hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌に対するヒト抗菌ペプチドhCAP18による抗腫瘍効果と樹状細胞誘導療法

目的:生体内に存在する自然免疫に関与する抗菌ペプチドを用いて口腔感染症や口腔癌の治療薬として応用することを目的とした.その結果は以下に示す1.口腔癌細胞移植ヌードマウスによるhCAP18ペプチドのin vivoにおける治療効果ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞をヌードマウス背部皮下または舌への同所移植を行い,合成ペプチドを投与し,in vivoでの抗腫瘍効果を判定した.その結果,腹腔内,腫瘍局所に連日,又は隔日局所投与を行うことで,腫瘍増殖抑制効果が認められたが,静脈内投与では無効であった.2.口腔癌および正常上皮細胞へのhCAP18/CAHP遺伝子導入による細胞形質の変化ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞SAS-H1および正常ヒト上皮細胞HaCaTを用いて,CAMP遺伝子を導入し高発現安定細胞を作製し,本細胞を用いて,細胞形質の変化を検討したところ,遺伝子導入による細胞増殖の変化はみられなかったが,CAMP遺伝子を導入し構成的に蛋白質発現を有するSAS-H1細胞では,hCAP18ペプチドで誘導されるアポトーシスが抑制され,その結果,抗腫瘍効果が減弱した.上記で得られたCAMP遺伝子導入細胞を用いて.本細胞が,nativeな活性ペプチドを産生分泌することを抗hCAP18抗体によるウエスタンブロットで,蛋白質発現と培養上清での確認を行った.そこで,菌体成分による細胞処理による生存細胞の変化を検討下結果,CAMP導入細胞では,菌体成分による殺細胞効果が抑制されていた.4.hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導と癌免疫療法への応用ヒト末梢血から単球を分離し,hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導の有無を,細胞表面抗原の解析と形態変化を指標に検討した結果,CAMP遺伝子導入癌細胞が産生するhCAP18ペプチより,樹状細胞の分化誘導が促進された.目的:生体内に存在する自然免疫に関与する抗菌ペプチドを用いて口腔感染症や口腔癌の治療薬として応用することを目的とした.その結果は以下に示す1.口腔癌細胞移植ヌードマウスによるhCAP18ペプチドのin vivoにおける治療効果ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞をヌードマウス背部皮下または舌への同所移植を行い,合成ペプチドを投与し,in vivoでの抗腫瘍効果を判定した.その結果,腹腔内,腫瘍局所に連日,又は隔日局所投与を行うことで,腫瘍増殖抑制効果が認められたが,静脈内投与では無効であった.2.口腔癌および正常上皮細胞へのhCAP18/CAHP遺伝子導入による細胞形質の変化ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞SAS-H1および正常ヒト上皮細胞HaCaTを用いて,CAMP遺伝子を導入し高発現安定細胞を作製し,本細胞を用いて,細胞形質の変化を検討したところ,遺伝子導入による細胞増殖の変化はみられなかったが,CAMP遺伝子を導入し構成的に蛋白質発現を有するSAS-H1細胞では,hCAP18ペプチドで誘導されるアポトーシスが抑制され,その結果,抗腫瘍効果が減弱した.上記で得られたCAMP遺伝子導入細胞を用いて.本細胞が,nativeな活性ペプチドを産生分泌することを抗hCAP18抗体によるウエスタンブロットで,蛋白質発現と培養上清での確認を行った.そこで,菌体成分による細胞処理による生存細胞の変化を検討下結果,CAMP導入細胞では,菌体成分による殺細胞効果が抑制されていた.4.hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導と癌免疫療法への応用ヒト末梢血から単球を分離し,hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導の有無を,細胞表面抗原の解析と形態変化を指標に検討した結果,CAMP遺伝子導入癌細胞が産生するhCAP18ペプチより,樹状細胞の分化誘導が促進された.目的:非特異的感染防御機構(自然免疫)に関与する抗菌ペプチドであるhCAP18を治療薬として用いることで、抗菌耐性菌や抗癌耐性細胞の克服を目指して、生体に優しい感染症及び癌治療の新しい治療展開を目的とした.1.口腔細菌に対するhCAP18合成ペプチドの効果成人型歯周病の原因菌とされるPoryphyromonas嘱に対するhCAP18の効果は.P. gingivalis, P. leviiとP. intermediaは生菌が確認できなかった.また,グラム陰性菌は一般にhCAP18に感受性であるが、菌株によっては抵抗性であった.次に,ベーチェット病患者由来のS. sanguisに対する殺菌効果もみられ,同菌の菌体成分であるLTA、または,グラム陰性菌の菌体成分LPSが主要なターゲット分子であることを明らかにした.LTAやLPSによるマウスの実験的ブドウ膜炎の系を用いて,hCAP18が実際のin vivoでも菌体成分を中和して,その発症を阻止することが示された.2.口腔癌細胞に対するhCAP18ペプチドのアポトーシス誘導とその伝達経路の解明ヒト口腔扁平上皮癌細胞を用いて、hCAP18合成ペプチドによる殺細胞効果を検討し、アポトーシスを誘導して抗腫瘍効果を示すことを明らかにした.さらにhCAP18によるアポトーシス誘導に至る伝達経路を解明するため、細胞画分を行いウエスタンブロット法でシグナル分子を検討した.その結果,Baxを介して,endonuclease Gがミトコンドリア,さらに核移行して,caspase活性を経ずして核の断片化を実行することを示した.目的:生体内に存在する自然免疫に関与する抗菌ペプチドを用いて,口腔感染症や口腔癌の治療薬として応用することを目的とした.

結果:1.口腔癌細胞移植ヌードマウスによるhCAP18ペプチドのin vivoにおける治療効果ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞をヌードマウス背部皮下または舌への同所移植を行い,合成ペプチドを投与し,in vivoでの抗腫瘍効果を判定した.その結果,腹腔内,腫瘍局所に連日,又は隔日局所投与を行うことで,腫瘍増殖抑制効果が認められたが,静脈内投与では無効であった.2.口腔癌および正常上皮細胞へのhCAP18/CAMP遣伝子導入による細胞形質の変化ヒト培養口腔扁平上皮癌細胞SAS-H1および正常ヒト上皮細胞HaCaTを用いて,CAMP遺伝子を導入し高発現安定細胞を作製し,本細胞を用いて,細胞形質の変化を検討したところ,遺伝子導入による細胞増殖の変化はみられなかったが,CAMP遺伝子を導入し構成的に蛋白質発現を有するSAS-H1細胞では,hCAP18ペプチドで誘導されるアポトーシスが抑制され,その結果,抗腫瘍効果が減弱した.上記で得られたCAMP遺伝子導入細胞を用いて.本細胞が,nativeな活性ペプチドを産生分泌することを抗hCAP18抗体によるウエスタンブロットで,蛋白質発現と培養上清での確認を行った.そこで,菌体成分による細胞処理による生存細胞の変化を検討下結果,CAMP導入細胞では,菌体成分による殺細胞効果が抑制されていた.4. hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導と癌免疫療法への応用ヒト末梢血から単球を分離し,hCAP18合成ペプチドによる樹状細胞誘導の有無を,細胞表面抗原の解析と形態変化を指標に検討した結果,CAMP遺伝子導入癌細胞が産生するhCAP18ペプチより,樹状細胞の分化誘導が促進された.
カリウムチャンネル開口薬の血管拡張作用機序に関する研究

Kチャンネル開口薬(KCO)は一般にagonist収縮を比較的よく抑制することが知られている.そこでこの研究では,Furaー2を細胞内に取り込ませたイヌの左冠動脈リング標本を用いて,細胞内Ca濃度([Ca^<2+>]_1)を張力と同時に測定して,thromboxan A_2 analogueであるU46619のagonist収縮作用に対するKCOの作用を検討した.20mM KClで脱分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は低い濃度から生じ,一方,cromakalimにより過分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は顕著に抑制された.さらにcromakalimの[Ca^<2+>]_1の減少作用を20mM KClで遮断して過分極作用が現われないようにするとU46619ではcontrolと同様に[Ca^<2+>]_1が増加した.KCOによるagonist収縮の抑制作用は膜電位を過分極にすることで,電位依存性Lーtype Caチャンネルを開きにくくしagonistによる[Ca^<2+>]_1の増加作用を抑制するためと考えられる.次にagonistのもう一方の収縮機構である筋小胞体(SR)からのCa遊離作用について検討した.細胞外液のCa^<2+>を0として,U46619による一過性の[Ca^<2+>]_1と張力の上昇に対する作用を検討すると,cromakalimはこの反応を抑制した.cromakalimの抑制作用は,Kチャンネルブロッカ-のTBAで拮抗され,[K^+]。を20mMとすると打ち消された.cromakalimはcaffeineによるCa遊離作用に影響しなかった.さらに,U46619とcaffeineとを続けて作用させると,それに応じてCa遊離が見られた.cromakalim存在下ではU46619によるCa遊離は抑制されるものの,caffeineによるものは抑制されずむしろ大きくなった.このようなU46619のCa遊離抑制作用は他の特異的なKCOによっても観察されている.すなわち,KCOは,thromboxane A_2受容体をはじめとしたagonistを介するIP_3によるCa遊離をも選択的に抑制すると考えられる.Kチャンネル開口薬(KCO)は一般にagonist収縮を比較的よく抑制することが知られている.そこでこの研究では,Furaー2を細胞内に取り込ませたイヌの左冠動脈リング標本を用いて,細胞内Ca濃度([Ca^<2+>]_1)を張力と同時に測定して,thromboxan A_2 analogueであるU46619のagonist収縮作用に対するKCOの作用を検討した.20mM KClで脱分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は低い濃度から生じ,一方,cromakalimにより過分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は顕著に抑制された.さらにcromakalimの[Ca^<2+>]_1の減少作用を20mM KClで遮断して過分極作用が現われないようにするとU46619ではcontrolと同様に[Ca^<2+>]_1が増加した.KCOによるagonist収縮の抑制作用は膜電位を過分極にすることで,電位依存性Lーtype Caチャンネルを開きにくくしagonistによる[Ca^<2+>]_1の増加作用を抑制するためと考えられる.次にagonistのもう一方の収縮機構である筋小胞体(SR)からのCa遊離作用について検討した.細胞外液のCa^<2+>を0として,U46619による一過性の[Ca^<2+>]_1と張力の上昇に対する作用を検討すると,cromakalimはこの反応を抑制した.cromakalimの抑制作用は,Kチャンネルブロッカ-のTBAで拮抗され,[K^+]。を20mMとすると打ち消された.cromakalimはcaffeineによるCa遊離作用に影響しなかった.さらに,U46619とcaffeineとを続けて作用させると,それに応じてCa遊離が見られた.cromakalim存在下ではU46619によるCa遊離は抑制されるものの,caffeineによるものは抑制されずむしろ大きくなった.このようなU46619のCa遊離抑制作用は他の特異的なKCOによっても観察されている.すなわち,KCOは,thromboxane A_2受容体をはじめとしたagonistを介するIP_3によるCa遊離をも選択的に抑制すると考えられる.Kチャネル開口薬は一般にagonist収縮を比較的よく抑制することが知られている。現在チャネル開口薬としてcromakalim,pinacidil,nicorandilなどが知られているが、我々の研究によると最も特異的なKチャネル開口作用を持つものとしてcromakalimがある。一方、agonist収縮についても種々の作用機序が報告されており、その中のどの機序がKチャネル開口薬により影響され弛緩が生じるのか明かでない。そこでこの研究では、細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>])を張力と同時に測定して、thromboxan A_2 analogueであるU46619のagonist収縮作用に対する種々のKチャネル開口薬の作用を検討した。Furaー2を細胞内に取り込ませたイヌの左冠動脈リング標本を用いて、340nmと380nmの励起光により得られる500nmの蛍光および蛍光比を経時的に張力と共に測定した。実験の最後に自家蛍光を求めてFuraー

2シグナルの成分を計算し直した。[Ca^2]や張力の大きさは各標本で実験の最初に行う90mM KC1による拘縮10分値をそれぞれの100%として計算した。U46619はKC1拘縮(30ー90mM)と比較して低い[Ca^<2+>]_1の増加でほぼ同等の張力を発生した。20mM KC1で脱分極するとU46619の[Ca^<2+>]の増加作用と収縮は低い濃度から生じ、一方、cromakalimにより過分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は顕著に抑制された。さらにcromakalimの[Ca^<2+>]_1の減少作用を20mM KC1で遮断して過分極作用が現われないようにするとU46619ではcontrolと同様に[Ca^<2+>]_1が増加した。以上の結果より、U46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用は膜電位が脱分極すると増強し、過分極すると抑制される電位依存性の性質を持つおそらくLーtype Caチャネルを静止膜電位で開かせることによると考えられる。逆に、Kチャネル開口薬によるagonist収縮の抑制作用は膜電位を過分極にすることで、電位依存性L+type Caチャネルが開きにくくなりagonistによる[Ca^<2+>]_1の増加作用が抑制されたためと考えられる。Kチャンネル開口薬(KCO)は一般にagonist収縮を比較的よく抑制することが知られている.そこでこの研究では,Furaー2を細胞内に取り込ませたイヌの左冠動脈リング標本を用いて,細胞内Ca濃度([Ca^<2+>]_1)を張力と同時に測定して,thromboxan A_2 analogueであるU46619のagonist取縮作用に対するKCOの作用を検討した.20mM KC1で脱分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は低い濃度から生じ,一方cromakalimにより過分極するとU46619の[Ca^<2+>]_1の増加作用と収縮は顕著に抑制された.さらにcromakalimの[Ca^<2+>]_1の減少作用を20mMKClで遮断して過分極作用が現われないようにするとU46619ではcontrolと同様に[Ca^<2+>]_1が増加した.KCOによるagonist収縮の抑制作用は膜電位を過分極にすることで,電位依存性Lーtype Caチャンネルを開きにくくしagonistによる[Ca^<2+>]_1の増加作用を抑制するためと考えられる.次にagonistのもう一方の収縮機構である筋小胞体(SR)からのCa遊離作用について検討した.細胞外液のCa^<2+>を0として,U46619による一過性の[Ca^<2+>]_1と張力の上昇に対する作用を検討すると,cromakalimはこの反応を抑制した.cromakalimの抑制作用は,Kチャンネルブロッカ-のTBAで結抗され,[K^+]。を20mMとすると打ち消された.cromakalimはcaffeineによるCa遊離作用に影響しなかった.さらに,U46619とcaffeineとを続けて作用させると,それに応じてCa遊離が見られた.cromakalim存在下ではU46619によるCa遊離は抑制されるものの,caffeineによるものは抑制されずむしろ大きくなった.
非塩素フロン混合系の熱物性に関する研究

現在,冷媒,作動熱媒体として汎用されている塩素系フロンHCFC-22(CHCIF_2)は21世紀の早い時期にその使用,製造が中止されることが決定している。これに代わる新たな純熱媒体はなく,その開発が国際的に緊急課題となっている。本研究は,塩素を含まないフロン(Hydro-Fluoro-Carbons,HFCs,非塩素フロン)混合系:[1]HFC-23(CHF_3)+HFC-134a(CF_3-CH_2F),[2]HFC-32(CH_2F_2)+HFC-134a(CF_3-CH_2F)液相中の熱物性(蒸気圧,音速,PVT)を調べ,HFC-22の代替え混合フロン媒体を見いだすことを目的として平成4年,5年の2年間実施された。純物質HFC-23,HFC-32,HFC-134aおよび混合系[1],[2]中の蒸気圧,音速,PVTを種々濃度について測定し,温度・圧力・濃度依存性について調べた。これら純物質の臨界点(HFC-23:Tc=298.98K,Pc=4.82MPa;HFC-32:Tc=351.56K,Pc=5.83MPa;HFC-134a:Tc=346.25K,Pc=3.811MPa)は大きく異なっている。ハロゲン化炭化水素化合物の熱物性値の絶対値は,蒸気圧-温度曲線,すなわち,臨界値の大きさに対応することが知れている。しかし,得られた結果は物質よって大きく異なることが判った。一方,混合系[1]の蒸気圧,音速は濃度に対して大きく依存する結果を得た。また,系[2]のPVTを含むこれらの値は濃度変化に伴ってほぼ直線関係を示しながら変化した。この系のHFC-32の高濃度領域において諸熱物性値がHCFC-22の性質にもっとも近いことが判明した。これら媒体の双極子能率は大きく,得られた結果の温度・圧力・濃度依存性にも強い分子間相互作用が関与していることを示唆した。このようにして得られた本研究の成果は,今日,もっとも緊急を要するHCFC-22に代わる混合冷媒あるいは作動熱媒体を開発するための重要な基礎情報になると確信する。今後,これらの系,あるいは他の混合系について,諸性質の温度・圧力効果,特に,それらの濃度依存性についてさらに詳細な研究が必要である。本研究は塩素を含まないHFC(ハイドロフルオロカーボン,非塩素フロン)CHF_3(HFC-23)+CF_3-CF_2F(HFC-134a)とCH_2F_2(HFC-32)+CF_3-CH_2F(HFC-134a)混合系の熱物性(蒸気圧,音速,PVT)を調べ,現在汎用されている塩素系フロン(CHCLF_2(HCFC-22)の代替混合冷媒を見いだすことを目的としている。

音速測定装置に改良を施し,低温から超臨界領域を含む広い温度・圧力範囲における純化合物中の音速の測定はほぼ終了した。これらをHCFC-22の測定値と比較し,結果は投稿準備中である。混合系中の音速測定は継続中である。HFC-23を除く化合物の臨界温度は360K付近であり,それらはHFC-32<HCFC22<HFC-134aの順に高い。飽和蒸気圧下の音速は臨界温度に近づくとともに減少し,臨界点で極小値を示す。これらの値は対応状態原理に基づいて検討するのが妥当であるが,音速測定のため試料中に発生された音波の吸収が臨界点において分子の熱運動に伴って極大となり,正確な値を実験的に得ることはできない。そこで,便宜的に臨界温度がほぼ同じ三フロンの飽和液体中の音速を比較したとき,298.15Kにおける絶対値は臨界温度とは逆の順で増加した。しかし,その温度効果は物質によって大きく異なる結果を得た。また,臨界温度が最も低いHFC-23中の音速の温度・圧力挙動は前述の値とは異なった。HFCフロンの双極子能率は大きく,混合系液中の音速測定結果にも強い分子間相互作用を伺わせる温度・圧力・濃度依存性を得ている。これらは,純物質の臨界値,蒸気圧などから推定できる挙動とは大きく異なっている。測定中のPVT,蒸気圧の値を併用することによって,HCFC-22の熱力学的性質に近い混合系・濃度を見いだすとともに,系の挙動を詳細に検討でき得ることが判った。研究成果中には関連するフロン関係論文も記載した。〔I〕HFC-23+HFC-134aおよび〔II〕HFC32+HFC134a系中の蒸気圧,音速,PVTを種々濃度について測定し,温度・圧力・濃度依存性について調べた。これら純物質の臨界点(HFC-23:Tc=298.98K,Pc=4.82MPa;HFC-32:Tc=351.56K,Pc=5.83MPa;HFC-134a:Tc=346.25K,Pc=3.811Mpa)は大きく異なっている。ハロゲン化炭化水素化合物の熱物性値の絶対値は,蒸気圧-温度曲線,すなわち,臨界点の大きさに対応することが知れている。しかし,得られた結果は物質,混合系によって大きく異なることが判った。系[I]の蒸気圧,音速は濃度に対して大きく依存する結果を得た。一方、系[II]のPVTを含むこれらの値は濃度変化に伴ってほぼ直線関係を示しながら変化した。これら媒体の双極子能率は大きく,得られた結果の温度・圧力・濃度依存性にも強い分子間相互作用が関与していることを示唆した。系[II]のHFC-32の高濃度領域において諸熱物性値がHCFC-22の性質にもっとも近いことが判明した。このようにして得られた研究の成果は,今日,もっとも緊急を要するHCFC-22に代わる混合冷媒あるいは作動熱媒体を開発するための重要な基礎情報になると確信する。今後,これらの系,あるいは他の混合系について,諸性質の温度・圧力効果,特に,それらの濃度依存性についてさらに詳細な研究が必要である。
刷り込み学習の臨界期を決定する脳内分子機構

ある種の学習は、生後の限られた臨界期又は感受性期と呼ばれる時期にしか習得できない。刷り込み学習はその典型例である。臨界期が閉じたヒナに、T3を注射すると、再び臨界期が開く。本研究では、T3が学習臨界期を開く分子機構の解明を試みた。その結果、臨界期を過ぎたニワトリヒナ大脳では、T3静脈注射によりIMHA領域でWnt-2b mRNAが上昇した。そこで、薬理学的にIMHA領域でWntシグナル伝達を阻害したところ、T3による感受性期の回復が阻害された。この結果は、Wntシグナル伝達がT3の下流で感受性期間の開始に重要な役割を果たすことを示している。本研究の目的は、刷り込み学習の臨界期を開く甲状腺ホルモン(T3)に注目して、学習臨界期の分子基盤を解明することである。ある種の学習は、生後の限られた臨界期又は感受性期と呼ばれる時期にしか習得されず、その時期を過ぎると習得できなくなる。鳥類のヒナが、孵化直後に親を記憶して追いかける刷り込み学習はその典型的な例である。私たちは、刷り込み開始後、甲状腺ホルモン(T3)が脳内へ急速流入し、臨界期を開く決定因子となること、そして遺伝子的発現を伴わず速やかに作用し(nongenomic)、ヒナは記憶を獲得することを発見した。平成27年度では、学習臨界期の開始を決定する分子機構の解明を試みた。私たちは、T3の脳内注入によりリン酸化が更新する蛋白の同定をフォスフォプロテオーム解析により行った。その結果、nucleotide diphosphate kinase2 (NDPK2)のリン酸化が亢進されることが分かった。NDPK2のキナーゼ活性を特異的阻害剤により抑制すると、刷り込みの感受性期が再び開かなくなることから、T3の下流で、臨界期を再び開く情報伝達経路に関わっていると考えられた。これまでに、代表者はRhoGTPaseファミリー蛋白質の一つであるRhoキナーゼの活性阻害剤が、T3と同様にメモリープライミング活性を有することを見出している。今後は、Rhoキナーゼ情報伝達経路とNDPK2の関連を調べていこうと考えている。この成果は、Neurosci Lett. 2016 612:32-37にて報告した。平成27年度は、刷り込み学習の臨界期を開く甲状腺ホルモン(T3)に注目して、学習臨界期の開始かかわる情報伝達経路の解明を行った。そのために、T3の脳内注入によりリン酸化が更新する蛋白の同定をフォスフォプロテオーム解析により試みた。その結果、甲状腺ホルモンの下流で、臨界期を再び開く情報伝達経路に関わるnucleotide diphosphate kinase2 (NDPK2)を同定し、この成果は、Neurosci Lett. 2016 612:32-37にて報告した。学習臨界期の開始かかわる情報伝達経路の解析が順調に進んでいると思われる。鳥類のヒナが、孵化直後に親を記憶して追いかける刷り込み学習は感受性期を持った学習の典型的な例である。刷り込み開始後、甲状腺ホルモン(T3)が脳内へ急速流入し、臨界期を開く決定因子となることを発見した(Nature commun. 2012)。学習臨界期の開始を決定する分子機構の解明を試み、T3の脳内注入によりリン酸化が更新する蛋白の同定をフォスフォプロテオーム解析により行った。その結果、nucleotide diphosphate kinase2 (NDPK2)のリン酸化が亢進されることが分かった(Neurosci.letter 2016)。さらに、刷り込み感受性期を開くのに必要な脳領域も新たに同定した(Neuroscience 2015)。臨界期を有する学習では、孵化直後の親子間の刷り込みの他にも、ソングバードにおける歌学習がある。ニワトリなど巣を作らない鳥のヒナは、卵からかえるとすぐに歩くことができる。そして親鳥の後をついて行って、餌を食べることができる。それに対してソングバードなどの巣を作る鳥のヒナは、卵からかえった後自分では餌をとることができず、親の世話を必要とする。これらのヒナには刷り込みが存在しない。刷り込みが存在しない鳥でも甲状腺ホルモンは。学習に重要な機能を果たすのだろうか。ソングバードの一種であるキンカチョウの脳内甲状腺ホルモンの量変化をラジオイムノアッセイにより定量した。その結果、オスとメスでT3はピークを迎える時期が異なっていた。キンカチョウのオスは、親から歌を習い、自分で親の歌の真似をして習得する時期がある。メスは歌を歌わず、このような歌の習得はない。T3の脳内での濃度変化のオスとメスの違いが、歌学習に影響しているのかもしれない。この結果は、PloS one 2017, 12, e0169643に報告した。本研究では、学習臨界期の開始を決定する分子機構の解明を試みた。

私たちは、T3の脳内注入によりリン酸化が更新する蛋白の同定をフォスフォプロテオーム解析により行った。その結果、nucleotide diphosphate kinase2 (NDPK2)のリン酸化が亢進されることが分かった。NDPK2のキナーゼ活性を特異的阻害剤により抑制すると、刷り込みの感受性期が再び開かなくなることから、T3の下流で、臨界期を再び開く情報伝達経路に関わっていると考えられた。さらに、刷り込み感受性期を開くのに必要な脳領域も新たに同定した。これまで哺乳類の連合野と相同な脳領域Intermediate Medial Mesopallium (IMM)は刷り込みの記憶の獲得に必須であることが分かっていた。我々はIMMの下流で働く脳領域の1つとして、Intermediate Medial hyperpallium apicale (IMHA)に着目した。T3がIMMで働いた後、IMMで刷り込みの記憶が形成され、IMHAはIMMからの神経投射を介して情報を受け取ることを明らかとした。IMHAは、一度覚えた刷り込みの記憶を思い出すこと(想起)に必要であることが分かった。このように、おおむね順調に進んでいる。ある種の学習は、生後の限られた臨界期又は感受性期と呼ばれる時期にしか習得できない。刷り込み学習はその典型例である。臨界期が閉じたヒナに、T3を注射すると、再び臨界期が開く。本研究では、T3が学習臨界期を開く分子機構の解明を試みた。昨年度までに、刷り込み感受性期を開くのに必要な脳領域も新たに同定した。この成果を、Neuroscience誌に報告した(2015)。本年度は、cDNAマイクロアレイ解析のより、T3の静脈注射によりヒナ大脳で遺伝子発現が上昇する遺伝子を網羅的に解析した。その結果、臨界期を過ぎたニワトリヒナ大脳では、T3静脈注射によりいくつかの遺伝子発現が上昇しており、そのうちの一つがWnt-2bであった。In situ hybridizationの結果、Wnt-2b mRNAはIMHA領域でそこで、薬理学的にIMHA領域でWntシグナル伝達を阻害したところ、T3による感受性期の回復が阻害された。この結果は、Wntシグナル伝達がT3の下流で感受性期間の開始に重要な役割を果たすことを示している。その成果は、Hormones and behaviorに掲載された(2018 in press)。
天然物とホウ素クラスターのハイブリッド分子プローブ開発とがんの低酸素応答機構解明

(1)エトポシドトリエン誘導体が有する熱ショックタンパク60(HSP60)シャペロン阻害活性を模倣したホウ素クラスター分子の設計と合成・活性評価本申請者は、すでにHIF-1αタンパクの安定化機構を阻害するホウ素クラスター含有化合物の開発に成功しており、その分子標的タンパク質がHSP60であることを明らかにしている。一方、HSP60のシャペロン活性阻害化合物としてエトポシドトリエン誘導体であるETBが唯一報告されている。そこで、本研究では、本申請者が既に開発したホウ素クラスター含有化合物のHSP60のシャペロン活性阻害活性について、その評価系を構築して調べた。さらに、構造活性相関を行い、更に活性の高い化合物を見い出した。(2)三環縮環系複素環骨格を有するHIF-1転写阻害剤開発とその作用機序解明本申請者は、三環縮環系複素環骨格を有するインデノピラゾール誘導体が低酸素環境下において誘導されるHIF-1αの転写活性を阻害することを見出した。そこで、インデノピラゾール誘導体の活性相関を検討し非天然型HIF-1阻害剤として、もっとも高い活性を有する化合物を見い出すとともに、その誘導体のケミカルプローブ化を検討した。合成したケミカルプローブを用いて、その結合タンパクをインゲル消化法を用いて標的タンパク質同定を試みたが、同定は出来なかった。一方、構造活性相関研究の過程で、非常に高い細胞増殖抑制を示すインデノピラゾール誘導体を見出した。そこで、理化学研究所の長田研究室で開発されたMorphoBaseプロファイリング法ならびにChemProteoBaseプロファイリング法を用いて、同研究グループの川谷氏と共同研究により、標的タンパク質の探索を行った。その結果、このインデノピラゾール誘導体の標的タンパク質がチューブリンであることを突き止め、チューブリン重合を阻害することによって、高い細胞増殖阻害を示すことを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍組織内では、酸素、栄養が不足していることから、血管網形成のためにHIF-1αによる血管新生因子の産生が強く亢進されている。そこで、低酸素下で誘導されるHIF-1αをがん分子標的としこれを阻害することで、腫瘍血管新生を阻害しがんを兵糧攻めすることができると考えられる。そこで本研究では、がんの低酸応答に関わる新しいシグナル伝達系を探索し、がん治療分子標的薬剤の新しい分子標的を創薬研究分野に提供することを目的とする。そのために、天然物骨格を基軸にホウ素クラスターの立体電子的効果を利用したハイブリッド化合物を分子設計し、プローブ化することで、標的タンパクの分子ツールを作成した。1Manassantinーホウ素クラスターハイブリッド分子の設計と合成:Manassantinは、低酸素におけるHIF-1αの安定化を100nMの低濃度で阻害することが報告されているが、詳細な作用機序は明らかになっていない合成の鍵は、Manassantinの中心骨格であるテトラヒドロフラン環の不斉合成であり、多段階合成を必要とする。そこで、このテトラヒドロフラン環により立体的にrigidでbulkyなカルラン骨格を導入したManassantinーホウ素クラスターハイブリッド分子を合成し、構造活性相関を検討した。2Combretastatinーホウ素クラスターハイブリッド分子の設計と合成:Combretastatin類は、シススチルベン骨格を有する天然物で、チューブリンバインダーとして働き抗腫瘍活性を発揮することが知られている。最近、combretastatinのHIF転写活性阻害が明らかにされている。そこで、シスの立体を持つ炭素ー炭素二重結合部位にホウ素クラスターを導入したハイブリッド分子を合成し、その細胞内局在を明らかにするとともに、作用機序解明を行った。

その結果、このインデノピラゾール誘導体の標的タンパク質がチューブリンであることを突き止め、チューブリン重合を阻害することによって、高い細胞増殖阻害を示すことを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。24年度において、Manassantinーホウ素クラスターハイブリッド分子の設計と合成ならびにCombretastatinーホウ素クラスターハイブリッド分子の設計と合成に成功している。HIF転写阻害活性を調べた結果、いずれも元になった天然物であるManassantinおよびCombretastatinの活性には及ばなかったが、ホウ素クラスター骨格が代用できることを証明できた。特に、Manassantinーホウ素クラスターハイブリッド分子に関しては、オルソカルボラン、メタカルボラン、いずれも有効であることがわかり、国際学術誌ChemMedChemにて発表したところ、内部表紙に採択された。また、Combretastatinーホウ素クラスターハイブリッド分子では、ケミカルプローブ化に成功し、標的タンパク同定を行ったところ、チューブリンタンパクが同定できた。実際に、有酸素状態においても、がん細胞内でチューブリンの重合を阻害しているのではなく、微小管の骨格形成を異常にしていることがわかった。このことより、微小管形成が、HIF転写に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。25年度では、既に本申請者が見出した高いHIF転写阻害活性を有する小分子、インデノピラゾールならびにrotenone骨格に着目し、構造活性相関を行うことで、活性の向上を目指すとともに、ケミカルプローブ化を行い、標的タンパク同定について検討する。特に、インデノピラゾール骨格を有する化合物は、低酸素状態で誘導されるHIF-1αタンパクの蓄積には影響することなく、HIF転写阻害活性を示すことを明らかにしている。現段階では、合成小分子において、報告されているHIF転写阻害活性分子の中で、最も活性が高い。そこで、このインデノピラゾール骨格をもつ化合物をケミカルプローブすることにより、標的タンパクを同定するとともに、作用機序を明らかにする。また、rotenoneは報告されている天然物の中で最もHIF転写阻害活性が強い化合物である。その阻害活性は、IC50値で1ー5 nMである。そこで、この化合物の骨格を元に構造活性相関を行うとともに、標的分子の探索を行う。具体的には、rotenone骨格にお含まれるカルボニル基やビニル基に着目し、還元的アミノ化あるいはエポキシ化を経て、アミノ基を導入し、アフィゲルに固定することで、標的タンパクを同定するとともに、rotenenに関わるシグナル伝達に関して作用メカニズムを明らかにする。
光捕捉構造体のもつべき条件-フィコビリゾーム系による研究

光合成生物の光捕捉構造体とエネルギー変換系との機能的な結合の条件を明らかにする目的で、ラン藻Anabaena variabilisのフィコビリゾームの115KDポリペプチド(アンカー蛋白)についての研究を行なった。フィコビリゾームおよびその亜粒子について、それらに含まれる115KDの蛋白分解酵素や抗115KD血清に対する反応性を比較し、115KDがフィコビリゾーム・コアの内部に埋っていて光合成膜との附着に直接関与している可能性は小さいことを明らかにした。亜粒子からフィコビリゾームを再構成させる際の抗115KD血清の作用や115KD分解の効果などから115KDはフィコビリゾーム・コア内の蛋白分子の集合の維持にはたらいていると思われる。このような知見をもとに、光合成系の光捕捉能を拡大する条件を模索し、以下のような方法でこれを達成しうることがわかった。即ち、フィコビリゾームを除去した光合成膜標品に115KDを含むアロフィコシアニン粒子(14.5S)を結合させ、これを核としてまずフィコビリゾーム・コアを形成させ、ついでフィコシアニン亜粒子を会合させると光合成膜・フィコビリゾーム複合体に類似した標品を得ることができ、この標品はその酸素発生活性に関する光強度依存性についてもとの標品よりも10倍程度光捕捉能が拡大されているのが見られた。この標品から分離したフィコビゾーム様構造は正常なフィコビリゾームよりも不均一であり、解離しやすいが、光捕捉機能に関する限り正常なものに近い機能を示している。単離したフィコビリゾームを光合成能に附着させた場合には光捕捉能の拡大はたいしたことはなく、フィコビリゾームのEnergy Sinkの位置で光合成膜に附着しないものが多いためと考えられる。
珪酸塩メルトの超高圧下複合分光測定から探る「深い」マグマオーシャンのダイナミクス

本研究では、地球深部条件におけるマグマの物性(構造、熱伝導率)をブリュアン散乱分光法やラマン散乱分光法、近赤外ー紫外領域光吸収法等の分光学的手法と放射光を利用した測定を組み合わせて解明することを目的として研究を行った。まず、地球深部に相当する超高圧力条件での、マグマの模擬物質の弾性波速度測定及び構造の情報を抽出するための測定システムを整備し、圧力100万気圧を越える条件での測定に成功した。また、光吸収測定では圧力80万気圧を越える条件で測定を行うことが可能となった。このシステムを利用して、マグマの模擬物質の構造が100万気圧を越えて超高密度化し、熱伝導率が劇的に減少することを発見した。今年度は圧力100GPaを越える超高圧力条件でのその場ラマン散乱分光測定を実施し、従来の既存ラマン散乱分光測定では得ることができなかった、高分解能のラマンバンドの測定に成功し、特に含水系鉱物の高圧力条件下での結合様式についての知見を得ることができた。また、ブリュアン散乱分光測定装置についても炭酸ガスレーザー加熱装置を配備して高温高圧力条件下での弾性波速度測定を行うことが可能になった。現在のところ予備的実験において約20GPa程度の圧力条件および約2300K程度の温度条件でのブリュアン散乱データの取得に成功した。本装置を用いて現在のところ、SiO2+H2O系、GeO2系、MgGeO3系非晶質試料の測定を終えており、圧力200GPa程度までの超高圧力条件下での弾性波速度測定を実施し、いずれも非常に高品質なブリュアン散乱スペクトルの取得に成功している。いずれの系の測定においても、以前の我々の実験結果が示唆したような超高圧力条件下での高密度化現象を支持するような結果が得られつつあり、解析中である。また、非晶質試料の測定と並行して、含水鉱物を試料としたラマン散乱およびブリュアン散乱測定同時複合測定についての研究プロジェクトも実施し、現在までに最下部マントルの圧力条件までの測定に成功した。本研究プロジェクトで得られた結果は、沈み込むスラブのダイナミクスを議論するうえで非常に重要な知見を与えるものであり、現在論文としてまとめ投稿準備中である。ラマン散乱分光測定システムの導入を、研究代表者と代表者の指導する院生を中心として行った。導入における主たる作業は以下の3点(1)前方散乱構成のための光学系システムの設計、導入。(2)レーザー加熱時に発生する熱輻射の影響の軽減。(3)微小試料からの信号強度の効率的な取得のための共焦点光学系の開発と導入。(1)の工程に関して、レーザー加熱式ダイヤモンドアンビルセルを用いた高温高圧力条件下でのラマン散乱に関する文献を参考に、複合する他の光学系システムとの光学的、物理的干渉を避けた最適な光学パスについていくつかの設計図を作成し、実際のシステム構築時に最適なものを選択した。(2)に関しては、レーザー加熱を用いた分光測定実験のエキスパートである、カーネギー地球物理学研究所のゴンチャロフ博士と共同で、熱輻射の影響を最小化する対策について検討し、プローブレーザーの波長選択等の最適化をはかった。(3)の開発に関しては、(2)の事項とも関連した重要な工程である。応募者は、共焦点系の光学系の設計に関連して、日本ローパーの技術者とともに最適な設計を行った。(1)ー(3)の作業の結果、炭酸ガスレーザー加熱を用いた高温のラマン散乱システムの構築に成功した。上記、ラマン散乱測定システムの構築と平行して、ブリルアン散乱システムへのレーザー加熱システムの組み込みも行い、高温高圧での弾性波速度測定を達成させる測定システムを完成させた。圧力80万気圧までの中央海嶺玄武岩組成を有するガラスおよび(Mg,Fe)SiO3組成を有するガラスの近赤外ー可視領域における光吸収測定に成功し、両組成ともに各圧力条件における吸光度を決定し、圧力の増加とともに光の吸収が劇的に減少することを発見した。この現象のメカニズムを明らかにするために、大型放射光施設SPring-8のBL11XUの放射光メスバウアー測定装置を用いて、57Feを含有する(Mg,Fe)SiO3組成を有するガラスの測定を圧力85万気圧まで行い、圧力の増加とともに鉄原子の周囲の電子状態が徐々に変化することを明らかにした。本結果から、核マントル境界付近でのケイ酸塩メルトの有する放射熱伝導率を見積もったところ、周囲を取り囲む下部マントル構成鉱物が有する放射熱伝導率に比較して525倍ほども放射熱伝導率が低いことが明らかになった。このことは、核マントル境界にわずかに存在するとされる

ケイ酸塩メルトが核マントル境界での熱輸送構造に著しい不均質をもたらすもので、地震波超低速度層からの巨大マントル上昇流の発生のトリガーとなりうるものであることを示した。超高圧力実験計画通りシステムの整備を行い、圧力100GPaを越える超高圧力条件でのその場ラマン散乱分光測定を実施し、従来の既存ラマン散乱分光測定では得ることができなかった、高分解能のラマンバンドの測定に成功し、特に含水系鉱物の高圧力条件下での結合様式についての知見を得ることができたため。また、ブリュアン散乱分光測定装置についても炭酸ガスレーザー加熱装置を配備して高温高圧力条件下での弾性波速度測定を行うことが可能になり、予備的実験において約20GPa程度の圧力条件および約2300K程度の温度条件でのブリュアン散乱データの取得に成功したため。申請時の研究計画に記載した通り、レーザー加熱式ダイヤモンドアンビルセルを用いた高温高圧力条件下でのラマン散乱測定システムの構築およびブリルアン散乱測定シスムへの加熱システムの組み込みを滞り無く遂行する事ができたため。具体的には、ラマン散乱測定においては(1)前方散乱構成のための光学系システムの設計、導入。(2)レーザー加熱時に発生する熱輻射の影響の軽減。(3)微小試料からの信号強度の効率的な取得のための共焦点光学系の開発と導入。の3つの作業工程の達成と、ラマン散乱測定システムにおけるレーザー加熱式システムの組み込みを達成しることができた。また、ブリルアン散乱システムを用いた予備的な実験においては、低圧力条件ではあるが、高温高圧での弾性波速度その場測定を行うことができ、低融点物質のメルトからの弾性波速度測定に成功する事にもしたため、当初の計画以上に進展しているものと考える。今後はこれまでに整備したブリュアン散乱分光測定装置およびラマン散乱分光測定装置を複合的に組み合わせて、より高圧力高温条件での実験を行うための改良を進め、ガラスおよび液体における超高圧力条件下での弾性波速度およびラマン散乱データの取得することを進める。また、ラマンバンドのバンド解析についても並行して連携研究者との連絡を密にとり、ラマンデータの解釈をより強固なものとする計画を立てている。複合分光測定システムの評価と、珪酸塩メルトの測定開始複合分光測定システムの評価と最適化システムの評価には、BK7ガラス標準試料を用いてブリルアン散乱システムおよびラマン散乱システムの校正等を行う。また実際の実験を開始するのに平行して、測定に伴うシステムの改善点等の洗い出しを院生とともに行い、随時システムの改良を行い、すべてのシステムの最適化を終わらせる。珪酸塩メルトの複合分光測定の開始珪酸塩試料は、MgO-FeO-SiO2の3成分系において、マントルを代表する典型的な組成を有する(Mg,Fe)SiO3,(Mg,Fe)2SiO4を使用して実験を行い、複合分光測定を開始する。測定条件は、圧力30万気圧、温度3000Kの条件から始め、圧力は約10万気圧から5万気圧刻み、温度は100度200度刻みでの実験を行う。平成24年度末までには100万気圧、4000K以上の条件を達成させる。また、研究計画の進捗に応じて研究協力者との連携を深め、研究計画の年度内の遂行につとめる。該当なし
核マトリックス蛋白質による核内分子複合体の構築機構

ヒトおよびマウスの核内タンパク質としてクローニングしたN/MAXは多様な機能性領域を持つタンパク質である。すなわち、a)Cのクラスターを認識して2本鎖DNAに結合する領域、b)スプライシング因子に見られるアルギニン・セリンに富むRS領域、c)hnRNPに見られるポリミジン結合モチーフを持つMH2領域、d)酸性核マトリックス蛋白質であるマトリン3と相同なMH1、MH2およびMH3領域、e)LVTVDEVIEEEDLの配列が繰り返すAcidicrepeat領域、f)亜鉛フィンガーに類似した領域。N/MAX組換体の抗体は核当たり数百個の顆粒状構造体を蛍光染色し、この複合体は核分裂時に凝集クロマチンから排除されて細胞質に拡散し、分離を完了した複製クロマチンに再会合して娘核内に収納される。これらの特徴は、N/MAXが染色体の特定DNA領域やRNA分子を組み込んだ分子複合体に含まれて何らかの核内反応の場を形成していることを示す。本研究ではN/MAXに関して以下の研究実績を挙げた。N/MAXの各種領域を"biteprobe"とするTwo-Hybrid Systemで、スプライシング因子であるSF2と同様に、RSを含む領域を介して32kDaのタンパク質(SF2-p32)と相互作用することが判明した。このことは、N/MAXがpre-mRNAを中心に形成されるスプライシオソームの構成因子であることを示した。これをさらに検討するために以下の実験を行った。1)HeLa細胞の核抽出液および人工pre-mRNAからなる試験管内スプライシング反応系を構築し、N/MAX抗体の添加によるスプライシング反応の阻害を検討した。微弱な反応抑制効果を見たが完全阻害を確認するには至らなかった。2)N/MAXでは、hnRNP/IおよびLに見られるポリピリミジンを認識するRNA結合モチーフのコア配列が3回繰り返している(MH2)。スプライシングで切り出されるpre-mRNAのイントロンの3'側では、一般にピリミジン含量が高い。これらのことは、N/MAXがMH2を介してイントロン配列の3'側におけるスプライシオソーム構造の構築に寄与している感応性を示唆する。そこでN/MAXとマトリン3のMN2配列を含む組み換え体が選択的に結合するRNA配列をSELEX法で決定しようとし、取りあえず、マトリン3のMH2領域がポリピリミジン配列に結合することを確認した。3)最近、RothらはRS領域を持つタンパク質に対する新しいモノクロナール抗体を作製し、スプライシオソームに十数個のRSタンパク質の存在を新たに示唆した。この中に、200kDa以上のサイズを持つものがあることを報告しているので、この抗体の分与を受けてN/MAXとの交叉性を検討した。核抽出液を用いた予備実験では、Rothの示した200kDa以上のRSタンパク質がN/MAXであることが示唆された。

この中に、200kDa以上のサイズを持つものがあることを報告しているので、この抗体の分与を受けてN/MAXとの交叉性を検討した。核抽出液を用いた予備実験では、Rothの示した200kDa以上のRSタンパク質がN/MAXであることが示唆された。
非放射性DNAプローブによる歯周病原菌の同定法の確立と臨床応用

成人性歯周炎患者15名および健常者6名の口腔内のすべての残存歯から歯肉縁下プラークサンプルを採取し、Porphyromonas gingivalis(Pg)ATCC33277株の染色体DNAをスルホン化標識したプローブを用いてPgを検出した。また、同時にサンプリング部位におけるプロービングデプス(PD)とプロービング時の出血(BOP)の有無(+、-)を記録し、Pgの検出率、検出量と臨床パラメーターとの関連について統計学的に検索した。その結果、Pgは患者全員および健常者群の3名から検出され、患者群における検出率の平均は31%であった。臨床パラメーターとの関連については、PDが4,6mm以上あるいはBOP+の部位では有意に高い検出率を示し、逆にPgがより多く検出された部位では、PDが4、6mm以上あるいはBOP+の部位の比率が増加する傾向が認められた。しかしながら臨床的には健常である部位からもPgは検出され、またPDの深い、あるいはBOP+でもPgが検出されない部位も認められた。以上のことから、Pgは成人性歯周炎における歯周組織の破壊において重要な役割を果たしているが、それはPgのみによるものではないことが示唆された。また、Pg 381株の線毛構成蛋白をコードする遺伝子をプローブとして、RFLP分析により臨床から分離したPg株の線毛遺伝子領域における多様性について検討した。その結果、臨床株において多様性が認められた。また同一患者の同一歯周ポケットからも遺伝学的に異なるPg菌株が存在していることも示された。この結果は今まで報告されていたPgの線毛の表現型の多様性を裏付けるものであった。昨年我々はDNAをスルホン化することにより標識し、これに対するモノクロ-ナル抗体を用いて標的細菌を検出するDNAプロ-ブの実用化を試みた。その結果Porphyromonas gingivalis(P.g.),Prevotella intermedia(P.i.)より抽出した全菌体DNAプロ-ブは、実験株同定時において感受性、特異性が高いことが確認され、培養を必要としない歯肉縁下プラ-クよりの直接的な細菌検定が可能であるとの基礎的な結果が得られた。そこでさらにP.g.に対するプロ-ブを臨床サンプルに応用し、さまざまな臨床症状との比較検討を行なった。成人性菌周炎と診断された患者8名(780部位)より、ペ-パ-ポイント法により歯肉縁下プラ-クサンプルを採取した。その約1/20量をフィルタ-上にブロットし、P.g.プロ-ブとハイブリッド形成させた。その結果P.g.は被験者すべてから検出され、その検出頻度は38%にのぼり、歯周炎患者ではP.g.が広く口腔内に分布していることが認められた。またポケットが深くなるにしたがいその検出率は上昇し、ポケットの深さが6mm以上で80%、8mm以上で90%であった。またP.g.の存在量とポケットの深さの間に直線的な相関関係は認められなかったものの、多量のP.g.の存在と4mm以上のポケットの存在の間には強い相関が認められた。さらにプロ-ビング時の出血においても多量のP.g.の存在との間に相関が確認された。そのほかGI、PlIについてはP.g.の存在との間に相関は認められなかった。以上の結果より、P.g.は広く口腔内に分布しており、その量的な増加が認められた場合においては歯周組織の破壊と結びついている可能性が示された。これらの研究結果は1991年IADR学会、第17回日本歯科医学会総会にて報告を行なった。歯周疾患においてPorphyromonas gingivalis(Pg)は重要な細菌として注目されている。

そこで成人性歯周炎患者におけるPgの分布状況の検索を目的として、非放射性DNAプローブによるPgの検出を行った。成人性歯周炎患者の歯肉縁下プラークを採取し,スルホン化標識したPgの全菌体DNAプローブを用いてPgを検出した。また、各被験部位における臨床症状および血清中抗体価とPgの感染との関連性についても検討した。Pgは被験者全員から検出され、検出率は35%であった。Probing depth(PD)が4mm以上の部位では、3mm以下の部位と比べて有意に高い検出率を示した。Bleeding onprobing(BOP)(+)の部位では、BOP(-)に比べて有意に高い検出率を示した。また、逆にPgがより多く検出された部位において、PD4、6mm以上の部位およびBOP(+)の部位の比率の上昇が認められた。その一方で健全部位からもPgは検出された。また、Pgの感染と臨床症状の関連性において、患者間でばらつきが認められた。Pgの検出率および全検出量と抗体価との相関については,両者の間に統計学的に有意な相関は認められなかった。しかし血清中抗体価が低くPgが多く検出された被験者は認められなかったが、血清中抗体価が高いにもかかわらず,Pgの検出量が少ない被験者は何例か認められた。以上のことから、Pgは成人性歯周炎患者の口腔内に広く分布しており、歯周組識の破壊に深く関連していることが示唆された。しかし、歯周組織の破壊がPgの感染のみによって起こるのではないことも同時に示唆された。これらの研究結果の一部は1992年日中医学会、第9回ICPR学会総会にて報告を行なった。成人性歯周炎患者15名および健常者6名の口腔内のすべての残存歯から歯肉縁下プラークサンプルを採取し、Porphyromonas gingivalis(Pg)ATCC33277株の染色体DNAをスルホン化標識したプローブを用いてPgを検出した。また、同時にサンプリング部位におけるプロービングデプス(PD)とプロービング時の出血(BOP)の有無(+、-)を記録し、Pgの検出率、検出量と臨床パラメーターとの関連について統計学的に検索した。その結果、Pgは患者全員および健常者群の3名から検出され、患者群における検出率の平均は31%であった。臨床パラメーターとの関連については、PDが4,6mm以上あるいはBOP+の部位では有意に高い検出率を示し、逆にPgがより多く検出された部位では、PDが4、6mm以上あるいはBOP+の部位の比率が増加する傾向が認められた。しかしながら臨床的には健常である部位からもPgは検出され、またPDの深い、あるいはBOP+でもPgが検出されない部位も認められた。以上のことから、Pgは成人性歯周炎における歯周組織の破壊において重要な役割を果たしているが、それはPgのみによるものではないことが示唆された。また、Pg381株の線毛構成蛋白をコードする遺伝子をプローブとして、RFLP分析により臨床から分離したPg株の線毛遺伝子領域における多様性について検討した。その結果、臨床株において多様性が認められた。また同一患者の同一歯周ポケットからも遺伝学的に異なるPg菌株が存在していることも示された。この結果は今まで報告されていたPgの線毛の表現型の多様性を裏付けるものであった。