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「巖谷小波日記」の翻刻と注釈による明治期の文学・文化の研究

平成15年度は、明治32年の「巖谷小波日記」及び「手帳」「俳句ノート」の翻刻と注釈を行い、このうち「手帳」の翻刻を白百合女子大学言語・文学研究センター「言語・文学研究論集」第4号に発表した。また、「日記」の翻刻と注釈も平成16年度「白百合女子大学児童文化研究センター論文集」IX号に発表する予定である。後者は平成15年度の同誌VIII号に発表予定であったが、児童文化研究センターの都合により掲載を断念せざるをえなかった。「俳句ノート」についても、平成16年度中に発表できるように努めたい。この年の小波は数え30歳である。1月は博文館より『世界のお伽噺』シリーズの第一編『世界の始』を刊行。また10月には妻・勇子と水口町山村家や京阪方面に旅行している。これら小波の事跡を日記本文の初めの翻刻として明らかにするとともに、日記を通した同時代の状況を注釈によって追求した。また、前年度に引き続き継続的な研究のための資料の整理、拡充にも努めた。(1)最新のパソコンを購入することによって、すでに電子ファイル化した「巖谷小波日記」の効率的な検索が可能になり、注釈に必須のレファレンス作業が従来よりも迅速かつ精確に行えるようになった。(2)お伽噺の口演をした巖谷小波の足跡は全国に及び、書家である父・一六の事跡や小波の句碑の存在なども視野に置くと、日記の注釈には実地調査とヴィジュアルな記録も欠かさない。今年度は京都霊山の法正寺にて巖谷家の墓所を確認、記録するなど、いくつかの足跡を辿ることができた。(3)小波関係の図書・雑誌を収集した。これらは今年度のみならず、今後の「巖谷小波日記」の基礎的な資料として活用されるものである。科学研究費補助金による研究期間は終了するが、今後も継続して本研究を進めたい。平成14年度は、明治31年の「巖谷小波日記」の翻刻と注釈を行い、その成果を「白百合女子大学児童文化研究センター研究論文集VII」に発表した。この年の小波は数え二十九歳である。博文館の雑誌「少年世界」の主筆として編集に携わりながら、「少年」向けの読み物を執筆。「乞食王子」「ミュンヒハウゼン」等、海外の作品を取り入れようとしている様子も窺われ、たいへん興味深い。また私生活では、六月二十六日に山村勇子と結婚式を挙げ、七月十七日に土手三番町の新居に移っている。これら小波の事跡を日記本文の初めての翻刻として明らかにするとともに、日記を通した同時代の状況を注釈によって追究した。また、今年度は継続的な研究のための資料の整理、拡充に努めた。(1)最新のパソコンを導入することによって、既に翻刻し電子ファイル化した「巖谷小波日記」の効率的な検索が可能になるとともに、「風俗画報」などの基礎資料がHDDにおいて活用できるようになり、注釈に必須のレファレンス作業が従来よりも迅速かつ精確に行えるようになった。(2)お伽噺の口演をした巖谷小波の足跡は全国に及び、書家である父一六の事跡や小波の句碑の存在なども視野に置くと、日記の注釈には実地踏査とヴィジュアルな記録も欠かせない。デジタルカメラの導入によって、小波日記の資料を電子映像で記録することができるようになった。

明治22年11月13日の日記に記されている芭蕉の句碑を、千葉県館山市の那古寺にて確認、記録することができたのは、今年度の大きな成果である。(3)小波日記の注釈に必要なもの中心に、小波の草稿、小波関係の図書・雑誌を収集した。これらは今年度のみならず、今後の「巖谷小波日記」の基礎的な資料として活用されるものである。来年度以降も継続して本研究を進めたい。平成15年度は、明治32年の「巖谷小波日記」及び同年の小波自筆「手帳」「俳句ノート」の翻刻と研究を行い、そのうち「手帳」の翻刻を「白百合女子大学言語・文学研究論集」第4号に発表した(「日記」の翻刻・注釈は、発表を予定していた「白百合女子大学児童文化研究センター研究論文集」が本年度は特別号となるため掲載できない旨の連絡があり、やむをえず次年度に延期した)。この年の小波は数え三十歳である。引き続き博文館の雑誌「少年世界」の主筆として編集に携わりながら、「少年」向けの読み物を執筆した。今回発表した「手帳」は主に7月から10月にかけて記されたもので、昔話の記録や創作メモ、日記、俳句などの下書きと思われる記載が見られ、小波の創作活動を知る上で貴重な資料である。未発表の「日記」本文には例年のように小波の事跡が1日も欠くことなく記されており、同じく未発表の「俳句ノート」には「清風亭小集」「青梅紀行」「筑波会」「紫吟社句会」「地久会」など、同年に催された句会・旅行などの記録が残されている。これらの翻刻原稿はほぼ完成しており、注釈等を付して次年度に発表の予定である。また、継続的な研究のための資料の整理、拡充も、前年度に引き続き行った。(1)パソコンによる資料の電子ファイル化、データの複数保存(バックアップ)、(2)キャビネットにファイリングすることで日記本文等(紙の資料)を整理・保存、(3)小波日記の注釈に必要なもの中心に、小波関係の図書・雑誌を収集。これらは今後の「巖谷小波日記」研究の基礎的資料として活用されるものである。
ハニカム構造をベースにしたフォトニック結晶スラブのトポロジカルな性質

Silicon on Insulator (SOI)基板を購入し、電子線露光描画でパターニングし、高速原子線でエッチングして、ハニカム構造を作製した。ハニカム構造の六員環ユニットを拡大または縮小することにより、バンド端における電磁場モードの対称性が変わることを数値計算によって確認した。購入したInGaAsカメラと既存の顕微鏡対物レンズを用いて円偏光の向きに依存した導波路伝搬をイメージを測定するための光学系を構築した。1次元誘電体積層構造のフォトニックバンド構造と電磁場分布を数値計算により調べた。周期に対する高誘電率層の厚さの比の関数としてフォトニックバンド状態をプロットすると、バンドギャップがいったんつぶれて再び開くこと、その前後においてバンド端状態の対称性が入れ替わることなど、トポロジカルに非自明な状態の特徴が表れることを見出した。トポロジーの自明/非自明が異なる相境界を伝搬するエッジモードによる光整流起電力を測定することで、トポロジカルな状態を検出する方法について議論した。光整流起電力は第二高調波生成と同様に二次の非線形光学現象であり、波長に依存した応答を調べることで、工学スペクトル測定では得られないトポロジカルな特徴を実験的に調べることができ可能性がある。当初計画していたSOI基板におけるハニカム構造の作製とその光学的評価は、担当の学生が不登校となってしまったため、途中で止まってしまっている。ハニカム構造のトポロジカル状態については、すでに多くの研究グループが研究を開始しており、今後担当学生が研究に復帰したとしても、世界に先駆けた結果を発表することはむつかしい。そこで本新学術領域研究における研究テーマを幾何学的位相に由来した2次の非線形光学効果にシフトさせ、この4月から修士に進学した学生に研究を遂行してもらうことにした。現在いくつかのデザインを考案し、実験を行うのに適当な構造パラメタを得るために数値計算を行っている。
高圧力下の高温加熱による超砥粒結合薄膜金属の強靱化機構の解明

本ホイールの開発には、被覆金属を薄くし、気孔を多くすると同時に、なおかつ十分な強さをもつ結合橋を造る必要があることが分かってきた。そこで、真空焼結に続き、2次処理として高温高圧オートクレープによる加熱実験を行った。万能焼結炉を製作し、完全な温度管理の下で、1次処理としての真空焼結を行った。その後、すでに、製作済みのオートクレープを用いて、とりあえず10気圧、500°C以下での温度での2次焼結を実施した。実験結果の整理は、結合橋の強さの解析より、結合橋の半径とせん断強さの関係を求めることにより行い、2次処理条件と結合橋の強さの関係を明らかにした。1次処理で真空焼結した試験片を2次処理した結果、10気圧、300、325°Cで3から4時間加熱したところ、空気中500°Cで20分加熱したときよりも高いせん断強度が得られた。また、350°Cでは60、120、180分と長くなるに従い、せん断強さは大きくなり、常圧加熱よりも高い値を得ている。ところが、400°Cで2から3時間加熱したところ、せん断強さは小さくなり、高圧高温処理の効果は見られなかった。この場合、リン青銅のほかに酸化銅の生成が著しく、脆くなったものと思われる。2次処理後の被覆金属の表面は滑らかになっており、常圧加熱で見られた泡立ちは消滅していた。同時に試験片内部までリン青銅が生成し、黒化していることが確認でき、高温高圧処理の効果が見られている。なお、結合橋が太い場合、結合橋の内部までリン化されず、せん断強さが小さくなるという結果も得ている。結合橋の太さが適度のとき、高温高圧下でのリン化処理は効果があることが判明した。
源氏物語の注釈史における儒教的仏教的言説の研究

源氏物語の研究は大きく本文研究、作品論研究、注釈史・享受史研究に分けられるが、本研究では源氏物語の中世近世の注釈史・享受史における儒教的仏教的言説を対象として、その歴史的背景を明らかにするとともに、それが源氏物語の主題や作品論に深く関わることを明らかにした。本年度は(1)源氏物語の享受層を具体的に明らかにするために、中世の代表的注釈書である『河海抄』調査、(2)近世の儒者の源氏物語に対する言説の調査を行った。(1)については、『河海抄』の確認できる写本60本のうち、その三分の一に当たる20本について奥書・識語・勘記などの調査を行った。6月に明治大学図書館、10月に国文学研究資料館、12月に天理大学図書館において、写本の実見調査、及びマイクロ資料・マイクロ紙焼きによって、奥書等の調査・撮影・模写を行い、その調査結果については、中書本・覆勘本の系統ごとに、翻刻・校異・伝本などをまとめ、報告書を作成した。また『河海抄』中の儒教的言説の調査に関わって、『河海抄』に引用される漢詩文の訓点が諸本によって大きな違いがあり、訓点をほとんど付さないものと非常に多く訓点を施しているものがあることが分かった。諸本に共通して付される訓点(おそらく『河海抄』原本に遡る古訓)と、『河海抄』享受の過程で書写者の必要に応じて付された訓点(江戸期の訓読を反映するか)とがあり、確認した江戸期の諸本ではそれらが区別なく記されている。後者の分析は、『河海抄』がどのような人々に求められたかという『河海抄』享受の様相を明らかにすることと密接に関わる。(2)近世儒者の源氏言説については資料の網羅的な調査と収集を行った。これも報告書を作成する。また源氏物語の背景となる平安時代の仏教については、中国・韓国の仏教との関係を調査し、その成果の一部は、2011年2月に中国南通大学における東亜文化研究国際学術研討会において発表した。平成23年度は、近世儒者の源氏言説、近世における儒教的な源氏批評について資料の網羅的な調査と収集を行った。これは資料集にまとめるが、データはほぼ完成した。宣長のいわゆる「もののあはれ」論が同時代において少数派の突出した議論であり、大方の賛同を得にくい議論であったことを証明する結果になろう。源氏物語における儒教の問題について、日向は『源氏物語東アジア文化の受容から創造へ』(平成24年3月刊)において『尚書』の影響の大きいことを論じた。しかし、この点に関して長瀬は『河海抄』等古注釈書の儒教的言説を調べてゆくと、『尚書』『礼記』等の儒教の経典そのものを引用するのではなく、儒教的理念を明確に示す白居易「調諭詩」や策林の引用に拠るという態度が認められると言う。古注釈書にみられる、白居易詩文を通して儒家的思想・理念を把握するという態度は、中世に至ってのものなのか。源氏物語の成立した平安中期以来の文人達、作者紫式部にも共有された態度であって、それが古注釈書にも表れているのか、この点は厳密に解明する必要があると言う。長瀬の成果は「一条朝の文人貴族と惟宗允亮-源為憲詩を起点として-」に纏められた。仏教の問題については、日向が光源氏の出家と『過去現在因果経』の仏伝とを比較した論文を纏めた(上掲著書)。袴田は『三宝絵詞』について研究を進めた。従来、『三宝絵詞』と『源氏物語』との関連性は注目されて来なかったが、浮舟に関して語られる「帝釈天」の故事は、『三宝絵詞』と密接に関係しているとする論文を準備している。また、若紫巻の「なにがし寺」の準拠とされる大雲寺跡地の実地調査も行い、調査報告をまとめた。平成24年度は前年度に引き続き、近世儒者、知識人層を中心とした19世紀の儒教的な源氏物語批評言説について幅広く調査を行い、データ化した。本調査はこれまで行ってきた17、18世紀の調査と合わせて近世における源氏物語の儒教的な享受言説資料集として、その時期の源氏物語享受の実態を理解するうえで、基本的な資料集となるものと思う。これまでにない資料集である。また明治大学図書館蔵『源氏物語聞録』「葵」巻の翻刻を行った。これが近世徳島藩の武家社会における源氏物語享受の貴重な資料であることは、前年度の報告でも触れた。これらは『明治大学古代学研究所紀要』18号に掲載する。日向は「紅葉賀」巻の『白氏文集』を引用する大きな本文異同ー「鄂州」(青表紙本系)と「文君」(河内本系)の異同がなぜ生じたか、その本文評価について検討考察した。また須磨で光源氏の弾く琴曲「広陵散」について従来の説の見直しを論じた。

長瀬は一条朝の惟宗允亮『政事要略』に『白氏文集』の「策林」「判」などが引用されることに注目して、当時の官僚にとって白氏諸篇は実務上の文書作成に当たって政治理念や儒教思想を示すうえで必要とされ、尊重されたことを明らかにした。それは平安中期の文人たち、紫式部にも共有された態度であったとする。白居易受容が詩だけでなく、文人たちにとって官僚としての実務面において政治理念、儒教思想まで広く深くなされたことを確認するものであり、注目すべき点である。仏教に関しては、袴田は藤壷が法華八講を主催し出家しながら、成仏できないでいるという問題について、9ー11世紀の法華八講の女性が願主になった史実を検討し、女性の置かれた現実に対する源氏物語の厳しい眼差しを論じた。平成22年度は源氏物語の享受層を注釈書の流布状況から明らかにするために、『河海抄』の奥書、識語、勘記などの調査を行い、23年度は近世儒者の源氏物語批評、儒教的な批評言説を網羅的に調査した。これらはデータにまとめた。明治大学図書館蔵『源氏物語聞録』「花宴」巻の翻刻を行った。これは近世武家の享受史料。仏教的な批評言説は近世になると影を潜めてくる。仏教は中世の源氏物語享受の特色として位置づけうるであろう。しかし、作品の構造としては新たな見直しを検討している。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に従い、平成22・23年度には本研究テーマに関わる注釈・享受資料の一覧表の補充や新規資料の発掘、翻刻を行った。新規資料としては徳島藩における講義資料と見なされる、明治大学図書館蔵『源氏物語聞録』全7冊の内、「花宴」巻の翻刻に続いて、「葵」巻の翻刻を行う。本資料は武家社会における源氏物語享受の実態を明らかにする興味深い資料である。近世儒者の源氏物語批評、儒教的な源氏物語批評言説の資料調査を進め、データにまとめているので、それらの分析を進め、中世から近世にかけて源氏物語の読み方に起こった変化を明らかにする予定である。仏教に関しては作品論としての検討と併せて中世における仏教的批評言説を捉え直す。
脳波デコーディングを用いた階層的コミュニケーションの構成的検証と制御

本公募研究は、ヒトがコミュニケーションのための記号システムを構築し利用する過程で働く脳システムのモデルを構成し、脳波デコーディングに基づく脳状態自己訓練をモデル検証に応用する新しい手法の開拓を目指す。これにより、記号コミュニケーションシステムの共創過程で働く脳情報モデルを、構成論的・操作的な手法を用いて検証することを試みる。研究の全体計画の中で初年度は、脳モデルの基礎的な構成要素の検討と行動実験課題の開発、および脳波計測実験を行った。特に、コミュニケーションのための記号システム(記号-意味対応)における、記号と意味の「接地」(記号に意味を対応付ける処理)と「脱接地」(記号から意味を一旦切り離す処理)の過程を検討する実験課題を設計し、実施した。色の記号情報に身体動作の意味情報を対応付けた後、色を徐々に変化させて意味の変化(脱接地と接地)を生じさせる実験課題を実施し、課題中の被験者の脳波応答を明らかにした。これまでの研究で、新規な記号と身体意味の接地の過程に、行動観察と行動実行の両方で同じ活動を示す脳内のミラーシステムが関与することが示唆されていた。今回の結果では、色が変化して対応する意味が思い浮かばなくなる過程においても、ミラーシステムの脳波指標と考えられているμ波パワー抑制が見られ、ミラーシステムが意味の脱接地にも役割を果たす可能性が初めて示唆された。上記の分析と並行して、課題中の脳波周波数パワー情報から記号や意味の内容を弁別するデコーディングが可能か検討を行った。色と意味を対応付ける課題中の脳波データを用いた色や意味の弁別は可能であったため、色変化中の意味の変化を弁別する解析へと進めている。また、個々の記号と意味の対応に関するこれら基礎的な検討に加えて、記号列の階層構造の捉え方に依存した意図伝達の特徴を実験的に検討する実験系の考案と理論考察を行った。記号と意味の対応付けを一旦切り離す過程での脳波μ波パワー抑制を初めて明らかにし、記号と意味の接地の過程だけでなく、脱接地の過程にも脳内のミラーシステムの活動が関与する可能性を示唆する知見を得た。単一記号と意味の新規な対応付けという実験記号論の基礎的な過程に関する上記の検討に加え、記号系列に階層構造を含む実験記号論の課題拡張を考案し、理論分析により実験デザインを整理することが出来た。これにより、本研究領域の中心的問いである、言語記号の階層構造が意図共有や意図伝達にどのように関わるかという問題について、実験記号論課題を用いて検討を行う手法の開拓を進めた。記号ー意味対応付け課題中の脳波計測データから、未学習データに対しても汎化性能を有する記号・意味状態弁別モデルを作成することができた。脳状態弁別モデルを用いた記号の意味推定が可能かの評価を引き続き行い、脳状態訓練実験へと繋げる必要がある。初年度の実施項目では、実験記号論のアプローチを援用しながら、記号と意味の対応関係を処理する脳の基礎的な反応を検討した。これに加えてさらに、要素的な脳過程に対応する脳活動状態を弁別するための脳波状態デコーディングについても基礎的な検討を行った。色と意味の対応付けの実験では、脳波周波数パワーの電極間空間パターンの分布から、異なる身体動作の単語視認状態の分類を行う機械学習デコーダを構築しており、これらデコーダを用いて、色変化中に被験者がイメージした意味を連続的に弁別する検討へと繋げる。また、このような状態弁別を、階層構造を有する記号列を用いた実験時の脳波データにも適用し、脳波状態を自律訓練させた場合の記号列の階層構造の使い方の変化などについての検討を試みる。

記号と意味の対応付けを一旦切り離す過程での脳波μ波パワー抑制を初めて明らかにし、記号と意味の接地の過程だけでなく、脱接地の過程にも脳内のミラーシステムの活動が関与する可能性を示唆する知見を得た。単一記号と意味の新規な対応付けという実験記号論の基礎的な過程に関する上記の検討に加え、記号系列に階層構造を含む実験記号論の課題拡張を考案し、理論分析により実験デザインを整理することが出来た。これにより、本研究領域の中心的問いである、言語記号の階層構造が意図共有や意図伝達にどのように関わるかという問題について、実験記号論課題を用いて検討を行う手法の開拓を進めた。記号ー意味対応付け課題中の脳波計測データから、未学習データに対しても汎化性能を有する記号・意味状態弁別モデルを作成することができた。脳状態弁別モデルを用いた記号の意味推定が可能かの評価を引き続き行い、脳状態訓練実験へと繋げる必要がある。初年度の実施項目では、実験記号論のアプローチを援用しながら、記号と意味の対応関係を処理する脳の基礎的な反応を検討した。これに加えてさらに、要素的な脳過程に対応する脳活動状態を弁別するための脳波状態デコーディングについても基礎的な検討を行った。色と意味の対応付けの実験では、脳波周波数パワーの電極間空間パターンの分布から、異なる身体動作の単語視認状態の分類を行う機械学習デコーダを構築しており、これらデコーダを用いて、色変化中に被験者がイメージした意味を連続的に弁別する検討へと繋げる。また、このような状態弁別を、階層構造を有する記号列を用いた実験時の脳波データにも適用し、脳波状態を自律訓練させた場合の記号列の階層構造の使い方の変化などについての検討を試みる。
新規細胞性免疫誘導型アジュバントを用いた百日咳ワクチンの開発

近年百日ぜきが再興感染症として注目されているが、その要因として現行のワクチンでは百日ぜき菌の排除に重要とされている細胞性免疫の誘導が弱いことが理由の一つと考えられている。現行の百日ぜきワクチンにはアルミニウム塩(アラム)がアジュバントとして添加されているが、アラムでは細胞性免疫の誘導が弱いことが示されている。そのため、新規百日ぜきワクチン開発のためには添加するアジュバントの見直しが必要である。本研究では我々が見出したCpG ODNとSTINGアゴニストを組み合わせた細胞性誘導型コンビネーションアジュバント(CpG+STINGアゴニスト)を用い、新規百日ぜきワクチンを開発することを目標とする。新規細胞性免疫誘導型アジュバントの解析として、申請者らが見出した新規アジュバントであるCpG+STINGアゴニストのin vivoにおけるアジュバント効果の解析を行った。モデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を用い、CpG+OVA、STINGアゴニスト(c-di-GMPまたはcGAMP)+OVA、CpG+STINGアゴニスト+OVAを後肢筋に筋肉内投与した。CpG+OVAやSTINGアゴニスト+OVA投与群に比して、CpG+STINGアゴニスト+OVA投与群では、抗原特異的なIgG2cの上昇や抗原特異的Th1サイトカイン(IFN-gamma)の増強が認められた。すなわち、CpG+STINGアゴニストは強力なTh1誘導型アジュバントとして機能することが明らかになった。またCpG+STINGアゴニストをアジュバントとして経鼻を介したワクチン経路が有効か否かを評価した。モデル抗原としてOVAを用い、CpG+OVA、STINGアゴニスト+OVA、CpG+STINGアゴニスト+OVAを経鼻によりマウスに感作したところ、筋肉内投与と同様にTh1型の抗体であるIgG2cが増強した。興味深いことに肺胞洗浄液中には粘膜型の抗体である抗原特異的IgA抗体の分泌が認められた。百日咳の感染経路が飛沫感染であることからも、IgAを誘導する特性を有するCpG+STINGアゴニストの経鼻投与が有効である可能性が示唆された。本年度計画していた実験のうち、最も重要視していた実験がCpG+STINGアゴニストの粘膜アジュバントとしての有効性についての解析であるが、実験結果よりCpG+STINGアゴニストが経鼻ワクチンのアジュバントとして有効であることが示された。これにより、平成28年度に計画していた、百日咳抗原を用いたCpG+STINGアゴニストの有効性の評価に関する実験にスムーズに移行することができる。前年度の成果に加え、CpG+STINGアゴニストをアジュバントとして百日ぜき抗原を用いたワクチン効果の検討を行った。抗原として、変異型百日ぜき毒素(PT mutant)および血球凝集素(FHA)をそれぞれ1μgおよび2.5μg/mouseで、アジュバントとしてCpG+STINGアゴニストをそれぞれ1μg/mouseで投与する。コントロール群としてアルミニウム塩(アラム)をアジュバントにしたものを使用した。投与経路は筋肉内投与(i.m.)で評価した。免疫後の抗体価を測定したところ予想に反してCpG+STINGアゴニストをアジュバントとした場合には百日ぜき抗原特異的抗体価は認められなかった。一方でアルミニウム塩(アラム)をアジュバントとして免疫したマウスでは高い抗体価が認められた。前年度の卵白アルブミン(OVA)を用いた検討ではCpG+STINGアゴニストをアジュバントとすることで強力な抗原特異的抗体価の上昇が認められたことから、百日ぜき抗原とCpG+STINGアゴニストとの相性の問題であることが示唆された。次に同様の実験を経鼻投与にて検討した。PT mutantとFHAを抗原として経鼻ワクチンを行ったところ、アジュバントなしでも高い抗体価が誘導された。この原因として市販のFHAには多量のエンドトキシンがコンタミしていることが示唆された。そこで、PT mutantのみを抗原とし、CpG+STINGアゴニストとともに経鼻にて投与したところ、血清中および肺胞洗浄液中にPT mutant特異的IgG1の誘導が認められた。しかしながら抗体価のレベルは百日ぜき抗原とアラムをi.m.にて免疫したマウスに比して低かった。OVAを抗原として使用した場合も、経鼻投与で非常に高い抗体価が認められることから、百日ぜき抗原を使用した場合は抗原量やアジュバント量の検討が必要であると考えられた。最初にCpG+STINGアゴニストを用いた百日咳抗原特異的な細胞性免疫誘導の解析を行う。前年度の結果を基盤に百日咳抗原を用いた免疫実験を行う。

抗原に関しては変異型百日咳毒素(Pertussis Toxin Mutant:PTm)および血球凝集素(Filamentous Hemagglutinin: FHA)を使用し、マウス当たりPTm 1 μg/mouse、FHA 2.5 μg/mouseになるように投与する。投与経路として筋肉内投与を行い、抗原特異的な抗体価および脾細胞の応答を解析することで、細胞性免疫応答を評価する。次にCpG+STINGアゴニスト+百日咳抗原の粘膜免疫の有効性についての解析を行う。前年度と同様の実験系で行う。モデル抗原としてPTmおよびFHAを用い、CpG+抗原、STINGアゴニスト+抗原、CpG+STINGアゴニスト+抗原を経鼻によりマウスを感作する。百日咳抗原特異的抗体価(IgG1、IgG2c)の測定、脾細胞の百日咳抗原特異的な増殖反応やサイトカイン産生に加え、肺胞洗浄液中の百日咳特異的IgA抗体価について評価し、新規百日咳ワクチンとしての可能性について評価する。免疫学
頂点作用素代数及びその表現論に関する研究

本年度は,前年度の研究結果をふまえ,Frenkel-Zhu両側加群の高次化を行った.その結果,Frenkel-Zhuの行った両側加群の構築は,Dong-Li-MasonのZhu代数の高次化と同様に高次化できることがわかった.この構成方法は,その表現論との関わりを非常に明確にしており,その先にある表現論や頂点作用素代数の構造との関連,そして加群の構造の解明に重要な役割を果たすと考えている.しかしその証明及び計算は非常に複雑な上,頂点作用素代数の構造を効果的に用いるため,更に簡潔にまとめる必要があると思われたため,年度中に研究論文としてまとめることができなかった.この研究内容については,近畿大学で行われた「代数的組み合わせ論研究集会」において研究発表を行った.本研究課題の一つであるW-代数の研究に関連して,本年度は新しいW-代数の構成を行った.すでに知られていたある特別な中心電荷のヴィラソロ代数の拡張として得られるトリプレット代数のシンプレクティックフェルミオンを用いた構成を拡張し,高次の頂点作用素代数を構成した.この頂点作用素代数は更に拡張でき,これまで知られていたs1_nに付随するW-代数の系列とよく似た系列を形成する.一般の系列についてはまだこれからの研究テーマだが,もっとも基本的な系列に現れる頂点作用素代数についてはその構造や既約加群の分類を行った.この新しく得られた頂点作用素代数は「非有理的でないC_2-有限な」頂点作用素代数の新しい例を与えており,一方その構造は比較的計算しやすくこれから更に多くのことがこの模型から知ることができると期待している.本年度は,研究目的の一つである頂点作用素代数の超選択則から派生した問題について取り組んだ.超選択則と頂点作用素代数の加群の間のテンソル積の間には自然な関係があると考えられるが,そのテンソル積との関連から,筑波大学の宮本雅彦教授が頂点作用素代数に付随し得られるホモロジー加群を導入した.このホモロジー加群は有理的な頂点作用素代数では自明となり,そうでなければ非自明になる.そこで昨年度構成した新しい頂点作用素代数について,このホモロジー加群を計算し,完全に決定した.このホモロジー加群は,現在のところ単なる例でしかなく,この結果のみでは研究業績としては不十分ではあるが,その現れ方からテンソル積の理論と密接に関わることが期待されており,その結果,頂点作用素代数の有理性が頂点作用素代数の構造のみから帰結されるという,研究目的の一つである超選択則とも密接に関係している.一方で現在,Frenkel-Zhuによる頂点作用素代数に付随するZhu代数の両側加群を更に一般の場合に拡張し,その観点から超選択則へアプローチしている.この両側加群に関しては,その導入以来,よく研究されたとは言い難く,その一般化の研究から新しい観点が得られると期待している.本年度は,前年度の研究結果をふまえ,Frenkel-Zhu両側加群の高次化を行った.その結果,Frenkel-Zhuの行った両側加群の構築は,Dong-Li-MasonのZhu代数の高次化と同様に高次化できることがわかった.この構成方法は,その表現論との関わりを非常に明確にしており,その先にある表現論や頂点作用素代数の構造との関連,そして加群の構造の解明に重要な役割を果たすと考えている.しかしその証明及び計算は非常に複雑な上,頂点作用素代数の構造を効果的に用いるため,更に簡潔にまとめる必要があると思われたため,年度中に研究論文としてまとめることができなかった.この研究内容については,近畿大学で行われた「代数的組み合わせ論研究集会」において研究発表を行った.
魚の肉質低下に伴うタンパク質分解機構の解明―プロテオミクスと免疫細胞化学的研究―

本研究では、魚類の保存に伴う筋肉軟化現象の解明に寄与し得る基礎的知見が得られた。プロテオーム解析より、マダイ筋肉軟化に伴うミオシン重鎖の分解及び可溶化、トロポミオシンの分解が認められ、分解産物も多数検出された。更に、個々のタンパク質の分解に関与するプロテアーゼ(タンパク質分解酵素)の特定を試みた。結果、ミオシン重鎖、トロポミオシンの分解には内在性セリン並びにメタロプロテアーゼが、α-アクチニンの分解にはシステインプロテアーゼが主に関与すると示唆された。また、各内在性プロテアーゼの構造・機能について調べ、抗体を作製・選定した。現在、免疫染色法により各プロテアーゼの局在変化を解析中である。本研究では、食品化学的観点から研究の進展が望まれている魚筋肉自己消化機構の解明のために、プロテオミクス技術を用いて冷蔵保存に伴い崩壊する筋細胞構成タンパク質を同定すると共に、筋細胞構成タンパク質分解に関与する内在性プロテアーゼの動態を免疫細胞化学的アプローチ(免疫電子顕微鏡法)により解明することを目指す。当該年度では、マダイを試料魚とし、一次元及び二次元電気泳動法を用いて冷蔵保存に伴う筋肉構成タンパク質の変化を明らかにしようと試みた。その結果、複数のタンパク質が魚肉の冷蔵保存に伴い崩壊することを見出した。尚、タンパク質の変化と魚肉軟化との関連性も総合的に考察できるよう、冷蔵保存における魚肉の鮮度低下の指標としてK値、及び魚肉の軟化の指標として筋肉の破断荷重も測定した。また、同試料の凍結切片を作製し、光学顕微鏡法による観察も行っている。また、免疫電子顕微鏡法に用いるための魚類特有プロテアーゼに対する特異抗体の作製を行った。まず、魚類特有の筋原線維結合型セリンプロテアーゼ(MBSP)のヒスチジンタグ融合タンパク質発現実験を試みたが、発現タンパク質が封入体を形成し、特異抗体を作製するために充分なMBSPタンパク質量を得るまでには至らなかった。そこで、MBSP全アミノ酸配列より立体構造を予想するとともに、エピトープとなり得る領域を探索し、その領域に対する抗ペプチド抗体の作製を行った。また、可溶性セリンプロテアーゼ(G1)については、前年度の研究によりヒトhyaluronan-binding protein 2(HABP2)と近縁なタンパク質であることが明らかとなったため、市販の抗ヒトHABP2抗体を免疫染色法に用いることとした。次年度の初めには、各々の特異抗体の魚類由来各タンパク質への反応性を確認し、免疫染色法を用いた形態学的観察を開始できる見込みである。本研究では、食品化学的観点から研究の進展が望まれている魚筋肉自己消化機構の解明のために、魚体の冷蔵保存に伴う筋細胞内微細構造の崩壊を電子顕微鏡法により形態学的に明らかにすると共に、プロテオミクス技術を用いて冷蔵保存に伴い崩壊する筋細胞構成タンパク質を同定することを目的とする。さらに、筋細胞構成タンパク質分解に関与する内在性プロテアーゼの動態を免疫細胞化学的アプローチ(免疫電子顕微鏡法)により解明することを目指す。当該年度では、免疫電子顕微鏡法に用いるための魚類特有プロテアーゼに対する特異抗体の作製、作製した抗プロテアーゼ特異抗体の試料魚に対する免疫交叉性の検討を目標として取り組んだ。その結果として、まず、魚類特有の筋原線維結合型セリンプロテアーゼ(MBSP)及びトリプシン型セリンプロテアーゼ(G1)mRNAの全塩基配列を決定し、各々242アミノ酸と633アミノ酸に相当するORFを確認した。さらに、両者の成熟型酵素のヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターの作製に成功した。次に、成熟型MBSPのヒスチジンタグ融合タンパク質の発現実験を試みたところ、発現タンパク質が封入体を形成したため変性剤を用いて可溶化し、ヒスチジンタグ融合成熟型MBSPを単離精製することができた。しかし、特異抗体を作製するために充分な量のヒスチジンタグ融合成熟型MBSPを得るまでには至らなかったため、今後スケールアップしてより多くの発現タンパク質を得る必要がある。また、G1についても、同様に発現実験を進めているところである。次年度の初めには、各々の特異抗体作製に着手できる見込みである。本研究では、プロテオーム解析及び免疫組織化学的手法を用いて魚肉軟化現象の解明を目指した。まず、プロテオーム技術(二次元電気泳動法,自動エドマン法,質量分析法)を用いてマダイ筋肉軟化に伴い崩壊するタンパク質を同定した。結果、軟化に伴いミオシン重鎖の分解及び可溶化、トロポミオシンの分解が認められた。5060 kDa付近に、軟化に伴う分解産物が多数検出された。そのN末端配列及びMSスペクトルの情報を収集しプロテアーゼによるタンパク質の切断部位を推定したが、魚類ゲノムデータの不足のため分解に関与するプロテアーゼの特定までには至らなかった。

そこで、個々の筋原線維タンパク質の分解に着目し関与するプロテアーゼの特定を試みた。活マダイの血中にプロテアーゼ阻害剤を注入し即殺後、魚体を保存した。その筋肉をウェスタンブロットに供した結果、ミオシン重鎖、トロポミオシン、β-コネクチン、トロポニンIの分解には内在性セリン並びにメタロプロテアーゼが、α-アクチニンの分解にはシステインプロテアーゼが主に関与すると示唆された。更に、免疫電子顕微鏡法により内在性プロテアーゼの筋細胞内局在を解明すべく、特異抗体の作製及び選定を行った。魚類特有の筋原線維結合型セリンプロテアーゼMBSPに対する抗ペプチド抗体を作製した。トリプシン型セリンプロテアーゼG1のcDNAクローニングにより本酵素の正体がHABP2だと判明したため、抗ヒトHABP2抗体を選定した。魚類筋肉カテプシンBのcDNAクローニングによる構造決定から抗哺乳類カテプシンB抗体を選定した。また、MMP-9及びカルパインの検出には先行研究で実績のある抗体を選定した。現在、これらの抗体を用いて魚筋肉内在性プロテアーゼの筋細胞内局在を免疫染色法により解析している。本研究の成果として、魚類筋肉軟化研究の発展に寄与し得る重要な基礎的知見が得られた。水圏生化学魚類特有プロテアーゼに対する特異抗体の作製、冷蔵保存に伴うタンパク質の変化を二次元電気泳動法及び光学顕微鏡法で検出するなど、おおむね順調に進展している。魚類特有プロテアーゼに対する特異抗体の作製までには至らなかったものの、その遺伝子の解析、並びに大量発現系の構築についてはおおむね順調に進展している。今後、MALDI-TOF MS法を用いて冷蔵保存中の魚肉軟化に伴い崩壊した筋肉構成タンパク質の同定を行うと共に、作製した抗プロテアーゼ特異抗体の試料魚に対する免疫交叉性の検討、免疫電子顕微鏡法による各プロテアーゼの筋細胞内局在の観察を行う予定である。これらの結果を総合して考察し、魚筋肉自己消化機構の一端を明らかにしたい。今後は、魚類特有プロテアーゼに対する特異抗体の作製に着手するとともに、冷蔵保存中の魚肉軟化に伴う筋肉構成タンパク質の変化をプロテオーム解析することに重点を置きたい。当該年度の研究費は適正に使用したが、若干の余剰分が次年度に繰り越された。次年度の研究費については、概ね請求どおりに使用予定である。
水環境中の病原ウイルス除去技術開発に関する研究

ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)は研究代表者が活性汚泥中から分離することに成功した水中病原ウイルスに対する吸着親和性の高いタンパク質である.このVBPを用いた全く新しい水中病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.平成16年度からの3年間において,以下に示す成果を得た.まず研究初年度においては,VBPの大量合成・抽出及び精製システムの構築を実現するため,大腸菌破砕法の検討及びVBP精製におけるアフィニティクロマトグラフィのスケールアップに成功した.VBPをウイルス吸着材として用いるためには大量のVBPが必要となる事から,VBP生産工程全般のスケールアップは本研究において非常に重要であった.研究次年度では,VBPの配向固定化を実現するために,リジンタグを付加したリジンタグ付きVBP (LysTagVBP)の創出を行った.VBPの固定化の際にはタンパク質分子中のリジン残基を利用したが,その固定化位置を揃えるために,VBPのC末端にリジンが6残基連なったタグを挿入したものである.このことから,VBP固定化を効率的に行うことが可能となった.研究最終年度においては,大量合成したLysTagVBPを固定化したウイルス除去カラムの作成及びウイルス除去能を確認する実験を行った.その結果,VBP固定化担体を用いたカラム実験では,実験開始1時間後に約40%のウイルス除去が確認され,さらに3時間後には70%のウイルス除去が確認された.VBPを利用した水中ウイルス除去技術開発は全く新しい試みであり,本研究を通じて得られたVBPの利用に関する有用な知見は,VBPを用いた水中病原ウイルス除去技術の実用化に加えてVBPに関する今後の研究の発展を促す礎になると考えられる.ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)は研究代表者が活性汚泥中から分離することに成功した水中病原ウイルスに対する吸着親和性の高いタンパク質である.このVBPを用いた全く新しい水中病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.平成16年度からの3年間において,以下に示す成果を得た.まず研究初年度においては,VBPの大量合成・抽出及び精製システムの構築を実現するため,大腸菌破砕法の検討及びVBP精製におけるアフィニティクロマトグラフィのスケールアップに成功した.VBPをウイルス吸着材として用いるためには大量のVBPが必要となる事から,VBP生産工程全般のスケールアップは本研究において非常に重要であった.研究次年度では,VBPの配向固定化を実現するために,リジンタグを付加したリジンタグ付きVBP (LysTagVBP)の創出を行った.VBPの固定化の際にはタンパク質分子中のリジン残基を利用したが,その固定化位置を揃えるために,VBPのC末端にリジンが6残基連なったタグを挿入したものである.このことから,VBP固定化を効率的に行うことが可能となった.研究最終年度においては,大量合成したLysTagVBPを固定化したウイルス除去カラムの作成及びウイルス除去能を確認する実験を行った.その結果,VBP固定化担体を用いたカラム実験では,実験開始1時間後に約40%のウイルス除去が確認され,さらに3時間後には70%のウイルス除去が確認された.VBPを利用した水中ウイルス除去技術開発は全く新しい試みであり,本研究を通じて得られたVBPの利用に関する有用な知見は,VBPを用いた水中病原ウイルス除去技術の実用化に加えてVBPに関する今後の研究の発展を促す礎になると考えられる.病原ウイルスに対して特異的吸着能力を有するタンパク質(ウイルス吸着タンパク質:Virus-Binding Protein, VBP)を活性汚泥中から分離し,このVBPを用いた水中病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.本研究グループはこれまでの研究において,活性汚泥からポリオウイルス1型に対する親和性を有するVBPを分離し,さらに活性汚泥細菌からのVBP遺伝子の分離およびVBPクローニングを行うことに成功している.本年度は,担体表面上への配向固定化を目的としたリジンタグ付加VBP(LysTag-VBP)の創出を試み,以下に述べる成果を得た.まずVBPのC末端にポリリジンタグを導入したLysTag-VBPの遺伝子合成を試みた.ポリリジンタグ導入用のプライマーを独自に設計し、PCR反応によりLysTag-VBP遺伝子を創出した.LysTag-VBP遺伝子の創出に至るまでには,リジンをコードするコドンを2つ連続させた領域を有するプライマーを3組設計し,3段階に分けてPCRを行った.このLysTag-VBP遺伝子を組み込んだプラスミドpRSETを大腸菌に導入して培養したところ,IPTGによる発現誘導下においてLysTag-VBPを効率的に合成することに成功した.大腸菌を破砕し,ニッケルカラムでLysTag-VBPを精製した後,このLysTag-VBPが確かにウイルス吸着能力を有することをELISAにより確認した.さらに,グルタルアルデヒドを架橋剤として用いた固定化手法を用いてガラスビーズ表面上にLysTag-VBPを固定化し,固定化されたLysTag-VBPを用いてPV1吸着実験を行ったところ,固定化LysTag-VBPとPV1型間の結合が親和性の高いものであることが確認された.ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)は本研究グループが活性汚泥中から分離することに成功した水中病原ウイルスに対する吸着親和性の高いタンパク質であるが,このVBPを用いた下水処理水からの病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.

平成16年度では,VBPの配向固定化を実現するために,C末端側にリジンタグが付加されたVBP,リジンタグVBP(Lysine-tagged VBP : LysTagVBP)の合成を試み,成功した.本年度においては,LysTagVBPをウイルス吸着材として用いるために必要なLysTagVBP大量合成システムの構築を試みた.LysTagVBP発現系のスケールアップでは,まず1Lの大腸菌培養槽を用いることで,従来と同じ時間内で10倍量の菌体を得る事を可能にした.スケールアップ前と比べて菌体当たりのLysTagVBP発現量には差がないことをSDS-PAGEにより確認した.また,従来の6倍容量を有する自作ニッケルカラムを作成し,LysTagVBP精製に関して約6倍のスケールアップに成功した.精製後のLysTagVBPのウイルス吸着活性を確認するために,タンパク質のリジン残基を固定化する事が可能なゲルにLysTagVBPを固定化して,ポリオウイルス吸着実験を行った.その結果,固定化したポリオウイルス抗体と同等の吸着活性が確認された.以上の結果から,LysTagVBPがウイルス除去技術におけるウイルス吸着材として有効利用できることを示す事に成功したと言える.ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)は研究代表者が活性汚泥中から分離することに成功した水中病原ウイルスに対する吸着親和性の高いタンパク質である.このVBPを用いた全く新しい水中病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.研究初年度及び次年度では,VBPの大量合成・抽出及び精製システムの構築を実現するため,大腸菌破砕法の検討及びVBP精製におけるアフィニティクロマトグラフィのスケールアップを行った.さらに,リジンタグを付加したリジンタグ付きVBP(LysTagVBP)の創出を行った.研究最終年度である18年度においては,大量合成したLysTagVBPを固定化したウイルス除去カラムの作成及びウイルス除去能を確認する実験を行い,以下に示す成果を得た.VBP固定化担体を用いたカラム実験では,実験開始1時間後に約40%のウイルス除去が確認され,さらに3時間後には70%のウイルス除去が確認された.さらに,LysTagVBP固定化担体を用いたカラム実験においても同様な結果を得た.このウイルス除去性能はカラム内の流速に依存しており,低流速での運転時ほど高いウイルス除去効率が確認された.このことは,サンプル水の流れが担体表面におけるVBPへのウイルス吸着に強い影響を与えることを示している.VBPを利用した水中ウイルス除去技術開発は全く新しい試みであり,本研究を通じて得られたVBPの利用に関する有用な知見は,VBPを用いた水中病原ウイルス除去技術の実用化に加えてVBPに関する今後の研究の発展を促す礎になると考えられる.
生体内マグネタイト微粒子氷晶モデルに基づいた無針状氷晶凍結技術の向上

生体内マグネタイト微粒子(Fe3O4)が氷晶核となり得ることに注目して、"生体内マグネタイト微粒子氷晶モデル説"を提唱し生物組織の破壊を阻止する技術を進めた。マグネタイト微粒子を取り除いた超純水では、融解熱の放出が測定され過冷却氷晶を形成する。マグネタイト微粒子を添加した水あるいは水道水(マグネタイトが不純物として存在する)では、この融解熱を放出しないで凍結することが検証された。過冷却が促進するか否かは、試料水に含まれるマグネタイト微粒子の含有量に依存することも明らかになった。凍結する前と後での体積変化率を調べてみた結果、過冷却が促進した場合は、氷晶の体積変化が小さいことも明らかになった。1.CASシステムの過冷却効果の検証実験においては、“CAS機能付き"という市販冷凍庫を購入し、その過冷却効果を検証した。CAS設定時間になっても冷凍室内の磁界変動は検出されず、その代わりに、冷凍室の側面から設定温度以下の冷気が、ある一定時間のみ、急速に流れる仕組みになっていたことが判明した。2.生体内の磁性体微粒子(マグネタイト)凍結モデル説実証実験においては、超低温冷凍庫(¬¬零下80度)を購入し、熱電対を使用することによって、温度測定・フリーザの内部温度を調整できるよう内部を改造した。生体内にあるマネタイト微粒子が、磁場下で過冷却操作可能な氷晶核因子となることを明らかにした(論文発表)。3.磁性体微粒子を振動させるに必要なヘルムホルツコイルの製作試作においては、1軸円形の電磁コイルを作成したが、地磁場の影響除去・磁場の振動のため、3軸仕様のヘルムホルツ電磁コイルを設計・製作することができた。4.添加するマグネタイト微粒子を均一に分散させる方法を考案した。カリフォルニア工科大学に設置されている縦型SQUIDを使用して、添加したマグネタイト微粒子の含有量を測ることを可能にした。2015年度前半は、磁性体微粒子を振動させるに必要なヘルムホルツコイルの製作試作においては、1軸円形の電磁コイルを作成したが、地磁場の影響除去・磁場の振動のため、新たに3軸仕様のヘルムホルツ電磁コイルの製作に時間を費やした。マグネタイトを添加した水溶液をいれる容器として水風船を自作することを考案し、その結果、水風船の材料として、超薄ポリウレタンシート集めに時間を費やす結果となった。後半は、実験材料が揃い始めたので、過冷却が生じる条件検討をすることができるようになった。弱い電磁場を暴露すると組織内の水分子が振動し、細胞の凍結損傷を防ぐCells Alive System技術(CAS)に対する疑問が出ている。CAS付きという過冷却促進機能を備えた冷凍庫も販売されている。低周波数の弱い電磁場下(10ガウス以下)で試料内の水分子を振動させると過冷却が促進され、細胞組織の破壊を最小限に抑えるということである。一方、CASの効果が得られない試料の存在(Suzuki et al. 2009)、CASの物理的な疑問が呈されている。水は弱い反磁性しか示さず、10ガウス程度の電磁場下では、水分子が受ける磁力は自身の熱運動にかき消されてしまう。水は弱反磁性であり、弱い電磁場下では影響を受けないからである。これまでヒト脳、がん組織細胞等を含めて、多くの生体組織内に形成する極微量の強磁性体マグネタイト結晶微粒子を検出してきた。水が凍結する時、水分子クラスターが、氷晶核サイトとなる金属・ミネラル等の結晶の表面で針状の結晶に成長する。本研究目的は、マグネタイト微粒子が振動磁場下で振動することに注目した“生体内マグネタイト微粒子氷晶モデル説"を提唱し、針状の氷晶形成を阻止する凍結技術の向上を図ることであった。通常の水と磁性体微粒子を取り除いた水を用いて、CASシステムの過冷却効果を実験的に検証した。そして、本研究で提唱する"生体内の磁性体微粒子凍結モデル説"を実証することができた。超伝導量子干渉素子装置(SQUID)による様々な試料の磁性体微粒子含有量の測定と氷晶核サイト数の予測が可能になった。それにより、過冷却の促進が現れない試料の予測が可能になり、今後の計画的な食料保存政策に貢献する。水風船内に詰める試料水及び生体組織内にある磁性体微粒子の含有量を超電導量子干渉素子(SQUID)装置で試料の残留磁化曲線を測定し、その曲線から水風船に詰めた磁性体の種類、粒子含有量等を決定していく。いろんな青果物を用いて、電磁コイルを用いた凍結効果を測定していく。

環境熱工学論文掲載料として確保していたが、別の財源で捻出することが出来た。当初の予定より安く物品を購入する事ができたので、次年度使用額が生じた。上記の理由により、次年度使用額が生じたが、必要な経費・消耗品にあてる。上記の理由により、次年度使用額が生じたが、必要な消耗品にあてる。今年度予算は当初の予定通り使用する。
劣性致死変異体を用いた包括的な初期胚発生分子機序の解析

マウストランスジーン挿入劣性致死変異体として、Ext2変異を同定した。EXT2は、ヘパラン硫酸鎖付加重合活性を持つため、ホモ変異胚は、ヘパラン硫酸鎖欠損を示し、FGFシグナル伝達が見られなかった。欠損胚において、FGFリガンド、受容体、コアタンパク質、ヘパラン硫酸の発現を解析した結果、細胞膜上のヘパラン硫酸鎖が、FGFリガンドの局所的な分布及びシグナル伝達に必須であることを明らかにした。実験動物としてマウスを用いて、注目する発生現象(未分化幹細胞の維持機構、細胞系譜や胚葉形成などの初期パターン形成機構、神経管形成や軟骨形成などの器官形成機構等)に異常を示す変異体を、表現型を指標に、選定する。同定した変異胚の表現型を形態レベル、細胞レベル及び分子レベルで、詳細に解析することで、異常の原因となっている領域や組織を明らかにする。次に、原因遺伝子の発現解析や相補実験などを行うことで変異原因である遺伝子を決定する。更に、原因遺伝子産物の生化学的な機能と表現型との関係を解明するため、遺伝学的手法や細胞生物学的な解析によって、どのような分子経路を介して、原因遺伝子産物が発生現象に関与しているのかを明らかにする。以上の解析を通じて哺乳動物発生を支配する新規な分子機構を包括的に解明する。1、トランスジーン挿入によって胚性致死変異を示す新規マウス劣性変異体を得た。得られた変異体の表現型の浸透度を調べたところ、ほぼメンデル率に沿って、表現型が認められた。トランスジーン挿入部位を同定するため、染色体FISH法を行ったところ、第2番染色体上に1箇所導入されていた。インパースPCR法により、挿入箇所の塩基配列を決定したところ、トランスジーンはExt2遺伝子のイントロンに挿入されていた。実際、ホモ変異胚においては、Ext2遺伝子のmRNA及びタンパク質とも、失われていた。更に、Ext2は、生化学的にヘパラン硫酸鎖の重合に働いているが、ホモ変異胚では、プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖付加に異常が見られた。次に、Ext2欠損が胚性致死の原因であるか検討するため、Ext2遺伝子のcDNAのみを発現するトランスジェニックマウスを作成したところ、ホモ変異体でもExt2を発現させると、正常に発生し、成長することが分かった。以上の結果から、今回得られた、劣性致死変異の原因遺伝子は、Ext2遺伝子であることが強く示唆された。2、Ext2ホモ変異胚の表現型を、組織切片レベルで解析したところ、変異体では、胚性6日目までには、異常がみとめられ、10日目まで、致死となることが分かった。特に、胚体外外胚葉、中胚葉に顕著な形成不全が見られた。更に、領域特異的な各種分子マーカーを用いて詳細に解析したところ、胚体外外胚葉領域が全く形成されていないこと、中胚葉は形成され、epithelial mesenchymal transitionも起こるが、脱上皮化した細胞が、適切に移動出来ないこと、後方神経上皮が全く誘導されないこと等が明らかになった。一方、ホモ変異胚において、エピブラスト、臓側内胚葉、前方中内胚葉、前方神経上皮などは、ある程度正常に形成されていた。1、現在までにトランスジーン挿入によって胚性致死を示す変異体がExt2遺伝子のナル変異であることを見いだしている。at2は、プロテオグリカンコアクンパク質にヘパラン硫酸鎖を付加重合する活性を持つ。そこで、ヘパラン硫酸鎖特異的な抗体で解析すると、ホモ変異胚では、プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖が失われていた。一方、コンドロイチン硫酸鎖は、正常に付加され、コアタンパク質も、細胞膜や基底膜などに正常様に分布していた。つまり、Ext2遺伝子は、プロテオグリカンへのヘパラン硫酸鎖の付加に必須であるが、コア蛋白質の細胞内局在制御には必須ではないといえる。2、ヘパラン硫酸鎖は、分泌性シグナル因子の適切なシグナル伝達機能に関与していると示唆されている。そこで、変異胚において、分泌性シグナル因子の標的遺伝子の発現を解析した結果、FGFの標的遺伝子の発現が失われていた。一方、Fgf受容体やリガンドの発現は、失われていなかった。つまり、変異胚で見られる異常は、主にヘパラン硫酸鎖が無いために、シグナルが適切に伝達されないことに起因していることが示唆された。一方、Wnt, BMP, Shh, Nodal等の標的遺伝子の発現は変異胚でも活性化されていたことから、これら分泌性因子は、ヘパラン硫酸鎖が無くても、シグナルを伝達できることか分かった。3、FGFからのシグナルにヘパラン硫酸がどのように関与しているか明らかにするため、外植体を用いて、FGFに対する反応性を解析した。野生型胚の外植体では、FGFによって、下流標的分子の発現が誘導された。一方、変異胚では、下流の遺伝子は活性化されなかった。しかし、ホモ変異体の外植体にヘパリンを添加すると、下流遺伝子の誘導が一部観察された。