hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウサギES細胞からの始原生殖細胞誘導法とそれを用いた生殖系列キメラ作製法の開発

平成29年度はウサギES細胞から始原生殖細胞(PGC)への効率的な分化誘導のための条件決定と、ウサギ胚発生におけるPGCの段階的な解析を試みた。分化誘導ではまずウサギES細胞の最適な培養条件を決定するため、未分化マーカーであるNANOGの遺伝子座にtdTomatoをノックインしたウサギES細胞を用い、未分化性を維持しながら安定して増殖可能な培養条件をサイトカインやシグナル阻害剤の添加を組み合わせて検討した。いくつかの条件では、NANOGを均一に高発現しながら、安定して培養が可能で、それを起点として分化誘導に進んだ。ウサギPGCへの分化誘導法は、研究代表者らが開発したヒトES細胞からPGCへの分化誘導法をウサギへ最適化することを試みた。分化の指標として、PGCを特異的に可視化・定量化できるように、PGC特異的な遺伝子であるNANOS3もしくはPGCの分化に必須な遺伝子SOX17の内在性遺伝子C末端にT2A-tdTomatoをノックインしたレポーターを持つウサギES細胞を樹立した。最適化の結果、まだ低率かつ不安定ではあるが、レポーターが陽性になる条件も見つかりつつあり、今後更なる改良を加える予定である。また並行して、PGCを移植し生殖系列キメラを作製するために基盤となる知見を得るため、ウサギ胚発生過程におけるPGCの組織学的解析を行った。その結果、ウサギ胚においてPGCが出現する時期などを特定しつつある。また次年度に計画予定のPGCの移植を想定して、マイクロマニピュレーターを用いウサギ胚への顕微操作も行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ピロロキノリンキノン生合成酵素の立体構造・反応機構解析

ピロロキノリンキノン(PQQ)は、グラム陰性菌のペリプラズムに見出される、NADやフラビンに依存しない種々の酸化還元脱水素酵素の補欠分子族である。生合成に関与する遺伝子がいくつかの細菌からクローニングされ、6つないし7つの構造遺伝子(pqqABCDEFG)が同定されている。pqqC変異株は生合成中間体を蓄積し、大腸菌内で発現させ精製したPqqCが試験管内でPQQへ変換できることを明らかとし、また生合成中間体の化学構造も決定した。この変換反応が酵素反応的に進行するためにはNADPHと未同定の活性化タンパク質因子(ActF)が必須であるが、その代わりにジチオスレイトール(DTT)が単独でPqqC反応を活性化できることを明らかとした。この反応についてさらに詳しく検討した。Methylobacterium extorquens AM1ではPqqCとPqqDは融合タンパク質PqqC/Dとして生産される。精製したPqqC/DとPQQを混合しゲルろ過すると複合体を形成して溶出されるが、溶出液にDTTを加えると複合体は形成せず分離して溶出された。Klebsiella pneumoniaeのPqqCでは、DTT存在下でも一部複合体を形成していた。DTTはPQQを還元することから、PqqC/Dは酸化型PQQと強固に結合するが、還元型PQQとは結合力が弱いことが示唆された。PQQとの結合過程をタンパク質の蛍光強度変化で追跡でき、それぞれの結合定数を明らかにした。部分精製したActFは、PQQ依存的にNADPH酸化活性を示した。ActFはPQQを還元することで生成物阻害を緩和し、その結果試験管内でのPqqC活性を促進するものと考えられた。PqqDは還元型PQQとPqqCとの結合力を低下するように働くことが予想された。個々の遺伝子の役割や反応段階の生化学的解析を試みた。PqqE遺伝子を大腸菌内で発現させ精製し、生化学的な活性を調べた。可溶性酵素として発現されることをSDS-PAGEで確認したが、精製を進めていくと分解が進んだ。DTTを加えることで安定化でき、精製できた。鉄硫黄クラスターを持つことが、可溶性画分の吸収スペクトルから予想できた。NADPHの存在下でPqqC反応を促進するタンパク質(活性化因子)を精製した。野生株では菌体内に蓄積しているPQQが活性測定を難しくするため、Methylobacterium extorquens AM1のpqqE変異株から精製した。主要タンパク質のN末端アミノ酸配列を決定したところヒドロキシピルビン酸還元酵素であったが、本酵素活性を欠失した変異株でも活性化因子活性が見られた。精製画分の成分の中にチオレドキシンパーオキシダーゼが確認されたので、活性化は過酸化除去によるものと推測した。活性化因子とNADPHの代わりにジチオスレイトールが単独でPqqC反応を促進することを見出した。生合成に関与する遺伝子がいくつかの細菌からクローニングされ、6つないし7っの構造遺伝子(pqqABCDEFG)が同定されている。

pqqC変異株は生合成中間体を蓄積し、大腸菌内で発現させ精製したPqqCが試験管内でPQQへ変換できることを明らかとし、また生合成中間体の化学構造も決定した。この変換反応が酵素反応的に進行するためにはNADPHと未同定の活性化タンパク質因子(ActF)が必須であるが、その代わりにジチオスレイトール(DTT)が単独でPqqC反応を活性化できることを明らかとした。この反応についてさらに詳しく検討した。Methylobacterium extorquens AM1ではPqqCとPqqDは融合タンパク質PqqC/Dとして生産される。精製したPqqC/DとPQQを混合しゲルろ過すると複合体を形成して溶出されるが、溶出液にDTTを加えると複合体は形成せず分離して溶出された。Klebsiella pneumoniaeのPqqCでは、DTT存在下でも一部複合体を形成していた。DTTはPQQを還元することから、PqqC/Dは酸化型PQQと強固に結合するが、還元型PQQとは結合力が弱いことが示唆された。PQQとの結合過程をタンパク質の蛍光強度変化で追跡でき、それぞれの結合定数を明らかにした。部分精製したActFは、PQQ依存的にNADPH酸化活性を示した。ActFはPQQを還元することで生成物阻害を緩和し、その結果試験管内でのPqqC活性を促進するものと考えられた。PqqDは還元型PQQとPqqCとの結合力を低下するように働くことが予想された。
泌尿器科癌におけるNa,K-ATPaseの役割:Caシグナルとアポトーシス誘導

Na, K-ATPase阻害剤であるウアバインによる各種培養細胞株、正常近位尿細管細胞に対する増殖抑制、細胞傷害作用、また腎癌組織におけるNa, K-ATPaseの発現を検討することによりジギタリスの抗癌治療応用への可能性を検討することを目的とした。前立腺癌、腎細胞癌培養細胞に対するウアバインの効果をアラマーブルー染色による色素還元法により測定した。10200nM範囲で増殖し抑制効果が認められたことが確認され、ウアバイン暴露により各種細胞がアポトーシスを起こしていることがTUNEL法により確認できた。しかし、各濃度間でのアポトーシス細胞の比率に相関は認められなかった。次に近位尿細管細胞に対する効果を検討知るため腎癌摘出組織よりprimary cultureを行った。正常近位尿管細胞としてTMUK-01,-02,-03,-04,-05,-06,-07の7系,癌細胞としてTMUR-04,-05,-06,-07の4系のprimary cultureに成功した.近位尿細管細胞であることの確認は,megalin, cubilin mRNAの発現をRT-PCR法により行い、正常近位尿細管ではmegalin, cubilinともすべてに、癌細胞ではmegalinは一部の細胞のみで発現、cubilinの発現は認められなかった。近位尿細管凍結保存細胞によりBrdU標識による細胞増殖能の検討を行ったが増殖が弱く評価不能であった。現在新たな手術検体より初代培養を行っている。パラフィン組織を用いたNa, K-ATPaseに関する検討では、パラフィン材料,抗体などの問題が原因で染色が微弱であり,凍結組織などを用いて検討すべきであることが判明、現在検体集積中である。心不全患者などでのジギタリス使用濃度とほぼ同程度で癌細胞において増殖抑制が示されることが判明したが、10%程度と弱く他剤との併用が必要であると考えられた。研究初年度にあたる本年度は、ジギタリス添加による各種培養細胞の生理学的な反応を検討するとともに、腎癌患者の手術検体より正常近位尿細管細胞および癌細胞のprimary cultureを行った。既存培養細胞は、前立腺癌細胞としてPC-3,DU-145,LNCaPを、腎癌細胞としてCaki-1,KU19-20を使用した。ウアバインの細胞増殖に対する効果は、ウアバイン投与後にアラマーブルーにて染色を行い、生細胞数を蛍光測定を行うことで検討した。いずれの細胞株にも増殖抑制効果がみられ、10200nM範囲で濃度依存性、また時間依存性に効果が認められることが確認された。また、MTT assayではミトコンドリア還元が抑制されることが確認できた。TUNEL法によるin situ labelingでは、各濃度でアポトーシスが誘導されていることが確認されたが、各濃度間でのアポトーシスの比率に優位な相関が認められるは至らなかった。今後の課題としてフローサトメトリーを用いたアポトーシス細胞の検出を検討している。次に正常組織と腫瘍組織に対する生理学的効果を検討するために現在腎癌患者よりprimary cultureを行っている。現在までに正常近位尿管細胞としてTMUK-01,-02,-03,-04,-05,-06の6種、また腫瘍細胞としてTMUR-04,-05,-06の3種の細胞でprimary cultureに成功しており、凍結保存するとともに細胞増殖能をBrdU標織によるフローサイトメトリーにより評価しているところである。

特にTMUK-04,-05,-06とTMUR-04,-05,-06は同一患者よりのprimary cultureに成功しており、今後はこれらに対するウアバインの効果を検討するとともに正常細胞と腫瘍細胞の反応性の差異について検討していく予定である。ジギタリスによる正常近位尿細管,腎癌,前立腺癌細胞株の生理学的反応,腎癌細胞におけるNa, K-ATPaseの発現を検討した。ウアバイン添加による各種培養細胞(前立腺癌細胞としてPC-3,DU-145,LNCaPを、腎癌細胞としてCaki-1,KU19-20を使用)の増殖性変化をアラマーブルー染色による色素還元法にて検討し、10200nM範囲で増殖抑制効果が認められことが確認された。この増殖抑制効果はFITC-dUTPを用いたTUNEL法によりアポトーシス誘導によるものと確認されたが、各濃度間でのアポトーシスの比率に優位な相関が認められるには至らなかった。生体でのジギタリス治療投与濃度である10nMでの増殖抑制効果はいずれも10%前後であり、単独投与での治療応用には限界があるもと考えられ、今後多剤併用による相乗効果なども検討が必要であると考えられた。腎癌患者よりのprimary cultureでは正常近位尿管細胞としてTMUK-01,-02,-03,-04,-05,-06,-07の7系,癌細胞としてTMUR-04,-05,-06,-07の4系のprimary cultureに成功した。近位尿細管細胞であることは尿細管のレセプター介在エンドサイトーシスに関わるmegalin, cubilinの発現をRT-PCR法にて確認した。megalin mRNAはすべての細胞で確認できた。しかし、凍結保存により増殖活性が著しく低下し、BrdU標識による細胞増殖能評価が不可能であった。現在新たな手術検体より初代培養を行っているが、今後実験方法の再検討が必要であると考えられた.また正常腎および腎癌組織におけるNa, K-ATPaseの局在を手術検体(パラフィンブロック)を用いて免疫組織学的手法で検討を試みたが正常腎皮質および癌組織ともに発現が認められず評価不可能であった。これはパラフィン材料・使用抗体などに問題があると考えられ、今後凍結組織を用いた実験を準備中である。
3次元自己組織化技術を用いた唾液腺組織誘導法の確立

マウス唾液腺初期発生過程における網羅的な遺伝子解析により唾液腺原器特異的な2種類の転写因子を同定した。これらの転写因子についてマウスES細胞由来口腔粘膜上皮にアデノウイルスを用いて過剰発現を行った。分化誘導23日において三次元的な外分泌腺様構造が誘導されることが明らかとなった。マウスES細胞から誘導された外分泌腺様組織は、胎生期マウス唾液腺と類似した構造を有していた。さらに、耳下腺切除モデルマウスへの同所移植実験において唾液腺様組織を形成することが確認された。マウス胎生期唾液腺原基と唾液腺原基直上粘膜特異的に発現する転写因子(16種類)について解析を進めた。Fluorescence in situ hybridization (FISH)を用いて候補遺伝子の局在を確認した。FISHを用いて胎生期唾液腺原基での局在が確認された10種類の転写因子について組換えアデノウイルスを作製し過剰発現系を構築した。また、胎生期唾液腺原基で発現している転写因子の一つであるSox9についてはマウス胎生期顎下腺の器官培養においてsiRNAを用いて抑制実験を行った。結果としてSox9の抑制によって唾液腺原基のbranchingが抑制された。このことから唾液腺器官形成に関わる転写因子群が同定できていると予想される。現在マウスES細胞から無血清凝集浮遊培養法(SFEBq法)を用いて分化誘導したES細胞由来口腔外胚葉への転写因子の過剰発現条件を検討している。現在、マウス胎生期唾液腺原基と唾液腺原基直上粘膜特異的に発現する転写因子10種類の組換えアデノウイルスを用いてES細胞由来口腔外胚葉の一部に転写因子の過剰発現を行うことに成功している。唾液腺初期発生において唾液腺原器およびその直上の口腔粘膜に発現する転写因子としてSox9を同定した。マウスES細胞からSFEBq法を用いて誘導した口腔粘膜上皮部分にアデノウイルスを用いてSox9を含む転写因子群を一過性に過剰発現させることでEBの分枝形態を誘導することに成功した。さらに誘導した3次元唾液腺様組織はAQP5, K18, α-SMAを発現し、RNA-seqを用いた網羅的な遺伝子発現解析では胎生18日唾液腺組織と極めて類似した発現プロファイルを示した。このES由来唾液腺組織はin vitroにおいて、カルバコール刺激により濃度依存性にCa releaseが認められ、水分泌におけるシグナルについても機能を有していた。加えてES由来唾液腺組織を胎生期唾液腺間葉組織と共培養することでES由来唾液腺に唾液様の粘液が貯留することも明らかとなった。また移植実験として耳下腺全切除マウスへGFP陽性ES由来唾液腺組織を胎生期唾液腺間葉組織と共に移植することによって、移植後1ヶ月で唾液腺様の組織が同所移植部位に生着していた。移植後1ヶ月で移植唾液腺以外の唾液腺全切除マウスの唾液分泌能解析の結果、移植した唾液腺は既存の耳下腺排泄導管と接続し、ピロカルピンの腹腔内投与によって移植唾液腺由来の唾液を口腔内に分泌することが明らかとなった。次年度に向けて、ES細胞由来口腔外胚葉へのより高い感染効率を得る方法の検討が必要であると考える。次年度は転写因子群を過剰発現したES細胞由来口腔外胚葉が唾液腺様の性質を示すか否かを詳細に検討していく予定である。口腔病理今年度は転写因子群の局在解析および機能解析が主であり予定よりも支出額が少なくなった。次年度はES細胞を使った分化誘導が主となるため、培地および分化誘導に用いるinhibitorやgrowth factorなどの物品費が予測される。
異文化コミュニケーションと他者認識

最終年度である本年度は、これまでの歴史的研究に理論的な集約をほどこし、その知見にもとづいて現代社会の異文化コミュニケーションと他者認識の位相の分析がなされた。歴史的に見た場合、異文化間のコミュニケーション不全は認識における対象・他者の疎外が原因ではない。むしろコミュニケーションの不全は言説の希少性に由来している。たしかにコミュニケーションとは関係的な出来事のあらわれではあるが、それが双方向的な認証の行為であるというのは幻想である。コミュニケーション行為がそもそも非対称的な出来事である以上、コミュニケーションが安定している状態とは行為者の属する言説空間(あるいは社会)が接触における干渉を除去されている状態である。換言すれば複数の文化が並びたつということは、それぞれの意味内容が理解され承認されているということをあらわしているのではなく、それぞれの言説空間において妥当な表象による記号化がなされているということである。したがって、コミュニケーションの不全は関係的な解れを指示しているのではなく、それを処理する言説(あるいは言説の元手となる表象)の希少性から記号化の配分を再編成するという言説空間内部の出来事なのである。こうしたことをコミュニケーションの異形接続として理論化した。この異形接続から現代社会を考察すると、ボードリヤールの指摘する他者の透明化はコミュニケーションにおける他者の疎外と理解されるべきものではない。むしろこの出来事は、コミュニケーションを他者という表象を経由して記号化することが高度化された消費社会・情報化社会においては記号化の技術として不適切であることを指示している。そうした意味で現代社会は言説の再編成の渦中にあり、とくに9.11同時多発テロ以降、敵対的な他者イメージにもとづく二元化された世界像とは、他者がコミュニケーションを一定の様態に留めおく機能的な表象にすぎなかったことを物語っている。本年度の研究成果としては論文「見るという出来事とトポス」をとりまとめ発表した。(1)言説分析の方法論的再検討と歴史のナラティヴィティの問題化に関して、ここではまず言説分析を構造主義的な図式的理解から分かつ知見としてこれまで一枚岩的に扱ってきた驚異の修辞の複層性をあきらかにした。このことによって言説の動態的な把握が可能となり、歴史を連続性によって解釈することへの異議申し立てとして不連続を唱えることがともすれば静態的な対立図式へと陥ることを回避する道筋を明示した。方法論的転回として言うならば、連続/不連続に線分から離れて偶発性のモメントを言説分析に開いたわけであり、このことは歴史のナラティヴィティの問題化にも密接に結びついている。その成果は歴史の記述を解釈学的な意味作用の軸線から出来事の事実性の推移へと変換させることとして具体化されている。(2)他者認識の歴史的分析に関しては、まず昨今では初期近代とされる十七世紀にも対象性の認識レベルの不在から他者性が構成されないことを明示した。そこで問題となるのは同じく他者性が不在な十六世紀と比較して「他者」と呼ばれうるものの認識が等しいかどうかである。このことは類似/表象という真理の図式に相関して説明されることが多いが、上記(1)の観点から偶発的な出来事からまなざしがいかに変異するのかということから今一度再考し、類似から表象へと言説空間が移りゆく狭間に真理に直接関説せずにまなざしが言説化されていく局面を捉えた。つまり「他者」はなにか説明されうるものとして真理と相関するものではなく、見られるものとしてまなざしがそれ自体素朴に信憑される経験性の領域にあったといえる。これは(3)他者の系譜的研究へとつながるひとつの階梯としての成果であり、現在の極度に矮小化されている他者認識に対してまなざしの歴史性に関する知見となるものである。本年度の成果は理論、歴史、そして現代社会への応用という三つの領域で、異文化コミュニケーションが他者を触媒にして理解可能性を担保してはいないということ、そして認識される他者は作用する言説の秩序のもとで表象可能であるということを明らかにしたことである。理論の領域では論文「世界の有限性の向こう側へ」を上梓した。本稿ではグローバリゼーションにおける異文化コミュニケーションの様態に着目し、コミュニケーションが文化間で行われているのではないことを指摘した。むしろコミュニケーションはそれぞれの文化が有している世界の有限性を触媒として成立しており、世界の有限性は認識論的には外部からの他者性を除去していることからグローバリゼーションがシステムとして他者疎外を全域化しているという従属論の知見を理論的に退けた。歴史の領域では著作「言説の未明と蒼海(仮)」を刊行に向けて最終的に改稿中である。本稿では16-18世紀に至る航海記などの文字テクストからこれまで明らかにしてきた他者不在のコミュニケーションの様態とその変動に応じた言説の秩序機制の変異を統合し、さらに本年度をとおして新たに分析してきた地図などの図像資料から空間表象においても文字表象と同様に他者が疎外されず不在であることを明らかにした。ここでの新たな知見とは地図の変異がコミュニケーションによる他者の回復ではなく新たな世界の有限性に基づいた他者表象の配置換えに相即しているということである。現代社会への応用としては論文「世界を語りうるもの-テロルと資本の現代的相貌-」を投稿中である。

本稿ではコミュニケーションおける他者性の欠如という知見から、9.11以降の世界をシステムの全面化と疎外された他者の遍在とするボードリヤールの解釈を退け、世界の有限性の現れとしての社会や文化がコミュニケーションをとおして直接接触することなく異形的に配置されていることを明らかにした。最終年度である本年度は、これまでの歴史的研究に理論的な集約をほどこし、その知見にもとづいて現代社会の異文化コミュニケーションと他者認識の位相の分析がなされた。歴史的に見た場合、異文化間のコミュニケーション不全は認識における対象・他者の疎外が原因ではない。むしろコミュニケーションの不全は言説の希少性に由来している。たしかにコミュニケーションとは関係的な出来事のあらわれではあるが、それが双方向的な認証の行為であるというのは幻想である。コミュニケーション行為がそもそも非対称的な出来事である以上、コミュニケーションが安定している状態とは行為者の属する言説空間(あるいは社会)が接触における干渉を除去されている状態である。換言すれば複数の文化が並びたつということは、それぞれの意味内容が理解され承認されているということをあらわしているのではなく、それぞれの言説空間において妥当な表象による記号化がなされているということである。したがって、コミュニケーションの不全は関係的な解れを指示しているのではなく、それを処理する言説(あるいは言説の元手となる表象)の希少性から記号化の配分を再編成するという言説空間内部の出来事なのである。こうしたことをコミュニケーションの異形接続として理論化した。この異形接続から現代社会を考察すると、ボードリヤールの指摘する他者の透明化はコミュニケーションにおける他者の疎外と理解されるべきものではない。むしろこの出来事は、コミュニケーションを他者という表象を経由して記号化することが高度化された消費社会・情報化社会においては記号化の技術として不適切であることを指示している。そうした意味で現代社会は言説の再編成の渦中にあり、とくに9.11同時多発テロ以降、敵対的な他者イメージにもとづく二元化された世界像とは、他者がコミュニケーションを一定の様態に留めおく機能的な表象にすぎなかったことを物語っている。
肝類洞内皮細胞機能の遺伝子工学的制御

昨年度までの検討で、ヒアルロン酸グラフト化ポリLリジン櫛形共重合体(PLL-g-HA)は核酸製剤を類洞内皮細胞に選択的に送達しうることが示された。しかし、プラスミド導入による遺伝子発現系では、リポーター遺伝子発現レベルが低値・短時間にとどまり、in vivo実験に用いるためには発現効率の改善が必要と考えられた。この問題を回避するために、RNA干渉、3重鎖DNAなと、オリゴ核酸とPLL-g-HAの組み合わせによる遺伝子工学的操作を目指して、siRNA等オリゴDNAとのナノ会合体形成、3重鎖形成オリゴ核酸(TFO)を用いた3重核酸形成能の面から、PLL-g-HA分子の最適化を行った。その結果、PLL-g-HAは従来の方法に比しより効果的に3重鎖核酸形成を安定させ、一種の人工分子シャペロンとして働くことが明らかとなった。また平成17年度では、類洞内皮細胞の再生による難治性病態の冶療を企図し、GFPトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞を四塩化炭素誘発肝障害マウスに移植し、類洞内皮細胞への分化誘導を検討した。その結果、比較的軽度の障害惹起条件では、多くのGFP陽性細胞の類洞内皮への分化を認めた。類洞内皮細胞への分化およびその細胞死に関わる遺伝子を探索するために、あらかじめsiRNAもしくはリボザイムライブラリを類洞内皮細胞に導入しておき、細胞分化あるいは細胞死シグナルを与えた際、応答の変異・細胞死回避を示す細胞から得られた切断核酸配列を指標(inverse genomics)としてスクリーニングを行い、機能遺伝子の同定を試みた。同様の手法を用いた肝星細胞死に関わる遺伝子解析が先行しており、10の新規遺伝子候補を得たが、類洞内皮細胞においても同様の解析を現在進めている。細胞特異性と細胞内ソーティング能を併せ持つ、類洞内皮細胞へのDNA送達システムの最適化を行ったヒアルロン酸グラフト化ポリLリジン櫛形共重合体(PLL-g-HA)において、ヒアルロン酸(HA)とポリLリジン(PLL)の分子量を変え、また、PLL backboneへのHAの導入密度を変化させ、DNAとの結合能を解析した。その結果、PLL Mn 4.6x10^4、HA Mn 1.5x10^4、PLL : HA=57:43にて最適のDNAとのナノ会合体形成能が得られた。PLL-g-HAはDNA2重鎖の安定化作用を呈し、水溶液中に極めて安定に分散することが示された。PLL : DNA電荷比約1.0にてPLL部位はDNAと電荷的に結合して凝縮体compactionを形成、PLL-g-HAのHA側鎖は陰電荷を持つにもかかわらず、PLLとは相互作用を持たず、PLL/DNA複合体の表面を覆うように遊離した状態で存在した(相分離性DNAナノ会合体)。このことは、HAがリガンドとして作用するために合理的であるのみならず、水和した陰性電荷HAがもたらすSteric exclusion効果により、細胞膜等との非特異的相互作用を回避する効果、すなわち、ステルス特性が得られることを示している。さらに、本組成のPLL-g-HAとプラスミドDNAとのナノ会合体はin vitroおよびin vivoで類洞内皮細胞にHAレセプタを介して特異的に取り込まれ、endosomeからlysosomeに移行する過程で一部は逸脱し、効率良く細胞核内に移行し、導入後72時間までレポーター遺伝子の発現が認められた。ヒアルロン酸グラフト化ポリLリジン櫛形共重合体(PLL-g-HA)のDNAとのナノ会合体形成能の面から、ヒアルロン酸(HA)とポリLリジン(PLL)の分子量、PLL backboneへのHAの導入密度の最適条件を決定した。

類洞内皮細胞ではサイトカインや酸化ストレスの刺激を受けてNF-kBの転写能亢進が惹起し、ICAM-1発現等様々な免疫応答を惹起(活性化)するため、NF-kBの転写能をスイッチングすることは類洞内皮細胞の機能制御につながる。平成16年度はNF-kBのコンセンサス配列を含むヘアピン型オリゴDNA(デコイ)を用い、PLL-g-HAとの複合体の形で類洞内皮細胞に導入した。類洞内皮細胞をTNFαで刺激すると速やかにNF-kBタンパクの核への移行が認められ、引き続いてICAM-1の発現が起こるが、デコイを導入した細胞では、NF-kBの核への移行が阻止され、ICAM-1発現も抑制された。NF-kBをおさえる手法はドミナントネガティブも使用されるが、デコイ法は効果の発現および消退が速やかで、遺伝子発現の迅速なswitching-on、offが可能になるというメリットがあり、肝移植後のグラフト障害や急性拒絶回避に適すると考えられ、灌流肝やin vivoモデルでその有用性を検証していく予定である。また平成16年度では、RNA干渉、3重鎖DNAなどオリゴ核酸による遺伝子発現制御法とPLL-g-HAの組み合わせによる類洞内皮細胞機能の遺伝子工学的操作を目指して、類洞内皮細胞へ3重鎖形成オリゴ核酸(TFO)、siRNAを送達する予備的検討を行った。昨年度までの検討で、ヒアルロン酸グラフト化ポリLリジン櫛形共重合体(PLL-g-HA)は核酸製剤を類洞内皮細胞に選択的に送達しうることが示された。しかし、プラスミド導入による遺伝子発現系では、リポーター遺伝子発現レベルが低値・短時間にとどまり、in vivo実験に用いるためには発現効率の改善が必要と考えられた。この問題を回避するために、RNA干渉、3重鎖DNAなど、オリゴ核酸とPLL-g-HAの組み合わせによる遺伝子工学的操作を目指して、siRNA等オリゴDNAとのナノ会合体形成、3重鎖形成オリゴ核酸(TFO)を用いた3重核酸形成能の面から、PLL-g-HA分子の最適化を行った。その結果、PLL-g-HAは従来の方法に比しより効果的に3重鎖核酸形成を安定させ、一種の人工分子シャペロンとして働くことが明らかとなった。また平成17年度では、類洞内皮細胞の再生による難治性病態の治療を企図し、GFPトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞を四塩化炭素誘発肝障害マウスに移植し、類洞内皮細胞への分化誘導を検討した。その結果、比較的軽度の障害惹起条件では、多くのGFP陽性細胞の類洞内皮への分化を認めた。類洞内皮細胞への分化およびその細胞死に関わる遺伝子を探索するために、あらかじめsiRNAもしくはリボザイムライブラリを類洞内皮細胞に導入しておき、細胞分化あるいは細胞死シグナルを与えた際、応答の変異・細胞死回避を示す細胞から得られた切断核酸配列を指標(inverse genomics)としてスクリーニングを行い、機能遺伝子の同定を試みた。同様の手法を用いた肝星細胞死に関わる遺伝子解析が先行しており、10の新規遺伝子候補を得たが、類洞内皮細胞においても同様の解析を現在進めている。
金属酸化物系スーパーキャパシタの開発

1、非貴金属酸化物系電極材料酸化チタンと酸化バナジウムを複合化した電極材料を合成し、市販の炭素材料に匹敵する質量換算容量(100F/g)を達成した。この電極材料の表面電荷量は0.4mC/cm2を越え、既存電極材料の中でももっとも高い表面活性を有することがわかった。また。酸化モリブデンを活性炭に担持したところ、硫酸水溶液中ではキャパシタンスは32%向上した。2、貴金属酸化物系電極酸化ルテニウムと酸化バナジウムを複合化した高比表面積化電極材料を創製し、さらに導電性炭素の添加効果、メカニズム解明を検討した。酸化ルテニウムの質量換算は最大で1200F/gを達成し、導電性炭素材料の添加により急速充放電用途にも適用可能な電極材料であることを見出した。これは既存の超微粒子酸化ルテニウム系材料の20倍以上、非晶質水和酸化ルテニウムと比較しても1.7倍の容量であり、世界最大容量を達成した。3、地域連携拡充に関する成果各組織間の情報交換を行うほか、研究打ち合わせ、及び下記の共同実験を実施し、地域連携推進を進めた。1)ルビコン(株)との主な共同実験:酸化モリブデンを担持した活性炭を電極として、有機電解液中で分極特性を評価したが、静電容量に対する酸化物添加効果はなかった。2)新光電気工業(株)との主な共同実験:信州大学にて作製した酸化ルテニウム系電極の表面分析(SAM,EPMA)により、ルテニウムの偏析状態を明らかにした。また、電気化学スーパーキャパシタを電子回路に組み込む際に求められる条件(耐熱性、容量、サイズ)についてディスカッションをした。3)長野工業試験場との主な共同実験:信州大学で作製した酸化イリジウム系電極の表面分析(SAM)により、イリジウムの偏析状態を明らかにした。また、酸化物電極の表面構造についてディスカッションした。1、ハイブリッド自動車に搭載する安価で大容量の電気化学キャパシタ用電極の開発非貴金属酸化物系電極及び炭素と金属酸化物とのコンポジット電極の開発を目標にして、信州大学とルビコン(株)が連携して電極材料の探索実験を進めた。前者については、Ti-V-W-O系を中心に電極特性評価を行ったが、現時点で得られた電極の静電容量は、目標値の5分の1の90Fg^<-1>である。また、金属酸化物前駆体とカーボンエアロゲルを用いて金属酸化物-カーボン複合体粉末を新規に合成しその電極特性評価を行っている。さらに、活性炭に酸化モリブデンを極く微量含浸させると静電容量が40%向上することを見出し、4月に学会発表を予定すると共に、現在論文を執筆中である。2、電子機器に装着する超小型・薄膜で高エネルギー密度の電気化学キャパシタの開発信州大学と新光電気工業(株)が連携して、Ru-V-O/Ti系およびRu-Ca-O/Ti系を中心に塗布法により電極を作製し、前者では350Fg^<-1>、後者では250Fg^<-1>の静電容量が得られた。前者については論文発表し、後者については学会にて発表した。目下、酸化物層の構造と組成について分析を進めている。3、地域連携拡充に関する成果平素より各組織間の情報交換を行うほか、4回(6月2回、11月、2月)にわたり研究打ち合わせを行った。また、11月29日には長野市にて公開セミナー「キャパシタおよび関連技術の最先端」を行い、本プロジェクトの構成グループ3名(繊維学部、ルビコン、新光電気工業)のほかに2名の講師を加えて講演・討論を行った。長野県工業試験場のメンバーの努力にも支えられて地元企業を含め102名の参加があり、長野県におけるキャパシタの研究の意義の理解を深めた。新規の電子関連企業との接点を広げることができた。また。

3)長野工業試験場との主な共同実験:信州大学で作製した酸化イリジウム系電極の表面分析(SAM)により、イリジウムの偏析状態を明らかにした。また、酸化物電極の表面構造についてディスカッションした。1、非貴金属系酸化物電極の材料選定、評価酸化物と炭素の複合化材料を創製した。MoO_3を実用可能な活性炭素に微量担持した電極材料を創製し、数十%の容量増加を達成した。また、各種評価により容量増加の要因の解析を行い、今後の複合電極調製の設計指針を得た。さらに、活性炭素以外により大容量が見込まれるメソポーラス炭素にもMoO_3を担持した複合電極を創製し、281 F/gを達成した。また、MoO_3以外のより軽量、安価な材料模索(TiO_2など)を行ったが、MoO_3を越える材料系の創製には至っていない。2、電極の材料選定、評価RuO_2をベースとした超微粒子化、高比表面積化Ru-V-O電極材料を創製し、1200 F/g_<(RuO2)>の容量を得た。これは既存のRuO_2系の容量の1.7倍の容量増加であり、世界最大容量を達成した。3、地域連携拡充に関する成果平素より各組織間の情報交換を行うほか、6回(6月2回、9月、11月、1月、2月)にわたり研究打ち合わせ、および下記の共同研実験を実施した。その結果、最終年度にむけて検討すべき課題を明確にできた。1)ルビコン(株)との主な共同実験:信州大学にて作製した活性炭に酸化モリブデンを担持した試料をルビコン(株)にて電極に成形し、有機電解液中での分極特性を評価。2)新光電気工業(株)との主な共同実験:信州大学で作製したRu-Ti-O/Ti系金属酸化物被覆電極の表面組成および断面組成を新光電気工業(株)にて分析・評価(SAM, EPMA)。3)長野県工業試験場との主な共同実験:信州大学で作製したRu-Ti-Ir-O/Ti系金属酸化物被覆電極の表面組成を長野県工業試験場にて分析・評価(SAM)。1、非貴金属酸化物系電極材料酸化チタンと酸化バナジウムを複合化した電極材料を合成し、市販の炭素材料に匹敵する質量換算容量(100F/g)を達成した。この電極材料の表面電荷量は0.4mC/cm2を越え、既存電極材料の中でももっとも高い表面活性を有することがわかった。2、貴金属酸化物系電極酸化ルテニウムと酸化バナジウムを複合化した高比表面積化電極材料を創製し、さらに導電性炭素の添加効果、メカニズム解明を検討した。酸化ルテニウムの質量換算は最大で1200F/gを達成し、導電性炭素材料の添加により急速充放電用途にも適用可能な電極材料であることを見出した。これは既存の超微粒子酸化ルテニウム系材料の20倍以上、非晶質水和酸化ルテニウムと比較しても1.7倍の容量であり、世界最大容量を達成した。3、地域連携拡充に関する成果各組織間の情報交換を行うほか、研究打ち合わせ、及び下記の共同実験を実施した。1)ルビコン(株)との主な共同実験:酸化モリブデンを担持した活性炭を電極として、有機電解液中で分極特性を評価したが、静電容量に対する酸化物添加効果はなかった。2)新光電気工業(株)との主な共同実験:信州大学にて作製した酸化ルテニウム系電極の表面分析(SAM,EPMA)により、ルテニウムの偏析状態を明らかにした。また、電気化学スーパーキャパシタを電子回路に組み込む際に求められる条件(耐熱性、容量、サイズ)についてディスカッションをした。
非コードDNA-男性不妊症をひき起こすAlu配列に関連した遺伝子異常を検索する-

Y染色体遠位側にあるBPY2遺伝子とAlu配列間にRepeatMaskerの分析および患者精巣組織の遺伝子発現実験において関連はなかった。一方、公開されているアレイデータベースを利用して、バイオインフォマチックスの手法を用いてリボゾーム経路が精子形成に関与している事を明らかにした。リボゾームの塩基配列はSINE由来と考えられているので、Y染色体遠位部領域にあるnon-coding RNA配列と各リボゾーム配列の関連ついて分析が必要である事を示唆した。Y染色体長腕に存在するMSY(male specific region on Y)、更にY染色体パリンドーム1,2,3近傍に焦点を絞ってreference sequenceをダウンロードしRepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/)を用いて同領域の反復配列を確認した。その結果537のAlu配列が確認された。これらのうちBPY2およびその近傍に存在するAlu配列に限定して調べたところ、3つ存在するBPY2のコピー全てにおいてその領域内にはAlu配列は認めておらず、その前後約10-20kbpに限定するとそれぞれのコピーの上流、下流において2つずつ計12のAlu配列を認めていた。これらに関して韓国の国立釜山大学の生物化学科のデータベースでも大きな相違が無いことを確認した。ダイレクトシーケンス法で、まずコントロールとしての400例の妊孕性患者の塩基配列を確認した。同領域には既知のSNPsも含まれておらず、塩基配列に新たな変異も検出されなかった。現在男性不妊症患者サンプルDNAについても同様に解析を行っているが、同様に新規変異は検出されていない。同時にcDNAが得られているものに関して定量RT-PCRを行いBPY2の発現を確認しているが、Y染色体微小欠失を認める患者サンプルは除外しているため、現在のところ明らかに発現が低下しているサンプルは確認されていない。今年度はセントロメア近位側BPY2遺伝子付近(Y染色体物理学的位chrY:251304410-2515160,順方向)とパリンドローム部の遠位部2ヶ所(chrY:26764151-26785352,順方向とchrY:27177050-27198251,逆方向)を分析した。各ゲノムのサイズは21202である。今回はSINEのみならず、LINEおよび繰り返し配列を中心に非コード領域DNAを分析した。前年報告で、我々の施設が保有しているサンプルでは有意な結果を得られなかったので、発現の有無とこの領域との関連性をチェックした。マイクロイアレイデータが公開されているGene Expression Ominibus(GEO)を利用した。無精子症とコントロールの比較は、精子形成遺伝子の欠失があるので、高度乏精子症患者から採取した精子から作成したアレイデータを使用した。GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)から高度乏精子症患者アレイデータ8サンプルからなるGSE6872を選択した。また13正常精子をコントロールアレイにした。これらのプラットフォームはAffymetrix Human Genome U133 Plus 2.0であった。これら21サンプルを標準化して、64356遺伝子を候補とした。今回研究ではDifferentiallyExpressed Gens Analysisからコントロールに対して2.5倍の閾値を設定した。これらの候補遺伝子510を選択できた。Y染色体遠位部の非コード領域と関連性の高い遺伝子と領域を、Kyoto Encyclopedia of genes and Genome (KEGG)のデータベース(http://www.kegg.jp)にマッピングすると、リボゾーム代謝系の2系列がヒットした。泌尿器科学サンプルDNAの質が一定していないためシーケンシングの結果が安定しておらず、複数回の解析を必要としているため時間を要している。同様にcDNAに関しても濃度調整から行っているため予定よりも時間を要している。現在のところ新たな知見が得られていないため、患者サンプルを高度造精機能障害(無精子症から精子濃度100万/mL以下の高度乏精子症)に限定して解析を進めて行く予定である。また、同時に測定の効率化のために既知のSNPsにターゲットを絞りその変異を検出できるようプライマー設定を行い、マルチプレックスPCRで増幅した後にLuminexシステムのsuspension arrayでの検出を予定する。シーケンシングも平行して継続するが、今後新規変異が検出されればその領域も適宜追加してゆく予定である。シーケシング解析およびcDNAに関しての実験が予定より遅れ、来年度に繰り越した為、それに使用する実験費用に残額が生じた。suspension arrayの実験で使用する予定だったPCRプローブ、合成キットを次年度へ繰り越し使用することとする。引き続きLuminexシステムでの解析に必要な試薬等を購入する。
電解生成超活性ダイアニオン有機分子の分子化合物生成能する研究

非水溶媒中の電極過程で生成するπ電子系ダイアニオンは、電子移動のみによって一次的に生成する超活性種であり、母体化合物に比べて著しく強い電子供与体となり得る。この特殊電子状態であるπ電子系ダイアニオンのn-σ型分子間電荷移動相互作用能を分光学的に明らかにするとともに、π-π型相互作用能に関する電気化学的測定を行った。先ず、ダイアニオンのような不安定でかつ不均化反応によってその生成が阻害されるような場合でも、効率よくダイアニオンの電解スペクトルを観測するための電解セルを試作した。そして、p-キノン類πダイアニオンのスペクトル測定に成功した。また、メタノール存在下では、このスペクトルは短波長シフトして観測され、通常のπ-π*吸収帯が水素結合によって長波長シフトするのとは逆にダイアニオンとの水素結合は短波長シフトとして特徴づけられた。この特徴はCNDO/S-CI計算および4-31G基底関数を用いた非経験的分子軌道計算により理論的に説明できた。ダイアニオンへの水素結合によるスペクトルの短波長シフトは、この水素結合にn-σ型電荷移動が大きく寄与する結果、ダイアニオン分子のHOMOが著しい安定化されるためであることが分かった。そして、ダイアニオンへの水素結合において、n-σ型電荷移動が非常に大きく寄与していることが明らかとなった。また、ジフェニレン類および芳香族交互炭化水素(BAH)類のサイクリックボルタモグラムの還元第二波に対する各種共役系分子共存の効果から、これらダイアニオンのπ-π型電荷移動相互作用能を見積もった。その結果、芳香族炭化水素類のBHA類のダイアニオンが相互作用能が高いことを明らかにした。このことをHuckelの(4n+2)π規則との関連から議論した。
マクロファージの組織発生機構の解明

生体では、細胞の分化や増殖は固有のニッチ環境により制御される。生体のほぼ全ての組織に常在するマクロファージは、組織固有の機能や形態を示す。これは組織微小環境を形成するニッチが、組織固有の発生や活性化をマクロファージに誘導するためと考えられる。本研究ではマクロファージの分化や組織固有性を制御する組織ニッチの実体、特にニッチを構成する細胞について明らかにする。本年度は、昨年度に同定した大網組織間質細胞が大網組織内のリンパ球クラスター周囲に局在することを明らかにした。また本間質細胞で特異的に発現する遺伝子を複数同定し、その遺伝子プロモーターの下流にCre遺伝子を導入したマウスを樹立した。今後、これらマウスを各種floxマウスと交配することで本間質細胞の機能解析を行う。本研究で着目する間質細胞が特徴的な組織局在を示すことを見出した。またその間質細胞で特異的に発現する遺伝子を同定し、その遺伝子プロモーターの下流にCre遺伝子を導入したマウスの作製に成功している。本年度に樹立したマウスを各種floxマウスと交配することで本間質細胞の機能を明らかにする。内定年度:2015生体では、細胞の分化や増殖は固有のニッチ環境により制御される。本年度は腹腔マクロファージの組織固有性を制御することが考えられる大網組織を解析し、大網組織内に存在するニッチ細胞を同定した。またこの細胞が大網組織内のマクロファージ発生の場と考えられる場所の近傍に局在することを見出した。そして、ニッチ細胞に発現する遺伝子を網羅的に解析し、腹腔マクロファージの固有性を制御する因子の候補を同定した。大網組織において、マクロファージの組織固有性を制御するニッチ細胞と考えられる細胞を同定し、その遺伝子発現を解析した。大網ニッチ細胞の遺伝子発現解析により見出された遺伝子のなかから、腹腔マクロファージの組織固有性を制御する因子の同定を行う。平成28年度に行う予定であった遺伝子発現解析の一部について、更なる条件検討が必要とされたことから次年度に行うことにした。抗体、培養試薬などの消耗品に、他の研究課題と共通で使用するものがあり、それらの一部を他の研究資金で購入した。次年度繰越額は本研究で使用するマウス各系統の購入費、維持費にあてる。平成29年度中に条件検討を完了し、直ちに使用する。
災害関連死の認定をめぐる実態把握の研究

本研究は、災害により死亡者が出た場合に「災害弔慰金の支給等に関する法律」(昭和48年9月18日法律第82号)に基づいて支給される災害弔慰金のなかで、その支給対象となっている災害関連死(すなわち、災害にともなう過労や環境悪化等による病死などの内科的死因にもとづく死亡)を取り上げて、各地方自治体で行われている災害関連死の認定の基準や手続をめぐる実態をできるだけ明らかにすることを目的としている。そのために、全国の県市町村へのアンケート・聞き取り調査を手掛かりにすることとした。本研究は、2018年度から4年計画で進める予定であり、2018年度および2019年度は、全国の県市町村に災害関連死に関するアンケート調査(郵送)および集計を行うこととした。2018年度は、全国の県市町村(現時点で1741自治体)の宛名(住所地・担当課)をラベル用に打ち込み、アンケート発送の準備を行った。併せて、2019年2月、災害法制に詳しい神戸の津久井進弁護士と災害関連死の実態について懇談すると同時にアンケート内容に関する助言を仰いだ。以上により、来年度までに予定しているアンケートの発送に着々と準備を進めることができた。2018年度から2019年度にかけて、全国の県市町村に災害関連死に関するアンケート調査(郵送)および集計を行う計画であるが、アンケートを発送する準備を整えることができた。全国の県市町村に災害関連死に関するアンケート調査を発送し、2019年度末までに集計を行う。そのなかで、特徴的な県市町村を選び出すことが可能であれば、当該自治体に聞き取り調査に赴く。全国市町村へのアンケート発送のために予定した消耗品(用紙・封筒など)の購入をしていないこと、および、2020年度に郵送する郵送代への繰り越しのためである。
糖鎖構造をモデルにしたカテプシンLの細胞内選別輸送の分子機構

この研究ではリソゾーム・システインプロテアーゼであるカテプシンLの糖鎖構造を決定し、カテプシンLの構造と機能発現、細胞内局在化機構への糖鎖構造の関与を明らかにすることを研究の目的としている。カテプシンLは申請者らとKirschkeらが各々独自に初めて、ラット肝より単離、精製に成功した糖蛋白質で、完全一次構造と遺伝子構造も申請者らによって決定済みであるが、糖鎖構造は未決定であった。そこで申請者らは精製ラット肝カテプシンLからN-グリカナーゼで糖鎖を切り出し、そのオリゴ糖還元末端に2-アミノピリジンを還元アミノ化反応(PA化)で結合させれ、糖鎖を蛍光標識して順相及び逆相カラム(HPLCシステム使用)を使って分析した。その際、設備備品として購入した蛍光分光光度計を使用した。この結果によるとカテプシンLは主に5種のM_2GlcNAc_2-(46%),M_3GlcNAc_2-(10%),M_4GlcNAc_2-(19%),M_5GlcNAc_2-(18%),M_6GlcNAc_2-(7%)含んでいることが推定された。申請者らはリソゾームシステインプロテアーゼファミリーであるカテプシンB及びHの糖鎖構造をすでに解析し報告しているが、Bの糖鎖の85.9%を占めるM2GlcNAc_2がLの糖鎖構造中にも46%も含まれているという非常に興味ある事実を見出した。従って申請者らの解析した3種のリソゾーム・システインプロテアーゼだけに限っても、カテプシンHはM_5→M_9GlcNAc_2-を含んだ高マンノウース型であり、Bは86%が持殊なM_2GlcNAc_2-であり、現在分析したLはM_2GlcNAc_2-が46%で残りはM_3→M_6GlcNAc_2-の高マンノース型で、BとHの混成した型の糖鎖構造から成っていることが明らかになった。それ故、糖鎖中にシアール酸を含むことが申請者らによって報告されているカテプシンJ(C)の糖鎖構造も解析して、各々のリソゾーム・システインプロテアーゼファミリーの生合成、分解の機構、細胞内局在化機構への糖鎖構造の関与について、さらに研究を進めている。
レ-ザ-光励起による超薄膜固定化金属酸化触媒の調製とその光触媒活性

SiO_2や多孔性バイコ-ルを吸着媒としてVOCl_3を吸着させ、この吸着系を室素レ-ザ-光で照射すると、VOCl_3分子が活性化され、吸着媒表面上のOH基と反応してVー化合物がーSiーOーVOCl_2の形で固定化されることが解った。一方、MoCl_5やTiCl_4は吸着後にレ-ザ-光照射しても固定化反応が進行しないことが解った。レ-ザ-光照射固定化の後、ーSiーOーVOCl_2を水で処理するとCl基がOH基で置換され、ーSiーOーVO(OH)_2の形となる。その後,酸素中で焼成することにより、シリカや多孔性バイコ-ルに超蒲膜状態で固定化されたバナジウム酸化物が調製できることが明らかになった。この固定化バナジム酸化物のキャラクタリゼ-ションはIR、ラマン、UV、ESR、ホトルミネックセンスなどの各種分光法などにより行い、レ-ザ-光照射により単分子層状超蒲膜固定化触媒が調製できることを初めて明らかにした。また、蒲膜形成に及ぼすレ-ザ-光強度や担体表面のOH基濃度、VOCl_3の吸着種濃度などの影響に付いても興味ある知見を得た。この様にした超薄膜固定化バナジム酸化物を光触媒として、その反応性に付いて検討した。オレフィンと酸素の存在下で超薄膜固定化バナジウム酸化物を光励起すると、オレフィンの部分酸化反応が進行し各種の含酸素化合物が生成することが解った。NOx除去の問題と関連して、NO存在下で超薄膜固定化バナジウム酸化物を光照射すると室素と酸素が生成し、常温でのNOの直接分解反応が光触媒分応として進行することを見いだした。一方、メタンを反応物とすると、エタンやエチレンが生成するが、反応は触媒自身の光還元を伴う。しかし、メタンとNOの混合系での光反応では、超薄膜固定化バナジウム酸化物を光触媒として、メタンの酸化カップリング反応が進行し、エタンたメタノ-ルが合成できることを見いだいた。ESRによる光照射下での反応中間体の検出を通して、超薄膜固定化バナジウム酸化物上での光触媒反応の機構を明らかにした。この様に、レ-ザ-光励超による超薄膜固定化金属酸化物媒の調製とその光触媒活性の研究において、興味ある多くの重要な研究成果を得ることができた。本年度は、超薄膜状で担体表面上に固定化された固定化触媒を調製する目的で、VOCl_3を担体としての多孔性バイコ-ルガラスおよびSiO_2上に吸着させ、これを窒素レ-ザ-光で励起し担体表面OH基との反応によりV化合物を固定化し、加水分解と酸素処理を経て固定化V酸化物触媒を調製した。この固定化V酸化物触媒の調製過程を窒素レ-ザ-による光照射下でのIR(表面OH基濃度の変化)とUV吸収(V化合物の濃度)の測定を行い、V化合物が担体の表面OH基と光照射下でのみ反応し固定化されることを明らかにした。

この方法で調製した固定化V酸化物触媒のIR、UV、ESR、およびホトルミネッセンススペクトルを測定し、レ-ザ-光励起により調製した単分子層状超薄膜固定化触媒の表面活性サイトのキャラクタリゼ-ションを行った。これらの結果は、いずれも固定化V酸化物触媒において、V種はVO_4ユニットの四配位構造を持った状態で単分子層の薄膜固定化触媒が形成されていることを示した。また、固定化V酸化物触媒を光触媒として用い、2-ブテンの光触媒異性化反応、プロピレンの酸素による光触媒酸化反応を調べ単分子層状超薄膜固定化触媒の特徴を検討した。その結果、固定化V触媒は、従来の含浸法で調製された触媒と比較して高い活性と高い選択性を示し、光触媒反応の収率は担持V量に比例して増大した。これらの特徴は、固定化V酸化物触媒においては光触媒反応の活性サイトであるVO_4の四配位構造を持ったV種が担体表面に均一固定化されている起因することを明らかにした。以上、本年度においては、レ-ザ-光励起により調製した単分子層状超薄膜固定化触媒の表面状態と光触媒活性に関して大変貴重な知見を得ることができた。今後はさらに、レ-ザ-光強度、担体表面OH基濃度、吸着種濃度などの影響に付いても検討を進め、レ-ザ-光励起により調製した固定化触媒の特徴を明かにする予定である。SiO_2や多孔性バイコ-ルを吸着媒としてVOCl_3を吸着させ、この吸着系を窒素レ-ザ-光で照射すると、VOCl_3分子が活性化され、吸着媒表面上のOH基と反応してVー化合物がーSiーOーVOCl_2の形で固定化されることが解った。この固定化の後、ーSiーOーVOCl_2を水で処理するとCl基がOH基で置換され、ーSiーOーVO(OH)_2の形となる。その後、酸素中で焼成することにより、シリカや多孔性バイコ-ルに超薄膜状態で固定化されたV酸化物種(A)が調製できることが明らかになった。この種(A)のキャラクタリゼ-ションはIR、ラマン、UV、ESR、ホトルミネッセンス分光法などにより行い、レ-ザ-光照射により単分子層状超薄膜固定化触媒が調製できることを初めて明らかにした。また、薄膜形成に及ぼすレ-ザ-光強度や担体表面のOH基濃度、吸着種濃度などの影響に付いても興味ある知見を得た。この様にして調製した超薄膜固定化V酸化物を光触媒として、その反応性に付いて検討した。オレフィンと酸素の存在下で超薄膜固定化V酸化物を光励起すると、オレフィンの部分酸化反応が進行し各種の含酸素化合物が生成することが解った。また、NO存在下で超薄膜固定化V酸化物を光照射すると窒素と酸素が生成し、室温以下の温度でのNOの直接分解反応が光触媒反応として進行することを見いだした。メタンを反応物とすると、エタンやエチレンが生成するが、反応は触媒の光還元を伴う。しかし、メタンとNOの混合系での光反応では、超薄膜固定化V酸化物を光触媒として、メタンのカップリング反応が進行することを見いだし、その反応中間体の検出を通して、反応機構を明らかにした。この様に、レ-ザ-光励起による超薄膜固定化金属酸化物触媒の調製とその光触媒活性の研究において、興味ある重要な研究成果を得ることができた。