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PMCA法を用いた医療器材消毒法の網羅的評価と現実的プリオン消毒法の確立

プリオンに効果的な現実的滅菌法を確立するため、異常プリオンタンパク質(PrP^<Sc>)のin vitro増幅系として注目されるProtein Misfolding Cyclic Amplification(PMCA)法を用いてプリオン滅菌法の効果を評価する方法を検討した。まずPrP^<Sc>の定量的解析を可能にする実験系を構築した。この系を用いてプリオン滅菌法の効果について検討したところ、市販のアルカリ洗剤と熱処理(オートクレーブ処理)を組み合わせた複合的な滅菌法が非常に効果的であり、その感染価の低下はおよそ7log以上であった。本研究の目的はプリオンに効果的な現実的滅菌法を確立することである。そこで、異常プリオンタンパク質(以下PrP^<Sc>)のin vitro増幅系として注目されるProtein Misfolding Cyclic Amplification(以下PMCA)法を用いてプリオン滅菌法の効果を評価する方法を検討した。これまでPMCA法を用いたPrp^<Sc>の超高感度検出に関する報告は数多くあるが、PMCA法を定量的解析に応用した報告ほとんどない。そこで本年度は、滅菌によるプリオンの感染価低下を正確に比較するため、どの程度まで微量PrP^<Sc>を高感度検出できるのか(検出限界の有無)を明らかにし、さらにPMCA法によるPrP^<Sc>の定量的解析を可能にする実験系を構築することを目的とした。段階希釈したハムスタースクレイピー感染脳ホモジネート中のPrP^<Sc>をマルチラウンドPMCA反応によって増幅し、ラウンド毎に各希釈系列から増幅される産物(proteinase K抵抗性プリオンタンパク質(PrP^<res>))の有無を解析した。その結果、PrP^<Sc>の希釈率とPrP^<res>が検出されるまでにかかるラウンド数は比例しており、PrP^<res>が検出されるラウンド数によって、増幅前のPrP^<Sc>量を概算することが可能であることがわかった。さらにこの感染脳ホモジネートからのPrP^<res>の検出限界は10^<-11.3>希釈であり、これ以上の定量的解析は困難であることが明らかとなった。以上の検討によりPMCA法による定量的解析が可能となった。現在この実験系を用いて中水準、高水準の消毒法を中心に、種々のプリオン滅菌法の効果について検討中である。結果の例として、市販のアルカリクリーナーと熱処理を組み合わせた複合的な滅菌法が非常に効果的であり、その感染価の低下はおよそ7log以上であった。現在「複合的な滅菌方法」についてさらに検討中である。前年度は異常プリオンタンパク質(以下PrP^<Sc>)のin vitro増幅系として注目されるProtein Misfolding Cyclic Amplification(以下PMCA)法を応用し、定量的解析に用いる系を確立したが、本年度は実際にこの方法を用いてプリオン滅菌法の効果を網羅的に評価した。市販の洗浄剤及び消毒剤を単独で用いる方法、または通常のオートクレーブ処理(121°Cで15分)と組み合わせた比較的簡便な方法について、ハムスタースクレイピー263K株を用いて不活化効果を定量的に解析した。洗浄剤(市販の実験器具用アルカリ洗剤、中性洗剤、酵素入り洗剤)、消毒剤(過酢酸、グルタラール、フェノール等)を単独かつ室温状態で浸漬させた場合には、プリオンを十分に不活化することは不可能であった。しかしながら、0.1 M NaOH、あるいは市販のアルカリ洗剤に浸漬し通常のオートクレーブを行った場合6 log以上の感染性の低下が認められ、中性洗剤でも通常のオートクレーブ処理と組み合わせれば高い不活化効果(5.38 logの感染性低下)が認められることが明らかとなった。前年度にアルカリ洗剤に浸漬し70°Cで30分熱処理する方法でプリオンを不活化できることが分かったが、汚染された器具類の高温煮沸処理などは寧ろ手技的に煩雑であり、周囲を汚染する可能性についても否定できないと考えられた。プリオンの不活化に推奨される135°Cでのオートクレーブ処理には耐えられない器具類は多いものの、脳外科手術に用いられる内視鏡については通常のオートクレーブ処理やアルカリ洗剤程度のアルカリには耐性があるものが多い。従って、アルカリ洗剤(中性洗剤の使用も有効)に浸漬した状態で、通常のオートクレーブ処理を行う滅菌法が非常に効果的であることが明らかとなった。
実験的頬粘膜癌の増殖に関する腫瘍内血管・神経に関する研究

実験動物として,体重約2.0kg前後の家兎を用い,実験腫瘍として家兎に可移植性のVX_2癌を用いた.まず,家兎の大腿筋肉内よりVX_2癌組織を取り出し,EagleMEM培養液で生細胞数が5×10^5個1mlになるように調整した.そのうち,0.1mlを左頬粘膜下に注入し,移植後、5,10,15,20日で家兎を薬殺した.腫瘍内血管の検索として,VB-HE染色を、腫瘍内神経の検索にはUngewitterの尿素硝酸銀法のPowers改変法に上野が改良を加えた神経染色(1961)を施した.本年はこのうち,5,10日例について検討した.〈結果〉移植したVX_2癌は,家兎の頬粘膜下に着床し,経日的に増殖していた.5日例:腫瘍細胞は静脈壁の一部を破壊し,静脈内へと浸潤していた.動脈の弾性線維の連続性は保たれており,腫瘍細胞による影響は認められなかった.神経線維は,一部に軽度の変性を認めたが,ほとんどが健常であった.10日例:腫瘍内動脈の外壁に変性を認めるものが認められはじめ,内皮細胞の剥離が観察された.神経線維は,軽度な変性を示すものも多く,さらには強度な変性も認められはじめた.また,リンパ節転移も認められるようになってきた.今後,15,20日例の検討を重ねる予定である.実験動物として,体重約2.0kg前後の家兎を用い,実験腫瘍として家兎に可移植性のVX_2癌を用いた.まず,家兎の大腿筋肉内よりVX_2癌組織を取り出し,EagleMEM培養液で生細胞数が5×10^5個1mlになるように調整した.そのうち,0.1mlを左頬粘膜下に注入し,移植後、5,10,15,20日で家兎を薬殺した.腫瘍内血管の検索として,VB-HE染色を、腫瘍内神経の検索にはUngewitterの尿素硝酸銀法のPowers改変法に上野が改良を加えた神経染色(1961)を施した.本年はこのうち,5,10日例について検討した.〈結果〉移植したVX_2癌は,家兎の頬粘膜下に着床し,経日的に増殖していた.5日例:腫瘍細胞は静脈壁の一部を破壊し,静脈内へと浸潤していた.動脈の弾性線維の連続性は保たれており,腫瘍細胞による影響は認められなかった.神経線維は,一部に軽度の変性を認めたが,ほとんどが健常であった.10日例:腫瘍内動脈の外壁に変性を認めるものが認められはじめ,内皮細胞の剥離が観察された.神経線維は,軽度な変性を示すものも多く,さらには強度な変性も認められはじめた.また,リンパ節転移も認められるようになってきた.今後,15,20日例の検討を重ねる予定である.
神経細胞の病理学的変化による心臓突然死の病態の評価-免疫組織学的検討-

心臓突然死を中心とした内因性急死の症例の脳において、発症から死亡までが短時間である群については、ヘマトキシリン-エオジン(HE)感染及びルクソ-ルファーストブルー(LFB)染色では神経細胞に虚血性変化等の明らかな形態学的変化を認めなかった。しかし、免疫組織化学的染色により、失神等の意識障害や心停止の既往歴がある虚血性心疾患、心筋症及び先天性心疾患であるファロ-の四徴症の海馬のCA2-4領域では、神経細胞の細胞質内に顆粒状のMAP-2陽性像が認められ、さらに同領域では熱ショック蛋白質(HSP70)及び癌遺伝子産生卵白(c-FOS)陽性像が認められたが、虚血及び低酸素に対して最も脆弱である海馬のCA1領域では、いずれの免疫活性も陰性であった。アストロサイトの変化について観察したところ、海馬の歯状回では、GFAP陽性の細胞質及び突起が肥大したアストロサイトが増生しているのが認められた。しかし、これらのアストロサイトについてビメンチン、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子(a-FGF、b-FGF)に対する抗体を用いて観察したところ、明らかな陽性像は認められなかった。これらの変化は、心疾患による虚血及び低酸素発作による病体を反映している可能性を与え、同様な病体を引き起こす気管支喘息の症例について検討したところ同様の結果が得られた。以上のことから、虚血及び低酸素性脳障害を引き起こす心疾患の剖検例における脳において、神経細胞の細胞骨格蛋白、アストロサイトの形態及び増生、熱ショック蛋白質、癌遺伝子産生蛋白について特徴的な神経病理学的変化を認めた。従って、免疫組織化学的手法は、心臓突然死の法医病理学的診断に寄与するものと思われる。
EU諸国におけるホームレスの実態とその対応策についての研究

ドイツ、イギリス、フランス、欧州連合そしてアメリカでの現地調査を実施した。各国のホームレスの実態、そして行政機関、支援NPOの活動について、各国それぞれ1015団体(および研究者)を訪問し、聞き取り調査を行った。それによって、各国のホームレス実態と政策の特徴明らかにしてきた。以下では、これらの点を整理しておきたい。第1に、EU諸国ではホームレス概念が日本と比べ広く捉えられ、支援政策も単に路上生活者に限定せず、「社会扶助施設・緊急施設・支援団体に宿泊する者」、「家族、友人宅に寄宿する失業者」、母子施設などの「若年母子世帯」なども含まれる。このことから、支援事業は、一般法の枠内で行われている。これに対し、アメリカは、おおむねEU諸国と同様のホームレス概念であるが、政策は路上生活ホームレスに対する特別法の枠内で行われている。第2に、EU諸国では、ホームレスを捉える視点また政策理念(「社会的排除」と「社会への参入」)では共通しているが、具体的政策はいくつか異なっている。ドイツでは連邦制国家であることから、各地域ごとに政策が多様である。イギリスはブレア政権のもとソシアル・エクスクルージョン・ユニットが組織され、重点的政策課題として取り扱われている。また、フランスでは反排除法の制定(1998年)にともなって、従来の支援策を継承しつつさらに強力にそれを推し進めようとしている。第3に、EU諸国・アメリカに共通していることだが、民間のNPO組織による支援活動がきわめて活発に行われていることも注目に値する。これは、多くの市民が、ホームレス問題を社会全体の重要課題であると認識していることの現れであろう。これらをいくつかの成果としてすでに発表し、さらに今後も成果発表を予定している。本年度は、ドイツ、イギリス、フランスそしてアメリカでの現地調査を実施した。来年度は、これらのデータを整理し、それらを比較研究する中で、各国のホームレス実態と政策の特徴を浮き彫りにしていきたい。以下では、今年度の研究から得た点を整理しておきたい。まず第1に、EU諸国では、ホームレスの概念が日本と比べ広く捉えられている。したがって、支援政策も単に路上生活者に限定せず、「社会扶助施設・緊急施設・支援団体に宿泊する者」、「家族、友人宅に寄宿する失業者」、母子施設などの「若年母子世帯」、施設居住の「40歳以上の単身者」、「車中生活の家族」なども含まれる。これに対し、アメリカは、おおむねEU諸国と同様のホームレス概念であるが、路上生活者が多いことから、政策は路上生活ホームレスに対する特別法の枠内で行われている。第2に、EU諸国では、ホームレスを捉える視点また政策理念(「社会的排除」と「社会への参入」)では共通しているが、その具体的政策になるといくつか異なっている。また第3に、EU諸国・アメリカに共通していることだが、民間のNPO組織による支援活動がきわめて活発に行われていることも注目に値する。

それによって、各国のホームレス実態と政策の特徴明らかにしてきた。以下では、これらの点を整理しておきたい。第1に、EU諸国ではホームレス概念が日本と比べ広く捉えられ、支援政策も単に路上生活者に限定せず、「社会扶助施設・緊急施設・支援団体に宿泊する者」、「家族、友人宅に寄宿する失業者」、母子施設などの「若年母子世帯」なども含まれる。このことから、支援事業は、一般法の枠内で行われている。これに対し、アメリカは、おおむねEU諸国と同様のホームレス概念であるが、政策は路上生活ホームレスに対する特別法の枠内で行われている。第2に、EU諸国では、ホームレスを捉える視点また政策理念(「社会的排除」と「社会への参入」)では共通しているが、具体的政策はいくつか異なっている。ドイツでは連邦制国家であることから、各地域ごとに政策が多様である。イギリスはブレア政権のもとソシアル・エクスクルージョン・ユニットが組織され、重点的政策課題として取り扱われている。また、フランスでは反排除法の制定(1998年)にともなって、従来の支援策を継承しつつさらに強力にそれを推し進めようとしている。第3に、EU諸国・アメリカに共通していることだが、民間のNPO組織による支援活動がきわめて活発に行われていることも注目に値する。これは、多くの市民が、ホームレス問題を社会全体の重要課題であると認識していることの現れであろう。これらをいくつかの成果としてすでに発表し、さらに今後も成果発表を予定している。
内胚葉幹細胞から作成したクローンブタを用いた遺伝性疾患の再生医療の評価システム

本研究では唾液腺から分離培養した内胚葉幹細胞をまず確立し、この細胞から作成したクローンブタを作成した。このクローンブタを用いて遺伝性疾患の細胞移植治療のモデルを作成した。さらに移植に適した肝臓細胞、膵臓内分泌細胞の作成をおこなった。培養液に添加するアミノ酸が幹細胞保存、増殖、分化において重要な役割を果たすことを見出した。(1)唾液由来内胚葉幹細胞作成本研究ではまずブタにおいて内胚葉系幹細胞を採取する方法を確立した。結紮前のブタ(生後4週、7kg、LWD種)の唾液腺組織は、PAS陽性の分泌細胞とPAS陰性の導管上皮細胞群から構成されている。主導管結紮後、2週間経過するとPAS陽性分泌細胞は8割程度脱落し、PAS陰性細胞の増加及び小型の上皮細胞が出現した。このような状態の唾液腺から内胚葉幹細胞を分離した。ヒトへの採取技術を応用し、ヒト由来の細胞の採取を考えると、導管を結紮しない状態で幹細胞の採取の条件を確立する必要があった。そこで結紮しない動物での分離を次に試みた。その結果、同様に細胞質内ラミニン陽性、CD49f陽性細胞を採取することができた。これには培養直後の細胞密度の調整が必要であること、そして培養面から浮遊してくる細胞を採取し携帯培養することが必要であることを明らかにした。(2)採取した細胞の分化誘導採取した唾液腺から得た細胞を分散後、GLP1を加えた培地に懸濁しプレート上に播種した。96 well U-plateへ分注12時間後には、全てのwellにてスフェロイドボディの形成が認められた。その中にインスリン陽性細胞が存在していた。スフェロイドボディを形成する細胞の3割がインスリン陽性細胞であった。(3)ヒト唾液腺を用いた検討ヒト唾液腺からは当然非結紮唾液腺を用いた検討をおこなった。細胞の分散採取後、付着系細胞とした培養することができた。これらの細胞はこれまで報告してきたような細胞質内ラミニン陽性、CD49f陽性細胞を分離することができた。これらの細胞を用いて分化誘導の検討を進めている。これまでのところ、膵臓内分泌細胞への分化については確認していないが肝臓前駆細胞への分化については確認できている。昨年に引き続き、ブタおよびヒト唾液腺から内胚葉系幹細胞を分離・精製し、移植モデルへの移植実験を進めた。前年度に加え本年度では、少量の組織から短時間に幹細胞を分離する方法を見出し、更に移植実験を実施した。どのような細胞を利用する場合でも移植までの準備期間及び移植に必要な細胞数の確保が必要不可欠であり、その第1段階である少量のブタおよびヒト体組織からの分離が可能となり、第2段階としての大量培養にも成功した意義は大きい。特にips細胞と一部共通した生物学的特徴を有するヒト唾液腺由来幹細胞を用いた移植研究は将来のips細胞移植への応用性が高い。更に移植成績および癌化の防止に必要不可欠であると考えられている標的臓器への分化誘導についても肝臓への分化を促進する立体培養条件・液性因子の解明が進んだ点も将来の応用に重要な点である。特に、培養液中のアミノ酸が分化に及ぼす影響について3種類のアミノ酸が分化を誘導することが判明した。逆に、これらのアミノ酸を欠乏させることで未分化な状態を維持する可能性も示唆されており、これらの方法を応用することで培養が難しい幹細胞をより安定的に維持する手助けとなると考えられる。更にこれらのアミノ酸の中で癌の進展を抑制する可能性のある因子が見出された。これらのアミノ酸解析については、全て当研究室が所有する高速微量アミノ酸分析機(HPLC/MS)を用いて行うことで可能となった。この機器を用いて、難病疾患モデルのアミノ酸分析を行い、疾患に特徴的にプロファイルが変化することが見出されている。これらの予備実験から実際に難病治療目的で肝臓移植が行われた症例における移植前後の血中アミン酸プロファイルを行ったところ、数種類のアミン酸の補充が術後管理に重要であることが分かった。アミノ酸プロファイルは現実的に臨床応用可能な技術であり、小児難病治療において大きな役割を担う可能性が示唆された0治療法がないとされてきた小児希少難病においても酵素補充療法、細胞移植治療あるいは遺伝子治療が出現し、大きく変化してきた。しかし、現在までに臨床応用という概念からは肝臓移植に替わるような完全に満足のいくものは未だ無く、さらなる病態生理に基づいた治療方法の開発が望まれている。このような観点から、我々は、先天性代謝異常症の治療においては従来の臓器細胞移植治療に代わる新規治療法の確立を目指して、本研究をおこなった。特に明治大学の長嶋らが開発したクローン豚作成技術においては、我々が開発した豚内胚葉最幹細胞が使用され、成果を上げてきている。そこで24年度の研究では、昨年に引き続いて、分離・精製した内胚葉幹細胞の培養条件における増殖、分化の検討を進めた。特に昨年度までの研究において、培養液中のアミノ酸組成に関連した、増殖と分化の方向性に与える影響についてさらに検討を進めた。

評価システムの開発においては、幹細胞マーカーの発現の検討を培養液中のアミノ酸組成を変化させることによる変化の観察を行った。同時に、このような条件下での幹細胞におけるアミノ酸代謝酵素の変化を観察した。その結果、内胚葉系幹細胞はある種のアミノ酸の欠乏状態において、アポトーシスに陥ることが判明した。同時に分化を達成した細胞はアポトーシス耐性になることも見出した。松本はこの重要な所見の応用をさらに進め、iPS細胞に由来する肝臓細胞の分化誘導の評価系にこの所見を応用する目的で、iPS細胞の作製も同時に進めている。これら研究は先天代謝異常症に対する内胚葉系幹細胞を用いた移植技術の確立ならびに評価系を確立に多いに寄与している。さらに、今後は熊本大学発生研究所と共同で様々な難病疾患の患者細胞からiPS細胞を樹立し、特異標的細胞を用いた細胞移植研究を大きく前進させると考える。この研究において今回の評価系は大いに重要であると考える。平成23年度で目的として挙げた(1)幹細胞の分離・選択、(2)幹細胞の選択、(3)ヒト幹細胞の肝臓への分化と遺伝子発現の検討、(4)大量培養系の確立についてはほぼ達成できた。更に幹細胞維持および分化に重要なアミノ酸を見出すととができ、やや伸展したともいえるが、遺伝子変化の調査が不完全であり次年度に繰り越した。これは、ヒト幹細胞が移植に用いるために大量に使用しなければならなかったことが大きい。24年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子変化に基づく治療戦略の見直しについては、ヒトのサンプルが非常に貴重であることからサンプルが多くえられるブタを用いて行う。遺伝子変化の評価にはreal time PCR(当科所有のABIおよびエッペンドルフ社)機器を用いて半定量的に評価を行うことで推進する。更に、評価方法として免疫蛍光染色法を追加することでより詳細な評価を行う。液性因子、特に本年度重要性が示されたアミノ酸については、高速微量アミノ酸分析機を用いて、引き続き幹細胞の未分化維持、分化誘導、移植効果の増強効果等について検討をつづける。
乏突起神経膠腫における化学療法感受性の分子メカニズムの解明

本研究では、多数の臨床検体を収集して腫瘍バンクを作成し、それらの腫瘍検体に対し、染色体の欠損(1p,19q,10q,CDKN2N)や遺伝子の変異(TP53)、増幅多数の症例についてのこれらの遺伝子マーカー(EGFR,CDK4)などを調べた。その結果、1p欠損を伴う腫瘍の多くは乏突起神経膠腫であり、また、乏突起神経膠腫の約60%に1pの欠損が認められることを再確認した。また、1pの欠損は多くは19qの欠損を同時に伴っていた。染色体1pの欠損のない突起神経膠腫にはp53の遺伝子変異が多く認められた。次に、乏突起神経膠腫の化学療法感受性関連遺伝子、および染色体1p上にあると想定される癌抑制遺伝子同定を目的とし、マイクロアレイ(DNA chip)による遺伝子発現プロファイル解析を行った。その結果、乏突起神経膠腫のうち化学療法感受性が高く、染色体1pの片側アレルの欠損を伴うタイプで、有意に発現が変化している209遺伝子を初めて同定することができた。また、染色体1p上の癌抑制遺伝子と思われる123遺伝子の発現が減少していることも確認した。さらに、星細胞腫や神経膠芽腫に対してGene chipによる遺伝子発現プロファイル解析を行い、乏突起神経膠腫との比較解析を施行した。その結果、乏突起神経膠腫の化学療法感受性が高いタイプで特徴的に増幅されている遺伝子は、ニューロンに発現の高い遺伝子群であることが判明した。また、星細胞腫や悪性神経膠芽腫に特徴的に発現されている遺伝子もいくつか同定された。解析した星細胞種(WHO Grade II)のうち2例は、悪性度の高い神経膠芽腫(WHO Grade IV)と発現プロファイルが似通っていたが、これらの症例の予後は実際に不良であり、臨床的にも神経膠芽腫に近い経過を示した。このように遺伝子発現プロファイルは個々の症例の予後を推定するツールとなりうる。また、遺伝子発現プロファイルと治療効果との関係が広く解明されれば、疾患毎ではなく患者毎により効果の高い治療法を提示することが可能となるであろう。乏突起神経膠腫は化学療法感受性の高い神経膠腫であることが知られるようになり、その適切な診断と治療は、臨床上極めて重要な課題となっている。また、その特異ともいえる化学療法感受性のメカニズムの解明はその他の神経膠腫における治療成績の改善にも結びつく可能性がある。我々は、これまでに約200例の神経膠腫をインフォームドコンセントをいただいた上で採取し、その病理診断を確定し、さらに遺伝子解析を行なって、乏突起神経膠腫の診断における遺伝子解析の役割を検討するとともに、乏突起神経膠腫において化学療法感受性の遺伝子マーカーである染色体1番短腕(1p)の欠失の有無によって遺伝子発現に差があるのかどうか、あるとすればどのような遺伝子群が異なっているのか、化学療法感受性に関連する可能性のある遺伝子が推定できるかということを目標に研究を進めている。これまでの検討で以下のことが結果として得られている。1)神経膠腫において、1pLOH, 19qLOHを有しかつ10qLOHの見られないものは、組織学的にはほぼ確実に乏突起神経膠腫と診断される。この組織診断は高度な経験を有しない病理医においてはなかなか一定せず、遺伝子解析による診断は有用である。

2)組織学的には乏突起神経膠腫と診断される腫瘍の中でも、1pLOHを有するものとTP53の変異を有するものとは重なりがなく、遺伝子異常の点からは異なるサブタイプに属する。組織学的にもわずかながらその特徴に違いが見られる。3)GeneChipを用いた遺伝子発現解析では、乏突起神経膠腫の遺伝子発現は1pLOHの有無によって、有意に異なり、発現のさが見られる遺伝子の中には興味深い遺伝子が多数存在する。今後は、化学療法感受性に関すると考えられる遺伝子を予想し、特定していく作業を進めていく予定である。突起神経膠腫の一部は化学療法感受性が高く、これが染色体1pの欠損(多くの場合、片側アレルの欠損のみ)と強く相関している。我々はまず、多数の臨床検体を収集し腫瘍バンクを作成し、それらに対して染色体の欠損(1p,19q,10q,CDKN2N)や遺伝子の変異(TP53)、増幅(EGFR,CDK4)などを調べた。その結果、1p欠損を伴う腫瘍の多くは突起神経膠腫であり、突起神経膠腫の約60%に1pの欠損が認められた。また、1pの欠損は多くの場合19qの欠損を同時に伴っていた。一方、染色体1pの欠損のない突起神経膠腫にはp53の遺伝子変異が多く認められた。次に、突起神経膠腫の化学療法感受性関連遺伝子および染色体1p上にあると想定される癌抑制遺伝子の同定を目的とし、マイクロアレイ(DNA chip)による遺伝子発現プロファイル解析を施行した。Affymetrix社が開発したオリゴヌクレオチドアレイであるGeneChipシステムを用い、突起神経膠腫のうち、1pの欠損を認める6例と認めない5例、および正常脳組織の遺伝子発現を比較解析した。その結果、発現が変化している209遺伝子を同定した。染色体1pの欠損がある群で上昇を認めた86遺伝子には、正常脳組織で発現している遺伝子が多数含まれていた。また、染色体1pの欠損がある群で発現の低下している123遺伝子のうち50%は1p上の遺伝子、10%は19q上の遺伝子で、その発現量の低下の平均は片側アレルの欠損を反映して約50%であった。これは、当システムによる遺伝子同定の信頼性の高さを示している。これらの遺伝子については、さらに多数の突起神経膠腫検体に対し、定量的PCRにて発現の変化を確認した。今回抽出した遺伝子が、協調しつつ腫瘍の化学療法感受性に影響を与えていると予想して現在検討を続けている。我々は多数の臨床検体を収集し腫瘍バンクを作成し、それらの腫瘍検体に対し、染色体の欠損(1p,19q,10q, CDKN2N)や遺伝子の変異(TP53)、増幅(EGFR, CDK4)などを調べた。その結果、1p欠損を伴う腫瘍の多くは乏突起神経膠腫であり、また、乏突起神経膠腫の約60%に1pの欠損が認められたと報告した。また、1pの欠損は多くは19qの欠損を同時に伴っていた。染色体1pの欠損のない突起神経膠腫にはp53の遺伝子変異が多く認められた。次に、乏突起神経膠腫の化学療法感受性関連遺伝子、および染色体1p上にあると想定される癌抑制遺伝子同定を目的とし、マイクロアレイ(DNA chip)による遺伝子発現プロファイル解析を行った。これにより、乏突起神経膠腫のうち化学療法感受性が高い、染色体1pの片側アレルの欠損を伴うタイプで有意に発現の変化している、209遺伝子を同定することができた。
う蝕原性口腔連鎖球菌グルカン合成酵素の立体構造解析に基づく新規阻害剤創製

口腔連鎖球菌Streptococcus sobrinusの不溶性グルカン合成酵素(GTF-I)は,ショ糖を分解し,水不溶性のグルカンを合成する酵素である。本菌のう蝕誘発性の原因とされるこの酵素の構造機能解析を行うために,本研究ではその立体構造解析に向けて,グルカン合成酵素の大量発現系の構築,精製法の確立,および結晶化条件の検討を行った。本酵素は,N末側の触媒ドメイン(GS)とC末側のデキストラン結合ドメイン(DXB)から構成されている。結晶化を試みるに先立ち,まず完全長GTF-I, N末端部分欠損体(83残基の欠損)GS-6R,および触媒ドメインのみからなるGSのそれぞれのタンパク質の大腸菌での発現系を構築した。菌体破砕液から,硫安分画,イオン交換クロマトグラフィー,吸着クロマトグラフィー,ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせることにより,それぞれのタンパク質を高収率で精製する方法を確立した。結晶化条件のスクリーニングは,ハンギングドロツプ法で行った。まず,pH,塩濃度,および沈澱剤の有無などの条件を検討した結果,完全長GTFではpH6-8,塩濃度0-0.2Mの範囲で微結晶を多く得られた。GS-6Rでは,いかなる条件でも微結晶はほとんど得られなかった。GSでは最も多くの微結晶が得られ,その条件は完全長GTFの場合と類似した。いずれの場合も沈澱剤の効果は見られなかった。さらに,DXBドメインのflexibilityを抑制する条件として,低温下あるいはデキストラン結合下でのスクリーニングを行ったが,結晶生成への改善効果は認められなかった。現在得られている微結晶は,X線結晶解析に供するには十分ではないが,本研究の結果をもとに,結晶化条件の最適化を目指す。口腔連鎖球菌グルカン合成酵素の立体構造解析に先立ち,本年度はまずその発現系を再検討した。申請者らは,すでにStreptococcu sobrinus 6715株の不溶性グルカン合成酵素(GTF-I)のN末端部およびC末端部を一部欠損するタンパク質(GTF-I^1)をコードするDNA断片をクローニングし,大腸菌での発現系を構築していた。しかし,C末端部はデキストラン結合に関与する部分であり,その部分の欠損は酵素活性に何らかの影響を及ぼすものと推察される。そこでまず,C末端欠損のないタンパク質(GS-6R)の発現系を遺伝子操作により構築した。このGS-6Rの発現系では,大腸菌でIPTG誘導による大量発現が可能である。精製は,菌体の超音波破砕,硫安分画,イオン交換クロマトグラフィー,ゲル濾過により行い,SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で単一バンドを示すGS-6R標品を20-25mg精製することができた。GS-6Rについて酵素反応キネティックを検討したところ,GTF-I^1と比べてグルコシル転移活性およびデキストランに対する親和性がともにより高い結果を示した。光散乱法で検討したところ,GS-6Rの方がGTF-I^1に比べてグルカン合成活性も高かった。GS-6Rの予備的な結晶化実験では,微少ながらも結晶の成長を観察した。現在,GS-6RのX線結晶解析のために,より質のよい結晶の作製を目指して,引き続き結晶化の条件を検討しているところである。昨年度,口腔連鎖球菌Streptococcus sobrinus6715株の不溶性グルカン合成酵素(GTF-I)遺伝子について,N末端部は一部欠損するがC末端欠損のないタンパク質(GS-6R)の大腸菌での発現系を遺伝子操作により構築した。

精製したGS-6Rの予備的な結晶化実験では,微小ながらも結晶の成長を観察した。しかし,その後の検討において,このGS-6Rの結晶はX線結晶解析に供するには質的に問題があることが判明した。その理由として,GS-6Rでは,GTF-IのN末側が一部欠損しているためではないかと考えられたため,N末端部の欠損もない完全長GTF-Iの精製に取り組んだ。すなわち,完全長GTF-Iを発現した菌体をリゾチームにて溶菌後,硫安分画,イオン交換クロマトグラフィー,吸着クロマトグラフィー,ゲル濾過クロマトグラフィー等によりGTF-Iを精製した。GTF-IはN末端部にシグナルペプチドを有するため,大腸菌ではペリプラズムに蓄積する。そのことが菌にとって有害であるためか,GTF-Iは,GS-6Rの場合と比べて産生量が少なかった。しかし,かなり純度の高い標品として予備的結晶化実験に用いるだけの量(6mg)を精製することができた。現在,さらに収量を上げるための発現系の検討を行うとともに,精製GTF-Iを用いて結晶化の条件を検討している。一方,口腔連鎖球菌Streptococcus cricetusの水溶性グルカン合成酵素の発現系の構築にも取り組んだ。この酵素は,すでに研究代表者らが遺伝子をクローニングし塩基配列決定を行ったものである。グルカン合成酵素遺伝子をPCR増幅し,プラスミドに組み込み,大腸菌を形質転換した。IPTGで酵素の発現誘導を行い,SDS-ポリアクリルアミド電気泳動したところ,予想される分子量の位置にバンドを検出した。当初,口腔連鎖球菌Streptococcus sobrinus6715株不溶性グルカン合成酵素(GTF-I)のN末端領域を一部欠損したGS-6Rの結晶化を検討していたが,結晶解析に供しうる良質な結晶を得ることが困難であった。このことから,N末端部を完全な形で保有することが良質の結晶化に重要ではないかと推測した。本年度は完全長GTF-Iの精製を行い,純度の高い標品が得られたが,なお収量的に結晶解析に充分な量を得るまでには至っていないため,次年度は引き続きGTF-Iの結晶化を行う。また,C末側のデキストラン結合ドメインを欠損し,触媒ドメインのみを有するGSについても結晶化を進める。一方,GTF-Iタンパク質をネガティブ染色し,電子顕微鏡写真を画像処理することにより,その構造的特徴を調べた。デキストラン存在下において,デキストランに結合していると考えられる分子の存在領域を解析した。GTFの触媒ドメインと考えられる投影像は,ほぼ中央に低密度の部分を有す,円形に近い形であることが明らかとなった。円の周辺部には局所的に高密度な領域が見られた。アミノ酸配列からの2次構造予測によって,触媒ドメインはα-amylaseなどのもつTIMバレルを部分構造としてもつことが推測されているが,以上の結果はその存在位置を示唆した。また,昨年度,口腔連鎖球菌Streptococcus cricetus HS-6の2種類の水溶性グルカン合成酵素の発現系の構築を行ったが,それらの酵素による産物を調べたところ,ホモロジー解析の結果から予測されたように,一つは水溶性,もう一つは難溶性のグルカンを合成した。ザイモグラムにより,電気泳動に際しSDS存在下98°Cで熱処理した標品でも,グルカン活性を保持していることを確認した。
企業の製品差別化戦略と製品の品質に対する消費者意識の関係

今年度は消費者が商品性質に関する不完全な事前知識を持つ場合に,消費者が商品情報を求めて行うサーチと,企業の商品価格戦略と商品情報を伝達する宣伝の戦略を分析するための理論モデルを構築した.商品情報の伝達には,(1)消費者が費用を負担し情報を入手する,(2)商品の売り手が費用を負担し消費者に情報を与える,(3)消費者と商品の売り手がともに費用を負担し消費者が商品情報を入手する,の3つが考えられる.まず(1)は消費者が書籍購入や専門家に意見を求める場合に相当し,(2)は商品の売り手が行うテレビなどでの宣伝に相当するものである.(3)は売り手の宣伝が載せてある雑誌を消費者が購入する場合などを表している.この場合は,宣伝がない場合に比べ,雑誌の値段,つまりサーチ費用は低下している.言い換えれば,商品の売り手は消費者のサーチ費用を低下させるよう補助しているとも考えることができる.本研究では,消費者の事前の情報量が増大した場合の企業の価格と宣伝戦略と,消費者や社会の厚生の変化を分析した.本研究で明らかにした結論は以下の通りである.まず,サーチコストの増大は必ずしも消費者の厚生を低下させないことが明らかとなった.これは,サーチコストが増大すると,企業が消費者にサーチさせるために価格を下げる場合があるからである.そして,消費者が多くの事前情報を持つ場合には,正のサーチコストが存在する場合に社会厚生が最大となることが明らかとなった.しかしながら,消費者の事前情報量の増大は,必ずしも消費者の厚生を増大させないことが分かった.なぜなら,消費者の事前情報量が増大すると,消費者の財への支払い意志額が増大するため,企業は消費者にサーチさせるために価格を下げる必要がないからである.さらに,消費者が多くの事前情報を持つ場合にだけ,企業が宣伝を行うことが明らかとなった.そして,宣伝が行われると,消費者と社会の厚生は低下することが明らかとなった.今年度は基礎的な理論モデルを構築することに専念した.まず,代表的な製品差別化のモデルであるHotellingモデルとDixit-Stiglitzモデルを統合するモデルを作成し,商品の多様性に関する選好を持つ消費者に対する小売業者の製品差別化戦略を,ショッピングセンター間の競争という枠組みで分析した.この研究では,消費者の選好が強い場合には,小売業者が都心において集解し立地するメカニズムを明らかにしたとともに,伝統的な商品の価格もしくは数量に関する競争とは異なる商品の多様性に関する競争という新しい概念を提案することができた.現在この研究の成果を雑誌に投稿中である.次に,消費者の商品の品質を認識する能力に関する基礎的な理論研究を行った.従来の研究では,消費者は商品の品質そのものを知らないとの情報の非対称性が想定されており,消費者はその品質を直接サーチするとの行動が想定されてきた.しかし消費者が自らが望む情報を直接に入手することが可能であるのかは必ずしも明らかでない.現実的には,限られた情報の中から消費者は品質を推測すると考えるのが妥当的であると考える.例えば,消去法のように,消費者は自分の好みでない商品を消去していくことで,結果として自分の好みである商品に近づくことができる.この考え方は,従来の消費者行動モデルではほとんど考慮されていなかった観点である.企業のブランド戦略においては,良いイメージをブランドに与える戦略とともに,イメージを悪くしないことも重要な戦略である.なぜなら,消費者のブランド観は多様であり,商品に詳しくない消費者は,悪いイメージがないという理由で商品を選択する場合があるからである.この研究で,多様な商品の品質を認識する能力を持つ消費者を同時に分析することが可能となる.現在,基礎的な理論モデルを構築中であり,来年度にそれを完成させ,さらに実証研究につなげることを計画している.今年度は消費者が商品の性質に関する事前知識を持たない場合に,商品情報がどのように消費者に伝達されるのかを明らかにするための理論モデルを構築した.商品情報の伝達には,(1)消費者が費用を負担し情報を入手する,(2)商品の売り手が費用を負担し消費者に情報を与える,(3)消費者と商品の売り手がともに費用を負担し消費者が商品情報を入手する,の3つが考えられる.まず(1)は消費者が書籍を購入したり専門家に意見を求める場合に相当し,これはStigler(1962)にはじまるサーチ理論と同一のものであり,既に理論体系が確立している.(2)は商品の売り手が行う宣伝に相当するものであり,既に様々な理論が提案されている.Anderson and Renault(2006)は(1)と(2)の両方を同時に分析するモデルを提案し,部分的な商品情報が開示される均衡が存在することを明らかにした.(3)は売り手の宣伝が載せてある雑誌を消費者が購入する場合を表している.この場合は宣伝がない場合に比べ,雑誌の値段,つまりサーチ費用は低下している.言い換えれば,商品の売り手は消費者のサーチ費用に補助を与えているとも考えることができる.本研究の目的はこれまでになかったこの考え方をモデル化することにある.既存の研究においては、商品情報の伝達は(1),(2)の両方の場合において社会的に過剰であるとの結論が多く出されている.しかしながら,(3)においては,全てのプレイヤーが費用を負担するのであるから,商品情報の伝達は社会的に最適である可能性があり,本研究ではこのことを分析する.

さらに,(1)と(2)の考え方を考慮しモデルを構築すれば,どのような経済状況のときに,どのような商品情報の伝達が行われるのか,そしてそれが社会にどのような影響を与えるのかを理解できることになる.現在は基本的な理論モデルが完成しており,来年度はそれを精緻化し,雑誌に投稿する予定である.今年度は消費者が商品性質に関する不完全な事前知識を持つ場合に,消費者が商品情報を求めて行うサーチと,企業の商品価格戦略と商品情報を伝達する宣伝の戦略を分析するための理論モデルを構築した.商品情報の伝達には,(1)消費者が費用を負担し情報を入手する,(2)商品の売り手が費用を負担し消費者に情報を与える,(3)消費者と商品の売り手がともに費用を負担し消費者が商品情報を入手する,の3つが考えられる.まず(1)は消費者が書籍購入や専門家に意見を求める場合に相当し,(2)は商品の売り手が行うテレビなどでの宣伝に相当するものである.(3)は売り手の宣伝が載せてある雑誌を消費者が購入する場合などを表している.この場合は,宣伝がない場合に比べ,雑誌の値段,つまりサーチ費用は低下している.言い換えれば,商品の売り手は消費者のサーチ費用を低下させるよう補助しているとも考えることができる.本研究では,消費者の事前の情報量が増大した場合の企業の価格と宣伝戦略と,消費者や社会の厚生の変化を分析した.本研究で明らかにした結論は以下の通りである.まず,サーチコストの増大は必ずしも消費者の厚生を低下させないことが明らかとなった.これは,サーチコストが増大すると,企業が消費者にサーチさせるために価格を下げる場合があるからである.そして,消費者が多くの事前情報を持つ場合には,正のサーチコストが存在する場合に社会厚生が最大となることが明らかとなった.しかしながら,消費者の事前情報量の増大は,必ずしも消費者の厚生を増大させないことが分かった.なぜなら,消費者の事前情報量が増大すると,消費者の財への支払い意志額が増大するため,企業は消費者にサーチさせるために価格を下げる必要がないからである.さらに,消費者が多くの事前情報を持つ場合にだけ,企業が宣伝を行うことが明らかとなった.そして,宣伝が行われると,消費者と社会の厚生は低下することが明らかとなった.
放射線の被ばく時年齢に依存してがんになりやすい突然変異細胞が異なるか？

本研究では、放射線の被ばく時年齢に依存した胸腺リンパ腫の形成過程を明らかにするため、異なる年齢で放射線に被ばくしたマウスの胸腺細胞における遺伝子異常を被ばく後から発がんの時期まで経時的に解析した。その結果、新生児期放射線被ばく後では、成体期被ばく後とは異なり、発がん過程の比較的早期から遺伝子異常を持つ細胞が増加した。また、発がん過程で観察される遺伝子異常の種類にも被ばく時年齢に依存した違いがある傾向がみられた。本研究により、放射線の被ばく時年齢に依存してがんの成り立ちが異なる可能性が示唆された。将来的には、被ばく時年齢に依存した発がんリスクやそのメカニズムの推定に役立つことが期待される。小児と大人の放射線被ばくによる発がんメカニズムは異なる。これまでに我々は、放射線誘発マウス胸腺リンパ腫の原因遺伝子が被ばく時年齢に依存して異なることを報告した(Sunaoshi et al., 2015)。しかし、原因遺伝子が放射線の被ばく時年齢依存的に変化することが、放射線被ばく直後の細胞動態によるものなのか、あるいは時間が経過してからの何らかの応答によるものなのかは明らかではなく、被ばく時年齢依存的な発がんメカニズムを紐解くには発がん途中の解析が必要である。本研究では、突然変異細胞の移植実験、並びに放射線被ばく後の経時的な突然変異解析により、放射線誘発マウス胸腺リンパ腫の発症過程において、がんになりやすい突然変異細胞が被ばく時年齢に依存して異なるか否かを明らかにする。突然変異細胞の移植実験(解析1)では、移植に用いる細胞を選定するために、これまでの研究で樹立された胸腺リンパ腫由来細胞株の培養を試みた。しかし、今回用いた細胞株の培養至適条件を設定することができず、移植実験まで至らなかった。そのため、今後新たに胸腺リンパ腫を発生させる実験を設定し、発生した胸腺リンパ腫由来の細胞を異なる年齢で放射線照射を行ったマウス胸腺に移植することで、その発がん率を調べる。放射線被ばく後の経時的な突然変異解析実験(解析2)では、当初の計画通り、マウスへの放射線照射による発がん処理、及び胸腺細胞の採取を完了した。今後は採取した胸腺細胞からDNAを抽出し、胸腺リンパ腫発症に関わる遺伝子異常の解析を行う。本実験により、小児期と成体期の放射線発がんメカニズムの違いが、被ばく後の初期応答により生じるのか(解析1)、あるいは放射線被ばく後から発がんまでの長期に渡る突然変異蓄積過程にあるのか(解析2)が明らかになれば、将来的に、被ばく時年齢を考慮した発がんリスク推定や早期治療法の確立への応用が期待される。平成28年5月より、放射線医学総合研究所(放医研)から長崎大学に所属機関を変更したことに伴い、実験の進捗にやや遅れが生じている。解析1の突然変異細胞の移植実験では、当初、トランスジェニックマウス由来のPtenあるいはIkaros遺伝子欠損細胞を移植細胞として用いる予定であった。しかし、この場合、移植に用いる細胞が異なるマウス系統由来であること、生じる遺伝子異常が放射線誘発のものではないこと、移植後胸腺リンパ腫が発症するかどうかの検討に時間を要することなどの理由から、よりこれまでの実験系に近い条件、かつ高感度に放射線の影響を観察できる実験計画に変更することとした。放射線照射後の胸腺に胸腺リンパ腫由来の細胞を移植すると高頻度かつ早期に胸腺リンパ腫が発生する。そのため、当初の予定を変更し、放射線医学総合研究所に保存されている胸腺リンパ腫細胞を培養し、移植実験に用いることを試みた。しかし、平成28年度中に培養の至適条件を見出すことができなかったため、更なる代替案を考案し、平成29年度に実施することとした。解析2の放射線被ばく後の経時的な突然変異解析実験では、当初の計画通り、1週齢(新生児期)あるいは8週齢(成体期)のB6C3F1♀マウスに放射線照射(1.2 GyのX線を1週間間隔で4回照射)を行い、照射後624週間までの胸腺細胞の採取を完了した。1週齢から照射を行った群では、照射後造血不良により死亡する個体が予想よりも多く観察された。そのため、実験群の規模を縮小することとなった。小児と大人の放射線被ばくによる発がんメカニズムは異なると考えられている。我々は、これまでの研究により、放射線誘発マウス胸腺リンパ腫における原因遺伝子が被ばく時年齢に依存して異なることを報告した(Sunaoshi et al., 2015)。この結果は、放射線被ばく後の胸腺リンパ腫が生じるまでの発がん過程が被ばく時年齢依存的に異なることを示唆する。本研究では、放射線による発がん処理後の胸腺細胞の移植実験、並びに発がん途中における経時的な遺伝子変異の解析により、がんになりやすい突然変異細胞が被ばく時年齢に依存して異なるか否かを明らかにすることを目的とした。突然変異細胞の移植実験では、前年度計画した通り胸腺リンパ腫を発生させる実験を設定し、がんの芽が存在すると考えられる時期の胸腺細胞の移植実験を行った。研究期間の進捗としては予備的な解析までに留まったが、現在は胸腺細胞を移植したマウスの経過観察を行っている。将来的には、当初の目的を達成するために、異なる突然変異を持つ細胞を放射線照射後のマウス胸腺に移植し、移植細胞の細胞競合の強さや組織内微小環境の違いによるがんのなりやすさの違いを比較する予定である。放射線被ばく後の経時的な突然変異解析実験では、発がん処理後のマウス胸腺細胞について胸腺リンパ腫発症に関わる遺伝子異常の解析を行った。

その結果、新生児期放射線被ばく後のマウス胸腺細胞では、発がん過程の初期から遺伝子異常が観察される頻度が高い傾向が見られた。また、発がん過程で観察される遺伝子異常の種類にも被ばく時年齢に依存した違いがある傾向が観察された。本研究により、放射線の被ばく時年齢依存的にがんの成り立ちが異なる可能性、特に放射線照射後の初期応答にそのメカニズムが隠されている可能性が示唆された。将来的には、被ばく時年齢を考慮した発がんリスク推定や早期治療法の確立への応用が期待される。本研究では、放射線の被ばく時年齢に依存した胸腺リンパ腫の形成過程を明らかにするため、異なる年齢で放射線に被ばくしたマウスの胸腺細胞における遺伝子異常を被ばく後から発がんの時期まで経時的に解析した。その結果、新生児期放射線被ばく後では、成体期被ばく後とは異なり、発がん過程の比較的早期から遺伝子異常を持つ細胞が増加した。また、発がん過程で観察される遺伝子異常の種類にも被ばく時年齢に依存した違いがある傾向がみられた。本研究により、放射線の被ばく時年齢に依存してがんの成り立ちが異なる可能性が示唆された。将来的には、被ばく時年齢に依存した発がんリスクやそのメカニズムの推定に役立つことが期待される。解析1の今後の方策として、培養細胞を移植するのではなく、新たに胸腺リンパ腫を発生させる実験を設定し、発生した胸腺リンパ腫の遺伝子変異解析を行い、PtenあるいはIkaros遺伝子に突然変異をもつ胸腺リンパ腫細胞を取得する計画を考案した。得られた胸腺リンパ腫細胞を、当初の計画と同様に、異なる年齢で放射線照射を行ったマウス胸腺に移植し、その後の胸腺リンパ腫の発生率を調べることにより、放射線照射後直後の細胞動態が、がんになりやすい細胞を変化させるのか否かを明らかにする。解析2に関しては、採取した胸腺細胞からDNAを抽出し、次世代シークエンスによる胸腺リンパ腫発症に関わる遺伝子異常の解析を行う予定である。造血不良により死亡したマウスに関して、追加実験を行うか否かは、今年度行う実験と遺伝子異常の解析結果により決定する予定である。放射線生物学当初、次世代シークエンス解析に用いる試薬類は平成28年度に購入予定であったが、これら試薬は平成29年度に使用予定であり、使用期限切れの試薬を使用することなどを防止するために平成29年度にまとめて購入する計画に変更した。次世代シークエンス関連試薬類が特価で販売される時期を見計らい、できるだけ安値で多くの試薬類を購入する予定である。多くの試薬類を購入することで一つでも多くのサンプルの解析を試みる。
行政法執行における内部告発者保護法制の活用

昨年度は、組織における個人の行動原理に焦点をあて、それが日本社会の中でどのように評価されて、通報者自身のもつリスクにつき検討した。これをふまえて、今年度は、個人に対して、様々なリスクを生み出すこととなっている「世間」という視点から検討を行った。通報者のリスク軽減のために仮に通報報奨金制度を導入したとしても、異質な行動をとることを極端に忌み嫌う「世間」の中では、妬みとなって通報者に更なるリスクを生み出すことになりかねない。企業等による自主的行動基準の制定にさいしても、組織によって程度の差ころあれ、とりあえず「世間」さまに対するパフォーマンスとしての機能をはたすという機能も少なからず有している。ただ、だからといって、こうした基準の制定の意義が希薄であるというわけではない。組織や個人の意識を少しずつでも変革させるためには、こうした「世間」の目をいかに活用するかが重要であると同時に、今後とも「世間」なるものの孕む病理を踏まえた制度設計が必要である。公益通報者保護法の制定も、「とりあえず」は無意味ではなかったと思われるが、「公益通報」を促すという意味では問題山積である。公益通報の問題は、私人がいかにして、どの程度、国家や社会の問題に積極的に関わるかという問題であるが、個人に過大な負担を強いることを前提とした制度設計を行うべきではない。こうしたことを踏まえ、木更津市生涯学習市民講座(2006/9/30開催)において、「義民伝承と公益通報者保護」という論題で講演した。本年度は、わが国における公益通報の現状と課題について調査・研究を行った。成果としては、大きく次の二点に分けられる。第一点としては、今般、制定された公益通報者保護法の評価に関するものである。同法は、企業等による自主的なコンプライアンス態勢の整備を促すことを主眼として制定されているが、以下の諸点において検討を要す。(1)通報者が組織内部に通報するか、外部に通報するかという通報先の選択のさいに、当該組織が、どの程度コンプライアンス態勢を整備しているかといった点に全く配慮がなされず、どのような企業も一律に通報の要件が定められていること。(2)保護の内容が実効性のあるものになっていないこと。具体的には報奨金制度、一度不正に関わったのち悔い改めた通報者・企業への制裁の減免といった制度が全く未整備であることなどがあげられる。また、(3)外国法に依拠しすぎない制度設計が検討されるべきである。第二に、自治体における通報者保護制度設計に関するものである。コンプライアンス態勢の整備の一環として、先駆的な自治体においては、業務改善ヘルプラインや職務への外部からの働きかけ対策などという形で定められているようである。公益通報条例として制定しているところは少ない。またヘルプラインなども含め、利用件数が少なく、実効性のある仕組みの検討に入っている自治体もでてきている。自治体の制度設計においては、他の自治体の制度の模倣に終始せず、地域の実情に応じた実効的な制度設計が求められる。昨年度は、わが国における現状と課題を把握すべく、制定されたばかりの公益通報者保護法をめぐる問題を抽出し、その課題と現時点での対案を素描した。これをふまえ、今年度は、組織における個人の行動原理・心理に焦点をあて、(日本)社会の中で個人が組織の不正を指摘し、行動することの困難さについて考察すべく、様々な環境下での個人のリスクにつき検討した。加えて、公益通報者保護法施行に伴い、様々な論者による解説や提案が相次いでいるが、自ら勤務する職場の不正を摘発した通報者が、通報後も職場の中で勤め続けることを前提とした提案が極めて多い。通報者に予想される様々なリスクを考えると、事実上勤め続けることは困難な場合も少なくない。こうした状況をふまえた提案が求められる。また、アメリカにおける内部告発をめぐる議論においても、通報者の行う通報行為は、誰、いずれ(組織、社会等)対して、忠誠を尽くすことになり、また逆にそうでないのか評価が分かれるところではある。より、人間の行動原理に即した制度設計が必要である。
開胸生検組織を用いた特発性肺線維症の病変進展機序の解析

びまん性肺疾患に対する開胸・胸腔鏡下生検を用いて以下のような検討を行った。1, IPF急性増悪例6例の増悪時における開胸生検組織を病理組織学的に観察した結果、6例中5例には背景の慢性的変化としてのUIPがみられ、それに加えて新鮮な又は器質化期のDADが種々の程度にみられた。1例は剖検にてUIPが確認された。DADにはウイルス感染など明らかな原因を示す所見はなく、IPFの自然史としてDADがおこりうると考えられた。2, IPFのうち病理学的に非特異性間質性肺炎(NSIP)を示す症例に膠原病にともなう同様の症例を加えて計17例につき臨床的病理的に検討した。病理学的にほぼ時相の均一な間質の線維化とリンパ球、形質細胞の浸潤がびまん性または斑状にみられ、しばしばリンパ濾胞をともなった。NSIPは病理学的に通常型間質性肺炎(UIP)、急性間質性肺炎(AIP)、剥離性間質性肺炎(DIP)、閉塞性細気管支炎を伴う器質化肺炎(BOOP)のいずれとも異なるが、各々境界領域の症例も少なからずあった。今後、免疫異常の関与を重視してさらに厳密な定義付けをする必要がある。3, 2,と同じ症例でサイトカイン(TNFα,IL-1,IFNγ,IL-6)、増殖因子(PDGF,IGF-I,TGFβ,bFGF)の発現を酵素抗体法により検討した。TNFα、IL-1、IL-6、PDGFは主として好中球、肺胞マクロファージ、II型肺胞上皮、気管支細気管支上皮、気管支軟骨に発現した。IFNγ、TGFβはリンパ球、肺胞マクロファージに強く発現した。IGF-Iは主として好中球、リンパ球、肺胞マクロファージ、II型肺胞上皮、気管支細気管支上皮、気管支軟骨に発現した。bFGFはリンパ球、II型肺胞上皮、気管支細気管支上皮に発現した。総じて発現は各細胞種にbroadで特異性に欠ける傾向があった。4,上記症例におけるHE染色組織での病理学的変化と各種活性物質の発現とを対比したところ、MMP2,9、TIMPl,2は主としてUIP.DIPなどの慢性的な病変の進行に関与し、MMP3はAIP、BOOPなどの急性変化に関与していることが示唆される。NSIPは両者の中間的な発現を示し、臨床的な病態の性格を反映していた。びまん性肺疾患に対する開胸・胸腔鏡下肺生検を用いて以下のような検討を行った、又は進行中である。1,IPF急性増悪例6例の増悪時における開胸生検組織のHE及びEMG染色切片を病理組織学的に観察した結果、6例中5例には背景の慢性的変化としてのUIPがみられ、それに加えて新鮮な又は器質化期のDADが種々の程度にみられた。