hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内ストレス応答反応の分子メカニズムの解析

神経ペプチドの一種であるニューロテンシンの高親和性受容体(Ntsr1)遺伝子に着目し、発生工学的手法を用いNtsr1遺伝子欠損(Ntsr1KO)マウスの作製を行いその解析を行った。現在までNtsr1KOマウスは、強制水泳ストレス負荷を行うとストレス応答ホルモンであるACTH,コルチコステロンの分泌抑制および、自発運動量の低下が認められていた。また行動学的に明暗試験を行うと、通常マウスは暗所滞在時間が明所滞在時間より長くなるが、Ntsr1KOマウスでは明所に長く滞在する傾向が認められた。今年度は新たに別のストレスパラダイムとして冷温刺激負荷を行った。その結果強制水泳負荷の場合と同じようにストレス負荷後において自発運動量の有位に低下していた。以上の結果より生体内におけるニューロテンシンの高親和性受容体を介する機能として、ストレス反応における脳内応答システムの中で、HPA axis系を調節することが示唆されると共に、情動行動へ関与することが明らかとなった。一方で今年度は生体内ニューロテンシン作動システムのさらなる解明のツールとして、低親和性受容体遺伝子(Nts2r)欠損マウスの作製へ向けて遺伝子クローニングを行うと共に遺伝子の構造を決定し、論文として投稿した。また、発生工学的手法を用いNts2r遺伝子欠損マウスの作製に成功し、現在C57BL/6J系統へのback crossを行っている。神経ペプチドの一種であるニューロテンシンに対する高親和性受容体(Ntsr1)遺伝子に着目し、発生工学的手法を用いNtsr1遺伝子欠損(Ntsr1 KO)マウスの作製を行いその解析を行った。現在までNtsr1 KOマウスは視床下部室傍核小細胞群におけるrVP免疫陽性細胞が顕著に減少している。行動学的解析からストレサーとして強制水泳負荷を行うと、Nts1 KOマウスでは対象マウスと比較して自発運動量の有意な低下を見いだしていた.今年度は、(1)強制水泳ストレス負荷前後におけるストレス応答ホルモンであるACTH,コルシチコステロンの血葉中濃度を内分泌学的に検討した。(2)明暗試験を行うことにより、情動行動の検討を行った。結果(1)強制水泳負荷前では、Ntsr1 KOマウスおよび対象マウスではACTHやコルチコステロンの血葉中濃度に差は認められなかった。通常ストレス負荷後でACTH,コルチコステロンの血葉中濃度は急激な上昇を認められる.強制水泳ストレス負荷後では対象マウスは血漿中ACTH,コルチコステロンの上昇が認められたが、Ntsr1 KOマウスでは前述のストレス応答ホルモンの上昇はほとんど認められず、特にコルチコステロンでは対象マウスと比較して有意分泌減少が認められた。(2)通常マウスは明所より暗所に滞在する時間が長くなるが、Ntsr1 KOマウスは明所へ長く滞在する傾向が認められると共に、暗所と明所を行き来する回数、明所へ進入する試みが対象マウスより多くなる傾向が認められた。以上の結果より生体内における、ニューロテンシンの高親和性受容体を介する機能として、脳内ストレス応答におけるストレス応答ホルモン分泌に関与することが示唆されると共に、情動行動へも関与することが明らかとなった。
人工呼吸離脱の指標としての簡便なP_<0.1>測定装置の開発と臨床応用

気道内圧測定は、Tピースの吸気側と呼気側に1方向弁を着け、Tピースの正中部で行った。気道内圧測定の値から吸気・呼気の判別を行い呼気時に電磁弁が閉じ、吸気を開始して0.15秒後に電磁弁が開放されるようにした。実際のP_<0.1>測定は、圧トランスデューサを介してひずみ圧力用アンプとミニポリグラフ(CP-642G,日本光電)で計測し、マイクロコンピュータ(LCII4M/80,アップルコンピュータジャパン株式会社)にて解析した。電磁弁を用いたこのP_<0.1>測定装置は、電磁弁の開閉に際して、強い甲高い音が発生し、実際の患者のP_<0.1>測定装置としては問題が残った。そこで、現在、バルーン開閉式の装置を用いて、気道閉塞のタイミング、閉塞の時間、吸気呼気の確実な認識の方法を考案中である。なお、P_<0.1>が人工呼吸離脱の指標として有用であることを明確にするために、70例の患者で人工呼吸離脱時のP_<0.1>、最大吸気圧、肺活量、分時換気量、呼吸数、一回換気量を比較検討した。P_<0.1>測定には、電磁弁方式は臨床使用上問題が残ったので、従来の手動による方式を用いた。人工呼吸離脱成功例と失敗例は、P_<0.1>は2.8±0.8cmH_2Oと5.6±1.8cmH_2O(P<0.0001)、最大吸気圧は40±13cmH_2Oと36±9cmH_2O(N.S.)、肺活量633±182mlと754±186ml(N.S.)、分時換気量8.3±31lと10.9±3.3l(P<0.005)、呼吸数20±6回/分と23±5回/分(P<0.05)、一回換気量425±112mlと478±126ml(N.S.)であった。以上の結果は、人工呼吸離脱の指標としては、P_<0.1>が最も信頼でき、次に分時換気量と呼吸数が有用であることを示唆した。この結果は、我々の以前の報告の結果と一致した。本年度のP_<0.1>測定に関する基礎データを基に、今後更にベッドサイドで利用できる簡便なP_<0.1>測定装置の開発を進めるとともに、次世代の人工呼吸器としてP_<0.1>自動制禦式人工呼吸器の開発を計画している。
自動運転技術と協調するスマート交通信号制御に関する研究

自動車交通の発展に伴って交通渋滞が日常的に発生し,様々な社会的問題が発生している.これほど,世界規模で発生し常態化している社会問題は稀であり,多くの人々がこれの解消を願っている.申請者の提案手法は,独自の交通量収支を定義することによりこれらを解決しているだけでなく,交差点ごとの性能評価が可能であったり,同一アルゴリズムで対象区間を拡大できる拡張性を備えている.本研究では,1リアルタイム処理への移行,2対象規模の拡大,3自動運転車との協調による実用性の向上を図る.以上の取り組みが達成されると,国家規模では経済の,個人規模では生活環境の向上に大きく貢献できる.自動車交通の発展に伴って交通渋滞が日常的に発生し,様々な社会的問題が発生している.これほど,世界規模で発生し常態化している社会問題は稀であり,多くの人々がこれの解消を願っている.申請者の提案手法は,独自の交通量収支を定義することによりこれらを解決しているだけでなく,交差点ごとの性能評価が可能であったり,同一アルゴリズムで対象区間を拡大できる拡張性を備えている.本研究では,1リアルタイム処理への移行,2対象規模の拡大,3自動運転車との協調による実用性の向上を図る.以上の取り組みが達成されると,国家規模では経済の,個人規模では生活環境の向上に大きく貢献できる.
唾液キットを用いた小児のストレス計測法の確立

小児の情動変化に関する疫学調査は数多く存在するが、簡便で実用的且つ客観的に情動変化を評価する方法は確立されていない。そこで申請者は、唾液中のストレスマーカーであるクロモグラニンAの濃度変化を指標に小児の外部行動を引き起こす情動変化を客観的且つ簡便に把握するための第一歩として小児の外部行動評価法の仮説モデル、さらに行動評価と心理評価の関連仮説モデルもまた構築した。過去の研究ではストレスとなる歯科処置前後において、唾液中のクロモグラニンA濃度変動に有意差がないとの報告もある。過去の研究は唾液採取時間が各々であることから、本研究ではまず歯科処置を行いストレス負荷後、クロモグラニンA濃度上昇が有意にみられる時間を予備研究として調査している。予備研究において歯科処置前後、患者を時間的に拘束できないため、歯科処置前後の唾液サンプルは家庭で冷凍保存(-18°C)し、冷凍宅急便(-18°C)での郵送後、-80°C保存を予定していたが、成人3人を対象に-18°C下での長時間保存はSDS-PAGE・銀染色実施の結果、10100KDa間のたんぱく質分解を認め、加えてYKO70Human Chromogranin A EIA実施の結果は1時間後にクロモグラニンAの濃度低下を認めたため予備研究はリアルタイムで行うことが必須と判断された。この結果を踏まえて、シーラント処置を行う小児4人を対象にリアルタイムで術前(処置30分前・15分前)・処置直前・処置直後・術後(処置30分後・15分後)に唾液採取を行い、YKO70Human Chromogranin A EIAを実施した結果、3名が処置直前に有意な濃度上昇を認めた。しかし1名は処置直前に有意に濃度低下を認めた。今後は対象人数を増やし、クロモグラニンA濃度変動時間の特定、さらにクロモグラニンA濃度変動パターンを分類し、クロモグラニンA濃度測定と小児の外部行動評価法の仮説モデル、さらに行動評価と心理評価の関連仮説モデルを比較検討し、ストレスを受けやすい小児を判定していく予定である。本研究は唾液中のストレスマーカーであるクロモグラニンAを指標に小児の外部行動を引き起こす情動変化を把握することを目的としている。小児の行動評価はFranklと黒須の分類を用いて評価を行い、黒須の項目の因子分析の結果、3つの因子と11項目が抽出された。そして共分散構造分析の結果、抽出された因子、項目とFranklの分類に相関が有意にあったことから、3因子と11項目を行動評価法の仮説モデルの1つとした。さらに小児の心理評価であるModified Dental Anxiety Scale(MDAS)と黒須の分類との構造的関連性を調査した結果、4因子と13項目が抽出され、MDASと相関があり、行動評価と心理評価の関連仮説モデルの1つとした。過去の研究ではストレスとなる歯科処置前後において、唾液中のクロモグラニンA濃度変動に有意差があるとの報告もある。予備研究において歯科処置前後、患者を時間的に拘束できないため、歯科処置前後の唾液サンプルは家庭で冷凍保存(-18°C)し、冷凍宅急便(-18°C)での郵送後、-80°C保存を予定している。しかし、-18°Cでの長時間保存は唾液の変性(たんぱく質分解)、特にクロモグラニンAの変性を生じさせる可能性があるので、-18°Cそして常温で何時間後に唾液変性を認めるのかを成人3人を対象にSDS-PAGE、銀染色を行った。常温では1時間後に変性を認め、-18°Cでは6日後に変性を認めた。10100KDa間のたんぱく質分解が確認された。今後は5日間-18°Cに保存した唾液において、クロモグラニンAの変動がないかYKO70Human Chromograllin AEIAを使用して調査を行う予定である。

この結果を踏まえて、シーラント処置を行う小児4人を対象にリアルタイムで術前(処置30分前・15分前)・処置直前・処置直後・術後(処置30分後・15分後)に唾液採取を行い、YKO70Human Chromogranin A EIAを実施した結果、3名が処置直前に有意な濃度上昇を認めた。しかし1名は処置直前に有意に濃度低下を認めた。今後は対象人数を増やし、クロモグラニンA濃度変動時間の特定、さらにクロモグラニンA濃度変動パターンを分類し、クロモグラニンA濃度測定と小児の外部行動評価法の仮説モデル、さらに行動評価と心理評価の関連仮説モデルを比較検討し、ストレスを受けやすい小児を判定していく予定である。
浚渫ヘドロを用いた沿岸域ヨシ湿地生態系の創出とその機能評価

本研究では、浚渫ヘドロを利用して、沿岸域でヨシを中心とする湿地を創出する技術を確立すること並びに創出したヨシ湿地生態系が有する水質浄化機能及び利用したヘドロの改良機能を評価することを目的と、ヨシの植栽に必要なヨシを大量に供給する技術並びに浚渫ヘドロへのヨシ植栽及び育成方法に関する検討を行った。・ヨシの種子の発芽試験:淡水産および海水産ヨシの種子を用いて、成型ピ-トモスに蒔いて、温度、栄養塩濃度、光条件、塩分濃度を変化させた時のヨシ発芽率を調べ、ヨシ種子の採取場所の違いによる効果を評価し、以下の結果が得られた。1.低温処理を施した場合、塩分濃度0.5%に希釈した自然海水に浸した系では発芽促進効果が見られた。2.照射条件は発芽促進に効果がなかった。3.種子の発芽率は温度が上がるにつれて高まり、淡水産種子と蒲生干潟産種子の発芽率は26.5°C以上の温度で90%程度で一定となった。4.淡水産種子よりも汽水産種子の方が塩分耐性が強い。・「茎植え」と「苗植え」手法との比較:「苗植え」は「茎植え」に比べ、活着率が良く、活着したものも順調に生育したため、ヨシの移植方法としては確実な方法であると考えられる。さらに、「苗植え」の場合、ヨシの種子を採取するための労力が少なく、採取場所のヨシ湿地を損傷することがないため、既存の湿地生態系への影響が少ない。したがって、ヨシ湿地を人工的に創出するために、大量のヨシを供給し植栽する方法として、種子から発芽生育させた苗を植栽する「苗植え」は実用性が高い方法であると考えられる。
東アジア金融取引市場における担保法の位相

本研究では、日中韓の担保法を専門とする研究者が、いくつかの統一テーマについて、制定法、判例、取引慣行やソフトロー、さらには、公示制度や執行制度を含めた、現地の研究者のみがなしうる広範なリソースの探求を経て、各国の同一の機能を担う担保制度の運用実態を調査した論考を持ち寄り、翻訳論考の検討を前提とした、通訳を介した議論により、異同を詳細に検討する。これにより、第一段階として、各国の地域的取引市場との関係で、担保権が把握する価値ないしその実現過程がどのように違うのかを明らかにする。さらに、第二段階として、各国の異なる取引市場を前提とした共通項でありながら、各国が共通の前提としている大陸法系と異なる運用を抽出することにより、東アジア市場における担保法の位相を明らかにすることを目的とする。かような目的から,本研究は,当課題の研究代表者および研究分担者の国内における研究のみでは進展せず,中国韓国の研究者との連携のもとに進められることになる。本年度は,初年度であったが,助成金の交付内定が12月末,決定が2月と遅い時期であったため,本年度末の現状は,上記の目的に向けた中国韓国の研究者との初会合の準備をしている段階にとどまっている。その準備として,残された2年の研究期間内における共同の研究課題を特にいわゆるアセット・ベースト・レンディング(ABL)などの債務者の事業の流動財産を包括的に担保にとる方法やそれと競合する動産債権担保の利用という取引現象に注目し,その東アジア市場の現状と関連する担保法の位相の検討を行うべきことを提案しており,少なくとも問題意識について,中国・韓国の研究者と問題意識を共有している。当助成金の交付の内定を頂いたのが,2018年12月末,決定を頂いたのが2019年2月であり,すでに研究代表者の所属機関の一般的な会計年度が締め切られた後であったことから,急な対応を行うことになった。そのような緊急対応の主眼として,2019年3月15日から17日にかけて,中国韓国から合計9名の研究者を招聘した研究会議を行う予定であった。しかし,中国側の国内事情により,中国の大学の役職者のVISAの発給基準や申請所要期間等の手続が急に厳格化されたとの連絡があり,上記のような年度末における緊急対応の時間的な制約の厳しさと相俟って,中止を余儀なくされた。同様の内容の研究会議は,2019年9月に予定している。以上のように,助成決定後2か月しか研究期間がないという変則的な初年度を迎えることになり,最大限の努力はしたが,外国の事情による延期という結果になったことから,「やや遅れている」との評価が妥当であると考えている。2019年9月20日から22日にかけて,本研究課題の目的に向けて,中国および韓国から研究者を招聘し,研究代表者と研究分担者との研究会議を実施する。ここで,特にいわゆるアセット・ベースト・レンディング(ABL)などの債務者の事業の流動財産を包括的に担保にとる方法やそれと競合する動産債権担保の利用という取引現象に注目し,その東アジア市場の現状と関連する担保法の位相の検討課題を絞る予定である。さらに,2020年度中には,そのような担保取引およびその法制に関する東アジア市場の特徴を明確にするため,中国および韓国に限らず,アメリカおよびヨーロッパからも研究者を招聘した研究会議を実施する予定であることから,この研究会議に向けた検討課題を本年度中に絞る予定である。

そのような緊急対応の主眼として,2019年3月15日から17日にかけて,中国韓国から合計9名の研究者を招聘した研究会議を行う予定であった。しかし,中国側の国内事情により,中国の大学の役職者のVISAの発給基準や申請所要期間等の手続が急に厳格化されたとの連絡があり,上記のような年度末における緊急対応の時間的な制約の厳しさと相俟って,中止を余儀なくされた。同様の内容の研究会議は,2019年9月に予定している。以上のように,助成決定後2か月しか研究期間がないという変則的な初年度を迎えることになり,最大限の努力はしたが,外国の事情による延期という結果になったことから,「やや遅れている」との評価が妥当であると考えている。2019年9月20日から22日にかけて,本研究課題の目的に向けて,中国および韓国から研究者を招聘し,研究代表者と研究分担者との研究会議を実施する。ここで,特にいわゆるアセット・ベースト・レンディング(ABL)などの債務者の事業の流動財産を包括的に担保にとる方法やそれと競合する動産債権担保の利用という取引現象に注目し,その東アジア市場の現状と関連する担保法の位相の検討課題を絞る予定である。さらに,2020年度中には,そのような担保取引およびその法制に関する東アジア市場の特徴を明確にするため,中国および韓国に限らず,アメリカおよびヨーロッパからも研究者を招聘した研究会議を実施する予定であることから,この研究会議に向けた検討課題を本年度中に絞る予定である。本助成金の交付決定時期が2019年2月であり,研究代表者およびほとんどの分担者が,すでに各所属機関における会計年度の締め切りを過ぎていたこと,および,2019年3月に予定していた中国韓国の研究者との研究会議が中国側のVISAの発給手続等の変更という国内事情により延期になったことが理由である。2019年3月に開催予定であった研究会議と同様の内容の研究会議の実施を2019年9月に開催する。また,その成果を,2020年度内に予定する拡大シンポジウムの実施に発展させるべく,スケジュールを調整し,共同研究を実施する。
実験法による社交不安のイメージ能力の解明と認知機能との関連

2018年度は、社交不安のイメージ能力および一般的なイメージ能力に関する研究を概観しまとめたうえで、社交不安のイメージおよびイメージと非常につながりの強い解釈バイアスの研究を積極的に進めているユトレヒト大学のExperimental Psychopathology LabのElske Salemink准教授と連絡を取り、2019年度の共同研究の計画を進めた。また、これまでの研究結果を論文として積極的に投稿した。社交不安者が社交場面をイメージしたときにネガティブに考えることを解釈バイアスと呼ばれているが、Salemink准教授はその分野において国際的に活躍している研究者の1人である。解釈バイアスは、社交不安者のイメージ能力との関わりが想定されるが、前者が状況に対する1つの回答を導き出すプロセスである一方,後者のイメージは状況に対して複数の回答を提示できる。そのため社交不安者のイメージ能力がどのようにネガティブな解釈バイアスに影響を与えているかはっきりとした結論は得られておらず、Salemink准教授との共同研究でその点を明らかにすることが可能となるだろう。そこで、2019年度はオランダに赴き、彼女と解釈バイアス課題の信頼性の検討をはじめとした研究を進める計画を立てた。投稿論文に関しては、次年度の研究とも関わるワーキングメモリトレーニングの論文を投稿し受理された。これまで、ワーキングメモリの量的なトレーニングばかり検討されてきたが、本論文ではワーキングメモリの質的なトレーニングにも着目し、検討している。またその他にも、これまでの社交不安の注意研究をまとめたレビュー論文など、4本の論文を投稿し、うち2本が査読中である。2018年度は、次年度以降の海外を拠点とした研究計画を立てることが中心となったこと、またこれまでのデータを分析して投稿したり、これまでの自身の研究をまとめてレビュー論文を執筆していたため、結果として本年度の研究自体はやや遅れた。2019年度は研究拠点をオランダに移し、社交不安の解釈バイアスを中心にイメージとの関わりについて明らかにする予定である。既にSalemink准教授と解釈バイアス課題の信頼性の検討に取り掛かっており、秋からは解釈バイアス、イメージ、注意バイアスを交えた研究計画を考えている。予定していた研究の実施が当初より少なくなったこと、また共同研究している大学院生の研究成果発表として旅費をあげていたが、本人の体調不良等が原因で取りやめとなった。そのため、予定よりも使用額が低くなった。2019年度は実験実施に専念し、当初の予定よりも多くの実験参加者を募る予定である。また、引き続き学会に参加し、研究成果を発表する予定である。そのため、当初の予定よりもかかる人件費・謝金、旅費に研究経費をあてる予定である。
動脈硬化プラーク破綻におけるマクロファージ・アポトーシスの役割解明と治療法

1.プラーク破綻モデルマウスの作成本研究において8週間の高脂肪食を負荷したApoE欠損マウスに4週間アンギオテンシンII持続負荷を行うことにより、腕頭動脈に高頻度の急性プラーク破綻(64%,n=11)およびburied fibrous cap(2.8±0.4/個体,n=11)生じるマウスモデルを作成した。2.マクロファージ選択的ナノ粒子の作成マクロファージ選択的に治療因子を導入するため、径200nmのpoly(lactic-co-glycolicacid)(PLGA)ナノ粒子を作成した。FITCを封入したPLGAナノ粒子(FITC-NP)をマウスへ静脈注射したところ、1時間後の末梢血ではCD11b(+)Gr-1(-)の単球に選択的にFITCの取り込みを認めた。また、高脂肪食負荷を行ったApoE欠損マウスにFITC-NPを静脈注射したところ、腕頭動脈・動脈硬化巣内のマクロファージにFITC免疫染色を認め、PLGAナノ粒子が単球、マクロファージ選択的キャリアとなることが示された。3.PPAR-γアゴニストであるピオグリタゾンは、マクロファージにおいてアポトーシスを誘導することが示されている(Thorp, Circulation 2007)。ピオグリタゾンをPLGAナノ粒子に封入し、上記プラーク破綻モデルマウスに対する静脈内投与を行ったところ、4週間後のプラーク破綻の減少を認めた。1)プラーク破綻モデルマウスの作成本研究において8週間の高脂肪食を負荷したApoE欠損マウスに4週間アンギオテンシンII持続負荷を行うことにより、腕頭動脈に高頻度の急性プラーク破綻(64%,n=11)およびburied fibrous cap(2.8±0.4/個体,nニ11)生じるマウスモデルを作成した。従来の動脈硬化プラーク破綻の治療法開発研究では、プラーク破綻率が低く研究期間が長期にわたることなど、適切な動物モデルがないことが問題であった(Schwartz, ATVB2007)。本モデルは比較的短期間に、頻度の高いプラーク破綻を観察できるモデルとなり、今後の応用も期待できる。2)マクロファージ選択的ナノ粒子の作成マクロファージ選択的に治療因子を導入するため、径200nmのpoly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)ナノ粒子を作成した。FITCを封入したPLGAナノ粒子(FITC-NP)をマウスへ静脈注射したところ、1時間後の末梢血ではCDllb(+)Gr-1(-)の単球に選択的にFITCの取り込みを認めた。3)今後の方針本PLGAナノ粒子にアポトーシスを制御する治療因子を導入し、マクロファージ選択的アポトーシス誘導が動脈硬化およびプラーク破綻に与える効果を検討する。1.プラーク破綻モデルマウスの作成本研究において8週間の高脂肪食を負荷したApoE欠損マウスに4週間アンギオテンシンII持続負荷を行うことにより、腕頭動脈に高頻度の急性プラーク破綻(64%, n=11)およびburied fibrous cap(2.8±0.4/個体, n=11)生じるマウスモデルを作成した。2.マクロファージ選択的ナノ粒子の作成マクロファージ選択的に治療因子を導入するため、径200nmのpoly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)ナノ粒子を作成した。また、高脂肪食負荷を行ったApoE欠損マウスにFITC-NPを静脈注射したところ、腕頭動脈・動脈硬化巣内のマクロファージにFITC免疫染色を認め、PLGA

ナノ粒子が単球、マクロファージ選択的キャリアとなることが示された。3. PPAR-γアゴニストであるピオグリタゾンは、マクロファージにおいてアポトーシスを誘導することが示されている(Thorp, Circulation 2007)。ピオグリタゾンをPLGAナノ粒子に封入し、上記プラーク破綻モデルマウスに対する静脈内投与を行ったところ、4週間後のプラーク破綻の減少を認めた。4.今後、治療効果の機序についての検討を進める予定である。
連鎖球菌由来病原因子の分子機構解析と創薬への応用

レンサ球菌が産生する細胞溶解毒素のなかから、膜コレステロール依存性、ヒト特異性、小児川崎病との関連性などに目を向けて機能解析を行った。特に、細菌感染臓器における深部膿瘍形成因子であるコレステロール依存性細胞溶解毒素(CDC)、ヒト細胞にのみ親和性を示し重篤な症状を引きおこすインターメディリシン(ILY)、小児川崎病発症因子の可能性が高いヒト血小板凝集因子(Sm-hPAF)、流産との関連が疑われるバジノリシン(VLY)、を主な題材として、標的細胞認識機構を解析し、感染および症状発現の制御、ならびに、治療薬開発について模索し主に以下の成果を報告した。1)ヒト口腔常在菌Streptococcus anginosusにはβ溶血性を示すサブグループが存在するが、そのβ溶血因子は不明であった。我々は、このβ溶血因子の探索を行い、化膿性連鎖球菌が産生する代表的なβ溶血因子であるStreptolysin-S(SLS)のホモログの存在を明らかにした。興味深いことに、S. anginosusではSLSホモログをコードしている遺伝子が2つタンデムに存在し、それぞれの翻訳産物がβ溶血性に寄与していることが示された。2)ILY、VLY、Sm-hPAFとヒト細胞側受容体(hCD59)との相互作用をvan der Waalsエネルギーなどから解析したところ、ILYのhCD59との相互作用はVLYやSm-hPAFより強いことが示唆された。ILY Arg432がhCD59 Glu76と水素結合を形成し、これを基点としてILYとhCD59は互いに整合性を満たす位置関係をとっていくと考えられた。VLYとhCD59では二つの水素結合が確認され、ILYとhCD59間にある様な柔軟な相互調節はないことが伺えた。また、Sm-hPAFとhCD59間でも二つの水素結合が確認され、VLYと同様な相互作用様式をとると考えられた。3)黄色ブドウ球菌由来プロテインAのIgG結合ドメインであるZを標的化ドメインとし、コレステロール依存性細胞溶解毒素(CDC)とのキメラタンパク質を構築した。精製したキメラタンパク質は、IgG結合性、コレステロール含有リン脂質膜結合性、還元条件下選択的な膜孔形成性など期待された機能を維持しており、さらに抗CEA抗体を結合させたキメラタンパク質はCEA発現細胞への選択的な送達が確認された。以上より、構築したキメラタンパク質を用いたDDSに関して、細胞標的化に関する汎用性の向上が期待された。2.ヒト口腔常在菌Streptococcus anginosusに由来するβ溶血因子の探索を行い、化膿性連鎖球菌が産生する代表的なβ溶血因子であるStreptolysin-S(SLS)ホモログの存在を明らかにした。S.anginosusではSLSホモログをコードしている遺伝子が2つタンデムに存在し、各々の翻訳産物がβ溶血性に寄与することを示した。これら2つの分子SagA1およびSagA2について動的構造を解析したところ、リーダーペプチド領域とプロペプチド領域を有し、分子内に環構造を形成することでリーダーペプチド部分とプロペプチド部分の切断が制御されることが示唆された。特に、細菌感染臓器における深部膿瘍形成因子であるコレステロール依存性細胞溶解毒素(CDC)、ヒト細胞にのみ親和性を示し重篤な症状を引きおこすインターメディリシン(ILY)、小児川崎病発症因子の可能性が高いヒト血小板凝集因子(Sm-hPAF)、流産との関連が疑われるバジノリシン(VLY)、を主な題材として、標的細胞認識機構を解析し、感染および症状発現の制御、ならびに、治療薬開発について模索し主に以下の成果を報告した医歯薬学本研究課題に関わるウェット実験の手技(遺伝子操作や細胞培養、タンパク質の生成・修飾、リガンド設計・合成など)は運用実績があり、操作過程での不具合が生じにくい。また各種ライブラリーも整ってきており、多様な実験に迅速に対応できる体制が出来上りつつある。ドライ実験に関しても、低分子化合物からタンパク質に対応できるツール(分子力学法(MM)、分子動力学法(MD)、分子軌道法(MO)など)が既に備わっており、研究の進捗に会わせてきめ細かい調節が出来る。また、共同研究者、研究協力者らとの定期的な打ち合わせによって、得られた実験データを開示し議論することで、問題点や今後の研究方策が明確になる。これらの理由から、概ね順調に進展している。本研究課題に関わる遺伝子操作や細胞培養、タンパク質の生成・修飾、リガンド設計・合成などのウェット実験の手技は、これまでに運用実績のあるものであり、操作過程での不具合が生じにくい。

またドライ実験に関しても、分子力学法(MM)、分子動力学法(MD)、分子軌道法(MO)などをはじめとして、低分子化合物からタンパク質に対応できるツールが既に備わっており、その運用実績もあって研究の進捗に会わせてきめ細かい調節が出来る。また、共同研究者、研究協力者らと定期的に研究の打ち合わせを行って、それまでに得られた実験データを交換し議論することで、問題点や今後の研究方策が明確になる。これらの理由から、概ね順調に進展している。1)β溶血因子であるStreptolysin-S(SLS)のホモログが活性を発現する際に、構造変化を伴うことをこれまでの解析から予測している。今後は分子内環状構造の形成と活性の関係を明確にする。2)種に特異性を示さない細胞溶解毒素とヒト特異性を示す細胞溶解毒素の分子論的解析をさらに進める。そのかなで、ヒト細胞膜を特異的に認識するツールの開発も平行して試行する。これにより、新規のターゲッティング手法が開発できる可能性がある。3)Streptococcus anginosus以外の菌種、例えば、Streptococcus constellatus subsp. constellatus(SCC)にはβ溶血を示すサブグループが存在するが、この溶血因子が化膿性連鎖球菌などが保有するペプチド性溶血因子であるStreptolysin S(SLS)のホモログとどういう関係にあるかを明らかにした。またこれらの菌グループが産生するβ溶血性Streptolysin-S(SLS)のホモログを探索し、その遺伝子構造と分子機能を明らかにする。ILYとヒト細胞側受容体hCD59との相互作用解析から、VLY、Sm-hPAFの持つ機能特性について見えてきた。VLYおよびSm-hPAFはILYの強力なヒト特異性を100%引き継いでいない変わりに、多種へ感染し生き残る術を獲得したと考えられ、細菌感染症の分子進化を考える上で非常に興味深い。これら毒素の種認識と細胞溶解のバランスについて、さらに詳細に解析しhCD59以外のVLY、Sm-hPAF特異的な受容体を探索する。CDCファミリーやILY、VLY、Sm-hPAFのみならず、細胞膜溶解を伴う細菌感染に関わる因子として、今回発見したβー溶血毒素SLSペプチドの機能についても検証を進める。SLSペプチドの設計を担う遺伝子には、sagAからsagIに至る9つの遺伝子が順に配置されており、そのうちsagA領域がコードする産物がSagA1、SagA2であることが今回明かとなった。これまでの解析からSagB, C, Dはヘテロ環形成に、SagG, H, Iは薬剤排泄に関与し、いずれもStreptococcus anginosus感染症に深く関わっていると考えられることから、より詳細な解析を行う。また、SagE, Fの役割についてもS. anginosusの感染病理を理解する上で重要だと考えている。購入を予定していた解析ツールのバージョンアップのタイミングが年度内に間に合わず、改めて導入について検討を要したため。ヒト細胞特異性に序列を持つタンパク質と受容体の動的相互作用解析から感染症を制御する構造の設計に繋げるべくウエット・ドライ実験系の運用に研究費をあてる。CDCの細胞膜結合能を利用したモジュールの試作を進めるなかで、N末端側領域の回転屈折の制御が細胞膜結合領域の細胞膜への結合に関わることが明かとなった。
転写因子RARγの制御下にある筋肥大誘導因子の同定とその分子機序の解明

転写因子であるレチノイン酸受容体(RAR)はビタミンA(ATRA)をリガンドとして活性化する。ビタミンA前駆体のβ-カロテンを摂取したマウスでは、RARアイソフォームのRARγの活性化を介して骨格筋が肥大(筋量が増加)し、筋力も増加することを発見したが、RARγを介して筋肥大が起こる詳細な分子機構は不明である。今年度はRARγの制御下にある筋肥大誘導因子を同定し、その分子機構を解明することを目的とした。筋肥大誘導因子に関してはRARγに依存して発現が増加し、分泌されるタンパク質がオートクライン的に筋肥大を誘発するとの仮説を立て、まずATRAに応答する遺伝子をRNA-seqにより網羅的に解析し、3倍以上発現が増加した遺伝子を細胞内外のプロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBを利用して解析することで分泌タンパク質の候補としてATRAで最も発現レベルの変動するtransglutaminase 2(TGM2)に注目した。TGM2はβ-カロテンを摂取したマウスのヒラメ筋で発現が増加したが、RARγをノックダウンしたヒラメ筋ではβ-カロテン摂取によるTGM2の発現上昇は抑制された。さらに組み換えTGM2を野生型(Wt-rTGM2)と活性を欠失した変異型(Mut-rTGM2)の2種作製し、各rTGM2存在下で筋管細胞を培養したところ、どちらのrTGM2でも筋管細胞が肥大化した。Wt-rTGM2と同様にMut-rTGM2は筋管細胞におけるタンパク質合成の促進とmTORシグナル因子の活性化を誘発したが、GPCRの一種であるGPR56の発現をノックダウンするとそれらの誘発は消失した。またTGM2による筋管細胞の肥大もGPR56をノックダウンすると抑制された。これらの結果からTGM2はGPR56を介してmTORシグナルを活性化し、タンパク質合成と筋肥大を誘発することが判明した。β-カロテンを摂取することでヒラメ筋が肥大し、筋量が増加することを見出し、その分子機構について検討した。筋肥大に関してはATRAに応答して発現の増加する分泌タンパク質がオートクライン的に骨格筋を肥大化させるとの仮説を立て、ATRA応答遺伝子をRNA-seqにより網羅的に解析し、その後細胞内外のプロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBで解析し、TGM2に注目した。TGM2が細胞外に分泌されることを証明し、さらに組換えTGM2を作製し、TGM2が酵素活性非依存的に筋管細胞を肥大化させ、またmTORシグナルを活性化してタンパク質合成を促進させることを証明した。さらにTGM2による筋肥大には細胞膜の受容体であるGPR56が関与していることを突き止め、RARγによる筋肥大誘発機構におけるTGM2の関与とTGM2による筋肥大誘発機構における情報を得ることができ、順調に進んでいるといえる。一方で、今年度骨格筋でRARγを高発現するマウスを作製してRARγの筋肥大における役割の検討する予定であったが、骨格筋でのRARγの発現が低く、現在条件を検討中である。GPR56を介したTGM2による筋肥大を促進する詳細な分子機構について検討するとともに、GPR56とTGM2が相互作用するとGPR56の構造あるいは細胞膜表面における局在に影響があるのか、また互いのどの領域を相互作用するのに必要とするのかという物理的な解析も行う。さらに人工的に分泌型となる組み換えTGM2を作製し、分泌後にTGM2がGPR56を介して筋肥大することをまずin vitro系で評価する。その後、in vivoにおける評価として、アデノ随伴ウィルスを利用してこの分泌型の組み換えTGM2をマウスの後肢筋で高発現させ、実際に筋肥大を誘発するのか、またin vitroで見出したシグナル伝達系が活性化されているのかを評価することで、分泌されたTGM2の筋肥大機能を証明する。またTGM2によって筋肥大した筋肉が筋力の増加をともなっているのかも合わせて評価する。さらにTGM2のプロモーター領域を解析することで直接RARγによって発現制御されているのかを評価するとともに、RARγのプロモーター領域も解析することでRARγの発現調節機構も明らかにする。一方、筋管細胞においてβ-カロテンがCD36を介して細胞内に取り込まれた後に細胞質以外に核内でも存在することを見出したので、β-カロテン自体がRARγのリガンドとなりうるのかも検討するため、大腸菌でβ-カロテン存在下で組み換えRARγを発現させ、精製し、結合を評価する。申請者はビタミンA前駆体のβ-カロテンを摂取したマウスでは、RARアイソフォームのRARγの活性化を介して骨格筋が肥大(筋量が増加)し、筋力も増加することを発見したが、RARγを介して筋肥大が起こる詳細な分子機構は不明である。骨格筋が量的・質的に向上するために鍵因子となるRARγの役割を明確にするため、本研究ではRARγの制御下にある筋肥大誘導因子を同定し、その分子機構を解明するとともに、RARγ自体の発現制御系も明らかにすることを目的とした。筋肥大誘導因子に関しては、特にRARγに依存して分泌されるマイオカインに着目して研究を進めた。ATRAで刺激した筋管細胞の培養上清は筋管細胞におけるタンパク質合成を促進したので、筋タンパク質の合成に寄与するマイオカインを探索するため、ATRAに応答する遺伝子をRNA-sequenceにより網羅的に解析した。

得られたデータをMagic Suiteで解析し、ATRAにより発現が2倍以上増加した遺伝子を細胞外および細胞内プロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBを利用してさらに解析し、分泌タンパク質の候補を絞った。また発現が10倍以上に増加した遺伝子に関する情報を集め、分泌される可能性のあるものを選別した。これらの上位から組み換えタンパク質を作製し、筋管細胞に及ぼす影響を検討し、transglutaminase 2 (TGM2)が筋管細胞を肥大化させることを見出した。TGM2はAkt、mTOR、p70S6Kのリン酸化を促進し、一方、mTOR、PI3K、Srcに対する阻害剤はTGM2によるmTORとp70S6Kのリン酸化を阻害した。ATRAで刺激した筋管細胞の培養上清は筋管細胞におけるタンパク質合成を促進したので、筋タンパク質の合成に寄与するマイオカインを探索するため、ATRAに応答する遺伝子をRNA-sequenceにより網羅的に解析し、得られたデータをMagic Suiteでさらに解析した。ATRAにより発現が2倍以上増加した遺伝子を細胞外および細胞内プロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBを利用してさらに解析し、分泌タンパク質の候補を絞った。TGM2はβ-カロテンを摂取したマウスのヒラメ筋で発現が2倍に増加していることも確認した。さらにin vitro実験により細胞外のTGM2がタンパク質合成に寄与するmTOR系を活性化することも見出し、シグナル伝達経路についての情報も得ており、順調に進んでいる。一方、今年度骨格筋でRARγを高発現するマウスを作製してRARγの筋肥大における役割の検討を開始している予定であったが、発現ベクターの作製が遅れ、現在、マウスにアデノ随伴ウィルス(AAV)法を用いて骨格筋でRARγを高発現させている最中である。転写因子であるレチノイン酸受容体(RAR)はビタミンA(ATRA)をリガンドとして活性化する。ビタミンA前駆体のβ-カロテンを摂取したマウスでは、RARアイソフォームのRARγの活性化を介して骨格筋が肥大(筋量が増加)し、筋力も増加することを発見したが、RARγを介して筋肥大が起こる詳細な分子機構は不明である。今年度はRARγの制御下にある筋肥大誘導因子を同定し、その分子機構を解明することを目的とした。筋肥大誘導因子に関してはRARγに依存して発現が増加し、分泌されるタンパク質がオートクライン的に筋肥大を誘発するとの仮説を立て、まずATRAに応答する遺伝子をRNA-seqにより網羅的に解析し、3倍以上発現が増加した遺伝子を細胞内外のプロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBを利用して解析することで分泌タンパク質の候補としてATRAで最も発現レベルの変動するtransglutaminase 2(TGM2)に注目した。TGM2はβ-カロテンを摂取したマウスのヒラメ筋で発現が増加したが、RARγをノックダウンしたヒラメ筋ではβ-カロテン摂取によるTGM2の発現上昇は抑制された。
自然言語とコンピュータソフトウェアの基本問題に関する日米協力研究

本調査は,昭和59年秋,当時の森文部大臣と,米国国立科学財団(NSF)のブロック長官の間の話合いのもとで始められた「日米科学技術協力(工学分野)の新展開」プロジェクトのうち,コンピュータソフトウェアに係る研究分野について行われた調査研究(日米ホノルルワークショップ,昭和62年1月12日14日)の成果をふまえ,今回は,ソフトウェアと言語という基礎面に的を絞って,ワークショップ形式で奥の深い研究討論を行うことを目的とする.ワークショップはテーマ別のセッションに分けられ,各セッションでは日本側,米国側からそのテーマを研究している研究者が発表を行い,それについての議論が行われた.少人数のワークショプであったため,かなり詳細で活発な議論ができた.また, 2日目(1月7日)の午後は,スタンフォード大学に場所を移し,ロボット研究などの人工知能関連の研究グループを訪問し,意見を交換した.また,このとき,米国側代表者S.Peters教授が所長をしているCSLI(Center for the Study ofLanguage and Information)への訪問も組まれ,ワークショップには直接参加していない研究者との意見交換もできた.この意見交換の場には, J.Bresnan,M.Kay,T.Winograd,T.Wasow,R.Cohen,D.Israel,J.Barwise,J.Perryなど多くのCSLI研究者が参加し,それぞれのグループに分かれて突っ込んだ意見交換を行った.インフォーマルな雰囲気の中で,本音を言い合う有意義な交流会であった.ワークショップ全体としても,計算言語学,理論言語学,ソフトウェア基礎理論という分野のの異なる研究者が相互の問題意識を議論する中で,共通の興味を発見するという刺激的なものであった.本調査は,昭和59年秋,当時の森文部大臣と,米国国立科学財団(NSF)のブロック長官の間の話合いのもとで始められた「日米科学技術協力(工学分野)の新展開」プロジェクトのうち,コンピュータソフトウェアに係る研究分野について行われた調査研究(日米ホノルルワークショップ,昭和62年1月12日14日)の成果をふまえ,今回は,ソフトウェアと言語という基礎面に的を絞って,ワークショップ形式で奥の深い研究討論を行うことを目的とする.ワークショップはテーマ別のセッションに分けられ,各セッションでは日本側,米国側からそのテーマを研究している研究者が発表を行い,それについての議論が行われた.少人数のワークショプであったため,かなり詳細で活発な議論ができた.また, 2日目(1月7日)の午後は,スタンフォード大学に場所を移し,ロボット研究などの人工知能関連の研究グループを訪問し,意見を交換した.また,このとき,米国側代表者S.Peters教授が所長をしているCSLI(Center for the Study ofLanguage and Information)への訪問も組まれ,ワークショップには直接参加していない研究者との意見交換もできた.この意見交換の場には, J.Bresnan,M.Kay,T.Winograd,T.Wasow,R.Cohen,D.Israel,J.Barwise,J.Perryなど多くのCSLI研究者が参加し,それぞれのグループに分かれて突っ込んだ意見交換を行った.インフォーマルな雰囲気の中で,本音を言い合う有意義な交流会であった.ワークショップ全体としても,計算言語学,理論言語学,ソフトウェア基礎理論という分野のの異なる研究者が相互の問題意識を議論する中で,共通の興味を発見するという刺激的なものであった.
父親への育児支援情報を多角的に発信するサービスシステムの普及に関する研究

本研究の目的の一つである未就学児の父親の育児参加を促す教育プログラムの実践を継続し、評価することでプログラムのエビデンスの向上を図るという点において、2018年8月に2017年度お父さんに役立つ育児セミナーのフォローアップセミナーを行った。また、2018年9月から2019年2月にかけて、お父さんに役立つ育児セミナーの新クール6回(父親に焦点をあてた育児の世話を中心に構成した教育プログラムの実施)を開始し、2019年8月にフォローアップを残して終了した。この新クールでは11組の01歳児の父親、母親、子どもが参加した。大阪市北区の子ども子育てプラザ、クレオ大阪子ども子育て館の地域の子育て支援組織と連携することによって、地域で育児をする父親に育児知識を提供する場、そして父親仲間をつくる場として、毎月1回の6回連続講座を行ったことで形成的評価としては高評価をいただいていると考える(評判が良いということを聞いている)。エビデンスに基づいた教育プログラムの実践という点においては、2019年7月のフォローアップセミナーでの調査をもって、大阪市北区で実施した4年間分セミナー実施回数28回、参加延べ人数250人以上の父親の育児参加というデータが収集できたため、分析を行うことができる。もう1つの研究目的のインターネット上で育児情報を提供するというで点においては、HP"お父さんの育児応援!"を展開させている。育児情報の提供と父親の育児を応援したいという観点で記事を一定の間隔でアップしている。HPでお父さんの育児応援を展開させている。育児情報の提供という観点で記事を一定の間隔でアップしている。2019年度はHPアクセスを増やすことに全力を注ぎたいと考える。HP上で父親のネットワークを作ることも目的の一つだが、こちらは進捗が思う様にいっていないと言える。なぜなら、HP上で仲間を求める父親がみられないことが挙げられる。お父さんに役立つ育児セミナーに参加されている父親方もそれぞれのSNSツールでつながっている現状があるため、HPがネットワークを作るツールとしては適当でないかもしれないという考えに至っている。HPは育児情報を提供するツールとして価値を見出されていると考えられる。この点においては計画の修正が必要である。2019年度は継続してお父さんに役立つ育児セミナーの実践を行う。そして、これまでの教育プログラムの実践で得られたデータ分析を並行して行っていくことで、未就学児(0歳1歳)の父親の育児参加、育児ストレス、夫婦関係などについて分析を行っていく。未就学児の父親への教育プログラムを提供、およびウェブサイト上から育児情報を発信するサービスシステムを普及、発展させるために、1未就学児の父親に対して、地域に根差した教育プログラムを実践し、育児知識や世話技術を提供するとともに教育プログラムの検証を行う。2ウェブサイトから育児期の父親に有益で利用しやすい情報の配信を行い、ウェブサイト自体の量と質を増やし充実させ、普及させる。3父親同士の仲間つくりの場、父親同士のネットワークを広げることを目標にしている。平成29年度は、月1回定期開催【全6回】、フォローアップセミナーの1回を1クールとして行う0歳児の父親を対象とした教育プログラムの実践をフォローアップを除き、6回実践している。教育プログラムの開催は、これまで3年間、同一地域で実施しており、地域の子育て支援関連団体と開催場所の選定、参加者の募集方法や開催時期について、地域に根差したものになるように意見交換を行っている。また、参加した父親とその妻(母)及び対照群父母への質問紙調査を2回実施している。それらのこれまでに収集した質問紙調査からのデータは現在分析中である。ウェブサイト“お父さんの育児応援!"の運営に於いて、「今日の育児情報」、「育児相談Q and A」、「父親育児サークルの活動紹介」などのコンテンツを新たに開設した。併せて、父親向け教育プログラムの内容に伴った育児情報の提供も行っている。ウェブサイト普及の補助ツールとして、Face book、Twitterとウェブサイトとのリンクを貼り、教育プログラムとウェブサイトでの情報提供が循環するようなサービスシステムの普及を目指している。教育プログラムの検証が遅れている、理由として1クールの教育プログラムの参加者がそれほど多くないことから複数クールのプログラムの参加者のデータを利用する必要があり、時間を要している。ウェブサイトから育児期の父親への情報の配信について、配信量にムラがあるため、配信予定を計画し配信量をある程度、一定にする必要がある。

もう1つの研究目的のインターネット上で育児情報を提供するというで点においては、HP"お父さんの育児応援!"を展開させている。育児情報の提供と父親の育児を応援したいという観点で記事を一定の間隔でアップしている。HPでお父さんの育児応援を展開させている。育児情報の提供という観点で記事を一定の間隔でアップしている。2019年度はHPアクセスを増やすことに全力を注ぎたいと考える。HP上で父親のネットワークを作ることも目的の一つだが、こちらは進捗が思う様にいっていないと言える。なぜなら、HP上で仲間を求める父親がみられないことが挙げられる。お父さんに役立つ育児セミナーに参加されている父親方もそれぞれのSNSツールでつながっている現状があるため、HPがネットワークを作るツールとしては適当でないかもしれないという考えに至っている。HPは育児情報を提供するツールとして価値を見出されていると考えられる。この点においては計画の修正が必要である。教育プログラムの検証について、スケジュールを組み直し出来るだけ早急に分析を行う。共同研究者にその旨の周知を行う。ウェブサイトから育児期の父親への情報の配信について、配信情報の内容や量について計画的に行うために、共同研究者とのミーティングを増やし、新たなアイデアを提案し合うことも含め、研究者内での意思疎通と目的意識と達成意識を高める。2019年度は継続してお父さんに役立つ育児セミナーの実践を行う。そして、これまでの教育プログラムの実践で得られたデータ分析を並行して行っていくことで、未就学児(0歳1歳)の父親の育児参加、育児ストレス、夫婦関係などについて分析を行っていく。成果発表における海外学会発表の機会が得られなかったことで、学会に関する旅費に余りが生じた。この余剰については、次年度の成果発表の旅費として計上したいと考える。国際学会等での研究成果発表がなく、研究費の支出が予定より少なくなったため、およびHP宣伝経費を抑えたために支出が少なくなった。2019年度は学会登録費と旅費、HP宣伝経費に研究費を当て、研究計画の遂行を行いたいと考える。