hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
五員環上への炭素鎖導入反応を基盤とするプロスタグランジン及びアルカロイドの合成

この際,カルボン酸(CO_2H)等価体としてCH_2OPMBを適用した。また,中性に近い条件下でカルボン酸への変換を行う反応条件を見いだした。(2)動脈硬化の原因物質として最近特定された5,6-エポキシイソプロスタンA_2ホスホコリンの合成法の確立では,γ置換シクロペンテノンとエポキシアルデヒドとのアルドール反応をキー反応としたイソプロスタンの合成法を確立し、これにリゾホスホコリンを縮合することで目的化合物を世界に先駆けて開発した。さらに,位置異性体の合成にも成功した。(3)ピペリジンアルカロイドへの変換を活用したキニーネおよびキニーネ骨格を持つアナログの合成法の開発では,はじめに,窒素原子の保護機としてTeoc基(Me_3Si(CH_2)_2OCO)に着目し,保護・脱保護が簡単に行えることを明らかにした。この保護基を実際のキニーネ・キニジン合成に活用すると前年度に確立した方法より短行程かつ高収率でこれらのアルカロイドが合成できた。さらに,Claisen転位を使っていた2つめの側鎖導入をanti SN2'に換えることで様々なアナログ合成が可能になった。(4)シクロペンテンモノアセテートにanti SN2'型でアリール基を入れる反応を初めて確立した。この反応を用いてプロスタグランジンF_<2α>の合成中間体を従来よりも簡便に合成できた。平成16,17年度において,入手容易な4-cyclopentene-1,3-diolmonoacetate(以下,五員環モノアセテート)から出発して,動脈硬化に関連する新規プロスタグランジンを含むphospholipidと核内レセプターアゴニスト活性をもつΔ^<12>-プロスタグランジンJ_2(Δ^<12>-PGJ_2)の合成に成功した。平成18年度はこれらの知見を活かして以下の研究を行なった。(1)植物のリノレン酸代謝産物のうち,チュベロン酸,Δ^2-OPC-8:0,OPC-6:0を合成した。特に,チュベロン酸の合成では,側鎖末端にある水酸基の保護と脱保護のタイミングに加え,シス配置の2つの側鎖を異性化せずに脱保護する試薬の探索が重要であった。我々は保護基としてTHPを用いた。既存の酸ではこれを脱保護できなかったが,MgBr_2を用いて目的を達した。(2)五員環モノアセテートの知見を六員環化合物に適用し,アルケニル基を選択的に導入する条件を見いだした。そしてこの反応生成物を使ってCannabidiolとその誘導体を合成した。(4)五員環上に1つの側鎖を有するエノンを合成し,インドールアルカロイドとイソキノリンアルカロイドの合成を行なった。
「新しい働き方」の検証と「新しい労働社会」の展望－クラフトを生業にする人たち

クラフトをイベント側からみると、2005年くらいから「同時発生」的に開催されるようになった。それから十数年が経ち、イベント数は増え、世間的な認知も高まった。そして、次の段階として、質が問われるようになった。当初の新規さは失われ、どこも同じような出店(出展)になり、出店者(出展者)のレベルの低さが目につくイベントも増えているからである。筆者が調査したクラフト展は、応募が毎回200から300あるなかで「セレクト」している。過去にさかのぼって活動をチェックしたり、毎回の売り上げを確認したりして、出店者のレベルを下げないようにしていた。それに対して、数を追ったり、質を重視しなかったり、出店者の分析が不十分であったりするイベントも存在し、そのようなケースでは、出展者の質が低く、店のばらつきが大きい。そのことはお客も感づいており、次は参加しなくなる。つまり、企画の水準を維持するには、出店者を選ぶ「目利き」が必要であり、それを確保できるイベントは、結果として、主催者、出店者、お客という「三者のクオリティ」が保たれ、イベントが順調に回っていく。三者は必ずしも利害を一致させているわけではないが、創発的な関係を保ちながら、イベントのレベルを維持・発展させていく。ひとたびこのサイクルができあがると、安定的に維持される。ただし、企画者を選定するにあたって、丸投げするようだとダメである。自治体の中にはそういうところもある。他方で、自分たちだけやろうとしてもうまくいかないことがある。なぜなら、えてして「成果」や「形式」にこだわりすぎてしまい、小さくまとまってしまうからである。イベントを好循環させるには、主催者が明確な「評価眼」を持つことが不可欠であるが、それと同時に、地元に対する「愛着」や「遊び心」といったコミットメントの要素を持つことも必要である。旧来の雇用慣行が崩れ、働き方の多様化が進んでいる。周知のように、非正規雇用が増加し、一つの会社に定年退職まで働くことが「普通」ではなくなった。このような変化に対して、働き方の可能性が広がるとして肯定的に捉える者もいれば、賃金格差や経済格差が広がるとして否定的に評価する者もいるが、いずれにせよ、働き方の「多様化」といった場合には、大方、雇用形態に限って議論されてきたのである。しかし、現在進行している多様な働き方とは雇用に限定されない。同じく正規社員の中にあっても、雇われ先にはさほど期待せず、安定収入を確保した上で、小遣い稼ぎをする者や趣味や家庭を優先する者もいる。非正規雇用に関しては、それこそ無数な働き方がある。正社員になりたくてもなれない人、複数の働き先を掛け持ちしている人、起業や独立などの夢をみている人、多くの時間を労働に割かれることを嫌う人、本当は正社員として働きたいが体や心がついていかない人などがいる。さらには、働いていない者であっても、働くことに対する価値観は多様である。本当は働きたいが、働けない者もいれば、当初はそうであったが、徐々に働かなくても生活していける術を身につけていった者もいる。つまり、働き方の多様化とは、労働観や勤労観の多様化を抜きにしては語れないことが分かった。むろん、雇用問題=賃金の問題がなくなったわけではない。現実問題として、お金の問題は切実である。したがって、経済環境を踏まえつつ、個々人はいかに自らが欲する働き方を「ストーリー化」して実現しているのか、あるいは挫折・妥協・修正しているのか、という込み入った点を明らかにしてはじめて、働き方の多様化の「実態」がみえてくるわけである。この点を明らかにすることが今後の課題である。本年度は、働き方の「多様化」を統計的におよびケーススタディから整理することが課題であった。おおむね順調に進んでいる。本研究は、「新しい働き方」に注目し、その一例としてクラフトを仕事に選んだ人たちの働き方・生き方を追っている。この仕事に従事する人たちの出自や背景は様々である。新卒、美大出身者、勤め人経験者、主婦など、多様な背景を持つが、自分のこだわりを形にしたり表現したりしながら働きたいという欲求を持つ点では共通する。いわゆる「大量生産方式」にモノを作ったり、画一的・従属的に働いたりすることを厭う傾向が強く、自分なりの働き方・生活を求めている。その裏腹ともいえるが、ほとんどの者は経済的に楽ではなく、仕事を継続していく中で、そのジレンマといかにつきあうかが大きな課題になっている。専業主婦など、主たる稼得者が別にいる場合は「片手間」でやることも不可能ではないが、独身者の場合は、経済問題が切実となるケースが多い。クラフト一本で暮らしていくことができず、他の仕事と掛け持ちする人、副業の方が主になってしまいクラフトに力を注げなくなってしまった人、自立した働き方を諦めて(再び)被雇用者に戻る人、来る話を無節操に受けるようになった人など、当初に描いていた「こだわりの働き方」とは異なる働き方をせざるを得なくなった人が少なくない。

現実は思ったようにはいかないようであるが、その理由や背景として、「一点もの」ばかりを作っていては「効率」が悪いので「大量生産型」にシフトする層が増えたり、「素人」と「玄人」のはざまでやってきた中で「業者」が入り込んできたり、クラフト展の企画が多くなりイベントの新規性が薄まったりして、クラフトの浸透と同時に陳腐化もあるように思われる。これらの環境の変化については、次年度明らかにしたい。当初の計画通りに進んでいる。クラフトをイベント側からみると、2005年くらいから「同時発生」的に開催されるようになった。それから十数年が経ち、イベント数は増え、世間的な認知も高まった。そして、次の段階として、質が問われるようになった。当初の新規さは失われ、どこも同じような出店(出展)になり、出店者(出展者)のレベルの低さが目につくイベントも増えているからである。筆者が調査したクラフト展は、応募が毎回200から300あるなかで「セレクト」している。過去にさかのぼって活動をチェックしたり、毎回の売り上げを確認したりして、出店者のレベルを下げないようにしていた。それに対して、数を追ったり、質を重視しなかったり、出店者の分析が不十分であったりするイベントも存在し、そのようなケースでは、出展者の質が低く、店のばらつきが大きい。そのことはお客も感づいており、次は参加しなくなる。つまり、企画の水準を維持するには、出店者を選ぶ「目利き」が必要であり、それを確保できるイベントは、結果として、主催者、出店者、お客という「三者のクオリティ」が保たれ、イベントが順調に回っていく。三者は必ずしも利害を一致させているわけではないが、創発的な関係を保ちながら、イベントのレベルを維持・発展させていく。ひとたびこのサイクルができあがると、安定的に維持される。ただし、企画者を選定するにあたって、丸投げするようだとダメである。自治体の中にはそういうところもある。他方で、自分たちだけやろうとしてもうまくいかないことがある。なぜなら、えてして「成果」や「形式」にこだわりすぎてしまい、小さくまとまってしまうからである。イベントを好循環させるには、主催者が明確な「評価眼」を持つことが不可欠であるが、それと同時に、地元に対する「愛着」や「遊び心」といったコミットメントの要素を持つことも必要である。新しい働き方および消費の仕方として、クラフトに焦点をあてる。クラフトの活動に従事している人たちを調査する。クラフト展に足を運び、クラフトに従事する人の調査を続けるが、上述したように、クラフトを取り巻く社会的背景にも目を向ける。町おこし、「B級グルメ」、「ゆるキャラ」など、当初は当地の独自性が際立ち、衆目を集めていたが、大衆化する中で陳腐化していく傾向がみられるが、クラフトにもそういった特徴があるのか。クラフトを企画する側にも目を向けて調査を続ける。ごく少額であるが、端数を次年度に繰り越した。基本的には予定通り。端数を次年度に繰り越した。次年度に速やかに使用する。
Ｔｏｌｌ様受容体システムによる抗原依存的な気道分泌調節機構の解明

Toll様受容体(TLR)システムによる抗原依存的な気道分泌調節機序は未解明である。本研究ではTLR2, 3, 4, 5の各サブタイプの気道分泌に対する影響、分泌細胞での発現、細胞内メカニズムを解析した。その結果、慢性気道感染の増悪に強く関与するグラム陰性菌である緑膿菌が有するLPSやFlagellinが、気管粘膜下腺細胞上に発現するTLR4やTLR5をそれぞれ刺激し、NO/cGMP/PKG系を介して分泌を増強することを明らかにした。本研究成果は今後の気道分泌研究をさらに発展させ、将来的には難治性気道炎症疾患の新規治療法の開発にも通じるものである。COPDなどの難治性の慢性気道炎症疾患における気道感染はしばしば気道過分泌を招き、病態の増悪に深く関与することが知られている。気道分泌は気道に分布する迷走神経末端からのアセチルコリンなどの神経伝達物質によって調節されていると考えられている。しかし、ウイルス感染時に比して細菌感染時により強い気道分泌増強が認められる調節機序など詳細には解明されていない点も多い。本研究では、Toll様受容体(TLR)システムを利用した抗原依存的な気道分泌調節機序が存在しているとの仮説のもとに研究を行っている。最終的にはそれぞれの認識抗原によって惹起される分泌調節の臨床的意義を完全解明し、気道分泌異常が深く関与する難治性慢性気道炎症疾患に対する新規治療戦略を確立することを目標としている。今年度も昨年に引き続き、TLR2, 3, 5, 7, 9の候補サブタイプによる網羅的な機能解析を行った。慢性気道感染の増悪には、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス感染など多くの病原菌が関与するため、今回はTLR 2,3,4,5のリガンドとしてそれぞれPGN, LTA, Poly(I:C), LPS, Flagellinを用いた。ヒトと類似した性質をもつブタ気管粘膜下腺細胞を単離し、パッチクランプ法を用いて水分分泌の程度をイオンチャンネルから流出する電荷量によって評価した。これらの中でLPSとFlagellinがそれぞれ気道分泌腺表面に発現するTLR4やTLR 5を刺激し、細胞内カルシウムの更なる上昇を伴わない機序で分泌増強因子として機能することが明らかになった。気道過分泌を特徴とする慢性気道炎症疾患においてはしばしば緑膿菌が気道表面へ定着しているが、LPSとFlagellinを共に有することが気道過分泌と関連している可能性が考えられた。以上の研究成果は、米国生理学学会雑誌に投稿し掲載された。生体にとって不都合な気道過分泌という現象は繰り返す気道感染に伴って二次的に生じるだけでなく、気管支喘息あるいは慢性閉塞性肺疾患(COPD)の病態増悪の形成に重要な位置を占めていることが注目されてきている。難治性慢性気道炎症疾患において気道過分泌の制御が病態改善をもたらす可能性があるが、気道過分泌を引き起こす詳細なメカニズムは不明である。本研究では、Toll様受容体(TLR)システムを利用した抗原依存的な気道分泌調節機序が存在しているとの仮説のもとに、以前の研究代表者らの報告を参考に、TLR2, 3, 5, 7, 9の候補サブタイプによる網羅的な解析をすることによってそれぞれの認識抗原によって惹起される分泌調節の臨床的意義を完全解明することを目標としている。今年度は慢性気道感染症においてしばしば臨床的に問題となる緑膿菌の構成成分に注目して研究を遂行した。緑膿菌にはグラム陰性菌由来のLPSおよび鞭毛由来のFlagellinを有し、気道粘膜面ではそれぞれTLR4およびTLR5によって認識され、自然免疫機構の賦活とそれに続く獲得免疫の惹起に寄与していることが知られている。研究代表者は、ヒトに類似した分泌様式を持つブタ気管から単離した分泌腺細胞からの水分電解質分泌の解析を可能にし、低濃度アセチルコリンを用いた生理的条件下と考えられる反応に対する、Flagellinの増強効果を検討した。FlagellinはTLR5との結合を介して生理的分泌反応を増強し、追加分泌として作用し得ることが示された。この反応には細胞内一酸化窒素(NO)合成酵素の活性化が関与しており、かつ細胞内cGMP依存性蛋白リン酸化酵素の活性化も関与していることも示された。本研究によってFlagellinはTLR5によって認識され、分泌腺細胞内NO/cGMP/PKG系が動員されて追加分泌を惹起することが示唆された。気管支喘息およびCOPDは病態解明と薬物開発の進展により治療成績が向上してる。しかし、高齢者喘息やCOPD合併喘息などでは適切な治療にも関わらず難治化する症例が多く、喘息死減少を妨げる要因となっている。

特に喀痰の多いCOPD症例では呼吸機能の経年低下が大きく、増悪の頻度も多く、健康関連QOLを悪化させることも知られており、COPDの長期管理において気道過分泌への対策は重要である。喘息やCOPD患者の感染時に健常者に比して気道分泌の過剰な増強が認められる機序は解明されていない点が多い。本研究では、病原菌の成分に反応するToll様受容体(TLR)システムを利用した抗原依存的な気道分泌調節機序が存在していることを解明することで、将来の新規治療戦略の構築に寄与することを目的としている。今年度は昨年に引き続き、TLR2, 3, 5, 7, 9の候補サブタイプによる気道分泌に対する網羅的な機能解析および関与するTLRの発現、細胞内メカニズムを解析した。その結果、慢性気道感染の増悪に強く関与するグラム陰性菌である緑膿菌が有するLPSやFlagellinが気管粘膜下腺細胞上に発現するTLR4やTLR5をそれぞれ刺激し、細胞内カルシウムの更なる上昇を伴わない機序で分泌増強因子として機能することを明らかにした。また、関与するTLRリガンドが気道表面の粘液線毛運動に対する影響を確認する準備を整え、予備実験を行い、さらなる研究の発展の礎を築いた。本研究期間全体を通じて、それまで知られていなかったTLRと気道分泌の密接な相互作用について初めて解明し、さらにその細胞内シグナル経路にはNO/cGMP/PKG系が重要であることを解明した。以上の研究成果は米国生理学学会雑誌に投稿し掲載され、呼吸器の気道分泌の研究分野に大きなインパクトを持って紹介された。医歯薬学平成24年度の当初の計画の主体は、気道粘膜に侵入し炎症を惹起する外来微生物の菌体成分を認識するものとして、既に報告されたTLR4以外にTLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR9を候補として選択し機能解析を行うことであった。実際にそれぞれのリガンドであるPeptidoglycan(PGN)、poly (I:C)、Flagellin、Imiquimod(R-837)あるいはR-848、CpG DNAを用いて解析し、Flagellinの増強効果が確認された。次いでTLR中和抗体あるいは特異的結合阻害剤などで前処理した状態で同様の実験を繰り返し、増強効果/抑制効果が解除されればリガンドと受容体との結合の重要性が証明された。さらには平成25年度に予定していた一部の研究すなわち細胞内細胞内シグナル経路も検討し、NO/cGMP/PKG系が候補として選択できた。当初計画よりも進展があったったため、平成26年度に購入予定であった高速度カメラ付き倒立顕微鏡を平成25年度中に導入することができた。このことにより、気道分泌だけでなく気道表面における粘液線毛輸送の直接的な観察が可能となり、本研究の主要な目的であるTLRおよびそれぞれのリガンド認識によって惹起される分泌調節の臨床的意義の完全解明が可能となる。平成26年度はTLR5のリガンドであるflagellinが気道表面の粘液線毛運動に対する影響を確認する予定である。一方でTLR2、TLR3、TLR4リガンドの粘液線毛運動対する長期的影響に関しても確認する予定である。さらにいまだ未解明であるTLR7、TLR8の気道粘膜下腺細胞での発現および分泌機能への影響を確認する予定である。影響が確認されれば細胞内メカニズムについても解明を進め、さらには粘液線毛運動に対する影響も確認する。
アルミニウム毒性と膜脂質 ― ゲノム情報に基づく lipidomics解析

アルミニウムイオン(Al)は酸性土壌での植物の生育を阻害する主たる要因である。しかし、その毒性機構については、酸化ストレスあるいは膜脂質流動性攪乱や、メタルイオン恒常性攪乱などが提唱されているが、その詳細は明らかではない。本研究では、高濃度Al耐性微生物であるAcidocella aluminiiduransおよびRhodotorula taiwanensisの脂質組成の解析を進め、Al感受性や耐性と脂質組成の関連について検討を加えた。また、モデル生物である出芽酵母からAl耐性変異株を確実に選択し、欠損によりAl耐性を示した脂質関連遺伝子群とAl毒性やAl耐性との関係に検討を加えた。アルミニウムイオン(Al)の毒性には、酸化ストレスあるいは膜脂質流動性の攪乱や、メタルイオンの恒常性の攪乱などが関与すると言われているが、その分子メカニズムの詳細はいまだ明らかになっていない。我々は酸性土壌に適応した植物・微生物共生系の研究から高濃度Al耐性と膜脂質組成(流動性)の間に強い相関があることを見出した。本研究では、高濃度Al耐性微生物あるいは出芽酵母などのモデル微生物について、ゲノム情報に基づき作成した各種変異株の脂質を精密かつ網羅的に(lipidomics)解析することにより、Al毒性および耐性と膜脂質の関係を明らかにすることを目指している。本年度は、モデル生物を用いた研究については、出芽酵母BY4741株由来のノックアウト・コレクション(4826株)を用いた選抜を進め、Al感受性に変化を生じた多くの変異株を単離し、エンドサイトーシスやトリカルボン酸回路などの細胞機能クラスがAl毒性や耐性と相関することが判明した。また、これら変異株の中には、膜脂質の組成や局在性に影響を与える遺伝子群も含まれており、本研究の材料として出芽酵母が有用であることが示された。一方、高濃度Al耐性微生物を用いた研究については、Acidocella aluminiidurans AL46株およびRhodotorula taiwanensis RS1株の脂質組成の検討を進めた。その結果、リン脂質量がAl感受性と関連する可能性を認め、詳細な検討に取り組んでいる。アルミニウムイオン(Al)は酸性土壌での植物、特に作物の生育に多大な影響を与えることから増加する人口に対応する食糧増産にとって重要な問題であると考えられている。Alの毒性機構としては、酸化ストレスあるいは膜脂質流動性の攪乱や、メタルイオンの恒常性の攪乱などが関与すると言われているが、その分子メカニズムの詳細はいまだ明らかにされてはいない。我々は酸性土壌に適応した植物・微生物共生系の研究に取り組んできたが、高濃度Al耐性微生物のAl耐性と膜脂質組成の間に強い相関があることを見出した。本研究では、高濃度Al耐性微生物あるいは出芽酵母などのモデル微生物について、ゲノム情報に基づき作成された各種変異株の脂質を精密かつ網羅的に(lipidomics)解析することにより、Al毒性および耐性と膜脂質の関係を明らかにすることを目指している。本年度の研究では、モデル生物である出芽酵母BY4741株由来のノックアウト・コレクション(4826株)を用いた選抜を精密に再度行い、Al感受性に変化を生じた変異株を確定させ、エンドサイトーシスやトリカルボン酸回路などの細胞機能クラスがAl毒性や耐性と相関することを明らかにした。また、これら変異株の中には、スフィンゴ膜脂質やリン脂質の組成や局在性に影響を与える遺伝子群が多く含まれていることを明らかにし、これら変異株細胞を再現性良く調製、分析するための条件を確立し、解析を進めた。一方、高濃度Al耐性微生物を用いた研究については、Acidocella aluminiidurans AL46株およびRhodotorula taiwanensis RS1株の脂質組成の検討を進めた結果、昨年度明らかにしたリン脂質量とAl感受性の関連に加え、水酸化脂肪酸量とAl感受性が関連する可能性を認め、これら脂質の解析を進めた。昨年度、出芽酵母BY4741株由来の確実なアルミニウム感受性変異株が得るために、精密な再実験や詳細な統計解析を行うとともに、精密かつ網羅的に解析するために必要な量の均一な細胞を再現性よく安定的に調製する条件を確立できたことから、計画した実験が順調に進み、遅れを取り戻している。本研究では、高濃度Al耐性微生物あるいは出芽酵母などのモデル微生物について、ゲノム情報に基づき作成された各種変異株の脂質を精密かつ網羅的に(lipidomics)解析し、Al毒性および耐性と膜脂質の関係を明らかにすることを目指している。昨年度の研究で、モデル生物である出芽酵母BY4741株由来のノックアウト・コレクション(4826株)から確定させたAl感受性に変化を生じた変異株について、本年度はエンドサイトーシスや膜脂質組成や脂質細胞内局在性などのそれぞれの細胞機能とAl毒性や耐性の関係について検討を進めた。これら2つの成果について国際学会で発表した。

本研究では、高濃度Al耐性微生物であるAcidocella aluminiiduransおよびRhodotorula taiwanensisの脂質組成の解析を進め、Al感受性や耐性と脂質組成の関連について検討を加えた。また、モデル生物である出芽酵母からAl耐性変異株を確実に選択し、欠損によりAl耐性を示した脂質関連遺伝子群とAl毒性やAl耐性との関係に検討を加えた。出芽酵母BY4741株由来のノックアウト・コレクション(4826株)から確実なアルミニウム感受性変異株を選抜するために、統計解析や再実験が必要となり、時間を要した。また、これら単離した出芽酵母の変異株の脂質を精密かつ網羅的に(lipidomics)解析するためには、ある程度の量の均一な細胞が必要だが、再現性よく安定的に調製するための条件を検討するために時間を要した。モデル生物である出芽酵母BY4741株から得られたAl感受性に変化を生じた変異株について、精密かつ網羅的に解析するために必要な量の均一な細胞を再現性よく安定的に調製する条件を用いて、本年度に引き続き、さらに解析を進めて行く。一方、高濃度Al耐性微生物を用いた研究については、リン脂質量とAl感受性の関連に加え、水酸化脂肪酸量とAl感受性の関連についても解析を進めて行く。環境農学モデル生物を用いた研究については、本年度検討した、出芽酵母の変異株の脂質を精密かつ網羅的に(lipidomics)解析するために必要な量の均一な細胞を再現性よく安定的に調製する方法を用いてlipidomics解析実験を進めて行く。また、高濃度Al耐性微生物を用いた研究については、本年度得られたリン脂質とAl感受性との関連に関する実験結果を用いて解析を進める予定である。これらを着実に遂行することにより、遅れを取り戻す予定である。本年度までの解析に要する物品費が計画時より少額で済んだことから、次年度の解析のための物品費と本研究で得られた成果を発表するための経費として繰り越すこととした。選抜した変異性株の細胞を再現性良く安定的に調製する条件の検討に時間を要し、当初の予定より少額しか経費を要さなかったため。繰り越した金額は、主として解析のための物品費と成果発表に使う予定である。物品費としては解析のための実験消耗品や解析用サーバーのメモリーなど、成果発表としては国際学会発表と学術雑誌投稿などを計画している。再現性が良く安定的な細胞調製法を用いて、当初計画に従いlipidomics解析を進める予定である。それに合せ予算の使用も進む予定である。
心筋細胞増殖能喪失の個体発生と系統発生:遺伝子発現正帰還制御ループの進化論

一般的に我々ヒトを含む哺乳動物の心筋細胞は終末分化細胞と考えられ,生まれた直後に分裂能を失い,出生後は増殖しないものとして理解されてきた。そこで本研究では,心筋再生能を有しているイモリおよび生後心筋再生能を喪失しているラット心筋細胞を実験対象として,ヒトを含む哺乳類における心筋再生能喪失メカニズムを,個体発生学的および系統発生学的観点から解明することを目的とし,研究を実施した。その結果,イモリでは心筋損傷によって周囲残存心筋の増殖能を増加させる何らかの因子が放出されており,その因子は系統発生学的に保存されていること,その因子が哺乳動物心筋の生後分裂能喪失に関与しているROS-p38MAPK活性化-Cx43発現の正帰還制御ループを開放することでラット心筋細胞の増殖能を亢進させる可能性を明らかに出来た。成人の心筋細胞が生後の分化によって,細胞周期から抜け出して分裂能を喪失するメカニズムは,これまでにも,その重要性から,様々な観点から膨大な研究が行われてきたが,未だ「謎」として残されている。そこで本研究では,心筋再生能を有しているイモリおよび生後心筋再生能を喪失しているラット心筋細胞を実験対象として,ヒトを含む哺乳類における心筋再生能喪失メカニズムを,個体発生学的および系統発生学的観点から解明することを目的とする。本年度に得られた研究成果は,以下のようにまとめられる。(1)イモリ心筋損傷・再生組織のextractsをラット心筋細胞培養系に付加し,心筋細胞増殖能の変化を解析した結果,細胞内活性酸素種(ROS)生成が抑制され,p38 MAPK活性も抑制された。また,細胞増殖のマーカータンパクであるPCNAの核内発現が上昇した。(2)イモリ心筋損傷・再生組織のextractsをラット心筋細胞培養系に付加したところ,心筋細胞の自発的な拍動リズムのゆらぎ(拍動周期の変動係数で評価)が増加した。また心筋細胞内ギャップ結合タンパクであるCx43発現も減少した。(3)以上の結果から,イモリでは心筋損傷によって周囲残存心筋の増殖能を増加させる何らかの因子が放出されており,その因子は系統発生学的に保存されていること,その因子が哺乳動物心筋の生後分裂能喪失に関与しているROS-p38 MAPK活性化-Cx43発現の正帰還制御ループを開放することでラット心筋細胞の増殖能を亢進させる可能性を明らかにした。イモリ心筋損傷・再生組織のextractsに含まれる,増殖能増加に関与している鍵分子の解明が今後に残された課題である。
金属薄膜周期構造における偏光近接場光の波長可変による共鳴増強効果

1996年に提案し,2001年にVCSEL用のエピウェーバにて直径10μmの素子を縦横100個ずつの二次元アレイを形成できた(全サイズが2mm×2mm)。しかし,各VCSEL素子からのレーザー出力は0.1mW程度であった。本研究による超並列近接場光ヘッドでは直径8μmのVCSEL出力窓から発生する各レーザー光ビームを30nm以下の超微小開口を通して近接場光(エバネッセント光)に高効率変換させることにある。平成16年度までは100nm開口で1μWの出力が得られ,平成17年度には開口を30nmにできたが,その30nm開口から得られる近接場光出力はわずか数μWであった。記録に必要なエバネッセント光波10μWにまでこの効率を増加させる手段として,平成18年度の萌芽研究では,ナノ構造をもつ金属回折格子薄膜による結晶との界面に表面プラズモン波(SPP波)を発生・共鳴をさせ,光波とSPP波とのGaP結晶中の分散の整合方式を明確にすることが課題である。直線偏光波が金属薄膜に近づくとs偏光波(横波)の電界強度に応じて薄膜を構成する金属原子の電子雲が表面に偏り,表面プラズモン密度波(縦波)が生じる。光波はGaP結晶の中から30nm開口のある金薄膜へ進む。GaP中での光波とSPP波の分散関係は,光波が線形であるのに対して,SPP波は非線形であるので,回折格子のグレーティングベクトルを利用し(逆格子はエネルギーのデメンジョンであるから),結晶中の光波・SPP波の波数分散を逆格子ベクトルとの和でエネルギー保存が成り立ち,両者の整合が可能である。三次元FDTD(時間領域差分法)解析により,開口を穿孔する材料として金薄膜を選び,表面への回折格子の幅が10nm50nm,高さが1050nmと変えて,ピッチを118nm一定にした場合のナノ構造回折格子における近接場光エンハンスメント現象のシミュレーションを行なった。従来からの金属回折格子のGaPへの埋め込み型(金属凸構造)と金属凹構造の二種類で試みた結果,従来とは異なる解が得られた。開口が20nmでもかなりの効率でエバネッセント波が得られることがわかった(0.1%,マイクロレンズ併用で0.5%)。困難な実証実験中に期間が終了。2007年度以降に実証したい。
マルチメガバール領域における鉄-軽元素系の超高圧高温実験と地球核への応用

地球中心核の構造および物性を物質科学的に明らかにするため,200万気圧以上のマルチメガバール領域における超高圧実験を実施した.これまでに行われた実験結果は以下のようにまとめることができる.1.マルチメガバール領域における超高圧力発生技術の確立:マルチメガバール領域での超高圧力実験を定常的に実施するため,超高圧力発生装置ダイヤモンドアンビルセル(DAC)および放射光実験技術の開発・改良を行った結果,地球中心部に相当する365万気圧までの圧力発生に成功した.この技術開発により,定常的に200-300万気圧領域の圧力発生が可能になった.2.地球中心核の圧力領城における鉄およびニッケルの圧縮挙動:地球中心核の主要構成物質である鉄およびニッケルに関して,確立した超高圧力発生技術を用い,地球中心部に相当する圧力条件(365万気圧)まで,放射光その場X線回折実験を行った.これまで静的圧縮実験技術を用いて,地球内核条件下(330-365万気圧)において,地球中心核を構成する物質の密度や物性を実験的手法により直接測定した例がなく,極めて重要な実験データを取得できた.3.マルチメガバール領城におけるメスバウワー分光法の開発:放射光を用いたメスバウアー分光法を開発し,従来不可能であったマルチメガバール領域での分光測定が可能になった.この開発した技術を用いて,世界で初めて250万気圧を超える圧力条件下での金属鉄のメスバウワー分光測定を行い,極端条件下での金属鉄の電子状態を調べることに成功した.高圧発生装置ダイヤモンドアンビルセル(DAC)と放射光を用いた実験によって,地球中心核の構造および物性を明らかにした.これまでに実施された実験結果は以下のようにまとめることができる.マルチメガバール領域における高温高圧発生技術の開発:マルチメガバール領域(200GPa以上)において,地球中心核の主要構成物質である金属鉄の結晶構造および相平衡関係を明らかにするために,レーザー加熱式DACと放射光を用いた金属鉄の高温高圧X線その場観察実験を行った.圧力210GPa,温度2300Kまで,金属鉄のhcp相が観測され,この相が安定に存在することが明らかになった.地球中心核領域における鉄ニッケル合金の相平衡関係:鉄ニッケル合金(Fe-10wt.%Ni)の結晶構造と相平衡関係を180GPa,2000Kまで高温高圧X線その場観察によって調べ,鉄に10wt.%のニッケルが加わることにより,hcpおよびfcc構造の鉄ニッケル合金が安定に存在することが明らかになった.地球の内核は金属鉄中に10wt.%ほどのニッケルが含まれていると考えられているが,この結果は地球の内核がhcp相だけでなく,fcc相も安定に存在する可能性を示唆するものである.鉄ニッケル合金と鉄ニッケル水素化物の状態方程式:地球中心核の主要構成物質である鉄ニッケル合金(Fe-10wt.%Ni)と核の軽元素の有力な候補である水素と鉄ニッケル合金に関して,高圧力下での圧縮特性を室温下53GPaまで調べた結果,金属鉄と同様にdhcp構造の鉄ニッケル水素化物は磁気転移に関連していると考えられる圧縮曲線の異常を観測した.地球中心核の構造および物性を物質科学的に明らかにするため,200万気圧以上のマルチメガバール領域における超高圧実験を実施した.これまでに行われた実験結果は以下のようにまとめることができる.1.マルチメガバール領域における超高圧力発生技術の確立:マルチメガバール領域での超高圧力実験を定常的に実施するため,超高圧力発生装置ダイヤモンドアンビルセル(DAC)および放射光実験技術の開発・改良を行った結果,地球中心部に相当する365万気圧までの圧力発生に成功した.この技術開発により,定常的に200-300万気圧領域の圧力発生が可能になった.2.地球中心核の圧力領城における鉄およびニッケルの圧縮挙動:地球中心核の主要構成物質である鉄およびニッケルに関して,確立した超高圧力発生技術を用い,地球中心部に相当する圧力条件(365万気圧)まで,放射光その場X線回折実験を行った.これまで静的圧縮実験技術を用いて,地球内核条件下(330-365万気圧)において,地球中心核を構成する物質の密度や物性を実験的手法により直接測定した例がなく,極めて重要な実験データを取得できた.3.マルチメガバール領城におけるメスバウワー分光法の開発:放射光を用いたメスバウアー分光法を開発し,従来不可能であったマルチメガバール領域での分光測定が可能になった.この開発した技術を用いて,世界で初めて250万気圧を超える圧力条件下での金属鉄のメスバウワー分光測定を行い,極端条件下での金属鉄の電子状態を調べることに成功した.
内在性神経幹細胞および自己修復能に着目した脊髄損傷の新規治療法開発

成体脊髄は一度損傷を受けると再生しないと考えられているが、我々は反応性アストロサイトが損傷後の組織修復と機能回復に重要であることを見いだした。この修復機構と神経幹細胞の関連を解析するため、反応性アストロサイトを選択的に採取する方法を確立し、neurosphere法により培養したところ幹細胞能を有していたが、組織中に於いては神経細胞への分化は確認されなかったため、神経細胞の補充による組織修復機構ではないことが示唆された。この脊髄組織からセルソーターを用いて目的の細胞分画のみを採取する本手法は、神経研究にとって今後強力なツールとなり得ると考えられる。本研究の目的は、マウス脊髄損傷モデルを用いて中枢神経外傷後の修復に関わる細胞群および関連遺伝子を同定することである。損傷亜急性期の運動機能回復に於いて、反応性アストロサイトによる損傷脊髄の修復が重要であることを報告した。しかし、反応性アストログリアは特定の細胞群ではなく、むしろ細胞形態の変化、場所、細胞骨格蛋白の発現変化という『現象』をとらえた定義であったため、非常に曖昧であり、それゆえこれまで解析が困難であると考えられた。そこで、反応性アストロサイトの起原同定をNestin-transgenicマウスを用いた経時的組織切片解析により行ったが、その起原はresidualな状態のアストロサイトであり、損傷後早期よりNestinの発現は広い範囲で上昇するものの徐々に損傷周囲に限局され、最終的にはグリア瘢痕を形成する反応性アストロサイトのみに残存することが示唆された。また、新たに発現遺伝子profileによる反応性アストログリアの定義を確立するため、細胞特異的遺伝子発現解析法の開発を試みている。これは、脊髄組織より全ての細胞核を採取・回収し、発現遺伝子によるソーティングを行うという新しい発想に基づくものである。実際に組織より核を抽出することに成功し、発現遺伝子によるニューロンやグリアのソーティングを行える段階である。本技術により反応性アストログリアの解析が進み、中枢神経外傷後の自己修復メカニズムが解明されれば新たな治療法に繋がる可能性は高いと確信している。脳や脊髄などの中枢神経系は多種多様な細胞が複雑なネットワークを構築して存在しており、外傷後に特定の細胞のみの機能を解析することは困難であった。実際に中枢神経系の分子生物学的研究は免疫組織化学あるいはin situハイブリダイゼーションによる解析が主流であるし、脊髄損傷後の遺伝子発現変化の報告は"組織全体"を用いた解析のみであり、どの細胞がどのような遺伝子を発現して役割を担っているのかは殆ど明らかにされていない。我々は先行研究により、損傷亜急性期の運動機能回復に於いて、反応性アストロサイトによる損傷脊髄の修復が重要であることを報告が、反応性アストロサイトを選択的に採取解析する手法が無いため、その機能解析は不十分であった。セルソーターを用いた反応性アストロサイトのソーティングも試みられているが、中枢神経系の組織においては、胎児細胞以外は単一細胞レベルへの単離が困難であることに加え、細胞脆弱性やマーカーとしての細胞表面抗原がほとんど存在しないことから解析は殆ど不可能であった。そこで本研究では、反応性アストロサイトなどの目的とする特定の細胞の"核"のみを生かしたまま選択的に抽出し、経時的な細胞増殖の推移や発現遺伝子の網羅的解析を目指した、新しい解析技術開発を試みている。今年度の成果として、我々は脱核剤とホモジナイザーを併用した物理的化学的刺激により、脳脊髄組織から高純度に核を抽出することに成功した。この方法は、従来の細胞骨格マーカーや細胞形態からのニューロン・グリア分類ではなく、核内発現蛋白や遺伝子を指標として分類する点も非常に独創的であると考えている。さらに、近年次世代大規模シークエンス技術が急速な発展を見せているため、これを応用することにより核内のすべての発現遺伝子の種類と量的関係を明らかにすることが可能である。今後、上衣細胞や運動ニューロンといった、中枢神経系を構成する重要な細胞でありながらこれまで選択的な解析が困難であった細胞群についても採取分画や発現遺伝子解析が可能であるかを検討する。最終的には脊髄損傷後の組織修復に重要な役割を果たす遺伝子群を同定し、新規の中枢神経外傷治療法開発に繋げたいと考えている。我々は先行研究により、損傷亜急性期の運動機能回復に於いて反応性アストロサイトによる損傷脊髄の修復が重要であることを報告したが、反応性アストロサイトを選択的に採取解析する手法が無いため、その機能解析は不十分であった。そのため、反応性アストロサイトのマーカーであるNestinあるいはGLAST遺伝子制御下にGFPを発現させたレポーターマウスを用いて、この細胞の選択的回収ならびに解析を試みた。まず、目的とする特定の細胞の"核"のみを生かしたまま選択的に抽出し、経時的な細胞増殖の推移や発現遺伝子の網羅的解析を目指した、新しい解析技術開発技術を立ち上げた。

脱核剤とホモジナイザーを併用した物理的化学的刺激により、脳脊髄組織から高純度に核を抽出することに成功した。この方法は、従来の細胞骨格マーカーや細胞形態からのニューロン・グリア分類ではなく、核内発現蛋白や遺伝子を指標として分類する点に特徴がある。しかし、GFP陽性核を採取しても、核移行シグナルが欠損した状態では核膜孔からGFPの漏出が起こり回収が不安定であることが判明した。そのため、脊髄組織のホモジナイズ条件を検討し、損傷脊髄中からGFP陽性細胞のみをセルソーターで回収することに成功した。回収した反応性アストロサイトは培養系に於いては増殖因子存在下で自己増殖能を示し多分化能も確認されたため、内在性神経幹細胞としての可能性が示唆されたが、in vivoの環境に於いてこれらが神経細胞へと分化することは確認されなかった。また、脊髄損傷後の炎症反応プロファイルをFACSを用いて詳細に解析することに成功し、浸潤好中球の制御が新規治療法に繋がる可能性を示した。
高エネルギー加速器研究者集団と機種変更

米国における超伝導超大型衝突型加速器(SSC)、日本における原子核将来計画の素粒子研究所の加速器のデザイン・機種が変更された経緯を、これらの変更にともなって研究組織に大きな改変が起きたことに注目し、技術的な側面だけでなく技術者集団の組織・社会の観点から分析する。先端的な大型装置のデザインはトランスサイエンスの典型例であり、専門家集団の多様な価値観が反映し、同時に集団の構造に影響する。不定性がある中での意思決定のありかたを探るため、高エネルギー加速器研究機構に保管されている史料、計画に加わった研究者の記録およびオーラルヒストリーを用いて、技術選択と研究者集団の関係、研究者集団の社会学を探る。
実機環境下におけるフィルム冷却制御デバイスの高効率化及び高信頼性化に関する研究

CO2排出の少ないガスタービンエンジンへの期待が高まっている中、本研究ではこれまでの経験、知見、技術的蓄積を活かしながら,実用環境下におけるフィルム冷却制御デバイスの高効率化及び高信頼性に資する調査と新たなデバイス開発を目的としている。本研究では、まず最適化手法としてタグチメソッドを用い、フィルム冷却効率と熱伝達率の両方を考慮した指標であるNet Heat Flux Reduction(NHFR)を最適化評価指標として取り入れ、デバイスとして最もフィルム付着性向上に貢献するDFCD形状最適化を試みた。その結果として、デバイスに対する流入角の増加に伴い、NHFRが増加する傾向が確認された。その一方で、DFCDはデバイスから生成される縦渦が大きいため、低吹き出し比で性能を発揮しにくいことや、空力損失増加が大きいことから、デバイスからの縦渦の規模が小さい新規デバイスであるFCD(DFCDの一方の突起のみを残したもの)及びDimple(DFCDとは逆に対となっているくぼみ)を新たに提案し、そのフィルム冷却性能について調査を行なった。FCDについては、設置位置を様々に変化させた結果、FCDは冷却孔中心からある程度スパン方向へ設置位置をずらした方が高い性能を発揮することが分かった。また、NHFRの減衰が非常に小さく、すべての領域で均一に冷却できるデバイスが探索され、同デバイスは全圧損失の点においても優位性があることを見出され。これまでのデバイスの欠点を克服できる可能性が明らかとなった。DimpleについてはDFCDと同様に、タグチメソッドを用いてFilm及びNHFRを最適化評価指標とし、形状最適化にも取り組んだ。二種類の目的関数に対して探索された最適形状の両者の性能を比較した結果、Opt(NHFR)が最も冷却性能が高く、かつ損失の少ないデバイスであることが明らかになった。実験では標準的な条件及び実際の流れ場で発生しうる複数の流れ場条件での空気・伝熱面での調査をデバイス無し翼を用いて行うとともに、最適化で探索された複数の種類のデバイスを装着した翼を用いて行い、最適化の妥当性を実験的に検証することができた。更に、汎用コードでの流れ解析を通じて数値的にもより深く現象を調査するための準備に着手できた。最終年度に本格的に使用を開始する大型環状セクター風洞については、光学計測機構の機能追加、PSP/TSP計測のin-site較正機能の実装、標準条件及び複数の主流乱れ条件時の翼列試験装置(デバイス無し翼使用)の空力・伝熱(フィルム効率、熱伝達率)性能計測のための機構設置とプログラミングを進めた。また、新たなデバイスの一つとして、V字デバイスの調査にも着手し、その基本性能を把握するとともに、V字デバイスのRANS解析をベースとしたロバスト最適化や多目的最適化の準備も進めた。最終年度では、「実機環境下におけるフィルム冷却制御デバイスの高効率化及び高信頼性化に関する研究」の総仕上げとして、下記の課題に取り組む。まずは、最適化によって探索された各種デバイス(FCD、Dimple、V字)の低乱れ度及び高乱れ条件下での性能調査を、平板試験装置に欄休講しを装着することで実施し、CFDベースでの最適化の妥当性を検証し、必要に応じて再最適化を行う。再最適化の際には、冷却性能と空力損失との多目的最適化を行い、前者を重視したタイプと後者を重視したタイプの最低2種類の新たなデバイスを探索する。また、その最適化結果に試験に対応したLES解析を実施し、CFDによる予測精度の限界などを探るとともに、制御すべき渦構造の抽出を行う。上記の作業と並行して、大型環状セクター風洞を用いて、主にエンドウォール上でのフィルム冷却に上記のデバイスを適用したモデルを製作し、3次元的な流れ場と入口高乱れ度の条件下でのデバイスの性能を調査する。冷却性能の調査では、PSPによるフィルム効率計測とともに、TSPを用いた過渡応答法でのフィルム効率・熱伝達率同時計測を試み、両者の融合化を行う事で、より高精度なフィルム冷却特性の把握を試みる。また、供試翼下流でのよどみ点圧力分布の計測を行う。これらの調査を通じて、デバイスによって誘発される空力損失増加の状況を把握し、冷却性能重視タイプと空力損失重視タイプでの定量的差異を明らかにし、実機適用性を議論する。この試験に対してもCFD解析を実施し、実験では達成し得ない高レイノルズ数条件での特性調査を行い、実験的研究の補完を行う。平成29年度の計画は下記の通りである。(1)実験では,大型環状セクター風洞試験装置を製作するとともに,計測に不可欠なPSP/TSP光学計測手法の高精度化などに取り組む。(2)高密度比化を実現するための二次空気供給系の設置,トラバース装置の設置などを進める。(3)最適化に関しては,CFDを用いたロバスト最適化,多目的最適化の準備を進める。(3)数値解析では,LES解析に備えたRANS解析を展開する。(1)(2)実験装置製作については、大型環状セクター風洞製作、大型トラバース装置製作及びPSP/TSP光学計測手法適用に必要な暗室環境整備を行った。また、高密度比化を実現するための二次空気供給系の設置も行った。(3)フィルム冷却の最適化については,過去の研究からCRVPと呼ばれる渦構造が冷却空気の被冷却領域への付着性を著しく低下させることであったことから,CRVPを抑制するために数多くの流れ場制御手法開発に取り組んだ。本研究では岩手大学が特許取得に成功した三次元形状の流れ

制御デバイス(DFCD)を冷却孔上流に設置することでフィルム冷却における流れ場を制御し,フィルム冷却性能向上を図っている。DFCDはこれまでFunazaki2),3)らにより密度比DR=0.85の条件下における形状最適化や吹き出し比BR=1.0条件下における数値解析を使用した形状最適化が行なわれてきた。しかしガスタービン実機は高DR条件であり,高吹き出し比を作動条件とする冷却孔も多く存在することから,本条件下における形状最適化はガスタービン実機適用を目指す上では必須項目であるといえる。そこで本研究では,最適化評価指標に面平均フィルム冷却効率を選定し,数値解析による調査、実験的調査の両者から高密度比DR=1.53,高吹き出しBR=1.5条件下でのDFCD最適形状の導出及び最適形状の性能評価を実施した。<1>研究実績の概要で示したように、平成29年度の研究計画の(1)(4)を全て適切に実施していること。<2>RANSベースの数値解析及び実験を用いた最適化により、下記のような成果が得られたこと。1)要因効果図(評価指標:面平均フィルム効率)における比較では,数値解析及び実験結果から導出された各制御因子におけるSN比の傾向に高い一致性が見られ、フィルム効率のロバスト性に大きく寄与する因子が明らかになった。2)数値解析・実験ベースのタグチメソッドにおいて両者の予測した最適形状は一致しており,比較的高い精度の最適形態予測が可能であることが明らかになった。3)今回導出した最適形状Optimal01は,BR=1.5条件において高いフィルム冷却性能を示し,誤差要因として設定した流入角の変化に対しロバストな性能を発揮する形態であることを確認した。CO2排出の少ないガスタービンエンジンへの期待が高まっている中、本研究ではこれまでの経験、知見、技術的蓄積を活かしながら,実用環境下におけるフィルム冷却制御デバイスの高効率化及び高信頼性に資する調査と新たなデバイス開発を目的としている。本研究では、まず最適化手法としてタグチメソッドを用い、フィルム冷却効率と熱伝達率の両方を考慮した指標であるNet Heat Flux Reduction(NHFR)を最適化評価指標として取り入れ、デバイスとして最もフィルム付着性向上に貢献するDFCD形状最適化を試みた。その結果として、デバイスに対する流入角の増加に伴い、NHFRが増加する傾向が確認された。その一方で、DFCDはデバイスから生成される縦渦が大きいため、低吹き出し比で性能を発揮しにくいことや、空力損失増加が大きいことから、デバイスからの縦渦の規模が小さい新規デバイスであるFCD(DFCDの一方の突起のみを残したもの)及びDimple(DFCDとは逆に対となっているくぼみ)を新たに提案し、そのフィルム冷却性能について調査を行なった。FCDについては、設置位置を様々に変化させた結果、FCDは冷却孔中心からある程度スパン方向へ設置位置をずらした方が高い性能を発揮することが分かった。また、NHFRの減衰が非常に小さく、すべての領域で均一に冷却できるデバイスが探索され、同デバイスは全圧損失の点においても優位性があることを見出され。これまでのデバイスの欠点を克服できる可能性が明らかとなった。
ニトロソ化シグナル伝達制御系の解明

本研究で,これまで知られていなかった一酸化窒素(NO)による細胞間情報伝達機構とその制御系を明らかにした.NOは細胞内で酵素的に産生された後,ニトロソシステイン(CysNO)に変換され,アミノ酸トランスポーターにより細胞膜を通過し,隣接した細胞へNOシグナルを伝達する.一方,細胞内においてはCysNO消去系が存在し,NOが過剰に作用することを防ぎ,NOストレスによる病態形成から生体を防御していることが明らかとなった.細胞間シグナルの伝達制御分子であるNOが,細胞間を伝播する機構を明らかにする.(1)NOが細胞膜を越える機構の解明(2)細胞内局所におけるNOの活性制御機構(3)ニトロソ化シグナルの乱れと疾患本研究で,これまで知られていなかった一酸化窒素(NO)による細胞間情報伝達機構とその制御系を明らかにした.NOは細胞内で酵素的に産生された後,ニトロソシステイン(CysNO)に変換され,アミノ酸トランスポーターにより細胞膜を通過し,隣接した細胞へNOシグナルを伝達する.一方,細胞内においてはCysNO消去系が存在し,NOが過剰に作用することを防ぎ,NOストレスによる病態形成から生体を防御していることが明らかとなった.本研究は、一酸化窒素(NO)が細胞膜を通過するメカニズムを明らかにし、細胞間情報伝達系がどのように制御されているのかを理解することを目的とする。さらにNOシグナルを人為的に制御するための方法論、病態におけるシグナル伝達系の破綻・病態特異的な伝達経路の解明を目指している。本年度は、研究の開始にあたり解析系の確立とread-outとなる事象の選定を行なった。A :隣接細胞由来のNOにより変化する遺伝子発現プロファイル解析細胞内シグナル伝達に与えるNOの影響は、これまで同一細胞内において産生されたNOによる影響として検討されてきたが、本課題においては、細胞内において産生されたNOが隣接したNO非産生細胞に及ぼす影響を、隣接細胞における遺伝子発現プロファイルの比較から検討している。生理的なNOの作用を模倣するためNO産生細胞とNO非産生細胞とを層状に密接させた共培養系を確立し、NO非産生細胞における遺伝子発現プロファイルの変化を捉えるため、DNAチップを用いた解析を行っている。現在,データの解析を進めているところである。隣接細胞から細胞膜を通過して伝わってきたNOにより生じる、細胞内かおける生化学的な反応系を個別に明らかかしていくための、read-outが得られる予定である。B :細胞内におけるNO消去系の探索NADH依存性にNOを消去する系が細胞内に存在していることを新規に見出し,各種細胞における酵素活性を検討した。NADH依存性に生じるNO消去活性は、NO産生細胞において高く、NO産生量の低い細胞においては低値を示すなど、生理的な調節を受けた酵素活性であることを示唆する興味深い結果が得られてきている。現在,細胞内オルガネラ毎のNO消去活性の検討ならびに酵素タンパク質の分離・同定を実施中である。本研究は、一酸化窒素(NO)が細胞膜を通過するメカニズムを明らかにし、細胞間情報伝達系がどのように制御されているのかを理解することを目的とする。本年度は、SNO化タンパク質の特異的微量測定技術が確立されたため,細胞内におけるニトロシル(SNO)化タンパク質の変動を詳細,かつ経時的に測定を行ない,細胞内におけるSNO化タンパク質の形成と分解機構の解明を主に進めた.A:隣接細胞由来のNOはSNO化物質を介して標的細胞へ作用する本年度の解析により,NO分子そのままよりもSNO化物質を形成した方が細胞膜上のトランスポーターを利用して効率的に細胞内へ侵入することができることを明らかにし,細胞内においてNO転移反応を介して細胞内タンパク質にSNOシグナルを伝達していくことが明らかにされた.これらの成果は,これまでNOが拡散反応により隣接細胞へ伝搬していくとの定説に新たな機序を提供することとなる.B:細胞内におけるNO消去系の探索前年度に見出したNADH依存性NO消去系の生化学的検討を行った.各種薬物に対する感受性試験・オルガネラ分布・酸素要求性について検討した結果,おもにミトコンドリアを中心としたスーパーオキサイド産生系に密接に関連した消去系であることが明らかとなった.細胞におけるNO産生量に相関した活性をもつことから,これらの消去活性は細胞内における過剰なNO産生に伴うストレス(RNSストレス)に対する防御系として存在しているものと考えられる.これらの酵素活性が細胞内のニトロシル化タンパク形成へ与える影響について,検討を継続している.NOによる細胞間シグナル伝達は,cGMPを介するものとニトロソ化(SNO化)によるものの二つに大別される.活性酸素シグナルの代表的なものの一つであるSNO化によるシグナル伝達が,どのような機序で制御されているのかについて明らかではない.本研究課題では,このSNO化による細胞間(細胞の外から中へ)のシグナル伝達制御系を明らかにすることを目的として研究を実施している.昨年度までの研究により,細胞内のSNO化シグナルは,NO分子よりもSNO化された分子により効率的に形成されることを明らかにしてきた.本年度は,SNO化分子は細胞膜表面のトランスポーター(主にアミノ酸トランスポーター:LAT)を経由して細胞内へ取り込まれ,ニトロソ化システイン(CysNO)が中間体として形成されることが必要であることも明らかにした.