hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
摂食障害と消費社会:飽食の時代における拒食と過食嘔吐

平成十四度の研究実績は、二月末の時点で、九件のインタビュー収録と一本の論文発表となる。九件のインタビューの内訳は、男性二件と女性七件である。特筆すべきは、男性のインタビューが二件収録できたことである。摂食障害者のほとんどは女性とされ、男性は数少ないとされている。男女比は、一対二十から一対十の割合と言われている。今回初めて男性の摂食障害者の事例を収集できたことで、摂食障害研究における新たにジェンダー的な対比と考察が可能となった。男性摂食障害者の事例研究は、論文発表の形でまとめたいと思う。また女性の摂食障害者についても、興味深い事例が得られた。それは、摂食障害という症状と、美的身体へのこだわりとの関連である。この美的身体へのこだわりは、美的身体を形成するための消費行動という点と、美的身体にかかわる仕事へのこだわりという点に現れていた。ある女性摂食障害者は美容師の見習いとして働いており、他の女性摂食障害者はエステ勤務の後、コンパニオンとして働いている。摂食障害と美的な産業との関連について、今後考察を深めたいと思う。論文は、二十五人の摂食障害者へのインタビューをもとに、摂食障害とその家族との関連を考察したものである。「摂食障害は家族によって生み出される」とする家族要因説を批判的に検討している。結論的には、家族要因説のみで摂食障害を語ることはできず、そしてそのように語ってしまうことの危険性を指摘している。
流れ盤斜面の地震時崩壊の誘因となる層理面の力学特性の類型化

層理面が有する典型的な力学特性について、地震時を想定した載荷条件下での研究が極めて少ないことから、これを明らかにするため、多様な試験条件下での結果を蓄積してきた。繰返しせん断試験を行うと、処女載荷時に大きなせん断抵抗を示した後、急激にせん断強度を失うことが観察された。過去に日本国内で発生した典型的な流れ盤斜面地すべりを対象に、それぞれの斜面で地すべりの原因となった層理面の繰返し載荷時の力学特性を明らかにした。また、これに基づく地すべりの数値シミュレーション(動的弾塑性FEM)を実施した。また、層理面の繰返し載荷時のせん断特性を把握する研究過程において、その面に垂直な引張強度が極めて低いこと、特に急速載荷時にこの傾向が顕著になることを発見した。その引張強度特性を詳細かつ定量的に調べるため、専用の岩盤打撃試験機を開発した。この装置は、層理面を挟在する岩盤の供試体の端部を層理面と垂直な方向に打撃することで、その衝撃波が層理面を波動として通過する際に層理面を引張り破壊させることを想定した新たな実験装置であり、段階的に打撃力を操作することで、層理面の引張り破壊に必要な最低限の引張力を逆算する仕組みとなっている。これを用いた層理面の引張り強度の計測結果から、地震時の層理面の引張り破壊と地すべりとの関連性を分析した。自然斜面、特に「流れ盤斜面」が地震時に平面すべり様の大規模崩壊を起こすことが良く知られている。本課題研究では、流れ盤斜面の内部に弱面として存在する層理面の力学特性を類型化するための各種の基礎的研究を行うことを目的とした。このような研究は、中山間地が巨大地震に襲われた際の土砂災害の軽減に極めて有効である。今年度は以下の3点の研究作業に着手した。(1)層理面を挟在するブロック状不撹乱試料の採取法の検討(2)層理面の地震時力学特性を把握するための室内試験法の検討(3)地震時に層理面に作用する荷重条件の解析的検討(1)について、新潟県柏崎市の聖ヶ鼻地区の大規模地すべり(2007年新潟県中越沖地震で発生)の現場近傍の流れ盤構造の顕著な露頭から、地震時に強度低下することが懸念される層理面を挟在するブロック状の不撹乱試料の採取を試みた。予想以上に層理面の引張り強度が小さく採取作業は難航したが、必要な物品の購入、専門技術者の協力等の試行錯誤により、室内試験に供しうる試験体の削出が成功した。(2)について、採取試料の室内試験の実施にあたり、地震時に実際に層理面に作用した力学条件(繰返し載荷、等体積条件、適切なせん断モードなど)を考慮した試験方法を検討した。既存の試験装置を製作・改造し、地震時に層理面が強度低下するメカニズムを試験室内で再現することに成功した。以上を踏まえて(3)の検討を行った。数値解析には研究代表者が開発した動的弾塑性有限要素解析コードを使用した。(2)で得られた力学特性を表現しうる構成モデルを導入して、既往地震の観測波形を用いた地震応答解析を行い、解析の結果得られた層理面内の応力ひずみ径路等から実際の地震中に層理面に作用する外力の条件を明らかにした。次年度には、以上の成果を取りまとめ、流れ盤斜面の力学的特徴と減災対策について考察を行う。本課題研究において取り組み、明らかにした点は以下のとおりである。層理面が有する典型的な力学特性がどのようなものであるか、地震時を想定した載荷条件下での研究が極めて少ないことから、これを明らかにするため、多様な試験条件下での結果を蓄積してきた。過去に日本国内で発生した典型的な流れ

盤斜面地すべりを対象に、それぞれの斜面で地すべりの原因となった層理面の繰返し載荷時の力学特性を明らかにした。また、これに基づく地すべりの数値シミュレーション(動的弾塑性FEM)を実施した。また、層理面の繰返し載荷時のせん断特性を把握する研究過程において、その面に垂直な引張強度が極めて低いこと、特に急速載荷時にこの傾向が顕著になることを発見した。その引張強度特性を詳細かつ定量的に調べるため、専用の岩盤打撃試験機を開発した。この装置は、層理面を挟在する岩盤の供試体の端部を層理面と垂直な方向に打撃することで、その衝撃波が層理面を波動として通過する際に層理面を引張り破壊させることを想定した新たな実験装置であり、段階的に打撃力を操作することで、層理面の引張り破壊に必要な最低限の引張力を逆算する仕組みとなっている。これを用いた層理面の引張り強度の計測結果から、地震時の層理面の引張り破壊と地すべりの誘発との関連性を分析した。この成果は現在論文として取りまとめ中であるが、地震動による斜面内のせん断力が地すべりを引き起こす主因と考えられてきた中で、新たに地震動の斜面直角方向成分が地すべりに寄与する可能性を指摘するものであり、今後の更なる研究の継続が望まれる。
神経芽腫モデルマウスを用いた新規制御因子の探索と機能解析

申請者らは、これまでの結果として、MYCN-トランスジェニックマウスの腫瘍組織から単離・培養したtumor sphereとマウス海馬由来の神経幹細胞との網羅的遺伝子解析からtumor sphereと腫瘍発生を結びつけるヒントを掴むに至らなかった。また、我々は昨年までの網羅的解析から得られた候補遺伝子の中から、NeuroD1と神経芽腫の進展について報告をした(Huang et al. 2011 Cancer Res)。しかし、候補遺伝子が多いこと、多くの候補遺伝子に対して並列化できるスクリーニング系を持っていないこと、そして将来的な研究の効率を考慮して候補の絞り込みに必要な情報を再構築することとした。はじめに、tumor sphereが腫瘍発生因子や進展因子をenrichしていると仮定し、tumor sphereと腫瘍組織の発現プロファイルを次世代シークエンサーで解析した。その結果、tumor sphereで発現量が2倍以上高い遺伝子を111個ピックアップした。次に、正常な腹腔交感神経節と腫瘍組織の発現プロファイルについてマイクロアレイを用いて解析した。その結果、腫瘍組織で発現量が2倍以上高い遺伝子を726個ピックアップした。続いて、それらで共通してピックアップした遺伝子について、オランダの臨床データベースR2を用いて発現量と生存曲線の相関をとり、有意差のある遺伝子を3つ(Csrnp3,Dock4,Pik3r1)ピックアップした。そして、絞り込んだ3つの遺伝子についてin situ hybridizationとqPCRを用いて時系列毎の発現プロファイルを解析した。その結果、モデルマウスにおいて腫瘍が発生すると考えている生後2週の段階で3遺伝子とも興味深い挙動を示した。現在、過剰発現ベクターとshRNA、siRNAのデザインを進め、神経芽腫細胞株を用いて候補遺伝子の詳細な機能解析を進めている。一般に,幹細胞はgrowth conditionにおいて,種々の未分化マーカーの発現が確認される.そこで,MYCNトランスジェニックマウスの神経芽腫腫瘍組織から初代培養したtumor sphereについて未分化マーカー(Oct3/4,SOX-2,Nanog等)の発現を免疫蛍光染色あるいはRT-PCR法を用いて解析した.その結果,典型的な未分化マーカーの発現プロファイルの確認ができた.また,tumor sphereと神経幹細胞(野生型マウスのE14から初代培養した細胞)の未分化マーカーの発現プロファイルについてreal-time RT-PCR法を用いて比較した結果,複数の遺伝子の発現量に有意な差が認められた.癌幹細胞と称される細胞は腫瘍原生を有していることが種々の固形癌で報告されている.そこで,tumor sphereの腫瘍原生を評価するために,tumor sphereを腎臓の皮膜下あるいは皮下に移植した際に腫瘍が形成されるかどうかを調べた.その結果,ヌードマウス,野生型問わず腫瘍を形成することをH&E染色を用いた組織染色により確認した.このことからtumor sphereが腫瘍原生を有していることがわかった.オリジナルの腫瘍組織とtumor sphereについてマイクロアレイを用いて比較したところ,gain,lossともに40個ほどの候補遺伝子を絞り込んでいる.絞り込んだ候補遺伝子には,既知の神経芽腫関連遺伝子もいくつか含まれている一方で全く報告のない遺伝子も多数含まれていた.現在,これらの遺伝子について解析すべく過剰発現ベクターの作製やノックダウンのためのsiRNA,shRNAのデザインに取り組んでいる.MYCNトランスジェニックマウスの腫瘍組織より単離・培養したtumor sphereについて,当初,安定した継代培養や細胞保存が困難であった.安定した培養系を確立させることで,同時期に由来の異なるtumor sphereを評価・検討することが可能となり,初代培養細胞を実験に用いる際に生じる個体差の影響を最小限に抑えた実験が可能になると考えた.そこで,tumor sphereの安定した継代培養や細胞保存の条件検討を行うことにした.初めに,他の肝細胞の培養を参考にすることを考え,これまで培養経験のある神経細胞以外の幹細胞(マウスES細胞やヒトES/iPS細胞)を用いて継代方法や細胞保存について学び,tumor sphereの系に応用することが可能なものを一つ一つ検討した.条件検討と改変の結果,tumor sphereは少なくとも3ヶ月以上の継続培養が可能になった.また,継続培養中において,細胞の形態や遺伝子発現プロファイルに異常は認められなかった.次に,免疫不全マウスを用いて腫瘍形成脳を検討した結果,初代培養した直後のtumor sphereと同様に,長期培養したtumor sphereも腫瘍形成能を示したことから,tumor sphereは長期培養しても腫瘍形成能を維持することがわかった.さらに,繰り返しの連結保存も可能になった(腫瘍形成能,遺伝子発現プロファイル,細胞の形態確認済み).これらの結果から,tumor sphereはESあるいはiPS細胞のようにある程度株化が可能な細胞であることがわかった.よって,今後は文頭に示した目的である"同時期に複数の株をスクリーニングすること"が可能になった.他方,マイクロアレイの結果より絞り込んだ遺伝子における過剰発現ベクターの作製やノックダウンのためのsiRNA,shRNAのデザインは継続して取り組んでいる.申請者らは、これまでの結果として、MYCN-トランスジェニックマウスの腫瘍組織から単離・培養したtumor sphereとマウス海馬由来の神経幹細胞との網羅的遺伝子解析からtumor sphereと腫瘍発生を結びつけるヒントを掴むに至らなかった。

しかし、候補遺伝子が多いこと、多くの候補遺伝子に対して並列化できるスクリーニング系を持っていないこと、そして将来的な研究の効率を考慮して候補の絞り込みに必要な情報を再構築することとした。はじめに、tumor sphereが腫瘍発生因子や進展因子をenrichしていると仮定し、tumor sphereと腫瘍組織の発現プロファイルを次世代シークエンサーで解析した。その結果、tumor sphereで発現量が2倍以上高い遺伝子を111個ピックアップした。次に、正常な腹腔交感神経節と腫瘍組織の発現プロファイルについてマイクロアレイを用いて解析した。その結果、腫瘍組織で発現量が2倍以上高い遺伝子を726個ピックアップした。続いて、それらで共通してピックアップした遺伝子について、オランダの臨床データベースR2を用いて発現量と生存曲線の相関をとり、有意差のある遺伝子を3つ(Csrnp3,Dock4,Pik3r1)ピックアップした。そして、絞り込んだ3つの遺伝子についてin situ hybridizationとqPCRを用いて時系列毎の発現プロファイルを解析した。その結果、モデルマウスにおいて腫瘍が発生すると考えている生後2週の段階で3遺伝子とも興味深い挙動を示した。現在、過剰発現ベクターとshRNA、siRNAのデザインを進め、神経芽腫細胞株を用いて候補遺伝子の詳細な機能解析を進めている。
魚類の筋成長に関連した筋線維形成機構に関する研究

筋肉は動物の動きを司る基本的な器官でその生理および代謝は生命の根幹をなす。一方、産業的に重要な生物種で筋肉は可食部のほとんどを占め、食品化学的見地からも重要な器官である。このように基礎および応用の両面で重要な筋肉であるが、発生や発達の機構は長年の多くの研究にもかかわらず、未知の部分が多く残されている。そこで本研究では脊椎動物の中で最もゲノムサイズが小さく、遺伝子解析が容易であるトラフグを対象に、従来からの生化学的手法に加え、分子生物学的技法をも駆使し、筋肉の主要タンパク質であるミオシンの重鎖サブユニット(MYH)をコードする遺伝子(MYH)の諸性状を調べることで、筋線維形成機構を明らかにすることを目的とした。トラフグ速筋型ミオシン重鎖遺伝子AYH_<M2528>およびMYH_<M454>,につき転写産物の発現状況を調べたところ、いずれも成体の外眼筋・速筋、遅筋に発現が認められた。また、MYH_<M454>,は腸にも発現がみられたが、胚体では転写産物はみられなかった。一方、MYH_<M2528>は胚体に発現がみられ、腸には発現がみられなかった。さらに、の5'上流域の配列をGFP遺伝子の上流域に組み込みレポーターベクターを作成し、メダカ受精卵にマイクロインジェクションで導入したところ、MYH_<M454>、ではいかなる部位でも発現は観察されなかった。一方、MYH_<M252>、は速筋で主に発現し、遅筋でも発現がわずかにみられた。さらに、をゼブラフィッシュ受精卵に導入したところ、MYH_<M2528>は目、顎、胸びれにも発現がみられた。これらの結果は、MYH遺伝子の発現調節領域が魚類間で共通しており、筋線維の形成機構に重要な役割を果たしていることを示唆する。一方、産業的に重要な生物種においては筋肉は可食部のほとんどを占め、食品化学的見地からも重要な器官である。本研究は、従来からの生化学的手法に加えて近年、進展が著しい分子生物学的技法をも駆使し、系統進化学的には脊椎動物では最も下等であるが、多産性であること、体外受精で胚発生が容易に観察できることなどの利点が多い魚類を対象として、筋線維の増殖と筋管形成の機構を明らかにすることを目的とした。1.モデルゲノムとしてゲノムデータベースの利用価値が高いトラフグから既に多くのミオシン重鎖(MYH)遺伝子(MYH)をクローン化している。そこで成体遅筋型MYH_<M2528>および胚型MYH_<M454,>につき、10kbpの5'上流域をトラフグ全ゲノムデータベースから抽出し、rVistaプログラムを利用してこの領域に存在する転写因子の結合配列を探索した。その結果、myoDファミリーなど、種々の転写因子の結合配列が同定された。2.次に、Multi-LAGANプログラムを用いてMYH_<M2528>およびMYH_<M454,>の5'上流域を、メダカ成体速筋型mMYH1mMYH11の相同領域と比較した。しかしながら、トラフグ両MYHの5'上流域と、メダカのそれとは相同性が認められなかった。3.ゲノムDNAを鋳型にトラフグ両MYHの5'上流域をPCRで増幅して、phrGFPベクターに挿入して組み換えDNAコンストラクトを作製した。4.上述のように作製したコンストラクトをメダカ受精卵にマイクロインジェクションで導入し、現在、MYHの5'上流域の転写活性をin vivoで調べている。筋肉は動物の動きに機能する基本的な器官でその生理および代謝は生命の根幹をなす。一方、産業的に重要な生物種においては筋肉が可食部のほとんどを占め、食品化学的見地からも重要な器官である。このように基礎および応用の両面で重要な筋肉であるが、発生や成長の機構は長年の多くの研究にもかかわらず、未知の部分が多く残されている。本研究は、従来からの生化学的手法に加えて近年、進展が著しい分子生物学的技術をも駆使し、系統進化学的には脊椎動物では最も下等であるが、多産性であること、体外受精で胚発生が容易に観察できることなどの利点が多い魚類を対象として、筋線維の増殖と筋管形成の機構を明らかにすることを目的とした。1.トラフグの胚体に特異的に発現し、成体では発現のみられないミオシン重鎖(MYH)遺伝子(MYH)、MYHM743につき、TFSEARCHプログラムで開始コドンから2kbの5'上流域のcis配列を調べた。その結果、myoDファミリーなど、筋特異的遺伝子の発現に関与する転写因子など、種々の転写因子の予想結合配列が同定された。2.次に上記の上流域をゲノムDNAを鋳型とするPCRに付して増幅し、phrGFPベクターに挿入した。このベクターを12細胞期のゼブラフィッシュ胚に顕微注入してゼブラフィッシュの発生に伴うGFP遺伝子の発現変動を調べた。その結果、GFPは受精後2448時間の体節に発現することがわかった。3.さらに、GFPの発現は胚体および艀化仔魚の頭蓋筋や胸鰭筋にも発現したが、非筋組織には発現が認められなかった。

4.以上の結果は5'上流域の2kb中にMYHM743の発現に重要な役割を果たす筋分化制御因子の結合配列を含まれていることを示唆する。筋肉は動物の動きを司る基本的な器官でその生理および代謝は生命の根幹をなす。一方、産業的に重要な生物種で筋肉は可食部のほとんどを占め、食品化学的見地からも重要な器官である。このように基礎および応用の両面で重要な筋肉であるが、発生や発達の機構は長年の多くの研究にもかかわらず、未知の部分が多く残されている。そこで本研究では脊椎動物の中で最もゲノムサイズが小さく、遺伝子解析が容易であるトラフグを対象に、従来からの生化学的手法に加え、分子生物学的技法をも駆使し、筋肉の主要タンパク質であるミオシンの重鎖サブユニット(MYH)をコードする遺伝子(MYH)の諸性状を調べることで、筋線維形成機構を明らかにすることを目的とした。トラフグ速筋型ミオシン重鎖遺伝子AYH_<M2528>およびMYH_<M454>,につき転写産物の発現状況を調べたところ、いずれも成体の外眼筋・速筋、遅筋に発現が認められた。また、MYH_<M454>,は腸にも発現がみられたが、胚体では転写産物はみられなかった。一方、MYH_<M2528>は胚体に発現がみられ、腸には発現がみられなかった。さらに、の5'上流域の配列をGFP遺伝子の上流域に組み込みレポーターベクターを作成し、メダカ受精卵にマイクロインジェクションで導入したところ、MYH_<M454>、ではいかなる部位でも発現は観察されなかった。一方、MYH_<M252>、は速筋で主に発現し、遅筋でも発現がわずかにみられた。さらに、をゼブラフィッシュ受精卵に導入したところ、MYH_<M2528>は目、顎、胸びれにも発現がみられた。これらの結果は、MYH遺伝子の発現調節領域が魚類間で共通しており、筋線維の形成機構に重要な役割を果たしていることを示唆する。
DNA修復蛋白の発現を利用した放射線治療効果の予測

前立腺癌の放射線治療において、Ku70の発現は臨床所見(グリソンスコア、D'amicoリスク分類)と相関がなく、独立した予測因子であった。PSA再発の予測因子として、グリソンスコア単独と比較してグリソンスコアとKu70発現を組み合わせると予測能が向上した。放射線治療とホルモン治療を併用した患者において、グリソンスコア7以下またはKu70低発現の患者ではPSA再発は一例も認めなかった。一方で、グリソンスコア8以上かつKu70高発現の患者では高いPSA再発率を示した。放射線による細胞死では、DNA損傷の一つであるDNA二重鎖切断が重要であり、その主な修復機構の一つに非相同末端結合がある。これに関与する蛋白として、XRCC4、DNA-PKcs、Ku70、Ku86があるが、これらの蛋白発現の強度と放射線治療成績の相関性を解析し、治療効果の予測因子となりうるかを検討した。対象は2001年から2010年において前立腺癌と診断された100例である。病期分類はUICCによるTstage分類でT1c 57例、T2以上43例、D'amicoのリスク分類でlow risk 13例、intermediate risk 37例、high risk 50例であった。放射線治療は、3D CRTで70グレイ、IMRTで76グレイを照射した。ホルモン療法は、intermediated risk,high risk群で施行された。治療前における、生検組織を用いて、前述した蛋白について免疫染色を行った。標本の腫瘍組織の中で最も強く染色される領域について、蛋白の発現率を算出した。PSA非再発率をエンドポイントとして解析すると、Ku70の発現率は単変量解析において、T stage、照射方法(照射線量)と共に、有意な、独立した予後因子であった。PSA非再発率を従属変数、年齢(70歳)、照射方法、T stage、グリソンスコア、などの因子を独立変数として多変量解析を行うと、グリソンスコア、照射方法とともに、有意な、独立した予後因子であった。前立腺癌の治療方針は、T stage、グリソンスコア、PSA値によって決定される。これらの臨床所見は放射線治療後の前立腺癌の局所再発を予測するリスク因子としては十分ではない。放射線感受性に関する指標が局所再発の可能性を予測するうえで必要とされる。方法:2007年8月から2010年10月までの期間にIMRT(強度変調放射線治療)による放射線治療を受けた前立腺癌患者の58例について探索群として解析し、2001年3月から2007年5月までの期間に3DCRT(3次元放射線治療)を受けた前立腺癌患者42例について検証群として解析した。病理標本を用いて非相同末端結合修復に関与する蛋白について免疫組織染色を施行した。結果:Ku70の発現は様々な臨床所見(例えばグリソンスコア、D'amicoリスク分類)と相関がなく、独立した予測因子であった。PSA再発の予測因子として、グリソンスコア単独と比較してグリソンスコアとKu70発現を組み合わせると予測能が著しく上昇した。検証群でも同様の結果を得た。結論:76Gyの放射線治療とホルモン療法はグリソンスコア7以下またはKu70低発現の患者においては効果的な治療方法であるが、グリソンスコア8以上かつKu70高発現の患者においては十分ではなく、他の治療アプローチを必要とするかもしれない。研究目的の一つとして、生検標本を使用した免疫組織染色による放射線治療効果予測法の確立を目指すことがあるが、前立腺癌で、有望な結果が得られた。医歯学生検標本を使用した免疫組織染色による放射線治療効果予測法の確立のための研究をさらに進める。この研究と並行して、リンパ細胞のDNA-PK活性の測定による放射線障害予測法の確立の研究も行う。すでに研究室にあった消耗品を使用して研究を行ったため、残額が生じた。平成26年度の残額と平成27年度の直接経費を使用して、免疫組織染色やリンパ細胞のDNA-PK活性の測定、in vitroの研究を行う。これらの研究における消耗品、実験補助のための人件費、学会参加のための費用などに使用する予定である。
干渉計のデータ処理とイベント選別・相関解析

H17年度は、米国LIGOグループとの国際共同研究の最終結果がまとまり、成果を論文および国際会議での発表に至った。このことは本計画研究のもっとも大きな目的である「重力波イベントの相関解析による探索」が一応の成功を納めたことになる。連星合体からのインスパイラル重力波探索については、TAMA DT8およびLIGO S2観測の同時観測データから、我々の銀河系について1年あたり49イベント以下(信頼度90%)という上限値を得た。またバースト重力波については、h_<rss>>2x10^<-19>についておよそ0.2以下[トリガー/日](信頼度90%)の結果を得、これはLIGO S2単体での結果を更新し、TAMA実験との同時性を要求した解析による改善を示した。本計画研究で世界に先駆けて行ってきたブラックホール準固有振動からのリングダウン重力波の探索については、TAMA DT6,7,8,9についての探索が行われ、我々の銀河系内での20太陽質量以下のイベントについて、3.4x10^<-2>[Hz]という上限値を得た。これらの上限値は、天文学的には他の観測や予測に比して、まだ十分なインパクトをもつものではないが、重力波研究において国際協力あるいは先鞭をつけた手法によって、実データの解析から上限を得られたことは大きな価値をもつ。まず、主にいままでTAMAでは手つかずであったブラックホールのリングダウン重力波イベントの探索を中心に研究を開始した。これらの環境として、計算用のPC(Linux)クラスターマシンを導入した。1CPUあたりの性能は600800Mflopsであるが、今回MPI並列計算を探索に導入したことにより、効率的に16倍の性能で予想波形とデータの相関計算をおこなえるようになった。またイベント探索と平行して、探索用のソフトウエアを整備し、汎用性をもたせて、他の波形の探索に応用できるような形式で開発した。つぎに相関解析については、我々の実験であるTAMAと競合する感度に達して運転を開始した米国のLIGO実験との間で、相関運転・解析を計画し、LIGOグループとのあいだに協定(Memorandom of Understanding)を結んだ。これに従って、相関イベントを探索する共同ワーキンググループができ、本計画研究においては、合成した感度、重力波源の方向決定についての角度分解能についての予想計算をおこなった。全天平均で合成感度は0.77(1台の場合は平均で0.44)、角度分解能は2度程度との結果であった。実際にイベント探索を行う実データは2002年度末の観測のものになる。相関を探す内容は、連星合体からのチャープ重力波イベント、バースト重力波イベントがあげられ、本研究の成果次第ではブラックホールリングダウン重力波イベントを加える。今年度は、TAMA検出器が2回の観測をおこなった。(うち一つは昨年度末からのもの。)これらは相関解析の協定を結ぶ米国LIGO計画の観測と同期して行われた。これらのデータを使用するために、クラスタ計算機のRAIDディスク容量を3TB増設した。イベント探索解析については、昨年度に着手したブラックホール準固有振動からのリングダウン重力波の探索について、多くの進捗が得られた。最も重要なのはマッチドフィルター解析において、最適なテンプレート群を用いるためのデザインと、実際の計算における最小マッチ率の確認である。これはシミュレーション等を用いて、TAMA実機データで確認しされた。リングダウン波形についてのこのようなテストは、まだよく考察されていない内容であり、世界に先駆けてリングダウン探索が成熟しつつある。現在、銀河系内でのイベント(質量の3%が重力波になると仮定)であれば、50%以上の検出効率でとらえることが可能である。次に雑音による疑似イベント棄却の手法(veto解析)をテスト中である。ここではフィルター出力の非対称性や指数関数的な減衰の性質をもちいた棄却方法、マッチしたテンプレート数の不自然さをもちいたveto判定を試みている。vetoの方法は、最終的に観測上限値を得るために、十分に雑音起因の偽イベントを棄却する必要がある。相関解析については、TAMA-LIGO間で、バースト重力波、連星合体のインスパイラル波形、γ線バースト(GRBO30329)との相関解析が進行中である。今年度は、特にブラックホール準固有振動からのリングダウン重力波探索について進展があった。我々はマッチドフィルタ解析をこの重力波波形にも応用してきたが、これによる検出において、もし実際の重力波であればどの程度でブラックホールの物理量を推定できるのかの評価が見積もられた。それによれば平均的な銀河イベントについては、ブラックホールの質量を210%程度で、Kerrパラメーターについては4060%程度で推定できることがわかった。特に質量分解能については、将来的にブラックホールの物理について知見を得られる可能性が大きい。また一方ではTAMA-LIGOの同時イベント解析も進んだ。TAMA計画の他研究者およびLIGO側研究者の協力を得て、バースト重力波についてはTAMA DT8-LIGO S2のデータ解析が終わり、連星合体重力波については10%のテストデータでの各種パラメーターの分布や閾値設定が終わった。バーストについてはLIGO単体での観測上限値を改善し、連星合体については検出器を組み合わせたことにより銀河イベントに対する検出効率が20%近く改善された。これらとはべつに、将来計画LCGT干渉計での同時解析のシミュレーションも開始した。

LCGTでは2台が同一サイトに建設予定であるので、雑音自体が2台の間でクロストークして真のイベントの検出性能を悪化させることが懸念である。シミュレーションの結果、定常的な雑音が30%程度クロストークしても、連星合体やブラックホールリングダウン解析では偽イベントの増加は10倍程度に収まることが確かめられた。H17年度は、米国LIGOグループとの国際共同研究の最終結果がまとまり、成果を論文および国際会議での発表に至った。このことは本計画研究のもっとも大きな目的である「重力波イベントの相関解析による探索」が一応の成功を納めたことになる。連星合体からのインスパイラル重力波探索については、TAMA DT8およびLIGO S2観測の同時観測データから、我々の銀河系について1年あたり49イベント以下(信頼度90%)という上限値を得た。またバースト重力波については、h_<rss>>2x10^<-19>についておよそ0.2以下[トリガー/日](信頼度90%)の結果を得、これはLIGO S2単体での結果を更新し、TAMA実験との同時性を要求した解析による改善を示した。本計画研究で世界に先駆けて行ってきたブラックホール準固有振動からのリングダウン重力波の探索については、TAMA DT6,7,8,9についての探索が行われ、我々の銀河系内での20太陽質量以下のイベントについて、3.4x10^<-2>[Hz]という上限値を得た。これらの上限値は、天文学的には他の観測や予測に比して、まだ十分なインパクトをもつものではないが、重力波研究において国際協力あるいは先鞭をつけた手法によって、実データの解析から上限を得られたことは大きな価値をもつ。
細胞極性制御因子aPKCによる毛包幹細胞の休眠制御機構

表皮には細胞極性に関わる2種類のaPKC (atypical protein kinase C)分子種(aPKCζ, aPKCλ)が発現している。本研究で私たちは、創傷治癒と創傷後毛包新生という、皮膚恒常性の維持に関わる重要な過程に、これらのaPKC分子種がどのように関与しているのかを調べた。表皮特異的aPKCλ欠損マウスでは創傷治癒が遅延し、Wnt経路の活性化を伴う創傷後毛包新生が亢進したが、aPKCζ欠損マウスではこのような現象は観察されなかった。本研究により、aPKCλが創傷治癒と創傷後毛包新生を繋ぐ重要な分子であることが初めて明らかになった。私たちは、これまでに細胞極性制御因子であるaPKCλ(atypical protein kinase C lamda)を表皮細胞特異的に欠損させた変異マウスを解析し、aPKCλが毛包幹細胞の休眠状態を制御することによって、皮膚恒常性の維持に関わっていることを明らかにした。本研究では、この成果をさらに発展させ、aPKCによる毛包幹細胞の休眠制御、および創傷治癒後毛包新生に関わるシグナル経路を明らかにすることを目的とし、以下の研究計画を進めている。1表皮から全aPKC分子種を欠損させた遺伝子改変マウスの作製:マウス表皮では、aPKCλ、aPKCζの2種のaPKCが発現している。両者の機能上の相補性を完全に除去し、皮膚恒常性維持におけるaPKCの役割を調べるために、aPKCλ・ζダブルノックアウトマウスの作製を目指している。その前段階として、aPKCλ、aPKCζがそれぞれ単独で欠損した遺伝子改変マウスの繁殖を進めた。2毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング:進行性の脱毛をきたす表皮特異的aPKCλcKOマウスの表皮とコントロールマウスの表皮で発現が変化する遺伝子をマイクロアレイにより解析した。3創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割:創傷は、毛包幹細胞を休眠状態から目覚めさせる刺激といえる。マウス背側皮膚に1cmx1cm大以上の傷を作ると、その治癒過程で創傷中央部に、Wnt経路依存的に毛包の新生が観察される。この創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割を調べるために、コントロールマウス、表皮特異的aPKCλcKOマウス、aPKCζKOマウスマウスで解析を行った。1表皮から全aPKC分子種を欠損させた遺伝子改変マウスの作製:表皮特異的aPKCλcKOマウスとaPKCζKOマウスそれぞれのコロニーは順調に繁殖している。現在、両者を交配し、aPKCλ・ζダブルノックアウトマウス(DKO)の作製を目指している。2毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング:生後23日目の休止期のコントロールマウス、および表皮特異的aPKCλcKOマウスの背側皮膚を採取し、RNAを抽出後cDNAを合成した。合成したcDNAをCy3, Cy5で蛍光ラベルし、マイクロアレイ解析を行い、cKOマウスで発現が2倍以上増減している遺伝子を網羅的に探索した。そのデータを基にパスウェイ解析を行った結果、2倍以上増減する遺伝子は、Focal Adhesion-PI3K- Akt-mTOR経路、Chemokine経路、Cell cycle経路、Hedgehog経路、Toll-like receptor経路、Delta-Notch経路、Wnt経路、MAPK経路、TGFβ経路などを構成する要素であることが判明した。これまで毛包形成に関わることが報告されているHedgehog経路やWnt経路、表皮の極性形成に関与しているDelta-Notch系経路の構成成分が検出されたことは、この解析の正しさを示している。現在、増減を示した遺伝子の発現をreal-time PCRで検証している。3創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割:コントロールマウス、表皮特異的aPKCλcKOマウスについては目安としていた20匹の解析が終了した。aPKCζノックアウトマウスについては5匹の解析が終了した。本研究では、この成果をさらに発展させ、表皮に2種類存在するaPKC分子種が制御する毛包幹細胞の休眠制御、創傷治癒、創傷治癒後毛包新生に関わるシグナル経路を明らかにするとともに、両分子種間の機能的差異を解析することを目的に研究を進めている。平成28年度は以下の研究成果を得た。両者の機能上の相補性を完全に除去し、aPKCの皮膚恒常性維持における役割を調べるために、aPKCλ・ζダブルノックアウトマウスを作製して解析した。3創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割:創傷は毛包幹細胞を休眠状態から目覚めさせる刺激と言える。

マウス背側皮膚に大きな傷(1cm2以上)を作るとその再生過程で、創傷中央部にWnt経路依存的に毛包の新生が観察される。この創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割を調べるために、表皮特異的aPKCλcKOマウスとaPKCζKOマウスマウスで創傷治癒過程、および創傷治癒後毛包新生の解析を行った。1表皮から全aPKC分子種を欠損させた遺伝子改変マウスの作製:表皮特異的aPKCλcKOマウスとaPKCζKOマウスを交配し、aPKCλ・ζダブルノックアウトマウス(DKO)を作製した。生まれてきた仔マウスの中に、遺伝子型がDKOマウスを示すものがなかったため詳しく解析したところ、DKOマウスは普通に生まれてくるものの、生後すぐに死亡することがわかった。2毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング:生後23日目の休止期のコントロールマウス、および表皮特異的aPKCλcKOマウスの背側皮膚を採取してマイクロアレイ解析を行い、cKOマウスで発現が2倍以上増減している遺伝子を網羅的に探索した。そのデータを基にパスウェイ解析を行った結果、2倍以上増減する遺伝子の中に、これまで毛包形成に関わることが報告されているHedgehog経路やWnt経路、表皮の極性形成に関与しているDelta-Notch系経路の構成成分が検出された。このことは、行った解析の正しさを意味している。増減を示した遺伝子の発現をreal-time PCRで検証した。3創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割:表皮特異的aPKCλcKOマウスについては目安としていた20匹の解析が終了した。その結果、表皮特異的aPKCλcKOマウスでは、コントロールマウスに比べ創傷治癒が遅延する一方、創傷治癒後毛包新生数はむしろ増加していることがわかった。aPKCζKOマウスについても20匹の解析が終了した。aPKCλの場合と異なり、aPKCζでは創傷治癒、および創傷治癒後毛包新生数にコントロールとの差は見られなかった。以上の結果から、マウスにおいてはaPKCλが主に創傷治癒、および創傷治癒後毛包新生に関与し、aPKC分子種間で機能に差があることが明らかになった。私たちは、これまでに細胞極性制御因子であるaPKCλ(atypical protein kinase C lamda)を表皮細胞特異的に欠損させた変異マウスを解析し、aPKCλが毛包幹細胞の休眠状態を制御することによって、皮膚恒常性の維持に関わっていることを明らかにした。本研究では、この成果をさらに発展させ、表皮に2種類存在するaPKC分子種(aPKCζ, aPKCλ)が、毛包幹細胞の休眠制御、創傷治癒、創傷治癒後毛包新生にどのように関与するのかを明らかにするとともに、両分子種間の機能的差異を解析することを目的に研究を進めた。平成29年度は以下の研究成果を得た。1表皮特異的aPKCλ欠損マウスでは、創傷治癒過程がコントロールに比べ著しく遅延したのに対し、aPKCζ欠損マウスでは創傷治癒の遅延は見られなかった。2表皮特異的aPKCλ欠損マウスおける創傷治癒の遅延は、細胞増殖の異常ではなく、創傷部への表皮細胞の移動の異常であることがわかった。
妊娠糖尿病妊婦の妊娠から産後１年までの継続支援プログラムの構築

妊婦は正常耐糖能の妊婦に比べ、高い非妊時体格、低い自己効力感、高い炭水化物エネルギー比率、少ない食物繊維摂取量などバランスの悪い食事を摂取している傾向にあった。分娩時は回旋異常から吸引分娩、鉗子分娩、緊急帝王切開に至る傾向にあり、LGA児の発症率が高く、高ビリルビン血症の出現率が高かった。また、2割の女性が産後に境界型または2型糖尿病と診断された。GDMと診断された妊婦に対して、妊娠期から産後まで継続的にフォローアップする必要性が示唆された。妊娠糖尿病は母子ともに周産期異常の発症を高めるばかりでなく、将来、2型糖尿病に移行するリスクをも高める。しかし、妊娠から産後まで継続した支援により、その発症率は最小限に抑えられる。本研究の目的は、2010年の妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus;GDM)の診断基準の改定に伴い、GDMの発症率が今後約4倍(10%)に増加すると推測されているGDMと診断された妊婦に対し、妊娠から産後までの継続支援プログラムを構築することである。調査は下記の2段階で実施する。第1段階として、妊娠中期(2026週)に実施する75gブトウ糖負荷試験でGDMと診断された妊婦と、非GDM妊婦をリクルートし、診断時点での栄養摂取状況からGDMの発生要因を明らかにする。第2段階として、GDM妊婦に対し、バランス栄養指導または低糖質食事指導の介入を行い、妊娠から産後1年の期間の血糖コントロールに影響する因子、低糖質食事療法が血糖コントロールに及ぼす効果を明らかにする。加えて、産後3か月時点で再度75gブトウ糖負荷試験を実施し、血糖コントロール状況を調査する。H24年度は、GDM妊婦、非GDM妊婦をリクルートし、妊娠経過を調査中である。H26年度は1前年度までにリクルートした59名のGDM妊婦と正常耐糖能妊婦119名のデータより、GDMと診断される妊婦の特徴、周産期異常の発症率を分析、2GDM妊婦59名を産後1年までフォローアップしたデータより、産後の耐糖能異常の発症率を分析した。結果1GDMと診断される妊婦の特徴と周産期異常の発症について:非妊時体格、セルフエフィカシー尺度を用いた自己効力感、診断時の簡易型自記式食事歴質問票による栄養摂取状況から評価した。その結果、GDMと診断される妊婦は正常耐糖能妊婦に比べ、非妊時BMI25kg/m2以上の割合が有意に高かった(p<0.05)。セルフエフィカシー総得点に差は見られなかったが、「自己管理・遂行能力」が高いと評価される11点以上の割合が正常耐糖能妊婦に比べて有意に低かった(p<0.05)。炭水化物エネルギー比率60%以上を占める割合が正常耐糖能の妊婦に比べて有意に高く(p<0.05)、1日の食物繊維摂取量が有意に低かった(p<0.05)。GDM妊婦の周産期異常の発症率は、分娩時に回旋異常となりやすく(p<0.05)、吸引分娩、鉗子分娩、緊急帝王切開に至るケースが多い傾向にあった。LGA児の発症率は有意に高く(p<0.05)、高ビリルビン血症の出現率が有意に高かった(p<0.05)。2産後の耐糖能異常の発症率について:GDM妊婦53名のうち産後12週時に75g糖負荷試験を受検した44名(83.0%)を分析した所、7名(15.3%)が境界型2型糖尿病、2名(4.5%)が2型糖尿病と診断された。産後の糖代謝異常の発症率は非妊時BMI≧25.0kg/m2以上の女性に有意に高く(p<0.05)、GDMのポイント数には関連が見られなかった。産後12ヶ月までフォローアップが終了している産婦は26名。2015年6月末までには約10名がフォローアップ終了予定である。データ終了を待ち、今後は妊娠から産後12ヶ月までの血糖値の変動をGDMポイント別、5大栄養素摂取量別に評価し、継続支援プログラムを構築する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。助産学26年度が最終年度であるため、記入しない。協力施設での妊婦健診者が減少していることから、妊娠糖尿病と診断される妊婦の数も減少している。加えて妊娠中期から産後1年まで追跡することから、研究参加者の確保がやや困難となっている。現時点でのリクルート数は予定の約5割であるため、計画に遅延が生じている。GDM妊婦のリクルートがH25年度まで要したため、介入終了時期に遅れが生じた。協力施設を1施設増やし、GDM妊婦のリクルート確保に努める。

妊娠中期、末期、産後1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月の血糖検査より、血糖値の推移、血糖コントロール状況を評価する。GDM妊婦および非GDM妊婦の診断時点での栄養調査から、GDM発生要因を評価する。GDM妊婦にバランス栄養指導または低糖質食事指導の介入を行い、血糖コントロール状況を評価する。リクルートしたGDM妊婦を産後1年までフォローアップする予定である。最終年度は低糖質食事療法の効果を妊娠中の血糖コントロールの推移、周産期異常の発症などから包括的に評価する予定である。また、第一段階、第二段階の介入研究の結果を基に、血糖コントロールを良好に保つための栄養・体重管理を含めた生活指導に関する継続支援プログラムを構築し、臨床で活用可能なツールを作成する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度からの妊娠糖尿病妊婦のリクルート期間が予定以上に延長したため、栄養調査実施時期および血液検査の時期も延長した。リクルートしたGDM妊婦を産後1年まで継続的に調査することから、今年度にリクルートしたGDM妊婦の産後1年間の栄養調査の分析費用、血液検査費用に使用する。
発生期腎臓におけるS字体形成の3Dロジック解明

腎臓の機能単位すなわちネフロンは胎生期の後腎間葉から形成される。間葉から上皮への転換によって球状の腎胞が形成され、これがC字体、さらにはS字体に変形し、最終的にネフロン(糸球体や尿細管)に分化する。C字体からS字体に変化する際にはそれまでと反対側の膜が収縮する必要があると考えられるが、何がこれを制御するのか、どんな力学的機構が働いているかは一切不明である。よって本計画は、マウスの腎臓形成におけるS字体の形成過程を可視化し、その物理的な変化を理論で説明することによって、細胞集団の交互の湾曲による3D形態形成のロジックを解明することを目的とした。S字体形成時の細胞表面(細胞膜)を蛍光標識できるマウスをCre-loxPシステムによって作成し、胎生12.5日の腎臓をフィルター上で数日間器官培養した。その過程を共焦点顕微鏡でタイムラプス解析を行ったが、解像度の高い画像は得られなかった。そこで、様々な発生段階のS字体が混在する胎生15.5日の腎臓の静止画に絞って解析を行った。具体的には、上記遺伝子改変マウスの胎生15.5日の腎臓を、さらに核や管腔面を共染色した。それを透明化した後、画像処理ソフトウェアImarisで処理することによって高解像度静止画像を得た。これをもとに本領域数理班と議論した結果、S字体の下部はこれまで考えられてきたような屈曲した細い管ではなく、船の底のように扁平で丸みをもった構造であることを見出した。管腔の体積を一定と仮定したシミュレーションなど多くの提言を受けており、S字体形成に働く力学的原理を引き続き検討したい。29年度が最終年度であるため、記入しない。原因としては、蛍光が弱い上にフィルター越しの観察になること、タイムラプス蛍光顕微鏡の解像度が不十分なこと、器官培養すると生体内と比較してS字体の形成が悪いことなどが考えられた。そこで、様々な発生段階のS字体が混在する胎生15.5日の腎臓の静止像に焦点を絞って、高解像度3次元データを取得することとした。そのためにはwhole mount染色法とそれに続く透明化法、そして画像を処理するソフトウェアImarisの習得が必要となった。S字体の細胞膜を可視化できる遺伝子改変マウスの妊娠率が想定以上に悪く、さらにタイムラプス共焦点顕微鏡の作動が安定しなかったため。様々な発生段階のS字体が混在する胎生15.5日の腎臓をwhole mount染色し、透明化して高解像度3次元データを取得する。それをImarisで画像処理した後、理論班と共同で解析することにより、3次元的構造の理解を目指す。
ケモカインCXCL12の細胞動態制御、血管研成における作用機構に関する研究

骨髄の微小環境は血液系腫瘍、骨転移腫瘍など、がんの病態形成においても重要である。骨髄の主要血球成分のひとつであるBリンパ球において、最も初期の前駆細胞(プレプロB細胞)、最終分化した形質細胞は、ケモカインCXCL12を必要とする。骨髄のCXCL12発現細胞とIL-7発現細胞を可視化すると、CXCL12発現細胞は、ストローマ細胞の一部であり、IL-7発現細胞と異なる細胞で、両者は一定の間隔をあけて分布していた。プレプロB細胞は、CXCL12発現細胞の細胞体に結合、さらに、プレプロB細胞の次の発生段階でありIL-7を必要とするプロB細胞は、CXCL12発現細胞を離れ、IL-7発現細胞に結合していた。骨髄で産生されたBリンパ球は、脾臓に至り、抗原刺激後、形質細胞に分化し骨髄に帰るが、形質細胞の大部分は、CXCL12発現細胞に結合していた。以上より、骨髄において、CXCL12発現細胞、IL-7発現細胞は、Bリンパ球の分化段階特異的なニッチ(特定の機能を担う特定の微小環境)として機能する細胞であること、血球の分化に伴う局在とニッチ間の移動がはじめて明らかになり、その局在と維持をCXCL12が正に制御することが示唆された。これらの知見は、CXCL12発現細胞が、形質細胞由来の多発性骨髄腫細胞を含む血液系腫瘍細胞のニッチである可能性を提示する他、CXCL12の白血病の病態形成、がんの骨転移における役割が報告されていることから、腫瘍細胞とニッチを含む骨髄の微小環境との相互作用の理解においてきわめて重要であると考えられる。一方、胎生期の腸を栄養する血管の形成においては、臓器特異的な血管形成機構が存在し、CXCL12は、隣接する大型の動脈と原始血管叢を結合させることにより、血管形成を支持することが示唆された。
活性酸素DNA損傷修復酵素欠損の分子病態

酵母mutT funactional homologをクローニングするために、mutT欠損大腸菌のミューテーター活性を相補する酵母遺伝子をgenomic libraryから検索した。その結果1つのクローンが得られ、塩基配列を求めたところ、脱ユビキチンに関わる遺伝子であることが明らかとなった。この遺伝子のアミノ酸配列中には非常に弱いながらmutT-box様の配列が認められた。MutT欠損大腸菌は、mutT^+株に比べて約100倍高い自然突然変異となるが、酵母の遺伝子を持つmutT欠損株では約10倍となり、1/10に低下した。この遺伝子を破壊した酵母株は野生株に比べて2.56倍高い変異率となった。突然変異体の塩基配列変化を求めたところ、A:T→C:G transversionのみが有意に増加していた(P<0.05)。A:T→C:G transversion変異は大腸菌mutT欠損に特徴的な塩基置換突然変異である。以上の結果は、この遺伝子が、mutT-functional homologであることを強く示唆している。一方、遺伝子破壊株で観察される突然変異の増加は、大腸菌mutT欠損株で観察されるほどには高くはならなかった。このことは、今回クローニングした遺伝子以外にもmutTを相補する遺伝子があるのかもしれない。大腸菌のmutT欠損を相補するものとしてクローニングしてきた経緯から、脱ユビキチンの作用は今回の観察には関わらないと考えられる。
迅速な肺炎・敗血症診断を可能にする細菌ゲノム抽出・増幅・同定システムの構築

肺炎・敗血症は、誰もが罹患する可能性があり、本邦での死因の上位を占めている。敗血症は、臓器障害を呈する重症な状態で、死亡率は約10-50%と高く、迅速な診断と適切な治療が必要である。臨床では、症状や所見から総合的に診断され、感染源から想定される微生物を考慮した経験的抗菌薬の治療が開始される。その後、培養検査結果を参考に、抗菌薬が選別され治療が確立する。しかし、各種培養から微生物が検出されないことも多く経験する。培養されにくい微生物、検体採取前の抗菌薬投与、検体採取のタイミングなど、様々な原因が考えられる。そこで近年報告されつつある、次世代DNAシークエンサー(NGS)を用いた原因微生物の同定法に注目して、実際の臨床診断や治療経過を考慮した上で、同定方法として有効であるのかを検証した。今回、2017年4月以降に、臨床的に敗血症と診断した症例を対象とした。研究の同意を得られた場合に検体を採取して、連携体制にある各研究室で、検体の匿名化と処理(DNA抽出、細菌由来DNA(16S rRNA領域)のPCR増幅)、NGS(Ion PGM)による塩基配列データとGSTK解析(メタゲノム解析ソフト)を行い、原因微生物の同定を試みた。敗血症患者126名中で同意が得られたのは10名であり、NGSにより原因微生物を同定したのは、尿路感染症の3例で、残りの検体は現在解析中である。解析した3例では、尿培養と尿NGS解析の主要な同定微生物がEscherichia coliで全て一致した。また、NGS解析では、培養検査より多くの微生物が検出され、複合感染の可能性も示唆された。一方では、真の原因微生物を特定するには、検出された各々の微生物の占拠率や病原菌の統計学的頻度を参考に判断する必要がある。さらに、検体解析数を増やしていき、敗血症におけるゲノム解析による原因微生物の同定法の有効性を検証する必要がある。肺炎・敗血症は、季節や流行状況により症例数が変動する。また、敗血症は感染症で最も重症であり生死にかかわる状態のため、患者様だけでなく家族様からも研究の同意を得るのは困難なことが多い。さらに、初期抗菌薬投与後や検体採取のタイミング次第では、原因微生物が検出されづらいため、検体採取のタイミングも限定されてしまい、症例数が不足している。また、検体採取や処理の段階での常在菌の混入が問題となり、研究解析が一時中断していた。丁寧かつ平易な説明による研究同意の取得、原因微生物を特定するのに質の高い検体の採取、採取時や検体処理時の常在菌の混入防止の強化など、を推進していく。また、敗血症のゲノム解析による原因微生物の同定方法を確立するのに、培養検査結果やゲノム解析結果の微生物占拠率に加えて、病原菌の統計学的頻度、臨床診断や臨床経過も考慮した上で、臨床に活用できる真の原因微生物の同定方法を検証する。また、従来の培養検査結果とゲノム解析結果が異なる場合に、どのように判断するかを適切に解釈する。さらに、近い将来に、臨床現場で一般的な検査として使用されるには、検査の簡便性や迅速性や費用対効果も追及する必要がある。

また、敗血症は感染症で最も重症であり生死にかかわる状態のため、患者様だけでなく家族様からも研究の同意を得るのは困難なことが多い。さらに、初期抗菌薬投与後や検体採取のタイミング次第では、原因微生物が検出されづらいため、検体採取のタイミングも限定されてしまい、症例数が不足している。また、検体採取や処理の段階での常在菌の混入が問題となり、研究解析が一時中断していた。丁寧かつ平易な説明による研究同意の取得、原因微生物を特定するのに質の高い検体の採取、採取時や検体処理時の常在菌の混入防止の強化など、を推進していく。また、敗血症のゲノム解析による原因微生物の同定方法を確立するのに、培養検査結果やゲノム解析結果の微生物占拠率に加えて、病原菌の統計学的頻度、臨床診断や臨床経過も考慮した上で、臨床に活用できる真の原因微生物の同定方法を検証する。また、従来の培養検査結果とゲノム解析結果が異なる場合に、どのように判断するかを適切に解釈する。さらに、近い将来に、臨床現場で一般的な検査として使用されるには、検査の簡便性や迅速性や費用対効果も追及する必要がある。予定していた研究の症例数が集まらなかったため、分析をおこなうゲノム解析数が少なかった。また、途中で汚染菌の混入などにより研究解析を中断していたいため、当初予定していた消耗品の購入をしなかった。今年度は、解析を再開しており、昨年度も含めて研究に必要なフローセルやチップなどに使用する予定。