hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
繊維状食品添加気泡混合ゲルの物理的特性と咀嚼・嚥下機能

若年健常者をパネルとした官能評価より、品温20°Cの泡除去ゲル試料が、20°C含泡ゲル試料に比べ有意にべたつき感があり、口中の残留感も大であることが認められた。また、官能評価と同じ被験者による嚥下時舌骨上筋群筋電位測定の結果、官能評価でべたつき感があり、口中の残留感も大きかった品温20°C泡除去ゲル試料の筋活動量は有意に大きく、一方、べたつき感、残留感が少なかった品温20°C含泡ゲル試料の筋活動量は有意に小さいことが示された。一方、品温10°Cの含泡ゲル試料と泡除去ゲル試料との間に、官能評価、嚥下時筋電位測定結果において有意差は認められなかった。平成29年度は、卵白を用いた冷凍市販エスプーマゲル状食品を解凍したものを試料とし、気泡混合ゲルと気泡を含まないゲル試料の物理的特性の測定方法を確立することが第一の達成目標であった。また、人の食べやすさの測定方法の確立も目標であった。気泡混合ゲル試料と気泡を含まないゲル試料の物理的特性を明確に表すことができるパラメータは、密度、密度より求められる気泡の空隙率、破断特性において弾性要素を示すヤング率、低ひずみ領域より得られた降伏応力であることがわかった。また、気泡の分散状態を光学顕微鏡を用いて観察することで気泡の大きさ、分散状態を把握できることがわかった。人の食べやすさの評価として、分析型官能評価、嚥下状態の評価として舌骨上筋群筋活動の測定が有効であることが示された。現在進行中であり、研究実績の概要には示していないが、寒天、ゼラチン、ジェランガムをゲル化剤として調製したゲルに、亜酸化窒素ガス気泡を調理器具エスプーマにより分散させ、卵白ゲルを用いない含泡ゲル試料の調製実験を継続している。ゲル化剤としてネイティブ型ジェランガムを用い、添加濃度が0.4、0.5、0.6%(w/w)の基本ゲルを調製した。これらの基本ゲルに、エスプーマアドバンスで亜酸化窒素ガスを封入し、気泡混合ゲルを調製した。基本ゲル、および気泡混合ゲルの密度、気泡含有率、光学顕微鏡による気泡の分散状態の観察、圧縮測定によるひずみと応力の関係、広がり係数(リング法)の測定を行った。気泡混合ゲルは基本ゲルに比べ、密度が有意に小さくなった。また、基本ゲル、気泡混合ゲルの密度にジェランガム添加濃度の影響は認められなかった。気泡混合ゲルの気泡含有率は、0.4%気泡混合ゲルで33.9±5.5%、0.5%気泡混合ゲルで37.3±6.0%、0.6%気泡混合ゲルで32.7±5.4%となり、有意差は認められなかった。ゲルに分散している気泡長径の平均は0.4%気泡混合ゲルで(8.79±2.83)×10^2μm、0.5%気泡混合ゲルで(9.63±4.62)×10^2μm、0.6%気泡混合ゲルで(7.99±3.65)×10^2μmとなった。ひずみ-応力曲線より、基本ゲルは脆性破断を示し、一方、気泡混合ゲルは明確な破断点が認められなかった。初期弾性率は気泡混合ゲルが基本ゲルに比べ、有意に小さくなった。基本ゲル、気泡混合ゲルともに分散媒のジェランガム濃度が大きくなるに従い、初期弾性率は大きくなった。広がり係数は、いずれのジェランガム濃度においても、気泡混合ゲルが基本ゲルに比べ、有意に小さいものとなった。ジェランガム濃度が異なる基本ゲル、気泡混合ゲルについて、嚥下時筋電位測定を行った。その結果、気泡混合ゲルは基本ゲルに比べ、食塊形成時間が有意に短いことが認められた。以上より、ジェランガムゲルに気泡を分散させることで、口中で食塊形成がしやすくなることが示され、気泡混合ジェランガムゲルの嚥下食へ応用が可能になることが示唆された。
対流圏オゾン濃度の上昇が植生の蒸発散と群落微気象に及ぼす影響

自然状態の1.5倍のオゾン濃度環境を人工的に保持したコムギ畑および水田(E-O3)と非制御で自然状態のコムギ畑および水田(A-O3)で, 2シーズンにわたって微気象観測と植物生理生態観測を行い,オゾン濃度の影響を組み込んだ気孔コンダクタンス(gs)モデルを構築した.モデルにはJarvis型の式を用い,累積O_3投与量が増加するにつれてgsが低下するプロセスが再現できた.E-O3とA-O3で植物体表面温度(T_s)と気温(T_a)の鉛直分布を測定した.両区で比較した結果,高度によって温度差に違いはあるがE-O3におけるT_sの方が1°C前後高く, T_aも最高で0.5°C前後高かった.この結果から,オゾン影響の蓄積によるgsの低下が温度上昇につながることが明らかにできた.自然状態の1.5倍のオゾン濃度環境を人工的に保持したコムギ畑および水田(E-O3)と非制御で自然状態のコムギ畑および水田(A-O3)で, 2シーズンにわたって微気象観測と植物生理生態観測を行い,オゾン濃度の影響を組み込んだ気孔コンダクタンス(gs)モデルを構築した.モデルにはJarvis型の式を用い,累積O_3投与量が増加するにつれてgsが低下するプロセスが再現できた.E-O3とA-O3で植物体表面温度(T_s)と気温(T_a)の鉛直分布を測定した.両区で比較した結果,高度によって温度差に違いはあるがE-O3におけるT_sの方が1°C前後高く, T_aも最高で0.5°C前後高かった.この結果から,オゾン影響の蓄積によるgsの低下が温度上昇につながることが明らかにできた.中国江蘇省江都市郊外の実験水田で、微気象環境の自動測定を行うとともに、ライシメータによる実蒸発散量の測定と、気孔コンダクタンス、植物体面積密度、群落内部の日射透過率、植物体表面温度などの鉛直分布を手動測定した。手動測定は、7月28日-8月5日と8月28日-9月5日に実施した。オゾン濃度([O_3])を人工的に上昇させたFACE水田と対照水田で、植物体面積の鉛直分布を比較した結果、FACE水田において緑葉が少なく赤斑点を持つ葉が多く、高[O_3]が植物の生育に影響を与えたと考えられた。両水田で測定した気孔コンダクタンス(gs)の鉛直分布を比較すると、FACE水田においてgsが小さかった。このことからオゾン曝露の積算効果がgsに影響を与えるという従来の知見が検証された。また、両水田における植物体表面温度(放射温度)の鉛直分布を比較すると、FACE水田のほうが高かった。これはgsが低いすなわち蒸散量が少ないためであると考えられた。両水田におけるgsの測定結果を用いて、光合成有効放射、飽差、オゾン曝露積算量および[O_3]の関数による気孔コンダクタンス・サブモデルを構築した。このサブモデルを組み込み、微気象環境・[O_3]・各フラックスの鉛直分布およびオゾンの吸収過程を再現する多層モデルを構築した。モデル計算値は、微気象観測による測定結果とおおむね良く一致し、モデルの有効性が検証された。モデルにより、高[O_3]の葉内蓄積(障害としての蓄積)が気孔コンダクタンスを低下させ、個葉蒸散量が低下するとともに、葉面積が減少するため水田蒸発散量が低下することが明らかになった。またこれと同時に、植物体温度が上昇するため、気温上昇につながると予測された。このように、微量ガスである[O_3]の上昇という大気環境の汚染によって温度が上昇すると予測された点が、本成果の重要な点である。中国江蘇省江都市郊外のコムギ・イネ2毛作地帯に設置されたオゾン濃度([0_3])をFACE装置によって人工的に上昇させたFACE圃場(E-03)と対照圃場(A-03)で,微気象環境の自動測定を行うとともに,個葉の蒸散・光合成速度,気孔コンダクタンス,植物体面積密度,群落内部の日射透過率,植物体表面温度などの鉛直分布を手動測定し,水田ではライシメータによる実蒸発散量の測定を行った.現地での手動測定は,2008年4月15-24日,7月8-17日,9月2-11日に実施し,それ以外に機器のメンテナンスを2009年3月17-20日に実施した。出穂開花期に,両圃場で緑葉,黄緑葉,枯死葉別に葉面積を測定した結果,E-03の植物体の方が緑葉が少なく,黄緑葉と枯死葉が多いことが明らかになった.これは,高オゾン環境が植物体の老化を促進させた結果であると考えられた.E-03とA-03で,コムギ(YM16)とイネ4品種(WYJ21,LYPJ,SY63,YD6)の気孔コンダクタンス(gs)を測定し,気象条件(光合成有効放射;PAR,飽差;VPD,気温),土壌水分,オゾンドウス(AOT40),出葉後日数(phenology),1日の時問(time)とgsの相関を分析し,試行錯誤によってJarvis型の関数でgsをモデル化した.昨年度はコメ1品種についてgsモデルを完成させたが,今年度はコムギに加えてコメ4品種のgsモデルを構築した結果,VPD,AOT40,phenology,timeの関数に,コムギとイネの違いとイネ4品種問の違いが表された.

また,AOT40が約2000ppbhを越えるとgsを減少させる効果が現れ始めた.これにより,オゾン濃度の上昇がgsの低下を通して個葉の蒸散量を低下させ群落の温度を上昇させる効果が再現されたこのように,作物種や品種によって差異はあるものの,微量ガスである[0_3]の上昇という大気環境の汚染が植物体の老化を促進し,気孔の閉鎖によって温度を上昇させると予測された点が,本成果の重要な点である.
OPG遺伝子欠損マウスの歯牙再植実験による歯髄・歯周組織治癒過程に関する研究

OPG添窩溶液が脱落歯保存液としての有効性を検討するために以下の実験を行った。OPG添窩溶液に脱臼歯を保存した後の正常マウスならびOPG遺伝子欠損マウスの上顎第一臼歯を用いた歯牙再植実験実験動物には5週齢の雄性OPG遺伝子欠損マウス(OPG遺伝子欠損群)を用い、十分な麻酔下で実態顕微鏡のもと上顎右側第一臼歯を抜去した。抜去した歯に破折が無いこと確認した後、生理食塩水(OPG無添加群)ならびOPG濃度が0.1,10,1000ng/ml(OPG投与群・3群)に調整された溶液の中に30分保存した後、元の位置に再植した。対照実験として、5週齢の雄性野生型マウスを用いて同様の実験を行いコントロール群とした。再植後1,3,7,14,28,72日後にアルデヒド溶液にて潅流固定を行い、上顎顎骨を摘出し、EDTA溶液にて脱灰後、パラフィン切片、凍結切片、および樹脂切片を作製し、再植した上顎右側第一臼歯の歯髄・歯周組織の組織学的観察を行った。OPG遺伝子欠損群では、脱臼歯の保存液濃度が10と1000ng/mlの中には、非常に良好な治癒経過を示すものも観察されたが、再植歯の歯根吸収が著しいものも中には観察され、脱臼・再植の一連の手技やその後の再植歯の環境が各固体によって異なるために、内因性のOPGタンパク欠如によって更に増幅され、再植歯の予後に影響を与えている可能性が推察された。コントロール群では、OPG遺伝子欠損群同様に10と1000ng/mlの中に、高い確率で、非常に良好な治癒経過を示すものが観察された。治癒経過が不良なものでもOPG遺伝子欠損群に比べ、その侵襲の程度は組織化学的に非常にマイルドなものを示した。以上の結果より、10ng/ml以上のOPG添窩溶液は脱臼歯の保存液として有効性が高いことが推察された。但し、内因性OPGタンパクの欠如は、歯牙再植においてもRANK・RANKLの作用によって破骨細胞・破歯細胞形成を活発化し、より大きな侵襲を引き起こすことが示唆された。OPG遺伝子が欠損した状態での再植歯の歯髄・歯周組織の治癒過程を経時的に評価するために以下の実験を行なった。OPG遺伝子欠損マウスの上顎第一臼歯を用いた歯牙再植実実験動物には5週齢の雄性OPG遺伝子欠損マウス(OPG群)を用い、十分な麻酔下で実態顕微鏡のもと上顎右側第一臼歯を抜去した。抜去した歯に破折が無いこと確認した後、直ちに元の位置に再植した。歯牙の抜去および再植時の歯冠部の保持には、先端部分を独自に加工した専用のピンセットを用いた。対照実験として、5週齢の雄性野生型マウスを用いた歯牙再植処置を同様に行いコントロール群とした。OPG群では、著しい歯根分の象牙質ならびセメント質の吸収が認められ、その周囲には多数のTRAPase(酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ)陽性を示す破歯細胞が観察された。再植後14日後では、歯根部がほとんど吸収され、その概形も消失しているのが観察された。一方、コントロール群でもTRAPase陽性の破歯細胞が観察され、若干の歯根吸収を認められたが、OPG群ほどの著しいものではなく、歯根概形は保たれていた。ただし、歯髄組織内部では、骨様の硬組織形成や著しい炎症性細胞の浸潤が観察された。以上の結果より、OPG遺伝子の欠如は、OPGによる破骨細胞形成の抑制が期待できないので、直接的にRANK・RANKLの作用によって破骨細胞形成が活性化されことが推察された。また、歯牙再植処置のような局所的な組織傷害や侵襲に対しても、OPGが破歯細胞形成を抑制し再植歯の治癒に何らかの良い効果を与える可能性が示唆された。

再植後1,3,7,14,28,72日後にアルデヒド溶液にて潅流固定を行い、上顎顎骨を摘出し、EDTA溶液にて脱灰後、パラフィン切片、凍結切片、および樹脂切片を作製し、再植した上顎右側第一臼歯の歯髄・歯周組織の組織学的観察を行った。OPG遺伝子欠損群では、脱臼歯の保存液濃度が10と1000ng/mlの中には、非常に良好な治癒経過を示すものも観察されたが、再植歯の歯根吸収が著しいものも中には観察され、脱臼・再植の一連の手技やその後の再植歯の環境が各固体によって異なるために、内因性のOPGタンパク欠如によって更に増幅され、再植歯の予後に影響を与えている可能性が推察された。コントロール群では、OPG遺伝子欠損群同様に10と1000ng/mlの中に、高い確率で、非常に良好な治癒経過を示すものが観察された。治癒経過が不良なものでもOPG遺伝子欠損群に比べ、その侵襲の程度は組織化学的に非常にマイルドなものを示した。以上の結果より、10ng/ml以上のOPG添窩溶液は脱臼歯の保存液として有効性が高いことが推察された。但し、内因性OPGタンパクの欠如は、歯牙再植においてもRANK・RANKLの作用によって破骨細胞・破歯細胞形成を活発化し、より大きな侵襲を引き起こすことが示唆された。
眼型粘膜類天疱瘡の病態に関するマクロファージと制御性T細胞の関与

Ocular Mucous Membrane Pemphigoid(眼型粘膜類天疱瘡:OcMMP)は両眼性に慢性に進行する難治な瘢痕性結膜疾患であり、自己免疫疾患とされる。患者血清中の31種類のサイトカイン濃度解析を施行したところ、年齢や病型と関連して複数の炎症性サイトカイン濃度に有意差を認めた。患者血清中のサイトカイン濃度の不均衡が多彩な臨床病態と関連している可能性がある。Ocular Mucous memebrane Pemphigoid(眼型粘膜類天疱瘡:OcMMP)は主に高齢者に発症する極めて難治な瘢痕性結膜疾患である。稀少疾患であり、診断が難しいために、本邦の眼科において本症に関する報告は極めて少ない。今年度は臨床所見から本症に合致する患者の24検体の血清を採取し、31種類のサイトカインについて検定を行った。解析結果から複数のサイトカインについて正常者と患者の間に血中サイトカイン濃度に差がある傾向を認めた。また正常者では血清中サイトカイン濃度が収束しているにもかかわらず、患者ではばらつきが目立つ傾向があった。これらの結果について統計学的処理を行い検討したところ、正常者と比較して患者ではIL-6,IL-8,IL-10,FGFbが有意に上昇、IP-10が有意に低下していた。患者を年齢別(60-70代と80代)に比較したところ、80代ではIL-1b, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10 ,IL-12, IL-13, IFNg, VEGF, PAI-1について有意な低下を認めた。患者の臨床所見から病変が眼に限局している症例と眼と眼以外の粘膜に病変がある症例の2群に分類して比較したところ、眼と眼以外の粘膜に病変がある症例ではIP-10とLeptinについては有意に低下、Eotaxinについては有意に上昇していた。これらの結果から本症の患者では血清中のサイトカイン濃度の不均衡が存在し、病態と関与している可能性があることが明らかとなった。今後症例数を増やすとともに、病期(急性期、慢性期)や治療前後など病態を含めた比較も行い、今回得られた結果について検証をすすめる必要がある。さらに炎症の主座である結膜組織について検討し、血清について得られた結果と対応づける必要がある。Ocular Mucous Membrane Pemphigoid(眼型粘膜類天疱瘡:OcMMP)は両眼性に慢性に進行する難治な瘢痕性結膜疾患である。睫毛乱生、結膜嚢短縮、瞼球癒着などの線維性変化が進み、進行例では角膜上皮幹細胞が疲弊し、瘢痕性角膜混濁による重篤な視力障害をきたす疾患である。稀少疾患であり、診断が難しいため、本邦における症例報告が少なく、全体像が不明である。本症は眼以外の粘膜/皮膚に病変を来しうる全身性自己免疫水疱症であるが、亜型として眼に限局する症例があると考えられている。研究期間内に当科を受診したOcMMP患者25例について眼以外の粘膜/皮膚病変の有無、既往歴、生化学検査結果、血清中のサイトカイン濃度を検討した。眼に限局した症例は15例、眼と眼以外の粘膜に病変を認めた症例は10例であった。既往歴として中耳炎に起因する鼓膜穿孔があった5例は全例病変が眼に限局した症例であり、脳血管障害があった6例は全例眼と眼以外の粘膜に病変を認めた症例であった。生化学検査において好中球/リンパ球分画比が3.0を超えた症例は全て眼と眼以外の粘膜に病変を認めた症例であった。今年度患者16検体、正常者22検体について31種類の血清中サイトカイン濃度の検討を行った。昨年と同様正常者ではサイトカイン濃度が収束しているのに対し、患者ではばらつきがある傾向を認めた。眼に限局した症例と眼と眼以外の粘膜に病変を認めた症例では複数のサイトカインに濃度差を認めた。本症患者では血清中のサイトカイン濃度の不均衡が存在し、臨床病態と関連している可能性がある。炎症の主座である結膜組織での検証が必要であるが、眼表面再建術の対象となる症例が少なく、採取した組織は瘢痕化が強かったため予定した検討に至らなかった。今後組織学的に検討を行うとともに、さらに症例数を増やして検証する必要がある。本疾患の特徴として患者数が少なくかつ高齢であること、病態悪化のリスクがあり結膜組織の採取が困難であること、また確定診断が非常に難しいことが挙げられる。そのため本邦眼科からは少数の症例の報告があるのみで、まとまった数の症例に関する報告はない。したがって今回本学にて臨床所見から本症に合致する約20症例の患者から血清を集め、解析できたことは一つの成果と考えられる。これらの患者の臨床病態については、国内学会にて報告を行った。

血清中の31種類のサイトカインについて解析し、正常者と患者の比較、患者間での年齢別比較、臨床病型別の比較を行ったところ、それぞれ複数のサイトカインについて統計学的に有意な解析結果が得られた。現在フローサイトメトリーを用いた制御性T細胞等、免疫担当細胞分画の検討については効率のよい検索法を模索中である。眼科本年度に続いて患者血清中のサイトカインの解析を行う。本年度に解析した症例についても経時的に測定を行い、眼表面再建手術前後の変化や病勢との相関をみることで、疾患活動性の指標について模索する。また眼表面再建術時に得られた結膜組織について免疫組織染色を行い、マクロファージ、リンパ管マーカー、制御性T細胞、各種炎症性サイトカイン等の発現を解析し、血清中サイトカイン濃度との関連について検証する。さらにフローサイトメトリーを用いた患者末梢血中の制御性T細胞、マクロファージなどの免疫担当細胞分画の解析を進める予定である。本年度眼表面再建術の適応となり解析可能な結膜組織が得られた症例が1例のみであった。そのため次年度の症例と合わせて免疫組織染色を行う予定となった。またフローサイトメトリーについても効率のよい解析方法を確立中であり、必要な試薬、抗体が未購入であるため次年度使用額が生じた。免疫組織染色に必要な試薬、抗体やフローサイトメトリーの試薬、抗体、サイトカインアッセイに必要なキット、その他の消耗品に使用する予定である。
遺伝性進行性ジストニア(瀬川病)の分子機序の解析

遺伝性進行性ジストニー(HDP)は年齢依存性の症度変化、著明な日内変動を呈し、常染色体優性遺伝病であるにもかかわらず浸透率は低い。本病はGTP cyclohydrolase I (GCH)遺伝子以上に起因した疾患で、この遺伝子異常による酵素活性の30%を下回る減少の結果、黒質線条体-ドパミン-ニューロンの終末部のチロシン水酸化酵素の選択的減少をきたす.これは他の優性神経遺伝病の病理が一般に変性であり、たとえば酵素異常をともなう筋萎縮性側索硬化症が進行性で予後不良であるという事実とは対照的である.そこで、HPDの病態の分子機序の解明は、多くの酵素異常症の発症機構、および治療への展望が開くものと考えている.ここでは、まず遺伝子異常をもつ未発症例では、遺伝子の転写が正常のそれに比して相対的に低下していることを報告した.さらに浸透度の機序を細胞発現系において検討するため、野生型および種々の変異をもつGCHcDNAを合成して、単独あるいは野生型と変異型を同時にCOS-7細胞に発現させた.HPD患者から変異GCHの単独発現では酵素活性はなく、野生型との共発現ではGCH活性は変異GCHmRNAの発現量が増加するにしたがい低下した.変異GCHcDNAの種類によって低下の程度は異なったが、いづれの変異型も野生型と反応して活性を低下させるドミナントネガティブ効果を示した.遺伝性進行性ジストニー(HDP)は年齢依存性の症度変化、著明な日内変動を呈し、常染色体優性遺伝病であるにもかかわらず浸透率は低い。本病はGTP cyclohydrolase I (GCH)遺伝子以上に起因した疾患で、この遺伝子異常による酵素活性の30%を下回る減少の結果、黒質線条体-ドパミン-ニューロンの終末部のチロシン水酸化酵素の選択的減少をきたす.これは他の優性神経遺伝病の病理が一般に変性であり、たとえば酵素異常をともなう筋萎縮性側索硬化症が進行性で予後不良であるという事実とは対照的である.そこで、HPDの病態の分子機序の解明は、多くの酵素異常症の発症機構、および治療への展望が開くものと考えている.ここでは、まず遺伝子異常をもつ未発症例では、遺伝子の転写が正常のそれに比して相対的に低下していることを報告した.さらに浸透度の機序を細胞発現系において検討するため、野生型および種々の変異をもつGCHcDNAを合成して、単独あるいは野生型と変異型を同時にCOS-7細胞に発現させた.HPD患者から変異GCHの単独発現では酵素活性はなく、野生型との共発現ではGCH活性は変異GCHmRNAの発現量が増加するにしたがい低下した.変異GCHcDNAの種類によって低下の程度は異なったが、いづれの変異型も野生型と反応して活性を低下させるドミナントネガティブ効果を示した.GTP-cyclohydrolasel(GCH)遺伝子の異常を有し、常染色体優性遺伝形式をとるDRD(Dopa-responsivedystonia)が知られているが、この臨床的浸透度が正常と異常GCH遺伝子の相対的発現レベルに影響される可能性について報告してきた.さらに浸透度の機序を細胞発現系において検討するため、野性型および種々の変異をもつGCHcDNAを合成して、単独あるいは野性型と変異型を同時にCOS-7細胞に発現させた.DRD患者からの変異GCHの単独発現では酵素活性はなく、野性型との共発現ではGCH活性は変異GCHmBNAの発現量が増加するにしたがい低下した.変異GCHcDNAの種類によって低下の程度は異なったが、いずれの変異型も野性型と反応して活性を低下させるドミナシトネガティブ効果を示した.一般に酵素異常症では、活性が正常の50%となるヘテロ接合体では発症しないが、DRDに存在する変異は正常酵素活性を抑制するため、総活性は50%以下の低値となり発症に結び付くことが考えられる.一方、GCH遺伝子異常を有するもののなかに、劣性遺伝形式をとるatypical hyperphenylalaninemia(HPA)が報告されている.この変異GCHについて同様に発現実験を行いドミナントネガティブ効果について確認した.遺伝性進行性ジストニア(HPD)患者のゲノムDNAからクローニングした、変異GTP cyclohydrolase I(GCH)をコードする5種類のcDNAをRSV/LTRプロモーターとするpRc/RSVベクターを用いてヒト線維芽細胞に導入して、ネオマイシンを含む培養液中で継代して安定化クローンを得た.導入遺伝子の発現についてはノーザンブロット法、RT-PCR法、あるいはウエスタンブロット法によって確認した.こうして種々の変異GCHを発現している細胞株からmRNAを抽出してcDNAライブラリーを作製した.この平均長は1.5Kbであった.このcDNAを鋳型として、32PdCTPを基質として加えたPCR法によって放射化したcDNAをアクリラミド電気泳動によって分離後、オートラヂオグラフィーを行った.同様の操作を正常GCH遺伝子導入細胞についても行い、両者間で異なる7種類のバンドが得られた.現在それらをプローブとして、それぞれの細胞株から抽出したRNAについてノーザンを行いその特異性について検討している.これらの特異性が証明できれば、脳神経細胞cDNAライブラリーをスクリーニングして全長クローンを得る.
わが国の常緑針葉樹林の長期動態特性とそれに及ぼす気候変化の影響に関する研究

わが国の主要気候帯(亜寒帯,亜高山帯,冷温帯,暖温帯)に成立する常緑針葉樹林における樹木群集動態と中長期的な気候変化との関連性についての調査・解析を行った.1990年以降の気温変化の傾向は,本州(暖温帯・冷温帯・亜高山帯)と北海道(亜寒帯)の針葉樹林内では異なっていた.また,各森林の針葉樹種における生長速度の長期的傾向から,暖温帯と冷温帯の常緑針葉樹林では生長速度に顕著な変化はなく,一方,亜寒帯と亜高山帯では,気温と生長速度の変化の傾向に対応関係が示された.本研究課題はわが国の常緑針葉樹林における樹木群集動態特性の解明とそれに及ぼす中長期的(1525年)な気候変化の影響に関する知見を明らかにすることを目的とし,大面積長期動態モニタリング手法を用いて、各気候帯(亜寒帯、亜高山帯、冷温帯、暖温帯)に成立する4つの常緑針葉樹原生林に設置された面積12haの調査区の樹木群集の時系列的・空間的な変化に及ぼす要因を定量化するための調査・解析を実施した。本研究課題初年度となる当該年度は冷温帯常緑針葉樹林1.2ha調査区と亜寒帯常緑針葉樹林2ha調査区の対象サイズ以上の樹幹の毎木調査を行った.また,各調査地に隣接するアメダス気象統計データが調査区温度環境として有効であるかを検討するために,すべての調査区内に温度記録計を設置して年間を通した林内温度環境の測定を開始した.当該年度は樹木群集の時系列的・空間的な変化に及ぼす要因の定量化に関する解析方針を決定するために,亜寒帯常緑針葉樹林における13年間の樹木群集動態と光環境要因とを関連させた解析を検討した.共存する3樹種(アカエゾマツ・エゾマツ・トドマツ)の死亡率パターンには明確な違いがあり,また,幹直径の成長速度では下層と林冠層で種順位が入れ替わるような成長パターンの違いが認められた.林冠木と下層木(樹高≧1.3m)の個体群動態や成長動態の傾向は3樹種の樹木競争関係(Nishimura et al.,2010)から説明できることがわかった.一方,樹高<1.3mの稚樹個体の成長については一般化線形モデルにより個体サイズ・林冠ギャップ・樹木混みあい程度などを要因に解析した結果,倒木に集中しがちな樹高<1.3mの稚樹間では目立った競争は検出されず,稚樹成長速度を規定する条件として,各個体直上の光環境を決定する要因と光応答に関する種生態特性の相対的重要性が,樹種により異なっているという結論が得られた.当該年度は,北方針葉樹林に設置した二次林1ha調査区において樹高≧1.3mであった幹の毎木調査を実施し,北方針葉樹原生林2ha調査区における2000年以降の4回の樹高≧1.3mの幹のモニタリングデータと,二次林1ha調査区における2006年以降の3回の樹高≧1.3mの幹のモニタリングデータから,構成樹種の成長動態についての比較解析を行った.原生状態林分における2001-2004年,2005-2008年,2009-2013年の3期間の樹高≧1.3mの全樹木の胸高直径平均成長速度は,それぞれ1.73,1.83,1.64 mm/年であった.一方,原生状態に達していない林分における2007-2009年,2010-2014年の2期間の樹高≧1.3mの全樹木の胸高直径平均成長速度は,それぞれ1.45,1.13 mm/年であった.原生状態林分では2009-2013年の胸高直径成長速度は2005-2008年に比べてやや小さかった.一方,原生状態に達していない林分では2期間の胸高直径成長速度に有意な違いが検出され,2010-2014年の胸高直径成長速度は,2007-2009年の期間に比べて平均的に約20%小さかった.また,各樹種の平均成長速度においても(特に原生状態に達していない林分において)同様の傾向があった.さらに,どちらの林分でも成長速度の期間変化における樹種間の差が検出され,原生状態の林分では2009-2013年におけるエゾマツの成長速度は,2005-2008年の期間に比べて小さく,同様に,原生状態に達していない林分での2010-2014年におけるエゾマツの成長速度は,2007-2009年より有意に小さかった.一方,トドマツやアカエゾマツでのこのような傾向は有意ではなかった.この現象に関して気象統計データとの対応を調べた結果,各年の成長期間前の冬期や早春の寒さとの関連性が推察された.本研究の目的は,わが国の常緑針葉樹林における樹木群集動態特性の解明とそれに及ぼす中長期的な気候変化の影響に関する知見を蓄積することにある.

そこで,亜寒帯,亜高山帯,冷温帯,暖温帯に成立する代表的な4つの常緑針葉樹原生林を対象として中長期経時的な樹木群集の動態に関する調査,林冠状態の時・空間的な変化に関する調査,および,肥大生長変動に関する解析を計画的に実施している.27年度においては,(1)林内気温観測との比較による各調査地に隣接したアメダス気温データの有効性の検証,(2)個体生長量の年変動パターンをモデル化する手法の検討,(3)気象因子と生長速度の長期変化傾向に関する解析,の3つの項目を実施した.(1)各原生林分内に設置した温度ロガーによる気温データと近接する周辺数カ所のアメダス気温データから林内の気温特性を解析した結果,アメダス気温と林内気温との関係においてどの調査地でも高い相関があり,傾きを示す回帰係数はほぼ1で,林内気温の推定には近接アメダスデータが有効であることがわかった.(2)北海道東大雪北方針葉樹林の樹高>1.3mの幹について2006-2015年の9年間の肥大生長パターンを解析した結果,全ての樹種と階層で2007-2009年の期間に比べて2010-2014年の直径生長速度が低くなり,特に,エゾマツの林冠木でその傾向が顕著であった.さらに,この結果を検証するために階層ベイズモデルによる動的線形モデルを構築し,期間ごとの各個体の生長変化のパターンを比較したところ同様の結論が得られた.(3)岐阜県の亜高山帯針葉樹林における1992-2015年の26年間における肥大生長量の変化をアメダス観測データ(気温,降水量,日照時間)と比較して解析を行った結果,年平均気温や4-5月の5°C以上の積算温度が高い年が多かった期間ほど,年生長速度が高い傾向があることが明らかとなった.本研究課題の目的は、わが国の常緑針葉樹林における樹木群集動態特性の解明とそれに及ぼす中長期的(1525年)な気候変化の影響に関する知見を収集することである.本年度の亜高山帯針葉樹林における現地調査により,亜寒帯と亜高山帯における過去15-26年の毎木データベースを使用しての予備的な解析を試みたところ,解析手法の方向性やデータの有効性などが確認でき,最終年度のまとめについての見通しが付いた.さらに,森林の温度環境を収集するためには数年間継続しての測定が必要であり,継続的に各調区内に温度記録装置による観測を実施し,追加データを含めて最終年度である28年度にとりまとめる予定である.本研究の目的はわが国の常緑針葉樹林における樹木群集動態特性の解明とそれに及ぼす中長期的な気候変化の影響に関する知見を蓄積することにある.最終年度の28年度は,まとめとして気象因子(特に気温)と生長速度の長期変化の傾向に関する解析を中心に行い,以下のような成果が得られた.亜寒帯,亜高山帯,冷温帯,暖温帯に成立する代表的な4つの常緑針葉樹原生林における長期間における気温変化の傾向を把握するために,調査区に近接するアメダス観測所の気象データを解析した.西日本の暖温帯と中部日本の冷温帯・亜高山帯の常緑針葉樹林における年平均気温は2000年までは顕著な増加傾向を示し,2000年以降はほぼ横ばいで,2011年以降はやや低下傾向にあった.一方,亜寒帯の常緑針葉樹林では目立った変化はなく,2011年以降は他の森林と同様の傾向があった.次に,各森林における生長速度の長期的な変化の傾向に関して解析したところ,暖温帯と冷温帯の常緑針葉樹林では生長速度の変化に目立った傾向はなく,一方,亜寒帯と亜高山帯では,近年の生長速度がやや低下している傾向があり,気温と生長速度の変化の傾向に対応関係が示された.そこで,これらの2つの森林における気温と生長との関連性についての解析を行った.亜寒帯針葉樹林の林冠木から生長コアを採取して,2000-2015年の15年間の肥大生長パターンを解析した.すべての樹種において2011年以降の幹直径における肥大生長速度が小さくなっている傾向があった.また,前年秋期,当年春期と夏期の気温条件が当年の生長速度に影響を及ぼしていることが推測され,これらの時期の気温条件における影響は樹種ごとに異なっていた.さらに,亜高山帯針葉樹林の年平均気温と主要構成樹種の生長速度に関してサイズ別に一般化線形混合モデルにより検討した結果,モミ属2種の生長速度には年平均気温に正の効果が認められた.
T2K実験におけるニュートリノ振動の測定と反ニュートリノ振動の研究

T2K実験は、加速器によって得られたミューオンニュートリノを用いて、電子ニュートリノ出現事象による振動パラメータθ13の測定、そしてミューオンニュートリノ消失事象による振動パラメータθ23、及び混合状態の質量二乗差Δm^2_23の精密測定を行っている。炭素標的から280mに設置された前置検出器及び295km離れた大型水チェレンコフ検出器(Super-K)にてニュートリノ事象数をはかり、両者を比べる事で振動パラメータの測定を行う。2013年5月までに測定したデータを用い、同年にθ13がゼロである事を7.3σの統計的有意性で棄却した事を発表した。さらに、同データを用いて世界最高精度でθ23を測定し、今年2014年にその結果を発表した。ニュートリノ振動で現在残されている課題としては、1.)レプトンセクターでCP保存が破れているのか、2.)質量階層性、3.)θ23は最大混合(45度)なのか、という主にこの3点が挙げられる。これらの課題を解決するためにも、反ミューオンニュートリノを用いたニュートリノ振動の測定は大変重要であると考えられている。私はこの反ミューオンニュートリノの生成量を検証するためにCT (Current monitor)を用意し炭素標的下流118mに設置準備を行った。このモニターにより反ニュートリノと共に生成された反ミューオンの量を測定が出来る事が期待され、その結果として、反ニュートリノの生成を確認する事ができる。現在T2K実験で測定されている振動パラメータの不定性の原因としてニュートリノ反応モデルの不定性によるものが大きい。この不定性は反ニュートリノの測定においても大きな影響を与えると考えられている。私はCTのR&Dと平行して、前置検出器に近い位置に設置した主に鉄及び炭素で構成された検出器「INGRID」を用い、未だ測られていないエネルギー領域におけるニュートリノ反応断面積の測定を行った。この解析による結果、測定値は現在のニュートリノ反応モデルと矛盾しない事が分かった。(抄録なし)T2K実験は、加速器によって得られたミューオンニュートリノを用いて、電子ニュートリノ出現事象による振動ハラメータθ13の測定、及びミューオンニュートリノ消失事象による振動パラメータθ23、及び混合状態の質量二乗差Δm^2_<23>の精密測定を行っている。実験手法としては、炭素標的から280mに設置された前置検出器及び295km離れた大型水チェレンコフ検出器(Super-K)にてニュートリノ事象数をはかり、両者を比べる事で実際にニュートリノかの振動したかどうかの検証を行っている。T2K実験では2012年にθ13がほぼ有意に0以上である事を、また今年2013年には非常に良い精度で測定されたθ23およびΔm^2_<23>の結果について発表を行った。次のステップとして、レプトンセクターでCP保存が破れているかの検証およびθ23のさらなる精密測定が課題とされている。そのためには反ミューオンニュートリノを用いたニュートリノ振動の測定が必要と考えられている。私はこの反ミューオンニュートリノの生成量を検証するためにCT(Current monitor)を用意し炭素標的下流118mに設置準備を進めた。このモニターにより反ニュートリノと共に生成された反ミューオンの量を測定できる事が期待されている。さらに予測精度向上のためのニュートリノフラックスの研究も行い、Super-Kにおけるフラックス不定性を10%程度に抑える事ができたがミューオンフラックスについてはまだ改善の余地がある。また今年度はニュートリノ反応のモデルの向上を目的として、ニュートリノの鉄との荷電カレント反応断面積測定を始めた。これは前置検出器に近い位置に設置した主に鉄及び炭素で構成された検出器、INGRIDを用い、そこでのニュートリノ事象を測定する、という手法を用いている。いまだ測られていないエネルギー領域におけるニュートリノ反応断面積を測定する事で、これまで考えられてきたモデルの大きな手助けになり、ニュートリノ物理そのものの理解を深める事ができると期待されている。それだけでなく、この測定手法に用いられているトポロジーを使う事で、現在のニュートリノ振動の解析の向上に向けた取り組みも行っている。これにより現在のニュートリノ振動解析だけでなく、反ニュートリノ振動解析のより精密な測定を行える可能性がある。

このモニターにより反ニュートリノと共に生成された反ミューオンの量を測定が出来る事が期待され、その結果として、反ニュートリノの生成を確認する事ができる。現在T2K実験で測定されている振動パラメータの不定性の原因としてニュートリノ反応モデルの不定性によるものが大きい。この不定性は反ニュートリノの測定においても大きな影響を与えると考えられている。私はCTのR&Dと平行して、前置検出器に近い位置に設置した主に鉄及び炭素で構成された検出器「INGRID」を用い、未だ測られていないエネルギー領域におけるニュートリノ反応断面積の測定を行った。この解析による結果、測定値は現在のニュートリノ反応モデルと矛盾しない事が分かった。反ニュートリノ生成研究のためのCTの準備もほとんど終わっていて、後はインストール検出器からの信号を確認するのみである。一方T2K実験では振動パラメータθ13を有意に0以上である事を確かめるため高統計量を必要としており、ニュートリノモードの測定を最優先にしている。したがって反ニュートリノモードのテスト実験はまだ先になる予定であり、当初の予定よりやや遅れをとっている。T2K実験では現在ニュートリノモードを用いたデータ取得を起こっているが、この夏から始まる加速器のシャットダウンに伴い、一時実験を中断する。その前にCTを設置し、反ミューオンではなく、まずはミューオンによる信号を取得し、データ解析を行う予定である。また、モンテカルロを用いたニュートリノ・ミューオンフラックスについて、色々と改善の余地がある事が分かっており、このスタディも進めていく予定である。また、平行して現在解析中であるニュートリノ反応断面積の研究も進め、今年度中に結果を出す予定である。(抄録なし)
ニアフィールドフォトニクス-ナノ空間に局在したフォトンの科学と工学-

本研究では、Heisenbergの不確定性原理あるいは光の波動的性質である回折限界によって決まるべき光の空間的拡がりをはるかに乗り越えて、ナノメーター・オーダーの空間領域にフォトンを局在化させることのできる物理と、ナノ空間での物質とフォトンの相互作用の科学、そして、相互作用がもたらすエンジニアリング的アプリケーションを展開する研究プロジェクトを、我が国において、緊急に準備推進することを目的としてきた。このような目的で、1.ナノメーターサイズの微粒子間の、近距離電磁相互作用の計測法に関する調査2.原子スケールおよびメゾスコピックスケールの粒子間の、光学的ニアフィールドにおけるフォトンの力学的作用の解析・実験・応用研究に関する調査3.エバネッセントフォトンによって誘起される光化学について、物質内電子とフォトン間のエネルギー・トランスファーや物質・光共鳴現象などの基礎原理と、それらの原理に基づいた光記録、光加工などへの応用技術に関する調査を進めたきた。またシンポジウムを開催し、これらの調査結果を互いに情報交換した。
多重解像度ピークを用いた心電図波形の解析と圧縮に関する研究

本研究では、ウェーブレット極大値表現による心電図圧縮・解析法を提案した。対称な平滑化関数の2次導関数を基本ウェーブレット関数に用いたウェーブレット極大値表現では、波形の変曲点でウェーブレット極大値が発生することから、波形のピークの性質を記述することができ、これを特にマルチスケールピーク解析と定義した。マルチスケールピーク解析では、心電図波形のP波からT波の5つの波形の開始点、ピーク点、終了点でウェーブレット極大値が発生する。この性質より心電図の各波の分類を行うアルゴリズムを提案した。また、凸射影復元法を適用することで、高精度の原信号復元を行うことが可能であることを示し、復元加速法について考察した。その結果、約30回程度の射影で診断に十分な精度で波形復元が行えることを確認した。提案した心電図波形の表現法は、特異点解析能力と原波形復元が可能であることから、区分点の検出と心電図のデータ圧縮を同時に行うアルゴリズムを提案することができた。本研究で提案した圧縮方式をMIT-BIH心電図データベースに適用した結果、正常な心電図データに対して、PRD8%程度の精度で1/12の圧縮率、また異常心電図に対しては平均してPRD9%程度の精度で1/10から1/14程度の圧縮率を実現した。また、専門医との検討により提案した心電図圧縮法で圧縮・復元された心電図は不整脈検出に十分利用可能であり、診断に不要な雑音を除去し、診断に有為な情報は保存する性質を持つことを確認した。
ハイブリッド伝導帯を有する協奏電子機能材料の創製

本研究課題では、伝導帯の底部でs軌道とd軌道あるいはs軌道とf軌道の各軌道のエネルギーが近接し、それらがハイブリッドしたバンドを形成する物質を設計、合成し、エネルギーバンドの解明と伝導性の付与および強磁場下における伝導性の測定を通して、新規な特性を有する酸化物電子伝導体の開拓を目指した。その成果として、パイロクロア型Sn_2M^V_2O_7(M^V:Nb,Ta)の低温酸化により、Sn^<IV>とM^Vが規則配列しSn5s軌道とNb 4d軌道、Sn 5s軌道とTa 5d軌道のエネルギーが近接した準安定な新しい複合酸化物SnMO_<4+x>の合成に成功した。それら新規な複合酸化物の結晶構造を明らかにし、相変化メカニズムを提案した。SnTaO_<4+x>とSn 5s軌道とCe 4f軌道がハイブリッドしたCeSnO_4では、水素雰囲気中での熱処理により酸素空孔を生成し、それによる電子ドープに成功し、ハイブリッド伝導帯を有する電子伝導性酸化物を得ることができた。磁場との相互作用による新規な特性の発現を期待し、これらSnTaO_<4+x>とCeSnO_4の7Tの磁場下での伝導性を研究したが、残念ながら特異な性質を見出すには至らなかった。これは、伝導帯での各軌道のハイブリッドがそれほど強くないことに起因するものと推察された。一方、蛍石型構造のSnTaO_<4+x>を還元すると670Kから酸素を放出しパイロクロア型酸化物へと相変化すること、同じ組成であってもα-PbO_2構造のSnTaO_<4+x>では相変化がより高温の820Kから起こることが示され、本研究により合成方法が確立された新物質が、その化学的性質においてユニークな振舞いを示すことが明らかとなった。計画に挙げた候補物質のうち、本年度はs^Oおよびd^O電子配置の陽イオンからなるSnNbO_<4.5>とSnTaO_<4.5>、s^Oぉよびf^O電子配置の陽イオンからなるCeSnO_4について重点的に検討を行った。いずれの物質も研究代表者らが開発してきた、パイロクロア型酸化物を前駆体とした前駆体酸化法により作製した。前駆体Sn_2Ta_2O_7を酸素中400°Cで5時間酸化することにより蛍石関連構造のSnTaO_<4.5>が得られた。蛍石関連構造のSnTaO_<4.5>を酸素中700°Cで5時間アニールすることにより、α-PbO_2関連構造のSnTaO_<4.5>を合成することができた。SnTaO_<4.5>は既に報告済みのSnNbO_<4.5>に比べ短時間で合成できた。CeSnO_4の前駆体であるCe_2Sn_2O_7は、SnO、SnO_2、CeO_2の混合物を白金坩堝に入れ、それを石英ガラス管に10^<-6>Torrで真空封入し、1000°Cで焼成することにより作製できた。得られたCe_2Sn_2O_7を、酸素中400°Cで3時間酸化し、目的のCeSnO_4を得た。それらの試料の電気伝導性を可視域から近赤外域の光吸収スペクトルにより予備的に評価した。蛍石関連構造とα-PbO_2関連構造のSnNbO_<4.5>

とSnTaO_<4.5>および蛍石関連構造のCeSnO_4のいずれも、2000nm以上の長波長域で、伝導電子のプラズマ振動による吸収が観測された。これより、いずれの試料も僅かでは有るが、作製時にすでに伝導電子が注入されていることが示された。各試料の電子構造を検討するにあたって、それらの結晶構造の詳細を調べた。SnNbO_<4.5>は結晶性が悪く、構造解析に耐えなかった。蛍石関連構造のSnTaO_<4.5>についてRietveld法による解析を試みた結果、κ-CeZrO_4と同型の構造であることが示された。昨年度の検討から合成条件が確立された上記3物質について、光吸収スペクトルを測定し、それらのエネルギーバンドギャップ近傍の電子構造の解明を試みた。その結果、SnNbO_<4.5>、SnTaO_<4.5>は伝導帯底部が主にSn5s軌道から構成されると推察された。CeSnO_4は、僅かな酸素空孔を導入すると、Ce^<3+>が生成することが明らかとなり、電子伝導はCe4f軌道のホッピング伝導により起こると推察された。SnTaO_<4.5>、CeSnO_4について、微量酸素分析装置を用いて酸素空孔を導入することにより、キャリア電子の注入を試みた。その結果、SnTaO_<4.5>、CeSnO_4のそれぞれで、室温大気雰囲気下で7×10-7Scm-1、4×10-7Scm^<-1>の伝導性を得ることに成功した。超伝導磁石を用いて7Tの磁場下で電気伝導度を測定したが、室温では伝導度の露な磁場依存性は観測されなかった。試料の伝導度が小さかったため、低温での測定はできなかった。(2)CdTiO_3、ZnTiO_3の合成と酸素空孔の導入による電子ドーピング混合伝導帯を有する酸化物の母物質であるs^0およびd^0電子配置の陽イオンからなるイルメナイト型CdTiO_3,ZnTiO_3を通常の固相反応法で合成した。得られた試料をZrO_2酸素ポンプを内蔵した微量酸素分析装置内で、低酸素分圧下で熱処理することにより、酸素欠陥を導入しキャリア電子のドーピングを試みた。現状では、低酸素分圧下で熱処理すると、CdやZnが揮発し、第2相としてTiO_2が析出し、キャリア電子のドーピングには成功していない。イルメナイト型のCdTiO_3、ZnTiO_3の電子構造をエネルギーバンド計算により評価した。結果については現在解析中である。本年度は、(1)協奏電子機能材料の候補物質のエネルギーバンド計算、(2)CdTiO_3、ZnTiO_3へのNbドーピングを試みた。(1)については、SnNbO_<4.5>とSnTaO_<4.5>の計算可能なモデル構造の構築を試みたが、妥当なモデルを得るに至らなかった。(2)については、3at%のNbをドープしたZn(Ti_<0.97>Nb_<0.03>)O_3の作製に成功したが、電気伝導度は10^<-9>Scm^<-1>未満と小さく、キャリア電子を注入するには至らなかった。そこで、昨年度までの検討で、電子ドープに成功しているCeSnO_4について、交流電場を印加した状態での蛍光スペクトルの測定を試みたが、特異な現象を観測することはできなかった。本研究では電子伝導を特徴付ける伝導帯が、移動度の大きな陽イオンのs軌道と、キャリアを多量に注入できる陽イオンのd軌道やf軌道とのハイブリッドにより形成される複合酸化物による、新しい機能の開拓を目指して行なってきた。その過程で、その候補物質である準安定な蛍石構造とa-PbO_2構造のSnTaO_<4.5>を見出し、それら準安定相の生成機構、結晶構造を解明することができた。さらに、蛍石関連構造のSnTaO_<4.5>が、還元雰囲気下では高い電気伝導性を(10^<-4>Scm^<-1>)を示すこと、250°C以上では素早く酸素を放出しパイロクロア相へと相変化することなどを見出した。
頭頸部癌幹細胞の生物学的活性亢進の機序の解明

頭頸部癌細胞の表面マーカーについて検討した。頭頸部癌細胞株5株(舌癌)全てにCD44rich細胞を多数認めた。しかしCD133rich細胞は1株にのみに同定された。手術切除2試料(舌癌)ではCD44rich細胞が多い試料と少ない試料に別れた。次に手術切除4試料(声門上癌2、下咽頭癌1、舌癌1)でCD44vとALDH1A1について検討した。2試料にCD44vrich細胞を多く認めた。ALDH1A1rich細胞はいずれの試料にも一定の割合で認めた。以上より頭頸部癌幹細胞の表面マーカーとしてはCD44、CD44v、ALDH1A1が候補としてあげられると考えられた。頭頸部癌幹細胞の分離と同定が本年度の目標であった。頭頸部癌幹細胞は未だ道程はできていない。そのため何を頭頸部癌幹細胞の表面マーカーにすれば良いかはわかっていない。現時点では、他の癌種と同様にCD44, CD133を頭頸部癌幹細胞の表面マーカーに設定し検討をおこなうことが適切ではないかと思われる。このCD44, CD133の占める割合は、各試料で異なる。この差は、試料を採取した個々の症例で異なる特異的なものなのか、ただ単に採取した部位で異なるものなのかは不明である。頭頸部癌幹細胞がおかれている微小環境が癌幹細胞にどのように影響を与えるかは、今後の研究課題として予定をしている。その研究において、これらの点はある程度明らかにすることができると思われる。本研究は手術標本からいかに効率良くかつ確実に癌細胞を分離して、フローサイトメトリーでスキャンできるかがキーとなっている。本年度はその最適条件を検討することに時間をかなり費やした。未だ最適条件を見出した状態ではないが、種々の条件を整えており、間も無く最適条件を設定できる見込みである。CD44+CD133+細胞は頭頸部癌幹細胞様の生物学的活性を示すものと考えている。今年度は手術切除標本より検体を採取し、CD44+CD133+癌細胞を分離し、その細胞の生物学的活性を確認する予定であった。しかしながら、CD44及びCD133の表面マーカーにより細胞をフローサイトメトリーで分離した再現性が低い現実がある。理由はいずれも細胞数が少なく、再現性の担保がされにくいためである。そのため癌細胞株を用いてCD44+CD133+、CD44+CD133-、CD44-CD133+、CD44-CD133-の細胞分離条件を検討しフローサイトメトリーでの分離を行っている。癌細胞株での分離を継続して行っているが、再現性のある安定した分離の条件設定に予想以上に苦労している。invasion chamberを用いた浸潤能の検討及びマウス尾静脈より癌細胞を注入する転移能の検討の手技は過去の研究において確率はされているので、癌細胞の分離条件が確立されたならば、短期間で予定された研究を進めることができると考えている。手術切除標本検体は10検体を収集できている。フローサイトメトリーを用いての研究と並行し、CD44+CD133+癌細胞の局在を免疫組織化学染色で検討中である。現在頭頸部癌幹細胞の表面マーカーをCD44とCD133と想定しフローサイトメトリーでの分離を行っている。実際の手術切除標本を用いてのCD44+CD133+癌細胞の分離作業前に、癌細胞株を用いて分離条件の設定を行っているが、いずれも細胞数が少なく、再現性にかける状況が続いている。再現性のある安定した分離の条件設定に予想以上に苦労している。頭頸部癌幹細胞の表面マーカーをCD44+CD133+と仮定し研究を開始した。CD44+CD133+を細胞表面マーカーとしたのは過去の報告を参考にして決定した。過去の報告では頭頸部癌細胞株を用いて研究報告がされていた。そのため当科で保有する頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いてフローサイトメトリーで細胞分離を行なった。ところが当科で保有する7癌細胞株の細胞はCD44+だがCD133ーであった。細胞株として樹立された癌細胞は一定の培養条件に増殖が可能な一様の癌細胞であり多様性にかけるため癌幹細胞としての生物学的特徴を失ったものではないかと推測した。培養条件などを変更した場合にはこれらの癌細胞が癌幹細胞としての生物学的活性を再獲得する可能性があるが、その探求は別の研究で行う方針とした。次に実際の患者さんの手術標本より試料を採取し検討を行なった。この研究は自治医科大学附属病院臨床研究第臨A14-094及び第臨A14-210として認可を受けて行なった。手術標本の癌組織をフローサイトメトリーで細胞分離を行なった。まず2試料(舌癌)ではCD44+CD133ー、1試料(咽頭癌)ではCD44+CD133+細胞がごく少数認められるのみであった。当初想定したCD44+CD133+細胞の回収が悪かった。このまま継続した場合には研究成果が得られないと判断し、癌幹細胞の表面マーカーを変えることとした。他の論文を参考にCD44v+ALDH1A1+を癌幹細胞の表面マーカーと想定し、7試料(舌癌、咽頭癌)にフローサイトメトリーで細胞分離を行なった。