hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポジトロン断層(PET)検査の卵巣癌診療への導入に向けた細胞病理学的研究

【目的】腫瘍細胞で糖代謝が亢進する事実を利用したポジトロン断層(PET)検査が、各種悪性腫瘍の診断に活用されている。申請者らは、糖代謝薬剤の^<18>F-fluorodeoxyglucose(FDG)を用いたPET検査を、卵巣癌の術前・再発診断に臨床応用することを検討してきた。その結果、FDGは卵巣癌に集積するがその程度は症例毎に異なり、卵巣癌の13%に集積が認められないこと、逆に良性腫瘍にも16%に集積が認められることを見いだした。今回申請者は、FDGの取り込みが卵巣腫瘍のどのような細胞病理学的性質を反映するのかを明らかにするため本研究を行った。【対象と方法】臨床的に卵巣癌を疑い、術前にFDG-PET検査を施行した後手術を行なった17例(臨床進行期III期6例、II期2例、I期5例、境界悪性2例、良性2例)を対象とし、臨床進行期、腫瘍細胞の分化度、増殖力、糖代謝とFDGの取り込みに相関があるかを調べた。【結果】(i)上皮性卵巣腫瘍において、FDGの集積は、良性腫瘍に比べ悪性腫瘍に高い集積を示した。(ii)卵巣癌において、Glut-1発現、MIB-1陽性細胞数、及び細胞分化度は、FDGの集積と有意な正の相関を示した(いずれもP<0.05)。(iii)logistic回帰分析により、FDGの集積はGlut-1の発現に最も強い相関を示した。【考察】Glut-1の発現が強い卵巣癌は、明らかに術後の無再発生存期間が短いと報告されている。申請者は今回の研究を基に、Glut-1を強発現する卵巣癌の不良な予後は、腫瘍細胞の増殖力、及び腫瘍細胞の分化度を反映していると考察している。【結論】以上のように本研究は、卵巣癌に対する術前のFDG-PET検査が、従来までの形態画像とは異なり、非侵襲性に腫瘍細胞の活動性を画像化できる検査であることを明らかにした。本研究目的である、FDGの集積が卵巣腫瘍のどのような性質を反映するのかを、細胞病理学的に明らかにした。具体的には、FDGの集積と、病理組織像、腫瘍細胞密度、細胞増殖能、血管新生、細胞膜グルコーストランスポーターとの関連を解析した。以下の新たな知見を得た。1.FDGの集積と腫瘍マーカー(CA-125)、臨床進行期は、相関せず。2.FDGの集積と細胞分化度、細胞密度、細胞増殖能、細胞膜グルコーストランスポーターの発現と相関した。3.FDGの集積と細胞膜グルコーストランスポーターの発現が、回帰分析したところ独立した強い相関を認めた。4.卵巣癌において細胞膜グルコーストランスポーターの発現と予後に相関があるという報告がある。以上の結果より、FDGの集積は卵巣癌の予後と相関する可能性が示唆された。それにより、これまでの卵巣癌の術前の予後指標としていた腫瘍マーカー(CA-125)や臨床進行期とは違うマーカーとしてPET検査が利用できる可能性を示す事が出来た。現在、論文投稿中。
転移性腎細胞癌に対するHedgehog経路に対する新規標的治療

進行腎細胞癌に対するHedgehogシグナルに対する新規治療の確率及び現在の進行及び有転移腎細胞癌治療の1stライン治療であるSunitinibに対する薬剤耐性の克服に関する新たな知見を得ることを目標として研究を行い、樹立したSunitinib耐性ヒト腎細胞癌ではSunitinib治療後もHedgehogシグナルの重要な役割を担うGli2の発現が保たれていることを見出し、39例のSunitinib治療を行なった有転移腎癌の摘出標本の免疫染色においてもGli2発現レベルがSunitinib治療の無増悪生存期間と相関しており、バイオマーカーとなり得ることを英文誌に報告した。淡明細胞型腎細胞癌のGliの発現レベルとスニチニブの治療効果の関連を確認するために、2008年2011年にスニチニブを導入した転移性腎細胞癌症例のうち原発巣の摘除を行い組織学的に淡明細胞癌の診断を得た33例の摘除標本のパラフィン包埋組織を用い、免疫組織染色の手法を用い腫瘍組織におけるGli2発現レベルの評価を行い、各臨床パラメータとスニチニブの奏功期間との相関を検討した。Cox比例ハザードモデルを用いた生存分析では、原発巣のGli2高発現は有意な独立した予後不良因子であることが確認できた。次に、ヒト腎細胞癌株であるACHNを低濃度のスニチニブより開始し徐々に高濃度となるように継代培養を行いスニチニブ抵抗性ACHN細胞株を樹立し、母細胞株と比較しスニチニブ治療によりGli2蛋白発現レベルが低下しないことを確認することができた。これらの結果より、腎細胞癌におけるGli2発現レベルがスニチニブ治療抵抗性の獲得と関連している可能性が示唆できる結果となった。Gliを標的とするアンチセンスオリゴの至適濃度や細胞へのトランスフェクション条件の設定に時間を要するため。進行腎細胞癌に対するHedgehogシグナルに対する新規標的治療の確立および既存の分子標的治療の薬剤抵抗性の克服に関する新たな知見を得ることを目標とし,腎細胞癌に関してはsunitinib治療を行った転移性腎細胞癌のうち淡明細胞型腎細胞癌の原発巣の摘出標本における様々なチロシンキナーゼ阻害薬に関連する標的分子やHedgehogシグナルに関連する分子のタンパク発現レベルを免疫組織学的手法により評価を行なった。その結果、Gli2蛋白発現レベルと癌特異的生存の相関を認め,Gli2蛋白発現レベルが治療抵抗性を予測するバイオマーカーとなることを発見し、更にはヒト腎細胞癌株を用いたsunitinib治療抵抗性の細胞株を樹立し、sunitinib治療抵抗性の腎細胞癌細胞株では親株と比較しsunitinib治療後においてもGli2発現レベルが低下することなく維持されていた。このことよりGli2がsunitinib治療抵抗性を克服する新規標的治療の可能性を示唆しており、本研究結果を英文誌に発表した.進行腎細胞癌に対するHedgehogシグナルに対する新規治療の確率及び現在の進行及び有転移腎細胞癌治療の1stライン治療であるSunitinibに対する薬剤耐性の克服に関する新たな知見を得ることを目標として研究を行い、樹立したSunitinib耐性ヒト腎細胞癌ではSunitinib治療後もHedgehogシグナルの重要な役割を担うGli2の発現が保たれていることを見出し、39例のSunitinib治療を行なった有転移腎癌の摘出標本の免疫染色においてもGli2発現レベルがSunitinib治療の無増悪生存期間と相関しており、バイオマーカーとなり得ることを英文誌に報告した。本研究のeffortの割合をふやし、本実験で用いるアンチセンスオリゴのトランスフェクションの至適条件を早急に見いだせば後の実験計画に支障が生じないと考える。泌尿器癌治療
人体カドミウムおよび鉛負荷を指標とした環境汚染の経年変化

岩手、宮城、三重、山口、沖縄の各県下から総数274名(男子55名、女子219名)よりそれぞれ陰膳方式により24時間食事検体(朝・昼・夕の3食およびオヤツなど摂取したすべての飲食物を、かつ摂取した量だけ容器に取り置いて回収し検体とする)を得た。食事検体はその全量を磨砕したのち、その10gを礦酸の存在下に湿式灰化した。清澄となった灰化液を検体として無炎原子吸光法によってカドミウムおよび鉛の濃度を求め、食事の全量に換算して1日の摂取量を算出した。但し鉛の測定に際してはモディファイヤーとして礦酸アンモニウムを添加した。男子55名、女子219名のカドミウム1日摂取量〔幾何平均値μg/日(幾何標準偏差)〕はそれぞれ25.0(1.90)と17.5(1.93)で女子の方が有意(p<0.01)に低値であった。鉛の1日摂取量〔幾何平均値μg/日(幾何標準偏差)〕はそれぞれ12.1(1.93)と10.8(2.25)で女子が低値の傾向を示したが、その差は有意ではなかった(p>0.05)。被検者を調査地区別・性別にわけ、かつ1980年時点での対応する測定値の有無について検討したところ、宮城県下で男子2対・女子3対、山口県下で男子1対、沖縄県下で男子1対・女子2対の計9対(男子4対・女子5対)について1980年時点の測定値と今回の測定値を得ることが出来た。両年度間の推計学的な比較を行ったところカドミウムでは男子3対・女子2対の計5対、鉛では男子2対・女子3対の計5対において有意(p<0.05)な減少を認めた。逆に増加を示した対は全く見当らなかった。また対を形成した男子(1980年49名、1990年40名)女子(1980年62名、1990年78名)のそれぞれの幾何平均値は男女ともに1990年の値が1980年の値に比してカドミウムでは約60%、鉛では45%に低下し、食物を介しての負荷量は過去10年間に著明に低下したと推定された。分析用機器として必須である原子吸光分光光度計(自動サンプラ-付)および検体の灰化処理に必要な局所排気装置の設置を終え、習熟運転を開始した。また検体の採集については1980年代の調査地区である仙台市太白区秋保(旧秋保町地区)、新たな調査地区として三重県南勢町および岩手県大迫町内川目地区を調査地区として協力を得た。各地区ことに各家庭の基幹労働力となっている男女(調査への協力が得やすいことから、とりわけ家庭の主婦)最低20名より、特定の行事のない日の丸1日の食事(3食および間食その他すべての食物および飲み水やお茶を含むすべての飲物について、かつ摂取したと同じだけの量:いわゆる陰膳方式)の提供をうけた。

得られた検体は朝・昼・夕の3食および間食に大別したのち極力構成食品ごとに区分し、それぞれの食品の重量を測定・記録した。このデ-タは後日食品成分表(4訂版)に記されている分析値を利用して、各個人の1日当り栄養摂取量を算定するのに用いる。次いで全食品を再度一つの容器にまとめ、ホモゲナイザ-を用いて磨砕物を作成し、その重量を求めた。この磨砕物の一部を凍結保存し、後日湿式灰化ののち原子吸光法およびICP法によりカドミウムや鉛を含む各種汚染重金属を測定して、1日当りの摂取量を求める。またこれらの対象者から末梢血および1日尿(またはスポット尿)の提供を受けた。これらの検体は凍結保存して後日重金属の分析を行う。本年度中にはさらに仙台市泉区南光台(旧泉市南光台地区)においても調査を行うことを予定している。各地域ごとに被検者20名についてその静脈血検体および陰膳方式による24時間食事検体を収集し、それぞれを鉛・カドミウム分析用検体とした。検体収集は仙台市秋保地区・同南光台地区・岩手県大迫町地区・山口県徳地町地区・沖縄本島沖縄市美里地区・沖縄県宮古島地区・宮城県河南町地区・宮城県桃生町地区について完了し、前3地区については血中鉛およびカドミウム分析ならびに食物中カドミウム分析を終了した。秋保地区および南光台地区の血中鉛および血中カドミウム濃度について1980年と1991年の測定値の比較をしたところ、幾何平均値は血中鉛、血中カドミウムのいずれについても一般に1980年代に比して1991年の値は低値である傾向が明らかで、秋保地区の女子を例にとると血中鉛濃度は35.0μg/1から23.5μg/1に、血中カドミウム濃度は3.15μg/1から2.76μg/1に低下していた。但し例数が限られているため、推計学的には必ずしも有意の差ではない。食物からのカドミウム摂取量についても1980年代の調査結果があるのでこれと比較すると、秋保地区では男子は37.8μg/日から20.1μg/日、女子は27.4μg/日から15.3μg/日と摂取量が小さくなっている。また大迫町の場合も1976ー7年と1989年を比較すると、男子では28.2μg/日から21.6μg/日,女子が23.2μg/日から15.7μg/日といずれも同じ程度の減少を示した。但し、南光台地区は21.5μg/日と23.2μg/日と大差は示さない。現在までに終了した調査の規模はまだ全国的な変化を推定するには十分な大きさではないが(1)血液中の鉛、カドミウム濃度は1991年では1980年代に比較して低下している。(2)食物からのカドミウム摂取量も1980年代に比較して1991年では低下していることを示す成績を得た。その要因の一つとしては米飯からのカドミウム摂取量が低下していることで、米飯の摂取量そのものの減少と米飯中のカドミウム濃度の低下によるものと推測される。宮城県下において4箇所の調査を行い計64名(男子15名、女子49名)より、沖縄県下において2箇所の調査を行い計47名(男子14名、女子33名)より、さらに山口県下において1箇所の調査を行い計14名(男子11名、女子3名)を対象に、それぞれ陰膳方式による24時間食事検体(朝・昼・夕の3食およびオヤツなどを摂取したすべての飲食物を、かつ摂取した量だけ容器に取り置いて回収し検体とする)を得た。あわせて被検者の大部分から調査当日に静脈血約15ml、スポット尿2050mlおよび前日の24時間尿を採取した。宮城、沖縄、山口県下の男女別の食事検体中のカドミウム量〔幾何平均値μg/日(幾何標準偏差)〕はそれぞれ宮城では32(1.70)と21(1.71)、沖縄では20(1.74)と21(1.97)、また山口では32(1.70)と21(1.71)であった。同様に鉛の1日摂取量〔幾何平均値μg/日(幾何標準偏差)〕は宮城では13(1.73)と14(1.57)、沖縄では10(2.56)と8(2.63)、山口では16(1.59)と18(2.44)であって、一般にカドミウム摂取量の方が鉛摂取量よりも高値を示す傾向にあったが、逆に変動の幅(すなわち幾何標準偏差)は鉛の方が大きい傾向にあった。カドミウム摂取量の大小と鉛摂取量の大小との間には相関はない。カドミウムの最も大きい負荷源は米飯であり、一般に男子の方が女子よりも大きいと期待される。
心不全における心筋修復機構の解明;心筋オートファジーとミトコンドリア機能解析

我々は、心筋オートファジーの流れを検出する新しい評価方法を使い、心不全の進展における心筋修復機構の解明を行った。その結果、心不全の初期に心筋オートファジーが亢進し、心筋保護に働くことを突き止めた。また、虚血心筋や糖尿病、あるいは抗がん剤による障害心筋においてはこの心筋修復機構が障害され、p53-TIGARの経路がこれを制御していることを示した。本研究の目的は、心不全における心筋修復機構を、オートファジーとミトコンドリアエネルギー代謝の観点から明らかにし、心不全の新しい治療法開発につながる病態解明を目指すことにある。そこで平成21年度は、次の3点を行った。1.心筋オートファジーを評価できる実験系の準備。まず、オートファジーの過程でオートファゴソームの膜に結合するLC3を検出すべく、in vitroではGFP-LC3を強発現した培養心筋細胞を、in vivoではGFP-LC3 transgenic miceを用意した。さらに、申請者らが開発した心筋オートファジー評価方法(Autophagy. 2008 ; 4 (3) : 322-9.)を用いるべく、必要な試薬、機器等を準備した。2.心不全におけるオートファジーの役割解明。1で用意した実験系を用いて、まず心不全で惹起される交感神経系に注目し、交感神経刺激とオートファジーの関係を調べた。すると、交感神経α経路とβ経路はどちらも心筋オートファジーを惹起するのに、前者はアポトーシスを抑えることによって心筋保護に働き、後者は逆にアポトーシスを誘導して心筋障害に働くことがわかった(2009AHA.oral presentation)。また、心不全の過程においては、早期の拡張不全期にオートファジーが惹起され、収縮不全に陥ると逆に減弱することも明らかにした。現在この詳しいメカニズムを検討中である。3.心筋ミトコンドリア代謝とオートファジーに関わる研究。強力な腫瘍抑制因子であるp53は、心筋のミトコンドリア代謝に影響し、アポトーシスを誘導することが知られる。このp53によるアポトーシス誘導に、オートファジーの抑制が関与することがわかり、このモデルにおける心筋オートファジーの心筋保護効果を示した。現在詳しいミトコンドリア代謝機構を検討中である。心筋オートファジーの流れを検出する新しい方法(Autophagy.2008;4(3):322-9.)を使い、心筋オートファジーの普遍的な役割を調べた。その結果、心不全の初期に心筋オートファジーが亢進し、心筋保護に働く可能性を突き止めた(2010アメリカ心臓協会学術集会)。また、心筋オートファジーの調整には、がん抑制遺伝子の一つであるp53が関与することを発見した(2010アメリカ心臓協会学術集会)。また、糖尿病モデルマウスを用いて、心筋エネルギー代謝にp53-SCo2が関与することを発見した。以上の研究は、次の実験方法を用いた。(1)心筋オートファジーにおけるミトコンドリアエネルギー代謝の調節実験。;オートファジーにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を、酸素電極やミトコンドリアの融合と解離の評価、糖代謝もしくは脂肪酸代謝の検討、などを通して、心筋保護のために最も重要なエネルギー代謝調節経路を究明した。(2)心不全モデルへの介入治療研究。;心筋オートファジーを調節して心保護に働く方法を、ドキソルビシン心筋症モデル、カテコーラミン負荷による心不全モデル、心筋梗塞モデル、虚血-再灌流モデル、大動脈縮索モデル、等、様々な心筋障害動物実験モデルに導入し、効果を生存率、心エコー、心筋組織検査、ウェスタンブロッテイングなどで評価した。(3)心不全治療への臨床応用を見据えた研究の準備;臨床応用を見据え、対象疾患の選別、既知の治療法と組み合わせた解析を実施すべく、観察型疫学研究を準備した。心筋オートファジーの流れを検出する新しい評価方法(Autophagy.2008;4(3):322-9.)を使い、心筋オートファジーの普遍的な役割を調べた。その結果、心不全の初期に心筋オートファジーが亢進し、心筋保護に働く可能性を突き止めた。また、虚血心筋ではp53-TIGARの経路が、ミトコンドリアのオートファジー"ミトファジー"に関与することを発見した(J Mol Cell Cardiol. 52,175-184,2012)。さらに、脂質代謝異常や糖代謝異常において、心筋ミトコンドリアが重要な役割を果たし、p53が関与することを示した(Circ Heart Fail 2011 Epub)。以上の実験研究には、次の方法を用いた。(1)心筋オートファジーにおけるミトコンドリアエネルギー代謝の調節実験;オートファジーにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を、酸素電極やミトコンドリアの融合と解離の評価、糖もしくは脂肪酸代謝の検討、などを通して、エネルギー代謝調節経路を究明した。

;心筋オートファジーを調節して心保護に働く方法を、マウス心筋梗塞モデルとマウス糖尿病モデルに導入し、効果を生存率、心エコー、心筋組織検査、などで評価した。以上の知見をふまえ、現在、がん化学療法における心筋障害を抑制する方法を検討中である。動物実験系では、ドキソルビシン心筋症のモデルを用いて既存の薬剤によってオートファジーを調整できるかどうか、また心筋障害の進行を抑制できるかどうか、検討している。一方で、乳がん等がんの化学療法について後ろ向きコホート解析を行い、観察型疫学研究を実施すべく準備をしている。
代謝型グルタミン酸受容体を介したシュワン細胞の分化調節機構

グルタミン合成酵素(GS)の基質であるグルタミン酸はシュワン細胞の分化制御に関与しているが、その分子機序は明らかになっていなかった。本研究によって、シュワン細胞で代謝型グルタミン酸受容体2 (mGluR2)の発現が高いことが明らかとなった。また、mGluR2を介したシグナルを阻害することで末梢神経傷害時のシュワン細胞の脱ミエリン化が遅延し、再生時には再ミエリン化が促進することを明らかにした。このことから、mGluR2を介したグルタミン酸シグナルはシュワン細胞の分化制御において重要な役割を担っている可能性が示唆された。これまでに、神経傷害時にGlutamine synthetase(GS)がzinc finger/Ring finger 1(ZNRF1)によりユビキチン化されプロテアソーム系で分解されることを明らかにした。さらに、神経細胞とシュワン細胞の共培養系において、シュワン細胞にGSを過剰発現させることでミエリン形成を有意に亢進することからGSがシュワン細胞の分化制御に関与することを報告してきた。本研究では、GS発現変化からシュワン細胞の分化調節にいたる分子機序を明らかにすることを目的とした。前年度は、Glutamine synthetase (GS)の発現変化からシュワン細胞の分化調節にいたる分子機序について解析を行い、GSの基質であるグルタミン酸が代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)を介してシュワン細胞の増殖・分化の制御に関与することを明らかにした。これまでに、mGluRには8種類のサブタイプが存在することが報告されている。本年度は、シュワン細胞の分化に関与するmGluRのサブタイプの同定および細胞内シグナルの解析を行った。初代培養シュワン細胞に各mGluRに対する特異的阻害剤の添加、および、各mGluRのノックダウン実験を行い、mGluR2がシュワン細胞の増殖・分化の制御に関与することを明らかにした。さらに、mGluR2を介したシグナルが、細胞増殖や分化を制御することは報告されているErk経路を活性化することで、シュワン細胞の増殖・分化を制御することを明らかにした。これら結果を日本分子生物学会にて発表した。平成23年度は、GS発現変化からシュワン細胞の分化調節にいたる分子機序について解析を行った。はじめに、GSの基質であるグルタミン酸がシュワン細胞の増殖に与える影響を解析した。初代培養シュワン細胞及びマウス坐骨神経にグルタミン酸を投与した結果、細胞増殖が促進された。このグルタミン酸による細胞の増殖は代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)アンタゴニストにより抑制されたことから、グルタミン酸がmGluRを介しシュワン細胞の増殖を制御することが示唆された。次に、グルタミン酸がシュワン細胞の分化に与える影響を解析した。グルタミン酸を神経細胞とシュワン細胞の共培養系に添加した結果、神経突起のミエリン形成を抑制した。また、mGluRのアンタゴニストの添加により、神経突起のミエリン形成が亢進された。さらに、グルタミン酸シグナルがシュワン細胞の脱分化に与える影響をマウスの坐骨神経傷害後モデルを用いて解析した。坐骨神経切断時にmGluRのアンタゴニストを局所的に投与した結果、神経傷害後のシュワン細胞の脱分化が遅延した。これらのことから、mGluRを介したグルタミン酸シグナルがシュワン細胞の増殖、分化の制御に関与することが強く示唆された。本研究の目的は、ミエリン形成不全を起こすCharcot-Marie-Tooth病(CMT)のモデルマウスであるTremblar-JへのmGluRアンタゴニスト投与によるミエリン形成促進効果の検討および、その機構となる細胞内シグナルの解明である。平成23年度は、目的達成に向け、in vitoおよびin vivoにおいてグルタミン酸がシュワン細胞の分化・増殖に与える影響を解析すること、及びTremblar-JへのmGluR2アンタゴニストの坐骨神経投与よるミエリン形成不全への治療効果の解析の準備を進めることを計画していたが、研究実績の概要に記載したように当初の計画通り研究を進めることができ、mGluR2を介したグルタミン酸シグナルが、生体内においてもシュワン細胞の増殖に重要であり、このシグナルを制御することで、神経傷害時のシュワン細胞の脱分化も制御できる可能性を明らかにした。

また、mGluR2の活性化からシュワン細胞の脱分化・増殖に至る細胞内シグナルに関しても解析を行うことができた。申請時の研究計画に基づき、ミエリン形成不全を起こすCharcot-Marie-Tooth病(CMT)のモデルマウスであるTremblar-JへのmGluRアンタゴニスト投与によるミエリン形成促進効果(in vivo)の解析を行う。具体的には、アンタゴニストを投与したTremblar-Jマウスの坐骨神経をプラスチック包埋しsemi-thin sectionを作製しトルイジンブルー染色によりミエリン形成を評価する。必要に応じて電子顕微鏡を用いて観察する。また、運動神経障害の症状改善の検討を、回転する棒の上にマウスをのせマウスが落下するまでの時間を測定する(ロタロッドテスト)を用いて解析する。これらの結果と前年度の研究結果をまとめ、国内外の神経科学関連学会において発表し、更に論文として公表する。申請時の研究計画に基づき、研究の遂行に必要な各種薬剤、試薬、抗体、消耗品、実験用動物等の購入および、研究成果を発表するための出張費、論文別刷費用等に使用する予定である。
手術部位感染を引き起こす要因と看護ケアとの関係に関する研究

手術部位感染の発生は入院期間を延長させ患者のQOLを低下させるといわれているが、手術部位のスキンケアについては明確にされていない。今回、消化器外科手術を行う41症例に対して、2種類の創傷被覆材を用い創傷被覆材貼付部位における皮膚の生理機能と細菌発生の実態調査を行った。今回の調査では、SSI発生が少なく、差は確認できなかった。しかし、A群の創傷部位にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の発生を多く認めた。また、皮膚生理機能においては、角質水分量の1項目でA群はB群より有意に高い値を示した。以上の結果より、A群では血塊ができやすく、細菌発生の素地となっている可能性が示唆された。看護ケアの介入については、手術後創傷部位に対し、A群では皮膚の水分量を整え、かつ一過性の菌を排除するスキンケアの介入が、B群では緑膿菌などの一過性の菌を排除するスキンケアの介入が示唆された。当該年度の研究においては、まず、平成18年度に実施した研究結果の再検討を行い、この結果から、研究方法の妥当性についての検証を行った。その結果、使用した皮膚測定機器の一部か皮膚の角層機能の評価を行うのに信頼性が低いことが指摘された。これはは、対象者の年齢および、創傷被服材の基材が皮膚に及ぼす影響をデータとして捉えきれないことから、スキンケアの具体的予防対策に影郷を及ぼすものと考えた。よって、他機器についての信頼性、妥当性の検証を文献をもとにさらに深め、研究協力者とともに測定機器についての講習および演習の実施を行った。このことは、次年度調査の実施を行う際に、信頼性、妥当性の高いデータが得られることにもつながり、意義のあるものとなった。次に、健常者である研究代表者1名および協力者3名の計4名を対象とし、研究方法の検討および創傷被服材の貼付が健常皮膚に及ぼす影響を確認する目的でプレテストの実施を行った。その結果、A群ポリウレタンフィルム群(以下A群)、B群ハイドロコロイドドレッシング群(以下B郡)ともに、創傷被服材貼付部位の健常皮膚は、貼付外の健常皮膚と比較して、皮膚生理機能に高い値が示されていた。また、各創傷被服材貼付内においての比較では有意的な差は認められなかった。しかし、B群では創傷被服材がケル化し、皮膚から剥離されていることが認められた。このことから、対象者の活動性と創傷被服材の素材が関与していることを推測し、対象者の生活に合わせた創傷被服材の選択がSSSIの発生に影響を及ぼすことが推測された。今後、細菌調査を加え、さらに検証していくことが重要である。(675文字)平成20年度のおける研究の目的は新規調査施設の開拓を行い、プロスペクティブに調査の実施を行うこと、平成19年度に調査したデータを振り返りSSSIの発生要因と看護ケアとの関連性について分析することの二点であった。1つ目の目的である新規調査施設の開拓については、調査の承諾を得ることが可能となり、平成21年度からの調査開始が決定となった。調査開始期間の間、研究協力者へのオリエンテーションおよび、医療機器の取り扱い方についてのデモンストレーションを実施することで、研究内容を深めることが行えた。2つ目の目的であるSSSIの発生要因と看護ケアとの関連性については、10症例から得られたデータをもとにA群(ポリウレタンフィルムドレッシング群)とB群(ハイドロコロイドドレッシング群)に分類し、統計的手法および帰納的記述的手法をもちい、分析を行った。その結果、創傷被覆材間にSSSI発生の有意差は認められなかったが、SSSI発生の因子には、排液を吸収する能力が高く、静菌作用を有する創傷被覆材よりも、排液を吸収する能力はほとんどなく、静菌作用を有しない創傷被覆材のほうが、SSSIの発生数が多かったことから、創傷被覆材内における細菌数の増加ではなく、皮膚へ付着する排液の性状にあると推察された。さらに、消化器外科手術後の創傷に対する看護ケアについては、創傷被覆材貼付48時間後、A群では細菌を除去することを目的としたケアの実施を、B群では、湿潤環境を整えるスキンケアの実施が重要であることの示唆を得ることができた。平成21年度における研究の目的は、新規調査施設でのプロスペクティブな調査の実施および、まとめであった。平成21年5月に埼玉県立大学および、調査実施施設での倫理審査を終了し、4ヶ月間の調査を行った。

その結果、昨年度に引き続き、加えて31症例のデータから得られた内容より分析を深めることが可能となった。研究の目的および方法は昨年同様とし、統計的手法および、帰納的記述的手法をもちい分析を行った。今回、研究期間の限界より今回の調査ではハイドロコロイドドレッシングとポリウレタンフィルムではSSI発生が少なく、差は確認できなかった。しかし、ハイドロコロイドドレッシングでは血塊ができやすく、細菌発生の素地となっている可能性が示唆された。また、看護ケアとの関係については、手術後創傷部位に対し、A群:ハイドロコロイドドレッシングでは皮膚の水分量を整え、かつCNSなどの常在菌と緑膿菌などの一過性の菌を排除するスキンケアの介入が、B群:ポリウレタンフィルムドレッシングでは緑膿菌などの一過性の菌を排除するスキンケアの介入が重要であることの示唆を得ることができた。今回この研究を実施したことで、創傷被覆材貼付部位における皮膚生理機能の実態を明らかにし、手術部位における看護ケアの方向性を見出すことが可能となったことは、看護師本来のケアの在り方を見直すといった意味、さらには消化器外科手術の感染率を減少さるという効果において大変意義のあるものとなったと考える。
金属クラスターによる一酸化炭素のアセチレンへの触媒的変換反応の開発

Cp'_4Fe_4(CO)_4(Cp'=C_5H_4Me)とLiAlH_4との反応により生成するアセチレンクラスターCp'_4Fe_4(HCCH)_2(1)は、一酸化炭素と水素の混合ガスから炭化水素化合物を合成するFischer-Tropsch反応における中間体のモデル化合物と考えられ、その反応性特にアセチレンフラグメントの性質については興味が持たれる。本研究では、アセチレンフラグメントの化学修飾反応を指向した、1の反応性に関する研究を行ったので報告する。1とBrosted酸との反応を行ったところ、クラスターのプロトン化または分解による炭化水素化合物の放出は観測されず、1の一電子酸化体および二電子酸化体が、用いる酸の当量関係に応じて生成することがわかった。また、アセチレン水素の引き抜きを目的としたn-BuLiとの反応およびアセチレン配位子の置換反応を目的としたアセチレン類との反応を検討したが、いずれの場合においても、1がほぼ定量的に回収された。これらの実験結果は、1が強固なクラスター骨格を有することを示している。つぎに1に反応活性サイトを導入する試みとして、臭素化剤であるDBUと1との反応を検討した(DBU=N-ブロモスクシンイミド)。この反応はほぼ定量的に進行して、用いるDBUの当量に応じて、[Cp'_4Fe_4(HCCBr)(HCCH)]Br、[Cp'_4Fe_4(HCCBr)_2]Br、[Cp'_4Fe_4(BrCCBr)(HCCBr)]Br、[Cp'_4Fe_4(BrCCBr)_2]Brが得られた。原料1およびその一電子酸化体は空気中で安定であるのに対し、これらの臭素置換体は不安定であることから、反応性の向上が示唆された。今後、臭素置換体の反応性に関する研究を行っていく予定である。遷移金属を触媒として用いて、一酸化炭素などのC_1化合物をC_n化合物へと変換する反応は、有機合成化学あるいは化学工業において基本的かつ重要である。その代表的な触媒反応としては一酸化炭素と水素をアルカンあるいはアルコール等に誘導するFischer-Tropsch反応があげられる。この反応は不均一系で進行すると考えられ、同一分子内に複数の金属中心を有する遷移金属クラスターは、反応が進行する金属表面の良いモデルと見なすことができ、その機構的研究に適していると考えられる。我々は、一酸化炭素が金属表面に吸着したモデルとして四鉄カルボニルキュバン型クラスターCP_4Fe_4(CO)_4をとりあげ、LiAlH_4との反応を検討し、カルボニル配位子の還元的カップリングによりアセチレンクラスターCp_4Fe_4(HCCH)_2(1)が収率54%で得られることを明らかにした。クラスター1の結晶構造を単結晶X線構造解析により明らかにした。1の四鉄骨格はバタフライ構造を有し、二つのアセチレンが上下から架橋配位している。アセチレン部位の炭素-炭素結合距離およびラマンスペクトルにおける炭素-炭素伸縮振動の波数から、アセチレン配位子の炭素-炭素結合の結合次数はほぼ1であることがわかった。1のサイクリックボルタモグラムを測定したところ、1は電気化学的に0価から+2価までの可逆な2段階の1電子酸化還元を、+2から+3価までの準可逆な1段階の1電子酸化還元を受けることがわかった。以前、我々はカルボニルキュバン型四鉄クラスターCp'_4Fe_4(CO)_4(Cp'=Cp, MeC_5H_4)とLiAlH_4との反応により、アセチレンクラスターCp'_4Fe_4(HCCH)_2(1)が生成することを見出している。本研究では、クラスター1の性質について検討した。1.クラスター1と一酸化炭素との反応上記の反応を触媒サイクルへ応用する試みとして、1と一酸化炭素との反応を検討した。1をCO加圧下(3atom)80°Cで3日間反応させたところ、一分子のアセチレン配位子が2つのカルボニル配位子により置換されたクラスターCp'_4Fe_4(HCCH)(CO)_2(2)が得られた。この反応では、四鉄骨格はバタフライ型構造を保持していることがわかった。2.クラスター1とRu_3(CO)_<12>との反応アセチレンクラスター1に金属フラグメントを新たに導入することによる、より高次のクラスター合成を目的として、1とRu_3(CO)_<12>との反応をおこなった。1とRu_3(CO)_<12>のトルエン溶液を加熱還流させたところ予期に反して、ルテニウムフラグメントが還元された[1]_2[Ru_<10>C(CO)_<24>]^<2->が得られた。この反応は、1は酸化還元電位が非常に低く(E([1]/[1]^+)=-0.73V vs. Ag/Ag^+)、電子豊富なクラスターであることを示している。また1の強い還元能を利用することで、有機溶媒中でプロトンも還元できることを明らかにした。

Cp'_4Fe_4(CO)_4(Cp'=C_5H_4Me)とLiAlH_4との反応により生成するアセチレンクラスターCp'_4Fe_4(HCCH)_2(1)は、一酸化炭素と水素の混合ガスから炭化水素化合物を合成するFischer-Tropsch反応における中間体のモデル化合物と考えられ、その反応性特にアセチレンフラグメントの性質については興味が持たれる。本研究では、アセチレンフラグメントの化学修飾反応を指向した、1の反応性に関する研究を行ったので報告する。1とBrosted酸との反応を行ったところ、クラスターのプロトン化または分解による炭化水素化合物の放出は観測されず、1の一電子酸化体および二電子酸化体が、用いる酸の当量関係に応じて生成することがわかった。また、アセチレン水素の引き抜きを目的としたn-BuLiとの反応およびアセチレン配位子の置換反応を目的としたアセチレン類との反応を検討したが、いずれの場合においても、1がほぼ定量的に回収された。これらの実験結果は、1が強固なクラスター骨格を有することを示している。つぎに1に反応活性サイトを導入する試みとして、臭素化剤であるDBUと1との反応を検討した(DBU=N-ブロモスクシンイミド)。この反応はほぼ定量的に進行して、用いるDBUの当量に応じて、[Cp'_4Fe_4(HCCBr)(HCCH)]Br、[Cp'_4Fe_4(HCCBr)_2]Br、[Cp'_4Fe_4(BrCCBr)(HCCBr)]Br、[Cp'_4Fe_4(BrCCBr)_2]Brが得られた。原料1およびその一電子酸化体は空気中で安定であるのに対し、これらの臭素置換体は不安定であることから、反応性の向上が示唆された。今後、臭素置換体の反応性に関する研究を行っていく予定である。
中空粒子内微小空間の高次構造アクティブ制御による新機能の創出

微粒子を規則的に並べたコロイド結晶の作製においては、球形粒子だけでなく非球形粒子を規則配列させることも求められている。これに対して本研究では、球状の中空粒子の内部において非球形粒子を合成し、同球状粒子を規則的に配列させる新たな手法を提案した。本法により内包された非球形粒子は中空粒子内を自由に動くことができるという特徴も有するため、今後は中空部内における各非球形粒子の位置を外部場によって制御することも期待される。シリカシェルが形成する微小空間に、サブミクロンサイズのシリカコア粒子を埋め込んだ中空粒子を合成した。この中空粒子は、コア粒子/ポリマーシェル/シリカシェルからなる多層コアーシェル複合粒子のポリマーシェル部分を選択的に除去することによって得られる。コア粒子の可動性を確保するには、ポリマーシェル除去のための熱処理過程で生じるシリカコアーシリカシェル間の焼結を解消する必要がある。シリカコアをシリカシェル内壁から引き剥がすための処理として従来は、水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を使ってシリカ成分を化学的にエッチングしていた。しかしながら、エッチング溶液に含まれるアルカリ金属が残留しデバイス作製時に不純物となる可能性も考えられる。そこで、アルカリ金属に代わるエッチング溶液としてアンモニア水溶液によるエッチングを検討した。その結果、エッチング溶液のpHを10前後に調整することで、シリカコアーシリカシェル間の焼結を解消でき、可動性を確保できることを明らかにした。非晶質かつ低密度の酸化物粒子を球状コアとして使い、可動コア内包型の中空粒子を合成すると、内包した球状コアの一部がポリマーシェル除去のための熱処理過程で非球形化した。この結果はシリカシェルが形成する微小空間内で熱処理された球状粒子が、周囲のシリカシェルの影響を受けながら高密度化かつ変形することを示唆しており、非球形化の機構を明らかにすれば、新しい異型粒子合成の開発にもつながる可能性がある。最終年度の前年度は、コア粒子/ポリマーシェル/シリカシェルからなる多層コアーシェル粒子を熱処理する過程においてシェルポリマー熱分解とともに、球状のコア粒子が非球形化する現象を見出した。この結果を受け最終年度は、コア粒子の非球形化の要因を検討した。その結果、コア粒子合成過程の合成溶媒組成が、熱処理過程のコア粒子変形に強く影響を及ぼすことを明らかにし、球状シェル内に非球形コアを閉じ込めた粒子(非球形コア内包型Yolk/Shell粒子)の合成指針を示すことができた。多層コアーシェル粒子は、熱処理過程でもその単分散性、すなわち粒径均一性は維持されることから、粒子規則配列体(コロイド結晶)のビルディングブロックとしても利用できる。この単分散性を使い、非球形コア内包型Yolk/Shell粒子からなる2次元規則配列体を作製した。作製した粒子配列体には弱アルカリ処理を施し、内包された非球形コアが各中空部内で自由に動けるようにした。この可動性非球形コア内包型のコロイド結晶に交流電場を印加したところ、特定の印加周波数を使えばシェル空間でのコア粒子の運動を制御できることを光学顕微鏡による直接観察により明らかにした。非球形粒子を集積させてコロイド結晶を作製する場合は従来、液晶分子にように電場等の外場を作用させた状態で集積させることが行われていた。しかしながら、このような粒子集積プロセスでは、非球形粒子の相対的な位置が固定化されてしまうため、集積させた粒子の空間的な配置を後から動かすことはできない。これに対して本研究では、Yolk/Shell粒子を集積させた後でも内包された非球形コアはシェル内を自由に動けるため、粒子を集積させた後でも外部場によってその配置を制御できることができる。以上述べたように、本研究により外部場応答型コロイド結晶の新しい合成法を提案することができた。材料化学工学当初は異型酸化物粒子をコアとし、それを球形化できるポリマー被覆法を検討することで、異型コア内包型の中空粒子を合成することを狙っていた。しかしながら、研究実績の概要に記したようにポリマー除去過程で球状コアが非球形化する現象が観察されており、異型酸化物粒子をコア粒子に使わずとも、異型粒子を埋め込んだ中空シリカ粒子を合成できる可能性を示すことができたため。多層コアーシェル粒子の中間層となるポリマー相を選択的に除去する中空化プロセスを引き続き検討するとともに、中空粒子の集積化プロセスについても合わせて検討する。埋包した異型粒子の可動性が確認できた粒子配列体に関しては、透過スペクトル等の光学的評価を行う。このような透過率評価を、外場を印加した場合と印加しない場合の両者について行い、外場印加が内包粒子の配向状態に及ぼす影響を調べる。次年度使用額は、今年度の研究を効果的に推進したことに伴い発生した未使用額である。平成26年度請求額と合わせ、平成26年度の研究遂行に使用する予定である。
骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響について

骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響を検討するため,溝のない平滑な試料(溝なし試料)と表面に幅60μmの溝を付けた試料(溝付き試料)の上で骨芽細胞を最長21日間培養し,細胞密度の違いによるDNA量,アルカリフォスファターゼ(Alp)活性,コラーゲンの走向と石灰化物の重量を調べた.1.細胞密度溝付き試料の細胞密度は17±3個/60μmで,溝なし試料の8±2個/60μmより有意に大きかった.2.造骨活性1) DNA量DNA量は経時的に増加し.培養2日目,7日目には両試料で差がなかった.しかし14日目には,溝付き試料で1.39±0.09μgで,溝なし試料の1.20±0.09μgより有意に多かった.14日目以降は増加率が減少し,21日目には両試料で差がなかった.2) Alp活性AIp活性は,両試料とも培養7日目まで急増し,それ以降増加率が減少した.培養2日目,7日目,14日目には両試料で差がなかった.しかし21日目には,溝付き試料で85.7±8.6μmol/mg protein/20minで,溝なし試料の71.8±4.3μmol/mg protein/20minより有意に高かった.3)コラーゲンの走向コラーゲン線維は,培養7日目以降に観察された.培養14日目以降には.コラーゲン線維は溝付き試料では溝に沿って配列して方向性が見られたが,溝なし試料では不規則に配列していた.4)石灰化物の重量21日目の石灰化物重量は,溝付き試料では10.2±2.3mgで.溝なし試料の4.4±1.1mgより有意に大きかった.3.まとめ輻60μmの溝を付けた試料表面では骨芽細胞の密度が大きく,これが細胞の増殖を早め,細胞のAlp活性が高まって石灰化物形成が促進されると考えられた.また,石灰化物形成の促進にはコラーゲン線維の方向性も関与していることが示唆された.骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響を検討するため,溝のない平滑な試料(溝なし試料)と表面に幅60μmの溝を付けた試料(溝付き試料)の上で骨芽細胞を最長21日間培養し,細胞密度の違いによるDNA量,アルカリフォスファターゼ(Alp)活性,コラーゲンの走向と石灰化物の重量を調べた.1.細胞密度溝付き試料の細胞密度は17±3個/60μmで,溝なし試料の8±2個/60μmより有意に大きかった.2.造骨活性1) DNA量DNA量は経時的に増加し.培養2日目,7日目には両試料で差がなかった.しかし14日目には,溝付き試料で1.39±0.09μgで,溝なし試料の1.20±0.09μgより有意に多かった.14日目以降は増加率が減少し,21日目には両試料で差がなかった.2) Alp活性AIp活性は,両試料とも培養7日目まで急増し,それ以降増加率が減少した.培養2日目,7日目,14日目には両試料で差がなかった.しかし21日目には,溝付き試料で85.7±8.6μmol/mg protein/20minで,溝なし試料の71.8±4.3μmol/mg protein/20minより有意に高かった.3)コラーゲンの走向コラーゲン線維は,培養7日目以降に観察された.培養14日目以降には.コラーゲン線維は溝付き試料では溝に沿って配列して方向性が見られたが,溝なし試料では不規則に配列していた.4)石灰化物の重量21日目の石灰化物重量は,溝付き試料では10.2±2.3mgで.溝なし試料の4.4±1.1mgより有意に大きかった.3.まとめ輻60μmの溝を付けた試料表面では骨芽細胞の密度が大きく,これが細胞の増殖を早め,細胞のAlp活性が高まって石灰化物形成が促進されると考えられた.また,石灰化物形成の促進にはコラーゲン線維の方向性も関与していることが示唆された.溝のない平滑な試料と表面に幅60μmの溝を付けた試料の上で骨芽細胞を最長3週間培養し,骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響を調べた.1.細胞密度溝に直角な薄切切片上での60μm当たりの細胞密度は,溝のない平滑な試料(溝なし試料)では8±2個,表面に幅60μmの溝を付けた試料(60μm試料)では17±3個であった.2.アルカリフォスファターゼ(Alp)活性14日目のAlp活性は,60μm試料では60.3±6.7μmol/mg protein/20minで,溝なし試料の46.1±11.3μmol/mg protein/20minより5%未満の危険率で有意に大きかった.3.石灰化物の重量21日目の石灰化物重量は,60μm試料では10.2±2.3mg,溝なし試料の4.4±1.1mgより1%未満の危険率で有意に大きかった.4.DNA量21日目のDNA量は,60μm試料では5.2±0.8μg,溝なし試料では4.5±0.7μgで有意な差はなかった.5.コラーゲンの分布

21日目のコラーゲンの分布は,60μm試料では溝に沿って規則的に整列していたが,溝なし試料では規則性がなかった.6.まとめ60μm試料では骨芽細胞の密度が大きく,Alp活性が高く,石灰化物重量も大きかったことから,骨芽細胞の密度が大きいと細胞の造骨活性も高まると考えられた.さらに,骨芽細胞の密度だけでなく,コラーゲンが溝に沿って規則的に整列して細胞の相互作用が高まり,造骨活性が高まったと考えられた.15EA08:7.今後の計画I,III型コラーゲン及びオステオカルシンに対する免疫組織化学的観察を行う.骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響を検討するため,溝のない平滑な試料(溝なし試料)と表面に幅60μmの溝を付けた試料(溝付き試料)の上で骨芽細胞を最長3週間培養し,細胞密度の違いによるアルカリフォスファターゼ(Alp)活性,石灰化物の重量,DNA量とコラーゲンの分布の差を調べた.1.細胞密度細胞密度は溝なし試料では8±2個/60μm,溝付き試料では17±3個/60μmで,溝付き試料で有意に大きかった.2.造骨活性1)Alp活性Alp活性は,両試料とも培養7日目まで急増し,それ以降増加率が減少した.培養2日目,7日目,14日目には両試料で差がなかったが,21日目には溝付き試料で85.7±8.6μmol/mg protein/20minで,溝なし試料の71.8±4.3μmol/mg protein/20minより有意に高かった.2)石灰化物の重量21日目の石灰化物重量は,溝付き試料では10.2±2.3mgで,溝なし試料の4.4±1.1mgより1%未満の危険率で有意に大きかった.3)DNA量DNA量は両試料とも経時的に増加し,培養2日目,7日目には差がなかったが,14日目には溝付き試料で1.39±0.09μgで溝なし試料の1.20±0.09μgより有意に多かった.14日目以降は増加率が減少し,21日目には両試料で差がなかった.コラーゲンの分布コラーゲン線維は,培養2日目には観察されなかった.培養14日目以降には,コラーゲン線維は溝付き試料では溝に沿って配列して方向性が見られたが,溝なし試料では不規則に配列していた.3.まとめ骨芽細胞の密度が大きいと,細胞の増殖は早まり,コラーゲン線維は方向性をもつようになり,細胞のAlp活性が高まって石灰化物形成が促進されると考えられた.骨芽細胞の密度が細胞の造骨活性に及ぼす影響を検討するため,溝のない平滑な試料(溝なし試料)と表面に幅60μmの溝を付けた試料(溝付き試料)の上で骨芽細胞を最長3週間培養し,細胞密度の違いによるアルカリフォスファターゼ(Alp)活性,石灰化物の重量,DNA量とコラーゲンの分布の差を調べた.1.細胞密度細胞密度は溝なし試料では8±2個/60μm,溝付き試料では17±3個/60μmで,溝付き試料で有意に大きかった.2.造骨活性1) Alp活性Alp活性は,両試料とも培養7日目まで急増し,それ以降増加率が減少した.培養2日目,7日目,14日目には両試料で差がなかったが,21日目には溝付き試料で85.7±8.6μmol/mg protein/20minで,溝なし試料の71.8±4.3μmol/mg protein/20minより有意に高かった.2)石灰化物の重量21日目の石灰化物重量は,溝付き試料では10.2±2.3mgで,溝なし試料の4.4±l.lmgより1%未満の危険率で有意に大きかった.3) DNA量DNA量は両試料とも経時的に増加し,培養2日目,7日目には差がなかったが,14日目には溝付き試料で1.39±0.09μgで溝なし試料の1.20±0.09μgより有意に多かった.14日目以降は増加率が減少し,21日目には両試料で差がなかった.4)コラーゲンの分布コラーゲン線維は,培養2日目には観察されなかった.培養14日目以降には,コラーゲン線維は溝付き試料では溝に沿って配列して方向性が見られたが,溝なし試料では不規則に配列していた.3.まとめ骨芽細胞の密度が大きいと,細胞の増殖は早まり,コラーゲン線維は方向性をもつようになり,細胞のAlp活性が高まって石灰化物形成が促進されると考えられた.
オルガノイドで切り開く未来のポドサイト治療

イムノトキシンLMB2の静注によりポドサイト特異的傷害の誘発が可能なNEP25マウスの胎児腎臓を採取し、CDP法を行って、NPC細胞株を樹立した。このNPCを培養し、分化を誘導してオルガノイドを作成した。20 nMのLMB2を添加すると、ポドサイト特異的タンパク質であるpodocalyxinの発現の消失を確認し、オルガノイドにおいてもLMB2によるポドサイト特異的傷害誘導が可能である事が示された。ポドサイト特異的にHAタグ付加リボゾーム蛋白Rpl22を発現するRibotag/Nephin-Creマウスの胎児腎を採取し、CDP法を行って、NPC細胞株を樹立した。このオルガノイドにおいて、nephrinを発現するポドサイトに、HAが発現していた。オルガノイドのホモゲネートから、抗HA抗体による免疫沈降によりRNAを採取し、ポドサイト特異的mRNAが濃縮されている事を確認した。すなわち、腎オルガノイドからポドサイトRNAの単離方法が確立された。NPCの効率的遺伝子改変方法の確立をめざして、lipofection法を試みたが、NPCの細胞特性が変化してしまった。Electroporation法を試みたが、導入細胞の薬剤選択が有効になされなかった。CRISPR-Cas9系を用いた遺伝子改変法の開発を目的に、Cas9 knock-inマウスを導入した。NPCの培養、分化誘導、オルガノイドの形質解析を安定してできるようになり、またCDP法によりNEP25マウスのNPCと、Ribotag/Nephrin-CreマウスのNPCの樹立に成功した。さらに、LMB2によるポドサイト傷害の誘導が可能であり、またポドサイト特異的RNAの採取も可能である事を示せた。これらは、本計画の本幹技術で、様々な苦難はあったものの、まずは順調に達成された。簡便な遺伝子導入方法の開発は、試みたものの現在のところ成功していない。NEP25/Ribotagマウス由来腎オルガノイドにイムノトキシンLMB2を作用させて、ポドサイト傷害を誘発し、傷害前後のポドサイトRNAを採取する。in vivoのNEP25マウスのポドサイトで傷害後に変動を示した遺伝子に関して、オルガノイドポドサイトでも同様の変動が認められるか定量RT-PCR法で調べる。同様の実験をpuromycinで傷害する事により行い、変動するRNA変化が普遍的かどうか検証する。NEP25由来NPCとRibotag由来NPCを混合させて、キメラオルガノイドを作成する。これにLMB2を作用させて、NEP25 NPC由来ポドサイトを傷害する。HA抗体による免疫沈降により、Ribotag NPC由来ポドサイト(hCD25非発現)のRNAを採取する。in vivoでは、hCD25発現・非発現ポドサイトが混在するモザイクマウスでは、hCD25非発現ポドサイトも二次的傷害をうけたが、キメラオルガノイドで同様の現象が認められるかどうか検証する。tdTCas9 knock-inマウスをSix2-Creマウスと交配し、胎児腎からCDP法でCas9発現NPCを樹立する。このNPCは、gRNAのみの導入により、容易に遺伝子改変が可能であると期待される。このNPCを用いて、遺伝子改変オルガノイドを作成する事をめざす。

in vivoのNEP25マウスのポドサイトで傷害後に変動を示した遺伝子に関して、オルガノイドポドサイトでも同様の変動が認められるか定量RT-PCR法で調べる。同様の実験をpuromycinで傷害する事により行い、変動するRNA変化が普遍的かどうか検証する。NEP25由来NPCとRibotag由来NPCを混合させて、キメラオルガノイドを作成する。これにLMB2を作用させて、NEP25 NPC由来ポドサイトを傷害する。HA抗体による免疫沈降により、Ribotag NPC由来ポドサイト(hCD25非発現)のRNAを採取する。in vivoでは、hCD25発現・非発現ポドサイトが混在するモザイクマウスでは、hCD25非発現ポドサイトも二次的傷害をうけたが、キメラオルガノイドで同様の現象が認められるかどうか検証する。tdTCas9 knock-inマウスをSix2-Creマウスと交配し、胎児腎からCDP法でCas9発現NPCを樹立する。このNPCは、gRNAのみの導入により、容易に遺伝子改変が可能であると期待される。このNPCを用いて、遺伝子改変オルガノイドを作成する事をめざす。