hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多層的オミックス解析を用いた機能性精神疾患のバイオマーカー開発

気分障害、統合失調症、健常者の脳脊髄液等生体試料を収集し、オミックス技術(タンパク質、遺伝子などの網羅的解析法)を用いて、診断や経過判定の指標となるバイオマーカーを探索した。その結果、脳脊髄液のプロテオミクスによりfibrinogenが一部のうつ病の病態を示すバイオマーカーとなることを見出した。また、脳脊髄液中のタンパク濃度を規定する遺伝子多型のカタログを構築した。マイクロRNAについても網羅的解析を行い、精神疾患のマーカーとして有力な分子を特定した。血液のトランスクリプトーム解析から、うつ病患者ではVAMP2, FKBP4, CRHR2などの発現変化がバイオマーカーとなる可能性を見出した。近年、統合失調症や気分障害の診断や経過判定の指標となるバイオマーカーの開発が精力的になされているが、いまだに確立したマーカーといえるものはない。生化学的指標では血液を中心に探索されているが、脳内動態をどの程度反映するか疑問が残る。そこで本研究は、脳脊髄液の分子動態を網羅的に明らかにするとともに、統合失調症と気分障害の脳脊髄液を用いて診断や経過判定の指標となるバイオマーカーを見出すことを目的とする。これまでに、アプタマー技術を用いた最新のプロテオミクス解析によって、212名の被験者のたんぱく質(1129分子)について定量した。その中で、統合失調症や気分障害の診断マーカー、症状判定指標となる候補分子を140同定した。例えば、うつ病との関連で特に注目される分子としてfibrinogenがあり、健常者の上位95パーセンタイルより高い値を示したうつ病患者が7名おり、独立のサンプルでも確認されたことから、「中枢フィブリノーゲン亢進型うつ病」というサブタイプがある可能性が示唆された。そのほか、接着分子B(特許出願予定のため具体的な分子名は伏せる)は、健常者と比較してうつ病患者において有意な低下を示すとともに、重症度と有意な負の相関を示した。免疫系の分子Cも、一部のうつ病患者で突出した値を示し、サブタイプ分類に有用である可能性が示唆された。なお、BDNFの受容体であるTrkBは、うつ病で低下しており、注目された。統合失調症においても、多数の興味深い結果を得ている。miRNAについては、東レ3D-Geneによる上記サンプルの解析を行い(2019分子の網羅的解析)、バイオマーカー候補として重要な39分子を同定した。今後、再現サンプルによる検証を行い、さらに分子を絞る予定である。上記のサンプルのうち138名のサンプルについて100万SNPsチップを用いた全ゲノム解析を終了した。本研究は、脳脊髄液の分子動態を網羅的に明らかにするとともに、統合失調症と気分障害の脳脊髄液を用いて診断や経過判定の指標となるバイオマーカーを見出すことを目的とする。その中で、統合失調症や気分障害の診断マーカー、症状判定指標となる候補分子を140同定し、26年度中に特許出願した(特願2014-102090 )。さらに、うつ病との関連で特に注目される分子としてフィブリノーゲンがあり、脳脊髄液中の上昇と脳MRIでの軸索障害を示す群は、「中枢フィブリノーゲン亢進型うつ病」というサブタイプとして切り分けられる可能性が示唆された(論文投稿・修正中)。さらに、食欲を制御するタンパクCARTがうつ病患者の脳脊髄液中で減少していることをELISAによって明らかにした(論文準備中)。統合失調症や双極性障害においても、多数の興味深い結果を得ている。さらに、安価なキットを用いて非常に多数の検体での解析を行うために、最も有望な12タンパク分子についてELISAキットによる解析を行い、アプタマーでの結果との相関を明らかにした。miRNAについては、東レ3D-Geneによる解析を行い(2019分子の網羅的解析)、バイオマーカー候補として重要な39分子を同定し、特許出願を済ませた(特願2015-008710)。miRNAとタンパク発現との相関をみたところ、多重比較を考慮しても15704ペアのmiRNAとタンパクの有意な相関を見出した(論文準備中)。これは、脳内でどのmiRNAがどのタンパク発現を制御しているか明らかにする上で貴重なデータベースとなる。なお、上記のうち170名について100万SNPsチップを用いた全ゲノム解析を終了した。本研究は、精神疾患患者や健常者を対象として脳脊髄液など生体試料を収集し、プロテオミクスやゲノミクス等のオミックス技術を用いて脳脊髄液を中心とした試料の分子動態を網羅的に明らかにするとともに、統合失調症と気分障害の診断や経過判定の指標となるバイオマーカーを見出すことを目的とする。これまでに、アプタマー技術を用いたプロテオミクス解析によって、たんぱく質の網羅的解析を行っている(1129分子)。既に統合失調症や気分障害の診断マーカー、症状判定指標となる候補分子については26年度中に特許出願したが(特願2014-102090)、その中でトップヒットであった分子としてフィブリノーゲンがあり、脳脊髄液中の上昇と脳MRIでの軸索障害を示す群は、「中枢フィブリノーゲン亢進型うつ病」というサブタイプとして切り分けられる可能性を見出し論文報告した(Sci Rep, 2015)。その後、症例数を増やしてエビデンスの構築を行った。また、中枢神経系に豊富に発現している細胞接着因子の1つneural cell adhesion

molecule (NCAM)について検討し、双極性障害患者の脳脊髄液中で低下していることを明らかにした(論文準備中)。さらに、今年度は血液のトランスクリプトーム解析を終了し、うつ病患者の白血球では、VAMP2, FKBP4, CRHR2などの分子の発現が変化しており、バイオマーカーとなる可能性について報告した(Sci Rep, 2016)。遺伝子多型に関するゲノムワイド解析データと脳脊髄液中のプロテオミクスデータとの関連を検討し(pQTL解析)、多重比較を考慮しても446ペアの一塩基多型(SNP)と脳脊髄液中タンパク濃度との有意な相関を見出した(論文準備中)。これは、脳内でのタンパク発現がどのような遺伝子多型によって規定されているかを明らかにする上で貴重なデータベースとなる。気分障害、統合失調症、健常者の脳脊髄液等生体試料を収集し、オミックス技術(タンパク質、遺伝子などの網羅的解析法)を用いて、診断や経過判定の指標となるバイオマーカーを探索した。その結果、脳脊髄液のプロテオミクスによりfibrinogenが一部のうつ病の病態を示すバイオマーカーとなることを見出した。また、脳脊髄液中のタンパク濃度を規定する遺伝子多型のカタログを構築した。マイクロRNAについても網羅的解析を行い、精神疾患のマーカーとして有力な分子を特定した。血液のトランスクリプトーム解析から、うつ病患者ではVAMP2, FKBP4, CRHR2などの発現変化がバイオマーカーとなる可能性を見出した。脳脊髄液サンプルの収集は、本研究計画提出時(2013年10月)におよそ400検体であったが、その後、順調に収集を続けることができ、2015年5月には664検体(統合失調症227、大うつ病138、双極性障害101、健常者168、その他30)となった。ただし、非服薬症例は依然として少ないという問題点がある。オミックス解析については、当初の予定では、網羅的解析(スクリーニング)を行う対象は、既に収集されている脳脊髄液を供与した被験者のうち、年齢・性をマッチさせた126名(統合失調症32、双極性障害32、大うつ病32、健常者32)であった。しかし、これまでにプロテオームに関しては212名(統合失調症60、双極性障害32、大うつ病60、健常者60)、miRNAに関しては136名(順に30、16、30、60)、GWASに関しては170名(30、16、46、140)の被験者に関するデータを得て、そのデータベースを構築した。これは、いずれも当初の計画を上回る数字である。また、タンパク、miRNAについて2件の特許申請を済ませた点は大きなステップである。さらに、miRNAとタンパクの相関のデータベースを構築したことは、本研究の大きな目標の1つを達成したと考えている。ただし、本研究は、2014年10月から開始されたこともあり、得られたデータ量は膨大であるため、その解析は現段階で終了しておらず、鋭意進行中である。今後の解析によって極めて有望な分子に絞り込むことができると考えている。例えば、上記のfibrinogenは、精神医学のブレークスルーとなるのではないかと考えられ、他に炎症関連の極めて有力な候補分子を同定している。
マルチセクター協調による社会的課題の解決に関する地理学的研究

東日本大震災において様々な社会的課題が出現したが、各被災地域の比較研究からは、行政、営利企業、NPO/NGOなどのサードセクターといったマルチセクターの主体が協調的に対応した地域において対応能力が高く、それには「市民協働」などとして表現される、地域ごとに歴史的に構築されてきた協調にかかわる制度(ルール、規範、建造環境など)が寄与していることが明らかになってきた。マルチセクターの協調を促す制度の効果と、制度が具体地域に構築される様子を把握し、多様な主体が協調して社会的課題の解決をなすことで、地域として社会的課題に対応していく条件について把握する。
生殖細胞の分化・増殖に必須なmRNA安定性制御機構の解明

線虫の生殖細胞の分化・増殖に必須なクロモドメインタンパク質MRG-1の始原生殖細胞への限局は、生殖細胞系列と体細胞系列において母性mrg-1 mRNAの安定性が異なることによるものである。このmRNA安定制御は3'非翻訳領域(3'UTR)に依存しているが、詳細な機構は不明である。本研究では、3'UTRに存在するmRNA安定性制御に必要十分なシス配列を明らかにするとともに、シス配列に相互作用する因子を同定し、mrg-1 mRNAを生殖細胞系列で安定化し、体細胞系列で分解する機構の全容を解明することを目的とする。平成30年度の解析では、前年度にmrg-1 3'UTRと相互作用する因子として同定された細胞骨格系のタンパク質群のうち、トロポミオシンタンパク質LEV-11に注目した。lev-11遺伝子は19種のアイソフォームが存在し、各々が時期・組織特異的な発現を示す例も報告されているが、これらの機能や生理学的意義については明らかにされていない。そこで、mrg-1 3'UTRとの相互作用が期待されるアイソフォームC、及びE(LEV-11 C/E)に対してRNAi法による阻害実験を行ったところ、多くの個体が産卵異常、あるいは胚致死を示した。そのため、始原生殖細胞が形成される胚発生後期におけmrg-1 mRNAの発現解析を行うことができなかったものの、LEV-11 C/Eが生殖細胞形成あるいは初期発生に重要であることが示された。さらに、LEV-11 Eを消化管の元となるE細胞系列で特異的に発現するトランスジェニック線虫を作製し解析を進めたところ、これらの細胞において、mrg-1 3'UTRレポーター遺伝子の発現が亢進する様子が観察された。これらの結果は、LEV-11 C/Eが生殖細胞形成に寄与すると共に、3'UTRを介したmrg-1遺伝子の翻訳促進に関与することを示している。lev-11遺伝子については順調に解析が進んだものの、lev-11遺伝子以外の細胞骨格関連因子群については阻害実験の効果が薄く、生殖細胞形成やmrg-1 mRNAが受ける転写後制御への関与を十分に検証することができなかったため。他の細胞骨格因子群について、組織特異的な過剰発現実験を中心とした解析によりmrg-1 mRNAが受ける転写後制御への影響を検証する。さらに、本年度の解析においてmrg-1遺伝子の翻訳促進に寄与する可能性が挙げられたlev-11 c/e遺伝子について、その発現様式が明らかとされていないことから、in situ hybridization法によってmRNAの局在解析を行うことでmrg-1遺伝子の発現様式との関連を検証する。平成29年度はまずmrg-1 mRNAの3'UTR(全長250塩基)によるRNA安定性制御シス配列の解析を進めた。この3'UTR内にステムループ構造をとる部分を中心に欠失変異体を作成し、レポーターmRNA由来のGFP蛍光を観察した結果、このステムループ構造は安定性制御に関与していないことが示唆された。また、mrg-1 3'UTRに相互作用する因子を同定するために、GFP-ヒストンの下流に、MS2結合配列(MS2コートタンパク質の認識配列)とmrg-1の3'UTRを付加したレポーターmRNAを発現するトランスジェニック系統を作製した。このトランスジェニック系統を大量培養し、その胚から得られた抽出液をMS2コートタンパク質と混合し、レポーターmRNAを免疫沈降することによって、レポーターmRNAと相互作用するタンパク質を回収した。これらのタンパク質を質量分析法によって解析したところ、想定外の細胞骨格系のタンパク質であるミオシン、トロポミオシン、アクチンなどを同定することができた。平成29年度に予定していた研究計画は概ね順調に進んだが、学内共同利用機器を利用している質量分析の予約状況が混み合っていたため、一部の試料の解析を平成30年度に繰り越すことになった。

そこで、mrg-1 3'UTRとの相互作用が期待されるアイソフォームC、及びE(LEV-11 C/E)に対してRNAi法による阻害実験を行ったところ、多くの個体が産卵異常、あるいは胚致死を示した。そのため、始原生殖細胞が形成される胚発生後期におけmrg-1 mRNAの発現解析を行うことができなかったものの、LEV-11 C/Eが生殖細胞形成あるいは初期発生に重要であることが示された。さらに、LEV-11 Eを消化管の元となるE細胞系列で特異的に発現するトランスジェニック線虫を作製し解析を進めたところ、これらの細胞において、mrg-1 3'UTRレポーター遺伝子の発現が亢進する様子が観察された。これらの結果は、LEV-11 C/Eが生殖細胞形成に寄与すると共に、3'UTRを介したmrg-1遺伝子の翻訳促進に関与することを示している。lev-11遺伝子については順調に解析が進んだものの、lev-11遺伝子以外の細胞骨格関連因子群については阻害実験の効果が薄く、生殖細胞形成やmrg-1 mRNAが受ける転写後制御への関与を十分に検証することができなかったため。RNA安定性制御とは一見無関係な細胞骨格系のタンパク質がmrg-1の3'UTRに相互作用することが明らかになったので、この相互作用の妥当性を検証するために、まずはmrg-1の3'UTRをもつレポーター系統において、これらの細胞骨格系タンパク質をRNA干渉法によって阻害し、その効果を評価することを最優先とする。他の細胞骨格因子群について、組織特異的な過剰発現実験を中心とした解析によりmrg-1 mRNAが受ける転写後制御への影響を検証する。さらに、本年度の解析においてmrg-1遺伝子の翻訳促進に寄与する可能性が挙げられたlev-11 c/e遺伝子について、その発現様式が明らかとされていないことから、in situ hybridization法によってmRNAの局在解析を行うことでmrg-1遺伝子の発現様式との関連を検証する。学内共同利用機器である質量分析装置の利用状況を勘案し、一部の解析を次年度に繰り越すことにしたため。繰越額は平成30年度に質量分析経費として使用する予定である。lev-11以外の候補遺伝子に対する阻害実験による解析がやや遅れていることに対応するため、変異体作成やin situ hybridization法によるmRNA局在解析に必要とする経費の一部を2019年度に繰り越すことにしたため。
19世紀アメリカ文学にみる動物表象と科学言説の関係についての研究

本研究において、多様化のすすむ19世紀中葉のアメリカ合衆国における文学と科学の接点を、進化論的言説の受容と動物表象の関係において考察しようとした。19世紀中葉がら活発になっていく進化論的言説の生成とそのアメリカでの受容についてまずあきらかにした。また、文学作品において、進化論的言説への賛否が微妙に動物描写に反映されている点が確認できた。ダーウィニズム以前の進化論における擬人化される動植物にこめちれた意味にういて考察することで、種という概念と人種という捉え方の相関関係に科学と文学の接点が見出された。この点を論証するため、まず、進化論的言説の受容を研究し、エマソンのエッセイ「自然論」に注目し、エマソンの科学に対する興味と理解について検討した。この成果を、エマソン学会・ホーソーン学会・ポー学会共催の国際学会において発表した。エマソンは、ダーウィニズム以前の進化論を受容し、また大西洋を渡って交流した人々、そこでの自然から進化論的な表現を見出していった点を明らかにした。この発表・及びハンティントンライブラリーで調査した結果をもとに、エマソンの進化論的な自然観が動植物への共感を基点として、イギリスでの体験からえた科学と宗教との相克から、人間肯定的なものに辿りついていく様が論文としてまとめた。この論文は『英文学研究(英文号)』(2007年3月)に掲載された。これらの研究により、進化論的言説のなかにある人間中心的な視点も一方であきらかになり、神話的な世界との関連、そこでの動物表象の問題、また、人間の認識を中心としたライフ・ワールド的生活圏の構築の問題などの視点もえられ、これらをメルヴィルの『クラレル』を中心に考察することとし、2007年8月に開かれるメルヴィル国際学会での発表として採択された。
主要組織適合クラスI抗原の胎生期発現とそのマウス胎児-母体関係への影響

主要組織適合クラスI遺伝子の発現は非常に厳密に発生中期から始まるように制御されている。この制御の生物学的な意義を検証するためにクラスI抗原を発生初期から強く発現するトランスジェニックマウスを作った。そのためにまず、クラスI遺伝子L^dとK^bからプロモ-タ-を取り除き、ニワトリ細胞質β-アクチンプロモ-タ-に置き換えたものを作成した。β-アクチンは体のほぼすべての細胞で、常に高いレベルで作られており、そのプロモ-タ-はF9細胞を含む様々の培養細胞株で強い活性を示す。このβ-アクチンプロモ-タ-は細胞の発生分化の段階に拘わらず強い活性を示すことから、クラスI遺伝子を発生初期より強く発現させるのに最も適したプロモ-タ-の1つと考えられた。クラスIL^d遺伝子(K^bも同様)をこのプロモ-タ-に接続した合成遺伝子(Ac-L^dとAc-K^b)を作成し、マイクロインジェクション法により各々、C57BL/6(B6)、B6C3HF1マウスの受精卵に導入した。仮親はICRまたはB6C3HF1マウスを用いた。B6マウスは約80匹生まれ、このうち3匹のマウスにAc-L^d遺伝子が入っていることが確かめられた。これらマウスをB6マウスに交配して得られた子孫マウスにおけるAc-L^d遺伝子の発現を調べるため、様様の臓器から抽出されたRNAをノザ-ン法により調べた。その結果、脾臓、腎臓だけでなく、普通はクラスI遺伝子の発現しない脳や筋肉でも強い発現が確認された。また、末梢リンパ球をL特異的単クロ-ン抗体で染めて解析したところ、本来L^dを発現するBalb/cマウスと同程度の発現が認められた。一方、Ac-K^b遺伝子を受精卵に導入したものより、約30匹のマウスが誕生した。このうち、5匹にAc-K^b遺伝子が導入されていたが、K^bの発現は今後調べて行く。これらのマウスを用いて、胎児と母体の間で異常の有無を調べて行く予定である。
発電阻害物質の除去機構を実装した多段階フロー式酵素燃料電池の開発

複数の代謝酵素を電極触媒とした酵素燃料電池は、燃焼を経ずに糖やアルコールを二酸化炭素と水まで酸化でき、それらの持つ膨大な化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換できる。しかし従来のバッチ式では電解液に溜まった生成物が酵素反応を阻害するため、途中で発電が止まってしまう問題があった。本研究では、循環型社会に適した次世代モバイル電源の創出を目指し、発電阻害物質除去機構を実装した酵素燃料電池の構築に取り組む。
undecided型の進路未決定者に対する意思決定支援プログラムの開発と評価

大学3年生の秋の時点で卒業後の進路について意思決定ができない人のうち、強い不安と領域を問わない優柔不断性の低いundecided型の未決定者を研究対象として、4種類の研究を行った。目的は、彼らに対する効果的な支援のあり方の検討と、それを通しての未決定者の理解である。まず質問紙調査においては、"個性"や"自分らしさ"にこだわって進路を考える人ほど決定しにくいであろうとの予測の下に研究したが、「仕事における個性発揮」の因子は納得のいく決定と関連しているとの結果が得られた。それに対して「自己分析の先行」は未決定を促進する方向での関連を示した。ただし、これらの"個性"や"自分らしさ"にこだわる進路選択のあり方は、未決定やその関連の変数をあまり多くは説明していない。続く面接調査では、彼らが「自分が働いている姿」が見えないゆえに決められないこと、あるいは探索行動よりは自分により合ったもののなかでベストなものを探そうとしている姿が事例として明らかになった。研究3の対個人の支援では、個々の事例がもつ選択肢について論理的・合理的にやりとりをすること、調べてくる・考えてくるといった、職業情報探索を伴った課題を出してペースメイクすること、現実性を重視して進めることが効果をもつことが明らかになった。研究4の対集団の支援では、彼らに選択肢を具体化させ、多面的に見直させることには成功した。しかし参加者が次回までに行う職業情報探索をうまくペースメイクできなかったために、新たな考えが身についたという感覚、もっと調べなければという危機感を持たせはしたが、実際に調べてきた職業情報をもとに選択肢を再吟味したり、意思決定に近づかせるといった、意思決定へのより実際的な接近にはあまり奏功できなかった。大学3年生の秋・冬の時点で進路意思決定ができていない学生を未決定の学生と見なしているため、2005年秋に滋賀大学教育学部、同年末2006年1月にかけて、近畿地方の非教員養成系の文科系学部にて質問紙調査を行った。その結果、教育学部の有効回答者数は109名、それ以外の学部では223名であった。現在分析中で、2006年度の心理学関係の諸学会にて発表予定であるが、分析過程で得られた知見や感触は、後述する「青年心理学研究」に発表した論文のなかにも生かされている。また、上述の質問紙の末尾にて面接調査の協力依頼を募ったところ、30名以上の承諾者が得られた。承諾者の回答や意思決定状態を調査用紙への回答から整理し、協力依頼を15名に打診したが、実際に面接調査に応じてくれた学生は現在のところ6名である。今後、時期を見て、再度依頼を行う予定でいる。また面接調査の結果は、現在のところまだ被験者を募ることもあり、分析は十分に行っていないが、2006年度じゅうに紀要論文の形でまとめる予定である。昨年度の量的調査、面接調査に基づいて、進路未決定者への個人単位の支援・介入を行った。その過程と結果から把握できた未決定者の特徴は以下の通りである。1.彼らは自分にもっともフィットする選択肢を探していながら、そのイメージは曖昧で、さらなる選択肢を探索することに対して気後れしている。2.彼らにとって魅力的な選択肢とは非常に限られており、また採用の実現可能性、あるいは残された時間からみて、非現実的なものである。3.外的要因として、彼らは往々にして多忙であることが挙げられる。進路を探索・思考するのに必要な機会や時間は得てして後回しになる。4.彼らは自身の進路意思決定に真摯であるものの、「どんな進路が私に最もマッチしているか?」、「私はその仕事に就く資質があるのか」といった問題にとらわれてしまう傾向にある。

以上の知見を元に、今年度は複数の未決定者に対して一斉に行うガイダンスのプログラムを作成する計画である。教員養成学部の3年次生で10月中旬時点で進路未決定である者のうち希望する人15名に定期的に集まってもらい,計4回のセミナーを行った。それを通して,集団的な意思決定支援効果を検討すると同時に,undecided型の未決定者の特質を明らかにした。まず意思決定まで到達できたかについては,中途で脱退した1名を除いた14名中9名が決定できた。ただ,セミナー以外の要素(企業の説明会等)で決めた人も含んでいる。次に,考えが進んだ感触をもてたか否かで見てみると,考えが整理できた,見えてきた,課題が整理できたとの感想は個々のプログラムについては得られたが,決定へと考えが進んだという積極的な感想は見られなかった。次に選択肢の吟味が進んだ否かで見てみると,専攻学業や募集人員の点で現実性が低い選択肢を,確たる成算がないまま保持した人が多かった。志望の段階評定もセッションを通した変動は全体的に少なかった。ただ,回を追うごとに選択肢が具体的になり,判断材料が増えた点では探索・吟味のペースメイクはできた。募集数や自身の強みを判断材料に含める人も増えた。全体を通して,講義を聞き,職業カードソート技法や意思決定モデルの実習といった作業によって,それまでの具体的な探索を伴わない思考から脱することに寄与したことは成果である。ただ到達点を個別に確認して,不十分な点を指摘したり,努力を怠っている参加者に注意を与えたりは行えなかったため,探索や吟味の行動に従事させることが十分できなかった。また個々人のケースについてやりとりをしなかったことは,参加者にとって自分の場合をつきつめて考えられないことにつながり,昨年の個別的支援に比べて不全感を残じた感がある。
西洋倫理思想史における身体の問題

本研究は、西洋倫理思想史ならびに西洋哲学史において古来問われつづけてきた「身体」の問題をめぐって、現在的な状況との関わりとのなかであらためて正面から問いなおそうとするものである。具体的な活動としては、時代ごとに区分されたおのおのの分科会が、随時研究会を開催するとともに、毎年度の秋には全体的な研究会を開催して、それまでのおのおのの分科会の研究成果を報告しながら研究をとりまとめることになった。そうして、古代ヘブライ思想ギリシア思想ならびに中世キリスト教思想などの近代以前の歴史的な思想の身体観に照らした検討することを通じて、通常歴史的に対立すると捉えられている近代以前の身体観と近代以降の身体論とが、これまでそう認定されてきた以上の内在的な類似性と連続性を有することが明らかになった。また、その当の類似性と連続性が現代の様々な身体研究のうちにも反響していることが同様に確認された。すなわち、古代・中世思想における身体観も、常識的にはそうとらえられるほど素朴なものではなく、霊肉二元論という宗教的な表象の影をおびたものであるにせよ、近代以降において先鋭化するとふつうは理解されている、心身の対立をすでに知っていることが解明されたのである。こうして、これまでの研究に対して新たな研究成果がもたらされるとともに、さまざまな分野にわたって研究された成果が報告書というかたちで総括的にまとめられることになった。本研究は、西洋倫理思想史ならびに西洋哲学史において古来問われつづけてきた「身体」の間題をめぐって、現在的な状況との関わりのなかで改めて正面から間いなおそうとするものである。本年度は研究計画の初年度であり、西洋倫理思想史の源泉としての、古代ヘブライ思想ならびにギリシア思想について、その読み直しをはかるととともに、それとの反照において、近代以降の西洋倫理思想史における身体観の展開をも捉えかえす手がかりを求めようとした。具体的には、時代ごとに区分された各分科会が、随時、研究会を開催するとともに、12月には全体研究会を開催して、研究の方向を討議し、またこれまでの研究の動向を報告しながら、新たな研究成果について検討をおこなった。その結果、通常は対立して考えられるヘブライズムとヘレニズム(古代ギリシア思想)の両者において、意外なほどの類似性が確認されること、近代以降の身体観と一般にはまとめられるもののうちには、存外に多様な展開が見られ、なお十分には研究されていない、さまざまな可能性が秘められていることが確認された。ヘレニズムとヘブライズムとに共通して認められる身体観とは、一口で言えば、気息あるいは呼吸をモデルとした身体の捉え方であるが、そこには同時に、いわゆる身体といわゆる精神とを一つのものとして考えようとする思考の傾向があり、それは、たとえばデカルトの所論にも見られるとおり、実は近代以降にあっても完全には消失したわけではない。そうした身体観はまた、身体をめぐる現下の議論にあっても、もう一度かえりみられるに価するものであるように思われる。本研究は、西洋倫理思想史ならびに西洋哲学史において古来問われつづけてきた「身体」の問題をめぐって、現在的な状況との関わりとのなかで改めて正面から問いなおそうとするものである。本年度は、研究計画の二年次目であり、西洋倫理思想史の源泉としての、古代ヘブライ思想、ギリシア思想ならびに中世キリスト教思想について、その読み直しをはかるとともに、それとの反照において、近代および現代の西洋倫理思想史における身体問題の展開をとらえかえそうとした。具体的には、時代ごとに区分された各分科会が、随時、研究会を開催するとともに、9月には全体研究会を開催して、研究の方向を協議し、またこれまでの研究成果を報告しながら、その検討を行った。また、3月には、中世キリスト教思想担当者との研究打合せ・研究方向の討議・研究成果の突き合わせを行った。その結果、通常、歴史的に対立するものとしてとらえられる、近代以前の身体観と近代以降の身体論とが、これまでそう認定されてきた以上の内在的な類似性と連続性を有することが明らかになった。また当の類似性、連続性が現代の様々な身体研究のうちにも反響していることが確認された。

すなわち、古代・中世思想における身体観も、常識的にはそうとらえられるほど素朴なものではなく、霊肉二元論という宗教的な表象の影をおびたものであるにせよ、近代以降先鋭化するとふつうは理解されている、心身の対立をすでに知っていることが解明された。近現代の、身体をめぐる哲学的・倫理学的思考にあっても、そうした問題系が幾たびも反復的に回帰しているのである。本研究は、西洋倫理思想史ならびに西洋哲学史において古来問われつづけてきた「身体」の問題をめぐって、現在的な状況との関わりとのなかであらためて正面から問いなおそうとするものである。本年度は、研究計画の最終年度であり、これまでの研究成果を踏まえて、研究を総括することになった。具体的には、時代ごとに区分された各分科会が、随時研究会を開催するとともに、9月には全体研究会を開催して、これまでの研究成果を報告しながら、研究をとりまとめた。そうして、古代ヘブライ思想、ギリシア思想ならびに中世キリスト教思想などの近代以前の歴史的な思想の身体観に照らした検討を通じて、通常歴史的に対立すると捉えられている近代以前の身体観と近代以降の身体論とが、これまでそう認定されてきた以上の内在的な類似性と連続性を有することが明らかになった。また、その当の類似性と連続性が現代の様々な身体研究のうちにも反響していることが同様に確認された。すなわち、古代・中世思想における身体観も、常識的にはそうとらえられるほど素朴なものではなく、霊肉二元論という宗教的な表象の影をおびたものであるにせよ、近代以降先鋭化するとふつうは理解されている、心身の対立をすでに知っていることが解明されたのである。こうして、これまでの研究の成果が総括されるとともに、多彩な分野にわたって研究された成果が報告書というかたちで総括的にまとめられることになった。
中高一貫校における才能教育とリーダー育成のためのカリキュラム開発研究

最終年度に当たる18年度は、才能教育とリーダー育成の両面において大きな教育効果が期待される文化祭の行事をカリキュラムとして単元開発することを試みた。まず、文化祭の運営を通じたリーダー育成の機能を明確にするため、各参加団体の企画と運営を担った在校生の「デコ責(デコレーション責任者)」に対して集団面接を行い、彼らが獲得している能力要素を検討した。次に、とくに起案力と調整力について職種や分野による有用性の違いを確認するため、卒業生(平均年齢45.3歳)に対し集団面接を実施した。これらの調査結果をもとに18年度の文化祭ではその単元を改善する形で試行してみた。すなわち、学級別による高2生の参加形態を「組」別に再編し、選択性と専門性をより高めて、そのカリキュラムとしての評価を教員への質問紙調査によって実施した。教員からの評価によれば、先を見通す力、事務処理能力、および問題処理能力の発揮において「組」の間で大きな差異が生じていた。そして、この差異を生み出す要因として、とくに信頼関係を築く上でリーダーの必須条件である「丁寧な合意形成」の重要性が確認された。3年間に及ぶ本研究の成果として、中高一貫校における才能教育とリーダー育成に向けたカリキュラム開発の条件が次のように導き出された。すなわち、(1)生徒の自主的な活動が展開されるように学習環境を整えるとともに、(2)リーダー経験の機会を豊富にして、より多様な役割を経験させ、(3)仲間との間で粘り強く合意の形成を求めて活動する経験内容を充実することなどが必要である。16年度は、まず、中高一貫による才能教育とリーダー育成の理念・目的・システムについて、文献・資料および専門家への聴き取りの内容を検討した。その結果、教育理念を特別支援教育の一環として位置づける立場から、「早修」(acceleration)よりも「拡充」(enrichment)の方を重視した教育目的を設定し、これを達成するため、たとえば「異年齢構成によるクラブ活動型の選択制システム」を採用することが有益ではないかとの結論を得た。つぎに、筑波大学附属駒場中・高等学校の卒業生から1/2無作為抽出法により選定した2,513名を対象に、才能教育とリーダー育成に関する教育的ニーズを把握するための郵送法による質問紙調査を実施し、469名(回収率18.7%)から回答を得た。その分析結果から、とくに「仕事の進め方について起案する能力」と「職場の人間関係を察して調整する能力」において教育的ニーズが高いことが明らかとなった。そこで、カリキュラム開発に当たってこうした起案力と調整力を重点的に育成することを目指す必要があり、これを全体構想に取り込むこととした。これらの研究結果の一部は、日本カリキュラム学会機関誌『カリキュラム研究』第13号に論文発表するとともに、第4回筑波大学教育学会においても研究発表した。また、これを附属駒場中・高等学校の教員研修会の場でも報告し、今後の共同研究の方向について協議した。17年度は、上記の研究結果をさらに詳細に検討し、また、卒業生の職業分野別による第二次調査を行い、その結果をもとにカリキュラムの開発を試みる。17年度は、まず、中高一貫による才能教育プログラムについて、「異年齢構成によるクラブ活動型の選択制システム」の可能性を探るため、中高生が合同で活動している囲碁部、数学研究会、及び剣道部を中心に、在校生と卒業生を対象とした聴き取り調査を実施した。その結果をもとに、18年度に試行するクラブ活動型のプログラムについて、その骨格と単元構成を検討している段階にある。次に、リーダー育成について、学校行事の中で卒業生調査による評価が高かった文化祭の実行委員会を調査し、とくにデコレーション担当者(通称:デコ担)が企画と調整に活躍していることがわかった。そこで、これを担った中・高生徒を対象に、質問紙調査と集団面接を行った。すると、これらの生徒の多くが起案能力と調整能力を中心としたリーダーシップを高めており、しかも、彼らの過半数が小学生時代の早くからリーダーとしての経験を有していることが明らかとなった。この調査結果は、16年に論文発表した「音楽祭によるリーダー育成の機能」をさらに具体的に示すものとして注目されるので、現在、共同研究の報告書の一部にまとめており、次年度以降に学会での発表と論文投稿を予定している。なお、17年度に計画していた卒業生を対象とした第二次調査は、研究の目的をより一層絞り込むため、上記の調査結果をもとに開発している複数のカリキュラム案の類型に関する意見調査として実施することにしている。

3年間に及ぶ本研究の成果として、中高一貫校における才能教育とリーダー育成に向けたカリキュラム開発の条件が次のように導き出された。すなわち、(1)生徒の自主的な活動が展開されるように学習環境を整えるとともに、(2)リーダー経験の機会を豊富にして、より多様な役割を経験させ、(3)仲間との間で粘り強く合意の形成を求めて活動する経験内容を充実することなどが必要である。
多危険因子にともなう心血管リモデリングに対する新しい治療法の開発

(1)MCP-1 7ND : Fcキメラ(7ND)遺伝子作成と、そのドミナントネガティブ活性検討ヒトMCP-1の細胞外ドメインにヒトイムノグロブリンFc鎖を結合させたキメラ遺伝子をPCR法を用いて作成し、HA-tagged発現プラスミドベクターpVR1255に組み換える。(2)7ND遺伝子導入法の確立HA-tagged 7ND遺伝子組み換え発現プラスミドをnaked DNA法にてラット大腿四頭筋に筋注導入し局所で7NDを分泌蛋白として発現させ、血中に分泌された7NDにより生体の作用部位〔心・血管〕においてMCP-1機能を拮抗阻害するという戦略を用いる。この方法には、免疫原性の低いnaked DNA法により標的遺伝子を骨格筋局所に導入することから、遺伝子を繰り返し導入し長期間にわたり発現を維持しえると考えられる事から慢性疾患モデルに応用できるメリットがある。導入局所発現を抗HA免疫染色にて、血中7ND濃度を抗ヒトFcELISA法にて、7ND発現の程度と時間経過を検討したところ、pVR1225プラスミドの発現が導入局所筋肉においてきわめて低く、血中には有意な分泌が得られていない事が明らかになった.このため、現在ウィルスベクターも含めた新たな発現ベクター数種に組み換えて最も生体内での発現効率の良いものを検索中である。(3)糖尿病・高脂血症モデル(OLETFラット)を用いた検討糖尿病・高脂血症合併モデルとしてOLETEラットを便用し、コントロール群はLETFラットを使用した。40週令時点で同様の検討を加えた。また、抗MCP-1中和抗体によるMCP-1機能抑制実験も行った。【結果】LETFラット群に比し、OLETFラット群では有意な心筋問質線維化・心筋細胞脱落所見を認め、血管においては血管外膜の硬化が著明であった。また、心筋線維化に先行し、血管周囲にマクロファージ主体の炎症細胞浸潤・線維芽細胞増殖が認められ高血糖においても炎症反応を有する組織傷害リモデリングが介在する可能性が示唆された。10週間MCP-1中和抗体を投与したが明らかな心筋線維化抑制は認めなかった。これは、中和抗体を長期間投与した事による免疫作用などにより効果が慢性的には期待できないと判断した。このため長期間効果発現が期待できるMCP-1 7ND遺伝子導入法の確立を現在目指している。(1)多危険因子のモデル作成:肥満・糖尿病・高血庄といった心・血管病危険因子を有するモデルである5週令のOLTEラットに腹部大動脈縮窄術を施し、高血圧を追加するOLETF/HTラットを作成した。コントロール群はLETFラットを使用した。各病勢期に心エコー・カテーテルにて生理学的評価を加えた。(2)組織学的評価:摘出血管・心臓を用いた左室肥大の有無、血管リモデリングの有無を検討した。LETFラット群に比し、OLETF

ラット群では有意な心筋間質線維化・心筋細胞脱落所見を認め血管においては血管外膜の硬化が著明であった。(3)免疫組織学的検討による組織・細胞障害評価:心筋間質の線維性障害に先行し、血管周囲にマクロファージ主体の炎症細胞浸潤を認め、線維芽細胞マーカーが陽性である間質細胞の増殖がPCNA陽性により認められた。これらの反応はOLETFラットに比しOLETF/HTラットで著明であり、高血糖および圧負荷により組織・細胞障害が増幅されているものと考えられた。(4)ケモカイン・サイトカインの関与:多危険因子モデル(OLETF/HTラット)における心・血管リモデリング過程における炎症/細胞増殖反応にMCP-1/TGF-βの関与とこれらのkey factorであるNF-κBをreal time RT-PCRおよびelectro mobility gel assayにて検討中である。(5)酸化ストレスの検討:多危険因子モデル(OLETF/HTラット)における心・血管リモデリング過程での酸化ストレス評価を施行中である。(1)MCP-1 7ND:Fcキメラ(7ND)遺伝子作成と、そのドミナントネガティブ活性検討ヒトMCP-1の細胞外メインにヒトイムノグロブリンFc鎖を結合させたキメラ遺伝子をPCR法を用いて作成し、HA-tagged発現プラスミドベクターpVR1255に組み換える。(2)7ND遺伝子導入法の確立HA-tagged 7ND遺伝子組み換え発現プラスミドをnaked DNA法にてラット大腿四頭筋に筋注導入し局所で7NDを分泌蛋白として発現させ、血中に分泌された7NDにより生体の作用部位〔心・血管〕においてMCP-1機能を拮抗阻害するという戦略を用いる。この方法には、免疫原性の低いnaked DNA法により標的遺伝子を骨格筋局所に導入することから、遺伝子を繰り返し導入し長期間にわたり発現を維持しえると考えられる事から慢性疾患モデルに応用できるメリットがある。導入局所発現を抗HA免疫染色にて、血中7ND濃度を抗ヒトFcELISA法にて、7ND発現の程度と時間経過を検討したところ、pVR1225プラスミドの発現が導入局所筋肉においてきわめて低く、血中には有意な分泌が得られていない事が明らかになった.このため、現在ウィルスベクターも含めた新たな発現ベクター数種に組み換えて最も生体内での発現効率の良いものを検索中である。(3)糖尿病・高脂血症モデル(OLETFラット)を用いた検討糖尿病・高脂血症合併モデルとしてOLETEラットを使用し、コントロール群はLETFラットを使用した。40週令時点で同様の検討を加えた。また、抗MCP-1中和抗体によるMCP-1機能抑制実験も行った。【結果】LETFラット群に比し、OLETFラット群では有意な心筋間質線維化・心筋細胞脱落所見を認め、血管においては血管外膜の硬化が著明であった。また、心筋線維化に先行し、血管周囲にマクロファージ主体の炎症細胞浸潤・線維芽細胞増殖が認められ高血糖においても炎症反応を有する組織傷害リモデリングが介在する可能性が示唆された。10週間MCP-1中和抗体を投与したが明らかな心筋線維化
連続液体クロマトグラフの試作とその天然有機化合物の分離・精製への応用

天然由来あるいは合成による有機化合物の混合物を液体クロマト法で分離する場合に、従来から広く用いられている試料の導入と溶出を繰り返す方法では多大の時間を要し、かつ充填剤を有効に利用できないなどの理由から、連続的に混合物を分離する方法の開発が望まれている。クロマトグラフ法による連続分離の原理はMartinによって提唱されたが、その後、大きな発展はみられていない。そこで本研究において、混合物を連続的に分離することができる液体クロマトグラフを設計し、試作した。この装置の構造的な特長は、通常のクロマトカラムに相当する部分がガラスとステンレスの円盤に挟まれたディスク状(厚さ2mm、直径270mm)になっており、この分離盤がモーターによって回転させられる点である。充填剤は分離盤の回転(1200rpm)による遠心力で充填される。溶離液は分離盤の中心にポンプで圧送され、充填剤層を周辺に向って流れる。また、混合物試料液は、中心から40mmの位置に静止している試料注入口から、充填剤層に連続的に注入され、溶出液は36個の画分に自動的に分画捕集される。シリカゲル-ODSを充填した本装置を用い、2rphの定回転下で、メタノール-水(19:1、流量8ml/min)を溶離液として、フタル酸ジ-2-エチルヘキシルとフタル酸ジブチルの混合物を各成分について60mg/hの速度で連続分離することができた。また、シリカゲルとヘキサン-酢酸エチル系を用いた場合には、この混合物を160mg/hの速度で連続分離が可能であった。また、親水性ポリビニルゲルと水系によるアミノ酸(フェニルアラニンとトリプトファン)混合物の連続分離では、2成分に完全に分離されることが示された。以上の結果から、本研究において試作した回転分離盤をもつ連続液体クロマトグラフは有機混合物の分離・分取に有用であることが明らかになった。
天然物生合成における三級水酸基のサクシニル化反応に関わる触媒反応機構の解明

リベロマイシンA (RM-A)は放線菌が生産する二次代謝産物である。このRM-A生合成の最終段階に有機合成では超高圧条件下(1.5 GPa)でしか反応しない三級水酸基のサクシニル化反応が存在している。本反応を詳細に解析することは、合成化学的には高エネルギーを要する反応を、生体触媒を用いることにより省エネルギー化できる、というメリットにつながる。さらに本反応を利用すると、難溶性で生体内での吸収を課題としている化合物を対象に三級水酸基の位置にサクシニル基を付加することで、その課題を解消することができる。本研究では相互作用解析をはじめ、応用利用に向けて本反応メカニズムの詳細を明らかにしていく。
体節形成における分子時計の進行波と定常波の関係の分子遺伝学的解析

我々が従来解析してきたMesp2欠損マウスは、Mesp2遺伝子座にLacZレポーターとPgk-neoがノックインされている。Dll3ノックインマウスではDll3遺伝子と共に挿入されたpgk-neoを、後にCre-loxPシステムにより除去している。P2MCMマウスではpgk-neoをflp-FRTシステムにより除去しているので、単なるMesp2欠損マウスとしてコントロールに用いることができると考えられた。そこで野生型、従来のMesp2欠損マウス、Pgk-neoをもつP2MCMマウス、Pgk-neoを除去したP2MCMマウス、Pgk-neoをもつDll3ノックインマウス、Pgk-neoを除去したDll3ノックインマウスの6種のアリルについて、体節形成における表現型を比較した。その結果、pgk-neoを除去したP2MCMマウスとDll3ノックインマウスにおいて、外見上体節の分節が観察された。組織学的観察の結果、この2種類のマウスでは野生型に比べて不完全ながら体節境界が形成されていることがわかった。Mesp1の発現レベルは従来のMesp2欠損マウスでは野生型とあまり変わらないのに対し、他の全てのアリルではMesp1の発現が顕著に上昇しており、2本のストライプをもつ異常なパターンも観察された。以上の結果から次のことが考察された。未分節中胚葉前方にはredundantな機能をもつMesp1とMesp2の2つの転写因子が発現しているが、Mesp2が欠損した場合にはMesp1の発現が上昇するような代償性の制御機構が存在している。従来のMesp2欠損マウスではなんらかの理由でこの代償機構が働かなかったため、MesP2の機能が明らかになったが、その他のアリルではMesp1の発現が上昇して体節形成の異常をレスキューするため、不完全な回復がみられたと考えられる。脊椎動物の体節の規則正しい繰り返しパターンは、未分節中胚葉に内在する分子時計の振動によって作られる。bHLH型転写因子Hes7と、Notch活性を修飾する酵素L-fngの発現は、未分節中胚葉において周期的に振動する。Hes7はHes7自身とL-fngの転写を抑制しNotchシグナルの振動をつくりだすことがわかっている。一方、Hes7もL-fngもNotchシグナルによって誘導される。マウス未分節中胚葉にはD111,D113の2種類のNotchリガンドが発現しているが、これらとHes7、L-fngの関係は明らかでない。そこで我々は、Hes7、L-fngを誘導するNotchシグナルのリガンドは何か、遺伝学的に解析した。まずD111ノックアウト胚ではHes7の発現は未分節中胚葉前方に達していないが、D113ノックアウト胚では発現していた。しかしHes7の発現は振動するため位相が個体ごとに異なり、個体間、異なるgenotype間で比較することが困難であった。一方Hes7ノックアウト胚ではHes7の抑制機能がないため、Hes7自身、L-fngの発現共に振動せず、どの個体でも常に高い状態で観察できる。そこでこの発現レベルにD111とD113がどのように影響するか検討するため、Hes7欠損マウスにD111あるいはD113の欠損を導入したD111/Hes7およびD113/Hes7ダブルノックアウト胚において、Hes7自身とL-fngの発現について検討した。その結果、Hes7自身とL-fngの発現はD111/Hes7ダブルノックアウト胚ではほとんど失われていたが、D113/Hes7ダブルノックアウト胚では減少は観察されなかった。

このことから分子時計の振動においてHes7とL-fngの発現を上昇させるNotchシグナルはD111に依存していることがわかった。我々が従来解析してきたMesp2欠損マウスは、Mesp2遺伝子座にLacZレポーターとpgk-neoがノックインされている。Dll3ノックインマウスではDll3遺伝子と共に挿入されたpgk-neoを、後にCre-loxPシステムにより除去している。P2MCMマウスではpgk-neoをflp-FRTシステムにより除去しているので、単なるMesp2欠損マウスとしてコントロールに用いることができると考えられた。そこで野生型、従来のMesp2欠損マウス、pgk-neoをもつP2MCMマウス、pgk-neoを除去したP2MCMマウス、pgk-neoをもつDll3ノックインマウス、pgk-neoを除去したDll3ノックインマウスの6種のアリルについて、体節形成における表現型を比較した。その結果、pgk-neoを除去したP2MCMマウスとDll3ノックインマウスにおいて、外見上体節の分節が観察された。組織学的観察の結果、この2種類のマウスでは野生型に比べて不完全ながら体節境界が形成されていることがわかった。Mesp1の発現レベルは従来のMesp2欠損マウスでは野生型とあまり変わらないのに対し、他の全てのアリルではMesp1の発現が顕著に上昇しており、2本のストライプをもつ異常なパターンも観察された。以上の結果から次のことが考察された。未分節中胚葉前方にはredundantな機能をもつMesp1とMesp2の2つの転写因子が発現しているが、Mesp2が欠損した場合にはMesp1の発現が上昇するような代償性の制御機構が存在している。従来のMesp2欠損マウスではなんらかの理由でこの代償機構が働かなかったため、Mesp2の機能が明らかになったが、その他のアリルではMesp1の発現が上昇して体節形成の異常をレスキューするため、不完全な回復がみられたと考えられる。
精子クロマチンにおけるヒストン残存領域の規則性解明

科学研究費助成事業研究計画調書において、本研究員は平成30年度に(1)若齢マウス、加齢マウスの精子クロマチン構造比較、(2)環境因子曝露マウス精子の採取、および、NPMを用いた精子クロマチンサンプル調整およびChIP-seqの実施、精子クロマチン構造比較を予定していた。今年度は、上述の研究計画の内、(1)若齢マウス、加齢マウスの精子クロマチン構造比較を中心に進行した。昨年度までの研究結果から、若齢マウスでは精子残存ヒストンがその修飾状況によって特徴的な局在を示すという知見を得ていたので、今年度は昨年度までに確立した精子ヒストン局在解析の手法を用いて、若齢マウスおよび加齢マウスの比較検討を行った。解析の結果、若齢マウスで確認される精子残存ヒストン局在、特に修飾ヒストン局在が、加齢マウスでは大きく変動していることが確認された。また、この精子ヒストン局在に変動が起こった領域は、神経系発達に重要な遺伝子領域であることが判明し、次世代の遺伝子の発現変動と有意に相関を示すことが判明した。この結果はエピジェネティック遺伝を示唆するものであり、他のエピジェネティック因子である、DNAメチル化やsmall non-coding RNAとは発現変動が起こった遺伝子とは有意には相関しなかったことから、精子ヒストンおよび修飾ヒストンを介したエピジェネティック遺伝が引き起こされたことを強く示唆するものである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、Nucleoplasmin(以下、NPM)を用いて、精子クロマチン構造を評価する際の障害となる精子特異的タンパク質であるプロタミンを除去することによって、精子クロマチン構造を再評価することを目的とする。当該年度においては、(1)NPMを用いた若齢マウス精子クロマチン調整およびChIP-seqの実施、(2)NPM処理若齢マウス精子を用いたATAC-seq解析、(3)加齢マウス精子および環境因子曝露マウス精子の採取を計画した。以下にそれぞれの詳細について記載する。(1)NPMを用いた若齢マウス精子クロマチン調整およびChIP-seqの実施においては、ChIP-seq解析まで完了した。解析の結果、精子ヒストンはその多くが、遺伝子間領域に存在するものの、精子H3K4me3は発生に関与する遺伝子の転写開始領域に局在することが判明した。この結果は精子ヒストンが転写開始領域に局在するという報告と、精子ヒストンが遺伝子間領域に局在するという報告の、精子ヒストン局在性に関する相容れない結論(Sato et al., Dev Cell, 30, 2014)を矛盾なく説明することができた。また、精子H3K9me3はセントロメア・ペリセントロメアに特徴的なサテライトリピートに局在しており、これは精子における蛍光免疫染色の結果とも合致しており、NPMを用いた精子ヒストン局在性解析が有用であることを示せた。(2)NPM処理若齢マウス精子を用いたATAC-seq解析に関しては、NPM処理によって、精子クロマチンがほぼ全て(99%)フリーDNAとなってしまったため、特徴的な領域を検出できなかったため、条件を検討中である。(3)加齢マウス精子および環境因子暴露マウス精子の採取に関しては、加齢マウス精子の採取・精子クロマチン調整・ChIP-seqの実施まで進行した。当該年度においては、(1)NPMを用いた若齢マウス精子クロマチン調整およびChIP-seqの実施、(2)NPM処理若齢マウス精子を用いたATAC-seq解析、(3)加齢マウス精子および環境因子曝露マウス精子の採取を計画したが、(1)NPMを用いた若齢マウス精子クロマチン調整およびChIP-seqの実施、および、(3)加齢マウス精子および環境因子曝露マウス精子の採取が特に進捗した。当該年度の計画では、(1)NPMを用いた若齢マウス精子クロマチン調整およびChIP-seqの実施において、ChIP-seq解析の実施までを予定していたが、研究が順調に進んだため、蛍光免疫染色等を用いたChIP-seq解析の妥当性を評価することができた。これは当初の研究計画において、平成30年度に実施予定だった研究である。また、上述の研究内容によって得られた知見は現在、国際誌に投稿中である。また、(3)加齢マウス精子および環境因子曝露マウス精子の採取においては、加齢マウス精子の採取・精子クロマチン調整・ChIP-seqの実施まで進行した。これも当初の研究計画において、平成30年度に実施予定だった研究である。しかしながら、(2)NPM処理若齢マウス精子を用いたATAC-seq解析に関してはNPM処理によって、精子クロマチンがほぼ全て(99%)フリーDNAとなってしまい、特徴的な領域を検出できなかったため、条件を検討中である。総括すると、精子クロマチン構造評価のために、当初はChIP-seq、ATAC-seqを実施予定であったが、ChIP-seqのみ実施可能であった。しかしながら、ChIP-seqに関しては当初の計画よりも研究が早く進み、新しい知見も得られたため、概ね順調に進捗していると考えられる。科学研究費助成事業研究計画調書において、本研究員は平成30年度に(1)若齢マウス、加齢マウスの精子クロマチン構造比較、(2)環境因子曝露マウス