hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNAメチル化パターンを指標とした各種体液証明法の開発

精液特異的脱メチル化サイトDACT1及び血液特異的メチル化サイトcg06379435について,MethyLight法による定量的メチル化解析法を確立した.本検査法による多検体試料の解析結果から,閾値となるメチル化率を設定し,陳旧斑痕を解析したところ,いずれも正確に精液及び血液証明が行われた.リアルタイムPCRをベースとした本検査法は,バイサルファイト変換後,PCR反応液調製の1ステップのみで検査可能であることから,簡便でコンタミネーションリスクの低い,実務により適した検査法であるものと考えられる.精液特異的脱メチル化領域DACT1について、TaqManプローブを用いた定量的解析法の確立及び検証を行った。DACT1遺伝子領域の3個のCpGサイトに対応する1組の蛍光標識プローブペア(メチル化検出プローブ及び脱メチル化検出プローブ)、プライマー及びリアルタイムPCR装置を用いて、当該CpGサイトが0,30,50,70,100%メチル化されたDNAを解析した。算出されたCt値をもとに、メチル化度を計算したところ、おおむね予測された値が算出され、本検出系による定量的解析が可能であることが確認された。さらに、各種体液(精液、血液、唾液、膣液、n=5-9)や陳旧斑痕(29年経過精液斑; n=7、29年経過血痕; n=7、2年経過唾液斑; n=1)等の様々な資料から抽出したDNAを用いて本検査法で解析を行った。その結果、すべての試料で少なくともいずれかのプローブのシグナルが検出され,精液及び精液斑においてほぼ0%、それ以外の体液及び斑痕においてほぼ100%のメチル化率であった。また、解析を行った陳旧精液斑については、従来法との比較のため、酸性ホスファターゼ活性を指標とした検査、顕微鏡による精子検査を行った。その結果、一部の陳旧精液斑については、酸性ホスファターゼ活性が認められず、尾部を伴う完全な形の精子が観察されないものがあった。以上の結果から、本検査法は、従来の検査法と比較しても陳旧に強く、有用な検査法であることが示唆された。血液特異的DNAメチル化サイトして既に報告されていた、cg06379435、cg08792630、C20orf117の血液特異性について、プールサンプルを用いて、バイサルファイトシークエンス法により検証を行なった。その結果、cg06379435について、比較的血液特異性が高いことが確認された。続いて、この部位の血液特異性について、より多くの検体で検証するため、リアルタイムPCRを用いた定量的メチル化解析法の確立及び検証を行なった。cg06379435とその近傍の二つのCpGサイトに対応する1組の蛍光標識プローブ(メチル化検出プローブ及び脱メチル化検出プローブ)及びプローブ結合領域を含む115bpを増幅するプライマーペアを設計し、リアルタイムPCR装置を用いて、当該CpGサイトが0,10, 30, 50, 70, 90%メチル化されたDNAを解析した。得られたCt値をもとに、メチル化度を算出したところ、おおむね予測された値が算出され、本検出系による定量的解析が可能であることが確認された。さらに、血液(n=22)に加え、精液(n=14)、唾液(n=15)、膣液(n=7)由来のDNAを解析したところ、血液DNAにおけるメチル化率が高いことがあらためて確認された。さらに、この血液DNAのメチル化率を元に、血液判定の閾値となるメチル化率を設定し、現場資料を想定した陳旧資料(血痕:n=6、唾液斑:n=3、精液斑:n=4)を解析したところ、血痕試料からのみ陽性判定が得られる結果となった。血液特異的メチル化領域の定量的解析法を確立し、陳旧資料における有用性について確認することができ、順調な推進状況と考えられる。精液特異的脱メチル化サイトDACT1及び血液特異的メチル化サイトcg06379435を指標とした、リアルタイムPCRによる精液及び血液証明法について、引き続き検証を行った。cg06379435検出系については、昨年度血液判定閾値となるメチル化率を設定していたが、DACT1検出系については、精液判定の基準となるメチル化率が未設定であったことから、本検査法を用いて多検体の各種体液を解析し、精液判定閾値を設定した。設定した閾値について、各種体液斑痕で検証したところ、いずれの試料においても正しく判定が行われた。さらに、検出感度を検証するため、両検出系について、それぞれ精液DNA及び血液DNA希釈液を用いて解析を行った。その結果、両検査系ともに1ngのDNAから精液及び血液の証明が可能であった。続いて、他体液種試料の混合の影響を検証するため、血液DNAと精液DNAをさまざまな割合で混合し、どの程度まで精液及び血液証明が可能か予備的な検討を行った。この検討に際し、上述の多検体解析において、DACT1は他の体液でほぼ完全にメチル化されていたため、混合精液判定用の閾値を設定した。その結果、DACT1では80%の血液DNAが混合した試料からも精液証明が可能であった。一方、cg06379435検出系については、精液DNAが半分程度混合した試料からも、血液証明が不可能となり、実務における混合試料からの検出は困難であることが想定された。

そこで、この問題に対する一つの対応策として、cg06379435とその近傍に位置する一塩基多型部位(rs7359943)を同時に解析可能なバイサルファイトシークエンスによる検査系を確立した。本手法により、アリル特異的なcg06379435のメチル化率の解析が可能となり、条件は限られるものの、混合試料からの血液証明における有効な一手法となることが期待された。精液特異的脱メチル化サイトDACT1及び血液特異的メチル化サイトcg06379435について,MethyLight法による定量的メチル化解析法を確立した.本検査法による多検体試料の解析結果から,閾値となるメチル化率を設定し,陳旧斑痕を解析したところ,いずれも正確に精液及び血液証明が行われた.リアルタイムPCRをベースとした本検査法は,バイサルファイト変換後,PCR反応液調製の1ステップのみで検査可能であることから,簡便でコンタミネーションリスクの低い,実務により適した検査法であるものと考えられる.精液特異的脱メチル化領域の定量的解析法を確立し、陳旧資料における有用性について確認することができ、順調な推進状況と考えられる。なお、当初実施予定であった、網羅的解析による他体液に特異的なメチル化領域の探索については、他グループから同一の研究が相次いだことから、本年度は実施しなかった。これまでに検討を行なった精液特異的脱メチル化領域を指標とした精液検査法及び血液特異的メチル化領域を指標とした血液検査法について、混合資料からの解析を想定した検討を行なう。また、他グループによって報告された唾液、膣液等の他の体液特異的メチル化領域の有用性についても検討を行なう。法医生物学他グループによって報告された、各種体液特異的メチル化領域について、その特異性をバイサルファイトシークエンス法等により確認を行う。さらに、特異性が確認された体液種については、精液と同様、リアルタイムPCR等を用いたより簡便な検査法の確立を試みる。特異性について、再現性に問題がある体液種がある場合は、新たな網羅的手法による、より特異性の高いメチル化領域の同定を試みる。網羅的解析法による、体液種特異的メチル化領域の同定を行う予定であったが、他の研究グループから同様の手法による血液特異的メチル化領域の報告があったことから、その有用性の検証、及びより簡便な検査法の確立に注力したため。体液種特異的メチル化領域の同定のため、網羅的解析を行う予定であったが、他研究グループから同一の報告が相次いだことから、実施しなかったため。唾液及び膣液に特異性が高いことが報告されているメチル化領域について検証を行ない、再現性に問題がある場合は、新たな網羅的解析手法によるより特異性の高いメチル化領域の同定を試みる。これらのマーカーの特異性が確認された場合は、当初予定にはなかった、次世代シークエンサーによる、すべての体液種特異的メチル化領域を包括的に解析する検査法の開発を進める予定である。報告が行われた体液特異的メチル化領域について検証を行い、再現性に問題がある体液種がある場合は、新たな網羅的手法による、より特異性の高いメチル化領域の同定を試みる。
セマフォリンの肝類洞再構築ガイダンス作用:肝再生における役割

本研究は、神経ガイダンス因子であるセマフォリン3A(Sema3A)およびその受容体ニューロピリン-1(Nrp-1)の肝再生における類洞再構築に及ぼす影響を検討した。in vivoではラット2/3部分肝切除(PHx)後、類洞内皮細胞におけるNrp-1の発現が増加し、肝実質細胞におけるSema3Aの発現が減少した。一方、in vitroで、Sema3AはPHx後ラットから分離した類洞内皮細胞の遊走能を抑制し、アポトーシスを誘導した。Sema3AとNrp-1の相互作用が肝切除後の類洞再構築を制御する一因となっている可能性が示唆された。本研究では、神経ガイダンス因子であるセマフォリン3A (semaphorin 3A ; Sema3A)が、肝再生における類洞再構築に及ぼす影響について明らかにすることを目的とする。肝再生の動物実験モデルである70%肝切除ラットを作成し、術後6、24、48、72、96、192時間での残存肝を採取してreal-time PCR法で解析した結果、Sema3AのmRNA発現量は肝切除後24、48、72、96時間で有意に減少していた。又、免疫染色法によりSema3Aは肝実質細胞に発現していることが証明された。さらに、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor ; VEGF)とSema3Aの共通受容体であるニューロピリン-1(Nrp-1)抗体および肝類洞内皮細胞のマーカーSE-1を用いて二重染色を行い、肝におけるNrp-1の発現・分布を検討したところ、Nrp-1は主に門脈側の血管内皮細胞と肝類洞内皮細胞に発現しており、中心静脈内皮細胞には発現していないことが明らかとなった。類洞内皮細胞におけるNrp-1の発現量は肝切除後24、48時間後に増加がみられた。一方、in vitroでは、初代培養類洞内皮細胞におけるNrp-1のmRNAとタンパクの発現が認められることがreal-time PCRと免疫染色法によってそれぞれ確認された。VEGFは肝再生における類洞再構築促進因子として重要であり、Sema3AはVEGFのcoreceptorであるNrp-1と競合することにより、VEGFによる血管内皮細胞の遊走、血管新生を抑制することが報告されている。従って、肝再生においてSema3AはNrp-1を介し、類洞再構築の抑制因子として働いている可能性が示唆され、肝切除後のSema3A発現の減少は類洞再構築に寄与しているものと考えられた。神経軸索伸長の方向性を決定するガイダンス因子の受容体は血管内皮細胞にも発現しており、血管新生の制御因子として注目されている。本研究の目的は、神経ガイダンス因子であるセマフォリン3F(semaphorin 3F;Sema3F)およびその受容体ニューロピリン-2(neuropilin-2;Nrp-2)の肝再生における類洞再構築に及ぼす影響を検討することにある。肝再生の動物実験モデルである2/3部分肝切除(PHx)ラットを作成し、術後6、24、48、72、96、192時間に残存肝を採取してreal-time PCR法で解析した結果、Sema3FのmRNA発現量は肝切除後6時間に有意に増加していた。又、免疫染色法によりSema3Fは肝実質細胞に発現していることが証明された。Sema3Fの受容体であるニューロピリン-2(Nrp-2)抗体および肝類洞内皮細胞のマーカーSE-1を用いて二重染色を行い、肝におけるNrp-2の発現・分布を検討したところ、Nrp-2は肝類洞内皮細胞に発現していることが明らかとなった。一方、in vitroでは、免疫染色法によりnommal ratから分離した初代培養類洞内皮細胞に比べ、PHx後のラットから分離した類洞内皮細胞(PHx-SECs)においてNrp-2の発現増加が観察された。また、PHx-SECsの遊走能はSema3Fによって抑制された。さらに、Sema3FはPHx-SECsのアポトーシスを誘導したが、normal ratから分離した類洞内皮細胞のアポトーシスを誘導しなかった。以上の実験結果より、Sema3FとNrp-2の相互作用が肝切除後の類洞再構築を制御する一因となっている可能性が示唆された。
オープングリッドコンピューティングにおけるセキュアプロセッシング技術の開発

(1)「処理の隠蔽」アルゴリズムの改善これまで,処理対象となるプログラムを分割し,ダミーコードと共に再構成することで,グリッドを構成するコンピュータに元のプログラムの処理や目的を隠蔽するアルゴリズムの提案を行ってきた.しかし,プログラム断片から得られる結果を収集し,次の処理コンピュータに分配する処理を信頼できるコンピュータで行うと,負荷の集中が起こってしまう.そこで,結果の受け渡しをグリッドを構成するコンピュータに行わせる一方で,複数のコンピュータを経由させることで,プログラム断片間の繋がりをわかりにくくする方法を提案した.また,提案方法に対して数学的な解析を行い,その信頼性について定量的評価を行い.実用性が高いことを示した.(2)「委託に対する信用性確保」技術の改善不正な改ざんや不正処理に対する有効な対策として,同じ処理を複数のコンピュータで行う多重化がある.エクスターナルグリッドは,インターネット上の多数のコンピュータで構成されるため,多重化による資源の消費は問題とならないが,改ざんや不正処理の検出を行うための多数決処理に伴う負荷の集中が問題となる.そこで,多数決処理もグリッドを構成するコンピュータに行わせる方法の提案を行った.提案方法では,同一の処理結果をもたらす複数のコンピュータとその結果を受け取る複数のコンピュータ間で,多対多の関係で,結果の受け渡しを行う.そして,結果を受け取る側で多数決処理を行い,改ざんや不正処理を検出する.この方法では,多数決処理が分散的,かつ並列的に行われる為に,負荷の集中を避けることができ,さらには高い信頼性も確保できる.また,数学的手法で,その信頼性を定量的に評価した.なお,その成果は,2009年10月開催のInternational Multi-Conference on Advanced Computer Systemsで発表の予定である.○処理の隠蔽アルゴリズの開発とその達成度の定量的評価を目指し、以下の2点の研究を行った。1.プログラム中に含まれる変数の数とプログラムの行数の関係の検討プログラムに含まれる変数の数とプログラムの行数(プログラムの規模)の間には、正の相関関係があると考えられる。また、プログラムを分割して得られた断片についても、その中に含まれる変数の数と断片の行数の間にも正の相関関係があると考えられる。しかし、プログラム全体での相関関係と、断片における相関関係は同一であるとは言い切れない。もし、同一でないとすれば、断片に含まれる変数の数と行数から、分割前のプログラム全体の規模が類推できる可能性がある。この試験期間において、上記それぞれの相関関係についての評価、検討を行った。また、プログラム断片中の変数の数と行数から、元のプログラムの全体像を類推した場合の誤差についての検討を行った。2.プログラム中の行相互間の依存関係と隠蔽についての検討プログラムの各行は、変数に対する書き込み、読み出しによってもたらされる依存関係がある。この依存関係を追跡することで、プログラムの全体像を把握できる可能性がある。従って、プログラムを複数の断片に分割しても、断片間の依存関係を解析者に知られると、結果的に分割の効果がなくなってしまう。そこで、実際のプログラムを対象に、プログラム解析の視点から依存関係の分析を行い、依存関係分析の点から、適切なプログラム断片のサイズについての検討を行った。○委託に対する信頼性確保技術の開発をめざし、結果のわかっているプログラムを細分化して、各コンピュータノードに実行を依頼するプログラム断片に混入させることで、委託した処理が適切に実行されているかどうかを検証する方法の提案と検討を行った。(1)「処理の隠蔽」アルゴリズムの改善これまで,処理対象となるプログラムを分割し,ダミーコードと共に再構成することで,グリッドを構成するコンピュータに元のプログラムの処理や目的を隠蔽するアルゴリズムの提案を行ってきた.しかし,プログラム断片から得られる結果を収集し,次の処理コンピュータに分配する処理を信頼できるコンピュータで行うと,負荷の集中が起こってしまう.そこで,結果の受け渡しをグリッドを構成するコンピュータに行わせる一方で,複数のコンピュータを経由させることで,プログラム断片間の繋がりをわかりにくくする方法を提案した.また,提案方法に対して数学的な解析を行い,その信頼性について定量的評価を行い.実用性が高いことを示した.(2)「委託に対する信用性確保」技術の改善不正な改ざんや不正処理に対する有効な対策として,同じ処理を複数のコンピュータで行う多重化がある.エクスターナルグリッドは,インターネット上の多数のコンピュータで構成されるため,多重化による資源の消費は問題とならないが,改ざんや不正処理の検出を行うための多数決処理に伴う負荷の集中が問題となる.そこで,多数決処理もグリッドを構成するコンピュータに行わせる方法の提案を行った.提案方法では,同一の処理結果をもたらす複数のコンピュータとその結果を受け取る複数のコンピュータ間で,多対多の関係で,結果の受け渡しを行う.そして,結果を受け取る側で多数決処理を行い,改ざんや不正処理を検出する.この方法では,多数決処理が分散的,かつ並列的に行われる為に,負荷の集中を避けることができ,さらには高い信頼性も確保できる.また,数学的手法で,その信頼性を定量的に評価した.なお,その成果は,2009年10月開催のInternational Multi-Conference on Advanced Computer Systemsで発表の予定である.
パフォーマーのプレゼンス――現代日本演劇における非＝人間、新＝人間的側面の研究

2016年度には、前年度に引き続いて研究代表者と研究分担者は定期的に議論・討議する機会を持ち、2016年7月にメルボルン大学にて開催されたパフォーマンス・スタディーズ・インターナショナル(PSi)に参加し、研究分担者が企画したパネルにおいて共同発表を行った。2017年6月にハンブルクで開かれるPSiの年次大会においても同様に、同一パネルにおいて共同で学会発表を実施する予定である。同時に、日本におけるドラマトゥルギーの研究と実践の発展にも寄与すべく、日本ドラマトゥルク連絡会にもともに参加を継続した。また、研究分担者は梅田宏明や畑澤聖悟らの稽古場・ワークショップにも定期的に参加し、日本各地(東京、横浜、静岡)で開催される演劇祭、山口情報芸術センターおよび城崎国際アートセンターの文化施設、楽塾およびさいたまゴールドシアターのシニア劇団を視察調査した。その成果として、研究分担者は上記のPSiメルボルン大会においてパネルを企画し、同パネルで研究代表者とともに発表を行ったほか、2017年度にもさらに3つの国際学会(PSiハンブルク大会を含む)において口頭で成果を発表する予定である。英語で1本の論文がすでに出版され、2本が出版される予定であり、ハンガリー語で1冊の共編著を出版し、同書に1本の論文が掲載されている。さらに研究分担者は、JSPSが主催するサイエンス・ダイアローグに参加し、豊島岡女子学園高等学校にて英語でレクチャーを行った。28年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度には、研究代表者と研究分担者は共同して、まず6月に、代表者のゼミに出席している大学院生向けに、身体性に対する意識を高めることを目的としたワークショップを実施した。12月にはニューヨーク市立大学シーガル・センターで開催された国際シンポジウム「パフォーマンス・ロボット・ドラマトゥルギー」に参加し、同じパネルにおいて共同発表を行った。さらに3月には、早稲田大学におけるトリアー大学・神戸大学との3大学共同国際研究集会においても、「ノンヒューマン・パフォーマンスの詩学」と題して、共同発表を行った。2016年7月にメルボルン大学で開催される国際パフォーマンス学会(PSi)の大会においても共同発表を行うべく、定期的に議論する機会を持ち、準備を進めているところである。同時に、日本におけるドラマトゥルギーの研究と実践の発展にも寄与すべく、日本ドラマトゥルク連絡会にもともに参加している。また、研究分担者は単独で、平田オリザや長内真理らの稽古場にも定期的に観察者として参加し、長内真理、石黒浩にインタビューを行い、日本各地(東京、横浜、京都、利賀)で開催される演劇祭を視察調査した。その成果として、8月末に国際パフォーマンス学会において、英語で学会発表を行い、英語で2本の論文(出版済みないし出版確定)、ハンガリー語で2冊の共編著を出版し、4本の論文(共編著書に掲載された論文2本を含む、すべて出版済み)を執筆した。また、JSPSが主催するサイエンス・ダイアローグに参加し、法政女子高等学校にて英語でレクチャーを行った。2015年度中には、早稲田大学において大学院生向けのワークショップを共同で実施、ニューヨーク市立大学での国際シンポジウムにおいて共同発表を行い、早稲田大学におけるトリアー大学・神戸大学との3大学共同国際研究集会において共同発表を行うなど、当初の計画以上に共同研究は進展していると判断する。2015年度の成果を受けて、いっそう緊密に連携し、共同研究を継続していく。
マクロファージ指向性HIVウイルスのEnvelope蛋白の構造・機能解析

HIVの感染機構の解析ために、BH-10株のgp120のV3領域の細胞膜結合部位をN端と決定した。炎症組織でのトロンビンを含むプロテアーゼによる感染促進作用を明らかにするために、H9/IIIB細胞を種々のプロテアーゼで処理して、gp120/41の機能エピトープの発現をFACSで解析した。その中でトロンビンはV3の反応性を減少させるとともにgp120の補受容体結合部位、CD4結合部位及びgp41の中和エピトープの反応性も増加させた。H9/IIIB細胞とMAGI細胞の融合をもトロンビンは促進させた。これらのことは血中の炎症由来分子であるトロンビンはgp120を活性化させることによりHIVの感染を促進させたと思われる。またpost-fusogenicgp41を認識するモノクローナル抗体(50.69と98.6)陽性gp41が細胞膜上でraftと挙動をともにすることを明らかにした。また、50.69陽性、98.6陽性gp41が細胞表面だけではなく、細胞内にも存在することを示した。また、50.69と、98.6がH9/IIIB細胞表面で特徴的な一方通行の競合を示すことを明らかとし、sCD4処理によるエピトープの変化によってH9/IIIB表面のエンベロープ蛋白にheterogeneityが存在することを示した。カリニ肺炎患者(PCP)と長期生存患者(LTS)血清が50.69、98.6、ならびにgp41三量体特異的抗体T26とどのように競合するのかを検討し、PCPは50.69、98.6抗体とよく競合することをしめし、PCP血清中には抗gp41抗体が多く含まれ、gp41に対する免疫がより強く誘導されていることを示した。一方、T26のH9/IIIB細胞への結合を促進することを示した。これは、PCP血清中のなんらかの成分がH9/IIIB表面のエンベロープ蛋白の、特にgp120の、立体構造変化を促した可能性を示唆する。A.目的HIVが標的細胞に感染する際の二つの受容体とgp41の時空変化の詳細を明らかにした。gp120のV3ループの細胞膜結合領域をV3ループの種々のエピトープを認識する抗体で解析し、結合部位を想定した。また融合にかかわる、gp41のC領域とN領域が作るpost-fusogenic formを認識する抗体50.69を用いて、50.69抗体陽性のgp41の膜上での存在様式をraftとの関係を検討した明らかにした。B.材料・方法細胞結合V3ペプチドの検出:X4ウイルス由来V3 loopの結合はT細胞にとどまらず、補受容体の発現していない細胞(U87,HOS)にもみられた。しかしR5ウイルス由来V3ループの結合は非常に弱かった。さらにV3 loopの様々なエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用し、細胞に結合したV3ペプチを検出した。V3 loopのどの領域が細胞膜に結合するかを検索した。mAb IIIB-V3-21を除くすべての抗体が細胞膜表面に結合した。ELISAプレート上のペプチドには全ての抗体が反応した。50.69抗体陽性細胞の検出:50.69抗体陽性gp41をホルマリンで固定し、saponin処理したH9/IIIB細胞を用いて検索した。

RaftsをコレラトキシンFITCで蛍光し、50.69と二重染色したところ、両者は一致した。C.結果HIVの感染機構の解析ために、BH-10株のgp120のV3領域の細胞膜結合部位をN端と決定した。またpost-fusogenicgp41を認識するモノクロナル抗体(50.69)陽性gp41が細胞膜上でraftと挙動をともにすることを明らかにした。これらよりHIVの感染にはgp120とgp41の立体構造とその変化を勘案しながら、より詳細な研究が必要である。特にV3ループのN端に重要な活性があることが他でも知られているのでその結合分子についても解析したい。Post-fusogenic抗体を認識するgp41を認識する抗体がraftに存在するgp41に反応することより、その意義について更なる研究が必要である。HIVは感染個体の免疫不全を招来するが、初期に感染するウイルス(R5ウイルス)の標的細胞は組織の樹状細胞かマクロファージである。また著明なCD4細胞の減少の背景にはこれらの細胞群へのR5ウイルスの感染があるとの主張もされている。さらにHIV associated dementia(HAD)の発症機構にもマクロファージやそれから由来するグリア細胞へのHIV感染が関与している。しかしながら、これらの細胞へのR5ウイルスの感染はT細胞株特異的なHIV(X4ウイルス)のそれにくらべ中和抗体、可溶性CD4,T20に抵抗性である。一年間R5ウイルスをPM1細胞株に感染した樹立株を得ようとしているが、成功していない。既に存在するH9/IIIB及び/MN上にて可溶性CD4により抗V3 KD-247(村上博士化血研)447-52D(Zolla-Pazner博士)、CD4結合部位に対する抗体IgG1b12、CD4により誘導されるケモカイン受容体結合部位に対する抗体17b(NIH)、またZolla-Pazner博士よりV2に対する抗体830-A、1357-D、215、gp41の融合殻構造に対する抗体50.69; Immunodominatepitopeに対する抗体246-D、また前構造に対する抗体2F5(NIH)に対する抗原変化を検出し、新たな知見を得ている。一方でカリニ肺炎を合併したエイズ患者由来のウイルスを国立仙台病院・国立感染研と共同で分離し、解析している。それらの指向性とEnv遺伝子の塩基配列をもとに、その中でR5ウイルスとX4ウイルス)の異なる点を明らかにする。また予備実験ではR5/X4のウイルスが検出できている。HIVを構成する蛋白に対する免疫と予後の相関にはさまざまな報告があるが、gp41のcore structure領域に対する免疫に関しては未だに報告がない。H16年度に我々は、HIV感染長期生存患者(Long time survivors ; LTS)とカリニ肺炎患者(pneumocystis carinii patients ; PCP)血清を用いて、抗gp41 core structure抗体と競合実験を行った。これによって、PCP血清はLTS血清に比べて抗gp41免疫のcore structureを構成する領域に対する抗体とよく競合し、特にsix-helix bundle特異的な抗体とより競合することがわかった。したがって、PCPはこの構造に対して強い免疫を持つことになり、今後の方向性としては、予後との相関や免疫の誘導に関心が持たれる。
準線形双曲・楕円型連立方程式系の初期値問題に関する研究

輻射気体の運動を記述する方程式系およびそれを含む一般の双曲・楕円型連立系の初期値問題について組織的な研究を行い、以下のような成果をあげた。最簡約版モデルである非粘性Burgers方程式と楕円型方程式の連立系に関して:1.古典解が有限時間で爆発するための十分条件、並びに、古典解が時間大域的に存在するための十分条件を、いずれも初期値の導関数の下限に関する条件として定式化した。2.Sobolev空間に属する滑らかな時間大域解の存在を示し、その解の減衰評価を求めた。さらに、その解が粘性Burgers方程式の自己相似解を用いて定義される拡散波に漸近することを示した。3.非粘性Burgers方程式の有心希薄波を用いて系の希薄波の定義を与え、さらにその希薄波の漸近安定性をその摂動の減衰率も込めて示した。4.進行波形の衝撃波の存在を示すとともに、強い衝撃波は不連続衝撃波を内在すること、一方、弱い衝撃波はその弱さの程度に応じて高い微分可能性をもつことを明らかにした。さらに滑らかな衝撃波の漸近安定性をその摂動の減衰率も込めて示した。5.衝撃波に対応するRiemann問題の弱解の時間大域的存在を示した。さらに、その弱解の不連続点における跳びが指数的に減衰し、解は時間無限大において滑らかな衝撃波に漸近することを示した。一般の双曲・楕円型連立系に関して:6.エントロピー関数の数学的定義を与え、エントロピー関数の存在と系の対称化可能性の同値性を示した。次に系の安定性条件を定式化し、その条件の下、Sobolev空間に属する滑らかな時間大域解の存在とその減衰評価を示した。さらにその解が対応する双曲・放物型連立系の解で漸近的に近似出来ることを明らかにした。これらの結果は輻射気体の方程式系に応用可能である。本研究の初年度である平成7年度は、最簡約版モデルである非粘性Burgers-Helmholtz連立系の初期値問題について研究を行い、多くの新しい結果を得た。具体的には、次の通りである。1.解が有限時間で爆発するための十分条件、並びに、滑らかな解が時間大域的に存在するための十分条件を求めた。2.Sobolev空間に属する滑らかな時間大域解の存在を示し、その解の時間無限大での減衰評価を得た。さらに、その解が時間無限大で、粘性Burgers方程式の自己相似解を用いて表される拡散波に漸近することを示した。3.希薄波の漸近安定性を示した。すなわち、初期値が希薄波からの摂動である場合に解が時間大域的に存在し、しかも、時間無限大においてその希薄波に漸近することを示した。最簡約版モデルである非粘性Burgers-Helmholtz連立系に対しては、当初に計画した課題(解の時間大域的存在、減衰評価、拡散波・希薄波・衝撃波の漸近安定性)のうち、衝撃波に関する事項を除けば、上記の通り、ほぼ完全に研究目的を達成することができた。特に、当初の計画にはなかった解の有限時間での爆発に関する結果が得られたことは、予期せぬ成果であった。輻射気体の運動を記述する圧縮性オイラー方程式と楕円型方程式の連立系、および、その最簡約版モデル方程式系に関連して研究を行い、以下のような成果をあげた。1)最簡約版モデル方程式に対し希薄波の漸近安定性を示した。

希薄波は非粘性バーガース方程式の有心希薄波を用いて定義される。その安定性の証明では、希薄波の滑らかな近似を利用するが、その近似を粘性バーガース方程式のリーマン問題の厳密解を用いて構成した。この厳密解の高階までの導関数の詳細な評価を与え、それを基に、希薄波の漸近安定性をその摂動の減衰率も込めて示すことに成功した。従来の近似法では速度成分の安定性がいえるだけであったが、本近似法はその欠点を補い、減衰率の高い熱流成分の安定性をも示すことを可能にした。本近似法は、類似の系の希薄波の漸近安定性の解析に広く応用できるものと期待される。2)同じ最簡約版モデル方程式に対し、進行波形の衝撃波の存在とその漸近安定性を示した。まず、強い衝撃波は不連続衝撃波を内在すること、弱い衝撃波はその弱さの程度に応じて高い微分可能性をもつことを確かめた。これは進行波形の衝撃波に関してこれまでに知られていなかった現象であり、興味ある結果といえる。さらに、3階微分可能な衝撃波は常に漸近安定であることを、その摂動の減衰率も込めて示すことに成功した。3)圧縮性オイラー方程式と楕円型方程式の連立系を特別な場合として含む、一般の双曲-楕円型連立系についても、その一般的な枠組みを設定することを試みた。これに関して、局所解の存在、大域解の存在とその漸近挙動、双曲-方物型連立系による近似等の事項について、本研究の最終年である来年度においてまとまった成果をあげるめどがたった。輻射気体の運動は圧縮性Euler方程式と熱流に対する楕円型方程式の連立系で記述される。その最簡約版モデルは非粘性Burgers方程式と楕円型方程式の連立系である。本年度はこれらの方程式系とそれらを含む一般の双曲・楕円型連立系に対して総括的な研究を行い、以下のような成果をあげるとともに、国内外の研究集会に積極的に参加し本研究成果の発表を行った。1.最簡約版モデルである非粘性Burgers方程式と楕円型方程式の連立系に対し、1点でのみ跳びをもつ階段関数を初期値とするリーマン問題を考察し、その弱解の時間大域的存在と時間無限大における漸近挙動を明らかにした。すなわち、初期値の不連続点における跳びが小さければ弱解が時間大域的に存在し、しかもその弱解の不連続点の集合は時間・空間平面上の1直線になることを示した。さらに、解の不連続点における跳びは時間とともに指数的に減衰し、時間無限大において、解は滑らかな衝撃波形の進行波解に漸近収束することを示した。2.一般の双曲・楕円型連立系に対する初期値問題を考察し、時間大域解の存在と時間無限大における漸近挙動を明らかにした。まず、エントロピー関数の数学的定義を与え、エントロピー関数の存在と系の対称化可能性の同値性を示した。次に、この事実に基づき系に対する安定性条件の下で、Sobolev空間に属する小さい初期値に対する時間大域解の存在を示した。また、対応する線形系の半群の減衰評価を求め、それを利用して解の時間無限大における減衰評価を与えた。さらに、その減衰評価を利用して、解が対応する双曲・放物型連立系の解で漸近的に近似出来ることを明らかにした。これらの結果はすべて輻射気体の方程式系に応用可能である。
老化による神経軸索変性とその遺伝子及び栄養操作による救助

老化促進マウスのSAMP10とklotho変異マウス、さらに脳卒中易発症性高血圧ラット(SHRSP)を用いて、中枢神経系の神経細胞、特にその軸索の変性に注目して形態学的生化学的に解析し、老化促進マウス及び脳卒中の発症頻度が高くなる生後半年以降のSHRSPでは軸索のニューロフィラメント(NF)、ライソソームなどの細胞小器官の蓄積による軸索の膨化が目立ち、変性像を示すことがわかった。赤ワインポリフェノールが老化及び老化関連疾患にどのような影響を与えるか、赤ワイン、日本酒及び純粋のエタノール(すべてエタノール濃度は14%)投与で比較した結果、有意に赤ワインが細胞老化像と類似した神経変性像の出現を遅延させることがわかった。他のポリフェノール類のウコンをエタノールに混入し投与した場合でもアルコールの細胞障害作用の有意な緩和がみられ、抗酸化作用を有するポリフェノールの細胞老化及び老化関連細胞障害に対する抑制効果が細胞レベルで初めてわかった。klotho変異マウスは約2ヶ月の寿命のため、老化症状を示すかどうか明確でなかったが、klotho遺伝子の過剰発現で有意に寿命が延びることが示されたので、このマウスの中枢神経細胞の性質を老化と対応させて詳細に解析した。ニューロン及びグリア細胞発現蛋白質の中で、老化に伴い発現が増加する細胞骨格系、ライソソームプロテアーゼ、オートファジー関連蛋白質及び細胞死促進蛋白質の増加し、さらに老化で発現が減少する微小管関連蛋白質、シナプス小胞関連蛋白質、細胞死抑制蛋白質及び細胞分裂関連リン酸化酵素は減少することがわかった。形態学的にも神経細胞での細胞骨格系の変化、ライソソームの分布密度の増加及びシナプス関連構造の減少がみられ、また星状膠細胞ではグリアフィラメントの増加がみられ、この変異マウスが細胞レベルで老化の特徴を示すことがわかった。老化促進マウス(SAM P10)の神経細胞がアルコール投与により、構造及び性質がどのように障害され、その障害をポリフェノールなどの植物化学物質(フィトケミカル)で予防あるいは抑制できるかを解明する一環として、本年度はアルコールの影響を直接に受ける肝臓の変化について解析した。まず酒類の中で最もポリフェノールを豊富に含む赤ワインの肝細胞への影響について、他のアルコール類、すなわち日本酒と純粋のエタノールとをエタノール濃度を一定にして比較検討した。その結果、アルコールによる肝細胞の障害程度、すなわち脂肪滴や核小体の増加の程度が赤ワインで最も少なく、日本酒とエタノールではほぼ同程度の著しい肝細胞の障害性変化がみられた。従って、赤ワイン投与では肝細胞へのアルコールによる障害を赤ワインのポリフェノールが抑制することが示唆される。さらに、遂行中であるが、このマウスの小脳プルキンエ細胞の変化も肝細胞同様、他のアルコール類に比べて、赤ワインでその障害程度が減少していることがわかった。今回は飲料水の代わりにアルコール類を連続的に投与したが、飲料水を与えながら適量の赤ワインを投与すれば、神経細胞の加齢的変化を遅らすことが期待される。次にアルコールの障害作用を抑制すると言われているポリフェノールの一種であるウコンの老化あるいは変性神経細胞に対する効果を解析する目的で、アルコール投与の肝臓でどのような効果があるかを検索した。この場合は純粋の希釈エタノールのみを用い、エタノールのみ投投したものとエタノールとウコンを同時投与したものを比較した。その結果、ウコンをアルコールと同時投与すると、肝細胞の脂肪滴の増加やディッセ腔への膠原線維の出現などのアルコール障害作用が有意に抑制された。神経細胞での変化は現在解析を開始しているが、赤ワインの場合と同様の結果が予想される。従って、アルコールなしでウコン単独投与であれば、神経細胞の老化や変性さらには細胞死を抑制できることが示唆される。老化促進

マウスのSAMP10とklotho変異マウス、さらに脳卒中易発症性高血圧ラット(SHRSP)を用いて、中枢神経系の神経細胞、特にその軸索の変性に注目して形態学的生化学的に解析し、老化促進マウス及び脳卒中の発症頻度が高くなる生後半年以降のSHRSPでは軸索のニューロフィラメント(NF)、ライソソームなどの細胞小器官の蓄積による軸索の膨化が目立ち、変性像を示すことがわかった。赤ワインポリフェノールが老化及び老化関連疾患にどのような影響を与えるか、赤ワイン、日本酒及び純粋のエタノール(すべてエタノール濃度は14%)投与で比較した結果、有意に赤ワインが細胞老化像と類似した神経変性像の出現を遅延させることがわかった。他のポリフェノール類のウコンをエタノールに混入し投与した場合でもアルコールの細胞障害作用の有意な緩和がみられ、抗酸化作用を有するポリフェノールの細胞老化及び老化関連細胞障害に対する抑制効果が細胞レベルで初めてわかった。klotho変異マウスは約2ヶ月の寿命のため、老化症状を示すかどうか明確でなかったが、klotho遺伝子の過剰発現で有意に寿命が延びることが示されたので、このマウスの中枢神経細胞の性質を老化と対応させて詳細に解析した。ニューロン及びグリア細胞発現蛋白質の中で、老化に伴い発現が増加する細胞骨格系、ライソソームプロテアーゼ、オートファジー関連蛋白質及び細胞死促進蛋白質の増加し、さらに老化で発現が減少する微小管関連蛋白質、シナプス小胞関連蛋白質、細胞死抑制蛋白質及び細胞分裂関連リン酸化酵素は減少することがわかった。形態学的にも神経細胞での細胞骨格系の変化、ライソソームの分布密度の増加及びシナプス関連構造の減少がみられ、また星状膠細胞ではグリアフィラメントの増加がみられ、この変異マウスが細胞レベルで老化の特徴を示すことがわかった。
骨の老化予防に対するビタミンCの効果

ビタミンC投与が、軟骨における成熟架橋ピリジノリンの生成に対しどのような影響を有するかを調べ、骨の老化予防におけるビタミンCの有効性を探ることを目的とした。まず、加齢に伴う軟骨ピリジノリン量と血漿中ビタミンC量の変化を調べ、さらに、ビタミンC投与の有無による軟骨ピリジノリン量の変化を測定した。1)加齢に伴う軟骨ピリジノリン量と血漿中ビタミンCの変化:ビタミンCを生合成できないモルモットを実験動物として用い、市販固形飼料で2-24週間飼育後軟骨コラーゲン中のピリジノリン生成量および血漿中のビタミンCの経時的変化を調べた。この結果、軟骨のピリジノリンは10週齢までの成長期において急速に増加し、10週齢以降の成熟期には減少傾向を示した。一方、血漿中のビタミンCは成熟架橋の変化と同様に成長期に増加、成熟期以降は徐々に減少した。2)ビタミンC投与の有無による軟骨ピリジノリン量の変化:成長期および成熟期モルモットを投与および無投与の2群に分けビタミンC欠乏飼料で4週間飼育を行った。投与群にはビタミンC5mg/日を経口投与した。この結果、成長期においては軟骨ピリジノリン量は無投与群で有意に高い値を示したのに対し、成熟期ではビタミンC投与の有無は軟骨ピリジノリン量に顕著な影響は示さなかった。以上、成熟架橋が急速に生成される成長期においてはビタミンCの投与によりピリジノリン生成が抑制されたことから、ビタミンCが過度の架橋生成を調節する可能性が推察された。
皮質脊髄シナプスの可塑的発達

我々はラット感覚運動皮質と脊髄のスライスを共培養し、皮質脊髄路をin vitroで再構築することに成功し、皮質脊髄シナプスが当初脊髄全体に形成されるが、その後腹側のシナプスがNMDA依存的、更にGluRε2(NR2B)依存的に除去されることを示した。また同様のシナプス除去がマウス培養系とラットin vivoでも生ずることを示している。これまでシナプス活動とその発達をフィールドEPSPの変化として捉えてきたが、今回、膜電位感受性色素(Di-4-ANNEPS)を用いて膜電位の空間的分布を直接記録し、7-11 DIVにおける腹側からのシナプス除去を確認した。更に薬理実験と組合わせて、発達に伴いNMDA受容体がNR2BからNR2Aにシフトすることを示した。また、前年度に引き続き、GluRε2(NR2B)KOマウス(東大薬理・三品教授から分与)由来と野生型由来のスライス共培養系を用い、皮質ではなく脊髄のε2受容体が必須の関与をしていることを示した。しかし、ε2KOマウスでは、そもそもNMDA受容体がすべて出現しない可能性も示唆されていたが、εI(NR2A)と考えられる受容体が少なくとも皮質脊髄シナプスには発現することをホールセル記録により示し、シナプス除去に対するε2の特異的関与を確認した。皮質脊髄軸索を生きたまま標識してその腹側からの撤退過程をみるため、EYFP発現プラスミドを皮質スライスに遺伝子導入して、レーザー共焦点顕微鏡でライブ観察した。撤退の様式には退縮(retraction),切断(autaxotomy),変性(degeneration)の少なくとも3種類があることがわかった。退縮は約9μm/hのほぼ一定した速度で間歇的に起こること、軸索の分岐点まで退縮することが多いが、分岐点を超えることはないことが示された。変性とはEYFPが4μmほどの周期的な数珠状構造を形成し、その輝度が増減を繰り返しつつ消失していく、全過程が2-3時間の速い変化である。この特徴的な変性過程はこれまで報告されておらず、また切断を軸索撤退の過程として実時間的に捉えたのも今回の我々の観察が初めてである。我々はラット大脳運動感覚皮質と脊髄のスライスを共培養することにより皮質脊髄投射をin vitroで再構築し、皮質脊髄シナプスが当初(6-7 DIV)脊髄全体に形成されるが、後に(-11 DIV)胆側のシナプスが除去されること、このシナプス除去はNMDA依存的であり、軸南側枝の除去を伴っていることを示した。同様のシナプス除去、軸索撤退がin vivoラットにおいても生じていることも示した。また、このシナプス除去の後に、神経支配の第二波ともいうべき、最初の神経支配より更に大きい軸索の増生かあることを見出している。今年度、我々は、遺伝子改変動物を用いるため、マウス由来のin vitroスライス培養系を導入し、この系でも基本的に同様の時間経過をもった可塑的シナプス形成があることを確認した。更に、NMDA阻害剤APVのみならず、GluRε2(2B)特異的阻害剤によってシナプス除去が阻害されることから、NMDA受容体のうち、このタイプの受容体が重要であることを確認した。そこで、GluRε2KOマウス(東大薬理・三品教授から分与)と野生型(WT)マウス由来のスライスを用いて培養すると、皮質(KO)一脊髄(WT)の組合せではシナプス除去が生じるが、皮質(WT)一脊髄(KO)の組合せではシナプス除去が生ぜず、皮質ではなく、脊髄におけるGluRε2が本質的に重要であることが示唆された。in vivoラットにおける神経支配の第二波について、定量的な順行性標識を行い、P13頃から始まり、P18頃にはほぼプラトーに達しすることがわかった。単一二ューロン軸索のトレーシングを行って第一波と第二波の軸索の変化を比較すると、第二波は脊髄内分枝の増加によることが示唆された。また、P7、P10、P15のラットの脊髄急性スライスで、膜電位感受性色素によって皮質脊髄シナプス応答を調べた。P7からP10にかけ、腹側のシナプス応答が減弱して、胆側からのシナプス除去が裏づけられた。またP10からP15にかけて再度胆側のシナプス応答が強まり、また背側のシナプス応答も更に増大し、第二波の軸索増生かシナプス増生を伴っていることが示された。

しかし、ε2KOマウスでは、そもそもNMDA受容体がすべて出現しない可能性も示唆されていたが、εI(NR2A)と考えられる受容体が少なくとも皮質脊髄シナプスには発現することをホールセル記録により示し、シナプス除去に対するε2の特異的関与を確認した。皮質脊髄軸索を生きたまま標識してその腹側からの撤退過程をみるため、EYFP発現プラスミドを皮質スライスに遺伝子導入して、レーザー共焦点顕微鏡でライブ観察した。撤退の様式には退縮(retraction),切断(autaxotomy),変性(degeneration)の少なくとも3種類があることがわかった。退縮は約9μm/hのほぼ一定した速度で間歇的に起こること、軸索の分岐点まで退縮することが多いが、分岐点を超えることはないことが示された。変性とはEYFPが4μmほどの周期的な数珠状構造を形成し、その輝度が増減を繰り返しつつ消失していく、全過程が2-3時間の速い変化である。この特徴的な変性過程はこれまで報告されておらず、また切断を軸索撤退の過程として実時間的に捉えたのも今回の我々の観察が初めてである。
麻酔・疼痛シグナル伝達におけるイオンチャネルとイオン・トランスポーターの制御機構

過去の10年間の神経化学の発達に相応し、疼痛の受容・制御機構や麻酔薬の作用機序に関してさまざまな面からの研究成果が報告されているが、本研究で意図している課題『麻酔・疼痛シグナル伝達におけるイオンチャネルとイオン・トランスポーターの制御機構』に関する研究は極めてわずかである。局所麻酔薬のリドカインなど様々な作用をもつ薬が、中枢神経系ニューロンのNa+チャネルに作用し麻酔作用を発揮するとともに、難治性のニューロパッシクペインに効果があるとの報告が散見されているが、その疼痛伝達シグナル機構への作用機序は明らかではない。本研究は動物実験、DRGニューロンを用いたパッチクランプ法、細胞内シグナル分子MAPキナーゼのリン酸化の3つの方法を用いて研究を行った。ラット脊髄後根神経節(DRG)細胞のNa^+チャネルの活動に対する、のTTX抵抗性Na^+チャネルの活動に対する影響と、NMDA受容体拮抗薬、ketamine, dextromethorphan, idenprodilのTTX抵抗性、感受性Na+チャネル活動に対する影響を観察した。上記NMDA受容体拮抗薬はいずれもTTXRNa^+チャネルの活性を投与量依存的に抑制した。臨床で使用可能なNa+チャネルブロッカー、NMDA受容体拮抗薬のいずれも、疼痛シグナル伝達の制御に影響していると示唆される。麻酔薬ロピバカインとブピバカインが、ERKリン酸化を与える影響を、光学異性体による違いがあるかを検討し、光学異性体による異なりは観察されなかった。ATP感受性K+チャネル作動薬は、MAPKカスケードの内、主に細胞増殖刺激により活性化されるERKを賦活する。局所麻酔薬、ロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子PLDの活性へ影響し、またその異性体の細胞内シグナル伝達タンパクのリン酸化への影響は、局所麻酔薬によっては異なるが、その光学異性体のMAPKのリン酸化に対する影響は同じであるとの結果を得た。痛みの制御機構に関しては細胞内シグナル蛋白、特にMAPキナーゼが役割を演じていると示唆される。神経系の機能は、脳・脊髄のニューロンやシナプスのイオンチャネルや受容体の活性よる神経伝達物質遊離を介するシグナル伝達機構によって維持される。しかし、Na^+、Ca^<2+>、K^+チャネルなどの知見に比して、イオン調節機構であるNa^+-K^+、Na^+-H^+、Na^+-Ca^<2+>の麻酔や疼痛受容機構における知見は極めて少ない。中枢神経系内のこれらのイオン交互輸送システムの、麻酔薬の作用や疼痛受容」の神経伝達機構における役割は全く明らかではない。研究者らは、ラットの使用して、細胞内外のNa^+とK^+の濃度を一定にしている細胞膜にある重要な膜蛋白であるNa^+,K^+-ATPaseが脊髄鎮痛シグナルを関与する(Zeng W, Dohi S et al. : Anesthesiology 1999)の報告に引き続いて、Na^+-K^+-2Cl^-、Na^+-Ca^<2+>が脊髄における疼痛伝達シグナルへの影響を検討した。Na^+-H^+の阻害薬(アミロライド)は投与量に依存して抗侵害効果を発揮した。-方、Na^+-K^+-2Cl^-cotranspoterの阻害薬であるフロセミドには抗侵害作用はなく、むしろ痛覚過敏作用を呈した。細胞内のK^+濃度は細胞によって大きな差はないが、Cl^-の濃度は神経細胞内では4mmol、血液細胞では100mmolである。

Cl^-の細胞内濃度は電気化学的な平衡状態からかなりはずれているが、これをNa^+-K^+-2Cl^-cotranspoterのsymportの働きによってCl^-を細胞内移動させる。ループ性利尿薬(furosemide、bumetanide)は、この阻害薬である。腎臓でのNa^+再吸収やCl^-の調節、呼吸系の上皮細胞のボリウムや分泌細胞の塩と水分の調節に重要な役割を演じているが、中枢神経系にも存在し、神経系では細胞内のCl^-の濃度の調節、それ故GABAの神経系反応に影響すると推測されている。しかしながら、私どもの使用した濃度では脊髄レベルで痛覚過敏状態をきたしたのは、抑制系の神経伝達物質ではGABAに機能に何からの影響を与えたと推測される。ウアバイン受容体は中枢神経系内に幅広く分布していることが示されており、また、脊髄後根神経節ニューロンにも分布しサブタイプの機能に関しても研究されている^<19)>。Na^+-H^+ antiporterやNa^+-K^+-2Cl^-cotranspoterの中枢神経系内での作用は今後の研究を待たなくてはならないが、Na+ポンプ(Na^+-K^+ ATPase)と同様、さまざまなホルモンや神経伝達物質の遊離を調節している可能性があり、チャネル蛋白などリン酸化を調停など、疼痛制御機構におけるさまざまな役割が明らかになってくるものと期待される。神経系の機能は、脳・脊髄のニューロンやシナプスのイオンチャネルや受容体の活性よる神経伝達物質遊離を介するシグナル伝達機構によって維持される。しかし、Na^+、Ca^<2+>、K^+チャネルなどの知見に比して、イオン調節機構であるNa^+-K^+、Na^+-H^+、Na^+-Ca^<2+>の麻酔や疼痛受容機構における知見は極めて少ない。中枢神経系内のこれらのイオン交互輸送システムの、麻酔薬の作用や疼痛受容」の神経伝達機構における役割は全く明らかではない。本年度は、ラットの使用して、Na^+-Ca^<2+>が脊髄における疼痛伝達シグナルへの影響を検討した結果、Na^+-H^+の阻害薬(アミロライド)は投与量に依存して抗侵害効果を発揮した。一方、Na^+-K^+-2Cl^- cotranspoterの阻害薬であるフロセミドには抗侵害作用はなく、むしろ痛覚過敏作用を呈した。細胞内のK^+濃度は細胞によって大きな差はないが、Cl^-の濃度は神経細胞内では4mmol、血液細胞では100mmolである。Cl^-の細胞内濃度は電気化学的な平衡状態からかなりはずれているが、これをNa^+-K^+-2Cl^- cotranspoterのsymportの働きによってCl^-を細胞内移動させる。腎臓でのNa^+再吸収やCl^-の調節、呼吸系の上皮細胞のボリウムや分泌細胞の塩と水分の調節に重要な役割を演じていると結論できる。また神経系では細胞内のCl^-の濃度の調節、それ故GABAの神経系反応に影響すると推測されている。