hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
知的画像診断支援のための人体臓器モデリングに関する研究

医用画像から異常陰影を検出する医用画像認識の研究は様々な研究グループで行われている.例えば,胸部X線CT画像から肺がん陰影を自動検出する研究,X線写真から肺がん陰影を自動検出する研究,MRA画像における脳動脈瘤を検出する研究,マンモグラムにおける腫瘤陰影の検出などがある.これらの研究ではボトムアップの認識手法が主に採用されていることが多い.その認識手法は,まず異常の候補陰影をフィルタ処理などによって検出し,領域抽出し,特徴量を計測・解析し,正常か異常かを識別するというアプローチである.一方,トップダウンの認識手法を採用している手法もある.このアプローチは,まず解剖学的知識に基づいた仮説をたて,その仮説と画像とを照らし合わせ,演繹的に検証することによって,入力された画像が正常か異常かを認識する手法である.この手法で重要な役割りを果たすのが人体臓器構造を再現したモデルである.モデルは解剖学的知識を具象化し,照合のための基準として利用される.本研究では,トップダウンアプローチにおいて中心的な役割りを果たす人体臓器構造のモデルを構築する手法として,次の4つのモデリング手法:(1)肺結節・血管の3次元モデリング(2)固有画像による画像モデリング(3)肺血管配置モデリング(4)肺血気管径アトラスの構築を開発した.さらにそれらの臓器モデルを胸部X線CT画像に応用し,肺癌病巣を認識する手法を開発した.医用画像から異常陰影を検出する医用画像認識の研究は様々な研究グループで行われている.例えば,胸部X線CT画像から肺がん陰影を自動検出する研究,X線写真から肺がん陰影を自動検出する研究,MRA画像における脳動脈瘤を検出する研究,マンモグラムにおける腫瘤陰影の検出などがある.これらの研究ではボトムアップの認識手法が主に採用されていることが多い.その認識手法は,まず異常の候補陰影をフィルタ処理などによって検出し,領域抽出し,特徴量を計測・解析し,正常か異常かを識別するというアプローチである.一方,トップダウンの認識手法を採用している手法もある.このアプローチは,まず解剖学的知識に基づいた仮説をたて,その仮説と画像とを照らし合わせ,演繹的に検証することによって,入力された画像が正常か異常かを認識する手法である.この手法で重要な役割りを果たすのが人体臓器構造を再現したモデルである.モデルは解剖学的知識を具象化し,照合のための基準として利用される.本研究では,トップダウンアプローチにおいて中心的な役割りを果たす人体臓器構造のモデルを構築する手法として,次の4つのモデリング手法:(1)肺結節・血管の3次元モデリング(2)固有画像による画像モデリング(3)肺血管配置モデリング(4)肺血気管径アトラスの構築を開発した.さらにそれらの臓器モデルを胸部X線CT画像に応用し,肺癌病巣を認識する手法を開発した.
末梢動脈疾患の改善に対する運動誘発性マイオカインの役割

最終年度は、これまでの研究で着目したケモカインを筋特異的に欠損したマウスに運動トレーニングを実施させ、運動による血管新生に対する着目したケモカインの重要性の立証を目的とした。実験は、作成した筋特異的にケモカインを欠損したマウスと同腹子の野生型マウスに4週間の自発走行運動を実施させ、運動期間終了後に骨格筋を採取し評価した。自発走行運動は、運動期間中継時的に走行距離を測定し、運動が十分に実施されていることを確認した。運動期間終了後の骨格筋採取はトレーニング期間終了24時間後に実施した。骨格筋は、ヒラメ筋、腓腹筋、足底筋と白色広筋を採取した。ヒラメ筋、腓腹筋と白色広筋は直後に液体窒素にて急速冷凍し実験に使用するまで-80°Cにて冷凍保存した。足底筋は冷却したイソペンタンにて急速冷却し、薄切後に毛細血管と筋線維タイプのマーカーの抗体で蛍光免疫染色し毛細血管の評価に使用した。その結果、自発運動の走行距離は欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。運動によるMHCIIa線維の増加も欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。毛細血管密度は運動により増加するが、欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。またMHCIIaおよびMHCIIbの筋線維に接着する毛細血管数は運動により増加するが、欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。以上、最終年度に実施した研究とこれまで実施した研究をまとめると、運動や筋収縮は血管新生に必要なケモカインの産生を増加することを明らかにした。しかしながら、筋特異的にこのケモカインを欠損したマウスを作成し運動を実施すると、野生型マウス同様に血管新生が観察されたことから、本研究で着目したケモカインは運動による血管新生には直接的には関与しないことが示唆された。骨格筋の血管新生因子の分泌を筋線維タイプ別および運動トレーニングの有無から統合的に検討し、血管新生を促進する筋内環境の構築に必要なマイオカインの同定を行った。実験にはC57BL/6マウスを用い、自発走行運動による運動トレーニングを6週間実施した。その間、安静群は通常飼育した。運動トレーニング期間終了24時間後、マウスを麻酔下にて採血した後頸椎脱臼し、遅筋優位なヒラメ筋、速筋優位な外側(白色)広筋、速筋と遅筋が混在する足底筋と腓腹筋を採取した。採取した骨格筋は、タンパクやmRNAの発現を検討するため、ウェスタンブロット、RNA抽出、ELISAやプロテインアレイに適した溶液にてホモジネイトした。また、足底筋の一部はOCTコンパウンドに包埋し、免疫染色に使用した。その結果、運動は骨格筋の毛細結果密度を増加した。また、遅筋は速筋よりも毛細血管密度が高かった。安静群よりも運動群の方が高く、速筋よりも遅筋の方が高い血管新生因子をプロテインアレイにて網羅的に検討したところ、1つのケモカインが血管新生に重要である可能性が示唆された。このケモカインに焦点を絞りさらに詳細に検討したところ、ウェスタンブロットやRT-PCRでもプロテインアレイと同様の結果が得られた。また蛍光免疫染色の結果、遅筋線維であるMHCIの方が速筋線維であるMHCIIbよりも発現が高かった。さらに、運動がケモカインを変動するメカニズムを解明するため、C2C12培養細胞に伸展刺激を加え、着目したケモカインの変動を検討したところ、伸展刺激によりケモカインのmRNAの発現は有意に増加した。本年度は、計画していたほぼ全ての実験を実施することができ、一部を除きほぼ仮説通りの結果を得ることができた。したがって、本研究はこれまでのところおおむね順調に進んでいる。初年度の研究で同定した筋収縮や運動トレーニングで変動し、骨格筋の毛細血管密度を調節すると推測されるケモカインに焦点をあて、このケモカインを筋特異的に欠損したマウスの作成と解析を実施した。筋特異的なケモカインの欠損マウスはCre/loxP発現制御システムを用いて作成した。筋特異的に欠損するためのCreマウスにはMlc1f-Creを使用し、目的とするケモカインのloxPマウスと交配し作成した。作成した遺伝子改変マウスは、CreマウスとloxPマウスともにC57BL/6マウスを使用したため、戻し交配することなく実験に使用することができた。作成した遺伝子改変マウスはPCR法で遺伝子改変の有無を判別した。また解剖後、骨格筋の目的としたケモカインの発現をELISAにて評価し遺伝子改変の有無を正確に評価した。その結果、筋特異的欠損マウスと野生型マウスを正確に評価することができた。作成した筋特異的欠損マウスと野生型マウスに運動トレーニングを実施し、着目したケモカインの欠損が運動による毛細血管密度の増加に及ぼす影響を評価した。実験は作成した欠損マウスと野生型マウスを使用した。マウスは運動群と安静群に分け、運動群には4週間の自発走行運動を実施させ、安静群は通常飼育した。運動期間終了24時間後、マウスから遅筋優位なヒラメ筋、速筋優位な外側(白色)広筋、速筋と遅筋が混在する足底筋と腓腹筋を採取した。採取した骨格筋は、解析に適した溶液にてホモジネイトし、タンパクやmRNAの発現の検討に使用した。

また、足底筋の一部はOCTコンパウンドに包埋し、毛細血管密度を評価するための免疫染色に使用した。現在、これらの検体を解析している。筋特異的欠損マウスの遺伝子発現の判別に予想以上の時間を費やしたが作成することに成功した。運動による骨格筋の毛細血管密度の変動の評価に必要な実験手法はすでに習得しているため、解析の実施に支障は生じない。したがっておおむね順調に進展していると考えている。最終年度は、これまでの研究で着目したケモカインを筋特異的に欠損したマウスに運動トレーニングを実施させ、運動による血管新生に対する着目したケモカインの重要性の立証を目的とした。実験は、作成した筋特異的にケモカインを欠損したマウスと同腹子の野生型マウスに4週間の自発走行運動を実施させ、運動期間終了後に骨格筋を採取し評価した。自発走行運動は、運動期間中継時的に走行距離を測定し、運動が十分に実施されていることを確認した。運動期間終了後の骨格筋採取はトレーニング期間終了24時間後に実施した。骨格筋は、ヒラメ筋、腓腹筋、足底筋と白色広筋を採取した。ヒラメ筋、腓腹筋と白色広筋は直後に液体窒素にて急速冷凍し実験に使用するまで-80°Cにて冷凍保存した。足底筋は冷却したイソペンタンにて急速冷却し、薄切後に毛細血管と筋線維タイプのマーカーの抗体で蛍光免疫染色し毛細血管の評価に使用した。その結果、自発運動の走行距離は欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。運動によるMHCIIa線維の増加も欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。毛細血管密度は運動により増加するが、欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。またMHCIIaおよびMHCIIbの筋線維に接着する毛細血管数は運動により増加するが、欠損マウスと野生型マウスの間に違いは観察されなかった。以上、最終年度に実施した研究とこれまで実施した研究をまとめると、運動や筋収縮は血管新生に必要なケモカインの産生を増加することを明らかにした。しかしながら、筋特異的にこのケモカインを欠損したマウスを作成し運動を実施すると、野生型マウス同様に血管新生が観察されたことから、本研究で着目したケモカインは運動による血管新生には直接的には関与しないことが示唆された。次年度は、着目したケモカインの筋特異的欠損マウスを作成し、骨格筋の血管新生に対する生理学的な意義を検証する。骨格筋の毛細血管密度を評価し、欠損マウスと野生型マウスに違いが観察された場合は、血流量や筋機能などの評価を実施する。割引きや為替レート変動による消耗品の価格変更の理由から66円の残金が発生した。実験消耗品の価格変動などにより次年度使用額が生じた。残金は次年度に繰り越し、新たな価格変更への対応などに有効に利用する。残金の66円を次年度に繰り越し、新たな為替レート変動などによる価格変更への対応などに有効に利用する。
細胞老化と細胞骨格調節機構から紐解く肺線維症発症機序の解明

本研究では肺上皮細胞特異的Pten欠損マウス(Pten-KOマウス)を用い解析を進めた。Pten-KOマウス肺で、AECでの老化細胞増加とp53発現亢進がみられた。Pten-KOマウスで、気管支肺胞洗浄液中総細胞数の増多がみられ、単離AECでIL-6とIGFB5の発現亢進がみられた。さらに、30週齢のPten-KOマウスでは、肺リモデリングを示唆する平均肺胞径と肺胞破壊指数の増加がみられた。また興味深いことに、Pten-KOマウスのAECでは紡錘体形成不全がみられた。以上より、上皮Ptenの欠損は紡錘体形成不全を介して細胞老化が加速し、肺リモデリング亢進を引き起こすことが示唆された。特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis;IPF)は原因不明の肺リモデリング疾患で、進行性の呼吸不全を来し、生存期間中央値2.5年と予後不良である。IPFの病態解明と有効な治療法の開発は急務の医療課題であると考えられる。本研究では、肺胞上皮細胞(AEC)特異的Pten欠損マウスを用い、上皮PTENが与える細胞老化と肺線維症発症・進展の関連を検証した。酸性βガラクトシダーゼ活性(SA-βGAL)染色の結果、30週齢のAEC特異的Pten欠損マウスは、AECでの老化細胞が有意に増加していた。また、AEC特異的Pten欠損マウスでは、細胞老化の特性であるsenescence-associated secretory phenotype(SASP)を示唆する気管支肺胞洗浄液中総細胞数の増多がみられた。さらに、30週齢のAEC特異的Pten欠損マウスでは、肺リモデリングを示唆する平均肺胞径と肺胞破壊指数の増加がみられた。Pten-siRNAを導入したヒト不死化肺上皮細胞株(BEAS-2B)では、MMTアッセイでの増殖能低下がみられた。以上から、上皮Ptenの欠損は細胞老化の加速、細胞増殖能の低下、SASPを惹起し、肺リモデリング亢進を引き起こすことが示唆された。本年度は、Wnt5a-Rorシグナル解析のためにRor2floxマウスを神戸大学細胞生理学分野より、RhoA-ROCKシグナル解析のためにRhoAfloxマウスを和歌山県立医科大学分子医学研究部より導入した。現在、肺上皮細胞特異的Ror2欠損マウス、肺上皮細胞特異的RhoA欠損マウスを作成中である。本年度では、1. AEC特異的Pten欠損マウスを用いたAEC細胞老化の解析、2. AEC特異的Pten欠損マウスでの肺線維症自然発症の解析ならびに3. Ptenノックダウン肺上皮細胞での細胞老化シグナル解析について、AEC特異的Pten欠損マウスとコントロールマウス、ならびにPten-siRNA遺伝子導入ヒト肺上皮細胞株を用いて解析を行った。その結果、上皮Ptenの欠損は、細胞増殖停止とSASPからなる細胞老化の加速、高齢期における肺リモデリング亢進を生じることを見出した。さらに本年度はWnt5a-Ror経路解析のために神戸大学細胞生理学分野と、RhoA-ROCKシグナル解析のために和歌山県立医科大学分子医学研究部、Cincinnati Children's Hospital Medical Centerと共同研究を開始し、肺上皮細胞特異的Ror2欠損マウス、肺上皮細胞特異的RhoA欠損マウスの作成を開始した。以上の研究成果から、本研究課題の解明について当初の計画以上に進展しているもの考える。本研究の結果、肺上皮Ptenは細胞老化を制御することにより肺リモデリング疾患の病態制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。今後は上皮Ptenの肺リモデリング疾患病態への病態生理学的意義をさらに解明するため、肺上皮Ptenが与える細胞骨格調節機構への影響を解析する。Ptenノックダウン肺上皮細胞を用い、創傷修復能を解析する。細胞骨格の経時的変化をシリコンローダミンプローブを用いた細胞骨格生細胞イメージングにて解析する。細胞骨格調節蛋白発現変化をウエスタンブロッティングにて測定する。AEC特異的Pten欠損マウスを用い、細胞老化関連シグナル分子の発現動態について、単離AECでのp53, p16Ink4a, p21,p19ARF発現をウエスタンブロッティングと定量RT-PCRにて測定する。肺上皮細胞特異的Ror2欠損マウスと肺上皮細胞特異的RhoA欠損マウスを用い、肺線維症の自然発症の有無、細胞外マトリックス蓄積、AEC細胞骨格変化を解析する。基底膜へのAECの接着とAEC間連結について電子顕微鏡にて解析する。

呼吸器内科学28年度に予定していた遺伝子組換えマウスの導入が、動物実験施設の事情等により延期となったため。遺伝子組換え動物の導入に使用を予定している。該当する遺伝子組換え動物の遺伝子組換え実験計画書、動物実験計画書はいずれも28年度に承認済みである。
運動は歩行・姿勢制御とそれに関与する神経系の老化を抑制・改善できるのか？

運動開始時の年齢が老齢期の移動能力,そして筋と脊髄前角細胞の形態に与える影響をラットに自発走行を課すことで調べた。老齢期における走行距離は,中年齢からの走行運動では増加したが老齢期からのそれでは変化しなかった。また自発走行は最高走行速度は向上させたが,中年齢から開始した方が効果が大きかった。後肢筋の筋湿重量は加齢に伴い減少したが,自発走行は中年齢,高齢期いずれから開始してもこの低下を抑制した。加齢は腰髄前角細胞数を減少させたが,中年齢から自発走行はこの減少を防止した。以上より,運動介入は老齢期における筋の形態を維持改善するとともに,開始時期に依存して脊髄前角細胞の保護にも働くことが示された。雄性Wistarラットを,12または24ヶ月齢まで自然飼育した群(それぞれ12および24ヶ月齢対照群),自然飼育後,22-24ヶ月齢または12-24ヶ月齢の間で回転ケージ内で飼育した群(それぞれ短期および長期運動群)の全4群に振り分けた。これら群の走行能力,筋収縮能力,脊髄前角細胞数を比較し,運動介入による高齢動物の移動能力の変化を検討した。実験終了時,長期運動群は,12および24ヶ月齢の対照群,そして短期介入群より, 1日あたりの走行距離,そして最高走行速度は有意に高い値を示した。一方短期運動群では,1日あたりの距離は12および24ヶ月齢の対照群と変わりなかったが,最高走行速度は有意に高かった。一方,運動介入された群と対照群間で,ひらめ筋と長母指伸筋の電気刺激により発生する筋張力に差はなく,両筋の疲労の特性にも差はなかった。さらに介入期間の違いは,これらの筋機能の特性に影響していなかった。ニッスル染色された腰髄組織切片の評価から,12ヶ月齢対照群より24ヶ月齢対照群の方が脊髄前角細胞が減少していること,この減少は長期運動群で抑制されてることがわかった。短期と長期の運動群間における1日あたりの走行距離の差は呼吸・循環系の能力差と言うことで説明できるかもしれない。しかし,最高走行速度の差は電気生理的な筋機能の差では説明できず,神経系の調整能力の差と推察される。この予想は,今回行ったニッスル染色の結果が支持しているように思われる。以上の結果は,高齢期における運動介入による移動能力の向上は,神経学的な可塑性に基づいている可能性が高いことを示しており,今後,臨床における治療戦略を検討する上での材料となり得る。運動開始時の年齢が老齢期の移動能力,そして筋と脊髄前角細胞の形態に与える影響をラットに自発走行を課すことで調べた.89ヶ月齢のWistar系雄性ラットを購入し,112ヶ月齢まで運動介入を行わなかった群(12 mo SED,n = 8),224ヶ月齢まで運動介入を行わなかった群(24 mo SED,n = 8),322-24ヶ月齢まで回転かごによる自発走行を行わせた群(S-WR,n = 10),412-24ヶ月齢まで自発走行を行わせた群(L-WR,n = 11)の4群に分けた.実験期間中,1日の摂取カロリーは全てのラットで揃えた.SED群について走行能力を調べるため,最期の24時間を回転カゴ内に置いた.最期の24時間において回転カゴ内でラットが走行した距離は,L-WR群では増加したがS-WR群では変化しなかった.また自発走行は最高走行速度は向上させたが,L-WR群の方がより向上していた.ヒラメ筋と長指伸筋の筋湿重量はいずれも12 mo SED群より24 mo SED群で減少していたが,これらの群の値よりS-およびL-WR群のそれは有意に重かった.S-およびL-WR群群間の値に差はなかった.腰髄前角細胞の数は12 mo SED群より24 mo SED群で低値を取ったが,L-WR群の値は24 mo SED群より多くまた12 mo SED群との間に差は見られなかった.以上より,運動介入は老齢期における筋の形態を維持改善するとともに,開始時期に依存して脊髄前角細胞の保護にも働くことが示された.そしてこれらの変化が老齢期における移動能力の改善につながったと予想された.当初の目的として,姿勢および歩行の制御に寄与しているセロトニン作動性のニューロンとその終末の加齢に伴う減少を運動介入が抑制・改善し得るのか調べることを掲げており,これについて現在分析を進めている.運動開始時の年齢が老齢期の移動能力,そして筋と脊髄前角細胞の形態に与える影響をラットに自発走行を課すことで調べた。合計34匹のラットを用いて実験を開始した。

これらの中で,12匹を12ヶ月齢に到達した時点で走行量を記録可能な回転ケージ内で飼育し,24時間連続した運動介入と走行量の記録を行っている。この介入は24ヶ月齢に到達するまで継続される。別の12匹について23ヶ月齢に到達するまで飼育された後,1ヶ月間回転ケージ内での飼育・運動介入が行われる予定である。残りの10匹は対照群として利用される予定である。全てのラットの飼育は摂食量を調整しながら行われている。現時点において,最高齢のラットで19ヶ月齢に到達しているが,死亡した個体はない。当初,加齢に伴う移動能力低下に対する運動介入の効果を分析対象として研究を進めてきた。これに加えて,同じ動物を用いて,加齢に伴う記憶学習能力の低下に対する運動介入の効果についても分析を行い,データが得られつつある。これら研究における生化学的分析は,広島大学ストレス脆弱性克服プロジェクトの協力を持って進めることとなった。同プロジェクトは特にBDNFについての豊富な知識と技術の蓄積を持っておられる。その結果,実験結果の飛躍的な精度向上が見込まれる。さらに,生化学的分析についての労力削減が得られたことから,他の分析や論文作成など成果の公表のための作業に注力できている。また,同じ動物を屠殺する際,骨・筋系の組織を同時に採取し,埼玉県立大学のグループに分析を依頼した。現時点で公表されたデータは非常に限られているが,以後,非常に多面的で豊富なデータを提供できる予定である。本年度11月に最も長期間運動介入が行われる群の飼育と介入が終了し,データ収集と分析が行われる予定である。また本年度3月に短期間運動介入が行われる群の飼育と介入が終了する予定である。これらは当初の予定通りでおおむね順調に実験が進展しているといえる。動物を飼育し運動介入を実施する過程はすでに終了し,動物から得られた検体および行動データを分析しているところである。分析は,運動介入による移動能力,そして記憶学習能力の維持改善の二方面から行う予定である。移動能力に関連した昨年度までの実験と分析から,運動介入が期間依存性に移動能力の低下を防ぐこと,そしてこの効果が筋系というより神経系の可塑性に基づいていることがわかった。そして,神経系の可塑性の高さは,長期の運動介入が腰髄前角細胞の加齢に伴う現象を抑制したことに由来する可能性が示唆された。この運動による脊髄前角細胞の救助はBDNFの発現動態から説明できる可能性がある。また,加齢は脊髄に投射するセロトニンの量を減少させることが知られているが,このセロトニンはBDNFの発現を調整する作用を持っている。運動が脊髄に対するセロトニン支配を維持している可能性がある。以後これらの観点から分析を行う予定である。記憶学習能力に関連した分析では,現時点では運動介入による短期および長期記憶の改善効果をみるための行動評価を行い,そのビデオ解析を行っているところである。加えて脳のゴルジ染色および海馬,前頭前野におけるBDNFの発現動態を生化学的に分析する方向で,連携研究者と協議している。以上の結果について,本年度2回の学会発表,そして2編以上の外国語論文を公表することを予定している。本年度全てのラットの飼育と運動介入が終了し,来年度組織学的および生化学的分析が行われ全ての分析が完了する予定である。これに伴って来年度以降より研究結果の発表を順次行っていく予定である。主に研究結果公表のための学会参加(国際学会),および論文掲載のための費用として研究費を消化する予定である。分析のために必要な試薬等の経費,研究結果の発表のための経費として予算を利用していく予定である。
高圧技術を主とした欠陥制御によるペロブスカイト関連構造高速プロトン伝導体の探索

固体酸化物型燃料電池の低温作動化を目的として、中温域(200-700度)で高いイオン伝導度(>0.01 S/cm)を示すプロトン伝導体を探索する。実用研究がなされているジルコン酸バリウムを基として、ペロブスカイト関連構造に着目する。高圧合成法やパルスレーザー堆積法(PLD法)を用いた欠陥・結晶構造・水和状態の制御により、新規材料開発を行う。
児童・生徒の攻撃的問題行動に対処する教師に望まれる生徒理解の構えと具体的対応

本研究の目的は,中学生の攻撃的問題行動の兆候に対する,教師の意識の向け方についての個人差を明らかにすることであった.関東甲信越地区の28校の公立中学校に依頼を行い(有効回収率は,73パーセント),同意を得た305名の教諭(男性185名,女性120名)から,無記名の調査への協力が得られた.その結果,最も問題とすべき危険な兆候は,「服装や頭髪などの校則違反」や「校外でのトラブル」であることが確認された.ついで,「友人関係のトラブル」,「自己中心的態度の増加」,「教師に対する反抗的言動」,「学校活動に対する意欲低下」,「信頼関係の築きにくさ」,「家庭の事情の悪化」,「感情表出の低下」なども,比較的選択率が高かった.被選択率がきわめて低いのは,「依存傾向」,「学力低下」,「動作の遅さ」,「緊張の強さ」,「落ち着きのなさ」などであった.これら,危険な兆候の選択率において,教職年齢や性別は,関連しなかった.さらに,カイ自乗検定による解析を行った結果,教師の「危機感」の抱き方は,「学校内外でのトラブルや規範逸脱などに対してより強く向かう」タイプ,「自分勝手な言動に対してより強く向かうタイプ」,「意欲や感情表出に強く向かう」タイプに大きくわけられることが示された.本研究は,中学校の生徒および教師を対象として,児童・生徒の攻撃的問題行動そのものに対する受けとめ方や具体的対応,および,さまざまな受けとめ方や対応を,主に調査研究によって明らかにすることを目的とした.まず,平成10年9月までに,新潟市,および村上市の数校の小・中公立高校に対し,調査協力の依頼を行い,同意を得た学校において,予備的調査を行った.内容は,攻撃的・反抗的問題行動発生の状況と,それに主に関わった教師の態度,具体的対応,教師の判断などであった.これと平行して,平成10年10月までに,SPSS統計システムをパーソナルコンピュータにおいて完成させた.調査データは,平成10年11月までに,データ入力,相関分析および重回帰分析などで処理された.また,平成11年1月には,同じ調査対象に対して,追跡調査を行い,平成11年2月末現在,データの入力およびデータの解析中である.上記の研究の結果,対教師ストレスを含む対人関係のストレスと,個人差としての敵意性が,生徒の攻撃的問題行動の発生に大きな影響を及ぼしていることがあきらかになった.本研究の目的は,中学生の攻撃的問題行動の兆候に対する,教師の意識の向け方についての個人差を明らかにすることであった.関東甲信越地区の28校の公立中学校に依頼を行い(有効回収率は,73パーセント),同意を得た305名の教諭(男性185名,女性120名)から,無記名の調査への協力が得られた.その結果,最も問題とすべき危険な兆候は,「服装や頭髪などの校則違反」や「校外でのトラブル」であることが確認された.ついで,「友人関係のトラブル」,「自己中心的態度の増加」,「教師に対する反抗的言動」,「学校活動に対する意欲低下」,「信頼関係の築きにくさ」,「家庭の事情の悪化」,「感情表出の低下」なども,比較的選択率が高かった.被選択率がきわめて低いのは,「依存傾向」,「学力低下」,「動作の遅さ」,「緊張の強さ」,「落ち着きのなさ」などであった.これら,危険な兆候の選択率において,教職年齢や性別は,関連しなかった.さらに,カイ自乗検定による解析を行った結果,教師の「危機感」の抱き方は,「学校内外でのトラブルや規範逸脱などに対してより強く向かう」タイプ,「自分勝手な言動に対してより強く向かうタイプ」,「意欲や感情表出に強く向かう」タイプに大きくわけられることが示された.
Green tide control at Great Lakes using possible grazers

大型底生緑藻の異常繁茂が、世界の多くの海岸や淡水域で発生している。日本でもアオサや糸状藻類の異常繁茂が各地で報告されている。原因として栄養塩の増加など、増える要因を検討するものが多い。本研究ではシオグサ属大型底生緑藻の異常繁茂により湖岸が極端に嫌気的になり、水鳥の大量死など生態系が著しく撹乱されている北米の五大湖で現地調査を行い、なぜ減らないかという観点から検討する。具体的にはシオグサの補食者の状況を確認し、捕食者が存在する場合は捕食しない原因を検討する。捕食者が少ないか不在の場合は、流入河川など周辺水域に緑藻を捕食する動物がいないかなどを調査し、補食者の復元・導入方法について共同研究を行う。
高分解能分光を用いた高分子融体からの変形過程における構造形成のin-situ計測

これまで、超高分子量ポリエチレン(UHMW-PE)の溶融延伸過程における相構造形成メカニズムを、シンクロトロン放射光を用いたin-situ(その場)広角X線回折(WAXD)測定によって検討してきた。そこでさらに、溶融延伸過程におけるin-situ小角X線散乱測定を行うことによって、WAXD測定で得られた六方晶への一時通過的な結晶化と伸び切り鎖結晶への構造発展の相関について総合的に議論した。その結果、UHMW-PEの溶融延伸過程において分子鎖絡み合い特性がその構造形成機構を支配していることが明らかとなった。この分子鎖絡み合い特性が構造形成に及ぼす影響は、UHMW-PE溶融延伸試料の昇温過程におけるin-situ WAXD解析の結果からも確認された。また、高機能材料である超高分子量ポリテトラフルオロエチレンの溶融延伸過程に対してもUHMW-PEと同様のin-situ WAXD計測を適用し、その構造形成メカニズムと力学物性の相関を見積もった。これらの結果から、溶融延伸過程における相構造発展は分子鎖絡み合い変化に代表される非晶鎖の構造変化に誘起されて進行することがわかってきた。そこで、非晶鎖の分子運動性が検知可能な核磁気共鳴(NMR)分光を用いて溶融延伸過程におけるin-situ計測を行うことで、分子鎖絡み合い状態の変化に伴う緩和時間変化の評価を行った。まず、溶融延伸機構と応力検知システムを組み込んだin-situ計測用NMR装置の開発を行った。この装置を用いてUHMW-PEの溶融延伸過程におけるin-situ NMR計測を行ったところ、これまでのX線測定では検知できなかった分子鎖絡み合い状態の程度の違いを見積もることに成功した。これは、成形加工工程における相構造形成メカニズムの解明において非常に有用な手段となると考えられる。
核医学機能画像の高速生成手法に関する研究

本研究では、核医学動態解析において、トレーサの体内での挙動を記述する際に使用されるコンパートメントモデルの高速な同定手法の構築を目的とした。高速なモデル同定が可能となれば従来行われている関心領域を設定してのモデル同定に比べて、遥かに空間分解能の高い画像を得ることが可能となり、より多くの臨床的知見が得られる可能性が考えられる。本研究では、フルオロデオキシグルコース(FDG)を用いた糖代謝に関する速度定数パラメータの画像と、フロマゼニール(FMZ)によるヘンゾジアゼヒンレセプターの分布画像の作成を対象とした。FMZに関しては、線形化によってモデル同定の高速化を図っているLoganplot法と、従来通りの非線形計画方に基づく同定手法の一つである、マルケ-ト法との比較を行った。その結果両法は、正常脳組織、および癲癇の焦点,脳血管障害に起因する損傷部位いずれに対しても、ほぼ同一の結果が得られることを確認した。またシミュレーションによって、様々なモデルパラメータの範囲において同様の検討を行った結果、両法はほぼ一致した。演算時間ではLoganplot法は100倍以上高速であることから、Loganplot法は実用手法として妥当であると言える。FDGに関しては、マルケ-ト法に対して自提案の冗長重み付き積分法を比較した。冗長重み付き積分法は、マルケ-ト法の概ね100倍の速度でコンパートメントモデルの同定が可能であった。しかし一方で、入力データのノイズに対して、結果が数パーセント変動することが確認された。ノイズレベルに対する依存性は、実用上大きな問題であることから、今後の課題である。
原生代前期海水中の銅、亜鉛濃度の推定

前期原生代の地層からは真核生物と解釈される形状化石が複数報告される。この時代は全球的に大気海洋が酸化的になった時代とされており、その大気海洋の酸化に応じて酸化還元鋭敏元素の濃度変化が起こったことが期待される。本研究では真核生物が多量に必要とする銅・亜鉛の海洋内における濃度変遷を調べる事を目的としている。当該時代の海洋の痕跡を保存している岩石を連続採取するために、ガボン共和国フランスヴィル地域周辺にて陸上掘削を行った。掘削場所はフランスヴィルから北西に位置するDoume駅の傍で、この地に産するFD層から下位に向かって75m分の掘削試料を採取した。掘削試料の一時的な保管場所であったフランスヴィル・マスク工科大学へと出張し、掘削試料の記載を行った。その結果、掘削試料は主に砂質岩と有機物に富んだ頁岩から成り、所々に炭酸塩鉱物や硫化物に富んだ地層が含まる事を確認した。一方で、現地で作成した粉末試料を用いた予察的な分析に基づくと、炭酸塩炭素同位体比は同時代他地域と同様の値を示した。この事は、この岩石に対する風化変質の影響は炭酸塩炭素同位体比が保存される程度に低く、またこの岩石が全球的な古環境を反映している事を意味する。日本への岩石試料の輸送も終え、次年度に銅・亜鉛同位体比測定を行う目処が立った。また、太古代から原生代最初期の海洋環境情報を得るべく、当該時代の炭酸塩岩を含む表成岩を採取すべく南アフリカ・バーバートン緑色岩帯でも地質調査を敢行した。主に玄武岩やコマチアイトといった火山岩とそれに付随する炭酸塩岩を採取し、日本への輸送を終えた。今後、海洋やマントルの酸化還元状態に関する情報を得るべく、化学分析を行っていく予定である。元々予定していた計画では、2018年度は(1)ガボンの乾季に陸上掘削を行い、日本へ輸送するのと共に、(2)銅と亜鉛の酸分解後のイオン交換による元素単離手法を確立すること、の2つを目標としていた。陸上掘削試料の輸送に関しては2月までに終えることができたが、元素単離に関しては現状目標を達成するには至っていない。具体的には、亜鉛の単離には成功し、亜鉛同位体比の再現性もある程度保証されるレベルまで洗練された。しかし、銅を、同位体比分析時に干渉して妨害元素となる事が見込まれる鉄やチタンと分けるためには2回のイオン交換が必要で、この2回のイオン交換の際に、試料によっては銅同位体比の再現性が確保されなかった。現在、問題点の洗い出しを行っている最中である。一方で、ガボンにおける地質調査の結果を、日本語の雑誌ではあるが論文化する事ができた。その論文内では、Okloの天然原子炉付近の地層中におそらくまだ誰も記載したことの無いThの硫化物を発見することができた。化学組成から考えて、この鉱物も放射線源として、天然原子炉の稼動に加担していたと考えられる。以上の事から、上記の自己評価をするに至った。今年度の主要な達成目標は堆積岩中の銅・亜鉛同位体比を測定し、化石出現層序前後における銅・亜鉛濃度の復元を行うことである。前年度に日本に輸送した掘削試料からマイクロドリルを用いて粉末試料を作成し、王水にて酸分解を行う。前年度から引き続き、陰イオン交換樹脂AG-MP-1Mを用いて銅と亜鉛を、特に鉄とチタンから分離する手法を確立する。それぞれ単離した銅と亜鉛をUC DavisのMC-ICP-MSを用いて同位体比分析を行う。得られた結果をその他の有機物炭素・窒素同位体比測定結果等と併せ、前期原生代海洋中での銅と亜鉛濃度の変遷を推察する。また、ガボンでの地質調査時に数層準の凝灰岩を発見し、岩石試料を採取してきた。これらからジルコンを分離し、UC DavisにてU-Pb年代測定を行っている。先行研究はコンコーディア曲線から離れた分析点しか得られなかったが、私たちの予察分析においては数粒はコンコーディア曲線上に分析点がプロットされた。これらについても引き続き分析を続け、ガボンの前期原生代地層に対する年代制約も継続して行っていく。これらの成果が得られ次第、順次学会や国際誌にて成果を公表していきたい。前期原生代の地層からは真核生物と解釈される形状化石が報告される。この時代は全球的に大気海洋が酸化的になった時代とされており、その環境移行期において真核生物に必須の海洋中銅・亜鉛濃度の変遷を調べる事を目的としている。その時代の海洋の痕跡を保存している岩石を連続採取するために、ガボン共和国フランスヴィル地域周辺にて陸上掘削を予定している。本年度は当該地域にて8月に10日間ほどの地質調査を行い、掘削場所の選定を行った。掘削場所はフランスヴィルから北西に位置するDoume駅の傍で、この地に産するFD層から下位に向かって掘削試料を採取する予定である。現在いくつかの掘削会社と陸上掘削に関する詳細を摺り合わせている最中である。採取した岩石を日本に持ち帰り、薄片を作成して走査型電子顕微鏡で構成鉱物及び銅・亜鉛のホスト鉱物を調べた。その結果、銅と亜鉛のほとんどは黄鉄鉱や黄銅鉱、閃亜鉛鉱等の硫化物に含まれている事が明らかになった。次年度の化学分析時にはこれら硫化物を酸分解するために王水を用いる方針である。一方で、フランスヴィルの北側に位置するOkondja盆地の堆積岩から新たに化石と思しき構造を発見した。

この化石はフランスヴィル盆地の真核生物と解釈される構造が発見される地層よりも下位の層準から発見され、より古い真核生物化石の痕跡かもしれない。Okondja盆地の地層の堆積年代は貫入花崗岩中のジルコンのU-Pb年代によって制約されているが、ジルコンが非放射改変起源のPbを含むために誤差が大きかった。貫入岩体であるN'Goutou複合岩体から花崗岩を採取し、ジルコンを分離して年代測定を行った。先行研究同様非放射改変起源のPbが多かったが、混合曲線を引く事によってその影響を除外し、2191 +/- 13Maという年代を得る事ができた。この誤差は先行研究の1/10程度である。元々予定していた計画では、昨年度は(1)ガボンの乾季に地質調査を行い、陸上掘削試料を採取する場所を選定する事と、(2)地質調査時に堆積岩を採取して日本に持ち帰り、薄片観察を通して銅と亜鉛のホスト鉱物を特定して酸分解の指針を立てる事、の2つを目標としていた。これらに関しては上述の通り目標を達成する事ができた。これに加えて、Okondja盆地の堆積岩から新たに発見した化石に関する記載は共著ではあるものの国際誌に2報出版された。また、N'Goutou複合岩体中の花崗岩の年代制約に関しても筆頭著者で国際誌に結果を報告する事ができた。当初予定の完遂に加え、化石と年代に関する論文も発表できたことから上記の自己評価をするに至った。前期原生代の地層からは真核生物と解釈される形状化石が複数報告される。この時代は全球的に大気海洋が酸化的になった時代とされており、その大気海洋の酸化に応じて酸化還元鋭敏元素の濃度変化が起こったことが期待される。本研究では真核生物が多量に必要とする銅・亜鉛の海洋内における濃度変遷を調べる事を目的としている。当該時代の海洋の痕跡を保存している岩石を連続採取するために、ガボン共和国フランスヴィル地域周辺にて陸上掘削を行った。掘削場所はフランスヴィルから北西に位置するDoume駅の傍で、この地に産するFD層から下位に向かって75m分の掘削試料を採取した。掘削試料の一時的な保管場所であったフランスヴィル・マスク工科大学へと出張し、掘削試料の記載を行った。その結果、掘削試料は主に砂質岩と有機物に富んだ頁岩から成り、所々に炭酸塩鉱物や硫化物に富んだ地層が含まる事を確認した。一方で、現地で作成した粉末試料を用いた予察的な分析に基づくと、炭酸塩炭素同位体比は同時代他地域と同様の値を示した。この事は、この岩石に対する風化変質の影響は炭酸塩炭素同位体比が保存される程度に低く、またこの岩石が全球的な古環境を反映している事を意味する。日本への岩石試料の輸送も終え、次年度に銅・亜鉛同位体比測定を行う目処が立った。また、太古代から原生代最初期の海洋環境情報を得るべく、当該時代の炭酸塩岩を含む表成岩を採取すべく南アフリカ・バーバートン緑色岩帯でも地質調査を敢行した。主に玄武岩やコマチアイトといった火山岩とそれに付随する炭酸塩岩を採取し、日本への輸送を終えた。今後、海洋やマントルの酸化還元状態に関する情報を得るべく、化学分析を行っていく予定である。元々予定していた計画では、2018年度は(1)ガボンの乾季に陸上掘削を行い、日本へ輸送するのと共に、(2)銅と亜鉛の酸分解後のイオン交換による元素単離手法を確立すること、の2つを目標としていた。
混合アニオンガラス及びその透明ガラスセラミックスの創製と光学特性評価

Ge-S系硫化物ガラスの作製法を検討した。Ga_2S_3-La_2S_3(GLS)硫化物系ガラス及びGa_2S_3-La_2O_3-La_2S_3(GLSO)硫化物/酸化混合アニオン系ガラスを作製し、La_2O_3が光学特性と熱的安定性に及ぼす影響を調べた。GLSOガラスでは、可視の吸収端が若干短波長側へシフトするものの、赤外域での光透過性がLa_2O_3の添加により損なわれる傾向にあった。GLS及びGLSOガラスは同等の屈折率を有する重金属ガリウム酸塩ガラスと比較して、低分散性を示す。この結果は、Laの陰イオン配位数が大きいため、多量に含まれるLa_2O_3及びLa_2S_3によって、屈折率に大きく影響を与えるS^2-及びO^2-イオンの充填率が高くなることに基因するものと考えられる。TTT図と粘度の温度依存性を組み合わせた熱的安定性の評価により、GLSOガラスはGLSガラスに比べて熱的安定性に優れるものと判断される。GLSO系ガラスの結晶化により透明ガラスセラミックスを作製することが可能であった。析出した微結晶は長軸0.51μm、短軸約0.1μmの針状を呈しており、その結晶相はメリライト族ケイ酸塩構造のGa_6La_<3.33>S_<14-X>O_Xであった。Nd^<3+>イオンを含むGLSOガラスの結晶化により得られたガラスセラミックスについて、Nd^<3+>:^4F^<-4>_<3/2>I_<11/2>遷移の発光特性を評価した。GLSOガラスセラミックスにおけるNd^<3+>イオンの発光スペクトルの形状は結晶化により明らかに変化し、析出したGa_6La_<3.33>S_<14-X>O_X中にNd^<3+>イオンが含まれていることを示唆する結果であった。従来のアルミノケイ酸塩ガラスとは異なる、新しい混合アニオンガラス及びその透明ガラスセラミックスを形成するための基礎ガラス系として、高純度Ge-S系及びGe-Ga-S系ガラスの作製法を検討し、ガラス化範囲を決定した。同ガラスの基礎物性としてガラス転移温度、密度および屈折率の組成依存性を評価した。さらに代表的希土類イオンNd^<3+>の溶解性を調べ、少量(5%)のGa及びInの添加が、Ge-S系ガラスへのNd^<3+>の溶解度を増大させることが明らかとなった。Ge-S2元系ガラス(S含有量6075%)の結晶化過程を調査し、初期において比較的大きな結晶(約10μm)が表面と内部に析出するため、同系の透明結晶化ガラスを作製するためには新たに組成の探索が必要であることがわかった。新しい硫化物系ガラスの基礎的な光学特性として、Ga_2S_3-La_2S_3系及びGa_2S_3-La_2O_3系ガラスの屈折率波長分散を評価し、その決定因子を検討した。同系ガラスは可視から近赤外域において比較的高屈折率(2.32.5)で低分散特性を有し、この特性はGa-S結合の共有結合性とLaの高いO^<2->、S^<2->イオン配位数と関連づけられた。

Ga_2S_3系ガラスの結晶化初期過程を調査し、70Ga_2S_3-30La_2O_3混合アニオンガラスを600°C付近で長時間(60時間)熱処理した結果、長軸0.51μm、短軸約0.1μmの針状結晶がランダムな方向に多数析出した透明ガラスセラミックスが得られた。この透明ガラスセラミックス(厚さ約4mm)は、500700nmで透過率3060%を有し、可視域では母ガラスの透過率4070%に比べて劣るものの、26μmの赤外域では70%以上と母ガラスの透過率と同等の値を持つことを示した。70Ga_2S_3-(30 - x)La_2S_<3-x> La_2O_3ガラスの等温熱処理を行い、その結晶化過程を調査した。La_2O_3の含有量が比較的少ないx<5mol%で結晶相としてGa_4La_2S_9が表面から優先的に生成するのに対し、La_2O_3の含有量がx > 5 mol%ではGa_6La_<10/3>S_<14-x>O_xが内部から均一に生成することが認められた。特に70Ga_2S_3-30La_2O_3モル組成の混合アニオンガラスでは、Ga_6La_<10/3>S_<14-x>O_x相が内部から1μm以下の微細な針状結晶の形態で析出するため、等温熱処理条件を変化させ、析出する微結晶のサイズと量の制御を行った。結晶サイズは幅0.10.5μm、長さ0.53μmで制御可能であり、この範囲内であれば巨視的には透明の、いわゆる透明ガラスセラミックスを作製することができた。結晶化初期過程での原子間力顕微鏡(AFM)観察によれば、微結晶の生成前の過程において混合アニオンガラス中で分相の発達が示唆された。調製した透明ガラスセラミックスは、可視光域の500700nmで透過率3060%を有し母ガラスの透過率4070%に比べて劣るものの、26μmの赤外域では母ガラスと同等の70%以上の透過率を持っている。Yb^<3+>及びNd^<3+>の希土類イオンを含有するGa_2S_3-La_2O_3系混合アニオンガラスの等温熱処理により、Ga_6La_<10/3>S_<14-x>O_x微結晶を析出させた透明ガラスセラミックスを作製した。析出したGa_6La_<10/3>S_<14-x>O_x微結晶はGaO-Al_2O_3-SiO_2系のGa_2Al_2SiO_7相と類似のメリライト族ケイ酸塩構造を有する。Nd^<3+>イオンの発光スペクトルは、過去に報告されているNd^<3+>含有Ga_2Al_2SiO_7のものと類似しており、本研究で取り扱った透明ガラスセラミックス中に、Nd^<3+>イオンを含むGa_6(Nd,La)_<10/3>S_<14-x>O_x微結晶が析出していることを指示する結果であった。
新規の化学的歯質接着メカニズムの創出-プレ配置された水素結合の応用-

本年度は,平成18年度の結果を踏まえて,NH...Oをプレ配置した新たなポリマーを合成し,歯質接着性の検討を行った。1.材料の調製Poly(ethylene-maleic anhydride)共重合体に,methoxyethyl amineとisocyanato ethyl methacrylate,またはmethionineを付加反応させたポリマー,ならびにmethacyloyl β-alanineポリマーの三種を作製し,これらを基にして調整した液成分と,FAlSiガラスとを組み合わせて新規のグラスアイオノマーセメントを試作した。2.硬化性および歯質接着強さの検討試作セメントの硬化性を評価したところ,最も良好な硬化性を示したPoly(ethylene-maleic anhydride)にmethionineを付加したポリマーからなる液とFAlSiガラスの組合せでも,硬化時間は約25分であり,市販品に匹敵する硬さは得られなかった。一方,ヒトエナメル質および象牙質への微小引張り接着強さは,Poly(ethylene-maleic anhydride)共重合体とmethoxyethyl amine, isocyanato ethyl methacrylateからなるポリマーにmethacyloyl β-alanineとTEGDMA,クエン酸を添加した液と,CQを配合したFAlSiガラスの組合せが最も高い値を示し,それぞれ2.89±1.38,3.78±1.95MPaであった。市販のFujiIXと比較した場合,エナメル質では有意差が認められず,また,破断様式が主に被験体の凝集破壊であったことから,ある程度の接着性が発揮されているものと考えられた。しかし,機械的強度が低いため界面分析を行うには至らず,接着性の厳密な評価にはさらなる物性の改善が必要であることが示された。提出した計画書に基づいて実験を実施し,以下のような成果が得られた。1.プレ配置した水素結合を含むポリマーの合成と被験材料の調製Poly(ethylene-maleic anhydride)共重合体にmethoxyethyl amineを付加反応させてNH...Oをプレ配置したポリマーリガンドを合成し,さらに,これにIsocyanato ethyl methacrylateを付加して側鎖に二重結合を導入したポリマーを合成した。これらのポリマーと,NH...Oを含むmethacyloyl β-alanine, HEMA, TEGDMA,クエン酸,重合触媒をさまざまな比率で配合することにより五種の液成分を調製し,フルオロアルミノシリケートガラスと組み合わせて従来型およびレジンモディファイドグラスアイオノマーセメントを試作した。2.硬化性の検討試作した各種セメントの硬化性を評価したところ,従来型,光重合型にかかわらず,いずれも硬化体となるには30分以上の時間を必要とし,1時間以上経過した後も,市販のグラスアイオノマーセメントよりも硬度が低かった。3.エナメル質に対する接着強さの測定上記の実験で比較的硬化性が良好であった試作材料について,微小引張り接着試験によりヒト健全エナメル質への接着性を評価した。その結果,側鎖に二重結合を導入したポリマーリガンドに,methacyloyl β-alanine, TEGDMAとクエン酸を添加した液を用いた従来型硬化方式の試作セメントが最も高い接着強さを示したが,市販のレジンモディファイドグラスアイオノマーを上回るほどではなかった。この結果は,試作材料の硬化特性が不十分であることに起因しているものと考えられ,より硬化性にすぐれた材料を得るべく,現在,成分配合比や,触媒の添加法などについて再検討を加えている。
ラン藻oxyR遺伝子のクローニングと解析

大腸菌では過酸化水素によりカタラーゼ遺伝子katGを含む数種類の遺伝子が誘導され、これには転写調節因子OxyRタンパク質が関与している。OxyRは分子内にDNA結合ドメインと酸化還元センサードメインを兼ね備えている。OxyRの199番目のCys周辺のアミノ酸を置換した大腸菌変異株では、OxyRが酸化型に固定されて構成的にカタラーゼ等を高発現し、この株が酸化ストレスに対して抵抗性を増すことが報告されている。他の原核生物でもoxyR相同遺伝子が報告されている。しかしながら植物ではこれに類する系は未だ知られていない。植物は活性酸素分子種により光障害を受けるが、このような制御因子の遺伝子操作を行うことで、活性酸素に対する防御遺伝子群の総合的な発現増加をもたらし光障害を受けにくくすることが可能と考えられる。本研究では、植物からoxyRに相当する遺伝子をクローニングし、その機能を解析することを目標とした。そのための第一歩として、転写制御される側であるカタラーゼ遺伝子をラン藻からクローニングすることを試みた。まず、原核生物katGの塩基配列を元にしてmix primerを合成し、PCR法によりラン藻Synechocystis PCC6803およびSynechococcus PCC7942よりkatG相同遺伝子断片をクローニングした。更にSynechocystis PCC6803においては、この遺伝子断片を用いてゲノミックDNAライブラリーより5′上流の非翻訳領域を含んだ完全長のラン藻katG遺伝子をスクリーニングした。この遺伝子の全塩基配列を決定した結果、ラン藻katGタンパク質は729個のアミノ酸からなり、全体に渡り他の原核生物katGと高い相同性をもつことが明らかになった。今後は、このラン藻katG遺伝子における過酸化水素等の活性酸素による転写調節様式とその機構を調べていくことを予定している。
「ふりかけるだけ」細胞内一分子ナノ計測の提案

本研究では、細胞内の任意の分子の一分子計測を容易に可能にする材料と手法の提供を目的とした。そのために、極めて安定で明るい蛍光ナノ材料、量子ドットに対して、低分子リガンドと特異的共有結合を形成するタグタンパク質を利用した目的分子との特異的結合能の獲得と細胞膜透過性ペプチドを利用した細胞膜透過性の獲得の2点を試みた。前者については目的を達成したものの、後者は導入効率等に課題があったため断念した。しかし、エレクトロポレーション法により低い細胞毒性にて高効率な細胞内導入を可能にすることができた。これにより細胞内におけるミオシンの一分子計測を行うことができ、本研究の目的を達成することができた。細胞内における分子の動きは、あらゆる細胞機能の発現を司る決定的因子の一つであり、その破綻は様々な障害や疾患と直結する。これを高精度に計測することで、分子動態という全く新しい概念に基づく疾患の理解や予測、治療戦略の提供という革新的社会貢献を可能とする。研究代表者らはこれまでに、リサイクリング膜タンパク質に対してその分子動態を計測できる系を確立し、従来の研究手法では得ることのできなかった複数の知見を提示することに成功してきた。本研究では、この手法をさらに細胞内に存在する様々なタンパク質の分子動態計測に適用できる手法へと改良することを目的とし、一分子計測に最適である蛍光ナノ粒子、量子ドットを細胞内に容易に導入するとともに、任意の分子に特異的かつ高親和性に結合させるための手法を開拓する。本年度は、上記の計測を可能とする量子ドットを作製し、これを様々な手法により細胞内に導入して導入効率を検討した。具体的には、低分子リガンドと1:1の特異的共有結合をするタグタンパク質を利用し、量子ドットに低分子リガンドを結合させ、細胞にタグタンパク質を融合した計測対象となる目的タンパク質を外来性に発現させた。そして、様々な手法を用いて細胞内への導入を試み、高効率での細胞内導入と低い細胞毒性を両立できる条件設定に成功した。これにより、現在までに細胞内におけるモータータンパク質の挙動の検出に成功している。現在、量子ドットと低分子リガンドとの結合反応におけるモル比を様々変化させ、分子の挙動を正確に検出するための条件の最適化を進めている。これを高精度に計測することで分子動態という全く新しい概念に基づく疾患の理解や新規治療戦略の開拓等の革新的社会貢献が可能となる。研究代表者らはこれまでに、一分子計測に最適な蛍光ナノ粒子、量子ドットを用いて特定のリサイクリング膜タンパク質に対して細胞内分子動態をナノ計測できる系を確立し、従来の研究手法では得られなかった知見を複数提示することに成功してきた。本研究ではこの手法をさらに細胞内の任意のタンパク質に適用できる手法へと改良することを目的とした。本年度は、昨年度までに成功していた1量子ドットを細胞内に高効率かつ低毒性にて導入できる手法と2計測対象タンパク質に特異的に結合できる能力を獲得させる手法とを組み合わせ、細胞内の複数種のミオシン分子に注目した挙動計測を試みた。その結果、アクチンフィラメント上を動いていると考えられる直線的な挙動を示すミオシン由来と考えられる量子ドット蛍光の動きの検出に成功した。ただし、過去の文献と同様に、そのような挙動を示す量子ドット蛍光の割合はおよそ5%程度であった。また、このときに同時にアクチンフィラメントを可視化できるLifeAct-venusを発現させ量子ドット蛍光と同時に観察することにより、確かに量子ドットがアクチンフィラメント上を運動していることを確認した。さらに、細胞内におけるミオシンの挙動に対するインスリン作用について検証し、現在これらの知見について論文準備中である。交付申請書に記載した本年度遂行予定の項目はほぼ達成した。細胞生理学量子ドットと低分子リガンドとの結合反応におけるモル比を様々変化させ、分子の挙動を正確に検出するための条件の最適化を進めるとともに、細胞内における分子挙動について詳細な計測を進める。比較的量子ドットの作製が順調であり、必要とする試薬量が見込みよりやや少なく済んだことが大きな理由である。作製した量子ドットを利用した細胞における計測が増加することを見込んでいるため、細胞培養のための器具や計測の際の試薬の購入に使用する予定である。