hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音声処理と言語処理の融合に基づく大規模音声ドキュメントの内容検索

(B)の音声内容検索について、任意の可変長音声区間を適合区間として動的に決定する手法の検索手法を拡張し、検索質問拡張手法の一つである適合性モデルを導入して検索性能の向上を図った。また、認識誤りに対応するため、複数認識候補を対象とするようにテキスト検索手法を拡張した。(C)の音声検索語検出と内容検索の統合について、提案法は未知語に頑健であるという性質を持つのに対し、従来法は既知語であれば高性能が期待できるという性質があるため、互いの相補的な性質を利用した両者の統合手法を開発し、未知語への頑健性と検索性能の向上を両立させた。また、音声検索語検出を前処理に用いることによって生じる偽陽性の問題に対応するために、認識結果の信頼度を利用した検索モデルを開発した。この手法は、単語に加えて単語の共起を素性としてベクトル空間法を適用するものである。この検索モデルにより、提案法だけではなく、従来法に適用した場合でも、検索性能が向上することを確認した。当初予定の音声検索語検出と音声内容検索、それぞれの基本技術開発はほぼ完了した。音声検索語検出の新しい手法であるMetric Subspace Indexing法のツール化も行った。両者の統合手法についても、その効果を実験的に確認している。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り、音声検索語検出と音声内容検索の統合システムの構築を進める。統合手法に用いる音声検索語検出の高速化を進めて、本枠組みへのクエリ拡張手法の導入を行う。また、新しい音声検索語検出手法であるMetric Subspace Indexing法の開発が順調に進んだため、統合手法の音声検索語検出法をこの新手法で置き換えることも検討する。これにより、本手法の距離順に検出結果を高速に出力するという特徴を活かした応用分野の検討を行う。
適応免疫誘導の為の自然免疫の解析;TLRシグナルと遺伝子発現におけるIRFの役割

IRFファミリーはウイルスなどの病原体感染における免疫系賦活化に重要な転写因子であり、中でもIRF5は病原体認識受容体であるToll-like receptor(TLR)刺激によって活性化され、IL-6などの炎症性サイトカインの誘導に重要な役割を果たす。一方で、IRF5はp53の誘導遺伝子であるとともに、DNA傷害によるBcl-2の転写誘導に重要である事が報告されており、さらに近年ウイルス感染時のアポトーシス誘導にIRF5が重要な役割を果たすことも明らかとなりつつある。本研究ではウイルス感染によるアポトーシス誘導がIRF5によってどのように制御されているのか明らかにするため、IRF5欠損マウスの解析を行なった。昨年度までに、Fas依存的アポトーシスにおいてIRF5が重要な役割を果たし、IRF5欠損マウスがFasリガンド投与によるショック死に耐性である事を明らかにしている。これらの成果をもとに本年度においてさらに解析を行なった結果、IRF5欠損マウスでは肝臓の細胞におけるFasシグナル伝達経路のうちJNKを介するシグナルが減弱していることを見出した。また肝臓細胞のみではなく他の免疫応答関連細胞についても解析を行った結果、樹状細胞をTLR9のリガンドであるCpG-BDNAで刺激するとFas感受性の亢進が起こることを見出した。この反応はIRF5欠損細胞では誘導されず、IRF5がFasによるアポトーシスの感受性を調節していることが示された。この結果はIRF5がFas下流シグナルに関連する様々な遺伝子の誘導を制御する事で、Fasによるアポトーシスの感受性をコントロールし、特定の細胞にのみ選択的な死を誘導することを示唆している。本研究助成は最終年度となったが、今まで得られた貴重な結果に基づいて、今後IRF5の標的遺伝子を特定し、IRF5による選択的細胞死感受性の制御の生理的意義についてさらに検討を行なう予定である。IRFファミリー転写因子はウイルスなどの病原体感染における免疫系賦活化に重要な転写因子であり、中でもIRF5は病原体認識受容体であるToll-like receptor(TLR)刺激によって活性化され、IL-6などの炎症性サイトカインの誘導に重要な役割を果たす転写因子である。従来、IRF5はp53の誘導遺伝子であるとともに、DNA傷害により活性化し、Bcl-2の転写誘導に重要である事がin vitroの解析により報告されていることから、cell cycle arrestやアポトーシスとの関連が示唆されていたものの、生理的な状況下におけるIRF5の役割りは上記の炎症性サイトカイン産生以外には不明であった。しかしながら最近の報告でIRF5はウイルス感染時のIFN産生、アポトーシス誘導に重要な役割を果たす事が報告され、病原体に対する免疫応答の多岐にわたって重要な役割を果たす転写因子であることが分かりつつある。しかしながら、そのようなウイルス感染時におけるIRF5によるアポトーシス誘導の分子メカニズムや免疫応答における役割は依然として不明であった。本研究によりIRF5はFasによって誘導されるアポトーシスに重要な役割を果たす事がマウス個体および細胞レベルで明らかにされた。すなわちIRF5欠損マウスはFasリガンド投与によるショック死に耐性を示し、肝臓の傷害も顕著に減弱された。IRF5はその下流で様々な遺伝子を誘導する事でFasによるアポトーシスを起こしやすいように細胞の状態をコントロールし、特定の細胞を選択的に死に至らしめることが明らかとなった。このような機構は、一度活性化した免疫系細胞中で同様に活性化状態にあるIRF5が、自己細胞を死にやすくすることで免疫応答を収束させることに関わるものと思われる。これら一連の検討はPNAS誌に論文として投稿し、すでに受理されている。ヒト全身性エリトマトーデス(SLE)患者においてもIRF5遺伝子に一塩基変異多型(SNP)が報告されていることから今後、過剰な免疫応答や自己免疫におけるIRF5の生物学的な意義をさらに検討して行く予定である。また、他のIRFファミリー転写因子群についても検討を加えることを予定している。

本研究助成は最終年度となったが、今まで得られた貴重な結果に基づいて、今後IRF5の標的遺伝子を特定し、IRF5による選択的細胞死感受性の制御の生理的意義についてさらに検討を行なう予定である。
データ収集ミドルウェアを使ったワークフローシステムの研究開発

DAQ(Data Acquisition)ミドルウェアを使ったCC/NET用データ収集システムにワークフローの技術を導入した枠組みを作った。DAQミドルウェアはRT(RobotTechnology)ミドルウェアという国際規格のロボット技術をベースにしたネットワーク分散型のデータ収集システムのフレームワークである。DAQミドルウェアとDAQワークフロー処理を一つGUI上で操作ができるようにしたことで、分散型DAQの利点を活かすことが可能になった。本研究の目指すところは、DAQミドルウェアを使ったデータ収集システムの中にワークフローの技術を導入することで、オンラインデータ解析等の機能を強化することである。この研究開発はネットワーク分散化の考えに沿っており、その効果は、ネットワークベースのDAQミドルウェアの有用性を一段と発揮できることを意味する。導入作業の内、今年度は、DAQワークフローシステムの開発環境の整備、及びシステム構築上の基本的な技術の調査研究を主に行った。これらの作業は、以降のDAQワークフローシステム構築時の作業能率に、大きく影響する部分なので慎重に検討する必要がある。本研究開発用のシステムとしてLinuxシステムを構築した。この開発環境の下で、DAQワークフローシステムシステム構築に必要な基本的な技術の検討を行った。やったことは、DAQワークフローシステムシステムを構築するのに必要なワークフローエンジンとしてどの製品を利用するのが適切かを検討することであった。多くの候補の中から、本研究の要求に合致する製品を選択し、テストを行った。テストしたことは、DAQワークフローシステムを実現するための機能を持っており、且つ、開発にあたって、操作がし易いこと等を中心に行った。更に、ワークフロータスクの追加、修正についての操作性も重要な要素である。この点についても慎重に検討を行った。その結果、オープンソースのJBossjBPMエンジンが、DAQミドルウェアシステムを構築する上で必要な機能を満たしていることを確認した。今年度に行った基礎的な調査研究の結果を、来年度のソフトウェア構築作業の中にを活かしていく見通しができた。前年度に行った、テスト結果を基に、今年度はDAQワークフロー基本部分の構築を行った。DAQワークフローシステム用のエンジンには、JBossjBPMを使用した。このエンジンは、オープンソースのJavaベースのエンジンで広く利用されているもので、本研究での使用には充分な機能を備えている。jBPMグラフィカルプロセスデザイナと呼ばれる操作性にすぐれたツールも用意されており、プロセス定義の更新およびシステムの開発が容易に行えるようになっている。今回、構築した基本部分では、ユーザーインターフェースであるGUI Clientを使って、サーバ情報のセッティングを行うことができるようにした。ワークフローシステムにおいて最も基本的な機能である、プロセスの開始、終了、フォーク、ジョインといった基本動作を実行できるようにした。また、オペレータの介入によってタスク処理を進める方法と、介入なしにタスク処理を進める方法の両方を実行できるようにした。さらに、タスク中から行う処理の例として、リモートのLinuxマシン上のアプリケーションを実行できるようにした。実行するアプリケーション例として、ROOTの例題アプリケーションの実行、およびDAQミドルウェアの実行を、Linuxのスクリプトファイルを起動することによって可能にした。いずれも問題なく実行できることを確認した。このように、DAQシステムで必要とされる操作をDAQワークフローシステムによって実現できた。このDAQワークフローシステムの基本部分を、実際のDAQシステムでの要求に合わせたプロセス定義としてタスクを記述することにより、さらに実践的なシステム構築につなげることができる見通しを得た。本研究の目指すところは、DAQミドルウェアを使ったCC/NET用データ収集システム中にワークフローの技術を導入して、オンラインデータ解析やDAQフローコントロール等の機能を強化することである。前年度までに、DAQワークフローシステムの開発環境の整備、システム構築、ワークフロー基本部分の構築を行った。今年度は、プロセス定義ファイルの再構成、および再構成後のプロセス定義ファイルの再実行部の構築を行った。ワークフローエンジンには、最新版のjBPM5.1.0を使用した。前年度までの作業では、その時点での最新版jBPM4.4を使ってきた。今回のワークフローエンジンのバージョンアップに伴って、DAQワークフローシステムもjBPM4.4、からjBPM5.1.0への移行のための作業を行った。プロセス定義ファイルの再構成部では修正変更を実施する例を示すために、新たなタスクを追加作成した。この追加したタスク中から、リモートマシン上のスクリプトを実行して、DAQミドルウェア例題を起動した。ここで使用したリモートマシンは、ワークフロー基本部分で使用したものとは別のマシンである。また、起動した例題アプリケーションもワークフロー基本部分で使用したものとは別のアプリケーションである。再構成したあとのプロセス定義ファイルの再実行は、正常に実行できることを確認した。これで、DAQワークフローのプロセス定義ファイルを自由に修正・変更して再実行することが可能になった。また、タスクが起動するアプリケーションは、任意のマシン上の任意のアプリケーションを実行できるという環境を構築することができた。今年度までの作業で、GUI ClientからCC/NET用データ収集システムを操作してデータ収集を行い、一方で、DAQワークフローシステムを操作してDAQフローコントロールが可能なシステムのフレームワークを構築できた
粘弾性液体の多孔質媒体内流動の解析

粘弾性流体であるポリアクリルアミド水溶液は,流路径が複雑に変化する多孔質媒体内を流動する際、せん断流のみでは評価できない過剰な圧力損失を生じる.この圧力挙動を把握するため,径の異なる2種類の円管を組み合わせた複合毛管モデルと,ガラスビーズを充填した充填層モデルを製作し,ポリアクリルアミド水溶液が流れる際の圧力挙動を観測した.ポリマー溶液の濃度,モデルをかえて,それらが過剰な圧力損失に及ぼす影響を調べた.また一方で,ポリアクリルアミド水溶液の粘弾性的性質の静的及び動的測定を行い,濃度との関連を調べた.研究の結果,次のような知見が得られた.(1)流量が大きくなると,複合毛管モデル,充填層モデルのいずれにおいても過剰な圧力損失の発生がみられた.過剰な圧力損失は,流量とともに,急激に増加した.(2)複合毛管モデルの実験では,濃度が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,濃度が小さいほど大きかった.(3)複合毛管モデルの実験で,2種類の円管の径の比が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,同一流体の場合,径の比の違いによらず,ほぼ等しかった.(4)ポリアクリルアミド水溶液は,濃度が大きくなるにつれて,弾性的性質が強くなり,緩和時間が大きくなった.粘弾性流体であるポリアクリルアミド水溶液は,流路径が複雑に変化する多孔質媒体内を流動する際、せん断流のみでは評価できない過剰な圧力損失を生じる.この圧力挙動を把握するため,径の異なる2種類の円管を組み合わせた複合毛管モデルと,ガラスビーズを充填した充填層モデルを製作し,ポリアクリルアミド水溶液が流れる際の圧力挙動を観測した.ポリマー溶液の濃度,モデルをかえて,それらが過剰な圧力損失に及ぼす影響を調べた.また一方で,ポリアクリルアミド水溶液の粘弾性的性質の静的及び動的測定を行い,濃度との関連を調べた.研究の結果,次のような知見が得られた.(1)流量が大きくなると,複合毛管モデル,充填層モデルのいずれにおいても過剰な圧力損失の発生がみられた.過剰な圧力損失は,流量とともに,急激に増加した.(2)複合毛管モデルの実験では,濃度が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,濃度が小さいほど大きかった.(3)複合毛管モデルの実験で,2種類の円管の径の比が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,同一流体の場合,径の比の違いによらず,ほぼ等しかった.(4)ポリアクリルアミド水溶液は,濃度が大きくなるにつれて,弾性的性質が強くなり,緩和時間が大きくなった.本研究では,孔隙構造と液体のレオロジー方程式を組み合わせて,粘弾性液体が多孔質媒体内を流動する時の流動特性を予測する数学モデルを開発する。さらに,このモデルを用いて,粘弾性液体の地層内流動の解析を行い,地下の加工技術やEOR法における粘弾性液体の利用方法についての検討を行う。本年度は,研究の対象とする粘弾性液体としてポリアクリルアミド水溶液を考えて,以下の研究を行った。1.レオメーターによる液体の粘弾性の測定レオメーターを用いた強制振動法による測定から,ポリアクリルアミド水溶液(濃度500ppmと1,000ppm)の動的弾性率と動的粘性率の測定を行った。測定データは,角周波数ωが0.1100rad/sの範囲で得られた。但し,測定データに適合した溶液の構成方程式の決定にはまだ至っていない。2.孔隙流路モデルを用いた流動実験ガラス管を材料とした実験の孔隙流路モデル(単一径の円管から成る単一毛管モデルと,径の異なる2種類の円管を組み合わせた複合毛管モデル)を製作した。複合毛管モデルでは,くびれ部と広がり部の繰り返し構造から成る多孔質媒体内の流路を模擬した。両モデル内をグリセリン水溶液とポリアクリルアミド水溶液が流動する時の圧力損失と流量の関係を測定した。その結果,グリセリン水溶液の両モデル内の流動特性は,溶液をニュートン流体と仮定することにより適切に予測できることを確認した。一方,ポリアクリルアミド水溶液では,溶液をべき乗則流体を仮定することにより,単一毛管モデル内の流動特性のみを適切に予測することができた。溶液の弾性を考慮した流動方程式の構築が次年度の研究課題である。粘弾性流体であるポリアクリルアミド水溶液は,流路径が複雑に変化する多孔質媒体内を流動する際,せん断流のみでは評価できない過剰な圧力損失を生じる.この圧力挙動を把握するため,径の異なる2種類の円管を組み合わせた複合毛管モデルと,ガラスビーズを充填した充填層モデルを製作し,ポリアクリルアミド水溶液が流れる際の圧力挙動を観測した.ポリマー溶液の濃度,モデルをかえて,それらが過剰な圧力損失に及ぼす影響を調べた.また一方で,ポリアクリルアミド水溶液の粘弾性的性質の静的及び動的測定を行い,濃度との関連を調べた.研究の結果,次のような知見が得られた.(1)流量が大きくなると,複合毛管モデル,充填層モデルのいずれにおいても過剰な圧力損失の発生がみられた.過剰な圧力損失は,流量とともに,急激に増加した.(2)複合毛管モデルの実験では,濃度が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.

流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,濃度が小さいほど大きかった.(3)複合毛管モデルの実験で,2種類の円管の径の比が大きくなると,過剰な圧力損失は大きくなり,また,より小さな流量で発生した.流量とともに過剰な圧力損失が増加する割合は,同一流体の場合,径の比の違いによらず,ほぼ等しかった.(4)ポリアクリルアミド水溶液は,濃度が大きくなるにつれて,弾性的性質が強くなり,緩和時間が大きくなった.
細胞増殖・ストレス応答・神経回路形成におけるmRNA粒子による翻訳調節機構の解析

神経樹状突起へのmRNA輸送と局所的翻訳は、シナプス長期増強並びに学習記憶に必須であり、それらは主にmRNA粒子によって担われている。本研究では、mRNA粒子構成因子RNG105のターゲットmRNAを同定し、それらmRNAの神経樹状突起への輸送がRNG105によって担われていることを明らかにした。翻訳調節に関しては、RNG105以外の因子の関与が示唆された。またRNG105は、増殖細胞においてはストレス誘導性のストレス粒子に局在すること、及びその粒子はmRNAの翻訳を抑制していることを示した。細胞質に存在するRNA粒子は,mRNAの輸送と局在化に中心的な役割を果たすとともに、細胞外からの刺激に応じた翻訳のON/OFFの調節に働いている。本研究では、RNA粒子に局在するRNA結合タンパク質RNG105のターゲットmRNAを同定し、それらmRNAの細胞内動態および翻訳調節機構を明らかにすることを目的とする。本年度は、平成21年度以降に計画していた、神経細胞におけるmRNAの動態と翻訳調節についての解析を以下のようにおこなった。神経細胞においてRNG105のターゲットmRNAの一部として同定していたNa^+/K^+ATPaseサブユニットアイソフォーム4個(alpha3, FXYD1, FXYD6, FXYD7)の3'非翻訳領域(3'UTR)をGFPの翻訳領域にcisにつなげ、神経培養細胞に導入した。これらmRNAはRNA粒子に取り込まれ、神経樹状突起へ輸送・局在化することが分かった。GFPの蛍光強度を測定することによってその翻訳量を調べると、これら3'UTRをつなげたGFPの翻訳は、コントロール3'UTRをつなげたものに比べて、神経細胞において著しく低下することが分かった。このことは、RNA granuleに取り込まれたmRNAは、輸送中にその翻訳がOFFに調節されていることと良く一致した。RNG105ノックアウトマウスの神経細胞においても同様の実験をおこなったところ、mRNAの樹状突起への輸送は低下したが、細胞体におけるGFPの翻訳量はコントロールの神経細胞と差がなかった。以上の結果から、RNG105はこれらmRNAの樹状突起への輸送に関与するが、翻訳調節に関しては別の因子が存在することが示唆された。神経樹状突起へのmRNA輸送および局所的翻訳は、シナプス形成および可塑性、ひいては神経ネットワーク形成に重要な役割を果たしている。mRNA輸送と局所的翻訳制御は、mRNA粒子と呼ばれる高次複合体によって主に担われている。我々はその粒子に局在するRNA結合タンパク質RNG105を初めて同定し、その解析をおこなってきた。本年度は、網羅的に同定したRNG105結合mRNAのオントロジー解析をおこなった。その結果、複数のNa^+/K^+ ATPaseサブユニットアイソフォームを含むイオンホメオスタシス関連因子、活性酸素種除去に関わる金属結合タンパク質、アミロイド関連因子などが有意に多いことがわかった。神経細胞では、シナプス刺激に応答して、樹状突起側の後シナプスでカチオン濃度の上昇、それに伴う活性酸素種の増加が引き起こされる。このようないわゆるストレスに対応するべく、イオンホメオスタシス関連因子や金属結合タンパク質が樹状突起において刺激に応じて局所的に翻訳される可能性が示唆された。また、同定したmRNAの蛍光タイムラプスイメージングをおこなった。Na^+/K^+ ATPaseサブユニットアイソフォームmRNAにMS2システムを用いてGFPを直接つなぎ、一方RNG105にはRFPを融合して、両者を神経培養細胞に同時に導入した。タイムラプス観察の結果、mRNA-GFPとRNG105-RFPが共にmRNA粒子にリクルートされ、同時に樹状突起中を移動する様子を観察することができた。さらに、mRNA-GFPのみを導入する実験をおこない、RNG105ノックアウト神経細胞においては、mRNA-GFPの動きが著しく低下することも明らかにした。以上の結果から、同定したmRNAがRNG105によって樹状突起に輸送されることをイメージングによって直接的に示すことができた。細胞質に存在するRNA粒子は、特定のmRNAの輸送と翻訳を制御することによって、神経細胞におけるシナプス可塑性や増殖細胞におけるストレス応答に関与する。我々はこれまで、神経細胞RNA粒子の構成因子として新規RNA結合タンパク質RNG105を同定し、その解析をおこなってきた。本年度は、RNG105のパラログであるRNG140を同定し、RNG105とRNG140が神経細胞および増殖細胞でどのような局在性と刺激応答性を示すかについて比較解析をおこなった。RNG105とRNG140は以下の点で大変良く似た性質を持つことが分かった。すなわち、mRNAに結合して翻訳抑制活性を持つ点、RNA粒子の形成を誘導する点、脳に最も発現が高く、神経樹状突起に局在し、一部はシナプス付近に局在する点、神経細胞でノックダウンすると、シナプスおよび樹状突起の発達が低下する点である。

しかし、RNG105とRNG140が形成するRNA粒子は、お互いを排除し、構成因子も異なることから、別の種類のRNA粒子であることが分かった。さらに、増殖細胞に酸化ストレスを与えるとRNG105粒子は形成が誘導されるのに対し、RNG140粒子は全く形成が誘導されないことが分かった。また、神経細胞におけるRNG105およびRNG140のノックダウンは、それ自身の遺伝子発現によってレスキューされるが、それぞれお互いの遺伝子発現ではレスキューされなかった。以上の結果から、RNG105とRNG140は異なるRNA粒子に局在し、異なるパスウェイで機能することが示された。特に、ストレス応答に関しては、RNG105が関与し、RNG140は関与しない機能が存在することが示唆された。
銀微粒子分散膜を用いるSERS分光法による薬物,環境汚染物質の検出

銀微粒子分散酢酸セルロース膜による薬物等の検出を通して,微量物質の検出における,SERSのより広範な利用の一助となることを目指すのがこの研究の目的である.分散膜を用いる方法は膜を一度作れば,測定時にカッターナイフなどで適当な大きさに切り使用でき,試験紙を用いるような感覚で,SERSの測定を行うことができることができる.本研究により銀微粒子分散酢酸セルロース膜が,SERSの測定のセンシンング材料として用いることができることがわかり,この方法が電極法やコロイド法より簡便に行えることが示された.本法により以下に示す薬物のSERSバンドを観測できることが示された.キナクリンは坑マラリア作用を持つ薬物であるが,10^<-7>Mの溶液からもSERSバンドを観測することができ,本研究で取り上げた薬物の内で最も低濃度までSERSを観測できた.その他つぎのような薬物の検出に成功した(括弧の中の値は検出限度濃度を示す).テオブロミン(利尿剤:10^<-6>M),ニコチン酸(ビタミン:10^<-6>M),4-アミノピリジン(麻酔薬:10^<-4>M),ニコチン(タバコの含有成分:10^<-5>M),エリプトシン(坑癌剤:10^<-5>M),ウリジン(10^<-6>M).環境汚染物質としては洗剤を取り上げたが,本法でそのSERSの観測に成功していない.今後更に研究を継続して行く予定である.本法によるSERSの観測での最大の問題点はBlankのバックグラウンドである.これは主に銀表面で光分解で生ずる無定型炭素によるバンドである.このバンドは,コロイド法や電極を用いるSERSでも現れるが,分散膜法では特に顕著である.この問題点についても今後の検討が必要である.銀微粒子分散酢酸セルロース膜による薬物等の検出を通して,微量物質の検出における,SERSのより広範な利用の一助となることを目指すのがこの研究の目的である.分散膜を用いる方法は膜を一度作れば,測定時にカッターナイフなどで適当な大きさに切り使用でき,試験紙を用いるような感覚で,SERSの測定を行うことができることができる.本研究により銀微粒子分散酢酸セルロース膜が,SERSの測定のセンシンング材料として用いることができることがわかり,この方法が電極法やコロイド法より簡便に行えることが示された.本法により以下に示す薬物のSERSバンドを観測できることが示された.キナクリンは坑マラリア作用を持つ薬物であるが,10^<-7>Mの溶液からもSERSバンドを観測することができ,本研究で取り上げた薬物の内で最も低濃度までSERSを観測できた.その他つぎのような薬物の検出に成功した(括弧の中の値は検出限度濃度を示す).テオブロミン(利尿剤:10^<-6>M),ニコチン酸(ビタミン:10^<-6>M),4-アミノピリジン(麻酔薬:10^<-4>M),ニコチン(タバコの含有成分:10^<-5>M),エリプトシン(坑癌剤:10^<-5>M),ウリジン(10^<-6>M).環境汚染物質としては洗剤を取り上げたが,本法でそのSERSの観測に成功していない.今後更に研究を継続して行く予定である.本法によるSERSの観測での最大の問題点はBlankのバックグラウンドである.これは主に銀表面で光分解で生ずる無定型炭素によるバンドである.このバンドは,コロイド法や電極を用いるSERSでも現れるが,分散膜法では特に顕著である.この問題点についても今後の検討が必要である.平成6年度は,下記の二つの項目について検討した.(1)分散膜の表面状態の観察分散膜中では直径約10nm程度の銀微粒子が,幾つか集まって塊として分散していることが分かっている.SERS活性な膜では多くの微粒子の塊が見られるのに,塊の無い膜では殆ど増強効果は見られないので,この塊が表面増強効果の発現に重要な役割を演じている.微粒子の大きさ及びその集合状態は,微粒子を分散させる前のセルロース膜中のポア(穴)の大きさ,分布状態に依存する.分散前の膜ではこのポアに水が含まれているので,含水率を調べるために本科研費により購入したFT-IR装置によりIRスペクトルを測定したが,膜中に含まれる水の吸収はブロードで意外に弱く定量するのは困難であった.しかしATR法により膜の表面近傍の状態を,セルロースアセテートのエステル結合に着目して観察できることが,分かった.分散膜は対向拡散法によって作るがこの過程で,セルロース膜は水酸化ナトリウム溶液と接触するため,アセチル基が取れ,水酸基生じ膜中への試薬の透過性に影響を与える考えられる.現在のところ拡散時間が短い(2,3分程度)時は,影響はないが,それ以上になると,アセチル基が取れることが分かった.この詳しい検討は次年度に行う予定である.(2)薬物の検出SERSスペクトルの測定を試みた薬物はシンコニジン(抗マラリア剤,解熱剤),レゼルピン(精神安定剤),テオブロミン(利尿剤),アミノピリジン(麻酔剤),クレアチニン(尿中に含まれる物質)である.このうちテオブロミンについては,10^<-6>M溶液からもSERSバンドが観測できた.またアミノピリジンは,10^<-4>

M溶液までしかSERSは観測できなかったが,良好なスペクトルが得られた.今年度は最適分散膜の調製のための膜の状態分析を行った。酢酸セルロース膜には細孔がありその中には水が捕らえられていて,水の量により細孔の数,大きさが決まる。水のIR吸収強度から細孔の数,大きさを見積もることを試みた。しかし真の量を見積もるのは困難であった。そこで赤外分光法による検討の方向を,膜中の細孔から表面状態の観察に変更した。SERS測定時に分散膜に試料溶液を浸透させるが、この時溶液は表面を通過して銀微粒子に到達する。従って,溶液の浸透し易さは表面状態にも依存する。高分子膜等の表面を調べるには全反射赤外分光法(ATE-IR)が有効であるので,この方法で分散膜の表面観察を試みた。スペクトルの測定には本研究費で購入した島津IR408赤外分光光度計を用い,水平ATR測定装置を使用して行った。その結果,対向拡散時に酢酸セルロース膜の水酸化ナトリウム水溶液に触れる面はエステル結合が僅かに加水分解され,この面の親水性が増すが,硝酸銀水溶液に触れる面は全く変化を受けないことが分かった。今年度は薬物以外に,洗剤の検出を試みたが,SERSの観測はできなかった。そこで以前検討した薬物の内まだSERSバンドの帰属に問題が有るニコチン酸(水溶性ビタミンB)とテオブロミン(利尿剤)を再検討をした。その結果,ニコチン酸に関しては膜中でnicotinate anionの他にzwitter ionも僅かに存在していることを明らかにした。テオブロミンに関しては,重水素化物の赤外とラマンスペクトルを測定しこれを参考に,吸着配向を決めるのに重要なNH結合の関与する振動の帰属の再検討を行った。この帰属を基に,テオブロミンが銀表面でどのように吸着しているかの検討は現在進行中である。
星細胞と線維化肝で発現する新遺伝子stapの分子機能と臨床病態的意義の解析

ラットの星細胞に対してプロテオーム解析を行った結果21kDaの蛋白質が活性化星細胞で強誘導されることを見出し、STAP (stellate cell activation-associated protein)を同定した。また、ヒト星細胞株からヒトSTAPもクローニングした。STAPはラットの活性化星細胞ならびに肝硬変で誘導される蛋白であり、ヒト肝臓の星細胞にも発現している。今回は、STAPの蛋白発現動態と機能解析を行った。1)STAP陽性細胞はラット肝星細胞のみでなく、内臓各臓器の間質に存在し、これらはビタミンA貯蔵細胞と一致することが判明した。従って、STAPは内臓系線維芽細胞(臓器特異的星細胞)のマーカーとなり得る。STAP発現は線維化肝のみでなく、慢性膵炎や腎炎でも増加することが明らかとなった。2)初代培養星細胞におけるSTAP発現は血清、PDGF-BBやTGF-β刺激で軽度に増加することが判明した。3)STAPはアミノ酸配列上グロビンやミオグロビンと約40%の相同性示す。リコンビナントラットならびにヒトSTAPを作製して分光学的に解析した結果、STAPはヘム蛋白であることが判明した。STAPに存在するヘムの第5、6配位子はともにHisであり第6配位子が空位であるヘモグロビンやミオグロビンとは異なる性質を有するヘム蛋白である。解析の結果、His81とHis113がヘムの配位子であることが判明した。しかしながら、STAPは酸素や一酸化炭素とミオグロビンと同等に結合することができることも明らかとなった。4)GFP-STAP発現ベクターをHuh-7細胞にtransient transfectionして解析したところ、STAPはHuh-7細胞の増殖を抑制し、細胞死を誘導することが判明した。
解析的積分とその応用

本研究課題の研究代表者は、平成11年度13年度は青本和彦、平成14年度は三宅正武であった。これは、青本が平成14年3月に定年退官した事により、それまでの研究分担者の三宅に引き継いだ事による。4年間の研究期間において得られた研究成果は多岐に渡るが、以下に述べる成果は、その一端に過ぎない事をお断りしておく。青本和彦の研究成果には次のようなものがある1)準超幾何函数の一般的な積分表示を確立し、Picard-Lefschctz変換を用いて、そのモノドロミー公式や、特異点についての陽の公式を与えた。2)LR変換と密度行列の理論のた次元への拡張を与えた。具体的には与えられた密度行列に対して、辞書式順序によるGram-Schmidtの直交多項式を定義し、LR変換を定式化した。特に、Koorwinnder多項式に明示的な公式を与えた。三宅正武の研究成果に次のようなものがある。3)偏微分方程式の初期値問題に現れる発散級数解のボレル総和可能性の問題とボレル和の積分表示の問題を研究し、ある種の定数係数の非コワレフスキ型の方程式の場合に解決した。4)解析的非線形一階偏微分方程式において、特異性の概念を明らかにし、特異点の分類問題の一貫として、形式巾級数解の収束、発散の判定の基本原理を与えた。(1)分数排他統計に表れるWuの方程式によって定義された準超幾何関数の対称性、特異点、モノドロミーの構造を明らかにする論文を、井口和基さんと書いた。(2)準超幾何関数の一般的積分表示を確立し、picard-Lefschetz変換を用いて、モノドロミーの公式、特異点について陽の公式を得た。この結果を平成11年6月半ばに行なわれたHong-Kongの特殊関数の国際会議で発表した。(3)平成11年8月始めRIMSにおいて離散可積分系の研究会に参加し、密度行列についての講演を行なった。(4)平成11年8月半ばに本研究科においてAnatole Kirillov氏らと超幾何関数と組合せ論の国際研究会を開催し、(1)の内容を発表した。(5) Anatole Kirillov氏とともに、平成12年2月半ばに本研究科において、パリのエコール・ポリテクニックの教授であるLassalle氏を招き、超幾何関数と組合せ論の小研究会を開催し、研究交流を行なった。今年度は2つの方向での研究を推進した。<その1>超平面配置積分にまつわる差分方程式の接続問題において,特別な2個の正反対方向に対する互いの関係を与える接続行列を求めること,すでに知られているKita-Yashidaによるツイスト輪体の交差行列と関連づけて,凸多面体上のある加法的関数をもちいた定式化をした。さらに,MacPhersen-Procesiらの極小驚異コンパクト化& Stanleyらの結果をむすびつけて一般的な予想を立てた。<その2>LR変換と密度行列について多次元版への拡張を手がけた。密度を与えて辞書式順序によるGram-Schmiotlの直交多項式を定義し,LR変換を定式化した。特にKoovninder多項式の場合に明示的な公式を与えた。<招待講演>2000年7月はじめ,マイソール大学(インド);2000年7月下旬,カタニヤ大学(ミチリア),200年10月初旬,南開大学(中国)で上記の内容について講演した。今年度は、主に2個のテーマについて研究した。ひとつは、多変数直交多項式におけるLR-変換と直交多項式の接続関係式についてである。1変数の場合に、LR-変換は固有関数展開における密度行列のことばで、線形ないし射影変換として表現されることを明らかにしているが、これを多変数に拡張することは困難を伴う。多変数直交多項式に辞書式順序が導入できるならば、この順序に関してガウス分解が考えられる。スペクトル領域上のあるラドン測度を密度とする、この辞書式順序による直交多項式の系を考える。スペクトル領域上のひとつの正値多項式は掛け算作用素としてこの直交系に線形に作用する。

これが、一方では直交多項式の接続関係式を、他方では固有方程式を定義する差分作用素のLR-変換を与えることを証明した。この基本的事実を、Koorwinnder多項式に適用して明示的な公式を得た。これらの結果を、2001年8月Augsburg大学で開かれた、差分方程式のワークショップで発表した。また、2002年1月に、東北大学数学教室談話会でも講演した。もうひとつは、n次元球面内の(n-1)次元超球面配置に附随する超幾何積分のガウス・マニン接続についてである。私は、すでに1982年にこのテーマについて論文発表しているが、いくつかの誤りを含んでいることを発見、それを修正すること及びさらなる精密化と簡易化をめざした。この結果を2002年1月、ルイジアナ大学での超平面配置に関するワークショップで発表した。今年度は主に複素解析的な非線形偏微分方程式の特異点における形式的巾級数解の構造の研究を行った。具体的には一階非線形偏微分方程式に対して、特異点の概念を一般的に定義し、それは線形方程式に対しては従来のものと変わりが無いが、非線形方程式の場合には、解に応じて変わりうるものである事を明らかにした。さらに、特異点の分類の研究を、特異点における形式解巾級数解の収束、発散の問題と捉え、そのような場合の特徴付けのの研究を行った。一般化されたポアンカレ条件のもとでの形式巾級数解の収束性を証明し、そうで無い場合(発散級数解になる場合)には、発散の程度を与える指数(ジュブレイ指数)の決定がどのようになされるのかの基本原理を明らかにした。また、これらの証明の基本原理は古典的な優級数法の改良版であった。この方法が解析的な非線形偏微分方程式の多くの問題に有効に用いられ、Cauchy-Kowalevskiの定理を始め、グルサー問題や種々の特異方程式に解の存在定理の証明が格段に易しくて、しかも短くなることが明かとなった。これらの結果を、2002年7月にギリシャ、パトラス大学で開催された偏微分方程式に関する国際会議で発表した。また、2003年1月にプィリピン大学で開催されたワークショップでは、上の述べた理論全体を概観する講演を行った。
古典的条件付けによりウミウシ視細胞で発現量が変化する遺伝子の検索

本研究は、アンチセンスRNA増幅法の導入により、ウミウシという各種の遺伝子の塩基配列が未知の動物について、古典的条件付けによる神経細胞での遺伝子発現量の変換を検出することを当初の目的として行った。遺伝子発現を検出するためには各遺伝子のDNAプローブが必要であり、神経可塑性に関与する可能性のある遺伝子としてPLC、CREB、PKC、TRK遺伝子、および全mRNA量の指標として解糖系酵素GAPDHの遺伝子のDNAプローブを作製した。文献とのDNAデータベース検索により各遺伝子の保存性の高い領域を探し、それに相当するDNA断片をラットまたはマウス脳cDNAからPCR法にて増幅し、精製してプローブとした。これらのプローブが軟体動物腹足類に対して使用可能かどうかを、モノアラガイ中枢神経系からジゴキシゲニン標識アンチセンスRNAを作製し、ドットブロットハイブリダイゼーション法で判定した。その結果、複数のプローブが使用可能なことが確認されたが、いずれもシグナルが弱く、単一神経細胞レベルでの検出は困難であると思われた。アンチセンスRNAを電気泳動で観察すると比較的短いRNA断片が多く、テンプレートである2本鎖cDNA作製法に問題があることが示唆された。cDNA作製法を改良するためにはcDNA合成効率を見積もる指標が必要であると考え、モノアラガイras遺伝子の部分塩基配列の決定を行ない、PCR法により検出することで指標とした。その結果、これまでのcDNA作製法ではモノアラガイ中枢神経系約2万分の1個分のcDNAからras遺伝子発現が検出された。現在はcDNA作製過程を改良しており、予備実験では少なくとも100倍程度増やすことが可能となってきている。モノアラガイ中枢の神経細胞数が約2万5千個であることを考え合わせると、今後、単一神経細胞レベルで遺伝子発現量が測定できるものと考えている。
Zeolite法を用いた超短尺構造ファイバレーザーの開発

光ファイバの主要な素材であるシリカガラス中では、希土類元素のドーピングによるクラスタ化が容易に発生し、それらの影響から濃度消光を引き起こす。そのため、今日でも研究に用いられている希土類ドープファイバは2000ppm程度までの濃度で使われているのが現状である。本提案はZeolite法という我々が新しく開発したシリカガラス中への希土類元素の高濃度ドーピング手法(1.25wt%(Nd_2O_3)で量子効率が81%)を用いて、光ファイバのコア材料を製作し、光ファイバの線引き装置を用いて、これまでにない、高濃度希土類ドープコアを持つ光ファイバの製造とそれを用いた超短尺型のファイバレーザーの実現を目的とするものである。本年度は、Zeolite法により最適化されたコアガラスの製作、ロッドインチューブ法による目的構造のプリフォーム・マルチモードコアクラッド構造ファイバの製作、超短尺構造ファイバレーザーの製作と励起入力に対する出力エネルギーの測定並びに高効率化の検討を行った。高濃度Ndドープコア材料・光ファイバは順調に作製できた。昨年度、確認されたレーザー発振における問題点は試行錯誤の上解決され、世界で初めて5cmの短尺光ファイバでレーザー出力10mW達成し、装置構成の最適化によりさらなる高出力化が可能なことが分かった。今後、更に短尺化を進めることで、100GHzを超えるクロックを安価に構成する光源としてや、他の希土類元素の短尺ファイバによる医療、精密加工、マーキングなどの様々な分野への応用が可能となる。現在、以上の成果をまとめ、論文執筆中である。昨年度、確認されたレーザー発振における問題点である強励起によるアップコンバージョン現象は、該当短尺ファイバを適切に冷却することにより解決されることが分かった。冷却の手法を検討し、利得の増加を得ることで、上記問題は解決され、世界で初めて5cmの短尺光ファイバでレーザー出力10mW達成し、装置構成の最適化によりさらなる高出力化が可能なことが分かった。
骨折治癒過程における異常の分子病態学的解析

ビタミンCを合成できないミュータントラット(ODSラット)における骨折治癒不全現象を分子組織学的に解析した。ODSラットにおいては正常に比較して著しい膜性骨化の欠損が観察され、オステオポンチン発現型骨芽細胞は全く認められなかった。また、内軟骨性骨化における軟骨細胞系細胞の分化にも異常が観察された。オステオネクチン発現型軟骨細胞、Matrix Gla Protein(MGP)発現型増殖軟骨細胞は認められたが、オステオポンチン発現型肥大軟骨細胞は全く認められなかった。このようにいずれの場合にもオステオポンチン遺伝子の発現がビタミンC欠損時に著しい阻害をうけることが判明した。オステオポンチンは石灰化に深く関与する蛋白であり、壊血病における石灰化の不全がオステオポンチン遺伝子の発現の阻害によることが強く示唆された。さらにOpn遺伝子の発現制御について分子生物学的検討を行った。その結果、オステオポンチン遺伝子の5'上流域300bpに結合して遺伝子発現を制御している転写因子としてPEBP2αA/CBFA1、Ets-1、PU.1、MITFをin vivo,in vitroで同定した。さらに、外力による骨のリモデリング時に骨細胞で発現するオステオポンチンが骨表面に達し、破骨細胞の遊走因子として機能していることを示した。特に圧迫力をうける面においてこの現象は顕著であり、骨折修復期において適度な外力が加わることが骨折治癒に必要であることが示されたと同時に、誤った方向からの力が仮骨形成とそのリモデリングに障害的であることも分子生物学的に示唆された。また、石灰化を伴う骨肉腫ににおいて、骨肉腫の細胞それ自体が骨化するのか、あるいは骨肉腫から放出されたサイトカインが正常組織の細胞の骨化を誘導しているのかをヌードマウスへのヒト骨肉腫細胞の移植実験により検討した。ヒトとマウスの細胞は種特異的な反復配列の存在により識別した。症例により、両方の場合への分類が可能であることを示した。マウス、ラット(ビタミンC合成系欠損ミュータントラット、破骨細胞欠損マウスミュータント(mi)において、外因と組織修復の関係を明らかにすることを目的として研究を行なった。マウスを用いた骨折修復過程における組織学的、分子生物学的な検討を行ない、その過程に関与する因子の影響を調べた。具体的には実験動物の大腿骨、あるいは肋骨をダイヤモンドカッターで手術的に切断し、それを骨折モデルとして、手術後の経過観察を分子生物学的な手法を用いて行ない以下に示す結果を得た。1.骨組織修復後の初期過程として、肢芽発生過程において重要な役割を担っていると考えられるBMP-4,Sox-9,Hox-2.6等の遺伝子mRNAが未分化間葉系細胞に強く発現していることをin situハイブリダイゼーションによって明らかにした。これらの遺伝子は正常状態の骨組織においては発現が観察されず、組織損傷を起点として転写活性が上昇したものと考えられる。2.仮骨形成期において、正常状態においては発現の認められないOsteopontin遺伝子の強い発現を未分化骨芽細胞に検出した。Osteopontin遺伝子は種々の石灰化をともなう病変においても強い発現を示し、炎症を起点とするなんらかのシグナルによって誘導される性格を有すると考えられた。3.生理的、あるいは強制的な歯の移動にともなう歯槽骨のリモデリングにおいて、骨細胞にOsteopontin遺伝子の強い発現を認めた。骨折治癒過程におけるこの遺伝子の強い発現誘導と、本現象には関係があると考え、0steopontin遺伝子の発現制御領域を解析し、TPA response element,AP1,E-boxなどのエンハンソンが機能していることを培養細胞レベルで確認した。

症例により、両方の場合への分類が可能であることを示した。正常、あるいは異常な組織修復の過程において発現される遺伝子の組織レベルにおける局在性をin situハイブリダイゼーション法を中心として解析することを目的として検討を行なった。骨折修復過程の欠陥については実験動物として、人体に起こる変化と異常をある程度再現することが出来るビタミンC合成系に障害があるラット、を用いた。ビタミンC合成系欠損ミュータントラットにおける骨折治癒過程は内軟骨性骨化、膜性骨化ともに重篤な障害を受けていた。しかしながら、内軟骨性骨化が起きる部位において、軟骨細胞の出現が観察され、線維芽細胞、未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化にはビタミンCが必須ではないことが明らかにされた。しかしながら、肥大軟骨細胞の出現は完全に抑制され、その分化過程においてビタミンCの重要性が示唆された。一方、膜性骨化においてはアルカリフォスファターゼ陽性の骨芽細胞の出現が観察されず、骨芽細胞の分化にビタミンCが必要であることが判った。ビタミンCはコラーゲンのハイドロキシレーションに必要である。ハイドロキシレーションを受けていないコラーゲンは細胞外に放出されず、結果的に細胞外基質が正常に形成されない。正常な細胞外基質が骨関連遺伝子の発現にどうかかわるかをin situ hybridizationで検討した。その結果、骨関連遺伝子のうち、Osteonectin,Matrix Gla Proteinは正常の発現を示していたが、Osteopontin,Osteocalcinの発現は全く認められず。これらの遺伝子発現の必要条件として、正常な細胞外基質の存在が示された。
オートファジーを焦点とした消化器難治性疾患の病態解明および治療開発

肝脂肪化によって肝細胞とKupffer細胞のオートファジー機能が低下した。肝細胞においては脂肪蓄積によってオートファジー誘導が抑制されるだけでなくリソソーム内酵素カテプシン発現低下によりオートファジーを介した蛋白分解も障害されていた。さらにオートファジー抑制はエンドトキシン感受性亢進や肝発癌誘導に作用した。また消化管においてはオートファジー欠損は腸炎を増悪させる方向に作用したが消化管腫瘍形成に関しては有意な関与を示さなかった。以上よりオートファジー機能障害は様々な消化器疾病発症において重要な役割を果たしているものと考えられ、オートファジーを標的とした新規治療法開発は消化器疾患予防において有用である可能性が示唆された。本年度はオートファジーと脂肪肝、大腸炎との関与を明らかにする目的で研究を行った。(1)オートファジーと脂肪肝遺伝的肥満モデルOb/Obマウスを用いて脂肪肝におけるオートファジー機能について解析をおこなった。コントロールマウスと比較しOb/Obマウスでは、肝細胞質内にオートファジーが誘導され、LC3-II蛋白発現も増加していた。しかし肝組織中p62は増加しており、単離肝細胞における蛋白分解アッセイでもOb/Obマウス肝細胞では蛋白分解が抑制されていることが分かった。またGSH/GSSG測定でもOb/Obマウスでは酸化ストレスの増加が確認され、ミトコンドリアの形態異常が観察された。肝組織よりショ糖勾配法によって脂肪滴を単離し脂肪滴膜の蛋白を評価したところ、LC3-IIが蓄積していることが分かった。以上のことから脂肪肝では酸化ストレスや障害ミトコンドリアによってオートファジーが誘導されるがオートファゴソームが脂肪滴に融合してしまい機能が低下している可能性が示唆された。脂肪性肝炎におけるマロリー体形成機序には脂肪滴によるオートファジー機能障害が背景にあるのかもしれない。(2)オートファジーとDSS腸炎大腸特異的オートファジー欠損マウスを用いてDSS腸炎モデルを作成した。オートファジー欠損によってDSS投与後腸炎の増悪を認めた。またTUNEL染色によってオートファジー欠損マウスにおいてはDSS投与によって大腸粘膜にアポトーシスが誘導されやすいことが分かった。またTNFαやIL-1β発現の増加もオートファジー欠損マウスにおいて強く誘導されていた。以上のことからオートファジーはDSS腸炎において臓器保護的に作用しているものと考えられた。本年度も引き続きオートファジーと脂肝、大腸炎との関係を明らかにる目的で研究を行った。(1)消化管炎症モデル本年度は、オートファジー欠損によってdextran sulfatesodium (DSS)腸炎が増悪する機序を明らかにすべく検討を行った。オートファジー欠損によりDSS投与後の大腸組織中のTUNEL陽性細胞が増加すること、Caspase-3, -7活性化が強く誘導されていることが分かった。さらにPERK発現、elf2α活性化の増加も認められる事からオートファジー欠損によりDSS添加後の小胞体ストレスが増加し、腸管粘膜細胞のアポトーシスが誘導されたものと想定された。一方、azoxymethane (AOM)/DSS投与による大腸発癌モデルでばオートファジー欠損により大腸腫瘍の数、大きさ、部位などに明らかな差を認めなかった。予想に反し、オートファジー欠損は腸炎発症には関与するが大腸発癌とは直接的には関与していないような結果となった。オートファジーは潰瘍性大腸炎よりもクローン病の発症に大きく関与していると考えられており、潰瘍性大腸炎と比較したときのクローン病の発癌率が低いことを反映しているのかもしれない。(2)オートファジーと脂肪肝脂肪肝において観察されるオートファジー機能障害の発生機序を明らかにすべく検討を行った。肥満モデルマウスでは肝組織中のカテプシンL発現がほぼ消失し、カテプシン活性の有意な低下を認めた。一方でLC-3とLAMP1発現は、コントロールマウスとOb/Obマウスからの肝細胞においてほぼ全部のオートリソソーム膜上に共発現しておりオートファゴソームとリソソームの融合は脂肪肝においても障害されていないものと想定された。以上のことから、脂肪肝ではリソソームのカテプシン成熟障害が生じるものと考えられ、これによりオートファジーを介した蛋白分解が抑制されたものと思われた。平成23年度は、オートファジー機能障害によって生じる肝細胞障害や酸化ストレス増加がエイコサペンタエン酸(EPA)投与によって改善するのかを検討した。肝特異的オートファジー欠損マウスを通常食にて飼育すると4週後に肝障害が生じたが、EPA含有食で4週間飼育すると肝障害が有意に改善した。また肝細胞内封入体形成も減少していた。

一方、オートファジー欠損によって肝組織中GSH/GSSG比低下や8-OHdG増加が認められ、酸化ストレス増加が生じていると考えられたが、EPA食投与によって、これらの酸化ストレスマーカーが有意に減少した。以上のことからオートファジー欠損によって肝細胞内酸化ストレスの増加を介した肝細胞死が生じるがEPA投与によって酸化ストレス増加が抑制され変性蛋白蓄積や細胞死が抑制されたと推測された。一方、脂肪性肝炎モデルOb/ObマウスにPPARγagonistを投与したところ、インスリン抵抗性は改善したが、脂肪蓄積によって生じるオートファジー誘導抑制やp62蛋白蓄積はほとんど改善しなかった。PPARγagonistを投与しても脂肪滴が肝細胞に残留しており、またインスリン抵抗性も完全に正常化できなかったことから通常投与量のPARγagonistでは脂肪蓄積によって生じる肝オートファジー機能を改善させることは難しいと考えられた。以上のことから脂肪肝において観察されるオートファジー障害は肝障害や肝発癌に関与していると考えられるがEPA投与による予防的介入の有効性が示唆された。
収束電子回折法による結晶構造解析用エネルギ-フィルタ-系の試作

電子回折法は従来結晶構造を定性的に決める方法として使われてきた。われわれは、これを定量的な方法、すなわち原子位置の決定を行える方法にまで引き上げることを最終の目的としている。そのために第一に必要なことはエネルギ-フィルタ-を用いて非弾性散乱電子を取り除き、弾性散乱電子のみによる収束電子回折図形を得ることである。今回、スキャンジェネレ-タ-によって入射電子線の角度を2次元的にコントロ-ルし、試料を通過した電子をセクタ-型エネルギ-分析装置に導びき、弾性散乱電子のみを通過させ、スキャンジェネレ-タ-からの同期信号を用いて、入射角の変化を位置の変化としてフィルム上あるいはディスプレ-上に収束電子回折図形を記録した。この方法を、現在われわれが推進している原子位置の決定法に必要な高次ラウエ帯反射線のプロフィルから非弾性散乱を除去することに応用した。約5eV以上の非弾性散乱電子を取り除くと、バックグラウンドが顕著に減った。われわれは、はじめて動力学理論によって計算される強度と比較できる実験強度曲線を得ることに成功した。次に、零次ラウエ帯反射の二次元的に拡がる回折強度から非弾性散乱を除去することを試みた。その結果、従来得られていた収束電子回折図形がいかに非弾性散乱電子によって不明瞭になっていたかが明らかになった。エネルギ-フィルタリングした図形にはパタ-ンが鮮明にあらわれるようになった。この結果は、次に予定している六方晶チタン酸バリウムの結晶構造解析の遂行に自信をもたらした。今回の試作で、エネルギ-フィルタリングした回折図形が容易に得られるようになり、エネルギ-フィルタリングが定量測定に極めて有効でありかつ必須なものであるかがあらためて確かめられた。