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キノコの品質に及ぼす鮮度の影響

近年、食用キノコは健康・栄養・嗜好面が重視されるなか、栽培技術や流通機関の進歩に伴い、多種類生産され販売されている。キノコ類のうま味成分の一つである5′-ヌクレオチド類の加熱調理過程での生成が、保存条件によってどのような影響を受けるかを明らかにするために、平成9年度では保存中における鮮度低下の現象を視覚的に検討すると共にRNA量の変化を測定した。2年めにあたる平成10年度では、保存中における5′-ヌクレオチド類の変動について分析し、鮮度と加熱調理過程での5'-ヌクレオチド蓄積との関係を検討した。試料は、収穫後の鮮度の良いシイタケ、ブナシメジ、マッシュルームを、購入したトレーのまま、7・20°Cで保存し、これらの傘ヒダ部や切り口が褐変するまでの期間、経日的にサンプリングし、一定昇温速度で加熱調理を行い、核酸関連物質の分析を行った。さらに、キノコ類の保存中に5′-ヌクレオチド量が変動するものについて粗酵素液を抽出し、ヌクレアーゼおよびホスファターゼの保存中における安定性を測定した。その結果、加熱調理過程での5'-ヌクレオチド蓄積能はキノコ保存中に低下する場合が多く、たとえば、シイタケのこの蓄積能力は、7°C保存では保存直後が高く、褐変が進むと共に低下した。マッシュルームの場合は、褐変するころをピークに5′-ヌクレオチド蓄積能が最大になりその後減少したが、ブナシメジの場合は、7°C保存では2日めごろに5'-ヌクレオチド蓄積能が高くなった。また、生のキノコ中のATPとADPは保存中に減少する傾向がみられた。キノコ類のうま味成分の一つである5'-ヌクレオチド類の加熱調理過程中の分解・生成機構については若干の知見が得られているが、保存条件がヌクレオチド蓄積に与える影響については、ほとんど知られていないのが現状である。そこで、本研究の1年めにあたる平成9年度では、加熱調理過程での5'-ヌクレオチド類の生成と、保存条件との関係を明らかにするために、保存中における鮮度低下の現象を視覚的に検討すると共にRNA量の変化を測定した。試料は、収穫後の鮮度の良いシイタケ、シメジ、マッシュルームを用い、これらの傘ヒダ部や切り口が褐変するまでの期間、購入したトレーのまま、7・20°Cで保存した。経日的に各温度で保存したキノコの外観、傘の開き具合や臭いを視覚的・臭覚的に観察し、さらに色差計を用いて傘ヒダ部や切り口の褐変・退色度を測定した。RNA量はSTS法に従ってRNA画分を分離し、Mejbaumの方法を用いてオルシノール反応を行った。その結果、シイタケは20°C保存では23日め、7°C保存では12日めで、マッシュルームは20°C保存では23日め、7°C保存では34日め位から傘ヒダ部や切り口に褐変が観察された。一方、シメジは7・20°C保存いずれも褐変はほとんど見られなかった。RNA量は3種のキノコいずれも保存中に減少傾向を示した。平成10年度は保存中における5'-ヌクレオチド類の変動について分析し、視覚的に判断した鮮度とヌクレオチド蓄積との関係を検討する。
超漸近解析における消滅定理おその現代への応用

漸近解析における消滅定理を無限遠点が頂点となるいくつかの角領域による開被覆に関するチェック・コホモロジーで表現するとき,データとして与える関数の漸近級数等に関する条件を加えて,分解する関数の漸近展開性について以前より詳しい剰余項の評価,漸近級数の係数の評価を伴う形まで精密化することである.すなわち,超漸近解析的な形の定理にすることである.これについて,Adri B.Olde Daalhuis氏,共同研究を推進させることができ,Level 1,Level 2の超漸近解析的な評価を伴う形に精密化できた.これらを非同次単独高階線形常微分方程式に応用して,発散解の超漸近性を知る方法も確立されている.その応用として,Bessel方程式に付随する非同次方程式の解,特にAnger関数についての応用例を計算した.Airy方程式に付随する非同次方程式の解への,特にScorer関数への応用を課題の一つと考え,Airy関数の無限遠点の周りでの漸近展開にについて再考察し,形式解を計算する見通しのよい方法を確立できた.また,上の研究に関連して,偏微分方程式の漸近解について研究しているWerner Balse,多変数の漸近級数の総和性について研究しているReinhart Schaefke氏を招聘することができ,多変数の関数に関する漸近解析における消滅定理(加法的な場合および乗法的な場合)の拡張可能性について議論をし,漸近性の条件を弱めた形での定理を確立できた.その際、仮定した条件は,筆者が例えば,Lecture Note in Math 1075, Springe Verlagで課したのとは違う.その応用部分については未完成である.一方,一変数のBessel関数などの元になるKunmmer関数を解にもつ常微分方程式の多変数版にあたる合流超幾何偏微分方程式系について,基本解系,その漸近展開,ストークス係数を一般な超平面上の特異点の付近においては計算できた.これに類する計算はまだすべきものが残っている.漸近解析における消滅定理を無限遠点が頂点となるいくつかの角領域による開被覆に関するチェック・コホモロジーで表現するとき,データとして与える関数の漸近級数等に関する条件を加えて,分解する関数の漸近展開性について以前より詳しい剰余項の評価,漸近級数の係数の評価を伴う形まで精密化することである.すなわち,超漸近解析的な形の定理にすることである.これについて,Adri B.Olde Daalhuis氏,共同研究を推進させることができ,Level 1,Level 2の超漸近解析的な評価を伴う形に精密化できた.これらを非同次単独高階線形常微分方程式に応用して,発散解の超漸近性を知る方法も確立されている.その応用として,Bessel方程式に付随する非同次方程式の解,特にAnger関数についての応用例を計算した.Airy方程式に付随する非同次方程式の解への,特にScorer関数への応用を課題の一つと考え,Airy関数の無限遠点の周りでの漸近展開にについて再考察し,形式解を計算する見通しのよい方法を確立できた.また,上の研究に関連して,偏微分方程式の漸近解について研究しているWerner Balse,多変数の漸近級数の総和性について研究しているReinhart Schaefke氏を招聘することができ,多変数の関数に関する漸近解析における消滅定理(加法的な場合および乗法的な場合)の拡張可能性について議論をし,漸近性の条件を弱めた形での定理を確立できた.その際、仮定した条件は,筆者が例えば,Lecture Note in Math 1075, Springe Verlagで課したのとは違う.その応用部分については未完成である.一方,一変数のBessel関数などの元になるKunmmer関数を解にもつ常微分方程式の多変数版にあたる合流超幾何偏微分方程式系について,基本解系,その漸近展開,ストークス係数を一般な超平面上の特異点の付近においては計算できた.これに類する計算はまだすべきものが残っている.表記の研究は,漸近解析における消滅定理を無限遠点が頂点となるいくつかの角領域による開被覆に関するチェック・コホモロジーで表現するとき,データとして与える関数の漸近級数等に関する条件を加えて,分解する関数の漸近展開性について従来より詳しい剰余項の評価,漸近級数の係数の評価を伴う形まで精密化することである.すなわち,超漸近解析的な形の定理にすることである.これについて,Adri B.Olde Daalhuis氏を招聘することができ,その前後のメール等によるやりとりも併せて,共同研究を推進させることができ,Level 1,Level 2の超漸近解析的な評価を伴う形に精密化できた.すなわち,通常の漸近展開をある適切な項までで打ち切り,剰余項が指数減少となること,その剰余項を積分表現を用いてそれを展開し適切な項までで打ち切ると新たな剰余項がより強い指数現象となることを2段階まで証明できた.これらを非同次単独高階線形常微分方程式に応用して,発散解の超漸近性を知る方法も確立されている.結果の一部については,札幌で行われた研究集会(第12回日本数学会国際研究集会『特異点論とその応用』)と京都大学数理解析研究所で行われた研究集会(『複素領域における微分方程式の大域解析と漸近解析』)で口頭発表を行った.その発表内容の概要は出版予定の京都大学数理解析研究所講究録に掲載される.本論文は、現在はまだ原稿段階であるが,主定理の証明は完成している.また,Bessel方程式に付随する非同次方程式へ応用した場合,どういう結果になるかも計算でき,数値計算も行っている.

昨年に引き続き,超漸近解析的な形の消滅定理,すなわち,チェック・コホモロジーで表現すると,無限遠点が頂点となるいくつかの角領域による開被覆に関して,関数をデータとして与えその漸近級数等の条件を加えて,分解する関数の漸近展開性について従来より詳しい剰余項の評価,漸近級数の係数の評価を伴う形まで精密化するという研究を行っている.昨年度のAdri B.Olde Daalhuis氏との共同研究の主たる定理,Level1,Level2の超漸近解析的な評価を伴う形の精密化.すなわち,通常の漸近展開をある適切な項までで打ち切り,剰余項が指数減少となること,その剰余項を積分表現を用いてそれを展開し適切な項までで打ち切ると新たな剰余項がより強い指数減少となることを2段階まで実行した結果については,京都大学数理解析研究所講究録1367に掲載された.その応用(Bessel方程式に付随する非同次方程式へ応用等)に関する部分も含めた共著論文をほぼ完成させた.また,上の研究に関連して,多変数の漸近級数の総和性について研究しているReinhart Schaefke氏を招聘することができ,多変数の関数に関する漸近解析における消滅定理(加法的な場合および乗法的な場合)の拡張可能性について議論をし,漸近性の条件を弱めた形での定理を確立できた.しかし,その応用部分については,まだ,未完成であり,継続して研究を行うこととなっている.一方,一変数のBessel関数などの元になるKunmmer関数を解にもつ常微分方程式の多変数版にあたる合流超幾何偏微分方程式系について,基本解系,その漸近展開,ストークス係数を一般な超平面上の特異点の付近においては計算できた.その結果については京都大学数理解析研究所講究録1397に掲載されている.これらの超漸近解析的な剰余項の評価,漸近級数の係数の評価については今後の課題となっている.一昨年度,昨年度に引き続き,超漸近解析的な形の消滅定理,すなわち,チェック・コホモロジーで表現すると,無限遠点が頂点となるいくつかの角領域による開被覆に対して,関数をデータとして与えその漸近級数等の条件を加えて,分解する関数の漸近展開性について従来より詳しい剰余項の評価,漸近級数の係数の評価を伴う形まで精密化するという研究を行ってきている.一昨年度のAdri B.Olde Daalhuis氏との共同研究の主たる定理,Level 1,Level 2の超漸近解析的な評価を伴う形の精密化.すなわち,通常の漸近展開をある適切な項までで打ち切り,剰余項が指数減少となること,その剰余項を積分表現を用いてそれを展開し適切な項までで打ち切ると新たな剰余項がより強い指数減少となることを2段階まで実行した結果については,京都大学数理解析研究所講究録1367に掲載された.その応用として,Bessel方程式に付随する非同次方程式の解,特にAnger関数についての応用例を計算した.今年度は,Airy方程式に付随する非同次方程式の解への,特にScorer関数への応用を課題の一つとした.
細胞内品質管理プロセスを用いた次世代蛋白質生産システム創製

抗体医薬を代表とする蛋白質医薬品は、世界の製薬産業の成長エンジンとなっている。我が国で上市されている蛋白質性医薬品のうち、26%がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いて生産されており、CHO細胞は10g/Lを超える高レベル生産も可能である。特に本課題では、CHO細胞内における品質管理プロセスに着目し、品質管理機構の解明と制御を通して次世代型蛋白質を高度に生産可能な次世代の蛋白質生産システムを構築するための基盤的研究を行った。抗体医薬を代表とする蛋白質医薬品は、我が国においても大きな市場を形成している。現在、我が国で上市されている蛋白質性医薬品84品目のうち、大腸菌(28品目)に次いで多い22品目がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いて生産されている。CHO細胞は10g/Lを超える高レベル生産も可能であり、g/Lレベルの生産を行うことにより、その生産コストも大腸菌、酵母とそん色ないg数ドルのレベルにまで引き下げることができる。一方、CHO細胞を用いた蛋白質生産技術は、もはや完成された技術と誤解されがちであるが、大腸菌や酵母と比較して生産細胞の構築には大きな問題点があるといわざるを得ない。現在、高生産を実現する細胞株の構築は、1年近くにわたる長期の試行錯誤による構築期間が必要であるが、時間をかけてスクリーニングしても高生産株が得られない場合も多く、生産性が上昇しない理由も十分に解明されていない。本研究では、細胞内における品質管理プロセスに着目し、品質管理機構の解明と制御を通してこれらの次世代型蛋白質を高度に生産可能な次世代の蛋白質生産システムを構築する。平成23年度は(1)網羅的遺伝子発現解析による生産性向上メカニズムの解明に関しては、既に高生産を実現可能であるATF4高発現株の網羅的発現解析を通して、PERK経路の活性化のメカニズムを探り、ATF4高発現細胞株において関連すると推定される発現遺伝子配列を得た。さらに、(2)複雑なドメイン構造をもつ蛋白質を対象とした生産性向上プロセス構築に関しては、ドメイン構造の例として、抗体IgG分子を取り上げ、この発現細胞株に小胞体ストレス応答に関連する遺伝子を導入することにより、生産性向上を検討し、現在発現株を得ており、評価を行っている。特に、本課題では、細胞内における品質管理プロセスに着目し、品質管理機構の解明と制御を通してこれらの次世代型蛋白質を高度に生産可能な次世代の蛋白質生産システムを構築するための基盤的研究を行った。平成25年度は最終的な総括として1.前年度に得られた、網羅的遺伝子発現解析による生産性向上メカニズムの解明に関しては、既に高生産を実現可能であるATF4高発現株の網羅的発現解析を通して、PERK経路の活性化のメカニズムを探り、ATF4高発現細胞株において関連すると推定される発現遺伝子配列を得、候補遺伝子として得られた3種類により、1種類の遺伝子を絞り込んだ。2.複雑なドメイン構造をもつ蛋白質を対象とした生産性向上プロセス構築に関しては、ドメイン構造の例として、抗体IgG分子を取り上げ、この発現細胞株に小胞体ストレス応答に関連する遺伝子を導入することにより、生産性向上を検討した結果、PERK経路の活性化メカニズムとしてATF4を利用することにより、より複雑なIgG分子についても生産性向上効果を示す効果とあわせて、1.によって得られた因子をIgG分子を生産するCHO細胞に対して適応した結果、ある一定以上の比生産速度の向上効果ならびに生産濃度の上昇がみられた。一方、この遺伝子は、直接的には品質管理プロセスとは関連しない遺伝子であり、これまで知られていないメカニズムによっても品質管理プロセスが制御されていると推定され、さらなる生産性向上への手掛かりが得られた。我が国で上市されている蛋白質性医薬品のうち、26%がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いて生産されており、CHO細胞は10g/Lを超える高レベル生産も可能であり、g/Lレベルの生産により、生産コストも大腸菌、酵母とそん色ないg数ドルのレベルにまで引き下げることができる。ここでは、CHO細胞を用いた蛋白質生産技術の大きなボトルネックの一つと考えられている細胞内における翻訳・翻訳語修飾以降のプロセスに焦点をあて、生産性向上に関する基盤的研究を行う。特に、本課題では、細胞内における品質管理プロセスに着目し、品質管理機構の解明と制御を通してこれらの次世代型蛋白質を高度に生産可能な次世代の蛋白質生産システムを構築する。平成24年度は前年度に引き続き、1網羅的遺伝子発現解析による生産性向上メカニズムの解明に関しては、既に高生産を実現可能であるATF4高発現株の網羅的発現解析を通して、PERK経路の活性化のメカニズムを探り、ATF4高発現細胞株において関連すると推定される発現遺伝子配列を得、これについて機能解析を行った。

候補遺伝子として得られた3種類より、1種類の遺伝子を絞り込み、これを用いた発現系を構築し、糖タンパク質生産CHO細胞に導入することにより、生産性向上に及ぼし効果について検討している。さらに、2複雑なドメイン構造をもつ蛋白質を対象とした生産性向上プロセス構築に関しては、ドメイン構造の例として、抗体IgG分子を取り上げ、この発現細胞株に小胞体ストレス応答に関連する遺伝子を導入することにより、生産性向上を検討した。その結果、PERK経路の活性化メカニズムとしてATF4を利用することにより、より複雑なIgG分子についても生産性向上効果を示すという結果が得られている。2011年の夏に新たにCHO細胞の全ゲノム情報が公開されたため、本情報を取りこんでさらに深化させた解析を行うために、検討する時間が必要となった。そのため、網羅的遺伝子解析実験の時期が変更となり、当初の予定より少し遅れて研究が進行している。25年度が最終年度であるため、記入しない。2012-13年にかけて新たにチャイニーズハムスター、CHO細胞の次世代シークエンス解析情報が公開されたため、本情報を取りこんでさらに深化させた解析を行うために、検討する時間が必要となり、少し計画が後ろ倒しとなったが、現在では、本情報も参考にしながら研究が推移し、概ね順調に進展している。今後の推進方策として、特に、(1)網羅的遺伝子発現解析の推進によって得られた遺伝子の機能解析、ならびに複雑なドメイン構造をもつ蛋白質による実証の2点に注力して研究を推進を行っていく予定である。今後の推進方策として、これまでの結果を融合させ、網羅的遺伝子発現解析の推進によって得られた遺伝子の機能解析ならびにその応用について取り纏めを行う予定である。また、ゲノム推進課題にも選定されているので、その結果も融合させて取り纏める。
妊娠時インスリン抵抗性の機序に関する分子生物学的研究-酸化ストレスの関与

妊娠時は非妊娠時に比し酸化ストレスが増大していることが報告されており,妊娠自体が酸化ストレスの生じている状態であると考えられている。一方,これら酸化ストレスが生体に作用すると防御機転が働き,種々の酸化物質に対し抗酸化物質が産生され,これら抗酸化物質の抗酸化シグナルを介し,アポトーシスが抑制されることも知られているが,抗酸化系機構の妊娠時における役割は不明である。そこで,今回我々は抗酸化系分子の一つであるthioredoxin(TRX)に着目し,TRXを全身に過剰発現するマウス(TRX-tg)を用いて妊娠時の抗酸化系機構の意義を検討した。まず非妊娠TRX-tgマウスを用いて糖質代謝を検討した。糖負荷試験の結果,TRXtgは,野生型(WT)に比し耐糖能が良好であることが判明し,インリン負荷試験の結果,TRX-tgはインスリン感受性が良好であることが示された。さらに膵臓におけるβ細胞の占める割合やβ細胞におけるインスリン含有量を検討したところ,両群のマウスにおいて差は認められなかった。すなわちTRX-tgでは,インスリン感受性が良好であることが示唆され,抗酸化系機構が糖代謝とりわけインスリン感受性に影響を与える可能性を示すものである。次にTRX-tgマウスを妊娠させたところ,耐糖能はWT妊娠群に比し,耐糖能は低下し,インスリン抵抗性が高くなった。この結果は,妊娠時のマウスの代謝動態に抗酸化システムが関与した結果生じたものと考えられ,その機序としてTRXとグルココルチコイド受容体のシグナルトークの可能性があり,現在解析を進めているところである。本機序を行うことにより,臨床応用への可能性があり,興味深いところである。最近、酸化ストレスが2型糖尿病や肥満においてインスリン抵抗性を惹起することを示す報告がなされており、特にインスリン抵抗性における重要な因子であると考えられてきている。一方、妊娠時は非妊娠時に比し酸化ストレスが増大していることが報告されており、妊娠自体が酸化ストレスの生じている状態であると考えられている。またこれら酸化ストレスが生体に作用すると防御機転が働き、種々の酸化物質に対し抗酸化物質が産生され、これら抗酸化物質の抗酸化シグナルを介し、アポトーシスが抑制されることも知られているが、抗酸化系機構の妊娠時における役割は不明である。現在我々は抗酸化系分子の一つであるthioredoxin(TRX)に着目し、TRXを全身に過剰発現するマウス(TRX-tg)を用いて妊娠時の抗酸化系機構の意義を検討している。我々はまず非妊娠TRX-tgマウスを用いて糖質代謝を検討した。その結果、TRX-tgは、WTに比し耐糖能が良好であり、その原因としてインスリン感受性が良好であることを示した。すなわち、本結果は抗酸化系機構が糖代謝とりわけインスリン感受性に影響を与える可能性を示した。膵臓のβ細胞のインスリン含有量に差がないことからもインスリン感受性に影響を与える可能性が高い。以上の結果については、現在行っている実験の結果が得られた後に論文として発表する予定である。現在、WTおよびTRX-tgに対してhigh fat dietの食餌摂取を行い、肥満と耐糖能低下を生じたマウスを用いて、インスリン抵抗性の相違などにつき検討中である。本実験により、実際のインスリン抵抗性を生じる生体を用いて抗酸化系物質がどのように糖代謝に作用を及ぼすかにつき検討ができると考えている。現時点でWTマウスにhigh fat dietを負荷することにより、肥満と耐糖能低下が生じ、インスリン抵抗性が生じていることを確認した。今後TRX-tgマウスも使用することにより、さらなる解析を加える予定である。
負の余次元を持つ特異写像の研究

まず,負の余次元を持つ折り目写像に対する同境不変量を構成し,それにより,これまで知られていた球面の安定ホモトピー群だけではなく,ベクトル束の分類空間の安定ホモトピー群も,折り目写像の同境群の直和因子となることを示すことに成功した.これは,折り目写像の同境群を決定する上で大変重要な結果であり,今後のこの方面の研究に大きく影響を与えることが予想される.また,余次元-1の折り目写像が,特異点集合の像に沿って,コンパクト群を構造群とし,特異ファイバーをファイバーとするファイバー束構造を持った部分にきれいに分解することを厳密に示し,それを用いて,単純な折り目写像の同境群を完全に決定した.また,余次元が非正の特異写像に対するPontrjagin-Thom-Szucs構成を定式化し,それを用いて,与えられた特異ファイバーを持つ余次元-1の安定写像の同境群に関する重要な結果を得た.一方,4次元多様体上の折り目写像のなす同境群と,4次元多様体上の諸構造との関連を研究するのが,当初の計画の大きな柱であった.これに関連して,向きづけられた4次元多様体から3次元ユークリッド空間への,与えられた特異ファイバーのみを持つ折り目写像のなす同境群を完全に決定することができた.さらに,そうした同境群の完全不変量を幾何的に構成することにも成功した.さらに,今後の研究の発展のために,Seiberg-Witten理論とこうした理論の融合を図るための準備も開始し,重要なアイデアを得た.このように,当該年度の研究により,十分に満足のゆく結果が得られたと言える.当初の計画に沿って,まず,いくつかの与えられた特異ファイバー型のみを持つ,余次元が-1の折り目写像の同境群について詳しい研究を行った.その際,そうした写像に対する分類空間を構成してポントリャーギン・トム型構成を整備し,さらに法束の構造も加味したはめ込み写像の同境類と言った幾何的不変量を用いることにより,かなり一般的な状況で,折り目写像の同境群に対する分解定理を得ることができた.さらにこの結果を用いることにより,与えられた特異ファイバー型を持つ余次元-1の折り目写像の同境群を,いくつかの場合に完全に決定することに成功した.これらの結果の中には,当初目標としていた4次元多様体から3次元ユークリッド空間への折り目写像の同境群の完全な決定も含まれており,当初の目的の大部分が達成されたと言え,その意義は大変大きい.その後は,当初の計画では余次元が-2の折り目写像の同境群について研究を進めてゆく予定であったが,それでは一般的な結果は期待できないことが予想されたため,余次元が一般の負の偶数である折り目写像の同境群について研究を推し進めた.その結果,そうした折り目写像の同境類の完全不変量を,安定枠付き多様体の同境群などを用いることにより得ることができた.さらに4の倍数次元の多様体から平面への折り目写像の同境群を,こうした完全不変量を用いて調べ,そうした同境群を完全に決定することにも成功した.こうした結果により,負の余次元を持つ特異写像の同境群のうち,折り目写像の場合がかなり明らかにされたことになる.こうした意味で,本研究による成果は十分にあげられたと言える.まず,負の余次元を持つ折り目写像に対する同境不変量を構成し,それにより,これまで知られていた球面の安定ホモトピー群だけではなく,ベクトル束の分類空間の安定ホモトピー群も,折り目写像の同境群の直和因子となることを示すことに成功した.これは,折り目写像の同境群を決定する上で大変重要な結果であり,今後のこの方面の研究に大きく影響を与えることが予想される.また,余次元-1の折り目写像が,特異点集合の像に沿って,コンパクト群を構造群とし,特異ファイバーをファイバーとするファイバー束構造を持った部分にきれいに分解することを厳密に示し,それを用いて,単純な折り目写像の同境群を完全に決定した.また,余次元が非正の特異写像に対するPontrjagin-Thom-Szucs構成を定式化し,それを用いて,与えられた特異ファイバーを持つ余次元-1の安定写像の同境群に関する重要な結果を得た.一方,4次元多様体上の折り目写像のなす同境群と,4次元多様体上の諸構造との関連を研究するのが,当初の計画の大きな柱であった.これに関連して,向きづけられた4次元多様体から3次元ユークリッド空間への,与えられた特異ファイバーのみを持つ折り目写像のなす同境群を完全に決定することができた.さらに,そうした同境群の完全不変量を幾何的に構成することにも成功した.さらに,今後の研究の発展のために,Seiberg-Witten理論とこうした理論の融合を図るための準備も開始し,重要なアイデアを得た.このように,当該年度の研究により,十分に満足のゆく結果が得られたと言える.
斜面に対する対処行動の発現メカニズムの解明

本研究課題の目的は、斜面に対する対処行動の発現メカニズムを解明するために、乳児の斜面に対する反応の行動現象的レベルと基礎的・生理的レベルとの関連性を検討することである。まず、昨年度から行っている実際の斜面における行動現象的レベルと斜面提示時における視覚的自己受容感覚といった生理的レベルの関連を検討するための研究を引き続き実施した。具体的には、角度を変えることができる滑り台を製作することにより、実際の斜面およびバーチャルムービングルームの両方の課題を同一の8ヵ月のハイハイ児に実施し、これらの発達の関連を検討した。さらに現在、ハイハイ開始0、2、4、6週目に実際の斜面とバーチャルムービングルームの両方の課題を実施し、これらの発達的変化を縦断的に検討している。また、昨年度に追加で実験を実施した視覚的自己受容感覚の発現に対するハイハイによる自己移動経験の影響に関する研究について、結果の取りまとめを行った。この研究から得られた結果については、2016年5月国際赤ちゃん学会(ICIS)のシンポジウムでの発表が受理され、発表に向けて準備を進めている。さらに、バーチャルムービングルームを用いて斜面状の視覚的流れに対する姿勢補償および生理的な心拍反応を角度別に検討した採用第1年度目の研究について、指導教員の共同研究者であるカリフォルニア大学バークレー校キャンポス教授と打ち合わせを行い、学術雑誌に論文投稿を行った。本年度、学術雑誌に掲載された(『発達心理学研究』第26巻第4号)。その他、本研究を幼児に発展させた研究を別途実施している。具体的には、実際には幼稚園に実際に訪問し、幼稚園児の危険回避能力の発達に関する研究を行っている。この研究から得られた結果についても取りまとめ、2015年6月に日本交通心理学会において学会発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、下り斜面に対する対処行動が発現する基礎的なメカニズムを解明するとともに、臨床場面への応用を目指した研究である。そこで、行動の獲得の基礎となると考えられている斜面提示時における視覚的自己受容感覚について検討を行っている。平成25年度は、まず生後9ヵ月児34名を対象に、バーチャルムービングルームを用いて、仮想的な下り10°および30°の斜面状の光学的流動に対する反応を検討した。その結果、9ヵ月児は角度に応じた姿勢補償を示すと共に、下り30°の斜面状の光学的流動に対してより心拍数の上昇を示した。急な下り斜面に対して生じる姿勢補償に伴う心拍数の上昇は、適切な対処につながる可能性がある。このように生理的レベルでの分析を行うことにより、斜面に対する対処行動の基礎的なメカニズムの一端が明らかになったと言える。また、本研究のベースとなる研究として、バーチャルムービングルームにおける実験パラダイムを確立するための研究を発展的に実施した。生後9ヵ月児30名を対象に、ムービングルームとバーチャルムービングルームの両方の装置を用いて、視覚刺激の前後方向の動きに対する姿勢補償を検討した。その結果、両装置において9ヵ月児は視覚刺激の動きの方向に対応した姿勢補償を示し、これらの反応には関連が見られることが明らかになった。すなわち、バーチャルムービングルームは実際に壁が動くムービングルームと同様の視覚的効果があることが示唆された。これらの研究は、新たな実験パラダイムを確立し、斜面に対する対処行動の発現メカニズムに生理的レベルの視覚的自己受容感覚を取り入れたという点で、重要な意義を持つと考えられる。平成26年度は、申請時の研究計画に従い、実際の斜面における行動現象的レベルと斜面提示時における視覚的自己受容感覚といった生理的レベルの関連を検討するための研究を開始した。具体的には、角度を変えることができる滑り台を製作することにより、実際の斜面およびバーチャルムービングルームの両方の課題を同一の8ヵ月のハイハイ児に実施し、これらの発達の関連を検討している。また、視覚的自己受容感覚の発現に対するハイハイによる自己移動経験の影響に関する研究について、さらに追加で実験を実施した。乳児はハイハイを開始することにより、急な下り斜面といった環境に直面した際、周囲の視覚情報を適切に処理し、その情報を利用した姿勢補償や心拍反応が生じ、適切な対処がとれるようになる可能性が明らかになった。この研究から得られた結果を取りまとめ、現在海外誌への論文投稿に向けて準備を進めている。さらに、バーチャルムービングルームを用いて斜面状の視覚的流れに対する姿勢補償および生理的な心拍反応を角度別に検討した採用第1年度目の研究について、指導教員の共同研究者であるカリフォルニア大学バークレー校キャンポス教授と打ち合わせをし、9ヵ月のハイハイ児のみに焦点を当てて分析を行った。その結果、9ヵ月のハイハイ児は、角度に応じた適切な姿勢補償を示すと共に、30°の下り斜面状の光学的流動に対して特に心拍数の上昇を示すことが明らかになった。この結果を取りまとめ、2014年7月に国際赤ちゃん学会(ICIS)のシンポジウムにおいて発表を行うと共に、現在学術雑誌に論文投稿を行っている。

具体的には、角度を変えることができる滑り台を製作することにより、実際の斜面およびバーチャルムービングルームの両方の課題を同一の8ヵ月のハイハイ児に実施し、これらの発達の関連を検討した。さらに現在、ハイハイ開始0、2、4、6週目に実際の斜面とバーチャルムービングルームの両方の課題を実施し、これらの発達的変化を縦断的に検討している。また、昨年度に追加で実験を実施した視覚的自己受容感覚の発現に対するハイハイによる自己移動経験の影響に関する研究について、結果の取りまとめを行った。この研究から得られた結果については、2016年5月国際赤ちゃん学会(ICIS)のシンポジウムでの発表が受理され、発表に向けて準備を進めている。さらに、バーチャルムービングルームを用いて斜面状の視覚的流れに対する姿勢補償および生理的な心拍反応を角度別に検討した採用第1年度目の研究について、指導教員の共同研究者であるカリフォルニア大学バークレー校キャンポス教授と打ち合わせを行い、学術雑誌に論文投稿を行った。本年度、学術雑誌に掲載された(『発達心理学研究』第26巻第4号)。その他、本研究を幼児に発展させた研究を別途実施している。具体的には、実際には幼稚園に実際に訪問し、幼稚園児の危険回避能力の発達に関する研究を行っている。この研究から得られた結果についても取りまとめ、2015年6月に日本交通心理学会において学会発表を行った。本研究は当初の計画に従って進められ、研究成果は学術雑誌および学会発表において発表されている。また、その展開となる研究を発展的に実施しているのは、当初の計画以上に進展していると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の目的である斜面に対する対処行動の発現メカニズムの解明を達成するために、当初の計画に従い、斜面における適切な対処行動の発現と視覚的自己受容感覚との関連性をさらに検討する予定である。具体的には、滑り台を用いた研究を継続して実施すると共に、ハイハイ開始0、2、4、6週目に実際の斜面とバーチャルムービングルームの両方の課題を実施し、これらの発達的変化を縦断的に検討することを計画している。また、これらの研究を幼児や発達障害児にも発展させて実施することにより、今後さらに十分な研究成果が得られることが期待される。また、当初の研究計画に加えて、バーチャルムービングルームを用いた実験パラダイムを確立するためのベ一スとなる研究も実施されており、当初の計画以上に研究は進展していると考えられる。
核酸塩基のシミュレーションのための多体相互作用ポテンシャルの開発

アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)のための分極モデルポテンシャル関数を、ab initio分子軌道法の計算結果を基にして開発した。分子軌道計算のレベルとしては、MP2/6-31+G^*を用いた。分極モデルポテンシャル関数は、クーロン項、レナードージョーンズ項および分極項からなる。クーロン項の点電荷は、静電ポテンシャル最適化法を使用することによって決定した。分極項の多中心分極率は、分極可能一電子ポテンシャル最適化法を使用することによって決定した。多中心分極率として、原子分極率を採用した。原子分極率モデルは、核酸塩基の分極をよく再現した。分極モデルポテンシャル関数を使用する計算では、ワトソン-クリック型のA-TとG-Cの塩基対の相互作用エネルギーは、それぞれ-15.6と-29.2kcal/molであった。Hoogsteen型のA-T塩基対の相互作用エネルギーは-17.7kcal/molであった。これらの結果は、MP2/6-311++G(3df,2pd)を用いた量子化学計算をよく再現している。A-TとC-Gのスタッキングの相互作用エネルギーは、それぞれ-9.3と-10.7kcal/molであった。これらの結果は、MP2/6-311++G(2d,2p)の計算結果をよく再現している。更に、核酸塩基の表面に、ナトリウムイオンまたは塩素イオンが近接した場合の、相互作用エネルギーの計算を行ったところ、エネルギー表面の再現は非常に良かった。核酸塩基は、かなり大きい分極異方性を示す分子であるが、簡単な原子分極率を採用することによって、高度な量子化学計算結果をよく再現するポテンシャル関数を作ることができることを示すことができた。核酸塩基の分極ポテンシャルの導出を目的として、以下に述べる理論的研究を行った。1核酸塩基の多中心分極率の決定アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、ウラシル(U)について、多中心分極率を決定した。参照の量子化学計算としては、MP2/6-31+G*レベルを実行し、POPFITプログラムを用いて、最適な原子分極率およびボンド分極率パラメータを決定した。原子上に分極率を置く場合に較べ、更に、ボンド方向に異方的な分極率をおいた場合、量子化学計算をよく再現する結果が得られた。2核酸塩基の分極ポテンシャルパラメータの決定分極ポテンシャルを構成するクーロン、分極Lennard-Jones(LJ)の各項のパラメータを決定した。静電項のパラメータは、静電ポテンシャル最適化法で決定した。分極項のパラメータは、1で決定した多中心分極パラメータを使用した。LJ項のパラメータは、ペアポテンシャルで用いられる既存の値を使用したが、量子化学計算から得られる二分子間のポテンシャルエネルギー面を再現するよう若干の修正を加えた。ATおよびGC核酸塩基ペアの水素結合モデル及びスタッキングモデルについて、ポテンシャル面の再現性を検討したところ良好な結果が得られた。また、核酸塩基にNaイオンが近接するモデルについても検討したところ、非常に良好な結果が得られた。尚、参照とした量子化学計算のレベルは、MP2/6-31+G*である。1核酸塩基の双極子モーメントと分子分極率の算出アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)について量子化学計算を行い、双極子モーメントと分子分極率を求めた。

計算レベルを変えて計算を行ったところ、MP2/6-31+G^*の双極子モーメントは、MP2/6-31++G(2d,2p)の計算結果をよく再現するとともに、実験値もよく再現することがわかった。分子分極率に関しては、MP2/6-31+G^*はMP2/6-31++G(2d,2p)を3%過小評価する結果となった。計算が比較的容易であるためMP2/6-31+G^*レベルの計算をベースとして分極ポテンシャルの開発を行うこととした。2核酸塩基の分極ポテンシャルパラメータの決定分極ポテンシャルを構成するクーロン、分極、Lennard-Jones (LJ)の各項のパラメータの決定を行った。静電項のパラメータは、静電ポテンシャル最適化法で決定した値を用いた。分極項の多中心分極パラメータは、分極1電子最適化法で決定した値を用いた。LJ項のパラメータは、ペアポテンシャルで用いられる既存の値を使用したが、量子化学計算から得られる二分子間のポテンシャルエネルギー面を再現するよう修正を加えた。ATおよびGCの水素結合モデル及びスタッキングモデルでは、MP2/6-31+G^*レベルの計算でも基底関数スーパーポジションエラーが認められたためMP2/6-311++G(3df,2pd)またはMP2/6-311++G(2d,2p)の計算を行った。LJ項のパラメータの再調整を行い、相互作用エネルギーを再現する分極ポテンシャルの導出を行うことができた。また、核酸塩基にNa^+やCl^-イオンが近接するモデルについても検討したところ、非常に良好な結果が得られた。核酸塩基の分極ポテンシャルの導出を目的として、分極ポテンシャルを構成するクーロン、分極、Lennard-Jones (LJ)の各項のパラメータの決定を行った。分極項の多中心分極率パラメータは、分極1電子最適化法で決定した値を用いた。ATおよびGCの水素結合モデル及びスタッキングモデルでは、MP2/6-31+G*レベルの計算でも基底関数スーパーポジションエラー(BSSE)が認められたためMP2/6-311++G(3df,2pd)またはMP2/6-311++G(2d,2p)の計算を行った。また、核酸塩基の分子表面にNa^+やCl^-イオンが近接するモデルについても検討を加えた。BSSE補正を行ったMP2/6-311++G(2d,2p)計算をよく再現する結果が得られた。以上の計算結果から次の結論がえられた。1.核酸塩基は分極異方性が強い分子であるが、多中心分極率パラメータとしては、原子上に分極率を置くモデルでも十分異方性を表すことができる。2.水素結合やスタッキングのような比較的弱い相互作用から、イオンが隣接する強い相互作用までを統一的に記述することができる分極ポテンシャルを作ることが可能である。
血管肉腫に対する抗VEGF抗体/抗IL-17抗体併用による腫瘍増殖抑制効果の検討

血管肉腫細胞株への抗VEGF阻害抗体単独投与および抗IL-17抗体併用投与で、腫瘍細胞増殖抑制を比較検討する。また当科で樹立した血管肉腫マウスモデルISOS-1(Masuzawa et al. J. Dermatol.Sci.16:91-98,1998)を用いて、がん微小環境が存在するin vivoにおいても腫瘍細胞増殖抑制効果が認められるかについて検討する。
多種多様な試料をより良く観察できる特殊光学顕微鏡組み込み型走査電子顕微鏡の開発

科学研究費によって補助された本研究は、当初の研究実施計画の半分以上を遂行出来た。しかも、申請の時点では考えられなかった本装置の可能性も見いだされた。以下、それらの概要について述べる。当初の研究実施計画に対応させた実際の成果について(番号は交付申請書中の番号に一致)1.実際にOM機能をSEMの中で使えるようにするためのアタッチメントを設計・制作し、同一視野がSEM、OMで観察できるようになった。ただし、OMを完全に真空の中に持ち込むと焦点合わせ等の作業が今のところ困難なので、鉛ガラス一枚を隔ててパラメータの調整は真空外から行っている。2.残念ながら当初目標は達成できなかった。理由は装置に組み込まれている単板式超小型CCDカラーカメラから得られる画像信号のクオリティーが予想外に劣悪だったことい起因する。目下、三板式のカメラは大き過ぎて本OMに装着できない。しかし、今後一年以内に本研究に必要な仕様を満たした装置が開発される予定であり、それを待って本項目の研究を再開する。3.本研究項目では、理想的には大気圧で動作する環境制御型SEMの導入が必要であったが、予算的に考えてそれは不可能だった。その代替え手段として、試料に帯電防止剤をコートして(即ち金属コーティング無しに)実験を行った。結果、ほとんどの試料でSEM像とOM像のコントラストは大きく異なり、本複合装置が完成すれば、様々な試料に対して役立つ確信が得られた。一方、申請時に述べなかった本装置の重要な可能性として、ディジタル画像処理によるOM像焦点深度の増大法、SEM像のカラー化、等の興味ある題材が浮上し、既に研究をスタートさせている。以上報告する。以上報告する。
キラル高分子膜の高度な秩序形成法の確立とその光機能発現機構の結晶光学的解明

キラル高分子は結晶性高分子であり,問題になるのはその複雑な高次構造である.本研究では,キラル高分子の一種であるL型ポリ乳酸(PLLA)を用い,様々な試行錯誤を繰り返し高次構造制御を試みた.しかし,通常行われる延伸法などの発展では困難であった.そこで,まず微小領域の旋光性や光変調性が評価できる三次元複屈折旋光評価システム(複屈折Retardation分解能0.4nm(0.2deg))を開発した.このシステムを用いることで,迅速で系統的な物性評価が可能になった.その結果,我々は,金属加工で利用されている鍛造法を改良し,PLLAに適用することにより,非晶部分が殆どない高配向した膜(高度に構造制御された膜)が得られる可能性を見出した.更に研究を進めた結果,鍛造法は,PLLA膜にμm以下の微細な不均一構造を発生させていることが分かった.更に,その中に,配向方向がtiltしつつも,強い配向状態を示し,高結晶性である領域が存在することも判明してきた.実際,この不均一な試料の極一部に巨大な旋光性が存在する.この鍛造法により構造制御されたPLLA膜の旋光能は,7200°/mmにも達する可能性を見出した.これは旋光性結晶として有名なα-水晶の約300倍である.即ち,3mmの厚みを必要とした素子が10μmで同性能となりうる.一方,作製したPLLA試料の光変調性も追及した.測定は,PLLA試料の繊維軸に平行に直接レーザ光を入射し,印加交流電界の振幅や周波数に対する透過光強度の変化を評価した.透過光強度は,測定範囲内で,効率よく変化した.特に透過光強度が印加電界の二乗に比例し,変化することが確認できた.この実験事実は作製したPLLA試料に光変調性が存在することを示すものである.キラル高分子は結晶性高分子であり,問題になるのはその複雑な高次構造である.本研究では,キラル高分子の一種であるL型ポリ乳酸(PLLA)を用い,様々な試行錯誤を繰り返し高次構造制御を試みた.しかし,通常行われる延伸法などの発展では困難であった.そこで,まず微小領域の旋光性や光変調性が評価できる三次元複屈折旋光評価システム(複屈折Retardation分解能0.4nm(0.2deg))を開発した.このシステムを用いることで,迅速で系統的な物性評価が可能になった.その結果,我々は,金属加工で利用されている鍛造法を改良し,PLLAに適用することにより,非晶部分が殆どない高配向した膜(高度に構造制御された膜)が得られる可能性を見出した.更に研究を進めた結果,鍛造法は,PLLA膜にμm以下の微細な不均一構造を発生させていることが分かった.更に,その中に,配向方向がtiltしつつも,強い配向状態を示し,高結晶性である領域が存在することも判明してきた.実際,この不均一な試料の極一部に巨大な旋光性が存在する.この鍛造法により構造制御されたPLLA膜の旋光能は,7200°/mmにも達する可能性を見出した.これは旋光性結晶として有名なα-水晶の約300倍である.即ち,3mmの厚みを必要とした素子が10μmで同性能となりうる.一方,作製したPLLA試料の光変調性も追及した.測定は,PLLA試料の繊維軸に平行に直接レーザ光を入射し,印加交流電界の振幅や周波数に対する透過光強度の変化を評価した.透過光強度は,測定範囲内で,効率よく変化した.特に透過光強度が印加電界の二乗に比例し,変化することが確認できた.この実験事実は作製したPLLA試料に光変調性が存在することを示すものである.キラルな分子がら旋構造を造る高分子(キラル高分子)は,その構造から典型的なら旋状の電子軌道が発生し,結晶状態で,大きな旋光性を示すことは直ちに想像できる.本年度は第一段階として,これを定量的に評価するための,高次構造制御試料の作製と,測定システムの試作を試みた.キラル高分子結晶が持つ旋光性の結晶光学的評価1)高度に高次構造を制御したキラル高分子膜の作製...キラル高分子の高次構造制御は難しく,一般に乱れた構造が多く導入される.しかしながら,キラル高分子の旋光性を固体状態で,結晶光学的に追究するためには,高次構造の単純な材料を作り出す必要がある.本年度は,金属加工で利用されている鍛造法を応用し,キラル高分子の一種であるL型ポリ乳酸(PLLA)の高次構造制御を試みた.具体的には,鍛造時の温度,圧力のかけ方を最適化する形状の選定を行った.試料は,分子量や異性体(D体)含量の異なるものを用意した.現在,数多くの実験によって得られた成形試料の高次構造を精力的に解析している.次年度は,この解析結果を踏まえ,PLLAの分子量,異性体(D体)含量に対する最適な高分子膜の作製条件を決定する.2)測定装置の試作...試料の旋光性は,複屈折より遥かに小さく測定が困難な上に,本研究のようにlaser光を繊維軸方向より入射する場合,特に,試料の光学軸のずれや光学素子による見かけ上の影響を除くことは大変難しい.現在,高分子膜用の旋光・光変調測定装置は殆ど見あたらない.

そこで,試料の膜厚以下の径を持つ光ファイバを検光子の直ぐ後ろに置き,透過光を受光するシステムを構築した.その結果,試料や光学素子の反射や回折による影響が除けることを実証した.次年度は,このシステムを光変調測定が可能なものに拡張する.本年度は,昨年度試作した評価システムを運用し,高次構造を制御したキラル高分子膜,特にL型ポリ乳酸(PLLA)膜の旋光性を結晶光学的に評価した.1)結晶光学的評価に必要なPLLAの旋回テンソル成分g_<ij>の測定測定結果を以下に示す.(1)巨大な旋光性を主に担う分子鎖方向の旋回テンソル成分g_<33>は8x10^<-3>となり,符号を含めconsistentであった(分子論的に正:無機旋光性結晶は10^<-6>程度であり,それと比べ予測通り巨大).(2)PLLA結晶にはその対称性から二個の独立なg_<33>より遥かに値の小さいが成分(g_<11>,g_<22>)の存在が予測されるが,これも確認した.2)PLLAの巨大な旋光能の起原(結晶光学的理解)我々は,複屈折値とg_<ij>が1μmピッチで測定可能なシステムを開発した.この装置を用い測定した結果,巨大な旋光能が発現するPLLA膜には,μm以下の微細な不均一構造が存在することが分かった.更に,その中に,分子鎖の配向方向がtiltしつつも,強い配向状態を示し,高結晶性である領域が存在することを見出した.そして,この不均一な試料の極一部に巨大な旋光性が存在することを発見した.その部位を,cuttingする技術を民間ベンチャ企業と確立し,これを切り出すことで,巨大な旋光性を持つ試料として具現化した.(ここで得られる試料の大きさは厚み・径とも数μm以下である).3)その他(1)旋光測定システムを光変調性測定システムへ拡張微小領域での測定が可能な光変調性測定システムを,ヘテロダイン法を応用し,開発した.測定周波数はGHzまで原理的に可能である.本システムを用い,PLLAの光変調性をMHz領域まで確認した.(2)PLLA以外の高度に高次構造を制御したキラル高分子膜の作製セルロース誘導体である酢酸セルロースやシアノエチルセルロースを用い,開発した新鍛造浩により高次構造制御を行った.圧力を増大させることで,試料に高複屈折値を示すミクロン以下の領域が出現した.この結果,新鍛造法を用いることで,セルローヌ誘導体の構造も制御可能であることが分かった.
ヒト肝由来細胞株を使用した代用人工肝による環境汚染物質の肝内代謝実験モデルの開発-ラジアルフロー型バイオリアクターを用いて-

環境汚染や薬剤使用時に生体への影響が問題となる毒性物質や癌原性物質の代謝経路は,ヒトと動物では異なる。現在は,これらの代謝検定は動物実験をもとに,ヒトへ外挿されているのが実情である。動物愛護の見地からも,よりヒトに近い代謝経路での研究が必要となっている。申請者らの樹立したヒト肝由来細胞は,ラジアルフロー型バイオリアクター(RAD)で高密度三次元培養することにより,単層培養と比較して,高アルブミン産生を有するだけでなく、アンモニア,薬物など毒性物質の解毒能をも保持している。肝における毒物代謝経路で律速段階となる酸化系酵素チトクロームP450(CYP)の分子種ごとの活性では,ヒト肝由来細胞株にヒトと同様のCYP分子種の1A,3Aなどに活性が認められた。また,加水分解系酵素のカルボキシルエステラーゼ活性と,ヒトと同様の分子種も確認された。アンモニア負荷実験では,代謝産物である尿素の上昇と,尿素サイクルの中間代謝産物であるシトルリンの上昇が認められた。ヒト生体肝の解毒シミュレーションとして,ナファモスタット,アンチピリン,アンモニアをRADシステムへ負荷した結果,これらが代謝されることを認めた。また,変異原性物質を用いた小核試験では,ヒト肝由来細胞において,変異原性物質の検定に有効であることが確認された。この結果,ヒト生体肝に近い実験モデルとして,ヒト肝由来細胞を用いたRADシステムは,環境汚染物質や毒性化学物質,薬剤の生体への影響,変異原性物質の代謝系の検定などに有用と思われた。環境汚染物質や薬剤等の化学物質の毒性や発癌性、それらの生体内での代謝経路の検定は実験動物を用いて行なわれてきた。ヒトと実験動物では代謝経路に差があり、動物実験のヒトへの適応には慎重さが必要である。また動物愛護の見地からも動物実験はひかえ、これに代わる研究手段の開発が求められている。この分野における培養細胞の応用は多方面より期待されている。申請者らが樹立したヒト由来肝細胞を、ガラス坦体(シラン)を用いたラジアルフロー型バイオリアクター(RAD)で培養すると、200ml容量のRADで総細胞数は2.88x10^<10>個と高密度培養が可能であった。このRAD(ヒト肝の1/6容)でアルブミン産生量15g/dayと正常ヒト肝臓と同等の産生能を示した。当プロジェクト開始時の200mlのRADを本研究用に小型化し、50ml、30ml、5ml仕様を作製した。50mlRADでは下記の成果を上げている。さらに5個のRADを並列培養する装置をエイブル(株)で作製中である。薬物代謝のモデル実験としてナファモスタットメシレートとアンチピリンを培養液に添加し、そのRADによる代謝能を測定した。さらにリドカインについても検討中である。細胞膜障害の指標としては細胞膜中のアラキドン酸が酸化刺激により非酵素的に生じる8-epiPGF2αをGC-MSで測定した。酸素欠乏状態のRADで8-epi-PGF2αが増加し、細胞障害の検討に使用できると考えられる。以上のように基本的なRADの機能の確認と効率のよいシステム作製のための改良はほぼ終了している。今後はRADを用いて、さらに種々の化学物質の代謝、変異原性、細胞障害について検討を加えていく。

肝における毒物代謝経路で律速段階となる酸化系酵素チトクロームP450(CYP)の分子種ごとの活性では,ヒト肝由来細胞株にヒトと同様のCYP分子種の1A,3Aなどに活性が認められた。また,加水分解系酵素のカルボキシルエステラーゼ活性と,ヒトと同様の分子種も確認された。アンモニア負荷実験では,代謝産物である尿素の上昇と,尿素サイクルの中間代謝産物であるシトルリンの上昇が認められた。ヒト生体肝の解毒シミュレーションとして,ナファモスタット,アンチピリン,アンモニアをRADシステムへ負荷した結果,これらが代謝されることを認めた。また,変異原性物質を用いた小核試験では,ヒト肝由来細胞において,変異原性物質の検定に有効であることが確認された。この結果,ヒト生体肝に近い実験モデルとして,ヒト肝由来細胞を用いたRADシステムは,環境汚染物質や毒性化学物質,薬剤の生体への影響,変異原性物質の代謝系の検定などに有用と思われた。