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看護職従事者に必要とされる体力要素及び水準の評価を目指した基礎的調査研究

そして、ほぼ全員(46名中45名)が、看護実習を行っていく上で体力は必要だと思っており、特に必要な体力要素としてスタミナ(全身持久力)を挙げていた。来年度以降も、実習を経た学年ごとに同様の測定・調査を行い、標本数を増やして更に細かい検討を行っていく予定である。本研究は、看護大学の学生について在学中の体格・体力の推移を調査するとともに、看護実習中の身体的負担度と体格・体力との関連を検討することにより、看護職従事者として備えておくべき体力要素とその水準を明らかにしていくための基礎資料を得ようとするものである。本年度は、昨年度調査した学生の1学年下の学生を対象として協力者を募り、平成12年秋から平成13年春にかけての看護実習期間(およそ50日)を経た後に、昨年度と同様に身体の構造(体格、身体組成、骨強度)と機能(脚伸展パワー、有酸素性パワー、握力、背筋力、垂直跳び、長座体前屈)の測定を行うと同時に、看護実習期間における生活習慣、体調や身体的負担度(倦怠感、疲労感、痛みや異常を来す病的症状などの程度)及び体力に対する自己評価などについての質問紙調査を行った。協力学生数は女子66名であった。測定・調査結果を分析したところ、一日の実習後の疲労の程度が少ない群は、多い群より脚伸展パワーが有意に優れており、実習中の自覚症状を聞く51項目で「しばしば」もしくは「いつも」あったと応えた項目数が10以上あった群は、そうでない群に比べて、左手握力と背筋力が強い傾向がみられた。一方で、実習期間中の疲労感の大きい群の方が筋量が多いなど、必ずしも実習中の疲労度や自覚症状と体格・体力との関係は明白ではなかった。ただし、学生は看護実習を行っていく上で体力は非常に必要(60名)あるいは、どちらかといえば必要(6名)だと思っており、特に必要な体力要素としてはスタミナ(全身持久力)という答えが最も多く、次いで腕力、脚力の順であった。引き続き来年度も同様の測定・調査を行って標本数を増やし、検討を重ねるつもりである。本研究の目的は、看護大学生の体格・体力を運動実施状況との関連を踏まえて追跡調査するとともに、看護実習中の身体的負担度と体格・体力との関連を検討することにより、看護職従事者として備えておくべき体力要素とその水準を明らかにしていくための基礎資料を得ることである。本年度は、平成13年秋から平成14年春にかけての看護実習期間(およそ50日)を経た本学在学生女子46名を対象に、過去2年間と同様の方法で身体の構造(体格、身体組成、骨強度)と機能(脚伸展パワー、有酸素性パワー、握力、背筋力、垂直跳び、長座体前屈)の測定評価を行うと同時に、看護実習期間における生活習慣、体調や身体的負担度(倦怠感、疲労感、痛みや異常を来す病的症状などの程度)及び体力に対する自己評価などについての質問紙調査を行った。その結果、実習中の自覚症状を聞く51項目で「いつも」あったと応えた項目数と体重・BMIとの間に有意な正相関(それぞれr=0.34, 0.37, p<0.05)が認められた。また、実習中、疲れる原因であると思う項目数(26項目中)と実習中の自覚症状の合計点との間にも有意な相関がみられた。しかし、本年度の対象者においては、いずれの体力測定項目も実習期間中の疲労感や自覚症状の程度を表すスコアと明らかな関連性を示さなかった。但し、対象者全員が、看護実習を行っていく上で体力は「非常に」ないし「どちらかといえば」必要だと思っており、特に必要な体力要素を3つまで選ぶ質問項目においては、全員が全身持久力を選んでいた。次いで多かったのは腕力と脚力であり、この結果は過去2年間の調査と一致していた。本年度を以て研究期間が終了したので、3学年分の測定・調査結果を総合した分析結果と学年ごとの傾向の違いについて、研究成果報告書としてまとめた。
高性能脱水素化触媒の開発と低環境負荷型有機合成反応における活用

本研究課題は、研究代表者がこれまでに開発してきた、金属と機能性配位子の協働作用に基づく触媒的脱水素化に関する研究を発展させ、低環境負荷型有機合成において活用することを目的として遂行した。その結果、以下の成果を得た。1)機能性配位子を有する新しい高性能脱水素化触媒の合成に成功した。2)アルコールの脱水素的酸化触媒系を開発した。3)機能性配位子のファインチューニングによる触媒の高性能化に成功した。4)有機分子の触媒的脱水素化を基軸とする低環境負荷型有機合成反応への応用に成功した。5)簡便な手順による触媒回収法を開発した。本研究は、これまでに研究代表者が進めてきた、中心金属と機能性配位子との協働作用に基づいた脱水素化触媒の開発とその活用に関する研究について、格段に発展させることを目的として遂行している。本年度は最初に、電子供与能が極めて高いことが知られる含窒素複素環カルベンと、α-ヒドロキシピリジン骨格とを連結した新しいキレート構造の機能性配位子を得ること成功した。さらに、この配位子を有する新規イリジウム錯体を合成し、その構造をスペクトルデータ解析ならびに単結晶X線構造解析によって明らかにした。次に、脱水素化錯体触媒の中心金属として従来用いてきたイリジウムに代わり、8族遷移金属のルテニウムを有する新規錯体を合成した。このとき、機能性配位子として6,6'-ジヒドロキシ-2,2'-ビピリジンならびに6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジンを有する一連のルテニウム錯体を得ることに成功した。続いて、イリジウムおよびルテニウム錯体触媒を用い、アルコールを原料とする脱水素的変換反応について調査した。その結果、(1)機能性含窒素複素環カルベン配位子を有するイリジウム錯体触媒を用いることにより、アルコールの水溶媒中での脱水素的酸化によってカルボニル化合物を得る反応が、(2)機能性6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジン配位子を有するルテニウム錯体触媒を用いることにより、第二級アルコールの脱水素的酸化によってケトンを得る反応が、そして(3)機能性6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジン配位子を有するイリジウム錯体触媒を用いることにより、ジオールの分子内脱水素的環化によってラクトンを得る反応が、それぞれ高効率的に達成された。本研究は、研究代表者がこれまでに進めてきた、中心金属と機能性配位子との協働作用に基づいた脱水素化触媒の開発とその活用に関する研究について、格段に発展させることを目的として遂行している。本年度は最初に、2-キノリノン系機能性配位子を有する新規イリジウム錯体の合成に成功し、その構造を明らかにするとともに、同錯体が水溶媒中での第二級アルコールの脱水素的酸化によりケトンを与える反応において高い触媒活性を示すことを見出した。次に、脱水素化触媒反応の合成化学的応用の観点から研究を展開した。その結果、6,6'-ジヒドロキシ-2,2'-ビピリジン系機能性配位子を有する水溶性イリジウム錯体触媒を用い、第一級アルコールと水の混合物の脱水素化反応によって、酸化剤を一切用いずにカルボン酸を得ることができる新しい触媒系の開発に成功した。さらに、アミン類の脱水素化反応についても調査したところ、6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジン系機能性配位子を有するイリジウム錯体触媒を用いることによって、ピペラジンをはじめとする環式アミンの脱水素化が良好に進行することを見出し、3当量の水素の発生をともなってピラジン等の含窒素芳香族化合物を選択的に与える新しい触媒系を開発した。また、脱水素化反応による水素製造の観点からも研究を進めた。その結果、機能性配位子を有するアニオン性イリジウム錯体触媒を用い、メタノール水溶液の脱水素化によって効率的に水素を製造する触媒系の構築に成功した。平成27年度の研究実施計画は、(1)機能性配位子のチューニングによる触媒の高性能化、(2)アミンの脱水素的変換を基軸とする有機合成反応の開発、(3)アルコールの脱水素化を鍵過程とするカルボン酸合成、そして(4)脱水素化反応による水素製造、であった。これら(1)(4)のいずれについても、計画どおり順調に進展し、年度当初に掲げた目標を達成することができた。近年、グリーンケミストリーの観点から、原子効率に優れた直截的な分子変換に基づいた合成反応の開発が求められており、有機分子の脱水素的変換を基軸とする有機合成反応が注目されている。本研究では、研究代表者がこれまでに開発してきた、金属と機能性配位子の協働作用に基づく触媒的脱水素化に関する研究を発展させ、以下の目的の達成を目指してきた。すなわち、1)従来よりも高性能で実用性に優れた脱水素化錯体触媒を合成する、2)触媒的脱水素化を基軸とする低環境負荷型分子変換反応により、有用な有機化合物を原子効率高く合成する手法を開発する、3)簡便な触媒回収再利用法を確立し、合成手法としての実用性を高め、低コスト化を実現する、という3つが目的である。本年度はまず、上記1)に関する成果として、イリジウム錯体に結合した機能性配位子の電子的特性について考慮し、触媒的脱水素化における最適の錯体触媒を合成することに成功した。

具体的には、アルコール系化合物の脱水素化には電子供与基を持つ機能性配位子が有効であり、アミン系化合物の脱水素化には電子求引基を持つ機能性配位子が有効であることを明らかにした。続いて、上記2)に関する成果として、アミンの脱水素化によるイミンならびにニトリルの合成反応について検討した。各種の機能性配位子を有するイリジウム錯体触媒を用いて調査したところ、ベンジルアミン誘導体の脱水素化反応において、水素の発生を伴って対応するイミンが生成することが明らかとなった。その一方で、我々が開発してきた脱水素化触媒を用いた場合には、アミンを原料とするニトリル合成は極めて困難であることが明らかとなった。さらに、上記3)に関する成果として、脱水素化錯体触媒の水溶液中での液性変化に伴う構造変化を系統的に調査し、水相ー有機相間の抽出による錯体触媒の分離回収を容易に実現するための手順を確立した。本研究課題は、研究代表者がこれまでに開発してきた、金属と機能性配位子の協働作用に基づく触媒的脱水素化に関する研究を発展させ、低環境負荷型有機合成において活用することを目的として遂行した。その結果、以下の成果を得た。1)機能性配位子を有する新しい高性能脱水素化触媒の合成に成功した。2)アルコールの脱水素的酸化触媒系を開発した。3)機能性配位子のファインチューニングによる触媒の高性能化に成功した。4)有機分子の触媒的脱水素化を基軸とする低環境負荷型有機合成反応への応用に成功した。5)簡便な手順による触媒回収法を開発した。平成26年度の当初の研究実施計画は、(1)機能性含窒素複素環カルベン配位子を有するイリジウム錯体の合成、(2)機能性ビピリジン系配位子を有するルテニウム錯体の合成、(3)新規錯体触媒を用いるアルコールを原料とする脱水素的変換反応の開発、であった。これら(1)(3)のいずれについても、当初の計画どおり順調に進展し、目標を達成することができた。平成28年度も当初の研究実施計画にしたがって遂行していくが、特に触媒の回収再利用法の確立に重点をおいて研究を進める予定である。また、アルコールならびにアミンの脱水素的変換を基盤として、さらに有用な低環境負荷型有機合成反応の開発へと研究を展開したい。これらに加え、これまでに開発してきた触媒を凌駕する性能を備えた新規錯体触媒の開発にも注力する。28年度が最終年度であるため、記入しない。有機金属化学平成27年度以降も当初の研究実施計画にしたがって遂行していくが、触媒的脱水素化を基軸とする低環境負荷型分子変換反応によって合成対象とする有機化合物を、アルデヒド、ケトン、ラクトン、カルボン酸、アミド、ラクタム、イミン、ニトリル、等にまで拡張して研究を進める予定である。また、脱水素化反応による水素製造の観点からも研究を進める。平成27年度は、ほぼ当初の予算執行計画どおりに進め、次年度使用額は極めて少額(31円)である。平成26年度は、従来から当研究室が所有していた試薬やガラス器具等を有効活用したため、物品費の執行額を抑えることができた。また、研究成果発表費用の一部を大学運営費交付金によって支払ったため、その他費用を抑えることができた。上記により生じた次年度使用額は、物品費に充てる予定である。また、平成28年度に交付を受ける経費については、当初の計画どおりに執行する予定である。上記により生じた次年度使用額は、主として試薬、ガラス器具、ガスボンベ等の物品費(消耗品費)の購入に充てる予定である。
ガラニンおよびガラニン様ペプチドの睡眠・覚醒機構への関与の解明

私はこれまでにラットを用いてREM断眠後に視床下部視索前野のガラニンmRNAが有意に増加することを明らかにした。ガラニンは覚醒系を抑制する神経ペプチドとして知られている。ガラニンの受容体はGALR1,2,3が同定されている。近年、GALR2に特異的な内因性リガンドとしてガラニン様ペプチド(GALP)が同定された。現在のところ、GALPと覚醒・睡眠機構に関する研究は皆無である。本年度は、ウイスター系成熟雄ラットを用いて3時間断眠群、6時間断眠群、6時間断眠+3時間回復期間群の3群で選択的REM断眠を行い、視床下部弓状核におけるGALP mRNAの発現量をin situハイブリダイゼーション法により検討した。6時間選択的REM断眠の後、3時間の回復期間群を設定する目的は、選択的REM断眠による睡眠のリバウンド効果を調べるためである。REM断眠は睡眠時に毛筆を用いてラットの背部を接触する方法で行った。その結果、ストレスの指標として視床下部室傍核小細胞群におけるCRH mRNAの変動を検討したが、REM断眠後もCRH mRNAはコントロール群と比較して有意な変化は見られなかった。したがって、今回用いたREM断眠手法はラットにストレス反応を引き起こす可能性が低いことが示唆された。現在はGALP mRNAの変動を視床下部弓状核において観察すべく準備を進めているところである。すでに凍結切片作成は終了しており、ハイブリダイゼーションを行うのみの状態になっている。また、GALP遺伝子発現に関連して、サイトカイン(TNFα、IL-1β、IL-6)のラット静脈内投与による視床下部-下垂体系におけるGALP mRNAの変動を調べた。これらの前炎症性サイトカインは睡眠誘発物質としても知られている。その結果、下垂体でのGALP mRNAの増加が見られた。今後、視床下部においても検討する予定である。最近、GALR2に特異的な内因性リガンドとしてガラニン様ペプチド(GALP)が同定された。本年度は、ウイスター系成熟雄ラットを用いて6時間の全断眠を行い、視床下部弓状核におけるGALP mRNAの発現量をin situハイブリダイゼーション法により検討した。断眠はラットが睡眠時によく観察されるうずくまりの姿勢およびその類似行動を指標とし、毛筆を用いラットの背部を軽く接触する方法で行った。その結果、6時間の全断眠によりGALP mRNA量は視床下部弓状核において増加する傾向はあるもののコントロール群と比較して有意な増加は見られなかった。また、ストレスの指標として視床下部室傍核小細胞群におけるCRH mRNAの変動を検討した結果、全断眠後もCRH mRNAはコントロール群と比較して有意な変化は見られなかった。したがって、今回用いた全断眠の実験手法はラットにストレス反応を引き起こす可能性が低いことが検証された。今後、全断眠の時間を変えてラット視床下部弓状核におけるGALP mRNAの変動を検討すること、選択的REM断眠でのGALP mRNAの変動を調べることとした。また、サーカデイアンリズムとGALP mRNAの変動について経時的に調べることによりGALPと覚醒・睡眠リズムとの相関を明らかにすることとした。
低酸素で近赤外蛍光を発するインビボ腫瘍イメージングプローブの論理的分子設計と合成

癌の悪性化と密接に関わっている低酸素がん細胞を可視化することを目的として、非侵襲的な生体イメージングに適した近赤外領域の蛍光を利用するプローブの開発を本研究で行った。まず、低酸素環境選択的な還元反応を利用するべく、密度汎関数法に基づいて論理的なプローブ分子の設計・合成、ならびに培養細胞を用いた蛍光顕微鏡による評価を行った。その結果、低酸素環境下の細胞において特異的に蛍光が増強する化合物を創出した。本研究では生体組織透過性に優れ自家蛍光の弱い波長領域である近赤外領域の蛍光に着目し、浸潤・転移、血管新生といった癌の悪性化と密接に関わり、がん治療上重要な標的である低酸素がん細胞を特異的かつ非侵襲的に生きた状態で可視化することを目的とする。本年度においては、まずフロンティア軌道と蛍光特性の関連性に基づくプローブ分子設計の原理に注目し、低酸素領域特異的なニトロアレーンの還元的代謝反応に基づいて低酸素認識部位としてニトロベンジル基を選択した。近赤外蛍光色素としてはトリカルボシアニンを用い、ニトロベンジル基を本色素に組み込んだ一連の低酸素蛍光小分子プローブ候補の設計・合成を行った。続いて光学的な評価ならびに酵素を用いたin vitro評価を行って候補化合物の選抜を行った。その結果、トリカルボシアニンのインドレニン窒素原子に3,5-ジニトロベンジル基を導入した化合物の近赤外蛍光が、ジアミノ体へと還元された際に変化することを見出した。またこの蛍光変化はインドレニンの置換基により大きく左右され、適切な電子供与性官能基ならびに水溶性置換基を導入することによりこの蛍光が大きく増強することをも見出した。この蛍光増大は、還元反応によりプローブ分子同士のスタッキングが解消されること、ならびにフロンティア軌道の変化により合理的に説明することが出来た。さらにニトロレダクターゼを用いた酵素反応の結果からも、還元反応の進行とともに近赤外領域において大きく蛍光が増強することを見出し、本プローブが生体内反応の基質として働くことを確認した。以上、本年度においては近赤外低酸素蛍光プローブの一次選抜を行い、有望な候補化合物を得た。今後in vitro培養細胞系を用いた機能評価によるスクリーニング、引き続いてin vivo動物実験系を用いた機能評価を行い、所期の目的を達成する。本研究は、浸潤・転移、血管新生といった癌の悪性化と密接に関わり、がん治療上重要な標的である低酸素がん細胞を特異的かつ非侵襲的に生きた状態で可視化することを目的とするものである。そのために、生体組織透過性に優れ自家蛍光の影響の小さな波長領域である近赤外領域の蛍光に着目した。前年度においては、フロンティア軌道と蛍光特性の関連性に基づくプローブ分子設計の原理に注目し、低酸素領域特異的なニトロアレーンの還元的代謝反応に基づいた分子の設計・合成ならびに評価を行った。その結果、近赤外蛍光色素としてはインドレニン5-位にメトキシ基を導入したトリカルボシアニン誘導体を用い、一方のインドレニン窒素原子に3,5-ジニトロベンジル基を導入した化合物の光学特性を評価したところ、本化合物は蛍光を持たないものの、化学的にジアミノ体へと還元された際に蛍光が近赤外領域にて約10倍に増大することを見出した。ニトロレダクターゼを用いた酵素反応の結果からも、還元反応の進行とともに蛍光が増強することを見出し、本プローブが酵素反応の基質として働くことを確認した。今年度においては、上述の選抜化合物を用いてさらなる評価・検討を行った。まずヒト肺癌由来A549細胞の溶解液を用いて機能評価を行った所、常酸素環境下では蛍光強度がさほど変化しないのに対して低酸素環境下では優位に蛍光強度が増大し、36時間後に最大に達した。さらにA549細胞のライブセルイメージングを行った所、常酸素培養下に比較して低酸素培養下で優位な蛍光強度の増大が認められ、12時間後に最大に達した。以上の結果より、本プローブがin vitroレベルで低酸素がん細胞を近赤外蛍光で可視化することが明らかとなった。引き続き、担がんマウスを用いたin vivoダイレクトイメージングによって低酸素癌組織への集積性を検討し、現在結果の解析を行っている。
生体内の分子間ネットワークの人工制御を目指した新規機能性蛋白質の創製

本研究では、生体内のヘム濃度を感知してヘム分解酵素の発現を制御するヘム応答性の転写制御因子Bach1の働きに注目し、生化学的・構造生物学的見地から解析を進めてきた。本年度は、Bach1に結合したヘムの配位状態と結合部位の同定を意図し、Bach1-ヘム複合体に対する各種分光学的測定とシステイン-プロリン配列(CPモチーフ)の変異体に対する正確なヘム結合測定を行った。その結果、以下のような顕著な研究成果を得た。Bach1には5つのヘムが結合し、2種類のヘム結合様式があることを初めて明らかにした。また、1つはCPモチーフ以外のシステインと窒素性のアミノ酸が配位した状態(結合様式Type1)でBach1に結合し、そのうち4つは、3-6番目のCPモチーフのシステインが配位した状態(結合様式Type2)で結合することを示した。最近の報告によれば、3,4番目のCPモチーフはヘム依存的な核外排出に、5,6番目のCPモチーフはヘム依存的なDNA解離に関わっているとされており、本研究の結果はBach1による転写調節と核外排出が、結合様式Type2を示すヘムを複数個用いて、独立に制御されている可能性を示している。さらに、Bach1に取り込まれたヘムがHO-1に速やかに受け渡されることも実験的に示しており、核内のヘムを細胞質のHO-1に効率よく分解させるためにヘムを大量に核外へと排出させることも、Bach1の大きな役割の1つであると提案している。本研究で得られた知見は、Bach1のみならず、ヘムを感知することで転写や翻訳などの機能を制御する「ヘムセンサータンパク質」のヘム感知機構を解明する上でも極めて重要である。今後、結合様式Type1のヘムが制御している機能やType2のヘムとの関わりなどがさらに明らかになれば、生体内でのヘム応答機構を人工的に扱えるようになると考えている。本年度は、タンパク質による核酸の特異的な認識と、ヘム結合による機能制御のモデル構築の第一段階として、既存のタンパク質からその機能と構造の相関に関する知見を得ることを目的とした研究を行った。近年、高等生物で見つかったタンパク質Bach1は、核酸とヘムの結合部位を持っており、ヘム分解酵素をコードする遺伝子の上流に位置する転写制御領域に特異的に結合し、ヘム濃度によって転写をコントロールするヘム応答性のタンパク質であることが報告されている。このことから、Bach1はタンパク質の機能制御機構を分子レベルで理解するにあたって最適なモデルとなりうると考えている。そこでBach1の大腸菌による大量発現系を確立するとともに、以下、各種分光法を用いたBach1の構造解析を行った。紫外可視吸収の測定からは、Bach1が2種類のヘム結合部位を持っており、そこに結合したヘムの配位構造は高親和性部位と低親和性部位とでは異なっていることが示唆された。すなわち、高親和性部位に結合したヘムは6配位低スピン構造を、低親和性部位に結合したヘムは5配位高スピン構造をとっていると考えられた。そこでさらに詳細な解析をするために、電子スピン共鳴吸収・共鳴ラマン散乱の測定により実行し、その結果Bach1に結合したヘム配位子の一つが、どちらの結合部位においてもシステイン残基であることが明らかとなった。さらに、Bach1の高親和性部位へのヘム結合がDNAとの結合解離に関与することが蛍光偏光異方性を利用したアッセイ系の測定から示唆され、ヘムの特異的なタンパク質への結合と、タンパク質-DNA結合制御との関係が明らかになりつつある。昨年度からの培養条件や精製法の改良によってBach1をmgオーダーで大量に精製する方法を確立し、本年度はヘムに注目した各種分光測定を行うことでDNA結合を制御するヘムの配位構造の解析を行ってきた。その結果、分光学的性質からBach1には少なくとも一つはシステインを軸配位子にもつ2種類のヘム結合部位をもつことが明らかとなった。このヘム結合とDNA結合制御の関係をより詳細に調べるため、Bach1のパートナーであるMafKタンパク質との複合体として精製を試み、この高純度試料を得ることに成功した。現在、この精製試料と蛍光標識したDNAを用いて異方性の変化を測定し、複合体とDNAの結合について定量的な解析を進めている。また最近になってヘムとの特異的な結合がDNAとの結合だけでなく、Bach1の細胞内輸送にも関わっていることが明らかとなってきた。そこでBach1変異体の作成や紫外可視吸収などの分光測定を行うことでヘム結合部位の同定を試みており、これまでにヘム結合(Cys-Pro)モチーフの1つがこの結合に関与していることが明らかとなった。こうした比較的解析の容易なヘムを手がかりとして転写因子が関与する反応の素過程を一つ一つ明らかにし、Bach1の生物化学的な全体像を明らかにすることができれば転写因子による遺伝子発現調節メカニズムのプロトタイプを確立することができると考えている。

その結果、以下のような顕著な研究成果を得た。Bach1には5つのヘムが結合し、2種類のヘム結合様式があることを初めて明らかにした。また、1つはCPモチーフ以外のシステインと窒素性のアミノ酸が配位した状態(結合様式Type1)でBach1に結合し、そのうち4つは、3-6番目のCPモチーフのシステインが配位した状態(結合様式Type2)で結合することを示した。最近の報告によれば、3,4番目のCPモチーフはヘム依存的な核外排出に、5,6番目のCPモチーフはヘム依存的なDNA解離に関わっているとされており、本研究の結果はBach1による転写調節と核外排出が、結合様式Type2を示すヘムを複数個用いて、独立に制御されている可能性を示している。さらに、Bach1に取り込まれたヘムがHO-1に速やかに受け渡されることも実験的に示しており、核内のヘムを細胞質のHO-1に効率よく分解させるためにヘムを大量に核外へと排出させることも、Bach1の大きな役割の1つであると提案している。本研究で得られた知見は、Bach1のみならず、ヘムを感知することで転写や翻訳などの機能を制御する「ヘムセンサータンパク質」のヘム感知機構を解明する上でも極めて重要である。今後、結合様式Type1のヘムが制御している機能やType2のヘムとの関わりなどがさらに明らかになれば、生体内でのヘム応答機構を人工的に扱えるようになると考えている。
O-GlcNAc修飾を介したスフィンゴ糖脂質代謝制御機構の解明

細胞膜構成脂質の一つ「糖脂質」はその糖鎖部分の構造の違いによって多様な分子種が存在し、その発現異常は様々な疾患につながる。各糖脂質の真の機能解明には、従来までの糖転移酵素遺伝子改変だけでは不可能な、糖脂質の緻密な量的・質的改変技術が必須である。申請者は最近、タンパク質翻訳後修飾の一つ、“O-GlcNAc修飾"が糖脂質代謝を制御しうることを見出した。本研究では、「O-GlcNAc修飾による糖脂質代謝制御の分子機構を解明」し、「代謝制御機構理解に基づく新たな糖脂質発現制御法の開発」を行う。従来の遺伝子改変技術と新たな糖脂質発現制御法を組み合わせ、生細胞においてきめ細やかな糖脂質発現制御を行うことで、細胞における糖脂質の新たな機能の解明を目指す。生体内のO-GlcNAc修飾の制御・機能に関しては不明な点がいまだ多く、非常に多くのタンパク質がO-GlcNAc修飾をうけるにもかかわらず、その修飾、脱修飾にはそれぞれ一つの酵素(O-GlcNAc転移酵素(OGT)、O-GlcNAc脱離酵素(OGA))しかない。この2つの酵素は栄養条件によって大きく変化することがわかった。また、OGT, OGAの発現を変化させると連動して互いの発現が変化し、O-GlcNAc化修飾を一定に保つことが明らかになった(日本生化学会発表)。徐々にその発現制御機構が明らかになってきたのと、それを制御する因子もわかりつつあり、将来的なO-GlcNAc修飾の制御法開発に関しても道筋が見えてきた。また、O-GlcNAc修飾によって糖鎖関連糖の代謝酵素の発現が変化することが新たにわかり、糖鎖代謝の新たな制御機構が見えてきており、新たな展望が見えてきた(次年度以降に発表予定)。本年度は、「O-GlcNAc修飾量を変動させる因子の探索」、「糖脂質の細胞内動態解明の基盤作り」に注力し、ある程度進行できた。細胞は非常に厳密にO-GlcNAc修飾量の恒常性を保つ機構が存在することがわかってきた。複数のO-GlcNAc修飾関連酵素が細胞培養条件に応じて相互に連動して発現変動し、O-GlcNAc化の恒常性を保っていることが新たに明らかになった。その発現変動を誘導する培養条件、薬剤、栄養素もおおよそ検討でき、加えて、O-GlcNAc関連酵素の過剰発現株、発現抑制株の作製も順調に行えたことから、ある程度任意のO-GlcNAc修飾状態の細胞株を得ることができた。また、それらの細胞の解析から、注目した糖転移酵素(GM3合成酵素、Gb3合成酵素)以外の糖鎖関連酵素の発現にO-GlcNAc修飾が関わることが新たにわかりつつあり、今後それらに関して新たな展開が期待できる。クリックケミストリーを応用した蛍光標識糖および蛍光標識脂質代謝中間体を細胞に取り込ませることで、細胞内の糖脂質代謝産物の局在を可視化すること、および生化学的細胞分画を組み合わせることによって細胞内の糖脂質代謝の場をある程度詳細に可視化分析することができつつあり、糖脂質の細胞内動態解明のための基盤が確立しつつある。「O-GlcNAc修飾改変時に変動するタンパク質群の探索」に関しては、上記の新発見はあったものの、本来の糖脂質発現制御に関わる因子に関しては順調に進んでいないため今後注力する必要がある。O-GlcNAc修飾量を変動させる因子の探索に関しては、非常に多因子(栄養条件、増殖条件)が関与しており、繊細に制御されていることが明らかになったことから、今後さらに厳密な条件設定と検証を行う。それらの条件を培養細胞のみならず、動物個体にも応用し、個体レベル(臓器レベル)でのO-GlcNAc改変を試みる予定である。また、O-GlcNAc改変に連動して、当初注目していたもの以外の糖鎖合成のための酵素群が大きく発現変動することが予期せず明らかになった。この分子機構を詳細に解析することで、糖脂質のみならず、糖タンパク質糖鎖の改変にも応用が可能になる道が開けた。こちらも詳細な分子機構の解明を進める。O-GlcNAc関連酵素の過剰発現株、発現抑制株の作製、O-GlcNAc修飾量を変動させる因子の探索が進んでいることから、これらの細胞株や各種条件で培養した細胞株の糖脂質および代謝中間産物の網羅的解析を進める予定である。この代謝の流れを把握するため、蛍光脂質中間体、クリックケミストリーを用いた糖脂質代謝の細胞内動態を可視化技術の基盤を確立する。市販で手に入る蛍光産物は限りがあるため、市販のものを用いた代表例で確たる技術基盤を示し、化学合成系研究室とのコラボレーションの交渉を目指す。各実験用設備、試薬、技術基盤が本年度で整ってきたため、より詳細な解析を進め、計画通りの遂行と新たな発見の詳細解明に注力する。

従来の遺伝子改変技術と新たな糖脂質発現制御法を組み合わせ、生細胞においてきめ細やかな糖脂質発現制御を行うことで、細胞における糖脂質の新たな機能の解明を目指す。生体内のO-GlcNAc修飾の制御・機能に関しては不明な点がいまだ多く、非常に多くのタンパク質がO-GlcNAc修飾をうけるにもかかわらず、その修飾、脱修飾にはそれぞれ一つの酵素(O-GlcNAc転移酵素(OGT)、O-GlcNAc脱離酵素(OGA))しかない。この2つの酵素は栄養条件によって大きく変化することがわかった。また、OGT, OGAの発現を変化させると連動して互いの発現が変化し、O-GlcNAc化修飾を一定に保つことが明らかになった(日本生化学会発表)。徐々にその発現制御機構が明らかになってきたのと、それを制御する因子もわかりつつあり、将来的なO-GlcNAc修飾の制御法開発に関しても道筋が見えてきた。また、O-GlcNAc修飾によって糖鎖関連糖の代謝酵素の発現が変化することが新たにわかり、糖鎖代謝の新たな制御機構が見えてきており、新たな展望が見えてきた(次年度以降に発表予定)。本年度は、「O-GlcNAc修飾量を変動させる因子の探索」、「糖脂質の細胞内動態解明の基盤作り」に注力し、ある程度進行できた。細胞は非常に厳密にO-GlcNAc修飾量の恒常性を保つ機構が存在することがわかってきた。複数のO-GlcNAc修飾関連酵素が細胞培養条件に応じて相互に連動して発現変動し、O-GlcNAc化の恒常性を保っていることが新たに明らかになった。その発現変動を誘導する培養条件、薬剤、栄養素もおおよそ検討でき、加えて、O-GlcNAc関連酵素の過剰発現株、発現抑制株の作製も順調に行えたことから、ある程度任意のO-GlcNAc修飾状態の細胞株を得ることができた。また、それらの細胞の解析から、注目した糖転移酵素(GM3合成酵素、Gb3合成酵素)以外の糖鎖関連酵素の発現にO-GlcNAc修飾が関わることが新たにわかりつつあり、今後それらに関して新たな展開が期待できる。クリックケミストリーを応用した蛍光標識糖および蛍光標識脂質代謝中間体を細胞に取り込ませることで、細胞内の糖脂質代謝産物の局在を可視化すること、および生化学的細胞分画を組み合わせることによって細胞内の糖脂質代謝の場をある程度詳細に可視化分析することができつつあり、糖脂質の細胞内動態解明のための基盤が確立しつつある。「O-GlcNAc修飾改変時に変動するタンパク質群の探索」に関しては、上記の新発見はあったものの、本来の糖脂質発現制御に関わる因子に関しては順調に進んでいないため今後注力する必要がある。O-GlcNAc修飾量を変動させる因子の探索に関しては、非常に多因子(栄養条件、増殖条件)が関与しており、繊細に制御されていることが明らかになったことから、今後さらに厳密な条件設定と検証を行う。それらの条件を培養細胞のみならず、動物個体にも応用し、個体レベル(臓器レベル)でのO-GlcNAc改変を試みる予定である。また、O-GlcNAc改変に連動して、当初注目していたもの以外の糖鎖合成のための酵素群が大きく発現変動することが予期せず明らかになった。この分子機構を詳細に解析することで、糖脂質のみならず、糖タンパク質糖鎖の改変にも応用が可能になる道が開けた。こちらも詳細な分子機構の解明を進める。O-GlcNAc
カンジダ敗血症性急性肺障害における接着分子の役割の検討

今回、カンジダ敗血症において、カンジダの内皮細胞への接着におけるMac-1の役割を検討するため、(1)C.albicansのRPAECへの接着(in vitro)および(2)ラットカンジダ敗血症性急性肺障害モデル(in vivo)に及ぼすMac-1抗体の影響を検討する。まず、in vitroの実験を行っている。C.albicansのyeastの表面に発現するとされるMac-lの発現を確認するため、Flow cytometryを行った。現時点では、明らかな発現の確認には至っていないため、今後yeastの前処置につき再検討する予定である。次に、SD系雄性ラットのRPAECを肺動脈よりExplant法にて分離培養した。RI標識したC.albicansのyeastを培養RPAECに添加し、1時間後にRPAECの放射活性を測定した。C.albicansのRPAECへの接着率を計算し、Mac-1抗体を感染1時間前に投与した群(AMA(+)群)と、非投与群(AMA(-)群)を比較した。結果は近日中に判明する予定である。
唾液中の炎症性バイオマーカーと動脈硬化リスク因子との関連

都市部一般住民を対象に、国立循環器病研究センターにおいて、基本健診ならびに歯科検診を行い、以下のような関連を見出した。1.唾液中炎症性バイオマーカーと動脈硬化性疾患との関連についての縦断的解析の基礎資料を得た。2.唾液中の歯周病関連細菌の重積は脂質異常と関連していた。3.残存する咬合支持域によって、咀嚼能率に影響を及ぼす因子は変化した。4.咀嚼能率の時系列変化に影響を及ぼす因子が明らかになった。1)データの収集:すでに平成2024年に国立循環器病研究センター予防健診部において歯科検診を受診した吹田研究基本健診参加者(約1900名のうち、頸部エコー被験者は約1500名)の中で初回歯科検診から4年以上経過し、文書により同意を得た者に対して研究期間中に再評価を行った。平成27年度内の歯科検診再評価者は、目標400名に対し297名であった。初回歯科検診は目標100名に対し、41名であった。2)横断解析:唾液中炎症性バイオマーカーとIMTとの間に有意な関連は認められ、今後の縦断解析の基礎資料は得られた。3)歯周病菌と循環器疾患との関連についての横断解析:ベースライン時の歯科検診に参加した353名の唾液サンプルを解析し、唾液中の歯周病関連細菌と脂質異常との間に有意な関連が認められ、歯周病と循環器疾患との関連を裏付ける基礎資料が得られた。4)プレ縦断解析:ベースライン時ならびに再評価時(ベースラインより4年以上経過)の歯科検診にいずれも参加した783名の歯科データより、歯周状態の悪化が、動脈硬化性疾患のリスク因子である咀嚼能率の低下に影響を及ぼすことが明らかとなった。データの収集においては、再評価者、初回歯科検診者ともに目標は達しなかった。解析については、横断解析では、今後縦断解析の基礎資料となる結果が明らかとなり、また唾液中の歯周病関連菌と循環器疾患との関連が明らかとなることで、歯周病と循環器疾患との関連を裏付けるエビデンスが得られたと考えられる。またプレ縦断解析では、歯科のみのデータより、歯周状態の悪化が咀嚼能率の低下に影響を及ぼすことが明らかとなった。平成27年度内の歯科検診再評価者は297名であり、初回歯科検診は41名であった。平成28年度内の歯科検診再評価者は、目標300名に対し164名であった。初回歯科検診は目標50名に対し、15名であった。歯科検診再評価者60名の唾液中炎症性バイオマーカーを解析し、動脈硬化性疾患との関連についての縦断解析の基礎資料が得られた。2)歯周病菌と脂質異常症との関連についての横断解析:ベースライン時の歯科検診に参加した385名の唾液サンプルを解析し、唾液中の歯周病関連細菌と脂質異常症との間に有意な関連が認められ、歯周病と循環器疾患との関連を裏付ける基礎資料が得られた。3)歯周病とメタボリックシンドロームとの関連についての横断解析:ベースライン時の歯科検診に参加した1856名のデータより、歯周病と、動脈硬化性疾患のリスク因子であるメタボリックシンドロームとの関連が明らかになり、今後の縦断解析の基礎資料が得られた。4)咀嚼能率関連因子についての縦断解析:ベースライン時にならびに再評価時の歯科検診にいずれも参加した783名の歯科データより、動脈硬化性疾患のリスク因子である咀嚼能率の低下に関連を及ぼす因子(年齢、歯数、咬合力、歯周状態)を明らかにした。前年度より引き続いてデータ収集を行う。歯科検診再評価者は300名を目標とし、累積して1300名を目標とする。初回歯科検診は前年度41名であったことより、50名を目標とし、累積して2300名を目処にベースライン調査者数の増加をはかる。また、ベースライン評価からの追跡期間は最長でも6年と短く、外注検査費用が高額なためサンプル数も十分ではないが、前向きコホート研究のプレ解析として、これまで横断解析で頸動脈硬化との関連が認められている唾液中炎症性バイオマーカーのベースラインデータおよび追跡期間中の変化が、再評価時における動脈硬化性疾患リスク因子ならびに発症に及ぼす影響について、縦断解析(年齢、性別、既往歴、生活習慣を調整した多変量解析)を行い、今後の前向きコホート研究の基礎資料を得ることを目標とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学
ボルネオ多雨林生態系の地球環境変化に対する応答

本研究は,IGBP-GCTEのコアリサーチ「モンスーンアジア陸域生態系における地球変化のインパクト」(TEMA)の熱帯低地多雨林観測体制を担う目的で行なった.TEMAの観測体制は,熱帯低地雨林生態系のステーションが欠けていた.本研究は,インドネシア・マレーシアとの共同研究としてボルネオにおけるTEMAステーションの整備・立ちあげを行なった.気候的極相である低地混交フタバガキ林生態系とともに,内陸泥炭湿地林および海岸湿地林といった地形的・土壌的成因による貧栄養生態系にも調査ステーションを設けて,低地生態系の全体像を把握することに重点を置いた.ボルネオ島南部の内陸低地には木質泥炭が深く堆積する特殊な森林生態系が広く分布する.中央カリマンタン・パランカラヤ市近郊のラヘイ地区およびその周辺に設営したステーションでは,泥炭湿地林と,泥炭が欠落した珪砂質栄養土壌上のケランガス林に森林調査プロットを設営し,毎木調査と同定のための標本採取の他,リタートラップと分解実験のためのリターバッグ(葉および細枝)も設置した.さらに土壌のガス交換特性を調べるために,採気による温室効果ガスの測定を開始した.また,広域の集水域特性をみるために,パランカラヤからタンジュンプティ国立公園にかけての陸水学的予備センサスを行なった.また,並行してマレーシア・サバ州タビン保護区に海岸湿地林生態系のステーションを設置し,すでにTEMA観測が進行しているキナバル山でもプロットの再測定と,特に高標高地域の植物の繁殖過程を行なった.2月上旬にはTEMA共同研究をひとつの柱とした札幌のシンポジウムに参加するとともに,3月中旬に開催されたGCTE-LUCC国際会議に出席してTEMAの成果を発表し,今後の観測体制について討議した.本研究は,IGBP-GCTEのコアリサーチ「モンスーンアジア陸域生態系における地球変化のインパクト」(TEMA)の熱帯低地多雨林観測体制を担う目的で行なった.TEMAの観測体制は,熱帯低地雨林生態系のステーションが欠けていた.本研究は,インドネシア・マレーシアとの共同研究としてボルネオにおけるTEMAステーションの整備・立ちあげを行なった.気候的極相である低地混交フタバガキ林生態系とともに,内陸泥炭湿地林および海岸湿地林といった地形的・土壌的成因による貧栄養生態系にも調査ステーションを設けて,低地生態系の全体像を把握することに重点を置いた.ボルネオ島南部の内陸低地には木質泥炭が深く堆積する特殊な森林生態系が広く分布する.中央カリマンタン・パランカラヤ市近郊のラヘイ地区およびその周辺に設営したステーションでは,泥炭湿地林と,泥炭が欠落した珪砂質栄養土壌上のケランガス林に森林調査プロットを設営し,毎木調査と同定のための標本採取の他,リタートラップと分解実験のためのリターバッグ(葉および細枝)も設置した.さらに土壌のガス交換特性を調べるために,採気による温室効果ガスの測定を開始した.また,広域の集水域特性をみるために,パランカラヤからタンジュンプティ国立公園にかけての陸水学的予備センサスを行なった.また,並行してマレーシア・サバ州タビン保護区に海岸湿地林生態系のステーションを設置し,すでにTEMA観測が進行しているキナバル山でもプロットの再測定と,特に高標高地域の植物の繁殖過程を行なった.2月上旬にはTEMA共同研究をひとつの柱とした札幌のシンポジウムに参加するとともに,3月中旬に開催されたGCTE-LUCC国際会議に出席してTEMAの成果を発表し,今後の観測体制について討議した.本研究は、IGBP-GCTEのコアリサーチ「モンスーンアジア陸域生態系における地球変化のインパクト」(TEMA)の熱帯低地多雨林観測体制を担う目的で行った。TEMAの観測体制は、熱帯低地雨林生態系のステーションが欠けていた.本研究は、インドネシア・マレーシアとの共同研究としてボルネオにおけるTEMAステーションの整備・立ちあげを行なった.気候的極相である低地混交フタバガキ林生態系とともに、内陸泥炭湿地林および海岸湿地林といった地形的・土壌的成因による貧栄養生態系にも調査ステーションを設けて、低地生態系の全体像を把握することに重点を置いた.ボルネオ島南部の内陸低地には木質泥炭が深く堆積する特殊な森林生態系が広く分布する.中央カリマンタン・パランカラヤ市近郊のラヘイ地区およびその周辺に設営したステーションでは、泥炭湿地林と、泥炭が欠落した珪砂質貧栄養土壌上のケランガス林に森林調査プロットを設営し、毎木調査と同定のための標本採取の他、リタートラップと分解実験のためのリターバッグ(葉および細枝)も設置した.さらに土壌のガス交換特性を調べるために、採気による温室効果ガスの測定を開始した.また、広域の集水域特性ををみるために、パランカラヤからタンジュンプティ国立公園にかけての陸水学的予備センサスを行った.また、並行してマレーシア・サバ州タビン保護区に海岸湿地林生態系のステーションを設置し、すでにTEMA観測が進行しているキナバル山でもプロットの再測定と、特に高標高地域の植物の繁殖過程を行った.2月上旬にはTEMA共同研究をひとつの柱とした札幌のシンポジウムに参加するとともに、3月中旬に開催されたGCTE-LUCC国際会議に出席してTEMAの成果を発表し、今後の観測体制について討議した.
Bio・lipid産生酵素による新規な蛋白質翻訳後修飾と蛋白質運命の解析

細胞内で合成された蛋白質は、糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾を受けて生理活性を獲得したり、機能修飾が起こる。ボスホリパーゼD (PLD)は様々なアゴニスト刺激により活性化され、膜リン脂質のPCを加水分解してボスファチジン酸(PA)を産生し、このPAが下流ヘシグナルを伝達する。PLDは反応系に一級水酸基が存在すると加水分解反応よりもむしろPCのボスファチジル基を一級水酸基に転移する「ホスファチジル基転移反応」を優位に触媒する。代表者は、上述した既知の蛋白質翻訳後修飾とは異なり、PLDがユニークなボスファチジル基転移反応により、ホスファチジル基を蛋白質のセリン残基の水酸基に転移することにより蛋白質をボスファチジル化して、蛋白質の機能や安定性を調節するという、全く新奇の蛋白質翻訳後修飾の可能性を予想していた。哺乳動物細胞では、PLD1とPLD2の二種類のPLDが存在する。リコンビナントPLD2蛋白質とアイソトープ標識PCを用いたin vitroのアッセイ系を用いて検討したところ、PLD2はL-セリンの水酸基にホスファチジル基を転移した。さらに、PLD活性依存的にPLD2蛋白質自身がボスファチジル化されることを見出し、代表者が予想した新奇の蛋白質修飾反応がin vitroにおいて実際に起こり得ることが示された。次に、細胞膜のPCを特異的にアイソトープ標識したヒト好中球を走化性因子fMLPで刺激すると、顕著なPLD活性の上昇とともに53kDaの蛋白質などへのホスファチジル化が起こることを示し、細胞内においても蛋白質ボスファチジル化反応が起こっていることが強く示唆された。これらの結果から、リン脂質代謝酵素による新奇蛋白質翻訳後修飾・蛋白質ボスファチジル化が実際に存在し、基質蛋白質の機能変化や細胞膜へのアンカーリング、蛋白質運命の決定に重要な役割を果たしていると考えている。ホスホリパーゼD(PLD)は、生理的条件下では細胞膜構成リン脂質のホスファチジルコリンを加水分解して、bio-lipidとして機能するホスファチジン酸を産生する。一方、反応系に一級アルコールが存在すると、PLDは加水分解反応よりもむしろPCのホスファチジル基を一級水酸基に転移してホスファチジルアルコールを産生するホスファチジル基転移反応を優位に触媒する。蛋白質構成成分のアミノ酸のうちセリンは一級水酸基を有しており、蛋白質分子中のセリン残基がPLDによってホスファチジル化されてその機能が修飾されるという、今までに例を見ない新規の蛋白質翻訳後修飾の可能性が考えられ、この点について検討した。その結果、以下のような結果が今までに得られた。現在までに同定されているPLD1とPLD2の二種類のPLDアイソザイムのうち、リコンビナントPLD2を調製し、これを[^<32>P]PCと遊離セリン存在下でインキュベートすると、[^<32>P]ホスファチジルセリンが産生され、PLD2は遊離セリンをホスファチジル化することが明らかとなった。さらに、リコンビナントPLD2を[^<32>P]PCとインキュベートすると、PLD2への[^<32>P]の取り込みが認められたが、活性欠失型PLD2への取り込みは認められなかった。これらの結果から、PLD2はその活性依存的に自己ホスファチジル化される可能性が示唆された。リコンビナントPLD2を[^<32>P]PC存在下、J774.1細胞の膜画分とインキュベートすると、数種類の蛋白質への[^<32>P]の取り込みが観察された。さらに、好中球の細胞膜PCを特異的に^<32>P標識して、fMLPで刺激すると、数種の蛋白質への^<32>Pの取り込みが見られた。このことから、細胞膜蛋白質がPLD2によりホスファチジル化される可能性が十分考えられる。

次に、細胞膜のPCを特異的にアイソトープ標識したヒト好中球を走化性因子fMLPで刺激すると、顕著なPLD活性の上昇とともに53kDaの蛋白質などへのホスファチジル化が起こることを示し、細胞内においても蛋白質ボスファチジル化反応が起こっていることが強く示唆された。これらの結果から、リン脂質代謝酵素による新奇蛋白質翻訳後修飾・蛋白質ボスファチジル化が実際に存在し、基質蛋白質の機能変化や細胞膜へのアンカーリング、蛋白質運命の決定に重要な役割を果たしていると考えている。
αシヌクレイン老化が引き起こす個体老化パーキンソン病

パーキンソン病(PD)はその発症に老化が強く関連しています。モザンビークに棲息するアフリカメダカは脊椎動物で現在最も短命でありながら非常に早期に老化の兆候を呈します。この約5ヶ月で短い一生を終えるサイクルは内因的なもので、このサイクルは野生のみならず実験室内でも再現されます。さらに加齢に伴い、臓器の萎縮、運動能力の低下、脊柱彎曲、癌の発生頻度の上昇、テロメアの短縮、老化関連酸性β-ガラクトシダーゼの上昇など、老化の様々な兆候を示します。私達は"寿命最短・最速老化"脊椎動物=アフリカメダカが加齢によりヒトPDに類似した病態を呈するかどうかを検討しました。その結果この老化が抑制されない魚の中で、加齢以外なんら特別な処置なしに、ヒトPDに酷似した病変が進んでいくことを見いだしました。すなわちアフリカメダカは加齢依存性にドパミン・ノルアドレナリン神経の変性を示し、αシヌクレイン陽性の凝集体病変は神経系の局所から全中枢神経へ連続的に進展を見せました。またアフリカメダカのαシヌクレインはヒトαシヌクレインに対する伝搬性を持っていました。さらにアフリカメダカにおけるドパミン・ノルアドレナリン神経の変性は加齢及びαシヌクレイン依存性でした。今後はさらにアフリカメダカで知見を累積し、それをマウスやヒトにあてはめ、ヒトにおいても同様に、疾患発症初期あるいは発症前に、パーキンソン病の発症を抑止できるかどうかを臨床的に検討するに十分なエビデンスを得ます。またαシヌクレインの伝搬様式および細胞変性のメカニズムを明らかにすることでPD病変の開始・伝搬および進行・細胞変性、その全ての段階での治療介入を目指します。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。私達は小型魚類を利用し、パーキンソン病の病態を研究しています。その中でも加齢とともに自然経過でパーキンソン病に類似した病態を呈するアフリカメダカを観察し、かつその知見をin vitroからヒト剖検脳までを活用することで妥当性を検証してきました。今年度は、1)老齢のアフリカメダカとヒトパーキンソン病剖検脳において共通して蓄積する異常物質、2)老齢のアフリカメダカとヒトパーキンソン病剖検脳において共通して増加するαシヌクレインの翻訳後修飾、これらを同定しつつあります。また、3)腸内細菌が腸管神経と中枢神経のαシヌクレインに与える影響、もマウス、組織培養、アフリカメダカ等を用いることで検証しました。2) "老齢のアフリカメダカとヒトパーキンソン病剖検脳において共通して増加するαシヌクレインの翻訳後修飾"について特に詳細を述べますと、質量分析、免疫組織学的染色による、小型魚類(アフリカメダカ、メダカ、ゼブラフィッシュ等)、マウス、培養細胞、in vitro、ヒト剖検脳(脳研究所に蓄積された豊富な剖検症例を検討)などの検討により徐々に重要な修飾をしぼりつつある状況にあります。また遺伝子改変モデルや遺伝子導入を中心とした、その修飾の意義付け、特に細胞死や、凝集体形成などとの関連を現在も検索中です。疾患により修飾を受けているだけなのか、それとも細胞死に深く関わっているのか、その検証が今後の課題です。新規の修飾を見いだすのにかかった時間が想定より短かったため。様々なモデルやヒト剖検脳での検討をさらに進めていきます。