hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいパルプ漂白剤としての過マンガン酸カリウムの応用とその機能

2)エーテル化された非遊離フェノールを有する化合物では、遊離フェノール型化合物より反応性が高いものの、側鎖1位の酸化で反応が停止し、芳香核の解裂はほとんど認められなかった。また、この場合、酸性条件よりも中性からアルカリ性の条件の方が反応性は高いことが示された。3)モデル化合物の化学構造に関わりなく、モデル化合物1モルに対して過マンガン酸カリウムは2-2.2倍モルが消費された。2.セルロースモデルと過マンガン酸カリウムとの反応1)還元性末端基を有する糖(グルコース、セロビオース等)は還元性末端基を持たない糖(4-メチルグルコース等)よりも反応性が高い。2)メチル-β-D-グルコースと過マンガン酸カリウムとの反応で、グルコシド結合の解裂、6位の酸化等を受けた反応物が単離同定された。また、反応混合物のC13NMRスペクトルからC2位からC4位のどこかにカルボニル基の生成が生じていることが示された。3.モデル化合物の実験から、過マンガン酸カリウム漂白におけるシュウ酸添加の有利性が示されたが、パルプを用いた実験では明確な利点は認められなかった。
中生代における海洋底生生態系の変革：生痕化石からの実証と数理モデルによる評価

平成28年度は、前年度に引き続き野外調査による生痕化石データの収集を行い、同時にベースラインとなる数理モデルの設計に取り組んだ。野外調査においては、生痕化石記録からの実証を目的として、重点的に研究をしているPhymatodermaという生痕化石や、モデルの中核となる現象である「小型生痕によって選択的に乱された生痕化石」を研究対象として、調査を実施した。具体的には、豊浦層群西中山層、上総層群、千倉層群白間津層などを調査した。野外調査の中で特筆すべき成果としては、上総層群調査において生痕化石Phymatoderma(ただし厳密には一部のdiagnosticな形質を確認できておらず、記載上は、cf. Phymatoderma isp.)の標本を新たに発見した。さらに上総層群の調査では、小型生痕に選択的に乱された生痕化石についても新たな産出事例を発見した。これらの産出記録は、本研究の作業仮説と整合的である。一方、数理モデルによる評価については、ベースラインとなるモデルの基本設計を進めた。その際に、モデル化を試みている現象について、モデルのパラメータ設定を行う際に必要となる重要な野外データが、これまでの自身の研究データの中で欠如していることが分かった。そのため、モデル化をするためには詳細な野外調査に基づく新規生痕化石データが必要になるので、2016年度後半には不足データの採取を目的とした野外調査を千倉層群白間津層において実施した。その結果、モデル化の際に必要な全ての野外データを取得することは出来なかったが、モデル化を試みている生痕化石現象に関する新たな知見(小型生痕に選択的に乱された生痕化石に関する詳細な堆積学的・形態学的データや、選択的に他の生痕化石を乱している小型生痕の中でも代表的な種類であるPhycosiphonに関する堆積学的・形態学的データなど)を増やすことに成功した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。中生代には海洋生態系がそれ以前と比べて劇的に変化したことが知られているが、これらの知見の大半は体化石記録から得られたものである。そのため、体化石として保存されやすい硬組織を持たない底生生物(以下、soft-body底生生物)を中心とする生態系の変化については、知見が限られている。しかし、soft-body底生生物は現代の海洋底生生態系において、バイオマスや多様性の点で非常に重要なので、中生代の生態系変化の全容解明のためには、soft-body底生生物に関する知見が不可欠である。本研究では、生痕化石に注目することでsoft-body底生生態系の変遷パタンを実証し、その上で数理生態モデルを構築することで生態系変化の具体的要因を制約する、ということを主目的としている。平成27年度は当初のスケジュール通り、主に「生痕化石記録からの実証」に主眼を置いて研究を進めた。重点的に研究をしているPhymatodermaという生痕化石の新規標本の発見や、モデルの中核となる現象である「小型生痕によって選択的に乱された生痕化石」の新規発見を目的として、国内外で野外地質調査を実施した。特筆すべき成果としては、イギリス調査において新たに生痕化石Phymatoderma(厳密には、cf. Phymatoderma isp.)を発見した。さらに、上総層群国本層の調査において、小型生痕に選択的に乱された生痕化石の産出を新たに発見した。また、並列した行った系統的な文献調査の結果、新たに複数の海外の地層からPhymatodermaの産出報告を発見した。記載データを検討したところ、本研究の作業仮説に整合的なトレンドを示すことが分かった。さらに、採取したPhymatoderma標本について薄片を作成し、生痕化石中に産出する微化石の観察も行った。2015年度は主に野外調査に基づく生痕化石の研究に積極的に取り組んだ。実施したすべての野外調査で当該研究に必要かつ重要な結果を得たわけではないが、上述したように一部の野外調査(特に英国での調査と千葉県市原市における調査)では当該研究の作業仮説と整合的な結果を得た。さらに並列して行った文献調査からも、当該研究の作業仮説を裏付けるデータを発見した。一方で、作業仮説のメカニズムの検証のために、新たな数理生態モデルを構築することを計画しているが、こちらについてはモデルの構築まで至っていないのが現状である。しかし、ゼロから新しいモデルを構築するにはある程度の時間がかかるので、2015年度内に結果が出なかったとしても、それは想定の範囲内であり、当該研究の全体的な進行には大きな問題はない。モデルの基本設計とプログラミングの準備は進めているので、2016年度中にはシミュレーションを行えるようになると期待される。

野外調査の中で特筆すべき成果としては、上総層群調査において生痕化石Phymatoderma(ただし厳密には一部のdiagnosticな形質を確認できておらず、記載上は、cf. Phymatoderma isp.)の標本を新たに発見した。さらに上総層群の調査では、小型生痕に選択的に乱された生痕化石についても新たな産出事例を発見した。これらの産出記録は、本研究の作業仮説と整合的である。一方、数理モデルによる評価については、ベースラインとなるモデルの基本設計を進めた。その際に、モデル化を試みている現象について、モデルのパラメータ設定を行う際に必要となる重要な野外データが、これまでの自身の研究データの中で欠如していることが分かった。そのため、モデル化をするためには詳細な野外調査に基づく新規生痕化石データが必要になるので、2016年度後半には不足データの採取を目的とした野外調査を千倉層群白間津層において実施した。その結果、モデル化の際に必要な全ての野外データを取得することは出来なかったが、モデル化を試みている生痕化石現象に関する新たな知見(小型生痕に選択的に乱された生痕化石に関する詳細な堆積学的・形態学的データや、選択的に他の生痕化石を乱している小型生痕の中でも代表的な種類であるPhycosiphonに関する堆積学的・形態学的データなど)を増やすことに成功した。当該研究では、中生代における海洋プランクトンの進化が、soft-body底生生態系の大規模変遷の究極的な引き金になったと想定しているため、生痕化石中に保存されたプランクトン微化石や残存有機物についてのデータも拡充していく。併せて、中生代のsoft-body底生生態系の大規模変遷を引き起こした具体的なメカニズムを検討するために、新たな数理生態モデルを構築するべく研究を行う。究極的な要因として中生代のプランクトン進化が考えられる一方、soft-body底生生物が実際に直接的に影響を受けるのは、底質の状態や他の底生生物との競合といった別の要因であると想定される。したがって今後は、これらsoft-body底生生態系の変化の直接的な要因と考えられる少数の要素に特に注目して新たな数理生態モデルの構築を目指す。これにより、どのような要素がどの程度重要であったか、ということが明らかになると考えられる。具体的には、海底堆積物の鉛直断面の空間構造を明示的に表現するモデルの構築を目指す。すなわち、堆積物断面を鉛直方向に複数個のセクションに分割し、各々のセクションにおいて有機物量や競争の程度といったパラメータをそれぞれ変化させる。採用2年目は特に、少数の本質的に重要な要素のみを組み込んだ、モデルの基本的な骨格を作成することを目指す。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ウエストナイルウイルス感染における脳内浸潤T細胞による病態形成機序

ウエストナイルウイルス感染マウスモデルを用いて、脳炎発症時の脳内におけるT細胞の抗原特異性および免疫学的特徴について解明することを目的として研究を遂行した。感染マウスの脳ではCD3、CD8、CD69の発現レベルが増加した。これらの結果は脳内に活性化されたCD8T細胞が有意に浸潤していることを示している。また、T細胞レセプター解析により、細胞はクローナルなT細胞であることが明らかとなった。脳内に浸潤しているT細胞は日本脳炎ウイルスには反応せず、ウエストナイルウイルス特異的であることが示された。本研究は、マウスモデルを用いて、脳炎発症時の脳内におけるT細胞の抗原特異性および免疫学的挙動について解明することを目的とし以下の研究を遂行した。ウエストナイルウイルス(WNV)と、近縁のウイルスである日本脳炎ウイルス(JEV)において、感染マウスにおいて脳内に浸潤したT細胞の特異性と交差性を相互に検討した。TCRレパトアの網羅的解析、in vitroにおけるWNVおよびJEVに対する交差反応性の評価について詳細に解析を行った。その結果、WNV、JEV間で、脳内浸潤T細胞はクローンレベルで異なる事が明らかとなり、さらに近縁ウイルスの感染により誘導されるT細胞についてIFN-γ産生能を指標とした交差反応性においても交差性は全く確認されなかった。さらに、脳内に浸潤しているT細胞の役割を解析するために、JEV感染をモデルとして以下の研究を行った。同量のJEV接種後、著しい体重減少を示して死亡する群(重症群)と、体重減少が少なく回復する群(軽症群)における脳内浸潤T細胞の解析を行った。両群において脳内におけるIFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-5の発現量を調べると、重症群においてよりTh1にシフトしていた。一方、CD3、CD4、CD8のmRNA量には差が見られなかった。さらに、両群における脳内浸潤T細胞のT細胞レセプターの解析を行った。両群のマウスにおいては発現しているT細胞レセプターに相違がみられ、重症群においてより高いクローナリティが認められた。脳内におけるウイルス量は両群には有意な差がないことから、本結果は、脳内に存在するT細胞の質的な差が重症化に関与している可能性を示唆している。以上の知見はフラビウイルス脳炎の発症機序における脳内T細胞の役割に関して重要な知見となる。本研究は、ウエストナイルウイルス(WNV)感染マウスモデルを用いて、脳炎発症時の脳内におけるT細胞の抗原特異性および免疫学的挙動について解明することを目的として以下の研究を遂行した。WNVと抗体レベルで交差反応が認められと言われている近縁関係にある日本脳炎ウイルス(JEV)を感染させたマウスにおいて脳内に浸潤したT細胞とWNVのそれとについて特異性と交差性を検討した。WNVおよびJEV感染後に脳内に浸潤したT細胞の特異性の検討は、(1)TCRレパトアの網羅的解析、(2)in vitroにおけるWNVおよびJEVに対する交差反応性の評価について詳細に解析を行った。その結果、WNV、JEV間で、脳内浸潤T細胞はクローンレベル(TCRレパトア解析、CDR3クロノタイピング)で異なる事が明らかとなり、さらに近縁ウイルスの感染により誘導されるT細胞についてIFNγ産生能を指標とした交差反応性においても交差性は全く確認されなかった。これらWNV特異的T細胞に関して、免疫学的性状を詳細に評価するため、WNV感染後の脳内浸潤T細胞をCD4およびCD8の分画に分離し、WNVおよびJEV感染腹腔細胞との共培養を行いIFNγおよびTNFα産生を指標として反応性を測定した。その結果、WNV脳内浸潤CD8T細胞とWNV感染腹腔細胞の共培養においてのみ、INFγおよびTNFαの産生誘導が惹起された。以上の結果はWNV感染時の初期の局所では感染細胞を排除するために細胞障害性T細胞が展開されている事が蛋白レベルでも示唆された。この知見は、WNV特異的T細胞の抗原特異性に関する新規情報を示したに止まらず、ワクチン開発における基礎的知見を提供するに繋がると考えている。前年度の検討結果において確認されたin vitroにおけるT細胞によるINFγおよびTNFα産生誘導能の惹起はWNVおよびJEV間で全く交差反応性は認められなかった。さらに、IFNγおよびTNFα誘導能を有するWNV特異的T細胞はCD8陽性T細胞に限局していたことから、WNV初回感染時の初期過程の局所では、感染細胞を排除するために細胞障害性T細胞が展開している可能を示唆した。本研究結果は、並行して行われたリアルタイムPCRの結果とも相関しており、WNV感染で脳内に誘導浸潤したT細胞はTh1/Tc1タイプであることを、蛋白レベルで確認したものと考えている。

この結果からT細胞によって認識されるウイルスのエピトープはウイルス間(WNVとJEV)で全く異なることが示唆された。免疫賦活効果および特性を有するワクチンをデザインするためには、それぞれのウイルスに特徴的なエピトープの探索が必要であることも示唆した。今年度は、脳炎を発症したマウスから、脳内浸潤T細胞クローンを樹立する。抗原刺激により活性化したT細胞のクローナリティーは高いものと推測されるが、TCRの各Vセグメントに対する抗体を吸着させたmagnetic beadsを利用して、TCRレパートリー解析によって特定されたV遺伝子を有するT細胞を抽出することも考慮する。次に,樹立した各クローンのTCRα鎖及びβ鎖の発現型を確認し、ライブラリにおいて発現頻度の高かったTCR発現型を有するクローンを選び出す。このT細胞クローンに対して,in vivo解析としてWNV感染マウスに移入し、脳炎の症状に変化が現れるか否か,改善するのか増悪するのかを免疫学的所見及び病理組織学的所見を踏まえて評価する。T細胞クローン移入による症状の軽重判断が円滑に進まない場合は以下の方法を検討する。まず,正常マウスの末梢血リンパ球を採取し、TCRの各Vセグメントに対する抗体を吸着させたmagnetic beadsを利用して、特定のV遺伝子を発現しているリンパ球を除去する。残りのリンパ球をSCIDマウスに移入すれば、特定のTCR Vファミリーのみを欠落したマウスが得られるため,このマウスにWNVを接種して症状の軽重を観察することにより、特定のTCR Vファミリーを有するT細胞がWNVの病態に果たす役割を反証的に検討することができると考えられる。平成24年度物品費800,000旅費70,000人件費・謝金0その他30,000計900,000
薬物動態・薬理遺伝学に基づくがん化学療法の個別化医療の実現と安全性確保

ALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌患者を対象としたクリゾチニブのの臨床研究では、肝機能障害、QT延長は、血中濃度ならびに遺伝子解析結果との有意な相関は認められなかった。一方、クリゾチニブの輸送タンパクとして知られているABCB1多型変異が血中濃度上昇と関連する傾向が確認された。手術不能あるいは再発乳癌患者を対象としたエリブリンの薬物動態と遺伝子多型解析臨床研究は、症例集積が少ないため、症例集積中であるが、投与後24時間後の血中濃度と血液毒性が相関する可能性が示唆された。日本人を対象とした新規抗悪性腫瘍薬の市販後臨床試験を計画し、実地医療においてALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌に適応を持つクリゾチニブならびに手術不能・再発乳癌に適応を持つエリブリンを投与される癌患者に対して薬物動態・薬理遺伝学的解析を行い、それぞれの薬剤の定常状態の薬物血中濃度および有害事象に関わる遺伝子多型を探索を目的とする。(1)ALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌患者を対象としたクリゾチニブの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析の市販後臨床研究クリゾチニブ250mg1日2回経口投与後の定常状態でのクリゾチニブおよび代謝物の血漿中濃度を測定する。投与量の調整は主治医判断で有害事象に合わせて随時変更しても良いとする。特に、副作用回避のため減量投与した症例の場合、血中濃度と副作用の程度の変化を詳細に観察するためのプロトコールの承認を受けて既に、半数の予定症例を集積済みである。また、薬物血中濃度は高速液体クロマトグラフィーにトリプル四重極システムの質量分析装置を連結したLC/MS/MS(API 5500, AB SCIEX)を用いて測定方法は確立し中間解析を行った。グレード3以上の毒性と血中濃度の相関が認められた。また、クリゾチニブの薬物代謝酵素と薬物輸送トランスポータの遺伝子多型を解析するための次世代シーケンサーを用いたプローブ設計も完了した。(2)手術不能あるいは再発乳癌患者を対象としたエリブリンの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析の市販後臨床研究エリブリンメシル酸塩として1日1回1.4mg/m2(体表面積)を週に1回静脈内投与する。これを2週連続で行い、3週目は休薬とする。これを1サイクルとして投与を繰り返す。研究計画書は承認を受けているが症例の集積は目標の半数に留まっている。既に、薬物血中濃度の測定方法はLC/MS/MSを用いて確立し、分析バリデーションは完了している。(1)ALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌患者を対象としたクリゾチニブの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析クリゾチニブ250mg1日2回経口投与後の定常状態(投与開始から15日目以降)でのクリゾチニブおよび代謝物の血漿中濃度(投与前トラフ値)を測定する。特に、副作用回避のため減量投与した症例の場合、血中濃度と副作用の程度の変化を詳細に観察する。有効例と不応例のクリゾチニブ血中濃度の比較も行い、血中濃度が治療効果を予測するバイオマーカーとして有効か副次評価項目として検討を行う。すなわち、遺伝子多型解析によりバイオマーカーを決定出来ない場合、薬物血中濃度モニタリングによる個別化医療の実践を計画する。クリゾチニブの薬物動態に関連する薬物代謝酵素並びに薬物トランスポータの遺伝子多型解析を行い、クリゾチニブ血中濃度と薬物動態関連遺伝子の相互解析により血中濃度の個人差に影響するか総合的に検証を行う。既に、80例の症例が登録され、集積された薬物血中濃度の測定は完了した。一時的な解析により血中濃度と毒性の相関が確認されている。また、本薬剤の血中濃度ならびに毒性との薬物代謝酵素・輸送タンパク・中枢性薬理採用に関連する遺伝子群(総数130遺伝子)をターゲットした、全exonシーケンスを開始した。(2)手術不能あるいは再発乳癌患者を対象としたエリブリンの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析エリブリンメシル酸塩として1日1回1.4mg/m2(体表面積)を週に1回静脈内投与する。症例集積が遅いため、共同研究者と協議して、対象患者の拡大を含めて検討を行っている。日本人を対象とした抗悪性腫瘍薬の臨床試験を計画し、クリゾチニブならびにエリブリンを投与されるがん患者に対して薬物動態・薬力学・薬理遺伝学的解析を行った。(1)ALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌患者を対象としたクリゾチニブの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析の市販後臨床研究250mg1日2回経口投与後の定常状態での血漿中濃度(投与前トラフ値)を測定し、血中濃度と副作用の程度の変化を詳細に観察した。クリゾチニブ血中濃度は、分析バリデーション実施後、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析(LC-MS/MS)装置を用いて行った。更に、薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク、その他薬理作用に関連する遺伝子多型解析実施した。遺伝子解析は、簡易解析手法であるQuenching probe(i-densy IS-5320)法にて行った。最終登録症例数は78例であった。肝機能障害、QT延長は、血中濃度ならびに遺伝子解析結果との有意な相関は認められなかった。一方、クリゾチニブの輸送タンパクとして知られているABCB

1多型変異が血中濃度上昇と関連する傾向が確認された。(2)手術不能あるいは再発乳癌患者を対象としたエリブリンの薬物動態および毒性と遺伝子多型解析の市販後臨床研究エリブリン療法を受ける手術不能あるいは再発乳癌患者に1日1回1.4mg/m2(体表面積)を週に1回静脈内投与する。これを2週連続で行い、3週目は休薬とした。投与初日のエリブリンの血漿中濃度を測定する。薬物血中濃度はLC-MS/MSを用いて測定した。エリブリンに関連する薬物代謝酵素と薬物輸送トランスポータの遺伝子多型を解析し、エリブリン血中濃度、遺伝子多型解析結果と有害事象の発現との相関解析を行った。さらに、臓器機能(肝機能・腎機能)の影響も検討した。いずれの因子も、薬物動態と毒性ならびに遺伝子解析結果に相関は認められなかった。ALK融合遺伝子陽性非小細胞肺癌患者を対象としたクリゾチニブのの臨床研究では、肝機能障害、QT延長は、血中濃度ならびに遺伝子解析結果との有意な相関は認められなかった。一方、クリゾチニブの輸送タンパクとして知られているABCB1多型変異が血中濃度上昇と関連する傾向が確認された。手術不能あるいは再発乳癌患者を対象としたエリブリンの薬物動態と遺伝子多型解析臨床研究は、症例集積が少ないため、症例集積中であるが、投与後24時間後の血中濃度と血液毒性が相関する可能性が示唆された。クリゾチニブの研究は、目標症例数が確定され、解析を進めているため、想定以上に順調に推移している。一方、エリブリンでは、頻回採血が必要であるため、症例集積が遅れている。臨床薬理学クリゾチニブの血中濃度、副作用、遺伝子解析を実施し、有害事象を予測する因子の探索を行う。併せて、患者個々の臓器機能・併用薬の影響を併せて検討する。なお、エリブリンの症例集積が少ないため、採血回数が少ない解析手法も組み入れることとする。クリゾチニブ、エリブリンともにLC-MS/MSによる測定方法を構築済みであり、薬物代謝酵素と薬物輸送トランスポータの遺伝子多型を解析するための次世代シーケンサーを用いたプローブ設計も完了している。また、簡易的な測定を行うためのQuenching Probe法を利用した解析システム導入も準備することができた。クリゾチニブのプロジェクトでは、全国の呼吸器内科医の協力により順調に症例が集積されている。しかしながら、エリブリンのプロジェクトでは、頻回採血と入院が必要であるため、症例集積が遅れている。臨床試験の遅れがあり、予定された研究が遂行されなかったため。クリゾチニブの定常状態の血中濃度、代謝物の生成比、遺伝子多型解析結果と有害事象の発現との相関を解析する。それらに対する内因性要因の臓器機能(肝機能・腎機能)の有無、併用薬、食事の影響などの外的要因も精査する。エリブリン試験では、症例集積が遅い傾向になるため、分担研究者と検討の上、プロトコール変更を含めて検討する。研究計画を最終年度にて完了し、計画した解析を実施する。症例集積が遅れたため。計画に従い症例を集積し、研究計画にしたがい検討をすすめる
骨組織による血糖値調節機構の解明　―スフィンゴミエリンの重要性―

本研究課題では血糖値を調節する臓器として骨組織に着目し、特に骨芽細胞におけるスフィンゴミエリンの役割の解明をするために実験を行った。骨芽細胞からスフィンゴミエリン合成酵素1または2をノックダウンすると骨芽細胞分化や石灰化が抑制された。さらに骨芽細胞を介した破骨細胞分化も抑制した。これらの結果から、骨芽細胞の機能が抑制されたことが明らかになり、骨芽細胞による血糖値調節に影響を及ぼす可能性が示唆された。骨組織を中心とした多臓器間ネットワークによる血糖値調節機構については骨芽細胞がオステオカルシンを分泌し、膵臓のインスリン分泌、脂肪細胞でのアディポネクチン分泌を促進することにより糖代謝を制御することがわかっている。また、我々は糖尿病の発症原因の1つとして細胞内のスフィンゴ脂質の恒常性維持に重要な役割を担っているスフィンゴミエリン合成酵素(SMS)が欠失することや酸化ストレスの上昇により、骨密度が減少することを見いだした。そこで、これらの背景をもとに、骨芽細胞に存在するSMSが血糖値調節機構に関わっているかを検討した。実験方法として、SMSが消失した骨芽細胞を用いて、破骨細胞前駆細胞と共培養を行い、破骨細胞の分化に影響を及ぼすか確認した。その結果、骨芽細胞のSMSが破骨細胞分化に関与していることが示唆された。これは骨芽細胞のスフィンゴ脂質が破骨細胞の分化を促進することで、骨を吸収し、骨に埋め込まれているオステオカルシンの低カルボキシル化が起きることにより、血糖値調節機構に関与する可能性を示した。さらに今後、骨芽細胞特異的にSMSをノックアウトしたマウスを用いて、骨芽細胞のオステオカルシン発現や、破骨細胞の分化、吸収の変化を解析することで、骨芽細胞におけるスフィンゴ脂質をターゲットにした血糖値調節機構を明らかにすることができ、糖尿病患者の歯周病治療応用へと展開するための研究基盤となる可能性も示唆された。本研究は骨組織を中心とした多臓器間ネットワークによる血糖値調節機構にどのようにスフィンゴミエリン合成酵素(SMS)が関与しているかを明らかにし、スフィンゴミエリンをターゲットにした糖尿病患者の歯周病治療応用へと展開するための研究基盤を確立することが目的である。計画している具体的な研究項目は、1、SMSによる血糖値調節メカニズムの解明、2、骨組織を介した糖脂質代謝とSMSとの関連、3、SMSによる酸化ストレス調節と骨代謝の関係、4、SMSノックアウトマウスへのスフィンゴミエリン投与による血糖値の改善、の4つである。平成27年度は特に骨組織でのSMSの働きについて、注目し実験を行った。平成26年度までの予備実験でSMSノックアウトマウスにおいて、骨の変化を確認しているので、平成27年度はin vitroの実験を行った。実験方法として骨芽細胞からSMSをノックダウンし骨芽細胞分化に影響を及ぼすかを検討した。SMS2をノックダウンした細胞ではコントロールと比べて、骨芽細胞分化や石灰化が抑制されていた。さらに、骨芽細胞を介した破骨細胞分化も抑制していた。これらの結果から、SMS2は骨芽細胞の分化に関与し、RANKLの発現を制御することで、破骨細胞分化を調節している可能性が示唆された。さらに今後、SMSが骨芽細胞分化を調節することで、骨芽細胞が発現するオステオカルシンによる血糖値調節機構に及ぼす影響を明らかにすることができ、糖尿病患者の歯周病治療応用へと展開するための研究基盤となる可能性も示唆された。実験計画ではスフィンゴミエリン合成酵素(SMS)をノックアウトしたマウスを用いて、実験を行う予定であったが、必要数のマウスが得られなかったため、すべての実験ができなかった。前年度までにSMS1ノックアウトマウスにおいて、骨量の変化を確認し、in vitro実験においてSMS2をノックダウンした骨芽細胞は骨芽細胞分化や石灰化が抑制されていた。さらに骨芽細胞を介した破骨細胞分化が抑制していることや破骨細胞分化因子であるRANKL mRNA発現が抑制されているのが確認された。平成28年度は、前年までの結果を参考にして、SMS1をノックダウンした骨芽細胞を用いて、in vitro実験を行った。実験方法として骨芽細胞からSMS1をノックダウンし骨芽細胞分化に影響を及ぼすかについて、アルカリフォスファターゼ染色やアリザリンレッド染色法を用いて検討した。SMS1をノックダウンした骨芽細胞はSMS2ノックダウンした骨芽細胞と同様に分化が抑制されていた。次にSMS1をノックダウンした骨芽細胞を介した破骨細胞分化について酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色法を用いて実験を行った。しかし、破骨細胞分化に関しては、コントロールと比べて、染色に明らかな差が見られなかった。これらの結果から、SMS1が骨芽細胞分化に影響を与えることによりSMS1ノックアウトマウスの骨量が変化する可能性が示唆された。

さらに骨芽細胞を介した破骨細胞分化も抑制した。これらの結果から、骨芽細胞の機能が抑制されたことが明らかになり、骨芽細胞による血糖値調節に影響を及ぼす可能性が示唆された。実験計画ではスフィンゴミエリン合成酵素(SMS)をノックアウトしたマウスを用いて、頭蓋冠から骨芽細胞を単離し、培養した骨芽細胞を用いて、骨芽細胞の機能発現にどのように影響を及ぼすか検討する予定であった。しかし予定していた必要数のマウスが育たなかったため、すべての実験ができなかった。今後はSMS骨芽細胞特異的KOマウスから骨芽細胞を単離し、骨芽細胞の分化に及ぼす影響を確認する。また、SMSが欠損した骨芽細胞を用いて、糖代謝に及ぼす因子の発現や影響について、解析を行う。生化学今後はSMSs骨芽細胞特異的KOマウスにおける糖脂質代謝の影響を調べる。実験方法としてはブドウ糖負荷試験、血中オステオカルシン濃度の測定、背骨による骨形態計測、脛骨による遺伝子発現の確認、大腿骨による免疫組織学的解析をおこなう。少額のため、次年度に使用することにした。予定していたマウスが想定以上に育たなく、必要数が得られなかったため、できない実験が生じた。さらに、その結果、予定していた学会で発表することができなかったため、旅費が発生しなかったことがあげられる。試薬を購入した際に付け足す。平成27年度は平成26年度以上のマウスを用意し、交配することにより、必要数のマウスを得られるようにする。また、平成26年度に引き続きマウスが育たなかった場合も想定して、in vitro実験で骨芽細胞にsiRNAを導入することによりSMSがなくなった場合における骨芽細胞機能を調べる実験も行う。
バイオフィルム形成に影響を及ぼす齲蝕細菌表層蛋白のプロテオーム解析

プラークバイオフィルム形成に影響を及ぼす齲蝕細菌(Streptococcus mutans)の表層蛋白質を解析し、次の成果を得た。S.mutans 109cのSortase遺伝子(srtA)をPCRおよびInverse PCRで増幅後、ベクターにクローニングし、その全塩基配列を決定した。つぎに、その配列をもとに挿入不活化によりS.mutans 109cのsrtA欠損変異株を作成した。特異抗体を用いたウェスタンブロット解析は、SortaseがS.mutansの表層蛋白質(PAc : surface protein antigen),グルカン結合蛋白質(GbpC : glucan-binding protein),デキストラナーゼ(Dex : dextranase)の細胞壁への結合を触媒していることを証明した。次に、S.mutansの野生株(109c株)とsrtA欠損変異株のプラークバイオフィルム形成能を調べ比較した。その結果、srtA欠損変異株はデキストラン存在下でのグルカン依存性凝集能を消失し、さらに非水溶性粘着性グルカン合成能をも失っていた。これらの結果から、SortaseがS.mutansのPAc, GbpC, Dexの少なくとも3つの表層蛋白質の膜局在性を支配すると共に、それらの生理機能(齲蝕誘発性バイオフルム形成能)をも支配していることを示唆した。この現象はsrtA遺伝子の不活化のみならずSortase酵素の阻害でも期待できることから、Sortaseはプラークバイオフルム形成と齲蝕の予防の新たな標的として魅力的な酵素であることが示唆された。バイオフィルム形成に影響を及ぼす齲蝕細菌表層蛋白質を解析するために,本年度は齲蝕細菌表層蛋白質の細胞表層への結合を触媒している酵素"ソーターゼ(SrtA)"の遺伝子解析を行い,それをもとにSrtA欠損変異株を作成し,この変異株における表層蛋白質の膜局在性の変化が齲蝕細菌の歯面付着に与える影響を調べた.被験菌にはヒトの主要な齲蝕細菌であるStreptococus mutansを用い,そのソーターゼ遺伝子(srtA)をPCRで増幅しクローニング後,その全塩基配列を決定した.その結果,SrtAをコードする遺伝子の読み枠は741塩基対で246アミノ酸からなり,その分子量は27,481で等電点は10.1を示した.つぎに,この塩基配列をもとにSrtA変異株をsrtA遺伝子の相同組換えによる挿入不活化法により作成した.このSrtA変異株と野生株の細胞表層および培養上清中のタンパク質のSDS-PAGE分析パターンを比較したところ,分子量200kDaと75kDaの2本のバンドが新たにSrtA変異株の培養上清中に検出された.この2つのバンドは特異抗体を用いてウェスタンプロット解析により,それぞれ表層蛋白抗原(PAc,200kDa)とグルカン結合蛋白質(GbpC)であることを明らかにした.さらに,SrtA変異株はデキストラン依存性凝集能とショ糖非依存性の壁付着能を消失していることが明らかになった.これらの結果は,PAcとGbpCはSrtAによって細胞壁に結合され,プラークバイオフィルム形成に関与していることを示唆した.この現象はsrtA遺伝子の挿入不活化のみならずSrtAの阻害によっても期待できることから,SrtAは齲蝕予防の新たな標的として有用な酵素であると推測された.また,ここで決定したsrtA遺伝子の全塩基配列はDDBJ(日本DNAデータバンク)に登録した(登録番号:AB089932).研究初年度はStreptococcus mutansのSortase遺伝子(srtA)の塩基配列を決定し、それをもとにsrtA欠損変異株を作成し、SortaseがS. mutansの表層蛋白質(Surface protein antigen : PAc)の膜局在性を触媒していることを明らかにした。

そこで、本年度はS. mutansにおけるPAc以外のSortase支配下表層蛋白質の検出・同定を行うと同時に、srtA不活化変異株のプラークバイオフィルム形成能を調べ、齲蝕予防におけるSortaseの有用性を評価した。Sortaseの基質となるLPXTGmotifをもつ蛋白質をゲノム配列から検索した結果、PAc, Glucan-binding protein C (GbpC), Dextranase (Dex), Wall-associated protein antigen A (WapA), Fructosidase (FruA)の5つの蛋白質が検出された。S. mutans 109c (野生株)とそのsrtA欠損変異株におけるGbpCIとDexの局在性の変化を特異抗体を用いたWestern blot解析で調べた結果、GbpCおよびDexの細胞壁への結合がSortaseによって触媒されていることが明らかになった。次にsrtA欠損株の性質を調べると、この変異株はデキストラン存在下でのグルカン依存性凝集能を消失し、さらに非水溶性粘着性グルカン合成能をも失っていることが明らかになった,これらの結果から、SortaseはS. mutansのPAc, GbpC, Dexの少なくとも3つの表層蛋白質の膜局在性を支配すると共に、それらの生理機能(齲蝕誘発性バイオフルム形成能)をも支配していることが明らかになった。この現象はsrtA遺伝子の不活化のみならずSortase酵素の阻害でも期待できることから、Sortaseは齲蝕予防の新たな標的として有用な酵素であることが示唆された。
夏型過敏性肺炎の原因多糖体抗原の精製と構造解析

1.抗原性の検討1夏型過敏性肺炎(SHP)の原因抗原は、Trichosporon.asahiiおよびT.mucoidsを液体サプロー培地で培養した培養上清に存在する。更に、血清型特異的抗原はこれらの培養上清をセファロースCL-4Bで分画した時得られる2つのピークのうち高分子量画分に存在し、その本体は分子量約80万の多糖体である。このT.asah特異的抗原の抗原性を検討するため、われわれが開発した抗T.asahii特異的単クローン抗体を用いたELISAで検討した。抗原を121°C、20分間の加熱あるいはpH11に暴露すると患者血清および単クローン抗体との反応性は著しく低下した。T.asahiiおよびT.mucoides特異的抗原の構成糖はグルコース、キシロース、グルクロン酸であることが分かっているが、これら3糖の結合だけでこのような性質になることは考えにくいため、他の構成成分特にアセチル基などの存在について検討する予定である。2.血清中の抗T.asahiiIgGサブクラスの検討SHPの原因抗原に関しては、培養上清の硫安塩析画分に対するIgGサブクラスの分布の検討から、多糖体ではなく蛋白質である可能性が報告されているが、同画分がSHPの原因抗原である証明がなされていない。われわれが精製した抗原はSHP患者の血清中に高率にその抗体が存在する。この抗原を用いたサブクラスの検討では、患者血清中の抗T.asahiiIgG抗体はほぼ100%がIgG2で、この反応は多糖に対する反応に矛盾しなかった。更に、多疾患対照、正常対照では、抗T.asahiiIgG2抗体はまったく検出されないことから、血清診断の精度を上げることが期待される。夏型過敏性肺炎の主な原因抗原はTrichosporon asahiiとT.mucoidesであるが、このうちT.asahiiについては、T.asahii特異的多糖体抗原がT.asahiiの培養上清の粗抽出抗原の高分子量画分に存在し、T.asahii特異的単クローン抗体を用いたアフィニテイークロマトグラフィーによって精製が可能で、その大まかな構造はglucuronoxylomannannで、1-3結合のmannnanにmannose、xylose、glucuronic acidが数個の長さの側鎖として結合していることが判明しているT.mucoidesについて、その培養上清の粗抽出抗原をゲルろ過して得られた高分子量画分を酸加水分解し、その構成糖もT.asahiiと同様にmannose、xylose、glucuronic acidであることが判明した。T.mucoides特異的抗原について、T.asahiiと同様の方法でT.mucoides特異的抗原を精製するため、T.mucoides特異的単クローン抗体(11-7)を作成した。しかし、この抗体は特異性が当初判定したよりも高くないことと、抗体産生ハイブリドーマの抗体産生能が不安定で、継代を重ねると抗体を産生しなくなることが多いことから、再度単クローン抗体を作成する必要が生じた。現在、単クローン抗体作成の準備のため、T.mucoidesの培養濾液抗原のゲルろ過を行っている。
糸球体濾過障壁の恒常性維持におけるGpr116受容体の作用機構

哺乳動物の腎臓の糸球体は、尿生成の第一ステップである血液濾過を行う器官である。その為、糸球体の毛細血管壁には選択的な濾過を可能にするための構造的に特徴的な濾過障壁(バリアー)が形成されている。この濾過障壁は血管内皮細胞、基底膜、足細胞の三層構造から成っているが、その構造異常は腎疾患を誘発することが知られている。しかしながら、濾過障壁がどのようにして形成・維持されているか、その分子機構については不明点が多い。我々はこれまでのADGRF5(GPR116またはIg-Heptaとも呼ばれる)の欠損マウスの解析から、ADGRF5が糸球体血管内皮に発現し、糸球体濾過障壁の構造維持に関与することを見出した。本研究の目的は、糸球体血管内皮細胞におけるADGRF5の機能を明らかにし、濾過障壁の恒常性維持とその破綻による病態発症のプロセスを分子レベルで説明できるようにすることである。平成30年度では、前年度までに明らかにしているADGRF5欠損マウスの糸球体血管内細胞における遺伝子発現変化が他の血管内皮細胞(主に肺血管内皮細胞)においても同様に認められるかについて比較解析を行った。その結果、糸球体血管内細胞における遺伝子発現変化のうち、濾過障壁の主要構成成分(基底膜タンパク質)については肺血管内皮では同様な変化は認められなかったものの、一部、炎症性分子の発現上昇については両者ともに認められた。したがって、濾過障壁維持におけるADGRF5の機能は細胞特異的なものであるが、免疫調節の役割は共通の機能である可能性示唆された。ADGRF5のリガンド探索(活性化機構の解明)であるが、引き続き力学的刺激である伸展(ストレッチ)刺激について解析中であり研究期間内に一定の結果を得ることができなかった。腎糸球体の毛細血管壁には,尿生成の第一段階である血液濾過を担うバリアー(濾過障壁)が備わっており,その構造異常は腎疾患を誘発することが知られている。しかしながら,濾過障壁がどのようにして形成・維持されているかは不明点が多い。これまでのGpr116受容体の欠損マウスの解析から,Gpr116が濾過障壁を構成する血管内皮細胞の形態形成や基底膜構成分子の発現制御に関与することを見出した。本研究の目的は,糸球体毛細血管内皮細胞におけるGpr116の作用機構を解明し,濾過障壁の恒常性維持とその破綻による病態発症のプロセスを説明できるようにすることである。平成28年度では,糸球体におけるGpr116の発現局在とシグナル伝達の解析およびGpr116欠損マウスの表現型解析を行った。免疫組織染色および免疫電顕解析によってGpr116が糸球体血管内皮における局在部位を特定することに成功した。また,単離した糸球体血管内皮細胞を用いたマイクロアレイ解析によってGpr116欠損で発現変動する遺伝子候補を網羅的に同定し,濾過障壁の維持との関係が示唆される遺伝子が多く含まれていることが見出された。また,透過型および走査型電子顕微鏡観察によって,Gpr116欠損マウスの糸球体血管内皮細胞の形態異常の詳細を明らかにすることができた。Gpr116の発現部位や下流遺伝子を明らかにすることができ,リガンド候補や濾過障壁の異常に至る分子機序の解明へのヒントが得られた。当初計画していた通り,1糸球体血管内皮細胞におけるGpr116の細胞内局在の決定,2濾過障壁構成分子の発現解析,3Gpr116の下流遺伝子の網羅的同定について一定の成果が得られたため。Gpr116(Adgrf5またはIg-Heptaとも呼ばれる)は7回膜貫通型受容体でリガンド未知のオーファン受容体である。最近の研究により,Gpr116が肺における肺胞サーファクタントの量や免疫の恒常性維持に働くことが知られているが,申請者はこれまでに,Gpr116が腎臓の糸球体ろ過障壁の構造的,機能的な維持に機能していることを示唆する結果を得てきた。本年度では前年度に引き続き,Gpr116欠損マウスの糸球体血管内皮細胞における発現変動遺伝子の同定を行った。その結果,炎症初期に発現誘導が引き起こされることが知られている炎症性因子の発現上昇がGpr116欠損糸球体血管内皮細胞で生じていることを定量PCR解析およびウエスタンブロット解析により認めた。この炎症性因子の発現上昇はマウスより単離した肺毛細血管細胞においてもGpr116欠損によって引き起こされていることを認めたことから,Gpr116が毛細血管細胞において炎症応答を調節する働きがあることが示唆された。また,Gpr116の細胞内シグナル伝達経路を特定するために,Gpr116およびその変異体を恒常的に発現する細胞株を作成してそれらのシグナル伝達の状態(シグナル伝達分子のリン酸化状態など)をウエスタンブロット法により解析した。MAPKシグナリングなど代表的な経路のうちGpr116の過剰発現によって活性化状態に変動を示す経路の候補を同定することができた。今後,この経路が実際にGpr116欠損によって影響を受けて下流遺伝子発現に影響を及ぼしているかを確認する必要がある。免疫電顕解析によりGpr116が血管内腔側に局在することを認めたことから,リガンド探索として,流れ刺激(せん断応力)による活性化の可能性について検討した。しかしながら,Gpr116のシグナル伝達に影響を与えることを示す結果は得られなかった。

Gpr116欠損により影響を受ける遺伝子の特定をして,Gpr116が炎症との関連があるという生理的な機能を示唆する結果が得られた。また,細胞内シグナル伝達についても候補のシグナル経路を見出した。リガンド探索では申請者の仮説(流れ刺激応答)を支持する結果は得られなかったが,分子内プロセシング等による活性化など別の可能性を検討する方向に切り替えている。哺乳動物の腎臓の糸球体は、尿生成の第一ステップである血液濾過を行う器官である。その為、糸球体の毛細血管壁には選択的な濾過を可能にするための構造的に特徴的な濾過障壁(バリアー)が形成されている。この濾過障壁は血管内皮細胞、基底膜、足細胞の三層構造から成っているが、その構造異常は腎疾患を誘発することが知られている。しかしながら、濾過障壁がどのようにして形成・維持されているか、その分子機構については不明点が多い。我々はこれまでのADGRF5(GPR116またはIg-Heptaとも呼ばれる)の欠損マウスの解析から、ADGRF5が糸球体血管内皮に発現し、糸球体濾過障壁の構造維持に関与することを見出した。本研究の目的は、糸球体血管内皮細胞におけるADGRF5の機能を明らかにし、濾過障壁の恒常性維持とその破綻による病態発症のプロセスを分子レベルで説明できるようにすることである。平成30年度では、前年度までに明らかにしているADGRF5欠損マウスの糸球体血管内細胞における遺伝子発現変化が他の血管内皮細胞(主に肺血管内皮細胞)においても同様に認められるかについて比較解析を行った。その結果、糸球体血管内細胞における遺伝子発現変化のうち、濾過障壁の主要構成成分(基底膜タンパク質)については肺血管内皮では同様な変化は認められなかったものの、一部、炎症性分子の発現上昇については両者ともに認められた。したがって、濾過障壁維持におけるADGRF5の機能は細胞特異的なものであるが、免疫調節の役割は共通の機能である可能性示唆された。ADGRF5のリガンド探索(活性化機構の解明)であるが、引き続き力学的刺激である伸展(ストレッチ)刺激について解析中であり研究期間内に一定の結果を得ることができなかった。当初の計画通り,Gpr116欠損マウスで発現変動する遺伝子の情報を基に,細胞内シグナリング経路の特定や濾過障壁異常にいたるプロセスの解明に向けた解析を行っていく予定である。また,Gpr116のリガンド探索も進めていく予定である。候補のシグナル経路がGpr116の下流経路であるか検証する必要がある。変異体Gpr116を用いた解析,Gpr116のリン酸化状態やシグナル分子との相互作用,Gpr116の細胞内局在の変化など解析するとともに,Gpr116欠損血管内皮細胞や初代血管内皮細胞に対するGpr116のノックダウンを行うことでシグナル経路や下流遺伝子発現への変動についても解析を行う予定である。Gpr116の活性化機構を明らかにするために,引き続きリガンド探索や分子内プロセシング等による活性化の可能性について検討する予定である。当該年度の研究の遂行にあたり,当初想定していたよりも少ない実験回数で必要なデータが得られたため,その分の消耗品購入費を使用しなかったため。(理由)当該年度の研究遂行にあたり,低価格の消耗品の購入によるコストダウンを行ったため。(使用計画)次年度では,初代血管内皮細胞を用いた機能解析を中心に行うため,高額な細胞単離のための消耗品(磁気ビーズ,抗体,血清)の購入に充てる予定である。
ヒメイカを用いた心臓予定領域決定機構の解明

軟体動物頭足類は心臓を3個有している。1個は体心臓と呼ばれ、血液を全身に循環させる機能を担っており、脊椎動物の心臓と同様の役割を果たしている。他の2個は鰓心臓と呼ばれ、鰓に血液を送ることに特化した心臓である。このように特殊な心循環器系を有している頭足類において、体心臓、鰓心臓がどのように発生してくるのか、そのメカニズムは全く明らかにされていない。本研究では世界最小のイカであるヒメイカを用いて鰓心臓、体心臓の発生過程を調べた。脊椎動物の心臓特異的転写因子をヒメイカから単離し、発現様式を詳細に解析したところ、体心臓と鰓心臓は共通の心臓予定領域から発生してくる可能性が示唆された。イカ、タコなどの軟体動物頭足類は心臓と呼ばれる器官を3個有している。1個は体心臓と呼ばれ、血液を全身に循環させるという脊椎動物の心臓と同様の役割を果たしている。このように頭足類は非常に特殊な心循環器系を有しているが、どのようにして頭足類は2種の異なる心臓を有するようになったのか、その発生学的な解析はなされていない。本研究では世界最小のイカであるヒメイカを用いて鰓心臓、体心臓の発生学的な違いを明らかにするとともに、中胚葉形成から心臓予定領域決定に関わる分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでの研究では脊椎動物において心臓特異的転写因子として働いているNkx2.5遺伝子のヒメイカホモログを単離して発生過程における発現様式の解析を行った。その結果、Nkx2.5遺伝子が体心臓、鰓心臓両方の前駆細胞に発生の初期から発現していることが明らかとなり、左右両側に生じた心臓前駆細胞の一部が体の正中線上で融合して体心臓を形成し、左右両側に残った集団が鰓心臓となることがわかった。この体心臓の発生様式は、脊椎動物の心臓発生においても認められる現象であり、同じ機能を有する心臓が同様の発生過程を経るという点で非常に興味深い結果である。さらに、中胚葉からNkx2.5陽性である心臓前駆細胞が生じてくる過程を明らかにしていくために、中胚葉マーカーの単離も進めており、いくつか候補が得られているので、発現様式を確認して行く予定である。このように頭足類は非常に特殊な心循環器系を有しているが、どのように機能の異なる2種類の心臓が発生してくるのか、そのメカニズムは全く明らかにされていない。これまでの研究では脊椎動物において心臓特異的転写因子として働いているNkx2.5のヒメイカホモログを単離して発生過程における発現様式の解析を行った。その結果、Nkx2.5が体心臓、鰓心臓両方の前駆細胞に発生の初期から発現していることが明らかとなり、左右両側に生じた心臓前駆細胞の一部が体の正中線上で融合して体心臓を形成し、左右両側に残った集団が鰓心臓となることが考えられた。心臓前駆細胞が体の正中線上で融合して心臓を形成するという発生様式は、脊椎動物の心臓発生においても認められる現象であり、頭足類で脊椎動物心臓と同じ機能を有する体心臓が同様の発生過程を経るということは心臓の進化発生メカニズムを考える上で非常に興味深い。さらに発生を遡り、中胚葉からNkx2.5陽性である心臓前駆細胞が生じてくる過程を明らかにすることも試みている。一連の研究において、中胚葉マーカーの単離も進めており、いくつか候補が得られているので、それら因子の発現様式を脊椎動物の心臓発生と比較する。また、細胞系譜追跡により心臓前駆細胞がどのように移動して体心臓、鰓心臓を形成していくのか明らかにする。心臓マーカーのクローニングは順調に進み、発現パターンの解析から脊椎動物と共通のメカニズムと頭足類特有のメカニズムとが使い分けられることにより3個の心臓が形成されているのではないかという興味深い結果が得られている。この結果をさらに検証するために、心臓予定領域からの細胞の移動を明らかにすることを試みた。細胞系譜追跡方法として、色素注入による細胞ラベル、レポーター遺伝子の受精卵への顕微注入を試みたが、未だ成功していない。ヒメイカの卵は固い膜に覆われており、これまで実験動物として用いられて来た動物の受精卵とは性質が大きく異なる。そのため新たな注入法の開発が必要であると考えられ、卵殻除去の薬剤処理、レーザー照射などを試みたが、いずれも卵殻除去には至らなかった。引き続き様々な手法を検討していく予定である。1個は体心臓と呼ばれ、血液を全身に循環させる脊椎動物の心臓と同様の役割を果たしている。

このように頭足類は非常に特殊な心循環器系を有しているが、発生過程においてどのように役割の異なる2種類の心臓が形成されてくるのか、そのメカニズムは全く明らかにされていない。本研究では世界最小のイカであるヒメイカを用いて鰓心臓、体心臓の発生学的な違いを明らかにするとともに、中胚葉形成から心臓予定領域決定に関わる分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。脊椎動物において心臓特異的転写因子として働いているNkx2.5のヒメイカホモログを単離して発生過程における発現様式の解析を行ったところ、ヒメイカにおいてもNkx2.5は心臓特異的に発現しており、発生初期には体心臓と鰓心臓の予定領域と思われる部分に発現していることが明らかになった。詳細な発現解析から、ヒメイカの心臓形成様式として左右両側に生じた心臓前駆細胞の一部が体の正中線上で融合して体心臓を形成し、左右両側に残った集団が鰓心臓となることが予想された。そこでNkx2.5を発現している領域の細胞が将来的にどのような組織を形成するのか明らかにするために、色素注入によって細胞を標識し、その系譜を追跡することを試みた。ヒメイカの卵は固い膜に覆われており、これまで実験動物として用いられてきた動物の受精卵とは性質が大きく異なる。そのため新たな注入法の開発が必要であり、薬剤処理やレーザー照射などを試みたが、いずれも卵殻除去、細胞標識には至らなかった。軟体動物頭足類は心臓を3個有している。1個は体心臓と呼ばれ、血液を全身に循環させる機能を担っており、脊椎動物の心臓と同様の役割を果たしている。他の2個は鰓心臓と呼ばれ、鰓に血液を送ることに特化した心臓である。このように特殊な心循環器系を有している頭足類において、体心臓、鰓心臓がどのように発生してくるのか、そのメカニズムは全く明らかにされていない。本研究では世界最小のイカであるヒメイカを用いて鰓心臓、体心臓の発生過程を調べた。脊椎動物の心臓特異的転写因子をヒメイカから単離し、発現様式を詳細に解析したところ、体心臓と鰓心臓は共通の心臓予定領域から発生してくる可能性が示唆された。おおむね順調に進展している。心臓マーカーのクローニングは順調に進み、発現パターンの解析から脊椎動物と共通のメカニズムと頭足類特有のメカニズムとが使い分けられることにより3個の心臓が形成されているのではないかという興味深い結果が得られている。心臓予定領域からの細胞の移動を調べるための細胞系譜追跡方法として、色素注入による細胞ラベル、レポーター遺伝子の受精卵への顕微注入の実験系を立ち上げているが、ヒメイカの卵は固い膜に覆われており、これまで実験動物として用いられて来た動物の受精卵とは性質が大きく異なるため、新たな注入法の開発が必要であると考えられる。引き続き様々な手法を検討していく予定である。また、レポーター遺伝子を発現させるためのプロモーターとして、これまでに作製したFosmidライブラリーからNkx2.5遺伝子を含むようなクローンのスクリーニングも現在進めていることころである。心臓予定領域からの細胞移動を調べるために、引き続き細胞をラベルする方法の確立に取り組む。それとともに、心臓予定領域からの細胞の移動を阻害する実験も試みる。脊椎動物の心臓形成過程において、心臓前駆細胞の左右両側から正中線上への移動を薬剤によって阻害すると、左右両側にそれぞれ心臓が形成される二叉心臓(cardia bifida)となる。