hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生可能エネルギー有効活用のための広域情報に基づく電力システム信頼度監視制御

電力システムにおける広域観測情報を利用することで,不確定状況下においても特性の異なる電源が信頼性に与える影響度を定量的に評価する方法と,安定性向上のための制御方式を検討した。システム全体の慣性力の低下を実測データから評価するとともに,ダンピング向上のための観測情報を制御入力とする系統制御方式ならびに仮想的な慣性力向上による周波数変動抑制制御方式を提案し,その有効性を示した。電力システムにおいて,従来の回転機を用いた電源とは異なる特性をもつ電源が増加すると,特に同期状態を保ちもとの状態に戻ろうとする能力が低下し,安定性の維持が困難となる。とくに再生可能エネルギーを利用した発電はシステムの不確定性をさらに増大させ供給信頼性の低下につながる。本研究では,電力システムにおける広域観測情報を利用することで,不確定状況下においても特性の異なる電源が安定性に与える影響度を定量的に評価する方法を探究し,電力システムの信頼性を評価するための方法としての有用性を明らかにする。今年度は,観測情報を用いた電力システム信頼度指標の推定方法を検討した。特性の異なる電源が電力システムに連系されると,支配的な電力動揺モードの特性が変化することに着目し,広域同期計測情報を用いて動揺特性指標を求める方法を検討した。動揺特性はそれぞれの動揺モードに対する固有ベクトルを解析的に求めることで説明がなされるが,実システムにおいては求めることが難しく,計測情報から推定する方法を検討した。系統シミュレーションを用いて,電源構成の変化などを模擬した条件を設定して解析を行った。各計測地点における位相の揺れを可視化することで,発電機構成や系統構成の変化に伴う特性変化が捉えられることがわかった。また,動揺特性を支配する系統の慣性の変化を,取得可能な情報から捉えることを試みた。西日本における位相差情報,太陽光発電の導入量,日射量といった情報から,太陽光発電の発電量が慣性の変化に与える影響を試算した。とくに低需要期の昼間時間帯においては相対的に同期発電機による発電が低下することから,システム全体の慣性が低下することになるが,支配的動揺モードの動揺周期について過去のデータとの比較を行った結果,その傾向が現れていることを捉えることができた。監視情報に基づく電力システム状態の指標導出について,初年度における基礎的検討を進め,動揺特性を抽出して特性の変化を捉える方法を示すとともに,一部実測データを用いて実システムにおける変化を定量的に評価した。研究目的に対する初年度の計画についてはおおむね順調に進展していると考えている。とくに自然変動電源はシステムの不確定性をさらに増大させ供給信頼性の低下につながる。今年度は,観測情報を用いた信頼度評価のための特性抽出の方法ならびに安定化制御方法を検討した。電源構成の変化等が支配的な電力動揺モードの特性変化に影響することに着目し,広域同期計測情報を用いて動揺特性指標を求める方法を検討した。動揺特性は各動揺モードに対する固有ベクトルを解析的に求めることで説明がなされるが,実システムにおいては求めることが難しく,計測情報から位相の揺れを固有ベクトル相当の指標として可視化し特性を評価した。系統シミュレーションで得られる結果と実系統で取得したデータから得られた結果の対比を行ったところ,発電機構成や系統運用の変化に伴う特性変化が観測情報から説明できることがわかった。また,観測情報から安定化すべき主要な動揺モードが特定できることから,フィルタ処理により特定モードのみを抽出して安定化制御器への入力信号として用いることにより,効果的かつ他モードへの影響を抑制する安定化制御方法を検討した。制御出力から発電機出力までの応答遅れを加味し,動揺のダンピングを向上させる制御器の設計を試みた。系統シミュレーションを用いてモデル系統に適用した結果,系統故障を想定した大きな外乱に対して動揺抑制効果を有しており,また,特定モード抽出の有無による比較からも方法の有効性を確認することができた。監視情報に基づく電力システム状態の指標導出について,動揺特性を抽出して特性の変化を捉える方法として,一部実測データを用いて実システムにおける変化を定量的に評価し,系統シミュレーションとの対比を行うことができた。また,安定化のための制御方式も検討し,その効果を評価することができた。研究目的に対する計画についてはおおむね順調に進展していると考えている。本研究では,電力システムにおける広域観測情報を利用することで,不確定状況下においても特性の異なる電源が安定性に与える影響度を定量的に評価する方法と,信頼性向上のための制御方法を探究し,その有用性を明らかにすることを目的とした。最終年度においては,電力システムモデルから算出される固有ベクトルと電圧位相や電流の感度評価から算出される指標を用いて支配的な電力動揺モードの特性を評価し,その評価に基づいて支配モードを安定化するための制御方式を検討した。感度評価に基づく指標が制御器の動揺抑制効果と高い相関があることがわかり,系統安定化装置に対する入力信号の選定に有用であることがわかった。電力系統シミュレーションを用いて検証した結果,系統故障を想定した大きな外乱に対して動揺抑制効果を有することが確認できた。

本研究を通じて得られた成果として,1.位相差情報,太陽光発電の導入量,日射量といった情報から,特に相対的に同期発電機による発電が減小する低需要期の昼間時間帯においてシステム全体の慣性が低下する傾向を捉えることができ,観測情報からその影響度を評価できることがわかった。2.感度評価に基づいて電力動揺モードの特性を把握するとともに,その結果に基づいて支配モードを安定化するための制御方式を提案し,その有効性を示すことができた。3.系統連系装置に仮想的な慣性を持たせる方式による系統制御方式を提案し,システムの慣性力を向上させることで周波数変動抑制効果を示すことができた。これらの結果は,従来の回転機を用いた電源とは異なる特性をもつ電源の増加により低下する同期状態を保ちもとの状態に戻ろうとする能力について,観測に基づいて評価した上で系統制御により改善を行う方法であり,信頼性の向上に寄与できる。電力システムにおける広域観測情報を利用することで,不確定状況下においても特性の異なる電源が信頼性に与える影響度を定量的に評価する方法と,安定性向上のための制御方式を検討した。システム全体の慣性力の低下を実測データから評価するとともに,ダンピング向上のための観測情報を制御入力とする系統制御方式ならびに仮想的な慣性力向上による周波数変動抑制制御方式を提案し,その有効性を示した。計測情報から動揺特性の変化を捉える方法について基礎的な知見が得られたことから,より具体的な定量評価を行う。多様な電源で構成されることを想定した電力システムモデルを用いた解析を行い影響度の評価を行う。また,系統制御への展開を考え,動揺特性の変化を補償して信頼度を向上させる制御方法について考える。観測情報を用いた適応型の制御により効果的な方法について検討を進める。計測情報から動揺特性の変化を捉える方法について知見が得られ,またモード抽出による制御器設計の有効性を確認できたが,これらは個別に検討を進めてきた。今後は,より有用性を高めるため両者をうまく組み合わせることを考え,適応型の制御方式による供給信頼度向上方法について検討を進める。電力系統工学購入を予定していた備品について当初よりも安価に購入できたことから次年度繰越が生じた。学会への出席にかかる参加費等を他の経費から支出したことから次年度繰越が生じた。次年度では50万円以上の高額備品の購入は計画しておらず,主として研究調査や学会における成果発表のための国内外旅費での使用を計画している。また,遂行上必要な少額消耗品購入での使用を計画している。
中枢神経における鉄の沈着が神経変性に寄与するメカニズムに関する研究

PLA2G6遺伝子の異常により、neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA2)が起こる。PLA2G6ノックアウト(KO)マウスにおいては、加齢に伴い、中枢神経系に高度の鉄沈着が見られた。鉄トランスポーターであるDMT1や鉄調節蛋白(IRP)の発現がKOマウスにて著明に亢進。同様の結果がPLA2G6をノックダウンしたヒト神経細胞でも見られ、同時にミトコンドリア内膜の変性を認めた。PLA2G6遺伝子の異常により、ミトコンドリア機能異常が起こり、IRPが活性化しDMT1の発現が亢進することにより脳内に鉄が沈着するメカニズムが示された。カルシウム非依存性フォスフォリパーゼA2β(iPLA2β)をコードするPLA2G6遺伝子の変異により、中枢神経に鉄沈着を伴う神経変性疾患であるNeurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA type2)が惹起されることが知られている。我々は、PLA2G6遺伝子欠損マウスの脳を解析することにより、1年齢以降の欠損マウスでは主に錐体外路系に鉄沈着が見られることを発見した。今回我々は、iPLA2β欠損マウスに対して、神経毒であるMPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)の投与を行った。今後、解析を進める。さらに、ヒト神経芽細胞種由来のSH-SY5Y細胞を用い、PLA2G6遺伝子をノックダウンした系を確立した。PLA2G6遺伝子をノックダウンすると、24時間以降、細胞死が起こる。またPLA2G6遺伝子のノックダウンにより、ミトコンドリア内膜に存在するシトクロムcオキシダーゼ(CCO)の活性低下が見られることが、免疫染色およびウェスタンブロットで明らかとなった。同時に、PLA2G6遺伝子のノックダウンにより、ミトコンドリアにおけるATP(アデノシン三リン酸)の産生が低下することも分かった。ミトコンドリアの機能異常およびATPの産生低下が細胞内鉄代謝に大きく影響することが知られており、この系を確立することにより、ミトコンドリアを介した鉄代謝因子の解析に非常に有用であると考えられる。カルシウム非依存性フォスフォリパーゼA2β(iPLA2β)をコードするPLA2G6遺伝子の変異により、中枢神経に鉄沈着を伴う神経変性疾患であるNeurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA type2)が引き起こされることが知られている。今回、我々はiPLA2β欠損マウスの脳組織を用いて高感度鉄染色(Perls-DAB染色)を行うことにより、中枢神経における鉄沈着の分布とその経時的変化について評価した。また、比較のため同年齢の野生型マウス脳も同時に評価を行った。野生型マウスにおいて、中脳黒質や嗅結節などの部位の主にグリア細胞の胞体内において鉄沈着が見られ、これは15週齢、1年齢、2年齢と進むにつれ増強した。運動症状発症前の15週齢のiPLA2β欠損マウスでは、中脳黒質や嗅結節などの主にグリア細胞に軽度の鉄沈着を認め、これは同年齢の野生型マウスと明らかな差は認めなかった。1年齢(発症初期)になると、上記部位に加え線条体や淡蒼球のグリア細胞内や神経線維にも鉄沈着が見られるようになり、同年齢の野生型マウスと比較して明らかにその程度は強かった。2年齢(進行期)になると、中脳黒質、嗅結節、線条体、淡蒼球に加えて大脳皮質、小脳、海馬にも著明な鉄沈着を認めた。また、これら鉄沈着が見られるのは、グリア細胞の胞体内や神経線維のみならず、神経細胞内にも認められた。以上より、野生型マウスにおいても加齢に伴って中枢神経内の鉄沈着が増加することが分かった。さらにiPLA2βが欠損することにより、中枢神経内広範囲にわたり鉄沈着が増強することを証明した。iPLA2β欠損マウスは、中枢神経の鉄沈着に関わるメカニズムを解析するうえで有用なモデル動物と考えられる。iPLA2β欠損マウス脳では、100週齢において、鉄トランスポーターであるdivalent metal transporter 1(DMT1)の発現が著明に亢進していた。加えて、DMT1などの鉄トランスポーターの発現を調節する、iron regulatory protein(IRP1,および2)の発現亢進も見られた。また、iPLA2β欠損マウス脳では、進行期において酸化脂質である4-HNEの著明な増加を認めた。続いて、ヒト神経芽腫由来細胞株であるSH-SY5Y細胞において、PLA2G6遺伝子をノックダウンしたところ、iPLA2β欠損マウスと同様に、DMT1、IRP1、IRP2の発現増加が見られた。またPLA2G6遺伝子のノックダウンにより、ミトコンドリア内膜の変性(内膜蛋白であるCCOの発現低下)、ミトコンドリアにおけるATP産生の減少が見られた。

ミトコンドリアは細胞内の鉄センサーであり、ATP産生低下や酸化ストレスの増加を感知するとIRPの活性化を介して細胞内に鉄を取り込むことが知られているため、我々の成果より、iPLA2βが欠損すると、ミトコンドリア内膜変性が惹起されATP産生が低下し、同時に活性酸素種が増加することにより、IRPが活性化され鉄トランスポーターの発現が増加するために、脳内の鉄沈着が増強するというメカニズムが示された(Beck et al., in submission)。神経内科学iPLA2β欠損マウスに対する、神経毒であるMPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)の第1回目の投与は行うことができた。ただし、その後、iPLA2β欠損マウスがなかなか産まれず、解析を行えるだけの数が準備できなかった点において、やや遅れていると言わざるを得ない。一方で、PLA2G6遺伝子をノックダウンした培養細胞の確立は順調に終わり、これから解析を行える状態にある。iPLA2β欠損マウス、およびこのマウスにMPTPを投与したもの、加えてPLA2G6遺伝子をノックダウンしたヒト神経培養細胞を用い、鉄関連因子の動態を解析する。特にミトコンドリア内膜の変性との関連を調べる。iPLA2β欠損マウスに対し、中脳黒質のドパミン神経細胞選択的にミトコンドリアを障害する神経毒であるMPTPの慢性投与を行う。iPLA2β欠損状態にさらに負荷をかけることにより、中枢神経内の鉄沈着および鉄代謝関連因子の動態にどのような変化があるかを検討する予定である。また同時に、iPLA2β欠損マウス由来の皮膚線維芽細胞を用いた実験系の構築を行っている。この細胞を用いて、様々なストレス下における鉄代謝関連因子の動態について解析する予定である。当該年度に必要な物品の購入が完了したため。次年度に必要な物品を購入する。平成24年度同様に、マウスの購入・飼育費、免疫組織化学染色やウェスタンブロットに使用する抗体、遺伝子診断に使用する試薬、MPTP投与に必要なミニポンプや試薬が大半を占める。
老化・がん化耐性齧歯類ハダカデバネズミにおける特異な免疫システムの解明

免疫システムの適切な制御は生体内外の異物に応答し恒常性を維持するために重要であり、免疫機能の量的・質的な変化は老化や疾患と密接に結びついている。申請者は最近、老化・がん化に対して著しい耐性をもつ最長寿齧歯類であるハダカデバネズミで、免疫システムが特殊化している可能性を見出した。本研究では、ハダカデバネズミと他種の免疫応答の違いを規定するメカニズムを明らかにし、疾患耐性・長寿化を実現する生体防御機構の本態を解明することを目指す。
発生頑強性を規定する細胞死シグナルの解明

ショウジョウバエの神経発生では、細胞死による神経前駆体細胞(SOP)の選択が、SOPが生まれる最初期からおこっていた。SOP数の制御に関してカスパーゼ活性は非アポトーシス機能として関わっているが、カスパーゼ阻害によるSOP数増加の表現型には、ヒストンメチル化酵素eggless/SETDB1が関わっていた。成虫原基組織再生の安定性には、組織傷害に応答した脂肪体でのメチオニン代謝が関わることが明らかになった。また、哺乳類頭部形成に重要な前脳前端のシグナルセンターではFGF8産生細胞の大まかな入れ替わりに細胞死が関わり、アポトーシスが脳のパターニング制御の安定性に重要であることが示された。ショウジョウバエ外感覚器のもととなる外感覚器前駆体細胞(SOP)の数は、カスパーゼシグナルによって複数の作用点で調節されている。カスパーゼ活性は非アポトーシス機能としてマクロキートにおけるSOPの産生に関わるほか、アポトーシス実行により不適切に分化したミクロキートSOPを除去する働きがある。本年度は、マクロキートで作用するSOPの産生ステップに関わるカスパーゼの活性を調節する遺伝子を探索する実験系の構築を行った。また、組織再生時における発生頑強性を遺伝学的に調べることができる実験系の構築も行った。これらの実験系を用いて遺伝学的なスクリーニングを計画している。マウス神経管閉鎖不全は、カスパーゼとの関わりにおいて様々な発生の内的外的ストレスによって引き起こされる。我々は胚の培養と超高速共焦点レーザー顕微鏡を用いることで、実際に神経管閉鎖がおこる様子を観察する実験系の構築を行った。そして、カスパーゼ活性化検出プローブSCAT3を発現するトランスジェニックマウスを用いることで、カスパーゼの活性化状態を胚の中で単一細胞レベルの解像度で解析することを可能にした。本年度は、野生型及びカスパーゼ活性化変異体の神経管閉鎖の素過程(カスパーゼ活性化部位の空間的特定、閉鎖速度)を定量的に解析する実験系の構築を行った。さらに遺伝的背景の違うマウス系統でのカスパーゼ活性化を調べた結果、種差が顕著に表れる場所を見いだした。【ショウジョウバエ外感覚器前駆体細胞運命の揺らぎ】これまでの生体イメージング解析からショウジョウバエ外感覚器のパターン形成において、外感覚器前駆体細胞(SOP)運命はNotchによる細胞死誘導によって、異常な分化細胞を除去することで発生のノイズをキャンセルすることが明らかになった。次にこの発生過程における環境要因が及ぼす影響について検討を行った。胚環境ストレスとして知られる温度変化を施し、成虫における外感覚器のパターンを定量した結果、ショウジョウバエの生育可能条件である15°Cから29°Cにおいて、外的温度環境は外感覚器のパターン形成に異常は検出されなかった。どのような要因で分化異常細胞が生じるのかさらに原因を検討している。【マウス神経発生における細胞死シグナルの動態解析】アポトーシスは、ANRと呼ばれる脳のシグナリングセンターの領域調節を介して、脳の発生プロセスを時間枠内で正常に進行させる役割があることが明らかになった。現在、カスパーゼ活性化が発生頑強性を保証する機構を詳細に調べるためのシステムとして、カスパーゼ阻害因子p35をCre-loxP依存的に発現するLNL-p35Vマウスと、apaf-1条件的ノックアウトマウス(佐賀大学・吉田先生との共同研究)を作成、導入したところである。ショウジョウバエ外感覚器のもととなる外感覚器前駆体細胞(SOP)の数は、カスパーゼ活性の非アポトーシス機能による産生および、アポトーシス実行により不適切に分化したミクロキートSOPを除去にかかわることを明らかにしている。本年度は、マクロキートで作用するSOPの産生ステップに関わるカスパーゼの活性を調節する遺伝子を探索する実験系の構築を行い、いくつかの候補遺伝子を得ている。また、組織再生時における発生頑強性を遺伝学的に調べることができる実験系の構築も行い、時期組織特異的に細胞除去から再生が誘導される実験系が構築された。発生と同様に、組織再生が成虫でもおこる腸は、その組織恒常性がいかに頑強に維持されているかが問題となる。成虫での腸組織再生に関わるカスパーゼの新たな機能を明らかにした。マウス神経管閉鎖に影響する要因として、様々な発生の内的外的ストレスによって引き起こされるカスパーゼ活性化状態が重要であることが示唆されてきた。カスパーゼ活性化検出プローブSCAT3を発現するトランスジェニックマウスマウスを用い、生体イメージング観察系を改良することによって、カスパーゼの活性化状態を胚の中で単一細胞レベルの解像度で解析することを可能にした。本年度は、野生型及びカスパーゼ活性化変異体の神経管閉鎖の素過程(カスパーゼ活性化部位の空間的特定、閉鎖速度)を定量的に解析する実験系の構築を行い解析を進めている。さらに神経管閉鎖に関わる環境として胚の代謝状態変化が重要であるとの知見を得て解析を進めている。【ショウジョウバエ外感覚器前駆体細胞運命のゆらぎ】翅成虫原基小盾版プロニューラルクラスターの細胞運命解析から、ショウジョウバエ外感覚器前駆体細胞(SOP)を作り出す細胞運命決定にはカスパーゼの非細胞死誘導に関わる活性が必要であることが判っていた。また、カスカーゼ変異体では、その体液組成のメチル化指数に変化のあることも判ってきた。そこでメチル化によるSOPの制御、特に遺伝子のエピゲネティック制御に注目し、RNAi系統を用いた遺伝学的なスクリーニングを行った。

その結果、ヒストンH3メチル化に関わる遺伝子のノックダウンによってカスパーゼやその活性化因子の変異体と同様にSOP数の増加を伴う表現型が得られた。また、翅成虫原基全体でのカスパーゼ阻害によって翅の厳密なサイズ制御に細胞死シグナルが関わるとの結果を得ている。【マウス神経発生における細胞死の役割】マウスの神経管閉鎖がおこるステージにおいて、細胞死は神経管閉鎖時の閉鎖速度の制御、FGF8産生細胞の領域調節をしていることがこれまでの研究から判って来た。このようにアポトーシスは初期胚の神経発生に重要な役割を持っているが、アポトーシスのトリガーを含めてその制御は明らかになっていない。神経管閉鎖時にはダイナミックな代謝変化がおこっていることが明らかになり、アポトーシス制御との関わりが注目される。【ショウジョウバエ外感覚器前駆体細胞運命のゆらぎ】翅成虫原基小盾版プロニューラルクラスターから、ショウジョウバエ外感覚器前駆体細胞(SOP)を作り出す細胞運命決定にはカスパーゼの非細胞死誘導に関わる活性が必要であることが判っていた。遺伝子のエピゲネティック制御に注目し、RNAi系統を用いた遺伝学的なスクリーニングを行った。その結果ヒストンH3K9メチル化に関わる遺伝子SETDB1のノックダウンによってSOPの増加が観察された。この表現型はカスパーゼ活性化を促進すると抑制され、反対にカスパーゼ活性を抑制するとさらに強くなった。よって、カスパーゼとヒストンメチル基転移酵素との協調によってプロニューラルクラスターからのSOP数の調節が厳密になされることが考えられた。【マウス神経発生における細胞死の役割】発生期の脳においてマウスの神経管閉鎖がおこるステージではシグナリンセンターとして働くAnterior Neural Ridge(ANR)、及び神経管の閉鎖部位において大量の細胞死が観察された。これらの細胞死はモルフォゲン発現領域の調節によって脳のパターン化に関わること、及び神経管閉鎖の細胞運動に関連することにより頑強な神経発生が可能になることが明らかになった。また同じステージにおいてダイナミックな代謝変化がおこっていることが明らかになった。このステージでは解糖系が優先的に使われていたステージから、解糖系と酸化的りん酸化とが同時に活性化される特異的な代謝状態に移行することが明らかになった。この代謝変化が頑強な発生を支える基本的制御として関わるかに興味が持たれた。ショウジョウバエの神経発生では、細胞死による神経前駆体細胞(SOP)の選択が、SOPが生まれる最初期からおこっていた。SOP数の制御に関してカスパーゼ活性は非アポトーシス機能として関わっているが、カスパーゼ阻害によるSOP数増加の表現型には、ヒストンメチル化酵素eggless/SETDB1が関わっていた。成虫原基組織再生の安定性には、組織傷害に応答した脂肪体でのメチオニン代謝が関わることが明らかになった。また、哺乳類頭部形成に重要な前脳前端のシグナルセンターではFGF8産生細胞の大まかな入れ替わりに細胞死が関わり、アポトーシスが脳のパターニング制御の安定性に重要であることが示された。発生の頑強性を制御する仕組みとして体内環境に対する応答が重要であることが少しづつ明らかになってきた。
自己形成面内変調人工格子の作製と磁気機能性材料への応用

本研究では、膜面内にナノスケールの変調構造を有する磁性人工格子およびナノ構造を作製し、磁化、磁気異方性、磁気抵抗効果、磁気光学効果など、さまざまな磁気特性の評価を行った。面内変調構造の創製とそれに伴う磁気機能性に関して以下の成果を得た。1.MgO上にエピタキシャル成長させた薄いFe層において、一方向配列したピラミッド状の構造を走査トンネル顕微鏡と透過電子顕微鏡によって見いだした。さらに、この構造の上にMgOトンネルバリア層と自己形成Feナノドット層の形成を行なった。下部Fe層のモルフォロジーが転写され、MgOトンネルバリア層を隔てた自己形成Feナノドット層にも1方向配列構造が形成された。2.高保磁力材料の開発を狙って、B2構造のFeAl合金単結晶薄膜を作製し、ナノボア配列の自己形成のための熱処理とその上にL1_0o構造のFePtを成長させることを行なった。FeAlのナノボアの形態を通じてFePtの磁気特性の制御が可能であることが示唆された。3.FePtとMgOを多層積層する際に、適切な熱処理を行うことによって、ナノスケールの8面体構造を有する自己形成FePt粒子が生成することを見出した。大きな保磁力を示すことから、新しい磁気プローブ等への応用につながる可能性を有している。4.酸素反応スパッタによるNiO膜の作製と表面構造制御の実験では、矩形の穴が並んだ構造や網目状構造等、多種多様な面内変調構造を得た。ナノ構造創製のためのテンプレートとして利用できる可能性がある。5.Pt(100)上のFe-Au2次元合金の表面相分離による面内変調構造の創製に関する実験において、ストライプ構造などの面内で非一様な数原子層厚のナノ構造がSTMによって観測された。本研究では、膜面内にナノスケールの変調構造を有する磁性金属人工格子を作製し、磁化、磁気異方性、磁気抵抗効果、磁気光学効果など、さまざまな磁気特性の評価を行い、面内変調構造に伴う優れた磁気機能性を見出し、磁性人工格子の研究に新たなブレイクスルーをもたらすことが目的である。本年度は、主にMgO単結晶(100)面上のFeの成長に着目し、Feナノドット配列の制御に関する実験を行なった。MgO基板上に成長させたFe層の表面モルフォロジーはFe層の厚みよって大きく変化し、厚みが10nm以下のとき、Feのピラミッド状の構造が配列する現象を走査トンネル顕微鏡と透過電子顕微鏡によって確認した。興味深いことに、この配列は一方向性を有しており、走査トンネル顕微鏡像において、Feナノドットの明瞭な方向配列構造を見出した。断面透過電子顕微鏡像から、MgOとFeの界面付近にミスフィット転位が存在し、それがほぼ周期的に配列していることも分かった。MgOとFeの格子不整合とその緩和がFeナノドットの1方向配列構造の起原となっていると考えられる。さらに、このような構造の上にMgOトンネルバリア層と孤立Feナノドット層の形成を行なった。下部Fe層のモルフォロジーが転写され、MgOトンネルバリア層を隔てた孤立Feナノドット層にも1方向配列構造が形成されることが見出された。方向配列とともに平均粒径および粒径分布の減少が生じることも分かった。単一電子トンネル効果を用いた磁気抵抗材料の開発に有用な結果である(論文投稿中)。また、高保磁力材料の開発を狙って、B2構造のFeAl合金単結晶薄膜を作製し、ナノポア配列の形成のための熱処理とその上にL10構造のFePtを成長させることも行なった。

試料作製条件とFePtの磁気特牲の相関から、FeAlのナノポアの形態を通じてFePtの磁気特性の制御が可能であることが示唆された(2004年秋の金属学会において発表)。本研究では、膜面内にナノスケールの変調構造を有する磁性人工格子およびナノ構造を作製し、磁化、磁気異方性、磁気抵抗効果、磁気光学効果など、さまざまな磁気特性の評価を行い、面内変調構造に伴う優れた磁気機能性を見出し、磁性人工格子・ナノ構造の研究に新たなブレイクスルーをもたらすことが目的である。本年度は、主に大きな結晶磁気異方性を有し、人工格子化やナノ構造制御によって優れた磁気機能性が発現すると期待されるFePt合金を用いた研究を行った。FePtとMgOを多層積層する際に、適切な熱処理を行うことによって、ナノスケールの8面体構造を有するFePt粒子が生成すること、プロセス条件によって形態が種々変化することを見出した。面内の周期構造に関しては必ずしも明瞭ではないが、FePt粒子が8面体という特殊な構造を有すること、数テスラという大きな保磁力を示すことから、新しい磁気プローブ等の応用につながる可能性を有している。FeAl表面のナノポアをテンプレートとして利用して、FePtの規則配列を作製することを狙った研究では、MgOを中間層に用いることによってFeAlとFePtの間の相互拡散が抑制され、優れた磁気特性が得られることが分かった。FeAl薄膜のナノポアの形成条件がバルクの場合と異なることが示唆され、ナノポア形成に関する更なる研究が必要であるが、NiO等のFeAl以外の物質においてもナノポアの形成を見出した。昨年度から継続しているナノ粒子の1次元面内配列の実験では、Feナノ粒子のみならず、Coナノ粒子も配列することを確認した。一方、Au等のMgOとの界面エネルギーが大きい典型金属では同様の1次元配列現象は起こらなかった。本研究では、膜面内にナノスケールの変調構造を有する磁性人工格子・ナノ構造を作製し、磁化、磁気異方性、磁気抵抗効果、磁気光学効果など、さまざまな磁気特性の評価を行い、面内変調構造に伴う優れた磁気機能性を見出し、磁性人工格子・ナノ構造の研究に新たなブレイクスルーをもたらすことが目的である。本年度は、主に磁性金属や酸化物の表面における面内変調構造の作製を試みた。酸素反応スパッタによるNiO膜の作製と表面構造制御の実験では、成長条件の探索により、多種多様な表面構造を得た。得られた表面構造の中で特に注目すべき結果は、矩形の穴が並んだ構造と網目状の構造であった。通常、物理的結晶成長法であるスパッタ膜において表面に無数の穴が形成されることは珍しく、本研究の結果は、成長中の空孔凝集などの新しいメカニズムによるナノ構造形成過程を示している可能性が示唆される。網目状の構造に関しても、スパッタ膜では報告例はほとんどなく新規性のある結果である。100nmスケールでの秩序構造が形成されている点に興味が持たれる。Pt(100)表面上におけるFe-Au2次元合金の表面相分離に関する実験も行った。表面相分離の数値シミュレーションで見られるような完全な面内周期構造は得られなかったが、ストライプ構造などの面内で非一様な数原子層厚のナノ構造がSTMによって観測された。成長後熱処理の効果は顕著でないことも分かり、表面相分離構造の制御には成長中の基板加熱が有効であることが示唆された。
新しいiPS干渉法による膵β細胞誘導因子の同定

新しい『iPS(induced pluripotent stem cells)干渉法』により、膵臓β細胞へ直接リプログラミングを誘導する細胞内因子を同定した。【新規性】膵臓β細胞に特化して直接リプログラミングする因子は未だない。【有用性】再生医学の画期的シーズ。【先進性】高度な再生医療を、簡便で安全な方法で実現。【トランスレーショナル研究】先端医科学の臨床医学への展開。本研究において膵β細胞を誘導する因子候補として新しい技術であるiPS干渉法により複数のニーズを得ることができた。現在に引き続き生物学的な機能の研究を進め、知的財産の整備を進めており早期の臨床応用に向けて研究を加速化する。分化細胞を用いて、膵ベータ細胞に直接リプログラミングする強力な分化誘導因子を同定する(iPS干渉法)ことにより試験管内、および将来の臨床応用に繋げる小動物実験(ヒト化マウス)をすすめ、直接リプログラミングを促進する因子、阻害する因子を究明し精度を高め本法を膵以外の消化器臓器に応用する(肝・腸の再生医学基盤)ことを目的として研究を開始した。初年度はiPS干渉法の候補分子を同定し生物学的に分子正常を明らかにした。他の消化器臓器への応用解析:上記の成果を膵以外の消化器臓器の幹細胞(肝・腸)へ応用した。肝では肝細胞の網羅的発現解析を実施、分化細胞の発現と比較してコア転写因子群を同定した。同定したリストからウイルスベクター搭載、iPS転写因子(Oct3,Sox2, Klf4, c-Myc)搭載ウイルスベクターを同時に導入し、iPSコロニー数の減少(GFPのみの対照と比較)を指標としてβ細胞コアネットワーク構成転写因子を同定した(肝臓に対するiPS干渉法)。また腸では、腸管細胞(HCT)の網羅的発現解析、コア転写因子群を同定、iPS転写因子を同時に導入、コロニ-数を減少を指標としてβ細胞コアネットワーク構成転写因子を同定した(腸管に対するiPS干渉法)。外科学候補分子の同定に基づき分子間のネットワークが明らかにされ大きな波及効果を得られたから。現在ある数理的解析を駆使して高精度の予測とウェットの実験成果を融合させiPS干渉法としてのリード化合物(生理活性物質)を明らかにする。
ＭＥＧ実験―レプトンフレーバーの破れから大統一理論へ

大統一理論など新しい物理法則の決定的証拠となるミュー粒子の崩壊μ→eγを探索する国際共同実験MEGを実施し、分岐比でO(10^<-13>)の世界最高感度を達成した。予想に反してμ→eγ崩壊は発見されず、「標準的な」新物理のシナリオが間違っていたことを示した。また、測定器を改良してさらに一桁感度を上げる究極感度O(10^<-14>)の実験(MEG II)を提案し、スイスPSI研究所により承認されて実現に向かうことになった。平成22年度はまずμ→eγ崩壊探索データ取得に向け検出器改良および較正作業が行われた。前年度の探索実験で問題が判明していた一部のドリフトチェンバーモジュールの改良、波形デジタイザ時間精度の向上、ミュー粒子停止分布の改善などを実現したことにより、22年9月から非常に安定した効率の高いデータ取得を開始することができた。11月初めにビームラインの超伝導電磁石の一つが故障したため本年度の探索データ取得は中途終了を余儀なくされたものの、最終的には前年度のほぼ二倍のデータ統計量を取得することができた。また並行して前年度に取得した探索データの解析が精力的に行われ、その暫定的な解析結果が7月のICHEP国際会議で発表され国際的に高い評価を得た。その後解析アルゴリズムに改良が加えられ、主要な系統誤差を低減、陽電子の測定分解能を大きく改善することに成功した。これによりこれまでの崩壊分岐比上限値記録を3倍近く上回る前人未踏の探索感度を実現した。また、将来の究極感度の探索実験の実現に向けた研究開発も進められた。実験の感度を大きく左右する液体キセノン検出器の性能向上を目指し、高量子効率光電子増倍管、新型半導体光センサーPPDなどの光センサーの開発が行われ、PPDについては液体キセノンシンチレーション光の検出に初めて成功した。また高計数率、高分解能の陽電子スペクトロメータプロトタイプの設計作業も開始した。なお超伝導電磁石の故障により、12月に予定されていた検出器較正作業は翌23年度に繰り越されたが、探索実験終了後故障原因調査、修理が順調に行われ、PSI研究所加速器稼働再開後23年4-5月に検出器較正作業は無事終了、6-8月取得したデータの解析が行われた。研究成果について関連研究者と議論する予定であった23年3月の研究会は、3月11日に発生した地震の影響により4月にPSI研究所において開催されることとなり、その後最終結果を9月の日本物理学会で報告、研究成果の取りまとめを行った。平成22年度に取得したデータの物理解析は順調に行われ、解析アルゴリズムの改良や測定器の再測量などによって主要な系統誤差を削減し、測定精度を大きく改善することができた。7月には平成21年度に取得したデータの最終解析結果と合わせて、前人未到のμ→eγ事象探索感度を達成した。残念ながらμ→eγ事象の発見には至らなかったが、これまでの崩壊分岐比の上限値記録を約5倍改善し、標準理論を超える超対称大統一理論などの新しい物理に対してこれまでにない厳しい制限を与えた。この結果は欧州物理学会HEP2011国際会議の招待プレナリー講演で森が発表し、Physical ReviewLetters誌に掲載して、記者会見を行った。平成23年度もMEG実験を継続、前年度に比べより長期にわたって安定したμ→eγ事象探索データの収集を行って、最終的に前年度の約2倍の物理データを取得することができた。このデータの物理解析も順調に進み、解析手法の改良などによってさらに探索感度を向上させて、平成24年度中には最終結果が得られる見込みとなった。(その後平成25年3月に最終結果を発表した。)将来の究極感度実験に向けた開発研究も、液体キセノン測定器に使用する新しい光センサーの開発を中心に平行して行われたが、平成23年11月にPSIの液体ヘリウム供給設備が故障してビームラインの超伝導電磁石の運転ができなくなったため、予定していた研究の一部を翌年度に繰り越して行った。研究は順調に進み、平成24年度中にはMEG実験を基にした究極感度のμ→eγ探索実験の提案ができる見込みとなった。(その後平成24年12月に実験提案書をPSIに提出した。)平成25年、MEG実験では検出器メンテナンス、較正作業等の実験準備が着実に進められ、予定通り5月中旬から探索データ収集を開始した。データ収集は非常に順調に行われ、特にドリフトチェンバーの不調チャンネル数が低減されたことで例年より高いデータ収集効率を達成した。データ収集は予定通り8月末に終了、現行MEG実験で予定していたすべてのデータ収集を完了した。取得した平成25年のデータと現在解析中の平成24年のデータを合わせると総データ統計量は倍増することになる。全てのデータを用いた現行MEG実験の最終結果を導き出すべく、データ較正、解析アルゴリズムの改善も試みられた。

たとえば、陽電子の飛行中消滅起源のガンマ線バックグラウンドを抑制する解析アルゴリズムを新たに開発し、探索感度を15%改善することに成功した。将来の究極感度実験に向けた研究開発も順調に進められた。液体キセノンガンマ線検出器用の新型光センサーについては、新技術の導入により当初予想より高い性能を実現することに成功した。海外の研究機関による波形取得電子回路の開発が遅れたため、プロトタイプ検出器を用いた光センサー性能実証試験を平成26年度に繰り越して実施せざるをえなくなったが、回路を必要としない試験を先行して行うなどの工夫により研究全体の進捗への影響は最小限にとどまる予定である。また、陽電子タイミングカウンターについてはプロトタイプを用いたビーム試験が行われ、30ps台の究極の時間分解能が実現可能であることを実証した。さらにミュー粒子の輻射崩壊からのガンマ線バックグラウンドを同定する検出器を新たに開発、ビーム試験によりその有効性を実証した。平成25年10月、液体キセノン検出器用光センサーの波形取得電子回路の開発を担当しているポールシェラー研究所の海外研究協力者から、開発中の波形取得電子回路の設計に深刻な問題があることが判明したとの報告を受けた。検討の結果、目標とする検出器性能を達成するためには電子回路の設計に大幅な変更が必要であることが判明し、また問題を修正した電子回路の完成は平成26年8月となる見込みであることがわかった。平成25年12月にこの電子回路を用いたプロトタイプ検出器による光センサー性能実証試験が予定されていたが、電子回路無しではセンサーの性能について完全な実証ができないため、電子回路の完成を待って光センサーの性能実証試験を実施し、光センサーの性能を確認した上で実機用光センサーの生産を開始することとした。電子回路を必要としない試験を先行して行う光センサーの生産工程において、性能とは直接関係しない部分の準備を並行して進めるなどの工夫により、実験計画全体に対する影響は最小限にとどめることが出来た。平成26年夏には設計を変更し問題を解決した波形取得電子回路が予定通り完成し、光センサー性能実証試験を実施した。試験の結果、開発した光センサーが液体キセノン中でゲイン10^6以上、ダークカウントレート約1Hz/mm2程度以下、アフターパルス確率5%以下、光子検出効率15%以上であることがわかった。これにより液体キセノン検出器実機に用いる光センサーとして十分な性能を有することを実証された。これを受けて実機用の光センサーの製作を開始することができた。平成24年度もMEG実験は順調に実施され、長期にわたって非常に安定にmu->e gamma崩壊探索のためのデータ収集が行われて、平成20年の本格測定開始以降最も多くのデータを取得した年となった。並行して前年度までに取得したデータの物理解析も精力的に行われた。陽電子飛跡再構成アルゴリズム、ガンマ線パイルアップ解析等の改善により、探索感度のさらなる向上に成功した。改良した解析アルゴリズムを用いて平成23年に取得した新しいデータを解析、さらに21、22年に取得した以前のデータについても再解析を行った。残念ながらmu->e gamma崩壊事象の発見には至らなかったが、崩壊分岐比に関してこれまでで最も厳しい制限(5.7x10^-13以下)を与えた。この結果は平成25年3月に国際会議の招待講演で発表し、記者会見を行った。国際ジャーナル誌にも掲載された。
判断の柔軟性の神経基盤

ヒトはどのようにして柔軟に判断をし、多様な選択を行うことができるのだろうか。我々は、2つの弁別課題をランダムに切り替えるタスクスイッチ課題を遂行中のサルから神経活動を記録し、それぞれの弁別課題に特異的な感覚ニューロン群を使い分けることで判断の切り替えが実現されていることを発見した。本研究の成果は、柔軟な意思決定の神経メカニズムの解明にとどまらず、柔軟な判断を支援するブレインマシンインターフェースの開発にもつながると期待される。ヒトがどのようにして柔軟に判断をし、多様な選択を行うことができるか、その認知機能を理解することは神経科学の重要な課題である。本研究では、感覚情報がどのように判断に貢献するのかがすでに知られている2つの弁別課題をランダムに切り替えるタスクスイッチ課題を用いて、判断の柔軟性の神経メカニズムを検証する。試行開始と同時に提示される注視点の色に依存して、ランダムドットステレオグラムの運動方向あるいは奥行きを弁別するようにサルを訓練した。運動方向弁別の場合、ドットが上向きに動いていたら目を上に、下向きに動いていたら目を下に向ける。奥行き弁別の場合、注視点よりもドットが奥にあれば目を上に、手前にあれば目を下に向ける。このタスクスイッチ課題を遂行中のサルの大脳皮質MT野から、単一ニューロン活動の記録を行った。サルは完璧でないものの、2つの弁別課題を切り替えて答えることができた。このときのMT野ニューロンの発火頻度は、どちらの弁別課題を行っていても同じであった。次に、サルの答えとニューロン活動との相関(Choice Probability : CP)を算出し、2つの課題に必要な情報がMT野ニューロンからどのように抽出されているかを検討した。上向き/奥、下向き/手前(どちらの弁別課題を行っても正解が同じになる視覚刺激: Congruent刺激)によく反応するニューロンは、どちらの弁別を行っていてもCPが大きかった。一方、上向き/手前、下向き/奥(どちらの弁別課題を行うかによって正解が逆になる視覚刺激: Incongruent刺激)によく反応するニューロンは、どちらか片方の弁別を行っているときにのみCPが大きかった。以上の結果は、サルがタスクスイッチ課題を行う時、どちらの課題を行うかに依存して、MT野ニューロンの感覚情報の読み出しを切り替えていることを示唆している。本研究では、感覚情報がどのように判断に貢献するのかがすでに知られている2つの弁別課題(運動方向弁別課題と奥行き弁別課題)をランダムに切り替えるタスクスイッチ課題を用いて、判断の柔軟性の神経メカニズムに迫る。そのため、タスクスイッチ課題を遂行中のサルの大脳皮質MT野から、単一ニューロン活動の記録を行った。サルの答えとニューロン活動との相関(Choice Probability:CP)を算出し、2つの課題に必要な情報がMT野ニューロンからどのように抽出されているかを検討した。どちらの弁別課題を行っても正解が同じになる視覚刺激(Congruent刺激)によく反応するニューロンでは、どちらの弁別を行っていてもCPが大きかった。一方、どちらの弁別課題を行うかによって正解が逆になる視覚刺激(Incongruent刺激)によく反応するニューロンでは、どちらか片方の弁別を行っているときにのみCPが大きかった。判断を形成する際、証拠となる感覚情報を蓄積(時間積分)し、ある選択肢に合致する証拠が十分に貯まったときに判断が確定するという考え方が一般的である。この説に則ると、判断の切り替えを制御する方法は少なくとも2つある。一つは、不必要な情報が蓄積されないように感覚情報を遮断する方法(Gate説)、もう一つは一度貯めた情報を時間と共に廃棄する方法(Leak説)である。CPの時間経過を解析したところ、試行の後半部分で不必要なニューロン活動とサルの答えとが相関した。数理モデルを用いて検証をした結果、この結果はLeak説を支持することが判明した。今年度は、タスクスイッチ課題を遂行中のサルの大脳皮質MT野の電気刺激実験を行った。どちらの弁別課題を行っても正解が同じになる視覚刺激(Congruent刺激)によく反応するニューロン群を刺激した場合、どちらの弁別を行っていても電気刺激効果が見られた。一方、どちらの弁別課題を行うかによって正解が逆になる視覚刺激(Incongruent刺激)によく反応するニューロン群を刺激した場合、どちらか片方の弁別を行っているときにのみ電気刺激効果が得られる場合が多かった。

判断を形成する際、証拠となる感覚情報を蓄積(時間積分)し、ある選択肢に合致する証拠が十分に貯まったときに判断が確定するという考え方が一般的である。記録した大脳皮質MT野ニューロンの活動を疑似的に生成するシミュレーションを用い、一度貯めた情報を時間と共に廃棄する方法(Leak説)によって判断の柔軟性がどの程度説明できるかを検証した。このモデルにより、サルの行動データを再現することができ、かつ、不必要な情報が蓄積されないように感覚情報を遮断する方法(Gate説)と比較したLeak説の利点と行動学的な予測を議論することができた。
去勢抵抗性前立腺癌に対するDNA修復機構を標的とした新規治療戦略

本研究ではドセタキセル抵抗性ヒト去勢抵抗性前立腺癌細胞株C4-2AT6を用いてDNA修復経路に関連するPARP阻害剤の有効性について検討した。PARP阻害剤とドセタキセルの併用はC4-2AT6に対し高いアポトーシス誘導効果を示した。また、C4-2AT6を用いて作成したマウス皮下腫瘍モデルにおいてもPARP阻害剤とドセタキセルとの併用は抗腫瘍効果を示した。これらの結果は、PARP阻害剤がドセタキセル抵抗性前立腺癌におけるドセタキセル抵抗性改善に寄与する可能性を示した。当教室では去勢抵抗性前立腺癌細胞株であるC4-2をアンドロゲン除去下に培養し,C4-2に比し有意にドセタキセルに抵抗性を示すC4-2AT6細胞株を樹立した.去勢抵抗性前立腺癌は薬剤耐性機序を獲得していく中で後天的にDNA2本鎖修復を担うBRCA1/2機能不全と類似の病態を引き起こすと考えられている.BRCA1/2機能不全の状態においてはDNA1本鎖修復を担うPARP-1を阻害すると合成致死と呼ばれるアポトーシスの誘導が生じる性質に着目し,本研究ではPARP阻害剤を用いた去勢抵抗性前立腺癌の新規治療戦略を検討することを目的とする.はじめに去勢抵抗性前立腺癌の標準治療であるドセタキセルとPARP阻害剤の併用投与による抗腫瘍効果をIn vitroで検討した.C4-2AT6に対するドセタキセル単剤の抗腫瘍効果は濃度依存性であり,低濃度では十分な抗腫瘍効果が得られないが,PARP阻害剤を併用投与することで抗腫瘍効果が増強されることがWST assayにおいて示唆された.PARP阻害剤単剤での抗腫瘍効果は高濃度投与時にわずかに認める程度であった.同じ条件下でBrdU法を用いて細胞周期の変動を調べると2剤併用投与により著しく細胞周期が変動することが確認されたため,TUNEL法によりアポトーシスを評価したところ,核の断片化が生じ高い割合でアポトーシスが誘導されることが分かった.平成28年度にはIn vivoでの検討を行うとともにDNA修復機構を中心とした各シグナル伝達経路の相互作用をWestern-blot法,細胞蛍光免疫染色を用いて評価していく.当教室で保有する前立腺癌細胞株を用いた研究は順調に進んでおり,研究の結果はおおむね仮説に従っている.次に、In vivoではCastrationを施行したBALB-Cヌードマウスを用いてC4-2AT6皮下腫瘍モデルを作成し、1コントロール群、2DTX単独投与群、3Olaparib単独投与群、4DTX+Olaparib併用投与群の4群に分けてDTXとOlaparibの抗腫瘍効果を検討した。DTXはDay0に腹腔内投与、Olaparibは14日間連続腹腔内投与を行った。DTX単独群、Olaparib単独群における腫瘍径の増大はコントロール群に比しそれぞれ80%程度であったのに対し、DTXとOlaparib併用群における腫瘍径の増大はコントロール群に比し有意に小さく、腫瘍の増殖抑制効果を認めていた。以上より、DTXとOlaparibの併用はDTX抵抗性前立腺癌細胞株C4-2AT6に対して抗腫瘍効果を有する可能性が示唆された。今後はnを増やし再現性を検討するとともにWestern-blot法や免疫染色により詳細なシグナル機序等の解明を目指していきたい。平成28年度は大別して下記2点につき検討していく.2.DNA修復機構を中心とした各シグナル伝達経路の相互作用を検討する.医歯薬学
エピジェネティックな転写抑制を促進させる化学物質検出系の確立

エピジェネティックな遺伝子の変化、すなわちシトシンのメチル化は外来の化学物質によっても引き起こされると考えられる。O6-メチルグアニンDNAメチル転移酵素(MGMT)のプロモーターはこのようなエピジェネティックな変化を検出できる適当な配列である。本研究ではMGMTプロモーターの下流にヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(hprt)cDNAを連結し、さらにネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを作製し、hprt欠損細胞に導入することで、MGMTプロモーターが活性化したら6ーチオグアニン耐性になる細胞アッセイ系を作製した。この細胞を用いて外来のエピミュータジェンの探索を試みている。本年度は検出系の確立を目指し、細胞およびプラスミドの樹立を行った。子宮がん細胞HeLa S3細胞にX線を1.5グレイ照射し10の5乗個を10 cmディッシュに播種し、30μM 6-thioguanineまたは100μg/ml ganciclovir抵抗性コロニーを単離した。これらクローン化された細胞がhprt遺伝子およびtk遺伝子欠失であることをRT-PCR法で確認した。プラスミドHR210PA-1よりHSV-tk遺伝子を、hprt cDNAをPCR法でそれぞれ増幅した。またMGMT遺伝子プロモーターをアダプター付プライマーを用いてPCR法で増幅し、MGMTプロモーター(メチル化のターゲットとなるCpGアイランドを含む)の下流にHSV-tk遺伝子またはhprt cDNAをそれぞれ連結してプラスミドpSV3neoに導入した。このプラスミドは上記の細胞に導入した時にG418でポジティブセレクションが、tkの場合はガンシクロビル(Ganc)、hprtの場合は6-チオグアニン(6TG)でネガティブセレクションができる。現在プラスミドを構築中である。でき上がった上記のプラスミドを制限酵素で直線化し、HeLa tk欠損またはhprt欠損細胞にトランスフェクトする。プラスミドが導入された細胞クローンをG418で複数個選択する。各クローン細胞をtkの場合はGANC、hprtの場合は6TGを含む培地で培養し、細胞が死滅することを確かめる。1.HeLa S3細胞にX線を1.5グレイ照射し、2週間培養後、10 cm dishに105個播種し、30μM 6-thioguanineまたは100μg/ml ganciclovirを含む培地で選択し、生じたコロニーを10個ずつ単離した。これらクローン化された細胞をRT-PCR法によってhprtまたはtk遺伝子が発現していないことを確認した細胞を、それぞれHeLaHprt2、HeLaTK5細胞と名付けた。2.MGMTプロモーター(メチル化のターゲットとなるCpGアイランドを含む)の下流にHSV-tk遺伝子またはhprt cDNAを連結してプラスミドpSV3neoに挿入した。それぞれをpSV2neoMGMTtk、pSV2neoMGMThprtと名付けた。pSV2neoMGMTtkをHeLaHprt2細胞、pSV2neoMGMThprtをHeLaTK5細胞に導入し、共に400μg/mL G418を含む培地で選択した。それぞれ10コロニーずつ単離し増殖させた。これらクローン細胞を再度30μM 6-thioguanineまたは100μg/ml ganciclovirを含む培地で培養し、増殖しないことを確かめた。これらの細胞のうちRT-PCR法によってhprtまたはtk遺伝子が発現していることを確認できた細胞をHeLaEMhprt1、HeLaEMtk2細胞と名付け、以後の実験に用いることにした。3.現在HeLaEMhprt1、HeLaEMtk2細胞のMGMTプロモーターの低メチル化をHeLaMR細胞(MGMTプロモーターがメチル化している)との比較を通してbisulfite sequencingによって確認すると共に、ヒストンアセチル化酵素阻害剤garcinol、ヒストンメチル化酵素阻害剤ChaetocinでHeLaEMhprt1およびHeLaEMtk2細胞のそれぞれ30μM 6-thioguanine、100μg/ml ganciclovir耐性クローンの出現頻度を測定している。4.一方でHeLaMR細胞を用いたMGMTプロモーター脱メチル化系を用いて、三酸化ニ砒素(As2O3)の脱メチル化活性を確かめた。研究実施計画どおりに進めているがプラスミドの作成に手間取ってる。概ね予定通りの進捗である。分子細胞遺伝学平成26年度に引き続き、プラスミドを導入して細胞の樹立に努める。できあがった細胞はG418耐性・GANC感受性または6TG感受性であるはずであるが、ごく低頻度で自然にMGMTプロモーターがメチル化されることにより、tkまたはhprtが発現が発現するとGANCまたは6TG抵抗性になるはずである。それゆえ、G418・GANCまたはG418・6TGを含む培地でコロニー形成させspontaneousmethylation frequencyを求める。樹立した細胞の導入プラスミドのMGMTプロモーター配列をバイサルファイトシーケンシングによって決定し、CpGアイランドのメチル化のレベルを比較する。

メチル化を促進する可能性のある化学物質やEpimutagenicな作用をする可能性のある物質を細胞に処理し2週間培養後、GANC(tkの場合)または6TG(hprtの場合)抵抗性細胞の出現頻度を調べる。まず化学物質の候補として、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、ヒストンリジンメチル基転移酵素阻害剤、BIX-01338、メチル基供与体であるS-アデノシルメチオニン、また環境汚染物質でエピミュータジェンの可能性があるビスフェノールA、亜ヒ酸ナトリウムなどを用いる。