hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞による骨吸収とアトピー性皮膚炎との因果関係における研究

-colony Stimulating Factor(M-CSF)の存在下、破骨細胞前駆細胞へと分化し、間葉細胞からのReceptor Activator of NF-κB (RANK) Ligandが破骨細胞前駆細胞の膜表面に存在するRANKに結合することによって、シグナルが細胞内へ伝達され、細胞が互いに融合して多核の破骨細胞を形成する。その際、RANK ligandとそのおとり受容体としてのOsteoprotegerin(OPG)が破骨細胞への分化および活性化を制御している。昨年度は、アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤であるペプスタチンAが破骨細胞形成を直接抑制していることを明らかにした。本年度は、ペプスタチンAが破骨細胞形成のどの段階で作用しているのかを調べるために、ペプスタチンAの作用期間を変えて(03日、35日)破骨細胞の分化および活性化を解析した。すると、前半の03日にペプスタチンAを加えたときにより強く破骨細胞形成が抑制されていることが明らかとなった。さらに3日目で破骨細胞のマーカーであるTartrate-resistant acid phosphataseの発現を調べたところ、有意に破骨細胞の分化が抑制されていた。次に、ペプスタチンAの標的となる因子を見つけるため、まず破骨細胞の表面受容体であるRANKの発現をRT-PCRにて調べたところ、ペプスタチンAはその発現を抑制していた。マクロファージのマーカーであるF4/80やFc receptorは変化を認めなかったため、ペプスタチンAによる破骨細胞分化抑制はRANKの発現抑制のためであることが考えられる。現在は、RANKの下流のシグナルを解析中である。破骨細胞の形成は次のような段階を経て進行する。まず、血液幹細胞が、Macrophage-colony Stimulating Factor(M-CSF)の存在下、破骨細胞前駆細胞へと分化する。さらに、間葉系細胞からのReceptor Activator of NF-κB (RANK) Ligandが破骨細胞前駆細胞の膜表面に存在するRANKと結合することによって、シグナルが細胞内へ伝達され、細胞が互いに融合して多核の破骨細胞を形成する。その際、RANK ligandとそのおとり受容体としてのOsteoprotegerin (OPG)が破骨細胞への分化および活性化を制御している。昨年度は、アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤であるペプスタチンAが破骨細胞形成を直接抑制していること、特に破骨細胞前駆細胞から単核の破骨細胞へ分化する段階を強く抑制していることが明らかとされた。今年度は、RANKの下流のシグナル分子を調べるために、IκB,ERK,Akt,p38などのリン酸化抗体を用いて解析を行った。RANKL刺激によるIκB,Akt,p38のリン酸化には抑制は認められなかったが、ERKのリン酸化には抑制が認められた。
新規遺伝子改変マウスを用いた疼痛神経回路網の蛍光可視化システムの開発

我々が皮膚で感じ取る体性感覚はどのような情報処理を経て脳中枢に伝達されるのかを明らかにすることを目的として、体性感覚情報の中継点である脊髄後角の多数の神経細胞の活動を生きたマウスで同時計測する系を構築した。その結果、マウス皮膚への疼痛、接触、熱刺激、および異なる部位の皮膚への刺激に応答して特異的な位置の脊髄後角ニューロンの神経活動が活性化することが明らかとなった。本研究の結果より、異なる体性感覚刺激は脊髄後角レベルで異なる神経細胞群により情報処理される可能性が示唆された。本研究ではin vivoカルシウムイメージングを用いて体性感覚刺激に応答するマウス脊髄後角ニューロンの神経活動の三次元分布の解析を行い、脊髄後角神経回路による体性感覚情報処理のメカニズムの解明を目指すものである。今年度は皮膚の異なる部位への疼痛刺激を行うことにより、脊髄後角における刺激応答ニューロンの局在を解析した。その結果、マウス腰部脊髄後角(L1)においては、その部位に入力する一次求心性ニューロンを介する疼痛刺激のみならず、それより2体節離れた脊髄に入力する疼痛刺激によっても多くの脊髄後角ニューロンの神経活動が認められた。異なる層の間の介在ニューロンを介した情報の伝播がそれほど顕著には認められないという昨年度得られた成果と合わせて考えると、脊髄後角介在ニューロンは異なる層の間よりも吻尾軸方向の異なる体節間の体性感覚情報の伝達に大きく関与する可能性が示唆された。また、脊髄後角ニューロンの体性感覚刺激への応答性を神経サブタイプ特異的に解析するために、カルシウムインディケーター蛋白質をコンディショナルに発現するレポーターマウスを用いた解析に着手した。このレポーターマウスを脊髄後角介在ニューロン、および脊髄後角抑制性介在ニューロン特異的にCreリコンビナーゼを発現するドライバーマウスとそれぞれ交配させて、それぞれのニューロン特異的にカルシウムインディケーター蛋白質を発現させる試みを現在行っている。また予備実験として、これらのドライバーマウスとROSA26レポーターマウスとの交配マウスを用いて、組換えが起こる脊髄後角ニューロンの細胞種の同定を合わせて行っており、ドライバーマウスとして適切かどうかの検証を行っている。本研究では皮膚の感覚刺激が脊髄後角ニューロンにどのように伝えられるのか、また脊髄後角ニューロンがどのような情報処理をしているのかを明らかにすることを目的として、マウス脊髄後角ニューロンのin vivoカルシウムイメージングの系を構築した。まず脊髄後角ニューロンにカルシウムインディケーター蛋白質を発現させるためにマウス胎児子宮内電気穿孔法の系を確立した。次にこの遺伝子発現系を用いてカルシウムインディケーター蛋白質をマウス脊髄に発現させ、生後8週齢の導入マウスの脊髄後角ニューロンを二光子励起顕微鏡により観察する系を確立した。その結果、疼痛、接触、熱刺激により誘導される脊髄後角ニューロンの神経活動をin vivoカルシウムイメージングを指標に測定することに成功した。さらに、カルシウムインディケーター発現ニューロンの脊髄後角における三次元的分布を解析することにより、神経活動が認められるニューロンの細胞体の位置と刺激の種類の間に相関があることを見出した。さらに脊髄後角の細胞種特異的なカルシウムイメージングを可能にするためのレポータートランスジェニックマウスの作製を理研CDB動物資源開発室との共同開発により行った。このレポーターマウスはCre依存的にカルシウムインディケーター蛋白質を誘導発現できるものであり、今後、脊髄後角の神経細胞種特異的にCreを発現するドライバーマウスとの交配を計画している。本研究の昨年度の成果は、脊髄後角における多数のニューロンの神経活動がin vivoで解析可能となった点において大変意義深いものであり、今後に続く研究と合わせて脊髄後角神経回路による情報処理メカニズムの解明に大きく貢献するものである。平成26年度においてはこれまで確立してきたマウスin vivoカルシウムイメージングの系を用いて、皮膚の異なる点のピンチ刺激に応答する脊髄後角ニューロンの神経活動を網羅的に解析した。まずマウスのわき腹付近の皮膚において、吻尾軸方向に1cm離れた2点の体性感覚は2体節分離れた一次求心性ニューロンによってそれぞれ受容され、これらのニューロンの中枢投射は約2mmの距離を隔てて重ならないことを逆行性神経トレーサーによるラベリングにより確かめた。次に、これら異なる点のピンチ刺激に応答する第一腰部脊髄ニューロンの神経活動を解析した結果、2体節分離れた一次求心性ニューロンを介した体性感覚刺激によっても脊髄後角ニューロンの神経活動は顕著に認められた。これらの結果より、脊髄後角に入力した体性感覚情報は吻尾軸方向に広く伝播し、その伝達には介在ニューロンが関与している可能性が示唆された。次に当研究室で樹立したカルシウムインディケータータンパク質を誘導発現するレポーターマウスを用いた解析についても進めた。脊髄後角浅層のドライバーマウスLbx1-Cre、脊髄後角抑制性介在ニューロンのドライバーマウスPax2-

Creとこのレポーターマウスを交配させて得られたマウスを用いて、それぞれのニューロン特異的なカルシウムイメージングの系の樹立を現在進めている。本研究により、体性感覚刺激に応答する脊髄後角ニューロンの神経活動の網羅的解析、およびその三次元分布の解析が確立された。脊髄後角ニューロンの神経活動の三次元分布の解析は、特定の体性感覚刺激に応答するニューロンがどのようなパターンで分布しているかの解析を可能にし、脊髄後角神経回路による体性感覚情報処理のメカニズムの理解に今後大きく貢献すると期待される。神経科学上記のように、今年度は異なる部位への皮膚刺激に応答する脊髄後角ニューロンのin vivoカルシウムイメージングを行うことにより、脊髄後角介在ニューロンが脊髄後角の吻尾軸方向への情報の伝播に関与することを明らかにした。この成果は脊髄後角神経回路の情報処理機構の解明に大きく貢献するものであり、本研究の当初の目的の一部が達成されたといえる。一方、レポーターマウスを用いたin vivoカルシウムイメージングについては予想よりも伸展が見られなかった。その理由はレポーターマウスでのカルシウムインディケーター蛋白質の発現がヘテロのマウスでは弱かったためであり、現在ホモマウスを用いた解析への方針転換を図っている。現在までにレポーターマウス(トランスジェニックマウス)におけるトランスジーンの挿入箇所をジェノミックウォーキングにより決定し、ホモマウスをジェノタイピングにより簡便にスクリーニングする系を確立した。また、当初予定していた脊髄後角興奮性介在ニューロンのドライバーマウスがよく機能しないことが分かり、別のドライバーマウスの入手を現在検討している。また当初計画していた光神経科学の技術を用いた解析は上記の研究に時間を割かれ遂行することができなかった。以上の進展状況を総合的に判断すると異なる部位への皮膚刺激に対する脊髄後角ニューロンの応答性についてはほぼ計画通りに実験が遂行され、またレポーターマウスを用いた解析はやや進捗が遅れているものの次年度以降の研究の礎が築かれたということができる。したがって全体としては「おおむね順調に進展している」と自己評価するに至った。当初、神経回路網を蛍光可視化するマウスとしては、経シナプストレーサーWGAとCreリコンビナーゼの融合蛋白質を発現するマウスを構築し、WGA-Creのシナプス越え、CreによるloxP領域の遺伝子組み換え、組み換えによる蛍光蛋白質遺伝子の誘導発現の連鎖によって、脊髄後角ニューロンの神経回路を可視化させる計画であった。しかし、大脳皮質へのWGA-Creの一過性発現系を用いた予備実験の結果より、WGA-Creのシナプス越えは確認されず、方針転換することにした。
視覚および聴覚情報の優先性による楽器演奏方略の違いに関する実験検証

高度な技能の遂行には,視覚情報や聴覚情報,触覚情報などの感覚情報が活用される.特に緻密な運動制御を行うためには長期間にわたる訓練が必要である上,自己の能力を最大限に発揮するために自分にとって最適な情報処理方略をとる必要がある.ピアノ演奏を例にとれば,楽譜をすらすら読んで演奏できる子どももいれば,楽譜を読むのは苦手だが教師の演奏を聞いて演奏することはすぐにできる子どももいる.つまり,音楽を楽譜から視覚的に読みこんで運動に変換することが得意な子と,演奏を聴覚から取り込んで運動に変換することが得意な子がいるということである.このような個人差は,それぞれが用いる情報処理方略の違いによってもたらされていると考えられる.従って,最終的には同じ運動が出力されるとしても,優先される感覚情報によって運動に至るまでの情報処理方略が異なる可能性がある.しかしながら,多くの研究においては,演奏家と非演奏家というくくりで研究が行われており,演奏家内の情報処理方略の差は検証の対象になっていない.同じ出力が得られる場合にはおおよそ同じ方略を使用しているとされてきたため,実際には存在する違いが埋もれたままである可能性がある.そこで本研究においては,ピアニストを対象として,視覚および聴覚情報の入力から運動に至るまでの情報処理方略の違いを実験的に検証することを目指す.また,視覚情報の処理に重要であると考えられる読譜についても,その効率的な情報処理に活用されている楽譜上の手掛かりを検証する.本年度は,視覚情報の処理に重要であると考えられる読譜について,その効率的な情報処理に活用されている楽譜上の手掛かりを検証した.その結果,楽譜上の幾何学的情報に加え,演奏者が経験的に統計的な情報に基づく予測も効率的な読譜に貢献していることが明らかになった.しかしながら,当初計画していた聴取実験については,予想していたよりも実験の難易度が高く,実験参加者への負担が大きいことが明らかになったため,現在,計画を修正しているところである.効率的な読譜について,現時点では単純な音程等を用いた実験であるため,次により旋律的な音列についても,その手掛かりを明らかにする実験を実施する.今回用いた実験パラダイムが非常に上手く結果を示せることが明らかになったため,引き続き同様の実験を行う.聴覚情報処理については,ワーキングメモリとの関係も示唆されていることから,記憶課題との相関を検証することも試みる予定である.高度な技能の遂行には,視覚情報や聴覚情報,触覚情報などの感覚情報が活用される.特に緻密な運動制御を行うためには長期間にわたる訓練が必要である上,自己の能力を最大限に発揮するために自分にとって最適な情報処理方略をとる必要がある.ピアノ演奏を例にとれば,楽譜をすらすら読んで演奏できる子どももいれば,楽譜を読むのは苦手だが教師の演奏を聞いて演奏することはすぐにできる子どももいる.つまり,音楽を楽譜から視覚的に読みこんで運動に変換することが得意な子と,演奏を聴覚から取り込んで運動に変換することが得意な子がいるということである.このような個人差は,それぞれが用いる情報処理方略の違いによってもたらされていると考えられる.従って,最終的には同じ運動が出力されるとしても,優先される感覚情報によって運動に至るまでの情報処理方略が異なる可能性がある.しかしながら,多くの研究においては,演奏家と非演奏家というくくりで研究が行われており,演奏家内の情報処理方略の差は検証の対象になっていない.同じ出力が得られる場合にはおおよそ同じ方略を使用しているとされてきたため,実際には存在する違いが埋もれたままである可能性がある.そこで本研究においては,ピアニストを対象として,視覚および聴覚情報の入力から運動に至るまでの情報処理方略の違いを実験的に検証することを目指す.また,視覚情報の処理に重要であると考えられる読譜についても,その効率的な情報処理に活用されている楽譜上の手掛かりを検証する.本研究では,大きく分けて3つの実験を実施予定であるが,初年度において,そのうち1つ目の実験を終えることができた.具体的には,聴覚情報の優先度を定量化するための実験である.先行研究により,聴覚情報を優先する演奏家は暗譜が得意であることが示唆されたため,ランダム音列を用いて音刺激の入力モダリティと記憶量や記憶負荷との関係を検証する実験を行った.本実験では,入力モダリティとして視覚(V),聴覚(A),視覚+聴覚(AV)の3条件を用意した.また,楽器演奏時には,演奏音がフィードバックされるため,これが記憶を助けている可能性も考えられる.そこで,記憶した音列を回答するためにピアノを演奏する際,その音をフィードバックする(FB:Feedback)条件とフィードバックしない(NF:Non Feedback)条件を設定した.その結果,耳コピー演奏は得意だが初見演奏は不得意なピアニストは,有意に音列の記憶量が多いことが示された.一方,入力刺激モダリティやフィードバックの有無による記憶量の差は見られなかった.しかしながら,質問紙調査において,入力刺激モダリティやフィードバックの有無によって主観的な負荷が異なると回答していた.つまり,熟達したピアニストの場合,どのような入力刺激モダリティであっても,一旦,自分にとって記憶しやすい情報に変換して記憶している可能性が示された.高度な技能の遂行には,視覚情報や聴覚情報,触覚情報などの感覚情報が活用される.特に緻密な運動制御を行うためには長期間にわたる訓練が必要である上,自己の能力を最大限に発揮するために自分にとって最適な情報処理方略をとる必要がある.ピアノ演奏を例にとれば,楽譜をすらすら読んで演奏できる子どももいれば,楽譜を読むのは苦手だが教師の演奏を聞いて演奏することはすぐにできる子どももいる.

つまり,音楽を楽譜から視覚的に読みこんで運動に変換することが得意な子と,演奏を聴覚から取り込んで運動に変換することが得意な子がいるということである.このような個人差は,それぞれが用いる情報処理方略の違いによってもたらされていると考えられる.従って,最終的には同じ運動が出力されるとしても,優先される感覚情報によって運動に至るまでの情報処理方略が異なる可能性がある.しかしながら,多くの研究においては,演奏家と非演奏家というくくりで研究が行われており,演奏家内の情報処理方略の差は検証の対象になっていない.同じ出力が得られる場合にはおおよそ同じ方略を使用しているとされてきたため,実際には存在する違いが埋もれたままである可能性がある.そこで本研究においては,ピアニストを対象として,視覚および聴覚情報の入力から運動に至るまでの情報処理方略の違いを実験的に検証することを目指す.また,視覚情報の処理に重要であると考えられる読譜についても,その効率的な情報処理に活用されている楽譜上の手掛かりを検証する.本年度は,視覚情報の処理に重要であると考えられる読譜について,その効率的な情報処理に活用されている楽譜上の手掛かりを検証した.その結果,楽譜上の幾何学的情報に加え,演奏者が経験的に統計的な情報に基づく予測も効率的な読譜に貢献していることが明らかになった.しかしながら,当初計画していた聴取実験については,予想していたよりも実験の難易度が高く,実験参加者への負担が大きいことが明らかになったため,現在,計画を修正しているところである.これまでの実験により,熟達したピアニストの場合,どのような入力刺激モダリティであっても,一旦,自分にとって記憶しやすい情報に変換して記憶している可能性が明らかになった.記憶しやすい情報がどのようなものであるのかについては,それらの情報での記憶を阻害するような実験パラダイムを採用する必要がある.従って,今後の実験においては,記憶を阻害する様な課題を追加して実施する.また,より実際の演奏に即した状況での実験を実施するため,単音によるランダム音列だけではなく,音楽的な旋律や和声進行による実験も実施する.効率的な読譜について,現時点では単純な音程等を用いた実験であるため,次により旋律的な音列についても,その手掛かりを明らかにする実験を実施する.今回用いた実験パラダイムが非常に上手く結果を示せることが明らかになったため,引き続き同様の実験を行う.聴覚情報処理については,ワーキングメモリとの関係も示唆されていることから,記憶課題との相関を検証することも試みる予定である.本研究で行っている実験において,当初計画より被験者数を大幅に増加させる必要が生じ,実験参加者謝金の増額が必要となった.また,追加で得られた成果発表の費用も増額が必要となり,合計30万円の前倒し請求を行った.実験の性質上,記憶量が多い被験者は実験参加時間が長くなり,その分の謝金が増額となるため,多めに請求していたため,余剰が生じたものである.これについては,次年度の謝金として使用する.他に獲得した助成金によって実験参加者謝金を賄うことができたため,大幅に謝金の支払い額が減少した.これについては,次年度の実験参加者謝金として使用する.加えて,新たに実験刺激作成のためのソフトウェアの購入が必要になったことから,これにあてる.
認知症専門外来における看護実践モデルの開発研究

本研究の目的は、認知症専門外来を受診する患者・家族に対して専門性の高い看護を提供するための指針となる看護実践モデルを開発することにある。2018年度は、前年度より引き続き、第一段階研究として、認知症専門外来の看護の実際と課題並びに看護実践上の要素を抽出するために実施する認知症専門外来に所属する看護師を対象とした面接調査および郵送法による質問紙調査の準備をすすめた。前年度に行った文献調査および認知症専門外来に勤務する看護師へのヒアリング調査の結果を精査し、認知症専門外来における看護師による看護実践の内容や過程に関する研究論文が極めて少なく、看護実践モデルの根拠となる実践そのもののデータ化が急務の課題であることが確認された。また、認知症専門外来の看護活動を明らかにする際の視点として、初診時には外来を訪れるまでの相談対応が受診時の不安や疲労感を軽減し円滑な診療の補助につながること、患者・家族が経験している困り事や先の見えない不安を聴くかかわりが中心になること、認知症専門外来を認知症地域支援ネットワークの一つとみなし、日頃より地域包括支援センター等の行政機関、介護事業所や家族の会との関係づくりを行うこと等が整理された。続いて、認知症専門外来の看護実践の実態調査の準備として、調査対象者を探索した。調査対象候補として、各都道府県に設置されている認知症疾患医療センターや認知症外来を標榜している病院(約1,500か所)に勤務する外来看護師を想定し、対象選定の妥当性を研究チームで検討した。多くの病院施設において看護師は配置されているものの患者・家族に認知症看護の専門性をもってかかわってているケースが少ないことが予測された。認知症専門外来での看護の内容をデータ化するためには、調査対象者を看護師のみならず医師を含め再考する必要が生じた。2018年度は、本研究の第一段階研究の前半として、先駆的に認知症専門外来において専門性の高い看護を実践する看護師を対象にした面接調査と全国の認知症専門外来に勤務する看護師を対象とした質問紙調査の準備を行う予定であった。前年度から継続して文献検討を行い、ヒアリング調査の結果もふまえ、調査対象者と方法の検討をすすめた。この面接調査および全国調査の準備過程において、認知症専門外来の看護実践の内容を把握する上での調査の視点を明らかにすることはできたが、認知症専門外来に勤務する看護師の配置や役割機能の実情から、対象選定と調査依頼の手順、また調査票の構成について、再考が必要となりその検討に時間を要している。2019年度は、2017年度2018年度に行った先行研究および認知症看護認定看護師のヒアリングから整理した看護実践全般の内容を調査の枠組みとし、認知症専門外来における先駆的看護実践者を対象とした面接調査と全国的な質問紙調査の実施に取り組む。調査対象の選定方法や調査依頼手続きについては、専門家(認知症専門外来において診療を行う医師等)より指導を受け、適切・妥当な方法を検討し、速やかに実施する。2017年度は、第一段階研究として、認知症専門外来の看護の実際と課題並びに看護実践上の要素を抽出するために実施する認知症専門外来に所属する看護師を対象とした面接調査および郵送法による質問紙調査の準備をすすめた。まず、認知症専門外来での看護実践に関する先行研究について文献調査を行った。「認知症専門外来(認知症外来、物忘れ外来)」「看護」等をキーワードに過去5年の文献を検索した。その結果、認知症専門外来の看護師が行った具体的な看護実践の内容やプロセスに焦点をあてた原著論文は見当たらず、実践報告が散見された。実践報告の内容としては、家族の不安や介護負担の軽減への取り組みが主であり、外来での看護活動全般をとらえた研究・資料は乏しかった。文献調査から、認知症専門外来における看護実践として、介護家族の苦悩を受けとめ支えるケアの重要性が示唆されたが、医師の診療の補助、患者本人へのケア、地域や事業所・施設等の専門職連携については未検討であった。そこで、認知症専門外来での看護活動の全体像を明らかにするために、認知症専門外来において患者・家族に対応している認知症看護認定看護師1名を対象にヒアリングを行った。その結果、認知症専門外来の看護活動として、外来受診につながるまでの相談対応、診察時の問診および各種検査を受ける中で疲労や失敗を最小限にするケア・医師や検査室との調整、患者本人に対して自尊心と安心を支える問診・看護面接、家族の語りを十分に聴くケア、診断告知時の患者・家族の不安を軽減するケア、患者・家族を中心とした地域での支援ネットワークづくりが抽出された。2017年度は、本研究の第一段階研究の前半として、先駆的に認知症専門外来において専門性の高い看護を実践する看護師を対象にした面接調査と全国の認知症専門外来に勤務する看護師を対象とした質問紙調査の準備を行う予定であった。しかし、先行研究や関連する文献を検索する中で、認知症専門外来での看護実践の内容・プロセスに焦点をあてた研究が乏しく、調査の枠組みを決定するには先行研究の検討だけでは不十分であることが明らかになった。そこで、実際に認知症専門外来において看護実践を積み重ねている認知症看護認定看護師にヒアリングを行い、看護活動の全体像を整理した。このように、本調査の準備期間が延長したことにより、調査の実施が遅れた。

本研究の目的は、認知症専門外来を受診する患者・家族に対して専門性の高い看護を提供するための指針となる看護実践モデルを開発することにある。2018年度は、前年度より引き続き、第一段階研究として、認知症専門外来の看護の実際と課題並びに看護実践上の要素を抽出するために実施する認知症専門外来に所属する看護師を対象とした面接調査および郵送法による質問紙調査の準備をすすめた。前年度に行った文献調査および認知症専門外来に勤務する看護師へのヒアリング調査の結果を精査し、認知症専門外来における看護師による看護実践の内容や過程に関する研究論文が極めて少なく、看護実践モデルの根拠となる実践そのもののデータ化が急務の課題であることが確認された。また、認知症専門外来の看護活動を明らかにする際の視点として、初診時には外来を訪れるまでの相談対応が受診時の不安や疲労感を軽減し円滑な診療の補助につながること、患者・家族が経験している困り事や先の見えない不安を聴くかかわりが中心になること、認知症専門外来を認知症地域支援ネットワークの一つとみなし、日頃より地域包括支援センター等の行政機関、介護事業所や家族の会との関係づくりを行うこと等が整理された。続いて、認知症専門外来の看護実践の実態調査の準備として、調査対象者を探索した。調査対象候補として、各都道府県に設置されている認知症疾患医療センターや認知症外来を標榜している病院(約1,500か所)に勤務する外来看護師を想定し、対象選定の妥当性を研究チームで検討した。多くの病院施設において看護師は配置されているものの患者・家族に認知症看護の専門性をもってかかわってているケースが少ないことが予測された。認知症専門外来での看護の内容をデータ化するためには、調査対象者を看護師のみならず医師を含め再考する必要が生じた。2018年度は、本研究の第一段階研究の前半として、先駆的に認知症専門外来において専門性の高い看護を実践する看護師を対象にした面接調査と全国の認知症専門外来に勤務する看護師を対象とした質問紙調査の準備を行う予定であった。前年度から継続して文献検討を行い、ヒアリング調査の結果もふまえ、調査対象者と方法の検討をすすめた。この面接調査および全国調査の準備過程において、認知症専門外来の看護実践の内容を把握する上での調査の視点を明らかにすることはできたが、認知症専門外来に勤務する看護師の配置や役割機能の実情から、対象選定と調査依頼の手順、また調査票の構成について、再考が必要となりその検討に時間を要している。本研究は、認知症専門外来における看護の実際と課題ならびに看護実践上の要素を抽出する第一段階研究を2017年度2018年度の2年間で行う計画である。2018年度は、2017年度の先行研究および認知症看護認定看護師のヒアリングから整理した看護実践全般の内容を調査の枠組みとし、認知症専門外来における先駆的看護実践者を対象とした面接調査と全国的な質問紙調査の実施に取り組む。先駆的看護実践者の面接調査の対象については、文献調査等を行う中で、認知症専門外来での看護について報告・執筆の実績がある看護師数名を把握することができた。そのため早急に、所属機関の研究倫理審査および対象者への研究協力の手続きを経た後、面接調査の実施につなげたい。
戦時・戦後の日本における売買春問題に関する研究

2005年度には、以下の1,2,3の研究成果をあげることができた。1戦時における地方純潔運動に関する論文「軍需工場地帯における純潔運動」を『戦時日本の経済再編成』(日本経済評論社、2006年3月31日)に掲載することができた。この論文では、軍需工場地帯となった群馬県において顕著であった青少年工や徴用工の欠勤や不良化、闇取引や軍需工場がらみの経済犯罪に対抗しておこなわれた、同県の社会事業家らによる純潔運動の展開を明らかにした。本稿では、同運動が、国策と実際の戦時社会の荒廃との間の乖離を鋭く批判し、統制経済の指導者批判、人口政策批判を展開したことを明らかにした。本稿をふまえて、来年度にはこれまでの拙稿をまとめた著書を発表する予定である。2戦後沖縄におけるAサインバー・ホステス経験者に対する聞き取りの成果をもとに論文、「戦後沖縄におけるAサインバー・ホステスのライフ・ヒストリー」を執筆した。この論文では、沖縄本島北部出身のある女性からの聞き取りに基づき、米軍統治時代末期の沖縄における米兵向け水商売で働いていた女性従業員の労働、賃金、労働意識、暮らし、生い立ち、人物像などを明らかにした。1960年代末の米兵向け水商売では、前借金などから相対的に自由なホステスも存在していたこと、借金をしないで労働することのプライドが息づいていたこと、本土での進学・労働経験の持つ意味の重要性などが浮かびあがってきた。2004年度には、当初の研究計画(以下の1、2)以上の成果(3)もあげる事ができた。1戦時における地方純潔運動に関して史料収集、考察をすすめ、論文「軍需工場地帯における純潔運動-群馬県を中心として-」(原朗編『戦時期日本の経済と社会』(東京大学出版会、2005年刊行予定)に掲載予定である。この論文では、軍需工場地帯となった群馬県において顕著であった徴用工や青少年工の欠勤や不良化、享楽化、闇取引や軍需工場がらみの経済犯罪に対抗して行われた、同県社会事業家らによる純潔運動の展開を明らかにした。先行研究で、戦時純潔運動が国策と一体化し、優生学的傾向を強めたことが大雑把に指摘されているのと異なり、本稿では同運動が軍部の享楽に対する批判や統制経済の指導者批判、人口政策批判を鋭く展開していたことを明らかにした。2駒沢大学付属図書館所蔵の「烏山遊廓史料」のコピーをほぼ終え、大正8年と9年の「遊客人名簿」のデータベース化を開始した。3戦後の米軍統治下沖縄におけるコザ市センター通りの米軍向けバー(Aサインバー)に関する聞き取り調査をすすめると同時に、論文「米軍統治下Aサインバーの変遷に関する-考察-女性従業員の待遇を中心に-」(『日本東洋文化論集』11号、琉球大学、2005年3月)を執筆した。本稿では、主として1950年代から70年代にかけてのAサインバーにおける女性従業員への賃金支払い方法、女性従業員の居住形態・前借金などの変遷に関して、主として筆者が元Aサインバー経営者に対する聞き取り調査の内容から構成した大まかな見取り図を示した。Aサインバーに関しては、これまで断片的な調査やルポなどは存在するが、このような見取り図は初めて示されたものである。2005年度には、以下の1,2,3の研究実績をあげることが出来た。1戦時における地方純潔運動に関する論文「軍需工場地帯における純潔運動-群馬県を中心として-」を、原朗・山崎志郎偏『戦時日本の経済再編成』(日本経済評論社、2006年3月31日刊行)に掲載することができた。この論文では、軍需工場地帯となった群馬県において顕著であった青少年工や徴用工の欠勤や不良化、享楽化、闇取引や軍需工場がらみの経済犯罪に対抗して行われた、同県社会事業家らによる純潔運動の展開を明らかにした。

先行研究で、戦時純潔運動が国策と一体化し、優生学的傾向を強めたことが大雑把に指摘されているのとは異なり、本稿では、同運動が軍部の享楽に対する批判や統制経済の指導者批判、人口政策批判を鋭く展開していたことを明らかにした。本稿をふまえて来年度は、これまでの拙稿をまとめた著書を発表する予定である。2「烏山遊郭史料」の「遊客人名簿」(大正8、9年)のデータベース化をすすめ、約800件ほどの入力を終えている。同遊廓の遊客に関する諸事実が発覚しつつある。3戦後沖縄におけるAサインバー・ホステス経験者に対する聞き取りを、数年前から行っているが、その成果の一端を執筆し、「戦後沖縄におけるAサインバー・ホステスのライフ・ヒストリー」という論文にまとめ、『琉球大学法文学部紀要日本東洋文化論集』12号、2006年3月)に掲載した。この論文では、沖縄本島北部出身のある女性からの聞き取りに基づき、米軍統治時代末期の沖縄における米兵向け水商売で働いた女性従業員の労働、賃金、労働意識、暮らし、生い立ち、人物像等を明らかにした。1960年代末の米兵向け水商売では、前借金などから相対的に自由なホステスも存在していたこと、借金をしないで労働する道が必死で模索されていたこと、そのことに対するプライドが息づいていたこと、本土での進学・労働体験の持つ意味の重要性、などが浮かび上がってきた。このテーマについては今後も追究・執筆していく予定である。
電圧印加時の電子分光による強磁性半導体のキャリア誘起磁性に関する研究

磁性不純物や界面が誘起する磁気相互作用の創出を目的として、外場による相互作用の操作を目指した研究を展開してきた。そのための内殻電子・磁気分光測定装置の立ち上げを行い、スピンと軌道磁気モーメントの計測を進めた。これにより、酸化物半導体の酸素欠陥を介した交換相互作用について、ドナー準位を介した交換相互作用を検討した。また、強磁性合金と酸化物MgOの界面での垂直磁気異方性を誘起する起源が、FeとOの化学結合に起因する軌道磁気モーメントの異方性であることをX線磁気円二色性により突き止めた。これらの結果は、外場印加による制御性を議論するための知見を与えるものとなった。スピントロニクス材料を用いた新規物性として、電圧印加による物性制御が注目されている。スピン依存伝導特性の評価から議論が行われているが、電子状態の観点から捉える必要がある。異種元素の化学ドーピングよりも多量のキャリアを電圧印加により注入し、動作中の電子分光により、議論が進むものと考える。そこで、申請者が手がけてきた「試料作製」,「電子分光測定」,「伝導測定」を組み合わせて初めて可能となる、電圧印加時、すなわち動作時の電子分光法を新しく構築することを進めてきた。この技術を用いて、界面キャリア注入時の電子状態(フェルミ面の軌道対称性)を調べ、誘起する強磁性の発現メカニズムを明らかにすることを目的として研究を進めている。本目的を達成するには、磁性元素別の電子・磁気状態の観測が必要となる。そのためには、放射光をもちいた電子分光が有力となる。申請者が進めてきたX線吸収分光(XAS)、X線磁気円二色性(XMCD)の実験手法を活用して、測定パラメータとして外場を追加した新規分光法を開発している。本年度は、XMCD装置を立ち上げ、試料に電圧を印加できるシステムの開発を集中的に行った。特に、強磁性体・半導体界面での軌道磁気モーメントの精密測定を可能にする技術を確立し、入射光と試料垂直面の角度に依存した異方的な軌道磁気モーメントが垂直磁気異方性の起源であることを調べた。そして、界面の電子状態の特異性が軌道磁気モーメントの異方性をもたらすことを突き止めた。スピン依存伝導特性の評価から議論が行われているが、電子状態の観点から電圧印加時の物性を捉える必要がある。異種元素の化学ドーピングよりも多量のキャリアを電圧印加により注入し、動作中の電子分光により、フェルミ準位のシフトによる議論が進むものと考える。申請者が進めてきたX線吸収分光(XAS)、X線磁気円二色性(XMCD)の実験手法を活用して、測定パラメータとして外場を追加した新規分光法を開発した。2013年度は、上記の目的達成に向けて、試料作製装置を導入し、遷移金属合金と半導体の界面における軌道磁気モーメントの増強を誘起する系の探索を行った。前年度に開発したXMCD手法と組み合わせることにより、電圧印加によるスペクトル形状の変化についての知見を得た。さらなる理解を深めるために、次年度には試料構造の工夫や測定セットアップの改良により目的を達成するように進めていく。スピントロニクス材料を用いた新規物性の創出には、薄膜界面での磁気相互作用の理解が必須である。特に、電圧印加による物性制御が注目されており、スピン依存伝導特性の評価から議論が多く行われているが、電子状態の観点から電圧印加時の物性を捉える必要がある。そこで、申請者が手がけてきた「試料作製」,「電子分光測定」,「伝導測定」を組み合わせて初めて可能となる、電圧印加時の電子分光法を新しく構築することを進めてきた。この技術を用いて、界面キャリア注入時の電子状態(フェルミ面の軌道対称性)を調べ、誘起する強磁性の発現メカニズムを明らかにすることを目的として研究を進めてきた。特に2014年度は、磁性体と非磁性体(酸化物など)との界面に誘起される磁性の制御を達成することを目的として、素子構造を工夫し、軌道磁気モーメントの増大や近接効果による磁化誘起を調べた。

そのためには、放射光をもちいた電子分光が有力となる。申請者が進めてきたX線吸収分光(XAS)、X線磁気円二色性(XMCD)の実験手法を活用して、測定パラメータとして外場を追加した新規分光法を開発した。2014年度は、上記の目的達成に向けて、遷移金属合金と半導体の界面における軌道磁気モーメントの増強を誘起する系および界面近接効果により非磁性体に誘起される磁性の探索を行った。前年度に開発したXMCD手法と組み合わせることにより、素子構造に依存したスペクトル形状の変化についての知見を得た。これらの結果を投稿論文としてまとめている段階であり、本研究課題により、界面での軌道磁気モーメント増大のメカニズムに関する成果が得られた点が大きい。今後、外場印加電子分光が発展する礎となる研究が進展した。26年度が最終年度であるため、記入しない。電子分光26年度が最終年度であるため、記入しない。放射光を用いた電子・磁気分光のシステムの開発を行い、それが完成したところである。また、測定試料に電圧を印加できるシステムを開発した点が今年度の達成度であり、本目的の達成に向けて着々と進んでいる。この装置を用いたXMCD測定が可能となり、準備が整った段階である。今後、実際の試料での動作時の電子・磁気分光を推進していくことで目的が達成される。放射光を用いた電子・磁気分光のシステムの開発を行った。また、試料を作製する結晶成長装置を用いた研究が進展した。これらを組み合わせることで、本目的の達成に向けて着々と進んでいる。今年度立ち上げた電圧印加時の磁気分光を可能にする装置を用いて、実際の物質での測定、検討を進めることが必須となる。そのための準備が整い、今後、界面での軌道磁気モーメント変調の可能性が明らかになると考えられる。今年度立ち上げた電圧印加時の磁気分光を可能にする装置と結晶成長装置の整備か完成したところであり、これらを用いた研究の展開により、当初の研究目的の達成を目指す。H24年度は、XMCD装置の立ち上げを集中的に行った。当初は結晶成長装置を導入した試料作製までを目指していたが、電子分光測定装置の立ち上げを今年度行い、結晶成長に関する研究は、次年度に行うことにしたため、予算の使い方を一部変更した。次年度に結晶成長装置を導入し、本研究目的の達成に結実させる予定である。今年度は、結晶成長装置を導入し、今までに立ち上げた外場印加時のXMCD装置と組み合わせる段階まで達成した。実際に大きな成果を得るには、後1年の研究期間を要するため、その際に必要な物品の経費を次年度に回すことにした。次年度にも研究を遂行できるように、消耗品等を購入する予定である。
骨形成細胞(骨芽細胞)が分泌する未知タンパクの同定とその骨疾患での意義

骨形成機構の更なる理解と骨粗鬆症に代表される骨代謝疾患の病態解明のため、骨芽細胞の発現遺伝子の分析を通じて、骨芽細胞の新規機能の解明を行ってきた。その結果、ヒト骨芽細胞に発現している6個の新規遺伝子(Osteoblast specific gene;OBS16)の全長を決定した。OBSIは全長2075bp、509アミノ酸残基からなり、insulin like growthfactor binding proteinとhomologyが高い。OBS2は、3127bp、846アミノ酸残基でCarboxypeptidsNと高いhomologyを持つ。OBS3は、4847bp、1382アミノ酸をcodeし基底膜に存在する気質蛋白であるnidogenと塩基配列で55%、翻訳したアミノ酸配列で38%のidentityを認める骨気質蛋白であり重要なmotif構造を持ち、nidogenの相同性より骨気質においてcollagenと他の基質蛋白質の橋渡し役をするものと考えられる。OBS4は、2475bp、232アミノ酸からなる。OBS5は、1513bp、408アミノ酸残基からなり、C.elegansのgenome上のhypothetical proteinとHomologyが高い。OBS6は全長3016bp、845アミノ酸残基からなりマウスAEBP1(adipoyte enhancer binding site binding protein1)のヒトに対応する遺伝子である。AEBP1は、脂肪細胞の分化の研究で発見された遺伝子で、脂肪細胞の分化とともに発現が抑制され、脂肪細胞特異的遺伝子の発現抑制機能を持つことから、脂肪細胞の分化抑制能を持つと考えられている。この遺伝子が、脂肪細胞と起源を同じくする骨芽細胞にも発現しており、脂肪細胞と同様に骨芽細胞の分化とともに抑制されることから骨芽細胞においても分化抑制能を持つものと考えられる。また、実際の骨形成の場でのAEBP1の発現をIn situ hybridizationでみてみると仮骨を旺盛に形成している骨芽細胞に強い発現を認めた。他に非常にシステインに富む骨基質蛋白、甲状腺ホルモンに対する新規レセプターやまったく未知の遺伝子が同定されている。さらに新規遺伝子の同定を進めていくと同時に、その機能解析を行っている。ヒト骨芽細胞に発現している6個の新規遺伝子(Osteoblast specific gene; OBS16)の全長を決定した。OBS1は全長2075bp、509アミノ酸残基からなり、insulin like growthfactor binding proteinとhomologyが高い。OBS2は、3127bp、846アミノ酸残基でCarboxypeptidase Nと高いhomologyを持つ。OBS3は、4847bp、1382アミノ酸をcodeと基底膜に存在する基質蛋白のNidogenと類似しておりEGF like repeat、Thyroglobulin type 1 reepeatといったmotifを持つ。Homology searchの結果glucose-6-phosphate dehydrogenase geneの下流にあるintergenicregion(2-19gene)とhomologyがある。OBS6は全長3061bp、845アミノ酸残基からなり、マウスで既にクローニングされていた転写因子と強い相同性を有しそのヒト型の遺伝子と考えらえた。

Nidogenと類似していたOBS3に対するペプチド抗体を作成した。骨肉腫組織で免疫染色を行ったところ骨肉腫類骨基質に染色性を認め、この遺伝子のコードする蛋白質は新規の骨基質蛋白質であることを示唆する結果が得られた。現在これらの遺伝子それぞれについて順次その機能を検討している。骨形成機構の更なる理解と骨粗鬆症に代表される骨代謝疾患の病態解明のため、骨芽細胞の発現遺伝子の分析を通じて、骨芽細胞の新規機能の解明を行ってきた。その結果、幾つかの新規遺伝子を同定した。まず最初の遺伝子は、マウスAEBP1(Adipocyte enhancer binding site binding protein 1)のヒトに対応する遺伝子である。AEBP1は、脂肪細胞の分化の研究で発見された遺伝子で、脂肪細胞の分化とともに発現が抑制され、脂肪細胞特異的遺伝子の発現抑制能を持つことから、脂肪細胞の分化抑制能を持つと考えられている。この遺伝子が、脂肪細胞と起源を同じくする骨芽細胞にも発現しており、脂肪細胞と同様に骨芽細胞の分化とともに抑制されることから骨芽細胞においても分化抑制能を持つものと考えられる。また、実際の骨形成の場でのAEBP1の発現をIn situ hybridizationでみてみると仮骨を旺盛に形成している骨芽細胞に強い発現を認めた。次の遺伝子は、基底膜に存在する基質蛋白であるnidogenと塩基配列で55%、翻訳したアミノ酸配列で38%のidentityを認める骨基質蛋白質であり重要のmotif構造をもち、nidogenとの相同性より骨基質においてcollagenと他の気質蛋白質の橋渡し役をするもとのと考えられる。ほかに非常にシステインに富む骨基質蛋白、甲状腺ホルモンに対する新規レセプターや全く未知の遺伝子が同定されている。今後はさらに新規遺伝子の同定を進めていくだけでなく、その機能解析も同時に行っていく予定である。研究実績の概要骨形成機構の更なる理解と骨粗鬆症に代表される骨代謝疾患の病態解明のため、骨細胞の発現遺伝子の分析を通じて、骨芽細胞の新規機能の解明を行ってきた。今回は骨芽細胞のcell lineであるMC3T3-E1細胞の石灰化過程における遺伝子発現の解析と骨芽細胞にのみ発現している遺伝子(osteomodulin)の同定を行った。MC3T3-E1細胞の基質合成期と石灰化期からmRNAを抽出した、3'-directed libraryを作成し、約10000 cloneのsequenceを解析した。
カプセル封入多細胞スフェロイドを用いた放射線・化学療法併用方法の検討

p53 statusの異なる2種のヒト舌癌細胞(SAS野生株、SASp53変異株)を用い、これを我々が開発した方法によって径650μm程の半透膜カプセルに封入し内部に多細胞スフェロイドを構築させたところ、今回用いたこれらの細胞においてともにカプセル内にスフェロイド形成をすることが確認された。細胞を半透膜カプセルに封入しこれらが径650μm程度のスフェロイド形成して固形腫瘍モデルとして各種実験に使用可能になるまでに要する培養期間はともに約1ヶ月間であり、以前にマウスの腫瘍細胞で行った実験とほぼ同等であった。作成された2種類の細胞で構築された半透膜カプセル封入スフェロイドを用い、これらにin vitroの系で2-20Gyのγ線照射を行い、1条件あたり24個の半透膜カプセル封入スフェロイドを24穴マルチウェルプレートにまき照射後1ヶ月間培養を行った。培養後にカプセルを破壊し増殖しているスフェロイドとそうでないものの割合から各々の放射線線量・腫瘍治癒率曲線を求めたところ50%腫瘍制御線量TCD50はSAS野生株で11Gy程度、SASp53変異株では12Gy程度であった。両細胞の半透膜カプセル封入スフェロイドをパラフィン包埋し、組織切片を作成し、これに対しアポトーシスや低酸素分画といった組織学的検索を行って、これらの相違を確認中であり、化学療法剤であるシスプラチンとの併用効果に関して同様の手法を用いて腫瘍治癒率の比較検討を行っている。1.p53 statusの異なる2種のヒト舌癌細胞(SAS野生株、SASp53変異株)を用い、これを半透膜カプセルに封入し多細胞スフェロイドを作成を試みた。今回用いたこれらの細胞でカプセル内にスフェロイド構築をすることが確認された。実験使用までに要する培養期間は約1ヶ月間であり、他の動物腫瘍細胞とほぼ同等であった。2.作成された2種類の細胞で構築された半透膜カプセル封入スフェロイドを用いて、in vitroの系で各々の放射線線量・腫瘍治癒率曲線を求めたところTCD50はSAS野生株で11Gy程度、SASp53変異株では12Gy程度であった。3.現在、両細胞の半透膜カプセル封入スフェロイドの組織学的検索を行って、これらの相違を確認中である。今後はin vivoでの両細胞のスフェロイドの放射線に対する反応を調べるつもりである。
ブースティング技術を用いた知識発見アルゴリズムに関する研究

与えられた記号列から,それらを生成する確立が大きな隠れマルコフモデル(Hidden Markov Model,以下HMM)を推定する,いわゆるHMM推定問題は,音声認識やアミノ酸系列の解析などに広く応用されている.これに関しては,従来,Baum-Welch法,Gradient Deacent法(GD法),相対エトンロピー法などに代表されるバッチ型手法に多く用いられてきた.対象とする問題の大型化に伴い,入力とする記号列の全てが同時にメモリに入りきらないケースが多く発生するようになり,これに対応すべく,一つずつ系列を入力して逐次的にHMMを更新してゆくオンライン型の手法が,近年特に要求されるところになっている.GD法,相対エントロピー法については,従来法をほとんどそのままオンライン型に拡張可能であったものの,Baum-Welch法のオンライン化については未解決とされてきた.本研究では,Baum-Welch法に,ブースティングの手法においてよく用いられる学習定数をHMMの更新速度を制御するものとして導入することにより,オンラインモデル下でも適用可能となるように拡張した.また,提案した手法が,推定対象にある条件を設けた場合には,GD法や相対エントロピー法をそのままオンラインモデルのもとで適用した場合よりも,優れた性能を持つことを計算機実験により検証した.更に,本手法は,時刻が進むにつれて対象となるHMMが変化してゆく場合において,これを追従して学習する能力を有することを確かめた.これは,バッチ型アルゴリズムには備わっていない能力であり,この点からも提案手法の優位性が確かめられた.与えられた記号列から,それらを生成する確立が大きな隠れマルコフモデル(Hidden Markov Model,以下HMM)を推定する,いわゆるHMM推定問題は,音声認識やアミノ酸系列の解析などに広く応用されている.これに関しては,従来,Baum-Welch法,Gradient Deacent法(GD法),相対エトンロピー法などに代表されるバッチ型手法に多く用いられてきた.対象とする問題の大型化に伴い,入力とする記号列の全てが同時にメモリに入りきらないケースが多く発生するようになり,これに対応すべく,一つずつ系列を入力して逐次的にHMMを更新してゆくオンライン型の手法が,近年特に要求されるところになっている.GD法,相対エントロピー法については,従来法をほとんどそのままオンライン型に拡張可能であったものの,Baum-Welch法のオンライン化については未解決とされてきた.本研究では,Baum-Welch法に,ブースティングの手法においてよく用いられる学習定数をHMMの更新速度を制御するものとして導入することにより,オンラインモデル下でも適用可能となるように拡張した.また,提案した手法が,推定対象にある条件を設けた場合には,GD法や相対エントロピー法をそのままオンラインモデルのもとで適用した場合よりも,優れた性能を持つことを計算機実験により検証した.更に,本手法は,時刻が進むにつれて対象となるHMMが変化してゆく場合において,これを追従して学習する能力を有することを確かめた.これは,バッチ型アルゴリズムには備わっていない能力であり,この点からも提案手法の優位性が確かめられた.
ラボオートメーションを活用した大腸菌人工進化実験による適応進化ダイナミクスの解析

本研究は、進化過程における微生物の表現型・遺伝子型の変化を高精度に解析することにより、適応進化のダイナミクスを担うメカニズムの根源に迫ることを目的としている。まず系統的な進化実験を行うために、ラボオートメーションを用いた自動培養システムの構築を行い、数百系列の培養を対数増殖期を保つように植え継ぐことに成功した。そのシステムを用いて、様々なストレス添加条件下での進化実験を行い、その過程における遺伝子発現量の変化とゲノムへの変異固定を網羅的に定量した。これらのデータを統合することにより、一部の適応的な表現型の変化はゲノムの変異によって説明できないことが示唆された。本研究は、人工進化過程における微生物の表現型・遺伝子型の変化を高精度に解析することにより、適応進化のダイナミクスを担うメカニズムの根源に迫ることを目的としている。23年度は、ラボオートメーションを用いた自動培養システムの構築を行った。テスト培養として、大腸菌MDS42株を親株とした400時間程度の植え継ぎ培養を行い、M9合成培地において比増殖速度が20%程度上昇した株の取得に成功した。現在、高pH・低pH・高ブタノール濃度・高浸透圧のそれぞれの環境ストレスを加えた環境下での植え継ぎ培養を行っている。この植え継ぎ実験により、これらの環境ストレスへの耐性株を取得した後に、次世代シーケンサを用いたゲノム変異解析とマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を用いて、その表現型・遺伝子型変化のダイナミクスを解析する。加えて、先行研究における進化実験で取得したエタノール耐性大腸菌株について、その表現型・遺伝子型変化の詳細な解析を行った。まず、キャピラリー電気泳動質量分析器(CE-MS)を用いて細胞内の代謝物質濃度の定量を行ったところ、独立の進化実験で得られた複数の耐性株において共通の代謝状態の変化が起こっていることが確認された。また、マイクロアレイ解析を用いて、遺伝子発現プロファイルの時系列を取得したところ、複数の耐性株において共通の発現変化の軌跡を描いていることが示された。次世代シーケンサによる変異解析の結果はゲノム変異において耐性株間で共通性が低いことが確認されており、これらの結果から、ゲノム変異に依らない、長い時間スケールを持つ適応ダイナミクスの存在が示唆された。その目的のために、ラボオートメーションによる自動進化実験システムを構築した。そのシステムを用いて、酸・アルカリ・界面活性剤・重金属などの11種類のストレス誘因物質をそれぞれ添加した培地において、大腸菌MDS42株の対数増殖期を保った1000時間程度の植え継ぎ培養を行い、それぞれの環境ストレスに対して親株よりも高い耐性能を持つ大腸菌株の取得に成功している。次に、この進化実験で得られたストレス耐性株の超並列シーケンサを用いたゲノム変異解析を行った。11種類のストレスそれぞれについて5つの耐性株からゲノムDNAを抽出し、固定された変異の同定を行った。その結果、それぞれの耐性株において数カ所から20カ所程度の変異が同定された。興味深いことに、同じストレスに耐性となった株には共通の遺伝子に変異が同定されているケースが多く、それらの変異が耐性能の獲得に寄与することが示唆された。また、それらの株についてはマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、耐性能の獲得と遺伝子発現量変化の相関を解析した。結果として、グローバル制御因子として知られるRNAポリメラーゼのσサブユニットがそれぞれのストレス耐性株において共通の発現量変化を示していることが見出され、こうした制御因子が重要な働きをしていることが示唆された。これらの表現型と遺伝子型の網羅的情報を統合することにより、様々な環境に対する適応進化がどのようなメカニズムを基盤としているか、新たな理解が可能となると期待できる。本年度は、前年度までに構築してきたラボオートメーションによる自動進化実験システムを用いて、大腸菌の進化実験を行った。酸・アルカリ・界面活性剤・重金属などの11種類のストレス誘因物質をそれぞれ添加した培地において、大腸菌MDS42株の対数増殖期を保った1000時間程度の植え継ぎ培養を行い、それぞれの環境ストレスに対して親株よりも高い耐性能を持つ大腸菌株の取得に成功した。11種類のストレスそれぞれについて5つの耐性株からゲノムDNAを抽出し、Illumina Hiseqを用いて300倍程度の冗長度で解析を行った。