hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ライフサイクルを考慮した体系的な補強設計法の確立

付着界面の疲労モデルに基づく部材挙動の数値シミュレーションは今後も継続して行うこととした.補強後の付着界面の性状に与える環境作用の影響として,FRP接着補強面のせん断付着強度は1年間の湿潤環境暴露後もほとんど劣化しないが,破壊モードは既設部コンクリートの凝集破壊から付着界面剥離破壊の特徴が鮮明にでることを確認するとともに,せん断付着応力ーすべりモデルを提示した.破壊モードの変化は引張付着性状でも同様であった.増厚補強面の引張付着強度は,増厚補強部が凍害劣化を示さない場合にはほとんど低下しなかった.既設部コンクリートが凍害劣化を受けるとその凝集破壊となるが,それ以外は付着界面破壊となった.既設部の損傷の影響として,既設部コンクリートのひび割れ間隔を考慮した増厚補強および接着補強後の剥離耐力推定法を提示し,既往の実験結果を精度よく推定できることを確認した.接着樹脂層の影響として,通常の樹脂より剛性の小さいポリウレア樹脂層を設けた場合,設けない場合より常温下でも低温化でもせん断付着耐力が3倍となることを確認し,耐力向上は温度依存型付着応力ーすべりモデルにより説明できることを示した.増厚,接着補強ともに適用できるかぶりコンクリート割裂破壊による剥離耐力推定法とともに,補強有効度の最適化を図る手法を提示した.本研究の最新の成果を取り入れ,補強後の性能の経時変化に関する記述も加えた,既往のものに変わる新たな補強設計指針を提示した.浸水試験が予想より時間を要していることもあり,接着界面の構成モデルの構築が遅れ,数値解析による補強後の部材の挙動のシミュレーションが遅れている.また,移動輪荷重疲労試験も予想以上に時間を要している.24年度が最終年度であるため、記入しない。浸水試験,移動輪荷重疲労試験は鋭意継続し,その結果の解析から接着界面の構成モデルを迅速に構築し,数値解析によるシミュレーションを年度中に実施する.この数値解析には,当初の予定の有限要素解析だけでなく,既に構築済みの接着界面剥離・付着割裂による部材の破壊耐力推定モデルを適用すれば,短時間で実施できる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
(-)鎖RNAウイルスゲノム複製における極性制御メカニズムの解明

本研究では、センダイウイルス(SeV)をモデルとして、(-)鎖RNAウイルスの複製に置いて根源的に必要なウイルスRNA合成の極性メカニズムを明らかにすることを目的とし、そのC蛋白質が、ウイルス複製過程において経時的に(+)鎖ウイルスRNA合成を負に制御し、ウイルスRNA合成を最適化していることを見出した。また、この研究過程で、ウイルス感染が自然免疫系に感知されないようにC蛋白質がウイルスRNAの状態を制御している可能性を見出した。(-)鎖RNAウイルスの複製に於いて、(+)鎖のRNA合成(ウイルスmRNA合成とアンチゲノム合成)と(-)鎖のRNA合成を適切に制御することが必要であることが古くから考えられているが、その仕組みについては単純は(-)鎖及び(+)鎖RNA合成プロモーターの強度の差に依存する可能性以外には、ほとんど明らかにされていなかった。我々は、センダイウイルス(SeV)のアクセサリー蛋白質の一つであるC蛋白質がウイルスゲノムRNA合成の極性を最適化しており、その結果として、感染性ウイルス粒子の産生効率を最適化していることを明らかにした(lrie et al., 2008)。本年度は、この成果を基に、ウイルスゲノムRNAの3'及び5'末端プロモーター領域(Le及びTr)を入れ換えた組換えウイルスの作製を試み、野生型(WT)SeVをベースにしたものについては感染性ウイルスが得られたが、C蛋白質の発現を欠損した組換えウイルスrSeV-4C(-)をベースしたものではウイルスが回収できなかった。得られたウイルスの解析から、野生型(Le-Tr)に対してプロモーター領域をLe-Le及びTr-Trに組み換えたものでは若干の感染価の低下が、また、Tr-Trウイルスではさらに感染価の低下が見られたが、いずれの場合にもウイルスの増殖に致命的な影響はなく、Le及びTrのいずれのプロモーターでも効率の差はあるもののウイルスmRNA合成及びゲノム長のウイルスRNA合成活性を持つことが示された。また、本研究から派生して、C蛋白質が少なくとも3種類の異なる様式で、ウイルス感染による自然免疫誘導を抑制している可能性や、SeVのもう一つのアクセサリー蛋白質であるV蛋白質による新しい自然免疫誘導抑制機構、C蛋白質の一種であるY蛋白質による新しいインターフェロン応答阻害機構を報告した。(-)鎖RNAウイルスのRNA合成では、(+)鎖(ウイルスmRNA及びアンチゲノムRNA)と(-)鎖(ウイルスゲノムRNA)のRNA合成を適切に制御することが必要であるが、その仕組みについては古くから単純にゲノム両末端に存在する(-)及び(+)鎖RNA合成プロモーターの強度の違いとウイルスRNAポリメラーゼのRNA合成モードの変化(転写と複製モード)によるものであると考えられてきた。我々は、パラミクソウイルス科のセンダイウイルス(SeV)において、アクセサリー蛋白質の一つであるC蛋白質がウイルスRNA合成、特にウイルスゲノムRNAの極性を制御し、(+)鎖アンチゲノムを持った非感染性ウイルスと(-)鎖ゲノムを持った感染性ウイルスの産生を最適化していることを明らかにした(Irie,2008)。本年度は、C蛋白質によるウイルスのRNA合成の制御が実際のウイルス生活環においてどのように起こっているのかを明らかにすること試みた。感染細胞での(-)及び(+)鎖ゲノム長RNAの合成を経時的に観察し、野生型ウイルスでは感染68時間後までは(+)鎖が(-)鎖に対し優位に合成されるが、これを過ぎると(-)鎖合成が逆転すること、一方でC蛋白質欠損ウイルスではこの変化が観察されず、(+)鎖が常に相対的に優位に合成され続けることを観察した。またC蛋白質欠損ウイルスでも、トランスにC蛋白質を補うことで(-)鎖合成が相対的に優位に変化した。また、SeVとは異なるラブドウイルス科に属する水庖性口内炎ウイルス(VSV)では、観察した期間にわたって(-)及び(+)鎖ゲノム長RNAの割合に変化は見られなかった。さらに様々な(-)鎖RNAウイルスの比較では、SeV型のものとVSV型のものが見られた。SeV型では、感染早期とそれ以降の(-)及び(+)鎖ゲノム長RNA合成プロモーターの活性が、ウイルス蛋白質の経時的な蓄積により変化するが、一方のVSV型では、古典的な解釈どおり、各プロモーター活性に依存して一定の割合で(-)及び(+)鎖ゲノム長RNAが合成されると考えられた。
HTLV-1感染による宿主NMDの撹乱がATL多段階発癌プロセスに及ぼす影響

これまでの研究結果より、レトロウィルスHTLV-1の感染が宿主NMDを抑制し、その現象は主にウィルスmRNA結合たんぱく質のRexの働きによることが確認された。我々はRexの過剰発現によりNMDの抑制が起き、HTLV-1ゲノムRNAの安定化されることを示し、RexによるNMDの抑制がウィルスの自己複製に有利に働くことを示した。一方で内在性NMD標的nik mRNAの安定化も観察され、本来NMDによって分解されるべき異常mRNAや内在性標的mRNAの発現量が影響を受ける可能性が示唆された。HTLV-1関連細胞株ではNMDが抑制状態にあること、ATL細胞では多くのNMD標的mRNAの発現量が上昇していることが確認され、HTLV-1感染時にRexによって引き起こされるNMD異常が、宿主細胞の不死化および癌化と関連している可能性が示された。これまで我々は、ヒトレトロウイルスHTLV-1のゲノムRNAが宿主細胞mRNA品質管理機構(NMD)の標的となり、一方HTLV-1のウイルス蛋白質RexがNMDを阻害することを示した。22年度は実験計画に従って、以下のような実験を行った。<1.RexによるNMD抑制機構の解明>(1)NMDの中心因子UPF1とRexの相互作用をGST-pulldownで検討した結果、UPF1とRexが相互作用していることが分かった。また両者はNMDの場であるp-bodyで共局在し、さらに会合していることが分かった。(3)Rexのリン酸化状態とNMD阻害機能の関係を検討した。sHeLaにRexを過剰発現させH-7(リン酸化阻害)によってRexのリン酸化を抑制すると、RexのNMD阻害機能は低下した。以上の結果からRexとUPF1がNMDの場であるp-bodyで会合し、Rexのリン酸化状態がNMD阻害効果に影響することが分かった。今後これらのこととRexによるNMD阻害機構との関係を検討する。<2.HTLV-1以外のレトロウイルスがNMD活性に及ぼす影響の検討>(1)HTLV-1RexのcounterpartであるHIV-1RevのNMD阻害機能を調べた。その結果HIV-1RevはNMDを阻害しなかったが、HIV-1TatによってNMD阻害が引き起こされた。よってHTLV-1、HIV-1ともNMDを阻害する機能を持つ蛋白質を持つが、HIV-1ではウィルス転写制御因子のTatがその機能を持つことが分かった。RexとTatはウィルス生活環では異なる機能を持つが、mRNA結合蛋白質であるという共通点からNMDに対して類似した影響を持つのかもしれない。HTLV-1はヒトT細胞に感染し、極めて悪性度の高い末梢血T細胞腫瘍ATLを引き起こす。我々はHTLV-1の感染成立および感染細胞腫瘍化の基盤となる宿主細胞恒常性の撹乱の一つとして、ウィルスによる宿主mRNA品質管理機構、Nonsense-Mediated mRNA Decay(NMD)の機能抑制に注目してきた。本研究ではウィルスがどのようにNMDを回避し感染を成立させるのか、その分子機構を解明するとともに、感染T細胞形質への影響を明らかにすることを目的としているが、H23年度は下記に注目して実験を行ったので報告する。1.マイクロアレイ解析によるATL細胞でのNMD機能不全状態の把握:我々はこれまで、遺伝子発現マイクロアレイ解析によりATL患者の遺伝子発現異常を明らかにしてきた。今年度はアレイデータを詳細に解析し、さらに確認実験を行うことにより、IL2Rα,NIK,IL15mRNAなど、ATL細胞で過剰発現しているマーカー遺伝子産物がNMDの標的mRNAであり、NMD不全により上昇している可能性を見出した。2.HTLV-1感染によるNMD機能不全の原因究明:これまでの研究により、我々はHTLV-1の感染初期に、HTLV-1 Rexが宿主NMDを抑制すること、そして腫瘍化したArL細胞でもNMDの異常があることを示した。この実験ではHTLV-1感染およびRexによって引き起こされたNMD異常が細胞にどのような影響を与えるのかを検討した。そのためにはHTLV-1感染の場を再現するモデル実験系が必要と考え、ウィルス産生細胞株MT2との共培養感染やRex(+/-)infectious cloneを用いた擬似感染系を確立した。目下これらの系を用いて、JurkatやMolt4などのT細胞株にHTLV-1を感染したときのNMD活性の変化と細胞形質の変化を解析中である。
新学習指導要領を具現化する小学校書写指導　－ICTを活用した指導法の研究－

本研究は、2020年度から完全実施される学習指導要領に示された授業改善の視点に立った書写指導の授業モデルの立案と周知が目的である。その際、児童各自にタブレットを持たせることで、指導者と学習者それぞれにどのような効果が得られるかを検証し、より効果が高い活用の仕方を明らかにして、小学校教員に周知していくとともに、教科書出版社にも授業デザインの提案を行うことをねらっている。
観光、祭り、遊びを契機とする結合様式に関する実証研究

北海道ダウン・ザ・テッシ-オ-ペツ調査では、以下の点が観測された。当初、数人の仲間から始まった私的イベントが、その拡大に連れ、公的な色彩を帯び、全国レベルに拡大した。1998年度に全日本大会に成長し、2002年度には北海道新聞の支援の下、4日間で一気に100マイルを下る大規模なイベントに変化してきた。出発は手づくりカナディアンカヌーを製作した仲間という人間関係から始まり、流域地域に戻ってのカヌークラブ設立、個別カヌークラブの長が所属する広域カヌークラブ北海道カナディアンカヌークラブという構造から、当初の人間関係に基づく内実が失われ、現在まさにイベント集団分裂とイベント自体の再構成についての問い直しをしている。また、イベントが大規模になるにつれて、イベント集団と参加者の間に開きが出てきており、イベント集団の一部にはイベント自体の開催を危ぶむ事まで出てきている。これを回避するために、これまでの土着な人間関係のみに基づく集団から、NPO組織へ移行することにより、土着な関係からより強固な組織作りを目指している。また、高齢者・障害者の研究からは、養護学校の学生の修学旅行や、地元NPO法人の試みである「障害者のスポーツフェスティバル」、「障害者の海外旅行」を題材に、高齢者、障害者と健常者間の人間関係、とくに「生活への援助」の視点を超え、「遊びへの援助」の視点が、介助をする健常者、またイベント開催者側に芽生えつつある。(1)北海道天塩川流域(美深町、音威子府村、中川町)で8月に行なわれたカヌーイベント「ダウン・ザ・テッシ-オ-ペツ」にスタッフとして参加し、参与観察、ならびにスタッフ、参加者に対して聞き取り調査を行なった。遊びを媒介とする集団の形成と遊び以外の場面への集団の拡大などが確認された。ただし、イベントの性格の変化(地方イベントから全日本大会開催)が集団に微妙な変化をもたらしていることが確認された。(2)ユースホステルの調査から2つのことが指摘できた。第1に従来のユースホステル協会の枠を越えた「ユースホステル共和国」を設置し、全国の特色あるユースホステルが横の連携を取りつつ、事業の展開を図っている。この横の連携を担うものとして、「共和国建設大臣」の役割の重要性が確認できた。「共和国建設大臣」は共和国に属する全国のユースを1年かけて北海道から松山まで南下し、各ユースで実費のみで工事や機器の設置を行なっている。その際、各地のユースの情報も一緒に運んでいる。第2に、ユース独自のイベントによって地域に新たな結合様式が生まれている。このことからユースの教育的効果というものが分析できるであろう。(3)高齢者・障害者の研究からはスポーツを通しての連携、遊びを通しての健常者との連携が、障害者・高齢者の社会参加を促す強い要因になるであろうことを確認した。これらの成果の一部は、香川眞や若月博延によって日本国際観光学会第1回全国大会(2001年1月)で報告された。また、香川眞、若月博延、が「野外教育と観光教育-体験学習としての観光とその教育効果-」、香川眞、神原和彦、が「情報リテラシーと観光教育-情報化社会における観光教育の目標と方法-」、香川眞、山下隆が「ノーマライゼーションと観光教育-観光でノーマライゼーションを教育する-」として、2001年4月、図書出版くんぷるから刊行予定の『観光教育論』に発表される。(1)北海道ダウン・ザ・テッシ-オ-ペツ調査では、以下の点が観測された。当初、数人の仲間から始まったイベントが、その拡大に連れ、公的な色彩を帯び、イベントの規模も全国レベルに拡大した。しかし、当初の人間関係に基づく内実が失われたこともあり、現在、イベント集団の分裂とともに、集団の意味についての問い直しが始まっている。(2)ユースホステルの調査では、以下の点が観測された。利用者においては、目的をかかげながら有志を集め宿泊を超えた遊びの場所としての利用が始まっている。施設においては、まだ個人的な試みにすぎないが、施設間の情報交換やネットワーク作りが開始されており、上記の利用者の傾向に寄与している。

(3)高齢者・障害者の研究では、以下の点が観測された。とくに、「障害者のスポーツフェスティバル」における調査では、「生活への援助」の視点を超え、「遊びへの援助」の視点が、開催者側に芽生えつつある。参加者においても、生活を楽しみ自らの生活空間を拡大していこうとの姿勢が顕著になりつつある。むしろバリアフリーとかユニバーサルデザインの視点にとどまっているのは介助者であった。これらの成果の一部は、香川らによって、『福祉用具展示場の展示・販売のあり方に関する調査研究報告書』のなかで報告された。また、若月によって第2回国際観光学会全国大会で、「イベントを通したインバウンド創造の可能性-ダウン・ザ・テッシ-オ-ペツを事例として-」として報告された。さらに、香川が「観光行動」として、2002年6月、アエラムックから刊行予定の『<学問がわかるシリーズ>「観光学がわかる。」』のなかで発表される。(1)北海道ダウン・ザ・テッシーオーペツ調査では、以下の点が観測された。当初、数人の仲間から始まったイベントが、その拡大に連れ、公的な色彩を帯び、全国レベルに拡大した。今年度は北海道新聞の支援の下、4日間にわたる大規模なイベントに変化した。当初の人間関係に基づく内実が失われたこともあり、現在まさにイベント集団分裂とイベント自体の再構成についての問い直しをしている。また、イベントが大規模になるにつれて、イベント集団と参加者の間に開きが出てきており、イベント集団の一部にはイベント自体の開発を危ぶむ事まで出てきている。これを回避するために、これまでの土着な人間関係のみに基づく集団から、NPO組織へ移行することにより、土着な関係からより強固な組織作りを目指している。(2)高齢者・障害者の研究では、以下の点が観測された。とくに、「障害者のスポーツフェスティバル」における研究では、「生活への援助」の視点を超え、「遊びへの援助」の視点が、開催者側に芽生えつつある。今年度は身体障害者のスポーツ風景を基にP-Fスタディを周到したテストを作成し、実際にフェスティバルに介助者となるボランティアに調査を行い、介助者と障害者の心理的、社会的距離を測る尺度の作成を試みた。これらの成果の一部は、香川らによって、『障害者の運動機能の向上に適応する用具等に関する調査研究報告書』のなかで報告された。また、王らによって日本国際観光学会論文集第10号で、「観光の満足要因と不満要因」として発表された。
締固め土の圧縮・圧密特性と高盛土の沈下予測に関する研究

本研究では、まず締固め土の載荷直後の瞬時沈下(不飽和圧縮)と脱水に伴う圧密沈下との定量的関係を見出すために、種々の含水比・密度に締固めた盛土材料に対して大型三軸試験装置を用いたK_0圧密試験を実施した。載荷重を増しながら非排水・排水時の沈下量を比較したところ、載荷初期の瞬時圧縮量は一次圧密量の数倍に達すること(一次圧密比は0.10.4)、1次圧密比は載荷圧力の増加とともに減少する傾向にあるが、供試体の飽和度や密度にはあまり影響されないことなどが判明した。次に締固め土の転圧に伴う先行圧縮応力の特性と、先行圧縮前後の間隙圧・沈下挙動を調べるために、上記と同様の条件で作製した締固め供試体に対して等体積一面せん断試験を実施した。先行圧縮応力については供試体の飽和度や密度、更に粘土分含有量の影響を調べたが、同じ影響が一軸圧縮強度にも反映され、先行圧縮の効果を表す等価な指標になり得ることが示された。以上の実験結果を踏まえて高盛土の沈下予測に関する解析的検討を行い、予測手法の見直しと実際問題への適用について議論した。本研究では盛土を微小厚の水平土層に分割し、テルツアギの一次元圧密解を時間をずらして重ね合わせる形と堤体の圧密沈下に関する解析的表示を導いた。そして、移動境界の圧密問題に関するギブソンの理論解と対比しながら、フィルダムや高盛土の実例について,それぞれの手法を用いて実測値の整理・解析を行い、逆推定した物性定数の変動や沈下予測式の適用性について考察を加えた。この結果、1)施工中と施工後の圧密度の比率や施工後の沈下特性において解析的アプロ-チによる差異はあまり見られない、2)施工後の沈下挙動は簡単な指数関係式で表現できる、3)ただし実際問題への適用に当たっては、締固め土に関する上記の特性を加味して物性値を決定する必要がある、などが判明した。
脂肪組織由来幹細胞を用いた肺再生～肺胞上皮細胞への分化と細胞移植治療の開発～

幹細胞を用いた再生医療の研究は世界中で盛んに行われており、様々な分野で臨床応用が実現化してきている。肺に関しても研究が発展してきているとは言え、他臓器と比較してまだまだ再生は困難であると考えられている。一方、肺気腫を中心とする慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease ; COPD)は年々増加しており、2030年には世界の全死因の第3位になると予測されている。現在根治的な治療法として肺移植が最も有効であるが、脳死ドナー数は限られており新たな治療法の開発が期待されている。脂肪組織由来幹細胞(adipose-derived stem cell : ADSCs)を用いた肺再生を目指し、ADSCsから肺胞上皮細胞への分化誘導、COPDに対するADSCs補充療法による肺再生医療の確立を目的として研究を進めてきた。なかでも、ADSCsの多分化能に注目しII型肺胞上皮細胞へ分化可能であることを示した。ADSCsを末梢気道成長培地で培養するとII型肺胞上皮細胞のマーカーを認めるようになり、電子顕微鏡で観察するとII型肺胞上皮細胞に特異的なlamellar bodyを認めた。さらに、エラスターゼを用いて肺気腫モデルを作成し、ADSCsを尾静脈から投与して組織学的なCOPDに対する効果を検討したtところ、ADSCcを投与することによって気腫性変化の改善を認めた。また、胸部CTの3D画像ではADSCs投与による肺の過膨張の抑制を認めた。これらの結果はADSCsがII型肺胞上皮細胞へ分化できる可能性を示唆し、COPDに対する細胞治療として有効である可能性を示唆せいていると考える。in vitroでADSCsがII型肺胞上皮細胞へ分化する可能性を示した。まず末梢気道成長培地培養で培養したADSCsがII型肺胞上皮細胞のマーカーを発現していることをWestern-blotting法(WB)やqPCRで確認した。また、エラスターゼを用いて肺気腫モデルマウスを作成し、ADSCsのCOPDに対する効果を評価したところ、気腫の程度をあらわす平均肺胞壁間距離を測定すると、エラスターゼ投与で有意に拡大し、ADSC投与で改善を認めた。このようにADSCsをII型肺胞上皮細胞に分化させることができる可能性を示すことができ、肺気腫モデルマウスにおいて気腫性変化を改善させることを示すことができた。さらにこの結果を全国学会で発表した。ADSCsのII型肺胞上皮細胞への分化誘導について、他のプロトコールでも分化可能かを検証し、II型肺胞上皮細胞への分化誘導法を確立する。また、肺気腫モデルマウスを用いてADSCsの効果を呼吸機能の観点から評価する。小動物用のスパイロメトリーや超偏極129Xe MRIを使用して評価していく。これは吸入させたキセノンガスを励起させ約10万倍に信号強度を高め、それを磁気共鳴イメージングとして捕え肺中のガス分布、肺胞サイズ、拡散割合が計測できるというMRIで、呼吸機能を評価するのに重要なガス交換能を評価することができる。今までADSCsの効果を評価する際、組織学的評価が主であり、呼吸機能の改善を詳細に評価した報告はなく意義があると考える。さらに、細胞培養レベルだけでなく、肺気腫モデルマウスに投与したADSCsがII型肺胞上皮細胞に分化するかを検討する。既報ではADSCsの効果はパラクライン効果が主な効果であり、肺胞上皮細胞へ分化して再生するという可能性はcontroversialであろ。ADSCs自身がII型肺胞上皮細胞に分化して機能細胞を再生する効果が見いだせれば、新しいCOPDの治療薬につながる可能性がある。

まず末梢気道成長培地培養で培養したADSCsがII型肺胞上皮細胞のマーカーを発現していることをWestern-blotting法(WB)やqPCRで確認した。また、エラスターゼを用いて肺気腫モデルマウスを作成し、ADSCsのCOPDに対する効果を評価したところ、気腫の程度をあらわす平均肺胞壁間距離を測定すると、エラスターゼ投与で有意に拡大し、ADSC投与で改善を認めた。このようにADSCsをII型肺胞上皮細胞に分化させることができる可能性を示すことができ、肺気腫モデルマウスにおいて気腫性変化を改善させることを示すことができた。さらにこの結果を全国学会で発表した。ADSCsのII型肺胞上皮細胞への分化誘導について、他のプロトコールでも分化可能かを検証し、II型肺胞上皮細胞への分化誘導法を確立する。また、肺気腫モデルマウスを用いてADSCsの効果を呼吸機能の観点から評価する。小動物用のスパイロメトリーや超偏極129Xe MRIを使用して評価していく。これは吸入させたキセノンガスを励起させ約10万倍に信号強度を高め、それを磁気共鳴イメージングとして捕え肺中のガス分布、肺胞サイズ、拡散割合が計測できるというMRIで、呼吸機能を評価するのに重要なガス交換能を評価することができる。今までADSCsの効果を評価する際、組織学的評価が主であり、呼吸機能の改善を詳細に評価した報告はなく意義があると考える。さらに、細胞培養レベルだけでなく、肺気腫モデルマウスに投与したADSCsがII型肺胞上皮細胞に分化するかを検討する。既報ではADSCsの効果はパラクライン効果が主な効果であり、肺胞上皮細胞へ分化して再生するという可能性はcontroversialであろ。ADSCs自身がII型肺胞上皮細胞に分化して機能細胞を再生する効果が見いだせれば、新しいCOPDの治療薬につながる可能性がある。
水素結合型集積構造を有するスピン転移錯体のヒステリシス発現機構の解明

スピンクロスオーバー(SCO)現象は単分子由来の現象であるが、熱ヒステリシス発現はSCOサイト間の協同的相互作用に大きく支配される。SCO鉄(II)錯体では熱ヒステリシスを伴った急激なスピン転移を発現する例が多数報告されているが、鉄(III)錯体系では一般的に緩やかなスピン転移を示し、熱ヒステリシス発現の報告は数例しかない。本研究は、サレン型シッフ塩基四座配位子とイミダゾールからなる鉄(III)錯体を合成し、分子間水素結合に基づく集積構造を有し、熱ヒステリシスを発現するSCO錯体の合成を目的にしている。既にこのモデル錯体として、水素結合によって組織化した一次元構造をもつ鉄(III)錯体[Fe(Him)2(hapen)]AsF6を合成し、この錯体は鉄(III)系では稀な熱ヒステリシスをもつ急激なスピン転移を示すことを報告している。本年度は、配位子に置換基を導入した新たな鉄(III)錯体を合成し、水素結合による集積構造の次元性とSCO挙動の相関解明を目的とした研究を実施した。この研究に適した化合物群として、結晶中で孤立SCO分子系をもつ錯体から、水素結合組織化二核構造や一次元構造をもつ錯体を合成した。いずれの化合物も共通してN4O2型の六配位八面体構造をとり、エタノール溶液中では鉄(III)錯体特有のサーモクロミズムを示した。磁化率測定の結果、固体状態では孤立SCO分子系をもつ鉄(III)錯体はスピン転移を示さず、二核構造体は緩やかなスピン転移を示した。さらに一次元構造体はより急峻なスピン転移を示し、わずかに熱ヒステリシスも観測された。この結果は、水素結合による協同的相互作用によって急激なスピン転移と熱ヒステリシスが発現したことを示唆している。本研究は、熱ヒステリシスを獲得するのに要求される新しい分子設計指針を与えた。26年度が最終年度であるため、記入しない。スピンクロスオーバー(SCO)現象は本質的に単分子由来の現象であるが、分子間相互作用に基づく共同効果に大きく支配される。本研究は、分子間水素結合に基づく集積構造を有し、大きな熱および光履歴を発現するSCO錯体の合成を目的にしている。この研究の解決となるモデル錯体として、これまでに2-ヒドロキシアセトフェノンとエチレンジアミンの2:1縮合物である対称型シップ塩基配位子H_2hapenとイミダゾールが軸位に配位した鉄(III)錯体[Fe(Him)_2(hapen)]Y(Y=BF_4^-,CIO_4^-,PF_6^-,AsF_6^-,SbF_6^-,CF_3SO_3^-,BPh_4^-)を合成している。一連の化合物は多様な集積構造を示したが、その中でイミダゾールーフェノキソ酸素に分子間水素結合を有する一次元鎖状化合物[Fe(Him)_2(hapen)]Y(Y=PF_6^-,AsF_6^-,SbF_6^-)は、急激なスピン転移を示した。また、鉄(III)錯体では珍しい熱ヒステリシスを観測した。さらに配位子場強度を調整するために2-ヒドロキシアセトフェノンとアセチルアセトン、エチレンジアミンの1:1:1縮合物である非対称型シッフ塩基配位子H_2hapacenを用いた鉄(III)錯体[Fe(HIm)_2(hapacen)]-BPh_4・solvents(solvents=2EtOH,1-BuOH,2-PrOH)を合成した。単結晶が得られた錯体[Fe(HIm)_2(hapacen)]-BPh_4・2EtOHは単結晶X線構造解析から、結晶溶媒であるエタノール分子を介した水素結合による環状二核構造を形成していた。また各錯体は対称型配位子鉄(III)錯体と比較し、より高温域で緩やかなスピン転移を示したが、熱ヒステリシスは観測されなかった。以上の結果は、弱い分子間相互作用である水素結合と、それに基づく次元構造がSCO挙動に重要な影響を及ぼすことを示しており、熱ヒステリシスを獲得するのに要求される新しい分子設計指針を与える。分子集積の多様性は、金属錯体の物理化学的性質や機能性に大きな影響を及ぼす。単分子挙動と捉えられるスピンクロスオーバー(SCO)現象も、超分子集積様式に影響される。SCOは、外部情報により高スピン状態と低スピン状態間を相互変換する現象であり、その挙動は単一SCO分子の配位子場強度のみならず、隣接分子間に働く協同効果に大きく支配される。本研究は、分子間水素結合により組織化する分子設計を施したスピン転移化合物を合成し、水素結合に基づいた集積構造の次元性がスピン転移ヒステリシスの発現に及ぼす影響を詳細に明らかにし、スピン転移ヒステリシスの発現機構の解明を目的としている。今年度、この研究目的解決に相応しいSCO鉄(III)錯体として、o-ヒドロキシアセトフェノンとエチレンジアミンの1:1縮合物からなる平面N_2O_2型シッフ塩基配位子hapenと軸位にイミダゾールHimが配位した鉄(III)錯体[Fe^<III>(Him)_2(hapen)]AsF_6を合成した。

この錯体の分子構造は、平面四座配位子hapenと軸位に2つのイミダゾールが配位した六配位八面体構造を有しており、イミダゾール窒素と隣接鉄(III)カチオンのフェノキソ酸素間でNH...O水素結合を形成して一次元鎖状構造を構築していた。この一次元錯体は、鉄(III)錯体系では稀な急激なスピン転移と熱ヒステリシスを観測し、SCO分子が水素結合を駆動力として組織化されることで、急激なスピン転移と熱ヒステリシスが発現することを示した。現在、この一次元組織化鉄(In)錯体系を二次限系に拡張する錯体へと展開するため、新規四座配位子としてメチルエステル基とエチルエステル基をそれぞれ導入したサリチルアルデヒドとエチレンジアミンの1:1縮合物からなるN_2O_2型シッフ塩基配位子の合成し、これを用いた鉄(III)錯体の合成に取り組んでいる。スピンクロスオーバー(SCO)現象は単分子由来の現象であるが、熱ヒステリシス発現はSCOサイト間の協同的相互作用に大きく支配される。SCO鉄(II)錯体では熱ヒステリシスを伴った急激なスピン転移を発現する例が多数報告されているが、鉄(III)錯体系では一般的に緩やかなスピン転移を示し、熱ヒステリシス発現の報告は数例しかない。本研究は、サレン型シッフ塩基四座配位子とイミダゾールからなる鉄(III)錯体を合成し、分子間水素結合に基づく集積構造を有し、熱ヒステリシスを発現するSCO錯体の合成を目的にしている。既にこのモデル錯体として、水素結合によって組織化した一次元構造をもつ鉄(III)錯体[Fe(Him)2(hapen)]AsF6を合成し、この錯体は鉄(III)系では稀な熱ヒステリシスをもつ急激なスピン転移を示すことを報告している。本年度は、配位子に置換基を導入した新たな鉄(III)錯体を合成し、水素結合による集積構造の次元性とSCO挙動の相関解明を目的とした研究を実施した。この研究に適した化合物群として、結晶中で孤立SCO分子系をもつ錯体から、水素結合組織化二核構造や一次元構造をもつ錯体を合成した。いずれの化合物も共通してN4O2型の六配位八面体構造をとり、エタノール溶液中では鉄(III)錯体特有のサーモクロミズムを示した。磁化率測定の結果、固体状態では孤立SCO分子系をもつ鉄(III)錯体はスピン転移を示さず、二核構造体は緩やかなスピン転移を示した。さらに一次元構造体はより急峻なスピン転移を示し、わずかに熱ヒステリシスも観測された。この結果は、水素結合による協同的相互作用によって急激なスピン転移と熱ヒステリシスが発現したことを示唆している。本研究は、熱ヒステリシスを獲得するのに要求される新しい分子設計指針を与えた。26年度が最終年度であるため、記入しない。従来観測されていなかった鉄(III)系でヒステリシスをともなうスピン転移錯体を見出しているが、転移温度や結晶の安定性などの問題から低スピン状態での構造決定ができておらず、本研究課題である熱ヒステリシスの発現に必要な具体的な水素結合に基づく分子設計指針の解明には至っていない。本研究課題解決に相応しい錯体として、結晶溶媒を含まず、分子間水素結合により一次元鎖状に組織化するSCO鉄(III)錯体の合成し、鉄(III)錯体系では稀なヒステリシス発現を観測することができた。しかしながら、次元性の拡張によるスピン転移ヒステリシスの発現に及ぼす影響についてまだ詳細に明らかにできておらず、ヒステリシスの発現機構解明には至っていない。鉄(III)錯体では珍しい熱ヒステリシスをともなう急激なスピン転移を示す分子系を既に見出している。
クロノクーロメトリー法を用いた活性酸素ラジカルの発生と消去反応の解析

ポテンシャルステップクロノクーロメトリー法(PSCC法)を用いて、活性酸素ラジカルの生成および消去過程の解析を行った。昨年度は、種々のアニオンラジカルから酸素への電子移動(活性酸素の発生)が、本法を用いることにより、100m秒程度の反応時間で直接測定可能であること、また、還元電位の異なる種々のキノンおよびニトロアレーン類を用いた時、これらの化合物の一電子還元体(セミキノンアニオンラジカルおよびニトロアニオンラジカル)から酸素分子への酸素移動能(スーパーオキシドの発生能)が、電流量あるいはターンオーバー数で直接比較できることを明かにした。今年度は、PSCC法を用いて、活性酸素から化合物への電子移動、すなわち、活性酸素の消去能の測定を検討した。実験は、酸素飽和のDMF中、まず最初に、電気化学的にキノンアニオンラジカルとスーパーオキシドを発生させ、次に、電極電位をキノンアニオンラジカルの酸化電位にステップし、キノンが再生するときの単位時間あたりの電流量を250ミリ秒間測定した。同様の実験を、酸素非存在下およびキノン非存在下で行い、電流量を比較した。再生したキノンがスーパーオキシドから電子を受け取るとき、すなはち、活性酸素を消去できるときには、キノンがターンオーバーし電流量の増大が確認された。キノン類の活性酸素消去能をキノン類のターンオーバー数で比較すると、より還元され易いキノン、すなわち還元電位が高い化合物ほど活性酸素消去能が大きいことが明かになった。ニトロアレーンを用いたときにも同様な結果が得られた。本研究は、有機化合物の活性酸素消去能を直接数値化して比較したはじめての結果であり、活性酸素の消去過程の解析研究のための有効な手法となると考える。活性酸素ラジカルの生成および消去過程を、簡便にかつ直接的な方法で解析することを目的とし、高速反応の追跡に適した電気化学的測定法の一つであるポテンシャルステップクロノクーロメトリー法(PSCC法)の利用を検討した。その結果、支持電解質としてTEAPを含むDMF溶媒中、銀参照電極を用いることにより、種々のアニオンラジカルから酸素への電子移動、すなわち、活性酸素の発生が100m秒程度の反応時間で直接測定可能であることを明らかにした。次に、還元電位の異なる種々のキノンおよびニトロアレーン類を用いて、これらの一電子還元体(セミキノンアニオンラジカルおよびニトロアニオンラジカル)による酸素分子の還元能(スーパーオキシドの発生)の比較を行った。飽和溶存酸素を含むDMF中でキノンあるいはニトロアレーンの一電子還元を行い、単位時間あたりの還元電流量を測定し酸素非存在下での値と比較解析した。その結果、-1.1-1.4V(vs Ag+)に還元電位(Epc)を有するキノンやニトロアレーン類では、溶存酸素存在下、アニオンラジカルから酸素分子への電子移動に伴う還元電流の顕著な増加が見られることが明らかになった。酸素分子の還元電位は-1.41Vであり、この電子移動は酸化還元電位のギャップを乗り越えて進行する。電流量の増加率から酸素の還元的活性化能(メディエーター作用)をターンオーバー数として数値化した。その結果、酸素の還元電位との△Epcの小さいキノン及びニトロアレーン類ほどアニオンラジカルによる酸素の活性化が進行し、ターンオーバー数は5、12-ナフタセンキノンの時、最高29となった。ニトロアレーンアニオンラジカル類も同様に酸素に電子を渡すが、活性酸素発生効率は同じEpcを持つキノン類の約60%であった。
半導体における光励起プロセスの基礎(総括班)

本研究グル-プは、「半導体における光励起プロセスの基礎」の研究の総括班として、研究全体のまとめを行った。総括班会議は、第1回平成2年7月16日東京工業大学、第2回同年10月12日東京工業大学、第3回同年12月14日東京大学、第4回平成3年2月1日豊橋ホリデイ・インでそれぞれ開催した。本年度は、平成2年7月16日に東京工業大学で研究会を開催し、本研究に関する内外の研究状況、研究目的、本年度の研究実施計画についてそれぞれ研究代表者から発表された。平成2年12月14日には東京大学で公開講演会を開催し、本研究を内外に紹介した。また本年度の研究成果報告会が、豊橋ホリデイ・インで、平成3年1月31日、2月1日の2日間にわたり開催され、本年度の研究で得られた成果についてそれぞれの研究者から報告された。それぞれの研究分担者の相互の情報交換として、ニュ-スレタ-を2回出版し、また研究担当者名簿を発行した。
外来選択マーカーを用いない葉緑体遺伝子導入系の樹立

タバコ以外の植物に対して,未だ確立されていない葉緑体形質転換技術を開発・汎用化することは,葉緑体の光合成および代謝機能の向上,さらに新たな物質の生産・蓄積という応用面からも極めて重要である.形質転換選択マーカーとして,市場容認度の高い組換え農作物作出の観点から,植物由来のものに注目した.新規葉緑体形質転換選択マーカーを見いだすために,葉緑体の光合成およびその他の代謝機能を阻害する20種類の薬剤について,モデル植物シロイヌナズナ(アブラナ科)を用い,その培養細胞の生育を一過的に阻害するものを選定した.その結果,分岐鎖アミノ酸の合成を司るアセトヒドロキシ酸合成酵素[acetohydroxyacid synthase, AHAS;別称,アセト乳酸合成酵素(acetolactate synthase, ALS)]を標的とする除草剤が条件を満たすことを発見した.AHASは,変異ごとに耐性になる除草剤が異なっていることが期待されたため,8種類の変異型AHAS遺伝子を作製し,大腸菌発現ベクターpGEXにクローニングした.発現させた変異型AHASごとに,酵素活性の除草剤耐性を検定した.つぎに,AHAS遺伝子が葉緑体形質転換選択マーカーとして機能するのかどうかを検証するために,スペクチノマイシンによる葉緑体形質転換が可能なタバコを用い,変異型AHAS遺伝子を葉緑体形質転換aadAコンストラクトに連結し,パーティクルガン法によりタバコ葉緑体に導入した.スペクチノマイシシ耐性およびPCRにより確認された葉緑体形質転換系統に対し,AHASをターゲットする除草剤複数種について,選抜に対する適性およびその使用濃度を検討した.なお,本研究結果を基に,現在特許出願準備中であり,出願後,原著論文を発表するため,「11.研究発表」の「雑誌論文」に該当するものがない.今年度は,モデル実験植物として,遺伝子解析が最も進んでいるシロイヌナズナおよび葉緑体形質転換(葉緑体ゲノム遺伝子導入)が可能なタバコを取り上げた.特に,シロイヌナズナは,アブラナ科に属し,アブラナ科には,ナタネ,カラシ,ブロッコリー,カリフラワー,キャベツ,ハクサイ,ダイコン,カブラ,ワサビなど重要な野菜が含まれており,この観点からも重要である.シロイヌナズナにおける葉緑体形質転換の問題点として,(1)これまでタバコで成功しているスペクチノマイシンにより細胞が不可逆的な障害を受けること.(2)タバコに比べ葉細胞における葉緑体が小さくしかも疎に分布していること,さらに,(3)植物個体への再生効率が低いことが挙げられる.これらの問題点を克服するために,以下の研究を遂行した.新規選択マーカーとなる可能性を有する20種類の除草剤について検討した.その結果,分岐鎖アミノ酸の合成に必要なacetohydroxyacid synthase (AHAS)[別称:acetolactate synthase (ALS)]を標的とする除草剤が必要な性質を有することを見いだした.AHASを標的とする除草剤6種類に対して,耐性となるAHAS上のアミノ酸置換は共通でない.6種類をさらに絞り込み,シロイヌナズナ触媒サブユニットに対して,W574L/S653I変異導入を試みた.これを葉緑体プロモーターの支配下に置いたコンストラクトを作製している.根プラスチドは機能する翻訳装置を持たないため,緑色組織葉緑体にパーティクルガン法による形質転換を試みる必要がある.シロイヌナズナについては,再生能力が高い緑色組織として,エコタイプBensheimの胚軸および葉組織が優れていた.タバコ以外の植物に対して,未だ確立されていない葉緑体形質転換技術を開発・汎用化することは,葉緑体の光合成および代謝機能の向上,さらに新たな物質の生産・蓄積という応用面からも極めて重要である.形質転換選択マーカーとして,市場容認度の高い組換え農作物作出の観点から,植物由来のものに注目した.新規葉緑体形質転換選択マーカーを見いだすために,葉緑体の光合成およびその他の代謝機能を阻害する20種類の薬剤について,モデル植物シロイヌナズナ(アブラナ科)を用い,その培養細胞の生育を一過的に阻害するものを選定した.その結果,分岐鎖アミノ酸の合成を司るアセトヒドロキシ酸合成酵素[acetohydroxyacid synthase, AHAS;別称,アセト乳酸合成酵素(acetolactate synthase, ALS)]を標的とする除草剤が条件を満たすことを発見した.AHASは,変異ごとに耐性になる除草剤が異なっていることが期待されたため,8種類の変異型AHAS遺伝子を作製し,大腸菌発現ベクターpGEXにクローニングした.発現させた変異型AHASごとに,酵素活性の除草剤耐性を検定した.つぎに,AHAS遺伝子が葉緑体形質転換選択マーカーとして機能するのかどうかを検証するために,スペクチノマイシンによる葉緑体形質転換が可能なタバコを用い,変異型AHAS遺伝子を葉緑体形質転換aadAコンストラクトに連結し,パーティクルガン法によりタバコ葉緑体に導入した.スペクチノマイシシ耐性およびPCRにより確認された葉緑体形質転換系統に対し,AHASをターゲットする除草剤複数種について,選抜に対する適性およびその使用濃度を検討した.なお,本研究結果を基に,現在特許出願準備中であり,出願後,原著論文を発表するため,「11.研究発表」の「雑誌論文」に該当するものがない.
カルポニン遺伝子の抑制による新しい骨形成治療法の開発

平成12年度までの知見より、骨折部未分化骨芽細胞におけるカルポニン遺伝子の発現を抑制することにより、骨折治癒を促進できる可能性が示唆された。そこで、6週齢雄ICRマウスに肋骨骨折を作製し、筋膜表面から骨折部局所へカルポニン遺伝子mRNAに対するアンチセンスDNAの導入を試みた。ホスホチオエイト修飾アンチセンスオリゴDNA(マウスカルポニン遺伝子の翻訳開始コドンを含む18mers)を37°Cでゲル化するpluronic F127gel(BASF, Parsippany, U.S.A.)に4°Cで溶解し(2mg/ml)、その10μlを27G針を用いて、骨折48時間後に注入した。対照群には、センスオリゴDNA、5塩基を変異させたアンチセンスオリゴDNAあるいはゲルのみを注入した。オリゴDNAの組織内分布を、ローダミンラベルオリゴDNAを用いて蛍光顕微鏡で確認した。骨折後6日での骨折部組織におけるカルポニンmRNAをRT-PCR法で定量すると、アンチセンスオリゴDNAの投与によってその発現は約70%低下した。骨折後3週での骨折治癒率は、アンチセンスオリゴDNA群:50.9%(28/55)、センスオリゴDNA群:31.3%(16/51)、変異アンチセンスオリゴDNA群:28.6%(4/14)、ゲルのみ投与群:37.5%(6/16)であり、アンチセンスオリゴDNA投与群で有意に骨折治癒の促進が認められた(P<0.05)。さらに、大阪市立大学の小山英則博士と共同で、ヒトカルポニンの全長配列をセンス、アンチセンスの方向に含むRGDペプチド含有ファイバーミュータントアデノウイルスベクターを作成した。このアデノウイルスベクターがマウス血管平滑筋やラット膵腺管由来の細胞で十分量の導入遺伝子のmRNAを発現することを確認し、上述のマウス肋骨骨折モデルでカルポニン遺伝子の発現を抑制できるかどうかを検討中である。(1)アンチセンスDNAによる筋芽細胞の骨芽細胞への分化の促進正常筋芽細胞にアンチセンスDNAを導入してカルポニン遺伝子の発現を抑制することにより、骨芽細胞への分化を促進することができるかどうかを検討した。ICRマウス大腿筋よりトリプシン(0.08%)処理により筋芽細胞(3000個/cm^2)を分離した。まず、40ng/ml以下の濃度のrhBMP-2には、筋芽細胞を骨芽細胞に分化させる作用がないことを確認した。rhBMP-2(40ng/ml)と10%牛胎仔血清存在下で、カルポニン遺伝子に対するアンチセンスオリゴDNA(マウスカルポニン遺伝子の翻訳開始コドンを含む18mers)(80mg/ml)を筋芽細胞に48時間作用させた後、アルカリホスファターゼ(ALP)活性染色により骨芽細胞数を定量した。対照として、センスオリゴDNAおよび変異アンチセンスオリゴDNAを用いた。アンチセンスオリゴDNA処理群にのみALP陽性細胞が出現したが(全有核細胞中のALP陽性細胞の比率:32.4±3.9%,n=5,mean±S.E.)、センスオリゴDNA及び変異アンチセンスオリゴDNA処理群ではALP陽性細胞を認めなかった。(2)骨細胞特異的遺伝子発現ベクターの開発カルポニンプロモーターによって複製が開始される複製可能型単純ヘルペスウイルスベクターを作製した。骨肉腫細胞に感染させると、カルポニン遺伝子を発現する骨肉腫細胞でのみ選択的なウイルスベクターの複製を観察し、細胞溶解活性を認めた。(3)今後の研究計画

次年度は、上記アンチセンスオリゴDNAがin vivoで骨形成を促進し、実際に骨折治癒を促進させる効果があるかどうかをマウス肋骨骨折モデルを用いて検討する。また、ヒトカルポニンcDNAを用いてアンチセンスアデノウイルスベクターを作製する。(1)カルポニン遺伝子欠失マウスにおける骨折治癒の促進マウス肋骨骨折の実験モデルでは、骨折治癒率はホモ型欠失マウスで有意に高く(ホモ型欠失マウス:50.6%(9/16肋骨),野生型マウス:25%(4/16肋骨),P<0.05)、カルポニン遺伝子の欠失によって骨折治癒が促進されることが明らかになった。また、レーザー顕微鏡を用いた骨形態計測により、カルポニン遺伝子欠失マウスでは、類骨量および骨量が有意に高く、骨形成速度も有意に速かった。一方、吸収面や破骨細胞面には変化を認めなかった。(2)アンチセンスDNAによる骨折治癒の促進6週齢雄ICRマウスに肋骨骨折を作製し、筋膜表面から骨折部局所へカルポニン遺伝子mRNAに対するアンチセンスDNAの導入を試みた。アンチセンスオリゴDNA(マウスカルポニン遺伝子の翻訳開始コドンを含む18mers)を37°Cでゲル化するpluronic F127gel(BASF, Parsippany, U.S.A.)に4°Cで溶解し(2mg/ml)、その10mlを27G針を用いて、骨折48時間後に注入した。対照群には、センスオリゴDNA、5塩基を変異させたアンチセンスオリゴDNAあるいはゲルのみを注入した。骨折後6日での骨折部組織におけるカルポニンmRNAをRT-PCR法で定量すると、アンチセンスオリゴDNAの投与によってその発現は約70%低下した。骨折後3週での骨折治癒率は、アンチセンスオリゴDNA群:50.9%(28/55)、センスオリゴDNA群:31.3%(16/51)、変異アンチセンスオリゴDNA群:28.6%(4/14)、ゲルのみ投与群:37.5%(6/16)であり、アンチセンスオリゴDNA投与群で有意に骨折治癒の促進が認められた(P<0.05)。(3)CAGプロモーターの下流にヒトカルポニンcDNAをセンスまたはアンチセンスの方向に連結し、RGD配列をファイバーに有するアデノウイルスベクターを構築した。(4)骨細胞特異的に遺伝子を発現し複製する単純ヘルペスウイルスベクターを作成し、in vitroで骨肉腫細胞を破壊し得ることを確認した。(5)カルポニンプロモーターを用いたin vivoでの体細胞遺伝子欠失を確認するため、Cre/loxP、トランスジェニックマウスを作成した。
シナプス可塑性の恒常的維持機構の解明と神経機能再建への応用

海馬や大脳皮質などの脳領域は成熟期において可塑性誘導刺激に応じて樹状突起スパインを新生するが、その役割は未だ不明な部分が多い。我々は、可塑性誘導刺激に応じてスパインの前駆体である樹状突起フィロポディアを新生するシグナル系として、ニューロトリプシンによるアグリン切断系を同定した。本年度は、このシステムが作動しないニューロトリプシン遺伝子欠損マウスを用い、樹状突起スパインの新生が記憶・学習のどの段階に寄与しているのかを検討した。恐怖条件付け試験では、ニューロトリプシン遺伝子欠損マウスは恐怖記憶の獲得には異常を認めなかったものの、恐怖反応の消去学習が障害されていることを見出した。この障害は、キュー依存性の恐怖反応のみならず、文脈依存性の恐怖反応にも認められた。同じ刺激から別の学習を繰り返すことに障害が生じているという本結果は、スパイン新生が学習能の恒常的維持に寄与していることを示唆している。ニューロトリプシンによって切断されたアグリンC末端断片は海馬における樹状突起フィロポディア新生に必須であるが、その受容体はNa+/K+-ATPaseのα3サブユニットであると考えられている。そこでNa+/K+-ATPaseの機能を修飾できる薬剤である強心配糖体Digoxinが樹状突起フィロポディアの新生にどのような作用を持つのかを解析した。Digoxinを腹腔内投与したGFPトランスジェニックマウスにおいて、海馬CA1ニューロンの樹状突起フィロポディアを2光子レーザー顕微鏡で観察したところ、Na+/K+-ATPase活性を増加させる濃度のDigoxinを投与した条件で樹状突起フィロポディアの本数が増加する傾向があることを見出した。強心配糖体は学習能の恒常的維持、特にPTSDなどストレス障害からの回復に効果を有する可能性が示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。ニューロトリプシン-アグリン系による樹状突起フィロポディア新生がシナプスターンオーバーを介してどのように学習・記憶に関与するのかを検討するため、空間学習を検査するモーリス水迷路試験装置と恐怖条件付け装置を導入し、どの学習実験系により再学習行動が評価可能なのか、野生型マウスを用いて適切な条件設定を行った。その結果、モーリス水迷路試験では、一度記憶したプラットホームの位置を180度転換させるReversalLearningの系を、また恐怖条件付け試験においては、海馬と扁桃体の働きを必要とする文脈依存性恐怖記憶の消去実験(Extinction Learning)の系を立ち上げた。次に、これらの実験系を用いてニューロトリプシン遺伝子欠損マウスの再学習行動を野生型マウスと比較した。モーリス水迷路試験によるReversal Learningにおいては、ニューロトリプシン遺伝子欠損マウスは最終的にはプラットホームの位置を学習できるものの、位置変換前の空間学習の遅延と変換直後の再学習の障害の可能性が認められた。また、文脈依存性恐怖記憶の消去実験では、ニューロトリプシン遺伝子欠損マウスは恐怖記憶の成立には問題は認められなかったが、特に恐怖記憶の消去学習の後期相に若干の障害が見受けられた。これらの実験結果は、ニューロトリプシン-アグリン系による樹状突起フィロポディア新生が当初の予想通りにシナプス可塑性の維持に寄与するのみならず、長期記憶の形成過程にも関与している可能性を示唆するものである。上記行動実験系に加え、中枢神経系アグリン受容体の修飾薬である強心配糖体の樹状突起フィロポディア新生への効果を検討するため、Thy1-eGFPトランスジェニックマウスを導入するとともに、2光子レーザー顕微鏡による観察系を立ち上げた。現在予備実験を行っている最中である。

本研究課題を遂行するにあたり必須の遺伝子改変マウス2種(ニューロトリプシン遺伝子欠損マウス、Thy1-eGFPトランスジェニックマウス)については海外からその系統の導入を終え、現在安定して動物を供給できる体制を整えた。また、学習行動実験に必要な設備一式も本補助金によって揃え、予備実験によって本研究課題に必要な学習試験の条件設定も完了した。さらに、ニューロトリプシン遺伝子欠損マウスにおける再学習行動の基礎的解析も終了した。樹状突起フィロポディアの解析についても、2光子レーザー顕微鏡を柱とし、人口脳脊髄液灌流系を備えた海馬急性スライス観察システムを立ち上げ、現在どれくらいまでのリアルタイム観察が可能なのかを検討しているところである。以上、最低限の目標であった実験系の樹立は達成できたうえに、ほぼ予想通りの基礎的実験データを得られたことから、本研究課題は現在まではおおむね順調に進展していると考える。今後は、ニューロトリプシン-アグリン系による樹状突起フィロポディア新生の学習・記憶における役割をより詳細に検討すべく、条件設定を変えた再学習行動評価試験および空間記憶・恐怖記憶がどれだけ長期に維持されるかの試験をニューロトリプシン遺伝子欠損マウスを用いて行う。さらに、Thy1-eGFPトランスジェニックマウスと2光子レーザー顕微鏡による海馬ニューロン樹状突起フィロポディア観察システムを駆使して、強心配糖体にアグリンC末端切断断片と同様のフィロポディア生成作用があるかどうかを検討する。強心配糖体は、アグリン受容体であるNa/K-ATPaseを活性化する濃度(低濃度)と阻害する濃度(高濃度)で検討し、アグリンC末端断片の作用がNa/K-ATPaseを賦活することなのか、抑制することなのかを解析する。また、ニューロトリプシン遺伝子欠損マウスで障害が認められた学習行動も強心配糖体投与で改善できるかどうかを明らかにする。また、総頸動脈結紮により空間学習障害を引き起こす脳梗塞モデルマウスを作製し、その空間学習能をモーリス水迷路試験で評価するとともに、強心配糖体の脳室内投与や腹腔内投与が空間学習障害からの回復を促進するか否かを検討し、ニューロトリプシン-アグリン系の高次脳機能リハビリテーション促進薬としての可能性を探る。25年度が最終年度であるため、記入しない。