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日米同盟における国際法規範の役割に関する学際研究

本年度は、3年間にわたる研究プロジェクトの最終年度に当たる。本年度は、昨年度末に東京で行った第2回全体会合での意見交換を踏まえて、前年度と同様、各自でさらに研究を進めた。その後、年度末(2019年3月)に最後の全体会合を米国ニューヨークのコロンビア大学ロースクールで開催し、最終年度としての研究成果に向けて最後の意見交換を実施した。同会合では、テーマを「第一部武力行使と自衛の概念」、「第二部国内意思決定過程における武力行使と自衛」、「第三部共同行動(joint operations)の文脈における武力行使と自衛(台湾問題、朝鮮半島問題、サイバー空間、宇宙空間)」といった各セッションに分けたうえで、日米英で活動する研究者を招き、これらの細部テーマに即して意見交換を実施している。今年度は、前年度の会合とは異なり、主として、台湾問題、サイバー・宇宙空間の文脈に重きを置いて意見交換を行った。具体的には、前年度で判例および国家実行で明らかにされた国際法上の武力行使をめぐる一般的な日米両国の認識の違いが、これらの文脈のどのような局面で具体的に問題となりうるのかといった点が焦点となった。さらに、以上の文脈において米国の関係国内法(台湾関係法等)と日本の関係国内法(平和安全法制等)が、日米両国の考える関係国際法の枠組みの解釈適用(日米安保条約5条および6条を含む)と実際の共同行動においてどのように作用しうるのかについても意見交換を重点的に行った。これらを踏まえた議論は、日米両国の参加者の研究成果にそれぞれ反映されている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。国際法規範は、はたして日米同盟の実施運用そしてさらなる強化を支える「共通言語」ないし「共通のロジック」たり得るのか。つまり、国際法規範は日米同盟にとって本当に重要なのか。本研究は、以上を問題意識に、国際法さらにはその他の法的拘束力を有さない国際規範の諸枠組みが、(1)日米の同盟・安全保障実務における国内的平面と国際的平面双方のどのレベルにまで実際に依拠されているのか、あるいはされていないのか(単なるレトリックに過ぎないのか)、そして(2)それはなぜなのかを、武力行使の観念と自衛権の射程をめぐる両国のギャップに焦点を当てつつ、法学と政治学の視点から明らかにすることを目的としている。初年度では、研究体制の構築(全体テーマに関する問題意識の共有、および具体的な個別テーマ毎の役割分担の確認)に努めた。具体的には、電子メールをベースに、各自の構想についてメンバー間で調整を行いつつ研究作業を開始し、年度末にニューヨークのコロンビア大学で全体会合を開催し、意見交換を行った。同会合では、第一部武力行使と自衛の概念、第二部国内意思決定過程における武力行使と自衛、第三部共同行動の文脈における武力行使と自衛(朝鮮半島、南シナ海、サイバー空間、宇宙空間)とに分けてセッションを公開して意見交換を行った。米国大統領選挙の予期せぬ結果によりメンバー構成に変動が生じたものの、最終的には、当初より想定された、全体テーマに関する問題意識の共有および役割分担の確認、ならびに全体会合の実施といった実施計画をすべて達成することができた。このため、本研究プロジェクトは、おおむね順調に進展していると判断した次第である。本年度は、3年間にわたる研究プロジェクトの2年目に当たる。前年度末にニューヨークのコロンビア大学で行った第1回全体会合での意見交換を踏まえて各自でさらに研究を進めた。そのあと、年度末(3月)に昨年度と同様に全体会合を開催し、それぞれの研究成果を持ち寄って意見交換を実施した。同会合では、第一部武力行使と自衛の概念、第二部国内意思決定過程における武力行使と自衛、第三部共同行動の文脈における武力行使と自衛(朝鮮半島、南シナ海、サイバー空間、宇宙空間)のセッションに分けて実施している。意見交換の結果、日米両国間の国際法上の武力行使と自衛権の概念をめぐる理解には大きな違いが存在し、とりわけ「武力」とは何か、そして自衛権の発動条件である「武力攻撃」とは何かをめぐり日米間には大きなへだたりがあることが改めて浮き彫りになった。また、その背景には国際司法裁判所のニカラグア事件やオイルプラットフォーム事件での判断をめぐる両国の評価、さらには両国の歴史(とりわけ米国にとってはカロライン事件、日本にとっては日本国憲法第9条)が大きな要因となっていることも確認された。各国の国内意思決定過程では、米国が大統領の武力行使権限が大きく、議会のコントロールをどのように及ぼすかが問題となるのに対して、日本は立法府である国会の承認を通じた武力行使権限のコントロールが極めて重要な位置を占めることが確認されるなど、両国において国際法上の武力と自衛権を行使する際に果たす立法府と行政府の役割についてさらに検討を加える必要性も明らかになった。これらの要素は、個別事案に沿ってさらに検討が加えられ、それぞれの研究成果各種学術媒体で公刊された。本年度で計画されていた各自の研究成果を報告する全体会合を実施し、有意義な成果を得ることができたため、順調に進展していると判断した次第である。

同会合では、テーマを「第一部武力行使と自衛の概念」、「第二部国内意思決定過程における武力行使と自衛」、「第三部共同行動(joint operations)の文脈における武力行使と自衛(台湾問題、朝鮮半島問題、サイバー空間、宇宙空間)」といった各セッションに分けたうえで、日米英で活動する研究者を招き、これらの細部テーマに即して意見交換を実施している。今年度は、前年度の会合とは異なり、主として、台湾問題、サイバー・宇宙空間の文脈に重きを置いて意見交換を行った。具体的には、前年度で判例および国家実行で明らかにされた国際法上の武力行使をめぐる一般的な日米両国の認識の違いが、これらの文脈のどのような局面で具体的に問題となりうるのかといった点が焦点となった。さらに、以上の文脈において米国の関係国内法(台湾関係法等)と日本の関係国内法(平和安全法制等)が、日米両国の考える関係国際法の枠組みの解釈適用(日米安保条約5条および6条を含む)と実際の共同行動においてどのように作用しうるのかについても意見交換を重点的に行った。これらを踏まえた議論は、日米両国の参加者の研究成果にそれぞれ反映されている。次年度は、初年度の全体会合での意見交換を踏まえて各自が担当分野について研究を進めたのち、今度は、場所を日本に移して第二回の全体会合を開催して、最終年度に向けた準備を整えたい。次年度は、昨年度の第2回全体会合での意見交換を踏まえて各自が担当分野について研究を進めたのち、年度末に場所を再びニューヨークに移して本研究プロジェクトのまとめを行う最終会合を開催し、最終成果報告に向けた準備を整えたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
認知行動療法的観点からの吃音の病態理解、および事例研究による効果検証

平成30年度は、平成29年度に引き続き、コミュニケーションの満足度をアウトカムとして設定したうえで、即時的回答法(Ecological momentary assessment)を用いた測定を8名の吃音のある成人に対して実施した。データ分析の結果、ネガティブ感情は、吃音症状やそれに対する対処(「流暢に話そうとする」「吃音に注意が奪われる」など)・コミュニケーションの満足度と関連する一方、ポジティブ感情はコミュニケーションに対する集中やコミュニケーションの満足度と関連する可能性があることが明らかとなった。このことは、吃音のある成人に対して、ネガティブ感情・ポジティブ感情の影響を考慮しつつ、認知行動療法的な働きかけを行うことが有効である可能性があることを示唆している。さらに、吃音のある成人の社交不安の特徴を明らかにするため、328名の吃音のある成人のLiebowitz社交不安尺度(LSAS)の回答に対して因子分析を行った。その結果、吃音のある成人のLSASの因子構造は(吃音のない)不安症のある人とは異なること、また、吃音のある成人の社交不安は、主に発話を伴わない場面では低く、電話場面で高まることが明らかとなった。このことは、吃音のある成人の社交不安の臨床症状は、(吃音のない)不安症のある人とは異なり、その特徴に合わせた治療アプローチが必要であることを示唆している。加えて、LSASを含む様々な質問紙を用いて、吃音のある成人245名のデータに対する統計解析を行ったところ、吃音のある成人の社交不安はコミュニケーションの困難と直接的な関連が強いことがわかり、社交不安の緩和にはコミュニケーション困難を緩和させることが有効であることが示唆された。これらの研究成果は、吃音のある成人の社交不安の特徴を明らかにするとともに、日常生活の社交場面における病態理解を行った点で意義がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、吃音のある成人の問題維持を認知行動療法的観点から明らかにすることを第一の目的とし、アウトカムとして自覚的吃音症状とコミュニケーションの満足度を設定した。また、吃音症状には変動性があることが知られており、日常生活における問題の維持をより生態学的妥当性の高い形で捉えるために、Ecological Momentary Assessment(EMA)と呼ばれる即時的回答法を用いた。平成29年度は第一に、日常生活での発話を伴う社交場面におけるEMAを用いた予備的な測定を8名の吃音のある成人に対して実施し、測定が確実に行われることを確認し、測定項目を確定させた。そのうえで、19名に対する測定を実施した。全体として、自覚的吃音症状とコミュニケーションの満足度は強く負に関連しており、自覚的吃音症状には吃音に注意が奪われる注意バイアスが、コミュニケーションの満足度にはコミュニケーションに対する集中が強く関連することが明らかとなった。また、注意バイアスとコミュニケーションへの集中は、互いに弱い関連しか示さなかった。このことは、両者は独立した問題の維持要因であり、それぞれに対する治療的介入が必要であることを示唆している。また、特性的な社交不安は注意バイアスと正に関連し、特性不安はコミュニケーションに対する集中と負に関連することが示され、心理特性に応じて問題となる要因が異なることが示唆された。さらに、当初の計画に加えて、吃音のある成人の社交不安の特徴を明らかにするための調査を行った。

吃音のある成人の社交不安を、先行研究で報告されている不安症のある人と比べた結果、主に発話を伴わない場面では低く、電話場面で高いことがわかった。このことは、吃音のある成人は、発話が関連する社交場面で特に困難を感じることを示唆している。吃音のある成人を、自助団体・研究所HP等を介して募集したが、十分に参加者が集まらなかったため。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当初目標の30名に到達するよう、追加で参加者の募集を行う。
マイクロマシン応用能動自律センサー生体埋込み型センサー

平成5年度平成7年度、文部省の科学研究費を得て、医学、工学それぞれ3名の異種研究分野の専門的知識を結集して、マイクロマシン技術応用の新しい自律能動センシングデバイスを実現すべく以下のことを実施し、好結果を得た。(1)超音波をかけながら白金黒を電解折出させると高強度バイオセンサの基盤ができる。この発見は広く化学センサ全般に与える影響が大である。(2)血液付着の超音波洗浄効果を実験的に確かめ、センサ機能の劣化のないことを確認した。洗浄は血液とセンサ表面とのずれ力(剪断力)に依存する新しい知見も得られた。(3)洗浄液容積0.2mlの超小型ランジュバン方式の超音波洗浄槽の試作に成功し、針型センサの付着血液の洗浄に極めて有効であることを実験的に確かめた。(4)前項の超音波洗浄槽は消費電力約1W、共振周波数171KHz(RF)であり、世界で最小のものである。(5)センサ部と超音波洗浄槽との有機的結合機構の開発はこれからの課題である。(6)移動機構には超音波モータ、従来型の小型モータ駆動が考えられる。後者も有力である。(7)更に変換効率のよい、安定なバイオセンサの開発は必要である。後者も有力である。1.異種研究分野の専門的知識を結集して新しい自律能動センシングデバイスを実現すべく以下のことを実施し、好結果を得た。(1)全体総合討議会を2回実施し、さらに各分野の最先端技術の調査、検討、問題点の討議を行った。(2)血液付着の超音波洗浄は極めて有効なクリーニング手法であることが判った。(3)超小形、低エネルギーの超音波洗浄装置の開発必要。(4)超音波洗浄に長期間耐える針型グルコースセンサ必要。2.異種研究分野の専門家の集中討議は極めて有効であった。E側主張のマイクロマシン技術の導入は、生体機能の複雑さに加え、血液の物性など未解決の問題が多く、直ちに応用は困難を伴うことが判ったそこで、現時点の超小形部品を利用して、センサ、アクチュエータの一体化を計り、体外で機能を確認し、マイクロマシン技術を導入して目的を達成するのが近道であることが判明した。特にセンサの耐久性には無機機能材が有効である。クリーニングには超音波が有効であり、超小形、低消費エネルギーのランジュバン型の応用が有効であることを確かめた。3.個別に得られた、マイクロセンサおよびアクチュエータの試験結果に基づき、企画、計測の再検討および一体化技術の工夫を行う。さらに、治療制御システムの開発を実施し生体埋め込み型能動自律センサの実現を計る。異種研究分野の専門的知識を結集して新しい自律能動センシングデバイスを実現すべく以下のことを実施し、新しい成果を得た。(1)全体総合討議会を2回実施し、各分野の最先端技術の相互理解と問題点の討議。(3)血液付着の超音波洗浄は極めて有効なクリーニング手法である。(4)超音波洗浄に耐える白金黒の電解折出手法は超音波振動液中で実施すればよいことが判明した。従来の手法では白金表面で剥離する。(5)超音波中の電解折出で作ったバイオセンサは60分以上の超音波洗浄に十分耐える。(6)超小型洗浄槽を円筒型ランジュバン方式にして試作中である。今後は個別に得られた、マイクロセンサおよびアクチュエータの試験結果に基づき、企画、計測の再検討および一体化技術の工夫を行う。超音波装置メーカの協力を得てその利用を重点的に進めた。(2)異種研究分野の範囲を拡大して、それぞれの分担領域の個別調査および討議を数多く実施した。センサ国際会議での情報交換は有効であった。(3)血液付着の超音波洗浄効果を実験的に確かめ、センサ機能の劣化のないことを確認した。

(4)洗浄液容積0.2mlの超小形ランジュバン方式の超音波洗浄槽の試作に成功し、針型センサの付着血液の洗浄に極めて有効であることを実験的に確かめた。(5)前項の超音波洗浄槽は消費電力約1W、共振周波数171KHz(R. F)であり、世界で最小のものである。(6)血液または体液などセンサ表面に付着する妨害物質の除去には試作した小形洗浄槽は極めて有効である。平成5年度から7年度にわたって得られた成果は前述の概要に示すように、化学センサの基盤となる白金黒の機械的強度の増大、センサ表面に付着する異物の超音波洗浄による除去など画期的な要素技術である。これらを有機的に結合すれば、当初の目的の能動自律センサの生体埋込みの見通しも十分明るい。本研究で得られた成果の詳細は別冊子としてまとめて報告する。(平成8年6月発行予定)
江戸川乱歩と大衆の20世紀をめぐる総合的研究

従来の読み物的評論主導による固定化された乱歩像の氾濫に対して本研究では根本的な異議を唱え、厳密な研究的態度の確立を目指して、この三年間共同で研究を続けてきた。従来、通俗ものと貶められてきた昭和初年代の長編小説群を再評価し、それらと昭和戦前期の社会・世相・読者との関わりを探り、その意義・価値を再評価した。また戦中期・戦後期の少年ものに関しても、時代の激変との関係、乱歩の作家的生涯上への位置づけ、公教育やマスコミ・ジャーナリズムとの関係を考察し、従来のマニアックな少年ものへのアプローチを排した。また大衆社会や大衆と乱歩作品との濃厚な関係への考察も、本研究で力を注いだことのひとつである。従来の乱歩評論がとかく思いつきの列挙になりがちであったのに対して、本研究では厳密な研究的アプローチをめざした。それによって、研究の蓄積と前進とが図られると考えたからである。当初、本研究は、立教大学が引き受けることになった乱歩資料・旧蔵書とどのように関わっていくべきか、というところに端を発し、2004年の乱歩展、国文学解釈と鑑賞の別冊特集号の刊行を最初の成果として、その後は各メンバーが個々に独自の関心に基づき研究を持続してきた。それらの一部は同時提出の報告書に見られるとおりである。さて今後の展望だが、2006年6月に立教大学に乱歩蔵書・資料の公開と保存と研究を核とする大衆文化研究センターが設立された。共同研究のほうは2006年度で研究期間が終わったが、今後もセンターとの密接な連携の下で、さらに本研究の方向性はいっそう拡大・発展させていく必要がある。研究代表者である藤井淑禎が編集し、本研究の分担者たちが中心となって執筆した『国文学解釈と鑑賞』別冊「江戸川乱歩と大衆の20世紀」が予定通り04年7月に刊行され、好評を博した。同じく藤井を中心として企画された立教大学主催の同タイトルの展覧会(池袋東武デパート、8/1924)も大変な盛況だった。展覧会には、乱歩の遺族より寄贈ないしは寄託された乱歩旧蔵図書や資料、ノート、原稿などが現段階での整理を経て展示された。初公開のものも少なくなく、本研究の研究支援者や研究補助者の協力のもとに進められてきた資料整理が早くも実を結んだ格好である。ただ、図書や資料、ノート、原稿などの整理は今後もまだまだ長期にわたる作業となる。ところで、特集号や展覧会の成功の理由を考えると、やはり「大衆の20世紀」という視角を提示しえたことが大きかったのではないかと思われる。従来の乱歩研究が、とかく乱歩や乱歩文学の特殊性にばかり注目してきたのに対して、本研究を母胎とするそれらの企画では、大衆の20世紀を一人の生活者・家庭人として生きた乱歩の足跡に注目し、そこから、大衆文化研究という広々とした地平へと踏み出しているからである。また、10/31にはやはり本研究の分担者たちが中心となって乱歩と大衆文化をテーマとする国際シンポジウムも立教大学で開催された。そこで特に注目されたのは、昭和初期の上海でも乱歩が受容されたという報告であり、この事実は、当時の大衆文化の考察は、韓国・台湾など東アジア全体にまで範囲を広げなくてはならないことを示唆している。この課題への取り組みは本年度の後半より着手され、次年度以降もしばらくその可能性を模索することになる見通しである。従来の乱歩研究が乱歩や乱歩文学の特殊性にばかり注目してきたのに対して、本研究では、昭和モダンの時期を中心として大衆の20世紀を生きた乱歩の足跡に注目して、そこから、大衆文化研究という広々とした地平へと踏み出すことが企図されているが、本年度もそうした方向で諸研究が進められた。

石川巧と成田康昭は小説の中の犯罪と現実の犯罪との相関性の検討に取り組み、捜査方法の変遷、警察の関わり方の変化、都市や大衆と犯罪との関わり方の考察を進めた。原克は科学雑誌の検討を通じて作中の科学・都市と現実のそれとの相関を考察し、藤井淑禎は昭和モダンの世相・文化に乱歩作品がいかに多くを負っているかを検証した。渡辺憲司は近世からのサブカルチャーの流れとの関わりを、石崎等は『宝石』特集号に顔を見せた秀しげ子と乱歩との関わりを、前田一男は戦前戦後の少年像の変化と戦後の少年をめぐる状況を、そして宮川健郎は山本有三に象徴される優等生的少年ものと乱歩作品との比較を、それぞれ考察した。総括するに、現段階では、科学に着目した原の仕事が唯一世界的規模で乱歩問題を概観しているが、藤井や石川が協力者の支援のもと進めている、戦前期東アジアの大衆文化の中の乱歩、という観点も今後さらに模索を続けていく必要がある。他方、本研究のもう一つの重点項目である、寄贈ないしは寄託された乱歩旧蔵図書や資料・ノート・原稿などの整理は立教大学図書館を中心として作業が続いているが、今年度は、本研究としてはさほどの関連は持ち得なかった。さいわい、来年度は旧邸を拠点とした大衆文化研究センターの発足も見込まれており、それとの連携も今後の重要な課題となる。従来の固定化された乱歩評論・乱歩像の氾濫に対して、本研究では根本的な異義を唱え、いくつかの研究的な観点を設けて、この三年間共同で研究を続けてきた。その一つは、通俗ものと貶められてきた昭和初年代の長編小説群の再評価。二つ目は、乱歩の文学的生涯を鳥瞰した上で、そこにどのような軌跡を認められるかという問題。三つ目は、ジャーナリズムの中における、あるいは清張ら後続の作家との関連といった問題。さらに四つ目としては、全体として社会や外部世界と乱歩世界がどのような交渉なり関係を有しているかという問題。従来の乱歩評論がとかく思いつきの列挙になりがちであったのに対して、本研究では、厳密な研究的アプローチをめざしている。それによって、研究の蓄積と前進とが図られるからである。以上は全体的なことだが、そうした方向性のもとに、原は科学と作品との関係を整形外科手術を手がかりとして追究し、渡辺はサブカルチャーという観点から男色の問題にアプローチし、成田は犯罪を扱う記事の変質を明らかにした上でそれが現実と小説とを架橋することを立証し、石川は戦前から戦後にかけての連続・非連続の問題をプロパビリティーの犯罪の表現を手がかりとして探り、宮川は語り手の突出現象を少年もの以前に探り、前田は公教育と児童文学の世界の連続・非連続に光を当て、藤井は昭和戦前期における家族の問題と戦後の清張ら社会派との葛藤にアプローチした。また立教大学に乱歩蔵書・資料の公開と保存と研究を核として大衆文化研究センターが設立され、今年度で研究期間は終わるものの、センターとの密接な連携の下で、さらに本研究の方向性は維持・発展を続けていかなくてはならない。
生殖機能の経時的変化における神経内分泌調節

哺乳類の生殖機能やホルモン標的器官が中枢神経系の支配下におかれ、動物の一生の間に画然とした変化を遂げることを明らかにしてきた。従来の研究で得られた基礎的知見をもとに、以下の成果を得た。なお、研究組織に関して昭和63年度に変更があったが、研究遂行上の支障はなかった。1.ゴナドトロピン放出ホルモン(LHRH)の免疫組織化学とラジオイムノアッセイにより、LHRHニューロンの機能発現は雌よりも雄が早いことを見出した。LHRH分泌とそれにつづくLHサージに視交叉上核は、前方または後方のいずれかの遠心性回路が無傷であれば、エストロジェンとプロジェステロンの正のフィードバック作用が正常に発揮されることを見出した。2.各エイジのラットにおけるパルス状成長ホルモン分泌を測定し、老ラットはパルスピークの低下すること、下垂体含量も減少することを見出した。成長ホルモンの分泌低下は、肝臓の細胞膜への成長ホルモン結合部位数の増加、ソマトメジンーCの血中レベルの低下をもたらした。3.体内水分環境の維持に重要な後葉ホルモンの分泌動態を調べ、後葉ホルモン産生ニューロンの可塑性のエイジングに伴う低下を証明した。これは神経内分泌機能のエイジングを調べる有力な方法を呈示した意義がある。4.胎児期のラット精巣のFSH受容体は、はじめ親和性の低いものとして出現し、出生までに成体型となる。思春期以後のマウスでは精巣のFSH受容体にダウンレギュレーションが働いているが、そのしくみにインターナリゼーションが重要なことを、電顕オートラジオグラフィーおよび生化学的方法で証明した。LH受容体の調節にセルトリ細胞の分泌する因子が抑制的に作用する事実も見出した。5.子宮の形態異常の誘導にプロラクチンが促進的に作用する証拠を得た。以上の成果を報告した論文の全ては、成果報告書に記し、ここには代表的なものを記す。ラットとマウスを実験動物として用い,生殖機能と密接と関連した内分泌機能の中枢支配と末梢器官における変化を,in vivoとin vitroの系を組み合せて研究した.昭和62年度には以下の結果を得た.1.ゴナドトロピン放出ホルモン産生細胞の視床下部における量的変化を出生後のエイジを追って雌雄ラットで調べ,明瞭な性差のあることを確めた.また,成体雌ラットの発情周期の継続に視交叉上核が如何に関与しているかを調べた.外科的に部分的神経回路の切断を行い,他の神経領域との関連,特に視索前野と密接な関連の存在することをゴナドトロピン分泌の測定データに基いて確めた.視床下部の左右性についても研究した.2.下垂体前葉から分泌される成長ホルモンの経時的変化については,血中成長ホルモン・ソマトメジンのラジオイムノアッセイおよび成長ホルモン産生細胞の免疫組織化学により定量的な結果を得た.エイジングの進んだラットの肝臓の成長ホルモン受容体については,低親和性受容体の増加を認めた.現在,成長ホルモンの遺伝子発現の経時的変化を検討中である.3.ゴナドトロピン受容体数には一定の経時的変化があり,ゴナドトロピンの血中濃度がこれに影響していることはすでに報告した.その機構を解明するために,ダウンレギュレーションの主要要因と考えられるインターナリゼーションを生化学的に解析し,数理モデルを作成した.モデルによるシミュレーションは実験結果とよく一致した.

また,ゴナドトロピン受容体生成過程に見られる細胞間相互作用を培養系で調べ,未確認ながら,この相互作用が化学物質によることを明らかにした.4.ホルモン受容体の経時的変化の研究を進展させるため,受容体の可溶化の試み,受容体に対するモノクローナル抗体の作成に努力中である.本研究の最終年度にあたり、前年度までの成果をもとに以下に知見を得た。なお、本年度において研究組織に一部変更があったが、研究実施上の支障は無かった。1.ゴナドトロピン放出ホルモン(LHRH)とLH大量放出における視交叉上核の役割を明らかにするため、微小ハラース型ナイフを自作し、遠心性神経が前方または後方のみ残っていれば正常に機能することを見出した。また、ドーパミンやノルエピネフリン系よりも視交叉上核がLHRHとLHの大量放出とそれにつづく排卵に重要である示唆を得た。2.成長ホルモンのパルス状分泌はエイジングに伴いピーク値が低下するが、これに伴い肝臓の細胞膜への成長ホルモン結合部位数が増加し、ソマトメジン-Cの血中レベルが低下した。これらの現象をまとめ、エイジング過程における神経内分泌系の重要性について総説を書いた。3.後葉ホルモン分泌ニューロンのエイジングに伴う可塑性の低下は報告したが、さかのぼって発生初期過程の変化も調べ、詳細に記載した。また、腎臓のエイジングに伴う病理的変化をWistar/TW系ラットで、電顕により観測し、変化の原因の一つにアンドロジエンがあることを見出した。4.3胞刺激ホルモン(FSH)の受容体調節機構にFSH-FSH受容体のインターナリゼーションが重要であることを、数理モデルと実験データの一をもとに結論した。ラィディッヒ細胞のLH受容体に対する抑制因子をセルトリ細胞が分泌していることを見出し、今後の課題を提供した。5.幼児期のホルモン処理による持続的効果を、特にプロラクチンによる子宮腺筋症とすい臓肥大の発生をモデルにマウスで確かめた。本年度の成果公表論文中代表的なものを裏面に記した。
戦前期商社の内部不祥事と経営組織

これまで戦前期商社の人事システムを分析し、従業員の過半を学卒者(高等教育修了者)が占める人員構成や、処遇における学歴格差の稀薄さという特徴を発見した。その原因として従業員による内部不祥事に注目し、明治36年第2次大戦期の三井物産の社報を検討した結果、不祥事には学歴による偏りが存在し、学卒者の規律意識の強さが明らかになった。今回の課題では三井物産の明治創業期大正初年の重役会議事録を分析すると共に、件数は少ないものの長文の報告書が残る兼松や、従業員の不祥事によって突然に経営破綻した古河商事のケースも加えて、不祥事が経営組織に及ぼした負のインパクトの実態などを解明したい。
X線望遠鏡光学

0.110keVのエネルギ-領域で集光力と解像力の優れた反射X線光学系と,エネルギ-・位置分解能の優れた2次元X線検出器の開発がX線望遠鏡の大きな研究課題である。本年度の研究成果について述べる。1.反射X線光学系超精密非球面加工装置による切削のみで鏡面基板の製作が可能になり,そのマンドレルからポリイミド樹脂のレプリカ反射鏡を作製した。多層膜あるいはICB蒸着法を用いた成膜によって従来にない高反射率を持つ反射鏡が製作された。ICB法ではSTMによるその場観察で成膜の基礎過程が明らかになった。多層膜を回折格子に成膜することにより高効率X線分光素子が開発された。2.2次元X線検出器衛星搭載用撮像型蛍光比例計数管が製作され,種々の環境試験及びシンクロトロン放射光によって性能が詳しく評価された。CCDは表面の絶縁層を極力薄くすることにより0.3keV以下において十分な効率が得られるようになった。GeのX線ボロメ-タ-は0.3Kまで冷却することによりX線の信号特性が確められた。3.X線望遠鏡の総合性能評価衛星搭載用多重薄板X線望遠鏡(口径35cm,焦点距離3.5m,反射面:金)が完成し,その焦点面に位置検出型比例計数管及びCCDを設置して,宇宙研平行X線光源(Al-Kα,Ti-Kα,Cu-Kα)を用いて,集光力,結像性能が詳しく調べられた。その結果,可視光による測定結果と矛循なく,設計通りの性能を有していることが明らかになった。結像性能(3分角(HPD))にはまだ改良が必要なため,将来の大型化を目指して非球面多重薄板X線望遠鏡の試作を進めている。
ASCが癌治療を変える～ASCの発現、分化のメカニズム～

アポトーシスと炎症シグナル制御蛋白質(以下ASC)はp53の下流にあり、Baxとの結合を介してアポトーシスに関与することが報告された。また、免疫細胞に発現して抗腫瘍的に働いて、抗癌剤の感受性にも関連していることが報告された。当科の研究により口腔扁平上皮がん患者の組織(n=119)を用いた研究ではASC発現は、口腔扁平上皮癌の組織学的分化度と関連があることが示された。また口腔扁平上皮癌患者の5年生存率とも相関があり、相対危険度が上昇することが多変量解析で示された。口腔粘膜ケラチノサイトの分化マーカーとアポトーシスとの間に相関があるがあるこが明らかになった。現在までの研究により、培養している口腔扁平上皮癌細胞株SAS、Ca9-22、HSC2、HSC3、SQUU-A、SQUU-BにおいてWestern blot法により口腔扁平上皮癌細胞に特異的に少量のASC発現が判明した。特異的に発現しているASCは癌細胞のアポトーシス誘導のアダプター因子であり抗がん剤の感受性にも関連していることが報告されているため、当科における過去の頭頸部扁平上皮癌標本から、平成26年度では、ASCに対して免疫染色を行い、統計的に5年生存率との関連があることが確認された。ASCについてさらに精査するために、ASC発現とDNAのメチル化の関連を検討する必要があるが、悪性腫瘍でヒトの組織を使用し、メチル化の解析を行うために間質や炎症細胞、正常細胞のコンタミを避けたいため、特異的に悪性腫瘍部を選別するLCM法を使用する予定であった。そのための前組織採取は平成26年度で進んでおり、検体は集まってきているが、まだシークエンシングでの解析で、メチル化の割合は測れていない。今後はさらに検体の採取を進めるとともに、一定量の検体が集まった時点で、シークエンシングの前処置として、順次LCM法により特異的に選別された癌細胞をメチル化の解析を進めていく予定である。現在まで学会、論文などには発表を行なえていないが、抗体の購入や、実験が複雑で本科では不可能な解析を依頼する外注業者との連絡は終えており、研究体制の構築は進んできているため、今後は研究や実験を加速していく予定である。信州大学医学部附属病院で加療された口腔扁平上皮癌患者についてアポトーシスと炎症シグナル制御蛋白質(apoptosis-associated speck-like protein containinga CARD、以下ASC)の発現を後ろ向きに調査した。ASCは癌抑制遺伝子様に作用することも報告され、種々の悪性腫瘍ではASC領域のDNAのメチル化が報告された。これらの所見から、ASC発現と癌の予後との関連も示唆されている。そこでわれわれは口腔扁平上皮癌(OSCC)におけるASC発現とその臨床的意義について検討を行った。また、ASC発現とアポトーシスおよび分化との関連について検討を加えた。In vivo: OSCCと診断された119例を対象とし抗ASC抗体により免疫組織化学的手法によりASCの発現量を評価し、同症例の臨床病理学的所見および予後との関連を統計学的に解析した。またASCおよび分化マーカーであるinvolucrin(IVL)発現の比較検討を行った。加えてアポトーシス発現状況をTUNEL染色で調べASC発現状況との比較検討を行った。In vitro: ASCと分化との関連を検討するために以下の実験を行った。分化前後でのASCの変化を検討するために正常ヒト角化細胞(NHEK)と不死化ヒト角化細胞(HaCaT)を用い分化誘導行った。NHEKとHaCaTの分化前、分化後1日目と2日目のASCとIVLのmRNA発現を定量的PCRでタンパク発現とをwestern blot法で検討した。また正常細胞と口腔癌細胞株でのASCとIVLについて同様に検討した。その結果、下記の結果を得た。ASCはOSCCで統計学的に独立した予後因子であり、ASC低発現群のOSCCは統計学的有意に予後不良であった。ASC発現はアポトーシスが起きている周囲に発現しており、アポトーシスと統計学的にも関連していた。ASC発現は正常上皮の分化と相関している。またOSCCではcancer pearl周辺に発現していた。細胞株を用いた研究では分化が進むにつれASCのタンパク・mRNA発現が増加することが示唆された。検体の採取は進んでいたが、本年度までに実施予定であったDNAのメチル化の解析が進んでいない。口腔癌採取した検体へLaser Capture Microdissection(LCM)法を行い、前処置を順次終了させるとともに、一定量の検体が収集でき次第、遅延していたDNAのメチル化解析を進めていく。

また並行して免疫染色を行い、連続切片での抗体発現を、正常細胞と腫瘍細胞間で比較検討していく。当初計画で見込んだ額よりも安価に研究が進んだため、また研究の遅延が生じているため次年度使用額が生じた。次年度使用額は平成27年度に消耗品費と合わせて使用する。
ベクトル最適化の解析的研究と多目的意思決定問題への応用

本研究では,集合値写像の凸性と半連続性に関する性質を継続して解析すると同時に,この基礎研究をもとにして,集合値鞍点定理や集合値ミニマックス定理の研究とその多目的ゲーム理論への応用を試みた。得られた結果は以下の通りである。1.多目的ゲームの簡単な場合として,2目的2人零和行列ゲームの利得関数の像の形状の分類を数学的に正確に行った。これまでに未解決であった包絡線の形状をもつ場合の特徴付けを正確に行った。この結果については,ロシア・サンクトペテルブルグで開催された国際会議CAO2000において2000年7月に招待講演による発表を行い,その論文を投稿中である。発表では,UNIX上で開発したC言語プログラム資ノートパソコン上でも起動できるWindows用のVisual-Cプログラムに移植して行った。国内でも,2000年11月に京都大学数理解析研究所で発表を行った。2.ベクトル値関数の鞍点定理やミニマックス定理の体系的な結果をさらに洗練し,集合値鞍点定理や集合値ミニマックス定理の基礎となるKy Fanの不等式のベクトル値関数版と集合値関数版を得ることができた。この結果は,2000年7月にイタリアで開催された非線形解析学者国際連合会WCNA2000や2000年8月に京都大学数理解析研究所で発表を行った。3.上記の2で得られた結果の基礎理論の研究とアルゴリズムへの応用研究を行った。これらの結果は,2001年2月に京都大学で開催された数理解析研究所の共同研究集会で発表を行い,現在論文としてまとめている。これには,計算機上のC言語プログラムを利用して,これまでに得られていた結果を再現し,分類の基準となるパラメータを導き出した。これまで曖昧な特徴付けであった「不動点型」をさらに「バタフライ型」,「台形型」,「三角形型」に細分した。この結果の前半の部分については,台湾で開催された国際会議ICMAA2000において2000年1月に招待講演による発表を行い,後半の部分と3目的の場合を現在,論文にまとめている。これらの内容は,2000年6月に韓国で開催される国際会議INFORMS-KORMSで発表の予定である。現在,この結果を論文にまとめており,この内容とその応用を2000年7月にイタリアで開催される非線形解析学者国際連合会WCNA2000で発表する予定である。3.多目的ゲームのもう一つの試みとして,展開型協力ゲームの協力度合いの拡張概念について考察を行った。その結果として,「部分協力」という概念を導入することができ,論文にまとめることができた。
フェムト秒時間分解紫外磁気円二色性光電子顕微鏡の開発

これまでにない全く新しい磁気顕微鏡である波長可変紫外レーザー磁気円二色性光電子顕微鏡法(空間分解能50nm)を開発し、100フェムト秒(10兆分の1秒)レベルの時間分解磁気顕微測定を可能にした。現在の放射光X線磁気円二色性光電子顕微鏡法と比べて、実験室で観測できる上に、時間分解能が3桁以上向上した。さらには、高感度二光子磁気円二色性光電子顕微鏡法にも世界で初めて成功した。また、本発明のキーポイントである仕事関数しきい値近傍で感度が2-3桁も増強される現象の起源を角度分解光電子分光法により検討した。本研究は、我々が独自に開発した波長可変紫外磁気円二色性光電子顕微鏡法をさらに開発した上で、ポンプ-プローブ法に基づくフェムト秒時間分解測定を可能にすることを目的としている。実現すれば、現在の放射光X線磁気円二色性光電子顕微鏡法と比べて、実験室で観測できる上に、時間分解能が3桁以上上回るという特徴を有する。今年度は初年度であり、高出力波長可変Ti:sapphireレーザー(SpectraPhysics社製MaiTaiHP、2.5w,690-1020nm,80MHz,100fs)を本科研費予算で導入し、別途3倍波発生器、4倍波発生器を購入した。これらは納期の関係で本年度の実験には利用できなかったが、性能評価までを終了した。今年度は研究室現有のTi:sapphireレーザー(800nm,1W,80MHz,100fs)の2倍波をはじめ、405nm半導体レーザー(CW),HeCdレーザー(325nm,CW)など用いて予備的な実験を行った。光エネルギー最適化ではなくCsを吸着させて仕事関数を制御したNi/Cu(001)(Ni 12ML,垂直磁化)を試料として、まず静的なUV MCD PEEM観測を試みた。2秒ほどの積算で十分美しい磁気顕微像が得られ、リアルタイムでも何とか観測できるほどの感度が確認できた。感度的にも放射光XMCDPEEMを優に上回ると考えられる。時間分解測定も試み、ポンププローブ法による100-200fs程度の時間分解観測に試験的ながら成功した。また二光子磁気円二色性観測にも成功した。初年度としては十分な進捗状況であり、来年度中に当初目的が達成できるかもしれない。本研究は、我々が独自に開発した波長可変紫外磁気円二色性光電子顕微鏡法をさらに発展させ、ポンプ-プローブ法に基づくフェムト秒時間分解測定を可能にすることを目的としている。申請時は一光子過程での観測を想定していたが、二光子まで含めると利用エネルギー域が広がりより一般的手法となり得る。また二光子過程の光電子磁気円二色性は全く研究例のない現象でもあり、20年度はこれを重点的に行った。19年度に納入された高出力波長可変Ti:sapphireレーザー(SpectraPhysics社製MaiTaiHP、2.5W,690-1020nm,80MHz,100fs)と3・4倍波発生器を用いて、15原子層Ni/Cu(001)系で7(直入射)28%(45度入射)もの非常に高い感度での二光子光電子磁気円二色性観測に成功した。一光子では12%程度の感度であり、二光子の方がむしろ高感度の配置もあり、また、斜入射で高感度となる点は光電子顕微鏡法に好都合であるといえる。また、Co(3原子層)/Au(111)系でも一光子・二光子過程の光電子磁気円二色性観測に成功した。なお、19年度のうちに波長固定のTi:sapphireレーザー(800nm,1W,80MHz,100fs)の2倍波等により、15原子層Ni/Cu(001)系でリアルタイムでの磁気円二色性光電子顕微鏡観測と200fs程度の時間分解能でポンププローブ法による光電子顕微鏡観測成功しており、本研究の目標はすでに概ね達成できている。21年度には波長可変レーザーを用いたフェムト秒時間分解紫外磁気円二色性光電子顕微鏡法の開発が完結できるはずである。本研究は、我々が独自に開発した波長可変紫外磁気円二色性光電子顕微鏡法をさらに発展させ、ポンプープローブ法に基づくフェムト秒時間分解測定を可能にすることを目的としている。

20年度に15原子層Ni/cu(001)系でリアルタイムでの磁気円二色性光電子顕微鏡観測と200fsの時間分解能でポンププローブ法による光電子顕微鏡観測成功しており、本研究の第1目標は既に達成されている。また、申請時は一光子過程での観測を想定していたが、やはり昨年度にNi/Cu(001)系において二光子磁気円二色性光電子顕微鏡法に成功し、さら利用エネルギー域が広がり、より一般的手法となった。特に二光電子過程の光電子磁気円二色性は全く研究例のない現象でもあり、極めて重要なし成果が挙がった。21年度は最終年度であり、より基礎的事項の解明を目指し、Ni/Cu(001)系での紫外光電子磁気円二色性が1光子2光子に限らず仕事関数しきい値近傍で増強される現象をより深く理解するため、レーザー角度分解光電子分光法により検討を行った。仕事関数しきい値近傍では自発的に垂直出射となること、しきい値近傍の垂直出射でスピン軌道分裂したバンドの一方のみが効率よく検出できることが原因であることを明らかにした。また、垂直磁化Co/Pt(111)の1光子2光子光電子磁気円二色性および角度分解磁気円二色性光電子分光測定を行い、仕事関数しきい値近傍において、1光子2光子でそれぞれ2%,-13%の磁気円二色性を得た。この系でも1光子2光子とも通常の紫外磁気円二色性と比べて桁違いに高感度であることが証明でき、2光子の優位性も示す結果であった。
凍結切片を利用したiPS細胞の分化誘導メカニズムの解明と品質評価法としての有用性

凍結切片を利用したiPS細胞の分化誘導法のメカニズムの解明および本分化誘導法を応用した新たな品質評価法の実用化を目指して以下の研究を行った。これまでにわれわれが報告してきた凍結切片上培養法の分化誘導メカニズムにつきタンパク質性液性因子とmicroRNAの観点から分子細胞生物学的に検討をした。また、これらの因子がどの程度の割合で分化誘導に働いているのかを明らかにし、分化誘導効率の向上と品質評価の性能向上を目指すした。その結果、凍結切片から得られるタンパク質性液性因子が有効であることが明らかとなった。iPS細胞の分化誘導環境を実際に再生を目指す組織・臓器自体に求めることで分化誘導が可能ではないかという仮説の下、目的臓器の凍結切片上でiPS細胞を培養し分化を誘導した。マウスから肝臓、脳、脊髄、を摘出し、それぞれカバーガラス上に凍結切片を作製する。これを同径のガラスボトムディッシュ内に静置し、その切片上にiPS細胞を播種し、培養することで分化誘導を行った。その結果、肝臓凍結切片上で培養したiPS細胞で、肝細胞への分化が高率に誘導されることを見出した。また、脳および脊髄凍結切片上で培養したiPS細胞では、神経系細胞への分化が高率に誘導されることを見出した。これは異なる体細胞由来のiPS細胞や異なる樹立方法のiPS細胞4株でも同様の結果が得られ、本誘導法が普遍的に様々な由来のiPS細胞の分化誘導に応用できる可能性が強く示唆された。さらに本誘導法の実用化を目指すにあたり、本法における、培養上清中の各種因子の解析や、細胞の接着する足場としての微小環境などの分化誘導環境、さらには凍結組織切片が放出するmicroRNAなどに着目することにより、分化誘導環境の詳細な解析を行い、本法の分化誘導現象のメカニズムを解明することで、本法のみでなく現在報告されている分化誘導法をより効率的で確実な誘導法にすることを目指すとともに、本法による分化誘導刺激に対する反応性の差に基づいたiPS細胞クローンの選別および品質評価の判断が正しいかどうかについて検討し、本法の実用化が可能かどうかについて検討する。平成28年度の研究計画では、凍結切片上培養における分化誘導メカニズムの解明として、1液性タンパク質因子(増殖・分化因子)、2細胞外基質(組織の微細構造を含む)および3microRNAの3つの観点から検討を予定していた。13についての検討は、タンパク質因子とmicroRNAによる分化誘導への影響が評価できたため、概ね順調に進展していると評価できる。iPS細胞の分化誘導環境を実際に再生を目指す組織・臓器自体に求めることで分化誘導が可能ではないかという仮説の下、目的臓器の凍結切片上でiPS細胞を培養し分化誘導した。具体的には、マウスから肝臓、脳、脊髄を摘出し、それぞれの凍結切片を作製した。その凍結切片上にiPS細胞を播種し、9日間培養した。その結果、肝臓凍結切片上で培養したiPS細胞は肝細胞へ分化誘導されること、また脳、脊髄凍結切片上で培養したiPS細胞は神経系細胞へ分化誘導されることを見出した。これは異なる体細胞由来のiPS細胞や異なる樹立方法のiPS細胞4株でも同様の結果が得られ、本誘導法が普遍的にすべてのiPS細胞の分化誘導に応用できる可能性が強く示唆された。そこでさらに、本誘導法のメカニズムを解明することを目指して、1液性タンパク質因子(増殖・分化因子)、2細胞外基質(組織の微細構造を含む)および3microRNAの3つの観点から検討を行った。具体的には、マウスから肝臓、脳、脊髄から作製した凍結切片を4%パラホルムアルデヒドまたは冷アセトンにて固定することで、液性タンパク質因子を固定し、その作用を阻害し、分化誘導を行った。4%パラホルムアルデヒド固定の場合は、固定した後、残存するアルデヒドをグリシンにて不活化した。その結果、未固定凍結切片上での誘導効率は固定凍結切片上での誘導効率と比較し、優位に高い誘導効率を示した。このことより、凍結切片より得られる液性タンパク質が分化誘導に関与している可能性が示唆された。平成28年度の結果を得て、本法の誘導効率の向上の検討とiPS細胞の品質評価法の有用性の確認を行う。再生医療薬価の変動により、予定額との差が生じた。次年度の物品費にあてる。
X線CT法による気液並流充填層内の内部構造と流動の解析

気液下降並流充填層では、固体触媒の大きさおよび形状によって決まる充填構造が気液の流れに大きな影響を及ぼす。そこで、本研究では、球状(直径1.5,1.5,2.5,6.0mm),円柱状(楕円断面2.0×2.5,長さ3.5mm)および断面が三つ葉形状をした押出し成形粒子(高さ1.56mm,長さ5.4mm)などを直径120mmの円筒に充填し、空隙状態をX線CT法によって調べた。従来、粒子充填層の空隙分布は、充填層にエボキシ樹脂を流し込み、これを固化したのち旋盤ですこしずつ削り取り、この中に含まれるエボキシ樹脂の量から求める方法が一般的であるが、この方法で1回の測定に100時間以上を要するのが普通である。これに対し、本研究で用いたX線CT法では、数分で1回の結果が得られ、その精度は従来法に匹敵するものであった。このように、本研究では従来法よりも格段に迅速な充填層の空隙率分布を得る方法を開発した。X線CT法によって、前記の粒子を用い、それぞれの充填層内空隙率分布を測定した。直径6.0mmの球状粒を用いた時、空隙率の頻度分布が空隙率の広い範囲にわたって分布し、層内がかなり不均一であることがわかった。これに対し、直径2.5mmの球状粒子,円柱状粒子および三つ葉状粒子などの充填層では、空隙率分布は相互に類似し、頻度分布をそれほど広範囲にわたらなかった。さらに、1.5mm径の球状粒子を用いると空隙率はかなり均一となった。気液を並流で下方に流した時の局時液滞留率分布を調べたところ、粒子を充填した時の空隙率分布と類似していることが判明した。本研究で用いた三つ葉状粒子は工業的によく用いられている触媒と同じ形状であるが、従来このような粒子を用いた充填層の空隙構造に関する研究はなく、本研究によって新しい知見を得ることができた。
高温・高圧印加によるナノ多孔性ポリイミドの凝集構造解明と物性制御

主たる研究実績として,トレガーズ塩基(TB)と呼ばれる特徴的な構造を有する固有微細多孔性ポリイミド(PIM-PI)とその共重合体を新たに合成し,その屈折率の偏光依存性と波長依存性を利用して,これらのポリマーの自由体積分率(分子パッキング係数)および分子鎖の配向異方性を明らかにした.また,誘電率や線熱膨張挙動,面外熱拡散率など自由体積分率と分子鎖配向に関連する物性を定量的に調査し,PIM-PI関連ポリマー群の特性付けを行った。結果として,可視域における高い透明性,低い平均屈折率,低中程度の複屈折に加え,極めて低い熱伝導係数を示した。また,自由体積分率(Vf)を0.183-0.228の範囲で決定し,それぞれの化学構造と関連づけた。これらの物性は,PIM-PI群が大きな自由体積分率を有することと符合しており,その低い屈折率は近年,要求が高まっている高周波(5G規格)での低誘電率・低誘電正接の絶縁材料としての期待が持たれる。これらの物性は,太陽熱遮断フィルム,断熱テープ,遮熱コーティングなどの潜在的用途にも好適である。加えて,TB構造を有するPIM-PI群とその基本構造である半脂環式イミド化合物が,室温での燐光発光(室温燐光)を示すことを初めて明らかにした。これは重ハロゲン元素や金属元素を含まないイミド化合物における初めての例である。さらに,結晶性イミド化合物の結晶構造解析,温度可変や圧力可変の蛍光・燐光スペクトル,温度可変の発光寿命測定などにより,結晶中での比較的空隙の多い凝集状態および強い分子間相互作用が、イミドモデル化合物の室温燐光を誘起すること,そして剛直な構造の導入による局所的な分子運動の抑制が材料設計の鍵であることを明らかにした。これらの知見は,新規発光材料としてのPIM-PI群の分子設計指針の構築に有用である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Ｎａチャネルの構造解析による致死性不整脈の病態解明

原核生物NaチャネルのX線構造解析を行うために大腸菌にNaチャネルを大量発現させ結晶化を行ったが良好な結晶が得られないため、LCP (Lipidic cubic phase)法による結晶化を試みた。48時間後から結晶が観察されるようになり、徐々に成長しいくため結晶の成長を経時的に観察し、50umの結晶が得られたので大型放射光施設SPring8にてX線構造解析実験を行った。BL32UにてX線を当てたところ、反射は得られたが11Aと解析を行うだけの分解能が得られなかった。より良好な結晶を得るためにadditivescreenを行いつつ、sitting drop vapor diffusionのみで行っていた結晶化をhanging drop vapor diffusion法も試みたがこれらの方法では結晶を得ることができなかった。そこでpackingに影響を与えている可能性があるループ部の可動性領域を今までのconstructionから更に取り除き、新たなconstructionを構築した。大腸菌での発現を確認するため条件検討を行い、SDS-PAGEにて発現を碓認した。続いてNaチャネルの溶液中での安定性をF-SEC (fluorescence size-exclusion chromatography)にて確認したところ単峰性のpeakが得られ安定と考えられたため大量発現を行った。以前のconstructionで結晶が得られていた条件で精製を行ったが途中でggregationを起こしたため金属イオン及びBufferの濃度、種類の条件検討を行ない、都度F-SECにてNaチャネルの安定性の確認を行ったが結晶を得ることができなかった。そのため現時点では生物種を変えて、disopredにより可動性領域を予測してconstructionを作成、再度結晶化に向けて条件検討を行っている。上記のように原核生物のNaチャネルの結晶を得て反射を得ることができたことはその構造を解明する上では意義がある進展と思われる。(抄録なし)原核生物のNaチャネルのX線構造解析に耐えうる良質なタンパク質結晶を得た上で、大型放射光施設においてX線結晶構造解析実験を行うことを当初の目的とした。第一歩としてdisopredにより原核生物のNaチャネルから可動性を持つC末端やN末端を予測し、重要と思われる残基を残しながら不要な部位を除いたconstructionを遺伝子操作により得た。目的とするNaチャネルを組み込んだプラスミドを大腸菌に転換し発現を確認するため、大腸菌の培養温度、タンパク質が発現するタイミングの条件検討を5mlのsmall scaleにて行ったところ、SDS-PAGEにて発現が確認された。続いてNaチャネルの安定性する条件を得るため、可溶液の種類および濃度検討をF-SEC (fluorescence size-exclusion chromatography)により確認したところ、安定して得られる条件が得られたため、10Lでの大量培養を行った。得られた大腸菌を破砕の上可溶化し、Niカラム、サイズ排除カラムを使用し精製を行った。遠心濃縮を行い、金属イオン、Buffer、沈殿剤を加えて結晶化を行ったところ5日後に10umの結晶が得られた。しかしこの結晶は微小であり時間をおいても大きさが成長することなくX線構造解析に耐えうるとは考えにくかった。そこで良好な結晶を得るために金属イオンの濃度、種類の変更、緩衝液のpHの条件検討を10,000通り以上行ったが、現状では良好な結晶は得られていない。一年目の成果としてNaチャネルの結晶が得られていることは、分子量が大きく、可溶化した膜タンパク質は一般に結晶を得ることすら困難であることを考慮すると、X線構造解析のステップとしては重要と考えられる。現状までにNaチャネルの結晶を使ったX線実験に到達していないのは可動性領域の予測、及び発現条件の検討に時間がかかったことが原因と考えられる。

良好な結晶を得るために可溶液の沈殿剤濃度、金属イオン、Bufferの種類、タンパク質濃度を変えながら結晶化条件の検討を行いつつ、LCP (Lipidic Cubic Phase)法が近年は膜タンパク質の結晶構造解析に有用であることが提唱されているので同法を施行する予定である。(抄録なし)