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ヒトの気管支におけるガス交換メカニズム

ヒトの肺は,気管から末端の肺胞に至るまで分岐管の集合により構成されている.流路の一方の端(肺胞)は行き止まりであるにもかかわらず,肺は酸素と炭酸ガスの極めて効率良いガス交換を実現している.従来,流路軸方向のガス交換に寄与する因子として,(1)Taylor拡散,(2)streaming,(3)二次流れ,が挙げられているが,本研究代表者らが流れの挙動をより詳細に観察した結果,吸気・呼気いずれの場合にも,各分岐曲がり部での「はく離域の発生・消滅」とそれによる流体の「捕捉・放出」効果が,流路軸方向物質交換の基本機構であることがわかった.上述の物質交換過程は,実際の人肺においても生じていると推測されるが,本研究は,それをより実際に近い条件において定量的な観点から検証かつ解析し,ヒトの肺の気管支内におけるガス交換機構を工学的見地から明らかにすることを目的とする.流れの可視化実験および物理モデルの構築(担当望月)ヒトの肺を模して,3次元的に分岐するガラス製テストセクションを新たに製作し,通常呼吸および人工呼吸法のひとつである高頻度呼吸を再現する脈動周波数範囲での実験を行い,以下のことが明らかになった.(1)3次元流路でも「捕捉・放出」効果が生じている.(2)分岐上流部での流れの非対称性が影響を及ぼし,物質輸送速度が速い経路が存在する.(3)その経路は連続する分岐管軸方向の相対位置関係によって変化する.数値シミュレーション(担当村田)3分岐4世代の分岐管内非定常振動流と物質拡散の有限体積法による数値解析を行った.3通りの分岐角度での計算を行い,剥離泡の大きさと物質移動量の間には相関があり,最適な分岐角度の存在が示唆された.剥離泡の役割としては「捕捉・放出」効果による物質輸送促進と流路面積減少による流体加速の2つの効果が観察された.ヒトの肺は,気管から末端の肺胞に至るまで分岐管の集合により構成されている.流路の一方の端(肺胞)は行き止まりであるにもかかわらず,肺は酸素と炭酸ガスの極めて効率良いガス交換を実現している.従来,流路軸方向のガス交換に寄与する因子として,(1)Taylor拡散,(2)streaming,(3)二次流れ,が挙げられているが,本研究代表者らが流れの挙動をより詳細に観察した結果,吸気・呼気いずれの場合にも,各分岐曲がり部での「はく離域の発生・消滅」とそれによる流体の「捕捉・放出」効果が,流路軸方向物質交換の基本機構であることがわかった.上述の物質交換過程は,実際の人肺においても生じていると推測されるが,本研究は,それをより実際に近い条件において定量的な観点から検証かつ解析し,ヒトの肺の気管支内におけるガス交換機構を工学的見地から明らかにすることを目的とする.流れの可視化実験および物理モデルの構築(担当望月)ヒトの肺を模して,3次元的に分岐するガラス製テストセクションを新たに製作し,通常呼吸および人工呼吸法のひとつである高頻度呼吸を再現する脈動周波数範囲での実験を行い,以下のことが明らかになった.(1)3次元流路でも「捕捉・放出」効果が生じている.(2)分岐上流部での流れの非対称性が影響を及ぼし,物質輸送速度が速い経路が存在する.(3)その経路は連続する分岐管軸方向の相対位置関係によって変化する.数値シミュレーション(担当村田)3分岐4世代の分岐管内非定常振動流と物質拡散の有限体積法による数値解析を行った.3通りの分岐角度での計算を行い,剥離泡の大きさと物質移動量の間には相関があり,最適な分岐角度の存在が示唆された.剥離泡の役割としては「捕捉・放出」効果による物質輸送促進と流路面積減少による流体加速の2つの効果が観察された.ヒトの肺は,気管から末端の肺胞に至るまで分岐管の集合により構成されている.流路の一方の端(気管)は大気に開放されているが,他方(肺胞)は行き止まりであるにもかかわらず,肺は酸素と炭酸ガスの極めて効率良いガス交換を実現している.従来,流路軸方向のガス交換に寄与する因子として,(1)Taylor拡散,(2)streaming,(3)二次流れ,が挙げられているが,本研究代表者らが流れの挙動をより詳細に観察した結果,吸気・呼気いずれの場合にも,各分岐曲がり部での「はく離域の発生・消滅」とそれによる流体の「捕捉・放出」効果が,流路軸方向物質交換の基本機構であることがわかった.この新たに見出された上述の物質交換過程は,実際の人肺においても生じていると推測されるが,本研究は,それをより実際に近い条件において定量的な観点から検証かつ解析し,もってヒトの肺の気管支内におけるガス交換機構を工学的見地から明らかにすることを目的とする.流れの可視化実験および物理モデルの構築(担当望月)ヒトの肺を模して,3次元的に分岐するガラス製テストセクションを新たに製作し,通常呼吸および人工呼吸法のひとつである高頻度呼吸を再現する脈動周波数範囲での実験を一部の条件範囲について行った.可視化結果より,左右対称に分岐する場合でも物質輸送にその上流部での流れの非対称性が影響を及ぼし,物質輸送速度が速い経路が存在することがわかった.数値シミュレーション(担当村田)3次元的に分岐する管内の非定常流れと物質拡散の基礎方程式を用いて,有限体積法による数値解析を行った.3通りの分岐角度での計算を行い,剥離泡の大きさと物質移動量の間に相関があることが明らかとなった.

但し,その関係は単調なものではなく,最適な分岐角度および剥離泡の役割の詳細な検討は次年度の課題となった.ヒトの肺は,気管から末端の肺胞に至るまで分岐管の集合により構成されている.流路の一方の端(肺胞)は行き止まりであるにもかかわらず,肺は酸素と炭酸ガスの極めて効率良いガス交換を実現している.従来,流路軸方向のガス交換に寄与する因子として、(1)Taylor拡散、(2)streaming,(3)二次流れ,が挙げられているが,本研究代表者らが流れの挙動をより詳細に観察した結果,吸気・呼気いずれの場合にも,各分岐曲がり部での「はく離域の発生・消滅」とそれによる流体の「捕捉・放出」効果が,流路軸方向物質交換の基本機構であることがわかった.上述の物質交換過程は,実際の人肺においても生じていると推測されるが,本研究は,それをより実際に近い条件において定量的な観点から検証かつ解析し,ヒトの肺の気管支内におけるガス交換機構を工学的見地から明らかにすることを目的とする.流れの可視化実験および物理モデルの構築(担当望月)ヒトの肺を模して,3次元的に分岐するガラス製テストセクションを新たに製作し,通常呼吸および人工呼吸法のひとつである高頻度呼吸を再現する脈動周波数範囲での実験を行い,以下のことが明らかになった.(1)3次元流路でも「捕捉・放出」効果が生じている.(2)分岐上流部での流れの非対称性が影響を及ぼし,物質輸送速度が速い経路が存在する.(3)その経路は連続する分岐管軸方向の相対位置関係によって変化する.数値シミュレーション(担当村田)3分岐4世代の分岐管内非定常振動流と物質拡散の有限体積法による数値解析を行った.通りの分岐角度での計算を行い,剥離泡の大きさと物質移動量の間には相関があり,最適な分岐角度の存在が示唆された・剥離泡の役割としては「捕捉・放出」効果による物質輸送促進と流路面積減少による流体加速の2つの効果が観察された.
呼気ガスセンシングによる病状診断と予測アルゴリズム開発

本研究課題は、呼気を中心とする非侵襲データに基づき、機械学習法により複数の疾患を診断することを目的とする。これまでの研究から、呼気成分を用いて高精度で疾病診断できることが分かっているが、診断におけるデータの前処理・アルゴリズム、およびガスセンサの小型化・性能向上を行うことで、疾病・健康状態の状態推定の精度向上を目指す。また、呼気に含まれる複数の成分のうち、どの成分が疾病と関連するか、疾病のレベルとの関係性について知見抽出が行えるアルゴリズム開発を行うことを目的とする。さらに、1種のガスセンサで4種の状態(健常および3種の疾病)を特異的に診断できる可能性を調査する。呼気採取グループは採取する疾病の選択および被検者の準備(倫理関係の書面等も含む)行った。センサ開発グループは特定の4成分に対する感度調整を行った。アルゴリズム開発グループは、新規呼気ガスが採取されるまでの準備として、診断に有効な成分選択アルゴリズムの開発を行った。成分選択は機械学習の分野における特徴選択法に相当する。本研究課題に関連した新規の特徴選択法の開発に着手し、ある程度の性能が得られることを確認した。今後、採取された呼気ガスに対して本手法を適用していく予定である。本研究課題の手法が確立されれば、様々な非侵襲データを統合することで、高い精度の健康診断が簡素に行うことが可能となる。その簡便性から医療現場の労力を大幅に削減できるだけでなく、被検者にとっても診断のための経済的・身体的・心的・時間的負担が大幅に軽減される。ヒト由来試料採取を行う研究であるため、採取の手続きおよびデータの扱いについて、規定に従って進めている。採取グループ、センサ開発グループ、アルゴリズム開発グループそれぞれにおいて、具体的な研究事項を順調に進めている。新規に採取した呼気について、センサによる定量化と疾病診断性能の評価を行う。複数の疾病間の呼気成分の違いについて明らかにする。新規の特徴選択法について、他の手法との性能比較を行う。
オートファジーによるオルガネラ品質管理のマウス生体を用いた解析

Atg5ノックアウトマウスなどのオートファジー不全マウスは生まれて一日以内に致死となるためマウス成体におけるオートファジーの生理学的意義を解析するには制約が大きかった。本研究ではAtg5ノックアウトマウスに神経特異的プロモーター下でAtg5を発現させることにより神経特異的にオートファジーをレスキューしたマウスを作製した。このマウスは神経以外全身でAtg5を欠損する。この神経特異的Atg5レスキューマウスは新生仔致死を乗り越え、成体まで生き延びることができた。本年度はこのマウスの全身の臓器を組織学的及び生化学的に解析することでオートファジー不全により起こる組織学的異常と異常タンパク質の蓄積を全身網羅的に解析、臓器間で比較した。神経特異的Atg5レスキューマウスでは肝脾腫、細胞の腫大・空胞変性、パネート細胞の異常、筋肉・脂肪の萎縮など既報告の異常に加え、小腸絨毛・陰窩の形態変化、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、間質性肺炎、筋肉組織における核の増加、雄雌の生殖器の発達不全・生殖細胞の成熟不全、様々な臓器における炎症性変化が観察された。また心臓・肝臓・筋肉において特にユビキチン化タンパク質とオートファジー特異的基質であるp62の蓄積が顕著であることが観察された。さらに、これらの臓器ではp62の蓄積依存的に活性化される転写因子であるNrf2の増加とそのターゲット因子であるNqo1の増加が観察された。以上の結果より、オートファジー依存的な細胞の品質管理の欠損は臓器によりその影響の強さが違う可能性が示唆された。前年度までの結果から、この神経特異的Atg5レスキューマウスは鉄の吸収不全により鉄欠乏をきたすことが観察されていた。また、その原因として小腸における鉄関連因子の転写制御異常によることが観察されている。これらの結果を前年度までの成果と合わせて論文として投稿した。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経以外の全身でオートファジーを欠損した神経特異的オートファジーレスキューマウス(以下ノックアウトマウスとする)を用い、マウス成体の全身におけるオートファジーの生理学的意義を解析した。当初、全身の臓器においてオートファジーの破綻に起因するオルガネラの異常を解析する予定であったが、スクリーニングの途中でノックアウトマウスは貧血及び鉄欠乏を呈することが観察され、その鉄欠乏はノックアウトマウスの貧血の少なくとも一部であることが観察された。このことより、鉄欠乏の原因に重点を置いて解析を進めることとした。鉄欠乏の原因として1、吸収の低下2、分布の異常3、損失の増加の可能性をそれぞれ調べた。全身の臓器で組織鉄を定量したところ、鉄が異常に沈着した臓器は観察されなかった。また、ノックアウトマウスは明らかな外表出血はなく、便潜血も陰性であった。以上のことから、分布の異常と損失の増加は否定的であった。そのため、現在ノックアウトマウスの鉄欠乏は鉄の吸収異常に起因すると考えている。次に鉄吸収の低下の可能性を調べた。鉄吸収の抑制的制御として肝臓ホルモンであるヘプシジンが知られるが、ノックアウトマウスでヘプシジンは低下していた。よって、てつきゅうしゅうがか上に抑制されている可能性は否定的であった。一方、鉄吸収の促進的制御として、鉄不足の時に上部小腸上皮で鉄吸収に関連する因子であるDcytb, DMT1, Fpnの発現が亢進することが知られる。mRNAの発現をqPCR法で調べたところ、ノックアウトマウスは鉄欠乏にもかかわらず、これらの因子の発現がコントロールと比較し、同等か低下傾向にあった。このことから、ノックアウトマウスは鉄関連因子の発現不足により鉄の吸収異常を来していることが示唆された。神経以外で全身でオートファジーを欠損したマウスモデル(以下、ノックアウトマウスとする)を用い、オートファジーの生理的意義を解析している。前年度のスクリーニングの結果からこのノックアウトマウスは鉄欠乏を呈することが観察され、間接的証拠から鉄の吸収異常が疑われていた。今回、コントロールマウスとノックアウトマウスをともに鉄欠乏にして比較するため、両群に鉄欠乏食を与え、鉄吸収関連因子の転写誘導を観察した。コントロールマウスでは鉄含有食を与えた群と比較し、鉄欠乏食を与えた群で非常に劇的に鉄関連因子のmRNAが上昇した。一方、ノックアウトマウスは通常状態で鉄欠乏であるにもかかわらず、これらの因子が上昇しておらず、また、鉄欠乏食を与えたときもコントロールマウスと比較しmRNAの上昇が有意に低いことが観察された。このことから、ノックアウトマウスは鉄欠乏時における鉄吸収関連因子の発現が不十分であることが示された。同様に、生理的に鉄要求性の高い若齢マウスを解析したところ、鉄エクスポーターのmRNA発現が有意に低下していることが観察された。以上のことから、ノックアウトマウスは鉄吸収に必要な因子の発現低下により鉄欠乏を呈することが示唆された。鉄吸収の制御は肝臓からのホルモンによる抑制性の制御と小腸上皮における転写誘導による促進性の制御が知られる。現在、ノックアウトマウスで観察される鉄吸収不全の原因が上記のどちらの原因によるか、小腸上皮特異的オートファジー不全マウスおよび肝臓オートファジー不全マウスを用い解析しているところである。小腸上皮特異的オートファジー不全マウス、肝臓オートファジー不全マウス共に通常状態では鉄欠乏を呈さないことが観察されている。

今後、これらのマウスで鉄欠乏食を与えたときに鉄トランスポーター発現誘導不全が観察されるか解析する。Atg5ノックアウトマウスなどのオートファジー不全マウスは生まれて一日以内に致死となるためマウス成体におけるオートファジーの生理学的意義を解析するには制約が大きかった。本研究ではAtg5ノックアウトマウスに神経特異的プロモーター下でAtg5を発現させることにより神経特異的にオートファジーをレスキューしたマウスを作製した。このマウスは神経以外全身でAtg5を欠損する。この神経特異的Atg5レスキューマウスは新生仔致死を乗り越え、成体まで生き延びることができた。本年度はこのマウスの全身の臓器を組織学的及び生化学的に解析することでオートファジー不全により起こる組織学的異常と異常タンパク質の蓄積を全身網羅的に解析、臓器間で比較した。神経特異的Atg5レスキューマウスでは肝脾腫、細胞の腫大・空胞変性、パネート細胞の異常、筋肉・脂肪の萎縮など既報告の異常に加え、小腸絨毛・陰窩の形態変化、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、間質性肺炎、筋肉組織における核の増加、雄雌の生殖器の発達不全・生殖細胞の成熟不全、様々な臓器における炎症性変化が観察された。また心臓・肝臓・筋肉において特にユビキチン化タンパク質とオートファジー特異的基質であるp62の蓄積が顕著であることが観察された。さらに、これらの臓器ではp62の蓄積依存的に活性化される転写因子であるNrf2の増加とそのターゲット因子であるNqo1の増加が観察された。以上の結果より、オートファジー依存的な細胞の品質管理の欠損は臓器によりその影響の強さが違う可能性が示唆された。前年度までの結果から、この神経特異的Atg5レスキューマウスは鉄の吸収不全により鉄欠乏をきたすことが観察されていた。また、その原因として小腸における鉄関連因子の転写制御異常によることが観察されている。これらの結果を前年度までの成果と合わせて論文として投稿した。前年度に行ったスクリーニングより、ノックアウトマウスは鉄欠乏を呈することが明らかになっていた。その原因として鉄の吸収に異常がありそうだということが明らかになった。鉄の吸収異常の原因として、小腸上皮における鉄吸収に必要なトランスポーター等の発現誘導が不十分であることが観察された。現在臓器特異的ノックアウトマウスを作製し、原因となる臓器を特定するための解析を進めている。以上より、おおむね順調に進展していると自己評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。小腸上皮特異的オートファジー不全マウスと肝臓オートファジー不全マウスモデルを解析することで、小腸における鉄吸収不全が小腸内因性の原因であるか、肝臓からのホルモン(特にヘプシジン)制御であるかを調べる。また、神経特異的オートファジーレスキューマウスで観察される鉄関連因子の発現誘導不全がこれらの臓器特異的ノックアウトマウスで観察されるかを解析する。そして、観察される異常の直接的原因を精査していく予定である。また、得られた結果を論文としてまとめ、発表する予定である。ノックアウトマウスの表現型のスクリーニングが終わり、鉄欠乏に注目して解析を進める、という方向性が決まった。
骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導

本研究では骨髄幹細胞を用いた歯牙再生医療の臨床応用を目指す為、骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導制御に関する基礎的研究を行った。その結果、骨髄幹細胞は歯や歯周組織を構成する様々な細胞への分化能を有していることが証明された。また歯髄中に存在する幹細胞の解析から、骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導の可能性が示唆された。以上の結果は、将来の歯科再生医療において、骨髄に含まれる細胞から歯を形成できる可能性を示すものである。本年度研究では骨髄幹細胞を用いた歯科再生医療の臨床応用を目指す為、骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導制御に関する基礎的研究を行った。骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化能に関する研究では、GFPトランスジェニックマウス・ラット由来の骨髄細胞を用い、1. GFP骨髄細胞移植動物の作成と同動物の組織学的解析、2.歯髄組織中に存在するGFP陽性細胞の樹立を試みた。また骨髄幹細胞の歯牙構成細胞への分化誘導を行う上で、象牙芽細胞の解析を行うことは重要である。そこで歯髄細胞の分化過程の詳細を解析するため3. GFPトランスジェニックラットより歯髄幹細胞の樹立を試みた。1.免疫組織化学的解析では、GFP骨髄細胞移植後1ヶ月で歯髄組織中にGFP陽性細胞が多数認められた。GFP陽性細胞は6ヶ月の観察期間中細胞数の大きな変化は認められなかった。歯髄組織中のGFP陽性細胞は神経、血管等のマーカー陰性であり、また大部分が樹枝状形態を呈していることから免疫機能に関わる樹状細胞である可能性が示唆された。GFP陽性細胞は歯髄組織以外に、歯根膜組織等の歯周組織にも認められ、経時的にGFP陽性細胞数の増加傾向が認められた。以上のことから骨髄幹細胞が歯牙構成組織に深く関わっていると考えられた。2.歯髄組織中のGFP陽性細胞を培養したところ、数代の経代で細胞数は激減した。今後培養条件等の詳細な検討を行う予定である。3.ラット歯髄から樹立した歯髄幹細胞を、硬組織分化培地で培養した結果、高度な石灰化を生じた。また同細胞を免疫不全マウスに移植したところ、象牙質様の硬組織形成を認めた。本研究課題では骨髄および歯髄中に存在する間葉系幹細胞の性状解明をおこない、骨髄幹細胞を歯牙構成細胞に分化誘導し、歯科再生医療へ応用する為の基礎的研究データを得ることを目的としている。本年度研究ではGFP骨髄細胞移植ラットの歯髄組織中に存在するGFP陽性細胞の性状について詳細に解析を行った。また、歯髄組織から樹立した歯髄幹細胞についてその象牙芽細胞への分化能について検討を行った。歯髄中の移植骨髄由来GFP陽性細胞の免疫組織学的検索では、神経系およびマクロファージ系の抗体には反応を示さず、明らかな象牙質形成細胞への分化も認められなかった。また、培養実験では増殖活性に乏しく、ある程度分化段階の進んだ細胞であると考えられた。以上の結果から同細胞は現在までに同定されていない細胞である可能性が示唆された。歯髄組織から樹立した細胞の解析では、歯髄幹細胞は経代60代を経過しても高い増殖能を保持していた。また、同細胞を硬組織分化培地で誘導したところ、細胞外に多量の基質を産生した。電子顕微鏡による観察では産生された基質は線維状を呈しており規則正しい周期構造が認められたことから、基質の主体はコラーゲンであると考えられた。コラーゲン基質には針状結晶状の沈着が認められる箇所も存在しており、アリザリン染色に強陽性を示したところから、高度に石灰化していると考えられた。歯髄幹細胞をオスフェリオン・マトリゲルと共に免疫不全マウスに皮下に移植したところ、象牙質様の硬組織ならびに歯髄様の組織が認められた。免疫組織学的解析では硬組織を形成する細胞はGFP抗体陽性であり、移植した細胞が硬組織を形成したと考えらた。また硬組織および隣接する細胞に抗DSP抗体陽性を認めたことから、樹立した細胞は象牙芽幹細胞の性格を有すると考えられた。
プロテインホスファターゼ2Cβ遺伝子の発現制御-精巣特異的発現と多重プロモーター

我々はこれまでに、PP2Cには6種類のアイソフォーム(α,β-1,β-2,β-3,β-4,およびβ-5)が存在することを明らかにしてきた。これらのうちαとβは異なった遺伝子産物であり、βの5種類のアイソフォームは単一のpre-mRNAからの選択的スプライシングの産物である。また、これまでの研究の結果、マウス精巣の第1減数分裂パテキン期の精母細胞において、PPC2Cβ-3,-4および-5の発現が著しく上昇することが明らかになった。そこで、今回、精母細胞におけるPPC2Cβ遺伝子の発現制御機構の解明を目的に、PPC2CβゲノムDNAのクローニングと解析を行った。PPC2CβゲノムDNAのクローニングにより、これまでに8個のエクソンの存在が明らかになった。エクソンIVからエクソンVIIまでにPPC2Cβの5つのアイソフォーム(β-1β-5)に共通の翻訳領域がコードされていて、エクソンVIIIにPPC2Cβ-1に固有の配列と終止コドンが観察された。PPC2Cβ-2-5のC端末をコードするエクソンはさらに下流に存在するものと考えられる。エクソンIIの上流にはTATAボックスが存在し、性決定に重要な役割を果たす転写因子であるSRYの結合配列、およびNRE(c-mosの精巣以外での転写を阻害する因子)の結合配列が見出された。エクソンIIとその上流より成る7kbpのDNA断片をルシフェレースのレポーター遺伝子の上流に導入し、p19細胞にトランスフェクトしたところ、プロモーター活性が検出された。すでに我々は、PT-PCRによる解析で、エクソンII/III/IVを含む転写産物がマウス成獣の精巣に特異的に発現することを明らかにしている。以上の結果から、今回見出したプロモーター(P2)がPP2Cの精巣における特異的発現を制御するプロモーターであると結論された。我々はこれまでに、PP2Cには6種類のアイソフォーム(α、β-1, β-2, β-3, β-4およびβ-5)が存在することを明らかにしてきた。また、これまでの研究の結果、マウス精巣の第1減衰分裂パテキン期の精母細胞において、PP2Cβ-3, -4および-5の発現が著しく上昇することが明らかとなった。そこで、今回、精母細胞におけるPP2Cβ遺伝子の発現制御機構の解明を目的に、PP2CβゲノムDNAのクローニングと構造解析およびRT-PCRを用いた転写産物の解析を行った。その結果、翻訳開始点を含むエクソン(IV)の上流に3つのエクソン(I, II, III)が存在し、新生児マウス精巣(精祖細胞のみを含む)ではIIVを含む転写産物のみが検出されたのに対し、成獣マウス精巣の転写産物では、II III IVエクソンの読みとりが行われていた。さらに、Iエクソンの上流には構成的発現に関与すると考えられるプロモーター活性が検出された。以上の結果から、IIエクソンの上流に精巣特異的発現に関わるプロモーターが存在することが示唆され、現在その解析を進めている。また、FISH法により、PP2Cβ遺伝子がマウス17番染色体のE領域にマップされることが明らかになった。PP2CβゲノムDNAのクローニングにより、これまでに8個のエクソンの存在が明らかになった。

エクソンIVからエクソンVIIまでにPP2Cβの5つのアイソフォーム(β-1β-5)に共通の翻訳領域がコードされていて、エクソンVIIIにPP2Cβ-1に固有の配列と終止コドンが観察された。PP2Cβ-2-5のC末端をコードするエクソンはさらに下流に存在するものと考えられる。エクソンIIの上流にはTATAボックスが存在し、性決定に重要な役割を果たす転写因子であるSRYの結合配列、およびNRE(c-mosの精巣以外での転写を阻害する因子)の結合配列が見出された。エクソンIIとその上流より成る7kbpのDNA断片をルシフェレースのレポーター遺伝子の上流に導入し、p19細胞にトランスフェクトしたところ、プロモーター活性が検出された。すでに我々は、RT-PCRによる解析で、エクソンII/III/IVを含む転写産物がマウス成獣の精巣に特異的に発現することを明らかにしている。以上の結果から、今回見出したプロモーター(P2)がPP2Cの精巣における特異的発現を制御するプロモーターであると結論された。
Bordetella壊死毒の細胞膜受容体の同定

Bordetella壊死毒(DNT)を^<125>I標識して標的細胞との結合様式の解析を試みた。種々の大きさのDNT断片を作製しそれぞれを^<125>I標識して同様に結合実験をおこなったところ、N末端側から54位Gluまでのペプチド断片(B断片)にDNTの結合ドメインが存在することがわかった。MC3T3-E1細胞に対するB断片の結合のKd値は2.5x10^<-6>Mであった。B断片はDNTに感受性のある細胞にはいずれも結合し、非感受性の細胞には結合しなかった。このことから、DNTに対する感受性は細胞膜上の受容体の存在によって主に決定されると考えられた。DNT受容体の一過性発現クローニングの際に利用するアッセイ系を確立することを目的に、DNTの細胞に対する作用をさらに解析した。その結果、DNTは細胞のRhoファミリーGTP結合タンパクのスイッチII領域にあるGlnに特異的にポリアミンを付加することが明らかとなった。ポリアミン化されたRhoはGTP水解活性を失うほか、GTP非依存的に下流のエフェクタータンパクと効果的に相互作用するため、構成的活性型として機能することがわかった。B断片のアミノ酸配列を詳細に調べたところ、B断片のC末端側に動物細胞由来プロテアーゼのfurinの認識モチーフが存在することがわかった。そこでDNTをfurinで処理したところDNTはこのモチーフの位置で切断された。DNTの細胞に対する作用はfurin処理により100倍程度強くなり、逆にfurin認識部位に点変異を導入したDNTは細胞に対する作用が完全に消失した。Furin処理DNTは人工脂質膜であるlipsomeと結合しなかったが、DNTの細胞への結合ドメインを除いたDNTdeltaBはliposomeと結合した。さらに、DNTdeltaBは本来DNTに感受性のないBalb/3T3細胞に作用した。以上の結果から、DNTはN末端側のB断片が細胞膜上のfurinもしくはfurin様プロテアーゼと相互作用した後、酵素活性ドメインを含むC末端領域が直接に細胞膜と相互作用し、最終的に酵素活性領域が細胞内に直接移行すると考えられた。現在はこのfurinもしくはfurin様プロテアーゼがDNTの細胞膜上の受容体として機能しているのかどうか検討している。^<125>I標識した全長DNTをプローブに用いた場合、非特異結合が高いために特異的結合が検出できなかった。そこで非特異結合を抑えるために、種々の大きさのDNT断片を作製しそれぞれを^<125>I標識して同様に結合実験をおこなったところ、N末端側から54位Gluまでのペプチド断片(B断片)にDNTの結合ドメインが存在することがわかった。骨芽細胞系培養細胞のMC3T3-E1に対するこのB断片の結合のKd値は2.5x10^<-6>Mであった。種々の培養細胞へのB断片の結合を調べたところ、DNTに感受性のある細胞はいずれもB断片が結合し、非感受性の細胞にはいずれも結合しなかった。

このことから、DNTに対する感受性は細胞膜上の受容体の存在によって主に決定されると考えられた。DNT受容体の一過性発現クローニングの際に利用するアッセイ系を確立することを目的に、DNTの細胞に対する作用をさらに解析した。その結果、DNTは細胞内のRhoファミリーGTP結合タンパクのスイッチII領域にあるGlnに特異的にポリアミンを付加することが明らかとなった。ポリアミン化されたRhoはGTP水解活性を失うほか、GTP非依存的に下流のエフェクタータンパクと効果的に相互作用するため、構成的活性型として機能することがわかった。このことにより、DNTの毒作用が細胞機能の種々の局面で発現することが考えられた。前年度の研究において壊死毒(DNT)のN末端側から54位Gluまでのペプチド断片(B断片)にDNTの結合ドメインが存在することがわかった。B断片のアミノ酸配列を詳細に調べたところ、B断片のC末端側に動物細胞由来プロテアーゼのfurinの認識モチーフが存在することがわかった。そこでDNTをfurinで処理したところDNTはこのモチーフの位置で切断された。DNTの細胞に対する作用はfurin処理により100倍程度強くなり、逆にfurin認識部位に点変異を導入したDNTは細胞に対する作用が完全に消失した。DNTはfurin処理後もDNTのN末端領域とC末端領域は非共有的に結合していた。Furin処理DNTは人工脂質膜であるlipsomeと結合しなかったが、DNTの細胞への結合ドメインを除いたDNTdeltaBはliposomeと結合した。さらに、DNTdeltaBは本来DNTに感受性のないBalb/3T3細胞にも作用した。以上の結果から、DNTはN末端側のB断片が細胞膜上のfurinもしくはfurin様プロテアーゼと相互作用した後、酵素活性ドメインを含むC末端領域が解離して直接に細胞膜と相互作用する。その結果、最終的に酵素活性領域が細胞膜を通じて細胞内に直接移行すると考えられた。現在はこのfurinもしくはfurin様プロテアーゼがDNTの細胞膜上の受容体として機能しているのかどうか検討している。
難治性根尖性歯周炎の血管内皮細胞を介した炎症の遷延と治癒機構の解明

midkineの組織治癒機転を検索しiNOSinhibitorの影響を検討するため、歯根肉芽種69例を供した。血管内皮細胞にiNOS、midkineおよびCXCL1のタンパクおよび遺伝子発現が示されたが、健常歯肉では認められなかった。Porphyromonas gingivalisから抽出したLPSで血管内皮細胞を刺激したところ、iNOS、midkineおよびCXCL1の発現を認めたがiNOS inhibitorを添加するとiNOS量の著しい低下が認められた。以上のことから、歯根肉芽種中の血管内皮細胞は歯周病原菌の刺激を受け、iNOSおよびmidkineを発現することが明らかとなった。外科的に摘出した根尖病巣組織50例を試料とし、メスで2分割した。一方を中性緩衝ホルマリンで固定したのち、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリンーエオジン重染色した。試料の84%(42例)は重層扁平上皮とコレステリン結晶を含まず、肉芽組織中には幼弱な血管に富む高度な細胞浸潤を伴うため、歯根肉芽腫と病理診断し、以下の検索に供した。分割した他方を用いてmRNAを抽出し、相補的なDNAを合成した。ヒト誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、midkineおよびG3PDHに特異的なPCRプライマーを用いて、real-time PCR法による定量的遺伝子検索を行ったところ、全ての試料でiNOSおよびmidkineのmRNA発現を認めた。なお、iNOSとmidkineの遺伝子発現の割合には相関性を認めなかった。なお、陰性コントロールとしてインプラントの二次手術時に摘出した健常歯肉を試料とし、歯根肉芽種と同様に試料の検索を行ったところ、炎症細胞浸潤の程度は低く、また血管内皮細胞の数も少なかった。また、real-time PCR法による分析を行った結果、歯根肉芽種に比較して有意に低いiNOSおよびmidkineのmRNA発現を認めた(Kruskal-Wallis test)。以上のことから、iNOSおよびmidkineは炎症特異的に発現され、血管内皮細胞を介して歯根肉芽種の発症に影響している可能性が示唆された。1.供試試料:外科的に摘出した根尖病巣組織35例をヘマトキシリンーエオジン染色し、歯根肉芽種と診断した27例を供試した。また、埋伏智歯の抜去時に健常歯肉10例を採取し、陰性のコントロールとした。2.免疫組織化学的検索:抗ヒト誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)またはmidkine (MK)モノクローナル抗体で免疫染色を行ったところ、全ての歯根肉芽種でiNOSおよびMKの発現を確認したが、健常歯肉においてはどちらの発現も確認できなかった。iNOSおよびMKは炎症性細胞や血管内皮細胞で強い発現を示し、炎症性細胞は血管内皮細胞周囲に局在していた。3.遺伝子検索:歯根肉芽種および健常歯肉組織のiNOS発現を検索したところ、全ての歯根肉芽種からiNOS遺伝子の発現を認めたが、健常歯肉組織では確認できなかった。同様にMK遺伝子の発現を検索したところ、全ての歯根肉芽種で観察され、健常歯肉でもMK遺伝子の発現を確認したが、発現強度は歯根肉芽種に比較して有意に低かった。4.細胞培養:歯周病原菌の一種であるPorphyromonas gingivalisからLPSを抽出し、ヒト臍帯静脈血由来血管内皮細胞(HUVEC)を刺激したところ、濃度依存的に強いiNOSおよびMK遺伝子の発現を認めた。一方、iNOS inhibitorを添加してからP gingivalisのLPSを添加したところ、iNOS発現が著しく低下した。また、HUVECをガラス板に播種し実体顕微鏡で観察したところ、無刺激では敷石状の形態を示していた。しかし、P gingivalisのLPSで刺激した結果、その形態は紡錘形に変化した。その後iNOS inhibitorを添加したところ、HUVECは元の敷石状の形態に戻った。以上のことから、歯根肉芽種中の炎症性細胞は歯周病原菌の刺激を受け、炎症のメディエーターであるiNOSを発現すると共に創傷治癒に関与するMKを発現することが明らかとなった。歯根嚢胞と臨床診断され、外科的に摘出された根尖病巣組織を研究試料とした。得られた組織を二分割し、一方を用いてパラフィン切片を作製したのち、ヘマトキシリン・エオジン重染色を施した。試料の87%は重層扁平上皮とコレステリン結晶を含まず、肉芽組織中には幼弱な血管に富む高度な細胞浸潤を伴うため、歯根肉芽腫と病理診断し、以下の検索に供した。なお、重層扁平上皮を含む組織を歯根嚢胞と病理診断し、本研究から除外した。

歯根肉芽種と病理診断した組織の、分割した他方を用いて凍結切片を作製し、抗ヒト誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、midkine、CD105抗体を用いた免疫染色を行ったところ、肉芽種中のマクロファージやリンパ球などの炎症性細胞や血管内皮細胞にiNOSおよびmidkine抗体による染色性を示したが、特に血管内皮細胞で強陽性を示した。また、陽性細胞数は比較的少ないが、肉芽組織中にCD105陽性細胞の存在を認めた。なお、CD105陽性細胞は血管周囲に局在していた。健常歯肉を用いて同様に免疫染色を行ったところ、全ての試料で陰性所見を示した。これらの抗体を用いて蛍光二重免疫染色を行ったところ、炎症性細胞や血管内皮細胞はiNOSおよびmidkineを共発現していた。歯根肉芽腫の凍結切片からmRNAを抽出し、ヒトiNOSおよびmidkineに特異的なPCRプライマーを用いてreal time PCR法を行ったところ、iNOSおよびmidkine遺伝子の発現を確認した。しかし、健常歯肉から抽出したmRNAを検索した結果、これらの遺伝子発現は認められなかった。以上のことから、iNOSおよびmidkineは炎症特異的に発現され、歯根肉芽種の発症に影響している可能性が示唆された。当初予定していたよりも多くの試料を収集することができ、研究に供試することができたため、多くの研究データを得ることができたことが研究達成に大きく貢献している。研究内容については、病理組織学的、免疫組織学的および分子生物学的手法を用いて検索しているが、それらは申請者が以前から常日頃行っている手法であり、内容を熟知しているため、研究自体は非常に円滑に進行している。研究内容については、病理組織学的、免疫組織学的および分子生物学的手法を用いて検索しているが、それらは申請者が以前から常日頃行っている手法であり、手技の内容を熟知しているため、研究自体は非常に円滑に進行している。平成23年度の研究結果から、歯根肉芽種中の血管内皮細胞で、midkineおよび誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の強いタンパク発現が確認された。また、平成24年度の研究結果では、歯根肉芽腫中のmidkineおよびiNOSの遺伝子発現が確認され、健常歯肉に比較して有意に高い発現を示した。根尖性歯周炎の原因菌の一つであるPorphyromonas gingivalisから抽出したLPSを用いて、ヒト臍帯静脈血由来血管内皮細胞(HUVEC)を刺激したところ、midkineおよびiNOSの強い発現を確認したことから、歯根肉芽種中の血管内皮細胞がこれらmidkineおよびiNOSの発現に大きく関与していることが推察された。今後は、歯根肉芽種中で発現しているmidkineの機能を解析することを目的として研究を行う。すなわちchemokineの細胞遊走能に着目し、代表的な細胞遊走因子であるchemokineとmidkineの歯根肉芽種中の発現および細胞遊走能を比較検討していく所存である。23年度の研究結果から、難治性根尖性歯周炎の局所では肉芽組織に浸潤しているリンパ球やマクロファージなどの炎症性細胞よりも血管内皮細胞で、midkineおよび炎症のメディエーターである誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)が強く発現していることが明らかとなった。
冬季の海氷厚変動から見た北極海太平洋側海域における夏季の海氷量減少

北極海の太平洋側海域では夏季の海氷域の減少が近年になって特に顕著に見られているが、その要因は未だに良く解明されていない。その理由の一つは人工衛星データから正確に把握できる海氷の面積に較べて、その厚さの実態把握が不十分なことである。本研究ではこの海域における10年以上の長期に渡る海氷・海洋の現場観測による海氷厚などのデータと衛星マイクロ波放射計データから見積られる海氷生産量のデータなどを用いて、海氷の力学過程(海氷同士の衝突と重なりによる氷厚の増加)と熱力学過程から決まる冬季の海氷厚分布の実態を明らかにし、それが夏季の海氷分布とどのように関係しているかを調べ、この海氷減少の要因を明らかにする。
ＥｕＯにおける電界効果誘起磁気ポーラロンの研究

希土類酸化物EuOは強磁性転移と更に絶縁体ー金属転移を起こす稀な物質で、転移メカニズムにはキャリアで誘起される磁気ポーラロンが原因ともされている。固体表面にキャリアを導入できる電界効果、つまり電界効果ドーピングによって磁気ポーラロンやそれによる転移を制御することができれば、スピントロニクスデバイスとして新しい原理を導入できる可能性がある。本研究ではEuOの純良な単結晶育成を行うところから始め、得られた単結晶の劈開面を利用して、電界効果によるキャリア増幅効果に初めて成功した。これまでにEuOの純良な単結晶育成に成功してきている。2年目は、EuOの単結晶育成とサンプルのキャラクタリゼーションとともに、電界効果の実験を行った。電界効果に対しては、電界効果において最も問題となる表面状態と、電極に対して試行錯誤を行った。NaCl構造をとるEuOは(100)面で劈開するが、この劈開面をそのまま利用する方法と、その劈開面を更に研磨する方法を試した。また、電極については、金電極蒸着を行う方法と、直接、針電極をサンプル表面に付ける方法などで実験を行った。結果としては、壁回面を利用し簡易的な針電極を用いたプローブを用いた方法で、電界効果によるp型の増幅効果を観測することに成功した。今の所、イオン液体からの漏電を避けるために、イオン液体の部分とドレイン・ソース電極を十分に引き離した距離をとっているために、印加した電界に対する増幅効果の効率は30%程度である。現在、サンプル面上に電極端子や絶縁層を作成し、イオン液体による電界効果の効率を上げる配置を作成していくことにより増幅効果の改善を図っているところである。また、そのためにはEuO単結晶劈開面の良好な劈開面状態が必要となるが、更なる良質な表面を得るために引き続き単結晶育成を引き続き行っている。これまでにEuOの純良な単結晶育成に成功している。静的物性としては、磁化測定から得られたCurie点は69.5Kで、この温度から低温に向かい絶縁体から金属への転移へ伴う急減な伝導率の上昇(=抵抗の減少)が観測され、比熱にもシャープなピークを観測している。これらはこれまでの報告と一致しているが、熱膨張係数において50K付近に異常が観測されており、その原因については未だ解明できていない。そして作成した単結晶においては、非常に大きな(1cm2)な(100)面の劈開面が得られており、本課題の目的である電界効果のためのFET構造の作成には十分な条件を持っている。その電界効果については、サンプル面としては研磨面と劈開面、電極についても金蒸着や針電極等様々な方法で試行してきたが、現在までのところ劈開面を利用した簡易的な針電極を用いたプローフを用いた方法で、電界効果によるp型の増幅効果を観測することに成功している。但し、イオン液体からの漏電があるために、イオン液体の部分とドレイン・ソース電極を十分に引き離した距離をとっているために、印加した電界に対する増幅効果の効率は30%程度であった。増幅効果の向上のために、劈開時の雰囲気制御等などの劈開方法の様々な試行や、サンプル形状、様々な電極の試行などを行ったが顕著な改善は得られなかった。この試行錯誤にかなりの労力と時間を費やしたこともあり、研究協力者との議論も含めて、最終年度であるが、EuO単結晶劈開面の更に良好な劈開面状態が必要であると結論し、更なる良質な表面を得るための単結晶育成に重点を置いた。そこで、当初は測定系の高度化を予定して微少電流源を購入する予定であったが、単結晶育成のための高周波炉の改良に予算を利用した。現在、この改良によって得られた結晶の評価と電界効果への改善具合の評価を並行して行っており、それまでの結果も含めて学会等で発表する予定である。初年度は、EuOの単結晶育成とサンプルのキャラクタリゼーション、及びキャラクタリゼーションの効率化のための測定系の開発とFET作製に向けた準備を行った。本研究で目指す電界誘起の絶縁体ー金属転移の本質を見極めるためには、FET加工をする前段階でのEuOのキャラクタリゼーションが欠かせない。そのために、様々な物性測定(=キャラクタリゼーション)が可能なバルクのEuO単結晶を育成から行うことが、本研究の特長でもある。単結晶育成は、EuとEu2O3を出発原料として、タングステン坩堝に高真空中で封入したあと、高周波炉を用いて2000°C近くまで昇温しブリッジマン法により単結晶育成を行った。得られた単結晶は、全体がほぼシングルグレインの約10Φ×1cm程度の大型の単結晶で、NaCl結晶構造の特長的な(100)面の綺麗な劈開面が見られる。

得られた単結晶は、比熱、磁化、抵抗等の測定を行った結果を文献値と比較すると、目的とするドナー濃度(酸素欠損濃度)の試料が得られたと考えられる。また本初年度では、サンプル依存性が強いEuOのキャラクタリゼーションの効率化を目的に、Van der Pauw法の測定系の立ち上げを進めた。測定ホルダー等の開発を行うとともに、本年度は微小電流に対応するスイッチ回路を購入し、来年度には微小電流源を購入する予定である。FET構造の作製に関しては、本研究にFET加工を協力して行う同機構の矢ヶ部氏と有効な絶縁層の素材についての議論を進め、今回の単結晶の劈開面をそのまま利用するEuOに対しては、熱的なダメージを極力抑えるために、イオン液体も試すことになった。電界効果による増幅効果が観測されたことは、本課題の最大の難所の一つをクリアしたことになる。本研究では、最初に単結晶育成を行うことが必要となるが、震災による夏の節電のために、電力を必要とする高周波炉を利用する単結晶育成が予定通りに進まず、そのために全体に予定がやや遅れている。電界効果による増幅効果が観測されたものの、未だその効率は低い。この点の改善とともに、電界効果による物性の変化を観測することが今後の最大の課題である。増幅効果改善や物性測定のために、サンプル表面上の電極端子や絶縁層の作成を行っていく。また研磨面より劈開面の方が良好な結果が得られているが、これまでの試行錯誤によって得られた知見を元に、電界効果に適切な良好な劈開面の表面状態を得るような単結晶育成を引き続き行う。単結晶育成時の仕込み濃度を変えることによる、ホール濃度を変化させたサンプル作成も同時に行う。加えて今年度は、更に電界効果による物性変化を測定していくために、電界をかけた状態での物性測定や磁化測定に向けて、カンタムデザイン社のPPMS物性測定装置とMPMS測定装置の、それぞれに対応する測定プローブを開発する予定である。これらの結果については、今年度中の物理学会での発表を目指す予定である。やや遅れ気味の研究状況に対し、単結晶育成とキャラクタリゼーションと同時に、FET加工も2年目前半から進めていく。電場をかけた状態での物性・磁性測定用のプローブ開発や測定機器の購入を行う。測定機器については高額となり、単年度の配分額では不足となるので昨年度から持ち越している。結果の発表としての学会参加の旅費等に使用する。その他に原料購入に使用する予定。試料やFET加工の原料及び、測定に必要な部品等として物品費を使用する。また、本研究の調査及び測定のために旅費を使用する。必要な計測器を次年度予算と合わせて購入するため、本年度分の一部を次年度に持ち越している。
腸内細菌の質的・量的変化を指標とした食品中化学物質の安全性評価手法の開発

当該研究は、腸内細菌の質的・量的変化を指標とした、食品中化学物質の安全性評価手法の開発を目指す。当該研究の遂行において申請者は、食品ナノマテリアル(NM)の代表格である非晶質ナノシリカ(nSP)をモデル化学物質とし、nSPの経口投与における生体影響と腸内細菌の質的・量的変化の因果関係を精査している。具体的には、NMの粒子径・表面修飾の有無の観点から、物性の異なるnSPを経口投与したマウスを用いて、(1)ハザード解析、(2)ハザード発現における腸内細菌叢の寄与、(3)腸内細菌ポピュレーションの変動を解析する。当該年度は、本研究戦略の(1)を中心に実施した。nSPの経口曝露時のハザード同定に向けて、粒子経が30nm、70nm、300nm、1000nmのnSPを28日間マウスに経口投与し、体内動態解析および一般毒性学的観点からハザード解析を実施した。電子顕微鏡による定性的な体内吸収性解析の結果、いずれのnSPも体内吸収され、全身組織に分布することを明らかとした。一方で、血球検査、生化学検査、腸管局所の病理学的解析、体重・臓器重量の測定を実施したところ、いずれのnSPを投与したマウスにおいても、コントロール群と比較して有意な変動は認められなかった。以上の結果から、体内吸収量などを考慮する必要があるものの、nSPは食品NMとして用いるうえでは、極めて安全性が高い素材である可能性が示された。一方で、nSPが腸管局所に存在する腸内細菌に与える影響については世界的にも全く知見はない。従って、nSPは経口投与において一般毒性学的観点からはハザード発現は認められなかったものの、nSPの腸管局所への影響を考慮するうえで、nSPを腸管局所に曝露した際の腸内細菌の役割を評価することは重要である。今後は、腸内細菌除去マウスを用いて、nSP経口投与時の腸管局所の腸内細菌の役割を評価していく。
衛星観測と計算機実験による地球磁気圏におけるイオン-波動-電子結合系の物理-磁気圏物理学の新展開

本研究課題では、宇宙プラズマ中で発生しているイオン-波動-電子の結合系を明らかにするために、衛星観測技術の開発とデータ解析、および、計算機実験による理論計算を行うことを目的とした。具体的な研究実績としては、次の通りである。この結合系を衛星観測で明らかにするためには、複数衛星による観測が重要であるが、そのためには、高機能でしかも軽量化されたプラズマ波動観測器が必須である。そのため新しいデジタル技術、ソフトウェア技術を導入したプラズマ波動観測器を開発し、北極で行われたロケット実験に搭載して成功させた。ここで開発したプラズマ波動観測器は、将来の軽量化されたプラズマ波動観測器の一つのモデルとなるものである。また、衛星機上で直接、波動と粒子の相互作用をとらえることができる波動-粒子相関計(WPC:Wave-Particle Correlator)について基礎検討を行った。これまでのWPCが単純に波動と粒子を足し合わせていくだけであったのに対し、FPGAを使ってワンチップに収め、また、FPGA内におけるリアルタイムFFT処理による周波数バンド幅ごとの相関をとる手法などの検討を行った。また、FPGA評価ボードによる実際の設計も行うことができた。衛星データ解析ではReconnectionにおける電子の効果を示し、それがイオンスケールへと発展していくシナリオ解明に大きな道筋をつけた他、磁気圏境界層でのLower Hybrid Wavesの解析を行った。計算機実験では、大規模なビーム系の計算機実験を行い、電子ビーム、イオンビームから励起される波動が、それぞれ、背景のイオン、電子とカップリングしながらどのような非線形発展をしていくのかを広範囲なパラメータにおいて評価を行い、宇宙プラズマ中で発生しているイオン/電子ビーム不安定性の非線形発展を理解する上で重要なパラメータテーブルを用意することができた。平成12年度は、次世代のプラズマ波動受信機のモデルとして、デジタル型のプラズマ波動受信機の製作を行った。このデジタル型のプラズマ波動受信機は、オンボードでデータフローの制御や外部からの割り込み要求に柔軟に対応することのできるメインCPUとFFTやデータ圧縮といったデジタル信号処理を専門に行うDSP、および、ワンチップで周波数をダウンコバートできるデジタルダウンコンバータチップからなっている。これらのデジタル制御部と従来からの低雑音アナログ制御部を融合させ、ひとつの受信機として機能させデータを取得したほか、オンボードソフトによるリアルタイムデータ圧縮、デジタルダウンコンバータチップを用いた高速デジタル型周波数掃引受信機を実際に実現させ、それぞれの性能評価を行うことができた。このような受信機は、将来の磁気圏ミッションにおいて、高度で軽量で自律性の高い受信機へとつながっていくもので、このような受信機を実際に製作して機能させたことは、非常に有意義なことであった。実際に製作した受信機で観測されたデータは、時間分解能、周波数分解能、ノイズレベル、波形の圧縮レベルなど、当初の設計通りの性能となっていることも確認した。特にデジタルダウンコンバータを用いた高速デジタル型周波数掃引受信機では、従来、アナログ回路を用いた大規模な回路構成で行っても、高速で高時間分解能のスペクトルを精度よく得ることのできなかったものが、軽量な小規模な回路構成で実現できることを実証した。平成13年度は、平成12年度に製作したデジタル型のプラズマ波動観測機のデジタル部を、ひとつのFPGAの中に組み込むことができるかどうかを具体的なシミュレータを使いながら、検討に入った。、また、将来の複数衛星観測において、電子-波動-イオン結合系を議論する際に重要な観測手法となる、「波動一粒子相関計」(Wave-Particle Correlator)の設計を行った。この相関計は国外の衛星では用いられることが多いがわが国ではこれまでに使われたことがなく、そのため、まずその特性を明らかにするために、電子ビーム不安定の粒子シミュレーションを行い、そこで発生している粒子と波動のエネルギーのやりとりを、衛星に搭載した相関計でどのように見えるかを確認し、その線形から非線形に至る発展段階で示す相関計の指標の特性を明らかにした。

それをふまえて、次期ミッションにそなえ、高性能となった粒子観測機と波動観測機とのデータをどのように取り込んだ相関計を製作すればよいかを考慮し、デジタル技術を新たに取り込んだ相関計の設計を行った。また、一方、これもこれまでわが国では行われていなかった、「波動観測データから周辺プラズマの温度を測定」する手法を用いて、実際のデータから、Hotなプラズマの誘電率テンソルを計算し、そこから求めることのできるアンテナインピーダンスをもちいて、プラズマの温度を測定するプログラムを作成し、実際に衛星データから温度を求めることができることを確認した。さらに、この温度測定の精度を向上させるためには、現在のわれわれがもっているプリアンプ技術からノイズレベルを更に一桁減少させる必要があることも示し、将来の観測機設計に指針を与えた。平成14年度は、次期衛星ミッション用に、13年度に設計を行ったWave-Particle Correlatorを一つのFPGAの中に組み込む作業を行った。Wave-Particle Correlatorは、どうしても時間分解能に限界がある粒子観測機の限界を、波動と粒子の相関をとることにより、直接エネルギー授受を行っている成分をとりだし、打破しようとするものである。具体的には、取り込んだ波形をFFT処理して位相補正を行ったのち、その波形と粒子データとの直接の相関計算をFPGA一つでできるシステムをFPGAの評価ボードを用いて行った。一方、電界測定を精確に行い、波動エネルギーを正しく求めるためのアンテナインピーダンスの評価をホットなプラズマ分散を考慮した理論値と実際の観測値を比較した。そLて、その差異と物理現象との関係の研究を行い、イオンと電子プラズマ周波数範囲では理論と観測が一致、それ以外、特に、電子プラズマ周波数のレゾナンス付近では、大きくずれていくことを示すことに成功した。次に、このアンテナインピーダンスの結果を用いて、電子温度を電界測定値から求めるために必要となる、従来よりも一桁ノイズレベルが低いプリアンプの開発を行い試作した結果、目的の特性が得られことがわかり、その開発に成功した。また、実際の観測データを用いた波動とイオン-電子のエネルギー変換の評価については、GEOTAIL衛星が低緯度境界層で観測する低周波波動が、磁気圏の朝側と夕方側で差があることを示し、それが、プラズマシートの電子・イオンの加熱と相関があることを示すことに成功した。低緯度境界層は、プラズマシートの成因の解明には、重要な領域であり、そこでの波動と粒子の相関を発見したことは、波動-電子-イオンのカップリング現象の解明に大きな手がかりとなる。