hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｄ‐ドーパクロムトートメラーゼの脂肪細胞における発現調節機構に関する研究

肥満によるインスリン抵抗性改善作用を有するアディポカインであるD-dopachrome tautomerase(DDT)の転写調節領域がDDT翻訳開始点の上流200 bpから下流23 bpの間にあることを示した。DDT転写活性は過酸化水素処理による酸化ストレス、無血清培地による低栄養ストレスを与えた前駆脂肪細胞で上昇した。さらに、その転写調節におけるcAMP-activated protein kinase(AMPK)の関与が示唆された。脂肪細胞への分化に伴い発現が増加し、脂肪細胞の肥大化に伴い発現が低下するD-dopachrome tautomerase(DDT)は、肥満によるインスリン抵抗性改善作用を有するアディポカインである。DDTの脂肪細胞における転写機序を明らかにするため、これまでの研究により同定したDDTプロモータ領域の下流にルシフェラーゼを組込んだレポータベクターを発現させたヒト前駆脂肪細胞株SGBS細胞を用いて、肥満の脂肪組織が曝されている低酸素ストレス、酸化ストレス、低栄養ストレスを与えた際のDDT転写活性について検討した。DDTプロモーター活性の最も高い領域として同定した(-200/+23)領域を挿入したルシフェラーベクターを導入したSGBS細胞に、500 μM過酸化水素添加による酸化ストレス、1%酸素条件下で培養することによる低酸素ストレス、無血清培地による低栄養ストレスをそれぞれ与え、ルシフェラーゼ活性を測定した。過酸化水素を作用させた群及び無血清培地で培養した群で有意にDDT転写活性の上昇を認めたが、低酸素条件下での培養では上昇を認めなかった。さらに低血糖や運動時に活性化されるcAMP-activated protein kinase (AMPK)の活性化剤であるAICARがDDTの転写活性を上昇させることを認めた。以上のことより、脂肪細胞でのDDT転写活性は酸化ストレス、低栄養ストレスにより誘導されること、AMPKがDDTの転写活性の調節に関与していることが考えられた。D-dopachrome tautomerase(DDT)の発現は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴い増加するが、脂肪細胞の肥大化により低下することから、その発現量が肥満と関連することが示唆される。そこで、DDTの発現調節に関与する転写調節領域ならびに転写調節因子を同定することを目的とした。以前に、DDT遺伝子の転写開始点を基準とした(-272/+23)領域に転写活性に重要な領域が含まれることを明らかにした。そこで、さらに活性化の高い領域を絞り込むため、候補塩基配列として(-200/+23)、(-150/+23)領域を各々挿入したルシフェラーゼベクターを構築し、前駆脂肪細胞に導入後、脂肪細胞分化誘導を行った。分化開始3日目でのルシフェラーゼ活性は、(-272/+23)領域と比較すると、(-200/+23)領域でより高い値を示したのに対し、(-150/+23)領域では小さい値を示した。したがって、(-200/+23)領域をDDTの転写活性に重要な領域とした。続いて、転写調節因子の候補として考えられるC/EBPα、β、δを発現するベクターを作製し、各々前駆脂肪細胞で強発現させ、2日後(-200/+23)領域でのルシフェラーゼ活性を測定したが、いずれも活性化が見られなかったことから、C/EBP familyはDDTの転写調節に関与しないことが示唆された。以上の結果をもとに、今後DDTプロモーター領域(-200/+23)のDNAに結合する脂肪細胞の核抽出物から、質量分析にてDDT転写調節因子の同定を行い、発現調節機構を明らかとする。各種DDTプロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターを作製し、さらに転写活性の高い領域の絞り込みを行うことに時間を要した。また、バイオインフォマティクスによりDDTプロモーター上に結合すると予測された候補タンパク質(C/EBP)に焦点を当て、DDTプロモーター活性化度の検討を行ったが、C/EBPは転写活性化に関与しないことが示された。そのため、転写調節因子の同定のためには、さらにDDTプロモーター領域に結合するタンパク質の質量分析による解析を行う必要がある。DDTプロモーターDNAアフィニティカラムを作製し、脂肪細胞の核抽出物をカラムで展開する。得られた結合蛋白質を質量分析により同定し、その抗体によるChIPアッセイ、あるいDDT-Luc-SGBSに発現させ、分化誘導後のルシフェラーゼ活性の上昇(低下)を指標に、プロモーターとの結合能及びDDTの転写調節因子であるかを確認する。さらに、同定した転写因子の正常脂肪細胞および肥満脂肪細胞での発現変動についても検討する。また、DDTの発現に影響を与える可能性がある因子(低酸素、脂肪酸など)についても検討する。次年度への繰越額は遺伝子解析用試薬および生化学解析用試薬に使用する予定である。
多孔質膜の膜構造と物質透過の相関に関する研究

1.スポンジ型多孔質膜の構造と膜特性:平成3年度は構造の異なる各種のスポンジ型多孔質膜を対象として、まず耐水圧とバブルポイントを実験的に測定した。この結果は多用される直管型モデルでは説明ができなかったので、電顕写真での構造をよりよく反映するモデルとして、円柱状繊維径と開孔径をパラメータとするループモデルを提唱した。直管モデルでは、耐水圧とバブルポイントを同時に持つことはできないが、ループモデルでは可能であり、実験事実とも一致した。また、異なる表面張力、接触角をもつ各種の液に対する耐水圧、バブルポイントを膜毎に単一の繊維径および開孔径を用いて統一的に説明できた。ループモデルを3次元化し、同じ繊維径および開孔径をもつ格子モデルを用いて膜透過流束を計算機シミュレーションで計算した結果、気体透過実験からの有効拡散係数をよく説明できることがわかった。2.粒子凝集多孔体の構造と気体透過特性:平成4年度は粒子凝集多孔体を対象として、上記と同様の検討を行った。この多孔体はスポンジ膜とは異なる構造をもっているが、この場合も製造過程における条件の違いによる異なる構造の材料について、バブルポイントに関してはループモデル、気体透過に関しては格子モデルが適用できることが判明した。この結果、異なる構造をもつ多孔材料の複数の物性を、電顕写真と矛盾しない膜構造モデルで統一的に捉えることができた。(1)膜透過実験:組み上げた液透過実験装置を用いて、各種の孔径のの異なる市販多孔質膜の単独液(主として水)の圧透過実験を実施している。孔径の大きい膜では基本的にハ-ゲン・ポアズイエの式で説明できるが、膜の供給者によって公称孔径の決定方法の違いが問題であることが判明した。孔径が小さくなると、クヌ-セン機構を考慮することが必要になってくるが、現実には液の平均自由程は小さいので、現在使用している膜では、完全にクヌ-セン領域に入っている訳ではなく、遷移領域としての取扱が必要である。上記の液透過実験とともに、従来からある膜蒸留および湿度制御実験装置を用いて、各種膜に関する水蒸気の透過実験も実施している。この場合、孔径の大きい膜では分子拡散機構が適用できるが、孔径の小さい膜では、拡散係数は明らかに小さくなり、拡散係数が孔径に比例して小さくなる完全なクヌ-セン領域が測定された。直孔膜では理論式とよく一致したが、複雑な構造を有する膜では、平均孔径の円管としての式とは数値的に必ずしも一致せず、膜構造の適切な“ものさし"の必要であることが判明した。(2)計算機シミュレ-ション:まず、直孔内での分子運動をシミュレ-トするプログラムを作成した。得られた結果は理論値と一致し、このプログラムは分子拡散およびクヌ-セン拡散機構を正しく再現することが判明した。現在、規則的に配置された円柱および球で構成される膜でのシミュレ-シュンプログラムが一応完成し、結果を検討している。有効孔径の減少と共に拡散係数は減少するが、有効孔径として何を用いるかが問題である。(3)膜構造の表現:現在、各種の市販膜の構造を電子顕微鏡で観察しており、平均径や孔の構造を測定して、結果の整理法を検討している。(1)膜透過実験:本年度は主として、膜蒸留および湿度制御実験装置を用いて、各種疎水性多孔質膜に関する水蒸気の透過実験を実施した。孔径の大きい膜では分子拡散機構が適用できるが、孔径の小さい膜では、拡散係数は明らかに小さくなり、拡散係数が孔径に比例して小さくなる完全なクヌーセン領域が測定された。これらの多孔質膜は主として延伸法によって作られており、空隙構造は複雑であり、メーカーから与えられる公称孔径の円管としての式とは数値的に必ずしも一致せず、膜構造の適切な“ものさし"の必要であることが判明した。(2)計算機シミュレーション:昨年度の直孔内での分子運動をシミュレートするプログラムを、本年度は規則的に配置された円柱で構成される膜へ適用するシミュレーションプログラムに変更した。

円柱径、ポア径、膜面に垂直な円柱間隔を変えてシミュレーションを実施することによって、有効拡散係数が分子拡散領域からクヌーセン領域まで変化する様子を再現できることが判明した。(3)膜構造の表現:各種市販膜の膜構造を反映する物性として、耐水圧およびバブルポイントを実測し、ループモデルを提唱した。このモデルは電子顕微鏡で観察したポア径と繊維径を基礎として、実験結果をよく説明することが判明した。このモデルを3次元に拡張した円柱からなる格子モデルを上記の計算機シミュレーションに適用した。このモデルによって(1)の膜透過実験結果を統一的に説明することができた。
自然環境管理のバックボ-ンとしての宗教思想

「自然と文明の調和」を副題に、(1)自然と人間.(2)産業社会と環境、(3)思想と環境.(4)自然と文明の調和の4項目について研究を進めた。自然と人間では.現代社会の地球的規模での環境破壊をひきおこした人間活動を、適応と進化の面から解析した。産業社会と環境では以下のこと明らかにした。「自然観は時代と共に変化する。しかし、基本的には各時代の技術観もしくは社会観が.自然観を規定してきたように思われる。たとえば.ギリシャ時代には.形相やプラトンのイデアに象徴されるように.ポリスの秩序が自然の秩序のモデルになっていたし、近世においても機械や経済的自由競争が.機械的自然観もしくは進化的自然観に大きな影響を与えてきた。このように.いつの時代も.自然に対する見方は.人間中心の域を出ることがなかった。これが現在の地球レベルでの環境問題をひきおこした根本的原因であるように思われる。自然観の変遷を、森林管理の思想・技術に照らして分析したところ、プラトン以来の技術中心の森林管理技術とアリストテレスや日本の伝統的な自然重視の森林管理技術が、それぞれ独持の役割を果たしながら今日に至っていることが明らかになった。」思想と環境では.西欧キリスト教社会の基盤である聖書と、東アジアの自然観の形成に重要な役割を果したとみなされる仏教経典の森林観、自然観をとりまとめた。なお、社寺林の生態学的特徴についても調査を開始している。
微生物を利用する石炭浮選パルプの酸化還元電位の制御とその脱硫浮選への応用

本研究は、鉄イオンを含んだ鉱廃水の酸化還元電位を鉄酸化細菌により調節し、この液を浮選用水として用いて石炭中に含まれる黄鉄鉱を分離するプロセスを開発することを目的としている。本年度は、鉄(II)イオンと鉄(III)イオンをそれぞれ所定の濃度で含む模擬浮選液中での黄鉄鉱(柵原鉱山産)の濡れ性について、種々の方法(バブルピックアップ法、ハリモンドチューブ法、マイクロフローテーションセル法)で検討し、以下のような知見を得た。1.鉄イオン無添加の場合、黄鉄鉱はpH6以上の中・アルカリ性領域では親水性で気泡とあまり付着しないが、pH6以下の酸性領域では疎水性となり気泡とよく付着した。2.鉄イオンの添加濃度が高くなるに従い、黄鉄鉱が気泡と付着し始めるpHはより酸性側へと移行した。また、溶液の酸化還元電位が高くなるに従い、すなわち、全溶存鉄イオンにしめる鉄(III)イオンの比率が高い場合ほど、黄鉄鉱が気泡と付着し始めるpHは低下した。このpHは、水酸化鉄(III)の沈殿が生成し始めるpHとよく一致し、黄鉄鉱は水酸化鉄(III)の付着により親水化されるものと考えられる。3.水酸化鉄(III)が存在しない強酸性領域では、溶液の酸化還元電位が高くなるにつれ黄鉄鉱の疎水性は増した。これは、鉄(III)イオンにより黄鉄鉱が酸化され、元素硫黄が表面に生成してくるためと考えられる。
聴覚障害学生の認知・情報処理機能―　K-ABCⅡからのアプローチ　―

聴覚障害のある大学生及び聴者の大学生を対象に、認知処理能力及び基礎的学力を個別式で測定できるKABC-IIを実施し、聴覚障害学生の言語力や学力を支える認知情報処理機能及び学力に影響を及ぼす障害特性要因を検討した。結果、聴覚障害は、「継次処理」や言語性の「短期記憶」に影響を及ぼす障害特性要因ではないかと推察された。また、本研究対象の聴覚障害学生は、幼少期より言語や生活体験を視覚化或いはシナリオ化することにより事象を記憶し、学修を積み重ねた結果、抽象的推論や論理思考に弱さがあるが、聴者の学生と同等の基礎的言語力の習得がなされたと考えられた。大学に在学している聴覚障害学生及び聴者の学生を対象にKABC-IIを実施し、その特性を分析した。KABC-IIの提示は、障害の有無に関わらずイーゼル及びPCによる視覚的な提示と音声による提示を併用した。感音難聴の聴覚障害学生11名(男性6名、女性5名)、聴者の学生13名(男性5名、女性8名)を対象に分析を行った。結果は、認知検査においては「数唱(p<.05)」、「語の配列(p<.10)」、「パターン推理(p<.05)」、「ことばの書き(p<.05)」、認知尺度においては「継次尺度(p<.05)」、習得尺度においては「書き尺度(p<.10)」、CHC総合尺度においては「短期記憶(p<.05)」に有意差がみられた。CHCモデルによる評価点を比較すると聴覚障害学生が聴者の学生より常に低いということはなかった。認知尺度に関して「数唱(継次尺度・短期記憶尺度)」、「語の配列(継次尺度・短期記憶尺度)」、「パターン推理(計画尺度・流動性推理尺度)」は比して低い傾向がみられたが、「物語の完成(計画尺度・流動性推理尺度)」では高い傾向がみられた。習得尺度に関して、「ことばの書き(書き尺度・読み書き尺度)」では聴覚障害学生が聴者の学生よりも評価点が高い傾向がみられ、他の項目については有意な差がみられなかった。聴覚障害学生では、「継次尺度」の評価点が聴者の学生よりも低く、個人内差においても他の認知尺度よりも低いという傾向がみられた。「数唱」については、音声のみによる提示方法では聴覚障害学生にとっては制約が大きい。本検査は視覚提示(PC画面による数字の提示)を併用したが、結果として聴者の学生よりも低い結果となった。CHCモデルに基づく「短期記憶」においても、聴覚障害学生が低い傾向がみられ、従来の研究と異なる結果が得られている。継次処理能や短期記憶に影響を及ぼす障害特性による要因があるのではないかと推察される。今後対象人数を増やし、詳細に検討する予定である。感音難聴の聴覚障害大学生20名、聴者の大学生37名を対象にKABC-II検査を実施、認知情報処理特性の検討を行った。聴覚障害大学生には、聴覚的情報入力に制限があるために、本検査では、視覚的提示を聴覚的提示と同時に行い、聴覚的制限をなくしている。Welchによる平均値同等性検定を行った結果、認知検査の、「M3物語の完成(p=.018)」、「M4数唱(p=.000)」、「M9語の配列(p=.036)」、認知尺度として「継次尺度(p=.002)」、習得尺度として「書き尺度(p=.019)」、CHC総合尺度として「短期記憶(p=.002)」に有意差が得られた。また、認知検査の「A6ことばの書き(p=.082)」、「A8文の構成(p=.051)」、CHC総合尺度として「読み書き(p=.060)」に有意傾向がみられた。有意差が得られた「M4数唱」、「M9語の配列」、「継次尺度」、「短期記憶」については、聴者の大学生の方が高く、「M1物語の完成」、「A6ことば書き」、「A8文の構成」、「書き尺度」については聴覚障害大学生の方が高いという結果になった。短期記憶に関しては、聴覚障害大学生の言語処理能が要因となり聴者の大学生に比して低い結果になったと考察される。「M11手の動作」も短期記憶に関する検査ではあるが、p=0421であり、有意差はみられない。すなわち、非言語面での短期記憶には両者に差はない。このことからも言語処理能が短期記憶に影響を与えていると考察される。また、継次処理についても聴覚障害大学生の方が低い結果となっている。連続した刺激を順序よく処理する「継次処理能」は、複数の刺激をまとめて、全体として捉える力「同時処理能」よりも低いという結果となった。18歳6か月11か月の学生(難聴の大学生20名、聴者の大学生30名)をカウフマンモデル、CHCモデルにより比較しても同様の結果となった。聴者の大学生については、37名と予定以上の人数を集約している。聴覚障害大学生については20名と検査分析人数としては若干少ない。しかしながら、平成26年度の分析(難聴大学生11名、聴者の大学生13名)とほぼ同様の分析結果が得られている。平成28年度は、18歳6か月11か月の学生、それぞれ10名程度の検査を実施しまとめをする。

研究最終年度では、両者間の差の検討や18歳6か月11か月の学生についてのカウフマンモデルとCHCモデルの比較分析が実施できる学生数の集約ができると考えられる。聴覚障害学生の学習や学力を支える認知情報処理機能及び学力に影響を及ぼす障害特性要因を解明することを目的に、聴覚障害学生25名(18歳9か月11か月、男性16名、女性9名)、聴者の学生40名(18歳3か月11か月、男性11名、女性29名)を対象に、認知処理能力及び基礎的学力を個別式で測定できるKABC-IIを実施した。結果、聴覚障害学生は「短期記憶/Gsm」、「継次尺度」に聴者の学生よりも低い傾向がみられた。「数唱」については、視覚提示を併用したが、聴者の学生よりも低い結果となった。「書き尺度」に関しては、聴覚障害学生が評価点は高く、これまで聴覚障害児の語彙力や統語力は低いという報告がなされているが、本研究対象学生に関しては異なる結果が得られた。聴覚障害は「継次処理」や言語性の「短期記憶」に影響を及ぼす障害特性要因ではないかと推察される。また、本研究対象の聴覚障害学生は、幼少期より言語や生活体験を視覚化或いはシナリオ化することにより事象を記憶する学修を積み重ねた結果、抽象的推論や論理思考に弱さがあるが、聴者の学生と同等の基礎的言語力の習得がなされたと考えられる。聴覚以外の障害の有無やコミュニケーションモダリティ、教育等の違いが複雑に組み合わさって、聴覚障害児者の認知処理に影響を与えている。また、本研究対象の聴覚障害学生は、大学入試で選抜された学生であるので学力的には統制された群である。先行研究との違いは個々の家庭や教育環境に違いはあるが、学力的に統制された聴覚障害学生群であったからだと考えられる。すなわち、教育環境が保障され一定の学力が保障されると聴者の学生と同様の言語発達過程を経ると考えられる。一方、本研究を通して、聴覚障害学生の「継次処理」、「短期記憶」の課題が再確認され、「継次処理」、「短期記憶」が聴覚障害児の言語・認知発達に影響を与える要因である可能性が示唆された。聴覚障害のある大学生及び聴者の大学生を対象に、認知処理能力及び基礎的学力を個別式で測定できるKABC-IIを実施し、聴覚障害学生の言語力や学力を支える認知情報処理機能及び学力に影響を及ぼす障害特性要因を検討した。結果、聴覚障害は、「継次処理」や言語性の「短期記憶」に影響を及ぼす障害特性要因ではないかと推察された。また、本研究対象の聴覚障害学生は、幼少期より言語や生活体験を視覚化或いはシナリオ化することにより事象を記憶し、学修を積み重ねた結果、抽象的推論や論理思考に弱さがあるが、聴者の学生と同等の基礎的言語力の習得がなされたと考えられた。検査の提示方法の統一やアンケートの作成については、当初どおりの予定で進んでいる。対象学生の確保という面では、聴覚障害学生については、当初以上の学生数を確保することができた。平成28年度は、18歳6か月11か月の学生、それぞれ10名程度のデータ取集(7月10月)と分析を行い、研究のまとめを実施する。平成28年9月の日本特殊教育学会にて発表をする予定であり、併せて論文にまとめる。平成28年度が研究最終年度であるので、短期記憶、継次処理、ワーキングメモリーに関してディスカッションを行い、次の研究課題に発展する予定である。教育学、特別支援教育、聴覚障害、認知情報処理平成27年度は、データの収集と分析および、学会の発表やシンポジウムの開催を予定している。できるだけ多くの対象者を確保し、データの収集を図る。また、共分散構造モデル分析ができる人数が確保しだい、詳細な分析を行い、聴覚障害と認知処理に関する知見をまとめる予定である。本研究の対象者は大学生であるが、高校生以下の聴覚障害児の適応も視野に入れた、ディスカッションを進めていくことにしている。
優性変異アクチンを用いたアクチンフィラメントの機能解明

アクチンミオシン系の力発生において、アクチンフィラメントは線路として機能する一方、その協同的構造変化も何らかの重要な機能を果たすと考えられている。一般に協同的構造変化の機能の解明には、優性変異の解析が有力な研究手段となる。そこでAn and Mogami (1996)が同定した10個の優性変異アクチンについて、われわれ独自のアクチン発現系を用いて6変異の精製に成功し機能解析を行った。その結果、4変異は重合に、2変異はCa2+依存的な協同的スイッチ機構に異常があることを発見した。さらにグリシンスキャニング法(後述)により、新たに5個の優性変異アクチンを同定した。An and Mogami(199X)がショウジョウバエ間接飛翔筋で同定した10個の強い優性変異アクチンを、われわれのアクチンチモシン融合蛋白質発現系を用いて順次調製し、機能解析を進めている。18年度は、G63D,R95C,G156D,G156S,およびG268Dを調製した。その結果、G63D,R95C,G156D,およびG156Sは重合活性に問題があった。G156S/Dは、ATP結合ループに位置し、加水分解またはリン酸解離速度に問題がある可能性がある。G268Dは、いわゆるる疎水性プラグ領域にあり、同領域の柔軟性が損なわれ、かつ荷電残基が挿入されたことと関連があると思われる。ただし、こうした重合能の欠陥が、飛翔能の阻害につながるのかは不明である。一方、R95Cは正常な重合能を示し、骨格筋ミオシンを用いたin vitro運動活性も正常であった。ただし、トロポミオシン結合およびトロポニン・トロポミオシン存在下のATP分解活性に問題があることが明らかとなった(帝京大学・若林健之教授との共同研究)。今後は、正常アクチンとの共重合フィラメントの解析も含めて、優性な機能欠陥の機構を解明していく。グリシンスキャニングに関しては、G74V,G74AおよびG164Vを調製した。G74Vはキモトリプシン感受性が顕著に増大し、構造への大きな影響が推察されたが、精製が困難となり、別途精製法を検討中である。一方、G74Aには顕著な効果は見られなかった。G146Vの重合能は正常であったが、ミオシン運動能がほぼ完全に失われた。ただし、正常アクチンの運動能を優性には阻害しなかった。今後、構造解析を行っていく予定である。われわれは、アクチンフィラメントの構造機能連関、とくにミオシンとの相互作用におけるアクチン側の構造変化の解明を目指し、本研究を進めている。そのため、前年度までに変異組換えアクチンの効率的な新奇発現系の開発したが、今年度は、この新奇発現系と、それを用いて発現したふたつの酵母優性致死変異アクチンに関する解析結果をまとめ、論文発表を行った。またこれと平行して、同発現系を用いて発現した10個のショウジョウバエ優性変異アクチンの解析も進めた。その結果、重合に欠陥があるもの、トロポミオシンとの相互作用に欠陥があるものが同定さ、それらのデータをまとめた論文の準備に着手した。しかし一部の変異は、われわれの新規発現系をもってしても十分量発現することができず、それらについては解析できない状態となっている。この間題は、他の発現系(たとえば昆虫細胞系)を使えば解決できる可能性があり、次年度の課題としたい。一方、アクチンの構造変化には、分子内のグリシン残基が重要な働きをしている可能性が高いので、全てのグリシン残基を個別にあるいは適宜クラスター化して体系的に変異させていくグリシンスキャニング変異実験にも着手した。その結果、G146V変異は重合能を持つにも拘わらず、in vitroでのミオシンIIとの相互作用における運動性をほとんど持たないことが明らかとなった。この変異アクチンは、運動性に直接欠陥を持つ初めての変異であり、さらに詳細に解析していきたい。最上ら(1996)は、ショウジョウバエの遺伝学的解析から、10個の優性阻害型の変異を同定した。これらの変異においては、少数の変異アクチンがフィラメントに取り込まれることにより全体の機能が阻害された可能性があるので、その詳細なin vitro機能解析は、サブユニット間の協調的相互作用とその生理的機能の解明に資すると期待される。しかしハエから十分量の変異アクチンを精製することは困難なので、われわれの効率的組換えアクチン発現系を利用する。昨年度から、5個の変異アクチンを発現精製し、生化学的解析を行っている。今年度は、トロポニン・トロポミオシン存在下のE226K変異アクチンフィラメントは、Ca^<2+>存在下でも全く活性化されないことを見いだした。昨年度のデータと併せて論文の準備中である。

これと平行して、アクチン内のグリシンを順次Valに置換したsite-directed変異シリーズ(グリシンスキャニング)作成を進め、作成が終わった17変異アクチンのうち5変異(G13/15V,G36V,G74V,G146V,G156/158V)は、酵母の増殖を優性に阻害していた。このうちG146V変異アクチンは、重合能は正常で、骨格筋ミオシン(class II)と結合し、ATPaseを活性化できるにもかかわらず、運動性は大きく低下していた。発生する力も1/3に低下していた(阪大柳田グループとの共同研究)。しかしclass V myosinとの相互作用においては、運動速度、力ともに野生型と全く同等であった。Class IIとV myosinは運動性が質的に異なる(前者は高速non-processive、後者は低速processive)ので、G146が関与するアクチンフィラメントの構造変化が、高速non-processiveに重要な機能を果たしていると示唆された。
阻害剤開発の基盤構築を目指した薬剤排出トランスポーターのＸ線結晶構造解析

多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現に関与する薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の3つの課題に取組んだ。(1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーターMacBの結晶構造解析)平成28年度は目標に対し次の事が明らかとなった。1.MexY結晶を用いて大型放射光施設SPring 8で得たX線回折データから分子置換法で位相決定し、MexY構造を新たに決定することに成功した。しかしながら、この構造は薬剤認識・排出機能の議論をすることが難しいMexY単量体構造であった。そこで、より強固な三量体を構成するMexY変異体を作製し、このMexY変異体の薬剤耐性能および排出機能を保持することを確かめた。現在は、この変異体MexYの結晶化に取り組んでいる。2.前年度までにリンカー配列を最適化した1:1構成比のAcrB-AcrA融合たんぱく質を用いた発現量活性相関から、融合たんぱく質がそれ単体で排出活性を有することを確かめた。AcrBとTolCの間では、システイン残基を適当な場所に導入すると生理的条件で直にジスルフィド架橋を形成する。AcrB-AcrA融合蛋白質でも同様に架橋が形成されることを確かめ、親和性タグでの精製を最適化し、架橋を持ったAcrAB-TolC複合体の精製法を確立した。精製した複合体をネガティブ染色と透過型電子顕微鏡により観察すると、大きさの揃った粒子が観測された。この三者複合体の構造決定を単粒子像再構成により目指している。3.MacBの発現系を見直し、コムギ無細胞発現システムにより全長MacBを発現させた。リポソームに発現したMacBを用いて結晶化条件探索をしたが、結晶は得られていない。精製法、結晶化条件の検討を続け、構造解析可能な結晶の調製を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現への関与が明らかになりつつある薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、次の3つを目標にしている。(1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーターMacBの結晶構造解析)平成26年度は目標に対し次の事が明らかとなった。1.MexY精製法・結晶化条件の変更により分解能の改善に成功した。精製用親和性タグのヒスタグをより長くし、一段階での精製を可能とした。加えて可溶化に用いる界面活性剤をn-Undecyl-β-D-maltosideへ変更した。結晶化条件を調べた結果、形の良い結晶が得られ実験室レベルのX線回折装置で8Å分解能を達成した。条件調整により、大きく形の良いMexY結晶を得ることで、ポリペプチド主鎖の配置同定が可能な分解能での構造解析が期待される。2.AcrBとAcrAの結合比率を1:1に固定したAcrB-AcrA融合たんぱく質の解析を進めると、AcrB部位のみが発現したものが含まれることが判明した。融合たんぱく質の膜貫通リンカーとしてAcrB第7膜貫通ヘリックスを使用すると大幅に改善し、かつ融合たんぱく質は十分な排出活性を維持していた。更に膜貫通リンカーへ直結するAcrBのC末をより短くし、最適化した。この最適化した融合たんぱく質はAcrAの揺らぎが大きく制限され、かつ十分な排出機能を保持するので、AcrAの機能に必要な結合位置が予測でき、予測位置は過去文献とも一致した。また位置制限した事は結晶化に有利である事を意味し、AcrAB二者複合体の構造解明が期待される。3.MacBの大腸菌での発現系の問題点として、発現時に切断されている事が明らかとなった。MacBは二量体で発現するため、切断されたものもまた精製されてしまう。これを解消する方法の考案が必要である。多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現への関与が明らかになりつつある薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の3つの課題に取組んでいる。(1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーターMacBの結晶構造解析)平成27年度は目標に対し次の事が明らかとなった。1.精製したMexYに対するSecond Detergent Screeningにより新たに分解能向上に効果のある界面活性剤を見出し、条件検討の結果、SPring 8で4オングストローム程度のX線回折データの取得に成功した。現在は分子置換法、重原子憧憬置換法、多波長異常分散法により位相決定を試みている。2.前年度までに、AcrBとAcrAを1:1で結合させたAcrB-AcrA融合たんぱく質に関して、間をつなぐリンカーの最適化が完了した。AcrAホモログのAcrEの影響を指摘されたので、AcrEの影響及びAcrB-AcrA融合たんぱく質の発現量と排出活性の相関を検証した。acrAB欠損、acrABacrEF

欠損の両菌株において発現させた融合たんぱく質に機能の違いはなく、AcrEF自身の活性およびAcrABへの活性増強作用はみられなかった。また、AcrB-AcrA融合たんぱく質の発現量を制御したところ、acrABacrEF欠損株、acrB欠損株の両菌株で発現量-排出活性相関は変わらなかった。以上の結果は、融合たんぱく質がそれ自体で機能し、余剰なAcrAもしくはAcrEは排出活性に必須でないことを示している。3.MacBの大腸菌発現系の問題点として、発現時に切断されている事が明らかとなった。発現系を見直したところ、セルフリーサイエンス社のコムギ無細胞発現システム:ProteoLiposome BD Expression Kitを用いた場合に、全長MacBのみが発現することを確認した。結晶化条件の検討を続け、構造解析可能な結晶の調製を目指す。1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーターMacBの結晶構造解析、についてそれぞれ記述する。1.前年度に最適化したMexY精製法とSecond Detergent Screeningにより大型放射光施設SPring 8で4オングストローム分解能のX線回折データが取得できた。今回得られた4オングストローム分解能は、分子置換法による位相決定およびポリペプチド主鎖の構造決定が可能な分解能であり、今回得られている結晶の構造解析は実現が期待できる。以上から順調に進行していると考える。2.昨年度最適化が完了したAcrB-AcrA融合タンパク質は構造と機能が示唆されていたが、発現量-活性相関を取った結果、1:1で十分機能する予測に合致する結果となった。引き続き構造解析を目指してAcrB-AcrA融合タンパク質の結晶化を行う。精製法の確立も完了しており、また協働して機能する外膜ポリンTolCの精製法も確立し、三者複合体構造を解析するための準備は十分に整ったと言え、現在は三者複合体の結晶化を行っている。以上より、順調に進行していると考えられる。3.発現系にまで立ち戻った検討の結果、ProteoLiposome BD Expression Kitを用いた場合にリポソームに全長のMacBのみが発現することが確認できた。このことは、発現条件検討が完了したのみならず、精製も容易に行えることが期待される。また、大量発現を達成したリポソーム画分の精製後ほどの純度があるため、界面活性剤を使った可溶化、精製を経由せずに直接Lipid Cubic Phase法を適用する結晶化を検討している。以上より、発現系の再検討はあったものの、順調に進行していると考えられる。以上から、総合すると、概ね順調に研究が進展していると言える。多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現に関与する薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の3つの課題に取組んだ。(1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーターMacBの結晶構造解析)平成28年度は目標に対し次の事が明らかとなった。
内耳障害に対する局所投与治療の向上のためのstrategy

急性中耳炎による内耳障害を、ラットを用いた蝸牛外側壁の血流障害の観点より検討したところ、エンドトキシンによる中耳炎発症後1日目には有意な血流の低下を認めたが、14日目にはほぼ正常レベルにまで改善していた。血管拡張作用を有するプロスタグランディンE_1 (PGE_1)の局所投与では、正常群に比して中耳炎発症早期では血流の増加はわずかであった。この所見は、組織学的にも血管条の中間細胞領域の細胞間隙の増大とその改善という所見として裏付けられた。今までのNOS阻害剤の予防的全身投与法、DexamethasoneおよびNOS阻害剤の治療的局所投与法が、中耳炎発症後1日目の有意な血流の低下と血管条細胞間隙の増大を抑制し、PGE_1の反応を増加させた結果を踏まえて、今度は、heat shock protein(HSP)の発現およびその予防的投与法の効果を検討した。まず、HSPを内耳に発現する手段としてGeranylgeranylacetone(GGA)を全身および局所投与した。全身投与として経口的に局所投与として経鼓膜的鼓室内投与を行った。投与後、ともに内耳にHSP70の発現をみた。中耳炎による内耳障害に対する予防的投与法としてのGGAの効果判定として、局所投与ではエンドトキシン自体の内耳への波及に影響を与えることが考えられ、GGA経口投与後に中耳炎を発症させ、内耳障害に対する効果を検討した。この結果、電顕的に血管条細胞間隙の増大を有意に抑制する結果が得られた。GGAの局所投与自体も予防的投与として有効と考えられる。急性中耳炎による内耳障害を、ラットを用いた蝸牛外側壁の血流障害の観点より検討したところ、エンドトキシンによる中耳炎発症後1目目には有意な血流の低下を認めたが、14日目にはほぼ正常レベルにまで改善していた。血管拡張作用を有するプロスタグランディンE_1(PGE_1)を正円窓に局所投与したが、正常群に比して中耳炎発症早期では血流の増加はわずかであった。エンドトキシン投与時及び12時間後にNOS阻害剤を皮下投与した群では、発症後1日目の有意な血流低下は軽減できた。またPGE1局所投与の反応もきわめて良好であり、蝸牛外側壁血管周囲組織の障害も軽減できたと考えられた。Cationic liposomeを用いた局所遺伝子導入のための基礎実験で、TMAG MLV PEGFP-C1(2nmol)をモルモット内耳に直接正円窓経由で注入した。共焦点レーザーにおいて観察したが、遺伝子を含まないCationic liposome群と有意な差は見られなかった。局所治療のさらなる向上をめざして、エンドトキシン鼓室内投与30分後にDexamethasone、NOS阻害剤を鼓室内追加投与し、PBS投与群と比較検討した。Dexamethasone投与群、NOS阻害剤投与群ともに中耳炎発症1目且の血流障害は、PBS投与群に比し有意に軽減できた。これらの群では、PGE_1局所投与の反応も良好であった。DexamethasoneおよびNOS阻害剤の効果は、ともにiNOSによる組織障害を抑制したことによると考察された。急性中耳炎による内耳障害を、ラットを用いた蝸牛外側壁の血流障害の観点より検討したところ、中耳炎発症後1日目には有意な血流の低下を認めたが、14日目には改善していた。この所見は、組織学的にも裏付けられた。プロスタグランディンE_1(PGE_1)を正円窓に局所投与したが、中耳炎発症早期では血流の増加はわずかであった。エンドトキシン投与時及び12時間後にNOS阻害剤を皮下投与した群では、発症後1日目の有意な血流低下は軽減で、PGE_1投与の反応の増加も認められ、蝸牛外側壁血管周囲組織の障害も軽減できた。

Cationic liposomeを用いた局所遺伝子導入のための基礎実験で、TMAG MLV PEGFP-Cl (2nmol)をモルモット内耳に直接正円窓経由で注入し、共焦点レーザーにおいて観察したが、遺伝子を含まないCationic liposome群と有意な差は見られなかった。エンドトキシン鼓室内投与後にDexamethasone、NOS阻害剤を鼓室内追加投与し、PBS投与群と比較検討した。Dexamethasone投与群、NOS阻害剤投与群ともに中耳炎発症1日目の血流障害は、有意に軽減できた。これらの群では、PGE_1局所投与の反応も良好であった。DexamethasoneおよびNOS阻害剤の効果は、ともにiNOSによる組織障害を抑制したことによると考察された。次にheat shock protein (HSP)の発現およびその予防的投与法の効果を検討した。Geranylgeranylacetone(GGA)を全身および局所投与した。投与後、ともに内耳にHSP70の発現をみた。GGA経口投与後に中耳炎を発症させ、内耳障害に対する効果を検討した。この結果、電顕的に血管条細胞間隙の増大を有意に抑制する結果が得られた。GGAの局所投与自体も予防的投与として有効と考えられる。
特異エルミート幾何学に基づく消滅定理および正則切断の拡張問題の研究

本研究では,複素幾何/解析の立場から代数幾何的な半正値性と特異点を扱う枠組みの構築を目指し,代数幾何に現れる正則切断の拡張問題や消滅定理を特異エルミート幾何(特異計量,曲率カレントなど)の視点から研究する.2017年度は正則切断の拡張問題および非負断面曲率を持つ多様体の構造について研究した.拡張問題については, Junyan Cao氏, Jean-Pierre Demailly氏とともに,正則切断やコホモロジー類の部分多様体からの拡張問題を研究し,被約とは限らない部分多様体からの拡張定理を与えた.できる限り一般的な状況での定式化を目指し,正則凸多様体や最良と思われる曲率条件を扱った.証明では,部分多様体のスキーム構造を考慮した適切なノルムやBochner-Kodaira-Nakanoの等式の捻れ版を用いて, dbar-方程式の近似解を得て,その近似解をコホモロジーの分離性を用いて適切な解に収束させた.非負断面曲率については,近年解決されたShing-Tung Yau氏による断面曲率と有理連結性についての問題を自然に一般化する形で,非負断面曲率を持つ多様体の構造についての予想を得た.この予想の解決を目指し,極小モデル理論の仮定の下で,非負断面曲率を持つ多様体に対する最大有理連結射の像の数値的小平次元が零となることを示した.証明では, RC-正値性と呼ばれる概念とそこから導かれる最大値の原理を用いた.その応用として,非負断面曲率を持つ線織曲面の基がトーラスになることを示した.部分的な消滅定理を導く曲率条件を研究する過程で,当初の計画にはなかった正則断面曲率にまで研究の範囲を広げられた.拡張定理に関しては,代数幾何(特に双有理幾何)への応用を見据えて, Ohsawa-Takegosiの拡張定理のようなL^2-評価付き(ある種の境界条件付き)の拡張定理を与える方向での進展を目指す.関数論的な興味として擬凸多様体への一般化も考える.非負断面曲率の研究に関しては,今年度に得た結果の技術的な仮定(良い極小モデル理論の存在)を外していく.また,最大有理連結射を詳細に調べ,高次元の多様体に対しても(有限エタール射を除いて)その像がアーベル多様体になるかを調べる.本研究では,複素幾何/解析の立場から代数幾何的な半正値性と特異点を扱う枠組みの構築を目指し,代数幾何に現れる正則切断の拡張問題や消滅定理を特異エルミート幾何(特異計量,曲率カレントなど)の視点から研究する.2017年度は正則切断の拡張問題および非負断面曲率を持つ多様体の構造について研究した.拡張問題については, Junyan Cao氏, Jean-Pierre Demailly氏とともに,正則切断やコホモロジー類の部分多様体からの拡張問題を研究し,被約とは限らない部分多様体からの拡張定理を与えた.できる限り一般的な状況での定式化を目指し,正則凸多様体や最良と思われる曲率条件を扱った.証明では,部分多様体のスキーム構造を考慮した適切なノルムやBochner-Kodaira-Nakanoの等式の捻れ版を用いて, dbar-方程式の近似解を得て,その近似解をコホモロジーの分離性を用いて適切な解に収束させた.非負断面曲率については,近年解決されたShing-Tung Yau氏による断面曲率と有理連結性についての問題を自然に一般化する形で,非負断面曲率を持つ多様体の構造についての予想を得た.この予想の解決を目指し,極小モデル理論の仮定の下で,非負断面曲率を持つ多様体に対する最大有理連結射の像の数値的小平次元が零となることを示した.証明では, RC-正値性と呼ばれる概念とそこから導かれる最大値の原理を用いた.その応用として,非負断面曲率を持つ線織曲面の基がトーラスになることを示した.部分的な消滅定理を導く曲率条件を研究する過程で,当初の計画にはなかった正則断面曲率にまで研究の範囲を広げられた.拡張定理に関しては,代数幾何(特に双有理幾何)への応用を見据えて, Ohsawa-Takegosiの拡張定理のようなL^2-評価付き(ある種の境界条件付き)の拡張定理を与える方向での進展を目指す.関数論的な興味として擬凸多様体への一般化も考える.非負断面曲率の研究に関しては,今年度に得た結果の技術的な仮定(良い極小モデル理論の存在)を外していく.また,最大有理連結射を詳細に調べ,高次元の多様体に対しても(有限エタール射を除いて)その像がアーベル多様体になるかを調べる.
マクロライド耐性マイコプラズマ感染症の流行,薬剤耐性の把握と臨床的特徴の解明

肺炎マイコプラズマ感染時、菌の特異遺伝子の検出による確定診断とマクロライド系薬剤の感受性判定を迅速に行うことが症状の軽減、治療期間の短縮につながることが明らかとなった。2013年2015年の調査でマクロライド耐性は2015年に耐性率が急激に低下した。原因はマクロライド耐性I型菌からマクロライド感受性II型菌への交代であり、肺炎マイコプラズマは流行菌型の交代に伴い、耐性率の激変がみられることが判明した。マイコプラズマ肺炎は2011年後半から2012年にかけて大きな流行が見られたが、研究を開始した2013年は激減、8医療機関で36名の患者検体の収集にとどまり、当初予定した検体数200を集めることはできなかった。36検体中陽性は6検体であり、二層培地を用いた培養法によりそのすべての検体から肺炎マイコプラズマを分離できた。今後のマイクプラズマの流行が予測できないこともあり、さかのぼり調査として、2011年および2012年のマイコプラズマ感染または百日咳感染疑い患者保存検体219検体からの肺炎マイコプラズマの検出を試みた。その結果、38検体がGENECUBE法で陽性となり、培養検査により26株の分離菌株を得ることができた。肺炎マイコプラズマ陽性44検体中、マクロライド耐性は35株(80%)であり、大阪でもマクロライド耐性化が進んでいることが判明した。これらの菌株についてはマクロライド耐性に関与する23SrRNA遺伝子の塩基配列の解析を実施、耐性菌については耐性に関与する部位の塩基置換を確認、その多くは2063番目の高度耐性に関与する変異(A→G)であったが、GENECUBE法では判別することができない中度耐性に関与する変異(A→T)も見つかっている。肺炎マイコプラズマの型別法として、わが国ではP1遺伝子による型別法が実施されてきたが、この方法には型別できる型が少ないという欠点があった。そこでMLVA法(Multi-locus VNTR analysis)の導入を試みたところ、より詳細な型別が行える可能性が示唆された。マイコプラズマ肺炎は2011年後半から2012年にかけて大きな流行が見られたが研究を開始した2013年4月以降は患者が激減、2013年度はマイコプラズマ感染疑い患者検体は36検体しか集めることができなかった。しかし2014年度は11月以降に若干の患者数の増加が認められたこともあり、111検体を集めることができた。その111検体からは24株の肺炎マイコプラズマを分離でき、そのすべてを解析に供した。検査法としては、検体の濾過、PPLO brothと二層培地の併用等の細かい工夫により、特異遺伝子検出法と培養法の検出感度に差はなく、菌陽性患者のほとんどから菌を分離できた。マクロライド耐性に関してはGENECUBE法で迅速判定をするとともに微量液体希釈法によるMIC値の測定、23SrRNA遺伝子の塩基配列の解析を実施した。その結果、耐性率の年次推移が2011年;85.7%、2012年;81.8%、2011年;71.4%、2011年;73.3%となり、マクロライド耐性菌は漸減傾向にあることがわかった。肺炎マイコプラズマの型別法としてP1遺伝子の塩基配列の違いをPCR-RFLP法で確認する方法が汎用されているが、本型別法とマクロライド耐性との関連性を調査したところ、耐性菌はすべてI型菌、感受性菌では大多数がIIc1型菌という結果となり、P1遺伝子の型別結果とマクロライド耐性との関連性が示唆された。肺炎マイコプラズマの型別法としてはMLVA法が開発され、より多くの型に判別できると報告されている。本法の導入により、分離菌64株を13の型に分類できたが、5つのlocusのうち1つに型別に用いる遺伝子として問題がある事が判明し、それを除くと3つの型にしか分類できなかった。問題点のある型別法であることが判明した。マイコプラズマ肺炎は2011年から2012年にかけて全国的な流行が見られたが、本研究を開始した2013年からは激減、2014年から2015年にかけても非流行期が続いた。しかし大阪では2015年後半から患者数の増加がみられ、本年度は281名のマイコプラズマ感染疑い患者から、158株の肺炎マイコプラズマ菌株を分離できた。前年度から引き続いて分離菌の解析、薬剤感受性試験を実施、結果的に非流行期から流行期にかけての流行菌の変遷を観察することができた。ML系抗生剤に対する耐性率は2013年66.7%、2014年73.3%から2015年は43.0%に低下、P1遺伝子による型別ではI型主流から、I型、II型、IIc1型が混在する流行にシフトしていた。耐性と菌型の相関を見ると、I型のML系耐性率の減少はなく、ML系感受性の他の型の菌へのシフトであった。ML系以外のTC系、NQ系薬剤に対する最小増殖阻止濃度を測定したところ、その値に経年変化はなく耐性化の傾向は認められなかった。ML耐性菌による感染と重症度との関連を解明するため、患者ごとの検出菌のML耐性の有無および治療経過を調査、さらに医療機関ごとの検出マイコプラズマの耐性状況を比較・検討した。

その結果、一次医療機関の検出菌のML耐性率は低く18.2%であったのに対して、二次医療機関では56.4%と高率であった。この結果は一次医療機関受診患者では短期間のML系薬剤の投与で解熱する患者が多く治療期間も短かったのに対して二次医療機関ではML系薬剤での治療が効果を発揮せず重症化し入院する患者が多いことの裏付けとなる結果であったGENECUBEによる患者検体の迅速マイコプラズマ遺伝子検出検査はマイコプラズマの遺伝子検出とともにML耐性の有無も判定する。迅速な結果の還元により耐性のない薬剤の投与の選択も可能となりその有効性を証明できた。肺炎マイコプラズマ感染時、菌の特異遺伝子の検出による確定診断とマクロライド系薬剤の感受性判定を迅速に行うことが症状の軽減、治療期間の短縮につながることが明らかとなった。2013年2015年の調査でマクロライド耐性は2015年に耐性率が急激に低下した。原因はマクロライド耐性I型菌からマクロライド感受性II型菌への交代であり、肺炎マイコプラズマは流行菌型の交代に伴い、耐性率の激変がみられることが判明した。患者発生の減少により当初予定していた検体数の確保はできていないが、培養検査技術の検討・改良によりマイコプラズマ感染患者からの菌検出率を向上させ、解析可能な菌株を得ることができている。また、本事業開始以前に分離していた2011年および2012年分離株も多数残しており、経年的な変化を調査するのに必要な株数は確保できている。ただ陽性患者の総数が少ないことから、マクロライド耐性菌および感受性菌感染者の臨床的特徴の解析、耐性菌による感染と重症度との関連の解明をするには症例不足ではある。今後も継続して調査・研究を行っていくことにより症例数を確保していく予定である。細菌性呼吸器感染症これまでの研究における最大の障害は患者発生数の減少であるが20142015年冬季から患者数が若干増加傾向にある。今後も引き続き各医療機関とのネットワークを強固にし、患者検体の収集に努力していく。検査法(遺伝子検査&培養検査)、菌の解析法(薬剤感受性試験、遺伝子解析)に関して、ほぼ技術は確立できており、昨年度の研究の継続により、成果をまとめていけると考える。患者発生の減少により、当初予定した検体数の確保はできなかったが、以下の基本的な技術を導入することができ、今後の研究の進展に向けた準備が整った。1、分離培養法の検討:二層培地の導入により、核酸診断を上回る培養検査結果を得ることができ、今後のマイコプラズマ流行に備えた菌株分離法を確立できた。2、23SrRNA遺伝子の塩基配列の解析を行うことにより、GENECUBE法では識別し得なかった塩基置換を確認でき、より詳細な解析を行えるようになった。3、MLVA法の導入によりこれまで以上の詳細な系統鑑別ができるようになった。次年度使用額は少額であり、また研究継続の予定でもあるので残額をゼロとはしなかった。引き続き各医療機関での検体収集を継続するとともに、分離菌については型別、薬剤耐性に関与する遺伝子変異の特定、薬剤感受性試験を実施、菌側からの解析を充実させ、臨床的特徴および感染様式等との関連性を探る。肺炎マイコプラズマの薬剤感受性に関しては標準法は確立されておらず、その実施法から検討する。発育が非常に遅いマイコプラズマでは感受性ディスク法や寒天希釈法の実施は難しく、液体希釈法について検討していくことになるが、菌の発育を目で見ることができないマイコプラズマではpHの変動でその発育を判定することになり、薬剤ごとの培地の調整法から検討していく。次年度に物品費として使用予定。平成25年度はマイコプラズマ感染症の非流行期となり、目的とした検体数が確保できず、検査費用等がかなり減少した。