hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ相分離構造を有するイオン機能性材料の構築

有機塩の中には常温において溶融状態で存在するものが存在し、そのような塩をイオン液体と言う。イオン液体は、難揮発性・難燃性・高イオン伝導性といった優れた特徴を有しており、次世代電池電解質などへの応用が期待されている。イミダゾリウム塩・アンモニウム塩などがイオン液体を形成する代表的な有機塩である。これらの有機塩を適切に分子修飾することで、様々な液晶性イオン液体が報告されている。これらの液晶性イオン液体は、分子の集合構造に由来したイオン伝導挙動を示す新しい材料となることが報告されてきた。本研究では、様々な液晶性イオン液体の中でも、双連続キュービック相を発現する液晶性イオン液体に着目した。双連続キュービック相は三次元的なチャンネル構造を有する液晶相であり、そのチャンネルの機能化は非常に興味深い。重合性骨格を導入した双連続キュービック液晶を開発し、液晶状態で光重合をおこなうことで、3次元的なイオン性ナノチャンネルを有するポリマーフィルムをえることができた。このポリマーフィルムについてイオン伝導度の測定を行ったところ、三次元的なチャンネルは良好なイオン伝導パスとして機能することが明らかとなった。今後、このナノチャンネルを有するポリマー材料は次世代の分離膜材料などへの応用が期待される。イオン液体は、不揮発性・不燃性・高イオン伝導性といった特徴を有することから、次世代機能性材料として非常に注目を集めている。このイオン液体に液晶性を付与し、ナノ秩序構造を付与することで新たな機能の発現が期待できる。例えば、カラムナー液晶性を付与することで、カラム軸方向にのみ効率よくイオンを伝導する液晶性イオン液体の開発などが達成されている。本研究では、双連続キュービック相を発現するような液晶性イオン液体の開発を目指した。双連続キュービック相とは三次元的なナノチャンネル構造を有する液晶相であり、近年、ナノチャンネル材料として非常に注目を集めている液晶相の一つである。具体的には、疎水的な長鎖アルキル鎖および親水的なイオン性の骨格を有する種々の両親媒性分子を設計・合成し、それらの液晶性・分子の集合構造を調べた。液晶性は、偏光顕微鏡観察・示差走査型熱量測定・X線回折測定などを用いて行った。これらの結果をもとに、双連続キュービック液晶の開発に成功したことが実証できた。また、液晶性を比較することで、双連続キュービック相を発現するような分子デザインの指針を得ることができた。分子の集合構造についても考察した。分子内のイオン部位と疎水的なアルキル鎖がナノ相分離を引き起こし、イオン部位が三次元的なチャンネル状に組織化すると考えられる。双連続キュービック相を発現する化合物についてイオン伝導度の測定を行った。イオン伝導度の測定により、チャンネル内部でのイオンの動き易さを評価することができる。双連続キュービック構造におけるイオンチャンネルは良好なイオン伝導パスとして機能することがわかった。今後、実際にリチウム電池の電解質への応用を検討していく予定である。また、ナノサイズの均一なチャンネルという特徴を活かして、物質分離などの材料への応用も検討していく予定である。常温において溶融状態で存在する有機塩をイオン液体と言い、難揮発性・難燃性・高イオン伝導性といった優れた特徴から次世代電池電解質などへの研究が盛んに行われている。これらの有機塩分子に液晶性を付与することで、自己組織的にナノスケールのイオン性チャンネルを形成する材料の開発が行われており、異方的なイオン伝導パスとして機能することなどが報告されている。本研究では、チャンネル構造を有する液晶相のなかでも双連続キュービック相に着目した。特に、重合性のイオン性液晶性分子を開発し、液晶状態で重合することで三次元的なイオンチャンネルを有するイオン伝導性ポリマーの開発を目指した。様々なイオン性分子を合成したところ、双連続キュービック相を発現する重合性分子を得ること成功した。相の同定には偏光顕微鏡観察・示差走査熱量測定・X線回折測定により行った。光重合開始剤を添加したサンプルについて液晶状態において光照射を行ったところ自立性のあるポリマーフィルムを得ることに成功した。このポリマーフィルムについてX線回折測定を行ったところ、三次元的なイオンチャンネル構造を維持していることが明らかとなった。今後、これらのポリマーフィルムについてイオン伝導度の測定を行うことで固体電解質としての評価を行う予定である。

このポリマーフィルムについてイオン伝導度の測定を行ったところ、三次元的なチャンネルは良好なイオン伝導パスとして機能することが明らかとなった。今後、このナノチャンネルを有するポリマー材料は次世代の分離膜材料などへの応用が期待される。
海馬・扁桃体による環境・場所・時間変化の認知機構

生活圏内の地図の記憶や時間の認知に関与する神経機構を調べる目的で、サルを特殊駆動装置に乗せて、周囲の環境条件やサルの位置を変化させたとき(研究1)、サルに種々の視覚や聴覚刺激を様々な方向から呈示したとき(研究2)、サルにオペラント行動を行わせ、生物学的意味を有する種々の物体(既知の報酬性物体や嫌悪性物体あるいは未知の物体)を呈示したとき(研究3)の海馬体ニュ-ロンの応答性を系統的に解析した。1.研究1、2より、サルの海馬体には、(1)サルが特定の場所にいるときに応答し、時間とともに変化する自己の位置の認知に関与するニュ-ロン群、(2)呈示刺激に対して自己中心的空間または外界対象中心的空間に依存した応答性を示し、それぞれ、内空間または外空間の認知・記憶に関与するニュ-ロン群、(3)サルが特定の場所にいるときだけ呈示刺激に対して自己中心的空間や外界対象中心的空間に依存した応答性を示すことから、上記の(1)および(2)のニュ-ロン群からの入力を受け、空間情報の統合的な処理に関与するニュ-ロン群の存在を明らかにできた。2.研究3より、サルの海馬体には、(1)既知の報酬性物体または嫌悪性物体に強く応答し、物体のもつ意味を逆転または消去してもその応答性が変化せず維持されることから、過去に経験した物体のもつ意味の記憶保持に関与するニュ-ロン群、(2)ある特定の物体にだけに強く応答し、その物体の認知・記憶に関与するニュ-ロン群、(3)未知の新奇な物体に強く応答し、その物体の連続呈示に対して応答性の減弱(慣れ)を生じることから、物体の再認に関与すると考えられるニュ-ロン群が存在することを明らかにできた。以上から、生活圏内の地図や物体の認知・記憶への海馬体の重要性をニュ-ロンレベルで明らかにできた。海馬と扁桃体による地図、時間と場所に結びついた環境の変化と意味の学習や記憶および認知とそれに基づく適応行動の中枢機構をニューロンレベルで調べる目的で、サルの自己運転またはコンピュータ制御による特殊駆動装置および特殊脳固定装置を開発し作製した。開発したマイコン制御方式の特殊駆動装置はサルの自己運転または検者の操作により前後、左右など任意の方向に進行させることができ、内部には環境条件設定装置(外部がすべてハーフミラーで、シャッターおよびレバーを備え明暗、環境温および背景音を自由に制御できる)および慢性実験用脳固定装置を設置した。また開発したソフトウェアは、1)動物に左、前および右のレバーを押して特殊駆動装置を左、前および右に進行させ、一定時間後にある距離移動したときに報酬を獲得し、次に別のレバーを押して進行方向を変える課題を学習させる;2)動物のレバー押しに対応して、特殊駆動装置を進行させるとともに環境条件(例、極端な明または騒音環境)を変化させ、一定時間後にある距離移動したときに報酬を獲得し、次に別のレバーを押して進行方向を変え、自分に最適の環境条件に調節する課題を学習させることなどに用いた。このような特殊駆動装置はこれまでにまったく例がなく、ハードウェアとソフトウェアの開発に相当の時間を要したが、主にサルを用いて動物実験にも着手した。しかし、サルにとって種々の学習課題取得が比較的困難であり、ニューロン活動を記録し、応答様式を解析するまでには至らなかった。今後、本開発装置を用い、海馬と扁桃体による居場所と時間の変化、環境条件と時間の変化、居場所、環境および時間の変化と意味の学習や記憶および認知とそれに対する適応行動の中枢機構をニューロンレベルで本格的に解析する。これらの結果に基づき海馬と扁桃体による環境、場所および時間変化の学習・記憶と認知の中枢機構解明の糸口が得られる。

今年度は、生活圏内の地図の記憶や時間の認知に関与する神経機構を調べる目的で、サルを特殊駆動装置に乗せて、周囲の環境条件やサルの位置を変化させたとき(研究1)、サルに種々の視覚や聴覚刺激を様々な方向から呈示したとき(研究2)、サルにオペラント行動を行わせ、生物学的意味を有する種々の物体(既知の報酬性物体や嫌悪性物体あるいは未知の物体)を呈示したとき(研究3)の海馬体ニュ-ロンの応答性を系統的に解析した。1.研究1、2より、サルの海馬体には、(1)サルが特定の場所にいるときに応答し、時間とともに変化する自己の位置の認知に関与するニュ-ロン群、(2)呈示刺激に対して自己中心的空間または外界対象中心的空間に依存した応答性を示し、それぞれ、内空間または外空間の認知・記憶に関与するニュ-ロン群、(3)サルが特定の場所にいるときだけ呈示刺激に対して自己中心的空間や外界対象中心的空間に依存した応答性を示すことから、上記の(1)および(2)のニュ-ロン群からの入力を受け、空間情報の統合的な処理に関与するニュ-ロン群の存在を明らかにできた。2.研究3より、サルの海馬体には、(1)既知の報酬性物体または嫌悪性物体に強く応答し、物体のもつ意味を逆転または消去してもその応答性が変化せず維持されることから、過去に経験した物体のもつ意味の記憶保持に関与するニュ-ロン群、(2)ある特定の物体にだけに強く応答し、その物体の認知・記憶に関与するニュ-ロン群、(3)未知の新奇な物体に強く応答し、その物体の連続呈示に対して応答性の減弱(慣れ)を生じることから、物体の再認に関与すると考えられるニュ-ロン群が存在することを明らかにできた。以上から、生活圏内の地図や物体の認知・記憶への海馬体の重要性をニュ-ロンレベルで明らかにできた。
リボザイムからRNA‐蛋白質複合体への進化プロセスのモデル化

機能性生体高分子の分子進化の初期過程で生じたと考えられるRNAから蛋白質因子への機能移譲を4つの素過程にモデル化し、そのモデル分子を実際に構築することを目指した。H15年度に前半の2過程のモデル化に成功したため、H16年度は後半の2過程のモデル化を試みた。その結果、第3過程となる「進化中間体2」のモデル分子の構築に成功した。構築されたモデル分子においては期待されたように、RNA成分でもある程度の機能を保ちつつ、蛋白質因子の付加によって、さらに2倍の活性の向上がみられた。このことは、進化の中間状態における、RNAと蛋白質因子が同程度の寄与で等価な機能を重複してになっていたとする仮説に合致する。さらにこの「進化中間体2」のモデル化の成功に続き、進化の最終過程である、RNA-蛋白質複合体のモデル化にも成功した。「進化中間体2」から変異によってRNA因子の寄与を取り去った結果、そのRNAは単独ではほとんど活性を保持できないことが明らかとなった。この単独では活性を持たないRNAに対して、蛋白質因子を加えた場合、両者がRNA-蛋白質複合体を形成し、活性を回復することが明らかとなった。またこのRNA-蛋白質複合体の活性は、もとのRNA酵素の活性とほぼ同等であることも示された。以上の2年間の研究において、RNAから蛋白質因子への機能移譲を4つの素過程のすべてのモデル化に成功した。さらに、こうした機能委譲が、実際の生体内で起こり得るのかを検討するため、これらの分子種を大腸菌内で発現させ、その機能発現が大腸菌の増殖速度でモニターできる系を構築した。現在その系を用いて、連続的な機能の移譲の実験的検証を試みている。上記の研究課題遂行のため、RNAから蛋白質因子への機能移譲の過程を、素過程に分類してモデル化した。今年度は進化中間体1、および進化中間体2の分子設計を行い、それらデザインした分子種のRNA成分を試験管内合成によって合成した。これらの進化中間体RNAモデルはそれら自身が蛋白質因子の非存在下でも高い、あるいは中程度の触媒活性を示した。このことは、RNAから蛋白質因子への機能移譲が段階的に生じ、RNA成分の機能が段階的に低減していったとするモデルとよく合致する。次にこれら進化中間体と相互作用する蛋白質因子の分子設計を行い、それらデザインされた蛋白質を大腸菌の大量発現系とintein tag法により発現、単離、単一に精製する手法を確立した。ついでこれらの蛋白因子のRNA成分の触媒活性に与える影響を、RNA成分の活性を蛋白因子の存在下、非存在下で測定し、検討した。その結果、進化中間体1については蛋白因子の添加による活性変化はみられなかったのに対し、進化中間体2は蛋白質因子の存在下で活性が大きく上昇することを見出した。この結果は、RNAから蛋白質因子への機能移譲のモデル過程の予想と矛盾しない。従って、今年度の実験より、RNAから蛋白質因子への機能移譲の過程のうち、前半部分についてモデルを実証する実験系を構築できたことになる。それにつづいて現在は、進化中間体2に続く、最終的なRNA-蛋白質複合体、すなわち蛋白質因子を必須の補助因子として必要とするRNA成分のモデル化を行っている。
日本前近代の史料と体系的な語彙の翻訳に関する研究

「古記録」(漢文日記)は、貴族が政務を中心として詳細に記したものとして、日本史学の主要な史料である,しかし、読解には基礎知識と習熟が必要であり、まとまった英訳はないに等しかった。本研究では、古記録の英訳に関して、吉田が主導しラフィン助教授が協力者となった先行する2つのプロジェクトの成果を基礎として発展させる事を目指した。それは『貞信公記』の一年間の記事の全文英訳プロジェクトおよび、「古記録の全文翻訳と歴史用語の体系的・整合的な訳語の決定に関する研究」、すなわち制度・官職・組織などの歴史用語の適切かつ体系的な訳語の研究、とくに官職等の対訳語の研究である。研究の開始として、2009年夏にアメリカ南カリフォルニア大学において開催され、吉田を講師としラフィン助教授が参加した「古記録」読解ワークショップに関して、そのテキストで院政期の重要な史料である右大臣藤原宗忠の日記『中右記』について予備研究を行った。両名はワークショップの際に立ち上げられた英訳のためのプロジニクトに参加し、主催者ジョーン・ピジョー教授ととともに、予定刊行物の共同編集者となった。今年度は作成された『中右記』の英訳草稿をもとに、出版のために必要な英訳の厳密化・補注の作成などを行なうとともに、先行研究により収集した官職等の対訳語を基礎に体系的な訳語の選定を行い、10年6月のプロジェクト会合に両名で参加して、英訳本文を確定することができた。引き続き補注に対しての確定化の作業を続け、体系的な訳語の選定にも成果が得られた。またラフィン助教授は、セミナー「東アジア古典学のために-実践的進化をめざして」において、研究の成果の一端を発表した。「古記録」(漢文日記)は、貴族が政務を中心として詳細に記したものとして、日本史学の主要な史料である。しかし読解には基礎知識と習熟が必要であり、まとまった英訳はないに等しかった。研究の開始として、2009年夏にアメリカ南カリフォルニア大学において開催され、吉田を講師としラフィン助教授が参加した「古記録」読解ワークショップに関して、そのテキストで院政期の重要な史料である右大臣藤原宗忠の日記『中右記』について、英訳のための予備研究を行った。成果は直ちにワークショップにおいて生かされ、終了後は引き続き主催者ジョーン・ピジョー教授と協力し、作成された『中右記』の英訳草稿をもとに、出版のために必要な英訳の厳密化・補注の作成などを行なうとともに、先行研究により収集した官職等の対訳語を基礎に体系的な訳語の選定を試みた。ただ09年12月に予定されていたプロジェクト会合がピジョー教授の都合により10年6月に延期されたため、計画完了日を10年9月末に変更し、6月の会合に両名で参加して、当初の計画で予定した優れた英訳をほぼ得ることができ、体系的な訳語の選定にも有効な知見が得られた。またラフィン助教授は、10年3月パリで開催されたシンポジウム「源氏物語と女流日記文学」において、研究の成果の一端を発表した。
メモリ素子を用いたナノ信号処理システムの検出性能向上に関する研究

メモリ素子は,近年になって,その作製が可能になった新デバイスである。メモリ素子は,素子の過去の状態を記憶する機能を持つ。これまでに,アナログ計算機の一例として,メムリスタを用いた最短経路の探索回路が報告されている。今回,メムリスタネットワークを用いて最短経路を探索することで,音声や画像などのパターン認識において使用されるダイナミックワイムワーピングアルゴリズムの類似度を計算する手法を提案する。3bitのテストデータを用いて提案回路の動作を検証し,その結果,提案回路はパターンの認識が可能であることを確認した。本研究は,メモリ素子(メモリスタ,メムキャパシタ,メムインダクタ)に適度な「ゆらぎ」を加えることでセンサの応答を改善し,低SNR環境における信号検出性能の向上を目的とする。そのための基礎検討として,当該年度の目標をメモリ素子の特性の把握とする。メモリ素子として,多層薄膜を用いたメムキャパシタ【J. Martinez-Rincon etal.,Phys. Rev. B 81, 195430 (2010)】に着目し,その動作を解析した。メムキャパシタに交流信号とゆらぎとなる周期性信号を印加し,電圧-容量特性をシミュレーションした。周期性信号に応じてメムキャパシタの容量が増加した。以上より,メムキャパシタを用いることで,信号検出性能を向上できることを確認できた。また,メムキャパシタの物性とゆらぎの周波数が,信号増幅において重要なパラメータとなることを確認した。なお,既報では,メモリスタを用いた信号増幅効果が報告されている。今回得られた結果から,メモリスタ以外のメモリ素子でも,ゆらぎを用いた信号の増幅が可能であることが明らかになった。また,効果的な信号増幅を得るために,入力信号に応じ,ゆらぎの周波数やメモリ素子の物性など,パラメータを調節する必要があることがわかった。これらの結果は,複数のメモリ素子を組み合わせることで,任意の入力信号に対し,効果的な信号検出回路を実現できることを示唆している。今後,車載センサなど,より現実的な使用環境での入力信号について効果的な回路構成を提案し,その効果を検証する。H27年度の目標は,本研究の最終目標である「メモリ素子を用いた信号検出性能向上と,そのための最適な回路設計要件」に向けた,メモリ素子の基礎特性の把握である。以下に,その研究方法とその達成状況を示す。(a)メモリ素子の応答に周期性信号を加え,信号検出性能が向上することを確認する:メモリ素子として,多層薄膜を用いたメムキャパシタ【J. Martinez-Rincon etal.,Phys. Rev. B 81, 195430 (2010)】に着目し,その動作を解析した。これより,メムキャパシタにセンサの信号とゆらぎを加えその容量を観測することで,センサ信号の検出性能を向上できることを確認した。(b)メモリ素子の動作を把握し,応答に影響を与えるパラメータを明らかにする:上述のシミュレーションから,ゆらぎの周波数やメモリ素子の物性などが,効果的な信号増幅を得るための重要な設計要件であることがわかった。また,これらの要件は,入力信号の特性に応じて変化することもわかった。この結果は,入力信号に対し回路構成を調節する必要があることを示している。よって,メモリ素子を用いた信号検出性能向上のためには,実際の使用環境での入力信号の特性の把握と,それらに応じた回路構成の設計が必要であることが明らかになった。本研究は,メモリ素子(メムリスタ,メムキャパシタ,メムインダクタ)に適度な「ゆらぎ」を加えることでセンサの応答を改善し,低SNR環境における信号検出性能の向上を目的とする。今年度はメモリ素子の信号処理機能向上を目的として,メムリスタを用いたアナログ計算回路を検討した。実施項目を以下に示す。(1)適応LPソルバの開発:これまでにアナログ回路を用いたLP問題ソルバが提案されている。メムリスタは,入力値に応じて抵抗値が変化するため,入力信号を制御することでLP問題ソルバの回路トポロジを変更し,ひとつの回路で複数の問題に対応する回路を実現できると考えらえる。今回,1素子のメムリスタからなる簡易なLP問題ソルバ回路において,その動作を確認した。しかしながら,2素子以上の回路構成では,メムリスタの制御が困難になることがわかった。今後,制御手法の開発が求められる。(2)パターン認識回路の開発:ダイナミックワイムワーピング(Dynamic Time Warping, DTW)は,音声や画像などのパターン認識手法である。DTWは,動的計画法のアルゴリズムを用いて実現される。DTWは,時間軸を非線形に伸縮しながら,テストデータとリファレンスデータを照合することで,それらの類似度を計算する。ここでは,メムリスタネットワークを用いて最短経路を探索することでDTWアルゴリズムの類似度を計算する手法を提案し,その動作をシミュレーションにより確認した。例として,3bitのリファレンス,およびテストデータに対し,提案回路を用いてパターン認識を行い,その効果を確認した。

これまでに,アナログ計算機の一例として,メムリスタを用いた最短経路の探索回路が報告されている。今回,メムリスタネットワークを用いて最短経路を探索することで,音声や画像などのパターン認識において使用されるダイナミックワイムワーピングアルゴリズムの類似度を計算する手法を提案する。3bitのテストデータを用いて提案回路の動作を検証し,その結果,提案回路はパターンの認識が可能であることを確認した。H27年度は,回路設計要件に向けた課題の抽出を行った。H28年度は,抽出された課題に対する解決策と,最適な信号合成を達成可能な回路構成を提案する。具体的な実施項目を以下に示す。(a)メモリ素子の動作把握:これまでに動作を把握したメモリスタ,メムキャパシタ以外のメモリ素子について,その動作を把握する。これより,候補となるメモリ素子の選定し,最適な信号検出回路の構成を提案する上での基礎資料を得る。(b)実際の使用環境での入力信号特性の把握:H27年度の検討より,最適な信号検出を行うために,入力信号の特性を把握する必要があることが明らかになった。ここでは実システムとして車載センサを想定し,センサから出力される信号の特性を明らかにする。これより,メモリ素子の物性や信号検出回路の構成を提案する上での基礎資料を得る。(c)回路構成の設計:上述の検討項目より得られる,メモリ素子の特性とセンサからの出力信号特性を基に,信号検出回路を設計する。最適な信号検出を単一のメモリ素子で実現できない可能性があるため,複数のメモリ素子を組み合わせることで,任意の入力信号に対し効果的な信号検出回路を実現する。なお,申請時の計画では,設計の妥当性を確認するために信号処理回路の試作を予定していた。しかし,H27年度の結果から,当初予定しない実施項目(実際の使用環境での入力信号特性の把握)が生じたため,試作の実施を中止する。信号処理申請時の計画では,設計の妥当性を確認するために信号処理回路の試作を予定していた。しかし,H27年度の結果から申請時に予定しなかった実施項目(実際の使用環境での入力信号特性の把握)が生じ計画を修正した。計画の修正に伴い試作を中止したため,H27年度使用額を減額し,かわりにH28年度使用額を増額した。中止した試作に予定していた使用額を,申請時に予定しなかった実施項目(実際の使用環境での入力信号特性の把握)の費用に充当する。それ以外の使用計画について,申請時からの変更はない。
神経因性疼痛の成立および維持と脊髄グリア細胞-行動学的および免疫組織化学的研究

神経因性疼痛の成立および維持の機序と抗炎症薬および脊髄グリア細胞についての関係を探るべく、本研究では脊髄神経結紮により作成した神経因性疼痛モデルラットを用い、行動学的評価およびラット脊髄標本に対するGFAP免疫染色により示される脊髄アストロサイトの活性化反応を評価することで、神経因性疼痛の成立および維持における脊髄炎症性サイトカイン類や脊髄グリア細胞機能に影響する因子の関与および変動を探り、病的疼痛状態に関与するであろう脊髄グリア細胞の新たな機能について引き続き研究を行っている。薬剤投与法として全身投与のほか髄腔内持続投与法の技術を用いている。ステロイド性抗炎症薬およびCOX-2選択的阻害薬ともに、投与開始時期、投与経路および投与方法によっては全身投与より格段に少ない用量で鎮痛効果を発揮でき副作用発現を抑制できる点においても有用であること、神経因性疼痛の成立および維持に対し脊髄グリア細胞の活性化が関与していることを明らかにしているが、抗炎症薬と脊髄グリア活性化とのより具体的な応答関係は未知であり、これらを解明するためミクログリアの活性化反応を評価できるOX-42と炎症性サイトカインIL-1βの関与に新たなに注目し、OX-42免疫染色法、脊髄IL-1βに対する免疫染色法およびELISA法を用い、神経因性疼痛の成立および維持におけるこれらの関与と変動を探っている。データの収集後、研究成果を麻酔学関連の医学雑誌に投稿予定である。神経因性疼痛の成立および維持の機序と抗炎症薬および脊髄グリア細胞についての関係を探った研究は未だ少ない。本研究の目的は、神経因性疼痛の成立と維持の機序について検討し、臨床的な治療戦略の基礎データを得ることである。具体的には、脊髄神経結紮により作成した神経因性疼痛モデルラットを用い、行動学的評価およびラット脊髄標本に対するGFAP免疫染色により示される脊髄アストロサイトの活性化反応を評価することで、神経因性疼痛の成立および維持における脊髄炎症性サイトカイン類や脊髄グリア細胞機能に影響する因子の関与および変動を探り、病的疼痛状態に関与するであろう脊髄グリア細胞の新たな機能について引き続き研究を行っている。薬剤投与法として、全身投与のほか髄腔内へのカテーテル挿入留置およびミニ浸透圧ポンプを利用しての髄腔内持続投与法の技術を用いている点が独創的である。申請者はこれまで、ステロイド性抗炎症薬およびCOX-2選択的阻害薬ともに、投与開始時期,投与経路および投与方法によっては全身投与より格段に少ない用量で鎮痛効果を発揮でき副作用発現を抑制できる点においても有用であること、神経因性疼痛の成立および維持に対し脊髄グリア細胞の活性化が関与していることを明らかにしている。しかし、抗炎症薬と脊髄グリア活性化とのより具体的な応答関係は未だ解明できていない。これらを明らかとするため、本年度はミクログリアの活性化反応を評価できるOX-42と炎症性サイトカインIL-1βの関与に新たに注目し、OX-42免疫染色法、脊髄IL-1βに対する免疫染色法およびELISA法を用い、神経因性疼痛の成立および維持におけるこれらの関与と変動を探るべく研究を続けているところである。
ヒト型モノクローナル抗体による歯槽骨吸収抑制法の開発および治療への応用

今回,歯周組織局所における炎症性サイトカインの産生をコントロールすることで,歯槽骨吸収を防ぐ方法(ヒト型モノクローナル抗体を用いた病的骨吸収の予防法)の開発を行った.これまでの研究で,receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)は骨吸収を司る破骨細胞の分化誘導において必須なサイトカインであり,炎症性骨吸収において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている.そこで,まず,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の作成を目指した.リコンビナントRANKLをヒトリンパ球に体外免疫して,抗体を高生産する融合細胞株(融合パートナー細胞株)と融合させた.その後,抗体産生細胞のクローニングを行い,それぞれのクローンの抗体価をELISAで確認し,抗体産生能の高い複数のクローンを得た.さらに,抗体の特異性ををウエスタンブロットで確認した.次に,in vitroの培養系で,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の効果を調べたところ,RANKLの活性を抑制する抗体が得られた.そこで,その抗体をin vivoで応用するために,実験動物モデルを作成して,エレクトロポレーション法で抗体を局所投与する実験系の確立を試みた.しかし,これまでのin vivoおよびin vitroの研究では,骨吸収の抑制傾向はみられたものの,確実な効果を実証するまでには至らなかった.一方,今回の研究の過程で,この抗体投与によって,マウスの歯周組織の血流に変化が見られた.そこで,これを客観的に評価する方法として,舌血流測定装置一式を購入して機器の改良を行った.血流と歯槽骨吸収抑制に関して,きれいな相関は見られなかったものの,今後の研究につながる実験結果が得られた.今回,歯周組織局所における炎症性サイトカインの産生をコントロールすることで,歯槽骨吸収を防ぐ方法(ヒト型モノクローナル抗体を用いた病的骨吸収の予防法)の開発を行った.これまでの研究で,receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)は骨吸収を司る破骨細胞の分化誘導において必須なサイトカインであり,炎症性骨吸収において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている.そこで,まず,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の作成を目指した.リコンビナントRANKLをヒトリンパ球に体外免疫して,抗体を高生産する融合細胞株(融合パートナー細胞株)と融合させた.その後,抗体産生細胞のクローニングを行い,それぞれのクローンの抗体価をELISAで確認し,抗体産生能の高い複数のクローンを得た.さらに,抗体の特異性ををウエスタンブロットで確認した.次に,in vitroの培養系で,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の効果を調べたところ,RANKLの活性を抑制する抗体が得られた.そこで,その抗体をin vivoで応用するために,実験動物モデルを作成して,エレクトロポレーション法で抗体を局所投与する実験系の確立を試みた.しかし,これまでのin vivoおよびin vitroの研究では,骨吸収の抑制傾向はみられたものの,確実な効果を実証するまでには至らなかった.一方,今回の研究の過程で,この抗体投与によって,マウスの歯周組織の血流に変化が見られた.そこで,これを客観的に評価する方法として,舌血流測定装置一式を購入して機器の改良を行った.血流と歯槽骨吸収抑制に関して,きれいな相関は見られなかったものの,今後の研究につながる実験結果が得られた.歯科領域の2大疾患である齲蝕と歯周病の予防法の一つとして,マウス由来のモノクローナル抗体を用いた受動免疫法に関する研究が行なわれてきた.そのような背景を踏まえて,今回のプロジェクトでは,ヒト型モノクローナル抗体を歯科領域に応用することを主眼において行ってきた.一方,我々はこれまで蓄積してきた成果をもとに,歯周組織局所における炎症性サイトカインの産生をコントロールすることで歯槽骨吸収を防ぐ方法の開発を進めてきた.このような2つの研究の流れを重ね合わせて,今年度,ヒト型モノクローナル抗体を用いた病的骨吸収の予防法の開発に着手した.これまでの研究で,receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)は骨吸収を司る破骨細胞の分化誘導において必須なサイトカインであり,炎症性骨吸収において重要な役割を果たしていることが明らかとなっていることを考慮して,今回の研究プロジェクトでは,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の作成を目指した.まず,RANKLをヒトリンパ球に体外免疫して,その後,抗体を高生産する融合細胞株(融合パートナー細胞株)と融合させた.その後,抗体産生細胞のクローニングを行ない,これまでのところ,抗体産生能の高い複数のクローンを得ている.それぞれのクローンの抗体価をELISAで確認し,現在,抗体が特異的にRANKLを認識しているか否かをウエスタンプロットで確認しているところである.今年度の残された期間で,得られたヒト型モノクローナル抗体の効果をマウス骨髄培養法で検証する予定である.そこでの結果を踏まえて,次年度では,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の効果をさまざまな培養細胞で調べ,それと並行して,in vivoの実験系でもヒト型モノクローナル抗体の有効性を検証する予定である.今回のプロジェクトでは,ヒト型モノクローナル抗体を用いた病的骨吸収の予防法の開発に着手した.まず,破骨細胞の分化誘導過程で必須なサイトカインであるRANKLは炎症性骨吸収においても重要な役割を果たしているということを踏まえ,RANKLに対するヒト型モノクローナル抗体の作成を目指した.リコンビナントRANKLをヒトリンパ球に体外免疫して,その後,抗体を高生産する融合細胞株(融合パートナー細胞株)と融合させた後,抗体産生細胞のクローニングを行った.それぞれのクローンの抗体価をELISAで確認し,抗体産生能の高い複数のクローンを得ることができた.

さらに,抗体の特異性ををウエスタンブロットで確認した.次に,in vitroの培養系で,RAMKLに対するヒト型モノクローナル抗体の効果を調べたところ,RANKLの活性を抑制する抗体が得られた.そこで,その抗体をin vivoで応用するために,実験動物モデルを作成して,エレクトロポレーション法で抗体を局所投与する実験系の確立を試みた.その過程で,この抗体投与によって,マウスの歯周組織の血流に変化が見られた.そこで,これを客観的に評価する方法として,舌血流測定装置一式を購入し,器械の改良を行った.しかし,これまでのin vivoおよびin vitroの研究では骨吸収の抑制傾向はみられたものの,血流と歯槽骨吸収抑制との関連を明らかにするということでは,確実な効果を実証するまでには至らなかった.
三次元温度速度同時計測に関する基礎的研究

本研究は、流体中の速度と温度を三次元的に同時に計測することが可能な新たな計測手法を開発すべく、その基礎となる技術の可能性を探ることを目的とした。流体中の速度を三次元的に計測する方法としては。本研究者らが開発した三次元画像処理流速計(3-D PTV)という手法がある。この手法は、流体中に浮遊させた粒子の位置を複数台のカメラによって計測し、それらを時々刻々追跡することによって速度を計測するという手法で、すでにその計測原理及びその計測精度に対して十分な吟味がなされており、種々の流れ場の計測において大きな成果を上げている。一方、多点温度計測手法としては、レーザー励起蛍光法(LIF)という手法があり、レーザースリット光の当った断面内の二次元温度分布を計測することが可能である。しかし、流体中の温度を三次元的に計測する方法は未だに開発されておらず、流体中の熱輸送の詳細を解明するには、三次元的に速度と温度を同時に計測する手法の開発が待たれている。そこで本研究では、三次元画像処理流速計のトレーサー粒子に温度計測を可能とする機能を持たせることによって、三次元的に速度と温度を計測する可能性を模索した。種々の調査及び予備実験を行った結果、W-O-Wのエマルジェンによってトレーサー粒子を形成することによって、速度と温度を同時に計測することが可能性があることが分かった。この粒子は、球殻となる物質の配合を調整することによって速度測定に最適な比重を水と同じにすることが可能であるばかりでなく、内部の水溶液に感温物質を用いることによって温度計測も可能となると予想される。
低エネルギー太陽ニュートリノ検出装置のバックグラウンド評価と低減

本年度は、昨年度に引き続き中性子束の測定を中心に研究を進めた。これは低エネルギー太陽ニュートリノ観測に至るためには、そのプロトタイプ検出器を用い、その実現可能性を示すだけではなく、プロトタイプ検出器から物理学上の成果、ここでは暗黒物質探索についての結果を出すことが重要だと考えているためである。具体的に述べると10トン程度液体キセノンを用いる低エネルギー太陽ニュートリノ検出器のプロトタイプである800kg程度の暗黒物質探索実験においては、高速中性子は極めてシリアスなバックグラウンドになりうる。この暗黒物質探索は、本研究の目標へ至るマイルストーンであり、我々はこの前段階の検出器により太陽ニュートリノ検出器の実現可能性を示すことを予定している。この成功により、さらに太陽ニュートリノの観測に至る道筋を示せるので、極めて重要な研究内容となってきた。その800kg検出器で暗黒物質を捕らえるためには、高速中性子束を1.2x10^<-9>/cm2/s程度以下に抑えなくてはならない。これはすなわち、そのような小さな中性子束を検出する方法が必要とされることを意味する。このような高速中性子の検出には、液体シンチレータの波形弁別による高速中性子の同定と測定が用いられる。ただしγ線が飛びかう環境において高速中性子をこのような高い感度で測定しなくてはならない。必要とされる弁別能力は2x10^5に上る。そのため、手作りの液体シンチレータ(トルエン1.1リットル、POP5.6g, POPOP0.14g)を作成し、またバイクロンBC-501Aも用いた。これらを直径76mm,長さ240mmの容器に入れ、2つの3インチの光電子増倍管で測定した。波形弁別のために、波形を積分する時間の窓を0-500ns,0-50nsの二つとし、すべての信号についてこの2つの積分情報を同時に得た。さらにその比を取ることにより、γ線と高速中性子の弁別を行う。これらの比が1.12-1.17(手製シンチレータ)、1.16-1.36(BICRON)であるときに高速中性子とみなすことにすれば、効率45%(手製),90%.(BICRON)で高速中性子を捕らえられ、かつγ線との弁別能力は1.9x10^4(手製),1.4x10^4(BICRON)を達成することができた。この数字は目標には至っていないが、γ線の統計が足りないためである。上記比の分布を見た限りにおいては、ほぼ目標に達していると考えられる。また、ドイツで開催された国際会議「Beyond the Desert 2003」や、つくばで開催された国際会議「宇宙線国際会議2003」に参加・研究発表してきた。同時に低バックグラウンドを基礎にした世界中の様々な実験、研究の進捗状況の情報収集を行うことができた。本年度は、大深度地下である岐阜県神岡町神岡鉱山において環境中世子束を測定した。この実験の目的は、将来低エネルギー太陽ニュートリノの測定や暗黒物質探索を行う際、中性子束がそれらの測定のバックグラウンドになるため、その値を要求される感度で測定し、対策を立てる指針に役立ことにある。中性子束を測定する一つの方法は、ヘリウム3カウンターを使用して熱中性子を測定するものである。我々は直径5cm、長さ44cm、3気圧のカウンターを準備し、熱中性子の測定を行った。その結果、熱中性子束として(7.7+-0.6)x10-6/s/cm2を得た(誤差は統計誤差)。また、10cmの厚さのポリエチレンでカウンターを囲み、熱中性子以外の成分も測定を行った。その際、ポリエチレンの応答関数(A. Aroua et al., Nucl. Instr. Meth. a 321 (1992) 298)を使用し、中性子束スペクトルは1/E(Eは中性子の運動エネルギー)を仮定し、解析を行った。その結果、熱中性子以外の中世子束として、(1.1+-0.1)x10-5/s/cm2を得た(誤差は統計誤差)。これらの測定より、例えば液体キセノンによって低エネルギー太陽ニュートリノを観測する際には熱中性子を10万分の1程度、それ以外の成分を1万分の1程度に下げる必要がある。これはすなわち将来的にその感度で中性子束を測定する必要があることを意味する。そのような高感度の中性子カウンターとして、カナダのSNO実験で使用されているヘリウム3カウンターを入手することを検討している。彼らのカウンターは、知られているもののうち最もバックグラウンドレベルの低いものである。来年度はその一つを入手し、測定を行う予定である。さらに高速中性子に対しては、液体シンチレーターの開発を行っている。液体シンチレーターは、その発光波形を観測することにより、高速中性子を弁別することが可能である。また、液体シンチレーターは内部に含まれる自然放射能が極めて少なくできるので、このような測定にも向いている。本年度はプロトタイプを作成し、必要な感度の見積もりと実現可能性を検討している段階である本年度は、昨年度に引き続き中性子束の測定を中心に研究を進めた。

この暗黒物質探索は、本研究の目標へ至るマイルストーンであり、我々はこの前段階の検出器により太陽ニュートリノ検出器の実現可能性を示すことを予定している。この成功により、さらに太陽ニュートリノの観測に至る道筋を示せるので、極めて重要な研究内容となってきた。その800kg検出器で暗黒物質を捕らえるためには、高速中性子束を1.2x10^<-9>/cm2/s程度以下に抑えなくてはならない。これはすなわち、そのような小さな中性子束を検出する方法が必要とされることを意味する。このような高速中性子の検出には、液体シンチレータの波形弁別による高速中性子の同定と測定が用いられる。ただしγ線が飛びかう環境において高速中性子をこのような高い感度で測定しなくてはならない。必要とされる弁別能力は2x10^5に上る。そのため、手作りの液体シンチレータ(トルエン1.1リットル、POP5.6g, POPOP0.14g)を作成し、またバイクロンBC-501Aも用いた。これらを直径76mm,長さ240mmの容器に入れ、2つの3インチの光電子増倍管で測定した。波形弁別のために、波形を積分する時間の窓を0-500ns,0-50nsの二つとし、すべての信号についてこの2つの積分情報を同時に得た。さらにその比を取ることにより、γ線と高速中性子の弁別を行う。これらの比が1.12-1.17(手製シンチレータ)、1.16-1.36(BICRON)であるときに高速中性子とみなすことにすれば、効率45%(手製),90%.(BICRON)で高速中性子を捕らえられ、かつγ線との弁別能力は1.9x10^4(手製),1.4x10^4(BICRON)を達成することができた。この数字は目標には至っていないが、γ線の統計が足りないためである。上記比の分布を見た限りにおいては、ほぼ目標に達していると考えられる。また、ドイツで開催された国際会議「Beyond the Desert 2003」や、つくばで開催された国際会議「宇宙線国際会議2003」に参加・研究発表してきた。同時に低バックグラウンドを基礎にした世界中の様々な実験、研究の進捗状況の情報収集を行うことができた。
金属表面上の磁性イオンクラスターの電子状態

以下の2つのナノ構造磁性体系について研究を進めた1.典型元素金属,貴金属の表面に置換した磁性イオンからなるクラスターのクラスターサイズおよび形状が磁性および物性にあたえる効果を評価することを目的に,前年度に引き続きアルミニウム中のコバルト・クラスタの磁性について調べた.計算は局所密度近似のもとで,KKRグリーン関数法を用いておこなった.局所密度近似による不純物計算によれば.アルミニウム中のCoは非磁性である.計算の結果.磁性の現れる最小のクラスターはコバルト原子を3個を再近接の正三角形にならべたものであることがわかった.クラスターのうちこのようなユニットをふくむものは全て磁性的であるのに対して.このようなユニットを含まない物はサイズが大きくなっても磁性を示さない.特に,同じ三角形でも頂角が90度のものは非磁性である.直角三角形のみを含む場合には反強磁性交番磁場を加えたときの帯磁率がきわめて大きい.実際,非磁性への収束はおそく,収束前の状態は強磁性的配列ではなく反強磁性的であり,反強磁性ゆらぎが大きいことを示している.このことから,直角三角形を並べて作られる一次元鎖は反強磁性的であることが予想される.2. (In_1-x-yMn↑_xMn↓_y)As/(Al_1-zBe_z)Sb,超格子の電子状態をKKR-CPA法を用いて第一原理的に計算した.Mn↑とMn↓はそれぞれ磁化にたいして平行および反平行な局所磁気モーメントを持ったマンガン原子である.(In,Mn)AsではMnはアクセプタとなりp型伝導を示すが(In,Mn)As/AlSb超格子では(In,Mn)As層は空乏層となっている.(In,Mn)As/(Al,Be)SbではBeはアクセプタ不純物となり,Be濃度zを変えることによってキャリア濃度を調整することができる.キャリア濃度の高いところかで系は強磁性を示す.キャリア濃度の低いところでスピングラスの生じる可能性を調べるために,上向きモーメント,下向きモーメントを持つMn原子が不規則に合金を作る場合の計算も行った.その結果,(In,Mn)As/(Al,Be)Sbではz=0ですでにInAs層・のキャリア濃度は低くスピングラスが安定であるが.zの増加とともに,キャリア注入がInAs層に起こり,強磁性が安定化されることが分かった.このような安定化はすでにz=0.02程度の低濃度で起こる.強磁性が生じるメカニズムは二重交換相互作用の一形態であるといえる.以下の2つのナノ構造磁性体系について研究を進めた1.典型元素金属,貴金属の表面に置換した磁性イオンからなるクラスターのクラスターサイズおよび形状が磁性および物性にあたえる効果を評価することを目的に,前年度に引き続きアルミニウム中のコバルト・クラスタの磁性について調べた.計算は局所密度近似のもとで,KKRグリーン関数法を用いておこなった.局所密度近似による不純物計算によれば.アルミニウム中のCoは非磁性である.計算の結果.磁性の現れる最小のクラスターはコバルト原子を3個を再近接の正三角形にならべたものであることがわかった.クラスターのうちこのようなユニットをふくむものは全て磁性的であるのに対して.このようなユニットを含まない物はサイズが大きくなっても磁性を示さない.特に,同じ三角形でも頂角が90度のものは非磁性である.直角三角形のみを含む場合には反強磁性交番磁場を加えたときの帯磁率がきわめて大きい.実際,非磁性への収束はおそく,収束前の状態は強磁性的配列ではなく反強磁性的であり,反強磁性ゆらぎが大きいことを示している.このことから,直角三角形を並べて作られる一次元鎖は反強磁性的であることが予想される.2. (In_1-x-yMn↑_xMn↓_y)As/(Al_1-zBe_z)Sb,超格子の電子状態をKKR-CPA法を用いて第一原理的に計算した.Mn↑とMn↓はそれぞれ磁化にたいして平行および反平行な局所磁気モーメントを持ったマンガン原子である.(In,Mn)AsではMnはアクセプタとなりp型伝導を示すが(In,Mn)As/AlSb超格子では(In,Mn)As層は空乏層となっている.(In,Mn)As/(Al,Be)SbではBeはアクセプタ不純物となり,Be濃度zを変えることによってキャリア濃度を調整することができる.キャリア濃度の高いところかで系は強磁性を示す.キャリア濃度の低いところでスピングラスの生じる可能性を調べるために,上向きモーメント,下向きモーメントを持つMn原子が不規則に合金を作る場合の計算も行った.その結果,(In,Mn)As/(Al,Be)Sbではz=0ですでにInAs層・のキャリア濃度は低くスピングラスが安定であるが.zの増加とともに,キャリア注入がInAs層に起こり,強磁性が安定化されることが分かった.このような安定化はすでにz=0.02程度の低濃度で起こる.強磁性が生じるメカニズムは二重交換相互作用の一形態であるといえる.
Notchシグナルとヘキソサミン経路を介した血液脳関門の制御

細胞外O-GlcNAcはO-GlcNAc転移酵素EOGTにより触媒され、EOGTによるNotch受容体のO-GlcNAc修飾がDLL4を介したNotchシグナルを制御する。本研究では、Notchシグナル精密制御の血液脳関門に代表される血管バリア機能における役割を検討した。Eogt欠損マウスの解析より、ビオチン誘導体の血管外漏出とフィブロネクチンの沈着が認められた。また、血管内皮特異的Eogt欠損マウスでも同様な結果が得られた。N-カドヘリンに加えて、タイトジャンクション構成因子の発現低下が認められ、EOGT依存的なNotchシグナルを介する血管バリア機能の新たな制御機構の存在が示唆された。血液脳関門(BBB)の機能維持には、血管内皮・Pericyte・アストロサイトの3種の細胞の相互作用が関与する。EOGT変異マウスにおける脳血管系の異常の原因を特定するため、細胞特異的なEOGT欠損マウスを用いたEOGT作用部位の同定を行ない、分子機構の解析のために、Notch1変異マウスと交配し、遺伝学的相互作用を観察することを計画した。本年度は、Tie2-Cre; Eogt[flox/flox]マウスを作製し、その解析を行った。In situ hybridizationの結果、網膜血管の内皮細胞におけるEogtの発現の減少が確認できた。そこで、Sulfo-NHS-LC-Biotinをトレーサーとして用いて血管のバリアー機能を評価したところ、脳血管外へのトレーサーの漏出が認められ、血液脳関門の異常が認められた。また、脳組織標本の免疫染色により、GFAP強陽性の反応性アストロサイトの増加が観察された。これらの結果より、EOGTは血管内皮において血管のバリアー機能に重要な働きをすることが示唆された。一方、Notch1の変異マウスにおいても、同様な血液脳関門の異常が観察された。また、Tie2-Cre; Eogt[flox/flox]マウスにおいて、脳毛細血管におけるDll4の染色レベルが低下していた。しかしながら、予想と反して、EOGTとNotchの2重変異マウスでは、単独変異マウスに比べて、明らかに重篤な異常が観察されなかった。次年度以降に、EOGT変異マウスにおける血液脳関門の異常が、Notch受容体機能の異常によるものか、それ以外に重要な基質が存在するのか、こうした疑問点を解決するために、BBBの構成分子の発現量を含めた、より定量的な解析を行う必要があると考えられた。今年度は、Tie2-Cre; Eogt[flox/flox]マウスにおけるDll4の発現低下より予想された、Notch1との遺伝学的相互作用を検出することができなかった。血液脳関門(BBB)の機能維持には、異なる細胞間の相互作用が重要な働きをする。EOGT変異マウスにおける脳血管系の異常の原因を特定するため、細胞特異的なEogt欠損マウスを用いたEOGT作用部位の同定を行った。そして、分子機構の解析のために、Notch1変異マウスと交配し、遺伝学的相互作用を観察することを計画した。本年度は、まずは、前年度の問題点を解決した。昨年度は、Eogt変異マウス、Notch1変異マウス、そして2重変異マウスを作製し、Sulfo-NHS-LC-Biotinをトレーサーとして用いて脳血管外へのトレーサーの漏出によるバリアー機能の異常を解析したが、単独変異マウスに比べて、明らかに重篤な異常が観察されなかった。そこで、より定量的な解析を行うために、生後15日目の網膜を用いて血液網膜関門(BRB)の解析を行った。BBBの異常と同様に、Tie2-Cre; Eogt[flox/flox]マウス、Eogt変異マウス、Notch1変異マウスにおいて、BRBの異常を確認した。さらに、EogtとNotch1の2重変異マウスでは、単独のノックアウトマウスに比較して、より重篤な異常が観察された。従って、Eogt変異マウスのBRBの異常はNotchシグナルの異常によりおきることが示唆された。次に、Eogt変異マウスにおけるNotchシグナルの低下が血管バリアー機能に及ぼす影響を解析するために、タイトジャンクションの構成因子の発現を解析した。その結果、定量的RT-PCRでは、ZO1の発現レベルの低下を認めたが、サンプル間の違いが大きく、免疫組織染色では有意差を検出するには至らなかった。脳組織から単離した血管内皮細胞を用いて、より精密な解析を行う必要があると考えられた。今年度は、昨年度に生じた計画の遅れを解消できた一方で、単離した脳血管内皮細胞を用いた解析を確立する必要性が新たに生じたため。

EOGT変異マウスにおける血液脳関門の異常が、Notch受容体機能の異常によるものか、それ以外に重要な基質が存在するのか、こうした疑問点を解決するために、BBBの構成分子の発現量を含めた、より定量的な解析を行う。糖鎖生物学単離した脳血管内皮細胞を用いて、タイトジャンクションの構成因子の発現量の定量的解析を進めると並行して、ヘキソサミン経路の活性化に伴うNotchシグナルや血管バリアー機能の変化を明らかにする。EOGTとNotch1との遺伝学的相互作用を検出することができず、一部の実験計画に遅れがあるため。当初計画では、Eogt変異マウスを用いて、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおける血液脳関門の評価を行う予定であったが、コントロールとして用いるEogt変異マウスの血液脳関門の評価に時間を要したため。BBBの構成分子の発現量について、定量的な解析を行うために必要なq-RT-PCR用の試薬の購入に使用する。脳組織より単離培養した血管内皮細胞を用いて、血液脳関門の評価を行うことを目的としたマウス飼育費や細胞培養用経費として、使用計画を立てている。
毒素原性大腸菌耐熱性下痢毒素の受容体結合部位とダイマー構造形成部位

毒素原性大腸菌の産生する耐熱性エンテロトキシン(STa)は、腸管上皮細胞膜上に存在する受容体蛋白質(STaR)に特異的に結合して、ヒトや家畜に急性の下痢を引き起こす毒素である。本研究において、STaとSTaRの結合部位を明らかにする目的で、STaRの細胞外領域を構成するアミノ酸のデリーションおよびポイントミューテーションを行った。STaRデリーション変異体は、N末端側のシグナルペプチドの後ろから下流に削った変異体10種類とC末端側の細胞膜近傍から上流に削った変異体5種類を作製した。これら15種類のSTaR変異体のSTa結合活性を調べた結果、いずれもSTa結合活性を示さなかった。そこで、STaRの細胞外領域を構成するアミノ酸をポイントミューテーションしてSTa結合に重要な部位を解析した。18種類のSTaR変異体を解析した結果、Arg136,Met138およびAsp347,Asn348を変異させた2種類のSTaR変異体が、STa結合活性を全く示さず、STa結合に重要な部位であることが示唆された。さらに、これらのSTaR変異体が発現していることを、市販のモノクローナル抗体の認識するエピトープを導入して免疫沈降にて確認した。この結果、蛋白質が発現しているにもかかわらず、Arg136,MeT138およびAsp347,Asn348を変異させた2種類のSTaR変異体はSTa結合活性を失っており、この部位がSTa結合に重要であるとわかった。