hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AAA型分子モーター、ダイニンの作動メカニズム解明

ダイニンは、ATP結合・加水分解を利用することで微小管上を滑り運動する、巨大な生体分子モーターである。本研究課題は、ダイニン滑り運動の分子機構を明らかにすることを目標としたものであり、本年度は以下の研究成果をあげた。<ダイニンのクロスブリッジサイクルの速度論的解析>ダイニンの運動活性はそのATP加水分解過程によって引き起こされる2つの素過程-レールである微小管との結合解離、変位を生み出す構造変化(テールドメインの動き)-のアンサンブルにより生み出されると考えられているが、その詳細は明らかではなかった。本研究では、この2つの素過程の速度論的解析を行い、ダイニンのクロスブリッジサイクルの詳細を部分的に明らかにした(2報の投槁論文として報告)。<ダイニン分子内の微小管結合部位とATP加水分解部位との間の情報伝達メカニズム>ダイニン分子内の微小管結合部位とATP加水分解部位は、ストークと呼ばれる長い(1015nm)コイルドコイルで連結されている。したがって、ダイニンが運動活性を発揮するためには、この2つの機能部位間の長距離分子内情報伝達機構が必要である。本研究では、この情報伝達の構造的基盤を明らかにする目的で、組み換えダイニンの利点を生かした分子解剖的アプローチによる研究を行った。その結果、ストークコイルドコイル内の微小構造変化がダイニン分子内の情報伝達に中心的役割を果たすことが直接示された(投稿準備中)。<FRET法によるダイニン構造変化の動的解析>ダイニン重鎖内に蛍光タンパク質であるGFPとBFPを導入し、そのFRETの動的変化を検出することにより、以下の点を明らかにした(投稿論文として報告)。1.ダイニン重鎖はその結合ヌクレオチドの状態により、構造的に異なる2つの状態(State-IとState-II)をとる。2.State-IからStage-IIへの構造変化はATP結合後かつその加水分解の前におこり、State-IIからState-Iへの変化はATP加水分解後のADP放出直前におこる。後者の構造変化がダイニンのパワーストロークに相当すると思われる。3.4つのATP結合・加水分解部位のうち、AAA1モジュール内に存在する1番目のATP加水分解部位がこの構造変化に直接共役している。また、AAA3及び、AAA4のATP加水分解部位は、AAA1におけるATP加水分解サイクルを直接もしくは間接的に制御している。<4つのATP結合部位の機能解析>従来使用されている蛍光ATPの大部分はダイニンには機能しないことが明らかとなり、このサブテーマは難航したが、Mant-ATPおよびMant-ADPは機能することを見出した。これらMant-ラベルヌクレオチドとダイニン内在性トリプトファンとのFRETを測定することで、少なくとも2つ以上のATP結合・加水分解部位へのヌクレオチドの結合解離を検出することが可能となった。現在その詳細を検討している。<テールドメインのダイニンモーター活性への寄与>前年度の研究で、ダイニンのテールドメインがATP加水分解サイクルに対応して動くことを明らかにした。今年度はこの研究を発展させ、テールドメインの動きと運動活性の関連について研究を行った。具体的には、遺伝子組換えダイニンと運動活性評価系を組み合わせることで、以下の点を明らかにした(投稿論文として報告)。1.テールドメインはダイニンの運動活性に重要な役割を果たす。この動きがいわゆるパワーストロークに相当すると思われる。2.このパワーストローク以外に、遅い運動を担う第二の分子機構が存在する。<微小管結合部位とATP加水分解部位との間の分子内情報伝達メカニズム>ダイニンのATP加水分解サイクルと微小管結合・解離サイクルについて、速度論的解析を行い、その相関を部分的に明らかにした(投稿中)。また、この2つの機能部位間の情報伝達メカニズムを明らかにする目的で、変異体解析を進行させている。<ダイニンモータードメインの結晶化>本年度は約2万条件で結晶化の検討を行ったが、現時点では構造解析可能な結晶を得ることには成功していない。変異体を導入するなど新たなアプローチを組み込みつつ、結晶化への努力を継続している。
RANK系シグナルをターゲットとした脳梗塞における新規炎症制御ペプチドの開発

本研究により、MHP1の活性中心部位が明らかになると共に、TLR4だけでなくTLR2や7/8などのシグナルも抑制できることが明らかとなった。また、血清中での半減期や代謝産物も明らかとなった。また、静注において、脳梗塞部位に浸潤できることも明らかとなり、末梢投与にて、神経機能障害の改善、脳梗塞サイズの改善も明らかとなった。また、RANKLで問題となる破骨細胞の活性化を惹起することは無かった。ただ、治療効果を得るためには大量のペプチドが必要であったため、今後、マウス血清との混合によって得られた分解産物情報に基づいたペプチドの改変が重要であると考えられた。本年度は、MHP1の全身投与による効果の検討を行った。まず、MHP1が脳内に浸潤するか確認するために、FITCで標識したMHP1 200μgを脳虚血4時間後に頸静脈から静注し、FITCの免疫染色を行うことにより、脳実質へのMHP1の取り込みを検討した。投与5分後の脳梗塞側半球では、血管だけでなく、血管周囲および脳実質へのMHP1の浸潤が認められた。一方、投与1時間後では、FITCの発現が低下していたことから、MHP1は、脳梗塞による血液脳関門の破綻により脳実質に取り込まれるが、取り込まれている時間は比較的短時間であることが明らかとなった。この結果より、MHP1の効果発現のためには持続投与が必要であることが示唆された。次に脳梗塞4時間後あるいは6時間後のいずれかにMHP1 300μgを静脈投与した後に336 μgを持続皮下投与し48時間後まで観察したところ、生食投与群では神経機能スコアが悪化したが、MHP1を投与したマウスでは、4時間後および6時間後に治療を開始したいずれの群においても神経機能スコアが有意に改善し、脳梗塞サイズも有意に減少した。また、F4/80の免疫染色による活性化ミクログリア・Mφの脳梗塞領域への浸潤も、MHP1を投与したマウスでは、抑制される傾向にあった。また、MHP1に脳梗塞後の静注、および皮下投与により麻痺肢の破骨細胞の活性化を引き起こすことがないか、脳梗塞2日後の麻痺肢橈骨の遠位関節におけるTRAP染色において検討を行った。結果、正常マウスに比較し、生食投与脳梗塞マウスではTRAP陽性細胞が増加したが、MHP1を投与したマウスでは、TRAP陽性細胞の発現が低下する傾向にあった。以上の結果から、MHP1は全身投与でも脳梗塞後の炎症を抑制し、脳梗塞による神経機能障害を改善しうるとともに、麻痺肢における破骨細胞の活性も抑制しうることが示された。当初計画した予定どおり、MHP-1による脳梗塞モデルマウスにおける治療効果が確認されたことから、おおむね順調に進展していると判断している。今年度は、MHP1の作用メカニズムの解析を行った。まず、MHP1の作用がRANKLの受容体であるRANKを介しているかの検討をおこなった。siRNAでRANKのノックダウンをRAW264.7細胞(マクロファージ)およびMG6細胞(ミクログリア)にて試みたところ、RAW264.7細胞でのノックダウン効率が70.8±8.3%と高かったため、RAW264.7細胞での検討を行った。RAW264.7細胞ではLPSによるILー6、TNFαの発現がMHP1にて抑制されるが、RANKをノックダウンした細胞ではILー6、TNFαの発現が抑制されておらず、MHP1の作用はRANKを介していることが明らかとなった。次に、RANK下流のNFκBの活性化を、NF-κBサブユニットp65のリン酸化で確認した。RANKLでは抗炎症作用を示す100 ng/mlで明らかなp65のリン酸化の亢進が認められることに対し、MHP1ではp65のリン酸化の程度が軽度であった。また、RAW246.7細胞を破骨細胞に分化させる系において、RANKLとMHP1による破骨細胞のマスターレギュレーターであるNFATc1 mRNAの発現を解析したところ、RANKLではNFATc1の発現が亢進するが、MHP1では発現が亢進しないことが明らかとなった。これらの結果は、MHP1の抗炎症作用は、RANKLとは異なり、RANK-NFkB、RANK-NFATc1以外のシグナルを介していることを示唆していた。次に、MHP1がTLR4以外の炎症性サイトカインの発現にも作用するか検討を行った。TLR2/6のリガンドであるFSL1を用いた検討では、MHP1がIL-6、TNFαの発現を抑制することに対し、RAGEのリガンドであるS100βによる炎症性サイトカインの発現は抑制することがなく、MHP1の作用はTLRに特異的である可能性が示唆された。当初計画していた、MHP1の作用メカニズムについて、RANKLとの相違点を中心に明らかにできるとともに、MHP1の抗炎症作用がTLRに特異的である可能性を示すことができた。今年度は、MHP1のマクロファージ、ミクログリアへの作用として、M1/M2についての解析を行った。

MHP1が炎症抑制作用を有することから、マクロファージあるいはミクログリアをM0からM2に移行させる作用があることを想定し、M2のマーカーであるCD206の発現について、MG6細胞およびRAW264.7細胞をMHP1で刺激し、FACSと免疫染色にて解析を行ったが、明らかなCD206の発現の増加はなかったことから、M2への移行を促進させる作用はないことが明らかとなった。しかし、LPSで刺激したMG6細胞では、F4/80+CD206-細胞(M1)が増える一方でF4/80+CD206+細胞(M2)は低下するが、MHP1を加えた細胞では、M1細胞増加およびM2細胞低下が抑制されており、MHP1ではLPSによるM1シフトを抑制できることが明らかとなった。また、PI3K inhibitorであるLY294002を加えた検討では、MHP1による炎症性サイトカインの発現抑制効果が抑制されることが明らかとなり、MHP1によるTLR関連炎症の抑制効果がAkt/PI3K経路を介していることが示唆された。また、今後の臨床応用を考え、HPLC/MSを用いた血清中でのMHP1の安定性と分解産物を解析したところ、マウス血清中での半減期は約30分と、一般的な合成ペプチドよりも安定しており、また、分解産物も明らかにできた。分解産物のなかには、MHP1の活性中心部位を含むペプチドも多く含まれていたことから、血清中で分解されても、ある程度の活性は期待できることが明らかとなった。本研究により、MHP1の活性中心部位が明らかになると共に、TLR4だけでなくTLR2や7/8などのシグナルも抑制できることが明らかとなった。また、血清中での半減期や代謝産物も明らかとなった。また、静注において、脳梗塞部位に浸潤できることも明らかとなり、末梢投与にて、神経機能障害の改善、脳梗塞サイズの改善も明らかとなった。また、RANKLで問題となる破骨細胞の活性化を惹起することは無かった。ただ、治療効果を得るためには大量のペプチドが必要であったため、今後、マウス血清との混合によって得られた分解産物情報に基づいたペプチドの改変が重要であると考えられた。平成28年度は当初の予定どおり、MHP-1によるミクログリア由来の炎症性サイトカインの発現抑制機序の解明を進めていく予定である。MHP1の作用メカニズムをさらに解明するために、MHP1によるマクロファージあるいはミクログリアのM1/M2フェノタイプにたいする作用の解析を行う。また、抗炎症作用のシグナルについて、RANK-NFkB、RANK-NFATc1以外の経路として、過去の報告からはRANK-PI3Kの経路の関与の可能性が考えられるため、PI3 kinase inhibitorなどを用い、MHP1の抗炎症作用のシグナル解明を試みる。老年内科
理工系科目の教育に使用される言葉についての研究-問題点の解明と改善について-

技術者教育の初期段階において、漢字熟語で表記される専門用語が多用される。これらの漢字熟語は、漢学を学問の素養としていた明治期の科学技術者によって作られた。しかし、現代の学習者は、漢語に対する馴染みが薄くなっており、専門用語の理解に困難を感じ始めている。本研究は、専門用語理解の現状を明らかにし、伝統的な漢文訓読の手法を用いて専門用語を理解する等、学習内容の定着に向けた実践とその効果について検証した。近年、小中高生の理科離れが深刻な状況に陥っている。これは科学技術立国を国是とする我が国にとって、憂慮すべき事態であろう。本研究では、理科離れの一因を、理工系教育における「言語」のあり方の問題に求め、有効な改善方法を研究・開発することを目的とする。具体的には、理工系教育に使用されている教科書・教材等を、言語表現の観点から見直し、児童・生徒・学生に対するアンケートおよび聞き取り調査等を踏まえて、理科系科目の学習において「難解さ」「嫌悪感」等が生じる原因を探る。そして、その上で、発達段階や理解レベルに配慮した適切な用語、文脈の構成等を提案できるようにする。この提案に際しては、難解語・難解表現のデータベースを作成し、理工系教育に携わる者が授業等に活用できるようなフォーム(辞書等)にまとめることを目標とする。補助金支給期間(平成18年度平成21年度)の初年度に当たる本年は、主として、理工系教育に用いられている用語の収集および整理を行った。明治時代に漢語に置き換えることで成立した欧米語の翻訳語は、科学技術の教育の中で、その姿をほとんど変えることなく生き延びている。本年度は、まず、学生が実際に使用している教科書・教材をサンプルに、そのような漢語の科学技術用語を収集した。そして、原語となる欧米語、その意味や用例、ラテン語・ギリシャ語・アラビア語等語源の意味等々を調べ、インデックスを作成する作業を行った。そのため、この作業を進めていくために必要な、辞書類やレファレンス用ソフトウエア、パーソナルコンピュータ等を購入した。この作業は思った以上に手間暇が懸かり、当初に計画していた学生の科学技術用語の理解度を計るアンケート調査にまで至ることができなかった。しかし、近代日本において、科学技術の導入・普及に努めた先人たちの、言葉に対する工夫の跡をある程度辿ることができたように思われる。ただ、残念なことは、第二次世界大戦敗戦後に進められた教育改革、日本語表記改革のために、日本人の中から漢学の素養が失われ、明治大正期に作られた科学技術用語が、今の学生たちにとって理解が困難なものになっていることである。本研究の目的の一つは、その難解さの原因を究明し、先人が作り上げた言葉を現在に生かす方途を探ることであるが、原因と思われるものは、様々な要因が複雑に絡み合っていることが分ってきた。次年度は、本年度に蓄積した用語の理解状況について、学生や授業担当者へのアンケート調査や聞き取り調査を実施し、問題点の究明を進める予定である。補助金支給期間(平成18年度平成21年度)の2年目に当たる本年は、昨年度に引き続き、理工系教育に用いられている用語の収集および整理を実施した。そして、昨年度に蓄積した用語の理解状況について、主に授業担当者へのアンケート調査や聞き取り調査を実施し、問題点の究明を進めた。この聞き取り調査の結果、興味深い事実が幾つか明らかになってきた。例えば、「物理学」において、「work」の翻訳語として用いられている「仕事」という用語があるが、日本語の「仕事」という言葉があまりにも日常的なものであるために、授業等でその概念を理解させようとする際、学生に多少の混乱が生じることがあるという。また、「数学」において、「imaginary number」の翻訳語として用いられている「虚数」という概念を理解させる場合には、現代の学生には「虚実」といった漢語の概念に馴染みが薄いこともあって原語と翻訳語との間に乖離が生じており、概念理解を難しくしているように感じられるという。このような事例は、物理や数学教育に従事する教員の間では、以前からよく知られていたことのようだが、科目横断的に学術用語を理解することの困難を問題にし、総合的に考察したものはまだ少ないようである。この聞き取り調査の結果およびそれに対する考察については、独立行政法人国立高等専門学校機構主催・平成19年度教育教員研究集会において発表を行った。本研究は、理工系科目の教科書・教材をサンプルとして参照するケースが多いため、本年度は高性能のスキャナーを購入し、文章の取り込みを迅速なものにした。また、シソーラスその他の辞書関係コンピュータ・ソフトを購入して効率の良い語彙検索を実現した。補助金支給期間(平成18年度平成21年度)の3年目に当たる本年は、理工系教育の現場(主に授業)で用いられている用語の整理を行った。本年度は、学生が実際に使用している教科書・教材をサンプルに、漢語の科学技術用語を収集し、その成立過程も含めて文献的な調査を実施した。

原語となる欧米語、その意味や用例、ラテン語・ギリシャ語・アラビア語等語源の意味等々を調べ、インデックスを作成する作業を昨年度に引き続き実施した。この作業を進めていくためには、詳細な辞書類や研究書が必要であり、研究費のかなりの部分をその購入に充てざるを得なかった。昨年度から続けているこの作業は、思った以上に手間暇が懸かり、当初に計画していた学生の科学技術用語の理解度を計るアンケート調査はまだ不完全な状態である。しかし、近代日本において、科学技術の導入・普及に努めた先人たちの、言葉に対する工夫の跡をある程度解明できつつあるように思われる。現在、本研究は、学生の理解の実態調査(仮の聞き取り調査では、理解度は低い)の後、理工系教育の中で、いかに漢語による専門用語を分かり易く伝え、学習内容に活かしていくことが可能か、という教育方法の開発にシフトしつつある。学生の理解が低いということを解明しても、現場での教育には何も役に立たないからである。それよりも、専門用語の漢語の成り立ちを、漢字一文字の字義レベルから解き明かし、それが理工系の用語としてどれほど適切に機能しているのかを丁寧に調査・解明し、少しずつでもよいからデータを蓄積していくことが大切であると考える。次年度は、補助金支給の最終年度に当たるため、現在まで蓄積した調査結果を発表し、協力者を得て、実際の授業の中で漢語理解を通じた概念把握の実践を試みたいと考えている。補助金支給期間(平成18年度平成21年度)の最終年度に当たる本年は、昨年に引き続き、理工系教育の現場(主に授業)で用いられている用語の整理を行うとともに、それをもとに九州内の大学・高専の先生方と意見交換を行った。本年度は、昨年度に引き続き、学生が実際に使用している教科書・教材をサンプルに、漢語の科学技術用語を収集し、その成立過程も含めて文献的な調査を実施した。それに加え、本年度は、今までの調査結果を援用しつつ、学生の用語理解に資するために、理工系教育の現場に、研究成果を還元する方法についても、考察を深めた。本研究は、最初の段階から、理工系科目の授業を担当しない一般科目(国語国文)教員が進めたものであったため、当初に計画していた学生の科学技術用語の理解度を計ることに困難があった。しかし、最終年度を迎え、ようやく、大学・高専の先生方(主に電気学会)との間に、協力関係を築くことができ、展望が開けてきた。このことは、研究のあり方として、遅きに失した観がないわけではないが、文科系と理工科系科目の協力という、実験的な要素があったことを思うと、僅かな前進であっても得たものは大きいと考えている。専門用語の漢語の成り立ちを、漢字一文字の字義レベルから解き明かし、それが理工系の用語としてどれほど適切に機能しているのかを丁寧に説明し、教科書等の文脈の中でどのように用いられているのか、という読解の基本を学生に伝えることは、初期教育において、最も大切なことである。今年度は研究会等で理工系科目を専門に教えておられる先生方を対象に、研究成果を発表し、有意義な意見交換をすることができた。今後は、本研究で得た知見と、人的なネットワークを生かして、更に分かり易い理工系科目の初期教育のあり方を、漢語研究の中から模索していきたい。
神経・免疫・代謝におけるガイダンス因子の病的意義の解明とその制御

免疫の恒常性維持や、その破綻によって生じる自己免疫疾患において、代謝の重要性が指摘されている(免疫代謝:Immunometabolism)。研究はこれまで免疫・炎症制御に関わる一群の分子群の存在(免疫セマフォリン)の役割を明らかにしてきた(Nature 2002, Nature2007, Nat Immunol. 2008,Nat Immunol 2010, Nature 2010, Nature 2012, Nature Commun 2013, Arthritis Rheumatol, 2015)。研究代表者は、発現調節メカニズムの解析の中で、代謝・栄養センサーであるmTOR関連シグナルの免疫・炎症制御への関与を示す知見を得た(Nature Commun 2016, Nature in press)。本研究では、「免疫代謝:Immunometabolism」をキーワードに、免疫と代謝の相互連関メカニズムと自己免疫疾患病態への関与を明らかにし、免疫操作法の確立に繋げる成果を目指した。今年度は基盤S交付確定までの短期間ではあるが、その解析基盤として、セマフォリン関連遺伝子改変マウスの作成、免疫調節バイオアッセイシステムの確立、代謝測定システムを免疫細胞、特にマクロファージで評価できるシステムを確立している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ストレス応答性アポトーシス制御因子の網羅的探索と機能解析

癌抑制遺伝子p53は細胞周期の制御や、アポトーシス誘導に重要な役割を果していることが明らかになってきたが、その生理機能と調節機構の詳細ははっきりしない。特に、p53転写活性の調節についての情報は極めて少ないのが実状である。我々は、リン酸化酵素プロテインキナーゼCファミリーの一員であるPKCdeltaが翻訳後修飾だけでなく、転写レベルでもp53の発現を制御していることを見いだした。p53のプロモーターを用いたレポーターアッセイの解析から、PKCdeltaがp53のプロモーター領域のうちCPEと呼ばれる配列を介して、p53の転写活性を促進することを明らかにした。さらに、我々はCPEに結合している転写因子はアポトーシス促進因子Btfであることを見いだした。DNA損傷によりPKCdeltaはBtfと複合体を形成しており、PKCdeltaによって活性化されたBtfはCPEと結合し、p53のプロモーター活性を誘導するが、PKCdeltaの阻害剤によりBtfとCPEの結合が顕著に抑制された。その結果、p53のmRNAと蛋白質レベルの発現も明らかに減少した。また、PKCdeltaの阻害剤やBtfのsiRNAを用いることで、DNA損傷によるp53依存性アポトーシス誘導が著しく低下した。これらの結果から、PKCdeltaはBtf依存性p53転写制御を介して、DNA損傷によるアポトーシスを誘導することが明らかになった。c-Ablチロシンキナーゼは細胞質、核両方に存在するが、核内c-AblがDNA損傷により活性化しアポトーシスを誘導する。このメカニズムを解明するためLC-MS/MSによって複合体を解析し、14-3-3を単離した。14-3-3は多彩な機能を有するが、その一つとして相互作用する標的タンパク質の細胞内局在を調節していることが多数報告されている。我々はすでにc-AblはDNA損傷に伴って核に移行することを見い出していることから、14-3-3がこの核移行に何らかの関与があるかを検討した。細胞を抗癌剤で処理すると、c-Ablと14-3-3の複合体形成が著しく低下していることが明らかとなった。これはc-Ablと14-3-3の相互作用が、DNA損傷によって解消されることを意味する。また、c-Ablと14-3-3の複合体は細胞質にのみ見られることから、DNA損傷によるc-4blの核移行は14-3-3との解離によるものではないかと考えられた。そこでc-Ablと14-3-3の解離のメカニズムについて検討したところ、DNA損傷におけるc-Ablの14-3-3からの解離にはJNKによる14-3-3のリン酸化が関わっていることが判明した。さらにDNA損傷におけるc-Ablの核移行には14-3-3が関与していることから、その制御がアポトーシス誘導にどのような影響を与えているかについて検討した。細胞にc-Ablを導入するとアポトーシスを誘導し、抗癌剤処理によりその誘導能は増強される。そこに14-3-3を加えると、有意にアポトーシスを抑制することがわかった。さらにJNKでリン酸化を受けない14-3-3変異体を加えると、アポトーシス抑制能はさらに高まることが明らかとなった。この結果からc-Ablの核移行を14-3-3によって阻害すると、DNA損傷によって惹起されるアポトーシス誘導が抑えられることが示唆された。PKCdeltaはDNA損傷などのストレス刺激に応じてアポトーシスを強く惹起することが知られている。抗がん剤によって活性化されたPKCdeltaはそのキナーゼドメインを含む触媒領域がp53と会合することを見出した。この会合がp53のリン酸化に関わっているかをPKCdeltaの阻害剤を用いて検討したところ、Ser46のリン酸化に関わっていることが示唆された。またPKCdeltaはp53DINP1と会合してp53にリクルートされることを明らかにした。Ser46のリン酸化はp53依存性アポトーシスに必須であることから、DNA損傷によって誘導されるアポトーシスにはPKCdeltaを介したp53のセリSer46のリン酸化が関わっており、新たなアポトーシス誘導機構が明らかとなった。またPKCdeltaの複合体構成因子の探索を目的として、PKCdeltaをベイトとした免疫沈降法による一次元電気泳動と質量分析計を用いたプロテオミクス解析を行っており、現在までに複数の会合分子を同定している。その一つとして細胞分裂に必須なタンパク質であるトポイソメラーゼIIalphaを単離した。PKCdeltaとトポイソメラーゼIIalphaの会合は細胞周期特異的であり、主にS期で観察された。またPKCdeltaによつてトポイソメラーゼIIalphaの発現が上昇し、それに伴い酵素活性も強まることがイン・ビトロ及び各種細胞を用いた実験から明らかとなった。またS期をターゲットとするような抗がん剤によるPKCdeltaの活性化がトポイソメラーゼIIalphaの過剰な活性化を引き起こし、この過剰な活性化が引き金となってアポトーシス誘導を惹起しているという、全く予想外の知見を得た。

p53のプロモーターを用いたレポーターアッセイの解析から、PKCdeltaがp53のプロモーター領域のうちCPEと呼ばれる配列を介して、p53の転写活性を促進することを明らかにした。さらに、我々はCPEに結合している転写因子はアポトーシス促進因子Btfであることを見いだした。DNA損傷によりPKCdeltaはBtfと複合体を形成しており、PKCdeltaによって活性化されたBtfはCPEと結合し、p53のプロモーター活性を誘導するが、PKCdeltaの阻害剤によりBtfとCPEの結合が顕著に抑制された。その結果、p53のmRNAと蛋白質レベルの発現も明らかに減少した。また、PKCdeltaの阻害剤やBtfのsiRNAを用いることで、DNA損傷によるp53依存性アポトーシス誘導が著しく低下した。これらの結果から、PKCdeltaはBtf依存性p53転写制御を介して、DNA損傷によるアポトーシスを誘導することが明らかになった。
陸と海から見たアメリカ独立革命とアボリショニズムの統合的研究

これまでアメリカ独立革命の研究は、ヨーロッパからの入植者に関する社会・思想史が主流を占めていたため、東部沿岸部に発展した英領植民地と本国イギリスとの関係を考察する研究に偏重してきた。本研究は、そのような東部沿岸部とイギリスやアトランテック史に偏ったアメリカ史像の再検討を促す。具体的には、北米東海岸から海洋を見渡す眼差しのみならず、アパラチア山脈を超えた西部領域からの視座を取り込むことにより、白人開拓者および先住民部族間の西部をめぐる覇権争いのなかで大西洋世界のアボリショニズムの台頭が新共和国の言論空間に及ぼした影響を探り、1830年代までに顕在化した地域間の政治文化の分裂過程を解明する。
GFP遺伝子導入ヒトグリオーマ細胞を用いた脳腫瘍モデルでの抗微小管剤の研究

1)Fischer 911 ratの脳を取り出して凍結後、10ミクロンの厚さで凍結切片を作成した。この切片で脳梁辺縁部に細胞を移植し、坑微小管剤SI-27を入れた培地で3日間培養し、薬剤の入っていない培地で培養したものを対照とした。その間移植1,4,8,16,24,32、48、72時間後にGFP発現をてがかりに細胞の広がりを倒立実体蛍光顕微鏡で観察し、GFPの発現範囲の変化をdigital image analyzerで数量解析を行った。結果としてSI-27投与群では有意にGFP標識細胞の広がりが抑制された。さらにはconfocal lazer microscopyでの観察ではGFP標識細胞が脳の切片の中に浸潤していて、脳切片の表面を遊走しているのではないことが明らかとなった。2)坑免疫剤サイクロスポリンを移植2週間前より生後4週のFischer 911 ratに投与して、免疫を抑制しておいた。glioblastoma multiforme細胞はステレオタクティック装置を用いて脳梁辺縁部下端に移植した。坑微小管剤SI-27は移植翌日から隔日5回ほど腹腔内投与した。SI-27投与群は非投与群(生食水同量投与を対照群とした)に比して有意に生存日数を延長した(SI-27投与群、58.5日;非投与群31.8日、p<0.001)。生存日数の解析に用いた動物とは別に移植三週後に脳を取り出してCD34で血管内皮細胞を蛍光免疫染色したが、SI-27投与群では非投与群に比して有意に血管内皮細胞が低下していて、腫瘍血管新生に抑制効果があることを見出した(p<0.005)。さらにGFPを発現している腫瘍細胞の細胞浸潤も有意に抑制されていた(p<0.001)。以上の結果から坑微小管剤SI-27を用いることによって、脳腫瘍動物モデルでは腫瘍細胞浸潤と血管新生が制御可能なことが明らかとなった。(方法)ヒト悪性グリオーマ細胞U87MG, U251MG, U373MGにgreenfluorescent protein (GFP)遺伝子を導入するためpEGFP-C1 vectorをelectroporesion法にて導入し、その後毎週GFPの発色の見られたcolonyのみを繰り返し培養した。二ヶ月後にはcolonyはすべてGFPを発現したのでこれを用いた。Matrigel 1μ1あたり10^5個のGFPのcloneを入れて、gelを10μ1ずつ厚さ20μmのSCIDマウスのbrain sliceのbasal gangliaに移植した。このsliceを孔0.4μmのmicro-pore fliter付きのBoiden chamber上面にのせて、下面に0,1,10,100,1000μg/mlのEstramustine溶液を入れday 1,3,5,7に移植したGFPでラベルしたグリオーマ細胞のbrain sliceでの拡がりを実体蛍光顕微鏡で観察し、冷却CCDカメラで得られた画像をコンピューターに取り込み、image analizerでvolume expansion rate (V. E. R.)を解析した。(結果)対照群(0μg/ml)では3種のグリオーマ細胞はいずれも指状の浸潤を示し、対側の半球には脳梁交連を経ていた。MTT assayでのnon-cytotoxic level group(1,10,100μg/ml)では細胞浸潤は対側の半球に及ばなかった。

V. E. R.はday 5とday 7で有意に抑制された。Cytotoxic level group(1000μg/ml)のV. E. R.はday3,5,7でday 1よりも低下していた。これらのサンプルではレーザー共焦点顕微鏡でグリオーマ細胞がsliceの内側を浸潤しているのが、確認された。神経膠腫の浸潤およびangiogenesisに対する坑matrix metalloproteinase剤の有効性はほとんど従来はin vitroでの浸潤モデルで検討されてきた。今年度我々は昨年の基礎実験に引き続き、動物のglioma細胞を用いたラット脳腫瘍モデルで検討した。あらかじめヒトglioma(U251MG)にpEGFP geneをtransfectして安定したEGFPを表現するクローン作成しておいた後に、Fischer 944 ratのstriatumと脳梁の間へstereotacticalにxenograftした。免疫抑制はシクロスポリンAを投与した。坑matrix metalloproteinase剤SI-27(1mg/kgあるいは10mg/kg)をxenograftから3日間腹腔内注入した。対照群は薬剤溶解液(PBS)を使用し比較検討した。各群(15頭)ともにxenograft後の生存率を検定したが、いずれも3週後から死亡例が出現し始めたのでこれらとは別にxenograft3週後に脳を摘出した。angiogenesisは血管内皮細胞をFactor VIIIの免疫染色で浸潤glioma細胞はEGFP発現細胞をそれぞれ蛍光顕微鏡のイメージをCCD cameraでcomputer image analysissystemに入力後定量的に分析した。一方冷凍脳組織切片でin situ zymographyを行ってMMP活性を評価した。結果として合計30mg/kg投与群は、対照群と比較して、平均存続時間が統計学的に著しい延長をみた(p<0.001)(47.3対32.6日)。さらにMMP活性、浸潤glioma細胞密度および血管新生は有意に低下していた。しかしながら3mg/kg投与群の動物ではこれらの有意差はいずれも得られなかった従って結論としてEGFP発現細胞を用いれば細胞浸潤の良い指標となると同時に今回の実験法では坑matrix metalloproteinase剤SI-27はラット脳腫瘍モデルでgliomaの浸潤と血管新生を抑制し、今後の臨床応用が期待されると思われた。1)Fischer911ratの脳を取り出して凍結後、10ミクロンの厚さで凍結切片を作成した。この切片で脳梁辺縁部に細胞を移植し、坑微小管剤SI-27を入れた培地で3日間培養し、薬剤の入っていない培地で培養したものを対照とした。その間移植1,4,8,16,24,32、48、72時間後にGFP発現をてがかりに細胞の広がりを倒立実体蛍光顕微鏡で観察し、GFPの発現範囲の変化をdigital image analyzerで数量解析を行った。結果としてSI-27投与群では有意にGFP標識細胞の広がりが抑制された。さらにはconfocal lazer microscopyでの観察ではGFP標識細胞が脳の切片の中に浸潤していて、脳切片の表面を遊走しているのではないことが明らかとなった。2)坑免疫剤サイクロスポリンを移植
酸化ストレス応答因子Nrf2が皮膚の紫外線発癌・光老化の予防に果たす役割

紫外線(以下UV)照射は、細胞のDNAを直接傷害することにより、発癌や老化を引き起こすものと従来から考えられてきた。しかし、近年、UV照射は、NOや活性酸素などの酸化ストレス物質の強力な細胞内発生刺激であることが知られてきており、UVの細胞傷害作用、発癌性、老化原性は、UVのDNAに対する直接的障害作用だけではなく、UV照射によって発生した活性酸素等の酸化ストレスに起因することがわかってきている。そこで本研究では、マウス個体を用いて、UVB照射に対する皮膚組織の生体防御機構におけるNrf2の役割をin vivoで明らかにした。すなわち、UVBの急性照射によるサンバーン反応とUVBの慢性的反復照射における皮膚発癌とNrf2との関係についてNrf2ノックアウトマウスと野生型マウスを比較することにより解析を行った。その結果、Nrf2ノックアウトマウスは、野生型マウスに比べて200mJ/cm2の一回UVB照射に対して有意にサンバーン反応が強く、且つ長く続いた。Nrf2ノックアウトマウスでは組織学的に表皮壊死、真皮皮下組織の著明な浮腫、炎症細胞浸潤が著明で、サンバーン細胞も有意に多かった。さらに、TUNEL法では表皮細胞のアポトーシスをNrf2ノックアウトマウスで有意に多く認め、酸化的DNA障害の指標である8-OHdG陽性細胞もNrf2ノックアウトマウスで有意に多かった。これらの結果は、Nrf2がUVB照射に対して生体を保護する役割を果たしていることを強く示唆した。一方、慢性長期UVB照射による皮膚発癌では、腫瘍の発生数、発生時期にNrf2ノックアウトマウスと野生型マウスで有意差がなかった。このことは、慢性長期UVB照射による皮膚発癌では、Nrf2によるDNA障害抑制効果とアポトーシスを抑制することに寄る腫瘍プロモーション効果が拮抗していることを示唆しているものと考えられた。酸化ストレス応答系Nrf2-Keap1は、酸化ストレスに対して細胞が対抗する中心的システムとして最近同定された細胞内シグナル伝達系であり、細胞が酸化ストレスに暴露されると活性化し、抗酸化・生体防御蛋白の発現を活性化する経路であり、酸化ストレスから細胞を保護する主要な経路である。一方、近年、UV照射は、NOや活性酸素などの酸化ストレス物質の強力な細胞内発生刺激であることが知られてきている。そこで本年度は、酸化ストレス応答系Nrf2-Keap1が、UV照射に対する細胞の反応、癌化、老化にどのように関わっているかを解析することを目的として以下の実験を行った。野生型正常マウスを麻酔後、背部皮膚を剃毛。UVB6を1回照射し、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間後のそれぞれのtime courseで、照射部位の切除生検を行い、その組織標本を用い、抗Nrf2ポリクローナル抗体を用いて、標本を免疫染色し、Nrf2の細胞質から核内への移行を検索したところ、Nrf2の核内移行は確認できなかった。さらに、組織から各time pointでのmRNAを抽出し、ラジオラベルしたNrf2プローブを用いて、ノザンプロットを行い、Nrf2の転写レベルの増減を検索したところ、Nrf2の転写レベルに変化はなかった。また、組織から各time pointでのmRNAを抽出し、グルタチオンS転位酵素・グルタニルシステイン合成酵素・NADPHキノロン酸化還元酵素・ヘモオキシゲナーゼ・チオレドキシンなどのNrf2標的遺伝子群のラジオラベルプローブを用いてノザンブロットを行い、Nrf2の活性化・抑制が下流の抗酸化ストレス遺伝子産物の動きと連動しているかを検索したところ、各遺伝子はUV照射に連動して低下した。

酸化ストレス応答系Nrf2-Keap1は、酸化ストレスに対して細胞が対抗する中心的システムとして最近同定された細胞内シグナル伝達系であり、細胞が酸化ストレスに暴露されると活性化し、抗酸化・生体防御蛋白の発現を活性化する経路であり、酸化ストレスから細胞を保護する主要な経路である。一方、紫外線(以下UV)照射は、細胞のDNAを直接傷害することにより、発癌や老化を引き起こすものと従来から考えられてきた。しかし、近年、UV照射は、NOや活性酸素などの酸化ストレス物質の強力な細胞内発生刺激であることが知られてきており、UVの細胞傷害作用、発癌性、老化原性は、UVのDNAに対する直接的障害作用だけではなく、UV照射によって発生した活性酸素等の酸化ストレスに起因することがわかってきている。そこで本研究では、マウス個体を用いて、UVB照射に対する皮膚組織の生体防御機構におけるNrf2の役割をin vivoで明らかにした。すなわち、UVBの急性照射によるサンバーン反応とUVBの慢性的反復照射における皮膚発癌とNrf2との関係についてNrf2ノックアウトマウスと野生型マウスを比較することにより解析を行った。その結果、Nrf2ノックアウトマウスは、野生型マウスに比べて200mJ/cm2の一回UVB照射に対して有意にサンバーン反応が強く、且つ長く続いた。Nrf2ノックアウトマウスでは組織学的に表皮壊死、真皮皮下組織の著明な浮腫、炎症細胞浸潤が著明で、サンバーン細胞も有意に多かった。さらに、TUNEL法では表皮細胞のアポトーシスをNrf2ノックアウトマウスで有意に多く認め、酸化的DNA障害の指標である8-OHdG陽性細胞もNrf2ノックアウトマウスで有意に多かった。これらの結果は、Nrf2がUVB照射に対して生体を保護する役割を果たしていることを強く示唆した。
ホスホリパーゼA2を基盤とする心血管病の成因解明と新しい予防・治療薬の探索

ホスホリパーゼA_2(PLA_2)を介して産生されるアラキドン酸カスケード関連脂質は心血管病の発症・病態に深く関与していることが示唆されている。本研究では、secretory PLA_2の心血管病への関与を網羅的に解明し、PLA_2を標的とする有用な心血管病予防・治療薬を開発することを目的とした。その結果、X型およびV型secretory PLA_2が心筋梗塞発生の病態に関与することが判明した。さらにsecretory PLA_2活性阻害剤が心不全を予防することを明らかにした。本研究では、PLA_2の心血管病への関与を網羅的に解明し、PLA_2を標的とする有用な心血管病予防・治療薬を開発することが本研究の目的である。初年度は以下のことを明らかにし既に学会・専門雑誌に報告した。X型secretory PLA_2ノックアウトマウスに心筋梗塞を作成し、その程度を野生型マウスと比較検討した。その結果、X型secretory PLA_2ノックアウトマウスでは心筋梗塞の範囲が有意に低下し、心臓超音波検査上も心機能の低下が抑制されていた。X型secretory PLA_2は心筋そのものには発現せず、心筋梗塞組織では心筋内に遊走している好中球に発現していることが明らかとなった。X型secretory PLA_2ノックアウトマウス由来の好中球はフリーラジカルおよび蛋白分解酵素産生・放出能、遊走能が野生型好中球に比べて有意に低下していた。その細胞生物学的機序に関して以下のことが明らかとなった。即ち、X型secretory PLA_2ノックアウトマウス由来の好中球の反応はアラキドン酸およびPMAなどの細胞表面受容体を介さない刺激には野生型と同程度の反応を示した。さらにX型secretory PLA_2ノックアウトマウス由来の好中球におけるフリーラジカルおよび蛋白分解酵素産生・放出能、遊走能を司るいくつかの分子発現には異常を認めなかった。さらにX型secretory PLA_2ノックアウトマウス由来の好中球にX型secretory PLA_2を添加すると低下した好中球活性が回復することが明らかとなった。以上より、X型secretory PLA_2ノックアウトマウス由来の好中球におけるフリーラジカルおよび蛋白分解酵素産生・放出能、遊走能の仕組み自体は変化がなく、分泌されるX型secretory PLA_2そのものが欠損しているためにX型secretory PLA2ノックアウトマウス由来の好中球では活性が低下していることが推測された。また、X型secretory PLA_2阻害剤を野生型マウスに投与することで、X型secretory PLA_2ノックアウトマウスと全く同様の知見が得られた。以上から、X型secretory PLA_2が心筋梗塞の病態に深く関与していること、好中球に存在するX型secretory PLA_2が重要であることが明らかとなった。二年目は心筋梗塞に合併するうっ血性心不全の病態における分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)の関与とsPLA_2阻害薬の治療効果の検討し以下のことを明らかにし既に学会に報告した。研究目的:心筋梗塞に合併するうっ血性心不全の病因・病態におけるsPLA_2の重要性およびその阻害剤の治療薬としての有用性を実証し、sPLA_2阻害剤の心血管病治療薬として臨床応用に繋げることを目的とした。方法:1014週の雄マウス(C57BL/6J)に対し麻酔・人工呼吸管理下で開胸、冠動脈左前下行枝を結紮することで心筋梗塞モデルを作成し、14日間飼育した。そのマウスに対し生食またはisoproterenol(ISP)10 mg/kg/hrを持続投与した。心筋梗塞後14日目のマウスに対し治療群としてsPLA_2阻害剤(LY374388)100mg/kgを腹腔投与し、1時間後にISP 10mg/kg/hrを持続投与開始、解析を行った。結果:ISP持続投与による肺うっ血の程度をsPLA_2阻害剤投与群と非投与群のlung-to-body ratioで比較したところ、治療群で有意に肺重量の低下が認められた。これらの病理組織学的観察では、未治療群において肺胞間質の浮腫、細胞浸潤、肺胞出血が認められたが、治療群ではそれらは抑制されていた。ISP持続投与し30分後のLVEDPを測定したところ、sPLA_2阻害剤投与群においてLVEDPは非投与群に対し有意に低下していた。sPLA_2阻害剤投与群および非投与群に対してISP持続投与24時間までの生存率を比較したところ、非投与群に比べsPLA_2阻害剤投与群の有意に高い生存率を示した。

結論:以上よりsPLA_2が急性心原性肺水腫の病態に関与し、その阻害薬が急性うっ血性心不全に対し治療効果があることが示唆された。アラキドン酸カスケードによって産生される脂質の多くは動脈硬化、血栓、炎症の惹起因子・増悪因子であり多くの心血管病の発症・病態に深く関与している。Phospholipase A_2(PLA_2)はアラキドン酸カスケードの最上流に位置する酵素である。本研究では、PLA_2の心血管病への関与を網羅的に解明し、PLA_2を標的とする有用な心血管病予防・治療薬を開発することが目的である。平成21年度は以下のことを明らかにし既に学会・専門雑誌に報告した。V型secretory PLA_2ノックアウトマウスに心筋梗塞を作成し、その程度を野生型マウスと比較検討した。その結果、V型secretory PLA_2ノックアウトマウスでは心筋梗塞の範囲が有意に低下し、心臓超音波検査上も心機能の低下が抑制されていた。V型secretory PLA_2は心筋そのものに発現し、梗塞後の残存心筋に強発現した。野生型に比べてV型secretory PLA_2ノックアウトマウス心筋においては、アラキドン酸由来の炎症惹起因子であるトロンボキサンおよびロイコトリエンの組織濃度が有意に低下していた。V型secretory PLA_2はIV型PLA_2と関連しながらアラキドン酸産生を行うことが知られている。そこで、V型secretory PLA_2活性を抑制した場合、V型secretory PLA_2ノックアウトマウスと野生型にて心筋梗塞の程度がどのようになるか検討した。IV型PLA_2活性阻害剤投与下においては、V型secretory PLA_2ノックアウトマウスと野生型にて心筋梗塞の程度には有意な差は得られなかった。心臓超音波検査上も心機能の低下も同等であった。これらのことから、V型secretory PLA_2は心筋梗塞の病態に深く関わり、その作用機序の下流にIV型PLA_2が働いていることが示された。
法数学推計と実践的分析による限界的な微量混合試料における関与者同定法の確立

現代のDNA鑑定において、混合微量試料の分析は不可避であるため、混合試料を作成して常染色体上のSTRのタイピングシステムを再検討したところ、ヘテロ接合体のピークバランスが崩れることがわかった。また、混合人数が2人か3人の場合はアリルピーク値を用いない方法であっても関与者の推定に極めて有用であることが示された。また、非関与者が関与者と判断されてしまう危険性が生じるが、多数のシミュレーションにより、特に第一度血縁の非関与者ではその危険性が高いことが示された。さらに、新たなSTRローカスのタイピングを行って頻度を求め識別力を検討した。最後に、混合試料解析の分析手順のフローチャートを作成した。今年度は、実際の混合試料におけるマルチプレックスSTRシステムの識別力の検討をおこなった。血縁関係のない20人のDNA溶液を、吸光度法で0.1ng/μl程度の濃度に希釈した後、Quantifilerキットにて濃度の精度を高めた。これらの資料について、2人の濃度比を9:1から等量比まで段階的に混合したものを試料とした。マルチプレックスSTRシステムとしてアイデンティファイラー・キットを用いて、これらの試料のタイピングを行い、検出されたエレクトロフェログラムのピーク値を測定した。ピーク値の変化はヘテロ接合体の2つのピークバランス(Hb)を算出して検討した。その結果、混合試料だけでなく、対照試料として用いた1個人試料においてもHbが国際法遺伝学会が示す基準を外れる場合があることがわかった。また、混合試料における含有DNA量の少ない方の関与者(mc)のDNA量が減少するに従い、Hbは基準値(0.61.66)を外れる傾向にあることが明きらかとなったので、アリルピーク値を利用した混合試料の関与者の判別法(定量法)は、アイデンティファイラー検査では信頼性に疑問があると考えられた。このため、ピーク値を考慮せず、関与人数を設定して検出されたアリルの数だけから想定されるあらゆる遺伝子型の組み合わせを考慮する方法(定性法)の有用性を検討した。プログラムRによって、混合試料における関与者の有無の尤度比(LR)算出プログラムを作成し、1万例についてシミュレーションを行った。その結果、LRの最低値が2人混合試料の場合で2.01x10^9、3人の場合でも37500となり、刑事事件で尤度比の解釈のひとつの基準値といえる1000を遥かに超える値が得られたので、定性法であっても、2人または3人の場合であれば、関与者の推定に極めて有用であることが示唆された。これまで15STRローカスのタイピングキットであるアイデンティファイラー検査によるDNA検査の混合試料における有用性を判断するため、既知のDNA試料を何度もタイピングして、ヘテロ接合型の2つのアリルのピークバランスを検討したり、混合試料の関与者の一人の型が既知の場合(例えば被害者の型)などにおける混合試料において、被疑者の型が含まれると判断できるか、被疑者の第1度血縁の非関与者の誤判定について検討を行ってきた。今年度はこれらの結果をまとめ、信頼性の高い混合試料解析のための前提条件と解析方法を確立した。前提条件は、4人以上の関与者の解析はアイデンティファイラー検査の識別力の限界を越えるため避けること、全てのアリルはピークと認められている閾値を超えていること、既知の関与者の全てのアリルが混合試料で検出されていること、関与者相互の血縁が高くないこと、である。混合試料のDNAプロファイルがこれらの前提条件を満たしていれば、フローチャートに従って関与人数の組合せが推定できる。具体的には、まず、既知の関与者の数を決め、次に既知の関与者にはないアリルが最も多いローカスの未知の関与者由来のアリル数をとる。そして、最小関与人数とそれより1人足した人数におけるその組合せで混合試料のプロファイルと同じになるような尤度を比較して、高い方を混合試料における関与人数とその組合せとした。なお、混合試料の関与者の識別力をより高めるため、新たなSTRローカスの日本人頻度を求め、その識別力を検討した。また、研究の過程で、stochastic effect (SE )の起こる閾値を設定するという考えを用いないContinuous system(CS)が発表された。このためドロップ・モデルを利用したソフトウェアによる尤度比計算の信頼性には問題があると判断し、CSの導入を早める研究に計画を変更した。混合試料では、1ローカスあたりの検出アリル数が1人分のDNA試料と比較して多いため、混合試料の非関与者が関与者と判断されてしまう危険性が生じる。特に、関与者の血縁者である場合には関与者と類似した遺伝子型を有するため、その危険性は増大する。

そこで、他人や血縁者で作成された混合試料において、その関与者の血縁者のアリルが全て検出されて、“関与者"とされてしまうような場合の発生率をソフトウェアRによってシミュレーションし、関与者の血縁者が混合試料分析に与える影響を検討した。その結果、全ての家系において非血縁者を関与者の候補から排除でき、第三度血縁では1例も生じず、第二度血縁でも10万例中3例にとどまった。よって、関与者との血縁関係が第二度血縁よりも薄い混合試料の非関与者が関与者と判断される可能性はまずないといえる。ところが、第一度血縁の非関与者では、関与者と判断してしまう場合が0.02%、同胞では約0.1%認められた。また、混合試料において問題となる関与者以外の関与者の型が既知の場合は、未知の場合と比較すると、混合試料の非関与者が排除できるローカス数は増加する。同胞2人の混合試料では他の関与者の型が未知の場合、親である非関与者では約0.7%、同胞であれば約1.2%が関与者と判断されてしまうことがわかった。関与者が既知の場合は、未知の場合と比較すると、非関与者を関与者と判断してしまう場合は、同胞や親の場合にはそれぞれ9例認められたが、第二度血縁、第三度血縁、非血縁の場合では全く認められず、全ての非関与者は排除された。今回の検討により、被害者の型など一方の型が判明していれば、真の関与者の血縁者である非関与者が関与者として判断される可能性は低いが、関与者の型が分かっていない場合には同胞や親、子などの第一度血縁の非関与者が関与者とされてしまう危険性があることが示された。最初の研究計画であるアイデンティファイラー検査による混合試料判定実験において、予想に反するHb外れ値が多発したため、実験精度の検証を繰り返し行った。その結果、実験精度の問題ではなく、システムそのものの揺らぎであることがわかったため、実験計画の変更が必要となった。しかし、シミュレーションによる定量法の有効性が示唆されたため、論文作成ができるデータを得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの混合試料におけるアリルピーク高の定量的解析と定性的解析の比較において、アイデンティファイラー検査においては、定性的分析法でも予想以上に高い尤度比が得られることがわかった。したがって、定量法を扱う研究計画を変更したが、新たに実務において混合試料の関与者の血縁者が関与者として疑われる場合に、どれほど正確に判断できるかという問題が発生した。このため、その検討を早急におこない、その成果を学会で発表し、論文作成をおこなった。当初の計画にはない研究テーマが増えたため、研究の進捗状況はやや遅れたが、混合試料の関与人数推定法の確立を目指す本研究において極めて重要な検討であり、これまでの検討結果も、仮想の非血縁者集団ではなく、より実際例に近づけた汎用性のあるものになった。混合試料分析におけるアリルピーク高の定量的解析と定性的解析の比較において、まず、定性的解釈の有効性を検討したが、アイデンティファイラー検査においては、予想以上に高い尤度比が得られることがわかった。したがって、定量法だけを選択する必要はなく、むしろ控えめであっても再現性のよい定性法による実験を継続する。