hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラストレーションとカイラリティ

その結果、理論で予想されている異方性依存症と調和的な結果を得、ホール係数が確かにカイラル帯磁率に対応する量であることを示す実験的証拠を得た。スピングラス系と類似のカイラルグラス相は、.グラニュラー超伝導体である高温超伝導セラミックスでも期待されている。本年度、新たに合成した高品質セラミックス試料を用いた高感度の電流・電圧測定を行い、磁気測定から定めたカイラルグラス転移温度で線形電気抵抗が有限に残ることを明らかにすることに成功した。これは、超伝導セラミックス系においてスピン(位相)とカイラリティ(フラックス)が分離していることを示す。その他、金属パイロクロア磁性や異方ジョセフィン結合系等、カイラリティが関連した秩序化現象に対し、有用な理論的・実験的知見を得ることに成功した。カイラリティとは、秩序状熊の構造が局所的に右手系か左手系かを表す自由度として定義される。固体・統計物理の分野でも、フラストレート系研究の急速な進展に伴い、フラストレーションの効果がしばしばカイラリティ自由度を誘起すること、かつ生起されたカイラリティが系の諸物性に新奇な効果を及ぼすことが明らかになってきた。21年度は、カイラリティ秩序の理論面に関しては、スピングラスのカイラリティ機構の基本仮定であるスピン-カイラリティ分離を大規模数値シミュレーションによって確認することに成功した他、磁場中の2次元異方的ジョセフソン結合系においても同様の現象を新たに見出した。スピングラスのカイラリティ秩序の実験研究に関しては、磁気異方性を制御したカノニカルスピングラス試料に対するホール係数の精密測定を行って信号の磁気異方性依存性に関する依存性を定量的に評価し、ホール係数の理論結果との間に良い一致を見た。また超伝導セラミックスのカイラルグラス相探索の実験に関しては、高品質YBCOセラミックス試料の電気伝導を電流-電圧測定を行い、グレイン間カイラルグラス転移温度においても線形抵抗が有限値にとどまっていることを示唆するデータを得た。次年度以降の精密測定により、より信頼性の高いデータ取得を目指す予定である。カイラリティとは、秩序状態の構造が局所的に右手系か左手系かを表す自由度として定義される。22年度は、カイラリティ秩序の理論面に関しては、長距離相互作用を有する1次元のハイゼンベルグスピングラスの大規模数値シミユレーションを行い、転移がスピン-カイラリティ分離を伴う場合と伴わない場合の双方が、次元に相当するパラメータにどのように依存するかを系統的に明らかにし、系の包括的な相図を得ることに成功した。また、典型的な幾何学的フラストレート系として注目されているパイロクロア格子上の反強磁性ハイゼンベルグモデルに関しても、今回、反強磁性相互作用をランダムに分布させることにより、スピングラスと同様のスピン-カイラリティ分離現象を見出した。また臨界性質の解析も合わせておこない、先に3次元ハイゼンベルグスピングラスモデルに見出した臨界指数と誤差範囲で一致する値を得た。
児童生徒の不適応行動の変容を目指したストレスマネジメント実施に関する研究

本研究においては,昨年度までに小中学生を対象として実施した,心理的ストレス,学校不適応,攻撃行動,および登校意欲に関する実態調査の結果を踏まえて,児童生徒の不適応行動の変容を目指したストレスマネジメントを実施した.その際,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,および,セルフ・エフィカシーの向上(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中学校をそれぞれ選定し,ストレスマネジメント実施の効果を比較した.ストレスマネジメントプログラムは,昨年度までに実施したプログラムに適宜修正を加えて作成した.プログラムの効果測定においては,主観的なストレス反応,学校不適応感,攻撃行動,登校意欲を中心とした質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.その結果,ストレス反応,学校不適応感に関しては,小学生,中学生ともに,社会的スキル訓練が軽減効果を持つことが示された,また,攻撃行動に関しては,小学生のみ社会的スキル訓練とセルフ・エフィカシーの向上が軽減効果を持つことが示された.しかしながら,他の指標においては顕著な効果が認められなかった.これらの結果を総合すると,小中学生を対象とした場合,行動的変容は一貫したストレスマネジメント効果が認められた一方で,認知的変容は条件設定などの要因によってその効果がさまざまであることが示された.逆に言えば,これまでには比較的困難であると考えられてきた小学生を対象とした認知的変容によるストレスマネジメント効果も,プログラムを工夫することによってその介入効果が期待できると考えられる.今後は,学校を基盤としたストレスマネジメントプログラムの定着に向けた諸問題の解決を念頭に置きながら,より高い効果の期待できるストレスマネジメントプログラムの修正を考えていく必要がある.本研究においては,関東甲信越地区の公立小中学校,および高等学校を対象として,心理的ストレス,学校不適応,攻撃行動,および登校意欲に関する実態調査を実施した.そして,この調査結果を踏まえ,児童生徒の不適応行動の変容を目指したストレスマネジメントを実施した.その際,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中高校,セルフ・エフィカシーの向上(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中高校,および,ソーシャルサポートの充実(児童生徒を取り巻く環境の調整)を中心とした介入を実施する小中高校をそれぞれ選定し,ストレスマネジメント実施の効果を比較した.効果測定においては,ストレス反応,学校不適応感,攻撃行動,登校意欲を中心とした質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.その結果,ストレス反応に関しては,小学生を対象とした場合,社会的スキル訓練のストレス反応軽減効果が示された.一方,中学校を対象とした場合には,社会的スキル訓練,セルフ・エフィカシーの向上において,ストレス反応軽減効果が示された.また,高等学校を対象とした場合には,セルフ・エフィカシーの向上においてストレス反応軽減効果が示された.ところが,他の指標においては顕著な効果が見られなかった.その一方で,児童生徒個人を対象としたストレスマネジメント介入(ケース研究)においては,小中学生,高校生ともに多くの指標において効果が見られた.これらの結果の差異は,個人と集団のベースラインの差異や,データの集計方法の影響を受けていることが考えられる.今後は,ストレスマネジメントの円滑な実施を考える上での諸問題,および,本研究において顕著な効果が得られなかった変数に関する問題点を解決しながら,ストレスマネジメントプログラムの修正を考えていく必要がある.本研究においては,昨年度までに小中学生を対象として実施した,心理的ストレス,学校不適応,攻撃行動,および登校意欲に関する実態調査の結果を踏まえて,児童生徒の不適応行動の変容を目指したストレスマネジメントを実施した.その際,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,および,セルフ・エフィカシーの向上(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中学校をそれぞれ選定し,ストレスマネジメント実施の効果を比較した.ストレスマネジメントプログラムは,昨年度までに実施したプログラムに適宜修正を加えて作成した.プログラムの効果測定においては,主観的なストレス反応,学校不適応感,攻撃行動,登校意欲を中心とした質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.その結果,ストレス反応,学校不適応感に関しては,小学生,中学生ともに,社会的スキル訓練が軽減効果を持つことが示された,また,攻撃行動に関しては,小学生のみ社会的スキル訓練とセルフ・エフィカシーの向上が軽減効果を持つことが示された.しかしながら,他の指標においては顕著な効果が認められなかった.これらの結果を総合すると,小中学生を対象とした場合,行動的変容は一貫したストレスマネジメント効果が認められた一方で,認知的変容は条件設定などの要因によってその効果がさまざまであることが示された.逆に言えば,これまでには比較的困難であると考えられてきた小学生を対象とした認知的変容によるストレスマネジメント効果も,プログラムを工夫することによってその介入効果が期待できると考えられる.今後は,学校を基盤としたストレスマネジメントプログラムの定着に向けた諸問題の解決を念頭に置きながら,より高い効果の期待できるストレスマネジメントプログラムの修正を考えていく必要がある.
抗精神病薬治療の合理的ストラテジー開発に関する臨床薬理学的・分子薬理遺伝学的研究

ブチロフェノン系抗精神病薬であるtimiperone(TIM)とhaloperidol(HAL)の還元経路の差異について明らかにするために、TIMで治療中の精神分裂病患者において血中TIMおよび還元型TIM濃度を測定し、TIMの薬物動態学的研究をおこなった。体重あたり投与量が同じでも、TIMの血中濃度はHALのそれの約60%であることがわかった。TIMとHALの還元経路の差異についてより詳細に検討するために、ヒト肝臓cytosolを用いてのin vitro実験をおこない、上記の所見がHALとTIMの固有クリアランスの差によるものであることがわかった。231名のHALで治療中の精神分裂病患者において併用薬物のHAL血中濃度への影響を検討したところ、carbamazepineはHAL血中濃度を平均37%低下させ、phenobarbitalはHAL血中濃度を平均22%低下させ、HALの代謝にCYP3A4が大きく関与していることを確認した。66名のHALで治療中の精神分裂病患者で喫煙のHAL血中濃度への影響を検討したところ、喫煙者ではHAL血中濃度が平均で約23%低下することがわかった。47名の男性精神分裂病患者でCYP2D6遺伝子型とHAL血中濃度、還元型HAL(RHAL)血中濃度およびRHAL/HAL比との関連を検討したところ、CYP2D6*5を持つ個体(CYP2D6*1/CYP2D6*5,CYP2D6*5/CYP2D6*10)ではHAL血中濃度が高い傾向があり、RHAL血中濃度およびRHAL/HAL比は有意に高いことがわかった。66名の精神分裂病患者において、東洋人で頻度の高いCYP2D6変異遺伝子であるCYP2D6*10のHAL血中濃度への影響を検討したところ、CYP2D6*10の個数とHAL血中濃度の間には有意な関係が見いだせなかった。また、2級アミン三環系抗うつ薬のdesipramineの水酸化とCYP2D6変異遺伝子との関連について検討し、CYP2D6変異遺伝子のホモ接合体はCYP2D6正常遺伝子のホモ接合体およびヘテロ接合体に比較して有意にdesipramineの血中濃度が高く、水酸化能は有意に低いことがわかった。本研究は、ブチロフェノン系抗精神病薬の代謝に併用薬物が及ぼす影響と、さらにその血中濃度の個体差とcytochrome P450(CYP)2D6遺伝子型との関連について検討し、抗精神病薬治療の合理的ストラテジーを開発することを目的としている。ブチロフェノン系抗精神病薬であるハロペリドール(HAL)血中濃度に及ぼすカルバマゼピン(CBZ)、パ-フェナジン(PPZ)、レボメプロマジン(LPZ)併用の影響について、同意の得られた80名の患者のデータを収集した。血中HAL濃度と体重あたり用量との間には正の相関があり、血中濃度/用量比の個体差は約7倍であり、CBZはHAL濃度を有意に低下させ、LPZはHAL濃度を有意に上昇させた。PPZは血中HAL濃度に有意な影響を与えなかった。

ブチロフェノン系抗精神病薬であるブロムペリドール(BRP)血中濃度の個体差について、同意の得られた23名の患者のデータから、BRP血中濃度/体重あたり用量には20.4倍と大きな個体差を認めたものの、CYP2D6の変異遺伝子であるCYP2D6Ch(Chinese mutation)の保有とBRP血中濃度との間には明らかな相関は認めなかった。HAL血中濃度を上昇させたLPZはCYP2D6を阻害することが、HAL血中濃度を低下させたCBZはCYP3A4に関与していることが知られており、HALの代謝には従来から示されてきたCYP2D6のみならずCYP3A4も関係していることが示唆された。一方でHALと類似の構造を持つBRPの代謝にはCYP2D6は関与していないことが示された。尚、上記の所見については、第7回日本臨床精神神経薬理学会、第18回日本臨床薬理学会での学会発表を行った。HALの代謝とCYP2D6の遺伝子型との関係についての検討を行うため、今後も引き続きサンプル収集と遺伝子解析を行う予定である。本研究は、ブチロフェノン系抗精神病薬の代謝に対して併用薬物が及ぼす影響と、さらにその血中濃度の個体差とcytochrome P450(CYP)2D6遺伝子型との関連について検討し、抗精神病薬の合理的ストラテジーを開発することを目的としている。231名のハロペリドールで治療中の精神分裂病患者において併用薬物のハロペリドール血中濃度への影響を検討したところ、カルバマゼピンはハロペリドール血中濃度を平均37%低下させ、フェノバルビタールはハロペリドール血中濃度を平均22%低下させることがわかった(Hirokane et al,Therapeutic Drug Monitoring,in press)。また、ブチロフェノン系抗精神病薬であるチミペロンとハロペリドールの還元経路の差異について明らかにするために、チミペロンで治療中の精神分裂病患者において血中チミペロンおよび還元型チミペロン濃度を測定し、チミペロンの薬物動態学的研究をおこなった。体重あたり投与量が同じでも、チミペロンの血中濃度はハロペリドールのそれの約60%であることがわかった(Shimoda etal,Psychiatry & Clinical Neurosciences,1998)。チミペロンとハロペリドールの還元経路の差異についてより詳細に検討するために、ヒト肝臓cytosolを用いてのin vitro実験をおこない、上記の所見がハロペリドールとチミペロンの固有クリアランスの差によるものであることがわかった(Shimoda etal,Pharmacology & Toxicology,1998)。
ヒト咬筋のエネルギー代謝と筋線維組成との関連性

本研究は,顎関節症患者に認められる咀嚼筋の疼痛の原因と病態を解明することを目的として,咬筋のエネルギー代謝状態と筋線維組成との関連性について検討してきた.平成14年度は平成13年度に染色条件を確立したミオシンATPase染色法と^<31>P-magnetic resonance spectroscopy(以下MRS)を用いて,筋線維組成分析とクレアチンリン酸(以下PCr)濃度分析を行った.被験者は北海道大学歯学部附属病院を受診し,顎矯正手術を施行予定で咀嚼筋に疼痛を認めず,本研究についての同意が得られた顎変形症患者8名の14咬筋浅層である.PCr濃度はエネルギー代謝分析である^<31>P-MRSの2D-CSI法により顎矯正手術直前に測定した.voxels sizeを10×20×30mm^3として咬筋浅層のPCr,α,β,γ-ATP,無機リン(Pi)の各々のスペクトルを得た後,エネルギー代謝状態のパラメータとしてPCrとβ-ATPの面積比(PCr/β-ATP比)を算出した.筋線維組成分析は顎矯正手術中にMRSの測定領域より採取した約5×5×5mm^3の筋組織に対してミオシンATPase染色を施行した.筋線維をType I, IM, IIA, IIB, IICに分類し,各切片の各筋線維数/総筋線維数と,Type IとType IIの組成比であるType I/Type II比も算出し,PCr/β-ATP比とType I/Type II比および各筋線維組成率との関連性を分析し,以下の結果を得た.1.筋線維組成は,四肢の筋肉には通常見られない中間型筋線維(Type IM線維やType IIC線維)を比較的多く含んだ広範囲な組成を示した.以上より,ヒト咬筋浅層におけるPCr濃度の大小は,酵素組織化学的分類による筋線維組成の違いだけでは説明できないことが示唆された.また,その原因の一つとして,咬筋が中間型筋線維を含んだ複雑な筋線維組成を有する点が考えられたことから,中間型筋線維の性質についてさらに詳細に分析する必要があることが示唆された.本研究は,筋生検により筋線維組成分析が可能な部位について31P-MRSを用いてエネルギー代謝分析した後,筋線維分析を行い,両者の関連性を明らかにし,顎関節症患者の主症状の一つである咀嚼筋疼痛の原因および発症機序を解明することを目的としている.本年度は, 1.筋線維組成分析法の一つであるATP ase染色法について,本研究室における条件(至適pH)を確立すること, 2.データ収集を進めることを目標とした. 1に関してはpH4.25, (4.5), 4.7, 10.65の4条件で筋線維をタイプI, IM, IIA, IIB, IICの5種類に分類できることを確認した. 2に関しては咬筋肥大による審美障害を主訴とする症例に対して,咬筋部分切除術を経験したので,その咬筋について1の条件をもとに筋線維組成分析,筋電図検査, 31P-MRSによる咬筋エネルギー代謝分析を行い,比較検討した.その結果咬筋肥大の原因のひとつとして考えられてきたブラキシズムのような筋の過剰運動を示唆するような所見は各分析法からは得られず,改めて.それらの関連性を明らかにする必要性が出てきた.更に,研究に対する説明を十分に施し,同意が得られた顎変形症患者を対象に同様に分析を行っているが,エネルギー代謝と筋線維組成との関連性について,タイプIMやIICのいわゆる中間型線維がどのように代謝機能に関与しているか検索していく必要性があり,今後の研究課題となるであろう.本研究は,顎関節症患者に認められる咀嚼筋の疼痛の原因と病態を解明することを目的として,咬筋のエネルギー代謝状態と筋線維組成との関連性について検討してきた.平成14年度は平成13年度に染色条件を確立したミオシンATPase染色法と^<31>P-magnetic resonance spectroscopy(以下MRS)を用いて,筋線維組成分析とクレアチンリン酸(以下PCr)濃度分析を行った.被験者は北海道大学歯学部附属病院を受診し,顎矯正手術を施行予定で咀嚼筋に疼痛を認めず,本研究についての同意が得られた顎変形症患者8名の14咬筋浅層である.PCr濃度はエネルギー代謝分析である^<31>P-MRSの2D-CSI法により顎矯正手術直前に測定した.voxels sizeを10×20×30mm^3として咬筋浅層のPCr,α,β,γ-ATP,無機リン(Pi)の各々のスペクトルを得た後,エネルギー代謝状態のパラメータとしてPCrとβ-ATPの面積比(PCr/β-ATP比)を算出した.筋線維組成分析は顎矯正手術中にMRSの測定領域より採取した約5×5×5mm^3の筋組織に対してミオシンATPase染色を施行した.筋線維をType I, IM, IIA, IIB, IICに分類し,各切片の各筋線維数/総筋線維数と,Type IとType IIの組成比であるType I/Type II比も算出し,PCr/β-ATP比とType I/Type II比および各筋線維組成率との関連性を分析し,以下の結果を得た.1.筋線維組成は,四肢の筋肉には通常見られない中間型筋線維(Type IM線維やType IIC線維)を比較的多く含んだ広範囲な組成を示した.以上より,ヒト咬筋浅層におけるPCr濃度の大小は,酵素組織化学的分類による筋線維組成の違いだけでは説明できないことが示唆された.

また,その原因の一つとして,咬筋が中間型筋線維を含んだ複雑な筋線維組成を有する点が考えられたことから,中間型筋線維の性質についてさらに詳細に分析する必要があることが示唆された.
ポスト成長社会における社会経済格差と居住地域分化の関係に関する小地域分析

本年度は、社会経済的な居住分化の変遷とその形成要因を明らかにすることを目的とした。2000年から最新の2015年の国勢調査データを用いて、日本の10大都市における職業階層に基づく居住分化指標の変化からは、都市間で大きな差は見られないものの、ほぼすべての都市においてホワイトカラー層とブルーカラー層の小地域スケールでの空間的分離が進んでいることが明らかになった。また地理的な観点からは、居住分化指標は類似した水準であっても、都市内部での地区構成や空間分布は大きく異なるが、多くの都市に共通してホワイトカラー層が卓越する地区が増えていること、特にそのような地区が都心部に集中する傾向があることも見出された。一方、居住分化の形成要因としては経済格差の拡大のみならず、グローバル化による産業構造の変化や住宅・福祉政策などの影響が指摘されているが、実際にジニ係数が高い都市や第2次産業就業者割合が低い都市、公的住宅の空間的偏りの大きな都市でホワイトカラー層とブルーカラー層の間の居住分化が大きい傾向がみられた。ただし、その変化との関係については、必ずしも居住分化の変化と連動しているわけではないことも示された。さらに本年度はオランダで行われたセグリゲーション研究の国際会議で招待講演を行い、海外研究者との意見交換や情報収集ができたほか、居住分化関連の論文を複数発表し、上記の研究成果について日本地理学会春季学術大会等で口頭発表した。最新の国勢調査である平成27年の小地域集計結果が当初の予定よりも早く入手できた一方で、分析に併用した別の統計調査のオーダーメード集計の手続きに時間がかかったため。都市レベルの居住分化の測定に関して都市圏を含む空間スケールの問題について再検討すること、対象都市数を拡張すること、住宅供給動向との関連性のより詳細な検討を行うことなどを予定している。また最終年度であることを踏まえ、これまでの研究成果についてとりまとめ、地理学や都市計画関連の学会誌において公表する予定である。1.1980年以降の東京都区部における職業階層による小地域単位での居住地域分化の推移について定量的に明らかにした。1980年代以降、経済格差の拡大が指摘されるようになったが、対象地域全体としての居住地域分化の程度は、継続して低下していることが複数の居住分化指数により示された。例えば、いずれも居住地域分化の水準が大きいことを示すMultigroup dissimilarity indexやInformation theory indexは、25年間でそれぞれ0.165から0.124、0.038から0.025に減少している。しかしこの間に管理職のみは、同様の指標で見ても、ブルーカラー職を含む他の集団と居住地域分化を進展させており、ホワイトカラーの一部では空間的な隔離が強まっていることが明らかになった。立地係数の分布の変化からは、特に彼らは都心へと空間的集中を強めていることも示された。2.全国市町村の2010年と2015年における社会階層の分極化と都市内居住地域分化の関係について明らかにした。1.と同様に職業構成に着目すると、対象となった2015年における268都市のうち、中間層の割合が低下したのは236都市であり、そのうち198都市で中間層以外の両端の層の割合が増加した分極化の現象が見られた。しかし居住地域分化の水準を表す相違指数(Dissimilarity index)の平均は、19.0(最大41.0:つくば市最小7.6:小金井市)であり、214都市が2010年よりも減少していた。したがって必ずしも分極化の進展と居住地域分化の進展は対応するものではないことが分かり、両者の関係を文脈づける要因の解明が今後の課題となることが示唆された。「研究実績の概要」で述べた2点の研究成果については、前者は論文として取りまとめて査読付き学術誌に投稿し、後者は2017年日本地理学会秋季学術大会で口頭発表した。また本年度は文献調査およびデータ整備についても当初の予定通り進めており、文献調査に関しては、主に1990年代以降の地域格差やその決定要因に関する国内外の理論や実証研究成果を収集し、海外の居住地域分化研究の実証分析の成果については、その対象都市の特性や範囲、分析で採用された社会経済変数、居住地域分化を計測する定量的指標や空間スケール等についても整理することができた。

さらに本年度はオランダで行われたセグリゲーション研究の国際会議で招待講演を行い、海外研究者との意見交換や情報収集ができたほか、居住分化関連の論文を複数発表し、上記の研究成果について日本地理学会春季学術大会等で口頭発表した。最新の国勢調査である平成27年の小地域集計結果が当初の予定よりも早く入手できた一方で、分析に併用した別の統計調査のオーダーメード集計の手続きに時間がかかったため。本年度までに明らかになった社会経済格差と居住地域分化との関係(有無や強さ)が、どのような都市特性によって規定されているかについて、統計的手法や空間分析により明らかにしていく。また得られた結果については速やかに学会報告を行い、論文としてもまとめていく予定である。都市レベルの居住分化の測定に関して都市圏を含む空間スケールの問題について再検討すること、対象都市数を拡張すること、住宅供給動向との関連性のより詳細な検討を行うことなどを予定している。また最終年度であることを踏まえ、これまでの研究成果についてとりまとめ、地理学や都市計画関連の学会誌において公表する予定である。今年度に予定していた海外での国際発表を次年度に変更したため。具体的には、2018年9月にオランダ・デルフト工科大学で開かれる国際会議「Urban Poverty and segregation in a globalized world」において招待講演を行うことが決定し、日本における居住地域分化とその国際比較について研究成果を報告する予定である。招待講演により当初予定していた海外旅費が不要になったため次年度使用額が生じたが、その分に関しては研究成果公表にかかる費用に充てる予定である。
GABAB受容体遺伝子のクローニングと機能解析

私たちは、ラット小脳より精製したmRNAよりGABA-B受容体のfunctional clonigをこころ見たが、時を同じくして、Bettlerのグループらにより二つのGABA-B受容体(GABAB-R1a,GABAB-R1b)がクローニングされた。私たしたちもラット小脳よりRT-PCR法を用いてこの二つのGABA-B受容体をクローニングし、アフリカツメガエル卵母細胞系に導入した。しかし、うち向き整流性K+電流の活性化は認められなかった。そこで、以下の二つの可能性を考え実験を行った:1)二つのクローン以外にうち向き整流性K+電流の活性化をするGABA-B受容体が存在する。2)受容体以外に他の共役する蛋白が必要。1)に対しては、ラット小脳より得たcDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法を用い新たな三つのGABA-B受容体クローンを得、それらの組織分布が異なることをRT-PCRを用いて明らかにし、このうちの二つのクローン(GABAB-R1c,GABAB-R1d)について公表したが、私たちの得たいずれのクローンもK+チャネル(GIRK1とGIRK2)を導入にしたアフリカツメガエル卵母細胞系においてうち向き整流性K+電流の活性化は認められなかった。そこで、2)の共役する蛋白の同定を試みていたが海外のグループよりGABAB-R2が報告され、GABA-B受容体は、GABAB-R1とGABAB-R2がheteromerを形成し機能することが明らかとなった。GABAB-R2と私たちの得た新たなクローンを共発現させ既知のクローンとの機能的違いを明らかにしつつある。私たちは、アフリカツメガエル卵母細胞にGタンパク質(Gi)で活性化されるK^+チャネル(GIRK1とGIRK2)をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、そこにラット小脳より精製したmRNAを導入することにより、GABA_B受容体による内向き整流性K^+電流活性化が見られることを明らかにした。この結果より、ラット小脳には内向き整流性K^+電流と共役するGABA_B受容体の存在が示された。そこでRT-PCR法を用いて既知の2つのGABA_B受容体をクローニングし内向き整流性K^+チャネル(GIRK1とGIRK2)とアフリカツメガエル卵母細胞にcoexpressionさせたが内向き整流性K^+電流活性化は見られなかった。これらの実験事実より次のような可能性が考えられた。1) Bettlerのグループが明らかにしたGABA_B受容体の2つのサブタイプ以外に内向き整流性K^+チャネルを活性化するGABA_B受容体が存在する。2) CGRP受容体で明らかにされたように、GABA_B受容体が内向き整流性K^+チャネルを活性化するには、共役する何らかの蛋白が必要。次に私たちは、既知のGABA_B受容体クローンのcDNAを用い、ラット小脳より得たcDNAライブラリーに対してプラークハイブリダイゼーション法により、新たな2つのGABA_B受容体のクローンを見つけ出した(GABA_B1c,GABA_B1d)。しかしながら、この2つのクローンについても内向き整流れ性K^+チャネル活性化は見られなかった。私たしたちもラット小脳よりRT-PCR法を用いてこの二つのGABA-B受容体をクローニシグし、アフリカツメガエル卵母細胞系に導入した。

そこで、以下の二つの可能性を考え実験を行った:1)二つのクローン以外にうち向き整流性K+電流の活性化をするGABA-B受容体が存在する。2)受容体以外に他の共役する蛋白が必要。1)に対しては、ラット小脳より得たcDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法を用い新たな三つのGABA-B受容体クローンを得、それらの組織分布が異なることをRT-PCRを用いて明らかにし、このうちの二つのクローン(GABAB-R1c,GABAB-R1d)について公表したが、私たちの得たいずれのクローンもK+チャネル(GIRK1とGIRK2)を導入にしたアフリカツメガエル卵母細胞系においてうち向き整流性K+電流の活性化は認められなかった。そこで、2)の共役する蛋白の同定を試みていたが海外のグループよりGABAB-R2が報告され、GABA-B受容体は、GABAB-R1とGABAB-R2がheteromerを形成し機能することが明らかとなった。GABAB-R2と私たちの得た新たなクローンを共発現させ既知のクローンとの機能的違いを明らかにしつつある。
微生物における遺伝子増幅の機構とその機能

生物界での代表的な2種類の遺伝子増幅機構(一つはリボソームRNA遺伝子(rDNA)、他はガン遺伝子)について、前者は既に増幅機構を明らかにしているため、ここでは増幅された多コピー遺伝子の維持機構について、後者については増幅機構について出芽酵母を用いて明らかにした。さらに遺伝子増幅の遺伝子進化への関与の可能性を探るため、大腸菌を用いてミクロ遺伝子進化系を確立して調べたところ、遺伝子増幅以外に、集団内で複数の変異(挿入配列の挿入や点突然変異)が独立して起こり、その間での増殖速度の競争と選択が起こることを明らかにした。(1)真核生物のリボゾームRNA遺伝子(rDNAと呼ぶ)は、リピート遺伝子の典型例である。一方真核生物の複製フォーク阻害点(RFB)は、rDNAユニット内に存在し、以前はrDNAの転写と複製の衝突回避のためにあるとされた。我々の研究室では、RFBでのフォーク阻害に必要なタンパクの遺伝子FOB1を10年前に同定し、Fob1タンパクがそれまで謎であったrDNAのコピー数の増減に必須であることを発見した。事実fob1欠損株ではrDNAのコピー数の増減が停止する。しかし相同組換え活性の高い酵母においては、rDNAのリピート構造維持は謎のため、我々は未知の維持機構を仮定し、その欠損株と思われる株を分離解析することで、その維持には、染色体の凝縮と分離に必須なコンデンシンが働いていることを見出した。しかも、ゲノム全体に働くとされてきたコンデンシンがFob1タンパクに依存して特異的にRFBに結合することを発見した。実際fob1とコンデンシンの2重変異株のrDNAリピート数は激減した。ここでは、そのリピート数の激減は、rDNAの転写酵素PoIIに依存することから、おそらくrDNAの転写がコンデンシンのrDNAへの一般的な結合を阻害していると考えた。結論として一般的なコンデンシンの染色体への結合は、転写に依って阻害されるとした。このことから我々は真核生物一般に見られるM期特異的な転写抑制は、染色体へのコンデンシンの結合に必須あるいは促進するためにあると考えた。(2)rDNAとは異なる多コピー遣伝子(例えばDHFR)の増加の機構は現在でも不明である。我々は出芽酵母を用いて、高速・高効率な遺伝子増幅系を構築した。この系の効率をさらに上げるため、Cre-lox系を利用した系が可能と考え、実験したところ、2種類の増幅系で同じ増幅産物を得ることができた。このことは、生物個体のどこの組織でも、遣伝子増幅が可能となることを意味する。そのテストに動物細胞(CHO)を用いて、Cre-lox系による増幅系を構築し、現在遺伝子増幅の有無を検討中である。本研究の具体的目標は、微生物(大腸菌と出芽酵母)における(1)遺伝子増幅の分子機構、(2)増幅後のリピート構造の維持機構、(3)遺伝子進化における遺伝子増幅の役割、の解明にある。遺伝子増幅には大きくわけて2種類あり、リボゾームRNA遺伝子(rDNA)とがん遺伝子である。どちらの増幅機構も不明であったが、前者については以前我々のメンバーであった小林を中心に突破口が開かれ、基本的に解明されたと言って良い。後者に関しては、(1)酵母を用いて我々はモデル系を構築し、ダブルローリングサークル複製(DRCR)により高速増幅が可能なことを見出した。本年度はこのモデル系の増幅開始反応にCre-lox系を用いても、DRCRによる増幅が達成できることを確かめた。これから、酵母における高速遺伝子増幅はDRCRによって可能であると結論した。現在、同じ系を動物細胞で構築し、増幅の有無を検討中である。(2)これまで我々の研究からrDNAのリピート構造の維持には、染色体の凝縮と分配に必須なコンデンシンが必須であり、その為にはコンデンシンのrDNAの複製阻害部位(RFB)への結合が必要なことを見出していた。この結合の分子機構を知るため、コンデンシンのRFBへの結合に必須な遺伝子に欠損が起こった3種類の変異株を分離し、現在その遺伝子を同定・解析中である。コンデンシンの染色体へのリクルートタンパクは未同定であることから、興味深い成果が期待できる。(3)大腸菌を用いて、本来資化不能なキシリトールを資化可能な能力を獲得できるマイクロ進化の系を確立した。複数の進化株の解析から、塩基置換、ISの挿入に加え、確かに遺伝子増幅も起こっていることを見出した。本研究の具体的目標は、微生物(大腸菌と出芽酵母)における(i)遺伝子増幅の分子機構、(ii)増幅後のリピート構造の維持機構、(iii)遺伝子進化における遺伝子変化の役割、の解明にある。遺伝子増幅には主に2種類あり、リボゾームRNA遺伝子(rDNA)とがん遺伝子である。どちらの機構も不明であったが、前者については我々の研究室が既に基本的にほぼ解明したと言ってよい。

後者については、これまで(i)我々はCre-loxを用いた酵母モデル系を構築し、ダブルローリングサークル複製(DRCR)により高速増幅が可能なことを見出した。20年度はCre-lox系に依らず、相同組換えによるDRCR誘導で増幅が達成できることを確かめた。これにより、ガン遺伝子タイプの増幅は、DRCRによることが強く示唆された。現在、動物細胞を用いても、相同組換えによるガン遺伝子増幅を検証している。(ii)従来、我々はrDNAのリピート構造の維持には、染色体の凝縮と分配に必要なコンデンシンが必須であり、その為にはコンデンシンのrDNAの複製阻害部位(RFB)への結合が必要なことを見出していた。本年度、この結合には3種類の遺伝子産物が必要であることを明らかにし、コンデンシンの染色体へのリクルート系を始めて解明した最初の例となった。(iii)大腸菌を用いて、本来資化不能なキシリトールを資化可能な能力を獲得できるマイクロ進化の系を確立した。この系により分離した、複数の進化株の解析から、遺伝子増幅、塩基置換、ISの挿入によってミクロ進化が可能であることを見出したが、本年度は、大腸菌株(C株とK12株)によって、それらの変化に偏りがあり、例えばIS挿入の多いK12では、一つの培地中で、同時並行的な独立のISの挿入により、その挿入株同士間での競争が起こり、生育の早いクローンが優勢になるダイナミズムが働くことが明らかとなった。
経済行動における国際比較モデルの理論的・歴史的研究:ポスト冷戦の新基準

平成5年度は主に理論研究、平成6年度は主に事例研究に重点を置いて、ポスト冷戦期の国際比較モデルの可能性を探った。最終年度である平成7年度には、各研究者の事例研究を共同研究会の場で討議を重ねた。また平成7年9月には、アジア、アフリカ、旧ソ連圏などをフィールドとする研究者が集まって、現代世界における市場経済モデルの諸側面を検討した。研究が進むにつれ、ポスト冷戦期における最大の問題は、計画経済から市場経済への移行が不可避であるにしても、アメリカ型市場経済の普遍性には疑問があり、とくにIMFや世界銀行による構造調整、あるいはアメリカ型市場モデルの日本への「押しつけ」が大きな問題を含んでいるとの認識に至った。また市場の論理と公共性の論理との齟齬が、今後の世界を考えるうえで鍵を握るイシューであることが確認された。初年度にあたり、研究に必要な文献-とくに日米の経済構造・行動、および現代米国社会一般に関する文献-の収集につとめ、経済活動の国際比較モデルにまつわる、社会科学の諸理論および仮説を検討した。議論の中心は近代化論や経済発展論の批判的再検討にあったが、ヘゲモニー論を中心とする政治学諸理論も考察の視野にとり入れた。研究会の方式としては、年度内に4回の共同研究会を開催し、また合宿形式による研究会も行った。今後は、テープに録音した議論の文字化につとめ、今年度の研究でうかびあがってきた諸問題をさらに追求する予定である。とくに、「平成不況」と呼ばれる、日本経済の現況に関する評価基準を中心にすえる予定である。平成6年度は、月一度程度の定期的研究会を開催し、おもに20世紀を代表する世界モデルであった「アメリカン・ウェイ・オブ・ライフ」の再検討を行った。(その成果については「研究発表」欄参照。)またこのモデルと表裏一体の関係にある「近代化論」の基礎文献(アイゼンシュタット、アプター、ドイッチ、ア-モンドなど)やウォラ-スタインをはじめとする「世界資本主義システム論」の諸文献を読み返し、「アメリカ的近代」のイメージを採った。なお、研究代表者の飯田と研究分担者の柏岡は、それぞれ別件で出張した東南アジアや欧州共同体で、両地域がめざしている新しい近代の諸側面についてインタビューや資料収集を行った。これらについては来年度の共同研究会で討論の素材とする予定である。また平成7年度に国際日本文化研究センターで開催する国際研究集会(「市場経済への移行と市場経済の移行」、実行委員長、飯田経夫)に際しても、本研究の目的を部分的に反映させるべく、綿密な準備作業をすすめた。平成7年度は、当初の予定通り1カ月・2カ月に一度の割合で行動研究会を開催し、平成5年度の理論研究の成果と、6年度の事例研究とをつきあわせて、ポスト冷戦期の国際比較モデルの可能性をさぐった。また、あわせて「日本型モデル」論の検証を行った。具体的研究経過としては、(1)各研究者に課題を与え、共同研究会の場で発表させた。(2)発表原稿は、討議をふまえて、学術論文として書きあらためる作業をすすめている。(3)9月にアジア、アフリカ、旧ソ連圏、南米などをフィールドとする研究者が集って、3日間のシンポジウムを開催した。その成果(プロシ-ディングズ)は現在とりまとめ中である。
３Ｈｅ偏極装置の高度化に向けた単結晶セルの開発と３Ｈｅ高偏極化の研究

スピン交換法による3He核偏極には温度に依存する偏極緩和が存在し、これにより到達偏極率が80%程度で頭打ちとなっている。この偏極緩和については、現在その原因が不明だが、現象論的に3Heガスを封入するガラス容器(セル)内壁面で生じていることが示唆されている。通常、3Heセルは清浄なガラスでできているが、ガラスの多孔質性がこの未知の偏極緩和と関係している可能性がある。そこで、ガラス材料の代わりに単結晶材料を用いた3Heセルを製作し、その偏極緩和を調べることにより、未知の偏極緩和に対する知見を得るとともに、85%を超えるスピン偏極率を実現する可能性を探るべく3He偏極用単結晶セルの開発を目指した。本研究では、ヘリウム3偏極セルの試作とその性能評価が重要である。ヘリウム3核偏極を実現するために、本研究ではスピン交換法を用いている。スピン交換法では、まず円偏光のレーザーによりルビジウムの原子偏極を得る。この原子偏極、すなわちルビジウムの最外殻電子の偏極がヘリウム3原子核に移行して、最終的にヘリウム3核偏極が実現される。高い偏極率を実現するためにはヘリウム3偏極セルの材料が重要で、セル材料にわずかでも磁性体が含まれていたり、あるいはそれに類する性質があると、大きなヘリウム3偏極緩和が生じてしまう。また、セル材料が石英ガラスのような多孔質構造の場合、ヘリウム3原子がセル内壁に浸透拡散し、これによりヘリウム3偏極緩和が助長されてしまうという問題もある。そこで、本研究では磁性不純物を含まず、かつ表面が密である物質として結晶材料でヘリウム3偏極セルを製作し、その偏極性能を評価する。当該年度は、サファイアを基材とするヘリウム3偏極セルを複数個試作し、これにヘリウム3ガスやルビジウム等を封入するためのガラス配管を接続した。一方、ヘリウム3偏極セルの性能を評価するには、雰囲気中に存在する非偏極のルビジウム原子と偏極したヘリウム3原子核がスピンを交換することによりヘリウム3原子核が偏極緩和する効果を差し引かなければならない。この効果の大きさは、ヘリウム3の核偏極率とルビジウムの原子数密度を同時に測定することにより得られ、ヘリウム3核偏極率はNMRにより、ルビジウムの原子数密度は低濃度ルビジウム蒸気を透過するレーザーのファラデー効果から測定する。当該年度は、このファラデー効果を測定する光学システムの開発も行った。Heの同位体である3Heの原子核はスピンに依存した大きな熱中性子吸収断面積を持つため、核偏極した3Heガスに対して中性子を透過させればスピン偏極した中性子ビームが実現できる。3Heの核偏極は、スピン交換法あるいはメタスタビリティー法により実現できる。スピン交換法では、Rbなどアルカリ金属原子の不対電子を光ポンピングにより偏極させ、この偏極電子と3He原子核がスピンを交換することにより3He核偏極が達成される。十分な強度の光があればRbの電子は100%に近い偏極が得られる。Rbと3Heのスピン交換断面積については実験・理論の両面から理解が進んでおり、それによればRbの電子偏極と同程度の3He核偏極が達成できるはずである。しかし、実際には、温度に依存した原因不明の3He偏極緩和により、3Heの核偏極率は85%程度で頭打ちとなっている。この未知の偏極緩和は3Heガスを封入するセル内壁で起きていることが示唆されており、セル材料の違いにより偏極緩和に大きな差異が確認されている。3He偏極セルには通常ガラスが用いられているが、もしガラスの多孔質構造がこの偏極緩和と関係していれば、セル材料としてガラスではなく単結晶を用いることにより3He偏極率を上げることができる。そこで、サファイア単結晶を用いたセルを試作し、ガラスセルと同様のプロセスでセルのベーキングを行った。しかし、ベーキング中にサファイア単結晶の一部に亀裂が入り、セルとしての気密が保てなくなった。この亀裂は複数のセルで同様に起きたため、サファイアセルの製作段階で結晶内に生じた歪みが原因と考えられる。この問題を克服すべく歪みの入りやすい部分の接合には耐熱接着剤を用いた新しいセルの試作に着手した。この新しい単結晶セルは研究期間内に完成に至っていないが、今までに得られた知見を生かして単結晶セルによる3He偏極の研究は継続する予定である。本研究では、3He偏極セルの試作とその性能評価が重要である。

高い偏極率を実現するためには、3He偏極セル内を清浄に保ちつつ、高純度のヘリウム3ガス、窒素、ルビジウムを封入する必要があり、そのためには高真空排気システムを含むガス精製装置やルビジウム封入のための仕掛けが必要となる。当該年度は、これら高真空排気システム等を整備した。一方、ヘリウム3偏極率については、NMRないしは中性子ビームの透過率により測定することができる。ヘリウム3偏極率の絶対値評価には中性子ビームが有効であるが、NMRでもヘリウム3偏極率の相対値や変化率などは十分測定することができる。当該年度は、このNMRシステムの開発を進め、このシステムにより必要な測定精度を得られることが確認できた。また、3He偏極セルの性能評価には、ヘリウム3の核偏極率だけではなくルビジウムの偏極率も重要であり、これを測定する装置の技術的検討を進めた。具体的には、ルビジウム雰囲気中におけるレーザーの旋光を測定する必要があり、そのための光学装置や測定精度についてシステム設計に向けた検討を行った。予定外の業務が増加したため本来計画していた時間を本研究に費やすことができなかった。特に、J-PARC中性子施設の運転や保守業務で担当グループの人員が削減されたため、これによる負荷が増加し、研究時間を削ってこれに充てた。結晶材料によるヘリウム3偏極セルが試作できたことは本研究において最も重要な進展といえるが、当該年度内にセルにヘリウム3ガス等を封入するテストまで進めることが不可能であった。一方、ルビジウム原子数密度をファラデー効果から測定するための光学システムに関しては予定通りの研究進展となっている。震災復旧とくにJ-PARC施設の震災復旧業務に対応したため、本来計画していた時間を本研究に費やすことができなかった。また、震災により国内の中性子施設がすべて停止し、中性子ビームによるテストができない状況となり、これも研究遅延の原因となった。本研究では、3He偏極セルの試作とその評価がもっとも重要であるが、セル製作に関する情報収集及び試作テストで遅れが生じている。3He偏極セルの性能評価研究については、中性子ビームが使用できない状況のためNMR装置の開発を重点的に進め、これについては予定通りの進展をみている。ヘリウム3偏極セルの性能評価をするための道具立ては整っているので、セルにヘリウム3ガス、ルビジウム等を封入し、偏極試験及び偏極緩和試験を行う。このガス封入及び評価試験を繰り返し、再現性を含めた結晶セルの性能評価を進める。現状やや遅れている3He偏極セルの試作を重点的に進める計画である。とくに情報収集と3He偏極セル試作に向けたテスト環境の整備を進める。また、3He偏極セルの性能評価に必要なルビジウムの偏極率を測定するシステムのテストないしは開発を進める。本年度の残金は、主として試験用セルの製作費に充てる。本研究推進で最も重要なことは試験用セルを製作し、その性能を評価することである。本年度の残金は少額のため、試験用セルの製作に有効利用することができないと判断し、これを次年度に繰り越し、次年度予算と合わせて試験用セルの製作費とすることにした。3He偏極セル試作に向けた材料の調達あるいはセル試作に研究経費を使用する。
ヒトゲノムGC含量ドメイン構造の解析と遺伝子高密度領域の探索

ヒトゲノムがGC含量のMbレベルの区分構造よりなり、この巨大区分構造が染色体バンド領域と関係することを報告してきた。生物学的意味に富んだバンドの属性と塩基配列との関係づけは、ゲノム解析における重要な課題である。MHCクラスIIとIIIの境界領域にシャープなGC含量の変移点を見い出していたが、S期内の複製タイミングを測定したところ、GC含量と複製タイミングの変移点が一致することが明らかになり、この変移領域がバンド境界の要件を満たすことが示された(Tenzen et al.,1997)。この現象の一般性を検証する目的で、クラスIからテロメア側の非MHC領域について、約1.5Mbのゲノム歩行を行い、GC含量分布の測定を行った。非MHC領域との境界部位に新たなGC含量の変移点が特定され、FISH解析により、6p21.3とp22.1の境界に対応することが示された。上記のゲノム解析を行う過程で、9個の新規遺伝子を見い出した。その内のGABA受容体B遺伝子については、完全構造の決定と転写開始点ならびに転写制御領域の解析を行った結果、約5kb離れて存在する2箇所のプロモーターより2種の転写産物が発現していることが判明した。第2プロモーターにのみCRE(cAMP response element)が存在しており、CRE/CREBによる発現調節機構により、GABAB受容体遺伝子が自己調節を受けていると予想され、シナプスの可塑性と関係する可能性が考えられる。クラスIIとIIIの境界領域に見い出したNOTCH4についても、完全遺伝子構造の決定を行い、顕著な多型性を示すCTGリピートを見い出した(Sugaya et al.,1997)。
うがい液試料の統合的マルチオミクス解析に基づく口腔癌プレシジョン治療の実現

口腔癌においても液体生検による最適化治療の確立は急務であるが、有用なマーカーは見出されておらず、その基盤となる統合的遺伝情報データベースも存在しない。そこで本研究では、口腔癌症例および健常者から非侵襲的に採取したうがい液検体を用いてゲノム・エピゲノム・マイクロRNAなどの統合的マルチオミクス解析を行い、まず口腔癌および正常粘膜の統合的遺伝情報データベースを構築したのち、遺伝情報に基づいた口腔癌の個別プレシジョン治療を実現することを目的とする。
pH制御を介したインスリンの再充填メカニズムの解析

グルコースは、インスリン顆粒膜と細胞膜との融合を促進することで、膵B細胞からのインスリン分泌を制御している。一方、グルコースは、融合した顆粒膜の回収過程(エンドサイトーシス)にも関わっている。エンドサイトーシスは、インスリン分泌前後で膵B細胞の容積を一定にするためにも、インスリン顆粒を再充填するためにも必須の過程であるが、その分子メカニズムはほとんど知られていない。本研究では、Rab27aがプロトンポンプの複合体形成を促進することを明らかにした。これは、Rab27aが、取り込んだ小胞の酸性化を介してエンドサイトーシスを制御することを示唆している。本研究では、膵B細胞におけるpHコントロールを解析することで、インスリン分泌を終えた小胞にインスリンを再充填するメカニズムの解明を目指す。この再充填機構は、膵B細胞を疲弊させることなく、インスリンを長期間にわたって放出し続けるために必須であり、その破綻は2型糖尿病の新たな原因となりうる。しかし、これまでの研究では生合成されたインスリンを放出するまでを扱い、その後のステップを扱った研究は皆無である。本研究は、開口放出後に活性化されるGタンパク質とプロトンポンプの結合調節と機能制御を解析することで、インスリンを再充填するメカニズムの解明を行う。申請者は、本研究が新しいタイプの糖尿病治療薬を開発する基盤になりうると考えている。平成28年度は、Gタンパク質がプロトンポンプとの複合体形成と活性に及ぼす影響を検討した。免疫沈降実験より、Gタンパク質がプロトンポンプと細胞内で複合体を形成することを明らかにした。さらに、精製タンパク質を用いたin vitro binding assayより、その結合が直接であることを明らかにした。また、Gタンパク質とプロトンポンプの結合を抑制した細胞では、エンドサイトーシスされた小胞内の酸性化が抑制された。以上の結果より、インスリン分泌を終えた小胞内でpHをコントロールする分子メカニズムの一端が明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うGタンパク質の活性制御機構の解析を理解する上で極めて重要であると共に、膵B細胞のエンドサイトーシスシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。本研究では、インスリン分泌を終えた小胞内でpHを制御するメカニズムを、以下に従って解析する予定である。平成28年度:Gタンパク質がプロトンポンプとの複合体形成と活性に及ぼす影響を検討する。平成29年度:プロトンポンプを再構成するシグナルの上流を解明する。本年度は、Gタンパク質がプロトンポンプを介してインスリン分泌を終えた小胞内のpHを制御することを明らかにした。本研究は、開口放出後に活性化されるGDP型Rab27aとプロトンポンプvATPaseの結合調節と機能制御を解析することで、インスリンを再充填するメカニズムの解明を行う。平成29年度は、vATPaseを再構成するシグナルの上流を解明するために、Rab27aがGDP型に変換されるメカニズムを解析した。Rab27a-GAPをリガンドとしたアフィニティカラムクロマトグラフィとマス解析を組み合わせることで、Rab27a-GAP結合候補タンパク質を複数見出した。精製タンパク質を用いた結合実験より解離定数(Kd)を算出し、結合が直接かつ特異的であることを明らかにした。また、pull down assayの結果より、このタンパク質がRab27aの変換に関わることを明らかにした。平成29年度は、前年度の成果を基盤にGタンパク質の活性化シグナルの解明を試みる。1) GAPをリガンドとしたアフィニティカラムに膵B細胞の抽出液をアプライし、結合タンパク質をマス解析により同定する。2)精製タンパク質を用いた結合実験より解離定数(Kd)を算出し、結合が直接かつ特異的であることを示す。

3)グルコース刺激前後の細胞から調製した抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーとショ糖密度勾配遠心法で分画し、GAPと同定した分子の結合形態や結合様式を解析する。4)同定した分子がGタンパク質の変換に及ぼす影響を、in vitro GAP assayとpull down assayにより評価する。5)細胞をグルコースで刺激し、各タンパク質の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡(TIRF-MS)、超解像度顕微鏡(STED-MS)を用いたライブイメージングにより解析する。6)同定したタンパク質のドメイン構造を指標に複数のフラグメントを作製し、GAP結合部位を同定する。さらに、結合部位より各種変異体の作製を行う。7) siRNAや上記変異体を細胞に導入し、各タンパク質の局在や動態に及ぼす影響を検討する。エンドサイトーシスに及ぼす影響は、フォグリン抗体の取り込み実験やエンドサイトーシスマーカーFM4-64により解析する。pHに及ぼす影響は、pH感受性の蛍光指示薬や蛍光タンパク質を用いて評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子糖尿病学29年度が最終年度であるため、記入しない。