hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
敗血症病態における遺伝子認識型受容体シグナルのノックダウン解析

敗血症は,救急・集中治療の対応する重症病態として知られている。敗血症は,菌やウイルスに対する全身性炎症であるが,未だに抗菌薬以外に炎症を制御する有効な治療法が確立されていない。本研究では,siRNAを投与してFADD、TAK-1等の遺伝子転写を阻害する事により敗血症モデルマウスの生存率を改善し、これが遺伝子認識型受容体の肺,腎臓,大動脈のLC3発現量と活性化の両者を抑制する結果である機序を明らかにすると共に,電子顕微鏡像においても敗血症病態でのオートファゴソーム形成が亢進せずに,正常化している事を見出した。遺伝子認識型受容体シグナルの抑制により、細菌感染症、ウイルス感染症、遺伝子治療に随伴する臓器炎症を軽減できる結果に繋がると考えられ、重症感染症における新規創薬を提案する意義を持つと言える。本研究では,盲腸結紮穿孔により敗血症を生じた敗血症マウスモデル,およびインフルエンザRNAセグメントなどの静脈内投与を用いて,遺伝子認識型Toll-like受容体(TLR3, TLR7, TLR8, TLR9)の作用と発現を,脳,肺,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,腸管,膵臓,血管などで評価した。一方,TLR3, TLR7, TLR8およびTLR9のsiRNAにより,これらの発現量をあらかじめ減少させても,肺におけるNF-κBやAP-1の活性を抑制できず,48時間以内に研究に用いた10例全例が死亡した。一方,TLR9リガンドとしてCpG DNA,TLR3/7/8リガンドとしてインフルエンザウイルスRNAセグメントを尾静脈より静脈内投与した研究系では,TLR3, TLR7, TLR8およびTLR9のsiRNAによる発現減少により,各々10例がすべて生存した。細菌性感染による敗血症病態では,TLR3, TLR7, TLR8,およびTLR9は,敗血症病態の増悪に強く関与していない可能性が示唆された。しかし,ウイルス感染では,TLR3, TLR7, TLR8,およびTLR9が生存に関与する可能性が示唆された。肺,心臓,腎臓,血管系などのマウスの主要臓器細胞におけるToll-like受容体(TLR)3/7/8/9と細胞内情報伝達シグナルの発達差を解析し,さらにTLR3/7/8/9シグナルに関与する分子の遺伝子ノックダウンをマウスに施し,主要臓器の基幹細胞におけるTLR3/7/8/9シグナルの特異的作用を明らかとすることを目的とした。遺伝子導入後にイソフルラン麻酔下で摘出した肺,心房筋,腎臓,大動脈などより抽出した蛋白にはTLR3/7/8/9 mRNAが回収できたが,盲腸結紮穿孔による敗血症過程では,これらが増加することはなかった。肺の免疫沈降法ではTLR9はadaptor protein 3やMyD88と会合することが確認され,TLR7もMyD88と会合することが確認された。一方,TLR3はTRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β)以外にも会合する数種に蛋白があることが確認できた。このような状況において,盲腸結紮穿孔により敗血症病態としたマウスの肺では,転写因子NF-κBの核内移行は盲腸結紮穿孔後3時間から10時間で高まった。TLR3やTLR9の肺における発現をsiRNAで抑制したマウスでは,盲腸結紮穿孔後初期の肺のNF-κB活性を抑制することができたが,後期のNF-κB活性を抑制することはできなかった。盲腸結紮穿孔後10時間ではTLR3とTLR9の肺における発現は低下しており,これらの受容体シグナルが低下している可能性が示唆された。本研究は,感染症増悪時の多臓器不全発症の機序を解明するという学術的特色を持つ。本研究におけるTLR3/7/8/9シグナルの評価により,細菌感染症,ウイルス感染症,遺伝子治療に随伴する臓器炎症を解明できる結果が予想される。。TLRなどの受容体ノックダウンが難しいものの,研究は概ね順調に進行している。TLR3/7/8/9受容体のノックダウンに必要とするsiRNAの設計に基づいた遺伝子配列の発注や,TLR3/7/8/9受容体シグナルに関与するTRAF, TRIF,TAK-1, FADDなどのアダプター分子などのsiRNA作成のための費用,そしてそれらが遺伝子レベルでノックダウンされているかのmRNA発現解析,そして培養細胞飼育などの費用として,すべて単体が5万円を超えないレベルの消耗品として研究費を使用する。
細胞極性崩壊による発癌機構に着目した婦人科腫瘍の悪性化予測バイオマーカーの開発

CAGE法による網羅的転写産物解析を行い、異形成細胞に比べて頸癌細胞では細胞極性、接着系遺伝子群が制御されていることがわかった。また、異形成細胞に特異的なHPV由来のPolyA付加のないアンチセンスRNAを新規に同定した。分子生物学的検討では、細胞極性制御因子であるhScribがRas-ERK経路を制御する機能を持つこと、脱リン酸化酵素Protein Phosphatase 1γ(PP1γ)がhScribと直接結合することで、ERK経路を負に制御することを証明した。また、PP1γが、子宮頸部の前癌状態から癌への進行に伴い細胞内局在異常をきたしており、病変の進展マーカーとなり得ることを報告した。子宮頸部異形成レベルの細胞と、子宮頸癌細胞を比較し、ハイリスクヒトパピローマウイルス(以下HPV)感染から子宮頸癌に至る癌化の過程について、HPVと細胞の両者の網羅的遺伝子発現解析によって発癌予知バイオマーカーを探索することを目的とした。子宮頸部異形成レベルの細胞(W12E)と子宮頸癌細胞(CaSki, SiHa)に関して、次世代シークエンサーを用いた網羅的オミックス解析とバイオインフォマティクス技術で遺伝子発現を検討した。HPVには9つの蛋白質発現に至る(コードされた)遺伝子があるが、HPVゲノム由来のコードされていない(ノンコーディング)RNAは同定されていない。1) CAGE解析の導入:HPV16陽性のCIN1由来のW12細胞と子宮頸癌細胞株SiHa、CaSki細胞のRNAを抽出し、細胞内の全RNAの5'端にマーカーをつけ、次世代シークエンサーで網羅的オミックス解析(CAGE法)を行った。CAGE法により細胞内の全転写物の転写開始点とRNA量がわかる。全ノンコーディングRNAをウイルスもしくは細胞ゲノム上にマッピングした。2)全転写開始点の同定: HPV16ゲノムにマッピングされたノンコーディングRNAの各転写方向と転写産物を確認し、転写開始点を網羅的に同定した。また細胞および臨床頸部検体での、新規に同定された転写物をクローニングした。3)ウイルス側の解析:新規に同定された転写物の発癌メカニズムにおける役割を検討するために、その転写物の発現ベクターを作製し、培養細胞で強発現させ、HPV16陽性細胞に与える影響を調べた。4)細胞側の解析:バイオインフォマティクスのデータベースを用いて遺伝子発現解析を施行し、CINから癌へ至る過程で上方制御、および下方制御されている遺伝子群をそれぞれ抽出した。ハイリスクのHPV特有の発癌モデルを解明する目的で、前癌状態である子宮頸部上皮異形成から癌化に寄与するメカニズムについて分子細胞生物学的な検討を行った。本年度は主に培養細胞を使用した検討を行った。正常ヒトケラチノサイト(HaCaT細胞)を使用して、RNAi法で細胞極性決定因子の一つであるScribbleをknock downさせ、ERKの活性化をWestern blot法、蛍光免疫染色法で検討した。HPV16型陽性CaSki細胞、HPV18型陽性HeLa細胞を用いて、RNAi法でE6癌蛋白をノックダウン後、Cell fractionationを行った。ウエスタンブロット法、蛍光免疫染色により、hScrib-PP1複合体の発現、細胞内局在の変化、ERK系路依存的増殖能獲得について調べた。またHPV陰性HaCaT細胞およびC33a細胞、293細胞に16型E6あるいは18型E6 DNAを遺伝子導入し、hScrib-PP1複合体への影響を検討した。また、HPV16型および18型陽性子宮頸癌組織に対して免疫組織染色を施行し、hScrib-PP1複合体の異常発現と病理組織像との関連について調べた。培養細胞および子宮頸癌組織の検討から、HPV16陽性子宮頸癌では、E6癌蛋白とhScribが結合する事により、細胞質にhScrib-PP1複合体が過剰発現をする事がわかった。しかし、18型陽性子宮頸癌腺癌ではE6癌蛋白とhScrib-PP1複合体に一定の相関関係は認められなかった。また、病理学的検討ではhScrib-PP1複合体の細胞質内過剰発現と扁平上皮癌、未分化癌では有意な相関関係が認められた。Scribbleが細胞内で正常発現ができなくなると、PP1やERK経路のシグナル異常を引き起こし、子宮頸部で癌化を来すことがわかった。ハイリスクHPV感染から子宮頸癌に至る癌化の過程について、発癌過程に関与するメカニズムを検証し、癌化を予測できる診断薬や治療薬開発へと応用することを目的とした。網羅的転写産物解析(CAGE法)による検証:全ヒトゲノムシークエンス側にマップされた全転写産物の発現解析をもとに、バイオインフォマティクスのデータベースを用いた発現解析(KEGGパスウェイ解析)を施行し、その生物学的解釈を行った。

CINから癌へ至る過程で上方制御、および下方制御されている転写産物群をそれぞれ抽出した。プロテオミクス解析による検証:細胞抽出液中で免疫沈降されたhScrib蛋白質を用いて、マススペクトロメトリーによる質量解析を行い、蛋白複合体の同定を行った。次にリン酸化蛋白質分析によりhScrib内リン酸化部位とリン酸化伝達系について検討を行った。CAGE法による網羅的オミックス解析によって得られた宿主側の転写産物のうち、CIN1細胞株に比して、頸癌細胞株で最も抑制されていた遺伝子群が細胞極性・接着系であった。また、リン酸化蛋白質分析によりhScribのリン酸化部位とリン酸化伝達系について検討を行ったところ、ERKとhScribは特異的配列を介して直接結合することで、Ras-ERK系路の活性化と増殖能獲得を抑制することがわかった。さらにhScribのリン酸化機構を制御する蛋白質としてプロテインホスファターゼ(PP1γ)を同定した。また臨床検体を用いた検証では、子宮頸癌組織ではPP1γの細胞内発現が、約20%の検体で消失していること、CIN組織では異型度の段階が上がるに従い細胞内局在に異常をきたすこと、を確認した。婦人科腫瘍学子宮頸部上皮異形成細胞株であるW12E細胞には16型HPVがエピゾームとして存在しているが、子宮頸癌細胞株であるCaSKi細胞あるいはSiHa細胞では16型HPVが宿主側のゲノムにインテグレーションされている。次世代シークエンサーを用いた網羅的解析によりウイルス側、細胞側の全ての転写物を確認することで16型HPV感染により細胞が発癌へ向かう過程を検討した。その結果、16型HPV感染細胞ではウイルス側の転写開始点がセンス鎖に22個、アンチセンス鎖に8個あり、未知の転写物が含まれていた。未知の転写物のうち、最も発現量の高い転写物は、HPV16のE1遺伝子上に転写開始点があり、アンチセンス鎖方向のノンコーディングRNA(E1アンチセンス)であった。一方で、細胞側のCIN由来W12細胞に比して、子宮頸癌細胞株で最も抑制されていた遺伝子群が、細胞極性・接着系であった。PDZドメイン蛋白質の下流で作用する遺伝子群が網羅的オミックス解析によっても抑制されていることが確認された。ScribbleなどのPDZ蛋白は早期癌の悪性化予知マーカーになりうる可能性があるとともに、PDZ binding motif (PBM)は配列特異性が高いため、例えばE6癌蛋白に結合をすることができないような、配列特異的な阻害剤を作成することが可能と考える。また、hScrib-PP1複合体はHPV16型陽性子宮頸部扁平上皮癌では細胞質に異常発現することで、ERK系路依存的な増殖能の獲得をしている。しかし、18型陽性子宮頸部腺癌ではhScrib-PP1複合体は異なる役割をしている可能性が示唆され、腺癌の発癌過程には別の機構が存在している事がわかった。本研究の結果、CAGE法によりHPVゲノム由来のアンチセンスRNAを新規に同定した。E1アンチセンスは、頸癌細胞で欠失し、E1発現を相補的に負に制御することから、CINからの発癌を抑制するバイオマーカーとなりうる。
労使関係法原理と公務員法原理の調整という視角からの公務団体交渉・協約法制の研究

アメリカ合衆国・ドイツ及びフランスにおいて公務員の団体交渉及び労働協約締結に関してインタビュー等を通じた実地調査を行い、私企業部門を基礎にして構築された労使関係法原理と、国民・住民の公務員に対する統制法理を中核とする公務員法原理とが制度上どのように調整され、その制度が実際上どのように運用されているのか、それら制度と運用の実態にどのような長所と問題点があるのかを研究した。2011年3月22日から同月29日(30日に日本に帰国)まで研究代表者の渡邊及び連携研究者の同志社大学教授大島佳代子が合衆国に出張し、その間、カリフォルニア州オークランド市に設けられているCalifornia State Mediation and Conciliation Service、同州サクラメント市にあるPublic EmploymentRelations Board(PERB)、及びUniversity of Berkeleyを訪れ、California State Mediation and Conciliation ServiceのsupervisorであるPaul Roose氏、PERBのOffice of the General CounselのDivision ChiefであるLes Chisholm氏、及びCPERのEditorであるCarol Vendrillo氏と面会し、カリフォルニア州の公務員労使関係に関するインタビューを行った。また、PERB及びCPERでは資料収集も行った。これら資料収集・インタビューを通じて、カリフォルニア州における公務員労使関係の実態、そこで発生している諸問題に対応するための法制度、当該法制度のもつメリット・デメリット、そこで展開されている解釈論の内容に関する知見を得ることができた。また、当初インタビューを行うことを予定していたPERBのAdministrative Law JudgeであるDonn Ginoza氏とは、インタビュー予定の日に氏がインフルエンザで欠勤したことから面会できなかったが、インタビューで予定していた質問項目(カリフォルニア州の公務員労使関係に関する問題のうち、主として団体交渉事項に関する質問)を氏の同僚職員に渡したところ、後日Ginoza氏より上記質問に対する解答を内容とするメールが送信され、これによって、カリフォルニア州の公務員労使関係における団体交渉事項の内容と性格づけを知ることができた。本研究では平成22年度にカリフォルニア州の調査を行ったが、その結果、合衆国各州で公務員制度改革の動きがあることが判明した。そこで本研究では、当初平成23年度に予定していたドイツ・フランスの調査研究に代え、平成22年度に引き続き合衆国の調査を行うこととし、平成23年度中に研究代表者が、'来年度予定されていたニュー・ヨーク州の調査を、連携研究者である同志社大学政策学部大島佳代子教授とともに行い、コロンビア大学において、コロンビア大学ロースクールLance Liebman教授(雇用関係法・労働法)及び同大学ロースクールMark Barenberg教授(雇用関係法・労働法)と面会し、ニュー・ヨーク州及びニュー・ヨーク市の公務員労使関係における団体交渉・協約締結の制度及び実態につきインタビューを行った。Liebman教授はニュー・ヨーク市の実態に精通しており、Barenberg教授は、わが国で言えば平成23年度後期にコロンビア大学ロースクールで公務員法に関する講義を開講していることから、きわめて有意義なインタビューとなった。特にこのインタビューを通して、合衆国全体における公務員の団体交渉・協約締結をめぐる法状況、近年におけるその変化、それら全体状況と比較した場合のニュー・ヨーク州及びニュー・ヨーク市の法状況の特徴に関する知見を得ることができた。これらはわが国において必ずしも十分に明らかにされていない点を多く含んでおり、今後わが国における公務員の団体交渉制度・協約制度を検討する上で参照に値する点を多く含むものである。また、前年度に行ったカリフォルニア州における各種のインタビューの内容を翻訳し、本研究の研究代表者・連携研究者間で情報共有するとともに、それらインタビュー等を通して得られた知見を起訴とした視点を用いて、わが国において現在試みられている公務員制度改革では必ずしも十分には問題として意識されていない点(具体的には、締結された協約を法制度化する際に発生する可能性のある問題)について、平成23年度に発表した拙稿において問題提起を行った。平成24年度においては、連携研究者の根本到教授がドイツにおける公務員制度の概略、公務員の労働基本権、特に協約締結権と勤務条件決定制度等の、公務労使関係法制の制度状況について、2013年2月16日から22日の間、ドイツで実地調査を行った。また晴山一穂教授がフランスのパリにおいて、2012年12月22日から12月30日の間、フランス政府「国家改革・地方分権・公務員省」の公務員制度総局を訪問し、国際関係・比較政治分析担当課長補佐Gerardine Achard-Bayle氏及び同専門員Sandra Laquelle氏からフランスの公務員制度がおかれている現状及び改革課題についてヒアリングを行った。さらに研究代表者の渡辺賢と、連携研究者の大島佳代子教授が北海道大学に出張し、中村睦男北海道大学名誉教授及び道幸哲也北海道大学教授と面談を行い、公務員の団体交渉制度の現状とその問題点、及び今後の見通しに関する意見交換を行った。アメリカ合衆国における調査では、当初の計画以上に多様な相手方とインタビューを行うことができ、当初の想定以上に多様な視点を獲得することが実現できている。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では平成23年度に予定していた、連携研究者である晴山一穂専修大学教授によるフランスの調査及び根本致大阪市立大学教授によるドイツの調査を平成24年度に行い、フランス・ドイツとの比較研究を行う。

また、東京在住の晴山一穂教授に来阪してもらい、大阪市立大学において研究代表者・連携研究者相互間で、これまでの研究成果を確認するとともに、今後の研究の具体的なあり方を確定する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
環境維持のための教育:仙台広域圏RCEでの活動に関連した、生態学、環境的な知識や価値の利用

生態学的影響に関する学生の知識レベルを調査し,講義によるその変化を評価し,日本とガーナの小学校・中学校・高校の生徒と大学の学生に対して比較調査することを目的とした.調査の方法は,1)食肉生産が森林伐採と気候変動の課程に与える影響について事前調査を行い,2)事前調査のあとに,生態学的持続性(EcoS : ecological sustainability)について講義を行うことによって彼らの気づきを促し,3)事後調査として,それらに対する姿勢と認識がどの様に変化するかを再び評価した.調査の結果、食肉生産の生態学的影響(森林伐採と気候変動の課程に与える影響)についての知識が顕著に増加し,使うことの出来る基本的な生態学的用語や概念,また,社会的な活動についての理解も深まったことが示された.講義の後には,回答者が持続不可能な行動をとろうとする意志の少なくとも一部は減少した.テレビや雑誌などのメディアは生態学的知識の情報源としては,一般的に低かった.ガーナ人は,蛋白源は魚が多く,その次に鶏肉,豚肉,そして牛肉の順番となった.日本人の蛋白源は,肉が多かった.年齢が低いと牛肉を食べ,年齢が上がるに従って鳥の割合が増加し,豚は3番目だった.生態学的影響に関する学生の知識レベルを調査し,講義によるその変化を評価し,日本とガーナの小学校・中学校・高校の生徒と大学の学生に対して比較調査することを目的とした.調査の方法は,1)食肉生産が森林伐採と気候変動の課程に与える影響について事前調査を行い,2)事前調査のあとに,生態学的持続性(EcoS : ecological sustainability)について講義を行うことによって彼らの気づきを促し,3)事後調査として,それらに対する姿勢と認識がどの様に変化するかを再び評価した.調査の結果、食肉生産の生態学的影響(森林伐採と気候変動の課程に与える影響)についての知識が顕著に増加し,使うことの出来る基本的な生態学的用語や概念,また,社会的な活動についての理解も深まったことが示された.講義の後には,回答者が持続不可能な行動をとろうとする意志の少なくとも一部は減少した.テレビや雑誌などのメディアは生態学的知識の情報源としては,一般的に低かった.ガーナ人は,蛋白源は魚が多く,その次に鶏肉,豚肉,そして牛肉の順番となった.日本人の蛋白源は,肉が多かった.年齢が低いと牛肉を食べ,年齢が上がるに従って鳥の割合が増加し,豚は3番目だった.
高等植物における硝酸還元酵素の生体内動態に関する研究

硝酸還元酵素(NR)の生体内分解機構を解明するためには,先ずNRそれ自体の構造を知る必要があると考え,タンパク質化学的および分子生物学的手法を用いて検討した。その結果,ホウレンソウ緑葉NRは2つのサブユニットから成る酵素であり,そのサブユニット内に,各々FAD,ヘム,モリブデンを含む3つのドメイン構造が存在することを明らかにした。これら各ドメインの1次構造のホモロジ-は植物問で比較的高い。しかし,これらドメインとドメインの間を連結する領域のホモロジ-は低かった。しかし,FADドメインとヘムドメインの間には,Staphylococcus aureus V8プロテア-ゼによって切断される部位が,まヘムドメインとモリブデンドメインの間には,トリプシンで切断される部位が様々な植物のNRに広く保存されていることが明らかとなった。これは,NRの生体内でのタ-ンオ-バ-速度が速いことと何らかの関係があるものと推定された。いっぽう,ホウレンソウ緑葉中には,プロテア-ゼ活性をもたないタンパク質性NR不活性化因子(NRI)の存在することが知られているが,その実体は不明であった。そこで今回,このNRIの単離精製を試みた。pH5処理,SE53クロマトグラフィ-,ConAセファロ-スクロマトグラフィ-,クロマトフォ-カシング,HPLCにより,ホウレンソウ緑葉粗抽出液からNRIを16,000倍にまで精製することに成功した。精製NRIは,分子量110,000の糖タンパク質であり,分子量53,000のサブユニット2個から構成されていることが判明した。またサブユニット間は,ジスフィド結合で結合していることも明らかとなった。このNIは,NRに結合するタンパク質ではないので,その不活性化機構は大変興味深いが残された課題である。本年度は、ホウレンソウの細胞内に硝酸還元酵素(NR)の分解中間体が存在することを確認すること、またNRに対する全長CDNAを単離することに重点をおいて研究を進めた。先ずNRの分解中間体を単離するために次のような実験を行った。NRの分解中間体は細胞内で速やかに代謝されるものと考えられるので、細胞摩砕時にプロテア-ゼ阻害剤を共存させることで分解産物がさらに低分子化されるのを防いだ。また、ホウレンソウ緑葉から抽出されたNRの分解中間体は、抗NR抗体を固定化したカラムに吸着させることで高濃度に濃縮することができた。抗体カラムから得られた分解中間体の同定には、NRに対するモノクロ-ナル抗体(MC)を用いた。このMCは、NRのサブユニット内に存在する3つのドメインのうち、FADを含むドメインを特異的に認識する。このドメインは、NRのC末端領域に位置していることがわかっている。本実験で得られた6つのNR分解中間体のうち、MCと反応したのは、110、100および44KDaのポリペプチドであった。この結果から、各断片のNR分子中での位置関係を推定し、さらにNRの分解過程を推測することが可能となった。いっぽうin vitroでNRを加水分解するトリプシンおよびスタフィロコッカスアウレウスのV8-プロテア-ゼの作用部位を特定するためにNRに対するcDNAを単離し、その構造解析を試みた。その結果、トリプシンはアルギニン-251の、またV8-プロテマ-ゼはグルタミン酸-369のカルボキシル基側に作用することを明らかにすることができた。1).ホウレンソウ硝酸還元酵素(NR)に対するCDNAを単離し,その構造を解析し,アミノ酸配列を推定した。一方精製NRのトリプシンおよびVー8プロテア-ゼによる消化

断片を得,そのN末端配列を決定し,先に得られたNRの1次構造と比較することから,これらプロテア-ゼの切断部位を推定した。さらに他起源のNRの1次構造をホウレンソウNRの1次構造と比較したところ,これら切断部位は,比較的ホモロジ-の低い“可変領域"に存在していることが明らかになった。しかしながら,これらプロテア-ゼによって切断される部位は,これに可変領域内によく保存されてることも見い出すことができた。このプロテア-ゼに切断され易い部位が高等植物のNRに広く共通していることは,この部位が生体内におけるNRの分解機構に何らかに関与があるものと考えた。2).NR不活性因子(NRI)を,ホウレンソウ緑葉から単離精製し,その作用様式を考察した。NRIは約53KDaのサブユニット2個から成る糖タンパク質である。従来NRIは,ある種のプロテア-ゼか結合タンパク質ではないかと考えられていた。しかし,今回精製されたNRIにはプロア-ゼ活性もNRへの結合能も認められない。ところが今回単離されたNRIには基質となるNR分子を2つ,3つと互いに非共有結合的につないでいき,巨大なNR分子集団を形成する作用のあることが明らかとなった。このNR分子の巨大化に伴なってNRのもつNADH依存活性が選択的に失活した。これらのことはいわゆる“分子シャペロン"様の作用がNRIにあることを示しており,今後このタンパク質の真の生体内での機能を考えていきたい。硝酸還元酵素(NR)の生体内分解機構を解明するためには、先ずNRそれ自体の構造を知る必要があると考え,タンパク質化学的および分子生物学的手法を用いて検討した。その結果,ホウレンソウ緑葉NRは2つのサブユニットから成る酵素であり,そのサブユニット内に,各々FAD,ヘム,モリブデンを含む3つのドメイン構造が存在することを明らかにした。これら各ドメインの1次構造のホモロジ-は植物間で比較的高い。しかし,これらドメインとドメインの間を連絡する領域のホモロジ-は低かった。しかし,FADドメインとヘムドメインの間には,S.aureus V8プロテア-ゼによって切断される部位が,またヘムドメインとモリブデンドメインの間にはトリプシンで切断される部位が様々な植物のNRに広く保存されていることが明らかとなった。これはNRの生体内でのタ-ンオ-バ-速度が速いことと何らかの関係があるものと推定された。いっぽう,ホウレンソウ緑葉中には,プロテア-ゼ活性をもたないタンパク質性NR不活性化因子(NRI)の存在することが知られているが,その実体は不明であった。そこで今回,このNRIの単離精製を試みた。pH5処理,SES3クロマトグラフィ-,ConAセファロ-スクロマトグラフィ-,クロマトフォ-カシング,HPLCにより,ホウレンソウ緑葉粗抽出液からNRIを16,000倍にまで精製することに成功した。精製NRIは、分子量110,000の糖タンパク質であり,分子量53,000のサブユニット2個から構成されていることが判明した。またサブユニット間は、ジスルフィド結合で結合していることも明らかとなった。このNRIは,NRに結合するタンパク質ではないので,その不活性化機構は大変興味深いが残された課題である。
教師の発達を支える授業リフレクション研究方法の開発

平成7年度には、澤本が開発したこの方法を、多数の教師に実験的に試行してもらうことを課題とした。東京のお茶の水国語教育研究会と山梨の山梨大学教育学部附属教育実践研究指導センター研究プロジェクトおよび教育方法研究会を通じて、教師と共に授業研究を実施した。東京グループでは、授業リフレクション研究を、自己リフレクション・対話リフレクション・集団リフレクションに分けて、有機的に組み合わせる方法を開発した。山梨では、当センターで導入した授業リフレクション研究を支援する授業研究演習システムを利用する環境設定と、ソフトの開発を実施した。平成8年度は、東京では研究成果の一部を整理し、書物として出版した。国語科説明文・論説文の授業を対象とする。授業リフレクションの研究としては、初めての小学校から高等学校までの事例研究を含む研究所であると自負している。山梨では、平成7年度に開発した授業研究演習用ソフトを用いて、研究者と現職教員、開発業者の協力により、授業研究演習システムのデータを、同期再生ソフトを用いて2台のVDRを同期させて再生する方法を確立した。平成9年度は、東京グループでは、この研究のまとめを行った。同時に、山梨では、ダブルビデオデッキを利用した同期再生画面を作成し利用する研究方法を開発した。また、スタンドアローン型のWindows95上で動作するソフトを開発した。いずれも、学校や自宅でも簡便に研究するための教師支援システムである。こうした研究成果は、刊行・出版し、日本教育工学会等で発表して評価を受けた。同時に、甲府市や山梨県を中心とする教員研修プログラムで導入したり、山梨大学公開講座「教員リフレッシュ研修」でも、実用化している。1995年3月末導入の授業研究演習システム用ソフトを利用して、次の3つの研究を進めた1.附属小学校3年生(守木貴教諭担任)の朝会のデータ採取と分析2.富士吉田市立吉田西小学校2年生(小林勇教諭指導)の国語科授業のデータ採取と分析3.山梨大学教育学部技術科教育(佐藤博助教授)のデータ採取と分析この過程及び結果から、ソフトのバ-ジョンアップを行い、成果は学会等で発表した。これを並行して、お茶の水女子大学附属小学校を中心とするお茶の水国語教育研究会を通して、小学校から高校までの説明文・論説文指導事例を分析した結果を著書にまとめた。これは本年4月末刊行の予定である。昨年度までの東京地区での研究成果をまとめ、5月末に東洋館出版より、澤本和子・お茶の水国語教育研究会編『わかる・楽しい説明文授業の創造-授業リフレクション研究のススメ』を出版した。これは小中高校の国語科説明文・論説文の理解指導に絞った研究である。山梨地区では、4月からシステムの改良を続け、竜王西小学校、吉田小学校で国語科の授業を録画し、夏休みを使ってデータを作成した。これは、昨年度からの研究の継続である。この結果と併せて山梨での研究成果の一部は、教育実践研究指導センター研究紀要第3号(1996年11月)に発表した。澤本和子「教師の実践的力量形成を支援する授業リフレクション研究:その1授業研究演習システムの開発」(pp.3-11)、浅川栄司・小林進・澤本和子他「同:その2集団的リフレクションによる単元学習事例研究」(pp.13-22)、守木貴「教育実習における対話的リフレクション研究」(pp.23-31)である。大学の教育研究として3年生を対象とする技術科教育の事例研究を継続してきたが、これを整理し、6月刊行の教師教育学会年報第5号に佐藤博と共著で「教師教育のためのself-reflectivemethodの開発」(pp.129-139)として発表した。以上の成果を踏まえ、11月の日本教育工学会金沢大会では、大会シンポジューム提案「21世紀における教育工学の展望-今を生きる教師自身が開発する授業リフレクション研究-」、および課題研究発表「授業モデルの形成と授業リフレクション研究-中堅教員を対象として」を行った。

なお、このとき、RoTTe研究会(生田孝至代表)主催の自主シンポジューム「授業研究と教師の成長」でも、発表を行った。この内容は、同会発行『教師学研究』第一号(1996年10月)に述べた。以上のとおり、研究を継続しながら、その成果を順次発表し、ようやく本研究も一定の成果を収めつつあるが、ソフトのバ-ジョンアップなどの課題については継続して研究中である。平成7年度には、澤本が開発したこの方法を、多数の教師に実験的に試行してもらうことを課題とした。東京のお茶の水国語教育研究会と山梨の山梨大学教育学部附属教育実践研究指導センター研究プロジェクトおよび教育方法研究会を通じて、教師と共に授業研究を実施した。東京グループでは、授業リフレクション研究を、自己リフレクション・対話リフレクション・集団リフレクションに分けて、有機的に組み合わせる方法を開発した。山梨では、当センターで導入した授業リフレクション研究を支援する授業研究演習システムを利用する環境設定と、ソフトの開発を実施した。平成8年度は、東京では研究成果の一部を整理し、書物として出版した。国語科説明文・論説分の授業を対象とする。授業リフレクションの研究としては、初めての小学校から高等学校までの事例研究を含む研究所であると自負している。山梨では、平成7年度に開発した授業研究演習用ソフトを用いて、研究者と現職教員、開発業者の協力により、授業研究演習システムのデータを、同期再生ソフトを用いて2台のVDRを同期させて再生する方法を確立した。平成9年度は、東京グループでは、この研究のまとめを行った。同時に、山梨ではダブルビデオデッキを利用した同期再生画面を作成し利用する研究方法を開発した。また、スタンドアローン型のWindows95上で動作するソフトを開発した。いずれも、学校や自宅でも簡便に研究するための教師支援システムである。こうした研究成果は、刊行・出版し、日本教育工学会等で発表して評価を受けた。同時に、甲府市や山梨県を中心とする教育研修プログラムで導入したり、山梨大学公開講座「教育リフレッシュ研修」でも、実用化している。
自然生態系におけるVA菌根菌バイオマスの定量

広島県太田川河川敷のヤハズソウ群落を対象に、エルゴステロールを指標にして、根外の菌糸を含む全VA菌根菌バイオマスの推定を行なった。根内のエルゴステロール量は、月日の経過とともに増加する傾向があり、開花期(8月)では個体当たり4.96μgであった。ポット栽培で求めたVA菌根菌バイオマスの根内外比と菌糸体のエルゴステロール含量を用いて推定した野外8月の全VA菌根菌バイオマスは、個体あたり30.3mgと推定された。このVA菌根菌バイオマスは、根乾重の43%、植物群落内の全土壌有機炭素量の3.6%に相当し、炭素の大きなシンクであることが明らかになった。VA菌根菌のバイオマスに対するリンの影響を調べるため、ヤハズソウと菌根菌Gigaspora margaritaを用いてポット実験を行なった。砂1kgあたり0,0.1,1,5,10mgPになるようにNaH_2PO_4溶液を加え、人工気象機内で60日間栽培した。リン濃度5および10mgP kg^<-1>では,根内の菌根菌バイオマスの低下が認められたが,根外の菌根菌バイオマスにはリン濃度による差は認められなかった。広島県太田川の州に生育するネコヤナギ、アカメヤナギ、タチヤナギについて,菌根の形成状況を調査したところ、いずれの種にもVA菌根と外生菌根の形成が認められた。しかし、VA菌根の感染率は低く,ネコヤナギ実生とG.margaritaを用いたポット実験でも菌根菌接種による成長促進は認められなかった。また、施肥実験から窒素が実生の生育の制限要因になっていることが示唆された。土壌のリン濃度がVA菌根菌のバイオマスにどのように影響するかを調べるために,ポット実験を行った。栽培ポットに滅菌した川砂を入れ,砂1kgあたり0,0.1,1,5,10mgPになるようにNaH_2PO_4溶液を加え、その半数に菌根菌Gigaspora margaritaを接種した。これらのポットに宿主植物のヤハズソウKummerowia striataを植付け,人工気象機内で60日間栽培したのち,植物体重と菌根菌バイオマスの定量を行った。菌根菌バイオマスについては,Fujiyoshi et al.(2000)の方法により,根および砂の中のエルゴステロール量を定量し,その値から変換係数を用いて,根内外のVA菌根菌バイオマスに換算した。植物体重,植物体のリン濃度は,菌根菌接種により有意に増加した。リン濃度5および10mgP kg^<-1>では,根内の菌根菌バイオマスの顕著な低下が認められたが,根外の菌根菌バイオマスにはリン濃度による有意な差は認められなかった。根外の菌糸を含む全菌根菌バイオマスは根の重量の3442%を占めると推定された。河畔に生育するヤナギ類について,野外における菌根の形成状況とポット実験による菌根の影響の評価を行った。広島県太田川中流域の調査地に生育するネコヤナギSalix gracilistyla,アカメヤナギS.chaenomeloides,タチヤナギS.subfragilisについて,菌根の形成状況を調査したところ,いずれの種についても,VA菌根と外生菌根の形成が認められた。しかし,VA菌根の感染率は低く,ポット実験でもVA菌根菌の接種による有意な成長促進は認められなかった。これらの結果から,これらのヤナギ類については,VA菌根の役割は小さいものと推測された。

広島県太田川河川敷のヤハズソウ群落を対象に、Fujiyoshi et al.(2000)の方法より、エルゴステロールを指標にして、根外の菌糸を含む全VA菌根菌バイオマスの推定を行なった。まず、野外群落からヤハズソウの根を定期的にサンプリングし、根内のエルゴステロール量を求めた。一方、ポット栽培条件下で、ヤハズソウと野外群落から集めたVA菌根菌胞子を用いて菌根を合成し、定期的にサンプリングして根と土壌中のエルゴステロール量を測定した。野外の根内のエルゴステロール量と、ポット栽培における根内外のバイオマス比(植物根:土壌中)、および菌糸体のエルゴステロール含量から、野外群落のVA菌根菌バイオマスを推定した。野外に生育するヤハズソウ根内のエルゴステロール量は、月日の経過とともに増加する傾向があり、開花期(8月)では個体当たり4.96μgであった。また、ポット栽培で求めたVA菌根菌バイオマスの根内外比は、1:2.3(植物根:土壌中)であり、菌糸体のエルゴステロール含量は0.54mg/gであった。以上の結果より、野外8月の全VA菌根菌バイオマスは、個体あたり30.3mgと推定された。このVA菌根菌バイオマスは、ヤハズソウの根乾重の43%、また、植物群落内の全土壌有機炭素量の3.6%に相当した。ヤハズソウ群落においてVA菌根菌バイオマスは、宿主由来の炭素の大きなシンクであることが明らかになり、群落内の植物の炭素経済や土壌炭素フローに大きな影響を与えている可能性が示された。
ケロイド、肥厚性瘢痕の増殖病態の解明:telomerazeとの関連

1)平成14年度より収集した臨床検体(肥厚性瘢痕7検体、ケロイド12検体)に対して、テロメラーゼの局在を検討した、組織は4%パラホルムアルデハイド固定パラフィン切片を使用した。3)前年度の検討の通り、肥厚性瘢痕、ケロイドともに、テロメラーゼの発現が確認され、その発現はケロイドで強かった。4)肥厚性瘢痕、ケロイドともに組織の辺縁から正常組織と考えられる移行部での発現が主体であった。しかしながら、組織内部での発現を確認した検体もあった。5)平成14年度、15年度の研究の結果、ケロイド、肥厚性瘢痕の増殖形態には、テロメラーゼ活性が深く関与していること、また、その発現の部位、発現量の差がケロイド、肥厚性瘢痕の病態の違いに関係していることが明らかとなった。1)組織検体の収集:ケロイド、肥厚性瘢痕の形成術にて切除される組織ならびに、軟部腫切除に伴う余剰正常皮膚を患者の同意の上、収集した。この結果、ケロイド7例、肥厚性瘢痕6例、正常皮膚3例の組織を収集した。また、ケロイドおよび肥厚性瘢痕いては、その瘢痕組織とともに、隣接する正常皮膚も組織検体とした。組織検体は、の一部は、組織内テロメラーゼ活性の定量のために凍結し、残りは、テロメラーゼRNAの局在およびtelomericrepeating factor 1,2の局在の判定のために4%パラホルムアルデハイド固定パラフィン切片を作成した。2)組織内テロメラーゼ活性の検出:テロメラーゼ活性の定量にはFluorescence-based telomeric repeat amplification protocolを用いた。3)ケロイド、肥厚性瘢痕、正常皮膚のいずれにおいてもテロメラーゼ活性は検出されなかった。しかしながら、ケロイドに接した正常皮膚では4.45-48.08Unit(平均23.69)/μg proteinと高い活性が見られた。また、肥厚性瘢痕に接した正常皮膚では6例中5例で活性は見られなかったが、切除後に再発した1例でのみ、8.04 Unit/μg proteinの活性が見られた。4)今年度の研究の結果はケロイドと肥厚性瘢痕に接する正常皮膚のテロメラーゼ活性の差異を明瞭に示していると考えれ、ケロイドにおける損傷部位を越えて発育する現象を説明すると思われた。
シーディングによる脳内環境の破綻伝播メカニズムの解明

DNA/RNA結合タンパク質であるFUS(TLS)をコードする遺伝子への変異は、家族性の筋萎縮性側索硬化症の原因として報告されている。さらに、病因性変異はFUSの核内移行シグナルとして機能するC末端領域に数多く同定されており、変異型FUSは細胞質に異常に蓄積することで本来の機能を喪失することが提案されている。しかし、C末端領域以外にも多くの病因性変異が見つかっており、そのような変異型FUSは野生型と同様に核内に局在することから、変異型FUSによるALSの分子病理メカニズムは明らかでない。そこで、野生型及び各種のALS変異型FUSタンパク質を作製・精製し、その凝集反応を試験管内で比較検討したところ、核内移行シグナルに影響を及ぼさない病因性変異(G156E)はFUSの凝集性を増大させ、アミロイド様の線維を形成することが分かった。また、G156E変異型FUSはヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yやラット海馬神経初代培養細胞において、核内で凝集体を形成することを明らかにした。興味深いことに、G156E変異型FUSが核内に凝集体を形成した神経細胞では、MAP2の染色性が低下しており、何らかのダメージを受けていることが示唆された。さらに、G156E変異型FUSが形成する線維はシードとして機能することで、野生型FUSを線維化させることが分かった。実際、核内に形成するG156E変異型FUSの凝集体には、野生型FUSが共局在していることが明らかとなった。つまり、細胞内局在に影響を及ぼさないアミノ酸変異であっても、FUSの凝集性を増大させる変異が存在することが分かった。そのような変異型FUSが核内で形成する線維状凝集体は、シードとして野生型FUSの線維化を促進することができ、FUSの生理機能を「雪だるま式」に低下させることで、神経細胞死を引き起こすと考えられた。25年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質線維が脳・神経組織に蓄積すると神経細胞死の原因となり、アルツハイマー病などの神経変性疾患を引き起こすとされる。シードが何らかの形で生体内に形成・導入されると、タンパク質の線維化が一気に促進しうることから、神経変性疾患の感染危険性や、あるいは時間とともに拡大する病態の伝播性を、シーディング現象により説明できるのではないかと考えている。つまり、細胞内にシードが自発的に形成したり、あるいは細胞外環境から導入されたりすると、シーディング現象が細胞内・間で爆発的に進行し、病巣(タンパク質線維が認められる領域)が加速度的に拡大・伝播することで、「脳内環境」を一気に破綻させ病態を進行させることが考えられる。そこで本課題では、線虫に着目した新たな動物モデルを構築することで、シーディング現象が病態の進行・拡がりを制御する可能性を検証し、その分子メカニズムを明らかにする。平成24年度では、神経変性疾患ALSの病因タンパク質であるSOD1をモデルとして着目し、GFP融合型ALS変異SOD1(GFP-SOD1)の作製・精製を行った。また、大腸菌内にALS変異SOD1を過剰発現させて不溶性の封入体を形成させ、それらがアミロイド様の線維状凝集体であることも確認し、さらに試験管内にて、精製したGFP-SOD1の凝集を開始させる「シード」として機能することも明らかにできた。現在は、GFP-SOD1を発現するトランスジェニック線虫の作製を進めており、線虫をモデルとしたタンパク質線維化のシーディング機構についての検討を進めている。

平成24年度では、ALS変異型SOD1の線維状凝集体を大腸菌内に形成させることに成功し、それらはGFP-SOD1の凝集を開始させるシードとして機能することを試験管内にて確認することができた。よって、本研究の目的である「線虫を用いたシーディングモデルの構築」のための基礎的データを得ることができ、概ね順調に遂行されたと言える。GFP-SOD1を発現するトランスジェニック線虫の作製を行い、線虫内におけるALS変異SOD1の凝集の観察を行う。大腸菌に形成させたSOD1の線維状凝集体をトランスジェニック線虫に与えることで、シーディング現象を再現することができるか検証する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
カルバミルリン酸をとりまく代謝酵素系遺伝子の分子進化

カルバミルリン酸をとりまくピリミジン合成系、アルギニン合成系および尿素合成系遺伝子は複雑かつ多彩な分子進化を示す。原核生物である大腸菌ではただ1つのグルタミン利用性カルバミルリン酸合成酵素(CPSII)が存在する。ところが、真核生物である酵母ではピリミジン合成とアルギニン合成に専用の2種のCPSIIに分れている。高等動物では肝臓において尿素サイクルが形成されるが、これはアルギニン合成系から進化したものと予想される。そしてCPSIIはアンモニア利用性酵素CPSIとなり、次段のオルニチントランスカルハミラーゼ(OTC)と共にミトコンドリアへ局在化する情報を獲得する。われわれは尿素サイクルを構成する5種の酵素のうちOTCとアルキナーゼについてcDNAを単離し、尿素サイクルがアルギニン合成系および分解系の酵素より進化したことを証明した。さらに、尿素サイクルの第4段の酵素であるアルギニノコハク酸リアーゼのcDNAを単離し構造を解析したところ、トリのレンズ蛋白質であるδクリスタリンとの間にアミノ酸レベルで64%の相同性があることが分った。そこで、ラットのアルギニノコハク酸リアーゼの染色体遺伝子を単離し構造解析を行った。本酵素遺伝子は約16Kbにおよび、16個のエクソンより構成されていた。本酵素遺伝子のエクソン-イントロン構成はδクリスタリン遺伝子ときわめてよく似ており、δクリスタリン遺伝子がアルギニン合成系および尿素サイクル酵素であるアルギニノコハク酸リアーゼ遺伝子から進化したことが明らかとなった。
複素2次元射影空間上の有理写像の不定点における力学系構造

高次元複素力学系は,実力学系の問題を複素化して解決を図ること,また,高次元複素力学系独自の現象を定式化すること等を目標に活発に研究されている.複素2次元射影空間上の有理写像による力学系はこれらの目標の解決に最も適切な研究対象の一つである.これまでに有理写像の不連続点である不定点での力学系の研究は,Y.YamagishiやT.C.Dinhなどにより行われてきた.彼らはカントール集合と同濃度の個数の安定多様体(軌道が不定点に収束する点からなる集合)からなる不変曲線の族が不定点に存在する写像を定式化し,不定点にカオス現象を起こす不変集合が存在することを指摘した.一方,私は平成18年度までに,有理写像の不定点に存在する不変曲線族を,代数幾何の手法であるblow upを用いて定義する方法を考案した.この方法により,不定点に存在する不変曲線として,安定多様体だけでなく,不安定多様体(軌道が不定点から離れていく点からなる集合)や中心多様体も扱うことができるようになった.また,不安定多様体からなる不変曲線族を持つ有理写像を具体的に構成した.平成19年度はこの方法と実力学系の双曲型力学系の理論用いて,中心多様体からなる不変曲線の族を持つ有理写像を具体的に構成した.また中心多様体を定義する関数の漸近展開を求め,滑らかさの評価を行った.中心多様体は古くから研究されている重要な対象であるが,多変数複素力学系においては自明なもの以外に知られていなかった.今回の結果より,写像の不連続点の近傍に複雑で豊富な力学系構造が存在することを示すことができた.次年度以降もこの方法を応用し,特に現時点ではほとんど研究が進んでいない3次元以上の射影空間上の有理写像の力学系構造の研究を行いたい.高次元複素力学系は,実力学系の問題を複素化して解決を図ること,また,高次元複素力学系独自の現象を定式化すること等を目標に活発に研究されている.複素2次元射影空間上の有理写像による力学系はこれらの目標の解決に最も適切な研究対象の一つである.これまでに有理写像の不連続点である不定点での力学系の研究は,Y.YamagishiやT.C.Dinhなどにより行われてきた.彼らはカントール集合と同濃度の個数の安定多様体(軌道が不定点に収束する点からなる集合)からなる不変曲線の族が不定点に存在する写像を定式化するなどし,不定点にカオス現象を起こす不変集合が存在することを指摘していた.一方,私は平成17年度までに,有理写像の不定点に存在する不変曲線族を,代数幾何の手法であるblow upを用いて定義する方法を考案した.この方法により,不定点に存在する不変曲線として,安定多様体だけでなく,不安定多様体(軌道が不定点から離れていく点からなる集合)や中心多様体も扱うことができるようになった.平成18年度はこの方法を用いて,不安定多様体からなる不変曲線の族が不定点に存在する有理写像を具体的に構成した.また,その不安定多様体の個数をカントール集合の真部分集合を用いて表すと共に,曲線族上の力学系をカントール集合上のシフト写像を用いて完全に決定することができた.今回の有理写像により得られた力学系構造は,これまでに知られていない新しいものであり,写像の不連続点の近傍に非常に複雑な力学系構造が存在することを示している.次年度以降もこの方法を利用し,不定点で,より複雑な力学系構造を持っ写像,例えば不変曲線が中心多様体からなる写像などを構成していきたい.高次元複素力学系は,実力学系の問題を複素化して解決を図ること,また,高次元複素力学系独自の現象を定式化すること等を目標に活発に研究されている.複素2次元射影空間上の有理写像による力学系はこれらの目標の解決に最も適切な研究対象の一つである.これまでに有理写像の不連続点である不定点での力学系の研究は,Y.YamagishiやT.C.Dinhなどにより行われてきた.彼らはカントール集合と同濃度の個数の安定多様体(軌道が不定点に収束する点からなる集合)からなる不変曲線の族が不定点に存在する写像を定式化し,不定点にカオス現象を起こす不変集合が存在することを指摘した.一方,私は平成18年度までに,有理写像の不定点に存在する不変曲線族を,代数幾何の手法であるblow upを用いて定義する方法を考案した.この方法により,不定点に存在する不変曲線として,安定多様体だけでなく,不安定多様体(軌道が不定点から離れていく点からなる集合)や中心多様体も扱うことができるようになった.また,不安定多様体からなる不変曲線族を持つ有理写像を具体的に構成した.平成19年度はこの方法と実力学系の双曲型力学系の理論用いて,中心多様体からなる不変曲線の族を持つ有理写像を具体的に構成した.また中心多様体を定義する関数の漸近展開を求め,滑らかさの評価を行った.中心多様体は古くから研究されている重要な対象であるが,多変数複素力学系においては自明なもの以外に知られていなかった.今回の結果より,写像の不連続点の近傍に複雑で豊富な力学系構造が存在することを示すことができた.次年度以降もこの方法を応用し,特に現時点ではほとんど研究が進んでいない3次元以上の射影空間上の有理写像の力学系構造の研究を行いたい.
ヒト男性ホルモンレセプター遺伝子疾患における発症メカニズムの解明

アンドロゲン代謝異常に伴う多因子疾患遺伝子としてアンドロゲンレセプター(AR)に着目し、個体レベルでの作用機構解明に取り組んだ。これらモデル個体の表現型の解析ならびに標的遺伝子の探索により発症の分子基盤を構築した。アンドロゲン不応症モデルはAR遺伝子完全欠損マウスを作出した。X染色体上に位置し伴性劣性遺伝形式をもつAR遺伝子完全欠損雄マウスは不妊となることが予想され、作出に際しCre-loxPシステムを用いて成し遂げた。この雄マウスの表現系は睾丸性女性化症を呈していた。さらに生殖器の分化異常(睾丸萎縮)や高回転型骨代謝異常による骨量減少、雄的性行動異常を確認している。続いて球脊髄性筋萎縮症モデルは、ポリグルタミンリピート異常型AR過剰発現ショウジョウバエを作出し、神経変性症の解析系として確立されている個眼形成の形態を観察した。ショウジョウバエに導入したポリグルタミン異常伸長型ARの個眼形成は、アンドロゲン依存的に顕著な神経変性が生じることを見出した。詳細な表現系はアンドロゲン依存的に個眼形成の破綻、色素欠失、神経変性であり、これらの表現系は従来汎用されているAR転写活性抑制型の抗前立腺癌アンタゴニスト投与でも生じることが判明した。このことは、神経変性症がARのアンドロゲン依存的な転写活性化による作用点とは異なることを意味している。最終的にこの分子メカニズムはアンドロゲン依存的なARリガンド結合領域の立体構造変化にが引き金になることを強く示唆した。現在これらモデル個体の詳細な解析とともに、これら疾患に関与する分子の網羅的なスクリーニングによる発症メカニズム全貌解明を展開している。1)AR遺伝子完全欠損型雌マウスの作出・解析により得られた知見をもとに、雌雄個体差を考慮したAR標的遺伝子の単離同定を試みている。2)球脊髄性筋萎縮症モデル型ショウジョウバエの表現型解析による神経変性促進あるいは抑制遺伝子の網羅的なスクリーニングを試みている。