hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポリタイプへテロ構造における2次元電子・正孔分布の制御とデバイス応用

分子線エピタキシ-法によりGaAlSb/InAs/GaAlSbポリタイプへテロ構造の成長を行った。III族ならびにV族ビ-ムの同時切り換えによる成長条件を検討し、急峻なヘテロ界面を得る方法について調べた。ヘテロ構造の特性を評価するため、フォトルミネッセンスとラマン散乱の光学測定を行い、ホ-ル効果の結果との対応についても調べた。InAs/AlGaSbを高速デバイスに利用する際、良好な電気的特性を得る条件とプロセス安定性等の両条件を満たすAl組成比を決める必要がある。そのためFETに適した構造を思い出すため、AlGaSb障壁層の厚上と組成の異なるInAsチャンネルをもつ3種類の量子井戸構造を作成し、その電気的特性を比較した。チャネル中の電子濃度が高く、かつ移動度の高い構造として、60AのAlSbを障壁にもつヘテロ構造を成長しFETを試作した。ゲ-ト長1.7μmのInAsチャネルFETにおいて、相互コンダクタンスが460ms以上の高い値を得た。これは同一構造のGaAsやInGaAsチャネルHEMTに比較しても優れた特性であり、今後超高速デバイスとして期待のもてるヘテロ構造といえる。InAs/AlGaSbヘテロ昇面の電子・正孔分布を制御するため、ヘテロ昇面に垂直な電界を印加してフォトルミネッセンスを測定した。タイプIIヘテロ構造では、電子と正孔は異った層に分離して分布する。この電子と正孔の再結合発が垂直電昇により変化する様子について調べた。発光エネルギ-が高エネルギ-に変化するブル-シフトを伴うシュタルク効果を初めて観測した。これはタイプIIヘテロ構造中の電子と正孔の分布が、外部電昇により変調されると同時に2次元準位が変化したことを示している。このシュタルク効果は、高速のオプトエレクトロニクス素子に応用することができる。分子線エピタキシ-法を用いて、GaSb/InAs/Al(Ga)Sbヘテロ構造を成長した。V族分子線(Sb,As)の切り換えによるヘテロ界面組成の急峻な変化を得る方法について詳細な検討を行った。従来から一般に用いられている方法によると、As原子とSb原子の相互置換が生じ混晶が界面に形成される。この問題を解決するため、高速反射電子線回折(RHEED)の測定を成長中に行い、成長表面構造の観察と評価をもとに急峻なヘテロ界面を得る条件を見い出した。種々の条件で成長したポリタイプヘテロ構造の結晶性を評価するため、ラマン散乱の測定を行い、フィノンスペクトルの解析からMBE成長条件との関連について調べ、多くの知見を得た。InAs,GaSb,AlSbを組み合わせた種々の量子井戸構造を電子物性等の観点から調べるため、井戸層を単原子層から数原子層まで変化した構造を作製し、そのフォトルミネッセンスを極低温で測定した。InAs単原子層を井戸層にもつ単一量子井戸構造からは、急峻なピ-クをもつ発光が観測された。井戸層厚が増すにしたがって、発光スペクトルが広がるが、そのピ-クエネルギ-を井戸層の厚さについて依存性を調べた。有効質量近似による2次元電子準位と正孔準位差の計算結果と比較することにより、ヘテロ構造の評価を行った。InAsチャネルに閉じ込められた2次元電子の高速性に着目して、種々の構造をもつヘテロ構造の電気的特性を測定した。Al(Ga)Sbからなるバリヤ層を変えることにより、2次元電子ならびに正孔分布が変化することが分った。この実験事実に注目して、電子と正孔の実空間分布を制御する方法について検討を行った。

以上の研究から得られた分子線エピタキシ法、ヘテロ構造の評価等に関する成果を学会誌等に発表した。分子線エピタキシ-法によりGaAlSb/InAs/GaAlSbポリタイプヘテロ構造の成長を行った。III族ならびにV族ビ-ムの同時切り換えによる成長条件を検討し、急崚なヘテロ界面を得る方法について調べた。ヘテロ構造の特性を評価するため、フォトルミネッセンスとラマン散乱の光学測定を行い、ホ-ル効果の結果との対応についても調べた。InAs/AlGaSbを高速デバイスに利用する際、良好な電気的特性を得るた条件とプロセス安定性等の両条件を満たすAl組成比を決める必要がある。そのためFETに適した構造を見い出すため、AlGaSb障壁層の厚さと組成の異なるInAsチャネルをもつ3種類の量子井戸構造を作成し、その電気的特性を比較した。チャネル中の電子濃度が高く、かつ移動度の高い構造として、60A^^°のAlSbを障壁にもつヘテロ構造を成長しFETを試作した。ゲ-ト長1.7μmのInAsチャネルFETにおいて、相互コンダクタンスが460ms以上の高い値を得た。これは同一構造のGaAsやInGaAsチャネルHEMTに比較しても優れた特性であり、今後超高速デバイスとして期待のもてるヘテロ構造といえる。InAs/AlGaSbヘテロ界面の電子。正孔分布を制御するため、ヘテロ界面に垂直な電界を印加してフォトルミネッセンスを測定した。タイプIIヘテロ構造では、電子と正孔は異った層に分離して分布する。この電子と正孔の再結合発が垂直電界により変化する様子について調べた。発光エネルギ-が高エネルギ-に変化するブル-シフトを伴うシュタルク効果を初めて観測した。これはタイプIIヘテロ構造中の電子と正孔の分布が、外部電界により変調されると同時に2次元準位が変化したことを示している。このシュタルク効果は,高速のオプトエレクトロニクス素子に応用することができる。
骨組織形態学的分析により、微小骨片から旧石器時代の狩猟獣を復元する

旧石器時代の人類遺跡から出土した微小骨片の種同定を目的として、更新世動物群の骨組織構造を比較形態学的に検討した。その結果、二次オステオンの大きさ、骨皮質の厚さ、葉状骨の有無を指標として、中型シカ、大型偶蹄類、小・中型食肉類、大型偶蹄類、ゾウ、ヒトを識別できることを明らかにした。この方法を用いて北海道柏台1遺跡から出土した旧石器時代の焼骨片を解析したところ、それらが中型シカに相当する可能性が高いとの結論を得た。方法論に関して、これまでの検討により、二次オステオンの面積、ハバース管の面積、線形に配列された二次オステオン(osteon banding)の有無、Plexiform boneの有無、および骨皮質の厚さを組み合わせることで、中型偶蹄類、大型偶蹄類、小中型食肉類、大型食肉類、ゾウ、およびヒトの識別が可能であることを明らかにした。また、青森県尻労安部洞窟遺跡の調査に参加し、旧石器時代の層準から石器と動物骨を採取することに成功したが、出土動物遺体はいずれも小片で、骨片はいずれも肉眼観察では種の同定が困難であり、本研究の骨組織形態学的検討が種同定に有効であることが期待された。現在、同遺跡出土資料の分析を進めており、その結果は2013年度に刊行予定の報告書に掲載される予定である。その他、本研究の方法論を援用して著した原稿が書籍として刊行された(澤田純明「焼骨からわかることーミクロ形態学によるヒトと動物の識別ー」、瀧川渉編『市民の考古学12骨考古学と蝦夷・隼人』、同成社、2012年)。日本列島の後期更新世人類遺跡から出土した微小骨片の種同定を可能とすべく、更新世動物群の骨組織構造を比較形態学的に検討し、骨組織形態学的分析の種同定法への応用を試みた。まず、日本列島の後期更新世に生息していた代表的な中大型乳類群(イノシシ、ニホンジカ、ニホンムカシジカ、ヤベオオツノジカ、カモシカ、バイソン、ウシ、ゾウ、ヒグマ、イヌ、キツネ、タヌキ、テン、ウサギ、ヒト)の四肢長骨緻密質を採取して組織切片を作成し、ハバース系および葉状骨の所見記載、オステオンとハバース管の面積計測、および骨皮質の厚さの計測を行った。組織形態計測値を統計的に検討した結果、長径が5mm以上、できれば1cm以上残存する哺乳類の四肢骨幹部であれば、(1)シカやイノシシなどの中型偶蹄類、(2)ヤベオオツノジカやバイソンなどの大型偶蹄類、(3)イヌやテンなどの小中型食肉類、(4)ヒグマに代表される大型食肉類、(5)ウサギ、(6)ヒトの各動物群を、ある程度まで識別できることを明らかにした。この方法を用いて北海道柏台1遺跡から出土した旧石器時代の焼骨片の組織形態を解析し、生物地理学的知見も併せて検討した結果、それらが中型シカ科に相当する可能性が高いとする結論を得た。さらに青森県尻労安部洞窟から出土した旧石器時代の微小骨片についても研究を進めており、近々結果を報告する予定である。本研究の成果は、旧石器時代における動物資源の利用様相の実証的な解明に貢献するものである。日本列島の旧石器時代遺跡から状態の良好な動物骨が出土した例はごく少なく、当該期の動物資源利用の様相はいまだ充分に明らかにされていない。本研究の目的は、これまで分析されてこなかった微小骨片からも情報を引き出すべく、更新世動物群を対象とした骨組織形態学的分析に基づく種同定法を確立し、これを遺跡出土骨片の研究に適用して、日本列島の旧石器時代の狩猟獣を復元することである。2011年度は、完新世日本列島に生息する中・大型哺乳類、アジアゾウ、バイソン、および更新世に絶滅したナウマンゾウ・オオツノジカ・ニホンムカシジカの骨格から緻密骨の薄切標本を作成して、骨組織形態計測を実施した。この骨組織形態計測データをもとに動物種の組織形態学的識別基準を検討し、さらに、この基準を北海道柏台1遺跡から出土した更新世の微小焼骨片に適用して動物種の同定を試みた結果、この焼骨が中型シカ科に相当する可能性の高いことを明らかにした。この結果は、The 4th Annual Meeting of the Asian Palaeolithic Associationにおいて報告した。現在、これらの成果を論文にまとめ、投稿する準備を進めている。そのほか、日本列島に近接する地域の更新世動物群から骨組織形態計測データを収集するため、ハノイのベトナム考古学院を訪問し、ホアビン省Hang Cho遺跡から出土した後期更新世の動物骨の整理と同定を行った。同遺跡出土資料の整理作業は2012年度も継続して行う予定である。本研究の成果は、旧石器時代における動物資源利用の様相の実証的な解明に貢献するものである。比較標本の収集とそれらの骨組織形態計測は当初の予定通りに進んでおり、更新世人類遺跡から出土した骨片の分析も実施した。

これまでに、その成果の一部を国際学会と著書で発表した。現在、研究成果の一部を論文にまとめ、国際学術雑誌への投稿準備を進めている。比較標本の収集とそれらの骨組織形態計測は当初の予定通りに進んでおり、更新世人類遺跡から出土した骨片の分析も実施した。その成果の一部を国際学会で発表したが、2011年度中の論文投稿には至らなかった。2012年度のなるべく速い段階で投稿すべく、現在準備を進めている。1.比較標本の骨組織形態計測データ収集を完了させ、その解析を実施する。2.研究成果を国際学術雑誌に投稿する。1. 2011年度に引き続き、比較標本の骨組織形態計測データを収集する。2.青森県尻労安部洞窟遺跡の発掘調査において採集された後期更新世の動物骨を整理し、肉眼では種の同定が困難な小片について骨組織形態学的検討に基づく同定を試みる。3.日本列島の近隣地域の更新世動物群から骨組織形態計測データを収集するため、2011年度に引き続き、ベトナムのHang Cho遺跡出土更新世動物骨の整理と同定を実施する。遺跡出土骨試料および比較動物骨標本の収集のため遺跡・研究機関を訪問する旅費、試料の採取と包埋を行う作業補助員への謝金、および成果発表のため論文の英文校閲料を計上した。骨組織形態計測に際し、試料の包埋とプレパラート作成に関する薬品、スライドガラス、カバーガラスを購入する。また、遺跡出土骨試料および比較動物骨標本の収集のため遺跡・研究機関を訪問する旅費、試料の採取と包埋を行う作業補助員への謝金、および成果発表のため論文の英文校閲料を計上した。なお、次年度使用額は包埋に要した樹脂の費用が当初の見積もりより低く抑えられたために生じた金額である。これについては、試料の採取ならびに包埋の作業効率を向上させるため、平成24年度作業補助員の謝金に充てる予定である。
高速動作可能な無限平面装置の開発

地表徘徊性動物の行動をトレッドミル(ルームランナー)を拡張した無限平面上で観察することにより,観察対象動物の長時間にわたる自由な行動や,外的刺激に対する反応の定量的な特性が明確化される。本研究では,素早く動く動物を観察対象にできるよう,高速動作可能な無限平面装置を開発する。特に,単に高速に動作するだけでなく,高速動作に起因して発生する振動を適切に除去する手法を確立する。
サカナのふるえ-恒温動物のふるえの原型か

ほ乳類や鳥類は,環境温が低下すると,ふるえによる産熱反応を起こして体温を保つ。一方,爬虫類,両生類,魚類は,環境温が低下しても産熱反射を生まず体温が下がる変温動物である。しかし,ふるえが系統発生上いつ生じたのかわかっていないここでは,低温でふるえ様の反応がサカナで生まれるとの仮説を立て,それを検証する実験をおこなった.受精後3日齢のゼブラフィッシュの稚魚を,28.5°Cから12°Cの水に移すと,尾ひれを律動的に振る相(ON相,約10Hz)と静止する相(OFF相)が,約3秒の周期で断続的に生じた(ON-OFF相)。しかし,サカナに前進運動は見られなかったので,その運動は産熱のための考えられる.ここでは,発砲スチロールで熱流を遮蔽した試験管に少量の12°Cの水を入れ,その中に稚魚をいれ,ふるえで生じる水温の上昇を産熱の指標として測定した。一匹の稚魚を入れたときの温度上昇は,対照群の温度上昇と差はなかった。5匹の稚魚を入れると,水温は,対照群の上昇速度より高い速度で上昇した。10匹の稚魚を入れると,水温は,5匹の上昇速度のほぼ2倍の速度で上昇した。魚類の麻酔薬MS222で処理した5匹の稚魚を入れたとき,温度上昇は対照群と差はなかった。これらの結果は,尾びれのふるえ様の動きで熱が生まれたことを示す。間欠的な動きを生む発振器の場所を探るため,脳神経系のレベルで切断しふるえの変化を見た。後脳と脊髄の間を切断すると,間欠的な動きが連続的なものに変わった.これは,脳の発振器が,連続的なふるえを周期的に遮断していることを示す。ほ乳類や鳥類は,環境温が低下するとふるえなどの産熱反応で体温を正常値に保つ恒温動物である。一方,爬虫類,両生類,魚類は,環境温が低下しても産熱反射が起きず,体温が下がる。しかし,ふるえが脊椎動物の系統発生上いつ生じたのかわかっていない.この研究の目的は,ふるえ様の反応がサカナで生じるとの仮説を立て,検証することである.受精後3日齢のゼブラフィッシュの稚魚を,28.5°Cから12°Cの水に移すと,尾ひれを連続的に振る相と静止する相が約3秒の周期で交代する間欠的なパターンを示した。このような活動は,恒温動物のふるえに似ている.低温でおきる尾ひれの活動が熱を生むかどうかを測った。外部との熱の流れを遮蔽した箱の中に試験管を置き,12°Cの少量の水を入れた.その水の中に稚魚をいれると,ふるえ様の活動が生じ,水温が上昇した。尾びれの動きを生む発振器の場所を探るため,脳脊髄をいろいろなレベルで横断した。後脳と脊髄の間を切断すると,間欠的な動きが連続的なものに変わった.これは,脳の発振器が間欠的な活動を生み,脊髄の発信器が連続的な活動を生むことを示す。成魚ではふるえ様の活動は知られていない.そこで,ふるえ様の活動の成長に伴う変化を調べた.12°Cでのふるえ様の活動が持続する時間は,成長に伴って短縮し20日を過ぎるとふるえ様の活動は消失した.体温の維持は,恒温動物の生存に不可欠の機能である.しかし,その機能が脊髄動物のどの段階で生じたのか全くわかっていない.この研究は,ふるえ様の活動がサカナですでに生じていることを示す.これは,高温動物への進化を示す重要な研究と意義づけられる.ほ乳類や鳥類は,環境温が低下すると,ふるえによる産熱反応を起こして体温を保つ。後脳と脊髄の間を切断すると,間欠的な動きが連続的なものに変わった.
電極/電解質一体型固体酸化物型燃料電池薄膜の作製と評価

酸素イオン伝導体であるイットリア安定化ジルコニアなどの固体電解質は,固体酸化物燃料電池(SOFC)などへの応用が期待されている.SOFCは全て固体で構成されているので,電解質と電極材との整合性が必要で,我々は電極材料として,電解質材料である安定化ジルコニア(YSZ)をベースにした電子-イオン混合伝導体を用いることを考えている.しかしながら電子伝導性を向上させるにはYSZに添加する材料の濃度を高める必要があるので,整合性が悪くなる.そこでYSZに添加する材料の濃度を傾斜し,電極/電解質界面での整合性を良くすることが考えられる.本研究ではYSZに添加する材料としてCeO_2を取り上げ,CeO_2濃度を変化させた組成変調薄膜(FGM膜)をレーザアブレーション法により作製し,単セル試験を行い,電極としての特性を評価した.YSZ単結晶基板を固体電解質とし,組成変調膜および単一組成膜(Ce-YSZ)を燃料極として成膜した.空気極として白金を用い,単セル試験を行った.その結果,発電性能はFGM膜を用いることにより向上することを明らかにした.これは電極内で組成変調させることにより,電解質/電極界面での整合性が向上し,電極過電圧が低下したためと考えられる.単セル試験用セル及び単セル試験装置を用いて,カレントインタラプタ法により電極過電圧の測定を行った結果,FGM膜の方がCe-YSZ単層膜よりも過電圧が低下し,電極としての性能が向上していることが明らかになった.以上の結果より,電極材に組成変調構造を導入することにより,SOFCの電気化学的特性を向上させることが明らかになった.今後,さらに,燃料極として最適な材料の探索や組成変調法を研究し,高性能傾斜機能化SOFCの開発を行うことが必要となる.酸素イオン伝導体であるイットリア安定化ジルコニアなどの固体電解質は,固体酸化物燃料電池(SOFC)などへの応用が期待されている.SOFCは全て固体で構成されているので,電解質と電極材との整合性が必要で,我々は電極材料として,電解質材料である安定化ジルコニア(YSZ)をベースにした電子-イオン混合伝導体を用いることを考えている.しかしながら電子伝導性を向上させるにはYSZに添加する材料の濃度を高める必要があるので,整合性が悪くなる.そこでYSZに添加する材料の濃度を傾斜し,電極/電解質界面での整合性を良くすることが考えられる.本研究ではYSZに添加する材料としてCeO_2を取り上げ,CeO_2濃度を変化させた組成変調薄膜をレーザアブレーション法により作製し,電気的特性評価を行った.YSZ単結晶基板上に作製した薄膜は,いずれも緻密で基板に平行に(100)面が成長していた.また2次イオン質量分析器(SIMS)を用いて膜内のCeの分布を観察すると,薄膜内での組成の変化が確認できた.薄膜の面内方向の導電特性は傾斜化により,イオン導電率,電子導電率が共に増加し,全酸素分圧領域で電気特性が向上することが明らかになった.またSIMSと酸素の同位体^<18>Oを用いて組成変調膜内及び薄膜/基板界面における酸素の同位体拡散試験の結果,単一組成薄膜に比べ,拡散速度が向上することを明らかにした.以上の結果より,電極材に組成変調構造を導入することにより,SOFCの電気化学的特性を向上させることが明らかになった.今後,さらに,SOFCへの組成変調した電極材の適用可能性について検討し,単セル試験を行う予定である.酸素イオン伝導体であるイットリア安定化ジルコニアなどの固体電解質は,固体酸化物燃料電池(SOFC)などへの応用が期待されている.SOFCは全て固体で構成されているので,電解質と電極材との整合性が必要で,我々は電極材料として,電解質材料である安定化ジルコニア(YSZ)をベースにした電子-イオン混合伝導体を用いることを考えている.しかしながら電子伝導性を向上させるにはYSZに添加する材料の濃度を高める必要があるので,整合性が悪くなる.そこでYSZに添加する材料の濃度を傾斜し,電極/電解質界面での整合性を良くすることが考えられる.本研究ではYSZに添加する材料としてCeO_2を取り上げ,CeO_2濃度を変化させた組成変調薄膜(FGM膜)をレーザアブレーション法により作製し,単セル試験を行い,電極としての特性を評価した.YSZ単結晶基板を固体電解質とし,組成変調膜および単一組成膜(Ce-YSZ)を燃料極として成膜した.空気極として白金を用い,単セル試験を行った.その結果,発電性能はFGM膜を用いることにより向上することを明らかにした.これは電極内で組成変調させることにより,電解質/電極界面での整合性が向上し,電極過電圧が低下したためと考えられる.単セル試験用セル及び単セル試験装置を用いて,カレントインタラプタ法により電極過電圧の測定を行った結果,FGM膜の方がCe-YSZ単層膜よりも過電圧が低下し,電極としての性能が向上していることが明らかになった.以上の結果より,電極材に組成変調構造を導入することにより,SOFCの電気化学的特性を向上させることが明らかになった.今後,さらに,燃料極として最適な材料の探索や組成変調法を研究し,高性能傾斜機能化SOFCの開発を行うことが必要となる.
ナノ粒子積層薄膜プレートの構築と環境バイオセンシング技術への応用

本研究は、環境バイオセンシング技術への応用を目指して、表面支援レーザー脱離イオン化質量分析(SALDI-MS)のための新規なSALDIプレートの開発を目的としている。その研究成果として、SALDI-MSのための新規なナノ粒子積層薄膜プレート、(1)金ナノ粒子/高分子交互積層薄膜と(2)ポリエチレンイミン修飾グラファイトシートを開発した。金ナノ粒子/高分子交互積層薄膜では、フェムトモルオーダのペプチドの高感度検出、分子量1万程度の蛋白質の検出など、従来の金ナノ粒子を用いたSALDIに比べて、感度と検出限界分子量ともに向上できた。環境分析を目的としたポリエチレンイミン修飾グラファイトシートでは、近年、環境残留の点で問題となっている炭化フッ素系の界面活性剤(PFOS,PFA)の高感度検出と定量分析の有効性を示すことができた。本研究は,近年,特にライフサイエンス分野・環境分野において物質分析の重要な地位を築きつつあるレーザー脱離イオン化質量分析(LDI-MS)のための新規なLDIプレートとして,シリコン基板上にナノ粒子と高分子を交互に積層吸着させた"ナノ粒子積層薄膜プレート"を開発する。このナノ粒子積層薄膜プレートと質量分析計を結合することにより、抽出操作が不要で(敏速分析),かつ高感度(サブフェムトmol以上),高選択性を有するハイスループットなスクリーニング分析システムを実現することを目標とする。本年度は, LDI-MSのためのレーザー脱離ソフトイオン化を支援する金ナノ粒子担持イオン化基板として,カチオン性高分子(ポリアリルアミン塩酸塩)のバインダーとして,クエン酸アンモニウム塩で保護された金コロイドが積層された金ナノ粒子積層薄膜プレートを作製した。その際,(a)高分子や金コロイドの濃度,(b)高分子の種類や分子量, (c)浸漬時間,及び(d)ナノ粒子の積層数を変えて, LDI-MSの高感度化を実現するための構造最適化を行った。その結果,従来の金ナノ粒子を用いたLDI-MS用のイオン化基板と比べて,標準試料として知られるアンジオテンシンIの検出感度が10倍向上し(数フェムトモル),チトクロームCなどのタンパク質も検出できるようになった。更にナノ粒子積層薄膜プレートに試料を濃縮させることにより, PRTR法「第一種指定化学物質」に指定されている陽イオン性界面活性剤としてビス(水素化牛脂)ジメチルアンモニウムクロリドの検出において, 10^<-17>g/Lという極微量の試料を検出できることが明らかとなった。本研究は、近年、ライフサイエンス分野・環境分野において低分子物質分析の重要な地位を築きつつある有機マトリックスを用いない表面支援レーザー脱離イオン化質量分析(SALDI-MS)のための新規なSALDIプレートの開発を目的としている。本年度は、SALDI-MSのためのナノ粒子積層薄膜LDIプレート(ナノ粒子を含む)として、尿素表面修飾酸化チタニア粒子、ポリエチレンイミン修飾グラファイトシート、白金ナノ粒子担持シリコン基板、及びスルホン基修飾FePtCu磁性ナノ粒子が有効であることを見出した。尿素表面修飾チタニア粒子では、サブフェムトモルオーダのペプチドの高感度検出、分子量3万程度の蛋白質の検出など、従来のチタニア粒子を用いたSALDIに比べて、感度と検出限界分子量ともに向上できた。環境分析を目的としたポリエチレンイミン修飾グラファイトシートでは、近年、環境残留の点で問題となっている炭化フッ素系の界面活性剤(PFOS, PFA)の高感度検出と定量分析の有効性を示すことができた。スルホン基修飾FePtCu磁性ナノ粒子では、血清中の蛋白質をナノ粒子により磁性分離してナノ粒子に結合した蛋白質をSALDI-MSで直接検出するという"アフニテイSALDI-MS"を実現した。白金ナノ粒子担持シリコン基板では、レーザー光照射によって生じる電子とホールの電荷分離が、SALDI-MSにおけるペプチドのプロトン付加分子の生成を促進するという新規なイオン化メカニズムを提案でき、SALDI-MSでは検出が困難であったプロトン付加分子の生成を促進する方法を見出した。以上のように、本研究ではSALDI-MSのために新規なLDIプレートを作製し、その特徴を生かして高感度化、検出限界分子量の向上、プロトン付加分子の生成促進、LDI-MSによる定量分析、及びアフニテイSALDI-MSを実証できた。
新素材DNA/人工脂質複合体の機能を利用した抗菌性歯科材料の開発

歯科医療分野においては、寝たきり老人を含め高齢者社会の急速な進行に伴って補綴物や義歯の需要が増加している。しかし、これらの装着物が口腔微生物の温床となりそこで異常に増加した微生物に起因する高齢者の嚥下性肺炎が深刻な問題となっている。従って補綴物や義歯が微生物の温床となることを避けるため、これらに抗菌性を付与させる研究が進められており、と同時に生体に安全で効果的な歯科材料の開発が望まれている。そこで近年、バイオナノテクノロジーの新素材として注目されているDNAの特性を利用して、DNA/人工脂質複合体を作成し、これに抗菌性を付与した歯科用新素材の開発を試みた。平成14年度は、アルキル鎖の異なる脂肪族アルコールと必須アミノ酸を用いて合成した人工脂質とサケ精子由来のDNAを用いて10種のDNA/人工脂質複合体を作成した。これらはCDスペクトル分析からコンフォメーションの変化の有無や程度の確認、細胞毒性試験を行った。さらに院内感染および口腔疾患の原因となる細菌6種とカンジダ菌6種に対する抗菌性を調べた。その結果、グリシンあるいはアラニンを用いたC10およびC12のDNA/人工脂質複合体は、細菌6種とカンジダ菌6種に対しての抗菌性を示した。平成15年度はDNA/人工脂質複合体を有機溶媒に溶解し、テフロン上でDNAフィルムを作製し、細胞毒性試験および4種の口腔細菌(う蝕および歯周病起因菌)に対する抗菌試験を行った。その結果、グリシン群のC10、C12、C14は4種の細菌に対して抗菌性を示した。アラニン群はC10、C12、C14、C16が4種の細菌に対して抗菌性を示した。また全てのDNAフィルムは、ラットの皮下組織において埋入3日後にはコントロールとの差はみられなかった。今回開発した抗菌性を有するDNA/人工脂質複合体は、賦形性の面においても歯科材料および生体材料としての用途の拡大が可能と考えられる。また、DNAへの薬剤のインターカレーションやグルーブバインディングにより、ドラッグデリバリーシステム(DDS)における効果が期待される。高齢者の増加、外科的技法の向上および歯周病患者の増加に伴い、適度な生体分解能を有し、遅発炎症や抗原抗体反応が無く抗菌性を示す歯科用生体材料の開発は急務となっている。そこで、DNAのインターカレーションやグルーブバインディングは生体材料のキャリアーとして魅力ある機能である。しかし、賦形性に乏しく、水溶性であるために取り扱い方、成型方法、生体内での代謝、拡散速度の調整などに難点があるため、これらの問題点を解決するためにカオチン性人工脂質による複合化を試みた。1.人工脂質の合成:人工脂質を容易に生体内で分解させるためと同時に為害性を配慮して、アルキル鎖の異なる5種の脂肪族アルコールと必須アミノ酸であるグリシンおよびL-アラニンとのエステル化により合計10種のカオチン性人工脂質を合成した。2.DNA/人工脂質複合体の合成:サケ精子由来のDNA(300bp、200mg)含有水溶液(100ml)に合成脂質(DNAのリン酸アニオンに対して1.12等量)含有水溶液を滴下してDNAと脂質とを反応させた。反応後、直ちに反応液中の沈澱物を遠心分離で回収し、蒸留水で数回洗浄後、再度遠心分離で回収した白色沈澱物を凍結乾燥した。3.人工脂質およびDNA/人工脂質複合体の抗菌性:院内感染および口腔疾患の原因となる細菌4種と、義歯床の清掃不良による寝たきり老人の嚥下性肺炎の原因と去れているカンジダ菌6種に対しての抗菌性を調べた。複合化により抗菌性は低下するものの、グリシン系、アラニン系共にC10とC12の抗菌性は優れ、特にDNA/C10-グリシン複合体は4種の細菌に抗菌性を示した。また、グリシン系、アラニン系共にC10およびC12で6種全てのカンジダ菌に抗菌性を示した。今回作製したDAN/人口脂質複合体はDNAへの種々の薬剤のインターカレーションやグルーブバインディングが期待され、歯科材料や生体材料としての応用も可能と考えられる。

平成15年度はDNA/人工脂質複合体を有機溶媒に溶解し、テフロン上でDNAフィルムを作製し、細胞毒性試験および4種の口腔細菌(う蝕および歯周病起因菌)に対する抗菌試験を行った。その結果、グリシン群のC10、C12、C14は4種の細菌に対して抗菌性を示した。アラニン群はC10、C12、C14、C16が4種の細菌に対して抗菌性を示した。また全てのDNAフィルムは、ラットの皮下組織において埋入3日後にはコントロールとの差はみられなかった。今回開発した抗菌性を有するDNA/人工脂質複合体は、賦形性の面においても歯科材料および生体材料としての用途の拡大が可能と考えられる。また、DNAへの薬剤のインターカレーションやグルーブバインディングにより、ドラッグデリバリーシステム(DDS)における効果が期待される。
家族性パーキンソン病責任遺伝子産物LRRK2の機能解析

優性遺伝性パーキンソン病(FPD)の中でも頻度の高いPARK8の病因遺伝子産物LRRK2は、Ras様GTP結合ドメイン(Rocドメイン)、プロテインキナーゼドメインを併せ持つ、約2500アミノ酸からなる蛋白質である。これまでにLRRK2が培養細胞内においでGTP結合依存的にリン酸化を受けることを見出したが、そのリン酸化残基や機能的意義は明らかでなかった。まず、アミノ末端に3xFLAGタグを付加した全長LRRK2を恒常発現するHEK293細胞株を作製し、FLAGタグに対する抗体カラムを用いて全長LRRK2を精製した。精製したLRRK2が自己リン酸化活性ならびに基質(Moesin)リン酸化活性を保持していることを確認した。精製したLRRK2をトリプシンによりSDS-PAGEゲル内において消化し、Fe^<3+>ビーズを用いてリン酸化ペプチドを濃縮したのちにMALDI-TOF質量分析計により解析した。その結果、リン酸化ペプチドは複数検出されたが、いずれのリン酸化残基もLRRドメインのアミノ末端側に局在することが明らかになった。さらにタンデム質量分析により、LRRK2のSer910およびSer973がリン酸化を受けることを明らかにした。また、LRRK2のRocドメインよりC末端側をGST融合タンパク質として培養細胞に発現させると、細胞内において他のキナーゼによるリン酸化を受けないことから、LRRドメインを中心とするN末端側領域がリン酸化部位であることを確認した。これらのリン酸化残基のAlaもしくはAsp置換体の機能解析(GTP結合活性、キナーゼ活性)から、LRRK2活性制御における細胞内リン酸化の役割が明らかになると期待される。優性遺伝性家族性パーキンソン病(FPD)の中でも頻度の高いPARK8の病因遺伝子産物LRRK2は、Ras様低分子GTP結合蛋白質ドメイン(Rocドメイン)、キナーゼドメインを併せ持つ約2500アミノ酸からなる蛋白質であるが、そのキナーゼ活性の制御機構や基質は明らかになっていない。まず、FPD変異型LRRK2のキナーゼ活性を検討したところ、最も頻度の高いキナーゼドメイン内の変異G2019Sでは、野生型に比べてキナーゼ活性が有意に上昇することを確認した。次に、RocドメインへのGTP結合とキナーゼ活性の機能的関連を調べた。Rasなどの低分子量G蛋白質のGTP結合能を喪失させることが知られているアミノ酸置換をRocドメインに導入したところ、LRRK2のGTP結合能がin vitroにおいても培養細胞内においても消失した。GTPを結合しない変異体は、自己リン酸化活性を持たず、人工基質であるミエリン塩基性蛋白質(MBP)もリン酸化しなかった。興味深いことに、GTPを結合しない変異体では、培養細胞内でのLRRK2自身のリン酸化も消失した。これらの結果から、LRRK2のRocドメインへのGTP結合は、LRRK2の細胞内におけるリン酸化に必要であるとともに、そのキナーゼ活性にも必要であることが示唆された。LRRK2を細胞内でリン酸化するキナーゼを同定するため、代謝ラベリングと同時に様々なキナーゼ阻害剤で細胞を処理し、LRRK2のリン酸化の変化を検討した。その結果、PKA阻害剤として知られるH-89とKT5720でLRRK2のリン酸化が阻害されることを見出した。また、LRRK2はin vitroにおいてPKAによってリン酸化された。これらの結果から、PKAがLRRK2をリン酸化する可能性が示唆された。
逆問題における再構成アルゴリズムの提唱につながる新しい方法の発見

1.囲い込み法の数値実験とその正則化与えられた物体表面における一組の電流密度と電位分布から、多角形状の空洞、あるいは導電率の不連続性をもたらす介在物の凸包を解析的に引き出す公式の数値実験を行った。さらにその数値実験結果を説明するために、データに誤差が混入したとき、その公式を修正した公式を与えた。2.探針法の展開物体表面における境界条件が混合型の場合に、介在物や亀裂の形状および位置の情報を引き出す問題を考察した。解(いわゆる反射解)の挙動をより詳しく解析することにより、研究代表者が過去に発見した探針法が適用できることがわかった。特に、楕円型方程式の解の正則性の結果として有名なDe Giorgi-Nash-Moserの定理の境界値逆問題への応用を与えた。3.囲い込み法の一般化囲い込み法によって得られる、未知の介在物などの情報は凸包のみと少ない。そこで、凸包以上の情報を引き出し、しかも、探針法よりも単純な、Mittag-Lefflerの関数の解析性と漸近挙動に基礎をおく方法を発見した。また今までは直流を流し込んで未知の介在物の情報を、Dirichlet-to-Neumann写像(あるいはその一部)から引き出す問題を考えていたのであるが、交流を使うことも実際になされている。そこでその数学モデルを取り上げ、その問題へ囲い込み法およびその一般化を応用した。4.囲い込み法の層状材料への応用厚さをもった何枚かの、異なる等方的な導電率をもつ、板状の物質からなる多層材料中に生じた介在物などの欠陥の位置および形状の情報をDirichlet-to-Neumann写像から具体的に引き出す問題を考察した。そのために何枚かの平行な平面上に不連続性を持ち、他では定数であるような係数をもつ楕円型方程式に対して複素幾何光学解を構成しそのパラメタに関する漸近挙動を調べた。さらにその応用として介在物の凸包を引き出す公式を、囲い込み法を使って与えた。1.囲い込み法の数値実験とその正則化具体的には、物体表面におけるひと組の電流密度分布と電位分布(観測データ)から、多角形状の空洞、あるいは導電率の不連続性をもたらす介在物の凸包を引き出す公式の数値実験を行った。さらにその実験結果を説明するために、データに誤差が混入したとき、その公式をどう修正すればよいかという問題を考察し、その修正した公式を与えた。2.囲い込み法の一般化囲い込み法によって得られる、未知の介在物などの情報は凸包のみと少ない。そこで凸包以上の情報を引き出し、しかも、研究代表者が以前導入した探針法よりも単純な方法を発見した。それはMittag-Lefflerの関数に基礎をおく方法で、Dirichlet-to-Neumann写像から、未知の介在物の境界上の、無限遠点から見えるような点全体の集合を引き出す公式をもたらした。その数値実験は今後の課題である。3.交流を使った問題への応用今までは直流を流し込んで未知の介在物の情報を、Dirichlet-to-Neumann写像(あるいはその一部)から引き出す問題を考えていたのであるが、交流を使うことも実際になされている。そこでその数学的モデルを取り上げ、その問題へ囲い込み法およびその一般化を応用し,観測データとしてDirichlet-to-Neumann写像をとったときの対応する結果を得た。ひと組の電流密度分布と電位分布を観測データとしたらどうかについては今後の課題である。

1.囲い込み法の数値実験とその正則化具体的には、物体表面における一組の電流密度と電位分布から、多角形上の空洞、あるいは導電率の不連続性をもたらす介在物の凸包を引き出す公式の数値実験を行った。さらにその実験結果を説明するために、データに誤差が混入したとき、その公式をどう修正すればよいかという正則化の問題を考察し、その修正した公式を与えた。2.探針法の展開物体表面における境界条件が混合型の場合に、介在物や亀裂の形状および位置の情報を引き出す問題は、弾性体への応用を念頭にするならばきわめて自然である。この問題に対し、解(いわゆる反射解)の挙動をより詳しく解析することにより、研究代表者が過去に発見した探針法が適用できることがわかった。3.囲い込み法の一般化囲い込み法によって得られる、未知の介在物などの情報は凸包のみと少ない。そこで、凸包以上の情報を引き出し、しかも、探針法よりも単純な方法を発見した。また今までは直流を流し込んで未知の介在物の情報を、Dirichlet-to-Neumann写像(あるいはその一部)から引き出す問題を考えていたのであるが、交流を使うことも実際になされている。そこでその数学モデルを取り上げ、その問題へ囲い込み法およびその一般化を応用した。
南アジア近・現代における経済変動と社会変化-特に,下層社会集団の動向-

本プロジェクトは,日本人研究者とインド,バングラデシュの研究者とが密接な連携を保ちつつ,南アジア近・現代における経済変動が下層社会集団にどの様な社会変化を及ぼしてたのかというテーマに迫ったものである。以上が,プロジェクトの概要とその成果の公表のあらましであるが,以下において,このプロジェクトによって明らかになった事,及び,なお将来の課題として残された諸点について述ベよう。まず,歴史班の成果から見て行く。ワークショプでは,4編の論文が発表された。その内2編(S.Islam論文と脇村論文は,ヒンドゥー教が確立している平野部(旧ベンガル州とUP州)における下層階層に焦点をあて,他の2編(B.Chaudhuri論文と谷口論文)は,山岳,丘陵部に追いやられた非ヒンドゥー社会が平野部のヒンドゥー社会と交じりあう時に生じる諸問題に焦点をあてている。前二者の扱う問題領域は,階級問題としての側面が強いが,後二者が主に扱う問題は,むしろ,きわめて異質な共同体間の,或いは,小文化と大小化間の接触,統合の過程にあるといえよう。そして,これら4編の論文は,いづれも,英国植民地支配の確立した19世紀に,流通・経済構造に大きな変動が生じ,それを重要な契機の一つとして,平野部でも丘陵部でも,大きな社会変化が下層社会集団の中に生じた事を明らかにしている。本プロジェクトの中心を成す現状分析班からは,8編の論分が発表された。それらは,今回の主たるフィールドとなったクジャラート州を含むインド西部の指定カースト,指定部族の全般的な就業構造の解明作業(Visari& Gumber論文),彼等の農村における存在状況(中里亜夫論文,福永論文),都市近郊における彼等の経済状況(柳沢論文),そして,都市部に於ける下層社会集団の問題については,彼等にとって最も典型的な職業である清掃業の現状分析(篠田論文,三宅論文),及び,工場労働者の中での下層社会集団の状況(B.Patel論文,木曽論文)に分ける事が出来る。これらの多様な実態調査から,重要な幾つかの共通論点が浮び上がってくる。農村では,下曽社会集団の多くは伝統的な職業に縛られ,未だ改善のきっかけが掴めない場合が多いが,都市,就中,都市の中大規模工場では,下層社会集団は最早不浄で忌避されるものではなくなりつつある。しかし,下層社会集団の内部に更に分析を加えると,彼等の間にも,積極的に高等教育を受け,高度な専門的職業に進出していく者を多く輩出する集団と,教育水準の向上が殆ど見られず,社会の底辺において伝統的な′′不浄な′′職業に甘んじている集団とが,かなり明確に分離してきている。また,後者の中でも,地方自治体等に雇用機会を得,かなりの高給と職の安定を得た人々と,その様な上昇のきっかけを掴めないままの人々への両極化が見られる。何故,この様な,違いが下層社会集団の内部に生じてきたのか。その諸要因を究明する事は,残された今後の重要な研究課題となるであろう。

しかし,下層社会集団の内部に更に分析を加えると,彼等の間にも,積極的に高等教育を受け,高度な専門的職業に進出していく者を多く輩出する集団と,教育水準の向上が殆ど見られず,社会の底辺において伝統的な′′不浄な′′職業に甘んじている集団とが,かなり明確に分離してきている。また,後者の中でも,地方自治体等に雇用機会を得,かなりの高給と職の安定を得た人々と,その様な上昇のきっかけを掴めないままの人々への両極化が見られる。何故,この様な,違いが下層社会集団の内部に生じてきたのか。その諸要因を究明する事は,残された今後の重要な研究課題となるであろう。本プロジェクトは3年計画で進められており、初年度の本年は、南アジア近・現代史における下層社会集団の構造とその歴史的変容を究明する為に、イギリス、インド、バングラデシュに隊員を派遺し各種史・資料の収集につとめ下記の如き成果を得た。脇村隊員は、北インドUP州における下層社会集団のあり方の地域的変差を解明すべく、異った特微を示す同州の東部と西部の両地域について,地租査定報告書、県地誌、地租局議事録、県地租行政文書を調査し、相当量の文献を収集した。谷口隊院は、東部インドの西ベンガル州における下層社会集団の構造と歴史的変容を研究する為に、イギリスではカ-スト関係の手書き文書群、県裁判所記録集を複写し、インドでは、国立図書館、西ベンガル州文書館、県記録室などで、関連文献を調査し、又、その一部をマイクロ写真に収めた。中里隊員は、西ベンガル州のカルタッタ、シャンティニケタンの二地区で下層社会集団と、しの上に展開した地主経営に関する史・資料の収集につとめ、特にシャンティニケタでは、ヴィシュヴァバラティ大学ベンガル語科所蔵の貴重な地主経営文書群(ベンガル語)の写真撮影に成功した。バングラデシュでは、国立文書館、県記録室において、関連資料の残村状況を調べた。この間、第二年度現地調査に参加する諸隊員は、国内で研究会を重ね、牛皮革業の製造・加工に関する実地見学を行い、又、センサスその他の刊行資料を用いて、現地実態調査に備えて、準備作業を行った。本度、海外調査を行った歴史班は、収集した厖大な史・資料の整理・分析を始めており、その成果の発表は、次年度以降に行ってゆくことになろう。平成3年度は、北インドのグジャラ-ト州を中心に、農村と都市の双方に於いて現地調査が実施された。篠田隊員は、ア-メダバ-ド市の自治体に雇用される清掃人内部の雇用確保のメカニズム、彼等の経済状況、そして、意識等に関する調査を実施し、又、貴重な政府報告書類を収集した。篠田は未組織清掃人も調査し、両者を比較することによって雇用の近代化がインドの下層民に及ぼした影響を調べた。三宅隊員も西ベンガル州のカルカッタ市に於いて、篠田とほぼ同様な視角から情報収集を行ない、篠田の仕事の比較軸を用意することができた。木曽隊員は、ア-メダバ-ド市内の6工場に於いて、下層民を含む200名の工場労働者から雇用、昇進、教育等について聞き取り調査を実施した。柳沢隊員は、ア-メダバ-ド近郊のある村落における下層民の複数のコミュニティの経済状況を、就業構造、教育水準、意識構造等について聞き取りにより調査し、これらのコミュニティの最近の変容を促えるべく努めた。福永隊員は、ビハ-ル州で下層のあるコミュニティを対象に徹底した聞き取り調査を通して、彼らの生活史を調べ、社会経済的な状況の近時の変容を追求した。中里隊員は、ある酪農を主たる生計とする村落に於ける職業構成の変化を、酪農業の近代化の中で位置付けるべく、聞き取り調査を実施した。
マウス舌の初期発生の分子制御と遺伝子異常による舌筋形成不全

舌筋細胞は後頭体節の軸下側筋板の筋前駆細胞に由来し、下顎突起内に移住してきた筋前駆細胞が予定舌領域で筋芽細胞に分化し、次いで多核化した筋管細胞へと分化する。前年度から継続してきた蛍光二重免疫染色法と3次元組織観察により、Desmin陽性/MyoD陰性の筋前駆細胞は後頭体節→体幹間充織→第3-4鰓弓動脈の腹側→第2鰓弓正中側を経由して、E10.3には下顎突起正中部に到達することを明らかにした。この研究成果については、平成17年度歯科基礎医学会優秀ポスター賞を受けた。本年度においてはin vivoでの舌形成の観察と並行して、胎生9.710.5日前後で採取した鰓弓の器官培養モデルを確立した。BGJb培地では上皮細胞層の変性と下顎突起の癒合不全や舌形態への分化抑制をともなうが、DMEM/F12培地は上皮細胞と筋系譜細胞の増殖分化に適していた。in vivoでの舌初期発生と相同して、培養試料(DMEM/F12培地)でも筋系譜細胞の下顎突起正中部への集積、この筋系譜細胞集団内での筋前駆細胞からMyoD陽性の筋芽細胞への分化、細胞集団辺縁に位置する筋前駆細胞と上皮細胞との接触現象も再現できている。ただし、in cultureにおいては下顎突起間葉織での非筋系譜細胞の増殖活性に依存する外側舌隆起の形成誘導、あるいは下顎突起癒合後の舌膨隆も軽度にとどまっている。以上の形態観察から、器官培養系では筋系譜細胞の移住と集落形成、上皮との相互作用を梃子とする舌形態形成の仕組みを再現していると結論できる。ただし、舌組織の成長発育は制限されており、舌形態形成での組織容積の制御に寄与する増殖因子あるいは移住細胞の影響を明らかにする課題が残されている。本年度では、胎生日数9.8から12.3までのマウス試料を対象として、後頭体節から下顎突起・舌予定領域までの筋系譜細胞の移住経路を蛍光二重免疫染色法と3次元立体観察により明らかにした。胎生9.8日前後の後頭体節から遊走する筋系譜細胞はDesmin陽性/MyoD陰性で仮足形成を特徴とした。後頭体節に由来する筋前駆細胞の移住経路としては、背側側方の後頭体節から鰓弓に向かって遊走を始め、体幹間充織から第3-4鰓弓動脈の腹側を経由して第2鰓弓正中側に達し、胎生10.3日には下顎突起中央の正中部に到達することが確かめられた。筋前駆細胞の一部は移住路にあたる体幹間充織でDesmin陽性/MyoD陽性を示す筋芽細胞に分化するが、胎生10.3日前後に筋前駆細胞として下顎突起に到達した。下顎突起内では筋前駆細胞は増殖活性を維持するとともに、多角形に細胞形態を変化させ、正中近傍において細胞突起を伸ばして相互に連結した細胞集団を構成した。舌の初期形態と見なされる外側舌隆起は胎生11.4日前後に非筋系譜の間葉細胞の増殖により形成され、移住してきた筋系譜細胞はこの隆起形成には直接には関与していない。外側舌隆起の形態が明瞭になった胎生11.7日前後に正中溝上皮と連結した筋前駆細胞群に誘導されるように筋系譜の細胞集団は外側舌隆起内に移動する。

舌の形態が一応完成した胎生12.3日では、筋芽細胞は増殖活性を停止して多核の筋管細胞に最終分化する。次年度においては、これらの時空間軸での舌形態形成を基礎にして、microdissection/RT-PCR、リアルタイムPCRにより筋系譜細胞の表現型と分化の制御に関わる遺伝子群の解析を進めていく。舌筋細胞は後頭体節の軸下側筋板の筋前駆細胞に由来し、下顎突起内に移住してきた筋前駆細胞が予定舌領域で筋芽細胞に分化し、次いで多核化した筋管細胞へと分化する。前年度から継続してきた蛍光二重免疫染色法と3次元組織観察により、Desmin陽性/MyoD陰性の筋前駆細胞は後頭体節→体幹間充織→第3-4鰓弓動脈の腹側→第2鰓弓正中側を経由して、E10.3には下顎突起正中部に到達することを明らかにした。この研究成果については、平成17年度歯科基礎医学会優秀ポスター賞を受けた。本年度においてはin vivoでの舌形成の観察と並行して、胎生9.710.5日前後で採取した鰓弓の器官培養モデルを確立した。BGJb培地では上皮細胞層の変性と下顎突起の癒合不全や舌形態への分化抑制をともなうが、DMEM/F12培地は上皮細胞と筋系譜細胞の増殖分化に適していた。in vivoでの舌初期発生と相同して、培養試料(DMEM/F12培地)でも筋系譜細胞の下顎突起正中部への集積、この筋系譜細胞集団内での筋前駆細胞からMyoD陽性の筋芽細胞への分化、細胞集団辺縁に位置する筋前駆細胞と上皮細胞との接触現象も再現できている。ただし、in cultureにおいては下顎突起間葉織での非筋系譜細胞の増殖活性に依存する外側舌隆起の形成誘導、あるいは下顎突起癒合後の舌膨隆も軽度にとどまっている。以上の形態観察から、器官培養系では筋系譜細胞の移住と集落形成、上皮との相互作用を梃子とする舌形態形成の仕組みを再現していると結論できる。ただし、舌組織の成長発育は制限されており、舌形態形成での組織容積の制御に寄与する増殖因子あるいは移住細胞の影響を明らかにする課題が残されている。
生殖細胞の雄性分化におけるRNA制御とその破綻による精巣腫瘍発生の分子機構

マウスNANOS2は始原生殖細胞の性分化において、異所的な減数分裂を抑制すると同時にオス特異的な遺伝子発現を促進することが明らかになっている。しかしながら、NANOS2はin vitroにおいてRNAとランダムに結合することから、その特異性を決める分子機構は不明であった。本研究においては、もう一つのRNA結合タンパク質Dead end1とNANOS2の結合を明らかにし、その生理的・生化学的な意義について解析を行った。その結果、Dead end1がNANOS2のRNA結合特異性を決定することで雄性分化に重要な役割を果たすことが明らかになった。Dead endは脊椎動物間で保存されたRNA結合タンパク質であり、ゼブラフィッシュやメダカにおいて生殖細胞の発生に必須であることが報告されている。マウスにおけるホモログ遺伝子Dead end1(Dnd1)は発生直後の始原生殖細胞に発現し、かつ、そのnull変異個体においては、移動期の始原生殖細胞が劇的に減少することが知られている。このことから、マウスDND1は移動期の始原生殖細胞の発生に重要であることが明らかになっている。しかしながら、生殖巣に到達した後の雄性分化におけるDND1の機能については不明であった。本研究において、申請者はDND1の条件付き欠損マウスを作製し、始原生殖細胞が生殖巣に到達した後にDND1を欠損させた。その結果、精巣性テラトーマを発症することが明らかになった。この結果は、DND1を欠損する始原生殖細胞が分化多能性細胞へと脱分化し、その後に様々な細胞種へと再度分化することによって精巣性テラトーマを発症したと考えられる。そこで、分化多能性細胞を蛍光標識するために、Nanog-GFPトランスジェニックマウスをDND1条件付き欠損マウスへと導入して蛍光を観察した。その結果、DND1を欠損する始原生殖細胞をGFPの蛍光で標識することが可能となった。平成27年度においてはGFP蛍光を用いたセルソーティングによってDND1欠損始原生殖細胞を単離し、その遺伝子発現についえて解析を行う予定である。マウスの始原生殖細胞(PGC)は精細管内で初期胚様細胞へと転換して分化多能性の精巣性テラトーマを形成することがある。しかしながら、生体内でPGCが分化多能性の細胞へと転換するメカニズムの全体像は未だに不明である。私たちは、最近、RNA結合タンパク質Dead end 1(DND1)の条件付き欠損マウスにおいて精巣性テラトーマが発症することを発見した。本研究においては、DND1の機能を解析することによってPGCの分化多能性を制御する機構を明らかにすることを目的とする。そのためにまず、Dnd1条件付き欠損マウスのPGCをEGFPによって蛍光ラベルした遺伝子改変マウスを作製した。このマウスを用いて、Dnd1条件付き欠損PGCをセルソーターによって回収したのちにRNAを抽出し、次世代シーケンスによって遺伝子の発現量を解析した。本解析によって、DND1を欠損させたPGCの遺伝子発現の変化を明らかにした。具体的には、正常なPGCと比較してDND1欠損で発現が上昇する遺伝子を約30個、発現が下降する遺伝子を約10個同定した。同定した遺伝子の中には多能性の制御に関与する遺伝子が含まれており、DND1がそのような遺伝子を転写後に制御することによってPGCの分化多能性を抑制する機構が想像できる。一方で、まったく予想外のGOに属する遺伝子群の変化も観察されたことから、DND1の機能は分化多能性の抑制だけでなく多岐に渡る可能性が示唆された。今後は、DND1とこれらの遺伝子のRNAの相互作用を生化学的に解析することによって詳細な機構を明らかにする必要がある。本研究においては精巣性テラトーマ発症の原因を探索する目的で、Dnd1欠損におけるPGCのトランスクリプトーム解析をかがげていた。当初計画で2年目までにデータを取得する予定であり、その通りに進行していることから、概ね順調に進展していると考えられる。マウス始原生殖細胞は胎児期の精巣内で脱分化・異常増殖して精巣性テラトーマへと転換する場合があることが知られているが、その発症原因の分子基盤については未だに不明である。本研究は、RNA結合タンパク質Dead end1(DND1)の欠損が精巣性テラトーマの発症を誘発することに着目し、DND1が制御するRNA分子機構を明らかにすると同時に、その破綻による精巣性テラトーマ発症のメカニズムを明らかにすることを目標とした。まず、DND1条件付き欠損マウスに、Nanogプロモーターの下流でGFPを発現するトランスジーンを導入したところ、テラトーマ前駆細胞をGFPで標識することが可能となった。また、GFPをこう発現する細胞においてはOct3/4やSox2といった多能性関連因子が高発現することを明らかにした。一方で、これまでにDND1結合タンパク質として同定した遺伝子について、特にDND1と同様のRNA結合タンパク質に着目して解析を行った。その結果、いくつかのRNA結合タンパク質がDND1と細胞質で顆粒状に共局在を示すことが明らかになった。そこで、それらのタンパク質とDND1との結合ドメインを同定し、RNA非依存的にDND1と結合することを見出した。そこで、現在は、それらの遺伝子欠損マウスを作製して、テラトーマ発症の有無について解析を行いつつある。今後はその遺伝子欠損マウスの表現型を解析することで、DND1によるテラトーマ発症機構がより明らかになると考えられる。マウスNANOS