hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規血小板凝集促進因子Aggrusの機能解析

以上の結果より、Aggrusの機能発揮には、34番目と52番目のスレオニン残基を含むPLAG1とPLAG3ドメインが関与していることが明らかとなった。血小板凝集はがんの転移形成を促進する。研究代表者は、がん細胞膜上に発見している新規血小板凝集促進因子(Aggrus)の遺伝子クローニングに世界で初めて成功していた。1、ヒトAggrus結合分子の探索そこで本研究課題では、Aggrus結合分子の探索を行ない、膜4回貫通型タンパク質であるTetraspaninファミリー遺伝子の1つであるCD9を同定した。CD9はがん転移抑制分子として知られていたがその機能の詳細は不明であった。In vivoイメージング技術を用いることにより、CD9を過剰発現させたがん細胞では、肺へのトラップの過程で障害が生じ、肺転移が抑制されていることが確認された。そこで、Aggrus依存性血小板凝集誘導活性に対するCD9の効果を検討した結果、CD9はAggrus誘導性血小板凝集を抑制することが確認された。CD9はTetraspanin Web形成のオーガナイザーとして機能するが、AggrusもCD9と結合することによりTetraspanin Webに取込まれていることを生化学的な解析により確認した。さらに、AggrusとCD9の結合にはCD9上の膜貫通ドメイン1と2が関与しており、この部位を欠失したCD9には血小板凝集抑制活性が認められず、転移抑制効果も認められなかった。以上よりCD9は、Aggrusの血小板凝集誘導活性を中和することによりその転移抑制機能を発揮していることが明らかとなった。2、Aggrusの発現制御機構の解析Aggrus発現に関わる転写因子として、ホメオボックス転写因子Prox1の関与が示唆されていたため、がん細胞におけるProx1の強発現に伴うAggrus発現を検討したがほとんど変化が認められず、Aggrus発現制御には、メチル化などのエピジェネティックな遺伝子の発現制御機構が関与している可能性が示唆された。
ニワトリ細胞株DT40の温度感受性株の作製とDNA複製チェックポイントの解析

1.DT40細胞におけるRad50条件破壊株の作製Rad50遺伝子は細胞の増殖に必須であることが予想されるので、以下の方法で条件破壊株を作製した。(1)Rad50ヘテロ接合体(+/-)の作製まず一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をヒスチジノール耐性遺伝子の挿入により破壊した。(2)Rad50遺伝子発現コンストラクトの構築とヘテロ接合体への導入テトラサイクリン誘導プロモーターの下流にニワトリRad50cDNAを挿入し、さらにその下流に内部リボゾーマル結合サイト(IRES)とルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。さらにこれら全体を2つのloxPシグナルで挟んだベクターを構築した。(培地にタモキシフェンを添加により、エストロジェン受容体-Cre組み換え酵素の融合蛋白(ER-Cre)を発現している細胞では、2つのloxPに挟まれた挿入遺伝子をゲノムから切り出すことが可能である。)このRad50発現ベクターと転写因子(tTA)発現ベクターをRad50ヘテロ接合体に導入した。(3)Rad50ホモ接合体(-/-)の作製もう一方の対立遺伝子上のRad50遺伝子をブラストサイディン耐性遺伝子の挿入により破壊した。また得られたホモ接合体にER-Cre発現ベクターを導入し、Rad50条件破壊株を樹立した。2.Rad50条件破壊株のフェノタイプ解析(1)Rad50条件破壊株は薬剤を含まない培地では正常に増殖したが、ドキシサイクリンまたはタモキシフェンの培地への添加により増殖できなくなった。(2)(1)の処理によりレポーター遺伝子のルシフェラーゼ活性は著しく減少した3.温度感受性Rad50ミュータントcDNAの構築Rad50は中央にcoiled-coil構造を持つSMC様蛋白で、Mre11と複合体を形成する。最近Rad50蛋白の結晶構造解析から3次元構造が明らかになった。構造解析を行った米国のTainer博士との共同研究で、Mre11との蛋白相互作用に温度感受性を示すような変異を予想し、Rad50の特定アミノ酸部位に変異を導入したcDNAを構築している。
表在型バレット腺癌のncRNA網羅的解析と食道洗浄廃液による超早期分子診断の検討

食道バレット腺癌は我が国において今後増加すると考えられているが、欧米ではラジオ波焼灼治療が施行されることが多く、その発生初期の分子病理学的特徴に関して解析が進んでいない。本邦では内視鏡的粘膜切除術(ESD)が広く行われており、今回我々はその切除標本を用いて分子異常を解析した。その結果、複数の消化器癌で異常が報告されているPI3K/Akt経路で重要なPIK3CA遺伝子の変異が表在型バレット腺癌の15%で認められ、PIK3CA遺伝子変異群は野生型群と比較してLINE-1メチル化レベルが低いことが明らかとなった。我が国においても食道バレット腺癌は生活習慣の欧米化に伴って今後、増加する可能性がある。しかしながらバレット腺癌の発生初期段階における分子病理学的特徴に関しては不明な点が多いのが現状である。その理由として欧米ではラジオ波焼灼治療が施行されることが多くなったため、その組織検体が得られる機会が少なく、その分子異常の解析が十分になされていないことが要因と考えられる。一方、本邦におけるバレット腺癌はShort Segment Barrett Esophagus(SSBE)をベースとして食道胃接合部付近に発生することが多く、表在癌であれば焼灼治療ではなく、内視鏡的切除術が行われている。特にわが国では近年、表在型食道癌に対してもESDが広く行われており、病変を周囲粘膜も含めて一括切除できるため、その発生初期の分子異常を解析するのに十分な組織検体を得られるというメリットがある。そこで本研究では完全一括切除された表在型食道バレット腺癌と噴門部胃癌を対象に両者の分子異常を網羅的に解析し、それらを比較検討。同定された分子異常を利用し、食道洗浄廃液を用いた新たな食道バレット腺癌の分子診断や進行癌症例での標的治療の可能性についても探求し、将来的な臨床応用を目指す。今回の研究を行う意義として、表在型食道バレット腺癌の分子病理学的異常を解析することで、その初期の発癌機構解明やその分子異常をターゲットとした進行癌症例での標的治療、またバレット食道を有する患者の発癌リスクについての新たな分子診断の可能性があげられる。我が国において、食道バレット腺癌は生活習慣の欧米化に伴って今後増加する可能性が指摘されている。しかしながらバレット腺癌の発生初期段階における分子病理学的特徴に関しては不明な点が多い。その理由として欧米ではラジオ波焼灼治療が施行されることが多く、その組織検体が得られる機会が少なく、分子異常の解析が十分になされていないことが要因として考えられる。一方、本邦においては表在癌であれば内視鏡的粘膜切除術(ESD)が広く行われており、病変を周囲粘膜も含めて一括切除できるため、その発生初期の分子異常を解析するのに十分な組織検体を得られる。そこで本研究では本邦においてESDで完全一括切除された表在型食道バレット腺癌と噴門部胃癌を対象に両者の分子異常を網羅歴に解析し、それらを比較検討した。特にPIC3CA遺伝子の解析においてはexon1、9、20の変異に関して独自に設計したプライマーを用い、パイロシークエンサーで解析した。さらにゲノムワイドDNAメチル化レベルの指標となるLINE-1のメチル化解析も施行した。二年度に渡る症例の集積と解析の結果、PIC3CA遺伝子変異は表在型食道バレット腺癌の15%で認められ、PIC3CA遺伝子変異群は野生型群と比較して有意にLINE-1メチル化レベルが低いことを明らかにした。またLINE-1メチル化レベルに加え、食道扁平上皮癌で予後不良との相関が報告されているIGF DMR0メチル化レベルを解析した。その結果、食道バレット腺癌においては食道扁平上皮癌と比較して総じてメチル化異常が多く、特に喫煙歴を有する症例ではIGF DMR0のメチル化レベルの低下が認められた。今回得られた知見は、食道バレット腺癌の発生初期の分子異常の解明につながるとともに、バイオマーカーや標的治療など将来的な臨床応用につながると考える。我々は当施設と関連施設(恵佑会札幌病院、手稲渓仁会病院)にてESD(内視鏡的粘膜下層剥離術)で切除された100例を超える表在型食道バレット腺癌と噴門部胃癌からDNA、RNAを抽出した。またPIK3CA遺伝子はexon1、9、20の変異に関して独自に設計したプライマーを用い、パイロシークエンサーで解析した。その結果、PIK3CA遺伝子は表在型食道バレット腺癌の15%で認められることを明らかにした。またゲノムワイドDNAメチル化レベルの指標となるLINE-1のメチル化解析も施行。その結果、PIK3CA遺伝子変異群は野生型群と比較して有意にそのメチル化レベルが低いことも明らかとした。

医歯薬学ESDで切除された癌組織から抽出されたノンコーディングRNAを抽出。表在型食道バレット腺癌、バレット食道、噴門部胃癌、食道扁平上皮癌をそれぞれ5ー10例ずつ用いて、アレイキットでノンコーディングの発現を解析し、クラスター解析等で発現プロファイルを作成。またバイオインフォマティクスや生物統計学を用いてデータ解析し、有望なノンコーディングが同定された場合、定量Real-time PCRで全症例を対象にその発現レベルを検証し、それぞれの組織で特異的に発現するノンコーディングを同定する予定。またバレット食道、表在型バレット腺癌患者の食道洗浄廃液からDNA、RNAを抽出し、これまでに同定された有望な分子異常を解析することも予定している。
一般線形群の指標の積公式、既約表現の次元公式と数え上げ組合せ論

数え上げ組合せ論の重要性が置換群の表現理論の立場より再認識されてひさしい。一方計算可能な確率モデル(例えば最も簡単な例である二項係数は、原点より平面の格子点までの正方向の格子道全体を数え上げている。)豊富な組合せ構造を持っている事が知られている。これは確率、統計の理論と置換群(さらに広く群構造又は、群表現)との密接な関係を暗示している。実際、私は置換群の表現論の中に良く知られた自然な確率モデルが存在する事を次のように確認した。(1)“二人候補者の投票問題"は、反射原理、包含原理に基づいて前世紀末に解かれた。この多人数候補者の場合への一般化は上記二つの原理遠で解く事ができ、又この解は良く知られた置換群の表現の次元公式(Frame、Robinson、Thrallの公式)になっている。(2)この反射原理、包含原理による数え上げは一般線形群の指標の積の公式(Littlewood-Richaedson則)とその一般化の証明を与えている。
ヒトES/iPS細胞の未分化性維持に関与するシグナル伝達経路の探索

ヒト多能性幹細胞の自己増殖は、様々なシグナル経路によってサポートされることが知られている。その中でもFGF-2シグナルは、未分化状態の維持に必須であると考えられている。しかしながら、FGF-2に応答する下流シグナル経路によって制御されるヒト多能性幹細胞の分化や自己増殖の機構は、十分に解明されていない。これまで私たちは、ミニマムエッセンシャルな成分からなる既知組成培地hESF9を開発した。この培地を用いてFGF-2シグナルの下流経路に作用し、未分化なヒトES/iPS細胞の自己増殖を促進させる小分子化合物を探索した。未分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を指標として数多くの小分子化合物をスクリーニングした結果、私たちは未分化なヒトES/iPS細胞の増殖を促進させるPKC阻害剤(GF109203X)を発見した。PKCは、ヒト多能性幹細胞の分化・未分化性を制御する重要なFGF-2の下流シグナル伝達経路に関与することが考えられた。PKCノックダウン解析の結果、私たちはPKCがFGF-2の下流経路であるAKT、ERK1/2、GSK3βのリン酸化に関与することを明らかにした。またActivin Aの添加は、FGF-2と相乗的にERK1/2、GSK3βのリン酸化を増加させた。このERK1/2とGSK3βのリン酸化は、GF109203XおよびERK経路阻害剤U0126の添加によって阻害された。さらに、GF109203XおよびU0126の添加は、ヒト多能性幹細胞の安定な増殖を促進し、単一細胞剥離による継代を可能にした。本研究において私たちは、FGF-2の添加により活性化するPKCによって、ヒトES/iPS細胞の分化・未分化な状態が制御されることを明らかにした。研究の目的:本研究課題は、ヒトES/iPS細胞の未分化性維持に関与する細胞内リン酸化シグナル伝達経路の探索を目的とする。現在一般的に使用されているヒトES/iPS細胞用培地は、数多くの不特定因子を含み、それら因子によって未分化性・分化能に関与する多くの内在性シグナル伝達経路が活性化されるため、添加する薬剤・増殖因子の正確な機能解析を行うことができない。申請者らは、これまでヒトES細胞の未分化性の維持が可能な最小増殖因子から成る無血清培地を開発した。22年度は、この培地を用いてヒトES/iPS細胞の制御に関与する重要な細胞内シグナル伝達経路を効率的に探索する新規評価手法の開発を目指す。この新規手法を用いて、ヒトES/iPS細胞の未分化能・増殖能等に影響を及ぼす数多くのシグナル伝達経路阻害剤の効果を検証し、ヒト多能性幹細胞を制御する重要な細胞内リン酸化シグナル伝達経路を探索する。22年度実施成果(効率的な解析手法の確立):未分化性細胞の判別に利用される従来法のアルカリフォスファターゼ染色は、簡易であるが定量性・感度に乏しく正確な評価が難しい。申請者らは、多検体処理を可能にするため、アルカリフォスファターゼ(ALP)の蛍光基質を利用してALP活性を測定できる高感度かつ定量性に優れている手法を開発した。その新規評価法を用いて、BIOMOL社のキナーゼ阻害剤ケミカルライブラリーに含まれる各々化合物がヒトES/iPS細胞の未分化性・分化に与える影響について検証を行った。現在、ヒトES/iPS細胞の未分化性に対して効果的ないくつかの阻害剤を見出し、それらの阻害剤の作用機序の探索・解明を進めている。

現在一般的に使用されているヒトES/iPS細胞用培地は、数多くの不特定因子を含み、それら因子によって未分化性・分化能に関与する多くの内在性シグナル伝達経路が活性化されるため、添加する薬剤・増殖因子の正確な機能解析を行うことができない。申請者らは、ヒトES細胞の未分化性の維持が可能な最小増殖因子から成る無血清培地を用いて、多検体処理が可能であり、高感度かつ定量性に優れている手法を開発した。私たちが開発した新規評価法を用いて、BIOMOL社のキナーゼ阻害剤ケミカルライブラリーに含まれる各々化合物がヒトES/iPS細胞の未分化性分化に与える影響について検証を行い、ヒトES/ips細胞の未分化性に対して効果的ないくつかの阻害剤を同定した。23年度実施成果:この同定した阻害剤の作用点から、ヒト多能性幹細胞の分化・未分化性を制御する可能性がある重要な細胞内リン酸化シグナル伝達経路を見出した。私たちはこのリン酸化シグナル経路を活性化させた場合、もしくは抑制した場合の多能性幹細胞の分化・未分化性との関連を検証した。その結果、このシグナル経路を活性化させた場合、顕著に細胞分化が観察され、一方で抑制した場合は、未分化性が維持された。この結果よりこのシグナル伝達経路は、多能性幹細胞の分化・未分化性の制御に重要であることが示唆された。現在、私たちはこのシグナル伝達経路を制御する上流因子、およびこの経路により制御される下流因子の探索を進めている。本研究課題は、ヒトES/iPS細胞の未分化性維持に関与するFGF-2によって活性化されるリン酸化シグナル伝達経路の探索を目的とする。現在一般的に使用されているヒトES/iPS細胞用培地は、数多くの不特定因子を含み、それら不特定因子によって多くのシグナル伝達経路が活性化する。そのため、添加する小分子化合物や増殖因子の作用機構の解明を困難にしている。申請者らは、ヒトES細胞の未分化状態の維持に必須であると考えられているFGF-2のみを含む無血清培地を用いて、アルカリフォスファターゼ活性を指標とした多検体処理の可能な手法を開発した。この新規評価法を用いて、FGF-2シグナルの下流経路に作用し、未分化なヒトES/iPS細胞の自己増殖を促進させる小分子化合物を探索した。数多くの小分子化合物をスクリーニングした結果、申請者らは未分化なヒトES/iPS細胞の増殖を促進させるPKC阻害剤(GF109203X)を発見した。PKCは、ヒト多能性幹細胞の分化・未分化性を制御する重要なFGF-2の下流シグナル伝達経路に関与することが考えられた。PKCノックダウン解析の結果、私たちはPKCがFGF-2の下流経路であるAKT、ERK1/2、GSK3のリン酸化に関与することを明らかにした。またActivin Aの添加は、FGF-2と相乗的にERK1/2、GSK3のリン酸化を増加させた。このERK1/2とGSK3のリン酸化は、GF109203XおよびERK経路阻害剤U0126の添加によって阻害された。GF109203XおよびU0126の添加は、ヒト多能性幹細胞の安定な増殖を促進し、単一細胞剥離による継代を可能にした。本研究課題の遂行により申請者は、FGF-2の添加により活性化するPKCによって、ヒトES/iPS細胞の分化・未分化な状態が制御されることを明らかにした。
高圧水中ウォータージェットを用いた汚染土壌浄化法

高圧水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションの有機化合物に対する基礎的な分解能力を明らかにすることを目的として,H17年度に開発した高圧水中ウォータージェット分解実験装置を用いて水深300m相当までの環境圧力下でシュウ酸の分解実験を行い,その分解能に及ぼす吐出圧力,環境圧力およびノズル開角の影響を調査した.また,従来の超音波振動子による方法で得られた結果との分解効率の比較も行なった.本研究で得られた主な知見は以下のようである.1.水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションにより水深300m相当までの高圧水中下においてもシュウ酸の分解が可能である.2.いずれの環境圧力においても,吐出圧力が大きいほどシュウ酸の分解速度が大きい.また,いずれの吐出圧力においても,環境圧力が小さいほどシュウ酸の分解速度が大きい.これは,吐出圧力が大きく,環境圧力が小さいほど水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションの量が増大し,その結果,より多くのラジカルが生成されるためである.従って,環境圧力が大きい原位置においても吐出圧力を大きくすることで,分解速度の向上が可能である.3.本研究で用いたノズルでシュウ酸の分解速度が最も大きかったのは,開角が全角で60°のホーン型ノズルであった.これは,水中ウォータージェットにより生ずるキャビテーションの量がノズルの開角に依存しており,開角が全角で60°の時に生ずるキャビテーション量が最も大きくなるためと考えられる.4.超音波振動子法に比べ水中ウォータージェットを用いる本方法の方が単位エネルギー当たりの分解量が格段に大きい.従って,本方法は超音波振動子法に比べ少ないエネルギーで効率よく分解を行なうことができる.高圧水中ウォータージェット(WJ)により生ずるキャビテーションを利用した汚染土壌の無害化処理法の有効性を評価することを目的として,本年度は高圧水中WJ汚染土壌浄化試験装置の開発を行った.開発した試験装置の概要は以下のとおりである.試験装置は,主に,薬液タンク,現有の高圧水ポンプ,浄化試験用圧力容器,耐圧サイクロン式沈殿槽,キャビテーション観察用アクリル製圧力容器および計測機器で構成されている.流路での汚染を防ぐために,高圧水配管および圧力容器はSUS316製とし,高圧ホースはテフロン製の内壁のものを用いた.薬液タンクの容量は200lであり,タンク底面をポンプの吸込口よりも上部に設置した.薬液タンクと高圧水ポンプおよび圧力容器の経路上には,試料採取用の弁が複数設けられている.圧力容器は,内径50mmであり,3MPaの耐圧を有し,圧力容器内で流れが滞留しないよう,圧力容器隅角で渦が生じにくい構造とした.WJノズルにはキャビテーションの発生を促進するホーン型キャビジェットノズルを用いた.WJノズルは圧力容器底部に設置され,WJは上向きに噴射される.キャビテーション観察用のアクリル製圧力容器には,内部にガラス管を設置し,キャビテーションによる損傷を防いだ.吐出圧力および圧力容器内の圧力は,ひずみゲージ式圧力変換器により計測され,圧力容器内の温度は,測温抵抗体により計測される.来年度は,開発した試験装置を用いて高圧水中キャビテーションの汚染物質の分解能ならびに汚染土壌の洗浄能を実験的に明らかにする.得られた結果より,高圧水中キャビテーションによる有機化合物の分解プロセスと分解メカニズムを明らかにし,水中WJを用いた汚染土壌の高速大容量浄化システムを提案する.高圧水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションの有機化合物に対する基礎的な分解能力を明らかにすることを目的として,H17年度に開発した高圧水中ウォータージェット分解実験装置を用いて水深300m相当までの環境圧力下でシュウ酸の分解実験を行い,その分解能に及ぼす吐出圧力,環境圧力およびノズル開角の影響を調査した.また,従来の超音波振動子による方法で得られた結果との分解効率の比較も行なった.本研究で得られた主な知見は以下のようである.1.水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションにより水深300m相当までの高圧水中下においてもシュウ酸の分解が可能である.2.いずれの環境圧力においても,吐出圧力が大きいほどシュウ酸の分解速度が大きい.また,いずれの吐出圧力においても,環境圧力が小さいほどシュウ酸の分解速度が大きい.これは,吐出圧力が大きく,環境圧力が小さいほど水中ウォータージェットにより誘起されるキャビテーションの量が増大し,その結果,より多くのラジカルが生成されるためである.従って,環境圧力が大きい原位置においても吐出圧力を大きくすることで,分解速度の向上が可能である.3.本研究で用いたノズルでシュウ酸の分解速度が最も大きかったのは,開角が全角で60°のホーン型ノズルであった.これは,水中ウォータージェットにより生ずるキャビテーションの量がノズルの開角に依存しており,開角が全角で60°の時に生ずるキャビテーション量が最も大きくなるためと考えられる.4.超音波振動子法に比べ水中ウォータージェットを用いる本方法の方が単位エネルギー当たりの分解量が格段に大きい.従って,本方法は超音波振動子法に比べ少ないエネルギーで効率よく分解を行なうことができる.
低リン酸耐性ニンジン細胞のクエン酸代謝関連酵素の変動

低リン酸耐性細胞は、通常植物が利用しがたいリン酸アルミニウムを唯一のリン酸給源として選抜された。この細胞は、培地に放出したクエン酸により定量的にリン酸を可溶化して、良好に生育する。本研究では、ニンジン及びアルファルファの低リン酸耐性細胞の、クエン酸代謝に関連する酵素群の活性を測定し、低リン酸耐性機構の一端を明らかにすることを目的とした。先ず、素酵素液中のクエン酸合成酵素、PEPC、ICDH、アコニターゼ活性を測定したところ、ニンジン及びアルファルファ低リン酸耐性細胞は、共通してクエン酸合成に直接関与するクエン酸合成酵素の活性が野生型細胞に比較して、培養条件によらず2倍程度高く、さらに分解に関与する酵素のうち、NADP特異的イソクエン酸脱水素酵素活性が、50%程度であることが分かった。このことは、低リン酸耐性細胞が野生型細胞に比較して、糖代謝の過程でクエン酸を余剰に生産する能力を持つことを示唆している。一方、これらの細胞ではパターンは異なるものの、分解系の酵素のうちニンジンではNAD-ICDH、アルファルファではアコニターゼの活性が高く、低リン酸耐性細胞がクエン酸をロスしながら生育する場合に必須な、適応現象である可能性が高い。今後は、これらの酵素を精製し、その性質を調べるとともに、分子生物学的なアプローチにより低リン酸耐性の鍵となる酵素の特定を目指す。尚、本研究では今後の研究で必要となる分子生物学的なアプローチに必須な、シロイヌナズナの水耕栽培法を新規に考案し、その低栄養応答を調べ、同植物が低リン酸に対して応答することを明らかにした。
水素供給を必要としない非絶対的嫌気条件下における微生物による石油の脱硫系の開発

多環芳香属化合物は発がん性を有するため自然環境中での分解が懸念されてきた。本研究者らは脱硫系の開発を行う過程においてこれらの化合物を効率良く分解し、かつ含イオウ芳香属化合物について著しい分解性を有する菌Achromobacter sp.SS6株を分離した。そこでバイオレメディエーションの観点から、本菌について詳しく検討した。多環芳香属化合物の分解は生育条件下においては基質濃度3mM、5mlの培地、30°Cで行った。化合物量はHPLCとGCによって測定した。また、菌体反応は0.6mMの基質濃度で行った。本菌はフェナントレンの分解が優れており、高い分解能を持つと報告されているPseudomonas cepacia F297の3.5倍の分解が見られた。菌体反応において、35時間後にはナフタレン、ビフェニール、ジベンゾチオフェン、ジベンゾフラン、カルバゾールはそれぞれ、100、74、83、75、60%分解した。また、イオウ化合物のみを検出できるFPDにより、24時間の菌体反応後フェニルジスルファイド、チアンスレン、ベンジルジスルファイド、4,4'-チオフェニル、ジベンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、はそれぞれ、57,3、49.2、49.0、47.2、32.4、11.0%の脱硫が確認された。汎用されているRhodococcus IGTS8ではチアンスレンはジベンゾチオフェンの62%、4,4'-チオフェニルは45%、ベンジルジスルファイドは14%、フェニルジスルファイドは8%の分解性しかないのに比べ、本菌では152、146、151、177%の分解性を有しており、Rhodococcus IGTS8とは異なる基質特異性を持つことが明らかとなった。今後はこれらの優れた脱硫能を非絶対的嫌気条件下において発揮できるような系の構築に取り組みたいと考えている。1.緒言石油中のイオウ化合物は酸性雨の原因となる。われわれはこれまでに報告のない、生育に水素を必要としない硫酸還元菌を分離し、これらの菌について石油のモデル化合物としてのケロセンへの耐性と、難分解性へテロ環系イオウ化合物のモデル化合物としてのジベンゾチオフェンからの脱硫能の検討を行った。2.方法及び結果硫酸還元菌の分離は二重皿法を用いて窒素ガス下で行い、39土壌サンプルから200株が、黒いコロニーとして得られた。次にこれらのうち69株について液体培地に10%(v/v)ケロセンを加えたものと加えていないものについての生育の違いから、ケロセンに対する耐性を調べたところ、次の4つのタイプが見られた。A最大生育量がケロセンを加えた時と加えていない時で同じであるが、ケロセンを加えた時は加えていない時に比べ生育が始まるまでの期間が長い。B最大生育量がケロセンを加えた時には加えていない時より低いが、ケロセンを加えた時と加えていない時とで、生育が始まるまでの期間が同じである。C最大生育量がケロセンを加えた時には加えていない時より低く、生育が始まるまでの期間が長い。Dケロセンを加えた時は生育しない。次にこれら69株について初期濃度0.1%のジベンゾチオフェンを含む液体培地での窒素ガス下における分解を調べた。その結果、50株は分解せず、14株が10%以上の、5株が弱い分解を示した。培養液の酢酸エチル抽出物をガスクロマトグラフィーによって分析したところ、10%以上の分解を示した菌の培養液にはジベンゾチオフェンの分解産物として5つのピークが見られたのに対して、弱い分解能しか持たない菌の場合にはこれら5つのうちの1つのピークしか見られなかった。また、ビフェニルに対応するピークはみられなかった。さらに10%以上の分解能を持つ菌のうち、ケロセンに耐性のあるAグループの2菌について16SRNAによる同定を試みたところ、Desulfomicrobium escambiumとDesufovibrio longreachiiに95%の相同性が認められた。3.考察ジベンゾチオフェン分解能を持つ硫酸還元菌は窒素ガス下での新たな脱硫系の可能性を有している。フルオレンや異種元素を構成要素として含むジベンゾチオフェン、カルバゾール、ジベンゾフランなどの多環芳香属炭化水素はクレオソート、原油、シェールオイルなどの構成妻素であり、毒性や発ガン性を有するため汚染問題を引き起こしている。ジベンゾチオフェンやカルバゾールなど硫黄や窒素を含む分子の燃焼は酸性雨の原因となる酸化硫黄や酸化窒素の生成をもたらすため石油からの除去が重要である。ジベンゾフランは農薬として、あるいは染料の媒介試薬として多用されてきた。フルオレンは強い毒性をもつ塩素を含む多環芳香属炭化水素のモデル化合物として分解経路の解明が進められている。本研究者は石油からの脱硫を行う微生物を探索する過程において、上記の多環芳香属炭化水素を分解する能力を持つ菌を取得した。この菌は好気的に培養された時、これまで、嫌気性菌でのみ報告されている分解系を持つことが示唆されたため、嫌気的な条件下での分解も可能であると考え、詳しく分解能及び代謝経路について検討を行った。生育条件下では初期濃度3mMにおいて12日目でジベンゾチオフェン、カルバゾール、ジベンゾフラン、フルオレンがそれぞれ46、36、46、29%分解された。

休止菌体反応において35時間後に初期濃度0.6mMのジベンゾチオフェン、カルバゾール、ジベンゾフラン、フルオレンのそれぞれ83、58、75、63%が分解された。ジベンゾチオフェン、ジベンゾフラン、フルオレンの分解産物に由来すると考えられる吸収が375nm、345nm、326nmで最大値を示した。これらの化合物のGC-MSにより同定を試みたところ、ジベンゾチオフェンについて、代謝産物がビフェニルであることが確認された。また、上記4化合物に共通して同一分子量を持つ化合物の形成が見られた。一方、16S rRNA法により、本菌はAchromob acter sp.と99%の相同性を有していた。多環芳香属化合物は発がん性を有するため自然環境中での分解が懸念されてきた。本研究者らは脱硫系の開発を行う過程においてこれらの化合物を効率良く分解し、かつ含イオウ芳香属化合物について著しい分解性を有する菌Achromobacter sp.SS6株を分離した。そこでバイオレメディエーションの観点から、本菌について詳しく検討した。多環芳香属化合物の分解は生育条件下においては基質濃度3mM、5mlの培地、30°Cで行った。化合物量はHPLCとGCによって測定した。また、菌体反応は0.6mMの基質濃度で行った。本菌はフェナントレンの分解が優れており、高い分解能を持つと報告されているPseudomonas cepacia F297の3.5倍の分解が見られた。菌体反応において、35時間後にはナフタレン、ビフェニール、ジベンゾチオフェン、ジベンゾフラン、カルバゾールはそれぞれ、100、74、83、75、60%分解した。また、イオウ化合物のみを検出できるFPDにより、24時間の菌体反応後フェニルジスルファイド、チアンスレン、ベンジルジスルファイド、4,4'-チオフェニル、ジベンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、はそれぞれ、57,3、49.2、49.0、47.2、32.4、11.0%の脱硫が確認された。汎用されているRhodococcus IGTS8ではチアンスレンはジベンゾチオフェンの62%、4,4'-チオフェニルは45%、ベンジルジスルファイドは14%、フェニルジスルファイドは8%の分解性しかないのに比べ、本菌では152、146、151、177%の分解性を有しており、Rhodococcus IGTS8とは異なる基質特異性を持つことが明らかとなった。今後はこれらの優れた脱硫能を非絶対的嫌気条件下において発揮できるような系の構築に取り組みたいと考えている。
α-synucleinキナーゼの同定とα-syuclein凝集機序の解析

α-synucleinはパーキンソン病の発症に関与する重要な蛋白として注目を集めている。しかし、α-synucleinが神経細胞内でどのように修飾を受け、どのような機序で凝集体を形成するのか、そのプロセスは未だ不明である。われわれはα-synucleinをリン酸化する酵素の検索を行い、α-synucleinのリン酸化がα-synucleinの凝集に及ぼす影響を検討した。中枢神経でシグナル伝達に重要な役割を担うチロシンキナーゼであるFyn、Lyn、PYK2、FAK、およびセリン・スレオニンキナーゼであるMAPK/ERK1、SAPK/JNK、Cdk5をそれぞれCOS7細胞に発現させ、[γ-32P]ATPを用いて免疫沈降キナーゼアッセイを行った。基質にはGST融合α-synuclein蛋白を用いた。今回検討した7種類のキナーゼのうち、Fynがα-synucleinのチロシン残基をリン酸化した。家族性パーキンソン病で報告されているA30PおよびA53T変異型α-synucleinもFynにより同様にリン酸化された。α-synucleinは4つのチロシン残基(Y39、Y125、Y133、Y136)を持つが、Fynによるα-synucleinのリン酸化部位はY125であることが判明した。脳内におけるα-synucleinの発現は黒質、線条体、海馬などに多く、Fynの発現部位と一致し、また免疫蛍光染色と共焦点レーザー顕微鏡による観察でもα-synucleinとFynは細胞内で共存し、細胞内でα-synucleinがFynによりリン酸化されることが推察される。さらにチロシンがリン酸化を受けていない高純度のα-synuclein蛋白をstreptolysin-OによりSH-SY5Y細胞に導入し培養したところ、生きた細胞内にα-synucleinからなる凝集体が容易に形成された。リン酸化、脱リン酸化や、ニトロ化などによるα-synucleinのチロシン残基の修飾は、α-synucleinの凝集機序や、神経変性過程を解析する上で重要であると考えられる。平成13年度は、平成12年度の成果をふまえ、さらに研究を進める予定である。
照葉樹林の生物多様性保全に関する研究

1.照葉樹林の樹林面積と種多様性日本海側における両者の関係を明らかにし(石田ほか,2001),それ以前に報告した2地域の結果を合わせてその結果を成果報告書にまとめた。樹林面積と種多様性についてはいずれの地域においても相関が認められ,回帰直線の傾きはほぼ一致した。2.照葉樹林フロラ九州以北(服部・南山,2001),国内全体(Hattori et al.,2003)の照葉樹林フロラを明らかにした。国内の照葉樹林構成種数は1008種であった。構成種のうち約30%の種が各都府県で絶滅危惧の状態にあることが明らかとなった(服部ほか,2002)。3.照葉樹林の種多様性維持に大きく寄与するギャップ相ギャップ相は夏緑系植物の生育の場であることはすでに報告されていた。本調査によって,ギャップ相は夏緑系植物だけでなく,照葉樹林構成種にとっても生育の場であることがわかった。ギャップ相は成熟相よりも地生植物の種多様性維持に大きく寄与している(服部ほか,2004)。4.各種環境条件と種多様性微地形条件,土壌条件,海抜条件,気温条件と種多様性との関連を明らかにした(小舘ほか,2001;服部・浅見ほか,2003;服部・南山ほか,2003)。1.照葉樹林構成種のリスト作成および構成種の現状本年度は各種文献を用いて九州以北の照葉樹林構成種のリストを作成した。その結果、九州以北の照葉樹林構成種として479種が認められた。この成果は「人と自然」に発表した。このリストを用いて、各都道府県の照葉樹林構成種の絶滅危惧状況を調査した。その結果、約34%の種が各々の都府県で絶滅危惧状況にあることが明らかとなった。その中でラン科やシダ植物の絶滅危惧率が高く、保全対策の必要性が認められた。この成果は「日本造園学会誌ランドスケープ研究」に発表した。2.孤立化した照葉樹林の種数と面積の関係長崎県対馬等の孤立化した照葉樹林について、その種数と面積の関係について調査を行った。調査の結果、両者には明快な対応関係が認められた。種多様性を確保するためにはできるだけ大面積の照葉樹林を保全する必要があると考えられた。また種数・面積関係には地域差が認められたが、その要因等については現在解析中である。この成果は「植物地理・分類研究」に発表した。3.各地域の照葉樹林構成種の単位面積(100m^2)あたりの種多様性本年度は秋田県、山形県、岩手県、新潟県、鹿児島県、宮崎県、沖縄県の照葉樹林の植生調査を行った。今回の資料の中ではもっとも多様性の高い照葉樹林は西表島(約70種/100m^2)で、もっとも低い照葉樹林は飛島(8種/100m^2)であった。詳細については来年度以降解析を行う。1.照葉人工林の種多様化手法の開発工場内緑地などに形成されている照葉人工林は植栽種が高木に限られていること、孤立していることなどにより、樹林の種多様性は非常に低い。種多様化を計るために各種の照葉樹林要素を照葉人工林に植栽し、定着の可能性を数年にわたって調査した。年降水量が非常に少ない年が続いたのにもかかわらず、植栽種は定着し、照葉人工林の植栽による種多様化は十分可能であることが明らかとなった。この成果は「日本造園学会誌ランドスケープ研究66」に発表した。2.照葉原生林内の成熟相とギャップ相の種多様性の比較宮崎県霧島等の照葉原生林において成熟相とギャップ相の調査を行い、両者の種多様性を調査した。ギャップ相には陽地生植物が多数出現する他に、地生の照葉樹林要素の種数も多く、種多様性は高かった。成熟相は着生植物が多く出現した。

この成果は「人と自然13」に発表した。3.各地域の照葉樹林の種多様性本年度は宮崎県、西表島、奄美大島、徳之島、屋久島、与那国島等において照葉樹林の種多様性に関する調査を行った。4.照葉樹林の種多様性の復元兵庫県赤穂市生島の照葉樹林はムベによって壊滅的な被害を受けていた。ムベの伐採を住民参加で行い、照葉樹林の種多様性を確保した。1.地形条件に対する種多様性の研究照葉原生林が保全されている宮崎県綾町川中において微地形および土壌条件と種多様性・種組成の関係を調査した。その結果,斜面下部の種多様性がもっとも高かった。種多様性を維持している要因として土壌の良好な物理性(気相の割合の高さ)に依ると考えられた。2.九州における種多様性の比較良好な照葉樹林が保全されている9地域の照葉樹林の100m^2調査区における種多様性を比較した。結果,宮崎県綾北川の種多様性がもっとも高かった。種多様性の高さと最寒月の月平均気温には相関が認められた。3.照葉樹林の成熟相とギャップ相の種組成および種多様性の比較3地域の照葉樹林を調査した結果,ギャップ相は夏緑系の植物だけではなく,照葉樹林構成種の種多様性が高いことが明らかとなり,ギャップ相は照葉樹林の種多様性維持に大きく寄与していることが明らかとなった。4.照葉樹林の構成種(照葉樹林フロラ)平成13年度の九州以北の照葉樹林構成種のリスト作成に続いて,国内全体の構成種のリストを作成した。国内の照葉樹林構成種数は1008種と認められた。
機能的結合による大脳高次機能のモデリング

脳のコーディングを扱うモデル研究の多くは、モデルニューロンの減衰時定数等を決めた時点でコーディングを陽に指定してしまうという問題を内包している。この問題を克服するために、生理的に妥当なパラメータを持つHodgkin-Huxleyニューロンの発火前後の入力コンダクタンスに注目し、入力コンダクタンスの値とその4-5msec間の変化量にそれぞれ発火閾値を持つDual Thresholdニューロンモデルを提案した。このニューロンモデルは、Hodgkin-Huxleyニューロンと同様の発火特性を持ちながら、計算量はその数百分の1に過ぎない。次に計算量が少ないという特徴を生かして、ニューロンを数千オーダーで相互結合させた大規模なネットワークを構築した。その結果、文脈に依存してニューロンの実効的減衰時定数が変化し、発火率コーディングとテンポラルコーディングの両コーディングが同一のネットワーク上で共存可能であることが示された。これは、コーディングが単一ニューロンの特性によって決まるものではなく、ネットワークダイナミクスに依存した入力スパイク時系列の特性によって決まることを示唆している。また、発火時刻と入力スパイクの到着時刻の差でLTPとLTDが逆転する「時間ヘブ則」を適用することにより、繰り返し与えられる外部入力に対して自己組織化が起こり、「機能的結合による多層構造」が出現すると同時に、ニューロンの実効的減衰時定数が減少することが示された。さらに、ドーパミンによって実現される報酬による遅延強化を行うと、テンポラルコーディングから発火率コーディングに移行することが確認された。この研究の結果、モデル上でテンポラルコーディングと発火率コーディングが文脈に依存して切り替わるデュアルコーディングが示された。最近の生理実験の結果の多くは、感覚入力などを伴う外的イベントに関しては発火率コーディングが使われ、「予測」、「期待」などの内的過程においてはテンポラルコーディングが用いられる可能性を示唆している。
心筋症ハムスターの遺伝的地図作成と原因遺伝子探索

心筋症ハムスターは、ヒト特発性心筋症のモデル動物として重要であるが、常染色体性の単一遺伝形式にて100%の浸透率をもって発症するにも拘わらず、DNAマーカーが存在しないため遺伝的解析が遅れている。今回、心筋症の原因遺伝子座位を同定するために、シリアンハムスターの全染色体地図の作成を目的とした。主な戦略は、restriction landmark genomic scanning(RLGS)を用いて、RLGS spot mapping法により全ゲノムマップを作成し、その中に、心筋症の表現形質を支配する遺伝子をマップする。まず、RLGSゲルの大量生産系(RLGSVer.1.8)を確立した。RLGSVer.1.8は、RLGS prototype(RLGS Ver.1.0)に比してラベリングの反応系の縮小化を行ない、フェノール抽出によるバッファー系の置換の必要性をなくしたため高速にRLGSパターンの生産ができるようにデザインしてある。予備実験の結果、ACNがBio14.6と多型がもっとも多いと考えられたので、Bio14.6とACN系の戻し交配家系60匹を対象とした。制限酵素の組み合せをNotI-PvuII-PstI,NotI-PstI-PvuII,NotI-EcoRV-MboI,BssHII-PvuII-PstI,BssHII-PstI-PvuIIの5種類用い、Bio14.6とACN、およびそのあいだに生まれたF1のRLGSパターンを作成した。約500個の多型マーカーを検出し、戻し交配によって得られた個体についておのおのRLGSパターンを作成後、その伝達を集計した。連鎖解析にはMap Managerを用い、組み替えの頻度が最小限となるようにした、こうしてできた遺伝地図は、全長約1300cMであり、全ゲノムの90%以上カバーすると考えられる。また、27個のリンケージグループからなり、表現形質は、そのうち1つのリンケージグループの上にマップされた。[結論]RLGS法そのものRLGS spot mapping法は、我々の開発したオリジナルな方法であり、これをハムスター亜種間の多型解析に応用し、全染色体地図を作成した。これによる心筋症ハムスターの遺伝学的解析の結果、原因遺伝子のマップされるリンケージグループを同定した。
ミドリイシ属サンゴの雑種種分化-雑種体の妊性と多種同調産卵からの解明-

トゲスギミドリイシとサボテンミドリイシを対象に、ミドリイシ属サンゴの雑種種分化を検証した。多種同調産卵する地域では、両者の中間形態群体が複数みられた。遺伝子解析により中間形態群体と対象2種は共通のハプロタイプが見つかり、遺伝子浸透していることが示唆された。一方、人為的に作出した雑種体は妊性を持ち、雑種体同士での交配および親種との戻し交配が可能であった。さらに、雑種体はミドリイシ属サンゴではみられない自家受精がみられた。以上のことから、多種同調産卵する場所では雑種体が形成され、新たな種として存続できる可能性が高いと考えられた。本課題では、以下の3項目について研究を行うことでミドリイシ属サンゴの雑種種分化の機構を明らかにする。対象は、群体形態の極めて異なるトゲスギミドリイシとサボテンミドリイシの2種に加え、これまで継続してきた研究成果の中で得られた2種の中間形態を持つ推定雑種および確定雑種である。1)分子系統学的アプローチ:十分なレベルでの遺伝的な系統推定による雑種性の検討。2)生態学的アプローチ:多種同調産卵する場所(阿嘉島)としない場所(瀬底島)における雑種形成の違いについての調査。1推定雑種の分布調査2同調産卵状況の調査3交配実験。3)確定雑種を用いた解析:確定雑種の繁殖能力について、1生殖細胞の形成2産卵3親種との交雑能の各点に着目した形態学的観察および交配実験。平成26年度は、2)生態学的アプローチおよび3)確定雑種を用いた解析についての結果が得られた。2)では、瀬底島における分布調査において、阿嘉島でみられた対象2種の推定雑種は確認されなかった。また、対象2種各5群体について産卵を確認したところ、産卵日が7日間異なっており、種間交配は行うことができなかった。今後さらに多くの群体数について野外における産卵調査は必須であるが、これらの結果から、雑種形成には種間の同調産卵が必要であると考えられた。3)では、確定雑種の配偶子(卵と精子)形成と産卵が確認され、雑種体は妊性を持つことが示された。また、雑種体同士での交配がみられたため、雑種体は種として存続できる可能性がある。一方で、親種との戻し交配もみられたことから、雑種体が独立した種として存続していくためには、親種が周りに分布していない等の条件が必要であると考えられた。平成27年度は、1)分子系統学的アプローチ、2)生態学的アプローチおよび3)確定雑種を用いた解析について結果が得られた。1)では、既存の遺伝子マーカーを用いた系統解析により、確定雑種は親種2種由来のアリルが存在することが示された。2)では、瀬底島における分布調査において、昨年までは確認できなかった阿嘉島でみられた対象2種の推定雑種が確認できた。瀬底島では、数年ぶりにミドリイシ類の多種同調産卵がみられたが、水槽内において対象2種はそれぞれ別の日に産卵した。これらの結果から、稀に同調産卵をおこなう地域でも雑種体が形成される可能性があり、野外における産卵調査がますます必要である。3)では、昨年度に引き続き確定雑種の配偶子形成と産卵が確認された。さらに、確定雑種は、ミドリイシ類ではみられない自家受精を行うことがわかった。さらに、自家受精由来の胚はプラヌラ幼生まで正常に発生し、その後定着した。このことから、親種がいない場所に雑種が加入した際、自家受精により集団を形成・維持していくことができると考えられる。ミドリイシ属サンゴの雑種種分化の鍵となる「雑種体の繁殖能力」について、設定していた検討項目(配偶子形成と産卵および雑種体同士・親種との受精能の確認)に加え、ミドリイシ類では通常見られない自家受精が確認された。これらの結果は、"Isomura N, Iwao K, Morita M, Fukami H (2016) Spawning and fertility of F1 hybrids of the coral genus Acropora in the Indo-Pacific. Coral Reefs (in press)"として発表済である。また、同種・異種精子が存在する時に、同種・異種交配がどのような頻度で生じるのかを調査した精子選択実験、同種交配と異種交配由来の受精卵についての胚発生の比較、および確定雑種の形態解析の結果について、投稿準備がほぼ完了している。さらに、雑種体の繁殖能力については、6月にハワイで開催される国際サンゴ礁学会で発表予定である。以上の経過から、現在までの進捗状況を判断した。

一方で、1)分子系統学的アプローチ:十分なレベルでの遺伝的な系統推定による雑種性の検討は、未完了である。阿嘉島および瀬底島の両調査地において対象群体すべてついてDNA抽出はすでに終了しているため、今年度はマイクロサテライトマーカーとRad-Seqを用いた集団解析・系統解析を行ない、遺伝学的な見地から雑種の存在を明らかにしていく予定である。ミドリイシ属サンゴの雑種種分化について、最終年度は、「1.低濃度条件下における精子選択」、「2.雑種体の自家受精に関する詳細な検討」および「3.エクソン領域とSNPによる系統解析の予備実験」を主に行った。1では、至適濃度では同種精子と優先的に受精することが先行研究で明らかにされていた。しかし、低濃度条件下で交配実験を行ったところ、異種精子と高頻度で受精する種の組合せがあることが示された。これは、気候変動等でサンゴ全体の群体数が減少する中における、ミドリイシ属サンゴの生存・繁殖戦略の一つであると考えられた。2では、人工的に作出した雑種体(サボテンミドリイシ卵×トゲスギミドリイシ精子)において、同群体内の異なるポリプ由来の配偶子だけではなく、同ポリプ由来の精子と卵による自家受精が確認できた。このことから、少なくとも本研究の対象種であるトゲスギミドリイシとサボテンミドリイシ間の雑種体は、親種とは著しく異なる繁殖形質を持つことが示された。3では、ミドリイシ属他種の研究で遺伝浸透を検証するために用いられたエクソン領域2つの配列でハプロタイプネットワーク解析を行ったところ、野外で見つかった推定雑種とトゲスギミドリイシ、サボテンミドリイシで共通のハプロタイプを持っていることがわかった。推定雑種は対象種2種の雑種体である可能性が高いこと、さらに、対象2種を含め同所的に生息しているミドリイシ属サンゴで遺伝子浸透が生じている可能性がある。一方、2bおよびez-RADの結果を用いて系統樹を作成したところ、対象種と雑種体が入り交じるクレードが形成された。こちらは、サンプル数を増やすこと、さらに他地域のサンプルを加えることで、詳細な系統解析が行えると考えている。トゲスギミドリイシとサボテンミドリイシを対象に、ミドリイシ属サンゴの雑種種分化を検証した。多種同調産卵する地域では、両者の中間形態群体が複数みられた。遺伝子解析により中間形態群体と対象2種は共通のハプロタイプが見つかり、遺伝子浸透していることが示唆された。一方、人為的に作出した雑種体は妊性を持ち、雑種体同士での交配および親種との戻し交配が可能であった。さらに、雑種体はミドリイシ属サンゴではみられない自家受精がみられた。以上のことから、多種同調産卵する場所では雑種体が形成され、新たな種として存続できる可能性が高いと考えられた。ミドリイシ属サンゴの雑種種分化の鍵となる「雑種体の繁殖能力」について、設定していた検討項目(配偶子形成と産卵および雑種体同士・親種との受精能の確認)がほぼすべてにおいて明らかになったことが上記判断の理由である。しかしながら、雑種体の性成熟が親種群体に比べて遅かったこと、また飼育している雑種体数が少ないことから、産卵の時期だけではなく季節を通して注意深く観察・飼育していく必要がある。今年度はまず、1)分子系統学的アプローチ:十分なレベルでの遺伝的な系統推定による雑種性の検討、を完了させる。