hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プルーム火成の新しいモデル

マントルプルームの起こすマグマ活動を解明するために、米国のコロンビアリバー洪水玄武岩の成因を実験岩石学的に検討した。1)コロンビアリバー玄武岩の大部分はぺリドタイトの部分融解によって生じたマグマではないこと、2)10億年以上前に沈み込んだ海洋底地殻(MORB)が約70kmの深さで20-60%部分融解すればコロンビアリバー玄武岩を作ることが出来ること、我々の研究の結果、コロンビアリバー玄武岩を供給したイエローストーンホットスポットは、通常のアセノスフィアより最大でも100°C程度しか温度が高くなかったことが分かった。玄武岩およびぺリドタイトの2成分よりなるプルームの溶解過程を理解するために、標準的なマントルペリドタイトKLB-1と玄武岩を異なる割合で混合した出発物質について、1-3GPaの圧力下で融解実験を行い、メルト生成量と温度圧力の関係、メルトの化学組成、融け残り鉱物の化学組成とその量比を決めた(Kogiso, Takahashi, Hirose, E.P.S.L., in press 1998)。この研究の結果、玄武岩成分に富むカンラン岩の融解過程では、Ca輝石とガ-ネットが溶解の後期まで溶け残り、メルト組成は海洋島玄武岩(OIB)に普遍的に見られるシリカに乏しいアルカリ玄武岩となることが分かった。
JNKシグナル系による骨代謝制御機構の解析

本研究ではストレスシグナル伝達系である、MKK-JNKシグナル経路の骨細胞における生体内高次機能の解明を目的として研究を進める。具体的には、1)骨細胞特異的な時期特異的遺伝子破壊システムの構築と条件付きSEK1遺伝子破壊マウス系統の樹立を行う。続いて、これらマウス系統を交配する事で2)骨細胞特異的SEK1,MKK7遺伝子破壊マウスの作出を行い、ストレス応答性シグナル伝達分子の骨組織での高次機能について解析を行う。さらに、ストレス応答経路の分子機構を解明する事により、3)骨組織の重力ストレス感知機構における新規分子標的の同定を目的とする。これまでにMKK7遺伝子破壊マウスの作出され、成長遅延の表現型が観察されており、骨組織への影響も生じていると考えられる。本マウスの詳細な解析により、本シグナルの新たな生理機能が解明されると期待される。今年度は、時期組織特異的遺伝子破壊に用いるfloxed SEK1遺伝子改変マウスの作成を試みた。具体的には、E14K ES細胞をフィーダー細胞非存在下にて純粋培養し、1290laゲノムDNAを抽出、PCR法を用いてSEK1/MKK4遺伝子断片を取得した。取得したSEK1/MKK4遺伝子断片に、loxP配列・ネオマイシン耐性遺伝子を組み込み、ネガティブ選択マーカーとしてDTA遺伝子を加え、floxed SEK1/MKK4遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築したベクターをE14K ES細胞にエレクトロポレーション法を用いて遺伝子導入し、G418存在下で1週間に渡って培養、G418耐性コロニーを得た。各々のコロニーからゲノムDNAを抽出し、PCR法・サザンブロッティング法にて相同組換え体ESクローンを同定した。各クローンをC57BL/6の胚盤胞ヘインジェクション法により導入、floxed SEK1/MKK4キメラマウスを得た。現在、生殖細胞系への移行を確認するため野生型マウスとの交配を行っている。生物は様々な外部環境の変動(ストレス)に対して、的確に応答する事で生体内の恒常性を保ち、個体を維持している。このようなストレスには高温や紫外線のほか、ウィルス・細菌等の生体に対する異物、機械的刺激、更には心理的・生理的刺激など非常に多くの種類が存在する。近年、これらの様々なストレス刺激によって、c-Jun amino-terminal kinase(JNK)系を介するシグナル伝達系が活性化され、細胞増殖・分化・機能調節に関与する事が、主に培養細胞を用いた研究によって明らかになってきている。申請者が新たに所属する研究グループでも、これまでに2種類の活性化因子、SEK1/MKK4とMKK7が協調してJNKをリン酸化し、強力な活性化状態を誘導する事、さらにSEK1およびMKK7の全身性遺伝子破壊マウス系統を樹立し、ともに胎生期の10.512.5日齢で致死である事を見出している。続いて、これらマウス系統を交配する事で2)骨細胞特異的SEK1, MKK7遺伝子破壊マウスの作出を行い、ストレス応答性シグナル伝達分子の骨組織での高次機能について解析を行う。
生検肝組織のin vitro標識法による慢性肝疾患の病期の解析(肝細胞の細胞回転と線維化の進行様式)

目的:慢性肝疾患における一定時期の肝細胞の障害と線維化の度合は、常に進行するのではなく、炎症の盛衰と肝細胞再生の活性化により変動するもので、そのために病理組織像から病期と予後を判定することが困難であるものと考えられる。本研究では肝構成細胞の細胞回転を知ることにより、日常の肝生検組織診断に際し病期の判定、肝細胞の予備力、予後の推量に役立てようとする。症例と方法:肝硬変症(LC)4例、慢性活動性肝炎(CAH)12例、慢性非活動性肝炎(CIH)2例、急性肝炎治癒期(AH)1例、アルコ-ル性肝障害(ALI)1例の計20例の生検肝組織を用いた。1時間の短期組織培養にてBromodeoxyuridine(BrdU)を取り込ませ、抗BrdU単クロ-ン抗体を一次抗体として、ABC法にて免疫組織化学を行ない、S期肝細胞の標識率と分布を求めた。併せて、細胞増殖に関与するといわれるEGF、EGF receptor、c-Ha-ras p21、c-myc p62の発現を免疫組織化学的に検討した。結果:BrdUにて標識された肝細胞はすべての症例において観察され、その平均は16.5±7.3%であった。CIH2例の平均が3.6±2.6%であったことから、LCやCAHにおいては肝細胞が活発に再生を繰返していることが明らかとなった。LC4例とCHA12例の平均標識率は22.4±4.2、16.9±3.8%であり、両者の間には有意の差異が認められた。LCやCAHの原因別による標識率には差異は認められなかった。また、組織学的な炎症細胞浸潤や肝細胞壊死の度合とも、肝細胞のBrdU標識率は相関しなかった。Growth factorやoncogene protein発現の検討ではEGF(0/20)、EGF receptor(0/20)、c-Ha-ras p21(7/21)、c-myc p62(2/20)であった。しかし、p21やP62の発現症例がBrdU標識法との間に一定の関係は認められなかった。考察とまとめ:生検肝組織を用いたin vitroのBrdU標識法にて、LC22.4%、CHA16.9%という高い標識率が得られ、これらの慢性肝疾患では肝細胞が活発に再生していることが明らかとなった。肝細胞の標識率は組織の線維化とに相関し、炎症細胞浸潤や肝細胞壊死の度合とは関係しなかった。肝組織におけるgrowth factorやoncogene protein発現と、肝細胞の再生の度合には直接の関係は認められなかった。目的:慢性肝疾患における一定時期の肝細胞の障害と線維化の度合は,常に進行するのではなく,炎症の盛衰と肝細胞再生の活性化により変動するもので,そのために病理組織像から病期と予後を判定することが困難であるものと考えられる.本研究では肝構成細胞の細胞回転を知ることにより,日常の肝生検組織診断に際し病期の判定,肝細胞の予備力,予後の推量に役立てようとする.症例と方法:肝硬変症(LC)3例,慢性活動性肝炎(CAH)9例,慢性非活動性肝炎(CPH)1例,治癒期急性肝炎(AH)2例を検索に用いた. 1時間の短期組織培養にてThymidineの類似物であるBromodeoxyuridine(BrdUrd)を取り込ませ,抗BrdUrd単クローン抗体を一次抗体として, ABC法にて免疫組織化学を行ない, S期肝細胞の標識率と分布を求めた.結果:BrdUrdにて標識された肝細胞はLC(3/3), CAH(6/9),の大部分の症例において認められたのに対し, CPH(0/1)と治癒期AH(0/2)では認められなかった.標識率は150%と差異が大きかったが, LCとCAHともに線維化や炎症の度合いとの間に一定の関係は認められなかった.肝小葉内における特定の部位への局在はみられなかったが,標識率の高い肝硬変症例では, 1つの偽小葉の大部分がS期細胞より成っていた.Kupffer細胞や線維芽細胞の標識の有無は,標識された炎症細胞の浸潤のために判別できなかった.考察と反省:LCとCAHでは、肝細胞が活発に再生していることが明らかにされた。これに対し、CPAや治癒期AHでは、肝細胞は休止期(Go)にあることが示された。しかし、各症例における標識率は150%と差異が大きく、病理組織像と臨床像と併せて、その意義の検討が必要である。また、50D%もの肝細胞が同時にS期にあるとは考え難く、免疫組織化学の精度の向上が必要である。1^3H-prolineによる線維化の検討は、オ-トラジオグラフィ-標本の作製が困難であり、次年度に繰越された。症例と方法:肝硬変症(LC)4例、慢性活動性肝炎(CAH)12例、慢性非活動性肝炎(CIH)

2例、急性肝炎治癒期(AH)1例、アルコ-ル性肝障害(ALI)1例の計20例の生検肝組織を用いた。1時間の短期組織培養にてBromodeoxyuridine(BrdU)を取り込ませ、抗BrdU単クロ-ン抗体を一次抗体として、ABC法にて免疫組織化学を行ない、S期肝細胞の標識率と分布を求めた。併せて、細胞増殖に関与するといわれるEGF、EGF receptor、c-Ha-ras p21、c-myc p62の発現を免疫組織化学的に検討した。結果:BrdUにて標識された肝細胞はすべての症例において観察され、その平均は16.5±7.3%であった。CIH2例の平均が3.6±2.6%であったことから、LCやCAHにおいては肝細胞が活発に再生を繰返していることが明らかとなった。LC4例とCHA12例の平均標識率は22.4±4.2、16.9±3.8%であり、両者の間には有意の差異が認められた。LCやCAHの原因別による標識率には差異は認められなかった。また、組織学的な炎症細胞浸潤や肝細胞壊死の度合とも、肝細胞のBrdU標識率は相関しなかった。Growth factorやoncogene protein発現の検討ではEGF(0/20)、EGF receptor(0/20)、c-Ha-ras p21(7/21)、c-myc p62(2/20)であった。しかし、p21やP62の発現症例がBrdU標識法との間に一定の関係は認められなかった。考察とまとめ:生検肝組織を用いたin vitroのBrdU標識法にて、LC22.4%、CHA16.9%という高い標識率が得られ、これらの慢性肝疾患では肝細胞が活発に再生していることが明らかとなった。肝細胞の標識率は組織の線維化とに相関し、炎症細胞浸潤や肝細胞壊死の度合とは関係しなかった。肝組織におけるgrowth factorやoncogene protein発現と、肝細胞の再生の度合には直接の関係は認められなかった。目的:慢性肝疾患における一定時期の肝細胞の障害と線維化の度合いは、常に進行するものではなく、炎症の盛衰と肝細胞再生の活性化により変動するもので、そのために病理組織像から病期と予後を判定することが困難であるものと考えられる。本研究では肝構成細胞の細胞回転を知ることにより、日常の肝生検組織診断に際し病期の判定、肝細胞の予備力、予後の推量に役立てようとする。結果:BrdUrdにて標識された肝細胞はLCとCAHの全例において1030%(平均28.5%)認められたのに対し、CPHとAHでは1%以下であった。標識率の高いLC例では1つの偽小葉の大部分の細胞がS期細胞より成立っており、活発に再生増殖していることが明らかとなった。しかし、線維化や炎症の度合いとの間にEGF,oncogene productsは全例においてび慢性に肝細胞に認められたが、EGF-recepterは陰性であった。考察と反省:LCとCAHでは、肝細胞が活発に再生していることが明らかにされた。これに対し、CPAや治癒期AHでは、肝細胞は休止期(Go)にあることが示された。しかし、各症例における標識率は1030%と差異が大きく、病理組織像と臨床像と併せて、その意義の検討が必要である。細胞増殖を促進させるEGF,c-Ha-ras-,c-myc-oncogeneのproductsが再生肝細胞に陽性であったことは興味深い。今後の詳細な検討が必要である。^3H-prolineによる線維化の検討は、オートラジオグラフィー標本の作製が困難であり、次年度に繰越された。
カイコにおける発生段階ならびに性特異的遺伝子発現機構の解析

カイコSPI遺伝子の転写制御領域に結合する脂肪体核内因子について解析した。SP1遺伝子の5′上流1.4kbの領域より各種DNA断片を調製し、これらと4齢幼虫、5齢幼虫、蛹の各脂肪体核抽出液との相互作用についてゲルシフト法で解析したところ、各発生段階の脂肪体核には特異的なDNA結合因子が複数存在することが示唆された。SP1遺伝子の上流域にはSP2遺伝子と上流域と17塩基が完全に一致する配列が存在する。この領域をプローブとしてゲルシフト解析を行った結果、幼虫および蛹脂肪体の核中にはこの領域のDNA配列と特異的に結合する因子が検出されたが、これら因子は後部絹糸腺およびカイコ培養細胞中には検出されなかった。この結果はDNaseフットプリント解析でも確認されたことから、両遺伝子上流の17塩基配列は脂肪体組織特異的な転写制御のシス領域であることが推察された。脂肪体核抽出液とSP1遺伝子上流域との複合体形成を雌雄について比較してみると-764から+16の範囲には雌あるいは雄の核抽出液と特異的に結合する領域が複数検出された。このうち、-108-+16の領域は4齢雌雄および5齢雌の脂肪体核内因子と特異的複合体を形成したが、5齢雄の核抽出液とはその形成がみられなかった。5齢雌の核抽出液をDNAセルローズクロマトグラフィーで分画したところ、0.2M NaCl溶出画分にこのDNA結合因子が部分精製されていることが確認された。この因子は5齢雄の核抽出液の画分には検出されないことから、SP1遺伝子の雌特異的転写に関与していることが推察された。カイコ後期発生過程における遺伝子転写の制御機構を解明するため、カイコ幼虫脂肪体より無細胞転写系を確立し、この系においてクローン化遺伝子の転写を試みた。遺伝子転写の鋳型DNAを作成するため、カイコ主要体液タンパク質(SP1,SP2,30Kタンパク質,ビテロゲニン)、主要上皮タンパク質(LCP,PCP)の各遺伝子ならびにアデノウイルス主要後期遺伝子DNAより転写開始点上流域をプラスミド・ベクターに連結し増殖させた。次に、脂胞体細胞より効率よく核を分離。精製するため、細胞破砕法を改良した。カイコ脂肪体組織の外部表層は結合組織状の膜構造で覆われているため、通常のホモゲナイズ法で細胞を均一に破砕することは極めて困難であったが、幼虫より摘出後、脂肪体を0.2%NP40を含む低調液中に0°C、10分間保存し細胞を膨潤させたのちホモゲナイズすると脂肪体は完全に破砕され、効率よく核が遊離されることが判明した。この方法で調製した核を高調硫安溶液で抽出し脂肪体核抽出液を調製した。この抽出液は、-80°Cで凍結保存する限りRNAポリメラーゼ活性を少なくとも3箇月は安定に保持することが判明した。クローン化SP1遺伝子を鋳型として核抽出液中にて無細胞転写反応を行い、SIヌクレアーゼ・マッピング法により転写産物を定量し、反応系における各種パラメーターについて解析した。その結果、反応の最適温度は20°C、至適pHは7.9、カリウム,マグネシウムの最適濃度は、それぞれ60mM,4mMであった。この核抽出液は、SP2,30Kタンパン質,ビテロゲニン等の遺伝子を効率よく転写した。核抽出液の濃度の高い条件では系の鋳型選択性がみられ、SP1遺伝子はアデノウイルス遺伝子より高率で転写された。
関節リウマチのCD4T細胞を中心とした炎症病態解析

本研究課題では関節リウマチ(RA)の関節炎症病態におけるCD4T細胞の機能について解析をおこなった。関節リウマチ患者から採取した、末梢血、滑膜、関節液よりリンパ球を分離し、マイトジェン刺激で短時間の培養後、IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSFの計7種類のサイトカインを染色し、米ベクトンディッキンソン社製FACSVerseフローサイトメータを用いて検出した。末梢血に比べて関節内ではIFN-γ、IL-21を産生するCD4T細胞が有意差を持って増加していた。また近年新たな治療標的として注目されるGM-CSFを産生する細胞も、特に末梢血中ではIFN-γについで2番目に高い頻度で産生されていることが明らかになった。多重染色解析では、これらGM-CSF産生細胞のほとんどはIFN-γ産生CD4T細胞に含まれて、さらにその一部がIL-21も産生しているという状況であった。すなわち関節リウマチ患者の炎症関節内では、末梢血には見られない独特な多機能エフェクターCD4T細胞が浸潤していることが明らかになった。これらの結果は日本リウマチ学会などで発表したほか、英文雑誌上でも報告している(Yamada H et al. RMD Open 2017, 13;3(1):e000487)。上記実験と並行して、スウェーデンカロリンスカ研究所と共同で行った、マウス関節炎モデルにおけるT細胞研究からは、II型コラーゲン特異的自己反応性CD4T細胞の中で、転写後糖鎖修飾を受けたII型コラーゲン分子に特異的なものは胸腺上皮による免疫寛容が誘導されていないため、末梢で関節炎を引き起こすことが明らかになった。本研究結果についても、英文雑誌上で報告している(Roposo B et al. Nat Commun 2018, 9(1):353)。関節リウマチ患者から採取した、末梢血、滑膜、関節液よりリンパ球を密度遠心法にて分離し、ゴルジ装置阻害剤の存在下で、無刺激、あるいはマイトジェン刺激を加えて4時間培養した。その間に細胞内で産生、蓄積されたサイトカインの中で、IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSFの計7種類を染色し、その発現を米ベクトンディッキンソン社製FACSVerseフローサイトメータを用いて検出した。解析症例数を蓄積しつつ、CD4陽性Tリンパ球におけるこれらのサイトカインの発現を末梢血と関節内で比較したところ、関節内では特にIFN-γとIL-21の産生細胞の頻度が高いことがわかった。近年新たな治療標的として注目されるGM-CSFを産生する細胞については、特に末梢血中ではIFN-γについで2番目に高い頻度で産生されていることが明らかになったが、末梢血と関節内ではその数に差を認めなかった。これは滑液と滑膜でも差がなかった。ただし、末梢血中のGM-CSF産生細胞は他のサイトカインは産生しないものが多かったのに対し、関節内のGM-CSF産生細胞の多くはIFN-γも同時に産生していることがわかった。興味深いことにマウスの炎症性疾患モデルでその重要性が示されている、IL-17とGM-CSFを共産生するT細胞は、ヒト関節リウマチではほとんど存在しないことがわかってきた。なお、上記のサイトカインの発現パターンと、ケモカインレセプターなど各種細胞表面分子の発現パターンとの関係の解析も試みたが、これについては特にケモカインレセプターの発現が培養後に大きく変化することが多く、現在のところは十分な解析はできていない。多染色フローサイトメータ法による、RA患者ヘルパーT細胞サブセットの包括的解析については、滑液細胞は比較的入手しやすいこともあり、ほぼ順調に解析が進んでいるが、滑膜培養実験については、解析に適した炎症活動性が比較的高い滑膜組織を得ることが昨今極めて困難になっているため、条件検討実験もまだ十分に行えていない状態である。今後も劇的に状態が改善するとは考えづらいが、これを継続する必要がある。動物実験はまだ交配を進めている段階である。平成28年度に引き続き、関節リウマチ患者の末梢血と関節内からリンパ球を採取し、CD4T細胞のサイトカイン産生プロファイルの解析を行った。末梢血に比べて関節内ではIFN-γ、IL-21を産生するCD4T細胞が有意差を持って増加していることが確認された。またGM-CSF産生CD4T細胞も比較的多く認めたが、それらはほとんどがIFN-γ産生CD4T細胞に含まれており、その一部がさらにIL-21も産生しているという状況であった。すなわち関節リウマチ患者の炎症関節内では、末梢血には見られない多機能エフェクターCD4T細胞が浸潤していることが明らかになった。現在はこれらの細胞の特徴、特に関節内への浸潤機構を明らかにするため、各種ケモカインレセプターなどの細胞表面分子の発現パターン解析や機能解析を行っている。

一方、スウェーデンカロリンスカ研究所との共同研究による、マウスを用いたCD4T細胞の機能解析においては、自己II型コラーゲン特異的CD4T細胞の中でも転写後糖鎖修飾を受けたII型コラーゲン分子に反応するものは胸腺上皮によって免疫寛容が誘導されておらず、末梢で十分なエフェクター機能を発現し、関節炎を引き起こし得ることが明らかになった。本研究結果についても最近、英文雑誌上で報告した(Roposo B et al. Nat Commun 2018, 9(1):353)。当初目標である関節リウマチ患者の血液、関節液中のCD4T細胞の特徴を、主にサイトカイン産生パターンにからとらえることについては、現在までの解析でほぼ達成できており、今後は主にその他の分子による機能解析を中心に実験を継続する。ただし、滑膜組織を用いた解析、特に培養実験については、解析サンプル数が充分とはいえず、今後も精力的な継続が必要である。動物実験についても、ほぼ予定通り解析を行うことができている。本研究課題では関節リウマチ(RA)の関節炎症病態におけるCD4T細胞の機能について解析をおこなった。関節リウマチ患者から採取した、末梢血、滑膜、関節液よりリンパ球を分離し、マイトジェン刺激で短時間の培養後、IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSFの計7種類のサイトカインを染色し、米ベクトンディッキンソン社製FACSVerseフローサイトメータを用いて検出した。末梢血に比べて関節内ではIFN-γ、IL-21を産生するCD4T細胞が有意差を持って増加していた。また近年新たな治療標的として注目されるGM-CSFを産生する細胞も、特に末梢血中ではIFN-γについで2番目に高い頻度で産生されていることが明らかになった。多重染色解析では、これらGM-CSF産生細胞のほとんどはIFN-γ産生CD4T細胞に含まれて、さらにその一部がIL-21も産生しているという状況であった。すなわち関節リウマチ患者の炎症関節内では、末梢血には見られない独特な多機能エフェクターCD4T細胞が浸潤していることが明らかになった。これらの結果は日本リウマチ学会などで発表したほか、英文雑誌上でも報告している(Yamada H et al. RMD Open 2017, 13;3(1):e000487)。上記実験と並行して、スウェーデンカロリンスカ研究所と共同で行った、マウス関節炎モデルにおけるT細胞研究からは、II型コラーゲン特異的自己反応性CD4T細胞の中で、転写後糖鎖修飾を受けたII型コラーゲン分子に特異的なものは胸腺上皮による免疫寛容が誘導されていないため、末梢で関節炎を引き起こすことが明らかになった。本研究結果についても、英文雑誌上で報告している(Roposo B et al. Nat Commun 2018, 9(1):353)。基本的には当初の計画通りに研究を推進する。中でも解析が進んでいる、関節リウマチ患者T細胞の解析については、細胞表面分子の解析にセルソーターを用いた、培養前サブセット分取も取り入れて解析をさらに進める予定である。ただし昨年、米国の研究室から関節リウマチ患者の関節内で、T細胞活性化抑制分子PD-1を発現し、かつIL-21産生CD4T細胞が増加していることが報告され(Rao DA et al. Nature 2017 542:110-114)、大きく注目されていることから、今後は我々が解析してきたCD4T細胞群との関係も早急に明らかにしてゆくことが必要となってきた。臨床検体の入手状況などにより、一部の実験系の進捗が予定より遅延したため。
光親和性エピトープタグプローブを利用した就眠運動関連受容体の同定と生物有機化学

就眠運動は葉を開かせるLeaf-opening factor(LOF)と葉を閉じさせるLeaf-closingfactor(LCF)の2種の生理活性物質により制御されている.その作用機構解明のために,分子プローブを用いてこれらの生理活性物質の標的タンパク質を抗原性ペプチド(FLAG)で標識し、免疫沈降法を用いて精製しようと考えた.FLAGは特異性の高い優れた標識であるが、分子サイズが大きく,これを導入することにより、分子プローブと標的タンパク質との結合能の低下が予想された.そこで,アジドを導入したサイズの小さな分子プローブ用いて標的タンパク質をアジド標識化し,Click chemistryを用いて段階的にFLAGを導入することとした.一昨年度までに,本方法を用いてLOFであるイソレスペデジン酸カリウム標的タンパク質を発見,精製することに成功し,この配列解析を行った.昨年度は,本方法論を利用して,LCFであるジャスモン酸グルコシド(1)の標的タンパク質(MTJG)を検出することで,本方法論が低分子生理活性物質の標的同定に幅広く利用可能な優れた方法論であることを示した.ジャスモン酸グルコシド(1)はアメリカネムノキの葉を閉じさせるLCFである.化合物1に反応性官能基とアジド基を導入したプローブを用いてその標的タンパク質をアジド標識化し,その後,Click chemistryを利用してFLAGの導入を試みた.その際に,銅触媒存在下でのCuAACおよび銅触媒を必要としないCFCCとを検討した.その結果,CuAACを用いた場合に1の標的タンパク質であるMTJGを検出することに成功した.本結果より,Click chemistryを用いる段階的FLAG標識化が生理活性物質の標的同定において幅広く利用可能な優れた方法論であることが示された.イソレスペデジン酸カリウム(1)はカワラケツメイの就眠運動をコントロールする生理活性物質である.我々は分子プローブを用いて,1の標的タンパク質を抗原性ペプチド(FLAG)で標識し,免疫沈降法を用いて精製しようと考えた.FLAGは特異性の高い優れた標識であるが,分子サイズが大きく,これを導入することにより,分子プローブと標的タンパク質との結合能の低下が予想された.そこで,アジドを導入したサイズの小さな分子プローブを用いて標的タンパク質をアジド標識化し,Click chemistryを用いて段階的にFLAGを導入することとした.昨年度は,分子プローブを合成し,標的タンパク質の検出に成功した.ヨードアセトアミド基とアジド基を導入した分子プローブ(2)を設計し,合成した.合成した2は,3×10^<-6>Mでカワラケツメイの葉を開かせる活性を示した.これは天然物の活性値の3倍の値であり,活性をほぼ保持したままのプローブ化に成功した。続いて,化合物1の標的細胞である運動細胞をプロトプラスト化し,合成したプローブを用いた標的タンパク質の標識化実験を行った.運動細胞プロトプラストをプローブ2とインキュベートすることにより標的タンパク質をアジド標識化し,続いてClick chemistryを用いてFLAGを導入した.得られた反応物を細胞質画分と膜画分に分画したあと,各々をSDS-PAGEで分析した.その結果,細胞質画分に1の標的として.分子量83kDaのFLAG標識化タンパク質が検出された.続いて,抗FLAG抗体を用いた免疫沈降法によって,このタンパク質を精製することに成功した.このように,Click chemistryを用いる標的タンパク質のFLAG標識化は,生理活性天然物の標的検出と精製に利用できる強力な手法であることが示された.イソレスペデジン酸カリウム(1)はカワラケツメイの就眠運動をコントロールする生理活性物質である.我々はこの作用機構解明を目指し,分子プローブを用いて1の標的タンパク質を同定しようと考えた.分子プローブを用いた標識に当たって,タグとしては抗原性ペプチド(FLAG)を用いることとした.FLAGは特異性の高い優れた標識で免疫沈降法を用いた効率的精製が可能であるが,分子サイズが大きく,これを導入することにより,分子プローブと標的タンパク質との結合能の低下が予想された.そこで,アジドを導入したサイズの小さな分子プローブを用いて標的タンパク質をアジド標識化し,Click chemistryを用いて段階的にFLAGを導入することとした.一昨年度までに,分子プローブを合成し,標的タンパク質の検出,精製に成功しており,昨年度はこのタンパク質のLC-MS/MSによる配列解析を行いMetEと高い相同性を示すことを明らかにし,その作用機構解明を目指した研究を行った.まず,昨年度までに開発した方法で,イソレスペデジン酸カリウムの標的タンパク質をFLAGで標識し,抗FLAG抗体を用いた免疫沈降法によって精製した.これを,トリプシン消化後に,LC-MS/MSによる配列解析を行った結果,これはRicinus communis由来のMetE(5-methyltetrahydropteroyltrigultamate-homocysteine methyltransferase)と高い相同性を持つことが明らかになった.このように,Click chemistryを用いる標的タンパク質のFLAG標識化は,生理活性天然物の標的検出と精製に利用できる強力な手法であることが示された.現在このタンパク質がどのような機構で就眠運動にかかわっているのかについて検討を行っている.就眠運動は葉を開かせるLeaf-opening factor(LOF)と葉を閉じさせるLeaf-closingfactor(LCF)の2種の生理活性物質により制御されている.その作用機構解明のために,分子プローブを用いてこれらの生理活性物質の標的タンパク質を抗原性ペプチド(FLAG)で標識し、免疫沈降法を用いて精製しようと考えた.

FLAGは特異性の高い優れた標識であるが、分子サイズが大きく,これを導入することにより、分子プローブと標的タンパク質との結合能の低下が予想された.そこで,アジドを導入したサイズの小さな分子プローブ用いて標的タンパク質をアジド標識化し,Click chemistryを用いて段階的にFLAGを導入することとした.一昨年度までに,本方法を用いてLOFであるイソレスペデジン酸カリウム標的タンパク質を発見,精製することに成功し,この配列解析を行った.昨年度は,本方法論を利用して,LCFであるジャスモン酸グルコシド(1)の標的タンパク質(MTJG)を検出することで,本方法論が低分子生理活性物質の標的同定に幅広く利用可能な優れた方法論であることを示した.ジャスモン酸グルコシド(1)はアメリカネムノキの葉を閉じさせるLCFである.化合物1に反応性官能基とアジド基を導入したプローブを用いてその標的タンパク質をアジド標識化し,その後,Click chemistryを利用してFLAGの導入を試みた.その際に,銅触媒存在下でのCuAACおよび銅触媒を必要としないCFCCとを検討した.その結果,CuAACを用いた場合に1の標的タンパク質であるMTJGを検出することに成功した.本結果より,Click chemistryを用いる段階的FLAG標識化が生理活性物質の標的同定において幅広く利用可能な優れた方法論であることが示された.
全社的リスクマネジメントの理論・実証に関する研究

本研究は,全社的な見地から行われるリスクマネジメントである「全社的リスクマネジメント(ERM)」を理論的に検討し,その意義を実証分析によって証明した。具体的な成果として,(1) ERMは企業価値最大化を目標とし,役員レベルでの関与が重要となる,(2) ERMを積極的に推進している企業の企業価値は増加する傾向にある,(3)一方でERMに失敗する,すなわち内部統制に重要な欠陥が指摘される企業のリスクは増加する傾向にある,ことを示した。今年度は主に全社的リスクマネジメント(ERM)の理論・実証に関する研究の下地となる活動を行った。具体的には,文献収集による理論整理および実証分析と実施企業へのインタビューである。インタビューは,商社,小売業,私鉄,不動産,製造業等計8社に対して行った。インタビュー内容として,当社が行っているリスク管理体制や手法,特に不動産戦略に関する質問を行った。インタビューの成果は,来年度以降にERMのケーススタディとしてまとめていく予定である。今年度の研究成果は,論文掲載3本,学会報告1本であった。学会報告「株価長期パフォーマンスの検定方法に関する分析」は,わが国株式市場において15年の長期的な株式パフォーマンスを測定する際,どのような手法を用いれば測定誤差を小さくできるかを検証した論文である。企業のERMの成果を測定する際,ファイナンスでは株価パフオーマンスを用いて測定するのが一般的であるが,リスクマネジメントという性質上その成果は長期的視点にならざるを得ず,本研究はそのための予備段階の研究として位置づけられる。「保険制度の経済分析」は,リスクマネジメントにおける最も典型的な手法である保険に関して,その制度的特徴を経済学の視点から考察した論文となっている。「The calendar structure of the Japanese Stock Market」は,わが国株式市場の季節構造を分析し,上半期(1-6月)の株式収益率が下半期(7-12月)の収益率を上回ることを示し,その原因分析を行った論文である。これもわが国株司式市場の特徴を調べた分析であり,最終的な成果であるERMと株価パフォーマンスとの関係について応用していく方針である。「企業不動産マネジメントと株式市場」は,企業の不動産保有率が株価にどのような影響を及ぼすかに関して分析を行っている。実証結果として,不動産保有を高める戦略は企業全体のリスクを下げる方向に働くことが分かった。すなわち,不動産戦略は企業全体のリスクに影響を及ぼすことから,リスクマネジメント戦略の一環として応用することが可能となることが分かった。今年度は全社的リスクマネジメント(ERM)に関する実証データを集め,分析を行った。現在,ERMの議論の枠組みにおいて内部統制が盛んに言及されている。今年度は2010年度から開始されたJ-SOXによる内部統制報告制度を利用して,内部統制の不備,すなわち企業内リスクマネジメントに欠陥のある企業が市場でどのように評価されているのかについて分析を行った。本分析結果は,2011年4月の保険学セミナー(大阪)で報告し,コメントを基に論文を作成していく予定である。今年度に出された研究成果は,論文掲載4本,学会報告1本であった。論文掲載のうち,2本は不動産リスクマネジメントに関する論文である。企業不動産(CRE)は企業にとって非常に重要な資産である一方で,全社的な見地からの不動産管理はまだ進んでいない。本研究は,神戸大学大学院経営学研究科の砂川伸幸教授とみずほ証券の協力により,新たな不動産リスクマネジメントの提言のために様々な角度からの分析を行っている。今回報告した内容を簡潔にまとめると,(1)ガバナンスがぜい弱な企業は多くの不動産を抱える傾向にあり効率的な不動産管理がなされていない可能性がある,また(2)企業の本社移転イベントに関して不動産の有効活用を理由に挙げている企業は市場から好意的に評価される傾向にある,というものである。不動産リスクマネジメントは来年度も継続して研究を行い,本研究のテーマであるERMの枠組みでまとめていく予定である。また今年度は,「台風が及ぼすわが国損害保険会社の企業価値への影響」をテーマに,台風の上陸によって損保株にどのような影響がもたらされるのかについて分析を行った。その結果,台風の上陸が損保株にプラスの影響を及ぼすことが確認された。その理由としては,台風の上陸によって損保株の保険金支払いの増加が予測されるものの,将来の保険加入による収益の増大も予測されることから,その両者の兼ね合いとして平均的に損保の企業価値が上昇しているものと推測される。カタストロフィと保険会社の企業価値に関する研究はリスクマネジメントの研究においても重要なテーマであり,また2011年3月11日に発生した東日本大震災は日本に未曾有の大損害を引き起こしたことから,今年度は東日本大震災をテーマとした実証分析も行っていく予定である。本年度は,当科研の最終年度ということもあり,これまでに行ってきた研究の成果を公表した。

まず,全社的リスクマネジメントの理論・実証に関する研究として,ERMが企業価値に正の影響を及ぼしうることを理論的に検討し,実際にERMを導入している企業の中でも特に役員の積極的な関与が見られる企業においてそうした傾向が見られることを示した。本成果は,「ERMと企業価値」というタイトルで『甲南経営研究』に公表した。また,本科研はERMと内部統制に関する分析も目的としている。そこで,本年度では,内部統制が企業価値にどのような影響を及ぼしているのかについて研究を行った。具体的には2009年度より開始された内部統制報告制度を題材として,内部統制に重要な欠陥がある企業と公表した企業にたいして,株式市場はより高いリスク・プレミアムを上乗せしていることを示した。本成果は「内部統制報告および監査と株式市場の評価」というタイトルで査読誌『経営財務研究』に投稿しており,現在1回目の校正を行っている段階である。
インフルエンザウイルスの異種宿主間伝播に関与する細胞因子の研究

オルソミクスウイルス科に属するA型インフルエンザウイルスは様々な鳥類および哺乳類に感染する人獣共通感染症病原体である。その宿主域を決定する因子についてはこれまでに数多くの報告がなされている。それら因子のうちのいくつかは、宿主域のみならずウイルスの病原性をも決定することが知られている。しかしながら、ウイルスが宿主細胞へ侵入した後、それら因子がどのような宿主因子と相互作用し、どのようにウイルスの宿主域や病原性に関与しているのかを説明する知見はほとんど見られない。本研究は、これまで解明できなかったインフルエンザウイルスポリメラーゼ蛋白質と宿主因子の相互作用に関する様々な新しい知見を得ることを目的とする。FLAGタグをC末端あるいはN末端に付した組換えインフルエンザウイルス(HK483およびHK486株)ポリメラーゼ蛋白質(PB2、PB1およびPA蛋白質)を単独で発現するプラスミドを293T細胞に導入し、可溶化後、抗FLAGタグ抗体ビーズを用いて免疫沈降した。SDS-PAGEで展開した結果、幾つかの宿主由来蛋白質バンドが確認された。これらのバンドを資料分析によって解析した結果、宿主蛋白質であるHsp70およびhnRNP等であることが判明した。これらの蛋白質はポリメラーゼと相互作用する因子である可能性が高い。共焦点顕微鏡を用いた観察によって、ポリメラーゼとこれらの宿主蛋白質は細胞内で共局在することが明らかとなった。HK483およびHK486株以外のインフルエンザAウイルスでの同様の現象が認められた。特にPB2蛋白質との相互作用が重要であった。さらに、siRNAを用いてHsp70をノックダウンした細胞(293TおよびHera細胞)では、インフルエンザウイルスの増殖が抑えられることを見出した。また、各種ストレスによって細胞内に核内に誘導されるHsp70発現とウイルス増殖効率の間に相関があることを見出した。以上の結果は、Hsp70はインフルエンザAウイルスの増殖効率を高める宿主因子であることを示唆している。FLAGタグをC末端あるいはN末端に付した組換えインフルエンザウイルス(HK483およびHK486株)ポリメラーゼ蛋白質(PB2、PB1およびPA蛋白質)を単独で発現するプラスミドを作製し、様々な宿主動物由来の細胞(MDCK、Hela細胞等)を用いて発現を確認した。さらに、FLAGタグの付加がポリメラーゼ蛋白質の機能を損なわないことを、ポリメラーゼ蛋白質およびNP蛋白質の共発現によるルシフェラーゼアッセイ法を用いて確認した。また、これらのウイルスポリメラーゼ蛋白質と相互作用する宿主因子の検出を目的として、抗FLAGタグモノクローン抗体を用いた免疫沈降法を実施し、実験に適当な塩、界面活性剤およびキレート剤の濃度等の条件検討を行い、相互作用する宿主因子の同定に着手した。

本研究は、これまで解明できなかったインフルエンザウイルスポリメラーゼ蛋白質と宿主因子の相互作用に関する様々な新しい知見を得ることを目的とする。FLAGタグをC末端あるいはN末端に付した組換えインフルエンザウイルス(HK483およびHK486株)ポリメラーゼ蛋白質(PB2、PB1およびPA蛋白質)を単独で発現するプラスミドを293T細胞に導入し、可溶化後、抗FLAGタグ抗体ビーズを用いて免疫沈降した。SDS-PAGEで展開した結果、幾つかの宿主由来蛋白質バンドが確認された。これらのバンドを資料分析によって解析した結果、宿主蛋白質であるHsp70およびhnRNP等であることが判明した。これらの蛋白質はポリメラーゼと相互作用する因子である可能性が高い。共焦点顕微鏡を用いた観察によって、ポリメラーゼとこれらの宿主蛋白質は細胞内で共局在することが明らかとなった。HK483およびHK486株以外のインフルエンザAウイルスでの同様の現象が認められた。特にPB2蛋白質との相互作用が重要であった。さらに、siRNAを用いてHsp70をノックダウンした細胞(293TおよびHera細胞)では、インフルエンザウイルスの増殖が抑えられることを見出した。また、各種ストレスによって細胞内に核内に誘導されるHsp70発現とウイルス増殖効率の間に相関があることを見出した。以上の結果は、Hsp70はインフルエンザAウイルスの増殖効率を高める宿主因子であることを示唆している。開始当初に目的として掲げた以下の内容に関して、概ね達成されているから。(1)インフルエンザウイルス(HK483およびHK486株)ポリメラーゼ蛋白質の発現系を確立する。(2)それらの蛋白質が相互作用する宿主因子を同定する。(3)それらがウイルスの増殖にとって重要であることを証明する。(1)クロスリンカーを使って、さらに他の宿主因子を同定する。(2)鳥の細胞を用いて、同様の実験を行う。(3)hnRNPについて、ウイルス増殖における役割を解析する。
平板近傍後流における境界層型から自由流型への乱流構造の推移

本研究は一様な流れの中に流れに平行に置かれた薄い平板の下流に発達する二次元対称乱流後流を実験的に調べたものである。初期条件は標準的な乱流境界層であり、その運動量厚さをθ_0とするとき、平板後縁からの流れ方向距離xが約25θ_0までの`近傍場'における乱流構造の推移に着目した。近傍場の構造の変化が顕著に現れる内層域を比較的に拡大するため、θ_0に基づくレイノルズ数が10^3程度の低い範囲で実験を行った。測定には専ら熱線風速計を用い、速度場の挙動のみを調べた。現在までに得られた結果の概要は以下のとおりである。1.後流中心速度の回復は乱流境界層のy(壁面に垂直)方向分布と類似の変化を示し、初期境界層の壁変数(壁面まさつ速度u_τと動粘性係数ν)を用いてほぼ尺度化される。この特徴は従来の乱流モデルを用いた計算では十分表現できず、境界条件が急変する場に対する乱流モデルの改善が必要である。2.後流中心線上の速度変動強さとレイノルズ剪断応力の局所最大値は流れ方向位置xu_τ/ν=200付近で最大になる。このover-shoot現象は、従来平板後縁部におけるはく離によるにみなされていたが、近傍後流固有の性質と考えられる。その機構は未だ明確ではないが、条件抽出方を用いた予備的測定によると、初期境界層の内層中に洗剤する三次元渦構造の変形に関係している可能性が高いようである。3.後流中心線上のy方向速度変動成分のスペクトル解析および中心線をはさむ二点の流れ方向速度変動成分の時空間相関から、従来遠方場で観測されている準周期的な構造は少なくとも近傍場の終端付近からすでに形成されていることが明らかになった。今後、更に組織的乱流構造の消長を定量的に調べるとともに、これを考慮に入れた乱流モデルの検討が必要である。
反いじめ・平和構築のための教育プログラムの開発

30年度はハワイを視察した。ハワイはネイティブハワイアンを含むMinorityといわれる民族が大多数を構成している社会である。その意味でMinority Majyority Societyといわれる。その視察を通じて、平和の対概念は戦争や暴力だけではなく、差別や偏見などを含む広範な概念であり、平和とは、多様性の受容やダイバーシティの実現をも含む概念ととらえることができるということであった。視察を受けて研究の方向性について、平和構築を対人関係における問題解決と狭く捉えるのではなく、コミュニティにおける問題解決をも含む概念としてとらえる方向に軌道修正した。こうした観点から2018年度は2つのプログラムを実施した。一つ目はフィリピンでのストリートチルドレン保護施設(SPECS)での実践で、貧困と虐待にもかかわらず、ドラッグや犯罪に手を染めることなく、前向きに人生を切り開く能力を形成するための「愛着とレジリエンス形成プログラム」である。それが平和な社会の実現に役立つと考えたからである。SPECSでは、ストリートチルドレン29名を対象に各回20分のアクティビティを30回実施するプログラムが現在進行中である。評価に関しては、先行研究をもとに、毎月の変化を測定する簡易版と、プログラムの前後で実施する完全版を作成し、その変化を記録している。評価の対象は、1)プログラム自体、2)抽出児童7名である。二つ目は貧困地域に立つ私立学校(PEIS)におけるキャリア教育プログラムである。平和なコミュニティを作る能力を持った人材の育成が平和構築の基盤となると考えたからである。PEISでのキャリア教育プログラムは事前学習(6H)・キャリア体験ツアー(2泊3日)・事後学習(6H)で構成された。評価は事前事後のアンケート調査と各セッションごとのアンケート等によって行っている。2017年度は調査が中心で、実践プログラムの実施にまでたどり着かなかったが、2018年度は基本的な考え方と方向性を定め、2つの実践機関を決定し、実際にプログラムの実施にこぎつけた。ストリートチルドレン保護施設のSPECSでは2019年6月に30回の実践すべてが完了の予定で、その後はデータの分析に移ることができる予定である。また、貧困地域に立つ私立学校も1年間にわたる実践が終了し、データの回収も行い、今後はその分析を行うことが可能な状態になっている。2019年度は最終年度であり、まとめを行うことが必要になる。2つの実践のうち、キャリア教育に関連するデータはすでに手元にあり、今後その分析を行う。また、愛着とレジリエンス形成プログラムのデータについては、最終的には9月をめどに回収を行う。また、2019年度は、2018年度の実践をもとに修正したプログラムを2つの機関で実施し、改良版の実践プログラムを実施し、そのデータを収集し、追加の分析を行う予定である。なお、フィリピンでは、現地のスタッフにプログラムを提供しても確実な実施を期待することが現実的に非常に難しい。したがって、年間4回ほどの現地訪問を行い、実践の確認と評価を行う予定である。なお、平和構築における実践的課題という点に関して、当初の問題意識とかなりの変化が生じてきている。その部分との整合性を図ることが課題となっている。平成29年度は,1)建設的葛藤解決モデルの構築,2)多次元プログラム評価指標の開発,3)国外プログラムの調査の3つの目標を立てていた。29年度は,まず暴力や貧困が問題となっているフィリピンと,当初から予定していたシンガポールに加え,取組の進む香港を訪問し,視察調査を行った。フィリピンでは貧困地域に建つ学校とストリートチルドレンの保護施設を訪問し,貧困,暴力,薬物等の問題が横たわっている現状を目の当たりにした。平和の構築はこうした問題の解決と直結することが理解できた。また,香港ではこうした問題の解決の方向性としてキャリア教育の可能性を模索している現状を知ることができた。相対的貧困が主要な問題として語られる日本に対して,経済格差の大きい香港や,絶対的貧困の問題が社会全体を覆っているフィリピンを視察できたことは大きな意味があった。次に,建設的葛藤解決モデルについてであるが,社会的矛盾が大きく,安全が保証されないフィリピン(163カ国中138位,日本は10位)では,日本と葛藤解決の方向性が大きく異なることが印象的であった。具体的には,大渕(2003)によれば,建設的葛藤解決は,事実は何かと言うことを明らかにし,その上で協調方略をとることによって成立する。日本の学校においてはこうした方向性で間違いはおおむねないように思われるが,そもそも対立する両者の間に力の差があり,社会的正義も十分には期待できない社会においては,こうした問題焦点型対処方略よりも情動焦点型対処方略が選択される場面が少なくなかった。こうしたことを勘案すると,実践プログラムはVarnavaの述べる地域連携・価値・組織・環境・カリキュラム・トレーニングの6領域をより具体的に精査して,項目を検討する必要があることが分かった。ただし,29年度はその具体的作業には至らなかった。実際の手順としては,3)の視察調査に基づいて,1)建設的葛藤解決モデルを構築し,2)の評価指標開発という流れを考えていた。また,当初,想定していたモデルは,1事実は何かを明らかにし,2その上で協調方略をとることによって成立するモデルを考えていた。

ところが,フィリピンの貧困地域とストリートチルドレンの実態を視察したところ,貧困や暴力が蔓延する状況の中では,建設的葛藤解決の前提が必ずしも成立せず,その結果,建設的協調方略が必ずしも通用しない現実があることが分かった。つまり,建設的葛藤解決モデルは,対等な人間関係を前提とした協調的な問題焦点型対処方略ということができるが,犯罪や暴力が日常の生活にある状況下では対等な人間関係が必ずしも保証されないこと,問題が大きすぎたり,解決が困難な場合には問題焦点型対処方略は通用しにくい。そのため,実際に取られていた方略の比重は,豊かなファミリーサポートやピアサポートを中心とした情動焦点型対処方略にあった。こうした理由により,当初想定していたモデルをそのまま採用することは,貧困や暴力の影響力の大きい現実に対して有効性が高いとは言えず,モデルの再考が必要と考えた。このことが進捗の遅れの要因となっている。30年度はハワイを視察した。ハワイはネイティブハワイアンを含むMinorityといわれる民族が大多数を構成している社会である。その意味でMinority Majyority Societyといわれる。その視察を通じて、平和の対概念は戦争や暴力だけではなく、差別や偏見などを含む広範な概念であり、平和とは、多様性の受容やダイバーシティの実現をも含む概念ととらえることができるということであった。視察を受けて研究の方向性について、平和構築を対人関係における問題解決と狭く捉えるのではなく、コミュニティにおける問題解決をも含む概念としてとらえる方向に軌道修正した。こうした観点から2018年度は2つのプログラムを実施した。一つ目はフィリピンでのストリートチルドレン保護施設(SPECS)での実践で、貧困と虐待にもかかわらず、ドラッグや犯罪に手を染めることなく、前向きに人生を切り開く能力を形成するための「愛着とレジリエンス形成プログラム」である。それが平和な社会の実現に役立つと考えたからである。SPECSでは、ストリートチルドレン29名を対象に各回20分のアクティビティを30回実施するプログラムが現在進行中である。評価に関しては、先行研究をもとに、毎月の変化を測定する簡易版と、プログラムの前後で実施する完全版を作成し、その変化を記録している。評価の対象は、1)プログラム自体、2)抽出児童7名である。二つ目は貧困地域に立つ私立学校(PEIS)におけるキャリア教育プログラムである。平和なコミュニティを作る能力を持った人材の育成が平和構築の基盤となると考えたからである。PEISでのキャリア教育プログラムは事前学習(6H)・キャリア体験ツアー(2泊3日)・事後学習(6H)で構成された。評価は事前事後のアンケート調査と各セッションごとのアンケート等によって行っている。2017年度は調査が中心で、実践プログラムの実施にまでたどり着かなかったが、2018年度は基本的な考え方と方向性を定め、2つの実践機関を決定し、実際にプログラムの実施にこぎつけた。ストリートチルドレン保護施設のSPECSでは2019年6月に30回の実践すべてが完了の予定で、その後はデータの分析に移ることができる予定である。
単純ヘルペスウイルスの皮膚における感染様式と調節因子の解明

1)皮膚角化細胞由来のHSC-1細胞に、HSV1型(HSV-PH株)を用い、低い感染多重度(MOI)で感染させた。MOI=10^<-6>の場合に、継代可能となり、6週目(第9代)まで少数の細胞でのHSV蛋白の産生が示された。2)次にHSC-1細胞と神経細胞(NT-2)それぞれに低いMOIでHSV-1を感染させ、感染態度の違いをみた。その結果、神経細胞ではMOI=10^<-7>ないし10^<-8>ではCPEを起こさず、confluentになると、未感染細胞と同様に剥離する事、他方、皮膚角化細胞ではconfluentになると急激にCPEを引き起こした。よって、後者ではMOIの上昇により、急激な反応パターンの変化を示す事が示唆された。3)以上を基に皮膚角化細胞由来の細胞(HSC-1細胞とSV-HK細胞)と神経系細胞(SK-AS)にHSV-PHをMOI=10^<-2>10^<-6>で感染させ、経時的に回収した上清の力値を測定して比較した。a.細胞系を問わず、MOIが高いほど力値は高く、MOI=10^<-6>では零であり、非常に低いMOIでは形態変化、ウイルスの遊離を伴わない事が示唆された。b.細胞株間で比較すると、同じ感染効率では神経系細胞では皮膚角化細胞系の細胞に比べて上清の力値は常に高かった。回収した上清は細胞外に排出されたウイルス量の反映であり、皮膚角化細胞系の細胞はMOI=10^<-5>以上では神経系細胞と比較して、細胞内でのウイルスの増殖が抑制され、なおかつ、持続感染を成立させる事なく死に至る事が示唆された。以上より初感染、あるいは潜伏感染中の神経節での活性化で大量のウイルスが皮膚に現れると、急性感染を生じ、感染細胞は短期間に細胞死排除の過程を取り、感染は短期間に終熄するが、皮膚に現れたウイルスがごく少量であると、感染細胞は数週間は生存し続ける可能性があると考えられた。皮膚角化細胞(扁平上皮癌)由来のHSC-1細胞に、HSV1型(HSV-PH株)を用い、低いm.o.l.で感染させた。感染効率m.o.l.=10^<-6>の場合には、ほぼconfluentに達するまでCPEを示さず、継代可能となり、6週目(第9代)に達した時、抗HSV-1抗体を用いた蛍光抗体法で、少数のやや大型の細胞の核、細胞質に蛍光を認めた。よって、6週目でも少数の細胞でのHSV蛋白の産生が示されたが、7週目に細胞よりDNAを抽出し、HSV特異塩基配列の一部をprimerとしてPCRを行うと陰性であった。以上より継代中に細胞中よりHSV(DNA)が失われたか、感染細胞が除去されたと考えられた。現在、a)感染細胞の動向を経時的に調べる、b)mRNAレベルでの発現を調べる、c)蛍光抗体法で確認された少数の感染細胞のcloningを行い、持続感染系の確立を目指す、などを検討中である。2)HSV感染細胞に対するα-IFNの影響