hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線や活性酸素が誘発する塩基置換突然変異の由来とその修復酵素の研究

本研究の目的は、チミンのメチル基へのOHラジカルの付加反応によって生じる5-フォルミルウラシル(5-foU)の修復酵素を大腸菌から同定することである。APリアーゼ活性を持つDNAグリコシラーゼはシッフ塩基中間体を形成するが、このときNaBH_4で還元すると、DNAとグリコシラーゼが共有結合するようになる。この反応を利用して、5-foUを含むオリゴヌクレオチドにトラップされる大腸菌のタンパクを同定し、5-foU部位での鎖切断および5-foUによるinvivo突然変異に対する抑制について検討した。大腸菌野生株の抽出液と5-foUを含む二重鎖オリゴヌクレオチド(17-mers)をNaBH_4存在下で反応させると、3種類の異なるタンパクが関与する複合体の形成が観察された。様々のDNA修復酵素欠損株の抽出液を用いたトラッピング反応の結果、大腸菌mutM、nthおよびnei変異株の抽出液では、3種類のタンパクのうちの1つがそれぞれ消失した。大腸菌mutM nthnei変異株では5-foU-DNAにトラップされるタンパクはすべて検出できなかった。さらに、正常なmutM、nth、nei遺伝子を大腸菌mutM nthnei変異株に導入すると、それぞれの変異株の抽出液で検出できなかった複合体の形成が回復した。次に、MutM、NthおよびNeiタンパクを精製した。これらの精製タンパクはNaBH_4存在下で5-foU-オリゴヌクレオチドと複合体を形成することが分かった。さらに、MutM、Nth、Neiタンパクはいずれも、5-foUの部位で二重鎖のオリゴヌクレオチドを切断することを明らかにした。次に、5-foUを含むプラスミドpSVK3を大腸菌のmutM nth neialkA変異株の中で複製させたところ、その突然変異頻度は野生株、alkA株の場合に比べて有意に増大した。これらの結果は、MutM、Nth、Neiタンパクは、大腸菌における5-フォルミルウラシル修復酵素であることを示している。さらに、ヒトhNTH1タンパクが5-foUを含んだオリゴヌクレオチドとシッフ塩基中間体を形成すること、そのオリゴヌクレオチドを切断することが分かった。放射線や活性酸素によって、DNA中のチミンにはいくつかの種類のヒドロペルオキシドが生成する。ヒドロキシルラジカルがメチル基に反応して生じた5-ヒドロペルオキシドはさらに分解して、5-フォルミルウラシルと5-ヒドロキシメチルウラシルを生成する。放射線照射では、5-フォルミルウラシルの生成量はチミングリコ-ル、8-オキソグアニンより多く、5-フォルミルウラシルがチミンの主な酸化的損傷の一つであることを示している。本研究で、鋳型DNA中の5-フォルミルウラシルのin vitroDNA合成への影響について、Klenow fragment、Tth DNAポリメラーゼは鋳型鎖中の5-フォルミルウラシルによって合成停止などの阻害を受けず、その向かい側にdAMPのほかにdCMPを転入することが分かった。この性質はproof-readingの影響を受けない。このことから、細胞内においてDNA中に5-フォルミルウラシルが生じると突然変異の原因となる可能性が示唆された。さらに、5-フォルミルウラシルがin vivoにおいてどのような影響を生物にもたらすか調べた。このために、5-フォルミルウラシルを1カ所だけ含むオリゴヌクレオチドを合成し、それをシャトルベクターpSVK3に挿入した。このプラスミドを大腸菌に複製させ、その生存率をチミンの場合と比較した。さらに、その突然変異頻度と突然変異スペクトルを解析した。5-フォルミルウラシルの修復機構を解明するために。HeLa細胞からcrude extractを調整し、その分画から5-フォルミルウラシル-DNAグリコシラーゼを精製した。酵素活性を測定する基質としては5-フォルミルウラシルを含むオリゴヌクレオチドを用いた。Crude extractの調整、硫安分画、FPLCによる数種類のカラムクロマトの順で精製にほぼ成功している。

さらに、MutM、Nth、Neiタンパクはいずれも、5-foUの部位で二重鎖のオリゴヌクレオチドを切断することを明らかにした。次に、5-foUを含むプラスミドpSVK3を大腸菌のmutM nth neialkA変異株の中で複製させたところ、その突然変異頻度は野生株、alkA株の場合に比べて有意に増大した。これらの結果は、MutM、Nth、Neiタンパクは、大腸菌における5-フォルミルウラシル修復酵素であることを示している。さらに、ヒトhNTH1タンパクが5-foUを含んだオリゴヌクレオチドとシッフ塩基中間体を形成すること、そのオリゴヌクレオチドを切断することが分かった。
糖尿病態に好発するうつ病の分子病態メカニズムと速やかに臨床応用可能な治療法の解明

糖尿病患者のうつ病罹患率は高いことが知られているが、そのメカニズムは解明されていない。そこで本研究では、情動調節機能および脳組織中の代謝物プロフィールに与える糖尿病の影響について検討した。糖尿病マウスの体重は減少しており、血糖値は上昇していた。糖尿病マウスは情動行動と脳組織中の代謝物含有量に明らかな異常を認め、インスリンの処置により改善された。また、こうした異常と関連する生物学的パスウェイとして栄養因子受容体を介するシグナリングカスケードを同定した。以上のことから、糖尿病態下の脳組織では代謝物プロフィールが変化したことにより情動調節機能に障害が生じる可能性が示唆された。糖尿病患者はうつ病の併発率が高く、その結果として血糖コントロールが不良となり、糖尿病慢性合併症の発症率も高くなる。そのため、糖尿病がうつ病を引き起こす分子病態生理を解明し、その治療法を確立することが急務である。申請者は以前から糖尿病モデル動物の脳機能変化に注目し、うつ病発症の要因となるメカニズムの解明を目指してきた。本研究はその一環であり、特に抑うつ症状と関連の深い内側前頭前皮質のセロトニン神経に着目して、糖尿病状態がその機能に与える影響について研究するものである。ICR系雄性マウス(4週齡;日本チャールス・リバー)にストレプトゾトシン(200 mg/kg;Sigma)を尾側静脈内投与し、糖尿病を誘発した。また、溶媒である生理食塩液を同様に処置することで、対照群の動物を作製した。この処置から4日後にウロペーパーIII栄研「3」を用いてマウスの尿糖の有無を評価し、ストレプトゾトシン処置マウスの全例に尿糖が認められることを確認した。薬液処置から14日後にマウスから脳と血液を採取した。凍結した脳組織から薄切片を作製し、セロトニントランスポータータンパク質(SERT)を免疫組織学的手法により染色することでセロトニン神経線維を可視化した。採取した血液はヘパリンを添加することで凝固を阻止し、遠心分離(1000×g、10分、4度)後に上清を採取して血漿サンプルを得た。血漿中グルコース濃度を測定した結果、ストレプトゾトシン処置マウスは対照群と比べ有意に高値を呈したことから、糖尿病を発症したと判断した。また、ストレプトゾトシンを処置した全てのマウスにおいて高血糖を認めた。前頭前皮質スライスにおいて抗SERT抗体により免疫染色を行ったが、バックグラウンド染色が強かった。そのため、実験方法に修正を加えて染色性を改善させる必要がある。昨年度と同様のプロトコールで糖尿病モデルマウスと対照マウスを作製した。ペントバルビタール麻酔下にて採血後にホルマリン灌流固定を施し、脳を摘出し、オーバーナイトの追加固定を行った。この脳組織からビブラトームを用いて薄切片(50μm)を作製し、セロトニントランスポータータンパク質(SERT)を免疫組織学手手法により染色することでセロトニン神経線維を可視化した。採取した血液はヘパリンを加えることで凝固を阻止し、遠心分離(1000×g、10分、4°C)後に上清を採取して血漿サンプルを得た。免疫染色法を浮遊切片染色法に変更し、さらに切片の前処理方法に修正を加えることで、S/N比の高いSERTタンパク質染色像を得ることができた。糖尿病モデルマウスと対照群マウスの内側前頭前皮質におけるSERT陽性神経線維の密度をImage Jにより定量解析した結果、糖尿病モデルマウスでは対照群と比べてSERT陽性神経線維が少ない傾向が認められたが、統計学的な有意差は認められなかった。このことから、糖尿病モデルマウスに認められる行動学的異常は、セロトニン神経線維の形態変化ではなく、機能的変化に起因する可能性が示唆された。昨年度の課題であったセロトニン神経線維の免疫染色法の修正に関して、切片の前処理方法と染色方法を変更することでS/N比の高い染色像を得ることができた。また、病態モデルと対照群との比較を行うことができた。昨年度までと同様に、ストレプトゾトシン(STZ;200 mg/kg)を尾側静脈内投与することで糖尿病モデルマウスを作製した。溶媒である生理食塩液を同様に処置したものを健常対照群とした。STZおよび溶媒処置後5日目および12日目に血糖値を測定した。STZ処置マウスは処置後5日目において3群に分割し、1群には血糖値を下げる用量のインスリンペレットを(H-ins群)、1群にはその半量のインスリンペレットを(L-ins群)、残りの1群にはインスリンを含まないコントロールペレットを背部皮下に挿入した(DM群)。なお、溶媒対照群にはコントロールペレットのみを挿入した(Non-DM群)。STZおよび溶媒処置後13日目において、マウスの自発運動量を測定した。

加えて、STZおよび溶媒処置後14日目において、尾懸垂試験により無動時間を測定した。実験終了後、脳を摘出し、-80°Cで保存した。DM群はNon-DM群と比べて有意な血糖上昇を示した。インスリンの用量依存的に血糖値は低下し、H-ins群の血糖値はNon-DM群とほぼ同等であった。L-ins群の血糖値はDM群と比べて低い傾向はあるものの、Non-DM群と比べて有意に高い血糖値を示した。DM群の自発運動量はNon-DM群と比べて有意に高かった。インスリンは用量依存的に自発運動量を低下させ、H-ins群の自発運動量はNon-DM群とほぼ同程度であった。DM群の無動時間はNon-DM群と比べて有意に増加していた。L-ins群およびH-ins群の無動時間はDM群と比べて有意に減少しており、Non-DM群とほぼ同程度であった。データがまとまり次第、論文を作成し、速やかに投稿する予定である。補助期間の延長により対処する。昨年度までと同様に、ストレプトゾトシン(STZ;200 mg/kg)を尾側静脈内投与することで糖尿病モデルマウスを作製した。溶媒である生理食塩液を同様に処置したものを健常対照群とした。STZおよび溶媒処置後5日目および12日目に血糖値を測定した。STZ処置マウスは処置後5日目において3群に分割し、1群には血糖値を下げる用量のインスリンペレットを(H-ins群)、1群にはその半量のインスリンペレットを(L-ins群)、残りの1群にはインスリンを含まないコントロールペレットを背部皮下に挿入した(DM群)。なお、溶媒対照群にはコントロールペレットのみを挿入した(Non-DM群)。各群から採取したfrontal cortex (FCx)およびhippocampus (Hip)中の代謝物量についてメタボローム解析を行った。分散分析を行った結果、FCxでは15種の代謝物が、Hipでは3種の代謝物が統計学的に有意な変化を認めた。FCxにおいて認められた15種の代謝物についてパスウェイ解析(Ingenuity Pathway Analysis)を行った結果、ある種のキナーゼを介した細胞内情報伝達経路と関連性があることが明らかとなった。そこで、このキナーゼタンパク質(Kinase-A)およびキナーゼを活性化させる基質タンパク質(Substrate-A)のmRNA発現量について定量的PCR法により解析した結果、Substrate-A mRNA発現量はDM群において有意に減少しており、インスリン処置によって改善することを見出した。Kinase-A mRNA発現量は各群の間に有意な差を認めなかった。そこで、western blot法ならびにELISA法によってSubstrate-Aの発現量を解析したが、定量するために必要な測定感度をもって解析することができなかった。糖尿病患者のうつ病罹患率は高いことが知られているが、そのメカニズムは解明されていない。そこで本研究では、情動調節機能および脳組織中の代謝物プロフィールに与える糖尿病の影響について検討した。糖尿病マウスの体重は減少しており、血糖値は上昇していた。糖尿病マウスは情動行動と脳組織中の代謝物含有量に明らかな異常を認め、インスリンの処置により改善された。
脳動脈瘤破裂くも膜下出血後急性期における拡延性抑制の影響に関する検討

脱分極は脱分極を認めない群(type 1)、脱分極を認めるものの80%まで回復する群(type 2)、脱分極したまま回復しない群(type 3)の3つに分類された。組織評価ではtype1は正常であったが、type2と3は脱分極時間に依存して種々の程度の神経障害を認めた。50%の神経障害を引き起こす脱分極時間は22.4分であった。皮質拡散抑制はNADH蛍光画像で可視化することができ、typ1に属した。皮質拡散抑制を認めた組織では神経障害は認めなった。subarachnoidhemorrhage(SAH) modelとして、perforation modelを採用したが、一般に多く使用されている3-0ナイロン糸に加えて、血管内治療用のmicroguidewireを使用することでSAH発生率を上昇させ、model作成の成功率を上昇させることに成功した。spreading depressionの撮影についても、脳表が透見できる程度に骨を削り、脳表上に紫外線を断続的に照射し、それによるNADHの励起光として発せられる蛍光をCCDカメラにて撮影することでspreading depressionを観察することに成功した。同時にVital checkも行い、SAHの際の生理学的変化も観察している。その結果、spreading depressionの際に起こる脱分極の時間の長さに様々な形態があることがわかり、それによる組織障害の程度を今後検討していく方針である。これらの結果の一部は、各種学会にて報告も行っている。論文については、現在鋭意制作中である。DC potentialの変化は以下の3つのタイプに分類された。1時間の観察時間内に脱分極を認めない群(type 1)、脱分極を認めるものの平均33.3分で80%まで回復する群(type 2)、脱分極したまま回復しない群(type 3)。各タイプの頻度はtype 1: 44%、type 2: 27%、type 3: 29%であった。各タイプは頭蓋内圧の上昇と相関を認め、type 3で最も高い頭蓋内圧を認めた。50%の神経障害を引き起こす脱分極時間は22.4分と算出された。皮質拡散抑制はNADH蛍光画像で可視化することができた。また皮質拡散抑制はtyp1に属する3匹のラットくも膜下出血モデルで認め、モデル作成後平均5.1分で出現した。脳血流の上昇と共に頭部の前方から後方に向けて3 mm/分の速度で半球全体に拡散し、平均2.3分以内に再分極した。本研究ではくも膜下出血後急性期の皮質拡散抑制の2次元の可視化に初めて成功した。また、くも膜下出血後急性期の電気生理学的評価で脱分極は3つのタイプに分類され、皮質拡散抑制はその1つであり、神経障害を引き起こすには脱分極時間があまりに短いことが判明した。今回の結果は今後くも膜下出血早期脳損傷の病態解明に繋がると思われる。医歯薬学、外科系臨床医学、脳神経外科学subarachnoid hemorrhage(SAH) modelとして、perforation modelを採用したが、一般に多く使用されている3-0ナイロン糸に加えて、血管内治療用のmicroguidewireを使用することでSAH発生率を上昇させ、model作成の成功率を上昇させることに成功した。spreading depressionの撮影方法についても、脳表が透見できる程度に骨を削り、脳表上に紫外線を断続的に照射し、それによるNADHの励起光として発せられる蛍光をCCDカメラにて撮影することでspreading depressionを観察することに成功した。spreading depressionの撮影方法についての手技を確立することができたと考えられるため、今後は、SAHの際のspreading depressionの影響を調査するために、spreading depressionの際に起こる脱分極の時間の長さに注目し、組織学的検討を行っていくことを検討中である。方法としては、実験の24時間後にratを灌流固定し、HE染色を行い、正常細胞及び障害細胞をカウントすることで、どの程度組織障害が起こっているのかを調査する予定である。消耗品の予定購入金額に差額が生じたため(安価での購入となったため)、未使用額が生じた。引き続き、飼育動物の購入・飼育費及び麻酔薬・血液ガス分析キット等の消耗品に対する費用に使用する予定である。
FGF徐放性超気孔性β-TCPと培養細胞シートを用いた歯周組織再生療法の開発

本研究では、(1)培養細胞シートの作製方法の確立、(2)培養細胞シート、β-TCPコラーゲン複合体スキャフォールドおよび成長因子FGF-2併用による骨増生の有効性について検討を行った。その結果、(1)F344/Jclラット大腿骨から採取した骨髄細胞を用いて骨髄細胞シートを作成できた。また培養期間を延長することでシートの強度が増加した。(2)ラット頭蓋骨にβ-TCPコラーゲン複合体スキャフォールドおよびFGF-2を併用することで大量の新生骨が認められた。本年度は、スキャフォールドに細胞を播種させる前段階としてβ-TCPブロック上に細胞を培養させる方法を確立させることを試みた。具合的にはF344ラットの大腿骨を摘出し、骨髄を採取。骨髄由来の付着性細胞を10%FBS、1%抗生物質添加MEMにて培養。その後β-TCPブロック上に播種してさらに培養を行い、7、9、11日目に追加播種することで多層骨髄細胞シートを作製した。7日目に追加播種してからは培地を10%FBS、1%抗生物質添加MEMにアスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンを添加させたものに変更。培養14日後にトリプシン-EDTAで処理しディッシュから剥離、細胞シートを完成させた。さらに、本実験過程において14日間では細胞数が安定しなかったため培養期間をさらに1、2週間延長したものを作製し、至適培養期間について比較検討を行った。その結果、培養期間が長いほど細胞の成長が阻害されることが明らかとなったため培養期間として14日間が最適であることが示唆された。本年度は前年度の骨髄細胞シートに加え、歯根膜細胞シートの作製を行った。具体的にはF344ラットの歯牙を摘出し、歯根膜組織を採取。アウトグレース法にて歯根膜細胞を採取、継代培養し得られた細胞を凹型β-TCPブロック上で培養、追加播種することで多層歯根膜細胞シートを作製することを試みた。しかしながら歯根膜細胞シートについては細胞数が安定せず最適な供給までには至らなかった。一方で、FGF徐放性β-TCPコラーゲンスキャフォールドの作製を行った。具体的には規格化した超多孔性β-TCP(気孔率約70%、気孔径100400μm)プレート型ブロックと凹型ブロックを組み合わせて4×4×3mmに規格化し、内部にFGF(0、3、15μg/個)を含浸させたFC-HACスポンジを填入し、β-TCPコラーゲンスキャフォールドとした。さらに、培養した骨髄細胞シートについてはβ-TCPコラーゲンスキャフォールド上に付着させた培養細胞シート一体型β-TCPコラーゲンスキャフォールドを象牙質片に縫合し固定した試料を作製した。ラット頭蓋骨に4×4×2mmの骨窩洞部を形成後、試料を窩洞に接するように埋植した。その際の骨形成への影響に関して組織学的評価を行った。その結果、骨髄細胞シート一体型β-TCPコラーゲンスキャフォールドを用いた場合の新生骨形成についてβ-TCPブロック単体を埋植した時と比較して明らかな差は認められなかった。本年度は前年度の課題であった歯根膜細胞シートの安定した供給方法についての検討を行った。具体的には5週齢F344ラットの歯牙を摘出し、歯根膜組織を採取。アウトグロース法にて歯根膜線維芽細胞の初代培養を行った。培養細胞がコンフルエントに達した時点で継代を行った後、プレート型β-TCPブロック上に播種した。β-TCPブロック上で培養、追加播種することで、通常のディッシュ上よりも多層の歯根膜細胞シート作製が可能であった。また、プレート型β-TCPブロック+歯根膜細胞シートと、前年度までに作製していた凹型β-TCPブロック+骨髄細胞シートとを組み合わせ、中空部分にFGF2を含浸させたFC-HACコラーゲンスポンジを填入することにより培養細胞シート一体型β-TCPコラーゲンスキャフォールドの作製を行った。しかしながら骨髄細胞シートと歯根膜細胞シートを同時に安定した状態でスキャフォールド上に設置することは手法的に困難であり、十分な試料数には至らなかった。一方、この培養細胞シート一体型β-TCPコラーゲンスキャフォールドを用いた場合の骨新生状態について組織学的評価を行うために、10週齢F344ラットの頭蓋骨骨窩洞に埋植することを試みたが、初期段階でスキャフォールドが分解してしまったものが多く認められた。以上の結果から、スキャフォールドの安定化が必要と考え、これまでのコラーゲンスポンジとβ-TCPブロック同士を組み合わせるタイプのものから、一体化タイプのβ-TCPコラーゲン複合体を新たに作製、これをスキャフォールドした効果について再検討を行う計画へ変更した。β-TCPコラーゲン複合体をこれまでと同様にラット頭蓋骨骨窩洞へ埋植した結果、コラーゲンスポンジ単体の場合よりも多くの骨形成が認められたが、FGF2を添加することでさらに多くの骨形成が確認され、スキャフォールドとしての有効性が示唆された。

(2)ラット頭蓋骨にβ-TCPコラーゲン複合体スキャフォールドおよびFGF-2を併用することで大量の新生骨が認められた。本年度はビーグル犬を用いた実験的歯周炎モデルに対して、本細胞シート併用β-TCPコラーゲンスキャフォールドを用いた新規歯周組織再生療法による有効性を評価する予定であったが、歯根膜細胞シートの安定した供給が得られなかったこと、骨髄細胞シート一体型β-TCPコラーゲンスキャフォールドをラットに用いた場合において良好な新生骨形成には至らなかったことから、本方法についての再検討に時間を要したため目標より達成度は遅れている。再生歯学次年度以降は歯根膜細胞シートの安定した供給など本方法について検討を行う必要がある。さらに、本培養細胞シート併用新規スキャフォールド(β-TCPコラーゲンスキャフォールド)の有効性についてはビーグル犬に用いることはせず、引き続きラットを用いて評価を行う予定である。その際、最適な培養細胞シート、FGF、β-TCP、コラーゲンの量を明らかにしていく。本年度は、ラット骨髄を用いた細胞シート作製方法の確立が目標の一つであったため、その点については達成できたと考えるが、培養期間の検討などに時間を要してしまった。そのためラットを用いた動物実験による評価・検討の計画が遅れている。本年度は新たな培養歯根膜細胞シート作製方法の確立方法について再度検討が必要となったこと、次年度の引き続きラットを用いた動物実験に時間を要したため、予定していたビーグル犬購入などにかかる経費がかからなかったことによる。次年度以降は培養細胞シートを新規スキャフォールドであるFGF除放性β-TCPコラーゲンスキャフォールドに使用した際の有効性をラットを用いて評価していく予定である。次年度以降も培養細胞シート併用新規スキャフォールド作製の確立や、新規スキャフォールドを使用した際の有効性をラットおよびビーグル犬を用いた組織化学的評価評価に研究費を使用する予定である。また得られた知見は国際学会および英文論文誌に投稿を予定しているため、学会参加費、投稿料、英文校正料などにも使用する予定である。初年度は培養細胞シート作製方法の確立に時間を要したため予定していた動物実験が遅れたことでラット購入などにかかる経費がかからなかったため。また、培養細胞シート作製においても既存の実験動物、実験試料を使用することができたため研究費が抑えられたことによる。次年度以降は、新規スキャフォールドであるFGF除放性β-TCP-コラーゲンスキャフォールドの開発、ラットおよびビーグル犬を用いた組織化学的評価に研究費を使用する予定である。また得られた知見は国際学会および英文論文誌に投稿を予定しているため、学会参加費、投稿料、英文校正料などにも使用する。
膠芽腫の悪性形質に対する多面的アプローチ

膠芽腫は、ブレークスルーが最も待望されている難治性がんである。本研究は網羅的解析と機能解析の両面から膠芽腫の悪性形質を左右する新たな機能遺伝子を見出すことを目的としている。膠芽腫細胞を用いたこれまでの網羅的解析を基に新たな機能遺伝子候補として見出したCD24、MALAT1、METに着目して進めている。CD24については、幹細胞性や分化への関与、エクソソームとの関連を解析している。超遠心法を用いて培養上清からエクソソームを濃縮し、miRNAを含むtotal RNAを抽出する方法を確立し、2種類の膠芽腫培養細胞それぞれのコントロール株、CD24ノックダウン株において、細胞内miRNA・エクソソームmiRNAのプロファイルをmiRNAアレイ(アジレントSurePrint G3 Human miRNA 8x60K)で解析した。その結果、2種類の膠芽腫培養細胞に共通してCD24の発現によって変動するmiRNAを、細胞内miRNA、エクソソームmiRNAそれぞれ数種類同定した。現在、定量リアルタイムPCRのプライマーや条件設定を準備している。MALAT1については、膠芽腫細胞株においてantisense LNA (locked nucleic acid)を用いたノックダウンに成功し、MALAT1ノックダウンに伴う増殖、細胞周期、アポトーシス抵抗性、浸潤への影響を解析した。エクソソームの取得・濃縮方法の確立、その再現性の確保に困難をきたしたが、培養方法と超遠心分離法による濃縮方法に改善を加え、感度の高いマイクロアレイを準備し、細胞由来、エクソソーム由来それぞれのmiRNAプロファイルの取得までたどり着いた。マウス脳からのastrocyte初代培養、不死化細胞樹立方法の確立に難渋している。今までに得られたCD24発現変動に伴うmiRNA発現プロファイルを、mRNA発現プロファイルと合わせてバイオインフォマティックス解析し、CD24発現変動に伴う、膠芽腫における遺伝子発現制御のメカニズムを解析する。TCGA (The Cancer genome atlas)等のデータも有効に活用したいと考えている。絞り込んだmiRNAについて、Mir-X miRNA qRT-PCR Kit (TaKaRa)を用いて定量し、細胞やエクソソームでの発現やCD24との連動を確認し、機能解析(該当miRNAについてのmimic, inhibitorや強制発現・ノックダウン)を準備する。また、解析意義があると考えられたmiRNAについては、CD24との関係のみならず、MALAT1やMETシグナル関連因子との関係も検討する。マウス脳からのastrocyte初代培養、不死化細胞樹立方法の確立を急ぐ。また、HGF/METシグナル関連因子の解析のためにマウス脳からの蛋白抽出方法やimmunoblot条件を確立する。膠芽腫は、治療標的に関わるブレークスルーが最も待望されている難治性がんである。本研究は網羅的解析と機能解析の両面から膠芽腫の悪性形質を左右する新たな機能遺伝子を見出すことを目的とする。特に、これまで我々が様々ながんで得てきたプロテアーゼ活性調節による細胞周囲微小環境制御に関する知見が膠芽腫にも当てはまるのか検証する。本研究では、網羅的解析を基に解析対象として見出したCD24、MALAT1、METに着目して進めている。様々な悪性腫瘍での発現と、浸潤や不良予後との関連が報告されているGPIアンカー型糖蛋白であるCD24については、幹細胞性や分化への関与、エクソソームとの関連を解析している。培養上清からエクソソームを濃縮し、miRNAを含むtotal RNAを抽出する方法を確立し、現在、CD24の発現とエクソソームmiRNAプロファイルの関連を調べるマイクロアレイを準備している。肺癌を初めとする悪性腫瘍との関連が報告されている長鎖非翻訳RNAであるMALAT1については、膠芽腫細胞株においてantisense LNA (locked nucleic acid)を用いたノックダウンに成功し、増殖、細胞周期、アポトーシス抵抗性、浸潤への影響を解析している。肝細胞増殖因子(HGF)の特異的受容体チロシンキナーゼであるMETについては、細胞外環境におけるプロテアーゼ活性化機構、特に膠芽腫細胞でしばしば発現しているHGF activatorの活性調節、中枢神経系の組織で発現が見られるHAI-2 (HGF activator inhibitor type 2)との関連を中心に解析を進めている。膠芽腫、星状膠細胞でのDNAメチル化状態を解析し、多くの膠芽腫においてDNAメチル化によってHAI-2の発現が抑制されていることを確認した。細胞が弱らず、かつ、培養容器がコンフルエントにならない状態で培養上清を回収し、そこから解析に足る質と量を満たすエクソソームを得る方法を確立するのに困難をきたした。様々な培養方法やエクソソームの濃縮方法を試し、結局、あらかじめ超遠心を行って牛由来のエクソソームを取り除いた血清を用いて培養し、超遠心分離法で培養上清を濃縮、さらに洗浄する方法で解析できる状態を確保した。また、エクソソーム由来のmiRNAが微量でも解析できる感度の高いマイクロアレイを準備した。

超遠心法を用いて培養上清からエクソソームを濃縮し、miRNAを含むtotal RNAを抽出する方法を確立し、2種類の膠芽腫培養細胞それぞれのコントロール株、CD24ノックダウン株において、細胞内miRNA・エクソソームmiRNAのプロファイルをmiRNAアレイ(アジレントSurePrint G3 Human miRNA 8x60K)で解析した。その結果、2種類の膠芽腫培養細胞に共通してCD24の発現によって変動するmiRNAを、細胞内miRNA、エクソソームmiRNAそれぞれ数種類同定した。現在、定量リアルタイムPCRのプライマーや条件設定を準備している。MALAT1については、膠芽腫細胞株においてantisense LNA (locked nucleic acid)を用いたノックダウンに成功し、MALAT1ノックダウンに伴う増殖、細胞周期、アポトーシス抵抗性、浸潤への影響を解析した。エクソソームの取得・濃縮方法の確立、その再現性の確保に困難をきたしたが、培養方法と超遠心分離法による濃縮方法に改善を加え、感度の高いマイクロアレイを準備し、細胞由来、エクソソーム由来それぞれのmiRNAプロファイルの取得までたどり着いた。マウス脳からのastrocyte初代培養、不死化細胞樹立方法の確立に難渋している。2種類の膠芽腫細胞(U251とYKG-1)、細胞抽出RNAとエクソソーム抽出RNA、コントロール株とCD24抑制株、のそれぞれの組合せ(計8サンプル)について受託解析でmiRNAアレイ(アジレントSurePrint G3 Human miRNA 8x60K)を行い、解析対象とするmiRNAを絞り込むとともに、すでに得ているCD24発現変動に伴うmRNA発現プロファイルと合わせて、膠芽腫における遺伝子発現制御のメカニズムを解析する。絞り込んだmiRNAについては、Mir-X miRNA qRT-PCR Kit (TaKaRa)を用いて定量し、細胞やエクソソームでの発現やCD24との連動を確認する。また、解析意義があると考えられたmiRNAについては、CD24との関係のみならず、MALAT1やMETシグナル関連因子との関係も検討する。マウス脳からのastrocyte初代培養、不死化細胞樹立方法の確立を急ぐ。また、HGF/METシグナル関連因子の解析のためにマウス脳からの蛋白抽出方法やimmunoblot条件を確立する。今までに得られたCD24発現変動に伴うmiRNA発現プロファイルを、mRNA発現プロファイルと合わせてバイオインフォマティックス解析し、CD24発現変動に伴う、膠芽腫における遺伝子発現制御のメカニズムを解析する。TCGA (The Cancer genome atlas)等のデータも有効に活用したいと考えている。絞り込んだmiRNAについて、Mir-X miRNA qRT-PCR Kit (TaKaRa)を用いて定量し、細胞やエクソソームでの発現やCD24との連動を確認し、機能解析(該当miRNAについてのmimic, inhibitorや強制発現・ノックダウン)を準備する。
骨格筋におけるインスリン反応性糖輸送システムの獲得機能の解明

前年度までに、マウス骨格筋細胞系C2C12において、インスリン反応性糖輸送担体GLUT4を含有する小胞(GLUT4-storage vesicle:GSV)の構成タンパク質であるSortilinが、筋分化及びGSVのbiogenesisを促進することにより、インスリン反応性の糖輸送システムの獲得に関与することを明らかにしている。また、糖濃度の高い培地(22.5mMグルコースを含むDMEM)では、低糖濃度の培地(5mMグルコース)に比べて顕著に筋分化が促進され、その際、Sortilin量も増加することを見いだしている。今年度は主に、この糖濃度依存性のsortilin発現変動現象について、ラット骨格筋を用いin vivo実験(1)絶食時、2)高脂肪食(HFD)給餌時、3)ストレプトゾトシン(STZ)による高血糖誘導時)を行った。その結果、1)腓腹筋と長指伸筋において、絶食によるSortilinタンパク量の減少が見られた、2)HFDにより腓腹筋とヒラメ筋において、Sortilin量の有意な増加が見られた。一方、3)STZ群では腓腹筋、ヒラメ筋、長指伸筋ともにSortilin量の有意な増加は見られなかった。以上の結果から、in vivo骨格筋においてもSortilin量は、血糖や血中脂肪酸の濃度に応答して大きく増減することをはじめて明らかにした。特に、摂食時は主に速筋においてSortilin量が大きく変動することが明らかとなった。さらに、2)HFDによるインスリン抵抗性惹起時では、Sortilin量の増加が認められた。今回明らかにした筋肉Sortilin量の病態モデルにおける変動が、骨格筋のインスリン抵抗性発症にどのように関与しているのかは今後の検討課題であるが、インスリン反応性糖輸送システムの獲得に役割を果たすsortilin量の異常が、インスリン抵抗性(特にGLUT4トランスロケーション障害)惹起に直接関与する可能性を示す重要な知見である。今年度前半は、Sortilinについて以下の2つの機構に焦点を当て、研究を進めた。1)Sortilinによる分化促進機構の解析:Sortilinは低親和性NGFレセプター(p75NTR)と協調してproNGFと高いアフィニティーで結合することが報告されている。そこで、この複合体が筋分化でも働いているかどうかを調べるために、抗NGF/proNGF抗体または抗p75NTR抗体を増殖用培地中に添加し、分化促進が抑制されるかどうかをmyogeninの発現を指標に調べた。その結果、どちらの抗体を添加してもSortilin過剰発現による分化促進は抑制された。このことから、Sortilinによる分化促進はproNGFの分泌とp75NTRを介していることが明らかとなった。また、Sortilin-p75NTRはRho-ROCK経路を介して細胞骨格系に作用し、分化を促進することが示唆された。さらに、Sortilinノックダウンにより分化が抑制されたことから、内在性Sortilinが分化促進に重要であることも明らかにした。2)Sortilinによるインスリン反応性増強機構の解析:Sortilinがインスリン依存的なGLUT4膜移行を促進する際、[SortilinによるGLUT4の量的な制御]がおこなわれているかどうかを調べた。Sortilin過剰発現によるGLUT4の安定性を調べるために、タンパク合成阻害剤であるcycloheximideを添加し、GLUT4タンパク量の減少の程度をWTとSort-C2C12で比較した。その結果、WTに比べSort-C2C12でGLUT4の寿命が延びており、SortilinによりGLUT4の安定性が上昇することが分かった。また、様々なタンパク質の寿命を調節するUbc9の発現量がSortilin過剰発現によって増加することが分かった。以上、正常な筋芽細胞の分化を促進することによりインスリン抵抗性を改善するという観点から、筋分化促進の一経路を特定できたことは非常に意義深い。また、SortilinによるGLUT4タンパク量の増加がUbc9を介していることが示唆され、この現象はGLUT4のみならず、GLUT4膜移行に関わるタンパク質の量調節もSortilin-Ubc9を介して行われている可能性を示しており、Sortilinの機能の多様性を示すのに重要な発見をしたと考えられる。前年度までに、筋細胞において、GSV構成タンパク質のひとつであるSortilinが分化を促進し、その結果、GLUT4を介した糖取り込みが増強されることを見出した。今年度明らかにしたのは以下の3つである。1、Sortilinの脂肪細胞における役割3T3L1脂肪前駆細胞にSortilinを一過的に発現させると、分化マーカーであるPPARγなどのタンパク量が増加した。一方、分化誘導時に、Sortilinをノックダウンすると、分化は抑制された。よって、脂肪細胞においても、Sortilinは分化促進作用を持つことが明らかとなった。ただし、筋細胞と異なり、Sortilinによる脂肪分化促進の際、proNGF.NGFの介在は認められなかった。2、糖濃度と骨格筋におけるSortilin発現量の関係筋細胞において、細胞外糖濃度の上昇・低下に応答して、Sortilinタンパク量は増加・減少した。その量調節は、翻訳後のタンパク合成の段階で行われていることが分かった。また、細胞外糖濃度に応答したタンパク量増加は、rapamycin感受性mTOR経路を介することが明らかとなった。3、Sortilinの運動における役割筋細胞において、運動を模した電気刺激によるSortilinタンパク量の変化は認められなかった。

一方、局在については、細胞内に散在していたものの一部が、運動刺激後に細胞膜近傍に移行することを見出した。他の結果と併せると、運動刺激に応答して、SortilinがGSV輸送担体としてGLUT4膜移行を促進し、その結果、糖取り込みが促進されたと考えられる。以上より、筋肉におけるSortilinタンパク量および局在の制御が、正常な糖代謝の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、筋芽細胞のみならず、正常な脂肪前駆細胞の分化も促進することにより、インスリン抵抗性を改善する可能性が示された。前年度までに、マウス骨格筋細胞系C2C12において、インスリン反応性糖輸送担体GLUT4を含有する小胞(GLUT4-storage vesicle:GSV)の構成タンパク質であるSortilinが、筋分化及びGSVのbiogenesisを促進することにより、インスリン反応性の糖輸送システムの獲得に関与することを明らかにしている。また、糖濃度の高い培地(22.5mMグルコースを含むDMEM)では、低糖濃度の培地(5mMグルコース)に比べて顕著に筋分化が促進され、その際、Sortilin量も増加することを見いだしている。今年度は主に、この糖濃度依存性のsortilin発現変動現象について、ラット骨格筋を用いin vivo実験(1)絶食時、2)高脂肪食(HFD)給餌時、3)ストレプトゾトシン(STZ)による高血糖誘導時)を行った。その結果、1)腓腹筋と長指伸筋において、絶食によるSortilinタンパク量の減少が見られた、2)HFDにより腓腹筋とヒラメ筋において、Sortilin量の有意な増加が見られた。一方、3)STZ群では腓腹筋、ヒラメ筋、長指伸筋ともにSortilin量の有意な増加は見られなかった。以上の結果から、in vivo骨格筋においてもSortilin量は、血糖や血中脂肪酸の濃度に応答して大きく増減することをはじめて明らかにした。特に、摂食時は主に速筋においてSortilin量が大きく変動することが明らかとなった。さらに、2)HFDによるインスリン抵抗性惹起時では、Sortilin量の増加が認められた。今回明らかにした筋肉Sortilin量の病態モデルにおける変動が、骨格筋のインスリン抵抗性発症にどのように関与しているのかは今後の検討課題であるが、インスリン反応性糖輸送システムの獲得に役割を果たすsortilin量の異常が、インスリン抵抗性(特にGLUT4トランスロケーション障害)惹起に直接関与する可能性を示す重要な知見である。
スピノン・スピン流の実験的開拓

本研究課題では、量子スピン液体状態に特有なスピン励起(スピノン、マヨラナ粒子)を用いたスピン流の実験的開拓を目指して研究を行った。典型的な一次元量子スピン系銅酸化物Sr2CuO3においてはスピノン励起の存在が実験的に確立されており、本研究ではSr2CuO3に温度勾配を印加することでスピノンスピン流が生成されることをスピンゼーベック効果測定を用いて実証した。さらに、非常に最近特に興味をもたれているキタエフ模型スピン液体物質RuCl3において、同じく温度勾配を利用して生成したマヨラナ粒子の流れを、熱伝導率測定を用いて観測した。本研究では、量子スピン系(スピン液体状態)におけるスピン励起であるスピノンによるスピン流の開拓を目指して研究を行う。今年度は、典型的な一次元量子スピン系Sr2CuO3単結晶においてスピノンスピン流の実証をスピンゼーベック効果測定を用いて行った。結果として、Sr2CuO3|Ptにおいてスピンゼーベック電圧が観測され、その符号はフェリ磁性体Y3Fe5O12|Ptのスピンゼーベック電圧の符号と反対であることがわかった。これは、直観的には、フェリ磁性体のマグノンは磁化が減少する励起であるのに対し、スピノンは磁化がないときからの励起であるため磁化が大きくなるという違いに対応する。理論研究者との共同研究により微視的な理論も構築し、上記の直観的描像が正しいことを示した。また、一次元スピン鎖と直交する方向にはスピノンスピン流の寄与が観測されないこと、PtとWで逆スピンホール起電力の符号が逆になることなどを確かめ、結果をサポートした。上記内容をNature Physicsに投稿し、掲載受理された。現在は、より結果をサポートするために追加実験を行い、フォローアップ論文の準備を進めている。また、この研究成果を基盤とした研究展開として、物性物理学において現在ホットトピックの一つである二次元系の量子スピン液体に物質を拡げて研究することが考えられる。最近特に注目されるキタエフ候補物質RuCl3における研究も開始し、予備的成果としてスピン由来の熱伝導率を観測している(論文投稿中)。既に計画の目標であったスピノンスピン流の実験的実現を達成した。次年度はスピノンスピン流の長距離伝搬性の検証や、計画を超えて新奇スピノンスピン流現象の開拓や、他のスピン液体物質への展開を狙う。今年度は、昨年度に観測に成功したキタエフスピン液体候補物質RuCl3におけるスピン由来の熱伝導率に関する結果について、継続して研究を行った。投稿した論文の査読者から再現性についての質問があり、それに応える形で計5つの試料で追加実験を行い再現性を確認した。全ての試料において、キタエフ結合のエネルギースケールである100K付近で熱伝導率の異常を観測した。本研究で対象としたRuCl3は試料準備の過程で容易に欠陥(スタッキングフォールト)が入り物性に影響を与えることが知られているが、100K付近の熱伝導率異常の大きさは変化しなかった。熱伝導率の異常が試料内の欠陥の量と相関しないことから、スピン由来の信号であると結論した。仮にキタエフスピン液体で期待されるマヨラナ粒子に由来する熱伝導であると仮定すると、20nmほどの平均自由行程になり、Ru-Ru最近接長さよりも十分長いことから、長距離伝搬していることが示唆される。前年度までに報告した一次元量子スピン液体物質におけるスピノン・スピン流の実現に関する成果と上記キタエフ物質におけるスピン熱伝導の成果について、いくつかの研究会・学会において報告を行った。今後は、キタエフ量子スピン液体におけるスピン流物性について研究展開していく予定である。その他、いくつかのスピン液体物質を試料提供により準備し、スピン流計測を行った。有意な信号を得ている物質試料もあり、理論家と結果について議論しつつ継続して実験研究を行っている。次年度は計画を超えた新奇スピノンスピン流現象の開拓や、他のスピン液体物質への展開を狙う。スピントロニクス
多剤耐性菌による腎瘻カテーテル関連感染予防のための腎瘻ケアの開発

腎瘻カテーテル関連感染の主な原因は、尿流の停滞や逆流である。腎瘻造設患者への面接調査の結果、日常生活で都合のいいように独自の不適切な管理(尿流の停滞・逆流を無視したもの)が行われていることが明らかとなった。不適切な管理の予防には、看護師による患者指導が重要となる。そこで、患者指導をより有効に実施するため、看護師への質問紙調査を行い、日常生活の工夫をより具体的に記載した新たな指導書を作成した。これにより、どの患者にも一定の情報を伝えるとともに、日常生活の様子を確認しやすく、不適切な管理の予防の一助となると考えられる。今年度は、前年度に行った調査結果について学会での発表を行い、意見交換や新しい知見など情報収集を行った。発表を行った際には、腎瘻カテーテル関連感染や在宅での腎瘻カテーテルの実際の取り扱いついて医師、看護師などの興味が薄い印象を受けた。対象数も少なく1施設での研究結果ではあるが、尿道留置カテーテルとほぼ同等の感染率であり短期抜去が難しいことや、退院指導を実施しても日常生活を行う上で都合のいいように患者独自の不適切な管理方法を実施してる例を挙げたにもかかわらず、腎瘻カテーテルに関する感染予防や日常生活指導について重要視されていない様子がうかがえた。患者指導においては、退院時の指導は行っているが、退院後、外来において在宅における腎瘻カテーテルの管理についてはフォローがされておらず、医療者側から患者への情報提供が一方通行であることが分かった。そのため、在宅へ戻った際の腎瘻カテーテル管理についてのフォローの方法について検討していく必要性があると考えられた。また、関連学会等での情報収集を行ったところ、尿道留置カテーテルに関する研究は実施されているが、腎瘻カテーテルに焦点を当てた研究の発表は私以外なかった。しかし、実際に腎瘻カテーテルの不適切な扱いにより腎盂腎炎を繰り返す患者がいることは確かであり、その指導法、退院後の在宅におけるフォローや通院時のフォローについて検討し、エビデンスを積み重ねシステムの構築を行っていく必要性があると考えれた。前年度までの研究において、一部の腎瘻造設患者が、日常生活で都合のいいように独自の不適切な管理(尿流の停滞・逆流を無視したもの)をしていることが明らかとなり、不適切な管理の予防を図ることが腎瘻カテーテル関連感染予防に繋がると考えた。そこで、適切な腎瘻管理の継続には、看護師による患者指導が重要なカギになると考え、患者指導に用いる指導書に着目し本年度の研究を進めた。研究フィールドとした施設で使用している指導書や文献に掲載のある指導書は、いずれも簡易的で、日常生活に関する具体的な指導は看護師に依存していた。また、指導時に患者が日常生活をイメージし難いことも具体的指導に繋がり難い要因と考えた。これらを考慮し、指導書案をWOC看護師・泌尿器科医師と協働して作成後、看護師を対象に自記式質問紙調査を行った。この結果を基に、指導書案を評価・修正し完成させた。作成した指導書は、冊子(12頁)に新たな試みとしてスタートアップガイド(1頁)をつけ構成した。スタートアップガイドは、患者が腎瘻について知っておくべき必要最低限の情報を簡潔にまとめ、施術前や看護師の指導前に患者に渡し腎瘻について知ってもらうことを意図して作成した。冊子は、スタートアップガイドを補完する詳細な記載とともに、看護師が個別の患者に合わせて指導し易いよう日常生活等について細かく記載した。また、冊子には図を多用し視覚的理解を図り、患者が自宅で見直して活用できるよう考慮した。このように必要最低限かつ具体的な情報を示すことで、患者は事前に必要な情報を得て具体的な日常生活をイメージでき、患者の理解向上に繋がる。そして、看護師は指導の際にそのイメージをアセスメントしながら、より具体的に個別の患者に合わせた指導が可能になる。そのため、患者独自の不適切な管理の予防が図れ、腎瘻カテーテル関連感染の抑止に繋がると考える。腎瘻カテーテル関連感染の実態を明らかにするため,診療録による後ろ向き調査を行った.対象は診療録の医事情報から「腎瘻」というキーワードで抽出した32名とし,基礎疾患,腎盂腎炎の罹患,検出菌,抗菌薬の投与等に関して情報収集し分析した.65歳以上は16名(50.0%),担癌患者は27名(84.4%)であり,易感染宿主が多いことが明らかとなった.腎瘻カテーテル留置中に腎盂腎炎を発症した対象者は12名(37.5%)であり,抗菌薬はCTM,SBT/CPZ等が投与されていた.

過去3年間(2008年4月2010年3月)の経過明瞭な対象者15名の感染率は1.32であった.感染率はNHSNの算出法を採用し,腎盂腎炎と診断され抗菌薬による治療例を腎瘻カテーテル関連感染例とした.尿道留置カテーテルに関する感染率は,JHAIS(平均値1.2,中央値1.6),NHSN(2.2,1.8),国立大学病院感染対策協議会(0.88,0.65)であり,ほぼ同等かやや高い結果であった.短期抜去の難しい腎瘻カテーテルでは,より一層感染予防に注意したケアの必要性が示唆された.腎盂腎炎発症時の腎瘻カテーテル尿からの尿培養では,複雑性尿路感染症の分離菌と菌種はほぼ同様であったが,大腸菌が検出されていなかったことが特徴的であった.腎瘻ケアの実態を把握するため,泌尿器科外来における前向き調査を,独自のインタビュー調査票と腎瘻模型モデルを作成し開始した.定期的に腎瘻カテーテル交換をしている患者5名を対象に,診療録調査とインタビュー調査,細菌学的な試料調査を行ったところ,全て担癌患者であり,入眠時の蓄尿袋の管理,腎瘻カテーテルの未固定,外観や利便性により独自に工夫された間違った装具の使用方法が主な問題点として抽出された.また,外見が気になる,蓄尿袋の選択肢が少ない,コンパクトで目立たないものがほしい等のニーズも抽出できた.研究を遂行するに伴い、研究目的である腎瘻カテーテル関連感染予防を図るためには、患者への指導方法や退院後のフォローについて検討する必要性が考えられた。そのためには、再度研究手法を検討し、患者側への医療者のアプローチ方法や外来でのフォローについて検討する必要があり、調査方法を変更しようと考えているため。所属の倫理委員会による承認と,研究フィールドの病院部長会での承認を得た.また,泌尿器科医師や泌尿器科病棟・外来看護師らとの調整を図り,研究フィールドの確立ができた.後ろ向き調査として,診療録調査を行い研究フィールドにおける腎瘻カテーテルの感染率や腎盂腎炎発症時の検出菌等を明らかにした.それに引き続き,前向き調査として泌尿器科外来における診療録調査,インタビュー調査,試料調査を開始し,5名の対象者の調査が終了した.当初の計画とほぼ同様に順調に調査を実施できている.今後は,引き続き泌尿器科外来における調査を継続し,対象者数を増やしデータの収集と解析を行っていく予定である.対象を看護師として、腎瘻カテーテル造設患者に対する退院指導方法や外来における対応について質問紙を作成し、質問紙調査を実施する予定である。所属施設の研究倫理審査委員会へ申請を行い、承認後に実施する。収集したデータを分析し、新たな指導案、外来におけるフォロー体制の検討を行う予定である。引き続き泌尿器科外来における腎瘻カテーテル管理患者の調査を行い対象者数を増やしていくと共に,尿管皮膚瘻管理患者に対しても同様の調査を行い,比較検討をしていく予定である.また,泌尿器科病棟において,腎瘻カテーテルの新規造設を行う患者に対しても調査を進めていく予定である.平成25年度においては、研究計画の修正を行い実施していく予定であるが、質問紙の作成や実施、分析等において研究費を使用していく予定である。平成23年度は,科研費に加えて外部研究資金が得られたため次年度への繰り越しをする資金が生じたが,研究は概ね順調に計画通り進んでいる.引き続き研究計画に沿って進めていく予定である.