hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATP依存性プロテアーゼによる生理基質機能部位の優先切断機構

ATP依存性プロテアーゼLonは,細胞分裂阻害タンパク質であるSulAを分解する際に,構造的・機能的に重要な部位を優先的に分解することが,本研究者の従来の研究より明らかとなっている.このことは,基質機能の迅速かつ徹底的な抑制に貢献する新規の分子機構であると考えられる.一方Lonは,ポリリン酸存在下で,SulAを分解せず,リボソーム蛋白質S2を分解することが知られている,そこで本研究では,このポリリン酸存在下におけるS2の分解機構を詳細に検討し,SulAの場合と比較検討した,その結果Lonはポリリン酸存在下で,S2を3-17残基程度のペプチドにプロセッシブ分解すること,P1部位には,Phe等のかさ高い疎水性残基が主にみられること,主な切断部位は,分子表面よりむしろ分子内部に偏在すること等が明らかとなった.これらの特徴は,SulAの分解の場合と共通している.一方Lonは,ポリリン酸非存在下では8量体相当の分子量をもつが,ポリリン酸存在下では,4量体相当の分子量となることが,ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた解析から示された。従ってLonは,ポリリン酸存在下で会合状態が変化し,認識する基質も変化すること,しかし,基質の分解様式自体には大きな変化がないことが示された。また,ポリリン酸はアミノ酸飢餓状態で蓄積することから,LonによるS2の分解は,細胞内で枯渇したアミノ酸の補給に寄与すると考えられるが,Lonでは,ペプチドレベルまでしか分解されないことから,さらに別のプロテアーゼが,アミノ酸への分解を担当していることが示唆された.ATP依存性プロテアーゼLonは,細胞分裂阻害タンパク質であるSulAを分解する際に,構造的・機能的に重要な部位を優先的に分解することが,本研究者の従来の研究より明らかとなっている.このことは,基質機能の迅速かつ徹底的な抑制に貢献する新規の分子機構であると考えられる.本研究はこの機構が,Lonが他の生理基質を分解する際に,また,SulAを生理基質とするもう一つのATP依存性プロテアーゼHslVUがSulAを分解する際に,それぞれ見られるかどうか解明することを目的とした.まず,Lonの生理基質である,リボソームタンパク質S2およびcapsule polysaccharide合成調節因子RcsAについて,それぞれ組換タンパク質の大量調製系を確立した.これらをLonが分解する機構について現在検討中である.HslVUについては,ATPaseサブユニットHslUおよびプロテアーゼサブユニットHslVをそれぞれ組換タンパク質として大量調製した.このHslVUは,SulAをATP依存的に分解したが,その分解速度はLonに比べて顕著に遅かった.また,切断部位は,Lonの場合と若干の相違が見られた.これらの詳細は現在検討中である.また,この様な細胞内プロテオリシスを解析する新規手法として,新規蛍光基質を用いてラット海馬におけるcaspase-1様活性を可視化解析する方法を確立した(Nishii et al. FEBS lett. 518,149-153).さらに,新規セリン・カルボキシルプロテアーゼphysarolisinのクローニングと性状解析を行い,酵素触媒分子機構について有益な知見を得た(Nishii et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 301,1023-1029).ATP依存性プロテアーゼの生体内での基質は2種に大別される.第一は変性等による異常蛋白質であり,この種の基質の分解は細胞内蛋白質の品質管理に貢献する.第二は,各ATP依存性プロテアーゼに特異的な生理基質であり,迅速な分解によるそれらの機能抑制は正常な細胞機能の維持に必須である.これまでの研究より,大腸菌における代表的なATP依存性プロテアーゼであるLonは,生理基質である細胞分裂阻害蛋白質SulAを分解する際に,SulAの機能上,構造上重要な部位を優先して分解することが示した.このことは,基質の正確かつ迅速な機能抑制に貢献する新規の重要な分子機構であると考えられる.本研究では,他のATP依存性プロテアーゼと基質の間にも同様の機構が存在するか否かを検討することを目的とした.第一に,Lon同様SulAを生理基質とするATP依存性プロテアーゼHslVUについて,その分解機構を検討した.その結果,HslVUは,Lon同様SulAの機能上,構造上重要な部位を優先して分解することが示された.また,LonおよびHslVUのSulAに対する1次構造上の切断特異性は互いに異なっていた.このように切断特異性も触媒分子機構も異なる両酵素に共通して,前述の基質の機能部位の優先切断が見られることは極めて興味深い.第二に,Lonによるリボソーム蛋白質S2の分解について検討した.S2は飢餓状態で蓄積されるポリリン酸の存在下Lonにより分解されることが報告されている.本研究では,S2のLonによる切断部位を決定した.その結果,Lonは,S2の2次構造に富んだ領域を優先的に切断することが示された.また,ポリリン酸はLonによるS2の分解を促進するが,基質の切断特異性には影響しないことが示された.ATP依存性プロテアーゼLonは,細胞分裂阻害タンパク質であるSulAを分解する際に,構造的・機能的に重要な部位を優先的に分解することが,本研究者の従来の研究より明らかとなっている.

このことは,基質機能の迅速かつ徹底的な抑制に貢献する新規の分子機構であると考えられる.一方Lonは,ポリリン酸存在下で,SulAを分解せず,リボソーム蛋白質S2を分解することが知られている,そこで本研究では,このポリリン酸存在下におけるS2の分解機構を詳細に検討し,SulAの場合と比較検討した,その結果Lonはポリリン酸存在下で,S2を3-17残基程度のペプチドにプロセッシブ分解すること,P1部位には,Phe等のかさ高い疎水性残基が主にみられること,主な切断部位は,分子表面よりむしろ分子内部に偏在すること等が明らかとなった.これらの特徴は,SulAの分解の場合と共通している.一方Lonは,ポリリン酸非存在下では8量体相当の分子量をもつが,ポリリン酸存在下では,4量体相当の分子量となることが,ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた解析から示された。従ってLonは,ポリリン酸存在下で会合状態が変化し,認識する基質も変化すること,しかし,基質の分解様式自体には大きな変化がないことが示された。また,ポリリン酸はアミノ酸飢餓状態で蓄積することから,LonによるS2の分解は,細胞内で枯渇したアミノ酸の補給に寄与すると考えられるが,Lonでは,ペプチドレベルまでしか分解されないことから,さらに別のプロテアーゼが,アミノ酸への分解を担当していることが示唆された.
FMS指向自律走行天井クレーンのリアルタイム搬送制御システムの開発

FMS(Flexible Manufacturing System)の運用を考える際、各種生産工程間における搬送システムは重要な要素である。特に、天井クレーンは、(a)敷地内の上下方向を移動することにより、敷地面積をとらない、(b)3次元空間を自由に移動することで敷地内に置かれた障害物を回避するなどのフレキシビリティがある、(c)搬送システムを構築する際のコストが少なくてすむなど、2次元の搬送システムに比べてその利点は多く、応用範囲も広いと考えられ、FMSの運用の自由度を高めるためにも、その自動化が望まれる。そこで本研究では、「FMS指向自律走行天井クレーンのリアルタイム搬送制御システムの開発」を行った。まず、本年度はこれまで共同研究で使用していた豊橋技術科学大学の実験装置と同様の装置を新たに製作した。現在、実験装置の調整を行い、モデルパラメータの導出、モデルの検証を行い、目標軌道となる最適経路に追従させるべく、荷の位置に着目した搬送制御系により実験検証を行っている。これにより、本研究機関でのデータ解析が行え研究の遂行が一層計られる。また、オフラインでCCDカメラとレーザーラインマーカーを用いることにより障害物の位置を認識し、スタート地点から目標地点までの最適経路を探索し生成するシステムをオンライン制御確立のため、オブジェクト指向型言語JAVAを用い、ファジィ制御に基づいた移動障害物回避ソフトウェア開発を行った。次に、目標軌道となる最適経路に追従させるべく、荷の位置に着目したモデルと制御方法の提案を行った。これにより移動経路の追従性や位置決め精度を高め、搬送中や搬送終了時の荷振れを抑制し、高速搬送が可能なになった。これら一連の成果は学術論文にまとめ現在投稿中である。まず、(1)オフラインでCCDカメラとレーザーラインマーカーを用いることにより障害物の位置を認識し、スタート地点から目標地点までの最適経路を分枝限定法およびポテンシャル法で探索し生成するシステムの構築。そして、(2)オンラインでその経路に沿って、更に近接センサ、無線を利用し、固定障害物や移動障害物(搬送車等)を正確に認識することで、搬送中の障害物回避や協調作業を行う搬送車への荷物の受け渡しを行い、しかも搬送中の荷物の振れや停止時の振れ止めを考慮した制御システムを構築を行った。本年度は、特に上記(2)のオンライン制御確立のために、オブジェクト指向型言語JAVAを用い、ファジイ制御に基づいた移動障害物回避ソフトウェア開発を行った。また、目標軌道となる最適経路に追従させるべく、荷の位置に着目したモデルと制御方法の提案を行った。今後は計画された移動経路の追従性や位置決め精度を高め、搬送中や搬送終了時の荷振れを抑制し、高速搬送が可能な制御システムの開発を行う。具体的にはフィードフォーワード入力と最適サーボ系を併せた2自由度系の構築を考え、荷物の軌道の追従性を考慮した制御システムの開発を行う。なお、一連の研究成果は、平成11年8月ドイツで行われたヨーロッパ制御国際会議で論文発表を行った。
社会資源が限定的な地域における精神障がい者のリカバリーを促進する支援モデルの検討

本研究では、地域の共通性や相違性、強みや特色に着目しながら、社会資源が限定的な地域における精神障がい者のリカバリーを促進する支援モデルの検討を行う。研究の第1段階として社会資源が限られた地域における精神障がい者への支援に関する文献検討を行う。第2段階は社会資源が限定的な数ヵ所の町村を対象としてフィールド調査および精神障がい者支援に携わる者へのインタビュー調査を実施する。最終段階では、第1段階と第2段階の研究結果をもとに地域間での精神障がい者支援の比較検討を実施する。
口語英語の記述的研究-英語コミュニケーション教育のための基礎資料の収集と分析

研究成果としてまず、約11,000,000語からなる口語英語のデータ・ベース(一般にはcorpusと言われる)が完成し、これをWordSmithなどの検索ツールを使って様々な角度からデータ分析を行えるようにしたことを述べておかねばならない。このデータ・ベースをもとに、語彙・文法レベルでの口語英語の記述的研究を行い、さまざまな形で成果を発表してきた。このような研究の具体的な成果の第一は、実際にコミュニケーションで使われる表現や,わが国の研究書や辞書などではカバーされていない問題がいかに多いかを改めて認識したことである。国外国内を問わず、文法の常識とされてきたことが、このデータ・ベースを利用することによって、次々と覆されてきた。話し言葉には、書き言葉にない「近接性」(proximity)あるいは「直線性」(linearity)という概念で捉えることができる特徴がある。これは、分裂文(cleft sentence)、there構文、文末疑問詞疑問文(sentence-final wh-interrogative)などの分析の中に具体化されている。第二に、このデータ・ベースを利用することによって、わが国の英語教育の中で特に重要な役割を果たす英和辞典の記述上の問題点が数限りなく明らかになってきたことである。この事実は、論文の他に、「語法の鉄人」(小学館ランゲージワールド,http://www.1-world.shogakukan.co.jP。平成13年2月開始、現在も継続中)の中で逐次公表中である。第三に、将来の可能性として、談話分析(discourse analysis)や会話分析(conversation analysis)、あるいは談話辞(discourse markers)の分析への限りない可能性を拓いたことである。第四の点については、今後の研究で明らかにしてゆきたい。本年度も、昨年度に引き続き、アメリカのCNNテレビの番組"Larry King Live"で話されたことばのすべてを文字化したものと,番組を収録したビデオの音声と比較しながら,口語英語の特徴を捉える研究を中心に研究を進めた。とりわけ本年度は、わが国の英語教育には欠かすことのできない英和辞典に含まれるさまざまな問題点を取り上げ、その問題点を、収集したデータと検証しながら分析を進めた。その結果を「辞書とデータを読む-COD/OEDと英和辞典〈上/下〉」(『英語青年』8、9月号(Vol.CXLVI-No.5,6))、「英語辞書学序説-口語英語研究とコミュニケーション教育のために」『言語と文化』第4号の論文として報告した。また、同時に、口頭で現代英語特に口語英語の研究に資する目的で、「私の辞書学プログラム」(第1回関西英語語法文法研究会、於:関西学院大学、2000年7月8日)および「非自立的不定代名詞と自立的不定名詞」(第8回英語語法文法学会・第3回ワークショップ、於:大阪樟蔭女子大学、2000年11月17日)として発表した。また、国際辞書セミナーの一環として行われた「2言語使用の辞書」をめぐるシンポジウムの講師として、"Updating English-Japanese Dictionaries"(大学英語教育学会辞書研究会第4回ワークショップ、於:清泉女子大学、2001年3月26日)の題で、上記と同様の主旨の発表を行った。このシンポジウム参加の海外研究者のために、"Facts and Problems in English-Japanese Dictionaries"の題で、A4 30ページの論文を用意し、英和辞典の抱える問題点、とりわけ、口語的な英語の表現をいかに英和辞典に盛り込むかという点を論じた。また、招待講演「英和辞典の問題点とその原因をさぐる」(大阪言語研究会第136回例会、於:アヴィーナ

大阪、2000年7月2日)に於いても、英和辞典と現代英語、あるいは口語英語の記録の遅れなどを論じた。語彙・文法レベルの口語英語研究が一応の完結をみた。約11,000,000語からなる口語英語のデータ・ベースが完成し、これをWordSmithなどの検索ツールを使って様々な角度からデータ分析を行ってきた。その分析結果の一部を、アジア辞書学会(Asialex 2001,Asian Association for Lexicography2001年大会、於:Yonsei University(韓国・ソウル))において、"Patterning of English Adjectives for the Improvement of Learners' Dictionaries"の題で報告した。報告内容は、同名の論文として、Asialex 2001Proceedings : Asian Bilingualism and the Dictionaryに掲載されている。上記データ・ベースは、週1回更新の「語法の鉄人」(小学館ランゲージワールド,http://www.1-world.shogakukan.co.jp。平成13年2月開始、現在も継続中)の執筆や、『英語教育』誌連載「クェスチョン・ボックス」での回答執筆のための貴重なデータとなっている。同時に、関西学院大学言語コミュニケーション文化研究科所属の院生に対して、研究データとして利用に供している。本研究の最終的なまとめとして、関西学院大学言語教育研究センター紀要『言語と文化』(第5号、平成14年3月刊)に、「口語英語の文法特徴-LKL Corpusを使って」の題で論文を発表した。同論文の内容を拡大して「実証的言語研究の方法と展開」の題で、名古屋大学において講演をした(名古屋大学言語文化部平成13年度総長裁量経費プロジェクト「ネットワーク環境と人的資源を活用した外国語教育の改革の推進に関する調査研究」主催、名古屋大学大学院国際言語文化研究科・国際開発研究科後援)。また,英和辞典史の観点から英和辞典の問題点を整理し、その結果を英文論文"Facts and Problems in English-Japanese Dictionaries"(未刊、B5版75ページ)にまとめた。改定を重ねながら、何らかの形で公刊する予定である。
Z偏光ラマン分光法とMAIR分光法による非平滑界面の構造解析

表面が滑らかでない薄膜中の分子配向を解析する手法を,すでに独自に開発を進めているMAIR分光法とともに,ラマン分光法での実現を目指した.ラマン分光法は,極めて細く絞ったレーザー光により解析するため,薄膜のむらに影響されにくく,また赤外分光法では得られないC=CやN≡N伸縮振動バンドのような,構造異性化と構造異方性を同時に考える上で鍵となる化学構造を明らかにできる点で重要である.本研究では,Z偏光測定に相当する構造異方性に関する情報を定量的に得るため,定量精度の高い偏光ラマン分光装置をくみ上げた.さらに,レーザー光照射・光散乱の過程を,光学異方性を考慮しながら厳密に理論化し,偏光ラマンスペクトルから官能基の分子配向を求める手法を確立した.表面が滑らかでない薄膜中の分子配向を解析する手法を,すでに独自に開発を進めているMAIR分光法とともに,ラマン分光法での実現を目指した.ラマン分光法は,極めて細く絞ったレーザー光により解析するため,薄膜のむらに影響されにくく,また赤外分光法では得られないC=CやN≡N伸縮振動バンドのような,構造異性化と構造異方性を同時に考える上で鍵となる化学構造を明らかにできる点で重要である.本研究では,Z偏光測定に相当する構造異方性に関する情報を定量的に得るため,定量精度の高い偏光ラマン分光装置をくみ上げた.さらに,レーザー光照射・光散乱の過程を,光学異方性を考慮しながら厳密に理論化し,偏光ラマンスペクトルから官能基の分子配向を求める手法を確立した.有機超薄膜の偏光ラマン分光測定を行うための装置の組上げを行った。ラマン分光器自体は平成20年度に導入したが,厚さ数nmの超薄膜を測定する感度を確保することと,偏向解消度の定量的な精度を確保するため,約一年にわたる調整が必要であった。初期に導入した光学部品に問題が見つかったケースが多く,特に分光器の偏光特性を取り除くための偏向解消板がうまく働かず,むしろ新たな装置関数を生み出して測定を乱す問題に翻弄された。最終的には,1/2波長板を使ってこの問題を解決することができ,きわめて精度の高い定量的な偏光ラマン分光測定が可能となった。現在,薄膜の高感度測定の最適化をさらに進めており,全反射光学系の構築を完了し,水晶基板やCaF_2基板上の超薄膜測定と,液液界面での界面吸着種の測定に挑戦している。併せて,本課題の趣旨である非平滑界面として金属粒子薄膜のプラズモン異方性解析を進めており,偏光SERS測定として22年度に実施を予定している。ラマン分光法による薄膜の分子間相互作用の異方性の研究は,偏光測定が定量的に困難なことから本格的な取り組みがほとんどない。本年度は,界面吸着種などの非共鳴条件での高感度測定を実現させるため,分光器の光学系の最適化に重点的に取り組んだ。また,偏光解消度測定が定量的に行えるようにするため,分光器の偏光特性を除去するための工夫を重ねた。その結果,市販の偏光解消板では偏光特性を取り除くことができないことが判明し,1/2波長板を利用して精度の高い測定ができる状態にこぎ着けた。これと平行して,高感度な表面増強測定のための金属蒸着基板の分光学的特性を可視MAIR分光法によって解析する研究も進めており,波長選択的に双極子型および四重極子型のプラズモンを励起でき,さらに面内・面外方向でさらに励起波長が異なることが明らかとなった。こうしてZ偏光ラマン分光の準備が整いつつある。当初,Z偏光子を導入した測定を行う予定であった.ところが,実際にZ偏光子を導入した事例を聞いたところ,たしかに面に垂直な電場をもつZ偏光が得られるものの,Z方向に残る電場成分がわずかしかないため,光量が大幅に低下することがわかり,超薄膜レベルの極微量化学種測定は極めて困難になると予想された.そこで,Z偏光子を使わずにZ偏光測定に対応する測定・解析を実施するためのアイディアを練った.その結果,偏光ラマン分光法で薄膜の分子配向を決めるための,これまでにない厳密な理論構築を行った.すなわち,分子による光の吸収過程を光学異方性のある多層薄膜中での任意の位置での電場計算から定式化し,さらに散乱過程をローレンツの相反定理によって定式化した.配向はラマン散乱テンソルの実験室座標と分子座標の座標変換により厳密に表現した.これにより,対称性の高い官能基振動に関して,偏光ラマンスベクトル測定から精密にラマンバンドの強度を定式化できた.その結果,s偏光入射-p偏光検光測定(SP)およびPS測定の2つのスペクトルから,精密に分子配向を決定する手法を確立した.結果的に,Z偏光測定に相当する解析が可能となり,N=N伸縮振動など,赤外分光法では測定できない部位の解析ができるようになり,可視MAIRSや赤外MAIRSと組み合わせることで横断的な薄膜構造解析ができるようになった.結果的に,当初目指した非平滑界面の分子吸着薄膜の構造を解析するのにふさわしい分光法の基礎を構築することに成功した.
乳幼児貧血の発育・発達への影響と貧血の予防・改善方策に関する大規模疫学研究

乳幼児における貧血は小児科診療の場等で比較的よく認められる疾患であり、鉄欠乏性貧血が続くと精神・運動発達が遅れるという報告もある。そこで(1)母の妊娠中の状況と乳幼児の貧血発症との関連を明らかにする、(2)乳幼児の貧血が児の発達に与える影響を明らかにする、の2つを目的に研究を実施した。妊娠期間中の母の貧血の有無と乳児期の児の貧血との間にやや関連が認められた。乳児後期、1歳6ヶ月健診時の貧血の有無と3歳児の発達との間にはいずれの項目においても有意な関連は認められなかった。乳幼児貧血は小児科診療の場で比較的よく認められる疾患である。しかし、乳幼児貧血に関する疫学研究は我が国ではほとんど行われていない。そこで平成26年度は、母の妊娠中の状況と乳幼児の貧血発症との関連を明らかにすることを主な目的として研究を実施した。沖縄県では乳児前期・後期健康診査、1歳6か月時健診の際に全市町村で貧血検査(ヘモグロビン値の測定)が実施されている。そして、乳幼児健診のデータは公益社団法人沖縄県小児保健協会で全て電子化され、各市町村が保有している。また、妊婦健診の際にも貧血検査が実施されているが、妊婦健診のデータも沖縄県国保連合会で電子化され、各市町村がデータを保有している。そこで、これらのデータを沖縄県、各市町村と協力して、同一母児について結合する作業を行い、解析用データセットファイルを作成した。今回は20112013年度に実施された乳児前期健診・後期健診を受診した児とその母親のうち、妊婦健診1回目・5回目時点でのヘモグロビン値、および乳児前期・後期健診時点でのヘモグロビン値の全てがそろっている母児23,043組(男児:11,639人、女児:11,404人)を対象にデータ分析を行った。貧血を認める妊婦の割合は1回目妊婦健診時点で10.5%、5回目健診時点で42.6%であった。貧血を認める妊婦の割合を保健所ごとに比較すると、保健所間で差が認められた。また、やせの妊婦で貧血を認めるものの割合が高く、肥満の妊婦で最も少なかった。母の貧血の有無と児の貧血の有無との関係を検討すると、乳児後期健診時点で児に貧血を認めるオッズ比は5回目妊婦健診時点で貧血を認めた母から出産した児において1.3(95%信頼区間:1.1-1.5)であった。乳幼児の貧血が児の体格・発育・発達(精神・運動)に与える影響を明らかにすることを目的に、乳児から1歳6か月健診にかけての貧血(Hb値)の状況と1歳6か月・3歳健診時点の体格、発育、精神・運動発達との関連について、本研究で検討する。平成27年度は以下の研究を実施した。1.児の精神・運動発達を把握・評価するための調査票の作成: 1歳6か月・3歳健診時点での児の精神・運動発達を把握・評価するための調査票の作成を行った。児の精神・運動発達を正しく把握・評価するためには、信頼性・妥当性の確立された発達評価法を用いる必要がある。そこで、国内・海外で行われている同様の先行研究に関する文献レビューを進め、学術的評価に耐えることができ、かつ市町村の健康診断の場で実施可能な調査票の作成を行った。小児神経の専門家や市町村の保健師との意見交換を行う中で、市町村で実際に調査を担当する保健師等に受け入れられやすく、またわが国の実情に合っているという点から、今回の調査ではデンバー発達スクリーニング検査、遠城寺式発達知能検査、津守式精神発達診断法の項目を用いて設問を構成することとした。また、健診で児の貧血を指摘されたことを保護者が正しく認識しているか、および児の貧血の治療状況についても把握する設問を含むこととした。2.調査への協力可能市町村の募集、調整:沖縄県の協力を得て県内41全市町村に調査協力を呼びかけたところ、22の市町村から協力可能との回答があった。現在、これらの市町村と調査実施のための調整を実施中である。当初計画では、児の精神・運動発達に関する調査票を平成27年度に協力市町村で1歳6か月・3歳児健診時に実施する予定であったが、調査票の作成に時間がかかり、調査の実施が28年度へとやや遅れている。鉄欠乏性貧血が3か月以上継続すると精神運動発達の遅れに繋がるため、欧米では乳幼児貧血の予防・改善のための指針が策定されている。しかしわが国にはこのような指針はなく、乳幼児貧血に関する疫学研究もほとんど行われていない。そこで、乳幼児の貧血が児の体格や発育、精神発達・運動発達に与える影響を明らかにすることを目的に、乳児から1歳6か月健診にかけての貧血(Hb値)の状況と1歳6か月・3歳健診時点での体格、発育、精神発達・運動発達との関連について、本研究で検討する。平成28年度は以下の研究を実施した。

1.児の精神発達・運動発達を把握・評価するための調査票の実施: 27年度に作成した調査票を3歳児健診を受診した母児を対象に実施し、児の精神発達・運動発達の状況、貧血治療の状況について把握・評価を行った。調査票はデンバー発達スクリーニング検査、遠城寺式発達知能検査、津守式精神発達診断法の項目を用いた設問から構成されており、また、これまでの健診で児の貧血を指摘されたことを保護者が正しく認識しているか、および児の貧血の治療状況についても把握する設問も含まれている。調査は28年9月から29年2月の6ヶ月間、沖縄県内の7つの協力市町村で実施した。全部で1808人の児について、調査票を回収することが出来た。現在、調査票の記載内容を電子データ化する作業を進めている。当初計画では、児の精神発達・運動発達に関する調査票を平成27年度に協力市町村で3歳児健診時に実施する予定であったが、調査票の作成に時間がかかり、また研究代表者の育児を目的とした比較的長期間の休暇の取得なども重なり、調査の実施が28年度下期となった。そのため、データ分析や成果発表等が29年度へとやや遅れている。乳幼児貧血は小児科診療の場で比較的よく認められる疾患である。鉄欠乏性貧血が3か月以上継続すると精神運動発達の遅れに繋がるため、欧米では乳幼児貧血の予防・改善のための指針が策定されている。しかしわが国にはこのような指針はなく、乳幼児貧血に関する疫学研究もほとんど行われていない。本研究では「母の妊娠中の状況と乳幼児の貧血発症との関連を明らかにする」「乳幼児の貧血が児の体格・発育・発達(精神・運動)に与える影響を明らかにする」ということを研究目的とした。沖縄県では日本で唯一、県内全市町村で乳幼児健診の全受診児にヘモグロビン(Hb)値測定が行われている。また乳幼児健診・妊婦健診データが全て電子化され、それらのデータを利活用する仕組みが構築されている。そこで本研究は沖縄県内の市町村を対象に実施した。児の精神発達・運動発達の状況、貧血治療の状況について把握・評価するための調査票を27年度に作成した。調査票にはデンバー発達スクリーニング検査・遠城寺式発達検査法の通過年齢が3歳頃の設問、およびPARS-TR(広汎性発達障害日本自閉症協会評定尺度)の設問が含まれている。そして、この調査票を28年9月から29年2月に沖縄県内の7つの協力市町村で3歳児健診を受診した母児を対象に実施し、1808人の児について調査票を回収した。平成29年度(最終年度)は調査票の記載内容を電子データ化し、乳児・1歳6ヶ月健診時のヘモグロビン(Hb)値などのデータと結合した。そしてそのデータ分析および結果の市町村等への還元を行った。乳児後期健診、1歳6ヶ月健診のいずれかまたは両方でHb値が11g/dl未満であった児410人のうち205人(50.0%)が「健診で貧血と言われたことがない」と回答した。乳児後期、1歳6ヶ月健診時の貧血の有無と3歳児の発達との間にはいずれの項目においても有意な関連は認められなかった。乳幼児における貧血は小児科診療の場等で比較的よく認められる疾患であり、鉄欠乏性貧血が続くと精神・運動発達が遅れるという報告もある。そこで(1)母の妊娠中の状況と乳幼児の貧血発症との関連を明らかにする、(2)乳幼児の貧血が児の発達に与える影響を明らかにする、の2つを目的に研究を実施した。妊娠期間中の母の貧血の有無と乳児期の児の貧血との間にやや関連が認められた。
微絨毛におけるアクチン繊維と膜蛋白質との相互作用の解析

微絨毛において、アクチン繊維と細胞膜の結合にERM蛋白質は重要な役割を果たしていると考えられる。ERM蛋白質が直接結合する膜蛋白質を同定することにより、細胞膜のアクチン繊維との結合部位の分子構築が明らかになっていくと考え、本年度は、結合の候補である膜蛋白質CD43とCD44について試験管内での結合実験を行った。バキュロウィルスを利用して、昆虫細胞にERM蛋白質を産出させ、ERM蛋白質を精製した。一方、CD43とCD44に関しては、その細胞質領域がERMと結合すると想像されるので、それぞれの細胞質領域をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として大腸菌に発現させた。細胞質領域全長との融合蛋白質をはじめ、膜蛋白質側に欠損を生じさせた融合蛋白質も数種類得た。グルタチオン結合ビーズにより、それぞれの融合蛋白質を精製し、ERM蛋白質と混合し、両者の結合を生化学的に検討した。1、CD43は、生理的塩濃度下において、その細胞質領域でERMと直接結合する。CD43の、ERMとの結合に必要な領域の少なくとも一つは、細胞質領域の中央より、やや細胞膜側にかたよったところにある。これは、CD43欠損蛋白質の哺乳類培養細胞への発現実験において示唆された、微絨毛への局在に必要な領域とおおまかに重なる。2、CD44は、低塩濃度下では、特異的にモエシンと結合した。結合に必要な領域は、細胞膜直下の約30アミノ酸残基のなかに存在すると結論された。CD44については、哺乳類培養細胞への発現実験もあわせて行った。CD44の細胞質領域のなかで、微絨毛への局在に必要な領域は、先にで示した細胞膜直下の領域に重なることが明らかになった。
マウスラセン神経節細胞におけるTis21の細胞保護作用

マウス蝸牛正円窓に対する注入処置が困難であったため、モルモットを用いた。また、難聴化についてはシスプラチンを扱う実験環境が整わなかったため、ゲンタマイシン筋肉注射とエタクリン酸静脈注射による難聴化処置を行った。難聴化処置を行い、Ad-Tis21-GFPを蝸牛正円層より投与し、処置1日後、2週間後、1か月後に聴力評価を行った。2週間後には大きな差異は認めなかったが、1か月後には改善を認めた。また、らせん神経節細胞数カウントを行うと、2週間後、1か月後に明らかな差を認めた。すなわちTis21を内耳に導入することでらせん神経節細胞の保護効果を認め、ひいては難聴の進行抑制効果をもたらすことが示された。申請者は「マウスラセン神経節細胞に対して毒性を示すシスプラチンに対するTis21の細胞保護作用と治療効果について検討を行うこと」を最終的な目的としている。具体的な方法として、1シスプラチン投与による難聴処置前にTis21を組みこんだアデノウイルスベクターを正円窓経由にマウスの外リンパ腔内へ投与することで、内耳障害の発生を妨げることができるか、2シスプラチン投与による難聴処置後にTis21を組み込んだアデノウイルスベクターを正円窓経由にマウスの外リンパ腔へ投与することで内耳傷害の発生および進行が抑制されるか、について検討するが、平成26年度はまず、Tis21を組み込んだアデノウイルスベクターを正常マウスの正円窓経由に外リンパ腔へ投与した後のTis21の導入部位を確認した。具体的な方法として、1シスプラチン投与による難聴処置前にTis21を組み込んだアデノウイルスベクターを正円窓経由にマウスの外リンパ腔内へ投与することで、内耳傷害の発生を妨げることができるか、2シスプラチン投与による難聴処置後にTis21を組み込んだアデノウイルスベクターを正円窓経由にマウスの外リンパ腔内へ投与することで内耳傷害発生および進行が抑制されるか、について検討する。本年度は、まずin VitroでTis21の免疫染色法を行った。細胞はMEFを用い、Tis21を組み込んだアデノウイルスベクターを投与し、免疫染色の一次抗体として抗Tis21抗体を用い免疫染色を行った。その結果、アデノウイルスベクター10μl(2×107ffu/ml)および20μl(2×107ffu/ml)投与群の双方においてMEFの細胞質にTis21の発現を認めた。その後in vivoでの実験を行った。正円窓にスポンゼルに浸み込ませたTis21を組み込んだアデノウイルスベクターを留置することにより、Tis21は、有毛細胞、支持細胞、血管条、ラセン靭帯、ラセン神経節に導入されることを確認した。これまでの実験では、Tis21の免疫染色に難渋したため、in vitroで線維芽細胞を用いることで、抗Tis21抗体の確認を行った。マウス蝸牛正円窓に対する処置が困難であったため、動物種をモルモット変更し、実験を継続した。Tis21を組み込んだアデノウイルスベクター(Ad-Tis21-GFP)をモルモット蝸牛正円窓より注入することで、有毛細胞、支持細胞、蝸牛血管条、SGCにTis21が導入された。平成27年12月から平成28年1月まで申請者は産休および育児休暇を取得しており、このため、時間的制約により、平成28年度はモルモット内耳傷害モデルの作製までは至らなかった。平成27年12月から平成28年1月まで申請者は産休および育児休暇を取得しており、このため、時間的制約および手技の困難性、エフォートの実現の観点より研究を効率的に進めることができなかった。前年度より、マウス蝸牛正円窓に対する処置が困難であったため、動物種をモルモット変更し、実験を継続している。前年度には、Tis21を組み込んだアデノウイルスベクター(Ad-Tis21-GFP)をモルモット蝸牛正円窓より注入することで、有毛細胞、支持細胞、蝸牛血管条、SGCにTis21が導入されたことを確認した。当該年度には、シスプラチンではなくゲンタマイシンとエタクリン酸により内耳傷害モデルモルモットを作製し、難聴および前庭障害を起こすことを確認した。また、内耳傷害1日後に正円窓経由でAd-Tis21-GFP投与を行い、1週間後および1か月後の評価時点で難聴改善していることを確認した。

平成26年度はTis21を組み込んだアデノウイルスベクターを正常マウスの正円窓経由に外リンパ腔へ投与した後のTis21の導入部位を確認することを目標としたが、マウス正円窓にウイルスベクターを投与する手技がとても困難であった。また、Tis21の発現を確認する方法として免疫染色を用いる予定であるが、この免疫染色にも苦慮している状況である。Tis21を組み込んだアデノウイルスベクター用いた遺伝子導入を内耳傷害を来したモルモットに行い、内耳傷害に対するTis21導入の影響を評価する。Tis21の抗アポトーシス作用を検証するため、アデノウイルスベクターではなく、申請者らが以前より用いている細胞透過性蛋白であるポリアルギニンを用いて検証を行う。また、薬剤による内耳傷害モデルもシスプラチンではなく、申請者らがよく使用しているゲンタマイシンを用いて、実験を簡素化し研究を進める。内耳基礎研究マウスでの実験が困難な場合は、実験モデルの動物種をモルモットに変更することも検討中である。産休および育休により、平成27年12月7日平成29年1月22日まで研究活動を中断していたため、科研費を翌年度に繰り越すこととなった。実験の遂行が遅れているため、費用の支出も遅れている状況である。遅れている実験についても引き続き実施する予定であるため、それも伴い費用の支出も予定通り必要となる。
ヒト大腸がん幹細胞の継代培養系における腫瘍形成能維持のメカニズムの解明

近年、がん組織の一部に存在するがん幹細胞が、がんの発生や治療抵抗性、再発に深く寄与すると考えられている。本研究により、ヒト大腸がん手術検体よりがん幹細胞の特性を有する細胞の簡便かつ安定的な継代培養法を確立した。その為、我々が樹立した大腸がん幹細胞の培養法に基づき、がん幹細胞の生物学的特性を解明することは、革新的ながん治療法の開発につながる事が期待される。前年度までに、大腸がんの手術検体より、大腸がん幹細胞のスフェロイド培養法を確立し、スフェロイド中のCD44陽性細胞が「がん幹細胞」としての形質を有する事を明らかにした。そこで、今年度は大腸がん幹細胞の維持に重要であるCD44の発現制御機構について更なる解析を進めた。フローサイトメトリーを用いて、スフェロイド細胞をCD44陽性細胞と陰性細胞に分離後、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析、及びウエスタンブロット等の生化学的解析を行った。その結果、CD44陰性細胞と比較してCD44陽性細胞でAkt-mTOR経路が活性化している事を見出した。そこで、AktやmTORの特異的阻害剤により、Akt-mTORシグナル伝達経路を遮断すると、CD44の発現やスフェロイド形成が抑制された。さらに、マウス皮下腫瘍モデルにおいて、mTOR阻害剤を投与する事により、スフェロイド細胞による腫瘍形成が顕著に抑制された。以上の結果より、大腸がん幹細胞において、Akt-mTOR経路の活性化によるCD44の発現誘導がスフェロイド形成、及び腫瘍形成に重要な役割を担っている事が明らかとなった。今回の研究成果により、我々が確立したがん幹細胞のスフェロイド培養法は、大腸がんに限らず、種々のがん種に適用できる可能性がある。その為、がん幹細胞の本態の解明、及びがん幹細胞を治療標的とした研究等、幅広い研究領域において非常に有用であり、がんの撲滅に向けた治療戦略への応用が期待される。申請者は今年度、ヒト大腸がん検体より大腸がん幹細胞の特性を有する細胞の継代培養が可能となるスフェロイド培養法を確立し、スフェロイド中のCD44陽性細胞が「がん幹細胞」としての形質を有する事を明らかにした。一方、CD44陰性細胞は「幹細胞性」を失ってはいるが、CD44陽性がん幹細胞に脱分化する能力を持つという予想外の発見をし、論文発表した(Ohata et al., Cancer Res. (2012))。現在、ヒト大腸がん幹細胞における「幹細胞性」及び「CD44発現制御」のメカニズムとその生物学的な意義を解明するために、下記の二項に取り組んでいる。1. CD44による「幹細胞性」維持に働く遺伝子群の同定:CD44による「幹細胞性」維持のメカニズムを詳細に解析するために、CD44によって制御される下流遺伝子を探索している。フローサイトメトリーを用いて、スフェロイド細胞をCD44陽性細胞と陰性細胞に分離後、CD44陽性細胞と比較してCD44陰性細胞で発現減少している遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。現在、CD44に対するshRNAを導入したスフェロイド細胞を作製中であり、コントロール細胞と比較してCD44ノックダウン細胞において発現が減少している遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて探索する予定である。2.大腸がん幹細胞におけるCD44発現制御機構の解析:申請者は、CD44の発現誘導が大腸がん幹細胞の維持に重要である事を見出した(Ohata et al., Cancer Res. (2012))。そこで現在は、CD44の発現制御機構を解析しており、CD44の発現が転写後レベルで制御されている事が明らかとなってきた。一つは、マトリックスメタロプロテアーゼによるCD44の分解制御であり、もう一つはPTEN-Akt-mTOR経路によるCD44の翻訳制御である。今年度は論文の投稿に時間を要したため、達成できていない部分も多少あるが、概ね順調であると考える。その理由は以下の通りである。「CD44による「幹細胞性」維持に働く遺伝子群の同定」に関しては、CD44陽性細胞と比較してCD44陰性細胞で発現減少している遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。一方、コントロール細胞と比較してCD44ノックダウン細胞において発現が減少している遺伝子も、DNAマイクロアレイを用いて探索する予定であったが、現在CD44ノックダウン細胞を作製中であり、やや遅れていると考える。「大腸がん幹細胞におけるCD44発現制御機構の解析」に関しては、マトリックスメタロプロテアーゼによるCD44の分解制御とPTEN-Akt-mTOR経路によるCD44の翻訳制御が重要である事が明らかとなったので、大きく進展していると考える。「CD44による「幹細胞性」維持に働く遺伝子群の同定」に関しては、CD44ノックダウン細胞を作製し、コントロール細胞と比較して発現が減少している遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて解析する予定である。CD44ノックダウン細胞とCD44陰性細胞で共通して発現減少している遺伝子群を、CD44の下流遺伝子の候補とする。更に詳細な解析を進める。

「大腸がん幹細胞におけるCD44発現制御機構の解析」に関しては、RNAi法によりCD44の分解に関与するマトリックスメタロプロテアーゼの特定を試みる。一方、PTEN-Akt-mTOR経路によるCD44の翻訳制御に関しては、大腸がんにおける意義を検証する予定である。具体的には、スフェロイド細胞、マウス皮下腫瘍モデル、ヒト大腸がん組織等を用いて、CD44の発現とPTEN-Akt-mTOR経路の活性化との相関を免疫染色等により検討する。また、AktやmTORに対する阻害剤がスフェロイド細胞による腫瘍形成を抑制する可能性をマウス皮下腫瘍モデルにより検証する。該当なし
創薬評価のための血液脳関門(BBB)を有する神経組織アレイ

本研究課題では、膨大な種類の薬剤や毒性物質の神経細胞に対する影響を短時間で解析するために「血液脳関門(BBB)を有する神経組織アレイ」を構築する。具体的には、ガラス基板上に3次元神経組織をアレイ化し、上部に脳毛細血管細胞が培養された流路を構築することで、血液脳関門を有する神経組織の培養アレイを確立する。最終的に,アルツハイマー病モデル組織アレイの構築を行い、薬剤の灌流にともなう血管脳関門の薬剤透過性評価,多点観察システムを利用した薬剤添加時の神経細胞の組織学的・機能的な解析を行い本系の有効性を示すことを目的としている。本年度は、研究代表者が研究実施場所を異動したことから、クリーンベンチや顕微鏡システムなどを購入し、主に培養系のセットアップを主に行った。装置がそろい、研究体制が整備されるまでの間は、共同研究先で積極的に研究活動をすることで、時間のロスなく研究に取り組んだ。特に分担研究者の慶應大学の尾上とは神経幹細胞組織のアレイの構築に着手し、in vitroでマウス神経幹細胞やヒト神経細胞から構築された3次元神経組織の構築を行った。また、神経組織アレイに最適な神経組織の条件をマウス神経幹細胞を用いて行った。分化誘導後、構築された神経組織で、神経細胞への分化効率が高い高さ100 umの形状のモールドを神経組織アレイとして採用した。さらに構築された神経組織に対し、グルタミン酸投与による神経変性試験を行い、神経変性が誘導されることを確認し、神経組織としての有効性を検証した。本研究成果は、「神経幹細胞を利用したドラッグスクリーニングのための3次元神経組織構築」という内容で日本薬学会で発表した。研究代表者が研究実施場所を異動したことから、クリーンベンチや顕微鏡システムなどを購入し、主に培養系のセットアップを行っていたため、研究計画に少し遅れがみられるが、研究成果を学会発表出来たことから、おおむね順調と考えられる。神経組織アレイの構築に成功したため、次のステップとして脳の毛細血管を用いた共培養系の確立を行う。次年度は特に、共培養システムに重要な培養デバイスの開発を主に行いその成果を論文として発表する。
反省的実践家の教師像を育成する教師教育カリキュラム開発のための理論的・実証的研究

本研究の目的は、理論的研究(歴史的・比較教育学的研究)と臨床的・実証的研究に基づき、初等・中等学校教員の養成教育を主対象として、生涯にわたる教職開発(教師の専門的成長)の視座から、小学校・中等学校教員で「教科指導力」と「子ども理解力」の両方を兼ね備えた新しい教師像である反省的実践家としての教師養成のための方略を明らかにすることである。研究の結果、以下のことなどが明らかとなった。・英米においては「反省的実践家」はひとつの専門職としての教師像と認識され、教員養成教育段階からその育成が求められている場合があること。そしてそれは、養成教育と現職教育の連続性の視座に基づいていること。ただ、必ずしも「反省的実践家」については共通する明確な定義がなされてはおらず、このモデルに批判的な考え方も認められること。・イギリスの養成教育においては、教育実習生へのメンタリングが機能的に働いており、メンターの役割も教育実習生の発達段階に合わせて変容していくこと。これは、教育実習の量的拡大の重要性もさることながら、質的充実を示唆するものである。・わが国の臨床的・実証的研究からは、教職希望者を対象としたわが国の授業観察実習が教材作成のメタ認知的知識を授業者の視点から構造化していたこと、教育実習生の教育実習の目的観や教育実習への期待に関しプレ・ポスト調査と研究期間における継続調査により、教育実習生の認識の変容を明らかにした。以上のような知見やその他の知見を加え、教職の専門性を再検討し、育成すべき教師像を明確にした上で教員養成教育を生涯にわたる教師の専門的成長の導入段階と位置づけること、教員養成機関と教育実習校とのパートナーシップの確立の上に、効果的なメンタリングを行うこと、などを指摘した。本年度は、以下の3点に関して研究を行った。1.欧米において提唱され、実践されている新しい教師像である反省的実践家像の理論的解明新しい専門家像としての反省的実践家の教師像の本質について教科レベルにおける再検討を行った。この教師像は、研究者により多様な定義がなされていること、教科レベルでは研究・実践の程度が違っていること、などが明らかとなった。なお、アメリカの大学における教員養成プログラムについて資料収集するとともに、フィールドワークを行っており、反省的実践家の教師がどのようなプロセスで育成されるのについては、現在分析中である。2.わが国の教師に求められた資質の解明特に本年度は、戦前における小学校教師に求められた資質について、文献調査に基づいて師範学校における養成教育の分析から明らかにした。教職教養的教育について、現在のものと比較すると、最も大きな違いが認められるのは教育実習であった。教育実習の内容や期間についてもいくつかの違いは認められるが、特に教育実習の位置づけに大きな違いが認められる。戦前では、今日一般的な積み上げ方式は昭和初期に提唱されたが、最高学年における「師範教育の総仕上げ」としての位置づけは不変であった。3.国立大学附属学校教育実習指導教官への調査による教育実習の実態の解明研究代表者と分担者が所属する大学や他大学教育学部附属学校において、教育実習指導教官へのインタビュー調査を行い、教育実習の内実について検討した。その結果現時点では、教育実習の位置づけに関する考え方が、生涯にわたる教職開発の導入という意識が強いこと、教育実習生に対する大学と附属学校との支援やフィードバックが希薄であること、などが明らかとなった。本年度は、以下の研究を行った。1)イギリスの教師教育研究者(バース大学・Dr Paul Denley)を招聰し、研究協議会(平成15年10月広島大学にて)を開催し、イギリスの反省的実践家の理論的研究動向について協議した。またイギリスの教師教育の実践における問題点とその改善に向けての取り組みについて情報を得た。

その結果の一つとして、教育実習における教科メンターと役割が極めて重視されており、教育実習生とのコミュニケーションであるメンタリングが機能していることが明らかとなった。2)理論研究としてわが国の中等学校教師に求められていた資質について調査分析を行った。その結果、理科教師の場合を考察すると、初等教育をも含む中等教育全体に関わる知識基礎、その教科固有の知識基礎があることが明らかとなった。3)実証的研究として、(1)教育実習担当教師のライフヒストリーに関する調査、(2)教育実習生の教職と教育実習(本実習)に対する期待や取り組みに関する調査(事前調査と事後調査)、(3)学部学生を対象にした教育実習(観察実習)改善のための調査を行った。その結果、例えば、(1)より教育実習が単なる一過性の経験的営為となっていることが明らかとなった。また、(3)より教育実習生は実習前には「アドバイザー」の役割を実習校の指導教官に期待していたが、実習後には「役割モデル」、「トレーナーまたはコーチ」の役割であったと認識していることが明らかとなった。(3)に関しては、「生徒理解」に焦点化した調査であり、現在分析段階である。本研究は、教員養成教育を生涯にわたる教師の専門的成長の導入段階という視点で行った。本年度は、反省的実践家の教師の育成に不可欠であると考えられる、専門的力量形成のひとつの場である教育実習を中心に、理論的研究と実証的研究を実施した。理論的研究においては、主として、イギリスにおける教員養成教育段階におけるメンターの役割とメンタリングシステムの内実を明らかにした。また、実証的研究に関しては、わが国の教育実習における観察実習(事前指導)が教材作成のメタ認知的知識に及ぼす効果、本実習におけるメンタリングの可能性、および教育実習生の教職観と教育実習観(この調査のみ継続調査)について実態調査を実施した。その結果、以下のことが明らかとなった。1)理論的には、メンターは反省的実践家の素質を有していること、教育実習生の発達段階によりメンターの役割や指導内容が変容すること。実証的には、わが国の教育実習においては、指導教員による教育実習生への指導内容が具体的なものから抽象的なものへと変容する傾向が一部見られたこと、但し、それは必ずしも理論的な発達段階とは一致するものではない。2)授業観察を主体とした教育実習(授業観察や解説、討議等をすべて含む)によってメタ認知的知識が授業者の視点から構造化されるということ。3)教育実習前・後の調査や継続調査から、教育実習は教えるということがどういうことなのかを実際に経験して知るためにある、という考え方がいずれの調査においても、教育実習生は肯定的であること。以上のことは、教員養成教育における教育実習のより質的拡充の必要性を示唆するものである。この他にも、本年度の研究成果として、教師知識に関する理論的研究から教員養成教育における教科教育の再考が求められること、などを指摘した。