hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝臓幹細胞を用いたウィルソン病に対する細胞移植治療法の開発

1.目的(1)申請者らが確立した方法によって分離した、正常な機能を保持していると考えられるラット肝臓幹細胞(肝上皮細胞)を移植に適した状態に加工し、充分な治療効果が期待できる肝細胞移植法を確立する。(2)移植された幹細胞の肝臓内での動態あるいは機能を検討し、ウィルソン病のみならず他の代謝性肝疾患に対する治療として、幹細胞移植が効果的であるか否かを明らかにする。2.成果(1)健常ラット肝臓の非実質細胞画分から肝臓幹細胞と考えられる未分化な肝上皮細胞株を樹立できた。(2)この細胞は、核・細胞質比が高い小型の細胞(径20μm)であった。また、アルブミンやサイトケラチン18・19など成熟細胞のマーカー蛋白は発現しておらず、α-フェトプロエインを発現していたことから、未分化な性質を持った細胞であることがわかった。(3)幹細胞に分化能があるかどうかを調べるために、コラーゲンゲル内での3次元培養、あるいは肝星細胞との共培養を行ったところ、アルブミンの発現が認められるようになり、幹細胞が成熟した細胞に分化できることがわかった。(4)幹細胞を組織工学的にどのように加工すれば、in vivoで肝細胞として機能できるどうかを検討した。幹細胞をコラーゲンゲルあるいはコラーゲンスポンジを用いて無アルブミンラットに移植したところ、移植後に血清アルブミン量の増加を示した無アルブミンラットは、コラーゲンゲルを移植担体に用いた群では67%に、コラーゲンスポンジを用いた群では57%に認められた。また、移植が成功した例での血清アルブミンの変化を見ると、移植後10週から血清アルブミン量が増加し始め、25週頃まで維持されていた。3.まとめ本研究で樹立した肝上皮細胞は未分化で分化能を持っている幹細胞であることが明らかとなった。また、肝幹細胞としての性質を持った肝上皮細胞をコラーゲンを用いて組織工学的に加工して移植したところ、無アルブミンラット血清中のアルブミン量が増加したことから、肝上皮細胞が生体内で分化し、肝細胞として機能できることがわかった。以上のことから、幹細胞を利用した細胞移植は代謝性肝疾患に対する治療法として、臨床応用が可能であることが示唆された。[目的](1)申請者らが確立した方法によって分離した、正常な機能を保持していると考えられるラット肝臓幹細胞を移植に適した状態に加工し、充分な治療効果が期待できる肝細胞移植法を確立する。[成果](1)コラゲナーゼ灌流法およびパーコール密度勾配遠心法を行うことによって、健常SDラット肝臓から増殖可能な幹細胞と思われる細胞を分離・培養することができた。さらに、この細胞にGFP遺伝子を導入して、GFPを安定的に発現している細胞を樹立することができた。

(2)この幹細胞の分化度を知るために免疫染色法によって蛋白発現を調べたところ、アルブミンやサイトケラチン18・19など成熟細胞のマーカー蛋白は発現しておらず、α-フェトプロエインを発現していたことから、幹細胞は未分化な細胞であることがわかった。(3)幹細胞に分化能があるかどうかを調べるために、肝星細胞との共培養、あるいはコラーゲンゲル内での三次元培養を行い、蛋白発現を検討した。この結果、幹細胞でアルブミンの発現が認められるようになり、成熟した細胞に分化誘導することができた。すなわち、幹細胞は分化能を持っていることが明らかとなった。すでに、コラーゲンゲル内あるいはコラーゲンスポンジ内で培養した幹細胞をラットに移植しており、現在、その生着状態および分化状態を検討するための長期観察を行っている。1.目的(1)申請者らが確立した方法によって分離した、正常な機能を保持していると考えられるラット肝臓幹細胞(肝上皮細胞)を移植に適した状態に加工し、充分な治療効果が期待できる肝細胞移植法を確立する。(2)移植された幹細胞の肝臓内での動態あるいは機能を検討し、ウィルソン病のみならず他の代謝性肝疾患に対する治療として、幹細胞移植が効果的であるか否かを明らかにする。2.成果細胞移植実験:移植した細胞の同定を容易にするため、移植の対象として無アルブミンラットを用いた。移植は以下の2つの方法で行った。[方法1]肝上皮細胞をブタ腱由来I型コラーゲンゲルと混合して70%部分肝切除を施した無アルブミンラット肝臓に直接注射した。[方法2]肝上皮細胞をスポンジ状に加工したI型コラーゲン内に播種し、スポシジごと70%部分肝切除を施した無アルブミンラット腹腔内大網上に移植した。移植後に経時的に採血して、血清アルブミン量の変化をウェスタンブロット法で調べたところ、血清アルブミンの増加を示した無アルブミンラットは、コラーゲンゲルを移植担体に用いた群では67%に、コラーゲンスポンジを用いた群では57%に認められた。移植が成功した例での血清アルブミンの変化を見ると、移植後10週から血清アルブミン量が増加し始め、25週頃まで維持されていた。本研究において、肝幹細胞としての性質を持った肝上皮細胞をコラーゲンゲルあるいはコラーゲンスポンジを用いて組織工学的に加工して移植した結果、いずれの場合でも無アルブミンラット血清中のアルブミン量が増加したことから、肝上皮細胞が生体内で分化し、肝細胞として機能できることがわかった。このことは、幹細胞移植が代謝性肝疾患に対する治療法として応用できる可能性を示唆するものと考えられる。
北メソポタミアにおける粘土板文書の探究-シリア、テル・タバンの歴史考古学的調査-

本研究はシリア北東部にあるテル・タバン遺跡の歴史考古学的調査である。研究期間内には同遺跡の発掘調査を実施し、古バビロニア時代(前18世紀)新・中期アッシリア時代(前138世紀)の公共的建築遺構と多数の楔形文字史料を発見した。これらの発掘した考古資料と新情報が記された文字史料の解読成果により、未解明であった前2千年紀1千年紀の北メソポタミアの文化編年の構築、支配版図の変遷やアッシリア帝国の地方行政体制の解明に貢献することができた。本研究は、シリア北東部のテル・タバン遺跡の発掘調査と出土する楔形文字史料の解読・研究を主眼とする。同遺跡は古バビロニア時代(前19-18世紀頃)、中期・新アッシリア時代(前1311世紀頃・前9-7世紀頃)の北メソポタミア地方の統轄拠点として繁栄した古代都市"タバトゥム/タベトゥ"である。研究代表者は2005年から同遺跡の発掘調査を実施し、日本調査隊では初の大規模な粘土版文書板を発見した。これまでの調査成果は同地方の暗黒時代前2千年紀の解明に向けて大きく貢献している。研究期間内には,これまでの調査で蓄積した成果を更に深化すべく、発掘調査を継続し新たな文字史料の発見と建築遺構の全容解明、及び以前の調査で出土した未整理の粘土板文書の解読・研究を実施する。特に20052006年の調査で出土した中期アッシリアの約300点の未整理の粘土板文書と本研究期間内の調査で出土する文字資料の解読と分析を行い、それらの成果をとおしてアッシリア史の解明に向けて国内外の研究者が渇望している新情報を提供する。本研究成果からテル・タバンがアッシリアの中央政権と具体的にどのような従属関係あったのかを究明し、帝国の形成過程とアッシリア帝国の興亡史と人類初の帝国主義の実体の解明に貢献する。本研究の主眼としているシリア、テル・タバン遺跡の発掘調査を、8月初旬から9月末まで実施した。今回の調査は、2005年度の調査で中期アッシリア時代の粘土板文書群が出土した日乾煉瓦造の王宮跡の詳細究明に焦点を置いた。王宮跡の主要施設はテルの中心部にあったとみられ、テルの西側斜面に東西6m、南北6mのトレンチを設定し発掘を行った。上層からヘレニズム時代(紀元前後)(1層)、新アッシリア時代(前97世紀)(2、3層)、中期アッシリア時代(前1311世紀)(4層)の層位を確認した。大きな発掘成果は、新・中期アッシリア時代の層の調査でもたらされた。1.新アッシリア時代:トレンチの東西南北に走る壁の幅約3m、残高約2.5mの巨大日乾煉瓦造建物跡の一部を検出した。壁の規模や排水施設を持っていたことから公的建物と考えられる。注目すべきは、この壁に使用された煉瓦の中からブロンズ製人物像が出土したことである。同像は定礎記念像であったと推測される。この建物跡の下層からは甕棺墓を発掘し、墓碑銘と考えられる楔形文字が刻まれた土器を発見した。2.中期アッシリア時代:王宮跡と一連の日乾煉瓦造の南北約4m以上、東西約4m以上の部屋の一部を検出した。部屋は2時期にわたり使用され、最初の床面からは径約1mの馬蹄形の土器窯を認めた。特筆すべきは、この窯の灰原層から円筒形碑文片が出土したことだ。碑文は解読の結果、9799年の調査で出土したタバンの王"アッシュール・ケタ・レシェル2世"の定礎記念碑文と同種のもので、前11世紀前半に年代付けられることがわかった。上述の今年度の発掘調査での新アッシリア時代の公共的大日乾煉瓦造建物跡、定礎ブロンズ像、タバン初の同時代の文字資料の発見等の新事実は、タバンが古バビロニア時代、中期アッシリア時代のみならず、新アッシリア時代もシリア北東部の統轄拠点として君臨していたことを裏付ける大きな証拠を提示することができたと言える。今年度の調査で発見した襖形文字資料は計52点で、その内訳は粘土板文書3点、煉瓦片39点、円筒形碑文片6点、土製鋲片2点、土器1点、装飾片1点であった。粘土板文書2点は古バビロニア時代、土器は新アッシリア時代、それ以外の資料は中期アッシリア時代のものであった。これらの文字資料の解読を山田と柴田が現地で行った。文字資料には、これまで出土した資料の欠落を補う多くの貴重な新情報が認められ、暗黒時代の解明に向けて大きな貢献が期待される。本研究の主眼であるテル・タバン遺跡の発掘調査を8月初旬から9月末まで実施した。

1.テルの北側に東西24m、南北20mのトレンチを設定し発掘を行った。調査の結果、壁の厚さが約2mから7mを測る中期アッシリア時代の巨大日乾煉瓦造の公的建物跡を検出した。建物跡は5つの時期に大別され、これらの中で注目すべきは、最初の建物跡から検出した南北4m、東西3m以上の焼成煉瓦敷きの部屋である。この煉瓦敷きに使用されたと思われる煉瓦には“天候神献呈碑文"が刻まれており、初期に在位した王が創建した神殿・宮殿等の公的機能を有した建物跡であったことが明らかになった。このトレンチでは中期アッシリア時代の連続した層序を認め、タバンの歴代王が構築した建造物の特定や土器編年を確立するうえで非常に有効な資料を得ることができた。2.前年度発掘した西側地区のトレンチの継続発掘調査を行った。最大の発見は、中期アッシリア時代の医術・呪術を記した粘土板文書が出土したことである。この結果、この粘土板文書が出土した地点の近くに、宗教・文学文書等を集めた文書庫(図書館)が存在する可能性が非常に強くなった。今後の調査で、こうした文書庫が発見された場合は、これまでのタバン調査では最大の発見になるのは確実である。来年度の調査は、このトレンチを更に拡張し文書庫の発見を目指す。3.今回の調査では46点の中期アッシリア時代の楔形文字資料を採集した。その内訳は粘土板文書1点、テラコッタ1点、円筒形碑文2点、土器片1点、土製鋲片6点、煉瓦片25点で、これらの解読を文献班の山田、柴田が現地で行った。なお、山田、柴田は7月にドイツで開催された国際アッシリア学会で、これまでのタバン調査で出土した文字資料の報告を行い欧米研究者達から注目を浴びた。本研究の主眼であるテル・タバン遺跡の発掘調査を8月初旬から9月末まで実施した。昨年度調査した北側地区の継続発掘と2005年以来継続しているテルの西側地区の発掘を行った。北側地区では昨年度発掘した中期アッシリア時代の公共的巨大日乾煉瓦造壁跡(8b9b層)の各時期の正確なプランや増改築等の全容究明のため、重複した壁を上層から一つずつ取り外す作業を行った。調査の結果、建築は8時期に細分されることが判明した。これらの壁に伴う生活面からはアッシリア帝国の拠点都市"タベトゥ"の王統を確立するうえで有効な多数の銘文入り煉瓦が出土した。西側地区では2007年度に発掘したトレンチ15の東側斜面に南北10m、東西4mの拡張トレンチを設定し発掘を行った。上層からヘレニズム、新アッシリア、中期アッシリアの層序を確認した。中期アッシリア時代の層では2005年の調査で粘土板文書群が出土した日乾煉瓦造公共的建物跡(宮殿跡)と一連の建物跡の発掘を行い、新たな部屋の一部(南北1.8m、東西1.2m)を検出した。この部屋も同時代の創建期の主要施設で、最大の成果は粘土板文書群の塊(長さ約1.0m、幅約0.7m、厚さ3-5cm)がこの部屋の床面から出土したことである。この中には粘土板文書が少なくとも100点以上詰まっていると思われる。来年度の調査期間中に解体し清掃と解読を開始する。解読が進めば、これまで発掘された中期アッシリア文書にはない学会待望の新情報の提供が期待される。本年度の調査では、計49点の楔形文字資料を採集した。これらの文字資料の解読を連携研究者の山田、柴田が現地にて実施した。これらの中で特筆すべきは前16世紀の養子縁組契約粘土板文書である。古バビロニア時代と中期アッシリア時代の間の空白を補う資料で、この文書の発見によりタバンが古バビロニア時代以降も統轄拠点として君臨したことを実証した点は、今回の調査の大きな成果である。本研究はシリア、テル・タバン遺跡の歴史考古学的調査を主眼にしており、今年度も同遺跡の発掘調査を8月初旬から9月末まで実施した。
透明導電性物質である酸化亜鉛のP型伝導化および強磁性体化

透明導電性物質である酸化亜鉛中に遷移金属であるバナジウム(V)やコバルト(Co)を添加することによって強磁性的秩序が発現する可能性に関して研究をおこなった。これらの磁気秩序は酸化亜鉛中のキャリア量に依存するであろうことが吉田らによって予想されている。またキャリア制御の観点から、酸化亜鉛は酸素欠損によって電子ドープされることが知られている。本研究ではこの予測に基づき、Co-ドープおよびV-ドープ酸化亜鉛の薄膜をa面サファイア基板上にPLD法で作製し、還元雰囲気下において(N_21atm)アニールし、意図的に酸素欠損を導入することによって、キャリア量変化による磁性状態の変化をSQUIDによって検出することにした。その結果、Co15%ドープサンプルにおいて、もともと常磁性的であったサンプルが700°Cでの窒素中でのアニールによって強磁性体化することが確認された。一方でV15%ドープのサンプルでは600°C以上でのアニールによって常磁性から強磁性に変化することが確認された。以上の結果から、強磁性の起源がキャリア誘起であるという可能性を裏付けることが出来た。またこの強磁性がサンプル作製過程における不純物混入の可能性があることから、SIMS測定によってサンプル中の磁性イオンの含有量を調べた。その結果、最も多く含まれたFeイオンでも10^<17>cm^<-3>程度であり、そのモーメント量から磁性不純物が強磁性の起源であるという仮説を除くことが出来た。
構造改変したα型血小板由来増殖因子受容体遺伝子の機能解析

これらの結果をもとに、トランスジェニックマウスの作成を行った。先に明らかにしたPDGFRAの転写調節領域を変異型PDGFRA cDNAに接続した遺伝子を導入したトランスジェニックマウスでは、肺及び胎盤での強い発現が見られたが、目的とする脳での強い発現は見られなかった。現在、グリア細胞での強い発現を得ることを目的として、マウスglial fibrillary acidic protein遺伝子の転写調節領域を用いた導入遺伝子を構築し、トランスジェニックマウスを作成している。またin vitroにて、遺伝子導入した培養細胞が造腫瘍能を持つか否かを、soft agar assay及びnude mouseの皮下、脳内移植モデルを検討している。
学習者の視点から探る世界史学習の内発的動機づけー国際的志向性の観点から

世界史学習の意欲が喚起されるのはどのようなときか。本研究は学生および高校教員への聞き取り調査等により、世界史学習の契機、実践そしてその際の内面を質的に調査することによって、基礎教養的であるとともに問題解決志向型であるような新しい世界史授業の開発・提案を行い、学問と教育の架橋を目指すものである。方法としては、大学生・短大生を対象に聞き取り調査を行い、高校までの世界史学習への評価・世界史学習への動機づけ等を明らかにする。また、高大連携に積極的な学界全体の動向を踏まえ、全国の高校の世界史教員にも聞き取りすることにより、授業での学習意欲を高めるための取り組みを調査する。
胎盤における栄養状態によるエピゲノム制御の分子メカニズムの解析

近年、日本では、低出生体重児の頻度が約10%と増加傾向にある。またDevelopmental Origins of Health and Disease (DOHaD)説では低出生体重児は2型糖尿病をはじめ、様々な生活習慣病の発症リスクを高めるとされている。これらのことから、将来、生活習慣病の増加が危惧されている。しかし、DOHaD説の分子メカニズムは未だ明らかとなっていない。これまでに、我々はヒト組織の胎盤を用いて、どのような栄養成分がエピゲノムや遺伝子発現に影響を及ぼしているのか、また、胎盤重量、出生体重に影響を及ぼしているのかを明らかにすることを目的に、胎盤重量と出生体重の両方が低い3例と高い3例を用いて、各胎盤の遺伝子発現量をマイクロアレイで網羅的解析を行っており、出生体重の違いによって、胎盤で発現する遺伝子の違いを示した。今回、我々は、このマイクロアレイの結果より、低い出生体重と比較して高い出生体重で、発現量の高かった遺伝子Spexin(SPX)に着目した。まず、124検体の胎盤を用いてSPXの発現量と胎盤重量、出生体重との関連性を検討した。その結果、胎盤重量とSPX発現量には有意な正の相関関係が見られた。一方、出生体重とは相関関係は見られなかった。そこで、児の出生体重を2500g未満と2500g以上の2群に分けて、各母体の胎盤のSPX発現量を検討すると、SPX発現量は2500g未満と比較して、2500g以上で有意に高いことが示された。また、胎盤SPX遺伝子のDNAメチル化状態と胎盤重量、出生体重との関連性を検討した。その結果、胎盤重量とSPXのDNAメチル化率との間に有意な負の相関関係が見られた。一方、出生体重との関連はなかった。今後は、胎盤のSPXの発現量、DNAメチル化状態がどのような栄養成分によって影響を及ぼすのかを検討する予定である。近年,日本では,低出生体重児の頻度が約10%と増加傾向にある.またDevelopmental Origins of Health and Disease (DOHaD)説では低出生体重児は2型糖尿病をはじめ,様々な生活習慣病の発症リスクを高めるとされている.これらのことから,将来,生活習慣病の増加が危惧されている.しかし,DOHaD説の分子メカニズムは未だ明らかとなっていない.今回,我々はヒト組織である胎盤を用いて,どのような栄養成分がDNAメチル化を含めたエピゲノムや遺伝子発現に影響を及ぼしているのか,また,胎盤重量,出生体重に影響を及ぼしているのかを明らかにすることを目的として研究を行った.胎盤は母体と胎児の間で栄養成分や酸素の受け渡しに関与しており,以前より,出生体重と胎盤重量は相関関係があることが知られている.従って,母体の栄養状態によって,胎盤中の遺伝子発現やエピゲノムの変化が起こり,胎盤重量や出生体重に寄与している可能性が考えられる.そこで,まず,この仮説を検証するために,胎盤重量と出生体重の両方が低い3例と高い3例の合計6例を用いて,それぞれの胎盤中の遺伝子発現量をマイクロアレイで網羅的解析を行った.その結果,出生体重の高い3例は低い3例より,発現増加した遺伝子が38遺伝子,発現減少した遺伝子が69遺伝子あることが示された.今回,見出された多数の遺伝子は出生体重との関連が報告されていないものもいくつか含まれており,今後,出生体重や胎盤重量との関連性について検討する.初年度に計画した,胎盤重量と出生体重の両方が低い3例と高い3例の合計6例を用いて,それぞれの胎盤中の遺伝子発現量をマイクロアレイで網羅的解析を行い,興味深い結果を得ることができた.しかしながら,この解析には,品質の良いtotal RNAが必要となるが,RIN(RNA integrity number)値の高い胎盤のtotal RNAの抽出に計画以上に時間を費やし,初年度の計画に入っていた胎盤の網羅的なDNAメチル化解析まで進むことができなかった.従って,今回の進捗状況は「やや遅れている」と評価した.近年、日本では、低出生体重児の頻度が約10%と増加傾向にある。

そこで、児の出生体重を2500g未満と2500g以上の2群に分けて、各母体の胎盤のSPX発現量を検討すると、SPX発現量は2500g未満と比較して、2500g以上で有意に高いことが示された。また、胎盤SPX遺伝子のDNAメチル化状態と胎盤重量、出生体重との関連性を検討した。その結果、胎盤重量とSPXのDNAメチル化率との間に有意な負の相関関係が見られた。一方、出生体重との関連はなかった。今後は、胎盤のSPXの発現量、DNAメチル化状態がどのような栄養成分によって影響を及ぼすのかを検討する予定である。初年度の計画に入っていて出来なかった分を今年度に含めて研究を推進する予定である.具体的には,以下の通りである.1ヒト胎盤を用いた網羅的遺伝子発現解析の結果より,候補となる遺伝子を選択し,その遺伝子の発現量と出生体重,胎盤重量との相関関係を調べる.また,候補遺伝子の発現量と妊婦の各種栄養状態との関連性についても検討する.2胎盤重量と出生体重の両方が低い3例と高い3例の合計6例のヒト胎盤のゲノムDNAを用いた網羅的DNAメチル化解析を行う.3ヒト絨毛ガン由来細胞株BeWoを用いたエピゲノム変化および遺伝子発現量に影響を与える栄養成分の探索を行う.さらに,その栄養成分がどのようにしてエピゲノム変化および遺伝子発現量に影響を及ぼすのかを分子レベルで解析する.
感作ラットへの臓器移植における免疫寛容の導入と維持へのメカニズムの解析

nondepletingタイプ抗CD4mAb(RIB-5/2)の短期投与により感作ラットに誘導した免疫寛容にはCD4^+IL-4産生型Th2様の調節性T細胞(調節T)が誘導されているが、この調節Tの誘導のためには移植時における胸腺の存在が必要であり、胸腺摘除ラットに誘導された寛容はclonal anergyのみであった。また調節Tの維持は抗原依存性、即ち寛容維持期において移植心を除去すると2週間以内に"移入により寛容を誘導できる"調節Tが失われる事が判明したが、4週後でも寛容が維持されていることもあり、anergyの持続を示唆した。それ以降では寛容は消失したが、ドナー反応性抗体(IgM,IgG)の増加はなかったことから、B細胞anergyはT細胞anergyより長期間続くものの寛容には寄与しないと考えられた。一方、寛容維持期ラットの脾細胞を軽度放射線照射されたテストラットへ移入して成立させた寛容モデルから移植心を摘出して2週間後、新たにドナーの心臓を同モデルに移植したが、二次心は拒絶されなかったことより、調節Tの移入により成立させた寛容ラットにもclonal anergyの機構が獲得されていることが示唆された。さらに、寛容ラットに二次心を移植した時のグラフト内のサイトカインの変化を検索したところ、移植後10日では、IL-4が二次心で発現され一次心では消失し、IL-10とIFN-gが一次心で強く発現されていた。しかし長期経過後はいずれも発現が抑制されており、二次心移植時に調節Tが一次心から二次心へ移動して活性化したことが示唆された。以上、本モデルにおける免疫寛容にはT細胞clonal anergyと調節Tの二つが働いており後者はよりドナー抗原依存性で、前者を誘導するが如く作用する。【方法】RLB-5/2を移植前後に頻回投与(10×20mg/kg,-7日→+21日)することで、-7日のBNラット(RT1^n)皮膚移植により感作したLEWラット(RT1^l)に対する(LEW×BN)F1移植心は拒絶を免れ、96%がドナー特異的免疫寛容を獲得する。この寛容は抗原活性化LEW脾細胞の移入によっても破壊されず、寛容ラット脾には別のテストラットに寛容を次々に移入できるCD4^+調節性T細胞が誘導されている。今回、胸腺摘除あるいは、移植心摘除を種々のタイミングで行い、寛容誘導率や寛容ラット脾細胞(1×10^8個)の移入実験における寛容移入率、さらに移植心浸潤リンパ球のTh1,Th2由来サイトカインのmRNA発現らを検討した。【結果】移植前に胸腺を摘除したラットでのみ寛容誘導率は約50%に低下し、その寛容ラット脾細胞の移入では寛容を伝えられなかった。さらにこの寛容ラットへrIL-2あるいは抗原活性化脾細胞を投与することで拒絶反応が引き起こされた。また移植心でのIL-2、IL-4、IL-10 mRNAはEuthymusの寛容ラットと同様に著明に発現が抑制されていたが、IFN-γだけは有意に高く発現していた。Euthymusの寛容ラットにおいて移植心を摘出しても、その1カ月後には脾細胞は移入による寛容伝達能力を失っていた。23カ月後では寛容の記憶自体を失い二次心移植を拒絶した.また脾細胞移入実験の際に、移入後心移植が遅れたり、脾細胞を長時間抗原刺激のないin vitroに置いてから移入すると、寛容が伝えられなかった。なお長期生着心をLEWへ再移植すると急性拒絶された。【結論】

以上より本モデルではclonal anergyに加え、胸腺依存性に生み出され抗原刺激によって維持あるいは伝達(infect)される調節性T細胞の二つのメカニズムが働き、より安定した寛容システムとなっていた。しかし移植心の抗原性は保持されておりgraft adaptationは寛容維持に関与していなかった。nondepletingタイプ抗CD4mAb (RIB-5/2)の短期投与により感作ラットに誘導した免疫寛容にはCD4^+IL-4産生型Th2様の調節性T細胞(調節T)が誘導されているが、この調節Tの誘導のためには移植時における胸腺の存在が必要であり、胸腺摘除ラットに誘導された寛容はclonal anergyのみであった。また調節Tの維持は抗原依存症、即ち寛容維持期において移植心を除去すると2週間以内に"移入により寛容を誘導できる"調節Tが失われる事が判明したが、4週後でも寛容が維持されていることもあり、anergyの持続を示唆した。それ以降では寛容は消失したが、ドナー反応性抗体(IgM,IgG)の増加はなかったことから、B細胞anergyはT細胞anergyより長期間続くものの寛容には寄与しないと考えられた。一方、寛容維持期ラットの脾細胞を軽度放射線照射されたテストラットへ移入して成立させた寛容モデルから移植心を摘出して2週間後、新たにドナーの心臓を同モデルに移植したが、二次心は拒絶されなかったことより、調節Tの移入により成立させた寛容ラットにもclonal anergyの機構が獲得されていることが示唆された。さらに、寛容ラットに二次心を移植した時のグラフト内のサイトカインの変化を検索したところ、移植後10日では、IL-4が二次心で発現され一次心では消失し、IL-10とIFN-gが一次心で強く発現されていた。しかし長期経過後はいずれも発現が抑制されており、二次心移植時に調節Tが一次心から二次心へ移動して活性化したことが示唆された。以上、本モデルにおける免疫寛容にはT細胞clonal anergyと調節Tの二つが働いており、後者はよりドナー抗原依存症で、前者を誘導するが如く作用する。
バルト語動詞のテンス・アスペクト・ムード:スラヴ語との文法的比較対照研究

平成15年度は,東京大学大学院人文社会系研究科スラヴ語スラヴ文学研究室において,13年度に行った先行研究資料の分析と序論に提示した理論的枠組みをもとに,14年度から継続してきた調査作業を行い,バルト・スラヴ語の動詞の文法的カテゴリー,テンス・アスペクト・ムードの比較対照研究に従事した。主に考察の対象とした言語は,バルト語では,まずリトアニア語,さらに,ラトヴィア語,古プロシア語という最も資料の豊富な3つの言語である。また,スラヴ語では,まずロシア語,さらに,チェコ語,ポーランド語,ブルガリア語等のアスペクトに関する先行研究の充実している諸言語,および,通時的側面からの考察の為に必要な古代ロシア語,古代教会スラヴ語等である。現代バルト語の調査にあたっては,翻訳テクスト資料の観察・分析(同一内容をもつテクストの対照)およびネイティヴ・スピーカーに対するアンケート調査(インフォーマント・チェック)という方法を用いて行った。翻訳テクストは,時間構造と人称構造がより明確に異なる,小説における会話文および地の文を中心に,翻訳作品から資料を収集している。アンケート調査は,予め準備した例文・テクストに対する文法性・適合性のチェック,および,他の可能な表現の指摘等をネイティヴ・スピーカーに依頼する形で行った。平成15年度の研究成果は,以下の論文に纏めた。1.「リトアニア語とロシア語の過去分詞の状況語的(半述語的)機能-相対的時間表現と文の統語構造-」(日本ロシア文学会・『ロシア語ロシア文学研究』第35号)2.「リトアニア語とロシア語の分詞の時間表現-バルト・スラヴ語の比較対照論的観点から-」(名古屋大学大学院国際開発研究科・『国際開発研究フォーラム』第26号)今年度は,昨年度行った先行研究資料の分析と序論に提示した理論的枠組みをもとに,バルト・スラヴ語の動詞の文法的カテゴリー,テンス・アスペクト・ムードの比較対照研究に従事した。また,スラヴ語では,まずロシア語,さらに,チェコ語,ポーランド語,ブルガリア語等のアスペクトに関する先行研究の充実している諸言語および,通時的側面からの考察の為に必要な古代ロシア語,古代教会スラヴ語等である。現代バルト語の実態の調査にあたっては,翻訳テクスト資料の観察・分析(同一内容をもつテクストの対照),ネィティヴ・スピーカーに対するアンケート調査(インフォーマント・チェック)という方法を用いている。アンケート調査は,準備した例文・テクストに対する文法性・適合性のチェック,および,他の可能な表現の指摘等をネイティヴ・スピーカーに依頼する形で行っている。今年度の研究成果は,以下の通りである。来年度は,今年度行った調査作業を継続してゆく予定である。1.研究発表「リトアニア語とロシア語の過去分詞の状況語的機能-従属的タクシスの発達」(日本ロシア文学会・上智大学・2002年10月19日)2.研究論文「バルト語動詞の時間表現-スラヴ語との比較による特徴づけ」(学習院大学・『人文』1号)「リトアニア語の過去受動分詞の意味と機能(1)-時間性と定語的機能について」(大阪外国語大学・『ロシア・東欧研究』7号)平成15年度は,東京大学大学院人文社会系研究科スラヴ語スラヴ文学研究室において,13年度に行った先行研究資料の分析と序論に提示した理論的枠組みをもとに,14年度から継続してきた調査作業を行い,バルト・スラヴ語の動詞の文法的カテゴリー,テンス・アスペクト・ムードの比較対照研究に従事した。1.「リトアニア語とロシア語の過去分詞の状況語的(半述語的)機能-相対的時間表現と文の統語構造-」(日本ロシア文学会・『ロシア語ロシア文学研究』第35号)2.「リトアニア語とロシア語の分詞の時間表現-バルト・スラヴ語の比較対照論的観点から-」(名古屋大学大学院国際開発研究科・『国際開発研究フォーラム』第26号)
フラストレート磁性体でのスピン液体状態の探索および関連した諸問題の理論的研究

まず,ダイヤモンド装飾正方格子ハイゼンベルグ反強磁性体の低エネルギー有効ハミルトニアンとして得られる量子ダイマー模型について,相互作用パラメータのとりうる範囲を検討した。その結果,RVB状態が基底状態となるロキサー・キベルソン点を実現できることがわかり,ICM2018のプロシーディングスにまとめた。次に,リープ格子ハイゼンベルグ模型の基底状態特性の研究について,本年度はフラストレーション効果を導入し,リープ格子とカイロペンタゴン格子をつなぐ模型でのスピン波展開を行なった。この模型は2種類のサイトを持つが,それぞれのスピンサイズを変えた計算を行い,そのサイズによる物理量(磁化など)の振る舞いの変化を調べた。その結果,基底状態が一重項の場合に他と異なる振る舞いが見られ,また,カイロペンタゴン格子に対応するパラメータ付近でスピン液体を示唆する結果が得られた。その結果を物理学会にて発表した。続いて,球体カゴメ系の研究について述べる。球体カゴメ系{W72Mo30}にて低温磁化過程測定が行われ,クラスター磁性体で生ずるべきステップ構造が見られないことが報告されている。これに対し,ジャロシンスキー・守谷(DM)相互作用を導入すると低温磁化過程測定の実験結果が再現できることを示し,その結果を論文にまとめた。更に,熱的量子純粋状態の方法を用いて帯磁率の温度依存性を計算し,ICM2018のプロシーディングスにまとめた。最後に,熱的量子純粋状態の応用に関するフォーマルな研究として,純粋状態を解に持つ時間発展の方程式を用いて開放量子系の量子状態の計算が可能であることを数学的に示した。その結果を物理学会及び量子情報技術研究会にて発表した。そのほか,サイト間斥力を含む拡張ハバードラダーにおいて電荷秩序金属内での秩序形成(強磁性・超伝導)の問題にも取り組み,物理学会にて発表した。スピン液体基底状態を実際に書き下すことができる模型としてトリックコード模型やロキサー・キベルソン点の量子ダイマー模型が知られており,それらの実験系作成に関心が持たれる。しかし,現実の系で実現しうる相互作用はスピン演算子の2次のものに限られる。トリックコード模型を有効模型に持つ2次のスピン模型としてキタエフ模型が知られており,特に昨年,α-RuCl3が磁場下でキタエフ相互作用に由来したスピン液体状態となることが報告され,非常に大きなインパクトを与えた。一方,本研究の今年度の大きな進展は,ダイヤモンド装飾正方格子上のハイゼンベルグ反強磁性の有効模型としてロキサー・キベルソン点の量子ダイマー模型が実現可能なことを見出したことにある。キタエフ模型の相互作用が実空間・スピン空間で異方的であるのに対し,本研究の模型の相互作用は等方的なハイゼンベルグ相互作用であり,その実現は格段に容易である。そのため,光格子量子シミュレータ上でも実現できると思われ,将来的に,本研究で見出した量子ダイマー模型のスピン液体状態が量子トポロジカル計算の実現につながる可能性もある。球体カゴメ系{W72Mo30}の研究目的はRVB状態の特徴的な振る舞いの検出にある。しかし,磁化過程の研究を通じてDM相互作用の存在が明らかになってきており,その存在によってRVB状態の特徴的な振る舞いがかき消されてしまう懸念も出てきた。その一方,ごく最近の論文で比熱測定の結果が報告され,それによると低エネルギーシングレット状態の総数はDM相互作用がない場合の計算とほとんど変わらないとのことである。今後も予定通りRVB状態の特徴的振る舞いの検出に向け研究を進めていく。球体カゴメ系{W72Mo30}の比熱測定結果と以前の理論計算(DM相互作用なし)の結果の間には不一致もある。特に,磁場中比熱の測定結果では,理論計算と比較して磁場依存性が小さくなっている。DM相互作用が磁場中比熱の振る舞いをどのように変えるかは興味深く,次年度の重要な課題である。ただし,歪みを含む球体カゴメ系{Mo72Mo30}ではDM相互作用の影響はあまりないように見え,状況は混沌としている。その一方で,{W72Mo30}で低エネルギーシングレット状態は多数存在しているので,RVB状態に起因した物性の測定は期待できると思われる。次年度は,トリプレット励起の分数化(スピノン励起)の問題にも取り組む予定である。ダイヤモンド装飾正方格子上のハイゼンベルグ反強磁性の有効模型としてロキサー・キベルソン点の量子ダイマー模型を実現しうることがわかったので,この量子ダイマー模型でのスピノン励起の観測の問題にも興味が持たれる。また,ネール秩序を持つ正方格子ハイゼンベルグ反強磁性体においても,一部の波数領域で励起エネルギーの連続帯が現れ,マグノンのスピノンペアへの分離が起こっていることが報告されている。そこでの計算方法はフェルミオンを用いたグッツイラー変分法である。この方法をフラストレート系(球体カゴメ系や秩序を持つ三角格子系,カゴメ格子系)に適用し,マグノンのスピノンペアへの分離を系統的に調べることは興味深く,今年度はこの計算を実行できる体制を構築したい。まず,量子ダイマー模型に相互作用項をもたらす機構の検討について,元のスピン模型で向かい合ったダイヤモンドユニット間の交換相互作用を考慮することで,ダイマー間の引力相互作用が生じることを見出し,その結果を論文発表した。更にダイヤモンドユニットを正方格子面内に寝かせた場合を考えると,そのダイマー間相互作用が斥力になる領域があることを見出し,物理学会にて発表した。次に,リープ格子ハイゼンベルグ模型の基底状態特性の研究について述べる。

ダイヤモンド装飾正方格子系のフェリ磁性相で生じるリープ格子混合スピン系について,前年度までに得ていた修正スピン波理論による結果を,量子モンテカルロ法の結果と比較検討した。エネルギーや長距離秩序パラメーターの計算精度を確かめ,また,副格子磁化の縮みに関するスケーリング則が量子モンテカルロ法でも得られることを確認した。スケーリング則を長距離秩序パラメーターに対して証明することは困難であるが,修正スピン波理論の数理構造を再検証し,それが何を意味するか議論した。この結果を論文発表するとともに,ダイヤモンド装飾三角格子の場合の計算も実行し,物理学会にて発表した。続いて,球体カゴメ系の基底状態磁化過程の研究について述べる。球体カゴメ系{W72Mo30}にて低温磁化過程測定が行われ,クラスター磁性体で生ずるべきステップ構造が見られないことが報告されている。これを理解するため,(i)サイトごとにg因子の主軸方向が変化しているため,一様磁場印加によってサイトに依存した磁場が誘起されるうること,(ii)系の構造がジャロシンスキー・守谷相互作用を許容すること,の2点を考慮して基底状態磁化過程の厳密対角化計算を行い,その結果を物理学会にて発表した。まず,量子ダイマー模型の実現に関する研究について,元のハイゼンベルグ模型で取り込む摂動と,2次有効ハミルトニアンである量子ダイマー模型で現われるダイマー間相互作用の関係性の理解が進み,ごく最近になって斥力相互作用を得ることができた。量子ダイマー模型の先行研究(モンテカルロシミュレーション)によると,resonating valence bond (RVB)状態の実現には斥力相互作用が不可欠であり,その実現に一歩近づいたものと考えている。リープ格子ハイゼンベルグ模型の基底状態特性の研究では,全スピンの期待値と自発的対称性の破れを誘発する場(無限小のスタッガード磁場)の関係性について,N(系のサイズ)の二乗項の係数はマーシャルの定理での値と同一で,Nの一乗項以下の部分だけがスタッガード磁場の影響を受けるという,一般的な結論を導くことに成功した。球体カゴメ系の磁化過程計算では,現実的なジャロシンスキー・守谷(DM)相互作用の値で実験結果を再現することができた。一方,帯磁率測定の実験データも報告されており,DM相互作用の存在と帯磁率測定の結果が整合するか調べる必要がある。DM相互作用の導入によって帯磁率の理論計算は困難となるが,熱的量子純粋状態の方法で計算を試みたところ,有意な計算結果が得られている。今後,更なる検証を進めていく。まず,ダイヤモンド装飾正方格子ハイゼンベルグ反強磁性体の低エネルギー有効ハミルトニアンとして得られる量子ダイマー模型について,相互作用パラメータのとりうる範囲を検討した。その結果,RVB状態が基底状態となるロキサー・キベルソン点を実現できることがわかり,ICM2018のプロシーディングスにまとめた。
ヒト多能性幹細胞のゲノム不安定性誘導機構の解明とその統合的品質評価系構築への応用

単一細胞のゲノムに生じた変異でも、その変異が増殖優位性に関与する遺伝子変異であれば、培養時間とともにその変異をもつ細胞は主要な構成細胞集団となるため、ヒト多能性幹細胞由来製品の品質管理を想定した場合、このような細胞の存在を検出する系を確立しておくことは重要である。そこで今年度は、ヒトiPS細胞の長期培養過程で生じたゲノム変異の存在について、以下の解析に基づいて評価した。1「増殖速度の評価」に関しては、培養期間(継代数)および培養液の組成を一致させたiPS細胞を数株準備し、増殖速度を評価した結果、増殖優位能を獲得した細胞の出現を観察することはできなかった。次に、細胞集団中に僅かに潜む増殖優位能を獲得した細胞の存在を確認するために、2「増殖優位性に関与するゲノム変異の解析」を実施した。iPS細胞の培養期に生じた変異(一塩基変異、挿入、欠失)を検出するために、次世代シークエンサーを用いたエキソーム解析を実施し、継代ごとにおける変異の蓄積を検証した。その結果、染色体3番、15番、19番に位置する遺伝子において、継代に伴った変異の蓄積が観察された。この結果は、細胞集団中に増殖優位能を獲得した細胞が僅かに存在することを意味し、これら変異に位置する遺伝子の機能が、増殖優位性と深く関わりがあることも示唆している。今後は、必要に応じて、エクソン領域以外にも、細胞の増殖優位性に寄与する遺伝子変異が存在することも予想されため、全ゲノムにまで解析範囲を広げ、高密度なゲノム変異解析を試みる。また、遺伝子の変異だけに着目せず、エピゲノムの状態なども視野に入れた包括的なゲノム解析を追加して行う必要があると思われた。iPS細胞の培養期に生じた変異(一塩基変異、挿入、欠失)の蓄積の検出に成功したことにより、細胞集団中に僅かに潜む増殖優位能を獲得した細胞の存在を見出すことができた。「増殖優位性に関与するゲノム変異の解析」に用いる増殖優位性獲得細胞株を確実に取得するために、正常なiPS細胞に変異原性物質を添加することにより、増殖優位性の表現系を示すクローンを取得し、次世代シーケンサーを用いたエキソーム解析を実施する。エキソーム解析によって検出されたエクソン上の変異(一塩基変異、挿入、欠失)に関しては、継代数に伴って変異の蓄積が認められた領域に絞って情報処理を実施し、増殖優位性と関わりのある既知の変異だけではなく、未知の変異についても検証する。現在、ES細胞やiPS細胞と言ったヒト多能性幹細胞は、再生医療・細胞治療のための原材料として使用されており、これらヒト多能性幹細胞由来の細胞をヒトに投与する際には、安全性上の「明らかな懸念」がないかを厳密に確認する必要がある。最も配慮すべき安全性上の懸念事項は、移植された細胞の中にがん細胞になる細胞が含まれていないことを明確することである。そこで本研究では、ヒト多能性幹細胞由来細胞の腫瘍形成とゲノム変化との関連性について明らかにすることを目指す。体外で培養される細胞は、継続的な培養や分化誘導などの人工的な刺激により、ゲノム変化(染色体喪失、交叉・転座・欠失等の染色体再編、点突然変異)がもたらされることが知られていることから、今年度は、培養中においてゲノム変化が起こりやすいモデル細胞の樹立を試みた。ゲノム編集技術を用いて、DNAミスマッチ修復(Mismatch Repair:MMR)遺伝子であるMLH1,MSH2,MSH6などの遺伝子の標的破壊(ノックアウト)を試みた。その結果、標的遺伝子のエクソン領域において、塩基欠損の導入、または、挿入変異の導入をもつ細胞株を取得することができ、標的遺伝子のタンパク質の機能が破綻していると予想された。また、ヌクレオチド除去修復(Nucleotide Excision Repair:NER)機構に異常をもつiPS細胞においても増殖速度について検討を行ったところ、正常なiPS細胞との顕著な差は認められなかった。今後は、これらDNA修復機構が破綻した細胞株が、培養中におけるゲノム変化が起こりやすいモデル細胞として有用であるかについて解析を進める予定である。今年度は、「増殖優位性に関与するゲノム変異の解析」を主な研究計画として掲げ、ゲノム変化が起こりやすいと予想されるモデル細胞を取得することができたことから、当初の計画を概ね遂行することができた。

この結果は、細胞集団中に増殖優位能を獲得した細胞が僅かに存在することを意味し、これら変異に位置する遺伝子の機能が、増殖優位性と深く関わりがあることも示唆している。今後は、必要に応じて、エクソン領域以外にも、細胞の増殖優位性に寄与する遺伝子変異が存在することも予想されため、全ゲノムにまで解析範囲を広げ、高密度なゲノム変異解析を試みる。また、遺伝子の変異だけに着目せず、エピゲノムの状態なども視野に入れた包括的なゲノム解析を追加して行う必要があると思われた。iPS細胞の培養期に生じた変異(一塩基変異、挿入、欠失)の蓄積の検出に成功したことにより、細胞集団中に僅かに潜む増殖優位能を獲得した細胞の存在を見出すことができた。これまでに、ゲノム変化が起こりやすいと予想されるモデル細胞を取得することができたことから、今後は、これら細胞株についての特性解析、および、様々な培養環境化で培養した場合に起こりうるゲノム異常に関しての詳細な変異解析を実施する予定である。「増殖優位性に関与するゲノム変異の解析」に用いる増殖優位性獲得細胞株を確実に取得するために、正常なiPS細胞に変異原性物質を添加することにより、増殖優位性の表現系を示すクローンを取得し、次世代シーケンサーを用いたエキソーム解析を実施する。エキソーム解析によって検出されたエクソン上の変異(一塩基変異、挿入、欠失)に関しては、継代数に伴って変異の蓄積が認められた領域に絞って情報処理を実施し、増殖優位性と関わりのある既知の変異だけではなく、未知の変異についても検証する。研究資材の調達方法の工夫などにより、当初の計画より経費の節約ができたため。また、残金分は消耗品費及び旅費の一部として使用する。一部の物品において当該年度内での納入が間に合わなかったため。また、研究資材の調達方法の工夫などにより、当初の計画より経費の節約ができたため。残金分は消耗品費及び旅費の一部として、次年度へ繰り越した。
ヒト脂肪組織由来幹細胞を用いた新たな末梢神経再生促進療法の開発

移植8週間後再生組織を採取し、トルイジンブルー染色や抗S100抗体による免疫染色で組織学的評価を行ったところ、ADRC移植群でより多くの神経再生を認めた。しかし運動誘発筋電図や歩行解析の機能的評価では著しい改善は認めなかった。神経損傷部への移植と同時に骨格筋にADRCを移植することで、筋萎縮予防の効果も期待できると考えた。in vivo imagingでADRCの信号が消失したこと、免疫染色でヒト由来細胞が特定できなかったことから、ADRC移植による神経再生の作用機序として、ADRCの神経・血管等へ直接分化は考えにくく、ADRC移植により何らかのパラクライン効果が働いたと推測した。脂肪組織由来再生細胞の血管新生促進能を利用した、新たな末梢神経再生治療の確立を目指す。さらに、脂肪組織由来再生細胞を末梢神経とその支配筋に移植し、神経損傷による筋萎縮を防ぐ発展的な治療法の開発も目指す。手術の際廃棄される脂肪組織より、celutionと用いてヒト脂肪組織由来再生細胞(Adipose tissue derived regenerative cell: ADRC)の単離を行った。ADRCにおける細胞特性の解明として、flow cytometryを用いた表面マーカーの評価を行っている。現在適切な二次抗体の選択・組み合わせを検討中である。ADRC移植の神経再生効果と機序の解明のため、免疫不全ラットの末梢神経損傷モデルを作製している。PBS群・hFB群・ADRC移植群を各群n=6で作製し比較検討する予定だが、現時点では各群とも作製途中である。現時点での結果は以下の通りである。IVISを用いたin vivo imagingにより移植細胞の局在やその経時的変化を評価するが、hFB群では移植後8週で信号を認めたが、ADRC群は移植後12週まで信号を認めた。移植後8週での歩行解析では、各群間で有意差は認めていない。移植後8週で神経を採取するが、全てのグループで肉眼的に神経欠損部での再生組織の架橋を認めた。機能的な神経再生を確認するために損傷神経中枢を電気刺激し筋組織における筋電位を測定したが、ADRC群でのみ電位を認めた。組織学的評価では各群間で、有髄繊維数・軸索直径等に有意差を認めていない。免疫染色ではADRC群でS100陽性を認め、シュワン細胞の再生を確認した。しかしヒト特異的ミトコンドリア抗体は陰性で、ADRCから神経細胞への分化は認めなかった。現時点ではADRC群は十分に作製できておらず、今後更にサンプル数を増やす必要がある。組織学的評価では各群間で、軸索直径に有意差を認めなかったが、有髄繊維数・軸索充填密度ではADRC群で有意に大きい値を示した。現時点で行っているADRC単離の方法では、一回の操作で最低限必要な脂肪組織は100mlであるが、十分量が廃棄される手術の機会は頻回ではなく、ADRC獲得に難渋している。手術の際廃棄される脂肪組織より、celutionを用いてヒト脂肪組織由来再生細胞(Adipose tissue derived regenerative cell: ADRC)の単離を行った。ADRC移植の神経再生効果と機序の解明のため、免疫不全ラットの末梢神経損傷モデルを作製した。PBS群・hFB群・ADRC移植群を各群n=6で作製し、各群における神経再生を比較検討した。また、神経欠損部へのADRC移植と同時に、腓腹筋へ直接ADRCを注入したADRC-M群を作製し、腓腹筋萎縮の評価を行った。移植後8週で神経を採取したが、全てのグループで肉眼的に神経欠損部での再生組織の架橋を認めた。機能的な神経再生を確認するために損傷神経中枢を電気刺激し筋組織における筋電位を測定したが、ADRC群・ADRC-M群で電位を認めた。

組織学的評価では各群間で、軸索直径に有意差を認めなかったが、有髄繊維数・軸索充填密度ではADRC群で有意に大きい値を示した。免疫染色ではADRC群でS100陽性を認め、シュワン細胞の再生を確認した。しかしヒト特異的ミトコンドリア抗体は陰性で、ヒトADRCから神経細胞への分化は認めなかった。腓腹筋湿重量の測定では、PBS群・hFB群よりADRC群が、ADRC群よりADRC-M群で有意に重かった。マッソントリクローム染色を行った腓腹筋横断切片の腓腹筋筋線維径の測定では、PBS群・hFB群よりADRC群が、ADRC群よりADRC-M群で有意に大きな値を示した。移植8週間後再生組織を採取し、トルイジンブルー染色や抗S100抗体による免疫染色で組織学的評価を行ったところ、ADRC移植群でより多くの神経再生を認めた。しかし運動誘発筋電図や歩行解析の機能的評価では著しい改善は認めなかった。神経損傷部への移植と同時に骨格筋にADRCを移植することで、筋萎縮予防の効果も期待できると考えた。in vivo imagingでADRCの信号が消失したこと、免疫染色でヒト由来細胞が特定できなかったことから、ADRC移植による神経再生の作用機序として、ADRCの神経・血管等へ直接分化は考えにくく、ADRC移植により何らかのパラクライン効果が働いたと推測した。現時点で行っているADRC単離の方法では、一回の操作で最低限必要な脂肪組織は100mlであるが、十分量が廃棄される手術の機会は頻回ではなく、ADRC獲得に難渋している。ADRCの採取の他方法、ADRC保存に関して検討し、ADRC利用機会を増やす。徐々に実験サンプル数が増えてきており、各群間の比較・評価を進めていく予定である。整形外科学ADRCの採取の他方法、ADRC保存に関して検討し、ADRC利用機会を増やす。各群共にモデル作製を行い、その評価を進める。今年度に予定していた解析を翌年度に行えるよう、予算を確保したため。解析を行う費用に充てる予定である。
生体内ラジカル反応の制御を目的とした新規バイオマーカーの開発と応用

マクロファージや好中球由来のジチロシンはチロシンの二量体であり、特異的な蛋白質の酸化修飾マーカーである。これまでにコラーゲンやレンズクリスタリンなどのタンパク質でジチロシンが検出されているが、化学的な手法では組織・細胞内におけるジチロシンの局在性を明らかにすることは困難である。そこで、我々はジチロシンを認識するポリクロ一ナル抗体の作製を試み、その特異性を解析し、また、免疫組織染色によるヒト脳におけるジチロシンの検出及びその局在性を明らかにすることができた。また、脂質過酸化初期生成物として、リノール酸ヒドロペルオキシドがタンパクと反応し新しい付加生成物、ヘキサノイルリジンガ生成し、また、脂質過酸化終期生成物として、アクロレインが酸化ストレス発現に重要な役割を果たしていることを有機化学的に明らかにすることができた。さらに、糖尿病の新しいバイオマーカーとして、糖化蛋白質、特に、メチルグリオキサール(メイラード反応生成物)との反応産物であるアルグピリミジンに特異的なモノクロ一ナル抗体の作成に成功し、ヒトの動脈硬化巣に対する免疲染色に成功した。また、最近では、デオキシグアノシンと13-リノール酸ヒドロペルオキシドとの縮合物の化学構造の解析に成功し、モノクロ一ナル抗体の作成にも成功することができた。そこで、我々はジチロシンを認識するポリクローナル抗体の作製を試み、その特異性を解析し、また、免疫組織染色によるヒト脳におけるジチロシンの検出及びその局在性を明らかにすることができた。また、脂質過酸化終期生成物として、アクロレインが酸化ストレス発現に重要な役割を果たしていることを有機化学的に明らかにすることができた。さらに、糖尿病の新しいバイオマーカーとして、糖化蛋白質、特に、メチルグリオキサール(メイラード反応生成物)との反応産物であるArgpyrimidine化学構造を明らかにすることができた。そこで、アク口レイン修飾蛋白質やArgpyrimidinc修飾蛋白質を抗原として用い、動物(マウス)にそのまま免疫する。マウス脾臓からのハイブリドーマ作成手順などは定法通り行い、モノクローナル抗体の作成に成功し、ヒトの動脈硬化巣に対する免疫染色に成功した。また、MRXと命名した糖尿病の新しいバイオマーカーを糖尿病患者の尿中に見いだし、化学構造を明らかにすることにも成功した。一方、核酸由来の新規バイオマーカーの探索を目的に、核酸塩基をマーカー生成源として用い、チミジンと酸素ラジカル(ヒドロキシルラジカルなど)との反応生成物及びデオキシグアノシンと13-リノール酸ヒドロベルオキシドとの縮合物の化学構造の解析に成功したので、今後、モノクローナル抗体の作成を試みる予定である。また、脂質過酸化初期生成物として、リノール酸ヒドロペルオキシドがタンパクと反応し新しい付加生成物、ヘキサノイルリジンが生成し、また、脂質過酸化終期生成物として、アクロレインが酸化ストレス発現に重要な役割を果たしていることを有機化学的に明らかにすることができた。さらに、糖尿病の新しいバイオマーカーとして、糖化蛋白質、特に、メチルグリオキサール(メイラード反応生成物)との反応産物であるアルグピリミジンに特異的なモノクローナル抗体の作成に成功し、ヒトの動脈硬化巣に対する免疫染色に成功した。

また、最近では、デオキシグアノシンと13-リノール酸ヒドロペルオキシドとの縮合物の化学構造の解析に成功し、モノクローナル抗体の作成にも成功することができた。