hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3Dプリンタで形状だけでなく結晶方位も制御する基礎研究：単結晶セル格子多孔体創製

金属用3Dプリンタである電子ビーム(EB)積層造形を、形状だけでなく結晶方位も制御する手法として発展させるための基礎研究を行った。広く積層造形が適用されているNi基超合金ならびに生体用Co合金を対象として、EBの走査方向と造形物の方向と結晶方位の関係や、造形の基礎過程である微小溶融池の移動に伴う凝固結晶成長挙動とEB照射条件との関係を調べた。さらに凝固時の固液界面での温度勾配ならびに凝固速度を評価し、造形中の組織形成を予測するための基礎を構築した。加えて、結晶配向制御と格子多孔体の構造最適化の組み合わせにより、生体用Co合金の力学的生体親和性向上が期待される低ヤング率化が可能であること示した。金属用3Dプリンタである電子ビーム(EB)積層造形で見出した強い結晶配向性とエピタキシャル成長に注目し、同造形法を形状だけでなく結晶方位も制御する新しい単結晶育成法として発展させるための基礎研究を行った。具体的には、単結晶基板上でのEBを走査させた場合の溶融凝固結晶成長挙動に対する、EBの走査方向・走査速度・エネルギー及の影響、予熱の影響、粉末の有無の影響を実験的に調べるとともに、有限要素解析により、凝固時の熱流方向、固液界面での温度勾配(G)ならびに凝固速度(R)を評価した。それを基に高速溶融凝固条件での凝固結晶成長を科学的に理解・予測する方法を検討した。なかでも、広く積層造形が適用されているインコネル(IN)718合金を用いた実験で多くの成果が得られた。IN718合金多結晶ならびに単結晶バルク材に、出力P=1001000 Wの6水準、走査速度V=10010000 mm/sの5水準の計30種類の条件にて電子ビーム走査させた。溶融凝固で形成されたビードの幅と深さは、02 mmの範囲で、単位走査距離辺りの入力エネルギー(Line energy = P/V )の上昇とともに、ほぼ単調に増加した。ビード進行方向に垂直なビード断面の結晶方位分布をSEM-EBSDにて評価したところ、下地結晶の結晶方位を引き継いでビード内に結晶が成長する所謂エピタキシャル成長の発現が認められた。その発現頻度は、ビードの幅方向の中心部分すなわち凝固方向が試料表面に垂直な方向に成長する部分で高かった。但し、そのような部分であっても全ての結晶でエピタキシャル成長するわけではなく、下地の結晶方位の制御による造形物の結晶方位制御は、特定の結晶方位でのみ可能であることが示唆された。この成果により、3Dプリンターで形状だけでなく結晶方位も制御してこれまでに得られない力学特性を有す材料を創製の指針を得た。当初の予定どおり、IN718合金単結晶材を用いた電子ビーム走査による溶融凝固とそれによる結晶組織形成を調べることができた。種々の電子ビームの出力や走査速度での、ビードの組織観察を行った。単結晶だけでなく多結晶体を用いて実験を行うことにより、下地の結晶方位が異なる場合の凝固組織を効率よく調べることができ、当初の予定よりも大幅に研究を進展させることができた。またフェーズフィールドシミュレーションの準備も順調に進んでいる。金属用3Dプリンタである電子ビーム(EB)積層造形で発現する結晶配向性に注目し、同造形法を形状だけでなく結晶方位も制御する手法として発展させる基礎研究を行った。昨年度までのNi超合金の多結晶および単結晶基板上でのEB走査実験によって得られた、種々のEB出力と速度の種々の組み合わせで形成される溶融ビードのサイズや内部組織に関する知見を参考に、種々のEB条件での造形実験を行った。重要な知見として、独立した溶融ビードの断面観察の結果に基づいてEB走査の間隔を調整することで、広範囲にEB出力・走査速度の組み合わせを変化させた場合でも健全な造形が可能なことを見出した。即ち、EB出力が小さく走査速度が大きい場合に、単独のビードによる溶融が小さくても、それに適応させて走査線間隔を小さくすることで単位面積当りの投入エネルギーを保てば溶融不足による欠陥や溶融過剰による形状不良の少ない造形物が得られることを示した。これにより、EB出力と走査速度の大きく異なる条件でも同様の緻密度の造形物を得ることができ、それらの特性と組織との関係を評価することが可能となった。具体的には、走査速度を大きくしEB出力を小さくした場合には、等方的な多結晶が得られ、走査速度を小さくEB出力を大きくした場合には、配向性の強い単結晶状の結晶粒組織が得られることを明らかにした。他のNi基超合金においても、同様の造化物の組織のEB出力・走査速度同様の依存性を確認した。さらに、微小な造形物の組織を解析し、熱流束の方向を反映した柱状晶組織が得られることを見出した。<100>配向した単結晶状の組織が得られることを利用すべく生体用CoーCrーMo合金の多孔体をEB積層造形することで、<100>配向による低ヤング率化と多孔体化の組み合わせにより、骨と同等の弾性特性を発現させることに成功した。

広く積層造形が適用されているNi基超合金ならびに生体用Co合金を対象として、EBの走査方向と造形物の方向と結晶方位の関係や、造形の基礎過程である微小溶融池の移動に伴う凝固結晶成長挙動とEB照射条件との関係を調べた。さらに凝固時の固液界面での温度勾配ならびに凝固速度を評価し、造形中の組織形成を予測するための基礎を構築した。加えて、結晶配向制御と格子多孔体の構造最適化の組み合わせにより、生体用Co合金の力学的生体親和性向上が期待される低ヤング率化が可能であること示した。今後はこれまでの成果に基づいて、単結晶育成に適切な電子ビームの条件で実際の造形を行う。また、結晶方位を制御した種々のセル多孔体を造形するとともに、その力学特性評価を行う。また、構造最適化計算により設計したセル多孔体の造形も行いその力学特性も評価する。これにより、提案する設計手法の有用性を検証し、3Dプリンターで形状だけでなく結晶方位も制御することにより、これまでに得られない力学特性を有するセル多孔体の創製のための、学理を構築する。材料組織、材料プロセス、材料強度当初Inconel718合金粉末の購入を予定していたが、この合金の電子ビーム積層造形における組織形成が、金属粉末の性質の微妙な違いにより大きく異なり関連研究の成果により判明し、適切な粉末を見極められるまで、その購入をみあわせる必要が生じたため。適切な粉末の性質が判明しつつあるので、最終確認を行った後に、粉末を購入する。
動体追跡装置を用いた『体内臓器の動き』のデータベース化に関する研究

北海道大学病院において動体追跡装置を用いて測定された臓器の動きに関するデータを収集して一元化し、系統的な臓器の動きを把握する基盤(データベース)を、利用者側が容易に利用できるようにウェブ形式のシステムとして構築した。本研究において作成されたデータベースを用い、体内での臓器の動きのメカニズムの把握、研究を行う枠組みの検討を行い、構築したデータベースを用いて臓器の動きの解析を行った。本研究は、北海道大学病院において動体追跡装置を用いて測定された臓器の動きに関するデータを収集して一元化し、系統等的な臓器の動きを把握する基盤の作成を行い、体内での臓器の動きのメカニズムの研究および、実際の放射線治療における臓器の動きを考慮して導入されるマージンに対して定量的な根拠からの評価を行い、臨床へのフィードバックを行うことを目的としたものである。本研究を遂行するにあたり、1)動体追跡放射線治療装置により得られたデータのモデリングとシステムの構築、2)データの入手、3)データの入力、4)データの公開、5)データの解析の5つの過程を考え、平成21年度においては、1)データのモデリングと実装、2)データの入手、3)データの入力を行った。1)データのモデリングにおいては、データベースのシステム構築とともに、データベースに収載すべきデータについての調査ならびに議論を行った。本データベースのデータ利用および研究上必要と考えられるデータとして、動体追跡装置で得られる臓器の動きを表現している3次元の時系列データだけではなく、患者のセットアップ、治療での照射条件、対象疾患および治療対象部位などの情報も収集対象とした。この議論を元にデータベースのシステムの構築を行った。実装形式は、利用者が容易にアクセスできることを目的としてウェブベースで作成し、検索ならびに数値時系列データの作図機能を実装した。2)、3)データの入手、データの入力として、20072009年のデータ約140件について本データベースシステム上への登録を行い、研究・解析のための基盤を作成した。本研究は、北海道大学病院において動体追跡装置を用いて測定された臓器の動きに関するデータを収集して一元化し、系統等的な臓器の動きを把握する基盤(データベース)の作成を行い、体内での臓器の動きのメカニズムの把握、研究および、実際の放射線治療における臓器の動きを考慮して導入されるマージンに対して定量的な根拠からの評価を行い、臨床へのフィードバックを行うことを目的としたものである。本研究においては、1)動体追跡放射治療装置(Real-time tumor trackingradio therapy(RTRT))により得られたデータのモデリングとシステムの構築2)RTRTデータの入手、3)データの入力4)データの公開、5)データの解析の5つの過程を考え、平成22年度においては、21年度に引き続き、1)システムの構築と、2)データの入手、3)データの収集を継続した。また、データベースのシステムの再検討を行った。1)データベースの構築作業においては、21年度までに作成したウェブベースのシステムに、検索された患者データに対し、インタフェースとして提供できる機能を検討し、マーカの位置の位置情報の表示、マーカー分布、ヒストグラム形式、マーカの動きのアニメーション機能など、数値時系列で与えられるデータの理解を助ける機能を実装し、ここまでの成果を、第23回日本放射線腫瘍学会(千葉)にて発表した。収集したデータの解析を行い、部位ごとに動きの分布に違いがでることが明らかになった。また、他の研究者の臓器の動きの解析において用いられるなど、システムの有効性が示された。
海底ケーブル観測システムを利用した津波地震の早期予測に関する研究

2004年12月26日に発生したスマトラ島地震(M9.09.3)について、地震波ならびに津波から独立に推定された断層モデルを用いて、インド洋津波の発生および伝播過程の詳細な再現計算を行い、M9クラスの海溝型地震により発生する津波像を明らかにした。それぞれの断層モデルから計算される津波は、すべり量の違いにより波高に差異が見られた。さらに断層運動の動的効果ならびに破壊伝播の影響を調べるために津波計算の初期条件を変化させた。その結果、インド洋を伝播する津波への断層の動的効果の寄与は小さいが,断層面の破壊領域が大きいため断層の破壊過程が津波の到達時刻に影響することが明らかとなった。これらの研究成果は国内外の学術誌に掲載された。さらに、2006年11月15日に千島列島沖で発生したM8.3の海溝型地震に伴って発生した津波ならびに関連現象の解明のために,JAMSTECの「釧路・十勝沖海底地震総合観測システム」の観測データの精査を実施した。その結果、地震発生から約1時間後に、海底ケーブル観測システムに含まれる3台の海底津波計で振幅5cmの津波が観測された。これは北海道の最東端に位置する花咲よりも10分以上早い観測である。これは釧路・十勝沖の「海底ケーブル観測システム」が、千島海溝沿いで発生する津波に対して、わが国で最も早い津波観測を可能とするファシリティであることを示唆している。また、地震時には層別流向流速計(ADCP)も稼働していたが、津波伝播に関連する流速変化や環境変化は観測されなかった。現在のところ、既設ADCPにより津波シグナルを検知するのは、最小観測流速のしきい値の問題から困難である。この研究成果は、速報として国際会議で発表した。2004年9月5日19時07分および同日23時57分に、紀伊半島沖で気象庁マグニチュード6.9(前震)および7.4(本震)の地震が、北東-南西方向に約40kmの距離と約5時間の間隔をおいて相次いで発生した。一連の地震に伴い、伊豆諸島から四国にかけての太平洋沿岸で最大0.9mの津波が観測されたが、津波は室戸沖に設置してある海洋研究開発機構の海底ケーブル式海底地震総合観測システム1号機(以下、室戸システムと呼称)の海底水圧計PG1(水深2340m)とPG2(同1530m)でも捕らえた。本年度は、紀伊半島沖地震の沖合津波観測のリアルタイムデータ処理の検討および海底ケーブル式リアルタイム津波観測が津波防災上有用であること確認した。まず観測データから津波波形を抽出することを行った。海底水圧計で観測されるデータは1s間隔でサンプリングされているため、オリジナル波形では地震波ノイズが卓越するため津波の到達は認識できない。そこで60sの移動平均をオリジナル波形に施して、地震波ノイズを除去した。前震、本震ともに移動平均によって短周期の地震ノイズが除去されて、津波がそれぞれ19時25分頃、翌日00時20分頃に室戸システムを伝播している状況が確認できた。水圧1hPaは1cm水頭に相当するので、その振幅は前震では4cm相当、本震では7cm相当の津波を観測したことになる。一方、気象庁の報告によれば、前震と本震による津波は室戸システムに最も近い室戸岬にそれぞれ19時48分、翌日00時37分に到達した。その振幅は0.51mとなっている。すなわち室戸システムでは、室戸岬に到達するおよそ20分以上前に津波を検知することに成功した。さらに沿岸で観測された津波は、沖合の観測よりも約10倍の振幅を持っていることが明らかとなった。また、震源断層から沖合での津波シミュレーションを実施して観測データと比較した結果、両者は一致することを確認した。
腫瘍関連遺伝子FHITと担癌犬で検出されたその遺伝子座における変異の解析

本研究はFragile Histidine Triad (FHIT)遺伝子座intron4領域のゲノム欠失(Int4D)が犬の腫瘍マーカーと成り得るか検討したものである。結果としてInt4Dは、FHIT遺伝子発現とは関連しない、体細胞レベルで生じているゲノム欠失であることが明らかとなった。しかしながら、Int4Dを腫瘍マーカーとした場合の検出感度は決して高いとは言えず、現時点での実用化は困難と思われた。本研究は、申請者が明らかにした担癌犬で高率に検出されるFragile Histidine Triad(以下FHIT)遺伝子座intron 4領域におけるゲノムの欠失(Int4D)に関して、その分子生物学的な意義を明らかにし、犬の腫瘍マーカーとしての有用性を検討するものである。平成21年度は、申請者の所属する山口大学農学部附属動物医療センターにおいて、検査もしくは治療目的で外科的に切除された犬の腫瘤病変からDNA、RNA、蛋白抽出が可能となるようサンプリングを行なった。これまでの所(5月6日現在)、腫瘍性腫瘤サンプル(良性および悪性腫瘍)31検体、非腫瘍性腫瘤サンプル7検体が採取されている。さらに、腫瘤病変が採取された犬の末梢血液も、同時に採取しDNA抽出を目的として保存している。これまで、腫瘍性腫瘤サンプル(31検体)ならびに非腫瘍性腫瘤サンプル(7検体)からDNAを抽出し、PCR法によってInt4Dの有無を確認しているが、腫瘍性腫瘤サンプルでは21/31検体(67.7%)でheteroもしくはhomo接合性のInt4Dが検出され、6/31検体(19.4%)ではInt4Dを認めず、さらに4/31検体(12.9%)ではInt4D検出プライマーによるゲノムの増幅は認められなかった。一方、非腫瘍性腫瘤サンンプル(化膿性肉芽腫など)においても6/7検体(85.7%)でInt4Dが検出され、Int4Dが検出されなかったのは1/7検体(14.3%)であった。また、これら腫瘤病変が採取された犬の末梢血液におけるInt4Dの欠失パターンを見ると、いずれの症例においても腫瘤病変と同一の欠失パターンであることが確認された。以上の結果から、Int4Dは体細胞レベルで生じているゲノムの欠失であり、腫瘍性腫瘤サンプル群から高率に確認されるものの、非腫瘍性腫瘤サンプル群においても検出され得る事象であることと想定している。そのため、後者の群に含まれる犬においては、今後の腫瘍発生に関して追跡の必要があると考えられた。本研究は、腫瘍抑制遺伝子であるFragile Histidine Triad(以下FHIT)遺伝子座intron 4領域において、体細レベルで生じているゲノムの欠失(Int4D)に関し、FHIT発現との関連性、ならびにInt4Dが新たな犬の腫瘍マーカーに成り得るかを検討するものである。本研究に供した犬の腫瘤サンプルは、現在のところ計45検体となり、その内訳は腫瘍性腫瘤サンプル(良性および悪性腫瘍)37検体、非腫瘍性腫瘤サンプル8検体であった。これら各腫瘤サンプルからDNAを抽出し、PCR法によりInt4Dの欠損を確認した。結果として、腫瘍性腫瘤サンプルでは20/37検体(54.1%)でHeteroもしくはHomo接合性のInt4Dが検出され、1/37検体ではHouse keeping遺伝子として用いたCμ遺伝子の増幅は認められたものの、Int4D領域の増幅を認めなかった。一方、非腫瘍性腫瘤サンプルにおいても5/8検体(62.5%)でHeteroもしくはHomo接合性のInt4Dが検出された。またInt4Dの検出の有無と、同サンプルにおけるFHIT遺伝子発現、Fhit蛋白発現の間には相関性が認められなかった。少なくとも本研究の結果からは、Int4Dの出現が腫瘍症例において優位に認められる事象とは言えず、またFHIT遺伝子の発現との関連性も見出すことはできなかったことから、本領域を犬の腫瘍マーカーとすることは困難と思われた。現在NCBIに登録されている犬のゲノム配列には、FHIT遺伝子座のInt4領域の欠失は認められない。しかしながら本領域は犬のSINE配列であり、またintron領域に存在することから、犬種もしくは個体により配列の異なる遺伝子領域である可能性が示唆された。そのため犬種ごとの発現傾向を検討した。すると、柴犬では4/4検体でHomo接合性のInt4Dを、またM.ダックスフントでは、7検体中4検体がHomo、3検体がHetero接合性のInt4Dを示していた。そこでこれら2犬種に関し、さらに別個体から末梢血DNAを抽出して解析を行なった所、柴犬では7/7検体(腫瘍罹患犬4検体、非腫瘍性疾患罹患犬3検体)がHomo接合性のInt4Dを、M.ダックスフントでは5/6検体(腫瘍罹患犬2検体:Homo 2検体、非腫瘍性疾患罹患犬3検体:Homo 1検体、Hetero2検体)でInt4Dが検出された。
言語を情報伝達の媒体とするシミュレーションの開発

本研究は、ヒトが言葉で思考や認識をおこなう知的活動をコンピュータ上に実現するための研究の一環として、ヒトが言葉で思考する過程をシミュレーションのモデルとしてもちいる手法を提案する。シミュレーションの対象モデルとして、海外為替の変動などを予測するエコノミストやディーラーたちが数学的モデルをもちいなくても、言葉による思考で将来の変動予測をおこなっていることに着目し、かれらの予測の過程を言葉によってモデル化(言語シミュレーションモデル)し、数学的モデルとはまったく異なった人間の認知活動に近いシミュレーションのモデルを考えた。平成11年度においては、海外為替変動予測モデルの対象とした海外為替の変動がどのようにエコノミストらによって表現され、どのようにレポートとしてまとめられるのかについて調査した。対象として米ドルと日本円の変動について着目し、その変動予測を考える上で必要になる情報の収集・分析をおこなった。また、エコノミストらが予測する予測のプロセスを抽出し、どのような手順を経て予測をおこなっているかについて調査した。平成11年度後半から12年度にかけて、言葉によるマルチモーダル情報の統合手法を考察した。具体的には、為替変動を示すグラフがどのように言語として認識されるかについて考察をおこない、シミュレーションのなかでグラフというイメージ情報を言葉という情報媒体で認識することにより様々な情報の間にある隔たりをなくし、より人間をおこなっているような言葉によるシミュレーションをおこなうためのひとつの技術的な提案をおこなった。また、予測のモデルが言語のモデルとして構築される際に、どのような文法的特徴があるのかについて調査をおこない、ヒトが言葉をもちいて予測やシミュレーションをおこなう際にどのような文法的資源を利用するのかについて考察をおこなった。以上の結果をまとめて、米ドルと日本円の将来変動の予測をその当時の状況にあわせて予測する言語シミュレーションモデルの提案をおこなった。研究課題である「言語を伝達の媒体とするシミュレーションの開発」のために、平成11年度においては、シミュレーションの対象とした海外為替の変動がどのようにエコノミストらによって表現され、どのようにレポートとしてまとめられるのかについて調査した。対象として米ドルと日本円の変動について着目し、その変動予測を考える上で必要になる情報の分析をおこなった。具体的には、数値情報として発表とれる経済統計指標の数値情報、為替の変動傾向をしめすグラフの動向によるイメージ情報、また要人発言によるテキスト情報などであり、それらの情報がどのように為替変動予測において適切に用いられるのかについて考察をおこなった。また、変動予測が実験にどのようにおこなわれているのかを調べるために、新聞記事からエコノミストらが予測する予測のプロセスを抽出し、その当時の経済状況において彼らがどのような手順を経て予測をおこなっているかを抽出し、それらの情報をデータベース化する作業をすすめた。また、さまざまな為替の変動を表現するグラフなどがエコノミストらの予測の判断材料になるときに、為替変動を示すグラフがどのように言語として認識され、彼らのなかでグラフの動きを言葉により認識された情報として利用されるかについて考察をおこない、シミュレーションのなかでグラフというイメージ情報を言葉という共通の情報媒体で認識することにより様々な情報の間にある隔たりをなくし、より人間をおこなっているような言葉によるシミュレーションをおこなうためのひとつの技術的な提案をおこなった。
CキナーゼとDGキナーゼの神経情報伝達におけるクロストーク機構のイメージング解析

【緒言】プロテインキナーゼC(PKC)は、神経可塑性を調節していることが報告されているが、神経可塑性に関与する情報伝達経路の中でどのPKCサブタイプが、いつ、どこで、どのような役割を果たしているかという時空間レべルの解明は、未だ行われていない。我々は、GFP融合PKCを用いた検討により、PKCには種々に刺激に応じて異なる蛋白質へターゲットする機構(ターゲティング機構)があることも報告し、このターゲティング機構が神経可塑性においても重要であることを示唆してきた。本年度の研究において、神経におけるPKCターゲティング機構の解明、および、PKCターゲティングを制御する因子であるDGKとの関連の解明を目的として研究を行った。【結果と考察】1)脂質メッセンジャーであるアラキドン酸およびセラミドはPKCepsilon(前シナプス型サブタイプ)およびPKCdelta(痛覚路発現サブタイプ)のC1Bドメインに作用し、サブタイプ特異的にゴルジ体にトランスロケーションさせること、2)PKCの活性化をともなわないターゲティングによっても、細胞死などの現象を引き起こすこと、3)PKCgammaとDGKgammaは、カルシウム依存性に細胞内で直接結合し、お互いの機能を制御しうること、を見出した。これらの結果より、酵素の活性化とは関係なくPKCターゲティングが生理機能をもつこと、および、このPKCのターゲティングは調節する薬物のターゲットとして、PKC epsiolonのC1Bドメイン、DGKgammaなどが候補となることが示唆された。さらに、GFP標識した各PKCサブタイプを脳部位特異的、時期特異的に発現可能なトランスジェニックマウスを作成し、各脳部位でのPKCのターゲティングと電気生理現象の関連を解析を可能とした。脳スライスにおけるPKCターゲティングは培養細胞において観察されたものと異なっていることから、神経可塑性におけるPKCおよびDGKの機能を解析するためには、脳スライス内を用いたより生理的な条件下でのPKCターゲティングの検討が必要であることが示唆された。
１９３０年代連邦作家計画のガイドブックにおけるアメリカン・ナラティヴの創出

本研究は、連邦作家計画(FWP)が失業中のプロ・アマチュアの作家に書かせた各州と各都市のガイドブックが、いかにアメリカの自己イメージを醸成させながらアメリカの国民性と文化についてのナラティヴを紡ぎ、またそれがいかなるものであったのかを明らかにすることを目的としている。48州のガイドブックの他にアラスカ、プエルトリコ、またワシントンDCなどのいくつかの主要都市のFWPのガイドブックを半年ほどかけて読了した結果、初年度において得られた知見、および現在までに明らかにできたことは、以下の通りである。1)まず、いずれのガイドブックもガイドブックでありながら自動車旅行以外の情報の多さが顕著であり、各ガイドブックのうち約三分の二の分量を占めるのが州の歴史、地方文学、産業、建築、アート、文化、風習、伝承、地元新聞のゴシップの引用などであった。読者であるアメリカ人に自国を隅々まで紹介することで、当時まだヨーロッパにあった帰属感を完全に切り離し、アメリカを真の故郷(ホーム)にしようとする特異なガイドブックであったことが明らかとなった。またそのことは、ガイドブックの企画の草案が浮上したWPAの前身FERAの資料からも裏付けられた。2)つぎに、林業、漁業、農業などで日々ハードワークをこなす肉体労働者の描写が比較的多いことに着目した。肉体労働者についての描写には、アメリカのかつての開拓者の姿が重ね合わせられており、恐慌前にもてはやされた中産階級ではなく肉体労働者を「本当のアメリカ人」「魂を持つアメリカ人」として明確に描いていることから、少なくともFWPのガイドブックは、恐慌期にあってヒーローの再定義やアメリカ国民の再定義を行う意図があったことを示唆した。計画していた通り、全州と代表的な都市のガイドブックの読み込みのうち、全州のガイドブックの読み込みを完了した。地方都市の補助的なガイドブックについてはまだすべてをフォローできていないが、当初から2年目で完読予定であったので、おおむね順調に進展しているといえる。また、ガイドブックを通じて創出されたアメリカン・ナラティヴについて、その時点で明らかになったことについて学会発表を行った。日本語による国内研究発表であるが、予定していたことであるので、これも計画どおりに進んだといえる。さらには、当該年度において明らかにしたことを、編集委員の査読を経て、書籍(和文)として出版準備を進めている(現在、第一校)。研究過程でFWPガイドブックとそれ以前のガイドブックの違いを浮き彫りにする必要が生じたため、それ以前のガイドブックを一通り網羅する過程において、1906年からの国内旅行奨励キャンペーン「まずアメリカを見よう(See America First)」キャンペーンの存在を知り、そのガイドブックのFWPガイドブックへの影響について確認する必要が生じた。これについては研究計画に組み込んでいないことであったが、すでに資料は入手しているので、次年度に追加でフォローする予定である。次年度は「まずアメリカを見よう」キャンペーンのガイドブックの資料の読み込みを追加で進めながら、当初よりの研究計画を進める。まずは、国際・国内学会で研究発表(英語)を行う予定である。同様に計画に沿って英語論文を国内外の学会誌で発表する。投稿を続ける過程で、地方都市の補助的なガイドブックを含むすべてのガイドブックの読み込みを完了する予定である。FWPガイドブックは一冊800ページを越えるものもあり、総じて分量が多いが、今後控えている現地調査を効率的に行うためにも、遅れが出ないよう取り組みたい。

さらには、当該年度において明らかにしたことを、編集委員の査読を経て、書籍(和文)として出版準備を進めている(現在、第一校)。研究過程でFWPガイドブックとそれ以前のガイドブックの違いを浮き彫りにする必要が生じたため、それ以前のガイドブックを一通り網羅する過程において、1906年からの国内旅行奨励キャンペーン「まずアメリカを見よう(See America First)」キャンペーンの存在を知り、そのガイドブックのFWPガイドブックへの影響について確認する必要が生じた。これについては研究計画に組み込んでいないことであったが、すでに資料は入手しているので、次年度に追加でフォローする予定である。次年度は「まずアメリカを見よう」キャンペーンのガイドブックの資料の読み込みを追加で進めながら、当初よりの研究計画を進める。まずは、国際・国内学会で研究発表(英語)を行う予定である。同様に計画に沿って英語論文を国内外の学会誌で発表する。投稿を続ける過程で、地方都市の補助的なガイドブックを含むすべてのガイドブックの読み込みを完了する予定である。FWPガイドブックは一冊800ページを越えるものもあり、総じて分量が多いが、今後控えている現地調査を効率的に行うためにも、遅れが出ないよう取り組みたい。当該年度は全州と主要都市のガイドブックの収集と読了を進めたが、その中で出版当初のオリジナルのガイドブックには付録がついていることが判明したため、復刻版ではなく古書を極力手に入れるようにした結果、海外からの取り寄せに時間がかかり、また取り寄せ不可なども生じてしまった。それによる研究の遅れをとりもどすべく、州のガイドに関しては復刻版を入手する方針をとり、一方、研究計画で次年度で資料の読み込みを完了する予定の地方都市のガイドブックについては、時間的猶予があると考え、そのまま古書を手に入れる方向で進めた。その結果、手配中のままの資料がある関係で、次年度使用額が生じる結果となった。
大脳錐体細胞の構造と機能による分類と遺伝子発現プロファイリング解析

皮質下構造での大脳皮質の作用を理解するために、本研究では前頭皮質5層錐体細胞サブタイプの構造と機能を明らかにすることを目的としている。昨年度は、線条体と橋核に蛍光逆行性トレーサーを注入し、そこに投射する5層錐体細胞サブタイプで細胞の発火パタンを詳細に解析し投射先と発火特性に相関がみられることを明らかにした。本年度では、投射先と相関関係にある発火特性について2/3層錐体細胞からの結合特異性を先ず検討した。その結果、同じ発火特性を有する5層錐体細胞サブタイプ同士は同じ2/3層錐体細胞から共通に入力を受ける確率が高く、また5層錐体細胞サブタイプ間の発火特性が同じサブタイプ同士がシナプス結合を有する場合、共通の入力を受ける確率がさらに高いという結果を得た。昨年度の結果と併せて、これのことは2/3層から5層錐体細胞へのシナプス結合は、5層錐体細胞の皮質下構造への投射先に依存して分離していることを示唆する。次に、5層錐体細胞の発火特性の差異を決定するコンダクタンスを検討した。5層錐体細胞サブタイプの一つであるバースト発火する錐体細胞は、細胞の静止膜電位に依存して膜電位が浅いときはバースト発火が阻害された。これは、Ca^<2+>チャネルの活性化・不活性化がバースト発火の発生に関与していることが考えられる。発火特性サブタイプのもう一つの指標である、電流注入時のスパイク頻度の減衰について電極内液にCa^<2+>のキレーターである高濃度のEGTAを加え細胞内Ca^<2+>の関与について検討した。その結果、高濃度EGTAを含有した場合スパイク頻度の減衰が阻害されたことからCa^<2+>依存性K^+チャネルが関与していることが示唆される。今後、Ca^<2+>チャネル(特に活性化電位が低いR型)とCa^<2+>依存性K^+チャネルに特に着目し、その発現パタンなどをRT-PCRを用いて検討したい。大脳皮質から様々な皮質下構造への情報出力は、5層にある錐体細胞が担っている。従って、皮質下構造での大脳皮質の作用を理解するには、そこに投射する錐体細胞を同定し、その錐体細胞サブタイプの性質を理解することが必要である。そこで本年度では、線条体と橋核に蛍光逆行性トレーサーを注入し、そこに投射する5層錐体細胞を同定した。同定した5層錐体細胞サブタイプでスライスバッチクランプ法を行い、細胞の発火パタンを解析した。その結果、線条体に投射する殆どの細胞は電流注入に対して最初の期間しかスパイクが発生しなかった。一方、橋核に投射する細胞は電流注入中規則的にスパイクが発生する細胞と電流注入中規則的にスパイクが発生するが注入の最初でスパイクがバースト状に発生する細胞の2種類が記録され、5層錐体細胞の発火特性は投射先と相関しているという結果が得られた。さらに、5層錐体細胞サブタイプへのシナプス入力の性質について検討した。まず、サブタイプ間で自発性シナプス電流について解析した。しかし、自発性シナプス電流の振幅、頻度ともにサブタイプ間で違いが見られなかった。また、5層錐体細胞同士から同時に記録し5層錐体細胞間のシナプス結合について解析したが、発火パタンが異なる細胞間で違いが見られなかった。さらに、5層錐体細胞間のシナプス結合における短期可塑性を検討した。短期可塑性も発火パタンが異なる細胞間で違いが見られなかったが、振幅が小さなシナプス電流は増強され、振幅が大きなシナプス電流は抑圧される傾向があるという結果を得た。5層錐体細胞サブタイプ間の発火特性の差異を決定するコンダクタンスを現在検討中である。

その結果、高濃度EGTAを含有した場合スパイク頻度の減衰が阻害されたことからCa^<2+>依存性K^+チャネルが関与していることが示唆される。今後、Ca^<2+>チャネル(特に活性化電位が低いR型)とCa^<2+>依存性K^+チャネルに特に着目し、その発現パタンなどをRT-PCRを用いて検討したい。
Siglec-7と認識糖鎖の結合による癌の悪性形質増強と免疫監視逃避機構の解析

抑制性受容体Siglec-7は酸性糖シアル酸を認識し、主にナチュラルキラー(NK)細胞上に発現しており、癌細胞上のリガンドに対し反応すると癌への攻撃は抑制されてしまう。Siglec-7のリガンド糖鎖は幾つか報告があるが特異性など不明瞭な点が多い。我々はリガンド糖鎖としてタンパク質上にできるO型糖鎖を新たに発見し、質量分析によりそのキャリアータンパク質及びその糖鎖構造の候補も同定した。また、Siglec-7とリガンド糖鎖の相互作用において、免疫側ではリガンド糖鎖がSiglec-7の活性化を誘導し、免疫反応の抑制に働き、癌側へは運動能の増強という双方向のシグナルが伝わることを明らかにした。Siglec-7が認識する糖鎖のキャリア分子上のリガンド糖鎖の特異性及びその相互反応に基づく免疫細胞側及び癌細胞側へのシグナルを解析し、免疫監視逃避機構を明らかにするために、以下の検討を行った。組換えタンパク質Siglec-7との結合を誘導するとして同定したシアル酸転移酵素遺伝子cDNAと、Siglec-7のリガンド糖鎖キャリア分子として同定されたタンパク質のcDNAとの共発現により、シアル酸再構成タンパクを作成した。それが内因性のSiglec-7と結合することを確認し、リガンド糖鎖が認識可能な構造に修飾されたことを確認した。現在、翻訳後修飾解析用質量分析計Orbitrapfusionを用い、タンパク質上の糖鎖構造及び修飾アミノ酸残基の解析を行っている。U937Siglec7+とDLD-1及びそのSiglec-7結合トランスフェクタントとの共培養の結果、トランスフェクタントとの共培養でSiglec-7のITIMのチロシンリン酸化の増強が観察された。その結果、リガンド糖鎖がSiglec-7に結合し、免疫細胞側に抑制シグナルが伝わることが示唆された。また、DLD-1及びそのトランソフェクタントに対しSiglec-7-Fcを培養上清に加えたところ細胞の運動能を増強させることが分かった。またその時に種々のシグナル分子の活性化が認められた。このことからSiglec-7がシアル化糖鎖を介して癌細胞に有利なシグナルを伝える可能性が示唆された。この過程へのリガンド糖鎖キャリア分子として同定されたPODXLの関与を明らかにするために、PODXLをノックアウトするためのCRISPER/Cas9systemを設計中である。以上より、Siglec-7とリガンド糖鎖との相互作用が免疫細胞側へは負のシグナルを、癌細胞側へは有利なシグナルを伝え、癌の宿主免疫機構からの逃避を誘導することが示唆された。Siglec-7が認識する糖鎖のキャリア分子上のリガンド糖鎖の特異性及びその相互反応に基づく免疫細胞側及び癌細胞側へのシグナルを解析し、免疫監視逃避機構を明らかにするために以下の検討を行った。これまでに同定したSiglec-7リガンド糖鎖キャリアタンパク質とSiglec-7との結合を亢進させるシアル酸転移酵素をもとに作成したシアル酸再構成タンパク質の質量分析による糖鎖構造解析を行った。その結果、内因性のSiglec-7との結合が非常に強く見られるタンパク質から特徴的な糖鎖構造を持つペプチド断片が同定された。また、それらタンパク質から糖鎖を切り出し、糖鎖単体での質量分析でもその特徴的な糖鎖構造が同定された。この糖鎖構造はこれまで報告されていない新規の糖鎖構造であった。さらに、Siglec-7と相互作用する分子のプロテオーム解析によりさらに2つの分子を同定し、4種のタンパク質がSiglec-7のリガンド糖鎖を持つことがわかった。一方、すでに我々の研究でこのリガンド糖鎖がSiglec-7発現U937細胞においてSiglec-7のITIMモチーフのリン酸化レベルの亢進が見られていたが、さらにチロシンホスファターゼSHP-1をITIMへリクルートしリン酸化レベルを亢進させ活性化させていることが見出された。このことから、癌細胞上のリガンド糖鎖がSiglec-7を介し免疫細胞内へ抑制シグナルを伝達していることがわかった。以上、この研究で新規に同定されたSiglec-7リガンド糖鎖は癌細胞上に発現することで免疫細胞からの攻撃を免れる機能を持つことがわかり、さらにそのキャリア分子からの癌細胞へのシグナルで癌の悪性度を増強することが示唆された。現在これらの結果をまとめ論文作成中である。リガンド糖鎖を中心としたSiglec-7とPODXLの相互作用による免疫細胞側、癌細胞側、双方向におけるシグナル及び表現型を解析し、癌の免疫監視からの逃避機構が示された。また、リガンド糖鎖のキャリアタンパクの精製も完了し、質量分析計による解析もすでに開始しており、おおむね順調であると考えられる。

生化学、糖鎖生物学Siglec-7のリガンド糖鎖の構造解析を質量分析計により解析し、構造決定を行う。また、Biacoreやカロリーメーターなどを用い、同定された糖鎖構造とこれまでに報告されたリガンド糖鎖構造のSiglec-7への分子間相互作用の親和性を測定し、特異性を明らかにする。in vitroで明らかになったNK細胞の細胞障害活性の抑制をin vivoで解析するために、免疫不全マウスへSiglec-7を強制的に発現させたNK細胞を移入した後、DLD-1及びそのトランスフェクタント移植して、その腫瘍形成能を評価し、機能解析を行う。CRISPER/Cas9を用いPODXLのノックアウトを行い、Siglec-7による癌細胞側への運動能増強シグナルにおける役割の解明を行う。
定位固定放射線源と診断用骨盤部MRI画像を用いたPET減弱補正法の開発

次世代の診断装置として陽電子断層撮像法(PET)と磁気共鳴イメージング(MRI)を同一のスキャナで行えるPET/MRIの開発が進められている。正確なPET画像を生成するために、これまでは補正データ作成用のMRI撮像を追加で行っていた。本研究では通常の診断で用いるMRI画像だけを用いて補正データを作成することに成功した。本研究の成果によりMRIの撮像時間が従前よりも短縮できるため、単位時間内により多くの患者の診断ができるようになる。今年度は、診断用のT1強調MRIを基にして骨の影響を考慮した減弱補正用画像(μマップ)の生成法を開発し、次年度の評価のためのプログラムの作成やシミュレーション環境のセットアップを行った。診断用T1強調MRIを患者登録データベースシステムから抽出し、輝度値の確率密度関数をガウス混合分布モデルにフィッティングすることで領域分割を行うアルゴリズムを開発した。放射線科医の指導のもとに手動で領域分割した画像を作成し、これを正解値として、十分な精度で領域分割が行われていることを確認した。さらに、複数の被験者の手動画像における形状を標準化した上でした上で平均することによって、組織確率分布を作成しこれを輝度値の確率密度関数と合わせることで領域分割の精度が向上することがわかった。放射線源から検出器に至るまでの各領域を通過した線路長を求めるプログラムを作成し、擬似的に放射線減弱に伴う検出光強度変化を求めるプログラムを作成した。擬似的なμマップは上記の手動で作成した領域分割画像に文献値を割り当てることで作成できるようになった。PET画像再構成における減弱補正の影響を評価するために、STIRソフトウェア・ライブラリを用いてPETシミュレーションを行うための環境を計算サーバ上に構築した。また、STIRライブラリに適応するためのファイルIOや評価用プログラムを実行するためのスクリプトを作成し、動作確認を行った。計画時のアイデアに加え、組織確率分布を利用することで領域分割の精度が著しく向上することを示せたため。本年度は昨年度に開発した診断用のT1強調MRIを基にした骨の影響を考慮したPET減弱補正用画像(μマップ)生成法の評価を行った。前立腺がん患者の診断に用いたMRIを回顧的に用いて2種の従来法(閾値法,テンプレート変形法)と提案法によってμマップを生成したところ、提案を使ったほうが正確なμマップが作成できることが示された。さらに、前立腺がん患者のPETシミュレーションを行い、再構成したPET画像における放射能で提案法を評価した。閾値法では前立腺周辺部の放射能がシミュレーション真値よりも9%程度過小評価されたのに対し、骨の影響を考慮した提案法とテンプレート変形法では2%程度まで誤差を低減することができた。また、テンプレート変形法では原理的に腸管内ガス領域を検出できないため本来腸管部である位置に偽陽性が生じたが、患者本人のMRIに基づいている提案法と閾値法ではガスの影響は大幅に低減されることがわかった。以上より、提案法が従来法よりもの性能の良いμマップ生成法であることを示した。本研究の成果は減弱補正に特化したMRI撮像に時間を割くことなく診断用のT1強調MRIを用いればPET/MRIの減弱補正が十分な精度でできることを示している。このことは画像診断装置の稼働率の向上が見込まれることを示している。さらに、可動域が広い頭頸部においても提案法を適用するための基礎的検討を行い、提案法を応用することで変形しやすい部位においても正確な領域分割が行える可能性を示した。従前の計画通り、今年度に作成した評価環境にて、提案によるμマップ生成の条件を変えて、至適なμマップ生成法を探る。具体的には、線源の放射能、線源固定位置、線源個数、領域分割結果における領域数を変える。領域分割結果における領域数は、少なくするほど(ひとつの領域が大きいほど)各領域のμ値が安定して求まるが、一つの領域にμ値が異なる複数の領域が含まれてしまう可能性も高まるというトレードオフの関係がある。どの程度小さい領域を統合すれば、元の減弱補正用データと同等のものを作れるかを検討する。また、線源の放射能、固定位置、個数により、測定時間の短縮を図る。これらの条件の違いの影響は、前年度に開発した検出光強度変化の算出法では評価ができない。そこで、Geant4ソフトウェアライブラリを用いたモンテカルロシミュレーションにて求める。モンテカルロシミュレーションのプログラムは頭部組織の減弱補正法の開発時に作成したものを改変して使用する。これで求めた提案法によるμマップを前年度に開発したPET再構成シミュレーションに組込み、パラメータの違いがPET再構成画像に及ぼす影響を調査する。至適パラメータの関する研究は論文としてまとめて国際誌に投稿する。医用画像工学消耗品購入で端数が発生したため。今年度の消耗品購入に充てる。
光照射固体NMRによる細菌型センサリーロドプシンの光活性構造変化の解明

細菌型光受容膜タンパク質は物質輸送や信号伝達に重要な役割を果たしている。発色団レチナールが光サイクルを回る間に光受容体としての機能が発現する。本研究では光サイクル中に生成する光中間体を固体NMRによって観測するため、光照射固体NMR装置の開発を行った。この装置を用いて、プロトン輸送活性をもつバクテリオロドプシンの変異体Y185F-bRを用いて、光サイクル中に生成するO-中間体やCS*-中間体のNMR信号の観測に成功した。次に負の光走性を示すppR/pHtrII複合体について光照射を行った結果、M-中間体からO-中間体が生成し、N'-中間体がO-中間体から平衡反応で生成することが判明した。このなかでレチナールを有するレチナール膜タンパク質は、光照射によるレチナールの光異性化をトリガーとする光反応サイクルを経て、光受容体としての機能が発現する。しかし、このとき生成する光活性中間体とタンパク質の相互作用や構造変化については不明な点が多い。本課題は光受容膜タンパク質の機能発現に重要な光活性中間体を、新規に開発したin-situ光照射固体NMR法を用いて定常的に捕捉し、タンパク質側の動的構造変化の詳細な解析から、光活性構造変化により生じる信号伝達の分子機構を明らかにすることを目的とする。研究対象として生物が示す感覚応答のモデルとして注目されている光走性の信号を伝達する細菌型光受容膜タンパク質およびイオン輸送膜タンパク質を研究対象とする。この中で、高度好塩菌に存在する光駆動型プロトン輸送活性をもつバクテリオロドプシンと負の光走性を担うセンサリーロドプシンII(SRIIあるいはppR)および正の光走性を担うセンサリーロドプシンI(SRI)を研究対象とした。本年度は、SRIについて研究を進めた。SRIの発色団レチナールが光異性化を起こし、その構造変化がSRIに伝わる。次に結合トランスデューサー(HtrI)に構造変化が伝わり、さらにリン酸化経路を経て、菌の鞭毛に信号が伝わる。その結果、正の光走性の信号を伝達した場合は菌の反転頻度が下がり、菌は光に向かう正の光走性を示す。一方、負の光走性の信号を伝達した場合、菌の反転頻度が上がり、光から退避する負の光走性を示すことが明らかになった。さらにバクテリオロドプシンY185F変異体における光反応サイクルについて光照射固体NMRを用いて観測を行った。この結果、CS*中間体やO-中間体のNMR信号の観測に初めて成功した。本研究ではレチナール膜タンパク質がレチナールの異性化に応答して変化するタンパク質の局所動的構造変化を明らかにするため、レチナールの光異性化を観測することを可能にするin-situ光照射固体NMR分光器の開発を最初に行った。超伝導磁石の外側からLEDにより発生した緑色光を光ファイバーを用いて磁石内に固定しているNMRプローブの上側に光ファイバーを用いて誘導した。次にガラス棒を材料として製作したキャップでジルコニア試料管につめた試料を密閉した。この結果、高速回転する試料管の内部に効率よく光を照射することが可能になった。このin situ光照射NMR装置を用いて、連続で緑色光をセンサリーロドプシン試料に照射することにより高度好塩菌に存在するセンサリーロドプシンI(SRI)の光活性中間体の捕捉に成功した。この結果、SRIの正の光走性にはM-中間体が関与しており、負の光走性にはP-中間体が関与していることが明らかになった。つぎに、緑色光照射下ではM-中間体が生成し、紫外線照射下ではP-中間体が生成することを明らかにした。この結果、光受容膜タンパク質SRIにおいて波長依存的に活性が変換する分子機構を明らかにすることができた。光駆動型プロトン輸送活性をもつバクテリオロドプシンのY185F変異体を用いて、光反応サイクルをin-situ光照射固体NMRを用いて測定した。この結果暗状態ではAT-状態(13-trans, 15-anti)配座と、CS-状態(13-cis, 15-syn)配座を持っており、緑色光照射によりCS-状態はCS*ー中間体に変換し、AT-状態はN-(13-cis, 15-anti)およびO-中間体(13-trans, 15-anti)に変換することが明らかになった。CS*-中間体およびO-中間体のNMR信号を本研究により初めて観測した。レチナールを有するレチナール結合膜タンパク質は、光照射によるレチナールの光異性化を起点とする光反応サイクルを経て、光受容体としての機能が活性化される。しかしながら、このとき生成する光活性中間体とタンパク質間の相互作用や構造変化については、まだ不明な点が多く残っている。本研究課題は光受容膜タンパク質の機能発現に重要な光活性中間体を新規に開発したin situ光照射固体NMRを用いて定常的に捕捉し、タンパク質側の動的構造変化の詳細な解析を行う。これにより、光活性構造変化により生じる物質輸送や信号伝達の分子機構を明らかにすることを目的とする。研究対象として、生物が示す感覚応答のモデルとして注目されている光走性の信号伝達を司る細菌型光受容膜タンパク質およびイオン輸送活性をもつイオン輸送膜タンパク質を研究対象とする。

この中でも、高度好塩菌に存在する光駆動型プロトン輸送活性をもつバクテリオロドプシンと負の光走性を担うセンサリーロドプシンII(SRIIあるいはppR)および正の光走性を担うセンサリーロドプシンI(SRI)を研究対象としている。本年度は光駆動型プロトン輸送活性を持つバクテリオロドプシンのY185F変異体を用いて、この試料の光反応サイクルをin situ光照射固体NMRを用いて、中間体を定常的に捕捉することを試みた。この結果、暗状態ではAT-状態とCS-状態がモル比1:3で共存していたが、緑色光照射により、CS-状態はCS*-中間体に変換し、AT-状態はN-中間体を経て、暗状態にすると、O-中間体に変換することが明らかになった。CS*-中間体、O-中間体のNMR信号は本研究により初めて観測することに成功した。本研究ではレチナール膜タンパク質がレチナールの異性化に応答して変化するタンパク質の局所動的構造変化を明らかにするため、レチナールの異性化を観測するのを可能にするin situ光照射固体NMR分光器の開発を行った。超伝導磁石の外側からLED光源により発生した光をフォトファイバーを用いて磁石内に導入し、固体NMRプローブの上部に誘導した。次に透明なガラスキャップをジルコニア試料管の蓋として使用し、光を試料内に導入して試料管内部から照射する方式を確立することができた。このin situ光照射固体NMRを用いて、センサリーロドプシンII試料に緑色光照射を行い、Mー中間体の捕捉に成功した。さらに、これまで、観測されていなかったNー中間体の観測にも成功した。さらに青色光を照射することにより、Mー中間体からOー中間体に変換される過程を観測することに成功した。Nー中間体とOー中間体が平衡状態になっていることも本実験で明らかになった。バクテリオロドプシンY185F変異体を用いてin situ光照射固体NMRを用いてレチナールの光中間体の観測を試みた。緑色光照射を行った結果、CS状態はCS*中間体に変換することが判明した。さらに活性状態であるAT状態はNー中間体に変換することが判明した。低温で光照射状態から暗状態に戻したところ、Oー中間体の捕捉に成功し、始めてOー中間体のNMR信号の観測に成功した。また、Nー中間体は緑色光照射下では、Nー中間体からGー状態を経てNー中間体を形成することが判明した。細菌型光受容膜タンパク質は物質輸送や信号伝達に重要な役割を果たしている。レチナールを有する、レチナー結合膜タンパク質は光照射によりレチナールが励起されて光異性化を起こし、いくつかの中間体を経て元の基底状態に戻る光サイクルの間に光受容体としての機能が発現する。しかし、この時起こるタンパク質の構造変化と機能の相関については、不明な点が多い。本研究では光サイクル中に生成する光中間体を固体NMRによって観測し、レチナールとタンパク質の構造変化を検出するため、光照射固体NMR分光器の開発を行った。LED光を光源として、MAS試料管内部から、NMR測定の間にも光照射が可能な、in situ光照射固体NMR測定装置を開発した。この光照射固体NMRを用いて、プロトン輸送活性をもつバクテリオロドプシン(bR)の変異体(Y185F-bR)を用いて、光サイクル中に生成するO-中間体やCS*-中間体のNMR信号を初めて観測することに成功した。
酸素センサーの解明とその細胞工学への応用

赤血球造血因子エリスロポエチンは糖蛋白質であり、糖鎖はin vivoの活性に重要である。今年度は、低酸素条件で発現を誘導し、大量生産させたエリスロポエチンが、通常酸素条件下と同様の糖鎖構造を持ち、活性を有するかについて検討した。低酸素応答性を有する乳酸脱水素酵素A(LDHA)のプロモーターにエリスポエチンcDNAを接続した発現ベクターを安定導入したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を通常酸素条件下、低酸素条件下で培養し、その培養上清中からエリスロポエチンをアフィニティー精製し、糖鎖の構造と、生物活性を比較した。その結果、低酸素で培養しても糖鎖構造に大きな変化はなく、in vitro、in vivoの活性にも殆ど差が見られないことが分かった。この結果、今回我々が確立した強力なLDHプロモーターを用いた低酸素誘導性の動物培養細胞での物資生産系は、糖鎖が重要な機能を持っている物質でも問題なく利用でき、非常に有効であると考えられた。ところで、低酸素応答にはHIF-1という転写因子が低酸素エンハンサーに結合する事が重要である。また、この低酸素応答にはAKTキナーゼが関与することが報告された。そこで、AKTキナーゼ活性が低酸素誘導現象に必要十分であるかを検討するために、膜結合型で活性型のAKTを強制発現させた。その結果、AKTキナーゼのみでは低酸素状況をミミックできないこと、活性型AKTは低酸素刺激による応答を増強できること、ドミナントネガティブAKTは低酸素応答には必要だが、十分ではないことが示唆された。しかし、HIF-1αにはAKTキナーゼの基質配列はなく、別の因子のリン酸化が関与していると考えられた。エリスロポエチン(EPO)は赤血球の前駆細胞に作用しその分化・増殖を促進することで赤血球量を調節するホルモンであるが、その主な制御因子は酵素である。多量の出血や高地に行くことにより、組織への酸素供給が低下するとEPOの発現が誘導される。この誘導にはHIF-1(hypoxia-inducible factor-1)と呼ばれる転写因子が重要であることが明らかとなってきた。今年度は胚性腫瘍細胞P19に着目し、EPOの低酸素応答性の発現にはHIF-1以外の因子が必要であることを見いだした。まず、胚性腫瘍細胞P19がEPOを産生する事を発見したが、低酸素応答性の発現は見られなかった。一方、同じHIF-1を介して低酸素応答性に誘導される乳酸脱水素酵素A(LDHA)の誘導はP19細胞でも観察された。なお、P19細胞のEPO遺伝子の低酸素応答部位に変異は見られなかった。そこで、EPOを低酸素に応答して産生するヒト肝ガン細胞Hep3BとP19細胞を用いて、EPOとLDHAの低酸素応答エンハンサー(HIF-1結合部位を含む)が機能するかについてレポーター遺伝子を用いて解析した。その結果、Hep3B細胞ではいずれのエンハンサーも機能したが、P19細胞ではEPOエンハンサーは機能しなかった。つまり、低酸素が酸素センサーで認識され、EPOが誘導される際、HIF-1以外の因子も必要で、P19細胞はこの因子が欠損していると考えられた。一方、HIF-1結合部位を含んだLDHAプロモーターをEPO cDNAに接続してCHO細胞に導入し、低酸素刺激により効率的に動物培養細胞を用いた物質(この場合EPO)生産が可能であることを示した。EPOは糖蛋白質であり、その糖鎖がin invo活性には重要であるが、低酸素条件下でも通常酸素圧下と同様の糖鎖付加が見られることから、糖蛋白質の生産にも低酸素を利用したこの生産方法は有効であることが示された。ガン組織ではガン細胞が旺盛に増殖するために低酸素状態になっている。