hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MHC高親和性抗原ペプチドの経表皮性接種によるメラノーマの免疫療法の開発

前年度までの研究でC57BL/6マウスの耳介や腹部の皮膚をtape stripping後、メラノーマ抗原ペプチドであるTRP-2(181-188)、mouse gp100(ECSRNQWL)あるいはhuman-gp100(KVPPNQDWL)を塗布し、B16マウスメラノーマ(F10)において抗腫瘍効果がみられるか否かを検討したところ、耳介と腹部に塗布した場合に弱いながらも頚部リンパ節と腸間膜リンパ節にB16メラノーマ細胞に対する細胞障性T細胞(CTL)の誘導がみられることが明らかにされた。本年度は、mouse-gp100とhuman-gp100をtape strippingした耳介と腹部の皮膚に塗布した後に、マウスにB16メラノーマを移植し、抗腫瘍効果がみられるか否か、またfoodpadにおいてこれらの抗原ペプチドに対する遅延型過敏反応(DTH)がえられるか否かを検討した。結果は、mouse-gp100とhuman-gp100塗布群において溶媒(アセトン:オリーブ油=4:1)のみ塗布の対照群に比し、弱いながらも腫瘍増殖抑制効果がみられた。ただし、mouse-gp100とhuman-gp100塗布群の間に有意差は認められなかった。DTHについてはmouse-gp100塗布群のみにおいて有意に高いDTH反応が認められた。以上より、tape strippingした耳介と腹部にmouse-gp100を塗布することによりCTLの誘導は認められたものの、in vivoで有意な抗腫瘍効果を発揮するほどの強い効果はえられないことが明らかにされた。これらの結果は、同様な操作によって強い抗腫瘍効果がえられたとするSeoらの報告に相反するものである。今後さらにこの結果の違いについて検討する必要があるものと考える。信州大学皮膚科と慶応大学先端研においてそれぞれB16マウスメラノーマを用いた基礎的予備実験を行った。1)信州大学での実験結果:C57BL/6マウスの耳部と腹部の皮膚にセロテープを着脱させ、角層の除去具合を組織学的に確認した。いずれも9回の着脱操作でほぼ完全に角層が除去された。そこで、9回のテープストリッピング施行部のマウス皮膚に1%DPCPを塗布して感作し、5日後に同様にテープストリッピングした部位に0.1%DPCPを塗布したところ、強い誘発反応がえられた。同様のテープストリッピング部にメラノーマ抗原ペプチドの9mer、8merであるTRP-2(180-188)とTRP-2(181-188)をDMSOに溶解して1日目、14日目に塗布して感作した。15日目にB16マウスメラノーマF1、F10細胞株をそれぞれ接種し、腫瘍の生着、結節増大への影響を検討した。しかし、いずれの実験においてもマウスメラノーマに対する増殖抑制効果は認められなかった。2)慶応大学での実験結果:同マウスの耳部をテープストリッピング後、TRP-2(181-188)をアセトン:オリーブオイル=4:1の溶媒に溶かして塗布し、1週間後にマウス脾細胞、頸部リンパ節細胞を摂取し、ペプチド共存下に5日間培養し、B16メラノーマ細胞への障害活性をみたところ、リンパ節由来のT細胞に弱いながらもCTL活性が認められた。以上、施設間で研究結果に多少の差がみられたので、今後、実験条件を揃えて再確認する予定である。また、in vivoの腫瘍増大抑制効果についても再検討を始めている。本年度もC57BL/6マウスとその自家系腫瘍であるB16マウスメラノーマの系で抗原ペプチド塗布による細胞障害性T細胞(CTL)誘導の基礎的実験を継続した。主な結果は以下のとおりである。1.角層剥離耳介表皮へのメラノーマ抗原ペプチドgp100の2回塗布による検討:C57

BL/6マウスの右耳介部皮膚にセロテープを15回着脱させて角層を剥離し、24時間後にhuman-gp100(KVPPNQDWL)あるいはmouse-gp100(EGSRNQDWL)のペプチドを塗布し、2週間後に左耳介に同様の塗布を行った。2回目の塗布の5日後、マウスの脾臓と頸部リンパ節を摘出し、リンパ球をえた。これについて上記ペプチドによる^<51>Cr-release assayを行ったところ、頸部リンパ節細胞由来のリンパ球で弱いながらmouse-gp100に対しCTL活性が認められたが、脾臓由来のリンパ球にはCTL活性は見出されなかった。なお、human-gp100に対してはいずれのリンパ球にもCTL活性は見出されなかった。2.角層剥離耳介・腹部表皮への同上ペプチド2回塗布:同マウスの耳介と腹部をテープストリッピング後、同上ペプチドを2回塗布し、5日後にマウスの脾臓、頸部リンパ節、腸間膜リンパ節よりリンパ球をえてCTL活性をみた。その結果、やはりmouse-gp100に対して頸部リンパ節由来リンパ球と腸間膜リンパ節由来リンパ球でCTL活性が認められ、後者の方がやや活性が強いことが示された。なお、この場合もhuman-gp100に対するCTL活性は見出されなかった。以上、感作部位の所属リンパ節にはCTL活性が見出されるが、脾臓にはCTLは出現しないこと、予想に反してhuman-gp100に対する反応は誘導されないことが明らかにされた。前年度までの研究で、C57BL/6マウスの耳介や腹部の皮膚をtape stripping後、メラノーマ抗原ペプチドであるTRP-2(181-188)、mouse-gp100(ECSRNQWL)あるいはhuman-gp100(KVPPNQDWL)を塗布し、B16マウスメラノーマ(F10)において抗腫瘍効果がみられるか否かを検討したところ、耳介と腹部に塗布した場合に弱いながらも頚部リンパ節と腸間膜リンパ節にB16メラノーマ細胞に対する細胞障性T細胞(CTL)の誘導がみられることが明らかにされた。本年度は、mouse-gp100とhuman-gp100をtape strippingした耳介と腹部の皮膚に塗布した後に、マウスにB16メラノーマを移植し、抗腫瘍効果がみられるか否か、またfoodpadにおいてこれらの抗原ペプチドに対する遅延型過敏反応(Dm)がえられるか否かを検討した。結果は、mouse-gp100とhuman-gp100塗布群において溶媒(アセトン:オリーブ油=4 : 1)のみ塗布の対照群に比し、弱いながらも腫瘍増殖抑制効果がみられた。ただし、mouse-gp100とhuman-gp100塗布群の間に有意差は認められなかった。DTHについてはmousc-gp100塗布群のみにおいて有意に高いDm反応が認められた。以上より、tape strippingした耳介と腹部にmouse-gp100を塗布することによりCTLの誘導は認められたものの、in vivoで有意な抗腫瘍効果を発揮するほどの強い効果はえられないことが明らかにされた。これらの結果は、同様な操作によって強い抗腫瘍効果がえられたとするSeoらの報告に相反するものである。今後さらにこの結果の違いについて検討する必要があるものと考える。
悪性中皮腫における薬剤耐性の克服と分子標的治療の開発

ヒト悪性中皮腫細胞のペメトレキセド(PEM)耐性株を樹立し、核酸合成酵素の発現上昇が見られない耐性株と親株で網羅的に遺伝子発現を比較した。当該蛋白質が耐性株で増加し、PEM刺激でさらに増加した遺伝子としてCARPを同定した。しかし、siRNAを用いて発現を低下させてもPEM耐性に変化はなかった。次に耐性株ではリン酸化AMPKとリン酸化p70S6Kの発現が亢進し、PEM刺激によってこれらがさらに増強することを見いだした。さらにAMPK活性化剤が親株にPEM耐性を誘導し、阻害剤がPEM耐性株の耐性を減弱させることが示された。以上よりPEM耐性には活性化AMPKが関与していると考えた。悪性中皮腫は一般に抗がん剤耐性であることが多く、第一選択薬であるシスプラチンとペメトレキセドの併用によっても、平均生存期間が12ヶ月余りである。しかも、比較的短い治療時間で耐性が誘導され、効果が期待できない症例が多い。さらに、第二選択薬が知られていないため、当該抗がん剤耐の性克服は悪性中皮腫の予後の改善にとって極めて重要な課題の一つである。そこで、本研究ではペメトレキセド耐性の機序を解明し、その耐性克服の糸口を見出し、より効果的な抗がん剤治療の開発を目的とした。そこで、まず4種類にヒト悪性中皮腫細胞について、ペメトレキセド耐性株を、コロニー形成能を指標に確立した。チミジンキナーゼの発現亢進がペメトレキセド耐性に関与することが知られているので、当該遺伝子を除いて、2種類の耐性株と親株(NCI-H28、NCI-H228)のペアーに関して網羅的に遺伝子発現を検討(Agilent社Whole human Gemome Arrayを使用)したところ、6遺伝子(ANKRD1、ADRB2、SERPINE1、ITGB3、ADAMTS5、IGFBP3)が、2種類の耐性株で共に上昇していた。そこで、当該薬剤耐性の確認するため、別なアッセイ法であるWST試薬を用いて、ペメトレキセドに対する細胞障害活性を検討すると、確かに耐性株は細胞障害活性が低下していた。さらに他の2種類の細胞(MSTO-211H, NCI-H2454)についても同様に検討し、ペメトレキセド耐性を確認した。次に、mRNAレベルの発現上昇が、実際に蛋白質レベルでも発現の上昇が見られるかを確認するために、当該蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロット法で検討すると、ANKRD1とIGFBP3分子が、NCI-H28、NCI-H228細胞をはじめMSTO-211H, NCI-H2454細胞でも発現上昇が見られた。悪性中皮腫に対する治療薬として、シスプラチンとペメトレキセドの併用が第一選択薬として使用されているが、同薬剤に耐性となった症例では効果的な第二選択薬が知られておらず、この状況はここ10年以上も変わっていない。そこで当該抗がん剤の耐性克服は同疾患の予後改善にとって重要な課題である。本研究ではペメトレキセド耐性機構の一端を解明し、その耐性克服の糸口を検討しようとした。まずヒト悪性中皮腫細胞のペメトレキセド耐性株を、コロニー形成能を指標に樹立した。この耐性株はWST法においても細胞傷害活性が低下し、親株と網羅的に遺伝子発現を比較したところ、6遺伝子が、耐性株で上昇していた。そこで、当該蛋白質が実際に耐性株で増加しているかをウエスタンブロット法で検討したところ、ANKRD1とIGFBP3分子に発現上昇が見られた。そこで同分子の薬剤耐性における関与についてsiRNAを用いて検討したところ、ANKRD1分子の発現減少によっても、ペメトレキセド耐性は変化しなかった。一方、siRNAよるIGFBP3分子の発現低下は、3種類のsiRNAのいずれにおいても、薬剤耐性細胞におけるペメトレキセド耐性を増加させたが、親株における同薬剤耐性に影響を与えなかった。この結果は、IGFBP3分子の薬剤耐性における関与を示唆するも、発現上昇が同薬剤耐性に関連していないことを意味している。そこで、IGFBP3分子の発現に関してエライザ法を用いて検討したところ、薬剤耐性細胞では同分子の分泌が実は低下しており、siRNA処理によって、さらに分泌量は低下した。一方、細胞内部のIGFBP3は親株に比較して増加していた。すなわち、薬剤耐性細胞ではIGFBP3分子の分泌傷害によって細胞外分子の量が低下しており、それを補正するため産生量(細胞内蛋白量)が増加したと想定された。また、IGFBP3分泌の減少は増殖因子であるIGFの当該受容体への結合性を増加させ、薬剤感受性を減少させたと考えられる。薬剤耐性の関与する6候補遺伝子の中で、実際に蛋白質として発現上昇していたのは2種類であり、siRNA処理で薬剤感受性に影響を与えたのはIGFBP3分子のみであった。したがって、候補分子のスクリーニングは順調に実施しえた。ただし、発現量の増加が薬剤耐性を結びつくと想定していたが、実際は予想に反して、IGFBP3分子の分泌量が耐性株で観察され、しかもsiRNA処理によって、一層薬剤耐性が高まっていた。しかも、親株ではなく耐性株においてのみ、この薬剤耐性の増強が観察された。IGFBP3分子の機能は複雑で、IGFの当該受容体への結合を阻害する一面、それを促進することも知られている。

現時点においては、IGFBP3はIGF機能を阻害すると考え、IGFBP3の減少は増殖刺激を向上させ、細胞代謝阻害剤の効果を抑制したと考えている。親株は一定以上のIGFBP3が産生されており、siRNA処理による影響を受けなかったと思われる。一方薬剤耐性株における蛋白質の増加は、分泌量は低下したものの細胞内分子量は増加したためであろう。薬剤耐性株においてはIGFBP3分泌が傷害された点については、splice異常あるいは前駆体からの分解が阻止されていた可能性がある。事実ウエスタンブロット法において、薬剤耐性株のIGFBP3分子量は、親株のそれより高分子量に泳動されていた。本研究の目的はペメトレキセド耐性機構の一端を解明することである。まずコロニー形成能を指標にヒト悪性中皮腫細胞のペメトレキセド耐性株を樹立し、さらにWST法で耐性株であることを確認した。そこで親株と網羅的に遺伝子発現を比較したところ、6遺伝子が、耐性株で上昇していた。そこで、当該蛋白質が実際に耐性株で増加しているかをウエスタンブロット法で検討したところ、ANKRD1とIGFBP3分子に発現上昇が見られた。そこで同分子の薬剤耐性における関与についてsiRNAを用いて検討したところ、ANKRD1分子の発現減少によっても、ペメトレキセド耐性は変化しなかった。一方、siRNAよるIGFBP3分子の発現低下は、薬剤耐性細胞におけるペメトレキセド耐性をむしろ増加させたが、親株における同薬剤耐性に影響を与えなかった。この結果は、IGFBP3分子の薬剤耐性における関与を示唆するも、発現上昇が同薬剤耐性に関連していないことを意味している。そこで、培養上清液のIGFBP3分子をエライザ法を用いて検討したところ、薬剤耐性細胞では同分子の分泌が実は低下しており、siRNA処理によって、さらに分泌量は低下した。一方、細胞内部のIGFBP3は親株に比較して増加していた。すなわち、薬剤耐性細胞ではIGFBP3分子の分泌傷害によって細胞外分子の量が低下しており、それを補正するため産生量(細胞内蛋白量)が増加したと想定された。また、IGFBP3分泌の減少は増殖因子であるIGFの当該受容体への結合性を増加させ、薬剤感受性を減少させたと考えられる。さらに親株と耐性株をペメトレキセドで刺激したところ、ANKRD1発現上昇を認めたが、IGFBP3発現はほとんど変化しなかった。したがって、ANKRD1はペメトレキセド耐性のマーカーとなる可能性があり、同分子の発現にp53経路の活性化が関与していた。薬剤耐性に関与する6候補遺伝子の中で、蛋白レベルで発現上昇を確認出来たのは、ANKRD1とIGFBP3のみであった。そのうち、IGFBP3に対するsiRNA処理は薬剤感受性に影響を与えた。従って、候補分子のスクリーニングは順調に実施しえた。ただし、発現量の増加が薬剤耐性を結びつくと想定していたが、実際は予想に反して、IGFBP3分子の分泌量低下が耐性株で観察され、しかもsiRNA処理によって、一層薬剤耐性が高まっていた。しかも、親株ではなく耐性株においてのみ、この薬剤耐性の増強が観察された。IGFBP3分子の機能は複雑で、IGFの当該受容体への結合を阻害する一面、それを促進することも知られている。
輸送体群を束ね局在を制御する腎尿細管上皮細胞新規膜タンパク質の機能の解明

多数の近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子TRAPは、腎特異的に発現する新規膜タンパク質をコードし、近位尿細管管腔側膜に局在した。野生型マウスにおいてTRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることを示し、TRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像を明らかにした。TRAPノックアウトマウスにおける糖・アミノ酸等の尿中排泄の顕著な上昇は、この複合体の消失によるものと考えられた。さらに網羅的定量プロテオミクスおよびメタボロミクスを用いたマルチオミクスにより、TRAPが様々な管腔側膜輸送体の近位尿細管管腔側膜における局在を統合的に制御する分子であることを、強く示唆する結果を得た。研究代表者は、多数の近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子を、バイオインフォマティクスによって見出した。その遺伝子がコードするタンパク質TRAPは、腎特異的に発現する新規膜タンパク質であり、近位尿細管管腔側膜に局在した。TRAPノックアウトマウスは、Fanconi症候群類似の、糖・アミノ酸・尿酸の尿中排泄の顕著な上昇を示し、さらにそれらを輸送可能な複数の輸送体の局在が変化していた。野生型マウスにおいてTRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることから、TRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像と、それら輸送体の局在をTRAPが制御する機構を明らかにすることを目指した。網羅的比較定量プロテオミクスにより、TRAPの欠失により発現量の影響を受ける輸送体を明らかにした。また、免疫染色により、TRAPが輸送体の局在を規定することを示す結果を得た。さらに、TRAPがどのように一群の管腔側膜輸送体と結合するかを明らかにした。網羅的比較定量プロテオミクスによるTRAPノックアウトマウス尿細管輸送体の変動解析をおこなった。近位尿細管で再吸収されるはずの栄養素や代謝物が尿中へ漏出する場合、それらの再吸収を担う輸送体の分子の機能自体が低下しているか、あるいは管腔側膜上での存在量が低下しているかの2つの可能性がある。TRAPノックアウトマウスの管腔側膜上での各輸送体の存在量を野生型マウスと比較することにより、TRAPの役割についての重要な情報を得た。変化が見いだされた輸送体のうち、いくつかについては、Western blotでその変化を確認するとともに、免疫染色を行い輸送体タンパク質の局在の変動を検討した。さらに高空間分解顕微鏡SIM (Structured illumination microscopy)を用いることで、TRAPノックアウトマウスにおいて、局在市の変化を示す輸送体の一部について、より正確な輸送体の局在位置の変化を把握することに成功した。さらに、尿細管管腔側膜画分膜小胞を調整し、複数の化合物の輸送機能を、アイソトープラベルした基質を用いて測定し、TRAPノックアウトマウスにおける輸送体の発現量変動と機能変化について、定量的な解析を進めた。加えて、管腔側膜輸送体の機能を維持するTRAPの役割の解析のために、抗TRAP抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降物を質量分析計で解析し、輸送体との複合体形成の有無を検討し、TRAPがどのように一群の管腔側膜輸送体と結合するかを明らかにした。研究代表者は、多数の腎近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子を、バイオインフォマティクスによって見出した。TRAPノックアウトマウスは、糖・アミノ酸・尿酸などの尿中排泄が顕著に上昇するファンコニー(Fanconi)症候群類似のフェノタイプを示し、さらにそれらを輸送可能な複数の輸送体の局在が変化していた。そこでTRAPが管腔側膜輸送体の局在を統合的に制御する分子であると想定し研究を進めたところ、TRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることを見いだした。それに基づいてTRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像と、それら輸送体の局在をTRAPが制御する機構を解析した。網羅的定量プロテオミクスによりTRAPの欠失により発現量の影響を受ける輸送体を明らかにし、免疫染色によりTRAPが輸送体の局在を規定することを示した。さらに、TRAPが結合する一群の管腔側膜輸送体を明らかにし、定量的に解析した。またTRAPノックアウトマウスのフェノタイプに性差があることが分かったため、これまでオスを用いて研究を進めてきたが、メスについても研究対象にし、解析を進めている。加えて、TRAPノックアウトマウスでは細胞増殖因子GFxの著しい変動が起こることを明らかにしたことから、細胞増殖因子GFxの制御機構とTRAPの関連の解明を進めている。網羅的比較定量プロテオミクスによるTRAPノックアウトマウス尿細管輸送体の変動解析をおこない、TRAPノックアウトマウスの管腔側膜上での各輸送体の存在量を野生型マウスと比較することにより、TRAPの役割についての重要な情報を得た。さらに高空間分解顕微鏡SIM (Structured illumination microscopy)を用いることで、TRAPノックアウトマウスにおいて、局在の変化を示す輸送体の一部について、より正確な輸送体の局在位置の変化を把握することに成功した。さらに、尿細管管腔側膜画分膜小胞を調整し、複数の化合物の輸送機能を、RI標識した基質を用いて測定し、TRAPノックアウトマウスにおける輸送体の発現量変動と機能変化について、定量的な解析を進めた。

加えて、管腔側膜輸送体の機能を維持するTRAPの役割を明らかにするために、抗TRAP抗体を用いた免疫沈降を行い、免疫沈降物を定量型質量分析計で解析し、輸送体との複合体形成の有無を検討し、TRAPと結合している管腔側膜輸送体を定量的に解析した。またTRAPノックアウトマウスが示すフェノタイプに、性差があることが示された。これまでオスを用いて研究を進めてきたが、メスについても研究対象にし解析を進めた。加えて、TRAPノックアウトマウスでは細胞増殖因子Xの著しい変動が起こることが見いだされた。細胞増殖因子Xの制御機構とTRAPの関連の解明を進めている。共発現データベースCOXPRESdbを用いたバイオインフォマティクスによって、多数の腎近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子を見出した。その遺伝子がコードするタンパク質TRAPは、腎臓に発現する新規膜タンパク質であり、近位尿細管管腔側膜に局在した。TRAPノックアウトマウスは、糖・アミノ酸・尿酸などの尿中排泄が顕著に上昇するファンコニー(Fanconi)症候群類似のフェノタイプを示し、さらにノックアウトマウスではそれらを輸送すると考えられる複数の輸送体の局在が変化していた。TRAPが管腔側膜輸送体の局在を統合的に制御する分子であると想定し研究を進めたところ、TRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることを見いだし、TRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像を、質量分析計を用いた定量的なプロテオミクス解析により明らかにした。また、野生型とノックアウトマウスの尿のメタボロミクス解析を行った結果、ノックアウトによって尿中の濃度が著しく変化する物質群のプロファイルが得られた。さらに、近位尿細管管腔側膜の網羅的定量プロテオミクスにより明らかにしたTRAPノックアウトにより発現量の影響を受ける輸送体群と、メタボロミクス解析により明らかになったTRAPノックアウトにより尿中量が影響を受ける物質の相関性を解析した。これらの結果から、TRAPが様々な管腔側膜輸送体の近位尿細管管腔側膜における局在を統合的に制御する分子であることが、強く示唆された。多数の近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子TRAPは、腎特異的に発現する新規膜タンパク質をコードし、近位尿細管管腔側膜に局在した。野生型マウスにおいてTRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることを示し、TRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像を明らかにした。TRAPノックアウトマウスにおける糖・アミノ酸等の尿中排泄の顕著な上昇は、この複合体の消失によるものと考えられた。さらに網羅的定量プロテオミクスおよびメタボロミクスを用いたマルチオミクスにより、TRAPが様々な管腔側膜輸送体の近位尿細管管腔側膜における局在を統合的に制御する分子であることを、強く示唆する結果を得た。これまでの詳細な検討から、近位尿細管管腔側膜輸送体のうち、TRAPと連携するものとしないものが明らかになる。
サンゴ骨格年輪からのメコン川の汚染史の解読法の確立

本研究では人間活動による水質汚染の長期記録が残されていない、あるいは十分な水質観測が現在も行われていない東南アジア地域の水質汚染の実態把握に有効な方法の提案を目的とし、そのケーススタディとして過去50年間のメコン川水質汚染史の解読を季節分解能で復元することを目標とする。今年度は、メコン川の水質汚染史が記録されている可能性がある、メコン川河口から約90kmの距離にあるコンダオ島(ベトナムの南部)で採集したサンゴ骨格に記録された人間活動に起因する元素の時代変化について、東京大学に設置されているPIXE分析装置(RAPID)による定量分析の方法について検討した。また、メコン川の汚染の影響がないベトナム南部のフッコク島(富国島)のサンゴの採集を目的とする野外調査を行った。試料の前処理なしに元素分析が可能なPIXE法でのメリットを最大限に生かすためには、固体試料の定量的な元素分析を行う必要がある。PIXE法による固体サンゴ試料に含まれる人間活動に関係する元素を定量的に分析するために必要な基礎実験、分析に必要な標準試料、データ検証のための参照試料の調整及びICP法による濃度検定を実施した。本研究期間では微量元素の定量分析法の確立には至れなかったが、その分析方法を実際の試料に適用するために必要な基本的なデータが得られた。PIXE法に内標準法を使い分析することでサンゴ年輪試料の微量金属元素の半定量分析が可能であることがあきらかになった。実験方法の確立に関してはほぼ完了したが、実試料への応用は次の課題である。本研究では人間活動による水質汚染史の長期記録が残されていない、あるいは十分な水質観測が現在も行われていない東南アジア地域の水質汚染の実態把握に有効な方法の提案を目的とし、そのケーススタディとして、過去50年間のメコン川水質汚染史の解読を季節分解能で復元することを目標としている。今年度は、メコン川の水質汚染史が記録されている可能性がある、メコン川河口から約90kmの距離にあるコンダオ島(ベトナムの南部)で採集したサンゴ骨格に記録された人間活動に起因する元素の時代変化について、PIXY分析法を用い調べるための研究を行った。その結果については2つの論文として公表した。具体的には、サンゴの成長方向に沿ってSr/Ca比等をICP分析法で高分解能に求め、海水温の季節変動シグナルを解読し(Phong et al.印刷中)、サンゴ年輪の形成年代を正確に決定した。さらに、サンゴ年輪の炭素14濃度変化を詳細に分析し、核実験で放出された炭素14の濃度増加ピークのタイミングが記録された年輪を正確に求め、サンゴ骨格のSr/Ca比分析で決定されたサンゴ年輪編年の正確さを検証した(Phong et al.2004)。一方、PIXY法によるサンゴ試料に含まれる人間活動に関係する元素を定量的に分析するために必要な基礎実験を実施した。特に、PIXY法による多元素分析のための試料調整法の確立、PIXY分析の測定条件(パラメータ)の決定、PIXY分析計のステージ一部改良(他の研究グループと共同研究)、高精度PIXY分析のための問題点の検討を行った。次年度、今年度に得られた研究成果を、メコン川河口のコンダオ島及び近くに大河川が存在しないフッコク島(ベトナム南部)で採集したサンゴ試料に応用する予定である。
NMRによる硝酸ランタノイド抽出系における抽出化学種の構造

核燃料サイクルの抽出プロセスにおける超ウラン元素抽出剤として、テトラアルキルマロンアミド及びその誘導体が注目されている。本研究は、N,N′-ジメチル-N,N'ジブチルマロンアミド(DMDBMA)を配位子とするランタニド(III)硝酸塩錯体の配位構造及びその結合特性をNMR、赤外吸収及び磁化率等により調べることを目的として実施された。酢酸エチル中において合成、単離されたランタニド(III)硝酸塩-DMDBMA錯体の化学組成は全ランタニド系列内でLn(NO_3)_3-2DMDBMAである。DMDBMA及び硝酸イオンは、共に、二座配位でランタニド(III)イオンに結合し、その配位数は10である。炭素-13及び窒素-14-NMRスペクトル及び炭素-13-NMR縦緩和時間測定より、溶液中においては、DMDBMAの2つのアミド結合(CO-N結合)の二重結合性に起因する三種の幾何異性体の存在が示唆された。さらに、LIS(Lanthanide-Induced-Shift)解析から、軽希土系列と重希土系列との間に構造変化が見いだされた。それぞれの系列内においては、iso-structuralな構造を有すると考えられる。溶液中においては、DMDBMAは磁気主軸に関して赤道面内(A_2^0G+A_2^2G′<0)に、硝酸イオンは軸方向(A_2^0G+A_2^2G′>0)に位置すると考えられる。また、カルボニル炭素及びナイトレード窒素のケミカルシフト値へのFermi contactシフトの寄与が大きいこと、さらにネジオム錯体の磁化率測定においてorbital reductionが観測されたことも併せてランタニドイオンの4f電子の非局在化ならびに配位子との強い相互作用が見られた。
嗅細胞再生過程における嗅上皮細胞の分裂・分化と嗅球の役割について

ラット嗅上皮を透過・走査型顕微鏡で観察すると、嗅細胞、支持細胞、基底細胞の3種類の細胞が明確に同定された。嗅細胞は鼻腔面に向かって嗅小胞を突出させその先端に7-8本程度の嗅線毛が見られた。嗅細胞体は上皮の中間層付近にあり鼻腔面との間は微細管を多く束ねる細長い細胞質をもっていた。これは神経細胞の樹状突起に相当すると考えられた。嗅細胞は基底側に向かって軸索を突出させ無髄のまま上皮下へとのびていた。支持細胞は嗅細胞を取り囲むように存在し、縦に細長い形態をなしていた。鼻腔面には微繊毛が多く見られ特に水解小体が多く存在していた。よく発達したゴルジ装置も認められた。基底細胞は上皮基底部に存在し、細胞質には非常に多くの中間径フィラメントが見られた。実験的に嗅糸を切断したラット嗅上皮では切断2週間で上皮の高さが極端に低くなっていた。これは嗅細胞が変性脱落したことによる上皮高の減少と考える。嗅細胞に特異的な蛋白であるOlfactory Marker Proteinの発現をin situ hybridization法で検討すると、正常コントロールでは非常に多くのシグナルが見られたが、嗅糸切断動物では発現の極端な減少が見られた。嗅糸切断後8週間すると嗅上皮は形態学的にほぼ正常構造を示すようになっていた。今後、このような嗅細胞の再生を促す因子について検討するため、組織培養実験も行う予定である。
消化管ホルモンによる胃液、膵液分泌調節におけるプロスタグランジンの役割

消化管ホルモンとプロスタグランジンが消化器疾患の成因、進展に重要な役割を果たすことが知られてきたが、両者の生理的な関係は不明である。本研究は消化管ホルモン(セクレチン、CCK、ソマトスタチンなど)の生理的な(1)胃液分泌調節作用、(2)膵液分泌調節作用における内因性プロスタグランジンの役割、プロスタグランジン生合成に及ぼす影響を明らかにした。1.セクレチン、ソマトスチタンの胃酸分泌抑制作用における内因性プロスタグランジンの役割についての研究成果(1)ラット胃内灌流モデルで、ガストリン刺激の胃酸分泌に対する生理学的な量のセクレチン、ソマトスタチンの抑制効果をインドメタシン投与の有無で検討し、セクレチンの胃酸分泌抑制作用の発現には内因性プロスタグランジンの存在が不可欠であること、胃粘膜内プロスタグランジン濃度がセクレチンにより著明に増加することを明らかにした。ソマトスタチンにはそのような効果を認めなかったことより両ホルモンの胃酸分泌抑制機序が異なることが証明された。(2)胃粘膜防御因子増強薬にセクレチン遊離作用を発見し、この薬剤をラット十二指腸に投与し血中セクレチン濃度の上昇、胃酸分泌の抑制、胃粘膜内プロスタグランジン濃度の増加を確認し、内因性セクレチンの胃酸分泌抑制作用にもプロスタグランジンが介在していることを明らかにしたとともに、これらの胃潰瘍薬の薬理作用をセクレチンの面から解明した。セクレチン、CCK膵外分泌刺激作用における内因性プロスタグランジンの役割についての研究成果(1)ラットで生理学的な量のセクレチン、CCK刺激の膵液分泌に対するインドメタシンの影響を検討したが、両ホルモンの膵外分泌刺激作用にインドメタシンは有意な影響を及ぼさず、プロスタグランジンの関与は少ないと考えられた。また膵内プロスタグランジン含量の正確な測定は多量の蛋白分解酵素のため容易でなく、測定系の確立は今後の課題としたい。ラット摘出膵をコラ-ゲナーゼ処理し作成した遊離膵腺房でアミラーゼ分泌に対するインドメタシンの効果を検討した。インドメタシン存在下でアミラーゼ分泌の著明な増加が認められ、高濃度では膵腺房細胞の破壊が顕微鏡下に確認された。従って、細胞障害を引き起こさないインドメタシン添加量を決定するための基礎実験を追加し、現在、この検討を続けている。本研究では、消化管ホルモン(セクレチン、ソマトスタチン)の生理的な胃液、膵液分泌調節作用に内因性プロスタグランジンがどのように関与しているのか、プロスタグランジン生合成に及ぼす影響を明らかにする。本年度は、まずセクレチン、ソマトスタチンの胃酸分泌抑制作用に対する胃粘膜内プロスタグランジンの役割に関する研究をすすめた。

1.ラット胃内灌流モデルで胃酸分泌をガストリンで刺激し、生理学的な量のセクレチン、ソマトスタチンの胃酸分泌抑制効果をプロスタグランジン合成阻害剤であるインドメタシン投与の有無で検討し、セクレチンの胃酸分泌抑制作用には内因性プロスタグランジンが重要な役割を果していること、ソマトスタチンについてはプロスタグランジンの関与が少ないことが明らかにされた。また、胃粘膜内プロスタグランジンE2濃度はセレクチンにより著明に増加したが、ソマトスタチンは胃粘膜内プロスタグランジン濃度に影響しなかった。以上より、両ホルモンの胃酸分泌抑制機序が異なること、セラクチンの胃酸分泌抑制という生理作用の発現には内因性プロスタグランジンが重要な役割を果していることが証明された。2.新たに胃粘膜防御因子増強薬にセクレチン遊離作用を見いだし、このセクレチン遊離薬剤をラット十二指腸に投与し血中セクレチン濃度の上昇、胃酸分泌の抑制、胃粘膜内プロスタグランジン濃度の増加を確認した。1.で示した外因性セクレチンのみならず、内因性に遊離したセクレチンについても胃酸分泌抑制作用に胃粘膜内プロスタグランジンが介在していることが明らかにされた。3.以上より、胃酸分泌抑制ホルモンであるセクレチンとソマトスタチンの作用機序が異なること、セクレチンの生理作用発現には胃粘膜内プロスタグランジンが重要な役割を果していることが証明された。消化管ホルモンとプロスタグランジンが生体で密接に関わっていると考えられた。本研究は、消化管ホルモン(セクレチン、CCK、ソマトスタチンなど)の生理的な胃液、膵液分泌調節作用に内因性プロスタグランジンがどのように関与しているのか、プロスタグランジン生合成に及ぼす影響を明らかにするためのものである。昨年度はセクレチン、ソマトスタチンの胃液分泌抑制作用に対する胃粘膜プロスタグランジンの重要な役割を明らかにし得た。本年度(平成6年度)は、膵外分泌刺激あるいは抑制機構において、消化管ホルモンとプロスタグランジンの間にどのような相互作用が存在するのかを明らかにすることを目的に研究をすすめた。1.麻酔下のラット膵管より経時的に純粋膵液が採取できるモデルを作成し、生理学的な量のセクレチン、CCKで刺激された膵液分泌が、プロスタグランジン合成阻害剤であるインドメタシン投与の有無で影響を受けるかどうかを検討した。インドメタシン投与はセクレチン、CCK刺激で増加する膵液分泌に有意な影響を及ぼさなかった。さらに、実験終了時摘出した膵でプロスタグランジン含量の測定を試みたが、膵は胃粘膜と異なり蛋白分解酵素が多量に含まれているため、プロスタグランジンの組織内濃度の正確な測定は困難であった。膵内のプロスタグランジン濃度の測定には蛋白分解酵素阻害剤処理が不可欠と考えられ、測定系の確立は今後の課題としたい。2.ラットの摘出膵をコラ-ゲナーゼ処理し遊離膵腺房を作成し、インドメタシンの膵アミラーゼ分泌に対する効果を検討した。まず、基礎分泌状態の膵腺房で実験を行ったが、培養液中にインドメタシンをある濃度で添加するとアミラーゼ分泌の著明な増加が認められ、高濃度では膵腺房細胞の破壊が顕微鏡下に確認された。従って、直接的な細胞障害を引き起こさない程度のインドメタシン添加量を決定するための基礎実験を追加することとなり、現在、この検討を続けている。3.以上より、in vivoラットではセレクチン、CCKの膵外分泌刺激作用にプロスタグランジンの関与は少ないと考えられた。
遠赤外領域の分光測定による超伝導機構の解明

Bi-Sr-Ca-Cu-Oの単結晶が得られた。この単結晶の転移温度は80Kである。a-b面の伝導度に興味を持ち、この単結晶を劈開して厚さ約5μm面積2×2mm^2の単結晶の薄膜を得た。波数340cm^<-1>及び波数15500cm^<-1>領域は、それぞれラメラー干渉計及びマイケルソン干渉計フーリエ分光計によって透過測定の実験を行った。試料温度8、50と90Kにおいて透過スペクトルが得られた。この結果は3300cm^<-1>全領域にわたって透過率は8Kが一番高く、温度が高くなるに従って透過率は低下した。また、波数依存性については3300cm^<-1>領域にわたって波数とともに吸収係数が低下した。T=80Kの上下の50Kと90Kでは、その透過スペクトルには大きな変化がなかった。一方、TimuskらはBi-Sr-Ca-Cu-O単結晶試料に関して、10300cm^<-1>領域で100±1%の反射立を観測し、300cm^<-1>に反射端を明確測定している。この反射からエネルギーギャップは300cm^<-1>であると報告されているが、本研究からあたかもgaplessであるかのような透過スペクトルが得られている。また、3300cm^<-1>の吸収係数を透過スペクトルから計算すると、波数60、130、175、240、(290)cm^<-1>の各波数にphonon吸収が観測されている。と同時にα=650・ω^<1/2>に依存する吸収スペクトルが得られた。これはphoton-induced hoppingによる吸収であると考えられる。また、転移温度Tc=80Kより十分低温での酸化物超伝導体の電気伝導度は、常伝導体の銅の伝導度よりも低い事実と考え合わせると、上式の吸収は超伝導の揺らぎ、また、超伝導体の不完全な部分での伝導がphoton-induced hoppingとして観測されていると考えられる。以上の研究から完全な単結晶の作製と透過スペクトルの研究を持続すれば、エネルギーギャプ周辺の光学伝導度が明らかにされ、また超伝導電流の揺らぎの問題が今後解決されて行くと期待している。
押込型セラミックス破壊靭性測定法の改良

押込み法によるセラミックスの靭性評価は試験片の製作が安価で操作が容易であるためよく用いられている。しかし、原理的にKIアレストを求めていること及び押込み体と試料間の摩擦が影響することなど信頼性に疑問がもたれている。一般的にみて2MPam^<1/2>以下の場合はほぼ正しいとするデ-タがあるが以上では保証が無い。本研究は第2応力の負荷によって摩擦項の補正を行い20MPam^<1/2>以上までその測定範囲を拡大する手法の検討である。第1年度では予測された成果が挙げられたがその検証には信頼出来るセラミックスの破壊靭性値が必要である。金属ではKICを正しく求めるために疲労予き裂の導入が不可欠であるとされている。しかしセラミックスに疲労予き裂を導入するためには、伝播速度の応力感受指数が20以上と大きいために低荷重負荷を余儀なくされ、所要時間は100時間を越し、実用的でないためほとんど採用さめることは無い。第2年度は△K逓減型の試験片を考案し、疲労予き裂を効率良く導入する方法を開発した。アルミナ及びステアタイトを供試材として疲労予き裂導入の試験片を用いて破壊靭性試験を行なったところそれらの測定値の間に明に試験時期に依存する違いが認められた。併せて2MPam^<1/2>程度の低靭性の場合でも疲労き裂が必要なことが示された。セラミックスの疲労や曲げ強度に水分が関与することが知られている。破壊靭性値に及ぼす大気中の温度影響はまた知られていなかったが、疲労き裂を導入した試験片を用いることによってその効果が有意であることが示された。押し込み破壊靭性試験においても測定精度の向上の結果として湿度制御が必要であることが示された。第2年度はこれら確性試験を続行するとともに、経験的であった押込み法の評価式に検討を加え、摩擦に依存しない押込み法靭性評価の基礎を確立した。本研究の目的は構造用ファインセラミックスの高温のクリープ強度を性格に評価し得る試験機を開発し、これを用いてセラミックスのクリープ試験を体系的に実施し、構造用ファインセラミックスの高温強度評価法についての指針を与えることにあり、昭和62、63年度の2年間にわたって研究を行った。高温クリープ試験機の開発にあたっては、試験温度を10001350°Cとし、この温度を長期間にわたって安定して維持し得る加熱炉として、カンタルスーパー線を用いた電気炉を採用することにより、試験片の温度分布を含めて、温度変動の所定の±0.5%の範囲内に保つことができることを確認した。荷重負荷装置には通常のクリープ試験機と同様の方法を採用したが、試験片保持部は上記の試験温度に耐えるために、耐熱性の良好な炭化ケイ素を用いて製作し、さらに荷重の偏心を防ぐための工夫を行った。クリープひずみの検出には、炉壁を貫通する検出棒を炭化ケイ素製とし、精密てこ式によるひずみ測定装置を開発して良好な結果を得た。クリープ試験は代表的な耐熱性構造用をセラミックスである炭化ケイ素と窒化ケイ素について最長30日を限度として実験を行った。その結果、炭化ケイ素については1350°Cの温度においてもクリープひずみは検出されず、その高温強度は非常に高いことが確認された。一方、窒化ケイ素は1200°C、1250°Cの温度で明らかにクリープひずみが現れ、そのクリープ曲線は金属の場合と同様三つの領域からなり、定常クリープ速度とクリープ破断寿命との間に一意的な関係があることが見出された。このことから構造用ファインセラミックスの高温クリープ強度の評価は金属の場合とほぼ同様に行い得ること、とりわけ定常クリープ速度が重要なパラメータであることがわかった。さらに、関連研究として、窒化ケイ素について常温における圧縮強度、曲げ疲労強度等についても一連の研究を行い成果を得た。

破壊靭性値に及ぼす大気中の温度影響はまた知られていなかったが、疲労き裂を導入した試験片を用いることによってその効果が有意であることが示された。押し込み破壊靭性試験においても測定精度の向上の結果として湿度制御が必要であることが示された。第2年度はこれら確性試験を続行するとともに、経験的であった押込み法の評価式に検討を加え、摩擦に依存しない押込み法靭性評価の基礎を確立した。本研究の目的は構造用ファインセラミックスの高温クリープ強度を正確に評価し得るクリープ試験機を開発し,これを用いてセラミックスの高温強度評価法に関する指針を与えることにあり、本年度を最終として2年間にわたり研究を行った。まず、過年度において予定通りクリープ試験機の開発を完了し、一連の予備実験を行ったが、本年度は代表的な耐熱性構造用セラミックスである炭化ケイ素と窒化ケイ素を用いて1350°Cまでの温度範囲で最長30日に及ぶクリープ試験を行い、実験データを解析した。その結果、炭化ケイ素は1350°Cの高温においても検知し得るクリープひずみを発生せず、巨視的には全く脆性的であり、破断はある時間を経過した後に突発的に起る。この意味で、その破壊機構は内部微小欠陥からのき裂の安定成長によるものと考えられる。また、その破断強度は次に述べる窒化ケイ素に比べてはるかに高い。これに対して、窒化ケイ素は1200°と1250°Cの温度で明らかにクリープひずみを生じ、破断ひずみは通常数%、最大で約10%に達する。得られたクリープ曲線は金属の場合と同様、第I期、第II期、第III期の三つの領域からなり、第II期の定常クリープ域が最も長期間を占める。そして、この期間における定常クリープ速度と破断寿命の間には実験範囲内で、温度によらず一意的な関係が見出される。この意味で定常クリープ速度がセラミックスのクリープ特性を考える上での最も重要なパラメータの一つである。また、定常クリープ速度と負荷応力の間には各温度において一定の関係があり、これらの点を総合して、負荷応力と定常クリープ速度、破断寿命、クリープひずみおよび温度の間に存在する解析的関係を導くことができ、セラミックスのクリープ特性を総合的に評価することができる。さらに関連研究として、窒化ケイ素の常温における圧縮強度や曲げ疲労強度についても一連の研究を行い、成果を得た。
非線形トレンドのマクロ計量分析

本年度は主に次の2つの分析で進展があった。1番目に研究計画の根幹となっているマクロ時系列データの非線形トレンドの形状について、確率トレンドの有無に依存せずに正しく検定できる方法論の論文の草稿を完成させた。論文では三角関数を基底とする非線形トレンド関数の周波数選択について、モデルに含まれる周波数の数が真の周波数の数と同じか少ない場合には、効率的な一般化最小二乗推定量の残差平方和を最小にする方法が正しい周波数を漸近的に選ぶことを証明した。また、周波数を追加する場合にSup型やMean型のワルド検定統計量を逐次的に計算することで、最終的な周波数を確定できることを証明した。この論文で提案されている方法の有用性は比較的小さいサンプルサイズを用いた実験結果からも確認され、失業率データを用いた実証分析に応用した。この論文は国際学会で報告し、学会参加者からの意見を反映させて、現在、国際学術雑誌への投稿の準備中である。2番目に実際のデータを用いたマクロ経済モデルの実証分析では、非線形DSGEモデルに基づいた自然利子率の試算の精緻化を行った。自然利子率は、完全雇用GDPに対応するような緩和的にも引締め的にもならない実質金利であり、経済構造をモデル化することで、推定することが可能である。基本モデルの結果に加えて、消費の習慣形成を考慮した場合、及びゼロ金利制約に加えて、フォワードガイダンスも含めた金融政策ルールを考慮する場合の拡張を行った。この論文は現在に国際学術雑誌に投稿中である。本研究計画はマクロ経済データ分析において直接観測できない潜在変数の非線形性に関する方法論と実証分析の2つに分けることができるが、両者ともにその研究成果が複数の学会で報告された。昨年度までの研究はおおむね順調に進捗しており、現段階で計画遂行上の問題点はない。今年度以降も計画に沿って研究を進める予定である。初年度は主に次の2つの分析で進展があった。1番目に研究計画の根幹となっている、マクロ時系列データの非線形トレンドの形状について確率トレンドの有無に依存せずに正しく検定できる方法の開発を進めた。三角関数を基底とする非線形トレンド関数を採用した場合には、基底の周波数選択の問題を解消する必要がある。実際にトレンドに非線形性がない帰無仮説の下では、三角関数の周波数が識別できない。しかし、すべての可能な周波数の組み合わせについて個別に統計量を計算し、Sup型やMean型に情報を集約することで識別の問題を回避できることが確認された。またこのようなSup型及びMean型非線形トレンド検定統計量の統計的性質を明らかにし、実証分析に用いられるサンプルサイズの下で有用であることが実験から確認された。2番目に実際のデータを用いたマクロ経済モデルの実証分析では、非線形DSGEモデルに基づいた自然利子率の推計を行った。自然利子率とは、完全雇用GDPに対応するような緩和的にも引締め的にもならない実質金利である。自然利子率は直接観測できないが、経済構造をモデル化し推定することで、金融政策決定時の有効な指標となる。ところが我が国ではゼロ金利制約に直面している期間が長く、単純な線形モデルを用いても、自然利子率を正しく把握することができない。今年度はゼロ金利制約を考慮した非線形モデルを推定することで、自然利子率の試算を行った。
複数の内分泌攪乱物質の及ぼす複合毒性作用に関する研究

人為的に産卵させたアフリカツメガエル(Xenopus laevis)に対して、内分泌攪乱物質とされる17βエストラジオール、1,2,3,4,-TCDD、2,3,7,8,-TCDD、ビスフェノールAを10^<-5>Mから10^<-12>Mの濃度で作用させ、その効果を見た。受精直後の卵に17βエストラジオール処理を行った場合、10^<-5>MにおいてSt.33から頭幅、眼福の減少、尾部のゆがみ等が顕著に見られ、St.46までにすべての胚は死亡した。ビスフェノールA、1,2,3,4,-TCDD、2,3,7,8,-TCDD、はそれぞれ単体での処理では10^<-3>Mまでの濃度ではコントロール胚との差がみられず外見にも異常は確認されなかった。しかし、10^<-5>Mの17βエストラジオール処理を行う際に、同時に10^<-7>Mの1,2,3,4,-TCDDを処理した実験群では、17βエストラジオールでの外形の変化がみられず、また、胚の生存率もコントロールと同等にまで回復した。エストラジオール処理によって生じた頭部形態の異常について、光学および電子顕微鏡による解析を行ったところ、眼球の形態に顕著な差が認められた。エストラジオール処理胚ではレンズが眼球外部に突出している。顕微鏡観察の結果、特に、角膜近傍の細胞に多くの細胞死像が認められ、これによって眼球全体の形態を維持できなくなっている可能性が示唆された。対照、およびTCDD同時処理胚ではこのような結果が認められなかった。今後は、内分泌攪乱物質と細胞死との関係に着目し、エストラジオール処理胚ではアポトーシスの検出、TCDD処理による細胞死抑制機構の探索を継続して行っていく予定である。人為的に産卵させたアフリカツメガエル(Xenopus laevis)に対して、内分泌撹乱物質とされる17βエストラジオール、1,2,3,4,-TCDD、2,3,7,8,-TCDD、ビスフェノールAを10^<-5>Mから10^<-12>Mの濃度で作用させ、その効果を見た。現在、単体毒性としてもっとも強力とされる2,3,7,8,-TCDDの17βエストラジオール処理への効果、および濃度を検討中であるほか、17βエストラジオール処理による影響を光学・電子顕微鏡により解析中である。さらに、外見からは影響の判別できないビスフェノールA、1,2,3,4,-TCDD、2,3,7,8,-TCDDの単独処理胚についても、組織細胞化学的見地から解析している。
亜鉛欠乏ラットの味蕾とアポトーシスとの関連を探る

8週齢のWistar系雄性ラット32匹を亜鉛欠乏群とコントロール群に分け使用した.実験開始後,3,6,9,12週におけるラットを4%パラホルムアルデヒド固定液にて灌流固定し,舌の有郭乳頭を摘出後,通法に従いパラフィン切片を作製した.また一部のラットについては,Halh-karnovsky固定液にて灌流固定し,試料をPoly/Bedにて包埋後,超薄切片を作製した.(1)パラフィン切片におけるH-E染色,免疫染色H-E染色による観察では,有郭乳頭中の味蕾の数,形態に実験期間を通して差異は認められなかった.またアポトーシスのマーカーであるTUNEL法を施し,有郭乳頭の味蕾1個に含まれるTUNEL陽性細胞数をカウント後,欠乏群とコントロール群でStudents T-testによる統計学的解析を行った.その結果,9週目において欠乏群においてTUNEL陽性細胞数の有意な増加が認められた.さらにアポトーシスの誘導過程において重要な役割を担っている蛋白分解酵素Caspase-3の免疫染色においても,実験群の9週目において陽性細胞数が増加している傾向が認められた.(2)透過型電子顕微鏡による検索厚さ80nmの超薄切片にウラン-鉛二重染色を施し,透過型電子顕微鏡による検討を行った.アポトーシスを呈する味細胞がマクロファージや上皮細胞によって貪食され,その貪食胞内にはクロマチンの凝集した核が観察された.しかしながら,2群における味細胞の微細構造に関して今のところ顕著な差異は認められず,さらなる検討が必要であると思われる.本研究において,8週齢Wistar系雄性ラット30匹を使用した.また実験群には亜鉛欠乏試験用飼料(オリエンタル酵母工業),コントロール群にはMF粉末飼料を用いた.1.肉眼的所見実験開始直後より2群において体重増加,摂餌量に差異を認めた.実験群の体重増加はコントロール群と比較すると緩徐な増加傾向であった.また実験開始3週目頃より実験群では体毛が立毛したり頚部において部分的な脱毛の認められるラットが出現した.2.組織形態学的評価実験開始後3,5,7週目に各群より5匹ずつ選択し,4%パラホルムアルデヒド固定液にて灌流固定後,舌を摘出した.それらの試料は通法通りパラフィンへ包埋後,有郭乳頭を含む部位にて前頭断に薄切し,パラフィン切片を作成した.それらのパラフィン切片にTUNEL法用いて解析を行った.実験開始3週目では実験群において味蕾内の味細胞また乳頭溝の側壁上皮内に存在する上皮細胞にTUNEL陽性細胞が確認された.それらの細胞中には細胞核においてクロマチン凝集によるアポトーシスの形態変化が認められる細胞が存在し,染色性においては強陽性所見を呈していた.実験開始7週目では実験群においてTUNEL陽性を呈する細胞は味蕾内で増加しており,コントロール群ではTANEL陽性を呈する細胞は散在する程度であった.また実験群においては有郭乳頭内の味蕾数は減少する傾向であった.本研究では,8週齢Wistar系雄性ラット24匹を用いた.実験群には亜鉛欠乏試験用飼料(オリエンタル酵母工業),コントロール群にはMF粉末飼料を用いた.なお,実験期間中は食餌摂食量,飲水量に関して特に制限を設けず,自由に摂取できる環境下で飼育した.1.肉眼的所見実験開始3週目頃より,実験群とコントロール群との体重増加に差が生じ,実験群ではかなり緩やかな体重増加傾向を示した.また実験群では3週目頃より体毛の立毛が認められ,さらに実験期間が延びるにつれて頚部,背部における脱毛や眼瞼周囲に皮膚症状を生じるラットも出現した.2.組織形態学的所見実験開始後,3,6,9週で4%パラホルムアルデヒド固定液にて灌流固定を行い,舌の有郭乳頭を含む部分を摘出した.これらの試料は通法に従いパラフィン包埋を行い,厚さ4.5μmのパラフィン切片を作製後,H-E染色,TUNEL法による免疫染色を行った.H-E染色では実験群において経時的に多少の味蕾数の減少が認められたが,味蕾の形態には差異が認められなかった.またTUNEL法による染色では,実験群においてTUNEL陽性を呈する細胞数が経時的に増加している傾向があり,中にはクロマチンの凝集やアポトーシス小体の形成など特徴的な像を示しているものも観察された.実験開始3,9週において味蕾1個に含まれるアポトーシス陽性細胞の数を算出し,統計処理を行ったところ,実験群において有意差が認められた.また一部の試料はPoly/Bedに包埋し,超薄切片を作成し,透過型電子顕微鏡にてアポトーシスの微細構造,また基底細胞の動態およびその周囲に存在する神経線維との関連について検討中である.8週齢のWistar系雄性ラット32匹を亜鉛欠乏群とコントロール群に分け使用した.実験開始後,3,6,9,12週におけるラットを4%パラホルムアルデヒド固定液にて灌流固定し,舌の有郭乳頭を摘出後,通法に従いパラフィン切片を作製した.また一部のラットについては,Halh-karnovsky固定液にて灌流固定し,試料をPoly/Bedにて包埋後,超薄切片を作製した.(1)パラフィン切片におけるH-E染色,免疫染色H-E染色による観察では,有郭乳頭中の味蕾の数,形態に実験期間を通して差異は認められなかった.またアポトーシスのマーカーであるTUNEL法を施し,有郭乳頭の味蕾1個に含まれるTUNEL陽性細胞数をカウント後,欠乏群とコントロール群でStudents T-testによる統計学的解析を行った.

その結果,9週目において欠乏群においてTUNEL陽性細胞数の有意な増加が認められた.さらにアポトーシスの誘導過程において重要な役割を担っている蛋白分解酵素Caspase-3の免疫染色においても,実験群の9週目において陽性細胞数が増加している傾向が認められた.(2)透過型電子顕微鏡による検索厚さ80nmの超薄切片にウラン-鉛二重染色を施し,透過型電子顕微鏡による検討を行った.アポトーシスを呈する味細胞がマクロファージや上皮細胞によって貪食され,その貪食胞内にはクロマチンの凝集した核が観察された.しかしながら,2群における味細胞の微細構造に関して今のところ顕著な差異は認められず,さらなる検討が必要であると思われる.