hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人女性の軽度の低栄養状態が妊孕力に及ぼす影響

本研究は18歳から33歳の女性58人を対象とし、血液、唾液、尿を採取(N=58×4=232セット)することにより、1)軽度の低栄養状態が女性の妊孕力に及ぼす影響を、月経周期中のプロゲステロン濃度によって評価し、2)血中プロゲステロン濃度の指標として唾液や尿中のプロゲステロン濃度を用いることの妥当性を検討した。本研究の対象となった女性においては、栄養状態のちがいによるプロゲステロン濃度の差異は観察されなかった。また、血液中と尿中のプロゲステロン濃度とは異なり、唾液中のプロゲステロン濃度は過去のホルモン避妊薬使用によって異なる可能性が示唆された。本年度は、妊孕力の指標として用いるプロゲステロンの測定方法の確立と、調査を実施するための倫理許可申請を行った。倫理許可は、調査を実施した米国ワシントン州のワシントン大学にて申請し承認を得た。本研究の対象となる閉経前の女性においては、血中プロゲステロン濃度は月経周期内で大きく変動する。よって栄養状態がプロゲステロン濃度に及ぼす影響を評価するためには、周期内で繰り返し採血を行う必要がある。静脈血の採取は被験者の負担が重いことから、指先の穿刺により濾紙上に採取した血液(濾紙血)を使用することとし、この方法に関する検討を行った。濾紙血からの血液の抽出とプロゲステロン濃度の測定について試行錯誤を重ねた結果、酵素免疫抗体法(EIA)を用いた測定プロトコルを確立した。血清中と濾紙血中のプロゲステロン濃度(N=10セット)は、高い正の相関を示した(R^2=0.933)。さらに予備検討のため、女性1人を対象として36日間にわたり毎朝、濾紙血を採取し(N=36)、これらの濾紙血中から測定したプロゲステロン濃度が黄体期にピークを示すことを確かめた。今回用いたEIAは市販のキットを用いないため、安価にプロゲステロン濃度を測定することが可能である。また指先の穿刺による採血は、医療従事者でなくても実施可能であることから、臨床ではなく一般集団を対象とした研究に応用可能である。以上のことから、本研究で確立した方法は、公衆衛生学や人口学など、幅広い研究分野での活用が期待される。本研究の目的は、1)軽度の低栄養状態が女性の妊孕力に及ぼす影響を、月経周期中のプロゲステロン濃度によって評価することと、2)血中プロゲステロン濃度の指標として唾液や尿中のプロゲステロン濃度を用いることの妥当性を検討することである。18歳から33歳の女性58人(平均±SD24.0±4.4歳)を対象とし、身体計測と再生産歴に関する質問紙調査を実施したのち、毎週1回、連続4週間かけて血液、唾液、尿を採取した(N=58×4=232セット)。栄養状態の指標としてはBMIを用いた(-20低体重(N=10)、20-24.9標準体重(N=41)、25-過体重(N=7))。統計解析は、血液、唾液、尿中のプロゲステロン濃度について、各々独立したモデルを用いた。混合モデルを用い、プロゲステロン濃度を被説明変数、栄養状態を説明変数とし、年齢や月経周期などの共変量の影響を調整した上で解析を行った(N=232)。次に、卵胞初期(月経1-6日目)に限定し(N=45)、同様に重回帰分析を行った。どちらの分析においても、栄養状態の違いによるプロゲステロン濃度の差異は観察されなかった。しかし予想に反して、ホルモン避妊薬の使用歴のある女性は、使用歴のない女性と比較して唾液中のプロゲステロン濃度が低い(重回帰分析p=0.003)という結果が得られた。一方で、血中と尿中のプロゲステロン濃度については、避妊薬使用の有無による差がなかった。よってホルモン避妊薬の使用を中止して数年が経過しても、体内のホルモン結合などに影響が残存する可能性を示していると推測された。この仮説を検証するためにはさらなる調査が必要である。また、唾液中のプロゲステロン濃度は必ずしも血中のプロゲステロン濃度を反映しない可能性が示唆された。
iPS細胞の軟骨内骨化を利用した顎骨再生技術の開発

人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いた顎骨再生医療の開発は、より審美・機能的な補綴歯科治療を可能にするものと期待されている。本研究では、広範囲骨再生部位における軟骨内骨化の利点に着目し、試験管内でiPS細胞から骨/軟骨様細胞塊を作製する技術の開発を目的とした。本研究により、軟骨細胞および骨芽細胞分化誘導因子を併用することで、マウスiPS細胞の胚様体から、軟骨細胞/骨芽細胞の分化程度の割合を制御しながらハイブリッド軟骨/骨様細胞塊が作製可能であることを明らかにした。骨増生術における細胞移植治療は、より審美・機能的な補綴歯科治療を可能にするものと期待されている。従来の顎骨再生アプローチは、骨芽細胞の石灰化能に依存した「膜性骨化」を基本としていた。しかし、広範な骨欠損では細胞は低酸素状態に陥りがちであり、血液を供給する血管新生も困難であるため、この骨化様式による再生治療には限界があるかもしれない。これに対して本研究では、低酸素状態が有利に作用する「軟骨内骨化」に着目する。本研究は、iPS細胞から作製した軟骨細胞塊を用い、軟骨内骨化を模倣して骨欠損の再生を導く治療法の開発を目的とする。初年度は、マウス歯肉由来iPS細胞を用い、胚様体を軟骨細胞誘導培地で3次元的に培養する際に、小分子化合物、成長因子や分化誘導時の力学的刺激が、効率的な軟骨細胞塊の形成を著明に誘導することを明らかにした。本年度は、マウスiPS細胞から誘導した軟骨細胞塊および骨芽細胞塊への分化誘導を組み合わせることで、細胞塊を部分的あるいは全体的に石灰化させ、iPS細胞から軟骨/骨芽細胞複合体が作製できる可能性を示した。また、マウスiPS細胞に小分子化合物、成長因子および力学適刺激を与えて作成した軟骨細胞塊について、その分化の程度をRT-PCR、免疫組織染色等で解析した。その結果、誘導したiPS細胞由来細胞塊は球状の充実性の細胞塊を呈し、軟骨細胞特異的な遺伝子を高発現しており、軟骨細胞基質の染色に陽性を示したことから、細胞塊が成熟な軟骨細胞塊であることが確認された。一方、マウスiPS細胞から誘導した骨芽細胞塊を同様に解析した結果、細胞塊は内部に高度な石灰化を示し、骨芽細胞特異的な遺伝子を高発現する成熟な骨芽細胞塊であることが確認された。さらに、これら細胞塊をラット骨欠損モデルに移植し、細胞移植が骨形成を促進する知見を得た。平成28年度は、マウス歯肉由来iPS細胞を用い、胚様体から3次元的な軟骨細胞塊を誘導する際の、分化誘導期間、力学的刺激(振盪培養)、スタチン添加濃度の各条件を、アルシアンブルー染色、HE染色、Real-time RT-PCRを用いて検討した。また、マイクロ空間制御3次元培養器を用い、iPS細胞の軟骨細胞誘導過程における培養環境空間のサイズが分化に及ぼす影響を検討した。その結果、胚様体のサイズを培養器によって規定したうえで胚様体培養の期間を短縮し、これを誘導培地で振盪培養することで、iPS細胞構造体が効率的に軟骨細胞塊に誘導される可能性を示す知見を得ている。また、軟骨細胞誘導したマウスiPS細胞に対して、初期に骨芽細胞分化誘導培地を用いることで、細胞塊を部分的あるいは全体的に石灰化させることに成功し、iPS細胞から軟骨/骨芽細胞複合体を作製する技術基盤を確立しつつある。当初、平成28年度にiPS細胞を用いた軟骨/骨芽細胞複合体の作製技術の確立を予定していた。これについては、現在までに、マウスiPS細胞から軟骨細胞塊を効率的に誘導する特定の培養条件を同定しつつあり、この細胞塊を石灰化させる技術も得られていることから、次の研究段階に進むことが可能な状況にある。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。歯科補綴学平成28年度に決定したiPS細胞を軟骨細胞塊に効率的に誘導する条件で培養し、得られる軟骨細胞塊について、血管新生促進因子(VEGF、アンジオポエチン1、HGF等)の発現をELISA、免疫蛍光染色を用いて検討する。

また、このiPS細胞由来軟骨細胞塊および軟骨/骨芽細胞複合体の移植における安全性(生体内で腫瘍化するか否か)および異所性骨形成能を、SCIDマウスを用いた皮下移植モデルを用いて評価する。移植3か月後の腫瘍形成(テラトーマの有無)および異所性骨形成(軟骨内骨化の有無)を、組織切片観察(HE染色,von Kossa染色)、動物用マイクロCT解析を用いて評価する。さらに、これら細胞塊による骨再生効果を、ラット頭蓋骨広範欠損モデルを用いて評価していく。当初平成28年度に予定していた免疫蛍光染色および血管新生促進因子の測定(ELISAなど)について、iPS細胞から軟骨細胞塊に分化誘導する培養条件をさらに検討して確実なものにしてから行うよう研究を進めているため、これらの実験に要する費用を翌年度分として請求することとした。次年度使用額は、iPS細胞を確実に軟骨細胞塊に誘導するために要する費用および軟骨や骨芽細胞特異的蛋白質の発現を評価する免疫蛍光染色および血管新生促進因子の測定(ELISAなど)に要する費用に使用する。また、従来予定していた動物実験や機構解析など効率よく実験を進めるために、この程度の使用額は次年度に必要であると考えている。
ハイブリッド実験手法による弾塑性構造物の地震時許容吸収エネルギーの定量化

本研究により得られた成果の概要は次のとおりである.まずPC斜張橋のRC塔や高層建物のRC柱などのような,変動高軸力を受ける柱模型のハイブリッド曲げ地震応答載荷実験を実施し,柱部材の剛性やエネルギー吸収能の劣化過程を追及した結果,同部材の破壊は,応答変位と累積履歴エネルギー吸収能より定義される損傷度関数(Damage Index)でかなり精度よく表現できることが判明した.また塑性域における繰返し変形挙動についても,コンクリートと鉄筋の材料の構成則から精度よく解析的に予測可能であり,これを実際の構造物にも適用することが可能であることを,数値計算例によって示した.さらに修復されたRC部材のハイブリッド地震応答実験を実施した結果,各種修復工法により修復したRC部材は,静的な強度や剛性に関しては処女部材とほぼ同等あるいはそれ以上の値にまで回復するが,エネルギー吸収能から見たじん性の回復は低く,耐震安全性上問題点のあることが判明した.一方,多自由度履歴構造物における総地震入力エネルギーを数値シミュレーションによって検討した結果,構造物への総地震入力エネルギーは弾性系のそれとさほど変わらず,新しく提案した入力エネルギースペクトルと従来よりのモード解析とを組合わせることにより,ほぼ推定可能であることが判明した.したがって等価剛度を用いたモード形状などから,各部材の分担率を推定できれば,各々への入力エネルギーを算出できる.この入力エネルギーと前述のハイブリッド実験から得られた許容吸収エネルギーとの比較より,エネルギー論に基づいた耐震設計法が可能となる.本研究により得られた成果の概要は次のとおりである.まずPC斜張橋のRC塔や高層建物のRC柱などのような,変動高軸力を受ける柱模型のハイブリッド曲げ地震応答載荷実験を実施し,柱部材の剛性やエネルギー吸収能の劣化過程を追及した結果,同部材の破壊は,応答変位と累積履歴エネルギー吸収能より定義される損傷度関数(Damage Index)でかなり精度よく表現できることが判明した.また塑性域における繰返し変形挙動についても,コンクリートと鉄筋の材料の構成則から精度よく解析的に予測可能であり,これを実際の構造物にも適用することが可能であることを,数値計算例によって示した.さらに修復されたRC部材のハイブリッド地震応答実験を実施した結果,各種修復工法により修復したRC部材は,静的な強度や剛性に関しては処女部材とほぼ同等あるいはそれ以上の値にまで回復するが,エネルギー吸収能から見たじん性の回復は低く,耐震安全性上問題点のあることが判明した.一方,多自由度履歴構造物における総地震入力エネルギーを数値シミュレーションによって検討した結果,構造物への総地震入力エネルギーは弾性系のそれとさほど変わらず,新しく提案した入力エネルギースペクトルと従来よりのモード解析とを組合わせることにより,ほぼ推定可能であることが判明した.したがって等価剛度を用いたモード形状などから,各部材の分担率を推定できれば,各々への入力エネルギーを算出できる.この入力エネルギーと前述のハイブリッド実験から得られた許容吸収エネルギーとの比較より,エネルギー論に基づいた耐震設計法が可能となる.本研究の目的は、土木構造物の塑性域における地震時許容吸収エネルギーの定量化手法を提案し、エネルギー分担率に基づく新しい耐震設計法開発のための基礎資料を提供しようとするものである。変動高軸力下での鉄筋コンクリート(RC)柱のハイブリッド地震応答載荷実験および多自由度履歴構造物のエネルギー分担率に関する数値シミュレーションにより得られた主な結論は,下記のとおりである。1.地震入力強度が増大すると、RC柱の履歴によるエネルギー分担率は増加し、そのなかでも軸力増加側での履歴によるエネルギー吸収の割合が増加する。エネルギー吸収量が増大すると、劣化は激しく、剛度も底下する。2.入力地震波形として、エルセントロ記録と八戸記録を比較した結果、後者は供試体モデルの劣化後の剛性と共振しやすい周波数を含んでいる。そのため応答変位が大きくしかも劣化の著しい傾向となった。3.最大応答変位および履歴エネルギー吸収量の両者から定義されるダメージインデックスを、実験結果に適用したところ、全般的に部材の損傷度をよく表示しているものと認められた。4.Base Isotationを用いた構造物では、地震による構造物への総入力エネルギー量そのものが減少するのみならず、免振機構の粘性吸収エネルギーと塑性ひずみエネルギーとにより、そのほとんどが分担される。5.ダイナミックダンパーを用いた構造物では、地震による総入力エネルギーは若干増大する。しかしダンパー部におけるエネルギー分担率を高めることにより、構造部材に入力されるエネルギーを減少させ得る。6.構造物に入力される地震エネルギーが、構造要素の許容吸収エネルギー以下となるような規範で、耐震設計規準を作製する基礎的な資料が得られた。
フォトニック結晶による３次元立体光制御に関する研究

本研究では,導波路や共振器を組み合わせた3次元光回路の実現に向けて,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶の開発を行っている.本年度は3次元フォトニック結晶の体系的な設計方法を確立するべく,光の伝搬を禁止するフォトニックバンドギャップ(PBG)帯域における光の振る舞いを詳細に検討した.通常のバンド構造においてPBG帯域は,光の状態(モード)が存在しない帯域として表される.そのため,フォトニック結晶へ意図的に導入した欠陥部分はPBG帯域の光に対して,共振器や導波路として振る舞う.ここで,欠陥部分に閉じ込められた光は周囲のバルク部分にもエバネッセント的に浸み出している.そこで,欠陥が入っていないバルクのフォトニック結晶における光の振る舞いを,複素バンド構造を用いて表現し,それによって共振器や導波路の特性を理解することを検討した.まず,有限差分時間領域法を用いた複素バンド構造の解析手法を提案し,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶の複素バンド構造を解析した.そして,共振器及び導波路の光閉じ込め特性と比較した結果,共振器や導波路の光閉じ込めには,バルク結晶の特性が強く反映されていることが分かった.そのため,共振器からの光拡がり方向は,欠陥部の共振モードが,周囲にあるバルク部分のエバネッセント場へ,波数を保存して接続されていることが分かった.さらに,共振器の設計方法へ複素バンド構造の解析結果を応用することで,共振器からの光拡がり方向を制御可能であることを示した.今年度の研究により,3次元フォトニック結晶中における,PBG帯域の光の振る舞いを定量的に取り扱う方法を提案し,これにより共振器や導波路の特性をよく説明できることを示した.今後,本手法をさらに発展させることで低損失な光制御や放射パターンの制御など,新しい設計方法へと展開できると期待できる.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,導波路や共振器を組み合わせた3次元光回路の実現に向けて,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶(3D PC)の開発を行っている.本年度は立体光制御の体系化を目標に,導波路の集積化について検討を行った.ストライプ積層型3DPCを構成するロッドを1本抜き取ることにより導入した水平導波路を導波路Aとし,導波路A両隣のロッドの幅を0.30aから0.40aへ増大させた構造を導波路Bとした.最初に,同種の導波路を配置した場合について,A-Aの組み合わせにおいては、導波路間距離を6aとすると,結合長は1000a程度となるが,最大エネルギー移行割合は100%となる.その結果,エネルギー移行の許容度を例えば1%程度とすると,両者を50a程度の距離しか並列させられない.したがって,試料の大きさ(mmオーダ)を考慮すると,導波路間距離は8a程度離す必要があることが分かった.つづいて,異なる種類の導波路を配置した場合について検討を行った.導波路Bにおいては,ロッド幅の増加によって実効的誘電率が増加した結果,伝搬モードが低周波数側にシフトされる.導波路AとBを伝搬する光が異なる伝搬波数をもつため,導波路間の結合が抑制されて,高密度な集積が可能になると期待できる.同様にして,導波路Aと導波路Bの間の結合を解析したところ,導波路間距離を6a程度とするだけで,両者をどれだけの距離を並列させても最大のエネルギー移行割合が0.1%程度に留まることが分かった.今年度の研究により,3次元フォトニック結晶中に導波路を配置する際の,集積性について体系的な知見を得ることができた.これにより,3次元フォトニック結晶の内部へ構造を導入する際に,一つの試料中に適切な数の構造を導入できるようになると考えられる.本研究では,導波路や共振器を組み合わせた3次元光回路の実現に向けて,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶の開発を行っている.本年度は立体光制御の体系化を目標に,導波路の集積化について検討を行った.特に,3次元フォトニック結晶ににより3次元的な導波路の集積が期待されるため,導波路が立体的に交差している場合についてクロストークの検討を行った.ストライプ積層型3次元フォトニック結晶を構成するロッドを1本抜き取ることにより導入した水平導波路を基礎として,これが立体交差している場合の一方の導波路から他方の導波路へのクロストークを数値解析により計算した.その結果,導波路間の距離を7層程度(1.31 μmに相当)とすることで,クロストークを-25dB以下に抑制できることが分かった.また,周波数依存性を調査したところ,導波路間の距離および周波数に依存したディップが生じることが分かった.このようなクロストークのディップは,導波路の固有モードにおいて空間的なディップが生じてることと対応していると考えられる.そこで,異なる種類の導波路の組み合わせにより,クロストークの周波数依存性を抑制できると考えられ,実際に解析を行ったところ,周波数依存性を抑制しつつ,3層(0.59 μm)離すだけで30dB以下にクロストークを抑制できることを見いだした.今年度の研究により,3次元フォトニック結晶中に,3次元的に多数の導波路を配置するための,体系的な知見を得ることができた.今後,3次元フォトニック結晶の内部へ構造を導入する際の集積密度の目安を得られることが出来たと考えられる.

ストライプ積層型3次元フォトニック結晶において,これまでに,面内方向および層間方向において広帯域の光伝搬が可能な導波路を開発し,これらを連結させることにより,3次元光伝搬動作の実証に成功している.そして,昨年度より検討を進めている導波路の集積性について,さらに発展させるべく,立体的な光集積を考慮した集積密度の検討を行った.本年度の検討により,3次元フォトニック結晶の内部へ構造を導入する際に,適切な構造の集積密度を明らかにすることが出来たと考えられる.以上の成果について,平成27年度においては,論文発表1編,国際学会2件,国内学会3件の発表を第一著者として行った.そのほか,査読中の論文が1編あり,また上記の導波路の集積性に関する論文を現在執筆中であるなど,研究発表を進めている.本研究では,導波路や共振器を組み合わせた3次元光回路の実現に向けて,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶の開発を行っている.本年度は3次元フォトニック結晶の体系的な設計方法を確立するべく,光の伝搬を禁止するフォトニックバンドギャップ(PBG)帯域における光の振る舞いを詳細に検討した.通常のバンド構造においてPBG帯域は,光の状態(モード)が存在しない帯域として表される.そのため,フォトニック結晶へ意図的に導入した欠陥部分はPBG帯域の光に対して,共振器や導波路として振る舞う.ここで,欠陥部分に閉じ込められた光は周囲のバルク部分にもエバネッセント的に浸み出している.そこで,欠陥が入っていないバルクのフォトニック結晶における光の振る舞いを,複素バンド構造を用いて表現し,それによって共振器や導波路の特性を理解することを検討した.まず,有限差分時間領域法を用いた複素バンド構造の解析手法を提案し,ストライプ積層型3次元フォトニック結晶の複素バンド構造を解析した.そして,共振器及び導波路の光閉じ込め特性と比較した結果,共振器や導波路の光閉じ込めには,バルク結晶の特性が強く反映されていることが分かった.そのため,共振器からの光拡がり方向は,欠陥部の共振モードが,周囲にあるバルク部分のエバネッセント場へ,波数を保存して接続されていることが分かった.さらに,共振器の設計方法へ複素バンド構造の解析結果を応用することで,共振器からの光拡がり方向を制御可能であることを示した.今年度の研究により,3次元フォトニック結晶中における,PBG帯域の光の振る舞いを定量的に取り扱う方法を提案し,これにより共振器や導波路の特性をよく説明できることを示した.今後,本手法をさらに発展させることで低損失な光制御や放射パターンの制御など,新しい設計方法へと展開できると期待できる.ストライプ積層型3次元フォトニック結晶において,これまでに,面内方向および層間方向において広帯域の光伝搬が可能な導波路を開発し,これらを連結させることにより,3次元光伝搬動作の実証に成功している.本年度は,それをさらに発展させるべく3次元フォトニック結晶内部における導波路の集積性について検討を行った.本研究の成果として,3次元フォトニック結晶の内部へ構造を導入する際に,一つの試料中に適切な数の構造を導入できるようになったと考えられる.以上の成果について,平成26年度においては,国際学会2件,国内学会3件の発表を第一著者として行った.そのほか,昨年度より引き続き検討を行ってきた3次元フォトニック結晶の積層型斜め導波路の光出力特性に関して,2件の論文を現在執筆中であるなど,研究発表を進めている.
難治性慢性疼痛に対する新たな鎮痛薬開発を目指したP2X7受容体機能抑制機序の解明

侵害受容性疼痛や神経障害性疼痛を成因とする難治性慢性疼痛に対する新たな鎮痛薬として、P2X7受容体のみを選択的に阻害する薬物の開発に貢献するため、鎮痛作用を持つニューロステロイド、プレグネノロン硫酸塩と、神経傷害性疼痛に対する鎮痛薬として使用されている抗うつ薬、パロキセチンのP2X7受容体に対する影響を電気生理学的に調べた。その結果、これらの薬物が濃度依存性にP2X7受容体機能を抑制し、その抑制機序が非拮抗阻害であることを発見した。これらの結果は、P2X7受容体機能抑制機序を解明するのに役立つと考えられる。侵害受容性疼痛や神経障害性疼痛を成因とする難治性慢性疼痛の病態については未だ解明されておらず、現在の鎮痛薬では無効な例も多く、新たな鎮痛薬の開発は急務である。近年、慢性疼痛の発生機序として、ATP受容体サブタイプの一つであるP2X7受容体の活性化が深く関わっていることが示されているが、P2X7受容体活性化の調節機構そのものについて不明な点が多く、これを解明することが重要な鍵となると考えられる。そこで、P2X7受容体をターゲットにした新たな鎮痛薬開発に貢献することを目的として、研究計画を立てた。1.電気生理学的手法(アフリカツメガエル卵母細胞発現系)を用いたP2X7とP2X3受容体に対するニューロステロイド(NS)の影響解析、2.P2X7とP2X3受容体のcRNAを用いたキメラ型cRNAの作成、3.電気生理学的手法を用いたキメラ型P2X受容体に対するNSの影響解析による作用部位の同定、4.侵害受容性疼痛・神経障害性疼痛モデルマウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、5.遺伝子変異マウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、である。現在までに我々は、強い鎮痛作用を持つNS、アロプレグナノロン硫酸塩(APS)がP2X7受容体機能を抑制することを確認してきた。そこで、その他のNSであるプレグネノロン硫酸塩(PS)、プレグナノロン硫酸塩(PAS)、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩(DHEAS)と、ステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンのP2X7受容体に対する影響を電気生理学的に解析したところ、PAS、DHEAS、デキサメタゾンは、P2X7受容体機能に対して弱い抑制作用しか示さなかったが、PSはAPSよりも強い抑制作用を持ち、最も強くP2X7受容体機能を抑制することを発見した。今後、これらの結果を踏まえ、分子生物学的手法を用いてP2X7受容体機能抑制機構を解明していく予定である。APSがP2X7受容体機能を強く抑制することを、予備実験で確認していたが、その他のNSであるPSが、より強い抑制効果を持つ事を発見できた。1電気生理学的手法(アフリカツメガエル卵母細胞発現系)を用いたP2X7とP2X3受容体に対するニューロステロイド(NS)の影響解析、2P2X7とP2X3受容体のcRNAを用いたキメラ型cRNAの作成、3電気生理学的手法を用いたキメラ型P2X受容体に対するNSの影響解析による作用部位の同定、4侵害受容性疼痛・神経障害性疼痛モデルマウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、5遺伝子変異マウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、である。NSであるアロプレグナノロン硫酸塩(APS)、プレグネノロン硫酸塩(PS)、プレグナノロン硫酸塩(PAS)、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩(DHEAS)と、ステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンのP2X7受容体に対する影響を電気生理学的に解析したところ、PAS、DHEAS、デキサメタゾンは、弱い抑制作用しか示さなかったが、APS、PSは共に強い抑制作用を持ち、PSの作用が最も強いことを発見した。さらに、APS、PSの抑制機序を解析したところ、共にATP誘発性電流を拮抗阻害的に抑制することを確認した。P2X7受容体のATP誘発性電流に対するアロプレグナノロン硫酸塩(APS)とアロプレグネノロン硫酸塩(PS)の抑制機序が非拮抗阻害であることを確認した。

1電気生理学的手法(アフリカツメガエル卵母細胞発現系)を用いたP2X7とP2X3受容体に対するニューロステロイド(NS)の影響解析、2P2X7とP2X3受容体のcRNAを用いたキメラ型cRNAの作成、3電気生理学的手法を用いたキメラ型P2X受容体に対するNSの影響解析による作用部位の同定、4侵害受容性疼痛・神経障害性疼痛モデルマウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、5遺伝子変異マウスに対するNSの疼痛抑制効果の解析、である。NSであるアロプレグナノロン硫酸塩(APS)、プレグネノロン硫酸塩(PS)、プレグナノロン硫酸塩(PAS)、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩(DHEAS)と、ステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンのP2X7受容体に対する影響を電気生理学的に解析したところ、PAS、DHEAS、デキサメタゾンは、弱い抑制作用しか示さなかったが、APS、PSは共に強い抑制作用を持ち、PSの作用が最も強いことを発見した。また、APS、PSの抑制機序を解析したところ、共にATP誘発性電流を拮抗阻害的に抑制することを確認した。さらに、神経障害性疼痛の治療として使用される様々な抗うつ薬のP2X7に対する影響を調べたところ、抗うつ薬の中でパロキセチンのみがP2X7機能を抑制することを発見した。これらの結果もP2X7受容体活性化の調節機構を解明する上で、重要な手がかりになると考えられる。侵害受容性疼痛や神経障害性疼痛を成因とする難治性慢性疼痛に対する新たな鎮痛薬として、P2X7受容体のみを選択的に阻害する薬物の開発に貢献するため、鎮痛作用を持つニューロステロイド、プレグネノロン硫酸塩と、神経傷害性疼痛に対する鎮痛薬として使用されている抗うつ薬、パロキセチンのP2X7受容体に対する影響を電気生理学的に調べた。その結果、これらの薬物が濃度依存性にP2X7受容体機能を抑制し、その抑制機序が非拮抗阻害であることを発見した。これらの結果は、P2X7受容体機能抑制機序を解明するのに役立つと考えられる。これまでの結果を踏まえて、分子生物学的手法を用いてP2X7受容体機能抑制機構を解明していく予定である。これまでの結果を踏まえて、分子生物学的手法を用いてニューロステロイドによるP2X7受容体機能抑制機構を解明していく予定である。麻酔科学残った金額が少なく、必要な物品が購入できなかったため。残額が予定していた試薬・消耗品を購入するための金額に満たなかったため。翌年度分と合わせて、試薬などの必要な物品を購入する予定である。次年度分と合わせて、試薬・消耗品の購入に使用する予定。
P. gingivaris線毛によるリン酸化蛋白質の発現とIL-4による抑制作用

成人性歯周疾患の主要病原菌であるPorphyromonas gingivarisの線毛は、定着因子としての働きを持つ一方、炎症性サイトカインの産生誘導に機能していることが明らかにされている。故に、本線毛により誘導される炎症性サイトカインの発現に関する制御機構を明らかにすることは究めて重要な事と考えた。現在までに私共はP. gingivalis線毛によるサイトカイン遺伝子の発現が、そのレセプターを介して誘導される事の可能性を明らかにし、さらにマクロファージにおける炎症性サイトカインの発現には、本線毛により誘導された68kDaのリン酸化蛋白質が細胞内情報伝達因子として密接に関与している事を報告している。一方ごく最近、Interleukin-4が骨吸収に対して抑制的に作用するとの知見が報告された。同因子は抗炎症性サイトカインとしての働きが明らかにされており、またマクロファージの種々の機能発現を制御する因子としても注目されている。そこで、私はマウス腹腔マクロファージにおいてP. gingivalis線毛により誘導された68kDaリン酸化蛋白質が、IL-4により抑制されるか否かを検討した。その結果、同細胞においてP. gingivalis線毛処理後20分で誘導された68kDaリン酸化蛋白質は、IL-4処理により濃度依存的に抑制された。さらに、IL-4は線毛によるモノサイト特異的走化性活性化因子MCP-1/JE、及び好中球特異的走化性活性化因子KC/GRO/MGSAの発現をも抑制した。また、この抑制効果はIL-4前処理によって、より顕著であった。以上の知見はIL-4がP. gingivalis線毛により誘導される68kDaリン酸化蛋白質の発現を抑制することにより、炎症性サイトカイン産生を制御する事を示唆するものであり、歯周疾患における炎症反応成立機構の一端を明らかにしたものと考えられる。
運動学習におけるGluRδ2サブユニットの機能解析

グルタミン酸受容体チャネルGluRδ2サブユニットのノックアウトマウスは平行線維-プルキニエ細胞シナプスの長期抑圧を欠損している。GluRδ2が小脳プルキニエ細胞に特異的に発現することから、プルキニエ細胞特異的ノックアウトマウスとしてGluRδ2欠失マウスは運動学習における小脳皮質の機能を解析する最適の動物モデルである。本研究では、音(条件刺激、CS)と電気刺激(非条件刺激、US)を用いた瞬目反射条件付けを行いGluRδ2欠失マウスの運動学習機能を解析した。その結果GluRδ2欠失マウスはCSとUSを同時に与えるdelay paradigmにおいて、条件反射の獲得に顕著な障害を示した。一方、CSとUSに時間差をつけて与えるtrace paradigmにおいてGluRδ2欠失マウスは野生型マウスと同様に学習することが出来た。すなわち、小脳皮質の平行線維-プルキニエ細胞シナプスの長期抑圧は同時入力の連合学習に必須であるが、時間差のある二つの入力の連合学習には必ずしも必要ではないことが示された。以上の結果から、小脳長期抑圧の運動学習への関与は、学習パラダイムに依存すると結論された。また、小脳が関わる記憶・学習の分子機構の解明を目的として、特定の細胞において任意の時期に遺伝子欠損を引き起こすために、遺伝子組換え酵素Creとプロゲステロンレセプターとの融合蛋白遺伝子(CrePR)をGluRε3サブユニット遺伝子の5'領域に接続した発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作成した。このマウスに合成アンチプロゲステロンを投与し小脳顆粒細胞特異的にCre活性を誘導することができた。従って、このマウスを用いた誘導型遺伝子ノックアウト法は小脳運動学習の分子機構を解明する有効な手段となる。今年度は、小脳の特定の細胞において時期特異的に遺伝子ノックアウトを達成するために2つの系統のマウスを作成することを試みた。第1はテトラサイクリン(tet)オペロンを利用し、tet投与によりCreを発現させるベクターを導入したトランスジェニックマウスである。現在までにCre活性を発現できるマウスをスクリーニングし、小脳細胞においてほぼ特異的にCreを発現するマウスを得ており、活性制御の検討をおこなっている。第2はGluRδ2染色体遺伝子にCreの認識配列(loxP)を導入した標的遺伝子組み換えマウスである。このマウスの作成のためにベクターをES細胞に導入し標的遺伝子組み換え細胞を1クローン得た。この細胞を受精卵に注入しキメラマウスを作成した。現在、標的遺伝子が生殖系列に伝達するか検討している。またさらに新たなES細胞を取得するためのベクター構築を行っている。これらの研究成果の他に今年度はNMDA受容体チャネルGluRε2サブユニットのC末端部分を欠損させたマウスを作成した。このマウスは、シナプス形成に異常を示し生後致死であった。C末端欠損により蛋白発現量やシングルチャネルの性質には影響を与えなかったが、海馬CAlでのシナプスNMDA電流が低下しサブユニットのシナプス分布も低下した。これらの結果から、GluRε2サブユニットのC末端部分はシナプス局在に重要であり、NMDA受容体チャネルのシナプス局在が正常なシナプス形成に必須であることを明らかにした。またNMDA型グルタミン酸受容体のGluRε1サブユニットがシナプス可塑性と文脈学習の閾値に関わること、さらに虚血時の神経細胞死に関わることを見い出した。グルタミン酸受容体チャネルGluRδ2サブユニットのノックアウトマウスは平行線維ープルキニエ細胞シナプスの長期抑圧を欠損している。GluR

δ2が小脳プルキニエ細胞に特異的に発現することから、プルキニエ細胞特異的ノックアウトマウスとしてGluRδ2欠失マウスは運動学習における小脳皮質の機能を解析する最適の動物モデルである。本研究では、音(条件刺激、CS)と電気刺激(非条件刺激、US)を用いた瞬目反射条件付けを行いGluRδ2欠失マウスの運動学習機能を解析した。その結果GluRδ2欠失マウスはCSとUSを同時に与えるdelay paradigmにおいて、条件反射の獲得に顕著な障害を示した。一方、CSとUSに時間差をつけて与えるtrace paradigmにおいてGluRδ2欠失マウスは野生型マウスと同様に学習することが出来た。すなわち、小脳皮質の平行線維ープルキニエ細胞シナプスの長期抑圧は同時入力の連合学習に必須であるが、時間差のある二つの入力の連合学習には必ずしも必要ではないことが示された。以上の結果から、小脳長期抑圧の運動学習への関与は、学習パラダイムに依存すると結論された。また、小脳が関わる記憶・学習の分子機構の解明を目的として、特定の細胞において任意の時期に遺伝子欠損を引き起こすために、遺伝子組み換え酵素Creとプロゲステロンレセプターとの融合蛋白遺伝子(CrePR)をGluRε3サブユニット遺伝子の5'領域に接続した発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作成した。このマウスに合成アンチプロゲステロンを投与し小脳顆粒細胞特異的にCre活性を誘導することができた。従って、このマウスを用いた誘導型遺伝子ノックアウト法は小脳運動学習の分子機構を解明する有効な手段となる。
肝臓移植における脂肪肝移植の成績向上に向けての研究

脂肪肝の肝臓移植後に発生する肝グラフト機能不全を防止する方法は、いまだ開発されていない。本研究で、脂肪肝における肝グラフトのviabilityの低下を肝細胞増殖因子(HGF)によって防止し、移植後の生存率を向上せしめうるか否かを検討した。ラットにコリン・メチオニン欠乏食15日間投与による実験的脂肪肝を作成し、肝グラフトをUW液中12時間冷保存した後に同所性肝移植を行った。移植前に肝ドナーのラットにHGFを全身投与したのちにグラフト灌流液と保存液中にHGFを添加した群では、非投与の対照群に対して、グラフト流出液中およびレシピエント血清中のGOT、GPT、LDHが有意に低値であり、ヒアルロン酸の取り込み率も有意に良好であった。肝移植後生存率は、HGFを非投与の対照群で33%(18例中6例生存)であったのに対し、83%(18例中15例生存)と有意に生存率の改善を認めた。再灌流2時間後の肝グラフトの光顕所見では、対象群に比較し、投与群で肝類洞の欝血はより軽度であり、脂肪滴も少量で小型であった。電顕所見およびTUNEL染色では、投与群で類洞内皮細胞の障害はより軽度であり、肝細胞および類洞内皮細胞のアポトーシスもより軽微であった。さらに、投与群においてBrdU陽性肝細胞数は対象群に比較して増加しており、HGFの肝再生促進効果が示唆された。また、HGF投与12時間後のドナーラットの体重、肝グラフトの重量、ラット血清中GOT、GPT、LDHは非投与の対照群と比較して差はなかったが、血清Total cholesterol、triglyceride、LDL、VLDL値は有意に上昇していた。以上より、脂肪肝移植において、ドナーおよびグラフトへのHGF投与による移植後生存率の改善が得られ、その機序には、保存・再灌流による肝細胞および類洞内皮細胞の両方の障害に対して、HGFによる前処置の保護効果が関与すると考えられた。ラットにコリン欠乏食投与による実験的脂肪肝を作成し、種々の投与日数による脂肪肝の程度、肝重量、肝機能を検討した。21日間投与において肝重量が非投与群の12gに比して18.6gと肝腫大を認めたが、体重との比は非投与群の0.053に対して0.07と、有意差を認めなかった。肝機能としてAST、ALTは投与後2ないし3週目で120/79IU/Lと最高値となり、Total cholesterol値は4週目で非投与群の67mg/dlに対して80.5mg/dlと高値を示した。病理的に判定した脂肪肝の程度は投与7日目より7080%であり、これは2、3、4週間投与でも変化を見なかった。ラット肝移植後の生存率については、コリン欠乏食非投与の正常肝ではUW液中肝グラフト冷保存1、3、6、9、12時間後でも全例生存した。これに対して、コリン欠乏食23週間投与の脂肪肝においては、1時間保存で100%、6時間で60%、9時間で50%、12時間で17%と、著明に保存後の生存率の低下を認めた。コリン欠乏食10日間投与群でも同様の結果を得た(6時間保存で100%、12時間で0%)。

以上より、脂肪肝は正常肝に比較して、保存によるグラフトviabilityの低下が有意に大であるとの結論を得た。この脂肪肝におけるviabilityの低下をHGFによって防止しうるか否かを検討した。肝グラフトを6時間保存した後移植を行ったが、肝ドナーのラットにHGFを全身投与したのち保存液と灌流液中にHGFを添加した群での生存率は、HGFを投与しなかった対照群の生存率が40%であったのに対して、100%と全例の生存を得た。以上より、脂肪肝移植におけるHGF投与の有用性が示唆された。脂肪肝における肝グラフトのviabilityの低下をHGFによって防止しうるか否かを検討した。ラットにコリン欠乏食15日間投与による実験的脂肪肝を作成し、肝グラフトをUW液中12時間保存した後に同所性肝移植を行った。移植前に肝ドナーのラットにHGFを全身投与したのちにグラフト灌流液と保存液中にHGFを添加した群では、非投与の対照群に対して、グラフト流出液中およびレシピエント血清中のGOT、GPT、LDHが有意に低値であり、ヒアルロン酸の取り込み率も有意に良好であった。肝移植後生存率は、HGFを投与しなかった対照群の生存率が33%(18例中6例生存)であったのに対して、83%(18例中15例生存)と有意に生存率の改善を認めた。再灌流2時間後の肝グラフトの光顕所見では、対象群に比較し、投与群で肝類洞の鬱血はより軽度であり、脂肪滴も少量で小型であった。電顕所見では、投与群で類洞内皮細胞の障害はより軽度であり、肝細胞のアポトーシスもより軽微であった。なお、HGF投与12時間後のドナーラットの体重、肝グラフトの重量・ラット血清中GOT、GPT、LDHは非投与の対照群と比較して差はなかったが、血清Total cholesterol値は有意に高値であった。以上より、脂肪肝移植において、ドナーおよびグラフトへのHGF投与による移植後生存率の改善が示唆され、その機序には肝細胞およ類洞内皮細胞の両方に対するHGFの有する保護効果が関与すると考えられた。脂肪肝における肝グラフトのviabilityの低下をHGFによって防止し、移植後の生存率を向上せしめうるか否かを検討した。再灌流2時間後の肝グラフトの光顕所見では、対象群に比較し、投与群で肝類洞の欝血はより軽度であり、脂肪滴も少量で小型であった。電顕所見では、投与群で類洞内皮細胞の障害はより軽度であり、肝細胞および類洞内皮細胞のアポトーシスもより軽微であった。また、投与群においてBrdU陽性肝細胞数は対象群に比較して増加しており、HGFの肝再生促進効果が示唆された。なお、HGF投与12時間後のドナーラットの体重、肝グラフトの重量、ラット血清中GOT、GPT、LDHは非投与の対照群と比較して差はなかったが、血清Total cholesterol値は有意に高値であった。以上より、脂肪肝移植において、ドナーおよびグラフトへのHGF投与による移植後生存率の改善が示唆され、その機序には肝細胞および類洞内皮細胞の両方に対するHGFの保護効果が関与すると考えられた。
ユーゴスラヴィアの職場・地域・農村における自主管理のメカニズムに関する実証的研究

1.昭和61,62年の2年度にわたり上記課題による科学研究費補助金(第1年度=7000千円,第2年度=1700千円)をうけ,研究に当った.第1年度は,同年8月中間10月中旬の2カ月にわたりユーゴスラヴィアを訪門,同地の大学・研究機械,政治・行政機関で関係者に面会,ききとり調査をおこない,諸資料の蒐集に当たったほか,工場・地域・農村をひろく訪問して,政治・行政,経済,農業の各側面からの実態調査をおこなった.第2年度は,第1年度の研究成果をもとにして,研究の総括的とりまとめの作業をおこない,そのために,ユーゴスラヴィア・ザグレブ大学学長VLRODIMIR STIPETICを日本に招いて,種々助言をうけた.目下,とりまとめの作業もほぼおわり,研究成果を図書として公刊すべく,昭和63年度,一般学術図書に対する文部省の助成を申請中である.2.ソ連をはじめ一連の社会主義国では,いま,ペレストロイカ,グラスノユチなどのもとで一連の政治・経済改革が試みられていることは,日本でも大きな注目を集めている.從来の国権主義,官僚主義,秘密主義を打破し,自由と民主主義の場をひろげ,経済的にも企業の自主性,労働者参加による自主管理,市場メカニズム,農民経営を含む個人経営などを重視する方向が模索されている.周知のように,ユーゴスラヴィアはこういう方向での先達として,ソ連を中心とするコミンフォルムからの追放などのきびしい国際条件のもとで,民主主義的社会主義をめざし,そのための手段として自主管理制度を採用し,個人経営を尊重しつつ試行錯誤をつみかさねて今日に至っている.今日の一連の社会主義諸国での改革は,このユーゴでの方向や経驗をあるいみではくみとろうとしているといっていい.3.こんにちまでのユーゴスラヴィア研究は,どちらかというと社会主義諸国のなかでは特有なユーゴスラヴィアの自主管理制度の理念,ないし制度上のてたまえの分析に重点がおかれ,理念ないしたてまえのもとでどのような実態があるのかの分析はほとんどなされてこなかった.本研究は,自主管理制度のもとでのコーゴスラヴィアの実態を,政治・行政,経済,農業といった諸側面から分析することを試みた日本でもはじめての本格的研究だといっていい.4.自主管理制度の徹底は,1970年代の憲法改訂,連合労働法制定となるが,そのもとで末端の職場で組織される「連合労働基礎組織」(OOUR)を自主管理制度の基礎組織として,そこに直接民主主義による労働者管理,所得配分などの諸権限を下降させていくことが企図された.だが,こんにち,ユーゴスラヴィアが「経済危機」をむかえるなかで,自主管理制度の根幹となる憲法・連合労働法の改訂が1988年末をめざして企図されつつある.その方向は,從来とは逆に,OOURより上部組織である「労働組織」(RO,日本の企業に相当),や連邦などの諸権限を強化しようとするもの,権限の上向過程であるといっていい.本研究では,「危機」にさいしてゆれ動いているユーゴスラヴィアの実態を諸局面についてあきらかにしえた.5.ユーゴスラヴィア農業は,厖大な旧来的農民経営群と解放後あらたに創設れた少数の巨大な社会経営という2重構造でなりたっている.従来,ユーゴスラヴィア農業の基礎をなす農民経営の実態についてたちいった解明をなしえなかった.本研究は農村の実態調査を実施することにより,こんにちユーゴスラヴィアの農民層の2極分解がおこっていること,すなわち,一方には大多数の農民の「土地もち労働者」,「労働者ー農民経営」(兼業)化,他方では少数の上層農民の富裕化,ブルジョア化が進展しつつあることを確認しえた.1.昭和61,62年の2年度にわたり上記課題による科学研究費補助金(第1年度=7000千円,第2年度=1700千円)をうけ,研究に当った.第1年度は,同年8月中間10月中旬の2カ月にわたりユーゴスラヴィアを訪門,同地の大学・研究機械,政治・行政機関で関係者に面会,ききとり調査をおこない,諸資料の蒐集に当たったほか,工場・地域・農村をひろく訪問して,政治・行政,経済,農業の各側面からの実態調査をおこなった.第2年度は,第1年度の研究成果をもとにして,研究の総括的とりまとめの作業をおこない,そのために,ユーゴスラヴィア・ザグレブ大学学長VLRODIMIR STIPETICを日本に招いて,種々助言をうけた.目下,とりまとめの作業もほぼおわり,研究成果を図書として公刊すべく,昭和63年度,一般学術図書に対する文部省の助成を申請中である.2.ソ連をはじめ一連の社会主義国では,いま,ペレストロイカ,グラスノユチなどのもとで一連の政治・経済改革が試みられていることは,日本でも大きな注目を集めている.從来の国権主義,官僚主義,秘密主義を打破し,自由と民主主義の場をひろげ,経済的にも企業の自主性,労働者参加による自主管理,市場メカニズム,農民経営を含む個人経営などを重視する方向が模索されている.周知のように,ユーゴスラヴィアはこういう方向での先達として,ソ連を中心とするコミンフォルムからの追放などのきびしい国際条件のもとで,民主主義的社会主義をめざし,そのための手段として自主管理制度を採用し,個人経営を尊重しつつ試行錯誤をつみかさねて今日に至っている.

今日の一連の社会主義諸国での改革は,このユーゴでの方向や経驗をあるいみではくみとろうとしているといっていい.3.こんにちまでのユーゴスラヴィア研究は,どちらかというと社会主義諸国のなかでは特有なユーゴスラヴィアの自主管理制度の理念,ないし制度上のてたまえの分析に重点がおかれ,理念ないしたてまえのもとでどのような実態があるのかの分析はほとんどなされてこなかった.本研究は,自主管理制度のもとでのコーゴスラヴィアの実態を,政治・行政,経済,農業といった諸側面から分析することを試みた日本でもはじめての本格的研究だといっていい.4.自主管理制度の徹底は,1970年代の憲法改訂,連合労働法制定となるが,そのもとで末端の職場で組織される「連合労働基礎組織」(OOUR)を自主管理制度の基礎組織として,そこに直接民主主義による労働者管理,所得配分などの諸権限を下降させていくことが企図された.だが,こんにち,ユーゴスラヴィアが「経済危機」をむかえるなかで,自主管理制度の根幹となる憲法・連合労働法の改訂が1988年末をめざして企図されつつある.その方向は,從来とは逆に,OOURより上部組織である「労働組織」(RO,日本の企業に相当),や連邦などの諸権限を強化しようとするもの,権限の上向過程であるといっていい.本研究では,「危機」にさいしてゆれ動いているユーゴスラヴィアの実態を諸局面についてあきらかにしえた.5.ユーゴスラヴィア農業は,厖大な旧来的農民経営群と解放後あらたに創設れた少数の巨大な社会経営という2重構造でなりたっている.従来,ユーゴスラヴィア農業の基礎をなす農民経営の実態についてたちいった解明をなしえなかった.本研究は農村の実態調査を実施することにより,こんにちユーゴスラヴィアの農民層の2極分解がおこっていること,すなわち,一方には大多数の農民の「土地もち労働者」,「労働者ー農民経営」(兼業)化,他方では少数の上層農民の富裕化,ブルジョア化が進展しつつあることを確認しえた.
HBV持続発現小動物モデルを用いたHBV複製機構ならびにHBV変異誘発機構の解明

in vitroならびにin vivo B型肝炎ウイルス(HBV)発現系を用いてHBV複製機構と変異誘発機構を検討した。本研究の成果として、1)preS/S蛋白は単一細胞内HBV複製に影響を与えないこと、2)インターフェロン-γはHBVの初期排除に重要でないこと、3)B型肝炎劇症化に関与する新規HBV変異を同定したこと、4)HBVキャリアの肝炎発症時に起こるHBV変異はHBV増殖低下をきたすこと、5)precore、preS2変異はラミブジン耐性変異HBVの増殖を補助すること、6)V1753、C2189変異はアデホビルに対する治療感受性を増加させること、7)新規核酸アナログ多剤耐性変異を同定したこと、が挙げられた。B型慢性肝炎の治療として核酸アナログが使用されているが、この際薬剤耐性変異ウイルスの出現が大きな問題となる。in vivoでの薬剤耐性ウイルス誘発機構の解明は本研究課題の1つであるが、その前段階として本年度はin vitrosystemを用いて以下の2つの検討を行った。(1)ラミブジン耐性変異出現機序に関与するHBV変異についての検討ラミブジン耐性変異HBVは、耐性責任変異であるrtM204V/I変異のみならず、変異ウイルスの複製を補助するrtL180M変異も高率に有している。ラミブジン耐性変異HBV44株の全塩基配列を検討したところprecore stop codon変異とpreS2近位部の欠失変異を有する株では有さない株よりも有意にrtL180M変異が低頻度であった。in vitroHBV増殖系を用いた検討により、これらのprecore変異とpreS2変異はrtL180M変異と同様にラミブジン耐性変異HBVの増殖に補助的に働くことが示された。(J Infect Dis2008;198:1150-8)(2)アデホビル治療効果に寄与するHBV変異についての検討ラミブジン耐性をきたしアデホビル追加投与を施行した30例において治療効果に影響を与えるHBV変異の総括的スクリーニングを施行したところ、V1753(V=not T)とC2189変異を有するHBV株ではアデホビルに対する治療効果が良好な傾向が認められた。しかしながらin vitroHBV増殖系を用いた検討ではV1753、C2189変異ウイルスのアデホビル感受性は野生株と比べて差を認めなかった。このことよりこれらの変異を有するHBVは宿主免疫反応によるウイルス排除を受けやすく、その結果アデホビル治療効果がより良好となる可能性が示唆された。(J Med Virol2009;in press)本研究の課題の一つとしてin vivoにおけるHBV変異誘発機構を解明することが挙けられる。本年度はin vivoの前段階としてのin vitroでのHBV変異の検討として以下の2つを施行した。なお、in vivoにおける変異誘発機構に関しては本年度から次年度にかけて検討継続中となっている。(1)核酸アナログ多剤耐性変異HBVウイルスの同定HBV治療薬として核酸アナログが広く用いられているが、耐性ウイルスの出現が大きな問題点である。本検討ではラミブジン(LAM)、アデホビル(ADV)、エンテカビル(ETV)の3剤にて治療したB型慢性肝炎症例から多剤耐性HBVの同定を試みた。結果として本症例からは、i)rtL204V/rtL180M/rtS202G変異を有するLAM/ETV耐性株とii)rtA181T変異を有するLAM/ADV耐性株の2系統の変異.HBVが同定された。今後、核酸アナログ治療の進歩に伴い複雑な多剤耐性HBVの出現が予測されるため、本研究成果は非常に示唆に富むものと思われた。(Antivir Ther 2009 ; 14 : 873-7)(2)B型慢性肝炎致死的増悪症例から得られた変異HBVのウイルス学的特徴の検討B型劇症肝疾患の発症に関わるHBV変異に関してはいまだ完全には明らかになっていない。本検討では経過中に致死的な急性増悪をきたしたB型慢性肝炎症例における増悪1年前と増悪後の血清からHBVのサブクローニングを行い、そのウイルス学的特徴の比較検討を行った。増悪1年前のHBV株はpreS/S遺伝子に多くの変異を有し、その結果環状2本鎖(RC)HBV DNA合成能の低下が認められた。一方、増悪後のHBV株ではこのような特徴はみられなかった。このことより本症例ではpreS/S遺伝子における高変異状態が解除され、環状2本鎖(RC)HBV DNA合成能が回復した結果、HBV増殖能の著明増加ひいては疾患劇症化に至ったと考えられた。

本研究成果はB型劇症肝疾患発症に関与する新規HBV変異を示唆したものである。(Biochem Biophys Res Commun 2010 : 394 ; 87-93)本年度は以下の2つの検討を行った。(1)HBVキャリアの無症候期から肝炎期への移行におけるウイルス変異の役割についての検討本検討では8.3年の経過観察の後に活動性肝炎を発症した無症候性HBVキャリアの1例から経時的に採取した血清よりHBV全長の塩基配列を同定した。合計11カ所の点変異と2種類の欠失変異が検出されたが、これらの変異はいずれも肝炎発症と関連して出現していた。培養細胞へのウイルス遺伝子の導入実験において、肝炎発症前より発症後のウイルスで有意にHBV増殖活性の低下が認められた。以上よりHBVキャリアの肝炎発症時に起こるHBV変異はウイルス増殖低下をきたし、このことはHBV持続感染維持のためのウイルス側の適応反応であることが示唆された。(BiochemBiophysRes Commun 2010:394;574-80)(2)in vivoにおけるHBV排除におけるインターフェロン-γの影響についての検討hydrodynamic法にてマウス肝にHBV遺伝子導入を行う系におけるHBV複製は、ヌードマウスを用いた場合数ヶ月以上保持されるが、免疫系の正常なBALB/cマウスを用いた場合約2週間で認められなくな-る。本検討ではBALB/cマウスとインターフェロン-γノックアウト(GK0)マウスを用いて、上記のin vivo HBV遺伝子導入系を施行した。その結果、HBV遺伝子導入後における肝内でのHBV RNA発現、血中HBV DNA量、血中HBs抗原量はいずれも両者に差を認めず、さらにGKOマウスにおいてもBALB/cマウス同様、遺伝子導入後2週間までにHBV発現は消失した。以上よりin vivoにおけるHBVの初期排除の過程において、インターフェロン-γはあまり重要ではない可能性が考えられた。(unpublished data)