hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
第四世代膵島分離技術の確立とその臨床応用化

我々は以前に、1.膵管保護、2.二層法保存、3.新規臓器保存液、4.比重コントロールによる膵島純化、5.膵島追加純化、6.分離膵島低温保存、という6つの膵島分離技術を改変して第三世代膵島分離法を確立した。本研究では、1.膵管保護溶液にJNK抑制ペプチドを添加、2.新規臓器保存液(HN-1溶液)の使用、3.連続比重・密度勾配による純化、という3つの膵島分離技術を新たに導入することにより、第四世代膵島分離法を確立した。この膵島分離技術の確立により、2-3例の心停止ドナーからの膵島移植によるインスリン離脱のみならず、1例の脳死ドナーからの膵島移植によるインスリン離脱も期待できる。本研究では、第四世代膵島分離技術を確立しその技術の臨床応用化することを目的としている。申請代表者は、ハーバード大学、京都大学、ベイラー研究所で膵島移植を実施し、第三世代膵島分離技術を確立した。本研究ではその技術をさらに発展させ、第四世代膵島分離技術を確立することを目的としている。平成24年度は、1.JNK抑制ペプチドの安全性確認、2.新規保存溶液(HN-1溶液)の有効性の確認、3.連続比重・密度勾配による純化の検討、の3つを行った。1.JNK抑制ペプチドの安全性確認:膵管保護溶液にJNK抑制ペプチドを添加した場合の有効性および、JNK抑制ペプチドのマウスへの直接投与による安全性の確認は以前に行われていた。今回は、JNK抑制ペプチドを膵管から注入した場合の安全性の確認を行った。JNK抑制ペプチドを膵管から注入した場合、純化後の膵島浮遊液に含まれるJNK抑制ペプチドは検出感度以下となっており、膵島分離中にJNK抑制ペプチドがほぼ完全に除去されることが確認された。また、分離膵島のマウスへの移植による、副作用の発現は確認されなかった。2.新規臓器保存液(HN-1溶液)の有効性の確認:今回、新規臓器保存液(HN-1溶液)を開発し、UW溶液およびMK溶液との比較を行った。UW溶液およびHN-1溶液によるブタ膵保存を行った場合、HN-1溶液を用いたほうが膵島分離による膵島収量は有意に高いことが確認された。また、MK溶液との比較でも、HN-1溶液を用いた時の膵島収量の方が高いことが確認された。3.連続比重・密度勾配による純化の検討:今回、高比重と低比重の溶液の浸透圧を変化させ、連続比重勾配および連続密度勾配の純化溶液を作成し純化を行った。従来法と比較した場合、連続比重・密度勾配による純化の方が膵島純度が高いことが確認された。膵島収量は2群間で有意差は認められなかった。平成25年度は、1.新規臓器保存液(HN-1溶液)の安全性の確認、2.新規純化溶液の安全性の検討、の2つを行った。1.新規臓器保存液(HN-1溶液)の安全性の確認HN-1溶液で保存された膵から分離された膵島をマウスへ移植し、その安全性を検討したが、移植したマウスに副作用と考えらえる兆候、検査データはみられず、マウスレベルでは安全性を確認できた。ちなみに保存溶液中に存在する物質は、膵島分離中に理論上762,939,453,125,000,000分の1にまで希釈される。また、HN-1溶液で使用されている物質は、すべて既存の臓器保存液に含まれている物質であり、すでに臨床使用されているものである。2.新規純化溶液の安全性の検討連続比重・密度勾配によって純化された膵島を動物へ移植し、その安全性を検討したが、移植したマウスに副作用と考えらえる兆候、検査データはみられず、マウスレベルでは安全性を確認できた。純化後に行われる洗浄により、理論上、純化溶液は1,220,703,125分の1にまで希釈される。また、純化溶液で使用されている物質は、すべて既存の臓器保存液、純化溶液、および細胞洗浄液に含まれている物質であり、すでに臨床使用されているものである。本研究では、第四世代膵島分離技術を確立しその技術の臨床応用化することを目的としていた。

申請代表者は、京都大学所属時に、主要メンバーの一人として日本初となる心停止ドナーからの膵島移植、および世界初となる生体膵島移植に成功した実績を持つ。その後、ベイラー研究所で教授として100例以上のヒト膵島分離を実施しており、その時に第三世代膵島分離技術を確立した。その成績は、移植率は80%以上であり、かつ1回のみの移植でインスリン離脱率が100%であった。欧米の一般的な膵島分離施設の移植率は30-40%であり、通常2-3回の移植でインスリン離脱が達成できることを考慮すると、第三世代膵島分離技術のレベルの高さがうかがえる。本研究ではその技術をさらに発展させ、その技術を臨床応用化することを目的としていた。具体的には次の3つの改変を行った。1.膵管保護溶液にJNK抑制ペプチドを添加、2.新規臓器保存液(HN-1溶液)の使用、3.連続比重・密度勾配による純化、の3つを行った。1に関しては平成24年以前に申請代表者がヒト膵を用いてすでに有効性を確認していたため、安全性確認を平成24年度に行った。2、3に関しては有効性を平成24年度に確認し、平成25年度に安全性を確認した。平成26年度にこれらの技術の臨床応用化を行った。研究代表者は現在、京都大学、大阪大学、国立病院機構千葉東病院、信州大学の4施設で臨床膵島移植を実施しており、平成25、26年度に千葉東病院で2例、京都大学で2例、大阪大学で1例(自家移植)の移植を実施することができた。平成25年以降に全国で行われた臨床膵島移植は、5例の他家移植と1例の自家移植の計6例であり、この6例中5例に研究代表者が関与した。26年度が最終年度であるため、記入しない。膵島移植26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度に計画した通り、研究が進んでいる。平成25年度に計画した通り、研究が進んでいる。平成24年度は計画した通り、順調に研究が進んでおり、このまま計画書に従って研究を遂行していく予定である。平成25年度は計画した通り、順調に研究が進んでおり、このまま計画書に従って研究を遂行していく予定である。
心筋幹細胞の心筋分化機構におけるmicroRNAの発現様式の検討

我々は、ヒト心筋より心筋幹細胞株の単離に成功し、末期重症心不全患者における再生治療法を計画している。本研究では、同細胞の心筋分化機構を明らかにするために、遺伝子産物発現の新しい制御機構として注目されているマイクロRNAに着目し検討した。その結果、多数のmiRNA発現が心筋分化に伴い変動することを明らかにした。またmiRNAの生成に必須のRNase Dicerが心筋幹細胞において、細胞分化に必須であることを明らかにした。これらの結果から、心筋幹細胞の心筋細胞分化においてmiRNAがダイナミックに調節を受け、その細胞機能に深く関わることが明らかとなった。今回我々は心筋幹細胞クローン株を樹立し、その未分化維持や分化機構の調節に関与する表面抗原を同定するために検討を行った。まず成仔心臓内より心臓由来非心筋細胞群を単離し、dilution techniqueを用いて単一細胞より増殖する細胞株の単離を試みたところ、クローン株の抽出に成功した。フローサイトメトリー法及びRT-PCR法を用いた検討にて、同細胞はStemcell antigen-1(Sca-1)を強く発現しており、またテロメア活性の維持に必須とされるtelomerase reverse transcriptase(TERT)を強く発現していることが明らかとなった。次いで我々は、TERTをプロモーターに持つEGFPマウスを作製し、心臓内TERT陽性細胞の表現型を検討したところ、Sca-1を発現することを確認した。よって我々はSca-1に着目し、siRNAベクターを用いて作成したSca-1ノックダウン(KD)マウスを用い検討を行った。Sca-1KDマウス由来心筋幹細胞(Sca-1KD群)の表現型は野性型マウス由来心筋幹細胞と同一であり、多分化能においても両群間に有意差は認めなかったが、コロニー形成能がSca-1KD群において低下しており長期培養にても増殖能が低下していた。同現象は、Sca-1KD群におけるBrdU取り込み率低下及びhiston H3のリン酸化抑制、更にはTERTの活性能低下により証明された。また、興味深いことにSca-1KD群はapoptosisに陥りやすいことが明らかとなり、同現象には、bFGF及びEGF刺激に対するAktの不活性化が関与していることが確認された。現在、同クローン株の心筋分化機構におけるmicroRNAの発現様式をNorthen blot法にて確認中である。申請者らはマウス心臓由来非心筋細胞分画より心筋分化能を有する心筋幹細胞株の単離に成功し、その表現型を明らかにしてきた。さらに、ヒト心筋サンプルよりも心筋幹細胞を単離同定することに成功し,心筋梗塞モデルマウスにおける心機能改善の有用性を報告してきた。これらのマウス及びヒト心臓由来心筋幹細胞の同定は、今後末期重症心不全患者における再生治療法の新たな細胞源になり得る可能性を示しているが、現段階ではこれらの心筋分化効率についてはin vitro/vivoの両面において低率であり,また大量の幹細胞採取の困難性を考えると、今後、心筋分化機構の解明が急務である。そこで、本研究では、同細胞における心筋分化機構を明らかにするために、最近,遺伝子産物発現の新しい制御機構として注目されている小分子RNAであるマイクロRNA(microRNA;miRNA)に着目し、同細胞の心筋細胞分化を誘導し、その過程でのmiRNA発現の変化をマイクロアレイを用いてプロファイリングを行い、多数のmiRNA発現が心筋分化に伴い変動することを明らかにした。またmiRNAの生成に必須のRNase Dicerの過剰発現、shRNAによるノックダウンの系を確立し、Dicerは心筋幹細胞において、細胞分化に必須であることを明らかにした。
神経軸索反発分子ファミリーのクローニング及びその機能解析

コラプシン/セマフォリンは1993年に脊椎動物の脳から、神経回路の形成に誘引分子と共に重要である軸索反発分子として見いだされ、種間で保存されたセマドメインを有する。哺乳類ではセマフォリンと呼ばれ、現在脊椎動物で約13の分子が単離されている。最初に発見されたcol-1/semDは知覚神経などの成長円錐を反発するが、semD以外の分子の機能はほとんど不明である。私達はセマドメインを有し膜結合型であるマウスセマフォリン、M-semaFとM-semaGをクローニングし、mRNA発現分布と神経発生に伴う発現パターンの変遷について調べた。さらに蛋白生化学を専門とするWimalawansa、東山博士の協力を得てM-semaFとM-semaGの非常に良い抗体を作製し蛋白の発現部位を調べ、特定の神経回路に発現することを見いだした。これらの解析について発生学や組識学を専門とするSwanson、Kuwada、Ruda、岡本、中村博士の協力を得た。私達は免疫系に高発現するM-semaG(別名CD100)に注目し免疫学を専門とする小杉博士の協力を得てT・B cellのM-semaG発現を調べ、Tcellに高発現していること、ConAなどの刺激によりM-semaGの発現が低下しM-semaGが切れて遊離することを明らかにした。セマフォリンのゲノム構造はほとんど不明なので発生遺伝学を専門とするAllen博士、神経分子生物学を専門とする古山達雄博士の協力を得てM-semaGのゲノム構造の解析ならびにターゲッチングベクターの構築を進めている。さらにalternative splicingの分子が見つかりM-semaGとかなり異なる発現パターンを有することから異なる機能を有するものと考え、これらの分子について神経生理学を専門とするHu、重永、武田博士や細胞生物学を専門とするKolodkin,Zetter、Takada、松浦、Uhl博士の協力を得て研究を進めている。最近semDレセプターであることが報告されたニューロピリンとの結合活性、それに関連する分子や機能などについて、さらに本国際学術研究の遂行の結果得られた様々な領域を専門とする研究者らの協力を得て調べたい。コラプシン複雑な神経回路の形成に関与する神経反発分子として1993年に初めて鶏から単離された。私共は神経回路形成における反発分子の機能を明らかにするため、コラプシン/セマフォリンのファミリー分子を探索することを試みた。本研究達成のために必要な様々な知識・情報・技法を有する研究者と共同し情報交換を行い研究を遂行した。新規コラプシン/セマフォリンのファミリー分子としてM-Sema FとM-Sema Gの2分子をマウスから単離し、その構造がコラプシンとは異なる膜貫通型サブファミリー分子であった。膜貫通型分子の機能については全く不明なので以下の実験を行った。1)M-Sema FとM-Sema GのmRNA発現の組織学的及び発生学的検索を行った。M-Sema FとG mRNAは胎生の早期から神経回路形成期に神経系に発現することから神経回路、ミエリン及びシナプス形成に関与していることが予想された。さらにM-Sema G mRNAは胸腺のT細胞などに強く発現することから免疫系の細胞間認識分子として機能していることが示唆された。

2)M-Sema FとGの抗体を作成し、これら蛋白の発現を免疫組織化学法及びイムノプロット法を用いて解析した。M-Sema FとM-Sema Gの蛋白は回路形成期に一致して発現し、神経回路形成期の神経突起に局在することから神経軸索誘導分子として機能していることが示唆された。3)M-Sema FとGの蛋白を発現しのホモフィリックな接着能を調べたが陰性であった。4)M-Sema FとGはマウス胎児の嗅神経や聴覚上皮やラセン神経節に発現し嗅・聴覚神経の回路形成に関与していることが示唆された。今後さらに培養細胞やvivoの系を駆使してコラプシン/セマフォリンのファミリー分子の機能を明らかにしていく予定である。コラブシンは1993年に脊椎動物の脳から、神経回路の形成に誘引分子と共に重要である軸索反発分子として見いだされ、種間で保存されたセマドメインを有する。コラブシンは哺乳類ではセマフォリンと呼ばれ、現在脊椎動物で約13の分子が単離されている。最初に発見されたcol-1/semDは知覚神経などの成長円錐を反発するが、semD以外の分子の機能はほとんど不明である。私達はセマドメインを有し膜結合型であるマウスセマフォリン、M-semaFとM-semaGをクローニングし、mRNA発現分布と神経発生に伴う発現パターンの変遷について調べた。さらに蛋白生化学を専門とするWimalawansa、東山博士の協力を得てM-semaFとM-semaGの非常に良い抗体を作製し蛋白の発現部位を調べ、特定の神経回路に発現することを見いだした。これらの解析について発生学や組織学を専門とするSwanson、Kuwada、Ruda、岡本、中村博士の協力を得た。私達は免疫系に高発現するM-semaG(別名CD100)に注目し免疫学を専門とする小杉博士の協力を得てT・BcellのM-semaG発現を調べ、Tcellに高発現していること、ConAなどの刺激によりM-semaGの発現が低下しM-semaGが切れて遊離することを明らかにした。セマフォリンのゲノム構造はほとんど不明なので発生遺伝学を専門とするAllen博士、神経分子生物学を専門とする古山(達)博士の協力を得てM-semaGのゲノム構造の解析ならびにターゲッチングベクターの構築を進めている。さらにalternative splicingの分子が見つかりM-semaGとかなり異なる発現パターンを有することから異なる機能を有するものと考え、これらの分子について神経生理学を専門とするJames、重永、武田博士や細胞生物学を専門とするKolodkin,Zetter、Takada、松浦博士の協力を得て研究を進めている。接着活性などはみられなかったが最近semDレセプターであることが報告されたニューロビリンとの結合活性、それに関連する分子や機能などについて、本国際学術研究の遂行の結果得られた様々な領域を専門とする研究者らの協力を得て調べたい。
D-ブレーンと閉じた弦の場の理論

超弦理論の非摂動的な定式化を与える弦の場の理論について以下のような研究を行った。1.光円錐ゲージの超弦の場の理論の場合に、コンタクト項の問題に対処するため、次元正則化の方法を提案した。この方法により正しくtree振幅を計算できることを示した。2.Witten型の超弦の場の理論についても次元正則化の方法が使えることを示した。3.Witten型の開弦の場の理論の古典解に対して、エネルギーがgauge invariant ovservableの一種として書けることを示した。弦の場の理論を用いてD-ブレーンを記述し、D-ブレーンに関連する弦理論の非摂動効果についての知見を得る。超弦理論は重力を含む統一理論の最も有望な候補であるが、この理論を用いて素粒子の模型を作るためにはこの理論の非摂動的な性質を研究することが必要である。この研究では弦の場の理論を用いてこの理論のソリトン解であるD-ブレーンを記述することを目指す。これまでの研究で、Osp不変なボゾン弦の場の理論を用いてD-ブレーンに対応すると考えられる状態が得られていた。今年度はこの状態を用いて開弦の1ループ振幅にあたる量を計算し、この量が通常の方法で計算された結果と一致することを見た。これはわれわれの構築した状態がD-ブレーンに対応しているという更なる証拠を与える。また、D-ブレーンの著しい性質として、複数枚のD-ブレーンが存在する場合、D-ブレーン上の場は行列になることが知られている。我々は、我々の構築したD-ブレーン状態においてこの行列の自由度がどのように現れるかを示した。自下研究中の課題は、これらの成果を超弦の場合に拡張することである。超弦の場の理論にはコンタクト項の問題と呼ばれる問題がある。超弦の場の相互作用項には世界面上の超対称生成子に当たる演算子が含まれており、摂動展開を計算する際にこの演算子が発散をもたらすという問題である。超弦の場の理論においてはこの問題が常に存在し、特にこの問題の存在のために、矛盾のない閉弦の場の理論はこれまで作られていない。我々は、通常の場の理論で使われる次元正則化法と呼ばれる方法を適用し、コンタクト項の問題をある程度解決できるという結果を得た。光円錐ゲージの超弦の場の理論はtree振幅でさえ計算すると発散してしまう。この発散は、弦の相互作用点に存在する超対称チャージによるものであり、多くの超弦の場の理論に同様な問題がおる。今年度の研究において、我々はこの発散は次元正則化の方法を用いて取り扱えることを示した。次元正則化では時空の次元をずらしてしまうため、一見、超弦理論のような時空の次元について制限がおる理論には適用できないように見える。しかし、光円錐ゲージの理論はゲージを固定した理論であるため、時空の次元を臨界次元からずらした理論はローレンツ対称性がないことを除けば何の問題もなく定義できる。我々はまず、時空の次元をずらすことによって、tree振幅の発散が正則化できることを示した。発散が正則化されても、次元を本来の次元に解析接続する際に振幅に発散が現れると、これを相殺するためにカウンタータームを作用につけてやる必要が出てくる。正財化かゲージ対称性等の対称性を保っていると、カウンタータームの形が制限される。我々は、光円錐ゲージにおける次元正則化は高い対称性を保っており、少なくとも(NS,NS)セクターのtree振幅を計算する際には、作用にカウンタータームをつけなくても欲しい結果をもたらすことを示した。この結果は、弦の場の理論の様々な応用において非常に大きなインパクトをもたらす結果であると考える。光円錐ゲージの弦の場の理論は、相互作用項が非常に簡単な形をしているため、弦の非摂動効果を取り扱う際に便利な定式化であると考えられる。ところが、超弦理論について光円錐ゲージの場の理論を用いて計算すると、tree振幅さえ発散する形になってしまう。これは世界面上の相互作用点に存在する超対称カレントによるものであり、光円錐ゲージに限らず超弦の場の理論に共通する問題である。我々はこの発散を次元正則化の方法を用いて取り扱うことを提案した。これまでの研究で、この正則化は弦の場のゲージ対称性を保った正則化であること、及び、この正則化を用いれば全ての外線が(NS,NS)セクターの場合はtree振幅がカウンターターム無しに有限な値になり、第一量子化の結果と一致することを示した。本年度の研究で、これらの結果を外線がRセクターを含む場合について拡張した。Rセクターを扱うためには克服すべきいくつかの問題がある。まず、Rセクターは世界面上のスピン場に対応しているため、我々が提案している次元正則化に対応する世界面上の理論におけるスピン場を定義する必要がある。また、通常の次元正則化を超弦の場合に適用すると、フェルミオンを含まない理論になるという問題もある。

これらの問題を解決し、我々の方法によりtree振幅はカウンターターム無しに第一量子化の結果を再現することが出来ることを示した。この結果は、弦の場の理論の様々な応用において非常に大きなインパクトをもたらす結果であると考える。弦の場の理論は、多くの場合非常に単純な場の相互作用によって弦理論を記述することが出来るため、弦の非摂動効果を取り扱う際に便利な定式化であると考えられる。ところが、超弦理論について弦の場の理論を用いて計算すると、おうおうにしてtree振幅さえ発散する形になってしまう。これは世界面上の相互作用点に存在するpicturechanging演算子・超対称カレントによるものである。我々はこの発散を次元正則化の方法を用いて取り扱うことを提案した。これまでの研究で、光円錐ゲージの場の理論の場合、この正則化は弦の場のゲージ対称性を保った正則化であることを示した。本年度の研究で、これらの結果を拡張した。まず、光円錐ゲージの超弦理論について、外線がフェルミオンを含む場合について考察した。フェルミオンを扱うためには克服すべきいくつかの問題がある。まず、時空のフェルミオンは世界面上のスピン場に対応しているため、我々が提案している次元正則化に対応する世界面上の理論におけるスピン場を定義する必要がある。また、通常の次元正則化を超弦の場合に適用すると、フェルミオンを含まない理論になるという問題もある。弦の場の理論の研究において、様々な局面でうまい正則化が必要とされている。引き続き、弦の場の理論に関する研究を行った。Witten型の弦の場の理論は開いた弦の場のみを含む弦の場の理論であり、近年の研究によって、様々な非自明な古典解が作られている。これらの古典解の物理的性質を探るには、エネルギーとgauge invariant observableと呼ばれる観測量を計算することが一般的である。申請者は馬場氏(筑波大)とともに、この2種類の観測量の間の関係を研究し、エネルギーはあるgaugeinvariant observableと一致するということを示した。一般にエネルギーの計算は、gauge invariant observableの計算に比べて格段に難しいので、この結果は様々な古典解の解析をする際に非常に有用な結果である。また、我々は我々の結果を様々な古典解に応用した。BMT解と呼ばれる解については、我々の方法を用いれば、エネルギーがlump解のそれと一致することを示すことができる。また、Murata-Schnabl解と呼ばれる解については、我々の結果を用いて、gauge invariant observableの計算の際に用いられた正則化の方法を用いてエネルギーを計算することができる。これらの計算は、それぞれの解の物理的性質を理解するのに役立つ。申請者は村上氏(岡山光量子研)とともに、光円錐ゲージの弦の場の理論における散乱振幅の摂動の高次補正の計算に関する研究を進めた。
神経とグリアの相互作用におけるNOの役割

線条体の損傷モデルの作製を試み、iNOSの誘導が起きることを見い出した。定位脳手術によりラットの線条体にエタノール5μlを直接注入し、線条体の約20%が変性する損傷モデルを作り、RT-PCR法により初期応答遺伝子、iNOS、サイトカイン、神経栄養因子等の遺伝子の発現パターンを経時的、空間的に解析した。損傷操作後c-fosの遺伝子発現に続いて、IL-6、G-CSF、iNOSおよびCSF-1遺伝子の誘導が起こり、エタノール注入後、各々0.5、6、12、24および72時間でその遺伝子発現が最大となった。一方、GDNFを始めとする各種の神経栄養因子の遺伝子発現の変動は見られなかった。iNOSに関して、さらに、in situ hybridizationおよびimmunohistochemistry法により分析したところ、損傷部位と健常部位との境界領域に限局してミクログリアにiNOSのmRNAおよび蛋白質が発現していた。また、in situ hybridization法によりMn-SOD及びCu/Zn-SODのmRNA発現が、iNOS発現領域に一致して、損傷操作後24時間目の組織にみられた。SODは細胞をNOの毒性から保護するものと思われる。さらに、エタノール注入後5日目には、損傷部位にCSF-1の作用により増殖したと思われるミクログリアが出現しており、境界領域の神経細胞は脱落しグリオーシスが進行していた。しかし、NOSの阻害剤(L-NAME)を損傷操作直後にラットに全身投与しておくと境界領域にある神経細胞の脱落は減少した。以上のことから、ミクログリアの生成したNOは損傷部位と健常部位との境界領域で何らかのダメ-ジを受けた神経細胞を排除させるものと考えられる。マウスにMPTPを投与した場合、MPTPはグリア細胞に取り込まれ、代謝されMPP^+が生成する。その際、グリア細胞において誘導性NO合成酵素(iNOS)あるいはドーパミン神経の生存に影響を及ぼすグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)がどの様に変化するか明らかでない。NOは周囲を取り巻く環境の酸化還元状態により神経に対し保護作用だけでなく毒性も兼ね備えていると考えられている。特に、ドーパミン神経ではMPP^+が取り込まれた場合ニューロメラニンとの相互作用によりスーパーオキサイドアニオンを生じ、NOが保護因子としてではなく細胞毒としての作用を発揮する可能性がある。一方、GDNFはドーパミン神経に対する神経栄養因子であり、NOの毒性からドーパミン神経を救う可能性がある。今年度の成果は、グリア細胞におけるNOに関しては、誘導性NO合成酵素(iNOS)の抗体を作製し、グリア細胞におけるiNOSの誘導を蛋白質レベルにて分析する系を確立した。現在、MPTPおよびMPP^+のグリア細胞でのiNOS誘導に及ぼす影響について調べている。一方、GDNFに関しては、マウスGDNFのcDNAをクローニングし、蛋白質を発現させることができた。ラット胎児の中脳からのドーパミン神経細胞の初代培養系においてMPP^+存在下におけるドーパミン神経の生存に対してGDNFは保護効果を示すが、現在、MPP^+およびNOが関与した場合におけるGDNFのドーパミン神経の生存に及ぼす影響を検討中である。来年度は、MPTP投与マウスにおけるNOのドーパミン神経に及ぼす影響について、チロシン水酸化酵素、GDNF等の遺伝子に焦点を当て、解析を進めていく。線条体における神経とグリアとの係わりを考える場合、MPTP等の神経毒や線条体の損傷に対して、NOが神経細胞に対しどのような影響を及ぼすか興味がもたれる。初年度は、誘導性NO合成酵素(iNOS)およびグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)のcDNAをクローニングするとともに抗体を作製し、iNOSおよびGDNFの発現を組織レベルにて分析する系を確立した。本年度は、線条体においてiNOSの誘導がおきる損傷モデルの作製を試み、初期応答遺伝子、iNOS、神経栄養因子、サイトカイン等の遺伝子発現の解析を行った。

損傷モデルを作製する上では、ラットの線条体にエタノールを直接注入し、組織を壊死させる方法が最も有効で、線条体の約20%を変性させる系を確立した。この損傷モデルを用いRT-PCR法により各種遺伝子の発現パターンを経時的に解析したところ、c-fosの遺伝子発現に続いて、インターロイキン-6、顆粒球コロニー刺激因子およびiNOS遺伝子の誘導が起こり、エタノール注入後、各々6,12および24時間でその遺伝子発現が最大となった。一方、GDNFを始めとする各種の神経栄養因子の遺伝子発現の変動はなかった。iNOSに関して、さらに、in situ hybridizationおよびimmunohistochemistry法により分析したところ、壊死した部位を取り囲むようにしてアストログリア細胞にiNOSのmRNAおよび蛋白質が発現していることが分かった。さらにエタノール注入後5日目には、このグリア細胞群から一定の領域にある神経細胞が脱落し、ミクログリアが出現し、グリオーシスが進行していた。しかし、iNOSの阻害剤(L-NAME)をあらかじめラットに投与して措くとその範囲にある神経細胞の脱落は減少した。以上のことから、グリア細胞の生成したNOは壊死した部位からある一定の領域に存在する神経細胞をさらに脱落させることが明らかとなった。
大気CO_2増加に対する水稲の器官形成応答機構の解明

本研究は、高濃度CO_2が水稲の発育、器官数、器官サイズに及ぼす影響を解明するとともに、高CO_2応答にいかなる遺伝子変異が認められるかを明らかにしようとする。そのために、発育、形態特性が異なる品種を、2種類のチャンバー(温度勾配型、屋外半閉鎖型)と開放系大気CO_2増加(FACE)実験水田で、2水準のCO_2濃度(外気および外気+200μmol/mol)で栽培した。初年および2年目には、坊主5号、きらら397(以上、北海道品種)、あきたこまち、ササニシキ(以上、東北品種)の4品種を供試した。いずれの年次も東北2品種の出穂期は高CO_2濃度によって早まったのに対し、北海道2品種では変化しないか遅くなる傾向が認められた。また、最終葉数および葉身長は東北品種では高CO_2濃度によって減少したのに対し、北海道品種では増加したか変化しなかった。すなわち、発育の遅速に関するCO_2と遺伝子型の相互作用は、出穂期のみならず、生産性に直結する葉数や葉身長のCO_2応答にも影響する可能性がある。3年目には、一穂穎花数に着目し、シンクサイズの遺伝的変異が生育の高CO_2応答に及ぼす影響を調査した。供試品種は農林8号とその着粒突然変異系統のRM645である。RM645は、二次枝梗が極めて少なく、一穂穎花数が農林8号の5060%であったが、高CO_2による地上部乾物重の増加割合は、613%の狭い範囲にあり、有意な品種と処理の相互作用は認められなかった。いずれの実験においても、光合成の高CO_2応答の品種間差異は、主として葉色や葉身窒素の変異が関与し、草型やシンクサイズが光合成のアクリメーションに及ぼす影響は明らかではなかった。すなわち、高CO_2に対する精製反応の品種間差異は、主として発育、形態、窒素栄養に依存するものと推察された。本研究は水稲の器官形成に及ぼす大気CO_2濃度(以下,CO_2濃度)の影響を定量的に評価することを目的とする。本年度は,発育・形態形成に及ぼすCO_2濃度の影響の品種間差異に着目して,東北農業研究センターの温度勾配型CO_2制御装置(出入口気温差を約7°Cに制御)にて次の2実験を行った。実験1では,坊主5号,新雪,きらら397(以上,北海道品種),あきたこまち,ササニシキ(以上,東北品種)の5品種を供試した。このうち,あきたこまちについては標準窒素区(0.3gN/株)に加えて高窒素区(1.0gN/株)も設けた。実験2では,あきたこまち,コシヒカリ,日本晴を供試し,5段階の温度処理を行った。なお,両実験ともCO_2濃度は外気と外気+200ppmvの2水準とした。<実験1>至穂日数に及ぼすCO_2濃度の影響は品種間で顕著に異なり,高CO_2濃度によって北海道品種の出穂は遅延したか変化しなかったのに対して,東北2品種では34日早まった。また,最終葉数は,北海道品種では高CO_2濃度によって増加したか変化しなかったのに対して,東北品種では減少した。この傾向は主茎,分げつ茎ともに認められた。高窒素区における出穂日・葉数のCO_2濃度処理間差は標準窒素区に比べ小さかった。<実験2>至穂日数に及ぼすCO_2濃度の影響は,あきたこまちで大きく,コシヒカリでは認められなかった。

すなわち,CO_2濃度に対する出穂反応の品種間差は単に早晩性の違いによるものではないことが示唆された。高CO_2濃度による発育促進作用は低温下でより顕著に現れた。以上から,CO_2濃度に対する発育反応は,品種,温度および窒素条件によって大きく変化することが明らかになった。本研究は,高濃度CO_2が水稲の発育,器官数,器官サイズに及ぼす影響を解明するとともに,高CO_2応答にいかなる遺伝的変異が認められるかを明らかにしようとするものである。本年度は,昨年度に引き続き,温度勾配型CO_2制御装置(グラディオトロン)にて器官レベルの発育,形態反応を調査するとともに,開放系大気CO_2増加(FACE)実験水田において,圃場条件における発育,器官形成の高CO_2応答を調査した。両実験も,坊主5号,きらら397(以上,北海道品種),あきたこまち,ササニシキ(以上,東北品種)の4品種を2水準のCO_2濃度(外気および外気+200μmol/mol)で栽培した。グラディオトロンにおける出穂,最終葉数,葉身長の高CO_2応答を昨年度の結果とあわせて解析したところ,いずれの年次も東北2品種の出穂期は高CO_2濃度によって早まったのに対し,北海道2品種では変化しないか遅くなる傾向が認められた。また,最終葉数および葉身長は東北品種では高CO_2濃度によって減少したのに対し,北海道品種では増加したか変化しなかった。さらにFACE実験水田における主稈葉数,葉身長のCO_2応答についてもグラディオトロンとほぼ同様の傾向が認められたことから,これらの品種間差異の再現性は高いものと考えられた。いずれの試験においても出葉速度および葉身長のCO_2応答性の違いは,最終34葉(幼穂分化期頃以降)で顕著であったことから,一連の品種間差異は幼穂分化時期に及ぼす高CO_2濃度の影響に起因するものと推察された。すなわち,発育の遅速に関するCO_2と遺伝子型の相互作用は,出穂期のみならず,生産性に直結する葉数や葉身長のCO_2応答にも影響する可能性がある。大気CO_2増加に対する作物成長の応答には,シンクサイズやシンク:ソース比が関連することが指摘されているが,その実験的検証は必ずしも十分ではない.イネのシンクサイズには一穂穎花数,穂数,籾サイズが影響する.これらのうち,どの形質が高CO_2応答に影響するかを明らかにすることは,高CO_2条件に適した品種特性を明らかにする上で重要である.そこで本研究では,シンクサイズに関わる形質のうち一穂穎花数に着目し,その遺伝的変異が生育の高CO_2応答に及ぼす影響を,開放系大気CO_2増加(FACE)と2種類のチャンバー(温度勾配型,屋外半閉鎖型)実験により調査した.供試品種は農林8号とその着粒突然変異系統のRM645(農業生物資源研究所放射線育種場育成),CO_2濃度は外気と外気+200ppmvの2水準とした.RM645は二次枝梗が極めて少なく,一穂穎花数は農林8号の約60%であった.高CO_2が一穂穎花数に及ぼす影響は小さかった.最上位展開葉の光合成関連形質(最大CO_2固定速度,Vc,max;最大電子伝達速度,Jmax)は,葉面積当たりの窒素含量(Narea)とともに低下した.ただし,RM645のNareaは出穂期以降農林8号に比べて高くなったのに対し,Vc,maxとJmaxには品種間差異は認められず,登熟期における窒素当たりVc, maxとJmaxはRM645の方が,特に高CO_2区で小さい傾向にあった.
脊髄再生に対する遺伝子治療

平成14年は重錐落下法で脊髄損傷ラットを作成、ステロイド、コンドロイチナーゼABC、iNOS competitive inhibitorを投与し評価した。組織学的にはGDNF、BDNF、iNOS、アポトーシスの出現を免疫染色で評価した。ステロイド群は、コンドロイチナーゼABC、iNOS inhibitor群よりアポトーシス出現率を押さえることが可能であった。損傷後12時間、24時間、3日、7日で比較検討し特に3日でアポトーシスに関して有意にステロイド群が抑制、ノーマルコントロールとの比較ではコンドロイチナーゼABCも有意にアポトーシス発現を抑制していた。GDNF、BDNFでは、3日においてステロイド群、コンドロイチナーゼABC群が、iNOS群、コントロール群に比べ有意に増加させていた。機能評価にBBBを用い、3群ともコントロールと比較し有意な改善を認めたが特にステロイド群が改善した。脊髄損傷後におこる1次損傷(炎症反応)抑制としてはステロイドが有効と判断できた。平成15年の研究目標はGDNFpuromotorを組み込んだadenovirus vectorを作成し損傷脊髄に直接注入することによって機能回復をめざすことであった。しかし近年ウィルスベクターを使用すること自体の問題点、特に倫理面での問題がクローズアップされた。そこでウィルスベクターは使用せず有効かつ安全に遺伝子の導入ができるリポフェクション法とnucleophection法が可能となり、また多分可能を有する自己由来の骨髄由来幹細胞が遺伝子導入細胞としてまた神経細胞への分化も可能な細胞として注目された。本年度はラット骨髄細胞の培養が可能となりnucleophection法を用いこの培養骨髄細胞にGDNF plasmidを遺伝子移入することに成功した。しかし遺伝子導入率また導入後の細胞生存期間の問題もあり今後の研究課題としたい。臨床に近い脊髄損傷モデルとして重錐落下法が使用されてきたが、そのimpactionのばらつきにより実験の再現性が疑問視されてきた。近年NYU impactorとよばれる重錐落下装置が開発され、コンピューターにより重錐落下の衝撃の度合いを確認できるようになった。重錐落下法を用いて脊髄損傷モデルを作成した。脊髄損傷後、ステロイド、コンドロイチナーゼABC、iNOS competitive inhibitorの3種類の薬剤を投与し脊髄損傷後の回復の程度を組織学的、機能構築学的に評価した。組織学的にはGDNF、BDNF、iNOS、そしてアポトーシスの出現を免疫染色することによって評価した。機能評価にはBBBを用いた。組織学的評価:ステロイド投与群は、他のコンドロイチナーゼABC、iNOS inhibitor投与群よりもアポトーシス出現率を押さえることが可能であった。脊髄損傷後12時間、24時間、3日、7日においてそれぞれ比較検討を行ったが、特に脊髄損傷後3日の時点においてアポトーシスに関しては有意にステロイド群が抑制していた。ただノーマルコントロールと3群を比較すると、コンドロイチナーゼABCも有意にアポトーシス発現を抑制していた。GDNF、BDNFの出現率に関しては、損傷後3日の時点においてステロイド投与群、コンドロイチナーゼABC群が、iNOS投与群、コントロール群と比較して有意に増加させていた。機能評価:BBBを用いた評価において、3群ともコントロールと比較して有意な改善を認めたが、なかでもステロイド投与群が有意に改善していた。結論としては脊髄損傷後におこる1次損傷(炎症反応)抑制としてはステロイドが有効と判断できた。現在、骨髄由来幹細胞を用いて、この細胞へベクターとしてリポゾームを用いたリポフェクション法でGDNF、BDNFを遺伝子移入し、脊髄再生実験を行っている。平成15年度の研究目標はGDNFpuromotorを組み込んだadenovirus vectorを作成し、損傷脊髄に直接注入することによって機能回復をめざすことであった。しかし、近年ウィルスベクターを使用すること自体の問題点、特に倫理的な面での問題がクローズアップされた。

そこで倫理的に問題となっているウイルスベクターは使用せずに、有効かつ安全に遺伝子の導入ができるリポフェクション法とnucleophection法が可能となり、また多分化能を有する自己由来の骨髄由来幹細胞が遺伝子導入細胞としてまた神経細胞への分化も可能な細胞として注目された。今年の研究成果は、ラット骨髄細胞の培養が可能となり、nucleophection法を用いてこの培養骨髄細胞にGDNF plasmidを遺伝子移入することに成功した。GDNFは比較的最近発見された神経栄養因子で、その作用機序にはまだ不明な点が多いが、その強力な栄養作用は脊髄損傷後の修復機序の促進に期待されうる。このGDNF産生遺伝子をウィルスベクターを使用せずnucleophection法で行えたことが第1の特色である。第2の特色はこのGDNFをnucleophectionさせた細胞に骨髄由来幹細胞を利用した点である。この骨髄幹細胞は多分化能を有するといわれ、また自己由来であるがために採取方法、倫理面、拒絶反応がおこらないなどで多くの利点を有し、さまざまな臓器への移植を目的としたドナー細胞として注目を集めている。最近の研究では神経細胞への分化も報告されている。
ペロブスカイト型磁性酸化物人工格子における層間交換相互作用の制御と巨大磁気抵抗

本研究において、本年度はLa_<0.6>Sr_<0.4>MnO_3(LSMO)の低磁場における磁気抵抗効果を増大させる目的で、LSMO/Cr_2O_3(反強磁性絶縁体)の積層構造を作製し、その電気・磁気・磁気抵抗特性を調べた。LSMO、Cr_2O_3はSrTiO_3(111)基板上でそれぞれ(111)、(0001)配向する。薄膜面内でのスピン配列は、LSMOは強磁性的、Cr_2O_3は反強磁性的になっている。つまり界面においてMn-Cr間に超交換相互作用が働くと、それぞれがバルク内部でのスピン配列を保てなくなり、スピン配列にフラストレーションが発生する。磁場が無い状態ではLSMOのスピン配列がフラストレーションによって乱れ、二重交換相互作用を抑制して抵抗が増加し、磁場を印加するとLSMO内のスピンは磁場に平行にそろうために二重交換相互作用が有効に働いて抵抗が減少することが期待できる。レーザアブレーション法によってSrTiO_3(111)基板上にLSMO/Cr_2O_3二層薄膜を作製した。温度300Kにおいて±8kOeの範囲で磁場を変化させた際の、低磁場における磁気抵抗効果は、500Oeで約1.5%と、LSMO単層薄膜(500Oeで約0.5%)に比べ、磁気抵抗効果が非常に大きくなった。磁化測定の結果から、残留磁化が大幅に減少していること、磁化が飽和ために必要な磁場が増加しており、M-Hヒステリシスの角形比が小さくなっていることから、磁気抵抗効果の増大が無磁場状態でのスピン配列の乱れに起因していることが示唆された。本研究において、本年度はLa_<0.6>Sr_<0.4>MnO_3(LSMO)の低磁場における磁気抵抗効果を増大させる目的で、[LSMO]_m/[La_<1-x>Sr_xFeO_3(LSFO:反強磁性絶縁体)]_n(m,n:単位格子数)の[111]配向超格子を作製し、その電気・磁気・磁気抵抗特性を調べた。レーザアブレーション法によってSrTiO_3(111)基板上にLSMO/LSFO超格子を作製した。温度10Kにおいて±10kOeの範囲で磁場を変化させた際の、(LSMO)_<10>/(LSFO_<x=0>)超格子(50周期)の低磁場における磁気抵抗効果は、300Oeで約1.7%と、LSMO単層薄膜に比べ、磁気抵抗効果が非常に大きくなった。この結果について、以下の様に考察した。反強磁性体LSFOは磁場に対して応答しないので、超格子界面においてMn-Fe間に働く超交換相互作用のために、界面上のLSMO原子層も磁化反転できなくなる。つまり、界面Mnスピンを磁気的に「ハードな」状態にしたといえる。これに対して、界面から離れたLSMO原子層はLSFOによる影響をほとんど受けないので、LSMOの保持力程度以上の印加磁場では、LSMO層内において界面付近から層内部に向かってMn局在スピンの方向が変化することとなる。これにより、低磁場でLSMO層内の局在スピン配列が大きく乱れるため、LSMOの二重交換相互作用が低磁場で大きく抑制され、磁気抵抗効果が増加したと考えられる。
新規日本人由来前立腺癌細胞株を用いたホルモン抵抗性獲得機序の解明

本研究は新規樹立した日本人前立腺癌細胞株JDCaPを用い,その分子細胞学的性格の解析とホルモン抵抗性獲得の機序の解明を目的とした。JDCaPの由来となった患者組織とJDCaPでの分子学的性格を比較し,その類似性が示された.また,ホルモン抵抗性株の樹立に成功し,その分子学的解析を行った。ホルモン抵抗性株では, AR, PSA, PTEN, ERGの発現はすべて陰性であり,分子学的性格の変化が示された.本研究は新規樹立した日本人前立腺癌細胞株JDCaPを用い,その分子細胞学的性格の解析とホルモン抵抗性獲得の機序の解明を目的とした。ホルモン抵抗性株では, AR, PSA, PTEN, ERGの発現はすべて陰性であり,分子学的性格の変化が示された.本研究は新規樹立した日本人前立腺癌細胞株JDCaPを用い,その分子細胞学的性格の解析とホルモン抵抗性獲得の機序の解明を目的とする。本年度はJDCaPの由来となった患者組織とJDCaPでの分子細胞学的性格を比較した。前立腺パラフィン切片よりマイクロダイセクト法を用いて癌部を切除しDNAを抽出し,genomic DNAのARの遺伝子配列をシークエンスを行い,遺伝子変異の有無を検討した。また,TMPRSS2-ESTの癒合遺伝子の有無をFISH法を用いて検討した。結果,患者検体においてもAR遺伝子変異を認めなかった。この結果はホルモン抵抗性前立腺癌患者の転移巣から樹立したJDCaPがホルモン依存性を示す理由として,患者におけるホルモン抵抗性獲得機序がAR遺伝子変異によるものではないことが示唆された。また,患者検体のFISH解析により,TMPRSS2-ERG fusionを認めた。この結果もJDCaPの解析結果と一致した。iと同様の方法で癌部からtotal RNAを抽出し,リアルタイムPCR法でPCA3発現強度を解析した。患者検体でも同様にPCA3は強発現していた。iii.ホルモン抵抗性株の樹立JDCaPホルモン抵抗性株を樹立するために,マウス皮下にJDCaPを移植し,生着を確認した後に,外科的去勢術を行った。現在処置後3ヶ月経過を観察しているが,まだ抵抗性株は認めていない。来年度も引き続き研究実施計画に沿って,研究を行う予定である。本研究は新規樹立した日本人前立腺癌細胞株JDCaPを用い,その分子細胞学的性格の解析とホルモン抵抗性獲得の機序の解明を目的とする。本年度はJDCaPのホルモン抵抗性株の樹立に成功し,その分子細胞学的解析を行った。1)ホルモン抵抗性株の樹立JDCaPホルモン抵抗性株を樹立するために,マウス皮下にJDCaPを移植し,生着後,外科的去勢術を行った。腫瘍は縮小後に痕跡状の皮下腫瘤となったが,半年後再増殖を認めた。計20匹のJDCaP皮下移植マウスを去勢し,2系統のホルモン抵抗性株を認めた。これらの腫瘍それぞれを雌マウス,雄マウス皮下へ移植し,雄マウスは皮下腫瘤を触知後,外科的去勢術を行い,腫瘍の再増殖を観察した。それぞれの腫瘤は一定期間の後に増殖を認めたため,同様な方法で継代を繰り返し,安定系を確立した。これらの樹立したホルモン抵抗性株をJDCaP-hr1,JDCaP-hr2とした。2)ホルモン抵抗性株の解析本解析には樹立したホルモン抵抗性株のなかで,生着率の高いJDCaP-hr1を用いた。親株であるJDCaPはAR陽性,PSA陽性,PTEN陰性,ERG陽性,TMPRSS2-ERG fusion陽性であったため,これらの分子学的プロファイルが温存されているかを解明するために,AR,PSA,PTEN,ERGの発現を免疫組織染色およびreal-timePCRで検討した。JDCaP-hr1ではこれらの蛋白およびmRNAの発現はすべて陰性であった。さらに,TMPRSS2-ERG fusionについてFISH法で解析した。JDCaP-hr1において,TMPRSS2-ERG fusionは認められず,JDCaP-hr1のホルモン抵抗性獲得の機序は,アンドロゲン除去環境の中でJDCaPでは優性であったTMPRSS2-ERGfusion陽性の細胞群からfusion陰性の細胞群に置換された事が示唆された。
化学プロセス設計のための物性と相平衡の計算法の新展開

本研究は平成13年度5月に岡山県倉敷市で開催される第9回物性相平衡国際会議を支援する目的で組織され、同会議の母体というべき化学工学会の物性・物理化学分野の中心的存在である研究者と一部近縁分野の研究者によって実施されたものである。その内容を研究手法別にみると(1)実験的に得られた情報の新しい解釈を行ったもの,(2)化学工学熱力学に基づいて物性データの新しい計算方法を提案したもの、及び(3)分子シミュレーションの手法による物性の計算を試みたもの、とに分類できる。現在の研究動向を反映して(3)による研究が大きな比率を占めているが、この手法の現実の系への適用が体系化される基礎となる研究成果が一部ながら確立されつつあると思われる。本研究のなかで注目すべきものを若干挙げてみると、超臨界流体の分子動力法による検討が、妥当な分子間ポテンシャルを用いて広範かつ組織的に行われている。又、不均一な系における計算が膜透過を念頭においてLJモデルを用いて行われている。熱力学量との対応については自由エネルギーの計算やその応用とみられる溶解度の計算も試みられている。以上のような成果はあったものの各種物性の総括的な計算法の提案は将来の課題として残されたようにみえる。平成13年2月には分担者ほぼ全員が集まって研究発表会を行い、併せて情報交換を行ったが、次年度以後このような機会が与えられることを望みたい。
製品設計プロセスの段階的詳細化によるモジュールを用いた機械製品の発案支援

第1年度は、モジュールの組合せで様々なロボットを構成できる市販のブロック玩具を対象として、走行型ロボットの機体案生成のためのモジュールライブラリと遺伝的アルゴリズム(GA)によるモジュール配置の実装により、ロボット機体の発案支援システム構成の基礎を提示した。その結果、機体への要求機能をすべてGA適用時の配置制約に置き換えることは困難であり、また、ロボットとして要求機能を発現しているかの検証には、その動的挙動を見る必要があることがわかった。そこで、第2年度は、前述の問題点の解決法を提示し、さらに異なったタイプの様々なロボットにも適用範囲を拡張することを考えた。これにより、提案手法を用いて、一般の機械製品の発案支援システムを構成するための基盤を与えた。その方法は、次のとおりであった。(1)市販の動作解析ソフトウェアを用いて、設計案として提示された走行型ロボットの挙動解析を行い要求機能が満たされているかどうかを確認するステップを実装した。(2)提案手法の実用への適用を意識して、モジュールライブラリの構成法(構造、記述言語、手順など)について再考し、より複雑で多様なロボットの機体設計支援のためのライブラリを構成法を提案した。(3)新しいモジュールライブラリを用いて、モジュール組合せ配置案の生成、および各モジュール組合せ案での挙動解析を行い、その有効性を確認した。(4)以上により、単位機能の発現単位であるモジュールを複数組合せて発現する複合機能をユーザ要求と合わせることで製品イメージを創り出すという考え方に基づいて、一般の機械製品を対象とした発想段階で用いる設計支援システムの構築が可能なことを示した。これは、概略設計・詳細設計・試作という一連の設計プロセスを何回も繰り返し段々と製品イメージを具体化し段階的に詳細化していくことにより、設計者の発案を支援する方法である。平成15年度は、モジュールの組合せで様々なロボットを構成できる市販のブロック玩具(Lego Mindstorms)を対象として、発案支援システムを試作し、提案する手法の有効性を以下の手順で確認した。1.ロボットの各構成モジュールすなわち各ブロックの形状モデルを作成した。2.各ブロックのもつ単位機能をまとめて、述語論理により記述した。3.各ブロックを配置する際の拘束条件を列挙し、述語論理により記述した。4.複数のブロックの結合により発現する複合機能を、列挙した。5.24の結果に基づいて、複合機能・複合機能を構成する単位機能群・単位機能を実現するブロックの関係を階層構造で記述したモジュールライブラリを実装した。6.5で実装したモジュールライブラリを利用して、要求機能を満たすロボットを構成するために必要なブロックの組合せを選択する仕組みを実装した。但し、ロボットへの要求機能は、機体設計者により必要な複合機能に分解されるものとし、システムへの入力はこの複合機能とした。必要な単位機能と複数のブロックが対応している場合には、ブロックの組合せグループは複数となる。7.各々の組合せグループに対して、遺伝的アルゴリズムを適用してブロック配置の最適化を図った。ここで、各個体はグループを構成するブロックで構成し、遺伝子としては各ブロックの配置位置や向きをもたせた。モジュールライブラリ内に記述されている配置に関する拘束条件の充足度、設計空間内への配置、安定性などで各個体を評価し、評価値がプラスとなった要求機能を満たしているブロックの組合せすべてをロボットの機体設計案とした。以上により、ひとつの要求に対してモジュールすなわちブロックの組合せにより様々なロボットの機体が提案できること、提案の中に通常の発想範囲からはでてこないような機体が含まれていることを確認した。平成15年度は、モジュールの組合せで様々なロボットを構成できる市販のブロック玩具を対象として、走行型ロボットの機体案生成のためのモジュールライブラリと遺伝的アルゴリズム(GA)によるモジュール配置の実装により、ロボット機体の発案支援システム構成の基礎を提示した。

その結果、機体への要求機能をすべてGA適用時の配置制約に置き換えることは困難であり、また,ロボットとして要求機能を発現しているかの検証には,その動的挙動を見る必要があることがわかった。そこで、平成16年度は、前述の問題点の解決法を提示し、さらに異なったタイプの様々なロボットにも適用範囲を拡張することを試みた。これにより、提案手法を用いて、一般の機械製品の発案支援システムを構成するための基盤を与えた。その方法は、次のとおりであった。(1)市販の動作解析ソフトウェアを用いて、設計案として提示された走行型ロボットの挙動解析を行い要求機能が満たされているかどうかを確認した。(2)提案手法の実用への適用を意識して、モジュールライブラリの構成法を再考し、より複雑で多様なロボットの機体設計支援のためのライブラリを構成法を提示した。そして、そのモジュールライブラリをベースとして、機械モジュールの組合せ配置案の生成プロセス,各案が要求機能を満足しているかの検証プロセスを含んだ発案支援システムの構成を提案した。(3)以上により,単位機能の発現単位であるモジュールを複数組合せて発現する複合機能をユーザ要求と合わせることで製品イメージを創り出すという考え方に基づいて,一般の機械製品を対象とした発想段階で用いる設計支援システムの構築法を提示した。