hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
刺激に応答する単結晶DNA多孔体の開発と動的機能開拓

本研究では、刺激応答性のらせん構造体形成を当初の目的としていた。そのなかで、らせん構造体のユニットとして働く2次元結晶構造の合成、解析途中で予期せぬ新規結晶化現象を見出した。すなわち、「Screw Dislocationが提供するトポロジカル欠陥」が「結晶の核形成と成長」を促すことを直接示す現象を発見した。「結晶形成」は、無機、有機、無機ー有機複合、生体材料を問わず、様々な研究分野において普遍的に重要な現象である。しかし、特に多成分の結晶化は意のままにはならない。それは、結晶化のプロセスに多くの速度論的トラップが立ちはだかり、熱力学的に安定な一つの結晶への集約を阻害するからである。本研究課題ではこの現象の理解と深化を行い「結晶学における新学理」構築への足がかりを得た。具体的な発見は次の通りである。ポルフィリンとアゾピリジンのDMF/EtOH溶液に亜鉛イオンを加えて加熱し、金属ー有機構造体(MOF)の3D結晶を得た。構造解析から「ポルフィリンの亜鉛錯体と亜鉛イオンからなる2Dシートをアゾピリジンが柱として支えた多孔性構造」が判明した。ところが、顕微鏡を用いた結晶化の経時観察から驚くべき事実が見えてきた:(1)当初は3D結晶ではなく「アゾピリジンを含まない2D結晶」のみが生成、(2)その後2D結晶の中心部から3D結晶の成長が開始、(3)2D結晶を消費しながら結晶化が進行し最終的に3D結晶のみとなる。AFM測定から、2D結晶中央部にはscrew dislocationをきっかけとするらせん成長パターンが確認された。Screw Dislocationは多くの結晶形成において観測されている。しかし、長い結晶学の歴史においても『Screw Dislocationが提供するトポロジカル欠陥が結晶の核形成と成長を促すこと』が直接的に観測された例はない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。DNA二重らせんを構造形成モチーフとする結晶性多孔体の合理的合成法を確立し、DNA特有の刺激応答性を活かした動的機能の開拓を行うことを当初の目的としていたが、昨年度途中方針を変更し、ペプチドが生み出す動的らせん構造を利用した「結晶性」多孔体の構築を目指すこととした。非天然アミノ酸の一種である2-Aminoisobutyric Acid(Aib)は、炭素上に二つのメチル基を持ち、炭素上のかさ高さに起因した配座自由度の制限によりAibを多く含む短鎖ペプチドはヘリックスを形成しやすいことが知られている。また、Aibは不斉中心を持たないため、そのホモオリゴマーは左巻きおよび右巻きらせんの等量混合物を与え、溶液中ではそれららせん構造が反転を繰り返すという興味深い性質が知られている。この動的らせん構造を活かした様々な機能分子が報告されてきたものの、それら動的機能発現は溶液中での話に限られてきた。固体中で規則正しく整列、近接させたAibオリゴマーは動的かつ協同的な挙動を示すか?という興味から研究をスタートした。具体的には、溶液中で安定ならせん構造をとる最短のAib六量体を組み込んだMetal-organic framework(MOF)を合成し、その結晶化様式や結晶状態での動的挙動を明らかにすることを目的とする。Aib六量体を得るため、N末端およびC末端をそれぞれベンジルオキシカルボニル基(Z基)およびメチル基で保護したAib二量体Z-(Aib)2-OMeからスタートし、ペプチド伸長反応を行った。ペプチド結合形成には、Aibのように立体的に込みあった, -ジアルキルアミノ酸でよく用いられるオキサゾロン法を適用し、各末端保護基の脱保護、カルボキシル基からオキサゾロンへの変換、オキサゾロンとアミノ基とのカップリング反応を繰り返すことによりZ-(Aib)6-OMeを得た。新たな物質設計・物性開拓の報告性を見据え、研究の方針転換を行った。

AFM測定から、2D結晶中央部にはscrew dislocationをきっかけとするらせん成長パターンが確認された。Screw Dislocationは多くの結晶形成において観測されている。しかし、長い結晶学の歴史においても『Screw Dislocationが提供するトポロジカル欠陥が結晶の核形成と成長を促すこと』が直接的に観測された例はない。本研究では、刺激応答性のらせん構造体形成を当初の目的としていた。そのなかで、らせん構造体のユニットとして働く2次元結晶構造の合成、解析途中で予期せぬ新規結晶化現象を見出した。すなわち、「Screw Dislocationが提供するトポロジカル欠陥」が「結晶の核形成と成長」を促すことを直接示す現象を発見した。「結晶形成」は、無機、有機、無機ー有機複合、生体材料を問わず、様々な研究分野において普遍的に重要な現象である。しかし、特に多成分の結晶化は意のままにはならない。それは、結晶化のプロセスに多くの速度論的トラップが立ちはだかり、熱力学的に安定な一つの結晶への集約を阻害するからである。本研究課題ではこの現象の理解と深化を行い「結晶学における新学理」構築への足がかりを得た。具体的な発見は次の通りである。ポルフィリンとアゾピリジンのDMF/EtOH溶液に亜鉛イオンを加えて加熱し、金属ー有機構造体(MOF)の3D結晶を得た。構造解析から「ポルフィリンの亜鉛錯体と亜鉛イオンからなる2Dシートをアゾピリジンが柱として支えた多孔性構造」が判明した。ところが、顕微鏡を用いた結晶化の経時観察から驚くべき事実が見えてきた。すなわち、当初想定した3D結晶は、熱力学生成物として最終的に得られるが、それに先立ち速度論的生成物として2D結晶が得られる。さらに、常に2D結晶の中央部から3D結晶成長が始まり、2D結晶を消費しながら3D結晶への変換が行われていくことを見出した。2Dから3Dへの変換過程では、コアーシェル型ハイブリッド結晶が得られる。現在、結晶化過程の詳細、すなわち「なぜ常に2D結晶中央部から3D結晶が発生し、成長を遂げるのか?」について原子間力顕微鏡などを用いて検討を進めている。当初の方向性とは異なるものの、従来知られていない結晶化現象の発見、ならびに原理解明への手がかりが得られてきたため。酢酸エチル溶液から再結晶させることで得たZ-(Aib)6-OMeは、結晶中でヘリックス構造を取っていることを単結晶X線構造解析から予備的に明らかにした。現在、Aib六量体の両末端にピリジル基を導入し、目的とする配位子Py-(Aib)6-Pyの合成を行っている。各末端保護基の脱保護と、アミノ基またはカルボキシル基を有するピリジン誘導体との縮合反応を行うことにより配位子合成を完了する予定である。さらに配位子合成後、亜鉛イオン、テレフタレートおよび配位子Py-(Aib)6-PyからのMOF合成に挑戦する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。新たに発見した結晶化過程の詳細、すなわち「なぜ常に2D結晶中央部から3D結晶が発生し、成長を遂げるのか?」について原子間力顕微鏡などを用いて検討を進め、結晶学における新学理樹立を目指す。
真核細胞内の小胞外部におけるイオン環境制御の生理的役割とその分子的基盤

Na+/H+交換輸送体(NHE)は、ほぼすべての生物の細胞の形質膜や細胞内小胞膜に存在する。細胞質はpH7付近に保たれている。一方細胞内小胞の内部は酸性に保たれているが、その意味するところは不明である。細胞内小胞に存在するNHEはその遺伝子の異常で神経関連の家族性疾病発症が知られている。この研究では、この疾病の発症機構解明を目指し小胞型NHEによる小胞のpH制御について分子レベルで明らかにした。本研究では、細胞内膜型のNHE6からNHE9までの(1)生理的役割の解明、(2)制御の分子機構解明を研究の当初の2つの大きな達成目標としている。今年度〈21-22年度7月〉特にNHE6に関して大きな進展があり、成果を論文として発表できた。すなわちNHE6の生理的役割として、肝培養細胞(HepG2)において細胞内小胞輸送にからむ小胞内のpH維持を通してアピカル膜の形成、および安定化に寄与することが解明できた。とりわけ、NHE6の発現抑制または過剰発現のいずれの場合も小胞内のpHが有為に変化することを示せたことは、大きな成果である。さらにこのpH変化に呼応してアピカル面での膜脂質の安定性が失われることを示した。一方、HeLa細胞ではトランスフェリンのエンドサイトーシスにおいてNHE6が重要な役割を果たすことを明らかに出来た(論文準備中)。これらの新発見により、当初計画していた神経細胞における極性形成においてもNHE6の役割について来年度以降解明の糸口を期待できる。こうした研究成果は、本研究の最終目標達成に大きな貢献をするものである。また、NHE7については細胞内でTGNに局在する際に必須な分子内構造をみいだし(論文発表)、研究の柱である機能制御について輸送活性以外に細胞内の局在における制御も重要であることを示せた。NHE6については遺伝子欠失細胞を確立し引き続きその性質を解析している。HepG2細胞においてNHE6の遺伝子発現を抑制または過剰発現し、細胞極性形成におよぼす影響についてオランダの研究グループとさらに共同研究をすすめている。21年度は、NHE6の研究に大きく注力することで、NHE7-9の研究が当初より遅れることになった(研究費の繰り越し理由)が、NHE7に関する論文発表にこぎつけ21年度計画は達成できたと考えている。本研究の当初目標は、内膜型NHE6からNHE9の(1)生理的役割の解明、(2)制御の分子機構解明を達成することである。本年度はNHE6に力点を置き、年度途中の一部変更を含めて、次の3点を具体的目標とした。1.PC12細胞を用いて神経突起形成におけるイオン輸送蛋白NHE6の役割の解析。2.ヒト培養細胞におけるNHE6のエンドサイトーシスにおける役割の解析。3.酵母のNhx(NHE6アイソフォーム)の多胞体形成における役割の解析。目標は、1-3のいずれにおいても、ほぼ達成できた。成果の概略は、目標1については、NHE6が、神経突起成長に関わるNGFによるシグナル伝達系に一部関与していることを、明らかにした。また、目標2の成果としてトランスフェリンの細胞内取り込み過程にNHE6が関与することが示され、この関連でNGFの細胞内取り込み過程にもNHE6が関わることが新たな研究目標として設定できた。目標2の成果としてAm. J. Phys. Cell. Phys.誌に発表できた。目標3については、Nhxは酵母細胞での多胞体形成の初期過程に小胞の表面pHを調節することで関与するという新規な結果を得て、J. Biol. chem誌に論文を発表できた。真核生物の細胞質内部および細胞質内の小胞の内部pHは、それぞれ中性と酸性に厳密に制御されている。このpH制御には、形質膜、小胞膜に存在するNa+/H+H+交換輸送体群NHEが関わっているが、細胞質pH制御に比べ小胞を巡るpH制御と生理的役割特に小胞型(内膜型)NHEについては多くの点が不明のままでありこれらのNHEの役割と制御機構を解明することを本研究の最終的目的としている。本研究計画実施の中で研究の進展の著しい内膜型NHE6に昨年度に引き続き特に力点を置いて次の2点の成果を得た。NHE6の、神経系細胞における役割をPC12株や初代神経培養細胞を用い、細胞内局在解析と遺伝子ノックダウンとを組み合わせて昨年度までに解析したところ、神経軸索突起の伸張がNHE6発現量と相関することを見いだした。突起の伸張について、NGFが必要なので、NGFのシグナル伝達のどの段階でNHE6が作用するのか解析した。その結果、NHE6をノックダウンした場合に細胞内情報伝達系を構成するMAPKであるERK1/2のリン酸化レベルの低下が認められた。

さらに、この細胞ではNGF受容体であるTrkAの蛋白質発現量が低下していることが判明し、この発現量低下はユビキチンプロテアソーム系による分解であることが示唆された。これらの結果から、NHE6は細胞内の複数の作用点においてNGF-TrkA経路の機能に関与していることが示唆されたNHE6の酵母アイソフォームNhxに注目し、機能欠失株を系統的に昨年度までに解析したところ、細胞内小胞の多重膜構造形成(MVB)に影響し、この仕組みにpH制御を通して関わることを明らかにした。本年度この機構をすべて試験管内で再現する系を確立し、表面pH制御の重要性をさらに確固とすることを試みた。一部予備的に実験系を作ることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。
神経細胞の機能維持に関わるコレステロールの研究:病態成立との接点を求めて

コレステロールが神経細胞の機能維持に重要な働きをしていることが近年の研究で明らかにされつつある。なかでも、グリア細胞が分泌するコレステロールと、神経細胞の膜表面コレステロールの重要性に注目が集まっている。しかしながら、膜表面コレステロールが神経細胞のどこに存在しているのかといった基本的な知識が未だ欠如しているのも事実である。これは、いままで膜表面コレステロールのみを標識出来るような適当なマーカーが存在しなかったことが大きな理由である。我々は細胞表面のコレステロールのみを選択的に標識可能な新しいマーカーであるBCθを用いて、神経細胞の表面におけるコレステロールの生理的分布とその役割、ならびに病的状態におけるその変化を検出することを目的にこの研究を計画した。まず我々はラットの海馬神経細胞を低密度培養し、成熟段階における細胞表面コレステロールの発現を観察した.その結果、BCθは未成熟な細胞は染色せず、成熟した神経の特記のみを染色することが判明した.このことは、神経細胞表面のコレステロールが細胞の成熟段階にともなって局在してくることを示している.さらに、この表面にコレステロールの存在する突起を詳細に調べた結果、これらの突起が主として軸索であることが判明した.このことは、細胞表面のコレステロールが極性をもって局在していることを示しており、従来知られていなかった新しい知見をうることができた.さらに、同様の実験をニーマン・ピック病C型のモデル神経細胞を用いて行ったところ、これらモデル細胞の表面にはコレステロールが存在していないことが判明した.一方、コレステロールは細胞表面の特殊なドメインであるラフトに多く存在することから、同病モデル細胞でのラフト構造の存在を調べたところ減少していることが判明した。シナプスマーカーの分布についても調べたが、こちらは変化がなかった。しかしながら、膜表面コレステロールが神経細胞のどこに存在しているのかといった基本的な知識が未だに欠如しているのも事実である。まず我々はラットの海馬神経細胞を低密度培養し、成熟段階における細胞表面コレステロールの発現を観察した.その結果、BCθは未熟な細胞は染色せず、成熟した神経の特記のみを染色することが判明した.このことは、神経細胞表面のコレステロールが細胞の成熟段階にともなって局在してくることを示している.さらに、この表面にコレステロールの存在する突起を詳細に調べた結果、これらの突起が主として軸索であることが判明した.このことは、細胞表面のコレステロールが極性を持って局在していることを示しており、従来知られていなかった新しい知見をうることができた.さらに、同様の実験をニーマン・ピック病C型のモデル神経細胞を用いて行ったところ、これらモデル細胞の表面にはコレステロールが存在していないことが判明した.同病では神経細胞の脱落・変性が知られており、細胞表面コレステロールの変化が神経細胞死の原因となっている可能性が示唆された.コレステロールが神経細胞の機能維持に重要な働きをしていることが近年の研究で明らかにされっっある。

我々は細胞表面のコレステロールのみを選択的に標識可能な新しいマーカーであるBCθを用いて、神経細胞の表面におけるコレステロールの生理的分布とその役割、ならびに病的状態におけるその変化を検出することを目的にこの研究を計画した。まず我々はラットの海馬神経細胞を低密度培養し、成熟段階における細胞表面コレステロールの発現を観察した.その結果、BCθは未成熟な細胞は染色せず、成熟した神経の特記のみを染色することが判明した.このことは、神経細胞表面のコレステロールが細胞の成熟段階にともなって局在してくることを示している.さらに、この表面にコレステロールの存在する突起を詳細に調べた結果、これらの突起が主として軸索であることが判明した.このことは、細胞表面のコレステロールが極性をもって局在していることを示しており、従来知られていなかった新しい知見をうることができた.さらに、同様の実験をニーマン・ピック病C型のモデル神経細胞を用いて行ったところ、これらモデル細胞の表面にはコレステロールが存在していないことが判明した.一方、コレステロールは細胞表面の特殊なドメインであるラフトに多く存在することから、同病モデル細胞でのラフト構造の存在を調べたところ減少していることが判明した。シナプスマーカーの分布についても調べたが、こちらは変化がなかった。
動脈硬化における酸化ストレスイメージング-抗酸化物質による治療効果の核医学的評価

われわれは、酸化ストレスマーカである4ヒドロキシ2ノネナール(4HNE)に対する抗体を、放射線を発するヨード125で標識し、これをもちいて動脈硬化病変における酸化ストレスの発生状況をイメージングする方法の開発を試みた結果、取り出した大動脈において画像化に成功した。4ヒドロキシノネナールは、難治性で組織沈着性の物質であり、過酸化反応による細胞毒性の発現や動脈硬化発症の機構解明の上から最も有力な酸化ストレスのマーカーの一つとして注目を集めている物質である。これに対し、まずヨード125にて放射性標識を行い、テトラクロラミン法を用いてトレーサの作成を行った。純度は95%以上で作成可能であった。次に、作成したトレーサの生体内分布をC57/BL6を用いて調べた。静注、1-3時間で大動脈への集積がピークとなった。また、大動脈/血液比、大動脈/筋肉比がそれぞれ0.47、13.0であった。血液、肺のバックグラウンドの低下と、大動脈への集積程度、トレーサの排泄を考慮すると、投与後3時間での評価が適当と考えられた。今後は、本トレーサを、自然発症動脈硬化マウスに投与し、大動脈への分布を通常のマウスと比較し、さらにその局在を通常のマウスと動脈硬化発症マウスで画像化して比較する。4HNEは、ヒト腹部大動脈硬化症病巣について免疫組織染色により局在が解析されているが、血管内腔に面した脆弱化した動脈硬化巣に集まる泡沫細胞に陽性であったことが確認されており、動脈硬化巣の破綻において重要な役割を担う泡沫細胞の形成に寄与することなどが報告されているため、生体内での4HNEの局在を知ることは、酸化ストレスの観点から動脈硬化発症および進展を知ることにつながるため、意義深いことと考えられる。静注、3時間で大動脈への集積がピークとなったため、本トレーサを自然発症動脈硬化マウスに投与し、3時間後に大動脈を取り出し、大動脈への分布をオートラジオグラフィーを用いてコントロールマウスと比較した。さらにその局在を通常のマウスと動脈硬化発症マウスで画像化して比較した。トレーサは、コントロールではわずかな集積が認められるのみであったのに対し、自然発症マウスでは、動脈硬化の部位に一致して、高度の集積が認められた。4HNEは、ヒト腹部大動脈硬化症病巣について免疫組織染色により局在が解析されているが、生体内での4HNEの局在を知ることは、酸化ストレスと動脈硬化発症および進展との関連性を知ることにつながる。今回の結果は、動脈硬化病変と一致して酸化ストレスマーカの集積が認められており、酸化ストレスの動脈硬化への関与が強く示唆され、さらに本トレーサが生体内の酸化ストレスの解析に有用である可能性が考えられたため、意義深いことと考えられる。
感性評価とプラーク除去評価による個別介助歯磨きスキルの習得支援プログラムの開発

障害者・要介護者の口腔の健康を維持するためには介助者による歯磨き(以後、介助歯磨き)が必須である。本研究では、感性評価とプラーク除去評価を指標として要介助者にとっての適切な介助歯磨きスキルとは何かを明確にして、そのスキルを介助者が習得するためのプログラムを開発することを目的としている。本年度は、まずこれまで動作解析に用いてきた磁気式モーションキャプチャが周囲の金属の存在により磁界が影響を受け、データの欠損を生じることがみられたため、光学式モーションキャプチャへの変更を検討し、計測システムを再構築した。再構築した歯磨き動作解析システムを用いて、歯列模型上の人工歯をブラッシングした際の歯磨き動作と歯ブラシ圧を同期して、数値化・可視化できることを確認した。その成果は、「3次元ブラッシング計測システムの開発(Development of three-dimensional tooth-brushing measurement system)」としてライフサポート学会フロンティア講演会において発表した。さらに、再構築した歯磨き動作解析システムを用いて、プラーク除去効果が最大となる磨き方(歯ブラシの当て方、圧、動かし方)を導出することを試みた。歯列模型上の人工歯に人工プラークを塗布し、介助磨きの姿勢で複数の実験者が、歯ブラシの様々な動かし方、力の加え方で磨き、その際の歯ブラシの動きと歯面における力を三次元計測し、同時に除去できずに残存する人工プラーク付着面積を求める実験を実施した。得られたデータを解析してプラーク除去効果を最大とするための最適化シミュレーションを導出することを可能にした。新たに光学式モーションキャプチャを利用した歯磨き動作解析システムを構築することができ、そのシステムを用いて、本年度に予定したプラーク除去評価に基づく介助歯磨きスキルの最適化シミュレーション導出が可能となった。しかし、最適化を導くためのデータ数には不足があり、最適化シミュレーションの検証には至っていない。また、当初予定の歯磨きスキルの感性評価に関しては、文献検索等による方法の検討に留まった。再構築した光学式モーションキャプチャによる動作解析実験環境下では、口腔内での歯磨きの実施に困難が伴う可能性が高く、計測可能な環境設定の工夫を検討していく。当初予定していた磨かれる人の脳波計測と介助歯磨き動作の同時計測は断念せざるを得ないことも考慮して実験計画を再考する。脳波計測以外の感性評価法を再検討するとともに、模型上での介助歯磨きスキルの標準化と可視化、および最適化シミュレーションの検証と習得プログラム開発を先行して進めていく。本年度は、備品として脳波計測器を購入予定であったが、動作解析を磁気式モーションキャプチャから光学式モーションキャプチャに変更したため、新たな計測システム構築のための物品購入が主だった支出となった。36,000円程度を繰り越したが、使用額の総額としてはほぼ計画通りである。計測システムの変更により実験環境が変化したため、感性評価の方法として脳波計測器の使用が適当であるかを含めて再検討したうえで次年度は感性評価にかかわる物品を中心に購入する。また、福祉工学関連の国際学会での成果発表のための旅費を使用する予定である。
反芻家畜の受胎率向上に資する発情行動発現の分子制御メカニズムの解明

ウシの受胎率の低下は、微弱発情や無発情などの発情行動の異常に起因する。本研究では、発情行動の誘起に第一義的役割を果たすエストロジェン(E)の受容体(ER)発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギを、ゲノム編集技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを活用して作出する。この動物をモデルとして用いて、反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的とする。本年度は、これまでに引き続き、発情行動を任意のタイミングで誘起するため、卵巣除去シバヤギにプロジェステロンおよびEを処置して発情行動を誘起するプログラムを構築し、発情行動特異的な指標(行動量、発声、尾振り、交尾行動など)の定量と、血中黄体形成ホルモン(LH)濃度の測定を行った。その結果、行動量の増加がLHサージに先行して起こり、この時間的相関関係は無発情を示した個体においても顕著であったことから、発情に伴う行動量の増加は動物の発情を評価する定量的指標となることが明らかとなった。また、ゲノム編集技術を用いて、ヤギER遺伝子(ESR1)座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ(ESR1-floxedヤギ)を作出することを最終的な目的として、RACE法によりヤギESR1遺伝子mRNAの塩基配列および推定アミノ酸配列を同定した。その結果、ヤギESR1遺伝子mRNAには少なくとも2つのバリアント(3,836および4,353塩基)が存在することが明らかとなった。今後、ヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることを試みる予定である。さらに、より高効率な遺伝子改変ヤギの作出のために受精卵エレクトロポレーション法を用いたゲノム編集技術の導入を試みた。本年度は、シバヤギの1細胞期胚を効率的に採取するためのホルモン処置および卵管内受精卵の採取法の検討を行った。本研究では、発情行動誘起モデルの構築と発情行動の定量化を行うことを目的とした。これまでに、卵巣除去シバヤギを用いてプロジェステロンおよびEの投与により発情行動を誘起する条件設定により発情行動誘起プログラムの最適化を行い、モデル実験系の構築が完了した。このモデルを用い、発情行動特異的なパラメーター(行動量、発声、尾振り、交尾行動など)の定量と、その背景となる神経内分泌指標(血中LH濃度、性ステロイドホルモン濃度など)の経時変化を調べたところ、発情に伴う行動量の増加が発情を評価する定量的指標となることを明らかにできた。本研究では、研究第2年度までにヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてゲノム編集技術による相同組み換えを利用し、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系を樹立することを予定していた。現在のところ、ヤギESR1遺伝子座のゲノム構造情報の取得に時間を要していることから、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立には至っていない。次年度は、本年度に引き続いてESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立をめざす。また、ヤギにおいてより効率的にゲノム編集を実施し、遺伝子改変個体を作出できる技術として受精卵エレクトロポレーション法に着目し、マウスやブタにおけるゲノム編集が報告されている同法を本研究の目的である遺伝子改変ヤギ作出に導入することを試みた。受精卵エレクトロポレーション法では、1細胞期胚を用いてゲノム編集を行うため、ヤギの1細胞期胚を効率的に採取する必要がある。本年度は、ヤギの過排卵処置、オスとの交配のタイミング、卵管内受精卵を効率的に回収するタイミングなどの検討を行い、受精卵エレクトロポレーション法をヤギに適用するための基盤技術の最適化に着手した。次年度の早期にこれを完了し、ヤギ受精卵のゲノム編集技術の確立をめざす。本研究では、ゲノム編集技術によりヤギESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系を樹立したのちに、体細胞クローン技術を利用してESR1遺伝子座にloxP配列を導入したESR1-floxedヤギを作出し、さらにCre/loxPシステムによりコンディショナルにESR1をノックアウトして反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を解明することをめざしている。それぞれの技術をヤギに適用する手法は確立されつつあり、これまでに確立した発情に伴う行動量増加を指標とした発情行動の定量的評価系と組み合わせて、発情行動を制御する神経機構の解明に全力をあげる。また、体細胞クローン技術による個体作出を経ることなく、より高効率な遺伝子改変ヤギ作出が可能となる受精卵エレクトロポレーション法によりゲノム編集を行うことを試み、目的の遺伝子改変ヤギの作出を加速化させる。本研究では、発情行動に第一義的役割を果たすエストロジェン(E)の受容体(ER)発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギを、ゲノム編集技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを活用して作出する。この動物をモデルとして用いて、発情行動の変化を調べ、反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的とする。本年度は、発情行動を任意のタイミングで誘起するため、卵巣除去シバヤギにプロジェステロンおよびEを処置して発情行動を誘起するモデルを構築し、発情行動特異的な指標(行動量、鳴き、交尾行動など)の定量と、血中性腺刺激ホルモン濃度の測定を行った。

行動量(歩数)の増加が黄体形成ホルモンサージに先行して起こり、この時間的相関関係はオスに対する受容行動を示さない無発情個体においても顕著であったことから、発情に伴う行動量の増加は発情行動を評価する定量的指標となることが明らかとなった。また、ゲノム編集技術を用いて、ヤギER遺伝子(ESR1)座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ(ESR1-floxedヤギ)を作出することを目的として、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を行い、ヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることを試みた。現在、シバヤギのゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギESR1上流域の解析を実施している。さらに、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術に適用するため、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与する手法の開発を行った。脳定位固定装置と脳室のX線造影画像を用いて、ERが発現する領域に微量投与用カニューレを留置する手法の開発と、ヤギ脳組織への感染に最適なAAV血清型の探索を実施した。本年度の研究計画では、まず、発情行動誘起モデルの構築と発情行動の定量化を行うことを目的としていた。卵巣除去シバヤギを用いて、プロジェステロンおよびEの投与により発情行動を誘起する条件設定を行い、発情行動誘起プログラムの最適化によりモデル実験系の構築が完了した。このモデルを用い、発情行動特異的なパラメーター(行動量、鳴き、尾振り、交尾行動など)の定量と、その背景となる神経内分泌指標(血中性腺刺激ホルモン濃度、性ステロイドホルモン濃度など)の経時変化を調べたところ、発情に伴う行動量の増加が発情行動を評価する定量的指標となることを明らかにできた。また、本年度はヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてTALEN法またはCRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用し、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立することを予定していた。現在のところ、ヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していることから、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立には至っていない。次年度は、本年度に引き続いてESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立をめざす。さらに、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定まで到達できなかったが、他の遺伝子導入に際して導入効率が良いことを確認している血清型(AAV-1、AAV-5、AAV-DJなど)の情報を活用し、次年度には同定をめざす予定である。ウシの受胎率の低下は、微弱発情や無発情などの発情行動の異常に起因する。本研究では、発情行動に第一義的役割を果たすエストロジェン(E)の受容体(ER)発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギを、ゲノム編集技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを活用して作出する。この動物をモデルとして用いて、反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的とする。本年度は、昨年度に引き続き発情行動を任意のタイミングで誘起するため、卵巣除去シバヤギにプロジェステロンおよびEを処置して発情行動を誘起するモデルを構築し、発情行動特異的な指標(行動量、鳴き、交尾行動など)の定量と、血中性腺刺激ホルモン濃度の測定を行った。行動量の増加が黄体形成ホルモンサージに先行して起こり、この時間的相関関係は無発情個体においても顕著であったことから、発情に伴う行動量の増加は動物の発情を評価する定量的指標となることが明らかとなった。
金属微粉体援用による局所レーザ加熱無機－金属材料直接接合法の確立

本研究では、無機であるセラミックス複合材料と耐熱金属材料との間に、無機材料との親和性に優れた金属材料を、反応性が高い微粉体として封入し、レーザを用いた局所加熱により、無機と金属とを直接接合する手法の開発を目的としている。平成30年度においては、まず、炭化ケイ素繊維強化型炭化ケイ素複合材料(SiC/SiC)の平板と、ジルカロイ平板との間に、チタンの微粉体を挿入し、レーザをジルカロイ平板の外表面に照射し、照射条件としてレーザの移動速度を二種類に変化させて、ジルカロイ平板とチタン微粉体との溶融反応に及ぼす影響について検討を行った。その結果、レーザ移動速度が遅いほうがジルカロイ平板に観察された熱影響部の幅が大きく、チタン微粉体とジルカロイ平板との間に反応が生じることを確認できた。また、反応性を高めるため、チタン微粉体に加えて、チタン系のロウ材も加えた場合についても検討を行い、ロウ材を加えた場合のほうが、反応性が高まることを確認することができた。また、SiC/SiC円管とジルカロイ円管との間に、チタン微粉体を封入し、ジルカロイ円管の外表面部をレーザ照射したとき、チタン微粉体の封入方法が、両円管の接合性に及ぼす影響について検討を行った。SiC/SiC円管の外表面に円周状に溝を作製し、溝内にチタン微粉体を封入したが、溝幅が異なる二種類について接合試験を行った。その結果、溝幅が広い場合には、レーザ照射時に、封入していたチタン微粉体が飛散してしまったが、溝幅が狭い場合には、チタン微粉体とジルカロイ円管とが固溶体を生成し、部分的に、SiC/SiC円管と良好な接合部を生成することに成功した。その結果、レーザ照射後のSiC/SiC円管とジルカロイ円管との接合体は、機械的に良好な接合を形成することに成功した。当初計画では、ジルコニウム板にチタン微粉体を散布し、レーザ局所加熱によるジルコニウムとチタンとの溶融反応実験を実施する予定であったが、ジルコニウム板の発火性が強いことや、散布されたチタン微粉体がレーザ照射によって飛散してしまう危険性が高いことから、ジルコニウム板に代わってジルカロイ板を、また、ジルカロイ板とSiC/SiC板との間にチタン微粉体を封入することで、発火の危険、ならびにチタン微粉体の飛散を抑制した実験を実施した。これにより、ジルカロイ板とチタン微粉体との反応性に関する基礎的知見を得ることに成功した。また、平成31年度に予定しているSiC/SiCとジルコニウムーチタン固溶体との親和性評価試験に際しては、ジルコニウムとチタンとの固溶体の生成が必要であるが、ジルコニウムの発火性が高いという問題があるため、平板を用いたジルカロイ板とチタン微粉体との反応試験において、チタン微粉体に加えてチタン系のロウ材も封入した試験を行い、同じレーザ照射条件に対して、ロウ材を加えた場合のほうが、反応性が高くなる結果が得られている。つまり、当初計画のSiC/SiCとジルコニウムーチタン固溶体との親和性に代わって、チタン微粉体とチタンロウ材との比率を変化させることで、SiC/SiC円管とジルカロイ円管との接合体を作製させるのに効果的な条件を見出すことが可能になると考えられる。さらに、当初計画では平成31年度に実施する予定であったSiC/SiC円管とジルカロイ円管との直接接合試験についても、予備的試験として、チタン微粉体を封入するためにSiC/SiC円管の外表面に作製する溝幅の影響を明らかにすることに成功した。平成30年度にジルカロイ板とSiC/SiC板との間に、チタン微粉体、ならびにチタン微粉体とチタン系ロウ材との混合物を封入した状態で、レーザ局所加熱を実施し、ジルコニウムとチタン微粉体との溶融性を評価する実験を行った。しかしながら、レーザ照射条件に加えて、チタン微粉体とチタン系ロウ材との混合比率については、まだ十分な評価には至っていない。また当初計画では、SiC/SiCとジルコニウムーチタン固溶体との親和性評価試験を、固溶体の自由落下試験法を用いて実施する予定であったが、固溶体作製の発火性の危険を予防するため、チタン微粉体とチタン系ロウ材との混合物を用いた評価が効果的であることが分かった。そこで平成31年度は、平成30年度に引き続き、ジルカロイ板とSiC/SiC板との間に、チタン微粉体、ならびにチタン微粉体とチタン系ロウ材との混合物を封入した状態での、レーザ局所加熱試験を行い、良好な接合体を作製するために必要なレーザ照射条件、およびチタン微粉体とチタン系ロウ材との混合比率を明らかにする。また、SiC/SiC円管とジルカロイ円管との直接接合試験についても、当初は平成31年度に実施する予定であったが、平成30年度に実施した予備的試験結果より、良好な接合体作製には、狭い幅の溝をSiC/SiC円管の外表面に作製することで、溝部に封入するチタン微粉体がレーザ照射中に飛散することを抑制可能であることが明らかになった。そこで、平成31年度においては、溝部に、チタン微粉体に加えて、チタン微粉体とチタン系ロウ材との混合物を封入した実験を実施する。

封入する物質とレーザ照射条件は、同じく平成31年度に実施する平板での実験結果に基づいて決定し、最終目標とする、機械的特性、ならびに気密性に優れたSiC/SiC円管とジルカロイ円管との直接接合体の作製を目指す。本研究では、無機であるセラミックス複合材料と耐熱金属材料との間に、無機材料との親和性に優れた金属材料を、反応性が高い微粉体として封入し、レーザを用いた局所加熱により、無機と金属とを直接接合する手法の開発を目的としている。平成30年度においては、まず、炭化ケイ素繊維強化型炭化ケイ素複合材料(SiC/SiC)の平板と、ジルカロイ平板との間に、チタンの微粉体を挿入し、レーザをジルカロイ平板の外表面に照射し、照射条件としてレーザの移動速度を二種類に変化させて、ジルカロイ平板とチタン微粉体との溶融反応に及ぼす影響について検討を行った。その結果、レーザ移動速度が遅いほうがジルカロイ平板に観察された熱影響部の幅が大きく、チタン微粉体とジルカロイ平板との間に反応が生じることを確認できた。また、反応性を高めるため、チタン微粉体に加えて、チタン系のロウ材も加えた場合についても検討を行い、ロウ材を加えた場合のほうが、反応性が高まることを確認することができた。また、SiC/SiC円管とジルカロイ円管との間に、チタン微粉体を封入し、ジルカロイ円管の外表面部をレーザ照射したとき、チタン微粉体の封入方法が、両円管の接合性に及ぼす影響について検討を行った。SiC/SiC円管の外表面に円周状に溝を作製し、溝内にチタン微粉体を封入したが、溝幅が異なる二種類について接合試験を行った。その結果、溝幅が広い場合には、レーザ照射時に、封入していたチタン微粉体が飛散してしまったが、溝幅が狭い場合には、チタン微粉体とジルカロイ円管とが固溶体を生成し、部分的に、SiC/SiC円管と良好な接合部を生成することに成功した。その結果、レーザ照射後のSiC/SiC円管とジルカロイ円管との接合体は、機械的に良好な接合を形成することに成功した。当初計画では、ジルコニウム板にチタン微粉体を散布し、レーザ局所加熱によるジルコニウムとチタンとの溶融反応実験を実施する予定であったが、ジルコニウム板の発火性が強いことや、散布されたチタン微粉体がレーザ照射によって飛散してしまう危険性が高いことから、ジルコニウム板に代わってジルカロイ板を、また、ジルカロイ板とSiC/SiC板との間にチタン微粉体を封入することで、発火の危険、ならびにチタン微粉体の飛散を抑制した実験を実施した。これにより、ジルカロイ板とチタン微粉体との反応性に関する基礎的知見を得ることに成功した。また、平成31年度に予定しているSiC/SiCとジルコニウムーチタン固溶体との親和性評価試験に際しては、ジルコニウムとチタンとの固溶体の生成が必要であるが、ジルコニウムの発火性が高いという問題があるため、平板を用いたジルカロイ板とチタン微粉体との反応試験において、チタン微粉体に加えてチタン系のロウ材も封入した試験を行い、同じレーザ照射条件に対して、ロウ材を加えた場合のほうが、反応性が高くなる結果が得られている。つまり、当初計画のSiC/SiCとジルコニウムーチタン固溶体との親和性に代わって、チタン微粉体とチタンロウ材との比率を変化させることで、SiC/SiC円管とジルカロイ円管との接合体を作製させるのに効果的な条件を見出すことが可能になると考えられる。さらに、当初計画では平成31年度に実施する予定であったSiC/SiC
結び目のDehn手術に関する研究

結び目の外部空間の位相幾向的性質がDehn手術後保たれていないとき、そのようなDehn手術を例外型Dehn手術と呼ぶ。Dehn手術に関する問題の多くは“例外型Dehn手術を記述せよ"というものになっている。本研究ではDehn手術後Seifert多様体が得られるような例外型Dehn手術について研究した。その結果は東京電機大学の宮崎氏との共著論文(Seifert fibred manifolds and Dehn surgery,プレプリント)にまとめられている。そこではsatellire結び目のDehn手術でSeifert多様体が生じる場合について調べ、手術係数およびsatellire結び目の結び目型についてのいくつかの結果が得られている。手術係数については整数でなければいけないことが示されているが、その個数については最良な評価が得られるよう現在も研究を継続中である。今後は、双曲的結び目についても、それ以上のDehn手術でSeifert多様体が生じるものについて研究を行なっていく予定である。また、satellite結び目のアイソトピーのもとでの分類問題について神戸大学の河野氏と共同で研究を行い、Schubertの結び目の一意分解定理の一般化に成功した。それに関連して興味深い例がいくつか発見された。これらの結果についてOn satellite kuots,Math.Proc.Cambridge Phil.Soc.に出版されている。
LAMP法を用いた飲水等からの緑膿菌の迅速検出法の確立

Specific Pathogen Free(SPF)マウス飼育施設における緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の微生物学的モニタリング簡便化のため、Loop-mediated Isothermal Amplification(LAMP)法を用いた緑膿菌可視迅速診断法の開発を試みた。緑膿菌0prL遺伝子配列を元にプライマーセットを設計しその特異性を調べたところ、緑膿菌49株全てにおいて反応陽性を示したのに対し、7種のPseudomonas属菌を含む14株及びPseudomonas属以外の9菌種26株では全て反応陰性を示した。緑膿菌ゲノムを使用し本法の検出感度を調べたところ反応溶液あたり12 CFUであった。マウス飼育施設において適切に飲水の交換が行われている場合、この検出感度では本法による飲水からの緑膿菌検出は実用性に乏しいと考えられたため、対象を飲水から糞便へと変更した。糞便への緑膿菌の接種実験を行ったところ糞便0.1gあたり130 CFU(反応溶液あたり3.25 CFU)の検出感度を示した。緑膿菌をSPF対象項目とする2SPF施設、対象項目としない1SPF施設、そして微生物学的モニタリングを行っていない1 Conventional施設から集めた糞便サンプル、それぞれ27検体、12検体、7検体について緑膿菌の検出を試みた。いずれの場合も従来の培養法では緑膿菌コロニーを観察できなかったが、本法では緑膿菌をSPF対象項目としないSPF施設から集めた12検体中1検体、及びConventional施設から集めた7検体中2検体で反応陽性を示した。本法は従来の培養法とは違い、菌の生死に関わらず感染の履歴を検出することができるという点、またその操作が簡便でかつ迅速に行えるという点から、SPFマウス飼育施設における緑膿菌の診断方法として有用であることが示唆された。
病的函数を初期値とする Hamilton-Jacobi flow の研究

今年度は、研究課題である「病的函数を初期値とするHamilton-Jacobi flowの研究」について2つの研究成果を上げた。これら2つの結果は当初から予想されていたものである。現在、そのうちの一つは数学関係の専門雑誌に投稿中であり、もう一つは論文として纏め始めている。なお、ここで言う病的函数とは、実数直線状で定義されて、至る所連続で至る所微分不可能な函数のことである。まず現在投稿中の論文では、初期値となる病的函数のクラスとして"適切"と思われるクラスを設定した。そのクラスの函数は2階の中心差分に対応するものがある評価をみたす函数のクラスとして定義されて、病的函数としては定義されていない。しかし、このクラスの函数は結果的に病的函数になる。また、ある函数がこのクラスに属することは、この函数のグラフ上の点を頂点とする放物線の族がある種の不等式をみたすことと同値になるということで特徴づけられる。この特徴づけを使って、基本的な2次のHamilton-Jacobi semigroupに対する、このクラスの函数を初期値とするHamilton-Jacobi flowを考えると、このflowは各時刻で区分的に2次函数となる。すなわち、初期値は至る所で微分不可能であるが、flowの微分不可能点は各有界閉区間では有限個である。次に、現在纏め始めている論文では、上記のクラスの函数のうち、最も重要で典型的なものである高木函数を取り上げている。高木函数はこのクラスの函数なので、上にあげた性質を持つのはもちろんであるが、初期値が高木函数である時にはこのflowの表現をほぼ完全に記述できるということをまず示した。つぎに、それを使い、このflowが時間発展的な自己アファイン性を持つことを示した。上記研究実績の概要で書いたように、当初予想していたことをほぼ実現できたという意味では、おおむね順調に進展しており満足の行くものである。ただ、昨年度中に論文のアクセプトが得られなかったという意味で当初の計画以上に進展しているとは言い難いかもしれないと思う。具体的な内容について説明して行きたい。まず得られた2つの結果のうち、最初の結果は現在投稿中である。まだ審査は終わっていないものの論文の投稿という段階までに達した。この結果が現在投稿中の数学専門雑誌でアクセプトされるか否かは今後の進捗状況に多大な影響をもたらすが、もしレジェクトされるようなことがあってもあきらめずレフェリーから指摘された点を直すなどして別の雑誌に投稿したい。この論文の結果については、共著者を含め私も満足の行く結果だと信じている。次に、現在纏めている論文では、当初予想もしていなかった「自己アファイン性」という概念が出てきており、これは大いなる進展と思われる。この「自己アファイン性」はポジティブな結果であると信じているので今後の発展につなげて行きたい。そのために、フラクタルについて、再度勉強してこの「自己アファイン性」についての理解を深めて行きたい。さらに、できるだけ早い時期にこの結果を論文にまとめて論文の投稿にまで持って行きたい。上記2つの理由により、研究はおおむね順調に進展していると言ってよいと思う。もちろん、これに満足することなく、さらなる発展を目指したい。現在投稿中の論文については、何とかアクセプトまで持っていきたい。もし、レフェリーから何か言われて書き直しを要求されたときも、最善の方法を考えアクセプトまで持っていきたい。また、もしレジェクトされるようなことがあってもあきらめずレフェリーから指摘された点を直すなどして別の雑誌に投稿するなど次善の策を模索したい。次に、現在纏めている論文については、当初予想もしていなかった「自己アファイン性」という概念がはっきりと出てきており、今後も研究を深めてさらなる結果につなげて行きたい。この「自己アファイン性」は今後の研究の鍵となるものであると確信している。さらに、今年の7月1日から6日まで中国の上海の復旦大学で開かれる研究集会「New trends in Hamilton-Jacobi: PDE,Control,Dynamical Systems and Geometry」において招待講演を依頼されているので、この研究集会で上記2つの結果について講演してきたい。この研究集会は、Hamilton-Jacobi方程式関連の研究集会としては非常に大がかりな研究集会なので、その場で多くの研究者たちの意見を聞いてきたいと思っている。特に、「自己アファイン性」は面白い結果だと思うので、これについて意見を聞いてきたいと思っている。さらに、いくつかの研究集会でこれらの結果について発表したい。このために、連携研究者である富山大学の山口範和氏や北海道大学の浜向直氏らの意見を参考にして「自己アファイン性」の結果をより良いものとして行きたい。山口氏は同じ大学なので頻繁に会うようにしたい。浜向氏は札幌という遠隔地にいるが、時間を都合して何度か訪問したい。

そのクラスの函数は2階の中心差分に対応するものがある評価をみたす函数のクラスとして定義されて、病的函数としては定義されていない。しかし、このクラスの函数は結果的に病的函数になる。また、ある函数がこのクラスに属することは、この函数のグラフ上の点を頂点とする放物線の族がある種の不等式をみたすことと同値になるということで特徴づけられる。この特徴づけを使って、基本的な2次のHamilton-Jacobi semigroupに対する、このクラスの函数を初期値とするHamilton-Jacobi flowを考えると、このflowは各時刻で区分的に2次函数となる。すなわち、初期値は至る所で微分不可能であるが、flowの微分不可能点は各有界閉区間では有限個である。次に、現在纏め始めている論文では、上記のクラスの函数のうち、最も重要で典型的なものである高木函数を取り上げている。高木函数はこのクラスの函数なので、上にあげた性質を持つのはもちろんであるが、初期値が高木函数である時にはこのflowの表現をほぼ完全に記述できるということをまず示した。つぎに、それを使い、このflowが時間発展的な自己アファイン性を持つことを示した。上記研究実績の概要で書いたように、当初予想していたことをほぼ実現できたという意味では、おおむね順調に進展しており満足の行くものである。ただ、昨年度中に論文のアクセプトが得られなかったという意味で当初の計画以上に進展しているとは言い難いかもしれないと思う。具体的な内容について説明して行きたい。まず得られた2つの結果のうち、最初の結果は現在投稿中である。まだ審査は終わっていないものの論文の投稿という段階までに達した。この結果が現在投稿中の数学専門雑誌でアクセプトされるか否かは今後の進捗状況に多大な影響をもたらすが、もしレジェクトされるようなことがあってもあきらめずレフェリーから指摘された点を直すなどして別の雑誌に投稿したい。この論文の結果については、共著者を含め私も満足の行く結果だと信じている。次に、現在纏めている論文では、当初予想もしていなかった「自己アファイン性」という概念が出てきており、これは大いなる進展と思われる。この「自己アファイン性」はポジティブな結果であると信じているので今後の発展につなげて行きたい。そのために、フラクタルについて、再度勉強してこの「自己アファイン性」についての理解を深めて行きたい。さらに、できるだけ早い時期にこの結果を論文にまとめて論文の投稿にまで持って行きたい。上記2つの理由により、研究はおおむね順調に進展していると言ってよいと思う。もちろん、これに満足することなく、さらなる発展を目指したい。現在投稿中の論文については、何とかアクセプトまで持っていきたい。もし、レフェリーから何か言われて書き直しを要求されたときも、最善の方法を考えアクセプトまで持っていきたい。また、もしレジェクトされるようなことがあってもあきらめずレフェリーから指摘された点を直すなどして別の雑誌に投稿するなど次善の策を模索したい。
オートファゴソームの数と大きさの制御機構

オートファジーはリソソームを分解の場とする細胞質成分の大規模分解系である。オートファジーによる分解活性を制御しうる重要なファクターとしてオートファゴソームの数と制御がどのように制御されているかを検討している。このオートファジーの活性がどのように制御されているかについては、いまだ部分的にしか明らかにされていない。そこで、オートファジー制御に重要であると考えられている酵母Atg1の哺乳類ホモログであるULKを中心に、オートファジーの制御機構についても解析を進めた。Atg1は酵母において、Atg13、Atg17とともにキナーゼ複合体を形成しており、オートファジーの開始にはそのキナーゼ活性が必須であることが知られている。Atg1の哺乳類ホモログであるULK1/2の結合因子として、今回FIP200(RB1CC1:RB1 inducible coiled-coil 1)を同定した。FIP200は癌抑制遺伝子RB1の発現を調節し、癌抑制に働いている約180kDaのタンパク質であり、RB1との相互作用以外にも細胞サイズの制御や細胞接着への関与など多機能を有することが報告されている。FIP200がULK1/2と結合することから、FIP200の新たな機能としてオートファジーへ関与する可能性を考え検討した。初めに、内因性のFIP200を認識しうるpolyclonal抗体を作成し、これを用いてFIP200と内因性ULK1との結合を確認した。さらに、FIP200がオートファジー関連因子Atg13の哺乳類ホモログとも結合することが分かり、ULK1とともに三者複合体を形成していることが考えられた。これらはすべてオートファゴソームを形成する途中段階の隔離膜に特異的に局在することが観察された。さらにFIP200のノックアウト細胞を解析したところ、この細胞ではオートファジーの活性が消失していることが明らかとなった。また、この細胞ではULKが隔離膜に局在できず、自己リン酸化の程度も低下していた。従って、FIP200はULKとともにオートファゴソーム形成過程で必須な働きをする新規オートファジー因子であると結論された。マウス個体では、絶食後全ての臓器で一様にオートファジーが誘導されるわけではないことが観察された。肝では早く、遅れて心筋や骨格筋でおこり、脳は飢餓時でも誘導されない。その際,mTORシグナルを同時に観察するとオートファジー始動とmTOR経路の抑制のタイムコースが良く相関していた。このことから生体内でのオートファジー誘導は主にインスリン受容体-mTOR系の抑制によることが考えられた。しかしながら、インスリン分泌能を欠いたストレプトゾシン誘導糖尿病マウスにおいても、依然として絶食によるオートファジー誘導が観察されたため、インスリン以外の制御因子の存在が疑われた。また培養細胞においてもmTOR阻害剤であるラパマイシンとアミノ酸除去はオートファゴソームの数と大きさの両方に対して相加的な効果があったため、mTOR非依存的なアミノ酸シグナルの関与が考えられた。そこで、アミノ酸飢餓センサーとして機能するGCN2について解析を行ったところ、GCN2欠損線維芽細胞では、血清飢餓によるオートファジーは正常に誘導されるものの、アミノ酸飢餓によるオートファジーは有意に抑制されることが判明した。従って、オートファジー誘導にはインスリン受容体-mTOR経路のみならず、GCN2を介したアミノ酸シグナルも関与することが示唆された。

また、この細胞ではULKが隔離膜に局在できず、自己リン酸化の程度も低下していた。従って、FIP200はULKとともにオートファゴソーム形成過程で必須な働きをする新規オートファジー因子であると結論された。