hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デジタル位相共役技術を用いた簡便な光複素振幅生成法の3Dディスプレイへの応用

また,本研究で提案する新しい光学系による3次元表示実験の準備として,表示用SLMおよび拡散用SLMの仕様に合った位相分布データ表示を行うプログラムを作成し,3次元表示実験を進めている.本研究で提案する空間クロスモジュレーション法による光複素振幅生成法が,超解像性能を有することを明らかにし,提案法の解析的性能評価については大きく進展したが,当初予定していた基本的な3次元表示実験による性能評価ついて,SLMの仕様に合った位相分布データ表示プログラムの作成などに時間を要し,現在も実験が進行中である.よって,研究はやや遅れていると判断する.当初の研究計画に従い,波長633nmのHe-Neレーザと位相型SLMを用いて,光学系を改良した空間クロスモジュレーション法による3次元表示システムにおける3次元表示の基本的動作を確認する実験を行う.また,3次元CG像表示に対応した3次元表示システムシミュレータおよびデジタルエンコーダの開発を行う.波長633nmのHe-Neレーザと位相型SLMを用いて,光学系を改良した空間クロスモジュレーション法による3次元表示システムにおける3次元表示の基本的動作を確認する実験を行う.(理由)研究協力者との相談の結果,次年度に実施予定の光学実験において計上した予算では不足する恐れが出てきたため,今年度購入予定であった計算用PCの予算を次年度に繰り越すこととした.また,発表予定であった学会に校務の都合で参加することができなかったため,旅費などの支出が抑えられた.(使用計画)光学実験で使用する光学素子と光学素子制御用のPCの購入と,研究打ち合わせと学会発表に伴う旅費に使用する計画である.(理由)現在実施中の光学実験で必要となる実験器具や消耗品などで必要となる予算を確保するために昨年度から繰り越したものである.(使用計画)光学実験で使用する光学素子および観測装置などの購入と,研究打ち合わせおよび学会発表に伴う旅費に使用する計画である.
リアルタイム分子膜厚分布計測装置の開発

本研究は位相シフト技術を駆使し、リアルタイムで分子膜厚の計測を行えるシステムを確立するもので、平成10年から平成11年度の研究期間で以下に示す研究成果を得ることができた。(1)既存のマッハツェンダー干渉計に位相シフト技術を導入し、本研究の予備実験として各種物質の濃度拡散場を観察した。得られたディジタル画像から解像度の検証を行い、同時に物質拡散係数の推定を行った。その結果、現在のシステムではアナログデータをディジタルデータに変換し、さらに圧縮処理を施しているので、分子膜を観察するには更なる解像度の向上が必要であることが確認できた。また、高精度な画像を取得するためには、ノイズの影響も無視できないことが分かった。(2)上記知見より、波面分割精度を高精度化するため、高精度の偏光光学素子を使用して位相シフト画像を得るようにした。また、データ処理過程におけるA/D変換をなくすため、アナログ用のCCDセンサーに代わってディジタル用を使用し、初めてディジタル位相シフトカメラを開発した。(3)また高解像度の画像データを記録するために、新たな記録装置を開発した。この装置は電子ノイズの影響を考慮して10ビットの精度でデータを記録し、1秒間に60フレームの割合で画像データを得る。この画像記録装置とディジタル位相シフトカメラを組み合わせることで、高精度なリアルタイム画像を非圧縮処理で取り込むことができた。(4)位相シフト技術とエリプソメータの原理を応用して、位相シフトエリプソメータの原理を導き、観察セルを開発した。ペルチェ素子を用いてセル内のアルミ蒸着板を高精度温度制御することにより、水の分子膜生成に成功し、観察することができた。以上をまとめると、平成10年から平成11年度の研究期間中に、成果報告書に記載した内容を得るとともに、本研究の目的をほぼ達成した。平成10年度は、本研究遂行において重要な構成要素となる高精度な位相分割カメラを設計し、試作した。波面分割精度を高精度化するために、高精度の偏光光学素子を使用して、ポラロイド型の偏光板に比べて高精度な位相シフト画像が得られるようにしている。更に、ソニーのデジタルビデオカメラのCCD素子を分解し取り付けることによって、デジタル位相シフトカメラを初めて開発した。既存のマッハツェンダー干渉計を位相シフト型に改造し、各種デジタル画像を取り込み、その位相分割精度とデジタル画像の解像度の検証を現在進めている。その結果、現在のシステムではアナログデータをデジタルに変換し更に画像圧縮したものを再生しているので、位相シフト画像は従来の3CCDカメラに比べると格段に向上しているが、分子膜厚を計るためには更なる解像度の向上が必要であることが分かってきた。また、CCDセンサーを分解したことによる電子ノイズの問題も無視できないことが明らかとなってきた。これらの研究成果を基にして、新たな位相シフトカメラを開発し、その位相分割性能とCCDセンサーの精度と画像解像度の検証を行った。それと平行して、10ビットの精度を有する位相シフトカメラと画像データ記録装置を開発し、上記高精度位相シフトカメラと組み合わせることによって、高精度なリアルタイム画像を画像データの圧縮処理をしない状態で取り込むことが出来た。さらに、上記位相シフトマッハツェンダー干渉計を使用して、各種物質の拡散場を高精度で測定し、拡散係数の推定を行い、次年度の膜厚計測システム構築の予備実験とした。以上、本年度の研究目的はほぼ達成されていると考える。平成11年度は、前年度構築した膜厚計測システムを用いて、本研究の目的達成に重要な、画像の解像度について引き続き検証を行ってきた。また平行して分子膜を生成し測定する観察セルの製作も行った。解像度の検証については、平成10年度と同様に濃度拡散場を位相シフト干渉計で観察し、分子膜厚の測定に必要な解像度を確認した。

また平成10年度に開発したディジタル位相シフトカメラと画像記録装置を組み合わせることで、高精度なリアルタイム画像を非圧縮処理で取り込むことができたが、わずかに観察される光学系の誤差について調整を行い、更なる高精度化に向けてカメラ調整及び記録装置の改善を行っている。また画像記録装置には、膜厚測定の実験の際に得られる様々な数値データを画像データ内に記録できるアナログ入力も取り付け、実験環境の改善を試みている。観察セルについては、既存のエリプソメータと本研究の前年度成果で精度確認ができた位相シフト技術を用いて位相シフトエリプソメータの原理を導き、その原理を用いて分子膜厚が計測できる観察セルの設計を行ってきた。分子膜の生成には、水分子の凝縮過程を用いることにし、飽和水蒸気内に蒸着アルミ板を設置して、そのアルミ板を急速冷却することで行う。急速冷却に関して、非平衡熱電素子とコンピュータシステムを連動させた能動温度制御システムを構築し、同温度制御システムの非定常特性を検証した。その結果、非平衡熱電素子を用いることによって高精度な温度制御及び急速な温度変化を与えることが可能であることが確認でき、本拡散セルに適用した。その結果、分子膜の生成に成功し、観察できることが確認できた。以上をまとめると、本年度の研究自的をほぼ達成したといえる。
シロイヌナズナCLV3下流におけるSUMO化タンパク質の網羅的解析

CLE遺伝子は植物の器官に幅広く分布し、幾つかのCLEは重要な働きを示すことが知られる。研究計画開始当初は、茎頂部におけるCLV3遺伝子のシグナル経路にのみ焦点をあてて研究遂行に臨んだが、CLE遺伝子群は発現・ペプチド配列が類似しており、相補的に機能すると考えられ、網羅的に解析しなければ分子機構の解明はできない。そこで、CRISPR法を用いて32種類すべてのCLE遺伝子欠損リソースの樹立を行った。さらに、CLE41とCLE44の二重欠損体を作成して解析して投稿論文の執筆を行い、これらの成果は植物生理学会誌(Plant and Cell Physiology)平成29年11月号に掲載された。本研究課題では、シロイヌナズナを実験生物としてその器官形成における分裂組織の活性調節機構を明らかにするために、特にCLV3ペプチドホルモンのSUMO化に関する作用様式に着目して解析を進めることを計画した。しかし、シロイヌナズナでは、CLV3以外に、CLV3様のCLEシグナル領域をもつ31種類ものCLE遺伝子群が同定されている。これまでの研究結果から、植物体の茎頂・根端分裂組織など様々な領域で複数のCLE遺伝子が発現していることがレポーター解析によって確認され、またCLE遺伝子の強制発現体(Gain-of-function)解析などから、CLV3遺伝子を含め、CLE遺伝子群が非常に複雑に相互作用して、様々な組織の形成を調節することが理解されている。ところが、植物での遺伝子発現様式の解析がレポーター解析にとどまっていることや植物での遺伝子機能欠損技術(Loss-of-function)がなかったことから、どのCLE遺伝子がどこで発現しており、どの組織形成に必須であるかなど、分子生物学的、遺伝学的解析がほとんど進んでいないという問題があった。そこで、本課題ではCLV3遺伝子だけではなく、これらCLE遺伝子群の植物器官形成における分子機構を解明するべく、1CRISPRを用いたCLE遺伝子群の網羅的な遺伝子欠損体の作成と表現型の解析、および2根端部におけるCLE遺伝子群のmRNAの発現様式の解析(Whole-mount-In Situ Hybridization)を計画し、昨年度はその遂行に努めた。さらに、数多くの研究者に利用してもらうことを想定して、CLE遺伝子のあらゆる欠損体を網羅したリソースにするため、他のリソースセンターからもCLE遺伝子改変種を取り寄せ、より充実したリソースの樹立を目指している。多細胞生物は、細胞間で情報のやりとりを行い、各器官の間での相互作用や発生過程における細胞分化や個体としての統一性を保っている。本研究課題では、シロイヌナズナを実験生物としてその器官形成における分裂組織の活性調節機構を明らかにするために、CLV3ペプチドホルモンなどのシグナル伝達系の作用様式に着目して解析を進めることを計画した。特に12アミノ酸からなるCLEシグナル領域をもつペプチド分子である、CLV遺伝子は、植物の様々な器官形成に幅広く、重要な機能を示す。シロイヌナズナでは、CLV3様のCLEシグナル領域をもつ31種類ものCLE遺伝子群が同定されている。これまでの研究結果から、植物体の茎頂・根端分裂組織のみならず伸長中の茎部、葉部、根部など様々な領域で複数のCLE遺伝子が発現していることがGUSライン等のレポーター解析によって確認されており、またCLE遺伝子の強制発現体やペプチド分子を過剰に与える(Gain-of-function)解析などから、CLE遺伝子群が複雑に相互作用して、様々な組織の形成を調節することが理解されてきた。しかし、植物での遺伝子発現様式がレポーター解析にとどまっていることや植物での遺伝子機能欠損技術(Loss-of-function)がなかったことから、どのCLE遺伝子がどこで発現しており、どの組織形成に必須であるかなど、分子生物学的、遺伝学的解析がほとんど進んでいないという問題があった。そこで、本課題ではCLV3遺伝子だけではなく、これらCLE遺伝子群の植物器官形成における分子機構を解明するべく、1CRISPRを用いたCLE遺伝子群の網羅的な遺伝子欠損体の作成と表現型の解析、および2根端部におけるCLE遺伝子群のmRNAの発現様式の解析(Whole-mount-In Situ Hybridization, WISH)を計画し、昨年度はその遂行に努めた。現在のところ、本研究室ではCRISPR法によるシロイヌナズナの遺伝子欠損体が効率よく作成できる段階になっており、これまでに31種類すべてのCLE遺伝子群の遺伝子欠損体の選抜作業が完了し、現在はホモ遺伝子欠損体の作成作業に入っている。一方で、CLE遺伝子群の根端部における発現様式について調査を進めていたが、WISH法による検出は非常に困難であったため、RT-PCR法での解析を完了した。その結果から、レポーター解析により根端部で発現しているとされていた幾つかのCLE遺伝子については、実際には発現がほとんど検出されないことが明らかになった。現在のところ、CLE欠損体リソースが完成されつつあり、すでに数多くの研究室より供与の依頼が申請されている。申請者は平成27年度、7月2月まで産・育児休業を取得したため、当初の予定を超えて進展することはなかった。本研究課題では、シロイヌナズナを実験生物として、その器官形成における分裂組織の活性調節機構を明らかにするために、CLV3ペプチドホルモンなどのシグナル伝達系の作用様式に着目して解析を進めることを計画した。特に、ペプチド分子であるCLE遺伝子は、植物の様々な器官形成に幅広く分布・機能重複を示し、重要な働きを示す。研究計画開始当初は、茎頂部の形態形成におけるCLV3遺伝子のシグナル経路にのみ焦点をあてて研究遂行に臨んだが、CLV3を含むCLE遺伝子群は発現・ペプチド分子機能が非常に類似しているため、これら遺伝子の機能を網羅的に解析しなければ分子機構の解明はできないと考え、まずCLE遺伝子欠損リソースの樹立を目指した。

シロイヌナズナでは、CLV3を含め、CLEシグナル領域をもつ32種類ものCLE遺伝子群が同定されている。当該年度は、CRISPR法による網羅的なCLE遺伝子欠損体作成は順調に進み、CLE遺伝子欠損体リソースが完成した。リソースは学会等を通じて公表し、理研BRCとの連携のもと、数多くの研究者へ供与して共同研究が始まっている。一方で、根端部におけるCLE遺伝子群の網羅的発現解析を行い、RT-PCR法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)の結果から、これまでレポーター解析により根端部で発現していると報告されていた幾つかのCLE遺伝子については、実際にはその遺伝子の発現がほとんど検出されないことが明らかになった。さらに、CLE41とCLE44の二重欠損体を作成して解析し、CLE44欠損体の表現型などの新しい知見を得て、これらのデータを元に投稿論文を執筆中である。まず、根端部におけるCLE遺伝子群の発現様式をRT-PCR法によりまとめて新たな知見を得た。また、作成したCLE欠損体リソースの観察から、CLV3以外のCLE遺伝子の一重欠損体は、ほとんどすべてが顕著な表現型を示さないことが明らかにした。樹立したCLE欠損体リソースが、遺伝子機能解析に十分役立つことを示すために、リソース内での掛け合わせからCLE41/CLE44二重欠損体を作成して表現型を解析した。CLE41とCLE44は同じペプチド配列を有する重複遺伝子であり、CLE41については、胚軸の維管束形成において重要な役割をすることが報告されている。樹立したリソースのCLE41は報告と同様の表現型を示し、今回新しくCLE44もCLE41と同様の表現型を示すこと、さらにはCLE41/CLE44二重欠損体はそれぞれの一重欠損体よりも表現型が亢進することから、このリソースが機能重複のあるCLE遺伝子群の解析に有用である事が示された。これらの結果は、このリソースが今後のCLE遺伝子解析の主軸になることを示すことを意味している。この事をふまえ、現在は、以上の結果を投稿論文に執筆中である。本研究課題では、シロイヌナズナを実験生物として、その器官形成における分裂組織の活性調節機構を明らかにするために、CLV3をはじめ、シロイヌナズナにおける32種類のCLEペプチドホルモンのシグナル伝達系の作用様式に着目して解析を進めた。CLE遺伝子は、植物の様々な器官に幅広く分布・機能重複を示し、その器官形成に重要な働きを示す。研究計画開始当初は、茎頂部の形態形成におけるCLV3遺伝子のシグナル経路にのみ焦点をあてて研究遂行に臨んだが、CLV3を含むCLE遺伝子群は発現・ペプチド分子機能が非常に類似しているため、これら遺伝子の機能を網羅的に解析しなければ分子機構の解明はできないと考え、まず32種類すべてのCLE遺伝子欠損リソースの樹立を目指した。
日本における地域別がん死亡率の将来予測とマッピング・動的表示によるトレンド分析

【背景】都道府県別、臓器別のがん年齢調整死亡率を観察すると、地域により大きな違いがあることが分かる。我々は、この都道府県による背景要因の違いを適当な数理モデルとして表現することにより、わが国における消化器系がん死亡危険度の地理分布を説明できるのではないかと考えた。【目的】本研究の目的は、都道府県別栄養関連指標を用いて、消化器系がん死亡危険度と各種背景要因との関連性に関する数理モデルの構築を行なうことである。【方法】[使用したデータ]がん死亡危険度の指標としては、1999年での臓器別(胃、結腸、直腸、膵臓)SMRを使用した。栄養については、1995-99年における国民栄養調査結果の集計値を使用した。また本研究では、栄養的に偏った人の割合とがん死亡危険度との関連性ついても検討した。[解析方法]刈り込み重回帰分析を行い説明変数の絞り込みを行った。その後、変数間の因果構造を探索するため、グラフィカルモデリングによる検討を行なった。【結果】刈り込み重回帰分析による解析結果のうち、モデルに取り込まれた栄養に関して検討すると、栄養(下側)の方がモデルのあてはまりが良かったものは、男性胃がん、男女性胃がん、男女性結腸がん、男性直腸がん、女性直腸がん、男女性直腸がんであった。栄養(平均)の方がモデルのあてはまりが良かったものは、男性結腸がん、女性結腸がんであった。グラフィカルモデリングの結果、胃がん、結腸がんおよび直腸がんにおいては、病院数との間に乗法的な関係が見られた。膵臓がんでは、総合的社会指標の第3主成分との間に乗法的な関係が見られた。【結論】本研究により、栄養関連指標を用いた消化器系がん死亡に関するモデルの構築を行うことができた。今回開発したモデルを利用することにより、消化器系がん死亡危険度の動向に関する精度の高い将来予測を行うことができるものと考える。本研究の目的は、がん死亡率を予測する数理モデルを開発し、地域別のがん死亡率の将来推計値を得ることである。本研究では、栄養と関連の深い消化器がんに注目し、モデル開発を行なった。目的変数には、胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がんを用いた。膵臓がんは、栄養と直接的に関連しているとはいえないが、対照として採用した。説明変数として栄養データ(エネルギー、たんぱく質、脂質、炭水化物、カルシウム、鉄、食塩、ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンC)を用いた。また、喫煙、飲酒、運動、肥満、医療費、医師数、健康診査受診率、病院数についても説明変数として考慮した。モデル化にあたっては、説明変数の検討とともに、重み変数、マスク率、交互作用項の検討を行なった。結果は以下のようになった。胃がん死亡を説明する数理モデルにおいては、人口10万人あたりの病院数、ビタミンCの摂取、食塩の摂取がモデルに取り込まれた。結腸がん死亡を説明する数理モデルにおいては、人口10万人あたりの病院数、アルコールの摂取、たんぱく質の摂取がモデルに取り込まれた。直腸がん死亡を説明する数理モデルにおいては、人口10万人あたりの病院数、たんぱく質の摂取、運動がモデルに取り込まれた。膵臓がん死亡を説明する数理モデルにおいては、肥満および喫煙がモデルに取り込まれた。これらのモデルの妥当性を考慮するため、残差の分析を行なったが、問題は見られなかった。これにより、本研究により開発したモデルは、がん死亡をよく説明していると考える。
骨格筋における新規糖代謝シグナル伝達機構の解明

我々はadaptor protein, phosphotyrosine interaction, pleckstrin homology domain, and leucinezipper containing 1 (APPL1)が培養骨格筋細胞において伸展刺激による促進的に作用することを見出した。そして、そのシグナル伝達はPKCζ依存性の経路を介し、リン酸化PKCζはこれまで機能が不明であったnon-muscle MyosinIIA(NMIIA)に結合することが明らかとなった。本研究から糖取り込みに新たなシグナル伝達機構(PKCζ-NMIIA依存性)が存在することを見出した。Adaptor protein containing PH domain, PTB domain, and leucinezipper motif 1 (APPL1)が骨格筋培養細胞での伸展刺激に関与することが明らかとなったためAPPL1依存性シグナル伝達機構の解明を行った。まず平成25年実験計画A-2に示したとおり、伸展刺激によるAPPL1の細胞内局在を観察したところ伸展刺激により細胞内から細胞膜近傍に変化することが明らかとなった。計画A-4に示した機能解析目的にShRNAを用いてAPPL1をノックダウンさせたところ、伸展刺激による糖取り込みは著明に低下した。以上からAPPL1は伸展刺激により制御され、糖代謝に促進的に作用することが確認された。そこで計画A-3に予定したAPPL1過剰発現細胞において糖代謝に関与する蛋白の発現を確認したところ、Glut4、AMPK、Akt、GSK-3の何れも発現量に変化は認めなかった。しかし、予想と反して伸展刺激によるAktのリン酸化は低下し、AMPK、PKC zetaのリン酸化が増強されることを見いだした。そこで計画A-1に予定していたリン酸化部位の同定は延期し、計画A-5の通り阻害剤を用いてシグナル伝達機構を検討したところ、伸展刺激によるAPPL1糖代謝促進作用はAMPK依存性ではなくPKC zeta依存性であることを発見した。伸展刺激における糖代謝機構にはカルシウムイオンが重要であることが報告されているが、APPL1シグナルはカルシウムイオン非依存性(PKC zetaはカルシウムイオン非依存性であるため)であることが示唆され、骨格筋での新規糖代謝シグナル伝達機構発見の糸口である可能性があると考えている。培養骨格筋細胞を用いてAdaptor protein containing PH domain, PTB domain, and leucinezipper motif 1 (APPL1)の伸展刺激による糖代謝機構の解析を行っている。昨年度にAPPL1を介した糖代謝促進作用はキナーゼであるPKCzeta依存性のシグナル伝達系であることが判明した。そこでPKC zeta依存性シグナルの解析のため、APPL1を過剰発現させた細胞でのリン酸化PKC zetaに結合する蛋白解析を免疫沈降法、質量分析にて行った。同定された複数の蛋白の解析を行ったところ、興味深いことに伸展刺激のない基底状態ではフォスファターゼであるPP2Aが結合し、伸展刺激によりその結合が乖離すること。さらに伸展刺激により、骨格筋での機能が不明である非筋ミオシンIIaに結合することが明らかとなった。非筋ミオシンIIaの機能を特異的に阻害するインヒビターを用いると、PKC zetaのリン酸化、細胞内局在が変化すること、さらに伸展刺激による糖取り込みが基底状態のレベルまで抑制されることを見出した。以上のことからAPPL1を強発現することによって増強される伸展刺激による糖取り込み機構には、PKC zetaのリン酸化、細胞内局在が重要であり、それらはPP2A、myosin IIaによって制御されていることが明らかとなった。従来知られていなかった骨格筋での新たな糖取り込み機構が存在することが明らかとなり、論文発表を準備している。骨格筋培養細胞(C2C12)における伸展刺激による糖取り込み機構の解明を行った。骨格筋でのインスリン、アディポネクチン刺激による糖取り込み関与するAPPL1(Adaptor protein containing PH domain, and leucinezipper motif 1)に着目した。APPL1を過剰発現させたC2C12細胞を用いて伸展刺激を加えると、糖の取り込みが有意に増加していた。そのシグナル伝達機構を検討すると、PKC zeta-nonmuscle myosin IIa(NMIIA)が重要であることが判明した(前年度までに導き出した結果)。最終年度には、これまで成熟骨格筋細胞での機能が不明であったNMIIAの関与を確定するためNMIIAの機能を阻害する化合物質(Blebistatin)を用いたところ、PKC zetaの局在、リン酸化が抑制され、伸展刺激による糖取り込みを基底状態にまで抑制することを見出した。さらに、その結果を確認するためshRNAを用いてAPPL1をノックダウンさせたところ、伸展刺激による糖取り込みは有意に低下した。つまり、骨格筋での伸展刺激による糖取り込み機構において、APPL1は促進的に作用することが確認され、その下流のシグナル伝達(主にPKC zeta-NMIIA)を介して作用することが明らかとなった。以上を論文にし、現在投稿中である。さらに、本研究を元に伸展刺激によって骨格筋細胞から分泌される糖代謝改善物質の存在が示唆されたため、現在新たな研究を始めたところである。そして、そのシグナル伝達はPKCζ依存性の経路を介し、リン酸化PKC

ζはこれまで機能が不明であったnon-muscle MyosinIIA(NMIIA)に結合することが明らかとなった。本研究から糖取り込みに新たなシグナル伝達機構(PKCζ-NMIIA依存性)が存在することを見出した。骨格筋での新たな糖代謝機構が明らかとなった。これまで骨格筋での機能が不明であった非筋ミオシンIIaの新機能を発見した。現在論文投稿準備中糖尿病今年度研究計画A-1は未実施であるが、その他の研究計画は全て実施できた。予想外の結果を得、興味深い新発見から新規シグナル伝達機構発見の可能性が出てきたため。平成26年実験計画に示したAPPL1結合蛋白の同定とともに、PKC zeta依存性シグナル伝達機構の解明を続けている。平成25年度実験計画A-1を延期したため延期した平成25年度計画A-1を平成26年度実験計画に予定する。
非侵襲的血管粘弾性特性測定装置の開発

本研究は、従来計測不可能であった深部大動脈をも含めた動脈血管の局所的粘弾性特性の非侵襲的高精度計測装置の試作ならびに本装置の臨床応用を試みることを目的とした。開発した超音波微小変位計は、リニア走査式超音波スキャナーと、ディジタル式位相追従機構、管径および管径変化を算出するアナログ式変位算出部、の3部から構成され、測定精度は、拍動性径変化に相当する変位に関しては【10^(-5)】mm、平均径に相当する距離に関しては約0.5mmであり、非侵襲的に十分な測定精度で局所的弾性特性の計測が可能である。健常者61例の腹部大動脈の圧力弾性係数Epの平均は若年群0.99±0.34×【10^6】dyne/【cm^2】(mean±S.D.)、中年群1.55±0.68×【10^6】dyne/【cm^2】、老年群3.80±2.05×【10^6】dyne/【cm^2】で、加齢と共にP<0.001で有意の正の相関を有して増加した。同一の年齢分布を有する冠動脈疾患患者32名(40歳60歳)と健常者42名(40歳60歳)を比較すると、冠動脈疾患群の腹部大動脈のEp値は、1.83±0.75×【10^6】dyne/【cm^2】と正常群のEp値0.99±0.27×【10^6】dyne/【cm^2】に比べ有意に上昇(P<0.001)しており、冠動脈疾患患者では大動脈の硬化性変化の進行の強いことが認められた。血中脂質との関係は、冠動脈疾患群では、Epと血中総コレステロールとの間には有意の正の相関(P<0.01)が認められた。大動脈の硬化性変化には脂質の影響が認められ、大動脈の硬化にも冠動脈硬化と同様の促進因子の存在が示唆された。さらにカテ先型圧力トランスデュサーを併用して直接動脈圧の測定を行うことにより、粘性特性を含めたより精密な血管壁運動の力学的解析が、ヒト生体内の非開胸非開腹下で可能であり、Voigt modelを用いた解析により、粘性位相差(φ)0.087±0.036radin、粘性係数(η)2.34±1.30×【10^4】dyne・s/【cm^2】、loss・modulus(ηω) 1.83±1.01×【10^5】dyne/【cm^2】、Ep 2.02±0.68×【10^6】dyne/【cm^2】が得られた。
タンパク高発現系開発を目指したmRNA安定化機構の解明

本研究は、ミルクタンパクの一つであるカゼインmRNAの安定化制御機構を解明することで、ミルク中タンパク発現系の改良を目指すものである。本年度の成果として以下に報告する。1.カゼインmRNAの高い安定性の維持には、長いpoly(A)tailと3'UTRのARE配列がタンパク複合体を介して相互作用することが必要とされる。単にカゼイン3'UTR部をルシフェラーゼレポーター発現ベクターに組み込んでも高いルシフェラーゼ活性は得られなかったが、ホルモン刺激を加えることでその活性が増加することから、カゼインmRNAの高い安定性を再現するには、泌乳期に特異的に変化するmRNA結合タンパク質の存在も考慮する必要性が示唆された。2.実際に乳腺分化過程における主要mRNA結合タンパク質(HuR、AUF1)の局在変化を解析した結果、乳腺分化に従ってAUF1タンパクの局在が細胞質から核内へ移行していることが明らかとなった。また、乳腺分化のマーカーであるカゼインmRNAの発現増加、c-mycおよびcyclin D1 mRNAの発現低下が見られた。mRNAの安定化は一般に細胞質内で機能することが知られていることから、細胞質からのAUF1タンパクの消失は、乳腺分化過程において何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。3.RNAiノックダウン法を用いて細胞質からのAUF1タンパクの消失を再現することにより、カゼインmRNA発現増加とc-myc mRNAの発現低下の促進が見られ、逆に強制発現を行うことにより、カゼインmRNA発現低下とc-myc mRNAの発現増加が見られた。4.RNA-タンパク免疫沈降法により、AUF1タンパクのc-myc mRNAへの結合は見られたが、カゼインmRNAへの結合は認められなかった。本研究により、カゼインmRNAの安定化機構が明らかとなり、さらに乳腺分化過程においてmRNA安定化機構が細胞分化自体に重要な役割を果たす可能性を示した。今後、より本研究を発展・応用させタンパク高発現系の開発を目指していきたい。1.これまでの我々の研究から、カゼインmRNAの3'非コード領域(3'UTR)には、長いpoly(A)tailと相互作用する部位の存在が示唆されていた。カゼイン3'UTRのDeletionおよびMutation解析により、897-905ntに存在するARE配列がカゼインmRNAの安定性に重要な役割を担っていることが明らかとなった。また、このARE配列にはmRNA安定化タンパクとして知られるHuRタンパクが結合し、さらにHuRタンパクはpoly(A)binding protein(PABP)と複合体を形成することを明らかにした。以上より、カゼインmRNAは長いpoly(A)上のPABPと3'UTR上のHuRタンパクを介してRNA-タンパク複合体を形成することにより高い安定性を維持していると推察された。2.ルシフェラーゼレポーター発現ベクターの3'UTR部を上記カゼイン、持続発現型と予測されるGAPDH、短命型と予測されるIL-10の3'UTRに組み換えを行い、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、カゼイン>GAPDH>IL-10の順でルシフェラーゼ活性が高かった。しかし、組み換え前よりも全体的に活性が低いため、今後は部分的な組み換えを行い高い安定性を示す3'UTR部の改変を進める。3.1の結果より、HuRタンパクがカゼインmRNAの安定性に関与することが示唆されたため、RNAi法を用いHuRタンパクをノックダウンすることでカゼインmRNA発現にどのような影響を及ぼすかの検討を開始した。カゼイン発現に影響を与えそうな他のタンパクについても同様に検討を行っている。4.RNA-タンパク免疫

沈降法により、AUF1タンパクのc-myc mRNAへの結合は見られたが、カゼインmRNAへの結合は認められなかった。本研究により、カゼインmRNAの安定化機構が明らかとなり、さらに乳腺分化過程においてmRNA安定化機構が細胞分化自体に重要な役割を果たす可能性を示した。今後、より本研究を発展・応用させタンパク高発現系の開発を目指していきたい。
周術期心房細動における過分極誘発陽イオンチャネルの病態生理学的機能の解明

平成30年度は、心房細動におけるHCN4の関与について、生体単位で明らかにする計画であった。研究計画に沿って、心房細動の有無によって心房内のHCN4発現分布がどう変化するか、またHCN4の有無によって心房細動発現様式がどう変化するか、それぞれ解析するための準備を行った。1心内心電図電極付きカテーテルを購入し、野生型マウスの心房細動モデルを作成した。セボフルレンによる吸入麻酔下で、野生型マウスが洞調律であることを確認した後に、右内頚静脈から電極付きカテーテルを心房内に挿入した。このカテーテル電極を介し高頻度電気刺激を行ったところ、数秒間の心房細動が記録された。しかし、未だ安定した心房細動が得られていない。そのため、安定した心房細動が記録でき次第、HCN4遺伝子改変マウス心房細動モデルを用いた実験に進む予定である。2対照群1であるHCN4 Lucマウス非心房細動モデルのHCN4発現部位の確認を行った。セボフルレンによる吸入麻酔下にHCN4 Lucマウスの右心房を摘出した。右心房前面で切開しルシフェラーゼ発光イメージングを撮影したところ、洞房結節領域に強いHCN4の発現を認めた。3対照群2であるHCN4抑制マウスにおいて、心房細動モデル作成前の24時間心電図を確認した。イソフルランによる吸入麻酔下に、マウスの皮下にテレメトリー記録用送信器を埋め込み、自由行動下の心電図を記録した。洞不全症候群を認めたが、明らかな心房細動は認めなかった。心房細動モデル作成の安定に難渋しているため、遅延している。経内頚静脈による心房細動モデルの作成が難しい場合は、経食道による心房細動の誘発を試みる。物品購入以外の、旅費・その他を使用しなかったため。次年度は、実験に必要な物品購入に加え、学会発表のための旅費に使用する予定である。
定流量水静圧軸受用の低流量ポンプシステムの開発

昨年度試作性能試験を実施したシリンダポンプを4台製作し、アクリル製の透明テーブルの軸受けに作動流体を供給するシステムを試作した。テーブルは、作動流体の流れを可視化するために、透明なアクリル材料を使用した。作動流他の供給流量はシリンダポンプの送り速度にて制御し、配管中に設置した流量計を用いてインプロセス計測した。テーブルの浮き上がり量は静電容量型変位センサーで測定した、テーブルの質量は9.4Kgであり,これに23.7kgと23.2kgの重りを搭載した.基本的な性能試験を実施し、シリンダ送り速度50mm/min200mm/minの範囲でポンプ1個当たりの流量67270mL/minを得た.重りを搭載しない場合、0.63μm1.46μm浮上した.2つの重り(総質量56.3kg)の場合,0.76μm1.46μm浮上した.流量67mL/min時における前者の静剛性は703N/μm,後者の静剛性は1760N/μmであった.シリンダポンプにより期待通りの性能が得られたため、スクリューポンプによる補備実験は行わない。テーブル積載量を増やして軸受に大きな負荷をかけた際の定流量性能について確認する。もし、定流量性が得られない場合は、適用制御を用いて定流量性を担保する。各軸受けへの配管ごとに圧力計を設置し、搭載質量と圧力、軸受隙間と圧力の関係を計測する。研究成果を学会発表する。低流量範囲で使用する定流量プランジャーポンプを設計し,ステンレス製のピストンを固定し,ステンレス製のシリンダーをサーボモータとボールネジにより駆動するシステムを1台試作した.試作したプランジャーポンプシステムの単体性能を評価した.吐出側を絞ってポンプ内の圧力を変化させた際の定流量性能を測定・評価し,仕様通りの結果を得た.8月に発注したTHK製駆動装置が翌年1月に納入が遅延したため,実験装置の組み立てが遅延し,平成29年度の研究計画の一部が平成30年度にずれ込んだ.今年度中に日程遅れは挽回する予定である.昨年度試作性能試験を実施したシリンダポンプを4台製作し、アクリル製の透明テーブルの軸受けに作動流体を供給するシステムを試作した。1)試作した水静圧プランジャーポンプの性能を詳細に測定する.2)4式のプランジャーポンプを組み合わせた静圧テーブルシステムを試作し,その性能を実験的に評価する.3)試作プランジャーポンプシステムと市販の歯車ポンプシステムの性能を比較評価する.テーブル積載量を増やして軸受に大きな負荷をかけた際の定流量性能について確認する。THK製駆動装置の納入が半年遅延したため,実験装置の組み立てが遅延し,それに伴う消耗品,関連部品の購入が翌年にずれ込んだため.次年度は、スペインで開催されるヨーロッパ精密工学会euspen2019に出席し、定流量ポンプおよび水静圧軸受に関する調査権強雨を行う。また、研究代表者の由井が防衛大学校から神奈川大学に移籍したため、防衛大設備で使用していたデジタル記録計(約60万円)を購入する。
ニッケル錯体のスピンクロスオーバーが切り開く触媒反応

触媒設計により律速段階における活性化エネルギーを低下させる方法だけでは限界がある場合もある。その際には、問題となる律速段階を回避する様に反応経路を設計した触媒反応を検討することが重要となる。本提案研究では、ニッケル錯体のスピンクロスオーバーに着目し、一重項状態とは異なる特徴を有するラジカル的な反応性に富んだ三重項状態のニッケル錯体の反応性を活用する反応経路設計を行い、新規触媒反応の開発を実施した。スピンクロスオーバーによる『two-state reactivity』を活用して反応経路を改変することで高難度物質変換の実現を検討した。"電子効果と立体効果"に加えてスピン状態を考慮した触媒設計と反応経路設計により、ニッケルを用いる触媒反応開発の可能性が潜在的に広がることを明らかにした。具体的には、アルキンのヨウ化アリールによる分子間カルボヨウ素化反応が進行することを新たに見いだした。ニッケル(0)錯体およびビピリジン配位子存在化、種々のヨウ化アリールがアルキンと反応することにより、ヨウ化アルケニルが得られることを見いだした。種々の官能基を有するヨウ化アリールを用いた場合にも、対応するヨウ化アルケニルが得られた。例えば、臭素やホウ素エステル基を有する基質を用いても、目的化合物が得られることを明らかにした。炭素-炭素不飽和化合物のカルボハロゲン化反応による有機ハロゲン化物の新規合成法を開発した。ニッケルを触媒とするアルキンとヨウ化アリールによるカルボヨウ素化反応を基にして反応開発を実施した。反応は『基質の組み合わせ』としては極めて単純ではあるが、未開発の反応である。研究方法として、触媒反応開発とともに、触媒および中間体のNi-K端溶液XAFS測定やEPR測定などの溶液分光測定を行い、これらの結果をもとにして理論化学計算を実施することで反応機構を明らかにした。これまでの研究において、反応開発と理論化学計算および溶液分光測定を組み合わせた研究方法の有効性を示してきた。今後の研究推進方策として、新規触媒反応開発に留まらず、溶液XAFS測定やEPR測定などの分光測定を実施するとともに、これらの結果を活用した理論化学計算を行い触媒機能の解明を実施することで、3d遷移金属錯体を用いる反応におけるスピンクロスオーバーに関する知見を得る。
ホルムアミド保護シングルナノ金属微粒子触媒による高度分子変換法の探求

本研究計画では、担体、保護剤を一切用いることのない、シングルナノサイズ金属微粒子を合成する技術を開発する。また、得られた金属微粒子を用いフィードストックを原料とした超高活性触媒システムへと応用展開するための基盤となる以下の研究を行う。具体的には、ホルムアミド等を溶媒とすることにより、保護剤フリーの条件でのシングルナノサイズ金属微粒子の合成・サイズ制御を行うとともに、シングルナノサイズ金属微粒子のフィードストックを用いた高付加価値的触媒有機変換プロセス合成触媒としての実用化に繋がる研究を実施する。
分解吸収性素材を応用した徐放化栄養因子・麻酔薬による慢性痛治療法の開発

1.【薬剤作成】長期徐放型局所麻酔薬の作成を、京都大学再生医科学研究所生体材料学の教室の協力を得て行った。ポリ乳酸もしくはポリ乳酸とポリグリコール酸の重合体とリドカインを用いて、顆粒状徐放薬とシート状徐放薬を作成した。さらに、群馬大学工学部とも共同でポリデプシペプチドを用いた徐放薬作りを開始した。3.【行動実験】作成した徐放薬を用いて行動実験を行った。250gラットを用い、左後肢に切開を加える術後痛モデルを作成し、坐骨神経周囲へ徐放薬剤の投与を行った。痛みの評価は、機械刺激と熱刺激で行った。コントロール群(未治療群)との比較で、痛み閾値を低下させないことを確認し、さらに徐放されていないリドカインそのものとの比較でも徐放薬としての利点を示すことができた(10、24、48、72時間)。4.【脊髄免疫染色】鎮痛効果を認めたラットの潅流固定を行い、脊髄後角スライスを作成し、痛みのマーカーであるc-fosで免疫染色を行った。リドカイン徐放薬投与群では、コントロール群、リドカインそのもの群に比べて有意にc-fos陽性細胞数が少ないことを確認した。今回の研究を踏まえ、今後硬膜外投与についての実験を開始する予定である。これに関しては、投与薬剤が少なくすむという利点があるため、様々な徐放方法が考えられる可能性がある。さらに、リドカイン以外の鎮痛薬の徐放に関しても開始する予定である。ポリ乳酸もしくはポリ乳酸とポリグリコール酸の重合体とリドカインを用いて、願粒状徐放薬とシート状徐放薬を作成した。ポリマーの分子量や、ポリ乳酸とポリグリコール酸の割合を変えて20種類程度のリドカイン徐放薬を作成した。2.【徐放試験】pH7.4のPBS(phosphate buffer solution)溶液中における薬剤徐放試験を行った。初めのうちに作成したものは、初期のバーストが多かったが、リドカイン濃度を下げ、ポリマーの分子量をあげたシートタイプで比較的長く徐放する薬剤ができた。作成した中で最もゆっくり放出するタイプのリドカイン徐放薬は、分子量90000程度でポリ乳酸とポリグリコール酸の重合体をポリマーとして用いた30%リドカイン徐放シートであった。徐放試験では、24時間で20%、72時間で50%、1週間でほぼ100%放出することを確認した。250gラットを用い、左後肢に切開を加える術後痛モデルを作成し、局所、坐骨神経周囲、硬膜外腔へ徐放薬剤の投与を行った。未治療群と比較して、2時間後から1週間に渡って鎮痛効果を認めた。4.【脊髄免疫染色】鎮痛効果を認めたラットの潅流固定を行い、脊髄後角スライスを作成中である。今後、免疫染色の予定。5.【来年度予定】今後は、さらに臨床で使用可能な薬剤を目指し徐放薬の作成を行っていくと共に、慢性痛、神経因性疼痛モデルなど様々なモデルで鎮痛効果を確認していく予定である。
新しいタイプの単純接触効果-クールな認知とホットな認知をつなげる理論基盤の構築-

月単位のインターバルを挿入して潜在記憶を検出できる確実な実験条件と、同様に、長期インターバルを挿入して単純接触効果を検出できる実験条件の特定を目指し、研究を進めてきた。その結果、まず、意味を同定できないような、ランダムに作成された4秒程度の聴覚刺激を刺激として使った場合、その刺激との遭遇回数の効果を、14ケ月の範囲のインターバルを入れて確実に、また頑健に検出できる条件を確立した。この事実は記憶や認知研究はもちろん、知覚研究等にも多大なインパクトを持つと考えられ、現在複数の雑誌に投稿し始めている。他方、このような聴覚刺激を用いた場合は、逆に、単純接触効果を検出することが非常に困難であることも明らかになった。そこで、長期インターバルをいれ、潜在記憶現象と単純接触効果の両者を同一実験事態で検出できる条件を、これまでの実験結果と独自の理論に基づき種々検討した。その結果、顔の線画のイラスト刺激を刺激とした場合に、好意度と潜在記憶の指標の両者に、1ケ月前の提示回数の効果が有意に検出されることが明らかになった。検出される単純接触効果のパターンも、予測通り、学習回数に対してU字型を示すパターンであった。これまでの研究成果を概観すると、長期インターバルを挿入して両者を同時に検出するために考慮すべき条件もかなり特定できた。潜在記憶の指標には符号化の難しい(もしくは経験量が少ない)刺激を用いることが有効であり、他方、長期インターバル後の単純接触効果を検出するためには、弁別性は高いが、類似した情報との遭遇量が多い刺激を用いることが有効である。顔のイラスト刺激は、その特徴を持った最適な刺激となろう。その他本研究で、コンピュータなどを使わず(集団実験として)、画像データを対象者一人ひとりにランダムに提示し、なおかつカウンターバランスを実施できる、実験冊子の印刷技術が2種類開発されたことも特記される。本年度、インターバル要因を操作し新しいタイプの単純接触効果を検出するために、データ入力が効率的に行えるシステムを作り上げることを、一つの目的とした。その結果、OCRの入力システムを利用し、データ入力を自動化するシステムがほぼ完成した。ただ、開発が遅れたため、本年度はインターバルを統制した実験を実施するかわりに、インターバルが比較的短期間(2ヶ月程度)でも学習の効果が検出できることが明らかになってきた音刺激を用い、実験を実施し、潜在記憶と単純接触効果の相違を検討することを目指した。すなわち、潜在記憶課題(間接再認テスト)を用いた記憶実験では、音刺激を刺激として用いた場合に、極端に大きな学習の効果が2,3ヶ月後に検出できること、およびインターバルが比較的短くても検出できることが明確になってきた。例えば、間接再認テストの指標では、1度の遭遇経験により、2ヶ月後に、指標の変化範囲(それぞれ0.5)の6割8割に対応する変化が確実に検出される。そこで、潜在記憶課題と好意度評定の両者を指標に音刺激を材料にして2ヶ月以上のインターバルをあけ、過去の遭遇回数の影響を複数の実験で検討した。その結果、潜在記憶課題では極端に大きな効果が検出されるが、好意度評定には有意な効果が得られにくいことが明らかになった。潜在記憶と単純接触効果の生起メカニズムが異なる可能性を示唆する結果といえる。また、単純接触効果を検出する上では、無意味な音刺激よりもイラスト刺激を用いることが有効である可能性が示されたといえる。本年度2種類の刺激を用いた実験をそれぞれ複数実施し、長期持続的な単純接触効果と潜在記憶現象が確実に検出できる実験条件を明らかにすることを目指した。まず、これまでの研究で長期持続的な単純接触効果が検出しやすいと考えられるイラスト刺激を用いた2つの実験では、2-3ヶ月のインターバルを挿入した結果、長期的な単純接触効果の検出はできなかった。ただし、それらの実験条件とこれまでの実験条件を比較すると、イラスト刺激のなかでも、好意度の変動幅が小さい刺激(顔)を用いた方が遭遇回数の効果が得られる可能性が高まった。なお、長期持続的な潜在記憶現象は、従来と同様に検出された。もう一つ、無作為に作成されたメロディ刺激を用いた数個の実験では、1、2ヶ月のインターバルをおいた複数の実験で単純接触効果が検出された他、間接再認テストの指標に、1、2ヶ月前の1,2回の学習効果が、非常に(極端に)大きな効果として検出されることが明確になった。長期持続的な単純接触効果と潜在記憶現象の関係を検討する上で、ひとまず後者については、2-3ヶ月前の学習の効果を確実に検出できる実験が実施可能になったといえる。また、長期持続的な単純接触効果の現れる条件として、新たに実験参加者の年齢が関係している可能性も示された。次年度、長期持続的潜在記憶現象を検出する条件が確定された聴覚刺激を用い、長期持続的単純接触効果を検出できる実験条件の特定に焦点をあわせた実験を実施し、両者の関係性の理論的な説明を目指す。

この事実は記憶や認知研究はもちろん、知覚研究等にも多大なインパクトを持つと考えられ、現在複数の雑誌に投稿し始めている。他方、このような聴覚刺激を用いた場合は、逆に、単純接触効果を検出することが非常に困難であることも明らかになった。そこで、長期インターバルをいれ、潜在記憶現象と単純接触効果の両者を同一実験事態で検出できる条件を、これまでの実験結果と独自の理論に基づき種々検討した。その結果、顔の線画のイラスト刺激を刺激とした場合に、好意度と潜在記憶の指標の両者に、1ケ月前の提示回数の効果が有意に検出されることが明らかになった。検出される単純接触効果のパターンも、予測通り、学習回数に対してU字型を示すパターンであった。これまでの研究成果を概観すると、長期インターバルを挿入して両者を同時に検出するために考慮すべき条件もかなり特定できた。潜在記憶の指標には符号化の難しい(もしくは経験量が少ない)刺激を用いることが有効であり、他方、長期インターバル後の単純接触効果を検出するためには、弁別性は高いが、類似した情報との遭遇量が多い刺激を用いることが有効である。顔のイラスト刺激は、その特徴を持った最適な刺激となろう。その他本研究で、コンピュータなどを使わず(集団実験として)、画像データを対象者一人ひとりにランダムに提示し、なおかつカウンターバランスを実施できる、実験冊子の印刷技術が2種類開発されたことも特記される。
神経再生医療を目指した多能性組織幹細胞の単離と神経分化ペプチドによる神経分化誘導

多能性組織幹細胞として、神経幹細胞と皮膚由来間葉系幹細胞を用い、これらの細胞に神経分化誘導活性のある11種類のBCボックス蛋白由来の機能性ペプチド(SOCS1-7, ASB3, WSB2, LRR1, VHL)を細胞内へ導入した。結果として、11種類のペプチドは、分化誘導するニューロンのタイプがそれぞれ異なっておりVHLとSOCS7由来のペプチドは、ドーパミンニューロン,モーターニューロンを分化誘導し、SOCS5由来のペプチドは網膜色素上皮細胞とグルタミン酸ニューロンへと分化誘導した。これらの機能性ペプチドの神経分化メカニズムは、Stat3の分解によると考えられるが、現在、検討中である。本研究においては、まず、多能性組織幹細胞の単離を目的とした。そこで出澤らが報告した、多能性組幹細胞であるトリプシン抵抗性のMuse細胞の単離を行うために、Auto MACS装置を購入して、SSEA-3抗体陽性の多能性組織幹細胞の分離を試みた。しかしながら、Muse細胞の分離は考えていたよりも困難であったため、従来より使用していた多能性組織幹細胞である皮膚組織由来幹細胞をこの研究で用いた。蛋白導入ドメインを結合して合成した神経分化ドメインからなる10種類のBCボックスモチーフ構造の機能性ペプチド(SOCS1-7,ASB3,WSB2,LRR1,VHL)を皮膚組織由来幹細胞へ導入した。これらの機能性ペプチドはあらかじめ神経分化誘導活性を有することは検討ずみであった。ただ、興味深いことに用いた10種類の機能性ペプチドは、分化誘導するニューロンのタイプが異なることを見出した。例えばVHL由来の機能性ペプチドは、主に中脳のドーパミンニューロンを分化誘導するだけでなく、網膜の色素神経細胞の蛋白であるロドプシン陽性細胞を分化誘導することが判明した。また、SOCS4とSOCS7由来の機能性ペプチドは、分化誘導が難しいとされるコリンアセチルトランスフェラーゼ陽性のモーターニューロンを分化誘導することが判明した。これらの結果は、蛍光免疫染色とウエスタンブロットの結果より得られたものである。このメカニズムに関しては、BCボックスモーフのペプチドがelongin BCとelongin Aと拮抗阻害することとアストロサイトへの分化に重要なStat3をユビキチン/プロテアソーム系を通じて分解されること、さらにアストロサイトへの分化に必須のGFAPのプロモーターをメチル化することでニューロンへの分化が誘導されるものと考えられるが、VHLの場合はStat3がユビキチン/プロテアソーム系の基質であると考えられるが、その他のBCボックスモチーフペプチドでは、Stat3以外のStatの別の種類であり、このために分化誘導されるニューロンのタイプが異なるのではないかと考えられる。多能性組織幹細胞のうち、神経細胞へ分化することができて実際に神経再生医療に用いるために使用可能な細胞は、神経幹細胞、間葉系組織幹細胞などである。本研究では、多能性組織幹細胞として、既に単離後、樹立した神経幹細胞と間葉系組織幹細胞の一種である皮膚由来間葉系幹細胞を用いた。これまでの研究でBCボックス蛋白においてはリガンドであるエロンジンBCが結合する部位のアミノ酸配列が神経分化ドメインとして同定されているので、神経幹細胞と皮膚由来幹細胞に神経分化誘導活性のある11種類のBCボックス蛋白由来の機能性ペプチド(SOCS1-7, ASB3, WSB2, LRR1, VHL由来)を細胞内へ導入し、神経特異的蛋白の発現を蛍光免疫細胞化学およびウエスタンブロット法にて解析した。この結果として、11種類の機能性ペプチドは、分化誘導するニューロンのタイプがそれぞれ異なっていたが、神経幹細胞と皮膚由来間葉系幹細胞で分化誘導されるニューロンのタイプは同じであった。具体的には、VHLとSOCS7由来のペプチドは、ドーパミンニューロン,モーターニューロン, GABAニューロンを分化誘導し、SOCS5由来のペプチドは網膜色素上皮細胞とグルタミン酸ニューロンへと分化誘導した。また、SOCS5, 6由来のペプチドは、グルタミン酸ニューロンこれらの機能性ペプチドの神経分化誘導メカニズムに関しては、BCボックス蛋白由来のペプチドが組織幹細胞へ導入されるとエロンジンCと細胞内で結合し、その直後にStatの発現が阻害されることとことから、これらのペプチドがエロンジンBCとエロンジンAとの結合を拮抗阻害することとStat3の分解が神経分化誘導を惹起しているもの考えられた。以上の結果から多能性組織幹細胞を目的の神経細胞へ分化誘導後移植することによる神経再生医療の実現のためにこの研究成果は大いに貢献すると考えられた。I1幹細胞の神経分化ドメインの同定:幹細胞の神経分化ドメインをBCボックスモチーフのアミノ酸配列を含む蛋白群において同定するため、BCボックスモチーフを含む蛋白群を全蛋白質の中から同定し、そのアミノ酸配列を明らかにした。