hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接着分子オクルディンを利用した新しいドラッグデリバリー法の開発

オクルディンのノックアウトマウスを作成することに成功し、そのフェノタイプを詳細に解析した。オクルディンノックアウトマウスは一見正常に生まれた。しかし、その後の成長が野生型に較べ、有意に遅く、最終的に雌雄とも子供を作ることが出来なかった。その原因は明らかではないが、種々の解析の結果、性行動の異常があるのではないかと推測された。このマウスは、生まれた時には、組織学的には何の異常も見られないが、成長するにしたがって多くの異常が見られるようになった。もっとも顕著なのが、胃粘膜の変化である。生後数週の時期から、炎症性細胞の浸潤が見られるようになり、慢性炎症の像を呈するようになり、最終的には極度の上皮過形成が見られるようになる。また、骨にも異常が見られる。骨の発達が悪く、最終的には典型的な骨そしょう状態になった。さらに、脳実質の中に、燐酸カルシウムを含む沈殿物が多数見られるようになり、最終的にきわめて多数の沈殿物が散在するようになる。このような異常を、タイトジャンクションの機能異常と結びつけることは、現在のところ難しいが、何らかの未だ知られていないタイトジャンクションの機能をオクルディンが担っていることを意味しているのかもしれない。また、このようなマウスを用いて、種々の薬剤の動態を固体レベルで調べることにより、オクルディンをドラッグデリバリーにおいていかに利用するかという本研究の当初の目的が達成されると思われる。(1)オクルディンのドミナントネガティブ分子の作製オクルディンは、いろいろな状況証拠から、膜内で線状のポリマーを形成して機能していると考えられている。したがって、種々の変異オクルディン分子を細胞に発現させると、このうちのいくつかが、ドミナントネガティブ分子として働くことが予想される。培養上皮細胞の細胞間透過性の変化を測定することにより、どのような変異分がドミナントネガティブ効果を示すか、すなわち、細胞間透過性を冗進させるかを検討した。(2)マウス・オクルディンのアンチセンスDNA作製マウス・オクルディンの塩基配列から、数カ所の25mer程度のアシチセンスDNAをDNAaseの分解を受けにくいS-オリゴの形で合成し、これをマウス培養上皮細胞の培養液に加え、どのアンチセンスDNAが細胞間透過性を亢進するかについて検討した。(3)マウス・オクルディンの機能阻害抗体の作製オクルディンは、C末端とN末端を共に細胞質側に持つ膜4回貫通タイプの膜蛋白質である。細胞外に出ている部分は2カ所で、それぞれ40前後のアミノ酸よりなる。そこで、細胞外ドメインをコードするcDNAの部分を用いて、大腸菌に細胞外ドメインのみを作らせた。これを回収して、抗原としてラットに注射し、多くのモノクローナル抗体を得た。そして、培養したマウス上皮および内皮細胞を用いて、細胞間透過性を亢進させる抗体を選びつつある。(4)マウス・オクルディンの機能阻害ペプチドの作製細胞外ドメインを10アミノ酸位づつに分けて、それぞれのペプチドを合成した。そして、やはり培養マウス上皮および内皮細胞を用いて、どのぺプチドがオクルディンの接着阻害、すなわち、細胞間透過性亢進を引き起こすかを検討した。オクルディンのノックアウトマウスを作製することに成功し、そのフェノタイプを詳細に解析した。

骨の発達が悪く、最終的には典型的な骨そしょう状態になった。さらに、脳実質の中に、燐酸カルシウムを含む沈殿物が多数見られるようになり、最終的にきわめて多数の沈殿物が散在するようになる。このような異常を、タイトジャンクションの機能異常と結びつけることは、現在のところ難しいが、何らかの未だ知られていないタイトジャンクションの機能をオクルディンが担っていることを意味しているのかもしれない。また、このようなマウスでは、今のところ、タイトジャンクションのバリアー機能の異常は検出されていない。このようなマウスを用いて、種々の薬剤の動態を個体レベルで調べることにより、オクルディンをドラッグデリバリーにおいていかに利用するかという本研究の当初の目的が達成されると思われる。
複合格子上のエキゾチック超伝導体の発現機構の理論的研究

「複合格子上のエキゾチック超伝導体の発現機構」の提唱と解明が研究目的である。この目的遂行のため、本年度は特別研究員採用第1年度目の研究として、複合格子として最も簡単な物質であるグラフェンの電気的性質の解析を精力的に行った。先ず、超対称量子力学とベリー位相を用いてグラフェン上の量子ホール効果の研究を行った。通常の量子ホール効果との最大の違いは、電子が相対論的ディラック方程式で記述されることである。その結果、内在的ゼーマンエネルギーはサイクロトロンエネルギーのちょうど半分になる。この内在的ゼーマン効果の故に、エネルギーレベルはランダウレベルと本質的に違ったものになり、同じエネルギーレベルに違うランダウレベルからアップスピンとダウンスピンの電子が来る。私はこの事を初めて指摘し、その論理的帰結として、磁場中のクーロン相互作用がスピン依存性を持つ事を論証した。次に、グラフェン派生物であるナノディスクの電磁的性質の解析を行った。これは私が提唱した円盤状のグラフェン派生物である。これらの物質群を系統的にバンド計算することによりゼロエネルギー状態が三角ナノディスクのみで現れる事を初めて発見した。更に、この系の基底状態は、比較的小さいサイズのナノディスクに於いても、緩和時間の長い強磁性を示す事を発見した。これは将来的にナノディスクがメモリーに使える可能性を示唆している。
細胞核の内部構造構築とダイナミクスにおけるアクチン関連タンパク質の機能解明

真核生物のゲノム機能調節に重要なエピジェネティック制御において、細胞核は重要な役割を果たしている。細胞核は、高度に組織化・区画化された構造体であり、この構造に基づくクロマチンの核内収納がその分子基盤となっている。申請者はこれまでに、アクチンに進化的・構造的に関連性を有するアクチン関連タンパク質が、核内部の構造構築に重要であることを見致している。本研究では、どのようにアクチン関連タンパク質が細胞核の内部構造構築に寄与しているかについて、その分子機構を明らかにすることを目的とした。連帯研究者である、近畿大学の三谷匡、および海外研究協力者であるFriedrich Miescher Institute(スイス)のDr.Susan Gasserおよびカレル大(チェコ)のDr.Pavel Hozakと共に、研究を実施した。ニワトリDT40細胞を用いてアクチン関連タンパク質Arp6を破壊し、染色体テリトリーの核内配置を解析したところ、放射状配置に異常が観察された。ヒストンバリアントH2A.ZはArp6によりクロマチンに導入されるが、H2A.Z破壊細胞では、Arp6破壊細胞に比べて、放射状配置の異常の程度は低かったことから、Arp6がH2A.Z非依存性および依存性の二つの経路で、細胞核内部のクロマチン空間配置に重要な役割を果たすことを明らかにすることができた。この分子機構を解明する目的でプロテオミクス解析を行い、協調的に機能するタンパク質の複数の候補を得ることができた。今後、このタンパク質の解析も同時に行う予定である。真核生物のゲノムが納められている細胞核は、高度に組織化・区画化されたダイナミックな構造体である。この各構造に基づくクロマチンの核内収納は、遺伝情報の発現制御・維持継承における重要な分子基盤であり、発生・分化・疾病などと関連した核内構造の変化が観察されている。このような細胞核の機能構造形成にかく膜構造が重要な役割を果たすことが知られているが、核内部構造の特定やその分子構築には不明な点が多い。我々は、これまでに細胞核に局在するアクチン関連タンパク質(actin-relatedprotein ; Arp)の存在を見出し、これらのArpが核内部の構造構築に関与する可能性を見出している。本研究は、核内Arpの核内部構造構築への関与を明らかにし、さらに細胞分化に伴う核のダイナミクス変化への核内Arpの関与を明らかにすることを目的としている。当該年度では、1)出芽酵母細胞核のクロマチン空間配置におけるArpの機能解析、2)培養細胞を用いた、核内部空間構築におけるArpの機能解析、を行なった。これらの解析の結果、出芽酵母Arp6が、クロマチンの核膜近傍への空間配置に関与することを明らかにした。特に、リボソームタンパク質遺伝子領域にArp6の特異的な結合が観察され、arp6欠損株では、リボソームタンパク質遺伝子の発現上昇と核内配置の変化が観察された。これらの結果は、Arp6が核内部の機能構造形成おいて新規な機能を担うタンパク質であることを示している。
シオニズムの歴史社会学-東方ユダヤ人と西欧ユダヤ人の差異と相互関係に注目して

今年度は、5月にニューヨーク大学で開かれた国際学会で研究成果を発表するとともに、YIVO(イディッシュ科学)研究所にて関係資料を収集した。全体にわたってそこで集めた資料と前年度集めた資料の分析に本格的にあたり、以下の成果を出した。1)ロシア帝国におけるシオニズムに関して、それがいかなる国際秩序を描いていたかを析出した。具体的にはとしては、下記の研究論文(1つ目)と共著書して結実した。2)昨年度に収集した『ラスヴェト』誌をさらに分析を進めた結果、そこで議論されていたシオニズムの特質に関して新たな側面を発見することができた。すなわち、そこにおいて、ユダヤ人の定義、本質、内容等に関してほとんど議論されていない一方で、社会経済的な問題が議論されていたということである。1つに、このシオニズムが、世俗化を背景として伝統的なユダヤ教の求心力が低下することが予測された中で、ユダヤ人を取り巻く社会経済的な構造の変化によって出現することとなったユダヤ人大衆の問題をその中心に据えていたということがこれには関わっている。しかし、他方で、本質について不問に付したまま、社会経済的な条件さえ整えばユダヤ人がユダヤ人としてとどまり続けるとする信憑、すなわち、家族的な紐帯としてユダヤ人意識が確固として存在しているはず他とする想定は、ナショナリズムとしてのシオニズムの特質として挙げることができるのである。こうした点については、現在投稿論文を準備中である。本年度は、上記テーマを検証していくための中心的資料となるシオニストによるロシア語文字媒体(新聞や月刊誌の記事、パンフレットや本)の収集は、マイクロフィルムも含め、イスラエル国内の図書館にあるものに関しては(現存しているものはイスラエル国内、とりわけ国立図書館に概ね揃つている)概ね完了した。新聞や月刊誌に関しては、1898年から1923年にかけての該当紙(誌)(『ヴォスホート』『ブードゥシュノスチ』『イェヴレイスカヤ・ジーズニ』『ラスヴェト』等)の記事のタイトルなどに目を通し、重要と思われる記事を複写し、読み込みを開始した。現時点ではそれに基づく明確で体系的な研究成果は出ておらず、来年度以降の課題であるが、これまでの検証から以上のテーマに関して明らかになった、あるいは示唆されたことは以下の点である。1、調査した期間を通して、シオニズム機関紙において常にロシア帝国の政治社会やユダヤ社会に関する記述が一定のスペースを割かれており、パレスチナを目指すシオニズムが、ロシア帝国でのユダヤ人の位置についての関心を常に持ち続けていたことが窺えた。2、アラブ人による初めての本格的な反シオニズム暴動は1920年に発生したが、その頃まで、アラブ人に関する記述はほとんど見当たらない。パレスチナに関する記述は毎号決まったスペースに書かれているが、ユダヤ人入植地の様子についての記述が大半である。ただし、とりわけ青年トルコ革命の時期には(パレスチナは当時オスマン帝国支配下にあった)、オスマン帝国(「トルコ」)やオスマン帝国のユダヤ人に関する記述がある程度存在しており、オスマン帝国という帝国の視野でシオニズムが進められていたこともまた示唆された.本年度、上記テーマを検証していくための中心的資料となるシオニストによるロシア語文字媒体(新聞や,月刊誌の記事、パンフレットや本)の収集について、前年度に行ったものを補足する形で、ほぼ揃えることができた。前年度に引き続いて、新聞や,月刊誌に関しては、1898年から1923年にかけての該当紙(誌)(『ヴォスホート』『ブードゥシュノスチ』『イェヴレイスカヤ・ジーズニ』『ラスヴェト』等)の記事のタイトノセなどに目を通してチェック、し、一覧表を作ったうえで、読み込みを開始した。本年度までに見出された論点は以下のとおりである。すなわち、ロシア・シオニズムにおいては、国家とネーションが分離して考えられており、そこでのナショナリズムは、国家主権とは別の次元での、集合的な権利の問題であったことが見出された。なお、前年度までの成果を中心に、6月に国際学会であるThe Association for Israel Studiesの年次大会において発表を行った。また、10,月に日本社会学会年次大会で、11月に日本ユダヤ学会関西例会において発表した。リベラル・ナショナリズムに関する2著を比較し、論じたものを、11に示す業績として発表した。この点は、上記のナショナリスト自身が描くナショナリズムの文脈を考える上で重要な観点であり、ナショナリストが自らの思想・運動を公共的なものと考える一方で、そうした文脈を共有しない者からはそれが全くの誰弁に聞こえてしまう齟齬を考える第一歩となるものである。

しかし、他方で、本質について不問に付したまま、社会経済的な条件さえ整えばユダヤ人がユダヤ人としてとどまり続けるとする信憑、すなわち、家族的な紐帯としてユダヤ人意識が確固として存在しているはず他とする想定は、ナショナリズムとしてのシオニズムの特質として挙げることができるのである。こうした点については、現在投稿論文を準備中である。
統計モデルによる地震活動監視システム実用化への研究

大地震発生前の地震活動の異常については、これまで様々な研究が行われてきたにもかかわらず、現実には、これらを事前に検知するシステムが実用化されて役立っている例はない。本研究では、異常を検出するシステム、その基盤となる地震発生事前確率の推定、表示システムの3点について、検討した。第一の異常検出では背景活動に着目し、活発化等の異常を検出するシステムを開発した。地震活動の最も顕著な統計的性質は、時・空間的に集中することであり、その分布はOgata(1998)の提唱したETASモデルによって表現される。すなわち地震活動は、独立な背景活動と、統計的に独立でない活動(余震)とからなる。これまで行われてきた地震活動の解析では、この両者を分離せずに扱うことが多く、異常活動を見逃す、異常でない活動を異常と判断する、などの可能性が高い。本研究では、強度関数を用いた確率的分離を行い、客観性を担保した。人工地震カタログに対して同じ解析手法を用いたシミュレーションを行って比較し、SAIC(活動度の変化を考慮したモデルと活動度一定のモデルとのAICの差)が-8未満の静穏化、或いは10を超える活発化に注目すべきであるとの結論を得た。第二の事前確率の推定については、これまで提案されている8モデルについて、歴史地震活動との比較を行い、活断層データに基づく人工地震カタログの空間平滑化モデルが最も良い結果を与えることを示した。第三の表示法については、アニメーションを用いることとし、実際にb値の空間分布などのアニメーションを作成した。これまで行われてきた地震活動の解析では、この両者を分離せずに扱うことが多く、異常活動を見逃したり、異常でない活動を異常と判断してきた可能性が高い。また分離する場合には、Reasenberg(1985)の除群法が広く使われているが、この手法は経験則に基づくもので、無理やり分離が行われることや、パラメターの設定に任意性があるなどの問題がある。すなわち、個々の地震については、それが統計的に独立な事象である確率と、独立でない事象である確率とを求める。例えば、独立な地震の個数のかわりに、独立な地震数の期待値(独立な事象である確率の総和)を用いれば、むりやり分離する必要はなく、客観的に解析することができる。本研究では、まず独立な背景活動の定量化を行うとともに、人工地震カタログに対して同じ解析手法を用いたシミュレーションを行い、比較した。その結果、異常な活発化がしばしば見られることがわかった。これは、本研究の手法の限界によるものか、或いは背景活動が一定ではないためかと考えられる。一方、異常な静穏化は偶然生じる程度の頻度でしか起らなかった。これらの結果を用いて、気象庁の一元化地震カタログの解析で現れる異常活動をまとめた。第二の事前確率の推定については、これまで提案されている8モデルについて、歴史地震活動と比較した。

中地震および小地震それぞれの空間平滑化モデル、Frankel(1995)の重みでこれらを重ね合わせたモデル、垣見他の地域区分を用いて、中地震および小地震のそれぞれの地震活動から推定するモデル、損害料率算定会の地域区分モデル、および活断層とGPSデータそれぞれに基づくモデルである。歴史地震データを用いて、それぞれのモデルの尤度を計算した。GPSモデルのように、確率の絶対値の予測が必ずしも良くないものがあるため、モデルの確率をk倍して比較し、尤度が最も高くなるようにkの値を決めた。このようにしてAICを用いて比較した結果、活断層データに基づく人工地震カタログの空間平滑化モデルが最も良い結果を与えることがわかった。データを期間によって二分しても、このモデルは安定して良好な結果をもたらした。第三の表示法については、アニメーションを用いることとし、実際にb値の空間分布などのアニメーションを作成した。
戦後社会におけるジェンダー・セクシュアリティ秩序の形成と新たな親密性の構築

本研究では、日本とフィンランドという、女性同性愛に対し異なる抑圧形態をもった二つの国について、近現代社会における同性愛の法的処罰、西欧の性科学の影響、レズビアニズムの表象、ホモフォビアの現れ方などを比較した。とりわけ、フィンランドにおいて同性同士のパートナーシップが認められていく経緯を参照しながら、戦後日本におけるジェンダー・セクシュアリティ秩序の形成と、新たな親密性が生み出される社会的条件や政治的力学について検証した。本研究は、近代西欧に由来する「同性愛」という知が、非西欧社会における同性同士の親密な関係にいかなる影響を及ぼしたか、とくに「レズビアン」などと呼ばれてきた女性同士の親密な関係に注目し、近現代社会を支えたジェンダー・セクシュアリティ秩序の生成と、その過程で生み出されてきた、従来の家族とは異なる新たな親密性について考察することを目的とする。その際、日本とフィンランドという、女性同性愛に対し異なる抑圧形態をもった二つの国を比較し、近代的性規範を構成する多様で矛盾に満ちた要素を浮かび上がらせながら、新たな親密性が生み出される社会的条件や政治的力学について検証する。平成22年度は歴史資料をもとに、異性愛の規範化と表裏一体として起こった同性愛批判のプロセスを考察するため、日本においては断続的に、またフィンランドについては夏期に現地に滞在し、関連資料を収集した。日本については、国立国会図書館等で、戦後の同性愛にかんする新聞・雑誌記事、エッセイ等を収集した。資料調査の結果、日本のマスメディアでは1970年代以降、男性的なレズビアンが不可視化されていき、(女性的な)女性同士のセックスのみに注目する記事が大半になっていったことが明らかになった。フィンランドでは、同性愛の罪で起訴された女性の裁判記録およびそれらの裁判にかんする新聞・雑誌記事を収集、翻訳の予定であったが、これらについてはすでに当地の研究者が収集・調査を進めていることが判明したため、主に、同性婚/同性間パートナーシップ法に関連する資料をフィンランド国立図書館等で収集した。その結果、フィンランドでは国家が率先して同性婚の導入を検討していること、しかしそれは必ずしも当事者の要望を反映したものではないことが明らかになった。これらの調査から得られた成果をもとに、2010年10月にはオランダのライデンで、日本における女性同士の親密な関係の分節化を論じる研究報告を行った。また2011年2月には、これまでの研究の集大成となる単著を刊行した。その際、日本とフィンランドという女性同性愛に対し異なる抑圧形態をもった二つの国を比較し、近代的性規範を構成する多様で矛盾に満ちた要素を浮かび上がらせながら、新たな親密性が生み出される社会的条件や政治的力学について検証する。平成23年度は22年度に引き続き、異性愛の規範化およびそれと表裏一体として起こった同性愛批判のプロセスを考察するため、日本については国会図書館や日本近代文学館等で関連資料を収集した。特に22年度調査から明らかになった戦後日本のジェンダー・セクシュアリティ秩序において特徴的と言える、男性的な女性の社会的位置づけについて、戦前の資料も含めて調査、研究を行い、その成果をクィア学会第4回大会で報告した。男性的な女性については現在、クィア・スタディーズで扱われる重要なトピックの一つである。セクシュアル・マイノリティのみならず異性愛者も含みこむカテゴリーとして、現在、フィンランドも含め世界的に「クィア(Queer)」の概念が広く、急速に浸透しつつある。同性婚等、従来の家族とは異なる新たな親密性について先鋭的な議論を行っているのもこの研究領域である。そこで、フィンランドでの現地調査を平成24年度に延期することにし、Queerについて集中的に文献調査を行った。戦後日本については、セクシュアリティ規範の形成にかかわる事象について広く文献調査を行った結果、同性愛批判言説は、戦後間もなく発刊された雑誌等に見られるポルノグラフィックな性描写の氾濫、赤線の成立と廃止、純潔教育に見られるような「正しい」異性愛教育、フリーセックス・ブームなどと密接に関連しつつ、戦後日本のセクシュアリティ規範の一翼を担っていたことが明らかになってきた。本研究の最終年度となる平成24年度は、このプロセスを現代まで射程を広げて解明するため、引き続き歴史資料の収集を行う。その際、特に、これまでのセクシュアリティ研究で見過ごされてきた、日本のレズビアン・サブカルチャーに焦点を当てて調査する。また、フィンランドでは、同性婚/同性間パートナーシップ制度、およびセクシュアル・マイノリティのサブカルチャーにかんする現地調査を行う。

本研究は、近代西欧に由来する「同性愛」という知が、非西欧社会における同性同士の親密な関係にいかなる影響を及ぼしたか、とくに「レズビアン」などと呼ばれてきた女性同士の親密な関係に注目し、近現代社会を支えたジェンダー・セクシュアリティ秩序の生成と、その過程で生み出されてきた、従来の家族とは異なる新たな親密性について考察することを目的とする。その際、日本とフィンランドという女性同性愛に対し異なる抑圧形態をもった二つの国を比較し、近代的性規範を構成する多様で矛盾に満ちた要素を浮かび上がらせながら、新たな親密性が生み出される社会的条件や政治的力学について検証する。これまでの本研究から、戦後日本については、セクシュアリティ規範の形成にかかわる事象について広く文献調査を行った結果、同性愛批判言説は、戦後間もなく発刊された雑誌等に見られるポルノグラフィックな性描写の氾濫、赤線の成立と廃止、純潔教育に見られるような「正しい」異性愛教育、フリーセックス・ブームなどと密接に関連しつつ、戦後日本の新たなジェンダー・セクシュアリティ秩序の一翼を担っていたことが明らかになった。本研究の最終年度となる平成24年度は、このプロセスを女性同性愛に対するホモフォビアや「レズビアン」という主体が顕在化する1970年代まで射程を広げて解明するため、国会図書館等で関連資料を収集し、調査、研究を行った。その成果をクィア学会第5回研究大会で報告した。フィンランドでは、夏に現地調査を行い、同性同士のパートナーシップ制度やレインボー・ファミリーなど、新たな親密性がいかなる社会的条件のもとに生み出されるのか明らかにするため、特に重要と思われるセクシュアル・マイノリティの「人権」をめぐる問題に着目しながら、関連する資料や文献を国立図書館等で収集した。これまでの調査から、日本における同性愛批判の言説の浸透が、それ自体単独ではなく、戦後セクシュアリティ規範の形成という流れの中に組み込まれていたことが、より具体的に解明されてきたから。すなわち、同性愛批判言説は、ポルノグラフィックな性描写の氾濫、「正しい」異性愛教育、フリーセックス・ブームなどと関連しつつ、戦後日本のセクシュアリティ規範の一翼を担っていたことが明らかになってきた。また日本の場合、ジェンダーの越境、特に女性から男性への越境について、1970年代以降厳しく批判されるようになったこと、また、そのような男性的女性の扱いに、日本のジェンダー・セクシュアリティ秩序の特徴があることがわかってきたから。24年度が最終年度であるため、記入しない。クィア・スタディーズの急速な進展のため、その資料収集および読解に予想以上に時間がかかり、フィンランドの調査についてはまだ十分には進展しているとはいい難い状況である。ただ、クィア概念の浸透はグローバルな現象であり、フィンランドもその影響下にあること、また同性婚等新たな親密性についての議論が最も活発になされているのがこの研究領域であることから、必要不可欠な作業であると考える。そこで、当初予定していたフィンランドでのインタビュー調査の規模は縮小し、文献調査の充実を優先させる予定である。
超音波とフェロモンを評価に加えた実験動物におけるより精度の高い愛護と福祉の確立

身の危険を感じた個体が発する超音波「アラームコール」や化学物質「アラームフェロモン」は、それらを受容した同種他個体に不安を惹起し警戒させることがマウスやラットにおいて示されており、実験動物を取り扱う際に配慮する必要がある。しかしながら、実際の実験や飼育の操作において、それらが一体どの程度の影響を及ぼしているのかについては、ほとんど考慮されていないのが現状である。そこで本研究では、超音波とフェロモンの効果を加味した世界に先駆けたより精度の高い実験動物の愛護と福祉の確立を目指す第一歩として、その基盤となる基礎的実験データを収集することを目的としている。平成30年度は、アラームコールの研究ではラットにターゲットを絞り、発声における神経制御機構の解明の一環として、ストレス反応と社会行動の両方に関与することが近年注目の的である脳内制御物質バソプレッシンの2種類のレセプター(V1aとV1b)がアラームコール発声に同時関与するという画期的な事実が発見された。しかしながら、そのメカニズムを整合性をもって説明するにはデータが足りず、追加実験が必要と考えられた。また、超音波録音ならびに再生をラットの行動実験と融合させた新たな実験系を工夫し、今までの研究で見過ごされてきたアラームコールがラットの情動状態を変化させる確証を見出した。アラームフェロモンの研究では、マウスについて調べるその前段階として、ホームケージ、他マウスケージ、及びラットケージの床敷きの揮発性成分を提示した際の聴覚性驚愕反射(突然の大きな音に対するビックリ反射で不安の増加により増強する)を比較した。その結果、反射の減少(ホームケージの成分提示)や増加(ラットケージの成分提示)が再現性良く観察され、この生物検定系がマウスの揮発性物質提示による情動変化を的確に反映することが統括的に実証された。本研究の事業初年度である平成28年度に研究拠点の移動があり、当初予定していた実験環境とはまったく違った状況下での実験のスタートを余儀なくされたことが理由のひとつである。移動先の施設には十分に広い実験スペースが用意されておらず、制約の多い実験環境のもとで細々と実験を行わなければならなかった。改修工事によって事業2年目である平成29年度のはじめにようやく実験に十分な状況が整った。小型の機材を主体とし実験スペースをそれほど要しないアラームコールの実験とデータ解析については、事業の比較的初期から場所を何とか確保して継続的に実施することができたが、アラームフェロモンに関しては、クリーンな環境下でのフェロモン物質の採取、そして大型の機材と比較的広いスペースが実験に必要なことから、平成29年度の夏以降にようやく本格的に研究活動を始動することができた。アラームフェロモンの研究はマウスに照準を絞り、不安の増強を反映することで知られる聴覚性驚愕反射増強反応を指標とする実験系の確立を第一目標として作業を進め、成果を挙げつつ研究を進めた。ところが、今度は研究室の移転が大学側の方針により突然決まり、平成30年7月から約半年間をかけて、その立案と実行に労力を割かれ、実験に費やすはずの貴重な時間を否応なく削減せざるを得なかった。このことは全くの想定外であり、また避けることのできない事態であったため、本研究の事業期間の遅延理由のひとつとなった。以上の結果、本事業は1年間の期間延長を余儀なくされた。アラームコールに関しては、マウスでは実験環境下での発声は残念ながら従来と同様に観察できなかったので、ラットのアラームコールの研究に照準を絞り、その発声や聴取のメカニズムを行動学的に解明することを目指す。具体的には、バソプレッシンが脳内制御物質として2種類の受容体を同時に介してアラームコールの発声に寄与している証拠が得られつつある点を踏まえ、更なる証拠固めのための実験に挑む。また、超音波を録音しそれを高い水準で再生する技術を応用してアラームコールを録音再生しつつ、ラットの情動状態を行動学的に定量化する特殊なオープンフィールドテストを同時に行うことによって、アラームコールの持つ不安増強効果を明確に示すことに成功したことを発展させ、同一の実験系を用いてラットの飼育環境に存在するその他の超音波刺激の中から重要と考えられるものを厳選して録音再生しつつオープンフィールドテストを行い、得られたデータの解析結果をアラームコールの効果と比較検討する。アラームフェロモンに関しては、マウスにおいて聴覚性驚愕反射増強現象をフェロモン物質の受容を確認できる信頼性の高い生物検定系の柱として実験を行い情報を収集する。具体的には、フェロモン物質の化学的物質性状とその効果、可能ならば系統差、等を調べ、今までに得られている知見やラットのアラームフェロモンに関する情報と照らし合わせ考察する。また、可能な限りその他の行動学的な生物検定系(オープンフィールドテスト等)も実施して、複合的なフェロモン効果の評価も視野に入れ進める。そして、得られたデータを統合的に分析して考察し、アラームコールやアラームフェロモン、あるいはそれ以外の飼育環境中や実験環境中に存在する超音波や化学物質が、マウスやラットを実際に取り扱うエリアにおいて日常環境下でどのような影響を及ぼしているのかについて挑戦的な評価を試みる。身の危険を感じた個体が発する超音波「アラームコール」や化学物質「アラームフェロモン」は、それらを受容した同種他個体に不安を惹起し警戒させることがマウスやラットにおいて示されており、日本学術会議が各研究機関の機関内規程制定のために定めた「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」にも記述があることから、実験動物を取り扱う際に配慮する必要がある。

しかしながら、実際の実験や飼育の操作において、それらが実験動物にどのような影響を及ぼしているのかについては、ほとんど考慮されていないのが現状である。そこで本研究では、超音波とフェロモンの効果を加味した世界に先駆けたより精度の高い実験動物の愛護と福祉の確立を目指す第一歩として、その基盤となる基礎的実験データを収集することを目的としている。平成28年度は、アラームコールとアラームフェロモン、いずれの研究においてもマウスにターゲットを絞って進められた。成獣ラットは、様々なストレス刺激に対して「22-kHz calls」と呼ばれる超音波帯域のアラームコールを発することが知られており研究が進んでいるが、マウスの成獣におけるアラームコールの報告は今のところ存在しない。そこで、様々なストレス刺激を使ってマウスのアラームコールが存在するのか否かを検討する実験を行い一定の成果を得つつあり、現在も進行中である。また、マウスのアラームフェロモンについては、現在まで検討が不十分なフェロモンがマウスの行動に及ぼす変化を精査するべく、不安の増強を反映することで知られる聴覚性驚愕反射(突然の大きな音に対するビックリ反射)増強反応を指標とする実験系の装置の準備やセッティングと実験環境の整備を行い、ほぼ完了することができた。最大の理由は、研究拠点の移動により、当初予定していた実験環境とはまったく違った状況下で実験することを余儀なくされたことである。移動先の施設には十分に広い実験スペースが用意されておらず、共用の実験施設は存在するものの、改修工事によって数ヶ月間にわたって利用不能であった。年度末に至り、ようやく実験を実施することのできる十分に広いスペースを確保することができた。したがって、小型の機材を主体とし実験スペースをそれほど要しないアラームコールの実験とデータ解析は、当初の目標には届かなかったものの、おおむね計画どおりに実行することができた。それに対し、クリーンな環境下でのフェロモン物質の採取、および大型の機材と比較的広いスペースを必要とするアラームフェロモンの実験は、年度末までそれに適した場所を得ることができなかったため、実験系の立ち上げに際し大幅に時間をロスしてしまい、年度内に具体的な実験を行うに至らなかった。身の危険を感じた個体が発する超音波「アラームコール」や化学物質「アラームフェロモン」は、それらを受容した同種他個体に不安を惹起し警戒させることがマウスやラットにおいて示されており、日本学術会議が各研究機関の機関内規程制定のために定めた「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」にも記述があることから、実験動物を取り扱う際に配慮する必要がある。そこで本研究では、超音波とフェロモンの効果を加味したより精度の高い実験動物の愛護と福祉の確立を目指す第一歩として、その基盤となる基礎的実験データを収集することを目的としている。平成29年度は、まずアラームコールに関しては、マウスの成獣におけるアラームコールの報告は存在しないことから、様々なストレス刺激を使ってマウスのアラームコールの存在を検討する実験を行ったが、発声を観察することはできなかった。
高周波電波パルスの空間分布計測及び波源探査に関する研究

メタマテリアル構造を持つ電波吸収板に入射した高周波電波(平面波、球面波)の電界振幅・位相の2次元分布を、表面に配列した抵抗により精度よく計測できることを確認した。2.4 GHz帯の電波吸収板(30 cm×30 cm)を設計・試作し、複数の計測点(8×8)を設け入射電波振幅・位相の2次元分布を高速に計測・可視化するシステムを構築した。また、計測した分布にアレイ信号処理を適用することで、波源位置の特定を行い、その性能を評価した。マッシュルーム型メタマテリアル構造を持つ薄型電波吸収板に入射した電波の電力は表面の電極間に挿入した抵抗で吸収されるが、このとき入射波は反射(散乱)されないため、各抵抗の両端に誘起される電圧の振幅・位相は入射電波(電界)の振幅・位相にそのまま比例するはずである。理論解析及び電磁界シミュレーションにより、平面波に対して、各抵抗の電圧振幅・位相を計測することで入射電波の強度・位相分布を求められることを確認した。このとき、有限サイズの吸収板を用いると端部における散乱により入射電波の分布が板面上で不均一となることが明らかとなったが、端部における抵抗値や電極形状を調整することで、散乱を抑制できることが分かった。また、電波吸収板に球面波が入射したときに、板面上で如何に吸収されるかを、理論的に解析した。高速フーリエ変換を用いて球面波を平面波の合成として表すことで、平面波(斜め入射)の反射率・吸収率に基づいて球面波の反射・吸収を高速に計算する手法を開発し、近傍に置かれたダイポールアンテナ等から放射された球面波の吸収、計測特性を評価した。遠方電磁波源からの平面波(2.4 GHz帯)を計測するための小型電波吸収板(30 cm×30 cm)を設計・試作し、電波暗室でその吸収特性を評価した。吸収板の裏面には8×8=64箇所の計測点を2次元状に配置し、各点から水平及び垂直偏波の信号を直接引き出して計測できるようにした。その際、高周波スイッチにより計測点を高速に切り替えることで、1台のスペクトラムアナライザにより入射波の2次元強度分布を高速(数秒程度)、高感度(ー100 dBm以下)に計測できるシステムを構築し、動作を確認した。標準アンテナを用いて平面波を照射し、計測性能を評価した。一方、吸収板面上の振幅・位相分布に対して、干渉計法及びMUSIC法を用いて、平面波の到来方向を推定する手法について検討を行い、精度を確認した。昨年度に引き続き、マッシュルーム型メタマテリアル構造を持つ薄型電波吸収板の表面に入射し吸収された電波の電力・位相を計測する手法を、理論及びシミュレーションにより検討した。特に、遠方電波源から到来する平面波(斜め入射)に対して、吸収板表面電極間に挿入した抵抗に生じる電圧が、入射波電界の抵抗方向成分に比例することを示した。一方、球面波の平面波展開に基づき、近傍電波源からの球面波に対しては吸収体表面に配列された抵抗が2次元センサアレイとして働き、各抵抗の電圧振幅・位相を計測することで入射電界の振幅(電力)・位相分布を精度よく求められることを確認した。また、2.4 GHz帯の電波を計測するための小型電波吸収板(30 cm×30 cm)を設計・試作し、電波暗室でその吸収特性を評価した。その際、有限サイズの吸収体端部における抵抗値や電極形状を調整することで端部での散乱を抑制し、入射電波分布が板面上で乱れないようにした。吸収板の裏面には8行×8列=64箇所の計測点を2次元状に配置し、各点の水平及び垂直偏波を高周波スイッチにより高速に選択して2チャンネルスペクトラムアナライザに入力することで、各計測点の電圧振幅、及び吸収体上に設けた基準点との位相差を計測できるようにした。これにより入射波の2次元電力・位相分布を高速(約1秒)に計測するシステムを構築し、標準アンテナを用いて球面波を照射することで計測性能を評価した。さらに、吸収板面上の振幅・位相分布に対して干渉法及びMUSIC法を用いることで、平面波の到来方向及び球面波の波源位置を推定する手法について検討を行い、予備的な実験を行った。電波吸収板による平面波(垂直入射、斜め入射)及び球面波の吸収及び計測特性に関しては、理論及びシミュレーションによる解析が予定通りに進んでいる。1 m程度離れた電波源からの球面波を計測するための大型(60 cm×60 cm)電波吸収板の試作については、高周波スイッチネットワーク及び振幅・位相計測用回路を組み込んだ多層基板の製作が製造精度上またコスト的に困難であることが判明したため、小型電波吸収板(30 cm×30 cm)に変更して試作したが、小型であっても数十cm離れた電波源からの球面波の計測特性を十分に評価できることを確認した。また、試作電波吸収板と2chスペクトラムアナライザを組み合わせることで、入射電波の振幅(電力)及び位相分布を高速かつ高感度に計測するシステムを構築し、標準アンテナを用いた計測精度の評価を順調に進めている。一方、振幅・位相分布に基づく入射平面波の到来方向推定手法、及び球面波の波源位置推定手法の検討を理論及びシミュレーションにより進めており、干渉法やMUSIC法を適用した場合の波源探査性能を評価している。また上記システムに波源探査手法を組み込み、実測結果に基づく波源探査実験を行っている。

マッシュルーム型メタマテリアル構造を持つ薄型電波吸収板の表面に入射した不均一な空間分布を持つ電波に対して、電波吸収板による2次元電力・位相計測精度を理論及びシミュレーションにより解析した。複数の近傍電波源(ダイポールアンテナ)から放射される球面波の干渉パターンを精度よく計測できることを確認した。一方で、電波源が電波吸収板に近接した場合、電波吸収板からの反射及び近傍界の影響により、計測に影響が生じることが分かった。また、吸収板上で計測された電波の空間分布(複数地点の振幅・位相)に対し、アレイ信号処理を適用することで、球面波を放射している近傍電波源に対して、その位置及び向きを推定する手法を検討した。MUSIC法を用い、複数のインコヒーレント波源及びコヒーレント波源の位置及び向きを精度よく特定できることをシミュレーションにより確認した。2.4 GHz帯の電波に対する電波吸収板(30 cm×30 cm)を設計・試作し、裏面に14×14=196箇所の計測点を配置して、各計測点には水平及び垂直偏波の信号出力回路を設けた。各計測点からの信号を高周波スイッチにより高速に切り替え、順次ソフトウェア無線機に入力してダウンコンバージョンすることで、中間周波数の信号波形を直接取得できるようにした。信号波形をスペクトル解析し、振幅及び位相を高速に演算することで、入射波の2次元電力・位相分布を高速(1秒以内)に計測できるシステムを構築した。複数の標準ダイポールアンテナから球面波を放射し、振幅・位相を精度よく計測できること(電力誤差3 dB以内、位相誤差30度以内)、また計測結果を用いて波源位置を精度よく特定できること(20 cmの距離で誤差2 cm以内)を確認した。メタマテリアル構造を持つ電波吸収板に入射した高周波電波(平面波、球面波)の電界振幅・位相の2次元分布を、表面に配列した抵抗により精度よく計測できることを確認した。2.4 GHz帯の電波吸収板(30 cm×30 cm)を設計・試作し、複数の計測点(8×8)を設け入射電波振幅・位相の2次元分布を高速に計測・可視化するシステムを構築した。また、計測した分布にアレイ信号処理を適用することで、波源位置の特定を行い、その性能を評価した。小型電波吸収板による、遠方電磁波源から放射された平面波の吸収及び計測特性に関しては、理論及びシミュレーションによる解析が予定通りに進んでおり、併せて端部の散乱による影響の抑制対策も明らかにできるなど、順調に進展している。さらに、近傍から放射された球面波の吸収特性について、当初計画よりも前倒しで解析を進めており、従来理論解析が困難であった球面波の吸収特性を、高速に数値計算することに成功している。また、小型電波吸収板(50 cm×50 cm)の試作については、計測回路を含めた多層基板の製作に当初の想定よりも多額の経費がかかることが判明したため、30 cm×30 cmのサイズに縮小したが、入射平面波の計測性能には問題がないことを確認している。一方、入射電波の分布を計測する回路としては、当初予定していた高周波振幅・位相差計測用ICを実装した際に寄生成分の影響等により必ずしも想定する感度及び精度が得られないことが判明した。そのため、高周波スイッチとスペクトラムアナライザを用いることで、高精度・高速に吸収板面上の入射電波分布を計測するシステムを設計、試作した。強度分布の計測は実施したが、位相計測には対応できなかった。この点については、2入力同時計測可能なスペクトラムアナライザを用いることで、平成27年度に振幅・位相を含めた入射波分布の計測が可能になる予定である。
生体肺構造を組織工学的に模擬したハイブリッド人工肺に関する研究

本研究では,長期使用可能な人工肺の開発を目指し,そのアプローチとして細胞を組み込んだ人工臓器(ハイブリッド人工臓器)の基礎技術開発を目的とした.本年度は,生体組織に類似した微細繊維構造を紡糸する有効的な方法であるエレクトロスピニング法を用い,複雑な形状を有する人工臓器に対し,均一に繊維性の細胞足場(Scaffold)を堆積させ,目的部位にScaffoldを堆積させるシステムの構築を行った.Scaffold材料としてセグメント化ポリウレタンを使用し,任意に繊維の噴射方向を制御するため,電界の強さと繊維の噴射方向の関係を検討した.高分子溶液濃度14.5%,噴射距離15.0cm,印加電圧値7.0kVの条件下において,噴射距離間に様々な大きさの電界を加えることにより,噴射方向の制御が可能であり,目的部位へのScaffold構築が可能であった.また人工臓器表面に堆積したScaffoldは細胞外マトリックスに類似したナノからマイクロスケールの均一な繊維径を有していた.しかし,大気中の温度や湿度の影響から十分な再現性を得るには至らなかった.次に実際の生体肺に掛かるせん断応力を考慮した上で評価用モデル肺を構築した.そして,その内面にScaffoldのコーティングを施し,正常ヒト臍帯静脈内皮細胞を播種させ,リアルタイムで細胞挙動の観察を行った.その結果,人工肺の流入口に掛かるせん断応力約10Paを加えても,Scaffoldの構造は変化せず,耐久性があることが実証された.また細胞の増殖能は静置培養と比較しても差が生じず,流動条件下でも十分に細胞が伸展,増殖することが確認された。以上の検討により,組織工学と人工臓器の融合によるハイブリッド人工肺の実現に向けた基盤技術を形成することができ,in vivo評価にて,より詳細に検討していくことで長期使用可能な人工肺の開発が期待できると示唆された.生体組織の培養構築には、細胞が接着して分化・増殖するためのScaffold(細胞の足場)が必要である。我々は、「接触走性」と呼ばれる細胞の本能的な性質の利用を目指したScaffoldの開発を行ってきた。このScaffoldを円筒形に成形し、ラット腹部大動脈へ埋め込んだin vivo実験において、良好な組織化と同時にScaffoldの外壁から内腔面までを貫通する新生血管が発達する現象を確認した。このScaffoldを人工肺の血液接触面に構築し、内皮細胞による被覆とその主たる機能である抗血栓性を発揮させることが可能となれば、長期的な抗血栓性の劇的な向上が考えられる。対象とする人工肺内部における特殊な環境、用いる細胞を考慮し、それに最適化したScaffoldの最適な幾何学的構造を検討、設計し、実際に試作することを目的としている。今年度は、エレクトロスピニング法を用いて繊維性のScaffoldを作製し、作製条件と繊維形成の関係を検討および、水銀圧入法により微細繊維を備えたScaffoldの構造の詳細な検討を行った。またin-vitroにおけるScaffold上での細胞の増殖形態、Scaffoldと細胞の結合状況を観察することで組織工学的評価を行った。Scaffoldを構成する繊維径は高分子溶液流量および混合溶媒の二つの要素を調節することにより制御可能となった。作製したScaffoldの細孔径は細胞が繊維内部に侵入するための十分な大きさを備えていた。Scaffold表面上において良好な細胞増殖反応が確認された。以上の知見から、マイクロオーダーの繊維径を制御し、用いる細胞に最適な構造設計をすることにより、効果的に細胞を増殖させうることが示唆された。生体組織の培養構築には、細胞が接着して分化・増殖するためのScaffold(細胞の足場)が必要である。我々は、Scaffoldを人工肺の血液接触面に構築し、内皮細胞による被覆とその主たる機能である抗血栓性を発揮させることによる長期的な抗血栓性の劇的な向上を目的としている。対象とする人工肺内部における特殊な環境、用いる細胞を考慮し、それに最適化したScaffoldの最適な幾何学的構造を検討、設計し、実際に試作した。今年度は、昨年度に引き続きエレクトロスピニングシステムにより繊維性のScaffoldの試作条件と繊維径の関連性に関して入念な検討を行い、精密な繊維径制御のための条件設定を導くことができた。また、試作したScaffoldにおける細胞培養実験とその詳細な観察を行い、繊維径が細胞の移動、表面被覆へ与える影響を検討した。その結果、平滑な表面よりも繊維に接して接着した細胞は繊維をガイドとして移動範囲が広範に促進されることが確認された。また、人工肺への応用を考慮した基礎実験として、人工肺を模擬したチャンバーを樹脂により作成し、その中にScaffoldを設置、チャンバー内のScaffold上にて細胞培養が可能である事を確認した。今後はこのチャンバーでの実験を進め、コンプライアントなハウジング作成と流動下での細胞培養等を検討し、人工臓器のハイブリッド化を可能とする新たな知見の創出を目指す。本研究では,長期使用可能な人工肺の開発を目指し,そのアプローチとして細胞を組み込んだ人工臓器(ハイブリッド人工臓器)の基礎技術開発を目的とした.本年度は,生体組織に類似した微細繊維構造を紡糸する有効的な方法であるエレクトロスピニング法を用い,複雑な形状を有する人工臓器に対し,均一に繊維性の細胞足場(Scaffold)を堆積させ,目的部位にScaffoldを堆積させるシステムの構築を行った.Scaffold材料としてセグメント化

ポリウレタンを使用し,任意に繊維の噴射方向を制御するため,電界の強さと繊維の噴射方向の関係を検討した.高分子溶液濃度14.5%,噴射距離15.0cm,印加電圧値7.0kVの条件下において,噴射距離間に様々な大きさの電界を加えることにより,噴射方向の制御が可能であり,目的部位へのScaffold構築が可能であった.また人工臓器表面に堆積したScaffoldは細胞外マトリックスに類似したナノからマイクロスケールの均一な繊維径を有していた.しかし,大気中の温度や湿度の影響から十分な再現性を得るには至らなかった.次に実際の生体肺に掛かるせん断応力を考慮した上で評価用モデル肺を構築した.そして,その内面にScaffoldのコーティングを施し,正常ヒト臍帯静脈内皮細胞を播種させ,リアルタイムで細胞挙動の観察を行った.その結果,人工肺の流入口に掛かるせん断応力約10Paを加えても,Scaffoldの構造は変化せず,耐久性があることが実証された.また細胞の増殖能は静置培養と比較しても差が生じず,流動条件下でも十分に細胞が伸展,増殖することが確認された。以上の検討により,組織工学と人工臓器の融合によるハイブリッド人工肺の実現に向けた基盤技術を形成することができ,in vivo評価にて,より詳細に検討していくことで長期使用可能な人工肺の開発が期待できると示唆された.
歯肉縁下プラーク細菌叢を改善に導く新規抗菌物質の探索-LPS合成系からの挑戦-

LpxCはグラム陰性菌に特異的なリポ多糖合成系の第一段階に関わる酵素で、細菌の増殖や生存に必須であるので、新規抗菌薬開発の標的として有力視されている。本研究ではLpxC阻害剤CHR-12の各種口腔細菌に対する抗菌活性を調べた。大腸菌LPSやLpxC構造が類似しているA. actinomycetemcomitans等に対してCHR-12は顕著な増殖阻害やバイオフィルム形成阻害を示したが、P. gingivalis等に対しての阻害効果は弱かった。P. gingivalisリコンビナントLpxCを作製してその酵素活性測定系の確立を目指したが、大腸菌LpxC構造とは異なるためか困難であった。その結果、CHR-12はグラム陽性菌である口腔レンサ球菌に対する阻害効果は認められなかったが、グラム陰性菌であるAa、Cr、Ec、Fnに対しては110μg/mLの濃度で大腸菌と比較して同等の阻害効果が認められた。またCHR-12は10μg/mLの濃度でAaのバイオフィルム形成を阻害したことからLPSのバイオフィルム形成への関与が示唆された。一方、昨年度予想した通り、LPS構造が大腸菌のそれとは異なるCo、Pg、Pi、Pnに対しては100μg/mLの濃度でも阻害効果が弱かった。大腸菌必須遺伝子lpxCと各種口腔細菌のlpxCホモログ遺伝子候補、またそのCHR-12に対する阻害効果とを比較した結果、Pgをはじめ、腸内細菌群と異なるBacteroides属細菌のLpxCの構造と機能はとても興味深い。歯周病の発症と進行には歯肉縁下プラーク中のグラム陰性細菌の割合の増加が深く関わっている。グラム陰性細菌に特有なリポ多糖体(LPS)は歯周病の炎症や組織破壊に関わっている。本研究ではLPS合成系を阻害することで、歯肉縁下プラークのグラム陰性細菌を抑制し、歯周病の症状改善に繋げることを目的とした。そこで、PgからlpxCホモログ遺伝子候補を特定して、Brevibacillus Expression Systemベクター系で、PgLpxCリコンビナント蛋白発現を行った。その結果、PgのLpxCリコンビナント蛋白発現が認められ、蛋白結晶化、X線結晶解析などにおいてPgLpxCの構造と機能解明に関する足掛かりを得た。PgリコンビナントLpxC蛋白を用いて、Hernick Mの方法(Methods Mol. Biol. 2011;739:123-33)を基にその酵素活性測定を試みたが、既存の基質ではPgのLPSの脂肪酸の構成が異なるためか活性測定系の確立には至らなかった。さらにメトロニダゾール(MNZ)について臨床分離株PgとPiの感受性およびメトロニダゾール耐性遺伝子nimの有無についても調べた。それぞれのMICはPgでは0.016μg/mL0.064μg/mL、またPiでは0.0160.125μg /mLで、いずれもMNZ感受性であった。またいずれからもnimは検出されなかった。MNZは我が国でも歯周病の治療薬として有効であろう。平成25年度の研究成果を基にして今年度はさらにLpxC阻害剤CHR-12の各種口腔細菌に対する阻害効果およびA. actinomycetemcomitansのバイオフィルム形成阻害効果を調べた。昨年度各種ゲノム配列やLpxCの構造の違いから予想した通り、LpxC阻害剤CHR-12の細菌増殖阻害効果に違いが認められた。LpxC阻害剤CHR-12は腸内細菌属LPSの構造をもつ細菌群には増殖阻害効果を認めたが、Bacteroides属の細菌にはLpxC阻害剤CHR-12は弱く、改良や新規阻害剤の開発が必要であることが判った。今年度はこれまでの研究成果について国内学会で発表できた。歯学Bacteroides属の細菌のLpxCとしてPgからlpxCホモログ遺伝子候補を特定して、今年度は大腸菌発現ベクターからBrevibacillus Expression Systemベクター系に替えて、PgのLpxCリコンビナント蛋白発現を試みている。PgのLpxCリコンビナント蛋白発現がようやく認められたのでこれを基に、腸内細菌群とは異なるLpxCの構造と機能について調べて行きたい。平成25年度の研究実施計画はほぼ順調に進んでいる。その中で歯周病細菌P. gingivalis(Pg)のLPSの化学構造は、大腸菌をはじめとする腸内細菌科に属するグラム陰性菌のLPSのそれとは大きく異なっている。LPS合成系の第一段階のキーエンザイムであるLpxCを比較すると歯周病細菌は大腸菌LPSの化学構造が似ているものと異なるもので2つのグループに分類されるという興味深い分析結果が得られた。大腸菌および緑膿菌LpxCを阻害する化合物であるCHIR-090に類似するCHR-12の阻害パターンも予備実験ではLpxCの構造が異なるPgは比較的阻害しにくいことが判り、新しい知見が得られつつある。

1)課題である歯周病細菌A. actinomycetemcomitans(Aa)およびP. gingivalis(Pg)それぞれのLpxC発現ベクターの構築を引き続き行い、歯周病細菌リコンビナントLpxCを作製・精製する。3)大腸菌および緑膿菌に対してLpxCを阻害する化合物であるCHIR-090の類似化合物CHR-12について歯周病細菌AaおよびPgなどに対する増殖阻害効果およびバイオフィルム形成阻害効果について調べる。併せてリコンビナントLpxCに対する阻害効果も調べたい。PgのLpxCの酵素活性測定のための合成基質の改良や酵素活性方法の改善に当てたい。今年度は海外における学会での研究成果発表および最新の研究情報収集また学会中に海外研究者との研究打ち合わせのための海外出張旅費に当てたい。順調に25年度は研究計画を進めることができた。ただし、A. actinomycetemcomitans(Aa)およびP. gingivalis(Pg)、それぞれのLpxC発現ベクターの構築を行ったが、従来の大腸菌での発現系では十分なリコンビナント蛋白の発現が得られなった。そのため、次のステップの精製やLpxCの活性測定系の確立のための研究経費が次年度への繰越となった。従来の大腸グラム系から陽性菌Brevibacillus ExpressionSystemベクター系に代えてLpxC発現を行い、さらにリコンビナント蛋白の精製を今年度試みたい。