hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
基板表面に直接重合されたポリアニリン超薄膜の二次元凝集構造評価

本研究では、ポリアニリン超薄膜の対イオンである、ポリスチレンスルホン酸の鋳型重合骨格を有する有機シラン化合物の分子凝集状態の評価とパターン化の制御を行うため、以下の研究を行った。1,有機シラン単分子膜の分子凝集状態について多角的な解析を行い、その分子凝集状態について基礎的な知見を得た。2,重合開始骨格の基板表面での分布を評価するため、化学修飾探針を用いた表面官能基分布評価を行った。1,重合開始骨格を有する有機シラン化合物のモデル分子として、長鎖アルキルシラン分子を用いた。単分子膜は、423Kにおける気相からの化学吸着(CVA)法により調製した。GIXD測定、X線反射率測定などを行った結果、CVA法により調製した単分子膜は室温でも非晶状態にあることが明らかとなった。CVA法により調製した単分子膜の非晶性は単分子膜の調製温度に起因すると考えられた。アルキル鎖の融点以上の反応温度である423Kでは、有機シラン化合物と基板表面との間でシロキサン結合の形成が二次元的な架橋反応が進行している。このため、降温過程でのアルキル鎖の結晶化が阻害され、単分子膜の非晶性が室温でも維持されたと考えられる。2,水中で電荷を有する有機シラン単分子膜表面の官能基分布を、電荷を有する官能基で修飾した探針を用いた化学力顕微鏡測定により評価した。水溶液のpHを制御することで、探針とパターン化単分子膜表面間に同符号の電荷が働く場合は静電的斥力、及び異符号の電荷が働く場合は静電的引力に起因すると考えられる水平力の変化が観測された。以上より、pHを調節して官能基のイオン化状態を制御することで、単分子膜表面の官能基分布を評価可能であることを明らかにした。本研究では光リソグラフィー法に基づくポリスチレン(PS)スルホン酸の鋳型重合骨格のパターン化に関する基礎的知見を得るために、鋳型表面として有用な種々の有機シラン単分子膜のSi基板表面へのパターン化を行い、単分子膜上でのPS微粒子の位置選択的固定化について検討した。有機シラン化合物として1成分目にアルキルシラン、フルオロアルキルシラン、メルカプトシラン、2成分目にアミノシランを用いた。単分子膜の調製は化学気相吸着法に基づいて行った。単分子膜のパターン化は真空紫外光(λ=172nm)照射による共有結合の光励起分解に基づき行った。メルカプトシランのSH基は波長254nmの紫外線を照射により酸化し、スルホン酸基に変化させた。基板は表面スルホン酸基修飾PS微粒子分散水溶液(pH=2.9)に浸漬し乾燥後、電界放射型走査型電子顕微鏡(FE-SEM)で観察したFE-SEM観察より、パターン化単分子膜表面において、アミノシラン部分にPS微粒子が位置選択的に吸着固定化されているのが観察された。アミノシラン、及び酸化メルカプトシランで修飾したカンチレバーチップとシリコン基板表面の間の凝着力のpH依存性を評価した。その結果、アミノシラン単分子膜と酸化メルカプトシラン単分子膜表面のpKaはそれぞれpH=4付近とpH=23に存在することが明らかになった。このことから、pH=2.9では表面のアミノ基は正の荷電を、スルホン酸基は負の荷電を有していると考えられる。従って、微粒子の位置選択的な吸着はアミノシラン単分子膜表面のアミノ基、及び酸化メルカプトシラン単分子膜とPS微粒子表面のスルホン酸基の間に働く静電的相互作用に起因すると考えられる。以上より、pHを調整して単分子膜表面の荷電状態を制御することにより、種々の化学種を静電的相互作用により位置選択的に配列固定化可能であることが示された。水溶液のpHを制御することで、探針とパターン化

単分子膜表面間に同符号の電荷が働く場合は静電的斥力、及び異符号の電荷が働く場合は静電的引力に起因すると考えられる水平力の変化が観測された。以上より、pHを調節して官能基のイオン化状態を制御することで、単分子膜表面の官能基分布を評価可能であることを明らかにした。
企業経営のグローバル化にともなうSCMの組織的管理：需給調整とパフォーマンス管理

本研究では、初めに、日本の製造業におけるサプライチェーン・マネジメント(SCM)の組織構造について、理論精緻化を目的とした事例研究を行った。結果、5つの組織構造のタイプを確認するとともに、それらの特徴を整理した。続いて、さまざまな組織構造のタイプを採用する企業を対象に、SCM部門の役割に関する理論生成を目的とした事例研究を行った。最終的に、SCM部門の役割を説明するための枠組みを提示した。平成26年度は、交付申請書の研究実施計画の通り、次の2つの作業を実施した。ひとつは、「質問票の作成」である。主な質問項目は、1SCMを取り巻く環境特性と2SCM部門の有無および役割である。1については、Duncan(1972)の枠組みと学術文献の調査にもとづいて、SCMの特徴を反映させた尺度を開発した。2については、まず本研究におけるSCM部門の定義を明確にした。加えて、いくつかのタイプ(例:複数のライン部門を統合した部門、ライン部門との機能横断的な調整を担うスタッフ部門)を想定し、それを確認する方法を検討した。さらに、需給調整とパフォーマンス管理に焦点を当てて、役割を確認できるようにした。これらを盛り込んだ質問票を作成し、業種や規模が異なる4社への訪問・対面式でのテストを通じて改良を重ねた。なお、質問票を作成する過程での文献調査にもとづいて、SCMの組織構造についての文献レビュー論文を作成した。もうひとつは、「SCM部門を有する企業への調査協力依頼」である。グローバル化の進展の度合いが高い業種(例:自動車、電機、機械)と低い業種(例:食品・飲料、日用品・医薬品)の両方を対象として、事例が掲載されたビジネス文献の調査や専門家(業界団体、研究者)からの情報収集、国内講演会参加(2回)で得た情報をもとに対象企業を探した。100社強の候補企業をリストアップし、電話や訪問を通じて、質問票への回答を依頼した。1年目は、10社からの回答を目標としていたが、24社の回答を得ることができた。その内、協力依頼かつ/あるいは対面式での回答のために8社を訪問した。質問票の作成とテスト、調査協力依頼(一部は研究分担者も実施)、各種調整は主に研究代表者が行い、文献調査と議論を研究代表者と研究分担者が共同で実施した。研究協力者と研究分担者の打ち合わせは3回実施した。平成27年度は、主に次の2つの作業を実施した。ひとつは、交付申請書の研究実施計画の通り、「SCM部門を有する企業への調査協力依頼」を行った。平成26年度は目標の10社を上回る24社からアンケートの回答を得ることができたが、平成27年度は難航が予想された。1年間かけて、平成26年度にリストアップした残りの候補企業と平成27年度に新たにリストアップした候補企業に加えて、公益社団法人日本ロジスティクスシステム協会内の研究会所属企業、SCMやロジスティクスの研究者から紹介を受けた企業に協力を打診し、16社から回答を得た。この過程で、協力依頼かつ/あるいは対面式での回答のために5社(5回)を訪問した。もうひとつは、交付申請書では平成28年度の研究実施計画に記載していた「事例研究」である。需給調整および在庫パフォーマンス管理について、対象企業がどのような活動を行っているのか、特にSCM改革の前後でどのような変化が見られるのかについて、9社(17回)を訪問し、その内の5社の協力を得て、インタビュー調査を実施した。加えて、事例研究の分析の視点を獲得するために、ラインとスタッフ論、プロセス変革論、多角化とグローバル化の組織論に関する文献調査を行った。交付申請書では、中間的な研究成果を国際学会で発表することを予定していたが、アンケートでサンプル数を思うように増やせていなかったこともあり、国内の研究者および実務家との研究会(10月実施)および韓国・慶熙大学の研究者との意見交換(2月実施)に切り替えた。アンケートの協力依頼および結果の分析、事例研究の協力依頼および実査(一部は研究分担者も実施)、研究会および意見交換、各種調整は主に研究代表者が行い、文献調査と議論を研究代表者と研究分担者が共同で実施した。研究代表者と研究分担者の打ち合わせは3回実施した。平成27年度の初めに立てた研究計画からの遅れはなく、順調に進んでいる。平成28年度は、交付申請書の研究実施計画の通り、「有効性と効率性のパフォーマンスを高めるためのマネジメント上の工夫についての事例研究」を行った。具体的には、需給調整(S&OPを含む)、在庫パフォーマンス管理(パフォーマンス管理システムを含む)、SCM改革について、対象企業がどのような活動を行っているのかについて、8社(22回)を訪問し、インタビュー調査を実施した。また、調査結果をもとに、個々の事例および事例間の分析を行い、SCM部門の役割について考察した。具体的には、企業経営のグローバル化を踏まえて、製造業におけるSCM部門の役割を説明するための枠組みを提示することができた。分析・考察の過程で、研究成果を補強するための文献調査を行った。最終的に、3年間の研究成果をまとめた報告書を作成し、アンケートおよび事例研究に協力いただいた企業やSCMの研究者に配布した。研究成果の報告については、交付申請書の記載通り、国際学会(EurOMA2016、ノルウェー科学技術大学、2016/6)で発表した。

また、国内の研究者と実務家向けに、日本物流学会および海運経済学会関西部会の例会(大阪産業大学、2017/1)で発表した。加えて、平成27年度と同様、研究成果について、韓国・慶熙大学の研究者との意見交換(2017/3)を行った。事例研究の協力依頼および実査(一部は研究分担者も実施)、研究成果のとりまとめ、発表、意見交換、各種調整は主に研究代表者が行い、文献調査と議論を研究代表者と研究分担者が共同で実施した。研究代表者と研究分担者の打ち合わせは3回実施した。本研究では、初めに、日本の製造業におけるサプライチェーン・マネジメント(SCM)の組織構造について、理論精緻化を目的とした事例研究を行った。結果、5つの組織構造のタイプを確認するとともに、それらの特徴を整理した。続いて、さまざまな組織構造のタイプを採用する企業を対象に、SCM部門の役割に関する理論生成を目的とした事例研究を行った。最終的に、SCM部門の役割を説明するための枠組みを提示した。平成26年度の初めに立てた研究計画からの遅れはなく、順調に進んでいる。アンケートについては、当初目標としていた40社に達したが、得られたデータはまだ理論的飽和に達しているとは判断できない。よって、サンプル数を増やすために、平成28年度も継続する。事例研究については、現在5社の協力を得ているが、10-15社に増やしたい。詳細なデータ提供を求めるため、訪問・説明後に辞退される場合も多いが、訪問時の情報交換で分析のヒントを得られることも多く、平成28年度も積極的に協力依頼の訪問を重ねたい。オペレーション・情報管理質問票への回答企業の確保は、当初の想定通り、今後は難航が予想される。協力企業数を増やすために、業界団体のスタッフに、会員企業への協力依頼をお願いしている。具体的には、業界団体内での研究会の場で、スタッフから調査の趣旨や内容を説明してもらい、協力企業を募る予定である。アンケート調査でサンプル数を思うように増やせていないこともあり、予定していた海外での学会発表ではなく、国内の研究者および実務家との研究会および韓国の研究者との意見交換に切り替えた。前者は非常に有効であり、3年目も実施したいと考えているため、人件費・謝金に10万円を残しておきたい。また、後者のような海外研究者との意見交換も継続したいと考えており、旅費に15万円を確保したい。また、アンケート調査については、当初は2年目で終了する予定であったが、サンプル数を増やすために、3年目も継続する。その分で、旅費に15万円、謝金に5万円を残しておきたい。さらに、アンケートや事例研究に協力していただいている企業や企業紹介、研究成果へのコメントなどでお世話になっている研究者に対するフィードバックとして、研究成果をとりまとめた報告書を作成して配布したいと考えている。その分で、印刷・通信費に5万円を当てたい。交付申請書の研究実施計画に記載したように、企業調査を実施している。現時点では調査の進行は予定通りであるが、来年度は協力企業の確保が難しくなることが想定される。サンプル数を増やすために、関係者への協力依頼をする必要があるため、旅費や謝金にかかる費用を残しておきたい。上記の理由にもとづいて、旅費に30万円、謝金に15万円、印刷・通信費に5万円をあてる。上記の理由にもとづいて、謝金に2万円、残りを旅費にあてる。
逆問題の数値的・確率的パラメータ推定法の研究

大西は研究全体を推進すると同時に、数値解析的立場から偏微分方程式の未知初期値ならびに未知境界値の同定逆問題の計算法を研究した。すなわち、逆解析を制御における変分双対問題に帰着させ、有限要素・境界要素法を応用した近似計算法を示した。中村は関数方程式論の立場から、弾性体の逆問題についてlayer stripping法のアルゴリズムを確立した。清水は確率論の立場からイントラクラス相関をもつ2変量正規分布の多標本問題を扱った。データにミッシングがある場合に、等相関係数の最尤推定量と条件付き最尤推定量が満たすべき方程式を導き、相関係数の区間推定と検定を行う方式を与えた。矢部は制約条件付き最適化問題を解く逐次2次計画法に関し、拡張ラグランジュ関数のヘッセ行列を近似する構造化準ニュートン法の2次計画部分問題で扱われる行列の正定値性を保証するとともに、サイジングを利用して行列の固有値の制御を図った。また、非単調直線探索法を実行して、大域的収束および局所的超1次収束することを示した。宮岡は数理統計学の立場から従属的性質を持つデータに関して、一般化線形モデルを推移モデルに拡張し、そのモデルのもとでのパラメータ推定の方法を構成した。また、シミュレーションによる推定量の性質の研究を行った。斉藤は線形作用素に対し関数解析学の観点から逆解析について基礎的な研究を続け、既に斉藤によって得られた劣正規作用素の構造に関する定理を、Morrel-Clanceyの定理に適用し、その一般化を得た。これを研究集会「解析・調和関数空間の構造とその上の作用素論」(1995.12.4-12.7、推理解析研究所)で発表した。
天然資源抽出物質によるインスリン抵抗性症候群プロテオームへの影響

インスリン抵抗性症候群IRS(Insulin resistance syndrome)は、糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満の特徴であり、それを放置すると、複数の臓器障害、脳梗塞、心筋梗塞等の合併症を起こす。体重、血糖、血清脂質をコントロールすることがIRSの重要な治療指針となる。本研究の目的は天然資源抽出物質によるIRSプロテオームへの影響を解析することにより、IRSの病態に関与するタンパク質分子とIRS病態プロテオームを修復する有効成分を見いだし、IRSの病態治療のためのオーダー・メード薬につなげることにある。今回、我々は肥満ラット(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty:OLETF)が本研究の動物モデルとなりうることを確認の上、天然植物ギムネマシルベスタの水抽出物質(有効成分:ギムネマ酸)を投与し、体重、血糖、血清トリグリセリド、肝脂肪量への影響を検討した後、OLETFと対照ラット(Long-Evans Tokushima Otsuka:LETO)のプロテオームを比較した。また、ギムネマ酸の投与によるプロテオーム変化を検討した。4週齢のOLETF、LETOラットを長期間飼育し、体重、食餌量、飲水量、血糖値、血清トリグリセリドを経時的に記録した。OLETF群はLETO群と比較し、体重、食量、飲水量、血糖値、血清トリグリセリド値が有意に増加していた。飼育6ヶ月目からギムネマ酸を飼料に添加すると、OLETFラットでは投与一週間後から体重が減少し、投与OLETF群は非投与OLETF群に比較し、血糖値と血清トリグリセリド値が有意に低値であった。また、肝臓内脂肪の蓄積も低下していた。以上の結果に基づき、同時に解析できる二次元電気泳動法(2-DE)を用いて、新鮮摘出肝臓から抽出した全タンパク質のプロテオーム変化についてコンピューター解析を行い、タンパク質の発現変化と高血糖、高血脂、肥満との関連及びギムネマ酸投与の影響を検討中である。今後、関連タンパク質のスポットを抽出し、MALDI-TOF法で解析する予定である。
再突入飛翔体まわりの衝撃層における熱化学非平衡過程と表面触媒現象の統合的モデル化

本年度は、昨年度までに蓄積された分子動力学計算コードとDSMCコードを融合して、特に窒素分子の内部モード緩和と乖離の連成解析モデルを開発するために一連の解析を行った。窒素分子は内部励起準位が約9000存在するため、準位を個別に考慮した解析的な状態遷移解析は困難であるため、統計的な手法に基づいた直接計算法を採用した。この実現のため、本研究ではDSMC-QCTハイブリッド法を開発した。DSMC-QCTハイブリッドでは、分子の運動をモンテカルロ法で計算する一方で、分子間衝突に関する部分だけをQCT法で取扱う手法である。この手法は、今年度では実現できなかった課題である、表面触媒モデルとの連成を取りこむ上でも有効である。窒素分子の回転/振動準位はRKRポテンシャルに回転の効果を考慮した核間ポテンシャルを用いた量子計算により解析し、このRKRポテンシャルを核間ポテンシャルに、分子間ポテンシャルにBillingの経験式を用いて、QCT法による衝突計算を行なった。DSMC法はBirdのNTC法による。QCT法では遷移における量子力学効果が考慮されていないため、並進温度が低い領域では振動緩和レートが過小評価されることがわかった。遷移におけるこの効果を考慮した補正を行なうことで、実験に良い一致を得ることが出来た。また回転遷移レートに付いても実験値による精度検証を行なった。以上のモデル検証を終えた後、高温域での緩和パラメータを決定するために、並進温度200080000Kの範囲で解析を行なった。その結果、回転緩和モデルについては従来のParkerモデルを補正することで、また振動緩和モデルについては、高温域での緩和は従来考えられているよりもやや速く、一定の衝突断面積をもつ衝突制限モデルを導入することで、約80000Kまで緩和モデルを拡張することができることが確認された。本年度は、昨年度までに蓄積された分子動力学計算のノウハウを実際の問題に適用し、窒素分子の内部モードの緩和と解離について大規模な解析を行なった。窒素分子の回転/振動準位はRKRポテンシャルに回転の効果を考慮した核間ポテンシャルを用いた量子計算により解析し、このRKRポテンシャルを核間ポテンシャルに、分子間ポテンシャルにBillingの経験式を用いて、DSMC法による統計学的な衝突計算を行ない、回転準位間遷移定数、解離速度定数を定式化した。得られた各速度定数は並進温度が非常に高い領域まで求められており、工学的にも非常に重要な結果を与えていると考えている。並進温度が低い領域では、Rahnらの実験式と比較的良い一致が見られており、また解離速度定数は温度非平衡を考慮した場合のParkモデルと同様の傾向を示している。この速度定数を用いて衝撃波背後の緩和過程の解析を行なった結果、従来の緩和モデルよりもより実験に近い結果が得られた。また再突入飛翔体まわりの著しく非平衡状態にある衝撃層の解析に、上記のようにして得られる準位間遷移速度係数を組み込むためには、流れ場をDSMC法で計算するのが現実的である、との立場から、飛翔体まわりの3次元流れ場を解析するDSMCプログラムコードを開発した。現状では本コードはまた予備的なもので、旧来型のマクロな緩和速度定数から導出される緩和確率を用いて内部モードの緩和を計算しているが、本コードにより自由分子流から遷移領域まで広範囲な再突入環境の非平衡現象の3次元解析が可能となった。その応用の一つとして、MUSES-Cカプセル回りの非平衡流れ場を高度120から72kmまで解析し、希薄気体効果により変化する機体のピッチングモーメントについて調べた。その結果、飛行高度が上昇するにつれて機体は弱い静的不安定となることが確認され、0.2Hz程度のスピン安定により安定化させることが必要との知見を得た。

その結果、回転緩和モデルについては従来のParkerモデルを補正することで、また振動緩和モデルについては、高温域での緩和は従来考えられているよりもやや速く、一定の衝突断面積をもつ衝突制限モデルを導入することで、約80000Kまで緩和モデルを拡張することができることが確認された。
内向き整流Kチャネルの生理機能を担うブロック低感受性コンダクタ ンスの分子機序

Kir2内向き整流カリウム(K)チャネルの外向き電流のわずかな電流振幅変化は神経細胞を介する情報伝達や筋細胞収縮など多彩な細胞機能を修飾する。本研究ではKir2の外向き電流を運ぶ細胞内陽イオンブロック低感受性コンダクタンス成分の分子メカニズムを解明する目的でチャネル機能の電気生理学的な検討を行った。その結果ブロック低感受性コンダクタンス成分は1分子陽イオンによるブロックがサブコンダクタンスレベルを誘発するというモデルでは説明されないことがわかり、早いキネティクスによって見かけ上単一チャネルコンダクタンスが整流性を示すことが示唆された。Kir2サブファミリーに属する内向き整流性カリウムイオンチャネル(Kir2チャネル)は特に神経や筋において細胞膜に局在して細胞の興奮性や収縮を制御する重要な役割を担っている。しかし生理機能に大きく関与する外向き電流の大きさを制御する詳細な分子メカニズムは未だ明らかでなく、我々はこれまでの研究成果から、Kir2チャネルには外向き電流を抑制的に制御する細胞内のポリアミンやマグネシウムイオン等の陽イオンに対する感受性が異なる2つの分子状態があるものと推測している。本研究ではKir2チャネルの制御メカニズムの詳細を分子レベルで明らかにすることを目標とし、Kir2チャネル分子機能を、これを取り巻く細胞膜の脂質による調節を含めて検討するため、脂質の組成をコントロールした状態下にチャネル活性を測定できる人工脂質二重膜法による実験系の導入に着手した。具体的には、Kir2.1チャネルを哺乳動物培養細胞に高密度に発現させ、これを破砕して遠心分離によって膜分画成分を抽出し、チャネルを含む細胞膜ベジクルをチャネル活性に必要なイノシトールリン脂質と共に2種類のリン脂質(POPEとPOPG)から成る人工脂質二重膜に組み込み、単一分子のチャネル活性を電気生理学的に測定することを試みた。脂質二重膜へ細胞膜ベジクルを効率的に組み込むためには、さらに膜分画の精製法を改良してより適切なサイズのベジクルを作製したり、ベジクル内溶液組成を検討すること等が必要であることが分かった。Kir2サブファミリーに属する内向き整流性カリウムイオンチャネル(Kir2チャネル)の生理機能を担う外向き電流の大きさは主に細胞内陽イオン(ポリアミンやマグネシウムイオン)による膜電位依存性ブロックによって調節さていることが明らかになっており、我々はその特徴的な負のネガティブスロープを示す膜電位依存性の発現に、陽イオンに対するブロック感受性の異なる2成分が関与していると考えられることをこれまで明らかにしてきた。本研究ではKir2チャネルの細胞内陽イオンによるブロックの詳細な分子メカニズムの解明を目指しており、本年度は先ず哺乳動物培養細胞に異所性に発現させたKir2.1チャネルを用いてインサイドアウトパッチ膜法によって細胞質側液のpHの影響を詳細に解析した結果、ポリアミン(スペルミン)による高親和性ブロックと低親和性ブロックの2成分はpHの影響をほとんど受けないこと、さらにポリアミンやマグネシウムイオンとは異なるメカニズムによってpHの酸性化によって引き起こされる極めて遅い時間経過を示す膜電位依存性のチャネルゲーティングが存在し、ポリアミンやマグネシウムイオンによる高親和性ブロックのおそらく結合部位として働く174番目のアスパルギン酸残基がやはり重要な役割を担うことを明らかにした。一方で昨年に引き続き、細胞内側液中の陽イオン濃度を正確にコントロールした状態でKir2チャネル機能の解析を可能とするため、人工脂質二重膜法によってチャネル活性を測定できる実験系の開発を目指し、Kir2チャネルの精製を行った。Kir2サブファミリーに属する内向き整流性カリウムイオンチャネル(Kir2チャネル)の外向き電流は特に心筋細胞においては深い静止膜電位と速やかな再分極過程を決定づける重要な生理機能を担っているが、主に細胞内陽イオン(ポリアミンやマグネシウムイオン)による膜電位依存性ブロックによって制御されていると考えられているものの、その詳細な制御メカニズムにはなお不明な点が多い。われわれは特徴的な負のネガティブスロープを示す電流ー電圧特性の発現には細胞内陽イオンによるブロックを受けにくい特殊なチャネルコンポーネントが関与しているという仮説を提唱しており、本年度は我々が新たに見出したきわめて遅い時間依存性を示すチャネル開閉機構について特にセルフリーの状態でのpH依存性について詳細に解析を行ってその解明を目指した。その結果ポリアミンが結合する負の電荷をもつアミノ酸残基(D172、E224など)の電離度はpH6程度の酸性化によって影響を受けなかったこと等から、この開閉機構はpKaが比較的中性領域にある細胞内の陽イオン性分子による電位依存性ブロックがであるものと結論した。またこの分子はセルフリーの状態を長く保った膜にわずかに存在するのみであってもポリアミンと競合的にチャネルをブロックしたことから、生理的または病態生理的に重要な働きを担っている可能性があることが分かった。さらにポリアミンと同様に細胞質内領域のE224やE299よりも細胞膜内領域のD174に強い親和性があるものの、やはりD174がブロックを受けないチャネルコンポーネントが存在することが示唆された。

その他本年度は新たに電位依存性Naチャネルを抑制することで知られるアミド型局所麻酔薬がKir2チャネルを抑制することを見出し、そのpH依存性などを詳細に解析してチャネルの細胞膜内領域に結合部位があると考えられることなどを結論した。Kir2チャネルを単一チャネル電流レベルで詳細に解析するための人工脂質膜を用いた実験系の開発がまだ完成していない。24年度が最終年度であるため、記入しない。Kir2.1チャネルタンパクを精製し、人工脂質膜に埋め込み、チャネル機能の解析を行う方針である。
消化管上皮の内腔圧受容とATP放出機構の解明

国民の約15%が原因不明の慢性の腹痛を自覚し、胃腸内圧への過敏が原因の1つとされます。食道はTRPV4イオンチャネルで引っ張りを感じ、アデノシン三リン酸(ATP)輸送体(VNUT)で袋状になったATPを放出します。研究の結果、食道のみならず胃から直腸にTRPV4とVNUTがあり、引っ張りを含めたTRPV4刺激でVNUTを介してATPが放出されました。TRPV4を全身から除いたマウスは胃の動きが異常となり、ピロリ菌感染により、TRPV4が減少しました(遺伝子メチル化)。胃腸内で合成されるTRPV4活性化成分の定量化にも成功し、目に見えない腹痛を定量化できる可能性が出てきました。本研究では、1)胃及び結腸上皮細胞に、TRPV4イオンチャネル及びアデノシン三リン酸(ATP)を濾胞内に取り込む小胞型ヌクレオチド輸送体(VNUT)が発現し、2)伸展刺激によりTRPV4の活性化を介して、VNUTによって濾胞内に取り込まれていたATPがエキソサイトーシスによって放出されることを明らかにすることを目的としており、平成26年度は以下の結果を得た。1.マウス・ヒトの胃及び結腸、および、胃・結腸上皮細胞株におけるTRPV4及びVNUTの遺伝子発現をRT-PCR法にて確認した。2.免疫化学法、またはWestern blot法での上記細胞種におけるTRPV4及びVNUTタンパクの検出を試み、一部確認することができ、今後も実験を継続する予定である。なお、TRPV4欠損マウスの胃、結腸を用い、タンパク質発現の消失が確認された。以上の結果より、胃・結腸上皮細胞は伸展刺激によりTRPV4が活性化し、ATPをエキソサイトーシス機構により遊離できる可能性が示唆された。3.マウスの胃上皮細胞及び結腸上皮細胞をカバーガラスに貼り付け、TRPV4活性化剤による細胞内Ca2+濃度上昇及び、電流応答を観察しえた。少なくともマウスの胃・結腸上皮には機能的にTRPV4が発現していることが確認された。ヒトの胃及び結腸上皮での検討は困難であった。4.胃・結腸上皮細胞株に伸展刺激を加えたところ、有意なATP放出が観察された。本研究では、1)胃及び結腸上皮細胞に、TRPV4イオンチャネル及びアデノシン三リン酸(ATP)を濾胞内に取り込む小胞型ヌクレオチド輸送体(VNUT)が発現し、2)伸展刺激によりTRPV4の活性化を介して、VNUTによって濾胞内に取り込まれていたATPがエキソサイトーシスによって放出されることを明らかにすることを目的とし、当初は、細胞株で単層を形成させ、TRPV4活性化剤および伸展刺激によってATPが放出され、各種阻害剤で阻害されることを確認する予定であったが、平成27年度は以下の結果を得た。1)ヒト由来の正常胃上皮細胞株を探索したところ、GES-1細胞株が有望であったため、所有者とMTAを交わし取得した。2)機能解析としては、細胞株を用いたCaイメージング及び電気生理的解析の一部を行うことができた。3)ATP放出実験は、平成26年度に前倒しし一部実施済であり、細胞株に伸展刺激を加えた際のATP放出の阻害実験を行った。siRNA導入は難航したため、実験継続となった。4)VNUT欠損マウスを作出した研究グループとMTAを交わし、消化管組織を取得しタンパクの発現を検討した。当初本年度に予定した、ATP放出実験の一部は、前年度に行うことができ、有望な細胞株の取得、VNUT欠損マウスの組織の取得を行えたが、siRNAによるノックダウン実験が難航したため、おおむね順調に進展したと判断した。本研究では、1)胃及び結腸上皮に、TRPV4イオンチャネル及びアデノシン三リン酸(ATP)を濾胞内に取り込む小胞型ヌクレオチド輸送体(VNUT)が発現し、2)伸展刺激によりTRPV4活性化を介して、VNUTによって濾胞内に取り込まれていたATPがエキソサイトーシスによって放出されることを明らかにすることを目的とした。26年度は、1)遺伝子・蛋白発現解析、2)小動物の消化管上皮を用いた機能解析、3)消化管上皮に伸展刺激を加えた際のATP放出検討を行った。27年度は、1)ヒト由来の正常胃上皮細胞株取得及び解析、2)VNUT欠損マウスにおける発現解析、3)胃上皮細胞におけるsiRNA実験を行った。28年度は、以下の検討及び報告を行った。2)胃がん細胞株、及び、ピロリ菌が感染した正常胃上皮細胞では、TRPV4の発現が低下していることを見出し、当初検討を予定していなかったが、その機序が遺伝子メチル化であることを突き止めたため報告した(Mihara et al. Helicobacter 2016)。3)消化管上皮における内因性TRPV4活性化因子である5,6-EETの定量化を試みたが、学内設備では検出に難渋したため、外部委託し検出を試みたところ、より安定した8,9-EETの検出に成功した。1)マウス、ラット胃上皮細胞、ヒト胃上皮細胞におけるTRPV4の発現及びATP放出について2報発表し得た。また、米国消化器病学会、アジア神経消化器病学会にてポスター発表を行った。2)マウス個体の実験は行えていないが、当初想定していなかった胃

上皮細胞におけるTRPV4の新規発現制御機構を見出し得た。3)機能性ディスペプシア、過敏性腸症候群患者の症状と相関のありえる内因性TRPV4活性化因子の検出に難渋したが、検出が可能な外部委託業者を特定し、今後、ヒト検体を用いた検討に進むことが可能となった。本研究では、1)胃及び結腸上皮に、TRPV4イオンチャネル及びアデノシン三リン酸(ATP)を濾胞内に取り込む小胞型ヌクレオチド輸送体(VNUT)が発現し、2)伸展刺激によりTRPV4活性化を介して、VNUTによって濾胞内に取り込まれていたATPが開口分泌(エキソサイトーシス)によって放出され伝達物質として機能することを明らかにすることを目的とした。26年度は、1)遺伝子・蛋白発現解析、2)小動物の消化管上皮を用いた機能解析、3)消化管上皮細胞に伸展刺激を加えた際のATP放出検討を行った。27年度は、1)正常ヒト胃上皮細胞株取得及び解析、2)VNUT欠損マウスにおける発現解析、3)胃上皮細胞におけるsiRNA実験を行った。28年度は、1)正常ヒト胃上皮細胞株におけるTRPV4発現と活性化によるATP放出、及び小動物における胃排出への影響、2)胃上皮細胞におけるTRPV4のメチル化制御機構、3)消化管上皮における内因性TRPV4活性化因子の定量化の試み、を行った。29年度は、1)結腸上皮細胞株の取得・選定と、TRPV4の発現、ATP放出検討、2)胃・結腸上皮からのTRPV4活性化によるATP放出の新規VNUT阻害剤(Clodronate)での阻害実験、3)消化管上皮細胞株、および小動物の消化管において、各種内因性TRPV4活性化因子とその代謝産物(5,6-EET、8,9-EET、5,6-DHET、8,9-DHET)を測定しえた。4)当初は、胃上皮、結腸上皮が研究対象としていたが、小腸上皮細胞株、小動物の小腸にTRPV4、VNUTの発現を確認し、TRPV4活性化によるATP放出を確認した。国民の約15%が原因不明の慢性の腹痛を自覚し、胃腸内圧への過敏が原因の1つとされます。食道はTRPV4イオンチャネルで引っ張りを感じ、アデノシン三リン酸(ATP)輸送体(VNUT)で袋状になったATPを放出します。研究の結果、食道のみならず胃から直腸にTRPV4とVNUTがあり、引っ張りを含めたTRPV4刺激でVNUTを介してATPが放出されました。TRPV4を全身から除いたマウスは胃の動きが異常となり、ピロリ菌感染により、TRPV4が減少しました(遺伝子メチル化)。胃腸内で合成されるTRPV4活性化成分の定量化にも成功し、目に見えない腹痛を定量化できる可能性が出てきました。1.遺伝子発現解析は予定通り遂行することができた。2.タンパク発現解析は、一部遂行することができ、TRPV4欠損マウスの免疫染色を追加することができたが、終了することができなかった。3.機能解析としては、マウスの胃上皮細胞及び結腸上皮細胞を用いた、Ca2+イメージング法、及び電気生理的解析を予定通り終えることができたが、細胞株を用いた検討は終了することができなかった。4.ATP放出実験は、当初平成27年度に計画していたが、26年度中に伸展刺激機器の導入が可能となり、細胞株に伸展刺激を加えることができ、ATP放出が観察された。
線虫の温度走性を実現する行動戦略の同定およびその神経回路基盤の解析

本研究では線虫の温度走性行動をモデルとし、神経回路動作原理の解明を目指した。前年度までの研究において、温度走性を実現するのに重要であった、線虫の基本行動要素である"curve"および"reversal turn"を制御する神経回路を同定した。本年度の研究では、以下の2つの方策により、上記神経回路における情報処理機構に迫った。1)同定した神経回路を単一神経細胞レベルで数理モデル化し、情報理論解析によって回路内における情報の流れを定量比較した。数理モデルの構築にあたっては、現実の温度走性データを再現するような複数のパラメータセットを遺伝的アルゴリズムにより取得した。温度走性中のこれらモデル回路における移動エントロピーを算出・比較したところ、神経回路上流に比べ回路下流における移動エントロピーが大きく、また上流から下流への情報伝達は第1層の介在神経細胞であるAIBから直接運動神経につながる経路が担う割合が大きいといったことが示唆された。これらの予測は今後の研究を通じて実験的に検証していく。2)同定した神経回路中の複数の感覚・介在神経細胞に着目し、温度走性中の活動測定をおこなった。温度走性中の神経活動と温度入力、および神経活動とcurve, reversal turnとの相関解析を行ったところ、介在神経細胞の活動と温度入力との関係、および感覚神経細胞の活動と行動出力との関係は、線虫が記憶温度より低温域にいるか高温域にいるかによって逆転していた。このような、外界依存的な情報処理の切り替えにより、記憶温度より低温域では温度を上り、高温域では温度を下るという、記憶温度への恒常的な移動を実現することができ、温度走性行動が成立していることが明らかとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では線虫の温度走性行動をモデルとし、神経回路動作原理の解明を目指す。温度走性とは、線虫が過去に経験した飼育環境の温度を記憶し、温度勾配のある環境に移された際に飼育時の温度に移動する行動のことである。前年度までの研究において、大規模行動解析システムであるMulti-Worm Tracker (MWT)を用いて温度走性中の行動を詳細に解析することにより、温度走性行動を実現する線虫の行動戦略を同定した。コンピュータシミュレーションを用いた定量的な比較解析により、温度走性には線虫の基本行動要素である"curve"および"reversal turn"行動の制御が重要であることを明らにしている。本年度の研究では、温度走性行動中にこれら2つの行動要素を制御する機能的な神経回路の同定を試みた。まず細胞死誘導タンパク質であるCaspase-3を細胞特異的に発現させることで、神経回路中の特定の細胞のみが破壊された株の作成を行った。破壊した神経細胞は温度を受容することが報告されている3つの感覚神経細胞からcurve行動を制御する頭部筋肉に投射する運動神経細胞、およびreversal turn行動を制御することが知られている腹部介在神経細胞群にいたる約20細胞である。これら細胞が破壊された株の温度走性中のcurve/reversal turn行動をMWTシステムにより抽出し、野生型の行動と比較することで、行動要素の制御に寄与する神経細胞群の同定に成功した。その結果、curveとreversal turnを制御する神経回路は一部オーバーラップしているものの、互いに大きく異なっているが明らかとなった。興味深いことに、同じcurve行動を制御する場合においても、過去の飼育温度に低温側から向かうときと高温側から向かうときで違った神経回路を用いていることが示唆されている。本年度の研究により細胞破壊実験はおおむね完了し、期待通りの進展であるといえる。一方で、計画していた神経活動の測定実験については、測定装置や測定プローブの準備は整い、実際にデータを得られる段階にはあるものの、定量的な解析は行えていない。主たる理由として、上記20細胞のうち、現行の装置の解像度で測定可能な細胞はその半分程度にとどまり、また2細胞以上を同時に測定することができないことなどがあげられる。上記の課題を解決するため次項で記述するようなモデルベースのアプローチの導入を計画している。

このような、外界依存的な情報処理の切り替えにより、記憶温度より低温域では温度を上り、高温域では温度を下るという、記憶温度への恒常的な移動を実現することができ、温度走性行動が成立していることが明らかとなった。本年度は、同定した機能的神経回路においてどのように温度情報が処理され行動要素の制御にいたるのかを明らかにするため、1)これら神経回路を単一神経細胞レベルで数理モデル化することにより可能な情報処理機構のあり方を模索し、そこで提案された機構を、2)実際の神経活動を測定することによって確かめる、という方策をとる。モデル化の方法としては、各神経細胞の振る舞いをそれぞれ3個程度のパラメータからなる微分方程式で書き表し、それらの組み合わせとしての神経回路から生成される行動要素の特徴が実際にこれまで得られている行動データをよく再現するようなパラメータセットを探索することにより実現する。パラメータ探索には遺伝的アルゴリズムを用いる予定であるが、探索の収束状況によっては勾配降下法等機械学習の手法と組み合わせることで探索効率の向上をはかる。探索を繰り返し行い数1001000のパラメータセットを得たのち、クラスター分析によりそれらを数グループに分類する。それぞれのグループのパラメータセットがどの程度もっともらしいかを、実際にいくつかの神経細胞の活動を測定し比較することによって定量的に評価することが可能であると考えている。研究の締めくくりとして、実際の神経活動をもっとも反映していたパラメータセットから構成される神経回路モデルにおいて、移動エントロピーや相互情報量を計算するなど情報理論的な解析を行う。これらにより2つの異なる行動要素が互いにオーバーラップする機能的神経回路において独立に制御される過程を定量的に記述することができ、本研究の目的に掲げた神経回路動作原理の解明に対し一定の回答を提示することが可能となる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Gタンパク質共役型受容体シグナル複合体の細胞表面発現調節メカニズムの解析

多くの主要薬剤の分子標的として知られているGタンパク質共役型受容体(GPCR)分子が、細胞表面において正常に機能するためには、GPCRがリボソームで合成された後、受容体シグナル伝達分子複合体として細胞表面に効率的に輸送・発現されなければならない。本研究では、このGPCRの細胞表面への輸送過程が、GPCR分子のカルボキシ末端と相互作用する様々な細胞内タンパク質によって制御されていることを明らかにした。本研究は、ヒスタミンH3受容体を例として、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、またGPCRシグナル複合体が、小胞体から細胞表面に輸送される分子メカニズムを明らかにする事、特に受容体のカルボキシ末端細胞質内ドメインに結合するタンパク質の機能を明らかにする事を目的としている。H3受容体との相互作用が確認されているCLIC4・DRiP78・PhLPについて、ヒスタミンH1、及びH4受容体とのインビトロでの結合能を解析した結果、各受容体がそれぞれの分子に対して異なる結合活性を示したことから、各受容体の細胞内輸送が、それぞれ特異的なタンパク質相互作用によって制御されている事が示唆された。今年度は特にDRiP78のH3受容体に対する生理的機能について解析を行った。抗DRiP78特異的抗体、アデノウイルスを使用した高効率発現系を作成し、DRiP78過剰発現によるH3受容体の細胞表面発現に与える影響を解析した。その結果、DRiP78発現量依存的に細胞表面H3受容体量、また細胞内H3受容体総量が減少する事が明らかになった。種々の薬理学的阻害剤を用いた解析の結果、これらの変化が、受容体が小胞体で合成された後、細胞表面に輸送されるトラフィッキング経路の途中で分解系に導かれるためである事が明らかとなった。さらにこの分解が、通常の膜タンパク質が分解されるリソゾームではなく、プロテアソームによるものであることも明らかにされた。この事から、H3受容体の活性発現が、受容体分子の細胞表面への細胞内輸送調節によっても制御されている事が新たに示唆された。前年度までに、DRip78タンパク質がH3受容体カルボキシ末端細胞質内ドメインに結合する事、またDRip78の過剰発現により、細胞表面のH3受容体量が減少すると共に細胞内のH3受容体総量も減少する事、さらにこれらの現象にプロテアソームによるタンパク質分解系が関与することが明らかにされた。今年度は、H3受容体カルボキシ末端に、試験管内で、新たにCLIC6と呼ばれる細胞由来タンパク質が結合する事を確認した。CLIC6は細胞内クロライドチャネルタンパク質とされているが、膜に埋め込まれた分子としてだけでなく、細胞質に可溶性タンパク質としても存在している多機能タンパク質である。CLIC6はドパミンD3受容体と結合する事が報告されているが、我々の実験から、CLIC6がドパミンD1受容体とも特異的に結合する事が明らかとなった。この事から、CLIC6が、最近報告されたH3受容体とドパミンD1受容体による細胞内ヘテロ2量体の形成に関与している可能性が示された。H3受容体とドパミンD1受容体のヘテロ2量体の形成は、ヒスタミンのH3受容体を介した情報伝達に質的に大きな影響を与えるため、CLIC6がH3受容体の細胞内トラフィッキングと共に、情報伝達の質的調節にも関与している事が示唆された。前年度までに、H3受容体カルボキシ末端に、CLIC4、DRiP78以外に、新たにCLIC6と呼ばれる細胞由来タンパク質が結合する事が明らかになった。今年度は、CLIC4については、H3受容体の細胞表面発現を増加させるが、細胞表面H3受容体数の増加とH3受容体を介したシグナルの増加の間に解離がある事が明らかになった。この事は、CLIC4がH3受容体の細胞表面への輸送を促進する際、H3受容体とヘテロ3量体Gタンパク質からなる情報伝達複合体のアセンブリーを阻害し、強制的に受容体だけを細胞表面に輸送する作用を持っている可能性を示唆している。DRiP78及び、CLIC6については、インビトロの系だけでなく、細胞内においてもH3受容体との相互作用が存在する事を確認するために、二分子蛍光相補(BiFC)システムを利用して計測を試みたが、細胞内での相互作用はこの系においては観測されなかった。

この事は、これらのタンパク質とH3受容体との細胞内での相互作用が、いわゆるシャペロン様の一過性で短時間の相互作用である可能性を示唆している。さらにDRiP78、CLIC6について、H3受容体のカルボキシ末端とアミノ酸配列上、類似の配列を持つムスカリン性アセチルコリン受容体M1、M2との結合活性をインビトロの実験系で確認した。その結果、H3受容体と同じGαiとカップリングするM2受容体が、H3受容体と同様の結合活性パターンを示す事が明らかになった。
生命分子システムの有機化学的拡張による動的秩序の創出

本研究では、非天然アミノ酸および非天然分子を部位特異的に導入することで、タンパク質の動的秩序の検出および制御を試みた。本研究を通じて、抗原の結合を蛍光変化として検出できる抗体の発現、非天然アミノ酸を導入したタンパク質の生細胞内での発現、アミノアシルtRNA合成酵素のリポソーム内での分子進化、芳香族アミノ基含有非天然アミノ酸の導入と特異的修飾、非天然分子の部位特異的導入、光架橋アミノ酸の導入によるタンパク質分子間光架橋および立体構造に依存した分子内光架橋などの新たな手法を開発できた。これらの成果は、非天然分子導入により細胞外・細胞内でのタンパク質の動的秩序を捉えて制御することを可能にした。本研究では、非天然アミノ酸導入技術を用いて、タンパク質の本来の機能と人工的な動的秩序形成能を併せ持つ人工タンパク質の創出を目指している。まず、蛍光標識非天然アミノ酸を用いて、タンパク質の機能を蛍光変化として検出することも試みた。既に一本鎖抗体のN末端部位に蛍光標識アミノ酸を導入することで、抗原の結合を蛍光変化として検出できることを見出しているが、さらにC末端側に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとなる蛍光標識アミノ酸を導入する、あるいは緑色蛍光タンパク質を融合する、ことにより抗原の結合を蛍光強度比の変化として検出できる手法を開発した。この手法は、細胞内などでの抗原のレシオイメージングに応用できる。また、糖結合タンパク質(レクチン)に対しても糖基質の結合を蛍光変化として検出できることを実証した。一方、非天然アミノ酸導入タンパク質の新規合成法の開発も行なった。非天然アミノ酸導入タンパク質の合成に使用する無細胞翻訳系は収量が低く、種々の機能評価を行なうために十分な量のタンパク質を得ることが困難であった。そこで、非天然アミノ酸を基質とするアミノアシルtRNA合成酵素変異体とアンバーサプレッサーtRNAを大腸菌中で共発現させることで、非天然アミノ酸導入タンパク質を大量発現させることを可能にした。さらに、芳香族アミンを有する非天然アミノ酸をタンパク質に導入しておき、アルデヒド誘導体を弱酸性下で還元的アルキル化反応を行なうことで、部位特異的かつ高効率にタンパク質を蛍光分子などによって修飾できることを明らかにした。また、光異性化分子や光架橋分子など有する非天然アミノ酸を導入したタンパク質の発現系の構築も進めた。その他、光応答性非天然アミノ酸の導入によるタンパク質の複合体形成の光による制御や、糖修飾タンパク質の合成に向けた糖アミノ酸のタンパク質への導入などを行なった。まず、非天然アミノ酸導入タンパク質の新規合成法の開発を行なった。非天然アミノ酸を基質とするアミノアシルtRNA合成酵素変異体とアンバーサプレッサーtRNAを大腸菌中で共発現させることで、非天然アミノ酸導入タンパク質を大量発現させる手法を確立し、これにより、光異性化分子や光架橋分子などを側鎖に有する非天然アミノ酸を導入したタンパク質の発現系を構築できた。その一方で、アミノアシルtRNA合成酵素変異体の活性向上とアミノ酸特異性改変を効率的に行うために、アミノアシルtRNA合成酵素変異体のin vitroselection法の開発を行った(A02松浦班員との共同研究)。無細胞転写・翻訳系とともに、アミノアシルtRNA合成酵素遺伝子とアンバーサプレッサーtRNAをリポソーム内部に封入し、非天然アミノ酸が導入された場合のみGFPが発現する選択系を構築した。実際にランダム変異を加えたアミノアシルtRNA合成酵素遺伝子を用いて選択実験を行った結果、従来よりも活性の向上した変異体が取得できることを実証できた。一方、時計タンパク質の構成成分となるタンパク質等に対して、非天然アミノ酸の導入系の構築を行い、無細胞翻訳系において蛍光標識分子や光架橋分子、光異性化分子などを導入できることを確認した。また、抗原の結合を蛍光レシオ変化として検出できる二重蛍光標識抗体を合成して、蛍光基の種類およびリンカー鎖長の最適化により、蛍光変化量を向上できることを示した。加えて、昆虫細胞由来のミクロソームと無細胞翻訳系を用いることで、蛍光標識アミノ酸導入タンパク質を膜上に発現できる手法の確立も行った。さらに、非天然分子を間接的に導入する手法として、芳香族アミン含有非天然アミノ酸と修飾アルデヒドを用いてタンパク質を部位特異的に修飾する手法を開発しており、蛍光基や高分子鎖での修飾反応を評価し、いずれも高効率で修飾できることを実証した。非天然アミノ酸のタンパク質への導入技術は、光機能性分子や蛍光標識分子などの人工機能分子をタンパク質に組み込むことで、タンパク質複合体形成などの生体分子の動的秩序の制御や検出に有用である。しかし従来の手法では無細胞翻訳系を用いる必要があり、タンパク質の発現効率の低く各種分析手法に適用する上で障害となっていた。そこで本研究では、非天然アミノ酸導入タンパク質の大腸菌内での大量発現系の確立を進めており、27年度は実際に光機能を付与したタンパク質の大量発現を行った。光異性化分子(アゾベンゼン)および光架橋分子(ベンゾフェノン)を有する非天然アミノ酸を認識するアミノアシルtRNA合成酵素変異体と、アンバーサプレッサーtRNAを用いて、一本鎖抗体へ非天然アミノ酸の導入を行った。その結果、良好な収率で非天然アミノ酸導入タンパク質が取得でき、光照射による抗原タンパク質との結合活性制御、およびタンパク質複合体の光架橋を確認できた。また、光架橋と蛍光標識を同時に行うことのできる非天然アミノ酸導入タンパク質の合成方法を新たに開発した。加えて、新たな非天然アミノ酸認識アミノアシルtRNA合成酵素変異体の分子進化を、無細胞翻訳系を内包したリポソームを用いたin vitro selection法により試みた(A02班松浦班員との共同研究)。一方、非天然分子をタンパク質へ導入するための新規手法の開発も行った。

まず、弱酸性溶液中でアルデヒド誘導体を用いてアミノ基の還元的アルキル化を行うことで、N末端アミノ基を選択的に修飾できることを見いだした。また、SNAPタグタンパク質融合と蛍光標識SNAPリガンド添加により、一本鎖抗体の近傍に蛍光分子を局在させ、抗原の結合を蛍光変化により検出できることを示した。この場合、非天然アミノ酸の導入を必要とせず、非天然分子導入タンパク質を細胞に直接発現させることも可能であった。これまで進めてきた非天然アミノ酸導入タンパク質の大腸菌内での合成法に関して、実際に良好な収率で光異性化および光架橋性の非天然アミノ酸を導入したタンパク質を得ることができた。また、非天然分子をタンパク質へ導入する手法に関して、N末端アミノ基をアルデヒドを用いて修飾する手法、および、SNAPタグタンパク質を介して非天然分子をタンパク質に付加する手法を検討し、抗体ー抗原結合の蛍光検出に応用できることを示した。以上の点から、概ね順調に進展していると判断した。光機能性分子や蛍光標識分子などの人工機能分子を側鎖に有する非天然アミノ酸のタンパク質への導入は、タンパク質の動的秩序の制御や検出において有用である。特に、光架橋分子を有する非天然アミノ酸を導入することで、タンパク質複合体を光架橋することが可能となる。今年度は、非天然アミノ酸に対するアミノアシルtRNA合成酵素変異体を用いた大腸菌発現系により、光架橋アミノ酸を導入したタンパク質の発現を行い、実際に一本鎖抗体と抗原の効率的な光架橋が起こることを確認した。またその際にタンパク質の分子内光架橋も起こりうる点に着目して、タンパク質のコンフォメーション変化を分子内光架橋の変化として捉えることのできる新規原理を見いだした。マルトース結合タンパク質をモデルとして選択して、種々の部位に光架橋アミノ酸を導入して基質の有無による分子内光架橋の変化を調べたところ、特定の部位に導入した場合に、基質結合に伴うコンフォメーション変化により、電気泳動で区別可能な異なる分子内光架橋体が得られることがわかった。また、光架橋アミノ酸を導入したタンパク質を細胞内で発現させて光架橋を行った場合にも、同様の結果が得られており、細胞内でのタンパク質コンフォメーション変化も検出可能であった。一方、これまでに開発したアルデヒド誘導体を用いたIgG抗体のN末端特異的修飾法を用いて、抗原抗体複合体の光架橋も試みた。光架橋分子のアルデヒド誘導体を合成して、弱酸性溶液中で還元的アルキル化反応を行うことで、IgG抗体のN末端に光架橋分子を付加した。抗原存在下で光照射を行うことで、抗原との複合体を光架橋できることを確認した。また、タンパク質タグ(SNAPタグ)を用いた光架橋分子の導入とタンパク質間相互作用の光架橋も試みたが、現在までのところ達成には至っていない。