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リリンパ浮腫の発症病態メカニズムの解明と新規の標的薬物治療の開発

リンパ浮腫の基盤にある炎症プロセスと過剰なリンパ管新生について、その意義と、制御分子機構の解明を本研究者が開発したマウスモデルを用いて行った(1)。また、既に同定済みのリンパ浮腫抑制薬について、そのリンパ浮腫のプロセスへの作用機序を明確にした(2)。1炎症プロセスの誘導機構とリンパ管新生、リンパ管成熟障害への寄与の解析本研究者が確立したマウスリンパ浮腫モデルでは、リンパ球と単球・マクロファージを主体とした免疫細胞の集積が見られた。また、一部マクロファージはVEGF-Cを発現していることが明らかとなった。従って、炎症プロセスが、リンパ管新生をもたらしている可能性が明らかとなった。さらにサイトカインの投与および中和抗体を用いた解析をin vitroおよびin vivo実験で行い、集積したリンパ球のうちCD4陽性T細胞(Th1,Th17)が産生するサイトカインがマクロファージを刺激してリンパ管新生を促進するVEGFC産生を促進していることがわかった。2リンパ浮腫抑制薬の作用機序の解析本研究者は、すでに炎症と血管新生への作用が知られている薬剤について、そのリンパ浮腫への作用を解析し、既に2種の薬剤がリンパ管浮腫抑制作用を持つことを見いだしている。その作用機序に関して、薬剤がCD4陽性細胞の集積を抑制すること、そしてCD4陽性細胞のマクロファージへの関与が減少し、マクロファージからのVEGFC産生が抑制される結果、リンパ管新生と透過性亢進が抑制され浮腫が軽減することが明らかになった。
骨格筋小胞体の2種のカルシウム放出チャネルの機能

カエル(一般に鳥類以下の脊椎動物)の骨格筋では、小胞体のカルシウム(Ca^<2+>)放出チャネルとして分子量の異なる2種類のもの(哺乳動物の骨格筋型[1型]及び脳型[3型]にそれぞれ相同)がほぼ等量存在している。この2種類のCa^<2+>放出チャネルが生理的にどのように役割を分担しているのかを明らかにすることが本研究の目的である。本研究期間中に次の成果を得た。(1)1型チャネル欠損マウスを利用して3型チャネルの性質を調べ、1型、2型と同様CICRの性質を有するが、開口には高Ca^<2+>濃度を必要とすることを見出した。(2)3型チャネル欠損マウスの作成に成功した。その骨格筋の興奮収縮連関は正常であったが、中枢神経系に異常がある可能性が示唆された。(3)1型チャネル欠損マウスの骨格筋細胞に1型チャネルを発現させると興奮収縮連関は回復したが、2型チャネルを発現させても回復せず、骨格筋型の興奮収縮連関には1型チャネルが必須であることが分かった。(4)1型、3型両方のチャネルを同時に欠損させたマウスの作成に成功した。その骨格筋の小胞体のCa^<2+>取り込みは正常であるが、CICR機構を全く欠いていたので、骨格筋には2型チャネルは発現していない。また、イオン組成を変化させて小胞体を「脱分極」させたときのCa^<2+>放出は、1型チャネルの性質であることが分かった。(5)CICRを抑制すると報告されていたカルモデュリンは、低Ca^<2+>濃度では逆にCICRを促進すること、カルモデュリンによって1型チャネルでは促進、3型チャネルでは抑制が主として見られること、また、その作用はカルモデュリン抑制薬によっては拮抗されないことを見出した。(6)リアノジンは生理的モードで開口したCa^<2+>放出チャネルにも結合して開口固定し、持続収縮を起こすことを明らかにした。故に、放射性リアノジンを利用すれば、2種のチャネルがどのような割合で開口しているか分かる可能性がある。カエル(一般に鳥類以下の脊椎動物)の骨格筋では、小胞体のカルシウム放出チャネルとして分子量の異なる2種類のもの(哺乳動物の骨格筋型及び脳・平滑筋型にそれぞれ相同)がほぼ等量存在している。この2種類のカルシウム放出チャネルが生理的にどのように役割を分担しているのかを明らかにすることが本研究の目的である。生理的なカルシウム放出の際に、2種のカルシウム放出チャネルの両方が同程度に開口するか、それともその一方が主として働いているのかを調べるために、カルシウム放出チャネルの開口時にのみ結合することが知られているアルカロイドのリアノジンを利用するのが本研究計画の根幹である。その利用の前提として、リアノジンはカルシウム放出チャネルのカルシウムによるカルシウム放出(Ca-induced Ca release:CICR)モードでの開口時に結合することが証明されているものの、生理的モードでの開口時にも結合することができるかどうかは不明なので、この点をまず明らかにする実験を行った。

リアノジンがカルシウム放出チャネルに結合すると、チャネルが開口固定され、カルシウムが小胞体から漏出して筋は収縮する、という事実を利用して、生理的収縮時にリアノジンを存在させると、筋が拘縮状態に陥るか否かを調べた結果、生理的収縮時には二次的なCICRを十分抑制した条件下でも、リアノジンはやはりカルシウム放出チャネルに結合し、拘縮を起こすことを今回明らかにした。すなわち、このリアノジン結合の程度は、二次的に開口したCICRモードで開口したチャネルではなく、生理的開口の程度を反映しているものと考えることができる。この結果を利用して現在、放射性リアノジンを用いて、それが2種類のカルシウム放出チャネル分子にどのように結合するかを解析中である。カエル(一般に鳥類以下の脊椎動物)の骨格筋では、小胞体のカルシウム放出チャネルとして分子量の異なる2種類のもの(哺乳動物の骨格筋型[1型]及び脳型[3型]にそれぞれ相同)がほぼ等量存在している。この2種類のカルシウム放出チャネルが生理的にどのように役割を分担しているのかを明らかにすることが本研究の目的である。2種類のチャネルの機能を比較するには、遺伝子操作によって一方のチャネルの発現を抑制して1種類のチャネルだけを発現する動物を作り、調べるのが近道である。前年度の研究分担者の竹島らは、先に1型リアノジン受容体(=カルシウム放出チャネル)を欠失したマウスの作成に成功したが、その骨格筋には3型リアノジン受容体が発現していることを明らかにした。正常の哺乳動物の骨格筋でも量は少ないけれども3型が発現しており、定性的にはカエル骨格筋等と同様であることが明らかにされている。マウスにおいて、1型欠損動物では3型が発現していても興奮収縮連関が遮断されることは竹島らがすでに明らかにしたが、逆に3型を欠失させるとどうなるかを欠損マウスを作成して調べた。3型欠損マウスの興奮収縮連関は正常のものと全く変わらず、少なくともマウスにおいては3型リアノジン受容体は生理的な興奮収縮連関にはほとんど働いていないと結論される。カエル骨格筋の3型リアノジン受容体機能を考える上で示唆的である。なお、3型欠損マウス骨格筋のカルシウムによるカルシウム放出(Ca-induced Ca release:CICR)は、正常骨格筋と比べて高カルシウム濃度領域での放出速度のみが小さくなっており、すでに分かっている3型リアノジン受容体は高閾値型CICRの性質を有するという事実と一致した。
CD4^+CD25^+制御性T細胞の抑制機構の解明と治療への応用

CD4^+CD25^+制御性T細胞(Treg)の試験管内および生体内における抑制機構研究のため、以下の二実験を行った。第一の実験は、改良subtraction法やdifferential display法によりTreg特異的表面分子や分泌分子の同定と抑制機能への関与の検討を行い、第二の実験では、生体での役割を明らかにするため、トランスジェニックマウスを用いてTregによる全身性自己免疫応答の制御機構の検討を行った。制御性T細胞における機能が不明な表面分子や分泌分子に関しては、神経系で発現しているglucocorticoid-induced receptor(GPR83)やfolate receptor4をはじめ複数の分子が確認された。現在、種々の分子群の機能と更なる同定を行っている。また、同定した分子群が抑制機能と直接関係なくとも、細胞表面分子であることから、現在Tregの同定方法が模索されているなかで、本結果は今後のTreg研究に役立つと思われる。更に、生体における制御性T細胞の自己免疫疾患制御への関与を検討するため、核内抗原反応性Tregが生じるトランスジェニックマウスを解析した。このマウスでは著明な抗核抗体が産生されること及びin vitroの解析などから、cognate Treg-B interactionがある状況下では、Treg誘導によるT細胞免疫寛容が一方でB細胞の自己抗体産生誘導に連結している可能性が示唆された。これは、T細胞サブセットをヌードマウスに移入して惹起する抗核抗体誘導の検討でも、Tregが抑制しうる自己抗体、抑制せずむしろ惹起しうる自己抗体が存在することが明らかになったことからも裏付けられた。従って、Tregは、全身性自己免疫応答における制御においては、専ら抑制機構が発揮される臓器特異的自己免疫応答とは異なる役割を担っていることが示唆された。CD4^+CD25^+制御性T細胞(Treg)の抑制機能と自己免疫疾患への関与を検討するため、まずニワトリ卵白アルブミン(OVA)を全身性に核内に発現するトランスジェニックマウス(LdnOVA)とOVA特異的T細胞受容体(TCR)トランスジェニックマウス(DO11.10)を交配して得られたダブルトランスジェニック(DBL-Tg)マウスを解析した。このマウスではOVA特異的TCR発現Tregが胸腺から誕生し(J.Immunol 2002;168:4399)、CD4-CD25-T細胞(Tconv)もTCRの改編が行われ(現在投稿中)、自己反応性が回避されているにもかかわらず抗OVA自己抗体が産生されていた。TregのT細胞への抑制機能は保たれていたことから、直接B細胞の増殖や抗体産生機能にどの様な影響があるかをin vitroで検討した。OVA特異的TregやTconvをB細胞と共培養し、OVA結合F(ab')2抗IgG抗体や抗IgM抗体を用いて刺激したところ、Tregはcognate T-B interactionの状況では、B細胞を抑制せず、むしろ増殖や抗体産生機能に対して促進的に作用し、特にメモリーB細胞で顕著だった。また、in vivoでもRAG欠損LdnOVAマウスにOVA特異的TregやTconvをB細胞とともに移入後、抗OVA自己抗体を測定したところOVA特異的Tregを移入した群で抗体産生が認められた。Tregは自己反応性を有する細胞群であり、またその抑制機能は、cognate T-B interactionがある状況下ではB細胞には発揮されず、DBL-Tgにおける自己抗体産生からも、制御性T細胞が自己抗体産生に関与し、T細胞の免疫寛容誘導が一方ではB細胞の自己抗体産生に連結している可能性が示唆された。更にTregの抑制機序とその解除機構について検討した。
動脈硬化リスクの評価におけるＬｐ（ａ）コレステロールの意義

心血管病のない男性212人を対象とするHPLCリポ蛋白定量法を用いた分析では、Lp(a)-CはLDL-Cと相関を示さず、IDL-C、VLDL-C、カイロミクロン-Cと有意に正相関したが、HDL-CはLp(a)-Cと有意に逆相関した。動脈硬化のフラミンガムリスクスコア(Framingham Risk Score, FRS)はnon-HDL-Cと有意に正相関を示すが、Lp(a)-Cとは僅かな有意相関であった。血管内皮細胞において、アンジオテンシン2はその受容体を介して動脈硬化を不安定化するMMP-2を増強した。Lp(a)のMMP-2に対する増強効果については、その再現性と機序の解明が必要である。一般的な血清脂質、血圧、糖尿病の有無、年齢などから得られるフラミンガムリスクスコア(FRS)とトリグリセリド(TG)リッチリポ蛋白(IDL、VLDL、カイロミクロンレムナント)およびLp(a)との関連性を検討した。Lp(a)コレステロールとFRSの関連性については有意な正相関で認められたが(n= 212, r= 0.143, p< 0.05)、TGリッチリポ蛋白に比べ、FRSとの相関性は軽度であった。またFRSの程度による細分化によって結果が異なることから、さらなる検討が必要であった。一方、TGリッチリポ蛋白とFRSの関連性については、IDLコレステロールが独立して正の相関が確認され、その成績については論文にまとめ投稿し、現在、Acceptable revised preparation with minor revisionの段階にあり、修正稿(2013年6月7日まで)を作成中である。併せて実施している研究として、別の臨床研究(スタチン高用量とスタチン通常用量・エゼチミブ併用の比較)の中で、Lp(a)コレステロールの変化を検討しており、現在、保険医療で測定できるLp(a)濃度とともにLp(a)コレステロール濃度の推移についても比較検討する計画になっている。その他として、Lp(a)の動脈硬化形成に関するメカニズムとしてアンジオテンシンIIとの関連性に注目し、現在、アンジオテンシンIIの血管内皮細胞におけるMMP-2の分泌増強について検討を進めている。また、薬物治療の研究として、Lp(a)と酸化LDLの評価のに着目して、スタチン治療により、Lp(a)は変化せず、酸化LDLは低下し、酸化リン脂質は増加することが確認され、その成績を論文発表した。Lp(a)コレステロールの臨床的意義を評価するために臨床研究と基礎研究の両者を並行して研究を実施した。臨床研究としては健診ドックを受診した男性対象者212名について、HPLCリポ蛋白定量法を用いてリポ蛋白分析を行った。Lp(a)は本来LDL粒子と関連することからLp(a)コレステロールとLDLコレステロールが相関をすることが予想されたが、r= 0.093と全く相関はなかった。一方、IDLコレステロールおよびVLDLコレステロールに対して、それぞれr= 0.188 (p< 0.01)およびr= 0.184 (p< 0.01)とLp(a)コレステロールは有意に相関した。また興味深いことにカイロミクロンコレステロールがr= 0.28 (p< 0.0001)とLp(a)に顕著に相関していた。したがって、Lp(a)コレステロールはTGリッチリポ蛋白のコレステロールと有意に関連することが判明した。またこれを支持するようにHDLコレステロールはLp(a)コレステロールと有意な逆相関を示した(r= -0.191, p< 0.01)。フラミンガムリスクスコア(Framingham Risk Score、FRS)との相関分析を行ったところ、non HDL-CはFRSと有意な正相関を示すが、その説明因子としてはLp(a)コレステロール濃度はr= 0.1419 (p= 0.039)と僅かな有意相関に留まった。一方、Lp(a)コレステロールは尿酸値と顕著な正相関を示しており、新たなる課題が生じた。基礎研究としては、血管内皮細胞(HUVEC)におけるLp(a)コレステロールのMMP-2とLR-11分泌に対する影響を検討するために、まずHUVECのMMP-2分泌に対するTNF-αおよびアンジオテンシン2(Ang2)の影響について実験系の確立を試みた。Ang2はMMP-2を増強し、Ang2受容体拮抗薬はその効果を打ち消すことから、Ang2の効果はその受容体を介して発揮されていた。同じ系でLp(a)もMMP-2を増強する傾向がみられたが、その再現性とメカニズムを究明している。Lp

(a)コレステロールの臨床的意義を評価するために臨床研究と基礎研究の両者を並行して研究を実施した。臨床研究としては健診ドックを受診した男性対象者212名について、HPLCリポ蛋白定量法を用いてリポ蛋白分析を行った。Lp(a)は本来LDL粒子と関連することからLp(a)コレステロールとLDLコレステロールが相関をすることが予想されたが、r= 0.093と全く相関はなかった。一方、IDLコレステロールおよびVLDLコレステロールに対して、それぞれr= 0.188 (p< 0.01)およびr= 0.184 (p< 0.01)とLp(a)コレステロールは有意に相関した。また興味深いことにカイロミクロンコレステロールがr= 0.28 (p< 0.0001)とLp(a)に顕著に相関していた。したがって、Lp(a)コレステロールはTGリッチリポ蛋白のコレステロールと有意に関連することが判明した。またこれを支持するようにHDLコレステロールはLp(a)コレステロールと有意な逆相関を示した(r= -0.191, p< 0.01)。基礎研究としては、血管内皮細胞(HUVEC)におけるLp(a)コレステロールのMMP-2とLR-11分泌に対する影響を検討するために、まずHUVECのMMP-2分泌に対するTNF-αおよびアンジオテンシン2(Ang2)の影響について実験系の確立を試みた。刺激薬を添加する場合の培養液中の血清濃度が実験結果に大きく影響することが判明し、実験系の確立が難航した。現在、使用血清の至適濃度が判明し、今後はその条件の再確認を行うとともに、Lp(a)およびLDLの刺激によるHUVECのMMP-2およびLR-11分泌効果について検討する。フラミンガムリスクスコア(FRS)とLp(a)コレステロールの関連性は軽度であることから、細分化したFRSの層別解析を行う。また、FRSは米国の絶対リスクスコアだることから、動脈硬化予防ガイドライン2012に掲載されている日本人の絶対リスクスコアで再検討を行う必要がある。同じ母集団におけるLp(a)コレステロールと血清MMP-2濃度との関連性を併せて検討する必要がある。その他として、上記概要に記載した薬物治療の臨床研究は現在進行中であり、結果の総括は今後の課題である。臨床研究としてはLp(a)コレステロールと他のリポ蛋白コレステロールとの関連性が確認されたところであり、動脈硬化との関連性や脂質低下薬のLp(a)コレステロールの影響は今後の課題である。基礎研究としては血管内皮細胞における実験条件が確立されたところであり、実質的なLp(a)コレステロールの影響に関する成績は今後の課題である。臨床研究においては血中のMMP-2濃度の測定、基礎研究ではLp(a)刺激による血管内皮細胞のMMP-2分泌濃度の測定および細胞培養などに、前年度残高分と今年度交付分とを併せて活用し、本研究の一定の結論が得られるように努める。臨床研究については、前年度の対象者にフラミンガムリスクスコアとLp(a)としたTGリッチリポ蛋白のコレステロール濃度との関連性を検討する。また、頸動脈エコーを評価した動脈硬化リスク患者のLp(a)コレステロール濃度を測定し、動脈硬化プラークの有無および重症度とLp(a)コレステロールの関連性について他のリポ蛋白を比較検討する。さらに、動脈硬化リスクを有する患者におけるスタチンおよびエゼチミブ治療によりLp
オステオポンチンによるNKT細胞と樹状細胞分化及び活性化の制御機構解明

オステオポンチン(OPN)は、分子量約41kDaの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質である。自己免疫肝炎においてNKT細胞は肝障害を惹起する事が示唆されている。申請者は、NKT細胞の機能がOPN分子によって制御されている可能性を示唆するデータを得た。本科研費補助金の成果からOPN-KO成熟マウス肝臓のNKT細胞が野生型より半分欠損していることが分かったし、脾臓及び胸腺はOPN-KOマウスのNKT細胞が野生型より欠損している傾向があった。野生型及びOPN-KOマウスからNKTを分離しin vitroでα-GalCer、CD1dなど刺激しサイトカインの産生、活性化の変化を解析した。In vivoで刺激によりOPN-KOマウスの免疫担当細胞の活性化を分析した。TH1サイトカイン産生はOPN-KOマウスが野生型より減弱していることが分かった。NKT細胞は刺激を受けてNK1.1^+TCR^+マーカで数が減る(down-regulation)の活性化特徴が報告されっているため、OPN-KOマウスのdown-regulationを分析し、OPN欠損によってNKT活性化の異常を解析した。OPN欠損マウスではNKT細胞の活性化が弱いことが分かった。この活性化不良より、OPN欠損マウスでは肝炎に抵抗性であることを説明ができ、肝炎及びNKT関与する炎症疾患を制御する可能性がある。肝実質細胞障害発生メカニズムの中でNKT細胞の役割の詳細を分析するため、OPNの存在下、非存在下でのNKT細胞のサイトカイン産生、FasL発現を検討し、OPNがFasLの発現やサイトカイン産生に影響することを見出すことができた。現在、以上の結果をまとめた論文がJ Exp Medに投稿中である。本研究を進めることにより、NKT細胞と肝実質細胞障害の関連性を見出したいと考えている。OPN分子のNKT細胞における役割と機能解析。1.NKT細胞がOPNを大量産生し、OPN欠損によってNKT細胞機能不全である(Immunity.21:539-550,2004)ため、OPN分子におけるMKT細胞分化に影響の解析。野生型マウス及びOPNノックアウト(OPN-KO)マウスのNKT細胞の各臓器分布を比較した。必要抗体を購入してフローサイトメーターを用いて色々な分化段階の野生型マウス及びOPN-KOマウスの各臓器を調べたところで、OPN-KO成熟マウス肝臓のNKT細胞が野生型より半分欠損していることが分かったし、脾臓及び胸腺はOPN-KOマウスのNKT細胞が野生型より欠損している傾向があった。2.In vivoで刺激によりOPN-KOマウスの免疫担当細胞の活性化を分析する。In vitroでOPN-KOマウスの免疫担当細胞の活性化を分析する。野生型及びOPN-KOマウスからNKTを分離しin vitroでαGalCer、CD1dなど刺激しサイトカインの産生、活性化の変化を解析した。3.NKT細胞は刺激を受けてNK1.1^+TCR^+マーカで数が減る(down-regulation)の活性化特徴が報告されている。OPN-KOマウスのdown-regulationを分析して、OPN欠損によってNKT活性化の異常を解析した。この活性化不良より、OPN欠損マウスでは肝炎に抵抗性であることが説明ができ、肝炎及びNKT関与する炎症疾患を制御する可能性がある。
交信撹乱下における老化がコナカイガラムシ処女メスの繁殖能力と性的魅力に与える影響

果樹害虫フジコナカイガラムシのメス成虫は、通常交尾を行う羽化後13日齢時に最も多くの次世代を産出する能力を有することが示された。一方で、交信撹乱下で未交尾のまま取り残された場合、最も多くの性フェロモンを放出する28日齢の産卵数はピーク時の約半分であった。未交尾の雌成虫は数か月程度生存し、その約6割が産卵できるが、1雌あたりの産卵数はピーク時の数%であった。交信攪乱法は合成性フェロモンによって虫の配偶行動を阻害する防除法である。交信撹乱下では、多くの雌成虫は未交尾のまま取り残される。一般的に短命な蛾類では繁殖を抑えることができる。ところが、カメムシ目の果樹害虫フジコナカイガラムシの場合、未交尾雌が数か月生存する上、若い雌成虫と同等以上の性フェロモンを放出し続ける。そこで、老化した未交尾雌成虫の交尾の可能性や産卵数等の「繁殖ポテンシャル」と性フェロモン生産量や雄誘引性等の「性的魅力」の変化を明らかにするため、以下の試験を行った。交尾時の羽化後日数が異なる雌成虫の交尾率、産卵数等を調査したところ、日齢の経過にしたがって繁殖能力が低下することが明らかになった。同様に雌成虫が放出する性フェロモン量を調査したところ、羽化28日後までは増加し、その後減少することが明らかになった。性フェロモンを使った防除法、交信撹乱により多くの雌は交尾を阻害される。短命なガ類の場合と異なり、未交尾雌が3か月以上生存する果樹害虫フジコナカイガラムシについて、老化に伴う「繁殖パフォーマンスの低下」と「性的魅力の変化」を解明するため、試験を行った。昨年度までに、交尾時の羽化後日数の経過に伴い雌成虫の繁殖パフォーマンス(産卵数)は低下するが、性的魅力(放出する性フェロモン量)は羽化28日後がピークとなり、繁殖能力と性的魅力の消長が異なることを明らかにした。本年度は、繁殖パフォーマンスに影響を及ぼすと考えられる蔵卵数および共生微生物量と日齢の関係を調べた。その結果、蔵卵数は性的魅力(フェロモン放出量)と同様の消長を示し、共生微生物量は繁殖パフォーマンス(産卵数)と同様の消長を示した。事業開始当初の計画に従って試験を行っており、予定通り進んでいるため。合成性フェロモンをによって虫の配偶行動を阻害する防除法である交信撹乱により、多くの雌は未交尾のまま取り残される。短命なガ類の場合と異なり、果樹害虫フジコナカイガラムシは未交尾雌が3か月以上生存する。これまで交信撹乱が実用化されていなかったフジコナカイガラムシにおいて、長期間未交尾のまま生存した雌のフェロモン放出量や産卵能力の推移は未解明であった。これらを把握し、かつ、その要因を解析することは、今後、フジコナカイガラムシの交信攪乱を実施し、その効果を解析うえで重要であると考えられる。これまでの研究により、交尾時の羽化後日数の経過に伴う雌成虫の繁殖パフォーマンスと性的魅力の消長が異なることが明らかとなった。つまり、繁殖パフォーマンス(産卵数)は羽化直後をピークにその後低下するが、性的魅力(放出する性フェロモン量)は羽化後28日後がピークとなる。雌成虫の繁殖パフォーマンスに体内の共生微生物が関与している可能性を検証するため、フジコナカイガラムシ体内の共生微生物量を測定したところ、交尾時の羽化後日数に伴う共生微生物量の消長は繁殖パフォーマンスと密接な関係があることが示唆された。さらに、共生微生物量を直接的に測定するため、Whole mount FISH法で共生微生物を蛍光染色した。その結果、フジコナカイガラムシ体内の一次共生微生物および二次共生微生物の染色に成功し、体内の共生微生物保持量を直接観察することが可能となった。定量PCR法で共生微生物のコピー数が増減することが示唆された。次年度はWhole mount FISH法で共生微生物を蛍光染色し、虫体内の保持量の変化を直接的に観察することを試みる。さらに、不足データを補足し、これまでに得られた結果と合わせて論文にまとめる予定である。農業害虫に対する防除技術の開発未交尾雌は日齢の経過にしたがって繁殖パフォーマンスが低下することが明らかとなった。今後はその要因を解明するため、以下の試験を行う予定である。繁殖パフォーマンスは蔵卵数の影響を受ける可能性が高い。そこで、日齢と蔵卵数の関係を解明するため、日齢の異なる未交尾雌を解剖し蔵卵数を調べる。また、フジコナカイガラムシの体内に代謝の一部を担う微生物が共生していることが知られている。この共生微生物量と繁殖パフォーマンスの関係を明らかにするため、日齢の異なる未交尾雌の共生微生物量を調べる。

日齢の経過にしたがって繁殖パフォーマンスは低下するものの、一方で性的魅力である性フェロモンの放出量は羽化28日後にピークを示した。この「繁殖パフォーマンス」と「性的魅力」の時期の不一致について生態的意味の検討を行う。さらに、交信撹乱下で未交尾のまま取り残された雌成虫は、より大量の性フェロモンを放出する事で交信攪乱剤の役割を担う可能性がある。また、大量の性フェロモンを放出して雄成虫を引き寄せることで、羽化直後の繁殖パフォーマンスが高い雌成虫の交尾の機会を減らしている可能性がある。これらの理由により、蛾類などの交信撹乱に比べて高い次世代密度抑制効果が表れる可能性がある。これを評価する手法について検討を行う予定である。次年度必要になる追試用試薬代、供試虫飼育資材費、論文執筆のための打ち合わせ旅費、校正費等に充てるため今年度の試験経費を減らした。物品や旅費など計画的に使用したが、1,000円程度端数として残ったため。次年度の予算と合わせて、追試用試薬代、供試虫飼育資材費、論文執筆のための打ち合わせ旅費、校正費等に有効に利用する。次年度の予算と合わせて有効に利用する。
ヒヨコ内耳有毛細胞における機械刺激受容機構の可塑性

ヒヨコの内耳から酵素的に単離した有毛細胞を対象に機械刺派受容メカニズムの周波数応答特性を可塑的性質という観点から研究を進めている。61年度は研究の遂行に不可欠な二つの基礎的技術を確立した。(1)可聴周波数領域に到る微小機械刺激装置を完成させた。パッチクランプ下に膜電流を記録している有毛細胞感覚毛から10μm程度の位置で振幅5μm程度の機械刺激を行うと、溶液を介して感覚毛に機械振動を伝える事ができた。これらによって4KHzまでの機械刺激をコンピューターの制御下に与えられ、トランスダクションチャネルは、位相遅れをほとんど示さずに機械刺激に応答し電流を流した。これは通常の会話には十分な高い周波数であり、トランスダクション機構は確かに著しく速い応答特性を持つ事が実験的に証明できた。(2)細胞外から加わる様々な因子によってイオンチャネルは機能的修飾を受ける。チャネルにおけるそれらの変化は多くの場合、細胞内での情報変換分子の活性化と結びついている。【C_a】イオンは非常に有力な細胞内情報の伝達分子の一つである。Fura2を充填した有毛細胞を蛍光観察し、機械刺激に伴う細胞内【C_a】イオン濃度変化を二次元的に検出する基本システムを完成した。このシステムによって、機械刺激に伴い感覚毛部分で細胞内【C_a】イオン濃度が確かに変化する事を確認した。これは、トランスダクションチャネルを通って流入する【C_a】イオンによって局所的に【C_a】イオン濃度が感覚毛部分で増加する事によると考えられる。(1)及び(2)の基本的技術は、有毛細胞の周波数応答特性に関わる可塑的特性を機能的・物質的に研究する有力な手段であり、今年度中に技術を確立できた事によって来年度以降に研究の進展が期得できる。
外国銀行の国内市場参入によって開かれうる金融ショックの波及経路:豪州とNZの場合

金融市場統合の極端な例として、A国の銀行がB国の銀行市場を占拠したとする。このとき、もしA国の金融が引き締められると、銀行はより高い金利を求めてB国からA国へ資金を移すかもしれない。その場合、B国では貸付可能資金が減って金融が引締められたかのような事態が起こる。本研究の仮説は「金融市場の統合された二国間では、金融ショックが銀行の資金移動を通じて国家間で伝播する」である。本研究はこの仮説の成立を豪州とニュージーランドのデータから実証している。本研究は、金融政策の波及経路の一つである「クレジット・チャネル」に関連している。クレジット・チャネルとは「金融引き締めは、銀行の貸付可能資金を減少させ、企業の投資や家計の耐久消費財購入を抑制し、総需要を減少させる」というものである。従来、クレジット・チャネルは閉鎖経済の下で分析されてきた。しかしながら、現実には、銀行の融資は海外支店や現地法人を通じて国境を越える。したがって、クレジット・チャネルを開放経済の下で分析する必要がある。金融の国際化が進めば、ある国(A)の銀行市場は他の国(B)の銀行に席巻されてしまうことも考えられる。そのような事態になると、B国で金融が引き締められた場合、B国に本拠を置く銀行が、A国の支店から資金を集めて、B国で不足した貸付可能資金を補充する可能性がある。そうなってしまうと、B国の金融政策ショックが、銀行の国際間資金移動を通じて、A国へ伝播することになる。これが本研究の仮説である。この仮説の検定について、ニュージーランドと豪州は格好の題材となる。ニュージーランドは市場開放を進めた結果、銀行市場が豪州系の銀行に席巻されている。これまでの研究では、両国のデータから、ベクトル自己回帰モデルを推定した。その推定されたモデルをもとに、豪州での金利引き上げに対して、ニュージーランド国内の貸出金利と貸出量がどう反応するかをシミュレートした。統計学的に有意に得られた結果は「豪州での金利引き上げの後、ニュージーランド国内で貸出供給曲線が左方にシフトする」という、本研究の仮説と整合性のあるものであった。研究実施計画では、夏期休暇に豪州やニュージーランドに渡る予定であったが、出発を春期休暇に遅らせた。その理由は、制度面での知識が十分ではなかったことにある。そこで軌道修正を行い、今年度の前半は、豪州とニュージーランドの銀行市場がどのような経緯で統合されたのか、制度面から考察することにした。特にニュージーランドにおける郵便貯金銀行の民営化に注目した。今年度の後半は、その制度面の調査結果を元に、論文を執筆した。まず11月から12月にかけて、日本語で論文を執筆した。この論文では、計量経済学的な分析結果が理論と矛盾しないかどうか、金融政策のショック以外にも、財政政策ショックや総供給ショックに対する変数の反応も調べられている。その結果、いずれのショックに対しても、豪州とニュージーランドで、景気や物価の連動がみられた。これは先行研究の結果と合致する結果である。また、昨年度の研究でもみられたことであるが、豪州の金融政策ショックに対しては、ニュージーランドで貸出供給の減少が今年度の分析でも見られた。これは結果が頑健であることを示唆する。日本語の論文は、1月に日本金融学会へ送付済みであり、平成20年度の春季全国大会での報告が決まっている。2月にはニュージーランドに赴き、集中的に英語で論文を執筆した。3月、その成果をシドニー大学で開催されたAustralasian Macroeconomics Workshopで報告した。さらに、今年度の後半は、昨年度の論文の改訂にも注力した。1月に入って、海外の学術誌へ投稿していた論文に対する審査員のコメントが届いた。編集委員は審査員のコメントに応じて論文の改訂を要求しており、論文は改訂後に再審査となる。コメントは、主に計量経済学的手法の選択に関するものである。3月末現在、審査員のコメントに沿う形で、実証分析のためのコンピュータプログラムを書いている。一昨年、査読付き学術誌へ論文を投稿した。論文で検証した仮説は本研究の柱であり、「金融統合が進んだ二国では、一方の国で金融が引き締められると、両国で活動する銀行が他方の国から資金を移動させるので、後者の国で貸付資金が減って景気が減速する」というものである。この仮説をニュージーランド(以下NZ)と豪州のデータで実証分析した。昨年一月、この論文に対する査読コメントが届いた。したがって、平成20年度の前半、査読コメントに応じて、論文が改訂された。また、五月から七月にかけて三回の学会報告をし、新たなコメントも取り入れられた。改訂前の論文において、もっとも重要で統計学的に有意な発見は「豪州での金利引上げ後、NZで貸出供給曲線が左方シフトし、NZでGDPが減少する」というものであり、本研究の仮説と整合性のあるものであった。それに対し、改訂後の論文では、複数の異なるモデルを用いて、結果の頑健性が統計学的に示された。

いくつもの改訂点のなかで、これが今回の改訂における最大の意義である。改訂された論文は7月中旬に再投稿され、再審査後、掲載が決まった。上述の研究は大まかなアイデアを実証分析へ持ち込んだものであり、理論モデルを欠いている。そこで、八月頃から理論モデル構築に取り掛かった。当初の研究計画では、理論部分は共同研究に持ち込むことを予定していたが、モデル化のアイデアが固まってきたので、個人研究に変更した。そのモデルでは数値計算が必要なため、八月から十月を数値計算の学習に費やした。平成20年度の後半はモデルのシミュレーションに費やした。予想以上に前述の改訂に時間を取られたため、これらの結果はまとめられていないが、まとめられ次第、査読付き学術誌に投稿する。
超高速マイクロラジカルセンサの研究開発

化学反応の高速解析、生物質中の活性酸素の定量分析、機能性物質の劣化や経時変化の解析などへの応用を目的とした超微量フリーラジカルセンサの試作および評価を実施した。本研究では、電子スピン共鳴に基づく新しい測定法を提案した。従来の電子スピン共鳴測定装置とは異なり、直流電圧掃引のみによって、フリーラジカルの電子スピン共鳴スペクトラムが得られることを理論的に示した。さらに、標準的なLSI製造技術(CMOS 180nm)を用いて、1GHzの周波数帯を用いたフリーラジカルセンサを試作し、DPPH, TEMPOLなどの市販フリーラジカルに対して電圧掃引による電子スピン共鳴スペクトラムを得ることに成功した。物質の劣化や状態、生物の老化に関わる各種の活性化学物質(フリーラジカル)の種類と量を測定するための方法を提案し、集積回路技術を用いてセンサデバイスとして利用できるようにすることを目的としている。検出原理は、1945年にザボイスキーにより発見された電子常磁性共鳴を用いている。この検出原理は、現在でも、フリーラジカルを検出できるほぼ唯一の分光法として広く用いられている。ただし、従来の電子常磁性共鳴の測定装置は、大型であり、測定に時間がかかるため、研究用途に限って使用されていた。本研究課題で新たに提案する測定法では、電子常磁性共鳴の計測システム全体を半導体チップの上に集積化することが可能であるため、微量サンプルに含まれるフリーラジカルを検出することができる。また、完全に電子技術のみを用いた化学分析手法であるため、使用場所を選ばず、1種類のセンサでどのような物質にも対応できるので、研究用途以外にも広く活用することができる。新しく考案した測定回路により、従来法とは異なる測定変数を用いて、従来法と同等の電子常磁性共鳴信号のスペクトラムが得られることを理論的に証明し、特許出願した。さらに、提案法による測定回路を設計し、従来数メートルあった測定装置を、0.2ミリメートル程度のシリコンチップ上に収めることに成功した。また、測定時間を従来の数10分から1秒以内に短縮することが可能になる。試算によると、測定感度は、従来法に比較してやや低い可能性があるが、実測例がないため、測定回路を搭載した集積回路チップの試作を行った。使用した集積回路製造技術は、規格寸法180ナノメールの標準プロセス(CMOS 180nmテクノロジ)であり、殆どの半導体メーカに発注することが可能である。今後は、試作したフリーラジカルセンサの性能評価と回路方式の改良を進める予定である。フリーラジカルセンサの回路方式のうち、容量Cの掃引による発振周波数測定方式でフリーラジカルの電子スピン共鳴信号が得られることを数値シミュレーションにより確認した。さらに、CMOS180nmテクノロジを用いてセンサのアナログフロントエンド回路のLSIを試作し、安定なフリーラジカルであるDPPHの信号を検出した。この測定法および信号の解析方法を、パラメトリックESR法と名付け、特許を出願した(特願2015-092377)。試作したセンサLSIを用いた測定システムを組み立てた。開発した測定システムでは、従来の磁場掃引法と、本研究課題で提案するパラメータ掃引法をソフトウエアで切り替えられるようになっている。本測定法について、JST主催金沢大学新技術説明会で紹介を行い、民間企業1社と共同研究契約を結んだ。排他的な共同研究契約ではないため、応用分野が異なる他社や他大学と共同研究を実施することが可能である。現状では、当初目標のフリーラジカル検出感度とフリーラジカルの分子種の同定に必要なg値の測定精度が不足していることから、平成27年度中に改良版のセンサ回路と測定系の全体回路をLSI化したラボonチップを実現する予定である。また、本研究に関連する要素回路技術や信号解析法に関する成果は、電子情報通信学会総合大会、電子情報通信学会主催LSIとシステムのワークショップ、論文誌Sensors & Transducersで発表を行った他、金沢市主催産学連携ものづくり技術交流塾、電気学会アナログVLSIシンポジウム等で紹介した。平成27年度までに、化学反応の高速解析、生物質中のフリーラジカルの定量分析、機能性物質の劣化や経時変化の解析などへの応用を目的として、超微量フリーラジカルセンサの試作および評価を実施した。CMOS 180nmプロセスを用いて試作したセンサデバイスを用いて、DPPH(1.1-diphenyl-2- plcrylhydrazy)の電子スピン共鳴スペクトラムの測定に成功した。本研究課題で新しく提案したパラメトリックESR法(電圧掃引)によるスペクトラムと従来の磁場掃引スペクトラムを比較し、物質定数であるg値を調べたところ、よい一致が得られ、確かに電子スピン共鳴信号をとらえていることが確認された。予想よりも感度が低かったため、各種の測定回路方式の理論的な感度比較を行い、測定周波数に対する感度の増加率を調べ、高感度化の方法を明らかにした。シミュレーションによる予想と一致する実測結果が、再現性良く得られるようになり、実用化を目指した研究へと展開することが可能になった。本研究課題で提案したフリーラジカルセンサは、シリコンチップ上に集積化された電子スピン共鳴計測システムによって実現される。しかし、従来の電子スピン共鳴測定では、測定対象に印可する直流磁場強度と高周波電磁界の周波数を精密に制御する必要があり、大がかりな装置が必要である。

本研究課題では、パラメトリック電子スピン共鳴法を新規に提案し、従来の電子スピン共鳴装置のような電磁石による直流磁場と電磁界周波数の精密制御を必要とせず、直流電圧掃引のみによって、フリーラジカルの電子スピン共鳴スペクトラムが得られることを理論的に示した。さらに、標準的なLSI製造技術(CMOS 180nm)を用いて、1GHzの周波数帯を用いたフリーラジカルセンサを試作し、パラメトリック電子スピン共鳴法により、DPPH, TEMPOLなどの市販フリーラジカルに対して電圧掃引による電子スピン共鳴スペクトラムを得ることに成功した。この手法により、電磁石を使用せず、0.5ミリメートル程度のセンサのみで、短寿命フリーラジカルの好感度検出が可能となった。さらに、微細化されたチップ電気泳動流路やMEMS(Micro Electro Mechanical Systems)による化学物質分離システムなどに組み込むことを想定して、パラメトリック電子スピン共鳴法をチップ上に実装するための各種回路方式の提案と感度解析を行い、フリーラジカルセンサを高感度化する手法を明らかにした。化学反応の高速解析、生物質中の活性酸素の定量分析、機能性物質の劣化や経時変化の解析などへの応用を目的とした超微量フリーラジカルセンサの試作および評価を実施した。本研究では、電子スピン共鳴に基づく新しい測定法を提案した。従来の電子スピン共鳴測定装置とは異なり、直流電圧掃引のみによって、フリーラジカルの電子スピン共鳴スペクトラムが得られることを理論的に示した。さらに、標準的なLSI製造技術(CMOS 180nm)を用いて、1GHzの周波数帯を用いたフリーラジカルセンサを試作し、DPPH, TEMPOLなどの市販フリーラジカルに対して電圧掃引による電子スピン共鳴スペクトラムを得ることに成功した。当初計画では、平成2627年度に、センサの試作および性能評価を実施する計画になっていた。当初計画よりも早い平成26年度に、デモの可能な測定システムを構築することに成功したが、目標性能までは達成されていないため、平成27年に、改良バージョンの再試作を実施し、当初目標性能の達成したい。また、民間企業との共同研究により応用システムの開発を開始しており、当初計画より1年程度早い進捗となっている。DPPH以外の各種フリーラジカルの測定データの収集と、検出感度を高めたセンサの設計および完全な1チップ計測システムの設計を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。ナノマイクロシステム平成27年度に、フリーラジカルセンサの改良バージョンを試作し、当初目標性能を達成する。当初計画では、平成28年度にDPPHの電子スピン信号検出および性能評価を行う予定であったが、可能であれば、平成27年度中に、性能評価までを完了したい。同時に、共同研究企業と、応用システムの開発を行い、提案手法の応用実績を作りたい。平成28年度には、センサチップと測定用ソフトウエアを材料科学分野、生命科学分野の研究者に提供し、色々なフリーラジカルの検出と従来測定法による測定結果との比較を実施したい。
酸化亜鉛量子ドットにおける励起子超放射の解明と長い励起子コヒーレンス長の可能性

酸化亜鉛(ZnO)は、ワイドバンドギャップ半導体で、励起子結合エネルギーが大きく室温でも安定に存在することから、量子ドットにおける励起子の振る舞いを調べるのに適した材料である。また、環境にもやさしい物質であるので励起子状態を利用した紫外波長領域の光学材料としても有望視される。本研究では、ZnO量子ドット中の励起子状態を調べるために、ゾルゲル法によりZnO量子ドットを分散したシリカ膜を作製した。作製条件を最適化することで、吸収スペクトル測定が可能な透明な薄膜を作製することに成功した。また、濃度を自在に変えられる手法を確立した。試料のx線回折測定及び透過電子顕微鏡観測により、良質なZnO結晶の量子ドットがシリカ膜中に分散していることが確認された。オプティカルチョッパーを用いたロックインアンプによる検出法により吸収スペクトルを測定したところ、励起子による吸収ピークが明瞭に観測された。吸収ピークエネルギーが量子閉じ込め効果により高エネルギーシフトしていること、スペクトルがZnOの結晶の異方性を反映していることがわかった。次に発光スペクトルを測定したところ、紫外波長領域に複数の鋭い発光ピークが観測された。量子ドットの周りに表面保護剤がある場合とない場合で発光スペクトルに大きな違いはなく、量子ドット内の発光であることがわかった。発光の量子ドット濃度依存性に励起子コヒーレンス長の関与が示唆される結果を得た。さらに、発光スペクトルの温度、励起強度依存性および短パルスレーザーを用いた時間分解発光スペクトルを詳細に調べ、発光メカニズムについて議論した。本研究の目的は、酸化亜鉛(ZnO)量子ドットにおける励起子超放射現象を解明することにある。平成14年度は、実験システムの構築および試料の準備と評価を行う計画で研究を遂行した。実験システムは、既存の高分解能分光器に冷却型光電子増倍管と前置増幅器を取り付け、フォトンカウンティング法により高感度で測定できるように設計し、組み立てをほぼ完了した。試料は、純水やアルコールなどの溶媒に分散されたZnO量子ドットのスラリーを用いて、その結晶性や基礎光学特性を評価した。X線回折実験測定により、ウルツ鉱型の結晶構造を有する単結晶量子ドットであることが確かめられた。また、シェラーの式を用いて粒径を見積もったところ、本研究課題を進める上で適当なサイズの試料であることを確認した。この試料を適当な濃度に調整し、室温において吸収スペクトルを測定したところ、励起子による吸収構造が室温においても観測することができた。また、遠心分離することによりサイズを選択できることもわかった。さらに、低温での実験を可能にするため、ゾルゲル法により量子ドットを埋め込んだ薄膜の作製を行った。溶媒の種類や混合比など様々な条件を最適化し、石英基板上にスピンコートし、透明な薄膜が作製できるようになった。本試料により低温での吸収・発光スペクトルの測定が可能となり、バンド端付近の紫外波長域に発光が観測された。以上より、作製した量子ドットの結晶性や光学特性を調べ、本研究課題が進められることを確認した。
エンドヌクレアーゼ阻害を指標としたC60球状分子等の抗インフルエンザ化合物の探索

フラーレン派生化合物群にインフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害活性と抗インフルエンザ活性があることを見いだした。また葛根湯、麻黄湯、柴胡桂枝湯、桂枝湯、小柴胡湯、及び麻黄附子細辛湯の漢方薬エキスがPAエンドヌクレアーゼ活性を阻害した。竹如温胆湯には阻害活性は見いだされなかった。フラーレン派生化合物群や漢方薬がPAサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を阻害することを見いだしたのは本研究が世界で初めてである。さらに天然型バクチオールは、インフルエンザウイルス感染阻害効果を有することを示した。天然型バクチオール処理により細胞内酸化ストレス応答の遺伝子発現が上昇することも解明した。2009年に新型インフルエンザがパンデミックを引き起こし、高病原性の鳥インフルエンザウイルスによる死者が報告されるなど、インフルエンザウイルスは人類にとって脅威である。インフルエンザウイルスはマイナス鎖のRNAゲノムを有し、これを複製し転写する酵素としてRNA依存RNAポリメラーゼを有しており、ウイルスの増殖に対して根本的な役割を担っている。RNAポリメラーゼはPA、PB1、PB2の3つのサブユニットからなる複合体である。C60フラーレンはサッカーボール状の分子であり、こうような形状の分子が抗インフルエンザ活性を有していると言う発想はこれまで全くなされていなかった。本申請者の研究室では、複数のC60フラーレン誘導体が抗インフルエンザウイルス活性があることを示し、Plos ONE誌に論文を2013年に発表した(Shoji M, ..., Kuzuhara T. PLoS ONE, 2013)。複数のC60フラーレン誘導体がインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼのPAサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を試験管内で阻害し、インフルエンザウイルスの増殖を細胞系において阻害した。また既存の抗インフルエンザ薬であるオセルタミビルがその副作用としてマウスの行動を促進するメカニズムを解明し、British Journal of Pharmacology誌に発表した(HiasaM,..., Kuzuhara T. British Journal of Pharmacology, 2013)。オセルタミビルはプロドラッグ選択的にモノアミン酸化酵素を試験管内で阻害し、脳内投与によりプロドラッグ選択的にマウスの幾つかの行動を促進した。オセルタミビルの副作用メカニズムを解明し、さらに良い抗インフルエンザ薬を開発する礎を築いた。以上、新規抗インフルエンザ化合物の発見と既存の抗インフルエンザ薬の副作用メカニズムという総合的な解析ができた。【目的】インフルエンザウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼの構成要素の一つであるPAサブユニットはエンドヌクレアーゼ活性ドメインを有し、mRNAのキャップ構造を含むオリゴヌクレオチドを切り取り、プライマーとして使用することでウイルスゲノムの転写に重要な役割を果たしている。また、PAサブユニットは変異が少なく株間で保存性が高いため、抗インフルエンザ薬の新規ターゲットとして期待されている。そこで本研究では、所有する化合物ライブラリー及び各種漢方薬を使用し、PAサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物を探索した。【方法】大腸菌を用いてPAエンドヌクレアーゼドメインの組換えタンパクを作製・精製し、各種化合物によるエンドヌクレアーゼ活性阻害効果を生化学的に検討した。また、エンドヌクレーゼ阻害効果がみられた化合物に対し培養細胞を用いて感染阻害効果を検討した。【結果・考察】PAエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物として、フラーレン及びシアロ糖鎖を含む誘導体等を見出した。また、葛根湯及び麻黄湯、柴胡桂枝湯、竹如温胆湯、桂枝湯、小柴胡湯、麻黄附子細辛湯等の漢方薬もPAエンドヌクレアーゼ活性を阻害した。さらに、フラーレンはインフルエンザウイルス感染阻害作用が見られた。したがって、これらの化合物は、次世代の新規抗インフルエンザ薬のシード化合物として期待される。また、漢方薬においては新たな抗インフルエンザウイルス作用の一端を見出した。またインフルエンザウイルスRNA合成酵素PB2のアセチルCoA結合能の解析についてJ. Biol. Chem.(2014)に論文を発表した。インフルエンザRNAポリメラーゼPB2中央部位はアセチルCoA結合活性を有すること、アセチル化酵素阻害剤によって抑制され、結合モチーフであるVRG配列のアミノ酸置換によって消失した。VRG配列を介したアセチルCoAとの結合がPB2の活性発現において重要な働きを担うことが示唆された。インフルエンザウイルスは、人類にとって大変な脅威であり近年も新型が出現し流行した。そのため、新規抗インフルエンザ薬の開発は重要である。C60アナログの活性評価をしながら、新しい抗インフルエンザ化合物についても探索した。バクチオールは、マメ科の植物であるオランダビユから単離された天然有機化合物である。そこで、本研究では、バクチオールが新規抗インフルエンザ薬開発のためのリード化合物となり得るかを探るため、インフルエンザウイルス感染・増殖阻害効果を検討した。天然型或いは天然型の光学異性体である非天然型バクチオールと種々のA型インフルエンザウイルス株を共にインキュベーションしイヌ腎臓尿細管上皮由来細胞(MDCK)株に作用させることで感染及び増殖阻害作用を調べた。A型インフルエンザ感染において、ウイルス核タンパク質であるNPの免疫抗体染色を行った結果、NPタンパク質染色細胞数は、コントロール群及び非天然型バクチオール処置群と比較し、天然型バクチオール処置群で有意に減少した。次に、感染後の培養上清中のウイルス量を経時的に測定した結果、コントロール群及び非天然型バクチオール処置群と比較し、天然型バクチオール処置群で有意に減少した。以上より、天然型バクチオールは、インフルエンザウイルス感染・増殖阻害効果を有することが判明した。

光学異性体である非天然型バクチオールは天然型と比較し、ウイルス感染・増殖阻害効果が減弱したことから、これらの効果に光学活性が重要であることが示唆された。バクチオールは、新規抗インフルエンザ薬開発のためのリード化合物として期待される。さらにPAエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物として、フラーレン及びシアロ糖鎖を含む誘導体等を見出した。また、葛根湯及び麻黄湯、柴胡桂枝湯、竹如温胆湯、桂枝湯、小柴胡湯、麻黄附子細辛湯等の漢方薬もPAエンドヌクレアーゼ活性を阻害した。フラーレン派生化合物群にインフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害活性と抗インフルエンザ活性があることを見いだした。また葛根湯、麻黄湯、柴胡桂枝湯、桂枝湯、小柴胡湯、及び麻黄附子細辛湯の漢方薬エキスがPAエンドヌクレアーゼ活性を阻害した。竹如温胆湯には阻害活性は見いだされなかった。フラーレン派生化合物群や漢方薬がPAサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を阻害することを見いだしたのは本研究が世界で初めてである。さらに天然型バクチオールは、インフルエンザウイルス感染阻害効果を有することを示した。天然型バクチオール処理により細胞内酸化ストレス応答の遺伝子発現が上昇することも解明した。表題であるフラーレンによる抗インフルエンザ活性はPloS Oneに論文を発表することができた。フラーレン以外にも漢方エキスの中にインフルエンザ・エンドヌクレアーゼ阻害活性を示すものを見いだした。上述のインフルエンザPB2の新規活性を発見した。さらに、以下に述べるようなバクチオールという新規抗インフルエンザ活性を有する化合物も見いだすことができた。バクチオールは、芳香族環上に1個のヒドロキシル基および不飽和炭化水素鎖をもつフェノール系化合物であり、オランダビユ(Psoralea corylofolia)の種子から単離された。天然型バクチオールは、光学活性選択的にインフルエンザAウイルス感染阻害効果を有することを見いだした。バクチオールの抗インフルエンザ活性では、ウイルス側因子ではなく、細胞側因子を標的とする事が示唆されたため、バクチオールとウイルスを作用させたMDCK細胞に対して、次世代シークエンサーを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、天然型バクチオール処置により酸化ストレス応答の際に発現するNQO1とGSTA3の遺伝子発現が上昇した。これらの遺伝子は、転写因子Nrf2により発現誘導され、NQO1やNrf2の発現上昇は、インフルエンザウイルスの増殖を阻害することが報告されている。したがって、バクチオールによる細胞内酸化ストレス応答の関連遺伝子の発現上昇が、抗インフルエンザ作用のメカニズムの一つであると考えられる。