hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心血管病発症危険因子ホモシステインの新規作用機序の解明

ホモシステイン(Hcy)の血中濃度上昇は心血管病発症の独立危険因子として広く認識されているが、その機序の詳細については未だ不明である。私は、Hcy代謝酵素であるCystathionine β-synthase(CBS)の遺伝子欠損マウス(遺伝病ホモシスチン尿症モデル)の肝臓(脂肪肝)を解析し、脂質代謝の主要制御転写因子であるPeroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)の活性低下を見出した。さらにTR-FRET及びSPRアッセイにより、Hcy二量体であるホモシスチンがPPARαタンパク質に直接相互作用し活性阻害することを確認した。そこで本年度は、ヒトPPARαタンパクとホモシスチンの結晶構造解析を目指した。前年度に山梨大・大山拓次准教授(共同研究者)の協力を得てヒトPPARαリガンド結合部位(LBD)の高純度精製法を確立できたため、その活性確認(TR-FRET及びSPRアッセイ)と、リガンドとの共結晶化の条件検討を行った。種々の結晶化検討の末、hPPARα-LBD/ホモシスチン共結晶が得られ、播磨SPring-8のビームラインにてX線回折データを取得した。そして、現在までにPDB登録されているPPARαーリガンド結晶18種の最高分解能1.75Åを大きく上回る最高1.28Åの高分解能データの取得に成功した。その解析の結果、ホモシスチンはhPPARα-LBDの特定のCys残基にHcyとして共有結合することが明らかとなった。脂質性Mediatorが内因リガンドと想定されるPPARαのアミノ酸修飾による活性制御の報告例はかつてない。今後、この修飾がPPARαの機能制御(活性抑制)に繋がるか調べていく。以上の研究により、Hcyの新規作用点としてPPARαを提案した。28年度が最終年度であるため、記入しない。ホモシステイン(Hcy)の血中濃度上昇は、心血管病発症の独立危険因子として認識されているが、その機序については未だ不明である。これまでの解析により、私はHcy代謝酵素であるCystathionine β-synthase(CBS)欠損マウスの肝臓(脂肪肝)における脂質代謝の主要転写因子Peroxisome proliferator-activated receptoralpha (PPARα)の活性が低下すること、またTR-FRETアッセイによりホモシスチンによりPPARαとコアクチベーターの会合が阻害されることを見出し、新規Hcy標的として注目している。本研究課題ではその結合様式を明らかにすることを目指しているが、本年度は下記の4アプローチによりその課題に迫った。1Biacoreによる分子間相互作用解析を行い、TR-FRET結果の再現に成功した。さらに、自分で立ち上げた新規TR-FRETシステムにおいてもホモシスチンの阻害効果を確認した。2コンピュータシュミレーションから推定される結合関与部位のアミノ酸の点変異体を作成したが、変異に基づくホモシスチン結合能の変化は確認できなかった。3ホモシスチンによるPPARα活性化阻害を細胞レベルで調べるため、HepG2細胞に3xPPREの下流にルシフェラーゼ酵素遺伝子を有するプラスミドを遺伝子導入・発現させ、アゴニストとホモシステインを添加後のルシフェラーゼ酵素活性測定を行った。しかし、ホモシステイン刺激により細胞死が起こる、などの理由によりうまくいかなかった。4フェノフィブレート餌及びメチオニン餌を作成し、野生型及びCBSヘテロ欠損マウスに与え、食餌性高ホモシステイン結晶誘導時のPPAR活性に対する影響を調べた。メチオニン餌投与によりPPARα活性の若干の低下は見られたものの、血中ホモシステイン濃度に対応した変化ではなかった。順調に進んでおり、主に時間を費やしている1について説明する。まずヒトPPARα全長タンパク質を大腸菌により発現させ、センサーチップSAにコアクチベーターペプチドであるPGC1αを固定し、そこへhPPARαタンパク質とアゴニストあるいはアンタゴニストを流し、レスポンス変化を観察した。すると、アゴニスト添加時に相互作用の増大が観察され、そこにホモシスチンあるいはシスチンを共存させるとその増大が抑えられた。しかし、この条件ではチップの再生がうまくいかず、同チップで再現性を確認することはできなかった。一方、hPPARαタンパク質をセンサーチップCM5に固定し、アゴニストやホモシスチンを流す実験では、レスポンスを確認できなかった。研究を進めていく中で、実はhPPARαの全長タンパクは非常に安定性が低く、チップ固定時に活性を失うことが判明した。また、hPPARα全長タンパク質とPGC1αペプチドを用いてTR-FRETによる相互作用検出を試みたが、DTT共存無での測定が難しく、これも安定性が課題となった。そこで、共同研究者である山梨大学の大山拓次准教授にhPPARα-LBDプラスミドとその発現、精製方法について御教授頂き、この精製hPPARα-LBDタンパク質を用いて、Biacore、そしてTR-FERT実験を再度試みた。その結果、Biacoreでのチップ再生能が大きく改善し、それによりデータ再現性が向上した。また、TR-FRETでもDTT共存無でデータが得られるようになり、ホモシスチン阻害効果も確認できた。

私は、Hcy代謝酵素であるCystathionine β-synthase(CBS)の遺伝子欠損マウス(遺伝病ホモシスチン尿症モデル)の肝臓(脂肪肝)を解析し、脂質代謝の主要制御転写因子であるPeroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)の活性低下を見出した。さらにTR-FRET及びSPRアッセイにより、Hcy二量体であるホモシスチンがPPARαタンパク質に直接相互作用し活性阻害することを確認した。そこで本年度は、ヒトPPARαタンパクとホモシスチンの結晶構造解析を目指した。前年度に山梨大・大山拓次准教授(共同研究者)の協力を得てヒトPPARαリガンド結合部位(LBD)の高純度精製法を確立できたため、その活性確認(TR-FRET及びSPRアッセイ)と、リガンドとの共結晶化の条件検討を行った。種々の結晶化検討の末、hPPARα-LBD/ホモシスチン共結晶が得られ、播磨SPring-8のビームラインにてX線回折データを取得した。そして、現在までにPDB登録されているPPARαーリガンド結晶18種の最高分解能1.75Åを大きく上回る最高1.28Åの高分解能データの取得に成功した。その解析の結果、ホモシスチンはhPPARα-LBDの特定のCys残基にHcyとして共有結合することが明らかとなった。脂質性Mediatorが内因リガンドと想定されるPPARαのアミノ酸修飾による活性制御の報告例はかつてない。今後、この修飾がPPARαの機能制御(活性抑制)に繋がるか調べていく。以上の研究により、Hcyの新規作用点としてPPARαを提案した。まずhPPARαとホモシスチンの共結晶化により結合部位と阻害様式の同定を行う。結晶化に必要なタンパクの精製方法、結晶化の方法については、既に大山准教授に御教授頂いている。まず、一般アゴニスト共存下で精製したhPPARα-LBDが結晶化グレードであることを確認後、ホモシスチンとの共結晶化を目指す。適当な結晶が得られ次第、X線結晶構造解析を行う。また、LC-MS/MSを用いて組織中ホモシスチン/シスチン/GSSGを定量し、CBS欠損マウスの肝臓においてもPPARαとCoactivatorの会合がホモシスチンにより阻害されうる濃度であるか検討する。PPARαシグナリングに影響を与えうるホモシスチン/シスチン濃度がCBS欠損マウスあるいはCTH欠損マウスの肝臓で存在しうるかを検討する。血中総Hcy濃度はCBS欠損マウスとCTH欠損マウスではほぼ同等(180 μM)であるが、組織中における濃度は不明である。我々が通常用いている蛍光アミノ酸ラベルHPLC法による測定では、低濃度のこれらジアミノ酸の定量には至っていないが、今後はより高感度のLC-MS/MSを用いて定量する。さらに、血管組織やマクロファージなどを用いてPPAR阻害と動脈硬化との関連を明らかにする実験を開始する。PPARγアゴニスト投与により、マクロファージPPARγが活性化され、動脈硬化進展が軽減されるという既報があり、ホモシスチンによりPPARγが阻害されることで動脈硬化を悪化させる可能性について検証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子治療の技術を用いた異種臓器移植の研究

我々は、これまでの研究で、レトロウイルスベクターを用いて、ヒト補体制御因子(DAF及びHRF20)遺伝子を異種培養細胞へ導入することにより、異種免疫反応が著明に抑制されることを報告してきた。これらの結果を基に、本研究において、アデノウイルスベクターを用いて、ヒト補体制御因子(DAF及びHRF20)遺伝子を、異種臓器(マウス及びブタ)へ導入した。アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入により、マウス及びブタの肝臓で、導入遺伝子は、高率に発現した。特にブタ肝臓では、血管内皮細胞において、著明な発現を認めた。また、これらの遺伝子導入臓器に対して、ヒト血清を静注することにより、ヒトC3、C9及びIgG、IgMの沈着は著明に抑制されることが証明された。最近主要異種抗原としてGALαGALが同定され、その誘導酵素として、α(1.3)galactosyl transferase (α1.3GT)が同定されてきている。また遺伝子発現を抑制する手段として、アンチセンスリボザイムの有用性が報告されてきている。我々は、α1.3GTのメッセンジャーRNAの遺伝子配列で、GUCをコードする部分を含む、40bpのアンチセンスリボザイムを作成し、これを、ショットガンタイプのリボザイムベクターに導入し、そのベクターを用いて、リボザイム導入アデノウイルスベクターを作成した。このリバボイム導入アデノウイルスベクターを用いて、α1.3GTの発現抑制を検討したところ、in vitroで、GALαGALの発現の抑制が確認できた。次に、α1.3GTの発現を抑制する、もう一つの方法として、α(1.2)fucosyltransferase (α1.2FT)の遺伝子導入を行った。in vitroの結果では、α1.2FTの遺伝子導入により、GALαGAL抗原の発現は著明によってされ、またこれと比例して、補体依存性細胞障害活性は抑制された。超急性拒絶反応後に生ずる、遅延性拒絶反応(delayed-typed rejection)のメカニズムとして、endothelial activationが注目されている。我々は、endothelial activationを抑制する方法として、tissue plasminogen activator (TPA)及びinterleukin 10 (IL10)の遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて導入することによりその効果を検討した。ラット虚血再灌流モデルを用いて、TPA及びIL10遺伝子導入を、肝臓に行ったところ、障害は著明に抑制された。また、これに伴いTNFαの発生も抑制された。遅延性拒絶反応の後には、同種臓器移植と同じタイプの急性拒絶反応が出現すると考えられている。我々は、リンパ球活性化において重要な役割を果たす、CD28-B7のシグナル伝達を抑制するCTLA41gに注目した。CTLA41g遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて、ラット肝臓へ導入したところ、ラット肝臓における遺伝子発現期間は、10倍以上に延長した。CTLA41g遺伝子を導入した肝臓を同所性に同種移植を行ったところ、この肝臓の生着は、著明に延長した。

遅延性拒絶反応の後には、同種臓器移植と同じタイプの急性拒絶反応が出現すると考えられている。我々は、リンパ球活性化において重要な役割を果たす、CD28-B7のシグナル伝達を抑制するCTLA41gに注目した。CTLA41g遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて、ラット肝臓へ導入したところ、ラット肝臓における遺伝子発現期間は、10倍以上に延長した。CTLA41g遺伝子を導入した肝臓を同所性に同種移植を行ったところ、この肝臓の生着は、著明に延長した。アデノウイルスベクターによるin vivoでの遺伝子導入効率および発現期間を解析するために、ラットおよびマウスを用いてβgalactosidase (LacZ)遺伝子を導入し、肝臓および脾臓での発現を検討した。肝臓での遺伝子発現は、遺伝子導入後4-14日間認められ、以後漸減した。脾臓での発現は、導入後1日目にmarzimal zoneで認められ消失、14日目にperiarteriolar lymphoid sheathに再度認められた。遺伝子発現は、Cyclophosphamide (CyP)の前投与により増強したが、FK506えは変化しなかった。補体制御因子遺伝子(DAF,HRF20)遺伝子組み込みアデノウイルスベクターによる肝臓への遺伝子導入により、肝細胞、内皮細胞で遺伝子発現が認められた。異種抗原α(1,3)GTに対するアンチセンスリボザイムをアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入したところ、異種抗原の発現は効率的に抑制された。ラット補体制御因子遺伝子512をモルモット培養細胞に遺伝子導入した場合、ラット補体による異種免疫反応は効果的に抑制された。以上より、アデノウイルスベクターを用いたin vivo遺伝子導入は、遺伝子操作による異種臓器移植に有効であると考えられ、ブタからサル、モルモットからラットへの異種移植実験で有用であると考えられた。我々は、これまでの研究で、レトロウイルスベクターを用いて、ヒト補体制御因子(DAF及びHRF20)遺伝子を異種培養細胞へ導入することにより、異種免疫反応が顕明に抑制されることを報告してきた。これらの結果を基に、本研究において、アデノウイルスベクターを用いて、ヒト補体制御因子(DAF及びHRF20)遺伝子を、異種臓器(マウス及びブタ)へ導入した。アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入により、マウス及びブタの肝臓で、導入遺伝子は、高率に発現した。特にブタ肝臓では、血管内皮細胞において、著明な発現を認めた。また、これらの遺伝子導入臓器に対して、ヒト血清を静注することにより、ヒトC3、C9及びIgG、IgMの沈着は著明に抑制されることが証明された。最近主要異種抗原としてGALαGALが同定され、その誘導酵素として、α(1.3)galactosyl transferase(α1.3GT)が同定されてきている。
コマチゴケとナンジャモンジャゴケのゲノム情報を基盤とした総合的研究

コケ植物の系統基部に位置するナンジャモンジャゴケとコマチゴケを用いて陸上植物の初期進化を明らかにするための研究基盤整備を進めた。ナンジャモンジャゴケの葉緑体全ゲノム配列情報を公開した。ナンジャモンジャゴケの粘液毛内部のハルティヒネット様構造から単離された菌類は,ツツジ科植物から単離された子嚢菌と近縁であることが示された。これまでのところコマチゴケのゲノムサイズは約3.5Gbと推定している。多くの発生,形態形成関連遺伝子について,タイ類のモデル植物であるゼニゴケゲノムと同様,遺伝子重複が少ないことが明らかになった。ナンジャモンジャゴケの根茎の発生,発達過程を走査型電子顕微鏡,透過型電子顕微鏡,FIB-SEMを用いて観察し,粘液毛頂端部の粘液分泌孔が植物体内部への菌類の侵入経路となっていることを確認し,侵入した菌糸が粘液毛内部で維管束植物の菌根で知られるハルティヒネット様の構造を形成することを明らかにした.他の系統的に基部に位置するコケ植物とともに,ナンジャモンジャゴケの胞子の形態について観察し,基部コケ植物の胞子の特徴について議論した原著論文としてまとめた.コマチゴケに関しては,胞子体から新たに無菌培養株を確立し,生殖器官を誘導することに成功し,雌雄それぞれの無菌培養株を確立した.RNA-seqのために,コマチゴケ原糸体,ナンジャモンジャゴケ根茎,ナンジャモンジャゴケ茎葉体に関して,異なるタグをつけてそれぞれの種ごとにまぜてcDNAライブラリーを作成した.コケ植物の中で,系統的に最も基部に位置すると考えられているコマチゴケ綱(タイ類)とナンジャモンジャゴケ綱(セン類)について,形態学的研究とゲノム解析を進めた.本年度はナンジャモンジャゴケとコマチゴケの組織学的・形態学的研究,コマチゴケのゲノム解析を進めた.ナンジャモンジャゴケの茎頂にはっきりとした頂端細胞が存在するかどうかについては長年議論があったが,葉をつけ直立したシュート,側生器官がない横走茎,どちらの頂端部においても明瞭な頂端細胞が存在することを確認した.頂端細胞から生じた細胞(メロファイト)からの各組織の発生パターンは,他のセン類よりもむしろタイ類に似ていることがわかった.ナンジャモンジャゴケは脱落した葉から植物体が容易に再生・分化するが,植物体の再生・分化に先立って,脱落した葉の表面から菌類の植物体への進入口となる粘液毛が発生することがわかった.ナンジャモンジャゴケの生育は共生菌の存在に大きく依存しており,散布体からの植物体の発生・再生過程も菌類との共生に適応したものとなっていることが示された.コマチゴケ綱については,これまで解析に用いてきたコマチゴケに加え,国内に生育するヒメトロイブゴケ,キレハコマチゴケの生鮮試料を得て,比較研究のための栽培・培養株を確立した.コマチゴケのゲノムについて,リードデータから1.5 Gb程度の大きさがあることが推定できた.昨年度のRNA-seqのデータとすり合わせて解析を進めている.形態学的研究,ゲノム解析については進展が見られた.形態形成関連遺伝子の解析については,研究分担者がこれまでの研究や今後の研究の展開について総説的な著書を執筆したが,新たなデータの取得に関しては遅れ気味である.コケ植物の中で,系統的に最も基部に位置すると考えられているコマチゴケ綱(タイ類)とナンジャモンジャゴケ綱(セン類)について,形態学的研究とゲノム解析を進めた.一胞子由来のコマチゴケ半数体培養株から平均450 bpのインサートサイズのPCR Freeライブラリーを作成しHiSeq 2500で両端から250塩基ずつ合計で130Gbのデータを取得した.K-mer解析からゲノムサイズは3.5 Gbと推定された。また,Discoverによってアセンブルしたところ,全部で3.8GbのScaffoldが得られた(1kb以上の配列だと3Gb)。N50scaffold size = 23,363,N50 contig size = 19,745である。CEGMAによって真核生物に超保存的な248の遺伝子のどれだけが見つかるかを調べると,完全長191個(77.02%),部分配列220個(88.71%)とゲノムサイズの割には比較的高い値が得られた。さらに,10X GenomicsGemCodeによる,コマチゴケ(約3.5 Gb半数体)scaffoldingデータの取得を進めた.ナンジャモンジャゴケについては,脱落した葉からのシュート再生過程で,最初に粘液毛が形成されることを明らかにした.脱落した葉がすぐに粘液毛を形成し,共生菌との共生体構造を形成することで,脱落した葉や再分化したシュートの生残性を高める可能性が示唆された.粘液毛内部に生育する菌類を単離し,無菌化した植物体断片と共培養を行ったところ,新たに形成された粘液毛での菌根様構造を再構成する2種類の菌株を得た.分子系統解析は,これらが子嚢菌で,ツツジ科植物の根から単離された真菌と近縁であることが示唆された,コマチゴケのゲノム解析については進展があったが,ナンジャモンジャゴケについては葉緑体ゲノム配列のみを先行して公開しているが,核ゲノムに関しては海外の研究グループとの競合もあり,データの重複を防ぐために解析の進行を見合わせ,形態学的研究を中心に研究を進めた.

コマチゴケのゲノムの基礎的な情報を取得するため雌株のペアエンドシークエンスデータ167Gbを解析した結果、コマチゴケのゲノムサイズは4.4Gbと推定された。予備的なアセンブリーで総スキャッフォルド3.97Gb (N50長25kb)を得ている。得られたゲノム配列情報をもとに、複数の発生遺伝子及びオーキシン応答関連遺伝子配列を探索し、分子系統解析を実施した。ここまでのところ、コマチゴケは主要なオーキシン応答遺伝子がゲノム中に1コピーずつであるなど、多くの発生、形態形成関連遺伝子についてタイ類のモデルであるゼニゴケゲノムと同様、遺伝子重複が少ないことが明らかになった。ゲノム配列に関してはさらなる解析が必要であるが、これまでに得られた配列をもとに、各形態形成関連遺伝子の組織特異的発現解析にについての足がかりを得ることができた。各遺伝子の組織レベルでの発現を調べるためにin situハイブリダイゼーション解析を進めている。コケ植物における地下性シュートの進化を理解するために、コマチゴケゲノムから被子植物の根毛形成遺伝子RLSとLRLを探索し、新たにLRLのみを見いだすことができた。コマチゴケの造精器形成過程や精子形成過程を観察し、ゼニゴケとは造精器形成時の細胞分裂パターンや精子核の凝集の程度に違いがあることを明らかにした。ナンジャモンジャゴケについては、生育地でのフロラ調査結果を解析しツツジ科植物と同所的に生育することを明らかにした。これはナンジャモンジャゴケがツツジ科植物と共生菌を共有しているという我々の仮説を支持する。コケ植物の系統基部に位置するナンジャモンジャゴケとコマチゴケを用いて陸上植物の初期進化を明らかにするための研究基盤整備を進めた。ナンジャモンジャゴケの葉緑体全ゲノム配列情報を公開した。ナンジャモンジャゴケの粘液毛内部のハルティヒネット様構造から単離された菌類は,ツツジ科植物から単離された子嚢菌と近縁であることが示された。これまでのところコマチゴケのゲノムサイズは約3.5Gbと推定している。多くの発生,形態形成関連遺伝子について,タイ類のモデル植物であるゼニゴケゲノムと同様,遺伝子重複が少ないことが明らかになった。ナンジャモンジャゴケでは共生菌と考えられる菌類を除去した状況下での永続的な培養に成功しておらず,ゲノムドラフト解析は先送りにして,RNA-seqのみ先行して解析を行った.コマチゴケに関しては,研究分担者の勤務先の移動等もあり,研究体制が整わず,形質転換系の確立には至っていない.形態形成関連遺伝子の解析について,代表者,研究分担者の間でより連携と協力を高めて遅れを取り戻す.コマチゴケゲノム情報の解析,形態形成関連遺伝子の解析に注力して研究を進める.29年度が最終年度であるため、記入しない。植物形態学ナンジャモンジャゴケ無菌培養のための培地条件の検討を続けるが,ゲノム解析のためのナンジャモンジャゴケの無菌培養株の確立は困難な可能性がある.菌類の分離培養を並行して行い,ナンジャモンジャゴケの無菌株と共培養したものをゲノム解析に用いることも検討する.それ以外は当初の計画に沿った研究の遂行を目指す.研究分担者の異動等があり,形態形成関連遺伝子,ゲノム・トランスクリプトーム解析の一部について,研究の遂行に遅れが生じたため.コマチゴケゲノム解析の進行に伴い,年度の後半の研究の遂行に関し,予定とは異なる形態学的実験を進めたことで,消耗品の購入などに関し予定との齟齬が生じた.29年度が最終年度であるため、記入しない。
再循環リンパ球による免疫監視のMicroanatomy

1.再循環リンパ球を静脈内移入すると、投与後30分でリンパ節の高内皮細静脈や脾臓の辺縁洞を越えT細胞領域に遊走した。本研究のコンジェニックラットの組み合わせでは、ホストの免疫応答が起こらず、再循環リンパ球traffickingの生理的モデルとして極めて有用であることが明らかになった。応用として、このラットを用いて腸移植の系を解析した(発表論文2)。2.長期観察すると、投与後6ヶ月後でもドナー細胞はホストリンパ組織T細胞領域に多数存在し、ホストのMHCII陽性細胞と高頻度にクラスターを形成していた。このことから、恒常状態でも再循環リンパ球はリンパ組織を巡回する際に樹状細胞と必ず接触を繰り返し、抗原情報をチェックしているものと思われた。コンジェニックラット肝移植後3-12ヶ月の組織を作成し比較すると、やはりドナー肝由来細胞が少数だが有意に存在していた。3.抗原投与時について、マウスHSV感染時モデルを作成し、形質細胞様DC前駆体が、CXCL9とEセレクチン依存性に血中から高内皮細静脈をtransmigrationして全身のリンパ節へ直接遊走することを証明した(発表論文1)。4.GvH病のモデルでの解析。まず、蛍光染多重免疫色法を確立し、4重蛍光観察ができるようになった。これにより、ドナー細胞が投与後24時間以内に主に脾臓T細胞領域でホストDCとクラスターを形成、直接感作を受ける現場を明らかにした。ドナー細胞は1-3日間で増殖分化し、キラー細胞として、血行性にホストの粘膜固有層や肝臓に集積し、そこでさらに在住DCと会合して二次応答をおこし、標的組織を傷害することが強く示唆された。これは、2の抗原情報チェック機構が、移植抗原提示の現場になり、GvH病のエフェクター細胞を誘導したものと考えられる(投稿準備中)。
熱帯熱マラリア原虫の増殖を阻害するヒトモノクローナル抗体の開発

本研究は、熱帯熱マラリアの治療や予防に応用できるようなヒトモノクローナル抗体の作製をめざしており、熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト表面に存在するmerozoite surface protein1のC末端側19kDa領域(MSP-1_<19>)を抗体の標的分子とした。これまでに得たクローンPf25について、L鎖とH鎖の相補性決定領域(CDR)をコードする遺伝子に変異を導入し、1アミノ酸を置換して親和性の改良を試みた。L鎖では、CDR3においてTyr^<92>あるいはI1e^<97>を置換した結果、Tyr^<92>がAlaに、Ile^<97>がGly、Leu、Glu、Ala、Serに置換されたクローンが得られた。一方、H鎖では、CDR3においてVal^<101>あるいはTrp^<107>の置換を行った。Val^<101>についてはVal以外の配列を示したものはなかったが、Trp^<107>に関してはArgとSerに置換されたクローンが得られた。MSP-1_<19>に対する親和性は、L鎖のIle^<97>をLeuに置換したクローンで1.2倍、H鎖のTrp^<107>をSerに置換したクローンで1.1倍に向上していた。組換え型のFab抗体は改変が容易であり、エピトープ構造の解析にも応用できると考えられた。また、MSP-1遺伝子は二型性の対立遺伝子により表現されるため、対立遺伝子内の組換えにより抗原多型性が生じるが、Pf25はFCR3株と異なる対立遺伝子を有する3D7株とも反応した。従って、エピトープは両株間で良く保存されている領域に存在し、Pf25は抗原性の異なる様々な株に反応できる可能性が高いと考えられた。さらに、Pf25によって認識されるエピトープが熱帯熱マラリアに対して免疫のあるヒトの血清でも認識されているかどうかを明らかにするため、ソロモン諸島の住民の血清を用いて競合ELISA法によって検討した。その結果、30%の血清において有意な抑制が認められた。従って、Pf25によって認識されるエピトープ以外にも防御反応に関与するエピトープが存在すると考えられた。Pf25については、今後Fc部分を含む完全抗体分子に改変することで有用性が高まると考えられる。マラリアの年間罹患者数は世界で約5億人であり、そのうち約300万人が死亡すると推定されている。しかし、ワクチンはまだ実用化されておらず、薬剤耐性マラリアの拡散も問題になっている。本研究では、特に死亡率の高い熱帯熱マラリアの治療や予防に応用できるような、ヒトモノクローナル抗体の作製をめざしている。熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト表面に存在するmorozoite surface protein 1のC末端側19kDa領域(MSP-1_<19>)を抗体の標的分子と考えている。MSP-1_<19>の組換えタンパク質を用いてスクリーニングを行い、これまでに3クローンのヒトモノクローナル抗体Fab断片を得ている。その内のクローンPf25について、L鎖とH鎖の相補性決定領域(CDR)をコードする遺伝子にリコンビネーションPCR法で変異を導入し、1アミノ酸を置換して親和性の改良を試みた。

L鎖では、CDR3を構成するGlnGlnTyrGlySerSerProIleThr(アミノ酸番号90-98)において、Tyr^<92>あるいはIle^<97>を任意のアミノ酸に置換した。ELISAによってスクリーニングし、Pf25と同等あるいはそれ以上に高い反応性を示すクローンについて、塩基配列を調べた。その結果、Tyr^<92>がAlaに、Ile^<97>がGly、Leu、Glu、Ala、Serに置換されたクローンが得られた。一方、H鎖ではCDR3を構成するValGlyValTrpPheGlyGluLeuTrpTyr(アミノ酸番号99-108)において、Val^<101>あるいはTrp^<107>の置換を行った。ELISAによるスクリーニングの結果、Val^<101>についてはVal以外の配列を示したものはなかった。Trp^<107>に関しては、ArgとSerに置換されたクローンが得られた。現在、これらの改変Fabクローンについて、MSP-1_<19>に対する親和性を表面プラズモン共鳴法によって比較解析中である。マラリアの年間罹患者数は世界で約5億人であり、そのうち約300万人が死亡すると推定されている。本研究では、特に死亡率の高い熱帯熱マラリアの治療や予防に応用できるようなヒトモノクローナル抗体の作製をめざしており、熱帯熱マラリア原虫merozoite surface protein 1のC末端側19kDa領域(MSP-1_<19>)を抗体の標的分子とした。昨年度、抗MSP-1_<19>ヒトモノクローナル抗体Fab断片Pf25について、H鎖とL鎖のIle97をLeuに置換したクローンで、1.2倍、H鎖のTrp107をSerni置換したクローンで1.1倍に向上していた。組換え型のFab抗体は改変が容易であり、エピトープ構造の解析にも応用できると考えられた。また、MSP-1遺伝子は二型性の対立遺伝子により表現されるため、対立遺伝子内の組換えにより抗原多型性が生じる。Pf25はFCR3株と異なる対立遺伝子を有する3D7株とも反応することを、間接蛍光抗体法によって確認した。従って、エピトープは両株間で良く保存されている領域に存在し、Pf25は抗原性の異なる様々な株に反応できる可能性が高いと考えられた。さらに、Pf25によって認識されるエピトープが熱帯熱マラリアに対して免疫のあるヒトの血清でも認識されているかどうかを明らかにするため、ソロモン諸島の住民の血清を用いて競合ELISA法によって検討した。その結果、30%の血清において有意な抑制が認められた。一方、抗体遺伝子ライブラリーの作製に用いたリンパ球ドナーの血漿でも、8検体中3検体で有意な抑制が認められた。免疫血清とドナー血漿の間で平均抑制レベルに有意な差はなかった。従って、Pf25によって認識されるエピトープ以外にも防御反応に関与するエピトープが存在すると考えられた。
ストレス初期の脳内過程に関する研究

1時間といった持続するストレスによりラットの広汎な脳部位でnorーadrenalin(NA)の放出亢進が生じることはよく知られている。今回は特にストレス初期の変化について明らかにするため10分間拘束ストレスという短時間ストレスの脳内NA放出に及ぼす影響についてWistar系雄性ラットを用いて検討した。その結果、10分間という短時間ストレスであっても、ストレス解放60分後までの変化を観察すると、視床下部、扁桃核、青斑核部などの部位で70分間連続拘束ストレスとほぼ同程度のNA放出亢進が生じることが明らかになった。つまり1時間といった持続するストレスであっても初期の10分間位の間に生じる生体系の反応がその後の一連の生体反応に大きな影響を与えることが示唆された。そこで更に短いストレスである1分間、5分間の拘束ストレスについて検討したところ、5分間ストレスではごく限られた部位でNA放出亢進が生じるのに1分間では広汎な脳部位でNA放出が亢進した。両者の違いを検討するためtailflick法を用いてストレス鎮痛の有無を検討した。その結果、1分間ストレスでは全くストレス鎮痛は生じず、5分間ストレスではストレス鎮痛が生じしかもそれはnoloxoneにより拮抗された。この結果から5分間ストレスでは内在性opioid peptidesの放出亢進が生じ、それがNA放出亢進に抑制的に作用するためNA放出亢進する脳部位が限られるものと推測された。また視床下部に先端部に半透膜を装着したプロ-ブを挿入し微少潅流を行い潅流液中のNA含量を定量した。その結果、20分間の拘束ストレスによっても潅流液中のNA含量は速やかに有意に増加することが明らかになった。これらの一連の実験結果より、ストレス初期の生体内変化はその後の一連の生体変化に重大な影響を与えること、opioid peptidesの関与はストレス曝露より少し遅れることなどを明らかにすることが出来た。
水晶ねじれ振動子を用いた潤滑油の高圧粘度測定装置の開発

水晶振動子にはX軸を長さ方向に持つ直径5mm、長さ50mmの円柱状のものを用い、円周上にY、Z軸を境界とする4つの領域に金を蒸着することにより4つの電極を円周上に配置した。この振動子をインピ-ダンスアナライザに接続し、共振周波数変化及び等価回路定数を求め環境液体の粘性を求めた。測定は常圧下で行い高圧下での測定時に考えられる諸因子の影響についての検討を行った。高圧下において潤滑油の粘性は指数関数的に増大するため、高圧下で粘性を測定するためには、高い粘度まで測定が可能な装置でなければならない。粘度の測定限界を上げるためには、水晶振動子に印加する電圧を上げなければならないが、インピ-ダンスアナライザ-の電圧は低く高粘度の試料の測定はできないことがわかった。そこで、高電圧が印加可能な周波数発生装置と、周波数カウンタ、デジタル電圧計から成るシステムを採用し、測定された共振周波数変化、共振時の等価抵抗値から粘性を求める方法を採用した。ただし、水晶振動子のインピ-ダンスが高いため、直接水晶振動子の等価抵抗を測定することはできない。そこで、二重振動子法を用いた測定器を作成しその適用を検討した。なお、インピ-ダンスアナライザを用いた測定では、約1000cPまで測定可能であったが、約100cP以上の高粘度の試料油では、弾性の影響があらわれ、単なる粘性流体ではなく、粘弾性体として扱わなければならないことがわかった。実際に高圧下で測定を行える装置にするには、素子回りをかなり小型にしないとならず、今後の課題となった。また同時に、潤滑油の誘電緩和測定も行い、高圧下における潤滑油の粘弾性を探る指針とした。本年度においては先ず、水晶ねじれ振動子を用いた測定素子の作製を行った。水晶振動子にはX軸を長さ方向に持つ(Xカット)、直径5mm、長さ50mmの円柱状ものを用い、円周上にY、Z軸上を境界とする4つの領域に金を蒸着する事により、4つの電極を円周上に配置した。この振動子をインピーダンスアナライザに接続し、共振周波数の微少変化から外界の粘性を求めた。インピーダンスアナライザはGPIBによりパーソナルコンピュータに接続され、諸測定、データ収集等をコンピュータコントロールで行えるようにした。また、これと平行して、潤滑油の誘電緩和測定を行う準備を整えた誘電緩和測定は、同じインピーダンスアナライザ/コンピュータシステムを用い、電極としてはSUS304製の直径13mm長さ120mmの円柱型内部電極と、内径14mm、外径18mm、長さ150mmの円筒型外部電極からなる同心二重円筒型のものを作製した。測定に先立ち、先ず、測定用の各種ソフトウェアの作製を行い、測定が円滑に行えるようにすることから研究を開始した。その後、各測定系の作動検査を行い、蒸圧下における測定を開始した。測定は温度を変化させて行い、高圧での測定に必要な予備データの収集を行った。試料油としては、石油系潤滑油である、パラフィン系鉱油、ナフテン系鉱油、合成潤滑油である、ポリイソブチレン、ポリアルキレングリコールを用いた。装置は常圧下においてはおおむね良好に作動することが確かめられたが、測定可能粘度の上限を上げるためには、いくつかの改良が必要であることが明らかとなった。本年度は昨年度において作成を行なった水晶ねじれ振動子を用いた本格的な測定を行った。まず初めにこの振動子をインピ-ダンスアナライザに接続し、共振周波数変化及び等価回路定数を求め環境液体の粘性を求めた。

測定は常圧下で行い高圧下での測定時に考えられる諸因子の影響についての検討を行った。試料油としては、非極性で粘性の低い炭化水素化合物の中からn-ヘキサン、イソオクタンを、中程度の粘性を持つn-ヘキサデカン、スクアランを、また粘度の高い試料として炭化水素系合成潤滑油である、ポリイソブチレンを用いた。高圧下において潤滑油の粘性は指数関数的に増大するため、高圧下で粘性を測定するためには、高い粘度まで測定が可能な装置でなければならない。粘度の測定限界を上げるためには、水晶振動子に印加する電圧を上げなければならないが、インピ-ダンスアナライザ-の電圧は低く高粘度の試料の測定はできないことがわかった。そこで、高電圧が印加可能な周波数発生装置と、周波数カウンタ、デジタル電圧計から成るシステムを採用し、測定された共振周波数変化、共振時の等価抵抗値から粘性を求める方法を採用した。ただし、水晶振動子のインピ-ダンスが高いため、直接水晶振動子の等価抵抗を測定することはできない。そこで、二重振動子法を用いた測定器を作成しその適用を検討した。なお、インピ-ダンスアナライザ-を用いた測定では、約1000cPまで測定可能であったが、約100cP以上の高粘度の試料油では、弾性の影響があらわれ、単なる粘性流体ではなく、粘弾性体として扱わなければならないことがわかった。実際に高圧下で測定を行える装置にするには、素子回りをかなり小型にしないとならず、今後の課題となった。
監査と期待ギャップ

元々の期待ギャップの問題が、外部監査人が行っている監査と有価証券報告書(年次報告書)のユーザーが期待している監査とのギャップとの相違である。それらは企業の不正経理のスキャンダルとして我が国においても、昭和40年代から大きく問題となり、スキャンダルの度に会計に関する法律は改正され、監査基準もまた改正されてきた。かかる意味ではギャップ問題は監査の発展の原動力でもある。それだけでなく、期待ギャップの問題は、会計についてのギャップでもあるし、伝統的な監査と情報監査といわれるもののギャップでもある。今回の研究の柱の一つは、アンケートを通して、外部監査の現状と将来、監査人の役割と能力、外部監査方法の変化、外部監査の制度的枠組み等について、公認会計士と日経500社との理解を知ることである。それはもとより不正に関わる期待ギャップだけでなく、外部監査の将来像、監査制度についても両グループの理解と期待の同一と差違を抽出することであった。それとともに研究分担者は、我が国を例にとり、企業の不正経理の発覚を契機として、監査制度や監査技術、監査組織が発展してきたことを詳細に検証している。また監査というものが会計監査の領域から、情報監査へとさらの拡大されてくるにしたがって、監査という概念そのもの、監査の呼称が変化し、当初の不正問題から、拡張されてきていることを分析、抽出している。さらに情報技術の発展と普及によって、ギャップを解消するために監査は継続化、オンデマンド化しなければならないこと、そしてそのための制度的改革の提言を行っている。イギリスロンドンおよびフランスパリに在住の日本人公認会計士と、監査の期待ギャップに関して研究会をもった。最近の欧州における具体的な問題は,アメリカのエンロン事件に関する会計上の不正行為と,アンダーセン会計事務所の証拠隠滅行為である。これは,訪問先のロンドン・パリ・ローマでの研究会においていずれの会計士もその不透明さを強調しており,また監査人の独立性(監査業務とコンサルティング業務の兼任)から新たな期待ギャップに発展して監査への信頼が損なわれる可能性が高いこと、またその契機になることがおそれられている。また、期待ギャップを契機に監査概念の変化についての研究結果を発表した。すなわち、監査を行った結果生じる責任故、監査人はその失敗に関連して訴訟の対象となり、これが期待ギャップ問題の存在を顕在化させてきた。かかる問題の回避のために、監査人は、「監査」概念を保証水準の最も高いものに限定しようとした結果であるが、しかし反面、監査人に求められる業務は拡大し、これらを監査ではない監査類似業務として実質的に「監査」実務が拡大しているのが現状であるという結論を得た。さらに90年代後半から、我が国においても会計制度が大幅に変化しまたそれを取り巻く環境も著しき変化してきたので、10年前に行った期待ギャップのアンケートを、再び来年度は、我が国の公認会計士を対象に行う予定で、準備をすすめている。内容は研究分担者であるマンチェスター大学のハンフリー教授(申請時シェフィールド大学)と研究会を持ち確定している。元々の期待ギャップの問題が,外部監査人が行っている監査と有価証券報告書(年次報告書)のユーザーが期待している監査とのギャップとの相違である。それらは企業の不正経理のスキャンダルとして我が国においても,昭和40年代から大きく問題となり,スキャンダルの度に会計に関する法律は改正され,監査基準もまた改正されてきた。それだけでなく,期待ギャップの問題は,会計についてのギャップでもあるし,伝統的な監査と情報監査といわれるもののギヤツプでもある。今回の研究の柱の一つは,アンケートを通して,外部監査の現状と将来,監査人の役割と能力,外部監査方法の変化,外部監査の制度的枠組み等について,公認会計士と日経500社との理解を知ることである。それはもとより不正に関わる期待ギャップだけでなく,外部監査の将来像,監査制度についても両グループの理解と期待の同一と差違を抽出することであった。それとともに研究分担者は,我が国を例にとり,企業の不正経理の発覚を契機として,監査制度や監査技術,監査組織が発展してきたことを詳細に検証している。

また監査というものが会計監査の領域から,情報監査へとさらに拡大されてくるにしたがって,監査という概念そのもの,監査の呼称が変化し,当初の不正問題から,拡張されてきていることを分析,抽出している。さらに情報技術の発展と普及によって,ギャップを解消するために監査は継続化,オンデマンド化しなければならないこと,そしてそのための制度的改革の提言を行っている。
サイクリックAMPによる細胞外液中カテコールアミン神経伝達物質濃度の調節

筆者は,神経細胞のモデルであるpheochromocytomaPC12細胞において,cAMPがカテコールアミンの膜輸送過程を阻害し,細胞外液中のドーパミン濃度を大きく増加させることを見いだした.本研究が目的としたことは,中枢神経(脳)および抹消のカテコールアミン性神経細胞においても,cAMPがアミン輸送および細胞外液アミン濃度を調節する因子として機能していることを確証することである.このために,脳マイクロダイアリシスの手法を用いて,自由行動下ラット線条体の細胞外液dopamine濃度に対してcAMPの作用;交感神経細胞の初代培養を用いて,cAMPのアミン膜輸送および細胞外液中アミン濃度に対する効果について検討し,以下の成果を得た.1)cAMPはラット脳線条体部域の細胞外液dopamine(DA)濃度を上昇させた.cAMPの作用と,アミン取り込み阻害剤であるnomifensine,reserpineの作用との比較検討の結果は,cAMPが脳においてもアミン輸送を抑制し,細胞外液DA濃度の調節していることを明らかにした.また,DAの代謝物に対するcAMPと上記の取り込み阻害剤との作用の比較検討により,cAMPは線条体においても分泌小胞膜アミン輸送を抑制していることが示唆された.2)PC12を用いて,このようなcAMPの作用が,原形質膜ではなく分泌小胞膜でのアミン輸送を抑制するために生じることを明らかにした.3)交感神経(上顎神経節細胞)の初代培養に関する研究は,分担者が研究2年目の初めに病死したため,計画を変更せざるをえなかった.(現在,多量の細胞を得るために上顎神経節から効率よく培養に移す手法について検討中である)筆者は,神経細胞のモデルであるpheochromocytomaPC12細胞において,cAMPがカテコールアミンの膜輸送過程を阻害し,細胞外液中のドーパミン濃度を大きく増加させることを見いだした.本研究が目的としたことは,中枢神経(脳)および抹消のカテコールアミン性神経細胞においても,cAMPがアミン輸送および細胞外液アミン濃度を調節する因子として機能していることを確証することである.このために,脳マイクロダイアリシスの手法を用いて,自由行動下ラット線条体の細胞外液dopamine濃度に対してcAMPの作用;交感神経細胞の初代培養を用いて,cAMPのアミン膜輸送および細胞外液中アミン濃度に対する効果について検討し,以下の成果を得た.1)cAMPはラット脳線条体部域の細胞外液dopamine(DA)濃度を上昇させた.cAMPの作用と,アミン取り込み阻害剤であるnomifensine,reserpineの作用との比較検討の結果は,cAMPが脳においてもアミン輸送を抑制し,細胞外液DA濃度の調節していることを明らかにした.また,DAの代謝物に対するcAMPと上記の取り込み阻害剤との作用の比較検討により,cAMPは線条体においても分泌小胞膜アミン輸送を抑制していることが示唆された.2)PC12を用いて,このようなcAMPの作用が,原形質膜ではなく分泌小胞膜でのアミン輸送を抑制するために生じることを明らかにした.3)交感神経(上顎神経節細胞)の初代培養に関する研究は,分担者が研究2年目の初めに病死したため,計画を変更せざるをえなかった.(現在,多量の細胞を得るために上顎神経節から効率よく培養に移す手法について検討中である)本年度の研究計画は、培養神経細胞および中枢神経における細胞外液中のカテコールアミン濃度に対するcAMPの影響について検討することであった。1.ラット上顎神経節細胞の初代培養に関する実験:上頚神経節はカテコールアミンを神経伝達物質とする神経細胞の純粋な培養を得るのに適した材料であるが、神経細胞の特徴として培養後に増殖することはなく、多量の細胞を得るために効率よく培養に移すことが必要てある。現在、この手法について検討中である。2.ラット脳の細胞外液ドーパミン濃度に対するcAMPの影響:脳マイクロダイアリシス法によってドーパミン(DA)作動性神経細胞が局在する部域、線条体における細胞外液DAに対する原形質膜を透過可能なcAMPアナログ、dibutyryl cAMP(dBcAMP)の影響について検討した。dBcAMPはラット線条体細胞外液のDA濃度を増加させた。DA濃度はdBcAMP投与によってゆっくりと上昇し、1.52時間で最大レベルに達した。このときのDA濃度は基底レベルの約3倍であった。このレベルはdBcAMP投与が続く限り維持され、dBcAMP投与停止後ゆっくりと下降し2時間程後に基底レベル近くまで減少する。このようなdBcAMPによる細胞外液DAの上昇は、高KイオンによるDAの上昇とはまったく異なっている。高KイオンによるDA上昇は急速で3040分で最大に達し、それ以後は高Kイオンを与え続けてもDAは再び急速に低下する。また、dBcAMPにるDA増加作用は、高Kイオンの作用よりも細胞外液中のCaイオン濃度の低下による影響を受けにくい。これらの結果は、dBcAMPがnon-exocytoticな機構によって細胞外液中のカテコールアミン濃度を調節するという筆者らの仮説に一致するものである。本年度は,脳のカテコールアミン性神経におけるアミン輸送に対するサイクリックAMP(cAMP)の作用について検討した.また神経細胞のモデルとしてPC12細胞を用いてcAMPの作用機構について検討した.(本年度の研究計画のうち,初代培養神経細胞を用いる実験は,分担者病死のため変更せざるをえなくなった).

1)ラット脳の細胞外液ドーパミン濃度に対するcAMPの影響:脳マイクロダイアリシス法により,ドーパミン(DA)性神経細胞が局在する線条体部域の細胞外液DAに対するdibutyryl cAMP(dBcAMP)の影響を検討した.dBcAMPは細胞外液DA濃度を増加させた.また,細胞外液中のCaイオン濃度を低下させ高Kイオン刺激ではDA濃度上昇が起きない条件下でも,dBcAMPのDA濃度上昇作用が観察された.さらに,cAMPの作用との比較のためにnomifensine(原形質膜アミン輸送の阻害剤)とreserpine(分泌小胞膜アミン輸送の阻害剤)の効果を調べた.Nomifensine,reserpineともに線条体細胞外液DADA濃度の上昇を起こさせる.これらの阻害剤の作用は細胞外液中のCaイオン濃度を低下させた条件でも観察された.これらの結果は,生きた動物の中枢神経においてもcAMPがカテコールアミン輸送の調節因子として機能しているという考えを支持するものである.また,DA由来の代謝物であるdihydroxyphenylacetic acid,homovalinic acidに対するnomifensineとreserpineの効果も比較検討した.その結果は,cAMPが分泌小胞膜におけるアミン輸送を阻害することを示唆するものであった.2)モデル細胞(PC12細胞)を用いて,cAMPのアミン輸送阻害の作用機構について検討した結果,このcAMPの作用にはタンパク質リン酸化反応が関与していることが示唆された.
ETV2を中心とした細胞直接リプログラミングによる血液細胞の作成

ETV2は胎児期の造血ー血管系の発生に必須の因子である。申請者らは既に分化した体性細胞である成人皮膚線維芽細胞をETV2導入により血管内皮細胞に直接転換できることを報告した。面白いことにETV2発現線維芽細胞は造血分化に必須の転写因子RUNX1, TAL1, GATA2も発現していることを見出した。そこでETV2と共に20種類のhemogenic endothelium特異的転写因子を導入し、SCF, FLT3L, TPO, IL-3, IL-6の存在下でOP9細胞と共培養すると、CD45及びc-Kit陽性の血球様細胞が出現した。本成果より皮膚から血液細胞を作製できる可能性が見出された。申請者は単一の転写因子ETV2を導入する「細胞直接リプログラミング法」によりヒト成人皮膚線維芽細胞を機能的な血管内皮細胞に直接転換できることを報告した(PNAS 2015)。この中でETV2が皮膚線維芽細胞中に恒常的に発現しているFOXC2と共役的に作用することが直接転換に必須であることを明らかにした。一方、造血幹細胞と血管内皮細胞は共にhemogenic endotheliumという胎生期にのみ存在する特殊な血管内皮細胞より発生する。加えて、私達はヒト成人皮膚線維芽細胞が血球分化に重要な転写因子GATA2を恒常的に発現していることを見出した。そこで、本研究では、1)「ETV2と他の転写因子を組み合わせることでヒト成人皮膚線維芽細胞からhemogenic endotheliumの誘導が可能」2)「このhemogenic endotheliumを経ることによりヒト成人皮膚線維芽細胞から機能的なT細胞を分化誘導できる」と仮説し、血球分化に重要な30種類の候補転写因子のレンチウイルス発現ベクターを作成した。ETV2及びこれら30種類の転写因子をヒト成人皮膚線維芽細胞に導入し、OP9ストローマ細胞と共培養したところ、遺伝子導入12日後に汎血球マーカーCD43/CD45陽性細胞が出現した(1-2%)。この細胞のゲノムDNAを分離しゲノムに組み込まれている転写因子をPCRにより探索したところ、ETV2を含む22種類の因子が検出された。この結果はCD43/CD45陽性細胞が非常にヘテロな細胞集団であり、培養系をよりT細胞に特化させることでT細胞を誘導できることを示唆している。そこでIL-7存在下でNOTCHリガンドDLL1を安定発現しているOP9-DL1細胞と共培養したところ、CD3陽性細胞が出現することを見出した(2-3%)x造血系と血管系は共にhemogenic endotheliumという胎生期にのみ存在する特殊な血管内皮細胞から発生する。そのため造血系の分化に重要な転写因子の多くは血管系と共通していることが、マウスやゼブラフィッシュを用いた研究から明らかになりつつある。申請者らは「細胞直接リプログラミング法」によりETV2単独で成人皮膚線維芽細胞を機能的な血管内皮細胞に転換できることを報告した。ETV2はETSファミリー転写因子であり、胎児期の造血ー血管系の発生に必須の因子であることはマウスやゼブラフィッシュの研究により明らかにされている。しかし申請者らは既に分化した体性細胞をETV2により血管内皮細胞に転換させることにより、ETV2は強力な血管内皮細胞誘導因子であることを示した。ところが面白いことに、ETV2発現線維芽細胞は造血分化に必須の転写因子RUNX1, TAL1, GATA2を発現することを見出した。そこでETV2と共に20種類のhemogenic endothelium特異的転写因子を導入し、SCF, FLT3L, TPO, IL-3, IL-6の存在下でマウス骨髄ストローマ細胞株OP9細胞と共培養すると、CD45及びc-Kit陽性の血球様細胞が出現した。現在この血球様細胞のゲノムを解析することによりヒト血球の分化に重要な転写因子を同定を試みている。本研究成果よりiPS細胞を経ることなく皮膚から血液細胞を直接作製できる可能性が見出された。線維芽細胞からCD3陽性細胞を誘導できた。免疫学線維芽細胞由来のCD3陽性細胞からゲノムDNAを分離しゲノムに組み込まれている転写因子をPCRにより探索する。この成果を線維芽細胞にフィードバックすることにより、T細胞誘導因子を決定する。更に、本方法で誘導されたT細胞の機能をIn vitroおよびNOD SCIDマウスに移植しin vivoで評価する。当初の予想より早くCD3陽性細胞を得ることができ、サイトカイン・増殖因子・培地の使用量を減らすこととなった。余剰分は当初の実験計画に加え、in vivoアッセイに重点を置くためにより多くのNOD SCIDマウスの購入に当てる。
がん細胞のRas依存的non-apoptoticプログラム細胞死

我々はがんで特徴的に見られるRasの異常活性化により惹起されるnon-apoptoticプログラム細胞死の存在を初めて発見し、このような細胞死が実際に生体内で(Rasが異常活性化した)がん細胞の排除機構として機能していることを明らかにした。そこで現在このがん細胞のRas依存的non-apoptoticプログラム細胞死のin vitroモデル実験系を用いてその制御機構の解明を進めており、本年度(本研究課題)では従来から行ってきた細胞内活性分子の刺激薬・阻害薬を用いたスクリーニングの継続ならびにsiRNA発現ライブラリーを用いたゲノム・ワイドスクリーニングという新規方法論による細胞死制御因子の同定を試みた。細胞内活性分子の刺激薬・阻害薬のスクリーニングの過程ではcyclic AMPがRas依存的non-apoptoticプログラム細胞死の制御に関わっている可能性が明らかになってきた。また、Ras依存的non-apoptotic細胞死に対する感受性と細胞内cyclic AMPレベルの関係を調べてみたところ、細胞死感受性と細胞内レベルが相関する傾向が認められた。今後はこれらの所見の確認を進める予定である。またsiRNA発現ライブラリースクリーニングに関してはスクリーニングを実施するための準備(必要なマテリアルの作成や条件設定)を行った。特に本実験では生存細胞を選択的に回収する必要があり、これをflow cytometricに行うため緑色傾向蛋白質(GFP)でラベルしたRas蛋白質(GFP-Ras)を発現する発現ベクターを作成した。GFP-Ras発現ベクターとコントロールGFP発現ベクターを細胞内に導入した後flow cytometric analysisを行い、生存細胞と死細胞を分取するためのパラメータの選択、条件設定を行った。今後これらのマテリアル・条件を用いてスクリーニングを行う予定である。