hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高度負可土壌耐性植物がもつ根圏複合系の機能性解析とアグロテクノロジーへの応用研究

インドネシア熱帯泥炭林荒廃地の滅菌現地土壤(ペースト状の木質泥炭)におけるX.comp1anataの種子発芽はPenicillium属糸状菌Y-1株によってのみ強力に促進されたが、発芽種子は子葉の伸長以降は成長できず、1ヶ月後には真菌がまとわりついた様に立ち枯れて死に絶えてしまった。とこ芽種子は極めて良好な生育を6ヶ月以上持続したため、土壌生/種子付着性真菌のX.comp1anata発芽ステージでの発芽亢進機能とそれに引き続く土壌細菌のX.comp1anata芽生え生育ほう助機能とが明確に分担されていることが強く示唆された。シベリア永久凍土のタイガ林林床土壌では、低栄養要求性の単生窒素固定性Burkholderia属ならびにPseudomonas属細菌が主要な菌相をなし、細菌群集は0.02O.05%のマンニトールで十分に1%炭素源以上のアセチレン還元活性を示すことが分かった。また、表層に近い腐植成分を多く含む層から得た土壌微生物群集の窒素固定能力は1015°Cで最大限に発揮されること、中一アルカリ性(pH 6.0以上)では極端に抑えられ、弱酸性(pH 5.0付近)では極めて高い能力が発揮されることから、現地負荷環境条件の再現が当該微生物コンソーシアムの機能性を最大限に発揮させると結論付けた。2000年に噴火した有珠山の火山性荒廃地における先駆性植物の外生菌根(ECM)およびアーバスキュラー菌根(AM)共生について調査した。荒廃地に優占的に更新するヤナギ類3種、ドロノキ(Populusmaximowiczii)、エゾノバッコヤナギ(Salix hultenii var. angustifolia)およびオノエヤナギ(Salix sachalinensis)は定常的にECMを形成しており、全体での外生菌根形成率は、1742%であった。草本ではスギナとオオイタドリ以外の10種は全てAMを形成していた。植生再生の初期過程においては、菌根共生が植生再生と根圏土壌環境負荷緩和に先駆的役割を果たしていることが示された。高度負荷土壌として、酸性硫酸塩土壌、永久凍土、塩集積土壌、熱帯泥炭土壌ならびに永年無施肥土壌を選び、それらに生育できる植物の根面や種子に付く微生物の機能性と植物生育への影響をみた。また、これまで分離してきた微生物を用い、これらの機能性微生物が植物表面でどのような着生様式をもち、どのように植物との情報交換を行っているかを調べた。1)インドネシアの熱帯泥炭森林構成樹木、特にフタバガキ科植物の根面ならびに種子付着細菌から機能性細菌を探索し、多様なSphingomonas属細菌株を単離した。これらの中にはミクロ遷移を亢進し、フタバガキ科植物の生育を促進するAcidovorax sp.のような根面着生細菌の自然定着をスムーズに誘導する菌株が認められた。2)タイ南部、酸性硫酸塩土壌に成立するメラルーカ林の林床に生えている植物の根面細菌を探索した。

林床のアブラヤシ実生(本来、酸性土壌感受性)がメラルーカ、イグサ、メラストーマといった酸性土壌耐生植物に交じって生育しており、アブラヤシ根面の微生物相が最も多様性に富むこと、また、メラルーカ根面のみに見いだされたAcidovorax sp.が同じ分離源で主要菌相を占めるBrucella sp.との混合培養で酸性培地のpHを確実に中和する能力を発揮することを見いだした。3)塩集積土壌に生えるPanicum repensの根面微生物を検索し、10%濃度の食塩耐性を示す糸状菌を分離した。また、多くの10%食塩濃度に耐性を示す真正細菌類を分離した。これらが実際に、宿主植物の耐塩性発現に寄与しているかどうかを明らかにする実験を構築するため、実験植物をタイ・コンケンで探索した。現地調査の結果、特に耐塩性が強いことで知られるセスバニア(マメ科)とXyris sp.(トウエンソウ属)種子を適当な実験材料として採集した。4)表土を喪失した熱帯泥炭荒れ地に群落を形成できるXyris complanataの、発芽や生育に関わっている種子着生微生物の検索を行い、種子から分離したPenicillium sp.やFusarium sp.がX.complanata種子の強酸性泥炭土壌での発芽に不可欠であることを明らかにした。このうち、Penicillium sp.は芽生えの生育と窒素吸収にも寄与していることが分かった。高度負荷土壌のうち、特に永久凍土、熱帯泥炭土壌を中心に、それらに生育できる植物の根面や種子に付く微生物の機能性と植物生育への影響をみた。また、これまで分離してきた機能性微生物が植物表面でどのような着生様式をもち、またどのように植物や周辺の微生物群集との情報交換を行っているかを調べた。主な研究成果は以下のものである。2)インドネシアの熱帯泥炭森林開墾農地の亜酸化窒素(N_2O)生成細菌としてJanthinobacterium sp. A1-13株を単離し、これが中央カリマンタン・カランパンガン村農地からの膨大な量のN_2O放出に寄与していること、森林が消失した酸性泥炭土壌で活発に活動すること、さらには森林自体がその活動を抑制していることを明らかにした。これらの成果は、3月の2006年度日本農芸化学会本大会(京都)での口頭発表(橋床ら、2006)ならびに論文投稿を準備しているところである。3)病原菌汚染土壌という負荷環境で感染防御に関わる根圏細菌を単離し、それらがa)特異な根着生機構を持つこと(Islam et al.,2005)、b)抗生物質を生産し病原菌の有糸分裂や形態分化に異常を引き起こすこと(Deora et al.,2005,2006)、c)クオーラムセンシングシグナルミミック化合物を産生していること(Hatano et al.,2006,準備中)、d)クロストークシグナルを周辺へ放出していること(Ogita et al.,2006投稿準備中)を明らかにした。高度負荷土壌のうち、酸性熱帯泥炭土壌ならびに森林火災にあったタイガ林永久凍土を中心に、それらに生育できる植物の根面や種子に付く微生物の機能性とその挙動をみた。また、これまで分離してきた機能性微生物が植物表面でどのような化学シグナルを発し、周辺の微生物群集と情報交換を行っているかを調べた。2)東シベリアのカラマツ・ヒース林における窒素供給源特定研究を行い、低栄養要求性単生窒素固定性Burkholderia属細菌群集は0.020.05%の炭素源(マンニトール)で十分に1%炭素源と同等かそれ以上のアセチレン還元活性を示すことが分かった。また、部分的に生育するトナカイゴケの水抽出物に単生窒素固定細菌群集窒の素固定能を強力に亢進する化合物が存在することを見いだした。
膵癌患者由来の突然変異促進血清因子の精製と作用メカニズムの解析

膵癌組織においては、K-ras codon12の塩基置換変異が高頻度に検出されており、発癌および癌の進展に深く関与していると考えられている。我々はこれまでに、変異原因子(紫外線)によるK-ras codon12の変異誘導を促進する因子が、膵癌患者血清中に存在することを見い出している。平成12年度はその因子の部分精製を行い、カラーカラムクロマトグラフィーの活用が有効であることを明らかにした。また、変異頻度の解析のために、高感度の変異検出法を開発した。すなわち、変異原因子により高頻度に変異が誘導される培養ヒト細胞(RS)をメジウム処理後紫外線照射し、PCRとdot blot hybridizationを組み合わせてK-ras codon12の変異頻度を調べるというものである。平成13年度は、促進因子の作用に関与する遺伝子を探すこととした。そのために、混在する他の因子の影響が少なく、しかも血清と同様に変異誘導促進作用を示す因子を放出する膵癌組織由来細胞を使用した。この細胞の培養メジウムで処理した細胞と未処理の細胞から各々RNAを抽出し、differential display法およびNorthern blotting法により、両細胞間で発現量の異なる遺伝子を探した。その結果、膵癌細胞メジウム処理した細胞で、小胞体の分子シャペロンであるBip/GRP78の遺伝子発現レベルが低下していることを見い出した。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理により、その発現レベルを低下させた細胞では、紫外線による突然変異誘導頻度の上昇がみられた。従って、膵癌細胞培養メジウムによる変異誘導促進に、Bip/GRP78の発現レベルの低下が関わることが示唆された。一方、インターフェロンは、逆に紫外線やX線による変異誘導を抑制することがこれまでに判明している。この作用に関わる分子を同様の方法で探索した結果、細胞表面タンパク質であるLeu-13がインターフェロンによるX線抵抗化に関わることが示唆された。膵癌組織においては、K-ras codon 12の塩基置換変異が高頻度に検出されており、発癌および癌の進展に深く関与していると考えられている。我々はこれまでに、変異原因子(紫外線)によるK-ras codon 12の変異誘導を促進する因子が、膵癌患者血清中に存在することを見い出している。その因子の部分精製についてはカラーカラムクロマトグラフィーの活用が有効であることを明らかにした。一方、作用メカニズムについては、関与する遺伝子探しをPCR-based mRNA differential display法を用いて行うこととした。その際、多種多様の因子の影響を避けるため、他の因子の混在が極力少なく、かつ血清と同様に変異誘導促進作用を示す因子を放出する培養細胞を探すこととした。そのために、高感度の変異検出法を開発した。すなわち、変異原因子により高頻度に変異が誘導される培養ヒト細胞(RS)を膵癌組織由来細胞の培養液で処理後、紫外線照射し、PCRとdot blot hybridizationを組み合わせてK-ras codon 12の変異頻度を上昇させる培養液を探すというものである。この方法を用いて10種以上の膵癌組織由来細胞について検討したところ、1種類の細胞のメジウムで、促進活性の高いものが得られた。そのメジウムで処理した細胞と未処理の細胞からRNAを抽出し、25種類の任意のプライマーの組み合わせでdifferential display解析を行い、両細胞間で発現量の異なる遺伝子を探した。その結果、発現量の増加したcDNAが8個、減少したものが5個存在した。減少したものの中には小胞体の分子シャペロンであるBip/GRP78遺伝子が含まれていた。

これらの候補遺伝子について、今後、Northern blotting解析などでmRNA発現量を確認し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて機能解析を行う予定である。膵癌組織においては、K-ras codon12の塩基置換変異が高頻度に検出されており、発癌および癌の進展に深く関与していると考えられている。我々はこれまでに、変異原因子(紫外線)によるK-ras codon12の変異誘導を促進する因子が、膵癌患者血清中に存在することを見い出している。その因子の部分精製についてはカラーカラムクロマトグラフィーの活用が有効であることを明らかにした。一方、作用メカニズムについては、促進因子の作用に関与する遺伝子を探すこととした。そのために、混在する他の因子の影響が少なく、しかも血清と同様に変異誘導促進作用を示す因子を放出する膵癌組織由来細胞を使用した。変異頻度の解析には、自ら開発した高感度の変異検出法を用いた。すなわち、変異原因子により高頻度に変異が誘導される培養ヒト細胞(RS)をメジウム処理後紫外線照射し、PCRとdot blot hybridizationを組み合わせてK-ras codon12の変異頻度を調べるというものである。遺伝子発現の解析では、変異誘導促進活性を有するメジウムで処理した細胞と未処理の細胞からRNAを抽出し、differential display法およびNorthem blotting法により、両細胞間で発現量の異なる遺伝子を探した。その結果、膵癌細胞メジウム処理した細胞で、小胞体の分子シャペロンであるBip/GRP78の遺伝子発現レベルが低下していることを見い出した。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理により、その発現レベルを低下させた細胞では、紫外線による突然変異誘導頻度の上昇がみられた。従って、膵癌細胞培養メジウムによる変異誘導促進に、Bip/GRP78の発現レベルの低下が関わることが示唆された。一方、インターフェロンは、逆に紫外線やX線による変異誘導を抑制することがこれまでに判明している。この作用に関わる遺伝子を同様の方法で探索した結果、細胞表面タンパク質であるLeu-13がインターフェロンによるX線抵抗化に関わることが示唆された。
環境に配慮した液晶テレビの画像適応調光方式を用いた高画質・省エネルギー化

環境に優しいLEDバックライトを用いた液晶テレビに対し、画像適応調光方式を適用すべく調光パラメータの最適化を図った。一般的なテレビ映像に対しては、調光段階数を5、領域を16×12分割、発光分布の広がりを領域分割幅程度とすれば、従来方式の約半分の電力にできる可能性があることがわかった。また提案方式を応用したカラーブレイクアップの低減方法や、低輝度階調特性の向上など高画質化技術を提案し、その効果を確かめた。全世界的に環境保全や省エネルギー化が進むなかで、ますます大画面化が進んでいる液晶テレビに対しても低電力化、無水銀化が望まれている。これに対し研究代表者は、表示画像に応じてバックライト輝度を調光して低電力化を図る画像適応調光方式を提案している。これまで対角4インチの小型バックライトユニットを用いて実験を行いその效果を示してきた。本研究では環境に優しい光源であるLEDを用いたバックライトに画像適応調光方式を適用したシステムの開発を目的としている。今年度の研究期間においては、画像適応調光方式を適用可能な対角15インチ相当のLEDバックライトユニットを製作し、これを対角19インチLCDパネルと組み合わせて方式の效果を確かめた。LED光源はR,G,B個別に輝度制御可能なものとした。.効率よく低電力化するため、バックライは10×10の領域に分割して個別に輝度制御した。画像適応調光方式を用いるには、各領域の輝度分布を事前に知っておく必要がありそれを測定した。以上のバックライトユニットおよび各領域の測定結果を用いて10秒間の動画表示実験を行い、本方式の効果を確かめた。その結果、従来の測定結果などから予想されていた効果を確かめることができた。またその結果をもとに本方式に対するコンピュータシミュレーションの精度を向上した。次年度はシミュレーションを活用し、より一般的なテレビ映像に対する本方式の效果の検討や、領域分割方法や調光段階の最適化などを検討する。さらに実験も行いその効果を確かめる。全世界的に環境保全や省エネルギー化が進むなか、大画面化が進んでいる液晶テレビに対しても低電力化、無水銀化が望まれている。今年度の研究期間においてはコンピュータシミュレーションを活用し、より一般的なテレビ映像に対する本方式の効果の検討や、領域分割方法や調光段階の最適化などを行った。まずシミュレーションモデルを昨年度得た実験結果を元に再検討し、また多くの画像を用いて計算精度の向上を図った。テスト画像は国際電気標準会議が定めるテレビ消費電力測定用動画相当のものを199枚使用した。バックライト各ブロックの発光プロファイルは、広がりのパラメータを定義して変化させた。研究の結果、一般的なテレビ映像に対しては、バックライトの設計において、領域を16×12分割、調光段階数を5、発光プロファイルの広がりを領域分割幅程度とすれよいことがわかった。このとき消費電力は従来方式の約半分にすることができる。またLED光源を使用すると色毎の制御が可能で、単色表示であれば大幅な電力低減ができるが、一般的なテレビ映像の場合、色に偏りがある表示がほとんどないためその効果が少なく、最大でも15%程度の効果向上であることがわかった。また発光プロファイルと画質の関係の調査に着手し、特に発光プロファイルの広がりが非常に小さい時に生じる画質劣化要因の調査を行った。液晶パネル、バックライトの視野角依存性の測定などからその要因を検討し、画像適応調光方式と液晶パネル構造の相関による影響が最も大きいと予想した。今後はその検証を行い、画質劣化を含めたシミュレーションモデルの作成が必要である。
精神障害者の地域生活を促進するためのインテンシブ・ケアマネジメントモデルの開発

平成17年度は、平成16年度までに作成したインテンシブ・ケアマネジメントに関するケア・プロトコールをもとに、平成16年12月から平成17年3月までの間に、九州の私立K精神病院急性期治療病棟に入院した統合失調症及び統合失調症感情障害の患者50名を対象に、調査に同意のえら得た患者およびその家族に、ケア・プロトコールを実施し、その成果の判定を行った。成果は病状(GAF, BPRS),SELF-CARE, SOCIAL SUPPORT,家族の態度評価(Family Attitude Scale)を入院中は2週間ごと、退院後は、半年間1ヶ月ごとに評価を行った。そしてこの結果を、平成15年度に行った結果と比較し、ケア・プロトコールの評価を行った。今回対象となった50名の患者の平均年齢は36才、男性19名、女性31名、CP換算は225だった。退院後半年間の再入院率は15%で平成15年度の実態調査時の28%に比べるとやや低くなっていたが、有意な差ではなかった。さらにケア・プロトコール実施前の入院日数は89日だったが、ケア・プロトコール実施後の入院日数は45日と有意に少なくなっていた。またケア・プロトコール実施前後の対象者の特徴についてT検定を行ったが有意な差はみられなかった。またケア・プロトコール実施前後で、退院後半年間の病状、セルフケア、ソーシャル・サポートを比較すると実施前後ともGAF, BPRSに有意な差はみられなかったが、セルフケアの中でも特に病状や活動の仕方に関するセルフケアの方法が有意に異なっており、ケア・プロトコール実施後に病状や活動の仕方に関する工夫がみられるようになっていた。またケア・プロトコール実施前後のソーシャル・サポートについても有意な差はみられなかったが、プロトコール実施後にややソーシャル・サポートの専門家の数が増える傾向にあった。さらに家族の態度についてはケア・プロトコール実施前後に有意な差はみられなかったが、プロトコール実施後に、家族のケア満足度がやや高い傾向がみられていた。また看護師のケアにおいて特に退院を意識した患者のセルフケアヘの意図的働きかけが質的分析において出現頻度が高かった。今年度は、平成15年10月から平成16年2月までの間、九州および関西の2つの精神病院急性期治療病棟に入院し、調査に同意が得られ初回入院である任意入院の統合失調症および分裂病性障害と診断された患者および家族30組を対象とし、2週間に1回、入院中の病状、服薬量、セルフケア、ニーズ、ソーシャルサポートネットワークについて面接調査を行った。また対象者にケアを提供している受け持ち看護師15名に1ヶ月に1回インタビューを行い、ケアの実態について面接調査を行った。CP換算量の平均は入院時700、退院時680で多剤併用であった。また入院時の精神状態は重度で、セルフケアは部分介助が多かった。また家族は入院のショックから悲観的で、落ち込み、混乱が強かったが、患者の退院時には今後ケアしていけるのか、と不安が強くなっていた。また患者のニーズは早く退院したいがもっとも多く、病識があまりなく、内服についても拒否的で、飲みたくないが退院したいからしぶしぶ飲んでいる状況であった。

また受け持ち看護師は、患者の精神状態、セルフケアの安定をみながら患者がどのような時に不安定になるのか、内服薬の種類と患者の病状との関係、これまでの生活の仕方と現在のセルフケアの状況の関係、家族の協力の有無、を把握しながら信頼関係を重要視しながらケアを展開していた。また受け持ち看護師は、医師とのチームミーテイング、家族との信頼関係の確保、に困難を感じており、これらがうまくいくとケアが展開しやすく患者の今後の生活へのサポートもしやすい、と感じていた。今年度は、平成15年度の研究成果をもとに、ケアマネジメントのプロトコールを作成し、その妥当性を検討した。精神看護のエキスパート看護師20名に作成したプロトコールについて半構成的インタビューを行い、ケアマネジメントのプロトコールの妥当性について検討を行った。その結果、ケアマネジメントにおいて、入院時からの退院調整の必要性、退院時調整のための家族に関する支持・教育の頻度と回数、医療チームミーテイングの回数の設定、退院後の支援体制と支援場所の具体的方法の設定、入院前のセルフケアレベルの把握と生活の把握の仕方が最も重要であることが明らかになり、この点について加筆を行った。さらに平成16年10月から12月までケアマネジメントのプロトコール実施におけるトレーニングを行い、1週間に1回のケースカンファレンスを行い、14のケースについて訓練を行った。さらに平成16年12月以降、菊陽病院急性期治療病棟及び光愛病院急性期治療病棟に入院した患者で同意の得られた統合失調症と分裂病性感情障害患者50名に実施し、GAF, BPRS, NEEDS, SEF-CARE, MEDICATION, SOCIAL NETWORKについて、2週間ごとに評価を行い、また退院後は外来で、1ヶ月ごとにこれらの評価を行っている最中である。また同時に彼らにケアを提供している看護師10名にインタビューを行い、ケアマネジメントを個別に実施した際、最も重要視して行ったケアについて述べてもらっている最中である。現在までの段階では、ケアマネジメントのプロトコールに関する評価はできていないが、退院後1年間を通して平成15年度のケアマネジメント実施前のデータと比較する予定である。平成17年度は、平成16年度までに作成したインテンシブ・ケアマネジメントに関するケア・プロトコールをもとに、平成16年12月から平成17年3,月までの間に、九州の私立K精神病院急性期治療病棟に入院した統合失調症及び統合失調症感情障害の患者50名を対象に、調査に同意のえら得た患者およびその家族に、ケア・プロトコールを実施し、その成果の判定を行った。成果は病状(GAF, BPRS), SELF-CARE, SOCIAL SUPPORT,家族の態度評価(Family Attitude Scale)を入院中は2週間ごと、退院後は、半年間1ヶ月ごとに評価を行った。そしてこの結果を、平成15年度に行った結果と比較し、ケア・プロトコールの評価を行った。今回対象となった50名の患者の平均年齢は36才、男性19名、女性31名、CP換算は225だった。退院後半年間の再入院率は15%で平成15年度の実態調査時の28%に比べるとやや低くなっていたが、有意な差ではなかった。さらにケア・プロトコール実施前の入院日数は89日だったが、ケア・プロトコール実施後の入院日数は45日と有意に少なくなっていた。またケア・プロトコール実施前後の対象者の特徴についてT検定を行ったが有意な差はみられなかった。
超高精度計測システムとDNSを用いた表面粗度の流体摩擦抵抗影響の理論化の研究

粗度形状パラメータと乱流摩擦抵抗の関係を調査するため、幾何形状粗度を対象としてDNS計算、二重円筒試験、曳航水槽試験、風洞試験を実施した。その結果、粗面の乱流摩擦抵抗は、剪断力と局所的な圧力抵抗の和となり、粗度の形状がなだらかな波状粗面の場合、乱流摩擦抵抗の変化は局所的な圧力抵抗の変化で説明でき、圧力抵抗は、粗度の流線方向の断面形状に依存する抵抗係数、粗度の間隔に依存する粗度間の干渉現象、境界層内の速度分布に支配されることが判った。そして粗度形状パラメータと乱流摩擦抵抗の関係について定式化し、摩擦抵抗増加の推定式を導出した。本研究の目的は、物体の表面粗度が乱流中の流体摩擦抵抗へ影響を与える際に、どのような粗度パラメータがその現象を支配するかを解明することである。そこで、管理されたパラメータの幾何学的粗度の施工方法の開発、幾何学的粗度を施工した平板を対象とした水槽試験の実施、幾何学的粗度を施工した二重円筒試験の実施、波状粗面を対象としたDNS計算の実施、局所的な摩擦抵抗の時間変化を計測する手法について検討を行った。成果は以下の通りである。注射器状の容器に封入した塗料、樹脂に任意の圧力をかけて、注射針状のノズルから、塗料、樹脂を塗出させ、この注射器形式の塗布装置をコンピュータ制御により移動させることにより、任意の2次元的な凸線縞を平板上に施工可能な幾何学的粗度製造装置を製作した。本装置を用いて、高さは同じだが、凸部の間隔(粗度の頻度)の違う、2次元の幾何学的粗度を施工した平板を2種製作し、水槽試験を実施し、同じ高さの粗度であっても、粗度の頻度の違いにより乱流摩擦抵抗の増加率が変化することを確認した。二重円筒試験においても、3角柱状の2次元的粗度を対象とした実験を実施し、水槽試験結果と同様に、同じ高さの粗度であっても、凸部の頻度により抵抗増加率が変化したことを確認した。また、同形状の凹部については、凸部に比較して、抵抗増が少ないことが確認された。正弦関数状の波状粗面を対象としたDNS計算を行った結果、同じ粗度高さであっても、振幅に比較して波長が長いと抵抗増が小さくなり、その抵抗増の大部分は圧力抵抗成分であることが判った。これらの実験、計算の結果、粗度の頻度及び波長振幅比が摩擦抵抗増の支配パラメータの一部であることが判った。物体表面粗度が流体摩擦抵抗へ与える影響は、主に粗度高さを用いて評価されてきた。本研究の目的は、粗度高さのみでなく、粗度の勾配、周期等の他の粗度パラメータによる影響を解明し、粗度と摩擦抵抗の関係について、より実現象に即した一般的な法則を導き出すことである。また、粗度の各パラメータが乱流境界層の発達に影響を与えるメカニズムを解明することも目的としている。そのため、モデル粗面の製作法の開発、モデル粗面を対象とした系統的な抵抗計測、流場計測及び数値シミュレーションを実施することとなっている。それに従い、本年度は以下を実施した。2次元の正弦波状の粗面を対象として、粗度高は一定のまま、周期と両振幅の比(粗度の幅高さ比に相当)を変化させ、DNS計算を行った。その結果、粗度によるいわゆる摩擦抵抗増加は、勇断力成分の変化と圧力抵抗成分の変化の総和で評価でき、幅高さ比が10程度以上であれば、剪断力成分はほとんど変化せず、圧力抵抗成分の変化が、摩擦抵抗の変化を支配していることが判った。また粗度の間隔を変えた2次元幾何形状粗面を対象とした二重円筒試験、水槽試験の結果から、粗度間隔が変わると、粗度間の干渉が変化し、各粗度にかかる抵抗が変化するため、全抵抗に大きな影響を与えることが判った。そこで、2次元幾何形状粗度について、粗度形状の幅高さ比が10程度以上を適用範囲とする、粗度の高さ、幅高さ比、間隔をパラメータとした抵抗増加を推測するための式を仮定した。粗度の幅高さ比、間隔を変化させた2次元幾何形状粗度板を製作し、水槽試験を行った結果、粗度による抵抗増加量は、良い一致を見た。さらに二重円筒、風洞において、2次元幾何形状粗度まわりの流場計測を行い、粗度が流場に与える影響について調査し、メカニズム解明の基礎データを得た。粗度と乱流摩擦抵抗の関係は、従来、粗度高さに着目した研究が主に行われており、粗度の形状と乱流摩擦抵抗の関係がどうなっているかは明らかで無かった。そこで粗度の形状

パラメータが乱流摩擦抵抗にどのような影響を与えるか調査するため、2次元幾何形状粗度を対象として、DNSよる流場計算、二重円筒試験による抵抗値の計測と流場計測、平板模型を対象とした曳航水槽試験による抵抗計測、平板模型を対象とした風洞における流速分布計測を実施した。これらの計算結果、計測結果を解析した結果、いわゆる粗面の乱流摩擦抵抗は、剪断力と局所的な圧力抵抗の和で構成されることが判った。特に粗度の形状が比較的なだらかな波状粗面の場合、乱流摩擦抵抗の変化の大半は局所的な圧力抵抗の変化で説明でき、その局所的な圧力抵抗は、粗度の流線方向の断面形状に依存する抵抗係数、粗度の間隔に依存する粗度間の干渉現象(上流側の粗度の伴流に下流側の粗度が入り、粗度周りの流れの速度が小さくなる。)、境界層内の速度分布により決まることが判った。これらの知見を踏まえて、2次元幾何形状粗面における粗度の形状パラメータと乱流摩擦抵抗の関係について、定式化を行った。また粗度形状パラメータと乱流摩擦抵抗の関係について、3次元形状の粗度への適用をを行うため、3次元幾何形状粗度についても、粗度形状、配置を変化させた粗度を施工した平板模型を対象とした系統試験を曳航水槽において実施し、粗度の形状パラメータと摩擦抵抗増加の関係について調査した。DNSによるシミュレーション、2次元の幾何形状周期粗度を対象とした水槽試験及び2重円筒試験、粗度周りの流場計測から、2次元幾何形状周期粗度が流体摩擦抵抗に与える影響については、支配パラメータ、メカニズム等が、かなり解明できており、定式化の道筋もついてきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。2次元粗度と流体摩擦抵抗の関係については、かなりの情報を得ることができ、定式化も進めることができた。今後は、引き続き2次元粗度と流体摩擦抵抗の関係について調査を進めると共に、3次元粗度での粗度と摩擦抵抗の関係の調査し、粗度パラメータの流体摩擦抵抗への影響を調査する。
光合成色素系のエンジニアリング

光合成集光装置は、光合成の最初の段階を担うため、光合成の改変の標的として興味深い。そこで、N末制御ドメインを削ったクロロフィルb合成酵素(CAO)をシロイヌナズナに導入すると、クロロフィルbを過剰に蓄積し、さらに中心集光装置にもクロロフィルbが取り込まれた。この形質転換植物は、細胞死が誘導される一方、ステイグリーンの形質を示した。これらの結果は、光合成改変の農学的応用への可能性を示唆している。本年度はクロロフィルbを過剰蓄積した光合成色素系改変株の発育上の問題に焦点を当てて解析を行った。この形質転換植物は、通常の光条件下では、野生型と同じ生育速度を示し、ステイグリーンの形質を示したが、一方では、突然葉がしわしわになり、最終的にはクロロフィルを失い、白く枯れていった。この枯れ方は、一般的な老化とは異なっており、Pheophoribide a oxygenaseの変異体(pao)にみられるクロロフィル分解中間体Pheophorobideaの蓄積による細胞死とよく似ていた。そこで、光化学系改変株のクロロフィル分解経路を詳しく調べたところ、一部のクロロフィルbは通所の分解経路によって分解されず、分解の最初のステップがMgイオンの離脱であった。Mgが離脱したクロロフィルb(Pheophytin b)は、幾つかの酵素によってHydoxymethyl pheophoribde aに転換されるが、分解酵素の基質特異性から、それ以上の分解は進まなかった。Hydoxymethyl pheophoribde aがPheophoribide aと同様に、細胞死を誘導したと考えられる。野生型および形質転換植物から光化学系を単離し、in vitroでクロロフィル分解活性を調べたところ、集光性クロロフィルa/bタンパク質複合体(LHC)のクロロフィルbは正常な経路で分解されるが、コアアンテナに取り込まれたクロロフィルbは正常に分解されないことが解った。これらの結果は、クロロフィル分解が色素複合体と密接な関係にあるという新たな知見を与えると同時に、形質転換株の細胞死を克服する可能性を示唆している。現在、形質転換株でもPheophoribide類の色素が蓄積しないように、クロロフィル分解系の改変を試みている。現在の光合成は、30億年以上の進化を経て作られたもので、その各素過程は非常に高い効率で行われている。解析された光合成装置の原子構造をみると、光合成装置は、実に厳密に構築されている。これらの事実は、「光合成はもはや人工的には改変できない」「光合成は効率的なので改変しても意味がない」との考えにつながっていった。一方、光合成は、光エネルギー捕捉、エネルギー移動、電子伝達などの単純な物理過程で構成されている。そのため、新しい機能を付加することは、理論上十分可能である。これらは、光合成タンパク質等のエンジニアリングの有効性と改変の可能性を示している。本研究は、この高度に保存された光化学系の構造を改変し、新規光化学系を葉緑体内に構築するという新しい挑戦を行う。さらに、この改変した植物を利用して、(1)新規構築した光合成光化学系の機能特性、(2)新しく構築した光化学系の植物の発育に対する影響、(3)核遺伝子の発現に対する新規光合成の影響を調べることを目的としている。研究経過で示したように、本年度は、集光装置の大きさと色素組成の改変に取り組んだ。そのため、シロイヌナズナにPhCAOを導入すると同時に、クロロフィルb還元酵素を破壊した形質転換体を作った。興味深いことに、この形質転換体では集光性クロロフィルa/b-タンパク質複合体(LHC)の蓄積量が増加し、集光装置が大きくなった。また、色素組成も大きく変えることに成功した。この形質転換株に関する詳しい解析は24年度に行う予定である。一方で、集光装置の色素組成を改変したものは老化が遅れる。この植物の遺伝子発現を調べたところ、老化時に誘導される転写因子の発現が抑制された。光合成を改変することで、Transcriptional reprogrammingが起こり、これが老化を抑制したと考えられる。平成23年度の研究計画として、以下の項目を提案した。(1)光化学系の改変:(1)集光装置の大きさの改変:CAOの発現量を変えることによって集光装置の大きさを決めるLHCIIの量の調節を試みる。(2)集光装置の色素組成の改変:CAOのドメイン構造やアミノ酸配列を改変したCAOを導入すると同時に、HMCRやCBRを破壊することで、クロロフィルbを多く蓄積する植物を作成する。(2)老化抑制機構の解明:集光装置の色素組成を改変したものは老化が遅れた。我々は光化学系を改変すると、核のTranscriptional reprogrammingが起こり、これが老化を抑制したと考えている。これを明らかにするため、シロイヌナズナの転写因子1880をすべてPCRによって解析する。研究実績の概要に示した通り、当初の研究計画(1)、(2)は、ほぼ予定通りに達成され、順調に進展していると判断できる。ただ、予想外の大きな発見がなかったことが残念である。

大きな進展を得るためには、もう少し広い視点から、もしくはこれとは反対に焦点を絞って、この課題に取り組むことが必要であろう。挑戦的萌芽研究なので、もう少し挑戦的な姿勢が大切であるとの反省がある。初年度の研究は、ほぼ研究計画に示した内容通りに進展した。このため、当初の計画を大きく変えることはせず、以下の課題に取り組む。(1)光化学系の改変、(2)改変した光化学系の機能解明、(3)改変植物の形質の解析、(4)他の植物への応用。(2)に関しては、改変した植物が多量のLHCIIを蓄積していること、また蛍光特性がきわめて特徴的であることが予備的実験で明らかになってきた。そこで、改変植物の光合成活性を詳細に調べる。また、(4)に関しては、大変重要な課題となってきたので、特に重点的に取り組む。また、達成度に述べたように、もう少し挑戦的な姿勢で研究を進める。平成23年度の予算額が160万円のところ、実際に使用した額は146万1529円であった。後半、実験結果の検討に時間を要したため、実験の遂行が若干遅れたことにより未使用額が発生したが、ほぼ予定通りの支出である。平成24年度は、本研究を遂行する大学院生が増えるので、未使用額分については新入生の実験体制の立ち上げのため、試薬や器具等を購入するのに使用したいと考えている。
西鶴と団水の文芸に関する総合的研究

西鶴と団水の浮世草子、俳諧およびその周辺諸分野に関する研究を行った。俳諧については、特に西鶴晩年の連句における〈疎句〉の付合手法に着目して分析し、その注解を行った。浮世草子については、西鶴と団水の〈寓言〉についての理解の共通性を指摘するとともに、俳諧の手法を用いた浮世草子の特徴について論じた。また、以上の研究成果を含む著書『西鶴と団水の研究』(和泉書院)を刊行した。本研究は、浮世草子、俳諧、遊女評判記などの分析を行うことで、井原西鶴とその第一の門人である北条団水について、両者の関係性を明確にし、双方の作品を新たに捉え直すことを目的とする。その二年目にあたる今年度は、以下の研究成果を得た。(1)『好色破邪顕正』(貞享四〈1687〉年五月序)は、当代の好色本のみならず当時流行の浮世草子をも批判した書として従来注目されてきた。本書が団水作であることや、『伊勢物語』『源氏物語』『徒然草』の古注釈書を用いて執筆されていることは「団水の初期作」(『近世文芸』81号、2005年)にすでに述べたが、本書の「好色論」の内容についてはさらに追究する必要があった。そこで、本書が当時の『徒然草』注釈書の記述にもとづいて「物のあはれ」を喚起しうるいわば正しき「好色」を認める立場をとること、それまでの勢語学・源語学に説かれていた虚実説、寓言説を実直に踏襲していることを指摘した(学会発表「団水の好色論」佛教大学国語国文学会)。本書は、古典注釈書の好色論を当代の好色本批判にまで敷衍しつつ、「虚」「実」の正しい理解を示し、西鶴や団水の俳諧、浮世草子が好色の放埒を勧めるものでも「嘘」「偽」でもないことを理論的に跡付け、その正当性を明らかにしようとした書であると考えられる。(2)京都島原の遊女評判記の調査およびその翻刻を前年度に引き続き行った。(3)研究報告者がこれまでに発表した西鶴と団水の浮世草子、俳諧および両者と出版書肆との関係についての論文に全面的に加筆・修正を施したうえで、上記(1)(2)を含む今年度までの本研究課題の研究成果を加えて、『西鶴と団水の研究』(和泉書院、2013年2月)として刊行した。本研究は、浮世草子、俳諧、遊女評判記など当時の文芸諸ジャンルにわたる調査・分析を行い、井原西鶴とその門人の北条団水について、両者の関係性を明確にし、双方の作品を新たに捉え直すことを目的とする。その最終年度にあたる今年度は、これまでに実施してきた元禄期の西鶴の俳諧についての調査・分析結果にもとづき、以下の発表を行った。「西鶴晩年の俳諧について」(立教大学日本文学会、2013年7月、於立教大学)、「西鶴と元禄俳諧」(シンポジウム「西鶴と俳諧」、俳文学会東京例会・浮世草子研究会・西鶴研究会共催、2013年12月、於青山学院大学)。また、元禄期の西鶴の俳諧における〈意味〉の含ませ方について、連句作法の特徴や他の俳諧師との関係をふまえて検討した。現在その論文を執筆中である。研究期間全体を通じて実施した研究の成果について。2012年度までの研究成果については、その一部を『西鶴と団水の研究』(水谷隆之著、和泉書院、2013年2月)に収録して報告した。しかし、西鶴の俳諧に関する上述の論文のほか、『俳諧四国猿』(律友編、元禄4年刊)、『誹諧渡し船』(順水編、元禄4年刊)等に収められた西鶴とその周辺の俳諧師による連句の注釈や、団水作浮世草子および京都島原の遊女評判記に関する分析・翻刻など、研究期間内に公表が間に合わなかった研究成果も残っている。これについても成果をとりまとめ、追って公表する予定である。本研究は、浮世草子、俳諧、遊女評判記など当時の文芸諸ジャンルにわたる調査・分析を行い、井原西鶴とその第一の門人である北条団水について、両者の関係性を明確にし、双方の作品を新たに捉え直すことを目的とするものである。その初年度にあたる今年度は、以下の研究を行った。1,研究報告者がこれまでに実施してきた元禄期における西鶴および団水の俳諧諸作品に関する調査・分析を引き続き行い、その研究成果の一部を「『団袋』所収西鶴・団水両吟半歌仙注釈稿(二)」としてまとめ、学術誌に掲載した。2,俳諧に関してこれまでに得られた研究成果に基づき、西鶴作浮世草子の創作方法についての分析を行った。

うち、『西鶴諸国はなし』巻四の七「鯉のちらし紋」に関する分析を論文にまとめた(『鳥獣虫魚の文学史魚の巻』に収録、三弥井書店、2012年7月刊行予定)。本稿は、俳諧の連想語を軸に話を展開することにより複数の典拠を違和感なく配合し、その落差を楽しむ、西鶴浮世草子の特徴のひとつを具体的に示したものである。3,京都島原に関する遊女評判記の調査(主に寛文元禄期)を開始し、国立国会図書館、天理図書館をはじめとする諸機関において資料調査を行った。次年度はこの調査を本格化し、その結果を好色物浮世草子の内容分析にも活かす予定である。なお、今年度の一連の研究によって得られた知見をもとに、旧稿に加筆・修正をほどこし、『西鶴と団水の研究』と題した著書を執筆した。本書は次年度に公刊する予定である。以上の他、北条団水の研究史を執筆した。遊女評判記の調査・分析については当初の計画よりも遅れているが、西鶴と団水の関係および俳諧と浮世草子の関係に関する研究成果を予定よりも早く単著にまとめて公刊できた。西鶴と団水の浮世草子と俳諧に関する分析に相当の時間を要したため、島原遊女評判記の調査が当初の予定に比べ遅れている。遊女評判記の調査・分析に重点を置く。また、今年度までの浮世草子・俳諧に関する研究成果を論文化して公表する。浮世草子・俳諧に関する調査・分析を急ぐ。また、次年度は遊女評判記の調査を本格化する。該当なし。浮世草子・俳諧・遊女評判記など複数のジャンルにわたる研究図書、当該研究の遂行のために必要な江戸期和本の購入、論文執筆に係る諸経費ならびに国内外の所蔵機関における調査・資料収集に係る旅費として、研究費を使用する。なお、今年度は遊女評判記の調査に係る旅費として相当額を見込んでいたが、他の研究項目の遂行に時間がかかり、十分に果たせなかった。今年度の残額は、次年度の研究費とあわせ、資料調査のための費用として主に使用する予定である。
金属アレルギー発症機構における樹状細胞の動態解析

これまで我々はNiアレルギーモデルマウスを作製して樹状細胞を中心に解析してきた.本研究では, MKK6遺伝子を調節することでアレルギー症状の重篤さをコントロールすることができ, RhoAやRac1のような低分子量Gプロテイン発現を調節することで,アレルギー発症部位への細胞の遊走,あるいは炎症箇所から所属リンパ節への細胞遊走をコントロールできる可能性が示唆された.これまで我々はNiアレルギーモデルマウスを作製して樹状細胞を中心に解析してきた.本研究では, MKK6遺伝子を調節することでアレルギー症状の重篤さをコントロールすることができ, RhoAやRac1のような低分子量Gプロテイン発現を調節することで,アレルギー発症部位への細胞の遊走,あるいは炎症箇所から所属リンパ節への細胞遊走をコントロールできる可能性が示唆された.我々は,これまでにニッケル(Ni)アレルギー発症マウスを作製し,そのモデルマウスを用いた解析により金属アレルギーには樹状細胞(DC)とT細胞が深く関与していることを明らかにした.また,Niで刺激したDC上ではMAPキナーゼカスケードの中でもp38MAPキナーゼとその上流のMKK6のリン酸化が亢進していることも明らかとなった.そこで,アレルギー発症メカニズムをさらに深く追求するために,Niアレルギー発症過程におけるDCの活性をp38MAPキナーゼカスケードにより制御し,金属アレルギー発症を制御することを試みた.通法に従ってNiを腹腔に投与し(感作),2週間後に耳介皮下に再度Niを投与して(惹起)アレルギーを発症させたマウスをコントロールとした.MKK6活性化増強群では,pcDNA3.1-MKK6を培養DCにjet PEI mannose試薬を用いて遺伝子導入し,DC上にMKK6を強発現させた.そのDCを48時間Niで刺激した後にマウス腹腔に投与することで感作とし,通法通りに惹起を行った.MKK6活性化抑制群では,あらかじめ感作したマウス耳介皮下にMKK6SiRNAをアテロコラーゲンと共に投与し,5日後に惹起した.その結果,MKK6活性化増強群では,マウスの耳介腫脹量はコントロール(平均1.0mm)と比べて有意に大きく(平均1.4mm.p<0.01),MKK6活性化抑制群では有意に小さくなった(平均0.4 p<0.01).この結果から,本手法によりMKK6発現を調節することでアレルギー症状を調節できることが明らかとなった,今後,同様の手法でRhoA,Rac1遺伝子を調節してさらにアレルギー症状の増悪,軽減を観察する予定である.これらの遺伝子を調節することによってアレルギーそのものを調節することができれば,金属アレルギーの治療方法に有用であると考える.我々は,これまでにニッケル(Ni)アレルギー発症マウスを作製し,そのモデルマウスを用いた解析により金属アレルギーには樹状細胞(DC)とT細胞が深く関与していることを明らかにした.また,Niで刺激したDC上ではMAPキナーゼカスケードの中でもp38MAPキナーゼとその上流のMKK6のリン酸化が亢進していることも明らかとなった.そこで,アレルギー発症メカニズムをさらに深く追求するために,Niアレルギー発症過程におけるDCの活性をp38MAPキナーゼカスケードにより制御し,金属アレルギー発症を制御することを試みた結果,MKK6活性化増強群では,マウスの耳介腫脹量はコントロール(平均1.0mm)と比べて有意に大きく(平均1.4mm.p<0.01),MKK6活性化抑制群では有意に小さくなった(平均0.4 p<0.01).さらに,アレルギー発現部位である耳介の上皮シートを作製し,DC上に発現するMKK6を染色した結果,著明なリン酸化の亢進を認めた.同時に,GプロテインであるRhoAおよびRaclを染色し,同様にリン酸化が亢進していることを確認した.今後は,耳介皮膚から採取したタンパクを使ってRhoA,Raclともに免疫沈降を行い,アレルギー発症時のGプロテインの動態を観察し,DCの遊走との関連をさらに検討する予定である.この結果から,本手法によりMKK6発現を調節することでアレルギー症状を調節できることが明らかとなった,我々が作製したニッケル(Ni)アレルギー発症マウスを用いた解析で,金属アレルギーには樹状細胞(Dc)とT細胞が深く関与しており,Niで刺激したDc上ではMAPキナーゼカスケードの中でもp38MAPキナーゼとその上流のMKK6のリン酸化が亢進していることも明らかとなっている.pcDNA3.1-MKK6を培養DCにjet PEI mannose試薬を用いて遺伝子導入し,MKK6を強発現させたDCを移入して作製したアレルギー発症マウスにおいて,マウスの耳介腫脹量はコントロール(平均1.0mm)と比べて有意に大きくなった(平均1.4mm.p<0.01).あらかじめ感作したマウス耳介皮下にMKK6SiRNAをアテロコラーゲンと共に投与し,5日後にアレルギーを惹起したMKK6活性化抑制群では,耳介腫脹量が有意に小さくなった(平均0.4p<0.01).次にこれらのDCを用いてトランスウェル上でNi刺激に対するmigrationassayを行った.その結果,MKK6遺伝子導入群,およびMKK6遺伝子抑制群を比較して,細胞遊走に有意な差を認めなかった.アレルギーモデルマウス耳介皮膚で,細胞遊走に関わる分子であるRhoA,Rac1の発現を皮膚の上皮シートを作製して観察したところ,ケラチノサイト上に両分子の活性化を認めた。以上の結果から,本手法によりMKK6発現を調節することで,アレルギー症状を調節できることが示された.

またアレルギー発症マウスの皮膚では,RhoA,Rac1遺伝子が活性化していることが明らかとなった.RhoA,Rac1は細胞の遊走に関わる分子であり,これらの発現,活性化を調節することで,細胞遊走を調節し,金属アレルギーの発症を抑制することができる可能性が示された.
電気化学高速原子間力顕微鏡を用いたP型ATPaseの一分子反応解析

イオンポンプは,生体膜を隔ててイオンを輸送する膜タンパク質の一種であり,ATPを加水分解して得られる化学エネルギーを用い,濃度勾配に逆らってイオンを能動輸送する。近年,形質膜中でカチオン輸送を行うP型ATPaseの中の一つである筋小胞体カルシウムポンプ(SERCA)の結晶構造解析が進み,ダイナミックな構造変化を伴うイオン輸送の実体が明らかにされつつある。本研究では,そうしたP型ATPaseの反応動態を一分子レベル・リアルタイムスケールで解析し,その分子反応機構に迫ることを目的に,液中高速原子間力顕微鏡を利用した実験・観察系の構築を行った。これにより,ATP依存的に上下に構造変化をくり返すSERCA及び細胞膜ナトリウムポンプの様子をダイレクトに捉えることに成功した。イオンポンプは,生体膜を隔ててイオンを輸送する膜タンパク質の一種であり,ATPを加水分解して得られる化学エネルギーを用い,濃度勾配に逆らってイオンを能動輸送する.近年,形質膜中でカチオン輸送を行うP型ATPaseの中の一つである筋小胞体カルシウムポンプ(SERCA)の解析が進み,ダイナミックな構造変化を伴うイオン輸送の実体が明らかにされつつある.その一方で,SERCA以外のP型ATPase分子に関しては研究が遅れている.本研究課題では,「液中高速原子間力顕微鏡によるリアルタイム・ナノ構造解析技術」と「電気生理学的実験手法」とを組み合わせ,生体膜中にあるSERCAおよび細胞膜ナトリウムポンプの反応を,構造的・機能的側面から1分子レベルで解析し,ATPの化学エネルギーを利用したイオン輸送機構の分子レベルでの理解を目指した.(1)マイカ基板上にイオンポンプを含んだ膜試料を滴下し,高速原子間力顕微鏡用試料とする実験手法を確立した.(2)上記基板上に用意した,SERCAおよびNa^+_-Pump試料の高速原子間力顕微鏡観察を行い,静止状態における両試料の形態解析を行った.その結果,Na^+_-Pmmp試料においては,SERCAとほぼ同じ大きさをもつ構造と,SERCAに比べ半分以下の高さしかない構造が存在していることが確認された.(3)高速AFM装置と電気化学測定装置とを組み合わせることを目的に,まず電気化学測定装置のセットアップを行った.(4)ATP存在下,生理的条件下におけるSERCAの反応観察を行い,5ミリ秒の時間分解能でその構造変化を観察することに成功した.イオンポンプは,生体膜を隔ててイオンを輸送する膜タンパク質の一種であり,ATPを加水分解して得られる化学エネルギーを用い,濃度勾配に逆らってイオンを能動輸送する.近年,形質膜中でカチオン輸送を行うP型ATPaseの中の一つである筋小胞体カルシウムポンプ(SERCA)の解析が進み,ダイナミックな構造変化を伴うイオン輸送の実体が明らかにされつつある.その一方で,SERCA以外のP型ATPase分子に関しては研究が遅れている.本研究課題では,「液中高速原子間力顕微鏡によるリアルタイム・ナノ構造解析技術」と「電気生理学的実験手法」とを組み合わせ,生体膜中にあるSERCAおよび細胞膜ナトリウムポンプの反応を,構造的・機能的側面から1分子レベルで解析し,ATPの化学エネルギーを利用したイオン輸送機構の分子レベルでの理解を目指した.(1)Na+-Pumpを含んだ脂質二分子膜試料に対し,高速AFMによるリアルタイム構造解析を行った結果,膜表面から大きくせり出したNa+-Pumpのα-サブユニット,および小さなβ-サブユニットを溶液中に於いて観察することに成功した.両者は,形状の違いから明確に区別することが可能であった.(2)Na+-Pumpのβ-サブユニットに関しては,膜内で拡散運動する様子が観察された.一方で,α-サブユニットに関しては,膜内拡散運動は小さかった.これは,細胞内ドメインが試料基板表面にコンタクトしており,運動が阻害されているためと考えられる.(3)Na+-Pumpのα-サブユニットに関しては,ATP存在下かつ生理的条件下において,ダイナミックな構造変化を繰り返している様子が観察された.これは,SERCAで観察された構造変化と類似した動きであった.
立体構造に基づくGPCRとリガンドの相互作用の解明

GPCRの活性型構造は、agonistを結合させただけでは不安定でることから構造解析は難しく、agonistの結合様式に関する構造情報は限られている。本年度は、昨年度までに作製したagonistの親和性を高める構造認識抗体を結合させ、agonistが結合した状態の受容体の構造解析に成功した。構造解析の結果、結合させたagonistの電子密度は良好で、このagonistの結合様式の詳細が解明できた。また、類似の手法を他の膜蛋白質の構造解析に応用することにも成功した。また、最近になり、X線結晶構造解析に次世代X線源であるX線自由電子レーザーが利用できるようになった。我々は、X線自由電子レーザーを受容体の結晶構造解析に利用するための測定系を立ち上げ、いくつかの受容体の構造解析に成功した。そのうちの一種では、従来の放射光を用いて測定したデータより、リガンド周囲の電子密度が改善され、より詳細なリガンドの結合様式が解明できた。本研究で得られた成果は、他の受容体や膜蛋白質とリガンドの結合様式の詳細を解明するための膜蛋白質構造解析技術基盤の確立にも役立った。27年度が最終年度であるため、記入しない。GPCRはシグナル(agonist)を受容し活性化されるが、agonistの結合様式に関する構造情報は限られている。その原因は、GPCRの活性型構造がagonistを結合させただけでは不安定だからである。ヒト由来のGPCRで唯一の活性型構造はβ2アドレナリン受容体で決定されているが、結晶化のためにはagonistに加え、細胞内側にnanobody(ラマ由来の一本鎖小型抗体、作製は一般的でない)もしくはGタンパク質を結合させる必要があった。本年度は,ラマより一般的なマウスに免疫することでGPCRにagonistが結合した状態を安定化させる抗体の作製を試みた。このようにして得られた抗体には、agonistの親和性を高め、拮抗薬(antagonist)の親和性を低くするものが存在した。このような抗体はagonistが結合した状態を安定化させる抗体と考えられた。そこで、これらを利用することでagonistが結合した状態のGPCRの結晶化を行った。その結果、これらの抗体のうち2種類については、抗体とGPCRの複合体の結晶を取得することに成功した。また、これらの結晶について大型放射光施設において反射をチェックしたところ、タンパク質由来の反射が確認できた。H26年度の計画は、agonistが結合した状態のGPCRを安定化する抗体をマウスで作製し、それを用いてGPCRの結晶化を行うことであった。上記のようにH26年度は、agonistが結合したGPCRに抗体を結合させて結晶化、データ取得に成功しており、順調に研究は進展している。分解能の向上のために結晶化条件を検討するとともに、得られたデータを用いて構造解析を行う。位相の決定は分子置換で行う。agonistとの複合体構造を決定できたら、agonistの結合様式を不活性型構造の場合と比較する。また、結晶構造を基にin silicoスクリーニングも試みる。