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ヒト胆管癌細胞の糖鎖腫瘍マーカー産生量低下と腫瘍拒絶との関連

慈恵医大胆管癌患者より樹立されたTK細胞はその培養上清中に糖鎖腫瘍マーカー:CA19-9、CA50およびシアリルルイスx(sLe^x)抗原を多量に分泌するという特性を持つ.このTK細胞にIL-2及びB7-1遺伝子を単独/重複して導入したところin vitroでの細胞傷害効果とSCIDマウス移植腫瘍での拒絶が起こった.遺伝子導入細胞ではさらに細胞が本来産生していた糖鎖腫瘍マーカーの産生量が低下した.癌化・転移には糖鎖合成に働く糖転位酵素や糖鎖の修飾酵素の活性変動が関与しているため腫瘍拒絶と糖鎖腫瘍マーカー産生量の低下には強い関連性が示唆された.現在クローニングされている5種のヒトα-1.3-フコース転移酵素;Fuc-TIII,TIV,TV,TVI,TVIIのうちFuc-TIII、TVIIがCA19-9およびsLe^x抗原等の合成に関与している.本研究ではwild typeと遺伝子導入細胞での各酵素発現と酵素活性およびin vivoでの腫瘍拒絶について検討を行った.ウエスタンブロット法によるwild typeと遺伝子導入細胞の糖鎖腫瘍マーカー発現量とHPLCによる酵素活性の比較検討では、CA19-9、CA50およびsLe^x産生量は各遺伝子導入細胞で異なった結果を示したがHPLC法による酵素活性との明らかな関連は観察されなかった.またPCR,RT-PCR法によりwild typeと遺伝子導入細胞でのFuc-TIII、Fuc-TVII酵素の変異等の検討を行ったが、Fuc-TIIIのgene-specific部分についてのDNAシークエンス分析ではいずれの細胞でも変異は観察されず、Fuc-TVIIのRT-PCR法による検討でも差はなかった.しかし、SCIDマウスを用いた腫瘍移植実験では明らかな腫瘍拒絶が確認されたため今後は異なったアプローチでの解明が必要とされた.慈恵医大胆管癌患者より樹立されたTK細胞はその培養上清中に糖鎖腫瘍マーカー:CA19-9、CA50およびシアリルルイスx(sLe^x)抗原を多量に分泌するという特性を持つ.このTK細胞にIL-2及びB7-1遺伝子を単独/重複して導入したところin vitroでの細胞傷害効果とSCIDマウス移植腫瘍での拒絶が起こった.遺伝子導入細胞ではさらに細胞が本来産生していた糖鎖腫瘍マーカーの産生量が低下した.癌化・転移には糖鎖合成に働く糖転位酵素や糖鎖の修飾酵素の活性変動が関与しているため腫瘍拒絶と糖鎖腫瘍マーカー産生量の低下には強い関連性が示唆された.現在クローニングされている5種のヒトα-1.3-フコース転移酵素;Fuc-TIII,TIV,TV,TVI,TVIIのうちFuc-TIII、TVIIがCA19-9およびsLe^x抗原等の合成に関与している.本研究ではwild typeと遺伝子導入細胞での各酵素発現と酵素活性およびin vivoでの腫瘍拒絶について検討を行った.ウエスタンブロット法によるwild typeと遺伝子導入細胞の糖鎖腫瘍マーカー発現量とHPLCによる酵素活性の比較検討では、CA19-9、CA50およびsLe^x産生量は各遺伝子導入細胞で異なった結果を示したがHPLC法による酵素活性との明らかな関連は観察されなかった.またPCR,RT-PCR法によりwild typeと遺伝子導入細胞でのFuc-TIII、Fuc-TVII酵素の変異等の検討を行ったが、Fuc-TIIIのgene-specific部分についてのDNAシークエンス分析ではいずれの細胞でも変異は観察されず、Fuc-TVIIのRT-PCR法による検討でも差はなかった.しかし、SCIDマウスを用いた腫瘍移植実験では明らかな腫瘍拒絶が確認されたため今後は異なったアプローチでの解明が必要とされた.ヒト胆管癌細胞TK株はその培養上清中にCA19-9、CA50およびシアリルLe^x-1(SLX)抗原を多量に分泌するという特性を持つ.このTK株にIL-2及びB7-1遺伝子を単独/重複して導入したところin vitroでの細胞傷害効果とSCIDマウス移植腫瘍での拒絶が起こった.遺伝子導入細胞ではさらに細胞が本来産生していた糖鎖腫瘍マーカーの産生量が低下した.細胞膜表面に発現する糖鎖抗原、特にCA19-9およびSLXは血管内皮細胞への接着に関与するセレクチンファミリーのリガンド糖鎖として知られているため、これら糖鎖抗原産生量の低下と腫瘍拒絶には関連性が示唆される.また糖鎖は遺伝子の直接産物ではないため、癌化・転移に際し変化するのは、糖鎖合成に働く糖転位酵素や糖鎖の修飾酵素の活性変動に依るものとされている.この糖転移酵素のうちヒトα-1.3-フコース転移酵素(Fuc-T)遺伝子群は現在5種類がクローニングされており、特にFuc-TIII酵素はCA19-9およびSLX抗原の生体内合成に関与していることが近年証明された.遺伝子導入により引き起されたCA19-9/SLX産生量低下とFuc-Tとの関連を明らかにするため、平成11年度はまず各遺伝子導入細胞とwild type腫瘍細胞の培養上清と細胞破砕液をSDSで可溶化したのちポリアクリルアミド電気泳動と抗CA19-9抗体、抗SLX抗体および抗CA50抗体を用いたウエスタンブロッテイング法で産生腫瘍マーカーをタンパクレベルで比較解析した.またヒトFuc-TIII、Fuc-TVII酵素のオリゴヌクレオチドプライマーを作製しRT-PCR法で遺伝子導入細胞とwild type腫瘍細胞での各酵素の変化を検討中である.

また遺伝子レベルでの解析は、ヒトFuc-TIII酵素についてgene-specific:CCACCCGGGAGTGATGGTTCTGGCTGATTT(F)/CGATCCCACCTGTACCCTATAAGTGGTGGT(R)およびFuc-TIII,TV,TVI:CTCGAATTCACCCATGGATCCCCTGGGTGCAGC(F)/CTCA AGCTTCTCTCAGGTGAACCAAGCCGCTATG(R)の2組のオリゴヌクレオチドプライマーを作製しPCR法でwild type腫瘍細胞と遺伝子導入細胞で解析を行った.Fuc-TVII酵素に関してもORFオリゴヌクレオチドプライマー:CTCGGATCCAATCTCGGGTCTCTTGGCTG(F)/CTCGAATTCGGTGGTTTGATTTCGACACC(R)を作製しwild type腫瘍細胞と遺伝子導入細胞より抽出したRNAでRT-PCR法による解析を行った.特にFuc-TIII酵素についてはgene-specific PCR産物についてシークエンスも行ったが配列に変化はなかった.Fuc-TVII酵素についてもPCR法での発現差は示されなかった.Fuc-TVII-PCR産物は発現ベクターであるpcDNA2に組み込む過程まで進んだ.しかし腫瘍拒絶に糖鎖がどのように影響するかについてのin vivo実験は進まず、SCIDマウスを用いて遺伝子導入細胞に対する腫瘍拒絶が存在することを確認するに止まった.
くり返しパルス強磁場を用いたアクチナイド化合物のMSR及び中性子回折の研究

MSRの実験に関し、平成元年度6月までは、主として検出器の最適位置の探索に費やされた。ミュオンビームを磁場によって絞ることが予想どうりゆかず、結局コリメータによってビームを細く絞ったため強度がかなり減少し、そのため測定にかなり時間がかかることが判明した。また測定の手始めとして、既に低磁場でのデータがあり、ネール温度や緩和時間が丁度いい領域にあるMuOの綻緩和の測定を試みた。190Kでデータが得られ10.5テスラでの緩和時間が低磁場でのそれとほとんど同じ3μ秒であった。6月から12月まではKEKの加速器が停止していたので測定はおこなわれなかったが、その間にクライオスタットの制作および、6月までテストを行っていたμポートからもっと偏極度も高く強度も強いπポートへの移動を行った。これにより約10分の1の時間で測定がおこなえるものと予想された。平成2年1月から再びマシンタイムが与えられ、まずMnOの常磁性緩和の測定を行って比較したところμポートで行ったときよりもはるかにいいS/Nでデータを得ることができた。そしてメタ磁性を示すPr_2Co_2Si_2の強磁場中磁気相転移にともなう縦緩和の磁場変化を調べようとしている。この物質は12テスラで相転移をおこすが10.5テスラで緩和を測定することができた。現在磁場を変化させて縦緩和時間の変化を測定している。このような磁気相転移に関連した緩和についての情報は全くはじめてであり大きな成果と思われる。これと平行に2月から新しく中性子回折による強磁場中磁気構造の決定の実験が始められている。まず現在その特異な磁化過程と伊達モデルによって話題となっているPrCo_2Si_2について行う準備が進められている。今年度はこのための装置の開発とクライオスタットの制作、架台の設置等の作業が行われた。
鎮痛薬感受性の個人差とミューオピオイド受容体遺伝子配列との関連解析

モルヒネの鎮痛効果や副作用に大きな個人差があることが効果的な疼痛治療を妨げている。モルヒネ作用個人差の遺伝子メカニズムを解明してテーラーメイド疼痛治療に道を拓くため、我々はモルヒネの標的分子であるミューオピオイド受容体(MOR)遺伝子配列の差異とモルヒネ作用との関係を検討した。第一に、ヒト個人差のモデルとなるマウス系統差の遺伝子メカニズムを調べた。モルヒネ鎮痛効果が減弱していることで知られるCXBKマウスでは、MORmRNAの発現量が約半分に減少しており、またその配列で翻訳領域は正常だが非翻訳領域が異常に長いことが明らかになった。非翻訳領域はmRNAの安定性に関与することと、その配列に個人差が大きいことが知られているので、ヒトにおいてもMOR遺伝子の非翻訳領域の個人差がモルヒネ鎮痛の個人差を生み出す可能性が考えられた。また、12の野生由来マウス系統の遺伝子を解析した結果、ヒトで知られる多型と類似のアミノ酸配列置換を引き起こす塩基配列を有するマウス系統を見いだした。このマウス系統はヒトにおける多型の貴重なモデル動物であると考えられる。第二に、ヒトの3'非翻訳領域塩基配列を解析し、この領域に約80カ所の多型を見いだした。興味深いことに、多型の一つではCXBKマウスの場合のようにDNA配列の挿入があった。現在、術後疼痛治療におけるモルヒネ作用強度の個人差と今回見いだした遺伝子多型との相関解析を進めている。本研究成果は、遺伝子診断による適切なモルヒネ治療の実現や快情動発現の遺伝子メカニズムの解明に繋がるものと考えられる。鎮痛薬感受性個人差の分子メカニズムの解明を目指し、マウス鎮痛薬感受性系統差およびヒト鎮痛薬感受性個人差と、ミューオピオイド受容体(MOR)遺伝子配列の差異との関連解析を行っている。第1に、マウスMOR遺伝子のゲノム構造をほぼ明らかにした。翻訳開始点より5'側約5000塩基の配列、終止コドンより3'側約12000塩基の配列、およびメッセンジャーRNA(mRNA)の3'末端部位をそれぞれ初めて明らかにした。第2に、モルヒネ鎮痛効果が減弱していることで知られるCXBKマウスに関して、MOR遺伝子解析を行った。分子生物学的解析の結果、CXBKマウスにおけるMORのmRNAは正常なアミノ酸をコードするが、塩基長が異常に長く、発現量が60%程に減弱していることが明らかになった。さらにCXBKマウスにおけるMOR遺伝子配列を詳細に検討した結果、3'非翻訳領域対応部分にDNAが挿入していることが明らかとなった。CXBKマウスではMOR mRNAの非翻訳領域が異常であるためにこのmRNA量が減少し、オピオイドの効果が減弱することが考えられた。非翻訳領域は翻訳領域と比べその塩基配列が分子進化的にあまり保存されていないので、MOR mRNA非翻訳領域がマウス系統間で異なることが、マウス系統間での鎮痛薬感受性に差異が有ることの分子メカニズムの一つである可能性が示唆された。第3に、多種多様な表現型を示す野生由来マウスに関して、MOR遺伝子の塩基配列を解析し、その多様性を明らかにしつつある。第4に、ヒトMOR遺伝子を解析した結果、従来報告されていなかったポリモルフィズムを見いだした。以上の結果より、MOR遺伝子の塩基配列差異が、マウス鎮痛薬感受性系統差およびヒト鎮痛薬感受性個人差における重要な遺伝子メカニズムであると考えられた。
複雑系複合材料モデリングの簡易化及び詳細解析手法の開発

複雑系繊維強化複合材料の数値解析による挙動解明においては,有限要素モデル化の困難さと詳細な応力分布を得れる数値シミュレーション手法の開発が課題であった.本研究では,モデル作成の容易さと実際のき裂と対応可能な詳細さの両方を満たすことができる手法の開発を行った.具体的には,母材である樹脂や一方向積層板をモデル化した有限要素モデルに,強化材である強化繊維束の有限要素モデルを重ね合わせ,数値解析の際にそれらを考慮して変形挙動や応力・ひずみを計算する有限要素解析プログラムの開発を行った.また,繊維強化複合材料の周期性を考えて,その単位構造モデルのみを用い,そのモデルの重ね合わせを行いつつ,周期性を考慮した境界条件を適用することにより,積層による等価弾性係数の変化についても評価可能となった.さらに損傷発生による剛性変化についても,座古らの開発した手法を取り込み,複雑内部構造を有する繊維強化複合材料でも提案手法を用いて強度評価が可能となった.この時,精度向上のためには,母材および強化材の要素として適切なサイズと積分点数を有する要素を使用することにより一般の有限要素解析と同等の解を得ることが可能で,かつモデル化の大幅な簡易化が可能であることもわかった。これらのシステムを開発したことにより,織物繊維強化複合材料や縫合繊維強化積層板に代表される複雑系繊維強化複合材料の等価弾性係数や強度値が,数値解析により取得可能となり今後の材料開発での効率化に貢献した。
フランクフルト学派の理論にみる倫理と公共圏に関する研究

本研究はフランクフルトの倫理思想と公共圏に関する理論を課題とした。フランクフルト学派第1世代(ホルクハイマー、アドルノ、ベンヤミン)における倫理思想の核心を「いたみ(痛み/悼み)」という語によって総括、抽出し、この「いたみ」の思想の形成に関わる個別的な論点に関する研究を進めた。また、〈コミュニケーション論的展開〉以後のフランクフルト学派の思想、ハーバーマスの討議倫理、ホネットの承認論に関しても考察し、フランクフルト学派の新たな理論的展開においても、第1世代のいたみの思想が重要な寄与をなしうることを明らかとした。本年度は4本の論文を仕上げることになった。依頼原稿としての制約などから研究計画に記したとおりのものではないが、いずれも本研究テーマに関する重要な理論的貢献といえるものである。「《いたみ》の思想-《ポスト形而上学》の時代の唯物論」では、ポスト形而上学という哲学の現段階の水準における倫理のあり方を、ホルクハイマー、ベンヤミン、アドルノの影響関係の中から浮かび上がらせたものであり、フランクフルト学派の倫理思想の現代性を史的研究をつうじて示したものである。結果として本研究テーマの中心となる視点を提示し得たと考える。「《真理空間》と《天使のまなざし》」においては、それとは対照的な方法をとり、言語論的転回以後の現代哲学の議論の枠組みからのアプローチをおこなった。認識論的なものにとどまらず倫理的な意味をも含む「正しさ」の観念の成立するコミュニケーション空間の把握としてアルブレヒト・ヴェルマーの《真理空間》論を取り上げ、その空間の中にベンヤミンが絶筆で書き遺した《天使のまなざし》に象徴される神学的救済のモチーフを位置づけることを試みた。フランクフルト学派の史的遺産を現代哲学の問題構成の中で考察したものであり、ヴェルマーの《真理空間》論は公共圏の理解に関しても基本的な視点を提供うするものといえる。「《アドルノ》の今-二つの伝記を中心に」ではアドルノの伝記の検討しつつ、現代における文化的イコンとしてのアドルノの位置価について考察した。「倫理と市場-「社会的交通の疎外」への一視角」ではマルクスの疎外論に対するハーバーマスによる批判を出発点としつつ、ハーバーマスの説くようなコミュニケーション論的な視角からの資本主義批判が、有名な《労働の疎外》論とはべつの《社会的交通の疎外》の概念に存在することを示した。フランクフルト学派の議論をより広い社会思想史の文脈と接合しようとした論考である。今年度は学内資金により、本科研費の研究テーマに関わる資料の収集のための在外研究をおこなうことができた。フランクフルト大学付属図書館ホルクハイマー・アルヒーフとベルリン芸術アカデミーのベンヤミン・アルヒーフで調査を行った。この調査のための準備、収集した資料の分析が今年度の研究の中心的内容を占めることになった。調査の成果は大きく3種類に分けられる。(1)ホルクハイマー・アルヒーブにて、おもに『啓蒙の弁証法』に関する未公刊の草稿群を調査した。重要と思われる資料について、写真撮影して持ち帰ることができた。(2)ベンヤミン・アルヒーブでは、初期ベンヤミンの思想に関連する文献を調査し、一部を複写して持ち帰った。また、アルヒーフでのみ利用可能となっているベンヤミン全集の電子検索システムを利用してベンヤミンの重要概念に関する検索をおこなった。(3)ベンヤミン・アルヒーフに併設されているアドルノ・アルヒーフにてアドルノの未公刊講義録を調査した。いずれも本科研費の研究テーマの研究水準を高める貴重な資料であり、日本では入手が不可能であるか困難な資料を得ることができた。今後、これらの資料の分析を進め、成果として発表していく。また、8月には「アドルノにおける<他なるもの>」という報告を行った。アドルノの思想に関して、昨年度の発表成果をもとにしながらそれをさらに発展させるべく、展開の方向を試行するものであり、有意義な議論と有益な助言を得ることができた。今年度もフランクフルト学派の倫理思想に関する研究を着実に進行した。一件の学会報告と編著一冊の原稿執筆というかたちで具体的成果を出すことができた。唯物論研究協会の第34回研究大会分科会「痛みと正義の倫理的境界-カント、アドルノ、ハーバーマス-」における報告「《言語論的転回》以後のフランクフルト学派の倫理思想を再考する」では、ハーバーマスの討議倫理について、ハーバーマス自身がおこなっている限界づけからその性格、有効範囲をあきらかにし、それをふまえたうえで、アドルノの倫理思想が討議倫理と対立、矛盾したり、討議倫理に依ってたいたいされるものではなく、むしろ討議倫理が成立するためにも重要な前提となる契機を含んでいることをあきらかにしようとした。他の報告者のアドルノの社会批判の限界に関する指摘、参加者との討議により、フランクフルト学派の倫理思想の中でのアドルノ、ハーバーマスの意義について今後の研究に有効な多くの知見を得ることができた。

『西洋哲学の軌跡デカルトからネグリまで』の出版にあたっては全体の編集とともにアドルノの稿を執筆した。筆者が従来より注目しているアドルノの〈いたみ〉に定位する倫理について、簡潔にまとめるとともに、『啓蒙の弁証法』に関してあらためて考察する機会を得て、論文としてはごくコンパクトなものだが、フランクフルト学派の思想を自分なりにまとめる経験をすることができた。3月にはベルリン芸術アカデミーのベンヤミン・アルヒーフにて、おもにベンヤミンの初期思想に関する調査をおこなった。今年度出版予定の初期ベンヤミンに関する著作執筆のための有益な調査をおこなうことができた。本年度は、名古屋哲学研究会主催のシンポジウムにおける「〈時間の核〉と〈もの語り〉ーベンヤミンの歴史論」と題する報告にもとづき、名古屋哲学研究会の機関紙に同名の論文を執筆した。論文の趣旨は、ベンヤミンの絶筆、通称『歴史哲学テーゼ』における歴史観の特徴を概観したうえで、ベンヤミンの主張する、勝者の側に立つものではない歴史の具体相を彼の物語論と関連付けることで示した。歴史哲学テーゼでは、連続的な進歩と捉える歴史観が、歴史の勝者の側に立ったものであり、進歩の裏面にある野蛮を忘却したものとして批判され、歴史の連続性の打破が史的唯物論に課された課題だとされる。では、敗者の側に立つ歴史といかなるものか。そのイメージの一端がエッセイ『物語作者』に示されている。人が、ひとから聞いた話をいったん自分の中に沈めたうえで語り継ぎ、その中で変容していく物語に、ベンヤミンはいわゆる敗者が紡いでいく伝統をみていた。また上記の内容に加え、ベンヤミンが学生時代に師事したヘルマン・コーヘンの倫理的社会主義の立場との比較でベンヤミンの歴史観を考察し、ベンヤミンの歴史観がもつ思想史的位置を示した。社会民主党の歴史観につながることなった倫理的社会主義の立場に立ったヘルマン・コーヘンは、カウツキーの資本主義がその法則により没落するという自然主義的な史的唯物論理解を批判している。歴史哲学テーゼでは社会民主党の歴史観を批判しているが、コーヘンの立場を共有しており、コーヘンの理想主義的立場を、改変したといえる。ベンヤミンのもの語り論は、ハンナ・アレントにおける公共圏に関する諸論への影響関係を持つものであり、もの語り論と歴史哲学を関係づけ、コーヘンとの関係を考察することからその思想史意義を明らかにすることができた。今年度は前年度のベルリンのベンヤミン・アルヒーフにおける調査にもとづいて、初期ベンヤミンに関する研究をすすめた。アルヒーフでおこなった系統的な二次文献の調査からこれまで重視していなかったいくつかの影響関係を見出した。主要なものは以下の二点である。(1)マルティンブーバーの影響。ベンヤミンとユダヤ、シオニズムとの接触については、ゲルショム・ショーレムとの交友に始まるとすることが定説である。しかし、それ以前、ユダヤをめぐる友人との書簡による議論の中でブーバーへの言及がある。ブーバーとのベンヤミンの関係については、第一次大戦開戦以後のブーバーに対する否定的な態度のみを取り上げてきたが、より初期の段階においてブーバーから積極的影響を受けた可能性がある。
マウス脊髄後角神経系の構築と機能の解析

哺乳類の神経細胞の分化と神経ネットワーク形成の機構を分子レベルで明らかにすべく、マウス脊髄の後角神経系をモデルとして解析を行った。特に、モデル神経の代表である交連神経細胞と研究代表者がクローニングしたホメオボックス遺伝子のMbh1を中心に研究を進め、交連神経細胞ではMbh1が特異的に発現し、Mbh1の発現は転写調節因子のMath1で直接的に活性化されることが明らかとなった。また、Mbh1は神経細胞の分化運命を交連神経細胞へ決定する因子であるが、その機能を詳細に調べることにより、神経軸索の方向を交連神経とするために必須である以外にも、神経細胞体を本来の位置へ移動させる上で機能していることが明らかとなった。さらに、Mbh1の下流で働く遺伝子を網羅的に解析することにより、Mbh1は神経軸索を底板へ伸ばす上で重要なネトリンレセプターのDccの発現を誘導するとともに、神経軸索の伸長方向を制御するSlitタンパクのレセプターのRoboファミリーやSonic Hedgehogタンパクのレセプターなどの発現も制御していることが示された。これらの遺伝子は、神経細胞分化の特定のステージで特異的に発現しており、神経軸索の伸長に関わる遺伝子の発現は、Math1からMbh1へのカスケードで精密に制御されていることが明らかとなった。また、Mbh1の機能を神経細胞間で比較解析することにより、Mbh1は小脳の顆粒細胞の移動にも関わることが示され、神経ネットワークの形成で重要な機能を担うことが明らかとなった。哺乳類の神経系の発生と機能の関係を明らかにすべく、マウス脊髄の後角神経系をモデルとして、神経系の構築と機能の機構を分子レベルで解析している。脊髄神経系の発生はこれまで単純と考えられてきたが、研究代表者等の最近の研究で多くの神経細胞が接線(背腹軸)方向へも劇的に移動することが示され、極めて複雑であることが明らかとなった。特に、後角の最も背側で生まれる細胞は翼板の最深部まで移動し、交連神経細胞へ分化する。この神経細胞の分化過程では、プロニューラル因子の転写因子Math1が発現し、Math1がホメオボックス遺伝子Mbh1の発現を誘導し、Mbh1が交連神経細胞の分化運命を決定することを明らかにした。そこで、この分化過程をさらに詳細に解析するため、Math1やMbh1の下流で機能する因子の同定を進めてきた。生体内電気穿孔法を用いMath1やMbh1をマウス胎仔の脊髄で強制発現させた後に、発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイ法で網羅的に解析した。その結果、細胞接着や細胞骨格に作用する因子の発現が変化することが明らかとなり、これらの因子の発現と機能の解析を進めている。また、Mbh1遺伝子のエンハンサーの制御下でレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを詳細に解析したところ、Mbh1は脊髄の交連神経細胞以外に、小脳の顆粒細胞の分化過程でも一過的に発現することが明らかとなった。さらに、脊髄の交連神経細胞と小脳の顆粒細胞の分化を分子マーカーで比較することにより、両神経細胞の分化が分子レベルで極めてよく似ていることを明らかにした。哺乳類の神経細胞の分化と神経ネットワーク形成の機構を分子レベルで明らかにすべく、マウス脊髄の後角神経系をモデルとして解析を進めている。脊髄の神経細胞の分化は、運動神経細胞などを中心に研究データの蓄積が神経系の中で最も豊富であるが、遺伝子カスケードのレベルまで掘り下げると未だに不明な点が多い。研究代表者は、自身がクローニングしたホメオボックス遺伝子のMbh1の転写制御機構をトランスジェニックマウスなどを用いて詳細に解析してきた。その結果、プロニューラル因子の転写調節因子Math1がMbh1の発現を誘導し、Mbh1が脊髄の交連神経細胞の分化運命を決定することを初めて明らかにした。

このカスケードが他の神経細胞の分化でも保存されているのかを調べるため、以前に開発した電気穿孔法を用いた高効率遺伝子導入法を改良し、大脳や脊髄の他に小脳などへも遺伝子導入し、中枢神経系のほぼ全ての細胞へ遺伝子導入できる実験系を確立することに成功した。また、Math1やMbh1の発現制御機構と機能を詳細に解析することにより、小脳の顆粒細胞の分化においても、Math1からMbh1への転写調節因子のカスケードが存在し、Mbh1は顆粒細胞の分化をも制御することを明らかにした。さらに、Mbh1の下流で発現するDccやTag1などの遺伝子も両神経細胞の分化で発現し、神経細胞の分化機構が両者で保存されていることを明らかにした。現在、Math1やMbh1の下流遺伝子の候補としてマイクロアレイ法などで得た遺伝子群の発現を脊髄と小脳で比較し、両神経細胞の違いを生み出す機構を分子レベルで解析中である。哺乳類の神経細胞の分化と神経ネットワーク形成の機構を分子レベルで明らかにすべく,マウス脊髄の後角神経系をモデルとして研究を進めた。研究代表者は,今までの研究で,脊髄後角の交連神経細胞の分化運命が転写調節因子のMath1からMbh1へのカスケードで決定されることを明らかにしてきた。今年度は,交連神経細胞の分化と神経ネットワーク形成の分子機構を明らかにすべく,研究代表者が開発した遺伝子導入法で,Math1やMbh1をマウス胎児の脊髄で強制発現させ,得られたRNAをマイクロアレイ法で網羅的に解析した。その結果,Mbh1の下流で機能する遺伝子の候補を多数得ることに成功した。さらに,これらの遺伝子の発現をin situ hybridization法などで詳細に解析し,Mbh1の下流では,神経軸索の伸長を制御するSlitタンパクのレセプターのRoboファミリーやSonic Hedgehogタンパクのレセプターなどが細胞分化や軸索伸長の各ステージで特異的に発現することが示された。これにより,交連神経の軸索がまず底板へ向かい,底板を越えると直角に方向転換し脳へ向かう過程では,軸索伸長に関わる遺伝子の発現がMath1やMbh1の元で精密に制御されていることが明らかとなった。また,Mbh1の発現と機能を脊髄後角と小脳とで比較解析することにより,Mbh1は細胞の分化運命や軸索伸長方向の決定のみならず,神経細胞体を正しい場所へ移動させる上でも必須であることが示された。
霊長類の警戒音声は生得的な脅威対象と連合するか？警戒音声言語進化仮説の検証

ヒト乳児は16ヶ月齢までに、成人が恐れている声を聞いたときに(ゾウやキリンよりも)ヘビの画像を長く見る。すなわち生得的に脅威の音声とヘビの視覚情報が連合していることが示唆される。ある種の霊長類はヘビを指示する警戒音声を有するが、そのような音声と視覚的定位は学習が必要とされてきた。学習せずに警戒音声(聴覚情報)がヘビの視覚刺激と連合していることを示した結果は、限定的にしか示されていない。本研究では、1)ヘビを見たことのないマーモセットが同種他個体の警戒音声とヘビの映像を潜在的に連合させているかを検討する。それが確かめられれば、「霊長類の音声言語の起源の1つは特定の脅威を信号することである」可能性が示唆される。2)音声発達の偏りと社会的コミュニケーションに障害がみられる自閉症モデル・マーモセットにおいても、警戒音声とヘビに潜在的な連合があるかを検討する。また、3)社会性の異なる種で第三者のやり取りの認識が異なるか、すなわち言語進化に関連するとされる視点取得能力が社会性と関連するかを調べる。これらによって、進化・障害と視点取得の観点から豊富な音声レパートリーを有するマーモセットの音声表象が生得的に特定の対象と連合させているかを調べ、警戒音声が言語を進化させたとの仮説にアプローチする。H30年度は、1)マーモセットは、他個体の警戒音声を聞いたときにヘビの映像を注視する時間が長くなるか?と、2)種によって第三者のやり取りが互恵的か非互恵的かを区別できるか、すなわち言語進化に関連するとされる視点取得能力が社会性と関連するかを調べた。具体的には、ヘビ注視のための実験装置を作成した。また、ニホンザルとマーモセットを対象に第三者の互恵的・非互恵的認識実験を実施し、マーモセットはこれらを区別するが、ニホンザルではできないことを明らかにした。種の社会性と視点取得能力が関連するかを検討する実験は完了し、すでに論文は受理された。その意味では順調に進展している。いっぽうで、警戒音声とヘビ映像の潜在的な連合を調べる研究は、研究担当者が異動したこともあり、少し進捗が遅い。実験装置を完成させたが、マーモセットの警戒音声を録音するところまで進まなかった。ただし、映像と音声がそろえば実験が開始できる。これらを総合的に勘案すると、おおむね順調に進展しているといえる。実験装置が完成したので、実験個体を順次、装置に馴致させていく。それと平行して、マーモセットの警戒音声を録音する。そのために、おもちゃのヘビを購入し、ヘビに対する警戒音声を発するか調べる。音声を記録できれば、警戒音声を聞いているときに(コンタクトコールに比べて)、ヘビ(キリン・ゾウ)のビデオ映像を長く見るかを調べる。

音声を記録できれば、警戒音声を聞いているときに(コンタクトコールに比べて)、ヘビ(キリン・ゾウ)のビデオ映像を長く見るかを調べる。
周期運動の動的安定性制御に関する中枢神経機構論的および数理的研究

本研究では運動制御の分野で認識されている機能的神経回路である中枢パターン生成器(CPG)を中心とする中枢神経系の数理モデルを構築し,運動中の被験者から侵襲・非侵襲的に計測可能な物理量に基づいて中枢神経系の活動を逆問題的に推定し運動制御系の神経機構を理解することを目標としている.グルノーブル大学ではパーキンソン病患者の大脳基底核へ電極を埋め込み直接電気刺激を与える治療を行っており,電極埋め込み部位を同定するために大脳基底核周辺の神経活動を記録している.大脳基底核は高次運動中枢の1つであるため,この神経核を構成する神経細胞の活動を知ることは脊髄下行信号を考察する上で興味深い.このようにして得られた記録電位から電極周辺の個々の神経細胞の活動を再構築するためには,1.神経発火電位(スパイク)をノイズから分離する技術.2.スパイクを神経細胞毎に分類する(ソーティング)技術.が不可欠である.今年度は、神経外科手術中に得られた記録データを解析可能な情報へと変換するための技術開発を行った.教師無し学習により電極周辺に存在する神経細胞の典型的なスパイクの形状を自動的に学習し,これに基づいて個々の神経細胞活動を時系列として記録する技術を,アプリケーションとして誰でも容易に利用できる形で開発した.このアプリケーションは,オンラインとオフラインの両方で動作可能である.また,ハッチアプリケーションとして,大量のデータを次々に自動的に処理することかできる.従来のスパイク・ソーティングでは経験者の手作業によるスパイク波形のテンプレート作成が必要であったため,時間と経験が必要とされていた.これを本アプリケーションにより簡便化することが可能となった.神経科学の分野において神経活動の解析を行うためのみではなく,神経外科医が術中に神経活動情報を参照するための組み込みシステムとして発展する可能性を築いた.本研究では運動制御の分野で認識されている機能的神経回路である中枢パターン生成器(CPG)を中心とする中枢神経系の数理モデルを構築し,運動中の被験者から侵襲・非侵襲的に計測可能な物理量に基づいて中枢神経系の活動を逆問題的に推定し運動制御系の神経機構を理解することを目標としている.グルノーブル大学ではパーキンソン病患者の大脳基底核へ電極を埋め込み直接電気刺激を与える治療を行っており,電極埋め込み部位を同定するために大脳基底核周辺の神経活動を記録している.大脳基底核は高次運動中枢の1つであるため,この神経核を構成する神経細胞の活動を知ることは脊髄下行信号を考察する上で興味深い.このようにして得られた記録電位から電極周辺の個々の神経細胞の活動を再構築するためには,1.神経発火電位(スパイク)をノイズから分離する技術.2.スパイクを神経細胞毎に分類する(ソーティング)技術.が不可欠である.今年度は、神経外科手術中に得られた記録データを解析可能な情報へと変換するための技術開発を行った.教師無し学習により電極周辺に存在する神経細胞の典型的なスパイクの形状を自動的に学習し,これに基づいて個々の神経細胞活動を時系列として記録する技術を,アプリケーションとして誰でも容易に利用できる形で開発した.このアプリケーションは,オンラインとオフラインの両方で動作可能である.また,ハッチアプリケーションとして,大量のデータを次々に自動的に処理することかできる.従来のスパイク・ソーティングでは経験者の手作業によるスパイク波形のテンプレート作成が必要であったため,時間と経験が必要とされていた.これを本アプリケーションにより簡便化することが可能となった.神経科学の分野において神経活動の解析を行うためのみではなく,神経外科医が術中に神経活動情報を参照するための組み込みシステムとして発展する可能性を築いた.
血漿タンパク質LRGの翻訳後修飾に着目した膵癌早期診断マーカーの解析

早期診断が困難で予後不良な疾患である膵癌患者の血清を使用して、leucine-rich alpha-2-glycoprotein (以下LRG)が診断マーカーをなり得るかを検討した。膵癌患者68例、健常者10例の血清を使用し、ELISAによりLRGの発現量を検討した結果、健常者と比較して膵癌患者において有意にLRG値が高値であった。ステージ0-IIの症例でも健常者より高値を呈していた。さらにCA19-9が陰性の膵癌患者25症例中22例でLRGが高値を示しており、膵癌診断マーカーとしての可能性が示唆された。今後、LRGを血清から単離して、LRGに結合している糖鎖解析を行う予定である。早期発見が困難で、予後不良な疾患である膵癌に対して、早期診断マーカーの発見が望まれている。申請者らはプロテオミクスの手法を用い、leucine-rich alpha-2-glycoprotein (以下LRG)が膵癌患者血漿中で有意に発現量が増加していることを発見した。また、糖タンパク質であるLRGには複数のアイソフォームが存在しており、膵癌に特異的なLRGのアイソフォームが存在する可能性がある。本研究は血漿タンパク質LRGの翻訳後修飾に注目した膵癌早期診断マーカーとしての意義を確立する研究で、1. LRGアイソフォームの同定、2. LRGアイソフォーム測定系の確立、3.臨床検体を用いたLRGアイソフォームの測定とバイオマーカーとしての意義を確立することを目的としている。現在、ヒト血漿を使用し、免疫沈降の手法を用いてLRGを単離している段階である。同時に、膵癌患者の臨床検体を収集し、ELISAの手法を用いてLRG全体量の測定を試みている。今後の予定であるが、LRGの単離ができた後に、LRGに結合している糖鎖を酵素で切断して回収し、質量分析の手法を用いて糖鎖構造を同定する。それによりLRGアイソフォームによる糖鎖の差異を解析する。さらにLRGアイソフォームの測定系を確立し、LRG全体量を測定した検体において、各アイソフォームの比率を測定し、特定の分画の濃度上昇が膵癌でみとめられないかを検討する予定である。申請者らはプロテオミクスの手法を用い、leucine-rich alpha-2-glycoprotein(以下LRG)が膵癌患者血漿中で優位に発現量が増加していることを発見した。また、糖タンパクであるLRGには複数のアイソフォームが存在しており、膵癌に特異的なLRGアイソフォームが存在する可能性がある。本研究は血漿タンパク質LRGの翻訳後修飾に注目した膵癌早期マーカーとしての意義を確立する研究で、1. LRGアイソフォームの同定、2. LRGアイソフォーム測定系の確立、3.臨床検体を用いたLRGアイソフォームの測定とバイオマーカーとしての意義を確立することを目的としている。現在、膵癌患者の臨床検体を収集し、ELISAの手法を用いて膵癌患者血漿中のLRG全体量の測定を行っている。また、ヒト血漿から免疫沈降でヒト血漿中LRGの単離を試みている段階である。今後の予定であるが、ヒト血漿中LRGに結合している糖鎖を酵素で切断して回収し、質量分析の手法を用いて糖鎖構造を同定する。それにより、LRGアイソフォームによる糖鎖の差異を解析する。さらにLRGアイソフォーム測定系を確立し、LRG全体量を測定した検体において、各アイソフォームの比率を測定し、特定のアイソフォーム分画の濃度上昇が膵癌で認められないかを検討する予定である。膵癌患者血清を用いてLRG全体量を測定しているが、まだ症例数が少なくデータ集積量が不十分な段階である。ヒト血漿中のLRGの単離もまだ困難な状況が続いており、時間を要している。その後の糖鎖測定に関する手法は確立しているので、速やかにLRG単離を完了させる予定である。その後、質量分析の手法を用いて糖鎖解析を行う。本研究は、血漿タンパク質LRGの翻訳後修飾に注目した膵癌早期マーカーとしての意義を確立する研究で、1. LRGアイソフォームの同定、2. LRGアイソフォーム測定系の確立、3.臨床検体を用いたLRGアイソフォームの測定とバイオマーカーとしての意義を確立することを目的としている。また、ヒト血漿から免疫沈降でヒト血漿中のLRGの単離を試みている段階である。

また、膵癌以外の癌種に関しても血漿中LRG濃度を測定し、他疾患におけるLRG測定の有用性も検討している。凍結検体を用いて解析を行っていたが、評価対象のLRGが凍結融解により検出が困難な場合が予想以上に多かった。その定量性、再現性の検証に予想以上に時間を要したのに加え、新規の膵癌切除症例が予想以上に少なかった。資料は一期的に解析することが望ましいので、測定の信頼性を検証し、症例の蓄積を待っていた。さらに、血漿からLRGを単離する作業も困難な状況がつづいており、時間を要している。その後の糖鎖分離、糖鎖解析の手法は確立しているので、速やかにLRG単離を完了させる予定である。早期発見が困難で、予後不良な疾患である膵癌に対して、早期診断マーカーの発見が望まれている。申請者らはプロテオミクスの手法を用い、leucine-rich alpha-2-glycoprotein (以下LRG)が膵癌患者血漿中で有意に発現量が増加していることを発見した。また、糖タンパクであるLRGには複数のアイソフォームが存在しており、膵癌に特異的なLRGアイソフォームが存在する可能性がある。本研究は、血漿タンパク質LRGの翻訳後修飾に注目した膵癌早期マーカーとしての意義を確立する研究で、1. LRGアイソフォームの同定、2. LRGアイソフォームの測定系の確立、3.臨床検体を用いたLRGアイソフォームの測定とバイオマーカーとしての意義を確立することを目的としている。膵癌の血清収集に時間を要したが、膵癌患者血清68例と健常者血清10例に対してELISAの手法を用いて、膵癌患者血漿中のLRG全体量の測定を終了した。その結果、有意に膵癌患者においてLRG全体量の増加を認めた。また、ヒト血清から免疫沈降でヒト血清中のLRG単離を試みている。今後、免疫沈降により単離されたLRGに結合している糖鎖を酵素で切断し、回収する手法を用いて糖鎖解析を行う。糖鎖の構造は質量分析によって同定する。それにより、特異的なLRGアイソフォームによる糖鎖の差異を解析する。さらに、LRGアイソフォーム測定系を確立し、LRG全体量を測定した検体において、各アイソフォームの比率を測定し、特定のアイソフォーム分画の濃度上昇が膵癌で認められないかを検討する予定である。早期診断が困難で予後不良な疾患である膵癌患者の血清を使用して、leucine-rich alpha-2-glycoprotein (以下LRG)が診断マーカーをなり得るかを検討した。膵癌患者68例、健常者10例の血清を使用し、ELISAによりLRGの発現量を検討した結果、健常者と比較して膵癌患者において有意にLRG値が高値であった。ステージ0-IIの症例でも健常者より高値を呈していた。さらにCA19-9が陰性の膵癌患者25症例中22例でLRGが高値を示しており、膵癌診断マーカーとしての可能性が示唆された。今後、LRGを血清から単離して、LRGに結合している糖鎖解析を行う予定である。血漿中からLRGを単離する部分に時間を要しており、その後のLRGアイソフォーム同定まで研究が進んでおらず、研究計画予定よりも遅れている。さらに、膵癌患者の新規臨床検体の不足から、膵癌患者血漿中のLRG全体量を測定するデータの集積が悪い。
コムギ類の遺伝実験系統の保存とそのネットワーク構築に関する企画調査

コムギとその近縁5属の採集系統や実験系統、及び遺伝子・DNAクローンを組織的かつ恒久的に保存し、有効に活用するためのネットワークを構築するため、班会議(2回)で全体的問題を検討するとともに、班員を「系統保存システム」、「DNAレポジトリ-」、「情報ネットワーク」の3班に分け、これら問題を個別に検討した。(1)系統保存システム:コムギ類系統保存の現体制は、人員・経費の両面において今尚甚だ不十分であるので、その整備・充実を関係当局に強く働きかける。同時に、研究者の力を組織化するため、短期間対応としては研究者が自発的にコムギ類系統保存センターの機能を分担する(19研究室より役割分担の申し出あり)。長期的対策としては、大学において、研究者としても優れ、かつ系統保存に情熱をもつ後継者を意図的に養成する。(2)DNAレポジトリ-:核については、核遺伝子のcDNAとゲノミックDNAのクローン、及び非遺伝子領域の特殊配列のクローンを、オルガネラについては、葉緑体、ミトコンドリア両ゲノムの全体をカバーする整列クローンと、遺伝子のクローンを収集・配布する必要がある。これには、2研究部門程度の組織の新設が必要である。(3)情報ネットワーク:当初、ストックリストの編集・刊行を予定した。しかし、データベースを構築して随時情報を更新できるようにし、併せて、インターネットを利用し瞬時に情報を提供できるようにすべしとの結論に達した。そこで、予定した印刷費をデータベース構築用のソフトの購入に当てた。これを用い、19ステーションよりなるデータベースを構築した(協力者、山崎と西川の努力を負う)。これに18,000系統の情報を収めた。このデータベースは遺伝研をホストとするインターネットに「KOMUGI-Wheat Network in Japan」として開局され、世界に向けて公開される体制を整えた。また、フロッピ-の形でも情報を提供できにようにした。
AAVベクターによる神経細胞へのドーパミン合成関連酵素の多重遺伝子導入の長期効果-導入遺伝子の長期発現とドーパミンによる細胞毒性についての検討-

パーキンソン病に対する遺伝子治療法を開発するため、神経細胞へ安全かつ効率良く遺伝子導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた研究を進めた。ドーパミン合成に必要な三種類の酵素、即ち、L-ドーパ合成を触媒するチロシン水酸化酵素(TH)、L-ドーパからドーパミンへの変換に必要な芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)、及びテトラヒドロビオプテリン(THの補酵素)合成の律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼI(GCH)の各遺伝子を搭載したAAVベクター(AAV-TH、AAV-AADC及びAAV-GCH)を作製し、パーキンソン病のモデル動物の線条体に注入する実験を行った。前年度より検討を継続しているモデルラット(黒質線条体路を6-hydroxydopamineで破壊して作製)を用いた実験では、導入遺伝子の線条体における発現は18ヶ月後にも認められ、apomorphine投与後の異常回転運動に対する治療効果も持続していることを確認した。今年度はさらに、MPTPを慢性投与して薬剤性パーキンソニズムを発症させたモデルサルに上記の三種類のAAVベクターを片側の被殻に注入しその効果を検討した。運動機能の評価では対側の上下肢の運動障害の改善効果が認められた。被殻のドーパミン受容体過敏性をapomorphine投与によって検討したところ体幹の回転するような姿勢が認められ、ベクター注入側におけるドーパミン受容体過敏性の改善効果と考えられた。ベクター注入5週間後に行った免疫組織化学的検討では被殻の広い範囲で各遺伝子の発現が確認された。以上より、AAVベクターを応用して線条体内でドーパミンを直接合成させる遺伝子治療は、パーキンソン病の新しい治療法として期待される。私は,黒質ドーパミン(DA)神経細胞の変性により線条体のDA含量が低下するパーキンソン病(PD)の遺伝子治療法として,神経組織へ安全かつ効率良く遺伝子導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて線条体のDA含量を高める治療法を研究している.既にAAVベクターを用いてDA合成系酵素のチロシン水酸化酵素(TH),芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)を遺伝子導入し,モデル動物の線条体でのDA合成を確認した.さらにDA合成を促進するにはその律速酵素であるTHの酵素活性を高めることが重要である.それにはTHの補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)の細胞内濃度を高めることが有用と考え,今回はBH4合成の律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼ1(GCH)の遺伝子を,AAVベクターを用いてTH,AADC遺伝子と同時に導入することを試みた.治療用遺伝子としてAAV-TH,AAV-AADC,及びAAV-GCHを作製してモデルラットに投与し,その結果,1)3種類のAAVベクターの同時投与により神経細胞に重複感染が高い割合で起きていることから,別々のベクターを用いて複数の遺伝子を同一神経細胞に効率よく導入されることが確認された.2)AAV-GCHの導入により,GCH活性の上昇とBH4合成量の増加が確認された.3)AAV-THとAAV-AADCの二者併用よりも,AAV-GCHを追加した三者併用の方が,機能的(異常回転運動の抑制)にも生化学的(DA合成量の増加)にもより有用であることが示された.4)遺伝子導入後の長期効果については,7ヶ月後で異常回転運動に対する治療効果は持続しており,かつ導入遺伝子の発現も免疫組織化学的に明瞭に確認された.以上より,AAVベクターの重複感染を利用したTH,AADC,及びGCHの各遺伝子の三者同時導入はPDの遺伝子治療として期待されることが明らかとなった.パーキンソン病に対する遺伝子治療法を開発するため、神経細胞へ安全かつ効率良く遺伝子導入できるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた研究を進めた。
癌骨転移環境下での癌細胞と骨細胞間ネットワーク機構の解明

本研究では癌の骨転移環境下での骨細胞の挙動に着目した。特に、骨細胞と癌細胞との間のネットワークについて解析をすすめた。骨細胞が産生する因子の中で特に骨代謝に関与するFGF23に着目した。癌が転移した周囲の骨細胞でのFGF23の発現は認められなかった。一方、骨に転移した乳癌細胞はFGF23を過剰に産生することがわかった。以上より、骨細胞と癌細胞にはネットワークがあり、FGF23が関与していることがわかった。癌細胞が骨に転移することでFGF23を発現し、骨に指向性をもつようになるのかの詳細な検討は今後の課題と思われる。当研究は癌骨転移環境下での癌細胞と骨細胞間のネットワーク機構を解明することを目的としている。この研究課題に至った経緯として、骨に転移した癌細胞において従来であれば骨細胞が産生すると言われているFGF23を過剰に産生している結果が得られたことから開始している研究である。癌細胞が培養環境下ではFGF23産生がみられない状況であるが、骨に転移した部位では過剰に産生していた(癌骨転移実験動物モデルで組織化学的に研究結果を得ている)。FGF23は骨細胞で産生され、その発現により低リン状態となり、骨軟化症を示すことがすでに知られている。この結果から骨という環境が癌細胞にFGF23の発現を過剰に亢進させ、骨を脆弱にし、骨環境下での癌細胞の増大や伸展を助けている可能性は容易に推察できる。実際にFGF23を過剰発現させた癌細胞を作製し、その挙動(増殖能、浸潤能、運動能等)を検索し、どういったシグナル伝達経路が亢進されているかを検索するまでに至っている。今後は産生されたFGF23が癌細胞自身に作用するのかさらには周囲の骨細胞等に作用するのかを検索し、癌細胞と骨代謝の関係性を詳細に解析する。将来的にはFGF23過剰発現細胞株を動物実験に使用し、骨転移への影響を検索する予定である。FGF23過剰発現細胞株は通常の細胞株よりも骨に転移しやすいのか、また、周囲の骨代謝関連細胞への影響(骨代謝関連細胞の活性化)も検索する予定である。本研究では骨代謝、特に骨細胞に注目して研究を遂行してきた。骨代謝はマクロ単位でみると腎臓や腸などの他臓器との連携で行われ、ミクロ単位では骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞間のネットワークが関与している。そのなかでも骨細胞に対しては未だ解明されていないことが多くある。それゆえ本研究では骨細胞に着目して研究を遂行した。骨細胞の研究を進めるため乳癌骨転移モデルマウスを用いた系を樹立して行った。癌が骨に転移すると骨破壊や骨増生の双方が関与し、骨代謝が活性化されていた。癌転移巣での骨細胞をみると骨細胞産生因子であるFGF23の発現が低下していた。この結果は免疫組織染色の結果から明らかであった。FGF23は骨細胞で産生され、循環系を介して腎臓に作用し、リンの再吸収と1α,25《OH》2D3産生を抑制する役割を持っている。骨代謝に重要な役割をもつため、FGF23に着目した。転移モデルを作成するために用いた乳癌細胞株は本来培養状態であるとFGF23発現はほとんど認められなかったが、骨に転移した場所ではFGF23発現が亢進していた。骨と癌の間で骨代謝に関与するネットワークを検索するため、FGF23過剰発現細胞株の作製を試みた。FGF23過剰発現細胞を使用し、骨転移モデルにおける骨細胞の挙動を検索した。先に示すように骨代謝に関わる細胞には3種あり、骨細胞だけに注目するだけでは複雑なネットワークの解明は困難であると考えられ、他の細胞との関係も考慮する必要がある。当研究の主目的である癌と癌が転移した骨環境下でのFGF23因子の関わりは実験動物レベルでの系は樹立している。さらに詳細な検索するべく現在は細胞レベルでの検索中である。動物実験の系は樹立されているため、研究はおおむね順調に進展していると考える。口腔外科動物実験系で明らかとなった研究結果を細胞レベルで検索中である。癌が転移した骨環境下でのFGF23因子の関わりを多方面から検索する必要がある。FGF23因子は骨細胞が産生すると言われているが、骨に転移した癌細胞でも産生される可能性があり、それを探っている状況である。今後は癌細胞及び骨細胞双方の関係性をさらに検索する予定である。確かなデータを獲得し、その後は学会等で発表し、さらには論文投稿によって情報を発信していく予定である。当該年度に必要な物品等は購入し、研究は計画通り進んでいる。