hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニホンザルのキノコ食を通じた菌類の胞子散布機構の解明

キノコ(子実体)は、菌類が次世代を残すために胞子を生産する繁殖器官である。キノコの化学成分、とくに毒性の生態学的意義を解明するためには、ジェネラリスト的傾向が強く、広範囲を動き回り、バイオマスも大きい哺乳類のキノコ食について、基礎的な知見を積み重ねていく必要がある。本研究では(1)屋久島のニホンザルを対象に、サルが採食するキノコの多様性を明らかにし、毒性に着目して、サルによるキノコ選択の基準を明らかにすること(2)キノコを採食したサルが有効にその菌の胞子散布を行うことを実験的に証明することを目的とした。屋久島のニホンザルは、14ヶ月の観察期間中、年間を通じて67種(31属)という多様なキノコを食べていた。ニホンザルが検査行動なしにすぐに食べるキノコは毒キノコである割合が低く、ニホンザルが途中で採食を止めたキノコは毒キノコである割合が高かった。これらのことから、ニホンザルはキノコにたいしてある程度事前の知識を持っており、味覚とあわせて毒キノコ回避に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。一方、胞子散布については、サルに対してキノコの給餌実験を行うことが困難だったため、本研究期間内に実証することはできなかった。菌類の繁殖器官であるキノコは、昆虫や哺乳類など、多くの動物によって採食される。研究課題では、菌類は動物にキノコを食べられることで胞子を散布し、特定の動物に散布されるため(あるいは採食されないため)にキノコ毒、におい、動物にとっての栄養成分、特有の色、堅さなどの形質を持つようになったという仮説を検証することを最終的な目標とする。本年度は、野生ニホンザルの行動観察資料のとりまとめと、ニホンザルの胞子散布についての室内実験を行った。屋久島での14月間の行動観察と、その際に採取したキノコ断片の遺伝子解析により、以下のことが明らかになった。(1)ニホンザルは年間を通じて、少なくとも67種もの多様なキノコを採食する。(2)年間のキノコ採食時間は、全採食時間の2%程度に過ぎず、ニホンザルにとってキノコは重要な食物だとはいえない。(3)サルはキノコの利用可能性が高い時期にキノコの採食を増やし、キノコの採食の季節変化は他の食物とは無関係なので、キノコは比較的好んで食べられる食物だと考えられる。(4)サルが手に取った食物をすぐに食べてしまう場合、キノコの検査をする場合に比べて毒キノコが含まれる割合が低くなっていたので、サルはある程度毒キノコについての知識を持っていると考えられる。(5)一方、サルが検査して最終的に食べたキノコと拒絶したキノコの間には、毒キノコの割合に差がなかったので、サルが匂いをかいだりする検査行動そのものは、毒キノコの判別には有効でなかった。(6)サルが食べるのを途中でやめたキノコは、全部食べたキノコに比べて毒キノコの割合が高かったので、味によってある程度毒キノコを判別できる可能性が高い。一方、室内実験については、飼育ニホンザルにキノコを食べさせることができなかったため、菌根菌が作るキノコを採食した野生のサルの糞を、ブナ科実生に接種する実験を行うこととし、その準備中である。本年度は、屋久島のニホンザルが採食したキノコの分子種同定を中心に行った。サルが食べるキノコを、形態的に同定することが困難であることが、サルのキノコ食についてのすべての研究の隘路となっていたため、種を明らかにすることは、研究を進める上で、まず行わなければならない基礎的で重要な事項である。その結果明らかになったことは、以下の通りである。まず、屋久島の野生ニホンザルが67種(31属)という非常に多様なキノコを食べることが明らかになった。サルの採食行動パターンを段階的に、(1)キノコに遭遇したとき、(2)手に取ったとき、(3)検査行動(におう・かじる)をみせたとき、(4)食べたときに分けて分析したところ、ニホンザルは(1)の段階で他のキノコより食用キノコを、(2)の段階で毒キノコより他のキノコを選択していた。また、(4)の段階で、他のキノコに比べて、食用キノコならば全部食べ終わることが多く、毒キノコならば途中で食べるのをやめることが多かった。これらのことから、食用キノコの選択、毒キノコの回避のいずれにおいても事前の知識と味覚が重要な役割を果たしていることが示唆された。

さらに、繰り返し食べられるキノコ属を比較したところ、有毒種を多く含むテングタケ属のキノコを手に取った際には検査行動が多くみられることから、ニホンザルが毒キノコについて属レベルで何らかの知識を持っていると考えられる。また、繰り返し食べられるキノコ種に対する行動パターンに一貫性がみられる傾向があり、ニホンザルが種レベルでも知識を持っている可能性が示された。今年度の最大の進展は、キノコの分子種同定ができたことである。サルが食べるキノコを、形態的に同定することが困難であることが、サルのキノコ食についてのすべての研究の隘路となっていたため、種の同定は、研究の進展のために必要不可欠な段階であった。これができたことは、大きな成果であったといえる。その結果明らかになったことは、まずサルが食べるキノコが、67種もの非常に多種類におよんでいることである。サルが非常に多くの種類の菌類とキノコ食を通じて関係を持っているということは、サルが菌類の多様性維持に貢献するための、前提条件を満たすものである。これは、当初予想していなかった成果である。本研究が、単にサルによる胞子散布の実証にとどまらず、霊長類が生態系で果たす役割にまで研究を発展させる余地があることを示した点で、予想以上の成果であったといえる。また、サルの行動パターンの分析は、サルが毒キノコをある程度は事前に知っている一方で、その知識は完全ではなく、ある程度は実際に食べてみてから判断していることを示している。これらの事実は、毒性というキノコの性質が、サルに食べられるかどうかというキノコの運命に影響しうることを示している。キノコの形質とキノコ食の解明は、本研究の大きな柱のひとつであり、そのような特性のうち、もっとも興味深い毒性について、順調な成果を挙げることができた。一方、サルによる胞子散布の実証については、情報収集の過程で、さまざまな技術的な困難が明らかになり、現在のところはまだ実際の調査に着手していない。この点については、遅れが見られる。このように、予想以上の成果が挙げられた点、予想通り順調に進展している点、遅れている点があり、総合的にはおおむね順調に進展していると評価できる。次年度は、以下の二つの研究を推進する。第一に、キノコの属性がサルの食物選択に与える影響を明らかにする。このことは、キノコのもつさまざまな属性が、サルによる胞子散布を促進・抑制することを通じて、金の適応度に貢献し、それがその属性の進化を引き起こす、という仮説の検証の一部をなすものである。具体的には、屋久島で行ったキノコのフェノロジー調査で出現したキノコを分子種同定する。すでに種同定の終わっている行動観察中にサルが食べたキノコとあわせて、「サルが利用可能だが食べなかったキノコ」と、「サルが食べたキノコ」の種の一覧を作成する。この二つを比較して、毒性、栄養成分、色、堅さ、基質(地面か枯れ木か生木か)、菌根菌か腐生菌か、などのキノコの属性と、サルによる食物選択の関連を明らかにする。第二に、ニホンザルのキノコ食を通じた菌類の胞子散布を実証する。サルの糞の中には、さまざまな異物が入っているため、まずキノコだけを食べさせることが可能な、昆虫やマウスを使って、糞の中に含まれている胞子を顕微鏡下で観察する方法を開発する。
FabエンジニアリングによるADAs産生抑制に関する研究基盤の確立

世界で70品目を超える抗体医薬品が承認されており、がんや自己免疫疾患の治療に欠かせない存在となっている。しかし、患者体内で抗薬物抗体(anti-drug antibodies: ADAs)が産生され、それが治療効果の低下につながる場合があり、抗体医薬品の有効性と安全性を確保するうえでADAsの産生を抑えることは重要な課題となっている。一方、我々は抗原蛋白質の安定性を高めると、それに対する抗体産生が低下することを報告しており、これをADAs産生抑制法へと応用すべく、本研究では抗体フラグメントFabをターゲットに安定性と抗体産生の相関性を解析することとした。
知覚の体制化と関係系に関する総合的研究

本プロジェクトは、伝統的ゲシュタルト心理学及び実験現象学の立場から諸知覚現象を促え、これまでの諸法則を吟味すると共に新しい法則の発見と、それらを統括する理論の再構築を目標として計画された。2年という短期間に研究をまとめるという制限のために、研究対象を視知覚と触覚に絞らざるを得なかった。現在は聴覚についての実験を進れており、視、聴、触という異なるモダリティで得られた観察事実および実験結果をもとにこれまでの理論の修正と、それに伴う新しい理論の展開を試みている。報告書は、序において知覚研究における実験現象学的アプロ-チの重要性を説き、本論では研究結果を五章にまとめ、各現象の生起要因を吟味した。「結語」において包括的な議倫を行い、モダ-ル間に共通な法則性を明らかにし、実に新たな問題提起がなされた。各章は、「輪郭と面(かたち)の形成に関与する諸要因」(8編)、「面の明るさの知覚と陰影知覚における空間的体制化」(4編)、「錯視の知覚的次元に関する分析と関係系の作動機序」(2編)、「諸運動知覚における体制化の過程の分析」(4編)、「視覚障害者および脳損傷者における知覚の体制化」(2編)から成る。「結諸」において、各章で明らかにされた諸結果を、「知覚体制化ー静的事態(空間的体制化)と動的事態(時間・空間的体制化)」、「知覚ディメンションの明確化」、「現象記述と関係系」の三節に分れて論じ、されに今後の課題を提起した。特に強調されたことは、1)透明視、異種輪郭およびそれに関連する現象から面の層化の現象的分類を精微化し、知覚体制化の理論的枠組として役立つ、2)照明の方向による空間的体制化の変化は面の明るさの現われ方を変化される、3)運動知覚における対象の持続性と非持続の空間的体制化の相違、4)錯視における知覚ディメンションを考慮する必要性とその重要性等々である。62年度研究計画書で述べた如く、形が知覚される過程を多方面にわたる現象を実験的且つ総合的に考察し、知覚の関係系の概念から統一的な理解を試みるために、既にそれぞれの分担に従い研究が進められており現在データの収集の段階にある。一方、61年度においては分担課題にしたがった実験計画の検討、予備実験の進行状況についての報告集会を4回(昭和61年6月2122日,8月1214日,10月13日,11月22日)にわたって開催し、討論を重ねた。特に、11月22日の第4回の集会においてはこれまでに得られた結果の検討が行われ、今後の展望がなされた。新たに得られた知見:上述の如く、予定された実験は順調に進められているが、その過程で新たな関連現象が幾つか見いだされている。例えば、仮現運動における視覚と聴覚の共通点と相違点,透明視現象が形に於ける隣接領域間の明暗関係のみならず、多層図形のパターンにおいても見いだされ、両者の現象的共通点の吟味が行われている。当初の研究計画の進捗状況に付いては上述の如くであるが、4回にわたる会合において、W.METZGER,盛永らの関係系理論の枠組みに限定することについての議論がなされた。

特に、G.KANIZSAおよびF.METELLIらのイタリアの実験現象学的視点(いわゆるネオ・ゲシュタルト)をも積極的に採り入れ、より一層包括的な理論の構築を目指すべきである、との意見が多数の研究分担者から出され、その方向で今後検討が進められるべきとの了解が得られた。そのために、彼らとの実験結果についての意見の交換を積極的に行う必要があり、既に研究分担者の一部はトリエステ大学及びパドバ大学に赴き実験の紹介と共同研究を進めている。既に得られた実験結果の一部は、国内・国外において7編発表された。本研究は,M.Wertheimer,W.Metzgerらの伝統的ゲシュタルト心理学と,グラーク学派に端を発し,ゲシュタルト心理学の影響を強く受けているF.Metelli,G.Kanizsaらの実験現象学的観点から諸知覚現を捉え,従来の諸法則を吟味すると共に,新しい法則とそれらを包摂する理論の再構築を目標として計画された.本年度は2回の研究集会を持ち,得られた結果の主要な点のみを列挙する.(1)面の明るさの知覚:面の明るさ知覚は対象の視覚的空間構造により変化し,照明条件により表面色,面色,さらに影の印象を生じる.また,照明方向は対象の現われ方に影響するが,その方向は面の明るさの勾配,陰影によって決まる.(2)輪郭と面の形成:色の拡散効果によって形成される面とその現象的透明感の関係がKanizsa図形を初め種々の図形を用いて検討したが,Metelliによる透明感の予測式が現象の分類及びそのメカニズムを知る指標となり得ることが明らかとなった.また,同心的なディスク・リングからなるランダムドットの回転運動速度差による輪郭の形成が検討され,相対速度差のみに依存せず,静止と運動の組み合わせにおいて輪郭が顕著になることを示した.(3)体制化に果たす運動の役割:連続的運動とストロボ視による断続的運動の下での対象の体制化を比較検討した結果,ストロボ視条件での運動知覚の推移の過程が運動・形態知覚解明に大きく寄与することが明らかとなった.(4)幾何学的錯視に関与する諸要因:本実験では特に部分と全体の関係を問題としたが,従来のゲシュタルト法則に部分的であっても重大な修正をする必要性を認めた. (5)触による形態知覚:特定のパターンを同時または継時的に触る場合,文字においては後者が優れているが,図形ではむしろ前者の識別が良い.この事実は知覚過程と再認過程の体制化の間の相違を示している.(6)脳損傷患者の形態の体制化:色と形を用いて見本図版に従う構成過程を吟味した結果,健常者と脳損傷患者の間の群化の間に有意な差がみられた.
反応場の解明による多機能・高性能複合光触媒の開発

平成28年度では、複合光触媒における高活性領域は接合界面に近い表面領域であるという前年度に得られた知見に基づき、複合化形態を制御することで高活性な複合光触媒材料を開発することを目的とした。ここで光触媒材料としては、これまでに最も活性が高かった銅酸化物光触媒(Cu2OまたはCuO)と鉄酸化物光触媒(α-FeOOH)からなる複合光触媒に着目した。まず、前年度に得た知見から、光触媒粒子同士が結合してなる光触媒複合体が高い活性を発揮するために具備すべき構造を検討した。その結果、接合界面に近い表面領域が多い構造を得るためには、1個々の接点において接合界面が小さく、2接点の数が多いことが必要との結論に至った。次に、この構造を実現する光触媒複合体の合成方法を検証したところ、銅酸化物光触媒粒子と鉄酸化物光触媒粒子を分散媒中で凝集させることで高活性な複合光触媒を得ることができた。この方法は、昨年度までに行った従来法と異なり、焼成などの加熱処理はしない。そのため、粒子同士の接触面積が増え接点の数が減る焼成の影響を受けずに複合体が得られる。この凝集法で得た複合光触媒の活性は、可視光照射下における水溶液中有機色素(メチルオレンジ)の分解反応によって検証した。その結果、同じ出発材料・複合化比率で得た従来法による複合光触媒より高い活性を示し、複合化比率によっては約2倍の活性を示した。以上、本事業では銅酸化物と鉄酸化物を用いた光触媒複合体の構造と活性の関連性を検証し、接合界面に近い表面が特に高活性であることを明らかにし、この知見に基づき高活性な光触媒を得た。特に最終年度で得た簡易製法は、様々な材料の組合せ検証を容易にするであろう。本事業の成果は、高活性な複合光触媒を得る一つの構造的指針を与えると共に、簡易製法の提案により複合光触媒の開発を加速することができると期待される。本研究開発では、複数種類の光触媒粒子を結合して得られる複合光触媒材料について、複合化の効果が引き出され活性が高い表面領域を特定し、この知見に基づく高性能・多機能複合光触媒材料を得ることを目的としている。平成27年度は、形態を変化させた複合光触媒粒子の光触媒活性と構造の比較検証により、複合粒子表面上の活性部位(反応場)の解明を試みた。まず、大きさ約500 nm5 μmの数種類の粒子形態を持つ鉄酸化物光触媒(α-FeOOH)と銅酸化物光触媒(Cu2O,CuO)を複合化することで、同じ成分であり形状が異なる複合光触媒粒子を合成した。これらの光触媒活性を、主に過酸化水素存在下における有機色素(メチルオレンジ)の可視光照射下での分解速度を調べることによって比較した。その結果、粗大な粒子同士では、複合化の効果(活性の増大)が得られにくく、もとの光触媒材料を単体で用いた場合に比べて大きな活性向上は認められなかった。一方で、微細な粒子同士では高い効果が得られ、単体で用いる場合よりも大幅な活性向上が認められた。さらに、同じサイズの粒子を基に複合化した場合であっても、複合化の形態、即ち接合界面の位置によっても活性は変化した。粒子同士が互いの粒子内部まで入り込んで結合した複合体に対し、表面だけで接触した構造の複合体は、基の材料単体に比べて活性の向上が大きいことが分かった。以上から、複合光触媒における高活性領域は接合界面に近い表面領域であると考えられた。また、用いた粒子の大きさから、その領域は接合界面から数百nm以上にわたっているとは考えにくく数十nm以下のごく近傍の領域と推定した。平成27年度は、複合光触媒材料について複合化効果が得られる粒子表面上の領域を明らかにすることが目的であった。結果として、接合界面近傍の表面であることが明らかとなり、目的を達成することができた。よって、おおむね順調に推移している。

以上、本事業では銅酸化物と鉄酸化物を用いた光触媒複合体の構造と活性の関連性を検証し、接合界面に近い表面が特に高活性であることを明らかにし、この知見に基づき高活性な光触媒を得た。特に最終年度で得た簡易製法は、様々な材料の組合せ検証を容易にするであろう。本事業の成果は、高活性な複合光触媒を得る一つの構造的指針を与えると共に、簡易製法の提案により複合光触媒の開発を加速することができると期待される。平成28年度は、反応場面積の増大による高性能複合光触媒設計とその調製を試みる。前年度に得られた知見に基づけば、微細粒子同士の複合体、一方か粗大であっても他方が微粒子である等の条件で高い活性を示す光触媒複合体が得られることが予想できる。つまり、反応場となっている表面領域を広く取ることができる構造にすることでより高い活性を得ることが可能と考えられる。平成29年度は、他材料(金属助触媒やCdS、WO3などの異種光触媒材料)の複合化も検証する。これらの他材料は、鉄酸化物や銅酸化物とは異なる光触媒特性が報告されている。前年度までの知見を基にこれらを複合化することによって、より高活性な有機物酸化分解活性を獲得するだけではなく、それ以外の反応にも活性を有する多機能・高性能な複合光触媒の創成を試みる。特に水からの水素生成と二酸化炭素の還元といった人工光合成に関連する機能性についても検証する。
PKG/VASPシグナルの糖代謝に与える影響の解明

eNOS由来NOの欠損したeNOS-/-マウスは普通食飼育にも関わらずKupffer細胞のM1化と肝臓慢性炎症、肝インスリン抵抗性が出現したが、C57BL6マウスにPDE5阻害剤, sildenafilを投与しcGMP濃度を増加させるとHFDに伴うKupffer細胞のM1化と肝インスリン抵抗性が改善した。NO/cGMP/VASPシグナルが主要なインスリン感受性臓器である肝臓に在住するマクロファージ、Kupffer cells内や脂肪組織在住マクロファージ内の炎症を抑制し、糖尿病モデルマウスのインスリン抵抗性発症を抑えることを初めて明らかとした。C57BL6マウスを高脂肪食(HFD)で飼育すると8週後に肝臓慢性炎症と肝インスリン抵抗性が出現したが、それ以前の負荷4週後の時点で肝臓のeNOS-p (Ser1177)と一酸化窒素(NO)含量が低下していた。RAWマクロファージではNO供与体(DETA-NO)やcGMPアナログ(8Br-cGMP)によりLPS依存的TNFα、IL6、CD11c mRNAの増加(M1化)が抑制され、同刺激はAML12肝細胞でもパルミチン酸依存的炎症(IkBα-p)と肝インスリン抵抗性発症を抑制した。NO/cGMPの下流分子VASPをRAWマクロファージ、AML12肝細胞で各々過剰発現させるとNO/cGMPと同様に抗炎症インスリン抵抗性改善作用がみられVASP-/-腹腔マクロファージ、VASP-/-初代肝細胞は非刺激下にも関わらず炎症とインスリン抵抗性がそれぞれ誘導されていた。Kupffer細胞のM1化と肝インスリン抵抗性は普通食飼育下のVASP-/-マウスならびに骨髄移植にて樹立した骨髄特異的VASP-/-マウスでも認められた。DETA-NOや8Br-cGMPによる抗炎症作用はVASP-/-腹腔マクロファージで消失し、同刺激による抗炎症作用ならびにインスリン抵抗性改善作用はVASP-/-初代肝細胞でも消失しており、この作用がVASP依存的であることが示唆された。骨髄移植の手法を用い、骨髄細胞特異的にVASPを欠損させたとき、マクロファージの慢性炎症が誘導されインスリン抵抗性を発症するかどうか検討を行った。970radsの放射線を照射した野生型マウスにVASP欠損マウスより単離した骨髄由来マクロファージ(BMDM )を移植したところ、普通食飼育にもかかわらず肝臓、脂肪組織マクロファージはTNFαの上昇など慢性炎症の状態を呈し、インスリン抵抗性を認めた。この結果の再現性を得るまでに時間がかかり、CD68プロモーターを用いマクロファージ特異的にVASPを過剰発現させるマウスを作製し、このマウスが高脂肪食飼育にても慢性炎症とインスリン抵抗性をきたしにくいかどうかを解析する実験にはまだ移行できていない。

この結果の再現性を得るまでに時間がかかり、CD68プロモーターを用いマクロファージ特異的にVASPを過剰発現させるマウスを作製し、このマウスが高脂肪食飼育にても慢性炎症とインスリン抵抗性をきたしにくいかどうかを解析する実験にはまだ移行できていない。C57BL6マウスを高脂肪食(HFD)で飼育すると8週後に肝臓慢性炎症と肝インスリン抵抗性が出現したが、それ以前の負荷4週後の時点で肝臓のeNOS-p (Ser1177)と一酸化窒素(NO)含量が低下していた。RAWマクロファージではNO供与体(DETA-NO)やcGMPアナログ(8Br-cGMP)によりLPS依存的TNFα、IL6、CD11c mRNAの増加(M1化)が抑制され、同刺激はAML12肝細胞でもパルミチン酸依存的炎症(IkBα-p)と肝インスリン抵抗性発症を抑制した。eNOS由来NOの欠損したeNOS-/-マウスは普通食飼育にも関わらずKupffer細胞のM1化と肝臓慢性炎症、肝インスリン抵抗性が出現したが、C57BL6マウスにPDE5阻害剤, sildenafilを投与しcGMP濃度を増加させるとHFDに伴うKupffer細胞のM1化と肝インスリン抵抗性が改善した。NO/cGMPの下流分子VASPをRAWマクロファージ、AML12肝細胞で各々過剰発現させるとNO/cGMPと同様に抗炎症インスリン抵抗性改善作用がみられVASP-/-腹腔マクロファージ、VASP-/-初代肝細胞は非刺激下にも関わらず炎症とインスリン抵抗性がそれぞれ誘導されていた。Kupffer細胞のM1化と肝インスリン抵抗性は普通食飼育下のVASP-/-マウスならびに骨髄移植にて樹立した骨髄特異的VASP-/-マウスでも認められた。DETA-NOや8Br-cGMPによる抗炎症作用はVASP-/-腹腔マクロファージで消失し、同刺激による抗炎症作用ならびにインスリン抵抗性改善作用はVASP-/-初代肝細胞でも消失しており、この作用がVASP依存的であることが示唆された。NO/cGMP/VASPシグナルが主要なインスリン感受性臓器である肝臓に在住するマクロファージ、Kupffer cells内や脂肪組織在住マクロファージ内の炎症を抑制し、糖尿病モデルマウスのインスリン抵抗性発症を抑えることを初めて明らかとした。CD68プロモーターの下流にVASP cDNAを挿入しレトロウィルスを用いてBMDMに導入(CD68-VASP BMDM)し、骨髄移植後のマウスに移植することで骨髄細胞特異的VASP過剰発現マウスを作製する。このマウスが高脂肪食飼育にても慢性炎症とインスリン抵抗性をきたしにくいかどうかを解析する。VASPの抗炎症メカニズムの解明をめざす。
肺気腫におけるRAGEの役割の検討

RAGEは血球系細胞および支持組織の両方に発現しており、特に気道組織に高発現していることが報告されている。RAGE KOマウスでは野生型マウスに比較し気道炎症および気腫化が有意に抑制されることがわかった。また、血球系細胞のみにRAGEを発現するマウス、支持組織細胞のみにRAGEを発現するキメラマウスを骨髄移植により作製し、これらキメラマウスでPPE投与により惹起される肺気腫および気道炎症の程度を比較検討した結果、気道炎症および気腫化の発症のためには、支持組織へのRAGEの発現がより重要であることが示唆された。RAGEが気道炎症および気腫化に必須であるかどうかを証明するため、RAGEを全く発現しないRAGEKOマウスを用い、PPE投与後にCst(static lung compliance:静肺コンプライアンス)、気道炎症、気管支肺胞洗浄中(BAL)のサイトカインレベルを測定し、また肺組織の評価を行うことにより、コントロールの野生型マウスとの比較検討を行った。メスのC57BL/6マウスおよびRAGE knock out(RAGE KO)マウスに対し、day0に経気道的にPPEを投与することにより肺気腫モデルを作成し、申請者らが以前報告した方法(Waseda K et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2011;45:851)を用いて気道炎症、静肺コンプライアンス(Cst)、肺組織およびBAL液中の炎症細胞数の評価、好中球関連ケモカインと炎症サイトカインの測定をday1, day4およびday21に行った。このモデルにおいて、経気道的にPPEを投与された野生型マウスはday4にBAL液中の総細胞数および好中球数の増加を認め、また、KC,MIP2などの好中球関連ケモカインの増加、IL-1βやTNF-αなどの炎症サイトカインの上昇を認めた。また、PPE投与後day21に気腫化を生じ、Cstの上昇、肺組織の評価によるMLIの増加を認めた。野生型(RAGE+/+)マウスに比べ、RAGE KO(RAGE-/-)マウスはPPE投与後、day4においてBAL液中の総細胞数および好中球数の低値を示した。また、PPE投与後day21において野生型マウスに比べ、RAGE KOマウスはCstの低値を示し、RAGEが欠損するとPPE惹起の気道炎症およびその後の肺気腫進展が抑制される可能性が示唆された。レシピエントであるRAGE KO(RAGE-/-)マウスに放射線照射をおこなったのち、ドナーの野生型(RAGE+/+)マウスからの骨髄を移植し、血球系のみRAGEを発現し、支持組織はRAGEを発現しないキメラマウスを作成した。同様に、レシピエント野生型マウスに放射線照射を行い、ドナーRAGEKOマウスからの骨髄を移植し、血球系はRAGEを発現せず、支持組織はRAGEを発現するキメラマウスを作成した。また、コントロールとしてドナー、レシピエントともに野生型のマウス、ドナー、レシピエントともにREAGEKOマウスであるマウスを作成した。これら4群のマウスに経気道的にPPEを投与し気道炎症および気腫を生じさせ、程度の比較を行った。支持組織のみにRAGEを発現させたマウスでは野生型マウス同様に気道炎症および気腫を生じたが、血球系のみにRAGEを発現させたマウスではRAGE KOマウスに比べて有意な気道炎症、気腫を生じなかった。これらの結果から、気道炎症、気腫化の発症のためには、支持組織へのRAGEの発現がより重要であることが示唆された。デコイレセプターとしてRAGEをブロックする作用を有する可溶性RAGE(sRAGE)の投与、またRAGEのリガンドであるHMGB-1をブロックすることによる気道炎症および気腫化の抑制効果について検討中である。RAGE KO(RAGE-/-)マウスおよび野生型(RAGE+/+)マウスに経気道的にPPEを投与し、気道炎症および気腫化を評価したところ、RAGE KOマウスでは野生型マウスに比較し気道炎症および気腫化が有意に抑制されることがわかった。次に血球系細胞のみにRAGEを発現するマウス、支持組織細胞のみにRAGEを発現するキメラマウスを骨髄移植により作製し、これらキメラマウスでPPE投与により惹起される肺気腫および気道炎症の程度を、RAGEKOマウスおよび野生型マウスと比較検討した。RAGE発現の部位の違いによる気道炎症、気腫化の違いを検討した。支持組織のみにRAGEを発現させたマウスでは野生型マウス同様に気道炎症および気腫を生じたが、血球系のみにRAGEを発現させたマウスではRAGE KOマウスに比べて有意な気道炎症、気腫化を生じなかった。これらの結果から、気道炎症および気腫化の発症のためには、支持組織へのRAGEの発現がより重要であることが示唆された。

血球系細胞のみにRAGEを発現するマウス、支持組織細胞のみにRAGEを発現するキメラマウスを骨髄移植により作製し、これらキメラマウスでPPE投与により惹起される肺気腫および気道炎症の程度を、RAGE KOマウスおよび野生型マウスと比較検討したところ、支持組織のみにRAGEを発現させたマウスでは野生型マウス同様に気道炎症および気腫を生じたが、血球系のみにRAGEを発現させたマウスではRAGE KOマウスに比べて有意な気道炎症、気腫化を生じなかった。これらの結果から、気道炎症および気腫化の発症のためには、支持組織へのRAGEの発現がより重要であることが示唆された。デコイレセプターとしてRAGEをブロックする作用を有する可溶性RAGE(sRAGE)の投与、またRAGEのリガンドの1つであるHMBG-1をブロックする抗HMBG-1抗体の投与にて気道炎症および気腫化を抑制できるかどうか検討中である。RAGEは血球系細胞および支持組織の両方に発現しており、特に気道組織に高発現していることが報告されている。RAGE KO(RAGE-/-)マウスおよび野生型(RAGE+/+)マウスに経気道的にPPEを投与し、気道炎症および気腫化を評価したところ、RAGE KOマウスでは野生型マウスに比較し気道炎症および気腫化が有意に抑制されることがわかった。次に、血球系細胞のみにRAGEを発現するマウス、支持組織細胞のみにRAGEを発現するキメラマウスを骨髄移植により作製し、これらキメラマウスでPPE投与により惹起される肺気腫および気道炎症の程度を、RAGE KOマウスおよび野生型マウスと比較検討したところ、支持組織のみにRAGEを発現させたマウスでは野生型マウス同様に気道炎症および気腫を生じたが、血球系のみにRAGEを発現させたマウスではRAGE KOマウスに比べて有意な気道炎症、気腫化を生じなかった。さらに、治療への応用を目的として、デコイレセプターとしてRAGEをブロックする作用を有する可溶性RAGE(sRAGE)の投与、またRAGEのリガンドの1つであるHMBG-1をブロックする抗HMBG-1抗体の投与により気道炎症および気腫化を抑制できるかどうか検討を重ねたが、有意差をもった治療効果を得られなかった。RAGE KOマウスでは野生型マウスに比較し気道炎症および気腫化が有意に抑制されることがわかった。また、血球系細胞のみにRAGEを発現するマウス、支持組織細胞のみにRAGEを発現するキメラマウスを骨髄移植により作製し、これらキメラマウスでPPE投与により惹起される肺気腫および気道炎症の程度を比較検討した結果、気道炎症および気腫化の発症のためには、支持組織へのRAGEの発現がより重要であることが示唆された。RAGE KO(RAGE-/-)マウスでは、野生型(RAGE+/+)マウスに比べ、PPE投与後day4においてBAL液中の総細胞数および好中球数の低値を示し、PPE投与後day21においてCstの低値を示した。また、キメラマウスを作成し行った実験では、支持組織のみにRAGEを発現させたマウスでは野生型マウス同様に気道炎症および気腫を生じたが、血球系のみにRAGEを発現させたマウスではRAGE KOマウスに比べて有意な気道炎症、気腫を生じなかった。
RIイメージング技術による同一果房内の果実肥大の不均一性生起メカニズムの解明

H30年度は、前年度に確立したRIイメージング実験系を用いて、異なる葉位から果房内の各果実への光合成産物の転流様式の可視化を実施した。第2果房の直上葉を中心に、その上下2枚の葉それぞれ計5枚に順次11CO2を投与し、RIイメージング技術を用いて第2果房内の各果実への11Cで標識された光合成産物の移行様式を撮像した。その結果、光合成産物は11CO2を投与してから約70分後に果柄に到達し、その後徐々に果実へ輸送された。しかし、直上葉から第2果房への光合成産物の移行は確認されなかった。一方、直上葉より上下2枚の葉それぞれ計4枚から第2果房への光合成産物の輸送は果房内の各果実の着果位置によって異なることが分かった。果房内の果実に対して、直上葉より上2枚目の葉は主に偶数列に、直上葉より下1枚目の葉は主に奇数列に、光合成産物の輸送を担っており、概ね2枚以上の葉が一つの果実に対して光合成産物の供給を担当していることが分かった。また、果房より上位の葉から根に向かう光合成産物の輸送経路は根と果実の両方向に分かれているのに対し、果房より下位の葉から上方向へ向かう光合成産物の輸送経路は果房のみであり、果房を超えることはなかった。これらの画像データを基に、トマト全身の各葉位と果房間の光合成産物の篩管輸送経路のネットワークの分布模式図を作成したところ、一つの果房に対して少なくとも4枚の葉が光合成産物の供給を担っていることが明らかになった。また、CTを用いて果実の内部の篩管の走行配列を撮像したところ、果柄から胎座、中果皮、子室内の種子などへ至るまで発達した維管束の配列を可視化することができた。しかし、茎の中の維管束を対象にした場合、ほかの組織とのコントラストが困難だったため、維管束の明確な画像を取得することができなかった。11CO2を製造するためのサイクロトロンが故障したため、RIイメージング実験の回数が計画より大幅に減少した。前年度に未達成した各葉位から果房内果実への転流様式の評価のためのRIイメージング実験を継続して行うとともに、これらイメージングデータを基にサンプリングしたトマト果実(果柄)を用いてRNA-Seqを行う。また、果実発達の経時的変化に伴う果実間の光合成産物の転流動態の相互関係を定量的に評価する。得られたすべてのデータを統合し、数理的解析を進める。H29年度は、トマトにおける異なる葉位から同一果房内の各果実への光合成産物の転流様式を可視化するためのRIイメージング実験系を確立した。具体的には、果房周辺の葉に対して個別に11CO2トレーサガスを投与するための2種類の密閉型RI投与容器を開発した。これを用いて葉に11CO2を投与しポジトロンイメージング装置で撮像実験を行ったどころ、投与した総11CO2に対する葉における固定率が平均80%以上であることが確認できた。葉によって固定された11C標識光合成産物は、11CO2投与約70分後から果実に到達することが分かった。新たに開発したRI投与容器は短時間且つ簡便な操作で投与対象の葉を入れ替えられるため、イメージング実験効率の大幅な向上を実現した。また、植物の茎や果柄を局所的に冷却し、師管の輸送機能を一次的に停止または低下させるためのCold-girdling手法を確立した。高性能の冷却装置と発熱が少ないバイモルポンプの導入により、長時間(数時間)且つ持続的な低温処理(25°C)を実現した。この手法を用いて植物の茎の一部(幅約2 cm)に対して約5°Cの連続的な低温処理を行いながら、11CO2とRIイメージング技術を用いて撮像実験を行った。得られた画像データを解析したどころ、Cold-girdling処理によって光合成産物の転流速度が処理前に比べて4割以上低下したことが分かった。植物全身の葉、茎、果実を繋ぐ篩部の構造や連絡網の全体像を可視化するために、新しい画像化ツールとしてPET、MRI、CT撮像技術を導入し、各器官の篩部の立体構造を高分解能で可視化するための撮像条件の検討を行い、実験プロトコールを作成した。H29年度は当初の計画通り、RIイメージング実験系とCold-girdling手法を確立した。これに加えて、新しい画像化ツールとしてPET、MRI、CT撮像技術の導入を行っており、すでに実験プロトコールを作成してある。これは、H30年度に予定している各葉位から果房内果実への転流様式の評価に非常に有用なツールであると考えている。一方、当初計画していた果実の着果と肥大の順番を変化させる栽培方法については再現性が低いため、現段階でまだ試行錯誤を行っている最中である。

一方、直上葉より上下2枚の葉それぞれ計4枚から第2果房への光合成産物の輸送は果房内の各果実の着果位置によって異なることが分かった。果房内の果実に対して、直上葉より上2枚目の葉は主に偶数列に、直上葉より下1枚目の葉は主に奇数列に、光合成産物の輸送を担っており、概ね2枚以上の葉が一つの果実に対して光合成産物の供給を担当していることが分かった。また、果房より上位の葉から根に向かう光合成産物の輸送経路は根と果実の両方向に分かれているのに対し、果房より下位の葉から上方向へ向かう光合成産物の輸送経路は果房のみであり、果房を超えることはなかった。これらの画像データを基に、トマト全身の各葉位と果房間の光合成産物の篩管輸送経路のネットワークの分布模式図を作成したところ、一つの果房に対して少なくとも4枚の葉が光合成産物の供給を担っていることが明らかになった。また、CTを用いて果実の内部の篩管の走行配列を撮像したところ、果柄から胎座、中果皮、子室内の種子などへ至るまで発達した維管束の配列を可視化することができた。しかし、茎の中の維管束を対象にした場合、ほかの組織とのコントラストが困難だったため、維管束の明確な画像を取得することができなかった。11CO2を製造するためのサイクロトロンが故障したため、RIイメージング実験の回数が計画より大幅に減少した。H30年度は、RIイメージング実験系を用いて光合成産物の果実への転流を可視化し定量的に解析することで、転流動態モデルの構築を行う。具体的に、1)各葉位から果房内の個別の果実への転流様式を可視化し定量的に評価する、2)果実間の位置関係(空間分布)による転流動態の相互関係の定量的に評価を行う、3)果実の発達過程の経時的変化(時間分布)に伴う果実間の転流動態の相互関係を定量的に評価する。これらのデータを総合し、数理的に解析することで転流動態モデルを構築する。また、トマト果実を用いてRNA-Seqを行うための条件検討を行う。前年度に未達成した各葉位から果房内果実への転流様式の評価のためのRIイメージング実験を継続して行うとともに、これらイメージングデータを基にサンプリングしたトマト果実(果柄)を用いてRNA-Seqを行う。また、果実発達の経時的変化に伴う果実間の光合成産物の転流動態の相互関係を定量的に評価する。得られたすべてのデータを統合し、数理的解析を進める。RI投与容器の開発が想定より順調に進んだので、経費の節約につながった。発生した次年度への繰越金は、遺伝子発現解析に使用する予定である。RIイメージング実験の減少にともなう消耗品費の支出が減少した。次年度のRIイメージング実験用の消耗品の購入に使用する。
気候変動政策パッケージの提案に向けた法政策的研究-日欧比較調査を踏まえて

日本における気候変動関連法制を含む政策パッケージの構築について検討するための示唆を得るべく、主にEUおよびイギリスの取組動向を調査しフォローした。EUでは中期的には2020年までに温室効果ガス20%削減を図るとし、それに向けた法的拘束力のある措置を含む政策パッケージを打ち出し、さらに長期的には2050年までに80%削減を実現するためのロードマップを描いている。イギリスでは、2020年と2050年の温室効果ガス削減値を気候変動法において明記したうえで、具体的な各種措置を打ち出し実施している。このように明確なビジョンと目標値を法定のものとするとともに、法的拘束力をともなうものも含めた具体的な措置を着実に整備し実行していくことが必要である。EUにおける気候変動政策の法的枠組とそのもとでの政策パッケージの導入状況に関する調査を実施した。特に、イギリスにおける2008年の気候変動法制定以降の対応状況について調査研究を行った。具体的には、同法への対応として、2008年から2022年までの3期にわたる国全体のおよび官庁別のカーボン・バジェットの設定、2010年カーボン削減コミットメント(CRC)エネルギー効率スキーム命令の制定、カーボン排出削減目標(CERT)達成のエネルギー供給事業者への義務付け延長のための命令制定、廃棄物削減制度(パイロット事業)の導入に向けたガイダンス策定、使い捨て袋に係る課金制度導入に向けての業界団体との協定締結と削減率の合意、再生可能交通燃料義務(RTFO)制度の改正命令の制定などが行われており、これらの詳細をフォローした。加えて、気候変動法制定どの動向として、「英国低炭素移行計画」(LCTP)、「英国再生可能エネルギー戦略」、「低炭素交通:よりグリーンな未来」、「低炭素産業戦略」といった各種計画の策定ならびに2011年3月からの「The Carbon Plan」の開始がなされており、それらの内容検討を行った。また、環境政策手法とポリシーミックスに係る研究の一環として、EUにおける統合的汚染防止管理(IPPC)指令の見直し動向と改正指令案の内容に関する検討を行った。さらに、政策法務全般に係る理論と実践例の整理を行った。昨年度に引き続き、EUにおける気候変動政策の法的枠組とそのもとでの政策パッケージの導入状況に関する調査を実施するとともに、イギリスにおける2008年の気候変動法制定以降の対応状況について調査研究を行った。具体的には、EUが打ち出している気候変動政策パッケージ2020の概要に加え、さらに2050年までのロードマップの中身とそれらに包含される立法措置について調査検討を行った。さらに、イギリスの2008年気候変動法への対応として、2008年から2022年までの3期にわたる国全体のおよび官庁別のカーボン・バジェットの設定、2010年カーボン削減コミットメント(CRC)エネルギー効率スキーム命令の制定、カーボン排出削減目標(CERT)達成のエネルギー供給事業者への義務付け延長のための命令制定、廃棄物削減制度(パイロット事業)の導入に向けたガイダンス策定、使い捨て袋に係る課金制度導入に向けての業界団体との協定締結と削減率の合意、再生可能交通燃料義務(RTFO)制度の改正命令の制定などが行われており、これらの詳細をさらにフォローした。2011年3月11日の東日本大震災以降、原子力発電への依存度は低下せざるを得ず、日本におけるエネルギー構成が変わらざるを得ない状況にあるなかで、引き続き気候変動問題に適切に対処していくためには、明確なエネルギービジョンの策定に加えて、中長期的な目標に対して確たる法的根拠を付与したうえで、当該目標達成に向けての明確かつ具体的なプロジェクションと方途を示していくことが求められており、それを可能とする法的枠組みの整備ならびに関連法令の改正、具体的な施策やプログラムの提示は喫緊の課題となっている。本研究においては、気候変動に係る基本法および個別法を含めた法的枠組みの再構築ならびに政策パッケージのあり方について、EUおよびイギリスといった諸外国の状況に係る調査研究を踏まえつつ、比較法的ならびに法政策的な観点から検討し、提示することを目的として、欧州における最新動向をフォローするとともに、とりわけ、ポスト京都議定書をにらんだ国際交渉の場においてイニシアティブをとるべく、積極的な削減目標値の設定とその達成に向けたロードマップの提示にきわめて熱心な取組みをみせているEUに焦点を当てて、気候変動政策を含む環境政策の発展経緯と法的根拠、2020年を目途とする気候変動政策ならびにエネルギー政策パッケージの概要とそれを構成する各種立法措置の詳細、2050年に向けた長期的ビジョンについて把握・整理して、検証した。中長期をにらんで、年々新たな方針や施策が打ち出され、充実が図られてきているEUおよびイギリスにおける気候変動政策について、立法措置も含めて入念にフォローし、その概要および成果を把握・分析できており、日本の気候変動政策の構築に資する貴重な視座を得られていることから、当初の研究目標に照らして、おおむね順調に進展している。

24年度が最終年度であるため、記入しない。さらにEU等における最新動向とこれまでの成果について調査分析を進めつつ、これまで得られた知見をもとに、日本における立法措置を含む中長期的な気候変動政策に対する提言としてまとめあげていく。
C. difficileのクオラムセンシング機構に関する分子疫学と機能解明の研究

C. difficile感染症は近年強毒株による重篤化や治療後の再発など新たな問題が出現し、さらなる治療法の研究、開発が望まれる。申請者らはC. difficileのクオラムセンシング機構に着目し、その機構を介した病原因子制御を解明することにより、新たな治療戦略を見出すことを本研究の目的とする。これまで詳細に検討されていない臨床分離株を用いたC. difficileのクオラムセンシング機構関連遺伝子の分子疫学的解析を行い、病態との関連を検証する。さらに、クオラムセンシング機構の微生物学的な病原性への影響とその機序解明、新たな治療戦略を検証する。
反応経路決定因子の解明:Wittig反応かCorey反応か?

リンイリドとアルデヒドは立体選択的にオレフィンを与える(Wittig反応)。これに対し、リンイリドの同族体であるヒ素イリドは多くの場合アルデヒドと反応してオキシランを与える(Corey反応)。また、この2つの反応経路のうち、リンイリドはWittig反応のみを起こすが、ヒ素イリドは反応条件やアルデヒドの構造によって、両反応の割合が大きく影響を受ける。さらに、リンやヒ素と同じ周期律表15族の窒素やアンチモンのイリドも知られているが、これらが効率よくWittig反応を起こしたという報告はない。本研究では、これらの反応の進みやすさが何によって支配され、反応経路のswitchingがどのような理由によって生じるのかを明かにするために、一連の15族イリド、H_3M=CH_2、M=N、P、As、Sb、Bi、の生成反応、イリドの性質、およびイリドとアルデヒドとの反応について、非経験的分子軌道法計算(MP2/DZ+d)を行った。その結果、イリドの生成はPでもっとも容易で、As、Sbと周期律表の下に行くほど困難になること、またNではイリドが非常にできにくいこと。さらに、イリドのカルバニオン性はPからBiになるにしたがって大きく、Nでも大きくなると計算された。一方、イリドの反応は、Pの場合に最もWittig型反応が有利であり、As、SbとなるにつれてCorey型反応が容易になること、またNではWittig型反応が存在しないことが予想された。これらの計算結果は、実際の実験結果と完全に一致している。次に、これらの15族元素イリドの性質の違いが何によっているか検討した。その結果、15族元素の酸素親和性とM-C結合の強さに支配されていることが分かった。そして、酸素親和性は、隣接する電気的に陰性な基を安定化する能力と相関することが判明した。
骨細胞の分化・増殖関連遺伝子の発現に対するメカニカルストレスの影響に関する研究

申請者は、骨芽細胞のメカニカルストレスに対する生物学的な反応について解析した。1.培養骨芽細胞に対する機械的負荷と一酸化窒素(NO)の産生骨芽細胞への機械的負荷(周期的一軸方向伸展)によりNOの産生とiNOSの発現が認められた。毎分15回、7%の伸展刺激において培養上清中のNO産生量は最大値を示した。2.プロスタグランジン合成酵素(COX-2)、サイトカインの解析骨芽細胞を4時間、12時間伸展し、COX-2mRNAの発現量を定量RT-PCR法で解析した。伸展刺激によりCOX-2mRNA発現量は有意に増大し、12時間刺激では4.5倍の発現量が認められた。しかし、サイトカイン及びレセプターの発現量には有意な増減は見られなかった。3.細胞内シグナル伝達系の活性化細胞内シグナル伝達系のうち、特にMAP kinase(MAPK)familyの活性化を解析するために、経時的に骨芽細胞を採取しwestern blotting法で解析した。p38MAPKの活性化は亢進したが、p44/p42MAPKとSAPK/JNKには変化がなかった。1日4時間刺激を3日間加えると、p38MAPKの活性化は保たれていたが、p44/p42MAPKの活性化は減少し、SAPK/JNKの活性化は3日間変わらなかった。このことから、伸展刺激はp38MAPKの活性化を誘導することが示された。4.メカニカルストレスに対する骨芽細胞の生物学的反応培養骨芽細胞には分泌型破骨細胞分化因子(sRANKL)と破骨細胞形成抑制因子(Osteoprotegerin/OPG)の発現が見られた。これに、1日4時間3日間の伸展刺激を加えると、sRANKLの分泌は抑制されるのに対しOPGの産生は促進された。以上の結果から、骨芽細胞に対する周期的一軸方向伸展刺激のようなメカニカルストレスは、骨吸収よりも骨形成を促すことが示唆された。このことは、緩徐に増大する顎骨嚢胞周囲の骨組織が比較的密な骨塩量を示すという臨床的所見とも一致するものであった。本年度は、骨芽細胞への機械的刺激負荷の影響を分子生物学的に検討するため、定量PCR法による各種分化・増殖関連遺伝子mRNAの検出法を確立する研究を行った。研究補助金により蛍光検出器内蔵遺伝子増幅装置を購入した。定量PCR法は試料間における遺伝子発現の差異を解析することから、発現量の絶対値を得るため外部標準遺伝子が必要となる。しかし、現時点では定量PCR法に用いられる外部標準遺伝子は確立していない。そこで今年度は、外部標準遺伝子として目的とする遺伝子を大量生産し、これを用いた定量化を試みた。目的遺伝子としては内部標準としてのPBGD遺伝子とヒトIL-6遺伝子を用いた。ヒトPBGD遺伝子及びヒトIL-6遺伝子は、正常ヒト線維芽細胞が発現するmRNAを逆転写酵素でcDNAにし、それぞれのプライマーで増幅したPCR産物をTAクローニング法によって、ベクターとなるBluescript II SK(+)に組み込んだ。

始めに、ベクターをEcoRVで消化し、ベクターの3'末端にdTを付加し、PBGDのPCR産物を組み込み、さらに、SmaIで消化した後、同様にヒトIL-6遺伝子を組み込み、1つのベクターに内部標準遺伝子とIL-6遺伝子を組み込んだ。遺伝子がベクターに正確に組み込まれたか否かについては、ABI PRISM310を用い塩基配列を検索して確認した。当初、骨細胞系細胞として16日齢ニワトリ胚頭頂骨より骨細胞を分離培養する予定であったが、一定の細胞を得ることが困難であったため、市販の骨芽細胞(三光純薬社製)を入手し実験に供した。機械的負荷として、培養細胞伸展装置(既設)を用い周期的一軸伸展刺激を行った。予備的に1時間の機械的刺激負荷を行い、IL-6の発現を検討したが有意差は得られなかったため、次年度は刺激時間の延長を含め種々の培養条件を検討する。申請者は、骨芽細胞のメカニカルストレスに対する生物学的な反応について解析し以下の結果を得た。1.培養骨芽細胞に対する機械的負荷の方法とNOの産生骨芽細胞への機械的負荷により一酸化窒素(NO)の産生が認められた。0.25Hz、7%の周期的一軸方向伸展刺激において培養土清中のN0_2^-産生量は最大値を示し、iNOSの発現も認められた。以後この条件で検討した。2.COX-2産生の解析骨芽細胞を4時間、12時間伸展して、プロスタグランジン合成酵素(COX-2)mRNAの発現量を定量RT-PCR法でLightCycler(申請備品)を用いて解析した。無刺激に比べ伸展刺激でCOX-2mRNA発現量は有意に増大し、12時間刺激では4.5倍の発現量が認められた。サイトカイン産生量、サイトカインレセプターの発現量には有意な増減は見られなかった。3.細胞内シグナル伝達系の活性化骨芽細胞内のシグナル伝達系のうち、特にMAP kinase(MAPK)familyの活性化について検討した。伸展刺激開始から0分、10分、20分、30分、45分で骨芽細胞を溶解採取し、western blotting法で解析したところ、p38MAPKの活性化は亢進したが、p44/p42MAPKとSAPK/JNKには変化が認められなかった。さらに、1日4時間刺激を13日間加えると、p38MAPKの活性化は保たれていたが、p44/p42MAPKの活性化は減少し、SAPK/JNKの活性化は3日間変わらなかった。このことから、伸展刺激によりp38MAPKの活性化が誘導されることが示された。4.メカニカルストレスに対する骨芽細胞の生物学的反応培養骨芽細胞には分泌型破骨細胞分化因子(sRANKL)と破骨細胞形成抑制因子(Osteoprotegerin/OPG)の発現が見られた。これに、1日4時間3日間の伸展刺激を加えると、sRANKLの分泌は抑制されるのに対しOPGの産生は促進された。以上、14の結果から、骨芽細胞の伸展刺激は骨形成を誘導することが示唆された。