hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄間葉系幹細胞と多血小板血漿を用いた新しい低侵襲半月板修復促進法の開発

実験1.日本白色家兎を用いて内側半月板の内側2/3に3mm縦断裂を作製した。左膝を多血小板血漿(以下、PRP)群とした。断裂部をnylon糸1針で縫合し、PRPをCaCl2で活性化したのちに、液体状態で縫合部に塗布させたもの(Liquid群)、ゲル状態で縫合部直上に留置したもの(Gel群)で分けた。Liquid群4羽、Gel群4羽を12週で屠殺し、肉眼的および組織学的評価を行った。肉眼的評価はmodified Miguel's scoringsystemを用い、Liquid群、Gel群で差はなかった。組織評価はIshida's scoringsystemで行い、修復は両群とも得られなかった。過去の動物実験での半月板損傷モデルから、パンチ欠損モデルに変更して検討することとした。現在結果を解析しているが、今年度中に解析が完了できなかったため、結果は次年度中に論文誌上での公表を見込んでいる。2016年度は家兎半月板損傷モデルの作製を行った。予定していた半月板損傷モデルは内側半月板の前節、中節、後節に損傷を作製するであったが、家兎膝関節を最大屈曲位としても半月板の中節および後節を視野内に露出することは難しく、前十字靱帯や後十字靱帯を切離して関節を亜脱臼させることで半月板全周が露出することが明らかとなった。日本白色家兎だけではなくニュージーランド白色家兎、各種家兎の週数齢別で同様の実験を行ったが同じ結果であった。日本白色家兎の方がニュージーランド白色家兎より同じ週数齢では半月板が大きかったため、日本白色家兎を用いる方針とした。週数齢については、骨格的に成熟した13-17週のうち3.5 kg以上となっても半月板自体の大きさは変わらなかったため3.0 kg前後の家兎を選択することとした。靱帯の切離や関節の亜脱臼操作は生体内に及ぼす侵襲が大きく、多血小板血漿のみによる半月板修復効果を判断するのが困難であると考え、内側半月板前節に縦断裂を作製するモデルとした。ヒト半月板は一般に関節包側の一部しか血流のない組織であることが明らかとなっている。家兎の半月板が同様の解剖学的構造かどうかを評価するために、大腿静脈よりブルーインクを注入、灌流し家兎半月板の血行分布を評価中である。この結果をもとに、縦断裂を作製する部位を決定する。家兎の半月板の先行研究では、血流のない内側半月板前節に縦断裂を作製した場合、自然経過及び縫合術を行っても治癒しないと報告されている。臨床的には半月板縫合術のオーグメンテーションとしてフィブリンクロットが使用されており、家兎半月板縦断裂モデルにフィブリンクロットを使用した群と多血小板血漿を使用した群とで比較し、半月板単独損傷に対する半月板治癒促進効果を評価する。1.内側半月板前節に縦断裂を作製するモデルを設定した。2.縦断裂の作製部位は、半月板への血行分布を評価した後に無血行野に作成することとし、現在、ブルーインクを血管注入し組織学的に検討中である。2017年度は日本白色家兎の内側半月板前節に縦断裂を作製し、その自然治癒過程と縫合群、多血小板血漿治療群で修復過程を組織学的に比較した。家兎の半月板が同様の解剖学的構造かどうかを評価するために、大腿動脈よりブルーインクを注入灌流し家兎半月板の血行分布を評価したところ、内側2/3が無血流野であることを確認した。骨格的に成熟した12-16週で2.8-3.5kgの家兎を用いて内側半月板の内側2/3に3mm縦断裂を作成した。右膝は断裂のみ作成し、左膝は縫合群と縫合+多血小板血漿群に分けた。縫合は、inside-out法でnyron糸1針の垂直縫合とした。多血小板血漿はCaCl2で活性化してmembraneの状態にしてnyron糸に通して断裂直上に設置した。8、12週で屠殺し、マクロと組織で評価を行った。途中経過であるが、縫合群は8週2匹、12週1匹、縫合+多血小板血漿群は8週5匹、12週7匹まで行った。マクロ評価は、modified Miguel's scoringsystemを用い、縫合群は3点が1匹、0点が2匹、縫合+多血小板血漿群は3点が2匹、0点が10匹であった。組織評価をIshidaらによるscoringsystemで行ったが、断裂部に細胞は充填されておらず、縫合群3匹、縫合+多血小板血漿群12匹ともに0点であった。家兎半月板の先行研究では、血流のない内側半月板前節に縦断裂を作製した場合、自然経過及び縫合術を行っても治癒しないと報告されている。本研究では、家兎半月板縦断裂モデルに縫合ののち多血小板血漿を使用しても治癒促進効果は得られていない傾向にあった。この要因としては、多血小板血漿をmembraneの状態で使用していることにより成長因子が十分含まれていない可能性がある。多血小板血漿を活性化したのちclot化した状態で半月板断裂に使用できるようなモデルを再考中である。1.内側半月板前節の内側2/3に縦断裂を作製するモデルを設定した。

2.縫合群と縫合+多血小板血漿群を行い、組織学的に検討を行った。実験1.日本白色家兎を用いて内側半月板の内側2/3に3mm縦断裂を作製した。左膝を多血小板血漿(以下、PRP)群とした。断裂部をnylon糸1針で縫合し、PRPをCaCl2で活性化したのちに、液体状態で縫合部に塗布させたもの(Liquid群)、ゲル状態で縫合部直上に留置したもの(Gel群)で分けた。Liquid群4羽、Gel群4羽を12週で屠殺し、肉眼的および組織学的評価を行った。肉眼的評価はmodified Miguel's scoringsystemを用い、Liquid群、Gel群で差はなかった。組織評価はIshida's scoringsystemで行い、修復は両群とも得られなかった。過去の動物実験での半月板損傷モデルから、パンチ欠損モデルに変更して検討することとした。現在結果を解析しているが、今年度中に解析が完了できなかったため、結果は次年度中に論文誌上での公表を見込んでいる。2017年度は、日本白色家兎の内側半月板前節に縦断裂を作製し、その自然治癒過程と多血小板血漿治療群、フィブリンクロット治療群で修復過程を組織学的、生化学的に比較する。2018年度は予定した数まで評価を進め、統計学的に評価を行う。また、多血小板血漿によって得られると予想した結果外であった場合は、年度前半期までに損傷モデルの再考を行う。多血小板血漿をclot化すること、縦断裂の損傷部位を関節包側にすること、パンチ欠損モデルを検討している。半月板損傷モデルを作製するにあたって家兎の購入を見込んでいたが、予定の羽数に達しなかったため。また、発表に至るまでの結果が集積できなかったため旅費は計上されなかった。理由半月板損傷モデルを作製するにあたって家兎の購入を見込んでいたが、予定の羽数に達しなかったため。使用計画本年度中に日本白色家兎を購入し、実験を進める。本年度中に日本白色家兎を購入し、実験を進める。
緑肥作物クロタラリアは、いつから毒成分を含み飼料として利用できなくなるのか？

線虫抑制効果があり、緑肥作物として利用されているクロタラリア(Crotalaria. juncea L.)の国内での飼料利用に向け、毒成分を含まない期間を明らかにする。特に、開花の斉一性が悪いことから、毒を含むとされる種子が出来る前に収穫するためには、最初の花の開花後から結実までに要する期間と、種子に毒が含まれるようになるまでの期間を明らかにする必要がある。本研究では、栽培試験により開花から莢の熟成に要する期間を明らかにするとともに、収穫物の栄養成分および毒成分分析によりクロタラリアが毒を含むようになる時期を明らかにし、日本国内におけるクロタラリアの飼料作物としての実用開発へつなげる。
看護現場における犯罪被害者への対応の実態およびニーズの検討

犯罪被害者が二次被害を感じることなく医療機関を利用するための要因を、看護師と犯罪被害者の両面から検討した。看護師は犯罪被害者を、看護ケアをする上で研修が必須な存在とするほど重要視していない。犯罪被害者が医療機関に求めるニーズは、被害者特有のニーズと、患者共通のニーズの2つの側面があった。そこで、犯罪被害者を特別でない、患者の個別性のひとつと位置づけた研修を実施することが効果的であると考えられた。21年度は主として医療側、支援者側における犯罪被害者への対応実態、受け入れ経験と心理的受傷などの問題点を明らかにする予定であったが、対象者の確保の関係から、平成22年度に調査を行う予定であった、被害者当事者に対するインタビューと同時並行的に実施することとなった。インタビュー対象者は、医療関係者3名、犯罪被害者5名、犯罪被害支援者6名、合計14名であった。具体的には、犯罪被害者であり、医療者である者に対し、犯罪被害者と医療者の双方の立場における意識や問題点のインタビューを実施した。その際に、複数の犯罪被害者を紹介され、インタビューを実施することとなった。また、被害者と同席した犯罪被害者支援を行っている団体職員からも、被害者の立場から気づいたことなどについて、被害者自身も気づいていない独自の知見を得ることができた。その結果、医療機関における被害者の経験には、被害直後の問題、数年以上経過後にも生じる問題、肯定的な関わり、物理環境的な問題、被害者独自ではなく一般患者にも生じる問題などがあげられた。また、消防の救急職員、患者同士の関わりなど、医療者以外の者との問題などについての言及もあった。さらに、自己の経験のみではなく、問題や傷付きの防止方法などについても話が及んだ。また、被害者自身による出版物、ホームページなどからの情報収集も行った。これらについては、22年度に学会等で発表予定である。なお、インタビューの結果、当初予定していた病院を対象とした調査項目に変更を加える必要が生じ、調査1については、22年度の実施をすることとした。最後に、今回のインタビュー調査自体が、自己の体験を語り、社会への還元につながりうることを、被害者自身は肯定的にとらえており、調査自体が被害者へのサポートにもなっていた。(1)犯罪被害者自身の医療機関における経験について、新潟、富山、大阪で10名を対象に聞き取り調査を実施した。それぞれ、25名の集団インタビュー形式をとるとともに、少年事件など、被害の種類も増やしている。なお、年度末に関東・東北方面の調査を実施する予定であったが、震災の影響により実施できなかったため、数人については、今年度の聞き取りを予定している。昨年までの被害者の経験に関する成果については、第一報として、九州心理学会においてポスター発表を実施した。(2)医療機関における犯罪被害者の経験について、聞き取り調査を実施する以外に、被害者および遺族などが出版した書籍、公開しているホームページを検索して、医療に関係する記述の調査を実施した。現在、それらの記述の集計について検討しているところである。(3)犯罪被害者を受け入れた経験のある医療関係者、自身が被害経験のある医療関係者に、医療機関における対応のあり方について、パイロット段階の聞き取りを実施している。(1)犯罪被害者の医療機関における経験とニーズの聞き取りインタビューについて、遺族がほとんどであったインタビューに、交通事故等で受傷した被害者および被害支援者等へのインタビューを追加した。(2)犯罪被害者等を受け入れた経験のある医療関係者、被害者支援団体にあって医療機関へ入院した被害者への支援を行った相談員への聞き取り調査を実施した。特に、性被害支援看護師へのインタビューから、性被害者の医療機関におけるニーズを追加した。また、高速道路バス事故被害者への支援者へのインタビューから、家族から離れて入院する居住県外において入院した被害者に特徴的なニーズなどを追加した。(3)救急救命センターを有する医療機関に対して、PTSDと関連する被害者等に関する研修および看護師の二次受傷対策に関する調査を実施した。85病棟の有効回答があり、災害支援や終末期医療、患者暴力についての研修は多いが、犯罪被害者に関する研修は実施されていないこと、看護師の二次受傷対策が十分に実施されていない実態が明らかになった。(4)医療関係者を対象とした研修については、教材として追加するべき情報があると考えられた。そのため、犯罪被害支援者が医療機関にかかる被害者を支援するための留意点に関する研修教材試作と評価を実施した。5支援団体の研修担当者・相談員等15名による、研修教材の実施と支援例等の追加、コメントを得て、ほぼ必要と思われる内容を網羅した試作教材を修正・完成させた。本教材については、今後、民間の犯罪被害者支援センターを対象としたテキストや教材等として提案・利用する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
精巣腫瘍における生殖幹細胞発現遺伝子ＤＤＸ１の個体での機能解析

CAGプロモータ下流にloxP- Neomycin-loxP配列、Ddx1遺伝子を挿入したコンストラクトをマイクロインジェクションし、2種のトランスジェニックマウスの系統を樹立した。作出した2系統のトランスジェニックマウスと精巣特異的にCreを発現するNurogenin3-Creトランスジェニックマウスと交配した。CreリコンビナーゼによりNeomycinが除去され,CAGプロモーター下流にDdx1が挿入された個体について4 -12ヶ月の精巣を摘出し、トランスジェニックマウスとコントロールの精巣重量を比較したが,2系統共に特に目立った差は認められなかった。定量的PCRを用いた生後4-12ヶ月の精巣のDdx1の発現量はコントロールに比べ約2倍に亢進していた。そこで、摘出した精巣を固定、包埋後パラフィン切片を作成し、免疫組織染色によりDdx1の発現、分布を調べた。トランスジェニックマウス精巣では、GATA1を発現するセルトリ細胞は精細管周辺部に分布し、異常はみられなかったが、Ddx1発現細胞は精細管周辺部だけにとどまらず内腔方向に異常増殖している精細管も存在した。しかし、精子形成過程における大きな異常は検出できなかった。そこで,発生初期に全身でCreを発現するCAG-Creマウスとの交配により、CAG-CreーDdx1個体を得た。今後、発生段階を追って解析することにより精子形成過程への影響を調べる予定である。また、ノックアウトマウスについては、新たに生殖系列に伝播したキメラマウスを作出した。現在、Floxマウスまで作成が進んでいる。ホモ接合型のマウスが出来次第、精子形成過程における野生型との違いについて、精巣切片を作製して繊細に解析することと,RNA及びタンパクレベルでの発現を調べる予定である。DDX1遺伝子の過剰発現によりヒト染色体12p13領域上の生殖幹細胞遺伝子群の発現異常により引き起こされると想定される腫瘍形成について、生体での影響およびその分子機構を解明するために、コンディショナルトランスジェニックマウスの作製をおこなった。生殖系列にのった個体が得られたので、生後精巣特異的に発現するNurogenin3-Creとの掛け合わせにより、2種類のコンディショナルトランスジェニックマウスラインができた。今後、得られた個体について精巣の発達過程における変化をRNA,タンパクレベルでの発現解析、精巣切片を作製して免疫染色、in situ hybridizationにより繊細な発現解析を行う。また、DDX1遺伝子は生殖幹細胞発現遺伝子であることから、精子形成過程のおける役割を調べるために、コンディショナルノックアウトマウスの作製を行っている。しかし、現時点で個体作製に成功していないので、ひき続き個体作製に向けて努力する。コンディショナルノックアウトマウスの作製が順調に進まないためコンディショナルトランスジェニックマウスの解析導入遺伝子についてRNA,タンパクレベルでの発現解析を行う。精巣組織の発生過程における変化について:各ステージでの遺伝子発現やアポトーシス関連遺伝子を、精巣切片を作製してin situ hybridization,免疫染色により調べる。精巣組織の精原細胞発現遺伝子について:リアルタイムPCRを用いて、RNAレベルで発現量を野生型と比べる。年齢と精巣重量について野生型と比べる:腫瘍発生頻度と組織型重篤度を調べる.幹細胞の動態について:FACS解析,遺伝子、タンパクレベルで詳細に解析する。コンディショナルノックアウトマウスの作製マイクロRNAの解析消耗品:抗体マウス購入、飼育費PCR関連試薬、プライマー作成、その他試薬類旅費:UICC (モントリオール:8/27-30)日本癌学会(札幌:9/19-21)
中性子照射により広域分子追跡及び定位破壊力をもつボロントレースドラッグの創生

本研究の目的は,広域分子追跡及び定位破壊力をもつボロントレースドラッグを創出することである.そこで,終末糖化産物(AGE)を標的として,ホウ素修飾クルクミノイドUTX-51と熱中性子の併用によるウシ血清アルブミン(BSA)およびAGEモデルとしての糖化BSAの破壊実験と薬物動態解析を行った.UTX-51は熱中性子との併用時にBSAおよび糖化BSAを効率よく破壊すること,また,鶏卵モデルによる薬物動態解析よりUTX-51は血液脳関門を通過し脳に分布することが示された.以上の結果より,UTX-51はボロントレースドラッグとして有望であり,アルツハイマー治療薬の候補となり得ることが示唆された.本研究の目的は,中性子照射により広域分子追跡及び定位破壊力をもつボロントレースドラッグの創生である.ボロントレースドラッグは,含有する20%のB-10の中性子捕捉能による莫大なエネルギーによる分子破壊力と放出される即発ガンマ線による高感度トレーサビリティ機能をもつ,全く新しい次世代医薬品である.平成24年度は,スキャフォールド分子としてクルクミノイドを選択し,三フッ化ホウ素をα,β-不飽和カルボニル基に結合させたUTX-51を分子設計・合成し,中性子照射による血清タンパク質BSAの破壊を確認した.そこで平成25年度は,糖尿病患者の症状の悪化や心臓疾患やアルツハイマー病に関与している最終糖化物(AGE)をクリアランスターゲットとして,このAGEモデルとして糖化BSAに対するUTX-51の熱中性子照射による破壊実験を行った.UTX-51と糖化BSAの比率を変化させた混合物に対して熱中性子を照射し,SDS-PAGE電気泳動分析により糖化BSAを評価したところ,非照射群と比較して照射群において糖化BSAに由来するバンド強度の減少が観察された.コントロールと比較して,UTX-51と糖化BSAが同比率群において12%の減少,10倍群において15%の減少,100倍群において33%のバンド濃度の減少が確認された.この結果より,ボロントレースドラッグUTX-51は化学的手法だけでは困難であった凝集タンパク質の破壊を可能とし,糖化BSAを標的とするNDT薬剤として有望であることが示された.本研究の目的は,広域分子追跡及び定位破壊力をもつボロントレースドラッグを創出することである.そこで,終末糖化産物(AGE)を標的として,ホウ素修飾クルクミノイドUTX-51と熱中性子の併用によるウシ血清アルブミン(BSA)およびAGEモデルとしての糖化BSAの破壊実験と薬物動態解析を行った.UTX-51は熱中性子との併用時にBSAおよび糖化BSAを効率よく破壊すること,また,鶏卵モデルによる薬物動態解析よりUTX-51は血液脳関門を通過し脳に分布することが示された.以上の結果より,UTX-51はボロントレースドラッグとして有望であり,アルツハイマー治療薬の候補となり得ることが示唆された.本研究の目的は、中性子照射により広域分子追跡及び定位破壊力をもつボロントレースドラッグの創生である。ボロントレースドラッグは、含有する約20%のB-10の中性子捕捉能による莫大なエネルギーによる分子破壊力と放出される即発ガンマ線による高感度トレーサビリティ機能をもつ、全く新しい次世代低炭素型医薬品である。本年度は、フェノール性BODIPY含有フェノール誘導体およびBF2含有クルクミノイド誘導体を分子設計・合成し、中性子照射による標的分子の破壊能を評価した。フェノール性BODIPY含有抗化薬剤UTX-42、43、44は、フェノール部分とBODIPY部分を直列に縮合させたもので、DPPHおよび過酸化脂質反応に対する抗酸化活性実験を評価したところ、全ての化合物はBODIPY内に含有するホウ素原子の存在に影響せず、BODIPYを含まないフェノール部分だけ化合物と比較してより高い抗酸化活性を示した。BF2含有クルクミノイドUTX-51の分子設計は、ボロントレース分子スキャフォールドとしてクルクミノイドを選び、ホウ素原子を埋め込むべく、分子軌道法計算によるモレキュラーモデリングにより構造最適化し、化学合成した。各サンプルの中性子実験は、京都大学原子炉実験所の原子炉および京大エネルギー理工学研究所南3号棟に設置されている放電型核融合中性子源を用いた。ターゲット分子として血清タンパクBSAに対する中性子照射による破壊実験を行った。その結果、すべての化合物において、SDS-PAGE電気泳動におけるバンドは検出限界以下であり、ターゲット分子の破壊を確認した。以上の結果より、ボロントレースドラッグは中性子照射により標的分子の破壊能を有する新規薬剤であることが示された。当初計画していた化合物の分子設計および合成に成功しており、また、中性子照射による標的タンパク質の破壊実験を行い、予想どおり標的分子を破壊できることを示した。よって、おおむね順調に進展していると言える。今後の計画として、既に医薬品として利用されている抗がん剤にホウ素原子を導入した新規抗癌剤の分子設計・合成を行い、それら候補分子の抗腫瘍活性および薬物動態解析を行う予定である。ホウ素含有抗がん剤の合成に必要な有機試薬代として20万円、抗腫瘍活性の評価に必要な腫瘍細胞・血清・キット類に30万円、研究成果発表のための旅費として10万円を計上している。
新規カルコゲノカルボン酸典型元素誘導体:系統的な合成法の開発と応用

本研究ではカルボン酸誘導体の酸素原子を硫黄、セレン、或るいはテルル原子で置換した同族体の合成法の確立と物理化学特性や反応性を明らかにすることを目的としている。その内、炭素-セレン二重結合を有する同族体のうち1と2は既知である。今回、我々は3並びに4の合成法を検討し、種々の誘導体の合成に成功した。即ち、以下に示す4通りの方法で、何れもカラムクロマトグラフィーにより効率良く6090%の収率で合成することができた。得られた3は赤紫から濃青色で、4は濃青色から緑色を呈する何れも空気中で不安定な液体であるが、-20°C付近で無酸素下では長期間の保存が可能であることが明らかとなった。
CCNファミリー2/CTGFによる破骨細胞形成促進作用の分子メカニズムの解明

マウスマクロファージ系細胞株(RAW264.7)及び胎生14.5日肝細胞にRANKL,M-CSF及びCCN2を添加すると、多核巨細胞数はRANKL,M-CSF刺激群よりも増加した。このメカニズムを調べるために胎生14.5日のCCN2欠損マウスから肝細胞を採取し、RANKL,M-CSFを添加すると、単核の破骨細胞までは分化するが、その後の細胞融合は抑制された。またCCN2欠損マウス由来の単核破骨細胞にCCN2を添加すると破骨細胞融合が回復した。これらの結果はCCN2が破骨細胞形成、特に細胞融合に関与する事を示唆している。CCNファミリー2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF:CCN2)は軟骨細胞の増殖・分化を促進するだけでなく、骨芽細胞や血管内皮細胞の増殖・分化・遊走をも促進する成長因子であり、内軟骨性骨化において非常に重要な成長因子であるが、内軟骨性骨化の最終局面での軟骨基質の吸収に対するCCN2の作用は未だ解明されていない。CCN2欠損マウスの成長板では肥大軟骨細胞層が増大しており、この所見は軟骨基質を吸収する破骨細胞形成に障害が起こっていることを示唆している。そこで、平成20年度における本申請課題では主に破骨細胞形成におけるCCN2の役割をin vitro系を中心に解析し、以下の実験結果を得た。1.マウスマクロファージ系細胞株RAW264.7にGST融合RNAKL(GST-RANKL)を6日間作用させて破骨細胞を誘導すると、CCN2の遺伝子発現レベルは分化前の細胞よりも分化後の細胞で上昇した。2.GST-RANKLと組換えCCN2タンパク質(rCCN2)を同時に添加して破骨細胞を誘導すると、GST-RANKL単独で誘導するよりも破骨細胞のマーカーである洒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(Trap)で染色される3核以上の多核巨細胞数は増加した。また、Trapの遺伝子発現量の増加も見られた。4.DC-STAMPとCCN2が共局在することを蛍光免疫染色法で明らかにすると共に両分子が直接結合することを固相下結合実験法によって確認した。以上の結果からCCN2はDC-STAMPと結合し、細胞融合を促進することで破骨細胞形成を促進する可能性が考えられた。軟骨を鋳型に骨が形成される内軟骨性骨化では軟骨組織の吸収が不可欠である。CCNファミリー2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)が内軟骨性骨化を進行させる軟骨細胞や骨芽細胞、血管内皮細胞に対して増殖あるいは分化を促進させることはこれまでの研究で明らかにされているが、軟骨基質の吸収に主要な役割を果たす破骨細胞でのCCN2の役割は不明であった。この点を明らかにしようとした本研究課題では平成20年度にマウスマクロファージ系の細胞株であるTAW264.7細胞を用いて破骨細胞形成におけるCCN2の役割を明らかにし、平成21年度ではCCN2欠損マウス由来の細胞を用いてCCN2の作用をより詳細に検討した。1.破骨細胞の形成におけるCCN2の遺伝子発現レベル及びタンパク質産生の変動をRAW264.7細胞にRNAKLを添加し、time courseを取ってを詳細に検討したCCN2の遺伝子発現量及びタンパク質産生量は共に破骨細胞の分化後期に増加した。2. CCN2欠損マウスは生後すぐに死亡するため骨髄細胞を単離することが困難である。そこで、胎生14.5日ではまだ造血器官として機能している肝細胞を用いて、破骨細胞形成を検討した。野生型ではRANKLとM-CSFによって多核の破骨細胞が多数形成されたが、CCN2欠損マウス由来の細胞では多核細胞の形成はほとんど見られなかった。また、細胞融合に関与するDendriticcell-specific transmembrane protein(DC-STAMP)などの破骨細胞のマーカー遺伝子の発現レベルも野生型と比較して低下していた。3. CCN2欠損マウス由来の細胞を用いたM-CSF及びRANKLによる破骨細胞形成の誘導にrCCN2を添加すると、破骨細胞形成が一部レスキューされた。また、破骨細胞のマーカー遺伝子の発現レベルも上昇した。4. DC-STAMPの発現レベルを上昇させるためにDC-STAMPを発現するレトロウィルスを作製し、CCN2欠損マウス由来の細胞に感染させた。その結果、rCCN2を添加した時と同様に破骨細胞形成が一部レスキューされた。以上の結果からCCH2はDC-STAMPと結合し、細胞融合を促進することで破骨細胞形成を促進すると考えられた。これまでCCNファミリー2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)が軟骨細胞や骨芽細胞、血管内皮細胞において増殖・分化を促進させることを明らかしてきた。

内軟骨性骨化における最終局面での骨化段階では破(軟)骨細胞による軟骨・骨基質の吸収が血管及び骨芽細胞の入り込むスペースを作るために必要不可欠であるが、破骨細胞でのCCN2の役割は不明であった。この点を明らかにしようとした本研究課題では平成20年度にマウスマクロファージ系の細胞株であるRAW264.7細胞を用いて破骨細胞形成におけるCCN2の役割を明らかにし、平成21年度ではCCN2欠損マウメ由来の細胞を用いてCCN2の作用をより詳細に検討した。そして、最終年度である平成22年度では骨基質の吸収活性である破骨細胞機能におけるCCN2の役割及びCCN2遺伝子改変マウスを用いた破骨細胞形成及び機能に関して検討した。1.CCN2欠損マウス由来の胎生肝細胞にM-CSF及びRANKLを添加し、破骨細胞形成を誘導した。CCN2欠損マウス由来の細胞では破骨細胞形成が著しく抑制されたが、この系にrCCN2を添加すると、破骨細胞形成が一部レスキューされた。また、破骨細胞機能を調べるために人工の骨基質をコーティングしたプレート上に野生型あるいはCCN2欠損マウス由来の胎生肝細胞を播種し、破骨細胞形成を誘導させると、野生型由来の破骨細胞では多くの骨基質吸収が見られたが、CCN2欠損マウス由来の破骨細胞では見られなかった。この系にrCCN2を添加すると、破骨細胞機能である骨吸収像が見られ、その機能がレスキューされた。2.CCN2欠損マウスの上腕骨をTRAP染色すると、同腹の野生型マウスと比較してTRAP陽性細胞数が減少していた。また、逆にCCN2産生過剰マウスの脛骨をTRAP染色すると、同腹の野生型マウスと比べてTRAP陽性細胞数が増加していた。これらの結果はin vivoにおいてもCCN2が破骨細胞形成及び機能を制御していることを示唆している。3.これまでの成果をまとめてアメリカ骨代謝学会の機関誌であるJournal of Bone Mineral Researchに発表した。
収入の季節性と農家の栽培技術の選択行動： インドネシアの事例分析

2018年7月に、西ジャワ州スカブミ県チバダックにあるアブラヤシ・プランテーションの国営会社(PT. Perkebunan Nusantara VIII(PTPNVIII))を訪問し、農園経営に関する状況や課題等について、ヒアリング調査をおこなった。また、バンテン州ルバック県バンジャルサリにある同社のパーム油搾油工場において、搾油工場の経営状況と搾油工場近辺に展開する小農(平均農園面積1.5ヘクタール)との取引状況について、聞き取りを行った。さらに、小農が多く加盟しているAPKASINDO(Asosiasi Petani KelapA Sawit Indonesia:インドネシア・アブラヤシ生産農家協会)の役員も務めるバンテン州ルバック県バンジャルサリ郡で調査地の村長に農家の経営状況についてヒアリングを行ったほか、今後3年間の調査協力の依頼をしたところ、協力が得られることになった。また、2018年7月には、Indonesian Regional Science AssociationのInternational Conferenceにおいて、農家のリスク回避度の通時的安定性に関する研究発表をおこなった。また、ジャカルタにある中央統計庁(Badan Pusat Statistik)において、統計資料等の収集を行った。その後、2019年3月に、バンテン州ルバック県バンジャルサリ郡の調査地の村長の協力を得て、アブラヤシの生産農家160家計に対して、アンケート調査を実施した。当初計画していた調査予定地では、調査対象農家の家計数が少なかったため、研究計画とは異なる地域での調査を実施することになったが、新しい調査地でも研究協力を得られることになり、特に問題は生じておらず、第一回のアンケート調査を実施することができた。2019年7月にアチェ州のバンダアチェで行われるIndonesian Regional Science Associationで農業センサス個票データを用いて、アブラヤシ生産構造に関する研究発表を行う予定である。また、11月にはバンテン州ルバック県バンジャルサリ郡の調査村において、2回目の現地調査を行う予定である。
学校の民営化における「効率性」と「公正性」に関する総合的研究医術

本研究では、学校の民営化を「学校の設置・経営・運営形態の変更の現象」と狭義に定義し、教育政策の政治過程の分析、教育特区の事例分析、株式会社に対する教育市場への参入可能性を検証する意識調査、諸外国(アメリカ・イギリス・中国・ロシア・オーストラリア・ドイツ)における教育政策の分析と事例分析をとおして、学校の民営化の進行状況とその実態と課題を明らかにした。政策分析、特区調査、海外比較、企業調査の4つの班に分かれて、以下のような研究を行った。政策分析においては、歴史調査として、京都市と山梨県の地域教育史についての文献と資料を収集した。京都市では、京都市内の学区にとどまらず、市内の私立学校法人についても検証しつつある。山梨県では、中等教育機関の設置運営主体に注目し、その運営形態を検証しつつある。検証に際しては、学校史と法人史の両方を視野に入れることで、資金の集約・配分・教育活動への影響を把握することにしている。特区調査に関しては、全国の特区事例についての基礎資料を作成し基本情報を整理した。実態調査については、長野県天龍村・どんぐり向方学園、長野県上田市・さくら国際高等学校、岡山県岡山市(旧御津町)・朝日塾中学校を訪問、教委関係者と学校にインタビューを行い、関連資料を収集した。調査結果の一部を、関連研究会にて口頭報告した。比較研究としては、アメリカ、イギリス、中国、オーストラリア、ドイツ、フランス、ロシアの各国における、学校の民営化の動向分析を行った。具体的には、各国の学校民営化政策の分析を行い、民営化の理念・実態の比較検証をした。更に、政策分析と並行して、現地にて学校経営関係者、参入企業に対してインタビュー調査を行った。尚、中国研究に関しては、研究論文として成果をまとめた。企業調査班については、次年度に予定する教育関係産業対象の質問紙調査実施のための予備研究を行った。具体的には、研究打ち合わせ会を開催し、関係先行研究の動向をレビューした上で、本調査において1)現在の教育関係産業の教育市場への参入度合いとその評価意識、2)今後の公立学校経営への参入意識とその規定要因、3)日本型EMOsの成熟度合いとその戦略傾向を柱とする調査構想及び質問紙の内容構成案をまとめた。政策分析に関しては、上田市立図書館所蔵の『北信毎日新聞』について閲覧し、上田地域の行政と学校設置の動向を追跡した。同紙は、戦時期における地域新聞の統合による欠落期間をはさんで、この地域の公共性言説の集約点となってきた。メディアとしての同紙の役割をまとめるとともに、「総力戦時における地域メディアの欠落」という事態についての概括を論じることを目指し、調査を来年度も継続する。特区調査・企業調査に関しては、これまでの研究成果を、特区における学校民営化関連政策、調査において明らかになった特区民営化学校の実態および学校設置への企業参入の動機と枠組みの3点でまとめ、日本学習社会学会大会において発表した。今年度の資料収集においては、特区調査班では、東京シューレ、くまもと清陵高校、静岡県湯河原町における「食の大学院」構想に関して現地調査を行った。企業調査班は、企業関連資料の分析を進めるとともに、来年度実施する質問紙調査の準備を行った。また両班合同で、企業の訪問調査も行った。比較研究としては、中国における市場化にみる私教育費の構造変動、イギリスの学校民営化におけるアカデミーの位置、アメリカのシカゴ・ボストン学区における標準学力テストに基づくアカウンタビリティ政策と学校の民営化の関係について調査を行うとともに収集資料の分析を進めるほか、ドイツ、ロシア等についても調査、資料の収集・分析を進めている。それらの一部においては、成果を論文にまとめて発表した。政策分析、特区調査、海外比較、企業調査の4つの班に分かれて、調査研究を行い、3年間の成果をまとめた。なお、本研究の中心となる成果の一部は、『教職研修』(教育開発研究所)誌において、2009年1月号より連載中である。また、それらを加筆・修正して後日、書籍として刊行する計画がある。特区調査の資料収集においては、LCA国際小学校(相模原市)、いずみの学校(北海道豊浦町)の現地調査を行った。いずれも、設置主体となった人物や組織の強い設置意思により設立されたものであり、自治体との関係や財務上の有利性から後者はすでに学校法人化しており、前者も早期の移行を検討していた。企業調査においては、教育関連企業914社に対して、参入主体としてのレディネス、制度への希望、市場価値判断、参入条件や障壁という4つの視点について各企業がどのように考えているかについて質問紙調査を行い、160通の回答を得た。一定程度の企業が公立学校へのかかわりを深めつつ・あるが、その関与は授業や教員研修など限定的な状況にある。学校の設置・運営を直接担う希望はさほど高くなく、基幹業務や一部の業務に限定的に参入する希望が多かった。教員・教育活動関連業務へのビジネスチャンス意識は高く、経営関連業務についてはあまり高くなかった。企業に対する意識調査として貴重な情報を得た。

比較研究においては、ドイツ、中国、イギリスでの現地調査を行い、最終的には、これにアメリカ、ロシア、オーストラリアを含めて全6カ国についての状況をまとめた。
ヒト組織を用いたＰＧＥ２－ＥＰ４シグナル抑制による新規大動脈瘤治療法の開発

本研究では, PGE2 (Prostaglandin E2)-EP4シグナルによる腹部大動脈瘤の発症・進行メカニズムを明らかにすることを目的としている.前年度までの研究おいて,平滑筋細胞選択的EP4過大発現マウスにおいて, AngII依存性の腹部大動脈瘤発症が顕著に増加すること, EP4刺激はin vitro, in vivoの両方において炎症性サイトカインであるIL-6の発現を顕著に増加させることを明らかにしてきた.IL-6が腹部大動脈瘤組織で過剰に合成されることは多く報告されてきたが,具体的な働きに関する報告はほとんどない. IL-6受容体・抗体を投与されたEP4-Tgマウスでは, AngII負荷時の大動脈組織中炎症性単球/マクロファージの数が有意に減少していた.フローサイトメトリーによる細胞分画の分取実験から,大動脈組織においてIL-6の遺伝子発現は平滑筋細胞等の非免疫系細胞に認められ, IL-6Rの遺伝子発現は炎症性単球/マクロファージに認められた.さらに, EP4-Tgマウスの大動脈平滑筋細胞を用いて構築した3次元細胞積層体モデルにおいて, IL-6R・抗体は顕著にマウスマクロファージであるRAW264.7の平滑筋層への浸潤を抑制した. IL-6による刺激はヒト単球由来細胞であるTHP-1においてPGE2合成酵素であるCOX-2の発現および, MMP-9の遺伝子発現を亢進した.これらの結果から平滑筋由来のIL-6は,単球/マクロファージにおけるPGE2合成を亢進しPGE2-EP4シグナルによる炎症反応を過剰に亢進する可能性のあること, MMP-9発現の亢進し単球の平滑筋層への浸潤や弾性線維の分解を過剰に亢進することで腹部大動脈瘤の進行を促す可能性が示唆された.現在これらの結果をまとめて論文投稿中である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。腹部大動脈瘤(腹部瘤)は高齢者の発症率が高い疾患であるが、現在その進行を抑制できる内科的治療薬はない。我々は、プロスタグランディンE2 (PGE2)とその受容体であるEP4が腹部瘤を増悪させることを発見した。本研究はその進行メカニズムを明らかにすることを目的にする。【ヒト腹部瘤組織を用いたEP4誘導性増悪因子の同定】横浜市立大学付属病院および市民総合医療センターにおいて採取されたヒト腹部大動脈瘤組織7検体(患者の承諾,本学・倫理委員会の承認のもと提供)を実験に用いた。組織小片をEP4刺激薬で刺激した。分泌されたタンパク質をLC/MS/MSにより網羅的に同定し、同時に各タンパク質の量を比較した。17種のタンパク質がEP4刺激依存的に増加しており、腹部瘤の進行と関連が深いMMP-9や、その他の分解酵素、細胞外基質、好中球関連分子が含まれていた。【EP4による大動脈瘤進行における平滑筋細胞の働きの検討】上の結果から、EP4刺激は細胞外基質の分解を促進するとともに、好中球の活性化に働く可能性が見出された。我々の先行研究の結果より、腹部瘤壁では平滑筋細胞でのEP4発現が顕著に増加していることが示されていることから、平滑筋細胞からEP4刺激下で分泌される因子が好中球の活性化に関与しているという仮説を立てた。ヒト血管平滑筋からEP4刺激下で分泌が増加する分子として、IL-6や好中球の活性化を促進するG-CSF (granulocyte-colony stimulating factor)が見出された。G-CSF発現はヒト腹部瘤組織およびマウス腹部瘤組織において発現が亢進していた。上記の結果より、EP4による腹部瘤の進行には平滑筋細胞由来のサイトカインによる好中球の活性化が関与する可能性が示唆された。本研究では, PGE2 (Prostaglandin E2)-EP4シグナルによる腹部大動脈瘤の発症・進行メカニズムを明らかにすることを目的としている.平成26年度までに,ヒト腹部大動脈瘤組織においてEP4シグナル依存的に分泌が亢進するプロテアーゼやサイトカインが明らかになった。ヒト腹部大動脈瘤組織由来の平滑筋細胞ではEP4発現が亢進していたことから, EP4による腹部大動脈瘤発症メカニズムには平滑筋細胞を中心とした仕組みが存在するという仮説を立て,その仮説を検証するとともに,腹部大動脈瘤の発症メカニズムを明らかにすることを目的とし平成27年度は実験を行った.平滑筋細胞選択的にEP4が過大発現するマウス(EP4-Tgマウス)を作成し,検討を行った.Angiotensin II (AngII, 1.0μg/kg/min)を28日間持続的に投与し,血管炎症を惹起したところ,比較対照のNon-Tgマウスが全例(6匹)生存したのに対して, EP4-Tgマウスはおよそ6割が14日目を前に死亡し, 28日目までに全例(8匹)死亡に至った.腹部大動脈瘤発症の前段階であると考えられるAngII負荷day4の大動脈組織では好中球および炎症性単球/マクロファージの数が顕著に増加していることが分かり,これらの浸潤した炎症性細胞が分泌するMMP-9がEP4-Tgマウスにおける腹部大動脈瘤の発症に関与している可能性が示唆された.平滑筋細胞で発現する炎症性サイトカインのうちPGE2による増加率が大きいサイトカインとしてIL-6が同定され, IL-

6受容体・抗体による阻害によりEP4-Tgマウスにおける腹部大動脈瘤の発症が抑えられた.以上の結果から,平滑筋細胞におけるEP4シグナルはIL-6分泌を介して炎症反応を亢進し,腹部大動脈瘤の発症を促すと考えられる.1年目であった平成26年度は,タンパク質の網羅的解析によってEP4依存的に分泌が亢進する分子を同定し、当初の2年目までの目標を達成致した。2年目であった当年度は、平滑筋細胞においてEP4を過大発現したマウスを用いて、平滑筋細胞におけるEP4のシグナルが腹部大動脈瘤の発症に寄与することを明らかにし、そのメカニズムとしてEP4依存的なIL-6の増加が関わることをin vivo, in vitroの実験で多角的に検証した。本研究では, PGE2 (Prostaglandin E2)-EP4シグナルによる腹部大動脈瘤の発症・進行メカニズムを明らかにすることを目的としている.前年度までの研究おいて,平滑筋細胞選択的EP4過大発現マウスにおいて, AngII依存性の腹部大動脈瘤発症が顕著に増加すること, EP4刺激はin vitro, in vivoの両方において炎症性サイトカインであるIL-6の発現を顕著に増加させることを明らかにしてきた.IL-6が腹部大動脈瘤組織で過剰に合成されることは多く報告されてきたが,具体的な働きに関する報告はほとんどない. IL-6受容体・抗体を投与されたEP4-Tgマウスでは, AngII負荷時の大動脈組織中炎症性単球/マクロファージの数が有意に減少していた.フローサイトメトリーによる細胞分画の分取実験から,大動脈組織においてIL-6の遺伝子発現は平滑筋細胞等の非免疫系細胞に認められ, IL-6Rの遺伝子発現は炎症性単球/マクロファージに認められた.さらに, EP4-Tgマウスの大動脈平滑筋細胞を用いて構築した3次元細胞積層体モデルにおいて, IL-6R・抗体は顕著にマウスマクロファージであるRAW264.7の平滑筋層への浸潤を抑制した. IL-6による刺激はヒト単球由来細胞であるTHP-1においてPGE2合成酵素であるCOX-2の発現および, MMP-9の遺伝子発現を亢進した.これらの結果から平滑筋由来のIL-6は,単球/マクロファージにおけるPGE2合成を亢進しPGE2-EP4シグナルによる炎症反応を過剰に亢進する可能性のあること, MMP-9発現の亢進し単球の平滑筋層への浸潤や弾性線維の分解を過剰に亢進することで腹部大動脈瘤の進行を促す可能性が示唆された.現在これらの結果をまとめて論文投稿中である.現在までに、ヒトの腹部大動脈瘤組織7検体に関してタンパク質の網羅的解析を行った。中膜組織の1-2mm角小片を器官培養し、24時間の前培養の後、無刺激群, EP4刺激薬(ONO-AE1-329, 1μM), PGE2, (1μM), PGE2+EP4阻害薬(ONO-AE3-208, 1μM)の4群に分けて24時間培養を行った。培養上清中の分泌タンパをトリプシン消化後,にiTRAQで標識し, LC/MS/MSによりタンパク質の網羅的同定・比較定量を行った。776種類のタンパク質が同定され、分泌性タンパク質は280種類同定されてた。さらに、EP4刺激薬、PGE2により1.3倍以上に発現が増加し(対無刺激)、EP4阻害薬により0.77倍以下に減少する(対PGE2)傾向のあるものが17種同定された。
少子高齢化社会における世代間対立の政治：ミクロレベルからの検証

2018年度は、まず、有権者の政治的態度における世代間対立について、そもそも政策争点への賛否が異なるのかを検討したうえで、世代内における対立の構図が世代間で異なるかを分析した。1970年代中盤から2000年代後半までの世論調査データを経時的に分析することによって明らかになったのは、1990年代まではたしかに様々な政策意見について、世代間での対立が見られたものの、2000年代になると急速に縮小していっているという傾向であった。ただし、安全保障争点と比べても、小さな政府や社会保障に関する争点においては世代間での対立が観察することができた。とはいえ、それは「対立」といえるほど劇的なものでもない。イデオロギー理解に世代間で差異があるということが近年の研究では指摘されてきた一方で、政策争点態度について詳しく見ていくと、対立が激しい争点は年齢グループを超えてほぼ共通しているということが明らかになった。世代によって、異なる次元において政治対立が生じていると結論付けられるような分析結果ではなく、若年層と高齢層で差があったのは小さな政府に関する態度くらいで、高齢層では対立軸になりえるが、若年層ではそうではないという結果に過ぎなかった。保守革新イデオロギーに対する捻れた理解は、政策対立のあり方に基盤があるわけではないと考えられる。さらに、本研究で実施した郵送調査「世代と選挙に関する世論調査」では1999年に実施されたISSP調査の主観的世代間対立について尋ねたが、その両者の結果を比べると、いずれの生年コーホートでは加齢するほど、世代対立を認識する人が減るという加齢効果が認められる。その一方で、20歳代で強い世代対立を認識する割合が大幅に増えているのは、世代効果によって説明が可能であると思われる。集団対立が世代のラインに沿って生じているという見方は若者側の見方だということが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は、現代日本における世代間対立の構造と機能、さらに、その政治的帰結を有権者レベルの調査によって実証的に明らかにしようというものである。その際に注目するのは、世代間対立を主観的に認識しているか否かであり、それがどのように各世代の政策選好と関連するのかである。この世代間対立認識については1999年ISSPデータには含まれるものの、それ以降、代表性のあるデータでは聞かれていない。少子高齢化がさらに進展している今日の日本において、有権者がどのように認識しているのか、また、それがどのように政策選好と関連し、政治過程に反映される可能性があるのかについて明らかにする。そうすることによって巷間言われている「シルバーデモクラシー」的な状況が本当に起きているのかを実証的に明らかにし、少子高齢化と日本の民主主義のあり方について再考する機会を提供したい。本年度は、この世代間対立認識について、現代の有権者がどのように捉えているかを、まずはインターネット調査を実施して、データ取得をした。インターネット調査は代表性を欠くものの、指標の妥当性などを検討するために小規模のパイロット調査として実施した。また、政策選好と世代間対立については、各世代における政策選好の特徴について明らかにするような分析を行った。とりわけ、政治的対立が世代間によって異なって認識されている可能性が指摘されており、その点について政策選考の「客観的な」世代間対立として過去の選挙調査データなどから明らかにしようとしてきた。2017年度実施の郵送調査の準備が2016年度の主な目的であった。そのため、3月にパイロット調査としてインターネット調査を実施した。調査会社との折衝の中で従前から使用していた調査プログラムが使えないことが判明したため、新たに調査準備をやり直したことから、調査の実施自体が3月末にずれ込んでしまい、データの分析を行って調査票の具体的な検討を始めることができなかった。今後は、速やかに予備分析を始め、郵送調査の調査票の検討を進めたい。

その一方で、20歳代で強い世代対立を認識する割合が大幅に増えているのは、世代効果によって説明が可能であると思われる。集団対立が世代のラインに沿って生じているという見方は若者側の見方だということが明らかになった。本研究における2017年度の研究課題は、郵送調査の実施である。有権者レベルにおける世代間対立について検討する本研究において、世代ごとの政治態度や政策意見の相違だけではなく、社会における世代間対立の存在を有権者自身が認識しているかも研究の焦点としている。ただし、主観的な世代間対立に関する質問項目は世論調査で聞かれていることは極めて稀である。代表的な例としては、国際比較世論調査であるInternational Social Survey Programme(ISSP)の社会格差(Social Inequality)モジュールがあげられるものの、世代間対立について尋ねた1987年、1992年、1999年の調査のうち、日本が参加したのは1999年のみである。さらに、2000年代になってから同形式の質問が尋ねられているのは2012年のWaseda-Web2012データであるが、これはインターネット調査であり、代表性に限界がある。そのため、本研究では、1990年代と比較可能な形式で主観的な世代間対立を検討できるような世論調査を実施する必要があった。少子高齢化が一層進展したこの20年間の主観的世代間対立の変化について検討するためである。具体的には、2018年7月に「世代と選挙に関する意識調査」を実施した。調査対象者は全国の有権者で、選挙人名簿からの層化二段無作為抽出によって全国80地点から4000名の調査対象者を抽出した。調査は送付も回収も郵送で実施した。回答者数は1839名、回収率は46.0%であった。2017年度の主な課題は郵送調査の実施であった。当初は2017年秋に実施する予定であった。しかし、衆議院議員選挙が同時期に行われたため、この時期を避け、選挙と関係のない時期に繰り越して2018年初夏に実施した。2017年度においては、主観的世代間対立認識を尋ねる全国規模の郵送調査の実施に注力したい。調査終了・データ構築後は速やかに分析を始め、過去データ(ISSP)との比較を含め分析結果を発信したい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。郵送調査データが利用できるようになったので、今後はこのデータの分析に取り組む。その際に、世代ごとの政治態度・政策意見の相違を明らかにすると同時に、世代間対立の主観的な認識が何によって形成されているのかを検討する。