hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
牛扁桃由来豚丹毒菌の疫学的意義

牛における豚丹毒菌感染の実態を明らかにする目的で、牛の抗体保有状況、保菌状況及び分離菌の諸性状を検討したところ、以下の結果が得られた。1.1988-1992年に北海道から沖縄県に至る9道県で合計854頭の牛から採取された血清の生菌凝集抗体価を測定したところ、殆どの血清が4-128倍で、76%の血清は32倍以上を、34%の血清が128倍以上の高い抗体価を示した。以上より、わが国の牛が豚丹毒菌に感染していることが血清学的に明らかとなった。2.次で、1998-1999年に山形、宮城、東京、長崎の4都県のと畜場に出荷された健康牛、合計1,236頭の扁桃からの菌分離を種々改良を加えた選択培地を用いて試みたところ、79頭(6.4%)から豚丹毒菌が分離され、健康牛の豚丹毒菌保菌が明らかとなり、保菌牛が牛間及び他の動物や人への本菌の伝播源となる可能性が示唆された。3.分離豚丹毒菌79株の血清型別の結果、43株は豚に病原性があるとされる1bや2型を含む9種類の血清型に分けられ、残りは型別不能であった。4.分離菌79株のマウスに対する病原性は、5株(6.3%)が致死的で、21株(25.3%)は毛の逆立や削痩などの症状を引き起こし、残りの株では無症状であった。マウス致死性の5株と症状を引き起こした3株を豚に接種したところ、すべての豚が発熱し、生菌凝集抗体価の上昇が認められ、そのうち4株は皮膚に発疹を発現させた。以上より、牛由来豚丹毒菌がマウスと豚に病原性があることが明らかとなり、牛が本菌の感染源となり得ることが示唆された。1.牛における豚丹毒菌抗体の保有状況わが国の牛における豚丹毒菌感染を血清学的に確認するために、北海道、岩手、埼玉、静岡、石川、島根、徳島、長崎及び沖縄の9道県で19881992年に合計854頭の牛から採取された血清について生菌発育凝集反応を行い、本菌に対する抗体価を測定した。その結果、ほとんどの血清が抗体陽性で、4128倍の抗体価を示した。76%の血清は32倍以上を、34%の血清が128倍以上をを示した。抗体価は南で高く、北で低い傾向を示した。また、養豚が行われていない地域における牛の血清は明らかに低い抗体価を示した。以上より、わが国の牛が豚丹毒菌に感染していることが示され、牛での症例が存在した可能性及び午が本菌のキャリアーとなることが示唆された。2.と畜場の健康牛における豚丹毒菌の分布牛における豚丹毒菌の分布状況を調べるために、19981999年に山形、宮城、東京、長崎の4都県のと畜場に出荷された臨床症状のない健康牛、合計1,236頭の扇桃から菌分離を実施した。

菌分離において、増菌用のBHIブロスにツイーン80を0.1%、馬血清を5%、ゲンタマイシン(GM)を50μg/ml、窒化ソーダを0.1%、クリスタル紫を0.001%加えたものと、分離培地としてBHI寒天にツイーン80を0.1%、GMを50μg/ml、窒化ソーダを0.1%加えたものとの組合せが優れていることが判った。分離豚丹毒菌の同定は形態、TSI寒天での糖分解と硫化水素産生性、ゼラチン培地における試験管ブラシ状発育などを指標として行い、分離株についてはさらに20種の糖の分解能を調べた。菌分離の結果、79例(6.4%)の扇桃から豚丹毒菌が分離された。以上より、健康牛の豚丹毒菌保菌が明らかとなり、牛は牛間及び他の動物や人への感染源となる可能性が示唆された。1.健康牛の扁桃から分離された豚丹毒菌の血清型平成14年度報告書で記載した牛の扁桃から分離した豚丹毒菌79株について123型とN型の家兎抗血済を用いて分離株のオートクレーブ抽出抗原とのゲル内沈降反応による血清型別を行うとともに、血清型による菌種の同定を試みた。その結果、43株は9種類の血清型に分けられ、残りの36株は型別不能であった。型別された株のうち30株は血清型1b(4株)、2(6株)、5(2株)、9(3株)、12(1株)、19(13株)、21(1株)で、Erysipelothrix rhusiopathiaeと同定された。残りの1株は血清型3で、Erysipelothrix tonsillarumと同定された。以上より、牛扁桃由来豚丹毒菌の血清型はこれまで豚に病原性があるとされる1b型や2型の他、多種にわたるとともに、型別不能株が多いことが明らかとなった。2.健康牛の扁桃から分離された豚丹毒菌のマウスと豚に対する病原性1.で用いた牛由来豚丹毒菌79株のマウスと豚に対する病原性を調べた。その結果、5株(6.3%)がマウスに致死的であり、LD_<50>は0.33-5x10^2CFUであった。これらの株は血清型1b(1株)、2(2株)、19(1株)、及び21(1株)に属していた。21株(25.3%)は弱毒でマウスは毛の逆立や削痩を呈しただけであった。豚ではマウスに対して致死的であった5株と臨床症状のみを引き起こした3株について検討した。その結果、マウス致死性の5株のうち4株は発熱を伴って菌接種部位の皮膚に発疹を発現させた。そのうちの3株(1b、2及び19型)による発疹は全身の皮膚に及んだ。残りの1株(2型)による発疹は接種局所のみに留まった。1b型の別の株は発熱だけで、皮膚の発疹は発現されなかった。一方、マウスに対するLD_<50>がやや高かった21型の1株と臨床症状のみを引き起こした2型の2株では発熱が認められただけであった。また、分離株を接種された豚すべてにおいて生菌発育凝集抗体価の上昇が認められた。以上より、牛由来豚丹毒菌がマウスと豚に対して病原性があることが明らかになり、牛が、豚はもちろん人を含む他のほ乳類への本菌の感染源・伝播源となり得ることが示唆された。健康牛の扁桃から分離された豚丹毒菌の分子同定近年、細菌の同定において伝統的な手法に代ってpolymerase chain reaction(PCR)法などの遺伝学的手法を応用する例が報告されるようになった。豚丹毒菌については、最近、Takeshiら(1999)が、先にDNA相同性試験で分類された4菌種に特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR法を開発した。そこで、本研究で分離され、昨年度までに報告してきた牛由来株79株について本法による同定を試み、血清型による菌種の同定との比較を行った。その結果、PCR法により、79株中6株はErysipelothrix rhusiopathiaeと、1株はE.tonsillarumと同定され、残りの72株はErysipelothrix species strain 1と同定された。Erysipelothrix species strain2は含まれていなかった。血清型による菌種同定との比較において、79株中19株(E.rhusiopathiae6株E.tonsillarum1株及びErysipelothrix species strain 1 12株)は両方法による同定が一致した。また、血清型別不能であった36株はすべてがErysipelothrix species strain 1と同定された。残りのE.rhusiopathiaeと同定されていた24株はPCR法ではErysipelothrix species strain 1と同定された。
レーザースペックル現象を用いた網膜血流測定機の開発

レーザースペックル現象を応用した人眼網膜血流測定装置を開発した。He-Neレーザーを眼底カメラ内に設置し、反射レーザー光をピンホールを通して光電子増倍管で検出、この検出信号を光子計数ユニットで処理した後、その自己相関関数を計算し、自己相関時間が半分になる時の遅れ時間を相関時間と定義すると、その逆数による血流速度が評価できることがわかった。本測定装置の再現性および精度は1)様々な管径のガラス管中にヒト血液を流し、その血流速度を計る、2)正常人篤志者16名28眼の173本の網膜静脈における血流速度を測定するという実験により、検討された。以上の実験の結果、ヒト網膜静脈(血管径62μmから186μm)の血流速度分布は最小1.48mm/sから最大32.5mm/sであった。また、網膜静脈内血流速度は血管径の2.49±0.08乗に比例しているという結果が得られた。さらに、本測定装置を発展させリアルタイム血管径測定装置を組み込んだ。方法は眼底からの反射光をイメージセンサ上に結像させ、その画像を解析するものである。この血管径測定装置の精度を確認するために以下のような実験を行った。1)解像度チャートフィルムをモデル血管として、そのスリットの幅の測定を行い、本測定法の再現性、測定誤差を求めたところ、再現性が変動係数で0.160±0.083%(Mean±SD)、実値との相関係数は、0.999であった。また本測定法で得られた測定値の平均値は実値に対して誤差1.77±1.26%(Mean±SD)の範囲内であった。2)正常人篤志者20名40眼を対象とし、その再現性を検討、また測定直前に撮影した単色光による眼底写真スライド上の網膜血管の血管径を顕微鏡下で測定し本方法による測定結果と比較した。その結果、眼底写真による測定の再現性が変動係数7.2±5.4%(Mean±SD)であったのに対し、本方法では3.14±2.73%(Mean±SD)であった。また顕微鏡による測定値と本測定法との相関係数は0,835であった。レ-ザ-スペックル現象を応用した人眼網膜血流測定装置を作成した。装置作成にはHe-Neレ-ザ-と眼底カメラおよび光電子増倍管、光子計数ユニット、さらにマイクロコンピュ-タを用いた。照射レ-ザ-光の直径は網膜上で約0.7mmでレ-ザ-パワ-は18から150mW/cm^2までに設定できるようにした。反射レ-ザ-光は直径200μm,網膜上で約13μmに相当するピンホ-ルを通り、光電子増倍管で検出される。この検出信号を光子計算ユニットで処理した後、デジタルコリレ-タ-およびマイクロコンピュ-タで自己相関関数と計算する。自己相関が半分になる時の遅れ時間を相関時間と定義し、その逆数をもって血流速度を評価した。また血管径決定のため、測定機の眼底カメラで眼底写真を撮影し眼軸長と屈折でLittmanの式にしたがって血管径を決定した。

この装置を用いて、ガラス管内のヒト血液血流速度を測定し、そのデ-タを元にして、人眼網膜血流速度の換算式を作成した。正常人篤志者16名28眼の173本の網膜静脈における血流量を測定した。測定した血管径61μmから186μm(平均125μm)の網膜静脈中の血流速度は最小1.48mm/sから最大32.5mm/s、平均10.34mm/sであった。血流速度(V)および血流量(F)と血管(D)の関係は、それらの両対数をとって直線回帰分析を行ったところ、logV=〔0.49±0.08〕logD+〔0.07±0.16〕、logF=〔2.49±0.08〕logD-〔4.26±0.16〕(mean±SE)という結果が得られた。このことにより、網膜静脈内の血流速度は血管径の2.49±0.08乗に比例しているという結果が得られ、この結果はマ-レ-の法則から得られる値よりもいくぶん低いものであった。さらに、16名25眼においてそれぞれの血管内の血流量を合計することにより網膜全血流量をもとめた。平均の全血流量は51±10.0μ1/min(mean±SD)であった。平成3年度中に得られた結果をもとにして、2号機を作成したが、その際、網膜血流量測定において、血管内血流速度の測定以上に、血管径の正確な測定が必要であると考え、リアルタイム血管径測定装置を組み込むこととした。具体的には、眼底からの反射光をイメージセンサ上に結像させ、その画像を解析することにより、血管内血流速度測定と同時に、網膜血管径を測定しようとするものである。このときの照射光の中心波長は眼底像を結像したとき網膜血管と周囲組織のコントラストが最もよいとされる570nmとし、その反射光を512個のダイオードからなるPCDラインセンサー上に結像させた。この血管径測定装置の精度を確認するために、以下のような実験を行った。1)まず、予備実験として、解像度チャートフィルムをモデル血管として、そのスリットの幅の測定を行い、本測定法の再現性、測定誤差を求めた。スリット幅は8種類で、それぞれに対し、8回ずつの測定を行った。結果は、再現性が変動係数で0.160±0.083%(Mean±SD)、実値との相関係数は、0.999であった。また、本測定法で得られた測定値の平均値は実値に対して、誤差1.77±1.26%(Mean±SD)の範囲内であった。次に、正常人篤志者20名40眼を対象とし、1血管に対し38回の測定を行ない、その再現性を検討した。また、測定直前に撮影した単色光による眼底写真スライド上の網膜血管の血管径を顕微鏡下で35回測定、本方法による測定結果と比較した。その結果、眼底写真による測定の再現性が変動係数7.2±5.4%(Mean±SD)であったのに対し、本方法では3.14±2.73%(Mean±SD)であった。また、顕微鏡による測定値と本測定法との相関係数は、0.835であった。以上の結果をもとに、2号機に網膜血管径測定装置を組み込むこととし、その再現性実験、および各種薬剤の網膜血流量に与える影響をみる実験等を現在行っている。
血管平滑筋細胞応答に対するリポ蛋白中の脂質性シグナル分子の役割の解明

前年度に、低密度リポ蛋白(LDL)中のリゾフォスファチジン酸(LPA)が、平滑筋細胞のLPA1受容体を刺激して遊走、増殖など動脈硬化促進作用を引き起こし、高密度リポ蛋白(HDL)中のスフィンゴシン1-リン酸(S1P)が、平滑筋細胞のS1P2受容体を介して、血小板増殖因子(PDGF)による遊走応答を抑制し、アンチ動脈硬化作用を発揮している可能性を示唆した。本年度は、LDLとHDL中のLPA,S1P量を、我々が独自に開発した定量法を用いて定量した。その結果、HDLに比しLDL中には高濃度のLPAが存在する一方、HDL中にはLDLに比し、高濃度のS1Pが存在していた。この結果は上記可能性を支持する。さらに本年度は、LDL中のLPAをリパーゼ処理により分解、または平滑筋細胞のLPA受容体をアンタゴニストで阻害すると、LDLが平滑筋細胞の遊走を積極的に抑制し、アンチ動脈硬化作用を発揮することを新たに見出した。この抑制作用はS1P2受容体に対するsiRNAで阻害されること。実際に、LDL中にはLPAよりは少ないもののS1Pが存在することから、血管平滑筋細胞の遊走応答に対するLDL作用は、LDL中のLPA,S1P量のバランスと平滑筋細胞に発現するLPA,S1P受容体サブタイプによって決まることが明らかとなった。本年度はさらに、in vivoモデルとしてラット頸動脈肥厚モデルを用いてLPA作用を検討した。現段階ではLPA処理によりはっきりとした傾向が認められておらず、LPAの処理時間、濃度など、さらなる条件検討が必要である。血漿リポ蛋白は、血管機能、動脈硬化症と密接に関連している。我々は、脂質性シグナル分子であるスフィンゴシン1リン酸(S1P)、リゾフォスファチジン酸(LPA)の研究を通じ、これら脂質性シグナル分子がLDL, HDLなどリポ蛋白に濃縮して存在することを示してきた。そこで、「アンチ動脈硬化作用にはリポ蛋白中のS1Pが、動脈硬化促進作用にはリポ蛋白中のLPAが関与している」との仮説をたて、本研究を計画した。本年度は、ヒト冠動脈平滑筋細胞(CASMC)の遊走、増殖応答に対するLDL、HDL中に含まれるLPA, S1Pの作用を検討した。CASMCの増殖、遊走応答はLDLの添加によって引き起こされた。またこれらの応答は、百日咳毒素のよるGi蛋白の不活性化や、LPAなどを分解するリパーゼ処理により遮断された。よって、LDL中に含まれるLPAがLPA受容体を刺激して、CASMCの遊走、増殖応答を引き起こしていることが考えられた。そこで、どのLPA受容体サブタイプがこれらの応答に関与しているかどうかを、我々が開発に携わってきたKi16425を含むLPA受容体アンタゴニストを用いて検討した。その結果、LPA1受容体がこれら応答に関与する受容体であることが示された。さらにLPA1受容体に対するsiRNA処理によっても、これら遊走、増殖応答が減弱することを確認した。これらの結果は、LDL中のLPAが平滑筋細胞のLPA1受容体を刺激して遊走、増殖など動脈硬化促進作用を引き起こしている可能性を示している。一方、HDLは血小板由来増殖因子(PDGF)によるCASMCの遊走応答を制御した。この抑制作用はS1P受容体サブタイプの一種であるS1P2に対するsiRNA処理によって減弱したことから、HDLはHDL中のS1PがS1P2受容体を介して、アンチ動脈硬化作用を発揮している可能性が示唆された。

前年度に、低密度リポ蛋白(LDL)中のリゾフォスファチジン酸(LPA)が、平滑筋細胞のLPA1受容体を刺激して遊走、増殖など動脈硬化促進作用を引き起こし、高密度リポ蛋白(HDL)中のスフィンゴシン1-リン酸(S1P)が、平滑筋細胞のS1P2受容体を介して、血小板増殖因子(PDGF)による遊走応答を抑制し、アンチ動脈硬化作用を発揮している可能性を示唆した。本年度は、LDLとHDL中のLPA,S1P量を、我々が独自に開発した定量法を用いて定量した。その結果、HDLに比しLDL中には高濃度のLPAが存在する一方、HDL中にはLDLに比し、高濃度のS1Pが存在していた。この結果は上記可能性を支持する。さらに本年度は、LDL中のLPAをリパーゼ処理により分解、または平滑筋細胞のLPA受容体をアンタゴニストで阻害すると、LDLが平滑筋細胞の遊走を積極的に抑制し、アンチ動脈硬化作用を発揮することを新たに見出した。この抑制作用はS1P2受容体に対するsiRNAで阻害されること。実際に、LDL中にはLPAよりは少ないもののS1Pが存在することから、血管平滑筋細胞の遊走応答に対するLDL作用は、LDL中のLPA,S1P量のバランスと平滑筋細胞に発現するLPA, S1P受容体サブタイプによって決まることが明らかとなった。本年度はさらに、in vivoモデルとしてラット頸動脈肥厚モデルを用いてLPA作用を検討した。現段階ではLPA処理によりはっきりとした傾向が認められておらず、LPAの処理時間、濃度など、さらなる条件検討が必要である。
表面プラズモン共鳴フェムト秒光熱変換分光法の開発と固液界面エネルギー移動計測

フェムト秒過渡反射格子法を固液界面に応用し、今まで検出不可能だった固液界面の微小な誘電率の変化を計測することに成功した。さらに表面プラズモン共鳴を併用し、固体側から液体側への超高速エネルギー移動時の微小な誘電率の変化をその場計測することに成功した。これらの成果として、次の知見を得た。(1)ルチル構造酸化チタン単結晶とチオシアン酸カリウム水溶液の界面に150フェムト秒のパルスを入射し、その後の誘電率の過渡的変化をモニターした。その結果、従来知られている電子・ホール再結合の成分に加えて、110フェムト秒から690フェムト秒の速い時間領域で緩和する成分が新たに観測された。この速い成分の強度はチオシアン酸カリウムの濃度を増加させると増大した。これは超高速時間領域で励起状態のキャリアが吸着種であるチオシアン酸イオンに移動していることを示している。このような速い時間領域での電荷移動はこれまでの理論では説明できず、励起状態のホールが非平衡な状態でチオシアン酸イオンに移動していることを示唆している。これは酸化チタンのホットキャリアとその吸着種の相互作用の初めての観察である。光触媒、光電極として有名な酸化チタンでこのような相互作用が観察された意義は極めて大きい。(2)金/塩化ナトリウム水溶液界面におけるエネルギー移動を表面プラズモン共鳴過渡反射格子法で観測した。その結果、ホットエレクトロンによる緩和と界面熱移動による緩和の2種類の成分があることがわかった。これは界面におけるエネルギー移動には、励起状態にある電子が係わる速い成分と、熱に変化した後に移動する遅い成分の両方があることを示している。塩化ナトリウムの濃度を変化させて測定した結果、ホットエレクトロンと吸着種との電子的な相互作用が確認された。フェムト秒光熱交換分光法を固液界面に適用し、今まで検出不可能だった固液界面の微小な誘電率の変化を計測することに成功、固体側から液体側への超高速エネルギー移動のその場計測を実現した。その結果、固液界面における超高速エネルギー移動について次の知見を得た。(2)金/塩化ナトリウム水溶液界面におけるエネルギー移動を表面プラズモン共鳴過渡反射格子法で観測した結果、ホットエレクトロンによる緩和と界面熱移動による緩和の2種類の成分が見られた。塩化ナトリウムの濃度を変化させて測定した結果、ホットエレクトロンと吸着種との電子的な相互作用が存在し、それがエネルギー移動に影響を与えていることが示唆された。
ＤＩＣ病態における炎症と凝固のクロストークと血管作動性物質の役割

DICの本態は、著しい凝固活性化と微小血栓多発であり、進行すると不可逆的な臓器障害や出血症状をきたす。予後改善のためには、適切な診断基準の作成と病態に応じた早期の治療介入が必要である。DICモデルを用いた我々の検討では、充分な抗凝固療法を行っても、特に炎症の強い病態では微小循環障害や内皮障害に起因する臓器障害を伴うDICの進展は不可逆的であり、凝固活性化以外の要素が病態に深く関与していると考えられる。血管作動性物質は、DICの循環動態に影響を与える可能性が高いが、その意義は不明である。DICモデルでの血管作動性物質の意義については今後とも検討を継続する。血管奇形や大動脈瘤で線溶亢進型DICを合併すると、致命的な出血症状をきたしやすい。直接経口抗凝固薬と注意深いトラネキサム酸の併用はDIC病態を劇的に改善することを見出し、学会・論文発表を行った。TMAとDICには病態の差異があるが、凝血学的検査には類似点も多い。TMAの特徴的検査所見の一つとしてLDH著増がこれまで信じられてきたが、LDHが軽度上昇にとどまる例も多いことを文献的検討から指摘して、学会発表を行った。ALアミロイドーシスは時に全身性の出血傾向をきたし、FDP、D-ダイマー、TAT、PICの上昇をきたすためDICとの鑑別が問題になる。当院でのALアミロイドーシスを網羅的に登録して、凝固線溶病態を解析した。特にPIC上昇、第X因子低下などの特徴的所見がみられるが、トラネキサム酸の投与により、これらのデータの改善とともに出血症状が消失することを見出した(英文論文投稿中)。皮下血腫のためFDPやD-ダイマー高値となる病態でのDIC誤診例がある。凝固因子インヒビターの的確な診断法を検討して、学会・論文発表を行った。日本血栓止血学会DIC診断基準2017年版の作成に中心的な役割を果たし、検証作業を行なっている。播種性血管内凝固症候群(DIC)の本態は、基礎疾患の存在下における著しい凝固活性化と微小血栓多発であり、予後改善のためには適切な診断基準の作成と病態に応じた治療介入が必要である。DICモデルを用いた我々の検討では、充分な抗凝固療法を行っても、特に炎症の強い病態では臓器障害やサイトカイン発現を伴うDICの進展は不可逆的であり、凝固活性化以外の要素が病態に深く関与していると考えられる。血管作動性物質は、DICの循環動態に影響を与える可能性が高いが、その意義はほとんど検討されてこなかった。今回、DICモデルでの血管作動性物質の発現機序を解明し、内皮障害、微小血栓形成、臓器障害との関連を検討する。DICは、敗血症(LPS誘発モデル)型のDICに代表されるように臓器障害が前面に出る線溶抑制型DIC、急性白血病(組織因子誘発モデル)型に代表されるように出血症状が前面に出る線溶亢進型DIC、その中間の線溶均衡型DICに分類される。これら病態の差違にもかかわらず、画一的に診断されてきた。また、DICの本態である凝固活性化を反映するマーカーが診断基準に組込まれてこなかった。これらの点を改善し、適切に診断する能力を有したDIC基準を作成して、英文論文での発表を行った。DIC診断におけるFDPやD-ダイマーの測定意義は大きいが、両者測定の意義については十分な議論が行われてこなかった。両マーカー測定の意義とともに、これらのマーカーでのみ病態評価を行うことの限界についてシンポジウムなどでの発表を行った。大動脈瘤に起因するDICは炎症の関与が少ない一方で、時に大出血をきたす。また慢性に経過するために持続点滴治療は患者負担が大きい。ワルファリンはDICの病態を悪化させるのに対して、直接経口抗凝固薬はDIC病態を劇的に改善することを見出し、英文論文化した。DICの病型分類は、DICの病態解析、診断、治療法の開発などDIC研究の根幹に関わる極めて重要な概念である。線溶亢進線溶均衡型DIC(組織因子誘発モデルに類似した病態)、線溶抑制型DIC(LPS誘発モデルに類似した病態)といったDICの病型分類は我々が世界で最初に提唱した考え方であるが、国際的に共有された概念とまでは言い難かった。この度、このDIC病型分類の重要性を詳細に記述して英文論文化した。また、違った病態を有するにもかかわらず画一的な診断が行われてきたこれまでの矛盾を指摘して、この矛盾を解消すべく新しい診断基準の作成を行いその検証作業も行った。なお、この作業は内科のみならず、小児科、産婦人科、外科、救急医学、臨床検査医学など多くの領域における専門家の間での議論を繰り返して成し遂げられた。この新しい診断基準が今後浸透することで、DICの臨床、研究レベルの向上が期待される。新しいDIC診断基準の英文論文化は大きな一歩であったと言えよう。DIC診断の上で大きな比重をしめる血液凝固検査の意義およびその限界に関して、数々の学会学術集会での発表を行うとともに、総説論文や著書を通しても積極的に啓蒙活動を行った。大動脈瘤は、線溶亢進型DICを併発することで知られており、時に出血症状が問題となる。我々はこれまでも大動脈瘤の進展にアネキシンIIの関与があることを報告してきた。

また、大動脈瘤に起因するDICは慢性に経過するのが特徴であり、経口薬でのコントロールが可能であれば理想的である。ワルファリンは伝統的に用いられてきた経口抗凝固薬であり、専門家の間でもDICに対して有効ではないかと考える者もいた。今回我々は、ワルファリンはDICに対して全く無効であるどころかむしろ病態を悪化させるのに対して、直接経口抗凝固薬は速やかにDIC病態を改善させるという新知見を得たために英文論文化した。播種性血管内凝固症候群(DIC)の本態は、著しい凝固活性化と微小血栓多発であり、進行すると不可逆的な臓器障害や出血症状をきたす。予後改善のためには、適切な診断基準の作成と病態に応じた早期の治療介入が必要である。DICモデルを用いた我々の検討では、充分な抗凝固療法を行っても、特に炎症の強い病態では微小循環障害や内皮障害に起因する臓器障害を伴うDICの進展は不可逆的であり、凝固活性化以外の要素が病態に深く関与していると考えられる。血管作動性物質は、DICの循環動態に影響を与える可能性が高いが、その意義は不明である。今回、DICモデルでの血管作動性物質の発現機序を解明し、内皮障害、微小血栓形成、臓器障害との関連を検討する。DICは、敗血症(LPS誘発モデル)型のDICに代表されるように臓器障害が前面に出る線溶抑制型DIC、急性白血病(組織因子誘発モデル)型に代表されるように出血症状が前面に出る線溶亢進型DIC、その中間の線溶均衡型DICに分類される。従来は、これら病態の差違にもかかわらず、画一的に診断されてきたことや、DICの本態である凝固活性化を反映するマーカーが診断基準に組込まれてこなかったことが、問題点であった。我々はこれまでに、的確に診断する能力を有したDIC診断基準を作成して論文および学会発表を行うとともに、その検証作業を推進した。大動脈瘤に起因するDICは炎症の関与が少ない一方で、時に大出血をきたす。また慢性に経過するために持続点滴治療は患者負担が大きい。ワルファリンはDICの病態を悪化させるが、直接経口抗凝固薬はDIC病態を劇的に改善することを見出し論文化した。出血性素因のために皮下血腫をきたすことで、FDPやD-ダイマーが高値となる病態でのDIC誤診例が少なくない。凝固因子に対する自己抗体を発現した出血性素因の的確な診断法を検討して、英文論文化した。DICの病型分類は、DICの病態解析、診断、治療法の開発などDIC研究の根幹に関わる極めて重要な概念である。線溶亢進線溶均衡型DIC(組織因子誘発モデルに類似した病態)、線溶抑制型DIC(LPS誘発モデルに類似した病態)といったDICの病型分類は我々が世界で最初に提唱した考え方であるが、国際的に共有された概念とまでは言い難かった。我々は、論文および学会発表を通して、DICの病態の多様性について報告を行ってきた。また、違った病態を有するにもかかわらず画一的な診断が行われてきたこれまでの矛盾を指摘して、この矛盾を解消すべく新しい診断基準の作成を行いその検証作業を推進した上で、論文および学会発表を行った。この新しい診断基準が今後浸透することで、DICの臨床、研究レベルの向上が期待される。DIC診断の上で大きな比重をしめる血液凝固検査の意義およびその限界に関して、数々の学会学術集会での発表を行うとともに、総説論文や著書を通しても積極的に啓蒙活動を行った。大動脈瘤、解離性大動脈瘤などの血管疾患は、線溶亢進型DICを併発することで知られており、しばしば出血症状が問題となる。
プロドラッグを代謝する薬物代謝酵素の遺伝的多型の臨床的意義について

カルボキシルエステラーゼ(CES)の遺伝子多型によって、CES1で代謝される薬物の薬物動態に影響が認められるかを検討した。CES1A遺伝子多型及びCES1機能遺伝子数の違いでオセルタミビル(未変化体)及びオセルタミビルカルボキシル体(活性代謝物)の薬物動態に有意な差は認められなかったが、オセルタミビル血漿中濃度が著しく高値(約10倍)を示す被験者1例の存在を確認したため、CES1の個人差についてはさらなる検討が必要であると考えられた。カルボキシルエステラーゼ(CES)は,エステル結合やアミド結合によって分子修飾されたプロドラッグなどの医薬品の代謝活性化過程で重要な役割を果たしている薬物代謝酵素である。CES1酵素にはCES1A1およびCES1A2、CES1A1 variant、CES1A3の4つの遺伝子が存在する。これらの組み合わせで4つのハプロタイプ(Haplotype A:CES1A3/CES1A1, Haplotype B: CES1A2/CES1A1, Haplotype C: CES1A3/CES1A1 variant, Haplotype D: CES1A2/CES1A1 variant)が確認されている。このうちCES1A3は、蛋白発現につながらない偽遺伝子である。本酵素の個人差の原因については、ほとんど検討が行われていないため、オセルタミビル代謝における薬物血中濃度の差及び副作用がCES1遺伝多型による機能遺伝子数の違いに起因するかを検討する。健康成人30名を対象とし、オープン試験で実施した。オセルタミビル75mgを単回経口投与し、オセルタミビル投与前及び投与後啓示的に血漿中オセルタミビル(未変化体)及びオセルタミビルカルボキシル体(活性代謝物)濃度測定のための採血を行い、薬物動態パラメーターを評価した。CES1遺伝子多型による機能遺伝子数3が24名、機能遺伝子数4が6名であった。重篤な有害事象は認めなかった。今回解析したCES1遺伝子多型による機能遺伝子数の違いでオセルタミビル(未変化体)及びオセルタミビルカルボキシル体(活性代謝物)の薬物動態に有意な差は認められなかった。しかし、オセルタミビル血漿中濃度が著しく高値を示す被験者1例の存在を確認した。CES1遺伝子多型によって有意な差は認められなかったが、カルボキシルエステラーゼの個人差についてはさらなる検討が必要であると考えられた。CES1遺伝子の4つの遺伝子多型、CES1A1, CES1A1 variant, CES1A2, CES1A3の発現頻度解析を行った。またCES1で代謝活性化されるOseltamivir(商品名:タミフル)を用いた臨床試験を実施し、薬物動態解析を行った。被験者の平均年齢は23.7±3.7歳であった。CES1A1 wild type、1A1 variantの発現頻度はそれぞれ73.3%、26.7%であった。これらの値はこれまでに報告されている発現頻度と大きな違いをさなかった。CES1A2、CES1A3の発現頻度はそれぞれ60.0%、40.0%であった。CES1A2、CES1A3の発現頻度は、これまでに報告されている32.5% (CES1A2)、67.5% (CES1A3)とは大きく異なっていた。また、今回の研究では、CES1A3/1A3遺伝子を持つ被験者を見つけることができなかった。CES1A2、CES1A3の発現頻度の違いについては、今回の検討が30例と限られた症例数で実施したために生じた可能性も考えられるため、今後さらなる検討が必要である。また、今回の臨床試験において重篤な有害事象は、認めなかった。また、臨床試験を行った被験者のCES1遺伝子多型解析及びと薬物動態解析を行った。Oseltamivir(商品名:タミフル)の薬物動態は、今回測定したCES1遺伝子多型の違いによって有意な差を認めなかった。しかしながら、個人差は存在は確認できた。また、Oseltamivir(商品名:タミフル)の薬物血中濃度曲線下面積が他の被験者の平均より約10倍程度高い被験者が1名見つかった。現在、本研究結果については論文投稿中である。CES1遺伝子の4つの遺伝子多型、CES1A1, CES1A1 variant, CES1A2, CES1A3の発現頻度解析を行い、CES1で代謝活性化されるOseltamivir(商品名:タミフル)を用いた臨床試験の薬物動態解析結果を論文投稿するところまで実施できたため、おおむね順調に進展している。今回解析したOseltamivir(商品名:タミフル)の薬物動態については、CES1遺伝子の4つの遺伝子多型の違いによって説明できなかった。

これらについては、CES1A遺伝子多型で説明できない薬物動態の個人差が存在する可能性が明らかとなっている。しかし、薬物動態の個人差については認めたため、今後はCES1遺伝子の他の変異と薬物動態との相関を調べていきたい。薬物動態と関連するような新たな変異が見つかった場合には、さらに臨床試験を実施して検証したい。遺伝子解析費用、論文投稿費用、新たな変異が見つかった場合については、臨床試験実施費用として使用する予定である。
ファンデァロールス錯体よりエクサイプレックス生成における動的過程の研究

1.フルオレンと9-エチフルオレン間でファンデルクール錯体の生成することを超音速ジェット中で見出し,その光励起によりエクサイプレックス蛍光をはじめて観測した.この錯体からエクサイプレックスの生成には,励起エネルギー依存性が見られず,また,エクサイプレックス生成における錯体蛍光寿命が非常に短いことから,錯体よりエクサイプレックスの生成は非常に速く起ることが明らかとなった.2.フルオレンとアルキルベンゼンやクロベンゼン類との間のファンデルワールス錯体の生成を超音速ジェット中で見した.そして錯体の蛍光励起スペクトルに〓し〓分子間振動によるスペクトルを観測した.3.1-シアノー4-メチルナフタレンおよび1-シアノー2-メチルナフタレンとトリエチルアミンとの間で,ファンデルクールス錯体の生成を見出した.とくに1-シアノー4-メチルナフタレンとトリエチルアミンでの錯体では, 2種類の錯体をはじめて見出し,一方の錯体では励起状態から容易にエクサイプレックスを生成することを見出した.しかし他の錯体では,最低のエネルギー状態からはエクサイプレッスを生成せず,わずかに振動エネルギーの高い状態からエクサイプレッスの生成することを明らかにした.そして錯体よりエクサイプレッスの生成における分子間振動の役割について検討した.1.フルオレンと9-エチフルオレン間でファンデルクール錯体の生成することを超音速ジェット中で見出し,その光励起によりエクサイプレックス蛍光をはじめて観測した.この錯体からエクサイプレックスの生成には,励起エネルギー依存性が見られず,また,エクサイプレックス生成における錯体蛍光寿命が非常に短いことから,錯体よりエクサイプレックスの生成は非常に速く起ることが明らかとなった.2.フルオレンとアルキルベンゼンやクロベンゼン類との間のファンデルワールス錯体の生成を超音速ジェット中で見した.そして錯体の蛍光励起スペクトルに〓し〓分子間振動によるスペクトルを観測した.3.1-シアノー4-メチルナフタレンおよび1-シアノー2-メチルナフタレンとトリエチルアミンとの間で,ファンデルクールス錯体の生成を見出した.とくに1-シアノー4-メチルナフタレンとトリエチルアミンでの錯体では, 2種類の錯体をはじめて見出し,一方の錯体では励起状態から容易にエクサイプレックスを生成することを見出した.しかし他の錯体では,最低のエネルギー状態からはエクサイプレッスを生成せず,わずかに振動エネルギーの高い状態からエクサイプレッスの生成することを明らかにした.そして錯体よりエクサイプレッスの生成における分子間振動の役割について検討した.1)1-シアノナフタレンとトリエチルアミンとのファンデアワールス錯体よりエクサイプレックスの生成において、1-シアノナフタレンとエリエチルアミンとの分子間振動がエクサイプレックスの生成過程に重要な役割をはたしていることを初めて見出した。すなわち、錯体中の分子間振動を励起すると、効果的にエクサイプレックスが生成する。また蛍光の時間分解測定により、エクサイプレックス生成における励起振電エネルギー依存性とその動的機構を明らかにした。2)フルオレン2量体およびフルオレンと9-エチルフルオレンとの間のファンデアワールス錯体の励起状態よりエクサイマーおよびエクサイプレックスの生成することを見出した。とくにエクサイマー,エクサイプレックスの生成における時間分解スペクトルの測定により、そのエクサイプレックス生成の動的過程を明らかにしつつある。3)フルオレンとアルキルベンゼンやクロルベンゼン類との間のファンデアワールス錯体の生成を見出した。そのファンデアワールス錯体からの蛍光スペクトルを測定するとともに、蛍光励起スペクトルに分子間振動によるスペクトルを、多くのファンデアワールス錯体のうちで本研究ではじめて見出した。そのため、ファンデアワールス錯体における分子間振動について詳細な研究を行っている。
放射光による準安定リチウムイオンビームの生成と利用

放射光による気相リチウム原子の光イオン化によって準安定状態のリチウムイオンを大量に作り、そのビームをターゲット原子に衝突させ、ペニングイオン化を観測することを目的とした研究を進めた。改造型光イオン飛行時間差分析器を用いて希ガスを標的とした実験ではペニング電子自体が検出され、ペニング過程が起こっていることが確認された。次いでローレンスバークレー国立研究所の放射光研究施設で光電子分光装置を用いてペニング電子のエネルギー分析を行うことを試みたがペニングイオン化に関する確定的な測定結果を送るには至らなかった。一方、同光電子分光実験の結果衝突後効果と光電子捕獲について読めて興味深い実験成果が得られた。2012年6月に高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設において引き続き光イオン飛行時間分析装置(ToF)を転用した予備実験を行った。この予備実験において、flight tubeおよびMCP前面の電位を通常と逆転(正にする)させることにより、本来の加速領域に導入したターゲットガスから生じたペニング電子を検出するというものである。リチウムイオン生成の後に、イオンは検出器方向に向かい、光電子は反対方向に排除される。今回は前年のように時間ゲートをかけるだけではなく、リストモードにてペにング電子発生の時間構造をより詳細に解析することができた。また、同光イオン飛行時間分析装置をもちいて、マンガン金属蒸気の光イオン分光測定も行った。さらに、9月には、米国ローレンスバークレー国立研究所において放射光実験施設Advanced Light Sourceを行った。これは、光イオン化によって生成したリチウムイオンに対してターゲットガス(希ガス)を噴射して生ずるペニング電子を解析する試みであったが、通常の光電子によるバックグラウンドが大きく、目的のペニング電子を確実に検出することは困難であった。ただし、分光器調整作業のための測定を通じて、キセノン原子内殻光イオン化における光電子再捕獲とオージェー電子のPCI効果について興味深い知見が得られた。これは、光イオン化閾値に近い領域においてオージェー電子ピークにおける連続的なPCI効果から光電子捕獲によって、離散的なリュドベリ列構造が見られるようになるまでの漸次的な変化を明らかにしたものである。前年に米国ローレンスバークレー国立研究所の放射光実験施設Advanced Light SourceにおいてScientaSES400光電子アナライザーを用いて行った光電子・オージェー電子測定実験のデータ解析を進めた。キセノン原子内殻光イオン化における光電子の再捕獲とオージェー電子のPCI効果について分析と検討を進めた。Xeイオンのオージェー電子スペクトルにおいて高い主量子数にいたるリュドベリ構造が認められたので量子欠損をもとめ理論と比較検討した。さらに、光イオン化閾値に近い領域においてオージェー電子ピークにおける連続的なPCI効果から光電子捕獲によって、離散的なリュドベリ列構造が見られるようになるまでの漸次的な変化の様子を明らかにした。これをPCI効果の半古典論理論と引き合わせて検し、興味深い結果を得ることができた。現在論文を執筆中である。つくばの高エネルギー加速器研究機構においては上智大学が前年度に新規購入したScienta R4000高分解能光電子アナライザーを放射光真空紫外ビームラインに運搬設置し、立ち上げ調整実験をおこなった。予備的データとして、希ガスのおよび酸素・窒素の光電子スペクトルを測定し、充分な明るさで高い分解能がでていることを確認した。次の段階としてリチウム金属蒸気を用いた実験を行うために、光電子アナライザー用の新しい高温金属蒸気オーブンの設計作業を進めている。大震災の影響により、2011年度前半においては高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設において予定していた実験は行うことができなかった。年度の大半は主としてインドのGanshyam Purohitウダイプール大学准教授(上智大学客員准教授)と共同でdistorted wave approximationをもちいた散乱計算を行うことに費やされた。特に、準安定リチウムとターゲット原子との非弾性衝突の計算法の開発に主力が注がれた。その成果の1部は、2011年12月に開催されたCDAMOP国際会議において発表された。2012年2月になってやっと高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設において光イオン飛行時間分析装置(ToF)を転用した予備実験を行った。時間ゲートをかけることによって、準安定イオンが減速しながらターゲットガス領域に到達してから発生するペニング電子を識別することができた。放射光による気相リチウム原子の光イオン化によって準安定状態に励起したリチウムイオンを大量に作りだし、さらにそのビームをターゲット原子に衝突させ、ペニングイオン化を観測することを目的とした研究を進めた。

実際の研究実験は、米国のローレンスバークレー国立研究所およびつくばの高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設において行われた。高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設において改造型イオン飛行時間差分析器を用いて希ガスを標的とした実験においてペニング電子自体の検出がなされ、実際にペニング過程がおこっていることが確認された。上記成果をふまえてローレンスバークレー国立研究所の放射光実験施設において光電子分光装置を用いてペニング電子のエネルギー分析を行うことが複数回試みられたが、ペニングイオン化に関する確定的な測定結果を得るにはいたらなかった。一方同光電子分光実験においては、衝突後効果と光電子再捕獲について、極めて興味深い実験結果が得られた。とくに高励起イオンのリュドベリ状態の強度分布と連続的な衝突後効果のつながりかたについて詳しい解析をすることができた。今後はこの現象の詳細な測定を進める予定である。さらに派生成果として、ウラシル、ピリミジンなどの生体関連分子の低エネルギー電子照射における解離性電子捕獲について有意義な実験結果を得ることができた。原子分子物理学初年度において、東日本大震災のため、放射光実験施設等における実験がほぼ全面的に停止したことの影響があった。さらには、米国ローレンスバークレー国立研究所におけるユーザータイムが予想より少なくしか得られなかった。また、同研究所のScienta半球型光電子アナライザーの整備状態がわるく、ビームタイムの大半を装置調整にもちいなければならなかった。最終年度において、今までの経験を生かして充分な成果を得ることを期待したい。初年度において、東日本大震災のため、放射光実験施設等における実験がほぼ全面的に停止したことの影響があった。次年度以降には、米国ローレンスバークレー国立研究所におけるユーザータイムが予想より少なくしか得られなかった。25年度においては、上智大学のScientaR4000光電子アナライザーの立ち上げ作業を始めたが、同時にKEK放射光研究施設の運転時間が大幅に減少し、作業の進行が遅れている。震災による研究施設(KEK)被害のため、2012年2月まで実験を始めることができなかった。ただし、その間、理論計算は進展した。米国ローレンスバークレー国立研究所における再度の測定を試みる。希ガスおよび各種の気相2原子分子について一連のペニング電子エネルギー分解測定を行う。イオンToFを併用してペニング過程による2原子分の解離フラグメントを測定する可能性をさぐる。また、上智大学において新しく購入したScientaR4000型光電子アナライザーに金属蒸気オーブンを加え、日本においても実験を可能にする。
走査型プローブ顕微鏡による細胞の分子解剖技法の開発

現行のSPM装置によって、1)細胞の微細構造がどこまで詳細に解像できるか、2)微細構造上における機能物質の同定が可能か、という問題の解決に向けて研究を進め、以下の成果を得た。(1)細胞超構造の観察色々な方法で作成した標本の切片について比較検討した結果、80nm厚の凍結超薄切片を風乾あるいは臨界点乾燥したものを、先端曲率半径が10nm以下の探針を用いてサイクリックコンタクトモードで観察するのが現状では最善であることが判明した。これにより約30nmの解像力が確保されている。しかし、この解像力では生体膜の断面は一条の隆起として認められるのみで、脂質2重層に対応する像は解像されていない。更に解像力を向上させるためには探針の更なる鋭利化が求められている。(2)凍結割断-SDS処理標本凍結割断試料のSDS処理により親水面を露出させた材料で調査を進め、膜の真表面に約30nmの隆起物が認められるようになってきたが、それがいかなる分子あるいは分子集合体に由来するかを解像をするまでには至っていない。(3)細胞に標識した物質の同定技術の開発免疫組織化学あるいはレクチン組織化学法によりコロイド金を標識した材料で、金粒子の同定を試みた。その結果、直径15nmまでのコロイド金粒子はAFMにより容易に同定されるが、それより小型のもになると細胞構造の凹凸に埋没して判別が困難になることが明らかになった。また金粒子の直径は期待値よりかなり大きく、探針による側方効果が効いてくるためである。コンピュータの演算処理により側方効果を補正する案をAFMメーカーに提案中である。ii)組織化学反応産物のKFMによる同定コロイド金、および鉛法の酵素組織化学法の最終産物であるリン酸鉛を局所の表面電位差を測定するKFMモードにより検出を試みた。それにより直径20nmのコロイド金粒子ならば約120mVの表面電位差として、アルカリフォースファターゼや酸性フォースファターゼの酵素組織化学反応による最終産物のリン酸鉛約400mVの電位差として透過電顕的に観察されると同じ領域に検出された。しかし、現状のKFMモードのトポ像の解像力がAFMに比して劣ることと、検出感度が低いことにより高倍率でのみ検出され、低倍像では検出されないなどの問題があった。走査型プローブ顕微鏡により細胞構造、特に生体膜の分子レベルでの構造を観察し、併せて構成物質を同定するための新しい超微細構造解析技法を開発することを目的に研究を進め、本年度は以下の成果を得た。(1)包埋材料の切片を観察するための最適条件の決定a.包埋剤とエッチング処理の効果の検討:エポキシ樹脂、メタクリーレート樹脂等に包埋した材料の切片により、過沃素酸、過酸化水素による化学的エッチング、イオンボンバードによる物理的エッチングを行い、SPM観察に最適なエッチング条件を調査した。

種々の比較の結果、硬度の高いエポキシ樹脂に包埋してダイアモンドナイフによる超薄切片を何等の表面処理を行わずに観察するのが最善であるとの結論に達した。b.SPMモードの検討:タップモード(DFM)とタッチングモード(AFM)のSPMで切片像の画質を比較した。AFMでは高解像度を得ることができる。しかし生物試料ではカンチレバ-が表面と接触する機会が増して像質の低下が招来された。DFMでは解像度が低下するが良好な質の画像が得られ、細胞像の観察のためにはDFMモードの使用が適切であると判断された。(2)免疫組織化学法への応用技術の開発直径20nmのコロイド金を免疫組織化学的に細胞に標識した材料をKFMモードのSPMにより、表面電位の差異としてコロイド金粒子の局在を検出できることが判明した。今後この方法はSPMによる組織化学技法として有力な手段となるものと期待される。(3)連結試料からのアプローチa.連結超薄切片を臨界点乾燥法により表面構造を露出させ、SPMにて観察するための示適乾燥条件の設定を行った。b.凍結割断・エッチングした材料をSPM観察するための装置をメーカーと共同で試作した。平成8年度はこれによる研究が全力を挙げることになると思われる。(1)凍結超薄切片による観察手技の確立無包埋の凍結超薄切片を観察するための最適な切片作製法、観察条件を検討し、それにより細胞構造を観察する目的なら凍結超薄切片によるものが最適であることが判明した。(2)免疫組織化学法への応用技術の開発免疫組織化学の標識となる直径10nmのコロイド金をモデルにして、それをAFM、DFMで検出するための条件設定を行い、真の姿、人工産物、変形像を識別する技術が確定した。(3)凍結・割断法による表面の露出法の検討フリーズフラクチャー法によって割断した標本、並びにフラクチャーラベル法で処理したサンプルを観察するための条件設定を行った。(4)液中観察のための最適条件の検討液中DFM装置による観察条件の設定を行っているが、技術的な困難により高倍像が得られるまでには至っていない。A.細胞及び小器官の形状観察のための最適条件の決定(1)凍結超薄切片の観察技法の開発:細胞の超微細構造を最大限の解像力でAFMによる画像化のための最適条件を検討した。その結果、固定した試料の約800nm厚の凍結超薄切片を臨界点乾燥処理を施して、オリンパス製のACモード用ミクロカンチレバ-を使用してサイクリックコンタクトモードによる観察が至適なものであることが判明した。これにより約30nmの解像力で膜の超構造が観察できるが、本装置の潜在能よりはまだ遠く、今後カンチレバ-の先鋭化が焦眉の問題としてクローズアップされるに至った。(2)生体膜の真表面の観察:細胞膜の表面構造を観察するため、フリーズフラクチャー試料にSDS処理を施してサイクリックコンタクトモードで観察を行った。それにより膜の親水面に露出するリン脂質とタンパクが約30nmの凹凸となって観察されるようになってきた。B.組織化学法へ応用するための基礎的研究(1)組織化学標識物の観察:組織化学の標識物であるコロイド金粒子をモデルに、実際に生物試料に標識した場合、金粒子がどこまで固定可能かの検討を行った。その結果、標識された直径20nmの金粒子が、現状のベストの条件で高さが約18nm、x^-y方向の直径が約50nmとなって検出された。