hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胆汁酸シグナルによる骨格筋機能向上の分子機構解析

昨年度までに骨格筋におけるTGR5の新規標的遺伝子をマイクロアレイにより見出しており、筋肥大に関与し得るいくつかの遺伝子を選抜した。さらにその一部に関しては発現制御機構を明らかにした(Biosci. Biotechnol. Biochem. in press)。本研究では、胆汁酸が骨格筋機能に及ぼす影響を分子レベルで解析した。その結果、骨格筋に発現する胆汁酸受容体TGR5は骨格筋の肥大化や筋細胞分化を亢進することを明らかにした。TGR5を欠損するマウスにおいては、骨格筋の萎縮が確認された。したがって、骨格筋TGR5は加齢に伴う筋萎縮(サルコペニア)等の予防に向けた有力なターゲットになると考えられる。我々はすでにTGR5活性化能を持つ食品成分として、柑橘成分であるノミリンやオバクノンなど複数見出しており、TGR5との結合様式の解明に成功している。こういった機能性食品成分を活用することで、活力のある高齢社会の実現が期待される。マイクロアレイにより同定された新規TGR5ターゲット遺伝子に関して、promoter assayを中心に発現調節機構や転写制御エレメントの同定を行う。同時に、当該遺伝子を過剰発現した骨格筋培養細胞を用いて機能解析を行う。今後、メタボローム解析等を駆使した網羅的な機能研究を予定している。2)TGR5 KOマウスを用いたTGR5の機能解析TGR5 Tgマウスで確認されたフェノタイプに関して、TGR5 KOマウスを用いてさらに詳細に検討を行う。KOマウスの解析は予定を早めて既に着手しており、今後さらに詳細な解析を行う予定である。3)骨格筋TGR5によるサルコペニア予防Tgマウスを長期飼育し、経時的に筋力を測定することでTGR5がサルコペニアの予防に貢献し得るか検証を行う。既に長期飼育を開始しており、これを継続する。分子細胞生物学
送粉動物の学習行動を介した花の多様な形質進化：花色変化パターンの種間差に着目して

植物の中には、花が咲いてから散るまでにその色を劇的に変える種がいる。先行研究より、花色を変える「変化型」は、蜜を減らした古花の色を変えることにより蜜量を送粉昆虫に知らせることがわかっている。その一方で、古花を色を変えずに維持し、蜜量の減少を動物に知らせない「不変型」もいる。これらの変化型と不変型がどのような昆虫の訪問を受けるのかという疑問に答えるために、ニシキウツギ(変化型)とその近縁種タニウツギ(不変型)の自生地4地域で20122014年に調査を行った。変化型は蜜量を正直に動物に知らせるため、空間学習能力が高く、採餌しやすい株に固執する昆虫に好かれることが予想される。この予想を確かめるために、まず送粉昆虫の種類を調べると、変化型の主要な送粉昆虫は大型ハナバチ・小型ハナバチ・ハナアブであった。一方、不変型の主要な送粉昆虫は小型ハナバチやコガシラアブであり、昆虫相における大型ハナバチの割合は少なかった。つぎに、昆虫の同じ株への再訪問頻度を調べると、いずれの植物においても、大型ハナバチの再訪問頻度は小型ハナバチとハナアブより高い傾向があった。また、意外にもコガシラアブも同じ株に頻繁に再訪問していた。しかしながら、コガシラアブは株内で蜜が多い花を選ばないこと等から、採蜜しやすい株の位置を学習したというよりも、単に株の近辺を周回していた可能性が高い。以上の結果から、不変型は株への固執性が低い小型ハナバチとコガシラアブに花粉の運搬を依存している一方、変化型は空間学習能力が高い大型ハナバチにより依存していることが示唆された。植物種間で生育環境に明瞭な違いが見られなかったことも合わせると、上述のような送粉昆虫の違いが、自生地における植物の繁殖成功にとって重要であると考えられる。注)本年度に標本を増やし、統計方法を改善してデータを再解析したため、結論の一部が昨年度と異なる。26年度が最終年度であるため、記入しない。先行研究より、花の色を劇的に変える「花色変化」には、訪花昆虫に蜜が多い花を教えることを通じ、ハナバチのリピーターから好かれる効果があることが示唆されている(Suzuki & Ohashi 2014)。一方で、花の維持や色素生産にかかるコストを抑える点では、花が変色しない植物のほうが優れている可能性がある(Suzuki & Ohashi 2014)。このことをふまえると、ハナバチのリピーターが頻繁に訪れる環境では、花色変化の利益がコストを上回るため、花色変化する植物(以下、変化型)が集団中に広まりやすいことが予想される。一方、学習能力が高い昆虫種が少なく、かつ光合成の生産性が低い環境では、コストの抑制が可能な花色変化しない植物(以下、不変型)のほうが適応的となるかもしれない。この予想を確かめるために、野生のニシキウツギ(変化型)とその近縁種タニウツギ(不変型)の自生地において調査を行った。まず、訪花昆虫の種構成を比べると、不変型では小型ハナバチ・アブ・甲虫が8割を占める一方、変化型よりもマルハナバチの割合が有意に低かった。次に、訪花昆虫にマークをつけて再訪問率を調べた結果、変化型ではマルハナバチの再訪問率が高かった一方、不変型ではこの昆虫の再訪問率はほぼ0であった。また、小型ハナバチやアブの再訪問率はどの植物でも低い傾向があった。以上の結果から、変化型はマルハナバチのリピーターにより依存している一方、不変型は再訪問率が低い昆虫に依存していることが分かった。このように、昆虫種ごとの再訪問率を明らかにし、そして同じマルハナバチであっても植物種間で再訪問率が異なることを示した研究は世界初である。以上の成果は日本生態学会(2014年3月)において発表した。

しかしながら、コガシラアブは株内で蜜が多い花を選ばないこと等から、採蜜しやすい株の位置を学習したというよりも、単に株の近辺を周回していた可能性が高い。以上の結果から、不変型は株への固執性が低い小型ハナバチとコガシラアブに花粉の運搬を依存している一方、変化型は空間学習能力が高い大型ハナバチにより依存していることが示唆された。植物種間で生育環境に明瞭な違いが見られなかったことも合わせると、上述のような送粉昆虫の違いが、自生地における植物の繁殖成功にとって重要であると考えられる。注)本年度に標本を増やし、統計方法を改善してデータを再解析したため、結論の一部が昨年度と異なる。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度のあいだに、国際誌に投稿できる論文12本分に相当する成果が得られた。研究計画に記した項目(利益、コスト、送粉環境)のうち、コストに関する研究を除けばいずれも仮説を支持するデータが得られている。また、花の維持コストに関わるデータの一部(花の寿命など)は既に採取されており、現在研究室において結果をまとめている。平成25年度の交付申請書に記載された研究目的を全て達成できるという見込みから、「おおむね順調に進展している」と判断した。前年度に引き続き、筑波・日光・水上・仙台における送粉昆虫相の調査をおこなう。また、植物の自生地における光環境の比較を行い、花色変化する種は光合成にとってより好適な環境に生育していることを確かめる。平成25年度に採取した未発表のデータ(花の維持コストの指標、結実率、植物相)と合わせて12本の論文にまとめ、国際雑誌に投稿する。
昆虫サイトカインレセプターの構造と細胞内情報伝達系因子の解析

昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)は血球細胞の一種プラズマ細胞を活性化し、血球凝集塊形成反応や異物表面への付着を誘起する。アワヨトウGBPの構造-活性相関については様々な変異体GBPを用いて詳細な解析がなされているが、GBPによるプラズマ細胞活性化の情報伝達経路についてはほとんど分かっていない。本研究によって、私達は血球細胞のGBP受容体の性質を明らかにすると共に、分子量77kDaの新規GBP受容体アダプタータンパク質を発見した。P77 cDNAをクローニングし、一次構造を決定した結果、細胞膜を一回貫通する膜タンパク質であることが予想された。さらに、モチーフ検索により、その細胞内領域にはSH2/SH3ドメイン結合モチーフやimmunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM)様ドメインが存在することが明らかになった。これら同定されたドメインは,いずれも哺乳類の免疫関連受容体の多数のアダプター因子内に報告されているものである点は興味深い。P77はGBPと直接結合能力を持たないが、GBP刺激によって血球の細胞内領域チロシン残基は速やかにリン酸化される。P77のチロシン残基リン酸化は、血球細胞をEnterobactor cloacaeやMicrococcus luteusといった細菌で刺激した場合にも観察されるが、こうした病原微生物刺激によるプラズマ細胞のP77チロシンリン酸化は、血球から放出されたGBP前駆体が同時に分泌されるプロテアーゼによってプロセシングされて生じた活性型GBPによって誘起されるものであることを実証した。さらに、GBPによって刺激されたプラズマ細胞ではインテグリンβ1鎖のチロシンリン酸化が確認されたが、このチロシンリン酸化はP77のRNAiによって顕著に抑制され、さらに、プラズマ細胞の突起伸長活性化反応も阻害された。また、こうしたRNAiによってP77発現が抑制されたアワヨトウ幼虫では、グラム陰性菌Serratia marcescensに対する感受性が顕著に上昇した。以上のような一連の研究結果より、プラズマ細胞のGBP細胞内情報伝達にはGBP受容体アダプタータンパク質P77が必須であり、P77を介するインテグリン分子のチロシンリン酸化がGBPによるプラズマ細胞活性化に不可欠であることが証明できた。私達は、昆虫の幼虫発育阻害活性をもつ生理活性ペプチド(Growth-blocking peptide, GBPと命名)が多機能性を示す昆虫サイトカインであることを最近明らかにした。多彩な生理機能を有するこの昆虫サイトカインの活性発現分子機構を明らかにすることが、本研究の最終目標である。具体的には、大きく2つの研究目的からなる。(1)血球細胞からGBPレセプターを単離してその一次及び立体構造を決定すると共に、レセプタータンパク質内のGBP結合領域を同定しその構造を明らかにする。同様の手法を用いて昆虫培養細胞High Five(あるいは、Sf9)からGBPレセプターを単離、構造決定し、GBP結合領域の構造を明らかにすることによって血球細胞GBPレセプター構造との差異を明確にする。(2) GBP活性発現に関わる細胞内情報伝達因子を明らかにすべく、GBP-GBPレセプター複合体と親和性を持つ細胞質内共役タンパク質(情報伝達因子候補)を同定し一次構造を決定する。

昆虫の幼虫発育阻害活性をもつ生理活性ペプチド(Growth-blocking peptide, GBP)が多機能性を示す昆虫サイトカインであることが最近明らかになった。アミノ酸25残基という単純なペプチドであるにも拘らず、多彩な生理機能を発揮するこの昆虫サイトカインの活性発現分子機構を明らかにすることが、本研究の最終目標である。これまでの研究によって、アワヨトウ幼虫血球細胞からGBPレセプター候補として分子量77kDaタンパク質(P77)が同定された。このP77は細胞膜貫通ドメインを1個持つ膜タンパク質であり、単離した血球細胞をGBPと共にインキュベーションすることによって、インキュベーション開始後1分以内にそのチロシン残基がリン酸化される。また、その後、30分以内に速やかに脱リン酸化されることが明らかになった。このリン酸化はGBPによる血球活性化能と明らかな相関があり、リン酸化が観察されるのはGBP感受性のあるプラズマ細胞のみであることを確認した。クローニングしたP77cDNAを培養細胞(アフリカミドリザル由来Cos7細胞とショウジョウバエ胚由来SL2細胞)に導入し細胞膜での発現を試みた。この発現細胞を用いて、^<125>I-GBPを用いたラジオレセプターアッセイによって特異的親和性の有無を検討した結果、GBPとの直接結合は証明できなかった。したがって、P77は,少なくとも単独ではGBPレセプター活性がないレセプター複合体の一成分か、あるいは、レセプターの下流に位置する情報伝達系の一成分である可能性が高まった。昆虫の幼虫発育阻害活性をもつ生理活性ペプチド(Growth-blocking peptide、GBP)が多機能性を示す昆虫サイトカインであることが最近明らかになった。アミノ酸25残基という単純なペプチドであるにも拘らず、多彩な生理機能を発揮するこの昆虫サイトカインの活性発現分子機構を明ちかにすることが、本研究の最終目標である。アワヨトウ幼虫血球細胞からGBPレセプター候補として単離された分子量77kDaタンパク質(P77)は、レセプター結合実験によってGBPと直接結合しないことが明らかになった。したがって、P77はGBPレセプターそのものではないものと結論付けた。しかし、このP77は細胞膜貫通ドメインを1個持つ膜タンパク質であり、単離した血球細胞をGBPと共にインキュベーションすることによって、インキュベーション開始後1分以内にそのチロシン残基がリン酸化される。また、その後、30分以内に速やかに脱リン酸化される。つまり、P77はGBPレセプターではないとしても、GBPによる活性化シグナルを血球細胞内に伝達する機能を担っていることは間違いない。すなわち、少なくとも単独ではGBPレセプター活性がない
視覚的対象検出における視覚的・意味的文脈効果の検討

本研究の目的は,線画を用いて同じ妨害項目の中から一つの異なるターゲットを検出する視覚的探索課題において,1.妨害項目とターゲットの意味的・視覚的(形)類似性の高・低が文脈としてターゲット検出に及ぼす効果を検討する,2.併せて,探索行動に先行して,検出するターゲット情報(線画または単語)の提示が,ターゲット検出に与える影響を検討する,3.さらに周囲に配置された対象物の数の影響について検討をすることだった.研究1では,被験者は線画または単語が8項目ある探索刺激から異なる一つのターゲットを検出した.その結果,線画課題では,意味的・視覚的類似性共に高い条件が低い条件より対象を遅く検出した.研究2では,先行手がかりの効果を検討するため,線画または単語手がかりを先行提示した.その結果,先行手がかりと視覚的類似性の交互作用が見られ,線画手がかりの視覚的類似性が高い条件でターゲットの検出が遅かった.また,意味的類似性・視覚的類似性の高条件で検出が遅いという効果がみられた.次に,研究3では探索刺激を8から4項目に減じて,研究2と同じ手続きで刺激数の検討を行った.その結果,意味的類似性,視覚的類似性の各主効果,及び先行手がかりと意味的類似性の交互作用が認められ,単語手がかり条件で意味的類似性の高いときターゲット検出が遅かった.研究4では補足実験として,2刺激の場合のターゲット検出を検討した.先行手がかりには関係なく意味的類似性,視覚的類似性の高い条件でターゲット検出が遅い結果となった.これらから,線画の視覚的探索課題における対象検出には,周囲刺激のターゲットとの視覚的類似性,意味的類似性(近さ)が妨害的に影響することが明らかになった.手がかり先行提示の効果は概念的なものである可能性が高いが,視覚的妨害効果も見られる場合があることが明らかになった.総じて意味的・視覚的文脈の妨害効果が認められた.本研究の目的は,線画を用いて同じ妨害項目の中から一つの異なるターゲットを検出する視覚的探索課題において,1.妨害項目とターゲットの意味的・視覚的(形)類似性の高・低が文脈としてターゲット検出に及ぼす効果を検討する,2.併せて,探索行動に先行して,検出するターゲット情報(線画または単語)の提示が,ターゲット検出に与える影響を検討する,3.さらに周囲に配置された対象物の数の影響について検討をすることだった.研究1では,被験者は線画または単語が8項目ある探索刺激から異なる一つのターゲットを検出した.その結果,線画課題では,意味的・視覚的類似性共に高い条件が低い条件より対象を遅く検出した.研究2では,先行手がかりの効果を検討するため,線画または単語手がかりを先行提示した.その結果,先行手がかりと視覚的類似性の交互作用が見られ,線画手がかりの視覚的類似性が高い条件でターゲットの検出が遅かった.また,意味的類似性・視覚的類似性の高条件で検出が遅いという効果がみられた.次に,研究3では探索刺激を8から4項目に減じて,研究2と同じ手続きで刺激数の検討を行った.その結果,意味的類似性,視覚的類似性の各主効果,及び先行手がかりと意味的類似性の交互作用が認められ,単語手がかり条件で意味的類似性の高いときターゲット検出が遅かった.研究4では補足実験として,2刺激の場合のターゲット検出を検討した.先行手がかりには関係なく意味的類似性,視覚的類似性の高い条件でターゲット検出が遅い結果となった.これらから,線画の視覚的探索課題における対象検出には,周囲刺激のターゲットとの視覚的類似性,意味的類似性(近さ)が妨害的に影響することが明らかになった.手がかり先行提示の効果は概念的なものである可能性が高いが,視覚的妨害効果も見られる場合があることが明らかになった.総じて意味的・視覚的文脈の妨害効果が認められた.本研究の目的は,視覚的探索課題における対象検出への意味的・視覚的文脈効果を明らかにすることであった。そのために,視覚刺激として線画を用い,意味的文脈効果と視覚的文脈効果を分離するために,比較刺激として線画の名称を示す単語を用いて,ターゲット(検出する対象)と妨害項目(検出対象以外のもの)の視覚的類似性,意味的類似性が文脈としで対象検出の速さに及ぼす効果を検討した。意味的・視覚的類似性は高・低の各2条件を,主観的評価によって用意した。被験者は,意味的・視覚的類似性の異なる妨害項目の中にターゲットがあるか無いかを判断した。その結果,(1)線画条件の方が単語条件より対象の正検出が速く,(2)線画条件では,意味的類似性の低い条件の方が高い条件より速く対象を検出し,視覚的類似性が低い条件の方が高い条件より速く対象を検出することが見いだされた。他方,(3)単語条件では,意味的類似性の低い条件の方が高い条件より速く対象を検出するが,視覚的類似性については有意差がみられなかった。また,意味的類似性と視覚的類似性の交互作用があり,意味的類似性の低い条件では視覚的類似性の高・低の差が見られなかった。これらの結果から,意味的・視覚的類似性の文脈効果が線画と単語で異なることがわかった。次年度以降の予定だったターゲット検出のための手がかりを先行提示することが検出に及ぼす影響について,今年度の計画に組み込んで,実験2・3として実施中であり,先行てがかり提示の効果は,単語条件でみられるという結果の一部が見いだされている。妨害項目の数,探索刺激提示までの時間の効果については実施も含めて次年度以降に検討し,総合的に結果の検討をしていく予定である。

本研究の目的は,線画を用いた視覚的探索課題における対象検出への意味的・視覚的文脈効果を明らかにすることであった。視覚的類似性はターゲットと妨害項目間の全体的な形の類似性とし,意味的・視覚的類似性は高・低の各2条件を,主観的評価によって用意した。被験者は,意味的・視覚的類似性の異なる妨害項目の中にターゲットがあるか無いかを判断した。昨年度は,比較として単語探索課題を用意し,先行提示がない・あり条件での検出時間の比較を行った.その結果,線画条件では,意味的類似性の低い条件の方が高い条件より速く対象を検出し,視覚的類似性が低い条件の方が,高い条件より速く対象を検出することが見いだされたが,単語条件では,意味的類似性の低い条件の方が高い条件より速く対象を検出するが,視覚的類似性については有意差がみられなかった。本年度は,先行手がかりの効果が概念的なものか視覚的なものかを確認するため,実験3として探索刺激とは異なるターゲットを先行提示(線画探索では単語,単語探索では線画)して実験した.その結果,先行手がかりによって検出時間に差はみられず,共に,意味的類似性・視覚的類似性の効果がみられた.このことから,手がかり効果は概念的なものであることが示唆された.次ぎに,実験4として刺激数の検討を行うため,探索刺激を8から4に減じて,同様の実験を行った.先行手がかりを線画または単語として,実験3との比較を行った.その結果,意味的類似性,視覚的類似性の各主効果,及び手がかりの種類と意味的類似性の交互作用が認められた.意味的類似性・視覚的類似性共に高い条件でターゲットの検出が遅かった.手がかりが単語条件で意味的類似性の妨害効果が大きかった.今後は,これまでの実験結果をまとめ,補足的な実験とともに総合的な考察を行う予定である.本研究の目的は,線画を用いて同じ妨害項目の中から一つの異なるターゲットを検出する視覚的探索課題において,妨害項目とターゲットの意味的・視覚的類似性の高・低がターゲット検出に及ぼす効果を明らかにすることであった。視覚的類似性はターゲットと妨害項目間の全体的な形の類似性,意味的類似性はカテゴリーによる意味的近さの高・低の主観的評価により操作した。本年度の目的は,主にこれまでの実験結果を総合的に考察することであった。実験結果は以下のとおりである。実験1・2は,ターゲットの先行提示がない(実験1),あり(実験2)条件で,単語探索課題との検出時間の比較を行った.その結果,線画課題では,意味的・視覚的類似性共に低い条件が高い条件より速く対象を検出した。一方,単語課題では,意味的類似性の低い条件が高い条件より速く対象を検出するが,視覚的類似性については差がなかった。実験3は,先行手がかりの効果が概念的なものか視覚的なものかを確認するため,線画探索刺激とは異なる単語を,ターゲットの先行手がかりとして提示する条件を設けた。その結果,先行手がかりの種類によってターゲットの検出時間に差はなく,共に,意味的類似性・視覚的類似性の効果がみられた。次に,実験4として探索刺激を8から4に減じて,刺激数の検討を行った。同時に先行手がかりを線画または単語として,実験3との比較を行った。その結果,意味的類似性,視覚的類似性の各主効果,及び手がかりの種類と意味的類似性の交互作用が認められた。
CDMA移動通信網におけるソフトハンドオフの性能評価に関する研究

CDMA無線セルラーネットワークでは、端末が同時に複数の基地局と通信を行なうソフトハンドオフが可能であり、伝送品質の向上やシステムの容量を増加させることができる。その一方で、ソフトハンドオフによりネットワークの有線部分の付加が増加するため、その影響を明らかにすることが重要である。本研究では、昨年度は回線交換系のシステムを対象として、ソフトハンドオフによって、有線部分の性能尺度である呼損率やハンドオフ時の強制切断率、および無線回線の品質に関して統合的に評価を行なう手法を提案した。本年度は、CDMA上でパケット通信を行なう場合を想定し、上位のトランスポート層プロトコルとしてTCP(Transmission Control Protocol)を適用した場合に、ソフトハンドオフの程度によってTCPのスループットがどのように影響を受けるかを明らかにすることができた。対象とするセルラーネットワークを、ネットワークシミュレータns-2上でモデル化し、シミュレーションによって評価を行なった結果、ネットワーク中で静止している端末に関しては、ネットワークに対する負荷が小さい場合には、ソフトハンドオフによる無線品質の向上の効果で、TCPスループットが大きくなった。しかしながら、負荷が大きくなるにつれ、干渉電力の増大の影響が大きくなるため、ソフトハンドオフを行なうほどTCPスループットが小さくなることが明らかになった。さらに、移動して通信中にハンドオフを行なった端末では、ソフトハンドオフによってコネクションの中断を回避できるため、スループットの低下を抑えることができることが示された。CDMA方式によるワイヤレスセルラー網では、端末が同時に複数の基地局と通信を行なうソフトハンドオフを導入することにより、送信電力を抑えることができる。その結果、無線回線上の伝送特性が向上し、システム全体の収容力が増加する。その一方で、ソフトハンドオフを行なうことによって複数の基地局において有線回線が占有されることを考慮する必要がある。本研究では、CDMA方式におけるソフトハンドオフが、無線回線における伝送特性と、有線回線における性能基準に与える影響を統合的に評価するための手法を提案した。無線回線の特性としては干渉電力を評価の対象とし、有線回線については新しい呼に対する呼損率と、端末の移動によるハンドオフ時の強制切断率を対象とした。まず本研究では、ソフトハンドオフが可能な領域の大きさが、これらの性能に与える影響を解析的に導出する手法を提案した。さらに、呼損率および強制切断率といった有線回線における性能と、無線回線の伝送品質としての劣化率に着目し、これらの性能を統合的に評価する手法を提案した。さらに本提案手法の適用性を示すために、数値例を通じて、ソフトハンドオフ可能な領域の大きさがそれぞれの性能に与える影響を明らかにした。また、有線回線が有限であることによってソフトハンドオフができない端末が存在すると、他の端末に与える干渉電力が大きくなることが考えられる。本研究ではこのような端末による影響を明らかにし、有線回線が不足するような場合には、呼設定制御を行なうことによって、干渉電力を減らすことで性能を向上させられることを示した。
難治性気分障害の新規治療標的の探索～成体海馬神経新生の分子機構の解明から

bFGF依存性に増殖する成体海馬歯状回由来神経前駆細胞(ADP)の培養系を用いて、我々は既にGSK3βが糖質コルチコイドアナログであるdexamethasone(DEX)によるADPの増殖抑制に関与していることを見出していた。また、更にその詳細なメカニズムについて検討したところ、ROCK2がGSK3βの活性調節に関与していること、bFGFとDEXがROCK2の発現を相反的に調節することも見出していた。そこで、実際にin vivoにてROCK2が成体海馬歯状回神経細胞新生に関与しているか否かについて検討すべく、(1) in situ hybridizationを用いてROCK2が実際に成体ラット海馬歯状回神経前駆細胞で発現しているかどうか、(2) in vivoでROCK2が実際に成体ラット海馬歯状回神経前駆細胞の増殖に関わっているかを調べることを目的に、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを用いたROCK2の強制発現系の構築、をそれぞれ行い、後述の通りの一定の成果を得た。1)FGFおよび糖質コルチコイドのROCK2発現調節機構の解明FGFがSH-SY5Y細胞においてROCK2の発現を促進し、糖質コルチコイドアナログであるdexamethasone (DEX)がROCK2の発現を抑制することを既に定量RT-PCRにより見出していたが、これらをWestern Blottingにてタンパクレベルにおいても確認した。現在、グルココルチコイド受容体が実際にROCK2の発現を直接抑制するのか否かを確認すべく、Gel-Shift assayとluciferase assayを行う準備をしているところである。ROCK2がGSK3βのTyr216リン酸化を抑制することを更に確認すべく、今まで行ってきた阻害薬による実験に加えてROCK2のoverexpressionを行う必要があると思われ、その準備を現在行っているところである。同時に、他の細胞系でGSK3βのTyr216リン酸化を直接行うことが知られているPYK2においてその活性化に重要な残基のリン酸化がROCK2によって抑制されるか否かを検討する予定である。また、PYK2の関与を検討すべく、siRNAによるPYK2のknockdownおよびoverexpressionを行うための準備も行っているところである。3)ROCK2およびGSK3βのin vivo neurogenesisにおける機能解析ROCK2、GSK3βが実際にin vivoで成体海馬歯状回の神経前駆細胞に発現していることを確認すべく、これらの分子と神経前駆細胞のマーカーである転写因子SOX2のリボプローブを作成して多重in situ hybridizationを行ったところ、GSK3βは確かにin vivoの成体海馬歯状回の神経前駆細胞に発現していることを見出した。ROCK2については現在行っているところである。また、海馬歯状回への局所注入を行うべく、レトロウイルスを用いたoverexpressionの系の構築を現在行っている。糖質コルチコイドアナログであるdexamethasone(DEX)によるGSK3βのTyr216リン酸化増加にROCK2が関与していること及びFGF2がROCK2の発現を増加させることを既にSH-SY5Y細胞を用いたin vitro実験により示している。そこで、ROCK2が実際にin vivoにおいてFGF2やDEXの成体海馬神経細胞新生への作用に関与しているかどうかを検討すべく下記の研究を実施した。(1)ROCK2が実際にin vivoで海馬歯状回の神経前駆細胞に発現しているのかを明らかにすることを目的に、多重in situ hybridizationを試みた。神経前駆細胞のマーカーとしてはSOX2を採用し、SOX2とROCK2のribo probe用プラスミドを構築してriboprobeを合成し、in situ hybridizationを行った。SOX2は神経前駆細胞が存在する海馬歯状回の顆粒細胞層下帯に比較的特異的に染色され、riboprobeが適切に作成されたことが確認された。しかし、ROCK2のriboprobeはなかなか適切に染色されるものが得られず、複数のriboprobeを作成して検討しているところである。(2)ROCK2を成体ラット海馬歯状回で強制発現およびノックダウンすることを目的に、レトロウイルスベクターの作成を試みた。In vivoで使用する前にin vitroで予備的検討を行ったが、ウイルスは十分量得られたにもかかわらずなかなか十分に感染せず、レトロウイルスを断念してレンチウイルスを使用することに変更し、現在レンチウイルスベクターを作成しin vitroでの予備的検討を行なっているところであるが、こちらの方は感染させ強制発現およびノックダウンを行うことに成功した。今後、in vivoでの使用に向けて更なる検討を行なっていく予定である。
教師と子どものより円滑な意思疎通を目的とした子どもの語彙や発話の分析研究

研究目的:子どもの語彙の特徴、言葉の品詞,組み立て方などを分析することで,教師は子どもが理解しやすい語彙、言葉や順序,情報量を選択して話し、より円滑な意思疎通が可能になると考える。それは教師と子どもの信頼関係を育むことにつながる。教師と子どものより円滑なコミュニケーションの在り方を検討し、実践の改善に資するデータを得ることを目的とする。研究方法:日々の幼稚園での遊びや生活において,子どもが話している言葉の構成を分析する。研究成果:5月の記録では、子どもの発言は目的語のみ、述語のみが多く、教師もできるだけ少ない言語の構成要素で話す必要があると考えた。また、話している内容は、教師が尋ねた内容よりも、子どもの関心がより強い方について答えている場合が多かった。子どもが何を伝えたいと思っているかを掴み、教師の問いかけを変えていく姿勢が必要だ。7月の記録では、教師が話している話題と異なる話を始める子どもがいた。2月と比べ、一つの話題について話を続けることのできる時間が短い。ここでは、水遊びで行った一つの遊びについて掘り下げて話をしたが、実際にその遊びをしていた子どもは全員ではないため、興味の持続が難しい。どの子どもも話に興味を持つことのできるよう、全員が発言できるような内容の選択が意思疎通を生み出す機会として重要である。2月の記録では、今日していた遊びの楽しかったことを問いかけ、様々な子どもが答えている。ここでは、主語、述語、目的語、補語を組み立てて話をしている子どももいる。子ども同士で発言を聞き合うことで、発言の得意な子どもの話し方が、他児にとって良いモデルとなることを感じ、発言のしやすい内容、例えば楽しかったことや好きなものなどで、話す機会を多く設けていきたいと感じた。
Pax6変異ラット脳に見られるアストロサイトの異常と神経機能異常との関連

我々はこれまでに、転写因子をコードするPax6遺伝子の変異ラットでは海馬の神経新生が低下しており、またアストロサイトの形態異常が認められることを見いだしている(Maekawa et al.,2005)。一方、行動学的解析により、Pax6変異ラットでは社会性の異常などが認められており、このラットは生後神経新生やアストロサイトの形態と脳高次機能との関連を解析する上での格好のモデル動物である。そこで本年度は、生後神経新生におけるPax6の機能を詳細に解析するため、Pax6の下流制御遺伝子としてのfabp7(fatty acid binding protein)に着目し、FABP7発現細胞の性質を検討した。その結果、野生型ラット海馬では、FABP7発現細胞のほとんどがPax6を共発現しており、またPax6変異ラットではFABP7発現細胞数が減少していた。胎生期脳ではFABP7は神経上皮細胞の未分化性維持に機能していることから(Arai et al. 2005)、生後海馬においてもFABP7はPax6の標的遺伝子として神経新生の制御に関わっている可能性が考えられる。またPax6は生後大脳皮質のGFAP陽性アストロサイトにも発現が見られる。In vivo、in vitroにおいて大脳皮質アストロサイトの形態を検討した結果、野生型と比べてPax6変異ラットのアストロサイトは突起伸展率が低下していた。以上の結果から、転写因子Pax6はFABP7を介して神経幹細胞の増殖を制御し、また分化したアストログリアの形態を制御している可能性が示唆された。神経新生(神経細胞とグリア細胞の産生)という現象は主に神経幹細胞が多く存在する胎児期の脳神経系で盛んに起こる現象であるが、近年成体脳の局所的な領域(海馬歯状回及び側脳室の脳室下帯)においても神経幹細胞が存在し、神経新生が起こっていることが広く知られている。我々はこれまでに、転写因子であるPax6遺伝子が海馬歯状回で発現していること、またPax6遺伝子に変異を持つ成体ラットでは歯状回の神経新生が減少していることを見いだしてきた。そこで今回は、歯状回でPax6を発現している細胞の特性と、Pax6変異ラット歯状回の組織構築を免疫電顕法及びBrdU標識法により詳細に解析した。歯状回で増殖している細胞はその特性から幾つかのタイプに分類されるが、NestinやMusashiといったマーカーの発現、また電顕による形態学的解析により、Pax6はタイプIと呼ばれる早期前駆細胞で主に発現していること、PSA-NCAMを発現するタイプIIではほとんどその発現が見られないことが明らかとなった。また海馬歯状回におけるPax6遺伝子の機能を解析する目的で、Pax6変異ヘテロラットの海馬を調べた。その結果、Pax6変異ラットではタイプI細胞の増殖率が非常に低下していることが明らかになった。またPax6変異ラット歯状回ではアストロサイトの突起伸展が異常であることも見いだした。これらの結果より、Pax6は成体海馬歯状回において、タイプI細胞の増殖もしくは維持、またアストロサイトの正常な分化に必要であることが予測された。
遺伝子導入と白血病抑制因子(LIF)ノックアウトマウスによる実験系の確立

下垂体特異的な白血病抑制因子(LIF)の発現とホルモン産生の制御、細胞増殖についてトランスジェニックマウスモデルを用いて、LIFの過剰発現が低身長、低体重を引き起こす事を分子生物学的方法で解析した。成長ホルモン産生細胞株の注入実験でもLIFの過剰発現と骨変化、特に下顎骨成長は相関がみられた。軟部組織創傷治癒の異常機転モデルである、ケロイドの細胞培養系を用いて、受容体型チロシンキナーゼの発現と病態解析を行なったところ、正常線維芽細胞に比し、ケロイド由来の線維芽細胞では、I型インスリン様成長因子(IGF-1)受容体の過剰発現が認められた。一方、ケロイド由来線維芽細胞にたいする浸潤性は、IGF-1添加により、強く認められ、IGF-1中和抗体によって、その浸潤性は減弱した。即ち、ケロイドの浸潤性には、IGF-1及びIGF-1受容体系を介した、情報伝達が関与している事が判った。LIFでは、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚炎症疾患において有意に発現上昇しており、LIFの過剰発現が、局所免疫に関与すると推測し、マウスの同種皮膚移植モデルを用い、LIFの局所過剰発現による同種移植免疫に対する効果を検討した。サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、マウスLIF cDNA挿入し、ウシスプライシングで発現したプラスミドを用いてB6D2F1及びBALB/c系間で、同種皮膚移植した。LIFcDNAを発現した移植群では、移植後12時間から24時間までにLIFの過剰発現が増強し、72時間まで発現を認めた。移植儀3週では、LIF群は有意に同種移植を寛容しており、また、LIFの情報伝達受容体であるgpl30およびそれとへテロ結合するLIF固有受容体共に、発現を認めた。即ち、LIFの過剰発現により、移植細胞性免疫の寛容を認めた。尚、この移植の際、ヘルパーT細胞のうち、IL-2を産生するThl細胞の関与をRT-PCR法で確認できず、IL-10を産生するTh2細胞の関与は非常に微弱であった。創傷治癒過程における、白血病抑制因子(LIF)の発現、役割について研究を行なった。トランスジェニックマウスモデルを用い、下垂体に特異的に発現されたLIFは、下垂体成長ホルモン産生細胞のRathke′s嚢への形質転換を引き起こし、成長ホルモンの減少化とIGF-1の低下を来した。更に、下垂体での燐酸化CREB発現の著明な減少も見られ、転写因子の関与を伺わせた。また、個体全般では低成長、低体重を認め、局所のペプチドの過剰発現が形質に多大な影響を与え得ることが確認された。次に、成長ホルモン産生腫瘍株(GH3)のラットヘの注入実験では、全身性に過成長を認め、末端肥大症様の頭蓋骨変化を来した。即ち、下顎骨頭部の過成長、頭蓋冠の肥厚を認めた。これら下顎骨、頭蓋骨のin situ hybridization法によるLIFの発現実験では、頭蓋骨類骨部、下顎骨骨頭軟骨移行部での有意なシグナル増加を認めた。以上より、骨代謝とLIFが局所において相関することが判った。更に、ラット背側皮弁を用いたLIFの添加実験では、ゲルフォームを用いた徐放性基剤から放出によって対照群よりもむしろ皮弁生存を悪化させる結果であった。

これは、皮膚軟部組織では、臨床的に乾癬などの炎症疾患にLIFがよく相関することに対比し、局所での炎症性反応を引き起こしたと考えられる。皮弁延長に効果のあるbFGFを用いた、LIFとの混合群、bFGF単独群との比較では、混合群が、対照群と同程度の皮弁効果を示し、bFGFとLIFは異なる情報伝達経路を介すことが皮弁実験でも示された。また、悪性黒色腫を初めとする軟部悪性腫瘍では、病期によって、腫瘍の悪性度によってLIFの血中値が相関することが示され、また、急性広範囲熱傷では予後に相関することが示され、今後の更なるin vitro実験へ興味を引き継がせた。創傷治癒の異常機転モデルである、ケロイドの細胞培養系を用いて、受容体型チロシンキナーゼの発現と病態解析を行なったところ、正常線維芽細胞に比し、ケロイド由来の線維芽細胞では、I型インスリン様成長因子(IG F-1)受容体の過剰発現が認められた。更に、血清添加群とIGF-1添加群の細胞増殖能の比較ではIGF-1添加によって増殖性は認められなかった。一方、ケロイド由来線維芽細胞にたいする浸潤性は、IGF-1添加により、強く認められ、IGF-1中和抗体によって、その浸潤性は減弱した。即ち、ケロイドの浸潤性には、IGF-1及びIGF-1受容体系を介した、情報伝達が関与している事が判った。また、局所因子、サイトカインの中で、白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)は、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚炎症疾患において有意に発現上昇しており、LIFの過剰発現が、局所免疫に関与すると推測し、マウスの同種皮膚移植モデルを用い、LIFの局所過剰発現による同種移植免疫に対する効果を検討した。サイトメガロウィルスプロモーターの下流に、マウスLIFcDNA挿入し、ウシスプライシングで発現したプラスミドを用いてB6D2F1及びBALB/c系間で、同種皮膚移植した。LIFcDNAを発現した移植群では、移植後12時間から24時間までにLIFの過剰発現が増強し、72時間まで発現を認めた。移植儀3週では、LIF群は有意に同種移植を寛容しており、また、LIFの情報伝達受容体であるgp130およびそれとヘテロ結合するLIF固有受容体共に、発現を認めた。即ち、LIFの過剰発現により、移植細胞性免疫の寛容を認めた。尚、この移植の際、ヘルパーT細胞のうち、IL-2を産生するTh1細胞の関与をRT-PCR法で確認できず、IL-10を産生するTh2細胞の関与は非常に微弱であった。
高効率分子デバイスを目指した分子積層膜構築のためのコンビナトリアル表面ナノ化学

本研究は、種々の機能性分子ユニットを合成し,表面での錯形成を利用した各ユニットの逐次積層化により電位傾斜や外部刺激応答性をもつ表面ナノ積層構造をコンビナトリアル化学の手法で作製し,高効率なエネルギーおよび情報変換デバイスの創製を目指した。研究期間中に、層間にレドックス電位傾斜を持たせた表面ナノ積層構造の構築と整流素子への応用について検討した。固液界面への金属錯体モジュールの自己組織化膜形成にホスホン酸基をアンカーとしてもつ四脚型配位子を用いることで表面からの分子の配向を制御した。それに続く逐次的な錯形成によるナノ分子積層膜の構築についても検討した。積層膜のXPSの角度依存性から積層膜内での分子の交換反応は起こらないことが確認できた。また、構成ユニット分子の表面への積層の際にコンビナトリアル化学的手法の導入により、ポテンシャル傾斜を導入し電気化学的手法によりその整流作用について調べた。まずレドックス活性ならびに光応答性機能をもつ金属イオン(RuおよびOs)とホスホン酸基をもつ配位子との組み合わせから,ビス(ターピリジル)ベンゼンで架橋された二核錯体およびビス型単核錯体を新規に合成し、これらの錯体の酸化電位はRu>Osであるので、表面からの順番を変えることで電位傾斜を任意に変化させることが可能である。表面からの錯体分子モジュールの順番を変えることで積層膜内のコンビナトリアル化学が可能である.表面からITO電極||Ru-Ru(二核)|Ru-Ru(二核)|Ru(単核)とITO電極||Ru(単核)|Ru(単核)|Ru-Ru(二核)と三層積層した場合とで電気化学測定を行った場合、溶液での酸化電位がRu-Ru(二核)よりRu(単核)の方が高いので,電位勾配が生成し電子移動の方向が制御できることを明らかにした。また、横方向の二端子間の配線法として、DNAを配線材料としてDNAを捕捉可能な分子を表面に固定し、溶液からDNAを捕捉することで、配線する方法を提案した。特に、表面分子を固定したAu/SiO_2パターン基板上でのAu基板上での選択的なDNA捕捉によりAu-Au間でのDNAをテンプレートとしたナノ配線に成功した。本研究は、種々の機能性分子ユニットを用意し,表面での錯形成を利用した各ユニットの逐次積層化により電位傾斜や外部刺激応答性をもつ表面ナノ積層構造をコンビナトリアル化学の手法で作製し,高効率なエネルギーおよび情報変換デバイスの確立を目指している.初年度は、層間にレドックス電位傾斜を持たせた表面ナノ積層構造の構築と整流素子への応用について検討した。固液界面への金属錯体モジュールの自己組織化膜形成ならびにそれに続く逐次的な錯形成によるナノ分子積層膜の構築については検討してきた。今回はホスホン酸基をアンカーとしてもつ四脚型配位子を用いることで表面からの分子の配向を制御した。特に、構成ユニット分子の表面ナノ積層膜の構築にコンビナトリアル化学的手法の導入により、ポテンシャル傾斜を導入し電気化学的手法によりその整流作用について調べた。

まずレドックス活性ならびに光応答性機能をもつ金属イオン(RuおよびOs)とホスホン酸基をもつ配位子との組み合わせから,ビス(ターピリジル)ベンゼンで架橋された二核錯体およびビス型単核錯体を新規に合成した。これらの錯体の酸化電位はRu>Osでり、またターピリジン基をもつ二核錯体の方が高電位側で酸化される。これらの酸化電位の違いは表面からの順番を変えることで電位傾斜を任意に変化させることが可能である。表面からの錯体分子モジュールの順番を変えることで積層膜内のコンビナトリアル化学が可能である.表面からITO電極||Ru-Ru(二核)|Ru-Ru(二核)|Ru(単核)とITO電極||Ru(単核)|Ru(単核)|Ru-Ru(二核)と三層積層した場合とで電気化学測定を行った場合、溶液での酸化電位がRu-Ru(二核)よりRu(単核)の方が高いので,電位勾配が生成し電子移動の方向が制御できることを明らかにした。また、平滑ITO基板上での原子間力顕微鏡による観察において、単核錯体では基板から1.6nm,二核錯体では3.5nmと錯体の分子構造モデルから予想して、分子が基板から垂直に立っていると考えた場合の高さに近い値となった。単核ならびに二核錯体の積層化に伴う吸光度の変化と積層数とは直線となることから積層が規則的に起きていることが明らかとなった。電気化学的な電流値は積層数とともに二核錯体で飽和になることがわかった。これらの知見をもとに,表面ナノ積層構造での電子ホッピングや触媒電流についても新しい知見が得られた。本研究は、表面での自己組織化膜と錯形成を利用した機能性ユニットの逐次積層化により電位傾斜をコンビナトリアル化学の手法で自在にコントロールし、表面での電子移動方向の制御ならびに外部刺激応答性をもつ表面ナノ積層構造を作製し,高効率なエネルギーおよび情報変換デバイスの確立を目指している.初年度に続き、2年目の本年度は、中心金属としてルテニウムおよびオスミウム、アンカー基としては四脚型ホスホン酸基を有する三座配位子をもつ単核および二核錯体を、固体表面上で任意の順番に組み合わせて,多積層錯体膜を作製した。マイカ基板上に8層積層した膜の断面TEM像からきれいに30nmで均一に積層されている様子が観測され、分子が基板から垂直に立っていると考えた場合の予想される高さに近い値となった。錯体の酸化電位はRu>Osであり、また二核錯体の方が高電位側で酸化される。これらの酸化電位の違いは固体表面からの順番を変えることで電位傾斜を任意に変化させることで、電位勾配による電子の整流作用を付与することが可能である。さらに、最外層にプロトン共役電子移動可能なビス(ベンズイミダゾリル)ピリジンをもつ単核錯体を用いて、表面からITO電極‖Ru-Ru(二核)‖Ru(単核)の構造をとる二層積層膜において、pH誘起の分子スイッチを構築した。溶液のpHを変化させて電気化学測定を行うと、pH上昇に伴い、低電位側のRu(II/III)酸化波がより負電位側にシフトするとともに二層間のポテンシャル差が増大し、電子移動がブロックされるために最初可逆的に見えた低電位側のRu(II/III)酸化波の還元ピーク電流値が減少し最外層にRu(III)が蓄積されることがわかった。さらに、Ru二核錯体の3積層膜とヘキサシアノ鉄(II)酸イオンとの触媒的酸化反応について回転ディスク電極法を用いて検討し、膜との間の電子移動速度を決定することができた。
ｓＲＡＧＥに着目した脳死移植時代のあらたな肝、小腸虚血再灌流障害抑制法の開発

本研究では国内で2010年より急速に増加している脳死ドナーからの臓器活用拡大を目指し、効果的な肝虚血再灌流障害の治療法開発を目指した。各種炎症性疾患で治療標的として注目されている核内タンパクHigh mobility group box-1 (以下HMGB1)とその可溶性受容体(sRAGE)に着目し研究・開発を進めた。sRAGEを産生するアデノウィルスベクターの作製に難渋したが、代わりにHMGB1阻害作用を持つ別のタンパクHMGB1Aboxを産生するアデノウイルスベクターの作成に成功した。このウイルスベクターをラットの門脈に投与することで、ラット急性肝不全モデルの予後が改善することを示した。本研究では、国内で2010年より急速に増加している脳死ドナーからの臓器活用拡大を目指し、効果的な肝虚血再灌流障害の治療法を開発する。各種炎症性疾患で治療標的として注目されている核内タンパクHigh mobility group box-1 (以下HMGB1)とその可溶性受容体(sRAGE)に着目し、遺伝子治療、細胞移植、体外循環治療などの特殊技術に絡め、研究・開発を進める。平成24年度までにHMGB1 A box cDNAを発現するアデノウィルスベクターの作製を行った。具体的にはラット初代培養肝細胞にAdex-Aboxを添加、37°Cにて1時間培養し感染を成立させ、培養上清中のAboxをWestern blotにて確認した。次にラット肝虚血再灌流障害モデルの作製に取り掛かっている。本研究では、国内で2010年より急速に増加している脳死ドナーからの臓器活用拡大を目指し、効果的な肝虚血再灌流障害の治療法開発を目指した。各種炎症性疾患で治療標的として注目されている核内タンパクHigh mobility group box-1 (以下HMGB1)とその可溶性受容体(sRAGE)に着目し、遺伝子治療、細胞移植、体外循環治療などの特殊技術に絡め、研究・開発を進めた。HMGB1は敗血症などの病態で新たな炎症メディエーターとして注目されている。平常時にはDNAの構築や維持の役割を果たしているが、組織障害が生じると、壊死した細胞からHMGB1が放出され、このHMGB1が免疫細胞のRAGEやTLRを通して炎症シグナルが伝達されていく。本研究では平成25年度までにHMGB1 Aboxを発現するウイルスベクターを作成していた。HMGB1 AboxはHMGB1を構成するタンパク質の一部であるが、このHMGB1 Aboxが大量に存在するとHMGB1に代わり膜受容体と結合し、HMGB1の受容体への結合を阻害することで炎症を抑制すると考えられた。このHMGB1Aboxを発現するウイルスベクターをラットの門脈に投与し、投与後72時間で肝臓においてAboxタンパクが発現することを確認した。そこで、ラットの薬剤誘導性急性肝不全モデルを作成し、肝不全発現の72時間前にラット門脈にウイルスベクターを導入した。ウイルスベクター導入群は非導入群と比較して、肝機能、炎症性サイトカイン、予後が改善することを示した。(1)小動物を用いた肝、小腸の虚血・再灌流障害モデル、さらには移植モデルにおいて、a) sRAGEの遺伝子導入療法、b) sRAGE産生性肝細胞の細胞移植、c)sRAGE産生性肝細胞内臓リアクターを用いた体外循環治療等の障害改善効果の検討、(2)さらにsRAGE関連治療の臨床応用を念頭に、生体・脳死の肝・小腸移植レシピエントにおける、HMGB1、sRAGE動態の検討を目標として研究を開始した。次に平成23年度の実施計画につき評価する。HMGB1 A box cDNAを発現するアデノウィルスベクターついては、COS-TPC法を用いて、sRAGE cDNAを組み込んだ組換えアデノウィルス(Adex-sRAGE)を作製中である。本研究においてはAdex-sRAGEを大量に必要とするため、現在Adex-sRAGEの大量産生を試みている段階である。sRAGE産生性肝細胞の作製と体外循環型リアクターへの埋め込みについては準備をすすめている段階である。COS-TPC法を用いて、HMGB1 A boxアデノウィルスベクターはすでに作製し、大量生成しており、同様にsRAGEで行うのみであるが、現時点ではCOS-TPC法でHMGB1 sRAGEcDNAを組み込んだ組換えアデノウィルスを作成中である。

本研究では、効果的な肝虚血再灌流障害の治療法を開発するべく、HMGB1とsRAGEに着目し、各種実験を計画した。現在、遺伝子治療、細胞移植、体外循環治療などにつき準備を進めている段階である。当グループはAdex-Aboxにて同様の研究を並行して実施しており、すでに結果を残している。sRAGEが大量生産できれば本研究を順調に遂行できると考えられる。ラット肝虚血再灌流障害モデルを作成中であり、並行してHMGB1 A boxアデノウィルスベクターと同様にsRAGE産生性肝細胞の作製に取り掛かる予定である。我々はラット急性肝不全モデルでAbox遺伝子導入効果の実験をすでに施行してるため、同様にラット肝虚血再灌流障害モデルでsRAGE遺伝子導入効果の検討を行う。評価項目としては、血漿中GOT、GPT、LDH、IL-1、IL-6、TNFα、HMGB1、sRAGE、肝組織中IL-1、IL-6、TNFα、HMGB1、肝組織H.E光顕像、TUNEL染色、肝生体顕微鏡像、生存率などがあげられる。さらに、ラット肝・小腸虚血再灌流障害モデルにおけるsRAGE産生性肝細胞移植の効果の検討、ラット肝・小腸虚血再灌流障害モデルにおけるsRAGE産生リアクター治療効果の検討、ラット肝移植モデル、小腸移植モデルにおけるsRAGE関連strategyの効果の検討を予定している。さらにはブタ肝移植モデル、小腸移植モデルにおけるsRAGE遺伝子導入効果も検討しており、臨床応用のためには大動物で結果が得られることが重要であると考えている。I(A)ラット部分肝虚血モデルにおいて、虚血24時間前にAdex-sRAGEを門脈内に投与し、経時的に各種パラメータを検討する。(B)ラット小腸虚血モデルにおいて,虚血24時間前にAdex-sRAGEを門脈内に投与し、各種パラメータを比較検討する。(C)前述のモデルにおいて、門脈あるいは脾臓内にsRAGE産生性肝細胞を虚血24時間前に注入し、再灌流後同様のパラメータを測定し評価する。(D)前述と同様のモデルにおいて、再灌流と同時にsRAGE産生リアクターを接続、灌流を行う。虚血再灌流障害の抑制効果を、同様のパラメータを測定し評価する。II.ラット肝移植モデル、ラット小腸移植モデルにおいて、温冷虚血を実施し、次のsRAGE関連strategyの効果の検討をする。ラット肝移植モデルにおいてはi)移植24時間前にAdex-sRAGEをドナー門脈内に投与、ii)移植24時間前にsRAGE産生性肝細胞をレシピエント脾臓内に投与、iii)再灌流と同時にレシピエントにsRAGE産生リアクターを接続し灌流を行う。ラット小腸移植モデルにおいては、iv)移植24時間前にAdex-sRAGEをレシピエント門脈内に投与、v)移植24時間前にsRAGE産生性肝細胞をレシピエント脾臓内に投与、vi)再灌流と同時にレシピエントにsRAGE産生リアクターを接続し灌流を行う。IIIブタ肝移植モデル、小腸移植モデルにおけるsRAGE遺伝子導入効果の検討を行う。ドナーをKCl静注にて心停止させ,阻血した後肝全摘または回腸40cmを摘出、冷保存し,レシピエントに移植する。