hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫四次元空間におけるNotchリガンドの役割解明

Notchリガンドの構造機能解析については、我々の推定した新たなNotchとの結合様式の妥当性について、当該領域の変異体を速やかに作成し、機能解析を行うことにより、検証する。ILC2については、in vivoでの分化に必須のNotchリガンドを、KOマウスを用いた解析から、明確にする。パイエル板におけるDll4の役割については、Treg/Tfh分化転換との関連から、生理的意義を追求し、IgA産生における意義を調べる。また、同様のリンパ器官である虫垂についても、検証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
磁場勾配NMRおよびESRによる超分子中の物質の移動とその応用に関する研究

Iジェランガム/陽イオン/水系におけるコイル-ヘリックス並びにゾル-ゲル転移両転移過程に対する陽イオン依存性がNMR緩和時間およびCDにおけるモル楕円率により検討された。コイル-ヘリックス転移の転移温度と可逆性に対する陽イオン依存性が顕著になり、特にKとCaイオンはジェランと強い相互作用があることが見いだされた。ゾル-ゲル転移に対しては、2価陽イオンは2個のカルボキシル基間に架橋を形成することによりゲル化を促進するが、1価陽イオンはまず糖鎖の陰イオン性を遮蔽して高分子鎖を接近する役目を果たした後に、水素結合により形成されるゲル構造を補強する働きがある。ゲル化機構ならびにゲル構造が水素結合の観点から議論された。2価陽イオンとしてCuイオンを採用しESRスペクトル変化から架橋点における配位構造と配位の強さを見積った。Cuイオンは2個のカルボキシル基により配位された平面四辺形錯体として架橋を形成するが、その結合の強さはグルクロン酸による配位に比べて弱い事が解った。IIデキストラン/陽イオン/水系におけるゲル化機構Kイオンのみがゲル形成に寄与すること、これは糖鎖がイオノフォア的超空間を形成しその大きさがKイオンにフィットすることとKイオンの水和特性に起因することをK-NMRと水の拡散係数から明らかにした。また、Naイオンを共存すると、ゲル化を促進すると共にゲルの熱安定性を高める効果があることが確認され、AFMにより骨格構造に違いがあることを示した。IIIカードランのローセット及びハイセットゲルのケル化機構カードランはゲル化温度によって水素結合あるいは疎水性結合によりゲルを形成する。ゲル形成過程における構造変化は膨潤過程、溶解過程及びゲル形成過程の3段階に行われることがNMR緩和時間の解析から得られた。ゲル化はローセットゲルにおいては40°Cから、ハイセットゲルにおいては60°Cから始まっていることも明らかにされた。IVプルランの特異的水和構造デキストランとプルランは共に中性の多糖である。先に述べたように前者はKイオンによりゲル化するが、後者はどんな条件下でもゲル化しない。プルランにおいては水分子との相互作用が極めて強くまたバルク水との交換が遅いことが高分子鎖間での架橋形成を阻害していると結論された。Vカードラン及び澱粉ゲルの水和特性と凍結解凍過程カードランゲルの水構造変化をスピンプローブESRにより検討した。さらに凍結解凍過程におけるゲルの安定性、水分子の凍結挙動の違い、不凍水や過冷却水の回転運動の相関時間や存在量を推定した。1)ジェランガムゲルの陽イオンによるゲル化挙動1価及び2価の陽イオンによるゲル形成過程を1H-NMRと円偏光二色性(CD)により検討した。

金属イオン濃度が低い場合には、金属イオンを添加しない場合と同様に90°Cからの冷却によりランダムコイルからヘリックスへの転移が生じるが、再加熱により可逆的に元に戻るのに対して、金属イオン濃度が高い場合にはこの転移は非可逆的であった。この原因としてヘリックス間の会合ばかりでなく、コイル間の会合も関与していることが結論された。陽イオンの価数によるゲル化に要する最低濃度の違いおよびゲル化機構の違いが解明された。2)デキストランの特異的陽イオン取り込みとゲル構造、水和構造との関連デキストラン-Kイオン間の特異的な構造形成を39K-NMRで確認し、化学シフトと緩和速度の解析から化学反応論的考察を加えた。特異的な取り込みの原因はデキストランの共有電子対により形成されるポケットのサイズとカチオンサイズの適合性およびカチオンの水和特性によることを水分子の拡散係数から検証した。3)プルランの水和特異性プルランはどんな水分含量においてもゲル化しないことが知られている。その原因は水和特性にあるのではないかと考え、水プロトンの緩和過程を解析しグルコース1ユニット当たりの水和数とその運動性を明らかにした。高濃度になるにつれ水和水(プルランと強く相互作用しており、自由水との交換が遅い水分子)の運動性は減少する。グルコース1環当たりの水和数の数は温度、濃度によらず一定であった。プルランの水酸基と水分子間の水素結合はきわめて強いと推測される。4)ジェラン水溶液中のスピンプローブの回転拡散ジェランがランダクコイルからヘリックスに変わる過程はスピンプローブの回転拡散の相関時間に反映された。金属イオン共存下の系について実験を継続中である。1)陽イオンによるジェランガムゲルのゲル化における糖鎖の会合状態の解明ゲル形成過程においてダブルヘリックス間の会合が生じることは知られていたが、1価陽イオンを高濃度(80mM)に加えた場合にはランダムコイル間の会合も生じていることが明らかになった(第47回高分子学会年次大会及びISOPOW発表)。ゲル化機構ならびにゲル構造を水素結合の観点から論文にまとめた(論文2)。2)ジェランガムゲルのゲルにおける架橋構造のESRによる解明ゲル骨格構造は陽イオンの価数にはよらず同一であることが拡散計測の解析から示唆されたが、架橋点の微細構造に差があると予測される。2価陽イオンとしてCuイオンを採用しESRスペクトル変化から架橋点における配位構造と配位の強さを見積った。Cuイオンは2個のカルボキシル基により配位された平面四辺形錯体として架橋を形成するが、その結合の強さはグロクロン酸による配位に比べて弱い事が解った。3)ジェランガムのコイル-ヘリックス転移における糖鎖の動的挙動に対する陽イオンの影響ゲル化に先行してコイル-ヘリックス転移が起こるが、ヘリックス形成に対する1価陽イオンの種類と糖濃度の依存性をCD(円偏光二色性)計測により明らかとした(論文1)。転移温度はRb,Kにおいてより高温、Na,LiTMAにおいてより低温にシフトし、また高分子濃度の増加と共に高温側にシフトした。4)デキストラン及びプルランの特異的水和構造と物性との関連デキストランとプルランは共に中性の多糖である。前者はKイオンによりゲル化するが、後者はどんな条件下でもゲル化しない。
磁場の可視化に関する研究

この研究の目的は、磁場を測定してそのデータを基に、数値計算を用いて測定していない領域の磁場分布も求め、3次元的にグラフィックス装置に磁場分布を可視化表示することである。今年度は、磁場を広範囲に測定し可視化する可視化装置の試作及びそれを用いた応用について検討した。以下に研究の概要及び成果を示す。(1)可視化装置の試作:可視化装置は、測定用プローブ、磁束計測アンプ・コントローラ、パソコン、ディスプレイで構成される。磁束測定プローブは、ホール素子を32個づつ3次元方向に3列配置し、同時計測を可能にした。磁束計測アンプ・コントローラは、ホール素子の切り替え、信号増幅、さらにそれぞれの素子のオフセットを補償する働きをする。パソコンでは、増幅された磁場信号をA/D変換して入力し、可視化画像を計算する。画像はディスプレイ上に1670万のカラー色を用いて、連続色または段階色で2次元、3次元的に表示される。画面のピクセルの色は、有限要素法で用いる1次の内挿関数を用いて計算した。このシステムを用いて、永久磁石、電磁マグネット、及びそれと強磁性体を組み合わせた各種体系の測定を行い、可視化表示画像を得た。(2)強磁性体欠陥探傷への応用:磁場の可視化を強磁性体の欠陥探傷に応用した。電磁マグネットと欠陥のある強磁性体を組み合わせて、その表面を計測した。その結ぶ、長さ1mm深さ1mmの模擬割れ欠陥を、可視化画像上に鮮明に捕らえることができた。磁場を可視化表示することにより、従来行われているように数点の測定で磁場を評価することに比べ、より高度な情報が得られ、電磁機器の診断や非破壊検査などに役立つことが解った。今後は、測定と3次元磁場解析を組み合わせた3次元空間の磁場の可視化表示、非定常磁場の可視化に取り組む。
脳神経精神疾患患者脳脊髄液の分子レベル解析による疾患関連物質探索研究

「脳神経精神疾患患者CSFの分子レベル解析を最新質量分析法を用いて実施し疾患関連物質を見つける」ことを目的としCSF中のペプチド群の無作為的同定研究を実施した。脳内に測定できる一次構造の決定されたペプチド群について精神神経疾患との関連性を検討した(大阪大学医学部医学倫理委員会承認)。「疾患特異的に出現する物質」を発見することを主眼点とした。精神疾患患者CSFおよび健常者CSFについて、その中に含まれる微量ペプチドを数千種類同定した。そして、それらについて疾患に関連して大きな差異のあると考えられるものを抽出することを試みた。約1000種類のペプチド断片をについて統合失調症などの精神疾患との関連について検討したが、現時点では有意に疾患に関連すると考えられるペプチドは同定できなかった。質量分析法で測定できるペプチドや脂質代謝産物はまだまだよく調べられていない。我々は本資金終了期間までの期間には関連ペプチドが見つけられなかったが、今後も研究を継続していく予定である。本研究の目的は「脳神経精神疾患患者脳脊髄液中の分子レベル解析を最新質量分析法を用いて実施し、疾患関連物質を見つける」ことである。この研究により遺伝子の発現量のパターン解析のように「疾患特異的な様々な物質量のパターン」を示せる可能性を持つが、我々はむしろ「疾患特異的に出現したり、量が著しく増減する物質」を発見することを主眼点としている。このようにして最新の科学技術を用いて過去の精神疾患の生化学的解析の精度を遥かに越える、多種多様な低分子量物質を脳脊髄液中で同定・定量する。本年度はヒト脳脊髄液を質量分析器で解析するために、前処理法の検討を行った。限外ろ過法、有機溶媒を用いた沈殿法やアフィニティーカラムを用いた方法などで脳脊髄液を処理し、様々な低分子物質の性質に応じて最適な処理法を検討した。その結果、まずより多くの低分子物質を網羅的に解析するには脳脊髄液中に比較的大量に存在するアルブミンおよびグロブリンを除去したサンプルが適切なことを見出した。このサンプルをABI社製Q-TRAP3200型LC/MS/MSシステムを用いて繰り返し解析を行った。そして各測定で同定されたペプチドの重複の程度から推測したところ、約500種類のペプチド断片を恒常的に同定することに成功した。「脳神経精神疾患患者CSFの分子レベル解析を最新質量分析法を用いて実施し疾患関連物質を見つける」ことを目的としCSF中のペプチド群の無作為的同定研究を実施する。少量のヒトCSF中の高分子量物質を取り除いた後、LC/MS/MSシステムで処理することで過去の精神疾患の生化学的解析の精度とは比較にならない、多種多様の低分子量物質をヒト脳内に簡単に同定・定量できると考えられる。この戦略で脳内に測定できる一次構造の決定されたペプチド群について精神神経疾患との関連性を検討する。この研究は遺伝子の発現量のパターン解析のように「疾患特異的な様々な物質量のパターン」を明らかにする可能性を持つが、むしろ「疾患特異的に出現する物質」や「疾患になるとその量が数十倍以上あるいは数十倍以下の著しい変化を示す物質」を発見することを主眼点としている。精神疾患患者CSFおよび健常者CSFについて、その中に含まれる微量ペプチドを数千穏類同定する。そして、それらについて疾患に関連して大きな差異のあると考えられるものを抽出する。もし該当する物質が見つかれば、その物質の増減が疾患にどれほど関連するか多数例の疾患患者CSFを用いて検討する。まず23年度はヒトCSF中からアルブミンおよびグロブリンを除去したサンプルをABI社製Q-TRAP3200型LC/MS/MSで解析した。この方法で10回の解析によりいくつのペプチドが同定され、その測定間の同定ペプチドの重複の程度から全体の同定可能ペプチド数を推測した。この様な方法で、分離測定可能な約100種類のペプチド断片を同定した。少量のヒトCSF中の高分子量物質を取り除いた後、LC/MS/MSシステムで処理することで過去の精神疾患の生化学的解析の精度とは比較にならない、多種多様の低分子量物質をヒト脳内に簡単に同定・定量できる。この戦略で脳内に測定できる一次構造の決定されたペプチド群について精神神経疾患との関連性を検討した。

本研究では遺伝子の発現量のパターン解析のように「疾患特異的な様々な物質量のパターン」を明らかにする可能性を持つが、むしろ「疾患特異的に出現する物質」や「疾患になるとその量が数十倍以上あるいは数十倍以下の著しい変化を示す物質」を発見することを主眼点とした。精神疾患患者CSFおよび健常者CSFについて、その中に含まれる微量ペプチドを数千種類同定した。そして、それらについて疾患に関連して大きな差異のあると考えられるものを抽出することを試みた。ヒトCSF中からアルブミンおよびグロブリンを除去したサンプルをABI社製Q-TRAP3200型LC/MS/MSで解析した。この方法でまず10回の解析によりペプチド群を同定し、その測定間の同定ペプチドの重複の程度から全体の同定可能ペプチド約1000種類のペプチド断片をについて十数例の統合失調症などの精神疾患との関連について検討したが、現時点では有意に疾患に関連すると考えられるペプチドは同定できなかった。質量分析法で測定できるペプチドや脂質代謝産物はまだまだよく調べられていない。我々は本資金終了期間までの期間には関連ペプチドが見つけられなかったが、今後も研究を継続していく予定である。質量分析解析により精神神経疾患患者CSF中に多くのペプチド断片が同定されている。これらの中で疾患に関連する物質を探索する方法を確立する必要がある.24年度が最終年度であるため、記入しない。これらの中で疾患に関連する物質を探索する方法を確立する必要がある。しかし、まずは一つ一つの新規ペプチドについて疾患群と非疾患群の間で目視により比較していく必要がある。これを今後地道に行っていく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
教職志望学生が採用直前期に抱える課題に基づいた教員養成プログラムの開発

子どもの生きる力や確かな学力を育成する上で,教育活動を直接担う教員の養成が重要な課題となっている。このような課題に対し,教員養成と現職教育のそれぞれのカリキュラムを考察するとともに,その接点をいかに連続するかが重要といえる。このような状況に応えるべく,インターンシップ等のような取り組みが見られるが,これは単に実践経験の場を提供するのみで,文部科学省(2001)や日本教育大学協会(2004)が提案した実践経験と理論的考察の往還関係が十分に機能しているとは言えない。そのため,教員養成から現職教育へのスムーズな移行に向けた,接続時期の教員養成プログラム構築が求められている。本研究では,教員採用試験から教職に就くまでの期間を利用し,理論と実践の往還運動を取り入れた,教員養成と現職教育を接続する教員養成プログラムを開発することを目的としている。そこで17年度は,教職志望学生に対して採用直前期にアンケート調査を行い,同時期に学生が抱える課題や,そこで求める支援について探索した。平成18年度は,このアンケ-ト調査をもとに採用前研修プログラムを開発し,平成18年2月3月に試行した。同プログラムを受講した学生を対象として,事前と事後にアンケート調査を行い,プログラムを再構築した。このような実績を踏まえて本年度は,1年間にわたるプログラムを開発・施行した。その結果,昨年度の短期集中型と比較して,プログラム間に時間的余裕があるため課題を遂行しやすいという利点がある-方で,プログラムの間に教員採用試験や副免教育実習が入るため,間延びしてしまうといった課題が生じた。また,採用が決定した後(2月3月)に行う方が,受講者の意欲が高いこともあり,学生同士の一体感が生まれることがわかった。平成21年度から,大学4年次を対象とした必修科目「教職実践演習(仮)」を設けることが検討されている。教員養成大学では,その具体的なカリキュラム開発に取り組み始めているが,本研究で得られた知見は,こういった教職実践演習にも適応可能であり,さらなるプログラムの充実と課題への対応に取り組みたい。本研究は、教員採用試験から教職に就くまでの期間を利用し、理論と実践の往還運動を取り入れた、教員養成と現職教育を接続する教員養成プログラムを開発することを目的としている。この目的に向けて、本年度は次年度以降に採用直前期の支援プログラムを開発する基礎的研究として・教職志望学生へのインタビュー調査から採用直前期の課題意識に関する質問項目の作成・質問紙調査を実施し、教職志望学生が採用直前期に抱く課題と支援内容の解明・既存のカリキュラムや支援体制の改訂とその効果の分析を実施した。具体的には、平成17年8月から10月にかけて教職志望の4年次学生にインタビュー調査を行い、従来の教員養成カリキュラムで補いきれていない、かつ教職志望学生が求める支援内容について、多様な意見を抽出した。とりわけ、教育実習では経験することが少ない学級経営や校務分掌などに焦点をあて、教職志望学生の課題意識を解明した。以上のインタビュー調査をもとに質問項目を作成し、平成18年度から教育現場に赴任する学生を対象として、平成18年2月に質問紙調査を実施した。100名超の学生による回答結果を今後分析し、次年度以降のカリキュラム開発に生かす予定である。また、教職課程において採用前に実施している情報教育科目や学校ボランティア活動のカリキュラムおよび支援体制を開発・試行し、その効果を検証した。本年度の研究により、教職への熱意はあるが、具体的な準備ができていない教職志望学生が採用直前期に抱える課題を把握でき、次年度以降にその課題解決に向けた教員養成プログラムを提案する基礎資料を収集することができた。昨年度は,教職志望学生に対して採用直前期にアンケート調査を行い,同時期に学生が抱える課題や,そこで求める支援について探索した。本年度は,このアンケート調査をもとに,採用前研修プログラムを開発し,試行した。開発したプログラムは6日間にわたり,平成19年2月末から3月上旬にかけて行った。受講者は平成19年4月から教職に就く6名である。プログラムの各テーマは,(1)これからの教職生活+4月の授業って何だろう,(2)小学校6年間の学習ってどうなってるの?,(3)教室環境について考えよう,(4)教師の仕事は授業だけではない,(5)学校ってどんな仕事があるの?,(6)先生に聞いてみようであった。同プログラムを受講した学生を対象として,事前と事後にアンケート調査を行っており,今後詳しく分析するとともに,来年度以降のプログラムの再構築に生かしていく予定である。現在,平成20年度から大学4年次を対象として,必修科目「教職実践演習(仮)」を設けることが検討されている。その一方で教員養成大学では,その具体的なカリキュラム開発に取り組み始めている。

本研究で得られた知見は,こういった教職実践演習にも適応可能であり,さらなるプログラムの充実に取り組みたい。子どもの生きる力や確かな学力を育成する上で,教育活動を直接担う教員の養成が重要な課題となっている。このような課題に対し,教員養成と現職教育のそれぞれのカリキュラムを考察するとともに,その接点をいかに連続するかが重要といえる。このような状況に応えるべく,インターンシップ等のような取り組みが見られるが,これは単に実践経験の場を提供するのみで,文部科学省(2001)や日本教育大学協会(2004)が提案した実践経験と理論的考察の往還関係が十分に機能しているとは言えない。そのため,教員養成から現職教育へのスムーズな移行に向けた,接続時期の教員養成プログラム構築が求められている。本研究では,教員採用試験から教職に就くまでの期間を利用し,理論と実践の往還運動を取り入れた,教員養成と現職教育を接続する教員養成プログラムを開発することを目的としている。そこで17年度は,教職志望学生に対して採用直前期にアンケート調査を行い,同時期に学生が抱える課題や,そこで求める支援について探索した。平成18年度は,このアンケ-ト調査をもとに採用前研修プログラムを開発し,平成18年2月3月に試行した。同プログラムを受講した学生を対象として,事前と事後にアンケート調査を行い,プログラムを再構築した。このような実績を踏まえて本年度は,1年間にわたるプログラムを開発・施行した。その結果,昨年度の短期集中型と比較して,プログラム間に時間的余裕があるため課題を遂行しやすいという利点がある-方で,プログラムの間に教員採用試験や副免教育実習が入るため,間延びしてしまうといった課題が生じた。また,採用が決定した後(2月3月)に行う方が,受講者の意欲が高いこともあり,学生同士の一体感が生まれることがわかった。平成21年度から,大学4年次を対象とした必修科目「教職実践演習(仮)」を設けることが検討されている。教員養成大学では,その具体的なカリキュラム開発に取り組み始めているが,本研究で得られた知見は,こういった教職実践演習にも適応可能であり,さらなるプログラムの充実と課題への対応に取り組みたい。
高齢者のスポーツ活動に関する研究

これまでの高齢者スポーツの調査・研究が、スポーツ参与とそれまでのスポーツ経験やいくつかの社会的属性との関係であり、地域社会からスポーツ活動を切りとった研究がほとんどであったとの反省に立ち、「地域の高齢者スポーツ活動の現状把握」と「参与と生活構造との連関」を視点として、地域社会との関係のなかで高齢者スポーツを考えるのがこの研究の目的であった。調査対象地を茨城県牛久市奥野(農村地:以下O),牛久(旧商業地:以下U)緑野(新興住宅地:以下M)とし、アンケート調査.インタビュー調査を実施した。結論としては、牛久市の高齢者のスポーツ活動はより活発化・多様化している。特に年々.後期高齢者の参加率が上昇している.又、多様化に関しては.クロッケ-やゲートボールだけでなく.多くの種目が行なわれるようになっている。そしてこの傾向は.O<U<Mの順で強くあらわれている。O地区は.老人会にほぼ全員が加入し、老人会組織が生活拡充・余暇拡充集団としての機能をもっており.他組織の存在・加入を不必要としている。M地区は.新開発地区であることから.多くの余暇拡充・生活拡充集団が形成されており.老人会への加入率が悪い反面、上記の集団への加入率が良い。高齢者のスポーツの多様化の地区的差は.地区の生活構造をそのまま反映したものとなっている.又、個人の役割からしても..O地区の高齢者の多くは.まだ農業に従事しており、あと継ぎ不在のなかで.農村の多くの地域社会役割や重要な家庭内役割をもっており.老人会加入だけで十分との認識が多い。その点.M地区では.ほとんどが.退職者で.役割縮少過程にあり,それをうめるために.多くの集団へ加入しようとする傾向にあり、この点においても.地域というものが.スポーツ活動の傾向に強く影響していることが理解される.この他.地域の生活構造の視点から.独居高齢者のスポーツ活動についても検討を行った。また.当初.調査地として選択した米沢市は.現在.調査進行中であり、終了しだい牛久との比較を行う予定である.これまでの高齢者スポーツの調査・研究が、スポーツ参与とそれまでのスポーツ経験やいくつかの社会的属性との関係であり、地域社会からスポーツ活動を切りとった研究がほとんどであったとの反省に立ち、「地域の高齢者スポーツ活動の現状把握」と「参与と生活構造との連関」を視点として、地域社会との関係のなかで高齢者スポーツを考えるのがこの研究の目的であった。また.当初.調査地として選択した米沢市は.現在.調査進行中であり、終了しだい牛久との比較を行う予定である.
コミュニケーション脳の発達過程：機能的結合の解明

本研究は発達初期の脳活動、脳機能結合と、後のコミュニケーション能力の発達との関係を明らかにすることを目的としている。このために、定型発達児、早期産児、自閉症リスク児を対象とした縦断的な脳機能実験、行動実験を0ー3歳で定期的に行った。この結果、音韻対立に対する脳の敏感性が後の言語獲得に影響を与えることが示唆された。音韻対立に対する脳の反応性が典型的で強い程、後の音声発話の発達が良好であった。更に新生児時期の母親声に対する脳機能結合が正期産児でのみ強まり、言語野や社会性関連部位が活性化されることが明らかになった。本研究は発達初期の言語、社会認知機能を支える脳機能・脳部位結合の発達過程とその障害例を明らかにすることを目的とした乳幼児縦断研究である。本研究では30週齢から12ヶ月齢までの(新生児期、3,6,12ヶ月時点)正期産児、早産児、発達障害リスク児を含む乳児の安静時および言語、社会刺激処理における脳活動、脳部位間の機能的結合性、その発達変化をNIRS(近赤外分光法)計測にて明らかにする。それら脳活動パターン、脳部位結合パターンとその後(1-2歳)の乳児の言語獲得・社会的行動発達との関係を検討することによって脳機能回路発達の定型、社会性障害などの非定型例を類型しコミュニケーション脳の発達を解明する。平成24年度は、慶應義塾大学で生まれた約40名の新生児(正期産児、早産児を含む)について、1.大脳半球の機能的側性化を検討する合成音声による聴覚刺激、2.乳児の母親声・非母親声による乳児向け音声刺激、3.音声の系列学習刺激に対する脳反応をNIRS計測した。計測した乳児に対してはほぼ全員に40週齢、44週齢時に同様の実験を行った。その後の3,6,12ヶ月、1歳半時点のフォローアップ研究への参加を募り、希望者が慶應義塾大学三田キャンパスでの脳機能実験、行動実験に参加した。今年度は初年度であるが、新生児グループについては発達初期の機能的側性化および音声刺激に対する側頭部の血行動態反応を評価するグループ解析を行うことができた。早産児は酸素化ヘモグロビンが下降するという非典型的な反応から修正月齢とともに典型的な血行動態反応を示すことが明らかになった一方で、正期産児のように抑揚音声に右半球優位反応が出始めるのは修正月齢39週であることが示された。それら脳活動パターン、脳部位結合パターンとその後(1ー2歳)の乳児の言語獲得・社会的行動発達との関係を検討することによって脳機能回路発達の定型、社会性障害などの非定型例を類型しコミュニケーション脳の発達を解明する。2年目である今年度は、慶應義塾大学病院で生まれた約35名の新生児(正期産児、早産児を含む)について、1、大脳半球の機能的側性化を検討する合成音声による聴覚刺激、2、乳児の母親声・非母親声による乳児向け音声刺激、3、音声の系列学習刺激に対する脳反応をNIRS計測した。その後の3,6,12ヶ月,1歳半時点のフォローアップ研究への参加希望者のみが脳機能実験、行動実験に参加した。今年度はフォローアップ希望者が少なかったが、本実験開始以前より収集していた縦断データを併せ暫定的な解析を行うことができた。その結果、新生児時期の音韻対立に対する(上記1刺激)脳反応が、9ヶ月、12ヶ月の言語発達指標と正の相関を示すことが明らかになった。このことは音韻に対する新生児期の脳の感受性が、後々の言語発達を予期することを示唆するものである。社会性やコミュニケーション能力に困難がある自閉症スペクトラム障がいは、脳機能の問題によって生じる障害である。その中でも脳部位結合の問題であることが、これまでのfMRI(機能的磁気共鳴画像法)実験や神経線維イメージング実験で示唆されている。この脳部位結合の違いは発達初期から発現していることが考えられるにも関わらず、これまでに0歳代の言語や社会機能の脳機能結合は定型、非定型を含めほとんど報告されていない。本研究は定型発達児と早産児を含める小規模コホートの縦断的な脳機能測定、行動実験によりヒトのコミュニケーション能力を支える脳内基盤の発達を明らかにしようとするものである。

本研究は、まず30週齢から12ヶ月齢までの正期産児、早産児を含む乳児の安静時および言語、社会刺激処理における脳活動、脳部位間の機能的結合性、その発達変化をNIRS(近赤外分光法)計測にて明らかにする。それら脳活動パタン、脳部位結合パタンとその後(1ー2歳)の乳児の言語獲得・社会的行動発達との関係を検討することによって脳機能回路発達の定型、社会性障害などの非定型例を類型しコミュニケーション脳の発達を解明する。以上の目的のために約50名の乳児を対象とした3年間の縦断研究を行ってきた。新生児期から1歳まで3ヶ月おきにNIRS実験、行動実験、発達検査を並行して行った。1歳以降は1歳半、2歳時で行動実験、発達検査を行った。脳機能実験は大きくわけて音声言語、社会認知に関係し、行動実験はアイカメラ検査と観察実験を行った。1歳以前の音声処理や社会的刺激における脳機能活動、脳機能結合と1歳以降の言語や社会認知能力を含めるコミュニケーション能力との相関性を検討し、コミュニケーション発達を予期する脳機能特徴を明らかにすることを目指した。26年度が最終年度であるため、記入しない。発達認知神経科学26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度より縦断研究を進めていたこともあり、0-2歳児のデータは着実に収集されている。特に今年は実験参加者である新生児のリクルート状況が良好であったため、多くの早産児データを取得し、結果をまとめることができた。今年度の縦断フォローアップ参加者は少なかったが一昨年度より縦断研究を進めていたこともあり、0ー2歳児のデータは着実に収集されている。縦断データも行動データ、脳機能データと大量であるが、各々データ入力とデータ整理はされており、今年度いつでも多変量解析による検討が行える状況である。24年度はリスク児のリクルートが比較的困難な状況にあったため、25年度はリクルート方法、対象を検討し、より多くのリスク児を縦断研究に含める予定である。また、縦断研究のドロップアウトをできるだけ減らすと共にドロップアウトした参加者についても1歳半や2歳時点での質問紙調査は行えるようにし、万が一当初の目的とする縦断研究が成立しなかった事態に備える。最終年度にあたる今年度は縦断データを着実に取得するとともに、大規模データを総合的に解析し、結果をまとめていく予定である。脳機能データについては脳活動の強さ、コネクティビティを解析するが、種々の新しい解析法があるため先行研究を吟味し、最適な手法をとりいれていく。縦断フォローアップ研究参加者を増やすために、リクルート方法を工夫する。縦断研究のドロップアウトをできるだけ減らすと共にドロップアウトした参加者についても1歳半や2歳時点での質問紙調査は行えるようにし、万が一当初の目的とする縦断研究が成立しなかった事態に備える。次年度は更に縦断研究の参加者数が増加するため、人件費を次年度にまわすこととした。さらに縦断データの解析も次年度から試みるため、解析補助の人権費としても考慮した。最終年度時のデータ解析に当初の予想以上に時間がかかることが見込まれてきたため、人件費として計上する部分を繰り越した。また、縦断実験の参加者が少なかった分、来年多くの縦断研究参加者を追加する必要ができたため。縦断研究の参加者数を追加するため、一部の人件費を今年度の参加者謝金として使用する。
北米に侵入したデング熱媒介蚊であるヒトスジシマカの日本由来説の集団遺伝学的検証

デング熱などを媒介するヒトスジシマカは元来アジアに生息していたが,1980年代以降北米など世界各地にその分布を広げている.中古タイヤについた卵により侵入したと考えられている北米のヒトスジシマカは生理的な違いや中古タイヤの輸入量などから日本由来と考えられている.しかし,その遺伝的裏付けは今のところはっきりしていない.ヒトスジシマカの世界的分布を遺伝的に調べるため,前年度はその手がかりとして日本国内集団での違いをミトコンドリア遺伝子配列によって調べた.その結果,それまではヒトスジシマカは近年世界的に広がったため種内変異が少ないと考えられていたが,日本国内にもある程度変異が存在することがわかった.今年度はさらにタイ・インドネシアの集団のミトコンドリア遺伝子配列を調べた.タイ・インドネシアのヒトスジシマカは日本の沖縄や西南日本に分布するタイプであり,主に日本に分布するタイプとは異なっていた.さらにアメリカの個体も調べた結果,アメリカの個体はインドネシア・タイに分布しない主に日本に分布するタイプであった.日本以外の集団については集団数・個体数が十分ではないものの,この結果は北米のヒトスジシマカが日本由来説を肯定するものであった.今後は東南アジアや近年分布を広げている南半球やヨーロッパなどの地域の集団を調べ,北米の日本由来説を遺伝的に確かめ,他の地域についてもどの程度が日本由来なのかを検討する必要がある.また,国内のヒトスジシマカの分布についても沖縄や西南日本に分布するタイプが東南アジアと共通なことから,それらのタイプが日本に入った後現在主に広がっているタイプに変異したと思われる.今後は国内の集団の遺伝的違いと寒耐性や休眠などの生理的違いの関係を検討すべきである.デング熱などを媒介するヒトスジシマカは元来アジアに生息していたが,1980年代以降北米など世界各地にその分布を広げている.中古タイヤについた卵により侵入したと考えられている北米のヒトスジシマカは生理的な違いや中古タイヤの輸入量などから日本由来と考えられている.しかしその遺伝的裏付けは今のところはっきりしていない.ヒトスジシマカの世界的分布を遺伝的に調べるため,今年度は日本国内の集団のミトコンドリアDNAでの遺伝的分布を調べた.国内の12の地域(水戸・東京・横浜・金沢・静岡・名古屋・鳥取・高松・福岡・大分・延岡・那覇)で採集し,ミトコンドリアDNAのCO1(cytochorome c oxydase subunit 1)の一部421bpとND5(NADH dehydrogenase subunit 5)の一部406bpをPCRで増幅し,配列を決定した.CO1では7のサイトで,ND5では10のサイトで変異が見つかった.これら17の変異によって22のハプロタイプに分類され,これらハプロタイプの分布をみると地域間で違いがみられた.これらハプロタイプの地域間の違いはヒトスジシマカの国内地域間での移動が限定的あることを示している.これまではヒトスジシマカのミトコンドリアの塩基配列では変異が少ないとされていたが,日本の集団内でもある程度の変異を保有していた.多くの変異はその頻度が0.03以下と低かったが,CO1領域において0.29,0.28,0.20と頻度の高い変異がみられた.これらの頻度の高い変異を手がかりとし,今後海外のヒトスジシマカの集団との比較を行っていく.デング熱などを媒介するヒトスジシマカは元来アジアに生息していたが,1980年代以降北米など世界各地にその分布を広げている.中古タイヤについた卵により侵入したと考えられている北米のヒトスジシマカは生理的な違いや中古タイヤの輸入量などから日本由来と考えられている.しかし,その遺伝的裏付けは今のところはっきりしていない.ヒトスジシマカの世界的分布を遺伝的に調べるため,前年度はその手がかりとして日本国内集団での違いをミトコンドリア遺伝子配列によって調べた.その結果,それまではヒトスジシマカは近年世界的に広がったため種内変異が少ないと考えられていたが,日本国内にもある程度変異が存在することがわかった.今年度はさらにタイ・インドネシアの集団のミトコンドリア遺伝子配列を調べた.タイ・インドネシアのヒトスジシマカは日本の沖縄や西南日本に分布するタイプであり,主に日本に分布するタイプとは異なっていた.さらにアメリカの個体も調べた結果,アメリカの個体はインドネシア・タイに分布しない主に日本に分布するタイプであった.日本以外の集団については集団数・個体数が十分ではないものの,この結果は北米のヒトスジシマカが日本由来説を肯定するものであった.今後は東南アジアや近年分布を広げている南半球やヨーロッパなどの地域の集団を調べ,北米の日本由来説を遺伝的に確かめ,他の地域についてもどの程度が日本由来なのかを検討する必要がある.また,国内のヒトスジシマカの分布についても沖縄や西南日本に分布するタイプが東南アジアと共通なことから,それらのタイプが日本に入った後現在主に広がっているタイプに変異したと思われる.今後は国内の集団の遺伝的違いと寒耐性や休眠などの生理的違いの関係を検討すべきである.
DNA複合体微粒子内包アパタイトによる持続型遺伝子治療製剤の創製

DNA複合体微粒子を内包したアパタイトセメントおよびアパタイトナノカプセルは、破骨細胞によって継続的に分解され、DNA複合体をほぼ一定の速度で放出した。これらを皮下腫瘍モデルマウスの腫瘍近傍に投与したところ完治を含め非常に高い治療効果を示した。これらは、注射可能な長期発現型核酸徐放製剤としての応用が期待される。非ウィルス型の遺伝子治療において、一般に外来遺伝子の発現は極めて短期間で自然消滅してしまうため、有効な治療に結びつきにくい。そのため効果が持続する叙放タイプの遺伝子導入製剤が強く望まれている。そこで、本研究では、ヒアルロン酸で被覆したDNA複合体を自己硬化型アパタイトセメント中に包含させる。または、アパタイト薄膜でマクロカプセル化することにより、持続性のある注射可能な核酸製剤を創製することを試みた。自己硬化型アパタイトセメントはリン酸水素カルシウム・二水和物とリン酸四カルシウム、さらに添加剤としてアテロコラーゲン、デキストランまたはポリエチレングリコールを加えて混合粉砕し、リン酸水溶液で懸濁させることで調整した。これらのアパタイトセメントにDNA複合体粒子を内包し、破骨細胞様のMLC-6細胞を加えたところ、MLC-6細胞はアパタイトセメントと相互作用してアパタイトセメントを溶解しDNA複合体を効率良く放出した。同様に調整したDNA複合体含有アパタイトセメントスラリーをマウスの大腿骨近傍に投与して、そのアパタイトの溶解挙動を評価したところ、アパタイトセメントは経時的に分解し、その分解速度はポリマーの種類・量に依存した。DNA複合体内包アパタイトマイクロカプセルはヒアルロン酸で被覆したDNA複合体を疑似液体に浸漬することで調整した。アパタイトによるカプセル化を電気泳動法で、走査型電子顕微鏡で評価したところDNA複合体が効率良くアパタイトに内包されていることが確認された。このDNA複合体内包アパタイトマイクロカプセルは酸性条件下でDNA複合体を比較的早く放出した。これらの結果から、DNA複合体をアパタイトに含有させることで、その条件によって、DNA複合体の放出速度を制御できることが示された。そのため効果が持続する徐放タイプの遺伝子導入製剤が強く望まれている。そこで、本研究では、ヒアルロン酸で被覆したDNA複合体を自己硬化型アパタイトセメント中に包含させる、または、アパタイト薄膜でマイクロカプセル化することにより、持続性のある注射可能な核酸製剤を創製することを試みた。自己硬化型アパタイトセメントはリン酸水素カルシウム・二水和物とリン酸四カルシウム、さらに添加剤としてアテロコラーゲンを加えて混合粉砕し、リン酸水溶液で懸濁させることで調製した。DNA複合体微粒子濃厚懸濁液は、免疫活性化遺伝子であるGM-CSFをコードしたプラスミドDNA(DNA-GM-CSF)を用い、希薄条件下で調製したDNA-GM-CSF/ポリエチレンイミン(PEI)/ビアルロン酸超微粒子を凍結乾燥・再水和することで得られた。マウスメラノーマ細胞B16をマウスの皮下に移植して担癌マウスを作製し、DNA-GM-CSF複合体含有アパタイトセメントスラリーを腫瘍近傍に投与した。生体内で固化したセメントは1ヶ月以上にわたって徐々に溶解し、DNA複合体粒子を放出し続け、完治を含む非常に高い治療効果を示した。DNA複合体内包アパタイトマイクロカプセルはヒアルロン酸で被覆したDNA/PEI複合体を疑似体液に浸漬することで調製した。このDNA複合体内包アパタイトマイクロカプセルをB16培養細胞に導入したところ、発現期間の遅延が見られた。これらをメラノーマ担癌マウスの腫瘍局所内に投与したところ顕著な延命効果が示された。以上のように、DNA複合体微粒子を内包したアパタイトセメントは及びアパタイト薄膜でマイクロカプセル化したDNA複合体は注射可能な長期発現型核酸徐放製剤としての応用が期待される。
植物固有のAS2ファミリータンパク質の分子機能の解析

植物界に特異的なAS2ファミリーのメンバーは、極めて特徴のある約100アミノ酸からなるドメイン構造(AS2/LOBドメイン)をもつ。本研究においては、最も研究が進んでおり、シロイヌナズナの葉の発生・分化に重要な機能をもつことがわかっているASYMMETRIC LEAVES2(AS2)に着目して解析した。AS2のAS2/LOBドメインは核と核小体周縁部の局在に必要であることがわかった。また、AS2/LOBドメイン内のアミノ酸配列はAS2の機能において極めて特異的であることがわかった。分化は、細胞が機能的にその祖先の細胞と異なった性質を獲得する過程である。葉の細胞の分化過程では茎頂メリステムからの何らかのシグナルを受けて、葉の分化因子と多くのクロマチン関連因子が互いに相互作用し、分化状態の維持と継承がなされていると考えられる。我々は、これまでに、シロイヌナズナのAS1とAS2遺伝子が、葉の分化初期過程で、葉の細胞の分化状態を維持しつつ、表側化の極性の確立に関わること、複数の遺伝子発現制御に関与していることを示唆した。AS2は、核内の核小体のまわりの特定の領域に局在すること、また、AS1も核に局在するが、AS2と共に、核小体のまわりの特定の領域に局在することを明らかにした。本年度は、このような核局在に必要な、AS2タンパク質のアミノ酸配列を特定する事を目的として、AS2の欠失、及びアミノ酸置換体にYFPを融合したタンパク質をつくらせるコンストラクトを作製し、シロイヌナズナに導入した。得られた形質転換体の蛍光を観察した結果、このような核局在にはAS2/LOBドメインが必要であること、特に、AS2/LOBドメイン内のC-motifが重要である事が明らかになった。AS2/LOBドメインのうち、特に、C-motif(CX_2CX_6CX_3C)の配列は、シロイヌナズナ以外の植物も含めて極めてよく保存されている。このことから、核内の核小体のまわりの特定の領域に局在することは、AS2ファミリーのメンバーに共通の機能において、重要であると考えられる。我々は、これまでに、シロイヌナズナのAS1とAS2遺伝子が、葉の分化初期過程で、葉の細胞の分化状態を維持しつつ、表側化の極性の確立に関わることを明らかにした。AS2は、核内の核小体のまわりの特定の領域に局在する結果がえられている。また、AS1も核に局在するが、AS2と共に、核小体のまわりの特定の領域に塊状に局在する。我々は、このようなAS2の塊状の局在をAS2bodyと命名した。このような核局在にはAS2/LOBドメインが必要である。さらに、核小体のまわりの塊状の局在には、AS2/LOBドメイン内のC-motif(CX_2CX_6CX_3C)の配列が必要である事を明らかにした。C-motif内の4つのシステインと塩基性アミノ酸の配列は、AS2bodyの局在に必要であることも明らかにした。C-motifはAS2/LOBファミリーのメンバーでは、極めてよく保存されていることから、AS2/LOBファミリーのメンバーに共通の機能にかかわる可能性がある(Matsumuraetal.,Plantc J.2009)。
異種分散型データベース用アクセスプロトコルの開発と実装

本研究は、異種のデータベースを統合するための分散データベース(Heterogeneous Federated Distributed Database System、異種統合型分散データベースシステム、以下HFDDSと略す)に関するものである。HFDDSを構築する場合の基礎的な問合せ処理について検討し、その有効性を示すために、HFDDSのデータベースアクセスプロトコルを設計し実装することを目的として、三年にわたって研究を実施した。まず、異種分散データベースにおける機能要素について理論的な考察を行った。HFDDSで要求される一般的な機能要素を検討した。読み出し専用のデータベースの場合について大域的スキーマとローカルなスキーマの統合について、仮想データベースという概念を導入することにより、利用者が複数の情報資源の存在を意識せずに、問合せを自動的に分解し関係するサーバに転送し、その結果を受けとるような処理手法を提案した。このような問合せ処理手法、問合せの分解等の形式化を行い、この処理によって得られる解の正しさと完全性について証明することができた。た。以上に述べた処理手法により、個別の問合せをそれぞれのサーバに送って得られる解の集合より、提案する手法を用いた方が、大きな解が得られることが一般的にいえるが、この程度をシミュレーションによって評価することができた。また、問合せ分解アルゴリズムを実装し、プロトタイプのシステムとして、LAN上の複数のデータベースサーバから並行して問合せの解を得るようなシステムを動作させ、提案した手法が有効に機能することを示した。た。本研究では、三年にわたる研究の第一年次として、以下の技術的課題を検討した。1.(異種統合分散データベースにおける機能要素)HFDDSで要求される一般的な機能要素を検討した。読み出し専用のデータベースの場合と更新処理のある場合の相違点を明らかにし、本研究で採用する大域的スキーマの仕様と機能要素を吟味した。2.(プロトコルの骨子の設計)データベースアクセスでまず重要になるセッション管理の機能とデータベースの構造情報の転送機能に着目して、プロトコルを設計した。3.(プロトコルの予備的実装と実験)プロトコルの骨格部分をRPCを使って作成した。4.(プロトコルの詳細化/実験の評価)骨子の設計に引続き詳細化を行いつつある。これはプロトタイプ実装作業と並行して行い、実験により判明した問題点等を詳細化に反映させながら次年度に継続して行っている。5.(実験環境の整備)第2年目以降には、実際的な環境で動作実験を行う。このために必要となる環境の準備を行う。1.(プログラミング)詳細化されたプロトコルの仕様の検討とコーディングを前年度に引き続き委託により行った。サーバ側のデータベースにアクセスするモジュールなど、実験環境に合わせるためのプログラムも作成した。2.(実験環境)作成されたプログラムの動作環境を作成した。サーバ側の現有計算機には関係データベースを搭載したものを使い、100MbpsのLANである現有のFDDIを介してクライアント側計算機との交信を行う。今後は高速ネットワークの使用が広まると考えられるので、まずFDDIで満足する結果が出るよう、ソフトウェアの改良等を実施した。3.(プロトコルの実装と実験)プロトコルの全体を実験環境で動作させ、性能特性などを測定した。マルチメディア情報への適用も考えているので、画像情報のバースト的な転送時の挙動等も含めて、負荷試験も行った。4.(ISDNによる実験環境)広域ネットワーク環境化での実験として、シリアル回線を介してネットワーク接続した場合のソフトウェアの挙動を通信速度を変えて調査しつつある。5.(プロトコル機能の拡張)低速の広域網での実験に基づき、再度プロトコル仕様全体を見直しつつある。また、この分野に造詣の深い研究者に仕様のレビューを依頼する計画である。1.(プロトコルの実装と実験)前年度に引続き、プロトコルの全体を実験環境で作動させた。マルチメディア情報への適用も考えているので、画像情報のバースト的な転送時の挙動等も含めて、試験を行った。2.(ISDNによる実験環境)広域ネットワーク環境化での実験として、シリアル回線を介してネットワーク接続した場合のソフトウェアの挙動を調査した。そのためISDN回線での実験を行った。3.(プロトコル機能の拡張)1994年におけるANSIの活動を調査して、再度プロトコル仕様全体を見直した。

また、この分野に造詣の深い研究者に仕様のレビューを依頼し、前年までに作成したソフトウェアに変更を加えた。4.(システムの評価)最終的に実現したネットワークソフトウェアの性能、すなわち実効的なデータのアクセス、転送レート等を勘案し、システムのボトルネックを調べた。5.(報告書の作成)本研究の成果を報告書に取りまとめた。
小脳神経回路にコードされる恐怖応答記憶のメカニズムの解明

脳の発達した動物では、嫌悪刺激と連動した感覚情報を受け取り学習し、同じ感覚情報を受けた場合に素早く反応できる。この反応は、恐怖刺激を無条件刺激、感覚情報を条件刺激とする恐怖応答学習としてとらえられる。本研究では、ゼブラフィッシュを用いて恐怖応答学習における小脳神経回路の役割を解析した。1.小脳神経回路の神経活動をモニターまたは神経活動を操作できるTg系統の作製:小脳神経回路を構成する顆粒細胞、プルキンエ細胞、eurydendroid細胞、下オリーブ核ニューロン、およびBergmannグリア細胞、に改良型転写活性化因子Gal4を発現するTg系統を作製した。また、プルキンエ細胞特異的遺伝子aldocaのプロモーターを用いて、プルキンエ細胞にGCaMP6s、ボツリヌス毒素BoTx-GFP、光遺伝学ツールを発現する系統を作製した。2.恐怖応答学習において活動が制御される小脳神経回路の検索:受精後約20日のゼブラフィッシュ稚魚を、顕微鏡ステージ上にアガロースで固定し、電気ショックを無条件刺激、消灯を条件刺激として、恐怖条件付けを行う実験系を確立した。全ての神経細胞にGCaMP7aを発現する稚魚を用いて恐怖応答学習実験を行い、学習に相関して活性化される小脳ニューロンを見出した。3.恐怖応答学習における小脳神経回路の役割の解明小脳体の顆粒細胞に特異的なGal4系統とGal4依存性にボツリヌス毒素を発現する系統を交配し、顆粒細胞の機能を抑制したゼブラフィッシュ稚魚を作製し、恐怖応答学習実験を行った。その結果、小脳体の顆粒細胞を阻害しても、条件刺激依存性の徐脈は誘導することができたが、顆粒細胞を阻害していないコントロールに比較して、徐脈の持続時間が延長した。この結果は、顆粒細胞からの信号が、恐怖応答の長さあるいは回復のタイミングを制御している可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。脊椎動物の小脳は、円滑な運動制御のみならず、認識・感情などの高度な精神活動とそれに関連する学習にも関与する。これら精神活動において学習された情報は小脳神経回路に貯蔵されると考えられるが、実際の学習過程で情報がどのように処理・記憶されるかは明らかでない。真骨魚類においては、嫌悪刺激(電気ショック等の無条件刺激)と条件刺激(光刺激等)を連合学習させることにより、条件刺激だけで恐怖情動を誘発し、徐脈・逃避行動を誘導することができる(恐怖応答学習)。(1)小脳神経回路の神経活動をモニターまたは神経活動を操作できるトランスジェニックフィッシュ(Tg)系統の作製:小脳神経回路を構成する、顆粒細胞、プルキンエ細胞、投射神経、下オリーブ核ニューロン(入力ニューロン)に転写因子Gal4を発現するTg系統を作製した。さらに、Gal4依存性にCa2+ indicator GCaMP6sや神経活動調節能を有するタンパク質(ボツリヌス毒素、光遺伝学素子)を発現するTg系統を作製または入手した。(2)ゼブラフィッシュを用いた恐怖応答学習系の確立:受精後2週間以降のゼブラフィッシュ稚魚を、顕微鏡のステージ上で、電気ショックを無条件刺激、消灯(照射光を消す)を条件刺激として条件付けを行い、条件刺激依存性に徐脈と逃避行動を誘導する系を確立した。(3)恐怖応答学習における顆粒細胞の役割の解析:顆粒細胞をボツリヌス毒素で抑制した際の、恐怖応答学習を検討したところ、条件刺激依存性の徐脈誘導反応は延長した。このことから、顆粒細胞を介したシグナルは恐怖応答のタイミングを制御している可能性が考えられた。

(1)小脳神経回路の神経活動をモニターまたは神経活動を操作できるトランスジェニック(Tg)系統の確立に関しては、より詳細な解析のために新規のTg系統の開発は行っているものの、解析に必要な系統の大半を揃えることができた。(2)ゼブラフィッシュを用いた恐怖応答学習系の確立に関しては、顕微鏡ステージ上での恐怖応答学習の系を立ち上げた。(3)恐怖応答学習における個々の小脳回路の役割の解明に関して、顆粒細胞の役割を解析することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。(1)小脳神経回路の神経活動をモニターまたは神経活動を操作できるトランスジェニック(Tg)系統の確立に関しては、より詳細な解析のため、顆粒細胞およびプルキンエ細胞特異的遺伝子の制御領域にGal4発現ユニットをノックインして、より良いTg系統を作製する予定である。(2)ゼブラフィッシュを用いた恐怖応答学習系の確立に関しては、神経活動のイメージングを行う条件下で、恐怖応答学習できる系を確立する。小脳神経回路特異的にGCaMP6sを発現した系統を用いて恐怖応答学習を行い、学習過程および記憶の維持の際に活性化されるニューロン・神経突起を明らかにする。(3)恐怖応答学習における個々の小脳回路の役割の解明に関して、顆粒細胞の解析を続ける。さらに、プルキンエ細胞や下オリーブ核ニューロンなど他の神経回路阻止を阻害または活性化した際の、恐怖応答学習に与える影響を検討し、小脳神経回路の役割を明らかにする。