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強磁場ESRと中性子回折による磁性体の磁場誘起新量子現象の探索

ダイヤモンド鎖、Δ鎖、ジグザグ鎖など様々な低次元磁性体のモデル物質を開拓し,以下のような新奇な磁場誘起量子現象の観測に成功した。1)ダイヤモンド鎖のモデル化合物Cu_3(CO_3)_2(OH)_2を世界で初めて発見した。その単結晶の磁化率の温度依存性を測定したところ、二温度において極大がある事を見いだし,短距離秩序の発達が二段階に進むことを見い出した。さらに,極低温での強磁場磁化の測定から,理論的に予測されたような1/3プラトーを発見した。これはダイヤモンド鎖における磁化プラトーを実験的に実証した最初の例である。理論曲線と比較してスピン間相互作用を評価することができた。また,強磁場ESRからそのダイナミクスと磁化プラトーに対応するESRモードを明らかにした。2)Cu-benzoateにおいてはブリーザーモードの飽和磁場に至る観測,高磁場における磁場誘起ギャップの減少の観測,飽和磁場以上での励起モードへのクロスオーバーの観測がおこなわれた。BaCu_2(Si_<1-x>Ge_x)_2O_7においては,混晶系にもかかわらず,ブリーザーモードが確認された。3)直交ダイマー系SrCu_2(BO_3)_2の高次励起構造が解明され,two-triplet束縛状態の詳細な観測がおこなわれた。4)巨大反強磁性多面体における磁化プラトー異常を発見し,プラトー概念の有限系への拡張をおこなうとともに,5角ネットワークを含む系のフラストレーション効果を観測した5)10kbarの高圧下で強磁場ESR測定を可能にするシステムを開発した。この装置でダイマー系KCuCl_3の圧力下強磁場ESR測定を4.2Kでおこない,スピンギャップが660GHz(常圧)から200GHz以下(6.5kbar)に減少することが直接的に観測された。6)強磁場ESR測定により,有限ハルデン系の低エネルギー励起(鎖端スピン状態)を鎖長分解的に直接観測することに成功した。その結果,低温における相関長という系本来の情報を直接的に精度よく得ることができることを明らかにした。今年度は量子性が強いと期待されるS=1/2の系に問題をしぼり,ダイヤモンド鎖とデルタ鎖のモデル物質について試料評価と強磁場ESR測定をすすめた。また他の系についても強磁場ESR測定をすすめた結果,以下の成果をえた。1)ダイヤモンド鎖のモデル物質であるアズライト単結晶について詳細なX線構造解析をおこなったところ,天然鉱物ゆえの不純物マラカイトの混入がみつかり,マラカイトを分離した。その結果Cu^<2+>のESR信号としては非常に線幅が広く,強磁場ESRでなければ観測できない吸刈又がアズライトの本質的な吸収であることが明らかになった。強磁場ESRの温度変化測定で,gシフトが観測され,現在実験結果の解析をすすめている。2)デルタ鎖のモデル物質である[Cu(bpy)(H_2O)][Cu(bpy)(ma1)(H_2O)](ClO_4)_2単結晶の結晶軸をX線構造解析で決定し,X-band ESRによる角度依存性測定をおこなったところ結晶がtwinをもつことが明らかとなった。

低次元系に特有のgシフトおよび低温における線幅の発散が観測され,これとデルタ鎖内に存在するフラストレーションとの関係を検討中である。3)BaCu_2(Si_<1-x>Ge_x)_2O_7についてX-band ESRおよび強磁場ESR測定をすすめた。その結果x=0,1の物質についてはT_N以上で低次元性を反映する振舞いは観測されなかったが,T_N以下の反強磁性共鳴の観測から磁気異方性とDM相互作用にかんする情報がえられた。さらにx=0.65単結晶では,強磁性的鎖間相互作用と反強磁性的鎖間相互作用がちょうど打ち消し合って,DM相互作用をもつ一次元反強磁性体特有の線幅とg値の温度依存性が観測され,押川-Affleck理論で非常にうまく説明されることが明らかとなった。4)S=1スピンラダーのモデル物質と考えられるBIP-TENOのX-band ESR測定から低次元性を反映したマジックアングルや吸収線形の振舞いが観測された。さらに低温のgシフトが昔からよく知られているNagata-Tazukeの振舞いと異なることがわかった。5)圧力下強磁場ESRに関しては,圧力較正の候補物質としてルビーを検討し,圧力によりCr^<3+>のD項の変化が観測され,圧力較正に使える見通しがたった。また圧力下強磁場ESRをS=1/2スピンラダー物質といわれているCHpCに対しておこなったところ圧力による欠陥サイトなどによる新しい吸収は観測されず強度の温度依存性も磁化率に対応することが明らかになり,圧力下で磁化率にみられる低温での増加は本質的な現象であると考えられる。昨年度に引き続き量子性が強いと期待されるS=1/2の系を中心にダイヤモンド鎖とデルタ鎖のモデル物質について強磁場ESR測定をすすめた。また他の系についても強磁場ESR測定をすすめた結果,以下の成果をえた。1)ダイヤモンド鎖のモデル物質であるアズライト単結晶について昨年導入したSQUID磁化率測定装置で低温まで測定したところ,5Kと23Kにピークを持つことが初めてわかった。さらに,H//b(鎖方向)について1.5Kで磁化測定をおこなったところ,この系の強い量子性を反映した1/3プラトーが,16Tから26Tの範囲で発見された。またプラトーを含む磁場範囲について1.8Kで強磁場ESR測定をおこなったところ直接遷移と考えられる吸収が観測され,その振るまいが1/3プラトー領域と相関が強いことがわかった。これらの結果をふまえてアズライトの基底状態は,ダイヤモンド鎖のdimer-monomer状態ではないかと考えられる。2)デルタ鎖のモデル物質である[Cu(bpy)(H_2O)]【Cu(bpy)(mal)(H_2O)](ClO_4)_2単結晶の強磁場ESR測定をおこなった。低次元系に特有の9シフトおよび低温における線幅の発散が観測され,この結果を広島で開催された低温の国際会議で発表した。3)BaCu_2(Si_<1-x>Ge_x)_2O_7についてX-band ESRおよび強磁場ESR測定をおこなった。x=0.65単結晶では,強磁性的鎖間相互作用と反強磁性的鎖間相互作用がちょうど打ち消し合って,DM相互作用をもつ一次元反強磁性体特有の線幅とg値の温度依存性が観測され,押川-Affleck理論で非常にうまく説明されることが明らかとなった。さらに測定を他のx濃度との比較検討をすすめている。
運動の円滑性を用いたストレッチング効果指標の開発－肩関節疾患への応用－

肩関節は肩関節複合体と呼ばれ、関節周囲に存在する十数以上の筋によって制御されている。そのため、目的とした肩関節の運動を達成するためには、肩関節周囲に存在する複数筋が円滑に制御されなければならない。本課題は、肩関節運動の円滑性に着目したストレッチングの新たな効果指標を確立することを目的としている。本年度は円滑性の指標の確立に取り組んだ。健常成人を対象に、自作した空間内において、対象者が多方向に肩関節を動かす14種類の運動を実施した際に、表面筋電図を用いて肩関節筋の筋活動を計測した。分解アルゴリズムを用いて、全運動の筋活動データ及び各運動の筋活動データからそれぞれ筋シナジーを抽出し、関連を検討した。また、各運動の筋活動データから算出した筋シナジーは少数の全運動の筋活動データより算出した筋シナジーの結合により構成されているという仮説に基づき、全運動の筋活動データより算出した筋シナジーの線形結合により併合したシナジーを作成した。併合したシナジーにより各運動の筋活動データから算出した筋シナジーが再現できるかを確かめるために、併合したシナジーと各運動の筋活動データから算出した筋シナジーの関連を検討した。その結果、全運動の筋活動データより、約6つの筋シナジーが抽出された。各運動の筋活動データより、約2つの筋シナジーが抽出された。また全対象者において、各運動より抽出された筋シナジーは全運動の筋活動データより算出した筋シナジーおよび併合したシナジーと概ね類似していた。本研究結果は、表面筋電図の筋活動データより算出される筋シナジーが、肩関節の新たな円滑性の指標となることを示唆した。健常者と対象とし、肩関節の円滑性の指標となる可能性がある筋シナジーの算出に成功した。健常者を対象とした肩関節の円滑性の指標の算出が終了したため、この結果をもとに、ストレッチングにより筋シナジーがどのように変化するか検討する。さらに、肩関節疾患患者を対象とした研究を進める。
イオンチャネルを制御する巨大複雑天然物の網羅的全合成および新機能分子の創出

生命現象の根幹をなすイオンチャネルは、感覚・感情・思考などに深くかかわり、その機能不全は多くの疾患を引き起こす。そのため、チャネルに作用する医薬品の合理的な開発は、現代科学における緊急課題である。分子量が500を超え酸素官能基が密集した巨大複雑天然物は、一般的な医薬品や天然物では実現不可能な、チャネルの高選択的阻害・活性化を可能にする。そこで、申請者は複雑天然物の全合成およびチャネルの機能解析・制御法開発のための新機能分子創出を目的とした。すでに申請者は、モデル基質において三成分連結反応(method A, method B)およびラジカル二量化反応(method C)の開発に成功しており、これらが分子の複雑性を一挙に増すことが出来ることを報告した。本研究提案では、method A-Cを創造的に組み合わせることによって、全合成が極めて困難なイオンチャネルに作用する巨大複雑天然物群の超効率的構築を実現する。本年度は、特にレジニフェラトキシン、スクアモシンAおよびバトラコトキシンの全合成ルートの確立を目標とした。以下に成果を報告する。レジニフェラトキシンは、TRPV1チャネルを介した強力な鎮痛作用を有する。5/7/6員環上に酸素官能基が密集していることが構造的特徴であり、全合成が極めて困難な巨大複雑天然物の代表例といえる。method Aを利用して合成した中間体から、すでに全合成を達成した。スクアモシンAは、Ca2+依存性K+チャネル活性化作用と強力な細胞毒性を有し、抗がん剤として期待されている。そのビステトラヒドロフラン構造を、method Cによって一挙に構築した。バトラコトキシン(電位依存性Na+チャネル活性化)の全合成では、まず、ラジカルー極性交差反応(method B)によって二成分の連結し、多数の酸素官能基を有するステロイド骨格を効率的に構築した。29年度が最終年度であるため、記入しない。
多指ロボットハンドの協調動作における安定性と自己組織化

本研究は、把持の安定性の問題を扱ってきた。多指システムの総コンプライアンスは、第一に、指自身のコンプライアンスに由来し、第二に、しばしば把持の不安定性の原因となる、接触力の相互作用に由来する。我々の研究においては、安定性の特性を把持の力の分布と関連付けている。このため、安定性解析はコントロール・システムの階層性のプランニングレベルで行われる。このアプローチでは、剛性テンソルが線形化された剛体モデルにより直接導かれる為、人間に関する特性をモデル化する必要がない。初めに、コンスタントな力を受ける剛性のポテンシャル関数が導かれ、接触力の分解により、剛性テンソルの構造が表現される。剛性テンソルは、重力および内部力に起因するものとの2つの要素を持つ。内部力のパラメータ化は接触点の組を通じて行われる。上記に述べた結果を延長すればパラレル構造メカニズムの力依存安定性を分析することもできる。さらに、このアプローチをシリアルメカニズムの安定性研究に用いることも可能である。このことを示すために、分析的フォームにおける二次元メカニズムの安定性条件を導き出した。この研究においては、拘束人体運動における力分布の問題も調査した。拘束運動としてクランク回転運動を取り上げ,最適化による運動計画モデルとして,手先力変化最小規範を提案する。クランク回転運動の数学的モデルは、多指システムの最もシンプルなモデルとして考えられる、クランク回転運動では,非拘束下でのリーチング運動を再現する躍度最小規範やトルク変化最小規範で予測される運動軌道よりも,手先力変化最小規範によって予測された運動軌道が,ヒトの実験データをよく再現した。これは運動計画が腕やクランクなどのダイナミクスと関連して決定されることを示唆し,手先と外界との相互作用があるような条件下では,手先空間での滑らかさが運動計画に求められていると考えられる。本研究は、評価関数が単純かつ解析的に求められるように,関節間・指間の局所的振舞いの簡易モデルを構築することが目的であった。現段階までは、把持の安定性の問題を扱ってきた。多指システムの総コンプライアンスは、第一に、指自身のコンプライアンスに由来し、第二に、しばしば把持の不安定性の原因となる、接触力の相互作用に由来している。このアプローチでは、剛性テンソルが線形化された剛体モデルにより直接導かれるため、人間に関する特性をモデル化する必要がない。ここに、分析を安定させることに加えて、関節剛性の統合過程が概説された。安定動作パターン生成における自己組織化のメカニズムを理解するために、クラシファイアシステムの形態で実施される強化学習の手順が開発された。この手順はその構造が多指メカニズムと類似している多足歩行マシンでテストされた。実験においては、各足はそのクラシファイアシステムによって制御される。初期の実験では報酬と罰のバランスが正しく調節された場合に、安定動作パターンが首尾よく習得されることがわかる。さらに、GAを使用すると、クラシファイヤシステムにおける最適な自律分散制御が達成されることも分かっている。

多指システムの総コンプライアンスは、第一に、指自身のコンプライアンスに由来し、第二に、しばしば把持の不安定性の原因となる、接触力の相互作用に由来する。我々の研究においては、安定性の特性を把持の力の分布と関連付けている。このため、安定性解析はコントロール・システムの階層性のプランニングレベルで行われる。このアプローチでは、剛性テンソルが線形化された剛体モデルにより直接導かれる為、人間に関する特性をモデル化する必要がない。初めに、コンスタントな力を受ける剛性のポテンシャル関数が導かれ、接触力の分解により、剛性テンソルの構造が表現される。剛性テンソルは、重力および内部力に起因するものとの2つの要素を持つ。内部力のパラメータ化は接触点の組を通じて行われる。上記に述べた結果を延長すればパラレル構造メカニズムの力依存安定性を分析することもできる。さらに、このアプローチをシリアルメカニズムの安定性研究に用いることも可能である。このことを示すために、分析的フォームにおける二次元メカニズムの安定性条件を導き出した。この研究においては、拘束人体運動における力分布の問題も調査した。拘束運動としてクランク回転運動を取り上げ、最適化による運動計画モデルとして、手先力変化最小規範を提案する。クランク回転運動の数学的モデルは、多指システムの最もシンプルなモデルとして考えられる。クランク回転運動では、非拘束下でのリーチング運動を再現する躍度最小規範やトルク変化最小規範で予測される運動軌道よりも、手先力変化最小規範によって予測された運動軌道が、ヒトの実験データをよく再現した。これは運動計画が腕やクランクなどのダイナミクスと関連して決定されることを示唆し、手先と外界との相互作用があるような条件下では,手先空間での滑らかさが運動計画に求められていると考えられる。
過渡分光法によるアシルオキシルラジカルの反応性の研究

過酸化ジアロイルの光分解の際に生じるベンゾイルオキシルラジカルを過渡吸収法を利用して直接観測することにより,これらのラジカルの絶対反応速度定数や活性化パラメータなどを求めることができる.本研究では,2-位または2,6-位に置換基を導入したベンゾイルオキシルラジカルの反応性を明らかにすることを試みた.過酸化ジ(置換ベンゾイル)(X-BPO)の光分解で発生する置換ベンゾイルオキシルラジカルは一般に,500-800nmの長波長領域に幅広い吸収帯を示す.ところが,過酸化ジ-2-ブロモベンゾイル(2-Br-BPO)の光分解では,長波長領域とともに,400nm付近にも強い過渡吸収が観測された.この吸収はカルボキシルラジカルが2-位の臭素原子と相互作用して生成した臭素(III)中心ラジカルの吸収に帰属できる.また,2-Br-BPOでは,C-Br結合が光開裂することを分解生成物の分析により確認した.過酸化ジ-2-アルキルベンゾイル(2-RCH_2-BPO;R=H,CH_3,C_6H_5)の光分解では,300-400nmの短波長領域に,ベンゾイルオキシルラジカルの分子内水素引き抜きにより生成したベンジル型ラジカルの吸収が観測された.これに対し,過酸化ジ-2,6-ジメチルベンゾイルおよび過酸化ジ-2,4,6-トリメチルベンゾイルから発生したベンゾイルオキシルラジカルでは,分子内水素引き抜きは進行せず,脱炭酸のみが進行した.しかも,2,6-位の置換基によりカルボキシル基がベンゼン環と共平面を取りにくく,脱炭酸が加速される傾向が認められた.これらの反応について過渡吸収の減衰速度の温度依存性を調べ,活性化パラメータを決定した.過酸化ジアロイルの光分解の際に生じるベンゾイルオキシルラジカルを過渡吸収法を利用して直接観測することにより,これらのラジカルの絶対反応速度定数や活性化パラメータなどを求めることができる.本研究では,2-位または2,6-位に置換基を導入したベンゾイルオキシルラジカルの反応性を明らかにすることを試みた.過酸化ジ(置換ベンゾイル)(X-BPO)の光分解で発生する置換ベンゾイルオキシルラジカルは一般に,500-800nmの長波長領域に幅広い吸収帯を示す.ところが,過酸化ジ-2-ブロモベンゾイル(2-Br-BPO)の光分解では,長波長領域とともに,400nm付近にも強い過渡吸収が観測された.この吸収はカルボキシルラジカルが2-位の臭素原子と相互作用して生成した臭素(III)中心ラジカルの吸収に帰属できる.また,2-Br-BPOでは,C-Br結合が光開裂することを分解生成物の分析により確認した.過酸化ジ-2-アルキルベンゾイル(2-RCH_2-BPO;R=H,CH_3,C_6H_5)の光分解では,300-400nmの短波長領域に,ベンゾイルオキシルラジカルの分子内水素引き抜きにより生成したベンジル型ラジカルの吸収が観測された.これに対し,過酸化ジ-2,6-ジメチルベンゾイルおよび過酸化ジ-2,4,6-トリメチルベンゾイルから発生したベンゾイルオキシルラジカルでは,分子内水素引き抜きは進行せず,脱炭酸のみが進行した.しかも,2,6-位の置換基によりカルボキシル基がベンゼン環と共平面を取りにくく,脱炭酸が加速される傾向が認められた.これらの反応について過渡吸収の減衰速度の温度依存性を調べ,活性化パラメータを決定した.
植物病原糸状菌への遺伝子導入と形質転換ベクタ-系の開発

本研究の最初度においては、エレクトロポ-レ-ション法を使用することによって、トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)の分生胞子に直接外来物質を導入できることを明らかにし、Journal Phyto pathology誌の1989年125巻に発表した。最終年後の研究においては、導入された遺伝子の発現を効果的なものとするため、本菌で有効に機能するベクタ-系の開発につとめた。遺伝子発現に至る第1段階としては、導入した遺伝子が本菌染色体DNAに組込れることが必須となる。そこで、染色体上には多数のrRNA遺伝子が存在することに着目し、これらの遺伝子をベクタ-内に連結することで、ベクタ-と染色体DNA間での相周組換えによる遺伝子導入法を検討した。まず、本菌のrRNAからcDNAを合成し、それが染色体上のrRNA遺伝子と同一であることをサザンハイブリダイゼ-ションによって明らかにした後,検出マ-カ-(ハイグロマイシン低抗性遺伝子)の上流および下流に分割した挿入したベクタ-を構築した。このベクタ-は、本菌の分生胞子にエレクトロポ-レ-ション法で効果的に導入され、検出マ-カ-遺伝子が組込れた形質転換体の作出に成功した。また、これらの遺伝子が本菌の生育・分化段階においても安定して継代されていることを証明するため、in situハイブリダイゼ-ションを行った。すなわち、それぞれの発育段階における菌糸細胞にプロ-ブDNAをマイクロインジェクション法で注入し、細胞質内におけるmRNAとのハイブリダイゼ-ションを行わせた。以上の結果は、日本農芸化学会英文誌に現在投稿中である。本年度に実施した研究の概要を以下の項目別に要約する。1.植物病原菌胞子に外来遺伝子を直接導入するための実験法の確立植物病原菌としては、トマト萎凋病菌の小型分生胞子を使用し、エレクトロポ-レ-ション(EP)法によって外来高分子の導入を試みた。EPの条件としては、電場強度、パルス回数、導入物質の濃度を検討し、最適条件を明らかにした。これらの研究結果は、Journal of Phytopathology誌の1989年第125巻8996に掲載された。また、本法を用いた外来遺伝子の導入については、水銀無毒化遺伝子を組込んだベクタ-DNAを使用し、病原菌胞子染色体に挿入され、かつその遺伝子の発現が認められることを明らかにした。これらの研究結果については、平成元年度日本植物病理学会大会(札幌)で発表した。2.糸状菌で作用するプロモ-タ-領域の探索トマト萎凋病菌をデンプン添加培地で培養したところ、活発なアミラ-ゼ王産が認められたので、アミラ-ゼ王産遺伝子の転写、すなわち本遺伝子のプロモ-タ-活性が強力であると考え、アミラ-ゼ遺伝子の単離とその上流部塩基配列の解析を試みることにした。まず、萎凋病の染色体DNAから遺伝子バンクを作製する目的で、Sai3AI制限酵素で切断したDNAをEmbel3ファ-ジベクタ-に組換え、染色体全部をカバ-するクロ-ンを分離した。次に、アミラ-ゼ遺伝子を単離するため、デンプン添加培地で培養中の菌体からmRNAを分離し、上述の遺伝子バンクと相同性試験を行った。今回の実験によってアミラ-ゼ遺伝子を分離したので、これらの結果を学会発表するとともに、さらにそれらの遺伝子構造を解析する予定である。本研究では,植物病原菌としてトマトの萎凋病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)を使用し,本菌における発現ベクタ-を完成した。すなわち,本菌の染色体からリボゾ-ムRNAをコ-ドする遺伝子を分離し,それを薬剤検定マ-カ-遺伝子の上流および下流域に接続した。

このようにして作製したベクタ-を使用すれば,本研究で分離した遺伝子と相同な部位が,病原菌染色体上に多数存在することから,容易にかつ効果的に導入遺伝子との組換えをひき起こすことが可能となる。また,今回分離した遺伝子は他の病原糸状菌のリボゾ-ムRNA遺伝子とも高い相同性を示すことから,多くの病原菌の適用が可能であった。一方,本遺伝子は単にその染色体導入を可能にするだけではなく、その発現検出にも有効に利用できることが証明された。すなわち,この遺伝子を標識してプロ-ブに使用することで,細胞内における遺伝子発現を直接同定することに成功した。以上の結果は,論文にまとめ,現在日本農芸化学会誌に投稿中である。病原菌におけるベタタ-系の開発は,上記の目的に加え,本研究の最終目標でもある病害防除にも有効に利用できる。病原菌が伸長する際には,その細胞壁の合成が必要であるが,その際に細胞型成分が分泌され,宿主植物にシグナルを与え,植物の抵抗反応を誘導もしくは抑制すると考えられている。そこで本菌の細胞壁を固型NMR法で分析し,その主要成分がキチンーキトサンから成ることを明らかにした。このような事実から,本菌の防除・抑制にはキチン分解酵素が有効であると考え,キチン分解性放線菌を分離するとともに,その生産遺伝子をクロ-ニングし,塩基配列を決定した。これらの結果の一部は、日本農芸化学誌に公表した。また他の一部については米国微生物学会誌に投摘中である。
哺乳類オートファジーの研究、PI3K複合体と下垂体オートファジーによる解析

オートファジーは細胞質内の一部を膜構造体で取り囲み、リソソームと融合することでタンパク質分解を行う大規模タンパク質分解系である。特異的にタンパク質分解を行うプロテアソーム-ユビキチン系と比べ、大規模に、さらに細胞小器官も分解できることが特徴である。障害を受けた不良細胞小器官を恒常的に分解することが品質管理機構として重要であることが考えられている。近年の研究から、オートファジーは非選択的だけでなく、選択的にタンパク質分解を行っていることがわかってきた。しかし、その認識機構についてはよくわかっていない。昨年までの研究から哺乳類オートファジー因子の階層関係やオートファゴソームの形成サイトを同定することができた(ltakura et al.,Autophagy 2010)。そのサイトにはオートファジーの選択的基質であるp62がリクルートされることもわかった(Itakura et al., JCB 2011)。この知見を活かし、さらに今年度はオートファジーによるミトコンドリアの選択的分解(ミトファジー)の認識機構についての研究を発展させた。一連の研究から、1,不良ミトコンドリアはオートファジー因子ULK1,Atg9にそれぞれ非依存的に認識されている。2,LC3-PEを欠損した場合、不良ミトコンドリアをオートファゴソーム内に取り込めなくなるが、オートファゴソームの近くに不良ミトコンドリアが存在する。これらの結果から、不良ミトコンドリアはオートファゴソーム形成サイトにリクルートされ、その場からオートファゴソーム形成が不良ミトコンドリアを包み込むように開始されることがわかった。この発見はミトコンドリアの品質管理不全が関与すると考えられるパーキンソン病などの神経疾患症状発症のメカニズムの解明やその治療法への確立に役立つと考えられる。オートファジーとは一言で説明すると細胞質内大規模蛋白質分解系である。初年度にあたる今年度は主にオートファゴソーム形成の分子機構を中心に解析を進めてきた。現在まで多くの哺乳類オートファジーに関わる蛋白質が同定されたが、それらの関係はよくわかっていない。そこで私はそれらの蛋白質をULK1複合体、Atg14-PI3K複合体、Atg16複合体、PI3P結合蛋白質、LC3の5種類に分類し、それらの間に階層関係があるかどうかをノックアウト細胞またはsiRNAによるノックダウン細胞を用いて解析した。その結果、これらオートファジー蛋白質間には階層関係があり、ULK1複合体、Atg14複合体、PI3P結合蛋白質、Atg16複合体、LC3の順にオートファゴソームに局在していくことなどがわかった。これらのことはオートファゴソーム形成段階をそれぞれの分子の局在で決定できることから、今後オートファゴソーム形成の研究を進めていく上で非常に重要な発見であると考えられる。オートファゴソーム形成はVps34キナーゼ阻害剤であるWortmanninによって阻害されることが知られているが、さらに私はAtg14の飢餓依存的な細胞質内ドット形成はWortmanninによって阻害されないことを発見した。これはAtg14がオートファゴソーム形成サイトに局在している意味する。さらにこのオートファゴソーム形成サイトにはULK1複合体も局在していることがわかった。そしてこのサイトは小胞体上にあることもわかった。これらのことは今まで議論され続けてきたオートファゴソーム膜の起源は小胞体であり、さらにオートファゴソーム形成は小胞外上で開始されることを強く示唆している。これらの結果をまとめ、現在論文を投稿している。またこのオートファジー分子機構の解析が予想以上に進展したことから、来年度も分子機構の解析をさらに推し進めていく予定である。近年の研究からオートファジーは非選択的に細胞質成分を取り囲むだけではなく、選択的にも分解を行っていることがわかってきた。選択的オートファジーの理解は重要である。ダメージを受けたオルガネラやタンパク質を特異的に分解することで細胞ないし個体の恒常性を保っているからである。しかし哺乳類オートファゴソーム形成サイトが不明だっことは、オートファゴソーム形成の詳しい分子機構を調べるための障害の一つであった。初年度から行っている実験がさらに発展し、哺乳類オートファゴソーム形成サイトを同定することができた。この結果より哺乳類オートファゴソーム形成のための研究の基礎ができあがったと考えられる、この結果を用いてさらにオートファジー選択的基質の局在様式の解析にも取り組んだ。今まで選択的基質はLC3との結合だけがその局在に重要であると考えられていたが、実はさらにその前段階として選択的基質はオートファゴソーム形成サイトに集まり、その後、LC3との結合によりオートファゴソームに取り込まれるということを明らかにした。このことは今後オートファジーによる選択的分解が神経変性疾患などにおいて蓄積している不良タンパク質を分解させるのための治療の発展に大きく寄与できると考えられる。これらの結果はイタリアで開催されたGordon Research Conferenceで発表し、さらにAutophagyとJournal Cell Biologyに報告をした。さらにこれらの結果を用いて、来年度もこの詳しい分子メカニズムの解明を目指す。

近年の研究から、オートファジーは非選択的だけでなく、選択的にタンパク質分解を行っていることがわかってきた。しかし、その認識機構についてはよくわかっていない。昨年までの研究から哺乳類オートファジー因子の階層関係やオートファゴソームの形成サイトを同定することができた(ltakura et al.,Autophagy 2010)。そのサイトにはオートファジーの選択的基質であるp62がリクルートされることもわかった(Itakura et al., JCB 2011)。この知見を活かし、さらに今年度はオートファジーによるミトコンドリアの選択的分解(ミトファジー)の認識機構についての研究を発展させた。一連の研究から、1,不良ミトコンドリアはオートファジー因子ULK1,Atg9にそれぞれ非依存的に認識されている。2,LC3-PEを欠損した場合、不良ミトコンドリアをオートファゴソーム内に取り込めなくなるが、オートファゴソームの近くに不良ミトコンドリアが存在する。これらの結果から、不良ミトコンドリアはオートファゴソーム形成サイトにリクルートされ、その場からオートファゴソーム形成が不良ミトコンドリアを包み込むように開始されることがわかった。この発見はミトコンドリアの品質管理不全が関与すると考えられるパーキンソン病などの神経疾患症状発症のメカニズムの解明やその治療法への確立に役立つと考えられる。
ヒト膀胱粘膜病変の加齢による推移に関する病理学的研究

ヒト膀胱における前癌病変やさらに癌にいたる諸変化を解明するために313剖検例の膀胱を展開固定し,粘膜全体を病理組織学的に検索し,各病変の分布と加齢による推移を検討するとともに,手術例より得られた材料を用いて,膀胱粘膜の酵素組織化学および免疫組織化学を行なった.その結果,ブルン細胞巣,腺性膀胱炎などの増殖性膀胱炎や化生性病変は年齢に関係なく高頻度に認められ,膀胱癌との関連性は否定的と考えられた.しかし上皮過形成や上皮異形成は高齢者に多くみられる傾向があり,また発生分布も癌の好発部位である側壁あるいは前後壁におおく,膀胱癌との関連性が強く示唆された.特に上皮異形成は組織学的異型もはっきりとしており,前癌病変としての重要性が高いことが示された.また正常および膀胱癌上皮について17種類の諸酵素の変動を酵素組織学および免疫組織化学的に検索し比較した結果,癌組織ではアルカリフォスフォターゼ(ALP)の軽度の減少, β-グルタミールトランスペプチダーゼ(GTP)と酸フォスファターゼ(ACP)の軽度の上昇, β-グルクロニダーゼ(β-GL)の中等度の上昇,コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)とG6Pデヒドロゲナーゼ(G6PDH)の高度の上昇を,チトクロームP-450のa, b, c, dの4分子種とも軽度から中等度の上昇を,グルタチオンS-トランスペプチターゼ(GST)のμ, π, Iの3型のうちπの軽度の減少を認めた.癌胎児性抗原(CEA)は軽度上昇していた.以上ALPの減少, CEAの出現は癌細胞に共通の脱分化に関与したのであり, P-450の増加と抱合酵素のGST-πの減少は発癌物質の代謝活性化の亢進と同時に解毒機能の低下を示唆するものとか解される.これらのデータからヒト膀胱癌の指標酵素としてはG6PDHとSDHが注目される.ヒト膀胱における前癌病変やさらに癌にいたる諸変化を解明するために313剖検例の膀胱を展開固定し,粘膜全体を病理組織学的に検索し,各病変の分布と加齢による推移を検討するとともに,手術例より得られた材料を用いて,膀胱粘膜の酵素組織化学および免疫組織化学を行なった.その結果,ブルン細胞巣,腺性膀胱炎などの増殖性膀胱炎や化生性病変は年齢に関係なく高頻度に認められ,膀胱癌との関連性は否定的と考えられた.しかし上皮過形成や上皮異形成は高齢者に多くみられる傾向があり,また発生分布も癌の好発部位である側壁あるいは前後壁におおく,膀胱癌との関連性が強く示唆された.特に上皮異形成は組織学的異型もはっきりとしており,前癌病変としての重要性が高いことが示された.また正常および膀胱癌上皮について17種類の諸酵素の変動を酵素組織学および免疫組織化学的に検索し比較した結果,癌組織ではアルカリフォスフォターゼ(ALP)の軽度の減少, β-グルタミールトランスペプチダーゼ(GTP)と酸フォスファターゼ(ACP)の軽度の上昇, β-グルクロニダーゼ(β-GL)の中等度の上昇,コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)とG6Pデヒドロゲナーゼ(G6PDH)の高度の上昇を,チトクロームP-450のa, b, c, dの4分子種とも軽度から中等度の上昇を,グルタチオンS-トランスペプチターゼ(GST)のμ, π, Iの3型のうちπの軽度の減少を認めた.癌胎児性抗原(CEA)は軽度上昇していた.以上ALPの減少, CEAの出現は癌細胞に共通の脱分化に関与したのであり, P-450の増加と抱合酵素のGST-πの減少は発癌物質の代謝活性化の亢進と同時に解毒機能の低下を示唆するものとか解される.これらのデータからヒト膀胱癌の指標酵素としてはG6PDHとSDHが注目される.ヒト膀胱における前癌病変や更に癌に至る諸変化を解明するために剖検例の膀胱を展開固定し、粘膜全体を病理組織学的に検索し、各病変の分布と加齢による推移を検討すると共に、手術例より得られた材料を用いて、膀胱粘膜の酵素組織化学および免疫組織化学を行なった。その結果、本年度では肉眼的正常剖検膀胱及び小粘膜腫瘍の4例を追加検索し、総計315例の膀胱についてのデーターとなった。増殖性病変としてのブルン細胱巣と腺性あるいは、嚢胞性膀胱炎、化生性病変である扁平上皮化生および円柱上皮化生、それに上皮過形成(男31例、女13例)、異形成男13例、女7例)および上皮内癌(男1例)の種々の病変について各膀胱をマッピングし、詳細に検討したところ、上皮異形成に随伴してよく見られた病変はブルン細胞巣や腺性膀胱炎であった。ブルン細胞巣や腺性膀胱炎は年令に関係なく高頻度にみられており、化生性病変と同様に異形成や腫瘍性病変の発生と直接関係のないことが判明した。2例の膀胱腫瘤は非角化重層扁平上皮が乳頭状増殖を示したもので扁平上皮乳頭腫を思わせたが免疫組織化学的にパピローマウイルスの抗原を上皮細胞の核内に認め、膀胱の尖圭コンジローマと診断された。

正常膀胱粘膜の酵素組織学的検索の結果、G6Pデヒドロゲナーゼが陽性を示した他はアルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼおよびG6Pアーゼが弱陽性であった。γ-グルタミールトランスペプチダーゼとATPアーゼは陰性であった。免疫組織化学検索ではグルタチオンS-トランスフェラーゼのπ型が強陽性を示したがμ型とI型は弱陽性、チトクロームP-450のb型が弱陽性、a型、c型、d型が陰性、エポキシドヒドラーゼは陰性であった。
移植後拒絶反応時の末梢血T細胞内カルシウム濃度とMAPK活性

本年度の研究成果は以下のごとくである。現在、本研究はFK506を投与した拒絶抑制モデルおよび少量FK506投与のMild拒絶モデルを作成中であり、今後FK506投与群および少量FK506投与群でのMAPKおよびMAPKK活性を測定する予定である。尚、得られたデータは解析し、平成15年度、日本移植学会、国際移植学会にて報告する予定である。本年度の実験の概要は以下のごとくである.まず,syngenic modelとして雄性Lewis to Lewisの肝移植モデルとHigh responder群,雄性DAラット(Rtla)をドナー、雄性Lewisラット(RT11)の2群での同種性同所性肝移殖モデルを作成した.免疫抑制剤はとしてK506を0.1mg/kg/day筋肉内注射し、上記の2群を、それぞれ術後免疫抑制剤非投与群、術後3日間のみ投与群にわけて、移植後7日目に採血と肝臓を摘出し,(1)末梢血のFK506の濃度、(2)血清中のIFNγ,IL2,IL4,IL10をELISA法で測定した。(3)肝臓組織のH・E染色を行い拒絶反応の程度をBanff分類でgradingした。(4)T細胞内カルシウム濃度は,レシピエントの末梢血T細胞と肝臓内T細胞を採取し各群のドナーのラットの脾臓から採取し放射線照射して不活性化したリンパ球と反応させた際の細胞内カルシウム濃度を、犠死させた際に採取したラット血清中とPBS液中で測定し,データを解析中である.今後,同様のモデルを作成しT細胞内MAPKスーパーファミリーの酵素活性測定:レシピエントの末梢血T細胞と肝臓内T細胞を採取しin vitro測定法でMAPK, MAPKK活性の両者を、またゲル内リン酸化法でMAPKとSAPK/JNK活性を測定する予定である.さらにlow responderとmiddle responderを作成し,同様の検討を行う予定である.本年度の研究成果は以下のごとくである。
造血巣の移動の解析

造血巣は,哺乳類では一般に卵黄嚢→胎子肝→骨髄(一部脾臓または胸腺やリンパ節)と移動し,成熟動物の造血は主として骨髄やリンパ組織で終生行われる。このような造血巣の移動が何故みられるかについてラット胎仔肝における造血巣の変化を追うことによって解析を試みた。この3年間の研究においておよそ以下のようなことを明らかに出来たと考えている。1.ラット胎仔肝造血系細胞に特異的なモノクロナル抗体UB-12に反応する造血系細胞の数をラジオイムノアッセイで測定したところ造血巣の移動が胎仔肝から骨髄に移る様子が定量的に測定できた。2.UB-12に反応する細胞を免疫組織化学的方法やflow cytofluorometryにて解析したところ胎令1416日をピークに急速に造血巣が増加し,やがて出生前の20日令ではほとんど散在性にした造血巣が存在しないことが観察出来た。3.造血系の細胞が胎仔肝に棲みつき増殖する場を与えているのは未熟なタイプの肝実質細胞(hepatocyte)ではないかということが形態学的に(隣接しているなどの点から)示唆された。4.未熟なタイプのhepatocyteを成熟ラットのhepatocyteと比較したところ,その光顕・電顕形態学的な差の他に,肝細胞膜表面抗原に対する各種モノクロナル抗体(HAM18)に対する免疫組織化学,免疫電顕学的解析においても明白な発現の差が確認できた。5.未熟なhepatocyteで,成熟ラットhepatocyteの表面に発現している膜抗原(HAM18)を発現していないか,弱くしか発現していない細胞は,肝細胞に特有の極性(毛細胆管面,接触面,洞様毛細血管面)が少なく,そのような細胞が存在していることと,造血系細胞が増殖していることとの間にかかわりがあることが示唆された。造血巣は,哺乳類では一般に卵黄嚢→胎仔肝→骨髄(一部脾臓または胸腺やリンパ節)と移動し,成熟動物の造血は主として骨髄やリンパ組織で終生行わりる。このような造血巣の移動が何故みられるのかについては,発生・分化の基本的な問題でありきわめて難しい問題である。しかし,移動がみられる場合には,必ず移動して行く場所での急速な造血がみられること,そして移動されてしまう場所では,次第次第に造血が消退して行くようであり,その結果造血巣の移動は完結するようである。従って造血巣の移動がなぜ起るのかを解明するうえで,急速な造血を支える“場"の解明が最も重要であろう。つまり循環血中の造血幹細胞を導き入れ,各種血球へと分化させる母体となる組織(stromal cellなど)が何なのかという点である。そこで,胎仔肝の場合造血が爆発的に起る胎令14日17日の胎仔肝に存在する造血支持細胞の株化を行うことによって造血の仕組みの解明が行えると考える。株化は遊離胎仔肝細胞を作製し10%Fcsを含むRPMI1640培地にて細胞培養して行った。現在までのところ胎仔肝stromallcell株FF5を得ている。この株は線維芽細胞株であり胎仔肝造血細胞に対する支持細胞能はあまり強くはない。胎仔肝造血系の細胞の増殖を支持する細胞株としては他にFFー1(hepatoma細胞株),FFー4(ラット骨髄細胞培養株)を得てその詳細を検索中である。一方胎仔肝造血系細胞に特異的なモノクロナル抗体(UBー12)についての更なる詳細を検索し,その結果を報告している。

すなわち、UBー12陽性細胞はラットの骨髄細胞の約20ー30%を特異的に認めることがわかり、従来報告されているラット造血幹細胞を識別する抗体との比較から、ユニ-クな抗体であることがわかった。これらの解析には設備備品として購入した蛍光顕微鏡用の備品がきわめて役立った。今後UBー12「群を骨髄より分離し,その本体の解明をすすめていく。造血巣は,哺乳類では一般に卵黄襄→胎仔肝→骨髄と移動する。この造血巣の移動が何故みられるのかを肝仔肝における細胞の動態を解析することによって解明していくことが研究の目的である。その場合に造血幹細胞を流血中より迎え入れて各種血球へと増殖分化させる支持細胞が重要になる。昨年は線維芽細胞様株(FFー5)について解析を加えたが,今年度は,幼若型の肝実質細胞が,赤芽球系などの増殖を支持する細胞ではないかと考え解明してきた。胎仔肝において最も造血が盛んに行われている時期(胎令12ー14日頃)に存在する肝実質細胞は,成熟ラット肝実質細胞にみられる特徴(sinusoidal face,bileーcanalicular face及びcontiguous faceの3つの極性を保持している)を備えておらないか,きわめて不完全にしか備えていないことが,胎仔肝実質細胞の表面抗原の解析から明らかに出来た。そして極性を持たない未分化な肝実質細胞のまわりにおいて造血系細胞は都合よく増殖分化を行うことになると考えられる。おそらく,このような未分化な肝実質細胞からは血球増殖因子が有意に分泌されていることであろう。このような幼若胎仔肝実質細胞に何らかのシグナルが与えられて,成熟ラット肝実質細胞にみられるような機能を備え,極性のはっきりした実質細胞へと成熟することになり,結果的には造血系の未熟な細胞が到来しても,もはや充分に増殖を促す場を提供出来なくなっているように思われる。現在このような造血系細胞の増殖を促す能力を備えた幼若肝実質細胞の株化を進めている。またこのような未熟な実質細胞と相互作用を行うための膜表面抗原が胎仔肝造血系細胞の膜表面に存在すると思われ,既に我々が確立している胎仔肝造血系細胞に特異的なモノクロナル抗体(UBー12)の認める細胞膜抗原の単離精製を進めている。また,モノクロナル抗体(UBー12)の妊娠ラットへの投与によって胎仔肝造血巣への影響を検索中である。造血巣は,哺乳類では卵黄嚢→胎仔肝→骨髄と移動する。この造血巣の移動が何故みられるのかを胎仔肝における細胞の動態を解析することによって解明していくことが研究の目的である。ラット胎仔肝造血においては胎生の12日16日に,流血中の造血幹細胞を引き入れてそれを増殖に向かわしめる最も重要な時期であると考えられた。これまでの研究で,この時期に存在する肝実質細胞(hepatocyt)がそのような造血支持細胞としての能力を発揮しているものと考え,そのような細胞の形態的特徴などを解析してきた。また,昨年までに光顕レベルの免疫組織化学的手法を用いて,胎仔肝実質細胞の表面には,成熟ラット肝実質細胞が発現しているような膜抗原(HAM4,HAM2,HAM8抗原など)をほとんど発現しておらず,ようやく胎生末期で,造血巣が胎仔肝から消失して行く頃になると発現して来ることを示した。そこで今回そのような膜抗原の発現の程度を,更にイムノゴールドを用いた免疫電顕法を用いて解析したところ,HAM4抗原は胎令18日頃に肝実質細胞の表面に確認できた。他の膜抗原についても類似の所見が得られた。
腸内細菌による高分子ポリフェノール代謝物の新たな疾病予防機構の検討

平成31年度実施予定の動物試験で使用する高分子ポリフェノールを調製するため、リンゴ未熟果より果汁を調製し、酵素処理によって清澄化した後、Daiaion HP-20カラムに負荷し、ポリフェノール画分を分離した。さらに、プロシアニジン画分を抽出、調製した後、凍結乾燥した。次に、順相クロマトグラフィーによって、プロシアニジン類は重合度(カテキンの結合数)別に分離、調製した。一方、得られた重合度別のプロシアニジン試料やポリフェノール標準品の腸管バリア機能への影響を評価するため、ヒト上皮細胞株Caco-2細胞(理研セルバンクより購入)を2週間10%FCS含有ダルベッコ変法イーグル培地で培養(37°C、5%CO2)後、各濃度のポリフェノール試料を添加し、48時間透過性の変化を評価した。すなわち、DMSOに溶解したポリフェノール試料を管腔側に添加後、Caco-2細胞膜の管腔側と基底膜側の電気抵抗値(TER)を経時的に48時間測定した。現在、ポリフェノール類やその代謝物(15種類)のCaco-2細胞の電気抵抗値の計測が終了した。さらに、高分子ポリフェノールやいくつかの代謝物の気抵抗値に及ぼす影響を評価するとともに、ムチン産生能(Muc1およびMuc2)やタイトジャンクション関連因子(Occludin、ZO-1)のmRNA発現量を評価する。リンゴからの高分子ポリフェノールの調製は終了したものの、Caco-2細胞のバリア機能の評価では、当初予定していたポリフェノールや代謝物の試料数に達していない。しかしながら、評価系の構築は終了していることから予定通りの試料の評価をすることが可能であると考えている。平成30年度に引き続き、Caco-2細胞を使いポリフェノールやその代謝物の腸管バリア機能への影響を評価する。また、当初の計画通り、12週間高分子ポリフェノールを摂取させた肥満モデルマウス(C57BL6Jマウス)から糞便、尿を採取し、代謝物を調製してCaco-2細胞による腸管バリア機能改善効果を評価する。研究は概ね当初の計画通り進行していると考えているが、研究を効率よく行い、研究費の節約に努めている。また、来年度は、各種ポリフェノールを暴露したCaco-2細胞での腸管バリア機能に関連する遺伝子解析のため、再度細胞の採取を行う。また、本年度は国際ポリフェノールと健康学会での発表する予定であるため研究費はほぼ使用することになると考えている。
ES/iPS細胞を用いた幹細胞化学発がんメカニズムの解析

近年,がん組織中にがん幹細胞が発見され,その起源の一つとして幹細胞のがん化が指摘されている.本研究では,強力な発がん物質である7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセンがマウス胚性幹(mES)細胞に対して引き起こすDNA損傷や異物代謝酵素誘導,未分化状態への影響を検討した.その結果,mES細胞は発がん物質の標的となること,DNA損傷により増殖停止・分化誘導されることが示唆された.この分化誘導は,異常な幹細胞を排除するという幹細胞防御機構の一つであると考えられる.生体内にはごくわずかに組織幹細胞が存在し,自己複製と分化を繰り返して臓器あるいは組織をメンテナンスすることにより,生体の恒常性を維持している.近年,がん組織においても自己複製および分化することができる幹細胞様の細胞集団「がん幹細胞」が発見されている.がん幹細胞の起源にはいくつかの経路が考えられるが,本課題では「幹細胞のがん化」について検討することとした.既に多くの研究で明らかとなっている強力な発がんイニシエーターである7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン(DMBA)がマウス胚性幹(mES)細胞に対して引き起こすDNA損傷や異物代謝酵素誘導,未分化状態への影響を検討した.これまでに,DNA損傷および異物代謝酵素誘導の程度をマウス胎児性線維芽細胞(MEF)と比較し,未分化状態にある細胞もDMBAによって異物代謝酵素が誘導され,DNA損傷が誘発されることを明らかにした.その損傷レベルはCyp1b1のmRNA発現レベルと相関していた。このDNA損傷が誘発される条件でmES細胞を培養すると未分化状態を維持するために必要ないくつかの遺伝子群が大きく変動し,用量依存的に発現低下を引き起こすことが明らかとなった.この時,mES細胞のコロニーサイズは対照群と比較して小さかったことから,mES細胞の細胞周期が停止していると考えられる.しかし,mES細胞の細胞周期を薬物を用いて停止させてもmES細胞の未分化状態に影響を与えないことが報告されており,このことから今回観察されたDMBAによる細胞周期の停止およびそれに続く未分化状態の破たんは,DNA損傷に起因するものであり,すなわち「幹細胞の品質保証機構」の一端であると考えられる.近年,がん組織中にがん幹細胞が発見され,その起源の一つとして幹細胞のがん化が指摘されている.本研究では,強力な発がん物質である7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセンがマウス胚性幹(mES)細胞に対して引き起こすDNA損傷や異物代謝酵素誘導,未分化状態への影響を検討した.その結果,mES細胞は発がん物質の標的となること,DNA損傷により増殖停止・分化誘導されることが示唆された.この分化誘導は,異常な幹細胞を排除するという幹細胞防御機構の一つであると考えられる.生体内にはわずかに組織幹細胞が存在し,自己複製と分化を繰り返して生体の恒常性を維持している.近年,がん組織においても増殖・分化するがん幹細胞が発見され,その起源の一つとして幹細胞のがん化が挙げられる.本研究では,強力な発がん物質イニシエーターとして知られる7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン(DMBA)がマウス胚性幹(mES)細胞に対して引き起こすDNA損傷や異物代謝酵素誘導,未分化状態への影響を検討した.また,これらの影響の程度をマウス胎児性線維芽細胞(MEF)と比較することにより未分化細胞特有の応答をについて検討した.DMBA処理により両細胞ともDNA付加体量が増加し,それはMEFにおいて顕著であった.化学物質非存在下により,Cyp1a1発現は両細胞で同程度だが,Cyp1b1はMEFにおいて高発現であった.また,DMBA処理によりSox2発現・ALP染色陽性細胞が減少したことから,mES細胞が分化傾向を示していることが確認された.一方,3-メチルコラントレン処理では,Cyps発現誘導は確認されたが,DNA付加体は検出されず,mES細胞の未分化状態に影響を及ぼさなかった.したがって,未分化状態の破綻にはDNA損傷が寄与していると考えられる.以上の結果から,mES細胞は発がん物質の標的となること,DNA損傷により分化誘導されることが示唆された.この分化誘導は,異常な幹細胞を排除するという幹細胞防御機構の一つであると考えられる.平成23年度には、主にDNA付加体の測定とその分子メカニズムの解析、メチル化シトシン量を測定する高感度分析法の確立とその適用について実施してきた。これらの点については、大きく進展しているといえる。一方、ルシフェラーゼ発現マウス胚性幹細胞(Luc-ES細胞)の樹立に関しては、本学における遺伝子組み換え実験規定の大幅な改定と重なったため、新規の遺伝子組み換え実験に対する承認審査が滞っていた。したがって、平成23年度内でのLuc-ES細胞の樹立には至っていない。以上を総合し、本課題はおおむね予定通り進行していると判断した。達成度の項でも述べたように、平成23年度内でルシフェラーゼ発現マウス胚性幹細胞(Luc-ES細胞)の樹立には至らなかった。そのため、細胞樹立およびin vivoイメージングのために見積もっていた実験動物やイメージング試薬などの費用を平成24年度に持ち越すこととなった。したがって、今後の研究推進方策としては、早急にLuc-ES細胞を作製し、in vivoイメージング法を用いた幹細胞のがん化を評価するための実験系を確立する。また、それと並行して、ヒト幹細胞での化学発がん物質に対する応答を評価するために予定している女性ヒトiPS細胞の樹立も進める。平成24年度の研究費は、主に消耗品に使用する。

その内訳として、実験試薬、放射性試薬、細胞培養試薬、プラスチック消耗品、および実験動物などが挙げられる。また、得られた研究成果を国内・国際学会で報告するとともに、学術論文へ掲載するための費用としても使用する。上記は、研究費申請当初の配分計画に沿った内容で見積もっている。