hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血心の血管新生療法における自家骨髄幹細胞移植の有効性と安全性に関する研究

(結果)IGF-1+BMMSC群では1日後および一ヵ月後の細胞生着数が多く存在し、6時間後のアポトーシスは有意に少なかった。また移植細胞は1ヵ月後も分化せず未分化な形態を維持していた。心筋凍結切片の免疫染色ではIGF-1使用群でホスト由来の心筋細胞と血管の新生が有意に多く認められ、一ヵ月後のホスト心筋梗塞辺縁心筋細胞のアポトーシスは少なく、エコー上でも左室駆出率の改善とLVIDdの拡大抑制が有意に認められた。IGF-1+LY294002(PI3K阻害薬)+BMMSC群ではIGF-1+BMMSC群の効果をすべて欠いていた。Von Kossa染色は陰性であり骨形成は認めなかった。(結論)IGF-1はPI3Kを介して心筋梗塞部位に局所注入したBMMSCの生着を促進し、ホスト由来の心筋細胞、血管の新生といったBMMSC移植の効果を改善した。(目的)我々はかねてより虚血性心疾患に対する自家骨髄細胞を用いた心筋再生に着目し、ブタの心筋梗塞モデルで自家骨髄単核球の有効性を検討してきた。その結果、虚血心筋に細胞移植した自家骨髄単核球が高率に内皮細胞へと分化することを認め、有意な血管新生作用のあることを見出した。しかし、この方法のみでは自家骨髄単核球を心筋細胞に分化させることは困難で、すでに心筋が壊死に陥った領域では血管新生のみで心機能を改善させることに限界のあることが判明した。そこで、我々はin vitroの実験系で骨髄幹細胞が心筋細胞に分化する機序を解明し、in vivoにフィードバックして心筋再生療法を確立すべく研究を行った。(方法)Green fluorescence protein (GFP)発現ラットの骨髄細胞を単独、または新生児ラットから分離した心筋細胞と共培養した。培養5日目の接着細胞数をカウントし、細胞の表現型を各種細胞特異的タンパクに対する抗体を用いて免疫染色した。Insulin-like growthfactor-I (IGF-I)を用いて細胞接着、分化におよぼす影響を観察した。(結論)IGF-1はPI-3K依存性に骨髄由来細胞の増殖を促した。この効果は細胞接着の促進によると考えられた。また、IGF-1は共培養下において骨髄由来細胞の心筋細胞への分化を促進した。この効果もPI-3K依存性であった。以上の成績からIGF-IはPI3Kを介して骨髄細胞の心筋細胞への接着と心筋細胞への分化を促進することが示唆された。骨髄幹細胞の分化と増殖に関する機序を解明し、心筋再生療法の有効性と安全性を検討すべく実験を行った。まずGreen fluorescence protein発現ラットから採取した骨髄幹細胞を用いてin vitroにおいて分化と増殖に関るシグナルを検討した。その結果、骨髄幹細胞の接着にphosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)が重要な役割を果たし、骨髄幹細胞の増殖に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。また、PI3Kの活性化は骨髄幹細胞のアポトーシスを抑制し、その生存にとっても重要であることが判明した。さらに、PI3Kは骨髄間葉系幹細胞のself-renewalに関っており、これを抑制すると骨芽細胞、平滑筋細胞や心筋細胞といった種々の間葉系細胞に分化することを発見した。次にラットの心筋梗塞モデルにおいて骨髄間葉系幹細胞移植の有効性と安全性を検討した。移植した骨髄間葉系幹細胞は心筋梗塞巣に集積し定着したが、それらのほとんどは1週間以内に死滅した。また、移植した骨髄間葉系幹細胞の大部分に骨芽細胞のマーカーであるosteocalcinの発現がみられ、これに伴って一部の心筋では石灰化が認められた。移植後1ヶ月で施行した超音波心エコーでは心機能の有意な改善は得られなかった。以上の結果から、現行の骨髄間葉系幹細胞移植法はその有効性が乏しいのみでなく、心筋の骨化を促して心機能に悪影響をおよぼす危険性が示唆された。一方、PI3Kを移植後も持続的に活性化させた骨髄問葉系幹細胞は生存率の向上と骨化抑制が期待され、骨髄間葉系幹細胞移植法に新たな展開をもたらすと考えられた。
旧石器時代の動物骨に関するタンパク質考古学的研究

本研究課題は、旧石器時代から新石器時代にかけての新・旧人類の交代劇や狩猟、牧畜、農耕といった人類の動物利用に関する文化史を解明する上で必要な、動物種の正確な判定によって本領域の研究に貢献することが求められている。旧石器時代の動物骨ではDNAが分解によって失われていることが多く、動物種の判定にはタンパク質として残存する可能性が最も高いコラーゲンのアミノ酸配列解析が有効である。骨に含まれるI型コラーゲンが経年劣化を受けにくい最大の理由は、2本のα-1鎖と1本のα-2鎖が絡まりあった強固な3重鎖構造にあると考えられる。それにもかかわらず、平成29年度に行なったヨルダンのTor Hamar遺跡から出土した約5万年前の動物骨からはコラーゲンが全く検出されなかった。本年度は、同じTor Hamar遺跡の3万から3万5千年前の動物の歯についてコラーゲンの抽出と動物種の判定を試み、従来の約6倍に試料の量を増やし、質量分析もMALDI法に加えてnanoLC/ESI-MS/MS法を用いることで15の資料中4つの検体からコラーゲン由来のペプチドを得ることができた。そのうち資料JQ-T15の歯からヤギに特異的なペプチドを得たため、この歯については動物種がほぼ確定した。この分析を行うにあたって、質量分析によるアミノ酸配列解析において残基質量(113 Da)がロイシンとイソロイシンと等しいヒドロキシプロリン(Hyp)を判別するために、Hypやセリン(Ser)などのOH基を無水酢酸ーギ酸混合液でホルミル化し、質量を28 Da(CO分)増加させる方法を開発した。この方法は、最初に試みたアゼルバイジャンのギョイテペ遺跡から発掘された8千年前のヒツジとヤギの骨で有効であることが明らかとなり、3万から3万5千年前のコラーゲンにも有効であったことから、今後より年代を遡る考古遺物中の動物骨(歯)への適用が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は、主に西アジア地域の発掘調査で採集された動物骨のコラーゲンのアミノ酸配列解析を行った。特に、新石器時代のアゼルバイジャンのギョイ・テペ(資料番号を“Goy"で示す)およびハッジ・エラムハンル・テペ(資料番号を“Hac"で示す)で発掘されたヒツジまたはヤギの骨、Goy-4、Goy-6、Goy-9、Hac-7などについては、既に形態観察とミトコンドリア(mt)DNAによる予備的な同定が行われ、その結果Goy-4はヤギ、Goy-6とGoy-9はヒツジと判定されている(Kadowaki, S. et al. 2017)。未だmtDNAの解析結果が得られていないGoy-6については、今回のアミノ酸配列解析の結果からヒツジに特異的な配列(ウシおよびブタと一致するがヤギおよびシカとは2残基に変異をもつα2鎖934-966残基のペプチド)を確認し、形態観察と一致する結果を得た。資料Hac-7は形態観察からはヒツジ、mtDNA分析ではヤギと、異なる同定結果が得られていたが、Hac-7から抽出したコラーゲンのトリプシン分解物の中から、アミノ酸配列がヒツジに特有の配列AGEVGPPGPPGPAGEK(α1鎖918-933残基)を持つペプチドを発見したことにより、形態観察の結果が支持された。Hac-7の質量分析においてコラーゲンの質量分析とmtDNAの塩基配列解析と異なる結果を得た原因として、種の判定に使うmtDNAの塩基配列が同一の動物種の中でも異なるために必ずしも動物種を正確に反映せず、互いに似通ったヒツジとヤギのmtDNAが増幅の過程で混同される可能性もあることなどが考えられる。このほか、イランのムシュキ遺跡(6000 BC)のガゼルの骨を分析した結果、同じウシ科のウシとは異なるアミノ酸配列をもつペプチドを発見し、質量分析によるアミノ酸配列解析の有用性を示すことができた。計画当初は、古代の動物骨や皮革から抽出した膠のコラーゲンを対象として、質量分析によるアミノ酸配列解析を行い、動物種を同定する、および同定するための新しい方法を開発することが目的であった。昨年度から共同研究として始めた旧石器時代から新石器時代にかけての動物骨の種を同定するための研究で、I型コラーゲンのα1鎖とα2鎖の全2000残基におよぶ配列中、わずか4残基のみが異なるヤギとヒツジを区別する必要が生じた。形態観察の結果、既にヤギまたはヒツジであることがほぼ確実な資料とともに、小さな破片状で形態からは判別できない資料まで、通常の質量分析法にペプチドの末端アミノ酸の化学的標識法を駆使した結果、問題の4残基中3残基を含むペプチドが検出できたため、すべての資料の動物種の判定に成功した。このほか、同様な手法により、考古学資料でしばしば問題となる同一種に属するウシ、シカ、ガゼルのコラーゲンについても、いくつかのマーカーとなるペプチドを検出することができた。これらの成果により、約1万年前の動物骨については形態からの種の判定が不可能で、DNAが完全に失われた資料でも、コラーゲンが残存していれば、質量分析によって動物種の判定が可能であることを実証した。この点において、本研究が「当初の計画以上に進展している」と判断した。

また、本新学術領域の研究会やA02班内の議論において、骨以外に歯のエナメル質にもコラーゲンが長期間残存している可能性が示唆され、さらに歯石にもコラーゲン以外に当該動物の摂食行動を反映するタンパク質が残留している可能性が出てきた。本研究が分析対象とする考古資料は、当初の計画では骨に含まれるコラーゲンにほぼ限定されていたが、こうして人類の行動により直接的に関係する可能性の高いタンパク質を分析対象とすることによって、新人文化形成プロセスの研究の推進により深く貢献できると期待される。本研究課題は、旧石器時代から新石器時代にかけての新・旧人類の交代劇や狩猟、牧畜、農耕といった人類の動物利用に関する文化史を解明する上で必要な、動物種の正確な判定によって本領域の研究に貢献することが求められている。旧石器時代の動物骨ではDNAが分解によって失われていることが多く、動物種の判定にはタンパク質として残存する可能性が最も高いコラーゲンのアミノ酸配列解析が有効である。骨に含まれるI型コラーゲンが経年劣化を受けにくい最大の理由は、2本のα-1鎖と1本のα-2鎖が絡まりあった強固な3重鎖構造にあると考えられる。それにもかかわらず、平成29年度に行なったヨルダンのTor Hamar遺跡から出土した約5万年前の動物骨からはコラーゲンが全く検出されなかった。本年度は、同じTor Hamar遺跡の3万から3万5千年前の動物の歯についてコラーゲンの抽出と動物種の判定を試み、従来の約6倍に試料の量を増やし、質量分析もMALDI法に加えてnanoLC/ESI-MS/MS法を用いることで15の資料中4つの検体からコラーゲン由来のペプチドを得ることができた。そのうち資料JQ-T15の歯からヤギに特異的なペプチドを得たため、この歯については動物種がほぼ確定した。この分析を行うにあたって、質量分析によるアミノ酸配列解析において残基質量(113 Da)がロイシンとイソロイシンと等しいヒドロキシプロリン(Hyp)を判別するために、Hypやセリン(Ser)などのOH基を無水酢酸ーギ酸混合液でホルミル化し、質量を28 Da(CO分)増加させる方法を開発した。この方法は、最初に試みたアゼルバイジャンのギョイテペ遺跡から発掘された8千年前のヒツジとヤギの骨で有効であることが明らかとなり、3万から3万5千年前のコラーゲンにも有効であったことから、今後より年代を遡る考古遺物中の動物骨(歯)への適用が期待できる。現在までに海外からのタンパク質を含む考古学資料は数だけでなく年代や地域についても予想以上の広い範囲で集まっている。また、これまでの膠や骨などのコラーゲンに加えて歯や革紐など、新たに試料の抽出法と調製法を個別に確立して対応することが必要となった。さらに、資料の数量の増大に伴って、分析操作が複雑で解析に長期間を要する年代の古い(1万年以上前の動物骨や極端に量が少ない壁画片など)も増えている。これらの困難に対応するために、分析方法の改善と新たな実験方法の開発は、当初の計画通り進めなければならない。具体的には質量分析の感度向上のためのペプチドの化学修飾法の開発と、コラーゲンに特有の問題である、ヒドロキシプロリン(Hyp, 113.0582 Da)と質量がほぼ等しい113.0946 Daのロイシン(Leu)とイソロイシン(Ile)を化学的に区別するための方法の開発を進めたい。後者の問題は、高分解能の“Orbitrap"のような質量分析装置によってHypとLeu/Ileの違いが識別できるまでに装置の性能が向上しているが、本研究ではより汎用性の高いMALDI質量分析装置で容易に区別する方法の開発により対応したい。また、考古学
セラミックスー金属接合部の機械的特性評価に関する研究

セラミックスー金属接合部の信頼性を高めるため、接合部の機械的特性をいかに合理的に評価するかについて研究を行った。得られた研究成果を要約すると以下の如くである。1.セラミックスー金属の接合において良好な接合部を得るための基本的問題として、熱応力特性を理論的、実験的に明らかにした。セラミックスー金属接合部に発生する熱応力は接合された両材料のヤング率比と、線膨張係数の差で一義的に定めることが出来、寸法に関しては相似則が成立することが明らかとなった。さらにこの熱応力を低減する方法として中間層を挿入する方法以上に接合界面形状を変化させる方法を提案し、その有効性を実験により確認した。2.熱応力を低減したセラミックスー金属接合部を製作し、その強度評価を曲げ試験により行った。熱応力を低減した場合でも接合部には何等かの欠陥が含まれており、これを起点として破壊が生じていた。そのため接合部強度は低く、またその値に非常に大きなバラツキが生じた。このことより接合部の強度評価は接合部には何等かの欠陥が含まれているとの前提で、破壊力学的に行うべきだということが明らかとなった。3.破壊力学的パラメ-タとしてJ積分値を取り上げ、き裂を含む異種材料接合部のJ積分におよぼす接合材のヤング率、接合部形状、さらに中間層のヤング率、中間層の厚さ等の影響を数値シミュレ-ションにより明らかにした。そしてこれらの結果から、任意の材理の組合せ、および任意の形状の接合部のJ積分値を簡単の求めることが出来る算定式を導出した。これを用いると実験で得られた、強度特性を定性的に説明できた。分後定量化し、接合部の機械的特性評価の確立をはかりたい。セラミックス-金属接合部の機械的特性評価を行うにあたって、まず接合部近傍に発生する熱応力特性を明らかにする必要がある。そこで本年度は接合部近傍に生じる熱応力特性を明らかにし、この熱応力を低減する方法について検討し以下の結果を得た。1.基本的な知見を得るため、異種材料を接合した場合に生じる熱応力に関しての弾性理論解析を行った。そして熱応力に関するパラメ-タを整理し、このパラメ-タを用いて異種材料接合部に生じる熱応力を、定量的に評価できるようにした。その結果、熱応力は接合部の長さで無次元化すると相似則が成立すること、接合材のヤング率比が0.5程度で熱応力が最も大きくなることなどを含めて熱応力におよぼす各種要因の影響を明らかにすることが出来た。2.実際の問題として窒化ケイ素とCy-Mo鋼をCu系ろう材を用いてろう付け接合した縦手を対象とし、接合部近傍に生じる熱応力の解析を行った。そして熱応力・残留応力におよぼすろう層の厚さおよび接合部形状の影響を明らかにした。さらにその結果を用いて接合部の熱応力を低減することのできる最適ろう層厚さおよび最適接合部形状を求め、従来の縦手んに比べて15%熱応力が減少することを理論的に明らかにした。3.上記理論解析結果の妥当性を確認するため窒化ケイ素とCy-Mo鋼の接合実験を行った。従来の縦手では熱応力のみで窒化ケイ素に割れが発生していたが、本研究の理論解析から得た接合形状では割れは発生しにくく、熱応力が実際に低減されていることが確認出来た。前年度の研究で、セラミックスー金属接合部の熱応力特性を明らかにし、熱応力を低減した接合部が得られるようになった。そこで本年度は熱応力の低いセラミックスー金属接合部について機械的時性評価をどのように行うべきかについて検討し以下の結果を得た。1.アルミナとステンレス鋼をアルミろう材で高温真空ろう付けした接合部の機械的特性評価を曲げ試験により行った。

さらにアルミナとアルミナをアルミろう材で接合した接合部についても特性評価試験を行った。熱応力を低減した接合部でも、接合部には何らかの欠陥が含まれ破壊はその欠陥を起点として生じていた。そのため接合部強度はかなり低く、またそのバラツキも大きかった。したがってセラミックスー金属接合部には何らかの欠陥が含まれているのを前提とした破壊力学的手法による特性評価を行うのが望ましいことが明らかとなった。2.セラミックスー金属接合部のように異種材料接合部にき裂が存在する場合の応力拡大係数はK_IとK_Jが同時に存在し複雑となるので本研究ではJ積分に注目した。そして材料A(ヤング率E_A)と材料B(E_B)を中間層材C(Ec)を用いて接合したモデルを対象にJ積分値を有限要素法を用いて計算した。このような場合のJ積分値はE_B/E_A、Ec/E_A、中間層C材の厚さdの関数として一義的に定められることを明らかにした。そしてこれらの値が与えられた場合のJ積分値が簡単に求められる計算式を導出した。異材接合部のJ積分値は中間層の材質が軟らかく厚さdが厚いほど大きくなる。この傾向より上述の実験結果で中間層の厚さdが大きいほど強度が低くなるという結果を定性的に説明することが出来た。なお定量的検討は今後の問題である。
複合材料におけるミクロ-及びマクロ的界面強度解析手法に関する研究

ガラス繊維複合材料を用いて、複合材料中の強化繊維-マトリクス界面の接着強度を求めた。一般に、引き抜き強度が最も高く、せん断強度はその1/31/2程度であり、垂直方面強度はその中間のレベルを示した。この実験結果をもとにハイブリッド型数値解析により、界面剥離強度をシミュレーションした。界面の接合力はバネ要素により表現し、3次元方向にバネ要素を配置し、その応力が実験より求めた強度(σ^*またはτ^*)に達した瞬間、バネは切断され、その剛性を失うものとしてモデル化した。数値解析より求められた界面剥離挙動は実験で求められた結果と良く一致しており、マクロ場における複合材料の界面強度を"FEM-BEMハイブリッドバネモデル"で解析する有効性が確認された。ミクロ場の解析は以下のような方法でおこなった。強化繊維分子とエポキシ樹脂分子を分子動力学法にしたがってモデル化し、分子場で引張力、せん断力を加えてその挙動を求めた。ただし、エポキシ樹脂分子については、その構造が複雑であるうえ、実際はゲル化して大きな分子となっていると考えられているため、本研究ではミクロゲルとして扱うことにし、分子量数の大きなミクロゲルが、鎖状に連結したモデルとした。まずガラス分子鎖とエポキシ樹脂分子(ミクロゲル)の架橋率による界面強度の変化を求めた。このとき界面ではガラス繊維とミクロゲル分子鎖が1対1の比率で整合的に分布するモデルについて解析を行った。この整合モデルに垂直応力とせん断応力を負荷した解は、架橋率により界面強度が放物的に変化する挙動を示した。また界面の粗さが強度に与える影響について、繊維層に凹凸が分布するモデルについてMD解析をおこなったところ、界面粗さが増大するにしたがい、せん断方向強度には顕著な増加がみられた。初年度の研究ではまず実験により複合材料中の強化繊維-マトリクス界面の接着強度を求めた。3種類の試験片(垂直方向強度σ^*、せん断方向強度τ^*試験片、および引き抜き強度試験片)を用い、ガラス繊維布とエポキシマトリクス界面の接着強度データを求めたところ、一般に引き抜き強度が最も高く、せん断強度はその1/3-1/2程度であり、垂直方向強度はその中間の強度レヴェルにあることが確認された。この実験結果をもとに有限要素法と境界要素法を併用した、いわゆるハイブリッド型数値解析により、界面剥離強度をシミュレーションした。マトリクス-強化繊維界面の接合力はバネ要素により表現し、3次元方向に弾性バネを配置し、その応力が実験より求めた強度(σ^*またはτ^*)に達した瞬間、バネは切断され、その剛性を失うものとしてモデル化した。数値解析により求められた界面剥離挙動は、実験で求められた結果と良く一致しており、マクロ場における、複合材料の界面強度を"FEM-BEMハイブリッド-バネモデル"で解析する手法の有効性が確認された。さらにこの手法を、分散型モデルコンポジットの破壊解析に適用し、破壊の発生から剥離亀裂進展、マトリクス割れ、最終破断にいたるモデルコンポジットの破壊の全プロセスをシミュレーションした。またこれと同一のモデルによる破壊実験をおこない両者の結果を比較検討した。解析による複合材料の破壊プロセスは、実験における破壊挙動を良く再現しており、マクロ的な複合材料界面の強度解析は本手法が極めて有効となることが示された。マクロ的な界面強度評価については、引き抜き試験を行ない、界面強度を求めた。マトリクスはエポキシ樹脂(ビスフェノール型エポキシ)を用い、強化繊維としてはEガラス繊維による、ロービングクロス、ガラスクロス、チョップストランドマットの3種類を用いた。試験片としては以下の3種類のものを用意した。(1)引張り接着強度試験、(2)引張りせん断接着試験、(3)引抜き試験。

これらの試験を実施した結果、引張り接着強度σはせん断接着強度tauより20-30%高目の値となった。また引き抜き強度tauはσ、tauのいずれよりも高く、それらの2倍ほどの値を示した。さらにグラスクロス-マトリクス界面よりもロービングクロス-マトリクス界面のほうがいずれの接着強度も高く、またチョップ繊維-マトリクス界面はその中間の値を示した。さらに有限要素法を用いて、マトリクス-強化繊維界面の接着強度を理論解析したところ、界面に沿って応力の匂配が現れ、複合材料の界面強度は、従来の界面方向の平均的物性値を用いては正確な剥離挙動が理解できないことが示された。一方、ミクロ的なアプローチについては、分子動力学法による、プログラム開発を行った。その方法は、界面におけるガラス繊維分子(Si原子集合)をランダムに分散させた内部に、方向性を持つ分子状鎖CH_2-CH-CH_2を埋め込み、分子鎖の一方に力を与えた場合の、挙動を解析する方法を試みている。現在のところ、プログラムソフトの基本ができあがり、本研究の最終年度(平成10年度)にその結果を求める計画である。ガラス繊維複合材料を用いて、複合材料中の強化繊維-マトリクス界面の接着強度を求めた。3種類の試験片(垂直方向強度、せん断方向強度、および引き抜き強度試験片)を用い、ガラス繊維布とエポキシマトリクス界面の接着強度を求めたところ、一般に、引き抜き強度が最も高く、せん断強度はその1/31/2程度であり、垂直方向強度はその中間のレベルを示した。この実験結果をもとに有限要素法と境界要素法を併用した、いわゆるハイブリッド型数値解析により、界面剥離強度をシミュレーションした。マトリクス-強化繊維界面の接合力はバネ要素により表現し、3次元方向にバネ要素を配置し、その応力が実験より求めた強度(σ^*またはτ^*)に達した瞬間、バネは切断され、その剛性を失うものとしてモデル化した。数値解析より求められた界面剥離挙動は実験で求められた結果と良く一致しており、マクロ場における複合材料の界面強度を“FEM-BEMハイブリッドバネモデル"で解析する有効性が確認された。ミクロ場の解析は以下のような方法でおこなった。ガラス強化複合材料界面においては、ガラス分子鎖の集合体の間隙にエポキシ樹脂分子が進入し、両者が複雑に混合しあうことにより、界面の強度が発生する。まずこのモデルの有効性を確かめるため、ガラス分子鎖とエポキシ樹脂分子が1対11対5の比率で整合的に分布するモデルを考え、解析を行った。解析手法は分子動力学(MD)を用いた。この整合モデルに垂直応力とせん断応力を負荷した解は、混合比率により界面強度が放物的に変化する挙動を明らかにした。またガラス分子鎖と樹脂分子がランダムに混合しあうモデルについてもMDにより解析をおこなっている。
Src相同領域から成る連結分子Ash/Grb2を介した情報伝達経路の解明

我々と別のグループが発見したアダプター蛋白質Grb2/Ashは、細胞外から受容体に伝わった刺激をRasなどに伝えるという、シグナル伝達系の鍵となる連結分子のひとつである。我々は昨年度に引き続き、その機能の解析を更に進めた。まず、Ashに対する抗体を細胞に微量注入する実験を発展させ、以前我々が明らかにしたAshの細胞膜ラフリングへの関与がインスリン刺激に際しても存在することを示した。また、GST融合蛋白質や免疫沈降法を用いてAshと他の蛋白質との相互作用を調べ、上流側では、AshのSH2ドメインは、刺激を受けてリン酸化された上皮成長因子受容体の特定のチロシン残基に直接、また別のチロシン残基にはShcを介して間接的に結合することを明らかにした。一方、下流側では、AshのSH3エドメインはRas蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子であるSos、ミクロチュブール結合性GTPaseであるダイナミンのほかに、新規分子N-WASP、シナプトジャニンに会合することを見出した。また、cDNAライブラリーを念入りに再スクリーニングすることにより、Ashにはスプライシングの違いにより生成したサブタイプが存在することを発見し、タイプによってそのSH3ドメインに結合する下流分子に違いがあることを示した。このように、Grb2/Ashを巻き込んだ複雑な分子間相互作用のネットワークを明らかにしたことにより、Ashを介したシグナル伝達系の解析は相当程度進展し、その生理的役割の解明に向けての重要な知見が得られた。現在我々はさらに進めて、AshのSH3に結合する蛋白質を包括的に検索するという作業を進めているが、完全なSH2ドメインを持ち、転写制御因子様の配列を含む新規分子など、Ash下流で働くシグナル伝達分子と思われるクローンが得られたので、それらについて解析を進めている。最近われわれと別のグループが発見し,解析を進めているアダプター蛋白質Grb2/Ashは,細胞外から受容体に伝わったシグナルをGTP結合蛋白質に伝えるという,シグナル伝達系の鍵となる連結分子のひとつであることが分かってきた.その機能をさらに明らかにするため,われわれは,Ashに対する抗体を細胞に微量注入する実験を進め,以前われわれが明らかにしたAshの細胞膜ラフリングへの関与がインスリン刺激に際しても存在することを示した.また,GST融合蛋白質や免疫沈降法を用いてAshと他の蛋白質との相互作用を調べたところ,Ashの下流側では,Ras蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子であるSosのほかに,新規分子C3Gが発見され,またミクロチュブール結合性GTPaseであるダイナミンがAshに結合することが見出され,AshとGTP結合蛋白質あるいはそれらの調節分子との相互作用のますます多様であることが明らかになった.一方,上流側では,Ashは神経成長因子の作用発現に関与しているにも関わらず,刺激を受けてチロシン残基がリン酸化されたその受容体Trkには直接結合しないことが分かり,Ash/Grb2を介したシグナル伝達系がさらに複雑であることが示された.このように,Grb2/Ashを巻き込んだ分子間相互作用の解析は充分に進展し,その生理的役割について重要な知見が得られたと思われる.われわれはさらに進めて,2種類のDNAをベクターに組み込み,コードするペプチドを発現し,その2分子間の相互作用を検出するというシステムを活用することによってcDNA発現ライブラリをスクリーニングし,Ashに結合する未同定の蛋白質を包括的に検索するという計画を進めているが,これまで知られていなかったAshに結合する思われる分子がいくつか得られたので,それらのcDNAクローンについて解析を進めている.我々と別のグループが発見したアダプター蛋白質Grb2/Ashは、細胞外から受容体に伝わった刺激をRasなどに伝えるという、シグナル伝達系の鍵となる連結分子のひとつである。

我々は昨年度に引き続き、その機能の解析を更に進めた。まず、Ashに対する抗体を細胞に微量注入する実験を発展させ、以前われわれが明らかにしたAshの細胞膜ラフリングへの関与がインスリン刺激に際しても存在することを示した。また、GST融合蛋白質や免疫沈降法を用いてAshと他の蛋白質との相互作用を調べ、上流側では、AshのSH2ドメインは、刺激を受けてリン酸化された上皮成長因子受容体の特定のチロシン残基に直接、また別のチロシン残基にはShcを介して間接的に結合することを明らかにした。一方、下流側では、AshのSH3ドメインはRas蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子であるSos、ミクロチュブール結合性GTPaseであるダイナミンのほかに、新規分子N-WASP、synaptojaninに会合することを見出した。また、cDNAライブラリーを念入りに再スクリーニングすることにより、Ashにはスプライシングの違いにより生成したサブタイプが存在するを発見し、タイプによってそのSH3ドメインに結合する下流分子に違いがあることを示した。このように、Crb2/Ashを巻き込んだ複雑な分子間相互作用のネットワークを明らかにしたことにより、Ashを介したシグナル伝達系の解析は相当程度進展し、その生理的役割の解明に向けての重要な知見が得られたと思われる。現在我々はさらに進めて、AshのSH3に結合する蛋白質を包括的に検索するという作業を進めているが、完全なSH2ドメインを持ち、転写制御因子様の配列を含む新規分子など、Ash下流で働くシグナル伝達分子と思われるクローンが得られたので、それらについて解析を進めている。
外部因子に対応した選択的複製系の再構成

膨大な抗体分子の中から目的の抗原にのみ結合する分子を選択する仕組みは本来的にヒトの中に備わっているが、これを試験管内で人工的に再現する技術は十分に成熟していない。個々のDNA分子そのものを反応容器として考えるという全く新しい発想により既存の技術の主な制約(取り扱える元の分子集団数の限界)を桁外れに拡大させる挑戦的な新技術を提案し、実現の可能性について実験的に検討した結果、いくつかの要素となる技術は可能であることを示すなど、再構成に向けて有意義な知見を得た。本研究は外部因子に依存して特定の配列をもつプラスミドが複製・増幅される系の構築を目的としている。前年度(平成23年度)の結果より、効率的な複製には1.高純度な再構成系の構築、2.指数関数的な増幅機構の導入、3.複製開始因子のスプリット化が重要であることが明らかになったため、本年度は各々の準備を進めた。1.H23年度はクルードな抽出液を用いて検討を進めたが実用的な効率という観点からは夾雑するDNAase活性が障害であった。そのため、平成24年度は既知の18種のタンパク質因子について単独発現系を用いて高純度の精製品による再構成系構築の検討を進め、多くの成分について高純度標品を得た。単独で不溶性で高純度品を得られなかった一部の因子については複合体発現系での高純度品調製の検討を進めた。2.指数関数的な増幅のためには、「複製の開始、伸長、娘プラスミドの分離、娘プラスミドの複製開始」といった一連のサイクルを完全に再現すればよいため、近年明らかになってきた大腸菌由来の天然の分離装置XerC/XerD/FtsKの導入と再構成の検討を進め、各因子について発現を検討したところ、いずれも良好な発現が確認された。3.複製開始因子RepAタンパク質のアミノ酸配列から2次構造予測および天然変性領域の探索を行い、スプリット化のサイトとして有力である構造非形成と予測される領域で断片化されたRepAを多数設計し、それぞれN末断片とC末断片の発現を検討を行ったところ、いずれも良好な発現が確認された。本研究は特定の外部因子(低分子化合物またはペプチド)に応答して、膨大な遺伝子ライブラリーからその外部因子に親和性の高い有用抗体分子をコードする遺伝子DNAのみが選択的かつ自発的に自己複製することで結果として有用抗体分子のスクリーニングが自動的に行われる系の構築を目指した。自身をコードする遺伝子のみ複製開始する酵素(複製開始酵素RepA)が知られており、この天然の仕組みをそっくり試験管内で再現し、かつ、開始された複製反応を継続して目的の遺伝子を増幅し、その上で外部因子に対応する複製開始酵素のみを活性化する仕組みを整える予定で検討を進めた。複製開始酵素RepAに関連する複製分子複合体(レプリソーム)及び複製された娘プラスミドを分離する仕組みは多くのタンパク質が一体となって働くため、その再構成のためには多種類(20種以上)のタンパク質の高純度・高濃度品が必要なため、種々の発現系を構築し検討した。多くのタンパク質は高純度品が得られた反面、中には物性が極端に悪く種々の検討にもかかわらずどうしても純度の低いものや収量の低いものしか得られなかった。そのため完全な再構成系による実用性の検討は今後の課題となった。他方、天然の機能の一部をより単純な酵素で代替するという発想の転換により、機能性タンパク質を変性することない温度(37°C以下)で複製反応を継続する方法について予備的な検討を行った。本研究で得られた知見により、選択的な自己複製系による有用抗体分子などのスクリーニングの実用化に向けた検討が加速することであろう。本研究では外部因子に依存して特定の配列をもつ配列が選択的に複製・増幅される系の構築を目的としている。本年度はその要素技術である、(1)選択制の付与のための複製開始因子RepAの発現系と、(2)実用化の要となる試験管内複製反応の高効率化の準備を行った。(1)は以下を実施した。RepAの発現系は、Cis-特異的な複製開始因子RepAの無細胞タンパク質合成系での発現系を構築し、実際に沈殿画分に効率よく発現されることを確認した。このタンパク質のスプリット化には試行錯誤と時間を要することが予想されたため、まず酵素相補アッセイによる迅速なスクリーニング系の立ち上げを検討し必要な準備を進めた。ポジコンとなる既知スプリットタンパク質と既知結合タンパク質の組でアッセイ系を動かして正常な動作を確認した。また、結合タンパク質として抗EGFR抗体の単鎖抗体MR1-1の準備を行った。これらの要素と(2)に述べる複製評価系を組わせることでRepAの最適なスプリット化酵素を得る準備がほぼ整った。(2)は以下を実施した。

試験管内複製系は、既知の試験管内複製系を参考にして必要となるタンパク質因子、夾雑するDNA分解活性の測定、複製産物のReal Time PCRによる評価系などの準備を進めた。本系は完全な再構成系ではなく一部にクルードな抽出液を用いることもあり、持ち込みのDNA分解活性により正味の増幅量が少なくみられることが分かった。また、本系は時間とともに線形に増幅する系であるため、多大なライブラリーから希少分子を選択増幅するためには、今の仕組みで反応時間を延長しただけでは原理的に不十分であり、新たに指数増幅ステップの導入などの対策が必要であることが分かった。複製開始因子RepAおよびそれ以外の複製を構築する因子群および分離酵素群からなる高効率な完全複製再構成系の再構築するためには高純度品を得る必要があるが、因子の多くは安定かつ可溶性に存在し高純度品の調製が容易に達成できたが、一方で、一部の因子は不溶性や不安定など単独での高純度品を得るという観点では物性が悪いことが分かった。単独で高純度品の準備が容易ではない場合には、複数因子の複合体として高純度品を準備することが定法であるが、構成する因子数が数十という多因子であるため、構成する因子数の掛け算で生じる複合要因の検討のための実験を進めている。要素技術の準備と既知方法の改善点の洗い出しは当初の予定通りの進行で概ね達成しているが、各要素の組み合わせでの評価が未実施であることと、既知方法の弱点と改善計画が明らかになったため、上記の評価とした。単独で高純度標品が得られていない一部の因子について、安定な複合体を形成することが知られているパートナー存在下での発現と、同時に複数因子の発現を行う共発系の検討を進め、複合体発現系での高純度品調製の検討を更に進めることで高純度の再構成系により複製効率の評価系を構築する。この評価系により、複製の開始、伸長、娘プラスミドの分離、娘プラスミドの複製開始といった一連のサイクルの各工程での効率を評価して各工程の効率化する。特に律速となる工程が明らかになれば、その工程を特に重点的に効率化・改善することで系全体としての高効率化を実現する。複製開始因子RepAのスプリット化については既に構築済みの発現コンストラクトから、同じ評価系により最適なコンストラクトを探索する。スプリット化RepAと複製系のシステムの構築後は、単鎖抗体の可変領域にランダム変異を導入した単鎖抗体の可変領域にランダム塩基を導入したライブラリーを発現させ、スプリット化RepAをレポーターとして用いた酵素相補アッセイにより、特定のペプチドエピトープを特異的に認識する単鎖抗体遺伝子とそうでない遺伝子の増幅挙動を分析することで選択性と増幅効率の実証実験を行う。これまで準備を進めてきた要素技術を完成させるとともに、その組み合わせを検討する。実用的なシステム構築には、指数増幅と選択性とがキーとなる。文献ではプラスミド複製の開始に必須な要素の多くは同定されているが、その複製効率は投入した鋳型量と同程度以下と低効率である。また、増幅の機構から線形の増幅であり、単純にそれを再現して反応時間を延長しただけでは実用上不十分であり意味がない。本研究では、ライブラリーから特定の因子を選択的に増幅することが趣旨であるため、実用的に十分高効率化な複製系を目指して、新たに指数増幅するステップの導入検討を推し進める。高い選択性のためには、よいスプリット化RepAの探索が鍵となる。
「磯焼け」鉄原因説に迫る

日本各地の沿岸海域で起きている「磯焼け」の鉄原因説について、溶存鉄化学種に関する平衡論と実試料分析からの検証を行った。低濃度Fe(II)のオンサイト分析のために開発した固相分光法により、山地渓流水中の数ppbレベルのFe(II)を現場で定量できた。また、Fe(II)を保存するためにCO2を用いた独自の採水方法を確立した。降雨に伴う増水時に河川水中のFe(II)濃度はほとんど低下せず、川底付近の貧酸素条件となった高濃度Fe(II)を溶存する水塊が増水時に短時間で海域まで供給され、それが沿岸域の溶存鉄源になっている可能性が高い。前年度、速やかに酸化されるFe(II)を測定するための固相分光法によるオンサイト分析法を確立し、山地渓流水においてもFe(II)が数ppb存在することを現地で確認した。ただし、Fe(II)の酸化を防ぐことができれば、研究室まで試料を持ち帰り、より性能の良い装置を用いた定量が可能となる。そこで、測定までの試料の保存法について検討を行った。二酸化炭素を試料に溶解させればpHと酸素分圧を低下させることができ、Fe(II)の酸化を抑制できることをオンサイト分析により確認した。二酸化炭素溶解後、1時間以内にろ過をし、pH 2にするFe(II)の固定法を確立できた。この方法を用いて河川の溶存鉄のスペシエーション分析を行い、河川底層には貧酸素状態の局所的還元環境があり、そこにFe(II)が高濃度で存在していることが分かった。多々良川水系の河口より約2 km上流の雨水橋において平水時(流量1 m3/s:2013年12月6日)と増水時(流量74 m3/s:10月11日;170 m3/s:10月24日)の溶存鉄のスペシエーション分析を行った。主要成分はほとんどが増水時よりも平水時のほうが高かったが、Fe(II)濃度はそれぞれ5、13、16 ppbと、増水時のほうが高くなった。平水時に河川底層に存在していた溶存鉄が増水により、河川全体に混合されたためである。博多湾へのFe(II)フラックスは平水時よりも増水時のほうが100倍以上大きくなることが分かった。新日鐵住金との共同研究として、長崎県壱岐および大分県名護屋湾において、鉄肥料の施肥効果の有無を確認するために溶存鉄スペシエーション分析を行った。施肥を行った海域ではFe(II)濃度が高いことはわかった。近年,沿岸域の藻場が消失する“磯やけ"が深刻になってきている.その原因の一つとして,陸域からの溶存鉄(おもに有機錯体)の供給量の減少があげられている.とくに洪水時に河川を通じて供給されるFe(II)濃度が減少したことがその原因であるという作業仮説を立て,Fe(II)を現場でN2雰囲気化で固定し,研究室に持ち帰ってただちに分析する手法を確立した.1,10-フェナントロリンを呈色試薬として用い,試料25 cm3中のFe(II)を呈色錯体としてMuromac AG 50W-X2陽イオン交換樹脂0.06 cm3に濃縮し,その光吸収を通常の分光光度法で測定する固相分光法で定量を行った.溶存全Feは,ヒドロキシルアミンでFe(III)を還元した後に同様の操作で定量ができた.検出限界(3σ)はFe(II) 0.07 μg dm-3と全Fe 0.09 μg dm-3であった.多々良川水系九州大学農学部附属福岡演習林および雨水橋,室見川において平水位および降雨後の増水時の採水を行った。得られた測定結果から,通常の酸素分圧下ではほとんど存在しないと考えていたFe(II)が,山地渓流水中でも数μg dm-3レベルで存在することがわかってきた.リターなどが堆積した淀みでは局所的還元環境が存在するためであると推定できた.さらに,人為的な有機汚濁の程度が高くなる中流域の淀みでは,数十μg dm-3のFe(II)が検出された.また、降雨時には流量は増加しているにもかかわらず,515 μg dm-3のFe(II)が溶存することが確認された.そこで,沿岸域でのFe(III)ー有機錯体形成のための鉄のソースは河川の底質や淀みの下部に蓄えられたFe(II)であり,増水時にFe(II)が海域に短時間に供給され,酸化される過程で有機錯体となっている可能性が高いことが明らかとなった.最終年度に実施した研究の成果:福岡市多々良川、室見川および長崎県壱岐市幡鉾川において平水時と降雨増水時に溶存鉄のスペシエーション分析を行った。

また、壱岐島の磯焼け、健全、鉄施肥実験海域において溶存鉄スペシエーションの季節変化を追跡した。いずれの河川においても降雨による増水時にFe(II)濃度は10 μg dm-3以上であり、増水時でもFe(II)濃度は低下しなかった。壱岐健全海域において、降雨に際して河川から供給されたと考えられるFe(II)濃度の増加が観測された。多々良川から博多湾へのFe(II)供給量は、総降水量100 mmを超える降雨イベントにおいて100 kgオーダーに達することがわかった。研究期間を通じて実施した研究の成果:日本各地の沿岸海域で起きている「磯焼け」の原因の一つとして河川から海域への溶存鉄供給量の減少が挙げられている。河川水中における主要溶存鉄はおもに腐植酸とのFe(III)有機錯体であるが、それらは河口域で凝集沈殿する。したがって、沿岸海水中の溶存鉄は海水中で生成したFe(III)有機錯体であり、そのためには海域でFe(II)が存在する必要がある。とくに増水時に河川を通じて海域へ供給されるFe(II)の役割が大きいという作業仮説をたて、観測による実証を試みた。酸素存在下で速やかに酸化されるFe(II)を保存するためにCO2を用いた独自の採水方法を確立し、Fe(II)を流れ分析法で迅速定量するとともに全鉄をICP-MSで定量することによって、鉄のスペシエーション分析を行った。さらに、河川から海域への溶存Fe(II)供給量を見積もった。河川の底質や淀みの下部の貧酸素条件となった水塊にFe(II)が高濃度に存在し、増水時に短時間で海域まで供給され、酸化される過程で有機錯体となることで、沿岸域の溶存鉄源になっている可能性の高いことが明らかとなった。分析化学・地球化学全体としては、ほぼ目的を達成できたと評価できる。河川から、洪水時に多量のFe(II)が短時間に海域に供給されていることを定量的に示すことができた。ただし、海域における溶存鉄スペシエーションとの因果関係はまだ明らかにできていない。全体としては,ほぼ目的を達成できたと評価できる.作業仮説の妥当性はほぼ確認することができた.ただし、個別の項目に関してはすこし問題点が残ったので,次年度の改善を図る.1.固相分光法による超微量Fe(II)のオンサイト分析法を確立することにしていたが,測定の再現性にまだ問題が残ることが分かった。簡易分析装置を固相分光法に応用するためには、経験と情報の蓄積が足りなかったためである.2.窒素気流下でのオンサイト採水法に関しては,ほぼ確立することができた.3.洪水時の分析が一度しか行えなかった.方法論の確定に手間取ったためである.1.福岡市多々良川水系について集中的に調査を行う。特に、洪水時に海域に運ばれる溶存鉄フラックスについて、流量との関係を明らかにする。2.固相分光法で明らかとなった溶存鉄スペシエーションに関して、化学平衡論的にその理解を試みる。3.特に、壱岐において、磯焼け、健全、施肥海域の溶存鉄スペシエーション分析を継続し、情報を蓄積することで、溶存鉄の供給源および磯焼けと溶存鉄濃度との関係を定量的に明らかにする。1.固相分光法による超微量Fe(II)のオンサイト分析法の確立:当初,オンサイト分析まで行うことにしていたが,実際に簡易分析装置(サトダサイエンス社製固相分光測定器SP-301型)にLEDを光源としたシステムを用い,現場で分析操作を行ったところ,検出限界が0.8 μg dm-3程度と,まだ十分な信頼性を得ることはできなかった.そこで,さらに改良を加え,さらに信頼性の高いオンサイト分析法を確立する.
金属人工格子の膜面内伝導現象

Fe/Cr人工格子の試料について,50%に及ぶ巨大磁気抵抗が発見された。Fe/CrはFe膜内の平行に揃ったスピンが,外部磁場により反強磁性配列から強磁性配列に転移する。この過程に伴って巨大磁気抵抗効果は生じており,スピン方向に分裂した電子ポテンシャル散乱と関連して,多層膜特有の伝導電子散乱現象であるので注目されている。我々は,この試料について熱電能の磁場効果を測定した。熱電能についても,磁気抵抗の場合に対応した磁場について,明らかな磁場効果が観察され,磁気抵抗のみではなく更に一般的に多層膜特有の伝導電子散乱が起っていることが確認された。磁気抵抗についてはその符号は常にマイナスであったが,熱電能についてはその符号が温度により変化し,4.250Kまではプラス,50120Kではマイナス,120K室温では再度プラスと符号を変え,その大きさは80Kにおいて約ー10%,250Kにおいて+15%であった。これは伝導電子のスピン散乱構構が栄一のものではなく,2つ又はこれより多数のスピン散乱機構が意合しており,その符号と温度変化が異なるために,その総和としての熱電能の符号が温度変化するものと解釈できよう。多層膜中の伝導電子は明らかに人工格子の周期よりも大きな休束になって散乱を受けており,人工格子による電子物性の制御・設計に至る入口となる可能性があり,更に研究する必要がある。
生活美学の原理と展開

前年度に引き続き以下の4点にわたって研究を実施した.1)都市文化・社会史的方法:室町期以降の江戸・明治・大正・昭和・平成の都市文化・社会史の中に、菜食主義,酒宴,衣生活の近代化について生活美学的観点から再構成を試みた(森谷・横川・大塚)。2)考現学的方法:現在の社会現象を、ツーリズム,ホテルの機能,阪神モダニズム,たまごっちの流行などを題材に生活美学の観点から分析した。この場合はすべてフィールドワークを実施して、研究が実施されている。その結果から、21世紀の生活文化の遊芸ならびにレジャーの在り方が、典型的にホテルの機能やツーリズムに予兆として現れていることを分析した(高田・藤本・角野)。3)未来学的方法:人のしぐさや趣向・感性の変化など、モードや身体の飾りなどの身体論的観点ならびに音環境に対する反応を通して、微細な美意識に関して議論を行った(鷲田・平松)。4)哲学的方法:以上の3点におよぶ調査研究を、生活美学の哲学的観点から抽象化し、その上で、領域をそれぞれ限定した上で、生活美学と生活文化論の視座を導き出すことを試みた(鷲田,横川)。以上の成果をふまえて、生活美学のテキストブックを作成する予定である。平成7年度は、大学および短期大学における生活美学教育について、(1)制度上の系譜の検討、(2)生活美学および類似講義課目の開講現況把握、(3)現在出版されているテキスト等の内容構成の検討という3つの視点から調査検討を行い、以下の成果を得た。(1)すでに第二次大戦前に日本女子大学校において生活美学関連科目が開設されており、戦後の新制大学にあっては数校において開講されていた。(2)琉球大学が、生活美学に関するアメリカの教育内容をいち早く取り入れ、戦後の国内の大学教育において先導的役割をはたした。(3)現在、全国の家政系の大学、短期大学において生活美学の講義を開講しているところは46校にのぼり、その内容は家政学全般の多岐にわたる領域を対象としている。(4)家政学の教科書および生活学に関する叢書などの内容は、いずれも近代科学のパラダイムに色濃く支配される記述となっており、生活分化論の分野でも機能主義的色彩の強いものであることが認められた。その結果として、現在、家政学領域に用いられるテキストには生活美学的な視点がほとんどないことが確認された。以上の結果を批判的に分析すると、現在の家政学が伝統分化、伝統的生活形態を機能主義的に超克することを意図したあまり、その美的要素や美的価値観を削ぎ落としてきたこと、ならびに新たな風俗現象を取り入れるにいたっていないことを指摘した。上記資料は、生活美学データベース作成の基礎資料として共同研究者において共有することとした。研究代表者ならびに研究分担者が精力的に研究会を開催し,生活美学の原理と展開に関して討議を重ねた。その結果,本年度は以下のようなの成果を得た。1)室町期以降の江戸,明治,大正,昭和,平成の都市文化,社会史の中に生活美学のキーワードを導入し,歴史的な検証を行った。たとえば「花」に関する歴史を生活美学の視点を交えつつ考察した。2)現在の社会現象を生活美学の観点から検証するために,生活美学のキーワードを雑誌に掲載された記事から収集した。それに基づいて考現学的考察を加えた。たとえば結婚式のファッションの推移と女性の結婚観との関連をフィールドワークの成果と雑誌の記事とから論じ,グッズについて考現学的考察を行った。3)生活美学の原理について哲学的考察を行った。「風俗」「ファッション環境」「ファッション学」についてその原理的諸問題を整理し,今後の展開を予言した。4)生活美学の講義は,アメリカの州立大学で成立し,琉球大学に移植された経緯がある。これを資料を渉猟して追跡し,生活美学の歴史を考察した。以上の成果を踏まえつつ,生活美学のテキストブック作成に向けて,その構成と内容に関し,議論を深めた。本年度の研究実績の概要前年度に引き続き以下の4点にわたって研究を実施した。1)都市文化・社会史的方法:室町期以降の江戸・明治・大正・昭和・平成の都市文化・社会史の中に、菜食主義,酒宴,衣生活の近代化について生活美学的観点から再構成を試みた(森谷・横川・大塚)。

2)考現学的方法:現在の社会現象を、ツーリズム,ホテルの機能,阪神モダニズム,たまごっちの流行などを題材に生活美学の観点から分析した。この場合はすべてフィールドワークを実施して、研究が実施されている。その結果から,21世紀の生活文化の遊芸ならびにレジャーの在り方が,典型的にホテルの機能やツーリズムに予兆として現れていることを分析した(高田・藤本・角野)。3)未来学的方法:人のしぐさや趣向・感性の変化など、モードや身体の飾りなどの身体論的観点ならびに音環境に対する反応を通して,微細な美意識に関して議論を行った(鷲田・平松)。4)哲学的方法:以上の3点におよぶ調査研究を、生活美学の哲学的観点から抽象化し、その上で、領域をそれぞれ限定した上で、生活美学と生活文化論の視座を導き出すことを試みた(鷲田・横川)。以上の成果をふまえて、生活美学のテキストブックを作成する予定である。
病原性細菌のヘムシャペロンと「トロイの木馬」型化合物

病原性細菌の繁殖には鉄が不可欠である。従来の常識では、これらの細菌は他の一般的な細菌と同様に低分子キレートであるシデロフォアを利用する方法かまたは鉄タンパク質あるトランスフェリン・ラクトフェリンを菌体内に取り込む方法によって鉄を獲得していると考えられてきた。しかし、近年、これらの細菌は感染時において宿主の持っている赤血球を溶血させ、そこから放出されるヘモグロビンのヘムを鉄源としていることが明らかになった。本研究は、病原性細菌のヘムの取り込みに関与する一連のタンパク質群について、キャラクタリゼーションと構造解析を行い、病原性細菌のヘム取り込み、鉄獲得機構を明らかにすることが目的である。今年度は、その中で、ジフテリア菌由来のヘム分解酵素HmuOの反応中間体のX線結晶構造解析を主に進めてきた。HmuOは、活性中心であり基質であるヘムに酸素を結合し、それを活性化させ、ヘム自身を、ヒドロキシヘム→ベルドヘム→ビリベルジンへと順に変換する反応を行う。結晶用顕微分光器や嫌気グローブボックスを用い、酸素化型ヘム複合体を結晶中で安定に捕らえる方法を確立し、その結晶をX線照射により還元させ、ハイドロパーオキソ中間体を得ることに成功した。また、様々な実験条件でさらにX線を照射することにより、続くヒドロキシヘム中間体の電子密度図を得ることに成功した。原子レベルの結晶構造解析により、ハイドロパーオキソ中間体では、近傍の水分子が動くことにより、それに続く反応を起こしやすくしていることが示唆された。本年度はその中で脳膜髄炎菌のヘム輸送対であるHemTについて発現系を構築することに成功した。また、ヘム分解酵素のHemOについては、そのヘム分解における位置選択性を変換させるような変異の導入を行い、その結晶構造解析に成功した。その結果、位置選択性を生み出す構造的要因に迫ることができた。ジフテリア菌由来のヘム分解酵素HmuOについては着々と研究が進んでいる。今年度の主な成果は、反応中間体の一つであるビリベルジン結合型、ヘムが結合していないアポ型の高分解能X線結晶構造解析に成功し、哺乳類のヘム分解酵素とは異なる中間体構造をしていることが明らかになった。アポ型の構造で驚くべきは、ヘム(誘導体)結合型に見られていた近位側のヘリックスがほどけて、ループ状に構造変化をしていた。