hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん遺伝子および関連遺伝子の染色体マッピング

1.がん遺伝子および関連遺伝子の染色体マッピングヒトゲノミックDNAより,vーros遺伝子をプローブとしてcーrsー1およびfltを分離した.これらの遺伝子をin sityハイブリダイゼーションによりヒト6q22および13q12へそれぞれマッピングした.同様に,ヒトDNAより,分離したmyb関連遺伝子であるnit,bーmybを第8および第13染色体上へ,Ski関連遺伝子であるskyを第3染色体上へ位置づけした.また,癌細胞由来トランスフォーミング遺伝子として分離された胃癌由来hstー1および肝癌由来lcaをそれぞれ11q13.3,2q14へマッピングした.hstー1は胃癌由来の組織,偏平上皮癌由来培養細胞で増巾がみられ,さらに11q13上に存在するintー1がん遺伝子もこれらの組織・細胞で増巾しているのが観察された.すなわち2種類の遺伝子の共増巾がみられたのである.また,増殖因子に関連する遺伝子としてインターロイキン5(ILー5)および顆粒球増殖因子遺伝子CSF3をそれぞれ5q23→q31,17q21→q22へ位置づけした.また,Tリンパ性白血病細胞から,T細胞レセプター遺伝子が再編成を起こし,DーJ結合の際に外れた遺伝子DNA断片をクローニングした.この遺伝子は第6染色体上に位置していることが分った.すなわち,DーJ結合の際に切り出されたDNA断片がもう一度ゲノムの中に挿入されるという新事実を思い出した.2.変異型Ph^1染色体転座の生成機構をcーabl,Cーsisおよびbcr遺伝子の各プローグを用いin sityハイブリダイゼーションにより解析し,従来第9染色体を含まないと考えられていた変異Ph^1は全てこの染色体を含む異常であること,それはt(9;22)より二次的に汎生したものであること,さらに,Ph^1転座は9q34/22q11の再構成が必須であることなどが分った.3.MDSのdel(20)染色体異常は従来末端欠失と考えられていたがcーsrc座位を含む中間欠失である事を明らかにした.1.がん遺伝子および関連遺伝子の染色体マッピングヒトゲノミックDNAより,vーros遺伝子をプローブとしてcーrsー1およびfltを分離した.これらの遺伝子をin sityハイブリダイゼーションによりヒト6q22および13q12へそれぞれマッピングした.同様に,ヒトDNAより,分離したmyb関連遺伝子であるnit,bーmybを第8および第13染色体上へ,Ski関連遺伝子であるskyを第3染色体上へ位置づけした.また,癌細胞由来トランスフォーミング遺伝子として分離された胃癌由来hstー1および肝癌由来lcaをそれぞれ11q13.3,2q14へマッピングした.hstー1は胃癌由来の組織,偏平上皮癌由来培養細胞で増巾がみられ,さらに11q13上に存在するintー1がん遺伝子もこれらの組織・細胞で増巾しているのが観察された.すなわち2種類の遺伝子の共増巾がみられたのである.また,増殖因子に関連する遺伝子としてインターロイキン5(ILー5)および顆粒球増殖因子遺伝子CSF3をそれぞれ5q23→q31,17q21→q22へ位置づけした.また,Tリンパ性白血病細胞から,T細胞レセプター遺伝子が再編成を起こし,DーJ結合の際に外れた遺伝子DNA断片をクローニングした.この遺伝子は第6染色体上に位置していることが分った.すなわち,DーJ結合の際に切り出されたDNA断片がもう一度ゲノムの中に挿入されるという新事実を思い出した.2.変異型Ph^1染色体転座の生成機構をcーabl,Cーsisおよびbcr遺伝子の各プローグを用いin sityハイブリダイゼーションにより解析し,従来第9染色体を含まないと考えられていた変異Ph^1は全てこの染色体を含む異常であること,それはt(9;22)より二次的に汎生したものであること,さらに,Ph^1転座は9q34/22q11の再構成が必須であることなどが分った.3.MDSのdel(20)染色体異常は従来末端欠失と考えられていたがcーsrc座位を含む中間欠失である事を明らかにした.
自然界におけるA群ロタウイルスの流行動態の解明と新たな流行リスクの分析

これまでの血清疫学調査により多様なA群ロタウイルスが高頻度で感染していると考えられたウシと野生のイノシシを対象に、感染状況や実態に関する調査を進めた。200306に愛知、岐阜、群馬県で捕獲されたイノシシの腸管内容物135例からRT-nested PCR法によりロタウイルスVP4遺伝子の検出を試みたところ、岐阜県のサンプルの1例が陽性となった。同遺伝子の一部塩基配列を解読した結果、韓国においてヤギから分離されたGRV株に最も近縁で、P遺伝子型はP[3]と考えられた。続いて、同様に健康なウシについての調査を実施した。2006年4月から2007年6月に採取された、岐阜県内の健康なウシから採取した糞便2,146例について、ロタウイルスVP4遺伝子の検出を試みた。陽性44例についてVP4遺伝子の塩基配列を解読した結果、検出されたウイルスの遺伝子型はP[5]、P[11]、P[14]に加え、これまで報告のないタイプの新しい遺伝子型のウイルスと考えられた。また、本ウイルスの感受性が低いとされる成牛や非流行期である夏季にも、ウイルス遺伝子が検出された。さらに、一部、VP7遺伝子を解析した結果、同一農場で検出されたロタウイルスに遺伝子組換え体が存在し、非流行時であってもウイルス分節の組換えが起きていることが示された。以上、A群ロタウイルスは、幼若期以外の健康なウシにおいても感染・排泄が起きており、流行がほとんどみられないとされる夏季にもこの現象が観察された。今回、常在化しているロタウイルスが流行を引き起こす可能性と、遺伝子組換え体の存在から新たな変異ウイルスによる流行リスクがあることを示すことができた。これまでの調査地域以外でのイノシシにおける本ウイルスの感染状況を把握することを目的に、愛知県および四国4県ナ捕獲されたイノシシ182例について、P遺伝子型特異抗体検出法により血清疫学調査を実施した。その結果、24%のイノシシがP[17]遺伝子型のトリで流行しているロタウイルスの感染を、41%がP[4]あるいは[8]遺伝子型のヒトで主に流行しているロタウイルスの、56%がP[2]あるいは[3]遺伝子型のロタウイルスの感染を受けたと考えられた。抗体価の解析から、野生のイノシシでは、様々なあるいは未知のロタウイルスが感染・流行していることが推測された。そこで、平成1518年に愛知、岐阜、群馬県で捕獲されたイノシシの腸管内容物135例からロタウイルスVP4遺伝子の検出を試みたところ、岐阜県のサンプルの1例が陽性となった。塩基配列を解読した結果、韓国において山羊から分離されたGRV株に最も近縁で、P遺伝子型はP[3]と考えられた。血清疫学調査からもP[3]遺伝子型ロタウイルスの流行が推測されており、本遺伝子の検出はそれを裏付ける結果となった。さらに、ウシでのロタウイルスの感染実態を調査するため、ウシの糞便より本ウイルスの検出を試みた。2006年に岐阜県で採取されたウシの糞便587例のうち子牛の正常便1例からロタウイルスVP4遺伝子が検出された。その塩基配列を解読した結果、米国においてウVから分離されたB223株に最も近縁で、P遺伝子型はP[11]と考えられた。以上、本研究により、下痢症の流行を伴わないロタウイルスの感染が自然界で起きている実態について明らかになりつつある。平成18年度の研究により、ウシ正常便1例からA群

ロタウイルス遺伝子が検出された。そこで、調査地の拡大と材料の増数を図り、健康なウシからウイルス遺伝子を検出することにより同ウイルスの感染動態についての解明を進めた。岐阜県内の健康なウシから採取した糞便2146例について、RT-nestedPCR法によりロタウイルスVP4遺伝子の検出を試みたところ、44例が陽性となった。これらのウイルスは全て、非流行時に健康なウシから検出されたものである。また、このうち7例は子牛ではなく成牛から検出され、2例は78月の夏季に検出された。VP4遺伝子の塩基配列を解読した結果、これらのウイルスの遺伝子型は、P[5]、P[11]、P[14]および既知のP遺伝子型とは異なるタイプであることが明らかとなった。これらの遺伝子型のウイルスは、日本あるいは近隣地域で、ウシにおける下痢症流行の原因となっている。従って、常在的にウシが保有するロタウイルスが下痢症流行を引き起こす潜在性を有していると考えられた。さらに、一部、VP7遺伝子を解析した結果、同一農場で検出されたロタウイルスに遺伝子組換え体が存在し、非流行時であってもウイルス分節の組換えが起きていることが示された。以上、A群ロタウイルスは、幼若期以外の健康なウシにおいても感染・排泄が起きており、流行がほとんどみられないとされる夏季にもこの現象が観察された。今回、常在化しているロタウイルスが流行を引き起こす可能性と、遺伝子組換え体の存在から新たな変異ウイルスによる流行リスクがあることを示すことができた。
運動課題遂行時の作業記憶（ＷＭ）関与の解明―効果的な訓練法の開発に向けて―

運動イメージ中に事象関連電位(ERP)の記録を行い、運動イメージ課題における作業記憶の関与を検討した。結果、運動イメージ課題への認知負荷量を変化させることでERPに明瞭な差異を検出した。運動イメージ課題に要する作業記憶、注意資源量の変化により、ERPが変化したと考えた。本研究結果は関連学会において報告を行った。研究期間を通じて、運動発現に至るまでのプロセスに作業記憶が関与することを明らかにできた。臨床的には作業記憶の関与が指摘されており、この点の神経生理学的な基礎的知見として有用な結果を見出したと考えている。平成25年度も前年度に引き続いて脳波による測定を継続して実施した。加えて、脳磁計での測定も追加して行った。運動イメージ中の聴覚逸脱反応(聴覚ミスマッチ陰性電位)の記録を行い、運動イメージ課題における作業記憶(ワーキングメモリ)の関与を検討した。解析の結果、運動イメージ課題への認知負荷量を変化させることで聴覚逸脱反応に明瞭な差異を検出した。運動イメージ課題に要する作業記憶資源量の変化により、その認知資源を共有すると考えられる聴覚ミスマッチ陰性電位に変化が生じたと考えた。臨床的にはこれまでに作業記憶の関与が指摘されてきたが、この点の神経生理学的な基礎的知見として有用な結果を見出したと考えている。運動課題を用いたリハビリテーションプログラム作成において、作業記憶を考慮したプログラム検討の必要性が明らかとなった。本研究の今後の展望として、運動イメージを促進する課題内容の検討をすることで、実際のプログラム立案に直接繋げることが可能となると考える。本報告書への記載はできなかったが、本研究結果について論文の作成を進めており、関連学術国際雑誌へ投稿する計画である。まず初めに脳磁計測、脳波測定における機器の設定を整えたことで測定が可能な状態となった。本研究で最も重要な点は、運動課題遂行時の作業記憶の関与を解明するための課題作成であった。脳磁計測、脳波測定中は実際の運動を実施することは測定上困難である。そのため、実際の運動遂行に類似した脳活動が報告されている、運動イメージ中の作業記憶の関与を検討することとした。これにより、脳磁計測、脳波測定手法においても、運動に関連した認知機能の検討が可能となった。さらに被験者には運動イメージ課題にのみ集中してもらい、その間に課題に関連の無い刺激として聴覚oddball paradigmを提示し事象関連電位(ERP)の測定を行う2重課題を設定した。これにより被験者の注意が脳反応に影響を与える、というこれまでの2重課題の問題点を解決することができた。つまり、被験者は運動イメージ課題にのみ注意を向けているため、課題に関連の無い聴覚oddball paradigmを背景刺激とすることで、運動イメージに要す情報処理と、聴覚刺激の情報処理との間の干渉、または不干渉を被験者の注意の影響を最小限に抑えて検討することが可能となった。上記の2重課題を用いて、脳波測定を5名の被験者に実施した。結果、聴覚oddball paradigmにより導出できるERPを明瞭に記録することができた。また、運動イメージ課題に難易度を設定することにより、記録されたERPの差異を検出することができた。これにより、難易度の異なる運動イメージ実施時の認知機能に関連した脳反応の比較検討が可能となり、データを蓄積することで統計的解析が実施できる状態となった。本研究の最も重要な点は、運動課題に関連した認知機能を導出するための課題を設定することにあった。この点について、研究申請期間初年度において課題を検討、作成し、実際にその課題を用いて脳波測定を実施している。また、測定データの解析の結果、本研究で目的としていた脳反応を記録できていることが確認されている。脳磁測定、脳波測定の機器の設定も同様に完了している。被験者の数を増やし、データの蓄積を2年目で実施することで本研究の目的は達成できると考える。よって現在までの達成度はおおむね順調に進展していると考える。これまでに本研究で用いる脳磁測定、脳波測定の測定準備は完了している。加えて最も重要であった運動課題に関連した脳反応を記録するための課題の作成も完了している。よって、今後は各測定方法におけるデータ測定を進めていき、予定していた被験者数を超えたところで、統計的解析を行う。また、本研究の成果について、リハビリテーション関連の雑誌に投稿する予定である。脳磁測定、MRI測定に要する施設使用料について、初年度で測定を実施していないため、そのための経費を支出する。また、研究発表および論文投稿費用について支出する予定である。
分子遺伝学的手法による託卵鳥と宿主の相互進化に関する研究

長野県では、最近になってオナガとカッコウの双方が分布を拡大した結果、両者の分布が重なり、25年ほど前からオナガへのカッコウの託卵が開始された。カッコウの託卵に対して十分な対抗手段を持っていなかったオナガは、最初一方的に託卵されていたが、短期間の間にカッコウに対する攻撃性、自分の卵とカッコウの卵を区別してカッコウ卵を排除するという形での対抗手段を発達させた。そのため、この間に両者の関係はダイナミックに変化していることが、これまでの10年にわたる研究から明らかにされている。長野市郊外の千曲川調査地では、オナガの他にオオヨシキリ、モズといった計3種類の宿主へのカッコウの託卵が見られる。そのため、この調査地は、カッコウは宿主に対応した系統にどの程度分かれているのかといったgentiesの問題を明らかにするのに適した場所である。カッコウと宿主の相互進化を検討する上で重要なこの問題を明らかにするため、平成3年度からこの地域に生息するカッコウの成鳥と雛から血液の採集を行っている。3年目にあたる平成5年度には、千曲川の調査地に生息する雄のカッコウのほぼ8割にあたる計22羽、雌のほぼ7割にあたる計26羽を捕獲でき、血液を採集することができた。また、この地域で生まれた計24羽の雛からも血液の採集ができた。採集されたこれらの血液は、親子関係、性関係などを分析するため、共同研究者のカナダMcMaster大学のLisle Gibbs氏に送った。また、血液採集後、個体識別できるように標識したカッコウの野外観察を行い、血液分析の折りに役立つ、各個体の行動圏、託卵行動域などについての調査もこれまでと同様に行った。
貴金属基β相合金におけるベイナイト変態のFE電子銃付き高分解能分析電顕による研究

我々はこれまでにβ相CuーZnーAlおよびAgーCd合金のベイナイト変態を高分解能分子電子顕微鏡により調べ、その変態には原子拡散が核生成の段階から本質的に関わることを明らかにした。本年度は、2段階成長機構を示唆する結果が以前に報告されているβ相CuーAuーZn合金におけるベイナイト変態を光学顕微鏡、電子顕微鏡および高分解分析電子顕微鏡により、特に、ベイナイト内の組成の場所的な変動の有無に注目して調べた:Cuー4Auー39Zn(at%)合金(配合組成)を溶体化処理後、200°Cで等温処理したときに生成した板状ベイナイトのうち、厚さが150ー200nmのベイナイト内での、その厚さ方向の組成変動は、Cuの濃度変化として表せば、62.4±0.4(at%)であり、±0.6%程度の変化でしかなかった。すなわち、ベイナイト内の溶質濃度は、以前報告されたような、特に中心部で高いということは認められず、ほとんど一定であることがわかった。本結果はベイナイト変態機構解明上重要な知見である。今後は、Wu and Wayman(1989)によって極く最近報告された、やはり、2段階成長機構を示唆する電顕観察結果を検証するために、彼らが調べた合金と同じ組成の合金を作製して、その合金におけるベイナイト変態を本研究と同様の観点から検討する予定である。また、本研究では、溶体化処理温度の違いによってベイナイト組織が明らかに異なることが光学顕微鏡による観察で見い出された。これはベイナイトの核生成機構を考察する上で重要な結果であると思われるので、この点についても更に、結晶学的に、また、組成の観点から詳細に検討する予定である。なお、購入した設備備品はすべて本合金を加熱あるいは冷却ステ-ジの取り付いた光学顕微鏡で観察しながら、ベイナイト変態あるいはマルテンサイト変態の有無ならびにそれらの変態に伴う組織変化のその場観察とその記録に役立った。
大型梗塞後心不全に対するアポトーシス阻害ならびに心筋再生の併用療法の試み

大型梗塞後心不全に対する抗アポトーシス治療と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)治療の併用療法を行った。1)無治療群、2)抗アポトーシス(sFas遺伝子大腿筋投与)単独治療群、3)G-CSF(梗塞作製1日後よりG-CSF100microg/kg/dayを5日間連日皮下注射)単独治療群、4)併用療法群の4群でマウス心筋梗塞慢性期(4週後)の心機能と心室リモデリングを比較したところ、心機能悪化ならびに心室リモデリングの改善は併用療法群で最も顕著にみとめられ、次いで抗アポトーシス治療群、G-CSF治療群で同程度に改善が認められ、併用療法の有効性が立証された。G-CSF投与にて心筋細胞の肥大(代償性肥大を上回る)が生じ、かつ心筋線維化が抑制されたが、骨髄由来細胞による心筋細胞の再生は認められなかった。一方、sFas遺伝子治療では梗塞巣肉芽組織細胞のアポトーシスが抑制されその結果慢性期瘢痕組織の残存間質細胞が、増加、梗塞壁厚の増大がみられた。これにより壁ストレスが減少し、リモデリングが抑制され心機能の改善がもたらされたと考えられた。併用療法では両者の組織学的特徴がみられたため、相加作用的に梗塞後心機能の改善がもたらされたものと考えられる。分子生物学的機序については、G-CSFによるJak/Stat,PI3K/Aktの活性化ならびにG-CSF受容体の発現亢進、sFasによるFas受容体以下のシグナル伝達の抑制が確認された。今年度は、大型梗塞後心不全に対する抗アポトーシス治療と顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)治療の併用療法を行う前段階乏して、併用療法のコントロールとして抗アポトーシス単独療法ならびにG-CSF単独療法をマウス心筋梗塞モデルにて行った。1)抗アポトーシス単独療法:当初の計画ではcaspase阻害薬による抗アポトーシス療法を考えていたが、心筋梗塞肉芽組織のアポトーシスの分子機構にFas-Fasリガンド系が強く関与することを我々は見いだし、本系を阻害することにより実際肉芽組織細胞のアポトーシスが有効にブロックされたことから、抗アポトーシス因子である可溶性Fas(sFas)による遺伝子治療に変更した。マウスの左冠動脈結紮による心筋梗塞モデルで梗塞3日目にアデノウィルスをベクターとしてsFas遺伝子を大腿筋に投与した。対照はLacZ遺伝子を用いた。梗塞4週後の検討では、対照群に比しsFas群で左室リモデリングならびに心機能の有意な改善が認められた。2)G-CSF単独療法:マウスを開胸し左冠動脈結紮により心筋梗塞モデルを作製、梗塞作製1日後よりG-CSF100microg/kg/dayを5日間連日投与した。無治療コントロール群には同量の生食を同様に投与した。梗塞4週後の心エコーならびに心臓カテーテルによる検討では、対照群に比しG-CSF治療群で左室リモデリングならびに心機能の有意な改善が認められた。1)無治療群、2)抗アポトーシス(sFas遺伝子大腿筋投与)単独治療群、3)G-CSF(梗塞作製1日後よりG-CSF 100microg/kg/dayを5日間連日皮下注射)単独治療群、4)併用療法群の4群でマウス心筋梗塞慢性期(4週後)の心機能と心室リモデリングを比較したところ、心機能悪化ならびに心室リモデリングの改善は併用療法群で最も顕著にみとめられ、次いで抗アポトーシス治療群、G-CSF治療群で同程度に改善が認められ、併用療法の有効性が立証された。

一方、sFas遺伝子治療では梗塞巣肉芽組織細胞のアポトーシスが抑制されその結果慢性期瘢痕組織の残存間質細胞が、増加、梗塞壁厚の増大がみられた。これにより壁ストレスが減少し、リモデリングが抑制され心機能の改善がもたらされたと考えられた。併用療法では両者の組織学的特徴がみられたため、相加作用的に梗塞後心機能の改善がもたらされたものと考えられる。分子生物学的機序については、G-CSFによるJak/Stat,PI3K/Aktの活性化ならびにG-CSF受容体の発現亢進、sFasによるFas受容体以下のシグナル伝達の抑制が確認された。
機能性超薄膜の創製に向けた表面プラズモン重合反応の開発

金属薄膜や金属微粒子の表面には,金属中の電子のプラズマ振動と光が結合した表面プラズモンが存在する.このような表面電磁波は,"表面局在性"や"電場増強"など通常の光にはない性質を秘めている.本研究は,このような表面プラズモンをナノメートルサイズの極微小空間内に存在する光励起子場としてとらえ,光センシングおよび光化学反応への応用を検討した.表面プラズモンは,Kretschmann光学配置を利用して共鳴励起させた.金を蒸着させたガラス基板をプリズムの底面にマッチングオイルで貼り付け,角度を変えながらHe-Neレーザー光をプリズムに入射させ,プリズム底面で発生したエバネッセント波を利用して金薄膜表面に表面プラズモンを共鳴させた.金薄膜上に種々のモノマーや重合開始剤,およびマットリックスポリマーを含む溶液をスピンコート法によって塗布し,共鳴条件下重合反応を試みた.トリメチロールプロパントリアクリレート(TMPT)などの多官能性のビニル系モノマーにボレート系開始剤(TBAB),および感光波長領域をコントロールするためシアニン系色素(NK-529)を分光増感剤として共存させた複合型光開始系において光重合に成功した.表面プラズモンを利用した重合反応では,その"表面局在性"を反映して超薄膜の形成が期待される.形成させた光硬化膜の原子間力顕微鏡観察から,実際にその膜厚が数十数百nmであることを確認した.表面プラズモンのしみだし長は225nmと算出され,表面プラズモンを利用すれば可視光でもナノスケールの超薄膜を容易に形成できることがわかった.金属薄膜や金属微粒子の表面には,金属中の電子のプラズマ振動と光が結合した表面プラズモンが存在する.このような表面電磁波は,"表面局在性"や"電場増強"など通常の光にはない性質を秘めている.本研究は,このような表面プラズモンをナノメートルサイズの極微小空間内に存在する光励起子場としてとらえ,光センシングおよび光化学反応への応用を検討した.表面プラズモンは,Kretschmann光学配置を利用して共鳴励起させた.金を蒸着させたガラス基板をプリズムの底面にマッチングオイルで貼り付け,角度を変えながらHe-Neレーザー光をプリズムに入射させ,プリズム底面で発生したエバネッセント波を利用して金薄膜表面に表面プラズモンを共鳴させた.金薄膜上に種々のモノマーや重合開始剤,およびマットリックスポリマーを含む溶液をスピンコート法によって塗布し,共鳴条件下重合反応を試みた.トリメチロールプロパントリアクリレート(TMPT)などの多官能性のビニル系モノマーにボレート系開始剤(TBAB),および感光波長領域をコントロールするためシアニン系色素(NK-529)を分光増感剤として共存させた複合型光開始系において光重合に成功した.表面プラズモンを利用した重合反応では,その"表面局在性"を反映して超薄膜の形成が期待される.形成させた光硬化膜の原子間力顕微鏡観察から,実際にその膜厚が数十数百nmであることを確認した.表面プラズモンのしみだし長は225nmと算出され,表面プラズモンを利用すれば可視光でもナノスケールの超薄膜を容易に形成できることがわかった.表面プラズモンとは,金属中の電子のプラズマ振動と光が結合してできる表面電磁波の一種であり,"表面局在性"や"電場増強"など通常の光にはない性質を秘めている.本研究は,このような表面プラズモンをナノメートルサイズの極微小空間内に存在する光励起子場(ナノ光源)としてとらえ,機能性超薄膜の形成に向け光重合反応を中心に近接場光化学反応への応用を検討した.表面プラズモンを共鳴させる光学系には,Kretschmann配置を採用した.プリズムの底面に真空蒸着法によって膜厚50nmの金薄膜を形成させ,その底面で入射光が全反射されるようにHe-Neレーザー光(632nm)を照射し,発生したエバネッセント波を利用して金属表面に表面プラズモンを共鳴させた.この表面プラズモン共鳴条件下,金蒸着膜に種々のモノマー及び重合開始剤を含む反応溶液を接触させ,金膜上に高分子の超薄膜の形成を試みた.表面プラズモンにともなう電場は顕著な電場増強効果を示し,2光子励起過程を経る光化学反応が期待できる.そこで,通常ならばHe-Neレーザー光に感光できない開始剤の存在下,各種の多官能モノマーの重合反応を行った.しかし,いずれのモノマーについても薄膜の形成は確認できなかった.次に,二種類以上の光重合開始剤や促進剤を併用する複合型光開始系について検討した.ボレート系開始剤n-Bu_4N[B(n-Bu)Ph_4]に加え,感光波長領域をコントロールするためスクワリリウム色素(λ_<max>=624nm)やシアニン色素(λ_<max>=638nm)などのカチオン色素を分光増感剤として共存させたとき,金薄膜上に生成物が確認された.金属薄膜や微粒子の表面には,金属中の電子のプラズマ振動と光が結合した表面プラズモンが存在する.このような表面電磁波は,"表面局在性"や"電場増強"など通常の光にはない性質を秘めている.本研究は,このような表面プラズモンをナノメートルサイズの極微小空間内に存在する光励起子場としてとらえ,光センシングおよび光化学反応への応用を検討した。粒径が数nmの金ナノ粒子は,表面プラズモンに由来する吸収帯が可視領域に存在し,その溶液は赤い色を示す.

このようなナノ粒子表面にアミドアルカンチオールの単分子膜を形成させるとリン酸イオンなどの生体内重要アニオンをトリガーにナノ粒子が凝集し,顕著なスペクトル変化が誘起されることを見出した.即ち,ナノ粒子を近接させることで表面プラズモンに摂動を与え,分子認識現象を吸収スペクトル変化としてセンシングすることに成功した.一方,微粒子とは異なりバルクの金に直接光を照射しても表面プラズモンを共鳴させることはできない.そこで,屈折率の高いプリズムの底面に金を蒸着させ,プリズム底面で入射光が全反射されるようにレーザー光を照射し,発生したエバネッセント波を利用して金薄膜表面に表面プラズモンを共鳴させた(Kretschmann光学配置).通常の光とは異なり空間を伝播しない表面プラズモンは,マスプロダクションを目的とした光化学反応には適さない.従って共鳴条件下,金蒸着膜に種々のモノマー及び重合開始剤を含む反応溶液を接触させ,金膜上に高分子の薄膜の形成を試みた.このような微小空間内で進行する光化学反応系を測定する有用な手段がなく,定量的な評価を行うことは出来なかったが,広範な材料探索を行った結果,ボレート系開始剤に加え,感光波長領域をコントロールするためスクワリリウム色素やシアニン色素などのカチオン色素を分光増感剤として共存させた複合型光開始系において光反応物の形成が確認された.
脳の細胞外蛋白質分解システムにおける新規マトリクスメタロプロテアーゼの解析

脳神経系に発現する特異的な新規のマトリクスメタロプテアーゼ(MT5-MMP)の機能解析を行った。脳におけるMT5-MMPの局在を調べる為に、in situハイブリダイゼーションを行った。更にMT5-MMPに対するウサギポリクローナル抗体を作製し、ラット脳の免疫組織染色を行った。これらの解析のよりMT5-MMPは海馬CA領域の錐体細胞、歯状回の顆粒細胞、小脳の顆粒細胞、プルキニエ細胞などの神経細胞に特異的に発現していることが分かった。特にこの分子は神経細胞の細胞体と樹状突起に強く局在していた。次に小脳における発現時期を調べる為に生後ラットの小脳を発生段階を追ってウエスタンブロットした。MT5-MMPは生後徐々に増加し生後14日齢から35日齢で更に増加し、成体脳では高い発現レベルを示し、その発現は加齢脳でも保たれていた。小脳では生後14日齢から35日齢にかけてプルキニエ細胞の樹状突起の発達が起こるが、この時期の樹状突起にMT5-MMPの強い発現が見られることから、プルキニエ細胞の樹状突起の形態形成にMT5-MMPが関与していることが考えられた。また、MT5-MMPはヒト・アルツハイマー脳において老人斑に局在していることが分かった。以上の研究結果を現在Eur.J.Neurosci.に投稿中である。脳神経系に発現する特異的な新規のマトリクスメタロプテアーゼ(MMP)の機能解析を行った。まず、新規MMPのアミノ酸配列をもとに合成ペプチドを作製し、これに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。また、培養細胞にcDNAを導入し、新規MMPの強制発現系を確立した。前述の抗体で新規MMP発現細胞のライセートをウエスタンブロットしたところ、この抗体は65KDaのタンパク質を認識した。ラット脳の細胞下分画を行いウエスタンブロットしたところ、55KDaのタンパク質が膜画分に検出された。この分子は分子量から活性化型であると考えられた。よって、生体内では活性化型で存在していることが明らかになった。次に、新規MMPの存在形態や細胞内局在を調べる為に、新規MMP発現細胞の抗体による免疫細胞染色を行った。新規MMPは細胞内のER/Golgi様の膜構造や細胞膜に発現していた。また細胞質にパッチ状に発現が見られた。よって、新規MMPはその一次構造からも推測されたように膜型のMMPであると考えられる。更に、脳における局在を調べる為に、ラット脳の免疫組織染色を行ったところ、神経細胞に特異的に発現していることが分かった。この酵素は神経細胞において細胞膜上に存在することから、細胞外あるいは膜上の基質タンパク質を分解する可能性が考えられる。現在、この酵素分子の脳内における機能的役割を解析する目的でノックアウトマウスの作製を行っている。
ナノ粒子を用いた貪食細胞特異的治療の開発

ステロイド(デキサメサゾン、DEX)含有ナノ粒子(DEX-NP)の炎症抑制効果は、生体では週令の雄SD-rat使用して、病態(NMDAモデル、網膜剥離モデル)眼に投与し、治療効果(FluoroGoldで逆行性染色した網膜神経節細胞の生存数を数えること、視細胞のTUNNEL染色陽性細胞を数えること)を確認した。培養細胞においては、初代培養したマクロファージにDEX-NPを投与し、qRT-PCRで炎症(TNFα、MCP1)抑制効果を定量した。DEX-NP(13μg/ml、DEX0.65μg/ml相当)の治療効果について、培養マクロファージに対してステロイド(DEX)単独投与(0.65μg/ml)と同等の炎症抑制効果、そしてより長期間(2日間まで)に効果が持続したことを、TNFαMCP1のmRNA発現で確認した。生体では、NMDA病態モデルに対してミクログリア活性化の抑制、網膜神経節細胞(RGC)のapoptosisの抑制効果を認めた。網膜剥離モデルに対して、視細胞のapoptosisを抑制できた。これまでに網膜剥離、緑内障、網膜虚血、ぶどう膜炎、脈絡膜血管新生の動物モデルにおいて、マクロファージ、ミクログリアの神経毒性を報告してきたことから、網膜疾患の神経保護治療に有効な可能性がある。ステロイドはその薬効から臨床的に良く用いられているが、意図しない副作用(緑内障、白内障)のために慢性疾患には長期投与が難しい。マクロファージとミクログリアに特異的に薬剤伝達できれば、免疫抑制以外の副作用が軽減できる。本研究で使用したナノ粒子がマクロファージ、ミクログリアへ取り込まれる特性を利用して、薬剤をターゲット細胞特異的に運搬し、副作用を抑えた新しい眼内投与法の開発が期待できる。本年度はγPGAナノ粒子の眼内動態、局在、経時的変化を調べた。正常SDラットにナノ粒子(0.8mg/ml,4mg/ml,20mg/ml)を5μl眼内投与し、局在、経時的変化を眼球凍結切片および網膜伸展標本で調べた。その結果、正常網膜にはナノ粒子は集積しないことが判明した。最大濃度(20mg/ml)の眼内投与では若干の炎症細胞の遊走が認められたが、0.8,4mg/mlでは炎症惹起性も認められなかった。続いて網膜障害モデルでナノ粒子の眼内動態を検討した。動物病態モデル(網膜剥離モデル、網膜虚血モデル、ブドウ膜炎モデル、)にナノ粒子を投与し、2日後、7日後、14日後、28日後に眼球摘出し、凍結切片でナノ粒子の細胞レベルの局在と、粒子の滞留性を調べた。網膜剥離モデルでは、網膜下腔に遊走したマクロファージにナノ粒子の集積を認めた。網膜虚血モデルでは、活性化したマイクログリア細胞にナノ粒子の集積を認めた。ぶどう膜炎モデルでは、硝子体腔内に遊走したマクロファージに粒子の集積を認めた。マクロファージ、マイクログリア細胞へのナノ粒子の取り込みを検討するために、初代培養法にてマクロファージとマイクログリア細胞を回収し、ナノ粒子を取り込ませた。その細胞はTNFαで刺激され炎症性サイトカインを分泌するが、消炎作用を持つデキサメサゾンをナノ粒子に含有し投与すると、その炎症反応が抑制された。本研究で使用したナノ粒子が病的状態のマクロファージ、マイクログリアへ取り込まれる特性を利用して、薬剤をターゲット細胞特異的に運搬し、副作用を抑えた新しい眼内投与法の開発が期待できる。
肉腫患者における免疫モニタリング

本研究は、治療対象になる希少がんである肉腫患者に対して前向きに採血を行い、免疫モニタリングを行うことである。肉腫に対する標準治療として一般的に行われている手術や抗がん剤治療レジメンが、免疫機能に与える影響を解析することを目的とし、新規治療標的やバイオマーカーの探索を進めてきた。具体的には、免疫機能が受ける影響に治療方法で差を認めることや、抗がん剤が免疫機能に与える影響に個体差があることを確認することで、新たな視点に基づく患者ごとに個別化した免疫療法の開発や、抗がん剤治療と免疫療法との併用療法の開発、また、肉腫における免疫系新規予後マーカーの開発にもつながることが期待している。昨年度の計画通り検体収集及び解析が行なわれている。また、論文作成も開始ししている。今後の推進方策としては、現在まで採取し、凍結保存している末梢血検体を用いて、免疫担当関連細胞の解析を行う。具体的には、T・B・NK細胞のフェノタイプ・活性化マーカー、各種免疫チェックポイント分子発現を多重染色法を用いたマルチカラー解析法のためのFlow cytometry(BD社LSR Fortes X-20)を用いて解析を行う。また、各症例の臨床情報との関連を解析し、上記のMDSCなどの免疫抑制細胞とT・B・NK細胞などの免疫関連担当発現との関連を解析し、治療効果や予後関連する免疫抑制細胞及び免疫担当関連細胞を進め、新規治療標的やバイオマーカー開発を行う。本年度は、検体の採取及び保存が研究の主体となったため、物品費などの使用が少なく未使用額が発生したと考えられた。次年度の使用計画としては消耗品などの物品費及び学会参加などの交通費を計上する予定です。
ナノ空間内でのビルドアップ型の合成反応による超効率的分子デバイスの作製

本研究では、機能性部位をπ共役鎖内により数多く導入することにより、外部刺激による応答性を向上させた分子デバイスの作製を目指し、本手法の鍵となる被覆型共役モノマーの合成及び種々の機能性分子との園頭共重合反応による被覆型機能性分子ワイヤの合成を行った。また、ナノ電極間での共重合反応による分子配線を試みた。既存法により合成した完全メチル化α-シクロデキストリン(PM α-CD)モノトシラートから5段階を経て、総収率42%で両端にアルキニル基を有する被覆型共役モノマーを合成した。次に、この被覆型共役モノマーと両端にハロゲン基を有する機能性分子であるポルフィリン、ジアリールエテンとの薗頭共重合反応を行うことにより、被覆型機能性分子ワイヤの合成を行った。得られた各分子ワイヤに対して分光及び電荷移動度測定を行ったところ、それぞれの機能性部位に由来する特性が確認された。次に、フォトクロミズムによりスイッチング機能を有する機能性分子を用いた分子デバイスの作製を試みた。20nmのギャップを持つ金電極をパラ位にエチニル基を有するジフェニルジセレニド溶液に浸漬させ、電極表面に重合反応部位を導入した。次に、得られた修飾電極を洗浄後、量論量の被覆型共役モノマーと機能性分子の入った溶液に浸漬させ、薗頭共重合反応を行った。反応終了後に得られた電極を313nmの紫外光照射下で電流値を測定したところ、電流値の増加が見られ、本手法による分子結線に成功した。以上、本研究では、共重合反応による分子配線法での結線を目指し、被覆型共役分子として2種類の連結型[3]ロタキサン及び、機能性分子としてポルフィリン誘導体、ジアリールエテン誘導体の合成に成功し、これらの分子を用いて、共重合反応による分子配線法による結線にも成功した。
咀嚼運動時の食感と下顎運動パターンに関する研究

テクスチャー用語で表現される食感の差,咬合感覚の違いが咀嚼時の下顎運動にどのような影響を与えるかを調べる目的で,硬性破砕性食品3種と軟性食品2種の被験食品をテクスチャー用語に従って分類し,健常者における咀嚼運動経路の違いを6自由度顎運動測定装置MMJI-E(松風社製)にて分析した.その結果,4種類の被験食品では切歯点の前頭面における咀嚼終末位から開口に至る経路が平衡側を通過し,中沢の第5相が認められたのに対し,テクスチャー用語で「さくさく」と表現されるりんごのみが,咀嚼終末位から作業側に鋭角的に開口し,中沢の第5相が認められなかった.また,各食品の咬合相における水平面経路と側方滑走経路とを比較すると,硬性食品では咀嚼経路が側方滑走経路の後方にあり,後外側から咬頭嵌合位付近に向かい閉口する経路が多かったのに対し,軟性食品では側方滑走経路と一致する経路が多く認められた.したがって「ばりばり」で表現される硬い食品の場合,下顎はより後方から食塊を捉え,力を加えて咬み込んでいく様相が推察された.以上より,テクスチャーの違いに伴う感覚入力の差が中枢へ伝達され,個々の食品の性状に応じた最適な咀嚼運動が営まれることが示唆された.また,下顎遊離端義歯装着者の下顎位を分析するために,その咬合採得の再現性について擬似粘膜を付与した口腔モデル上で,印象法,咬合採得材を変え,咬合床を用いて咬合採得を行い上下作業用模型の位置関係を三次元計測器にて解析したところ,上下作業用模型間で垂直的な顎間距離の増加が認められ,さらに加圧印象法では下顎が後方へ変位する傾向が認められた.しかし咬合採得材にアルワックスを使用した場合には後方への変位量は小さかった.したがって,遊離端欠損の下顎位の決定には適正な咬合採得材を使用して,可及的に変位を抑えて咬合採得する必要性が示唆された.テクスチャー用語で表現される食感の差,咬合感覚の違いが咀嚼時の下顎運動にどのような影響を与えるかを調べる目的で,硬性破砕性食品3種と軟性食品2種の被験食品をテクスチャー用語に従って分類し,健常者における咀嚼運動経路の違いを6自由度顎運動測定装置MMJI-E(松風社製)にて分析した.その結果,4種類の被験食品では切歯点の前頭面における咀嚼終末位から開口に至る経路が平衡側を通過し,中沢の第5相が認められたのに対し,テクスチャー用語で「さくさく」と表現されるりんごのみが,咀嚼終末位から作業側に鋭角的に開口し,中沢の第5相が認められなかった.また,各食品の咬合相における水平面経路と側方滑走経路とを比較すると,硬性食品では咀嚼経路が側方滑走経路の後方にあり,後外側から咬頭嵌合位付近に向かい閉口する経路が多かったのに対し,軟性食品では側方滑走経路と一致する経路が多く認められた.したがって「ばりばり」で表現される硬い食品の場合,下顎はより後方から食塊を捉え,力を加えて咬み込んでいく様相が推察された.以上より,テクスチャーの違いに伴う感覚入力の差が中枢へ伝達され,個々の食品の性状に応じた最適な咀嚼運動が営まれることが示唆された.また,下顎遊離端義歯装着者の下顎位を分析するために,その咬合採得の再現性について擬似粘膜を付与した口腔モデル上で,印象法,咬合採得材を変え,咬合床を用いて咬合採得を行い上下作業用模型の位置関係を三次元計測器にて解析したところ,上下作業用模型間で垂直的な顎間距離の増加が認められ,さらに加圧印象法では下顎が後方へ変位する傾向が認められた.しかし咬合採得材にアルワックスを使用した場合には後方への変位量は小さかった.したがって,遊離端欠損の下顎位の決定には適正な咬合採得材を使用して,可及的に変位を抑えて咬合採得する必要性が示唆された.日本人は欧米人に比べ食べ物の素材を生かした料理を好み,歯ざわり,噛みごたえを重視した独自の食文化,食習慣を形成してきた.ぱりぱり,さくさく等の擬音語,擬態語は食感を表す日本語独特の表現といえ,食物の物性を示すテクスチャーの指標となる.咀嚼は歯,咀嚼筋・顎関節等の末梢からの情報を受け,口腔内の食物の性状,食塊の変化に応じて最適な運動を営むことが知られている.しかし,テクスチャー用語で表現される微妙な食感の差,咬合感覚の違いが咀嚼時の下顎運動にどのような影響を与えるかは未だ不明である.本研究では,咀嚼運動時の咬合感覚と下顎の動態について,被験食品をテクスチャー用語に従って分類し,咀嚼運動経路の違いを分析した.被験者は健常有歯顎者3名で,被験食品には硬性・破砕性食品のアーモンド,堅焼き煎餅,薄焼き煎餅と軟性食品のりんご,ガムを選択した.下顎運動は6自由度顎運動測定装置MMJI-E(松風社製)にて測定し,分析は各咀嚼ストロークにおける下顎切歯点,左右顆頭点の経路を検討した.

その結果,各食品の咀嚼経路の特徴が咬合相の水平面経路に表れることが判明し,従来のマクロ的なストローク全体の前頭面経路の比較とは異なる分析が可能となった.咬合相での切歯点の水平面咀嚼経路と側方滑走経路とを比較すると,硬性食品では咀嚼経路が側方滑走経路の後方にあり,後外側から咬頭嵌合位付近に向かい閉口する経路が多かったのに対し,軟性食品では側方滑走経路と致する経路が多く認められた.また,咬合相における顆頭点の水平面咀嚼経路については,硬性食品で作業側顆頭が咀嚼経路の後方にて最外側から内側に大きく移動し,咀嚼終末位に至る特徴的な運動が認められ,作業側顆頭の水平移動距離は硬性・軟性食品間で有意な差が生じた.以上より、テクスチャーの違いに伴う感覚入力の差が中枢へ伝達され,個々の食品の性状に応じた最適な咀嚼運動が営まれることが示唆された.テクスチャー用語で表現される食感の差,咬合感覚の違いが咀噛時の下顎運動にどのような影響を与えるかを調べる目的で,硬性破砕性食品3種と軟性食品2種の被験食品をテクスチャー用語に従って分類し,健常者における咀嚼運動経路の違いを6自由度顎運動測定装置MMJI-E(松風社製)にて分析した.その結果,4種類の被験食品では切歯点の前頭面における咀嚼終末位から開口に至る経路が平衡側を通過し,中沢の第5相が認められたのに対し,テクスチャー用語で「さくさく」と表現されるりんごのみが,咀嚼終末位から作業側に鋭角的に開口し,中沢の第5相が認められなかった.また,各食品の咬合相における水平面経路と側方滑走経路とを比較すると,硬性食品では咀嚼経路が側方滑走経路の後方にあり,後外側から咬頭嵌合位付近に向かい閉口する経路が多かったのに対し,軟性食品では側方滑走経路と一致する経路が多く認められた.したがって「ばりばり」で表現される硬い食品の場合,下顎はより後方から食塊を捉え,力を加えて咬み込んでいく様相が推察された.以上より,テクスチャーの違いに伴う感覚入力の差が中枢へ伝達され,個々の食品の性状に応じた最適な咀嚼運動が営まれることが示唆された.また,下顎遊離端義歯装着者の下顎位を分析するために,その咬合採得の再現性について擬似粘膜を付与した口腔モデル上で,印象法,咬合採得材を変え,咬合床を用いて咬合採得を行い上下作業用模型の位置関係を三次元計測器にて解析したところ,上下作業用模型間で垂直的な顎間距離の増加が認められ,さらに加圧印象法では下顎が後方へ変位する傾向が認められた.しかし咬合採得材にアルワックスを使用した場合には後方への変位量は小さかった.したがって,遊離端欠損の下顎位の決定には適正な咬合採得材を使用して,可及的に変位を抑えて咬合採得する必要性が示唆された.
心血管マルチバイオマーカーによる過重労働者の心血管リスク進展機序解明に関する研究

長時間労働により変動する心血管バイオマーカーを検索することを目的に、月間80時間以上の時間外労働(以下、長時間労働)者を対象とし、一般生化学検査に加え、アディポネクチン・マトリックスメタロペプチダーゼ-9・小粒子低密度リポ蛋白SD-LDL)・マロンジルデヒド修飾LDL(MDALDL)・ホモシステイン・高感度- CRP等を測定した。さらに、同一人で月間時間外労働が80時間未満の際に再度同様な項目の測定を行い月間時間外労働80時間以上のデータと比較検討した。本研究において、長時間労働者の77.4%でMDA-LDLが基準値を超え、月間時間外労働80時間以上では80時間未満時に比しMDA-LDL/LDLは有意な高値を示した。MDA-LDL/LDLが長時間労働後に高値を示したことは長時間労働により動脈硬化巣形成が促進された可能性が示唆された。近年、過重労働による壮年期の心血管系疾病有病率の増加は大きな社会問題となっている。しかしながら、過重労働に起因する心血管疾患発生の病態生理学的機序の詳細は未だ十分解明されているとは言えない。一方、種々の心血管系バイオマーカー測定が可能となり、それらが動脈硬化進展や粥腫破綻等の病態解明のよい指標となりうることが判明した。そこで、今回の研究では、10項目以上に及ぶ心血管系マルチバイオマーカーを測定して、過重労働が心血管系リスク進展に及ぼす病態生化学的機序を解明することにより過重労働によって惹起される心血管疾患の予防戦略・リスク層別化・治療戦略の新たな展開を創生するための基盤を確立することが目的である。本年度では、過重労働者の中から25名以上の協力者を確保して、過重労働者の産業医診察を従来の如く過重労働認定月に実施し、過重労働者からwritten informed consentを得て上で、患者基本属性である年齢・性別・身長・体重・BMI・血圧等を測定し心電図牽記録し、さらに健康アンケート・メンタルヘルスチェック・採血を実施してデータベースの構築を図った。採血資料に関しては、血清あるいは血漿に分離し-80°Cにて凍結保存し測定に備え可及的速やかに測定すると共に連結可能匿名化資料として一部凍結保存を継続している。一般生化学検査はこれまでどおりの契約業者にて実施し、MMP・small-dense LDL・MDA・LDL・IL-6・ホモシステイン・アディポネクチン等の特殊検査項目についてはSRL等に依頼し測定精度の確保に努め、順次測定を実施している。この中に基準値を超す症例の多い項目が見いだされ、心血管疾患発生の病態生理学的機序解明に繋がることが期待されるので次年度はさらに症例を追加して研究継続予定である。長時間労働により変動する心血管バイオマーカーを検索することを目的として、月間80時間以上の時間外労働(以下、長時間労働)者を対象とし、一般生化学検査とCBCに加え、アディポネクチン(ADI)・Matrix metallopeptidase (MMP)-9・Small-dense low density lipoproteincholesterol (SD-LDL)・MalondialdehydeModified (MDA)-LDL・ホモシステイン(HOM)・高感度- CRPを測定した。さらに、同一人で月間時間外労働が80時間未満の際に再度同様な項目の測定を行い月間時間外労働80時間以上のデータと比較検討を進めている。月間80時間以上の時間外労働後の検査でバイオマーカの基準範囲を逸脱した人数の割合は、Malondialdehyde Modified (MDA)-LDLが70%を超えていたが、今回検討した他のバイオマーカは20%を下回っていた。月間時間外労働80時間以上と80時間未満での同一例2回の比較検討では、MDA-LDLおよびMDA-LDLとLDLとの比(MDALDL/LDL)は月間時間外労働80時間未満で各々低い傾向と有意な低値を示したが他の項目では有意差を認めていない。MMP-9、SD-LDL、HOMは冠動脈疾患発症リスクを増加すること、高感度-CRPおよびADIは古典的危険因子とは独立した予後予測因子であること等が報告されている。MDA-LDLは、糖尿病や透析患者で高値を示し、冠動脈硬化症の二次発症等の予測にも有用であること、また、頚動脈内膜中膜複合体肥厚度が高値のとき、MDA-LDLが高い傾向が報告されている。

長時間労働者の7割以上でMDA-LDLが基準値を超え、月間時間外労働80時間以上では80時間未満時に比しMDA-LDL/LDLは高値を示した。長時間労働により変動する心血管バイオマーカーを検索することを目的として、月間80時間以上の時間外労働(以下、長時間労働)者31例(男性29例、平均年齢32.2±5.9歳)を対象とし、一般生化学検査とCBCに加え、アディポネクチン・Matrix metallopeptidase・SD-LDL・Malondialdehyde Modified (MDA)-LDL・ホモシステイン(HOM)・高感度- CRPを測定した。さらに、同一人で月間時間外労働が80時間未満の際に再度同様な項目の測定を行い月間時間外労働80時間以上のデータと比較検討した(n=19)。1例において月間80時間以上の時間外労働後の検査で基準範囲を逸脱した人数(%)は、ADI:3人(9.7%)、MMP-9:4人(12.9%)、SD- LDL:4人(12.9%)、MDA-LDL:24人(77.4%)、HOM:3人(9.7%)、高感度-CRP:3人(9.7%)、総コレステロール:3人(9.7%)、LDL:6人(19.4%)、HDL:3人(9.7%)、HbA1c:0人(0%)、TG:11人(35.5%)、WBC:2人(6.5%)であった。また、これらの項目について、月間時間外労働80時間以上と80時間未満での同一例2回の比較検討では、MDA-LDLおよびMDA-LDLとLDLとの比(MDALDL/LDL)は月間時間外労働80時間未満で各々低い傾向(123.3±50.0 vs 109.1±51.9 U/L, p=0.077)と有意な低値(1.04±041 vs 0.88±0.37, p=0.021)を示したが他の項目では有意差を認めなかった。MDA-LDL/LDLが長時間労働後に高値を示したことは長時間労働により動脈硬化巣形成が促進された可能性が示唆された。研究協力を頂いている企業の過重労働減少に対する積極的な取り組みと、景気の低迷もあって、過重労働者数が予想を下回っているため、研究参加基準を満たす症例も減少していることから対象者数が当初の期待には達していないこと。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、さらに研究対象者数を増加させ、MCP-1等のバイオマーカ解析を加えて研究を進めていく計画である。
マウス胃初代培養系を用いたびまん性胃癌発癌モデル

胃癌における遺伝子変異プロファイルは明らかになってきたものの、その変異遺伝子の癌における役割はまだ解明が不十分であり、治療標的として有用な遺伝子の速やかな同定が望まれている。そこで、癌関連遺伝子の機能解析のために、マウスの正常な胃細胞を生体外で培養することに成功した(オルガノイド培養)。さらに作成したオルガノイドにおいて、遺伝子の発現制御を行うことで、正常な胃をもとにした発癌モデルを確立することができた。癌細胞では遺伝子変異が多数認められるが、その中には癌化を促進するドライバー変異と、癌化したことによって受動的に生じたパッセンジャー変異に分けられる。近年は次世代シークエンサーを用いた網羅的ゲノム解析により、癌の遺伝子変異プロファイルが明らかになってきているが、癌化や治療法の検討のためには、ドライバー変異かパッセンジャー変異かを見分けることが重要である。本研究は、遺伝子変異の機能を解析するため、マウス胃より採取した正常上皮細胞を培養したオルガノイドを作成した。これに対し、レンチウイルスベクターを用いたshRNAによるノックダウン・cDNAの強制発現を行い、オルガノイドの発現調節を行うことで、遺伝子変異の機能を解析するモデルとしている。実際に、複数のベクターの組み合わせも試み、real-time PCR、免疫組織化学によって発現変化を確認できた。さらに、作成したオルガノイドをヌードマウスの皮下に移植することで、腫瘍形成能の有無を検討している。特に、びまん性胃癌に特異的に認められるRHOA遺伝子の変異、融合遺伝子の機能解析を中心に行っており、現時点ではオルガノイドがヌードマウスの皮下に生着することは確認されたが、腫瘍(癌)としての形成には至っていない。発現調節を行う目的としている遺伝子の組み合わせにおいて、明らかな腫瘍形成能を持つものが認められなかったため、形成された腫瘍における発がんメカニズムの解明には至っていない。さらに、作成したオルガノイドをヌードマウスの皮下に移植することで、腫瘍形成能の有無を検討した。特に、びまん性胃癌に特異的に認められるRHOA遺伝子、CDH1遺伝子の変異や、融合遺伝子の機能解析を中心に行い、移植したオルガノイドがヌードマウスの皮下に生着することが確認された。また、その組織学的評価から、びまん性胃癌に特徴的な印環細胞様の細胞が出現しうることが確認でき、発癌モデルとして有用であると考えられた。腫瘍形成に必要な因子を探索すべく、液性因子の添加、間質細胞との共培養、他の遺伝子発現操作などを追加実験している。また、目的とする遺伝子の機能評価としては、腫瘍形成能だけでなく、in vitroでの網羅的な発現変化も検討していく。胃癌研究計画としては本年度中に、形成された腫瘍における発癌メカニズムの解明(発現解析、リン酸化解析等)まで行う予定であったが、腫瘍形成に至らず、腫瘍形成実験を繰り返したことにより、金額に差異が生じた。今後も腫瘍形成に必要な因子の探索および、発癌メカニズムの解析を進める計画である。