hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本及びアメリカにおける統計作成のための外部データ利用に関する制度の比較研究

本研究においては、統計機関が外部データを利用することにより統計調査を改善するために望ましい制度的枠組みを解明することを目的とする。具体的には、アメリカにおける、統計機関が外部データを利用する場合の法的制約の研究を行い、これを日本の対応する制度と比較検討する。本研究では、本年度は、文献調査及び担当者へのインタビューにより、主としてアメリカの法制度の解析を行った。アメリカにおいては、統計機関ごとに制定された統計上の個別データに関する秘密保護規定が、統計機関が外部データを利用する際のの障壁となっている。これに対し、議会においては、統計関係部局を統合して独立行政機関を作ることにより対処しようとする動きと、執行部の支持を受けた統一的な秘密保護制度を設けることにより対処しようとする動きの二つの流れがあった。しかし、両者の間に妥協が成立し、両方の規定を盛り込んだ法案が今議会に提出されている。日本においては、統一的な統計に関する法規として統計法(昭和22年法律第18号)が存在している。同法は、統計情報に関する厳格な秘密保護規定を置いている(第14条第15条の2)一方で、調査票の目的外使用の規定を置いており、統計データの省庁間相互利用を可能にする法制度となっている。日本における課題は、非統計上の目的で収集された行政記録を統計作成に使用することを実質的に促進することである。こちらについては、総務庁統計局統計基準部によれば、1997年の閣議決定「申告負担軽減対策」に基づき、同部が統計作成に利用可能な行政記録について調査中である。
糖鎖連結クロリンによる新規光線力学的療法の腫瘍免疫増強メカニズムの解明と臨床応用

光線力学的療法(PDT)は,光感受性物質が選択的に集積した腫瘍組織にレーザー光を照射し腫瘍細胞を選択的に破壊する治療法である。我々は,癌細胞が糖を取り込む性質を利用し,糖をクロリンに連結することにより,飛躍的な腫瘍選択性と殺細胞効果を達成した。さらに糖鎖連結クロリンによるPDTは,強力な抗腫瘍免疫を誘導することを見出したが,その詳細なメカニズムは不明である。本研究では,糖鎖連結クロリンの標的腫瘍細胞内での動態,腫瘍免疫増強効果のメカニズムの解明を行う事により,宿主に対しては極めて低侵襲でかつ強力な殺腫瘍細胞効果を有する次世代PDTの臨床への応用を目指した。光線力学的療法(Photodynamic Therapy, PDT)は,光感受性物質が選択的に集積した腫瘍組織にレーザー光を照射し腫瘍細胞を選択的に破壊する治療法である。本研究では,糖鎖連結クロリンの標的腫瘍細胞内での動態,腫瘍免疫増強効果のメカニズムの解明を行う事により,宿主に対しては極めて低侵襲でかつ強力な殺腫瘍細胞効果を有する次世代PDTの臨床への応用を目指し検討している.光線力学的療法(PDT)は,光感受性物質が選択的に集積した腫瘍組織にレーザー光を照射し腫瘍細胞を選択的に破壊する治療法である。本研究では,糖鎖連結クロリンの標的腫瘍細胞内での動態,腫瘍免疫増強効果のメカニズムの解明を行う事により,宿主に対しては極めて低侵襲でかつ強力な殺腫瘍細胞効果を有する次世代PDTの臨床への応用を目指し検討を行った。初年度には糖鎖連結クロリンの癌細胞内における殺細胞のメカニズム,特に免疫の関与につき詳細に検討する。すなわち癌細胞内に取り込まれてからの細胞内局在,活性酸素,さらにアポトーシス,オートファジー誘導能につき臨床にて使用されている第2世代のレザフィリンと比較検討した。また,マウス移植腫瘍モデルを用いて,免疫の有無によりその糖鎖連結クロリンによるPDTの腫瘍抑制効果を比較検討した。本研究では,糖鎖連結クロリンの標的腫瘍細胞内での動態,腫瘍免疫増強効果のメカニズムの解明を行う事により,宿主に対しては極めて低侵襲でかつ強力な殺腫瘍細胞効果を有する次世代PDTの臨床への応用を目指す。消化器内科糖鎖連結クロリンの癌細胞内における殺細胞のメカニズム,特に免疫の関与につき詳細に検討した。マウス移植腫瘍モデルを用いて,免疫の有無によりその糖鎖連結クロリンによるPDTの腫瘍抑制効果を比較検討する。次年度以降には,腫瘍免疫増強効果の指標となるCRT,HMGB1の発現に注目し,糖鎖連結クロリンによるPDTによるCRT,HMGB1の発現を解析した。CRT,HMGB1の発現がELISAにて確認できず,ウェスタンブロット・Real Time PCRによる確認を行った.初年度には糖鎖連結クロリンの癌細胞内における殺細胞のメカニズム,特に免疫の関与につき詳細に検討する。次年度以降には,腫瘍免疫増強効果の指標となるCRT,HMGB1の発現に注目し,糖鎖連結クロリンによるPDTによるCRT,HMGB1の発現を解析する。CRT,HMGB1をknockdownした細胞,HMGB1の受容体であるTLR4のknockout mouseを用いて,糖鎖連結クロリンを用いたPDTでの免疫誘導による腫瘍抑制効果を検討することにより腫瘍免疫増強効果のメカニズムを解明を予定している。今後CRT,HMGB1を介した抗腫瘍免疫誘導の解析とその結果報告を行うことを予定としている.

1.免疫調節のメカニズムにつき,免疫原性細胞死の指標となるCRT,HMGB1の発現を免疫蛍光染色等にて検討する。3.抗腫瘍免疫誘導におけるTLR4の役割について,TLR4のknockout mouseを用いて腫瘍免疫増強効果を測定し,正常免疫マウスとの効果の差を比較する。CRTとHMGB1の発現がELASAにて確認できず,ウェスタンブロット・Real Time PCRによる確認を行った.そのため,CRT,HMGB1を介した抗腫瘍免疫誘導の解析を施行できず未使用額が生じた.このため,CRT,HMGB1を介した抗腫瘍免疫誘導の解析とその結果の報告を次年度に行うこととし,未使用額はその経費に充てることとしたい.昨年に引き続き,比較対象となるレザフィリンの購入費,細胞培養,マウスの購入,および飼育などを中心とした消耗品に対する費用,また学会発表の際の旅費に使用予定。
咬合不全が高次脳機能低下を招く神経機構の解明：三叉神経中脳路核周囲の回路網の解析

多数歯の喪失による咬合支持の崩壊が、認知症の危険因子のひとつであることは多数の疫学調査の結果から示唆されているが、その機構についてはほとんど判っていない。青斑核は中枢神経系内で最大のノルアドレナリン作動性ニューロンの集団であり、覚醒レベル制御、ストレス反応、注意等の高次脳機能に関与していることが知られている。青斑核ニューロンはその表現型の維持に転写因子Onecutファミリーを必要とするが、胎生の一時期を除き、自身で当該の因子を合成することができず、同核に隣接あるいは重畳している三叉神経中脳路核のニューロンから供給を受けている(Espana & Clotman, Mol. Cell. Neurosci., 2012)。老齢動物(ラット・マウス)に対して、軟食飼育或いは臼歯歯冠切除を施すと、学習・記憶の中枢である海馬・大脳皮質へ投射する前脳基底部コリン作動性ニューロンの細胞死と、行動学的に認知症様の症状を招いた。これは、軟食飼育或いは臼歯歯冠切除によって、歯根膜機械受容器及び閉口筋筋紡錘を支配する三叉神経中脳路核一次感覚ニューロンが活動低下ないし死滅することで、転写因子Onecutファミリーの合成が低下し隣在の青斑核ニューロンの活動に変調を来たすことで、高次脳機能の低下を招くことが示唆された。尚、青斑核ニューロンー三叉神経中脳路核ニューロン間の直接的な結合は、前者から後者へのノルアドレナリン作動性入力以外に見出されなかった。現時点では、青斑核ニューロン活動の変調が前脳基底部コリン作動性ニューロンの細胞死を招く機構については明らかでない。実験設備の整備が様々な原因から計画通りに進まず、研究計画全体に若干の遅れを生じているが、延長期間中に完了する見込みである。三叉神経中脳路核(MTN)は、唯一例外的に中枢神経系内に存在する一次感覚ニューロン(psn)の集団である(閉口筋筋紡錘と歯根膜機械受容器を支配)。一方、青斑核(LC)は橋尾側部に存在するノルアドレナリン作動性ニューロンの集団である。LCニューロン(LCn)は中枢神経系へ広汎に投射しており、覚醒レベルの調節に重要な役割を果たしていることが知られている。多重免疫染色の結果、ラット脳幹の吻尾的レベルに依って、LCとMTNは隣接したり、LCnとMTNnが完全に混在していることが確認された。MTNニューロン(MTNn)の細胞体は、末梢感覚受容器から上行して来るスパイク列を中継する際に発火し、また、細胞体に対する興奮性シナプス入力や膜電位が脱分極側へ緩徐に大きくシフトすると生じる膜電位変動に応じて発火することから、MTNnは少なくとも2つの機能モード(psnモードと介在ニューロンモード)を呈すると考えられる。MTNnに発現している過分極活性化型陽イオン電流(IH)が活性化しているとグルタミン酸作動性シナプス電流(gEPSC)が大きく減弱する[投稿中]。従って、IHを活性化する入力系の活動レベルに応じ、gEPSCの有効/無効(遮断)が切り換わることが想定される。この切り換えにLCnが関与し得るか検討した。LCnとMTNnの同時、或いは、MTNnの単独パッチクランプ記録を実施した。LCnとみなして記録した細胞については、蛍光色素をパッチ電極内液に加えておき、記録後に抗TH抗体による免疫染色を行ってLCnであることを確認した。LCnを細胞内通電或いは細胞外電気刺激により活性化させると、MTNnのIHは抑制された。α2受容体拮抗薬存在下ではIHは抑制されなかった。これら所見から、MTNnは、LCnの活動によってIHが抑制され、gEPSCが遮断されない状態に維持されることが示唆された。当初当該年度での実施を予定していた「遺伝子改変Sindbisウイルスベクター法」による単一乃至少数細胞の詳細な形態学的解析は、共同研究者とのスケジュールの不一致を主な原因として、思う様に進めることが出来なかったが、代わりに、平成29年度以降に実施予定であった電気生理学的解析を一部実施することが出来た。歯根膜機械受容器や閉口筋筋紡錘を支配する一次感覚ニューロンで或る三叉神経中脳路核(MTN)ニューロンは、種々の神経伝達物質作動性ニューロンの入力を受けている。主要な興奮性入力のひとつとしてグルタミン酸がAMPA型受容体(AMPAR)に結合して生じる興奮性シナプス後電流(EPSC)が挙げられる。偽単極性の形態である同ニューロンの細胞体はほぼ球形で、その表面には無数の微絨毛様突起が発達しているが、研究代表者らの先行研究から、これらの突起はナトリウムイオンの微小ドメインとして機能することが判明していた。今回、全細胞パッチクランプ記録下のMTNニューロンにグルタミン酸をパフ投与して得られた電流/電位波形の解析、数学的なシミュレーション、及び、免疫電子顕微鏡法による組織学的探索の結果、MTNニューロンの微絨毛様突起にはAMPARと過分極活性化型陽イオンチャネル(Hチャネル)、ナトリウム-カリウムポンプが共在しており、膜の過分極或いは薬剤によってHチャネルが活性化された状態では、マイクロドメインのナトリウムイオン濃度の上昇によりグルタミン酸によるEPSCが大きく減弱され、興奮性シナプス伝達が抑制されることが示された。

生体内では、Hチャネルを活性化する入力系の活動が高まった状態でAMPAを介する入力がキャンセルされ、逆にHチャネルを不活性化する系が働いている際には入力が有効となることが想定される。この機構は、一次感覚ニューロンであり、同時に、主に咀嚼筋運動ニューロンへの情報伝達経路での介在ニューロンとしても働くするMTNニューロンの「機能モード」を切換える最も主要なスイッチとなっていることが示唆される(Front. Cell. Neurosci., 12:113, 2018)。実験設備の整備が様々な原因から計画通りに進まず、研究計画全体に若干の遅れを生じている。現在は原因となった事象が解決されつつあるため、平成30年度の早い内に整備を終え、遅れた分を可及的早急に取り戻したい。多数歯の喪失による咬合支持の崩壊が、認知症の危険因子のひとつであることは多数の疫学調査の結果から示唆されているが、その機構についてはほとんど判っていない。青斑核は中枢神経系内で最大のノルアドレナリン作動性ニューロンの集団であり、覚醒レベル制御、ストレス反応、注意等の高次脳機能に関与していることが知られている。青斑核ニューロンはその表現型の維持に転写因子Onecutファミリーを必要とするが、胎生の一時期を除き、自身で当該の因子を合成することができず、同核に隣接あるいは重畳している三叉神経中脳路核のニューロンから供給を受けている(Espana & Clotman, Mol. Cell. Neurosci., 2012)。老齢動物(ラット・マウス)に対して、軟食飼育或いは臼歯歯冠切除を施すと、学習・記憶の中枢である海馬・大脳皮質へ投射する前脳基底部コリン作動性ニューロンの細胞死と、行動学的に認知症様の症状を招いた。これは、軟食飼育或いは臼歯歯冠切除によって、歯根膜機械受容器及び閉口筋筋紡錘を支配する三叉神経中脳路核一次感覚ニューロンが活動低下ないし死滅することで、転写因子Onecutファミリーの合成が低下し隣在の青斑核ニューロンの活動に変調を来たすことで、高次脳機能の低下を招くことが示唆された。尚、青斑核ニューロンー三叉神経中脳路核ニューロン間の直接的な結合は、前者から後者へのノルアドレナリン作動性入力以外に見出されなかった。現時点では、青斑核ニューロン活動の変調が前脳基底部コリン作動性ニューロンの細胞死を招く機構については明らかでない。実験設備の整備が様々な原因から計画通りに進まず、研究計画全体に若干の遅れを生じているが、延長期間中に完了する見込みである。必要な研究機材の整備も進んでおり、また、研究を実施する時間も昨年度に比して多く確保出来る見込みである。本年打破、昨年度に実施予定であったのに取り掛かれなかった「遺伝子改変Sindbisウイルスベクター法」による単一乃至少数細胞の詳細な形態学的解析を進めると共に、当初計画通りに電気生理学的解析を実施していく。電気生理学的実験に依存する部分は当初予定よりも大きく進展したため、平成30年度はウィルスベクター法を用いた組織学的解析を進めて行きたい。当初当該年度での実施を予定していた「遺伝子改変Sindbisウイルスベクター法」による単一乃至少数細胞の詳細な形態学的解析は、共同研究者とのスケジュールの不一致を主な原因として、思う様に進めることが出来なかったため、当該の解析で用いる予定であった費用を次年度へ繰り越すものである。研究計画の若干の遅れに伴い、主に、購入を予定していた備品・消耗品が未購入となっていることに因る。それらの物品を次年度の早い内に購入する見込みである。
カイコガ前胸腺および精巣におけるエクジステロイド合成の制御機構

前胸腺あるいは精巣でのエクジステロイド(Ecds)合成を制御しているペプチドホルモンについて、それらの作用機構、時間的合成調節機構の解明、相互作用、変態・脱皮にかかわる他のホルモンのエクジステロイド合成系への介入などを明らかにするため実験を行った。本年度は、精巣におけるエクジステロイド合成について検討した。精巣におけるEcds含量は、体液Ecds変動とほぼパラレルであった。精巣Ecdsは主にエクジソンと20-ハイドロキシエクジソンであった。5齢68日目での抱合型と遊離型のEcds含量に変化がみられ、精巣でのEcds存在形態に新知見を提出することとなった。遊離腹部や培養精巣へのラベルエクジソンの取り込み実験から、精巣で独自のEcds代謝系が存在することが明らかとなり、更にラベルされたコレステロールの取り込み実験より、精巣ではコレステロールを素材としてEcdsを合成していることが判明した。精巣全体と精巣被膜でのEcds含量の比較を行った。その結果、精巣被膜には全体の3044%程度のEcdsが認められ、Ecds合成場所はほぼ精巣被膜であることが判明した。幼虫脳における精巣Ecds合成刺激活性物質の検索を行ったが、確実な証明にはいたらなかった。一方、精巣Ecds合成と環状ヌクレオチドとの関係を検討したところ、5-10mMのcAMPによって精巣培養液中のEcds含量は対照区の約2.25倍増加した。さらに精巣被膜の培養ではcAMP存在下では約3.5倍のEcdsが培養液中に検出された。
アウトブレイクにおける知識の信頼性の経時分析とコミュニティ・レジリエンス評価

2018年度はデータ収集を目的とした現地調査と、成果発表をバランスよく実施できた。これにより、知識の流通に関し、1)立場の多様性(直接的な影響の有無・周囲との関係性)と2)取捨選択の難しさ(必要とする情報の多様性とその変化)という課題があきらかとなった。これまでのまとめとしては、2018年5月に日本アフリカ学会第55回学術大会において、「在外ギニア人たちとEbolaー出身地の社会問題との向き合い方ー」というタイトルで口頭発表を行った。これは主に、2018年2月から3月にかけて、パリ在住の性別・職業・在住歴が異なるギニア人5名に対し実施した、出身地におけるエボラ出血熱の流行をめぐる体験をテーマとした聞き取りをまとめたものである。在外ギニア人たちが「故郷」における深刻な社会問題について、「正しい」情報を共有することよりも、問題をめぐっての感情の共有を重視する様子や、「正しい」情報を流通させたい側の思い込みや過剰な期待について指摘した。また、2018年8月から9月にかけてパリにおいて再度同じテーマで、さらに2018年12月から2019年1月にかけて約2週間のフィールドワークをギニア共和国内にて実施した。ここでは、主に首都と地方(ボケ県カムサー地区)における情報や知識の共有のされ方をテーマとしたインタビュー調査を実施した。2017年度まで産休育休により遅れが生じていたが、2018年度では、口頭発表および2度のフィールドワークを実施することで、可能な限り挽回を計った。ただし、総括するまでには至らなかったため、研究期間を1年延長した。今年度は研究の総括として、近接分野の研究者によるワークショップまたは研究会を実施したと考えている。また、研究の成果を幅広くフィードバックするために、写真を多数用いたフォトブックの作成を予定している。平成27年度は、本研究のベースとなるデータ収集を主たる目的とし、以下の研究活動をおこない、国際社会や各国政府が科学的な根拠にもとづき、エボラ出血熱に関する知識を流通させようとするプロセスと、その際の課題についての情報を収集した。また、こうした科学的知識へのレスポンスと、その背景となる知識のしくみをローカルな文脈から分析するためのデータが得られた。1)既存の関連資料の精読:科学的な知識の流通プロセスを把握するために、ギニア保健省やWHOが発行する資料について収集し、その内容を検討した。2)ギニア「外」のステークホルダーへのインタビュー:2015年8月から9月にかけて、隣国のセネガル・ダカール在住のギニア人たちを対象とした、聞き取り調査を実施した。3)ギニア「内」の現状に関する情報収集:現地アシスタントとの連携により、現地における啓蒙活動の様子や、病についての理解(症状・その原因・対処方法)とエボラ出血熱に関する理解や情報の蓄積に関するインタビューシートを用いた個別インタビュー(8人)を実施した。これらの研究成果を次の通り発表した。口頭発表:日本アフリカ学会第52回学術大会(2015年5月)において「納得と拒否という住民の反応にみる、感染症対策における課題ーギニアにおけるエボラ出血熱に関する知の構造ー」、論文・エッセイなど:「アフリックアフリカ・アフリカ便り」(2015年5月、web版)にて「エボラがつなげるわたしと彼らの日常」を、『アフリカレポート』No.53:pp73-104(2015年11月)にて「ギニアにおけるエボラ出血熱の流行をめぐる「知」の流通と滞留」を、「SYNODOS,シリーズ「等身大のアフリカ/最前線のアフリカ」」(2015年11月、web版)にて「日常に埋め込まれたエボラ出血熱ー流行地ギニアに生きる人びとのリアリティ」を発表した。平成27年度の研究実施計画にあげていた、3つの軸1)既存の関連資料の精読、2)ギニア「国外」のステークホルダーへのインタビュー、3)ギニア「国内」のステークホルダーへのインタビューは概ね、計画通り実施することができた。しかし、日本国内で開催される関連研究会などへの参加ができず(研究会そのものがほとんどなかったと思われる)、国内の類似テーマについて研究する者との交流があまり進まなかった。ただし、(本研究とは異なる研究資金を利用し)終息宣言後に現地入りし、直接的なインタビューや情報収集を実施できたこと、研究成果の発表機会を多く得ることができた点から、上記のように判断した。平成28年度は当初、ギニア国内の特定の地域・コミュニティを対象とした情報収集およびインタビュー調査を実施するために、気候が安定している乾季である12月から3月のあいだに1ヶ月ほどの渡航を予定していた。その際の調査対象地域としては、1)科学的知識のゲート・多様な知識の生産と流通のハブとして位置付けられる首都コナクリ、2)トップダウン型の知識の導入に翻弄された地域としてのBossou地区、3)コミュニティのレジリエンスが比較的高い地域としてのKamsarを想定していた。しかしながら、10月以降、健康上の理由(妊娠)から、今年度中の渡航を断念せざるを得なくなった。そこで、今年度の予定を大幅に変更し、現地アシスタントを介し(メールおよび電話にて連絡をとることにより)、1)コナクリと3)Kamsarにおける間接的な情報収集を実施するに至った。コナクリにおいては質問票をベースに半構造的インタビューを5件行い、これによって、コナクリにおけるa)病と死をめぐるローカルな知識、b)水や大気といった環境と人との関係性(宗教的な実践・衛生観など)についての基礎的情報を得ることができた。

また、Kamsarについては、現地の文脈からコミュニティ・レジリエンスのキー概念の析出をおこなうための、エボラ出血熱流行中における生業活動の課題についての情報収集をおこなった。また、日本国内に在住するギニア出身者数名に対し、現地とのコミュニケーションのあり方やネットワーク形成についてインタビューし、現地の情報伝達や意思決定のしくみへの影響について考察した。健康上の理由(妊娠)から、渡航できず現地調査を実施できなかったことと、同様の理由により11月にパリで開催された学会大会「Ebola 3 ans apres : les grandes questions」における研究成果の発表を見送ったことが、上記のように判断した最大の理由である。しかし、現地アシスタントと連絡を取り合い間接的な現地調査、日本国内に在住するギニア出身者を対象にインタビュー、既存の関連資料の精読によって、情報のアップデートと研究の継続に務めた。2017年度については、2017年5月末より2018年1月末までが産前産後休業および育児休業期間だったため、当初の計画通りに研究を進めることが困難だった。よって、申請時に作成した研究計画よりは遅れが生じている状況にある。ただし、休業期間中も現地アシスタントとの連絡を取り続けることにより、メールにて随時報告を受け、現場の状況把握は可能な状態にあった。また、日本(特に関西)在住のギニア出身者を中心に、非公式ではあるが、研究テーマに関連する聞き取りをおこない、情報を収集した。復職後の2018年2月から3月にかけてフランス・パリにおいて、約2週間のフィールドワークを実施した。このフィールドワークでは、パリ在住の(性別・職業・在住歴が異なる)ギニア人5名に「エボラ熱の流行をめぐるそれぞれの体験」についてのインタビュー調査をおこなった。これによって、エボラ熱をめぐる知の流通プロセスの一端と、流行の有無にかかわらず、アフリカ出身者に対する偏見やそれに対するかれらの理解・対応の様子があきらかとなった。また、エボラ熱流行当時から現在に到るまで、在外ギニア人が「故郷」における深刻な社会問題をどのように認識し、また対応するのかについての情報が得られた。これにより、これまで注目してきた科学的に正しいとされる知識とローカルな知識の対立と融合に加え、知識の一次的な変更という新たな分析軸への視野が開けた。このように2017年度に実施したパリおよび日本での聞き取り(インタビュー)は予備調査的な位置づけのものである。研究実施計画において3年目となる2017年度は、産休および育休取得という、申請当時には予期していなかった事態が発生した。これに伴い、研究活動を中断せざるをえず、研究は実施計画よりは遅れていると言わざるを得ない状況にある。2018年度はデータ収集を目的とした現地調査と、成果発表をバランスよく実施できた。これにより、知識の流通に関し、1)立場の多様性(直接的な影響の有無・周囲との関係性)と2)取捨選択の難しさ(必要とする情報の多様性とその変化)という課題があきらかとなった。これまでのまとめとしては、2018年5月に日本アフリカ学会第55回学術大会において、「在外ギニア人たちとEbolaー出身地の社会問題との向き合い方ー」というタイトルで口頭発表を行った。
低出生体重児の肝芽腫リスクの要因解析

低出生体重児の肝芽腫リスクの原因究明を目的として、小児がん全国登録19851999年診断例16870例の資料を用いて、出生年別に各小児がん中の低出生体重児の比率を調べた結果、肝芽腫でのみ有意に高く、出生体重が低いほど相対危険度が顕著に上昇していた(2000-2499gで1.64、1500-1999gで2.83、1000-1499gで6.86、1000g未満で46.46)。1000g未満出生児の相対危険度は出生年が1985-89年で29.78、90-94年で47.63、95-1999年で58.97と年々上昇しており、低出生体重児の生存率と生存期間の向上に伴って今後の更なる増加が予想され、早期発見体制の強化が望まれる。1500g未満出生児における肝芽腫の診断年齢は4-106ヶ月で、1500g以上児の0-180ヶ月に比して生後少し経てから発生する現象が観察され、出生後の因子が関与している可能性が強まった。前回および今回の患者対照調査からも酸素投与または出生体重復帰に要した日数が危険因子として示唆された。低出生体重児では生後の体重が1500gを越すまでは尿中の8-OHdG量が高く、以後、低値に安定することを既に報告したが、本研究により、ラットの肝で酸素暴露により8-OHdGが生じること、ラット新生児期には抗酸化活性が低いことが示された。ヒト低出生体重児は新生児期には抗酸化活性が低いため、酸素暴露により肝にDNA障害が生じ、肝芽腫の発生を導くという仮説を支持する結果が得られた。
生体膜リン脂質の転写制御における役割の解明

大腸菌の主要酸性リン脂質の膜中レベルを低下させるpgsA3変異およびホスファチジルエタノールアミンを消失させるpssA完全欠損変異はいずれもポーリンタンパク質OmpFを減少させ、構造遺伝子ompFの翻訳段階を負に制御するmicF RNAの発現を両変異は増大させた。また、鞭毛マスターオペロンflhDCは両リン脂質変異によりいずれも転写段階で抑制されていた。これらの減少は、特定のリン脂質の多寡でなく、両性リン脂質と酸性リン脂質の量比の異常により惹起されると考えられる。大腸菌の主要酸性リン脂質の膜中レベルを著しく低下させるホスファチジルグリセロリン酸シンターゼの構造遺伝子pgsA3の欠損変異pgsA3による鞭毛マスターオペロンflhDの転写抑制に関わるflhD上流制御領域の性質を調べた。pgsA3変異による転写抑制がflhD上流制御領域のうち、転写開始点とプロモーター領域を含む114bpにより生ずることを明らかにした。またこの領域でカタポライト抑制並びに2成分制御系EnvZ-OmpRによる高浸透圧での転写抑制がみとめられた。大腸菌野生型P90C株をトランスポゾンminiTn10::camを保持したプラスミドpNK2884で形質転換し、IPTGで誘導して、染色体上に無差別にクロラムフェニコール(CM)耐性遺伝子を指標にしたトランスポゾンを挿入して、遺伝子破壊突然変異を起こした。酸性リン脂質欠損のままでflhDCの転写活性が、元のPgsA3変異株より上昇している株を用いてCM耐性遺伝子挿入による、破壊遺伝子部位を同定する解析を進めている。flhDC転写発現において、重要な細胞機能を示す制御領域と膜酸性リン脂質欠損の関わる領域での重複が認められ、また酸性リン脂質によるflhDC転写抑制に関わる遺伝子が推察されたことは、酸性リン脂質の遺伝子発現における役割を考える上で大変興味深い。大腸菌の欠損したホスファチジルグリセロリン酸(PGP)シンターゼをコードする′′pgsA3変異による酸性リン脂質欠損は致死的である。今までにこの致死性を抑制する変異として主要外膜リポタンパク質Lppの欠損のみが知られていた。今回新たに枯草菌染色体部位ypoPを低コピープラスミドに保持させることにより、PGPシンターゼ活性とリン脂質組成を正常に回復せずに、致死性を抑制することを見いだした。この枯草菌遺伝子部位の発現で酸性リン脂質欠損によるストレスシグナルに影響を及ぼす可能性が考えられる。大腸菌の主要酸性リン脂質合成欠損変異pgsA3変異の致死性を抑制する新たな変異として、好気性グリセロールー3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子glpDの変異が見い出された。glpD変異によりG-3-Pの酸化が低下し,基質レベルが増大し,酸性リン脂質合成が高まり,pgsA3変異の致死性が抑制されたと推察される。大腸菌の主要両性リン脂質ホスファチジルエタノールアミンの合成開始過程を触媒するホスファチジルセリン(PS)シンターゼの構造遺伝子pssAの発現制御の存在と仕組みを明らかにしようとした。今まで不明であつたpaaAの転写開始点、プロモーター領域を初めて明らかにし,またlacZをレポーター遺伝子とするpssA上流域との転写または翻訳融合のλファージ溶原株を用いて,転写発現および翻訳発現が培養温度で異なり、高温(42°C)でいずれも抑制される結果を得た。さらに遣伝的なpssA発現の制御因子を探索のため,トランスポゾンによる遺体子破壊変異のpaaA1温度感受性変異株への導入により,PSシンターゼ活性が約30倍に上昇した変異株が分離された。

大腸菌の欠損したホスファチジルグリセロリン酸(PGP)シンターゼをコードする′′pgsA3変異による酸性リン脂質欠損は致死的である。今までにこの致死性を抑制する変異として主要外膜リポタンパク質Lppの欠損のみが知られていた。今回新たに枯草菌染色体部位ypoPを低コピープラスミドに保持させることにより、PGPシンターゼ活性とリン脂質組成を正常に回復せずに、致死性を抑制することを見いだした。この枯草菌遺伝子部位の発現で酸性リン脂質欠損によるストレスシグナルに影響を及ぼす可能性が考えられる。大腸菌の主要酸性リン脂質合成欠損変異pgsA3変異の致死性を抑制する新たな変異として、好気性グリセロールー3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子glpDの変異が見い出された。glpD変異によりG-3-Pの酸化が低下し,基質レベルが増大し,酸性リン脂質合成が高まり,pgsA3変異の致死性が抑制されたと推察される。大腸菌の主要両性リン脂質ホスファチジルエタノールアミンの合成開始過程を触媒するホスファチジルセリン(PS)シンターゼの構造遺伝子pssAの発現制御の存在と仕組みを明らかにしようとした。今まで不明であつたpaaAの転写開始点、プロモーター領域を初めて明らかにし,またlacZをレポーター遺伝子とするpssA上流域との転写または翻訳融合のλファージ溶原株を用いて,転写発現および翻訳発現が培養温度で異なり、高温(42°C)でいずれも抑制される結果を得た。さらに遣伝的なpssA発現の制御因子を探索のため,トランスポゾンによる遺体子破壊変異のpaaA1温度感受性変異株への導入により,PSシンターゼ活性が約30倍に上昇した変異株が分離された。本研究は生体膜リン脂質が転写制御にどのような役割を果たしているかを大腸菌のリン脂質合成欠損突然変異による転写レベルの変動を抑制する変異株の分離し、シグナル伝達の2成分制御系遺伝子の転写発現との関連並びに膜リン脂質の最適存在状態と転写能との関連性を考え、研究を企図した。平成9年度の本研究により、次のような成果が得られた。(1)大腸菌リン脂質合成欠損変異株における生育の致死性並びに転写レベルの変動に対応した運動性の低下を抑制する突然変異株の分離。野生型大腸菌W3110染色体断片に突然変異誘発トランスポゾンminiTn10cam(クロラムフェニコール耐性遺伝子保持)を挿入した変異を含むPlファージ溶菌液を調製し、酸性リン脂質合成欠損pgsA3変異株に形質導入した。野生型遺伝背景ではこの変異は致死的であるが、致死変異を制御するlpp欠損変異以外の抑制変異株また運動能の回復する変異株の分離を行った。この結果、数株の酸性リン脂質合成欠損変異pgsA3による運動能低下または致死性を回避した変異株を分離した。このうちの一株のcam挿入部位の塩基配列を調べたところグリセロリン酸の還元に関わる遺伝子と相同性が認められた。この部位のみを保持した株にpgsA3変異を単独で導入すると酸性リン脂質合成が部分的に回復し、生育する株が分離された。この変異により、グリセロリン酸のプールの変化で酸性リン脂質欠損でも生育可能になったと推察される。
肺気腫におけるアポトーシスの研究

高齢者人口の増加に伴い肺気腫の罹患率や死亡率が増加しつつあるが、その発症機序は未だ解明されていない。本研究では「肺気腫の発症機序にアポトーシスカ欄与しているのではないか」という仮説を検証するために実験的に肺気腫動物モデルを作成した。すなわちC57BI/6マウスの気管内に1)PBS、2)activecaspase-3(CAS)、3)chariot(CHA:細胞内蛋白質導入剤)、4)CAS+CHA、5)CAS+CHA+DEVD(CAS阻害剤)、または6)nodularin(セリン・スレオニンリン酸化酵素阻翻Dを注入した。その結果、CAS+CHAを注入した2時間、後には肺胞壁にアポトーシスが生じ、肺胞壁の破壊と気腫化がもたらされた。二重免疫染色の結果からアポトーシスを生じた細胞はほとんどが肺胞および気道の上皮細胞と考えられた。このような気腫化はCAS阻害剤であるDEVDの同時注入により抑制された。経時的に観察すると肺の気腫化はCAS+CHAの注入15日後まで継続してみられたが、線維化や肺内への炎症細胞の浸潤はほとんど観察されなかった。一方、CAS+CHAを注入されたマウスではBAL液中に酸性領域で活性化されるエラスターゼ活性が上昇していた。さらにラットの肺から分離培養したII型肺胞上皮細胞にアポトーシスを誘導すると酸性領域においてエラスチン分解活性がみられた。したがってアポトーシスによる肺の気腫化にはなんらかのエラスターゼの活牲化び関与していると考えられた。以上の結果から肺胞壁のアポトーシスは肺気腫をもたらす直接的な原因になることが示された。1 8週齢C57BL/6マウスに豚膵エラスターゼ(2単泣)を気管内に注入後、肺を経時的に摘出して組織切片を作成し、TUNEL法によりアポトーシスを検出した。その結果、エラスターゼの気管内注入24時間後には肺胞壁細胞(特にI型およびII型肺胞上皮細胞)にアポトーシスが観察された。48時間以後には従来の報告どうり広範な気腫病変が観察された。以上の結果から、エラスターゼにより惹起される肺気腫モデルにおいて肺胞壁細胞にアポトーシスが生じることが示唆された。2このような肺胞壁細胞のアポトーシスが肺気腫の原因となるかどうかを明らかにするためにin vivoにおいて蛋白導入試薬(Chariot【○!R】)を用いて活性化カスパーゼ3を肺胞壁細胞内に導入した。すなわち活性化カスパーゼ3とChariot【○!R】の混合体をマウスの気管内に注入し、経時的に肺を摘出した。混合体の注入2時間後には肺胞壁細胞に広範なアポトーシスが観察された。さらに6時間後には肺胞壁の破壊と肺胞腔の拡張を伴う気腫病変が形成された。このような気腫病変はカスパーゼ3阻害薬DEVD-CHOを混合体に加えることにより抑制された。一方、Chariot【○!R】を用いずに活性化カスパーゼ3のみを気管内に注入してもアポトーシスや気腫病変は観察されなかった。またアポトーシス誘導物質であるnodularinを気道内に注入しても同様に肺胞壁細胞のアポトーシスと気腫病変が形成された。以上の結果から肺胞壁細胞のアポトーシスが肺の気腫化の原因となることが示唆された。本研究では「肺気腫の発症機序にアポトーシスが関与しているのではないか」という仮説を検証するために実験的に肺気腫動物モデルを作成した。

すなわちC57BL/6マウスの気管内に1)PBS、2)active caspase-3(CAS)、3)Chariot(CHA:細胞内蛋白質導入剤)、4)CAS+CHA、5)CAS+CHA+DEVD(CAS阻害剤)、または6)nodularin(セリン・スレオニンリン酸化酵素阻害剤)を注入した。その結果、CAS+CHAを注入した2時間後には肺胞壁にアポトーシスが生じ、肺胞壁の破壊と気腫化がもたらされた。二重免疫染色の結果からアポトーシスを生じた細胞はほとんどが肺胞および気道の上皮細胞と考えられた。このような気腫化はCAS阻害剤であるDEVDの同時注入により抑制された。経時的に観察すると肺の気腫化はCAS+CHAの注入15日後まで継続してみられたが、線維化や肺内への炎症細胞の浸潤はほとんど観察されなかった。一方、CAS+CHAを注入されたマウスではBAL液中に酸性領域で活性化されるエラスターゼ活性が上昇していた。さらにラットの肺から分離培養したII型肺胞上皮細胞にアポトーシスを誘導すると酸性領域においてエラスチン分解活性がみられた。したがってアポトーシスによる肺の気腫化にはなんらかのエラスターゼの活性化が関与していると考えられた。以上の結果から肺胞壁のアポトーシスは肺気腫をもたらす直接的な原因になることが示された。
遺伝子発現の正確性を保証するmRNA品質管理機構

生命現象の基盤となる遺伝子発現の正確性は、様々な品質管理機構によって保証される。異常mRNAの品質はリボソームにより感知され、異常な翻訳終結が引き金となって分解が促進される。本研究では、(1)異常翻訳の認識と解消機構1、(2)異常mRNAと異常タンパク質の迅速な分解機構が明らかになり、品質管理機構の全体像の解明に貢献した。生命現象の基盤となる遺伝子発現の正確性は、細胞の保持する様々な品質管理機構によって保証されている。mRNAの品質はリボソームにより感知され、異常な翻訳終結が引き金となって分解が促進される。研究代表者は、真核生物における品質管理機構の全体像を理解することを目的として、(1)翻訳異常の認識機構、(2)異常タンパク質分解機構、ついて研究を行った。また翻訳異常の認識後のmRNA分解系の理解にはPab1pによるmRNA安定化機構の解明が必須であるため、(3)ポリ(A)鎖結合因子によるmRNA安定化機構、についても研究を行った。生命現象の基盤である遺伝子発現の正確性は、様々な品質保証機構により保証される。多様性獲得の過程で合成される異常mRNAは、異常な翻訳が引き金となって分解が促進される。研究代表者は、先行研究において終止コドンを持たないノンストップmRNAの品質保証機構を解析した。その結果、通常翻訳されないポリ(A)鎖がノンストップmRNAでは翻訳され、(1)翻訳伸張阻害(アレスト)と(2)プロテアソームによる異常タンパク質分解、がおこることを明らかにし、真核生物のmRNAの普遍的な修飾であるポリ(A)鎖の全く新しい役割を見いだした(EMBO J.,2005 ; Cenes&Dev.,2007)。研究代表者は、遺伝病の主要な原因変異であるナンセンス変異を持つmRNA由来の異常タンパク質の発現について解析し、NMD(ナンセンス変異依存mRNA分解系)に必須なUpf複合体が、異常タンパク質のプロテアソームによる分解を促進することを見いだした。これは、「異常タンパク質の分解促進」というUpf複合体の全く新しい役割を示すとともに、翻訳に共役した異常タンパク質分解が品質保証機構の普遍的な分子機構であることを示唆する。具体的な研究項目は以下の3つである。(1)翻訳異常の認識機構(2)異常タンパク質の分解機構3)ポリ(A)鎖結合因子(Pablp)によるmRNA安定化機構。なお平成20年度については研究費の交付を受ける期間が短いため、謝金や旅費があまり必要でない結果、物品費の割合が90%を超えたが、問題なく研究を遂行できた。特に(2)異常タンパク質の分解機構については、これまでの研究結果をまとめた論文の発表を行った(J. Biol. Chem., 2009)。過程で合成される異常mRNAは、異常な翻訳が引き金となって分解が促進される。その結果、通常翻訳されないポリ(A)鎖がノンストップmRNAでは翻訳され、(1)翻訳伸張阻害(アレスト)と(2)プロテアソームによる異常タンパク質分解、がおこることを明らかにし、真核生物のmRNAの普遍的な修飾であるポリ(A)鎖の全く新しい役割を見いだした(EMBO J., 2005;Genes&Dev., 2007)。平成20年度には、(2)異常タンパク質の分解機構についての研究結果をまとめた論文の発表を行った(J. Biol. Chem., 2009)。平成21年度には、遺伝病の主要な原因変異であるナンセンス変異を持つmRNA由来の異常タンパク質の発現について解析し、NMD(ナンセンス変異依存mRNA分解系)に必須なUpf複合体が、異常タンパク質のプロテアソームによる分解を促進することを見いだした(EMBO report, 2009)。研究代表者は、真核生物における品質管理機構の全体像を理解することを目的として、(1)翻訳異常の認識機構、(2)異常タンパク質分解機構、について研究を行った。平成22年度の研究成果は以下はである。(1)異常タンパク質の分解機構:「異常タンパク質の分解促進」というUpf複合体の新しい機能について分子機構の解析を行った。(2)翻訳異常の認識

機構:連続した塩基性アミノ酸残基による翻訳伸長阻害(アレスト)に必須な因子として、40Sサブユニットに結合するRACK1を同定した(EMBO Reports, 2010)。ノンストップmRNAの迅速な分解(NSD)には終止コドン非依存の翻訳終結反応が必須である。翻訳終結因子eRF1/eRF3複合体と相同性を持つDom34/Hbs1複合体が、終止コドン非依存の翻訳終結反応に必要であることを明らかにした(PNAS, 2010)。(3)ポリ(A)鎖結合因子(Pab1p)によるmRNA安定化機構:Pab1pによるmRNA型非翻訳RNAの安定化機構を見いだした(J. Biol. Chem., 2010)。生命現象の基盤となる遺伝子発現の正確性は、細胞の保持する様々な品質管理機構によって保証されている。mRNAの品質はリボソームにより感知され、異常な翻訳終結が引き金となって分解が促進される。研究代表者は、真核生物における品質管理機構の全体像を理解することを目的として、(1)翻訳異常の認識機構、(2)異常タンパク質分解機構、ついて研究を行った。また翻訳異常の認識後のmRNA分解系の理解にはPablpによるmRNA安定化機構の解明が必須であるため、(3)ポリ(A)鎖結合因子によるmRNA安定化機構、についても研究を行った。平成23年度の研究成果は以下である。(1)異常タンパク質の分解機構:(1)「異常タンパク質の分解促進」というUpf複合体の新しい機能について分子機構の解析を行った。その結果、フォールディング異常がUpf複合体による分解促進を受ける条件であることが明らかとなった。(2)翻訳アレストに共役する新生ポリペプチド鎖の分解機構において機能する2つのE3ユビキチンライゲースの基質特異性が明らかとなった。(2)翻訳異常の認識機構:(1)ノンストップmRNAの迅速な分解(NSD)には終止コドン非依存の翻訳終結反応が必須である。翻訳終結因子eRF1/eRF3複合体と相同性を持つDom34/Hbs1複合体が、mRNAの3'末端で停滞したリボソイームを解離させることで、エキソソームによるノンストップmRNA迅速な分解を引き起こすことを明らかにした(Mol. Cell, 2012)。(2)連続した塩基性アミノ酸残基による翻訳伸長阻害(アレスト)に必須な因子として、40Sサブユニットに結合するRACK1を同定されたため、翻訳アレストによるmRNA分子内切断について解析を行った.その結果、翻訳伸長反応自体の阻害(translation arrest)とmRNA2次構造によるリボソームの阻害(road-block)によるNGDが別の機構であることが明らかとなった。(3)ポリ(A)鎖結合因子(Pablp)によるmRNA安定化機構:mRNA型非翻訳RNAの安定性を測定する系を用いてmiRNAによる発現抑制機構に必須なGW184の新たな活性を明らかにした。
水田土壌のメタン生成過程における硫酸還元菌群集の動態の解明

本研究では、水田土壌中で硫酸還元反応と発酵による水素生成反応の2つの役割を担う硫酸還元菌群集を対象に解析を行った。本研究により、水田土壌にはこれまで考えられていた以上に多様な硫酸還元菌が生息しており、その群集構成や動態は水田圃場により異なることが示唆された。また水素生成に関わる酵素[FeFe]-ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とその転写産物の解析から、硫酸還元菌が複数のヒドロゲナーゼを保有し、条件に応じて使い分けるとともに、水田土壌の嫌気的な有機物分解過程において水素生成者として重要な役割を担うことを示唆する知見を得た。本研究は、水田土壌のメタン生成過程における硫酸還元菌の動態を、硫酸還元過程を触媒する酵素と水素生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を対象とした解析により解明することを目的とする。本年度は、国内4カ所の水田(安城、大曲、筑後、黒石)より経時的に採取した水田土壌試料を対象に、硫酸還元過程の最終ステップを触媒する異化的亜硫酸還元酵素(DSR)のβサブユニットをコードするdsrB遺伝子を標的としたPCR-DGGE、定量PCR、クローンライブラリー解析を行い、水田土壌中の硫酸還元菌の群集構造を明らかにした。PCR-DGGE解析の結果、全ての水田において土壌中の硫酸還元菌の群集構造は、水稲作付け期間(湛水期間)、落水期間に関わらず安定していたが、地域間の水田では異なった群集構造を形成していることが明らかになった。クローンライブラリー解析により、計472クローンのdsrB遺伝子を解析し、95%の類似度でOTUを作成して系統的多様性を調べた結果、Deltaproteobacteria綱、Firmicutes門、Nitrospira門の菌に近縁なdsrB遺伝子が得られたとともに、既知菌株と系統的に大きく異なるクラスターを形成するdsrB遺伝子が得られた。各水田におけるそれらの系統的分布は、大きな分類群で見ると類似していたが、全ての水田より共通して得られたOTUはわずかであり、同じ分類群の中でも地域間に違いがあることが明らかになった。加えて、安城および筑後水田の一部試料を対象に行った定量PCRの結果、土壌1gから約10の8乗のdsr遺伝子が検出され、安城水田では中干し期間にその値が大きく減少することが示された。以上より、水田土壌には系統的に比較的類似した菌が安定した群集構造を形成しているが、地域により特徴的な菌が存在すること、また、土壌中の硫酸還元菌数は水管理の影響を受ける可能性があることが推定された。本研究は、水田土壌のメタン生成過程における硫酸還元菌の動態を、硫酸還元過程を触媒する酵素と水素生成を触媒する酵素をコードする遺伝子(dsrおよびhyd)を対象とした解析により解明することを目的とする。昨年度に引き続き、国内4カ所の水田(安城、大曲、筑後、黒石)の硫酸還元菌の群集構造解析をdsrB遺伝子を対象に行い、群集構造の特徴について以下の点が明らかになった。水田土壌の硫酸還元菌の群集構成は、地域間で大きく異なっていたものの、同一圃場内の群集構成に経時変化はほとんど見られなかった。一方で、土壌中のdsrB遺伝子数は、湛水や落水によらずほとんど変化しない、あるいは湛水期間中に減少した。安城水田を除いてdsrB遺伝子数は土壌抽出DNA量と正の相関があったことから、それらの圃場では硫酸還元菌数の増減は土壌微生物バイオマスに規定されていることが推定された。水田土壌にはこれまでの水田分離菌の多様性以上に、幅広い分類群の硫酸還元菌が存在することが明らかになり、その多くが既知の硫酸還元菌と系統的に異なる菌であることが推定された。また、群集構成が異なることから、圃場により有機物分解に関与する硫酸還元菌は異なることが推察された。次に、水田土壌より分離した硫酸還元菌とメタン生成古細菌を共培養し、硫酸還元菌の水素生成に関わる酵素ヒドロゲナーゼをコードするhyd遺伝子を対象に、その転写活性と水素生成活性の関係を解析した。分離した硫酸還元菌株は少なくとも5種類のhydA遺伝子を保有しており、それらの転写活性がメタン生成古細菌存在/非存在条件下、また増殖に伴い変動することを明らかにした。以上より、メタン生成条件下における水田土壌中での硫酸還元菌の水素生成活性を推察する上で重要な知見を得た。研究計画では、硫酸還元菌の群集構造解析をさらに進めることに加え、分離菌を用いた硫酸還元菌の水素代謝活性について解析を進めていくことを計画していた。群集構造解析については、計画通りに進めることができた。分離菌を用いた解析では、まだいくつかの解析が残っているが、硫酸還元条件下と共生条件下でのヒドロゲナーゼの転写活性に違いを明らかにすることができ、おおむね当初の計画通りに進んでいると言える。本研究では、水田土壌のメタン生成過程における硫酸還元菌の動態を分子生物学的手法を用いた解析により解明することを目的とした。これまでに、稲わらを添加した水田土壌にを嫌気培養し、水素生成に関わる酵素[FeFe]-ヒドロゲナーゼの活性中心ドメインをコードするhydA遺伝子の転写産物のクローンライブラリー解析を行い、培養初期ではDeltaproteobacteria門、特に硫酸還元菌や鉄還元菌に近縁な微生物由来のhydA転写産物が大きな割合を占めていたが、メタン生成条件下ではFirmicutes門やDeltaproteobacteria門などに属する多様な微生物由来のhydAが転写されることを明らかにした。また、水田土壌より分離した硫酸還元菌Desulfovibrio sp. A

1株を硫酸塩非存在下で水素消費メタン生成古細菌と共培養したところ、一つのhydAパラログの転写活性が水素生成時に上昇することを見出した。今年度、土壌中で転写されたhydAと水素生成時にA1株が転写したhydAパラログをさらに解析し、A1株のhydAに近縁な配列がメタン生成条件下の土壌中においても転写されていることを見出した。本研究により、硫酸還元菌がメタン生成段階の水田土壌中で水素生成に寄与していることを示唆する結果を得た。そこで、土壌中でhydAを転写する微生物の特性について、さらに情報を得ることを目的として、土壌中で分解中の稲わらより標的hydA配列を持つ細胞をフローサイトメトリー法により回収することを試みた。しかし、標的hydA遺伝子断片を挿入したプラスミドベクターを形質転換した大腸菌を用いて検討実験を行ったが、標的hydAを保有する細胞を検出する条件の確立には至らず、今後さらなる検討が必要であった。本研究では、水田土壌中で硫酸還元反応と発酵による水素生成反応の2つの役割を担う硫酸還元菌群集を対象に解析を行った。本研究により、水田土壌にはこれまで考えられていた以上に多様な硫酸還元菌が生息しており、その群集構成や動態は水田圃場により異なることが示唆された。また水素生成に関わる酵素[FeFe]-ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とその転写産物の解析から、硫酸還元菌が複数のヒドロゲナーゼを保有し、条件に応じて使い分けるとともに、水田土壌の嫌気的な有機物分解過程において水素生成者として重要な役割を担うことを示唆する知見を得た。当初の計画では、平成26年度は水田土壌に生息する硫酸還元菌の群集構造を明らかにすることを目的としていた。平成26年度中に、安城、大曲、筑後、黒石の4カ所の水田より経時的に採取した土壌を対象に、分子生態学的な手法を用いて硫酸還元菌の群集構造を計画通りに解析することができた。定量PCRは全ての試料を対象に行ったわけではなく、今後必要に応じて未分析の試料も解析を進める必要があるが、おおむね順調に進展していると判断した。引き続き、分離菌を用いた硫酸還元菌の水素代謝活性について解析を進める。また、室内培養実験において土壌に鋤きこまれた稲わらの分解過程における硫酸還元菌の動態について解析を進める。これまでの解析結果より、土壌中には多様な未知の硫酸還元菌が存在していることが推察されたことから、稲わら分解に関わる硫酸還元菌のdsr遺伝子およびhydA遺伝子の解析に加え、16S rRNA遺伝子の解析を進め、水田土壌中の硫酸還元菌群集の系統、機能について総合的に解釈をする。土壌微生物学平成27年度は、平成26年度に得たデータを踏まえて、水田土壌がメタン生成段階に移行した条件下での硫酸還元菌の役割、特に硫酸還元菌の水素代謝について解析を進めて行く。また、安城水田土壌より分離した硫酸還元菌およびメタン生成古細菌を用いた培養実験を行い、硫酸還元時、メタン生成時での両者の水素代謝活性等を解析する。具体的には、硫酸還元反応に関わる酵素をコードするdsrB遺伝子に加えて、水素生成反応に関わるヒドロゲナーゼ酵素をコードするhydA遺伝子およびそれらの転写産物を対象として、発現のタイミング、発現量などの解析を進めて行く。