hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GC療法による術前化学療法の薬学的バイオマーカーを用いた個別化療法の確立

本研究の目的は、化学療法前後の腫瘍に発現している薬学的バイオマーカーの動態を解析し、筋層浸潤性膀胱癌患者におけるGC療法を用いた術前化学療法における薬学的バイオマーカー候補物質の有用性を検証することである。これまで、我々は、ゲムシタビンに対する有力なバイオマーカーの候補物質としてhENT1がゲムシタビンに対する強力なpositive regulatory proteinである可能性を報告してきた。これらの知見をさらに発展させるためには、複数のバイオマーカーの発現を組み合わせて解析することが必要である。本研究初年度の平成28年度については他の有力な薬学的バイオマーカーを同定することを目的とした。我々が着目したバイオマーカーは、ゲムシタビンのバイオマーカーとしてRRM1およびシスプラチンのバイオマーカーとしてERCC 1である。当院においてGC療法を施行した進行性膀胱癌患者の化学療法前の膀胱癌組織に発現しているRRM1とERCC1について免疫組織染色法を用いて評価し各種臨床病理学的因子との関連を解析した。本内容について下記論文に報告した。本研究初年度の達成目標は、hENT以外の有力な薬学的バイオマーカーを同定することであった。これまでの研究結果から、我々が着目したバイオマーカーの一つであるRRM1は、GC療法を施行する進行性膀胱癌患者においてnegative regulatory proteinである可能性が示唆された。hENT1とともにRRM1もゲムシタビンの効果を予測する上での有力なバイオマーカー候補物質であることを見出したことで、本研究は概ね順調に進展しているものと考えられる。Overexpression of ribonucleotide reductase subunitM1 protein predicts shorter survival in metastatic bladdercancer patients treated with gemcitabine-containing combinationchemotherapy. Matsumura N, Nakamura Y, Kohjimoto Y, Nishizawa S, Kikkawa K, Iba A, Kodama Y, Hara I. Int J Urol. 2017 Mar; 24(3):230-235.本研究の目標は、hENT以外の有力な薬学的バイオマーカーを同定することである。これまでに施行してきた後ろ向き研究で得られた結果において、我々が着目したバイオマーカーの一つであるRRM1は、GC療法を施行する進行性膀胱癌患者においてnegative regulatory proteinである可能性が示唆された。本バイオマーカー候補物質の信頼性を向上させるためには、前向き研究によって得られた結果によって妥当性を検証する必要がある。現状においては、前向き研究に必要不可欠な症例登録が予定よりもやや遅れているものの、研究は開始されており凍結切片からのmRNAの抽出も開始しており、おおむね順調に進展しているものと認識している。本研究の最終的な目的は、化学療法前後の腫瘍に発現している薬学的バイオマーカーの動態を解析し、筋層浸潤性膀胱癌患者におけるGC療法を用いた術前化学療法における薬学的バイオマーカー候補物質の有用性を検証することである。これまでの後ろ向き研究で、ある程度研究成果が得られてきている。今後問題となるのは、前向き臨床研究である。すなわち、筋層浸潤性膀胱癌患者から同意を得たのちに手術材料を用いバイオマーカー候補物質の発現を調べ抗癌剤感受性の予測を行う研究を開始する予定である。術前化学療法としてGC療法を施行した後にフォローアップを行い、近接効果、非進展生存率、疾患特異的生存率、全生存率に関する情報を収集し、バイオマーカーの発現が予後予測因子となり得るか否かにつき統計学的に多変量解析を行う予定である。これまで施行してきた後ろ向き研究において、ある程度研究成果が得られてきている。今後の課題としては、前向き臨床研究による結果の妥当性の検証である。現状、多施設共同研究として前向き研究が開始されいる。ただし、症例登録にやや苦慮しているのも事実である。今後、解析に必要な症例数に到達するのには、もう少し時間を要するものと考えている。推進方策としては、研究参加施設に対して転移性尿路上皮癌患者の本研究へのリクルートを奨励していくことが肝要であると考えている。また、不十分な症例数の時点においてもpreliminaryな研究成果を発表していく必要があると考えている。本研究の裏付け実験として当初予定していた膀胱癌細胞を用いた基礎研究の進捗状況が、予想以上に悪く、関連する試薬などの購入を差し控えたことが主たる原因であると考えている。

前向き研究に関する症例登録が、少し遅れており次年度使用額が発生している。今後実験に関する消耗品(mRNA抽出などに関する試薬)や前向き研究の症例登録に必要な郵送費などに使用する予定である。現在、裏付け研究としての基礎研究が必要か否か検証中である。必要な場合は、次年度に試薬購入などに利用する予定である。裏付け研究が不要と判断した場合は、前向き臨床研究の予算に回す計画である。
唾液腺腫瘍における癌抑制遺伝子Maspinに関する研究

1.ヒト唾液腺由来細胞におけるMaspinの発現とp53による発現調節ヒト顎下腺由来唾液腺癌細胞(HSG)とヒト耳下腺癌細胞(HSY)のp53は野生型であり、転写活性化能を保有するとともに、Maspinの発現を認めた。SV40 DNAの導入により不死化したヒト唾液腺細胞(NS-SV-DC,NS-SV-MC)のp53は野生型であったが、転写活性化能が消失しており、Maspin発現の低下を認めた。すなわち、ヒト唾液腺細胞におけるMaspinの発現には、p53が重要な役割を担っていることが示唆された。2.HSG細胞およびHSG-AZA1細胞におけるMaspinの発現HSG細胞およびHSG細胞を5-Azacytidineで処理することにより分化誘導され筋上皮細胞の表現形質を持つHSG-AZA1細胞を用いて、Maspinの発現を検索した。これらの細胞は、Maspin遺伝子・蛋白を発現しており、Maspin遺伝子に点変異(A271G→Ile66Val)が検出された。両細胞とも、Maspin蛋白は細胞質に局在し、その発現量には差が見られなかった。3.酪酸ナトリウムによる筋上皮細胞への分化誘導に及ぼすMaspinの影響酪酸ナトリウムによりHSG細胞の分化を誘導したが、Maspinの発現量には変化が見られなかった。また、Maspin遺伝子のアンチセンス導入により、HSG細胞のMaspin発現量を低下させたが、酪酸ナトリウムによる分化誘導には影響を及ぼさなかった。2と3の結果より、唾液腺細胞において、筋上皮細胞への分化には、Maspinが関与しないことが示唆された。4.ヒト唾液腺腫瘍におけるMaspinの発現唾液腺良性腫瘍において、上皮細胞では細胞質に、多形性腺腫の筋上皮細胞では、核にMaspinの発現を認めた。また、唾液腺悪性腫瘍において、Maspinの発現が低下していたことより、唾液腺腫瘍においても、悪性化に伴いMaspinの発現が低下することが示唆された。本年度の研究では,初代培養唾液腺細胞,唾液腺癌細胞株(HSG, HSY, TYS),HSG細胞を脱メチル化剤で処理することにより得られた細胞株(HSG-AZA1),SV40mtantDNAの導入により不死化した唾液腺細胞株(NS-SV-DC, NS-SV-MC)および唾液腺良性腫瘍(多形性腺腫,ワルチン腫瘍),唾液腺悪性腫瘍(腺様嚢胞癌,腺癌),正常唾液腺におけるmaspinの発現を検索し,p53との関連性につき検討した。その結果,初代培養唾液腺細胞,HSG, HSG-AZA1, HSY, TYS, HSG-AZA1およびNS-SV-DC細胞において,細胞質にmaspinの発現を認めた。NS-SV-DC細胞はmaspinの発現量が低下しており,NS-SV-MC細胞はmaspinを発現していなかった。また,初代培養唾液腺細胞では,筋上皮細胞にmaspinの発現を認めた。HSG, HSG-AZA1およびHSY細胞のp53は,core domainに変異は見られず転写活性化能を保有していたが,NS-SV-DCとNS-SV-MC細胞のp53は,SV40T抗原との結合により転写活性化能が低下していた。

TYS細胞のp53は,core domainに点変異を有しておりP53の分解遅延を認めたが,転写活性化能を保有していた。正常唾液腺,多形性腺腫およびワルチン腫瘍では,上皮細胞の細胞質にmaspinの発現を認め,P53は検出されなかった。また,正常唾液腺および多形性腺腫では,筋上皮細胞にmaspinの高発現を認めた。腺様嚢胞癌および腺癌では,腫瘍細胞にmaspinの発現を認めず,P53が染色される腫瘍細胞が散在していた。以上の結果より,唾液腺細胞および唾液腺良性腫瘍はmaspinを発現していることが示された。また,唾液腺細胞においても,maspinの発現にp53が関与していることが示唆された。1.ヒト顎下腺由来唾液腺癌細胞(HSG)およびHSG細胞を5-Azacytidineで処理することにより分化誘導され筋上皮細胞の表現形質を持つHSG-AZA1細胞を用いてMaspinの発現を検索した。すなわち、RT-PCRにより、Maspin遺伝子open reading frameの全長を増幅し、塩基配列を検索することにより、これらの細胞がMaspin遺伝子を発現していることを確認した。なお、これらの細胞のMaspin遺伝子は点変異(A 271 G)を有し、コドン66番目のイソロイシンがバリンに置換されていた。Maspin蛋白は、Western blottingにより分子量42kDの単一のバンドとして検出され、HSG細胞とHSG-AZA1細胞におけるMaspinの発現量には、差が見られなかった。また、免疫組織学的染色により、Maspin蛋白は細胞質に局在を認め、核には発現を認めないことを明らかにした。2.酪酸ナトリウムによりHSG細胞の筋上皮細胞への分化を誘導したが、Maspinの発現量には変化が見られなかった。また、Maspin遺伝子のアンチセンス導入により、HSG細胞のMaspin発現量を低下させたが、酪酸ナトリウムによる分化誘導には影響を及ぼさなかった。1と2の結果より、唾液腺細胞において、筋上皮細胞への分化には、Maspinが関与しないことが示唆された。3.唾液腺良性腫瘍(多形性腺腫、Warthin腫瘍)において、上皮細胞の細胞質にMaspinの発現を認めた。また、正常唾液腺の筋上皮細胞では、細胞質と核にMaspinの発現を認めたが、多形性腺腫の筋上皮細胞では、核にMaspinの発現を認めた。唾液腺悪性腫瘍(腺様嚢胞癌、粘表皮癌、管状腺癌)において、Maspinの発現は低下しており、特に、腺様嚢胞癌では発現が見られなかった。この結果より、唾液腺腫瘍においては、悪性化に伴いMaspinの発現が低下することが示唆された。
未就学児の潜在的文字学習評価に基づく発達性ディスレクシアの早期発見と介入法の確立

未就学児の潜在的な文字学習について更なる検討を行うため,拗音を用いた行動課題を作成し,幼稚園および保育園の年長児のデータを収集した。方法として,拗音を含む言葉の(例:おもちゃ)の拗音部分(ちゃ)を隠し,その部分に当てはまる文字を正しい拗音,拗音の清音表記,誤った拗音の中から選択してもらった。合わせて,課題で提示した拗音の単語をいくつ読めるかを調べ,拗音表記の潜在的な学習(選択課題)と読みの対応関係を調べた。その結果,拗音の音読を獲得していない子どもでも,選択課題ではチャンスレベル以上の正答を示す児が一定数おり,音読できる以前にも文字に対する認識を持っていることが,昨年度に引き続き明らかになった。文字学習の脳機能評価については,測定法の改良を進めたところ,計測時に参加者に求める課題の内容が事象関連電位に影響することが示された。さらに,就学前の文字に対する認識と,就学後の読みの力の関連を調べるため,昨年度以前に本研究に参加した子ども(今年度:小学校12年生)を対象に追跡調査を行った。その結果,幼稚園/保育園の年長時に文字認識の弱さを示した子どもは,小学校1年生時点でひらがな音読の正確性および速度が低下しており,2年生になっても音読の困難が持続することが示された。これらより,未就学時点での文字学習の低下は,小学校入学後に発達性ディスレクシアおよび類似の特性を示し得る子どもの重要な兆候であることが示され,早期発見の手立てとして今後一層の精緻化および一般化を図っていく必要があると考えられた。未就学児における文字学習を評価するための脳機能および行動指標を作成した。主な対象者は成人と小学生であり、未就学児における文字学習評価の準備的な研究として、学校における正式な文字学習の結果を評価出来る指標の確立を進めた。脳機能評価では成人を対象とし、ひらがなの文字列(有意味語・無意味語)に対する事象関連電位の初期成分を測定した。目的はそれらに反映される文字列処理の処理単位を明らかにすることであり、文字列を1まとまりとして行われる処理と、文字列中の1つ1つの文字に対して行われる処理のどちらを反映するか検討した。その結果、文字列に対する事象関連電位の初期成分には文字列中の個々の文字の処理を反映するものがあることが示唆された。文字学習の初期段階では文字列中の文字を1つずつ認識していくことが知られており、上記の反応はそうした初期の文字学習を評価する脳機能指標として有用と考えられる。行動指標の作成では小学生を対象とし、文字を用いた課題での反応時間と音読成績、および注意等の個人特性に関する検討を行った。その結果、反応時間は文字学習の程度(音読成績)だけでなく注意特性とも関連する可能性が示唆された。従って、文字の学習や処理については今後、注意の要因も含めて検討・評価する必要がある。文字を習得する途上の読み手(小学生)、および文字習得が完成した読み手(成人)において得られた結果は未就学児の評価基準を確立する上で重要な成果であり、今後はこれらを基に未就学児のデータ収集を進めていく。未就学児の文字学習を評価する方法について、成人と小学生を対象とした研究から測定手法と指標が示されつつある。しかし、評価課題やパラダイムの確立と予備データの収集・解析に当初の予定よりも時間を要したため、実際の未就学児への適用とデータ収集が計画通りに進んでいない。そのため、計画よりもやや遅れていると評価した。未就学児を対象とした読み習得状況の調査,成人を対象とした文字処理の基礎的検討,および文字の学習に伴う脳機能変化の検討を行った。未就学児については,潜在的な文字学習評価の予備的知見として,顕在的な読み(ひらがな音読)がどの程度可能であるかを調査した。その結果,年長児(5-6歳)の大多数はひらがな文字のほとんどを音読出来ることが分かり,潜在的な文字学習はそれ以前の発達段階から進んでいることが示唆された。この結果から,より低年齢の未就学児を対象として文字学習を評価出来る指標および手法の開発が求められたため,次年度にかけて進めていく予定である。成人を対象とした基礎的検討では,ひらがなで書かれた文字列(単語・無意味語)に対する事象関連電位を測定し,文字単語の学習に関わる神経応答を探索した。その結果,成人は単語を見た直後に,語頭文字に注意が向くことが分かり,文字や読みの学習により形成された注意および神経応答の特性であることが示唆された。この成果については,国際学会で発表を行った。同様の特性は,文字を潜在的に学習しつつある未就学児にも存在する可能性があり,成人の実験手法および知見の応用を検討している。文字の学習に伴う脳機能変化については,子どもを対象として新規な文字の読み指導を行い,その前後で事象関連電位の変化を調べた。その結果,学習は文字に対する初期の視覚誘発反応を増強させ,文字と文字ではない記号に対する脳活動の差異を拡大させる事が示された。これらの変化は文字学習の神経基盤と考えられ,未就学児の検討において有用な指標になることが期待される。この成果については国際誌に原著論文として投稿中であり,国際学会での発表も予定している。文字学習の評価方法に関わる基礎的知見が蓄積されつつあり,文字学習に伴う脳機能変化についても解明を進めることが出来た。未就学児を対象とした検討においてもデータの収集および評価方法の改良を進めることが出来たため,おおむね順調に進展していると評価した。

未就学児を対象として,行動指標を用いた潜在的な文字学習の検討を行った。方法として,幼稚園および保育園の年中児・年長児に,よく知っている言葉の1文字を隠したものと,その言葉に対応する絵を見せ,隠されている文字を選択肢の中から選んでもらった。これと合わせて,参加児がひらがなを何文字音読出来るかを調査し,潜在的な文字の学習(選択課題)と顕在的な読み(音読)の対応関係を調べた。その結果,ほとんどもしくは全てのひらがなを音読出来た参加児では選択課題もほぼ満点であったが,読めるひらがなが半数未満であるにも関わらず,選択課題ではチャンスレベル以上の正答率を示した児が一定数いた。ひらがなが全く読めない(10文字以下)子どものほとんどは,選択課題もチャンスレベルの成績であった。このことから,まだひらがなを読めない未就学児でも言葉の中の文字についてはある程度の認識を持っていることが示された。今年度の研究で用いた上記課題は日常場面でも実施出来る簡便なものであり,実施時間も数分以内と非常に短い。そのため,年少の未就学児にも適用出来る,潜在的な文字学習評価の指標が得られたと言え,発達性ディスレクシアの早期発見にも寄与することが期待される。ただし,今年度は年長(5-6歳)の参加児が多かったため,多くの子どもがほとんどのひらがなを音読出来ており,文字を潜在的に学習している段階にある子どもの絶対数は少なかった。そのため,年中(4-5歳)以下の参加児でデータ収集を継続していく必要があると考えられた。未就学児における潜在的な文字学習の一端を明らかにすることができ,多くの子どもを簡便に評価出来る行動指標の確立に向けて一定の成果が得られた。今後の検証が必要ではあるが,未就学児を対象としたデータ収集と評価方法の開発を更に進めることが出来たことから,おおむね順調に進んでいると評価した。未就学児の潜在的な文字学習について更なる検討を行うため,拗音を用いた行動課題を作成し,幼稚園および保育園の年長児のデータを収集した。方法として,拗音を含む言葉の(例:おもちゃ)の拗音部分(ちゃ)を隠し,その部分に当てはまる文字を正しい拗音,拗音の清音表記,誤った拗音の中から選択してもらった。合わせて,課題で提示した拗音の単語をいくつ読めるかを調べ,拗音表記の潜在的な学習(選択課題)と読みの対応関係を調べた。その結果,拗音の音読を獲得していない子どもでも,選択課題ではチャンスレベル以上の正答を示す児が一定数おり,音読できる以前にも文字に対する認識を持っていることが,昨年度に引き続き明らかになった。文字学習の脳機能評価については,測定法の改良を進めたところ,計測時に参加者に求める課題の内容が事象関連電位に影響することが示された。さらに,就学前の文字に対する認識と,就学後の読みの力の関連を調べるため,昨年度以前に本研究に参加した子ども(今年度:小学校12年生)を対象に追跡調査を行った。その結果,幼稚園/保育園の年長時に文字認識の弱さを示した子どもは,小学校1年生時点でひらがな音読の正確性および速度が低下しており,2年生になっても音読の困難が持続することが示された。これらより,未就学時点での文字学習の低下は,小学校入学後に発達性ディスレクシアおよび類似の特性を示し得る子どもの重要な兆候であることが示され,早期発見の手立てとして今後一層の精緻化および一般化を図っていく必要があると考えられた。
直腸肛門奇形術後症例における失禁原因の解明及びその対策

鎖肛術症例の失禁に対する恥骨直腸筋、外肛門括約筋、大殿筋の役割として平成5年度の研究結果を考察し、以下の結論が得られた。1.恥骨直腸筋は正常人が通常の便意をこらている状態ではForward angulationへの関与だけでなく直腸を左右方向から収縮させていた。鎖肛術後症例でClinical scoreが良好な者でも直腸は円形にではなく、左右方向に狭い防錘形に収縮していた。この形は恥骨直腸筋群にそった形態変化であり、恥骨直腸筋自体の収縮力の重要性を示すものであった。従って鎖肛術後症例でClinical scoreが良好であるためには引き抜きかれた腸管が肛門拳筋群の中を通り、かつ恥骨直腸筋に収縮力が有ることが必須の条件といえた。また恥骨直腸筋群の失禁にたいする作用はForward angulationをつくることより直腸を収縮させることに重要性がある事も判明した。2.外肛門活約筋の鎖肛術後症例における失禁に対する役割は、負荷前後の肛門管径の変化とClinical scoreとの間に明らかな相関は見出せなかったこと、肛門管下部横断像及び肛門管矢状断像で外肛門括約筋の特異的変化を指摘しえなかったことから、少ないものと考えられた。3.大臀筋の役割については、その収縮は術後排便機能良好群では顕著で、不良群ではそれを認めなかったことから、恥骨直腸筋、外肛門活約筋だけでは便を保持できない場合に失禁を防止する役割を担っている事が示唆された。鎖肛術後症例における大臀筋の役割は今まで重要視されてこなかったが、大臀筋を収縮させることで鎖肛術後患者では失禁を回避しうる一因となっている事が判明したわけで、この知見をもとに排便機能不良群にバイオフィードバックトレーニッグで学習させたところ、1例において失禁の改善を認めた。現段階で得られた知見の概要は以下のとうりである。正常人:安静時と排便こらえ時の比較で、浣腸刺激では肛門挙筋は5±3.9mm、肛門管は横径で2.1±1.8mm、前後径で1.6±2.4mm、大臀筋は4.1±5.0mm拡大した。バルーン刺激では恥骨直腸筋群は3.7±2.9mm収縮し、肛門管は横径で0.6±0.7mm拡張し、前後径で0.3±2.6mm収縮した。大臀筋は1.7±4.0mm拡大した。鎖肛術後症例:臨床的肛門機能評価点(Clinical score)4点であったものは全例恥骨直腸筋群の5mm以上の収縮と大臀筋の10mm以上の拡張を認めた。肛門管の横径は1例で4mm拡張し、1例で3mm拡張した。前後径はいずれも3mm、1mm減少した。Clinical score0点のものでは恥骨直腸筋群は3例で2-7mmの拡張を認め、1例でmmの収縮をみとめた。大臀筋は1例で2mmの拡張をみとめたが、他の3例では変化を認めなかった。。肛門管は1例で4mmの横径拡張を、1例で3mmの横径収縮を認めた他は変化を認めなかった。以上の知見をまとめると,1)正常例では通常の排便こらえ時に肛門管上部は恥骨直腸筋によって左右方向に収縮する。浣腸刺激下では肛門管は前後左右両方向に収縮する。大殿筋は浣腸刺激時に収縮する。

2)鎖肛術後症例のうち,無失禁例では恥骨直腸筋及び大臀筋の収縮が良好で,失禁例ではそれらを認めなかった。内外肛門括約筋に対しては特異的所見を認めなかった。従って,失禁に関する限り上記二筋肉が重要な役割を担っていると推察される。鎖肛術後症例の失禁に対する恥骨直腸筋、外肛門括約筋、大殿筋の役割として平成5年度の研究結果を考察し、以下の結論が得られた。1.恥骨直腸筋は正常人が通常の便意をこらえている状態ではForward angulationへの関与だけでなく直腸を左右方向から収縮させていた。鎖肛術後症例でClinical scoreが良好な者でも直腸は円形にではなく、左右方向に狭い紡錘形に収縮していた。この形は恥骨直腸筋群にそった形態変化であり、恥骨直腸筋自体の収縮力の重要性を示すものであった。従って鎖肛術後症例でClinical scoreが良好であるためには引き抜かれた腸管が肛門挙筋群の中を通り、かつ恥骨直腸筋に収縮が有ることが必須の条件といえた。また恥骨直腸筋群の失禁にたいする作用はForward angulationをつくることより直腸を収縮させることに重要性がある事も判明した。2.外肛門括約筋の鎖肛術後症例における失禁に対する役割は、負荷前後の肛門管径の変化とClinical scoreとの間に明らかな相関は見出せなかったこと、肛門管下部横断像及び肛門管矢状断像で外肛門括約筋の特異的変化を指摘しえなかったことから、少ないものと考えられた。3.大臀筋の役割については、その収縮は術後排便機能良好群では顕著で、不良群ではそれを認めなかったことから、恥骨直腸筋、外肛門括約筋だけでは便を保持できない場合に失禁を防止する役割を担っている事が示唆された。鎖肛術後症例における大臀筋の役割は今まで重要視されてこなかったが、大臀筋を収縮させることで鎖肛術後患者では失禁を回避しうる一因となっている事が判明したわけで、この知見をもとに排便機能不良群にバイオフィードバックトレーニングで学習させたところ、1例において失禁の改善を認めた。
PNA-PCRクランピング技術を用いた植物根圏の糸状菌フロラ解析法の確立

土壌の微生物群集の解析には,培養することなく,直接抽出した核酸をPCR法で増幅して解析する手法が多く用いられている。しかし,この方法を植物根圏の微生物群集に適用する場合には,植物由来の核酸の混入が,障害となってくる。すなわち,特異的なPCRプライマーが存在しないため,微生物群集のSSUrDNAをPCR増幅する場合,同時に植物由来のSSUrDNAも増幅され,その解析が妨げられる。そこで,本研究では,植物根圏の微生物群集とくに糸状菌群の解析法を確立するため,PNAによるPCRクランピング法を組み合わせることにより,この障害を回避することを目的とした。SSUrDNAの配列データベースが充実している細菌を対象として,群集解析に適用可能なPNAとして,植物ミトコンドリア特異的PNA(Mit1492)およびプラスチド特異的PNA(Pla1492)を作製した。これら2種類のPNAを用いた植物根圏の細菌群集構造解析法の有効性を確かめるために,土壌で栽培した植物根圏からビーズ法で直接抽出したDNAをサンプルとして,T-RFLP法にて根圏の細菌群集構造の解析をおこなった。従来のT-RELP法では,植物オルガネラSSU rDNAの大きなT-RFピークが細菌群集構造の解析を妨げた。一方,PNA-PCRクランピングによるT-RFLP法では,植物根由来のDNAの影響を受けることなく,細菌DNAのみを解析できることが確認できた。ここで確立した手法の糸状菌群集構造解析への適用を試みたが,糸状菌群集解析への適用については,糸状菌データデータベースの不十分さなどにより,適したPNAを作製することができなかった。PNA-PCRクランピング技術は,植物根圏の微生物群集構造を解析する場合に,有効な手法であることが示されたが,糸状菌群集についてはさらに検討する必要性が示唆された。土壌の微生物群集の解析には,培養することなく,直接抽出した核酸(DNA,RNA)をPCR法で増幅して解析する手法が多く用いられている。すなわち,特異的なPCRプライマーが存在しないため,微生物群集のSSU rDNAをPCR増幅する場合,同時に植物由来のSSU rDNAも増幅され,その解析が妨げられる。そこで,本研究では,植物根圏の微生物群集とくに糸状菌群の解析法を確立するため,PNA(Peptide Nucleic Acid)によるPCRクランピング法を組み合わせることにより,この障害を回避する研究を進めている。本年度は,SSU rDNAの配列データベースが充実している細菌を対象として,群集解析に適用可能なPNAの作製を試みた。代表的な細菌種,植物ミトコンドリア,プラスチドのSSU rDNAのアライメントデータをもとに細菌SSU rDNA用プライマーと競合する位置でなおかつミトコンドリアあるいはプラスチドに特異的な領域を検索した。その結果,細菌SSU rDNA用プライマー1492rと競合する位置にミトコンドリア特異的PNA(Mit1492)およびプラスチド特異的PNA(Pla1492)を設計することができた。次に,これら2種類のPNAの植物種に対する適用範囲をSSU rDNAデータベース(RDP-II Release9)を対象に調査した。また,細菌種に対する適用範囲も同様に調査したところ,約12万のデータのうちMit1492では0%,Pla1492では0.01%の細菌種にしか一致せず,植物根圏の細菌群集構造解析に適用可能であると考えられた。

土壌の微生物群集の解析には,培養することなく,直接抽出した核酸をPCR法で増幅して解析する手法が多く用いられている。しかし,この方法を植物根圏の微生物群集に適用する場合には,植物由来の核酸の混入が,障害となってくる。すなわち,特異的なPCRプライマーが存在しないため,微生物群集のSSU rDNAをPCR増幅する場合,同時に植物由来のSSU rDNAも増幅され,その解析が妨げられる。そこで,本研究では,植物根圏の微生物群集とくに糸状菌群の解析法を確立するため,PNA(Peptide Nucleic Acid)によるPCRクランピング法を組み合わせることにより,この障害を回避することを目的とした。前年度に,SSU rDNAの配列データベースが充実している細菌を対象として,群集解析に適用可能なPNAとして,植物ミトコンドリア特異的PNA(Mit1492)およびプラスチド特異的PNA(Pla1492)を作製した。そこで今年度は、これら2種類のPNAを用いた植物根圏の細菌群集構造解析法の有効性を確かめるために,土壌で栽培した植物根圏からビーズ法で直接抽出したDNAをサンプルとして,T-RFLP法にて根圏の細菌群集構造の解析をおこなった。従来のT-RFLP法では,植物オルガネラSSU rDNAの大きなT-RFピークが細菌群集構造の解析を妨げた。一方,PNA-PCRクランピングによるT-RFLP法では,植物根由来のDNAの影響を受けることなく,細菌DNAのみを解析できることが確認できた。しかしながら,糸状菌群集解析への適用については,適したPNAを作製することができなかった。PNA-PCRクランピング技術は,植物根圏の細菌群集構造を解析する場合に,有効な手法であることが示されたが,糸状菌群集についてはさらに検討する必要性が示唆された。
戦後日本における宗教系大学をめぐる宗教運動・政治運動の関係史

本研究の目的は、宗教系大学の学生による宗教運動と政治運動の大学に対する主張と、それに対する大学側の反応を明らかにすることで、戦後日本における大学のあり方と大学が置かれていた文脈を問い直すことである。具体的には、(1)政治運動(団体)の宗教系大学への主張、(2)宗教運動(団体)の宗教系大学への主張、(3)大学および個別大学の学生の反応と帰結を、明らかにすべき課題として設定している。平成30年度(1年目)においては、分析枠組みを構築するための先行研究の整理および、運動団体についての史資料の収集と分析を行うことで、次年度以降の分析の基礎を固めた。具体的には、社会運動論・社会運動史、および大学史・教育社会学の先行研究を収集・整理し、また、各種の社会運動団体の機関誌および個別の大学の学校史や学報などの資料の収集・整理も行った。とくに、(1)社会運動論・社会運動史の研究成果を参照することによって既存の教育社会学分野における研究への貢献が可能であるという見通しがついたこと、(2)主にYMCA関係の資料について分析・発表することを通じて社会運動・キリスト教・大学の関係史を分析する際の座標軸を設定することができたこと、(3)戦前期を対象とした研究も参照することによって戦後日本の文脈を広く捉えることができたことを、実績として挙げることができる。これら実績は、次年度に行う団体のケーススタディおよび大学関係の資料の分析を行う際の基盤として重要だと考える。近年進展している社会運動論・社会運動史の研究成果を参照することによって、教育社会学における知見との差異や関係を明らかにするという課題を、研究開始以前よりも明確に見出すことができた。また、とくにYMCAの機関誌を分析したことによって、次年度以降に行う分析のモデルを作成することができた。他方で、運動団体の機関誌の収集は容易ではなく、設定した研究計画よりもやや広い範囲について調査を行う必要があるという課題が見えてきたが、概ね研究計画通りに行うことが可能だと考えている。平成31年度(令和元年度)は、引き続き資料・研究の収集・整理を行いながら、特定の社会運動団体・大学の資料を分析する予定である。また、学会発表を3回以上行うとともに、論文を投稿することにより、社会に成果を発信していく予定である。購入予定であった図書の発行が遅れ、年度内に購入することができなかったため。翌年度に購入する予定である。
自然の音環境の構造の解析-快適音環境創造のための分析および評価方法について-

自然の音環境の構造を明らかにするために、平成5年度は地域生態系の生命活動を反映するような音環境の区分と、音環境の要素の抽出と分類に関する有効で能率的な方法を検討し、平成6年度には以上のまとめと、個々の音環境の音空間における種の分布の特徴の検討と水辺の自然環境の保全のための音による生物学的多様性の指標の予備的な考察を予定している。平成5年度の成果は、次のとおりである。(1)資料収集活動では、利根川の流域調査により、川辺の音環境の基本的な資料(録音・環境写真・諸環境条件)が大方そろった。房総および関連地域の森林ならびに農村と都市の音環境と併せて、音環境の区分に関する検討に必要な基礎材料が整備された。(2)資料整理では、利根川については地点ごとに十分な整理が進んたが、他地域のものの中に整理が不十分なものがあって、資料全体を能率的に検討するにはまだ作業がたりない。ただし、整理の仕方について先に成果を見ているので、今後の進展が期待される。(3)資料分析では、利根川流域の音環境資料について、構成要素の分類整理を終了した。対象とした音源は自然から人間社会までを含み、とくに鳥類・両生類・昆虫類・風などによる植物の音について、種類数と構成を検討した。房総の森林・農村・都市における同様な検討の結果、とくに動物が発生する音については環境区分ごとのの比較が可能となった。ところで、補助金により強力化されたKAY DSPソナグラフコンピュータシステムとビデオプリンタによる音環境の解析は、基本解析手順の詳細を見いだしたところで、コンピュータシステムのインターフェースについての技術的な問題が生じ、かなり手間取っている。大量のデータを能率的に解析するためのファイルが利用できるようになれば、視覚的な音環境の解析がより自由にできる。(4)新たな知見としては、第1に利根川沿いの音環境が、周辺の地形・植生・土地利用によって多様であること、第2に房総の森林・農村・都市の音環境と照らし合わせると、川辺らしさの要素が抽出可能であること、第3に自然の音の多様性と生物学的多様性の関係について、房総の農村・住宅地・ニュータウンの音環境資料の検討から、都市における自然環境の復元や快的音環境についての基礎的知識や基準に関する考え方をまとめることができた。なお、視覚的な検討が遅れているので、音空間の利用パターンについての結果に関してはここでは保留したい。
自己免疫性関節炎に特異的なFoxp3+制御性T細胞サブセットとその制御機構の同定

関節リウマチの動物モデルを用いた解析においては、関節炎を誘導後のリンパ節内において関節炎原性のヘルパーT(Th)細胞サブセットとされるTh17細胞分化のマスター転写因子とされるRORγtを発現したFoxp3+制御性T細胞が増加していること、また細胞遊走に重要であるケモカイン受容体CCR6を発現し、抑制性サイトカインであるIL-10を高産生することを昨年までに確認していたが、関節炎発症後の関節局所に浸潤した細胞分画の解析によりこのRORγtを発現したFoxp3+制御性T細胞がリンパ節や脾臓といった免疫組織と比較して関節局所に集積していることを見出した。これらの詳細な解析のためにFoxp3-creマウスとRORγtflox/floxマウスを交配することによって得たFoxp3+制御性T細胞でのみ転写因子RORγtを欠損するconditional knock out(cKO)マウスを作成し、関節炎モデルの解析を実施したところコントロールマウスと比較してcKOマウスにおいて関節炎が有意に増悪することを明らかにした。以上の結果は、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎においてTh17を特異的に制御して病態の抑制に関与することが報告されたTr17と類似しており、関節炎の発症制御においてもこれらの制御性T細胞サブセットが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。ヒト検体を用いた解析については、治療未施行の関節リウマチ患者の末梢血および関節局所CD4+T細胞を分離したうえでマルチカーラーサイトメトリーを用いて転写因子やサイトカイン、ケモカイン受容体の発現を網羅的に解析し、関節リウマチ患者末梢血においても制御性T細胞における転写因子RORγtの発現が亢進している可能性が示唆されており、マウスと同様の病態制御機構がヒトにおいても存在する可能性が示唆された。関節リウマチの動物モデルを用いた解析については、Foxp3-GFPマウスを用いた解析の結果から、Foxp3+制御性T細胞が関節炎の炎症局所に存在していることを見出している。Foxp3+制御性T細胞には、ヘルパーT細胞の各サブセットへの分化の決定に重要な役割を持つマスター転写因子を発現したエフェクター制御性T細胞が存在することが明らかにされており、自己免疫性関節炎におけるこれらのエフェクター制御性T細胞の関与について明らかにしたいと考えており、現在Foxp3-creマウスとRORγt flox/floxマウスを交配することによってFoxp3制御性T細胞特異的に転写因子RORγtを欠損するconditional knockoutマウスを作成して検討するための準備を進めている。ヒト検体を用いた解析については、末梢血CD4+T細胞を分離したうえでマルチカラーフローサイトメトリーを用いたヘルパーT細胞サブセット、制御性T細胞とこれらに発現する転写因子について網羅的な解析を試みており、関節リウマチ患者と健常人、および変形性関節症患者との間での比較検討を行っている。現時点では、関節リウマチにおいてヘルパーT細胞サブセットの一つであるTh17において転写因子RORγtの発現が亢進し、また同時Th17特異的なケモカインレセプターの発現上昇が認められる。またin vitroにおける細胞遊走能の解析結果から、RA患者由来のTh17がケモカインリガンドに対する高い遊走能を持つというpreliminaryな結果を得ている。さらに関節リウマチにおいて関節滑液中のTh17の増加、対応するケモカインリガンドの高値を認め、in vitroでの解析結果を支持する結果と考えている。動物モデルの解析においては、Foxp3-creマウスとRORγt flox/floxマウスを交配することによってFoxp3制御性T細胞特異的に転写因子RORγtを欠損するconditional knockoutマウスを作成し、その免疫学的特性を検討することを目標としていたが、当初納入したFoxp3-creマウスの繁殖が悪く、十分な解析に足るだけのマウスを確保することが困難であった。後述の通りの対策を講じて、解析を行うべく対応している。関節リウマチの動物モデルを用いた解析においては、Foxp3-GFP reporterマウスを用いた解析から、関節炎を誘導後にリンパ節内において関節炎原性のヘルパーT(Th)細胞サブセットとされるTh-17細胞分化のマスター転写因子とされるRORγtを発現したFoxp3+制御性T細胞が増加しており、これらが関節炎局所への細胞遊走に重要であるケモカイン受容体CCR6を発現し、さらに抑制性サイトカインであるIL-10を高産生する一方で、炎症性サイトカインであるIL-17産生は抑制されていることを見出した。またこれらの細胞が関節炎発症後に関節局所に集積している可能性を示唆する結果を得ている。別のモデルではあるが実験的自己免疫性脳脊髄炎で報告されたTr-17細胞と同様に、関節炎原性のTh-17細胞を特異的に抑制する制御性T細胞サブセットが関節炎モデルにおいても存在している可能性がある。これらの詳細な解析についてはFoxp3-creマウスとRORγt flox/floxマウスを交配することによって得たFoxp3+制御性T細胞でのみ転写因子RORγtを欠損するconditional knockoutマウスによって検討することを予定しており、マウス作成に成功し予想通りの表現型が確認できたため、現在関節炎に関する解析を開始している。

ヒト検体を用いた解析については、治療未施行の関節リウマチ患者の末梢血および関節局所CD4+T細胞を分離したうえでマルチカーラーサイトメトリーを用いて転写因子やサイトカイン、ケモカイン受容体の発現を網羅的に解析し、末梢血におけるTh-17細胞でのRORγt、およびケモカイン受容体CCR6の増加と、これに伴った細胞遊走能の更新を認めた。これらの発現変化は、治療介入後には健常人レベルに低下しており、関節リウマチの病態形成に関連している可能性が示唆された。当初から予定していたconditional knockoutマウスの作成に時間を要した。しかし繁殖効率が悪かったFoxp3-creマウスについて別系統のマウスを導入したことによってマウスの作成に成功し、現在基礎的な解析ができる段階となっている。今後、予定していた関節炎モデルの解析を進めていく予定である。ヒトの解析については、一定の結論を導くに至り、研究結果の論文報告に至っている。関節リウマチの動物モデルを用いた解析においては、関節炎を誘導後のリンパ節内において関節炎原性のヘルパーT(Th)細胞サブセットとされるTh17細胞分化のマスター転写因子とされるRORγtを発現したFoxp3+制御性T細胞が増加していること、また細胞遊走に重要であるケモカイン受容体CCR6を発現し、抑制性サイトカインであるIL-10を高産生することを昨年までに確認していたが、関節炎発症後の関節局所に浸潤した細胞分画の解析によりこのRORγtを発現したFoxp3+制御性T細胞がリンパ節や脾臓といった免疫組織と比較して関節局所に集積していることを見出した。これらの詳細な解析のためにFoxp3-creマウスとRORγtflox/floxマウスを交配することによって得たFoxp3+制御性T細胞でのみ転写因子RORγtを欠損するconditional knock out(cKO)マウスを作成し、関節炎モデルの解析を実施したところコントロールマウスと比較してcKOマウスにおいて関節炎が有意に増悪することを明らかにした。以上の結果は、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎においてTh17を特異的に制御して病態の抑制に関与することが報告されたTr17と類似しており、関節炎の発症制御においてもこれらの制御性T細胞サブセットが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。ヒト検体を用いた解析については、治療未施行の関節リウマチ患者の末梢血および関節局所CD4+T細胞を分離したうえでマルチカーラーサイトメトリーを用いて転写因子やサイトカイン、ケモカイン受容体の発現を網羅的に解析し、関節リウマチ患者末梢血においても制御性T細胞における転写因子RORγtの発現が亢進している可能性が示唆されており、マウスと同様の病態制御機構がヒトにおいても存在する可能性が示唆された。遺伝子改変マウスについては、平成28年度中に繁殖の悪く解析に至ることができなかったFoxp3-creマウスに変えて、新規に別系統のFoxp3-creマウスを納入した。現在、本マウスの繁殖を試みており、特に問題なければ目的とする遺伝子改変マウスを作成して、解析を実施する予定である。ヒト検体を用いた解析については、現在までに得られているpreliminaryな結果を確定するため、検体数を増加させることが必須であると考えている。
BDNF欠損による抑制性細胞の発達障害とバレル機能の解析

大脳皮質には様々なsensory mapが存在するが、このような機能マップは活動依存的に変化することが知られている。げっ歯類の体性感覚野には頬髭の受容野であるバレルマップが存在し、マップ編成が最も顕著である臨界期において、脳由来栄養因子(BDNF)が発現している。内因性BDNFを欠損することにより、機能マップの発達形成に対するBDNFの役割を解明することを目指している。実験はマウスのバレル皮質より、視床-皮質スライスを作製し、GABA細胞に対して実験を行い、以下の結果を得た。1)発達初期の細胞に対して、電流注入量に対するスパイク発火数、Adaptation ratio(AR), Afterhyperpolarization(AHP)の振幅により興奮性か抑制性かを判断できることが判明した。2)抑制性細胞のfast spiking property(FS)は生後2週以降に発達することが示された。成体マウスのGABA細胞は、ARの高いFS細胞と、ARの低いRegular spiking nonpyramidal(RSNP)細胞の2種類に分けることができるが、生後10日以前ではARの低い(<0.8)細胞のみが存在した。ARの高い細胞は発達につれて次第に増加し、0.8以上のFS細胞は生後約2週以降にのみ記録された。FS細胞のマーカーと考えられているParvalbuminの発現もほぼ同時であった。3)幼若動物では過分極電流によりh電流を呈する細胞が多くその振幅も成体マウスのものより有意に大きかったが、h電流を呈する細胞の割合は発達に従い減少し、その振幅も生後2週以降では成体マウスと同等レベルに減少していた。4)BDNF欠損マウスでは、ARの上昇、h電流の振幅、Parvalbumin(PV)陽性細胞の出現のどの点においても未熟な特徴を示した。5)PV陽性細胞の樹状突起の発達にはBDNFが必要であることが示された。BDNF欠損マウスにおいて、PV陽性細胞の形態学的な検討を行ったところ、軸索支配領域には顕著な差が見られなかったが、primary dendrite数、dendritic branch数に減少が見られた。以上の結果より、BDNFは抑制性細胞の電気生理学的特性の発達に必要であり、これにより皮質内局所回路の興奮性を制御し、機能マップを変化させていることが考えられる。1)発達初期の細胞に対して、電流注入量に対するスパイク発火数、Adaptation ratio(AR),Afterhyperpolarization(AHP)の振幅により興奮性か抑制性かを判断できることが判明した。成体マウスのGABA

細胞は、ARの高いFS細胞と、ARの低いRegular spiking nonpyramidal(RSNP)細胞の2種類に分けることができるが、生後10日以前ではARの低い(<0.8)細胞のみが存在した。ARの高い細胞は発達につれて次第に増加し、0.8以上のFS細胞は生後約2週以降にのみ記録された。FS細胞のマーカーと考えられているParvalbuminの発現もほぼ同時であった。3)幼若動物では過分極電流によりh電流を呈する細胞が多くその振幅も成体マウスのものより有意に大きかったが、h電流を呈する細胞の割合は発達に従い減少し、その振幅も生後2週以降では成体マウスと同等レベルに減少していた。4)BDNF欠損マウスでは、ARの上昇、h電流の振幅、Parvalbumin(PV)陽性細胞の出現のどの点においても未熟な特徴を示した。5)PV陽性細胞の樹状突起の発達にはBDNFが必要であることが示された。BDNF欠損マウスにおいて、PV陽性細胞の形態学的な検討を行ったところ、軸索支配領域には顕著な差が見られなかったが、primary dendrite数、dendritic branch数に減少が見られた。以上の結果より、BDNFは抑制性細胞の電気生理学的特性の発達に必要であり、これにより皮質内局所回路の興奮性を制御し、機能マップを変化させていることが考えられる。
尾索動物種を用いた生殖細胞系列における転写制御機構の解析

生殖細胞は全能性を維持するために発生過程において体細胞と分離し続けなければならない。そのためには体細胞を作る遺伝子発現を抑制しつつ、生殖細胞を作る遺伝子をONにするなど、遺伝子発現の調節を厳密に行わなければならない。本研究では、マボヤを用いて、卵に既に存在し、生殖細胞を作る細胞系列に受け継がれる3つの因子が、この遺伝子発現調節に関わることを明らかにした。さらに、マボヤの近縁種であるユウレイボヤ、ワカレオタマボヤを用いた解析により、この遺伝子発現調節機構が、例え系統的に近い種間においても、異なることを明らかにした。本研究では、尾索動物胚を用いた生殖細胞系列での転写制御機構に焦点を当てた発生学的および比較発生学的な解析を通して、発生初期における生殖細胞系列形成機構とその進化について明らかにすることを目的とする。27年度は、近年申請者らが同定したホヤにユニークな母性局在転写抑制因子PEMを足掛かりにして、他のホヤ母性局在因子群による生殖細胞系列での転写制御機構を、PEMとの関連のもとに解析を行った。母性局在因子群の中でも、特にZinc-fingerドメインを持ちRNA結合たんぱく質をコードすると考えられるZF-1に着目した。これまでは、ZF-1の機能阻害により、生殖細胞系列で胚性発現を示す遺伝子(クローン45)の初期の発現が消失し、発生に伴うPEMタンパク質の減少が抑制されたことを示すにとどまっていたが、今回、ZF-1とPEMのダブルノックダウン実験から、ZF-1機能阻害による胚性遺伝子発現消失が、PEMの機能をさらに阻害することで、発現が回復することを明らかにした。このことは、ZF-1の胚性遺伝子発現制御が確かにPEMを介したものであることを示しており、ZF-1がPEM mRNAの翻訳または安定性を制御し、PEMのタンパク量を発生に伴って減少させることで、PEMによる転写抑制を解除させ、胚性遺伝子発現開始の条件を整える、という我々のモデルを支持するものである。一方で、別の生殖細胞胚性発現遺伝子であるクローン172を用いて同様の実験を試みたところ、現在までのところ、ダブルノックダウンでの発現回復は観察されていない。遺伝子により転写抑制解除機構が異なるとなれば興味深いが、PEMがRNA polymerase IIの活性化抑制を介してグローバルに転写抑制をしていることを考えると、今後十分に検討の余地があると考えているところである。実験を遂行する大学院生が療養のために休養したため。現在は完全復帰し今後の計画遂行に支障はない。本研究では、尾索動物胚を用いた生殖細胞系列での転写制御機構に焦点を当てた発生学的および比較発生学的解析を通して、発生初期における生殖細胞系列形成機構とその進化について明らかにすることを目的とする。28年度は、近年申請者らが同定したマボヤの母性局在転写抑制因子PEMを足掛かりに、他の尾索動物における生殖細胞系列での転写制御機構を解析した。まず、マボヤと同じホヤ綱に属するユウレイボヤにおいて、PEMの機能を解析したところ、マボヤPEMと同様に体細胞遺伝子に対して転写抑制活性を持つが、この活性に必要なドメインはマボヤPEM内で既に同定されている同等のドメインとは別領域に存在することを示唆する結果を得た。これは、ホヤ綱の動物種間でさえも、転写抑制機構に多能性を示すことを示唆する大変興味深い結果となった。さらに、同じ尾索動物でありながら、PEMをそのゲノム上に持たないオタマボヤ(オタマボヤ綱に属す)の転写抑制機構を明らかにするために解析を行った。まず初期段階として、オタマボヤ胚における始原生殖細胞マーカーVasaの抗体染色を行い、4細胞期以降の卵割期で、生殖細胞系列の細胞に染色が観察されることを明らかにし、オタマボヤが生殖質局在型による始原生殖細胞の形成を行うこと、生殖細胞系列に局在する母性因子の存在を示唆するに至った。また、これらの系列細胞で転写抑制が起こっているのか否かを、転写が起こっている指標となるRNA polymerase IIのリン酸化を認識する抗体により抗体染色を行った。その結果、少なくとも8、16細胞期では、リン酸化が観察され、ホヤでのリン酸化状態とは異なることを明らかにした。この結果もまた、転写抑制機構の多様性を示唆するのかもしれない。本研究における2本柱のうちの1つ、すなわち生殖細胞系列形成機構の進化、については、上記に述べたように興味深い結果が得られつつあり、順調に進んでいると言える。しかしながら、もう1つの柱である、マボヤ初期胚生殖細胞系列における転写制御機構を体系的に理解しようとする試みについては、論文作成のためのデータの再現性をとる実験に終始してしまい、28年度は新しい知見を得ることができなかった。したがって、2つをトータルで考えると、やや遅れていると言わざるを得ない。最終年度は、マボヤ生殖細胞系列の転写制御における母性局在因子Popk-1およびZf-1の機能を、追試により確かなものとし論文を投稿した。また生殖細胞関連遺伝子の胚性発現がおこる直前から、H3K27me3のレベルが体細胞のそれに比して上昇することを見出した。この時期、生殖細胞系列ではH3K4me3のレベルも高いので、抑制と活性マーカーが同在するPoised chromatin状態が生殖細胞系列と体細胞系列の分離に関わる可能性が示唆された。プレリミナリーではあるが、H3K27me3の阻害剤処理胚において、生殖細胞系列で体細胞遺伝子の異所的発現を検出した。