hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前立腺肥大症における5α還元酵素 type3の機能解析：新たな治療ターゲット

肥大した前立腺を縮小させるためテストステロンをデヒドロテストステロンに変換する5α還元酵素(SRD5A)を阻害する薬が使われている。SRD5Aにはtype 1とtype 2以外に私達がクローニングしたtype 3(SRD5A3)があるが、前立腺肥大症との関連はよくわかっていない。そこで前立腺肥大症の組織、前立腺細胞株を用いて、SRD5A3について検討した。SRD5A3は前立腺上皮、間質の両者に発現しており、臨床症状が軽いほどその発現が高く認められた。細胞株に炎症を抑制させるIFNγを添加するとその発現が増強した。SRD5A3の発現を高くすると前立腺肥大症の症状を緩和させる可能性が示唆された。まず臨床検体を用いて、前立腺肥大症における5α還元酵素(5αredactase, SRD5A)type3(SRD5A3)の発現を見るために、試料は前立腺肥大症で経尿道的前立腺切除術を行い、そこで得られた検体と前立腺癌で前立腺生検を行い、前立腺癌ではなかったことを確認した検体を用いた。SRD5A3のタンパクレベルの発現を検討するために免疫組織染色でその発現の比較を行った。現在、条件がまだ定まっておらず、それらの2つの検討をしている段階である。またmRNAレベルのSRD5A3発現は前立腺肥大症の手術検体と前立腺癌で前立腺全摘術を行った標本のうち、前立腺癌のない部分を病理学的に確認しえた正常組織からcDNAを作成し、RT-PCRにて発現解析を行った。super-SCIDmouseを用いて、デュタステリドの効果を検討したところ、デュタステリドではRhoAの発現が抑制されており、これが前立腺収縮抑制につながり、切迫感を改善していることが予想されている。そこでデュタステリドのRhoAの発現やRho kinaseの発現についての効果を検討するために前立腺間質細胞を用いて実験を行った。前立腺間質細胞は不死化しているものがなく、継代が重なることでその性質が異なってくる。現在までにデュタステリドのRhoAの発現やRho kinaseの発現については予備実験の段階である。SRD5A3のknock downは現在のところ、前立腺間質細胞を利用して作成中である。当初予定していたよりも手術検体を収集することに時間を要している。また、免疫組織染色やPCRの条件設定も予想していたよりも難しく、やや時間がかかっている。また前立腺間質細胞を利用した実験は不死化の細胞がないため、その性質の均一化の評価に苦労している。前立腺肥大症がテストステロンやさらに強力な作用を持つデヒドロテストステロン(DHT)との関連があることはわかっている。DHTの酵素を活性化させる5α還元酵素(5αreductase、SDR5A)にはtype1-3の3種類があるが、このうち肥大症を縮小させていたり、また肥大症の予防にどのタイプが最も関連しているかはわかっていない。そこで前立腺においてSDR5A type3が前立腺の肥大に関与しているかどうかを検討している。前立腺肥大症にて経尿道的前立腺レーザー核出術を行った症例で、病理用に組織を提出したあとの残った試料を用いて、SRD5A3のタンパクレベルの発現を免疫組織化学染色で検討した。現在、前立腺肥大症で手術を受け、組織学的に検討できる症例数を増やしているところである。super-SCIDマウスを用いて、デュタステリド(5α還元酵素type1とtype2の阻害剤)の組織学的検討を行ったところ、デュタステリドによってRhoAの発現が抑制されており、これが前立腺筋層の収縮抑制につながり、様々な排尿症状の改善に寄与していることが予想される。このデュタステリドがSDR5A type3の抑制の効果があるかどうかも非常に興味深く、現在、その予備実験の段階である。ただし前立腺細胞(間質細胞)は不死化している細胞株が存在しないため、継代することで性質が変化してしまうことが問題となっているが、RhoAやRho kinaseの発現を調べている。当初予定していた手術検体を収集することが非常に時間を要している。また、免疫組織化学染色などの条件設定にも時間を要しているため、実験は遅れいている。また、前立腺間質細胞を使用した実験では不死化の細胞株がなく、継代により性質が変化するので、その対処に苦慮している。前立腺手術や膀胱全摘術時に採取した計31名の前立腺組織をホルマリン固定し、ステロイド5α還元酵素(5αredactase、SRD5A)Type1、2、3(5A1、5A2、5A3)について免疫学的染色を行った。SRD5A1,5A2は前立腺腺管のみに発現が認められたが、5A3は腺管だけでなく、間質細胞にも発現を認めた。5A1、5A2、5A3の発現には多くの場合その強度は一致していたが、5A3だけが発現が強いものや5A2だけが発現が強いものがあった。これらの発現と免染でのPSA、アンドロゲンレセプターの発現と比較したが、5A1とは関連が認められたが、5A2、5A3とは関連が認められなかった。また、前立腺が肥大すると5A1,5A2の発現が低くなる傾向があった。年齢との関連も認められなかった。さらにreal time RT-PCRにて5A1、5A2、5A3のmRNAでの発現を比較した。5A1の発現が高い組織では5A3の発現は高く、同様に5A1の発現が低い組織では5A3は低く、発現の強度の傾向が似ていた。

しかし5A2の発現は5A1や5A3との発現とは異なり、5A1や5A3の発現が高い組織でも5A2の発現が弱い場合やその反対の場合もあり、一定の傾向を認めなかった。さらに5A1や5A3では個人個人の発現にあまり差を認めなかったが、5A2は個々の発現に差があった。この研究をさらに進めるためにin vitroでの研究を行っている。細胞株として、前立腺正常組織上皮細胞と間質細胞、さらに前立腺癌細胞株としてLNCaP、DU145、PC3を用いて、その発現を-PCRで確認した。すべての細胞株で5A1、5A2、5A3が発現していることがわかった。これらの細胞に前立腺肥大症の発生に関連の強いサイトカインであるIL-1、IL-17、抑制のサイトカインであるIFN-γを添加し、SRD5Aを変化を見ている。肥大した前立腺を縮小させるためテストステロンをデヒドロテストステロンに変換する5α還元酵素(SRD5A)を阻害する薬が使われている。SRD5Aにはtype 1とtype 2以外に私達がクローニングしたtype 3(SRD5A3)があるが、前立腺肥大症との関連はよくわかっていない。そこで前立腺肥大症の組織、前立腺細胞株を用いて、SRD5A3について検討した。SRD5A3は前立腺上皮、間質の両者に発現しており、臨床症状が軽いほどその発現が高く認められた。細胞株に炎症を抑制させるIFNγを添加するとその発現が増強した。SRD5A3の発現を高くすると前立腺肥大症の症状を緩和させる可能性が示唆された。まずは免疫組織染色、PCRの実験を進めるとともに、in vitroの実験を並行して行うことで、実験の進捗状況の改善を目指す。また、同時に多くの検体が必要なためその検体も手術のたびに収集する必要がある。手術検体を収集し、免疫組織化学染色を進めるとともに、in vitroの実験も平行して、行うことで実験の遅れを取り戻す。泌尿器科研究に遅れが生じ、予定していた学会発表が延期になった為。延期していた学会発表に参加する。
初期糖尿病性腎症の病因の解析 一酸化窒素との関連について

糖尿病性腎症の原因の一つとしてあげられている腎血行動態の異常に関して、インスリン非依存型糖尿病モデルであるGKラットを用い、一酸化窒素合成酵素(NOS)およびシクロオキシゲナーゼ-2(COX2)の発現に関して検討した。GKラットは週令12週から蔗糖を負荷したもの(GS)と負荷しないもの(G)の2群を、対照群としては雄性Wistarラットを用い、36週目の腎臓を調べた。NOSの発現は神経型に関しては、macula densaに局在し、GS群で対照群、G群に比較し有意差はなかったが、減少、減弱傾向が認められた。しかしながら対照群、G群間いは差を認めなかった。内皮型はすべての動脈、細動脈、糸球体を含む毛細血管の内皮細胞に発現していたが、3群間で明らかな差はみられなかった。誘導型は発現が認められなかった。COX-2の発現に関しては、macula densaに局在があり、糸球体1個あたりのCOX-2陽性を示すmacula densa細胞数はG、GS群で対照群に比較し、増加傾向がみられ、さらにGS群はG群よりも多い傾向が認められた。以上より、蔗糖負荷しないGKラットのような軽度の高血糖ではmacula densaの神経型NOSの発現に変化はないが、蔗糖負荷でより高血糖にすると減少傾向がみられた。macula densaのCOX-2は神経型NOSと異なり、高血糖では増加傾向がみられ、蔗糖を負荷しない軽度の高血糖でもこの傾向が認められた。macula densaにおける神経型NOS、COX-2によって産生される一酸化窒素およびプロスタグランジンは糸球体血流量やレニン分泌に影響を与えることが報告されているが、高血糖における神経型NOS、COX-2は逆の発現パターンを示すことが示唆された。ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病ラットはSTZ投与2週後では腎腫大,腎での一酸化窒素(NO)産生の増加,それに伴う腎糸球体濾過値の増加が報告されている。STZ投与2週後の対照群,未処置STZ糖尿病群,NO産生阻害剤であるnitro-arginine methyl eater(L-NAME),アミノグアニジン(AG)投与糖尿病2群間で腎におけるNOSの発現を検討した。STZ投与2週後に摘出された腎は正常対照群に比べて有意に増加していたが,L-NAME,AG投与による影響は受けなかった。傍糸球体装置の神経型,内皮型,誘導型NO合成酵素(NOS)の発現を免疫組織学的,組織化学的に調べた。その結果,緻密斑に発現する神経型NOSはNADPH diaphorase活性で代用したが,糖尿病群で対照群に比べ有意に活性が減弱していた。このことは初期糖尿病で緻密斑における神経型NOSの発現の低下を示唆する。糖尿病群へのL-NAME,AG投与により神経型NOS発現の低下は阻止された。輸出入細動脈と糸球体係蹄における内皮型NOSの発現は免疫組織学的には4群間で明らかな差異を認めなかった。誘導型NOSはすべての群の傍糸球体装置,糸球体での発現はみられなかったが,糖尿病群に対照群で認められなかったouter medullaおよび少数のinner medullaの集合管での発現がみられ,L-NAME,AG投与によりさらに発現が増強していた。傍髄質領域の糸球体表面積は糖尿病群で有意に増加していたが,L-NAME,AG投与による有意な変化はみられなかった。以上の結果より,糖尿病状態における緻密斑の神経型NOSの低下は高血糖自体による直接影響ではなく,tubulo-glomerular feedback機構によることが示唆された。初期糖尿病ラットにおける腎のNO産生増加は,集合管における誘導型NOSの発現亢進が原因の一つとして考えられた。今回の研究により、初期糖尿病の腎におけるNOの病態生理の一部が明らかになった。

macula densaにおける神経型NOS、COX-2によって産生される一酸化窒素およびプロスタグランジンは糸球体血流量やレニン分泌に影響を与えることが報告されているが、高血糖における神経型NOS、COX-2は逆の発現パターンを示すことが示唆された。
β-カテニン系シグナルループによる子宮内膜癌の増殖抑制機構の解明と治療への展開

平成17・18年度の2年間にわたりβ-カテニンシグナルループによる子宮内膜癌(以下、内膜癌と略)細胞の増殖抑制機構の分子機構を検索し、β-カテニン遺伝子よる内膜癌遺伝子療法の可能性を模索した。内膜癌細胞株のIshikawa細胞にβ-カテニンを過剰発現させると、p14発現誘導を介してp53/p21系が活性化し、結果として細胞増殖は停止した。この過程でβ-カテニンの転写パートナーであるTCF4の発現増加を認め、TCF4のプロモーター解析により、β-カテニン/TCF4/p300複合体がTCF4のプロモーター領域に結合して転写レベルでその発現を誘導するpositive feedback loopを形成しp14/p53/p21系を活性化することが明らかになった。さらに、外因性β-カテニン過剰発現は、内因性p16発現増加を誘導し、p16のプロモータ0領域の解析の結果、β-カテニンがTCF4非依存性にp16遺伝子の翻訳開始点から上流の-385bpから-280bpのプロモーター領域を刺激することにより、その転写能を増加させる事が判明した。加えて、内膜癌細胞の増殖能はpRbのリン酸化及びp16の発現増加と相関し、その増殖抑制によりpRbのみが発現抑制されたことより、β-カテニンは、p16の発現調節を介してp16/pRb系を改変し内膜癌細胞の増殖を抑制することが判明した。今後は、これまでの結果を総合的に捕らえ、β-カテニンシグナルループによる内膜癌細胞増殖制御機構の分子基盤を確立させることにより内膜癌のβ-カテニン遺伝子療法への展開に繋げたい。子宮内膜癌細胞株であるIshikawa細胞で、変異型β-カテニンを恒常的に発現させると細胞増殖能は著しく抑制された。また、テトラサイクリンによる変異型β-カテニン発現誘導系でも同様の結果が得られた。この分子メカニズムとして、変異型β-カテニンがp14発現誘導し、その下流のp53/p21系が活性化し結果として細胞増殖が停止することが確認できた(Saegusa et al,Am J Pathol,2004 164,1739)。この過程で変異型β-カテニンの転写パートナーであるTCF4の発現増加を認めた。TCF4のプロモーター領域を検索すると、翻訳開始点から-430から-424bp上流にCTTTGAAというTCF4 binding siteが認められた。そこで、そのプロモーター領域をpGL3B vectorにサブクローニングしレポーターアッセイを行ったところ、変異型β-カテニンによりその転写活性は元進し、これは転写補助因子であるp300の添加により約12倍に増加した。これらの変化が上記binding siteの3塩基を置換することにより消失したことより、TCF4の発現は変異型β-カテニン/TCF4/p300がそのプロモーター領域に結合することにより転写レベルで発現が誘導され、かつpositive feedback loopを形成することが明らかになった。この結果を検証するために子宮内膜癌の外科的切除検体で、免疫組織学的に検索すると、変異型β-カテニンの核内集積部に一致してTCF4の発現が認められ、TCF4は変異型β-カテニンのターゲット分子であることが確認できた。現在、増殖抑制因子のp16発現調節における変異型β-カテニンの関与を分子レベルで検索中である。平成17年度に引き続きβ-カテニンシグナルループによる子宮内膜癌(以下、内膜癌と略)細胞の増殖抑制機構の分子機構を検索した。これまでの検索結果から、β-カテニンはTCF4及びp300と複合体形成しp14/p53/p21系活性化を介して細胞周期をG1期で停止させることが判明した。そこで、平成18年度は、もう一つの細胞周期G1/S期調節系であるp16/pRb系に注目した。

前回作成した外因性変異型β-カテニンを恒常的に過剰発現する内膜癌細胞(Ishikawa細胞)では、内因性p16の発現増加がmRNA及び蛋白レベルで確認できた。さらに、p16のプロモーター領域の解析を行うことにより、β-カテニンがTCF4非依存性にp16遺伝子の翻訳開始点から上流の-385bpから-280bpのプロモーター領域を刺激することにより、その転写能を増加させる事が判明した。一方、内膜癌細胞の増殖能はpRbのリン酸化及びp16の発現増加と相関し、その増殖抑制によりpRbのみが発現抑制されたことより、p16の発現誘導がpRb発現を抑制し、結果として内膜癌細胞の増殖が制御されることが示唆された。この結論を検証するために、外科的に切除された内膜癌組織検体の免疫組織学的検索を行ったところ、β-カテニンの核内異常集積巣に一致したp16の過剰発現及びpRbの発現低下が確認できた。以上から、β-カテニンは、p16の発現調節を介してp16/pRb系を改変し内膜癌細胞の増殖を抑制することが判明した。今後は、これまでの結果を総合的に捕らえ、β-カテニンシグナルループによる内膜癌細胞増殖制御機構の分子基盤を確立させることにより内膜癌のβ-カテニン遺伝子療法への展開を模索したい。
非線形偏微分方程式の解の構造と特異摂動問題の研究

昨年度、俣野と婁は、境界が鋸の刃状の形状をした平面内の帯状領域における曲率流方程を考えた。ある条件下で、この方程式は「周期進行波」と呼ばれる解をもつ。この周期進行波の平均速度が、境界の形状にどのように依存するかを調べるのは応用上も重要な問題であるが、これまで全く結果がなかった。俣野は婁と共同で境界の鋸の刃の周期を限りなく小さくしていったときの極限における平均速度を調べ、形式的な漸近解析によって、極限速度を精密に予想することに成功した。今年度は上に述べた周期進行波の平均速度を厳密な手法で評価し、予想が正しいことを証明した。詳しくいうと、平均速度の極限は、境界の凹凸の最大の傾きにのみ依存する。これは非常に意外な結果であり、我々自身も驚いている。また、上の結果を、境界が準周期的凹凸をもつ場合に拡張することにも成功した。この場合、周期進行波ではなく「準周期進行波」なるものが出現するが、このような進行波は新しい概念であり、その正確な意味付けも行った。我々は、さらに、周期的波状境界を持つ高次元シリンダー領域における界面進行波を考えた。その結果、進行波の平均速度は二次元と同じように評価され、極限進行波のプロファイルも類似の常微分方程式の解によって与えられることが分かった。今年度は次の成果を得た。平面上の一般的な曲率流方程式について、閉曲線の凸性を保存する条件が見つかった。よく分かるように、曲率流方程式(V=κ:Vは曲線が法線方向に動く速度、κは曲線の曲率)を満たす平面閉曲線は、凸の初期値から凸性を保存し、一点に縮む。この性質は空間一様、異方性を持つ平均曲率流方程式(V=F(κ,ν)、νは曲線の法線方向)に対しても正しいのであるが、空間非一様の方程式に対しては正しくない(簡単な反例がある)。婁はまず方程式V=κ+▽h(x,y)・ν(hはR^2の関数)に対して閉曲線の凸性を保存する条件を見つけた。さらに我々はこの結果を一般的な'(空間非一様、異方性を持つ)曲率流方程式(V=F(κ,ν,x,y))に拡張した。具体的には凸の閉曲線を初期値として曲線がずっと凸性を保存するための十分条件はHess_<x,y>Fが非負定値であることを示した。最近、俣野と婁は、境界が鋸の刃状の形状をした平面内の帯状領域における曲率流方程V=κ+Aを考えた。Aが十分大きくであれば、この方程式は「周期的進行波」と呼ばれる解をもつ。この周期的進行波の平均速度が、境界の形状にどのように依存するかを調べるのは応用上も重要な問題であるが、これまで全く結果がなかった。俣野は婁と共同で境界の鋸の刃の周期を限りなく小さくしていったとこの極限における平均速度を計算した。これは通常の"homogenization"の手法が全く通用しない特異極限問題であるが、詳細な漸近解析を行うことにより、極限速度を決定することに成功した。現在、この手法をより一般の形状の周期的境界を持つ帯状領域に拡張途上である。
社会関係資本の醸成に寄与するコミュニティカフェの特性に関するフィールド研究

人びとが安心して暮らしていくうえで,自分らしくいられる居場所があること,心地よい人間関係があることは重要である。くわえて,自宅(ファーストプレイス)や職場・学校(セカンドプレイス)のほかにも,居場所をもつことの意義が指摘されている。そうした場はサードプレイスと呼ばれ,人びとのつながりをはぐくみうる。ただし,どこかに場所を設ければ,自ずと人びとの居場所となったり,人びとのつながりが生まれるわけではなく,様々な工夫や配慮が求められる。本研究では,サードプレイスが機能する仕組みを詳細に明らかにすることを目的とする。とくに,サードプレイスのひとつとなりうるコミュニティカフェに焦点をあてる。
心筋細胞保護シグナルにおけるコネキシン43の役割

心筋細胞において細胞膜上のコネキシン43(Cx43)はG蛋白連関受容体のβサブユニットと相互作用することによってクラスIB PI3キナーゼ(PI3K)の活性化に寄与しており、PI3K-Akt-グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β経路の活性化、その結果としての細胞死抑制に必須な役割を果たしていることが明らかとなった。一方、ミトコンドリアATP感受性K^+チャネルの制御に寄与しているミトコンドリアCx43はG蛋白連関受容体によるPI3K-Akt活性化には関与していないことが示された。培養心筋細胞(H9c2細胞)においてIGF-1受容体、δ-オピオイド受容体の刺激はいずれも細胞保護シグナルであるAkt、glycogen synthase kinase-3β(GSK3β)のリン酸化をもたらすが、siRNAを用いてコネキシン43(Cx43)の蛋白発現を抑制するとIGF-1によるAkt-GSK3βリン酸化には影響がなかったが、δ-オピオイド受容体刺激によるものは有意に阻害された。エンドセリン受容体刺激によるAkt-GSK3βリン酸化もCx43の発現抑制により阻害された。酸化ストレスによる細胞壊死はIGF-1、δ-オピオイドいずれによっても有意に抑制されたが、δ-オピオイドの細胞保護効果のみCx43の発現抑制により阻害された。GSK3βを直接塩化リチウムにより阻害した場合には、低酸素再酸素化やantimycin Aによる活性酸素の産生が抑制されることが観察された。以上の成績より、Cx43はサイトカイン受容体であるIGF-1受容体の刺激によるAkt-GSK3βリン酸化には必須ではないが、G蛋白連関受容体によるこの細胞保護シグナルには重要であること、またGSK3βリン酸化によるその活性抑制が細胞保護をもたらす機序の一つとして活性酸素抑制が考えられた。G蛋白連関受容体によるPI3K-Akt-GSK3βリン酸化に寄与するCx43が細胞膜上のものであるのかミトコンドリアに局在するCx43であるのかを明らかにするために、ミトコンドリアへのCx43輸送をgeldanamycin (HSP90阻害薬)ならびにTOM20siRNAで抑制することを試みた。これまで種々の濃度のgeldanamycinを検討したが、この薬剤ではミトコンドリア分画のCx43を有意に減少させることはできなかった。TOM20siRNAについてもこれまで十分効果的なものが得られておらず現在検討を継続中である。培養心筋細胞(H9c2細胞)においてIGF-1受容体、エンドセリン(ET)受容体刺激による細胞壊死抑制効果の特徴を評価するためにantimyicin A(AA)の用量とapotosis,necrosisとの関係、IGF-1ならびにETの細胞保護効果の用量依存性につきflow cytometryを用いて解析した。種々の条件で実験を行ったが、いずれの条件でも障害された細胞では接着した状態からの分離に伴う細胞死が惹起され、細胞死量を過大評価することが明らかとなり、H9c2細胞を用いた細胞障害の解析には適さない方法であると考えられた。ミトコンドリアにおけるコネキシン43(mCx43)の機能制御に関与する分子としてmicroRNA199a(miR199a)を想定し、miR199a antagomirのAkt,GSK-3βへの影響、IGF-1,ETによる細胞保護効果への影響を解析した。その結果、miR199a antagomirはHIF-1αの発現を亢進させたがAkt,GSK-3βのリン酸化に有意な影響を与えなかった。しかし、miR199a antagomirによるmiR199aの抑制はIGF-1,ETと同様にAAによるapoptosis,necrosisからH9c2細胞を保護し、その効果はIGF.-1,ETの併用によっても増強されなかった。これらの成績よりmiR199aは細胞死制御に重要な分子であると考えられ、現在mCx43の発現ならびに機能とmiR199aの機能、cyclophilin-Dとmitochondrial permeability transition poreの構成蛋白であるadenine nucleotideとの蛋白蛋白相互関連におけるmCx43、GSK-3β、miR199aそれぞれの役割について検討を継続中である。平成21年度までに、G蛋白連関受容体活性化によるPI3K-Akt-GSK-3βシグナルにはconnexin-43(Cx43)の存在が必要であること、一方、同じシグナル経路をIGF-1受容体刺激で活性化する際にはCx43は必要とされないことを明らかにした。今年度では、G蛋白連関受容体刺激で活性化されるPI3K-Akt-GSK-3βシグナルに関与するCx43が細胞膜上のものであるのか、ミトコンドリアに存在するCx43であるのかを検討した。

ミトコンドリアにおけるCx43のみをHSP90阻害により減少させることを試みたが、十分な結果が見られなかった。そこでミトコンドリアCx43の主な機能がATP感受性K^+チャネル(mK_<ATP> ch)の開口による活性酸素(reactive oxygen species,ROS)を利用し、Mito Tracker RedをプローブとしたROS産生をミトコンドリアCx43機能の指標とした。H9c2細胞において、G蛋白連関受容体(δ-opioid受容体、ET_<A/B>受容体)刺激ならびにmK_<ATP> ch開口薬であるdiazoxideはROS産生を亢進させたが、IGF-1にはそのような効果はみられなかった。さらにsiRNAを用いてCx43の蛋白発現を80%抑制した条件でも、G蛋白連関受容体刺激によるROS産生には低下がみられなかった。一方、免疫沈降実験によりCx43によりG蛋白のβ-subunitが蛋白蛋白結合することが示され、GβsiRNAを用いたGβ発現のノックダウンはCx43ノックダウンと同様に、G蛋白連関受容体活性化によるPI3K-Akt-GSK-3βシグナルを阻害した。抗PI3K p110γsubunit抗体によってCx43を免疫沈降することはできなかった。以上の成績から、細胞膜上のCx43とGβとの蛋白蛋白相互作用class I_B PI3Kの活性化に寄与していると考えられた。
乳児の泣きにみる発声-四肢運動間の同期性と自律神経活動との関連

本年度は、昨年度に引き続き、3-4ヶ月齢の健常満期産児を対象に、自発的啼泣時の自律神経活動および発声-運動間の同期性に関する調査を実験室環境下で実施した。分析については、運動面だけでなく発声面に関しても、啼泣前後において各指標がどのように変化するのかを検討した。これまでの分析から明らかになった点は以下の通りである。3-4ヶ月児は啼泣時において、1)自発発声の頻度が増加する一方で、メロディー(F0の時間的反動)・フォルマント周波数(F1, F2)の抑揚や発声間隔の変動が減少する点、2)自発運動の頻度・活動量が増加する一方で、躍度の上昇や両足の協調性の減少が生じる点、3)心拍数の増加と心拍変動の全体的な減少などの自律神経活動の動的な変化が生じる点が明らかになった(Shinya, Watanabe, & Taga, 2018;新屋・渡辺・多賀, 2019)。これらの結果から、啼泣時には情動中枢の活動亢進により、副交感神経系(迷走神経)が抑制され、声帯・声道の緊張が高まることで音響特徴が変化する可能性や、皮質の発声・運動中枢が抑制され、随意的な制御が低下する可能性が示唆された。今後は各指標の時系列データに関するより詳細な分析を追加し、国際ジャーナルに論文を投稿する予定である(Shinya, Watanabe, & Taga, in prep)。また、本研究で示した自律神経系と運動・発声間の共変動については、皮質機能の発達に伴い抑制や調整が可能になっていくと考えられるが、今後はより年長の児を対象とすることで検証していく必要がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまでに、周産期の自発的な泣き(啼泣)に関する研究を行い、その基本周波数の特徴が、自律神経活動の個人差や、その後の言語発達と関連することを明らかにしてきた。一方、先行研究の大半は、啼泣時の発声のみを対象としており、啼泣時の生理状態の動的な変化や、発声と四肢運動の関連性については検討されてこなかった。本研究では、申請者の先行研究を発展させ、乳児期初期の児を対象に、啼泣時の自律神経活動の動的な変化を測定し、その際の発声・四肢運動の特徴および、発声-運動間同調との関連性を検討することを目的とした。本年度は3ー4ヶ月齢の健常満期産児を対象に、実験室環境下において、自発的啼泣時の自律神経活動および発声-運動間の同期性に関する調査を実施した。運動の指標として、両足の動きの加速度および躍度、両足の加速度の相関関係を評価した。また、自律神経活動の指標として、心拍・呼吸・顔面皮膚温を取得し、発声の指標として、基本周波数や音声パターン(メロディーやリズムの変動性)についての解析を行った。現在までの分析で、以下の点が明らかになった。3ー4ヶ月児は啼泣時において、1)自発運動の頻度が増加する一方で、ぎこちなさ(躍度)が上昇し、両足の協調性が減少すること、2)同時に、心拍数の増加と心拍変動(ゆらぎ)の全体的な減少などの自律神経活動の動的な変化が生じること、が明らかになった。来年度はさらにデータの収集を進め、発声を含む自発運動と自律神経活動の共変動や相互作用についての分析を進めていく予定である。本年度は、本研究課題の予備的計測を行った上で、実験室環境下における3ー4か月乳児のデータ取得および分析を進めることができた。現在までに得られた知見については、来年度6月に開催される発達科学系の国際学会(国際赤ちゃん学会)において発表する予定である。

また、本研究で示した自律神経系と運動・発声間の共変動については、皮質機能の発達に伴い抑制や調整が可能になっていくと考えられるが、今後はより年長の児を対象とすることで検証していく必要がある。来年度はデータの収集および分析をさらに進め、得られた成果については国内外の学会で積極的に発表し、公の場での検討を積み重ねる予定である(国際赤ちゃん学会、日本発達心理学会など)。また同時並行で、原著論文の執筆を行い、年内に国際学術誌に投稿することを目指す。さらに、申請者のこれまでの研究と本研究で得られた知見から、乳児期初期の自発的啼泣の神経生理的メカニズムに関するレビュー論文を執筆する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Toll-like receptorの遺伝子多型が敗血症の病態と予後に及ぼす影響

近年、敗血症(Sepsis)の病態や予後に炎症性メディエーターの遺伝子多型が関与するのではないかとの報告が相次ぎ、注目を集めている。Toll-like receptor 4(TLR4)は最近発見されたLPS受容体でLPSに対する生体の反応性に重要な役割を果たしている。昨年ヒトのTLR4に遺伝子多型が存在し、LPSに対する生体感受性に関与する可能性が報告された。ヘム分解の律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO)はストレス蛋白の1種でその発現にTLR4が関与することが示唆されている。本研究ではTLR4の遺伝子多型がSepsisの予後に及ぼす影響を明らかにする第1段階として、全身麻酔、あるいは脊髄くも膜下麻酔を受ける外科手術患者を対象に、HOによるヘム分解反応により体内で生成される一酸化炭素(CO)を動脈血中COヘモグロビンレベルと呼気COレベルで検知し、その周術期における変化を検討した。その結果、呼気COレベル、動脈血中COヘモグロビンレベルはともに術前値にくらべて術後1日目には有意な高値を示すことが明らかとなった。一方、全身麻酔群と脊髄くも膜下麻酔群の比較ではいずれの値も有意差が認められなかった。この結果は、全身麻酔による肺への侵襲より、むしろ外科侵襲による全身性の炎症反応が酸化的ストレスを引き起こし、HOを細胞内に誘導し呼気COレベルの増加につながったことを示唆している。この結果はTLR-4の遺伝子多型研究につながる画期的成果である。そこで、TLR4遺伝子多型がSepsisの病態と予後に及ぼす影響について検討するため、以下の研究計画を立案した。日本人のTLR4遺伝子、TLR4と関連するLPS受容体:CD14遺伝子、炎症の遺伝子であるTNF-α遺伝子、これらの遺伝子多型が白血球のLPS反応性に及ぼす影響を明らかにする。そのため、健康成人50名(男性25名、女性25名のボランティア)より、各人、20mlずつ採血を行い、密度勾配遠心法により多形核白血球(PMN)、単球を分離する。PMNよりDNAを精製し、Restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction(RFLP-PCR)法により、これらの遺伝子多型を解析し、野生型遺伝子と変異型遺伝子の頻度を検討する。さらに、分離した単球を10%FCS-MEM培地にて培養し、LPS(10μg/ml)を培地に添加した後、培地中の炎症性サイトカインTNF-α濃度をELISA法にて測定し、遺伝子多型とTNF-α濃度と関係について検討する。本研究はヒトDNA解析を行うため、現在、上記研究計画を岡山大学医学部倫理委員会へ申請している。
電圧制御型スピン波演算素子の要素技術開発

磁気モーメントの波である「スピン波」は周波数・位相・強度などの情報を有しており、それらを制御したり干渉させることによって、様々な論理演算を行うことができる。従来のスピン波論理演算素子は磁場やスピントルクなど電流によって励起・制御されるものがほとんどであり、演算操作に大きな電力を消費してしまう。本研究では、代表者がこれまでに行ってきた電圧誘起磁気異方性制御技術を応用することで、電圧によってスピン波を生成、強度・位相制御を行う新しい技術の開発に取り組む。本年度は、昨年度得られたPt/Co/MgO系において得られた電圧効果によるスピン波の変調から、スピン波のロジック演算に必要な180度位相を反転させるの必要な電圧効果を理論的に見積もった。その結果、これまで報告されている電圧効果の範囲で十分実現可能である事がわかった。またFeCoB/Ru/FeCoBの人工反強磁性体におけるスピン波伝搬の観測を行った。この系では、上下の強磁性体が非磁性層を介した反強磁性的な層間交換結合に加えて、スピン波が存在する時には双極子磁場による相互作用のために、単層の強磁性体とは異なるスピン波の特性を有する事がわかった。具体的には、磁場を加える方向によって、スピン波の分散関係が波数に対して非対称となり、巨大に非相反周波数シフトが観測された。これは、これまで報告されていたジャロシンスキー守谷相互作用による周波数シフトに比べても非常に大きな効果であった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。従来のスピン波論理演算素子は磁場やスピントルクなど電流によって励起・制御されるものがほとんどであり、演算捜査に大きな電力を消費してしまう。そこで本研究では、代表者がこれまで行ってきた電圧誘起磁気異方性制御技術を応用することで、電圧によってスピン波の生成、強度・位相制御を行う新しい技術の開発に取り組む。本年度は、電圧による磁化ダイナミクス励起現象の解明と、電圧による垂直磁気異方性変調の効率を上げることを目的に研究を行った。まず、MgO/FeB/Wをフリー層とする垂直磁化型のトンネル磁気抵抗素子を用いて高周波電圧を印可した際の磁化ダイナミクスをホモダイン検波法を用いて明らかにした。高周波電圧の電圧強度を大きくしていくことで、磁化の歳差角が大きくなり共鳴ピークが低周波側にシフトし、ひずんだ共鳴スペクトルが観測された。また興味深いことに、共鳴周波数のの1/2の周波数ところにも共鳴ピークが観測された。この現象はマクロスピンシミュレーションによっても再現され、これらの非線形現象を理解することは、電圧によるスピン波励起に向けて重要な鍵になると思われる。次に、MgO/CoFeB接合系において電圧による垂直磁気異方性変調の効率を上げるためにTa下地層においてCoFeBの組成依存性及びアニール温度依存性を調べた。すると全ての組成において250°C付近のアニール温度で電圧効果は最大となり、またFeとCoの組成比率を7:3にした時に大きな電圧効果が得られた。これらの事はスピン波を効率的に制御する上で重要な知見が得られた。電圧によるスピン波励起に向けた電圧誘起強磁性共鳴における非線形磁化ダイナミクスの解明にはさらなる追加実験やシミュレーション計算による検討が必要なことから、論文としての報告は遅れている。一方、電圧による垂直磁気異方性変調の高効率化については、おおむね順調に進展している。そこで本研究では、代表者がこれまでに行ってきた電圧誘起磁気異方性制御技術を応用することで、電圧によってスピン波を生成、強度・位相制御を行う新しい技術の開発に取り組む。本年度は、Pt/Co/MgO系において評価を行った。Pt/Co/MgO系は、界面垂直磁気異方性(PMA)および界面ジャロシンスキ・守谷相互作用(DMI)に関する多くの研究が進められており、その系において電圧効果を評価することが意義があるものと考えられる。まずスピン波の伝搬方向に依存した共鳴周波数の違い(非相反性)から界面DMIの大きさを評価した。次に電圧印可下で共鳴周波数の違いからPMAおよびDMIの電圧変調度を評価することができた。またスピン波ロジック演算操作に必要なπ位相変調に必要な電圧変調度も計算により見積もった。またこれまでは強磁性金属を中心に電圧効果の研究を進めてきたが、新たに強磁性絶縁体であるイットリウム鉄ガーネット(YIG)の電圧効果についても研究を進めた。今年度は主に成膜条件の探索を行う事で、スパッタ成膜によりナノメートル膜厚で制御されたYIGの作製に成功した。またスピン波伝搬の膜厚依存性も観測することができた。電圧によるスピン波の制御に関して、界面垂直磁気異方性(PMA)および界面ジャロシンスキ・守谷相互作用(DMI)について広く研究されているPt/Co/MgO系において、スピン波を用いてそれぞれの電圧変調度を観測することに成功した。しかし、電圧変調度は小さく、まだまだ改善が必要である。

またこれまではスピン波伝搬の媒体として強磁性金属を中心に研究を進めてきたが、新たに強磁性絶縁体であるイットリウム鉄ガーネット(YIG)のスピン波伝搬に関する研究も進めている。当初の研究計画に予定していなかった成果も得られており、おおむね順調に進展していると思われる。磁気モーメントの波である「スピン波」は周波数・位相・強度などの情報を有しており、それらを制御したり干渉させることによって、様々な論理演算を行うことができる。従来のスピン波論理演算素子は磁場やスピントルクなど電流によって励起・制御されるものがほとんどであり、演算操作に大きな電力を消費してしまう。本研究では、代表者がこれまでに行ってきた電圧誘起磁気異方性制御技術を応用することで、電圧によってスピン波を生成、強度・位相制御を行う新しい技術の開発に取り組む。本年度は、昨年度得られたPt/Co/MgO系において得られた電圧効果によるスピン波の変調から、スピン波のロジック演算に必要な180度位相を反転させるの必要な電圧効果を理論的に見積もった。その結果、これまで報告されている電圧効果の範囲で十分実現可能である事がわかった。またFeCoB/Ru/FeCoBの人工反強磁性体におけるスピン波伝搬の観測を行った。この系では、上下の強磁性体が非磁性層を介した反強磁性的な層間交換結合に加えて、スピン波が存在する時には双極子磁場による相互作用のために、単層の強磁性体とは異なるスピン波の特性を有する事がわかった。具体的には、磁場を加える方向によって、スピン波の分散関係が波数に対して非対称となり、巨大に非相反周波数シフトが観測された。これは、これまで報告されていたジャロシンスキー守谷相互作用による周波数シフトに比べても非常に大きな効果であった。本年度は所属が産業技術総合研究所から京都大学へ移動したため、前半は研究室内での素子作成技術の確立、および測定環境の整備を行う。環境が整い次第、スピン波の電圧制御に関する研究に注力していきたい。現状得られている電圧変調度ではまだまだ小さく、今後強磁性層/絶縁層の界面の最適化や材料系の工夫によりさらに電圧変調度を上げていきたい。また新たにナノメートルスケールで制御されたイットリウム鉄ガーネット(YIG)薄膜におけるスピン波の電圧制御に関する研究についても進めていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
小児の感染症における抗生剤の有効性について

薬剤の唾液への移行濃度を測定することによって、薬剤の有効性の指標となる血中濃度を推測することが可能であるかどうか、両者の相関性について、新規マクロライド系抗生物質クラリスロマイシンを用いて検討し、また、同剤について小児における歯科口腔領域の臨床的有効性について検討した。研究方法:本実験に対して、承諾の得られた健康成人11名(男子8名、女子3名)に対し、クラリスロマイシン200mgを投与後、経時的に血液と唾液を採取し、Bioassay法(paper disc法)にて各々の濃度を測定し、パーソナルコンピューターNEC 9801を使用し、一次吸収one compartment modelによる薬動力学的パラメータを求め、血中および唾液中濃度濃度曲線を作成した。次に3歳11カ月から15歳5カ月までの小児で、感染予防症例13名と、歯性感染症例8名、合計21名の患児に対し、同剤を適量投与し、臨床的有効性を検討し、小手術症例に関しては、術前に1回量を内服してもらい、術中、手術創内に貯留した血液および唾液を同時に採取し、濃度を測定した。結果:成人の平均値の血中および唾液中濃度曲線のパラメータでは、血液は、Tmax2.02h,Cmax1.34mug/ml、唾液は、Tmax2.32h,Cmax1.44mug/mlと、Tmax,Cmaxとも、唾液の方が、血液よりやや高い値を示したが、両者間には、有意な差は認められなかった。また唾液中濃度は、血中濃度とほぼ類似した体内動態をとり、これより血中濃度を推測することが可能であると同時に、小児においても、同様なことがいえると考えられた。小児では、小手術症例すべてが、本剤のMIC 0.39mug/ml以上の濃度を示し、唾液中、血中濃度とも同程度の値を示した。臨床的有効性については、歯性感染症例では87.5%、感染予防症例では、92.3%と高い有効率を示した。
外集団敵対行動の一般交換過程に関する実証的研究

平成15年度は、外集団敵対行動の連鎖(集団間における報復の連鎖)をもたらすマイクロ過程の外集団一体視に関する実験研究と、外集団一体視の成立基盤と考えられる集団内制裁行動に関する実験研究とコンピュータ・シミュレーション研究を行った。1)ポジティブ感情における外集団一体視に関する実験研究平成14年度までの研究からは、外集団成員に対する否定的感情は外集団一体視を引き起こし、その外集団のほかの成員にまで敵対行動を向けさせることが明らかにされている。本研究ではさらに、外集団成員への否定的感情と同様に肯定的感情も外集団一体視を引き起こすかどうかを検討した。実験では、14年度に開発した鎖状独裁者ゲームを用いた。実験の結果、外集団のある成員に厚遇された実験参加者は、その外集団に属する別の成員を厚遇する傾向が認められ、外集団一体視の存在が確認された。2)集団内制裁傾向の規程因に関する実験研究外集団一体視にはどのような適応的機能があるのか。ここでは、「外集団一体視が、その外集団内部における制裁(報償)を促進させる」という仮説をたて、その妥当性を場面想定法実験によって検討した。実験では、「ある集団の成員として一体視される状況では、そうでない状況より、内集団の逸脱者に対する否定的感情が喚起される」という実験仮説を検証した。しかし仮説は支持されなかった。3)集団内制裁行為の進化に関するコンピュータ・シミュレーション研究集団内制裁行為がどのような状況で進化するのかを検討するため、進化的シミュレーションを実施した。その結果、集団内制裁行動における「フリーライダー問題」が克服されるのは、集団成員の逸脱にともなう不利益が集団成員全体へ波及する場合であることが示唆された。外集団一体視には、このような波及作用をもたらす機能があると考えられる。平成14年度は、独裁者ゲームを用いた2つの実験によって、「外集団成員からの被差別」という経験が、外集団一体視(集団を1つの主体のように捉えること)を生み、それによって敵対行動の一般交換(外集団のある成員によって喚起された敵意を、同じ外集団の別の成員へ向けること)がもたらされることを検証した。独裁者ゲームとは、分配者の役割をするプレイヤーが、ある一定額の報酬を、自分と被分配者の役割をする別のプレイヤーの間で自由に分配するものである。第1実験では、この独裁者ゲームを用いて、外集団一体視による敵対行動の一般交換が生じるかどうかを検討した。この実験の参加者は、最初に被分配者の役割をし、外集団成員(他学科生)の分配者に搾取される経験をした。次に分配者の役割をし、自分と他の1人との間で自由に報酬を分配する機会が与えられた。この際、その被分配者が、最初に実験参加者から搾取した者と同じ外集団に所属している場合(同集団条件)と、異なる外集団に所属している場合(異集団条件)が設定されていた。外集団一体視が起きれば、同集団条件の方が被分配者から搾取するはずだが、実験の結果、そのような差は認められなかった。これは、外集団成員から個人的に不当な扱いを受けた場合ではなく、差別的な扱いを受けた場合に、外集団一体視が起こるという神(2001)の指摘を支持するものである。次いで、分配者が、自分以外の内集団成員と外集団成員の間に報酬を分配する変形独裁者ゲームを用いて、それ以外は第1実験と基本的に同じ手続きで第2実験を行った。その結果、被分配者時に外集団成員による内集団ひいきで不利益を被った参加者は、分配者時に、同じ外集団の成員に対して少ない報酬を与える傾向が認められ、差別的な行為に対しては外集団一体視が生じ、敵対行動が連鎖することが示された。
患者自己決定志向に及ぼす諸要因に関する研究

本年度は乳がん治療における患者自己決定行動に影響を及ぼす要因の同定と、乳がん治療後の抑鬱傾向に対する自己決定志向の影響について評価を試みた。対象者は調査に同意を得た某総合病院の乳がん入院患者73名(平均年齢51.0歳)であり、術後1週間後に調査員による面接調査を行った。また治療後の抑鬱傾向を聴取するため退院2ヵ月後に郵送自記式調査を行った。解析は面接調査にて欠損値のない72名(治療後抑鬱の解析は42名)を対象とした。乳がん治療における自己決定行動は実際に受けた治療を「治療方針の選択肢からある特定の治療法を選択する(選択)」、「選択された治療方針を受容する(受容)」二つのプロセスに分け、それぞれについて自身が関与した程度を5段階のスケールで評価した。それぞれの自己決定行動スコアと前年度評価した自己決定志向スコアとの単純相関係数は0.28(選択)、0.22(受容)であった。また各自己決定行動スコアを従属変数とした多変量解析を行ったところ、選択決定行動に自ら関与する者の傾向として未婚、乳がん家族歴有、高自己決定志向が、また受容決定行動に関与する者の傾向としては未婚であることが示唆された。さらに治療後抑鬱傾向についてもCES-D(The Center for Epidemiologic studies for Depression)スコアを従属変数とした多変量解析を行ったところ、抑鬱傾向はその時点でのGHQ(The General Health Questionnaire)による精神的健康状態と痛み、吐き気症状の有無と有意な関連が見られ、自己決定志向については有意な関連は見られなかった。本研究により乳がん患者において治療法選択行動に自己決定志向が関与していること、また治療後の抑鬱傾向には自己決定志向が関与しているとはいえないことが示唆された。本年度は医療における自己決定志向を計量する質問項目の開発を行い、無作為に抽出された某市一般住民を対象にその評価を試みた。某市の選挙人名簿をもとに20歳以上70歳未満の一般住民を各年齢層性別に30名ずつ計300名を無作為抽出し、郵送にて無記名調査票を配布、回収した。回収率を上げるため催促状も郵送し、164名より調査票を回収した。解析は欠損値のない男性64名、女性62名について行った。自己決定志向を示す6項目について内的整合性を示すCronbach'sα係数は0.70であった。また自己決定志向に影響を及ぼすと考えられる自身の身体、心の状態(健康資本)に対する質問項目を因子分析したところ、「健康資本に対する所有」および「健康資本の保全向上」の二因子に分かれ、それぞれのCronbach'sα係数は0.71、0.68であった。自己決定志向6項目の合計得点を自己決定志向得点とし、その外的妥当性を検討するため他の指標得点との相関係数を求めたところ、「健康資本の保全向上」得点および、DeberらによるDecision Making scoreとの相関係数が有意となり、それぞれ0.26、0.23であった。また年齢、性別等の影響を取り除くため自己決定志向得点を従属変数とした多変量解析においてもこの二要因が有意な影響要因として検出された。この調査結果から個人の医療における自己決定志向を計量するのに6つの質問項目が有用であること、また自己決定志向には自己の健康資本に対する所有意識よりも健康資本の保全向上意識が影響していることが示唆された。この結果をもとに、自己決定志向と実際の医療の場面での自己決定行動との関連および自己決定志向と治療後不安との関連を明らかにするため、現在某総合病院にて乳腺疾患患者を対象にインタビュー形式の調査が進行中である。
口腔がんに対する、がん抗原由来長鎖ペプチドを用いたがんペプチドワクチン療法の開発

本研究では、口腔がん患者に対する、より有効性の高いがん免疫療法の開発を目指して、1ヘルパーT細胞と細胞傷害性T細胞の両者を誘導・活性化するHLAクラスII分子拘束性の腫瘍抗原由来の長鎖ペプチドの同定、2ペプチドワクチンの治療効果を予測するマーカーの開発について検討を行った。その結果、腫瘍抗原であるIMP-3、DEPDC1、MPHOSPH1由来の長鎖ペプチドを複数同定した。これらの長鎖ペプチドの一部は、ヘルパーT細胞のみならず細胞傷害性T細胞も活性化することができ、腫瘍免疫の活性化に有望であることが示唆された。また、これらの腫瘍抗原特異的ヘルパーT細胞のT細胞受容体の同定を行った。細胞傷害性T細胞(CTL)誘導性短鎖ペプチドを用いたがんペプチドワクチン療法の臨床試験の際に標的となった腫瘍抗原である、IMP-3、DEPDC1、MPHOSPH1由来の新規長鎖ペプチドの同定を行った。長鎖ペプチドのアミノ酸配列の推定にはコンピューターアルゴリズムを利用した。その際、適応患者を考慮して日本人に発現頻度の高いHLAクラスII分子を標的とし、また長鎖ペプチドのアミノ酸配列内にCTLエピトープ配列を自然配列として内包させることで、CTLとヘルパーT (Th)細胞の両者を誘導し得る可能性を持つ長鎖ペプチドを合成した。これらの長鎖ペプチドを用いて、in vitroで健常人由来の末梢血単核細胞(PBMC)を刺激し、ペプチド特異的なTh細胞の誘導を行った。ペプチド特異的なT細胞の解析には、IFN-γELISPOT解析およびテトラマー解析を用いた。その結果、合成した長鎖ペプチドに特異的なTh細胞の誘導を複数確認でき、これらのペプチドをTh細胞誘導性の長鎖ペプチドとして同定した。次に、CTLエピトープ配列を自然配列として含む長鎖ペプチドのクロスプレゼンテーション能をin vitro、およびin vivoで検証した。その結果、CTLエピトープ配列を自然配列として含む長鎖ペプチドによって、Th細胞のみならずCTLも誘導できることをin vitroおよびin vivoの両者で確認できた。さらに、これらのTh細胞を特異的ペプチドで刺激しその培養上清をELISAで解析した結果、Th1サイトカインが優位に産生されていることが分かった。次いで、これらの長鎖ペプチド特異的なTh細胞のT細胞受容体(TCR)を遺伝子解析した。その結果、ペプチド特異的に反応するTCRを同定することができた。これらの研究成果を2016年10月に行われた日本口腔外科学会総会・学術集会、12月に行われた日本免疫学会総会・学術集会で発表した。理想的な腫瘍抗原である、IMP-3、DEPDC1、MPHOSPH1に由来するTh細胞誘導性の長鎖ペプチドを複数同定することができ、これらのペプチドのクロスプレゼンテーション能、TCR解析を行うことができた。腫瘍細胞と成人の精巣のみ発現するとされる、腫瘍関連抗原(DEPDC1、MPHOSPH1)由来の新規長鎖ペプチドの同定を行った。コンピューターアルゴリズムでHLAクラスIIに高親和性を示す長鎖ペプチドのアミノ酸配列を複数推定し、in vitroで健常人由来の末梢血単核細胞(PBMC)をそのペプチドで刺激し、ペプチド特異的なヘルパーT細胞の誘導を行った。また、その長鎖ペプチド内に細胞傷害性T細胞(CTL)エピトープ配列を自然配列として内包させ、CTLとヘルパーT細胞の両者を誘導し得る可能性を持つ長鎖ペプチドも合成し、その免疫原性とクロスプレゼンテーション能を健常人のPBMC、もしくはHLA-A2トランスジェニックマウスを用いて確認した。次に、癌患者のPBMCを用いて、同定した長鎖ペプチド特異的なヘルパーT細胞の反応が癌患者の体内に実際あるか否か検討し、癌患者内に同定した長鎖ペプチド特異的なヘルパーT細胞の存在を確認した。次に、DEPDC1、MPHOSPH1由来の長鎖ペプチドに特異的なヘルパーT細胞クローンのT細胞受容体(TCR)の遺伝子解析を行い、ペプチド特異的に反応するTCRのα鎖とβ鎖を同定した。これらの研究成果より、同定された長鎖ペプチドはがんペプチドワクチン療法に有用である可能性が示された。これらの研究成果を2017年10月に行われた日本組織適合性学会大会で共同演者として発表し、学術奨励賞が授与された。また、これらの研究成果をOncoimmunology (Impact Factor; 7.719)に投稿し、アクセプトされた。近年、免疫チェックポイント阻害薬が大きな注目を浴びている。頭頸部癌においても、2017年3月に保険適応となった。今後は、ペプチドワクチン療法と免疫チェックポイント阻害療法の併用療法の有効性を検討したいと考えている。また、免疫チェックポイント阻害抗体の投与タイミングなどを調整し、最も抗腫瘍効果の高い併用療法のプロトコールを探索する予定である。

さらに、ペプチドワクチン療法の治療効果予測に有効なバイオマーカーの同定を、患者血液中の血清を用いて行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。口腔がん29年度が最終年度であるため、記入しない。