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東アジアの高齢者ケアとケアギヴァー：異なる福祉発展段階での市場化政策とその影響

平成30年度の研究は、高齢者介護に関する調査(中国・韓国での調査)、高齢者介護に関する東アジア国際会議の開催、中間報告という3つの方向で行われた。(1)中国と韓国における高齢者ケアに関する実態調査及び聞き取り調査を行った。韓国の場合は、韓国高齢者ケア政策、ケアギヴァーの実態に関する聞き取り調査を3回行っている。主に、老人長期療養保険制度実施(2007年)以降の変化について、高齢者ケアに関わる事業所や保険者(老人長期療養公団)、研究者を対象にした聞き取り調査である。また、韓国南部の中小都市、晋州地方の高齢者家族介護の調査を行った。中国の高齢者介護については、2019年1月22日から26日の間、吉林省延辺州地域を中心に研究者、高齢者介護関連の公務員、施設長などを対象に、聞き取り調査とともに資料収集を行った。また、現在推し進められている脱貧困事業の現場調査を行い、脱貧困事業と高齢者介護とのかかわりについて、事業担当者を対象に聞き取り調査を行った。(2)2018年8月23日から26日の間、韓国の済州道にて佛教大学総合研究所との共催で「第2回東アジアにおけるケアと共生を模索する国際会議」を開催した。会議では日本をはじめ、中国と韓国の研究者による14本の研究報告がなされ、報告論文集も発行された。(3)研究の中間報告としては、2019年3月14日、韓国保健社会研究院主催の「第20回グローバル社会政策フォーラム」にて研究報告を行った。研究は計画通り順調に進められている。2019年度の研究は3つの部分から成る。それは、現地調査及び聞き取り調査、国際会議の開催を通した情報交換と資料収集、そして研究成果の報告、の3つである。(1)市場化政策の影響に関する現地調査および聞き取り調査:市場化政策以降、ケア・ケアギヴァーの状況はどう変化したのか、子女の有無によってどのような格差があるのかを明らかにするために、東アジアのさまざまな高齢者施設の施設長、官僚から聞き取り調査を中国と韓国で行う。中国の場合、近年になって失独家庭に対する特別な支援を実施しているが、そうした政策の背景・正当性・影響について、関連専門家から意見を聴取し、その制度に対する総合的評価を行う。また、補足的聞き取り調査を実施し、研究のまとめに向けての検討を行う。今までの研究や聞き取り調査結果をふまえ、必要な場合、研究を補足するための専門家意見調査を行う。(2)研究成果報告のための国際シンポジウムの開催:2019年12月14日から17日まで佛教大学にて、中国・韓国の海外研究協力者4名を含む東アジア高齢者ケア専門家が参加する国際シンポジウムを組織する。報告する国際シンポジウムを研究代表者の所属大学で組織する。、中国・韓国の研究協力者4名を招聘して行う。(3)研究成果のまとめを行い、報告書を作成・提出する。東アジアの高齢者ケア問題の比較研究を通して、次のような2つの領域に関わる問題提起を行い、介護に関する哲学的論議をまとめた:1家族ケアと職場生活の両立を可能にする条件は何かを、中国の中小都市の介護状況に基づいて問題提起すること、2比較研究方法の側面としての問題提起であり、家族ケアではなく施設ケアを選択したケース、再婚家族のケア問題を探求することによって家族主義の概念をより鮮明にすることができるということである。中国のケア状況については、介護と仕事の両立を可能にする条件は何かについて、中国中小都市の5つの家族ケア事例の分析に基づいて問題提起をした。次年度の本格的調査のための予備的調査活動である。韓国については、東アジア家族主義の概念を明確にするために、再婚・重婚などの家族関係と家族ケアとの関係性を施設入所者5名の調査に基づいて分析した。この研究は第13回国際社会保障フォーラム(中国・南京大学、2017.9.1617)で報告された。また、ケアを受ける人とケアギヴァーが共生する共同体とはどのような特徴の組織なのかという観点から「共同体の哲学:相互義務システムとしての共同体」という論文をまとめた。共同体とは次のように概念定義された:1人間関係や人格的親密さ、あるいは道徳的倫理的信念に基づいて形成された組織体である、2そのメンバーの間では、他者の生活と生命への強い関心と配慮がなされ、必要に応じて相互扶助的連帯と実践が日常的に行われる組織体、3血縁・地縁を超えてこうした組織に賛同する見知らぬ人がそのメンバーとして加わるほどよりよい社会になるといった共通意識がメンバーの間に共有されている組織。この論文は、第1回東アジアにおけるケアと共生国際学術会議(中国社会科学院、2017.8.16)にて報告された。研究は計画通りに順調に進んでいる。

中国の高齢者介護については、2019年1月22日から26日の間、吉林省延辺州地域を中心に研究者、高齢者介護関連の公務員、施設長などを対象に、聞き取り調査とともに資料収集を行った。また、現在推し進められている脱貧困事業の現場調査を行い、脱貧困事業と高齢者介護とのかかわりについて、事業担当者を対象に聞き取り調査を行った。(2)2018年8月23日から26日の間、韓国の済州道にて佛教大学総合研究所との共催で「第2回東アジアにおけるケアと共生を模索する国際会議」を開催した。会議では日本をはじめ、中国と韓国の研究者による14本の研究報告がなされ、報告論文集も発行された。(3)研究の中間報告としては、2019年3月14日、韓国保健社会研究院主催の「第20回グローバル社会政策フォーラム」にて研究報告を行った。研究は計画通り順調に進められている。平成30年度の研究は、1990年代以降の高齢者ケア・ケアギヴァーの状況の変化を明らかにすることである。1ケアの市場化政策が導入される前の段階で、日中韓のケア・ケアギヴァーの状況を考察し、その時点で三国の脱商品化の水準にどのような格差があったのかを明らかにすること、22016年8月に、応募者が行った中国黒竜江省地域の高齢者ケア施設を対象とした予備調査によると、ケア・ケアギヴァーの地域間格差はその深刻さを増していると判断される。介護施設に対する公共部門の整備がスタートする前の段階で市場化政策が行われたことにその原因があるが、そのような点を東アジア比較の観点から明確に示すことである。研究中間報告として、第14回社会保障国際フォーラム(2018年9月1516日、中国、大連財政大学)で報告する予定である。また、平成31年度の場合は、高齢者ケア・ケアギヴァー領域に対する市場化政策の影響を明らかにすることを目標として設定している。低い水準の福祉発展段階での市場化は、直ちにケアギヴァーの社会的排除に繋がるということを明らかにし、しかし、ある程度ケアの社会化が達成された国においても、程度の差はあるにしても、社会的に排除されつつある存在になっていることを明確に示す。2019年度の研究は3つの部分から成る。それは、現地調査及び聞き取り調査、国際会議の開催を通した情報交換と資料収集、そして研究成果の報告、の3つである。(1)市場化政策の影響に関する現地調査および聞き取り調査:市場化政策以降、ケア・ケアギヴァーの状況はどう変化したのか、子女の有無によってどのような格差があるのかを明らかにするために、東アジアのさまざまな高齢者施設の施設長、官僚から聞き取り調査を中国と韓国で行う。中国の場合、近年になって失独家庭に対する特別な支援を実施しているが、そうした政策の背景・正当性・影響について、関連専門家から意見を聴取し、その制度に対する総合的評価を行う。また、補足的聞き取り調査を実施し、研究のまとめに向けての検討を行う。今までの研究や聞き取り調査結果をふまえ、必要な場合、研究を補足するための専門家意見調査を行う。(2)研究成果報告のための国際シンポジウムの開催:2019年12月14日から17日まで佛教大学にて、中国・韓国の海外研究協力者4名を含む東アジア高齢者ケア専門家が参加する国際シンポジウムを組織する。報告する国際シンポジウムを研究代表者の所属大学で組織する。、中国・韓国の研究協力者4名を招聘して行う。(3)研究成果のまとめを行い、報告書を作成・提出する。
奄美諸島における木質系バイオマス生産システムの構築

本研究では,サトウキビを基幹作物として栽培している奄美諸島においてサトウキビ用収穫機を利用して木質系バイオマスを栽培,収穫するシステムを構築することを目的としている.1.亜熱帯地域に適した早生樹種に関する検討沖縄県から東南アジアに分布するアカギという樹種について,生長量などについて調査したところ,年平均生長量は17.66m^3で,容積密度は0.42であったことからバイオマス生長量に換算すると7.3t/ha/年の生産力であった.このように他の樹種に比較して極めて成長が早いという特徴があることが判明した.2.アカギの切断特性に関する基礎データの収集既存のサトウキビ収穫機を基本としてできるだけ少ない改造・部品交換などの処置により,アカギの収穫に使用できるようにするには,刈刃部の性能が最も重要と考えられる.そこで,サトウキビ収穫機で使用されている刈刃を用いて切断抵抗を測定した.切断条件として,切断角を0°と30°の2種類について行った.また,切断特性を比較するため,サトウキビサンプルについても切断抵抗を測定した.その結果,いずれの切断角度においてもアカギは,サトウキビよりも大きな切断応力となっていたが,切断角度30°の場合には,0°の場合のサトウキビ切断応力よりも小さくなり,大きな切断応力の減少効果が得られた.このように,既存の収穫機械を若干改造すればアカギを切断可能との見込みが得られた.本研究では,サトウキビを基幹作物として栽培している奄美諸島においてサトウキビ用収穫機を利用して木質系バイオマスを栽培,収穫するシステムを構築することを目的としている.1.亜熱帯地域に適した早生樹種に関する検討沖縄県から東南アジアに分布するアカギという樹種について,生長量などについて調査したところ,年平均生長量は17.66m^3で,容積密度は0.42であったことからバイオマス生長量に換算すると7.3t/ha/年の生産力であった.このように他の樹種に比較して極めて成長が早いという特徴があることが判明した.2.アカギの切断特性に関する基礎データの収集既存のサトウキビ収穫機を基本としてできるだけ少ない改造・部品交換などの処置により,アカギの収穫に使用できるようにするには,刈刃部の性能が最も重要と考えられる.そこで,サトウキビ収穫機で使用されている刈刃を用いて切断抵抗を測定した.切断条件として,切断角を0°と30°の2種類について行った.また,切断特性を比較するため,サトウキビサンプルについても切断抵抗を測定した.その結果,いずれの切断角度においてもアカギは,サトウキビよりも大きな切断応力となっていたが,切断角度30°の場合には,0°の場合のサトウキビ切断応力よりも小さくなり,大きな切断応力の減少効果が得られた.このように,既存の収穫機械を若干改造すればアカギを切断可能との見込みが得られた.本研究では、サトウキビを基幹作物として栽培している奄美諸島においてサトウキビ用収穫を利用して木質系バイオマスを栽培、収穫するシステムを構築することを目的としている。1.木本の切断特性に関する基礎データの収集既存のサトウキビ収穫機を基本としてできるだけ少ない改造・部品交換などの処置により、木質系バイオマスの収穫に使用できるようにするには、刈刃部の性能が最も重要と考えられる。そこで、サトウキビ収穫機で使用されている刈刃を用いて樹木を切断した場合の切断抵抗を測定した。採取した樹種は、スダジイ、アカガシ、ホソダハブ、ヤブニッケイの4種である。それぞれの樹種の切断特性を測定した結果、剪断応力はホソダハブが6.91MPaと最も小さく、次にスダジイ(8.78MPa)とヤブニッケイ(8.48MPa)であり、アカガシが最も大きな値(11.38MPa)となっていた。2.奄美群島の樹種に関する検討2000年林業センサスデータをもとに奄美群島の森林資源の状況を調べると,森林面積は約68,300haあり,そのうち人工林が12,770ha,天然林が55,500haとである。現地調査ならびに過去に行われた奄美大島での植生調査結果から,天然林の主要樹種はリュウキュウマツとスダジイであることが分かった。リュウキュウマツはパルプチップあるいは工芸材料としての需要があることから,スダジイが利用可能な資源であると考えられた。今後,その他の広葉樹種の特性を調査し,プランテーションとしての可能性を検討する。本研究では,サトウキビ収穫機を利用して木質系バイオマスを栽培,収穫するシステムを構築することを目的としている.1.亜熱帯地域に適した早生樹種に関する検討沖縄県から東南アジアに分布するアカギという樹種について,沖縄県宮古島にて生長量などについて調査したところ,他の樹種に比較して極めて成長が早いという特徴があることが判明した.よって,アカギは奄美諸島においても利用可能な資源であると考え,サンプルを採取し,切断抵抗特性を測定することにした.2.アカギの切断抵抗特性の測定サトウキビ収穫機の刈刃部を用いて木質バイオマスの収穫の可能性を検討するためには,サトウキビに比較して木質バイオマスがどのような切断抵抗特性を有するかを知る必要がある.

そこで,サトウキビ収穫機で使用されている刈刃を用いてアカギ樹木を切断した場合の切断抵抗を測定した.また,切断特性を比較するため,鹿児島大学農学部ほ場にて生育中のサトウキビサンプルを採取し,同様の方法で切断抵抗を測定した.その結果,アカギは,切断開始とともに切断抵抗が急増してピークに達した後,急激に減少していた.一方,サトウキビは,切断抵抗が最大値に達した後もしばらくその値を維持した後,減少し,アカギ等の樹木とは異なる性質を示した.最大切断抵抗は,サトウキビが2.9MPaであったのに対してアカギは4.9MPaと約1.7倍の大きさであったが,この値は昨年度測定した4つ樹種のいずれよりも小さな値であった.すなわち,アカギは成長が早く切断抵抗も小さく,木質バイオマスとして有望な樹種であることが判明した.本研究では,サトウキビ収穫機を利用して木質系バイオマスを栽培,収穫するシステムを構築することを目的としている.1.アカギの成長に関する調査本研究で最も適した樹種として選定したアカギについて,生長量などについて調査したところ,5年生から10年生では平均胸高直径が5.3cm17.8cmで,平均樹高は3.5m9.6mであった.また,年平均生長量は17.66m^3で,容積密度は0.42であったことからバイオマス生長量に換算すると7.3t/ha/年の生産力であった.2.アカギの切断抵抗特性の測定サトウキビ収穫機で使用されている刈刃を用いてアカギ樹木を動的に切断した場合の切断抵抗を測定した.切断条件として,切断角を0°と30°の2種類について行った.また,切断特性を比較するため,鹿児島大学農学部ほ場にて生育中のサトウキビサンプルを採取し,同様の方法で切断抵抗を測定した.その結果,切断角度0°の場合,アカギ2026kN/m^2,サトウキビ1607kN/m^2で1.26倍になっていた.切断角度30°の場合,アカギ1505kN/m^2,サトウキビ959kN/m^2で1.57倍になっていた.いずれの切断角度においてもアカギは,サトウキビよりも大きな切断応力となっていたが,切断角度30°の場合には,0°の場合のサトウキビ切断応力よりも小さくなっていた.切断角度が0°から30°になることで,アカギの場合74.3%,サトウキビの場合59.6%に減少しており,切断角度が30°になると大きな切断応力の減少効果が得られた.
多バンド系における光誘起幾何学効果と相関電子系の非平衡相転移

トポロジカル相転移を光によって引き起こす手法の開拓を目指し、分子性有機物質に着目した研究を行ってきた。申請者の提案した光誘起トポロジカル相転移が世界的にも広く認識され、例えば光学系を用いた実現がNature誌に掲載された(Rechtsman et al. Nature, 496, 196 (2013))。強相関系の非平衡現象:有機物質は強相関効果が幅広く現れることが知られている。特に、有機モット絶縁体を取り上げ、レーザーを照射した相関電子系に現れる非平衡電子状態の解析を行い、Oka PRB 86, 075148 (2012)にまとめた。この論文では一次元ハバードモデルの厳密解と量子トンネル理論を組み合わせた手法を開発し、また、得られた知見としては照射するレーザー光のエネルギーによって光キャリア分布の振る舞いが定性的にも異なることをみいだした。光誘起電気伝導:強力なレーザーを照射した電子系の電気伝導について調べた。系の電気伝導を正確に決めるためには電極との結合による緩和機構を考えた上で、大規模な系で計算を行う必要がある。この目的を達成するため「Floquet+Landauerの方法」という手法を開発し、Dirac電子系の光誘起伝導に応用した(Kitagawa et al. Ann. Phys. (2012))。24年度が最終年度であるため、記入しない。分子性結晶を舞台とする光誘起相転移についてトポロジカルな効果(光誘起幾何学効果)に注目しながら理論的な研究を行うのが本課題の目標である。平成23年度は手法開発を行うと共に光誘起幾何学的効果のもたらす新規物性を探索した。光誘起電気伝導の研究:強力なレーザーを照射した電子系の電気伝導について調べた。この目的を達成するため「Floquet+Landauerの方法」という手法を開発し、グラフェンの光誘起伝導に応用した。研究成果はKitagawa et al.Phys.Rev.B(2011)として論文にまとめた。強相関系の非平衡現象2:強相関に分類されるハドロン物理のモデルであるQCDについて、ゲージ・重力双対性を用いて緩和の問題を解析した。結果はHashimoto et al.Phys.Rev.D84(2011)にまとめた。dpモデルの解析:電荷移動型モット絶縁体における光誘起相転移を上で開発した手法により解析した。特にZhang-Rice singletの描像が光誘起状態では使えないが、新しい描像を提案し、結果は現在投稿準備中である。非平衡動的平均場理論に基づく論文が完成し、出版された。当初の予定と比較し、順調に研究が進展しているといえる。本研究は順調に進展しており、大きな研究計画の変更はない。今後も計画通り研究を進めていく。
神経細胞内ミオシン機能の新規制御機構の解明

アクチン結合タンパクの一つfilamin Aと結合するFILIP分子の新たな機能について本研究を行った。FILIP分子は細胞の形態に関わるアクチン線維とともに働くミオシン分子の一つと結合し、その細胞内分布に影響を与えることを明らかにした。また、FILIP分子は、このミオシン分子との結合により神経細胞の形態調節に関わる可能性を明らかとした。本研究は、分子生物学的実験を用いて、中枢神経系で神経細胞の形態に及ぼすFILIPを通じた新たなミオシン制御機構を明らかとした。FILIP分子はMyosin2bと結合し、その細胞内分布に影響を与える。Myosin2bとの結合部位を欠損したFILIP変異分子など、様々なFILIP変異分子を用いて細胞内でのMyosin2bの細胞内分布に与える影響を検討したところ、Myosin2bと結合できないFILIP変異分子では、そのMyosin2bの細胞内分布に与える影響は減弱していた。また、FILIPのC端側を欠損する変異分子も、Myosin2bの細胞内分布への影響が減弱することを見いだした。このFILIPのC端側は、FILIPと結合するMyosin2b以外の分子との結合部位であることが判明した。さらに、この結合分子の機能を抑えることでFILIPによるMyosin2bの細胞内分布への影響を低下させることが判明した。以上より、FILIPのMyosin2bへの作用は、他の分子の機能が必要であることがわかった。現在、この分子の機能とFILIPの機能の関係について検討を行っている。また、FILIPが神経細胞の棘突起の形態変化を引き起こす現象は、Myosin2bを過剰発現させることで、FILIPの影響を阻害できることを見いだした。さらに、Myosin2bの阻害剤であるblebbistatinを神経細胞に添加した場合、棘突起の形状はFILIPを過剰発現したときと同様な変化をした。この棘突起の変化は、培養海馬神経細胞を用いてMyosin2bをknockdownしたときにも観察された。以上より、FILIPはMyosin2bとの結合を介して、神経細胞の棘突起に影響を与えると考えられる。また、神経細胞へのFILIPが及ぼす生理学的な影響については、piriformの神経細胞で、興奮性に関わっている可能性を見いだしている。FILIPの神経細胞内ミオシン調節機構について明らかにするため、主に培養神経細胞を用いて、FILIPの機能とMyosin2bの機能の関連について検討を行った。まず、FILIPを発現しているpiriform cortexの神経細胞とFILIPを発現していない海馬神経細胞に対してMyosin 2bの機能を阻害するblebbistatin投与し、その影響を観察したところ、海馬神経細胞ではblebbistatinは効果を認めたが、piriform cortexの神経細胞では効果を認めなかった。また、RhoによるMyosin2bの活性化機能と、FILIPによるMyosin2bの機能抑制の関係について、培養神経細胞を用いて検討を行った。活性型RhoAを強制発現した場合、Myosin2bが活性化され棘突起が短くなるが、培養神経細胞にFILIPを発現させると、この活性型RhoAの神経棘突起に及ぼす影響が強く現れる傾向があることが判明した。この正確な機構は、今回の検討で明らかに出来なかったが、FILIPはMyosin2bの活性化状態では、Myosin 2bの作用に促進的に働く可能性が判明した。つまり、神経細胞の棘突起に関し、Myosin2bの活性化シグナルが細胞に入らない場合、FILIPはMyosin2bの機能を抑制しているが、活性化シグナルが入った場合は促進的に働く可能性を見いだした。また、平成25年度に同定したFILIPに結合する分子の阻害剤を培養神経細胞に投与したところ、FILIPによる神経棘突起の形態変化の作用が減弱していることが判明した。また。培養細胞内のMyosin2bの分布に関しても、この新規結合分子の機能を阻害すると部分的にFILIPの影響を減弱することが判明した。以上の結果より、この新規結合分子の機能が、FILIPの神経棘突起に対する機能に必要であることが明らかとなった。FILIPとMyosin2bの結合について、詳細に検討するため、FILIPとMyosin2bの結合部位の同定を、様々な変異分子による免疫沈降法を用いて試みた。その結果、FILIPはFILIPの今までドメインとしての報告の無い部位でMyosin2bのhead domainに結合することを見いだした。このMyosin 2bのドメインは、Myosin2bがアクチン線維と相互作用し、機能を発揮するのに必要なアクチン結合領域とATPase活性部位を有していた。この結合部位の情報より、FILIPが結合することにより、Myosin2bとアクチン線維との結合が阻害される可能性が考えられた。そこでFILIPの強制発現によりMyosin2bと細胞骨格であるアクチン線維との結合が変化する可能性を検討した。FILIP存在下では、Myosin 2bは、培養細胞内でアクチン線維と共存しない傾向が認められた。

そこで、培養細胞の蛋白を、細胞骨格を含まない分画と細胞骨格を含む分画とに分け、Myosin2bがどの分画に存在するかを調べた。その結果、FILIP存在下では、Myosin2bはアクチン線維を含まない分画に存在する傾向が強いことを見いだした。この結果は、FILIPの結合が、Myosin2bのアクチン線維との結合を阻害することを示していた。また、piriform cortexの細胞を培養し、そのMyosin2bの神経細胞内での分布の変化を検討した結果、FILIPの有無により、その分布に変化が生じることを見いだした。以上の結果は、神経細胞内でもFILIPにより、Myosin2bの機能が調節されることを示しており、新たな調節系として重要であると考えられる。当初の研究対象であったFILIPによるMyosin2bの修飾の有無に関して、今まで明らかにすることはできていない。しかしながら、Myosin2bの細胞内分布の機構に関しては、FILIPと結合する他の分子の機能が重要であることを見いだしており、当初の予想とは異なる機構を明らかにしつつある。このほかの実験に関しては、順調に進んでおり、結果を得ることができている。また、現在、FILIPの有無により、神経細胞内での受容体に関して変化を生じているという結果も得ることができており、全体としてはおおむね順調に本研究は進展していると判断している。本年度、研究代表者八木秀司は福井大学より兵庫医科大学に移動となった。この影響も有り、当初予定していた生体マウスの心筋を用いて行うFILIPによるMyosin2bの分子量変化の分子機構の解析は遅れている。また、この研究では、心筋のMyosin分子が多く存在し、それらの影響がMyosin2bの分子量に関する検討に影響を与えていることが判明した。これら他のMyosin分子の影響を分離して検討するためには、実験系として複雑になることがわかり、平成24年度から研究推進の方法を変更する予定である。このほかの実験は順調に進んでいると判断している。平成23年度に遂行したMyosin2bの細胞内分布の変化の検討、FILIPとMyosin2bの結合ドメインの同定に関しては、先の研究実績の概要に述べたように、期待以上の進行を認めている。平成23年度の結果よりFILIPによる結合は、Myosin2bの細胞内分布の調節に関わる新たな機構と考えられることが判明した。また、平成23年度に予定していたpiriform cortexを用いた神経細胞培養は遂行可能な状況であり、すでに平成23年度には、平成24年度に行う予定であった一部の実験結果を得ている。この結果より、Myosin2bの調節に関わるFILIPの神経細胞内での調節系の一部が明らかにできつつある。以上より、本研究は全体としてはおおむね順調に進展していると判断している。平成25年度は、以下の実験を行い、成果を公表する予定である。1Myosin2bの活性化を制御しているRhoAの機能とFILIPによるMyosin2bの機能調節に関して検討を行う。
特定の細胞周期で機能するCas9による多重遺伝子ノックインマウス作製

目的配列を標的遺伝子座に挿入したノックインマウスは、生命科学研究で広く使われている。特に、多重遺伝子ノックインマウスは、高い需要がある。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて、ノックイン効率を上昇させることで、より効率的な多重遺伝子ノックインマウス作製方法を確立することを目指した。細胞周期とノックイン変異が生じる時のDNA修復経路の関係性に着目し、特定の細胞周期のみで機能する改良型Cas9タンパク質を構築した。この改良型Cas9タンパク質を用いて、単一遺伝子を標的としたノックイン系を構築し、マウス受精卵に導入したところ、ノックインマウス作出効率が上昇するという良好な結果が得られた。目的遺伝子座に外来遺伝子が導入されたノックインマウスは、生体で生じる複雑な生命現象を理解するために、様々な研究分野で広く使われている。特に、多重遺伝子ノックインマウスは、分子間・細胞間の相互作用の解析やより高次元のヒト化マウス作製などが可能となるため、高い需要がある。本研究は、CRISPR/Cas9システムを用いて、より効率的な多重遺伝子ノックインマウス作製方法の確立を目指したものである。平成28年度は、細胞周期とノックイン変異が生じる時のDNA修復経路の関係性に着目し、特定の細胞周期のみで機能する新規Cas9タンパク質を構築した。遺伝子改変マウスの作製方法には、マウスES細胞を用いる場合とマウス受精卵を用いる場合とがある。そこで、この新規Cas9タンパク質のノックイン効率への有効性を調べるため、単一遺伝子ノックイン系を構築し、マウスES細胞およびマウス受精卵に導入した。マウスES細胞に導入した場合には、予想に反して、ノックイン効率に違いは見られなかった。これは、遺伝子導入時にマウスES細胞の細胞周期が同調していなかったのが、原因と考えられる。一方、マウス受精卵に導入した場合には、ノックインマウス作出効率が大幅に上昇するという非常に良好な結果が得られた。複数の遺伝子座に対して、新規Cas9タンパク質の効果を調べたが、マウス受精卵ではどの実験系においても、ノックイン効率の上昇が確認できた。さらに、マウス受精卵で生じさせたノックイン変異は個体作出後も維持され、次世代へと伝播可能であった。当初の予定通り、新規Cas9タンパク質の構築が終了し、単一遺伝子ノックイン系では、マウス受精卵でのノックイン効率が上昇することを確認できたため。単一遺伝子ノックイン系で、新規Cas9タンパク質の効果が確認できたマウス受精卵に関しては、当初の予定通り、複数遺伝子ノックインマウスの作製を試みる予定である。一方、単一遺伝子ノックイン系で、その効果が確認できなかったマウスES細胞に関しては、細胞周期を同調させた状態で再挑戦し、その効果を調べる予定である。実験動物学、発生工学
構造制御された結晶性セルロース構造体の酵素合成

生体分子の自己組織化は生体組織や器官を形成するうえで必要不可欠な現象である。これまでに様々な生体分子の自己組織化が研究されてきたが、結晶性オリゴ糖の自己組織化はほとんど研究されてこなかった。そこで本研究では、酵素反応により生成されるアルキル化セルロースオリゴマーに着目し、それらの自己組織化により形成される集合構造について解析した。その結果、アルキル基の長さが集合体の形態や結晶構造に大きな影響を及ぼすことを見出した。C末端に6残基のヒスチジンが導入された、Clostridium thermocellum YM4由来のセロデキストリンホスホリラーゼ(CDP)を大腸菌により発現させた後、大腸菌を破砕し、遠心分離により酵素懸濁液を得た。これをニッケル-ニトリロ三酢酸カラムを用いて精製し、高純度のCDPを調製した。α-グルコース一リン酸をモノマー、アルキルβ-グルコシドをプライマーとして、調製したCDPを用いて還元末端がアルキル化されたセルロース誘導体を緩衝液中で酵素合成した。この際、プライマーのアルキル基の炭素数を1から8まで変化させ、得られる生成物の溶液状態や形態に加え、セルロース部位の平均重合度、重合度分布、結晶構造などの構造特性を評価することにより、アルキル化セルロースの分子構造や集合構造に対するアルキル鎖長の効果を系統的に検討した。炭素数1から5の場合には反応液はゲル化し、生成物はよく成長したナノリボンからなるユニークなネットワーク構造を形成した。一方で、炭素数6から8の場合には生成物の水分散液が得られた。この際、炭素数6の場合にはらせん状のナノロッドを、炭素数8の場合には不定形のナノシートをそれぞれ形成した。また、セルロース部位の平均重合度はアルキル基が長くなるにつれて小さくなる傾向にあり、例えば、炭素数1の場合の約10から炭素数8の場合の約7まで変化した。なお、それぞれのセルロース部位が所定の重合度分布を示した。一方、セルロース部位は、炭素数1から5の場合に逆平行鎖のセルロースII型を、炭素数6から8の場合に平行鎖のセルロースI型の結晶形を形成した。なお、プライマーの臨界ミセル濃度を評価した結果、ミセル形成の有無が結晶形を直接、決定している訳ではなかった。このように、セルロースに導入するアルキル基の長さによって、酵素反応により得られる生成物の溶液状態、セルロース部位の重合度や結晶構造、集合形態が変化することを見出した。計画に従って調製した酵素と、アルキルβ-グルコシドをプライマーとして用い、今後の基準となる重要な実験系であるアルキル化セルロースの酵素合成を予定通りに実施できた。これにより、生成物の溶液状態、セルロース部位の重合度や結晶構造、集合形態に与えるアルキル鎖長の効果について、興味深い知見を得つつあるため、おおむね順調に進展していると考えている。前年度に、セロデキストリンホスホリラーゼ(CDP)を用いるセルロースオリゴマーの酵素合成において、反応の起点(プライマー)であるグルコース誘導体のアノマー位に導入するアルキル鎖長が比較的短い場合に(炭素数で2から4程度)、セルロースII型結晶を有するナノリボンネットワークで構成されるハイドロゲルが得られることを見出した。この新規なセルロース系ハイドロゲルに反応性基を導入し、自在に機能化することを目指し、アノマー位にエチル基を介してアジド基が導入されたグルコース誘導体である2-アジドエチル-β-D-グルコピラノシドをプライマーとして、セルロースを酵素合成した。その結果、この新規なプライマーがCDPにより認識されることでアジド基を有するセルロース系ハイドロゲルが酵素合成でき、また、クリック反応により、ハイドロゲルをポスト機能化できることを見出した。また前年度に、グルコースプライマーのアノマー位に導入するアルキル鎖長が比較的長い場合に(炭素数で6から8程度)、セルロースI型結晶を有するナノロッドや不定形ナノシートが得られることを見出した。これらの構造体を引き続き構造解析した結果、脂質集合体によく見られる二分子膜構造を基本単位として、それらの構造体が構築されていることが分かった。得られた構造体が脂質集合体と同様の特性を示す可能性があると予想し、水分散したオクチルβ-セルロシドの水面上に対する単分子膜(いわゆるギブス単分子膜)の形成について評価した。その結果、結晶化した固体状の水分散液であるにも関わらず、経時的に高密度な水面単分子膜を形成すること、また、それらの水面単分子膜が通常の脂質単分子膜とは比較にならないほどの高い力学強度を有することを見出した。このように、酵素反応により合成されるセルロース誘導体の構造形成や機能化に関するこれまでに例のない基礎知見が得られた。酵素反応により得られるセルロース誘導体の構造形成に及ぼす置換基の効果について系統的な知見を得るために、引き続きさまざまな置換基が導入されたグルコース誘導体をプライマーとして酵素合成する。また、得られた構造体の物性や機能についても同時に検討し、新規なセルロース材料の創製に向けた基盤を構築していく。生体高分子化学
仮想交通環境を用いた自動車運転モデル構築に関する基礎的研究

ドライバが行う運転行動には,経路選択,コース追従,加減速・右左折直進,障害物回避などがある.本研究の目的は各運転行動を階層的に表現するドライバモデルを構築することである.まず,ドライビングシミュレータの構築を進めると同時に,アンケート分析やプロトコル分析による経路選択行動分析や,従来の操舵モデルを用いて理論的に導出した制御則の有効性検討などを行った.シミュレータ完成後は,被験者実験を行うことによって,より詳細な考察を行った.二年間の研究において得られたことをまとめると下記のようになる.1)経路選択に関する研究未経験環境における経路選択行動に関して,ドライバは,旅行時間,わかりやすさ,快適さという代表的な三つの経路選択基準の中でもわかりやすさを重視して経路選択を行っていること,ドライバは地図から経路種類,経路の屈曲回数,駅の有無,経路距離という四つの属性を抽出していることが明らかになった.2)コース追従(操舵)に関する研究従来の操舵モデルの一つに,一定時間後の車両到達地点に相当する前方注視点と目標コースとの距離(コース誤差とよぶ)に比例して操舵するというモデルがある.同モデルと車両の運動方程式から導出されるコース誤差動特性の式に着目して撃心横加速度制御則を提案し,閉ループシミュレーションとドライビングシミュレータを用いた被験者実験により提案する制御則の有効性を示した.3)加減速行動に関する研究ドライバは加速感を知覚するときに減速行為が誘発されやすい.設置間隔が徐々に短くなるゲートを道路に沿って設置することで,等速で通過する車両のドライバに対して錯視による加速感を与える.ドライビングシミュレータを用いた被験者実験により,1)提案するゲート群を等速で走行するときに加速感を感じる,2)減速行為が誘発され速度抑制効果が示唆される,などの結果を得た.1.研究実績「研究計画・方法」に記載した「研究計画概要」に書いてあるように,本研究は「自動車運転行動を階層的に表現するグローバルドライバモデルの構築」を目標に研究を遂行している.研究計画において平成13年度は(実験I)被験者操縦車両1台による運転行動,(実験II)被験者操縦車両2台による運転行動に関する実験を行い,その解析を行う予定であったが,ドライビングシミュレータの構築に予想以上の時間を費やしたために,実験計画が遅れているというのが現状である(後述「2.実験設備」参照).しかし,ドライビングシミュレータが未完成である時期に同時並行的に,平成14年度に行う予定であった,経路選択行動に関する実験を遂行した.その実験では,1)被験者が未経験目的地まで地図を用いて経路選択する実験と2)被験者が経験目的地まで実車を運転する実験を実施し,プロトコル分析によってつぎのようなことを明らかした.(1)未経験目的地までの経路選択では経路選択基準として「わかりやすさ」を重視している.また,「経路の幅」を頻繁に抽出して経路選択を行っている.(2)経験目的地までの経路選択では,「旅行時間」を重視している.また,環境から「時間がかかる」ことをアフォードしている属性を抽出し,経路選択に関する意思決定を行う.2.実験設備「研究計画・方法」に記載した「実験設備概要」の「1.ドライビングシミュレータ(Sim-A, Sim-B)」は,1)被験者の運転に基づいてトラッキングセンサを内蔵したHMDに運転環境を表示できる,2)車両位置データを通信することにより,他のドライビングシミュレータ上に他車両の動きを表示できる,という段階まで完成しているが,「2.他車両動作計算用PC」は車両追従モデル(加減速モデル)の一部のみ構築している現状である.ドライバが行う運転行動には,経路選択,コース追従,加減速・右左折直進,障害物回避などがある.本研究の目的は各運転行動を階層的に表現するドライバモデルを構築することである.まず,ドライビングシミュレータの構築を進めると同時に,アンケート分析やプロトコル分析による経路選択行動分析や,従来の操舵モデルを用いて理論的に導出した制御則の有効性検討などを行った.シミュレータ完成後は,被験者実験を行うことによって,より詳細な考察を行った.二年間の研究において得られたことをまとめると下記のようになる.1)経路選択に関する研究未経験環境における経路選択行動に関して,ドライバは,旅行時間,わかりやすさ,快適さという代表的な三つの経路選択基準の中でもわかりやすさを重視して経路選択を行っていること,ドライバは地図から経路種類,経路の屈曲回数,駅の有無,経路距離という四つの属性を抽出していることが明らかになった.2)コース追従(操舵)に関する研究従来の操舵モデルの一つに,一定時間後の車両到達地点に相当する前方注視点と目標コースとの距離(コース誤差とよぶ)に比例して操舵するというモデルがある.同モデルと車両の運動方程式から導出されるコース誤差動特性の式に着目して撃心横加速度制御則を提案し,閉ループシミュレーションとドライビングシミュレータを用いた被験者実験により提案する制御則の有効性を示した.3)加減速行動に関する研究ドライバは加速感を知覚するときに減速行為が誘発されやすい.設置間隔が徐々に短くなるゲートを道路に沿って設置することで,等速で通過する車両のドライバに対して錯視による加速感を与える.ドライビングシミュレータを用いた被験者実験により,1)提案するゲート群を等速で走行するときに加速感を感じる,2)減速行為が誘発され速度抑制効果が示唆される,などの結果を得た.
人胆汁中コレステロール結石形成促進因子及び抑制因子の分離精製とその応用

コレステロール胆石症の治療に関しては近年、胆汁酸による溶解療法、超音波衝撃破砕療法など目覚しく進歩しているが、その成因機序に関しては論議の的であり未だ確立されていない。欧米の諸施設から胆汁中にコレステロール結晶の形成(Nucleation)と成長(Growth)を促進あるいは抑制するglycoproteinsの存在が報告されている。我々は、それら因子の胆汁中の量的バランスが、コレステロール結石の誕生に大きな役割を果たしていると考えてきた。そこで、胆汁中に形成されるコレステロール結晶を分光光度計を使用して半定量的に測定するcholesterol nucleation&growth asssay法とゲル濾過法、レクチン・アフィニティー・クロマトグラフィー(Concanavalin A、Helix pomatia)、高速液体クロマトグラフィー等の諸蛋白分離法を組み合わせて、胆石患者と正常人胆汁を用いてコレステロール結晶の形成促進因子と抑制因子の分離精製を試みた。その結果、コレステロール結晶形成促進作用を有するヒト胆汁中糖蛋白はCon Alectin結合蛋白分画中に多く存在し、一方、抑制作用を有する糖蛋白はHelix pomatialectin結合蛋白分画中に多く存在することがコレステロール結晶を分光光度計を用いて半定量的に測定するcholesterol nucleation&growth asssay法で確認された。現在、それぞれの糖蛋白分画をイオン交換とゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分離精製している。コレステロール結晶形成促進作用を有する糖蛋白分画に関してはSDS-PAGE電気泳動上4つの蛋白バンドまで分離された。現在、これら糖蛋白のさらなる分離精製とmonoclonal antibodyの作成を試みている。コレステロ-ル結晶形成促進作用を有するヒト胆汁中糖蛋白はCon Alectin結合蛋白分画中に多く存在し、一方、抑制作用を有する糖蛋白はHelix pomatialectin結合蛋白分画中に多く存在することがコレステロ-ル結晶を分光光度計を用いて半定量的に測定する新しいcholesterol nucleation & growth asssay法で確認された。現在それぞれの糖蛋白分画をイオン交換とゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ-で分離精製している。ゲル濾過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ-で分離されたコレステロ-ル結晶形成促進作用を有する糖蛋白分画はSDSーPAGE電気泳動上4つの蛋白バンドとして確認にされている。さらに、異なるカラムを用いてこの分画の精製分離を試みているが、これらの糖蛋白は凝集傾向が強く高速液体クロマトグラフィ-を用いての分離では4つの異なる蛋白分画を分離するに至っていない。これは、これらの糖蛋白がかなりの割合で糖鎖を有している為と考えられる。現在、種々の界面活性剤を使用しこれら糖蛋白の分離精製試を試みている。コレステロ-ル結晶形成促進作用を有する糖蛋白分画に関してはSDSーPAGE電気泳動上4つの蛋白バンドまで分離された、そして現在、これら糖蛋白の分離精製を試みている。さらに、コレステロ-ル結晶形成促進作用を有する糖蛋白は、分子量30ー120kD間に存在すると思われる。以上、平成3年第27回日本肝臓学会総会に報告した。

そので、胆汁中に形成されるコレステロール結晶を分光光度計を使用して半定量的に測定するcholesterol nucleation&growth asssay法とゲル〓過法、レクチン・アフィニティー・クロマトグラフィー(Concanavalin A、Helix pomatia)、高速液体クロマトグラフィー等の諸蛋白分離法を組み合わせて、胆石患者と正常人胆汁を用いてコレステロール結晶の形成促進因子と抑制因子の分離精製を試みた。その結果、コレステロール結晶形成促進作用を有するヒト胆汁中糖蛋白はCon Alectin結合蛋白分画中に多く存在し、一方、抑制作用を有する糖蛋白はHelix pomatialectin結合蛋白分画中に多く存在することがコレステロール結晶を分光光度計を用いて半定量的に測定するcholesterol nucleation&growth asssay法で確認された。現在、それぞれの糖蛋白分画をイオン交換とゲル〓過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分離精製している。コレステロール結晶形成促進作用を有する糖蛋白分画に関してはSDS-PAGE電気泳動上4つの蛋白バンドまで分離された。現在、これら糖蛋白のさらなる分離精製とmonoclonal antibodyの作成を試みている。
発癌遺伝子移入による正常造血系細胞のimmortalzation

1)、発癌遺伝子の可能性が疑われているヒト成人性T細胞白血病ウイルスHTL-1 tax-1遺伝子を正常骨髄細胞に移入して、これを放射線照射を受けたマウスに注入してキメラマウスを作成し、或いはこのtax-1遺伝子をマウス受精卵に移入を行ってトランスジェニックマウスを作成し、個体レベルにおけるtax-1遺伝子の作用を分析した。サーザン解析によってtax-1遺伝子が検出されたキメラマウスの胸腺、脾では未熟なリンパ球がビマン性に浸潤し、髄質の構造が失われ、T細胞の分化、成熟の抑制が認められた。又、トランスジェニックマウスでは胸腺の萎縮が著明で、発育低下、早死にするものが多く、生長したものでは「悪性リンパ腫の他「肺ガン」,皮膚の「線維肉腫」,末梢神経の「シュワノーム」等の種々のがん発生がみられ、且つこれ等がん組織でtax-1の遺伝子の発現が認められたので、tax-1そのものが発癌遺伝子であることが示された。又、ヒト免疫不全病ウイルス(AIDS,HIV)tatIII遺伝子がTNFの共存下で、HIV遺伝子発現を著明に増強することが見出され、TNFはHIV-LTRの「エンハンサー」を介して作用すること明らかとなった。2)、胸腺の染色体外環状DNAの分析から、これらがT細胞受容体α鎖及ζ鎖遺伝子の再配列の結果、切り出されたものである事が初めて明らかにされた。又、ヒト胃癌由来の発癌遺伝子HST1をヒト第11染色体の長腕(q13-3)に位置付けした。又、これら胃癌で別の発癌遺伝子INT2が同時に増幅していることが見出された。3)、ヒト白血病細胞U937に発癌遺伝子v-mosを移入するとマクロファージに分化することが見出された。又、ヒト小細胞肺癌細胞をビタミンA欠乏状態で培養することによって悪性度の低い腺癌様細胞に分化することが見出された。今后はHIV-tatIII遺伝子移入トランスジェニックマウスの作出を行いAIDSの分析を行う予定である。
吸入GM-CSFは肺胞蛋白症病変をどのように改善するか

自己免疫性肺胞蛋白症の新規治療のGM-CSF吸入治療の効果機序の解明を試みた.GM-CSF吸入治療後経過観察で治療前の%VCが予後予測因子となる可能性が示されたが,CTでは線維化所見はほとんどみられず,サーファクタント物質の貯留量との関連の可能性が考えられた.この点はCTスコアがKL-6等の血清マーカーともよく相関することからも示唆された.画像所見の解析では,陰影の範囲に濃度の評価を加味したスコアが治療効果評価に有用で,濃度の改善の作用が大きいことが示唆された.GM-CSF製剤の検討では,糖鎖が肺胞マクロファージへの取り込みを抑えて,生理活性の延長に関与する可能性が示唆された.本研究では,GM-CSF吸入治療を受けた自己免疫性肺胞蛋白症患者(APAP)患者の改善の機序を明らかにすることを目的とする.患者のCT画像,気管支肺胞洗浄液(BALF)や血清などの患者検体,培養細胞を用いた検討よりアプローチする.GM-CSF吸入治療を受けた患者のCTを陰影の強度および広がりからスコアリングして検討したところ,CT gradeは,血清マーカー,肺機能所見,PaO2と有意に相関し,その増減は治療効果と相関することが確認された.APAP患者の抗GM-CSF抗体の肺局所での分布を調べるため,]APAP患者のBALFおよび血中の,GM-CSFと抗GM-CSF抗体が結合した複合体の定量を,ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法で試みた.その結果,BALF中の複合体の濃度は,血清中のそれよりはるかに高いことが分かり,血中の抗体は,肺内に移行して,II型肺胞上皮が作るGM-CSFとすぐに結合すると考えられ,吸入GM-CSFは両者の平衡に影響を与えると考えられた.吸入治療に用いたGM-CSFは,酵母由来ないし大腸菌由来のヒトリコンビナントGM-CSFで,ヒト細胞で産生されるGM-CSFに比べ,糖鎖がほとんどない点で異なる.糖鎖に富む哺乳動物細胞のCHO由来のヒトリコンビナントGM-CSFと酵母由来ないし大腸菌由来のGM-CSFを用いて,培養細胞に対する生理活性を比較したところ,CHO由来GM-CSFは,細胞の増殖や生存をより強く促進することが判明し,糖鎖が,GM-CSFのとりこみや分解に関係する可能性が考えられた.自己免疫性肺胞蛋白症は,GM-CSFに対する自己抗体の出現により肺胞マクロファージのサーファクタント除去能が低下し,肺胞内に無構造物質が蓄積して呼吸不全をきたす.本研究では,肺胞蛋白症の新規治療として期待されるGM-CSF吸入治療の治療効果のメカニズムを画像細胞まで様々なレベルで探っている.本邦の医師主導の多施設第II相試験のGM-CSF吸入治療を完遂した肺胞蛋白症患者の治療後3年の経過観察の検討で,治療前の肺機能検査での肺活量が追加治療までの期間とKaplan-Meier解析で有意に相関し,治療後の予後と関連することが示されている.そこで肺活量の低下の原因として,肺線維化との関連を考え,当該患者の胸部CT画像32例の線維化所見を複数の独立した放射線科医により再検討したが,線維化関連所見として牽引性気管支拡張,気管支拡張症,多発性嚢胞を各1例みるのみで,線維化との明らかな関連はみられず,肺胞内へのサーファクタント物質の蓄積の多寡による可能性が残った.上記の患者CTの解析では治療後のHRCTスコアが,予後に関連することも示された.CTスコアは血清マーカーや肺活量とも有意に相関することが観察されているので,こうした臨床マーカーから肺内沈着物質量を評価する必要が考えられた.GM-CSF吸入治療に用いられる大腸菌ないし酵母由来のヒトリコンビナント(rh)GM-CSFでは糖鎖はほとんどないがヒトの体内のrhGM-CSFは糖鎖の付加がある.哺乳類細胞株のCHO細胞由来のrhGM-CSFも糖鎖が多く,GM-CSF依存性細胞株に対して長時間作用での増殖活性が高い.この活性は,シアリダーゼ処理により糖鎖のシアリル基をとると著しく減少することから,このシアリル基がGM-CSF活性に重要であると考えられた.ヒトのGM-CSFは様々な分子量のものが精製されており,糖鎖修飾の程度により受容体との親和性が変化して組織特異的な活性を生じている可能性も考えられた.肺は,円滑な呼吸のため表面張力を減じるサーファクタント物質を産生する.自己免疫性肺胞蛋白症は,顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)に対する自己抗体の出現により肺胞マクロファージのサーファクタント除去能が低下するため肺胞構造内に無構造物質が蓄積する疾患である.本研究では,本症の新規治療であるGM-CSF吸入治療の治療効果の機序を画像細胞レベルで探った.本邦での多施設II相試験でGM-CSF吸入治療を完遂した本症患者の治療後3年間の経過観察の検討では,治療前の肺機能検査での肺活量が追加治療までの時間と相関し,予後との関連が示された.そこで肺活量の低下として肺線維化との関連を考え,当該患者での胸部CT画像の線維化を複数の放射線科専門医で評価したが,線維化の所見は少なく関連は示されなかった.一方,HRCTのdeinsitometryでの検討では,すりガラス影に相当するCT値-900HU-750HUの領域の広さと肺活量や血清マーカーとの相関が示唆された.

従って肺活量低下は肺内沈着物質量を反映し,その多寡が本症の重症度やGM-CSF吸入治療の治療効果と関連する可能性が考えられた.吸入治療で用いられるGM-CSFの糖鎖構造の検討として,糖鎖のない大腸菌由来製剤と,糖鎖の豊富なCHO細胞由来製剤とを,GM-CSF依存細胞株の実験系で比較した.CHO細胞由来製剤は,長時間作用型で増殖活性が高く,糖鎖が受容体との親和性に影響し,長大な糖鎖が細胞の取り込みを遅らせ,効果時間が延びる可能性が考えられた.またGM-CSF吸入動物系での抗体産生を検討し,糖鎖のない大腸菌由来製剤の方が抗体価が高く,糖鎖の長いCHO細胞製剤で,抗体価は低くなる傾向が示された.また患者側の要因の検討として,GM-CSF受容体変異による肺胞蛋白症患者の全肺洗浄前後の比較より,IL-2やIL-5等が病状の推移に並行に動く一方,IL-3やM-CSFは高値を維持し,GM-CSFの信号低下を補正する機序への関与が考えられた.自己免疫性肺胞蛋白症の新規治療のGM-CSF吸入治療の効果機序の解明を試みた.GM-CSF吸入治療後経過観察で治療前の%VCが予後予測因子となる可能性が示されたが,CTでは線維化所見はほとんどみられず,サーファクタント物質の貯留量との関連の可能性が考えられた.この点はCTスコアがKL-6等の血清マーカーともよく相関することからも示唆された.画像所見の解析では,陰影の範囲に濃度の評価を加味したスコアが治療効果評価に有用で,濃度の改善の作用が大きいことが示唆された.GM-CSF製剤の検討では,糖鎖が肺胞マクロファージへの取り込みを抑えて,生理活性の延長に関与する可能性が示唆された.GM-CSF治療を受けた肺胞蛋白症患者の新規例の臨床情報の蓄積が進み,肺機能検査やCT検査,血清マーカー等の解析が進み,肺活量の低下の重要性が明らかとなり,肺活量低下の原因として肺線維化の放射線科医による評価を行ったが,明らかな関連はみられず,肺線維化以外の肺内沈着物質量などの要因が関与する可能性が示された.肺胞蛋白症患者の胞洗浄液での抗体価および抗原抗体複合体の解析が進んでいる.GM-CSFの糖鎖修飾と生理機能活性との関係について、GM-CSF依存性細胞株での解析が進み,シアリダーゼによる処理でのシアリル基の重要性が明らかになっている.以上のように各領域で解析が進み,新知見が得られ,概ね順調に進展している.呼吸器内科学今後の推進方策1画像所見の解析:GM-CSF吸入治療を受けた肺胞蛋白症患者の画像解析について,治療後の予後と相関する肺活量の低下に関連した所見として,32例の放射線科医の肺線維化の検討をおこなったが有意の結果が得られなかったので,肺活量と陰影範囲の関連と,陰影の改善がどの領域でみられたかに視点を置いて検討する.吸入治療後の予後については,吸入治療直後の下肺野のCTスコアが関連を示唆する結果が得られているが,治療前の肺胞蛋白症患者のCT所見では下肺野が最もスコアの高く,改善を反映しやすい領域の可能性がある.新規治療例のCT所見も含めて検討を進める.2PAP患者の検体の解析:肺胞洗浄液および血清中のGM-CSF,抗GM-CSF抗体の定量ならびに,両者の結合した抗原抗体複合体の解析を進める.末梢気道内に蓄積したサーファクタント物質と気道上皮細胞の関連について検討するため,上皮関連マーカー,腫瘍関連マーカーの解析を行う.3培養細胞を用いた解析:GM-CSF依存性細胞株における大腸菌