hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
未知のポリＡＤＰ－リボシル化タンパク質の同定、修飾部位決定と生物学的意義の解明

ポリADP-リボシル化の生物学的な意義は、DNA修復以外にはまだ不明な点が多い。特にin vivoにおけるポリADP-リボシル化のアクセプター蛋白質の同定から機能を調べることとした。この目的にポリ(ADP-リボース)の分解酵素のノックアウト・ショウジョウバエを用いた。この変異体は、温度条件により羽化できるが神経変性症状を示し神経疾患のモデルともいえる。ポリ(ADP-リボース)抗体のアフィニティーカラム、アルカリ処理、2次元電気泳動法と質量分析を組み合わせて、ポリADP-リボシル化のアクセプター蛋白質候補を検索し、alcohol dehydrogenaseを含む複数の蛋白質を同定した。In vivoにおけるポリADP-リボシル化のアクセプタータンパク質の同定については、すでにポリ(ADP-リボ-ス)分解酵素(Poly(ADP-ribose) glycohydrolase)のショウジョウバエにおける欠損変異体を用いて、2次元電気泳動により分離されたスポットの質量分析により、数種類のタンパク質がその候補として分かってきた。そして、それらのタンパク質がin vitroでもポリADP-リボシル化されるかどうかについて調べてきた。今回は、もっとも顕著に認められたタンパク質として同定されてきたショウジョウバエのAlcohol dehydrogenase (ADH)について調べた。大腸菌でショウジョウバエのADHを生合成させて精製後、ヒトポリ(ADP-リボ-ス)合成酵素1(hPARP1)を用いてin vitroにおけるポリADP-リボシル化反応を行った結果、現在の条件ではポリADP-リボシル化が検出できないという結果を得た。これは、用いた酵素がヒト由来のPARP1であったことによる可能性と、in vivoにおいては、各種の補助タンパク質が必要であるなどとin vitroにおける反応条件とは異なるためであるかもしれないとの可能性がある。例えば、従来は、ポリADP-リボシル化反応は、PARP1については、DNAの切断端が必要であり、今回のように、分解酵素の欠損によるポリADP-リボシル化タンパク質の蓄積は、DNAの損傷とは異なる可能性が大きい。今後は、ショウジョウバエのPARPを用いた実験による検証を行う必要があると考えている。ポリADP-リボシル化の生物学的な意義は、DNA修復がこれまで主なものとして知られてきたが、実際にはまだ不明な点が多い。一方世界的には、現在ポリADP-リボシル化の特異的阻害剤が、抗がん剤としての臨床研究が始められている。エピジェネティックな調節機構として生化学的な基本的知見がまだ不足している。特にin vivoにおけるポリADP-リボシル化のアクセプター蛋白質の同定は、マウスなどにおいては、ポリ(ADP-リボース)の分解酵素のノックアウトは、胎生致死になるため、なかなか研究が進んでいない。私たちは、ショウジョウバエにおいては、ポリ(ADP-リボース)の分解酵素のノックアウトは、温度条件により羽化することが出来ることを示し、これを用いてin vivoにおけるポリADP-リボシル化蛋白質が蓄積している可能性を考えて研究を行ってきた。ショウジョウバエのポリADP-リボシル化の分解酵素遺伝子欠失変異体を用いて、ポリ(ADP-リボース)抗体のアフィニティーカラム、アルカリ処理、2次元電気泳動法と質量分析を組み合わせて、ポリADP-リボシル化のアクセプター蛋白質候補を検索し、昨年度は、alcohol dehydrogenaseを同定していたが、本年度はさらにA kinase anchor protein 200 isoform D (AKAP200), glycogen phosphorylase, glycerophosphate oxidase oxidase 1, enolase, fatbody protein 1, troponin T, actin-87E, malate dehydrogenaseを同定できた。DNA損傷修復、転写制御、細胞増殖と細胞死、分化などに関与するとされるポリADP-リボシル化の生理的役割は、目的タンパク質(被修飾タンパク質)の同定が必須であるにもかかわらず、基質NAD+の細胞膜非透過性、迅速な代謝による易分解性等のため未だになされていない。我々の樹立したポリ(ADP-リボース)分解酵素の欠失変異体のショウジョウバエに蓄積するポリADP-リボシル化タンパク質を、特異抗体を用いたアフィニティーカラムにより分析可能な量まで大量に精製し、質量分析装置により同定する方針で進めている。昨年度は、3,000匹のショウジョウバエでは同定ができなかったので、本年度は、30,000匹のポリ(ADP-リボース)分解酵素の欠失変異体のショウジョウバエを用いて、ポリ(ADP-リボース)に対する特異抗体をアフィニティーカラムにより精製後、アルカリ処理によりポリADP-リボシル化が外れて来たタンパク質候補を2次元電気泳動により分離して質量分析装置により解析したところ、目的タンパク質候補と考えられる14種のタンパク質が同定できた。この中から神経細胞死に関連が深いと考えられる、細胞質局在型のリンゴ酸脱水素酵素タンパク質について、大腸菌での発現を試みた。

このために、ショウジョウバエの培養細胞S2からmRNAを調整し、PCRによりcDNAを増幅作製し、これを大腸菌BL21内でHisタグを付加した形で発現させた。発現させたタンパク質を精製することができたので、現在、in vitroにおけるポリADP-リボシル化反応を試みている。先に述べたように、従来のDNA切断に依存したポリADP-リボシル化は、よく研究がなされているにもかかわらず、DNAの切断が無い状況下におけるポリADP-リボシル化については、極めて知見が乏しい現状である。そのため、in vivoにおいて、検出されたポリADP-リボシル化のアクセプター蛋白質は、DNA損傷の無い状況下で行われていると考えられるので、通常のポリADP-リボシル化のアクセプタータンパク質とは異なる可能性がある。また、一方、ショウジョウバエのPARPを用いた検証は必要である。(理由)交付申請書で記載した研究計画の7段階のうち6段階の半ばまで進展している。In vitroにおけるポリADP-リボシル化の検証が成功していないことは、必ずしもin vivoにおいて同定されたアクセプタータンパク質が間違っていることを意味しない。そこで、今回は、in vivoの分解酵素欠失変異体のショウジョウバエを出発として、その抽出液を精製し、ショウジョウバエのADHに対する抗体を用いてポリADP-リボシル化を外すアルカリ条件で作用させて、抗体で検出されるADHタンパク質が、もとの分子量に戻ることを証明することを主にしたい。また、ADHタンパク質のポリADP-リボシル化がショウジョウバエの神経変性の原因であるならば、ショウジョウバエ個体のADHの活性が低下していることが考えられる。ショウジョウバエのADH活性を測定する。また、ショウジョウバエの検出系においては利用できる抗体なども十分ではないので、ヒトの細胞においてADHがポリADP-リボシル化されていないかどうかを調べ、ヒトにおけるポリADP-リボシル化のアクセプタータンパク質の同定を合わせて行って行きたい。交付申請書に記載した6段階を完結することを最優先する。すなわち目的タンパク質候補14種類の中での一つについてin vitroおよびin vivoにおけるポリADP-リボシル化を証明する予定で進めている。これまで得られた結果、及び問題点について、外国のこの分野の研究者とも打ち合わせ討議を行い、場合により共同研究によりこの問題を解決したい。そのために、実験に使用する消耗品のほかに、この方面の詳しい、NIHのDr. Mossの研究室との共同研究を提案し、打ち合わせを行いたい。また、2013年はポリ(ADP-リボ-ス)に関する国際学会がカナダで行われるので現状の報告とともにこの分野の研究者との討議を通して問題の解決を図りたい。そのために外国旅費としての使用をお願いしたいと考えている。
音波の放射圧を利用した大型液晶ガラス基板用非接触搬送システムの構築

1.音波浮揚現象を用いた搬送システムの基礎特性測定(1)振動振幅-搬送速度特性たわみ振動モードの振動振幅と浮揚物体の搬送速度の関係を調べた。振動振幅と搬送速度が比例することが明らかになった。(2)搬送物体の応答特性の測定搬送物体の応答特性を測定した。(3)静止時の特性測定振動板に定在波たわみモードを励振すると、搬送物体の静止が可能となる。この時、浮揚物体周辺の流速分布を測定した。安定な浮揚条件について検討を行った。2.液中での非接触搬送システムの検討(1)液中での浮揚・搬送測定空気中と同様なシステムを水中に設置し、板状物体の搬送を試みた。この時、板状物体の水中での浮揚特性をレーザ変位計により測定した。(2)液中搬送が可能であることを明らかにした。3.音波浮揚現象に伴う位置保持現象の基礎特性測定(1)振動振幅-保持力特性矩形ホーンを持つ振動子を用いて、振動振幅と保持力の関係を調べた。振幅の増大に伴い、浮揚距離も変化するため、明確な結論は出せなかったが、振幅が小さい範囲内では比例関係になることが明らかになった。(2)浮揚空間環境周辺環境の温度湿度を変化させた場合の現象の変化を測定した。(3)流れの可視化浮揚物体をずらした状態で空気の流れを可視化し、保持力発生メカニズムの考察に利用した4.音波浮揚現象の有限要素法解析(1)実験結果と同じ計算結果が得られる境界条件の設定超音波振動子、浮揚物体、浮揚空間、周辺空間、全てを考慮することで、計算と実験の値がほぼ一致することがわかった。研究の目的本研究課題では、大型ガラス液晶基板のような、大型の板状物体を対象とした音波を用いた非接触搬送システムの実現を目指す。そのために、以下の4つを目的とする。1.大型板状物体が浮揚・保持可能な音波を用いた非接触搬送・保持方式の開拓。2.音波を用いた非接触搬送・保持のメカニズムの解明。3.液中での音波を用いた非接触搬送システムを実現。4.非接触搬送と超音波洗浄を同時に可能となる搬送技術の開拓。平成12年度に得られた成果1.音波浮揚現象を用いた搬送システムの基礎特性測定(1)振動振幅-搬送速度特性たわみ振動モードの振動振幅と浮揚物体の搬送速度の関係を調べた。

4.非接触搬送と超音波洗浄を同時に可能となる搬送技術の開拓。平成13年度に得られた成果1.音波浮揚現象に伴う位置保持現象の基礎特性測定(1)振動振幅-保持力特性矩形ホーンを持つ振動子を用いて、振動振幅と保持力の関係を調べた。振幅の増大に伴い、浮揚距離も変化するため、明確な結論は出せなかったが、振幅が小さい範囲内では比例関係になることが明らかになった。(2)浮揚空間環境周辺環境の温度湿度を変化させた場合の現象の変化を測定した。(3)流れの可視化浮揚物体をずらした状態で空気の流れを可視化し、保持力発生メカニズムの考察に利用した。2.音波浮揚現象の有限要素法解析(1)実験結果と同じ計算結果が得られる境界条件の設定超音波振動子、浮揚物体、浮揚空間、周辺空間、全てを考慮することで、計算と実験の値がほぼ一致することがわかった。
網膜毛細血管内皮細胞の細胞増殖制御因子の遺伝子解析

温度感受性SV40 T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから樹立した条件的不死化網膜毛細血管内皮細胞株(TR-iBRB)と条件的不死化網膜ペリサイト株(TR-rPCT)を用いて両細胞間における細胞間相互作用因子を解析することを目的とした。TR-iBRB細胞とTR-rPCT細胞とをインサートの上側と下側にそれぞれ播種した接触系およびTR-iBRB細胞をインサート上側に播種し、TR-rPCT細胞をdish上に播種した非接触系の共培養系を用い、さらにTR-rPCT細胞を無血清培地で24時間培養した培地を濃縮した培地をもちいて、TR-iBRB細胞の増殖性および増殖に関与する因子を解析した。非接触系の共培養(濃縮していない培地)では、TR-iBRB細胞単独培養と比較して増殖に有意な違いは示されなかった。一方、接触系の共培養系においては、TR-iBRB細胞の増殖性はTR-iBRB細胞単独培養と比較して、培養開始4日までは違いが示されなかったが、5日目以降有意に減少した。濃縮した培地を用いた場合、濃縮の度合いに依存してTR-iBRB細胞の増殖抑制作用が示めされ、ペリサイトの液性因子が内皮細胞の増殖に関与していることが示唆された。さらに、TR-rPCTと共培養を行ったTR-iBRBのMCT1mRNAは、TR-iBRBの単独培養のMCT1 mRNAと比較して41.9%減少した。血液網膜関門の防御機構としてL-cystineの輸送機構を解析したところ、TR-iBRBはsystem x_c^-のmRNAであるxCTおよび4F2hcが発現していた。TR-iBRBにおける[^<14>C]L-cystineの取り込みはsystem x_c^-の特徴を示した。酸化的ストレスのモデルであるdiethyl maleate(DEM)100μMで24時間処理を行ったTR-iBRBにおいて、xCTmRNAの発現は非処理時の2.6倍に増加し、[^<14>C]L-cystineの取り込みは2.3倍に上昇した。血液網膜関門では酸化的ストレスによりsystem x_c^-が誘導され、L-cystineの輸送を活性化させることが示唆された。温度感受性SV40 T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから樹立した条件的不死化網膜毛細血管内皮細胞(TR-iBRB)と条件的不死化網膜ペリサイト株(TR-rPCT)を用いて両細胞間における細胞間相互作用因子を解析することを目的とした。

一方、接触系の共培養系においては、TR-iBRB細胞の増殖性はTR-iBRB細胞単独培養と比較して、培養開始4日までは違いが示されなかったが、5日目で39%、6日目で43%有意に減少した。2倍に濃縮した培地を用いた場合、TR-iBRB細胞の増殖はコントロールと比較して培養4、5、6日目で22%、36%、41%減少した。同様に5倍の濃縮では56%、74%、69%減少した。従って、TR-rPCT培地中因子の濃度依存的なTR-iBRB細胞の増殖抑制作用が示めされ、何らかの液性因子が増殖に関与していることが示唆された。この液性因子がタンパク質であるか、低分子の物質であるかを解析する目的でTR-rPCT細胞培養5倍濃縮液に対する熱処理の影響を解析したところ、TR-iBRB細胞の増殖抑制は熱処理で消失したことから、熱処理で変性するタンパク様の物質がTR-iBRB細胞の増殖抑制に関与していることが示唆された。さらに、TR-iBRB細胞にTGFβ1を添加して細胞増殖に対する影響を解析したところ、10ng/mlのTGFβ1で増殖抑制が示されたことから、TGFβ1の関与の可能性も示唆された。
幼小教育現場におけるアクティブ・ラーニングの源流と可能性に関する日仏共同研究

本研究の目的は、日仏両国に戦前から存在したアクティブ・ラーニングの源流ともいうべき教育実践の思想と方法について、戦前からの教育実践の分析に加え、子どもの人格形成の土台を作る時期である、特に幼小における実践の観察とその記録を詳細に分析し論証を通して、明らかにしていくことである。本年度のフランスでの調査としては、2018年5月に、南仏ラシオタにあるジャン=ジョレス中学校を訪問した。2018年は、フランスの公立中学校・高校の中に初めて設けられたフレネ教育クラスとして、実験的かつ先駆的な実践を試みてきたCLEFが誕生してからちょうど10年の節目であり、ジャン=ジョレス中で卒業生や在校生、その保護者たちや研究者たちも参加し、記念式典とシンポジウムが行われた。この機会に、ラシオタ周辺の主にマルセイユでフレネ教育を実践している幼稚園と小学校の現場の教師たちも複数参加しており、中等教育以前の段階でどのようにフレネ教育が行われているかについて、ビデオを通してではあるが、確認できたことは大変有意義であった。こうした幼児教育・初等教育におけるフレネ教育を土台とした延長線上に、中等教育においてフレネ教育を実現させる意味があるということも、再認識できた。日本での調査としては、2018年9月に成城幼稚園を見学した。フレネ教育とは違うが、子どもの表現活動を尊重し教育を行っている姿があった。2019年2月には、御茶ノ水女子大学附属小の本田祐吾学級(小1)と、大阪の箕面こどもの森学園小を見学した。本田学級では、「てつがく」というサークル対話を中心とした授業内での子どもたちの協働的学びの中で発表された文章を元に、国語における作文と漢字の学習につなげる実践や、箕面こどもの森小では、算数のグループ学習の様子などを見学した。ともに、それぞれの環境で目の前の子どもたちの生の声を学びに活かす学習の様子がみてとれた。初年度の研究では、フレネ教育と生活綴方の両教育実践が今日の日本において置かれている現状を分析し、それらの教育的意義が今新たに見直される可能性について検討することを目標とした。研究対象となる現場として、1)80年代からフレネ教育実践を展開する国立お茶の水女子大学付属小(特に自由テクストを低学年にて積極的に実践している本田祐吾学級)、2)80年代から埼玉でフレネ教育を土台とした自然教育を実践している私立幼稚園のけやの森幼稚園のクラス、3)戦前より生活教育の実践を積み上げてきた私立和光小(特に自由テクストの実践を進めている松本あゆみ学級と山下淳一郎学級)、4)20年前から生活綴方実践を続けている埼玉の公立小の新井郁子学級、5)埼玉大学にてフレネ教育について学んだ後教師となり現場でフレネ教育実践を始めた栃木県日光市の公立小の福田奈奈学級、を予定していた。そのうち実際に訪問できたのは、1)の本田学級と、大阪の箕面こどもの森学園小学校のみであった。さらに、秋以降に仏トゥールーズ大学のギャラン教授を日本に招聘し、日本が戦前から如何に学習者主体の先駆的な実践を行ってきたかについて、フランス人研究者の観点からの講演をして頂く予定であったが、予定が合わず叶わなかった。そして年度末にはフランスに赴き、北部ナンシーではロレーヌ大学のゴ准教授との共同研究についての打ち合わせと、ナンシーのフレネ教育を実践する幼小の現場訪問、南部ヴァンスではフレネ学校における幼小クラスの実践の参観を行う計画であった。実際には、2019年3月に、オランダで学校ぐるみでフレネ教育を行っている小学校2校を見学し、仏のロレーヌ大学とトゥールーズ大学にそれぞれ赴いた。共同研究者であるゴ准教授と今後の研究の打ち合わせや、大学の講義内で日本の教育の歴史について発表を行ったり、ギャラン教授とも今後の連携について話し合うことができた。二年目は、仏ロレーヌ大学ゴ准教授が所長であるLISEC研究所や、フランスのフレネ教師たちの国内組織ICEMの中に創設された、世界のフレネ実践を記録し後世に残すことを目的とする研究グループ等と連携を取りながら、日本でのフレネ実践とフランスでのそれとの比較研究を進める。さらに初年度に見学が叶わなかった日本の他のフレネ学級も含めて引き続き見学し、継続的な実践記録を積み重ねていく。同時に、日本のフレネ教育の実践家で以前生活綴方を実践されていた教員たちへのインタビューも行い、両者の関わりや共通点・相違点について深める。同時に、仏トゥールーズ大のギャラン教授と引き続き連携を取りつつ、現代日本における子どもの自由な表現を尊重する教育実践の事例に関して、所属する仏の日本研究学会:SFEJにて来年度での学会発表のための原稿の完成を目指す。さらにはギャラン教授を日本に招聘し、日本が戦前から如何に学習者主体の先駆的な実践を行ってきたかについて、フランス人研究者の観点からの講演をして頂く。以上の研究成果を生かして、フレネ教育と生活綴方に代表される自由教育の現代的意義とその可能性について、論文執筆に入る。その際、正確かつ生のフランスの情報を取り入れるため、9月と3月の二度のフランスでの学校現場の調査とインタビュー、資料収集を行う。また、上記のフランスでのCLEF十周年記念式典の際に、ラシオタ近郊の村の小学校と幼稚園でフレネ教育を実践している教師と出会うことができたので、次回の調査の際には是非とも訪問したいと考えている。さらに、トゥールーズ大の先生との交流の中で、トゥールーズ市内に私立の幼稚園・小学校・中学校を併設するフレネ教育を実践する学校があることが判明したため、こちらも次回にぜひ見学したい。

本研究の目的は、日仏両国に戦前から存在したアクティブ・ラーニングの源流ともいうべき教育実践の思想と方法について、戦前からの教育実践の分析に加え、子どもの人格形成の土台を作る時期である、特に幼小における実践の観察とその記録を詳細に分析し論証を通して、明らかにしていくことである。本年度のフランスでの調査としては、2018年5月に、南仏ラシオタにあるジャン=ジョレス中学校を訪問した。2018年は、フランスの公立中学校・高校の中に初めて設けられたフレネ教育クラスとして、実験的かつ先駆的な実践を試みてきたCLEFが誕生してからちょうど10年の節目であり、ジャン=ジョレス中で卒業生や在校生、その保護者たちや研究者たちも参加し、記念式典とシンポジウムが行われた。この機会に、ラシオタ周辺の主にマルセイユでフレネ教育を実践している幼稚園と小学校の現場の教師たちも複数参加しており、中等教育以前の段階でどのようにフレネ教育が行われているかについて、ビデオを通してではあるが、確認できたことは大変有意義であった。こうした幼児教育・初等教育におけるフレネ教育を土台とした延長線上に、中等教育においてフレネ教育を実現させる意味があるということも、再認識できた。日本での調査としては、2018年9月に成城幼稚園を見学した。フレネ教育とは違うが、子どもの表現活動を尊重し教育を行っている姿があった。2019年2月には、御茶ノ水女子大学附属小の本田祐吾学級(小1)と、大阪の箕面こどもの森学園小を見学した。本田学級では、「てつがく」というサークル対話を中心とした授業内での子どもたちの協働的学びの中で発表された文章を元に、国語における作文と漢字の学習につなげる実践や、箕面こどもの森小では、算数のグループ学習の様子などを見学した。ともに、それぞれの環境で目の前の子どもたちの生の声を学びに活かす学習の様子がみてとれた。初年度の研究では、フレネ教育と生活綴方の両教育実践が今日の日本において置かれている現状を分析し、それらの教育的意義が今新たに見直される可能性について検討することを目標とした。研究対象となる現場として、1)80年代からフレネ教育実践を展開する国立お茶の水女子大学付属小(特に自由テクストを低学年にて積極的に実践している本田祐吾学級)、2)80年代から埼玉でフレネ教育を土台とした自然教育を実践している私立幼稚園のけやの森幼稚園のクラス、3)戦前より生活教育の実践を積み上げてきた私立和光小(特に自由テクストの実践を進めている松本あゆみ学級と山下淳一郎学級)、4)20年前から生活綴方実践を続けている埼玉の公立小の新井郁子学級、5)埼玉大学にてフレネ教育について学んだ後教師となり現場でフレネ教育実践を始めた栃木県日光市の公立小の福田奈奈学級、を予定していた。そのうち実際に訪問できたのは、1)の本田学級と、大阪の箕面こどもの森学園小学校のみであった。さらに、秋以降に仏トゥールーズ大学のギャラン教授を日本に招聘し、日本が戦前から如何に学習者主体の先駆的な実践を行ってきたかについて、フランス人研究者の観点からの講演をして頂く予定であったが、予定が合わず叶わなかった。
内分泌かく乱物質がアワビ資源に及ぼす影響の評価に関する研究

全国32地点からマダカアワビ、メガイアワビ、クロアワビ及びエゾアワビ試料を入手し(各地点で各種15個体ずつ)、常法による生殖巣組織標本の作製・検鏡とプロピル化/GC-FPD法による組織中有機スズ濃度の分析・定量を行った。入手した雌の標本において卵巣中での精子形成など雄性化の所見が認められた割合が019%であり、組織中から微量のブチルスズ及びフェニルスズ化合物が検出された。検出された有機スズは筋肉より頭部において相対的に高濃度であった。組織中有機スズと雌の雄性化との間に関連性が窺われた。対照海域産メガイアワビに対するトリブチルスズ(TBT)の3ヶ月間流水式連続曝露試験(対照、50及び500ng/L)を実施し、試験海水中TBT濃度及び供試個体の組織中有機スズ濃度の測定と生殖巣組織標本の観察を1.と同様に行った。その結果、卵巣中で少数の精子形成が観察されたが、TBT濃度依存性は不明瞭であった。有機スズ汚染が既知の海域(B海域)の造船所近傍でマダカアワビの種苗生産試験を行い、放卵量、受精率、孵化率、ベリジャー幼生の正常発生率と生残率、幼生の着底率、着底稚貝の生残率及び成長速度の推定を行った。今後、対照海域においても同様の種苗生産試験を行い、結果の比較を行う予定である。マダカアワビ、メガイアワビ及びクロアワビの受精卵及びベリジャー幼生に対するTBTとトリフェニルスズ(TPT)の48時間止水式曝露試験を行い,半数致死濃度とともに発生・発達及び遊泳行動に関する半数影響濃度(EC_<50>)を推定した。その結果、TBTの48-h EC_<50>は0.150.24μg/L、TPTの48-h EC_<50>は0.17μg/L(いずれも設定濃度として)と推定された。造船所やマリーナの近傍海域などでは上記のEC_<50>を上回る海水中TBT濃度が検出されてきたため、有機スズ汚染によってアワビ類幼生の加入阻害が生じてきた可能性がある。アワビ類初期稚貝の加入状況の把握を目的として、B海域への付着基質の設置による着底初期稚貝の出現状況調査を行い、親貝資源密度と累積着底稚貝密度との関係を解析した。今後、調査対象海域を増やして比較・解析を進める予定である。平成14年度は、下記の項目について、それぞれ、以下のように研究を実施した。1.アワビ類の内分泌かく乱に関する全国実態調査全国32地点からマダカアワビ、メガイアワビ、クロアワビ及びエゾアワビを、各地点で各種について原則として15個体ずつ活魚として入手して生殖巣組織標本を作製し(ゲンドル液で固定、パラフィン包埋、ヘマトキシリン=エオシン液で染色)、検鏡を行っている。並行して、体内有機スズ含有量を定量するための化学分析を実施している。

2.アワビ類の内分泌かく乱に関する実験的検討:有機スズ化合物の流水式曝露による雌における精子形成の再現対照海域から入手したメガイアワビを用いて、コントロールの他、50ng/L及び500ng/Lに設定されたトリブチルスズ(TBT)に対する3ヶ月間の流水式連続曝露試験を実施した。試験海水中のTBT濃度を実測するため、毎週、試験海水を採取して化学分析を行った。曝露開始3ヵ月後に供試した全個体を取り上げ、1.と同様の方法により、生殖巣組織標本を作製し、検鏡を行っている。また、供試したメガイアワビの体内有機スズ濃度の測定も実施している。3.天然海域におけるアワビ類の産卵、幼生と稚貝の生残と成長、並びに資源の現状に関する評価こぶし大の御影石(計1トン)を夏季に投入し、無節石灰藻を繁茂させ、そこにおけるアワビ稚貝の出現調査を通じた、天然海域でのアワビ稚貝の着底と分布について調査中である。4.アワビ類の繁殖能力の低下に及ぼす内分泌かく乱の影響:有機スズ曝露を受けたアワビ成貝の繁殖能力の評価マダカアワビ成貝(雄と雌の組み合わせで2組)を通常の飼育下で産卵させ、産卵量と受精率の推定を行った。受精卵の発生を経時的に観察し、孵化率を推定して、孵化したベリジャー幼生について、正常(異常)発生率、生残率及びベリジャー幼生の着底率の推定も行った。着底後の稚貝の生残率も推定し、成長に関する観察を継続している。1.アワビ類の内分泌かく乱に関する全国実態調査全国32地点からマダカアワビ、メガイアワビ、クロアワビ及びエゾアワビ試料を入手し(原則として、各地点で各種について15個体ずつ)、常法による生殖巣組織標本の作製・観察とプロピル化/GC-FPD法による組織中有機スズ濃度の分析・定量を行った結果、入手した雌の標本において卵巣中での精子形成など雄性化の所見が認められた割合が019%であり、組織中からブチルスズ及びフェニルスズ化合物が、微量ながら検出された。また検出された有機スズは筋肉よりも頭部において相対的に高濃度であった。組織中有機スズと雌の雄性化との間に関連性が窺われた。2.アワビ類の内分泌かく乱に関する実験的検討対照海域産メガイアワビを用い、トリブチルスズ(TBT)に対する3ヶ月間流水式連続曝露試験(対照;50及び500ng/L)を実施し、試験海水中TBT濃度及び供試個体の組織中有機スズ濃度の測定と生殖巣組織標本の観察を1.と同様に行った。その結果、卵巣中で少数の精子形成が観察されたが、TBT濃度依存性は不明瞭であった。3.アワビ類の繁殖能力に及ぼす内分泌かく乱の影響の評価有機スズ汚染が既知の海域(B海域)の造船所近傍でマダカアワビの種苗生産試験を行い、放卵量、受精率、胚の正常発生率、艀化率、艀化したベリジャー幼生の正常(異常)発生率と生残率、幼生の着底(成功)率、着底稚貝の生残率承び成長速度の推定を行った。今後、対照海域においても同様の種苗生産試験を行い、結果の比較を行う予定である。4.アワビ類の幼生や稚貝に及ぼす内分泌かく乱物質の影響の評価マダカアワビ、メガイアワビ及びクロアワビの受精卵及びベリジャー幼生に対するTBT及びトリフェニルスズ(TPT)の48時間止水式曝露試験を行い、半数致死濃度とともに発生・発達及び遊泳行動に関する半数影響濃度(EC_<50>)を推定した。その結果、TBTの48-h EC_<50>は0.150.24μg/L、TPTの48-h EC_<50>は0.17μg/L(いずれも設定濃度として)と推定された。造船所やマリーナの近傍海域などでは上記のEC_<50>を上回る海水中TBT濃度が検出されてきたため、有機スズ汚染によってアワビ類幼生の加入阻害が生じてきた可能性がある。5.天然海域におけるアワビ類の産卵、幼生や稚貝の分布と成長に関する検討
肝内受容体(センサー)による膵ホルモン分泌調節に関する研究

本研究は(1)正常ラットに認められる肝内グルコースセンサー、アルギニンセンサーが視床下部腹内側核(VMH)破壊ラットとストレプトゾトシン糖尿病ラットではどのように機能しているのか、及び(2)アルギニン以外のアミノ酸に対するセンサーが肝内に存在するのかを検討することを目的とした。実験はSD系雌ラットを用いて迷走神経肝臓枝切断後、無麻酔無拘束の条件下で、腹腔内グルコース及びアルギニン負荷後の血糖、血中インスリン、血中グルカゴンを測定した。その結果、(1)VMH破壊ラットでは迷走神経肝臓枝切断群は偽切断群と比較してグルコース及びアルギニンに対する血糖、インスリン及びグルカゴン分泌反応に差を認めなかった。一方、インスリン分泌予備能を保持したストレプトゾトシン糖尿病ラットでは迷走神経肝臓枝切断群は偽切断群と比較して血糖の低下とインスリン分泌反応の著明な亢進を認め、アルギニン負荷後のインスリン分泌反応も著明な亢進、腹腔内ロイシン投与後のインスリン、グルカゴン分泌亢進を認めたが、グルカゴン分泌反応には差を認めなかった。(2)正常ラットでは迷走神経肝臓枝切断群は偽切断群と比較して腹腔内アラニン投与後のグルカゴン分泌亢進を認めたが、グリシン、フェニールアラニン投与後のインスリン、グルカゴン分泌反応に差を認めなかった。以上の成績より(1)神経性伝達の高インスリン血症を有するVMH破壊ラットではグルコース、アルギニンセンサーは機能的にマスクされている。(2)低インスリン血症を有するストレプトゾトシン糖尿病ラットでは両センサの感受性亢進がある。(3)アルギニン以外のアラニン及びロイシンに対する肝内センサーが存在する可能性などが明らかになった。今後、アラニン及びロイシンセンサーの存在を電気生理学的に検討する予定である。
5-FU誘発口内炎モデル動物を用いた口内炎予防・治療薬の探索および基礎的研究

本研究において我々は、ハムスターでの口内炎誘発モデルを用いてトコフェロールおよびレバミピドの口内炎治療効果を検討した。5-FU(60mg/kg)を2回投与(day0およびday2)したハムスターのチークポーチをブラッシング(day1およびday2)することで5-FU誘発口内炎モデルを作成した。トコフェロールは20mg/gの割合で白色ワセリンに混合し、口内炎発症時(day3)より1日1回連日塗布した。レバミピドは1mg/gまたは10mg/gの割合でアルギン酸ナトリウムを主原料とするフィルムに含有させ、口内炎発症時(day3)より1日1回連日貼付した。口内炎面積の経日的変化を肉眼的に観察したが、トコフェロール軟膏(20mg/g)塗布群、レバミピド1mg/g群、10mg/g群ともに口内炎治癒促進効果は認められなかった。また、Day3からDay17までの口内炎総面積(AUC)においても有意な差は認められなかった。口内炎発症にはフリーラジカルの関与が示唆されていることから、我々は抗酸化作用を有するトコフェロールの作用を検討したが、口内炎治癒促進効果は認められなかった。また、レバミピドは作用機序として、胃粘膜保護作用、損傷胃粘膜修復作用、活性酸素除去作用、抗炎症作用などを有していることから、口内炎治療薬としての臨床応用が期待されたが、今回の我々の結果は治癒促進効果に関しては否定的なものとなった。今回の検討において抗酸化作用や抗潰瘍作用を有する薬剤で治癒促進効果が認められなかった。したがって今後はさらに強力な抗炎症作用等を有する薬剤での検討ならびに口内炎予防効果の検討が必要と考えられる。
BおよびC型肝炎ウイルス受容体の解明と感染制御

本研究は、ヒト肝癌発症の原因ウイルスと考えられるB型およびC型肝炎ウイルスの機能的受容体の構造と性質を解明し、ウイルス性肝癌の発症機構における宿主受容体の役割を明らかにする。これにより肝癌発症の予防、診断、治療への基礎的情報を得ることを目的としている。本年度ほ成果として下記の結果が得られた。1)B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)粒子に結合性を示す微量糖タンパク質をヒト肝臓から部分精製することが出来た。2)この糖タンパク質上のシアル酸含有糖鎖が、受容体活性に重要であり、Neu5Ac α2-6Gal、Neu5Ac α2-3Galおよび、Gal β1-3GalNAcを含有すること、O-シアログリコプロテインエンドペプチダーゼ処理によりムチン型(O-グリコシド型)糖鎖を含むこと、N-グリコシド型糖鎖も存在することなどを見い出した。3)さらに、この糖タンパク質に対する単クローン抗体を作製することに成功した。得られた単クローン抗体のサブクラスは、IgG1kであり、本糖タンパク質の糖鎖を認識しているものも得ることが出来た。この抗体は、HBsAg粒子感染機構の解明に有用であることが期待された。以上、本研究により、HBVの機能的受容体の構造の基本的性質が明らかにされたが、その機能、生体における分布、遺伝子、さらに感染における役割、発癌への移行メカニズムなどはこれからの研究に待たなければならない。さらに本研究を継続できればと考えている。
網膜を用いた中枢神経の再生にかかわる研究

中枢神経の機能再生をめざすために、網膜神経節細胞を対象として案験を行った。神経細胞の生存維持と再生能の賦活をインビトロで評価する実験系を確立した。組織片として切り出された、成熟哺乳動物の網膜を培養した。三次元的にコラーゲンゲル内を再生神経突起が伸長する様子を観察した。培養液に各種物質を添加することでそのものが、神経に対して及ぼす影響を評価した。そしてある程度効果が見られたものに関しては、最適な濃度、投与時期などの検討を加えることができた、これは既存のインビボの実験系では評価困難であったことである。この実験系において神経栄養因子のBDNF NT-4は良好な効果が確認された、そしてその作用時期は培養初期により強く見られた。つまり神経が障害を受けた場合には、より初期からのこれら薬剤の投与が有効であることが示唆された。また、BDNF NT-4の投与濃度については0.01μg/mlから1000μg/mlまでは濃度依存的に効果を発現することがわかった。そのほかNGF CNTFインターロイキンなどの評価を行ったこれらもある程度の効果が見られた。さらに新規の系統の薬剤として神経に対する効果が未知なものを各種検討した。そのなかでインドシアニングリーンが網膜神経節細胞の再生神経突起数の増加を示すことが見つかった。現在は効果発現のメカニズムを解明中である。また評価された薬剤の投与下において、生体での神経移植実験を行っており良好な結果が得られてきている。collagen gel中で成熟哺乳動物の三次元網膜培養を行い神経突起の再生を観察し再性能を評価した。培養に薬剤を添加して再生に及ぼす効果を検討した。1.網膜培養を行い、現時点では神経にたいしては効果が未知であるが、再性能の向上が期待できると思われる薬剤の評価を進めている。2.効果があると評価された因子が疾患にたいしても同様に作用を及ぼすかを調べた。対象として網膜神経節細胞に障害をきたすSandhoff病のモデルのノックアウトマウスを用いた。網膜培養を行い、神経栄養因子としてNGF, BDNF, NT-3,NT-4,CNTFを作用させ低下した機能の回復を評価した。結果として、基本的な培養下でコントロールマウス(ワイルドタイプ)に比べノックアウトでは再生機能が落ちていることが確認された。つぎに上記栄養因子を添加して培養したところノックアウトにおいても再生能の向上が確認された。病的な状態においても栄養因子が効果を発揮することが分かった。臨床応用への可能性が示唆された。またもっとも患者が多い糖尿病モデル動物を作製している、血糖値の上昇はあるが、糖尿病網膜症の発症にはいたっていない、出血などをきたすには長期をようするとおもわれるので網膜症の初期変化を網膜電図などをもちいて評価を試みている。
細菌の2成分転写制御系による多剤耐性化メカニズムの解析

成分転写制御因子KdrABが多剤排出ポンプKexDの遺伝子周辺域と直接相互作用しているどうかについて明らかにするため、2成分転写制御因子KdrABのうちレスポンスレギュレータであるKdrAとDNAとの相互作用の有無を明らかにすることを目指している。平成29年度に作成したKdrA大量発現用プラスミドでは、KdrAの発現量が少ないという問題が発生したため、新たにプラスミドを構築しなおした。このプラスミドでKdrAの発現実験を行った結果、KdrAの発現を確認することができた。しかし、一部のタンパク質が不溶性の凝集体となっていることも明らかになった。凝集体が存在すると、大量精製の効率が低下するため、現在、より良い発現条件を検討している。また、本課題ではKexDを大量発現しているKdrB変異株と親株についてRNA発現解析を行うことにしている。解析を行うためのデータベースを構築し、連携研究者が所属する広島大学自然科学研究支援開発センターの協力を得て、RNAの品質確認を行った。その結果、用意したRNAはRNA発現解析に必要な品質条件を満たしていることがわかった。調製したTotal RNAの大部分はリボソームで占められているため、次にこのRNAからリボソームRNAを除去する必要がある。しかし、Total RNAからリボソームRNAを除去する試薬の調達が不可能(試薬の販売停止)となった。代替品を用いてリボソームRNAの除去状況を確認したが、リボソームRNAの除去が出来ていないことが判明した。現在、別のプロトコールによる方法によって広島大学自然科学研究支援開発センターが条件検討を行っている。条件検討が終了次第、RNA発現解析を実施する予定である。平成29年度のKdrAの大量発現に問題が発生し、平成30年度にプラスミドの構築からやり直す必要が生じた。また、昨年度中に実施予定だったRNA発現解析のプロトコールは広島大学自然科学研究支援開発センターで確立されていたが、使用予定の試薬の販売をメーカー側が停止したため、プロトコールの再構築をせざるを得なくなった。RNA発現解析については、当初使用予定であったMiSeqからHiSeqに変更する方向で検討している。Total RNAからリボソームRNAを除去するプロトコールでは、約1000万以上のリード数を担保可能なMiSeqで十分なデータが得られることがわかっていた。しかし、リボソームRNAを除去するキットが販売停止になった結果、いくつかの検討が必要となった。Total RNA中の大部分を占めるリボソームRNA存在下でもリード数が圧倒的に多い(3億リード程度)HiSeqを使用すれば、リボソームRNA存在下でも十分なmRNAの発現に関するデータが得られると考え、この方向で実施する予定である。KdrA精製のためのプラスミド構築については、新たに構築したプラスミドでは発現量を上昇させることができたものの、2量体を形成すると考えられている転写制御因子の性質から、凝集体が多く形成されるという問題が発生した。低温で発現させるなどの条件検討を進めつつ、さらに別のベクターの使用も視野に入れ実施する。肺炎桿菌は抗菌薬耐性化が臨床現場で問題になっている細菌のひとつである。申請者は2成分転写制御因子(KdrAB)の変異が多剤排出ポンプkexDの発現を上昇させ、その結果、多剤耐性化が生じるという現象を以前に見出していた。本課題ではKdrABがkexD遺伝子周辺域と直接相互作用しているどうかについて明らかにすることを目指している。また、KdrABの肺炎桿菌における生理的な意義を明らかにするため、この転写調節因子が発現調節を行っている遺伝子をRNAシーケンス解析により明らかにすることを目指している。まず平成29年度はゲノムとKdrAとの相互作用を調べるために、KdrA精製用のプラスミドの構築を行うことを目指した。この過程で発現ベクターの検討を行う必要が生じたため、現在、新たなプラスミドを構築中である。RNA発現解析は当初より、外注で行う予定にしていた。連携研究者の助言により、データ解析においても指導等が受けられるという理由から、広島大学自然科学研究支援開発センターに外注することを決定した。現在、解析を行うためのデータベースの構築作業を行っている。KexDの発現上昇はkdrBの1塩基置換により生じている可能性が高い。しかし、この変異がKdrAB系の機能を亢進しているのか、機能不全を引き起こしているのかは明らかではない。KdrAとゲノムとの相互作用実験では、この相互作用が引き起こす多剤排出ポンプKexD発現上昇との関連を、RNA発現解析ではKdrB変異が引き金となり細胞全体に与える影響を調べたいと考えている。そして、KdrABが肺炎桿菌で果たしている役割を明らかにすることで、多剤排出ポンプ発現亢進までの情報入力を遮断し、抗菌薬耐性化を抑制する化合物の探索に繋げることができると考えている。平成年度はKdrAを精製するためのプラスミドを構築し、精製までを行う予定だった。プラスミドの構築はできたものの、発現量が少なく精製の段階で問題が発生した。そのため、現在、ベクターを変更して、新たにプラスミドを構築している。RNA発現解析については、広島大学自然科学研究支援開発センターに外注することを決定した。どのような状態のサンプルを調製すればよいかなどについても、相談し、おそらく、従来通りの調製方法で問題は生じないだろうということが判明した。また、解析を実施するにあたり、肺炎桿菌のオープンリーディングフレームについてのデータベースが必要であるとのこと指示を受けた。しかし、解析したい変異株はゲノム情報が明らかになっていない株に由来している。

親株については以前にゲノム変異解析を行ったことがあるため、連携研究者の協力の元、昨年度は断片情報を96本のContigにまで繋いだ。現在はこのContig情報を元にデータベースを構築中である。成分転写制御因子KdrABが多剤排出ポンプKexDの遺伝子周辺域と直接相互作用しているどうかについて明らかにするため、2成分転写制御因子KdrABのうちレスポンスレギュレータであるKdrAとDNAとの相互作用の有無を明らかにすることを目指している。平成29年度に作成したKdrA大量発現用プラスミドでは、KdrAの発現量が少ないという問題が発生したため、新たにプラスミドを構築しなおした。このプラスミドでKdrAの発現実験を行った結果、KdrAの発現を確認することができた。しかし、一部のタンパク質が不溶性の凝集体となっていることも明らかになった。凝集体が存在すると、大量精製の効率が低下するため、現在、より良い発現条件を検討している。また、本課題ではKexDを大量発現しているKdrB変異株と親株についてRNA発現解析を行うことにしている。解析を行うためのデータベースを構築し、連携研究者が所属する広島大学自然科学研究支援開発センターの協力を得て、RNAの品質確認を行った。その結果、用意したRNAはRNA発現解析に必要な品質条件を満たしていることがわかった。調製したTotal RNAの大部分はリボソームで占められているため、次にこのRNAからリボソームRNAを除去する必要がある。しかし、Total RNAからリボソームRNAを除去する試薬の調達が不可能(試薬の販売停止)となった。代替品を用いてリボソームRNAの除去状況を確認したが、リボソームRNAの除去が出来ていないことが判明した。現在、別のプロトコールによる方法によって広島大学自然科学研究支援開発センターが条件検討を行っている。条件検討が終了次第、RNA発現解析を実施する予定である。平成29年度のKdrAの大量発現に問題が発生し、平成30年度にプラスミドの構築からやり直す必要が生じた。また、昨年度中に実施予定だったRNA発現解析のプロトコールは広島大学自然科学研究支援開発センターで確立されていたが、使用予定の試薬の販売をメーカー側が停止したため、プロトコールの再構築をせざるを得なくなった。RNA発現解析については、本年度中に実施可能である。解析についても、サンプルを調製し、シーケンサーにかけてもらう時期によるが、ある程度のところまで実施可能であると考えている。発現解析を実施する広島大学自然科学研究支援開発センターへの支払いや、サンプル調製に必要な試薬等の購入の関係から、現在、連携研究者を研究分担者に変更し、予算配分を行うことを検討している。プラスミド構築については、構築したプラスミドではうまく発現させられなかった等の問題が発生したため、現在、構築をやり直している。プラスミドの構築自体は可能であったため、このプラスミドの構築が致死的であるとは思えない。
核多角体病における宿主域決定の分子機構解析

核多角体病ウイルス(NPV)の宿主域決定機構を解析するために、4種類のNPVとそれぞれの宿主細胞系を用いて16種の感染実験を行い、細胞病変効果、ウイルスDNAの蓄積、出芽ウイルス産生、ウイルス構造タンパク質の蓄積、ポリヘドリンの蓄積、および多角体の形成について調査した。Ac(Autographa californica)NPVはSF21、SpIm、Se301細胞においては増殖して多角体を形成したが、BmN-4細胞では増殖するものの多角体は形成しなかった。Bm(Bombyx mori)NPVはBmN-4細胞においてのみ明らに増殖し、SpIm細胞ではごく一部の細胞で増殖した。SF21細胞ならびにSe301細胞では、ウイルスの増殖を示すいずれの事象も認められなかった。Hc(Hyphantria cunea)NPVは、SpIm細胞およびSe301細胞において増殖して多角体を形成した。SF21細胞では、はっきりとした増殖は認められなかったが、ウイルスDNAは多量に蓄積していた。BmN-4細胞においては増殖しないものの、ウイルスDNAは蓄積しており、細胞は良好な状態にはなかった。Se(Spodoptera exigua)NPVは、Se301細胞においてのみ明らかに増殖した。SpIm細胞では多角体形成はほとんどみられなかったが、アポトーシス様形態の細胞が多数観察された。以上のように、それぞれのNPVは宿主培養細胞種の違いに応じて、様々な感染増殖様相を呈すること、ならびにそれぞれの培養細胞は異なったNPVに対して様々に応答することが明らかになった。本実験系を活用することにより、NPVにおける宿主域決定要因が効率よく解析できるものと考えられる。Autographacalifornica NPV (AcNPV)とカイコNPV (BmNPV)は、宿主域を異にする別種のNPVであるにもかかわらず、多くの遺伝子で高い相同性が認められる。AcNPVは従来カイコの培養細胞では増殖しないとされていたが、最近の研究でカイコの培養細胞であるBM-NとBmN-4細胞で出芽ウイルス粒子(BV)を産生することが明らかになった。しかし、AcNPVはカイコの培養細胞では、SF細胞でのBV産生量の1/100程度のBVを産生するのみであり、かつポリヘドリンの発現と多角体の形成を行わない。本研究では、BM-NとSFの両細胞において多角体を形成する、AcNPVを母体とするBmNPVとのリコンビナントNPV (Ac/Bm (Xho) NPV)を作出し、その増殖特性とゲノムの解析を行った。その結果、Ac/Bm (Xho)NPVは、カイコ培養細胞ではBmNPVと、SF細胞ではAcNPVとほぼ同じkineticsでBVを産生することが認められた。また、Ac/Bm (Xho)NPVのゲノムではAcNPVのゲノムのmu4.8-7.35の領域に変化が生じていることが判明した。さらに、Ac/Bm (Xho)NPVにはこの領域において約50bpと約380bpの2つの欠失があり、後者の欠失によりAcNPVのORFの1つが欠落していることが明らかになった。Ac(Autographa californica)NPVはSF21、SpIm、Se301細胞においては増殖して多角体を形成したが、BmN-4細胞では増殖はするものの多角体は形成しなかった。

SF21細胞ならびにSe301細胞では、ウイルスの増殖を示すいずれの事象も認められなかった。Hc(Hyphantria cunea)NPVは、SpIm細胞およびSe301細胞において増殖して多角体を形成した。SF21細胞では、はっきりとした増殖は認められなかったが、ウイルスDNAは多量に蓄積していた。BmN-4細胞においては増殖しないものの、ウイルスDNAは蓄積しており、細胞は良好な状態にはなかった。Se(Spodoptera exigua)NPVは、Se301細胞においてのみ明らかに増殖した。SpIm細胞では多角体形成はほとんどみられなかったが、アポトーシス様形態の細胞が多数観察された。以上のように、それぞれのNPVは宿主培養細胞種の違いに応じて、様々な感染増殖様相を呈すること、ならびにそれぞれの培養細胞は異なったNPVに対して様々に応答することが明らかになった。本実験系を活用することにより、NPVにおける宿主域決定要因が効率良く解析できるものt考えられる。
モバイルコンピューティングを支援する高速連続メディア向けリアルタイムOSの研究

今年度は,リアルタイム処理の性能を確認するツール開発に着手した.具体的には,コンピュータの性能評価手法の1つである命令トレーサを開発した.命令トレース結果を用いれば,コンピュータの基本的な動作を取得可能であるため,ログラムの制御の流れや実行した命令,割込みや入出力などのイベントを取得できることが可能となる.そこで,この性能評価ツールから得られる情報を基に,各種基幹情報サーバ類の設計指針,ならびにコンピュータ・アーキテクチャなどの評価を行うために,各種の解析,性能評価を行うことを研究の目標においた.さらに,マルチパーソナルなOS環境を実現するために,一台の計算機上に複数のOSを同時に動作させる仮想計算機(以下VMと記す)を制御することを目指した.この制御プログラムをVMCP(Virtual Machine Control Program)とよび,その設計と試作開発を試みた.本研究では次に示す機能の設計を行うこととした.ここでの主機能は(1)VMメモリ空間の多重化(2)VMのスケジューリング機能(3)VMの画面表示のエミュレーション機能(4)VM生成,デバッグに関するコマンド類の実装などである.また,インターネット上のパケット・トラフィックを測定するプログラムを開発した.その結果を解析することにより,ネットワークのトポロジカルな問題解決やネットワークの利用形態がもたらすコンピュータ資源の問題解決などを研究のターゲットにした.以上から,モーバイル環境にて高速なメディア処理の開発・評価を行える環境が整ったと考えられる.モーバイルコンピューティングでは,無線通信の信頼性向上,通信コスト,データ転送速度,セキュリティの脆弱などの問題があり,これらの問題解決を試みた.ホームページの閲覧や検索,ファイルのダウンロードの利用での高コストを解決するために,モバイルエージェントシステムを提案している.エージェントをダイヤルアップ先のサーバマシンに常駐させ,外出先からのアクセス時にホームページの情報検索を代行させる方式を提案した.エージェントはキーワードを複数の検索サイトに問い合わせ,検索結果を基にデータを取得する.ユーザが指定した情報が集まった時点で,エージェント側からクライアントにコールバックしデータを転送する仕組みを実現した.さらに,データ転送の際に生じる無線通信路の断絶に対して,転送保証機能をもつプロトコルを考案した.セキュリティに関しては,PHSの発信者番号通知を利用したユーザ認証を行う提案を行った.これらの機能を統合したモバイルエージェントシステムにより,モバイルコンピューティング環境での通信コストの削減を行った.連続メディア処理<マルチメディア>としてVideo On Demand(VOD)を取り扱った.連続メディア処理のでは,データの取得,展開,描画などの基本的処理を周期的に繰り返す性質を持ち,時間的な正確さを要求するリアルタイム性にある.本研究では,連続メディア処理の要求を満たす周期的CPUを割付け機能を持つタスクスケジューラの開発を目的とした.ここでは,周期的タスクモデルを提供し,連続メディア処理を実現した.具体的には,起動周期と1周期に必要なCPU時間をOSに宣言する機能,・1周期内の処理が終了したことをOSに通知し,スリープする機能、・デッドライン超過時に呼び出されるハンドラの登録を行う機能の機能を提供している.本周期的タスクモデルを実現するスケジューラの実現では,・周期的タスクの優先度はその他のタスク(非周期的タスク)より高くする・短い周期的タスクを優先するRate Monotonic方式とする・同一起動周期内のタスクに対して,FCFSでスケジュールする機能などを実現した.上記の目標の達成を実証するために,MPEWG1の要求である30frame/secの処理を起動周期33msの周期的タスクとしたとき,スケジューリング遅延が起動周期の5%以下になることを確認した.今年度は,リアルタイム処理の性能を確認するツール開発に着手した.具体的には,コンピュータの性能評価手法の1つである命令トレーサを開発した.命令トレース結果を用いれば,コンピュータの基本的な動作を取得可能であるため,ログラムの制御の流れや実行した命令,割込みや入出力などのイベントを取得できることが可能となる.そこで,この性能評価ツールから得られる情報を基に,各種基幹情報サーバ類の設計指針,ならびにコンピュータ・アーキテクチャなどの評価を行うために,各種の解析,性能評価を行うことを研究の目標においた.さらに,マルチパーソナルなOS環境を実現するために,一台の計算機上に複数のOSを同時に動作させる仮想計算機(以下VMと記す)を制御することを目指した.この制御プログラムをVMCP(Virtual Machine Control Program)とよび,その設計と試作開発を試みた.本研究では次に示す機能の設計を行うこととした.ここでの主機能は(1)VMメモリ空間の多重化(2)VMのスケジューリング機能(3)VMの画面表示のエミュレーション機能(4)VM生成,デバッグに関するコマンド類の実装などである.また,インターネット上のパケット・トラフィックを測定するプログラムを開発した.その結果を解析することにより,ネットワークのトポロジカルな問題解決やネットワークの利用形態がもたらすコンピュータ資源の問題解決などを研究のターゲットにした.以上から,モーバイル環境にて高速なメディア処理の開発・評価を行える環境が整ったと考えられる.