hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複雑系数理の基礎理論を用いた燃焼振動の非線形ダイナミックスの解明とその新展開

(1)昨年度までの研究成果(Murayama et al. Physical Review E, vol.97, 022223,2018)にから,ノズル出口付近の燃焼振動の速度変動は雑音周期振動であり,乱流ネットワークのPrimary hubが顕著に形成されることが示されている.この点に着目し,燃焼振動の火炎基部にスワーラから二次空気噴射を与えることで,発熱率分布を変化させ,燃焼振動が抑制される.(2)二次空気噴射による燃焼振動の抑制過程においても,乱流ネットワーク構造の強度の確率分布に明瞭なべき乗則が現れ,スケールフリー性が存在する.燃焼振動の振幅が著しく抑制される直前まで,スケールフリー性が保持され,スケールフリー性の寿命時間の確率分布にもべき乗則が現れる.(3)圧力変動とOH自発光強度変動から構築された遷移ネットワークと主成分分析を組み合わせた新しい方法は,燃焼振動の前兆を捉えることができる.現在までの進捗状況で示されるように,次年度の研究計画の一部を実施した.本年度に予定していた燃焼騒音からリミットサイクル振動への増幅過程とリミットサイクル振動の減衰過程についても,十分発達した燃焼振動の場合,検討していく必要がある.今年度,燃焼振動の流体力学的構造に複雑ネットワークを導入することが可能となり,本研究は著しく進展している.ただ,昨年度からの課題である燃焼騒音からリミットサイクル振動への増幅過程とリミットサイクル振動の減衰過程についても検討する必要がある.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
運動習慣と心肥大の形成に関与する脳内因子の解明

我々が構築した世界初の高自発運動モデル動物SPORTSを実験のツールとして用い、運動習慣の制御機構だけでなく、心筋肥大の形成機構を同時に解析することを本事業の目的とした。SPORTSラットにおいては、運動による血圧増加を伴わず生理的な刺激による心筋の成熟機構とは異なる機序で心筋肥大が形成されていることが判明した。さらに、脳内モノアミンは運動習慣の制御のみならず、心拍数制御や心筋の肥大形成に関与することで、自発運動に適応する心臓循環機能を獲得することに貢献する可能性が示唆された。本研究では、我々が世界に先駆けて発見し樹立した高自発運動性ラットSPORTSを用いて、このラットの運動習慣規定因子である脳内モノアミンが運動習慣の制御だけでなく心筋肥大の形成や心機能調節に関与しているかどうかを生理学的に解析する。また、その詳細な調節機構を明らかにすることを目的とする。本年度の事業では、脳内モノアミンは運動習慣の制御のみならず、心拍数制御や心筋の肥大形成に関与することに貢献する可能性を精査するため、SPORTSラットの脳内モノアミン動態を薬剤(MAOA阻害薬)投与により再現したモデルを作成し、自発運動量と心拍変動解析、また心拍数制御に関わるタンパク質の発現解析を行った。リアルタイムPCR法やWestern blot法により、SPORTSラットの心拍調節に関わるイオンチャネルやキナーゼ、心筋特異的転写因子の発現を調べたところ、SPORTSラット心筋では、L型カルシウムチャネル(Cav1.2)mRNA発現及びタンパク発現が顕著に亢進していた。また、同様にMAOA阻害薬投与群(脳内カテコラミン増加群)においてもCav1.2 mRNA及び、タンパク発現の亢進が認められた。さらに、心筋におけるCav1.2の転写を制御する転写因子であるCREBのリン酸化の亢進が両群で認められ、脳内モノアミンの増加による心拍数増加には、転写因子CREBを介したCav1.2発現の増加が関わる可能性が示唆された。一方、形態学的観察の結果からは、MAOA阻害薬投与群では心筋細胞のサイズが対照群に比べやや増加する傾向が認められ、脳内モノアミン動態を変化させることで、運動(圧負荷)を介さなくとも心筋細胞を成熟させられる可能性が示唆された。今後さらなる追実験が必要である。本事業では、我々が世界で初めて確立した高自発運動性を示すモデル動物SPORTS ratを用いて、このモデルラットの高自発運動性に働く因子である脳内モノアミンが運動習慣の制御だけでなく、心筋肥大の形成や心機能調節に関与しているかどうか、またその詳細な調節機構を明らかにすることを目的とした。脳マイクロダイアリシスの結果、SPORTSラットのモノアミン放出量は対照ラットに比べて有意に上昇しており、これにより自発運動が誘発されていることがわかった。またテレメトリ埋め込み法により安静時及び自発運動時のSPORTSラットの心電図を記録し心拍変動スペクトル解析を行ったところ、SPORTSラットは対照ラットに比べ速い心拍を示し著名な心肥大を呈することが判明した。また心拍変動解析の結果から、安静時のSPORTSラットの心臓交感神経活動は亢進しており、それに伴い心拍数が増加していることがわかった。一方で、SPORTSラットの心筋筋原線維は肥大していたが線維化は見られなかったため、SPORTSラットの心肥大は交感神経緊張による圧負荷に応答した変化であるが、生理的な肥大シグナルにより制御されている可能性が示唆された。今後も運動意欲の制御中枢である脳に再度着目し、脳内モノアミンが自発運動の制御のみならず心機能調節や心筋の肥大(成熟)に関与することで、自発運動に適応する心臓循環機能を獲得することに貢献する可能性をin vivo生理学実験により検証していきたい。前年度から引き続き、SPORTSラットの運動時の心電図記録、および脳灌流サンプルの採集を行い、同時に以下の点について本年度は検討を行った。これまでの心電図記録による心拍変動解析から、SPORTSラットの心拍数の制御が心臓自律神経活動だけでは説明ができない可能性が示唆されたため、心筋細胞の自動能に作用する未知の心拍数制御因子があることを考慮し、その因子と脳内モノアミンやその調節因子群が相互作用することによっても運動習慣が規定される可能性を考えた。そこで、本年度の事業では、SPORTSラットと対照ラットから心筋と脳(海馬・線条体)を採取し、RNA抽出の後DNAマイクロアレイ解析を行い遺伝子発現の差異を網羅的に解析した。SPORTSラットの脳海馬ではトランスサイレチンやcatechol-O-methyl transferase (COMT)などの脳内カテコールアミンの制御に関わる遺伝子群が有意に発現低下し、一方、神経栄養因子群(NGF, NT-3, BDNF)は有意に発現亢進していることがわかった。心筋(心房、心室)においては、細胞内カルシウム濃度の調節因子(L型Ca2+チャネルやNa+/Ca+ exchanger)の発現が有意に増加していた。

これらの遺伝子発現変化は、通常であれば自発運動後に起こるものであると考えられているが、SPORTSラットにおいては、脳海馬、心臓において生まれつきこれらの遺伝子群が発現変化していることで、活動性を増大させ心筋の肥大を引き起こしている可能性が示唆された。運動生理学マイクロダイアリシスによる脳内モノアミン定量とテレメトリー送信機による心電図記録を同時に測定するためのシステムの稼働がうまくいくようになり、安定した実験結果が得られるようになったため当初の実験計画のとおりに進められた。安定した結果が得られたことから、SPORTSラットの運動習性を規定するモノアミン濃度がある程度わかり薬剤実験に進むことができた。脳内モノアミンと運動習性との連関作用を解明するために、自発運動前後の脳内モノアミンや心機能の解析を行っているが、ラットの心電図記録、及び脳灌流サンプルの採集は生理的な状態で継続的に行うために、実験中のトラブル(運動中に脳カニューレがはずれてしまうなど)が多々ありサンプリングやデータ収集までに多大な時間を要したため、当初予定していた遺伝子発現解析実験に遅れが生じてしまった。自発運動と心拍数を制御する分子が心筋肥大(成熟)にどのように関わるかについて引き続き検証実験を行う。さらに、SPORTSラットと薬剤投与により脳内モノアミン構成を再現したモデルラットの自発運動量や心電図、脳内モノアミン濃度を測定したのち心筋を採集し、RNA抽出やタンパク抽出を行い心筋の構造的あるいは電気的リモデリングに関わるタンパク群(イオンチャネル、細胞内キナーゼ、転写因子等)の細胞内シグナル経路の解析を行う。具体的には、心筋からRNAを抽出しDNAマイクロアレイ解析を行い遺伝子発現を網羅的に解析する。DNAマイクロアレイ実験の準備はすでに整っている。現在、脳内モノアミンと運動習性との連関作用を解明するために、自発運動前後の脳内モノアミンや心機能の解析を行っているが、自発運動負荷中に脳カニューレがはずれてしまうことが多々あり、脳灌流サンプルの回収に多大な時間を要したため、当初予定していた遺伝子発現解析実験に遅れが生じている。しかしながら、自発運動中ラットの脳カニューレの固定方法を改めると改善がみられたため、我々が考案した脳カニューレとテレメトリ心電計の同時装着による実験系は脳ー心連関作用による自発運動制御機構の解明に貢献すると考えられる。運動により多くの遺伝子群やタンパク群の発現変動が起こることは予想できるため、今後は、遺伝的な差を調べるために、自発運動をさせない安静群のSPORTSラット及び対照ラットの心筋を採取し、RNAあるいはタンパクを抽出し心筋収縮に関わるタンパク群(イオンチャネル、細胞内キナーゼ、転写因子等)の解析を分子生物学的手法で行う予定である。さらに、心機能異常を伴わずに運動量を制御する脳内シグナル分子が同定できた後には、その分子が生体にとって質的良好な運動基盤分子であることを遺伝学的、及び生理学的に証明できるか実験により証明することが重要と考えられる。このためには、同定された分子を遺伝子操作により、欠損あるいは過剰発現させたモデル動物を作成し、SPORTSラットでみられた表現型があらわれるかどうかを解析する必要があると考えている。
歯周病原菌感染予防DNAワクチンの検討

Actonobacillus actinomycetemcomitansは、若年層歯周炎の病原菌であるだけでなく成人性歯周病炎の病巣に多くその発症と進行に密接に関与することが明らかにされている。本菌種の菌体表層にある線毛抗原は、本菌種の歯周局所への定着因子となっている。私共は、A.actinomucetemcomitansの線毛抗原に対する血清中IgGの結合力価が高いグループは、本菌の感染が少ないことを見出した。次いでA.actinomycetemcomitanの線毛抗原のアミノ酸配列を読み取り、その抗原性が高いと思われるオリゴペプチドを合成した。このオリゴペプチドを合成した。このオリゴペプチドをmulriple antigen peptide法によって分子量を大きくしてアジュバントと一緒にウサギに免疫下。そのウサギ免疫血清は、A.actinomycetemcomitansの全ての共試菌株と反応性を示した。また本抗血清は、本菌種の実験的ペリクトル、ヒトの頬粘膜上皮および培養線維芽細胞への付着をIn vitroで濃度依存的に抑制することを明らかにした。私共の得た知見はA.actinomycetemcomitan線毛抗原に対する特異抗体が本菌感染防御作用を有することを明らかにしたものといえる。本菌の感染を抑える線毛抗原に対する抗体産生を誘導する副作用の少ないDNAワクチンの開発を検討するため、すなわち特定の歯周病原菌の排除をもたらす抗体産生を誘導する遺伝子治療への可能性を探った。高齢化に伴い機能をもたない抗体の産生が増え、防御性を示す抗体産生能が低下する。本研究では、有効に働く特異抗体産生をDNAワクチンで誘導することである。具体的には、アミノ酸配列から複数のオルグヌレオチドを作成し、それらをプローブとしてA.actinomycetemcomitansの線毛遺伝子をクローニングした。現在サイトメガロウイルスのプロモーターに線毛遺伝子を結びつけ、ワクチンとして投与したこのDNAが実験動物で本菌線毛に対する抗体の産生を誘導できるか否かを調べている。歯の喪失をもたらす歯周炎の病原菌は、歯周局所に増加するグラム陰性桿菌とスピロヘータなどである。なかでもPorphyromonas gingivalisとActinobacillus actinomy-cetemcomitansは、線毛などの付着因子で局所に定着し、内毒素や種々の酵素などで歯周病原性を発揮する。本研究は両菌種の付着因子を不活性化するDNAワクチンの開発に関わる基礎的解析を行うことを目的とした。最初にA.actinomycetemcomitansの線毛あるいは線毛形成に関わる遺伝子のクローニングを試みた。A.actinomycetemcomitansの線毛を分離しN末端から41番目までのアミノ酸配列を読み取ることができた。このアミノ酸配列に基づいて作成した複数のオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、このN末端からのコード領域をPCR法によって増幅した。その後、A.actinomycetemcomitansの線毛抗原のN末端とC末端をPfuDNAポリメラーゼとpCR-Scriptを用いてクローニングした。A.actinomycetemcomitans線毛DNAはfap(fimbriae associated protein)としたDNAシークエンスおよびアミノ酸配列を決定した結果、fap遺伝子は228bpから成り、76のアミノ酸をコードし、分子量は7970.74であった。現在このfap遺伝子、サイトメガロウィルスの細胞侵入性遺伝子などを組み込んだプラスミドへの組み込みを試みている。
豚タイプ２エンドリークモデルに対するＮＬＥによる予防的瘤内塞栓術の基礎的検討

【背景】我々は、N-butyl 2-cyanoacrylate (NBCA)に無水ethanolとlipiodolを混和した液体(NBCA-lipiodol-ethanol混和液:NLE)を作製し、その基礎的検討を行ってきた。NLEは、重合速度の変化が起こることで、NBCAと異なる非接着性の新たな塞栓物質となり、血液や生理食塩水などの電解質液内に注入すると、小さな油粒状とはならず、大きな1つの塊やペースト状になることを明らかにした。また、このNLEを用いて、豚頸動脈に作製したwide neck動脈瘤に対してバルーンアシスト下での塞栓を行った結果、NLEとバルーンとの接着なく瘤内の良好な貯留・塞栓効果を示すことを明らかにした。今回、豚の腹部大動脈に動脈瘤を作製後、Type IIエンドリークモデルを作製し、NLEを用いた瘤内充填術を行い、その塞栓効果及び安全性を比較評価した。【実験概要】全身麻酔下で、正常豚6頭の腹部大動脈に嚢状瘤を作成し、左腎動脈と腹部大動脈瘤を吻合後、腹部大動脈瘤部にステントグラフトを内挿し、Type IIエンドリークモデルを作製した。2頭はcontrol群として塞栓は施行せず、4頭に対して瘤内に留置したマイクロカテーテルよりNLEを注入し、動脈瘤内の塞栓を施行した。塞栓直後及び3日後に血管造影を施行し、塞栓状態を確認した。その後、豚をと殺し、動脈瘤を摘出し、摘出標本をホルマリン固定後、HE染色を行った。【結果】腹部大動脈瘤内へのNLEの高密度の充填と完全な塞栓が得られ、NLE塞栓群ではすべてType IIエンドリークは消失した。摘出標本では、瘤内の血栓化、動脈瘤血管壁の炎症性変化が認められた。我々は、N-butyl 2-cyanoacrylate(NBCA)に無水エタノールとリピオドールを混和した液体(NBCA・lipiodol・ethanol混和液:NLE)を作製し、その基礎的検討を行ってきた。NLEは、重合速度の変化が起こることで、NBCAと異なる接着性の低い新たな塞栓物質となり、血液や生理食塩水などの電解質液内に注入すると、小さな油粒状とはならず、大きな1つの塊やペースト状となる。豚頸動脈に作製したwide neck動脈瘤に対するバルーンアシスト下でのNLE塞栓の実験で、このNLEはバルーンと接着しないことを明らかにしてきた。今回我々は、豚腹部大動脈にType IIエンドリークモデルを作製し、NLE予防的瘤内充填術の基礎的実験を施行した。実臨床の手技に可能な限り近似させた実験遂行が必要であるため、腹部血管解剖がヒトに類似した大型動物である豚を使用した。さらに本研究は、開腹下に腹部大動脈に動脈瘤を作成するため、全身麻酔下での厳密な呼吸・循環管理が不可欠であり、麻酔器や血管造影設備が整った実験施設である宮崎テクノロジー&教育センター施設を使用し、豚腹部大動脈瘤Type IIエンドリークモデルに対する塞栓術の実験を行った。【実験概要】全身麻酔下で、正常豚5頭の腹部大動脈に嚢状瘤を作成後、大腿動脈より瘤内にマイクロカテーテルを挿入した。次に、腹部大動脈瘤部にステントグラフトを内挿し、Type IIエンドリークモデルを作製した後、マイクロカテーテルよりNLEを注入し、動脈瘤内の塞栓をおこなった。塞栓後血管造影を行い、Type IIエンドリークの有無を確認した。3日後、再度血管造影を行い、塞栓状態を確認後、豚をと殺し、動脈瘤を摘出した。実験は予定通り終了した。また、このNLEを用いて、豚頸動脈のwide neck動脈瘤に対してバルーンアシスト下で塞栓を行い、バルーンとの接着なく瘤内の良好な貯留・塞栓効果を示すことを明らかにした。今回、豚の腹部大動脈にType IIエンドリークモデルを作製し、NLEを用いた瘤内充填術を行い、その塞栓効果及び安全性を比較評価した。その後、2頭はcontrol群とし塞栓は施行せず、4頭に対して瘤内に留置したマイクロカテーテルよりNLEを注入し、動脈瘤内の塞栓をおこなった。動物実験を行い、予定通り考察を行い、学会発表を行った。【背景】

我々は、N-butyl 2-cyanoacrylate (NBCA)に無水ethanolとlipiodolを混和した液体(NBCA-lipiodol-ethanol混和液:NLE)を作製し、その基礎的検討を行ってきた。NLEは、重合速度の変化が起こることで、NBCAと異なる非接着性の新たな塞栓物質となり、血液や生理食塩水などの電解質液内に注入すると、小さな油粒状とはならず、大きな1つの塊やペースト状になることを明らかにした。また、このNLEを用いて、豚頸動脈に作製したwide neck動脈瘤に対してバルーンアシスト下での塞栓を行った結果、NLEとバルーンとの接着なく瘤内の良好な貯留・塞栓効果を示すことを明らかにした。今回、豚の腹部大動脈に動脈瘤を作製後、Type IIエンドリークモデルを作製し、NLEを用いた瘤内充填術を行い、その塞栓効果及び安全性を比較評価した。【実験概要】全身麻酔下で、正常豚6頭の腹部大動脈に嚢状瘤を作成し、左腎動脈と腹部大動脈瘤を吻合後、腹部大動脈瘤部にステントグラフトを内挿し、Type IIエンドリークモデルを作製した。2頭はcontrol群として塞栓は施行せず、4頭に対して瘤内に留置したマイクロカテーテルよりNLEを注入し、動脈瘤内の塞栓を施行した。塞栓直後及び3日後に血管造影を施行し、塞栓状態を確認した。その後、豚をと殺し、動脈瘤を摘出し、摘出標本をホルマリン固定後、HE染色を行った。【結果】腹部大動脈瘤内へのNLEの高密度の充填と完全な塞栓が得られ、NLE塞栓群ではすべてType IIエンドリークは消失した。摘出標本では、瘤内の血栓化、動脈瘤血管壁の炎症性変化が認められた。動物実験を行い、予定通り考察を行い、学会発表を行った。【背景】我々は、N-butyl 2-cyanoacrylate (NBCA)に無水ethanolとlipiodolを混和した液体(NBCA-lipiodol-ethanol混和液:NLE)を作製し、その基礎的検討を行ってきた。
悪性黒色腫におけるメラニン形成能を利用した生化学的指標に関する研究

悪性黒色腫はメラニン形成という分化形質を有しており、これを利用した生化学的指標についての研究が進められてきた。メラニンには黒色のユウメラニンと赤褐色のフェオメラニンの2種がある。これらメラニンの前駆体のうち、5-S-システイニルドーパ(5-S-CD)の尿中排泄量は黒色腫の進展を反映する指標として広く用いられている。一方、ユウメラニン関連インドール化合物6-ヒドロキシ-5-メトキシインドール-2-カルボン酸(6H5MI2C)がメラニン形成の特異的指標になることが示唆されている。我々も過去数年間にわたり、悪性黒色腫におけるメラニン前駆体の臨床的意義に関する研究を進めてきた。まず、血清・尿中5-S-CD及び6H5MI2Cの正常値を求めた。その結果、血清濃度には年齢差がないが、尿中排泄量は高齢者で低値を示す傾向があることを明らかにした。ついで、悪性黒色腫患者について、これら4種の指標の変動を定期的に追跡し、血清5-S-CD値が病勢を最も鋭敏に反映することを明らかにした。症例のなかには、血清5-S-CD値が画像診断に先だって、転移巣の存在を示唆する異常高値(10NMOL/L)を示す例もみられた。一方、5-S-CD値が異常高値であっても、6H5MI2Cは異常高値を示さない症例が多く、後者の臨床的意義は低いことがわかった。また、健常者10名について、2年間にわたり月1回血清5-S-CD値を追跡した結果、異常高値を示す例はなかった。現在は血清5-S-CDに的を絞って、転移の早期発見、化学・免疫療法の効果の判定、予後の推定などにおける臨床的意義について検討を進めている。なお、本研究の過程で、従来の血清5-S-CD定量法の分析時間が長い(80分)という問題点を改良した前処理法を開発した。これにより1検体当たりの分析時間が40分と半減し、検体の処理能力が倍増した。1.正常ヒト血清及び尿中メラニン関連代謝物の定量悪性黒色腫患者の尿中及び血清中5ーSーCDと6H5MI2Cの変動を定期的に追跡する一環として先ず、正常ヒト血清及び尿中5ーSーCDと6H5MI2CをHPLCにより定量した。これらの正常値を健常者(1844才)23名及び色素性病変のない皮膚疾患患者(5384才)10名から求めた。その結果、尿中5ーSーCD及び6H5MI2C値はそれぞれ0.45±0.29、0.39±0.32μmol/day、血清5ーSーCD及び6H5MI2C値は、それぞれ4.3±1.8、3.6±1.8nmol/lであった。これらの値より、正常値の上限を尿、血清中5ーSーCD及び6H5MI2C値に対して、それぞれ1.5μmol/day、10nmol/lとした。血清濃度は年齢差を示さなかったが、尿中排泄量は高齢者で有意に低値を示した。さらに又、血清濃度の方が尿中排泄量よりも変動が少ないことや血清の方が採取が容易であるということから、血清5ーSーCD及び6H5MI2C濃度の方が尿中排泄量よりも優れたマ-カ-になりうると推測された。

2.悪性黒色腫患者血清及び尿中メラニン関連代謝物の定量札幌医大皮膚科に通院・入院中の悪性黒色腫患者約30例について、原発巣あるいは再発巣を切除した前後から34ケ月おきに24時間尿及び血液を採取し、5ーSーCD及び6H5MI2Cを定量した。その結果現在のところ、血清5ーSーCD値の方が尿中5ーSーCD値に比べてより早期に鋭敏に上昇する傾向がみられた。又、血清及び尿中6H5MI2C値は、顕著な変動を示さないことがわかった。今後も引き続き、これらマ-カ-について化学療法に対する応答を比較する。1.悪性黒色腫患者血清及び尿中メラニン関連代謝物の定量5ーSーシステイニルド-パ(5ーSーCD)及び6ーヒドロキシー5ーメトキシインド-ルー2ーカルボン酸(6H5MI2C)はメラニン前駆体あるいはその代謝物であり、悪性黒色腫組織で産生される。従って、これらメラニン関連代謝物の血中あるいは尿中濃度を測定することにより、黒色腫の病態を把握することが可能と考えられる。札幌医科大学皮膚科に通院・入院中の悪性黒色腫患者約30例について、原発巣あるいは再発巣を切除した前後から24カ月おきに血清及び24時間尿を採取し、5ーSーCD及び6H5MI2CをHPLCにより定量した。その結果、転移巣が確認されていない患者では血中・尿中の両化合物ともに、正常値とほぼ同値を示した。一方、転移後、最終的には死に至った8例において、5ーSーCD値が再発・転移時に有意に高値を示し、このうち7例では、血清5ーSーCDの方が尿中5ーSーCDに比較して病勢をより鋭敏に反映した。また、5例において、5ーSーCD値が転移巣の臨床的な検出に先立って上昇する傾向がみられた。血清及び尿中の6H5MI2Cは末期患者を除き全て正常範囲にあり、病勢を反映しなかった。以上の結果、検体採取の容易さなどと考えあわせると、血清5ーSーCDが黒色腫の進展度の最も優れた生化学的指標であることが示唆された。今後は、血清5ーSーCDを中心に、黒色腫の進展度、予後推定、治療効果判定などにおける臨床的意義について検討していきたい。さらに、将来、臨床検査項目として確立するため、分析時間の短縮など、血清5ーSーCD定量法の改良を目指す。悪性黒色腫はメラニン形成という分化形質を有しており、これを利用した生化学的指標についての研究が進められてきた。5-S-システイニルドーパ(5-S-CD)及び6-ヒドロキシ-5-メトキシインドール-2-カルボン酸(6H5M12C)は、メラニン前駆体あるいはその代謝物であり、黒色腫組織で産生される。従って、これらのメラニン関連代謝物の血中濃度を測定することにより、黒色腫の病態を把握することが可能と考えられる。1.悪性黒色腫患者の血清・尿中メラニン関連代謝物の定量:悪性黒色腫患者(札幌医大)における、血清・尿中5-S-CD及び6H5M12Cの変動を定期的に追跡し、血清5-S-CDが病勢を最も鋭敏に反映することを明らかにした。症例のなかには画像診断による確定診断に先だって、転移巣の存在を示唆する異常高値(10nmol/L)を示す例もみられた。2.HPLCによる血清5-S-CD定量法の改良:従来の血清5-S-CD定量法における、HPLC分析時間が長い(80分)という問題点を改良した前処理法を開発した。これにより1検体当たりの分析時間が40分と半滅し、検体の処理能力が倍増した。3.悪性黒色腫のマウス実験系の開発:血漿20μL中の5-S-CDを定量する法を確立し、5-S-CD値が黒色腫の増殖をよく反映することを確認した。現在、本実験系を用いて、化学療法剤の効果と5-S-CD値との相関を調べている。
「ポスト国民国家」時代の主体性―オーストラリア文学におけるその可能性

近代国民国家が成立してゆく過程では、「国民文学」が建国の神話とナショナル・アイデンティティを構築するための機能を果たしてきた。平和な植民の物語が生産され消費されてきた豪州でも、1990年代になって先住民と非先住民の和解問題が社会的文脈で重要課題となり、「ポスト国民国家的主体性」を模索する文学が誕生している。本研究では、主流社会と交渉・折衝しながら主体構築を目指す先住民文学と、従来の「国民文学」を越えて、非先住民オーストラリア人の所属意識やナショナル・アイデンティティへの再考を促す作品を考察し、現代豪州文学が「ポスト国民国家」時代の文学的地平を拓き、新たな主体性を構築している様を明らかにした。本研究の目的は、「ポスト国民国家」時代の主体性の問題と可能性を、先住民と非先住民系オーストラリア人の交渉と和解のプロセスにおいて生成されるオーストラリア文学に焦点を当てながら考察することである。昨年は、パースとアデレードの文学祭に参加し、キャンベラの先住民研究機関で資料を収集しながら、先住民作家の作品を中心に考察を進めた。本年度は、昨年度の研究成果を2本の論文にまとめ出版した。そのうち、一本は日本英文学会の『英文学研究』に査読付き論文として掲載され反響を得た。さらに、11月にオーストラリア・ニュージーランド文学会において、先住民作家Jeanine Leaneを招聘し、「複数の文化・複数の歴史を書く:現代オーストラリア作家との対話」と題したシンポジウムをコーディネートするとともに、パネリストとして口頭発表を行った。本シンポジウムでは、タスマニアの先住民排除の物語を描いたRohan Wilsonも合わせて招聘し、オーストラリアの先住民作家と非先住民作家のパネリストを交えて、現代オーストラリア文学の動向と新たな可能性を日本へ紹介するきわめて重要な機会となった。また本年は、非先住民系作家の作品の考察を予定しており、セルビア系移民作家、B.Wongarを中心にその分析に着手した。2月下旬に渡濠し、資料の収集を行うと同時に、作家(Wongar)本人へのインタビューを行った。Wongarの作品は、アメリカやヨーロッパで出版され、世界的な評価を得ているのも関わらず、先住民作家としてアイデンティティを偽ったとして、オーストラリアではほとんど評価されることがなかった。しかし、今回の取材で、セルビアにルーツを持ちながら、先住民文化を深く理解し、作品を書いたWongarという作家が、本研究のテーマである「ポスト国民国家」の主体性を考察するうえで重要な手がかりを与える作家であることを確信した。本研究は、「ポスト国民国家」時代の主体性の在り方をオーストラリア文学の考察を通して探ることを目的としている。初年度から二年目にかけては、先住民文学を中心に分析し、Alexis WrightやJeanine Leaneといった作家の文学作品が、入植者の物語や文化と交渉・折衝しながら、先住民的歴史認識を前景化することで国民国家の物語を脱構築しようとしている様を考察し、論文にまとめた。最終年度としての本年度は、先の二年間の研究成果を踏まえ、非先住民系作家B. Wongarの文学作品の分析を行った。B. Wongarは、セルビア出身の移民作家であるが、先住民的世界観に基づいた作品を発表してきた。昨年、渡豪し、本作家のインタビューを行い、資料を収集したが、本年度はそれらの分析を行った。その結果、1950年代の英国のオーストラリアでの核実験と、現在まで続くウラン採掘が先住民文化と社会にもたらした影響をテーマに描き続けた本作家の作品群は、母国セルビアでの戦争の経験と先住民への核被害の経験の連累の表象に成功し、国家的戦略の中で展開される戦争や核政策に対する批判を通して、ポスト国民国家的主体を構築しようとしていること明らかにした。これらの分析と考察を、学会での口頭発表と論文にまとめた。本学会発表と論文は、世界的な文化のグローバル化の潮流にあって、ポスト国民国家的文学の新たな在り方を考察したものとして意義がある。また、アメリカ、ヨーロッパで広く紹介され、世界的評価を受けたにも関わらず、核という国家的政策をテーマとして扱ったため、オーストラリアでは認知されず、日本にも紹介されてこなかったWongarという作家の再評価としての重要性をも持つ。本研究は、先住民と非先住民系オーストラリア人の和解の過程において生成された文学作品に焦点をあて、従来の「国家」や「国民」という概念に根差した主体性のあり方を問う文学的実践を考察することを目的としている。本年度前半は、一次・二次資料の収集を国内にて行い、先行研究の整理を行う一方で、選定した作品の読解分析を進めた。先住民系作家Kim Sctott、アングロ・ケルテック系作家Kate GranvillやRichard Flanagan、セルビア系移民作家B.Wongerなどの作品分析を通して明らかになったことは、これらの作品が共通して国家の歴史的過去の語り直しを行っており、この文学的歴史再考の実践がオーストラリアの主体性の再考と再構築を促しているということである。

このオーストラリアの主体とは、従来の"白人性"を中心にした西洋的な主体ではなく、オーストラリアという大陸、土地という概念に根差したものである。Sctottは、入植初期の歴史を先住民的な視点から語り直し、国家や国民という概念の問い直しを行っている。一方、GranvillやFlanaganは、流刑植民者の歴史を描くことで、移民による大陸への所属意識の問題に取り組んでいる。Wongerは、英国政府による先住民の土地での核実験とオーストラリア政府によるウラン鉱山の開発について描き、先住民的土地への所属と西洋的土地の搾取の問題を前景化し国家主体の問題に挑んでいる。本年度後半には、パースとアデレードで行われたWriter's Festivalに参加し、作家の講演等に参加した。また、オーストラリアの大学や図書館で二週間に渡り新たな資料の収集にあたり、次年度の研究のための有益な資料を確保できた。現地調査では、最新のオーストラリア文学の動向を掴むことができ、実際に作家に話を聞くことによって、文学作品の理解を深めることが可能となった。昨年遅れていた1年目の研究の成果を2本の論文として出版できたのは、研究全体を進展させることにつながった。しかし、今年度の達成目標としていた、2年目の研究成果を論文にまとめることが出来なかった。分析対象としていた作家へのインタビューを行う時期が年末にずれ込み、論文として出版するには至らなかったのである。しかしながら、オーストラリアの調査旅行では、実際に作家に会い調査を行うことで、世界的にも非常に貴重な資料を手に入れることができたのは大きな前進であった。国内外の研究者と共同し、本研究のテーマにかかわるシンポジウムを日本で開催することができたことも、当初の計画を遂行できたということで、ひとつの達成であったと言える。実施計画よりは全体的に、若干遅れ気味の傾向にはあるが、予想を上回る貴重な資料を入手し、今後の研究に拍車をかける結果となった。次なる段階として、本年度の成果を来年度に口頭発表や論文として形にしてゆくことが望まれる。資料の収集と分析はおおむね順調に進展している。しかし、今年度の分析を論文にまとめ出版する予定であったが、叶わなかった。現在鋭意執筆中である。隔年で開催されるWriter's Festivalが2月から3月にかけて開催されたため、フェイールドワークと資料収集のための渡豪の時期が遅れた。そのため、必要な資料の収集や作家へのインタビューの実施が遅れ、論文の執筆を次年度に繰り越す必要が生じたことが論文執筆の遅れの理由である。今年度の研究調査の結果を、6月のオーストラリア学会で口頭発表する。その後、学会でのフィードバックを組み込む形で、その論考を9月締切(来年度3月刊行予定)の学術誌『オーストラリア研究』へ投稿する。また、再度、9月に渡濠し、作家本人(B.Wongar)の協力を得て、調査を進める。その結果を、書籍という形にまとめる準備をはじめる。
ガンマ線バーストとその母銀河から探る遠方宇宙の星・銀河形成

今年度、私は高い金属量をもつ銀河でのGRB発生とGRBの起源は低金属星とするシナリオの整合性を検証した。この研究テーマについては作年度末にMonthly Notice of Royal Astronomical Societyに投稿した論文が今年度に受理・出版され、この論文の中で私はGRB母銀河内部の非一様性を考慮しなければ母銀河の観測的性質とGRB起源星の性質を結びつけることはできないことを指摘した。GRB母銀河内部の非一様性の議論には現在の観測の空間分解能は不十分であり、これを補うには高解像度流体シミュレーションによる銀河モデルを使うことが有用である。私は適合細分化格子法(AMR)による銀河形成シミュレーションに取り組み、GRB母銀河のような激しい星生成を行っている銀河の内部構造を説明できる理論モデルを現在作成中である。私はすばる望遠鏡によるGRB100418Aの追観測データを用いた研究にも取り組んだ。GRB100418Aは比較的低赤方偏移(0.624)で発生したGRBでありながら、バースト後25.6日のすばるFOCASを用いた撮像および分光観測で付随する超新星が一切発見されなかった。超新星が観測可能な程度の低赤方偏移でGRBが発生した場合、その多くが明るいType Ic超新星を伴っており、このことはGRBが大質量星の重力崩壊によって引き起こされることを示す重要な証拠となっている。明るい超新星の不在が観測的に確かめられたGRBはGRB100418Aが3例目であり、これらのバーストの正体について結論を出すにはサンプル数が足りていないが、貴重な観測例を増やすことができたといえる。また、GRB100418Aは高金属な銀河で発生したGRBとしても興味深い。すばるFOCASによる分光観測で得られた輝線強度をしらべた結果、GRB100418Aの母銀河は太陽と同程度以上の金属量を持っていることがわかった。これまでに超新星の不在が確認されている3つのGRBのうち2つが高金属な銀河で起きており、サンプル数は非常に少ないものの、超新星を伴わないGRBの発生メカニズムが通常のGRBとは逆に高い金属量と関連している可能性を示唆する重要な観測結果がえられた。私はこの研究において付随する超新星への制限の計算を担当したほか、筆頭著者として議論を整理し論文としてまとめた。この研究成果をまとめた論文は現在Publication of Astronomical Society of Japanに投稿中である(投稿日は4/2)。本研究課題の目的であるガンマ線バースト(GRB)頻度史のモデルの考案にむけ、GRBを引き起こす起源天体の金属量に観測に基づいた制限を与えるための研究に取り組んだ。GRBは大質量星の重力崩壊であると考えられているが、大質量星の重力崩壊が常にGRBを引き起こすわけではなく、GRB発生の条件は分かっていない。この研究ではシミュレーションによって低赤方偏移^-1程度の銀河の性質を再現し、金属量ごとの星生成がどのような銀河で行われているか調べた。結果、一般の重力崩壊型超新星(以下、SN)の発生頻度は金属量と関係なく星生成をトレースする一方でGRBの発生頻度は太陽の金属量の10%程度以下の低金属な星生成をトレースすると考えれば、観測されているSNやGRBの母銀河の光度分布を再現できることがわかった。この研究はGRB母銀河の光度分布の観測と数値モデルを定量的に比較した初めての研究であり、GRBの金属量依存性を定量的に理解する上で重要な意味をもつ。以上の成果は国内外の複数の研究会において発表され、査読論文としてThe Astrophysical Journalより出版されている。また、この研究成果は2009年度以前にあげられた他の成果とともに、学位論文として京都大学理学研究科に提出された。また、2010年に金属量の大きいGRB母銀河の観測例が多数報告されたことをうけて、銀河の星質量・星生成率や金属量に関する経験則に基づいてGRB母銀河の金属量分布の予言を行った。全体で見た母銀河の金属量とGRB起源星の金属量が必ずしも一致しない事を考慮すれば、2010年に入って複数見つかった高い金属量をもつGRB母銀河の観測と従来提唱されてきたGRBの低金属星起源モデルが矛盾無く説明できることを示した。この成果は学術誌Monthly Notice of Royal Astronomical Society Lettersに投稿中である。

超新星が観測可能な程度の低赤方偏移でGRBが発生した場合、その多くが明るいType Ic超新星を伴っており、このことはGRBが大質量星の重力崩壊によって引き起こされることを示す重要な証拠となっている。明るい超新星の不在が観測的に確かめられたGRBはGRB100418Aが3例目であり、これらのバーストの正体について結論を出すにはサンプル数が足りていないが、貴重な観測例を増やすことができたといえる。また、GRB100418Aは高金属な銀河で発生したGRBとしても興味深い。すばるFOCASによる分光観測で得られた輝線強度をしらべた結果、GRB100418Aの母銀河は太陽と同程度以上の金属量を持っていることがわかった。これまでに超新星の不在が確認されている3つのGRBのうち2つが高金属な銀河で起きており、サンプル数は非常に少ないものの、超新星を伴わないGRBの発生メカニズムが通常のGRBとは逆に高い金属量と関連している可能性を示唆する重要な観測結果がえられた。私はこの研究において付随する超新星への制限の計算を担当したほか、筆頭著者として議論を整理し論文としてまとめた。この研究成果をまとめた論文は現在Publication of Astronomical Society of Japanに投稿中である(投稿日は4/2)。
聴覚受容に重要な働きをもつ感覚糸構成分子の代謝動態に関する研究

内耳有毛細胞の機械電気変換に中心的な役割を果たすtip link構造の障害からの再生過程を検証し、ほ乳類においても鳥類と同様にtip linkが自然に再生する可能性を示した。また、この再生能は内有毛細胞と外有毛細胞とで差があることを示した。さらにtip linkが成熟する時期に一致して外有毛細胞の頂側面形態が特徴的な変化を生じることを示した。有毛細胞頂側面には感覚受容のために特殊化した微絨毛である不動毛が存在し,その頂部にある機械電気変換(MET)複合体がMETの中心的役割を果たしている.MET複合体には感覚糸(tip link)と呼ばれる特有のフィラメント構造が存在し,不動毛の偏位により発生する張力をイオンチャネルに伝達することでMETを仲介している,鳥類ではtip linkが障害された後に自然再生することが知られているが,ほ乳類においてtip linkが再生しうるかどうかについては未だ明らかでない,本研究では蝸牛感覚上皮の器官培養システムを用いて,有毛細胞におけるtip linkの再生の可能性を検証した.Ca^<2+>キレーターによりtip linkを切断した後にCa^<2+>を再添加して48時間培養し,SEMを用いて観察したところ,蝸牛内有毛細胞においてtip linkの再生を示す所見が認められた.Tip linkの再生は外有毛細胞では確認できず,細胞種によってtip link再生能に差があると推測された.また,出生後早期の有毛細胞の形態を経時的に観察したところ,外有毛細胞の頂側面はtip linkが成熟する時期である生後1週間に特徴的な形態変化を示すことが判明した.tip link構造の成熟は不動毛内のシグナルを介して細胞頂側面に伝達され,細胞骨格の再構築を促す可能性が示唆された.今回確立された器官培養モデルを用いてtip link構成分子であるcadherin23およびprotocadherin15の挙動を観察することで,ほ乳類におけるtip link再生のメカニズムが解明されると期待される.さらに同モデルをより発生早期の蝸牛に適応することで,これらの分子が細胞頂側面の形態形成の制御に与える影響について明らかにできると期待される.本研究では,感覚糸(tip link)の破綻ならびに再生過程がほ乳類においても成立するかどうかにつき検証した.次いでtip linkならびに同様の分子構造をもつと考えられているdevelopmental linkが,細胞頂側面の形態形成に関与する可能性についても検討した.まず,蝸牛感覚上皮の器官培養システムを用いて、有毛細胞におけるtip linkの再生の可能性を検証した.培養したラット蝸牛感覚上皮をCa^<2+>キレーターで処理してtip linkを切断した後に,Ca^<2+>を再添加して18時間培養し走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ,蝸牛内有毛細胞においてtip linkの再生を示す所見が認められた.tip linkの再生は外有毛細胞では確認できず,細胞腫によってtip linkの再生能に差があると推測された.また,出生後早期の蝸牛感覚上皮細胞の形態を経時的に観察すると,外有毛細胞の頂側面はtip linkが成熟する時期である生後1週間に特徴的な形態変化を示すことが判明した.感覚糸構造の成熟が不動毛経由のシグナルを介して細胞小側面に伝達され,細胞骨格の再構築を促す可能性が示唆された.tip link障害が関与すると考えられる感音難聴において,内有毛細胞に比べて外有毛細胞の細胞死が多く認められることは良く知られている.今回の結果は,このような障害からの回復過程にtip linkの再生能の差異が関与している可能性が示唆された点で意義深い.さらに,tip linkの障害により細胞形態維持機構が破綻し,これが細胞死を引き起こす可能性も示された.今後,内有毛細胞と外有毛細胞におけるtip link関連分子の違いを解明することで,tip link再生を利用した新たな治療につながると期待される.
イオントラップ中での光解離反応を利用したタンパク質と水分子の相互作用

生体分子中の水分子は構造や機能に大きな役割を果たしている。気相中に水和した生体分子を取り出し、分光学的な研究を行うことで水分子の分子レベルにおける情報を得ることが可能となる。我々は水分子の数を制御した生体分子を作製し、波長選別した光をこの分子に照射し、その解離物から水分子の分光学的な情報を得ることを試みている。これらの研究結果は水分子の結合エネルギーや配位構造を推定するのに役立つと考えている。本年度は装置の更なる性能を向上させ、以下の結果を得た。1.イオントラップ質量分析計とマルチターン飛行時間型質量分析計を結合することが可能となり、イオントラップ/マルチターン飛行時間型質量分析計の装置が完成した。マルチターン飛行時間型質量分析計はイオンのパケットの大きさが質量分解能に大きく影響することがすでに報告されており、イオントラップとマルチターン飛行時間型質量分析計を結合した場合、イオントラップ中でのイオンの空間的広がりが質量分解能を悪化させるのではないかと懸念された。しかしながら、イオントラップとマルチターン飛行時間型質量分析計を結合した場合でも質量分解能が大きく悪化しないという実験的結果が得られた。これにより、生体高分子などの高質量の分析が可能となる。2.イオントラップ中での光解離反応を観測した報告例は少ないため、装置の性能の検証をかねて、有機化合物の光解離反応を行った。中性状態で532nmに光吸収を持つローダミン6Gとビフェニレンを試料とした。これらのイオンに532nmのレーザー光を照射した結果、水素脱離などの光解離反応物を観測した。高分解能な質量分析計を用いることで複雑な解離物の質量スペクトルが得られた。気相中での水和した生体分子イオンの光照射による反応を研究するためにRFイオントラップ/飛行時間型質量分析装置(IT/TOF-MS)を開発した。本装置の特徴を以下に述べる。・イオン分子反応の速度定数や熱力学量を測定するためのRFイオントラップを作製した。イオントラップのバッファガスをパルス化(約1ms)することで、トラップ中のイオン分子反応においてバッファガスの影響をなくすことが可能となった。金属イオンと溶媒分子のイオン分子反応における平衡観測から熱力学量の測定を行った。・高速粒子衝突イオン源(FABやSIMS)から生成した高速イオンをRFトラップに打ち込む技術を確立した。静電減速レンズを使用することでイオントラップに打ち込む効率を向上させ、強度の弱いイオンを効率よくトラップすることに成功した。・イオントラップとリニア飛行時間型質量分析器(TOF)との組み合わせる手法としてポテンシャルリフト法を開発した。これにより、生体分子などの質量数の大きなイオンを効率よくTOFで検出することが可能となる。本装置の性能を検証するためにAg+-ピロール(1:2)錯体とアンモニア分子との配位子交換反応を観測した。この反応における平衡定数から、Ag+-アンモニアの結合エネルギーを求め、量子化学計算と比較した結果、よい一致を得た。この結果より今回開発したイオントラップ/飛行時間型質量分析装置に熱力学量の測定に十分な性能を有していることが検証された。現時点では未報告であるAg+-ピロール(1:2)錯体の結合エネルギーの測定にも成功した。今後の展開として、生体分子をイオン化するイオン源(ESI型イオン源)を作製し、本装置と組み合わせる。大阪大学で開発したマルチターン飛行時間型質量分析計とイオントラップと結合し、質量分解能の向上を図り、水和生体分子の光解離反応を研究する。
胎児期環境による負のエピジェノム刻印を解除するための栄養戦略の基盤研究

AT2Rプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子を持つプラスミドを構築した後、段階的にメチル化を誘導し、Hek293t細胞へトランスフェクションした。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。DNAがメチル化されるほどプロモーター活性は減少しており、AT2Rプロモーター領域のメチル化は遺伝子発現を負に制御する可能性を見出した。胎児期低タンパク質食暴露された仔ラットを用い、腎臓中のAT2Rプロモーター領域のDNAメチル化状態を評価したところ、TATAbox近傍のCpG部位がメチル化されており、このメチル化状態とタンパク質発現量が負の相関であることが明らかとなった。妊娠期の母獣SHRSPラットに低タンパク質食(9%カゼイン食:LP群)または通常食(20%カゼイン食:CN群)を給餌し、出生後28日目の授乳期雄性仔ラットの腎臓を回収した。この腎臓を、網羅的なDNAメチル化状態解析(メチローム)と遺伝子発現解析(トランスクリプトーム)に供した。その結果、メチローム解析では、解析対象となった約3800万CpG部位のうち、25%以上のメチル化変動部位だったのは約760万CpG部位で、そのうちUpstreamにメチル化変動部位をもつ遺伝子数は1712遺伝子だった。一方、トランスクリプトーム解析では、解析対象となった約3万プローブのうち、FDR 0.05未満は323プローブ、重複を削除した遺伝子数は200遺伝子だった。メチローム解析とトランスクリプトーム解析に共通して変動した遺伝子は155遺伝子で、IPAにより機能解析を行ったところ、アルドステロンシグナリングやeNOSシグナリングといった経路が変動していた。ほぼ予定通りに推移している。それに加えて、発現量が低くてmRNAの定量ができなかったAT2Rに関してはデジタルPCRによるmRNA解析を行い、成果を得ることができている。メチローム解析も適切に行えている。出生後の食事条件を変えての検討についても、サンプルの取得は出来ており、最終年度に解析を終える予定となっている。妊娠中低タンパク質曝露後に出生後のタンパク質レベルを3段階に変化させたサンプルを取得しており、メチローム解析とiTRAQ法によるプロテオーム解析を実施中で、これらのデータ間またはトランスクリプトーム解析との比較を行っていく予定である。現在本計画の2報目の論文を投稿できる段階になっているが、残りの部分についても論文化を行う。今年度は、胎児期低タンパク質栄養環境によりDNAのメチル化状態と遺伝子発現の両方が顕著に変化する遺伝子が生後どのように変化するかを追跡する実験の(1)動物飼育とサンプリング、(2)トランスクリプトーム解析を実施した。(1)動物飼育とサンプリング:実験動物は、日本SLC株式会社より購入した9週齢の雌雄のSHRSP/Izm(以下SHRSP)を用いた。動物実験は、東京大学農学部動物実験委員会に申請を行い、承認を得た後に行った。妊娠期の母獣SHRSPラットに低タンパク質食(9%カゼイン食)または通常食(20%カゼイン食)を給餌し、出生後は各群ともに通常食と水道水で飼育し、出生後24日目に離乳させた。解析サンプルとして、出生後5日目(D5)、10日目(D10)の授乳期の雄性仔ラット、出生後28日目(D28)の離乳期の雄性仔ラット、出生後12週間目(W12)の成獣期の雄性仔ラットの腎臓をそれぞれ回収した。胎児期に低タンパク質食暴露された仔ラットは、D28とW12の終体重が増加傾向であり、W12の両腎臓重量が有意に増加していた。(2)トランスクリプトーム解析:D5、D10、D28は全腎臓組織、W12は皮質と髄質に切り分けた組織を用い、Trizol法によりはRNAを抽出した後、DNAマイクロアレイ解析(Rat Genome 230 2.0 Array、Affymetrix)を行った。データは、統計解析ツールRを用いてRAMによるノーマライズ後にRankProductsで2群間比較解析を行い、FDR<0.1と判定されたプローブセットをIPAにて解析した。上位変動パスウェイがD5とD10ではともに動脈硬化シグナリングであったのに対し、D28では線維芽細胞中IL-17Aシグナリングや上皮細胞中アルドステロンシグナリングと変化していることが明らかとなった。動物飼育とサンプリングは、飼育条件やサンプリング方法を検討するための予備実験を経た後に本飼育を開始したことで、解析するのに適切な動物匹数を十分確保することが出来た。また、トランスクリプトーム解析は、すでにデータを入手しており、データ解析を進行中である。またこれらの成果は、第72回日本栄養・食糧学会大会で口頭発表及びポスター発表を行うことが決定している。妊娠期の母獣SHRSP

ラットに低タンパク質食(9%カゼイン食:LP群)または通常食(20%カゼイン食:CN群)を給餌し、出生後28日目の授乳期雄性仔ラットの腎臓を回収した。この腎臓を、網羅的なDNAメチル化状態解析(メチローム)と遺伝子発現解析(トランスクリプトーム)に供した。その結果、メチローム解析では、解析対象となった約3800万CpG部位のうち、25%以上のメチル化変動部位だったのは約760万CpG部位で、そのうちUpstreamにメチル化変動部位をもつ遺伝子数は1712遺伝子だった。一方、トランスクリプトーム解析では、解析対象となった約3万プローブのうち、FDR 0.05未満は323プローブ、重複を削除した遺伝子数は200遺伝子だった。メチローム解析とトランスクリプトーム解析に共通して変動した遺伝子は155遺伝子で、IPAにより機能解析を行ったところ、アルドステロンシグナリングやeNOSシグナリングといった経路が変動していた。ほぼ予定通りに推移している。それに加えて、発現量が低くてmRNAの定量ができなかったAT2Rに関してはデジタルPCRによるmRNA解析を行い、成果を得ることができている。メチローム解析も適切に行えている。出生後の食事条件を変えての検討についても、サンプルの取得は出来ており、最終年度に解析を終える予定となっている。今後は、平成29年度に回収した腎臓サンプルを用い、メチローム解析とプロテオーム解析に着手する予定である。メチローム解析は、抽出DNAをバイサルファイト処理後、TruSeq DNA Methylation Kit(Illumina)でサンプル調整やインデックス付加によるラベリングし、DNAシークエンサー(HiSeq2500, Illumina)を用い、全ゲノムシークエンス解析を行う。プロテオーム解析は、iTRAQ法によって行う。その後、各オミクス解析により入手したデータを比較解析し、顕著にDNAのメチル化状態と遺伝子発現、タンパク質発現が変動している可能性の高い遺伝子を絞り込む。また、胎児期低タンパク質栄養環境によりDNAのメチル化状態と遺伝子発現の両方が著しく変化する遺伝子が生後のタンパク質摂取量の差によりどのように変化するかを検討するための実験系の動物飼育とサンプリング、トランスクリプトーム解析にも着手する。動物飼育は、妊娠期の母獣SHRSPラットに低タンパク質食(9%カゼイン食)または通常食(20%カゼイン食)を給餌し、出生後授乳期は各群ともに通常食と水道水で飼育し、出生後24日目に離乳させる。雄性の仔ラットのみ、4週齢から7週齢までの3週間、低タンパク質食(9%カゼイン食)、通常食(20%カゼイン食)、高タンパク質食(40%カゼイン食)を給餌する群に分ける。7週齢に解剖し、解析サンプルとして腎臓を回収する。妊娠中低タンパク質曝露後に出生後のタンパク質レベルを3段階に変化させたサンプルを取得しており、メチローム解析とiTRAQ法によるプロテオーム解析を実施中で、これらのデータ間またはトランスクリプトーム解析との比較を行っていく予定である。現在本計画の2報目の論文を投稿できる段階になっているが、残りの部分についても論文化を行う。