hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オーディトリーニューロパチーに対する再生治療の実現を指向した聴神経分化機構の解明

オーディトリーニューロパチーに起因する感音難聴の再生治療の実用を目指し、ホメオボックス型転写因子Tlx3を発現させた間葉系幹細胞から聴神経様細胞を分化誘導させる方法を報告した。しかし、この方法では分化効率が低く、それが再生治療法開発を進めるうえで問題となっている。Tlx3がクロマチンのアセチル化修飾を介して、胚性幹細胞(ES細胞)から聴神経様細胞への分化運命の決定を行うことを明らかにした。本研究計画では、分化誘導効率の改善を目指し、Tlx3強制発現ES細胞から聴神経様細胞の分化過程において、Tlx3がどのようにクロマチンのアセチル化パターンを変えるのか、その結果、遺伝子発現にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることである。これまで、Tlx3強制発現ES細胞の遺伝子発現パターンをコントロールES細胞(Tlx3を強制発現していない細胞)と比較し、Tlx3により発現が有意に変化する遺伝子を網羅的に調べた。Tlx3強制発現により発現が上昇した遺伝子が311、逆に発現が下がった遺伝子が113であった。これら変動した遺伝子の中に、聴神経分化において鍵となる遺伝子が含まれる可能性が高い。そこで、平成30年は主に、分化への関与の可能性が高い遺伝子の絞り込みを開始した。具体的には、今回得られたデーターからGO解析およびPathway解析、および遺伝子(因子)の発現および局在データベースを用い、遺伝子候補の絞り込みを行った。クロマチンを構成するヒストンのアセチル化修飾は、クロマチン構造変換を引き起こし、結果として遺伝子の転写活性を調節している。そこで、分化に関与すると考えられ候補遺伝子について、その遺伝子領域のアセチル化修飾パターンを解析すべく、Chipアッセイを開始した。平成28年度、実験材料となる細胞培養の条件の検討を行った。これに伴い研究計画時期の見直しを行い、これが平成30年度の進捗に影響した。さらに、網羅的解析により得られた遺伝子数が多く、分化に関わる候補遺伝子の絞り込みに時間を要したため。【現在までの進捗状況】でも述べたように研究計画は遅れている。さらなる結果解析にまだ時間がかかりそうではある。引き続き、解析を専門にしている研究分担者のサポートを得ながら、解析時間の短縮に努める。オーディトリーニューロパチーに起因する感音難聴の再生治療の実用を目指し、ホメオボックス型転写因子Tlx3を発現させた幹細胞から聴神経様細胞を分化誘導させる方法を報告した。しかし、この方法を治療に用いるには分化効率が低すぎる。Tlx3がクロマチンのアセチル化修飾の制御を介して、胚性幹(ES)細胞から聴神経様細胞への分化運命を決定することを明らかにした。これらの結果に基づき、本研究計画は、より効率の高い分化誘導法の開発を目指し、Tlx3強制発現ES細胞から聴神経様細胞への分化過程において、Tlx3がどのようなアセチル化修飾パターンをクロマチン上に生み出すのかを明らかにすることである。平成28年度は、まずTlx3強制発現ES細胞株の樹立を行った。Tlx3強制発現ES細胞株を作製し保管していたが、この株でのTlx3の発現量が継代と共に減少し、聴神経様細胞への分化効率が著しく落ちる。これを改善、すなわち安定かつ高い分化効率をもつTlx3強制発現ES細胞株の樹立を行った。現状用いている発現ベクターはES細胞での発現維持には適さないと考え、ヒトポリペプチド鎖伸長因子遺伝子のプロモーター(ES細胞に適しているとの報告があり)により発現を促す発現ベクターを用い、Tlx3発現ベクターの構築を行った。また、分化効率はES細胞の培養条件、特に血清のロットにより多大な影響を受ける。分化効率への培養条件による影響を抑える目的で、無血清培地およびフィーダー細胞フリーによる培養を適応した。Tlx3発現ベクターをES細胞に導入したが、導入後の培養で細胞が死滅してしまった。そこで、無血清培地培養条件の見直しを行った。結果、LIF,BMP-4,GSK3β阻害剤を含む無血清培地での培養で死滅は回避できた。今後はこの無血清培地を用いて研究を進めてゆく。研究実績で述べたように、本年度は、Tlx3の発現ベクターとES細胞培養条件の見直しから行った。当初半年くらいで終了する予定であったが、予想以上に培養条件の検討に時間がかかってしまった。平成29年度は、Tlx3強制発現ES細胞の遺伝子発現パターンを、コントロールES細胞(Tlx3を強制発現していない細胞)と比較し、Tlx3により発現が有意に変化する遺伝子を網羅的に調べた。その結果、Tlx3強制発現により発現が上昇した遺伝子が311、逆に発現が下がった遺伝子が113となった。そこで、平成29年度後半から、分化への関与の可能性が高い遺伝子を選別を開始した。

具体的には、今回得られたデーターと各遺伝子情報(生体内での発現パターンや機能情報のデータベース)から、遺伝子候補を選別している。平成28年度、実験材料となる細胞培養の条件の検討を行った。これに伴い研究計画時期の見直しを行い、これが平成29年度の進捗に影響したため。オーディトリーニューロパチーに起因する感音難聴の再生治療の実用を目指し、ホメオボックス型転写因子Tlx3を発現させた間葉系幹細胞から聴神経様細胞を分化誘導させる方法を報告した。しかし、この方法では分化効率が低く、それが再生治療法開発を進めるうえで問題となっている。Tlx3がクロマチンのアセチル化修飾を介して、胚性幹細胞(ES細胞)から聴神経様細胞への分化運命の決定を行うことを明らかにした。本研究計画では、分化誘導効率の改善を目指し、Tlx3強制発現ES細胞から聴神経様細胞の分化過程において、Tlx3がどのようにクロマチンのアセチル化パターンを変えるのか、その結果、遺伝子発現にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることである。これまで、Tlx3強制発現ES細胞の遺伝子発現パターンをコントロールES細胞(Tlx3を強制発現していない細胞)と比較し、Tlx3により発現が有意に変化する遺伝子を網羅的に調べた。Tlx3強制発現により発現が上昇した遺伝子が311、逆に発現が下がった遺伝子が113であった。これら変動した遺伝子の中に、聴神経分化において鍵となる遺伝子が含まれる可能性が高い。そこで、平成30年は主に、分化への関与の可能性が高い遺伝子の絞り込みを開始した。具体的には、今回得られたデーターからGO解析およびPathway解析、および遺伝子(因子)の発現および局在データベースを用い、遺伝子候補の絞り込みを行った。クロマチンを構成するヒストンのアセチル化修飾は、クロマチン構造変換を引き起こし、結果として遺伝子の転写活性を調節している。そこで、分化に関与すると考えられ候補遺伝子について、その遺伝子領域のアセチル化修飾パターンを解析すべく、Chipアッセイを開始した。これに伴い研究計画時期の見直しを行い、これが平成30年度の進捗に影響した。さらに、網羅的解析により得られた遺伝子数が多く、分化に関わる候補遺伝子の絞り込みに時間を要したため。見直しにより実験条件が決まったが、研究計画は半年遅れることとなった。今年度は、Tlx3によるアセチル化パターンを網羅的に調べる計画である。Tlx3の強制発現発現により発現量に変動がある遺伝子クロマチン領域で、特にアセチル化に変化が起きていると考えられる。遅れを取り戻すため、平成29年度後半で予定していたTlx3の発現により発現量に変動が見られる遺伝子の網羅的同定を前半に行う。これにより、先ずアセチル化変化が見られるであろう遺伝子をしぼることで、アセチル化解析を効率的かつ迅速に行う。【現在までの進捗状況】でも述べたように研究計画は遅れているが、昨年度の報告書で述べた到達目標は、ほぼ達成されている。
ＰＫＣｅｔａ多型からみた視神経脊髄炎・多発性硬化症への炎症性マクロファージの関与

PKCeta多型(rs2230500)は多発性硬化症(multiple sclerosis, MS)および視神経脊髄炎(neuromyelitis optica, NMO)のリスク因子ではなく、臨床経過との関連も認められなかったが、末梢血単球の機能分類では、無治療MSにおいてrs2230500-AA or GA群はGG群と比較してCX3CR1陽性細胞の割合が高く、髄液サイトカイン・ケモカイン測定では寛解期MSおよび一次進行型MSにおいてCXCL8濃度がrs2230500-AA or GA群で有意に高かった。多型間でのマクロファージ・ミクログリア機能の差異が示唆された。多発性硬化症(MS)の極めて初期の病巣における病理学的評価では,オリゴデンドロサイトの変性が先行することが示されており,また周囲には活性化したミクログリアが確認されている。また初期病巣におけるオリゴデンドロサイトの変性・アポトーシスは,周辺ミクログリアの活性化に伴う炎症促進性サイトカインの分泌がトリガーとなっている可能性がある。一方MSとは異なる病態機序を有すると考えられている視神経脊髄炎(NMO)においては,その特異的抗体の自己抗原であるaquaproin4(AQP4)がアストロサイトの足突起に主に発現していることや,病理学的評価によるGFAPやAQP4の発現低下の所見から,アストロサイト障害を主体としていると考えられているが,ミエリン蛋白の消失やミエリン蛋白貪食マクロファージはNMOにおいても認められており,アストロサイト障害と脱髄形成を結ぶ過程についてはいまのところ十分な説明仮説が存在しない。とくにミクログリアとの関連についてはほとんど不明である。我々は,日本人において頻度が高く,ラクナ梗塞の発症リスクであることが確認されたPRKCH多型(SNP rs2230500)がマクロファージ機能に影響を与える事が示されている事から,同多型の頻度をMS,NMO患者において確認したが,同多型と発症リスクとの関係は認められなかった。しかし,末梢血単球のサブセットをフローサイトメーターで検討したところ,無治療寛解期MSにおいて,rs2230500-AAまたはrs2230500-GAの群では,rs2230500-GG群よりもCD14+CD16-細胞中とCD14+CD16+細胞中のCX3CR1+細胞の割合が高かった.また,rs2230500-GG群において,無治療寛解期MSでは健常者よりもCD14+CD16-細胞の割合が少なかった.PKCeta多型(rs2230500)は多発性硬化症(multiple sclerosis, MS)および視神経脊髄炎(neuromyelitis optica, NMO)のリスク因子ではなく、臨床経過との関連も認められなかったが、末梢血単球の機能分類では、無治療MSにおいてrs2230500-AA or GA群はGG群と比較してCX3CR1陽性細胞の割合が高く、髄液サイトカイン・ケモカイン測定では寛解期MSおよび一次進行型MSにおいてCXCL8濃度がrs2230500-AA or GA群で有意に高かった。多発性硬化症(Multiple sclerosis; MS)の極めて初期の病巣における病理学的評価では,オリゴデンドロサイトの変性が先行することが示されており,また周囲には活性化したミクログリアが確認されている。一方MSとは異なる病態機序を有すると考えられている視神経脊髄炎(neuromyelitis optica; NMO)においては,その特異的抗体の自己抗原であるaquaproin4(AQP4)がアストロサイトの足突起に主に発現していることや,病理学的評価によるGFAPやAQP4の発現低下の所見から,アストロサイト障害を主体としていると考えられているが,ミエリン蛋白の消失やミエリン蛋白貪食マクロファージはNMOにおいても認められており,アストロサイト障害と脱髄形成を結ぶ過程についてはいまのところ十分な説明仮説が存在しない。我々は,日本人・漢人において頻度が高く,ラクナ梗塞の発症リスクであることが確認されたPRKCH多型がマクロファージ機能に影響を与える事が示されている事から,同多型の頻度をMS,NMO患者において確認した。MS114例,NMO54例,健常群140例においてSNP rs2230500多型を確認したが,同多型と発症リスクとの関係は認められなかった。特発性再発性中枢神経脱髄性疾患患者を対象とした,高感度のAQP4抗体測定を含めたNMO群,MS群の群分け,およびPRKCHの一塩基多型(rs61740172,rs2230500,rs2230501)をPCR direct sequencingにより確定した。さらに末梢血単球のサブセットのフローサイトメーターによる検討をおこなっている.病理学的解析については今までに収集されたMS5例,NMO11例の剖検標本(いずれもパラフィン包埋)を対象として,アストロサイトマーカーを中心に解析を進めている。今後マクロファージの集簇部位(急性期脱髄病巣)を中心にマクロファージ/ミクログリアの機能性バランスを表面抗原や産生物質を対象とした抗体を用いて免疫組織学的染色を行い評価する。

平成23年度に予定してたように,特発性再発性中枢神経脱髄性疾患患者を対象とした,高感度のAQP4抗体測定を含めたNMO群,MS群の群分け,およびPRKCHの一塩基多型(rs61740172,rs2230500,rs2230501)をPCR direct sequencingにより確定した。病理学的解析については今までに収集されたMS5例,NMO11例の剖検標本(いずれもパラフィン包埋)を対象として,アストロサイトマーカーを中心に解析を進めている。今後マクロファージの集簇部位(急性期脱髄病巣)を中心にマクロファージ/ミクログリアの機能性バランスを表面抗原や産生物質を対象とした抗体を用いて免疫組織学的染色を行い評価する。疾患リスクとしての相関は確認できなかったが,PRKCH多型はある特定の条件下で単球への影響が示唆された.したがって,臨床情報と多型頻度との相関を統計学的にさらに解析するとともに,末梢血,および脳脊髄液中のTh1/Th2およびM1/M2比を産生サイトカイン,表面抗原に対する抗体を用い,フローサイトメトリー法により同定する。これらTリンパ球,マクロファージの機能的なバランスとPRKCH遺伝子多型との関連を明らかにする。また脱髄性疾患患者再発時の髄液の収集を進め,蛍光ビーズサスペンショアレイ法によりサイトカイン・ケモカインを一括測定し,PRKCH多型との相関を明らかにする。PRKCH多型との関連が免疫学的に確認された場合は,PKCetaノックアウトマウスを用い、実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症させ,その重症度の違いをwild mouseと比較する。PKCeta以外のマクロファージ・ミクログリア機能に関連した候補SNPを検討し,いくつかの一塩基多型と特発性脱髄性疾患の発症リスクとの関連を明らかにする。疾患リスクとしての相関は確認できなかったがPRKCH多型のマクロファージ,T細胞への影響からその重症度や病状の進行に影響を及ぼしている可能性はある。臨床情報と多型頻度との相関を統計学的にさらに解析する。またMS,NMOの末梢血,および脳脊髄液中のTh1/Th2およびM1/M2比を産生サイトカイン,表面抗原に対する抗体を用い,フローサイトメトリー法により同定する。組織染色およびフローサイトメトリ,サイトカイン・ケモカイン測定用の抗体.またPKCeta以外のマクロファージ/ミクログリア機能に関連する多型検索のため,いくつかの候補SNPの同時的genotypingにかかる費用。組織染色およびフローサイトメトリ,サイトカイン・ケモカイン測定用の抗体.PRKCH多型との関連が認められた場合はPKCetaノックアウトマウスを対象とした実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導にかかる抗原,動物購入費用。
変性リゾチームによるノロウイルス不活化メカニズムの解明

平成30年度は、変性リゾチームによる不活化機構を3つの柱に分けて詳細に解析し、期待以上の進展が得られた。1つ目の柱として、変性リゾチームがノロウイルスに対する不活化効果を強く発揮する条件を探索し、その理由として示唆されるデータを示した。2つ目の柱として、サイトカイン発現解析により宿主細胞によるリゾチーム・ノロウイルス反応物の認識の有無を検証した。これにより、リゾチームによる不活化作用がノロウイルスの感染過程におけるどの段階で起きているのかを明らかにした。3つ目の柱として、ペプチドの置換体を用いた不活化ドメインの探索を実施した。既報ではノロウイルスの代替ウイルスであるMurine norovirus strain1(MNV-1)に対して不活化効果を示すリゾチームの部分配列を明らかにしている。本研究では、この部分配列に任意の置換を加えた際のMNV-1に対する不活化効果を検証した。さらに、当該配列の含まれない他の領域についても合わせて抗ウイルス効果の有無を検証した。これらのアプローチにより得られた成果は、2018年11月に開催された日本食品衛生学会第114回学術講演会にて口頭発表し、優秀発表賞を受賞した。当該発表賞は、食品衛生学会学術講演会で発表された演題のうち、口頭発表から2題のみ選出されるものである。リゾチームは卵白に由来する無味無臭のタンパク質であり、食品中においてもその効果を維持しながら食味に影響を与えないという利点がある。本研究により得られた成果は、変性リゾチームをノロウイルスの不活化製剤として利用拡大するにあたり有用な知見になると考えられる。現在、得られた成果を投稿論文として執筆段階にある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では加熱変性リゾチームによるウイルス不活化機構の解明と、応用性の検討の2課題を並行して進めている。初年度は加熱変性リゾチームの応用性検討に関して、まとまった成果が得られた。2年目にあたる本年度は、加熱変性リゾチームによるウイルス不活化機構の解明を重点的に進めていく予定である。現在までに、加熱変性リゾチームがノロウイルスに対して不活化効果を示す条件は精査されているが、不活化条件下での加熱変性リゾチームとノロウイルスの相互作用や、加熱変性リゾチームにおける不活化作用部位を明らかにするための検証を進めていく予定である。あわせて、加熱変性リゾチームをノロウイルス食中毒の主な感染源となる水産物に応用するための検証も行う。リゾチームは塩基性タンパクであるため、海水などの塩を含む溶液中では白濁・凝集し、食品の外観を損なうという問題点がある。本年度は加熱変性リゾチームの凝集性を解消し、水産物の洗浄等に利用可能な製剤開発を目指す。今年度は本課題の最終年度であるため、研究成果をまとめて国際誌等で発表できるよう準備も進める予定である。加熱変性リゾチームによるウイルス不活化機構の解明については現在も検証を続けているが、加熱変性リゾチームの応用性検証に関しては国際誌掲載などまとまった成果に出来たと考えている。2年目も不活化機構の解明と応用性の検証を並行して進めていくが、特に不活化機構の解明に特に注力してデータを取得していく予定である。2年目は加熱変性リゾチームの不活化機構の解明を重点的に進めていく。現在、加熱変性リゾチームがどのような条件で不活化効果を示すかについてはデータが揃いつつあるが、不活化条件のとき加熱変性リゾチームとノロウイルスがどのような相互作用をしているか、加熱変性リゾチームにおける不活化作用部位がどこなのか明らかにするための検証を行う予定である。

今年度は本課題の最終年度であるため、研究成果をまとめて国際誌等で発表できるよう準備も進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
次世代染色体工学の確立

コピー数多型(CNV)は、ゲノム上の重複、欠失などを表し、癌や精神疾患などの様々な疾患の原因と考えられている。それら疾患の病態解明、治療法の開発のためにはCNVモデルの開発が必須である。本研究では、最新のゲノム編集技術を用いて、簡便、高速、高効率を兼ね備えた「次世代」染色体工学の確立を目指した。実際にゲノム編集技術と相同組み替え用遺伝子を用いて、長い(Mbオーダー)ゲノムの欠損を作製することに成功した。ゲノム編集技術による「次世代」染色体工学の開発により、CNVの作製は革新的に早くなり、網羅的ヒトCNVモデルの構築が可能になり、また将来のゲノム治療の基盤的技術となりうる。コピー数多型(CNV)は、ヒトの多様性のみならず、癌や精神疾患などの様々な疾患の原因と考えられ、それらの病態解明、治療法の開発のためにはCNVモデルの開発が必須である。ES細胞相同組み替えを基盤とする従来の染色体工学では、一個の作製に数年の年月を要し、網羅的CNVモデルを作製するには限界があり、技術的ブレークスルーが必要である。本研究では、TALENやCRISPR/Casといった最新のゲノム編集技術と組み替え用セレクションマーカーを組み合わせ、簡便、高速、高効率を兼ね備えた「次世代」染色体工学の確立を目指す。我々はこれまでにTALENと組み替え用セレクションマーカーを組み合わせた方法によりMbオーダーのゲノム欠損に成功している。本研究では、この1TALENを用いた「次世代」染色体工学の検証として、off-targetの可能性を検討する。また、TALEN法の成功に準じて、CRISPR/Casと組み替え用セレクションマーカーを組み合わせた方法により2CRISPR/Casを用いた「次世代」染色体工学の開発を目指す。CRISPR/Casは、細菌の適応免疫システムで、その構成因子は、Casヌクレアーゼ及びCRISPR-RNA (crRNA)、trans-activating crRNA(trancrRNAs)とよばれるnon-coding RNAsである。標的DNA領域に相補的なcrRNAが標的DNAに結合し、それを目印としたCasヌクレアーゼが標的領域を破壊する。CRISPR/Casは、非常に高効率に二重鎖切断を導入でき、また複数の変異を一度に導入できる。上記TALEN同様に、ベクターにCNV両末端をターゲットとして組み込む事でヒト染色体15q25.2-25.3の480Kb欠失をえることに成功した。CRISPRベクターと上記TALEN法の際に用いた相同組み替え用セレクションマーカーを組み合わせたものを用いて、フィーダーを必要としないmES細胞株(EBRTcH3)で効率を確認した。5'アーム、3'アームそれぞれで複数の候補選び、ES細胞に導入して、surveyorアッセイで調べた。二本鎖切断の確認できたもの、かつoff-targetの可能性が少ないものの組み合わせを用いて、ES細胞に導入し、欠失をPCRでスクリーニングし、サザンブロティング法で確認した。昨年度までに確立したこれらの方法論の効率を挙げることに成功した。以上のように、CRISPR/Cas9を用いた「次世代」染色体工学の開発に成功した。1TALENを用いた「次世代」染色体工学の検証従来のCre-loxP系を利用した染色体工学的手法を用いて、あらたにヒト染色体15q25.2-25.3欠失のES細胞モデルを構築し、GTを経たキメラマウスの作製に成功していた。また、TALENと相同組み替え用セレクションマーカーを組み合わせることで、「one-step」で長い領域(480Kb)の欠失という染色体改変に成功した。本欠失作製に用いたベクターのホモロジーアームの長さは1Kbにまで短くしても、高効率に欠失変異体をえることができた。2CRISPR/Casを用いた「次世代」染色体工学の開発CRISPR/Casは、細菌の適応免疫システムで、その構成因子は、Casヌクレアーゼ及びCRISPR-RNA (crRNA)、trans-activating crRNA(trancrRNAs)とよばれるnon-coding RNAsである。

CRISPR/Casは、非常に高効率に二重鎖切断を導入でき、また複数の変異を一度に導入できる。上記TALEN同様に、ベクターにCNV両末端をターゲットとして組み込む事でヒト染色体15q25.2-25.3の480Kb欠失をえることに成功した。CRISPRベクターと上記TALEN法の際に用いた相同組み替え用セレクションマーカーを組み合わせたものを用いて、フィーダーを必要としないmES細胞株(EBRTcH3)で効率を確認した。5'アーム、3'アームそれぞれで複数の候補選び、ES細胞に導入して、surveyorアッセイで調べた。二本鎖切断の確認できたもの、かつoff-targetの可能性が少ないものの組み合わせを用いて、ES細胞に導入し、欠失をPCRでスクリーニングし、サザンブロティング法で確認した。病態医化学CRISPR/Casを用いた「次世代」染色体工学を用いて作製したCNVを有するES細胞を利用して、CNVモデルマウスの作製を試みる。細胞のスクリーニングに関して、当初予定していた以上に実験がうまくいき、物品費の使用が少なくなった。来年度は当初予定していた以上の実験としてマウス作製への試みに関して使用する予定である。
地盤-構造物の3次元相互作用に関する研究(特にトンネル群杭問題について)

2次元および3次元の地盤・構造物の相互作用問題として、トンネルと水平応力を受ける群杭を取り上げ、地盤材料や境界面の力学特性を考慮した解析を行なった。これらの解析結果を従来の解析結果と比較することにより、多次元解析の必要性を明確にするとともに地盤・構造物の挙動を定量的に評価できる解析法を提案することを目的とした。成果は以下のようにまとめられる。土の諸特性を考慮できる構成モデルを組み込んだ2次元および3次元有限要素解析プログラムを土・水連成解析が可能なプログラムに拡張し、粘土および砂の種々の要素試験の解析を行い、排水および非排水条件下だけでなく部分排水条件下におけるプログラムの一般的な3次元応力条件下での適用性と信頼性をチェックした。次に地盤と構造物の境界面の摩擦特性を考慮した2次元弾塑性ジョイントエレメントを拡張し、3次元問題に適用できるようにした。そしてその妥当性を要素レベルで検証した。トンネル形状を考慮したトンネル掘削問題の解析を行った。解析ではトンネル形状、地盤材料、施工過程等の違いによる、地表面および地中沈下や地盤内土圧分布の差異について特に検討した。また、トンネル形状を変えたモデル試験も併せて行い、解析結果の妥当性を検証した。埋立て地盤の圧密沈下時の群杭の引き込み沈下問題の解析を行い、他機関で行われた遠心力載荷試験結果と比較検討した。解析結果は部分排水条件下の杭の挙動を適切に表現できるもであった。
細菌病原因子と宿主標的蛋白質の相互作用基盤

腸管病原細菌による感染疾患は、開発途上国を中心に毎年200万の人命を奪い、依然として大きな脅威となっている。近年、開発途上国だけではなく、先進国や日本でも多数の被害者を出している。しかし、これらの病原性大腸菌を含む腸管病原細菌は近年、多剤耐性菌による感染症例が増加し、有効なワクチンもいまだ開発されていないため、新たな治療薬の開発が喫緊の課題である。広範な腸管病原細菌に対しての、既存の抗生物質とは異なる新たな治療薬の開発を究極の目的として、赤痢菌の感染成立に重要な病原因子とその標的宿主蛋白質の複合体の立体構造を明らかにし、感染における病原因子の制御機構を明らかにすることを目的とする。本年度は新規病原因子であるOspH,OspJおよび赤痢菌のユビキチンリガーゼIpaHファミリーの解析を行った。(1)IpaHファミリーの構造解析;IpaH4.5は宿主のプロテアソーム構成因子と結合し、分解することにより、赤痢菌感染においてプロテアソームの活性を制御することを明らかにした。本年度は複合体精製系構築し、複合体の精製法を検討している。連携研究者により、赤痢菌感染時に免疫反応を抑制するIpaH9.8の基質認識ドメインのX-線結晶構造解析に成功し、基質認識機構を解析している。機能未知のIpaH1880の全長の精製及び結晶化に成功し、精密解析を進めている。(2)新規エフェクター(OspJ,OspH)の精製系構築し、結晶化条件を検討している。Protein array法により新規エフェクターの宿主標的蛋白質の候補を得た。今後、複合体の構造解析を目指す。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は新規病原因子であるOspH,OspJの解析を行った。これら新規エフェクターの感染に果たす役割を調べるために、OspJ, OspHの欠損株をマウス肺に感染させ、感染応答を調べた。野生株赤痢菌感染組織に比べ、OspJ欠損株とOspH欠損株の感染肺組織では多くの免疫細胞の浸潤が認められ、炎症性サイトカインやケモカインの上昇が認められた。免疫応答に関わる制御機構を調べるために、上述の感染組織を用いて、マイクロアレイを行った。その結果、野生株に比べてOspH欠損株の感染肺組織ではCxcl3、ccl3などのケモカインとIL-1bなどのサイトカインの上昇が見られた。OspJ欠損株感染肺組織でもケモカインや炎症性サイトカインの上昇は見られたが、OspH感染組織とは異なる遺伝子の変化が見られた。これらの結果からOspHとOspJは炎症抑制に関わると考えられるがOspHとOspJは異なった経路を利用すると考えられる。OspJの蛋白質精製系を構築し、連携研究者によりこれらのエフェクターの単独状態の結晶化条件検討を行った。さらにOspHとその宿主標的タンパク質との複合体を安定的に精製が可能な精製系を構築した。

新規病原因子の構造解析のための発現系を構築し、感染において炎症免疫反応に関わることを得ることができた。新規病原因子であるOspH、OspJの単独構造を決定する。宿主標的タンパク質が同定されているOspHとIpaHに関しては、宿主標的タンパク質と複合体構造を決定する。宿主標的タンパク質が同定されてないOspJに関しては、プロテインアレイを用いて、宿主標的タンパク質を同定し、免疫応答に関わる影響を調べる。構造解析を行い、それぞれの病原因子が感染に関わる役割を明らかにする。
グローバル化時代における南北アメリカの国家・市民社会・社会運動

本研究では、先住民とアフリカ系人の市民権拡大を求める運動と国家による社会的包摂政策、とりわけ多文化主義政策の調査・分析を通じて、ラテンアメリカ諸国を中心とした南北アメリカにおける国家と市民社会の関係の現状を析出した。その成果の一端は、ペルーとメキシコにおいて現地の研究者とともに国際セミナーを開催して議論したほか、国内学会での個別報告や学会誌での論文発表を行い、最終年度に成果報告書を作成した。2010年度は、各研究分担者による海外調査を中心に研究活動を進めるとともに、研究会およびブラジルから研究者を招いてワークショップと講演会を開催した。海外調査については各研究分担者および研究協力者が、メキシコ(青木、受田)、ホンジュラス(金澤)ペルー(後藤)、ブラジル(鈴木)、ボリビア(福原、鈴木)、ベネズエラ(石橋)、アメリカ合衆国(中條)で行った。禪野は2010年7月から2011年3月まで勤務校の研究休暇でメキシコに滞在した。また、2011年2月には、鈴木がメキシコに赴き、メキシコ滞在中であった禪野、青木、受田とともにメヒケンセ大学イスラエル教授と、2012年度の国際ワークショップ開催の打ち合せを行い、会場を視察した。研究会については、第1回研究会(7月25日、東京外国語大学)において、本プロジェクト全体の研究計画を確認し、本年度の海外調査の打ち合せを行った。第2回研究会(11月6日、桜美林大学)では、ワークショップで招聘するレオナルド・アヴリツツアー氏(ブラジル・ミナスジェライス連邦大学教授)のラテンアメリカにおける民主化と政治参加に関する近年の研究について報告(鈴木)と討論を行った。同氏を報告者とするワークショップは、11月18日に主に政治参加をテーマとしてアジア経済研究所と共催で2回(午前:JETRO本部、午後:アジア経済研究所)、11月20日にはブラジルのアファーマティブ・アクションをテーマとして1回(東京外国語大学)開催した。また、京都外国語大学との共催で講演会「現代ブラジルの政治参加と市民社会」(11月22日、京都外国語大学)を開催した。また、2011年3月1日には「本年度の海外調査」と題して第3回研究会を開催(東京外国語大学)し、受田(メキシコ)、後藤(ペルー)、鈴木(ブラジル、ボリビア)が報告した。今年度は、1現地調査、2研究会、3国際ワークショップを中心として研究活動を進め、現地調査にあたっては、大統領選挙を通したペルーの国家と市民社会の関係と、国連の「世界アフリカ系人の年」にあたって南北アメリカ各地で実施される各種の催しの観察および刊行資料の収集に重点をおくことを計画した。この当初の目標は、ほぼ達成することができた。まず、現地調査に関しては、後藤が5月から6月にかけてペルーに滞在し、ペルー問題研究所(IEP)の協力を得て、大統領選挙の実施過程を観察し、テレビ報道の映像資料をはじめ、多数の資料を収集した。その成果の一部は、2011年7月9日に開催した本年度第1回研究会において報告された。一方、「世界アフリカ系人の年」については、9月に鈴木がブラジル、石橋がベネズエラ・エクアドル、新木がエクアドル、23月に研究協力者の金澤直也がホンジュラスにおいて調査した。なお、石橋のエクアドルにおける調査には、研究協力者のカルロス・ルア(コロンビア、NGOエコ・タンボール代表)が同行し協力した。また、先住民運動については、89月に青木と禪野がメキシコで、510月に研究協力者の福原亮がボリビアで引き続き調査した。研究会に関しては、前述の7月に加え、2012年3月1日に第2回目を開催し、本年度の研究活動の総括を行った。2011年9月6日にペルー、リマ市のペルー問題研究所において、同研究所と共催で公開の国際セミナー「グローバル化時代における南北アメリカの国家・市民社会・社会運動」を開催した。本科研からは4名が報告し、2名がコメントを行った。ペルー問題研究所員のほか、ベネズエラ、コロンビア、ペルーから報告者とコメンテーターを招聘し、アンデス地域とブラジルにおける国家と市民社会の関係について議論した。本研究は、先住民とアフリカ系人の市民権拡大をめぐる運動と政策の調査・分析を通して、現代ラテンアメリカにおける国家と市民社会の関係、およびその変容を明らかにすることをめざした。最終年度にあたった平成24年度には、1、メキシコ、ベネズエラ、ブラジルにおけ補足的な現地調査、2、先住民を中心としたエスニック・マイノリティの社会運動と国家との関係に関するメキシコとアンデス諸国との比較研究、3、メキシコにおける国際セミナー、国内における研究会の開催、の3点に重点的に取り組んだ。このうち、2013年9月6日にメキシコ・トルーカ市において開催した国際セミナー「市民権と社会運動:包摂を求めて」は、協力を仰いだメトロポリターナ自治大学所属の教員・研究者をはじめとして、メキシコ側から9名、本プロジェクトの研究分担者・研究協力者3名の報告(ほか、2名の討論者)を立て、メキシコと中米におけるエスニック・マイノリティーの社会運動と社会的包摂の現状、エスニシティとジェンダーから見た都市におけるメキシコの社会的包摂をめぐるせめぎ合い、農村における開発と社会的包摂の関係について活発な議論をすることができた。

そこでは、従来、社会経済格差是正策として普遍主義的な手段が重視されてきたとされてきたメキシコにおいても、先住民を中心に、これまでほとんど注目されてこなかったアフリカ系人の社会運動の活性化やネットーワーク形成が進展しているという新しい知見が得られた。なお、3年間の研究プロジェクトを終了するにあたり、今後の研究の発展に資するため、2012年9月にペルー・リマで開催した国際セミナーと今年度の国際セミナーの報告集(スペイン語、398ページ)を作成した。3年計画の本研究は、研究分担者および研究協力者による現地調査だけでなく、現地の研究者.研究機関との交流を通じて、積極的に意見交換を行ない、国家と市民社会・社会運動の関係についての最新の動向を明らかにすることを目的としている。初年度は、ラテンアメリカにおける民主化研究の第一人者レオナルド・アヴリッツァー教授を日本に招き、アジア経済研究所等と共催でセミナーを開催した。2年度はペルー問題研究所の協力を得て、ペルーでセミナー開催した.各分担者の担当地域における現地調査もほぼ順調に進捗している。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、各研究分担者の担当地域における現地調査を中心として研究活動を行なう。また、今年度はメキシコに重点を置くとともに、メキシコ自治大学(UAM)の協力を得てメキシコ市で国際セミナーを開催する。研究成果は、メキシコでのセミナー、年度末の研究会のほか、ラテンアメリカ学会等の学会報告、論文集の作成等による。また、ウェッブページの作成も検討する。
超音波CCDカメラを用いた完全鏡視下心腔内・大血管内手術systemの開発

1.横方向の観察が可能な血管内視鏡の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.先端角可変式の血管内視鏡に改良を加えた.先端にウレタン製のバルーンを装着し,working channelからCO2を送気した.視野の確保,耐圧性,血栓症等の発生を検討した.【結果】本実験では150mmHgまでの圧に対してもバルーンの破損は来さなかった.満足すべき視野が得られた.バルーン拡張により心腔内・大動脈内の明らかな損傷を来さなかった.血栓症等の合併症は認められなかった.2.カテーテル型吻合装置の開発:血管吻合器と内視鏡下治療用鉗子に改良を加え,カテーテル型吻合装置を考案した.【対象と方法】食用ブタをもちいた.宿主血管とグラフトとステプラーで吻合することが可能なカテーテルを作成した.改良した血管視鏡の観察下に吻合を行った.【結果】80mmHg程の血圧ではずれたももあったが,改良した.3.カテーテル型圧着装置の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.血管内腔とステントグラフトを圧着固定するカテーテルを作成した.ステントを留置した後に,本装置で拡張した.【結果】拡張力は十分であったが,過剰な加圧により大動脈損傷を来した.比較的軽微な内膜損傷であった.2.心腔内手術【対象と方法】ブタ心臓を用いた。心房に切開を加え、超音波CCDカメラ下に鏡視下手術用鉗子および剪刀を用い心房中隔に5mm程度の穴を開け心房中隔欠損モデルを作製した。欠損部にカテーテル型縫合装置を用い、フェルト片を縫合した。【結果】モニター上では距離感の把握が困難であったが、全例予定部位に欠損モデルを作製でき、またフェルト片を縫合し得えた。カテーテル型縫合装置は把持力も十分であり、リークも認めなかった。2.大血管手術【対象と方法】ブタを用い全身麻酔下に開胸開腹した.ステントグラフトを末梢側の大動脈から挿入した.以下の各群を作成した.A群:X線透視下に左鎖骨下動脈直下にステントグラフトを留置.B群:バルーン付血管内視鏡補助下に左鎖骨下動脈直下にステントグラフトを留置.さらにB1群:ステントグラフト留置のみを施行.B2群:ステントグラフトを留置後、血管吻合用カテーテルを用い中枢側のみ内膜からグラフトと宿主血管を吻合.B3群:ステントグラフトを留置後、圧着を施行.を作成した.【結果】術直後に,大動脈に切開を加えA,B群間でステントグラフト留置の正確さについて検討した.左鎖骨下動脈から留置されたステントグラフトまでの距離(の誤差)は両群間で有意差はなかった.従来のX線透視使用の留置も正確ではあるが,内視鏡使用でも正確に留置しえ今後の応用が期待された.B2,3群の血管吻合用カテーテルを用いた郡では,ステープルをかけた部分に問題となるような内膜の損傷は認められなかった.また,遠隔期も問題はなかった.1.横方向の観察が可能な血管内視鏡の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.先端角可変式の血管内視鏡に改良を加えた.先端にウレタン製のバルーンを装着し,working channelからCO2を送気した.視野の確保,耐圧性,血栓症等の発生を検討した.【結果】本実験では150mmHgまでの圧に対してもバルーンの破損は来さなかった.満足すべき視野が得られた.バルーン拡張により心腔内・大動脈内の明らかな損傷を来さなかった.血栓症等の合併症は認められなかった.2.カテーテル型吻合装置の開発:血管吻合器と内視鏡下治療用鉗子に改良を加え,カテーテル型吻合装置を考案した.【対象と方法】食用ブタをもちいた.宿主血管とグラフトとステプラーで吻合することが可能なカテーテルを作成した.改良した血管視鏡の観察下に吻合を行った.【結果】80mmHg程の血圧ではずれたももあったが,改良した.3.カテーテル型圧着装置の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.血管内腔とステントグラフトを圧着固定するカテーテルを作成した.ステントを留置した後に,本装置で拡張した.【結果】拡張力は十分であったが,過剰な加圧により大動脈損傷を来した.比較的軽微な内膜損傷であった.2.心腔内手術【対象と方法】ブタ心臓を用いた。2.大血管手術【対象と方法】ブタを用い全身麻酔下に開胸開腹した.ステントグラフトを末梢側の大動脈から挿入した.以下の各群を作成した.

A群:X線透視下に左鎖骨下動脈直下にステントグラフトを留置.B群:バルーン付血管内視鏡補助下に左鎖骨下動脈直下にステントグラフトを留置.さらにB1群:ステントグラフト留置のみを施行.B2群:ステントグラフトを留置後、血管吻合用カテーテルを用い中枢側のみ内膜からグラフトと宿主血管を吻合.B3群:ステントグラフトを留置後、圧着を施行.を作成した.【結果】術直後に,大動脈に切開を加えA,B群間でステントグラフト留置の正確さについて検討した.左鎖骨下動脈から留置されたステントグラフトまでの距離(の誤差)は両群間で有意差はなかった.従来のX線透視使用の留置も正確ではあるが,内視鏡使用でも正確に留置しえ今後の応用が期待された.B2,3群の血管吻合用カテーテルを用いた郡では,ステープルをかけた部分に問題となるような内膜の損傷は認められなかった.また,遠隔期も問題はなかった.1.横方向の観察が可能な血管内視鏡の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.側視型は制作が困難であった.このため先端角可変式の血管内視鏡に改良を加えた.内視鏡先端にウレタン製のバルーンを装着し,working channelからCO2を送気した.視野の確保,耐圧性,血栓症等が発生しないか等を検討した.【結果】本実験では150mmHgまでの圧に対してもバルーンの破損等は来さなかった.主要分岐の確認が可能であり満足すべき視野が得られた.しかし,斜め方向になり,細口径の側視鏡の開発がのぞまれる.バルーン拡張により心腔内・大動脈内の明らかな損傷を来さなかった.少量のヘパリンの使用により血栓症等の合併症は認められなかった.【まとめ】大動脈観察用の血管内視鏡は臨床応用可能と考えられた.2.カテーテル型吻合装置の開発血管吻合器と内視鏡下治療に使用されている鉗子に改良を加え,カテーテル型吻合装置を考案した.【対象と方法】食用ブタをもちいた.宿主血管とグラフトとクリップで吻合することが可能な径9Frのカテーテルを作成した.改良した血管視鏡の観察下に吻合を行った.【結果】クリップは血管内壁に打ち出されるものの把持力はなく,80mmHg程の血圧ではずれたものが多かった.【まとめ】カテーテル型吻合装置についてはより把持力のあるものを考案したい.3.カテーテル型圧着装置の開発【対象と方法】食用ブタをもちいた.血管内腔とステントグラフトを圧着固定するカテーテルを作成した.バスット鉗子に改良を加えた.ステントを留置した後に,本装置でpost-dilatationを施行した.【結果】拡張力は十分であったが,数例で過剰な加圧により大動脈損傷を来した.比較的軽微な内膜損傷であった.【まとめ】本装置の拡張力は十分であった.しかし,加圧の状態をバルーン(内圧)のように定量的に測定することが重要と考えられた.【緒言】前年度に考案・開発した手術器械を使用し,食用ブタを用いた基礎的実験を施行した.2.心腔内手術ブタ心臓を用いた。心房に切開を加え、超音波CCDカメラ下に鏡視下手術用鉗子および剪刀を用い心房中隔に5mm程度の穴を開け心房中隔欠損モデルを作製した。欠損部にカテーテル型縫合装置を用い、フェルト片を縫合した。手術後に予定した部位に手術が施行されているかを検討した。【結果】モニター上では距離感の把握が困難であったが、全例予定部位に欠損モデルを作製でき、またフェルト片を縫合し得えた。カテーテル型縫合装置は把持力も十分であり、リークも認めなかった。2.大血管手術【対象と方法】
組織工学的に皮下で作製した心臓弁（バイオバルブ）の大動脈系自家移植による性能評価

人工物を体内に留置した際の結合組織によるカプセル化反応を応用し、自己組織からなる心臓弁(バイオバルブ)を開発した。鋳型を成ヤギの皮下に埋入して8週間後摘出し、鋳型を抜去してバイオバルブが得られ、手術的に左室心尖-大動脈バイパスに組み込んで、動脈圧負荷をかけて性能を評価した。術後、弁葉の可動性も良く顕著な狭窄や逆流もなく経過した。最長8週後の観察では、弁葉自体の構造は保たれ、結合組織の中に細胞侵や新生血管の構築も見られた。本研究により、バイオバルブが、高圧系でも自己弁に近い性能を持って機能し得ることが示され、将来有望な移植グラフとなることが期待される。我々が開発中のバイオバルブ人工弁組織体は、動物体内をリアクターとして、高分子製鋳型を皮下に12ヶ月埋入することで自動的に形成される自己組織体である。これまでラットや兎において組織体が作製できることを確認し、前年度の研究では、山羊や牛など大動物においても、皮下で組織体の形成が可能であることが示された。今年度は、皮下より採取したバイオバルブ人工弁組織体をグラフトとして、生体の体循環系に移植して、その性能を評価した。また、現在臨床で使用され始めている経管的大動脈弁移植術(TAVI)への応用として、ステント付きバイオバルブの設計を行った。方法は、アクリル製のBiovalve鋳型を成ヤギ背部の皮下に埋入して8週間後摘出した。鋳型を抜去して3つの薄い弁葉とValsalva洞状形態を持つConduit型のBiovalveが得られ、これを人工血管に組み込んだグラフトを用いて手術的に左心バイパス(Apico-aortic bypass)を作成し、動脈圧負荷がかかる状態で慢性的に性能を評価した。その結果、術後、血管造影および経胸壁エコーにてバイパスグラフトの血流は良好でBiovalve弁葉の可動性も良く、顕著な狭窄や逆流もなく経過した。最長8週目で犠死後観察したところ、弁葉自体の構造は保たれていた。組織学的には結合組織の中に細胞侵入が見られ、新生血管の構築も見られた。血液接触面には一部内皮様の細胞も見られた。したがって、本研究により、皮下を組繊構築の場にして作製した自家組織心臓弁が、高圧系でも自己弁に近い性能を持って機能し得ることが示され、小児や成人の大動脈弁置換や大動脈根部置換などに対して将来有望な移植グラフとなることが期待される。ステント付きバイオバルブについては、バルーン拡張型と自己拡張型の2種類のステントを設計作製し、バイオバルブと組み合わせるための鋳型を作製した。我々が開発中のバイオバルブ人工弁は、高分子製鋳型を皮下に12ヶ月埋入することで自動的に形成される。これまでラットや兎の他、山羊や牛など大動物においても、皮下での作製が可能であることが示されている。前年度の研究では、皮下より採取したバイオバルブ人工弁を体の体循環系に移植して、性能を評価した。今年度は、バイオバルブの体循環系での性能評価実験をさらに行った。また、TAVI用の鋳型をステントと共に生体内に埋入し、ステント付きバイオバルブが設計通り形成されるか確認した。方法は、バイオバルブ鋳型を成ヤギ背部の皮下に埋入して8週間後摘出し、鋳型を抜去して得られたバイオバルブを用いて手術的に左心バイパス(Apico-aortic bypass)を作成し、動脈圧負荷がかかる状態で慢性的に性能を評価した。その結果、最長8週目までは、バイパスグラフトの血流は良好でバイオバルブ弁葉の可動性も良く、顕著な狭窄や逆流もなく経過した。組織学的にも結合組織の中に細胞侵入が見られ、新生血管の構築も見られたことより、バイオバルブが、高圧系でも自己弁に近い性能を持って機能し得ることが示された。ただ、Apico-aortic bypassによる評価では、8週以上になると、心尖脱血管の部分で血栓形成を生じる例があり、長期評価は、別モデルで行う必要があると考えられた。ステント付きバイオバルブについては、ステントとバイオバルブ鋳型を組み合わせた物を成ヤギ背部の皮下に埋入して8週間後摘出した。鋳型を取り除いた結果、ステントと強固に融合したバイオバルブが得られ、組織破壊を生じずにステントを収縮拡張出来ることが確認された。以上より、ステント付きバイオバルブ組織体が設計通り形成される事が確認できた。

我々が開発中のバイオバルブ人工弁組織体は、動物体内をリアクターとして、高分子製鋳型を皮下に12ヶ月埋入することで自動的に形成される自己組織体である。これまでラットや兎において組織体が作製できることを確認してきたが、山羊や牛など大動物においては未だ行っておらず、今回、これら大動物における組織体の形成能を調べた。(1)大動物皮下でのBiovalve埋入期間と組織体の形成能の評価実験方法:成ヤギを麻酔下、手術的にバイオバルブ作製用鋳型を複数個皮下に埋入した。1-2ヶ月後に周囲に形成された皮下組織体と共に作製用鋳型を取り出し、組織、力学的性質、機能性を評価し,埋入期間と組織体の形成能の関係を調べた。その結果、成ヤギにおいても皮下埋入後6-8週間で、3枚の弁葉とバルサルバ洞を持つ生体の大動脈根部と形態上非常に酷似した組織体が形成されることが確認できたが、形成が完了する期間に個体差があることもわかった。したがって、確実に組織体が形成される時期を把握するため、作製用鋳型にカプセル内視鏡を組み込んだ物を考案した。これにより皮下組織内での組織体形成過程の連続的な観察が可能になり、確実で安定した組織体の採取が可能になった。採取した組織体の組織学的性状を組織染色(HE,エラスチカファンギソン,マッソントリクロム,αSMA染色)で観察したところ、厚さ約200 umの膠原線維と線維芽細胞を主とする組織で形成されていることが確認された。採取したバイオバルブ人工弁組織体の力学的性質をモック回路を用いた模擬体循環回路にて検討したところ、体循環に近い循環動態(血圧、流量、心拍数等)にて、十分な耐用性を有していることが示された。当初の研究計画は、皮下より採取したバイオバルブ人工弁組織体をグラフトとして、生体の体循環系に移植して、その性能を評価することであり、研究実績の概要で述べたように、皮下を組繊構築の場にして作製した自家組織心臓弁が、高圧系でも自己弁に近い性能を持って機能し得ることが示された。また、現在臨床で応用が開始されている経管的大動脈弁移植術(TAVI)への応用としてステント付きバイオバルブの設計まで行うことが出来た。以上より、本年度の研究の目的を完全に達成し得た。当初の研究計画は、開発中のバイオバルブ人工弁組織体の大動物における組織体の形成能を調べることであり、研究実績の概要で述べたように、成ヤギにおいて組織体が形成されることが確認でき、組織学的、力学的性質の検討により、バイオバルブ人工弁組織体が移植グラフトとしての基本性能を有していることが明らかになったことより、本年度の研究の目的を完全に達成し得た。次年度は、バイオバルブ人工弁組織体をグラフトとして生体の体循環系に移植して、その性能を評価する実験をさらに行い、より長期間でバイオバルブ人工弁組織体が生体で機能するかどうかを評価する。可能であれば、現在臨床で応用が開始されている経管的大動脈弁移植術(TAVI)への応用として設計したをステント付きバイオバルブの鋳型を生体内に埋入し、組織体が設計通り形成されるか確認する。次年度は、本年度に採取したバイオバルブ人工弁組織体をグラフトとして、生体の体循環系に移植して、その性能を評価する。可能であれば、現在臨床で応用が開始されている経管的大動脈弁移植術(TAVI)への応用を検討する。次年度に施行する、バイオバルブ人工弁組織体を生体の体循環系に移植する実験では、動物の購入や、実験に使用する人工血管などの消耗品、慢性実験における抗生剤や点滴および循環動態をモニタリングするためのコード類などに研究費を使用する必要がある。また、本研究の内容は革新的で有り、今年度に得られた成果を来年度に国内外に広く発表するために来年度に学会参加出張旅費が必要である。
温度感受性リンパ管内皮細胞株の樹立及び組織アレイによる腫瘍リンパ管新生分子の検索

種々のがん患者の予後を規定する要因であるリンパ節転移のメカニズムについては未だ詳細は明らかとなっていない。リンパ管内皮細胞の培養・維持・継代は非常に困難であり、リンパ管内皮細胞を用いた研究は初代培養系で行われている。従って、リンパ管新生の詳細な細胞・分子レベルでの機序解明を推進するにあたり、安定したリンパ管内皮細胞株の樹立が待望されていた。既に我々は、温度感受性SV-40 Transgenicラットから、リンパ管内皮細胞(TR-LE)樹立し、33°Cにおいて培養することで、in vitroリンパ管新生評価系の開発を成功したばかりである。今回、この評価系を用いて、リンパ管特異的に発現している遺伝子をgene chipを使用して探索した。その結果、特徴的な17、の遺伝子を確認することが出来た。また、Western blottingにより、リンパ管新生時においてこれら分子の発現は上昇していることが確認された。次に、ヒト初代培養リンパ管内皮細胞に関して、これら17の分子の発現に関して調査した。その結果、TR-LEと共通して、リンパ管新生の際に発現が亢進する10の分子を同定することが出来た。現在、腫瘍リンパ管が確認できる組織標本を多数症例搭載した、腫瘍リンパ管高集積性組織アレイを作成中である。今後は、既に報告がなされているリンパ管マーカーであるポドプラニンの発現と上記10の分子に関しての発現を、本アレイを用いて免疫染色により確認し、臨床統計学的な解析により、新規腫瘍リンパ管新生マーカーを同定する予定である。最近、VEGF-CやVEGF-Dによるリンパ管新生の惹起に伴うがんのリンパ節転移機序が徐々にではあるが解明されつつある(Tammela T., PetrovaTV., and Alitalo K. : Molecularlymphangiogenesis : new players. Trends Cell Biol.,15:434-41,2005.)。しかしながら、これらの研究は、電子顕微鏡等を用いた形態学的なマクロの視点に立った研究が主に進められているのが現状である。従って、リンパ管新生の詳細な細胞・分子レベルでの機序解明の推進において、安定したリンパ管内皮細胞株の樹立が切望されていた。現在までに、リンパ管新生の研究は、電子顕微鏡等を用いた形態学・解剖学的なマクロの視点に立った研究が主に進められている。しかしながら、リンパ管内皮細胞の培養・維持・継代は非常に困難であり、リンパ管内皮細胞を用いた研究は初代培養系で行われている。温度感受性SV-40Transgenicラットは、東北大学加齢研究所所長・帯刀博士によって創出されたラットであり、本ラットの細胞は33°Cにおいては、細胞が不死化するという非常にユニークな特性を有している。今回、分担者は、温度感受性SV-40 Transgenicラットから、リンパ管内皮細胞を単離し、33°Cにおいて培養することで、安定したリンパ管内皮細胞株の樹立に世界で初めて成功した。また、これらの細胞は、特殊なゲル上で培養することで、生体内でのリンパ管網を模倣する管腔ネットワークを新生することも確認でき、この現象を利用して、in vitroリンパ管新生評価系の開発を成功したばかりである。現在、この評価系を用いて、リンパ管特異的に発現している遺伝子をgene chipを使用して探索中である。さらに、本評価系を用いた結果、Aktシグナル伝達系の下流に存在するmTORの阻害剤である免疫抑制剤、Rapamycinがリンパ管新生を著名に阻害する事を見いだした。