hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多施設共同レジストリの構築による急性心不全の病態把握の試み

心不全に対する治療法は多くの大規模臨床試験の成果により、ほぼ確立されてきた。しかし、これらのエビデンスは合併症を持たない比較的若年者という医療現場とはかけ離れた心不全例の知見が基盤となっている。実際の医療現場では高齢者や合併症を有する心不全例が多く、必ずしもこれらのエビデンスを適用することができないことも多い。本研究は医療現場に即した治療法を模索するため大規模レジストリーを構築し、心不全診療における問題点を抽出することを目的とした。平成23ー25年度にかけて3施設で心不全症例を前向きに登録し、計1500例のデータベースを構築した。得られたデータベースを様々な角度から解析し、学会・論文発表した。本研究の大目的は、我が国における急性心不全(AHF)のデータベースを樹立し、1背景となる因子の病態・疫学を明確にし、2急性心不全治療法の現況とガイドライン尊守の実態を把握し、3日常臨床で使用されているBiomarkerと予後との関連を明らかにすることであった。そのためには、まず欧米諸国と比較できる国際水準のAHF症例登録用ソフトを開発する必要があり、その登録システムそのものをインターネットを利用して汎用化し、医療施設からでも速やかに情報収集が可能と剃る必要がある。この作業により登録率を高め、かつ登録する医療関係者の労力を最小限に抑えることが可能となる。さらに、インターネットを通じてデータの解析結果を各医療施設はもとより一般にも適正な形で開示することで最新の情報を共有することが可能となる。登録後の予後最終調査は退院後二年間まで追跡し、その二年間の間に当大学病院および複数の関東圏内の主要な循環器関連施設からのデータ収集体制を確立する。データの集積が千人規模に到達した段階で、重症度を考慮に入れた危険度補正死亡率(Risk Adjusted Mortality)の算出も可能となる。入院中の短期的な予後の評価や中期、遠隔成績の把握は重要な診療情報であり、また国民に還元されるべき情報でもある。これらを大規模で正確に把握するためには、アンケート形式での調査ではきわめて困難であり、レジストリというデータベース形式にて“正確"で“妥当"な指標を把握する必要がある。本研究の主目的は,日本における急性心不全のデータベースを樹立し,1背景因子の病態・疫学の特定,2治療法の現状とガイドラインの実践具合を把握し,3日常臨床で汎用されるバイオマーカーと予後との関連を明らかにすることであった.現時点で慶應大学,榊原記念病院,杏林大学の三施設が参加し,互いの施設との連携を密に行い(定期的な合同会議やメールでのやり取り),2014年1月の段階で登録患者総数は約1500人にとなり,当初の目的を達成するのに十分な量のデータを収集することが出来ている.退院後の予後調査に関しても,約1000人の患者に関しては2年間のフォローアップが完了している,さらに、前述の3施設以外の施設とも共同し,具体的には,英国のUniversity of Hullと共同して,本邦と英国との心不全患者および治療内容の比較検討を行っている.上記登録情報より,下記の通り第78回日本循環器学会(2014.3)で発表を行っている.また,1本の論文も投稿・受諾され,業績を残している.心不全に対する治療法は多くの大規模臨床試験の成果により、ほぼ確立されてきた。本研究の目的は、我が国における急性心不全(AHF)のデータベースを樹立し以下のことを明らかにすることである。1.背景となる因子の病態・疫学を明確にする。2.急性心不全治療法の現況とガイドライン尊守の実態を把握する。3.日常臨床で使用されているBiomarkerと予後を明らかにする。そのためには、西洋諸国と比較できる国際水準のAHF症例登録用ソフトを開発する必要がある。登録率を高め、かつ登録する医療関係者の労力を最小限に抑えるためには、インターネットを利用することでどの医療施設からでも速やかに情報収集が可能になると考える。予後最終調査は退院後二年間まで追跡し、その二年間の間に当大学病院および複数の関東圏内の主要な循環器関連施設からのデータ収集体制を確立する。これらを大規模で正確に把握するためには、アンケート形式での調査ではきわめて困難であり、レジストリというデータベース形式にて"正確"で"妥当"な指標を把握する必要がある。現在も各施設で50100名程度の登録が続いており、主な問題点について話し合いを行い、逐次アップデートを行なっている。

また、各施設それぞれ1名のデータマネージャー(DM)を選出し、データ収集と各項目のvalidationに責任を持つこととした。さらに、データベースフォーマットソフトの作成を行い、ファイルメーカーベースでDropdown方式を多用し、手軽に入力できるものとした。また、外れ値に関しても自動的にピックアップできるようなプログラムを内包することとし、事前に入力エラーを予防する。これを各施設に配布し、使用している。入力項目の選定はデータベースの質を決定する上できわめて重要であったが、平成24年度内に2度のデータベースミーティングを行い、項目のアップデートを行った。加えて、中長期的なフォローアップも開始されており、概ね順調に進んでいる。世界的にも様々な形で試行錯誤が行われている。我が国においては、国民の移動が国内に限定されることが多く、比較的に追跡調査を行いやすい環境にあるといえる。また、心不全の遠隔成績を得ることは、その後の診療や手技の選択にあたってきわめて有用な情報になると考えられる。現在各施設で50100名程度の登録を行い、主な問題点について話し合いを行い、逐次アップデートを行なっている。入力項目の選定はデータベースの質を決定する上できわめて重要であった。平成23年度内に2度のデータベースミーティングを行い、大項目(1)(4)の選定を行った。(1)術前の患者背景、生年月日といった基本情報、(2)入院時の身体所見やバイタルサイン、検査所見、(3)治療の内容、その後のBiomarker値(BNP、TNT、hsCRPと決定)、(4)予後、合併症の有無(退院後二年間の再入院率および死亡率)。中長期的なフォローアップに関してはまだこれからであるが、世界的にも様々な形で試行錯誤が行われている。主要学会(日本循環器学会、日本心臓病学会)期間中等に心不全データベースワーキンググルーブ会議とデータマネージャー会議を開催し、入力説明と結果のフィードバック、そして入力項目の選定や追加などを行うものとする。なお、Web Baseが稼働する平成25年度後半からの参加施設については、Web Baseにてテスト期間を設け、入力に慣れた段階で参加する予定にする。また、米国データベース会議への参加と情報の収集を常に行う。
ステロイド抵抗性、難治性喘息の新規治療戦略の開発を目指して

(1)ステロイド抵抗性、好中球性気道炎症モデルについての解析:既存の報告をもとに、OVA/CFAによる抗原の経皮感作や、OVA吸入による気道炎症誘発について検証し、解析の対象とする好中球性気道炎症モデルの確認を行った。感作回数や吸入の回数を何通りか変更して、好中球性気道炎症の程度の変化を検証した。感作回数による好中球気道炎症の差異は小さく、1回感作でも十分にBALFへの好中球浸潤をみとめた。同一群内の個体間のばらつきが大きく解析上の障害となったため、感作に用いる薬液の作成方法を工夫することで投与する薬液の均一性を高めた結果、個体間のばらつきは減少した。(2)上記モデルにおける、アレンドロン酸(ALN)の投与方法の検証:上記の好中球性気道炎症モデルに対して、ALNの経口投与のタイミングや回数を変更し、好中球性気道炎症に対する効果を検証する最適なプロトコールを検証した。吸入60分前の経口投与で好中球性気道炎症の抑制傾向がみられた。(3)上記モデルにおける、コントロール群とALN投与群との、サイトカイン等の発現プロファイルの比較:肺ホモジネートやBALF中の、Th1系, Th2系, Th17系,自然免疫系など、様々な系統のサイトカインについてELISAで濃度の計測を行った。追試を繰り返したが、同一群内での個体間のばらつきが大きく、コントロール群と比べて優位な傾向はみられなかった。(4)OVA/CFA感作による好中球性気道炎症について、ALN投与による抑制やそのメカニズムの同定をすることが困難であったため、別モデルで検証を行った。OVA特異的TCRを発現したDO11.10マウスにOVA吸入を行うことで、好中球性気道炎症をおこすことが知られているため、OVA吸入前にALN経口投与を行い、コントロール群と比較した。郡内のばらつきがおおきく、有意な傾向は得られなかった。(1)ステロイド抵抗性、好中球性気道炎症モデルについての解析:既存の報告をもとに、OVA/CFAによる抗原の経皮感作や、OVA吸入による気道炎症誘発について検証し、解析の対象とする好中球性気道炎症モデルの確認を行った上で、感作回数や吸入の回数を何通りか変更して、好中球性気道炎症の程度の変化を検証した。OVA吸入後の気管支肺胞洗浄液(BALF)を回収して、好中球性気道炎症の程度を比較し、複数のプロトコールの中から有望なものへと絞り込んでいる。しかしながら、同一群内の個体間のばらつきが大きく解析上の障害となっているため、来年度は追試を行い、プロトコールを改善する。(2)上記モデルにおける、アレンドロン酸(ALN)の投与方法の検証:上記の好中球性気道炎症モデルに対して、ALNの経口投与のタイミングや回数を変更し、好中球性気道炎症に対する効果を検証する最適なプロトコールを絞り込んでいる。上記(1)でも問題となった、ALN非投与群(ポジティブコントロール群)と同様にALN投与群でも、BALFの好中球数について、同一群内での個体間のばらつきが多くみられることがあるため、来年度は追試を行い、プロトコールを改善する。BALF中の好中球数の結果と同様に、同一群内での個体間のばらつきが大きく、再現性をもって有意な差異を検出できていない。来年度は追試を行い、再現性を確認する。予備実験で確認できていた好中球性気道炎症モデルにおいて、再現性が十分確認できていないため。

(4)OVA/CFA感作による好中球性気道炎症について、ALN投与による抑制やそのメカニズムの同定をすることが困難であったため、別モデルで検証を行った。OVA特異的TCRを発現したDO11.10マウスにOVA吸入を行うことで、好中球性気道炎症をおこすことが知られているため、OVA吸入前にALN経口投与を行い、コントロール群と比較した。郡内のばらつきがおおきく、有意な傾向は得られなかった。ポジティブコントロール群を確立することを最優先事項とする。方法の見直しをおこなっても群内のばらつきが大きいままである場合は、1群あたりのマウス数を増やして対応する。貴重な研究費を途中で使い切らずに、継続的に研究を遂行できるようにするために、物品・試薬・マウスの発注などを、最小限にとどめました。申請時に許可いただいた、3年間の枠内での継続使用を計画しています。
利用者の日常生活行為を支える場としての高齢者居住施設のあり方に関する研究

本年度は研究の最終年度として、昨年度から引き続いてのフィールド調査によるデータの収集と、過去3ケ年の調査で得られたデータの分析とまとめを行なった。調査はユニット型特別養護老人ホームおよび認知症高齢者グループホーム、比較対象として従来型特別養護老入ホームで行動観察調査を中心に行い、利用者の日常生活行為の抽出、その様態把握のための観察調査を継続的に行うことで、利用者の「日常生活行為」の実態から見えてくる環境・空間および介護のあり方を分析・考察した。またあわせてスタッフの介護様態を明らかにすることで利用者の生活と環境との関わりも探った。特に夜間時の利用者の生活行動は十分把握されていないことから、夜間時の介護の様態と合わせて調査し、データを収集・分析した。そこからは空間構成の違いにより生活の形が異なること、家具や設備等しつらえの配置が生活行動に大きな影響を及ぼしている実態が明らかになり、今後の施設計画や生活環境づくりにおける貴重な知見を得ることができた。また、11月には、先進的な施設計画事例の視察調査を北欧・デンマークにおいて実施した。施設の視察および施設運営者・設計者等にヒアリングを行うことで、社会制度と施設のあり方、文化と生活と介護、空間との関わりにおける実態を調査し明らかにした。利用者の日常生活を支える場としての施設が向かうべき方向性、そのための制度や空間のあり方、環境の作り方に関わる重要な示唆が得られた。本年度は主に3つの調査を行った。ユニットケア型特別養護老人ホーム2施設おける調査と、比較対象としての認知症グループホームにおける調査である。本年度はまず、施設に居住する利用者の日常生活行為がどのような形で構成されているのか、生活行為から見た施設環境のあり方を明らかにしていくための基礎的なデータとして、それぞれの施設における利用者の生活様態、スタッフの介護様態を考察した。調査は行動観察調査により、入居者の生活様態については空間利用、生活、そして他者との関わりという視点から、またスタッフの介護の様態については空間利用、介護内容、利用者との関わりという視点からデータをとった。調査を通して、特別養護老人ホームとグループホームにおける利用者の生活の決定的な相違として、「関わり」行為の実態とその様態が示された。特に身体的に重介護で、かつ認知症を患う利用者にとってはスタッフからの関わり(直接的・間接的な他者とのコミュニケーション)行為が生活の質を高める上でも非常に重要となる。またその個別的な関わりを目指して生まれたのがユニットケア型の特別養護老人ホームではあるが、現実的には他者との関わり(対入居者間、対スタッフ)がきわめて少ない実態が明らかになった。そこには介護スタッフの業務様態、空間的な構成が影響していることも示された。一方でグループホームでは「関わることを目的とした関わり」という、特養ではほとんどに見られなかった関わりの様態が割合として多く観察された。来年度以降は、さらに「関わり」とその様態に着目しながら、個々の生活行為(食事や余暇など)の中での関わりの実態と、「関わり」を支える居住環境、介護環境のあり方を調査分析していく予定である。ユニットケア型特別養護老人ホーム1施設における調査(1)と、ユニット型老人保健施設における調査(2)、認知症高齢者グループホームにおける調査(3)である。調査(1)では、夜間時における利用者の行動と介護の様態について観察調査を行った。夜間時の要介護高齢者の生活行動の実態と、それに関わる介護の様態はこれまで十分な調査がされてきておらず明らかになっていない。今回はユニット型施設における調査を通して、利用者の生活様態と介護の様態とから、夜間勤務のスタッフの滞在場所や、ユニットの空間構成がその介護に影響を及ぼしている実態が明らかになった。調査(2)では、全国でも珍しいユニット型の老人保健施設における利用者の生活実態と空間利用の関わり、介護の様態と空間との関わりについて、丁寧な観察調査により明らかにした。特別養護老人のホームのユニットケアとは異なる生活の姿や、介護によって左右される空間利用の実態などを明らかにした。グループホームにおけるスタッフと利用者との「関わり」の様態を観察調査により明らかにした。調査対象施設における結果としては、短時間ではあるが個別的な関わり合いが、断続的に展開されるグループホームにおける生活と介護の実態と、関わりによってもたらされる認知症高齢者の生活展開の広がりを明らかにした。個々を支える形は、それぞれの生活の形と連動するものであり、きわめてきめ細やかな対応とそのための場が必要になる実態が明らかになった。また空間構成の違いが関わりの形に影響を及ぼす実態も明らかにされた。

そこからは空間構成の違いにより生活の形が異なること、家具や設備等しつらえの配置が生活行動に大きな影響を及ぼしている実態が明らかになり、今後の施設計画や生活環境づくりにおける貴重な知見を得ることができた。また、11月には、先進的な施設計画事例の視察調査を北欧・デンマークにおいて実施した。施設の視察および施設運営者・設計者等にヒアリングを行うことで、社会制度と施設のあり方、文化と生活と介護、空間との関わりにおける実態を調査し明らかにした。利用者の日常生活を支える場としての施設が向かうべき方向性、そのための制度や空間のあり方、環境の作り方に関わる重要な示唆が得られた。
微生物のエンドグリコシダーゼを用いた糖鎖の機能解析と酵素の遺伝子に関する研究

我々が土壌中より単離同定したMucor hiemalisが培養液中に生産するEndo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖の高マンノース型、混成型糖鎖のみならず複合型糖鎖をも切断遊離することのできる特異的なエンドグリコシダーゼである。本研究では本酵素の糖転移活性を利用することによって糖鎖をタンパク質やペプチドに付加することを試みるとともに、本酵素の有用性に鑑みて遺伝子の解析を試みた。1.糖鎖の転移活性:本酵素は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖のジアセチルキトビオース結合に作用して糖鎖を切断遊離する加水分解活性を有している一方、糖鎖を受容体に転移する糖転移活性をも有することを見出した。即ち、糖鎖の受容体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を用い複合型糖鎖を有するヒト血清アシアロトランスフェリンの糖ペプチドを供与体として、本酵素による糖鎖の転移を調べたところ、GlcNAcに糖鎖が付加した糖(鎖)転移生成物を確認した。2.糖鎖の転移受容体:糖鎖の転移受容体について調べたところ、GlcNAcのみならず、ジアセチルキトビオースやトリアセチルキトトリオースなどにもアシアロトランスフェリンの複合型糖鎖が転移することをHPLC分析などによって確認した。3.糖(鎖)転移活性測定法の開発:本酵素の糖鎖転移活性を、ピリジルアミノ化したジアセチルキトビオースを受容体として用いることにより、HPLCで迅速に分析することができる方法を開発した。4.卵白アルブミンの糖鎖のすげ替え:高マンノース型糖鎖を持つ卵白アルブミンをプロナーゼで消化して得られた糖ペプチドにEndo-HタイプのEndo-β-N-acetylglucosaminidaseを作用した後、アシアロトランスフェリン糖ペプチドを糖鎖供与体として、Endo-Mを作用したところ、複合型糖鎖を持つ卵白アルブミンの糖ペプチドが得られることを確認した。
高等学校数学における問題設定と解法の評価に関する実践的研究

【研究目的】高等学校1,2年生を対象に、以下の2つを研究目的とした。(1)生徒自身で問題設定ができるように指導をし、その問題の解法を記述したレポートを評価するための観点を示すこと。(2)その評価観点に基づいて実際に生徒のレポートを評価し、実用可能性を示すこと。【研究方法】(1)数学における研究方法、数学の問題設定と問題解決ならびに数学的な考え方に関するこれまでの研究の成果をもとに、問題設定と問題解決の解法を評価するための観点ならびに評価の段階を設定した。(2)問題設定に関する授業プログラムを作成し、そのプログラムを実践し、その後生徒に問題設定を行わせ、その問題ならびにその解法について、(1)で用いた評価の観点に基づき、評価を行い、評価の観点の実用可能性を検証する。【研究成果】(1)問題設定に関しては、仮定の変更(対象範囲の拡大や特殊化)、「逆」の活用、結論の変更(一般化と特殊化等)を、問題設定の方法とした。また、その解法に関しては、正確さ、表現のわかりやすさ、数学的な考え方、論理性を評価の観点と定めた。(2)問題設定に関する授業プログラムを、数学Aの「場合の数」、数学IIの「図形と方程式」、「対数関数」、「微分積分法」において開発し実践した。その結果、現在の教育課程の中に位置づけることが可能であることがわかった。また、生徒のレポートを評価する際の解法に対する評価の観点も実践可能であることがわかった。さらに、実践を通して、新たに問題を設定し、その問題を解くことができたことにより、その分野での理解が深まると同時に数学の創造に関わることにより数学に対する興味が高まった生徒も見られた。【今後の課題】数値の変更と、数値を文字化(一般化)することによる問題設定が多く見られた。「逆」の活用は、見られなかった。今後は、問題設定の適した教材の選定・発掘と授業の展開例を作成し、日常の授業に役立てたい。
構造主義権力論における構造変動と偶然性

本年度は、ルイ・アルチュセールとジャック・デリダの思想における、偶然性と時間性の問題について研究した。デリダは『マルクスの亡霊たち』において、「来るべきデモクラシー」という理念にもとづく抵抗の実践と、出来事(構造変動、切断)の関係について考察している。デリダ的抵抗の実践はそこで、現在と『来るべき出来事」との間に存在する非知、あるいは離接(「時間の関節が外れている」)という時間性に基づいて構想される。つまり、「来るべきデモクラシー」、あるいは「メシア主義なきメシア的なもの」という未来の時間性が定言的に命じる抵抗は、そのような理念と現在との間に見出される偶然性の空間(「離接disjointure」)によって支えられているのである。このような時間性は、さらに「亡霊spectralite」という「過ぎ去ったものpasse」と「来るべきものa-venir」との交錯として規定される時間性と共に、現在の抵抗を規定している。それに対して、アルチュセールにおける「出来事」の概念は、つねに現在性(「複合状況conjoncture」)の分析と密接にリンクされている。つまり、アルチュセールにおいて、「出来事」の可能性は現在性という時間に「限定」されている。この点が、デリダ的「出来事」概念との決定的な差異を構成する(「来るべき出来事」としての未来と過去の交錯)。アルチュセールが「出来事」の可能性を現在性という時間に限定するということは、必然的に偶然性の空間を現在性にのみ限定することを意味する。そこから、アルチュセールにおける「複合状況」の分析の優位(例えば、過剰決定概念における、経済的審級と政治的審級の役割の「置換」による、結果としての政治的審級の優位)が帰結する。「出来事」概念に関する、アルチュセールとデリダにおける時間性の差異は、実践の哲学における「メシア的なもの」(「来るべきもの」としての超越論的理念)の優位(デリダ)と、「複合状況」(現在性における政治的偶然性)の優位、という形で、抵抗の哲学に関する決定的な立場の相違を形成するだろう。本年度は、特にジャック・デリダの思想における構造変動と偶然性の問題について研究した。デリダは『マルクスの亡霊たち』において「メシア主義なきメシア的なもの」というモチーフを扱っているが、これは「来るべきデモクラシー」の実現という「厳命」であり「約束」に他ならない。「メシア主義なきメシア的なもの」が命じる「来るべきデモクラシー」が実現されるためには、現在の社会構造との間に「切断」(アルチュセール)が存在しなければならないのである。「切断」という概念は、デリダにおいて「空白」、「離接性」と名づけられているが、それは未来に関する「非知」であり、偶然性の侵入の場としての「開け」である。デリダはそうした偶然性の場がもたらしうる「切断」を「出来事」と名づけるだろう。「出来事」とは、他者性の侵入による、現在の主権秩序の変容である。絶対的な他者の単独性の侵入によって、固定化された現存の秩序の「共時的再生産」(アルチュセール)はある種の変容を迫られざるをえない。それは、固定化された現存の秩序に「不気味なもの」を導入することに他ならない。そうした「不気味なもの」の他者性は、現存の固定化された主権秩序を撹乱し、壊乱するだろう。そうした他者性の導入のための実践の形態の一つとしてデリダは「歓待」という概念を導入する。それは単に外国人の移民受入や同化を意味する概念ではなく、予期せぬ他者性の導入によって、「私」あるいは「私の家」(現存の主権的秩序)が変容をせまられるような、過酷な概念である。それは、ある場合には予期せぬ最悪の事態をもたらすかもしれない。しかし、そのような過酷な他者性と偶然性の導入によってのみ、固定化された主権的秩序の再生産プロセスの変容の可能性が開かれる。「来るべきデモクラシー」というメシア的「理念」がその可能性を「約束」するだろう。

そこから、アルチュセールにおける「複合状況」の分析の優位(例えば、過剰決定概念における、経済的審級と政治的審級の役割の「置換」による、結果としての政治的審級の優位)が帰結する。「出来事」概念に関する、アルチュセールとデリダにおける時間性の差異は、実践の哲学における「メシア的なもの」(「来るべきもの」としての超越論的理念)の優位(デリダ)と、「複合状況」(現在性における政治的偶然性)の優位、という形で、抵抗の哲学に関する決定的な立場の相違を形成するだろう。
炎症による上皮細胞分化制御の二面性と腫瘍形成機構への関与

本研究では、胃がんモデルマウスのマイクロアレイ解析からこれまでに得られた"炎症によって発現が変化する未分化性に関連した遺伝子"のなかから、腫瘍原性に関与するものをsiRNAとソフトアガーコロニー形成を用いたスクリーニングにより、Noxo1とGna14を炎症性微小環境に依存した発現を示す腫瘍形成促進因子の候補として同定した。これらの遺伝子の発現は、間質細胞ではなく腫瘍上皮細胞において、炎症性微小環境の作用により発現が亢進していた。また単離した胃上皮細胞では未分化状態で高い発現を示し、分化とともに減少することもわかり、未分化性との関連も示唆された。また、腫瘍原性に対する影響を調べるために、低酸素条件下で培養した胃がん細胞のスフェア形成における役割をsiRNAを用いて調べたところ、Noxo1, Gna14それぞれを阻害した場合にスフェア形成が抑制された。本年度はNoxo1についてさらに解析を行った。Noxo1はNADPH oxidaseorganizerで、活性酸素の産生に関与することが知られている。そこで、NADPH oxidaseの阻害剤であるApocyninを胃がんモデルマウスに投与したところ、腫瘍の増殖が抑制されることがわかった。また、NADPHoxidase阻害剤は、Noxo1 siRNAと同様にスフェア形成を阻害することもわかった。Noxo1発現をsiRNAで阻害した際の未分化性マーカーの発現を調べてみるとスフェア形成時の発現パターンが変化していることがわかった。これらの結果はNADPHoxidaseによる活性酸素の産生が細胞の未分化性に関与し、それが腫瘍形成をコントロールしうる可能性を示唆している。現在、Noxo1のコンディショナルノックアウトマウスを作成しており、それにより、Noxo1の腫瘍モデルマウスにおける役割が解析されるものと期待される。本年度は、胃がんモデルマウスのマイクロアレイ解析からこれまでに得られた"炎症によって発現が変化する未分化性に関連した遺伝子"の中で腫瘍原性に関与するものを、siRNAとソフトアガーコロニー形成を用いた腫瘍原性に対するスクリーニングにより同定した。また、Cox-2/PGE2経路活性化により構築された炎症性微小環境の中で、TNFalphaの重要な役割が明らかとなったので、TNFalpha依存的に胃腫瘍形成において発現変化が見られる遺伝子群についても、同様のスクリーニングを行った。その結果、Noxo1とGna14を炎症性微小環境に依存した発現を示す腫瘍形成促進因子の候補として同定した。炎症によって引き起こされるこれらの遺伝子発現の上昇が間質細胞ではなく腫瘍上皮細胞で起こっている事は、組織より酵素処理によって分離した上皮細胞を用いた解析、さらにレーザーマイクロダイセクションにより確認され、これらの遺伝子が炎症により腫瘍そのもので発現する促進因子である事がわかった。また、これらの遺伝子の発現は、ヘリコバクターを感染させた胃粘膜で上昇している事、PGE2レセプターのひとつであるEP4に対する阻害剤により炎症が抑制された胃では減少している事から、炎症との密接な関連が示された。一方、単離した上皮細胞を用いた分化の実験より、これらの遺伝子の発現が未分化状態で高く、分化と共に減少する事がわかり、未分化性との関連も示唆された。さらに、腫瘍原性に対する影響を調べるために、低酸素条件下で培養した胃がん細胞のスフェア形成における役割をsiRNAを用いて調べたところ、Noxo1, Gna14それぞれを阻害した場合にスフェア形成が抑制された。これらの結果から、我々はNoxo1とGna14は炎症によって誘導される胃がん発生促進に働く重要な因子であると考え、さらにその機能と役割の解析を行っている。

本研究は、遺伝子発現解析により得られた炎症によって発現が変化する細胞未分化性に関与する遺伝子の中から、腫瘍形成・進展に機能するものを同定、解析し、その役割と炎症による腫瘍形成・進展機序を分化の制御という視点から明らかにする事を目的としている。その中で今年度は、マイクロアレイ解析から得られた遺伝子リストの中から、siRNAを用いた機能的スクリーニングにより候補遺伝子を2つの遺伝子に絞り込む事ができた。また、これらの遺伝子の上皮細胞での発現の炎症依存性、未分化性、腫瘍原性への関与についてを示すデータも得られた。一方で、マウスの胃腫瘍ならびに正常細胞を継代培養し、遺伝子導入を行う系の確立を試みたが、解析に十分な効率で遺伝子導入を行には至っていない。そこで、SV40 T antigenを発現するトランスジェニックマウスを胃がんモデルマウスとの掛け合わせにより不死化した上皮細胞株の確立を行った。得られた細胞株についてては現在その性質を調べているところである。以上の状況から、本年度の大きな目的であった候補遺伝子の絞り込みは達成する事ができ、次年度からの機能解析へとつなげる事ができた。得られたNoxo1, Gna14の腫瘍形成における機能解析を行うために、誘導型のshRNA発現ベクターならびに遺伝子発現ベクターを構築し、ノックダウン、過剰発現をコントロールできる細胞株を樹立する。さらにこれらの細胞をルシフェレースレポーター遺伝子で標識し、in vivoに移植した細胞における腫瘍形成におけるこれら遺伝子の機能解析を行う。移植の方法としては、常法である皮下への移植以外に、胃粘膜下への同所移植をおこなう。また、炎症整備量環境によって誘導され、腫瘍原性に果たす役割が微小転移した腫瘍細胞の増殖二ksん夜する可能性も考え、脾臓、直腸への移植による転移における役割についても調べる。一方で腫瘍原性と未分化状態における役割が、がん幹細胞としての性質にも関与している事を考え、スフェア形成における役割の解析をさらに進め、幹細胞マーカーの発現との関与についてもFACSを用いて調べる。Noxo1はNADPH oxidase organizerをコードし、活性酸素を生成する酵素複合体の因子として働く事が知られている。この観点から、Noxo1による活性酸素レベルの変化とその胃がんにおける役割を、胃がんモデルマウスとNADPH oxidase阻害剤を用いた実験より調べる。また、in vitroにおいて、腫瘍原性とNoxo1,活性酸素の関連について調べる。また、これら遺伝子のin vivoでの機能を解析するために、コンディショナルノックアウトマウスの作出のためのベクター構築も始める。これらの実験より、Noxo1, Gna14の腫瘍形成における役割をマウスのin vivo実験を中心に明らかとし、ヒトにおける胃がんの予防、治療への適用の可能性を探っていく。該当なし
日本の労働時間と雇用数の変動に関する動学的一般均衡分析

日本の労働市場に関して興味深い事実として、雇用者一人当たり労働時間の変動が景気変動を4四半期先行するのに対し、雇用者数の変動が景気変動を3四半期後追いすることがあげられる。本研究は、既存の景気循環モデルでは説明できないこの現象を、労働時間と雇用者数を区別した確率動学的一般均衡モデルを用いて、定量的に分析する。本モデルでは、社会的意思決定者が生産性ショック、投資特有技術ショック、選好ショック、労働密度(Effort)ショック、政府支出ショックという外生変数に反応し、生産、消費、投資、雇用数、労働時間の配分を選択すると仮定する。定量分析に関して、実際に観測することのできない外生変数が存在するため、最尤法を用いて構造推計により、確率過程を推計し、それぞれの外生変数が景気循環に対してどのような役割を担っているかをシミュレーションによって検証する。この結果、生産性ショックは景気循環を説明するのに重要であること、投資特有ショックは投資と消費の比率を説明するのに重要であること、そして、Effortショックが景気循環に対する労働時間変動の先行と雇用者数変動の遅れを説明するのに重要であることが分かった。この結果から、Effortショックが日本の労働市場に重要な影響を与えていることが示された。ただし、本研究においては、厳密にはそのショックの正体を特定していない。推計されたEffortショックが景気を4四半期先導していることから、さらにミクロレベルでこの変数の変動要因を探ることは、労働市場のみならず、景気に関する政策の設計に有効であると考えられる。本研究の意義は、この点を明らかにすることにより、今後のさらなる日本の労働市場と景気循環の研究の発展を促すことである。
ゲノム領域特異的ヒストンアセチルの誘導によるがん治療法の開発

がんで発現していない遺伝子には、がんが増えることやがんを不死化することを抑える作用を示すものがあります。これはがんががんであるために出ることを抑え込んでいる遺伝子と言えます。また免疫からがんが逃れるために発現を止めている遺伝子もあります。我々はこの遺伝子をがんでもう一度発現させる薬を創っています。遺伝子の活性化を起こす薬を特定の遺伝子に運ぶとその遺伝子を特異的に活性化出来ます。まだ臨床に使えるほどの強い効果は得られていませんが、がんの嫌がる遺伝子を再発現させる薬を創り出しました。この研究から、がんではなく、iPS細胞を創る薬が出来、これは京都大学と共同研究に至っています。エピジェネティックな修飾をゲノムの特定の領域に能動的に働かせることができる基礎技術を疾患エピミューテーションの修復技術および表現型と関連するエピミューテーションの探索技術として実用化することを目的として研究実施計画に取り組んでいる。初年度は、ペプチド合成機PSSM8を購入し、ポリアミド化合物の効率的な自動合成系を千葉県がんセンター研究局内に確立し、ポリアミド化合物の合成と合成化合物の生成に成功している。このポリアミド化合物とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の複合体を合成し、HDACの阻害活性が有ることを確認し、何らかの変化が細胞に誘導できるか?また、ゲノムのヒストンのアセチル化をある特異性を持ってゲノムの特定領域に促すことができるか?さらに、標的遺伝子の発現パターンを変えることが確認できるかを検討している。標的遺伝子配列領域のDNAメチル化、ヒストンアセチル化およびヒストンH3K4とK27のトリメチル化の解析、遺伝子発現解析および標的外の領域での変化を検討することで、特異的に標的遺伝子を再発現させることができる方法の間接的理解を目指して、配列をランダムに選んで作成したポリアミドSAHA複合体ライブラリーによる、iPS細胞を誘導する山中因子、特にNanogの発現を誘導する化合物をヒト皮膚由来線維芽細胞でスクリーニングし、Nanogの候補化合物を京都大学との共同研究で得ることが出来た。さらにヒト皮膚由来線維芽細胞を多能性幹細胞様のアルカリフォスファターゼ陽性コロニーに変化させる表現型であることからがん幹細胞の誘導ができるかを検証している。エピジェネティックな修飾をゲノムの特定の領域に能動的に働かせることができる基礎技術を疾患エピミューテーションの修復技術および表現型と関連するエピミューテーションの探索技術として実用化することを目的として研究実施計画に取り組んできた。ペプチド合成機PSSM8を購入し、ポリアミド化合物の効率的な自動合成系を千葉県がんセンター研究局内に確立し、ポリアミド化合物の合成と合成化合物の生成に成功した。このポリアミド化合物とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤SAHAとを結合させた複合体を合成し、HDACの阻害活性が有ることを確認し、何らかの変化ががん細胞に誘導できるか?また、ゲノムのヒストンのアセチル化をある特異性を持ってゲノムの特定領域に促すことができるか?さらに、標的遺伝子の発現パターンを変えることが確認できるかを検討してきた。標的遺伝子配列領域のDNAメチル化、ヒストンアセチル化およびヒストンH3K4とK27のトリメチル化の解析、遺伝子発現解析および標的外の領域での変化を検討した結果、ある特異性を持って標的遺伝子を含むゲノムにヒストン修飾の変化が認められ、発現が停止もしくは低下している内在性の遺伝子を再発現させることができることが確認できた。残念ながら抗がん剤として使用できるような効果を示す化合物は未だ同定できなかったが、この方法を用いて合成された化合物により、iPS細胞を誘導する山中因子を誘導する化合物を同定し、マウスでiPS細胞を誘導でき、ヒト皮膚由来線維芽細胞でにおいても幹細胞を誘導する可能性のある候補化合物を京都大学との共同研究で得ることが出来た。ピロールイミダゾールポリアミド(PIP)化合物にHDAC阻害剤SAHAをコンジュゲートした化合物(SAHA-PIP)を合成し、6塩基認識の24種の化合物を合成した。化合物投与後のがん細胞増殖・細胞形態への影響をタイムラプス解析によって観察した。ヒト子宮がんHeLa、膀胱がんT24、乳がんMCF7、MDANB231、すい臓がんPanc1、正常HCE-T細胞株をテストし、化合物OとPがMCF7の増殖を抑制し、MはHCE-Tの増殖を抑制した。しかし明らかな形態変化は見られず、効果の再現性が不確実であっため、次世代型の環状PIP化合物による同様の探索を試みることとした。残念ながら計画していた次世代型の環状PIPとSAHAの効率的な合成には成功していない。随時工夫を加え合成法の検討を継続している。並行して、京都大学との共同研究でマウス線維芽細胞に対する上記ライブラリーの添加実験を行った。SAHA-PIP投与後24時間でマウス線維芽

細胞の遺伝子発現パターンを15-25%程度ES細胞に近似させることができる化合物を得、Scientific Reports2, Article number:544 2012に報告した。さらに繊維芽細胞を継代し、ES細胞維持用の培養液で維持することにより、マウスでのiPS様の細胞の樹立に成功した。現在ヒト皮ふ由来線維芽細胞に対しても同様のiPS化を試み、iPSへの形態変化を誘導する化合物が得られたため、化学物質によるiPS細胞の誘導に関する特許出願を進めている。さらにこのヒトiPS誘導化合物によるがん細胞への影響をスクリーニングしたが、現状では明らかな山中因子の誘導を起こすがん細胞株および形態変化を起こす細胞株は得られていない。随時研究を継続し、ヒトがん細胞における遺伝子誘導の新たな方法とがん細胞の形態変化の誘導を起こす化合物の探索を行う。初年度予定していた化合物の自動合成機の設置とその運用による化合物の合成と精製に成功している。また合成された化合物により、多能性幹細胞様のアルカリフォスファターゼ陽性の細胞コロニーを得ており、その細胞において山中因子の遺伝子領域のヒストンアセチル化の誘導と遺伝子発現が確認されている。がん細胞でのスクリーニングのための実験準備が完了している。自動合成機の調整に当初予定していた以上に時間が掛かってしまったため培養実験等の開始が当初の予定よりも遅れてしまっているが、ほぼ予定通りといえる。25年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノムの主な遺伝子のプロモータ領域には、GCリッチな配列が多く見られ、この配列を標的とすることは、従来のPIポリアミド設計では困難であった。我々はこの点を、新規に開発したブロック合成法およびβアラニンの交差構造の導入等により改善してきた。またピロールイミダゾールポリアミド(PIP)のヘアピン構造の問題点からの脱却によりアグリゲーションの問題や配列認識特異性の問題点の改善を図り、配列認識特異性が高くアグリゲーションの問題を解決できる可能性がある環状型PIP(cPIP)の合成に成功し、環状型のPIPもヘアピン型同様に細胞株で遺伝子発現を抑制できることを確認した。この結果は、米国癌学会AACR2013に採択され、報告した。当初計画していた次世代型のピロールイミダゾールポリアミド(PIP)の合成については、システインを利用したcPIPの合成は可能となったが、両側をγターンでシンメトリックにする合成を試みてきたがこれには未だ成功できていない。cPIPに対するSAHAのコンジュゲートSAHA-cPIPの合成も自動合成機によりコンスタントに合成することには成功できていない。このため、従来型のPIPを用いてSAHAのコンジュゲートを合成することで24種類SAHA-PIPのライブラリーを作成した。当初予定の合成に困難を生じたため全体に計画は遅れているが、線維芽細胞での多能性幹細胞(iPS細胞)様の形態変化の誘導という勇気づけられるデータが出ていることより、従来型を利用することで予定通り癌での表現型にも影響を与える化合物が得られるものと期待している。
混合型レシチン逆相ミセル-酵素・微生物複合系のバイオ生産・分解プロセスへの応用

AOTと非イオン性界面活性剤,レシチンとの混合ミセル系では酵素-AOT間相互作用が抑制されるためミセル界面が安定化され,AOT系と比較してさらに酵素の活性・安定性が増加した.したがってこの混合型逆相ミセル系は,酵素活性を高く保持しながら基質や生成物のみを選択的に透過・分離できるために,分離を伴うマイクロバイオリアクターとして有効であることが確かめられた.水溶性基質・生成物に対する酵素反応の一例としてβ-galaactosidase(β-gal)によるガラクトースの生産を行ったところ,低分子の基質・生成物は透過するが,高分子の酵素の移動抵抗は大きく増加し,酵素はバルク水相と分配した後もミセル内に安定に保持された.このとき,転化率は基質・生成物の二相間の移動速度に大きく影響されるが,この改善と連続操作は,遠心液々分配クロマトグラフィー(CPC)を用いることによって達成された.CPCのローター内には1068個の分配セルが固定され,各セル内には固定相として酵素を含む逆相ミセル溶液が遠心力により保持される.その中を移動相として基質を含む水溶液が通過する.移動相はセルの中を微細な液滴状になりながら分散しつつ通過し,各セル間で分散・合一を繰り返すため,移動相とミセル内水相間の物質移動が十分に促進され,AOT/レシチン混合ミセルおよびCPCを用いて反応を行った場合は,バッチ型反応槽を用いた場合し比較して,転化率は大きく改善された.またローターの回転速度を増加すると移動相水相がより小さな液滴に分散し,二相間の接触が改善されるため転化率はさらに増加した.AOTと非イオン性界面活性剤,レシチンとの混合ミセル系では酵素-AOT間相互作用が抑制されるためミセル界面が安定化され,AOT系と比較してさらに酵素の活性・安定性が増加した.したがってこの混合型逆相ミセル系は,酵素活性を高く保持しながら基質や生成物のみを選択的に透過・分離できるために,分離を伴うマイクロバイオリアクターとして有効であることが確かめられた.水溶性基質・生成物に対する酵素反応の一例としてβ-galaactosidase(β-gal)によるガラクトースの生産を行ったところ,低分子の基質・生成物は透過するが,高分子の酵素の移動抵抗は大きく増加し,酵素はバルク水相と分配した後もミセル内に安定に保持された.このとき,転化率は基質・生成物の二相間の移動速度に大きく影響されるが,この改善と連続操作は,遠心液々分配クロマトグラフィー(CPC)を用いることによって達成された.CPCのローター内には1068個の分配セルが固定され,各セル内には固定相として酵素を含む逆相ミセル溶液が遠心力により保持される.その中を移動相として基質を含む水溶液が通過する.移動相はセルの中を微細な液滴状になりながら分散しつつ通過し,各セル間で分散・合一を繰り返すため,移動相とミセル内水相間の物質移動が十分に促進され,AOT/レシチン混合ミセルおよびCPCを用いて反応を行った場合は,バッチ型反応槽を用いた場合し比較して,転化率は大きく改善された.またローターの回転速度を増加すると移動相水相がより小さな液滴に分散し,二相間の接触が改善されるため転化率はさらに増加した.疑似クロマト型連続向流分配装置(CPC)を用いて,向流分配抽出法により粗製レシチンを分離精製し,純度90%以上の精製レシチンを得ることに成功した.次いで,各種イオン性・非イオン性界面活性剤と精製したレシチンとより,混合型レシチン系逆相ミセルの調製を行い,その特性評価を試みた.その結果,精製したレシチンは単独では有機溶媒中でオルガノゲルを形成するが,これにアニオン性界面活性剤AOTをコサーファクタントとして添加することにより,ゲル化を抑制しバルク水相と接触可能な逆相ミセル溶液を調製することができた.添加量の増加と共にレシチン系逆相ミセルの界面流動性は高くなるが,AOT単独ミセル系と比較してミセルの合一速度は非常に遅いことがわかった.さらに親水性のβ-ガラクトシダーゼやα-キモトリプシン,および疎水性のリパーゼ等を用い,混合型レシチン系逆相ミセルへの選択的可溶化・保持特性や,酵素活性・安定性に及ぼす因子を定量的に評価した.これより,二相分配法によるレシチン系逆相ミセルへの各種タンパク質の抽出率はいずれも低いが,注入法によればいずれの酵素もミセル内に可溶化できること,またレシチン系逆相ミセルに溶解した酵素は従来のAOT系と比較して優れた安定性をもつことが明らかになった.因みに,AOT-レシチン混合逆相ミセル内にβガラクトシダーゼを注入法により可溶化すると,二相分配後もミセル相に活性を保ったまま安定に保持されており,高機能性生体触媒として,また酵素と反応生成物の分離を伴うマイクロバイオリアクターとしての利用に有効であることが示された.AOTと非イオン性界面活性剤,レシチンとの混合ミセル系では酵素-AOT間相互作用が抑制されるためミセル界面が安定化され,AOT系と比較してさらに酵素の活性・安定性が増加した.したがって,この混合型逆相ミセル系は,酵素活性を高く保持しながら基質や生成物のみを選択的に透過・分離できるために,分離を伴うマイクロバイオリアクターとして有効であることが確かめられた.

水溶性基質・生成物に対する酵素反応の一例としてβ-galactosidase (β-gal)によるガラクトースの生産を行ったところ,低分子の基質・生成物は透過するが,高分子の酵素の移動抵抗は大きく増加し,酵素はバルク水相と分配した後もミセル内に安定に保持された.このとき,転化率は基質・生成物の二相間の移動速度に大きく影響されるが,この改善と連続操作は,遠心液々分配クロマトグラフィー(CPC)を用いることによって達成された.CPCのローター内には1068個の分配セルが固定され,各セル内には固定相として酵素を含む逆相ミセル溶液が遠心力により保持される.その中を移動相として基質を含む水溶液が通過する.移動相はセルの中をを微細な液滴状になりながら分散しつつ通過し,各セル間で分散・合一を繰り返すため,移動相とミセル内水相間の物質移動が十分に促進され,AOT/レシチン混合ミセルおよびCPCを用いて反応を行った場合は,バッチ型反応槽を用いた場合と比較して,転化率は大きく改善された.またローターの回転速度を増加すると移動相水相がより小さな液滴に分散し,二相間の接触が改善されるため転化率はさらに増加した.
新規MAPKKK、LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の解析

申請者はこれまで、LRRK1がEGF刺激依存的にチロシンリン酸化されていることを見出していた。その後の解析から、LRRK1の944番目のチロシン残基(Y944)が活性化したEGFRによってリン酸化されること、またY944のリン酸化はLRRK1のキナーゼ活性を抑制することが分かった。さらに、EGFRによってリン酸化されない非リン酸化型LRRK1変異体(LRRK1-Y944F)ではキナーゼ活性が恒常的に上昇していた。このLRRK1-Y944Fを発現した細胞では、微小管上の輸送が過剰に促進された結果、EGFRの細胞内トラフィックが異常になることが分かった。以上の結果から、EGFRによるLRRK1のキナーゼ活性制御が、EGFRの適切な細胞内トラフィックに必要であることを明らかにした。また、申請者はLC-MS/MSによるLRRK1結合因子のスクリーニングで、Arf/Rho GAPドメインを持つARAP1を同定していた。ARAP1はEGFR細胞内トラフィックに関係することが報告されているGAP分子である。これまでにLRRK1のキナーゼ活性は、自身のGTPaseドメインによって制御されることが分かっている。そこで申請者はARAP1がLRRK1のGAPとして働き、そのキナーゼ活性を制御するのではないかと考え検討した。ARAP1 siRNAで内在性ARAP1をノックダウンすると、GTP結合型のLRRK1が増加していた。またARAP1をノックダウンした細胞では、LRRK1のキナーゼ活性が上昇し、EGFRの細胞内トラフィックが異常になった。さらにARAP1ノックダウンによるEGFR細胞内トラフィックの異常は、LRRK1のキナーゼ活性に依存していた。これらの結果から、ARAP1がLRRK1のキナーゼ活性制御を介して、EGFR細胞内トラフィックを制御していることが明らかとなった。申請者はこれまでにLRRK1がEGFRの細胞内トラフィックに重要な役割を持っていることを示してきたが、その詳細なメカニズムは不明であった。そこでLRRK1の作用メカニズムを解析するため、EGFRの細胞内トラフィックにLRRK1のkinase活性が重要か検討した。その結果、LRRK1 siRNA細胞で見られたEGFRの早期エンドソームへの蓄積はsiRNA耐性の野生型LRRK1を発現させることでレスキューされたが、kinase不活性型LRRK1ではレスキューされないことが明らかとなった。さらに、kinase恒常活性化型LRRK1を発現させるとEGFRの後期エンドソームへの移行が促進されることを明らかにした。この結果から、LRRK1のkinase活性はEGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を促進していることが示唆された。また、LC-MS/MSによるスクリーニングの結果、GAPの一つARAP1がLRRK1と結合することを見出した。LRRK1のkinase活性は自身のGTPaseドメインに制御されていることが報告されており、GAPであるARAP1はLRRK1のkinase活性を制御している可能性が考えられた。そこで次にARAP1がLRRK1の機能を制御しているか検討した。GTP-pulldown assayの結果、ARAP1をknockdownした細胞ではGTP結合型LRRK1の割合が増加することが分かった。さらにin vitro kinase assayの結果、ARAP1 siRNA細胞ではLRRK1のkinase活性も上昇することが明らかとなった。またARAP1 siRNA細胞ではEGFRの後期エンドソームへの移行が促進されることが分かった。以上の結果から、ARAP1はLRRK1のGTP結合状態を介してそのkinase活性を制御していることが示唆された。そこでLRRK1の作用メカニズムを解析したところ、ESCRT-0複合体構成因子STAM1と結合し、そのユビキチン化状態を制御することでEGFRの分解を調節していることが明らかとなった。この内容はNat.Commun.誌で発表した。また申請者のこれまでの研究から、LRRK1はEGF刺激依存的なチロシンリン酸化によって制御されていることが分かっていた。そこでこのLRRK1をチロシンリン酸化するキナーゼを探索したところ、受容体チロシンキナーゼであるEGFRがLRRK1をリン酸化することが明らかになった。EGFRはEGF依存的にLRRK1の944番目のヘチロシンをリン酸化することで、LRRK1のキナーゼ活性を抑制していた。944番目のチロシンをフェニルアラニンへと置換した非リン酸化型LRRK1(LRRK1-Y944F)はキナーゼ活性が恒常的に活性化しており、EGFRの細胞内輸送を過剰に促進した結果、核付近に異常なエンドソームの蓄積を引き起こした。LRRK1-Y944Fを発現した細胞では、EGFRの分解が阻害されており、EGFR下流シグナルも活性化し続けた。EGFR下流シグナルは正常な細胞の増殖や分化に必要である一方、その過剰な活性化は細胞の癌化を起こすことがよく知られている。今回得られた結果は、EGFRによるLRRK1の制御機構が細胞の恒常性維持にとって非常に重要な機構であることを示唆している。今後はY944のリン酸化がどのようなメカニズムでLRRK1のキナーゼ活性を制御しているのか検討していく予定である。

その後の解析から、LRRK1の944番目のチロシン残基(Y944)が活性化したEGFRによってリン酸化されること、またY944のリン酸化はLRRK1のキナーゼ活性を抑制することが分かった。さらに、EGFRによってリン酸化されない非リン酸化型LRRK1変異体(LRRK1-Y944F)ではキナーゼ活性が恒常的に上昇していた。このLRRK1-Y944Fを発現した細胞では、微小管上の輸送が過剰に促進された結果、EGFRの細胞内トラフィックが異常になることが分かった。以上の結果から、EGFRによるLRRK1のキナーゼ活性制御が、EGFRの適切な細胞内トラフィックに必要であることを明らかにした。また、申請者はLC-MS/MSによるLRRK1結合因子のスクリーニングで、Arf/Rho GAPドメインを持つARAP1を同定していた。ARAP1はEGFR細胞内トラフィックに関係することが報告されているGAP分子である。これまでにLRRK1のキナーゼ活性は、自身のGTPaseドメインによって制御されることが分かっている。そこで申請者はARAP1がLRRK1のGAPとして働き、そのキナーゼ活性を制御するのではないかと考え検討した。ARAP1 siRNAで内在性ARAP1をノックダウンすると、GTP結合型のLRRK1が増加していた。またARAP1をノックダウンした細胞では、LRRK1のキナーゼ活性が上昇し、EGFRの細胞内トラフィックが異常になった。さらにARAP1ノックダウンによるEGFR細胞内トラフィックの異常は、LRRK1のキナーゼ活性に依存していた。これらの結果から、ARAP1がLRRK1のキナーゼ活性制御を介して、EGFR細胞内トラフィックを制御していることが明らかとなった。