hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハイブリッドシステム論に基づく行動支援制御系の設計

連続/離散のハイブリッドシステムモデルに基づくシステム同定論に立脚した判断・動作統合型の行動モデリング手法をベースとして、「判断」「動作」の各フェーズで複合的な行動支援を行う支援制御器のための制御系設計論を構築した。具体的には、判断と動作の自動抽出技術に立脚し、行動モデルを構築、支援制御器と人間が同じモード遷移構造(判断特性)を共有する「判断特性共有型」の行動支援制御系を提案した。この設計思想のもと、オンライン最適化に基づくモデル予測型の行動支援制御系を構築し、自動車運転行動への適用を通してその有用性を立証した。1.行動データの観測ネットワークを介して遠隔操作されるロボットアームを用いて精密位置決め作業における行動データを収集し,提案手法を用いて数理モデルを構築、これをロボットの教示学習へ応用した.自動車の運転行動については,応募者の研究室で開発したドライビングシミュレータを用いて複数の被験者に関する運転行動データを収集し,提案手法を適用して運転行動モデルを構築した.また,改造小型電気自動車を用いて実環境における運転行動データを収集した.これを用いた運転行動モデルの構築および解析は次年度の課題である.2.新しい行動の数理モデルの提案特に,計算コストが小さいという手法の利点を活かし,行動データ収集とモデルのパラメータ推定を同時並行的に行うオンラインモデル同定について検討を行った.オンラインモデル同定では,現在から一定時間過去へさかのぼった分の行動データを用いてモデルパラメータを逐次更新することで,時々刻々変化する人間の行動特性を捉えることが可能となる.検討の結果,高精度に同定するためにどのくらい過去の行動データを用いるべきかはモード遷移や行動特性の変化周期と密接な関係があることが判明し,オンライン推定の実用性を向上していくための端緒が開けたと言える.運転行動は一般に、「認知」「判断」「操作(動作)」の各過程を経て発現すると考えられている。これまでこれらの機能を個別に解析・モデル化した例は多いが、統一的な数理的枠組みの下で解析した例はほとんどない。ドライバのミスが原因で発生する事故を予防するためには、「認知」「判断」「操作(動作)」の統合的な理解が不可欠である。昨年度の研究では、人間の判断・操作特性を(連続/離散)ハイブリッドシステムモデルとして表現し、これに基づいてアシストを最適化することで、適切な操作アシストが実行されることをシミュレータ上で確認した。今年度はまず、一人乗りの電気自動車を用いて実車でその有用性を検証した。さらには、運転時における散漫状態の推定等にも取り組み、提案する運転行動モデルの有用性を多岐にわたって立証することをめざした。具体的にはまず,昨年度の研究においてドライビングシミュレータ上で検証を行った運転支援システムを小型電気自動車に搭載し,屋外の走行実験を通じてより現実の走行環境に近い状況で検証を行った.実験の結果,普通自動車と小型電気自動車の運転モデルを比較すると,その速度域や加速性能の違いが運転行動モデルのパラメータの違いとなって現れることが明らかとなった.また,適切なタイミングで加減速支援が作動することを確認し,実車環境においても開発した運転支援システムの有効性がある程度確認された.次に,車内機器操作などの二次的タスクが運転行動に及ぼす影響を定量的に評価するため,運転者の判断に含まれるあいまいさを運転モデルから抽出する手法の開発を行った.具体的には,運転操作の切り替わりを確率的に表現するPrARXモデルを用いて運転行動のモデリングを行い,モデルのパラメータを元に算出されるエントロピの値によって,運転操作の切り替え判断にどの程度のあいまいさが含まれるかを測る方法を示した.実験の結果,機器操作時は通常走行時と比較してエントロピの値が増加することが明らかとなった.本研究では、人間と機械が判断特性を共有するという設計原理と人間行動のハイブリッドシステムモデルに立脚した統合型の行動支援制御系の設計論創出を主目的とした。具体的な成果は以下の通りである。(1)ハイブリッドシステムモデルにおいて、モード遷移条件(判断特性)が観測変数に依存した確率的な不確かさを含むモデルについて考察し、より人間の行動解析を意識した新たなモデルおよびパラメータ推定手法を考案した。(2)各モードにおける動作支援制御器を最適化指標に基づいて設計し、行動データより得られた人間の判断特性(モード遷移条件)と統合して支援制御器に実装することで判断特性共有型行動支援制御系を実現した。各モードにおけるアシスト量の設計に際しては、Mixed Logical Dynamical System (MLDS)表現と呼ばれるハイブリッドシステム固有の数理表現を導入し、混合整数計画法をベースとした最適化手法を適用することで、最適なアシスト量を設計した。(3)行動データに基づいて設計した判断特性共有型行動支援制御系のロバスト性能や未知環境への適応能力について検証した。また、視線、筋電位、心拍等の生体情報を取り込み、提案手法のエビデンスを確立し、人間と支援制御器の親和性をより高める方策を考案した。(4)自動車運転行動、人間協調型ロボット等を対象として、提案する設計論の妥当性を立証した。

本成果により、人間と支援制御器の判断特性の不整合により引き起こされるオートメーションサプライズの問題が解決される糸口を見いだせた。また各個人の特性、すなわち個性を考慮したより積極的なアシストが可能となり、安全性の観点から保守的な立場をとらざるを得なかった行動支援制御系設計問題に新たなブレークスルーをもたらす可能性を示唆できた。実験を通して理論の有用性を検証できたことは、研究経費の適切な執行という点から見ても高く評価できる。また、提案モデルを活用した散漫状態検出の糸口を見つけたことで、今後の新たな展開につながると期待できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。現実の車両制御系に実装するためには、より高速な計算手法の開発が不可欠であり、この問題に優先的に取り組む。本研究で提案する行動モデルは微分可能な区分的モデルとみなせるため、その特徴を活かした高速化を検討する。さらには、できるだけ被験者の数を増やし、データや結果の信頼性向上を目指す。
虚弱高齢者のための複合運動プログラムの開発

本研究は、虚弱高齢者に対する複合的トレーニングの効果について検討した。対象者は62名のデイサービスを利用している要介護レベルの高齢者であった。対象者には、一般的なトレーニング群と複合的トレーニング群に分け、各週2回20分間のトレーニングを12週間行った。結果は、一般的なトレーニング群と複合的トレーニング群ともに機能が改善を認めた。特に複合的トレーニング群においては、股関節伸展可動域が有意に改善し、また2Step testとTUGも有意に改善した。また、脊柱の彎曲角が改善され、姿勢矯正に効果が認められた。複合的トレーニングは虚弱高齢者の身体機能改善に有効と考えられた。本研究を具体化するため、共同研究者の堀江淳(京都橘大学)と安彦鉄平(京都橘大学)と進めている。共同研究施設として明石仁十病院(兵庫県明石市)を中心としたグループで研究を進めている。研究対象者は協力施設に通われている高齢者とその家族で、同意が得られた方のみを対象としている。現在は付き添われている家族(健康高齢者)が対象となり研究を進めている。対象者をランダムに従来のトレーニング方法と複合トレーニング方法の群に分け、それぞれの群で、トレーニング開始前後で四肢筋力(握力・大腿四頭筋)、関節可動域、片足立ち保持時間、歩行速度、TUG、SF36の初回データの収集を行っている。初期のデータから身体機能の特徴や精神機能面関係について横断的分析を開始している。共同研究施設との調整、測定のための準備ならびに測定の開始が当初の計画通り進んでいる。研究開始までの準備状況が的確、かつ実現可能性のある状況であったこと、研究協力者の積極的な協力を得られていることが、当初の計画通り順調に進んでいる要因となっている。本研究については、実際に地域でデータを収集している。共同研究者の堀江淳(京都橘大学)と安彦鉄平(京都橘大学)と進めている。昨年度と引き続き、共同研究施設として明石仁十病院(兵庫県明石市)とも一緒に研究を進めている。症例を増やすことが課題となっているが、徐々に増えており一定の結果が得られると考えている。これまで得られたデータを横断的分析を進めている。昨年度までに得られた分析結果をもとに、改善すべき運動方法についても検討を加えている。より虚弱高齢者が取り組みやすい運動方法についても随時アップデードしている。データ収集が計画通り順調に進んでいる。若干、症例数が少ないが今後、順調に増えていくと思われる。そのための対策も取っている。本研究は、共同研究者の堀江淳(京都橘大学)と安彦鉄平(京都橘大学)と進めている。昨年度と引き続き、共同研究施設として明石仁十病院(兵庫県明石市)とも一緒に研究を進めた。一般的なトレーニング群は、ROM練習と筋力増強トレーニングを中心に行った。複合的トレーニング群は、エロンゲーションバンドを使用した背臥位と側臥位でのトレーニングを実施した。測定項目は、身長・体重・BMI、肩・股関節関節可動域、片足立ち保持時間、TUG、2Step test、脊柱アライメント、下肢筋力とした。特に複合的トレーニング群においては、股関節伸展可動域が有意に改善し、また2Step testも有意に改善した。これらのことから、TUGも改善した。これは股関節伸展が容易におっこないるようになったことで、歩幅と歩行速度が改善したと考えらえた。また、複合的トレーニング群において、身長が有意に高くなっており、それを裏付けるように胸椎後彎角が減少していた。これは、複合的トレーニング群で、脊柱アライメントが改善したことを示すこと考えられた。これらの身体機能の改善が、今後要介護レベルに改善に寄与できるのかを検討する必要があると思われた。平成28年度対象者の選択基準、除外基準のもと、新規の対象者のリクルートを続ける。それらの対象者に対する身体機能、身体能力、精神機能面の初期データ測定を継続する。更に、28年度にリクルートした対象者縦断的データ収集、データ解析を進めていく。分析方法として、分析Iは、旧トレーニング群と新トレーニング群の変化量を比較し、縦断的に分析する。トレーニング期間を長めに設定し長期間のトレーニング効果について検討する。平成29年度対象者の選択基準、除外基準のもと、新規の対象者のリクルートを続ける。それらの対象者に対する身体機能、身体能力、精神機能面のデータ測定を継続する。更に昨年度測定して対象者に対して縦断的データ収集、データ解析を進めていく。

分析方法としては昨年度の測定値を本年度の測定値を比較して検討する。トレーニングの期間で差があるか否かも含めて、総合的に検討していく。運動器理学療法研究協力施設でデータ収集を行うため、備品、消耗品を協力施設で占有して使用可能な数を確保する必要がある。筋力計(ハンドヘルドダイナモメーター)は現有する1台では対象者の増加や協力施設の増加に対応できないため購入備品として必要である。また、エロンゲーションバンドについても同様の理由により必要である。本研究で使用するPCは、個人情報保護の観点からオフライン、かつ占有して使用する必要があるため備品購入する。更にデータ管理ソフト、統計解析ソフトを本PCにインストールする必要があるため備品購入する必要がある。研究データの収集、研究協力者とのミィーティングのための交通費として使用する必要がある。研究協力施設でデータ収集を行うため、備品、消耗品を協力施設で占有して使用可能な数を確保する必要がある為。エロンゲーションバンドは施設備品として購入出来ない為、購入備品として必要である。筋力計(ハンドヘルドダイナモメーター)、エロンゲーションバンド、パソコン、データ管理ソフト、統計解析ソフト等の備品と消耗品と研究データと研究協力者とのミィーティングのための交通費として使用予定。エロンゲーションバンド、パソコン、データ管理ソフト、統計解析ソフト等の備品と消耗品と研究データと研究協力者とのミィーティングのための交通費として使用予定。
造血幹細胞株の樹立とその分化の分子生物的解析

許容温度(35°C)では,トランフォーム能を有するが,非許容温度(39°C)では,トランスフォーム能を大きく洞弱させる温度感受性変異Abelsonウイルス(ts A-MulV)の全ゲノムのDNA sequenceから,v-ablのkinase domain内の566番目のアミノ酸のロイシンからアルギニンへの変異が,温度感受性を示す原因であることがわかった。このts v-ablをクローニングし,retouviral vectorにつないだ。このretroviral vectorのLTRは,Mo-MuLVのLTRとは異なり,未分化細胞であるEC細胞中でも発現しうるMPSVを用いた.このretroviral vectorを,5-FUで処理したマウスの骨髄細胞に,in vitroで感染させ(lL-6+SCFの条件下で2日間培養→感染→さらに2日間同条件で培養),致死的に放射線照射マウスに,骨髄移植を行い,約1カ月後,骨髄細胞や脾細胞を,lL-6+SCF下で,許容温度(35°C)で培養し,cell line化をはかった。このように方法で樹立されたcell line,ASC-1は,許容温度では,芽球様の形態を示し,c-Kit,Sca-1,Thy-1及び,すべてのlineage markerは,陰性であったが,非許容温度で一週間培養すると,Gr-1やSca-1が出現した。また,致死的に放射線照射したマウスに,このcell lineを輸注したところ,このcell lineは,Gr-1,Mac-1,TER119,Thy-1などのマーカーをもった細胞に分化することがわかった。以上より,このASC-1は,かなり未熟な細胞株であることが示唆された。
天皇主権論の総合的研究――昭和戦前・戦中期を中心として――

本研究は、昭和戦前・戦中期の公法学者たちが展開した天皇主権論について、綿密な資料調査に基づき、その全体像を明らかにすることを目的としている。美濃部達吉に代表されるいわゆる「立憲学派」の法学者たちの学説やその今日的意義はよく知られているが、それと比較すると、天皇主権論を唱える法学者たちについての研究は依然として進展が少ない。しかし、戦前の憲法学のあり方を正確に把握するためには、この「天皇主権学派」に対する理解が不可欠である。このことは、天皇の退位問題を巡るさまざまな議論の中で、時に帝国憲法についての言及がなされていることからも明らかである。平成30年度は、前年度に調査できなかった資料の収集、および収集した資料の分析に従事した。上杉慎吉に関する資料の追加等を実施した他、これまであまり脚光を浴びてこなかった清水澄らの議論について、穂積八束や上杉慎吉らの議論といかなる関係にあるかを調査した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は、資料調査および収集に従事した。その際、穂積八束・上杉慎吉ら、比較的よく知られている学者の資料はもとより、日本国憲法の制定に枢密院議長として関与した清水澄、京都帝国大学の憲法学者たち(井上密・佐藤丑次郎・黒田覚など)、私立大学に在籍した教授(山崎又次郎など)にまで裾野を広げること、また、著書・論文にとどまらない多くの資料(手書の文書など)にも目を通すこと、を意識した。これにより、昭和戦前・戦中期の「天皇主権学派」についての資料を、ある程度網羅的に収集することができた。平成29年度の目標である資料調査・収集は、「概要」欄に掲げた憲法学者を中心として、概ね順調に実施することができた。ただし、所在は把握しているものの調査未実施である資料も存在しており、これらについては平成30年度に追加の調査・収集を実施する予定である。平成29年度に調査できなかった資料について、追加調査を実施する。その上で、収集した資料の分析を進めていく。
戦後日本における県立大学の国立移管に関する研究―設置者変更の「意味」をめぐって

よく知られているように、戦後から1970年代にかけ、十数校の県立大学が国立へと移管された。移管には、敷地や校舎、設備備品等の譲渡、さらには移管後当面の整備費用の拠出まで伴っていたことから、これを国立高等教育機関の設置に際する一種の地元負担と捉えることが可能である。本研究は、当該地域での国立移管に際する議論や移管運動の実態、それに基づく当時の文部省との折衝過程を分析することを通じて、国立移管を実現させた地域が、どのような合意のもとに金銭的な負担を負いながら期成運動を展開していったのか、そして国立移管に何を期待してそのコストを支払ったのかを明らかにしようとするものである。
てんかん原因遺伝子の網羅的解析および心電図の診断有用性の検討

平成30年度は、プロトコールの倫理委員会再承認後、患者リクルートを開始した。年度途中から患者リクルートが開催された為、またER受診患者から、初発てんかん患者を選択する必要がある為(平成30年度は内因性疾患や頭部外傷後等の症候性てんかん患者が目立った)、当初の計画(年間30例)より遅延が生じており、平成30年12月までに4名の患者をエンロールし、現在、全エキソン遺伝子配列解析(WES)を修了したところである。現在、bioinformaticsの処理を行い、候補遺伝子の選定を行っている。さらに、患者リクルートを続けており、最近2例症例をエンロールした。iPSを使用した、神経細胞への分化培養モデルの作成は比較的安定したプロトコールが定まり、中脳細胞、全脳細胞への分化に成功し、神経細胞より多電極を使用した局所電位の記録に成功している。引き続きCa-imaging等の機能実験の準備を行っている。候補遺伝子の選定が済み次第、ゲノム編集により、遺伝子変異を有する神経細胞モデルの作成に入る予定である。症例数が、まだ集積されていない事と、機能実験がすべて終了していない為、平成30年度では、学会発表、論文発表は行っていない。平成30年度は、症候性てんかん(内因性の疾患を有するてんかん、外傷性のてんかん)やすでに加療中の転換の再発患者が多かった。また、救急外来が混雑している場合には、患者リクルートに時間をとっている時間がなく、患者リクルートが遅れている。患者の継続診療をお願いしている、てんかんセンターに他院から紹介される初発てんかん患者が居れば積極的にリクルート協力を依頼する。大学病院であるため、すでに治療を開始されているが治療に難渋している症例が多い為、大幅に症例数を増やすことは困難と思われるが、場合により後ろ向きの研究も考慮する必要がある。患者リクルート数が予定より少なかったため、次年度へ繰り越しを行った。
急性脳虚血に対する急速脳冷却法の開発

【目的】脳は虚血に対して極めて脆弱で、therapeutic time windowの短さが血行再建などの外科的治療を困難なものにしている。脳の低温は、虚血に対し劇的な作用を有するが、体重の大きなヒトに対しては、全身の冷却に時間が掛かり、また全身の過冷却は破局的な副障害をもたらすため、有効な治療法になっていなかった。本研究の目的は、ヒトの局所脳虚血を想定し、迅速で選択的な脳の低温を可能にする経動脈的冷却リンゲル液灌流法の安全性、有効性を検証することである。【方法】ビーグル犬(体重10.7±0.5kg)6匹を使用した。右頚動脈より脳血管撮影用の4Frカテーテルを挿入し、内頚動脈に導入、4°Cに冷却したリンゲル液を1.52.0ml/kg/minで動脈内投与した。右大腿静脈にダブルルーメンカテーテルを挿入し、透析回路と連結し投与したリンゲル液の等量を限外濾過にて除水した。両側頭蓋冠を穿頭し両側脳組織温、右脳組織酸素分圧を、Swan-Ganzカテーテルから心機能を経時的に測定した。90分の灌流後自然復温し、抜管後神経所見を観察し、10週後に屠殺し、組織学的に検討した。【成績】23.3±7.7分で右脳温は目標温度である28°Cに低下し、90129分間(平均106±13.7分)維持することができた。対側の脳温、中心静脈温、直腸温は34°C以下にはならなかった。冷却灌流中、体血圧、心拍数、心拍出量、脳組織酸素分圧は有意に低下したが軽度であった。麻酔覚醒後、神経学的異常所見は見られず、10週後の組織は虚血性変化を認めなかった。【結論】動脈内冷却水注入法は、急速に目的とする領域の選択的な冷却が長時間可能であり、外傷や虚血などの急性脳障害や難治性痙攣の治療手段として有望である。特に急性脳虚血の線溶療法の際に、虚血脳を急速に冷却することにより、血行再建の治療許容時間が著明に延長すると考えられる。脳の動脈にカテーテルを導入し経動脈的に冷却リンゲル液を注入することにより、脳を急速に、選択的に冷却することができる。本研究の目的は、この経動脈的冷却リンゲル液灌流法の、急性脳虚血に対する急性期治療としての有効性を検証することであった。第一年度に、マイクロカテーテルと血管内治療の手技を用いてイヌにおける局所虚血再灌流モデルの開発に取り組んだ。その結果、再現性のある脳梗塞モデルの作製が困難であり、プロトコールの変更を考えている。我々が以前開発した、選択的脳血管内冷却装置(冷却リンゲル液を灌流するためのポンプシステムおよび脱血、除水、加温、返血するための回路を一括して制御する装置)を使用し、急速な脳冷却だけでなく、同時に中心静脈温を正常に保ったまま脳のみを長時間選択的に冷却することに成功した。次年度は、臨床応用を想定した条件で、冷却リンゲル液の動脈内灌流による選択的脳冷却を行い、脳や全身に与える影響を検討したい。

本治療法により、脳虚血の治療可能時間の大幅な延長と予後の改善に寄与できるものと考える。【目的】脳は虚血に対して極めて脆弱で、therapeutic time windowの短さが血行再建などの外科的治療を困難なものにしている。脳の低温は、虚血に対し劇的な作用を有するが、体重の大きなヒトに対しては全身の冷却に時間が掛かり、また全身の過冷却は破局的な副障害をもたらすため、有効な治療法になっていなかった。本研究の目的は、ヒトの局所脳虚血を想定し、迅速で選択的な脳の低温を可能にする経動脈的冷却リンゲル液灌流法の安全性、有効性を検証することである。【方法】ビーグル犬(体重10.7±0.5kg)6匹を使用した。右頚動脈より脳血管撮影用の4Frカテーテルを挿入し、内頚動脈に導入、4°Cに冷却したリンゲル液を1.52.0ml/kg/minで動脈内投与した。右大腿静脈にダブルルーメンカテーテルを挿入し、透析回路と連結し投与したリンゲル液の等量を限外濾過にて除水した。両側頭蓋冠を穿頭し両側脳組織温、右脳組織酸素分圧を、Swan-Ganzカテーテルから心機能を経時的に測定した。90分の灌流後自然復温し、抜管後神経所見を観察し、10週後に屠殺し、組織学的に検討した。【成績】23.3±7.7分で右脳温は目標温度である28°Cに低下し、90129分間(平均106±13.7分)維持することができた。対側の脳温、中心静脈温、直腸温は34°C以下にはならなかった。冷却灌流中、体血圧、心拍数、心拍出量、脳組織酸素分圧は有意に低下したが軽度であった。麻酔覚醒後、神経学的異常所見は見られず、10週後の組織は虚血性変化を認めなかった。【結論】動脈内冷却水注入法は、急速に目的とする領域の選択的な冷却が長時間可能であり、外傷や虚血などの急性脳障害や難治性痙攣の治療手段として有望である。特に急性脳虚血の線溶療法の際に、虚血脳を急速に冷却することにより、血行再建の治療許容時間が著明に延長すると考えられる。
複数の反応サイトを有するナノ・バイオ分子の反応動力学と原子分割エネルギー描像

多電子の運動を定量化する多配置時間依存Hartree-Fock法を開発し,時間に依存する分子軌道(自然軌道)による一体描像の確立を目指してきた。自然軌道が従う時間依存有効一体ポテンシャルを導出し,CO分子では,近赤外レーザー電場によってC原子方向に電子に力がかかったときにだけ,C原子側に電子分布が偏っているHOMO軌道からトンネルイオン化が進むことがわかった。異方的な電子の動きが有効ポテンシャルによって理解できることを示した。異方的な分子の運動としては,空間的に非対称な2色レーザーを用いるとCO2分子の等価な2つのC-O結合の一方を選択的に解離させることができることを理論的に示してきたが,この選択的結合解裂を名古屋大学の菱川グループと共同で実験的に証明した。また,高強度近赤外レーザーパルスによってC60が扁長と扁平構造を交互に取るhg(1)振動モードが励起されることも,日米独の国際チームによって理論的・実験的に明らかにした。励起状態動力学に関しては,高速の非断熱動力学法を開発した。この方法では,非断熱遷移の結合行列を計算する必要は無く,電子状態計算から得られる断熱ポテンシャルの古典軌道上の時間微分から透熱ポテンシャルの傾きを推定すればよい。放射線や光によって生成した水分子多量体カチオンに適用し,2 eVより高い運動エネルギーをもつOHラジカルが発生することを明らかにした。また,DNAのまわりで高エネルギーのOHラジカルが発生すると容易にDNA鎖に接近し,DNAの糖から水素を引き抜き,リン酸基との間の結合を切断することを明らかにした。X線自由電子レーザー(XFEL)によるクーロン爆発をシミュレーションするためのイオン化過程をモデル化したDFTB動力学計算法の改良も進めた。CH2I2のクーロン爆発の実験結果(解離イオンの運動エネルギー分布など)を再現することができた。H29年度は実験グループとの共同研究で大きな成果が上がった。まず,空間的に非対称な2色レーザーを用いるとCO2分子の等価な2つのC-O結合の一方を選択的に解離させることができることを理論的に示してきたが,この選択的C-O結合解裂を名古屋大学菱川明栄教授グループと共同で実験的に証明することができた(Phys. Chem. Chem. Phys.掲載)。また,高強度近赤外レーザーパルスによってC60が扁長と扁平構造を交互にとるhg(1)振動モードが励起されることを計算で示してきたが,日米独のチームによって実験的にも明らかにした(Phys. Rev. Lett.投稿)。イオン化電子がもとの分子と再衝突する際の散乱を利用した全く新しい電子回折法をつかったもので,我々の理論計算との照合によって,この方法が分子の構造変化を追跡する強力な実験法であることが証明された。開発した高速の非断熱動力学法では,非断熱遷移の結合行列を計算する必要が無く,電子状態計算から得られる断熱ポテンシャルの古典軌道上の時間微分から透熱ポテンシャルの傾きを推定し,非断熱遷移確率のZhu-Nakamura公式に代入する。凝縮系や大きな光駆動分子モーターなど大きな系への適用が可能な高速計算法であり,既存の方法と比較しても同等以上の精度を有している。本手法を使って,放射線や光によって生成した水分子多量体カチオンからのOHラジカル発生の機構も調べ,高エネルギーのOHラジカルだけが水に囲まれたDNAに接近し,2本鎖切断を引き起こすことを明らかにした。これは,Mathurらの最新の実験結果(Phys. Rev. Lett. 112, 138105 (2014))とも一致している。以上,本年度は,動力学理論が実験結果を説明するだけでなく,その予測が実験によって実現されるという新たなステージに入ることができた。最終年度は,DNA鎖切断を引き起こす水からのOHラジカルの発生や光駆動分子モーターの回転など励起状態が関与するダイナミクスを中心に研究を進める。開発した非断熱遷移を効率よく高速で計算する方法を適用する。大きな光駆動分子モーターでも,量子収率やトランスーシスの回転の効率を求め,より高速の分子モーターの設計につなげる。原子分割エネルギーの概念を励起状態が関与する反発交差や円錐交差における非断熱ダイナミクスにも適用し,各原子の分割エネルギーの変化がそれらのダイナミクスとどのように相関するか明らかにする。DNAの鎖切断には,DFTB法やDFT法を使い,ピコ秒からナノ秒の反応動力学シミュレーションを実行する。OHラジカルや熱,光がどのように鎖切断を引き起こすか,エネルギー・電子移動の観点から明らかにする。放射線や光による高エネルギーOHラジカルの発生機構と拡散過程を調べ,それらの濃度と2本鎖切断との関係の定量化を目指す。また,DNAの周りに水などの溶媒やカウンターカチオンの鎖切断に及ぼす影響も明らかにする。C60 (OH)24のナノカーボンへの転換反応においは,多数のOH基とC60フラーレン骨格の間のエネルギー交換によってC60骨格の解裂が促進されることを明らかにしてきたが,本年度はTD-DFTB法を使って近赤光による励起過程を動力学シミュレーションに含め,実際のエネルギーの流れを調べる。ナノ・バイオ分子のクーロン爆発に関しては,イオン化過程をモデル化し,DFTB法と融合した動力学計算法の精密化を進め,重原子含有分子のXFELによるクーロン爆発の実験結果の再現性を高める。これをもとに,実験で得られる解離イオンの運動エネルギー分布や2体角度相関から分子の構造を再構築する反応イメージング法を理論的に確立する。

高強度X線自由電子レーザー(XFEL)超短パルスによるナノ・バイオ分子のクーロン爆発の動力学シミュレーション法を開発し,5-ヨードウラシルなどヨウ素含有分子に適用した。実験で得られた解離イオンの運動エネルギー分布をほぼ再現することができ,このシミュレーションから,爆発によりイオンが放出されるイオンの順番と,同程度の質量であれば,イオンの持つ運動エネルギーに正の相関があることも明らかになった。さらに分子構造を反映するイオン間の角度相関の分布も再現でき,XFEL誘起の高速クーロン爆発を利用すれば分子イメージングが可能であることを理論的にも裏付けた。また,分子の多電子ダイナミクスを理解することを目指し,電子相関を適切に取り込んだ多配置時間依存Hartree-Fock法を開発し,時間に依存する分子軌道(自然軌道)の一体描像を確立した。電荷に偏りがあるCOなどの異核2原子分子の近赤外パルスによるトンネルイオン化とそれに続く高次高調波発生がレーザー電場の符号にどのように依存するかを解明し,高次高調波を搬送波位相を使って制御する方法を見出した。とくに自然軌道が従う時間依存有効ポテンシャルを導出し,どの自然軌道のどの空間領域からイオン化が始まるかなどの情報が得られ,多電子ダイナミクスの理解を格段に進めることができた。さらには, DNAの熱やOHラジカルによる鎖切断に対してSCC-DFTB法に基づいた反応動力学シミュレーションを行った。エネルギーや電荷の流れを解析し,鎖切断機構を解明した。真空中では,DNAの鎖切断の活性化エネルギーは1 eV程度と低く容易に進行するが,水環境下ではカウンターカチオンが水和されている限り鎖切断は起こりにくいことがわかった。2本鎖の同時切断は,熱では起こらず,2つ以上のOHラジカルが2本鎖の両側の糖から水素を引き抜く場合にだけ起こることがわかった。XFEL誘起クーロン爆発の現状の動力学シミュレーション法では,原子核にかかる力を決める電子状態計算には膨大な数のトラジェクトリ計算に対処するため密度汎関数強束縛(SCC-DFTB)法を使っている。XFELにより起こる価数の上昇(内殻イオン化と引き続いて起こるオージェイオン化)は指数関数的,漸近的に最終電荷数となる逐次イオン化モデルを採用した。イオン化に伴う励起電子状態からの振動エネルギーへの緩和の効果は,電荷の変化時に各共有結合対の原子核に対し反跳(運動量保存則)を考慮した運動エネルギーを加えた。この分子の電荷・振動エネルギーの増加を考慮したXFEL誘起イオン化の現象論的動力学モデルによって,解離イオンの運動エネルギー分布や解離イオン間の角度相関などが定量的な議論ができるレベルで再現されている。しかしながら,イオンの電荷分布に関しては実験結果とは完全に一致していない。また,解離イオン間の角度相関の分布も実験よりシャープなピークになっている。これらは現状のシミュレーション法が,基本的に基底電子状態しか扱えていないことによるためであり,現在大きな分子に適用可能な励起電子状態動力学法を開発している。これによって,どのくらい早く電子やエネルギーが分子の中を移動するかを評価できるようになる。すでに,小さな分子に適用してその有効性の検証を始めている。
原発事故後の親子の生活・健康変化の実態解明と社会的亀裂修復に向けた介入研究

未曾有の原発災害における人間経験を生活変化と健康影響に焦点を当て長期的に追跡し、実態解明を行うとともに、社会的亀裂を修復するために次の二つの取り組みを行った。第一に、福島県中通り9市町村の2008年度出生児とその母親を対象に、原発事故が与える影響を生活と健康に焦点を当て継続的に記録するための大規模の調査票調査を行った。第二に、上記の福島県内の調査対象者への半構造化面接を行った。放射能の健康影響についての不安の度合いやリスク対処行動において温度差がある母親が原発事故の経験を広く社会と共有できることを目指している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。未曽有の原発災害における人間経験を生活変化と健康影響に焦点を当て長期的に追跡し、実態解明を行うために、大きく次の三つを行った。第1に、福島県中通り9市町村の2008年度出生児とその母親を対象に、原発事故が与える影響を生活と健康に焦点を当て継続的に記録するための大規模の調査票調査を行った。第2に、上記の比較対照として、福島県以外の2008年度出生児の母親に対するネット調査を実施した。第3に、上記の福島県内の調査対象者への半構造化面接を行った。過去3年間、合計3回の調査を行った上、今年度は4回目のパネル調査であるため。第2に、上記の福島県内の調査対象者への半構造化面接を行った。これは、当事者の語り部活動を行うための準備作業である。放射能の健康影響についての不安の度合いやリスク対処行動において温度差がある母親が、原発事故後の経験を広く社会と共有できることを目指している。実態把握のための調査が無事行われていることと、社会的亀裂を修復するための当事者語り部活動につなぐための半構造化面接を実施できているため。これまでに続けて下記二つの方向に研究を前進させる予定である。第1に、症例対照調査の結果を分析し、第5回のパネル調査に備えること第2に、放射能問題を抱える地域への介入研究として「当事者語り部活動」の手法開発、ならびに当事者と専門職者との相互交流による人的ネットワーク形成に取り組むことこれまで通りの研究に加えて、放射能問題を抱える地域への介入研究として「当事者語り部活動」のための手法開発に取り組むことこれまで通りの研究に加えて、放射能問題を抱える地域への介入研究として「親子をつなぐサポートブック」の製作と「当事者語り部活動」のための手法開発に取り組むこと平成30年度が最終年度であるため、記入しない。上記ホームページには、福島子ども健康プロジェクトの調査票調査の目的、概要、研究成果などを掲載している。また、フェイスブックには調査票調査の進捗状況の記載、新聞報道などを掲載している。福島親子パネル調査の概要と進展を記録している。特に、これまでの調査票、調査報告書、成果報告論文、書籍、調査参加者からのメッセージ、よくある質問とそれに対する回答などを掲載している。
腎癌細胞におけるArtemisinin誘導体の抗腫瘍作用の検討

進行性腎細胞癌に対する薬物治療は、種々の治療薬が使用され生存率の改善を認めているが、奏功率、副作用の面において依然厳しい状況である。近年、抗マラリア薬として使用されているartemisininの抗悪性腫瘍効果の報告が相次いでおり、泌尿器科系悪性腫瘍に対する効果も期待できる。本研究では、腎癌細胞に対するartemisinin(誘導体)の抗腫瘍効果と細胞障害の機序を明らかにすることで、腎細胞癌に対する新たな治療法の開発を目的としている。これまでの実験結果を以下に示す。1).Artemisinin誘導体の腎癌細胞株における増殖抑制効果の確認。WST-1 assayにて増殖抑制効果を検討した。DHAとARTESにおいて増殖抑制効果を確認できた。2).細胞周期への影響、DNAヒストグラムの確認。腎癌細胞株へのartemisinin誘導体のcell cycleへの影響を確認した。薬剤投与下で24時間培養を行い、処理した細胞をFlow cytometryにてPI染色を行い調べ、腎癌細胞のcell cycleにおける影響を確認した。ArtesnateにおいてG2/M期の増加を認め、腎細胞癌細胞周期においてG2 arrestを誘導していると考えられた。3).腎癌細胞株のアポトーシス誘導の確認。FITC標識したAnnexin Vをプレートに投与し、FACSで解析した。DHA,artesnateは腎細胞癌株においてアポトーシスを誘導することが示された。4).腎癌細胞株のヌードマウスへの移植方法の確立。腎細胞癌株SKRC-7,12,17,33,59をヌードマウスへ皮下移植し、腫瘍モデルマウスの作成が可能であることを確認した。サイクリン関連分子の発現、Rb関連分子への影響の確認。腎細胞癌cell lineを用い、Rb関連分子の発現をWestern blottingにて確認した。Western blottingによるタンパク発現解析実験において、当初予想していた結果が得られず予定が遅れる結果となった。また当初予定していた腎癌細胞cell lineの種類を増やし、より薬剤効果のデータの増加を目的とした。それらによる結果、やや遅れを認めている。研究実施計画に沿って、実験を進める予定である。進行性腎細胞癌に対する薬物治療は、現在までに種々の治療薬が使用され生存率の改善を認めているが、奏功率、副作用の面において依然厳しい状況である。FITC

標識したAnnexin Vをプレートに投与し、FACSで解析した。DHA,artesnateは腎細胞癌株においてアポトーシスを誘導することが示された。4).腎癌細胞株のヌードマウスへの移植方法の確立。腎細胞癌株SKRC-7,12,17,33,59をヌードマウスへ皮下移植し、腫瘍モデルマウスの作成が可能であることを確認した。サイクリン関連分子の発現、Rb関連分子への影響の確認。腎細胞癌cell lineを用い、Rb関連分子の発現をWestern blottingにて確認した。Western blottingによるタンパク発現解析実験において、当初予想していた結果が得られず予定が遅れる結果となった。また当初予定していた腎癌細胞cell lineの種類を増やし、より薬剤効果のデータの増加を目的とした。それらによる結果、やや遅れを認めている。研究実施計画に沿って、実験を進める予定である。予定していた物品、消耗品の使用が、実際には予定より少なかった。そのため次年度繰越金が発生した。また今年度予定していた実験の中で行えなかった内容も存在し、それらの実験経費として繰り越している。昨年度行えなかった、また購入できなかった物品については今年度購入する予定である。今年度予定実験内容は予定通り経費、物品の購入を行う予定である。実験計画の予定の遅れにより使用物品の消費が行われなかったことが原因と考えられます。
平滑筋ミオシンの活性中心及びアクチン結合部位の同定

横紋筋を中心にミオシンATPaseの活性中心の同定を行ってきた.その結果,多くのミオシンに共通した疎水性のペプチド構造が見つかった.この知見を血管平滑筋のミオシンについても検討し,収縮調節系の異なる運動系の構造的理解を深めようとした.まず,ミオシンの活性中心にADPの光アフィニティーアナログ(NANDP)をバナジン酸によってとじこめた.遊離のNANDPを除いた後,光分解によって活性中心を標識したところ,意外なことにミオシン重鎖とともに17kDa軽鎖が標識された.NANDPは非常に安定に活性中心にとじこめられていた上,その部位はADPと競争的な性質をもっていたことから標識部位が活性中心又はそのごく近くであることはまちがいない.この様な軽鎖の標識は横紋筋では全くみとめられていない.この結果によく対応する別の実験結果がある.即ち,ケイ光プローブで標識した17kDa軽鎖を組みこんだ平滑筋ミオシンに基質MgATPを加えると,その軽鎖の構造変化を示すスペクトル変化がみられた.このことは平滑筋ミオシンの17kDa軽鎖が未知の重要な生理機能を担っている可能性を示唆しているものと思われた.そこで平滑筋同様軽鎖のCa調節機構への関与が明白なホタテ貝横紋筋を用いて同様の実験を行ったところ, Caの有無にかかわらず軽鎖は全く標識されず,重鎖のみが標識された.この結果は17kDa軽鎖の標識が平滑筋に特有のものである可能性を示唆している.今後,軽鎖リン酸化による収縮調節系を検討するとともに,平滑筋ミオシンに特有の10S構造をとっている状態の活性中心の構造と17kDa軽鎖の関係を明らかにしていきたい.これらの研究を通して平滑筋細胞に特有の著しい細胞形態の変化とミオシンフィラメントの消長について理解を深め,それらの生理機能発現の構造的基盤を明らかにしていきたい.横紋筋を中心にミオシンATPaseの活性中心の同定を行ってきた.その結果,多くのミオシンに共通した疎水性のペプチド構造が見つかった.この知見を血管平滑筋のミオシンについても検討し,収縮調節系の異なる運動系の構造的理解を深めようとした.まず,ミオシンの活性中心にADPの光アフィニティーアナログ(NANDP)をバナジン酸によってとじこめた.遊離のNANDPを除いた後,光分解によって活性中心を標識したところ,意外なことにミオシン重鎖とともに17kDa軽鎖が標識された.NANDPは非常に安定に活性中心にとじこめられていた上,その部位はADPと競争的な性質をもっていたことから標識部位が活性中心又はそのごく近くであることはまちがいない.この様な軽鎖の標識は横紋筋では全くみとめられていない.この結果によく対応する別の実験結果がある.即ち,ケイ光プローブで標識した17kDa軽鎖を組みこんだ平滑筋ミオシンに基質MgATPを加えると,その軽鎖の構造変化を示すスペクトル変化がみられた.このことは平滑筋ミオシンの17kDa軽鎖が未知の重要な生理機能を担っている可能性を示唆しているものと思われた.そこで平滑筋同様軽鎖のCa調節機構への関与が明白なホタテ貝横紋筋を用いて同様の実験を行ったところ, Caの有無にかかわらず軽鎖は全く標識されず,重鎖のみが標識された.この結果は17kDa軽鎖の標識が平滑筋に特有のものである可能性を示唆している.今後,軽鎖リン酸化による収縮調節系を検討するとともに,平滑筋ミオシンに特有の10S構造をとっている状態の活性中心の構造と17kDa軽鎖の関係を明らかにしていきたい.これらの研究を通して平滑筋細胞に特有の著しい細胞形態の変化とミオシンフィラメントの消長について理解を深め,それらの生理機能発現の構造的基盤を明らかにしていきたい.
PDE関連シグナル・遺伝子療法-MeIanomaを中心に-

cAMPとcGMPは重要なセカンドメッセンジャーで細胞外からのシグナルによる反応を調整している.サイクリックヌクレオチドの分解によりphosphodiesterases(PDEs)はこれらセカンドメッセンジャーの濃度と作用を調整している.PDEは11種類(PDE1からPDE11)に分類されていて,正常細胞では各PDEがそれぞれの細胞で選択的に発現している.しかしながら,悪性種瘍細胞でのPDEの発現と機能に関する報告はほとんどない.そこで,悪性黒色腫細胞を中心にPDEの発現と機能を検討した.4種類のヒト口腔由来悪性黒色腫細胞株(HMG,PMP,MMN9とMAA),ヒト子宮由来悪性黒色腫細胞株(MVH-II),2種類のヒト皮膚由来悪性黒色腫細胞株(G361とC32),ヒトリンパ節転移由来悪性黒色腫細胞株(WM-266-4)とヒト肝臓由来腺癌細胞株(SK-Hep-1)をこの研究で使用した.それぞれの細胞株でいくつかのPDEが発現していた.HMG細胞ではPDE3A,PDE3B,PDE4B,PDE4DとPDE7Aが発現していた,PDE4特異的阻害剤で細胞増殖は促進されたが,PDE3とPDE7特異的阻害剤では細胞増殖は変化しなかった,PMP細胞ではPDE2が高発現しており,PDE2特異的阻害剤とPDE2のsiRNAで細胞増殖と浸潤が抑制された.PDE2とPDE4の遺伝子異常を検討したが,特に異常は認めなかった.また,baculovirus発現ベクターシステムによりSf9細胞にrecombinantPDEを発現させた.以上より,PDEシグナルが悪性黒色腫細胞では重要でありPDE関連シグナルに対する遺伝子療法が有効である可能性が示唆された.cAMPとcGMPは重要なセカンドメッセンジャーで細胞外からのシグナルによる反応を調整している.サイクリックヌクレオチドの分解によりphosphodiesterases(PDEs)はこれらセカンドメッセンジャーの濃度と作用を調整している.PDEは11種類(PDE1からPDE11)に分類されていて,正常細胞では各PDEがそれぞれの細胞で選択的に発現している.しかしながら,悪性種瘍細胞でのPDEの発現と機能に関する報告はほとんどない.そこで,悪性黒色腫細胞を中心にPDEの発現と機能を検討した.4種類のヒト口腔由来悪性黒色腫細胞株(HMG,PMP,MMN9とMAA),ヒト子宮由来悪性黒色腫細胞株(MVH-II),2種類のヒト皮膚由来悪性黒色腫細胞株(G361とC32),ヒトリンパ節転移由来悪性黒色腫細胞株(WM-266-4)とヒト肝臓由来腺癌細胞株(SK-Hep-1)をこの研究で使用した.それぞれの細胞株でいくつかのPDEが発現していた.HMG細胞ではPDE3A,PDE3B,PDE4B,PDE4DとPDE7Aが発現していた,PDE4特異的阻害剤で細胞増殖は促進されたが,PDE3とPDE7特異的阻害剤では細胞増殖は変化しなかった,PMP細胞ではPDE2が高発現しており,PDE2特異的阻害剤とPDE2のsiRNAで細胞増殖と浸潤が抑制された.PDE2とPDE4の遺伝子異常を検討したが,特に異常は認めなかった.また,baculovirus発現ベクターシステムによりSf9細胞にrecombinantPDEを発現させた.以上より,PDEシグナルが悪性黒色腫細胞では重要でありPDE関連シグナルに対する遺伝子療法が有効である可能性が示唆された.Phosphodiesterase(PDE)はcAMPとcGMPを分解する酵素で細胞内のcAMPとcGMP濃度を調節する非常に重要な役割を担っており,11種類(PDE1からPDE11)に分類されている.しかし,悪性腫瘍細胞でのPDEの報告はほとんどなくその役割は全く不明であった.そこでPDE関連シグナルが解明できれば新しい治療法(シグナル・遺伝子治療等)の開発に貢献できると考え,悪性黒色腫を中心に悪性腫瘍由来細胞株でPDE発現や細胞増殖との関係などを検討した.細胞はヒト悪性黒色腫細胞株(PMP,MMN9,MAA,HMG,HMV-II,WH-266-4,G361やC32),マウス悪性黒色腫細胞株(B16)などを使用した.PMPではPDE(1,2,4,5,7,8,9,10,11)の発現,G361ではPDE(1,3,4,5,7,8)の発現,他の細胞株でもいくつかのPDEが発現していた.PDE2が発現しているPMPではPDE2特異的阻害剤で増殖が抑制された.しかし,PDE3が発現しているG361やC32ではPDE3特異的阻害剤で増殖が抑制されずPDE3は細胞増殖には関係がないことが示唆された.次にポジティブコントロールとしてのリコミナントPDEを作製するためRT-PCRにて増幅後プラスミドベクターへ組み込み,シークエンスで確認し,バキュロウイルスシステムにて作製した.更に,PDEの各アイソザイムの増殖への影響を確認するためsiRNAを導入した.上記研究結果の検討を行い,更に研究を進めている.Phosphodiesterase(PDE)は11種類(PDE1からPDE11)に分類されており,cAMPやcGMPを分解しその濃度を調節している.したがって,cAMPやcGMPによる細胞内シグナル伝達系が存在すれば必ずPDEが存在し,そのシグナルに対して重要な役割を担っている.

しかし,悪性腫瘍細胞でのPDEの報告はほとんどなくその役割は全く不明であった.そこで平成16年度基盤研究(B)では悪性黒色腫を中心に悪性腫瘍由来細胞株でPDEを検討し,発現と阻害剤による細胞増殖への影響を確認した.本年度は細胞増殖以外の作用(浸潤)の検討とsiRNAの導入を確認した.浸潤の検討はPDE3が高発現しているヒト皮膚由来悪性黒色腫細胞株G361とC32を使用した.PDE3特異的阻害剤cilostamideでは浸潤に影響を認めなかった.siRNAの導入はヒト歯肉由来悪性黒色腫細胞株PMPと腋下リンパ節転移巣由来細胞株MAAを使用した.siRNAを2種類合成後,導入剤を使用して各細胞にsiRNAを導入した.mRNA発現の確認はトータルRNAを抽出,逆転写酵素にてcDNA合成後,リアルタイムPCRにて行った.PMP細胞ではmRNAの発現は約70%,MAA細胞では約90%抑制された.更に,PDE活性を測定したところmRNAの抑制率とほぼ同様であり,siRNAが有効であることを確認した.平成18年度では,ヌードマウスに腫瘍を移植し検討を行う予定である.ホルモンが細胞膜受容体に結合すると細胞内のcAMPとcGMPレベルが上昇し,この作用で遺伝子の発現などが起こり,ホルモンの作用が発揮される.しかし,細胞内のcAMP等のレベルの上昇がいつまでも続き,シグナルを伝達することは不都合で,そのレベルを下げることが必要である.PDEは11種類(PDE1からPDE11)に分類されており,cAMP等を分解しその濃度を調節している.したがって,cAMPやcGMPによる細胞内シグナル伝達系が存在すれば必ずPDEが存在し,そのシグナルに対して重要な役割を担っている.以上より,悪性腫瘍細胞でPDE関連シグナルが解明できれば新しい治療法(シグナル・遺伝子治療等)の開発に貢献できると考えられ,悪性黒色腫細胞を中心に悪性腫瘍由来細胞で検討した.悪性黒色腫細胞を中心にそれぞれの悪性腫瘍細胞で発現しているPDE特異的阻害剤を作用させたところ,PDE2では細胞増殖が抑制されたが,PDE4では促進された.しかし,PDE3とPDE7では変化は認めなかった.また,matrigelを使用して浸潤を検討したところPDE2では浸潤が抑制されたが,PDE3,PDE4とPDE7では変化しなかった.次に,PDE特異的阻害剤で効果の認められたPDEに対してsiRNAを作成し導入しそれぞれの細胞に導入した.そこでPDE2とPDE4の遺伝子異常を検討したが,特に異常は認めなかった.また,PDE2とPDE4の発現ベクターを作成し,Sf9細胞にbaculovirusを使用して導入し,リコンビナントPDEを発現させW.B.でサイズ等を確認したが変化は認めなかった.以上より,PDEシグナルが悪性黒色腫では重要でありPDE関連シグナルに対する遺伝子療法が有効である可能性が示唆された.
低酸素環境が軸索内ミトコンドリアに与える影響

虚血による神経の損傷は、中枢や末梢に関わらず、リハビリテーションの対象となり、そのメカニズムを解明することは重要である。今回、我々は低酸素環境に着目し、神経細胞の中でも軸索内のミトコンドリアに着目し、低酸素環境におけるその動態を観察した。加えて、低グルコースと低酸素・低グルコース(oxygen-glucose deprivation, OGD)による影響による、軸索内ミトコンドリアの動態も観察した。方法は胎仔ラット由来の初代末梢神経培養細胞を用いて、遺伝子工学的技法を用いて、軸索内のミトコンドリアを蛍光標識し、タイムラプス顕微鏡を用いて、軸索内のミトコンドリアの動態を観察した。微細構造の観察は透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた。その結果、24時間の0.5%濃度の低酸素環境では、対照群と比較して軸索内の輸送ミトコンドリアの数に変化はみられなかった。同様に低グルコース環境も軸索内輸送ミトコンドリアの数に違いはみられなかった。一方、OGD環境では、対照群と比較して輸送ミトコンドリアの数が有意に減少していた。TEMによる観察では軸索内ミトコンドリアの膨隆がみられたが、同時にネクローシス像も観察された。以上のことより、0.5%の低酸素環境は軸索内の輸送ミトコンドリアの数には影響を及ば差ないことが明らかとなり、OGD環境は軸索内輸送ミトコンドリアに影響することが推察されたが、ネクローシスの影響もみられたため、暴露時間を短縮するなどして、OGDと軸索内ミトコンドリアの関係をさらに、検証する必要がある。低酸素や虚血は神経細胞に重大な障害を及ぼし、結果として神経細胞のアポトーシスや、軸索の変性を引き起こす。また、ミトコンドリアは細胞内小器官の1つであり、ATP合成の中心的役割を果たしたり、細胞内カルシウム濃度の調節に関与する。軸索内のミトコンドリアは外的要因によって、その動態が大きく変化する。本研究は、末梢神経節初代培養細胞とウイルスベクターを用いて、軸索内のミトコンドリアを蛍光色素により標識し、低酸素チャンバーを用いて、軸索内ミトコンドリアの動態を観察し、低酸素状態が軸索内のミトコンドリアや軸索変性におよぼすメカニズムを解明することを目的とした。本年度は低酸素インキュベーターを用いて、3%と1%の酸素濃度における初代培養末梢神経節細胞軸索内のミトコンドリアの動態を観察した。その結果、48時間の低酸素暴露の前後において、軸索内の輸送ミトコンドリアの割合、停留ミトコンドリアのサイズなど、大きな変化はみられず、抗Neurofilament Protein抗体を用いた免疫組織化学染色においても、軸索には腫脹などの変性は観察されなかった。本年度は、機器導入の遅れから、実験回数が少なく、低酸素暴露前後の軸索内ミトコンドリアと、光学顕微鏡下での軸索の観察のみ行った。次年度以降は低酸素状態に加え、無糖培地を用いた疑似末梢循環障害モデルとして、末梢神経細胞軸索内のミトコンドリアの動態および軸索の状態を観察する予定である。研究に使用する機材の導入が予定していた時期よりも大幅に遅れ、予定していた実験の一部を行うことができなかった。当該年度は、ラット由来初代末梢神経節細胞を用いて、低酸素環境下におけるミトコンドリア動態の観察、及び、軸索変性の有無を観察した。その結果、免疫組織化学染色による、顕微鏡下での軸索観察では、3%酸素による24時間、および48時間の暴露では、対照群と比較して、軸索腫脹などの変化は観察されなかった。また、レンチウイルスベクターを用いて、培養細胞内のミトコンドリアを蛍光標識し、その動態を観察した結果、3%酸素による24時間および48時間の暴露では、軸索内輸送ミトコンドリアを完全に抑制することは不可能であった。さらに、今回は低グルコース培地を併用し、低酸素+低グルコースが末梢神経軸索およびミトコンドリアの輸送に影響を及ぼすかどうかを検討した。その結果、対照群と比較し、低酸素群、低グルコース群、低酸素+低グルコース群において、軸索の腫脹などは観察されず、輸送ミトコンドリアの抑制もみられなかった。今後は、得られたデータを詳細に解析し、低酸素および低グルコースが軸索内輸送ミトコンドリアに影響を及ぼすかどうかを速度や方向性などを含めて解析するとともに、実験数を増やし、より詳細なデータを得る予定である。初年度に機材の搬入が遅れたため、初年度に予定されていた実験の分だけ遅れている。生体では、低酸素環境は神経細胞に重篤な影響を及ぼすことは明らかであり、今回、我々は低酸素環境が末梢神経性軸索内のミトコンドリアにどのような影響を及ぼすのかを遺伝子工学技法、細胞培養法、タイムラプス顕微鏡などを用いて観察した。その結果、0.5%酸素環境下で24時間暴露した低酸素群を作成し、対照群と比較した。その結果、輸送ミトコンドリアの数、並びに軸索内ミトコンドリアの微小形態に大きな違いは観察されなかった。次に、我々は無糖培地を用いて、更に24時間、無糖培地に暴露した低グルコース群と、24時間、0.5%酸素と無糖培地に暴露された低酸素・低グルコース(OGD)群を作成して低酸素群、対照群と比較した。その結果、対照群および低酸素群と比較してOGD群の輸送ミトコンドリアの数が有意に減少していた。