hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオンドリフトチューブ法による異性体分離分光のクラスター内反応生成物への適用

開発した異性体分離装置では、飛行時間質量分析計の内部にHeガスを導入できるドリフトチユーブセルが設置されている。クラスター源で生成されたイオンは加速された後チューブ内に入射してHe原子と衝突を繰り返しながら電場に導かれて進行する。この進行速度はイオンの幾何学的断面積に依存した移動度によって決まり、その構造の違いによってセルを通過して出てくる時刻が異なる。もともとクラスターイオンは質量によつて飛行速度が異なるので、結局質量と構造異性体の両方を空間的に分離することが可能となる。本年度は開発している装置の排気速度を改善した第二号機の開発を進めた。その結果、より構造異性体の分離性能が高いと期待できる装置を完成させることができた。この研究と並行して、金属錯体型および分子吸着イオン結晶クラスターをはじめとする幾つかのクラスターイオンにおける構造異性体に関連した観測を行った。具体的には、(1)マグネシウム一価イオンとハロゲン化メチルからなるクラスターMg^+-XCH_3の光解離分光と解離ダイナミクスの研究、(2)ヨウ化ナトリウムクラスターイオンNa_nI_<n-1>^+へのアルコール分子吸着とその光解離分光、(3)光イオン化および準安定解離の観測によるアルカリ金属-アクリロニトリル分子系における三分子重合環化反応生成物の同定、(4)窒化ホウ素クラスターイオンB_nN^+の光解離。これらの本研究を通して、あからさまな異性体分離をすることなくクラスターの複数の異性体の共存を確認する分光法の確立にも寄与することができたと考えている。
エネルギーモニタリングシステムを利用したコミュニケーション

省エネ行動促進のためのコミュニケーション内容と受け手との関係性や,効果的な内容について検討することを目的とし,家庭用エネルギー診断による検討を行った。その結果,効果を質問紙で測定した行動実践度で捉まえると,エネルギー消費量の小さい受け手で,エネルギー診断を繰り返す度に省エネ行動を積極的に取り組む傾向がみられ,このような受け手の省エネ行動に対するベネフィット評価が高まっていることが確認された。これに対して,実測したエネルギー消費量でコミュニケーション効果を捉まえると,普段から消費量の大きかった受け手の方が,少しの行動で大きなエネルギー消費削減効果があるために,コミュニケーション効果が高いといえることが明らかになった。生活者の省エネ行動を促進するためのコミュニケーションにおいて,エネルギー消費量の見える化に効果があったとする先行研究は多い。しかし,どのような内容を,どのような受け手に対して実施することがより効果的であるかに関する議論が薄く,単純に情報をフィードバックするだけで人の行動変容を期待することにも限界があると考える。そこで,本研究では見える化内容と受け手との関係性を考慮し,より効果的なコミュニケーション方法を明らかにすることを目的として,エネルギー消費量を実測し,実際にフィードバックして検討を行った。初年度の平成22年度は,エネルギー消費量の見える化に関する国内外の先行研究を行い,仮説の導出を行うとともに,仮説検証のための実フィールドを確保し,エネルギー消費量の実測とともに実際に家庭用エネルギー診断を実施し,コミュニケーションの短期効果の検討を行った。その結果,コミュニケーション効果を行動実践度など質問紙によって計測した結果から捉まえると,コミュニケーションによって行動変容が生じやすいのは,普段から省エネ行動に対する意識が高く,省エネ行動を普段から実践している受け手であった。そして,このような受け手は,コミュニケーション実施前より,既にエネルギー消費量が小さい傾向があった。行動変容が生じにくい受け手,すなわち普段からエネルギー消費量の大きい受け手は,省エネ行動に対するコスト負担感や家族規範の影響が強いことが示された。またエネルギー消費量の見える化で示す内容として,消費量の過多を示すことは必ずしも重要ではないことも示された。これらより,普段から省エネ行動を積極的に取り入れているような受け手に対しては,従来から行われているようなコミュニケーション方法で十分な効果があると考えられるが,普段から消費量の多い家庭においては,訴求方法の検討が必要であることが明らかになった。省エネ行動促進のためのコミュニケーション内容と受け手との関係性や,効果的な内容について検討することを目的とし,前年度は家庭用エネルギー診断による短期効果の検討を行った。本年度は,同じ受け手に対してエネルギー診断の実施を繰り返し,その長期効果の検討を行った。その結果,コミュニケーションの効果を質問紙で測定した態度や行動実践度で捉まえると,短期効果と同様に,エネルギー消費量の小さい受け手では,エネルギー診断を繰り返す度に省エネ行動を積極的に取り組む傾向がみられ,このような受け手においては,省エネ行動に対するベネフィット評価が高まっていることが確認された。それに対して消費量の大きい受け手においては,ベネフィット評価が減衰しており,また短期効果では,省エネ行動を負担に思っていること,家族が非協力的であることによるモチベーションの低下がみられたが,これらの阻害要因においては,診断の回数を重ねるごとに軽減している様子が確認された。これらより,消費量の大きい受け手に対しては,ベネフィット評価を維持し,長期的なコミュニケーションを積極的に実施していくことが重要であることが示された。なお本研究課題名にもあるように,エネルギーモニタリングシステムを利用し,エネルギー消費量のフィードバックをリアルタイムで実施して,コミュニケーション内容や方法についての検討を計画していた。しかし,前年度確保したフィールドにおいて,東日本大震災の影響が大きく,リアルタイムでのフィードバックが実施困難となったため,家庭用エネルギー診断の継続およびインターネット調査による検討方法に変更している。
長鎖DNAのin vitroクローニングを可能にする高機能大腸菌宿主株の作成

シームレスクローニングと呼ばれる制限酵素による切断を必要としないDNAクローニングが普及し始めている。この方法は、市販の酵素・試薬キットなどを使用せずとも大腸菌細胞内に直にDNAを形質転換するだけでクローニングを可能とする。この廉価かつ簡便な細胞内でのシームレスクローニングを高効率で行わせるため、高形質転換効率-高インビボ組換え活性を持ったこれまでにない高機能宿主大腸菌株の開発を目指す。そのためまずはシームレスクローニングの分子メカニズムを解明を試みてきた。大腸菌の網羅的遺伝子破壊変異ライブリーを使い、高形質転換効率-高インビボ組換え活性に関連する遺伝子の探索を行った。その結果、1)細胞内の相同組換えに関する遺伝子群、2)DNA取り込み関する遺伝子群が見出された。このスクリーニングで見つかって形質転換効率に影響を与える遺伝子群の解析を進めることで、未だ不明である大腸菌のDNA取り込みメカニズムの解明にも迫ることが可能となった。形質転換に影響する変異株の特定のため、(A)複製起点の性質の異なるプラスミド、(B)複製起点は同じで異なる抗生物質耐性遺伝子を持つプラスミド、(C)プラスミドの環状化と線状化による形質転換効率の違い、(D) PEG/Mg2+法やCaCl2法による形質転換法による効率の違いなどを調べる。そして、DNAの取り込みに直接影響する遺伝子変異であることを立証する。そして、形質転換効率を向上させる変異の遺伝子を組み合わせ、相加的、相乗的にDNA取り込み反応を向上させ、特に10kbpを超える長いDNAの形質転換効率が上昇する大腸菌株の開発を行う。この高機能宿主大腸菌はゲノム合成研究等にも画期的な効果をもたらすものと期待できる。大腸菌の網羅的遺伝子破壊変異ライブリーのスクリーニングから見出した高形質転換効率-高インビボ組換え活性の遺伝子破壊株について解析を進めた。環状プラスミドを使った形質転換効率などの測定を行ったところ、rpoZ遺伝子、yfhA遺伝子、rsxC遺伝子、yeaE遺伝子、slyA遺伝子、及びsapC遺伝子の遺伝子破壊により形質転換そのものが促進されていることが明らかとなった。そのうちRNAポリメラーゼの構成因子の一つであるオメガ因子をコードするrpoZ遺伝子の形質転換効率の向上の機構についてさらに詳細な解析を進めた。オメガ因子はRNAポリメラーゼの転写の際に遺伝子の選択性に影響する因子である。この遺伝子の選択性に基づきRNAポリメラーゼは一群の遺伝子の発現を正または負に制御する。この制御下にある遺伝子の中に形質転換効率に影響するものがあると考え、その特定を試みた。オメガ因子依存的なRNAポリメラーゼの制御遺伝子群は染色体全体の散在している。そのどれが関係しているのかを特定するため、まず大腸菌の広域染色体領域欠損変異株を利用した。染色体の約20%、1Mbの領域を欠失した欠損変異株では、rpoZ遺伝子の欠損による形質転換効率の向上は認められなかったのに対して、その親株に当たる非欠損株ではその向上が確認できた。この結果より、この欠失染色体領域内に形質転換効率に関係する遺伝子が存在することが判明した。1Mbの欠失変異株の作製過程で27株の欠失変異体が順次に作製され欠失領域を拡大させた。この27株について形質転換効率を調べたところ、第6段階の欠失変異株からrpoZ遺伝子の欠損による形質転換効率の向上が失われていた。従って、この段階で欠失された領域に含まれる69遺伝子の中に原因遺伝子があると推定された。この領域の個々の遺伝子破壊変異株を使って原因遺伝子の特定を試みている。rpoZ遺伝子、yfhA遺伝子、rsxC遺伝子、yeaE遺伝子、slyA遺伝子、及びsapC遺伝子の遺伝子破壊により形質転換そのものが促進された。その他の変異遺伝子に関してもその作用機序に関して研究を進めるが、同時にこれらの変異を組み合わせて形質転換が相加的、相乗的に向上するのかを調べて研究の目的の一つである細胞内でのシームレスクローニングを高効率で行わせるため、高形質転換効率の高機能宿主大腸菌株の作成を行う。

形質転換に影響する変異株の特定のため、(A)複製起点の性質の異なるプラスミド、(B)複製起点は同じで異なる抗生物質耐性遺伝子を持つプラスミド、(C)プラスミドの環状化と線状化による形質転換効率の違い、(D) PEG/Mg2+法やCaCl2法による形質転換法による効率の違いなどを調べる。そして、DNAの取り込みに直接影響する遺伝子変異であることを立証する。そして、形質転換効率を向上させる変異の遺伝子を組み合わせ、相加的、相乗的にDNA取り込み反応を向上させ、特に10kbpを超える長いDNAの形質転換効率が上昇する大腸菌株の開発を行う。この高機能宿主大腸菌はゲノム合成研究等にも画期的な効果をもたらすものと期待できる。大腸菌の網羅的遺伝子破壊変異ライブリーのスクリーニングから見出した高形質転換効率-高インビボ組換え活性の遺伝子破壊株について解析を進めた。環状プラスミドを使った形質転換効率などの測定を行ったところ、rpoZ遺伝子、yfhA遺伝子、rsxC遺伝子、yeaE遺伝子、slyA遺伝子、及びsapC遺伝子の遺伝子破壊により形質転換そのものが促進されていることが明らかとなった。そのうちRNAポリメラーゼの構成因子の一つであるオメガ因子をコードするrpoZ遺伝子の形質転換効率の向上の機構についてさらに詳細な解析を進めた。オメガ因子はRNAポリメラーゼの転写の際に遺伝子の選択性に影響する因子である。この遺伝子の選択性に基づきRNAポリメラーゼは一群の遺伝子の発現を正または負に制御する。この制御下にある遺伝子の中に形質転換効率に影響するものがあると考え、その特定を試みた。オメガ因子依存的なRNAポリメラーゼの制御遺伝子群は染色体全体の散在している。そのどれが関係しているのかを特定するため、まず大腸菌の広域染色体領域欠損変異株を利用した。染色体の約20%、1Mbの領域を欠失した欠損変異株では、rpoZ遺伝子の欠損による形質転換効率の向上は認められなかったのに対して、その親株に当たる非欠損株ではその向上が確認できた。この結果より、この欠失染色体領域内に形質転換効率に関係する遺伝子が存在することが判明した。1Mbの欠失変異株の作製過程で27株の欠失変異体が順次に作製され欠失領域を拡大させた。この27株について形質転換効率を調べたところ、第6段階の欠失変異株からrpoZ遺伝子の欠損による形質転換効率の向上が失われていた。従って、この段階で欠失された領域に含まれる69遺伝子の中に原因遺伝子があると推定された。この領域の個々の遺伝子破壊変異株を使って原因遺伝子の特定を試みている。rpoZ遺伝子、yfhA遺伝子、rsxC遺伝子、yeaE遺伝子、slyA遺伝子、及びsapC遺伝子の遺伝子破壊により形質転換そのものが促進された。その他の変異遺伝子に関してもその作用機序に関して研究を進めるが、同時にこれらの変異を組み合わせて形質転換が相加的、相乗的に向上するのかを調べて研究の目的の一つである細胞内でのシームレスクローニングを高効率で行わせるため、高形質転換効率の高機能宿主大腸菌株の作成を行う。形質転換に関係する変位遺伝子群の特定に関する実験系でアッセイ方法の改良などの理由により当初の計画の遅れが生じ、使用額の繰越でその研究を継続して行う。
薬用植物の活性酸素代謝機構に関する構造生物学的研究

植物体内で発生した活性酸素種は、植物自身に強いストレスを与えることが知られている。多くの植物が、活性酸素種を解毒するシステムを有しており、パーオキシダーゼが解毒化反応に関わっていることが知られている。解毒化メカニズムを解明するために、ルヒネパーオキシダーゼとバイカレインパーオキシダーゼのX線結晶構造の解明を目指して様々な検討を行った。この結果、両酵素とも大腸菌で不溶化タンパクとして発現させ、巻き戻しにより活性タンパクとして大量に調製することに成功した。また、モルヒネパーオキシダーゼについては、結晶化にも成功した。昨年度は、大腸菌及びカイコを用いてバイカレインパーオキシダーゼとモルヒネパーオキシダーゼの大量発現系の検討を行った。この結果、大腸菌の系で両者の大量発現に成功したが、いずれも活性のない不溶性タンパクとして発現したので、巻き戻し条件を検討することにより両組み換えタンパク質を活性化させた。平成24年度は、巻き戻しに成功したモルヒネパーオキシダーゼMP-2の精製条件を検討したところ、リソースQを使用することにより電気泳動上単一バンドまで精製することに成功した。そこで精製したMP-2を用いて結晶化条件を検討したところ、pH6.5、PEG8000を用いた条件で、結晶を獲得した。ケシのパーオキシーゼの結晶化に成功した例はこれまでなく、研究目的であるモルヒネパーオキシダーゼの反応メカニズムの解明に大きく貢献すると思われる。しかしながら、結晶が針状晶のためより大型の結晶を獲得する条件検討を進めている。さらに平成24年度はケシのパーオキシダーゼと思われる他の2種の遺伝子の発現検討を行った。MP-1についてカイコで発現を検討した結果、モルヒネの酸化は確認されなかったが、ABTSやグアイヤコールなどの人工基質を酸化することが確認された。しかしながらカイコの発現系では少量しか組換え酵素が発現しないことから、大腸菌を用いた発現系を構築を行っており、現在至適発現条件を検討しているところである。またMP-3に関しても同様の発現系の構築を行っている。コガネバナのパーオキシダーゼに関してはBP-1及びBP-2の大量発現条件や巻き戻し条件の再検討を行った。すなわち大腸菌を用いて発現した後、システイン及びシスタミンを用いて巻き戻しすることにより活性酵素を得ることに成功した。現在イオン交換カラムを用いて精製を進めている。この解毒メカニズムを解明するために、モルヒネパーオキシダーゼ(MPー1、MPー2、MPー3)とバイカレインパーオキシダーゼ(BPー1およびBPー2)のX線結晶構造の解明を目指して様々な検討を行った。MPー2については、カイコで発現した組換えタンパク質の結晶化を試みたが、適切な条件を見つけることが出来なかった。そこで、MPー2の大腸菌での発現を検討した。BL21を用いて発現を行った結果、MPー2は不活性の不溶性タンパク質として発現していた。そこで、この不溶化タンパク質を可溶化後、ヘミン存在下で巻き戻しを行ったところ針状結晶の獲得に成功した。現在、X線結晶解析に適切な結晶条件の検討を行っている。なお、ケシにおいて過酸化水素の代謝に関与すると考えられる2種のパーオキシダーゼ遺伝子(MPー1遺伝子およびMPー3遺伝子)をクローニングしているが、両遺伝子についても大腸菌で発現を試みており、MPー2と同様不溶性タンパク質として発現した。MPー1については巻き戻しにより酵素活性の回復に成功した。極めて興味深いことにMPー1はMPー2と異なり、モルヒネを酸化できず、一般的なパーオキシダーゼの基質(ABTSなど)を酸化することが判明した。本酵素についても結晶化を試みている。BPについては2種の遺伝子(BPー1およびBPー2)の発現を試みたが、カイコ中での組換え酵素の発現を確認できなかった。そこで大腸菌を用いて発現を検討したところ、両酵素とも不活性な不溶性タンパクとして発現したので、巻き戻しを行うことにより、活性パーオキシダーゼとして獲得することに成功した。現在結晶化を行っている。平成23年度はモルヒンパーオキシダーゼ及びバイカレインパーオキシダーゼの大量発現系の構築を行った。モルヒネパーオキシダーゼ(MP-2)に関してはすでにカイコでの発現系の開発に成功しているので、本システムで発現した酵素を精製し、結晶化条件の検討を行ったが、結晶を得るには至らなかった。カイコを用いたシステムでは、配糖化などの翻訳後修飾を受けるので、この反応が結晶化を阻害したものと推定した。そこで、MP-2の大腸菌を用いた発現系の構築を試みた。

BL21を用いて発現を行ったが、大部分は不活性な不溶性タンパク質として発現したので、発現タンパク質の巻き戻しを検討した。この結果、ヘミン存在下でシスタミンおよびシステアミンを使用した条件で、活性型パーオキシダーゼに誘導することが判明した。現在本酵素の精製条件を検討している。また、ケシからパーオキシダーゼをコードしていると思われる遺伝子(MP-1遺伝子)をカイコを用いて発現した結果、組み換えタンパクを得ることができたが、モルヒネパーオキシダーゼ活性を確認できなかった。MP-1はモルヒネ以外の化合物を酸化する酵素と推定された。バイカレインパーオキシダーゼについても、2種のアイソザイム(BP-1およびBP-2)の大量調製法の開発を試みた。当初の計画通りカイコを用いて発現を行ったが、いずれの場合も組み換え酵素の発現を確認できなかった。そこで、大腸菌を用いて大量発現系の開発を試みた。モルヒネパーオキシダーゼと同様、BP-1およびBP-2ともに「不活性な不溶性タンパク質として発現したので、ヘミン存在下でシスタミンおよびシステアミンを用いて巻き戻しを行ったところ、パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質の巻き戻しに成功した。平成24年度では、パーオキシダーゼのX線結晶回折実験を行う計画であったが、このためには結晶を獲得することが不可欠である。本年度末にようやく結晶の獲得に成功したが、当該年度内に回折実験を実施できなかったので、目的の達成度は当初の実験計画よりやや遅れていると評価した。しかしながら、結晶が得られているので回折実験の実施や反射データの解析をはじめとする以降の実験計画は平成25年度に達成すると思われる。また、X線結晶解析は行うことはできなかったが、平成24年度ではケシパーオキシダーゼのアイソザイムであるMP-1の発現に成功し、その性質を解明した。すなわち本酵素がモルヒネを酸化することができないが、グアイヤコールなどの基質を酸化することを初めて明らかにするなど重要な知見も本年度の研究によって得られている。さらにコガネバナのパーオキシダーゼBP-1及びBP-2の大量調製にも成功しており、両酵素の結晶化も比較的容易に行えると思われる。以上のことから、X線回折実験を実施していないが、全体から見れば研究目的の達成に向かって着実に進展していると思われる。平成23年度では、(1)バイカレインパーオキシダーゼおよびモルヒネパーオキシダーゼの大量発現法の確立、(2)精製酵素の大量調製(3)精製酵素の結晶化条件の検討(4)結晶の回折実験の4項目の達成を目標としていた。バイカレインパーオキシダーゼに関する研究は、大量発現法の確立に成功しているが、精製が非常に困難で、進捗状況が(2)のステップで留まっているのが現状である。本酵素については、少し実験の進捗状況がやや遅れていると思われる。モルヒネパーオキシダーゼについては(1)大量発現法の確立(2)精製酵素の大量調製(3)結晶化条件の検討まで進めており、達成度は高いと考えられる。MP-2については結晶の獲得に成功しているので、速やかにX線解析実験を遂行する計画である。
新規再生促進因子に着目した肝硬変に対するエクソソーム医療の創生

肝硬変に対するエクソソーム医療の創生に向けた分子細胞基盤を確立するため、研究2年目となる2018年度は実験的脂肪性肝炎におけるOGFRL1内包エクソソームの分泌と傷害肝細胞への取り込みを検討するとともに、OGFRL1レポーターマウスの樹立を試み、以下の所見を得た。1)実験的脂肪性肝炎におけるOGFRL1の動態:マウスにメチオニン・コリン欠乏食を給餌して脂肪性肝炎を作製し、OGFRL1の動態を検討した。その結果、前年度に明らかにした四塩化炭素誘導性の肝傷害時の動態とは異なり、末梢血中にOGFRL1内包エクソソームは検出されず、肝細胞内にもOGFRL1の取り込みを示唆するドット状の染色所見は認められなかった。これらの所見より、OGFRL1は肝細胞が高度の傷害を受けた場合にのみ血球から分泌され、傷害肝の再生にはたらくことが示唆された。2)OGFRL1レポーターマウス樹立の試み:内因性Ogfrl1遺伝子の3'末端にmCherry遺伝子を挿入したF0マウス(キメラマウス)を得た。しかしながら、このF0マウスの自然交配ならびに人工授精のいずれによってもOgfrl1/mCherryを保持したF1マウスは得られず、OGFRL1のC末端には個体発生に必須な領域の存在が示唆された。そこで、上記F0マウスの骨髄細胞を移植して、血球細胞のみがOgfrl1/mCherryをキメラ状態で保持するレシピエントマウスを作製した。このマウスに対して四塩化炭素投与を行うと、末梢血中の単球分画におけるmCherry蛍光が増強し、四塩化炭素によるOGFRl1産生の促進が証明された。OGFRL1レポーターマウスは樹立できなかったが、図らずもOGFRL1のC末端に個体発生に重要な領域の存在を証明することができた。また、OGFRL1の組織再生マーカーとしての有用性について、前年度の国内特許出願に引き続いて今年度はオーストラリア出願を行った。次年度は、これまでの研究により明らかとなった肝傷害に伴う血球細胞からのOGFRL1内包エクソソームの分泌と肝細胞への取込みに関する所見に基づき、エクソソーム内包OGFRL1が胎仔期肝前駆細胞ならびに成熟肝実質細胞に対していかなる影響を及ぼすかについてin vitroの系で検証する。これにより、最終年度(次年度)に予定されている実験的肝線維症に対するOGFRL1内包エクソソームの投与実験に向けての理論的基盤を構築する。1)四塩化炭素単回投与24時間後のマウスから末梢血中のエクソソーム分画を採取し、カラムを用いてsize fractionationを行った上で、OGFRL1を大量に含む分画を同定する。また、任意の蛋白質を内包したエクソソームを効率よく細胞から分泌させるXPackベクター・システムを用い、OGFRL内包エクソソームを産生する発現プラスミドを作製し、これをトランスフェクションしたHEK293細胞の培養上清からエクソソームを回収する。2)上記のエクソソーム内包OGFRL1が肝前駆細胞の成熟分化に及ぼす影響を、E13.5の胎仔期肝前駆細胞を用いたマイクロアレイとReal time RT-PCRにより検討する。また、同細胞の増殖に対する効果を、コロニーアッセイ法により確認する。3)さらに、成熟マウスより肝実質細胞を分離し、OGFRL1内包エクソソームを培養上清中に添加した際の増殖に及ぼす影響を、BudUの取り込みとStat3/Aktのリン酸化から解析する。

また、OGFRL1の組織再生マーカーとしての有用性について、前年度の国内特許出願に引き続いて今年度はオーストラリア出願を行った。1)OGFRL1の全身臓器における発現分布:OGFERL1遺伝子の発現をリアルタイムPCRにより定量解析したところ、骨髄や脾臓といった造血系臓器で高く、次いで脳神経系や肺での発現が亢進していた。一方、肝臓におけるOGFRL1の発現は、骨髄の約7分の1と比較的低レベルであった。骨髄では、CD45+CD34-Ter119-の骨髄球系細胞で発現が高く、CD45+CD34+Ter119-の未分化細胞やCD45-CD34-Ter119+の赤芽球系細胞でも一定の発現が認められた。一方、骨髄間葉系幹細胞でのOGFRL1発現は低レベルであった。末梢血中では、CD45+CD11b+の単球分画に最も高い発現が確認された。2)肝傷害時に増加するOGFRL1内包エクソソームの動態:マウスに四塩化炭素を単回投与すると、24時間後の血中エクソソーム分画にOGFRL1が一過性に検出された。この際の血中エクソソーム分画をsize fractionationした後にウェスタンブロット解析を行ったところ、予想された50ないし100nmのエクソソーム分画を中心にOGFRL1タンパク質の存在が確認された。急性肝傷害の程度とOGFRL1内包エクソソームの末梢血への分泌量は比例せず、肝傷害のマーカーというよりも傷害からの回復を反映する組織再生マーカーである可能性が示唆された。初年度の研究目的としたOGFRL1の主要産生細胞の同定と、肝傷害時のエクソソーム内包タンパク質としての分泌を確認するとともに、組織再生マーカーとしての有用性について産学連携のもとで特許出願を行った。次年度は、これまでの研究により明らかとなった肝傷害に伴う血球細胞からのOGFRL1内包エクソソームの分泌と肝細胞への取込みに関する所見に基づき、エクソソーム内包OGFRL1が胎仔期肝前駆細胞ならびに成熟肝実質細胞に対していかなる影響を及ぼすかについてin vitroの系で検証する。これにより、最終年度(次年度)に予定されている実験的肝線維症に対するOGFRL1内包エクソソームの投与実験に向けての理論的基盤を構築する。1)四塩化炭素単回投与24時間後のマウスから末梢血中のエクソソーム分画を採取し、カラムを用いてsize fractionationを行った上で、OGFRL1を大量に含む分画を同定する。また、任意の蛋白質を内包したエクソソームを効率よく細胞から分泌させるXPackベクター・システムを用い、OGFRL内包エクソソームを産生する発現プラスミドを作製し、これをトランスフェクションしたHEK293細胞の培養上清からエクソソームを回収する。2)上記のエクソソーム内包OGFRL1が肝前駆細胞の成熟分化に及ぼす影響を、E13.5の胎仔期肝前駆細胞を用いたマイクロアレイとReal time RT-PCRにより検討する。また、同細胞の増殖に対する効果を、コロニーアッセイ法により確認する。3)さらに、成熟マウスより肝実質細胞を分離し、OGFRL1内包エクソソームを培養上清中に添加した際の増殖に及ぼす影響を、BudUの取り込みとStat3/Aktのリン酸化から解析する。次年度は、実験的脂肪性肝炎におけるOGFRL1内包エクソソームの血中分泌動態を測定し、脂肪性肝炎のバイオマーカーとしての有用性についても検証する。また、OGFRL
ネットワーク上の効率の良い種々のアルゴリズムに関する研究

いくつかのグラフ・ネットワーク上の問題を解く効率の良いアルゴリズムを開発した.以下が主な成果である.1.VLSIの1層配線問題には,2次元平面領域においていくつかの端子対を結ぶ互いに交差しない長さの総和が最小な道を求める問題がよく現われる.ここで“交差しない"とは,同じ点や線分をとおるかもしれないが平面上では交差しないことである.一方,平面領域に長方形の障害物の他に2層配線領域がある場合に,指令された2組の端子対を結ぶ道で,2層配線領域以外では互いに交差せず,長さの和が最小なものを求める問題はVLSIの2層配線問題に現われる.本研究では,この問題を解くO(nlogn)時間のアルゴリズムを与えた.ここで,nは長方形障害物と2層配線領域の総数である.2.平面上にいくつかの障害物がある場合に指定した2点を結び障害物を通らない道で長さが最小なものを求める問題はさまざまな場面で現われる.本研究では障害物の形状を軸平行多角形に限定し,先に障害物が与えられて前処理が可能である場合のアルゴリズムを与えた.前処理に要する時間はO(n^2log^2n)であり,2点が与えられた時にそれらを結ぶ最短路をO(log^2n)時間で求めることができる.3.直並列グラフや部分k-木上の多くの組み合わせ問題は線形時間で解けるが,辺彩色問題は直並列多重グラフ上でも今までに多項式時間のアルゴリズムが知られてない数少ない問題である.本研究では直並列多重グラフ上で辺彩色問題を線形時間で解く逐次アルゴリズムとO(log|V|)時間で解く並列アルゴリズムを与えた.ここでVは与えられる直並列多重ブラフの点集合である.この結果はスケジューリング問題を解く上で有用である.いくつかのグラフ・ネットワーク上の問題を解く効率の良いアルゴリズムを開発した.以下が主な成果である.1.VLSIの1層配線問題には,2次元平面領域においていくつかの端子対を結ぶ互いに交差しない長さの総和が最小な道を求める問題がよく現われる.ここで“交差しない"とは,同じ点や線分をとおるかもしれないが平面上では交差しないことである.一方,平面領域に長方形の障害物の他に2層配線領域がある場合に,指令された2組の端子対を結ぶ道で,2層配線領域以外では互いに交差せず,長さの和が最小なものを求める問題はVLSIの2層配線問題に現われる.本研究では,この問題を解くO(nlogn)時間のアルゴリズムを与えた.ここで,nは長方形障害物と2層配線領域の総数である.2.平面上にいくつかの障害物がある場合に指定した2点を結び障害物を通らない道で長さが最小なものを求める問題はさまざまな場面で現われる.本研究では障害物の形状を軸平行多角形に限定し,先に障害物が与えられて前処理が可能である場合のアルゴリズムを与えた.前処理に要する時間はO(n^2log^2n)であり,2点が与えられた時にそれらを結ぶ最短路をO(log^2n)時間で求めることができる.3.直並列グラフや部分k-木上の多くの組み合わせ問題は線形時間で解けるが,辺彩色問題は直並列多重グラフ上でも今までに多項式時間のアルゴリズムが知られてない数少ない問題である.本研究では直並列多重グラフ上で辺彩色問題を線形時間で解く逐次アルゴリズムとO(log|V|)時間で解く並列アルゴリズムを与えた.ここでVは与えられる直並列多重ブラフの点集合である.この結果はスケジューリング問題を解く上で有用である.
固体および液体状態におけるGaおよびInの密度測定

1.研究目的:GaおよびInは半導体ならびに超電導物質の材料となる重要な低融点金属(GaおよびInの融点はそれぞれ29.8°C,156.6°C)である。しかし、これらの金属の密度は正確に測定されていないのが現状である。本研究の目的はこれらの金属の固体および液体状態における密度を正確に測定するこである。このようなことから、すでにGaの密度の測定を行い報告(J.Non-Crystalline Solids,61-62(1984),415)した。前回の研究では温度の測定精度が±0.1°Cであった。そこで、今回の研究では、より正確な密度を測定するために温度を0.01°Cまで測定できる温度計と試料を浸漬する浴の温度を±0.01°Cに制御しうるような装置を使用した。2.研究方法:密度の測定方法はアルキメデス法である。この方法は液体中に試料を浸漬して試料に働く浮力を天坪で測定し、密度を求める方法である。Gaの密度を純水浴中で測定したが、満足しうる精度で密度の測定ができなかった。そこで、測定方法を膨張計法にかえてGaの体積の温度変化を測定した。このとき、Gaを長時間にわたって水中に浸漬していると、Gaと水が反応することがわかった。そこで、Gaと反応しないフタル酸n-ブチルを浸漬液として使用した。3.研究成果:前回に報告したGaの密度の測定結果によると、固体状態において、密度の温度変化は温度の上昇にともなって27-28°Cを境にして少し小さくなる結果を得えた。今回の研究においては、膨張計法によってGaの体積の温度変化を測定したが、前回のような結果は得られなかった。今後は、膨張計法により液体状態におけるGa体積の温度変化を測定し、また、アルキメデス法により密度を測定する。その後、Inの密度を測定する予定である。
ポートフォリオ選択における統計的手法

平成12年度1.M. Broadie(1993,Annals of Operations Research)がパラメトリック2次計画問題のもとで定義した、ポートフォリオ選択における真のフロンティア、推定フロンティア、実際のフロンティアを通常の平均・分散モデルの下で定義し、それらのいくつかの性質を証明した。特に、実際のフロンティアが常に真のフロンティアの右側に位置することを証明した。2.推定フロンティア上の点の値の漸近分布を求めた。3.パラメトリック・ブートストラップ法を用いて、推定フロンティアのメディアン・バイアスを修正した推定量を考案し、シミュレーションでその性質を調べた。4.ダブル・ブートストラップ法を使って、真のフロンティア上の点の信頼領域を構成する方法を考案し、シミュレーションでその性質を調べた。平成13年度1.パラメトリック2次計画問題の定式化の下で、推定フロンティアの期待値が、真のフロンティアの左側に位置することを示した。これは、この定式化の下で、推定フロンティアが期待値で見たときには効率的フロンティアを過大評価していることを意味する。2.パラメトリック2次計画問題の定式化の下で、ポートフォリオ・ウエイトの推定量の漸近分布を求める研究を開始し、すべてのポートフォリオ・ウエイトが正の場合に、漸近分布が正規分布になることを示した。平成12年度の研究結果は、2001年1月に一橋大学で開催されたシンポジウム「計量経済・計量ファィナンスの諸問題」にて発表した。発表論文は「ポートフォリオ・フロンティアの推定について」(吉田あつし教授との共著)。平成13年度の研究成果は未発表である。1.平均-分散モデルのもとで、収益率ベクトルの期待値と分散共分散行列をデータから推定するとき、真のフロンティア、推定フロンティア、実効フロンティアの3種類のフロンティアを定義した。これは、Broadie(1993,Annals of Operations Research)が異なる定式化のもとで定義したものにしたがっている。さらに、推定フロンティア上の点の漸近正規性を証明した。また、実効フロンティアが常に真のフロンティアの右側にくることも証明した。2.実効フロンティアの推定問題を研究した。ブートストラップ法を用いて推定フロンティアのメディアン・バイアスを減少させる推定量を考案し、その性質をシミュレーションによって調べた。シミュレーションは本補助金によって購入したソフト(MATLAB)を用いた。以上の結果は科研費研究集会「計量経済・計量ファイナンスの諸問題」(1月8日1月9日、一橋大学佐野書院)において「ポートフォリオフロンティアの推定について」(著者:福地純一郎、吉田あつし)という題で発表した。3.吉田あつし教授(大阪府立大学)との共同研究を進め、組み入れ証券数とポートフォリオ収益率の分散の関係を調べた。研究成果は論文「平均分散モデルにおける最適ポートフォリオのリスク推定」(著者:吉田あつし、福地純一郎、投稿中)である。4.その他、金融工学国際会議に出席し、金融工学の研究者と意見交換を行った。
方法としてのサイノフォン──華語語系文学史構築のための基礎的研究

サイノフォン(華語語系)とは、"中華人民共和国を中心とする"という従来の中国現代文学研究における前提を無効化し、「華語」を結節点として中国語圏文学の創生を世界規模で横断的に捉えてゆこうとする概念である。本研究では、中国語圏を貫く事件(抗日戦や国共内戦など)の語られ方を、異なる地域の文学の精読を通して比較し、その眼差しの異同を分析する。特に共産主義思想の扱われ方に注目すると同時に、サイノフォン作品における「トラウマ」を追い、最終的には従来の地域別文学史に替わる新たなサイノフォン文学史の構築を提言したい。
無水酸塩基反応を用いた有機-無機ハイブリッド低融点ガラス材料の創製

1.オルトリン酸とジメチルジクロロシランの反応過程出発原料にはオルトリン酸(H_3PO_4)、ジメチルジクロロシラン(Me_2SiCl_2)を用いた。窒素雰囲気の反応装置中でオルトリン酸とジメチルジクロロシランを3時間反応させた。組成はH_3PO_4:Me_2SiCl_2=1:0.753である。反応進行中はHClガスの発生が観測され、3時間後にはガスの発生はほとんど無かった。得られた粘性液体の^<31>P NMRスペクトルには、Me_2SiCl_2比が0.75付近では主に3本のシグナルが観測される。反応生成物は主に架橋数2のチェーン状分子であった。シリコン状の有機官能基を宮殿私的なフェニル基に置換することで反応収率の向上が観測されるとともに、化学的耐久性が大きく向上した。化学的耐久性の低さを克服できたことで、酸塩基反応法によるガラス合成が大きく発展することが期待できる。2.金微粒子含有有機-無機ハイブリッドシリコリン酸塩ガラスの作製塩化金を含有させることにより得られたガラスは金微粒子分散ガラスに特有の赤紫色を呈していた。X線回折スペクトルには金に帰属される回折線が観測され、金微粒子が含有されていることが分かる。また、光吸収スペクトルにもプラズモン吸収による吸収バンドが観測され、得られたガラスが金微粒子含有有機無機ハイブリッドガラスであることが分かった。これらのことから、本ガラス系は、過去に報告した、有機色素、(低原子価)希土類イオンに加えて金属微粒子も250°C以下の低温で含有することが可能であり、ガラスマトリックスの有機-無機ハイブリッド化だけではなく、光機能中心のハイブリッド化も可能であり、今までに報告されていない新たな機能性を持つガラスを創出することが期待される。本研究は、最近我々の研究室で開発された無水酸塩基反応法およびゾル-ゲル溶融法を用いて、実用上十分な化学的耐久性と組成(物性)設計自由度の高い有機-無機ハイブリッド低融点ガラスを作製することを目的としている。ゾル-ゲル溶融法では、シロキサン骨格を有する有機-無機ハイブリッドゲルを形成させる際に、有機官能基の種類および数を変えることによって有機-無機ハイブリッドゲルの溶融温度を制御した。得られたゲルは、100-200°Cの温度で再溶融・熟成処理し、冷却することにより軟化温度が制御でき、緻密な有機-無機ハイブリッドバルクガラスを得ることができた。これによって、これまで有機-無機ハイブリッドゲルに対して問題点とされていた不均一性、ポーラスという欠点を完全に解決することが可能となった。無水酸塩基反応法は、100-300°Cという低い温度で以下のような広義の意味での酸塩基反応を駆動力としてネットワークを構築する新規な低温溶融ガラス合成経路である。この反応では、反応生成物の一つであるHClが系外の放出されるために、Si-O-Pネットワークからなる三次元骨格構造が連続して形成される。Si上の有機官能基がネットワークの次元を下げるとともに、立体障害によりガラス中に自由体積を形成する効果が期待でき、現状ではガラス転移温度が室温付近から200°C程度のバルクガラスの合成に成功している。来年度は化学的耐久性の向上および機能性有機材料とのハイブリッド化に向けた研究を展開する。
遺伝子導入動物から迫る概日時計の新規構成分子

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。研究代表者らはこれまでに、概日時計の位相が前進する際にニワトリ松果体においてmRNAが誘導される新規分子を同定した。この分子をLCGと命名し、全長cDNAのクローニング・特異的抗体の作成ならびに強制発現系における細胞内局在の解析等を行ったところ、LCGは中心体のマーカーであるγチューブリンと共局在することが分かった。そこで次に、LCGが松果体においてγチューブリンと相互作用する可能性を免疫沈降法を用いて検討した。その結果、LCGとγチューブリンの結合が確認された。これらの結果から、LCGは時刻シグナルにしたがい中心体の活性を制御している分子である可能性が示唆された。LCGの解析と並行し、新しい光同調経路の発見を目指し、新規光受容分子を探索した。その結果、ニワトリゲノム中に、青色光受容タンパク質であるクリプトクロームの類似遺伝子が存在することを見いだした。これをcCRY4と命名し、cCRY4に関する解析を行った。その結果、cCRY4のmRNAは、網膜および松果体などの光感受性の概日時計組織に多く発現しており、培養した松果体細胞中においてmRNA量が光依存的に上昇することが判った。そこで、cCRY4を特異的に認識する抗体を作成し、タンパク質発現を調べたところ、松果体の多数の実質細胞および一部の間質細胞に存在することが判った。さらに、タンパク質発現もmRNAの発現量と同様の光依存的変動を示すことや、分画した細胞抽出液の水溶性画分中にcCRY4が検出されることがわかった。これらの結果から、cCRY4は光感受性の概日時計組織において青色光を受容する新規の光受容分子であり、ピノプシン等をはじめとする既知の光受容分子とは全く異なる光情報伝達経路に関与している可能性が強く示唆された。交付申請書に記載の研究計画に従い研究を遂行し、以下の知見を得た。(1)新規時計関連タンパク質群の解析研究代表者らがこれまでに同定した概日時計蛋白質E4BP4の機能解析を行った。E4BP4を特異的に認識する抗体を作成し、蛋白質レベルにおける挙動を検討した結果、光感受性の時計組織であるニワトリ松果体においてE4BP4蛋白質は、mRNA発現より数時間遅れて日周変動し、光により蛋白質レベルの誘導を受けることが判明した。さらに、E4BP4は時刻依存的にリン酸化されており、それにはカゼインキナーゼIが関与していること、およびリン酸化によって蛋白質分解が促進されることを発見した。これらのことからE4BP4は蛋白質レベルにおいても約一日周期でダイナミックに変化する分子であり、生物時計の中心的役割を担う分子の一つであると考えられた。(2)個体レベルにおけるメラトニンリズムの生理的意義研究代表者らはこれまでに、時計蛋白質BMAL1のドミナントネガティブ分子を松果体特異的に発現するトラジスジェニックゼブラフィッシュを作製し、そのメラトニンリズムが消失していることを見いだした。そこで次に、このリズム消失が全身の末梢時計に与える影響を調べるため、心臓における時計遺伝子発現の変動を調べた。その結果、トランスジェニックゼブラフィッシュにおいても時計遺伝子は日周変動していることが判明し、松果体以外の時計は正常に発振していることが示唆された。このことから、ゼブラフィッシュにおいてメラトニンリズムは末梢時計の発振には必須でないと考えられた。また、ゼブラフィッシュ個体レベルにおける行動リズムに与える影響を調べるために、行動リズム測定記録装置を完成させた。研究代表者らがこれまでに同定した時計関連分子の候補であるA78は、概日時計の位相が前進する際にニワトリ松果体においてmRNAが誘導される遺伝子である。この分子に着目し、まず全長cDNAをニワトリおよびマウスよりクローニングした。次に、A78の機能を明らかにするための第一歩として、A78に蛍光性タンパク質を融合し、培養細胞内に発現させることによりA78の細胞内局在を調べた。その結果、興味深いことにA78は中心体のマーカーであるγチューブリンと共局在することが分かった。現在のところ、概日時計機能における中心体の役割は全く不明であるが、本結果から、A78は中心体に発現して時計に関わる何らかの機能を担っている可能性が考えられた。そこで、A78の生理機能をさらに追求するため、遺伝子破壊のためのターゲティングベクターの作製を目指し、マウスのゲノムからのA78遺伝子のクローニングに着手した。上記と並行して、個体レベルの時計発振におけるメラトニンの生理的意義を探る目的で、メラトニンリズムが消失したトランスジェニック(Tg)ゼブラフィッシュの末梢時計の発振と行動リズムを調べた。心臓や眼球における時計遺伝子の発現をRT-PCR法により定量して結果、本Tg系統においても末梢組織において概日時計は発振しているが、その発振のリズムが野生型とは異なっていることが判った。次に、恒暗下における遊泳行動リズムを測定したところ、メラトニンリズムの消失しても行動のリズムを示すTg個体が存在することが判明した。以上の結果より、メラトニンは個体におけるサーカディアンリズムの形成に不可欠ではないが、臓器間の同調等において重要な働きをしている可能性が示唆された。

研究代表者らはこれまでに、概日時計の位相が前進する際にニワトリ松果体においてmRNAが誘導される新規分子を同定した。この分子をLCGと命名し、全長cDNAのクローニング・特異的抗体の作成ならびに強制発現系における細胞内局在の解析等を行ったところ、LCGは中心体のマーカーであるγチューブリンと共局在することが分かった。そこで次に、LCGが松果体においてγチューブリンと相互作用する可能性を免疫沈降法を用いて検討した。その結果、LCGとγチューブリンの結合が確認された。これらの結果から、LCGは時刻シグナルにしたがい中心体の活性を制御している分子である可能性が示唆された。LCGの解析と並行し、新しい光同調経路の発見を目指し、新規光受容分子を探索した。その結果、ニワトリゲノム中に、青色光受容タンパク質であるクリプトクロームの類似遺伝子が存在することを見いだした。これをcCRY4と命名し、cCRY4に関する解析を行った。その結果、cCRY4のmRNAは、網膜および松果体などの光感受性の概日時計組織に多く発現しており、培養した松果体細胞中においてmRNA量が光依存的に上昇することが判った。そこで、cCRY4を特異的に認識する抗体を作成し、タンパク質発現を調べたところ、松果体の多数の実質細胞および一部の間質細胞に存在することが判った。さらに、タンパク質発現もmRNAの発現量と同様の光依存的変動を示すことや、分画した細胞抽出液の水溶性画分中にcCRY4が検出されることがわかった。これらの結果から、cCRY4は光感受性の概日時計組織において青色光を受容する新規の光受容分子であり、ピノプシン等をはじめとする既知の光受容分子とは全く異なる光情報伝達経路に関与している可能性が強く示唆された。
酵素法による非天然型の機能性DNAの合成とその応用

機能性基を導入した修飾DNAのPCR法による酵素的な合成が可能となれば、新しい機能性修飾DNAの創製、試験管内選択法による修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の創製への応用が可能になると考えられる。酵素的に導入可能な修飾基質誘導体を探索するため、アミノ基、カルボキシル基、種々のアミノ酸、正電荷を持つイミダゾールあるいはグアニジン、糖類、キレート化剤、強い蛍光を発する、フルオレセイン、アクリドンなどの機能性基をC5位に導入したチミヂン誘導体を合成した。これらを基質に用い、KOD Dash DNAポリメラーゼおよびVent(exo-)DNAポリメラーゼを用いたPCR法(DNAの重合連鎖反応)による機能性修飾DNAの合成の検討、大量合成法の確立をはかった。修飾チミジン誘導体を基質に用いてPCR法で得られた修飾DNAの配列解析を行い、PCRの過程で変異が起こらないことを確認した。同様にしてC5位に種々の機能性基を導入したシチヂン誘導体あるいは、アデニンを修飾した基質(dATP)が上記のDNAポリメラーゼを用いることにより、PCRによる修飾DNAの合成が可能であることを明らかにした。さらに、T,C,Aの3種のヌクレオチドを修飾した基質を同時に用いてPCRを行い、3重修飾DNAの酵素合成を進めた。これまでの研究で酵素による取り込みが確認された修飾チミジン誘導体についてそれらの取り込み挙動、取り込み能をプライマー伸長反応で検討した。さらにPCR法による修飾DNAの合成反応及び試験管内選択法を適用し、細胞表面にある糖鎖シアリルラクトース、神経伝達物質として重要な役割を果たしている他、調味料として用いられているグルタミン酸、薬剤サリドマイド、あるいはミスマッチなどのDNAの構造の相違を認識して特異的に結合する新規修飾DNAアプタマーの創製を行った。それらの配列解析、2次構造の予測、結合の強度などの測定を行った。DNAの本来の機能と全く異なる、触媒活性などを持つ機能拡張DNAの創製とその応用は今後の大きな研究課題である。高活性で高機能性DNAの創製のためには、天然型のDNAでは不充分で、機能性基を導入した非天然型の修飾DNAの酵素合成、増幅が望まれる。そこで、5位に機能性を導入した種々のチミヂン誘導体を合成し、それらを基質に用いる酵素法による修飾DNAの合成について検討した。酵素、DNAポリメラーゼは基質特異性、鋳型特異性が厳密で、天然型のDNAの様に合成出来るとは限らない。古細菌由来のある種の耐熱性DNAポリメラーゼ(KOD Dash)のみが5位に置換基を有するチミヂン誘導体を基質として取り込み、対応する修飾DNAの酵素合成が可能であることを見出した。さらに、この酵素がチミヂン誘導体に対してどのような機能性基を導入した場合、基質として取り込むかどうかを検討した結果、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンを導入したアミノ基の+電荷を持つ誘導体、中性のメチルエステル導入体、-電荷を持つカルボン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミンの末端アミノ基を介して更にビオチンあるいはトリフロロ酢酸を導入した誘導体は基質として受け入れられ、対応する修飾DNAの合成が可能であった。一方、短いリンカーを介してバルキーな置換基を導入した誘導体は酵素による取り込みが阻害され、対応する修飾DNAは得られなかった。さらに、得られた知見をもとに、種々の機能性基を導入した修飾DNAのPCR法(DNAの重合連鎖反応)による大量合成法を確立した。現在、このPCR法による機能性DNAの合成を応用して修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の探索、創製の研究を展開している。

機能性基を導入した修飾DNAのPCR法による酵素的な合成が可能となれば、新しい機能性修飾DNAの創製、in vitro selectionによる修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の創製への応用が可能になると考えられる。しかし、酵素、DNAポリメラーゼは基質特異性、鋳型特異性が厳密で、天然型のDNAの様に合成出来るとは限らない。本研究では、昨年度の研究成果をふまえ、こはく酸、イミダゾール、ピリジン、フェナントロリン、フルオレセイン、種々のアミノ酸などの機能性基をC5位に導入したチミヂン誘導体を合成した。さらにこれらを基質に用い、好熱性DNAポリメラーゼを用いたPCR法(DNAの重合連鎖反応)による機能性修飾DNAの合成の可能性の検討、さらに大量合成法の確立をはかった。このため、これらを基質として受け入れる事が出来る好熱性DNAポリメラーゼの探索を進めた。その結果、KOD Dash, Vent(exo-)など数種のDNAポリメラーゼを用いた時にのみ、対応する修飾DNAが合成できることを見出した。また、修飾チミジン3りん酸の5位に導入した置換基がアニオン性の場合、酵素の基質にならないものあるいは取り込み能が低くなることが判明した。この修飾DNAの合成反応を応用してフルオレセインを導入したチミヂン誘導体及びKOD Dash DNAポリメラーゼを用いたPCR反応でDNAプローブとしてDNA解析に有用な蛍光標識化DNAの合成を行った。さらにPCR法による修飾DNAの合成反応及び試験管内選択法を適用し、甘味剤アスパルテーム、最近薬剤として注目されているサリドマイドなどの特定の分子に結合する新規修飾DNAアプタマーの創製を行った。機能性基を導入した修飾DNAのPCR法による酵素的な合成が可能となれば、新しい機能性修飾DNAの創製、in vitro Selectionによる修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の創製への応用が可能になると考えられる。昨年度までの研究成果をふまえ、リジン、アルギニン、ヒスチヂンなど15種のアミノ酸などの機能性基をC5位に導入したチミヂン誘導体を合成した。これらを基質に用い、KOD Dash DNAポリメラーゼを用いたPCR法(DNAの重合連鎖反応)による機能性修飾DNAの合成の可能性の検討、大量合成法の確立をはかった。さらに、チミジン誘導体以外に5位に置換基を有する2'-デオキシシチヂン誘導体あるいは2-アミノアデニン-誘導体などの三りん酸体を基質として受け入れる事が出来る好熱性DNAポリメラーゼの探索を進めた。その結果、K0D Dash, Vent(exo-)など数種のDNAポリメラーゼを用いた時に、対応する修飾DNAが合成できることを見出した。また、上記修飾チミジン誘導体及び修飾シチヂン誘導体の2種を同時に取り込んだダブル修飾DNAのPCR法による合成が可能であることを明らかにした。さらにPCR法による修飾DNAの合成反応及び試験管内選択法を適用し、最近薬剤として注目されているサリドマイド、細胞表面に存在しインフルエンザなどのウイルス感染に直接関係する糖鎖シアリルラクトースなどの特定の分子に結合する新規修飾DNAアプタマーの創製を行った。