hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エピゲノム情報を用いた拡張型心筋症と拡張相肥大型心筋症の鑑別法に関する研究

相肥大型心筋症(dHCM)は、類似した重症心不全の症状を示すが、突然死のリスクなどが異なり、治療方針の決定のためには両者の鑑別診断が不可欠である。本研究では、「DCMとdHCMを生体分子量により明確に区分し、確定診断に利用可能な新規バイオマーカーを確立すること」を目的として、左心室組織のエピゲノム解析(DNAメチル化)より見出したDCM/dHCM鑑別診断用のマーカー候補遺伝子について、個々のメチル化サイト(CpGサイト)のメチル化率を高精度・高感度に定量し、判別法を作成した。最終年度は、DCM/dHCMの比較で有意差のあった18個のCpGサイトについて、前年度未作成分を含めてパイロシークエンス法用のプライマーの設計を完了した。電気泳動による確認の結果、一部のプライマーでは標的配列の増幅が見られなかったため、充分な増幅が確認された標的のみを測定することとした。また、これらのCpGサイトの近傍に位置し、エピゲノム制御により発現が調節されている可能性の高い遺伝子のmRNAを定量するため、デジタルPCR用のプライマーを作成した。DCMおよびdHCMの患者の移植摘出心もしくは剖検心より抽出したDNA、RNA試料を用いて標的CpGサイトのメチル化率ならびに標的遺伝子のmRNA量の測定を実施した。一部のmRNAでは心筋組織での発現量が低値であったため、比較的発現量の多い標的mRNAのみを使用することとした。これらのデータを用いてDCMとdHCMが区別可能であるかをROC解析により評価した。その結果、CpGサイトのメチル化率の差DCM/dHCMでの差は想定異常に小さく、単独での区分は困難であることが明らかになった。そこで、複数のCpGサイトとmRNA発現情報より判別分析を行うことで、DCM/dHCMの区分が可能になると考えられた。次年度は、引き続きDCM/dHCMの判別法についての検証実験を行うとともに、関連遺伝子の生理的意義の解明を推進する。各標的CpGサイトについて実試料での測定を推進し、CpGサイトのメチル化率データから、比較検定、判別分析などの統計解析を実施し、DCM/dHCMの区分が可能なCpGサイトの組み合わせを選出する。最適な統計解析法を適用し、DCM/dHCMの判定式を作成する。さらに、別の検証用試料からDNAを抽出し、メチル化率の測定結果からDCMとdHCMを予測し、実際の病理診断との比較を行う。さらに、CpGサイトの組み合わせを検討し、より正答率の高い予測方法を見出す。また、同一検体のtotal RNAから合成したcDNAをテンプレートとして、デジタルPCRでマーカー候補遺伝子の発現解析を行う。DCM/dHCMで比較し、可能であれば上記の判別式に利用する。ラット心筋培養細胞を用いて、マーカー候補遺伝子の発現細胞を確認する。MC、CFのいずれかで充分な発現量が確認された遺伝子については、抗体を用いたキャピラリ電気泳動イムノアッセイ、ELISA、ラジオイムノアッセイなどによるタンパク質の検出法や、多重反応モニタリングよる質量分析計を用いた検出法を検討する。MC、CFに細胞障害性の刺激を与えた場合のマーカー候補遺伝子・タンパク質の発現量を測定し、これらの遺伝子の発現変動を誘発する刺激を探索する。さらに、薬剤等によりマーカー候補遺伝子やその関連パスウェイを活性化・不活性化し、重症心不全で典型的に増加・減少するタンパク質・遺伝子の発現変動を調べ、心不全との関連を評価する。
ダイズにおける新規な転移因子の挿入を介した突然変異体集団の作出

ダイズにおける新規なレトロトランスポゾンSORE-1の挿入による突然変異体集団を作出することを念頭におき、その転写ならびに転移の制御に関する解析を行った。SORE-1のゲノム中での分布の全体像、転写制御が末端の反復配列内に存在するプロモーターにより行われること、ならびに、環境条件や発生の段階によるSORE-1の転写制御を明らかにした。また、近年のダイズの品種分化の過程で実際にSORE-1が転移し、単一の系統に由来するダイズ集団中に遺伝子破壊の有無に関する多型が生じたことを見出した。研究代表者と研究分担者らが最近発見したダイズにおける新規なトランスポソンを用いて、遺伝子の機能解析、ならびに、育種素材の開発を行うことを目的として研究を行った。研究代表者と研究分担者は、日長に対して不感受性になるダイズ変異系統の解析から、ダイズにおける新規なTy1/copia様レトロトランスポゾンを見出し、これをSORE-1と名づけている。SORE-1が実際にダイズの進化の過程でフィトクロームA遺伝子を破壊している事実に基づき、SORE-1を突然変異原として使うことを想走して研究を進めた。SORE-1を突然変異原として用いる場合、ゲノム中に多数存在するSORE-1のコピーの中で、高い転移活性を保持するものを同定することは重要であるため、本年度は、最近転移したと考えられるSORE-1のコピーの同定を試みた。この目的から、第一に、ダイズ品種Williams 82に関するゲノムデータベースを解析することにより、この品種のゲノム中における完全なSORB-1のコピーが存在する位置をすべて同定した。続いて、トランスポゾンディスプレイ法を用いた系統間での比較により、最近、転移を起こしたと考えられるSORE-1コピーを同定した。その挿入部位を解析することにより、遺伝子領域に挿入したSORE-1のコピーを同定した。それらは、Williams 82において同定した挿入位置とは異なった場所に存在しており、転移が最近起きたことが裏付けられた。ダイズにおける新規なレトロトランスポゾンSORE-1の転移を制御し、その挿入による遺伝子の不活性化を誘導することを目的とし、以下の実験を行った。第一に、SORE-1の転移がおきやすい環境条件を明らかにするための実験を行った。レトロトランスポゾンの転移頻度が、環境要因によって影響を受ける例が多数知られている。また、一般にレトロトランスポゾンの転移活性は、レトロトランスポゾンの持つORFのmRNA量と関連性があることが知られている。そのため、SORE-1の転移頻度を増加させることを念頭に置き、SORE-1のORF mRNA量が多くなる環境条件を特定することを目指した。レトロトランスポゾンの転写制御はlong terminal repeat (LTR)配列がプロモーターとして機能することにより行われている。そのため、SORE-1のLTR配列をGUSレポーター遺伝子に連結したDNA配列を作成し、これをシロイヌナズナに導入した。通常の人工気象室内での栽培においては、形質転換体の葉においては高いGUS活性は検出されず、SORE-1の転写活性化は起きていないものと考えられた。今後は環境条件を変え、GUS活性に与える影響を調べる予定である。第二に、ダイズのさまざまな組織よりRNAを抽出し、SORE-1の転写量を解析した。その結果、子葉において胚軸よりも高い転写量が検出された。また、遮光条件で植物体を栽培した際にSORE-1の転写量が増加した。SORE-1のLTR領域の塩基配列をデータベースと比較することで、転写制御に関与すると推定されるシス因子の有無を調べたところ、胚発生の後期における転写および暗所で育成した植物における転写に関与するシス因子と推定される配列が、LTR中に存在することが明らかになり、転写量に関する解析結果が転写制御配列の存在から裏付けられた。ダイズは食料や飼料ならびに工業原料としての重要性を持ち、近年、そのゲノムDNAやcDNAに関する多量の塩基配列情報が公開されている。しかしながら、遺伝子の機能解析の手段が十分に整備されておらず、その開発がダイズの育種研究を進める上での重要性を持つ。本研究では、最近、申請者らが発見したダイズの新規なレトロトランスポゾンSORE-1の挿入による突然変異体集団を作出する観点から、SORE-1の転写段階における発現制御機構、ならびに、実際の転移状況を解明することを目的として研究を行った。SORE-1の転移頻度を増加させることを念頭に置き、SORE-1のORF mRNA量が多くなる環境条件を特定することを目指した。SORE-1のmRNA量をダイズの異なる組織で定量したところ、子葉および胚軸よりも葉において高かった。また、遮光して育成した植物体の葉では、光照射下で育成した植物体の葉よりも高かった。RACE法により、5箇所の転写開始点および1箇所の転写終結点が同定された。同定された転写開始点のうち2箇所はlong terminal repeat (LTR)配列内に存在した。

このことから、SORE-1の転写制御は、LTR配列がプロモーターとして機能することにより行われているものと推察された。SORE-1のLTR配列をGUSレポーター遺伝子に連結したDNA配列を導入したシロイヌナズナ植物体を用いて、レポーター活性を指標にSORE-1の転写制御を解析した。その結果、SORE-1の転写が生殖の過程で活性化されていることが示唆された。また、栽培品種を対象として、トランスポゾンディスプレイ法による解析を行った結果、近年の品種分化の過程でSORE-1が転移したことが明らかになった。当初の予定どおり、SORE-1のLTR配列とGUS遺伝子を連結した遺伝子コンストラクトを導入したシロイヌナズナ系統を複数得ることができた。これらを実験材料として、今後の解析を進めることが可能になったため、進捗状況は順調であると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。作成した形質転換シロイヌナズナをさまざまな環境条件で育成し、GUS活性の変化を調べる予定である。また、SORE-1の転写および複製の様式を明らかにする目的から、転写開始点および転写終結点を同定する予定である。
勒帯損傷診断ロボットのコンプライアンス制御に対するファジィ理論の応用

この研究は、勒帯損傷診断ロボティクスを応用する研究の一環をなすものであり、今年度は、ロボットのコンプライアンス制御システムの構築と、それに対するファジィ理論の応用を目指した。ロボットア-ムの運動が被験者の体形に一致した運動方向を正確に辿るために、医師の触診の際に行なわれる手探りの状態が、必要となる。そこで、ロボットア-ムに伝わる荷重を逐次センシングして、それをフィ-ドバックして、運動方向を修正するプログラムの開発を行った。はじめに、既設の多関節マイクロロボットに、本予算で購入した制御用コンピュ-タを接続し、動作試験を行った。多関節ロボットの末端効果器で、実験動物の下腿部を把持し、それをあらかじめ設定した方向に運動させた。その際に生じる、いろいろな方向への荷重の大きさを、既設の6軸力センサ-によって検出した。その荷重の値を、コンピュ-タにフィ-ドバックすることにより、最初に設定した運動の修正を行ない、最適な運動を実現するためのコンプライアンス制御プログラムを作成した。次に、屍体より採取した膝関節を実験台に固定し、臨床的に行われていると同じ方法で、動揺性試験を行った。それによって、コンプライアンス制御のプログラムを点検した。さらに、コンピュ-タによる膝関節モデルの運動機構の数値シミュレ-ションを行い、屍体膝関節の実験より得られた数値を下に、コンプライアンス制御に対するファジィ理論の応用の具体的な作業を行った。また、正常膝関節に対して、ファジィ理論を応用したコンプライアンス制御のもとで、ロボットア-ムによる勒帯損傷診断試験を行い、動作の精度、誤った制御指令に対する対応について検討した。最後に、外傷による勒帯損傷を疑われる患者について臨床実験を行ない、結果の評価を行った。
膜結合型増殖因子の分子機構:リンパ浮腫治療戦略の創成

組織再生に関与する増殖因子のうち、血管・リンパ管新生に関わる増殖因子の作用を検討した。リンパ管内皮細胞の膜表面では、特異的蛋白質のshedddingが誘導され、内皮細胞の遊走が促進された。本研究課題は、リンパ管新生に関わる分子機構の一つを解明した。この結果、今後リンパ浮腫治療の基盤を創出する可能性がある。本研究では、膜結合型増殖因子である表皮増殖因子(EGF)ファミリーのうち、Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF)がリンパ管新生を誘導し、リンパ浮腫改善につながることを見出し、本因子による新たなリンパ浮腫の治療戦略を創生することを最終目的としている。この実験系の確立のために、当該年度では本実験系において創傷治癒の亢進、血管・リンパ管新生の亢進が期待される実験個体として、表皮特異的HB-EGF誘導発現マウス(K5 Dox HB-EGF TG)の作製を行った。表皮特異的HB-EGF誘導発現トランスジェニック・マウスの作製に当たっては、通常の交配では胎生期の着床に問題があり系統維持ができなかったため、遺伝子発現誘導システムを用いて作製した。まず、pTRF-Tight vector (Clontech, Inducible Gene Expression System)を用いて、テトラサイクリン・レスポンシブ・エレメント下にHB-EGF cDNAをコードするベクターを構成し、これによりトランスジェニック・マウス(TRE-HB-EGF TG)を作製した。また、Tet-On Advanced vector (Clontech)をベースに、CNVプロモーターを表皮特異的ケラチン5(K5)プロモーターに置換したベクターを構成し、これにより表皮特異的に遺伝子を発現させるトランスジェニック・マウス(K5-rtTA TG)を作製した。これらのトランスジェニック・マウスTRE-HB-EGF TGとK5-rtTA TGを交配することによって得たダブルトランスジェニック・マウスが、表皮特異的HB-EGF誘導発発現マウス(K5 Dox HB-EGF TG)である。なお、遺伝子誘導にはドキシサイクリン(Dox)を用いた。現在、作製したダブルトランスジェニック・マウスK5 Dox HB-EGF TGに対してDoxを投与し、HB-EGFの発現とDoxの至適濃度を確認中である。この実験系の確立のために、創傷治癒の亢進、血管・リンパ管新生の亢進が期待される実験個体として、表皮特異的HB-EGF誘導発現マウス(K5 Dox HB-EGF TG)の作製を行った。表皮特異的HB-EGF誘導発現トランスジェニック・マウスの作製に当たっては、通常の交配では胎生期の着床に問題があり系統維持ができなかった。このため、遺伝子発現誘導システムを用いてK5 Dox HB-EGF TGを作製した。本マウス作製にあたっては、以下二つのマウスが必要である。一つは、tetracycline responsiveelement (TRE)プロモーター下にHB-EGFを発現するトランスジェニックマウス(TRE-HB-EGF TG)、もう一つは表皮特異的ケラチン5(K5)プロモーター下にrtTAを発現するトランスジェニック・マウス(K5-rtTA TG)である。両マウスを交配し、TRE-HB-EGF TG;K5-rtTA TGを作製した。このダブルトランスジェニック・マウスが、表皮特異的HB-EGF誘導発発現マウス(K5 Dox HB-EGF TG)である。遺伝子誘導にはドキシサイクリン(Dox)を用いた。A)背部皮膚全層創傷マウス背部の毛を除去し、パンチバイオプシーで創傷を作成した。実験は、マウスはK5 Dox HB-EGF TG及び対照群用いて行った。創傷面を経時的に観察し、創傷面積の測定、肉芽形成の測定を行った。B)尾部皮膚創傷<リンパ浮腫モデルの作製>マウス尾部の皮膚を、全周性に真皮レベルにて幅2mmにわたり切除した。尾動脈と筋及び骨組織は健常なまま残し、皮膚欠損部にI型コラーゲンとシリコンを注入した。この結果、末梢部にはリンパ浮腫が誘導された。K5 Dox HB-EGF TG及び対照群を用いて、経時的にデジタル画像で保存しリンパ浮腫のgradeを測定した。今後データを解析して、二群間に存在する可能性のある差異を検討して行く予定である。当該マウスから得られた知見を基礎として、組織再生に関与する増殖因子のうち、血管・リンパ管新生に関わる増殖因子の作用を検討した。リンパ管内皮細胞の膜表面では、特異的蛋白質のshedddingが誘導され、内皮細胞の遊走が促進されるという知見を得た。これらにより、本研究課題ではリンパ管新生に関わる分子機構の一つが解明されたと考える。

この結果、今後リンパ浮腫治療の基盤が創出される可能性があると思われる。当該マウスTRE-HB-EGF TG;K5-rtTA TGを作製し、現在創傷治癒実験に着手している。従って、実験計画としては、おおむね順調に進んでいると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、当該マウスTRE-HB-EGF TG;K5-rtTA TGの創傷治癒過程が、対照群と比較して差異のあるものなのか詳細に比較検討して行く。この過程により、HB-EGFが創傷治癒及びリンパ管新生に及ぼす効果を見極めることが可能になる。
脳血流動態を効果指標とした温度を活用した看護援助の開発

脳血管障害や認知症の患者の寝たきりや傾眠、昼夜逆転を予防、改善できる看護技術の開発を目指し、脳活動の指標である脳血流量を用いた実験的研究に取り組んでいる。本研究では、日常に存在する温かい温度を用いた脳の活動を促す看護援助の開発を目指し、足部への温熱刺激(以下、足浴)が脳の活動に及ぼす効果を脳血流動態を用いて明らかにすることを目的とする。足浴とは足先から足首あるいは下腿までを温湯に浸して洗う一連の行為を助けたり、代わって洗ったりする看護援助である。足浴は清潔の保持目的以外にも、精神的安寧や入眠促進、疼痛緩和などにも用いられる看護援助である。2018年度は本研究に関する研究安全倫理委員会の承認を得て、研究対象者を募り、実験を実施した。研究対象者に足浴を実施し、その足浴による刺激が脳血流動態に及ぼす影響を調査した。本研究の検証には時間分解能に優れた近赤外分光法(Near-Infrared spectroscopy以下、NIRS)と空間分解能に優れた核磁気共鳴画像法(MRI:magneticresonance immaging)のほかに、心拍数や皮膚表面温度、さらには主観的な感覚を確認するためのアンケート用紙を用いた。研究対象者22名を対象に、温度が異なる足浴を10分間実施し、NIRSを用いて足浴中の脳血流動態の変化を観察するとともに、MRIを同期させて脳の領域ごとの変化を観察した。それと同時に、心拍数と皮膚表面温度の計測、主観的な感覚を調査し、足浴の安全性ならびに快適性についても検証した。現在は実験結果を分析しながら、追加実験の必要性を検討しつつ、看護援助や脳活動に関する学会への論文投稿ならびに学会発表の準備を進めている。当初予定していた実験は終了し、現在分析を進めながら追実験の必要性の検討や論文投稿の準備を進めており、当初の予定通りに進展している。本研究で得られた結果を広く公表するため、関連学会での学会発表ならびに論文を投稿する。本研究では、日常に存在する温かい、冷たい温度(42°C16°C)を用いた脳の活動を促す看護援助の開発を目指し、温度刺激そのものと温度によって生じる快、不快の感覚が健康成人の脳の活動に及ぼす影響を脳血流動態の変化から明らかにすることを目的とする。本研究の検証には時間分解能に優れた近赤外分光法(Near-Infrared spectroscopy以下、NIRS)と空間分解能に優れた核磁気共鳴画像法(MRI:magnetic resonance imaging)、自律神経活動指標を測定できる心拍変動計を用いる予定である。平成28年度は研究に関する文献検討や脳の活動に関連する学会等に参加し、脳活動の評価指標や自律神経活動指標に関する知識やその分析方法について情報収集を実施し、研究計画、実験プロトコールの再検討ならびに細かな修正を行った。また、本研究の脳活動の効果指標である脳血流量を正確に測定するために必要な実験機器(主にNIRS)の設置およびその整備、機器使用に関する知識の習得や技術の鍛錬を実施した。現在は、本研究を実施するための研究安全倫理審査に向けた準備を実施している段階である。今後は研究安全倫理審査に承認され次第、研究に協力していただける研究対象者を募集し、実験介入ならびにデータ収集を実施していく予定である。交付当初よりスケジュールに沿って文献検討や関連学会に参加し、研究計画通りに進めていたが、本研究で脳活動の評価指標として扱う脳血流データを取得する実験機器(NIRS機器)の設置に時間を要した。また、その整備ならびに使用に関する知識の習得やその技術の鍛錬に時間を要した。そのため、研究の進捗状況に少々遅れが生じたが、正確なデータを採取するためには、この期間は重要であったと考える。今後研究安全倫理審査の承認を得て、研究に取り組んで行く。本研究では、日常に存在する温かい温度を用いた脳の活動を促す看護援助の開発を目指し、足部への温熱刺激が脳の活動に及ぼす効果を脳血流動態を用いて明らかにすることを目的とする。平成29年度は研究に関する海外文献の検討や温熱刺激に関する日本や海外の概念や位置づけなど研究計画内容を精査するための情報収集を実施した。それとともに、脳の活動に関連する学会などに参加し、脳活動の評価指標や自律神経活動指標に関する知識や分析方法についても情報収集を実施した。その後、プレテストを実施し、研究計画内容や実験プロトコールの再検討を行い、軽微な修正を行った。現在は本研究を実施する上で必要な研究安全倫理審査に向けた準備や被験者の募集など、研究を遂行していくための準備を整えている。系統的に計画された方法を実施するために必要な日本や海外での温熱刺激の概念や位置づけを再確認するための文献検討に時間を要した。それに伴い、研究計画書や研究安全倫理審査に向けた準備の見直しを行ったため、当初の予定より遅れてしまった。

本研究では、日常に存在する温かい温度を用いた脳の活動を促す看護援助の開発を目指し、足部への温熱刺激(以下、足浴)が脳の活動に及ぼす効果を脳血流動態を用いて明らかにすることを目的とする。足浴とは足先から足首あるいは下腿までを温湯に浸して洗う一連の行為を助けたり、代わって洗ったりする看護援助である。足浴は清潔の保持目的以外にも、精神的安寧や入眠促進、疼痛緩和などにも用いられる看護援助である。2018年度は本研究に関する研究安全倫理委員会の承認を得て、研究対象者を募り、実験を実施した。研究対象者に足浴を実施し、その足浴による刺激が脳血流動態に及ぼす影響を調査した。本研究の検証には時間分解能に優れた近赤外分光法(Near-Infrared spectroscopy以下、NIRS)と空間分解能に優れた核磁気共鳴画像法(MRI:magneticresonance immaging)のほかに、心拍数や皮膚表面温度、さらには主観的な感覚を確認するためのアンケート用紙を用いた。研究対象者22名を対象に、温度が異なる足浴を10分間実施し、NIRSを用いて足浴中の脳血流動態の変化を観察するとともに、MRIを同期させて脳の領域ごとの変化を観察した。それと同時に、心拍数と皮膚表面温度の計測、主観的な感覚を調査し、足浴の安全性ならびに快適性についても検証した。現在は実験結果を分析しながら、追加実験の必要性を検討しつつ、看護援助や脳活動に関する学会への論文投稿ならびに学会発表の準備を進めている。当初予定していた実験は終了し、現在分析を進めながら追実験の必要性の検討や論文投稿の準備を進めており、当初の予定通りに進展している。今後は、研究参加者を募集し、データを収集し、分析を実施する。データ収集(平成29年6月平成30年3月):前年度修正した研究計画に則り、研究協力の同意を得られた研究対象者に実験を実施する。実験は研究安全倫理審査の承認を得たのちに実施する。実験期間は、温度感覚は四季の気温による影響を受ける可能性があるため、年間を通して実施する予定である。研究対象者予定数は30名としているが、実験と同時に分析をすすめ、分析結果をもとに流動的に変更する予定である。データ分析(平成29年6月平成30年3月):データ収集を行った都度分析を実施する。研究安全倫理審査委員会の承認後、被験者を募集し、データを収集する。具体的には8月からの半年間でデータを収集しつつ、分析を進めていく予定である。本研究で得られた結果を広く公表するため、関連学会での学会発表ならびに論文を投稿する。昨年度の当初の予定は文献検討、学会参加による情報収集を行ったのちに、研究計画の軽微な修正を実行し、研究対象者を募り、実験介入を一部実施する予定であった。しかし、本研究で使用する実験機器(NIRS機器)の設置およびその整備に時間を要した。また、正確なデータを採取するためのNIRS装置の運用に関する知識の習得ならびに技術の鍛錬期間を設けた結果、研究対象者に対して実験介入を実施することができなかった。そのため、謝金やその他実験に関する消耗品の支出がなく、その分の使用額を次年度に持ち越すこととなった。当初の予定としては被験者を募集し、データを採取する予定であった。しかし、研究計画内容や研究安全倫理審査の準備の見直しに時間を要したため、被験者を募集することができなかった。
在日コリアンと日本人高齢者の抑鬱とソーシャルネットワークに関する看護社会学的研究

本研究は、在日1世コリアン高齢者の抑うつとソーシャルネットワークとの関係を調査し、日本人高齢者との比較検討から在日1世コリアン高齢者に対する地域ケア・地域看護モデルを構築することを目的としている。第一段階としては過去の調査の再分析を行った。それらの結果を踏まえ、インタビューガイドの作成を行ない面接調査を計画した。面接調査対象者の選定を行なうため、質的研究の理論的サンプリングの考え方にのっとって有意標本の抽出を実施した。しかしながら、面接調査を行うタイミングで、調査補助の依頼を予定していたエスニックグループの協力が朝鮮半島情勢の影響によって、円滑に得られなくなるという不測の事態が生じたため、調査方法の再検討・変更を行うこととなった。在日1世コリアン高齢者は対象者の年齢、言語の制限などがあり、単独での調査研究の継続が困難であった。そのため機縁法を用いて調査協力者の選定を行なった。また、併行して介護施設での参与観察も行った。現在、その結果をまとめ、分析を行っている。今後、結果がまとまり次第順次報告をしていく予定である。在日コリアン高齢者は日本人高齢者と比べ、社会的にも、経済的にも問題が多く、主観的健康観が低い、抑うつの割合が高い、独居の割合が高いなどハイリスク高齢者となりやすい傾向にあることが示され始めている。しかしながら、その研究は進んでおらず、また研究も限定した地域でのみ行われており、その他の地域では、あまり進んでいないのが現状である、本研究の目的は、質的な研究方法を用いながら、看護学、社会学の視点から、在日コリアン高齢者の抑うつを促進する因子について検討することを目的としている。本年はまず、在日コリアン高齢者の抑うつにかんする、重要な研究が新たに刊行されてきているため、先行研究の検討を行い、その知見と問題点を整理した。それらを踏まえ、本研究の調査項目を検討することを行った。その結果、在日コリアン高齢者の抑うつの要因として、無年金などの社会経済的問題、生活習慣病の罹患の程度が大きいこと、識字利率の低さなどの要因が指摘されているが、ソーシャルネットワーク評価については、十分に解明されていないため、ソーシャルネットワークの評価が高い在日コリアン高齢者を対象として、調査をする必要があることが明らかとなった。そこで、これを踏まえて、在日コリアン高齢者および日本人高齢者の調査対象者に、さまざまな方法で調査への参加を試みたが、調査対象者の収集が予定の通りに進まなかったため、調査対象者の収集と同時に在日コリアン高齢者を対象とした、施設でのフィールドワークを行った。その結果、ソーシャルネットワークが正常に機能することが在日コリアン高齢者の健康維持に有効な行動を選択させているという可能性が示唆された。これらの研究で得られた成果の一部を、今後開催される学会での発表を予定している。本研究の目的は、地域在住の外国人高齢者の中でも社会問題にもなってきている在日1世コリアン高齢者に焦点を当て、在日1世コリアン高齢者の抑うつとソーシャルネットワークとの関係を調査し、日本人高齢者との比較検討から在日1世コリアン高齢者に対する地域ケア・地域看護モデルを構築することを目的としている。本年度の研究では、前年度の調査結果を検討し、再分析を行なった。その結果、転倒経験があり、生活習慣病などの疾病を持つ後期高齢者である在日コリアンに、精神的健康度、身体的健康度が低い者が多いことが明らかとなった。その結果は、学会にて報告を行った。現在その結果をまとめ分析を行っている。今後結果がまとまり次第、順次報告をしていく予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
神経系を可視化したゼブラフィッシュを用いた神経特異的転写調節因子Ｄｐｆ１の解析

ゼブラフィッシュ中枢神経系における最も主要なdpf1トランスクリプトdpf1-002を決定し、塩基配列と胚における発現パターンを明らかにした。また、dpf1-tTA-GFPフィッシュにおいては、GFPトランスジーンがdpf1-002とは異なる転写開始位置から独立して転写されており、内在性dpf1-002の発現は影響を受けていなかった。dpf1-002に対するモルフォリノアンチセンスオリゴ(MO)による機能阻害実験を行ったが、再現性のある明確な神経系発生異常は見つかっていない。今後は、ゲノム編集などの異なる遺伝子ターゲティング法の検討も必要であろう。平成24年度に引き続き、ゼブラフィッシュdpf1 mRNAの発現部位の解析をin situハイブリダイゼーション(ISH)法により行った。ホールマウント標本による解析に加え、凍結切片を用いてより詳細な発現解析を行った。その結果、間脳や延髄腹側部などに特に強い発現が認められる一方で、終脳外套や中脳視蓋など発現が無いか極めて弱い領域があることが判った。これは、dpf1以外にもnpBAFの構成サブユニットとなり得る類似分子もしくはアイソフォームの存在を示唆しており、現在、候補分子を検索している。また、平成24年度に見出した転写バリアントの発現パターン解析を行った。配列の異なる領域が小さく特異的なプローブを作成できないバリアントもあったが、他種のホモログと相同性の最も高い、当初より予測した転写産物が主要な転写産物であり、各バリアント間にも明らかな発現パターンの違いは見出されなかった。上記の転写産物の発現解析の結果を元に、モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)あるいは合成RNAの受精卵注入による遺伝子ノックダウンもしくは強制発現系によるDpf1の機能解析に着手した。現在、各種の蛍光トレーサー発現トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いて、ノックダウンおよび強制発現による神経系の発生に対する影響を調べている。交付申請時の平成24年度研究実施計画に基づき、まず、ゼブラフィッシュdpf1 mRNAの発現部位の解析をin situハイブリダイゼーション(ISH)法により行った。その過程で、dpf1遺伝子には転写開始点が異なる複数の転写バリアントが存在することを見出した。これらバリアントは分子内の機能モチーフの有無が異なり、バリアント間で機能性に差異があると予想されるため、機能メカニズムの検討には各バリアントの発現パターンを明らかにする事が極めて重要であると考えられる。現有の抗体は特定のバリアントを選択的に検出することはできないため、それぞれのバリアントを特異的に検出可能なISHプローブの作製を試みた。現在、各バリアントについてISH法による詳細な発現解析を行うとともに、各バリアントに特異的な抗体の作製を準備中である。次に、dpf1-tTA-GFPトランスジェニックフィッシュにおけるtTA-GFP融合タンパク質の発現解析を行い、この融合トランスジーンは内在性dpf1とは異なる独立したトランスクリプトとして転写、翻訳されており、当該トランスジェニックフィッシュにおいても内在性Dpf1タンパク質は野生型同様に発現していると考えられた。この点についても、現在、野生型との間に発現パターンに相違がないか、詳細に確認中である。モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)を用いた遺伝子ターゲティングによるDpf1の機能解析については、前述のように複数の転写バリアントの存在が明らかになったために発現パターンの解析を優先し、その結果を踏まえてターゲティングの対象とするトランスクリプトならびに用いるMOの配列を決定する事とした。また、マウスdpf1の発現解析については、ISHプローブ作製用プラスミドのクローニングを行い、解析を始めたところである。ゼブラフィッシュ中枢神経系における、最も主要なdpf1トランスクリプト(dpf1-002)を決定した。このトランスクリプトは、dpf(BAF45)ファミリーに共通のDNA結合モチーフであるC2H2型とPHD型の2つのZincフィンガーの双方を有しており、他種のdpf1との相同性が非常に高いがゼブラフィッシュにおいてはこれまで未確認のトランスクリプトであった。また、PHD型のZincフィンガーを欠く短いトランスクリプトも確認されたが、塩基配列の重複が大きく、両者のの発現パターンの相違は確認できなかった。また、dpf1-tTA-GFPフィッシュにおけるGFPトランスジーンはdpf1遺伝子座のエクソン8と9の間のイントロン領域に挿入されており、本トランスクリプト(dpf1-002)には含まれていなかった。GFP融合蛋白質はdpf1-002とは異なる位置から転写開始されるトランスクリプトとして発現しており、トランスジェニックフィッシュにおいても内在性のdpf1-002の発現は影響を受けていないと思われた。この融合遺伝子の元となる内在性トランスクリプトの生理的意義は不明である。

dpf1-002の塩基配列に対して、3種類ずつの翻訳ならびにスプライシング阻害モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)を作製し、機能阻害実験を行った。dpf1-tTA-GFPフィッシュに加えて、HuC-kaede、islet1-GFP、zFucciなどの受精卵にも各MOを注入したが、現在までのところ再現性をもって認められる明確な神経系の発生異常は残念ながら見つかっていない。いずれのMOも阻害効果が期待に反して弱く、正常なDpf1蛋白質の発現を十分に阻害できていない可能性が高い。異なるMOや複数のMOの同時注入等の検討が必要である。CRISPR-CAS9システムを用いたゲノム編集等による、異なる遺伝子ターゲティングアプローチも検討対象となろう。スプライシングバリアントや類似分子による機能の冗長性についても、さらに詳細な検討の余地がある。神経解剖学昨年度に報告したように、複数の転写開始点を伴う転写バリアントの存在が新たに明らかになったため、その発現解析を行った。バリアントの中にはDNA結合モチーフの一部を欠くものも含まれており、バリアント間での機能上の違いが予想され、各バリアントの発現パターンやDNA結合能の違いなどの分子レベルの知見が個体レベルでの機能解析を行う上でも極めて重要であると考えたためである。さらに、遺伝子ターゲティングに用いるMOや強制発現に用いる合成RNAの配列決定のためには、翻訳開始点やエクソン/イントロン構造の情報が必要となる。そこで、当初計画に予定していなかった転写バリアントの発現パターン解析を行った上で、機能解析の対象とする主要な転写産物の同定を行った。前述のように、複数の転写開始点を伴う転写バリアントの存在が新たに明らかになったため、その発現解析を優先して行っており、遺伝子ターゲティングによる個体レベルでのDpf1の機能解析についてはまだ着手していない。確認した転写バリアントの中にはDNA結合モチーフの一部を欠くものも含まれており、バリアント間での機能上の違いが予想される。そのため、各バリアントの発現パターンやDNA結合能の違いなどの分子レベルの知見は、個体レベルでの機能解析を行う上でも極めて重要であると考える。さらに、遺伝子ターゲティングに用いるMOの配列決定のためには、翻訳開始点やエクソン/イントロン構造の情報が必要となる。このように、研究目的の達成度としては申請書の実験計画に比して遅れている点があることは否めないが、研究課題を遂行する上で必要な実験内容を優先して行っている状況である。上述のように当初の研究計画に比べて進捗状況が遅れたため、研究期間を1年間延長し、交付申請時の研究計画を継続して遂行する。これまで取り組んできた、[1]ゼブラフィッシュDpf1の発現パターンの詳細な解析および[2]dpf1-tTA-GFPトランスジェニックフィッシュのGFP発現パターン解析の結果を踏まえて、[3]遺伝子ターゲティングによるDpf1の機能解析を進めていく。ただし、ゼブラフィッシュに関する解析を優先的に集中して進める事とし、申請時の実施計画に記した[4]
全国の砂浜生態系を対象とした海面上昇に対する適応策の最適化手法の開発

本研究の目的は,1)従来の生物多様性の経済分析では考慮されてこなかった連続距離の次元を導入したモデルを開発し,どのように市場の失敗が起きているか理論的に明らかにすること,2)その市場の失敗を緩和する政策として最適な土地利用政策を提案することである.「生物の滞在時間密度」という新しい概念を用いて従来の生物モデルに連続的な距離の次元を導入し,都市経済モデルと統合することで,人間と生物の土地利用を表現可能な経済モデルを開発した.理論分析により,都市および自然地域のすべての地点において,人間と生物の土地利用がどのように市場の失敗を引き起こしているか明らかにした.野生生物は,都市政府が行う規制や政策に従わないので,生物の各地点の土地利用を最適に調整することは望めない.そこで,セカンドベスト政策として最適土地利用政策(都市サイズ規制,自然地域のすべての地点の植生密度調整)を提案した.最適な都市サイズは市場均衡に比べて大きい場合も小さい場合もあり得るという,Eichner and Pethig (2006)とは異なる結果を理論的に導出した.さらに,最適都市サイズを大きくすべきか小さくすべきかを決める十分条件について理論的に整理した.また,実際の都市を対象に数値計算を行い,理論的結果を確認した.以上の結果を,応用地域学会,環境経済政策学会,Regional Science Association Internationalの北米大会で発表した.本研究で開発したモデルは,生物多様性を考慮した都市政策を分析する枠組みの提案であり,今後,より深い研究が進展していくことが期待できる.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,1)従来の生物多様性の経済分析では考慮されてこなかった連続距離の次元を導入したモデルを開発し,どのように市場の失敗が起きているか理論的に明らかにすること,2)その市場の失敗を緩和する政策として最適な土地利用政策を提案することである.本年度は,目的1)について研究を行った.従来研究では,仮想的なバイオマス市場において捕食者と被捕食者が自身のバイオマスを取引しているという仮説をもとに生物モデルを構築していた.都市拡大により被捕食者(植物)の供給が少なくなることで,その上位の生物の個体数が減り,生物多様性が減少することを説明している.また,都市拡大による生物多様性の損失の負の外部性があるため,最適な都市サイズは市場均衡よりも小さいことを示した.これに対して,本研究では,経済活動と生物多様性の相互関係が人間と生物の距離に依存することに着目した.例えば,大型の肉食動物は生物多様性を構成する重要な生物であるにもかかわらず,人間に接触した場合には怪我などの危険を与えてしまう.生物ー人間の相互作用を分解すると,「人間と生物が同じ場所にいるとき,怪我や死亡の危険が生じる」,「その負の外部性の大きさは,各場所での人口密度・生物の個体数とその滞在時間に依存する」.自然との調和を考えた都市政策を行う際には,距離の次元を導入した経済モデルが必要である.しかしながら,従来の研究では,都市と自然生息域が単純な離散の2地域で扱われているため,面積変化による外部性しか考慮できないという問題点があった.従来の生物モデルに連続距離の次元を導入し,種間の捕食被捕食の関係性を空間的土地利用で説明するモデルを構築した.次に,従来の都市経済モデルに開発した生物モデルを結合し,都市サイズおよび,都市と自然地域の各地点における人間と生物の土地利用がどのように市場の失敗を引き起こしているか明らかにした.主として環境経済学に関する学術誌から生物多様性と土地利用に関する研究のレビューを,都市経済学に関する学術誌から最適土地利用政策に関する研究のレビューを行うことで,モデル構築に必要な知見の習得ができた.この知見をもとに,肉食動物・草食動物・植物で構成される一般的な3種の食物連鎖で構成される生物モデルに連続距離次元を導入し,種間の捕食被捕食の関係性を空間的土地利用で説明するモデルを構築することができた.これを従来の都市経済モデルに結合させ,都市と自然地域の各地点において,どのように市場の失敗を引き起こしているか理論的に明らかにできたため,ほぼ順調に進展している.本研究の目的は,1)従来の生物多様性の経済分析では考慮されてこなかった連続距離の次元を導入したモデルを開発し,どのように市場の失敗が起きているか理論的に明らかにすること,2)その市場の失敗を緩和する政策として最適な土地利用政策を提案することである.「生物の滞在時間密度」という新しい概念を用いて従来の生物モデルに連続的な距離の次元を導入し,都市経済モデルと統合することで,人間と生物の土地利用を表現可能な経済モデルを開発した.理論分析により,都市および自然地域のすべての地点において,人間と生物の土地利用がどのように市場の失敗を引き起こしているか明らかにした.野生生物は,都市政府が行う規制や政策に従わないので,生物の各地点の土地利用を最適に調整することは望めない.そこで,セカンドベスト政策として最適土地利用政策(都市サイズ規制,自然地域のすべての地点の植生密度調整)を提案した.最適な都市サイズは市場均衡に比べて大きい場合も小さい場合もあり得るという,Eichner and Pethig (2006)とは異なる結果を理論的に導出した.さらに,最適都市サイズを大きくすべきか小さくすべきかを決める十分条件について理論的に整理した.

また,実際の都市を対象に数値計算を行い,理論的結果を確認した.以上の結果を,応用地域学会,環境経済政策学会,Regional Science Association Internationalの北米大会で発表した.本研究で開発したモデルは,生物多様性を考慮した都市政策を分析する枠組みの提案であり,今後,より深い研究が進展していくことが期待できる.これまでの研究によって,自然地域と都市の各地点で市場の失敗が生じていることが明らかになった.野生生物は,都市政府が行う規制や政策に従わないので,生物の各地点の土地利用を最適に調整することは望めない.そこで,その市場の失敗を緩和するために,最適土地利用政策(都市サイズ規制,自然地域のすべての地点の植生密度調整)の提案を行う予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
H_2^<15>O法PETスキャンによる読字の神経機構の解析

読字の神経機構を明らかにするため、PETスキャンを用いて、読字中の局所脳血流量を測定し、読字における大脳賦活領域を求めた。これまでに、漢字とかな文字の音読課題の解析をすでに行ってきたので、今年度は、3文字かな有意語の黙読課題を負荷し、音読と黙読との比較検討を行った。右手利き正常被験者に対して、スクリーン上に2秒に1回、300ミリ秒間提示される3文字かな有意語を口や舌を動かさぬようにして黙読する黙読課題と、スクリーン上に提示された注視点を固視する注視課題の2種類を負荷し、課題遂行中にH_2^<15>Oを生理的食塩水の形で注射して、PETスキャンによる局所脳血流量の測定を行った。それぞれの課題につき3回づつの測定を行い、黙読課題の平均値から注視課題の平均値を減算して、黙読過程において特異的に賦活される大脳領域を求めた。賦活領域の同定は、各被験者毎に予め撮影しておいたMR画像との重ね合わせを基にし、径16ミリメートルの関心領域における局所脳血流量の増加率が5パーセント以上の領域を有意の賦活とした。黙読課題で有意に賦活された領域は、音読課題により少なく、また賦活程度も少なかった。有意に賦活されたのは、両側後頭葉内側部と外側部、左側頭葉後下部、左横回であり、音読時に賦活された、ブローカ領域を含む左下前頭回後部には有意の賦活が見られなかった。これまでの欧米からの報告には、黙読時にもブローカ領域を含む左下前頭回後部には有意の賦活がみられたというものがあるが、今回のわれわれの実験では、これは否定された。また、従来から読字の中枢と考えられてきた左下頭頂小葉には、音読においても黙読においても有意の賦活は見られないことが明らかになった。今後は、左下頭頂小葉にて営まれるとされてきた数字の読みや計算の能力について、同様の解析を行っていきたい。
肝血流低下による肝萎縮機構の解明とLSKLpeptideを用いた新規治療法の開発

野生型マウスを用いて右門脈を結紮して部分的な肝萎縮を誘導した。結紮肝(萎縮肝)ではPCNAの発現は結紮後6時間をピークに上昇し、その後発現は低下した。TUNEL染色では核の染色が増加した。結紮肝では術後6時間以降、肝細胞細胞質でのTSP-1の発現が上昇した。また、肝切除術のため、門脈結紮術を行ったヒトの結紮肝、非結紮肝に対してcDNAmicroarrayを行い、132遺伝子のうち、TSP-1が非結紮肝に比較して結紮肝で最も発現が上昇していた。以上より、門脈血流の低下は肝細胞におけるTSP-1の発現上昇を促し、肝細胞の増殖抑制とアポトーシスが誘導されていることが示唆された。門脈血流低下による肝萎縮において障害を受けた肝類洞内皮細胞からTSP-1分泌が誘導され、TGF-β-Smadシグナルを活性化することで肝萎縮が誘導されていると予想される。野生型マウス(C57BL/6J)を用いて左右門脈のうち右門脈を結紮して部分的な肝萎縮を誘導した。門脈の結紮を行った肝右葉を結紮肝、結紮を行わなかった肝左葉を非結紮肝とした。門脈結紮したマウスは術後6時間、24時間、48時間後にsacrificeし、結紮肝および非結紮肝を摘出した。各タイミングで5匹の門脈結紮マウスを作成した。摘出した肝臓は緩衝ホルマリン液に固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色、抗PCNA抗体による免疫染色、TUNEL染色を行った。結紮肝(萎縮肝)では術後6時間以降に類洞の拡張を認め、48時間以降で肝細胞核におけるヘマトキシリンの染色性が低下した。また、PCNAの発現は結紮後6時間をピークに上昇し、その後発現は低下した。TUNEL染色は術後6時間後核の染色が増加した。一方、非結紮肝(肥大肝)では術後6時間以降、PCNAの発現が上昇した。TUNEL染色では核の染色は認めなかった。抗TSP-1抗体および抗pSmad2抗体による免疫染色にて結紮肝では術後6時間以降、肝細胞細胞質でのTSP-1の発現は上昇し、核でのpSmad2の発現も上昇した。非結紮肝では肝細胞細胞質内でのTSP-1の発現、核でのpSmad2の発現を認めなかった。すなわち、門脈血流の低下は肝細胞におけるTSP-1の発現上昇を促し、TGF-β/Smad2シグナルを介して肝細胞の増殖抑制とアポトーシスが誘導されていることが示唆された。門脈結紮したマウスは術後6時間、24時間、48時間、72時間後にsacrificeし、結紮肝および非結紮肝を摘出した。また、PCNAの発現は結紮後6時間のみで上昇した。また、術後48時間で肝細胞がPAS染色陽性となった。一方、非結紮肝(肥大肝)ではPCNAの発現は結紮後6時間および24時間後に2峰性の上昇を呈した。また細胞質はPAS染色陰性であった。抗TSP-1抗体および抗pSmad2抗体による免疫染色にて結紮肝では術後6時間で肝類洞内皮細胞に発現が上昇し、それ以降は肝細胞細胞質でのTSP-1の発現は上昇し、核でのpSmad2の発現も上昇した。マウスの門脈の結紮にはヒトに対する血管結紮用のクリップ(small SLS clip)を用いた。マウスの門脈は微細であり、さらに微細な肝動脈の結紮を伴うことなく、結紮肝の壊死を来さないような正確な右門脈結紮手技を確立するのに時間を要した。また、門脈結紮手技が確立するまで、一定の実験結果が得られなかった。

上記の理由に加え、多数のtime pointでの結紮および非結紮肝組織の採取が必要であり、必要なサンプルを揃えるのに時間を要した。右門膜結紮により得られた結紮肝(萎縮肝)、非結紮肝(肥大肝)について、PCNAの免疫染色、TUNEL染色を行い、術後の肝細胞再生および肝細胞アポトーシスについて時系列的変化を明らかにした。結紮肝ではPCNAは術後6時間のみで誘導されるのに対し、ヒッ結紮肝では術後6時間および24時間で誘導され、肝肥大においては術後24時での増殖能の増加が見られることがわかった。以上より、結紮肝(萎縮肝)では肝細胞の増殖能の低下とアポトーシスの亢進、非結紮肝(肥大肝)では細胞増殖能の亢進とアポトーシスの抑制が確認された。また、TSP-1およびpSmad2の免疫染色によって、結紮肝ではTSP-1の発現が肝類洞内皮細胞で急激に上昇し、続いて肝細胞内で発現が上昇した。一方で、非結紮肝では肝類洞内皮細胞に一過性にTSP&#8212;1が誘導されるのみで、その後の発現は見られなかった。以上の結果から、門脈血流低下によるTSP-1が肝細胞再生の抑制とアポトーシス亢進による肝萎縮のメカニズムに関与していることを確認した。非結紮肝では逆にTSP-1の発現は低下し、肝細胞再生の促進とアポトーシス抑制が見られた。門脈血流低下による肝萎縮において障害を受けた肝類洞内皮細胞からTSP-1分泌が誘導され、TGF-β-Smadシグナルを活性化することで肝萎縮が誘導されていると予想される。野生型マウス(C57BL/6J)を用いて左右門脈のうち右門脈を結紮して部分的な肝萎縮を誘導した。門脈の結紮を行った肝右葉を結紮肝、結紮を行わなかった肝左葉を非結紮肝とした。門脈結紮したマウスは術後6時間、24時間、48時間後にsacrificeし、結紮肝および非結紮肝を摘出した。各タイミングで5匹の門脈結紮マウスを作成した。摘出した肝臓は緩衝ホルマリン液に固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色、抗PCNA抗体による免疫染色、TUNEL染色を行った。結紮肝(萎縮肝)では術後6時間以降に類洞の拡張を認め、48時間以降で肝細胞核におけるヘマトキシリンの染色性が低下した。また、PCNAの発現は結紮後6時間をピークに上昇し、その後発現は低下した。TUNEL染色は術後6時間後核の染色が増加した。一方、非結紮肝(肥大肝)では術後6時間以降、PCNAの発現が上昇した。TUNEL染色では核の染色は認めなかった。抗TSP-1抗体および抗pSmad2抗体による免疫染色にて結紮肝では術後6時間以降、肝細胞細胞質でのTSP-1の発現は上昇し、核でのpSmad2の発現も上昇した。非結紮肝では肝細胞細胞質内でのTSP-1の発現、核でのpSmad2の発現を認めなかった。また、肝切除術のため、門脈結紮術を行ったヒトの結紮肝、非結紮肝に対してcDNAmicroarrayを行い、132遺伝子のうち、TSP-1が非結紮肝に比較して結紮肝で発現が最も発現が上昇していた。すなわち、門脈血流の低下は肝細胞におけるTSP-1の発現上昇を促し、TGF-β/Smad2シグナルを介して肝細胞の増殖抑制とアポトーシスが誘導されていることが示唆された。野生型マウスを用いて右門脈を結紮して部分的な肝萎縮を誘導した。結紮肝(萎縮肝)ではPCNAの発現は結紮後6時間をピークに上昇し、その後発現は低下した。TUNEL染色では核の染色が増加した。結紮肝では術後6時間以降、肝細胞細胞質でのTSP-1の発現が上昇した。また、肝切除術のため、門脈結紮術を行ったヒトの結紮肝、非結紮肝に対してcDNAmicroarrayを行い、132遺伝子のうち、TSP-1が非結紮肝に比較して結紮肝で最も発現が上昇していた。以上より、門脈血流の低下は肝細胞におけるTSP-1の発現上昇を促し、肝細胞の増殖抑制とアポトーシスが誘導されていることが示唆された。マウスの門脈の結紮にはヒトに対する血管結紮用のクリップ(small SLSTMclip)を用いた。
破骨細胞によるトランスサイトーシスを介したグルタミン酸分泌の制御機構と意義の解明

本研究計画の背景は、小胞型グルタミン酸輸送体(Vesicular glutamate transporfer;VGLUT)1が破骨細胞のトランスサイトーシス小胞に発現していること、L-グルタミン酸(L-Glu)が破骨細胞からカルシウム依存的に分泌されること、L-Gluが破骨細胞に発現している代謝型グルタミン酸受容体mGluR8を介して細胞内cAMPを減少させることでトランスサイトーシスを抑制すること、の3点であり、課題は、1.L-Glu分泌を指標としたトランスサイトーシスの分子機構の解明、2.骨組織でのin vivoにおけるL-Gluシグナルの意義の解明、の2点である。平成19年度の科学研究費補助金により以下の知見を得た。1.について。L-Glu分泌がカルシウム依存的であるため、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(PKC)がトランスサイトーシスに関与するのではないかと考えた。PKC阻害剤は、L-Glu分泌を完全に阻害した。このことは、破骨細胞からのL-Glu分泌が、PKC依存的な経路により起こることを示唆している。SNARE複合体の関与については現在検討中である。また、トランスサイトーシス小胞の生化学的解析については、小胞を大量に単離する系を確立しようとしている段階である。2.について。8週齢及び16週齢のVGLUT1遺伝子欠損マウスの骨形態計測を行った。8週齢では、野生型に比べてVGLUT1遺伝子欠損マウスで骨形成速度及び骨吸収速度が共に上昇しており、骨代謝回転の亢進が認められた。しかし、骨量には有意な差が無かった。16週齢では、骨形成速度及び骨形成速度に有意な差は認められなかった。骨量は、野生型に比べてVGLUT1遺伝子欠損マウスで1015%程度低下していた。卵巣摘出条件及び炎症性骨吸収誘導条件下でのL-Gluシグナルの意義については、時間が足りず検討できていない。神経において、L-グルタミン酸(L-Glu)分泌に必須のタンパク質である小胞型グルタミン酸輸送体(Vesicular glutamatetransporter ; VGLUT)は、L-Glu分泌細胞を同定するための良い指標となる。私は、(1)VGLUT1が破骨細胞のトランスサイトーシス小胞に発現していること(2)脱分極刺激によりL-Gluと骨分解産物がカルシウム及びcAMP依存的に共分泌されること(3)L-Gluが破骨細胞に発現しているグルタミン酸受容体を介して細胞内cAMPを減少させることでトランスサイトーシスを抑制すること、を見出していた。これらの知見の上に、(1)L-Glu分泌を指標としたトランスサイトーシスの分子機構の解明、(2)骨組織でのin vivoにおけるL-Gluシグナルの意義の解明、という二つの計画を立案し、平成18年度の科学研究費補助金により以下の知見を得た。(1)破骨細胞からの脱分極刺激によるL-Glu分泌はcAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)阻害剤ではほとんど阻害されなかった。このことは、破骨細胞からのL-Glu分泌が、PKA非依存的な経路により起こることを示唆している。PKCの関与、及びSNARE複合体の関与については現在検討中である。(2)VGLUT1遺伝子欠損(KO)マウスの大腿骨骨量は、野生型マウスと比較して、8週齢で3040%程度、4ヶ月齢で5060%程度低下し、また、骨吸収マーカーである血清中TRACP5b量は増加していた。L-Gluが骨組織において、骨吸収を抑制する因子であることが示唆された。VGLUT1 KOマウスの骨形態計測は現在進行中である。VGLUT1 KOマウスの繁殖に予想以上に時間がかかったため、卵巣摘出条件及び炎症性骨吸収誘導条件下でのL-Gluシグナルの意義の検討については次年度に行うことにする。1.について。2.について。