hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
たたき工法による常温固化技術を用いた安心で安全な地盤材料づくり

本研究は日本古来の伝統的な左官技術として知られている「たたき工法」に着想を得て,石灰系微粉体による常温固化技術を用いた安心・安全な地盤材料の開発を行う。天然の地盤材料には見られない付加価値と環境保全に係わる機能を有する地盤材料の実用化および土質安定処理技術の確立が最終目標である。環境にやさしい地盤づくりへの貢献が期待される。近年、地球環境問題が世界共通の問題として認識され、地盤材料においてもセメントなどの人工的材料だけでなく土や石などの天然資源の利用を増やしていくことが求められている。そこで、本研究では土の常温固化技術を利用した「たたき工法」に注目した。「たたき工法」とは、母材となる土に消石灰とにがりを添加し、適量の水と練り混ぜ、締固めたものである。伝統的な左官技術であるたたき工法は、職人の経験と勘により施工されていたため、地盤工学的特性などの詳細は未だ解明されていない。本文では、にがりの代替材として食塩水を用いて、たたき土の地盤工学的特性を評価した。また、たたき工法を利用し、誰でも簡単に作成できる地盤材料の開発を目的として、たたき土をブロック化した「たたきキューブ」を提案し、短期養生におけるたたきキューブの最適な配合と強度を評価した。さらにたたきキューブに付加価値を持たせるために、古くから壁材として使用されている漆喰の利用を検討した。その結果、適度な消石灰を添加することで短期養生でも実用的な強度が得られた。たたき工法はコンクリートのような強度は望めないが、たたき土のより詳細な地盤特性を評価することで、簡便に作成でき、低環境負荷の地盤材料の開発が期待できる。また、漆喰を利用することでたたきキューブの外形の保持や保水性という付加価値を持たせることができた。地盤工学「たたき土」の地盤工学的メカニズムの解明のため,たたき土における養生方法の違い,養生期間,初期含水比が強度に及ぼす影響について検討した.この際,土の密度増加による強度発現の影響を除くために,密度一定の条件下で,たたき土を作成し,一軸圧縮試験を行うことができた。その結果,適切な試料配合設計案を作成し,誰でも簡単に作成でき,短期間で実用的な強度を有する低環境負荷の地盤材料づくりについて,研究の方向性を示した。(1)「たたき土」の地盤工学的メカニズムの解明のため,初期含水比,消石灰の添加量,そして,養生期間がたたき土の強度特性に与える影響を調べた。この際,土の密度増加による強度発現の影響を除くために,密度一定の条件下で,たたき土を作成し,一軸圧縮試験を行うことができた。その結果,適切な試料配合設計案を作成した。(2)たたき土をブロック化した「たたきキューブ」を考案し,誰でも簡単に作成でき,短期間で実用的な強度を有する低環境負荷の地盤材料づくりについて,研究の方向性を示した。(1)たたき土の施工方法の改善提案:たたき土の施工労力の軽減と施工品質の向上を目的として提案している「たたき土キューブ」において,さらなる付加価値を与えること検討し,種々の配合条件のもとで試作を行う。(2)たたき土のタイムカプセル化:たたき土の耐久性を探るには,長期にわたって継続的な強度実験調査を進める必要があると考えられる。そこで,「たたき土キューブ」を観測ヤードに設置し,将来(3年および5年後程度)の室内試験に備えてタイムカプセル化することを検討する。(1)たたき土の施工方法の改善提案:たたき土の施工労力の軽減と施工品質の向上を目的として提案した「たたき土キューブ」において,さらなる付加価値を与えること検討し,種々の配合条件のもとで試作を行う。
悪性脳腫瘍幹細胞のストレス環境下における分裂機構の解明

腫瘍細胞集団に化学療法などの治療が加わると、一時的に腫瘍のかさは小さくなるが、生き残った腫瘍幹細胞が腫瘍細胞集団を再形成するというシナリオが考えられている。そういう観点から、腫瘍を形成する能力を有する腫瘍幹細胞の数をコントロールすることが重要と考えられる。腫瘍幹細胞には2つの分裂様式が考えられていて、一度の細胞分裂で同等の2つの幹細胞を生み出す対称分裂と一つの幹細胞と分化のすすんだ腫瘍細胞を生み出す非対称分裂がある。1つの治療のコンセプトとして、腫瘍のかさを減らすということではなく、腫瘍幹細胞の数をコントロールすることに重きをおくと、腫瘍幹細胞の増殖に不利な非対称分裂を誘導することにより、分化した細胞の多い集団に導くことができる。脳腫瘍幹細胞の幹細胞性を低減する環境として、TGF-βファミリーに属するBone Morphogenetic Protein(BMP)4に着目した。まずBMP4投与環境下において、Glioma stem-like cell(GSLC)の幹細胞性に与える影響について検討した。スフェア培養したGSLCにBMP4を作用させたところ、神経幹細胞マーカー(CD133,Nestin)の発現が低下したことから、BMP4によりGSLCの幹細胞性が損なわれている可能性が考えられた。脳腫瘍幹細胞の幹細胞性に影響を与える環境について、低酸素環境、飢餓環境など検討したが、使用しているGSLCではよい結果が得られなかった。そのため分裂機構について検討するまでに至らなかった。BMP4投与により、スフェア培養したGSLCの幹細胞性が損なわれることが示唆された。特に代表的な神経幹細胞の細胞表面マーカーであるCD133の発現が低下することに着目している。幹細胞性が損なわれている機序として、分裂機構の側面から検討しようと考えており、細胞分裂時のCD133の分布を蛍光顕微鏡で観察することに取り組むこととしている。概ね予定通りに本年度の助成金を使用させていただいた。
光とイオンの同時測定による二次イオン放出機構の基礎的研究

本研究では、二次イオン放出現象が表面状態特にCsや【O_2】の存在によって著しく影響されることに注目し、スパッタリングにおける励起現象のこれら吸着種への依存性について基礎的なデータを収集し二次イオン放出機構の検討を行うことを目的とした。二次イオン放射現象は、試料の雰囲気や一次イオン種によって変わる試料表面の電子構造によって著しく影響をうける。SIMS(SeoordayIon Mass Spectrometry)で陽性元素の分析を行う場合、試料表面に【O_2】などの陰性元素が存在すると正の二次イオン化率が向上し、逆に陰性元素の分析には、Csなどの陽性元素が存在すると負の二次イオン化率が著しく向上することが知られている。これらを試料表面に供給するには、それらをガス状にして直接試料表面へ吸着させるか、それらをイオン化して一次イオン種として用いる方法があるが、本研究では前者に注目して基礎的データの収集を行った。その結果、Cs蒸着下でEHDイオン源からの【Ga^+】およびデュオプラスマトロンからの【Ar^+】により、GaAs基板を照射した際に【As^-】の相対二次イオン強度が数百倍に向上することが確認された。二次イオン生成は、一次イオンビームの照射によって形成される衝突カスケード内での電子的励起、および表面離脱時にうける、表面との相互作用との複合現象における一つの励起過程である。従って、放出イオンの数を調べるだけでなく、同時に放出される光を測定すれば、イオンあるいは中性原子の励起状態に関する知見が得られる筈である。そこで、本研究では既存のSIMS装置にフォトン検出系を付設した。この装置を用いて、デュオプラズマトロンからの【Ar^+】照射下におけるAl試料からの二次イオンとフォトンの同時測定を行った。その結果Al【I】の強度の大きい4本のスペクトルが分解能1Å程度で得られた。
細胞質分裂及び細胞基質間接着のシグナルに関わる蛋白質の構造と機能

本研究では,細胞の秩序だった形態変化とその制御のシグナル伝達を解析するためのモデル系として細胞性粘菌を用い,特に,細胞質分裂及び細胞基質間接着について,シグナル伝達に関わる分子群を同定し,個々の機能及び分子間相互作用の解析を行った上で,最終的には,組換え体タンパク質の発現精製を経てシグナル分子複合体の構造解析を目指している。今年度は,初年度として,個々の分子の同定、機能解析,発現系の構築を中心に研究を進めた。細胞質分裂シグナルに関わるIQGAP様タンパク質GAPAについては,GFP融合タンパク質を用いた細胞内動態の解析から、GAPAが細胞質分裂時に分裂溝に集積することを明らかにした。また,変異GAPAの実験から,GAPAとGAP-related domainで結合する未知タンパク質は、細胞質分裂には必須だが,GAPAの分裂溝集積には必須ではないこと,ミオシンの欠損株を用いた実験から,ミオシンもGAPAの分裂溝集積には必須でないことを明らかにした。一方,低分子量GTPaseのRac1AとRac1Bについて大腸菌での発現・精製系を構築し,GAPAとの弱い結合を明らかにした。また,GAPAの発現・精製系に関しては,大腸菌系では量・質ともに不十分であると判明し,バキュロウイルス-Sf9細胞系の検討に着手した。細胞質分裂に関わるCykAタンパク質に関しては,欠損株の解析から細胞質分裂の終結に関わること,進化上保存されたタンパク質であることを明らかにし,ホモログ分子のクローニングと配列決定を行った。また、大腸菌系による発現を検討中である。細胞基質間接着に関しては、タギング法で得た6株の変異株からタグに隣接した領域のクローニングと部分配列の決定を行ない,そのうちいくつかで,はっきりとしたopen reading frameを見いだした。現在全長cDNAのクローニング中である。
ヒト悪性黒色腫の悪性度に関するアクチン発現変化の意義についての研究

樹立されたヒト悪性黒色腫細胞株4種類より、transfectionの効率の良い細胞株28.1を選び、その細胞株にpSV_2 neoをtransfectionしてネオマイシン抵抗性の細胞株3種のクローンを得た。この3種についてin vitroでの細胞増殖速度および無胸腺マウスでの腫瘍形成能を検討した所、腫瘍形成能に関してはクローン間で差が認められたが、増殖速度はほぼ同等であった。そこでこの細胞株にカルシウムフォスフェイト法を用いてβmアクチン発現ベクター(10-20μg)とpSV_2 neo(1μg)のco-transfectionを行い、ネオマイシン抵抗性のクローンを抗βmアクチン抗体で染色し、解析した。その結果βmアクチン陽性のクローンは認められなかった。他の3種の細胞株に対しても同様にtransfectionを行ったが、βmアクチン陽性のクローンは得られなかった。この結果より、検討した黒色腫細胞株のtransfectionの効率が悪い可能性は残るが、βmアクチンが細胞の増殖を抑えるためにクローン化できないことが示唆された。今後はβmアクチンのプロモーターにinducerを導入し、実際にβmアクチンの発現がヒト悪性黒色腫の増殖を抑制するかどうかを検討する必要がある。また我々は、その他のアクチンとしてα-アクチンにも注目し、ヒトの悪性黒色腫の手術標本においてα-アクチンの発現が減少していることをウエスタンブロットにより明らかにした。そこでさらにα-アクチンの減少の原因を明確にするために14症例の手術標本をα-アクチンの抗体を用いて免疫組織学的に検討した。その結果、α-アクチンは腫瘍中、および周囲の血管に存在すること、また腫瘍のstageが進む程発現量が低下することが観察された。このことよりα-アクチンの発現量の測定はヒトの悪性黒色腫のstage分類に役立つことが示唆された。マウスの悪性黒色腫細胞に対して転移能を抑制することのできるβmアクチンの、ヒト悪性黒色腫に対する効果を調べるために、遺伝子導入を試みた。βmアクチンのcDNAにヒトβ-アクチンのプロモーターを連結して作成した発現ベクター(pHBA)を入手し、大腸菌を用いて増幅、分離、精製した。ヒト悪性黒色腫で、すでにクローン化されて浸潤能・転移能も検証されているUCLAM14株を用い、まずgeneticinかhygromycinで導入細胞の選択が可能かどうか確認するために培地に添加したところ、M14はgeneticin耐性、hygromycin感受性であった。そこでマーカーとしてhygromycin耐性遺伝子を持つpHEBOプラスミドを用い、pHBA10μgに対しpHEBO1μgの割合でリン酸カルシウム法で共沈させ、M14培地に混和した。翌日新鮮培地に交換し、翌々日より14日間hygromycin処理を行った。第一回の導入実験では細胞が全て死滅し導入細胞が得られなかった。第二回の導入後は生存クローンが得られたが継代培養後の蛋白の解析ではβmアクチンを発現していなかった。原因の一つとして,βmアクチンを発現すると、細胞自体が死滅する可能性が考えられるが、これを検討するために2種の別の細胞株(28と33.1)を用い、また耐性遺伝子もgeneticin耐性遺伝子に変更し、引き続き遺伝子導入を行っている。樹立されたヒト悪性黒色腫細胞株4種類より、transfectionの効率の良い細胞珠28.1を選び、その細胞株にpSV_2 neoをtransfectionしてネオマイシン抵抗性の細胞株3種のクローンを得た。

この3種についてin vitroでの細胞増殖速度および無胸腺マウスでの腫瘍形成能を検討した所、腫瘍形成能に関してはクローン間で差が認められたが、増殖速度はほぼ同等であった。そこでこの細胞株にカルシウムフォスフェイト法を用いてβmアクチン発現ベクター(10-20μg)とpSV_2 neo(1μg)のco-transfectionを行い、ネオマイシン抵抗性のクローンを抗βmアクチン抗体で染色し、解析した。その結果βmアクチン陽性のクローンは認められなかった。他の3種の細胞株に対しても同様にtransfectionを行ったが、βmアクチン陽性のクローンは得られなかった。この結果より、検討した黒色腫細胞株のtransfectionの効率が悪い可能性は残るが、βmアクチンが細胞の増殖を抑えるためにクローン化できないことが示唆された。今後はβmアクチンのプロモーターにinducerを導入し、実際にβmアクチンの発現がヒト悪性黒色腫の増殖を抑制するかどうかを検討する必要がある。また我々は、その他のアクチンとしてα-アクチンにも注目し、ヒトの悪性黒色腫の手術標本においてα-アクチンの発現が減少していることをウエスタンブロットにより明らかにした。そこでさらにα-アクチンの減少の原因を明確にするために14症例の手術標本をα-アクチンの抗体を用いて免疫組織学的に検討した。その結果、α-アクチンは腫瘍中、および周囲の血管に存在すること、また腫瘍のstageが進む程発現量が低下することが観察された。このことよりα-アクチンの発現量の測定はヒトの悪性黒色腫のstage分類に役立つことが示唆された。
運動が必要な慢性疾患を持つ高齢者へのMind-Body Wellness介入

今期では、身体機能維持・増進が期待される「運動」の効果を通し、心身共によりよい状態へ変化・成長することである「ウェルネス」を高める介入方法と効果の明確化を目的として文献検討したので、以下に報告する。日本の高齢化は世界に類をみない速さですすみ、高齢者における「元気よく生活できる人」の割合を維持・増進していくことが課題となる。そのため、まず運動の効果について文献検討したところ、適切な運動は体力の維持・増進、そして生活習慣病予防等の効果やメンタル・ヘルス改善にも効果があるとされていた。次に「ウェルネス」に関する文献検討で以下のことがまとめられた。アメリカを中心に、より高いレベルの生活機能に向けた絶えまない変化・成長プロセスである「ウェルネス」が15年来高まってきている。それは高齢者にとって、疾患があっても今の状態を維持・増進し、疾患のない人はよりよい状態になることと考えられる。我が国では「ウェルネス」をキーワードとした研究は少ない。類似する概念の「健康増進」、「健康づくり」をキーワードにしたものでも19872002年で数件であり、対象者は高齢者、肥満女性、地域住民が多く、介入方法は知識提供が多くなっていた。欧米では、その「ウェルネス」をキーワードにした研究は多くみられ、病態や年齢の幅広い対象者に、知識提供、行動療法的介入を組み合わせたプログラムが行われている。介入方法では主に知識提供と行動療法的介入があるが、前者では望ましい行動の維持期間が短いことが多かった。今後は「ウェルネス」の意義や介入方法とその効果の把握を更に行いながら、運動による効果や栄養・休養の知識提供と行動療法的介入を組み合わせた、我が国の高齢者に適するようなプロトコールを検討していく予定である。
肥満と内分泌かく乱物質の乳癌誘発作用についての内分泌学的・免疫毒性学的研究

^*11週令雌ラットをニトロソメチルウレア(NMU、50mg/Kg腹腔内)投与して、6ヶ月および8ヶ月飼育した。解剖時に乳腺に触知可能な腫瘤は認められなかった。組織検索上明らかな異型性を認めなかった。卵巣摘出群に対して、偽手術群は体毛の薄い箇所が見られた。^*11週令ラットを処置した後1週間後、一定量(0.25μL/hr、28日間)の物質を注入できるアルゼットチューブを用いて、(スチレンではチューブが溶解するため)ビスフェノールAをDSMOに溶かして、チューブに充填し4週間の観察を行った。4群に分け偽手術群(DMSO)、卵巣摘出群(DMSOのみ、チューブ内全量でLD50、チューブ内全量で1/10倍量のLD50)として、全例に対して、NMU(50mg/Kg、腹腔内2回投与)を投与した。4週目に安楽死して内分泌かく乱化学物質の内分泌・免疫機能に与える影響を観察した。解剖時異常を認めなかった。胸腺の形状・重量に差はみられなかった。卵巣摘出群でエストラジオールに差は見られなかった。なお体重は各群とも有意な差は認めない。FACSを用いたリンパ球表面マーカー解析(T,B,Th,Ts,NK)において、明らかな傾向は認められなかった。NK細胞傷害性活性は、卵巣摘出群において各群間に差は認められず、偽手術群において有意に高かった。閉経前後において別個の検討が必要であることが示唆された。*乳ガン好発ラットとしてBDII/Hanラットを導入する予定であったが、入荷に時間がかかるために、強力な発癌物質として知られる、ニトロソメチルウレアをラットに投与することにより、腫瘍好発ラットとすることとした。*5週令ラットを卵巣摘出術を施した。1週間後ポジティブコントロールとしてエストラディオール、内分泌かく乱化学物質としてスチレンモノマーをシラスティックチューブに充填してラット背側皮下に留置した。留置3日後に、NMU(ニトロソメチルウレア)を50mg/Kg腹腔内投与した。*4週間後に、乳腺の触診によるの結果明らかな腫瘍成長は認められなかった。乳腺組織を採取し、組織学的検索を行った。未梢血のリンパ球及び脾臓リンパ球の亜分画(T,B,Th,Ts)を当該施設現有の蛍光セルソーターで分析した。明らかな傾向は認められなかった。実験群において同時に測定した、卵胞刺激ホルモン甲状腺刺激ホルモン、エストロゲンには明らかな傾向を認めなかった。*より長期の観察および、ハイカロリー飼料の影響について現在検討を行っている。
量子固体ヘリウム3のラマンスペクトル構造による研究

従来より、我々は量子流体の素励起の動的性質を明らかにする上で、ラマン散乱が非常に有力な実験手段であることを示してきた。最近は、量子固体中の素励起の動的性質を明らかにする目的で、固体ヘリウムについて測定してきている。hcp構造の固体ヘリウム4のラマン散乱実験より得られた知見を以下に示す。測定は試料温度0.71K、1.1cm^<-1>の高分解能で行った。ラマン散乱スペクトルには、1フォノン散乱によるピークが7.39cm^<-1>に観測された以外に、従来の報告では分解能及び温度による困難から1つのブロードなスペクトルとして考えられていたスペクトルが4つのピーク(17.1,20.9,25.2,と約30cm^<-1>)でできていることが得られた。これら4つピークのエネルギーは、理論から計算されたブリルアンゾーン境界のフォノンの2倍のエネルギーと良く対応することから、これらピークは2つフォノンを同時に生成する2フォノン散乱であると結論した。これら以外に、ラマン散乱スペクトルには、高いエネルギー領域に、エネルギーの増加とともに強度が減少するスペクトルの存在も実験的に明らかになった。これらの知見は、Physical Review B誌において公表されている。総合科学部が平成5年3月に移転して以降、実験装置の主要部であるクライオスタットや周辺機器の整備に集中してきており、ようやく完了した。そして、総合科学部と低温センター間のヘリウム回収配管が平成6年3月末に完成するので、これから精力的に量子固体ヘリウム3の実験を行い、格子振動の力の定数、フォノンの分散関係、ゼロ点振動による単一粒子的運動の動的性質を明らかにしていく。
刑事手続への被害者の参加と訴訟構造論に関する研究

まず、昨年度に引き続き、現行法上の被害者保護制度のうち証人尋問における遮へい措置及びビデオリンク方式につき、その合憲性を認めた平成17年の最高裁判所判例及び各種判例評釈の検討を通じて、さらに思索を深めた。その成果の一部は、『判例講義・憲法』(分担執筆)(悠々社)において公刊される予定である(但し、諸般の事情から、同書の刊行時期は未定である)。また、同じく昨年度に引き続き、ドイツやアメリカ等の諸外国の被害者関連施策さらには刑事手続の構造一般に関する文献を多数収集、精読して分析を加え、比較法的研究を行うことにより、各国の刑事手続の基本的構造(ないし手続関与者の役割)と被害者関連施策のあり方との関係を解明しようと努めた。それとともに、平成17年12月に策定された犯罪被害者等基本計画を受けて、平成18年10月より法制審議会刑事法(犯罪被害者関係)部会が開催され、刑事手続において犯罪被害者等の権利利益の一層の保護を図るための法整備に関する審議が開始されたことから、同審議会部会の議事録等を詳細に検討・分析しながら、わが国においてあるべき刑事手続上の被害者関連施策について思索を深めた。これらの研究の具体的成果は、平成18年12月の「刑事司法研究会」において発表したほか、後掲の雑誌論文として公表した。同論文では、被害者関連施策のうちとくに刑事裁判への「直接関与」の制度を中心に考察を行い、同制度と刑事訴訟の基本構造等との関係、同制度導入による被告人の諸権利への影響、同制度を求める被害者のニーズの所在、といった問題点を整理・分析した上で、前記法制審議会部会においても審議された各種の具体的な「直接関与」制度(その一部は法制審の答申を経て策定された「犯罪被害者等の権利利益の保護を図るための刑事訴訟法等の一部を改正する法律案」に盛り込まれている)の効用と弊害を吟味し、それらの導入の当否を検討した。我が国における犯罪被害者をめぐる施策について、まず、現行法上の被害者保護制度に関し、平成17年4月に証人尋問における遮へい措置及びビデオリンク方式の合憲性を認める最高裁判所判例が出されたことから、これを被害者支援・保護と被告人の権利との合理的調整のあり方如何という見地から理論的に分析・検討し、その成果を複数の研究会で発表したほか、別掲の通り判例評釈として公表した。次に、平成17年4月より、犯罪被害者等基本法に基づく犯罪被害者等基本計画検討会が11回にわたり開催され、同年12月に犯罪被害者等基本計画が策定・公表されたことから、同検討会の議事録及び同基本計画を詳細に検討した。これらの研究を通じ、今後の被害者関連施策のあり方、とくに刑事手続への被害者関与のあり方について、一層の多角的・比較法的検討が必要であることを改めて認識するに至った。中でも、上記基本計画においては、「公訴参加制度を含め、犯罪被害者等が刑事裁判手続に直接関与することのできる制度について、我が国にふさわしいものを新たに導入する方向で必要な検討を行」うとされているところ、そこに例示される「公訴参加制度」が「我が国にふさわしいもの」であるか否かについては、同制度と我が国の刑事訴訟の基本構造との関係や全体的な(ありうる)被害者関連施策における同制度の位置づけ(重要度)如何という観点からの慎重かつ綿密な検討が不可欠であると考えられ(なお同基本計画も、「公訴参加制度」が「我が国にふさわしいもの」であると直ちに結論づけるものではないと解される)、このような関心から、諸外国、とりわけ公訴参加制度を有するドイツと、かかる制度を有しないアメリカについて、広く刑事訴訟の構造一般や被害者関連施策全般に関する文献を多数収集し、それらの精読・分析を、相互に比較することも含めて行った。

同論文では、被害者関連施策のうちとくに刑事裁判への「直接関与」の制度を中心に考察を行い、同制度と刑事訴訟の基本構造等との関係、同制度導入による被告人の諸権利への影響、同制度を求める被害者のニーズの所在、といった問題点を整理・分析した上で、前記法制審議会部会においても審議された各種の具体的な「直接関与」制度(その一部は法制審の答申を経て策定された「犯罪被害者等の権利利益の保護を図るための刑事訴訟法等の一部を改正する法律案」に盛り込まれている)の効用と弊害を吟味し、それらの導入の当否を検討した。
水中ハンドエルゴメーター運動を用いた運動処方と評価方法に関する研究

水中運動に関する先行研究は,運動肢が水中であることがほとんどであった.今回,運動肢を水の外に設定することにより,水中にある身体に及ぼす影響を選択的に明らかにする環境設定を考案した.このことによりハンドエルゴメーターを用いた運動処方と評価方法に関する新しい知見を提供できるものと考えた.各被験者に対して,ヘルシンキ宣言の趣旨に沿って研究の目的,方法,期待される成果,不利益がないこと,危険性を十分排除した環境とすることについて十分な説明を行い,研究参加の同意を得た.目的を遂行するために以下の実験を設定した.『・水中と陸上におけるハンドエルゴメーター運動時の腹部大静脈横断面積の比較・水中ハンドエルゴメーター運動における運動強度の違いが腹部大静脈横断面積に及ぼす影響・水中ハンドエルゴメーター運動における水位の違いが腹部大静脈横断面積に及ぼす影響・水中立位時の腹部大静脈横断面積の変化・水中立位における下腿部阻血が腹部大静脈横断面積に及ぼす影響』.本研究は,次の知見を新しい知見として提供する.1.運動時の腹部大静脈横断面積は,陸上条件より水中条件において有意に大きいこと.2.腹部大静脈の形態変化は,水中運動時の運動処方の指標として妥当な評価方法であること.3.水中運動時の静脈還流量の変化は,水位に依存して変化すること.4.同一被験者の静脈還流量は,年間を通してほぼ一定であること.5.水圧下の静脈還流は,秒単位で適応すること.6.足浴は,運動中の血圧変動には大きく関与することはないこと.7.水温40°Cの足浴は,リラクゼーション効果を促進させること.これらの新しい知見を運動処方へ適応すれば,水中運動は,予備の範疇で血液循環に対応できることを示し,負荷強度設定範囲に高い自由度を与えることができることを示唆する.水中運動に関する先行研究は,運動肢が水中であることがほとんどであった.今回,運動肢を水の外に設定することにより,水中にある身体に及ぼす影響を選択的に明らかにする環境設定を考案した.このことによりハンドエルゴメーターを用いた運動処方と評価方法に関する新しい知見を提供できるものと考えた.各被験者に対して,ヘルシンキ宣言の趣旨に沿って研究の目的,方法,期待される成果,不利益がないこと,危険性を十分排除した環境とすることについて十分な説明を行い,研究参加の同意を得た.目的を遂行するために以下の実験を設定した.『・水中と陸上におけるハンドエルゴメーター運動時の腹部大静脈横断面積の比較・水中ハンドエルゴメーター運動における運動強度の違いが腹部大静脈横断面積に及ぼす影響・水中ハンドエルゴメーター運動における水位の違いが腹部大静脈横断面積に及ぼす影響・水中立位時の腹部大静脈横断面積の変化・水中立位における下腿部阻血が腹部大静脈横断面積に及ぼす影響』.本研究は,次の知見を新しい知見として提供する.1.運動時の腹部大静脈横断面積は,陸上条件より水中条件において有意に大きいこと.2.腹部大静脈の形態変化は,水中運動時の運動処方の指標として妥当な評価方法であること.3.水中運動時の静脈還流量の変化は,水位に依存して変化すること.4.同一被験者の静脈還流量は,年間を通してほぼ一定であること.5.水圧下の静脈還流は,秒単位で適応すること.6.足浴は,運動中の血圧変動には大きく関与することはないこと.7.水温40°Cの足浴は,リラクゼーション効果を促進させること.これらの新しい知見を運動処方へ適応すれば,水中運動は,予備の範疇で血液循環に対応できることを示し,負荷強度設定範囲に高い自由度を与えることができることを示唆する.トレッドミル運動を用いると同一負荷様式で陸上と水中を比較することは困難である.しかしながらハンドエルゴメーターを用いれば,運動部位が水面上にあるので陸上と水中において同一運動様式,同一負荷強度下での比較が可能となる。本研究では,陸上と水中におけるハンドエルゴメーター運動時の循環器応答,腎機能,心臓自律神経調節について明らかにすることを目的とした.対象は,心疾患,腎疾患系の疾病歴を有していない健康成人男性8名とした.運動強度は,ハンドエルゴメーターを用いて評価した最高酸素摂取量の60%とした.ペダル回転数は,50rpmとした.それぞれ5分間の安静の後,30分間運動を行い,運動終了後,陸上条件は陸上で,水中条件は水中で,立位での回復を30分間行った.測定項目は,酸素摂取量,心拍数,直腸温,体重および尿成分とした.心臓自律神経調節は,運動前の安静,運動後510分及び2530分を評価した.水温は30°C,水位は剣状突起の高さとした.酸素摂取量ば,2条件間に有意な差を認めなかった.水中条件における安静,運動時及び回復時心拍数は,陸上条件と比較し有意に低値を示した.同様に水中条件における回復時の直腸温は,有意に低値を示した.

水中条件の運動後は,陸上条件と比較し,尿量,電解質排泄量が保たれた,水中条件における回復時LogHFは,陸上条件と比較し有意に高値を示した.以上のことから,水温30°Cにおける同一強度でのハンドエルゴエルゴメーター運動は,水温と静脈環流量の増大などが直腸温の上昇を抑制し,このことが直腸温の回復を促進することが明らかになった.上肢運動による最高酸素摂取量の60%強度の水中運動は,尿量を増加させ,電解質排泄量を保持し,腎の負担が軽滅される可能性が示唆された.水中条件の回復時における心臓迷走神経調節は,陸上条件と比較し早く亢進することが新たに示唆された.水中では生体に水の物性が作用し、陸上とは異なる生理的応答を示すことが広く知られている。静脈還流の促進は水圧作用によるものと理解されている。静脈還流量が増加すれば、静脈に血液が蓄積し、静脈の形態変化に影響を及ぼすものと予測される。腹部大静脈横断面積は、水中立位が陸上立位と比較し有意に大きい値を示すことを明らかにしている。そこで、水中運動時の運動処方の指標として腹部大静脈の形態変化定量が妥当な評価方法であるかを検証した。被験者は、健康成人男性6名(年齢:23±1歳,身長:173±5cm,体重:65±4kg,体脂肪率19±2%)とした。ヘルシンキ宣言に沿ったインフォームドコンセントを行い参加の同意を得て行った。水温は30.5±0.6°C、室温は25.4±0.4°C、湿度は64.7±1.1%であった。ハンドエルゴメーターを用いて、運動負荷(20%,40%,60%V^^・O_2max)を行った。陸上条件と水中条件を設けた。水位は剣状突起とした。心拍数、酸素摂取量および腹部大静脈横断面積を測定した。運動時の心拍数は、40%、60%V^^・O_2maxの時、水中条件が有意に低値を示した。運動後の心拍数は、水中条件がいずれの負荷においても有意に低値を示した。運動時の酸素摂取量は、20%、40%V^^・O_2maxの時、水中条件が有意に高値を示した。運動前後における腹部大静脈横断面積は、水中条件が有意に高値を示し、60%、40%、20%V^^・O_2maxの順にその差が大きかった。これらのことは、運動後の回復期における静脈還流量の変化に運動強度が関わりを持つことを示唆している。これらのことから、運動処方の指標として腹部大静脈の形態変化が妥当な評価方法であることが明らかとなった。
病初期・未治療パーキンソン病における非運動症状と脳機能画像の追跡

新規発症・未治療パーキンソン病患者52例を、18か月間前向きに運動症状、運動合併症、非運動症状を追跡した。27例では前駆非運動症状を認めた。40例では0-22ヶ月後に薬物治療が開始され、12例では未治療のままであった。3例では両側性の発症であったが49例では片側性の発症であり、49例中31例は15ヶ月後に両側性となった。この頃には、27例で運動症状出現後の最初の非運動症状が出現した。約40%の症例ではドパミン作動性神経系以外から病態が始まり、ドパミン作動性神経系における病態の進展は一様ではなく、運動症状が両側性になる頃には、コリン作動性神経系などのほかの神経系にも病態が更に進展した。病初期かつ薬物的に未治療のパーキンソン病患者の登録を開始した。1、各症例の運動症状、運動合併症、非運動症状をvalidateされた各種スケールで評価を行い、各症例間での比較を開始した。2、ドパミントランスポーターSPECTの撮像を行い、解析を開始した。3、MRI拡散テンソル画像の撮影を準備している。4、健常人コントロールの登録を開始した。以上の解析結果の一部を、第55回日本神経学会学術大会(福岡市)で発表した。病初期かつ薬物的に未治療のパーキンソン病患者の登録を行って、以下の検討を行っている。1、MDS-UPDRS、BDI、アパシースケール、ハミルトン不安スケールなど、この領域でvalidateされている評価スケールを用いて、各症例の運動症状、運動合併症、非運動症状の評価を行っている。2、各症例のドパミントランスポーターSPECTの撮像を行った。3、一部の症例でのMRI拡散テンソル画像の撮影を行った。4、健常人コントロールの登録を開始している。以上の解析結果の一部を、第55回日本神経学会学術大会(新潟市)と第9回パーキンソン病・運動異常症コングレス(東京)で発表した。MRI拡散テンソル画像とトラクトグラフィーの施行が遅れている。37例の病初期・未治療パーキンソン病患者(男21例、女16例、年齢43-85歳)を登録した。前駆症状の有無とともに、運動症状、運動合併症、非運動症状、衝動性障害の追跡を行っている。運動症状として、片側性から両側性への進展、転倒、すくみ足、構音障害、嚥下障害。運動合併症と入して、ジスキネジアとオン・オフ現象。非運動症状としては、起立性低血圧(ノルアドレナリン系)、不眠、過眠傾向、RBD(コリン系)、抑うつ、不安、アパシー、疲労、痛み(セロトニン系)。衝動性障害としては、DDS、DAWS、ICDの有無を含めた。各項目が出現するまでの期間を測定した。前駆症状のなかで多いものは、嗅覚低下と便秘であった。9例は未だ薬物治療の開始に至らず、28例では薬物治療が開始されてレボドパ換算量は40-534mgであった。運動症状では、23例ですでに両側性となり、5例は転倒を経験した。Hohen-Yahr重症度は1-4度である。運動合併症のなかで、ジスキネジアを呈したものはなく、オン・オフ現象を3例に認めた。非運動症状としては、起立性低血圧(ノルアドレナリン系)を呈したものはおらず、不眠、過眠傾向、RBD(コリン系)を8例、抑うつ、不安、アパシー、疲労、痛み(セロトニン系)を11例に認めた。衝動性障害を呈したものはいない。病初期・未治療パーキンソン病患者が、運動症状と運動合併症の進展程度が明らかになった。また、運動症状が出現してパーキンソン病の診断を受けたのちに、非ドパミン系の症状と考えられる非運動症状を呈するようになる状態が明らかになった。病初期・未治療パーキンソン病患者における前駆症状と、運動症状、運動合併症、非運動症状の進展形式はある程度明らかにすることができている。画像解析がまだ不十分であるところが遅れている。新規発症・未治療パーキンソン病患者52例(発症年齢:43-85歳)を、初診時から前向きに9か月(6-146か月)追跡した。運動症状、運動合併症のほかに非運動症状として、睡眠関連(質問表を用いたRBD、日中の過度の傾眠、不眠)、情緒関連(抑うつ、アパシー、疲労、不安)と痛み、嗅覚低下、便秘、症状を伴う起立性低血圧、日中の頻尿などの出現を追跡した。22例では運動症状発症前に非運動症状を経験し、内訳は便秘11例、日中の頻尿8例、睡眠関連7例、嗅覚低下6例、情緒関連と痛み4例であった。3例が両側対称性の発症であった。40例では2(0-22)か月後に薬物治療が開始され、3例では治療開始後9カ月でON/OFF現象が出現した(LEDD 399mg)。12例ではまだ薬物治療は開始されていない。49例中31例は15(0-138)か月後に両側性となった。15か月後には24例で運動症状出現後の最初の非運動症状が出現し、内訳は情緒関連と痛み15例、睡眠関連4例、便秘4例などであった。

約40%の症例では、黒質-線条体路のドパミン作動性神経「以外」のコリン作動性神経、セロトニン作動性神経、複数のニューロトランスミッター作動性神経からパーキンソン病が始まっていると考えられた。運動症状の出現は90%以上の症例で片側性であり、運動症状の進行は一様ではない。ごく一部の症例において、治療開始後9カ月で運動合併症が生じた。運動症状が両側性になるころに、運動症状出現後の最初の非運動症状が出現する。すなわちコリン作動性神経、セロトニン作動性神経、ノルアドレナリン作動性神経、複数のニューロトランスミッター作動性神経に病変が進展した。新規発症・未治療パーキンソン病患者を追跡して、ドパミン作動性神経、コリン作動性神経、セロトニン作動性神経、ノルアドレナリン作動性神経に病態が進展することを明らかにした。新規発症・未治療パーキンソン病患者52例を、18か月間前向きに運動症状、運動合併症、非運動症状を追跡した。27例では前駆非運動症状を認めた。40例では0-22ヶ月後に薬物治療が開始され、12例では未治療のままであった。3例では両側性の発症であったが49例では片側性の発症であり、49例中31例は15ヶ月後に両側性となった。この頃には、27例で運動症状出現後の最初の非運動症状が出現した。約40%の症例ではドパミン作動性神経系以外から病態が始まり、ドパミン作動性神経系における病態の進展は一様ではなく、運動症状が両側性になる頃には、コリン作動性神経系などのほかの神経系にも病態が更に進展した。MRI拡散テンソル画像とトラクトグラフィーの施行に時間を要しているため。関係者の協力は得られたので、MRI拡散テンソル画像とトラクトグラフィーを順次施行する。さらに症例を増やして、特にMRIの画像解析を進める。パーキンソン病臨床心理士を雇用して、非運動スケールの評価を行うことを検討している。2015年度は外国調査と国際学会出席を見送ったため。前年度は国際学会出席を見送ったため。2014年度は、外国調査と国際学会出席を見送ったため。物品費、その他の費用で使用する予定である。今年度は国際学会に出席することが決定している。2015年度は国際学会への参加を予定している。
尿中輸送体測定を用いた降圧利尿薬オーダーメイド医療の開発

偽性低アルドステロン症II型(PHAII)は、塩分感受性高血圧を呈する遺伝性疾患であり、原因遺伝子としてWNK1及びWNK4に加えて、KLHL3とCullin3が新たに同定された。我々はPHAII変異を持つKLHL3R528H/+ノックインマウスを作製し、変異KLHL3がWNK1、WNK4と結合できず、WNKキナーゼのユビキチン化が減弱し、WNK1及びWNK4の蛋白量が増加し、その結果結果としてWNKシグナルが過剰亢進するためPHAIIが発症することを報告した。その他、血管でのWNKシグナルの働き、KLHL3リン酸化でのWNKシグナル制御、SPAK阻害薬スクリーニングなどの報告を行った。偽性低アルドステロン症II型(PHAII)原因遺伝子としては、WNK1及びWNK4が同定されており、新たにKLHL3とCullin3がPHAIIの原因遺伝子として同定され、ヒトPHAII患者家系と同じ変異を持つKLHL3R528H/+ノックインマウスを作製・解析した。WNKとのKLHL3の結合能が変異によって低下し、腎臓遠位尿細管でWNK1とWNK4の蛋白分解が障害されて、ともに蛋白量が増加し、下流のOSR1/SPAK-NCCリン酸化シグナルが亢進して塩分再吸収が過剰に増加し、PHAIIを呈することを明らかにした(Hum Mol Genet, 2014)。また、血管平滑筋においてKLHL2がWNK3タンパク発現を制御する事がアンギオテンシンIIによる血管収縮のメカニズムの1つである事を報告した(J Am Soc Nephrol. In press)。その他、SPAKによるNCCリン酸化を使用した、SPAK阻害薬のスクリーニングを行い、2つの化合物がSPAK阻害薬として培養細胞とマウスで使用可能である事を明らかにした(J Am Soc Nephrol. 2014)。また、本申請における他の主要項目であった尿中バイオマーカーについては、尿中NCCの検出系は(Am J Physiol Renal Physiol. 2013)に報告、さらに尿中AQP2の検出のためのELISAが報告され使用可能な状態になっている。フロセミドのマーカーとなるべきNKCC2について、有望な抗体で検討したがバンドの検出が困難であり、手技的な改善が必要と考えられた。リンによるWNKシグナル制御については、細胞外のリン濃度によって活性化されるかを検討したが十分には確認できなかった。現在はWNK4ノックアウトマウス腎臓のマイクロアレイで発現が動いたキナーゼがリンによる制御を受けている可能性を検討している。偽性低アルドステロン症2型原因遺伝子として、WNK1及びWNK4が同定されており、新たにKLHL3とCullin3がPHAIIの原因遺伝子として同定されたことから、ヒトPHAII患者と同じ変異を持つKLHL3R528H/+ノックインマウスを作成解析し、WNKがKLHL3と結合して蛋白分解系に取り込まれること、PHAII変異によってWNK蛋白の分解が減ることによって、WNKシグナルが亢進するため発症することを解き明かした(Hum Mol Genet. 2014)。また、質量分析を用いてKLHL3のリン酸化サイトを同定し、PKAとAktによるKLHL3リン酸化がWNK4との結合を制御することを明らかにした。これはインスリンやバゾプレッシンによるWNKシグナル制御の生理的メカニズムの1つであると考えられた(BBRC 2015)。また、WNKはKLHL2/3-CUL3複合体によるユビキチン修飾後、プロテアソームによる分解だけでなく、p62を介した選択的オートファジーによる制御も受けていることを報告した(J Am Soc Nephrol. 2015, Biochem J. 2015)。また、新しいWNKの下流にあるSPAK阻害薬のスクリーニングを行い、報告した(J Am Soc Nephrol. 2015)。尿中輸送体測定はNCCとAQP2は測定可能(AJP. 2013)となったが、NKCC2については測定系の作成を試み、継続中である。腎臓内科WNK1,WNK4,KLHL3,SPAK, OSR1ノックアウトマウス等のWNKシグナルの中心分子のノックアウトマウスを保持しており、リンによる制御の検討を行う。リン負荷によるKLHL3のタンパク修飾の検討を行う。NKCC2検出系の更なる技術的な改善を目指し、使用可能なレベルまでもっていく。
長手方向に断面形状を変化させる押出し加工法に関する研究

前年度の結果より,提案したテーパマンドレルを用いた断面形状を変化させる新しい押出し加工法では,マンドレル先端がテーパ形状であるため,成形品外径がダイス出口直径より小さくなる問題が明らかになった.そこで,成形品外径減少の問題に対して,本加工法においてチョーク付きダイスを用いる方法を提案し,その有効性を検討した.1.マンドレルを移動させていない場合について,ダイスチョーク角が成形品外径・内径に与える影響を実験と有限要素数値シミュレーションにより明らかにした.その結果,ダイスチョーク角がマンドレルテーパ角より大きい場合では,成形品外径がフラットダイスの場合より小さくなり,成形品内径がフラットダイスの場合とほぼ同じになるのに対し,ダイスチョーク角がマンドレルテーパ角より小さい場合では,チョーク角が小さくなるにしたがい,成形品外径がダイス直径に近づき,成形品内径がより大きくなる.2.成形品外径減少改善に効果のあるチョーク付きダイスを用いてマンドレルを移動させた場合に,意図した形状に押出すことが可能であるかを実験的に検討した.そのために,ビレットの非圧縮性を考慮し理論的に求めた成形品長手方向の肉厚分布と,実験により得られた成形品長手方向の肉厚分布を比較した.その結果,チョーク上部で押出されたメタルが,チョーク部に接触するマンドレル速度においては,理論的に求めた成形品長手方向の肉厚分布と,実験により得られた成形品長手方向の肉厚分布は良い一致を示し,意図した形状に押出すことが可能であることを示した.以上のことより,提案した押出し加工法において,成形品外径減少の改善を目的としてチョーク付きダイスを用いることの有効性を明らかにした.先端にテーパ形状を有するマンドレルを,押出しと同時に押出し方向または逆方向に移動させることにより,ダイス面上でのマンドレルの直径を変化させ,成形品内径を長手方向に変化させる新しい押出し加工法の加工特性を明らかにするために,試作した押出し実験装置を用いた実験と,汎用有限要素プログラムLS-DYNA3Dを用いた数値シミュレーションを行った.マンドレル先端のテーパ角,マンドレル最大直径とフローガイド直径が,押出し荷重とマンドレル軸方向に加わる荷重,成形品の内径・外径に与える影響について得られた結果を以下にまとめる.1.マンドレル先端のテーパ角の影響(1)押出し荷重・マンドレル軸方向に加わる荷重はテーパ角の影響を受けない.(2)成形品外径はダイス直径より小さく,テーパ角が大きくなるにしたがい小さくなる.(3)成形品内径はマンドレル直径より小さく,テーパ角が大きくなるにしたがい小さくなる.2.マンドレル最大直径の影響(1)マンドレル軸方向に加わる荷重は,マンドレル最大直径が小さくなるにしたがいマンドレル軸方向の引張力が大きくなる.(2)成形品内径はマンドレル最大直径によらずダイス直径より小さい値をとり,マンドレル最大直径に影響を受けない.(3)成形品内径はマンドレル最大直径によらずマンドレル直径より小さい値をとり,マンドレル最大直径が小さくなるにしたがいマンドレル直径に近づく.3.フローガイド直径の影響(1)フローガイド直径が小さくなるにしたがい押出し荷重は大きくなり,マンドレル軸方向に加わる荷重は僅かに小さくなる.(2)フローガイド直径が大きいとき,フローガイドは成形品内径・外径に影響を与えない.(3)フローガイド直径が小さいとき,フローガイド直径が小さくなるにしたがい成形品内径は大きくなり,成形品外径はダイス直径に近づく.前年度の結果より,提案したテーパマンドレルを用いた断面形状を変化させる新しい押出し加工法では,マンドレル先端がテーパ形状であるため,成形品外径がダイス出口直径より小さくなる問題が明らかになった.そこで,成形品外径減少の問題に対して,本加工法においてチョーク付きダイスを用いる方法を提案し,その有効性を検討した.1.マンドレルを移動させていない場合について,ダイスチョーク角が成形品外径・内径に与える影響を実験と有限要素数値シミュレーションにより明らかにした.その結果,ダイスチョーク角がマンドレルテーパ角より大きい場合では,成形品外径がフラットダイスの場合より小さくなり,成形品内径がフラットダイスの場合とほぼ同じになるのに対し,ダイスチョーク角がマンドレルテーパ角より小さい場合では,チョーク角が小さくなるにしたがい,成形品外径がダイス直径に近づき,成形品内径がより大きくなる.2.成形品外径減少改善に効果のあるチョーク付きダイスを用いてマンドレルを移動させた場合に,意図した形状に押出すことが可能であるかを実験的に検討した.そのために,ビレットの非圧縮性を考慮し理論的に求めた成形品長手方向の肉厚分布と,実験により得られた成形品長手方向の肉厚分布を比較した.その結果,チョーク上部で押出されたメタルが,チョーク部に接触するマンドレル速度においては,理論的に求めた成形品長手方向の肉厚分布と,実験により得られた成形品長手方向の肉厚分布は良い一致を示し,意図した形状に押出すことが可能であることを示した.以上のことより,提案した押出し加工法において,成形品外径減少の改善を目的としてチョーク付きダイスを用いることの有効性を明らかにした.
二酸化炭素固定用高密度培養藍藻の水素生成高活性化に関する糖鎮工学的アプ-チ

再資源化を伴う二酸化炭素(以下CO_2)の排出抑制技術を構成するために本研究では藍藻Synechococuus leopoliensis IAMM-6株を用いてCO_2固定を促す培養条件を探索すると同時に、光合成増殖バイオマスからH_2を生成する反応の速度を向上させるための反応操作条件を次の作業仮説のもとで検討した。作業仮説:“S.lepoliensisのH_2生成にはヒドロゲナーゼが関与し、光合成産物の量よりはむしろ光合成産物の分解反応速度がH_2生成高活性化の主因となる。また、H_2生成に関連した光合成産物の中では貯蔵澱粉が極めて有用であり、澱粉中の蛋白質の分解反応を生起させる条件が澱粉分解反応を始動させる。′′この作業仮説を吟味するためにH_2生成中の細胞死滅反応、澱粉分解(または生成)反応、蛋白質分解(または生成)反応ついて検討を加えた。CO_2固定反応には外部循環式気泡塔(液量:1.2dm^3を試作し用いた。改変Detmer培地を用い、光強度を変え、さらに6%CO_2を含む空気の通気流量を変え光独立栄養増殖実験を行ならびにころ、光強度12klux、ガス空塔速度0.33cm/sとした条件で増殖活性は最も高くなり細胞濃度は1.1g/dm^3に達した。H_2生成反応は嫌気雰囲気下で実施した。反応液の組成、明暗所条件、初期pH値を変化させて反応条件を検討した結果、反応液には改変Detmer培地成分から硝酸塩を除外した液、pHは7.5、暗所反応条件がH_2生成に最も適していることがわかった。この条件ではH_2生成に伴う細胞の死滅が激しく、澱粉の分解および蛋白質の生成が活性化されていることが確認され、作業仮説を支持する実験結果が得られた。最適条件におけるH_2生成反応速度は0.25mol/(m^3・d)に達し工学上極めて有益な知見を得た。
タンパク質複合体内部の距離と角度の変化をリアルタイムで捉える蛍光計測法の開発

分子モーターの動作原理を理解する上で化学-構造-力学の三者共役の理解が不可欠である。回転分子モーターF1-ATPase(以下F1)はその動作原理の解析が最も進んでいる分子モーターの一つであるが、20種以上の結晶構造が解かれたにも関わらずATP結合待ちの構造が同定されておらず、このことが三者共役理解のネックとなっていた。そこで、1分子計測によるATP結合待ち構造の特徴抽出と主成分分析(PCA)による結晶構造の系統的構造比較を用いて、F1のATP結合待ち構造の同定を行い、さらにATP加水分解反応-構造遷移-回転運動の三者共役モデルを提案した。この三者共役モデルを検証するためにF1のサブユニットであるαとβの界面の動きを計測することを目指した。隣り合う2つのαサブユニットとβサブユニットの界面の動きを捉えるために偏光FRET法を考案し、研究を進めた。Cy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成し、αサブユニットにdouble cys変異を導入したF1およびdouble cys変異を導入したβサブユニットを単独で発現・精製し、Cy3-bis-βおよびF1(Cy5-bis-α)を作成した。Cy3-bis-βとF1(Cy5-bis-α)を高塩濃度環境下で混合し、サブユニットの交換反応を起こすことでF1(Cy5-bis-α/Cy3-bis-β)を得た。このF1(Cy5-bis-α/Cy3-bis-β)を用いて1分子偏光FRET計測を行った。まだプレリミナリーな結果だが、αβ界面の動きを反映したと考えられるFRET効率の変化が観察された。現在、計測条件の最適化とデータ解析を進めている。28年度が最終年度であるため、記入しない。F1-ATPase(以下F1)の回転ステップ運動はATP結合に伴う80°ステップと加水分解反応に伴う40°ステップから成る。しかし、F1のATPase cycleにおける構造遷移はまだ解明されておらず、特にATP結合待ちの構造が未解明であった。そこで、ATP結合待ち構造の特徴を捉えることを目的として、FRETと回転の同時計測を行い、F1の回転子γの回転ステップに伴う2つのβサブユニット間の距離変化を計測した。F1を構成する3つのβのうち2つのβ間の距離を計測するので、3通りの距離が計測される。加水分解待ちの停止では、High FRET(FRET効率が約0.8)が1回、Middle FRET(FRET効率が約0.5)が2回起きた。一方で、ATP結合待ちの停止では3回ともMiddle FRETであった。これにより、ATP結合待ち構造と加水分解待ち構造それぞれに固有の構造的特徴が明らかとなった。そこで、本研究と先行研究の知見に基づいてATP結合待ち状態および加水分解待ち状態と結晶構造とを対応させた。ATP結合待ち構造と同定された結晶構造はε抑制状態の結晶構造(PDB 3oaa)であり、加水分解待ち状態と同定した結晶構造はGrand-state structureと呼ばれる結晶構造(PDB 2jdi)であった。つぎに、3oaaおよび2jdiを含む5つの代表的な結晶構造について主成分分析(PCA)による構造比較を行った。F1の固定子α3β3の構造は、βのopen/closeそしてαとβの界面のloose/tightの2つの構造変化で記述(PCA map)することができ、5つの結晶構造から成るPCA mapはATP加水分解反応に沿った構造遷移サイクルを作った。これらの結果から、F1の回転と化学反応と構造遷移の3つの共役関係を説明する包括的なATPase cycleモデルを提案した。FRETと回転の同時計測によりF1の回転子γの回転角度、固定子α3β3の化学状態そして構造遷移というATPase cycleの概要を解明した。固定子α3β3の構造遷移はβのopne/closeとαβ界面のloose/tightで記述できることを示したわけであるが、αとβの界面の動きを直接捉えることがまだできていない。しかし、既存の1分子計測法では、αとβの界面の動きを直接捉えることは難しい。2つの偏光した蛍光間のFRETを利用した偏光FRET法であればαとβの界面の動きを直接捉えられる可能性がある。この偏光FRET法を実現させるには2つの蛍光色素をタンパク質の部位特異的に蛍光修飾した上で偏光させる必要がある。そこで、Cy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成した。収率はやや低いものの、1分子実験に使用するには十分な量を得ることができた。合成したCy3-bis-maleimideを、1つのα-helixに2つのCys変異を導入しているタンパク質に部位特異的に修飾できることを確認した。