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ホスホリパーゼA_2およびCの触媒機構の解明

1.PLA_2の触媒機構の解明-種々のPLA_2と真の基質,アミド型基質アナログ,およびオキサゾリジノン型基質アナログの結合におよぼすCa^<2+>の影響を調べた結果,I型酵素と真の基質またはオキサゾリジノン型基質アナログとの結合はCa^<2+>に依存せず,アミド型基質アナログとの結合はCa^<2+>の存在によって強められることが明らかとなり,真の基質とオキサゾリジノン型基質アナログの結合様式の類似性が示唆された.また,マノアライド類縁化合物によるウシ膵臓由来PLA_2の不活性化を調べた結果,Lys-56の修飾が,不活性化に関与することが明らかとなった.さらに,新たな種々のアルデヒドテルペノイドによるPLA_2の不活性化を調べた結果,比較的低分子のモノテルペンがLys残基を修飾することによってPLA_2を不活性化することが明らかとなった.次にこの化合物と1級アミンとのモデル反応実験から修飾後の付加物の構造が予測できた.2.PLCの触媒機構の解明-Bacillus cereus菌由来PC-PLCのLyso-PCを基質とする酵素反応パラメーターのpH依存性を調べ,PCを基質として得られた結果と比較したところ,どちらの基質を用いても触媒活性には3つの,基質結合には1つのアミノ酸残基の関与が確認された.しかし,Lyso-PCとPCの間で,基質が結合することによって起こるアミノ酸残基のpKシフトに違いが見られた.また,同菌由来SMaseのmutantであるD126GとD156Gを用いてHNPを基質とする酵素反応パラメータのpH依存性を調べた結果,Asp-126は基質結合と触媒活性の両方に関与し,Asp156はHNPに対する結合や加水分解能を弱めることが明らかとなった.さらにSMを基質に用いて調べた結果,触媒活性には,HNPの触媒活性に関与するアルカリ領域にpK値を持つアミノ酸残基の関与が見られなくなった.1.PLA_2の触媒機構の解明-種々のPLA_2と真の基質,アミド型基質アナログ,およびオキサゾリジノン型基質アナログの結合におよぼすCa^<2+>の影響を調べた結果,I型酵素と真の基質またはオキサゾリジノン型基質アナログとの結合はCa^<2+>に依存せず,アミド型基質アナログとの結合はCa^<2+>の存在によって強められることが明らかとなり,真の基質とオキサゾリジノン型基質アナログの結合様式の類似性が示唆された.また,マノアライド類縁化合物によるウシ膵臓由来PLA_2の不活性化を調べた結果,Lys-56の修飾が,不活性化に関与することが明らかとなった.さらに,新たな種々のアルデヒドテルペノイドによるPLA_2の不活性化を調べた結果,比較的低分子のモノテルペンがLys残基を修飾することによってPLA_2を不活性化することが明らかとなった.次にこの化合物と1級アミンとのモデル反応実験から修飾後の付加物の構造が予測できた.2.PLCの触媒機構の解明-Bacillus cereus菌由来PC-PLCのLyso-PCを基質とする酵素反応パラメーターのpH依存性を調べ,PCを基質として得られた結果と比較したところ,どちらの基質を用いても触媒活性には3つの,基質結合には1つのアミノ酸残基の関与が確認された.しかし,Lyso-PCとPCの間で,基質が結合することによって起こるアミノ酸残基のpKシフトに違いが見られた.また,同菌由来SMaseのmutantであるD126GとD156Gを用いてHNPを基質とする酵素反応パラメータのpH依存性を調べた結果,Asp-126は基質結合と触媒活性の両方に関与し,Asp156はHNPに対する結合や加水分解能を弱めることが明らかとなった.さらにSMを基質に用いて調べた結果,触媒活性には,HNPの触媒活性に関与するアルカリ領域にpK値を持つアミノ酸残基の関与が見られなくなった.1.ホスホリパーゼA_2の触媒機構の解明に関する研究これまでの我々の研究によって、オキサゾリジノン環を持つリン脂質アナログがPLA_2の酵素活性を拮抗的に阻害すること報告した,そこで次に、この基質アナログを基本構造として数種の基質アナログを合成し、PLA_2に対する阻害活性を測定した。その結果,オキサゾリジノン型基質アナログの5員環部分をオキサゾリジノン環,ピロリジン環,またはピロリジノン環に置換した化合物はPLA_2の酵素活性をほとんど阻害しなかった。この結果から,オキサゾリジノン型基質アナログでは5員環部分のケト基とエーテル基の酸素原子が酵素との結合に関与すると考えられた。また、PLA_2活性を阻害したオキサゾリジノン型基質アナログは,オキサゾリジノン環の4位にホスホコリンが結合している.そこで,ホスホコリンの結合する位置を5位に置換した基質アナログを合成し,PLA_2の阻害活性を測定した(このアナログはオキサゾリジノン環の4位と5位に不斉炭素を持ち4種類の光学異性体が存在する。また,5位はリン脂質に置き換えると2位に,4位は1位に相当する)。その結果,4位がRの配置を持つ異性体は,5位の立体配座に係わらずオキサゾリジノン型基質アナログと同程度の阻害活性を示した。

天然のリン脂質では2位の立体配座がPLA_2活性に重要であるが,今回合成した基質アナログはリン脂質の2位に相当する部位ではなく,1位に相当する部位の立体配座が,PLA_2との結合に関与するという結果は非常に興味深い。今後は,この基質アナログとPLA_2との結合様式を明らかにしていく予定である。2.ホスホリパーゼCの触媒機構の解明に関する研究スフィンゴミエリンを加水分解するホスホリパーゼCは一般にスフィンゴミエリナーゼ(SMase)と呼ばれている。我々は,SMaseの触媒機構を解明するために,必須金属であるMg^<2+>との結合について実験を行った。その結果,SMaseには少なくとも低親和性と高親和性の2つのMg^<2+>結合部位が存在し,低親和性部位に対するMg^<2+>の結合のみが酵素活性に影響を与えることがわかった。また,低親和性部位に対するMg^<2+>の結合は酵素と基質との結合には関与せず触媒活性を増大にさせることが明らかになった。さらに,酵素反応パラメータのpH依存性を調べたところ,酵素と基質との結合には1つの解離基が、触媒活性には3つの解離基が関与することがわかった。次に、126番目のAspをGlyに置換したD126G SMaseを用いてWild-Typeの結果と比較したところ,126位のAspはMg^<2+>結合には影響をおよぼさないが、酵素と基質との結合、および触媒活性に影響することがわかった。しかし,酵素反応パラメータのpH依存性の結果からこのAspは触媒活性や基質結合に必須ではないことがわかった。1.PLA_2の触媒機構の解明-オキサゾリジノン型基質アナログを基本構造に持つ種々のリン脂質アナログによるPLA_2の阻害を調べた結果,オキザゾリジノン環のケト基とエーテル基,および4位の窒素原子に結合するアシル基がPLA_2の阻害に重要であり,オキサゾリジノン環の5位へのホスホコリンの置換は,PLA_2とオキサゾリジノン環との相互作用を弱めることがわかった.また,種々のアルデヒドテルペノイドによるPLA_2の不活性化を調べた結果,比較的低分子のモノテルペンがLys残基を修飾することによってPLA_2を不活性化し,この化合物の幾何異性と2重結合の位置が重要であることがわかった.また,モデル反応実験からこのモノテルペンはシッフ塩基生成後,安定な環状構造の付加物を生成することが明らかとなった.2.PLCの触媒機構の解明-Bacillus cereus菌由来PC-PLCのLyso-PCを基質とする酵素反応パラメーターのpH依存性を調べ,PCを基質として得られた結果と比較したところ,どちらの基質を用いても触媒活性には3つの,基質結合には1つのアミノ酸残基の関与が確認された.しかし,Lyso-PCとPCの間で基質が結合することによって起こるアミノ酸残基のpkシフトに違いが見られた.また,同菌由来SMaseのmutantであるD156Gを用いてHNPを基質とする酵素反応パラメータのpH依存性を調べた結果,Asp-156はHNPに対する結合や加水分解能を弱めることが明らかとなった.さらにSMを基質に用いて調べた結果,触媒活性には,HNPの触媒作用に影響をおよぼすアルカリ領域にpk値を持つアミノ酸残基の関与が見られなくなった.この結果から,このアミノ酸残基は,SMaseの触媒作用に本質的に必須でないか,またはSMと結合した酵素の遷移状態複合体におけるpK値が8.5(測定した最大pH)よりもアルカリ性側にシフトした可能性が考えられる.
Tbx5,Tbx4遺伝子の相同性と多様性

これまでの研究からTbx5、Tbx4遺伝子は、それぞれ上肢(wing)と下肢(leg)の形態を規定していることが明らかとなっている。したがって、この2つの遺伝子はその構造状の相同性とは逆に、全く異なった機能を有することが予想された。両Tbx遺伝子はT-domainとよばれるDNA結合モチーフをもつ転写因子であるが、このT-domainの構造は非常によく似ており、DNA認識様式はほぼ同じであることが予想される。このような理由から、Tbx5、Tbx4遺伝子の生物学的機能の差は、DNA結合モチーフというより、そのC末端側にある領域(転写活性化能に関与すると考えられている)の構造状の差であると考えられた。このような観点に立って、本年度は主に、Tbx5、Tbx4のdomain swapと行い、Tbx5のDNA結合ドメインとTbx4のC末端側を有するキメラ蛋白、あるいはその逆の構造をもつ蛋白の機能を解析することに集中した。確たる結論に至るには、まだ実験の例数が足りないものの、Tbx蛋白の機能的な差はC末端側の構造に依っていることが明らかになりつつある。また、本年度は、Tbx遺伝子を幾つかの領域に分割し、それぞれの領域でコードされる蛋白の機能を解析することも行った。同時に、Tbx蛋白のDNA結合様式を分子生物学的に解析するための準備として、それぞれの蛋白を大腸菌に発現させ、精製してgel shift assayを行うための材料を作った。このようなアプローチは、発生生物学的な知見をより性格に論述するために必要不可欠な分子生物学的解析である、今後もより詳しい解析を行うよう、発展させている。
凝集タウの伝播におけるミクログリアの役割の解明

アルツハイマー病(AD)をはじめとするタウオパチーの患者脳では、不溶化したタウタンパク質の凝集体(凝集タウ)が病気の進行に伴って拡大することから、この凝集タウが神経細胞間を伝播することによって病態の進行に寄与する可能性が指摘されている。一方で、ADの遺伝学的危険因子として報告されたTREM2は脳の免疫細胞であるミクログリアによる貪食に関連する分子であり、凝集タウの伝播と蓄積に関与する可能性が高いと考えられる。本研究では、培養細胞や実験動物を用いて凝集タウ伝播モデルを作製し、TREM2欠損や変異の影響を調べることにより、凝集タウの伝播におけるTREM2・ミクログリアの役割解明を目指す。
パソコン・シミュレーション・ゲームによる民事紛争法学教育の実用化研究

(1)インタラクション・プログラムを開発するツール(オーサーウエアー・プロフェッショナル)を使って、民事紛争アクション・プログラムを組む。これにより、これまでは、「あるべき手続」「あるべき解決」「あるべき行動」が紛争処理理論では、求められてきたところがあるが、それに対して、つぎつぎと、どのようなインタラクションの応酬がつづくか。その中で、どうすればベタ-かを考える。そういうことが重要であることを明らかにした。(2)そのための題材として、まず第一に、これまでは、「囚人のゲーム」が紛争シミュレーションの基本パターンと考えられてきたが、それをパソコン上で走らせることによって、そうではないことを明らかにし、「裏切り」を咎める「オフ攻撃」を加えたパターンを基本とした「三択複合反復囚人のゲーム」をプログラム化し、これこそが、ベースに置かれるべきプログラムだとした。(3)つぎに、それを、つぎのような、現実的・具体的な民事紛争に応用する。1遺産分割紛争2詐欺の手口・訪問販売3貸金事件4土地交換事件(4)紛争行動の選択肢として、コミュニケーション拒否・電話・手紙・弁護士利用・内容証明郵便・調停申立・裁判・仮差押仮処分などから、暴力団利用・自殺などまでも含み込む。(5)これらの選択肢をどう動員すれば、相手方はどう出るか。これを繰り返していくうちに、相手方パソコンは、ある程度はランダムに、ある程度は戦略的・計算的に出方を返してくる。そのようなゲーム的なやりとりの中に、「時間」「紛争コスト」も当然織り込まれる。それら全体を視野に置いてゲームを展開してゆくと、これまで考えられてきたような、パイのぶん取り合戦とか、足の引っ張り合い・双方破滅といった紛争行動の考え方ではなく、もっと別の「対抗計算」にもとづいて、紛争行動に撃って出ているかが実体験されてくる。どのようなパソコン上でも(メーカーを問わず)動くプログラムを開発するためのハードとソフトを購入し、インタラクション方式でゲームを展開できる簡単なサブ・プログラムをいくつか作成(プログラム作成ツールは、ウインドウズ上で走るオーサーウエアー・スター(マッキントッシュ版への移行も可能))。これにより、最新のプログラム開発機材により、プラグラマー等の援助を仰がなくてもインタラクティブなプログラムを組むことができることが分かった。尤も、技術的な困難さも如実になった。これは、ウインドウズ上でプログラムを組むことがまだ緒についたばかりのためということと、そのツールのマニュアルが不親切なためである。そこで、東京に出向きそのツールの日本語版開発担当者から直接アドバイスをもらったが、ノウハウは秘密の要素があり、意図的だということが分かった。また、こちらがこう出れば、相手方(パソコン)はこう出る、ああ出る、といった選択肢を羅列し条件づけてゆくだけではなく、合理的な対応予測以外に、相手方の行動にパッと"反応する"形で、即興的に応じてしまう行動がもっと注目されてよいことが分かった。次に、パソコンを使わないゲーム方式の法学教育を試みられてきている方々(萩原金美・太田勝造・和田仁孝・樫村志郎教授や、廣田尚久弁護士)や、アメリカでネゴシエーション教育プログラムを受講された方(佐藤彰一助教授)、各方面の実務家(破産・保全部裁判官・弁護士・司法書士等)から、実践経験に即した幅広い教示を受けた。そして、裁判に関するゲームの部分について、「裁判を楽しくする実験即興劇企画」という題で、「交渉と法」研究会(全国の各法分野の法学研究者・社会学者・心理学者・弁護士・裁判官・司法研修所教官など参加)で報告し、さまざまな角度からの批判を受けた。1インタラクション・プログラムを開発するツール(オーサーウエアー・スター)を使って、民事紛争処理サブ・プログラムを組んできた。

従来は、「(反復)囚人のゲーム」が基本と考えられてきたが、それをパソコン上で走らせることによって、そうではないことを明らかにし、「裏切り」を咎める「オフ攻撃」を加えたパターンを基本としたプログラムにした。それを、具体的な民事紛争(詐欺・訪問販売・貸金・土地交換等)の攻撃防御武器に置き換え、繰り返しパソコン相手に戦えるサブ・プログラムを構築した。2サブ・プログラムとそれらを統合するメイン・プログラムのパソコン画面デザインを作成し、それらプログラムを走らせるためのマニュアルと法学用語解説をパソコン上と印刷物で参照できるようにし、とりあえずは、インターネット上の新潟大学法学部のwwwプラウザ(一部完成、他はβ版を公開中)で公開準備中である。3前記「オーサーウエア・スター」は、個人ユ-スを越える場合、「同・プロフェッショナル」でコンパイルしなければならず、このソフトも購入し、サブ・プログラムから、順次変換中である。4画像データー(仮差押決定・公正証書、内容証明郵便・登記簿謄本(コンピューター作成のものも)、調停・ラウンド・テーブル法廷等)もプログラムに貼り付け、前記wwwプラウザのみならず、CD-ROM化して配布するよう準備中である(CD-ROM作製器は購入済みで順次コピー)。また、文章は作成済みであり、本にして公開できるよう、平成7年度出版助成金も申請した。
有機溶媒にとけるDNA-脂質複合体の作製とフィルム化

本研究は,DNAとカチオン性脂質から脂溶性のDNA-脂質複合体からキャスト法やLangmuir-Blodgett法を用いてDNA二重らせん鎖が一方向に配向した薄膜を作製し,リオトロピックやサーモトロピック液晶としての性質や二重らせん鎖に沿った電子移動材料としての可能性を探ることを目的として以下の成果を得た。1)サケ精子由来のDNA(分子量200万以上)を超音波照射により切断し、分子量10万位の長さのそろったDNA二重鎖を調整した。DNA中のリン酸アニオン量と等モルのジアルキルアンモニウムカチオン性脂質を加えて、DNA-脂質複合体のポリイオンコンプレックスを沈殿として得た。これを有機溶媒-水から再沈殿精製した。ゲルパーミエーションクロマトグラフィー,元素分析,UVスペクトル等からDNA-脂質複合体が有機溶媒中や粉末状態でも安定な二重らせん構造をとっていることを確認した。2)DNA-脂質複合体のクロロホルム溶液をキャストして透明なフィルムを得た。これを一方向に延伸したフィルムの偏光吸収スペクトルやX線回折の結果から,DNA二重鎖が延伸方向と平行に配向していることが明らかになった。3)DNA-脂質複合体のクロロホルム溶液を水面上に展開して単分子膜を作製し,垂直浸漬法によりガラス基板上に累積した。得られたLB膜の偏光吸収スペクトルやX線回折の結果から,DNA二重鎖が累積方向と平行に配向していることが明らかになった。
周期的伸展刺激装置を用いた慢性腎疾患の新しいin vitroモデルの研究

岡山県立大学において、ウシ糸球体内皮細胞由来の培養細胞株GEN-Tをシリコン製チャンバーに播種し、培養細胞伸展システムhttp://www.strex.co.jp/products.htmlを用いて機械的伸展刺激を加える系を構築した。本システムは申請者の所属していた岩手医科大学の研究室で既に稼働中のものであり、チャンバーのコーティングや機械の温度管理などについて最適化がなされている。今回、岡山県立大学で購入した培養細胞伸展システムは、同じメーカーではあるが改良、更新されたモデルであり、特にシリコンチャンバーの処理システムが異なるため、伸展培養の要件を再設定した。その後、伸展刺激により発現誘導された12の遺伝子群についてタイムコース解析、各種メカノセンサーの阻害薬による解析を行い、データの再現性について検討を行った。一方、糸球体高血圧モデルである伸展刺激を受けたGEN-T細胞が何らかの液性因子を放出して、遠隔臓器の内皮機能を傷害する可能性の検討については、最近の研究の動向から、GEN-T細胞由来のエクソソームが関与する可能性が浮上してきたため、エクソソーム解析を行う予定で準備を進めた。これは、伸展刺激を受けたGEN-T細胞と刺激を受けていない同細胞の上清からエクソソーム画分を精製し、ここに含まれるRNAを網羅的に比較解析するものである。エクソソーム解析は次世代シークエンサーを使用して行う予定であるため、現在、別プロジェクトのサンプルを用いて次世代シークエンサーの手法についてデータ解析法も含めて習熟を図っている。培養していたGEN-T細胞の生育が不良となったため、販売元のDSファーマバイオメディカル株式会社から再度購入することとした。しかしながら、同社では在庫および今後の販売予定とも無いとのことで、同細胞株を樹立した東京女子医科大学新田孝作教授に分譲を依頼した。現在、分譲待機中である。このような理由から計画は遅滞しているが、研究手法自体に問題を抱えている訳ではないので、細胞分譲がなされれば研究を進めることができると考えられる。万が一、GEN-T細胞の入手が困難な場合、糸球体内皮細胞の初代培養細胞を購入し、これに伸展刺激を加えることにより得られた培養上清を用いてエクソソーム解析を行う予定である。また、研究計画に示したCKDモデル動物を作成し、血液中のエクソソーム画分についても対象動物のものと比較解析する。今回、岡山県立大学で購入した培養細胞伸展システムは、同じメーカーではあるが改良、更新されたモデルであり、特にシリコンチャンバーの処理システムが異なるため、現在以前のデータの再現実験を行っている。具体的には、伸展培養による細胞およびチャンバーにコートしたコラーゲン膜の形態について検討を行い、伸展培養の要件を再設定した。その後、伸展刺激により発現誘導された12の遺伝子群についてタイムコース解析、各種メカノセンサーの阻害薬による解析を行い、データの再現性について検討を行っている。一方、糸球体高血圧モデルである伸展刺激を受けたGEN-T細胞が何らかの液性因子を放出して、遠隔臓器の内皮機能を傷害する可能性の検討については、最近の研究の動向から、GEN-T細胞由来のエクソソームが関与する可能性が浮上してきた。エクソソーム解析は当初計画には含まれていなかったが、必要と考えられるので伸展培養条件の確認後は早期に行う予定である。培養細胞伸展システムの導入にあたって、設置スペースを確保するために予想以上に時間がかかった。また、機器がバージョンアップされていたことや、岩手と岡山の気候の違いによる冷却効率の違いにより、実験条件を再設定する必要が生じた。このような理由から計画はやや遅滞しているが、本質的な問題を抱えているわけではないので、今後は計画通りに研究を進めることができると考えられる。

エクソソーム解析は次世代シークエンサーを使用して行う予定であるため、現在、別プロジェクトのサンプルを用いて次世代シークエンサーの手法についてデータ解析法も含めて習熟を図っている。培養していたGEN-T細胞の生育が不良となったため、販売元のDSファーマバイオメディカル株式会社から再度購入することとした。しかしながら、同社では在庫および今後の販売予定とも無いとのことで、同細胞株を樹立した東京女子医科大学新田孝作教授に分譲を依頼した。現在、分譲待機中である。このような理由から計画は遅滞しているが、研究手法自体に問題を抱えている訳ではないので、細胞分譲がなされれば研究を進めることができると考えられる。糸球体高血圧モデルである伸展刺激を受けたGEN-T細胞が何らかの液性因子を放出して、遠隔臓器の内皮機能を傷害する可能性の検討については、最近の研究の動向から、GEN-T細胞由来のエクソソームが関与する可能性が浮上してきた。このため、当初計画されていた実験以外に以下のような研究を行う予定である。伸展刺激を受けたGEN-T細胞と刺激を受けていない同細胞の上清からエクソソーム画分を精製し、ここに含まれるRNAを網羅的に比較解析する。同様に、CKDモデル動物の血液中のエクソソーム画分についても対象動物のものと比較解析する。細胞とモデル動物で共通する因子についてさらに解析を行う。万が一、GEN-T細胞の入手が困難な場合、糸球体内皮細胞の初代培養細胞を購入し、これに伸展刺激を加えることにより得られた培養上清を用いてエクソソーム解析を行う予定である。また、研究計画に示したCKDモデル動物を作成し、血液中のエクソソーム画分についても対象動物のものと比較解析する。培養細胞伸展システムの導入にあたって、設置スペースを確保するために予想以上に時間がかかった。また、機器がバージョンアップされていたことや、岩手と岡山の気候の違いによる冷却効率の違いにより、実験条件を再設定する必要が生じたため研究計画がやや遅滞した。分譲が行われれば、予定通りの研究を進めるが、万が一、GEN-T細胞の入手が困難な場合、代替手段として糸球体内皮細胞の初代培養細胞を購入し、これに伸展刺激を加えることにより得られた培養上清を用いてエクソソーム解析を行う予定である。
電子ラマン散乱による電子-イオン混合導電体のイオンダイナミクスの研究

YSZ中の酸素イオンの化学拡散は、少数キャリアーである電子や正孔の自己拡散速度により律速される。我々は、光学的に電子濃度や酸素の拡散速度を調べることを目的に、電子ラマン分光法を用いて、redox-activeなイオンを大量にドープした時の電子捕獲中心のイオン拡散に対する影響を調べた。本研究ではCeをドープしたYSZの還元雰囲気におけるCeイオンの価数変化の酸素分圧依存性をラマン分光法を用いて測定し、その電子伝導機構に対するCeの影響についての解析を行った。その結果、低酸素分圧下においては、より浅い捕獲中心であるYSZのバンドテ-ルの状態密度が減少するため、深い順位にあるCe^<3+>にほとんどの電子が捕獲されていると考えられる。このため、Ce-YSZの全電気伝導度は低酸素分圧下で減少していると考えられる。また本研究では、ペロフスカイト型酸化物SrTiO_3におけるプロトン誘導型の電気伝導を理論的にしらべた。まず、軽いイオンであるプロトンの運動を量子力学的に計算し、酸素ネットワーク上でトンネリングやホッピングが可能な条件をつきとめ、活性化エネルギーや赤外吸収スペクトルの実験データと照合することにより、伝導機構を考察した。その結果、0-0間距離が2.65Åのところで、量子効果(零点振動、トンネル運動)のHとDとの差が最大となり、ホッピングが可能となる条件を満たし、かつそのときRH-H=0.5Åと求められた。この理論結果は、中性子回析とMDシミュレーションの結果を両立させて解釈できるものとなり、プロトン導電体の解明に向けて大きく前進させるものである。
熱帯産アリ類における外分泌腺情報伝達物質の機能解明

アリは他の昆虫類からは想像できないほど多種多様な外分泌腺を持ち、様々な化学物質を生産しているが、その外分泌腺物質の機能や分子構造が解明されているのはごくわずかである。本研究では、アジア熱帯・亜熱帯地域におけるアリ類の外分泌腺物質の機能を明らかにするとともに、長年議論されてきたが未だにその存在や物質的基盤が十分には解明されていない繁殖制御物質・警報防衛フェロモン・自己犠牲シグナル・抗菌物質などについて、その機能と化学構造の解明を目的に研究を実施した。おもな研究業結果は以下のとおり。1.数種のアリ類について、防衛物質を生産する外分泌腺の構造と機能について、実際の捕食者を用いて調査し、その機能を明らかにした。2.沖縄産トゲオオハリアリにおいて、卵巣を発達させた個体への攻撃による産卵前ワーカーポリシングが存在することを示した。体表物質がポリシングの鍵刺刺激である可能性を指摘した。3.社会性昆虫では一般に成虫の齢と繁殖をめぐる闘争の順位に相関があり、アリ類では若い個体ほど順位が高くなるのに対しカリバチ類では、逆に老齢個体の方が順位が高くなる。この現象について、生活史との関連から適応的な説明を与えるとともに、社会性昆虫が互いの余命を体表物質等でアセスしている可能性を指摘した。4.鳥やほ乳動物によって種子が散布される熱帯果樹の種子の生存に対するアリの影響を調査し、アリが果肉部をかじり取る際に何らかの抗菌物質を種子表面に塗り付けているらしいことが実験的に示された。5.アリ捕食者であるアマガエルをもちいた捕食実験を様々な種を対象に実施し、アリの種類によって捕食量が著しく異なることや、カエルは明らかに不味いアリを経験すると、それに外見が類似したアリや昆虫類を避けることが実験的に示された。これによって、アリ類の防衛物質の機能を生物検定する方法がほぼ確立された。本年度は、メンバーがそれぞれマレーシア、インドネシア、香港、沖縄などのフィールドで野外調査を実施し材料の選定と予備観察をおこなった。主な結果は以下の通り。(1)マレーシアにおいて、後胸側板腺が異常に発達しその結果胸部だけが黄色で著しく目立つシリアゲアリの1種Crematogaster inflataの行動と後胸側板腺の形態および分泌物の化学構造を調査し、本種の後胸側板腺分泌物が有毒であること、分泌腺の形態が特異な構造であること、さらに、本種に擬態しているらしいオオアリ、ハネカクシが存在することなどが明らかになった。捕食者を用いた実験によって、オオアリはこのシリアゲアリのベイツ型擬態種であることが示された。これは社会性昆虫におけるベイツ型擬態のはじめての実証例である。(2)香港、インドネシア、マレーシアにおいて、ハリアリ類のいくつかの種で特異な防衛物質を持つものが発見され、それらの分泌源である外分泌腺の構造を明らかにするとともに、機能に関する予備実験を実施した。Myopias属は、すべての種が良く発達した大きな腹板腺をもつことが明らかとなり、その形態・化学・機能に関する研究をおこなった。この腹板腺からは独特の臭気がある物質が分泌され、巣仲間に対する警報フェロモンとしての役割と外敵に対する防衛物質としての役割を持っていることが明らかとなった。(3)アリによる植物の果肉の齧りとりによって、種子のカビによる死亡率が低下することが示され、アリの大顎腺から分泌される物質が抗カビ作用を持っている可能性が実験的に示唆された。また、クリスチャン・ピータース博士とロスリーハシム博士を国際社会性昆虫学会の際に日本に招聘し今後の共同研究などについて討議した。

本年度も、メンバーがそれぞれマレーシアおよびインドネシア、沖縄などのフィールドで野外調査を継続するとともに外分泌腺機能に関する実験をおこなった。主な結果は以下の通り。(1)これまでに各種のアリ類で防衛に機能しているであろう外分泌腺の存在が指摘されているが、分泌物質の生物検定が不十分であった。そこでアリ類を多数捕食することが我々の研究で明らかになったアマガエルが生物検定のモデル生物として利用できるかどうかを室内で実験した。その結果、アリの種類によってカエルの反応や捕食量が著しく異なり、今後の外分泌腺の生物検定に利用可能であることが示唆された。(2)後胸側板腺はアリだけに存在する外分泌腺で、病原菌からアリを保護する抗菌物質を生産することがしられている。トビイロケアリの巣には様々な昆虫寄生性の病原菌が存在し、これが女王死亡後も娘女王が巣を継承しない理由であると考えられるのだが、ここで娘女王の後胸側板腺が巣継承時の感染リスクを下げないか検討するため、この外分泌腺をエナメルで塞いだ若い女王を母巣の巣財とともに室内でロニー創設させた。結果、後胸側板腺コートは女王の感染による死亡率を上げないばかりか、くり返しによっては死亡率を下げるケースもみられた。これらの事実はこのアリに寄生する病原微生物には後胸側板線分泌物は効果的でないことを示ている。(3)トゲオオハリアリにおいて長鎖の体表炭化水素成分が女王物質として機能しているとの仮説を厳密に検証するため、一部の長鎖の体表炭化水素を合成し、アリに塗布し生物検定を試みたが、ポジティブな結果はまだ得られていない。(4)オス間で化学物質をもちいた闘争をするなど行動学的に興味深い現象をしめすハダカアリ属について、熱帯アジアを中心に多種を採集し分子系統樹を作成した。(5)従来報告がなかったアリの体表全体に分布する外分泌腺の構造を記載し発表した。インドネシア・マレーシア・沖縄などの熱帯・亜熱帯地域を中心に昨年度に引き続き現地調査を実施し、それぞれのアリ類の行動生態と外分泌腺構造および分泌物の化学構造の調査を実施した。また辻はヨーロッパを訪問し、共同研究者らと実験・討論した。Billen博士を4月はじめに招聘し、研究代表者と研究内容や発表予定論文の内容を討議するとともに、今後の共同研究のすすめかたなどについて議論した。おもな研究実績は以下のとおり。(1)アジアツムギアリを用いた害虫の生物的防除は熱帯アジアの農業で実用化され今後も有望視されている。スマトラの果樹園において、このアリが果樹の送粉を妨害するという、応用上の難点を持つ可能性を野外調査により指摘した。原因として、アリの攻撃行動あるいは外分泌物による忌避効果が考えられた。(2)食卵による産卵後ワーカーポリシングの存在が示されている沖縄産トゲオオハリアリにおいて、卵巣を発達させた個体への攻撃による産卵前ワーカーポリシングもまた存在することを示した。体表物質がポリシングの鍵刺刺激である可能性を指摘した。(3)社会性昆虫では一般に成虫の齢と繁殖をめぐる闘争の順位に相関があり、アリ類では若い個体ほど順位が高くなるのに対しカリバチ類では、逆に老齢個体の方が順位が高くなる。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)の分子動態と遺伝的背景の解析

本研究は、COPDと気管支喘息発症機構を細胞内シグナル分子の機能解析と制御機構を中心に実施した。計画した遺伝的背景の解析は、学内倫理委員会の承認を受けた後に学外研究機関に症例のDNA配布を申請し、承認を受けたが、研究機関中に配布されなかった。このために、研究計画書に記載した、本研究目的の一部である細胞内シグナル分子の遺伝的多型性の解析は実施できなかったのは残念である。しかし、気道上皮細胞、血管内皮細胞のCOPDと気管支喘息の発症に密接に関係する細胞外刺激による細胞内シグナル分子の活性化機構やその生物学的意義に関して、その一端を解明した。さらに、細胞内シグナル分子、ASK-1ノックアウトマウスを使用し、試験管内で確認されたこの細胞内シグナル分子の機能を生体内での機能確認へと発展させた。ASK-1が分子標的治療の標的分子となる可能性を示唆したが、ノックアウトマウスの成績からはさらにその生物学的機能を確認する必要性が示された。呼吸器系のTLRの機能解析を気道上皮細胞と血管内皮細胞を中心に行い、TLRを会するMAPK経路とNFkB経路の活性化を明らかにした。さらに、その制御を、細胞内シグナル分子の阻害、A20蛋白による阻害と、多方面から明らかにした。従来、炎症の制御に関しては、炎症の発生.にpositiveの関与する細胞内シグナル分子や転写因子の機能を阻害薬などで制御する思考が主であった。本研究は、生体が本来兼ね備えている制御機構に着目し、炎症に関与する転写因子活性化を抑制する蛋白に着目した。その結果、NFkB活性化抑制蛋白であるA20の機能解析を行い、生体内の炎症発生を制御する可能性を示唆する成績を得た。現在、A20発現を遺伝的に操作したマウスでその生物学的意義を確認している。COPDの発症機序の一端を分子生物学的見地から解明する。COPDの発症には喫煙が重要な因子として考えられ、実際に喫煙によるMMP/TIMP産生のアンバランス、酸化ストレスによる細胞傷害など、COPD発症機序が明らかにされつつ有る。さらに、気道感染がCOPDの病態形成に重要であることが指摘されている。気道の感染機構は、粘液/繊毛系、マクロファージ、好中球が挙げられるが、気道感染を監視する機構の詳細は不明であった。近年、獲得免疫に対して自然免疫の概念が確立され、自然免疫でのtoll-like receptor (TLR)とTLRを介するシグナル伝達分子の機能と役割が明らかにされつつ有る。しかし、気道系におけるTLRとそのシグナル伝達機構、シグナル分子機能、など明らかでは無い。本年度は、気道のTLRの機能を明らかにし、TLRとCOPDの病態形成との関連性を明らかにする。成績1.気道のTLR発現:気道上皮細胞にTLR2,TLR4の発現を確認した。1)MyD88,IRAKなどのTLRからNF-kB活性化に至るシグナル分子機構を明らかにするためにdominant negative formを導入し、そのNF-kB活性化に及ぼす影響を解析した結果、これらの分子がNF-kB活性化経路に重要であることを認めた。結論:気道上皮細胞のTLR2,TLR4を介して気道上皮細胞に炎症性転写因子活性化とサイトカイン発現を誘導することが明かとなった。この成績は、COPDの発生にTLRを介した炎症性経路が関与する可能性が考えられ、今後、抗炎症性経路を含めた詳細な解析や遺伝的多型性の解析を実行して行きたい。

昨年度は、気道感染の監視機構としての気道上皮細胞のtoll-like receptor(TLR)とTLRを介するシグナル伝達分子の機能と役割を、気道上皮細胞のinterleukin-8(IL-8)発現を中心に解析した。IL-8は好中球の遊走活性を有し、感染防御に重要な働きを演じているサイトカインであるが、その反面、炎症局所に集積した好中球は組織障害を引き起こすことが知られている。IL-8遺伝子のプロモーター領域にはNFkB結合領域が存在し、IL-8遺伝子発現はNFkBで調節されている。よって、IL-8の2面性、即ち、感染防御と組織障害の双方のバランスをとるには、過度のNFkBの活性化を制御することが重要である。また、COPDの発症に関与するMMP遺伝子発現もNFkBによって制御されている。本年度はNFkB活性の制御に焦点をしぼり、内因性NFkB制御蛋白であるA20の気道上皮細胞での機能を解析した。成績1.気道のTLR発現:気道上皮細胞にTLR2,TLR4の発現を確認した。LPS、PGNによってIL-8発現が誘導され、また、IL-8 promoter活性が誘導されたLPS, PGN刺激によってNFkBpromoter活性が誘導された。LPS, PGN刺激によってA20 mRNA発現が誘導された。5.A20遺伝子導入によるNFkBおよびIL-8 promoter活性への影響A20遺伝子導入によってLPSおよびPGN刺激によるNFkBおよびIL-8 Promoter活性化が抑制された結論内因性NFkB抑制性蛋白のA20は気道上皮細胞のTLR2,TLR4を介した気道上皮細胞に炎症性転写因子活性化とサイトカイン発現を抑制することを明らかした。このような抗炎症性経路を含めた詳細な解析や遺伝的多型性の解析を実行して行きたい。COPDの発症機序の一端を分子生物学的見地から解明する。1生体応答Apotosis-regulating kiase(ASK)-1の機能解析:ASK-1は酸化ストレスで活性化されるレドックス感受性機能分子である。近年、LPSの慢性暴露がマウスに肺気腫様の病変を作ることが明らかにされた。また、LPSは細胞内のASK1を活性化することが明らかにされている。このような成績はLPS暴露がCOPD発症に関与することをしさする。そこで、ASK-1ノックアウトマウスを使ってASK-1のマウス生体内での分子機能を解析した。(1)肺病理組織所見:ノックアウトマウスはwild typeマウスと比べて肺の炎症所見が著しかった。(2)血管透過性:ノックアウトマウスはwild typeマウスと比べて肺血智透過性亢進が著しかった。予想に反してASK-1が生体防御に機能する分子であることが示唆されたが詳細は解析中である。2炎症制御分子のA20気道のウイルス感染はCOPD増悪の原因とで、その制御は重要な課題である。その機構を解析した。(1)インフルエンザウイルス感染によって気道上皮細胞にA20発現が誘導された(2)遺伝子導入されたA20はウイルス感染による気道上皮細胞のNFκB、IL-
ヒト歯根膜組織に特異的に発現する遺伝子の研究

平成13年度の研究で歯根膜組織由来mRNAを基に作製した3'末端cDNAライブラリから約1,700個のクローンを無作為に選出し、DNAシークエンシングを行って各々の塩基配列を決定した。そしてBLASTによる遺伝子検索を行い、それぞれの遺伝子の機能及びその出現頻度を順に列記した歯根膜gene expression profileを作成、解析することにより、in vivoの歯根膜組織において如何なる遺伝子が如何なる頻度で発現しているのかを明らかにした。2.歯根膜組織に特異的に発現する遺伝子の同定上述の歯根膜gene expression profileの解析結果と他の組織・細胞のgene expression profileを比較検討することによって、ヒト歯根膜において特徴的な発現が認められる一方で他の組織では発現が殆ど認められない3'末端配列を選出するとともに、これらの遺伝子の全長の塩基配列クローニングを行った。そして得られた全長cDNA塩基配列にてBLASTによる遺伝子相同性検索を行った結果、新規の細胞外マトリックスタンパク、BMP-2増殖因子のアンタゴニストなど、複数の興味深い遺伝子が単離同定された。さらに、これらの遺伝子の各々に特異的なPCRプライマーを設計合成し、培養ヒト歯根膜由来細胞に対してin vivoで分化誘導を行った際に認められる遺伝子発現パターンを、RT-PCRにて解析した。その結果、ヒト歯根膜由来細胞が分化誘導を受けて硬組織形成能を示す際に、その転写が誘導あるいは抑制される遺伝子が存在することが明らかとなった。すなわち歯根膜組織の増殖・分化機能への関与が示唆され、歯周組織の再生に際して重要な役割を果たしていると考えられる複数の遺伝子の単離・同定に成功した。本年度は歯根膜組織に特異的に発現する遺伝子の同定を目的として以下の実験を行った。まず、便宜抜去されたヒト小臼歯の根面より歯根膜組織を採取し、その半量を用いてmRNAの抽出を行なった。そして得られたmRNAをテンプレートとし、pUC119にoligo-dTを付加したベクタープライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成した。その後、制限酵素MboIを用いてインサートを切り出し、再度pUC119にサブクローニングして歯根膜組織由来mRNA3'末端cDNAライブラリを作成した。この方法によって作成されたcDNAライブラリはインサートに完全長のcDNAを有しているとは限らないものの、ヒト歯根膜由来細胞株から作成したcDNAライブラリとは異なり、細胞培養によって起こりうる遺伝子発現の構成変化を排除することが可能であるため、生体の組織におけるヒト歯根膜細胞の遺伝子発現構成を忠実に反映したものであると考えられる。現在、この歯根膜組織由来mRNA3'末端cDNAライブラリより約1700個のクローンを無作為に選出して塩基配列の決定をなうとともに、得られた塩基配列について遺伝子バンクに登録されている既知遺伝子との相同性検索を行っている。さらに、各クローンの出現頻度をもとに遺伝子発現頻度を解析している。一方、採取した歯根膜組織の半量より、組織検体処理装置を用いて細胞懸濁液を作成し、得られた細胞を10%FCS添加αMEM培地中で培養してヒト歯根膜由来細胞株を作成した。この歯根膜由来細胞株は今後、上述の実験により同定された遺伝子が歯根膜由来細胞の分化増殖や硬組織形成に与える影響を検討するための実験に使用する予定である。
心房細動がもたらす心房筋リモデリングとバイオマーカとしてのmicroRNAの解明

当該研究は、病理組織学的診断のついているメイズ術後洞調律維持群と心房細動再発群の2つのグループを対象として、心房筋リモデリング変化をマイクロRNAを用いて分子生物学的検討を行う。特に心房筋リモデリングのうちで線維化に着目する。平成28年度は、左心耳のホルマリン固定パラフィンブロックからRNA抽出が可能であることを実証した。平成29年度は、研究対象症例のリストアップが終了し臨床学的背景や既存疾患の有無、心機能や形態学的評価を行った。リストアップされた症例の病理組織的診断として心房筋リモデリングの指標として左心耳における線維化を数値化した。平成30年度は、リストアップされた左心耳のパラフィンブロックからRNAを抽出し、NucleoSpin Total RNA FFPE(MN)を用いてRNA抽出を行い,BioSpec-nano (SHIMADZU)による吸光度を測定し、次にQuantiFluor RNA System(Promega)にてRNA量の定量を行った.これらのサンプルうち比較的RNA収量が多かった7検体(SR維持群4例とAF再発群3例)の網羅的アレイ解析を実施した(タカラバイオ社)。AF再発群において2倍以上にup-regulation(p<0.05)している変動遺伝子は491遺伝子であり、既知のものとしてTNNC1・PDLIM5・TECRLが含まれていた。0.5倍以下にdown-regulation(p<0.05)している変動遺伝子は748遺伝子であった。また、同定されたマイクロRNAは(AF再発群において2倍以上にup-regulation(p<0.05)している)、microRNA6776、microRNA4520-1、microRNA7973-2であった。これまで心房細動に関与するmicroRNAの研究は増えてはいるものの,病態を解明するために心房筋の線維化といった病理組織学的なリモデリング変化に着目し,分子生物学的な視点であるmicroRNAの発現を比較検討することに当該研究の意義がある.これまでmicroRNAの抽出は新鮮検体から行うことが通常の手法であったが,本学では既に甲状腺のホルマリン固定パラフィン標本からのmicroRNA抽出する手法が確立されている.この手法を左心耳検体にも応用することが当該研究の肝といえる.まず,平成28年度分の研究では手術時に得られた左心耳のホルマリン固定パラフィン標本を対象とし,RNA抽出が可能かどうか検証をした.その際,古い標本(10年以上前)と比較的新しい標本(1年前)をサンプルとして選択し,経年変化による差の有無も検討した.10μmに薄切した標本からRNA抽出キットNucleoSpintotal RNA FFPE XS(タカラバイオ)を用いてRNA抽出し,吸光度測定を行った後に濃度調整し,PCRを行い比較的長いRNA(18s)が検出されることを確認した.またDNA等の混入もない状態であり,RNAの収量および質は問題ないことを確認した.これまで実施された他の組織(甲状腺など)からのRNA抽出と同一条件で行っても概ね問題はなく,またサンプルの経年変化はないことも分かった.左心耳のホルマリン固定パラフィン標本からRNA抽出に成功した報告はこれまで皆無である.心房細動を合併した弁膜症患者から手術時に得られた病理標本(ホルマリン固定パラフィン標本)である左心耳を対象とし,10μmに薄切した標本からRNA抽出キットNucleoSpintotal RNA FFPE XS(タカラバイオ)を用いてRNA抽出し,吸光度測定を行った後に濃度調整し,PCRを行い比較的長いRNA(18s)が検出されることを確認した.DNA等の混入もない状態であり,RNAの収量および質は問題ないことを確認した.他の組織(甲状腺など)のRNA抽出と同一条件で行っても支障なく,またサンプルの経年変化はないことも判明した.これまでに、斎藤ら(研究分担者)は心房細動患者における心房筋リモデリング変化について病理組織学的検討を行い報告している(Saito, Circ J, 2007; 71: 70-8)。当該研究は、心房筋リモデリング変化をマイクロRNAを用いて分子生物学的検討を行い、病理組織学的診断との相互解析をすることに意義がある。1研究サンプルの抽出:本学で施行された心房細動を合併した弁膜症手術患者の中から手術時に左心耳標本が得られている症例をリストアップした。リストアップされた症例は、臨床情報(年齢・性別・体格・喫煙・糖尿病・心疾患・罹患期間・心機能・左房径・心房波高など)を収集している。2病理組織学的診断:齋藤らの方法に則り、線維化(fibrosis)の程度を数値化して評価した。3マイクロRNA解析:平成28年度の成果として実際に左心耳のホルマリン固定パラフィンブロック(FFPE)からRNA抽出が可能であることを実証した。平成29年度は、リストアップされた症例のうち18症例について、RNA抽出を行った。1)RNA抽出:当初は心筋部位の局在を検討するためにレーザーマイクロダイセクション(ライカ社LMD6000)を用いてサンプル回収を予定していたが、実際のFFPEサンプル量を検討した結果、RNA収量が低く、第一段階として左心耳全体からサンプルを回収し、NucleoSpin Total RNAFFPE(MN)を用いてRNA抽出を行った。

2)RNAの定量:まずBioSpec-nano (SHIMADZU)を用いて吸光度を測定し、次にQuantiFluor RNA System(Promega)にてRNA微量定量を行った。左心耳のホルマリン固定パラフィンブロック(FFPE)からRNA抽出が可能であることを実証した前年度に引き続き、平成29年度は研究対象症例のリストアップが終了し臨床学的背景や既存疾患の有無、心機能や形態学的評価が分析できた。次に病理組織的診断として心房筋リモデリングの指標として左心耳における線維化を数値化した。さらに、マイクロRNAの解析手段として、リストアップされた左心耳のFFPEからRNAを抽出し、定量化する段階まで到達した。当該研究は、病理組織学的診断のついているメイズ術後洞調律維持群と心房細動再発群の2つのグループを対象として、心房筋リモデリング変化をマイクロRNAを用いて分子生物学的検討を行う。特に心房筋リモデリングのうちで線維化に着目する。平成28年度は、左心耳のホルマリン固定パラフィンブロックからRNA抽出が可能であることを実証した。平成29年度は、研究対象症例のリストアップが終了し臨床学的背景や既存疾患の有無、心機能や形態学的評価を行った。リストアップされた症例の病理組織的診断として心房筋リモデリングの指標として左心耳における線維化を数値化した。平成30年度は、リストアップされた左心耳のパラフィンブロックからRNAを抽出し、NucleoSpin Total RNA FFPE(MN)を用いてRNA抽出を行い,BioSpec-nano (SHIMADZU)による吸光度を測定し、次にQuantiFluor RNA System(Promega)にてRNA量の定量を行った.これらのサンプルうち比較的RNA収量が多かった7検体(SR維持群4例とAF再発群3例)の網羅的アレイ解析を実施した(タカラバイオ社)。AF再発群において2倍以上にup-regulation(p<0.05)している変動遺伝子は491遺伝子であり、既知のものとしてTNNC1・PDLIM5・TECRLが含まれていた。0.5倍以下にdown-regulation(p<0.05)している変動遺伝子は748遺伝子であった。また、同定されたマイクロRNAは(AF再発群において2倍以上にup-regulation(p<0.05)している)、microRNA6776、microRNA4520-1、microRNA7973-2であった。左心耳のホルマリン固定パラフィン標本からのRNA抽出可能であることが確認されたため,まず平成29年度は研究対象リストを作成し,以下の分析を行う.1左心耳を用いたmicroRNAの解析:心房細動を合併した弁膜症患者から手術時に得られた左心耳からレーザーmicroダイセクション(ライカ社LMD6000)を用いてRNAを抽出,7900HT Fast Real-time PCRシステム(Applied Biosystem社)を用いて網羅的かつ定量的発現プロファイル比較解析を行う.
情報通信技術の発展を考慮した我が国における流通システムの経済学的分析

本研究では、我が国の流通システムを描写する経済理論モデルを構築することにより、次のような研究成果を得た。第1に、一般的な製造業者にとっての、最適な流通チャネルの選択問題を分析し、どの様な環境下で流通業者を垂直統合すれば良いのか、また直販チャネルを利用すれば良いのか、を明らかにした。第2に、企業内において卸価格の役割を持つ振替価格の分析を行い、どの様な環境下でどの種類の振替価格設定を用いれば良いのかを明らかにした。第3に、国際的な流通システムを想定し、どの様な環境下で並行輸入を認めるならば、より高い経済厚生を達成できるのかを明らかにした。これらの成果は国際学術雑誌、国際学会において公表した。本研究課題の初年度である平成22年度は交付申請書に基づき、我が国の流通システムを念頭に置き、経済学の論理を用いた基礎的なモデリングを行うことに焦点を置いた。もともと流通システムの役割を問う研究は、経済学における組織の垂直的な境界に関する議論と密接な関係がある。その1つとして、特定の経済状況下において、企業は流通を担う機能を垂直統合するべきか、あるいは分離するべきかという二者択一の問題を論じる研究がこれまで存在する。類似した財を供給する企業間が価格面で競争する寡占的な状況下では、企業を垂直分離した方が他企業からの戦略的な反応を和らげることで競争を回避できるために、戦略としては望ましいことが先行研究では知られている。しかしながら組織の境界を決定するタイミングが企業間で異なるときは、こうした先行研究の結果とは逆に、企業を予め垂直統合しておくことが、企業にとって競争優位の戦略となることを示すモデルを構築したことが、第1の成果である。この成果は本年度に研究代表者所属機関のディスカッションペーパーとし、さらに国際学術誌へ投稿した。さらに第2の課題として、移転価格に関する研究を進行させた。一般的に、垂直的に分離された組織間での財の取引は卸価格と呼ばれるが、統合した企業内での部門間の取引価格は移転価格と呼ばれる。企業が組織の境界を決定する際に、特定のコミットメントの行動を取ることで、内部の移転価格の情報を意図的に外部へ伝達することにより、他企業に対する競争優位を保つことが可能となるモデルを現在作成している。こちらの課題は次年度へとつなげる。また、研究代表者による流通システムに関するこれまでの研究論文が、査読付きの国際学術誌に幾つか掲載・出版がなされた。本研究課題の2年目である平成23年度は交付申請書に基づき、経済学の論理を用いた我が国の流通システムを描写するためのモデル構築を継続した。第1に、小売部門を垂直統合した企業内において実質的な卸価格となる、振替価格に関する研究を行った。製造業者がサプライチェーンの調整(coordination)を行う目的で振替価格を手段として用いるモデルはこれまでに様々なものが作られている。本研究では競争的な状況下における、原価基準振替価格設定の役割の分析を行った。潜在的な参入の圧力が存在するとき、全部原価ではなく、直接原価に基づいて振替価格を決定することが、参入を阻止するためのコミットメントとなる状況が存在することをモデルにより示した。また振替価格の決定に関する規制として、独立企業の原則(arm's-length principle)が存在するが、この規制がサプライチェーン内における価格情報を他社にとって観察可能なものにすることにより、企業間が暗黙に共謀する状態を作り出すことを示した。この帰結として、独立企業の原則が課されている時の方がそうでない時と比べ、製品が販売される全ての小売市場で、消費者厚生が悪化することが示された。第2に、国際的な流通システムを想定し、メーカーの承認(authorization)を受けていない商品の並行輸入に関する流通モデルを構築した。商品の情報に関して企業と消費者間で非対称性が存在する状況下では、消費者の嗜好が多様であり、その意味で多数のセグメントに細分化されている時ほど、並行輸入を禁止しない方が、消費者厚生が向上することが示された。これは消費者の嗜好性が強ければ、商品情報の非対称性を解消するために、小売業者は自発的にその情報サービスを提供する誘因を持つためである。以上の具体的な研究成果は「現在までの達成度」に示しているが、今年度は特に研究の進展を得ることができた。本研究課題の最終年度である平成25年度は、我が国の流通システムに関する経済学モデルを構築した複数の研究論文を、国際学会において報告を行い、さらに国際学術誌に掲載し、実績を得ることができた。第1に平成23年度から行ってきた、国際的な流通システムにおける並行輸入に関するモデルを構築した論文が、国際学術誌に掲載された。