hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理活性を有する多置換テルペノイドクロマンの不斉全合成

多置換テルペノイドクロマンの位置選択的・エナンチオ選択的合成法を確立し、生理活性を有する天然および非天然有機化合物の合成へ応用することを目的として検討を進めてきた。1.鎖状モノテルペンアルコールを出発原料として、フェノール類との[2,3]シグマトロピー転位反応によるオルトアルキル化反応により、クロマン前駆体の2-置換フェノールを収率よく合成する方法を確立した。得られた化合物を脱硫、脱保護、保護を経てエポキシドに誘導し、さらに酸触媒を作用させて3-ヒドロキシクロマンを位置選択的およびジアステレオ選択的に得ることに成功した。2.位置選択的に6位を保護した4,6-ジヒドロキシフタリドの合成について検討し、新しい有効な方法を確立した。しかしこの化合物はシグマトロピー転位によるアルキル化反応に適さないことがわかった。3.そこで合成計画を変更し、フタリドの前駆体を用いて先ずアルキル化を行い、次にクロマン部を構築し、最後にフタリド部を構築することとした。そしてこの方針に適合する出発フェノール誘導体は3位を保護した3,5-ジヒドロキシ安息香酸エステルまたはアミドであることを見い出した。4.3,5-ジヒドロキシ安息香酸エチルと3,3-ジメチルアクロレインアセタールとから、ベンゼン環上に2種類の官能基を有する3-ヒドロキシクロマンを別途合成し、環ホルミル化を行ったところ、目的とするホルミル体が位置選択的に生成した。これを還元、酸処理することにより最終目的物の多置換クロマン骨格を構築することに成功した。5.N,N-ジエチル-3-ヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸アミドと2,3-ジヒドロキシイソペンチルスルフィド誘導体とから上に述べた方法を用いて3-ヒドロキシクロマン骨格を有する安息香酸アミドを合成し、環ホルミル化を経由して5員環ラクトン骨格を構築することに成功した。すでに3-ヒドロキシクロマンはジアステレオ選択的に構築できることが確立しているので、これにより生理活性多置換テルペノイドクロマンをジアステレオ選択的に構築する合成経路を確立することができた。[2,3]シグマトロピー転位反応によるフェノールのオルト位選択的なアルキル化を基軸として、多置換3-ヒドロキシクロマンのエナンチオ選択的合成法を確立し、この方法を応用して種々の生理活性天然有機化合物の立体選択的合成法を確立する目的で研究を実施し、本年度は次のような結果を得た。1.ゲラニオールおよびネロールを出発原料としてエポキシ化、Payne転位等を経てスルフィドジアセタートをジアステレオ選択的に合成することができた。次にこれとp-クレゾールとの[2,3]シグマトロピー転位反応によるオルトアルキル化反応は収率よく進行し、目的とする二置換フェノールを合成することができた。2.得られた化合物を、脱硫、脱保護、保護、エポキシ化を経てエポキシドに誘導し、さらに、エポキシドの環化反応による3-ヒドロキシクロマンの合成について検討した。この閉環反応では二置換オキシラン炭素上で立体反転で求核置換が起こり、6員環生成物のみが位置選択的およびジアステレオ選択的に得られた。3.4,6-ジヒドロキシフタリド誘導体の合成について検討し、3,4-ジヒドロキシ安息香酸から合成する方法を確立した。次に、これに対する[2,3]シグマトロピー反応アルキル化について検討したところ、一方のヒドロキシル基をメチルエーテルまたはアセチル体として保護した場合は、反応が極めて低収率でしか進行しないことがわかり、他の適当な保護基を選択する必要が生じた。

すでに3-ヒドロキシクロマンはジアステレオ選択的に構築できることが確立しているので、これにより生理活性多置換テルペノイドクロマンをジアステレオ選択的に構築する合成経路を確立することができた。フェノキシスルホニウムイリドのシグマトロピー転位によるフェノールのオルト位選択的なアルキル化反応を基軸として、多置換ヒドロキシクロマンのエナンチオ選択的合成法を確立し、生理活性天然有機化合物の合成へ応用することを目的として検討した。1.ファルネソールを原料として、エポキシ化、転位等を経てスルフィドジオールをジアステレオ選択的に合成する方法について検討し、その方法を確立した。次いでジオール部の保護について検討し、アセチル基、モノクロロアセチル基、ジクロロアセチル基について実際に用いて比較検討し、モノクロロアセチル基が最も適当な保護基であると結論した。2.位置選択的に6位を保護した4,6-ジヒドロキシフタリドの合成について検討し、3,5-ジヒドロキシ安息香酸を原料として効率良く合成する方法を確立した。次に、これに対するシグマトロピー転位によるアルキル化反応について、モデル化した単純なスルフィドおよび上で合成したテルペノイドスルフィドを用いて検討した結果、反応は低収率でしか進行しないことがわかった。これは、6位の保護基がエーテル型の場合であって、エステル型では目的物は全く得られなかった。3.そこで合成計画を根本的に変更し、フタリドの前駆体を用いて先ずアルキル化反応を行い、次にクロマン部を構築し、最後にフタリド部を構築することとした。そしてこの方針でのシグマトロピー転位反応に適合するフェノール誘導体について検討し、3位をエーテル保護した3,5-ジヒドロキシ安息香酸エステルまたはアミドが最も適当であることを見い出した。4.さらにこのエステルまたはアミドとモデル化したテルペノイドスルフィドを用いてシグマトロピー転位反応を行い、目的とするアルキル化が進行することを確認した。1.3位をエーテル保護した3,5-ジヒドロキシ安息香酸エステルに対し、5炭素の保護したジオールスルフィドを用いて[2,3]シグマトロピー転位反応を低温で行うと、目的とする位置に転位した生成物が主成分、目的としない異性体が副生成物として生成し、両者はカラムクロマトグラフィーで分離できることを確認した。2.3,5-ジヒドロキシ安息香酸エチルと3,3-ジメチルアクロレインジエチルアセタールとから、ベンゼン環上に2種類の官能基を有する3-ヒドロキシクロマンを別途合成し、t-ブチルリチウムを用いてホルミル化を行ったところ、目的とする位置のみがホルミル化された化合物が位置選択的に生成することを確認した。これを還元、酸処理することにより目的とする多置換クロマン骨格を構築することに成功した。3.o-プレニルフェノールをシリル基で保護し、エポキシ化の後に希酸で処理すると高収率で3-ヒドロキシクロマンが合成されることを発見した。そこで現在、1で述べた[2,3]シグマトロピー転位反応の目的生成物から環化反応により3-ヒドロキシクロマン構造を構築することについて検討している。
ＮＦ－κＢのパートナータンパク質ＩκＢζによる転写活性化複合体の形成機構の解明

NF-κBは、自然免疫応答に関わる遺伝子の発現誘導に中心的な役割を果たす転写因子である。NF-κBのパートナータンパク質であるIκBζは、NF-κBのコアクチベーターとして働き、抗菌タンパク質をコードするLcn2遺伝子など、NF-κBの標的遺伝子の中でも特定の遺伝子の転写を特異的に活性化する。IκBζは、NF-κBとの結合を介して標的遺伝子の転写を活性化すると考えられているが、どのようにIκBζが標的遺伝子を選んでいるのか、その分子機構は未解明である。これまでに私は、IκBζは、NF-κBとの結合に加えて、NF-κBが結合するDNA配列の下流にあるDNAエレメント(CCCCTC配列)を認識することにより標的遺伝子を選択することを示唆する結果を得てきた。今年度は、細胞レベルでのIκBζによるCCCCTC配列の認識機構の理解を更に深めるために、この結合が細胞内で調節を受ける可能性について検討を行った。まず、IκBζのCCCCTC配列との結合に必要であると考えられる部位にはリン酸化を受けうるセリン残基が存在することに注目して、IκBζのリン酸化による調節の検討を行った。その結果、IκBζとCCCCTC配列との結合は、IκBζに対するリン酸化によって調節を受けないことが示唆された。さらに、DNAメチル化やヒストン修飾によるクロマチン構造変化などDNAに起こる変化によって、IκBζとDNAエレメントとの相互作用が調節を受ける可能性についても検討を行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。NF-κBのパートナータンパク質であるIκBζは、NF-κBのコアクチベーターとして働き、抗菌タンパク質lipocalin-2をコードするLcn2遺伝子など、NF-κBの標的遺伝子の中でもLPS刺激時に遅れて誘導される遺伝子の転写を活性化する。IκBζは、NF-κBとの結合を介して標的遺伝子のプロモーター上にリクルートされて転写を活性化すると考えられているが、どのようにしてIκBζがNF-κBの標的遺伝子の中でも特定の遺伝子を選んでいるのか、その分子メカニズムは未解明である。これまでに我々は、IκBζがLcn2の転写を活性化する際には、NF-κBと結合することに加えて、NF-κBが結合するDNA配列の下流のエレメント(CCCCTC配列)を認識することを明らかにしていた。本研究の目的は、この知見をもとに、IκBζが標的遺伝子を選択する分子メカニズムを明らかにすることである。今年度は、Lcn2以外のIκBζ依存性遺伝子について、IκBζが認識するエレメントを同定することにより、我々がLcn2遺伝子で見出した分子機構が、Lcn2以外の遺伝子にも共通する一般的な分子機構なのかどうかを明らかにすることを試みた。まず、IκBζ依存性遺伝子として考えられている抗菌タンパク質pentraxin 3をコードするPtx3遺伝子について、IκBζが結合するために必要なプロモーター領域を明らかにした。さらに、この領域がIκBζによる転写活性化にも必要であることを、レポーターアッセイを行うことにより明らかにした。今回見出した領域内には、NF-κBが結合する配列に加えて、その上流にCCCCTCという配列が存在しており、我々がLcn2で見出した分子機構はLcn2以外の遺伝子にも共通する分子機構であることが期待された。今年度は、Lcn2以外のIκBζの標的遺伝子であるPtx3遺伝子について、IκBζが結合して転写を活性化するために必要な領域を明らかにした。さらに、その領域内に、我々がLcn2で見出していたIκBζ依存性を決める配列と共通の配列を見出すことが出来た。従って、順調に研究が進展していると考えている。NF-κBのパートナータンパク質であるIκBζは、NF-κBのコアクチベーターとして働き、抗菌タンパク質lipocalin-2をコードするLcn2遺伝子など、NF-κBの標的遺伝子の中でも特定の遺伝子の転写を活性化する。IκBζは、NF-κBとの結合を介して標的遺伝子の転写を活性化すると考えられているが、どのようにIκBζが特定の遺伝子を選んでいるのか、その分子機構は未解明である。これまでに私は、IκBζは、NF-κBと結合することに加えて、NF-κBが結合するDNA配列の下流にあるCCCCTC配列を認識することを明らかにしていた。本研究の目的は、この知見をもとに、IκBζが標的遺伝子を選択する分子機構を明らかにすることである。昨年度までに得ていたIκBζがCCCCTC配列を認識するという知見は、主に試験管内での実験を行うことで得られたものであった。そこで今年度は、IκBζによるCCCCTC配列の認識機構を細胞レベルで明らかにすることを試みた。まず、IκBζと細胞内在性Lcn2遺伝子のCCCCTC配列を含む領域との結合をクロマチン免疫沈降法により検討し、IκBζが細胞内在性のCCCCTC配列を認識しうることを確かめた。さらに、このIκBζのCCCCTC

配列との結合が、細胞内においてIκBζに対する翻訳後修飾(特にアセチル化修飾に注目した)によって調節を受けるかどうかについて検討を行った。その結果、IκBζによるLcn2遺伝子の転写活性化はアセチル化酵素の阻害剤によって影響を受けず、また、アセチル化修飾を認識する抗体によってIκBζは認識されなかった。従って、IκBζは細胞内でCCCCTC配列を認識するが、その結合はIκBζに対するアセチル化修飾によって調節を受けないことが明らかになった。今年度は、IκBζによるCCCCTC配列の認識機構を細胞レベルで明らかにすることを試み、IκBζがクロマチン構造をとる細胞内在性のCCCCTC配列を認識しうることを明らかにした。さらに、この結合は細胞内でIκBζに対する翻訳後修飾によって制御されないことも明らかにすることが出来た。従って、順調に研究が進展していると考えている。NF-κBは、自然免疫応答に関わる遺伝子の発現誘導に中心的な役割を果たす転写因子である。NF-κBのパートナータンパク質であるIκBζは、NF-κBのコアクチベーターとして働き、抗菌タンパク質をコードするLcn2遺伝子など、NF-κBの標的遺伝子の中でも特定の遺伝子の転写を特異的に活性化する。IκBζは、NF-κBとの結合を介して標的遺伝子の転写を活性化すると考えられているが、どのようにIκBζが標的遺伝子を選んでいるのか、その分子機構は未解明である。これまでに私は、IκBζは、NF-κBとの結合に加えて、NF-κBが結合するDNA配列の下流にあるDNAエレメント(CCCCTC配列)を認識することにより標的遺伝子を選択することを示唆する結果を得てきた。今年度は、細胞レベルでのIκBζによるCCCCTC配列の認識機構の理解を更に深めるために、この結合が細胞内で調節を受ける可能性について検討を行った。まず、IκBζのCCCCTC配列との結合に必要であると考えられる部位にはリン酸化を受けうるセリン残基が存在することに注目して、IκBζのリン酸化による調節の検討を行った。その結果、IκBζとCCCCTC配列との結合は、IκBζに対するリン酸化によって調節を受けないことが示唆された。さらに、DNAメチル化やヒストン修飾によるクロマチン構造変化などDNAに起こる変化によって、IκBζとDNAエレメントとの相互作用が調節を受ける可能性についても検討を行った。これまでに我々は、IκBζは、NF-κBに結合することに加えて、NF-κB結合配列の下流にあるDNA配列(CCCCTC配列)を認識することによって標的遺伝子を選択していることを示唆する実験結果を得てきた。今後は、IκBζによるCCCCTC配列の認識様式を明らかにすることを試みると共に、この結合が細胞内において翻訳後修飾などで制御を受ける可能性について検討を進めていきたいと考えている。これまでに私は、試験管内での実験および細胞レベルでの実験を通じて、IκBζは、NF-κBに結合することに加えて、NF-κB結合配列の下流にあるDNA配列(CCCCTC配列)を認識することによって標的遺伝子を選択していることを示唆する結果を得てきた。今後は、細胞レベルでの理解を更に深めるべく、IκBζとCCCCTC配列の結合が、細胞内でヒストン修飾やDNAメチル化等によって制御を受けるのかどうかについて検討を進めていく計画である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
花食に対する植物の防衛戦略と花食者の対抗進化

被子植物の約3割が、両性花ではなく、性の分化した花をつける。個体による性分化がある植物では、様々な形質に性的二型があるだけでなく、植食者による食害の程度にも性差があることが報告されている.片方の性に偏った食害が生じるのは、植物形質の雌雄差が植食者の適応度に影響し,植物の性に対する植食者の選好性を変化させるためであると考えられてきたが、これについての実証研究は行われてこなかった。また片方の性に偏った食害は、植物の性表現そのものの進化や、性比の偏りを産み出す淘汰圧としても重要であると考えられる.本研究では、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料に,植物側の防御の雌雄差とそれに対する植食者の適応を明らかにするための研究を行った。まず、ヒサカキを利用する植食者の野外観察を行い、ヒサカキの雌花の被食害は雄花より少ないこと、ヒサカキの雄花、両性花のみを食害し、雌花を食害しない花蕾専食性ソトシロオビナミシャクがいることを明らかにした。次に、化学分析により、ヒサカキの雌花は雄花より多くの化学防御物質を含むことを明らかにし、飼育実験によって、ソトシロオビナミシャクの幼虫は雌の花蕾を食べると死亡することを明らかにした。また、ヒサカキの花蕾の雌雄差はソトシロオビナミシャクだけでなく、葉と花蕾を利用するナカウスエダシャクの適応度と、花蕾の摂食程度にも影響を与えることを飼育実験で明らかにし、花蕾専食者でも、花蕾に虫瘤を形成するタマバエの1種では雌雄の花蕾を同等に利用していることを野外観察で明らかにした。本研究により、(1)ヒサカキの花蕾では雄に偏った食害が生じていること、(2)ヒサカキの花の防御に雌雄差があり、雌花がより防御されていること、(3)ヒサカキの花蕾の雌雄差は植食者の適応度に影響を与えることが明らかになった。雌雄が分化している植物と植食者間で生じる相互作用の一つに、雌よりも雄の植物の方が食害されやすいという現象がある。この現象は花の形質や性表現の進化と関係していると考えられるが、適応的な重要性についてはほとんど明らかになっていない。本研究では、植物の性と植食者の産卵選択性、植物の性と植食者の適応度、植物の性と化学防御の関係を明らかにすることを目的とした。これらの関係を明らかにするため、雑居性異株植物であるヒサカキ(Eurya japonica)とその花蕾食のソトシロオビナミシャク(Chloroclystis excisa)の相互作用系を用いて観察、実験を行った。野外において、ソトシロオビナミシャクは雄または両性のヒサカキの蕾を食害しており、雌のヒサカキの蕾での食害は観察されなかった。また、実験室下において、雌成虫は産卵基質として雌より雄のヒサカキをより多く選択し、雌のヒサカキの蕾を摂食したほぼ全ての幼虫は死亡した。ヒサカキの雌花の萼を除去し幼虫に与えると幼虫は死亡することなく成長する。このことから、幼虫に死亡要因は蕾を覆っている萼にあると分かった。雌の萼は雄の萼よりも、多くの総フェノール、縮合タンニンを含んでいることも明らかとなった。これらの結果は、植食者に対する化学防御の性差が花の性差と関係して進化したこと、防御の低い性に対する植食者の選択性は防御形質の性差に応じて進化してきたことを示唆している。雌雄異株植物では様々な形質で雌雄差があり、食植者から被る食害の程度が雌雄で異なる現象も観察されている。にもかかわらず、食害の程度が雌雄で異なる要因はほとんど分かっていない。本研究では、雌雄異株植物であるヒサカキ(Eurya japonica)花蕾の防御における性的二型が、花蕾食性鱗翅目であるソトシロオビナミシャク(Eurya japonica)(以下ナミシャク)に多大な影響を与えていることを示した。ナミシャク幼虫は花蕾を摂食する際、萼を摂食しなければならないが、雌の花萼には雄の花萼より多くの化学防御物質が含まれ、雌の花萼を摂取した幼虫は全て死亡した。つまり、野外で雌の蕾を食べた幼虫は死亡することになる。また、ナミシャクの成虫は雌花より雄花に多く産卵することも明らかになった。この結果は植物の防御形質の性的二型が植食性昆虫の幼虫期の適応度に影響を及ぼすことをはじめて明らかにしたものである。ナミシャクはヒサカキが生息できない寒冷な地域にも生息していることが分かっている。そこで、今回明らかになった適応的な産卵行動がヒサカキに対する適応なのかを検証するため、ヒサカキと共存する地域のナミシャクと、非共存地域のナミシャクの産卵選好性を比較した。その結果、共存地域のナミシャクの方がより雄花に産卵する傾向が強いことが明らかとなった。さらに、各地から採集したナミシャクのミトコンドリアDNAのCOI領域のシーケンスを行った。その結果、個体群内の遺伝変異が大きく、個体群間の変異が小さいことが明らかとなった。また、ヒサカキの共存域と非共存域の間で遺伝構造に有意な差はなかった。

この結果は植物の防御形質の性的二型が植食性昆虫の幼虫の生存を大きく左右し、その結果として成虫の産卵行動を変化させる選択圧として働く可能性を示唆している被子植物の約3割が、両性花ではなく、性の分化した花をつける。個体による性分化がある植物では、様々な形質に性的二型があるだけでなく、植食者による食害の程度にも性差があることが報告されている.片方の性に偏った食害が生じるのは、植物形質の雌雄差が植食者の適応度に影響し,植物の性に対する植食者の選好性を変化させるためであると考えられてきたが、これについての実証研究は行われてこなかった。また片方の性に偏った食害は、植物の性表現そのものの進化や、性比の偏りを産み出す淘汰圧としても重要であると考えられる.本研究では、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料に,植物側の防御の雌雄差とそれに対する植食者の適応を明らかにするための研究を行った。まず、ヒサカキを利用する植食者の野外観察を行い、ヒサカキの雌花の被食害は雄花より少ないこと、ヒサカキの雄花、両性花のみを食害し、雌花を食害しない花蕾専食性ソトシロオビナミシャクがいることを明らかにした。次に、化学分析により、ヒサカキの雌花は雄花より多くの化学防御物質を含むことを明らかにし、飼育実験によって、ソトシロオビナミシャクの幼虫は雌の花蕾を食べると死亡することを明らかにした。また、ヒサカキの花蕾の雌雄差はソトシロオビナミシャクだけでなく、葉と花蕾を利用するナカウスエダシャクの適応度と、花蕾の摂食程度にも影響を与えることを飼育実験で明らかにし、花蕾専食者でも、花蕾に虫瘤を形成するタマバエの1種では雌雄の花蕾を同等に利用していることを野外観察で明らかにした。本研究により、(1)ヒサカキの花蕾では雄に偏った食害が生じていること、(2)ヒサカキの花の防御に雌雄差があり、雌花がより防御されていること、(3)ヒサカキの花蕾の雌雄差は植食者の適応度に影響を与えることが明らかになった。
ジェンダーの視点から見た障害者の自立と親の自立に関する社会学的研究

本研究の聞き取りの対象者は、主として、障害者サポート団体,NPOに中心的スタッフとして参加している親たちである。その親たちのライフヒストリーの聞き取りを、母親の立場、また、父親の立場から記録し、その記録データをジェンダーの視点から分析した。分析の内容は、次のような点である。1,障害のある子の親たちが社会に開かれていくきっかけと「我が子が障害をもつということの意味」との関係。子どもが成長する各段階における父親と母親の違いや親としての共通性について分析した。2,性別役割分担規範がどのような影響を与えているのかについて、父親、母親と子どもとのの関わりについて分析する。3,親たちの「障害者の自立」についての考えと「我が子の自立」に向けての親たちの取り組みがどのようなものかを見る。5,以上をもとに、障害者の自立のために、どのような親子関係が形成されることが望ましいのか、そのための社会的サポートはいかなるものが必要かについて明らかにしていく。インタビュー調査から次のことが明らかになった。(1)「我が子が障害をもつということの意味」とは、子どもが人間としての権利と尊厳を持って生きることを支えるという親が次世代育成感を持った「本当」の親子関係を形成することの自覚の契機であること。(2)性別役割分業規範が、両親の大きな影響を与えており、母親の心身共の負担が大きいことが明らかとなった。それは、母子密着といわれる状況を生み出し、その結果、障害のある人々の依存的状況を作り出すことが明らかになった。(3)このような現状で、人間としての尊厳を持つために「我が子を自立」させていく上には、「母親の自立」を促すことが必要であり、そのためには、障害のある人々が地域自立することに理解のある「他者の存在」が重要であることが分かった。(1)事例調査:知的障害を持つ自閉症児の母親に、これまでの障害児をめぐるライフヒストリーを自由に語ってもらう手法で面接調査を行った。親のこれまでの「語り」を検討すると、以下の点が注目される。子育てに関連して、(1)母親の子育ての苦労は、子どもと高度なコミュニケーション方法を手に入れた(発見した)ことにより大きく変化する。(2)学齢期の子育ては主に学校教師との関わりが中心となる。母親の苦労は、地域の普通学校側の十分な支援により軽減される。その時期のきょうだいの関わりも重要である。(3)それに対し、乳児期、幼児期、学齢期での父親の存在は非常に薄い。(4)しかし、成人期以降は、父親の存在が障害者にとって、母親に代わり愛着の対象となり、重要となる。母親からの分離の表れとも推察される。子どもの障害については、(1)知的障害に関する「常識(思いこみ)」が障害の理解を妨げ、周囲の自閉症への理解が進むまで(親自身も経験により学習するのだが)周囲の人々から、とりわけ専門家から親の障害に対する理解のなさと曲解されるなど、トラブルを抱える。(2)相互作用から見た障害は多様であり、制度が認定した障害の程度と、現実生活の障害の重さとは一致しない。(2)文献研究:日本の障害者福祉制度における障害の概念や定義、およびサービスのありようについて、アメリカ障害者福祉制度の発展、イギリス障害者福祉制度の発展との比較において、日本の障害者政策の問題と課題に関する文献研究を行った。本年度は、事例研究を中心に行った。これまで、知的障害を持つ自閉症児の母親、血友病者の母親、そして精神障害者の母親に、現在までの障害児をめぐるライフヒストリーを自由に語ってもらう手法で面接調査を行った。親たちのこれまでの「語り」を検討すると、以下の4つの知見が注目される。

まず、子の自立と障害の受容について。親自身が子どもの自立を促す対応をするには、子どもがもつ「障害」の事実を肯定的に受け止める必要があるが、1)障害が目立ち方によって、また2)障害の事実をいつ知るかによって、親自身の障害の受け止め方に違いがある。他者との比較でより明確な違いが見られる場合、親自身に覚悟が生まれ、社会生活をしていくための前向きな対応を生み出す傾向がある。病気など、障害が目につかない場合は、スティグマもあって周囲に打ち明けず秘密にすることが多く、その結果、親子密着度が高くなり、子どもの社会性が低くなる傾向があり、子の自立にとってマイナスとなる。精神障害の場合、早くても思春期など中途で診断を受けることが多く、本人だけでなく、親自身も「障害」を受け入れることができず、社会生活について前向きに考えることが難しい。3)子どもの社会性の高さは、親が子どもを自主性が備わるよう育てるか否かと関わりがある。また、4)子どもが自分自身の障害を受け入れる程度は、親が障害を受け入れる程度と関わりがあり、親が障害を受け入れていない場合、子どもも白分の障害を受け入れることができず、親への甘えが見られ、自立生活への動機付けが難しい。今年度は、主としてかつて同じ小学校の親の会の母親たちに、面接調査を行った。親の「語り」をまとめと、以下の点が注目される。1)「母親ケアの特徴」について。(1)母親は、子供の障害を改善するために、ありとあらゆる努力をする。「何でもしてやりたい」「悔いを残すことなく」「親としてここまでできるだけのことをした」という充実感を手にいれるまでできるだけのことをする。それ故「おまえの好きなようにしなさい」という夫がもっともよい夫と見なされる。(2)母親のケアは、子供の命をもっとも重視するケアである。そのため、他者にケアを渡すことが難しい。(3)それ故、他者ケアは親と信頼関係が築けないとうまくいかない。本人の意志通りに動くことがよいわけではなく、本人のための介助でなければならない。(4)「母親の大変さ」とは、子の世話のために自由が束縛されることであり、母親支援のレスパイトケアが必要である。2)「地域支援」について。(1)「親仲間」について。障害をもつこの親たちに会えたことが安心につながる重要な体験であった。また、互いが子供のことを知っているがゆえに、信頼して援助を頼むことができる。(2)「地域の学校の先生」について。地域で生活する上で、地域の小学校の教師たちの力は大きかった。何事にも相談に乗ってくれ力を貸してくれた。(3)地域の学校は、障害をもつ子にとっても親にとっても重要である。本人には友人ができる。何かあったときには力を貸してくれる。本年度は、課題研究の最終年度に当たり、前年度に引き続き、聞き取り調査を行うとともに、先行文献による研究、またこれまでのインタビュー調査をふまえ、研究目的に沿って分析をした結果をもとに研究のまとめを行う。本研究は、既に自立した障害者および思春期を過ぎた障害をもつ子の親たちから聞き取りを行い、その語りをジェンダーの視点から分析し、以下の点を考察することを目的とした。
アルコール代謝関連酵素活性別にみた飲酒と睡眠の質及び生理的変化に関する研究

飲酒が睡眠時間や入眠時間、睡眠の質(深睡眠)に影響を与えている可能性は非常に高い。日本人を含む東洋人の多くが体質的にアルコール代謝能力に著しい個体差があり、特にアルコール脱水素酵素1B(ADH1B、旧名ADH2)とアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)は遺伝子型によって活性が大きく異なるため、飲酒の睡眠への影響も異なる可能性がある。本研究では(1)アルコール代謝関連酵素活性別にみた飲酒と睡眠の質(パルセンスデータ及び質問票)との関係を明らかにし、(2)アルコール代謝関連酵素活性の違いと飲酒後の睡眠時及び非睡眠時の生理的機能(心拍、血圧等)の変化を明らかにすることを目的としている。調査対象者は、企業で働く2070歳代の男性とし、調査対象者を募集している。企業に出向き調査説明会を行っている。説明会に参加してもらった者で調査の同意を得た者を調査対象者とし登録ている。調査対象者は、健康診断とあわせて食生活習慣調査(飲酒、睡眠、喫煙、運動、食習慣、ストレスチェック等)、アルコール代謝関連酵素活性遺伝子多型(ADH1B及びALDH2遺伝子)、アルコールパッチテスト、血流測定を行っている。また本研究では、脈拍数・活動量(3軸加速度)を組み込んだライフスタイルを計量化する健康腕時計(EPSON:パルセンスSP500)を用いて、脈拍と加速度から、活動時、非活動時、睡眠の状態を計測している。調査期間中は、2週間、パルセンスを装着してもらい、朝晩の血圧計測、行動日誌をつけてもらっている。現在、約60名の調査を行い、データ整理を行っている。2017年10月横浜市立大学の倫理審査が通り、2018年1月から調査対象者を募集し、調査説明会を行っている。現在までに調査希望参加者約70名の男性に調査協力の説明会を行った。調査協力の得られた約60名の内、健康診断を直近で受けた者に調査を行った。対象者は4070歳で、2週間、健康腕時計(EPSON:パルセンス)を装着してもらい、心拍、活動量、睡眠、エネルギー消費のデータを得た。また2週間の朝晩の血圧測定及び行動日誌をつけてもらった。調査を行った者から健康診断のデータを頂いた(身体計測、血圧、生化学データ)。質問票による既往歴、生活習慣、飲酒量、喫煙歴、食事摂取状況や睡眠の質、ストレス度、アルコールフラッシング質問票、血流分析等を調査した。またADH1B及びALDH2の遺伝子型の分析は口腔内を綿棒で擦りDNAの採取を行った。同時にアルコールパッチテストも行っている。一部対象者には、アルコールパッチテストを行いながら血流分析(30分間)を行っている。測定機器が少なく、測定の拘束時間が長いため、血流測定は調査実施者が少ない。調査対象者や企業の状況から、調査がすぐに実施できないこともあり、調査進行がやや遅れている。2018年4月2019年9月まで、研究対象者を募り調査研究を実施する。男性対象者、約10名追加募集する。調査では2週間の健康腕時計をつけてもらい、睡眠やストレス、消費エネルギー、活動量、心拍を測定。また朝晩の血圧測定を行う。質問票による既往歴、生活習慣、飲酒量、喫煙歴、食事摂取状況や睡眠の質、ストレス度、アルコールフラッシング質問票等用いた調査を行う。ALDH2及びADH1Bの遺伝子解析を行う。アルコールパッチテストと同時に簡易血流計による血流の測定を一部対象者に行う予定である。データを整理分析し学会等に発表する予定である。調査対象者は、健康診断とあわせて食生活習慣調査(飲酒、睡眠、喫煙、運動、食習慣、ストレスチェック等)、アルコール代謝関連酵素活性遺伝子多型(ADH1B及びALDH2遺伝子)、アルコールパッチテストを行っている。現在、8名の調査を行っている。2017年10月横浜市立大学の倫理審査が通り、2017年12月から3企業に研究の調査協力を依頼した。2018年1月からは3企業との研究打合せをしている。1つの企業では2018年1月から調査対象者を募集し、3月に調査希望参加者22名の男性社員に調査協力の説明会を行った。

調査協力の得られた22名の内、すでに健康診断を直近で受けた者8名に調査を行った。対象者は4070歳で、2週間、健康腕時計(EPSON:パルセンス)を装着してもらい、心拍、活動量、睡眠、エネルギー消費のデータを得た。また2週間の朝晩の血圧測定及び行動日誌をつけてもらった。調査を行った者から健康診断のデータを頂いた(身体計測、血圧、生化学データ)。質問票による既往歴、生活習慣、飲酒量、喫煙歴、食事摂取状況や睡眠の質、ストレス度、アルコールフラッシング質問票等を調査している。またADH1B及びALDH2の遺伝子型の分析は口腔内を綿棒で擦りDNAの採取を行った。同時にアルコールパッチテストも行っている。2018年2月に調査参加者に対する調査説明会を行った時に、直近に健康診断を受けた者が少なく、多くの者が次年度の夏以降実施となってしまった。そのため調査実施者が少なく、調査実施がやや遅れている状態になっている。飲酒が睡眠時間や入眠時間、睡眠の質(深睡眠)に影響を与えている可能性は非常に高い。日本人を含む東洋人の多くが体質的にアルコール代謝能力に著しい個体差があり、特にアルコール脱水素酵素1B(ADH1B、旧名ADH2)とアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)は遺伝子型によって活性が大きく異なるため、飲酒の睡眠への影響も異なる可能性がある。本研究では(1)アルコール代謝関連酵素活性別にみた飲酒と睡眠の質(パルセンスデータ及び質問票)との関係を明らかにし、(2)アルコール代謝関連酵素活性の違いと飲酒後の睡眠時及び非睡眠時の生理的機能(心拍、血圧等)の変化を明らかにすることを目的としている。調査対象者は、企業で働く2070歳代の男性とし、調査対象者を募集している。企業に出向き調査説明会を行っている。説明会に参加してもらった者で調査の同意を得た者を調査対象者とし登録ている。調査対象者は、健康診断とあわせて食生活習慣調査(飲酒、睡眠、喫煙、運動、食習慣、ストレスチェック等)、アルコール代謝関連酵素活性遺伝子多型(ADH1B及びALDH2遺伝子)、アルコールパッチテスト、血流測定を行っている。また本研究では、脈拍数・活動量(3軸加速度)を組み込んだライフスタイルを計量化する健康腕時計(EPSON:パルセンスSP500)を用いて、脈拍と加速度から、活動時、非活動時、睡眠の状態を計測している。調査期間中は、2週間、パルセンスを装着してもらい、朝晩の血圧計測、行動日誌をつけてもらっている。現在、約60名の調査を行い、データ整理を行っている。2017年10月横浜市立大学の倫理審査が通り、2018年1月から調査対象者を募集し、調査説明会を行っている。現在までに調査希望参加者約70名の男性に調査協力の説明会を行った。調査協力の得られた約60名の内、健康診断を直近で受けた者に調査を行った。質問票による既往歴、生活習慣、飲酒量、喫煙歴、食事摂取状況や睡眠の質、ストレス度、アルコールフラッシング質問票、血流分析等を調査した。またADH1B及びALDH
Sn-Pb-P-F-O系超低融点ガラスの構造

これまでTickらによって報告されているガラス作製法によって得られるSn-Pb-P-F-O系ガラスは、(1)リン酸原料中に含まれているアモニア成分がガラス中に多量に残存する、(2)出発原料組成でのF/0比と、得られるガラスのF/0比が大きく異なり制御性に乏しい、(3)色素などを添加する際に必要となる再溶融を行なうと、F成分が時間とともに減少しガラスの不均質・失透が生じる、という主に3つの問題点を含むものとなり、ガラス作製プロセスの改善が必要である。本研究では、酸化物ガラスを予め作製し、その後にフッ化物原料を添加する2段階溶融法を用い、上記の問題点について検討した。1段階目の酸化物ガラスの作製として、SnO-P_20_5系、Pbo-P_2O_5系の2通りについてまず検討し、溶存アンモニア成分を充分に取り除くにはN_2ガスバブリングを行いながら700°C以上で溶融する必要があることが分かった。さらにこの条件では、SnO-P_2O_5系でSr^<2+>→Sn^<4+>への酸化が促進され、フッ化物原料添加後、ガラス中にSn^<IV>P_20_7結晶が析出してしまうことが明らかとなり、Snの価数制御も考慮に入れる必要があることがわかった。一方、PbO-P_2O_5系で作製した場合、溶存アンモニアの低減に加え、F成分の損失を40%以下(Tickらの方法では70%以上損失してしまう)に低くすることが可能となった。この系を用いて得られたSn-Pb-P-O-Fガラスは、光透過性がよく、400°Cでの再溶融試験ではF/0比の経時変化が極めて小さい良質なガラスとなっていることがわかった。その結果、上記の3つの問題点をほぼクリアした溶融プロセスを見出だした。
術前運動療法による術後心機能・認知機能低下の予防効果

Sprague-Dawley雄性ラット6週齢に心筋梗塞を作成し、1週間後にEFが30%以下になっていることを確認した。9週齢からSedentary(非運動)群とExercise群にわけた。Sedentary群は通常の飼育ケージで、Exercise群は、自由運動のできる回転カゴ付きケージで6週間飼育した。その後、各群をさらにSurgery群とNon-Surgery群にわけた。Surgery群は、16週齢で、全身麻酔下に開腹手術を施行した。2cmの腹部正中切開で小腸を10cm取り出し、指で3分間小腸をもみほぐし、盲腸部に21Gで径1mmの穿孔を1カ所おこす操作を加え、15分ごとに4回腸管を腹腔から出し入れし1時間後で閉腹した。手術24時間後に、心エコーおよび心カテーテルによる心機能評価を行った。炎症の抑制は、運動療法の多面的効果pleiotropic effectsのなかのひとつでしかない。運動療法による炎症の制御により心機能が改善するという概論自体は独創的であるが、functional、hemodynamicなマクロな心機能の指標を示すことは困難であった。既報においても、運動療法は、中枢である左室機能への劇的な効果に関しては明確でなく、主に多く報告されているのは骨格筋筋力や末梢血管抵抗に与える末梢効果についてである。以上より現時点において、運動療法による術後の心機能改善効果を明らかにすることはできていない。このためプロトコールの変更も含めて検討が必要となったため、少し計画が遅れている。このためプロトコール変更が必要と思われる。さらなる運動期間の変更、手術侵襲の程度の変更、炎症性サイトカインの採血の方法やタイミングの検討が必要である。また手術や運動による介入で有意な差を得るには、多数の個体が必要である。高齢化社会に伴い手術患者の高齢化も進んでおり、術後の身体機能および高次脳機能障害に伴う生活レベルの低下は医学的のみならず、社会的・医療経済的にも問題となっている。これに対する治療法や予防法は確立していないが、手術前の運動療法(prehabitation)が手術後の身体活動の早期回復だけでなく、高次脳機能低下の予防にも効果がある可能性が臨床的には示唆されている。そこで、今回高齢者モデルを用いた基礎的な研究により、術後の心機能を含めた身体機能の低下および高次脳機能障害の予防について、prehabitationの効果とメカニズムを明らかにすることを目的とした。現在モデル動物の飼育環境を整え、運動療法を行うためのケージ(別の研究費で購入)、手術法の確立などの準備を行った。高齢者モデルラットに関しては飼育環境は整った。別の実験で用いているラットで予備実験として心機能評価を行っているが、現有の心エコー装置では評価がうまく行えていないため、別の装置あるいは別の方法での評価方法を模索する。手術モデルでは予備実験では安定して行えているため準備としては順調である。認知機能評価に関しては医学部内に装置があるためそれを利用する準備ができている。次年度は他の研究者および協力者の助言および強力をお願いしており、本格的に実験を行う予定である。心機能評価がうまく行えていないため、別の装置あるいは別の評価法を検討する。ダールラットを用いた左室駆出率が保たれた心不全モデルラットの作成を行ない、心エコー法あるいはコンダクタンスカテーテルを用いた圧モニタリングによる心機能評価も含めて確認出来、手技としても安定したモデル作成が出来たものと考えられる。運動負荷を行なうラットにおいて心機能が改善するかどうかについてある程度の結果が得られており、術後の心不全の進展が予防できるとの仮説をサポートする結果が出てきている。しかし、既に報告されている手術侵襲モデルにおいては、術後に大きな変化を来しておらず、侵襲モデルとしてはこれまで報告されているような術後に変化を来すほどの結果が得られておらず、別の方法を探っている。現在検討している内容としては、敗血症モデルのようなエンドトキシンを腹腔内に投与する方法や腸管穿孔モデルの様な比較的大きな侵襲を与えるようなものを確認し、認知機能や心機能の悪化に&#32363;がるようなモデルにならないかどうかを、現在確認中である。モデルラットの作成には成功しているが、手術侵襲モデルにおいては報告されているような変化は認められず、軽微な計画の変更が必要と考える。

運動療法による炎症の制御により心機能が改善するという概論自体は独創的であるが、functional、hemodynamicなマクロな心機能の指標を示すことは困難であった。既報においても、運動療法は、中枢である左室機能への劇的な効果に関しては明確でなく、主に多く報告されているのは骨格筋筋力や末梢血管抵抗に与える末梢効果についてである。以上より現時点において、運動療法による術後の心機能改善効果を明らかにすることはできていない。このためプロトコールの変更も含めて検討が必要となったため、少し計画が遅れている。本格的に実験をスタートし、年度内には結果が出るように進めていく。このための協力者などの準備は行えている。手術侵襲モデルをエンドトキシン投与に変更することで、研究計画が進展するものと思われる。このためプロトコール変更が必要と思われる。さらなる運動期間の変更、手術侵襲の程度の変更、炎症性サイトカインの採血の方法やタイミングの検討が必要である。また手術や運動による介入で有意な差を得るには、多数の個体が必要である。当初予定していた実験に手間取り、モデル動物の作成まで至らなかったため、動物の購入費用が必要とならなかった。また結果報告するための学会発表までいたらなかったため旅費も必要とならなかったため、予定していた経費を次年度に繰り越すこととなった。物品費などを教室の研究予算で処理したため。実験結果から研究計画の再考を必要とする状況となり、一旦研究を中断している。これにより次年度まで研究を延長して実施する必要が生じているため。実験の準備はほぼ整ったため、実験動物の購入、薬品の購入などに充てる予定である。また成果発表も考えている。
転座型白血病発症機構の遺伝子解析と臨床診断への応用

t(3;21)(q26;q22)は、慢性骨髄性白血病の急性転化時ならびに骨髄異形成症候群の白血化時に出現する染色体転座で、血液幹細胞のacute leukemic transformationに関与すると考えられる.分子解析の結果、t(3;21)による染色体切断点の遺伝子の再構成によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質が産生されることが判明した.このキメラ蛋白質は、N末側にruntドメインを含むAML1の一部を、C末側にEvi-1の全長を有する.生物学的解析によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用する可能性が示された.AML1、Evi-1は両者とも転写制御因子であり、キメラ蛋白質形成による機能変化が分化抑制と増殖促進を引き起こすと考えられるため、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能を解析した.その結果、AML1/Evi-1は、(1)AML1と同様にPEBP2部位に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに抑制する、(2)AP-1活性を上昇させる、ことが明らかになった.さらに、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能ドメインの欠失変異体を構築して検討したところ、(1)の機能は、AML1のDNA結合領域であるruntドメインに依存し、(2)の機能はEvi-1と同様に第2zincフィンガー・ドメインに依存していることがわかった。以上の結果は、AML1/Evi-1が互いに独立した2つの機能を有する転写制御因子であることを示す.これらの機能が、それぞれ造血細胞の分化抑制と増殖促進に関与し、leukemic transformationに至るのではないかと推定された.t(3;21)(q26;q22)は、慢性骨髄性白血病の急性転化時ならびに骨髄異形成症候群の白血化時に出現する染色体転座で、血液幹細胞のacute leukemic transformationに関与すると考えられる.分子解析の結果、t(3;21)による染色体切断点の遺伝子の再構成によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質が産生されることが判明した.このキメラ蛋白質は、N末側にruntドメインを含むAML1の一部を、C末側にEvi-1の全長を有する.生物学的解析によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用する可能性が示された.AML1、Evi-1は両者とも転写制御因子であり、キメラ蛋白質形成による機能変化が分化抑制と増殖促進を引き起こすと考えられるため、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能を解析した.その結果、AML1/Evi-1は、(1)AML1と同様にPEBP2部位に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに抑制する、(2)AP-1活性を上昇させる、ことが明らかになった.さらに、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能ドメインの欠失変異体を構築して検討したところ、(1)の機能は、AML1のDNA結合領域であるruntドメインに依存し、(2)の機能はEvi-1と同様に第2zincフィンガー・ドメインに依存していることがわかった。以上の結果は、AML1/Evi-1が互いに独立した2つの機能を有する転写制御因子であることを示す.これらの機能が、それぞれ造血細胞の分化抑制と増殖促進に関与し、leukemic transformationに至るのではないかと推定された.慢性骨髄性白血病(CML)の急性転化時に出現する付加的染色体異常の中で、t(3;21)(q26;q22)は相互転座であることが特異的である。我々は、この染色体異常をモデルとして転座型白血病の発症機構の遺伝子解析を行い、臨床診断への応用を試みた。t(3;21)転座を分子生物学的に解析した結果、AML1/EVI-1キメラ遺伝子が形成され、これは融合mRNAへと転写されることが明らかになった。融合mRNAは8.2kbと7.0kbの主に2種類存在した。t(3;21)転座を有するヒト白血病細胞株SKH1より作成したcDNAライブラリーをスクリーニングし、全長と考えられる2つの約6kbのcDNAクローンを得た。これらのcDNAクローンは1つのopenreading frameを持ち、5'側に正常AML1シークエンス、3'側に第2エクソンからpoly(A)tailに至るEVI-1シークエンスを含んでいた。AML1およびEVI-1に対するポリクローナル抗体はSKH1細胞において同じ180kDのAML1/EVI-1融合蛋白質を認識した。この融合蛋白質はrunt homology domainを含むAML1のN端側とzinc finger typeの転写因子であるEVI-1の全長より構成されていた。このAML1/EVI-1 fusionの形成はRT-PCRで検討したt(3;21)転座を有する3症例で共通であった。さらに多くの症例を用いた解析が必要であるが、この結果はt(3;21)転座型白血病の遺伝子診断への臨床応用が可能であることを示している。AML1あるいはEVI-1の転写開始部位に位置する20-merのアンチセンスオリゴヌクレオチドはSKH1細胞における^3H-thymidineの取り込みを著明に抑制することから、AML1/EVI-1融合蛋白質はt(3;21)転座を有する白血病細胞の増殖に重要であると考えられた。

以上の結果より、t(3;21)転座の結果新しいタイプのキメラ型転写因子が形成され、これがCML急性転化に関与している可能性が示唆された。t(3;21)(q26;q22)は、慢性骨髄性白血病の急性転化時ならびに骨髄異形成症候群の白血化時に出現する染色体転座で、血液幹細胞のacute leukemic transformationに関与すると考えられる.分子解析の結果、t(3;21)による染色体切断点の遺伝子の再構成によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質が産生されることが判明した.このキメラ蛋白質は、N末側にruntドメインを含むAML1の一部を、C末側にEvi-1の全長を有する.生物学的解析によりAML1/Evi-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用する可能性が示された.AML1、Evi-1は両者とも転写制御因子であり、キメラ蛋白質形成による機能変化が分化抑制と増殖促進を引き起こすと考えられるため、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能を解析した。その結果AML1/Evi-1は、(1)AML1と同様にPEBP2部位に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに制御する、(2)AP-1活性を上昇させる、ことが明らかになった.さらに、AML1/Evi-1の転写制御因子としての機能ドメインの欠失変異体を構築して検討したところ、(1)の機能は、AML1のDNA結合領域であるruntドメインに依存し、(2)の機能はEvi-1と同様に第2zincフィンガー・ドメインに依存していることがわかった.以上の結果は、AML1/Evi-1が互いに独立した2つの機能を有する転写制御因子であることを示す.これらの機能が、それぞれ造血細胞の分化抑制と増殖促進に関与し、leukemic transformationに至るのではないかと推定された.
カイコの眠性変異体の分子遺遺伝学的解析

本課題では、カイコの眠性決定座位であるmod,rt,Mのポジショナルクローニングを行うことで、カイコの眠性決定の分子機構の解明を試みた。カイコの眠性変異体modについては、その原因遺伝子の同定と機能解析が終了し、modの原因が幼若ホルモンの生合成の異常によるものであることを明らかにした。rtについては、約400kbまで絞り込んだが、有力な候補遺伝子の特定には至らなかった。Mについては、M候補遺伝子の詳細な発現解析を行い、M座がエクジソン生合成に関わる可能性を示唆する結果が得られた。このMの候補遺伝子は、生物のボディプランに関わる重要な遺伝子であるが、形態形成以外にも内分泌系への関与を通して生物の成長や発育タイミングを決定するという、これまで全く知られていなかった新規の役割を担う可能性が示唆された。本年度は、昆虫の脱皮・変態の「質」や「タイミング」を決定する分子機構を解明するために、カイコの眠性変異体の原因遺伝子のポジショナルクローニングを展開した。mod(2眠)、rt(劣性3眠)、M(眠性)の変異体それぞれについて、正常系統(ゲノム解析標準系統p50T)とのBC1個体を作成し、定法に基づいて原因遺伝子のファインマッピングを行った。その結果、それぞれの責任領域を300kb, 400kb, 40kbに絞り込むことに成功した。正常系統と変異体の間で、責任領域内に存在する遺伝子の構造比較を行ったところ、有力な候補遺伝子の単離に成功した。mod系統については、トランスジェニックカイコを用いたレスキュー実験を進めている。すなわち、mod系統に野生型のアリルを導入することで、眠性が正常に回復するかの検証を行っている。rt, M系統については、モデル甲虫であるコクヌストモドキを用いたRNAi実験による検証を試みている。また、UAS異所発現法によって新規の眠性変異系統の単離も試みた。UAS異所発現ベクターをゲノム内にランダムに転移させ、その後Actin-Gal4系統と交配することでゲノム中の遺伝子をランダムに強制発現させたものの、これまでのところ眠性に変化の生じた個体の単離には至っていない。昆虫の幼虫脱皮の回数がどのように決定されるのか、その分子機構はほとんどわかっておらず、さらに、眠性変異体もカイコ以外ではほとんど知られていないため、本研究の成果は極めて大きな意義を持つものであると考えられる。本年度は、カイコの眠性変異体のうちmod(2眠),M3(3眠)について集中的な解析を行い、その原因遺伝子の機能解析を行った。modについては、前年度までに同定した候補遺伝子が真にmodの原因遺伝子かを検証するため、トランスジェニックカイコを作出し、レスキュー実験を行った。すなわち、mod/modホモをバックグラウンドとするカイコ系統において、GAL4/UASシステムを用いて候補遺伝子を発現させた。GAL4系統としてアラタ体でGAL4遺伝子が発現する系統を用いた。その結果、2眠あるいは3眠になるはずの個体が正常に発育して4眠蚕となった。この実験によって、単離した候補遺伝子がmodの原因遺伝子であることを遺伝学的に証明することができた。また、mod系統における体内ホルモンの分析を行った結果、候補遺伝子の欠損が早熟変態を引き起こす事実を説明する、またmod座が眠性決定に極めて重要であることを裏付ける生化学的なデータを得ることが出来た。一方、M3については、責任領域内に存在する遺伝子の発現解析を行い、候補遺伝子と眠性決定機構との因果関係について調査した。また、M3のalleleであるM5についてもポジショナルクローニングを展開し、候補領域を36kbに絞り込むことができた。この成果は、M座がいかにして脱皮回数の決定に関わるのか、またM3,+M,M5という各allele間の関係を解明するための大きな手がかりになるものと考えられる。また、UAS異所発現法を用いた新規眠性変異体の作出については未だ新規変異体が単離できておらず、今後の課題となっている。本年度は、前年度に引き続き、カイコの眠性変異体mod, rt, Mのポジショナルクローニングを行った、UAS異所発現法による新規眠性変異体の作出については、狙い通りの結果が得られなかったため、実験の実施を中止し、眠性変異体の原因遺伝子の機能解析に注力することにした。カイコの眠性変異体mod(2眠)については、その原因遺伝子の同定と機能解析が終了し、modの原因が、幼若ホルモンの生合成の異常によるものであることを明らかにした。この成果をもとにmodに関する投稿論文の執筆と投稿準備を行い、また、国際学会においてその成果を公表した。

rt (劣性3眠)については、前年度までに約400kbまで絞り込んでおり、さらに候補領域を狭めるために約800個体のBC_1を用いてマッピングしたものの、残念ながら候補領域のさらなる絞り込みには至らなかった。しかし、副次的な成果として、rtのファインマッピングの過程で、rt座の近傍に位置する笹繭b (Gb)座の原因遺伝子を同定することができた。M座については、M候補遺伝子の詳細な発現解析を行い、M座がエクジソン生合成に関わる可能性を示唆する結果が得られた.また、M^<3>、+M、M^<5>の各allele間でM候補遺伝子の配列比較を行ったところ、候補遺伝子がコードするタンパク質にはアミノ酸置換が存在しないことが判明した。したがって、この候補遺伝子の転写調節あるいは翻訳後調節が、カイコの眠性決定機構に重要であることが示唆された。この候補遺伝子は、生物のボディプランに関わる非常に重要な遺伝子であるが、形態形成以外にも内分泌系への関与を通して生物の成長や発育タイミングを決定するという、これまで全く知られていなかった、新規の機能を持っている可能性がある。