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前立腺特異抗原(PSA)の糖鎖構造に関する研究

前立腺特異抗原(PSA)は糖蛋白であり、N結合型糖鎖が一ケ所存在する。PSAの糖鎖構造の癌性変異を検出するために、まずseminal fluid由来のPSA糖鎖の詳細な構造解析を行い、前立腺癌に特異的なPSAの糖鎖構造の変異を検出するレクチンの同定を行った。さらに詳細に前立腺癌特異的な糖鎖構造について検討したところ、PSAの糖鎖構造は従来同定された構造のみならず、非常に多様性に富んでいることが明らかになった。従来の報告では、PSAの糖鎖は2本鎖で末端にはシアル酸がα2-6でガラクトースに結合したN-glycanのみが発現しているとされていたが、我々の検討では、計19種類の構造が同定された。しかも、末端のシアル酸はα2-6のみでなくα2-3でガラクトースに結合しているものも約10%存在することが明らかになった。さらに、Sialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcが癌に多く発現していることが明らかになった。そこでSialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcを免疫原として同構造を認識するモノクローナル抗体の作成を開始した。しかし、糖鎖を認識するモノクローナル抗体は得られたが、Sialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcとSialic acid alpha 2,6 Gal-GlcNAcの構造を特異的に認識できるクローンはまだ得られていない。また、前立腺癌診断の精度を向上させるため、サンプルとして前立腺由来のタンパクが大量に採取できる前立腺圧出液を用いたプロテオミクス的アプローチを採用した。その結果、数種類のタンパク質を組み合わせることによって、90%以上の特異度で前立腺癌を診断できる方法を見出した。その成果を特許出願した。今年度はPSAの糖鎖構造の癌性変異を検出するために、まずseminal fluid由来のPSA糖鎖の詳細な構造解析を行い、さらに、前立腺癌に特異的なPSAの糖鎖構造の変異を検出するレクチンの同定を行った。seminal fluid由来PSAから糖鎖を切り出し、ピリジルアミノ化した後、high performance liquid chromatography(HPLC)で分析した。次にLens culinaris(Lch)、Aleuria aurantia(AAL)、Sambucusnigra(SNA)、Maackia amurensis(MAA)レクチンを用い、レクチンカラムクロマトグラフィーで各々の吸着率を求めた。非癌性PSAとしてはseminal fluidおよび前立腺肥大症組織を用い、癌性PSAとしてはLNCaP培養上清を用いた。レクチン親和性はさらにPlasmon resonance(SPR)分析で評価した。その結果、seminal fluid由来PSAのN-glycanの基本構造は2本鎖のオリゴ糖が主体であったが、癌性PSAはMAAとの親和性が高く、末端のシアル酸がα2,3でガラクトースに結合していることが示唆された。このことはSPR分析でも証明された。本年度の結論として、癌性PSAと非癌性PSAとではMAAレクチンとの親和性が大きく異なることが明らかになった。この親和性の違いを利用して、癌特異的PSAを検出する新規アッセイ法の開発が期待される。

さらに詳細に前立腺癌特異的な糖鎖構造について検討したところ、PSAの糖鎖構造は従来同定された構造のみならず、非常に多様性に富んでいることが明らかになった。Stameyらのグループは2本鎖で末端にはシアル酸がα2-6でガラクトースに結合したN-glycanのみが発現していると報告したが、我々の検討では、計19種類の構造が同定された。しかも、末端のシアル酸はα2-6のみでなくα2-3でガラクトースに結合しているものも約10%存在することが明らかになった。さらに、Sialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcが癌に多く発現していることが明らかになった。そこでSialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcを免疫原として同構造を認識するモノクローナル抗体の作成を開始した。また、前立腺癌診断の精度を向上させるため、サンプルとして前立腺由来のタンパクが大量に採取できる前立腺圧出液を用いたプロテオミクス的アプローチを採用した。経直腸超音波診断、針生検による診断法との比較検討を行っているところである。前立腺特異抗原(PSA)は糖蛋白であり、N結合型糖鎖が一ケ所存在する。PSAの糖鎖構造の癌性変異を検出するために、まずseminal fluid由来のPSA糖鎖の詳細な構造解析を行い、前立腺癌に特異的なPSAの糖鎖構造の変異を検出するレクチンの同定を行った。従来の報告では、PSAの糖鎖は2本鎖で末端にはシアル酸がα2-6でガラクトースに結合したN-glycanのみが発現しているとされていたが、我々の検討では、計19種類の構造が同定された。そこでSialic acid alpha2,3 Gal-GlcNAcを免疫原として同構造を認識するモノクローナル抗体の作成を開始した。しかし、糖鎖を認識するモノクローナル抗体は得られたが、Sialic acid alpha 2,3 Gal-GlcNAcとSialic acid alpha 2,6 Gal-GlcNAcの構造を特異的に認識できるクローンはまだ得られていない。その結果、数種類のタンパク質を組み合わせることによって、90%以上の特異度で前立腺癌を診断できる方法を見出した。その成果を特許出願した。
Tyk2ノックアウトマウスを用いたIL-12のシグナル伝達の解析

サイトカインのシグナル伝達におけるJakファミリーキナーゼの重要性は十分理解されているが、その中でTyk2キナーゼは、当初IFNαのシグナル伝達に必須のキナーゼとして同定された。In vivoでのTyk2の役割を明確にするために我々はTyk2欠損マウスを作成し、Tyk2はIFNαの大部分のシグナル伝達に必須ではないことを明らかにした。さらにIFNα以外にその刺激によりTyk2を活性化する抗癌サイトカインとして知られるIL-12のシグナル伝達にTyk2が重要であることも示したが、今回さらにIL-12とならび生体内の抗癌作用に重要なlFNY誘導サイトカインであるIL-18についてTyk2欠損マウスを用いて検討した。IL-18は、Jak-STAT経路ではなく、NF-κBを介する経路でそのシグナルを伝達するが、Tyk2欠損マウス由来脾細胞では、野生型マウスと比べIL-12刺激時に約1/6、IL-18刺激時に約1/3とNK細胞活性が減少していた。また、IL-12,IL-18刺激によるT細胞の増殖にはTyk2の欠損は影響を与えなかったが、IL-12,IL-18刺激によるIFNγの産生は著明に低下していた。野生型マウスでIL-12刺激時にみられるT, NK細胞におけるIL-18レセプターの発現亢進が、Tyk2欠損マウス由来T, NK細胞では見られておらず、このことがJak-STAT経路ではなく、MAPキナーゼ、NF-κBを介する経路をシグナル伝達に用いるIL-18の作用がTyk2の欠損により傷害される機序の一つとして考えられる。現在、これらサイトカインによる抗癌メカニズム解明に向けてTyk2ノックアウトマウス及び野生型マウス由来脾細胞をIL-12及びIL-18刺激により新たに誘導される遺伝子発現をMicroarray法により解析中であり、同定された新たな遺伝子の解析も進める予定である。
ナノ粒子化したチタン酸化物を用いた新規放射線増感療法

過酸化チタンナノ粒子は細胞実験系、動物実験系の双方の実験系において、X線照射により過酸化水素を中心とするROSを過剰に生成し、DNA損傷を介した有意な抗腫瘍効果を発揮することを見出した。今後は、本併用療法の長期の毒性の有無の評価や、更なる治療効果や分子メカニズムの検討が必要であるが、本研究の成果により独自に開発した金属ナノ粒子が新しい放射線増感剤になり得る可能性が示唆された。本研究の目的は、我々が発見したナノ粒子化したチタン酸化物が、X線照射によって大量のヒドロキシラジカルを発生することをこの成果の臨床応用でのこれまでにない放射線増感療法を開発し、膵臓癌などの難治癌に対する新たな治療戦略を提案する。計画では1Cell-free systemでのヒドロキシラジカル等のReactive Oxygen Species(ROS)生成メカニズムの解明。2細胞実験(有機物質環境下)での抗腫瘍効果とROS動態に関する酸化還元システムの解明。3ヒト癌細胞をヌードマウスに移植したin vivo環境での放射線増感とチタン酸化物ナノ粒子の毒性評価、4がん細胞を特異的に認識するIn vivo tumor targetingを実現する生体分子修飾ナノ粒子の開発することである。本年度の研究実績に関してが1では放射線線量依存性にROSの増加が得られることを見出し、そのROSは過酸化水素のバイオマーカーで識別されることを見出した。2に関しては現在その実験プロトコールの改善を図っているが、ナノ粒子の細胞内への取り組みに関しては研究分担者の荻野らが成功し、その増感効果に関して検討中である。3に関しては既に我々が確立したヌードマウスへ移植したヒト膵臓癌細胞を用いた実験系でナノ粒子化したチタン酸化物の放射線増感効果を既に確認できているが、毒性の有無に関してさらに検討を進めている。これまでの研究成果ではCell-freesystemでもin vivoでもナノ粒子化したチタン酸化物の放射線増感効果が著明に認められることを確認しており、今後は更なる腫瘍選択性や安全性の評価を引き続き行っていく予定である。本研究の目的は、我々が発見したナノ粒子化したチタン酸化物が、X線照射によって大量のヒドロキシラジカルを発生することをこの成果の臨床応用でのこれまでにない放射線増感療法を開発し、膵臓癌などの難治癌に対する新たな治療戦略を提案することである。前年度には1では放射線線量依存性にROSの増加が得られることを見出し、そのROSは過酸化水素のバイオマーカーで識別されることを見出した。2に関しては現在その実験プロトコールの改善を図っているが、ナノ粒子の細胞内への取り組みに関しては研究分担者の荻野らが成功し、その増感効果に関して検討してきた。本年度は、3に関して既に我々が確立したヌードマウスへ移植したヒト膵臓癌細胞を用いた実験系でナノ粒子化したチタン酸化物の放射線増感効果を既に確認できているが、毒性の有無に関して検討を行った。腫瘍内への局注では我々が開発したチタン酸化物の毒性は少なく、腫瘍の縮小を誘導できた。本研究では、過酸化チタンナノ粒子による放射線増感効果の有効性を明らかにし、これまでにない放射線増感療法を開発し、膵臓癌などの難治癌に対する新たな治療戦略を提案することである。具体的には、Cell-freesystem(無機物質:ナノ粒子のみの環境)でのヒドロキシラジカル等のReactive Oxygen Species(ROS)生成メカニズムが過酸化チタンナノ粒子の表面構造に大きく依存することが判明した。細胞実験(有機物質環境下)ではγH2AXで確認できるDNA fociの発生細胞数が、過酸化チタンナノ粒子を作用させた後で放射線照射をした群で有意に上昇していた。また、in vivo環境でも放射線増感が確認された。チタン酸化物ナノ粒子の毒性評価は採血や実験動物の体重の変化から判定したが、顕著な毒性は確認できなかった。過酸化チタンナノ粒子の尾静脈からの投与では腫瘍と肝臓により効率に集積する実験結果を得ており、今後の研究に重要な知見と考えられた。現時点では皮下移植腫瘍に対してはチタン酸化物の局注に関しては毒性は認められていないが、その他の投与方法における毒性や有効性を確認していく予定である。放射線腫瘍学チタン酸化物の表面修飾や適正濃度などの検討を繰り返し、動物実験にて実施していく予定である。動物実験の飼育場所の確保が一部困難であったため、前年度できなかった動物実験を本年度に移行して実施していく予定である。実験計画の4にあたるナノ粒子化したチタン酸化物の投与方法と毒性に関して更なる検討を進めていく予定である。繰越額の一部を実験動物の購入と飼育施設経費として、また放射線治療後の組織学検討のために使用する予定である。In vivoでの解析に関して一定の成果が得られたため、粒子の更なる改良を検討したうえでIn vivo実験をすることとなり、次年度の計画に組み入れた。
アンチセンスによる腎移植慢性拒絶反応に対する進行阻止の試み

移植腎の長期予後を左右する慢性拒絶反応の成因には、脳死や虚血再灌流障害といったantigen independent factorが慢性拒絶反応に強く関与すると考えられている。本研究の前半は脳死モデルをドナーとする同所性ラット腎移植モデルを作成し、移植前と移植後1時間後におけるグラフト内の遺伝子変化をAgilent社のmicroarrayを用いて解析しその成果を論文にまとめた。ついで動物実験を基盤とし、臨床検体を用いた解析を進めた。臨床検体は献腎移植8例(DCD群)、生体腎移植15例の移植後1時間生検に対し、Agilent【○!R】Human IAoligo microarray kitを用いて20,173遺伝子について解析を進めた。DCD群とLD群の比較では、DCD群で優位であり(DCD/LD>1.5)かつ2倍以上に発現が亢進している遺伝子は178であった。この中でosteopontin, chemokineやHSPsは著しい変化を示していた。この内容については、成果の一部を短報にまとめた。動物実験の結果をもとに、臨床検体と共通して発現の亢進した遺伝子を選択し、この中から今後診断と治療に応用可能な遺伝子、特に分泌蛋白について検討を加えるべく検索をすすめたところ、有力な候補のひとつとしてNGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin)が注目された。臨床検体での検討では1時間生検においてreal time PCRでの検討ではDCD群で優位にLD群と比較して発現亢進がみられた。NGALの移植後の血清を用いたELISA解析では、移植前の血清NGAL値は963±33ng/mlであり、生体腎移植例では移植後直ちに減少した。一方腎移植例では術後のNGAL変化は二峰性を示し除々に減少した。後半のピークを過ぎて数日で利尿が始まり移植腎機能は回復しはじめ、献腎移植における血清NGAL値の変化は無尿期における移植腎機能の回復を示すバイオマーカーの一つと考えられた。本研究の成果の一部は現在NGALに関してCell Transplantationに投稿しacceptされた。移植後早期の慢性拒絶反応増悪因子に関する検討移植早期においては、脳死やいわゆる虚血再灌流障害といったantigen independent factorが慢性拒絶反応に強く関与すると考えられている。脳死モデルをドナーとする同所性ラット腎移植モデルを作成し、移植前と移植後1時間後におけるグラフト内の遺伝子変化をAgilent社のmicroarrayを用いて解析した。その結果、ケモカインではMCP-1(Scya2),サイトカインではIL-1,IL-6ならびに接着因子ではE,P-selectin,ICAM-1といった遺伝子が脳死ドナーからのグラフトで増加しており従来の我々の研究結果等をrepeatしていた。さらにこのような移植早期にあっても、HO-1やBirc2といった従来臓器障害を抑制すると考えられる遺伝子の発現が増加しており、興味深い結果となった。また、現時点で役割の十分わかっていない遺伝子の中で、特異的な動きをするものもあり、今後更なる研究対象となると考えられる。今回のmicroarrayに関してはこの結果をもとに2004年秋に開催される国際移植学会への投稿に向けて準備を進めている。また、ラット同所性腎移植の手技に関しては、導入を予定していたKEYENCE社デジタルマイクロスコープを用いてモニターガイド下に手術を行うこととし、その手技を確立した。

これにより術者の負担と、モニターガイドによって今後の手術手技の改良ならびに伝達に優れており、この成果を2004年4月に開催される日本泌尿器科学会総会でビデオ発表の予定である。移植腎の長期予後を左右する慢性拒絶反応の成因を解明するため、antigen independent risk factorとして知られる脳死や虚血再灌流障害に伴う遺伝子変化に着目し、ラットを用いた腎移植モデルにおけるグラフト内の遺伝子変化をAgilent社ラットマイクロアレイキットを用いて約20,500の遺伝子について検討した。脳死によっては210遺伝子が、虚血再灌流障害によっては173遺伝子が発現亢進がみられた(2倍以上)。逆に脳死によっては138遺伝子が、虚血再灌流障害によつては74遺伝子の発現抑制がみられた(1/2倍以下)発現亢進がみられた遺伝子には、以前我々が検討したサイトカイン、ケモカインや接着因子が含まれており、同様の結果を確認した。さらに脳死と虚血再灌流障害に特異的に発現が亢進される遺伝子について検討したところ、脳死においては171遺伝子が特異的に発現亢進が認められ、虚血再灌流障害では118遺伝子が特異的に発現亢進が認められた。この各遺伝子群におけるpathwayを解析するため、Ingenuity Pathway Analysisを用いて検討した。その結果、脳死特異的なpathwayが5つ、虚血再灌流障害に特異的なpathwayが3つ見出された。また、各々のpathwayの中心を占める遺伝子を検討したところ、transcription factorとしては、脳死ではp53,Relaが虚血再灌流障害ではc-fos, JUNが中心を占める遺伝子と考えられた。経時的発現変化についてはp53,Rela,c-fos,JUN各々の遺伝子発現変化をreal time RT-PCRで確認したところ、microarrayと同様の結果を得た。尚本研究の成果は2004年度のウィーンで開催された国際移植学会ならびに日本移植学会で発表し、その成果の一部はTransplantation Proceedingsに掲載された。移植腎の長期予後を左右する慢性拒絶反応の成因を解明するため、本年度は前年度の動物実験を基盤とし、臨床検体を用いた解析を進めた。臨床検体は献腎移植8例(CD群)、生体腎移植15例の移植後1時間生検に対し、マイクロアレイを用いて20,173遺伝子につき解析した。生体腎移植15例に関しては腎摘出方法が従来の方法を工夫した小切開法9例(LD群)と腹腔鏡による6例(LD-Lap群)があり、気腹操作に伴う移植後の腎障害の報告もあり、各群に分けて検討した。CD群とLD群の比較では、CD群で優位であり(CD/LD>1.5)かつ2倍以上に発現が亢進している遺伝子は178であった。具体的にはオステオポンチン、ケモカインならびにケモカインレセプター、接着因子そしてヒートショック蛋白などであった。
血管内皮細胞における機械刺激受容の細胞内メカニズムの分子薬理学的研究

ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて、機械刺激が細胞内に伝達されて細胞内のカルシウム濃度上昇に至るメカニズムを検討した。細胞を無カルシウム溶液中で低張液にさらした場合、細胞内カルシウム濃度は徐々に上昇した。このカルシウム濃度上昇は一過性で、細胞内貯蔵部位よりの放出によるものと思われた。このカルシウム放出はIP_3、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼを阻害しても抑制されず、フォスフォリパーゼA_2阻害剤によってのみ抑制されたため、アラキドン酸がその伝達物質と思われた。このカルシウム放出は、静水圧による剪断力やパッチピペットによる膜の直径伸展でも見られ、この細胞では機械刺激全般に共通の現象と思われる。また、このカルシウム放出はファロイジンによって阻害され、アクチンの代謝回転が機械刺激の受容メカニズムに関与していると考えられた。さらに、通常のカルシウム濃度を含む溶液を細胞外液として用いた場合、低張液刺激によって細胞内カルシウム濃度は持続的な上昇を示した。これは低張液の灌流によってカルシウムが放出された後に、カルシウム放出後のカルシウム流入メカニズムが活性化されたこといによるものと思われる。また、カルシウム濃度とともにパッチクランプ法によって膜電流を同時に測定したところ、低張液によって-40mVの保持電位で内向きの電流が測定された。これは細胞内カルシウム濃度上昇とは無関係で、また、イオン透過性の検討より容量依存性クロライト電流であることが判明した。この電流は深い膜電位を維持することに寄与し、カルシウム放出後のカルシウム流入経路に十分な駆動力を与えるものと思われる。以上のような一連の細胞内の機械刺激受容体メカニズムによって、細胞内カルシウム濃度が上昇し、血管内皮細胞の機能発現に関与しているものと考えられた。
モデル生物を用いたカルシニューリン経路の分子機構に関する機能ゲノム学的解析

カルシニューリンは酵母から哺乳動物に至るまで高度に保存された蛋白質脱燐酸化酵素である。野生型分裂酵母では免疫抑制薬によりカルシニューリンの機能を抑制しても成育に影響がない。この現象に基づいて、我々は分裂酵母をモデル生物として用いて、免疫抑制薬の存在下で致死となる変異体(its変異体)の網羅的スクリーニングを展開し、多数の変異体を単離している。本研究では、これらのカルシニューリンと機能的に関連する遺伝子群の産物とカルシニューリンとの相互作用の解析を通して、カルシニューリンが関与する蛋白質脱燐酸化及び燐酸化ネットワークを明らかにする事を目的としている。本年度はits3及びits8変異体の原因遺伝子を同定し、解析を行った。its3遺伝子は必須遺伝子であり、ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)をリン酸化し、PI(4,5)P2を産生するPI4P5キナーゼをコードしていた。PI4P5キナーゼは細胞膜上にPI(4,5)P2と共局在し、細胞周期とともにその局在が変化した。its3変異体は制限温度下あるいは免疫抑制薬存在下でアクチンの局在異常及び細胞質分裂異常を呈した。its8遺伝子はGPIアンカー合成酵素の一つであるヒトPig-nと高い相同性を有する蛋白質をコードしていた。its8破壊体は非常に成育が遅く、多核多隔壁の細胞形態を示した。Its8融合蛋白質は小胞体に局在していた。its3及びits8変異体はともに、制限温度下あるいは免疫抑制薬存在下で、多くの細胞が分裂中隔を持った状態で増殖停止していたことから、細胞質分裂や細胞形態の制御に関与する事が示唆された。これらの遺伝子は哺乳動物細胞にもホモログが存在しており、酵母細胞と同様、細胞形態の維持に関与していると考えられる。
ヒトT細胞白血病ウイルスによる癌化機構の分子生物学的解析

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)はtax癌遺伝子(以下遺伝子はtax、蛋白質はTax)を有し、これによりTリンパ球を不死化させ成人T細胞白血病発症の中心的役割を果たしている。HTLV-I不死化T細胞株は野生型p53癌抑制遺伝子を発現しており、p53蛋白質(p53)発現量はTax高度発現細胞で増加していること、このp53発現増加はp53の安定化によること、またTax-p53複合体形成は免疫沈降法によっては検出されないことを我々はこれまでに明らかにした。動物およびヒト細胞の不死化およびトランスホーメーションにはp53の不活化は不可欠であると考えられるが、我々の結果はHTLV-I不死化細胞においてTaxがp53発現量を増加させ、しかもその増殖抑制能を阻害している可能性を示唆している。本研究においてp53発現量とp53の生化学的活性である転写活性化能におよぼすtaxの影響をp53の欠如したSaos-2細胞を用いて検討した。taxおよびp53両方を発現させた場合、p53単独発現導入時に比較して約20-30倍のp53発現量の増加が認められた。taxはCREB及びNFκB活性を有するが、in vitro mutagenesisにより作成した変異型taxを用いた実験により、p53発現量増加はCREB活性ではなくNFκB活性によるものと考えられた。p53結合配列を有するプロモーターに対するp53の転写活性化能はtax存在下でも保持されていたが、p53レベルが20-30倍増加してるのにも関わらずその転写活性化能の増加は認められなかった。以上よりHTLV-Iはその癌化機構においてtaxを介してp53癌抑制遺伝子の発現と転写活性化能を修飾していることが示唆された。
プロテアーゼ巨大分子複合体とウイルス様膜小胞による細菌の新規細胞機能の確立と応用

トリ羽毛の分解を行う好熱性細菌Meiothermus ruber H328株が産生するケラチン分解性プロテアーゼと細部表層から放出される膜小胞について研究を行った。まずトリ羽毛分解を担うプロテアーゼを、ゲノム解析と質量分析から同定した。プロテアーゼの変性剤耐性と熱安定性が膜小胞により向上することを確認した。膜小胞の簡便な検出のため、蛍光色素DiIによる方法を開発した。degP遺伝子破壊株において、膜小胞産生能が高まることを突き止めた。膜小胞の表面提示のため、S-layerタンパク質に絞ったが、この遺伝子破壊株を得ることができず他の検索から複数の足場となる3候補遺伝子を選択した。シグナルを得ることは出来なかった。しかし、この2つの遺伝子のオペロン解析からは、確実にオペロンを構成して発現することが判った。さらに、耐熱型カナマイシン耐性遺伝子をマーカーに用いた相同組換えによるH328株変異株作成法を確立し、これら2タンパク質の破壊を実施した。得られた2遺伝子破壊株を調査したところ、セリンプロテアーゼ活性は野生型株の30%程度にまで下落したものの、トリ羽毛分解能については野生株よりわずかに低いものであることが判った。即ち、セリンプロテアーゼ活性がトリ羽毛分解の律速ではないことが明らかになった。今後さらに膜小胞との関連を計画に従って追究していく予定である。シグナルを得ることが出来ないことが判った。H328株の遺伝子破壊株作成法を確立し、上記2タンパク質の破壊株を得た。この遺伝子破壊株のセリンプロテアーゼ活性は、野生型株のそれの30%程度にまで下落したものの、トリ羽毛分解能については野生株よりわずかに低いものに留まることが判った。このことから、トリ羽毛分解を向上させる因子がセリンプロテアーゼではなく別の因子であることが判り、別の遺伝子破壊を検討している。トリ羽毛分解を行う好熱性細菌Meiothermus ruberH328株が細胞表層から放出するウイルスに類似した「膜小胞」(membrane vesicle)について研究を引き続き実施した。大腸菌でdegP遺伝子の破壊が膜小胞の産生増加をもたらす情報を基に、本菌株に対し同遺伝子の破壊株を相同組換えにより構築した。なおdegP遺伝子の同定は、全ゲノム解析の情報を用いて挙がってきた3つの候補遺伝子から、大腸菌のdegP遺伝子との相同性、シグナル配列、局在性予測などをもとに1つ(mrh_0331)に絞り込んだ。このdegP破壊株は、H328株野生株が65°Cまでの温度で生育に異常がないのに対し、55°Cまで正常な挙動を示す一方、60°C以上では生育が抑えられることが判った。生育におけるこの温度感受性の挙動は、大腸菌の場合と類似しており、生育に伴う膜小胞の産生変化を、昨年度実施した蛍光色素DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)を用いた膜小胞の定量法を用いて実施した。膜小胞画分の簡便な調製法を培養液に対し、超遠心分離を含む操作により確立した。その結果、55°C時には見られなかった蛍光強度の増加が、60°C培養時だけ見られた。さらに、蛍光が増加した55°C及び60°C培養時のサンプルを、透過型電子顕微鏡解析(TEM)に供し、60°Cのみ膜小胞の同程度の増大が観察された。このことは、degP遺伝子欠損が、熱誘導により膜小胞の産生を促進したことが示唆され、世界で初めて膜小胞の増加を、TEMで証明することができた。今後、膜小胞表面提示を目指して、S-layerタンパク質にターゲットを絞って研究を推進する計画である。トリ羽毛分解を行う好熱性細菌Meiothermus ruberH328株が細胞表層から放出する膜小胞について引き続き研究を行った。大腸菌において、シャペロン機能を持つdegP遺伝子の破壊が膜小胞の産生増加をもたらす情報を基に、本菌株でも同遺伝子の破壊株を相同組換えにより構築した。膜小胞画分の簡便な調製法を、2, 4, 6日間の培養液に対し、超遠心分離(110,000 ×g, 2 h)を含む操作により実施した。その結果、60°Cで培養時4, 6日において、3-4倍の蛍光強度の増加が見られた。なお55°C培養時にはこの蛍光増加は見られなかった。さらに、蛍光が増加した55°C及び60°C培養時のサンプルを、透過型電子顕微鏡解析(TEM)に供し、negative染色で観察したところ、膜小胞の同程度の増大が60°Cで観察された。

このことは、degP遺伝子欠損が、熱誘導により膜小胞の産生を促進したことが示唆された。詳細なメカニズムについては不明であるが、世界で初めて膜小胞の増加を、TEMで証明することができた成果である。好熱性細菌Meiothermus ruber H328株によるトリ羽毛分解能の増強は、これまでターゲットしてきたプロテアーゼにかかる2つのタンパク質遺伝子だけでなく、羽毛ケラチンに多数含まれるジスルフィド結合に対して作用する酵素protein disulfide oxidaseの関与を示すことができた。特に、H328株中のPdo7遺伝子は、この遺伝子破壊株の羽毛ケラチン分解能が著しく低下することから、羽毛分解に大きく関わることを示した。具体的には、機能未知遺伝子mrh-1220の5'上流域にあるう転写のプロモーターを、-35領域、-10領域のコンセンサス配列情報との相同性から強力プロモーターとして選別し、これをPdo7遺伝子上流に、強力なプロモーターを挿入することで、Pdo7遺伝子の発現を強化した。その結果、培養初期におけるPdo7還元活性の上昇が生じ、プロテアーゼ非依存的なトリ羽毛分解の促進が明らかになった。別途、degP遺伝子破壊株を用いた膜小胞産生能の増強は、蛍光色素DiIを用いた分析法により、繰り返し確認することができた。しかし、羽毛の存在しない培地での現象に留まっており、羽毛含有培地での膜小胞産生強化の確認を取る必要がある。加えて、膜小胞の質的コントロールとして、膜小胞表面提示のために、細胞表層に最も多く存在しているタンパク質S-layerタンパク質を融合させることで可能性を探るとしていたが、S-layerタンパク質の欠損が、H328株にとって致死となるため、融合タンパク質としての発現ターゲットになれないことが判明した。このことから、別途TMHMMソフトウエアにより探索したところ、新たに3つの候補遺伝子が明らかになった。現在、異なるソフトウエアによる解析も含め、さらに検索を進め、上記3つの遺伝子を中心に、膜小胞表面提示タンパク質の候補を追究している。トリ羽毛の分解を行う好熱性細菌Meiothermus ruber H328株が産生するケラチン分解性プロテアーゼと細部表層から放出される膜小胞について研究を行った。まずトリ羽毛分解を担うプロテアーゼを、ゲノム解析と質量分析から同定した。プロテアーゼの変性剤耐性と熱安定性が膜小胞により向上することを確認した。膜小胞の簡便な検出のため、蛍光色素DiIによる方法を開発した。degP遺伝子破壊株において、膜小胞産生能が高まることを突き止めた。膜小胞の表面提示のため、S-layerタンパク質に絞ったが、この遺伝子破壊株を得ることができず他の検索から複数の足場となる3候補遺伝子を選択した。好熱性細菌Meiothermus ruber H328株について、これまでターゲットしてきた2タンパク質遺伝子だけではなく、羽毛ケラチンに多数含まれるジスルフィド結合に対して作用するプロテインジスルフィド還元酵素の遺伝子破壊を検討している。加えて、膜小胞がストレスにより誘導されることが他の細菌の通説になっていることから、ストレス応答性遺伝子であるdegP遺伝子に焦点を絞り、これをゲノム情報から特定し、この遺伝子破壊株を作成する試みを行っている。今後膜小胞とこれらの遺伝子との関連を検討し、本計画を推進したいと考えている。
人工筋肉をノズル部に用いた噴流拡散のフィードバック制御

本研究の根幹をなす人工筋肉は研究分担者である九州工業大学情報工学部機械情報工学科の田中和博教授,および渕脇正樹助手の熱・流体工学実験室でのみ,製作可能である.したがって,この研究室で実験を行い,得られた実験結果の解析は,鹿児島高専流体工学実験室で行った.人口筋肉で製作された仲縮自在なノズル部から流出する噴流の可視化実験を行った.縦×横×高さが50×250×200mmのアクリル樹脂製の水槽内に設置された小型ポンプからの水は,2片の人工筋肉で製作されたノズル部から水噴流となって水槽内に流出する.このときの流出速度は,駆動用モーターの回転数を制御することにより,種々変化させた.なお,人工筋肉製のノズルは最大伸長幅10mmであり,左右に約400秒かけて伸縮するため,人工筋肉製ノズルの最大幅とノズル部における最大速度を用いたレイノルズ数は約1,000から約3,000程度とした.なお,人工筋肉が流速に大きく影響を受けるので,レイノルズ数は,これ以上,大きくすることができないことも,明らかになった.このような流れ場をPIV解析することによって,人工筋肉によって変形するノズルから流出する噴流の速度計測を行なった.そして,得られた速度信号を用いて,平均速度分布,乱れ強さ分布,レイノルズ応力分布,および渦度分布などの乱流特性量分布を求め,人口筋肉製ノズルから流出する噴流の乱流組織構造を詳しく調べた.また,人口筋肉の伸長周期400秒の8分の1周期ごとの時系列速度信号を用いた速度時系列解析も行なった.本研究の根幹をなす人工筋肉は研究分担者である九州工業大学情報工学部機械情報工学科の田中和博教授,および渕脇正樹助手の熱・流体工学実験室でのみ,製作可能である.したがって,この研究室で実験を行い,得られた実験結果の解析は,鹿児島高専流体工学実験室で行った.人口筋肉で製作された仲縮自在なノズル部から流出する噴流の可視化実験を行った.縦×横×高さが50×250×200mmのアクリル樹脂製の水槽内に設置された小型ポンプからの水は,2片の人工筋肉で製作されたノズル部から水噴流となって水槽内に流出する.このときの流出速度は,駆動用モーターの回転数を制御することにより,種々変化させた.なお,人工筋肉製のノズルは最大伸長幅10mmであり,左右に約400秒かけて伸縮するため,人工筋肉製ノズルの最大幅とノズル部における最大速度を用いたレイノルズ数は約1,000から約3,000程度とした.なお,人工筋肉が流速に大きく影響を受けるので,レイノルズ数は,これ以上,大きくすることができないことも,明らかになった.このような流れ場をPIV解析することによって,人工筋肉によって変形するノズルから流出する噴流の速度計測を行なった.そして,得られた速度信号を用いて,平均速度分布,乱れ強さ分布,レイノルズ応力分布,および渦度分布などの乱流特性量分布を求め,人口筋肉製ノズルから流出する噴流の乱流組織構造を詳しく調べた.また,人口筋肉の伸長周期400秒の8分の1周期ごとの時系列速度信号を用いた速度時系列解析も行なった.本年度は,4片が人工的に駆動するノズル部を製作した.そして,各片を操作することにより矩形ノズルや星形ノズルに種々,変化させて,5台の熱線流速計システムによる多点同時計測実験を行った.ここで用いた実験装置および方法は,平成13年度からの科学研究費の補助を受けて,研究代表者の中島,分担者の田畑,椎が研究遂行した「傾斜切断面をもつ回転円管から流出する噴流のウェーブレット多重解像度解析」の研究で培われた実験装置と技術的ノウハウを活用した.すなわち,鹿児島高専の流体工学実験室において,遠心送風機から送られた空気は,内径400mmの鎮静胴で脈動成分を抑制された後,内径40mmの塩化ビニール管の先端に取り付けられたノズル部を通って流出する.このときの流出速度は,送風機駆動用モーターの回転数をインバーターで周波数制御することにより,種々変化させた.なお,ノズル出口における最大速度とノズル内径を用いたレイノルズ数は約5,000から約10,000程度とした.このときのノズル部下流位置における噴流の速度分布を熱線流速計システムで調査した.そして,得られた速度信号を自己相関およびスペクトル解析することにより,乱流組織構造を詳しく調べた.本年度は,研究分担者である九州工業大学情報工学部機械情報工学科の田中和博教授,および渕脇正樹助手の熱・流体工学実験室において,人口筋肉で製作された伸縮自在なノズル部から流出する噴流の可視化実験を行った.ここで用いた実験装置および方法は,平成13年度からの科学研究費の補助を受けて,研究代表者の中島,分担者の田畑,椎が研究遂行した「傾斜切断面をもつ回転円管から流出する噴流のウェーブレット多重解像度解析」の研究で培われた技術的ノウハウを活用した.すなわち,縦×横×高さが50×250×200mmのアクリル樹脂製の水槽内に設置されたポンプからの水は,人工筋肉で製作されたノズル部から水噴流となって水槽内に流出する.このときの流出速度は,駆動用モーターの回転数を制御することにより,種々変化させた.なお,人工筋肉製のノズルは最大伸長幅10mmで左右に約400秒かけて伸縮するため,最大幅とノズル部最大速度を用いたレイノルズ数は約1,000から約3,000程度とした.

このときの流れ場をPIV解析することによって,噴流の速度計測を行なった.そして,得られた速度信号を用いて,平均速度分布,乱れ強さ分布,レイノルズ応力分布,および滴度分布などの乱流特性量分布を求め,人口筋肉製ノズルから流出する噴流の乱流組織構造を詳しく調べた.また,人口筋肉の伸長周期400秒の8分の1周期ごとの時系列速度信号を用いた速度時系列解析も行なった.本研究の根幹をなす人工筋肉は研究分担者である九州工業大学情報工学部機械情報工学科の田中和博教授,および渕脇正樹准教授の熱・流体工学実験室でのみ,製作可能である.したがって,本年度も前年度に引き続き,この研究室で実験を行い,得られた実験結果の解析は,鹿児島高専流体工学実験室で行った.前年度に引き続き,人口筋肉で製作された伸縮自在なノズル部から流出する噴流の可視化実験を行った.縦×横×高さが50×250×200mmのアクリル樹脂製の水槽内に設置された小型ポンプからの水は,2片の人工筋肉で製作されたノズル部から水噴流となって水槽内に流出する.このときの流出速度は,駆動用モーターの回転数を制御することにより,種々変化させた.なお,人工筋肉製のノズルは最大仲長幅10mmであり,左右に約400秒かけて伸縮するため,人工筋肉製ノズルの最大幅とノズル部における最大速度を用いたレイノルズ数は約1,000から約3,000程度とした.なお,人工筋肉が流速に大きく影響を受けるので,レイノルズ数は,これ以上,大きくすることができないことも,今年度の研究で明らかになった.このような流れ場をPIV解析することによって,人工筋肉によって変形するノズルから流出する噴流の速度計測を行なった.そして,得られた速度信号を用いて,平均速度分布,乱れ強さ分布,レイノルズ応力分布,および渦度分布などの乱流特性量分布を前年度と同じ条件で求め,人口筋肉製ノズルから流出する噴流の乱流組織構造を詳しく調べた.また,人口筋肉の伸長周期400秒の8分の1周期ごとの時系列速度信号を用いた速度時系列解析も行なった.
コンテンツ循環における永続的かつ無矛盾な権利継承の自動化に関する研究

コンテンツ循環環境における永続的かつ無矛盾な自動権利継承処理手法を明らかにすることを通し、コンテンツの二次流通を促進する「権利継承技術」という新しい概念の明確化とその有効性を検証した。具体的には、権利処理における安全性と無矛盾性の確立、コンテンツの権利処理履歴と改版履歴管理手法の確立、コンテンツの利用条件記述手法の確立、コンテンツ構成情報記述手法の確立について検討・検証し、試作した映像編集システム上でその有効性を確認した。コンテンツが、「制作」、「流通」、「消費」の過程で循環的に繰り返し利用されるコンテンツ循環環境において、実処理に求められる永続性と、それに伴った権利の無矛盾性を保証できる権利処理を自動的に実現できる手法を明かにすることを通し、コンテンツの二次流通を促進する「権利継承技術」という新しい概念とその有効性を明らかにすることが本研究の目的である。平成19年度では、権利処理における安全性と無矛盾性の確立と、コンテンツの権利処理履歴と改版履歴管理手法の確立について主として研究を行った。前者の課題においては、「権利許諾処理」、「利用管理処理」、「権利継承処理」機能を備えた映像編集システムを試作し、コンテンツに対する元の権利者の意図が権利許諾として一次コンテンツから二次コンテンツへと継承され、永続的でかつ無矛盾に遵守されることを実験を繰り返すことで検証を行った。試作した映像編集システムは、映像編集に必要となる実用的な機能を-通り備えたものであり、このシステムによる検証を行ったことで、実処理へ適用可能であることが明かになったと考える。後者の課題においては、先に述べた映像編集システムにおいて、権利許諾処理情報、利用許諾情報、利用情報、制作・編集情報、継承許諾処理情報、権利継承情報に関する履歴管理機能を作り込み、同様に、実験を繰り返すことで、迅速かつ無矛盾な記録・更新・参照・削除が行えることを検証した。以上の研究成果は、学会発表によって公表している。今後の課題としては、許諾コード等の新しい実指向の国際標準方式との協調的利用方法などを検討していく必要があると考えられる。なお、平成20年度の研究課題であるコンテンツ構成情報記述手法の確立についても平成19年度では検討を開始し、基本的な考え方について学会発表を行った。コンテンツ循環環境における永続的かつ無矛盾な自動権利継承処理手法を明らかにすることを通し、コンテンツの二次流通を促進する「権利継承技術」という新しい概念の明確化とその有効性を検証することが本研究の目的である。本年度は研究の最終年度として、(1)コンテンツ利用条件記述手法と、(2)コンテンツ構成情報記述手法に焦点を当てて検討を行った。前者に関しては、国際標準規格であるISO/IEC21000-5(Rights Expression Language)を基に語彙の拡張を行い、実用的な権利記述語彙を定めた。語彙制定に当たっては、網羅的で典型的な編集作業シナリオを整理し、更に、広く使われている幾つかの映像編集システムの編集コマンドを分析することにより、様々なの要求条件を満たすよう検討した。後者に関しては、ISO/IEC15938(MPEG-7)を基に、コンテンツ中の特定の領域やオブジェクト、映像や音楽、テキスト等の複雑な表現形式が組み合わされたコンテンツ構成状態を考慮し、付随する権利情報を記述する方式を検討した。この方式は、各種の編集操作や視聴条件記述は、二次利用され編集されたコンテンツであっても、編集の結果が権利記述に影響を及ぼさないよう設計し、その有効性や問題点等について整理を行った。以上の検討の結果を、前年度に作成した映像編集システムに統合して検証システムを構築し、システム全体としての評価を行った。本研究を通し、永続的で無矛盾な権利継承記述を実現する一つの手法は明らかになったと考えるが、一方で、コンテンツの元の構造記述方式や符号化方式が権利記述の粒度や記述の詳細さに影響を与えることも分かった。今後の課題としては、コンテンツの構造情報や符号化情報と、権利記述や権利継承記述の関係をより一層明らかにし、それを利用した合理的な記述形式を検討する必要がある。
前方後円(方)墳古墳から考察する大和中央政権と東国地方政権との構造的関連

西暦3世紀末に突然のごとく出現し、4世紀には全国へ伝播する大型前方後円墳は、その墳丘の形態があまりにも極似していることから、その系列関係が判明するよい物的証拠になりうると考えた。土地の首長クラスの墓という性格もあり、設計・建築指導者は、それなりの社会的地位を有していたであろうし、その技術は特定の者にしか伝授しなかったと思う。そこで、墳丘各部の計測を行い、それらの比をとり、解析を行い、時間・空間を考慮に入れながら、前方後円墳同士の類似関係をみて、それらの系列化を追求してみようと考えた。畿内中央政権の関係者たちの墓と、関東地方豪族の墓との比較をする前に、今年度(平成7年度)は、まず関東の、それも北関東(群馬県、栃木県、茨城県)に的を絞り研究してみた。当初は、上述のわれわれの仮説が正しいかどうかも判明していなかったので、まず、北関東の中では最も前方後円墳の集合する群馬県に絞り解析したところ、驚く結果を得ることになった。クラスター分析、数量化III類、主成分分析を行ったところ、4世紀後半から6世紀半までの古墳が、驚愕する整合性をもって時系列上に並んで3つのグループに分類された。そこで、北関東全域に対象を広げて再度分析してみると、少数例の例外が出てきたが、大きく古いタイプと新しいタイプのふたつに分類された。そして、古いタイプ(4世紀後半5世紀前半)はくびれ部が顕著で比較的細長いタイプであり、新しいタイプ(5世紀後半6世紀後半)は首が太くなり前方部も広がるガッシリ型であることも判明した。地図上に古墳の立地を記しロケ-ショナル分析も試みると、やはり群馬県が当時の政治的拠点であることがうかがわれ、同時に茨城県にも複数の中心地があったように思われる。これに対して、栃木県は、少し後進地であったような感じがし、どちらに組せられるかというと、どうも茨城県の影響下にあったように思われる。
相対論的分子軌道法の負エネルギー解を含む場の量子論的再定式化

本研究課題は,相対論的電子状態理論の基礎方程式であるDirac方程式のもつ負の運動エネルギー解に関して分子軌道法の観点から物理的な,あるいは数値計算における問題点を明らかにし,解決することが主題である.その目的のために,まず,束縛状態のDirac方程式の負エネルギー解とDirac-Hartree-Fock法の負エネルギー非占有軌道が反粒子の空孔であると矛盾なく解釈できることを示した.また,この事実に基づき,従来用いられている相対論的ハミルトニアンであるNVPAハミルトニアンやVPAハミルトニアンがもつ負のエネルギー解に由来する問題点を含まないQEDハミルトニアンを基づく分子軌道法の定式化およびプログラムの開発をおこなった.その結果,QEDハミルトニアンが分子軌道のユニタリ変換に対しユニタリ不変でないこと,場の量子論の共変摂動論で生じる発散の問題がQEDハミルトニアンによる電子相関計算でも生じることが明らかになった.また,この発散がメラー・プレセット摂動法ではくりこみ不可能であることが示された.これらの新たな問題に対し更なる検討を行い,ユニタリ不変性の破れに関しては分子軌道が定常状態において時間発展しないという要請を理論に組み込むことで,発散の問題に関しては有限基底近似を運動量切断とみなすことで,それぞれ回避可能であることが明らかとなった.これにより,QEDハミルトニアンに基づく分子軌道理論が合理的なものであることが示された.以上より,これまで得られた知見から研究課題としてはおおむね達成されたものと考えられる.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究課題を遂行するに当たり,相対論的な電子ハミルトニアンの正負の運動エネルギー解の分離,および電子のみを場の量子化したQEDハミルトニアンの数値的な検証の2点に着目して研究を行った.1点目について,正負の運動エネルギー解を近似的に分離する相対論的2成分法について研究を行った.相対論的2成分法はその近似の違いから多くの方法が存在する.そこで,これらの方法の方程式を比較検討し,数値計算の結果と比較することで,その特性の違いを調べた.まず,各2成分法を単一のプログラムに実装し,ヘリウム様イオンおよび希ガス原子の全エネルギー,スピン軌道分裂等の値を計算した.これにより,各2成分法がどの程度の精度を有するかについて明らかにすることができた.また,一部の手法は変分的でないこと,相対論効果の強い系で破綻することも確認された.これらの結果は相対論的な計算を行う際の手法の選択における指標となりえる.2点目については,相対論的な電子ハミルトニアンをモード展開して得られる陽電子の生成・消滅演算子を含む項を再度,負の運動エネルギー電子の消滅・生成演算子に書き戻して得られるハミルトニアンを用いて,QEDハミルトニアンに基づく2次のメラー・プリセット摂動論(MP2),2電子励起までを含む配置間相互作用法(CISD),2次の多状態多参照摂動論(MC-QDPT)の表式の導出,計算プログラムの実装を行った.これらのプログラムによりQEDハミルトニアンによる量子化学計算を行った結果,問題点が存在することやその問題に対する対処法も明らかになりつつあり,従来の相対論的分子軌道計算にとりこまれていなかった効果を含んだより高精度な計算方法の可能性を示唆するものである.本研究課題は,相対論的電子状態理論の基礎方程式であるDirac方程式のもつ負の運動エネルギー解に関して分子軌道法の観点から物理的な,あるいは数値計算における問題点を明らかにし,解決することが主題である.その目的のために,まず,束縛状態のDirac方程式の負エネルギー解とDirac-Hartree-Fock法の負エネルギー非占有軌道が反粒子の空孔であると矛盾なく解釈できることを示した.また,この事実に基づき,従来用いられている相対論的ハミルトニアンであるNVPAハミルトニアンやVPAハミルトニアンがもつ負のエネルギー解に由来する問題点を含まないQEDハミルトニアンを基づく分子軌道法の定式化およびプログラムの開発をおこなった.その結果,QEDハミルトニアンが分子軌道のユニタリ変換に対しユニタリ不変でないこと,場の量子論の共変摂動論で生じる発散の問題がQEDハミルトニアンによる電子相関計算でも生じることが明らかになった.また,この発散がメラー・プレセット摂動法ではくりこみ不可能であることが示された.これらの新たな問題に対し更なる検討を行い,ユニタリ不変性の破れに関しては分子軌道が定常状態において時間発展しないという要請を理論に組み込むことで,発散の問題に関しては有限基底近似を運動量切断とみなすことで,それぞれ回避可能であることが明らかとなった.これにより,QEDハミルトニアンに基づく分子軌道理論が合理的なものであることが示された.以上より,これまで得られた知見から研究課題としてはおおむね達成されたものと考えられる.当初の目的としていたLCAO展開におけるQEDハミルトニアンの具体的な表式について物理的な要請から定めることができた上,このハミルトニアンに基づいて計算を行うプログラムについてもほとんど実装が完了している.また,このハミルトニアンに基づいて計算を行った場合の問題点とその対処法についても具体的な部分まで判明している.以上より,ここまでの研究はほぼ計画通りに遂行できていると言える.27年度が最終年度であるため、記入しない。

現在のところ研究は概ね順調に進展しており,特に変更点や問題点はない.今後はさらに計算プログラムを追加で実装し解析を行っていく予定である.また,今年度は得られた結果を学会や論文等で積極的に発表する.27年度が最終年度であるため、記入しない。
渦鞭毛藻の麻痺性貝毒生合成機構に関する研究

(1)毒生産に及ぼす阻害剤の影響:抗生物質6,DNA合成阻害剤6、RNA合成阻害剤2,核酸塩基アナログ4,細胞分裂阻害剤3種の渦鞭毛藻Alexandriumtamarenseの麻痺性具毒生産能に及ぼす影響を系統的に調べたが、通常の培養周期で観察される毒含量の変動幅を超えて毒生産能に影響を与える試薬は発見できなかった。また、全実験を通じ、毒組成に変動は見られなかった。(2)光周期と毒生産:Mitomycin Cで分裂を抑えて同調化した細胞を用いる実験系を開発し、光合成と毒生産能が密接に関係することを明らかにした。光照射と共に毒含量が急速に増加し、暗期3時間後から減少を始め、その変動幅は全毒量の50%に達した。このことはまた麻痺性貝毒のturn overがかなり短期間に起こることを示している。なお、直接作用する酵素は不明であるが、分解系が暗期によって活性化されるとをin vitro実験で明らかにした。(3)生合成中間体の検索:渦鞭毛藻中の麻痺性貝毒前駆物質の検索により、オ-ストラリア産のGymnodinium catenatumがsaxitoxin骨格を有する未知3成分を生産することを発見した。1成分が13-deoxyde-carbamoylsaxitoxinであることを機器分析により明らかにした。saxitoxin同族体の13位炭素はSANからtransmethylationによって導入されることがアイソト-プ実験によって示されており、13位の酸化を経る他成分への前駆体として生合成上重要な位置を占める化合物と考えられる。(3)修飾酵素の検索:A.tamarenseから調製した粗酵素液にdecarba moylsaxitoxinとフォルムアミド、硫酸、亜硫酸イオンを各種条件下でインキュベ-トし、変化を追跡したが測鎖へのカルバモイル基、11位への硫酸エステルの導入には成功しなかった。