hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子井戸マイクロストリップ線路におけるサブピコ秒電界パルス伝搬の速度制御

本研究では半導体量子井戸構造を含むマイクロストリップ線路を作製し,量子井戸層に光励起等によって電子・正孔を生成することで,サブピコ秒電気信号の伝播速度を変化させることを目的とした.研究においては素子作製・測定と同時に有限差分時間領域(FDTD)法による3次元電磁界解析等を平行して行い,以下のような成果が得られた.(1)本研究着手時に得ていた電気信号が,基板表面側の単線のみによって導波されていることを見いだした.単線導波はマイクロ波および光波領域で観測されている.テラヘルツ領域では導電率の実部と虚部が同程度の値をもつことから,電磁波導波における表面プラズモンの影響を明らかにする格好の舞台となりえる.また,導体を一様な誘電率の絶縁体で覆った場合にはマイクロストリップ線路よりも少ない減衰および分散が得られることなどが明らかになった.今後,応用展開が期待できる.(2)線路導体間に光を入射可能な透明導電膜ITOを裏面導体とするマイクロストリップ線路を作製し,1THzのスペクトル範囲であれば伝搬距離を1mm程度としても,十分に良好な伝送特性が得られることを実証した.またFDTD解析により1THzを超える周波数では,電気伝導をドルーデモデルで取り扱う必要があることが明らかになった.(3)有機ポリマー(ポリイミド)を絶縁層とする薄膜マイクロストリップ線路において数mm程度のサブピコ秒電気信号伝送が可能であることを実証した.(4)上記マイクロストリップ線路に半導体量子井戸層を埋め込むプロセス手法を確立した.光励起による伝播制御実験においては,励起光強度不足により,伝播速度制御の観測にはいたらなかったが,上記の素子作製プロセス手法はかなりの汎用性があり,今後の機能化マイクロストリップ線路実現へ向けた展開が期待できる.本研究では半導体量子井戸構造を含むマイクロストリップ線路を作製し,量子井戸層に光励起等によって電子・正孔を生成することで,サブピコ秒電気信号の伝播速度を変化させることを目的とした.研究においては素子作製・測定と同時に有限差分時間領域(FDTD)法による3次元電磁界解析等を平行して行い,以下のような成果が得られた.(1)本研究着手時に得ていた電気信号が,基板表面側の単線のみによって導波されていることを見いだした.単線導波はマイクロ波および光波領域で観測されている.テラヘルツ領域では導電率の実部と虚部が同程度の値をもつことから,電磁波導波における表面プラズモンの影響を明らかにする格好の舞台となりえる.また,導体を一様な誘電率の絶縁体で覆った場合にはマイクロストリップ線路よりも少ない減衰および分散が得られることなどが明らかになった.今後,応用展開が期待できる.(2)線路導体間に光を入射可能な透明導電膜ITOを裏面導体とするマイクロストリップ線路を作製し,1THzのスペクトル範囲であれば伝搬距離を1mm程度としても,十分に良好な伝送特性が得られることを実証した.またFDTD解析により1THzを超える周波数では,電気伝導をドルーデモデルで取り扱う必要があることが明らかになった.(3)有機ポリマー(ポリイミド)を絶縁層とする薄膜マイクロストリップ線路において数mm程度のサブピコ秒電気信号伝送が可能であることを実証した.(4)上記マイクロストリップ線路に半導体量子井戸層を埋め込むプロセス手法を確立した.光励起による伝播制御実験においては,励起光強度不足により,伝播速度制御の観測にはいたらなかったが,上記の素子作製プロセス手法はかなりの汎用性があり,今後の機能化マイクロストリップ線路実現へ向けた展開が期待できる.半導体量子井戸構造を含むマイクロストリップ線路の作製・測定および有限差分時間領域(FDTD)法による3次元電磁界解析等を進めた結果,以下のような成果が得られた.(1)基板厚さ350μmの金属マイクロストリップ線路構造において,本研究着手時に得ていたサブピコ秒電界信号が,通常の2導体系線路としてではなく,基板表面側の単線のみによって導波されていることを見いだした.このような単一導体線路における電磁波の導波はマイクロ波領域で近年確認されていたものであるが,THz領域でも同様の伝搬が起こることを示したことになる.テラヘルツ領域では導電率の実部と虚部が同程度の値をもつことから,電磁波導波における表面プラズモンの影響を明らかにする格好の舞台となりえる.(2)前記の単線導波の性質についてFDTD法による詳細な解析を行った.導体を一様な誘電率の絶縁体で覆った場合にはマイクロストリップ線路よりも少ない減衰および分散が得られることなどが明らかになった.今後,応用展開が期待できる.(3)本研究着手時には電界パルス信号は50μm程度しか伝搬できていなかったが,500μmまでの伝搬を確認した.(4)マイクロストリップ線路における導体間に光を入射するために必要となる透明導電膜ITOの成膜条件出しを進め,導電率2.5×10^3/Ωcmの値が得られた.FDTD計算による予測では,この導電率でも数100μm程度の伝搬は可能であるが,さらに1×10^4/Ωcmまで向上すれば,伝搬距離を1mm程度にのばすことができる.(5)光導電スイッチによるサブピコ秒電気信号発生において,光励起キャリアの速度オーバーシュート効果を含めた数値解析により,発生信号の予測を行った.伝送線路インピーダンスや励起キャリア密度によっては,波形が大きく変わること場合があることなどが明らかになった.

本研究では半導体量子井戸構造を含むマイクロストリップ線路を作製し,量子井戸層に光励起等によって電子・正孔を生成することで,サブピコ秒電気信号の伝播速度を変化させることを目的とした.研究においては素子作製・測定と同時に有限差分時間領域(FDTD)法による3次元電磁界解析等を平行して行い,以下のような成果が得られた.(1)本研究着手時に得ていた電気信号が,基板表面側の単線のみによって導波されていることを見いだした.単線導波はマイクロ波および光波領域で観測されている.テラヘルツ領域では導電率の実部と虚部が同程度の値をもつことから,電磁波導波における表面プラズモンの影響を明らかにする格好の舞台となりえる.また,導体を一様な誘電率の絶縁体で覆った場合にはマイクロストリップ線路よりも少ない減衰および分散が得られることなどが明らかになった.今後,応用展開が期待できる.(2)線路導体間に光を入射可能な透明導電膜ITOを裏面導体とするマイクロストリップ線路を作製し,1THzのスペクトル範囲であれば伝搬距離を1mm程度としても,十分に良好な伝送特性が得られることを実証した.またFDTD解析により1THzを超える周波数では,電気伝導をドルーデモデルで取り扱う必要があることが明らかになった.(3)有機ポリマー(ポリイミド)を絶縁層とする薄膜マイクロストリップ線路において数mm程度のサブピコ秒電気信号伝送が可能であることを実証した.(4)上記マイクロストリップ線路に半導体量子井戸層を埋め込むプロセス手法を確立した.光励起による伝播制御実験においては,励起光強度不足により,伝播速度制御の観測にはいたらなかったが,上記の素子作製プロセス手法はかなりの汎用性があり,今後の機能化マイクロストリップ線路実現へ向けた展開が期待できる.
網膜酸化障害マーカーの開発、及び網膜光障害に対する新規ビタミンE強化療法の効果

マウスのビタミンE(VE)欠損モデルを用いて,網膜の加齢におけるVEの役割を評価した。4ケ月齢のVE(-)群の網膜に含まれるα-TocopherolはVE(+)群よりも71倍少なかった。またγ-Tocopherolは検出されなかったためVE(-)群は厳密にVEが欠乏した状態であると判断された。この群では,n-3の不飽和脂肪酸が減少していたのに対し,他の脂肪酸は不変もしくは増加していた。18ケ月齢では,VE(-)群の外顆粒層(ONL)の核がVE(+)群より17%減少していた。電子顕微鏡で観察すると,VE(-)群ではONLの核の間のマトリックスが増加していた。また,杵体の外節が膨張し,網膜色素上皮細胞(RPE)内に多数の含有物が見られた。蛍光顕微鏡で観察するとVE(-)群のRPEで自家蛍光が増大していた。4ケ月齢と比較すると,18ケ月齢のマウスでは両群でHODEと8-iso-PGF_<2α>が網膜とRPEで増加していた。しかし,加齢による変化はVE(+)群よりもVE(-)群でより顕著であった。a-TTP^<-/->マウスにVE(-)欠乏食を与えることにより厳密なVE欠損モデルを作り出すことが出来た。VE欠損は網膜の脂質過酸化を増強し,加齢に伴う網膜の変性を促進することが明らかとなった。以上の結果より、網膜内のVEを増加させる事で網膜変性を抑制できる可能性が示唆され、VE点眼の有用性が高まった。4ヶ月齢のVE(-)群の網膜に含まれるα-TocopherolはVE(+)群よりも71倍少なかった。18ヶ月齢では,VE(-)群の外顕粒層(ONL)の核がVE(+)群より17%減少していた。4ヶ月齢と比較すると,18ケ月齢のマウスでは両群でHODEと8-iso-PGF_<2α>が網膜とRPEで増加していた。網膜組織に豊富に含まれる脂肪酸であるリノール酸の直接的な酸化代謝物であるhydroxyoctadecadienoic acid(HODE)、およびアラキドン酸の直接的な酸化代謝物である8-iso-prostaglandin F_2□(8-iso-PGF_2α)が生体で有効な網膜酸化障害マーカーとなり得るか、マウスの光障害モデルを用いて検討した。
種々の走査プローブ顕微鏡を用いた分子操作・加工による分子素子の製造と機能評価

昨年に引き続き、均一で安定な高配向性「超構造単分子膜」形成に関してはLangmuir-Blodgett(LB)膜の方法により、A-S-D三組分子の向きを揃えて単分子膜を形成できるかどうかを調べた。この目的のために2種類の構造を持つと考えられる多層膜の形成をヘテロLB膜形成装置を用い、一層おきにA-S-D三組分子を含む単分子膜を交互に積層した。タイプaではA-S-D三組分子のDの部位が空気側に、タイプbではAの部位が空気側に向いていると予想される。これらの膜の配向性の評価は走査表面電位顕微鏡で光照射時の光起電力を測定することによって行った。光起電力の測定結果は膜の配向性を強く支持している。さらにこの配向性の向上を図り、一分子層の単分子膜で十分な光起電力を発生させることにも成功した。「超構造」内のナノドメイン形成に関しては、A-S-D三組分子とアンテナ分子の混合単分子膜のドメイン形成を膜の自己組織化機能を利用して試みた。ここでは炭化水素鎖(HC)とフッ化炭素鎖(FC)を持つ両親媒性化合物の相分離機能をドメイン形成に利用した。これまでの研究から、アニオン性のHCとFCを持つ両親媒性化合物の混合単分子膜をポリイオンコンプレックス形成により作製すると、二階建て構造をとることが分かった。A-S-D三組分子はカチオン性、アンテナ分子はアニオン性両親媒性化合物であるので、HCを持つカチオン性とアニオン性の両親媒性化合物とFCを持つアニオン性の両親媒性化合物からなる3成分のLB膜を作製し、その構造をAFM、摩擦力顕微鏡、表面電位顕微鏡、SNOM及びSIMSを用いて検討した。また横並びの相分離構造を作る条件についても検討した。b)アンテナ分子と電荷分離三つ組分子の増感色素部位に相当する部位のみを有する両親媒性分子との混合単分子膜内でのエネルギー移動アンテナとして作用するビレン部位と増感色素であるアシル化ペリレン部位との間のエネルギー移動の効率を向上させるための条件を検討した。
頭頚部癌に対する制癌剤感受性試験

鈴木らはHuman Tunor Clonegic Assem法により舌癌、歯肉癌、上顎癌、咽頭癌および上顎悪性線維性組織球腫(MFH)など頭頚部癌8例に対して、BLM,CDDP,5-Fu,MMCの4剤を使用し検討した。結果は感受性陽性率BLM(10%),CDDP(25%),5-Fu(33%),MMC(33%)であり、CDDPを除く3剤については、臨床成績と一致した。ついで制癌剤と放射線の併用療法の基礎的検討もおこない、歯肉由来の培養細胞Ca9-22,Hela,MKN-45に用い、Ca9+22の制癌剤感受性は高く、放射線(X線)との併用はSteel and Peckrainの分析を用い、Supra-additiveで効果が期待できた。(日大口腔科学Vol15、No2、第1報153156,第2報157165,1989)上記を基礎実験として、(1)抗腫瘍剤併用投与時のラットにおける障害について検討し、骨髄障害の亢進、肝障害発現が増強されることが示唆された。(2)マイトマイシンCと温熱の併用致死効果の検討、(3)チャイニーズハムスター、オヴァリ-(CHO)細胞による温熱中性子線致死量率の検討。(2)については温熱とマイトマイシンCの併用で相加効果を示し、この致死機構は温熱シスプラチンとは異なることが予想された。(3)は温熱により、中性子線の致死効果をX線同様に増強することが明らかになった。(4)術前化学療法が有効症例につき、根治術施行後に、皮フ移植、筋及弁などを用いて再建が容易となる症例を経験した。(5)免疫賦加剤併用は、基礎実験の結果は、今後の悪性腫瘍による拡大手術の可能性を示唆した。(1)頭頸部癌および消化器癌につきHuman Tumor Clonogenic Asseyを用い基礎的検討として培地、細胞分散法を検討するとともに感受性についても実験をおこなった。培地については上層の培地を原法のCMRL1066からDMEに変更することで消化器癌におけるcolony形成能を高めることを、細胞分散にはenzyme cocktailを用いることで細胞収量を増加し得た。頭頸部癌についても上記と同様方法をおこない、感受性試験成功率、すなわち対照群において30colony以上colonyを形成し得た症例は62.5%であり消化器癌と同程度の形成能を示した。薬剤感受性については、BLMが100%の高い感受性を示し、臨床における舌癌の成績に相関している。CDDPは33%の低い感受性を示したが、薬剤濃度、接触時間について再検討したい。(2)頭頸部癌の放射線と制癌剤の併用については、歯肉癌由来のCa9-22は、対照としたHelaMKN-45に比べ50%survicalにおいてBLM、CDDP感受性が高く、γ線生存曲線におけるパラメータは胃癌由来のMKN-45とほぼ同程度を示し、Helaは最も感受性が高いが、BLMに対する感受性はCa9-22に比べ低く、CDDPに対する感受性は同程度であった。(3)5種の哺乳類細胞における温熱放射線増感効果について、チャイニーズ・ハムスター細胞系、CHOおよびV-79ヒト細胞系Hela、A-7およびHMN-1を使用し、温熱処理と放射線照射との時間間隔は、44゚Cで処理時間が長ければ長いほど放射線に対する高い感受性を示した。(4)細胞における温熱耐性の誘導とHeatshock proteinの発現につき、上記細胞を用い温熱処置後およそ10時間で温熱耐性が最大に発現し、この耐性の大きさの増減はHSP増減で容易に推察し得る。

(5)抗腫瘍剤併用投与時のラットにおける障害性は体重減少骨髄障害亢進、肝障害を認め、単独投与時より副作用が増強され得ることが示唆された。(1)異なる温度により誘導される温熱耐性とヒートショック蛋白質(第45回日大歯学会総会平成5年5月22日)チャイニーズハムスターオバリー(CHO)細胞を用い42°C・200分、43°C・75分、45°C・15分温熱処置を行い温熱耐性の大きさの動態及びヒートショック蛋白質(HSP)量、その関係を明らかにした。温熱処理後の耐性発現最大時間においてHSP量は最大を示した。これによりHSP量は、各々の温熱処置群で温熱耐性が最大発現時に最大量として発現されるが、処理温度が異なる場合、温熱耐性の大きさとHSP量は相関を示さないことが示唆された。(2)術前化学療法が奏功し、広背筋M/C flapにて一期的根治術が施行し得た乳癌の一例(埼玉県医学界雑誌第28巻第3号93年)乳癌T_<4a>N_2Mo・stage IIbの局所進行癌に対し、術前化学療法を施行し、PRの効果を認め、また広背筋M/C flapにて一期的に根治術が施行し得た症例を報告した。化学療法はCAF変法にてEndoxan・5-Fuの多剤併用量法である。最終的効果は50%以上の腫瘍縮小を認め、〓下リンパ節は病失、PRと判定、根治術が可能となり、合併症もなく術後25日目に退院した。(3)CHO細胞による温熱中性子線致死効果(日大原子力研究所報告書平成5年度)高LET線の中性子線と温熱療法の致死効果を調べることを目的として行った。実験はin vitroで行い温熱には44°Cを選択し、単独及び組み合わせた時の生存率曲線、増感効果の大きさを判定している。前処置の温熱処理時間が増大するに伴い、温熱増強効果比の増大が認められ、温熱は中性子線の致死効果を増強することが明らかにされた。実験に使用した細胞は、6種のヒト頭頭部由来扁平上皮癌細胞株、すなわちSQ20B,SQ-31,SCC-35,SCC-61,SCC-13,及びSCCKNである。培養液には10%牛胎児血清、1%抗生剤(PSN:GIBCO)及びハイドロコーテゾン(0.4μg/ml)添加のダルペッコMEMを用い、5%炭酸ガス下で37°C培養を行った。細胞播種率はSQ20B,SQ-31,SCC-35,SCC-61,SCC-13,及びSCCKN各々、0.38±0.1,0.085±0.012,0.30±0.05,0.26±0.06,0.39±0.07及び0.26±0.04であった。X線照射には、日立MBR-1520Rを用い、150kVp,0.5mmAl+0.3mmCu,20mA,線量率およそ1.0y/minにて照射を行った。温熱処置は44±0.05°Cwater bathにて行った.生存率曲線はコロニー法により行った。尚、100Gyを照射したNIH3T3細胞をフラスコ毎総細胞数が7.5×10^4になるようにfeeder細胞として添加した。生存率はmultiplicityによる補正を行い算出した。細胞内GSH量の定量は、還元酵素法により行った。ADFの定量はWastern Blot法により行った。『結果及び考察』X線及び44°Cに対する生存率曲線より、Doを算出した。X線に対する生存率曲線におけるDoでは、SQ20B,SQ-31,SCC-35,SCC-61,SCC-13,及びSCCKN各々、1.86±0.14,1.34±0.08,1.17±0.09,0.09±0.06,1.72±0.04及び2.04±0.05Gyとなった。
体育授業におけるモチベーションビデオによる集団効力感増強に向けた実践

本研究の目的は、体育授業で使用可能な集団効力感尺度を作成し、バスケットボール教材において、モチベーションビデオによる集団効力感増強に向けた実践に取り組み、作成した尺度でその効果を測定することであった。集団効力感尺度作成の調査対象は、熊本県または兵庫県の5・6年生児童128名(男72名、女56名)であり、調査は平成27年9月に実施された。授業実践の対象は、熊本県上益城郡5年生児童31名(男17名、女14名)で、平成27年11月-12月に8時限構成の授業で実施された。回収結果の分析は、SPSS 18.0 for windowsを用いた。尺度の構造は、主成分分析で確認した。信頼性を確認するためにα係数を求めた後、他の尺度との相関係数を算出した。集団効力感尺度調査の結果は、1因子構造(寄与率44.98%)であった。α係数は、0.88であり、尺度の内的整合性が確認された。妥当性については、関連が予想される子ども用孤独感尺度(Five-LSC)との相関を求めたところ-0.84であり、負の関連性が認められた。モチベーションビデオの作成は、学級担任が行った。作成上の留意点は、1チームのテーマを設定する。23分程度に編集する。画像1枚は5秒程度にする。3音楽は、テーマに合うものを児童が決定する。4挿入する言葉は、短く、ポジティブなものにする。5画像シーンは、チームメンバー(個人または集団)の良いプレイ映像、勝利や得点後の歓喜の輪、円陣の場面、応援、作戦タイムの場面であり、特定の選手に偏らないよう配慮する。6起承転結のストーリー性を持たせる。7視聴のタイミングは担任教師が決定するであり、今回は授業実施15分前後であった。視聴を通して集団効力感が増強したかどうか確認するため、授業実施前後の尺度得点の平均値に差があるかどうか、対応のあるt検定で確認した。その結果、視聴後、有意に集団効力感得点が高いことが認められた(t(30)=3.43, p<. 01)。
電気粘性流体による超精密主軸駆動システムの開発

本研究は電気粘性効果を積極的に利用した新たな構造概念に基づく主軸駆動システムを実現することを目的として以下の要素研究を実施すると共に,それらを統合化することにより,次に示すような工学上或いは工業上有用な研究成果を得ることができた.(1)超精密加工機や超精密測定機において広く用いられている空気静圧スピンドルををモデル化した評価用スピンドルシステムを新たに設計,試作し,それを用いて電気粘性効果を発現するための最適な電気粘性流体の選定,並びに最適電極間の形状,寸法の設定等,具体的なシステム構築に必要な基礎設計資料を整備することができた.(2)スピンドルシステムの特性制御を目的とした電気粘性流体の具体的な要求特性を明らかにするため,液晶系と分散系の電気粘性流体の詳細な特性比較を行うことにより,それらの得失等を定性的及び定量的に明らかにした.(3)電気粘性流体の特性評価試験装置を開発することにより,電気粘性流体の動的な特性を精密に評価することにより,電気粘性流体応用主軸駆動システムに最適な電気粘性流体の最適な使用条件を決定した.本研究は電気粘性効果を積極的に利用した新たな構造概念に基づく主軸駆動システムを実現することを目的として以下の要素研究を実施すると共に,それらを統合化することにより,次に示すような工学上或いは工業上有用な研究成果を得ることができた.(1)超精密加工機や超精密測定機において広く用いられている空気静圧スピンドルををモデル化した評価用スピンドルシステムを新たに設計,試作し,それを用いて電気粘性効果を発現するための最適な電気粘性流体の選定,並びに最適電極間の形状,寸法の設定等,具体的なシステム構築に必要な基礎設計資料を整備することができた.(2)スピンドルシステムの特性制御を目的とした電気粘性流体の具体的な要求特性を明らかにするため,液晶系と分散系の電気粘性流体の詳細な特性比較を行うことにより,それらの得失等を定性的及び定量的に明らかにした.(3)電気粘性流体の特性評価試験装置を開発することにより,電気粘性流体の動的な特性を精密に評価することにより,電気粘性流体応用主軸駆動システムに最適な電気粘性流体の最適な使用条件を決定した.
脊髄損傷に対するセンダイウイルスベクターを用いた遺伝子治療の検討

研究目的:センダイウィルスベクターは、強力な感染性・タンパク発現効率の高さ・安全性を特徴とするウィルスベクターだが、血管閉塞性肢疾患での臨床治験も計画され審議中であることもあり、非常に注目を集めている。本研究の目的は、センダイウィルスベクターの正常および損傷脊髄に対する投与法を検討し、感染効率・導入遺伝子の発現様式や副作用の有無を明らかにすることである。方法:雄ウィスターラット8週齢の胸椎を全身麻酔下に椎弓切除した。マーカー遺伝子としてgreenfluorescent protein(GFP)を搭載したセンダイウィルスベクター(SeV)を、ガラスマイクロピペットを用いて3μl脊髄内に注入した。コントロールとして、同量の生理食塩水を同部位に注入した。注入後6時間・12時間・1日・3日・1週・2週・4週まで、麻痺の有無を中心に、ラットの行動を観察した。行動観察終了後、組織切片を作成し、組織の概形を検討、さらに抗GFP抗体を用いた免疫染色を行い、導入遣伝子の発現パターンを時間的・空間的に解析した。抗GFP抗体と神経系細胞の特異的マーカーを用いた免疫二重染色を行い、導入遺伝子の発現細胞を解析した。結果および考察:センダイウィルスベクター注入後ラットは一過性に軽度の後肢麻痺を呈したが、注入後3日程度で回復し、以後6週まで行動学的異常を認めなかった。組織学的にも、注入部のわずかな脱髄および神経細胞脱落を認めるのみで、組織障害はごく軽度と思われた。免疫染色の結果、注入部のみならず注入部頭尾側の神経線維にGFPの強い発現が見られた。発現は注入後5日がピークであり、注入後2週ではもはやGFP発現は認められなくなっていた。結論:センダイウィルスベクターは脊髄に強力に遣伝子導入することが可能であり、脊髄損傷に対する遺伝子治療のツールとして有用であると思われた。目的:強力な感染性・タンパク発現効率の高さ・安全性を特徴とする、センダイウィルスベクターの正常および損傷脊髄に対する投与法を検討し、感染効率・導入遺伝子の発現様式や副作用の有無を明らかにすることを計画した。これにより、センダイウィルスベクターの脊髄損傷治療への応用の可能性を明らかにすることが本研究の主目的である。方法:マーカー遺伝子としてgreenfluorescent protein(GFP)を搭載したセンダイウィルスベクター(SeV)を、ガラスマイクロピペットを用いて5μl脊髄内に注入した。注入後6時間・12時間・1日・3日・1週・2週・4週まで、BBB locomotor scale(Basso et al., 1995)をもちいてラットの行動を観察した。行動観察終了後、それぞれの時間経過でラットを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定し、脊髄および脳を取り出し、凍結切片を作成し、ヘマトキシリン-エオジン染色・Luxol Fast Blue染色を行い、組織の概形を検討のうえ、抗GFP抗体を用いた免疫染色を行い、導入遺伝子の発現パターンを時間的・空間的に解析した。結果および考察:SeVを注入したラットでは特に異常行動(痙攣など)を呈するものは見られなかったが、注入直後より後肢の軽度の麻痺を呈した。麻痺は時間とともに徐々に回復傾向を示したが、注入後4週の最終観察時においてBBB score平均18点(満点は21点)と、軽度麻痺が残存していた。組織学的検討にて、SeV注入部周辺の空洞形成・炎症細胞浸潤がみられた。GFP免疫染色では、損傷部のニューロン・グリア細胞のみならず損傷部から頭尾側に、神経線維に沿ったGFP発現が見られた。発現のピークは注入後5日前後と思われた。他のウィルスベクターとは大きく異なるSeVに特徴的な遺伝子発現パターンとして、損傷部から頭尾側に広範囲に神経線維での発現が見られた。索路特異性などをさらに詳細に検討することでSeVを用いた遺伝子治療の脊髄損傷への応用の可能性につき探っていく予定である。

発現は注入後5日がピークであり、注入後2週ではもはやGFP発現は認められなくなっていた。結論:センダイウィルスベクターは脊髄に強力に遣伝子導入することが可能であり、脊髄損傷に対する遺伝子治療のツールとして有用であると思われた。
癌の放射線治療におけるアポトーシスに関与する癌遺伝子産物の免疫組織化学的検討

頭頸部偏平上皮癌40例において、治療前ならびに4Gy照射時、10Gy照射時および20Gy照射時に癌組織の一部を採取し、液体窒素中に超低温保存し、これよりクリオスタットにて6μm厚の切片を作成し、癌関連遺伝子(産物)に対するモノクローナル抗体とヒストファインSAB-POキットを用いて免疫組織化学的染色を行った。p53(Ab-3,mutant)の染色陽性率(+,++)は、治療前25.0%(9/36)、4Gy照射時36.4%(12/33)、10Gy時25.7%(9/35)、29Gy時13.8%(4/29)であった。放射線治療20Gy時のHE標本にて判定した局所効果とp53(ab-3)染色性との関係について、局所効果をremarkable/effective群とpoor群に分けて検定を行ったところ、治療前のp53(Ab-3)陽性群では有意に局所効果良好との結果を得た。4Gy時では統計学的有為差はないものの、同様の傾向が認められた。予後とp53(Ab-3)染色性との関係については、治療前および4Gy時には明らかではなかったが、10Gy時にはp53(Ab-3)陽性群のほうが予後不良傾向にあった。年齢、性、原発部位、T因子、N因子、病期、分化度とp53(Ab-3)染色性との間には明らかな関係は認められなかった。舌癌8例、上顎洞癌4例、中咽頭癌4例、口腔底癌3例、歯肉癌2例、硬口蓋癌1例、下咽頭癌1例の計23例について検討した。このうち、放射線治療前には20例、4Gy照射時には18例、10Gy照射時には20例、20Gy照射時には16例について、免疫組織化学染色を施行し得た。p53(Ab-3)の発現については、+または++と判定した症例は、治療前には30.0%(6/20),4Gy照射時には38.9%(7/18),10Gy時には25.0%(5/20),20Gy時には6.3%(1/16)となった。p53(Ab-6)の発現については、+または++と判定した症例は、治療前には10.5%(2/19),4Gy照射時には11.8%(2/17),10Gy時には5.0%(1/20),20Gy時には0%であった。c-H-ras(Ab-1)の発現については、+または++と判定した症例は、治療前には14.3%(3/21),4Gy照射時には18.8%(3/16),10Gy時には10.0%(2/20),20Gy時には0%となった。c-myc(Ab-1)の発現については、+または++と判定した症例は、治療前には0%、4Gy照射時には12.5%(2/16),10Gy時には4.8%(1/21),20Gy時には6.3%(1/16)であった。ANTI-c-FOSの発現については、+または++と判定した症例は、治療前には52.4%(11/21),4Gy照射時には70.6%(12/17),10Gy時には73.7%(14/19),20Gy時には62.5%(10/16)となった。

頭頸部扁平上皮癌40例において、治療前ならびに4Gy照射時、10Gy照射時および20Gy照射時に癌組織の一部を採取し、液体窒素中に超低温保存し、これよりクリオスタットにて6μm厚の切片を作成し、癌関連遺伝子(産物)に対するモノクローナル抗体とヒストファインSAB-P0キットを用いて免疫組織化学的染色を行った。p53(Ab-3,mutant)の染色陽性率(+,++)は、治療前25.0%(9/36)、4Gy照射時36.4%(12/33)、10Gy時25.7%(9/35)、20Gy時13.8%(4/29)であった。放射線治療20Gy時のHE標本にて判定した局所効果とp53(Ab-3)染色性との関係について、局所効果をremarkable/effective群とpoor群に分けて検定を行ったところ、治療前のp53(Ab-3)陽性群では有意に局所効果良好との結果を得た。4Gy時では統計学的有意差はないものの、同様の傾向が認められた。予後とp53(Ab-3)染色性との関係については、治療前および4Gy時には明らかではなかったが、10Gy時にはp53(Ab-3)陽性群のほうが予後不良傾向にあった。年齢、性、原発部位、T因子、N因子、病期、分化度とp53(Ab-3)染色性との間には明らかな関係は認められなかった。
革新的合成手法を駆使した自在開殻π造形

本研究では、開殻pi電子系分子を自在に創製する「自在開殻pi造形」の確立とその過程で合成される新奇開殻pi電子系の機能開拓を目的としている。1.閉殻構造をもつ分子群を足場とした開殻piユニット直接連結型金属錯体による開殻pi造形:開殻piユニットであるニトロニルニトロキシド(NN)が直接配位した各種金属錯体に関して、ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンに二つの金-NNを導入したジラジカル種の合成に成功した。2. NN直接連結型金属錯体を鍵とした芳香環への開殻piユニット直接導入による開殻pi造形:これまでに本研究者が開発した金-NN錯体を用いたカップリング反応により、これまでに調製が不可能だった、NN-置換オリゴチオフェンやNN-置換フェノチアジンの短段階合成に成功した。これらを用いてマルチラジカルpiシステムの創製が可能になり、磁気的相互作用に関する新たな知見が得られた。3.マルチラジカルpiシステムの創製:開殻pi電子系を種々組み合わせることで、複数の電子スピンをもつ安定マルチラジカルpiシステムの創製を検討した。前述のNN-置換オリゴチオフェンを1電子酸化することによって得られるジラジカルカチオン種では溶液中におけるpi-ダイマー形成を利用して分子ワイヤーの解析することに成功した。また、NN-置換フェノチアジンを1電子酸化することによって得られるジラジカルカチオンは大きな正の交換相互作用をもつ基底三重項であることがわかった。さらに、高い安定性をもつのと同時に、1000 nmを超える長波長領域にT-T吸収に由来すると考えられる吸収帯が存在することを実験的に明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに本研究者らは、空気中でも取り扱い可能なほど安定な基底多重項分子等の新規開殻pi電子系分子の合成・単離・結晶化に成功し、それらの電子・磁気物性を明らかにしてきた。本研究では、これまでに本研究者らが独自に開発してきた、開殻piユニットであるニトロニルニトロキシド(NN)の直接導入法を利用した自在に開殻pi電子系分子を創成する「自在開殻pi造形」の確立を目指している。具体的には、1.閉殻構造を有する分子群(閉殻piシステム)を足場とした開殻piユニット直接連結型金属錯体による開殻pi造形、2.NN直接連結型金属錯体を鍵とした芳香環への開殻piユニット直接導入法による開殻pi造形、3.以上のpi造形法を利用した新規マルチ開殻piシステムの合成を目指した開殻pi造形を展開を行った。同時に、領域内で造形されるあらゆるpiシステムを用いた開殻pi造形も検討した。本年度に実施した研究の成果を以下に示す。1.に関して、ホスフィンを含む閉殻π電子系を配位子に用いて、金(I)イオンを利用することで、迅速かつ効率的にNNユニットを導入する方法を見出した。2.に関して、特異な電子構造を有するπ電子系分子のヨード体に対してNNの金(I)錯体を用いたクロスカップリング反応を用いることで、比較的簡単に特異な開殻piシステムの合成を達成した。3.に関して、イミノニトロキシドラジカルを配位子とする三核金錯体の合成を達成し、特異な磁気挙動を示すことを明らかにした。また、基底五重項を有する新奇なテトララジカルカチオンの合成にも成功した。本研究者らは、空気中でも取り扱い可能なほど安定な基底多重項分子等のポリラジカル種を中心に、新規な開殻pi電子系の合成、単離、結晶化に成功し、それらの電子・磁気物性を明らかにしてきた。本研究では、これまでに独自に開発してきた開殻piユニットであるニトロニルニトロキシド(NN)の直接導入法を利用した自在に開殻pi電子系分子を創成する「自在開殻pi造形」の確立を目指している。1.閉殻構造をもつ分子群を足場とした開殻piユニット直接連結型金属錯体による開殻pi造形:閉殻構造を有するpi電子系分子群に対して、ホスフィン部を足場とすることで金(I)イオンを介して迅速かつ効率的にNNユニットを導入する方法を開発した。最近では複数のNNを一挙に導入する合成法の開発にも成功している。現在、ジラジカルやトリラジカル種の各種物性の解明を検討している。また、本法を用いた領域内の共同研究を現在進めている。2.NN直接連結型金属錯体を鍵とした芳香環への開殻piユニット直接導入による開殻pi造形:昨年度開発したpi電子系に対してクロスカップリング反応を用いることで直接NN部を導入する方法を活用し、種々の特異なpi電子系分子をコアとする新規開殻pi電子系分子を合成に成功した。この方法により新しいタイプの基底三重項ジラジカルカチオンの創成に成功した。また、新しい配位子を用いることで、銅錯体を利用したNNのカップリング試薬を開発した。非常に簡便にNNを導入手法を確立し、種々の閉殻pi電子系の開殻化に成功し、その電子、磁気物性を検討している。その合成法を利用して、領域内の複数のグループと共同研究を進めており、特異な分子が合成できることが分かってきた。本研究者らは、空気中でも取り扱い可能なほど安定な基底多重項分子等の新規な開殻pi電子系の合成、単離を検討している。

本研究では、開殻piユニットであるニトロニルニトロキシド(NN)の直接導入法を中心に、これまでに独自に開発してきた自在に開殻pi電子系分子を創成する「自在開殻pi造形」の確立を目指している。1.閉殻構造をもつ分子群を足場とした開殻piユニット直接連結型金属錯体による開殻pi造形:閉殻構造を有するpi電子系分子群に対して、ホスフィン部やN-ヘテロサイクリックカルベン部を足場とし、金(I)イオンを用いることで迅速かつ効率的にNNユニットを導入する方法を開発した。複数のNNユニットを導入することも可能であり、NN間における磁気的相互作用や電子的相互作用に関する知見を蓄積した。領域内外での本法を利用した共同研究を進めており、その中でA01の山村との研究成果をDalton Transaction誌に発表した。また、イミノニトロキシドを利用したトリラジカル金(I)三核錯体の合成、単離、結晶化に成功し、基底四重項種であることを見出した。本研究は金属種を介した磁気的相互作用制御法の新しい様式の一つと考えられる。現在、さらなる物性解明を検討している。2. NN直接連結型金属錯体を鍵とした芳香環への開殻piユニット直接導入による開殻pi造形:これまでNN-金(I)-ホスフィン錯体による方法の他に、NN-金(I)-N-ヘテロサイクリックカルベン、NN-銅(I)-ジホスフィン錯体を用いてもカップリング反応による芳香環へのNN導入化が可能であることを見出した。さらに、金属錯体を介さずとも無置換NN体を用いてもカップリング反応が進行する系を見出した。現在、さらなら反応検討を行っている。また、領域内外での本法を利用した共同研究を進めている。昨年度よりさらに進んだNN導入法を確立すること、また、種々のカップリング反応を検討することで、多様な閉殻pi電子系の開殻化に成功している。また、開殻piユニット間の相互作用により予期せぬ物性の発現も見出した。開発した合成法や分子を利用して、領域内の複数のグループと共同研究を進めている。本研究では、開殻pi電子系分子を自在に創製する「自在開殻pi造形」の確立とその過程で合成される新奇開殻pi電子系の機能開拓を目的としている。1.閉殻構造をもつ分子群を足場とした開殻piユニット直接連結型金属錯体による開殻pi造形:開殻piユニットであるニトロニルニトロキシド(NN)が直接配位した各種金属錯体に関して、前年度より検討してきた閉殻構造をもつホスフィン配位子に続き、N-ヘテロサイクリックカルベンやフェナントロリンを配位子とした誘導体の迅速合成法を開発した。各錯体の電気化学的挙動を精査することにより、NN部の酸化電位が金属イオンにより大幅に変調可能であることを見出した。2. NN直接連結型金属錯体を鍵とした芳香環への開殻piユニット直接導入による開殻pi造形:1で示した錯体のうち、N-ヘテロサイクリックカルベンやジホスフィンの銅(I)錯体が芳香環へのNN直接導入化に用いられることが分かった。これら銅(I)錯体の反応は申請者がこれまで開発してきた金(I)錯体よりも反応速度が速いことが分かった。
アブシジン酸誘導気孔閉口機構の解析

植物の気孔の開閉は、乾燥ストレス耐性や養分吸収に深く関与する。本研究では、乾燥ストレス耐性に深く関与する植物ホルモンの一つであるアブシジン酸が誘導する気孔閉口機構の解明を行なった。そして、新規の信号伝達因子として働くタンパク質や低分子化合物を発見した。植物の気孔は、蒸散やガス交換を制御する重要な組織である。これまでに、乾燥で誘導されるアブシジン酸によって誘導される気孔閉口において、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化や細胞内カルシウム濃度の上昇、オシレーションが重要であることが報告されて来ている。しかし、アブシジン酸誘導気孔閉口におけるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素(CDPK)の役割は明らかにされていない。そこで、本年度の研究の一つとして、気孔を形成する孔辺細胞に発現する2つのCDPKに着目して、シロイヌナズナを材料に用いて、アブシジン酸誘導気孔閉口機構の解析を行った。解析には、野生株とともにこれらのCDPKのシングルミュータントとダブルミュータントを用いた。アブシジン酸またはカルシウムによる気孔閉口、アブシジン酸または過酸化水素による原形質膜カルシウム(非選択性カチオン)チャネルの活性化やアブシジン酸またはカルシウムによる原形質膜Sタイプアニオンチャネルの活性化、原形質膜Rタイプアニオンチャネルの活性化、タンパク質のリン酸化活性について解析を行った。その結果、孔辺細胞でのアブシジン酸シグナリングにおいて、孔辺細胞内のカルシウム濃度に依存したタンパク質のリン酸化が重要な役割を果たしていることがカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素(CDPK)の変異株を用いることで明らかになった。また、新規アブシジン酸変異株を獲得し、解析を行った。そこで、本年度の研究の一つとして、昨年度に引き続き、気孔で発現するCDPKの役割について調べ、変異体を用いた実験から、孔辺細胞に発現するCDPK3とCDPK6がアブシジン酸シグナリングにおいて機能していることを明らかにした。具体的には、これら二つのCDPKが、ROSの産生、カルシウムチャネルの活性化、アニオンチャネルの活性化を制御していることを明らかにした。その成果をPLoS Biology (2006)に掲載した。また、これらの孔辺細胞でのアブシジン酸シグナリングは、ジャスモン酸シグナリングとシグナルネットワークを構築していることを明らかにした。また、それぞれのシグナリングのかなり上流にある分岐点に関する情報も得た。そして、その成果をPlant Physiol. (2007)に掲載した。また、アブシジン酸によってリン酸化・脱リン酸化されるタンパク質を同定し、その変異体のアブシジン酸に対する応答を調べ、新規アブシジン酸シグナル分子の候補を得た。植物の気孔は、蒸散やガス交換を制御する重要な組織であり、また、植物は乾燥への脅威を引き換えに、根からの養分の吸収を可能にしている。これまでに、乾燥ストレスによって産生されるアブシジン酸によって誘導される気孔閉ロにおいて、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化や細胞内カルシウム濃度の上昇、オシレーションが重要であることが報告されて来ている。本研究では、アブシジン酸誘導気孔閉口におけるタンパク質のリン酸化と脱リン酸化に着目し、数種のタンパク質を同定した。また、そのタンパク質の変異株を用いた解析から、同定されたタンパク質がアブシジン酸誘導気孔閉ロにおけるアブシジン酸シグナリングに関与する新規アブシジン酸シグナル分子であることを明らかにした。(現在投稿中)また、これらの孔辺細胞でのアブシジン酸シグナリングは、ジャスモン酸シグナリングとシグナルネットワークを構築していることを明らかにした。(現在投稿中)植物は、一対の孔辺細胞からなる気孔の開閉によってガス交換とともに水の蒸散の調節している。この水の蒸散は、根からの養分吸収や植物の耐乾燥性に深く関与している。特に、植物ホルモンのアブシジン酸によって誘導される気孔閉口は、乾燥ストレスに対する重要な応答である。本研究では、シロイヌナズナ孔辺細胞におけるアブシジン酸(ABA)シグナル伝達経路の解明を細胞生物学、分子遣伝学、生理学等の手法を用いて行なっている。主な成果として、ABAシグナル伝達経路の新規シグナル因子として、ミロシナーゼを見つけた。ミロシナーゼ変異株tgg1-3、tgg2-1とこれらの2重変異体を用いて解析を行った。野生株に比べ、tgg1-3とtgg2-1のミロシナーゼ活性には、有意な差はなかったが、tgg1-3 tgg2-1の活性には、有意な差があった。また、ABAによって、ミロシナーゼ活性は有意に変化しなかった。

野生株と同様に、tgg1-3とtgg2-1では、ABAによって気孔閉口が誘導されたが、tgg1-3 tgg2-1では、ABAによって気孔閉口が誘導されなかった。しかし、野生株と3つの変異株において、ABAによるROSの産生には差が見られなかった。野生株と同様に、tgg1-3とtgg2-1では、過酸化水素によって気孔閉口が誘導されたが、tgg1-3 tgg2-1では、過酸化水素によって気孔閉口が誘導されなかった。しかし、野生株とすべての変異株において、Ca2+による気孔閉口は、誘導された。また、ABAと同様に気孔閉口を誘導するジャスモン酸メチル(MeJA)についてもABAと同様の結果を得た。以上のことより、2つのミロシナーゼ、TGG1とTGG2が孔辺細胞のABAシグナル伝達ならびにMeJAシグナル伝達において、ROSより下流で、また、細胞内Ca2+上昇より上流で、重複して機能していることを明らかにした。植物は、一対の孔辺細胞からなる気孔の開閉によってガス交換とともに水の蒸散の調節している。この水の蒸散は、根からの養分吸収や植物の耐乾燥性に深く関与している。特に、植物ホルモンのアブシジン酸によって誘導される気孔閉口は、乾燥ストレスに対する重要な応答である。本研究では、シロイヌナズナ孔辺細胞におけるアラシジン酸(ABA)シグナル伝達経路の解明を、ジャスモン酸メチル(MeJA)シグナル伝達経路と比較しながら、細胞生物学、分子遺伝学、生理学等の手法を用いて行なっている。主な成果として、1) ABAシグナル伝達経路におけるカルシウム依存性シグナル伝達経路におけるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素の役割を調べ、ABAシグナル伝達経路とMeJAシグナル伝達経路とにおいて、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素の役割の違いを明らかにした。2)液胞膜イオンチャネル(TPC1)の気孔運動への影響を調べ、TPC1がABAやMeJAが誘導する気孔閉口には関与せず、カルシウムが誘導する気孔閉口にのみ関与することを明らかにした。3) ABAやカルシウムが誘導する気孔閉口には、ABAやカルシウムによるプライミングの必要であることを明らかにした。4) ABAシグナル伝達経路において、MAPキナーゼが関与していることを明らかにした。5)根からの水分吸収におけるアププラスティックフローの役割とその制御に関する知見を得た。以上のように、本申請研究によって、孔辺細胞のABAシグナル伝達ならびにMeJAシグナル伝達に関する新規な知見を得た。
Shhの腸上皮化生粘膜における低下の原因

Cdx2トランスジェニックマウスの胃粘膜におけるShhの発現を定量的PCRで検討したところShhの発現は完全に抑制されていた。RNAレベルのみならず免疫組織染色においても正常胃粘膜の壁細胞に発現しているShhが、腸上皮化生粘膜では完全に消失していた。このShhの発現低下の機序はShhのプロモータ領域のメチル化によるものではなく、転写因子であるCdx2がShhのプロモータ領域に存在するシスエレメントに結合することによりShhの発現を低下させていることが確かめられた。Shhは胃癌との関係のみならず、胃底腺を構成する上皮細胞の分化に関与している。ヒトの腸上皮化生粘膜ではShhの発現が低下していることが報告されている。しかし、このShhの発現低下のメカニズムは明らかにされていない。正常の胃粘膜から腸上皮化生粘膜への変化を分化の観点から見直すと、(A)腸粘膜上皮細胞の形質を発現すること、しかしこれだけでは不十分で、(B)胃粘膜の形質が消失することが必要である。(A)の腸粘膜上皮細胞の形質を発現することは転写因子Cdx2により誘導されることで説明が可能であり、当研究室で作成したCdx2トランスジェニックマウスが証明している。しかし、何故に、腸上皮化生粘膜になると本来の胃粘膜上皮細胞の形質が消失するのかには、現在まで解答が与えられていない。Cdx2トランスジェニックマウスの腸上皮化生粘膜でShhの発現が完全に消失していることをreal time PCRにて明らかにした。このことは、Cdx2がShhの発現低下を引き起こしていることを強く示唆しており、このCdx2によるShhの低下が胃粘膜形質の消失につながっていると考えて実験を行った。このCdx2によるShh低下のメカニズムを解明することは、腸上皮化生粘膜の成因に迫るだけではなく、胃粘膜上皮細胞・腸粘膜上皮細胞の分化のメカニズムにおけるShhとCdx2との関係を明らかにすることができるものと考えられる。in situ hybridizationにより正常胃粘膜で壁細胞にShhが発現しているがCdx2トランスジェニックマウスの腸上皮化生粘膜では消失していることを明らかにした。Shhの発現低下の原因としてShhのpromoter領域のメチル化の関与をBisulphitesequencingにより検討したが、promoter領域はメチル化されていなかった。そこでChIP(Chromatinimmunoprecipitation)assayによりCdx2のShhのpromoter領域へのin vivoでの結合を検討したところCdx2がShhのTATA boxに結合することを明らかにした。正常の胃粘膜から腸上皮化生粘膜への変化を分化の観点から見直すと、[O!A]腸粘膜上皮細胞の形質を発現すること、しかしこれだけでは不十分で、[O!B]胃粘膜の形質が消失することが必要である。[O!A]の腸粘膜上皮細胞の形質を発現することは転写因子Cdx2により誘導されることで説明が可能であり、当研究室で作成したCdx2トランスジェニックマウスが証明している。Shhの発現低下の原因としてShhのpromoter領域のメチル化の関与をBisulphite sequencingにより検討したが、promoter領域はメチル化されていなかった。そこでChIP(Chromatin immunoprecipitation)assayによりCdx2のShhのpromoter領域へのin vivoでの結合を検討したところCdx2がShhのTATA boxに結合することを明らかにした。ヒトの腸上皮化生

粘膜ではShhの発現が低下していることが報告されている。しかし、このShhの発現低下のメカニズムは明らかにされていない。正常の胃粘膜から腸上皮化生粘膜への変化を分化の観点から見直すと、(A)腸粘膜上皮細胞の形質を発現すること、しかしこれだけでは不十分で、(B)胃粘膜の形質が消失することが必要である。(A)の腸粘膜上皮細胞の形質を発現することは転写因子Cdx2により誘導されることで説明が可能であり、当研究室で作成したCdx2トランスジェニックマウスが証明している。しかし、何故に、腸上皮化生粘膜になると本来の胃粘膜上皮細胞の形質が消失するのかには、現在まで解答が与えられていない。Cdx2トランスジェニックマウスの腸上皮化生粘膜でShhの発現が完全に消失していることをreal time PCRにて明らかにした。このことは、Cdx2がShhの発現低下を引き起こしていることを強く示唆しており、このCdx2によるShhの低下が胃粘膜形質の消失につながっていると考えて実験を行った。このCdx2によるShh低下のメカニズムを解明することは、腸上皮化生粘膜の成因に迫るだけではなく、胃粘膜上皮細胞・腸粘膜上皮細胞の分化のメカニズムにおけるShhとCdx2との関係を明らかにすることができるものと考えられる。in situ hybridizationにより正常胃粘膜で壁細胞にShhが発現しているがCdx2トランスジェニックマウスの腸上皮化生粘膜では消失していることを明らかにした。Shhの発現低下の原因としてShhのpromoter領域のメチル化の関与をBisulphite sequencingにより検討したが、promoter領域はメチル化されていなかった。そこでChIP(Chromatin immunoprecipitation)assayによりCdx2のShhのpromoter領域へのin vivoでの結合を検討したところCdx2がShhのTATA boxに結合することを明らかにした。
SAGEデータを基盤にした胃型腸型形質を有する胃癌に関連する遺伝子の網羅的解析

本研究では、胃型・腸型形質を有する胃癌に関連している遺伝子を同定することを目的とした。腸型形質の胃癌で発現している遺伝子として、HOXA10とGJP6を同定した。免疫染色を行った結果、HOXA10は52%、GJP6は22%の胃癌で発現しており、腸型形質の胃癌で染色された。特にGJP6は、ギャップ結合を構成する膜貫通蛋白質であるコネキシン30をコードする遺伝子であり、治療標的として有用である。本研究では、胃癌において、胃型・腸型質に関連している遺伝子を体系的、網羅的に同定することを目的とした。平成19年度は、胃型形質を有する胃癌2例と腸型形質を有する胃癌2例を材料にアフィメトリクス社のGeneChipを用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、胃型・腸型形質に関連している遺伝子の発現していた。HOXA10はホメオボックス遺伝子HOXA10をコードする遺伝子であり、分化に関抽出を行った。その結果、腸型形質を有する胃癌において、HOXA10が高連する転写因子であることが知られている。外科的に切除された胃癌116例のパラフィン切片を材料にHOXA10の免疫染色を行った。非腫瘍部胃粘膜では腺窩上皮ではHOXA10の染色は認められなかったが、腸上皮化生の一部にHOXA10の染色勇が認められた。HOXA10は上皮性細胞の核に染色され、間質の細胞には染色されなかった。胃癌組織においては癌細胞の核にHOXA10の染色が認められた。10%以上の癌細胞が染色された症例を陽性とすると、60例(52%)の症例がHOXA10陽性であった。腸性形質のマーカーであるMUCの免疫染色も合わせて行い同様に評価したところ、MUC2は48例(41%)で陽性であった。MUC2陽性胃癌48例のうち、HOXA1O陽性例は32例(67%)であったのに対し、MUC2陰性胃癌68例では、HOXA10陽性例は28例(41%)であり、統計学的に有意に高頻度にMUC2陽性例でHOXA10も陽性という結果になった(P=0.0084)。以上の結果から、腸型形質の胃癌においてはHOXA10重要であり、HOXA10はホメオボックス遺伝子であることから、何らかの腸型形質を誘導する転写因子である可能性があり、HOXA10の標的遺伝子について検討を進めている。本研究では胃癌において、胃型・腸型形質に関連している遺伝子を体系的、網羅的に同定することを目的とした。これまでの網羅的遺伝子発現解析から、腸型形質の胃癌においてHOXA 10が発現していることを明らかにしている。本年度は、HOXA 10の標的分子の解析を行った。胃癌細胞株HSC-39、HSC-57を材料にHOXA 10をノックダウンし、MUC2、CD10の発現を検討したが、大きな変化はなかった。HOXA 10は腸の転写因子CDX2の標的遺伝子であること報告されており、大腸癌細胞株HT29を材料にCDX2の発現ベクターを導入し、HOXA 10の発現をWestern blotで検討したが、HOXA 10の発現はされなかった。腸型形質の胃癌におけるHOXA 10の発現の意義については未だ不明であり、現在腸型形質に関連するMUC2やCD10以外の分子について関連を検討中である。一方、胃型・腸型形質に関連している遺伝子として、GJP6を同定している。GJP6はギャップ結合を構成する蛋白質の一つであるコネキシン30をコードする遺伝子である。胃癌157例を材料にコネキシン30の免疫染色を施行したところ、34例(22%)に染色され、深達度が浅い症例において高頻度に染色された。コネキシン30陽性例では腸型形質を有する胃癌は71%に検出されたのに対し、コネキシン30陰性例では32%のみに腸型形質を有する胃癌が認めら、コネキシン30陽性例は有意に高頻度に腸型形質を有していた(P=0.0003)。コネキシン30はギャップ結合を構成する蛋白質の一つであり、腸型形質を有する胃癌では、細胞間情報伝達が異なっている可能性が示唆された。以上から、胃型・腸型形質の胃癌では遺伝子発現プロファイルが大きく異なっており、それぞれの病態形成に関わっていると想定された。さらにこれらの分子は治療標的としても有用である。