hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代シークエンサーによる迅速かつ安価な骨髄増殖性腫瘍関連遺伝子検査法の開発

○研究目的:骨髄増殖性腫瘍(MPN)は多能性造血幹細胞の異常に起因し、骨髄などにおいて複数系統の血球増加を認める疾患群である。近年、次世代シークエンサ(NGS)等を用いた網羅的変異解析により、JAK2/MPL/CALRの3変異がその90%以上に排他的に認められる事が明らかになった。現状ではMPNの遺伝子変異検索は研究機関ベースで行うしかない。本研究では、NGSによる自前の迅速/安価なMPN遺伝子検査法を開発、提供する事を目的とした。○研究方法:試行錯誤の結果、NGSでは遺伝子数を限定しても1検体あたりのランニングコストを5万円以下に下げることは困難であり、MPNの安価な検査法の開発という初期目標を達成できなかった。そこで、本研究では新規変異検出法としてデジタルPCR法に注目した。まずMPNの半数以上で検出され、主要な変異で診断と治療に有用なJAK2p. V617F変異の迅速かつ安価な検出法の実現とその開発に目的を修正する事にした。デジタルPCRは現有機器のQX200(バイオラッド社)を用いることとした。検出法は感度、特異度とも優れるprobe法を用い、V617野生型、p. V617F変異型をそれぞれFAM、HEXで蛍光標識した試作probeを作成した。解析検体はJAK2p. V617F変異がサンガー法で検出されている実際のMPNの患者検体をポジコンとして用いた。以上によりデジタルPCR法によるJAK2p. V617F変異アレルの検出によるアッセイの検証を行った。○研究成果:本手法により初期のprobe作製にかかった費用は4.6万円、ランニングコストは700円/回/sampleであり、安価な検査法という目的を達成した。また検査時間はDNA抽出を除いた場合試薬調整、検査時間2時間以内であり、こちらも目的を達成できた。また、限外希釈法で検証した検出感度は実に0.01%であり、サンガー法の10%、NGSの1%を大きく上回った。また、NGSで測定した場合とのアレル頻度の一致率はピアソンの相関係数0.81(P<0.01)と極めて良好であった。以上により迅速かつ安価なMPN検査法の開発という本研究の目的は達成し得た。また本測定法は従来法より極めて高感度であった。今後はCALR遺伝子など対象遺伝子を増やして検証していきたい。
mTert幹細胞に特異的な遺伝子の解析による幹細胞休止性と放射線抵抗性の理解

組織幹細胞は、変異が生じることでがんの起源になりうる重要な細胞である。幹細胞には、休止性と増殖性の2種類があり、腸管では増殖性幹細胞が放射線被ばくや炎症などのストレスにより失われた場合に、休止期幹細胞が増殖性幹細胞を補うことで組織の恒常性が保たれている。本研究では、高度に休止性を維持している腸管mTert幹細胞に着目し、組織幹細胞の休止性がどのような遺伝子やシグナル伝達経路で制御されているかを明らかにする。また、ストレス応答後に増殖性幹細胞を補うという性質から、休止期幹細胞は発がんリスクの真の標的であると考えられるため、どのようなストレス(放射線の強さ)によって活性化されるのかを明らかにする。
変調指数の空間分布制御に基づく光周波数コムの平坦化に関する研究

本研究は,超広帯域な変調サイドバンド列生成技術と,超高速波面制御技術を融合し,擬似速度整合型電気光学位相変調器において入射光ビーム断面内の位相変調指数の空間分布を制御することにより,サイドバンド列の強度分布が一様な超広帯域光コムを生成するデバイスを創出することを目的としている.本年度に遂行した研究の結果得られた成果を以下に示す.1.数値計算に基づく変調指数の空間分布形状の最適化最適化のコードを独自に開発し,入射光ビームの空間強度分布を考慮したうえで変調指数の空間分布を決定した.2.デバイスの試作項目1で最適化した位相変調指数の空間分布から理論的に求まる分極反転形状を,電界印加法によりLiTaO3を基板として実現した.微細かつ複雑な分極反転形状を実現するために印加電圧のマルチパルス化を図り,リアルタイムで打ち込み電荷量がモニタ可能なシステムを新たに構築した.これには,本年度備品として購入したデジタルオシロスコープとコミュニケーションインターフェースが非常に役に立った.3.基本動作の確認所期の動作が得られることを確認した.変調周波数16.25GHzにおいて,1THz以上の±3dB帯域を有するフラット光コムの生成に世界で始めて成功した.ここで得られた成果の一部は,Springer Verlagから書籍"Ultrafast Phenomena XIV"の一部として出版され,Optics Lettersに掲載される.
セキュリティアクセラレーションに対応した高効率なIoT向けメニーコア

本研究では、様々な規模のコアに対応するために、コアの規模に依存することなく電力を削減できるデータビット幅に着目する。そして、1チップ上に高電力64ビットコアと低電力nビットコア(n<64)を混載し、プログラムごと、又は、プログラム内の命令ごとにデータビット幅を圧縮しながら、低電力コアでより多くの命令を処理する。本年度においては、従来のソフトウェアベースのセキュリティ対策では効率的な電力性能比が達成できていなかった点に着目し、それを緩和するために、コアにセキュリティ機能をハードウェアとして付与することによって、動的にソフトウェアとハードウェアのセキュリティ対策を切り替えることを可能にする予備的な研究を行った。研究した対策は大きく2つに分けることができる。1つ目のハードウェア機能の付与は、プロセッサ上で取得できる情報(プロセッサ情報)を特徴量とした機械学習によって、セキュリティ対策を行うものである。IoT向けとして、ARMをターゲットとした場合の評価を行った。2つ目のハードウェア機能の付与は、I/Oから取得できるストレージアクセス情報を特徴量とした機械学習によってセキュリティ対策を行うものである。この対策は1つ目のプロセッサ情報に着目した手段との併用、あるいは、動的切り替えによって、さらなる性能向上を達成できる可能性がある。本年度においては、上記に加え、今後の実装を考慮して、ARMではなくRISC-Vを対象とした拡張についても検討を行い、予備評価を行った。これはセキュリティ対策を行うメニーコアの性能評価での活用が期待される。研究実績が十分に得られているため。平成31年度は、前年度に得られた成果をベースとして、研究計画に示された内容(未発表のアイデアを含むため詳細は省く)に沿って、研究を進める。なお、一部の研究課題については前年度から継続する。本年度においては、メニーコア上のnビットコアにおける細粒度の電力制御機構の開発を行った。開発した電力制御機構は動的電圧周波数制御(DVFS)が有効となっている時に、電力をさらに低減する機能を持つ。開発した機構は大きく2つに分けることができる。1つ目の電力制御機構は、CPU全体の消費電力の多くを閉めているキャッシュの電力を制御する。コアの動作周波数の変動に合わせて、アクセス速度が遅いキャッシュに制御を移すことによって、消費エネルギーを削減する。2つ目の電力制御機構は、コアの動作周波数の変動に合わせて、複数の演算回路間でデータをバイパスし、単位時間当たりの演算回数を増やすことによって、電力効率を上げる。その結果、消費エネルギーを削減する。本年度においては、上記に加え、ベンチマークとして、人工知能をベースとしたセキュリティ対策システムの実現を行った。人工知能は最新のサイバー攻撃に対応する定義ファイルの更新が不要であり、また、サイバー攻撃を高精度に検知できるため、IoTデバイスに適している(例:Cylance社の人工知能)。データセットとして、ハニーポット上でマルウェアが行う悪性通信のデータを収集し、それをデータセットとして整備、解析を行った。本研究課題の研究目的に沿った研究実績が十分に得られているため。平成30年度は、前年度に得られた成果をベースとして、研究計画に示された内容(未発表のアイデアを含むため詳細は省く)に沿って、研究を進める。次年度使用額が生じた理由は、研究代表者の勤務先変更に伴い、研究設備の更新等が必要となり、予定していた学会発表を次年度に繰り越す必要が生じたためである。
第５世代移動体通信システムにおけるIoTのための先端全２重通信技術の研究

本研究課題では,周波数資源不足が懸念されている次世代移動体通信システム(5G)における周波数高効率利用に向けた全二重通信(FD)に関する研究活動を行った.初年度である平成29年度では,送信機RFチェインにおける非線形雑音の影響を最低化するため,シンボルの送信確率を一様分布からマクスウェル・ボルツマン分布に変更することで非線形雑音の影響を抑制する確率変調変形について取り組んだ.これは交付申請書に記載した研究実施計画にほぼ一致する内容となっており,確率変調変形を用いた非線形雑音の抑制法及びその統計的解析について3編の査読付き国際論文を発行した.この結果,一様分布を用いた時と比べて0.3[bits/s/Hz]の利得を得ることができることを示し,各サブキャリアの周波数帯域幅がメガヘルツオーダーとなる現状の移動体通信システムでは極めて大きな利得を獲得できることを明らかとした.また,受信側でのレイリーフェージングに従う通信路を加味した非線形雑音の確率密度分布を導出し,非線形雑音下における理論的な通信容量及びBER特性を明らかとした.平成30年度では,平成29年度で得られた知見をもとに,複数アンテナを具備した双方向FD通信におけるプリコーディング及びビームフォーミング設計を行った.ここではプリコーディング行列をラグランジュ未定乗数法や勾配投影法,分数計画法などを用いて最適化することで,以前提案されていた手法の通信レート性能を上回り,さらにFD通信において最も問題となる自己干渉電力を移動体通信システムの一般的なノイズフロアである-110[dB]以下に抑制することが可能となった.ここで得られた研究成果は2編の査読付き国際会議にて採択されており,また現在IEEE論文誌の投稿に向け論文を執筆中である.平成29年度では、Full-Duplexシステム全体を構築する上でもっとも基盤となる2次元非干渉コンスタレーションの設計及び解析を行った。通常の無線通信システムでは線形的なガウス雑音が信号に対して均一に加わる一方、Full-Duplexシステムでは送信アンテナと受信アンテナの距離が極めて近いため、送信側増幅器の非線形雑音の影響により送信信号に非線形な雑音が加えられ、システムパフォーマンスに深刻な影響を与えてしまう。このような問題から変調方式を変形することにより、できる限り非線形雑音が隣り合うシンボル同士に及ぼす影響を抑える方式を提案した。具体的には、変調方式の各点が持つ雑音の分散が異なることを考慮し、各点の送信確率を変えることによって非線形雑音の影響を抑制し、受信側でのスループットおよびBER性能の最大化を図った。この提案手法(確率変調変形方式)を使用し非線形の影響が強いシンボルの送信回数を減らすことで、従来の方式よりも高い送信レートを実現することができ、非線形雑音の影響が比較的大きい環境では最大0.4[bits/s/Hz]のスループット利得を得ることができた。これはLTEにおける帯域幅が数十[MHz]であることを考えれば,極めて大きな利得であると言える。また、得られた研究成果をまとめ、国際会議論文4編、国内会議論文3編を投稿し、各会議において口頭発表を行った。平成29年度で挙げた研究成果及びその進捗状況は、申請時の研究計画に概ね従っている。また、本研究が順調に進んでいることを受け、研究計画を前倒しして進めることができており、平成30年度の研究計画に関する研究成果を既に国際会議論文として投稿している。このため本研究の進捗状況は大変良好であると言える5GやIoTなど、超多数デバイスが同時に通信を行う将来の無線通信システムでは、周波数の圧倒的不足が予測されている。本研究課題では、この問題を解決するため、全2重通信(Full-Duplex:FD)を用いた周波数有効利用率の高い無線通信システム構築を最終的な研究目標としている。平成29年度は本研究課題の初年度となるので、研究課題の整理、本研究課題の根本となる2次元非干渉コンステレーションの設計を行った。この問題の解決により、平成30年度から研究にあたる自己干渉除去やFDシステム全体の構築をスムーズに進めることができる。このように、平成29年度では、申請書で述べた研究計画に沿って研究を行った。以下に得られた研究成果を記述する。送信と受信を同時に行うFDシステムでは、送信アンテナと受信アンテナの距離が極めて近いため、送信機非線形雑音の影響がシステムパフォーマンスに深刻な影響を与える。図1に理解のため、非線形雑音のイメージ図を載せる。平成29年度では、変調方式を変形することによって、可能な限り非線形雑音が隣り合うシンボル同士に及ぼす影響を抑える方式を提案した。提案した変調変形方式では、各シンボルの送信確率を変える確率変調変形方式を採用し、非線形性の影響が強いシンボルの送信回数を減らすことで、従来の方式よりも高い送信レートを実現した。具体的には、非線形雑音の影響が高い環境において、確率変調変形によって最大0.5[bits/s/Hz]の利得を得ることができた。これはLTEなどの一般的な無線通信システムが、各ユーザに数MHzの帯域幅を割り当てられていることを考慮すると、極めて大きな性能改善である。成果は、複数の査読付き国際会議にて発表を行った。現在、平成30年度の研究課題である自己干渉除去方式の構築に取り掛かっており、先行研究を上回る性能を発揮する事が既に明らかとなっている。

本研究課題では,周波数資源不足が懸念されている次世代移動体通信システム(5G)における周波数高効率利用に向けた全二重通信(FD)に関する研究活動を行った.初年度である平成29年度では,送信機RFチェインにおける非線形雑音の影響を最低化するため,シンボルの送信確率を一様分布からマクスウェル・ボルツマン分布に変更することで非線形雑音の影響を抑制する確率変調変形について取り組んだ.これは交付申請書に記載した研究実施計画にほぼ一致する内容となっており,確率変調変形を用いた非線形雑音の抑制法及びその統計的解析について3編の査読付き国際論文を発行した.この結果,一様分布を用いた時と比べて0.3[bits/s/Hz]の利得を得ることができることを示し,各サブキャリアの周波数帯域幅がメガヘルツオーダーとなる現状の移動体通信システムでは極めて大きな利得を獲得できることを明らかとした.また,受信側でのレイリーフェージングに従う通信路を加味した非線形雑音の確率密度分布を導出し,非線形雑音下における理論的な通信容量及びBER特性を明らかとした.平成30年度では,平成29年度で得られた知見をもとに,複数アンテナを具備した双方向FD通信におけるプリコーディング及びビームフォーミング設計を行った.ここではプリコーディング行列をラグランジュ未定乗数法や勾配投影法,分数計画法などを用いて最適化することで,以前提案されていた手法の通信レート性能を上回り,さらにFD通信において最も問題となる自己干渉電力を移動体通信システムの一般的なノイズフロアである-110[dB]以下に抑制することが可能となった.ここで得られた研究成果は2編の査読付き国際会議にて採択されており,また現在IEEE論文誌の投稿に向け論文を執筆中である.平成29年度では、非線形自己干渉を最低化する2次元非干渉コンステレーションの設計を行い、FDシステムにおける通信レート向上を実現した。しかしながら、得られた研究成果に基づいたFDシステムの総合設計やFDシステムにおける最大の問題点である自己干渉除去方式の構築など解決すべき点は多く残っている。以下に解決するべき問題点について詳述する。FD技術とともに将来の無線通信システムにおける周波数不足解決の観点から注目されている技術として、複数のアンテナを用いたMIMO通信がある。FDとMIMOを組み合わせたFD-MIMO技術は、さらなる周波数有効利用及び通信容量の増大が見込めるが、アンテナ数の増加とともに自己干渉除去のためのデバイス回路設計も複雑となり、コスト面から実現が現実的でないとされてきた。この問題を解決するため、アンテナ数に依存しない自己干渉除去ビームフォーミング設計を行う。特に、本研究では、アンテナ数に依存しないMultitap Analog Cancellerを用いた、デジタル・アナログ自己干渉技術の組み合わせであるハイブリッド自己干渉技術を行う。研究代表者は、平成29年度2月よりこの課題解決に向けて取り組んでおり、既に先行研究の干渉抑制性能を上回る性能を示しており、得られた研究成果は早期の発表を予定している。平成31年度では、これまで得られた研究成果に基づき、送信機非線形雑音や自己干渉を考慮した双方向FD通信システムの理論的総合設計を行う。ここでは、研究代表者がミリ波システムでの電力の最適化を行う際に着想した方法である、位相変化を行うビームフォーミングと電力変化を行うビームフォーミングの2段階ビームを構築し、さらなる性能向上を図る。
高強度パルスレーザー照射による疼痛緩和機序の検討と適応・非適応の明確化

本研究は、出力10Wのレーザーをパルス照射するレーザー治療器を用いて、疼痛緩和のメカニズムの一端を明らかにしようとする研究である。加えて、その結果を基に、実際にどのような疼痛に対してHILTが効果を示すのか、またどのような疼痛は効果が無いのかを検討するものである。
Klotho遺伝子及びOCIF遺伝子のダブルノックアウトマウスによる骨代謝の研究

Klotho遺伝子変異マウスは、長管骨骨管端部及び椎体骨端部において骨梁骨の延長、骨幹部における皮質骨の皮薄化等を示し生後3ヶ月程度で死に至る。我々は、Klotho遺伝子変異マウスが、骨損傷後修復の過程における急激な骨形成に異常はないが、その後に続く骨の吸収過程において機能異常を示すことを明らかにしてきた。またKlotho遺伝子変異マウスでは、骨髄内の破骨細胞は部位特異的な形態異常を示し、OPG/OCIF遺伝子の発現が亢進している事を明らかにした。OPG/OCIFは、TNFレセプターファミリーに属する遺伝子で、破骨細胞の分化、活性化を抑制する機能を持つことが知られており、この遺伝子が欠損したマウスでは、重篤な海綿骨及び皮質骨の減少が観察されている。以上の知見から、我々は、klotho変異マウスにおける骨梁骨の増加や破骨細胞の異常はklotho遺伝子によるOPG/OCIFの発現制御の異常によると考え、これら二種類の遺伝子の二重変異マウスを作成し、骨梁骨の量的変化の測定をおこなった。その結果、klotho変異マウスにおいて観察された骨管端部における骨梁骨の増加は、OPG/OCIFの欠損により正常値近傍まで回復した。このことからklotho変異マウスにおける骨大理石病様の表現型の発現には、OPG/OCIFの発現の増加が必須であると考えられた。klotho遺伝子及びOCIF遺伝子によるダブルノックアウトマウスの作成。ダブルノックアウトマウスの作成上、早期老化を示すklotho遺伝子変異マウスが変異遺伝子をホモ(klotho(-/-))に持つ場合、生殖能力が低下し短命であるため、ヘテロ変異体(klotho(-/+))で系統維持する必要がある。また、OCIF遺伝子ノックアウトマウスはホモ変異体(OCIF(-/-))の寿命が約半年と短いので、このマウスもなるべくヘテロ変異体(OCIF(-/+))で系統維持する。Klotho遺伝子・OCIF遺伝子ダブルノックアウトマウスの作成は、以下に述べる方法で行なった。Klotho遺伝子変異マウスのヘテロ変異体(klotho(-/+))とOCIF遺伝子ノックアウトマウスのホモ変異体(OCIF(-/-))の掛け合わせからF1を得て、それらに関して遺伝子型の同定をPCR法を用いて行い、klotho(-/+)OCIF(-/+)を選別した。現段階ではこの選別したF1(klotho(-/+)OCIF(-/+))の雄20匹、雌13匹得られている。この選別したF1(klotho(-/+)OCIF(-/+))とOCIF(-/-)を再び掛け合わせてF2を得た。この中から上記と同様に遺伝子型を同定してklotho(-/+)OCIF(-/-)を選別して、実験に用いるダブルノックアウトklotho(-/-)OCIF(-/-)を作成するための親として系統維持を行なっている。この親マウスが現時点で雄4匹、雌3匹得られた。これらの掛け合わせから作成したklotho(-/-)OCIF(-/-)ダブルノックアウトマウス(雄1匹、雌1匹)において、klotho(-/-)単独と同じ生育遅延傾向を示した。生育の遅延に対してOCIF欠損による抑制効果は見られないと考えられる。
IgG陽性Ｂ細胞特異的に発現する新規シグナル分子によるＢ細胞選択の解析

IgG2a抗原受容体陽性のA20細胞の抗原受容体の架橋によるアポトーシス促進因子であるBimの発現亢進に与えるParm1の役割について解析したところ、Parm1欠損A20細胞においては、コントロールの野生型細胞と比べて有意にBimの発現が亢進していることが明らかとなった。そこで、Parm1 KOマウスにT細胞依存性抗原を免疫した場合に生成される記憶B細胞の抗原受容体を架橋したところ、アポトーシスが顕著に誘導されることが明らかとなった。これらの結果から、Parm1 KOマウスにおいて2次応答が著しく低下しているのは、IgG陽性B細胞が抗原受容体の再架橋により野生型であれば増殖や抗体産生細胞への分化が促進されるのに対してParm1を欠失していることにより、逆にアポトーシスが惹起されてしまうためであることが強く示唆される結果が得られた。さらに、記憶B細胞のactivation-induced cell death (AICD)に関与が示唆されているPumaについても同様の検討を行ったところ、Bim同様にParm1遺伝子を欠失させたA20細胞においては発現に異常をきたしていることが明らかとなった。そこで、Pumaに対するsiRNAをParm1欠損B細胞に導入し、抗原受容体の架橋によるアポトーシスの誘導を試みたところ、Parm1を欠失しているにも関わらず野生型B細胞と同程度のアポトーシスが誘導された。これらのことから、Parm1はアポトーシス関連遺伝子の発現制御により記憶B細胞の生死を制御していることが強く示唆される成果が得られた。Parm1ノックアウトマウスの骨髄細胞をB細胞を欠失するマウスに移植することにより、Parm1をB細胞においてのみ欠失する(bKO)マウスを作製した。コントロールマウスとして、野生型マウス由来の骨髄細胞を同様に移植したマウスを作製した。これらのマウスに抗原としてNP-chickenγglobulin(CGG)を免疫したところ、一次応答においてはbKOマウスにおいてもコントロールマウスと同等の免疫応答が観察されたが、bKOマウスにおいてはIgGクラスの二次応答に著しい減弱が認められた。一方で、IgG2a陽性B細胞株であるA20細胞のParm1遺伝子を破壊した細胞株を樹立し、抗原受容体(BCR)シグナルに関与する分子群の活性化に与えるParm1の役割を解析したところ、Parm1 KO A20細胞においては、BCR架橋によるPLCγ2の活性化が促進されており、それに伴ってカルシウムの応答も増強されていた。さらに、BLNKのリン酸化もParm1 KO細胞において増強されていた。一方で、PI3KやAktのリン酸化については野生型と同程度にしか認められず、PI3K下流のシグナル経路にはParm1は関与していないということが示唆された。これらの結果から、Parm1がBCRシグナルを負に制御していることが強く示唆されたため、Parm1によるシグナル調節機構にParm1の細胞質内領域に存在するITIMモチーフの関与が予想された。そこで、BCR刺激に伴うParm1のITIMモチーフのリン酸化について検討を加えた。その結果、Parm1のITIMモチーフに含まれるチロシン残基の微弱なリン酸化が認められた。これらの結果は、Parm1のITIMモチーフがBCRのシグナル調節に関与していることを示唆していると考えられる。免疫応答におけるParm1の役割を明らかにすることができたことと、抗原受容体シグナルを伝達する分子群のうち、どの分子にParm1が影響を与えているのかについて概要を明らかにすることができたことから、当初の予定どおり順調に進展していると考えられる。一方、Parm1によるシグナル調節に対するITIMの関与については、抗原受容体刺激により弱いリン酸化が認められることから、事前に計画した検討による成果が得られたと考えられるが、事前に予想していなかったシグナル調節機構の存在も示唆される結果であり、新たな可能性を示すことができた。これらのことを総合すると、実施計画で予定していた研究成果に加えて新たなシグナル調節機構の存在の可能性を得られたことから、当初の計画以上に進展していると考えられる。Parm1の細胞質内領域のチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体を複数作成して、その影響を調べたところ279番目のチロシン残基がParm1の安定な発現に必須であることが明らかとなった。当該チロシン残基は、NPxYモチーフと呼ばれるモチーフに含まれており、NPxYモチーフの機能を阻害したためにParm1が安定に発現できなくなってしまったと予想された。そこで、当該変異体(Y293F)とGFPの融合タンパクを発現し細胞内の局在を検討したところ、小胞体における凝集が認められた。このことは、Y293Fが小胞体からゴルジ体への輸送に異常をきたし、小胞体で分解されていることを示唆していると考えられた。一方で、一部の文献ではNPxYモチーフが機能発現するためにはモチーフ中のチロシン残基がリン酸化されている必要があることが強く示唆されている。一方で、Parm1のNPxYモチーフの役割については、これまで全く検討されておらず、そのチロシン残基のリン酸化が起きているのか否かについては、不明のまま残されている。そこで、Parm1を発現しているA20細胞を小胞体からゴルジ体への小胞輸送を阻害する薬剤であるBrefeldin Aで処理し、Parm1のリン酸化に与える影響について評価した。その結果、ゴルジ体で糖鎖修飾される以前の未熟型Parm1においてリン酸化が認められた。これらの結果から、Parm1のNPxY

モチーフに含まれるチロシン残基はParm1が小胞体からゴルジ体への輸送時にリン酸化を受けると考えられ、このことが正常なParm1の細胞内輸送に必須であることが強く示唆される。Parm1のシグナル伝達機構を詳細に解析する過程で作成した変異体の解析からParm1の発現に必須なチロシン残基が明らかとなったことから、これまで全く知られていなかったParm1の細胞内輸送機構の一端が明らかとなった。また、その過程で、NPxYモチーフのチロシンリン酸化が必須であることも明らかとなった。これまで、NPxYモチーフのリン酸化については、ごく一部の論文で解析が行われているにすぎず、詳細が明らかになっていなかったことから、本研究の結果は、Parm1に限らず一般的な分子群の小胞体からゴルジ体への輸送に関する知見を明らかにできる可能性を秘めており、非常に重要な成果であると考えられる。このような点より、当初の予想を上回る成果が出ていると考えることから、当初の計画以上に進展しているとされる。IgG2a抗原受容体陽性のA20細胞の抗原受容体の架橋によるアポトーシス促進因子であるBimの発現亢進に与えるParm1の役割について解析したところ、Parm1欠損A20細胞においては、コントロールの野生型細胞と比べて有意にBimの発現が亢進していることが明らかとなった。そこで、Parm1 KOマウスにT細胞依存性抗原を免疫した場合に生成される記憶B細胞の抗原受容体を架橋したところ、アポトーシスが顕著に誘導されることが明らかとなった。これらの結果から、Parm1 KOマウスにおいて2次応答が著しく低下しているのは、IgG陽性B細胞が抗原受容体の再架橋により野生型であれば増殖や抗体産生細胞への分化が促進されるのに対してParm1を欠失していることにより、逆にアポトーシスが惹起されてしまうためであることが強く示唆される結果が得られた。さらに、記憶B細胞のactivation-induced cell death (AICD)に関与が示唆されているPumaについても同様の検討を行ったところ、Bim同様にParm1遺伝子を欠失させたA20細胞においては発現に異常をきたしていることが明らかとなった。そこで、Pumaに対するsiRNAをParm1欠損B細胞に導入し、抗原受容体の架橋によるアポトーシスの誘導を試みたところ、Parm1を欠失しているにも関わらず野生型B細胞と同程度のアポトーシスが誘導された。これらのことから、Parm1はアポトーシス関連遺伝子の発現制御により記憶B細胞の生死を制御していることが強く示唆される成果が得られた。本年度までに明らかとなった抗原受容体シグナルに対するParm1の調節機構を詳細に明らかにするとともに、Parm1の細胞質内領域に存在するITIMの関与について詳細に検討を加える。加えて、NZBマウスにおけるParm1の過剰発現の役割についても検討を加える。今後は、戻し交配を行ったNZBマウスにおけるParm1の発現様式や、病態に与える影響について詳細に解析を加える。また、NPxY
腰部神経根性疼痛に対するシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤の役割について

椎間板ヘルニアにおける腰部神経根性疼痛の発現には,ヘルニアによる神経根の機械的な圧迫だけでなく,プロスタグランディンやセロトニン(5-HT),炎症性サイトカインに代表される種々の生理活性物質が関与している。シクロオキシゲナーゼ(COX)はアラキドン酸カスケードにおける重要なキーエンザイムであるが,近年になってCOX-1とCOX-2の亜型が存在することが明らかとなった。炎症部位においてはCOX-2が主に関与していると考えられているが,従来の非ステロイド性消炎鎮痛薬はCOX-1,COX-2双方を同時に抑制するものであり,疼痛発現過程におけるCOX-1とCOX-2の役割については一定の見解が得られていなかった。臨床的に椎間板ヘルニアは6070%保存療法で治癒すると報告されているが,疼痛やしびれの難治例も少なからず存在する。本研究は椎間板ヘルニアの治療に有用なCOX阻害剤の投与方法ならびに新しい治療薬の可能性を探ることを大きな目的とした。具体的には椎間板ヘルニアの動物モデルを用いて,COX-1選択的阻害剤,COX-2選択的阻害剤,5-HT2A受容体阻害剤の神経因性疼痛抑制効果を検討した。本研究で得られた成果は1.L4,L5神経根上に尾椎から摘出した髄核を留置して神経根性疼痛を惹起するモデル(髄核留置モデル)を用いて,COX-1選択的阻害剤,COX-2選択的阻害剤を術後3-7日目に投与するとアロディニアを有意に抑制すること,2.選択的5-HT2A受容体拮抗薬である塩酸サルポグレラートがアロディニアを有意に抑制すること,以上の2点を明らかにしたことであり,特に塩酸サルポグレラートが椎間板ヘルニアにおける新たな治療薬となりうる可能性を示したことである。しかしながら,当初の主要な目的であった神経因性疼痛の発現過程におけるCOX-1選択的阻害剤,COX-2選択的阻害剤の効果の違いについては有意差が得られず,より研究目的に適した動物モデルを改良する必要性など,課題を残した。われわれはこれまでに椎間板ヘルニアのモデル動物としてL4、L5神経根をchromic gutで結さつするモデルを用いてきたが、より臨床的な病態に近いものとして、摘出した尾椎の髄核を神経根上に留置して疼痛を引き起こするモデルを作成し、神経因性疼痛に対するシクロオキシゲナーゼ2選択的阻害剤(セレコキシブ)の効果、およびセロトニン5-HT2A受容体選択的阻害剤(塩酸サルポグレラート)の効果を検討した。SDラット30匹に部分椎弓切除を行い、露出した左L4、5神経根上に切断尾椎より採取した髄核組織(4mg)を留置した。処置後のラットは術後7日目までに処置側後肢の痛覚過敏(アロディニア)を示すようになり、術後21日目までに正常に復した。セレコキシブ(5mg/kg)を術後4日目より3日間経口投与すると(n=10)、その後のアロディニアの程度は有意に抑制された。塩酸サルポグレラート(200mg/kg)を術後7日目より反復投与すると(n=15)、投与後5日目と8日目の測定でアロディニアは有意に抑制されていた。

今回の実験により髄核留置による椎間板ヘルニアモデルの有用性が確認された。また、シクロオキシゲナーゼ2選択的阻害剤が神経因性疼痛の発症予防に有効である可能性および、抗血小板剤である5-HT_<2A>受容体拮抗薬が神経因性疼痛に対して有効である可能性が示された。今後、椎間板ヘルニアに対する最適な薬物治療の確立を目指し、同一実験系内で各種シクロオキシゲナーゼ選択的阻害剤、5-HT2A受容体選択的阻害剤の比較検討を行う予定である。本研究の目的は椎間板ヘルニアにおける神経根性疼痛メカニズムを解明し、効果的な薬物療法を開発することである。当初の計画では髄核留置モデル(SDラットの切断尾椎から摘出した髄核組織を腰髄神経根上に自家移植することで約2週間、神経因性疼痛を引き起こすモデル)を用いて、COX-1選択的阻害剤、COX-2選択的阻害剤、5-HT2A阻害剤の疼痛抑制効果を神経根処置後3日(急性期)と10日(慢性期)で、比較検討する予定であった。しかし、髄核留置モデルでは、治療薬の違いによる疼痛抑制の差をみるには、神経因性疼痛の強度と持続期間が不足していることが判明した。そこで、動物モデルを改善すべく、2つの方法を試みた。1つは椎弓切除により露出したL4、L5神経根を5-0ナイロン糸で緩く結紮した上に髄核を留置する方法(神経根結紮髄核留置モデル)であり、神経因性疼痛は従来の髄核留置モデルよりも、明白で長期(3週間)持続した。もう1つはラット尾椎の椎間板に慢性圧迫力を一定期間加える装置(イリザロフ型創外固定器)をつけて変性させた髄核をL4、L5神経根上に留置する方法(変性髄核モデル)であり、このモデルにおいても従来の髄核留置モデルよりも明白で長期に及ぶ神経因性疼痛が観察された。そこで、変性髄核モデルにおける神経因性疼痛増強のメカニズムを探る目的で、正常な髄核と8週間慢性圧迫を加えた髄核内のpHを微小電極で測定し、さらに髄核内のTNF-α、IL-1β、PLA_2を免疫組織化学染色により比較した。その結果、変性髄核のpHが低下していること、TNF-α、IL-1β、PLA_2は正常・変性いずれの髄核内にも発現しており、その染色性に差がないことが明らかとなった。平成18年度は改良したモデルを用いて、当初の目的であった選択的COX阻害剤の役割を解明する予定である。【目的】腰部神経根性疼痛に対するシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤の役割について研究を進める中で、腰椎椎間板ヘルニアによる神経根の炎症を惹起する生理活性物質の一つとして,セロトニン(以下5-HT)に着目し,髄核留置による椎間板ヘルニアモデルの神経因性疼痛に対する5-HT_<2A>受容体拮抗薬の塩酸サルポグレラート(以下SPG)の効果を検討した.【方法】SDラット20匹に部分椎弓切除を行い,露出した左L4,5神経根上に切断尾椎より採取した髄核組織(4mg)を留置した.処置後のラットはSPG投与(100mg/kg)群(n=10)と溶媒対象群(n=10)に分けて,術後7日目から8日間SPGまたは溶媒を1日1回反復投与した.薬効評価は投与後1,5,8日目にvon Freyフィラメントによる足底刺激に対するアロディニアの観察をブラインド下に行い両群を比較した.全ての行動評価終了後には左右両側の神経根と後根神経節を摘出し,5-HTと代謝物の5-HIAA含有量を測定した.【結果】処置後のラットは全例,経過中に左足部の麻痺を認めなかった.投与1日目はSPGの効果は明確でなかったが,5日目はSPG投与後90分と120分の時点でアロディニアが溶媒群に比して有意に抑制された,8日目には,投与前の時点で既にSPG群でアロディニアが軽減している傾向がみられた.
Ｍｕｓａｓｈｉ１ーＲＮＡ相互作用ゲノムマッピング

in vivo蛋白質-RNA相互作用検出法、HITS-CLIPにより、神経幹細胞に強く発現するRNA結合蛋白質Musashi1(Msi1)の胎生期マウス脳におけるMsi1-RNA相互作用のゲノムマッピングを行った。その結果、生体内におけるMsi1のRNA結合部位をゲノムワイド1塩基解像度で同定することに成功した。このMsi1-RNA相互作用ゲノムマップを用いる事で、新規のMsi1標的RNA遺伝子群を同定し、これまでの解析で明らかとなっていたMsi1のRNA制御に加え、新たに新規のMsi1の機能の発見を導く事ができた。in vivo蛋白質-RNA相互作用検出法、HITS-CLIPにより、神経幹細胞に強く発現するRNA結合蛋白質Musashi1(Msi1)の胎生期マウス脳におけるMsi1-RNA相互作用のゲノムマッピングを行い、Msi1のRNA制御メカニズムおよび生体内における役割に迫ることを目的とした。In vivoにおけるMsi1と相互作用している標的RNAを同定するため、UV照射したマウス胎児脳の抽出液よりMsi1を認識する抗体を用いMsi1欠損マウスをネガティブコントロールとした、HITS-CLIPライブラリーを次世代シークエンサーにより解読した。得られた配列情報をバイオインフォマティクス解析により、再現性、信頼性の高いMsi1-RNA相互作用部位、約16,000部位の同定に成功した。これらの結合部位は、特に3'非翻訳領域に多く存在する一方で、Codingエクソン、イントロンやintergenic領域といった様々な部位にMsi1結合部位がみられた。さらに、CIMS(Crosslinking-induced mutation site)解析を合わせ1塩基解像度レベルでMsi1-RNAの相互作用部位を検出した結果、従来in vitroで明らかとなった結合配列と同等な配列情報が得られた。さらに、標的遺伝子群を1000近く同定し、これらが前脳発生に重要な分子群と関連性が強いことがわかった。分子機能については、従来翻訳抑制因子としてその分子メカニズムが明らかとなっており、本研究において多くの神経発生制御に関わる新規標的遺伝子について翻訳抑制機能を有する事が確かめられた。また、従来の分子機能に加え、様々な領域におけるMsi1のHITS-CLIPマッピングにより、従来の翻訳抑制制御だけでなく新たに3つの新規機能を持つ事を明らかにし、それぞれの機能がMsi1-RNA相互作用依存的であり、新規のMsi1の直接RNA制御メカニズムとしてMsi1欠損マウス、初代培養系を用いることで証明した。次世代シークエンサーを用いたHITS-CLIP法により、胎生期大脳皮質におけるMusashi1(Msi1)-RNA相互作用のゲノムマッピングを行い、Msi1のRNA制御メカニズムおよび生体内における役割に迫ることを目的とした。Msi1-RNA相互作用解析のため、Msi1を認識する抗体を用いMsi1欠損マウスをネガティブコントロールとしてHITS-CLIPを行った。Msi1と結合するRNAのみをウエスタンブロットにより転写されたメンブレンより精製し、精度の高いRNA結合領域の同定を行い、精製した約50塩基長のRNAを逆転写酵素により、cDNAライブラリーを作成し、次世代シークエンサーにより解読した。バイオインフォマティクス解析により、Msi1のゲノム上の結合部位をアノテーションした結果、ゲノム上の、3'UTRエクソン、Codingエクソン、イントロンやintergenic領域など様々な部位に結合のピークがみられた。現在まで、信頼度の高いMsi1-RNAゲノムマッピング部位として2203カ所を同定している。Msi1-RNAゲノムマッピングに加え、Msi1欠損マウスのトランスクリプトーム解析を合わせて行い、Msi1の標的下流遺伝子の解析を進めた。これまでの生化学的解析により、Msiの機能として翻訳制御が考えられてきているが、翻訳制御を裏づける多くのmRNA群において、エクソン、3'UTR部位にMsi1結合部位を持つものが得られた。さらに、これまで未知であった非コードRNAやといった蛋白質をコードしていない領域におけるMsi1の機能についてもMsi1-RNAゲノムマップによって得られてきている。これまで、明らかにされていなかったMsi1のゲノムマップの完成に近づきつつある。またゲノムマップにより新規のMsi1の機能を見出した。次世代シークエンサーを用いたHITS-CLIP法により、胎生期大脳皮質におけるMusashi1-RNA相互作用のゲノムマッピングのデータセットを用いた詳細な生化学的解析、バイオインフォマティクス解析を行い、Muasashi1のRNA制御メカニズムの包括的解析および生体内神経幹細胞におけるMusashi1を介したRNA動態の役割を明らかにする。シークエンサーを用いた解析がすでに進んでいたため、当初24年度に予定していた未使用額が生じたが、25年度に行うマウスの解析を含め必要なため下記の研究計画遂行のため実施する。膨大なデータセットのバイオインフォマティクス解析、生化学的解析による検証、マウスを用いた解析などの研究費の消耗品に費やす。主に生化学的解析試薬、特にマウスの飼育費等が他の資金では足りず、主にマウスの解析に使う予定である。
ヨーロッパ史の中の軍隊-新しい軍事史の方法と課題-

本研究の目的は、軍事史を現代の歴史学の潮流の中に位置づけることであり、軍隊に関する史料に着目して、軍隊と社会の関係を考察した。ドイツ人研究者4名と日本史やアジア史の研究者4名により組織され、2010年3月に開催された国際シンポジウムにより、新しい軍事史研究の可能性を国内の研究者にアピールするとともに、日独の軍事史研究者が双方の研究状況について相互理解を深めた。本研究により、より広い歴史的な文脈で軍事を考察することの重要性を指摘することができた。プロジェクトの初年である本年度は、研究組織の確立、個別研究の実施、次年度に実施予定の国際シンポジウムの準備、翻訳プロジェクトの推進などで成果が認められた。研究組織の確立については、5月の西洋史学会の際に会合を持ち方針を確認するとともに、7月の「『軍隊と社会の歴史』研究会」や2月の合宿研究会での議論を通じて、問題意識の共有がなされた。個別研究の実施については、各人が必要な図書等を購入するとともに、佐々木、阪口、鈴木、丸畠、屋敷、古谷の6名が海外出張によって現地資料の調査や当該分野の研究者との情報交換を行った。国際シンポジウムの準備に関しては、報告予定者であるクロスターフース氏(プロイセン枢密古文書館館長)とプレーヴェ氏(ポツダム大学)にメールで連絡をとり企画への了承を得た後、海外での調査日程に合わせて、佐々木、阪口、鈴木の3名が9月上旬にベルリンとポツダムを訪れ、両氏とシンポジウムの内容に関する打ち合わせを行った。これを受け、2月に日本側の報告予定者である原田敬一氏(日本近代史・佛教大学)と杉山清彦氏(清朝史・駒澤大学)を招いて京都で合宿研究会を行い、内容についての調整を行った。翻訳プロジェクトについては、実施している阪口、鈴木、丸畠が本科研費を利用して内容の検討会を二回行い、出版に向けての準備を進めた。11月にドイツ近世史の専門家であるJ・ブルクハルト教授(アウグスブルク大学)とE. J.ウェーバー教授(同大学)が来日した際に、東京(駒澤大学)での講演会に本研究のメンバーが多数参加して両氏と意見交換をしたことと、2月の研究会での日本史やアジア史の研究者との情報交換により、今後の研究展開の方向性が見えてきたことも本年度の重要な成果であった。中間年度の本年は、個別研究の推進、国際シンポジウム、他分野の研究者との交流のいずれの計画においても顕著な成果が認められた。個別研究の推進では、各人がそれぞれのテーマで研究を行うとともに、2009年夏に佐々木、西願、屋敷がヨーロッパで資料収集・文書館調査を行った。国際シンポジウムに関しては、ラルフ・プレーヴェ氏(ポツダム大学教授)とユルゲン・クロースターフース氏(プロイセン枢密古文書館館長)、ポツダム大学大学院生2名を招き、3月21日と22日に「「新しい軍事史」の課題と方法-ヨーロッパ・アジア・日本-」という国際シンポジウムを実施した。アジア史と日本史の報告・コメントも加え、日独の研究者で現在の軍事史研究の課題を共有することができ、多くの有益な情報を交換することができた。本科研のメンバーが運営している「『軍隊と社会の歴史』研究会」においては、4月に分担者の淺野明が報告をし、7月には小野寺拓也氏(東京大学大学院)にナチス期の軍事郵便関する報告を依頼した。11月には松本彰氏(新潟大学教授)と今井昭彦氏(埼玉県立川本高等学校)にドイツと日本の戦没者慰霊についての報告を依頼し、戦没者追悼論に関する議論を行った。阪口、丸畠、鈴木による翻訳プロジェクトでは、本科学研究費補助金を利用して検討会が行われ、ラルフ・プレーヴェ『「19世紀における軍隊・国家・社会』の翻訳が完成した。本年4月に創文社から刊行される予定である。以上、いずれの分野においても、本年度の目標を達成することができた。特に、国際シンポジウムと研究会活動において、ドイツの研究者および、アジア史や日本史の研究者と本格的に連携を開始したことは、今後の研究の発展において非常によい効果を発揮するであろう。最終年度の本年は、個別研究の推進と2010年3月に開催した国際シンポジウムの成果の公表により研究のまとめを行った。また、他分野の研究者との交流をさらに進め、今後の共同研究の方向性を探った。これらのいずれにおいても顕著な成果が認められた。個別研究の推進では、各人がそれぞれのテーマで研究を行うとともに、2010年夏に西願と淺野が、2011年3月には丸畠がヨーロッパで資料収集・文書館調査を行った。阪口、丸畠、鈴木による翻訳プロジェクトでは、ラルフ・プレーヴェ『19世紀における軍隊・国家・社会』が2010年4月に出版された。2010年10月には、本科研メンバーのうちの6人が寄稿した『歴史と軍隊-軍事史の新しい地平-』が創元社より出版された。

本科研が運営している「『軍隊と社会の歴史』研究会」では、7月に上記プレーヴェの翻訳の合評会を行うとともに、谷口眞子(日本近世史、早稲田大学)が報告をした。12月には山形大学で合宿形式の研究会を行い、山崎彰(ドイツ史、山形大学)、中村篤志(モンゴル史、山形大学)、竹村厚士(フランス史、武蔵野大学)といった科研メンバー以外の報告により、研究の視座を拡大した。さらに、谷口眞子、杉山清彦(清朝史、駒澤大学)、吉澤誠一郎(中国史、東京大学)などの、今後に本研究を拡大する際に予定しているメンバーの参加も求め、共同研究の方針を検討した。2011年3月に辻本諭(イギリス史)の報告を予定していたが、震災の影響により中止した。以上、いずれの分野においても、本年度の目標を達成することができた。とりわけ、日本史やアジア史の研究者との情報交換が深まり、研究のさらなる進展の方向性が見えてきたことは、最終年度の大きな成果であった。なお、本研究の成果の公表としては、2010年3月のシンポジウムの報告とその補完の原稿を加え、『近世近代軍事史研究入門』の出版を画している。
統合失調症におけるＫｖ９．３カリウムチャンネルサブユニット発現変化の脳内分布

カリウムチャネルサブユニット遺伝子KCNS3は、大脳皮質のパルブアルブミン陽性ニューロン(PVニューロン)に選択的に発現し、それによる周期的神経活動(オシレーション)の形成を促進することで脳内ネットワークにおける情報処理(認知機能)に役立っていると考えられる。統合失調症の患者で低下が認められる視覚情報の作業記憶は、前頭前野、外側頭頂葉、視覚野などからなる神経ネットワークにより支えられており、これらの領域ではオシレーションの異常が多く報告されている。本年度は、それぞれ領域のPVニューロンにおいてKCNS3の発現が低下していることを確かめるための死後脳サンプルの準備を行った。まず、前頭前野として46野、外側頭頂葉として7野、視覚野として17野および18野の組織をすべて得られる統合失調症例20と対照例20の死後脳組織を準備した。疾患群と対照群の間では、性別比は同じで(男:女=16:4)で、死亡時の平均年齢(疾患群45.6±9.5,対照群47.7±9.6)、死後経過時間(疾患群15.5±5.8,対照群14.4±6.2)がほぼ等しくなるように調整した。さらに、脳組織の品質を示すRNA integrity number(疾患群8.3±0.5,対照群8.2±6.5)やpH(疾患群6.7±0.2,対照群6.5±0.3)にも差はなく、良好な状態にあることが判明した。また、real-time PCRによる定量の条件決定を行い、視覚野から得られたRNAサンプルで、KCNS3遺伝子断片を99%の増幅効率にて内部標準遺伝子であるbeta-actin, cyclophylin, GAPDHと共に増幅・定量出来る条件を設定した。それぞれの症例の各領域からのRNAの抽出も行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。統合失調症の大脳皮質では、周期性皮質活動γオシレーションの形成を担うパルブアルブミン陽性の介在ニューロンの機能変化が、認知機能障害に関与していると考えられる。カリウムチャンネルサブユニットKv9.3は、健常者の前頭前野ではパルブアルブミン陽性ニューロンに選択的に発現しγオシレーションの形成に関わる。我々は、本プロジェクト開始前までに、Kv9.3 mRNAの発現レベルが統合失調症の前頭前野において低下していることを見出していた。本年度は、性別・年齢などがマッチした健常対照例と統合失調症の14対から得られた前頭前野組織切片において、細胞外基質であるPeriNeuronalNetの抗体染色を基準にして、パルブアルブミン陽性ニューロンのみをLaser Capture Microdissection法を用いて切り出し、各症例ごとにマイクロアレイによる遺伝子発現データを得た。このデータから、Kv9.3 mRNAの発現は統合失調症で有意に低下していること、Kv9.3と結合するKv2.1サブユニットのmRNAの発現もKv9.3 mRNAと有意に相関する形で(r=0.5, p=0.007)減少していることが判明し、前頭前野のパルブアルブミン陽性介在ニューロンにおいてKv9.3とKv2.1サブユニットからなるカリウムチャネルが減少していることが示唆された。また、健常対照者4例から得られた一次視覚野の切片において、Kv9.3とパルブアルブミンのmRNAの同時検出dual-label in situ hybridiation法にて行った。標識細胞2474個の解析の結果、一次視覚野では、Kv9.3 mRNA発現細胞の94%がパルブアルブミンを、パルブアルブミン陽性ニューロンの96%がKv9.3 mRNAを発現していることが判明した。以上より、一次視覚野でもKv9.3はパルブアルブミン陽性ニューロンに選択的に発現していることが示された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。Laser Capture Microdissetcionによるパルブアルブミン陽性ニューロンのみのサンプルを用いてKv9.3ならびにKv2.1の発現定量に成功した。これによりKv9.3の発現がパルアルブミンニューロンで生じていることを直接示すことができた。このマイクロアレイデータはは、今後とも統合失調症の前頭前野パルブアルブミン陽性ニューロンにおける遺伝子発現の解析に有用と考えられる。当初の予定では、一次視覚野を含む複数の領域でKv9.3 mRNAとパルブアルブミンの発現を別々にin situ hybridization法で検出し、発現パターンを比較する予定であった。しかし、前頭前野ではKv9.3 mRNAをパルブアルブミンmRNAの発現量が大きく違うことで発現パターンにも相違が認められ、発現パターンのみの比較ではKv9.3のパルブアルブミン陽性ニューロンに選択的な発現の確認は難しいと考えられた。そのため、dual-label in situ hybridization法を導入し、一次視覚野でもKv9.3 mRNAがパルブアルブミン陽性ニューロンにほぼ特異的に発現することを示すことができた。連合野である前頭前野に加えて一次知覚野でもKv9.3 mRNAのパルブアルブミン細胞における選択的発現が確認されたことで、この発現パターンが機能の異なる皮質領域に共通していると考えられた。今後は、性別・年齢・死後経過時間がマッチした健常対照例および統合失調症例の20対から得られた死後脳組織の一次視覚野からRNAサンプルを抽出し、real-time PCRにて統合失調症における発現変化の有無について確認する。さらに他の皮質領域でも、dual-label in situ hybridization法によるパルブアルブミン陽性ニューロンに選択的なKv9.3発現の確認と、統合失調症における変化の評価を行ってゆく予定である。
細胞増殖の調節(特にG1期とG2期で)に関与するヒト遺伝子のクロ-ニング

細胞増殖の調節はG1期とG2期で主としてなされる。本研究ではこれらの時期に欠損を持つ温度感受性変異株を用いて、G1/G2期で細胞増殖の調節に働いているヒト遺伝子を分離しその機能を解析している。G1期変異株としてはtsBN462を、G2期変異株としてはtsBN2をとりあげ、これらの変異を相補するヒト遺伝子CCG1とRCC1を分離した。本年度はこれらの遺伝子の機能解析をさらに進めてつぎのことを明らかにした。(1)完全なCCG1遺伝子を分離した。前年度までに一部の形質転換株に維持されていた一連のヒトDNAと既に分離されているCCG1遺伝子とからコ-ドされているcDNAが新たに分離され、CCG1遺伝子産物は前年度から予想されていた200KDaのものであることが証明された。tsBN462変異を相補するだけであれば、C端とN端の一部が欠けた遺伝子で充分であるがCCG1遺伝子の本来は別の機能を持ちそれには全体の遺伝子が必要であると推測される。(2)RCC1遺伝子がBN2異変株において変異している遺伝子そのものであることを明らかにした。これまでRCC1遺伝子はBN2変異のサプレッサ-であって本来の遺伝子は別物ではないかとしばしば言われていたのであるが、野生型とBN2株のRCC1cDNAを分離しその塩基配列の比較からBN2変異部位をcDNAの上に同定した。これによりRCC1遺伝子がBN2変異遺伝子そのものであることが確定した。(3)BN2変異部位のデ-タ-にもとづいて変異がタンパク質の構造に及ぼす効果について解析した結果、非常に大きな変化が高温下で起ることが推測され、抗体を用いてRCC1タンパク質の挙動をBN2細胞で高温下で調べたところ、高温下でこのタンパク質は消失し、それにともなってH1キナ-ゼが活性化されることが確認された。