hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
排出過程におけるABC輸送体―基質相互作用を捉える

本年度は、構造変化の状態と基質相互作用との関係を調べた。これまでに、X線結晶構造解析によりGW変異体の構造は途中状態であることが示唆されたものの基質との共結晶は得られなかったことから、構造変化の途中状態における基質相互作用を調べるため、トリプトファン(Trp)の蛍光変化を利用して基質との相互作用の強さを観測する系を構築した。すなわち、CmABCB1の内向型と外向型の2つの立体構造を用いたモーフィング解析から、基質と相互作用するが構造変化の中で変わりうる複数の残基を予測し、それらをそれぞれTrpに置換した変異体を作成した。その結果、基質結合部位近傍のMetまたはPheの変異体は、基質の添加によって濃度依存的にTrp蛍光が大きく変化したことから、基質との相互作用を直接観測できていると考えられた。そこで本年度は、これらのTrp変異体を用いて、状態の違いによる蛍光変化への影響を観測する実験を行った。その結果、作成した変異体のうち、基質結合部位の細胞内側にあるMetをTrpに置換した変異体において、ATPの添加によって基質濃度依存的な蛍光変化の最大変化量が減少することを見出した。ATPは外向型への構造変化を引き起こすことから、この変化は外向型の割合の増加に伴い基質相互作用が減少したことによるものと考えられた。さらに、結晶構造から、外向型において基質相互作用が減少する要因は基質結合領域の収縮であると推定され、この収縮にGly132とAla246とのvan der Vaals相互作用が寄与する可能性を見出した。これらの残基のアミノ酸変異は輸送活性を著しく低下させたことから、基質が結合できなくなるように基質結合領域が収縮されることは基質排出に重要であることが示唆された。1.P糖タンパク質ホモログ変異体のX線結晶構造解析申請者らはこれまでに、P糖タンパク質ホモログの構造機能解析から、基質輸送前の状態である内向型構造を安定化し、外向型構造になりくくしていると予想される2つの膜貫通ヘリックス間の相互作用を予測していた。本年度は、この2つの膜貫通ヘリックスを引き離すことで内向型を不安定化し、内向型以外の状態を捉えることが可能かを明らかにするために、膜貫通ヘリックス間に嵩高い側鎖のTrpを導入した変異体を作成してX線結晶構造解析を実施した。まず、変異体タンパク質を精製して結晶化を行ったところ複数の条件で結晶が得られた。そこで、X線回折データを収集して構造解析を行った結果、変異体の結晶構造を3.2オングストロームで決定することができた。この結晶構造を野生型の内向型構造と比較したところ、導入したTrpの側鎖によって当該膜貫通ヘリックス間が野生型より離れ、外向型構造に近づいていることが判明した。したがって、本研究のアプローチによって基質輸送過程の途中状態を捉えられることが示唆された。2.P糖タンパク質ホモログの構造変化に寄与する部位の変異体の取得と機能解析P糖タンパク質ホモログの構造変化に寄与すると予想されるアミノ酸残基をAlaに置換した部位特異的変異体を作成し、アミノ酸変異によるATPase活性と基質輸送活性への影響を調べた。その結果、いくつかの変異体はATPase活性がそのままに、基質輸送活性が著しく減少していることが判明した。変異導入したアミノ酸はATPの結合を基質排出ゲートの開放に伝達すると予想される膜貫通ヘリックスにあることから、これらの変異体は排出ゲートが開かず、基質が途中で留まりやすくなっている可能性が示唆された。本研究の目的は、P糖タンパク質の基質輸送過程の途中状態を捉えることによって、基質が構造変化に作用するしくみを明らかにすることである。これまでの研究から、P糖タンパク質が最も安定であり基質が結合する前の状態である内向型を不安定化する変異体を用いて、内向型とは異なる状態を捉えることができた。さらに、アミノ酸変異によって構造変化の伝播が途中で途切れたことを示唆する結果が機能解析から得られている。したがって、これらのアプローチ法を進めることでP糖タンパク質が基質を内部に抱えた状態を捉えられるものと期待される。前年度に実施したP糖タンパク質ホモログと基質との相互作用をトリプトファン(Trp)の蛍光変化を用いて測定する系の構築において、非特異的な蛍光を除くために野性型にある6個のTrpのうち、機能に重要な1つを除きすべてをチロシン(Tyr)に置換した変異体(5WY)に安定性が低いという問題があった。置換した5つTrpのいずれかが安定性に重要な残基であると考えられたため、これらのTrpを1つずつTyrに置換した変異体を作成して、変異体タンパク質を精製し、それらのATPase活性の熱安定性を測定した。その結果、ATP結合ドメインの内部に側鎖が埋まっているTrp残基をTryに置換した変異体だけ著しく熱安定性が低下したことから、この残基が安定性に関与していることが判明した。そこで、このTrpを野生型に戻した変異体(4WY)を作成したところ、4WYの輸送活性と安定性はいずれもWTと類似していた。したがって、4WY変異体は新たに導入するTrpについて調べるために適していることが判明した。そこで、立体構造に基づいて基質結合部位の近傍のアミノ酸残基を選び、4WYのそれらの残基をTrpに置換した変異体を作成した。そして、変異体タンパク質を精製し、精製試料を用いて基質または阻害剤の存在下または非存在下でTrpの蛍光変化を測定した。その結果、化合物濃度依存的な蛍光変化が観測された。

それは野性型やベースとなった4WY変異体での蛍光変化と比べて、蛍光強度の変化量が大きく、また基質濃度依存性も異なっていた。このことから、このTrp変異を用いることで基質との相互作用が観測されていることが示唆された。初年度のGW変異体の研究によって、それまでに判明していた内向型とは異なる新規の結晶構造を決定し、その構造は途中状態であることが示唆されていた。前年度の研究では、計画していたGW変異体と基質との共結晶が得られていないが、Trp蛍光測定系を構築することができた。この系と、すでに構築していた輸送活性とATPase活性の測定系を用いて、GWの機能への影響を調べることによって、GW変異体で判明した構造変化の途中状態と機能との関係が明らかになるものと期待される。本年度は、構造変化の状態と基質相互作用との関係を調べた。これまでに、X線結晶構造解析によりGW変異体の構造は途中状態であることが示唆されたものの基質との共結晶は得られなかったことから、構造変化の途中状態における基質相互作用を調べるため、トリプトファン(Trp)の蛍光変化を利用して基質との相互作用の強さを観測する系を構築した。すなわち、CmABCB1の内向型と外向型の2つの立体構造を用いたモーフィング解析から、基質と相互作用するが構造変化の中で変わりうる複数の残基を予測し、それらをそれぞれTrpに置換した変異体を作成した。その結果、基質結合部位近傍のMetまたはPheの変異体は、基質の添加によって濃度依存的にTrp蛍光が大きく変化したことから、基質との相互作用を直接観測できていると考えられた。そこで本年度は、これらのTrp変異体を用いて、状態の違いによる蛍光変化への影響を観測する実験を行った。その結果、作成した変異体のうち、基質結合部位の細胞内側にあるMetをTrpに置換した変異体において、ATPの添加によって基質濃度依存的な蛍光変化の最大変化量が減少することを見出した。ATPは外向型への構造変化を引き起こすことから、この変化は外向型の割合の増加に伴い基質相互作用が減少したことによるものと考えられた。さらに、結晶構造から、外向型において基質相互作用が減少する要因は基質結合領域の収縮であると推定され、この収縮にGly132とAla246とのvan der Vaals相互作用が寄与する可能性を見出した。これらの残基のアミノ酸変異は輸送活性を著しく低下させたことから、基質が結合できなくなるように基質結合領域が収縮されることは基質排出に重要であることが示唆された。次年度は、P糖タンパク質に基質が結合した輸送途中状態での構造解析を目指して、得られた変異体を改良し、基質との複合体結晶を作成する。本年度の研究によって、構造解析を実施したP糖タンパク質ホモログの変異体が基質結合に適した状態に近づいていることが示唆された。さらに、基質がタンパク質内部に留まりやすいことが示唆される変異体を見出した。これらの変異体をベースに、アミノ酸変異導入位置の修正および基質との相互作用解析によって、基質親和性が高い変異体を選別し、基質との共結晶化を実施する。GW変異体の機能解析によって、立体構造の安定な状態の違いが機能に及ぼす影響を調べ、得られた結晶構造と機能との関係を明らかにする。
神経ペプチドとモノアミンによる行動制御の可塑性と新しい技術による研究

本研究にいて, brain-dialysisという新しい神経科学的技術を導入し,神経活動の動的研究を行った.更に神経ペプチドのうち,コレシストキニンの生後発達に伴う遺伝子量を測定し,その生理的意義の解明を試みた.先ず,無麻酔・無拘束ラット脳線条体においてbrain-dialysisを連続的に行い,透析液中のドーパミンおよびその代謝物DOPAC, HVAの薬物に対する変化を測定した.線条体内にはアセチルコリン神経があり,ドーパミンの神経活動を間接的に調節していると考えられているが,これを証明するため,アセチルコリン受容体RM_1とRM_2の作用薬と拮抗薬を透析液を介して線条件内へ投与し,その時に変化するドーパミン, DOPAC, HVAの量を高速液体クロマトー電気化学検出器により定量した.その結果,ラット脳線条件においては, RM_1はドーパミンの放出に促進的に作用し, RM_2は抑制的に作用していることを明らかにした.また,アセチルコリン受容体のもう一種であるニコチン性受容体は直接的にドーパミンの放出を促進していることも明らかにした.一方,線条体にはアセチルコリン神経が介在神経として存在している.本年はアセチルコリンの放出も測定できるようにし,ドーパミンの作用薬について検討したところ, D2拮抗薬がアセチルコリンの放出を促進することが分った.神経ペプチドの内では,コレシストキニンの量およびmRNA量をラットの生後発達に伴った変化について検討した.線条体にはコレシストキニンの神経終末のみが来ており,成長に伴ってコレシストキニンペプチドは増加した.しかし, mRNA量は殆ど検出できなかった.今後,コレシストキニン神経とアセチルコリン,ドーパミン神経との相互作用について検討するつもりである.本研究にいて, brain-dialysisという新しい神経科学的技術を導入し,神経活動の動的研究を行った.更に神経ペプチドのうち,コレシストキニンの生後発達に伴う遺伝子量を測定し,その生理的意義の解明を試みた.先ず,無麻酔・無拘束ラット脳線条体においてbrain-dialysisを連続的に行い,透析液中のドーパミンおよびその代謝物DOPAC, HVAの薬物に対する変化を測定した.線条体内にはアセチルコリン神経があり,ドーパミンの神経活動を間接的に調節していると考えられているが,これを証明するため,アセチルコリン受容体RM_1とRM_2の作用薬と拮抗薬を透析液を介して線条件内へ投与し,その時に変化するドーパミン, DOPAC, HVAの量を高速液体クロマトー電気化学検出器により定量した.その結果,ラット脳線条件においては, RM_1はドーパミンの放出に促進的に作用し, RM_2は抑制的に作用していることを明らかにした.また,アセチルコリン受容体のもう一種であるニコチン性受容体は直接的にドーパミンの放出を促進していることも明らかにした.一方,線条体にはアセチルコリン神経が介在神経として存在している.本年はアセチルコリンの放出も測定できるようにし,ドーパミンの作用薬について検討したところ, D2拮抗薬がアセチルコリンの放出を促進することが分った.神経ペプチドの内では,コレシストキニンの量およびmRNA量をラットの生後発達に伴った変化について検討した.線条体にはコレシストキニンの神経終末のみが来ており,成長に伴ってコレシストキニンペプチドは増加した.しかし, mRNA量は殆ど検出できなかった.今後,コレシストキニン神経とアセチルコリン,ドーパミン神経との相互作用について検討するつもりである.
歯周病の病状に反映するバイオマーカーに関する研究

本研究の目的は、ラット歯周病モデルを用いて歯周病の病態を反映し全身の健康に影響を与え得る血液中のmiRNAを特定することである。平成28年度では、8週齢Wister雄性ラット歯周病群(上顎第二臼歯への絹糸巻きつけによる歯周病惹起)と対照群に分けた(実験期間28日)。組織学的分析の結果、歯周病群では炎症性細胞浸潤および歯槽骨吸収を認めた。血液中のmiRNAをマイクロアレイによる網羅的解析を行ったところ、歯周病群は対照群より、3つのmiRNAにおいて2倍以上の発現を認め、22のmiRNAにおいて0.5倍以下の発現となった。平成29年度では、上記のmiRNAのうち、4のmiRNAに絞って逆転写PCR法を実施した。miR-376-3pの発現において、歯周病群が対照群より有意に高くなり、血液中のmiR-376b-3pが歯周病のバイオマーカーとなり得ることが確認された。肝臓病理組織像では歯周病群において僅かに肝細胞の変性および炎症性細胞の浸潤を認めた。本研究の目的は、ラット歯周病モデルを用いて歯周病の病態を反映する血液中のmicroRNAを特定することである。8週齢Wister雄性ラット16匹を歯周病群と対照群に分け、比較した。歯周病群には吸入麻酔下で上顎第二臼歯の歯肉縁上に絹糸を巻き、歯周病を惹起させた。対照群には歯周病群と同様に麻酔のみをかけた。28日間の実験期間の後、血液、歯周組織、肝臓、腎臓を採取した。肝臓と腎臓は、来年度の研究に備えて凍結保存した。歯周組織については、脱灰後、組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的検討を行った。その結果、歯周病群では炎症性細胞浸潤を認めたのに対し、対照群では明らかな変化を認めなかった。また、セメントーエナメル境と歯槽骨頂までの距離において、歯周病群は対照群より大きかった。逆転写リアルタイムPCRの解析に時間を要しており、研究の進捗状況はやや遅れている。本研究の目的は、ラット歯周病モデルを用いて歯周病の病態を反映する血液中のmicroRNA (miRNA)を特定することである。前年度実施した歯周病群と対照群のラットの血液におけるtotal RNAのマイクロアレイの結果、rno-miR-207、rno-miR-338-5p、rno-miR-674-5pにおいて、歯周病群は対照群より2倍以上の発現を認めた。肝臓の病理組織像において、歯周病群は対照群と比べ、僅かに肝細胞の変性および炎症性細胞の浸潤を認めた。一方で、腎臓においては両群間で差を認めなかった。これらの結果は歯周炎が肝臓の初期病変を誘発する可能性を示唆している。次年度ではこれらのmiRNAが歯周病と全身の健康との間のコミュニケーションの媒介として、どのような役割を果たすのかを解明するとともに、阻害薬の歯周病に対する影響に関する検討も併せて行う。逆転写リアルタイムPCRの解析に時間を要したため、研究の進捗状況はやや遅れている。マイクロアレイで違いを認めたmicroRNAについて逆転写Real-timePCRを行う。肝臓と腎臓の組織標本を作製し、病理観察を行う。肝臓と腎臓からmRNAを抽出し、PCRで増幅させマイクロアレイ解析を行う。血液と肝臓、腎臓のmiRNAのペアリング解析を行い、microRNAが歯周病と全身の健康との間のコミュニケーションの媒介として、どのような役割を果たす歯周病ラットに対する影響を検討する。本研究に使用する物品が、計上した予算よりも安価で入手することができた。次年度使用額が生じた理由は逆転謝PCRに必要とされるプライマーが想定よりも安く手に入ったためである。使用計画としては逆転謝PCRにおいて、ディプリケイトの予定だったものを、トリプリケイトにすることで再現性と精度を向上させる。次年度の解析項目を増やす予定であり、次年度使用額は請求した助成金と合わせて使用する。
FGF23がくる病マウスの硬組織形成細胞におけるリン輸送体の発現異常に及ぼす影響

X連鎖性低リン血症くる病(XLH)の疾患モデル動物であるHypマウスの歯におけるFGF23の分布を検討した結果、エナメル芽細胞および象牙芽細胞に発現していることがわかった。さらに, Hypマウスの歯では、野生型マウスと比較してFGF23 mRNAの発現量が有意に多かった。XLHの原因遺伝子であるPHEXは,主に骨芽細胞や象牙芽細胞に発現し, FGF23の発現を負に制御すると考えられている。今回の結果からFGF 23は骨ばかりでなく歯にも発現しており,さらに, Hypマウスにおいて過剰に発現することは上記の仮説を裏付けている。X連鎖性低リン血症くる病(XLH)は、発育遅延、低リン血症、骨形成不全を主症状とする遺伝性疾患であり、歯科的には特徴的な歯の石灰化異常を有することが知られている。XLHの疾患モデル動物であるHypマウスも同様に発育遅延、血清リン濃度の低下、および骨や歯の石灰化異常を有することが知られている。Fibroblastgrowth factor(FGF)23は、腫瘍性骨軟化症の腫瘍組織から最初に同定され、また、常染色体性低リン血症性くる病の原因遺伝子であることが知られている。さらに、XLHやHypマウスの血清におけるFGF23の濃度が高いことことが報告されており,これらのことから,FGF23はリンの代謝や硬組織の石灰化に重要な役割を有していることが示唆されているもののその詳細は不明である。本研究では、FGF23がリンの代謝異常を有するHypマウスの硬組織石灰化異常にどのように関連しているのかを検討した。まず,歯におけるFGF23の分布を,RT-PCR法およびin situ hybridiation法を用いて検討した結果、前エナメル芽細胞,エナメル芽細胞および象牙芽細胞にFGF23 mRNAが発現していることがわかった。さらに,定量的RT-PCR反応の結果、Hypマウスの歯では、野生型マウスと比較してFGF23 mRNAの発現量が有意に多かった。XLHの原因遺伝子であるPHEXは,主に骨芽細胞や象牙芽細胞に発現し,FGF 23の発現を負に制御すると考えられている。今回示したように,FGF 23が骨ばかりでなく歯にも発現しており,さらに,Hypマウスにおいて過剰に発現することは,このことを裏付けている。今後はFGF23の発現異常がHypマウスの歯の形成異常にどのように関わっているのかを検討する。X連鎖性低リン血症くる病(XLH)は、発育遅延、低リン血症、骨形成不全を主症状とする遺伝性疾患であり、歯科的には特徴的な歯の石灰化異常を有する。Fibroblast growthfactor (FGF)23は、常染色体性低リン血症性くる病の原因遺伝子で,さらに、XLHやその疾患モデル動物であるHypマウスの血清におけるFGF23の濃度が高いことなどから,リンの代謝や硬組織の石灰化に重要な役割を有することが示唆されているもののその詳細は不明である。まず,歯におけるFGF23の分布を,RT-PCR法およびin situ hybridiation法を用いて検討した結果、前エナメル芽細胞,エナメル芽細胞および象牙芽細胞にFGF23mRNAが発現していることがわかった。さらに,定量的RT-PCR反応の結果、Hypマウスの歯では、野生型マウスと比較してFGF23mRNAの発現量が有意に多かった。一方,小腸などで無機リンの細胞内への輸送に重要な役割を有している2型ナトリウムーリン酸共輸送体(Npt2b)が歯形成時にどのように分布しているかを調べた。その結果,エナメル芽細胞および幼若な象牙芽細胞にNpt2bが分布する事がわかった。また,歯根形成期においては,幼若な象牙芽細胞以外では一部の歯根膜線維芽細胞がNpt2b陽性であった。XLHの原因遺伝子であるPHEXは,主に骨芽細胞や象牙芽細胞に発現し,FGF23の発現を負に制御すると考えられている。今回示したように,FGF23が骨ばかりでなく歯にも発現しており,さらに,Hypマウスにおいて過剰に発現することは,このことを裏付けている。また,Npt2bは小腸などにおいてリンの吸収を担っていることが報告されており,FGF23との関連も考察されているが,今回の研究において,硬組織形成細胞でない線維芽細胞などに発現していたことから,歯の形成過程においてNpt2bは石灰化と関連しない可能性が示唆された。
金属・酸化物界面における新物質相の生成とその触媒化学

1.担持された貴金属複合酸化物の合成と固体化学的挙動2.触媒作用における貴金属複合酸化物の特徴これらのすべての複合酸化物系について、その還元・酸化の固体化学的挙動を検討した。複合酸化物の種類により分解温度が2700°Cの広範囲に分布するが、基本形にはRhNbO_4やRhVO_4の系で確立したSMSI挙動と類似の性質を示し、金属・酸化物相互作用におけるデコレーションモデルの一般性を更に広い範囲に拡張することが出来た。種々の触媒反応におけるSMSI挙動を検討する中で、幾何学的効果による活性抑制効果のほかに、電子的効果による顕著な活性促進の例(エチレンのヒドロホルミル化)を見出した。また、RhNbO_4のSMSIにおける脱水素活性の促進、MnRh_2O_4およびMoRh_2O_6等の複合酸化物自体が持つ著しい水素化分解活性など、多くの興味深い事実が得られた。3.メタンの接触部分酸化による合成ガスの生成CH_4接触部分酸化による合成ガス生成反応については、複合酸化物触媒から離れて、通常の担持金属触媒の金属間比較、担体効果および反応メカニズムの解明および反応の低温化の研究を重点的に行った。CO/H_2の生成が、完全酸化を経たのちH_2OおよびCO_2による改質反応として進行すること、CO_2の活性化を通して担体効果が顕著であること、2段パルス反応による低温化の可能性など、興味深いいくつかの新しい事実を明らかにした。1.<担持された貴金属複合酸化物の合成>___ー:Rh/SiO_2をベ-スとして、これにNb_2O_5,V_2O_5,MnO_2,MoO_3等の種々酸化物を添加した系について、担体SiO_2の種類、含浸の方法・順序、焼成条件等を詳しく検討した結果、ほぼ単一相の担持された超微粒子として、RhNbO_4,RhVO_4,MnRh_2O_4,MoRh_2O_6,WRh_2O_6,CuRh_2O_4の貴金属複合酸化物を合成することが出来た。2.<貴金属複合酸化物の固体化学的挙動など>___ー:還元・酸化による上記複合酸化物の固体化学的挙動を、X線回折、吸着、昇温脱離、昇温還元等の手法によって検討し、各種複合酸化物の安定性を確定した。とくに、RhNbO_4とRhVO_4について詳細な検討を行った結果、分解時における金属の再分散など、固体化学的に興味深い知見を得るとともに、モデル触媒に対する表面科学的研究とは異なる方法でSMSIにおけるデコレ-ションモデルをさらに明確に確立することが出来た。エタン水素化分解、エチレン水素化反応の挙動においても、デコレ-ションモデルと合致する結果を得た。3.<触媒作用における貴金属複合酸化物の挙動>___ー:RhNbO_4等の貴金属複合酸化物について、種々の触媒作用を検討した。複合酸化物自体の高い水素化分解活性、水素化分解と脱水素の著しい選択性の変化、SMSIにおける高い酸化活性など、多くの興味深い事実が得られた。また、複合酸化物の還元分解後に、CH_4の部分酸化により合成ガス(CO/H_2)を選択的に与える反応を発見した。触媒比較や反応メカニズムのさらに詳細な追究の過程で、これは必ずしも複合酸化物の特徴ではなく、金属自体の性質であることが明らかになり、現在、鋭意検討中である。1.担持された貴金属複合酸化物の合成2.貴金属複合酸化物の固体化学的挙動RhNbO_4とRhVO_4の系で、還元・酸化の固体化学的挙動を詳細に調べ、デコレ-ションモデルとの対応をすでに明らかにしていたが、その他のすべての複合酸化物系についても、その還元・酸化の挙動を検討した。複合酸化物の種類により分解温度が2300°Cの範囲で相違するが、基本的にはRhNbO_4やRhVO_4の系と類似の挙動を示した。MoRh_2O_6は、還元後に合金を生成する点で特異的であった。3.触媒作用における貴金属複合酸化物の特徴

シクロヘキサンの脱水素・水素化分解反応、アンモニア合成反応を中心に、各複合酸化物の触媒作用およびそのSMSI挙動を検討した。RhNbO_4のSMSIにおける脱水素活性の促進、MnRh_2O_4およびMoRh_2O_6等の複合酸化物自体が持つ著しい水素化分解活性など、多くの興味深い事実が得られた。CH_4部分酸化による合成ガス生成反応については、複合酸化物触媒から離れて、通常の担持金属触媒の金属間比較、担体効果および反応メカニズムの解明の方向に研究を展開している。1.担持された貴金属複合酸化物の合成と触媒化学挙動SiO_2に担持された貴金属複合酸化物の単一相超微粒子の合成についてRhに変えてNiおよびFe等の系にも検討の範囲を拡大し、化学混合法による合成の試みを重点的に行った結果、NiA1_2O_4,NiTiO_3,NiTa_2O_6,Ni_3V_2O_3,NiNb_2O_6,FeNbO_4,FeA1_2O_4,AlNbO_4など、多数の担持貴金属複合酸化物の合成法を確立した。また、これらのすべての複合酸化物系について、その還元・酸化の固体化学的挙動を検討した。複合酸化物の種類により分解温度が2700°Cの広範囲に分布するが、基本的にはRhnbO_4やRhVO_4の系で確立したSMSI挙動と類似の性質を示し、金属・酸化物相互作用の一般性を更に広い範囲に拡張することが出来た。2.触媒作用における貴金属複合酸化物の特徴シクロヘキサンの脱水素・水素化分解反応、アンモニア合成反応を中心に、各複合酸化物の触媒作用およびそのSMSI挙動を検討した結果、RhNbO_4のSMSIにおける脱水素活性の促進、MnRh_2O_4およびMoRh_2O_8等の複合酸化物自体が持つ著しい水素化分解活性など、多くの興味深い事実が得られた。3.メタンの接触部分酸化による合成ガスの生成CH_4接触部分酸化による合成ガス生成反応については、複合酸化物触媒から離れて、通常の担持金属触媒の金属間比較、担体効果および反応メカニズムの解明および反応の低温化の研究を重点的に行った。CO/H_2の生成が、完全酸化を経たのちH_2OおよびCO_2による改質反応として進行すること、CO_2の活性化を通して担体効果が顕著であること、2段パルス反応による低温化の可能性など、興味深いいくつかの新しい事実を明らかにした。
知覚順応に果たすボディ・イメージの役割:その視覚的性質

1992年8月に、眼上鏡式上下反転視実験を行った。被験者は本研究者自身であり、上下反転鏡着用期間は14日間であった。着用期間中、定期的に11種類のテストを行い、別に内観報告データの収集も行った。本実験の最も重要な目的は、2年前の直角プリズム式上下反転視実験と比較するところにあった。同じく上下反転視状況ではあっても、直角プリズム式めがねの場合には直前方方向しか視野内に捕らえられないため、たとえうつむいて足元を見ようとしても、自己身体の多くは視野内に入ってこない。しかも、このような姿勢を維持しながら日常生活を遂行することはできない。それに対し、今回用いた眼上鏡式上下反転鏡では、視方向が足元付近であるため、自然な姿勢のまま容易に自らの身体を視野内に捕らえることができる。本実験を行うに先立っての仮説は、上下反転視状況への知覚的順応が進行するためには自らの身体が上下反転視野内に適切に定位される必要がある、というものであった。もし、この仮説が正しいなら、自らの身体像を容易に視野内に捕らえることのできる今回の眼上鏡の方がプリズム式のものより上下変換された視野内での新しいボディ・イメージの構築が容易に進むと考えられた。実験結果は次のごとくであった。今回の眼上鏡では、自己身体像から外界の枠組み的視覚像(床や壁)までの連続感、すなわち斉合性が容易に得られた。しかし、そのことが直ちに見える位置に自己身体を知覚するという合一感を生むことにならなかった。個々の視対象は、床や壁という視覚的枠組みとの関係において正立して知覚されるところにまでは順応は進む。しかし、感じられる自己との関係における正立感までは至らない。これはひとえに、見える自己と感じられる自己との合一が達成されないゆえであることを、本研究を通して明らかにした。
人工合成ワクチンの創製を目指した簡便な糖鎖合成法の開発とその実践

グリコシルカルバメートとグリコシルカルバモチオエートを用いて、ワンポットのグリコシル化を行ったところ温度を変えるだけで、αα選択的に三糖を合成することが出来、簡便に糖鎖を構築する方法を見出した。グルコース、ガラクトース、マンノースで本方法が適用可能であることを明らかにすることができた。今後はこの方法を応用させて人工合成ワクチン合成に適用することを検討したい。本年度はカルバメートの特徴を生かしつつorthogonal glycosylationに適用出来る新たなグリコシルドナーを開発し、簡便に糖鎖を合成できる方法論を確立することを目的に本研究を行った。Orthogonal glycosylationとは、保護基の脱着を行うことなしに条件を変えるだけで簡便に糖鎖を構築する方法論である。この方法を我々の方法に適用するためには、カルバメートとは異なる反応性を示す新たなグリコシルドナーの開発が必要である。そこで筆者は、硫黄をカルバメートに導入することで反応性の差が生じ、これらのグリコシルドナーの組み合わせがorthogonal glycosylationに適用できると考えた。既知であり簡便に合成できるトリクロロアセチルイソチオシアネートを用いてグリコシルドナーであるカルバモチオエートを合成した。これを用いてグリコシル化の検討を行ったところ、低温では反応が進行せず温度を室温まで上昇させてはじめて反応が進行することを見出した。グリコシル化におけるカルバメートとカルバモチオエートの反応性の違いを利用し、one pot orthogonal glycosylationの検討を行った。まず、低温で1段階目のグリコシル化が終了するのを確認した後に、温度を40°Cに上昇させ2段階目のグリコシル化を行った。反応はαα選択的に進行し、温度を変えるだけで簡便に三糖が得られた。また、カルバメートは、one potで脱水的にグリコシル化出来る利点を有することから、この方法がone pot orthogonal glycosylarionにも適用できると考え検討を行い、one potで簡便に三糖を合成することが出来た。【総括】(1)新たなグリコシルドナーとして、カルバメートに硫黄を導入したカルバモチオエートを合成することが出来た。また、そのグリコシル化においても良好な結果が得られた。(2)カルバメートとカルバモチオエートを用いて、グリコシル化を行ったところ温度を変えるだけで、αα選択的に三糖を合成することが出来、簡便に糖鎖を構築する方法を見出した。次年度はこの方法を応用させて他の糖に適用し、研究の拡大を行いたい。本年度は前年度確立したグリコシルカルバメートとグリコシルカルバモチオエートの組み合わせによるorthogonal glycosylationのさらなる検討と適用範囲の拡大を目的に検討を行った。【結果】(1)6-OHグリコシルドナー6の合成法の確立これまで6はTBS基を用いて合成を行っていたが、その脱保護についてはカルバモチオエートの脱離も同時に起こり、不十分なものであった。そこで筆者は新たにPMB基を用いることで、この問題を改善することができた。(2)様々な糖を用いた検討上記の6-OHグリコシルドナーの合成法を用いて、グルコースに加え、ガラクトース、マンノースを出発原料に個々のビルディングブロックを合成した。さらにそれらをorthogonal glycosylationの条件に付したところガラクトース、マンノース両方とも本反応が適用可能であることを明らかにした。特にマンノースでは良好な反応性を示した。【総括】グリコシルカルバメートとグリコシルカルバモチオエートを用いて、グリコシル化を行ったところ温度を変えるだけで、αα選択的に三糖を合成することが出来、簡便に糖鎖を構築する方法を見出し、グルコース、ガラクトース、マンノースで本方法が適用可能であることを明らかにすることができた。
安全で効果的な術中運動誘発電位刺激電極および刺激方法の開発

本研究は脳神経外科手術における術中運動誘発電位(MEP)測定の安全で効率的な刺激電極および刺激方法の確立を目的とする。本研究ではラット脳の経皮質MEP刺激による脳障害モデルを確立し、刺激の強度、時間、回数、頻度を変化させ、刺激後の脳の障害との関連を検討した。脳障害は与えた総電力量(Q=I2Rt x刺激回数)に比例するものの、総電力量が同じ場合は、刺激強度と刺激回数は刺激時間に比べて障害をより強く起こすことを発見した。さらに、皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相性刺激でMEPの誘発閾値を比較した。単相刺激よりも二相性刺激でMEP閾値が高い傾向であることを発見し、臨床応用の端緒が得られた。現在、脳表刺激においては脳表脳波記録用プラチナ電極による刺激が多用されているが、医療機器として保険認定された電極はない。また、刺激方法についての注意点や基準がなく、時にけいれんなどの合併症報告が散見される。これは誤った条件でのMEP電気刺激が、脳へダメージを与えることが正しく認識されていないことによる。したがって、MEP刺激による脳への影響を詳細に検討し、安全なMEP測定法を開発・確立することはより安全な脳神経外科手術に極めて重要である。本研究者は(1)ラット脳の経皮質MEP刺激による脳障害モデルを完成させた。(2)刺激の強度、時間、回数、頻度の4つのパラメータを変化させ、刺激後の脳のダメージとの関連を検討した。この結果、脳のダメージは与えた総電力量(Q=I2Rt x刺激回数)に比例するものの、総電力量が同じ場合は、刺激強度と刺激回数は刺激時間に比べて障害をより強く惹起することを発見した。(3)この障害はフィブリン糊を利用することで減少することを実証した。(4)さらに、このラットを用いた電気刺激による脳障害モデルを用いて、皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相刺激でMEPの誘発閾値を比較した。単相刺激よりも二相性刺激でMEP閾値が高い傾向であることを発見した。これまで術中MEPの利用により、手術操作による運動麻痺を予測し手術方法を変更することで、術後の運動麻痺の回避が可能となり、多くの施設で使用され始めている。MEP刺激による脳への影響を詳細に検討し、安全なMEP測定法を開発・確立することはより安全な脳神経外科手術に極めて重要である。刺激の強度、時間、回数、頻度の4つのパラメータを変化させ、刺激後の脳のダメージとの関連を検討した。この結果、脳のダメージは与えた総電力量(Q=I2Rt x刺激回数)に比例するものの、総電力量が同じ場合は、刺激強度と刺激回数は刺激時間に比べて障害をより強く起こすことを発見した。(2)この障害はフィブリン糊を利用することで減少することを実証した。さらに、このラットを用いた電気刺激による脳障害モデルを用いて、皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相刺激でMEPの誘発閾値を比較した。これまで術中MEPの利用により、手術操作による運動麻痺を予測し、手術方法を変更することで、術後の運動麻痺の回避が可能で、多くの施設で使用されている。MEP刺激による脳への影響を詳細に検討し、安全なMEP測定法を担保することは、より安全な脳神経外科手術に極めて重要である。

本研究者は(1)ラット脳の経皮質MEP刺激による脳障害モデルを完成させた。刺激の強度、時間、回数、頻度の4つのパラメータを変化させ、刺激後の脳のダメージとの関連を検討した。この結果、脳のダメージは与えた総電力量(Q=I2Rt x刺激回数)に比例するものの、総電力量が同じ場合は、刺激強度と刺激回数は刺激時間に比べて障害をより強く起こすことを発見した。(2)この障害はフィブリン糊を利用することで減少することを実証した。さらに、このラットを用いた電気刺激による脳障害モデルを用いて、皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相性刺激でMEPの誘発閾値を比較した。単相刺激よりも二相性刺激でMEP閾値が高い傾向であることを発見した。脳神経外科学ラット実験モデルを用いて(A)皮質刺激における刺激種類を検討した:単極刺激と双極刺激anode皮質刺激で誘発される運動閾値と皮質に生じる脳障害を観察し、有効で安全な刺激条件(単極or双極)、刺激の強度、時間、回数、頻度の5つのパラメータを変化させて解析した。(B)単相刺激と二相性刺激の検討:上記(A)にて見出した条件下で、さらに皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相性刺激では、どちらが有効でかつ安全をか解析した。刺激を2相性に行うと、単相刺激と同じ電気量であるが、単相刺激よりも二相性刺激でMEP閾値が高い傾向であることを発見した。(C)上記で得られた結果に基づき、臨床例でのデータを蓄積・解析中である。ラット実験モデルを用いて(A)皮質刺激における刺激種類を検討した:単極刺激と双極刺激anode皮質刺激で誘発される運動閾値と皮質に生じる脳障害を観察し、有効で安全な刺激条件(単極or双極)、刺激の強度、時間、回数、頻度の5つのパラメータを変化させて解析した。(B)単相刺激と二相性刺激の検討:上記(A)にて見出した条件下で、さらに皮質刺激の種類を変えて単相刺激と二相性刺激では、どちらが有効でかつ安全をかを見出す。(1)ラットを用いた脳表刺激モデルでは、MEP測定の際に脳表刺を二相性刺激で行うと、単相刺激に比べ運動閾値は高い傾向であることが明らかになった。このモデルを使用し、脳表の障害の程度の検証を進め、どのようなMEP刺激が安全でかつ効率的な術中MEPモニタリング法であるかを検証する予定である。必要に応じて、ウサギなどの中動物を使用し検討する。(2)(1)の結果に基づき臨床症例を蓄積しデータを整理、発表する。必要に応じて、ウサギ、犬などの中動物を使用し検討する。当初計画で見込んだよりも安価に研究が完了したため次年度使用額が生じた。前年度未使用額と平成26年度経費を合わせた研究費を実験用動物、試薬、電極試作のための物品費、そのほか、成果発表旅費、プレパラート作成、論文投稿費用として使用する予定である。
システイン結合金微粒子の蛍光特性に及ぼす光学純度の影響の解明と不斉識別材料の開発

研究2年目にあたる本年度は,「システインの光学純度が金ナノクラスターの蛍光特性に影響するメカニズムの解明」について研究を行った。先ず,システインの類縁体で光学活性を有するホモシステイン,N-アセチルシステイン,システイニルグリシン,グルタチオンを用いて検討した。特に,システインとはメチレン基一つだけしか構造が違わないホモシステインについては詳細に比較検討した。その結果,これらのシステイン類縁体は370 nmに極大波長を持つ吸収スペクトルを与えず,システインの特異性を確認した。ついで,D,Lーシステインの混合比を変えることにより光学純度を調整し,得られる金ナノクラスターの蛍光特性について検討した。興味深いことに,ラセミ状態(D:L=1:1)のとき,蛍光強度は最も小さくなった。このとき,溶液の濁りは最も少なかった。そこで,D:L比や溶液の熟成時間などを変化させ溶液の濁りと蛍光強度の関係を検討したところ,溶液の濁りと蛍光強度には高い相関関係があることを見出した。先行研究の調査結果と上記の結果を比較すると,金ナノクラスターとチオール化合物とが形成する蛍光性化合物は,ポリマー状の水に不溶な化合物であるものと推測される。ラセミ状態において,蛍光性ポリマーの形成が最も低かったのは,ラセミ状態ではポリマー間の水素結合が弱いため,ポリマーの集合体を形成しにくかったためであると考えられる。29年度と今年度の進捗状況を研究計画と比較すると,蛍光性発現に関するメカニズムについては,概ね計画通りに進んでいる。しかしながら,蛍光性発現に関するメカニズムが当初想定したような金ナノクラスターの最表面に結合したチオール化合物によるではなく,金-チオール結合からなるポリマー状物質であることから,分子軌道計算についてはモデルに大幅な修正を余儀なくされている。この点については,若干の遅れは否めない。【今後の研究の推進方策】1当初計画通り,「光学活性物質の不斉識別を蛍光特性の変化として出力するナノ材料の開発」を行なうともに,2モデルに大幅な修正を行った後、分子軌道計算を行う。1については,これまで得られた知見を基に,不斉識別を蛍光特性に反映させる新たな系を構築する必要がある。それを進めるとともに,材料化を目指して,ゾルゲル反応を用いて粒子を作成する。異なる二種類の金ソース(非発光型金ナノクラスターおよび塩化金酸)とシステインとを反応させて,システイン結合蛍光性金ナノクラスターを再現性よく調製する方法を確立した。蛍光スペクトルおよび電子顕微鏡像から,得られたシステイン結合蛍光性金ナノクラスターは金ソースが違っていても同一なものが得られていることが明らかとなった。非発光型金ナノクラスターは塩化金酸から調製していることから、得られた知見に基づいて,以後の検討は金ソースとして塩化金酸を用いることにした。これにより,研究が非常にやりやすくなった。システイン結合蛍光性金ナノクラスターは,370 nm付近に吸収バンドを示すことを見出した。この吸収バンドは,検討したチオール化合物の中ではシステインを用いたときのみ現れることを見出した。この吸収バンドに及ぼすシステインの光学純度の影響を吸光光度法により検討した。その結果,光学純度の低下に伴って,370 nmの吸収バンドが低下した。この結果は,この吸収バンドは単に金とシステインのチオール基との結合で生じているわけではないことを見出した。その一方,溶液全体の旋光度はシステインの光学純度が低下すると(L体:D体=8:2まで)一旦急激に増大し,その後,また低下し始め,ラセミ条件(L体:D体=5:5)において0となった。システイン結合蛍光性金ナノクラスターの蛍光スペクトルに及ぼすシステインの光学純度の影響を蛍光光度法により検討したところ,吸収スペクトルの変化と同様に,光学純度の低下に伴って蛍光スペクトルが低下することを明らかにした。システイン結合蛍光性金ナノクラスターは,370 nm付近に吸収バンドを示す。システイン結合蛍光性金ナノクラスターの蛍光スペクトルに及ぼすシステインの光学純度の影響を蛍光光度法により検討したところ,吸収スペクトルの変化と同様に,光学純度の低下に伴って蛍光スペクトルが低下した。

特に,システインとはメチレン基一つだけしか構造が違わないホモシステインについては詳細に比較検討した。その結果,これらのシステイン類縁体は370 nmに極大波長を持つ吸収スペクトルを与えず,システインの特異性を確認した。ついで,D,Lーシステインの混合比を変えることにより光学純度を調整し,得られる金ナノクラスターの蛍光特性について検討した。興味深いことに,ラセミ状態(D:L=1:1)のとき,蛍光強度は最も小さくなった。このとき,溶液の濁りは最も少なかった。そこで,D:L比や溶液の熟成時間などを変化させ溶液の濁りと蛍光強度の関係を検討したところ,溶液の濁りと蛍光強度には高い相関関係があることを見出した。先行研究の調査結果と上記の結果を比較すると,金ナノクラスターとチオール化合物とが形成する蛍光性化合物は,ポリマー状の水に不溶な化合物であるものと推測される。ラセミ状態において,蛍光性ポリマーの形成が最も低かったのは,ラセミ状態ではポリマー間の水素結合が弱いため,ポリマーの集合体を形成しにくかったためであると考えられる。29年度と今年度の進捗状況を研究計画と比較すると,蛍光性発現に関するメカニズムについては,概ね計画通りに進んでいる。しかしながら,蛍光性発現に関するメカニズムが当初想定したような金ナノクラスターの最表面に結合したチオール化合物によるではなく,金-チオール結合からなるポリマー状物質であることから,分子軌道計算についてはモデルに大幅な修正を余儀なくされている。この点については,若干の遅れは否めない。蛍光性金ナノクラスターの集合状態と蛍光強度,吸光度および旋光度との関係をシステインのDL比の関数として評価し,集合状態と蛍光強度,吸光度および旋光度との関係を明確にする。ここでは,蛍光の凝集誘起増大(Aggregation-induce enhancement)を研究の指標とし,集合状態と蛍光強度,吸光度および旋光度との関係を明らかにする。特に,粒子の配列状態にシステインのDL比がどのように影響し,結果として光学特性(蛍光スペクトル,吸収スペクトル,CDスペクトル)に反映されるかをナノレベルで解き明かす。また,システイン以外のチオール化合物(特に,チオール基を有するペプチド)についても検討する。ここでは,その候補として,ホモシステイン,システイニルグリシン,グルタミルシステインおよびグルタチオンを検討する予定である。この中でも特に,ホモシステインはシステインに比べメチレン鎖1つ分しか違わない,L-体とラセミ体が入手できることから,上述した蛍光の凝集誘起増大(Aggregation-induce enhancement)に基づく集合状態と蛍光強度,吸光度および旋光度との関係に及ぼすわずかな分子構造の違い(メチレン鎖)について明らかにできるものと期待される。更に,その知見に基づいて,凝集を制御することにより,吸光特性,蛍光特性を外部刺激でコントロールする蛍光性金ナノクラスターの創製を試みる。このために,外部刺激に応答して,可逆的に凝集分散する刺激応答性高分子の導入について検討する。【今後の研究の推進方策】
極薄表界面層を有する高安定性銀薄膜の作製

銀は全金属で最も低抵抗率であるという特徴を有するが、高温で銀薄膜は凝集しやすく、抵抗率の増大を引き起こすという問題がある。銀の優れた特性を活かすためには、高安定性銀薄膜の作製が重要である。本課題において、我々は銀薄膜の凝集抑制のために適した表界面層物質を探索した。その結果、表面層物質には、高い凝集エネルギーを有してそれ自体が凝集し難い事、または、ギブスの酸化物形成自由エネルギーが大きく、酸化物形成し易い事、銀とほとんど固溶しないという性質が求められるという知見が得られた。一方、界面層としては、酸化物基板との密着性向上のために、酸化物形成し易い事、銀原子との原子サイズのマッチングにより銀薄膜の最密面を高配向させ得る物質が望ましいことが判明した。1.銀薄膜の安定化を目的とした、極薄表界面層物質の探索を行った。既に有効性を確認済みである、極薄Al層積層結果を基に、同じく酸化物形成エネルギーが大きい等の類似点があるTiに着目し、表面、界面、及びその両方を積層した銀薄膜構造の作製し、その安定性を調査した。また、比較のため、スパッタリング法でTi添加Ag薄膜を作製し、その安定性を調査した。その結果、表面、界面の両方にTi層を導入した構造が最も安定で、且つ、電気抵抗率も比較的低い値を維持することができた。各層の厚さについても最適化を行った。Ti添加Ag薄膜と比較した結果、抵抗率は積層構造の試料の方がより低く抑えられることが判明し、本法の優越性が確認できた。2.薄膜構造安定化に効果がある構造における、界面密着性について、超薄膜スクラッチ試験機を用いて、調査した。界面に極薄Ti層を導入した銀薄膜(厚さ60nm)は、導入していない試料に比べて、臨界剥離荷重値が4倍も増大するという結果が得られた。この事から、銀とSiO2基板との間に界面層を挿入することによる密着性の向上は、膜構造の安定化(凝集抑制効果)に大きく寄与するものとの知見が得られた。現在、継続して他の物質を界面層に導入した場合の影響を検討中である。熱的に高安定な銀薄膜作製のために有用な極薄表界面層物質の探索を行った。前年度、Tiの有用性を確認したので、今年度は、Tiと同様に安定な酸化物を容易に形成する特徴を有する金属群からNbと、貴金属群からPdを選択し、これらを用いて表面、界面、その両方にナノレイヤーを積層させた構造を作製し、熱処理前後における諸特性を調査した。'その結果、Nbでは、表面や界面に積層させることにより、熱的安定化が図れ、また、Tiと比較すると、Nbのバルクの抵抗率が低いことから、表面層として用いた場合の抵抗率の増大が抑制された。結果として、Nbの有用性が確認された。また、凝集抑制メカニズムの考察のために、積層構造(Nb/Ag)をスパッタ装置内でポストアニールし、XPSにより表面Nb層の化学状態を調査した結果、表面Nb層がメタル状態であっても、酸化物状態であっても、凝集抑制に効果があるという結果が得られた。したがって、酸化物形成の容易さが表界面層物質の必要条件ではないと考えられ、これは、表界面層物質の選択上、新規な知見である。一方、Pdを表界面層として用いた積層構造では、高い凝集抑制効果は認められなかった。加えて、PdがAgに全率固溶するという特徴から、熱処理後はナノレイヤーが消失して、Ag層に固溶し、結果的に抵抗率を大きく増大させることが判明し、固溶する物質は表界面層には不適であることが確認された。また、界面層の存在により、その上に成膜したAg膜の結晶配向性が向上する場合があることも判明した。Ag膜は多結晶膜ではあるが、Ti、Nb、Pdの順に配向性が優れていた事から、エピタキシャル成長の際の格子ミスマッチと同様の考察が成立すると考えられる。研究最終年度は、Ni, W, Zrの極薄金属表界面層を新たに追加して、高安定性銀薄膜の実現に関する実験を行った。また、表面層、界面層の役割を考察し、それらに適した金属について、総括した。当該年度の実験結果として、Niの表界面層は、ある程度の効果が認められたものの、前年度検討したNb等に比べて劣っている事が判明した。一方、W, Zr表面層を用いた場合は、高安定性銀薄膜が得られることが判明した。最終的な結論として、表面層物質には、まず、凝集エネルギーが大きく、加熱してもそれ自身が高安定であることが重要である事が判明した。W,Nb等がこれに該当する。

一方、同エネルギーが中程度の場合は、酸化物を形成しやすいことが重要であり、Tiがこれに該当することが判明した。Ni等のように、どちらも大きくない場合は、高安定化を図るための表面層としての役割は十分ではなかった。また、銀と大きく固溶するPdも、加熱により、表面層が消失することから、不適切であることを確認した。一方、界面層としては、固溶しない事に加えて、酸化物基板と銀薄膜の密着性を向上させる上で、酸化物形成能が高い物質が適していることが確認できた。更に、TiやNb等を用いた場合に、銀薄膜が最密面を高配向させて、表面エネルギーを低下させる効果があり、優れた安定性が得られた。この結果から、銀と界面層物質の間の、原子サイズのマッチングも重要であることが判明した。以上の結果から、高安定性銀薄膜作製時の適切な表界面層の選択に関する重要な知見が得られた。当初の予定に沿って、複数の金属群を用いての検討が実行できた。加えて、高安定性のためのメカニズムに関する知見が得られたことは、重要であると考える、24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年においては、酸化が容易ではなく、またAgに固溶しないという特徴を有するNi等を中心に実験を行い、銀薄膜の安定化に有用な表界面層物質に関する総括を行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒト皮膚癌株細胞の増殖・分化に対する各種薬剤の作用

原発性皮膚有棘細胞癌由来株SSCC-1と口腔粘膜原発扁平上皮癌皮膚転移巣由来株SSCC-2の2種類のヒト皮膚癌細胞株をSCIDマウスに腹腔内投与したところ,SSCC-2の方がSSCC-1よりも皮下腫瘤を形成しやすい傾向がみられた。しかしブファリン単独投与,ブファリン・ブレオマイシン併用のいずれにおいても明かな皮下腫瘤形成抑制作用は認められなかった。SSCC-1では細胞集塊から遊離した個細胞のほとんどが孤立性にフラスコヘ再接着し,その後も細胞同士が接合する傾向は乏しがったが,SSCC-2では当初から細胞同士が接合する傾向が強く、塊状にフラスコヘ再接着した。インボルクリンはSSCC-1で強陽性SSCC-2で弱陽性であったが,集塊部分と遊離細胞に差異はなかった。E-カドヘリンの発現はin vivo,in vitroのいずれにおいてもSSCC-2の方が強かった。正常線維芽細胞や各種細胞外マトリックスへの接着性はむしろSSCC-1の方が有意に強かった。一方,インテグリンβ_<1,2,4>の発現はin vivoでは全てSSCC-2の方が強かったが,in vitroではβ_<1,2>でSSCC-1の方が強かった。インテグリンβ_1に対するモノクロナール抗体で処理した癌細胞の線維芽細胞に対する接着性はSSCC-1で減弱した。癌の浸潤転移において,E-カドヘリンの発現が弱い腫瘍の方が原発巣から腫瘍細胞が遊離しやすいと言われている。しかし遊離した後は,脈管内での腫瘍塞栓形成や転移臓器での腫瘤形成の面では,E-カドヘリンの発現が強い細胞の方が細胞同士が接合しやすいため,浸潤転移には有利に働くのではないかと考えた。同一の細胞でもその時期に応じてインテグリンの発現量を変化させていることが示唆された。我々の樹立した、原発性皮膚有棘細胞癌由来株SSCC-1と口腔粘膜原発扁平上皮癌皮膚転移巣由来株SSCC-2の2種類のヒト皮膚癌細胞株を用いて、癌の浸潤転移能と各種薬剤によるその抑制作用について検討した。[in vivo]この両者をSCIDマウスに腹腔内投与したところ,SSCC-2の方がSSCC-1よりも皮下腫瘤を形成しやすい傾向がみられた。しかしブファリン単独投与、ブファリン・ブレオマイシン併用のいずれにおいても明かな皮下腫瘤形成抑制作用は認められなかった。[in vitro]細胞集塊から遊離した個細胞のフラスコへの再接着の形態を比較すると、SSCC-1では,ほとんどの細胞が孤立性にフラスコへ再接着し,その後も再接着した細胞同士が接合する傾向は乏しかったが,SSCC-2では,当初から細胞同士が接合する傾向が強く、細胞が塊状にフラスコへ再接着した。再接着細胞の免疫組織学的検討ではSSCC-1で,集塊部分・遊離細胞ともにE-カドヘリンは一部に弱陽性であったが、SSCC-2では,集塊部分・遊離細胞ともにほとんど全ての細胞でE-カドへリンが強陽性を呈した。インボルクリンは集塊部分・遊離細胞ともにSSCC-1で強陽性、SSCC-2で弱陽性であったが、集塊部分と遊離細胞に差異はなかった。正常線維芽細胞への接着性はSSCC-2の方が有意に強かった。[考案]癌の転移において、E-カドヘリンの発現が弱い腫瘍の方が原発巣から腫瘍細胞が遊離しやすい。しかし遊離した後はE-カドヘリンの発現が強い細胞の方が、細胞同士が接合しやすいため転移には有利に働くのではないかと考えた。細胞の遊離のしやすさと分化度には関連性はなかった。周辺組織(練維芽細胞)との接着性がよい方が転移しやすく、インテグリンの関与(未検索)が示唆された。

しかし遊離した後は,脈管内での腫瘍塞栓形成や転移臓器での腫瘤形成の面では,E-カドヘリンの発現が強い細胞の方が細胞同士が接合しやすいため,浸潤転移には有利に働くのではないかと考えた。同一の細胞でもその時期に応じてインテグリンの発現量を変化させていることが示唆された。