hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
未分化性腺の形成の分子機構と性分化との関連

研究代表者はステロイドホルモン合成酵素群の共通転写因子Ad4BPI/SF-1の詳細な発現解析によって性腺原基(未分化性腺)と副腎皮質原基が共に由来する共通原基を見いだした。又、性腺原基が精巣、卵巣へ分化する際にAd4BP/SF-1の発現に精巣で高く、卵巣で低い性的二型性が生じることを見いだした。このように性腺原基は精巣、卵巣へと分化して著しい性差を生じることは明白であるが、共通原基から生じるもう一方の副腎皮質の性差については、あまり研究がなされていない。代表者は本年度、成体マウス副腎のステロイドホルモン合成酵素群の発現に明瞭な性差が存在することを見いだした。この性差はメス特異的X zoneに発現する酵素群としない群に二大別され、X zoneではそれら酵素群の発現プロファイルからプロゲステロン産生が示唆された。またX zoneと網状層の境界領域にステロイドホルモンを産生しない層の存在が示唆された。更にX zone以外でも副腎皮質束状層、網状層、球状層、及び副腎髄質に散在する皮質細胞と、副腎皮質の全ての層で、これらステロイドホルモン合成酵素群の発現プロファイルに性差を認めた。これらの性差は性的に未熟な時期ではあまりはっきりしないが、性成熟につれて差が明瞭になったことから、エストロゲン、アンドロゲン等の性ホルモンによって、これら酵素群の発現が制御されていることが示唆された。そこでエストロゲン合成酵素であるアロマターゼの欠損マウスを予備解析し、メス型副腎は大枠においてエストロゲンの作用によって形成されることを示唆する結果を得たが、個々の酵素の発現プロファイルからエストロゲン以外の要因の関与も推察された。代表者はステロイドホルモン合成酵素の共通転写因子Ad4BP/SF-1の発現解析によって、Ad4BP/SF-1が性腺の性分化直後より精巣で高く卵巣で低い性的2型性を示すこと、セルトリ細胞でも発現して雄の性分化に必須のMIS遺伝子の発現制御に関与することを見出し、Ad4BP/SF-1が性腺の性分化に重要な因子であることを明らかにした。そこで未分化性腺の形成および性分化時にAd4BP/SF-1の発現量の調節候補因子を含む性分化関連因子群の相互関係を明らかにするために、性腺形成に必須の転写因子Wt1欠損マウスの解析に着手した。Wt1欠損マウスは、Wt1遺伝子ヘテロにおいても生殖能力が著しく低いことが明らかになり、遺伝的バックグラウンドをC57BL/6Nへの変換を試みている。また、Sry遺伝子をもたない遺伝子型がメスのWt1+/-マウスにおいて膣口をもたないマウスが存在した。これらのことはWt1ヘテロに起因する発現の量的効果が性分化、性成熟に影響することを示唆した。又、未分化性腺の形成前期にはWt1の発現が副腎前駆領域にも認められた。このとき、オス親のみの遺伝子が子マウスで発現されるPref-1の発現領域はAd4BP/SF-1の発現領域を含んでより広く、Wt1のみとの共発現細胞を認めた。又、性分化後のオス性腺に発現するステロイド合成酵素CYP11AとStARの転写活性が、培養細胞においてAd4BP/SF-1とTORC2により協調的に発現上昇すると共に、protein kinase阻害剤であるスタウロスポリンによってCYP11AとStAR mRNAの著しい発現上昇が認められた。スタウロスポリンはマウス個体に投与すると血糖値の上昇が認められた。又、メス性腺に特異的なaromataseの発現を新たな抗体を作成して調べている他、未分化性腺の器官培養を試みている。
断面画像情報からの,コンピュータによるステレオ像再構成システムの開発

再構成の第1段階として、顕微鏡連続切片写真上で各構造の輪郭線と基準点を、パーソナルコンピュータのディジタイザから入力した。輪郭線の繋がりの関係や分岐・合流の関係も指示されている。データをワークステーションに転送し、第2段階としてもとの輪郭面を再構成した。再構成は、上下に隣り合って対応する輪郭線の輪郭点を上下に結ぶ微小三角形パッチにより自動的の行われ、分岐・合流部も自動的に処理される。再構成を終えた三角形のデータは、第3段階として表示のための計算処理をうける。この段階では、仮想的な光源からの光に対して、多重輪郭面の光の透過率や、距離による光の減衰も導入され、視線のなす角の違いによる輝度の違いも考慮されているために、存在感の極めて明確な着色半透明ステレオ像としての表示が可能である。従って、表示された再構成像は、美しいだけではなく、全体の形態とともに、内部の諸構造の相互位置関係が一目で把握しやすいことが最大の特微である。入力用断面図上で、基本的ではない無用の複雑さをもつ構造(うねった腹膜など)に関しては、基本概念だけを示す模式的な断面図を描いて再構成を試みた。パーソナルコンピュータ上で、三次元カーソルプログラムによって作製した基本概念の折れ線像を立体視し、検討修正の後、各断面での折れ線データの座標値をグラフ用紙に記した点を手掛かりとして模式的断面図を描いた。こうして得られた再構成ステレオ像は明快に基本概念を具体化しており、解剖学の初心者に対する教育に最適の像であった。マウス胎仔に実験的に誘発された悩の異常の再構成像を正常像と比較し、内部形態の異常・いくつかの異常の関係など、研究結果の分かりやすい表示法としての優秀性も証明された、手軽に使えるパーソナルコンピュータと高性能のワークステーションとに作業を分坦させるこの再構成システムは、応用範囲の広い優れたものといえる。1.パ-ソナル・コンピュ-タ(以下パソコンと略す)からの断面画像情報の入力に関しては,基本的なアルゴリズムが確立された.これは,輪郭線をデジタイザのカ-ソルで連続的にたどれば,指定通りの間隔の輪郭点の並びとして自動的に分割される方式である.なお,輪郭線の曲率によって最適な間隔を選ぶことができる.現在,実際にプログラムを動かすなかで,一層洗練されたものにすべく改良を重ねつつ,実用になっている.2.パソコンから入力したデ-タをミニコンピュ-タ(以下ミニコン)に転送し,断面どうしの輪郭点を結ぶ微小三角形で輪郭面を再構成させる手法も確立された.このプログラムはパソコンにも移植され,分割した小量のデ-タに関しては,再構成された輪郭面の妥当性をパソコン上で検討し,必要に応じてデ-タの修正を加えることが可能となったので,医学部・工学部間の連携作業の能率は,飛躍的に向上した.3.ミニコン上で,再構成像を滑らかな着色半透明物体として表示させる手法も確立された.この方法で得られる再構成像を,立体視用のステレオペアとして表示させた像は,人体の三次元的構造を初心者にも分かりやすい形で提示してくれるので,解剖学教育に極めて効果的であることが判明した.現在ミニコンでの計算結果をパソコンに送って,パソコンのグラフィックディスプレイ上で表示可能とするためのプログラム移植作業が進行中である.

4.実際の輪郭線情報では不必要な複雑さをもつ場合(例えば腹膜のうねりなど)に関しては,パソコン上で描いた簡略化ワイア-フレ-ムステレオ像で三次元的な妥当性を検討・確認(必要に応じて修正)した後に,この像のデ-タを基に模式的断面図を描いて入力するシステムが開発され,その有効性が確認された.1パ-ソナルコンピュ-タによる輪郭線取り込みプログラムの改良版として,作業内容をメニュ-から選ぶ方式を採用するとともに,メインメニュ-から,各種のプログラムを実行できる形式が採用された.これにより,初心者にとっても扱い易いシステムとなった.一方,従来の方式は,実際の作業領域が大きく確保できる特徴があり,デ-タサイズが大きくなる場合には有利である.このように,局面に応じての使い分けが可能であり,適用範囲が広くなった.2基本概念だけに絞って単純化された模式的断面図を作製し,半透明ステレオ像を再構成する過程は,およその完成に近付いた.このシステムによって得られた腹膜の基本概念を表すステレオ画像は,他の方法では得られない分かり易さを備えており,既に今年度の解剖学実習において供覧され,効果の大きさが確認できた.3新たに,医学部(広島市)と工学部(東広島市)とを結ぶパソコンネットワ-クが構成され,稼働し始めたので,デ-タの転送時間が不要になり,作業効率の大きな向上が期待できるようになった.4工学部での三次元像再構成・着色半透明像表示の演算結果を,新たに医学部内に設置されたワ-クステ-ションに送って,医学部内で表示像を観察するシステムが導入され,間もなく稼働を開始することになった.これによって,表示結果の観察・検討や写真撮影のための医学部・工学部間の移動の必要が殆ど無くなり,作業効率向上に大きく寄与することになった.5自然な感じの輪郭面を再構成するためには,ディジタイザで輪郭線を入力する前に,各試料断面固有の問題点を予測し,予め解決策を考えておくことが,能率の向上に役立つことが明らかになった.この研究で開発する方法の新しい適用範囲を探るために,唾液腺腫瘍の顕微鏡用切片標本からの再構成を企画し,この試料固有の問題点を予測して対策をたて,入力作業が開始されることになった.1.再構成段階・着色半透明ステレオ像表示段階ともに,実用的には完成の域に達し,全力での稼働が可能になった.教育用のみならず,先天異常の研究結果の表示にも極めて有効であることが確認された.2.本来ワークステーションで行うべき再構成の妥当性の検討段階のプログラムをパーソナルコンピュータへ移植する作業が完了し,分割したデータファイルでの本格的な検討が可能となった.これは,ワークステーションをもたない研究室でも,切片・断面標本を扱う研究者自身がデータ入力とともに再構成の妥当性を確認できる点で,大変有効な手段であることが判明した.3.模式的断面図の作製に先立ち,パーソナルコンピュータ上で単純化されたワイアフレーム像を立体視して検討する方法が確立され,この方法の有効性と,作業の能率向上への寄与が確認された.4.再構成像を見る視点の違いによる表示効果の違いに関して細かく検討した結果,指定した眼の位置によっては気になる再構成像のシワは,僅かに眼の位置を変更すれば,見る方向の違いを意識させずにシワが目立たなくなることが判明した.5.連続切片標本からの再構成像のシワの原因について検討した.これには,切片製作上での問題も絡む可能性が強い.
「誕生日タグづけ」という新戦略でひも解く神経構築原理

新規技術は、新たな視点を提供し、新たな発見をもたらす。本研究では、代表者が開発した神経細胞の「誕生日タグづけ」という新規技術を用いて、神経系の構築原理を探ることを目的としている。この技術のねらいは、「誕生日」という古典的な神経細胞分類法を、現代神経科学に応用することである。「誕生日」の情報を、神経活動操作や軸索終末トレースなどの発展的技術にシームレスに繋げることができる。本年度は、この新規技術が最も真価を発揮すると予想される1.二次嗅覚系と2.網膜視覚系に的を絞って、主に形態学的な解析をおこなった。1.二次嗅覚系の誕生日依存的並行回路の研究二次嗅覚系の投射神経細胞は、早生まれの僧帽細胞と遅生まれの房飾細胞に大別される。誕生日タグづけマウスG2A系統を用いることで、この2種の投射神経細胞を区別してタグづけすることに成功し、これらの神経細胞の投射領域が全く異なることを明らかにした。これら2種の細胞の神経活動を選択的に操作しようと試みているが、神経活動を制御するためのエフェクター遺伝子が計画通りに発現してくれず困難を極めている。2.網膜神経節細胞の誕生日依存的サブタイプの研究網膜神経節細胞は、細胞生理学的性質の観点から最もよく分類された細胞群である。視覚刺激に対する反応から数十のサブタイプに分類されているが、そのうち分子マーカーがあるものはごく少数であり、大多数のサブタイプは分子的には同定できない。本年度は、誕生日タグづけマウス各種系統を用いて網膜神経節細胞の誕生日による分類を進め、この目的にはD1B系統が最も適していることがわかった。昨年度「網膜神経節細胞の誕生日依存的サブタイプの研究」項目の実施が遅れていたが、昨年度末にこれを担当する研究協力者が着任し順調に研究は進み始めている。「二次嗅覚系の誕生日依存的並行回路の研究」のほうは、神経活動を制御する方法が計画通りいかず、ウイルスベクターを用いる方法に切り替えることを検討している。神経活動の制御法に関しての計画を変更するに伴いタイムラグが生じるが、急がば回れの精神で着実にゴールをめざす。誕生日タグづけマウスG2A系統を用いることで、この2種の投射神経細胞を区別してタグづけすることに成功した。そして、これらの神経細胞の投射領域が全く異なることを明らかにした。本年度は、誕生日タグづけマウス各種系統を用いて網膜神経節細胞の誕生日による分類と既知サブタイプとの関連を調べる予定であったが、担当する予定であった研究協力者の着任が遅れたため、まだこの項目について検討を始めたばかりである。「二次嗅覚系の誕生日依存的並行回路の研究」項目は予定どおりの進捗であった。「網膜神経節細胞の誕生日依存的サブタイプの研究」のほうは、担当する予定であった研究協力者の着任が遅れたため、8ヶ月ほど遅れて研究を開始した。2.網膜神経節細胞の誕生日

依存的サブタイプの研究網膜神経節細胞は、細胞生理学的性質の観点から最もよく分類された細胞群である。視覚刺激に対する反応から数十のサブタイプに分類されているが、そのうち分子マーカーがあるものはごく少数であり、大多数のサブタイプは分子的には同定できない。本年度は、誕生日タグづけマウス各種系統を用いて網膜神経節細胞の誕生日による分類を進め、この目的にはD1B系統が最も適していることがわかった。昨年度「網膜神経節細胞の誕生日依存的サブタイプの研究」項目の実施が遅れていたが、昨年度末にこれを担当する研究協力者が着任し順調に研究は進み始めている。「二次嗅覚系の誕生日依存的並行回路の研究」のほうは、神経活動を制御する方法が計画通りいかず、ウイルスベクターを用いる方法に切り替えることを検討している。研究体制が整ったので、協力しながら効率的に研究を進める。神経活動の制御法に関しての計画を変更するに伴いタイムラグが生じるが、急がば回れの精神で着実にゴールをめざす。
精原幹細胞の内因的自己複製能維持機構の解明

3年間の目標は、精原幹細胞独特な遺伝子発現抑制系と、この系が関与している遺伝子群の網羅的解析にある。網羅的解析として、Plzfと相互作用するタンパク質群をプロテオーム解析および、Plzfのゲノム上における結合領域を明らかにするために行うクロマチン免疫沈降-シークエンス解析を行うことを目標とした。HAタグ(クロマチン免疫沈降-シークエンス解析において使用)、SBPタグ(プロテオーム解析において使用)、Flagタグの3種類のタグ付きPlzfが発現することのできるベクターを構築した。まず、293FT細胞株に構築したベクタープラスミドをトランスフェクションし、実際にタグ付きのPlzfが発現するかどうかについて、ウエスタンブロット法を用いて確認した。確認後、SBPタグを利用して、抗SBP抗体を用いた免疫沈降実験を行った。その結果、実際にPlzfに結合しているタンパク質の沈降が見られ、免疫沈降実験系構築の確認をすることができた。さらに培養i系精原幹細胞(GS細胞)における、Plzfと相互作用するタンパク質の同定を目指して、GS細胞にタグ付きPlzfを発現させたいと考えた。しかしながら、GS細胞では、通常のトランスフェクションでは遺伝子導入が難しいことが知られている。そこで、構築したプラスミドを元に、タグ付きPlzfを発現させることのできるレンチウイルスベクターを構築した。構築したベクターを使用してレンチウイルスを産生し、ウイルス液の濃縮を行った。作製したレンチウイルスをGS細胞に感染させたところ、感染がセルソーターにより確認され、タグ付きPlzf発現GS細胞の作製に成功した。(抄録なし)3年間の目標は、幹細胞独特な遺伝子発現抑制系と、この系が関与している遺伝子群の網羅的解析にある。初年度として、確実な目標遂行のための基盤的研究を行った。これまでの研究成果から、前駆細胞ではDNAメチル化機構が担っている遺伝子発現抑制システムが幹細胞においては存在せず、代わりに、Plzfという転写因子が介在する遺伝子発現抑制系が、その役割の一部を担っているのではないかと推測している。そこで1年目は、Plzfと相互作用するタンパク質群をプロテオーム解析により明らかにするための足掛かりとして、タグ付きのPlzfをGS細胞に導入するためのレンチウイルスベクターを作製している。このベクターが完成すれば、非常に優れた抗タグ抗体が存在するので、免疫沈降法によりPlzfを含むタンパク複合体を精製することができる。加えて、Plzfのゲノム上における結合領域を明らかにするために行うクロマチン免疫沈降-シークエンスの準備として、抗Plzf抗体によるクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、少数の細胞からでも良好な沈降結果を得ている。また、これまでの研究成果をより発展させるために、whole genomeにおけるDNAメチル化の状態を幹細胞と前駆細胞で比較する準備として、解析に必要な細胞集団をセルソーターによりマウス精巣から取得し、それらの細胞の品質管理を順次行っている。さらに、網羅的解析のためのコントロール実験として、いくつかの遺伝子領域、繰り返し配列などのDNAメチル化状態をBisulfite Sequencing法により解析した。3年間の目標は、幹細胞独特な遺伝子発現抑制系と、この系が関与している遺伝子群の網羅的解析にある。2年目として、初年度の研究成果を発展させた。Plzfと相互作用するタンパク質群をプロテオーム解析により明らかにするための足掛かりとして、SBP(ストレプトアビジン結合タンパク)タグ付きのPlzfをGS細胞に導入するためのレンチウイルスベクターを作製した。抗タグ抗体を利用した免疫沈降法により、Plzfを含むタンパク複合体を精製するための実験系を構築した。加えて、Plzfのゲノム上における結合領域を明らかにするために行うクロマチン免疫沈降-シークエンスの準備として、抗Plzf抗体によるクロマチン免疫沈降法の条件検討を行い、少数の細胞からでも良好な沈降結果を得た。この系を利用して、Plzfの精原幹細胞におけるChIP-Seqを行う予定である。また、これまでの研究成果をより発展させるために、whole genomeにおけるDNAメチル化の状態を解析した。解析に必要な幹細胞集団、前駆細胞集団をセルソーターによりマウス精巣から取得し、それらの細胞の品質管理を行ったうえで、PBAT法と呼ばれる方法を用いて次世代シークエンサーによる解析に必要なライブラリ作成を行った。次世代シークエンサーによる網羅的解析により、幹細胞集団と前駆細胞集団のメチル化部位の違いが明らかとなった。この結果を上記のPlzfのクロマチンにおける結合部位とも照らし合わせ、その関連性を模索し、精原幹細胞分化の内因的制御の解明につなげたいと考えている。

その結果、実際にPlzfに結合しているタンパク質の沈降が見られ、免疫沈降実験系構築の確認をすることができた。さらに培養i系精原幹細胞(GS細胞)における、Plzfと相互作用するタンパク質の同定を目指して、GS細胞にタグ付きPlzfを発現させたいと考えた。しかしながら、GS細胞では、通常のトランスフェクションでは遺伝子導入が難しいことが知られている。そこで、構築したプラスミドを元に、タグ付きPlzfを発現させることのできるレンチウイルスベクターを構築した。構築したベクターを使用してレンチウイルスを産生し、ウイルス液の濃縮を行った。作製したレンチウイルスをGS細胞に感染させたところ、感染がセルソーターにより確認され、タグ付きPlzf発現GS細胞の作製に成功した。これまでの研究成果を発展させるとともに、先を見据えた準備を行うことができた。しかしながら進行度合いとしては、当初の目標よりは若干遅れ気味であるので、さらに努力を続けていきたい。これまでの研究成果をもとに、それを発展させることができた。しかしながら進行度合いとしては、当初の目標よりはやや遅れ気味であるので、さらに努力を続けていきたい。当初の研究計画では、ChIA-PET法により、核内のクロマチン高次構造を明らかにする予定であったが、学会に参加してChIA-PET法のより詳細な情報を得たところ、非常に多くの細胞を必要とし、実験系としても不安定な部分が多いことが分かった。そこで、PlzfのChIP-Seqのデータと3C-PCRのデータを組み合わせることで対処したいと考えている。使用する方法論は異なるが、核内のクロマチン高次構造から幹細胞の特徴をとらえたいという目標には変更はない。最終年度は、2年間で構築した実験系を用いて、核内のクロマチン高次構造から幹細胞の特徴を明らかにしていきたい。具体的には、Plzfを含むタンパク質複合体解析、Plzfのゲノム上結合部位の同定を行いたい。また、クロマチンの動きを明らかにする実験系として、3C-PCRを習得したいと考えている。(抄録なし)
パラレルメカニズムを用いたマイクロメカニズム用超小型三次元座標測定機

本研究では,マイクロマシンパーツなどの立体的で高精度な機械部品の寸法や幾何偏差の測定を行うために,従来の直交座標型の三次元座標測定機(CMM)を縮小した機構ではなく,閉リンク構造を並列に持つパラレルメカニズムを用いた小型のCMMを提案している.(1)リンク配置の最適設計メカニズムの運動誤差の主原因と考えられるジョイントの回転誤差の影響が少なく,かつスケールユニットの分解能に対する測定分解能を向上させるリンク配置を調査するため,特異値分解と遺伝的アルゴリズムを用いたリンク配置の最適設計を行った.この結果,以前に試作したメカニズムに対して,運動精度および分解能を40%ほど向上するリンク配置を得た.(2)直動リンクの製作測長器とアクチュエータを組み込んだ直動リンクを製作した.具体的には,リニアボールガイドを用いた直動ジョイントに測長器となるリニアスケール(測定分解能:約2nm,ストローク:100mm)を組み込んだ.またナノメートルステップでの超精密位置決めが行えるように,アクチュエータとして積層型圧電素子を用い,インチワーム機構を構成した.(2)直動リンク駆動プログラムの作成直動リンクをインチワーム機構で駆動するための制御プログラムを作成した.内蔵したリニアスケールを用いないオープンループ制御プログラムで駆動した際,4N以上の推力が得られることを確認した.さらに,スケールユニットをフィードバックセンサとして用いたフルクローズドループ制御用のプログラムを作成した.10μmのステップ位置決めを行った際の位置決め制定時間は0.1μs以下であった.本研究では,マイクロマシンパーツなどの立体的で高精度な機械部品の寸法や幾何偏差の測定を行うために,従来の直交座標型の三次元座標測定機(CMM)を縮小した機構ではなく,閉リンク構造を並列に持つパラレルメカニズムを用いた小型のCMMを提案している.(1)リンク配置の最適設計メカニズムの運動誤差の主原因と考えられるジョイントの回転誤差の影響が少なく,かつスケールユニットの分解能に対する測定分解能を向上させるリンク配置を調査するため,特異値分解と遺伝的アルゴリズムを用いたリンク配置の最適設計を行った.この結果,以前に試作したメカニズムに対して,運動精度および分解能を40%ほど向上するリンク配置を得た.(2)直動リンクの製作測長器とアクチュエータを組み込んだ直動リンクを製作した.具体的には,リニアボールガイドを用いた直動ジョイントに測長器となるリニアスケール(測定分解能:約2nm,ストローク:100mm)を組み込んだ.またナノメートルステップでの超精密位置決めが行えるように,アクチュエータとして積層型圧電素子を用い,インチワーム機構を構成した.(2)直動リンク駆動プログラムの作成直動リンクをインチワーム機構で駆動するための制御プログラムを作成した.内蔵したリニアスケールを用いないオープンループ制御プログラムで駆動した際,4N以上の推力が得られることを確認した.さらに,スケールユニットをフィードバックセンサとして用いたフルクローズドループ制御用のプログラムを作成した.10μmのステップ位置決めを行った際の位置決め制定時間は0.1μs以下であった.本研究では,従来の直交座標型の三次元座標測定繊(CMM)を縮小しただけではなく,閉リンク構造を並列に持つパラレルメカニズムを用いた小型のCMMを提案している.本年度は以下の項目について研究を行った.(1)ジョイントに用いるねじり型弾性ヒンジの形状最適化設計リンクとリンクをつなぐ対偶部には摩擦の影響やスティックスリップのない弾性ヒンジを用いるが,許容回転角度および回転中心の移動が問題となる.ここでは回転中心の移動が少なく,回転角度範囲の大きなねじり型弾性ヒンジを提案し,その形状について検討した.まず,たわみが少なくかつねじりやすいねじりはりを有限要素法で解析し,従来の円弧切欠き型弾性ヒンジと比較しつつ検討した.さらに,はり部分に切欠きを入れたものについても検討した.以上の結果,たわみにくくねじれやすいはりの寸法と形状を得た.さらに,この方式の弾性ヒンジは従来のものと比較して数倍の回転角度範囲が得られること,はり部中央部に切欠きを入れることにより性能が向上することなどがわかった.(2)パラレルメカニズム型CMMのリンク配置の最適設計測定分解能および測定精度向上を目的として,リンク配置の最適設計を行った.ここでは微小運動学と最適化手法を用いて最適なリンク配置を検討した.この結果,従来のリンク配置と比較して,ジョイントの運動誤差が測定精度に及ぼす影響が約43%減少すること,さらに測定分解能が約37%向上していることがわかった.(3)直動ジョイントの設計以上のリンク配置の検討の結果,必要な直動ジョイントの寸法およびストロークがわかったので,これについての設計を行った.本研究では,従来の直交座標型の三次元座標測定機(CMM)を縮小しただけではなく,閉リンク構造を並列に持つパラレルメカニズムを用いた小型のCMMを提案している.本年度は以下の項目について研究を行った.(1)直動リンクの製作昨年度までの研究で,最適なリンク配置についての検討がほぼ終了しているので,本年度は全体の詳細な設計を行い,測長器とアクチュエータを組み込んだ直動リンクを製作する.具体的には,リニアガイドを用いた直動ジョイントに測長器となるリニアスケール(測定分解能:約2nm,ストローク:100mm)を組み込んだ.またナノメートルステップでの超精密位置決めが行えるように,アクチュエータとして積層型圧電素子を用い,インチワーム機構を構成した.(2)直動リンク駆動プログラムの作成

直動リンクをインチワーム機構で駆動するための制御プログラムを作成した.内蔵したリニアスケールを用いないオープンループ制御プログラムと,スケールの値を用いるフルクローズドフィードバック制御用のプログラムを作成し動作を確認した(3)ジョイント回転誤差補正と熱変位補正パラレルメカニズムではジョイントの運動誤差は機構の運動誤差の大きな原因であると考えられる.また,高精度の測定機では室温変動などによる熱変位の補正を行う必要がある.ここでは,変位計や温度計を用いずに,直動ジョイントの両端に設置する球面ジョイントの回転誤差の補正および直動リンク自体の熱変位を補正するための機構を組み込んだ.
大腸がんにおけるヒト内在性レトロウイルスの発現解析と機能解明

ヒトゲノム中にはヒト内在性レトロウイルス(human endogenous retrovirus ; HERV)が多数存在しており、その多くは通常は不活性化されているものの、生命現象の一部やがんを含むいくつかの疾患において活性化していることが報告されている。しかしながら、その機能や、疾患との具体的な結びつきについては不明な点が多い。本研究では、ロングリードのNanoporeシークエンスを用いて、大腸がんのがん部で高発現するHERV領域を正確に同定し、HERVの発現制御機構や、実際に機能をもつ領域を明らかにすることで、大腸がんにおけるHERVの機能を明らかにすることを目指す。
渓流に生息する両生類幼生の幼生期間と変態サイズにおける表現型の可塑性の意義

本研究は、渓流に生息する両生類幼生が示す表現型の可塑性が、どのような変態戦略に基づいて進化したのか理解することを大目的とし、1)渓流性幼生に見られる越冬の有無を、成長速度の減少に対する変態戦略の相違で説明すること、2)種によって異なる変態戦略を、成熟サイズに対する変態サイズの相対的重要性や、利用する水体の種類で説明すること、を目的とした研究を行っている。仮説1(渓流性幼生の越冬の有無は、成長速度の減少に対する反応の違いによる)については、越冬の有無が異なる渓流性の幼生を対象に、食物条件によって成長速度を操作する飼育実験を行う。変態サイズと幼生期間の関係を数理モデルに当てはめ、成長速度に対する反応を説明する。仮説2(種によって異なる変態戦略は、水域と陸域における成長の相対的重要性による)については、越冬の有無や利用する水体が異なる種において、変態サイズと成体サイズの関係を野外データから明らかにする。越冬の有無、および、利用する水体の特性(渓流/一時的な水体)の間でそれぞれ水域と陸域における成長の相対的重要性を比較することとしている。本年度は、昨年度から引き続き、越冬するツチガエル、オットンガエル、越冬しないアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を行い、オットンガエル、アマミハナサキガエル、カジカガエルについては飼育を終了した。成長結果と変態状況をまとめ、学会発表を行った。仮説2に関しては、年輪解析を進めており、研究計画通り進捗していると言える。仮説1については、越冬するツチガエル、オットンガエル、および越冬しないアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を行い、オットンガエルとアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を終了した。ツチガエルは一部が変態したが、2度目の越冬に入った個体があり、引き続き飼育を行っている。ここまでの飼育結果についてまとめ、学会発表を行った。越冬の有無によって戦略が大きく異なることは見られなかったが、越冬ありの場合、変態季節を揃える可能性が示された。そのため、次年度はオットンガエルの季節別飼育実験を行う予定である。仮説2については、成体の指骨採取を追加した。アマミイシカワガエルの指骨を用いた年輪解析を進めている。アマミイシカワガエルの野外における変態サイズの変異について論文にまとめ、投稿した。研究計画通り、順調に進捗しているといえる。仮説1については、引き続きツチガエルの飼育を継続する。オットンガエルについては、季節によって変態戦略が異なる可能性があることから、季節別の飼育を行う予定である。一方で、予定していたアマミイシカワガエルについては、飼育容量の限界と、卵塊の入手が困難であることから、飼育せず、オットンガエルによって代替する。仮説2については、アマミイシカワガエルの指骨解析を終了する。投稿している論文の対応を進めるとともに、成体サイズと変態サイズの関係について、仮説2の結果も踏まえて新規の論文を執筆する。初年度は、主に仮説1について、タゴガエル、アマミハナサキガエル(越冬なし)、オットンガエル、ツチガエル(越冬あり)を対象とした飼育実験を行った。このうちタゴガエルは飼育を終了したが、他3種については飼育継続中である。仮説2については、成体の指骨採取を進め、また、アマミイシカワガエルの指骨を用いた年輪解析を開始し、最適な脱灰方法や、染色方法について試行を繰り返している。アマミイシカワガエルについては卵塊が採取できなかったため、次年度以降の飼育とする予定である。本研究は、渓流に生息する両生類幼生が示す表現型の可塑性が、どのような変態戦略に基づいて進化したのか理解することを大目的とし、

1)渓流性幼生に見られる越冬の有無を、成長速度の減少に対する変態戦略の相違で説明すること、2)種によって異なる変態戦略を、成熟サイズに対する変態サイズの相対的重要性や、利用する水体の種類で説明すること、を目的とした研究を行っている。仮説1(渓流性幼生の越冬の有無は、成長速度の減少に対する反応の違いによる)については、越冬の有無が異なる渓流性の幼生を対象に、食物条件によって成長速度を操作する飼育実験を行う。変態サイズと幼生期間の関係を数理モデルに当てはめ、成長速度に対する反応を説明する。仮説2(種によって異なる変態戦略は、水域と陸域における成長の相対的重要性による)については、越冬の有無や利用する水体が異なる種において、変態サイズと成体サイズの関係を野外データから明らかにする。越冬の有無、および、利用する水体の特性(渓流/一時的な水体)の間でそれぞれ水域と陸域における成長の相対的重要性を比較することとしている。本年度は、昨年度から引き続き、越冬するツチガエル、オットンガエル、越冬しないアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を行い、オットンガエル、アマミハナサキガエル、カジカガエルについては飼育を終了した。成長結果と変態状況をまとめ、学会発表を行った。仮説2に関しては、年輪解析を進めており、研究計画通り進捗していると言える。仮説1については、越冬するツチガエル、オットンガエル、および越冬しないアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を行い、オットンガエルとアマミハナサキガエル、カジカガエルの飼育を終了した。ツチガエルは一部が変態したが、2度目の越冬に入った個体があり、引き続き飼育を行っている。ここまでの飼育結果についてまとめ、学会発表を行った。越冬の有無によって戦略が大きく異なることは見られなかったが、越冬ありの場合、変態季節を揃える可能性が示された。そのため、次年度はオットンガエルの季節別飼育実験を行う予定である。仮説2については、成体の指骨採取を追加した。アマミイシカワガエルの指骨を用いた年輪解析を進めている。アマミイシカワガエルの野外における変態サイズの変異について論文にまとめ、投稿した。研究計画通り、順調に進捗しているといえる。仮説1については、引き続き、アマミハナサキガエル(越冬なし)、オットンガエル、ツチガエル(越冬あり)の飼育を継続するとともに、今年度は新たにカジカガエル(越冬なし)の飼育を始める予定である。飼育施設の容量が限界のため、変態に達して個体数が減少しない限りは新しい種についての開始は行わないが、アマミイシカワガエルは、卵塊採取を待って今年度後半に開始を予定している。仮説2については、指骨の測定方法を確立し、適宜測定を進めていく。また、野外調査により、変態サイズ、成体サイズの収集を進める。当初計画通りの進捗を予定している。仮説1については、引き続きツチガエルの飼育を継続する。オットンガエルについては、季節によって変態戦略が異なる可能性があることから、季節別の飼育を行う予定である。一方で、予定していたアマミイシカワガエルについては、飼育容量の限界と、卵塊の入手が困難であることから、飼育せず、オットンガエルによって代替する。仮説2については、アマミイシカワガエルの指骨解析を終了する。投稿している論文の対応を進めるとともに、成体サイズと変態サイズの関係について、仮説2の結果も踏まえて新規の論文を執筆する。
プロジェクトマネジメントに関する学理的研究

本研究は、プロジェクトマネジメントの学理的研究について、研究領域、研究対象、フレームワーク、研究の方法論、今後の展開領域などについて、既存の関連学問領域の研究方法論を調査研究し、プロジェクトマネジメントに関する実践的な経験を踏まえて、新たな学問領域の一つとして展開する方向を探ることに目標を置いて行われた。本研究の研究者は、工学、情報、経営など複数にまたがる領域で研究活動を行って来た経緯から、研究者が専門とする領域での研究経験を生かして自律的にそれぞれのコンテキストのもとで研究を行い、今後の研究について満たすべき学理的条件や研究の方法論をある程度明らかにすることであった。研究の実施に当たっては、研究者の専門領域に関連して理論的フレームワークを(1)工学分野、(2)経営分野、(3)情報分野の三分野それぞれにおいて研究を行うこととた。研究成果として、(1)工学と社会科学にまたがる研究の方法論として、ケース研究実施上の留意事項、コンテキスト依存性の問題への対処、透明性の要求など(2)循環型社会の構築に向けてプロジェクトが目標重視から使命重視への視点転換に基づく新たなフレームワークの提案、複数プロジェクトモデルの統合原理およびこの基盤原則や統合マネジメントに対するP2M(Program & Project Management for Enterprise Innovation)標準ガイドブックの作成など(3)大規模、複雑化する情報システムの構築に必要な品質管理に基礎を置いたプロジェクトマネジメントの導入方法について明らかにし、成果をまとめた。プロジェクトマネジメントを学問として成立させるための要件は、学会活動が存在すること、教育課程が成立していること、当該領域における研究が科学またはその応用として認められること、などが挙げられ、いづれもこれらの条件を満たしているが、当該領域の研究報告については、海外に該当する学会が存在していないこと、我が国の関連学会(プロジェクトマネジメント学会)設立から日が浅いこともあり、関連研究業績(論文)は散在している状況にあり、代表的な分野として経営科学、経営工学が挙げられる。プロジェクトマネジメントの学理について予備的な検討を行ったが、先の記した学問として成立させるための要件から、経営科学(Management Science)の当該領域への応用を念頭に置いて、場のマネジメント、制度経営学などの最近の経営学分野の新たな動きに注目している。情報通信ネットワークやグループウエアの活用下における場の設定について研究することも必要になろう。また社会学の特定分野に応用範囲が限られているグラントセオリーアプローチについて、基本的な要素、概念は、研究に対するアプローチとして検討に値すると思われる。これらの初期的な予備研究に基づいて、プロジェクトの個別性を、技術、サービス、ソフトウエアなどの固有業務知識の非共通性に着目して明確に定義し、プロジェクトマネジメントの学理として共通の分析ツールまたは枠組みを設定し、これらに基づいて学問としての成立要件を研究し始めた。場としてプロジェクトを設定し、プロジェクトチームメンバーの行動規範(プロジェクトの目的に添い、プロジェクト共通の業務遂行ルールに従う)を前提にした自立的な行動の様子を具体的に研究していくことにより、現実を踏まえた学理の形成が可能になると考えている。本研究は、自然科学、その応用範囲である工学および社会科学に含まれる経営学などを基盤として、プロジェクトマネジメントに関する学理について研究し、新たな学問領域を構築することを目的としている。初年度(平成11年度)には、学会も設立されていない状況から本研究が開始された。科学の成立基盤(無矛盾性、因果性、斉一性)と実践的な側面(プロジェクト特性の個別性:有期性、非定型性)の両面から、個別プロジェクト事例に関係する諸条件を明確にすることにより、科学としてプロジェクトマネジメントに係わる理論化が可能であるとして、研究実施計画に沿って代表的な3領域(工学、情報、経営)におけるフレームワークを構築した後、これらの統合化を試み共通基盤を明らかにすることにしている。平成11年度には、専門領域の異なる研究分担者間で研究方法論を含め研究討論を通して、プロジェクトのライフサイクルに沿った価値の創造とそのための基盤となる知識体系の構築を目的としたフレームワークの原型を構築するための討議を行った。平成12年度はこの結果に基づいて、基盤知識による理論的フレームワーク案を提示するために、専門領域別((1)工学分野:梅田(2)情報分野:

(3)経営分野:小原)に知識体系化をはかった。具体的には、工学分野に関しては、ケース研究と工学基盤研究について科学哲学などの枠組みから考察を加え、通常明らかにされるプロジェクトの事例報告の特徴、透明度の向上の必要性を明らかにした。情報分野に関しては、ソフトウエア開発に焦点を当てて、プロジェクトマネジメント(PM)の学理構造についてPMフレームとソフト開発領域フレームを前提とした検討を行い、PMKOKなどのデファクトに従った、関連領域の整理が妥当である可能性が高いことを明らかにした。経営分野に関しては、循環型社会に向けて、複雑系プロジェクトマネジメントの提唱と有効性、実践科学認識論における事例から知識体系の形成への適用基準と方法について明らかにした。本研究では、研究者が担当する当該領域が異なること、また新たな展開の必要性および対象分野の違い(建設系、ソフト系など)から、研究者独自の研究を行い、本年度の研究成果を下記のように各研究者の概要を報告する。1)プロジェクトマネジメントの学理的研究には、研究領域、研究対象、研究の方法論、フレームワークなどを明らかにする目的で、工学、社会学、経営学などの研究の方法論に関する特徴を中心に調査研究した。プロジェクトマネジメント研究のパラダイム、コンテキストなどの設定は今後に待つとして、関連する私見をまとめた。特に、プロジェクトマネジメントについて工学に関連する研究を行うに当たって、従来あまり指摘されてこなかったコンテキスト設定の必要性を明らかにた。プロジェクトの遂行状況をいかにリアルに捉えるかについてケース研究の重要性とともに、その素材作成には厚い記述(Thick Description)が必要なことを指摘した。2)プロジェクト組織が直面する複雑系問題を解決するための学理の構築について研究してきた。結論として得られた原理は、従来の目的設定型から使命設定型に原点を移し、そのスキームから出発してシステムの構築を経て、その利用から派生する知識資産を資源としてプロジェクトを創造する循環結合を確立する新たな発想である。全体像を可視化するファイリング、ビジネスモデリング、代替案選択のリアルオプション理論、チーム結集のプラットフォーム、多元的評価のバランススコアカードなど理論を組み込み、P2M (Project & Program Management for Enterprize Innovation)の基盤原則や統合マネジメントに導入した。3)ソフトウエア開発分野におけるプロジェクトマネジメントの学理体系は、ソフトウエアエンジニアリングを基礎としたソフトウエア作成に関する議論と,それを円滑力かつ計画的に実施するためのマネジメント方法に関する議論の両者から成り立つ。
樹状細胞の機能とその特殊性に関する研究

強力な抗原提示細胞として免疫応答の誘導に関与することが知られている樹状細胞は、分布域によって分化成熟段階が異なり、抹消において異物を捕食・分解し、所属リンパ器官のT細胞領域へと移動して特異的T細胞を活性化することが知られている。ところが定常状態におけるリンパ器官T細胞領域に分布するいわゆる相互陥入樹状細胞(IDC)はその表現型のみならずT細胞活性化における機能も異なることが示唆されている。そこで本研究は、末梢組織のいわゆる未熟な樹状細胞の性状を解析すると同時に、マウスリンパ節におけるIDC調整法を確立し、その機能を検討することを目的として行い、以下の結果を得た。1.表皮内ランゲルハンス細胞や骨髄由来樹状細胞では、MHCクラスII分子は主に細胞内に存在し、この時に捕食した抗原を消化分解してMHCクラスII分子に結合した後、細胞表面へと運搬し、T細胞に提示することが、生化学的ならびに細胞生物学的検索により証明された。2.IDCの精製法を確立し、その結果、定常状態のリンパ節にはCD11c,DEC-205等の発現強度から少なくとも2-3種類の異なる表現型をもつ樹状細胞が存在することが確認された。また、これらの細胞は内因性抗原ペプチドを多く発現しており、特異的T細胞の活性化と同時にアポトーシスを誘導することも示されたことから、末梢リンパ器官における自己免疫寛容の誘導に関与することが示唆される。筋肉内あるいは皮下に抗原決定基をコードするDNAを接種すると、特異的免疫応答が誘導されるが、局所あるいは所属リンパ器官より調製される樹状細胞内にDNAが取り込まれていることが明らかになり,これらが抗原提示細胞として働いていることが示された。樹状細胞の分化成熟と抗原のプロセッシング機能を検討するため、ランゲルハンス細胞ならびに骨髄由来樹状細胞において、MHCクラスII分子とエンドソームの膜タンパクであるLamp-1(CD107a)の発現状態を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ、未熟な細胞では両者が細胞内に共存しているのに対して、成熟した細胞ではMHCクラスII分子は細胞表面にのみ発現されており、細胞内のLamp-1とは完全に異なる分布を示すことが明らかになった。この結果は、成熟した細胞では新たなMHCクラスII分子の合成が停止されるというこれまでの報告を指示するものである。また、このような細胞の成熟には、TNFαは促進的にIL-10は特性的に作用することが示された。一方、成熟した細胞の表面に発現されるDEC-205分子は、白脾髄T領域の樹状細胞には発現されているものの、リンパ節樹状細胞では細胞表面への発現程度は低いことが示された。しかし、特異抗体を生体に投与すると、所属リンパ節樹状細胞に特異的に取り込まれることが示された。また、この抗体で処理した樹状細胞を生体に注入すると、所属リンパ節において抗体特異的免疫応答を誘導することが明らかになった。C型レクチンであるDEC-205分子の糖蛋白のプロセッシングにおける機能を検討する目的で、樹状細胞によって比較的容易に免疫応答が誘導されるフェチュインを用い、その提示と取り込みを検討した結果、樹状細胞はB細胞に比べて、この糖蛋白を有効に捕食することが示された。また、シアル基を除去したタンパクでは誘導される免疫応答は低く、樹状細胞による捕食程度も減少していることが示されただけでなく、フェチュインの生体内投与によって、Th2T細胞の活性化が認められたが、Th1T細胞は不活化されていることが示唆された。

ところが定常状態におけるリンパ器官T細胞領域に分布するいわゆる相互陥入樹状細胞(IDC)はその表現型のみならずT細胞活性化における機能も異なることが示唆されている。そこで本研究は、末梢組織のいわゆる未熟な樹状細胞の性状を解析すると同時に、マウスリンパ節におけるIDCの調製法を確立し、その機能を検討することを目的として行い、以下の結果を得た。1.表皮内ランゲルハンス細胞や骨髄由来樹状細胞では、MHCクラスII分子は主に細胞内に存在し、この時に捕食した抗原を消化分解してMHCクラスII分子に結合した後、細胞表面へと運搬し、T細胞に提示することが、生化学的ならびに細胞生物学的検索により証明された。2.IDCの精製法を確立し、その結果、定常状態のリンパ節にはCDllc、DEC-205等の発現強度から少なくとも2-3種類の異なる表現型をもつ樹状細胞が存在することが確認された。また、これらの細胞は内因性抗原ペプチドを多く発現しており、特異的T細胞の活性化と同時にアポトーシスを誘導することも示されたことから、末梢リンパ器官における自己免疫寛容の誘導に関与することが示唆される。3.筋肉内あるいは皮下に抗原決定基をコードするDNAを接種すると、特異的免疫応答が誘導されるが、局所あるいは所属リンパ器官より調製される樹状細胞内にDNAが取り込まれていることが明らかになり、これらが抗原提示細胞として働いていることが示された。
線虫の減数分裂前期において染色体の動的なふるまいを制御する分子機構

有性生殖生物において、減数分裂は、遺伝情報の継承に必須のプロセスである。しかし、減数分裂前期における一連の染色体ダイナミクスを支える分子メカニズムには、未知の部分が多い。我々は、セリン/スレオニンフォスファターゼpph-4の変異株において卵細胞の減数分裂前期の染色体ダイナミクスに異常が見られることを発見し、平成26年度は、これまで明らかにしたpph-4変異株の減数分裂前期における表現型を論文としてまとめ、PLOS Genetics誌に発表した。発表論文では、減数分裂前期においてPPH-4が、相同染色体の対合、DNA二重鎖切断と交叉形成に働くことを報告した。さらに、pph-4変異株の表現型のうち、DNA二重鎖切断と交叉形成は、母体の加齢とともに減少し、この結果、pph-4変異株では、加齢とともに正常な卵母細胞の産生が有意に減少する。すなわち、これは、野生株において、PPH-4が、高齢の母体における卵母細胞の産出を助けていることを示しており、PPH-4の加齢効果における役割を明らかにすることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、PPH-4の機能解析を軸として、減数分裂前期に、相同染色体が、どのようにお互いのDNA配列相同性を確認して対合、シナプシスそして組換えにいたるか、という謎の一端を解明することを目指す。まず、PPh-4の変異株(tm1598)の生殖腺核で、PC結合タンパク質抗体やFISHを用いて、染色体の整列とシナプトネマ複合体重合について定量的解析をした。この結果、変異株で相同染色体の対合が遅れ、またシナプトネマ複合体の重合が、非相同染色体間において起こっていることがわかった。また、フォスファターゼデッドのpph-4トランスジェニック株をMos-sci技術を用いて作成した。その表現型解析を行った結果、フォスファターゼデッド変異体は、欠失株と同じ表現型を示すことがわかったため、フォスファターゼ活性が、PPH-4の減数分裂前期における機能に、必須であることが明らかになった。また、免疫染色より、変異株では、組換えに必要なタンパク質RへD-51やRPA-1が、核内につくるfociの数が現象することがわかった。これは変異体で、組換えの数そのものが減少している可能性を示唆する。DAPI染色により、ディアキネシス期のDAPI bodiesの数を定量化した結果、変異体では、6個以上のDAPIbodiesが見られたことから、変異体では、交叉の数が、野生株と比べて減少していることもわかった。これは、上記、RAD-51,RAP-1fociの定量化から明らかになった、相同組み換えの総数が変異体において減少しているという結果と、矛盾が無い。また、この組換え中間体、交叉の減少は、個体の加齢とともに悪化することがわかった。具体的には、幼虫L4期から数えて24時間後の成虫と、72時間後の成虫を比べると、24時間後の成虫のほうが、交叉数が多く、また6個のBivalent DAPIbodiesの数も多かった。PPH-4タンパク質は、高度に保存されており、線虫とヒト間では、約90%のアミノ酸配列が保存されている。加齢による卵母細胞の減数分裂中のエラーの増加は、哺乳類においても観察されることから、線虫pph-4の機能解明は、ヒトまで保存された減数分裂の分子機構の一端を明らかにする可能性がある。有性生殖を行うにおいて、減数分裂前期中の相同染色体の対合、シナプス形成(相同間のシナプトネマ構造による連結)、相同組み換えによる交叉形成は、必須のプロセスである。しかし、この、減数分裂前期における一連の染色体ダイナミクスを支える分子メカニズムには、未知の部分が多い。私は、セリン/スレオニンフォスファターゼpph-4の変異株において卵細胞の減数分裂前期の染色体ダイナミクスに異常が見られることを発見した。特に、前年度、pph-4変異体において、線虫の加齢と共に、その表現型がさらに悪化することを見つけた。そのため、今年度は、若い線虫、老いた線虫を用いて卵子の減数分裂前期の表現型を比較した。その結果、pph-4変異体では、相同染色体の対合、シナプシス形成に異常が出ことに加えて、DNA二重鎖切断の数が野生型に対して減ること、また既に減少しているDNA二重鎖切断が、加齢とともに、更に減少することを明らかにした。また、pph-4変異体では、DNA二重鎖切断に必須な因子のリン酸化が増えることから、PPH-4が、この因子の脱リン酸化を通して、DNA二重鎖切断量を調節している可能性が示唆された。また、質量分析解析より、複数のシナプトネマ構造構築に関わる因子のリン酸化がpph-4変異体で増加していることがわかり、PPH-4が複数の基質を脱リン酸化することで、減数分裂前期の対合、シナプシス、DNA二重鎖切断、交叉に至る組換えのプロセスを独立に制御することが示唆された。

我々は、セリン/スレオニンフォスファターゼpph-4の変異株において卵細胞の減数分裂前期の染色体ダイナミクスに異常が見られることを発見し、平成26年度は、これまで明らかにしたpph-4変異株の減数分裂前期における表現型を論文としてまとめ、PLOS Genetics誌に発表した。発表論文では、減数分裂前期においてPPH-4が、相同染色体の対合、DNA二重鎖切断と交叉形成に働くことを報告した。さらに、pph-4変異株の表現型のうち、DNA二重鎖切断と交叉形成は、母体の加齢とともに減少し、この結果、pph-4変異株では、加齢とともに正常な卵母細胞の産生が有意に減少する。すなわち、これは、野生株において、PPH-4が、高齢の母体における卵母細胞の産出を助けていることを示しており、PPH-4の加齢効果における役割を明らかにすることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の細胞生物学的解析は、おおむね予定通りに進展している。生化学的実験は、免疫沈降の条件検討に問題があるため、期待していただけの生化学的解析結果はまだ出せていない。変異体の解析は順調に進展した。質量解析解析は、アメリカの企業に解析を外部委託したのだが、その提出サンプルが、DNA組み換え線虫から抽出したタンパク質だったため、郵送の法的許可をとるのに非常に時間がかかってしまい、質量分析の結果を得るのが、予想よりもずっと遅くなってしまった。エンドジェナスのタンパク質を認識するPPH-4抗体では、免疫沈降の際に、効率よくPPH-4タンパク質を沈降できないという問題があるため、現在、タグを付けたPPH-4のトランスジェニック株を作成中である。本年度、生化学的実験は、このトランスジェニック株を使用して行うことを目指している。今後は、生化学実験より見つかったPPH-4の基質の候補となる分子の機能解析を行うとともに、PPH-4との相互作用のタイミングや、リン酸化制御の意味も明らかにしたい。