hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生殖細胞の雄性分化におけるRNA制御とその破綻による精巣腫瘍発生の分子機構

2は始原生殖細胞の性分化において、異所的な減数分裂を抑制すると同時にオス特異的な遺伝子発現を促進することが明らかになっている。しかしながら、NANOS2はin vitroにおいてRNAとランダムに結合することから、その特異性を決める分子機構は不明であった。本研究においては、もう一つのRNA結合タンパク質Dead end1とNANOS2の結合を明らかにし、その生理的・生化学的な意義について解析を行った。その結果、Dead end1がNANOS2のRNA結合特異性を決定することで雄性分化に重要な役割を果たすことが明らかになった。平成26年度にはDND1条件付き欠損マウスの表現型解析が主な計画であった。当初の目標通り、DND1条件付き欠損マウスにおける精巣性テラトーマ発症の詳細な表現型解析を行った。さらに、Nanog-GFPトランスジーンの導入によってそれらの細胞を可視化することにも成功した。27年度の解析からDnd1欠損におけるPGCのトランスクリプトーム変化が明らかになった。これにより、Dnd1欠損によって発現が上昇または下降した遺伝子の中に精巣性テラトーマ発症の原因となる遺伝子が含まれていると考えられる。28年度においては、これらの遺伝子を強制発現または欠損させることによって精巣性テラトーマを発症する遺伝子改変マウスを作製し、Dnd1欠損による精巣性テラトーマ発症の原因を明らかにすることを目指す。発生生物学、細胞生物学平成27年度においてはDND1結合タンパク質の機能解析を行う。具体的にはDND1との結合の生化学的な解析、局在等の細胞生物学的解析、さらには強制発現と機能喪失による生理的な解析を行う予定である。27年度はトランスクリプトームを解析する上でマイクロアレイとと次世代シーケンスを行った。マイクロアレイに関しては当初計画通りに行ったが、次世代シーケンスに関しては共同研究として行ったために当初計画よりも安い価格で行うことができた。平成26年度において、外部の研究機関から導入する細胞の到着が予定よりも遅れたため、計画通りに研究が進展しなかったため。28年度には数種類の遺伝子改変マウスを作製する予定である。作製するマウスの種類は多いほど研究の目標達成が近づく。そこで、当初計画よりも多い種類の遺伝子改変マウスを作製することで研究に役立てる予定である。既に細胞は到着しているので、前年度の遅れを本年度で取り戻す予定である。研究計画そのものに変更は無い。
細菌を細胞小器官とする窒素固定藻類の創製

窒素固定細菌と緑藻の共生系を確立し、その共生機構を物質やエネルギーの授受に注目して解析した。可溶性窒素化合物欠乏条件で緑藻の生育を促進する窒素固定細菌として、シアノバクテリア、好気従属栄養性細菌、紅色非硫黄光合成細菌が有効であることが分かった。ただし、それぞれが効果を発揮できる条件は異なっており、その違いから共生関係成立のための要素を抽出することができた。シアノバクテリアの場合と異なり、好気従属栄養性細菌や紅色非硫黄光合成細菌との共生系には、有機炭素を補助的に添加することが必要であった。これら窒素固定細菌が細胞外に遊離するアンモニア量は限られていると考えられるため、種間の効率的な窒素源の授受には、細胞同士の近接が重要であることが示唆された。二種培養系において、緑藻の細胞周囲に窒素固定細菌が集合している様子が観察されている。さらに、菌体を通さない膜で隔てた二槽培養装置を用いて、二種を隔離して培養したところ、緑藻はその膜上に張り付いて生育したことからも細胞の近接が重要であると考えられた。また、緑藻と共培養することでシアノバクテリアの窒素固定に関わる酵素(ニトロゲナーゼ)の活性が上昇することが観察された。このようにして得られた共生関係に関する知見をもとに、両者の細胞数変化を数理モデルを利用して解析した。分裂速度を、最大分裂速度、基質利用特性、生産能力(炭酸固定や窒素固定)、死滅速度、炭素や窒素の他種への供給能をもとに記述することで、両者の関係を示すことができた。これをもとに共生が成立するための条件、すなわち生育速度および生産能力等のバランスがとれた状態、を抽出することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。河床礫から緑藻を含むバイオフィルムを採取し、窒素固定条件で細菌を単離したところ、Xanthobacter属およびAzotobacter属と考えられる細菌を得ることができた。また、採取した河床礫バイオフィルムを、窒素化合物を欠いた独立栄養培地を用いて光照射下で継代培養を繰り返した。光照射条件等を変えることで、緑藻が安定して生育する培養系を複数、取得することに成功した。顕微鏡観察の結果、得られたすべての培養系に糸状性の緑藻を確認できた。培養系の多くにヘテロシスト形成性シアノバクテリアが緑藻と共存している様子が観察された。一方、シアノバクテリアが検出されなかった培養系から細菌を単離したところ、好気性窒素固定細菌を得ることができた。系統解析の結果、Aquincola属細菌と考えられた。ここで共存していた緑藻を分離し、18S rRNA遺伝子の塩基配列を解析したところ、Chaetophora属と考えられた。得られたAquincola属細菌の窒素固定条件を検討し、酸素や窒素ガスの供給および炭素源の最適化を図った。同時に、得られた緑藻の至適生育条件を探った。これらの条件をもとに、両菌の混合培養試験を開始した。それぞれの微生物を、有機物または窒素化合物を含む培地で別々に前培養し、細胞を充分に洗浄したのち、混合培養した。Aquincola属細菌の添加によって、窒素化合物制限下での緑藻の生育が促進される様子が観察された。顕微鏡観察の結果、緑藻の細胞表面に窒素固定細菌が付着していることが分かった。緑藻と共存する窒素固定細菌を複数、得ることができた。シアノバクテリアと緑藻との共生系のほかに、当初の目的であった好気性窒素固定細菌と緑藻の共生系の構築にこぎつけることができた。培養条件や混合条件によって、この共生系が影響を受けることを見いだしている。

また、細胞間の密な相互作用を示唆する観察結果も得られ、次年度における共生システムの解明に向けた準備が整った。さらに、窒素固定能を有する紅色光合成細菌を選別し、その窒素固定特性(酸素に対する耐性、窒素ガスに対する親和性、照射する光の強度や波長による影響等)の解析を進めており、緑藻との新たな共生系の確立に向けた知見を集積することができた。得られた複数の共生系について、それぞれの共生系の成立に最適な条件を、細胞レベル、代謝フラックスレベル、遺伝子発現レベルで明らかにしていく。そのために、培養・混合条件を最適化し、緑藻および窒素固定細菌について、自由生活時と共生生活時の生理状態の違いを解析する。また、緑藻が固定した二酸化炭素および細菌が固定した窒素の動態分析を進める。さらに、コンピューターシミュレーションも活用して、実験から得られる情報を統合し、共生系の代謝バランスおよび制御システムを記述する。共生系の物質・エネルギーフローを多角的に解析するため、窒素固定細菌としてシアノバクテリアや好気性窒素固定細菌だけでなく、紅色光合成細菌を含む新たな共生系の構築も進める。25年度が最終年度であるため、記入しない。
抗第VIII因子インヒビターに対する免疫療法の効果発現機序に関する研究

免疫寛容導入(Immune Tolerance Induction ; ITI)療法中のインヒビターIgGサブクラスの推移を検討したところ、ITIの治療効果のモニタリングとしてIgG1およびIgG4が有用であることが示唆された。また、トロンビン生成試験を用いてインヒビター存在下での第VIII因子の止血効果発現に関する検討を行ったところ、インヒビター認識部位によってトロンビン生成に差がみられ、ITI中の第VIII因子製剤定期輸注による出血予防効果にも差がみられることを示唆する結果であった。本年度は今後の研究に供する抗第VIII因子抗体(インヒビター)の性状の検討を行った。対象は先天性血友病患者16名に発生した同種抗体および後天性血友病患者16名に発生した自己抗体の性状をそれぞれ解析した。第VIII因子活性は第VIII因子欠乏血漿を基質とした凝固1段法で、第VIII因子抗原は高力価同種抗体を用いたサンドイッチELISA法で測定した。インヒビター力価はBethesda法で、IgGサブクラスは純化第VIII因子を固相化したELISA法で測定した。インヒビターの認識フラグメントはイムノブロット法もしくは第VIII因子フラグメントを用いた中和試験により同定した。先天性血友病患者16名の第VIII因子活性はすべて1%未満であり、インヒビター力価は5.0-2,000Bethesda単位/mlであっ1た。IgGサブクラスは9例中8例がIgG4に属していた。認識フラグメントの検索では12例中5例が第VIII因子H鎖を、4例がL鎖を、残り3例がH鎖とL鎖の両者を認識していた。一方、後天性血友病患者16名の第VIII因子活性はうち7例が1%未満であったが、9例では1.2-8.0%とわずかながら活性が検出された。従来言われているように第VIII因子とインヒビターが共存するタイプ2のインヒビターが半数以上を占めていた。これら9例の第VIII因子抗原も1.0-100U/dlと第VIII因子蛋白の存在が証明された。インヒビター力価は2.0-860Bethesda単位/mlであり、IgGサブクラスでは14例中IgG4優位のものが8例、IgG1優位が1例、IgG1+4が5例であった。認識フラグメントは9例中5例がL鎖を、4例がH鎖とL鎖の両方を認識していた。次年度は免疫寛容導入療法中のインヒビターの推移について解析を進めていく予定である。本年度は同種抗体(インヒビター)を保有する先天性血友病患者6例の免疫寛容導入(Immune Tolerance Induction ; ITI)療法中のIgGサブクラスの推移を検討した。対象はすべて血友病A患者でITI開始時年齢は6-17歳、インヒビター出現からITI療法開始までの期間は4.5-10年、ITI開始前のインヒビター最高値は5-532BU/mlであった。ITI開始時インヒビター値はく0.6-3.9BU/mlと全例5BU/ml未満の低力価であった。6例中3例は第VIII因子H鎖44kDaフラグメントを認識し、3例はH鎖44kDaとL鎖72kDaフラグメントの両者を認識する抗体であった。ITI療法開始後のインヒビター最高値は0.9-1,818BU/mlであり、6例中3例でインヒビターが消失し、1,818BU/mlまで上昇した1例は中止した。成功例はITI開始後それぞれ1か月、5か月、12か月でインヒビターが消失したが、成功例と不成功例ではインヒビターの認識フラグメントに差は認めなかった。経過中IgGサブクラスは6例中3例でIgG1、IgG2、IgG4を、2例でIgG4を、1例でIgG2、IgG4を認識していたが、IgG3は全例とも全経過中陰性であった。ITI後、インヒビター上昇がみられた4例では主としてIgG4がインヒビター力価にほぼ平行して変動した。不成功に終わった1例ではIgG4とともにIgG1が著明に上昇した。ITIの治療効果のモニタリングとしてIgG1およびIgG4が有用であることが示唆された。今年度はin vitroで免疫寛容導入(Immune Tolerance Induction ; ITI)と同等の条件を構築し、トロンビン生成試験を用いてインヒビター存在下での止血効果発現に関する検討を行った。対象は同意を得られたインヒビター保有血友病A患者4例で、うち2例は第VIII因子H鎖44kDaフラグメントを認識し、残り2例はL鎖72kDaフラグメントを認識する抗体であった。まず、それぞれの患者血漿からプロテインAカラムを用いてインヒビターIgGを精製した後、第VIII因子欠乏血漿で希釈し、5 Bethesda単位/mlとなるように調整を行い合成インヒビター血漿を作成した。

得られた合成インヒビター血漿に1および2単位/mlの遺伝子組換え型第VIII因子製剤を添加し、37°Cで10、30、60、120分間、加温した後、トロンビノスコープでトロンビン生成能を測定した。トロンビン生成試験のパラメーターのうち、LTおよびETPはいずれのインヒビターIgGにおいても差はみられなかった。PHはC2ドメインを認識する抗体では時間経過とともに低下し、120分後にはほぼ消失する傾向が見られたのに対し、A2ドメインを認識する抗体では時間経過による減衰が少なく、120分後でもトロンビン生成能は十分に残存していた。TTpeakでは10、30分後の値に差はみられなかったが、60、120分後はC2ドメインを認識する抗体の方がA2ドメインを認識する抗体よりも延長する傾向が見られた。これらの結果は実際のITI療法中における第VIII因子活性発現の観察結果と合致するものであり、インヒビター認識部位によってITI療法中の定期輸注の出血予防効果に差がみられることを示唆するものである。
味覚の発達を支える島皮質味覚野における摂食抑制因子のシナプス伝達修飾作用

パッチクランプ法を用いて、摂食抑制因子であるレプチンまたはインスリンの島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目標とした。レプチンを投与することにより抑制性シナプス後電流の振幅が濃度依存的に増加し、これはシナプス前ニューロンに作用していることを明らかとした。さらにレプチン受容体の各細胞内伝達経路阻害薬を用いることにより、レプチンによる抑制性シナプス後電流の振幅の増加はPI3-KまたはSTAT3経路を介して生じていることを明らかとした。これらの結果よりレプチンは島皮質における味覚情報処理に対して抑制的に作用すると示唆される。大脳皮質島領野(島皮質)は一次味覚野として知られ、摂食中枢である視床下部と密な神経連絡が存在する。したがって、味覚と食欲の情報は島皮質で統合されていると考えられる。そこで本研究は、主要な摂食抑制因子であるレプチンおよびインスリンの大脳皮質島領野(味覚野)における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目標とする。島皮質の複数のニューロンからパッチクランプ法によって同時に記録し、シナプス結合が存在するニューロンペアを見つける。シナプス前ニューロンに脱分極性パルスを与え活動電位を発生することによって誘発した単一性興奮性シナプス後電流(EPSC)ならびに抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、その振幅がレプチンによりどのように変化するか検討した。結果、100 nMレプチン投与によりIPSCの振幅が有意に増加した。レプチンの細胞内情報伝達経路にはphosphoinositide 3-kinase(PI3-K)経路と、mitogen activated proteinkinase(MAPK)、signal transducersand activatorsof transcription factors 3(STAT3)経路が存在する。それぞれの阻害薬を共投与した際にレプチン単独投与で認められた変化が生じるか検討したところ、PI3-KおよびSTAT3経路阻害薬の存在下においてレプチンによるIPSCの振幅の増加は認められなかった。一方でMAPK経路阻害薬の存在下ではレプチンによるIPSCの振幅の増加が認められた。また、レプチンの投与によりEPSCの振幅は有意に減少した。以上より、レプチンは島皮質の局所神経回路に対して抑制的に働き、この修飾作用はPI3-KまたはSTAT3を介して生じることを明らかとした。大脳皮質島領野(島皮質)は古くから一次味覚野として知られており、摂食中枢である視床下部と密な神経連絡が存在する。このため、味覚と食欲の情報は島皮質にて統合されていると考えられる。そこで本研究では、主要な摂食抑制因子であるレプチンおよびインスリンの大脳皮質島領野における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目的とした。島皮質の複数のニューロンからパッチクランプ法によって同時に記録し、シナプス結合が存在するニューロンペアをみつける。シナプス前ニューロンに脱分極性パルスを与え活動電位を発生させることによって誘発した興奮性シナプス後電流(EPSC)ならびに抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、その振幅がレプチン投与によりどのように変化するか検討した。結果、100 nMレプチンの投与によりIPSCの振幅は有意に増加した。さらに、レプチンがシナプス前ニューロンに作用することにより振幅の増加が生じることが明らかとなった。レプチンの細胞内情報伝達経路は主にphosphoinositide 3-kinase(PI3-K)とmitogen activated protein kinase(MAPK)およびsignal transducers and activators of transcription factor 3(STAT3)が存在する。それぞれの阻害薬をレプチンと共投与した結果、PI3-kおよびSTAT3の阻害薬は共投与することによりレプチン単独投与でみられた振幅の増加はみとめられなかった。一方、MAPKの阻害薬を共投与してもIPSCの振幅の増加はみられた。このことよりレプチンはPI3-KまたはSTAT3径を介してIPSCの振幅を増加させることが明らかとなった。また、レプチン投与によりEPSCの振幅が有意に減少した。以上より、レプチンは島皮質の局所神経回路に対して抑制的に働くことが明らかとした。本研究は多チャンネル同時ホールセル・パッチクランプ法を用い、摂食抑制因子であるレプチンおよびインスリンの大脳皮質島領野(味覚野)における局所神経回路に対する修飾作用の解明を目標とする。島皮質の複数のニューロンから同時ホールセル記録し、シナプス前ニューロンに脱分極パルスを与え活動電位を発生させることにより誘発した単一興奮性シナプス後電流(EPSC)および抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、レプチンにより振幅がどのように変化するか検討した。100 nMレプチンの投与によりIPSCの振幅が有意に増加する一方で、EPSCの振幅は有意に減少することを明らかとした。

次にレプチンの細胞内情報伝達経路の阻害薬とレプチンの共投与中のシナプス後電流の振幅の変化を見ることにより、レプチンによるシナプス後電流への修飾作用がどの細胞内情報伝達経路を介して生じているかを検討した。phosphoinositide 3-kinase(PI3-K)およびsignal transducersand activatorstranscription factors 3(STAT3)経路の阻害薬とレプチンを共投与したところレプチンによるIPSCの振幅増加は認められなかった。一方で、mitogen activated protein kinase(MAPK)経路の阻害薬との共投与ではIPSCの振幅増加が認められた。このことより、レプチンによるIPSC振幅の増加はPI3-KまたはSTAT3経路を介して生じていることを明らかとした。上記より、平成24年度の達成目標である「島皮質における局所神経回路におけるレプチンの修飾作用の解明」はおおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度で島皮質におけるレプチンの局所神経回路への修飾作用について、レプチンが抑制的に働くことを明らかとした。この結果をふまえ、平成25年度は島皮質の複数のニューロンからパッチクランプ法によって膜電流を記録し、脱分極パルスによって誘発した単一シナプス後電流におよぼすインスリンの修飾作用を検討する。平成24年度と同様にVenus蛍光タンパク遺伝子ノックインラットの島皮質を含む急性脳スライス標本を作製する。島皮質の複数のニューロンから同時ホールセル記録し、シナプス前ニューロンに脱分極パルスを与え活動電位を発生させることにより誘発した単一興奮性シナプス後電流(EPSC)および抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、インスリンにより振幅がどのように変化するか解析する。インスリンの塞翁内情報伝達経路にはレプチンと同様にPI3-K経路とMAPK経路が存在する。インスリンによる単一シナプス後電流への変化が認められた場合、それぞれの阻害薬であるwortmanninおよびPD98059とインスリンの共投与における単一シナプス後電流の変化を解析することにより、インスリンの島皮質におけるシナプス伝達修飾作用がどちらの細胞内情報伝達経路を介して生じているかについて検討する。
特異な体内動態を実現するタンパク質修飾siRNA内包ナノカプセル

核酸医薬はその配列によってあらゆる遺伝子疾患を治療でき、副作用も非常に小さいため次世代の医薬として注目を集めている。しかし、核酸は血中に存在する酵素により分解を受けやすく、腫瘍や脳組織など標的とする部位へ高効率で送達することは極めて困難である。これまでに我々は核酸医薬を内包した微小なナノカプセルを合成し、そのカプセル表面へ高い組織浸透性を示すトランスフェリンタンパク質(Tf)を導入することにより、核酸医薬を組織深部へと送達することに成功している。本研究では、Tfと同時に多様な機能性タンパク質をナノカプセル表面へ導入することにより、特異な体内動態を示す核酸医薬の輸送手法を開拓する。
口腔癌・歯原性腫瘍発生とアジア多民族遺伝子変異の調査研究

我国を始め、アジア各国は高齢化社会の進むなかで、頭頸部癌、口腔癌は著明な発生率の増加が予想される。アジア各国との国際共同研究を行うための調査と人的ネットワークを構築し、共通の遺伝子解析法と問題点を共有することが目的である。国際シンポジウム(300人参加)を開催した(2005年)。アジア特に中国東北部4医科大学と腫瘍バンク(手術材料の収集)設置で合意した(2006年)。環境整備のため、瀋陽に岡山大学中国事務所を設置、若年人材育成のための岡山大学双方向学位プログラム(O-NECUS)を創設した(2007年)。研究代表者が編集長を務める東アジアからの学術情報誌Journal of Hard Tissue Biology(我国の口腔領域雑誌として初めてISI web採録誌、電子ジャーナル併用)をネット構築し活用することになった(2008年)。本企画は、アジア民族の口腔癌・歯原性腫瘍の遺伝子解析・分子病理学的解析のため、アジア各国における実態調査とネットワークの構築を目的としている。本年度は、9月に国際シンポジウム(International Symposium of Maxillofacial & Oral Regenerative Biology)を岡山で開催した。本シンポジウムには多数の研究者が参加し(300人)、アジア各国の口腔癌・歯原性腫瘍に関する研究の最新の知見を得ることができた。シンポジウム参加国は中国、韓国、マレーシア、インドネシア、タイ、フィリピン、インド、フランス、フィンランドであり、海外及び国内共同研究者を岡山へ招聘した。またシンポジウム時に併せて、アジア各国や日本国内の共同研究者と口腔癌・歯原性腫瘍の実態調査のためのネットワーク構築、研究打ち合わせを行った。平成18年2月には中国医科大学の共同研究者を日本に招聘し、材料提供者の倫理面の協議、材料収集に関する討議を行った。平成18年3月には研究代表者永井教之が中国に渡航し、中国医科大学・吉林大学・大連医科大学・ハルピン医科大学の共同研究代表者と本プログラムに関する合同会議を行い、材料収集法やプロトコルの作成を行った。今後は、より具体的な材料収集法の協議を行い、材料収集を実践していく。中国4大学(中国医科大学・吉林大学・大連医科大学・ハルピン医科大学)と共同して、新鮮手術材料を取り扱った遺伝子解析を行う遺伝子バンクの設立を目指す。また、海外との情報交換手段としてTAOを利用したギガネットネットワークを改良し、使用する。本企画はアジア民族の歯原性腫瘍、口腔癌、悪性黒色腫の遺伝子解析のため、アジア各国との国際共同研究のための調査とネットワークの構築をすることを目的としている。本年度は、代表者(永井)が岡山大学の中国東北部重点地域構想O-NECUSプログラムの企画・実施WG室長であることから、5月中国東北部医療系4大学(大連医大、中国医大、吉林大、ハルピン医大)の頭頸部癌、歯原性腫瘍の研究者を招へいし、調査協力のためのシンポジウムを開催した。代表者は10月訪中4大学と大学間協定を締結すると共に、上記テーマの具体的調査、情報ネットワークの構築で合意した。特に中国医大には岡山大学国際交流分室を19年7月に設置(代表者永井が室長に指名された)することで合意した。又、同大学に頭頸部癌、歯原性腫瘍解析センターを設置(19年10月予定)することにより、癌材料収集の中国東北部のネットワークが構築された。又北京大学口腔医学院、マレーシア・マラヤ大学歯学部もこのネットワークに参加することで合意した。各大学における倫理規定や倫理委員会設置等を調査した結果、ほとんどの大学で未整備であり、今後岡山大学方式を教示することで合意した。一方、研究技術についてはパラフィン標本の遺伝子解析法が確立しつつあることから、アジア各国の材料解析が可能になりつつある。そこでこれらの技術を中国で実施できる設備等が備わっているかを調査した結果、若手研究者の技術研修が必要であることがわかった。本企画はアジア民族の歯原性腫瘍、口腔癌悪性黒色腫の遺伝子解析のため、アジア各国との国際共同研究の為の調査とネットワークを構築することを目的としている。中国医大(路振富教授)と大連医大に口腔癌の中国民族のモデル腫瘍バンクを設置するため、大連医大の肖晶教授を招聘し、打合わせを行い、月に長塚准教授を中国医大に派遣して、本研究調査団は口腔癌の腫瘍バンク設置の実務上の調査を行った。本年度は代表者(永井)が岡山大学-中国東北部大学院連携プログラム(0-NECUSWG企画運営座長)を主導している。医療系4大学と大学間協定を締結し、日英中の本プログラムのマニュアルを作成した。平成19年8月、副学長と共に訪中し、中国医大内に岡山大学瀋陽事務所を設置した。

所長に代表者(永井)が就任したことから、中国国内に於ける本研究調査の拠点が整った。事務所には中国医大が全面的に支援するため、要員を1名は配置した。合わせて、頭頸部癌、歯原性腫瘍解析センター(仮称)を設置した。窓口教授として路振富口腔医学院院長が世話役になったことから拠点運営はスムースに行える様になった。平成19年11月、中国医療系4大学(大連医大、中国医大、吉林大、ハルピン医大)8名の教授を学内COEの協力により招聘し、人材交流プログラムを完成させた。4大学設置の腫瘍バンクの利用法について検討した。平成20年1月には岡山大学0-NECUSの大学院修士の第1回面接を中国で行い、優れた人材確保として将来の腫瘍バンク管理運営に必要な院生2名(双方向学位、短期留学)を大連医大と中国医大から受入れることに決定した。(平成20年10月入学、21年3月渡日の予定)腫瘍バンクの材料として、新鮮材料と共にパラフィン標本から遺伝子解析法が完成し、学会発表、論文発表が別紙の如く行われた。中国共同研究者への技術移転が可能になりつつある。実験では硫化したGaAs基板にパラジウム原子を載せた系で周東・有澤(北大薬学)、塚本(阿南高専)らによってヘック触媒反応が報告されているので、まずその系に絞って第一原理計算を行った。2×2のスーパーセルでの第一原理計算により、硫黄原子とパラジウム原子のそれぞれの安定吸着位置と吸着エネルギーを計算した。さらに、硫黄原子とパラジウム原子がそれぞれ1個ずつ共吸着した場合での両原子の安定吸着位置と吸着エネルギーを計算した。また、それぞれの場合の電子状態の違いを調べた。計算の結果判明したことは、硫黄原子を先に吸着させても、後から吸着したパラジウム原子の安定吸着位置の方が硫黄原子より内側となることと、硫黄原子との共吸着の場合の方がかなりパラジウム原子の吸着エネルギーが強くなることである。つまり、硫黄原子の役割はパラジウム原子を強く表面上に結合させることであると言える。このことは、実験において硫化していないGaAs基板上にパラジウム原子を載せた場合に触媒活性は示すものの数回の実験で触媒活性が失われてしまうのに対し、硫化させたGaAs基板にパラジウム原子を吸着させた場合は100回程度実験を繰り返しても触媒活性の劣化があまり起きないという事実を説明する計算結果であると言える。このことから、硫黄以外の原子を代用させてパラジウム原子を固定させることも可能であることも結論づけられた。また、GaN(0001)基板についてもパラジウム原子と硫黄原子の吸着位置を明らかにした。本企画はアジア民族(中国人、日本人を含む)の口腔癌、頭頸部癌、口腔悪性黒色腫、歯原性腫瘍の遺伝子解析と分子病理学的解析を行い、手術後の再生医療基盤の国際共同研究を実施する為の調査とアジアネットワークの構築を目的としている。
セラミックス/金属接合材の疲労破壊プロセスと疲労強度評価手法の提案

高温環境下での高強度特性を有する高温構造用セラミックスは、優れた高温特性の反面、靱性が低く、セラミックス単体での構造物の構築は極めて困難である。しかし、ガスタービンのような構造用材料として使用されるセラミックス/金属接合材は、熱サイクル・繰返し疲労・応力腐蝕割れ・クリープなどの耐久性に対する信頼性を保証することが極めて重要である。特に、銅などの軟金属を中間層に用いるセラミックス/金属接合材料では、中間層の塑性変形によりセラミックスと金属の材料定数の差を吸収しているため、繰返し荷重による疲労・クリープ特性の把握とその破壊プロセスの解明は重要である。そこで本研究では、セラミックス/金属接合構造物の疲労強度評価手法の提案を行うことを目的として、セラミックス/金属接合材料(銅を中間層とした窒化珪素(Si_3N_4)/オーステナイト系ステンレス鋼)を用いて、曲げ疲労試験を実施し、以下のような結論を得た。1.SEMおよびEPMAで観察した結果、静的曲げと異なり、疲労曲げの破壊起点は中間層であることを明らかにした。2.繰り返し疲労の弾塑性有限要素解析を実施し、繰り返し負荷による相当塑性ひずみがセラミックス界面近傍に集中することから、セラミックス側の接合残留応力が緩和され、中間層が疲労破壊の起点となることを明らかにした。さらに、繰り返しによる接合残留応力の緩和によって静的強度が向上するすることを明らかにした。
甲殻類の成熟を制御する内分泌系: 卵巣由来タンパク質ホルモン群の包括的解析

甲殻類の生殖機能は、内分泌中枢の一つである眼柄内のX器官/サイナス腺で作られる卵黄形成抑制ホルモンにより制御されている。一方で、末梢組織に発現するタンパク質/ペプチド性ホルモンの関与についてはこれまでのところほとんど知られていない。本研究課題において、クルマエビ卵巣に発現するホルモン様因子に着目し、その発現や機能等を解析した結果、卵巣型甲殻類雌性ホルモンやニューローパーシン様ペプチドが生殖過程の制御に関わっていることが示唆された。クルマエビ卵巣のRNA-seq解析によって見出されたタンパク質ホルモン様分子の機能を明らかにするため、本年度は組換えタンパク質の作製を中心に研究を実施した。まず、甲殻類雌性ホルモン(CFSH)、ニューロパーシン(NPA)、甲殻類血糖上昇ホルモン族ペプチド(ovCHH)の全長cDNAをクローニングした。次に、各ホルモンがNusAタンパク質との融合体として得られるよう大腸菌発現用のプラスミドを構築した。これらのプラスミドを用いて大腸菌発現系においてタンパク質を産生させた結果、NPAとovCHHを含む融合タンパク質は菌破砕物の可溶性画分に大部分が回収された。一方CFSHについては不溶性画分に大部分が回収された。発現条件を検討したが、最良の条件でも可溶性画分への回収率はおおよそ50%であった。それぞれの融合タンパク質をNiアフィニティーカラムによる精製、酵素処理、逆相HPLCによる精製に供し、最終的に組換えホルモンを得ることができた。また、NPAについては上記の組換えホルモンを抗原として、CFSHについては合成ペプチドを抗原として、それぞれ抗体を作製した。加えて、この組換え体の作用を探るため、卵巣培養系における卵黄タンパク質前駆体遺伝子の発現に対する影響を調べた。CFSHとovCHHについては顕著な作用が観察されなかった。NPAについては遺伝子発現を変動させる可能性を示す結果が得られた。卵巣で発現しているタンパク質ホルモンのうち、NPAとovCHHについては大腸菌による大量発現系がほぼ構築できた。さらに組換えNPAを抗原とした抗体も作製した。一方でCFSHについては同様の方法で大量のタンパク質を得ることが難しいと判断されたため、別の方法を検討している。またこのことを受けて、合成ペプチドを抗原とした抗体を作製した。次年度以降、これらを用いた組織形態学的解析が可能となる。また、ホルモンの作用を検討するための卵巣培養実験も開始している。クルマエビ卵巣のトランスクリプトーム解析から見出されたホルモン様因子のうち、甲殻類雌性ホルモン(CFSH)について詳細な解析を行った。CFSH遺伝子の発現は生殖腺のみで観察された。卵巣での遺伝子発現は、未成熟期より卵黄形成期で高い傾向にあった。CFSHタンパク質についても同様の変動を示すことが、CFSHに対する特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって示された。免疫組織化学染色とin situハイブリダイゼーションにおいて、CFSHの発現は、卵黄形成期の卵巣の大部分を占めている発達中の卵母細胞群では観察されず、一部含まれている卵黄形成を開始していない卵母細胞群において認められた。以上から、CFSHはクルマエビ属に見られる多回産卵の制御と何らかの関連があると推測された。加えて、CFSH遺伝子の発現は、クルマエビ眼柄内のX器官/サイナス腺複合体から分泌される卵黄形成抑制ホルモン(CHH/VIH)による制御を受けていない可能性が示された。また、クルマエビCHH/VIHの一分子種(Pej-SGP-I)の前駆体について、構造活性相関に関する基盤的情報を得ることを目的としてX線結晶構造解析を行った。その結果、ペプチドのN末端側2/3の領域は、3対のジスルフィド結合と3つのα-ヘリックスからなる特有のフォールドを形成する一方、C末端側1/3の領域はフレキシブルな構造であることが判明した。CHHファミリーではC末端領域において配列の多様性が見られることと併せ、ペプチドのC末端領域が活性に重要であることが示唆された。CFSHについて、特異的抗体を用いたタンパク質側からの解析、更には遺伝子側からの解析により、卵黄形成にリンクした興味深い発現パターンを見出すことができた。また、卵黄形成を制御する中枢のホルモンであるCHH/VIHについて、前駆体の立体構造を明らかにした。このことは、構造活性相関研究を基にした成熟制御技術の開発へと繋がる。トランスクリプトーム解析によって、クルマエビの卵巣での発現が確認されたホルモン様因子の組換え体を、可溶性タグとの融合タンパク質として大腸菌発現系を用いて作製することを試みた。発現タンパク質のうち、卵巣型甲殻類雌性ホルモン(Maj-CFSH-ov)では約30%、甲殻類血糖上昇ホルモン様ペプチド(Maj-pCHH-B)では約50%、ニューロパーシン様ペプチド(Maj-NPLP)では約80%が、大腸菌破砕物の可溶性画分に回収された。これらの融合タンパク質から、可溶性タグの除去、精製などを経て得られた組換え体は、質量分析の結果、いずれも想定される数の分子内ジスルフィド結合を持つと考えられた。クルマエビ卵巣の培養系を用いた生物検定において、Maj-CFSH-ovとMaj-pCHH-Bは、卵黄タンパク質前駆体であるビテロジェニン(Vg)の遺伝子発現に影響を与えなかった。一方で、Maj-NPLPにはVg発現を増加させる傾向がみられた。

各ホルモン様因子の主要な発現部位は、Maj-CFSH-ovが生殖腺、Maj-pCHH-BとMaj-NPLPが各神経節であった。また、トランスクリプトームデータの再解析により、ショウジョウバエのニューロパーシン受容体のホモログがクルマエビ卵巣で発現していることも判明した。以上から、卵巣のトランスクリプトーム解析によって発見されたMaj-NPLPは、卵巣が主たる産生部位ではないものの、クルマエビの生殖制御に関与することが示唆された。甲殻類の生殖機能は、内分泌中枢の一つである眼柄内のX器官/サイナス腺で作られる卵黄形成抑制ホルモンにより制御されている。一方で、末梢組織に発現するタンパク質/ペプチド性ホルモンの関与についてはこれまでのところほとんど知られていない。本研究課題において、クルマエビ卵巣に発現するホルモン様因子に着目し、その発現や機能等を解析した結果、卵巣型甲殻類雌性ホルモンやニューローパーシン様ペプチドが生殖過程の制御に関わっていることが示唆された。まずovCHHに対する抗体を作製したのち、各ホルモンの局在解析を行う。併せて各ホルモン遺伝子の発現と成熟との関連を明らかにする。また、ホルモンの作用を検討するための組織培養実験を引き続き行うとともに、生体投与実験も開始する。トランスクリプトーム解析から見出されたCFSH以外のホルモン様因子(ニューロパーシン、バーシコン、CHHアイソフォーム等)について、同様に詳細な解析を進めるとともに、それらの生体での機能を明らかにするため、二本鎖RNA投与による遺伝子のノックダウンなどを試みる。農学・水圏応用科学対象としているホルモン分子のうち1つについて抗体作製に至らなかったことと、発現タンパク質の精製に必要な什器・消耗品について一部所属研究室に備蓄されていたものを転用できたことによる。予定より消耗品類への支出が少なく済んだために差額が生じた。その他に、予定していた国際学会への参加が都合により取りやめとなったため、その分の差額も生じた。未使用額は上述の抗体作製費用に充てるほか、次年度から行う生体投与実験において動物の購入費用が増加すると考えられるため、それにも充てる予定である。現在までに得られている研究成果について、国際学会や学術誌で発表する。
塩基性多糖を基質とする新規な多糖リアーゼカテゴリーの提案

鞘多糖の分解をもたらす酵素(鞘多糖分解酵素)の遺伝子の取得・解析し、大腸菌での発現による機能の確認を行った。鞘多糖分解酵素およびその遺伝子の由来は、鞘分解菌Paenibacillus koleovorans(研究代表者が単離、命名)である。同細菌より得られた構造運伝子は738アミノ酸残基からなるタンパク質をコードする2217塩基対で構成されていた。この遺伝子の周辺に鞘分解に関与すると思われる他の遺伝子は存在していなかった。解読した塩基配列は既知の多糖分解酵素遺伝子に部分的には類似性を示したが、全体的に有意な類似性を示す既知遺伝子はなかった。これは本遺伝子および酵素の新規性の高さによるものと思われる。本遺伝子を大腸菌に導入したところ、活性のあるタンパク質として発現させることができた。同酵素は作用未同定の多糖リアーゼとして、糖質関連酵素のデータベースであるCAZyに登録された。鞘多糖分解酵素の特徴は多糖の分解(エンド型分解)に伴って反応液の紫外線吸収量が増大する点である。このような現象は加水分解型の酵素にはみられず、脱離反応型酵素(リアーゼ)の特徴である。しかし、既知のエンド型多糖リアーゼはいずれもウロン酸を含む酸性多糖を基質とし、塩基性多糖に作用するものは知られていない。酵素反応産物を精製してアルジトール化を施した後、プロトンNMR解析を行ったところ、1次元プロトンNMRスペクトルにおける低磁場域に二重結合の存在を示すシグナルが観測された。また、酵素産物は5糖と判明した。低磁場域のシグナルは非還元末端ガラクトサミン残基の4位であることが2次元プロトンNMRで予想された。2次元プロトン-カーボンNMRにおいて、2重結合は同残基の4位と5位の間にもたらされていることが判明した。このような不飽和ガラクトサミン残基は、ガラクトサミンを含む多糖をアルカリで処理することによって生じる(ピーリング)ことが知られているが、酵素作用によってもたらされた例は報告されていない。アルジトール化を施さない未処理の酵素分解物の構造決定(NMRシグナルの完全帰属)も程なく終了する見込みである、これを達成すれば鞘多糖分解酵素が塩基性多糖に作用する新規な多糖リアーゼであることが明確に示され、対応する新たなE.C.番号の提案が受け入れられるはずである。有鞘細菌Spherotilus natansの鞘をヒドラジン分解して鞘多糖を調製した。平成14年度の目的は鞘多糖の構造を確定することである。メチル化分析の結果、鞘多糖からは1,4,5-トリ-O-アセチル-2,3,6-トリ-O-メチルヘキシトール、1,4,5-トリ-O-アセチル-3,6-ジ-O-メチル-2-N-メチルアセトアミド-2-デオキシヘキシトールおよび1,3,5-トリ-O-アセチル-4,6-ジ-O-メチル-2-N-メチルアセトアミド-2-デオキシヘキシトールが約1:3:1のモル比で検出された。ここにおいて、鞘多糖は直鎖のヘテロ塩基性多糖であることが明らかとなった。細菌由来のヘテロ多糖は通常、オリゴ糖の繰り返し単位から構成されている。事実、鞘多糖は特異的分解酵素(Paenibacillus koleovoransより分泌される)の作用で一つのオリゴ糖に分解されることがわかっている。この繰り返し単位と思われるオリゴ糖の還元末端に対して還元アミノ化反応によって疎水性タグを導入し、逆相HPLCで精製した。その後、FAB-MS分析を行ったところ、非還元末端側からグルコース-ガラクトサミン-ガラクトサミン-ガラクトサミンの配列が確認された。グルコース残基の非還元末端にはさらに何らかの残基が存在していたが特定はできなかった。特異的分解酵素による鞘多糖の分解に伴って、精製産物であるオリゴ糖に不飽和結合が導入されることが判明しているので、おそらくグルコース残基の非還元末端には不飽和糖残基が存在するものと予想された。鞘多糖全体の糖組成がグルコース:ガラクトサミン=1:4であることを考慮すれば、その不飽和糖残基はガラクトサミン由来と考えられる。すなわち、鞘多糖の繰り返し単位はガラクトサミン-グルコース-ガラクトサミン-ガラクトサミン-ガラクトサミンであろうとの結論に至った。以上のような情報を基にNMR解析を行った。まず一次元プロトンNMRを行い、5つのアノメリックプロトンシグナルを観測した。これによって繰り返し単位は5残基であるという仮説が実証された。さらに、それぞれのアノメリックプロトンシグナルの結合定数より2つのαアノマーと3つのβアノマーが存在することもわかった。^1H-^1H COSYで各糖残基の2位プロトンの化学シフトを特定し、続いて^1H-^1H TOCSYで、2位以降の帰属を可能な限り行った。TOCSYにおいて4位以降の帰属が困難だった4つの残基がガラクトサミン残基と考えられた。次に^1H-^1H NOESYによって各残基間の結合位置を確認した。重水に対する多糖の溶解度が低く、異核(^<13>C-^1H)の2次元NMR分析には至らずシグナルの完全帰属はできなかったものの、鞘多糖の構造は以下のような繰り返し単位からなる新規な塩基性多糖であることが確認された。

平成15年度は、この結果を記した論文を公表するとともに、鞘多糖の分解をもたらす酵素(鞘多糖分解酵素)の遺伝子の取得・解析、および大腸菌での発現による機能の最終確認を行った。鞘多糖分解酵素遺伝子の由来は、鞘分解菌Paenibacillus koleovoransである。同細菌より得られた遺伝子は738アミノ酸残基からなるタンパク質をコードする2217塩基対で構成されていた。この遺伝子の周辺に鞘分解に関与すると思われる他の遺伝子は存在していなかった。解読した塩基配列は既知の多糖分解酵素遺伝子に部分的には類似性を示したが、全体的に有意な類似性を示す既知遺伝子はなかった。これは本遺伝子の新規性の高さによるものと思われる。本遺伝子を大腸菌に導入したところ、活性のあるタンパク質を発現させることができた。遺伝子の取得と発現に関する論文を公表した。これにともなって、同酵素は作用未同定の多糖リアーゼとして、糖関連酵素のデータベースであるCAZyに登録された。鞘多糖分解酵素の特徴は多糖の分解(エンド型分解)に伴って反応液の紫外線吸収量が増大する点である。このような現象は加水分解型の酵素にはみられず、脱離反応型酵素(リアーゼ)の特徴である。しかし、既知のエンド型多糖リアーゼはいずれもウロン酸を含む酸性多糖を基質とし、塩基性多糖に作用するものは知られていない。本酵素が全く新規な鞘多糖分解酵素であることを証明するためには遺伝子の新規性の証明のみでは不十分で、分解産物の構造を確定しなければならない。そこで、分解産物のプロトンNMR解析を行った。ただし、分解産物は空気中において不安定で、徐々に褐変がもたらされた。これは脱離反応によって生じた二重結合に由来する不安定性と考えられる。分解産物を嫌気下で取り扱えば変化は起こらず、良好なNMRスペクトルを得ることができた。興味深いことに、NMRスペクトルにおける低磁場域に、二重結合の存在を示すシグナルが観測された。このシグナルは非還元末端残基の4位であることが2次元プロトンNMRて予想された。もしこの予想が正しければ、鞘多糖分解酵素は新規の多糖リアーゼであり、新たな多糖リアーゼカテゴリーの存在を示すことができる。現在、異核2次元NMR解析を行って分解産物の構造の確定を目指している。鞘多糖の分解をもたらす酵素(鞘多糖分解酵素)の遺伝子の取得・解析し、大腸菌での発現による機能の確認を行った。鞘多糖分解酵素およびその遺伝子の由来は、鞘分解菌Paenibacillus koleovorans(研究代表者が単離、命名)である。同細菌より得られた構造運伝子は738アミノ酸残基からなるタンパク質をコードする2217塩基対で構成されていた。これは本遺伝子および酵素の新規性の高さによるものと思われる。本遺伝子を大腸菌に導入したところ、活性のあるタンパク質として発現させることができた。同酵素は作用未同定の多糖リアーゼとして、糖質関連酵素のデータベースであるCAZyに登録された。
出芽酵母におけるM期離脱シグナル伝達経路の非対称性の分子機構の解明

高等真核細胞の中心体や酵母のSpindle Pole Body (SPB)は微小管重合中心として細胞分裂に必須の役割を果たすことに加えて、シグナル伝達経路の足場として重要な役割を果たしている。出芽酵母のシグナル伝達経路Mitotic Exit Network(MEN)はSPB上で非対称に局在・制御されるが、この非対称性の分子基盤と重要性は明らかになっていない。本研究では、MEN非対称性が細胞周期制御に果たす役割を検証する。また、非モデル酵母O. polymorphaでのMENおよびSPB構造・活性の分子制御機構を解析し、これらの制御機構が進化的に保存性されているかを明らかにする。
内耳における血液由来細胞の役割と老人性難聴回避への応用

内耳における血液由来細胞の可塑性を調べ、自己血由来細胞移植により老人性難聴の発症を防ぐ。本年度では、加齢難聴モデルマウスの解析と血液由来細胞の内耳での可塑性を検討し、以下の結果を得た。まず、加齢難聴マウスとして、C57BL6マウス並びにSAMP1マウスを用いた。ABRによる聴覚閾値変化は、加齢と共に顕著であり、両者がモデルマウスとして使用できることを確認した。次に、若年GFPマウスから骨髄細胞を採取し、さらにソートして得た造血幹細胞(Lin^-c-kit^+Sca-1^+)を若年マウスに投与して、内耳での移植細胞の分布性と可塑性について調べた。結果、移植時のガンマ線照射(9.0Gy)は聴覚機能および内耳形態に影響しなかった。また、移植細胞は、投与1週間では内耳には生着しておらず血管内のみに分布していた。投与数ヶ月後には、蝸牛軸付近、血管周囲を中心に移植細胞が認められた。それらの大半は、Iba-1とF4/80陽性のミクログリア・マクロファージであり、一部は、CD45陽性の単核球と考えられた。神経細胞やグリア細胞には分化していなかった。後者の結果は、2月の国際学会にて発表^*しており、現在投稿準備中である。
「わざ」職人におけるもの作りの探索活動の分析による理数科系学習モデルの構築

本研究が目指す理数科系領域の学習モデル構築に向け,(1)もの作りの体験を理数科系領域における学習の枠組みの中で再考し,理数科系領域の学習における教科の本質ともの作りとの関係構造を明確にする作業,及び(2)わざ職人を対象としたインタビュー調査によるもの作りの体験の描写,の2つの作業を実施した。まず,もの作りを再考する作業から得られた知見として次の2点があげられる。第1に,もの作りは,新たな発見に向けた工夫と反復が必要であり,そのために長い年月に渡る試行錯誤の体験が不可欠となる。第2に,そうした意味において,もの作りは理数科系教育の本質に大きく迫る探索活動と位置づけられる。次にインタビュー調査による体験の描写に関しては,厚生労働省による平成17年度現代の名工として表彰されたわざ職人から,次の基準により20名の対象者を選出した。(1)理数科系領域における卓越したわざを発揮している職人,(2)個人の持つ技能の卓越性がきわめて優れた技能として評価されている,(3)製造法等の開発の成果も高く評価されている,(4)現在,表彰を受けた技能に関わる職業に従事している,(5)後輩職人の育成も高く評価されている。また,職業能力開発局能力評価課による国際技能競技大会(国際技能オリンピック)日本代表者から,次の基準により12名の対象者を選出した。(1)平成17年度の国際技能オリンピックの日本代表選手として優れた成績をおさめている若手職人,(2)理数科系領域における技能オリンピックのわざ職人,(3)オリンピック大会においてわざを高く評価されている。以上の基準に基づいて選ばれた対象者に対し,インタビュー調査を実施した。分析作業の結果,わざ職人は,ものづくりを自身の体験として取り込み(意味の発見),徹底して追求し(探索的体験),自他が一体化される過程(知識の統合)によって構成されることが示唆された。本研究の目的は,もの作りのエキスパートである「わざ」職人が,どのような体験を経て当該領域の活動に専心し,卓越した技能を獲得するに至ったのかについて,質的に分析することで,今後の理数科系教育のあり方に関し,もの作りの観点から提言を行なうことにある。そこで,平成17年度は理数科系領域と関わりの深い専門領域の「わざ」職人を,(1)現代の名工としてその技能と活動を高く評価された職人,及び(2)技能五輪世界大会でその技能を高く評価された若手職人,の基準により調査対象者として選出し,調査を実施した。協力が得られた対象者は,現代の名工12名,及び技能五輪選手6名の計18名であった。対象者の専門領域は,金属,機械,化学,建築,電気,電子,木工であった。調査は,対象者の所属する職場等において,深層的,自由回答的,半構造的インタビューにより実施し,また許可が得られた場合は実際の作業の現場の観察もあわせて実施した。データ分析に関しては,次年度に予定されている調査が終了した後に行なうため,ここでは調査から得られた方向性についてまとめることとする。対象者による体験の特徴として下記の3点があげられる。第1に,幼少期から技能者初期に至るまでに,全ての対象者が,何かを自分で作り出す楽しさを体験している点があげられる。例えば,幼少期にナイフで木を削って何かを作ったり,機械を分解して新しいものを作り上げたりといった体験について報告している。そこでは,指導者の指導によらず,自分で試行錯誤しながら工夫を楽しんでいる。第2に,エキスパートの技に触れる機会を得ている点である。環境の中にもの作りの卓越性を印象付ける情報が埋め込まれている。第3に,ある時期に徹底した質の高い学びを体験している点である。「わざ」は極めて高い専門的知識と精密な技術が統合されて発揮される高度な技能であるため,反復学習を蓄積する中で達成されている。

以上の基準に基づいて選ばれた対象者に対し,インタビュー調査を実施した。分析作業の結果,わざ職人は,ものづくりを自身の体験として取り込み(意味の発見),徹底して追求し(探索的体験),自他が一体化される過程(知識の統合)によって構成されることが示唆された。
オートマチックトランスミッション用環状部成形のための新型加工装置の開発

本研究では,他に例を見ない新たな加工法を提案し,それにより自動車のオートマッチック・トランスミッション用部品であるカップ状素材側面部にスプライン成形を施した,クラッチハブ部品が成形可能かどうかの確認を目的としている。前年度に行った実験の結果,この加工法で目的の歯形付き環状部品が成形可能であることを確認し,各種形状精度に関しても,歯形精度は目標精度であるJIS6級を満たすことが分かった。しかしトランスミッション用部品として重要視される歯筋精度は,成形される歯溝が軸方向に対して斜めになる現象が生じ,その結果目標精度を満たさなかった。成形品を観察したところ,歯側面部を構成する部分の板厚が,左歯面と右歯面で異なっており,歯溝成形の初期もしくは成形過程で外工具と内工具との間の位相のずれて,歯形が成形されていることが分かった。この位相のずれが精度悪化の原因であると考え,幾つかの対策を検討し,その実証実験を行った。歯溝が軸方向に対して斜めに入るという問題を改善するため,通常ねじ状工具の進み角の分だけ傾けて成形部をワーク軸に水平にするところを,歯筋の傾き分を見越した量をさらに傾けたところ,歯筋精度が向上し,目標精度を満たした。しかし,この付加した修正量はワークの緒元その他の加工条件によって変化するものであり,工業製品として安定した加工を行う上においては適した方法ではないと思われる。加工中にワークを内工具に締結するボルトが緩み,その結果内工具,外工具間の位相のずれが生じるとも予想された。そこで,内工具とガイド歯車の位置決め用のピンを刺したままにすることで,位相のずれを抑制した加工を行ってみたところ,問題となっていた左右歯厚の違いや歯溝の傾きが改善された。今後,精度向上のため,ガイド歯車,ワーク,内工具の締結方法の改善,又は,内工具の回転を制御する機構の導入が必要であるものの,現有の実験装置での目的を十分達成することが出来た。1.実験装置研究計画を見直した結果,別の目的で使用された実験装置を改良することにより,新たな加工法を提案することにした.これまで,歯車の歯面仕上げ転造に用いられてきた転造装置をオートマチックトランスミッション用環状部品成形のために応用した.加工方式は,ねじ状工具による転造加工で,工具軸とワーク軸が直交する回転加工である.歯車の加工では,ねじ状工具と歯車はかみ合いながら加工が行われる.本加工では,ねじ状工具を外工具と呼ぶ.ワーク軸には歯形をもつ内工具に環状ワークを被せたものを取り付ける.今回外工具は歯車の歯面仕上げ転造に使用されたものをそのまま用いた.また内工具の形状は,外工具で加工される歯形を予想した結果を用い決定した.さらに内工具と外工具は直接かみ合わないものの,加工中位相が合わなければならない.これは,ワーク軸に取り付けられた歯車で,外工具とかみ合って回転するガイド歯車を用いることで解決した.ガイド歯車は内工具と同時加工を行うことで位相を合わせた.環状部品の加工は外工具であるねじ状工具がガイド歯車を回しながらワーク軸を軸方向に送り,歯溝を成形する.こうして全く新しい環状部品成形法を提案し,その実験装置の準備を行った.2.実験結果この加工法で環状部品が成形可能であることを確認した.また,各種形状精度も測定した.目標精度はJIS6級程度であったが,歯形精度はそれを十分満たした.歯筋精度はある実験条件では満たしていなかった.精度悪化の原因を加工初期の歯溝成形時であると考え,加工工程を工夫した結果,歯筋精度を向上させることができ,JIS6級に達した.本研究では,他に例を見ない新たな加工法を提案し,それにより自動車のオートマッチック・トランスミッション用部品であるカップ状素材側面部にスプライン成形を施した,クラッチハブ部品が成形可能かどうかの確認を目的としている。

今後,精度向上のため,ガイド歯車,ワーク,内工具の締結方法の改善,又は,内工具の回転を制御する機構の導入が必要であるものの,現有の実験装置での目的を十分達成することが出来た。