hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
京町屋を含む密集市街地での地上・航空機LiDARからの建物モデリング手法の開発

本研究では、京町屋を含む密集市街地における建造物群を対象に、地上LiDARと航空機LiDARから3次元建物モデルを自動生成する手法の開発を目的とし、下記の内容を実施した。1.地上LiDARからの建物属性の自動抽出手法の開発2.航空写真からの建物領域抽出手法の開発3.航空機LiDARと航空写真を併用した建物の三次元モデリング手法の開発4.航空機LiDARと航空写真を併用した都市内の景観指標の推定手法の開発5.近接写真測量を用いた建物の3次元モデリングにおける効率化本研究では、京町屋を含む密集市街地における建造物群を対象に、地上LiDARと航空機LiDARから3次元建物モデルを自動生成する手法の開発を目的とし、下記の内容を実施した。1.地上LiDARからの建物属性の自動抽出手法の開発2.航空写真からの建物領域抽出手法の開発3.航空機LiDARと航空写真を併用した建物の三次元モデリング手法の開発4.航空機LiDARと航空写真を併用した都市内の景観指標の推定手法の開発5.近接写真測量を用いた建物の3次元モデリングにおける効率化本研究では、京町屋を含む密集市街地における建造物群を対象に、地上LiDARと航空機LiDARから3次元モデルを自動生成する手法の開発を目的としている。平成22年度は下記の内容を実施した。●航空機LiDARデータから密集市街地の建造物群に対し、切妻屋根、寄棟屋根、平屋根等の3次元モデルを自動で生成するアルゴリズムを完成させた。京都市東山区の各地域において適用し改善を繰り返し、安定的に動作することを確認した。そのモデリングの前処理として必要な、航空機LiDARデータから地盤面データを除去するフィルタリング処理のアルゴリズムも併せて改善した。従来のアルゴリズムでは橋や河川敷、傾斜のある地形での自動処理は難しいとされていたが、全体的に平坦な土地に勾配の大きな地域が局所的に混在していても、自動で地盤面データを精度よく抽出できるようになった。●京都市東山区清水寺法観寺周辺で計測された車載LiDARデータを用い、建物群の側面データの自動および半自動抽出手法の開発に取り組んだ。最初に道路や歩道のデータを除去し、建物側面の開口部情報をLiDARデータおよび同時取得された写真から抽出する方法を検討した。●建造物群のモデリングの応用事例の一つとして、滋賀県東近江市百済寺の庭園を対象に、植生群落が存在する中で地上LiDARデータから建造物群をモデリングする方法論に関して研究を進めた。多数地点から計測された地上LiDARデータから、地盤面、池、植生などの非建造物群データを段階的に自動で除去し、計測された建物群の大まかな構造に関する情報を推定する手法を検討した。本研究では、京町屋を含む密集市街地における建造物群を対象に、地上LiDARと航空機LiDARから3次元建物モデルを自動生成する手法の開発を目的としている。平成23年度は下記の内容を実施した。1.地上LiDARからの建物属性の自動抽出:伝統的建造物群保存地区における格子窓の自動抽出を試みた。2.航空写真からの建物領域抽出手法の開発:密集市街地における影領域を含む建物領域の抽出精度を向上させるアルゴリズムを開発した。3.航空機LiDARと航空写真を併用した建物の三次元モデリング:密集市街地における建造物の三次元ワイヤーフレームモデルの自動生成アルゴリズムを確立し、京都市東山区に適用して有用性を検証した。4.航空機LiDARと航空写真を併用した都市内の緑視率、囲繞(いじょう)度の推定:景観工学における定量的評価指標の効率的作成支援として、航空機LiDARと航空写真を併用した緑視率、囲繞度の推定アルゴリズムを構築した。5.地上近接写真写測量を用いた建物の3次元モデリングにおける効率化:京都市東山区の密集市街地を対象に、多数のステレオペアを同時に処理する接続標定を実現し、またモデリングの際に支障となる大きな誤差を持つパスポイントを検知し除去する方法論の構築を試みた。また建物の三次元モデリングのために、複数の建造物上の平面領域を精度よく検出することを目的とし、建造物の平面幾何条件と画像の色情報を利用した平面領域の輪郭を抽出する方法を検討した。
抗炎症能力を増強した間葉系幹細胞をデバイスとする新たな歯周組織再生療法の確立

間葉系幹細胞(MSCs)は、ケモカインの作用により炎症部位に遊走・集積し、抗炎症作用や組織修復に働く。本研究では歯根膜線維芽細胞(PDL-Fs)とMSCの相互作用を解明することで、歯周炎症部位におけるMSCsの役割を検討した。炎症性サイトカインはPDL-FsにおけるMCP-1の発現を促進した。PDL-Fsと直接共培養されたMSCsはSca-1、CD44の発現が増強されると共に、IL-6の発現抑制に加えIL-10及びTGF-βの発現促進が確認された。すなわち歯周炎症部位に集積したMSCsは、周囲の歯周組織構成細胞との細胞間接触を介した相互作用によって、抗炎症作用が増強されると示唆された。一方、主として骨髄に存在する間葉系幹細胞(MSC)は血流を介し、炎症部位へ到達し、組織修復や再生に関与する。しかしながら、マウス骨髄より採取したMSCは増殖能が極端に低い。そこで、生後3週齢のGFPマウス骨髄由来間葉系幹細胞を採取し、不死化を行った。その結果、分化能の異なる複数の細胞株の樹立に成功した。それぞれの細胞株において表面抗原マーカーの発現を解析したところ、95%の細胞株においてMSCマーカーであるSca-1が陽性であった。しかしながら、他のMSCマーカーで発現量に差が認められた。さらにCCL22、Cx3cr1、Prl、Flt3、Prl、CCL12、CXCL13、CCL8のmRNA発現量に差が認められた。樹立された細胞株の違いを詳細に比較することによって、これらの差異を生かした部位特異的な幹細胞治療に繋がる可能性が期待される。炎症の誘発やそれに引き続く組織修復は、様々なサイトカインやケモカインによって調節されている。これら複数の因子や細胞が関与する調節機構は複雑であり、未だ全容の解明には至っていない。本年度は歯周組織における炎症を前提とし、歯根膜細胞における炎症性サイトカインの影響を調査した。さらに炎症抑制ならびに組織修復能を有する間葉系幹細胞と歯根膜線維芽細胞の相互作用を明らかにすることで、歯周組織における一連の炎症調節機構を理解する。炎症誘発から組織修復までの一連の過程を理解するために、本年度は歯根膜由来線維芽細胞と骨髄由来間葉系幹細胞のサイトカイン・ケモカインネットワークを介した相互作用を解明した。ット歯根膜由来線維芽細胞様細胞SCDC2をIL-1β、IL-6、TNF-αで処理するとケモカインSDF-1αとMCP-1の発現が誘導されることを見出した。SDF-1αとMCP-1はヒト骨髄由来間葉系幹細胞UE7T-13やGFPマウス骨髄由来間葉系幹細胞SG2の遊走能を有意に促進したが、SCDC2における効果は認められなかった。これらの結果から歯根膜細胞が炎症性サイトカインによって刺激されてケモカインを分泌し、分泌されたケモカインが間葉系幹細胞にパラクリンに作用することで炎症部位への遊走・集積を促進することが示唆された。最終的には炎症部位におけるケモカイン発現誘導ならびに間葉系幹細胞集積効果をin vivo実験系において確認するとともに、得られた知見を臨床へとフィードバックすることを目標とする。組織破壊を伴う重篤な歯周炎は主として局所に浸潤したマクロファージから分泌されるIL-1β、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインの作用による過剰な炎症反応が要因とされる。また、炎症治癒後の組織修復には、間葉系幹細胞(MSC)が関与する。主に骨髄に存在するMSCはケモカインの作用により炎症部位に遊走・集積し、抗炎症作用や組織修復に働く。しかしながら、歯根膜線維芽細胞(PDL)への炎症性サイトカインの影響や歯周組織修復におけるケモカインの影響などの詳細は明らかではない。本年度はPDLとMSCの相互作用を解明することで、歯周炎症部位におけるMSCの役割を検討した。ラットPDLを炎症性サイトカインで処理し、ケモカインのmRNA発現を調査したところ、MCP-1のmRNA発現が促進された。次にMCP-1による細胞遊走促進効果をPDLとMSC株で評価した。その結果、興味深いことにMCP-1はMSCの遊走能を促進する一方、PDLの遊走能は促進しなかった。さらにMSCとPDLを直接共培養したものと、trans-well systemを用いて細胞間接触しないように間接共培養し、MSCマーカーの発現、サイトカインのmRNA発現と分泌量を検討した。その結果、MSCとPDLの直接共培養のみでで、MSCマーカーSca-1、CD44の発現が上昇すると共に、炎症性サイトカインIL-6の発現が抑制され、抗炎症サイトカインIL-10及びTGF-βの発現と分泌が促進された。すなわち、歯周炎症部位に集積したMSCは周囲の歯周組織構成細胞との細胞間接触を介した相互作用によって、抗炎症作用が増強されると示唆された。PDL-Fsと直接共

培養されたMSCsはSca-1、CD44の発現が増強されると共に、IL-6の発現抑制に加えIL-10及びTGF-βの発現促進が確認された。すなわち歯周炎症部位に集積したMSCsは、周囲の歯周組織構成細胞との細胞間接触を介した相互作用によって、抗炎症作用が増強されると示唆された。骨吸収を伴った重篤な歯周炎は、主として局所に浸潤したマクロファージから分泌されるIL-1β、IL-6といった炎症性サイトカインの作用による過剰な炎症反応が要因とされている。本年度はこれら炎症性サイトカインの影響を確認するために歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞を用いて作用機序を検証した。その結果、炎症性サイトカインの刺激は間葉系幹細胞の遊走能を促進するケモカインSDF-1αとMCP-1の発現を誘導した。この結果は炎症部位への間葉系幹細胞の集積を意味するものであり、本研究の前提であるセルデバイスとしての間葉系幹細胞の利用を肯定するものであった。したがって、おおむね順調に進展していると判断した。口腔生化学現在までに歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞におけるケモカインの発現や、間葉系幹細胞における遊走促進効果を明らかにした。一方で興味深いことに、ケモカインSDF-1αやMCP-1は歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞の遊走を促進しなかった。これらの結果から、炎症性サイトカインによって刺激された歯周組織構成細胞がケモカインを分泌し、分泌されたケモカインが間葉系幹細胞にパラクリンに作用することで炎症部位への遊走・集積を促進する可能性が示唆された。これらの知見を元に、次年度の研究実施計画を記す。1)細胞間接触を介した相互作用の解析:我々が樹立したGFPマウス骨髄由来MSC(SG2、Sawada et al., 2015)を歯肉線維芽細胞や歯根膜細胞との共存培養下で分化させ、骨ならびに脂肪分化に与える影響を調査する。GFPの蛍光をトレーサーとして二種の細胞を分離後に遺伝子発現を解析し、異なる細胞間が相互にどのような影響を与えているのかを明らかにする。2)ケモカインの発現誘導ならびに間葉系幹細胞集積効果の検証:吉永らの方法(2010)にしたがって歯周炎モデルラットを作製し、SG2を尾静脈から注入する。口腔領域の組織切片を作製し、炎症部位への間葉系幹細胞の集積をGFPでトレースすることで確認する。さらに抗炎症性サイトカイン抗体や抗ケモカイン抗体を用いた免疫組織染色を実施することで、炎症性サイトカインの局在とケモカインの発現誘導の相関性について検証する。研究計画に従って研究を実施した結果、概ね期待される結果を得ることができた。本年度は特にベクター作製に注力し、様々なタイプのプロモーターに連結した発現ベクターを作製することができた。さらにこれらの発現ベクターを形質導入するための間葉系幹細胞を樹立することもできた。一方、ベクターを導入するための手法にエレクトロポレーション法を予定していたが電極等の問題で実施できなかった。しかしながら、それに代わる方法として糖質ベースのトランスフェクション試薬によって代替した結果、良好な結果を得ることができた。したがって、概ね順調に進展していると判断した。本研究では歯槽骨吸収を伴った重篤な慢性歯周炎治療において、MSCをセル・デバイスとした細胞治療cell therapyの臨床応用を目指した基礎的研究ならびに有効性の証明を目的とする。
MRSA増殖抑制効果を有する微生物の生体適用実用化研究

MRSAに対して強い増殖抑制効果を有するブドウ球菌Staphylococcus warneriおよびStaphylococcus lugdunensisについて最適培養条件(培地、培養時間、培養方法)を確立した。そして、その条件下で培養した時産生されるMRSA増殖抑制物質即ちバクテリオシンの抗菌活性測定法を検討し、再現性を有する方法を確立した。抗菌活性測定法については、実験を進めて行くなかで、従来から周知されているwell agar methodでは、バクテリオシンの活性が弱い場合、バクテリオシンが産生されているにもかかわらず抗菌活性が確認できないことがわかった。そこで、well agar methodを改良し、活性を測定可能とした。これは、特筆に値する。次いで、ゲル濾過によりS.lugdunensis産生バクテリオシンは分子量500KDaとかなり大きなタンパクであることがわかった。幾つかのサブユニットより構成されていることが考えられる。そこで、例えばウレアを作用させ、活性がどのように変化するか?今後検討していきたい。また、ゲル濾過後の活性分画をHPLCにより分析した結果(依頼分析)、顕著な2つの鋭いピークが確認された。出現したピークと活性との関係について今後検討する。S.warneri産生バクテリオシンについては、ゲル濾過により分子量十数KDaのタンパクであることがわかった。今後、両バクテリオシンともより最適な精製条件を検討し、単一な物質にまでもっていく予定である。抗菌活性作用機序については、S.lugdunensis産生バクテリオシンは一度増殖したMRSAを溶菌するかなり強い活性であった。一方、S.warneri産生バクテリオシンはMRSAが増殖した後では活性は確認されなかった。詳細についてはこれから検討する必要があるが、そのメカニズムは明らかに異なっていることが示唆された。平成8年度は、健康人鼻腔中でその存在が確認され同定がなされたMRSA増殖抑制を有する菌の培養条件の確立、抗菌物質の抽出、分離、精製を実施する計画であった。1菌種については、A)培養条件を確立した。B)抗菌物質の抽出、分離方法に関しても最適条件を見い出すことができた。得られた抗菌物質は生化学的検討を加えた結果、バクテリオシンであることがわかった。さらに引き続きバクテリオシンに対して幾つかの生化学的検討を加えた。なお、C)抗菌活性の測定法についても色々改良を試み、抗菌活性の再現性が確実なものとなった。D)精製についてはまだその途中であるが、ゲル濾過により分子量が十数KDaであることが示唆された。もう一方の菌種については、培養条件の確立にてこずっており現在検討中である。しかし、この菌の抗菌性もバクテリオシンによるものであると推定される。8年度実験を進めていく途上で、幸運にも新たに1菌種MRSA増殖抑制を示す菌が確認された。この菌についても同定を行い、さらに上記A)D)について同程度の結果を出すことができた。なお、このタンパクの分子量は百数十KDaであり、かなり大きいタンパクであることが示唆された。
名種セラミック材料に対する細胞接着性の評価

エンジニアリングセラミックスとして広く用いられているAl_2O_3およびZrO_2の酸化物は生体材料としても有効な材料である.そこで,これら酸化物に加えてSi_3N_4およびTiNの窒化物およびTiCの炭化物の焼結体を用いて,in vitroにおける細胞接着性からこれら材料の細胞適合性について検討を行い,他のエンジニアリングセラミックスの生体材料としての可能性について検討した.さらに,チタンおよびチタン合金表面に対して加熱酸化処理を行い,動的接触角およびずり応力負荷後の細胞残留割合から求めた相対細胞残留率によって酸化処理の影響を評価した.その結果,今回用いた5種類のエンジニアリングセラミックスは,対照とした培養用プラスチックシャーレに匹敵する相対細胞接着率を示した.このことより今回用いた材料が加工技術の進歩や他の材料との複合化によって新しい生体材料として有望であることが示唆された.また,チタンおよびチタン合金の加熱酸化処理によって,水に対するねれが小さくなり親水性を変化させることができたが,細胞の接着性には大きな変化を認めなかった.また,いずれの条件においても,ずり応力の負荷時間に伴って,細胞残留率は減少した.これらの結果は今後,さらに使用目的に適合した表面構造を創製することの重要性とその際の評価法として多面的に捕らえられることの必要性を示すものである.エンジニアリングセラミックスとして広く用いられているAl_2O_3およびZrO_2の酸化物は生体材料としても有効な材料である.そこで,これら酸化物に加えてSi_3N_4およびTiNの窒化物およびTiCの炭化物の焼結体を用いて,in vitroにおける細胞接着性からこれら材料の細胞適合性について検討を行い,他のエンジニアリングセラミックスの生体材料としての可能性について検討した.さらに,チタンおよびチタン合金表面に対して加熱酸化処理を行い,動的接触角およびずり応力負荷後の細胞残留割合から求めた相対細胞残留率によって酸化処理の影響を評価した.その結果,今回用いた5種類のエンジニアリングセラミックスは,対照とした培養用プラスチックシャーレに匹敵する相対細胞接着率を示した.このことより今回用いた材料が加工技術の進歩や他の材料との複合化によって新しい生体材料として有望であることが示唆された.また,チタンおよびチタン合金の加熱酸化処理によって,水に対するねれが小さくなり親水性を変化させることができたが,細胞の接着性には大きな変化を認めなかった.また,いずれの条件においても,ずり応力の負荷時間に伴って,細胞残留率は減少した.これらの結果は今後,さらに使用目的に適合した表面構造を創製することの重要性とその際の評価法として多面的に捕らえられることの必要性を示すものである.マウス結合組織由来のL-929細胞を用いて,アルミナ(Al_2O_3),ジルコニア(ZrO_2),窒化ケイ素(Si_3N_4),窒化チタン(TiN),炭化チタン(TiC)およびヒドロキシアパタイトの各焼結体における初期細胞接着性を培養用プラスチックシャーレに対する初期相対細胞接着率から求めた.なお,対照として硬質ガラスおよびテフロンについても実験を行った.その結果,10%血清添加条件では,30分および3時間培養群ともに対照として用いたテフロンを除いて相対細胞接着率は,80%以上を示した.しかし,窒化ケイ素,窒化チタンおよび炭化チタンにおいて他のセラミックスに比べてわずかに低い初期相対細胞接着率を示す傾向が認められたが,有意の差を認めなかった.次に1%血清添加条件についてみると,10%血清添加条件と同様な傾向を示し,30分および3時間共に相対細胞接着率は80%以上を示し,血清濃度あるいは培養時間による試料間での相対細胞接着率の相違はほとんど認められなかった.つぎに,10%血清添加条件における24時間後の相対細胞増殖度は,各セラミックスとも80%以上を示しており,これらセラミックスには細胞毒性は認められなかった.以上の結果より,本実験に用いたセラミックスが優れた細胞接着性を示すことが明らかとなった.しかし,セラミック材料の構造と細胞接着性との関係については十分に解明するに至らなかった.今後,不透明な試料上での細胞数および接着面積のより定量性の高い測定方法を開発することによって材料間での差をより明確にしていくことが必要であると考える.マウス結合組織由来のL-929細胞を用いて,アルミナ,ジルコニア,窒化ケイ素,窒化チタン,炭化チタン,ヒドロキシアパタイトおよび陶材の各焼結体における細胞接着性を評価した.まず最初に,培養用プラスチックシャーレに対する初期相対細胞接着率から評価した.なお,対照として硬質ガラスおよびテフロンについても実験を行った.材料表面に付着した細胞数の算定は,材料表面から細胞を剥離後,核数計算法により測定する方法と画像解析法による材料表面の細胞数を測定する方法を用いた.画像解析法としては,培養30分後PBSで洗浄後,3%ホルムアルデヒドで固定し,May-Grunwald Giemsaで染色後,金属顕微鏡で観察し画像解析ソフトNIHImageを用いて材料上の細胞数を測定した.その結果,培養30分後において,対照として用いたテフロンを除いて相対細胞接着率は80%以上を示し、今回実験に用いたセラミックスが良好な細胞接着性を示すことが明らかとなった.また,核数計算法と画像解析法との間に良好な相関性が得られ,本実験で用いた画像解析法が不透明な材料上における細胞数の定量法として有効であることが明らかとなった.次に,チタンとチタン表面に酸化膜を形成した材料を用いて,ずり応力負荷による細胞の剥離割合をみると,定ずり応力の負荷時間が長くなるほど材料表面上の細胞数は減少したが,両材料間で優位な差は認められなかった.
分子線エピタキシャル法によるP型ZnSの作成とその発光素子への応用

本研究は分子線エピタキシャル法によりP型ZnSを作成し発光素子への応用の可能性を見出すことを目的とし昭和63年度から平成元年度にかけて実施したもので、得られた研究成果の概要は以下の通りである。最初に分子線源としてZn用に固体ソ-ス、S用にH_2Sガスソ-ス、また基板面にGaAs(100)面を用いて成長実験を行い、分子線の熱解離条件、供給分子線強度比、基板温度等の多くのパラメ-タに関して良質なノンド-プ結晶を得るための最適条件を確立した。P型用不純物としてはI族元素、具体的にはNa_2S分子線源を用いNaを添加する方法をとり適切な成長法を設定して添加実験に成功した。しかしその結晶性はかなり低下するため種々の改善法を検討した。まず最初に分子線源の改善として固体、ガスし両ソ-スの併用法を止め全固体ソ-ス系とし、基板に無極性表面を使用することを試みやはりNaを充分添加しうることを見出した。しかし結晶性の顕著な改善はできなかったため成長時にさらに何らかの補助的手段を付加するのが良いであろうとの結論に達した。それらの方法としてレ-ザ照射効果の利用ならびに基板面方位の最適化をおこなうことにした。現在研究室に保有している諸装置の配置状況に関係上、レ-ザ照射をZnS用のMBE装置に適用するためには装置の移動ならびに改善に多大に経費が必要で実施困難のためレ-ザ照射効果の実験は独立的に実施することにした。実験結果によれば、波長192nmのArFエキシマレ-ザを用いそのピ-ク強度、繰返し等の照射条件を適切にし、基板面方位の選定や不純物用分子線の強度をうまく選定することにより、レ-ザ照射により結晶性を大幅に改善できることを見出した。本研究は終了時点では素子応用の段階までには達しなかったが数々の知見がえられた。そして実用デバイスの作成には装置の大幅な改善により充分可能であろうとの結論に達し、本研究の基礎的問題は完了したと考えられる。本研究の目的は分子線エピタキシヤル(MBE)法によりP型ZnSを作成し、最終的には青色発光素子を実現することであるが、初年度はP型導伝性結晶の作成として母体ZnSの結晶性を損うことなく不純物を導入し得る方法を確立することに専念した。すなわち(1)母体ZnS用および不純物Na用の分子線源の供給法の確立。(2)基板に用いるGaAs結晶方位がエピタキシヤル層の結晶性に及ぼす影響の解明の二点に絞り研究をおこなった。(1)に関しては分子線源用の原料選定ならびに供給分子種の最適化が最も重要な問題と考え本研究費で購入した半導体製造装置用ガス分析計により分子線供給法における主要パラメータ(分子線源セル温度、分子線の熱解離温度、供給分子線強度)により分子種がどのように変化するかを実験的に確かめ、最適成長法の確立のための研究をおこなった。これらの結果不純物用原料としてNa_2Sを用いる場合、母体結晶用原料としてZnSの組合せをとり適当な供給条件を用いるのが有効であることを見出した。多くの成長実験をおこなった結果Naが確実に結晶内に導入しうる条件を見出したが、作成された結晶はなおかなり高抵抗であり成長条件の最適化に対してなお研究する必要があることが判った。

(2)に関して結晶表面の極性が不純物導入に対し大きく影響を及ぼしているであろうとの考えより、無極性の(110)面を用いるのが良いだろうと考え実施したもので、その有効性を示す実験結果が二三得られたが、現時点ではなお再現性に乏しい。これは一般的な(100)、(111)面に較べ初期トリートメントの確立に問題があるようで次年度は反射電子回折によるin situ観測を実施1トリートメント法を確立する予定である。以上が本年度の経過であり、次年度もなお1ばらくP型結晶の作成法の確立のための研究を継続し、その後実用デバイスの基礎となるp-n接合素子の研究に移る予定である。前年度の研究結果から結晶性を損うことなく不純物添加をおこなうための種々の改善策を考案し,実験装置にも部分的に改造をした後研究を継続した。それらの主要な点は,(1)最初の計画では固体ソ-スとガスソ-スの併用法を用いたがそれらを全固体ソ-スに統一した。(2)ZnSを原料とする固体ソ-スを用いることにしたため生起しやすいと考えられるZn欠陥を補償するためZnの固体ソ-スを付加し,さらに各固体ソ-スを基板に供給する直前に再熱解離をおこなうようにした。(3)不純物材料の強いイオン性効果の対策として無極性表面がえられる面方位をもつ基板についても実験をおこなうこととした。これらの方法を採用しP型ZnSの成長実験を繰りかえし,その際考えられる限りの成長条件下で成長をおこなった。それらの結果不純物の添加量を広範囲に変化させる方法は見出したが添加量に比例して結晶性は低下し,通常のMBE法に何らかの補助手段を用いる必要があるとの結論に達した。それらの方法として(1)レ-ザ照射効果を利用すること,(2)アンチフエ-ズドメインの防止や二次元成長促進のための適切な面方位をもった基板の使用を行うことにした。研究室の装置の設置状況の制約のためこれらの研究をZnS用のMBE装置でおこなうためには多額の改造費と時間を要するため独立して実験することにした。レ-ザ光としてはArFエキシマレ-ザを用い基板面としては(100)(111)(110)の三種類について行った実験結果によれば,ArFレ-ザ照射,基板面方位,分子線供給条件を適切にすることにより結晶性が大幅に改善されることを見出した。また種々の実験結果からそのような場合の結晶成長メカニズムに対しても多くの知見がえられた。このような研究経過により本研究は不純物添加およびデバイス応用のための基礎的研究は一応完了した。
鉄筋コンクリートクラックの性状の磁気的非破壊検査法の開発

本研究はコンクリートクラックの非破壊検査に磁気および高周波電界を利用したことに特色がある。すなわち、磁気は浸透性にすぐれ特にコンクリートのように抵抗率の大きい材料においては、磁気に対して殆ど透明であり、そのため検査深度を向上することが可能である。測定システムは小型であり、作業性がよく、その結果あらゆる現場のコンクリート構造物のクラックの非破壊検査を低コストで提供することが可能である。さらに、本研究において電気的な検査法を試みた。すなわち、コンクリート表面よりひび割れに導電性液体を注入し、さらにコンクリート表面にアルミニウム等の導体板を設置しアースの機能を持たせ、ひび割れに注入した導体とアース板の間の入力インピーダンスを測定から、共振周波数を求め、コンクリートのひび割れ深さを判定する方法である。アンテナの長さが約4分の1波長となる周波数で共振することから、.モノポールアンテナ長すなわち、ひび割れ深さLは、コンクリートの比誘電率をε_sとすれば、L=λ/4=c/(4×f_0×√(ε_s))(1)と求められる。12mにおよぶ深いひび割れの共振周波数は15MHz7.5MHzであり、ネットワークアナライーザーなどにより精度良く測定できるので、ひび割れ深さも数%の誤差範囲で容易に推定できる。また共振時インピーダンスの実部の値がひび割れの進入角度に比例して、低下することより、ひび割れの進入方向の推定も可能である。我が国の経済状況を考えれば、コンクリート構造物の性能の劣化を早期発見し、早期補修をし長持ちさせることは必須であり、財政上の負担軽減および省エネルギーを達成し、地球環境に対する低負荷社会の実現に貢献し、地球環境に対し優しい社会を実現する技術として極めて重要な課題であると考えられる。さらに、コンクリート構造物に対する社会的不安を除くたど、社会的寄与は大きい。平成12年度は鉄筋コンクリートクラックの磁気的非破壊検査システムの構築のための準備として次の(1)および(2)の項目について実験を行った。(1)正弦波交流磁界励磁によるクラック深さ測定システムの構築全長40cm、断面が1.5×0.75cmのフェライトコアに1.8mmφのホルマル線を113回巻いた励磁コイルを2本製作し、これを互いに90°の角度で向かい合わせて配置しV形励磁コイルとする。発振器からパワーアンプを介してV形励磁コイルに20kHzの正弦波交流電流を流し、励磁磁界を発生する。フェライトコアに巻かれた検出コイルはV形励磁コイルの中心に位置し、クラックに注入した磁性粉の磁化による磁束を検出する。本システムによるクラックの深さの推定の検証を行うため、深さの異なる数種類のクラックモデルを製作し実験とシミュレーションを行った結果、V形励磁コイルの間隔と検出コイルの電圧の関係から6cmまでの未知のクラックの深さが推定できることが判った。(2)瞬間強磁界励磁によるクラック深さ推定のための瞬間強磁界発生装置の設計試作10cm_3に0.5Tの瞬間磁界を10μsec間発生させるための瞬間強磁界発生装置の励磁コイルと充電用コンデンサの過渡現象を解析し、コイルの形態の設計を行い、またコンデンサーの値を4000μF充電電圧は1000Vと決定し、装置の試作をおこなった。その試験は13年度に行う予定である。平成13年度は、鉄筋コンクリートクラック深さの非破壊検査法として、磁気的方法に加えて、新たに電気的な検査法を試みた。

すなわち、コンクリート表面よりひび割れに導電性液体あるいは導体粉を注入し、さらにコンクリート表面にアルミニウム等の導体板を設置しアースの機能を持たせ、ひび割れに注入した導体とアース板の間の入力インビーダンスを測定から、共振周波数を求め、コンクリートのひび割れ深さを判定する方法である。アンテナの長さが約4分の1波長となる周波数で共振することから、モノポールアンテナ長Lすなわち、ひび割れ深さは、コンクリートの比誘電率をε_sとすれば、L=λ/4=c/(4×f_0×√<ε_s>) (1)と求められる。深さが200mmのひび割れを持つコンクリート供試体を製作し、ひび割れに銅粉を溶剤と混合しスプレー状にして注入し、アルミニウムの導体板をアース板とし、このアース板のほぼ中央にN形レセブタクルコネクターを取り付け、中心ピンをひび割れ中の導電銀ペーストに挿入し電気的に導通している。アース板とひび割れ中の導体(銅)でモノポールアンテナを構成している。共振周波数をネットワークアナライザで測定し、(1)式より、深さを算出したところ十分な精度で推定できることがわかった。14年度は、実用化に向けて導電性液体や注入方法の検討を行い、実際のコンクリート構造物のひび割れ深さを測定する予定である。また、瞬間強磁界励磁によるクラック深さ推定の実験は瞬間強磁界発生装置の製作の遅れから、14年度に持ち越した。平成14年度は、13年度に引き続き、鉄筋コンクリートクラック深さの非破壊検査法として、電気的な検査法を試みた。すなわち、コンクリート表面よりひび割れに導電性液体を注入し、さらにコンクリート表面にアルミニウム等の導体板を設置しアースの機能を持たせ、ひぴ割れに注入した導体とアース板の間の入力インピーダンスを測定から、共振周波数を求め、コンクリートのひび割れ深さを判定する方法である。アンテナの長さが約4分の1波長となる周波数で共振することから、モノポールアンテナ長、すなわちひび割れ深さLは、コンクリートの比誘電率をε_sとすれば、と求められる。一辺の長さが1mのコンクリートブロックにひび割れに注入した導体に見立てた各種形状の銅線あるいは銅板を埋め込み、またアルミニウム導体板の大きさも変化し、複素インピーダンスを測定した。虚数部が零になった場合を共振周波数とすると、共振周波数は空気中に比べ5分の1に低下すること、また正方形導体板がアース機能を有するためには正方形板の1辺の長さは、ひび割れ長さの2倍必要であることがわかった。さらに、共振周波数空気中に比べて5分の1に低下することから、コンクリートの比誘電率は25程度であることがわかった。また共振時インピーダンスの実部の値がひび割れの進入角度に比例して、低下することより、ひび割れの進入方向の推定も可能である。本方法により、12mにおよぶ深いひび割れの共振周波数は15MHz7.5MHzであり、ネットワークアナライーザーなどにより精度良く測定できるので、ひび割れ深さも容易に推定できる。また、瞬間強磁界励磁によるクラック深さ推定の実験は瞬間強磁界発生装置のコンデンサーの事故により新たな実験はできなかった。
細胞のキラリティの分子メカニズムとその機能の解明

ゼブラフィッシュ黒色色素細胞は培養下で反時計回りに回転する。この回転運動をもたらしている細胞骨格の実体を解明するためLifeactmおよび微小管結合タンパク質であるMAP4を蛍光タンパク質に融合させ色素細胞に発現させた。これにより細胞の自転運動がアクチン繊維の運動によってもたらされていることが明らかになった。さらにこの細胞の回転運動をalpha-actininの過剰発現により阻害すると色素細胞間の相互作用が変化し、黒色色素細胞が減少し体表の模様形成が変化することを明らかにした。これは黒色色素細胞のキラリティが細胞間相互作用と細胞パターン形成において重要な働きをしていることを示唆している。本研究はゼブラフィッシュの色素細胞を用い、細胞のキラリティの分子メカニズムおよびその生理的意義を明らかにしようというものである。この目的のため色素細胞のアクチン骨格系を可視化するトランスジェニックフィッシュの作成を行った。アクチンの動態に影響を与えず、アクチン繊維の可視化を行うためアクチン結合タンパク質Lifeactに蛍光タンパク質GFP/mcherryを色素細胞特異的プロモータ下で発現させるトランスジェニックを作成し現在F1世代を育成中である。また、よりアクチン動態を詳しく調べるためPhoto-convertible fluorescent proteinであるKikGRをLifeactに結合させたタンパク質を発現するトランスジェニックフィッシュも作成を試みたがKikGRの自己結晶化能のためうまくいかなかった。これらアクチンの可視化系作成と並行してキラリティに影響を与えるという報告があった遺伝子actininを色素細胞に特異的に発現する系も作成中であり、現在F0世代が成長中である。現在のところはっきりしたパターンへの影響は見られないがF1世代を作成し色素細胞の配置パターンへの影響を調べていく予定である。本研究では色素細胞において様々なタンパク質を発現させたトランスジェニックを作成することが必要であるが、色素細胞特異的プロモータとの相性のためかいくつかの遺伝子の発現が良くない場合がありその最適化のため時間がとられた。またPhotoconvertible fluorescent protein KikGRの使用がタンパク質の自己結晶化という予期しない現象のため不可能になったことも影響している。本研究の目的は、ゼブラフィッシュの色素細胞のキラルな回転運動の分子機構と生理的意義を明らかにすることである。分子機構については、これまでの研究からアクチン骨格が重要な役割を果たしていることがわかっていた。そこで生細胞においてアクチン骨格の挙動を観察するため、アクチン特異的に結合するポリペプチドであるLifeactと蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトを色素細胞に発現するトランスジェニックフィッシュを作成した。この色素細胞を観察することにより、色素細胞が反時計回りに回転する際に、細胞周縁部に平行に走るアクチン繊維束が周縁部から細胞中心方向に向かって移動し、さらにこの繊維の束が生じる箇所が時計回り方向に徐々にずれていくことが明らかになった。おそらくこの時計回り方向へのアクチン繊維束の移動が細胞の回転をもたらしていると考えられる。そこでこのアクチン繊維の運動を制御する機構を調べるため、さまざまな阻害薬を投与しアクチン繊維の挙動に対する効果を解析した。その結果、ミオシン阻害剤であるblebbistatinを投与するとアクチン繊維の運動が不活性化されることが分かった。このことからアクチン繊維はミオシン依存的に局在変化していることが示唆された。さらに細胞の回転運動が持つ生理的意義について解析するため、ゼブラフィッシュにおいて色素細胞の回転に干渉し、その効果について解析した。2015年に発表されたTeeらによる培養細胞のアクチン骨格系の研究において、アクチン結合タンパク質であるActininを過剰発現させるとアクチン骨格系のキラリティが逆転することが示された。そこでゼブラフィッシュの色素細胞にActininを過剰発現させたところ、黒色色素細胞が成長に伴って減少し、模様に変化が現れることが分かった。現在この色素細胞を分離し、どのような変化が起きているかを解析中である。上で述べたように細胞の回転運動はアクチンの代謝に依存している。そこで色素細胞における安定したアクチン可視化系を作成しようとした。始めは色素細胞に特異的なプロモータであるNacreプロモータの下流にGFP-actinを発現させようとしていたがプロモータとの相性が悪く十分な発現が得られなかった。そこでアクチン結合ペプチドであるLifeactをもちいたところアクチンの可視化に成功した。さらにphotoconvertible蛍光タンパク質であるKikGRによってアクチンの挙動を解析しようとしたが、この蛍光タンパク質は発現量が高いと細胞内で結晶化するという予期しない結果が得られたため計画していたアクチンの挙動解析を行うことができなかった。またこれらの可視化による解析とは別にアクチンの構造や局在を制御する因子を特定することが必要であると考え、この因子の単離に取り組んでいる。色素細胞は血清非存在下で培養するとアクチン繊維の発達がみられず回転運動も示さない。これに対し血清刺激を加えるとアクチン繊維が発達して激しく局在の変化を示し、細胞は回転運動する。そこで血清刺激した細胞と、刺激を行わない細胞の懸濁液からそれぞれアクチンを沈降させ、共沈してくる結合タンパク質群の差を調べ、アクチンの制御にかかわる変化を示すアクチン結合タンパク質を特定しようと試みている。これまでに条件の検討を行い、細胞抽出液から安定してアクチンを沈降分離できるようになった。現在、このアクチンと結合するタンパク質をSDS-PAGEと銀染色によって解析中である。刺激の有無による細胞のアクチン構造の違いに由来すると考えられるいくつかのタンパク質の候補が得られており、質量分析による特定に取り組んでいる。

本研究はゼブラフィッシュの黒色色素細胞の反時計回りの自転運動に着目し、細胞がもつ固有のキラリティのメカニズムおよび、生理的意義について研究を行ったものである。ゼブラフィッシュの黒色色素細胞は、魚の体表において黄色色素細胞と直接相互作用し、この作用を通じてお互いの局在を制御することで体表の模様パターンを形成している。以前の研究において、これらの色素細胞をゼブラフィッシュのヒレから採取して培養する技術を開発し、培養下において色素細胞間の相互作用を解析したところ、黒色色素細胞は黄色色素細胞が接触すると黄色色素細胞から見て必ず左側へと忌避運動を見せることを発見した。この運動の偏りが何から生じているかを解析したところ、黒色色素細胞の表面が一定の方向(反時計回り)に持続的に回転しており、その表面に対して黄色色素細胞が接触すると回転運動のために黄色色素細胞は右方向へ進み、またその反作用として黒色色素細胞は左方向へと忌避することを発見した。この回転運動は黒色色素細胞を孤立した状態で培養した条件においても観察された。この運動方向は培養時の底面に塗布したマトリックスの種類には影響を受けず、また付着した状態でひっくり返しても影響を受けなかったためコリオリ力によるものではないことも示された。さらに、この運動はアクチン重合阻害剤によって阻害され、逆に微小管阻害剤によって活性化された。これらの結果からこの回転運動における方向性(=キラリティ)は細胞固有の機構に由来しており、アクチンの代謝における方向性から生じていることが示された。さらにアクチンに結合するタンパク質を蛍光タンパク質と融合させ、黒色色素細胞において発現させ観測したところ、アクチン繊維の一定方向の回転運動が観察されこの仮説が裏付けられた。ゼブラフィッシュ黒色色素細胞は培養下で反時計回りに回転する。この回転運動をもたらしている細胞骨格の実体を解明するためLifeactmおよび微小管結合タンパク質であるMAP4を蛍光タンパク質に融合させ色素細胞に発現させた。これにより細胞の自転運動がアクチン繊維の運動によってもたらされていることが明らかになった。さらにこの細胞の回転運動をalpha-actininの過剰発現により阻害すると色素細胞間の相互作用が変化し、黒色色素細胞が減少し体表の模様形成が変化することを明らかにした。これは黒色色素細胞のキラリティが細胞間相互作用と細胞パターン形成において重要な働きをしていることを示唆している。今後は現在育成中のアクチン可視化トランスジェニックフィッシュが成長次第、色素細胞を採取し、回転運動中のアクチン動態の解析を行う。またアクチン繊維の構造に関しては電子顕微鏡による解析も予定している。さらに、アクチニン導入トランスジェニック
トリクロロエチレンによるＨｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ特異蛋白の解明

トリクロロエチレン及び代謝物のトリクロロエタノール及びトリクロロ酢酸のマキシミゼーションテストを行った。トリクロロエチレンは雌雄で、トリクロロエタノールは雌において感作性が観察された。感作されたモルモットの肝臓には炎症細胞浸潤を伴った壊死像が観察された。また、感作動物のALTやIFNγは感作されていない動物より高かった。感作した動物の血清にはCYP2E1抗体と反応する25と50KDの蛋白が多く、プロテオミクス解析で、IgGが増えていると推察された。ヒトCYP2E1発現細胞を作成し、患者と対照者の血清と反応させたところ、患者血清にはCYP2E1に反応するIgGが増加している可能性が示唆された。各群10匹の雌雄のHartleyモルモットを使用した。Tangらの方法(J Occup Health, 2007)を参考にし、OECDのガイドラインに従い、トリクロロエチレン(TRI)とその代謝物トリクロロエタノール(TCE)およびトリクロロ酢酸(TCA)のマキシミゼーションテストを行った。TRIの感作率は雄70%、雌90%、TCAは雄10%、雌0%、TCEは雄20%、雌50%であった。感作性の原因(抗原)を明らかにするため、平成25年度はトリクロロエチレンによる感作性動物の肝臓のCYP2E1蛋白をSDS-PAGE法で測定した。感作性動物と非感作性動物の間には発現量の差は認められなかった。次に、Blue Native-PAGE法で電気泳動を行い、ゲルを染色した。5060kDaに感作性動物特異的バンドがみられたので、プロテオミクス解析を行った。しかし、感作性動物特異的たんぱく質は検出できなかった。ここで方針を若干変更し、検出しようとする抗原は血中にあると仮定し、血清を用いて、CYP2E1による免疫沈処理を行い、その後電気泳動(SDS-PAGE)を行って、ゲルをSYPRO Rubyで染色して、Trans-illuminatorで可視化、撮影した。感作性動物では25kDa、27kDaおよび50kDaの蛋白が増加していることが判明した。50kDaはCYP2E1が想定されるが、血清における増加は報告されていない。27kDaは感作性動物においてのみ検出された。25kDaは曝露動物にも観察されるが、感作動物の方が発現量が高かった。これら3つの分子量をもつタンパク質を同定するため、現在プロテオミクス解析中である。対照群では、感作性は見られなかった。雄の皮膚の病理解析では、TRI曝露群で真皮層に局所的に好酸球やリンパ球の浸潤が見られた。TCE曝露群でも同様な皮膚障害が見られたが、TRI曝露群に比べ軽度で、頻度も少なかった。TCA曝露群の皮膚は、ほぼ正常であった。TRI曝露群の雄の肝臓では、中心静脈周囲にリンパ球浸潤を伴う大きな巣状壊死が、局所的に観察された。TCA曝露群、TCE曝露群では、肝臓の辺縁部の一部にリンパ球浸潤や小さな壊死像などの肝障害が見られたが、その頻度や程度はTRI曝露群より軽度であった。TRI曝露は、雄の感作性動物の血清中IFN-γ、ALTおよびγ-GTPを上昇させたが、TCA曝露やTCE曝露ではこのような現象は観察されなかった。各曝露群の肝/体重比は、対照群に比べ低値であり、TRI曝露群の雄については、非感作性動物よりも、感作性動物の肝/体重比が明らかに低かった。肝臓中のCYP2E1の発現が対照群に比べ、TRI曝露群は雄1.9倍、雌1.3倍、TCA曝露群は雄1.4倍、雌1.1倍、TCE曝露群は雄1.4倍、雌1.1倍であり、それぞれの曝露による誘導の程度に雌雄差が見られた。モルモットを使用した感作性試験から、トリクロロエチレンには強い感作性が、代謝物のトリクロロエタノールにも弱いながら感作性があることが判明した。この2物質に共通しているのは、代謝にCYP2E1が関与していることである。

CYP2E1の局在は肝臓ミクロソームである。しかし、細胞の表面にも少量ではあるが発現している。CYP2E1蛋白は自身の触媒作用により生成した化学物質の活性代謝物と付加物を作成する場合がある。化学物質との付加物の生成はP450等の薬物代謝酵素の免疫原性を増大させ、変性蛋白に対する自己抗体の産生をプロモートすると解されている。これらのことから、本年はヒトCYP2E1 cDNAをpcDNA3.1D/V5 His TA発現ベクターに組み換えて、HK293細胞(ヒト腎臓がん)導入後、SDS-PAGEとWestern blottingを行い、cDNAを導入していない細胞と比較し、ヒトCYP2E1の発現を確認した。次いで、NIH3T3(マウスケラチノサイト)にも作成したベクターを導入した。両細胞抽出液をanti-CYP2E1と反応させ、Protein A Sepharose TM CL-4B(IgGを特異的に補足する)を用い免疫沈降して、anti-CYP2E1(rabbit), anti-rabbit-HRPで視覚化し、精製したものがヒトCYP2E1であることを確認した。これらの細胞を患者と対照者(トリクロロエチレン曝露を60日以上受けたが、疾病を発症していない健康労働者)の血清で反応後、二次抗体anti-Human-HRPをつけて化学発光で視覚化した。その結果、患者の血清中にヒトCYP2E1に反応するIgGが対照者より多く発現しており、CYP2E1に反応する自己抗体が多く発現しているかもしれない。社会医学達成度は80%である。感作性・非感作性動物の肝臓を用いて、数回Blue Native PAGE法でタンパク質を、未変性のまま負に帯電させて泳動した。5060kDの間に感作性動物と非感作性動物の間に発現量が異なる2つのバンドを切り出し、プロテオミクス解析を行った。しかし、感作性の差を説明する蛋白質を同定出来なかった。感作性物質は血流にのり、全身に分布し、皮膚炎を発症すると、視点を変え、血清のCYP2E1抗原蛋白の解析を行った。血清での発現は極めて微量と考え、免疫沈降法を使用した。対照として野生型マウスとCYP2E1欠損マウスの肝臓と血清を使用した。その結果、非感作動物では全く発現しないが、感作動物のみで新たに発現が観察されたのは27kDaの蛋白であった。これらの蛋白は野生型およびCYP2E1欠損マウスでは発現していなかった。現在この蛋白をプロテオミクス解析中である。この結果が出たら、抗体を作成する予定で、これが達成できていない20%の部分であり、繰越が発生した。24年度研究の達成度は80%程度である。動物実験で、親物質のみならず代謝物のTCEにも感作性があることが明らかとなったことは大きな成果であった。感作性動物の肝臓を用いて、仮説としたCYP2E1-TRI代謝物の複合体が形成されるかどうか、プロテオミクス解析をした。HSP70が検出されたが、感作性特有のものではなかった。この電気泳動では蛋白を変性するために、ついで、Blue Native PAGE法でクマシーブリリアントブルー色素を用いて、タンパク質を未変性のまま負に帯電させて泳動した。5060kDの間に感作性動物と非感作性動物の間に発現量が異なる2つのバンドがあったので、それを切り出し、プロテオミクス解析を行った。感作性動物の肝臓に多い蛋白として、cytochrome b5が抽出されたので、電気泳動を行い、蛋白発現量を検討した。
子宮内膜症のＳＦ－１プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の検討

子宮内膜症はエストロゲン依存性疾患で、これまでに局所におけるエストロゲン合成に関してsteroidogenic factor-1 (SF-1)によるアロマターゼ発現制御機構が重要と考えられてきた。今回、SF-1発現を制御するSF-1プロモーター領域に着目し、転写因子結合領域のE-boxやCCAAT box、Sp-1 siteなどの重要な遺伝子結合部位付近はもとより、SF-1プロモーター領域近傍におけるエピジェネティックな機構の解明を試みた。まず初めに、SF-1プロモーター領域がメチル化された子宮内膜症間質細胞の症例を用い、強制的に脱メチル化を行った。そして局所エストロゲン濃度および細胞増殖能変化を比較検討したところ、脱メチル化前後でそれらの有意差は認められなかった。同様に、SF-1プロモーター領域がメチル化されていない正常子宮内膜間質細胞を用いて検討をしたところ、子宮内膜症間質細胞で強制的に脱メチル化した症例との間で細胞増殖能やアポトーシス誘導などに関し両者間で有意差は認められなかった。また、子宮内膜症の間質細胞におけるE-boxおよびその転写因子であるUpstream Stimulatory Factor (USF)-1およびUSF-2の発現動態も併せて検討したところ、それらは子宮内膜症細胞間質における最重要因子であり、脱メチル化は関係が薄いと確認された。以上より、子宮内膜症の間質細胞におけるSF-1プロモーター領域のメチル化に関しては新たな発症・増殖進展因子の同定にはならなかった。よって、今後もE-boxおよびその転写因子であるUSF-1およびUSF-2が子宮内膜症において重要な治療標的となりうると推察された。26年度が最終年度であるため、記入しない。アロマターゼは局所におけるエストロゲン合成のkey enzymeであり、その発現量は主にSF-1によって制御されている。SF-1プロモーター領域にCpGアイランドが密に存在すること、およびその領域で正常子宮内膜と子宮内膜症においてメチル化されたDNAの発現動態が異なるという仮説に基づき、SF-1プロモーター領域近傍にSF-1発現を制御するエピジェネティックな機構が存在すると考え、その領域の詳細な検討を試みた。1)東北大学医学部倫理委員会の承認を得たのち、患者の同意を得た卵巣子宮内膜症性嚢胞3例と正常子宮内膜3例を採取した。卵巣子宮内膜症性嚢胞は卵巣嚢胞摘出術時に、正常子宮内膜は初期子宮頚癌のため子宮全摘手術時に採取した。2)得られたサンプルを初代培養した。まず、採取した検体をPBSで洗浄後、速やかに細断しコラゲナーゼ処理し、25-μmサイズのセルストイナーを通して間質のみを分離。DMEM/F-12(10%FBS+1%抗生剤)中で培養開始した。3)採取された検体におけるSF-1発現動態をreal-time PCR法を用いて各培養細胞で検討した。その結果、正常子宮内膜に比較し子宮内膜症組織において強発現を認めた。また、Immunoblotting法を用いてタンパク発現を検討し同様の結果であることを確認した。4)初代培養細胞より抽出したゲノムDNAをBisulfate処理し、SF-1プロモーター領域のシークエンスを確認し、培養細胞間におけるメチル化の差異を比較検討した。その結果、正常子宮内膜ではSF-1プロモーター領域におけるDNAメチル化によりSF-1の転写が抑制されていたが、子宮内膜症組織では脱メチル化が高率で起こり、転写が促進されSF-1が過剰発現していることが想定された。患者の同意を得て採取した卵巣子宮内膜症性嚢胞・正常子宮内膜および子宮内膜症を伴う正常子宮内膜組織の間質細胞をそれぞれ初代培養しストックした。子宮内膜症腹膜病変に関しては検体量が少なく十分な培養が行えなかった。今後引き続き症例の集積を図る。次に、採取した検体を用いてreal-time PCR法とImmunoblotting法でSF-1の発現を検討したところ、従来からの報告と同様に卵巣子宮内膜症性嚢胞では高発現、子宮内膜症を伴う正常子宮内膜組織では低発現、正常子宮内膜では全く発現を認めないため検体として適切であることを確認した。さらに初代培養細胞より抽出したゲノムDNAをBisulfate処理し、SF-1プロモーター領域のシークエンスを確認し、培養細胞間におけるメチル化の差異を比較検討したところ、正常子宮内膜細胞では8割近くのCpG islandがメチル化されているのに比し子宮内膜症細胞ではわずか2割程度しかメチル化されていなかった。このことより、SF-1発現は正常子宮内膜ではメチル化により抑制されていたが、脱メチル化されることにより子宮内膜症細胞において過剰発現している可能性が示唆された。また、正常子宮内膜細胞を5-aza-dC処理しSF-1プロモーター領域を脱メチル化したところ、SF-1の発現が上昇した。このことからも、SF-1プロモーター領域のメチル化がSF-1発現制御に関するkey factorであると推察される。StARおよびアロマターゼは局所におけるエストロゲン活性を制御する重要な酵素で、それらはSF-1により発現が制御されている。今後、StARおよびアロマターゼの発現量の変化に関しても各培養細胞で検討し、子宮内膜症および正常子宮内膜における局所エストロゲン活性の制御機構について実験計画に沿って研究を継続していく。StARおよびアロマターゼは局所におけるエストロゲン合成のkey enzymeであり、その発現量は主にSF-1によって制御されていることが報告されている。