hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンチトロンビンIIIが血管内皮細胞の抗血栓性機能を促進する機序

健常な内皮細胞はプロスタグランジンI2(PGI2)やトロンボモジュリン(TM)などの血栓抑制因子を組織因子(TF)などの血栓形成因子より優位に産生しているため,血栓形成を抑制している.しかし,内皮細胞が様々な刺激物質に曝されると血栓抑制因子の産生が低下し,逆に血栓形成因子の産生が優位になり,血栓を生じ易くなる.アンチトロンビン-III(AT-III)は内皮細胞に作用してPGI2の産生を促進する.本研究はAT-IIIがPGI2産生だけでなく,他の内皮細胞機能に対しても抗血栓に向かわせるかを検討した.1.培養血管内皮細胞がTNFαに曝されると,TFの遺伝子転写活性を促進してTF抗原の発現を誘導すること.AT-IIIはTF転写を抑制してTF発現量を低下させることを明らかにした.2.抗がん剤であるブレオマイシンは血管内皮細胞に直接作用して,転写因子NF-κBを活性化して白血球接着因子であるELAM-1の遺伝子転写活性を惹起し,その発現を誘導することを突き止めた.しかし,AT-IIIはELAM-1の発現誘導を抑制することはなかった.4.酸化LDL中の酸化リン脂質がRARs, RXRαおよびSp1たんぱく質の内皮細胞での発現を低下させるため,それらたんぱく質がTM遺伝子上流のそれぞれの結合部位へ結合できなくなり,TM遺伝子転写活性が低下することを明らかにした.酸化LDLによるTM発現低下をアンチトロンビン-IIIが抑制する作用は認められなかった.以上の結果は,AT-IIIが内皮細胞に対して,一部抗血栓性に作用するが,すべての抗血栓機能を増強することはないことを示している.健常な内皮細胞はプロスタグランジンI2(PGI2)やトロンボモジュリン(TM)などの血栓抑制因子を組織因子(TF)などの血栓形成因子より優位に産生しているため,血栓形成を抑制している.しかし,内皮細胞が様々な刺激物質に曝されると血栓抑制因子の産生が低下し,逆に血栓形成因子の産生が優位になり,血栓を生じ易くなる.アンチトロンビン-III(AT-III)は内皮細胞に作用してPGI2の産生を促進する.本研究はAT-IIIがPGI2産生だけでなく,他の内皮細胞機能に対しても抗血栓に向かわせるかを検討した.1.培養血管内皮細胞がTNFαに曝されると,TFの遺伝子転写活性を促進してTF抗原の発現を誘導すること.AT-IIIはTF転写を抑制してTF発現量を低下させることを明らかにした.2.抗がん剤であるブレオマイシンは血管内皮細胞に直接作用して,転写因子NF-κBを活性化して白血球接着因子であるELAM-1の遺伝子転写活性を惹起し,その発現を誘導することを突き止めた.しかし,AT-IIIはELAM-1の発現誘導を抑制することはなかった.4.酸化LDL中の酸化リン脂質がRARs, RXRαおよびSp1たんぱく質の内皮細胞での発現を低下させるため,それらたんぱく質がTM遺伝子上流のそれぞれの結合部位へ結合できなくなり,TM遺伝子転写活性が低下することを明らかにした.酸化LDLによるTM発現低下をアンチトロンビン-IIIが抑制する作用は認められなかった.以上の結果は,AT-IIIが内皮細胞に対して,一部抗血栓性に作用するが,すべての抗血栓機能を増強することはないことを示している.血管内皮細胞は血栓抑制因子と形成因子の両者を産生する.健常な内皮細胞では両者の発現バランスにおいて抑制因子が優位であるため,血栓形成は抑制され血流が維持されている.しかし,内皮細胞が炎症性サイトカインや細菌性毒素などの様々な刺激を受けると,血栓形成因子の発現が優位となるため血栓が生じやすく,多臓器不全や脳梗塞など重篤な疾患を引き起こす.血管内皮細胞が産生する血栓形成因子として組織因子(TF)が知られており,内皮細胞が組織壊死因子(TNF-α)などの炎症性サイトカン刺激を受けると発現が誘導される.一方,アンチトロンビンIII(AT-III)は血流中に存在するトロンビン阻害タンパク質で内皮細胞のPG12産生を促進することが知られ,内皮細胞の抗血栓性維持に寄与していることが推測されている.本研究は内皮細胞がTNF-α刺激を受けてTFが発現誘導するのをAT-IIIが抑制し,PG12産生以外にも内皮細胞の抗血栓性維持に寄与しているか否かを検討した.1.培養血管内皮細胞にTNF-αを添加すると,添加後6から8時間をピークにTFの発現が認められ,発現量はTNF-αの添加量に依存していた.3.TNF-α刺激によって発現したTFをAT-IIIは用量依存的に抑制した.内皮細胞は炎症時にELAMやICAMそしてVCAMなどの白血球に対する接着因子を産生し,内皮細胞障害を促進させることが知られている.その白血球接着因子としては白血球の内皮細胞へのローリングを引き起こすELAMなどのE-selectinがtriggerとして最も重要である.抗がん剤の一つとして汎用させているブレオマイシンは副作用として肺線維症を引き起こし,本剤の使用量が制限されている.本研究では,肺血管内皮細胞がブレオマイシンに曝されると,ELAM-1を産生誘導し,そのため白血球が内皮細胞に接着しやすくなり,その後,白血球が内皮下組織に浸潤して肺線維症を引き起こすのではないかと考え,その機序の検証とアンチトロンビン-IIIがELAM-1誘導を抑制し,肺線維症の予防および治療効果をもつか否かを検討した.

1)ヒト臍帯から調製した培養内皮細胞に,15μMのブレオマイシンを曝すと,ELAM-1の転写活性が濃度依存的に6時間をピークに高まり,抗原量はそれに2時間ほど遅れて発現上昇することが明らかになった.2)ブレオマイシンによるELAM-1の転写活性の増加はELAM-1遺伝子のプロモーター領域にあるNF-κB/Rel結合配列にp65/p50から成る活性化NF-kBがその配列に結合するためであることが明らかになった.3)1および2の結果は作業仮説通り,内皮細胞はブレオマイシンに曝されるとELAM-1を発現誘導し,内皮細胞障害に直接関与していることを示唆している.4)NF-kBの活性化をアンチトロンビン-IIIが抑制するか否かを検討したが,種々の濃度およびアンチトロンビン-III作用後12時間以内でNF-kBの活性化およびELAM-1の発現誘導を抑制することはできなかった.トロンボモジュリン(thrombomodulin, TM)は血管内皮細胞の膜表面に発現し,抗血栓機能を有する糖たんぱく質である.動脈硬化巣に蓄積する酸化LDLはTMの遺伝子転写活性を抑制し発現量を低下させることが知られており,動脈硬化巣で血栓が発症する原因のひとつと考えられている.本研究では酸化LDLがTM遺伝子の転写を抑制する機序を明らかにし,このTM発現低下に対するアンチトロンビン-IIIの抑制効果を検討した.その結果,以下の成果を得た.1.酸化LDL脂質画分中の酸化リン脂質がTM遺伝子転写を抑制していることが明らかになった.2.TM遺伝子の5'-flanking regionにはレチノイン酸応答配列およびSp1結合配列がある.ゲルシフトアッセイの結果,酸化LDLはレチノイン酸結合たんぱく質(RAR,RXR)およびSp1の細胞内での発現量を低下させ,その結果レチノイン酸応答配列へのRAR,RXRの結合およびSp1結合配列へのSp1の結合を低下させていることが明らかになった.3.酸化LDLによるTM発現低下をアンチトロンビン-IIIが抑制する作用は認められなかった.本研究成果は動脈硬化巣で血栓が生じやすいひとつの原因として,動脈硬化巣に蓄積する酸化LDLがレチノイン酸結合たんぱく質およびSp1の発現低下を介して内皮細胞表面でのTM発現量を低下させることによる機序を明示した.しかし,期待したアンチトロンビン-IIIのTM発現低下抑制は認められなかった.
微弱電波を利用した視覚傷害者・高齢者の歩行案内・誘導システムに関する基礎的研究

視覚障害者や高齢者が一人で都市内を歩行するとき、微弱電波を利用した補助システムとして歩行案内・誘導システムの基礎的研究を実施して多くの知見を得た。研究の内容は、心理地図作成のための視覚障害者に対する意識と歩行訓練の調査分析と、携帯ラジオから情報収集のために必要となる出力電界強度と音圧との相関特性調査の二部野についての研究である。1.心理地図盲学校の生徒の協力により、歩行時に問題となる障害物、ランドマーク、公共交通機関の駅での昇降、歩行に必要な情報等に関する意識調査を行い、歩行案内でもっとも重要となる情報を確定した。また、一般視覚障害者の地下鉄駅から県立図書館までの歩行訓練時の訓練状況を録画すると共に歩行訓練士の指導内容を録音しその結果を分析し、視覚障害者の歩行特性を明らかにした。その結果、心理地図作成に必要となる情報の種類及び情報提供の仕方が明らかとなり、心理地図作成のマニアルに近いものを作成した。なお、本研究では、視覚障害者の意見等を聞いた結果、誘導情報より地点での面的な案内情報が最優先するとのことで、一地点で数以内でしか聞こえない微弱電波により提供する心理地図の作成を主眼とした。2.出力電界強度と音圧との相関特性携帯ラジオはAGTの無いラジオを考えているので、微弱電波の出力電界強度とこの電波を受信するラジオの音圧(ボリューム一定時)との関係が重要になってくる。実験の結果、送信機の微弱電波出力が60dB以下でも発信点から5以内であれば、ラジオからの出力音圧(dB)に変化が見られなかった。なお、5以上離れると微弱電波出力は急激に減衰するので音圧もこれに比例して減少し聞こえなくなることが解った。本年度の研究は、街路を一人で歩行する視覚障害者に必要とする多くの情報を付与するために、微弱電波を利用して視覚障害者等が持つ受信器から音声情報として伝達する街路案内システムの開発を目ざして基礎的な問題点を解明した。1.心理地図の作成準備(1)視覚障害者歩行訓練調査歩行訓練士の協力により視覚札障害者に対する歩行訓練の座学と実習をビデオテ-プに記録し調査した。その結果、歩行者の"杖振り""伝い歩き"についての技術的な問題が明らかになった。また、歩行速度及び歩行軌跡等についても調査したが、視覚障害者の歩行経験によりなかなりの差がみられた、平均すると歩行速度82.6cm/s、歩幅47.4cmと健常者の80%以下であることが明らかになった。(2)視覚障害者の移動に関する意識調査名古屋盲学校の協力により19項目の質問について10人の回答者に面接調査を行った。その結果、"電車、バスの乗降の問題""ランドマ-クについて""方向の確認""人に目的地の尋ね方""距離感の確認法""階段、段差の確かめ方"等について問題点が明らかになった。2.電界強度と音圧との相関特性調査情報を微弱電波で発信して、これを受信器で受信し音声情報として得るためには、発信出力と受信音圧の関係を明らかにしておく必要がある。地上に展長したアンテナの上に発信器から1mと5m地点にATCを取った受信器を置き、受信器から1m離れた地点での音圧レベルと電界強度との関係を測定したのが右図である。これによれば発信出力60dB以上であれば、1m、5m地点ともほば音圧レベルの減衰が認められない。本年度は、平成3年度に行った視覚障害者の歩行に関する意識調査と歩行訓練調査の分析を実施し、その結果、都心部での心理地図作成時に盛り込むべき事項を集約する事ができた。

心理地図の提供方法として、前年度までの研究調査により誘導的情報提供(歩道下等に設置したアンテナからの微弱電波による情報提供方法)ではなく、案内的情報提供(一地点で半径23m以内に届く微弱電波による情報提供方法)が視覚障害者にとって非常に重要であることが解った。また、案内的情報提供方法でも地点情報としてある区域を包含する面的な情報があり、ついで面的な情報の中で本人が必要とする目的地としての点情報(建物、停車場等)が出現する、いわゆる情報の連続性が非常に重要であることが明かとなった。本研究では、前年度の二回にわたる調査分析結果と他の参考資料を集約して、主として案内的情報としての心理地図作成時に必要な情報資料として、最小限どのような事項にまで制限すべきかを中心に研究しその概要を示した。1.全般的事項a.地区周辺の主要公共施設の名称b.目的地への経路c.道路条件d.交差点e.ランドマーク2.交通機関に関する事項a.駅及びその内部b.ルートその他、本研究を通じて視覚障害者と関わりの中で知り得た情報を基に都市施設整備上注意しなければならないことを、歩道、階段、信号、電車・バスのホームに分け列挙した。
RNAサイレンシング経験植物に影響を及ぼす化合物の作用解析

本研究の目的は、植物においてRNAサイレンシングによって抑制された遺伝子の発現を復帰させることができる新規化合物を同定することである。化合物スクリーニングおよび分子生物学的手法による検定の結果、ひとつの特定のケミカルが最終候補としてみつかった。植物へのこのケミカルの処理によって、指標タンパク質とmRNAの蓄積の増加だけではなくRNAサイレンシングの指標であるsiRNAの蓄積も増加することがわかった。RNAサイレンシングとは、内在性RNAの配列と相同な配列または相補的な配列をもつ外来性RNAを導入すると両RNAが分解を受けるという現象である。植物において、RNAサイレンシングによる発現抑制機構が遺伝子組換による特定遺伝子の高発現を妨げていた。本研究の目的は、RNAサイレンシングによって抑制された遺伝子の発現を復帰させることができる新規化合物を同定し、それらの化合物のRNAサイレンシング経路内での作用点を明らかにすることである。一次スクリーニングとして96穴プレート上で、保有する約6千種の化合物をGFP-OLE融合タンパク質の遺伝子がサイレンシングしたシロイヌナズナに添加し、それらをUV照射下で撮影した。GFP蛍光強度をImage-Jソフトウエアを駆使した画像解析によって数値化し、GFPの蛍光が復帰するものを探索した。その結果、少なくとも70の化合物がGFP蛍光を何らかの理由により強めることがわかった。それらのうち、およそ8割の化合物は、植物の生長を阻害するものであった。さらに二次スクリーニングをおこない、今後の解析に進める約10種類の化合物を選んだ。一方、候補化合物の作用点を調べるため、BY-2懸濁細胞から作製したライセートを用いたRNAサイレンシングの実験系を確立した。この実験系を用いることにより、候補化合物がAGOによる標的mRNAの分解を阻害できるかを調べることができる。現在までに、この実験系を用いて候補化合物AがAGOによるmRNA分解を阻害できるかをまず試したが、その点を阻害できないことがわかった。一次スクリーニングとして、保有する約6千種の化合物をGFP-OLE融合タンパク質の遺伝子がサイレンシングしたシロイヌナズナに添加後、UV照射下で撮影し、GFP蛍光を復帰させるケミカルを探索した。さらに二次スクリーニングも行い、4つのケミカルを候補化合物として選んだ。2週間、候補ケミカルを含んだ培地で生育させた植物を観察したところ、無処理植物に比べて、形態異常や白化がみられる傾向を確認した。ウエスタンブロットによるOLE-GFPのタンパク質を検出したところ、候補ケミカル処理によるタンパク質の蓄積増加を確認した。候補ケミカルのRNAサイレンシングへの影響程度を知るために、ノーザンブロットによるOLE-GFPのmRNAおよびGFPのsiRNAの検出をおこなった。その結果、ひとつの特定のケミカル(ケミカルA)処理によって、mRNAの蓄積の増加だけではなくRNAサイレンシングの指標であるsiRNAの蓄積も増加することがわかった。ウイルスがもつサイレンシング抑制因子の多くは、siRNAに結合し安定化させる一方で、RNAサイレンシングを抑制することがわかっている。ケミカルAによる現象はサイレンシング抑制因子の作用に似ている。したがって、siRNAに結合する因子がケミカルAの標的となっている可能性が示唆された。植物分子生物学スクリーニングの撮影に使用している顕微鏡の不具合がたびたび発生したために、遅れがでた。RNAサイレンシングの指標の一つとして、siRNAの蓄積量が挙げられる。スクリーニングにより同定した候補化合物の処理により、siRNAの蓄積に影響がでるかを調査する。候補化合物のうち約8割が、植物の生長を遅らせてしまう。RNAサイレンシング経路と発生に関与するmiRNA経路は密接に関係している。いくつかの化合物はmiRNA経路を阻害しているかもしれない。したがって、生育遅延を起こす化合物について、miRNAの蓄積も調べるつもりである。また、BY-2ライセートを用いた実験系を駆使して、候補化合物がAGOの活性を阻害するかを調べていく。機器の故障が発生したため研究に遅れが生じ、学会や誌上での発表ができなかった。スクリーニングにより同定した候補化合物やラジオアイソトープによるsiRNAやmiRNAの検出のための機器類、試薬類の購入費用とする。さらに、学会において成果を発表するための旅費や誌上発表の費用とする。
性フェロモンにより誘起される生殖内分泌・性行動の神経回路解明

動物の生存のためには、外界の情報により体内の状態や行動を変化させることが不可欠である。とりわけ生殖活動においては多くの動物種で性フェロモンの情報が行動や内分泌系の制御に大きな役割を持つ。しかし、性フェロモンがどのような神経回路を介して内分泌・行動の変化をもたらすのかについては断片的にしか明らかになっていない。本研究は、脳が比較的小さいため脳全体の神経活動の同時的解析ができる、ノックアウトやトランスジェニックが容易に作出可能であるというメリットを持つゼブラフィッシュをモデルとして用い、性フェロモンの嗅覚入力から行動発現・内分泌変化という出力に至る一連の神経回路を包括的に解明することを目指す。
シトルリン血症におけるアルギニノコハク酸合成酵素異常の分子病理

尿素サイクル酵素の1つであるargininosuccinate synthetase(ASS)の異常は高アンモニア血症を伴ったシトルリン血症を引き起こす.これまでに120症例を超えるシトルリン血症を診断し,ASS蛋白の酵素学的解析,酵素欠損の臓器特異性,代謝変倚の違いなどから3型に分類し,その特徴を報告してきた.また分子遺伝学的解析により,成人発症II型シトルリン血症の病因が新生児小児発症シトルリン血症とは明らかに異なることを見いだし,2病型に大別した.本研究期間に得られた結果をそれぞれの病型ごとにまとめて報告する.(1)全身性のASS異常を示す新生児小児発症シトルリン血症では,27症例のcDNAおよび遺伝子を解析し,ASS遺伝子上に21種類の変異を同定した.特に日本の症例において2つの主要な変異の存在を見いだし,その遺伝子診断法を確立した.IVS-6^<-2>変異(mRNA上でexon7欠失を起こすスプライシング異常)は,日本の15症例中11症例(73%);29allele中15allele(52%)に存在し,非常に高い頻度を示した.次に続く比較的頻度の高いR304W変異は,4症例;4allele(14%)に見いだされた.これら2つの変異は,すでに報告しているアメリカの12症例には認められず,現在のところ日本に特徴的である.(2)わが国で数多く見られる成人発症II型シトルリン血症の特徴は肝臓特異的ASS欠損を示すことである.このことは,5年前に肝臓移植手術を受けた1症例においてその治療効果をあげている事実からも確認できる.今回,II型の病因がASS遺伝子上にないことをhomozygosity testにより明らかにした.すでに100症例近くのII型を酵素学的に診断してきたが,今のところ確定診断法としては肝臓のASS活性測定しかない状態である.II型は難病の1つであり,発症してからの予後は決して良くない.診断と治療の面からも病因解明は急務であり,現在,真の原因遺伝子の同定に取り組んでいる.尿素サイクル酵素の1つであるargininosuccinate synthetase(ASS)の異常は高アンモニア血症を伴ったシトルリン血症を引き起こす.これまでに120症例を超えるシトルリン血症を診断し,ASS蛋白の酵素学的解析,酵素欠損の臓器特異性,代謝変倚の違いなどから3型に分類し,その特徴を報告してきた.また分子遺伝学的解析により,成人発症II型シトルリン血症の病因が新生児小児発症シトルリン血症とは明らかに異なることを見いだし,2病型に大別した.本研究期間に得られた結果をそれぞれの病型ごとにまとめて報告する.(1)全身性のASS異常を示す新生児小児発症シトルリン血症では,27症例のcDNAおよび遺伝子を解析し,ASS遺伝子上に21種類の変異を同定した.特に日本の症例において2つの主要な変異の存在を見いだし,その遺伝子診断法を確立した.IVS-6^<-2>変異(mRNA上でexon7欠失を起こすスプライシング異常)は,日本の15症例中11症例(73%);29allele中15allele(52%)に存在し,非常に高い頻度を示した.次に続く比較的頻度の高いR304W変異は,4症例;4allele(14%)に見いだされた.これら2つの変異は,すでに報告しているアメリカの12症例には認められず,現在のところ日本に特徴的である.(2)わが国で数多く見られる成人発症II型シトルリン血症の特徴は肝臓特異的ASS欠損を示すことである.このことは,5年前に肝臓移植手術を受けた1症例においてその治療効果をあげている事実からも確認できる.今回,II型の病因がASS遺伝子上にないことをhomozygosity testにより明らかにした.すでに100症例近くのII型を酵素学的に診断してきたが,今のところ確定診断法としては肝臓のASS活性測定しかない状態である.II型は難病の1つであり,発症してからの予後は決して良くない.診断と治療の面からも病因解明は急務であり,現在,真の原因遺伝子の同定に取り組んでいる.シトルリン血症は、尿素サイクル酵素の1つであるアルギニノコハク酸合成酵素(ASS)の異常に基づく代謝性疾患であり、病因を異にする新生児小児発症型と成人発症型(TypeII)の2つに大別される。本研究の目的は、シトルリン血症におけるASS異常の病因を明らかにし、基礎的・臨床的分野に応用することである。新生児小児型シトルリン血症のASS欠損は、全身性に見られるものであり、その異常はASS遺伝子上に存在する。すでに14症例の解析を行い、14種類の変異を明らかにしている。mRNA抽出→cDNA合成→PCR増幅→M13クローニング→塩基配列決定という手法に従って、さらに別の症例の解析を行っている段階である。個々の症例について変異部位が同定できれば、希望する家族に対する出生前診断は可能である。変異を確認する発現系としてサル腎臓由来のBMT-10細胞システム以外に、操作が簡単なpETベクターを使用した方法を検討している。すでにpETシステムにより正常ASS蛋白が大量に発現でき、しかも充分に酵素活性を持つことを確認しているので、変異ASSの解析に応用できると考えている。一方、肝臓特異的ASS欠損を示す成人発症TypeIIシトルリン血症はこれまでに84症例を解析しており、そのうち20症例が血族結婚由来である。

もしASS遺伝子上にその異常が存在してTypeIIシトルリン血症が発症しているのであれば、血族結婚由来のAllele-DNAはHomozygosityが存在するはずである。しかし、ASS遺伝子内に存在する多型性マーカーを用いてRFLP解析を行ったところ、血族結婚由来の16症例のうち5症例はヘテロ接合体を示した。しかもそれらヘテロ接合体を示す頻度は対照と同じ30%であった。このことはTypeIIの原因がASS以外の別の遺伝子上に異常があり、その遺伝子の産物が肝臓特異的にASS蛋白低下に関係していることを示唆している。シトルリン血症は、尿素サイクル酵素の1つであるアルギニノコハク酸合成酵素(ASS)の異常に基づく代謝性疾患であり、病因を異にする新生児小児発症型(I型、III型)と成人発症型(II型)の2つに大別される。本研究の目的は、シトルリン血症におけるASS異常の原因を明らかにし、基礎的・臨床的に応用することである。昨年度は、homozygosity testを用いた解析により、肝臓特異的にASS欠損を示す成人発症II型シトルリン血症の原因がASS遺伝子上になく、他の未同定遺伝子の異常に起因する可能性を明らかにした。今年度(平成5年度)は、日本における新生児小児シトルリン血症の変異解析結果を中心に報告する。新生児小児発症型のASS欠損は全身に見られ、主にアメリカの14症例の解析からすでに14種類の変異を固定したように、その異常がASS遺伝子上に存在することは明白である。今回、日本のシトルリン血症I型5症例とIII型5症例からmRNA抽出→cDNA合成→PCR増幅→M13クローニング→塩基配列決定により、新たに5種類のミスセンス変異(A118T,A192V,R272C,G280R,R363L)を同定することができた。以前報告したR304W変異がさらに3症例に存在していた。これらすべてのミスセンス変異が、酵素の動力学的性質に異常をきたしたI型シトルリン血症に認められたことは興味深いことである。一方、mRNA内にexon7が完全欠失したDELTAEx7変異は、ASS蛋白が検出限界以下に低下するIII型を中心に多くの症例で見いだされた。ASS遺伝子上の異常部位を調べたところ、intron6の3′端側近くに1塩基置換(IVS-6^2変異)が確認でき、その結果スプライシング異常が生じることが示唆された。この塩基置換により変異遺伝子上に出現する制限酵素MspI siteを利用して遺伝子診断を行ったところ、IVS-6^2変異は15症例中11症例と非常に高頻度で存在すること、allele頻度では52%を占めることが明らかになった。
統合失調症におけるミクログリア制御異常による白質・シナプス伝達障害の機構解明

精神疾患患者を含む患者でのミクログリア異常を解明するための橋渡し研究ツールとして、末梢血単球に2種類のサイトカインを添加することでわずか2週間で作製可能な直接誘導ミクログリア様細胞(iMG細胞)を独自開発し、一次性ミクログリア病の那須ハコラ病患者、双極性障害患者、線維筋痛症患者で、iMG細胞の活性レベルが重症度と相関するなど疾患特異的な興味深い反応の抽出に成功した。さらに、ヒト線維芽細胞由来直接誘導ニューロン(iN細胞)の作製技術を自身のラボで改良し、わずか1週間で誘導可能な早期iN細胞の作製に独自で成功し、NF1患者由来の早期iN細胞において興味深い遺伝子発現パターンを見出すことに成功した。統合失調症におけるミクログリアを介した病理的な機構を解明するために、我々の班では、向精神薬を用いた基礎的な研究と、ヒトを対象としたトランスレーショナル研究の二本柱で研究を推進している。本年度は、まず、齧歯類由来のミクログリアとオリゴデンドロサイトとの共培養実験によって、ミクログリア活性化抑制作用があり抗精神病効果が見出されているミノサイクリンや一部の抗精神病薬に、活性化ミクログリアの制御を介したオリゴデンドロサイト保護作用を見出し、国際学術誌に報告した(Seki et al. Schizophrenia Research 2013)。統合失調症を研究対象とするからには、最終的にヒトにおける病理解明が不可欠である。従来の研究では、ヒトの脳内の神経やグリアを直接的に解析することは倫理的・技術的な問題からほぼ不可能であった。我々は、この限界を補うべく、ヒトの体細胞(血液や皮膚繊維芽細胞など)から、神経やグリアを誘導し、こうして誘導された細胞を解析することで患者の脳内のin vitroレベルの異常を検出するシステムを構築しつつある。本年度は、ヒト血液から各種誘導因子の導入により2週間でミクログリア様細胞を作製する技術を開発し、特許申請した(加藤隆弘,扇谷昌宏,神庭重信:特願: 2014-002129)。来年度以降の統合失調症の病態解明に強力なツールとなることが期待される。統合失調症におけるグリア仮説、特にミクログリア仮説を検証するために、モデル動物を用いた実験に加えて、ヒト血液由来直接誘導ミクログリア様細胞(iMG細胞)を用いたトランスレーショナル研究を実施している。Cuprizone投与モデルマウスにおいて、海馬におけるミクログリア活性化を認め、特定の薬剤が活性化制御することを見出しており、現在、論文投稿中である。本年度は、齧歯類由来のミクログリアを用いた培養実験によって、ウイルス感染症に類似したミクログリア活性化を呈するモデル細胞を作製し、一部の抗精神病薬が特定のチャネルを介してミクログリア活性化を抑制する可能性を見出しており、現在、その検証を進めている。さらに、ヒト血液から各種誘導因子の導入により2週間でミクログリア様細胞を作製する技術(iMG細胞技術)を我々の研究室では開発しており、この技術の国際特許出願を行った。現在、この技術を、統合失調症をはじめとする精神疾患のミクログリア仮説解明のための橋渡しツールとして応用し、臨床と基礎とを繋ぐ研究を進めている段階にある。抗精神病薬がミクログリア細胞のどのチャネルに働くか従来までの研究では明らかになっていなかったが、我々の今年度の研究により、その機構を明らかにしつつある点。加えて、ヒト血液由来ミクログリア様細胞(iMG細胞)の製作技術を駆使したトランスレーショナルを推進している点。統合失調症モデル動物を用いたミクログリアを中心とするグリアの異常解析を進めている。現在のモデルにおいて、海馬でのミクログリア過剰活性化を認めている。抗精神病薬による影響も測定しているところである。橋渡し研究としては、精神疾患における神経グリア相関異常を解明するためのトランスレーショナル研究を推進しており、平成28年度は、双極性障害患者から血液由来ミクログリア様(iMG)細胞を作製し、解析を行った。3名の患者由来iMG細胞において、躁状態の時と比べてうつ状態の時にCD206の遺伝子発現が亢進していることを見出すことが出来た(Ohgidani et al. Frontiers in Immunology 2017)。来年度は、さらに症例を増やして、妥当性を検証してゆく予定である。モデル動物実験では海馬でもミクログリア過剰活性化を見出すことに成功している。精神疾患患者から血液由来ミクログリア様(iMG)細胞を作製し、解析を行っており、いくつかの興味深い知見をFrontiers in Immunology誌をはじめとする国際学術誌に掲載することが出来たため。我々は、本研究において、ヒト末梢血からわずか2週間でミクログリア様細胞(iMG)を作製する技術を開発した(Sci Rep 2014)。このiMG技術により、これまで不可能であった患者のミクログリアの活性化特性や薬剤反応性が予測可能となり、臨床所見(診断・各種検査スコア・重症度など)との相関を解析することで、ミクログリア活性化特性が様々な精神病理現象にいかに影響するかを探ることが可能になると期待される(Front Cell Neurosci 2015)。今年度は、双極性障害患者および線維筋痛症患者由来iMG細胞の解析により、その反応の疾患特異性を見出した。

双極性障害患者では、M2タイプの特徴的マーカーであるCD206のmRNA発現がうつ相で上昇していた(Front Immunology 2017)。線維筋痛症をもつ女性患者では、女性健常者と比べて、ATP刺激後1時間のTNF-αmRNA発現および産生が上昇していた(Sci Rep 2017)。他方、米国ではiPS細胞由来ニューロン作製解析に加えて、直接誘導ニューロン(iN)技術を用いた橋渡し研究が推進しており、我々は、ヒト皮膚由来の繊維芽細胞から3種類の転写因子導入により、わずか一週間で早期ニューロンを作製する技術を独自に開発した。本技術により、レックリングハウゼン氏病(NF1発現異常により発達障害を高頻度で併存する遺伝性疾患)患者由来のiN細胞を解析し、MEX3D, BCL2, FOSなどの発現異常を見出した(Sci Rep 2017)。今後、iMG技術とiN技術とを融合させることで、ミクログリアーニューロン相関の異常解明のための橋渡し研究をさらに推進してゆければと期している。精神疾患患者を含む患者でのミクログリア異常を解明するための橋渡し研究ツールとして、末梢血単球に2種類のサイトカインを添加することでわずか2週間で作製可能な直接誘導ミクログリア様細胞(iMG細胞)を独自開発し、一次性ミクログリア病の那須ハコラ病患者、双極性障害患者、線維筋痛症患者で、iMG細胞の活性レベルが重症度と相関するなど疾患特異的な興味深い反応の抽出に成功した。さらに、ヒト線維芽細胞由来直接誘導ニューロン(iN細胞)の作製技術を自身のラボで改良し、わずか1週間で誘導可能な早期iN細胞の作製に独自で成功し、NF1患者由来の早期iN細胞において興味深い遺伝子発現パターンを見出すことに成功した。統合失調症におけるグリア仮説、特にミクログリア仮説を検証するために、モデル動物を用いた実験に加えて、ヒト血液由来直接誘導ミクログリア様細胞(iMG細胞)を用いたトランスレーショナル研究を実施している。Cuprizone投与モデルマウスにおいて、海馬におけるミクログリア活性化を認め、特定の薬剤が活性化制御することを見出しており、現在、論文投稿中である。前年度に引き続き、齧歯類を用いた基礎研究を、iMG細胞を鍵にしたヒト対象のトランスレーショナル研究をすすめてゆく。引き続き、上記の研究を推進してゆく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。精神神経科学モデル動物実験に加えて、iMG細胞を用いた統合失調症患者での臨床研究を推進してゆく。今年度は、齧歯類由来のミクログリアxオリゴデンドロサイト共培養システムを開発し、ミクログリア活性化抑制がオリゴデンドロサイトを保護する可能性を見出したこと、および、ヒトの体細胞から直接誘導ミクログリア様細胞作製法開発に成功したことから、研究は概ね順調に進展している。こうした成果を来年度以降の研究に活かしてゆきたい所存である。引き続き、(1)齧歯類由来のグリア細胞を用いたin vitro研究、(2)齧歯類モデル動物を用いたin vivo研究、(3)ヒト体細胞由来の誘導ミクログリア細胞等を用いたトランスレーショナル研究を推進してゆく。
環境会計情報が経営者意識および経営展開に及ぼす影響-北海道畑作経営を事例として-

地域の慣行と比較して化学肥料と農薬の使用を削減した特別栽培による小豆を対象に、環境会計を算定した。その結果、収益については特別栽培の方が慣行栽培よりも高く、労働時間については特別栽培の方が長い。これは機械の利用時間の延長をもたらし、二酸化炭素排出量を増加させる。これら計算結果について特別栽培を行う経営者に示したところ、収益は加算金があるために高いという点については認識したが、営農活動と二酸化炭素排出量を結びつけて考えるのは難しいと回答した。環境省「環境会計ガイドライン2005年版」によれば、一般的に企業に導入されている環境会計には以下に示す三つの構成要素がある。一つは環境保全コストである。環境負荷の発生の防止、抑制または回避、影響の除去、発生した被害の回復またはこれに資する取り組みのための投資額および費用額とし、貨幣単位で測定する。二つは環境保全効果である。これは環境負荷の発生の防止、抑制または回避、影響の除去、発生した被害の回復またはこれらに資する取り組みによる効果とし、物量単位で測定する。三つは環境保全対策に伴う経済効果である。これは環境保全対策を進めた結果、企業等の利益に貢献した効果とし、貨幣単位で測定する。畑作経営における環境保全活動は、化学肥料および化学合成農薬の投入削減と捉えることができる。化学肥料の投入に代替される堆肥の投入や化学合成農薬の投入に代替される除草作業の労賃などが環境保全コストとなり、これらコストをかけて削減した化学肥料や化学合成農薬の削減量が環境保全効果となる。ただし、エネルギーの使用が増えれば環境保全効果は必ずしもプラスになるとは限らない。環境保全対策に伴う経済効果は、化学肥料や化学合成農薬の投入が削減されたことによるコスト低下および農産物の販売価格上昇等である。本年度は、調査対象経営の選定を行い、これら三つの構成要素を算定するために必要なデータの収集を行った。具体的には、1.農産物の売上、資材購入状況等を記載したクミカンデータ、2.資材の使用状況が記載された栽培履歴、そして3.労働状況を把握する作業日誌である。作業日誌については、これまで調査対象経営において作業日および作業内容の記載は行われていたが、作業時間までは記載されていなかった。本年度は、作業日および作業内容とあわせて作業時間も把握し、労賃の算定に利用できるデータとした。本年度は、北海道畑作地帯に位置するA町の畑作経営を対象に、環境保全型農業の取り組みの一つである堆肥の利用に関し、アンケート調査を行った。具体的には、1.環境会計情報が提供される前の畑作経営の環境問題に関する意識について、2.堆肥の利用による化学肥料の削減や収量・品質の向上等の効果について、そして3.堆肥利用の問題点について、明らかにした。環境省「環境会計ガイドライン2005年版」によれば、環境会計とは、企業等が持続可能な発展を目指し、事業活動における環境保全のためのコストとその活動により得られた効果を認識し、可能な限り定量的(貨幣単位または物量単位)に測定し伝達する仕組みである。その構成要素には、環境保全コスト、環境保全効果、および環境保全対策に伴う経済効果の三つの構成要素がある。本研究では、畑作経営における環境保全活動を化学肥料および化学合成農薬の投入削減と捉え、化学肥料の投入に代替される堆肥の投入や化学合成農薬の投入に代替される除草作業の労賃などの環境保全コスト、これらコストをかけて削減した化学肥料や化学合成農薬の削減量を環境保全効果とする。そして、環境保全対策に伴う経済効果については、化学肥料や化学合成農薬の投入が削減されたことによるコスト低下および農産物の販売価格上昇等とする。本年度は、堆肥の利用が進む北海道畑作地帯に位置するA町の畑作経営を対象に、環境保全コストおよび環境保全対策に伴う経済効果の算定基礎となるデータを整理した。

そしてこれらデータを、化学肥料にかわって堆肥を投入する農業者に示し、環境保全に関する考え方をヒアリングした。さらに、堆肥を長期的に利用する農業者および短期的な利用にとどまる農業者に対して環境問題に対する意識調査を実施し、堆肥を長期的に利用する農業者については土壌の汚染に対する意識が高いことを示した。
ハイブリッドプロセッシングによる圧電セラミックスPZT薄膜の創製

本研究では,低温短時間で,良好な電気的特性および基板との密着性を示す厚さ1μm以上のPZT薄膜を作製するプロセスを開発することを目的として,ゾルーゲル法とレーザーアブレーション法のハイブリッドプロセッシングを検討した.ハイブリッドプロセッシングは,蒸着後のアニール温度が650°Cで,レーザーアブレーション法と比べると,100°Cほど下がった.ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜は(111面あるいは(100)面の結晶配向を持ち,良い電気的特性を示した.薄膜の微細組織について調べた結果,レーザーアブレーション法で作製したPZT層のペロブスカイト相への変態はゾルーゲル法で作製したPZT層の表面から始まるというエピタキシャル効果により,レーザーアブレーションで作製したPZT層は相対的に低いアニール温度でペロブスカイト相への変態が生じ,ゾルーゲル法で作製したPZT層と同じ結晶配向を持つことが分かった。また,ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜を用いて,2次元マイクロ・スキャナーを試作した.その結果,2次元マイクロ・スキャナーが良好な動作特性を示し,ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜はマイクロアクチュエータへの応用が可能であることが明らかになった.以上の結果から,ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングはプロセスの低温化と短時間化が実現でき,PZTの厚膜作製に対して有効であることは明らかになった.本研究では,低温短時間で,良好な電気的特性および基板との密着性を示す厚さ1μm以上のPZT薄膜を作製するプロセスを開発することを目的として,ゾルーゲル法とレーザーアブレーション法のハイブリッドプロセッシングを検討した.ハイブリッドプロセッシングは,蒸着後のアニール温度が650°Cで,レーザーアブレーション法と比べると,100°Cほど下がった.ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜は(111面あるいは(100)面の結晶配向を持ち,良い電気的特性を示した.薄膜の微細組織について調べた結果,レーザーアブレーション法で作製したPZT層のペロブスカイト相への変態はゾルーゲル法で作製したPZT層の表面から始まるというエピタキシャル効果により,レーザーアブレーションで作製したPZT層は相対的に低いアニール温度でペロブスカイト相への変態が生じ,ゾルーゲル法で作製したPZT層と同じ結晶配向を持つことが分かった。また,ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜を用いて,2次元マイクロ・スキャナーを試作した.その結果,2次元マイクロ・スキャナーが良好な動作特性を示し,ハイブリッドプロセッシングにより作製した薄膜はマイクロアクチュエータへの応用が可能であることが明らかになった.以上の結果から,ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングはプロセスの低温化と短時間化が実現でき,PZTの厚膜作製に対して有効であることは明らかになった.PZT薄膜のマイクロ・マシンの機械素子への応用としてはその用途にもよるが、1.510μmの厚さの薄膜を必要とする。PZT薄膜を作製するには、ゾルーゲル法やレーザーアブレーション法等の様々な方法があるが、厚さ3μmの薄膜を造るのに、いずれも多くの問題点がある。本研究では、ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングを用いて、低温短時間で、良好な電気的特性および基盤との密着性を示す厚さ3μm程度のPZT薄膜を作製するプロセスを開発することを目的とする。本年度は、ゾルーゲル法を用いて、完全にペロブスカイト(Perovskite)結晶構造からなり、(100)面或いは(111)面の配向性があり、質が良い厚さ0.15μmのPZT薄膜の作製方法を確立した。ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングを検討した。その結果、ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングにより作製したPZT薄膜は(111)面の優先配向を持ち、良い電気的特性を示した。すなわち、レーザーアブレーションで作製したPZT層のペロブスカイト相への変態はゾルーゲル法で作製したPZT層の表面から始まるというエピタキシャル効果により、レーザーアブレーションで作製したPZT層は相対的に低いアニール温度でペロブスカイト相への変態が起こり、ゾルーグル法で作製したPZTと同じ結晶配向を持つと考えられる。以上の結果から、ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングはPZTの厚膜作製に対して有効であることは明らかになった。PZT薄膜のマイクロ・マシンの機械素子への応用としてはその用途にもよるが,1.510μmの厚さの薄膜を必要とする.PZT薄膜を作製するには,ゾルーゲル法やレーザーアブレーション法等の様々な方法があるが,厚さ3μmの薄膜を造るのに,いずれも多くの問題点がある.本研究では,ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリツドプロセッシングを用いて,低温短時間で,良好な電気的特性および基盤との密着性を示す厚さ3μm程度のPZT薄膜を作製するプロセスを開発することを目的とする.本年度は,ゾルーゲル法とレーザーアブレーションのハイブリッドプロセッシングにより作製したPZT薄膜の結晶化過程を検討した.その結果,レーザーアブレーションで作製したPZT層のペロブスカイト(Perovskite)への相変態はゾルーゲル法で作製したPZT層の表面から始まるというエピタキシャル効果により、レーザーアブレーションで作製したPZT層は相対的に低いアニール温度でペロブスカイトへ相変態し,ゾルーゲル法で作製したPZT層と同じ結晶配向を持つことが明らかになった.

また,1層のPZT膜をコーティングした基板を500°Cに加熱しながら,その上にレーザーアブレーションでPZT薄膜を蒸着し,in situ成長によりPZT薄膜を作製した.作製した薄膜の結晶構造と微細組織を調べた結果,in situ結晶成長によりPZT薄膜の結晶配向を制御できることが分かった.また,ゾルーゲル層のペロブスカイト相の結晶粒のin situ成長によりレーザーアブレーションプロセス中に薄膜が完全に結晶化して,蒸着後のアニールが省略され,プロセスの低温化と短時間化が実現した.
確率分割モデルとその応用

有限集合の確率的分割としてクラスタリング過程が自然であり、諸種の現象に登場することを確かめできた。集合の要素を無視すると、これは自然数nの確率的な分割となり、順序を考慮するとDTG分布(Donnelly-Tavari-Griffiths)、順序を無視するとEwens分布となる。(2)GTM分布からの標本の分布はDTG分布またはEwens分布である。逆に標本分布がこれらの分布となるのはGEM分布に限る。証明はクラスタリング過程の特性より得られる。(3)集合の確率分割、DTG分布、Ewens分布を、できるだけ少い件で特徴づける試みを行い今までの結果を改善した。それより、これらの分布は頑健である。つまり、クラスタリング過程より広いモデルより導く可能性がある。(4)クラスタリング過程の一時点でいくつかの〓をランダムに選び、過程を逆時間向きにたどると、系統樹を逆向きに構成する確率過程、the coalescent,が得られるcoalescentの確率的構造も、クラスタリングの議論から組合せ論的に明確化できるという予想で研究中である。
蛋白質凝集体および炎症反応を標的としたイヌ変性性脊髄症に対する新規治療法の確立

犬の変性性脊髄症(DM)は致死性神経変性疾患で、ヒトの筋萎縮性側索硬化症の類似疾患である。これまでの研究成果から、神経におけるSOD1蛋白質凝集体の蓄積および炎症反応が病態に関与していることが明らかとなった。マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は神経細胞内では蛋白質凝集体を減少させ、神経細胞外では炎症反応を惹起する働きをもつ。DM症例にMIF分泌抑制剤を投与すると、神経細胞内での蛋白質凝集体が減少し、神経細胞周囲の炎症反応を抑制できると考え、治療効果を検証することにした。この研究課題の完遂により、DMの病態に基づいた新規治療法が確立でき、ALSの治療法開発にも寄与すると考えられる。
高温高圧水―炭化水素―塩混合系の分光研究

昨年度に引き続き、高温高圧水-炭化水素混合流体における塩の添加効果を調べた。実験はH_2OとD_2Oのモル比1:20の混合物に塩化ナトリウムを加えたものを試料水溶液とし、塩化ナトリウムの濃度01M、温度473573K、圧力100350barのトルエン相と水相が共存する範囲でトルエンに溶解させて赤外スペクトルを測定した。試料水中のH_2O、HDO、D_2Oの存在比は1:40:400となる。これによってOH伸縮領域(33003900cm^<-1>)の吸収が近似的にHDOのものとみなすことができる。実験で得られたスペクトルから同じ温度、圧力で測定したトルエンのみのスペクトルをリファレンスとしてHDOの吸光度を算出した。得られたトルエン中のHDOの赤外吸収スペクトルからは、まず、温度上昇に従ってOH伸縮領域の吸収強度が増加していることがわかった。これはトルエン相中の水の濃度が増加することを示している。また、水相に塩化ナトリウムを添加すると、吸収強度が減少することがわかった。水相への塩化ナトリウムの添加によって、積分強度が最大約40%減少することが見いだされた。すなわち、水相に塩が存在することによって、トルエン中の水の溶解度が減少することを示している。これはイオン-水分子間の相互作用が水-水分子間の相互作用よりも強いので、水分子が水相からトルエン相に移動しにくくなる(水相の化学ポテンシャルの減少)ためと考えられる。高温高圧下での水-デカンの二成分の混合状態の研究を行った。実験はH_2OとD_2Oの混合物を試料水とし、これを温度473648K、圧力80350barの範囲でデカンに溶解させ、飽和状態下でデカン相の赤外スペクトルを測定した。得られたスペクトルのOH吸収強度からデカン中の水の濃度を、デカンの近赤外吸収からはデカンの濃度を見積った。三相臨界終点より低温域では、水及びデカンの吸収の温度、圧力依存性はあまり見られなかったが、三相臨界終点より高温域では顕著な温度、圧力依存性が見られた。特に、液液気-三相平衡曲線の延長線付近で水及びデカンの濃度が顕著に変化することが見いだされた。得られたデカンと水の濃度から、デカン相全体の密度の温度・圧力依存性を算出した。更に得られたモル分率と、水、デカンの同じ温度・圧力の文献値から混合前の平均密度(計算値)を求め実験値と比較した。その結果、実験値の方が計算値に比べ小さいことがわかった。混合による体積変化は最大約10倍である。この顕著な体積膨張は臨界領域近傍に特有の現象で、水-疎水性炭化水素混合流体の共通した性質であると考えられる。高温高圧水-炭化水素混合流体の塩の添加効果について十分な理解を得るために、温度373523K、圧力100350barの範囲で水-トルエン-塩化ナトリウム三成分系の赤外スペクトルを測定した。1M塩化ナトリウム水溶液-トルエン混合流体におけるトルエン相中の水の濃度は、水-トルエン混合流体の時に比べ約60%に減少した。これはイオンの水和によって有機相に解け得る自由な水分子の減少のためと考えられる。ヘキセン中の水のスペクトルを測定し、電荷移動理論を用いたモデルを用いて解析したところ、水と芳香族炭化水素分子間と同様に、473K、100350barの範囲で水と不飽和炭化水素との間にπ-水素結合の存在が確かめられた。
ファイトケミカルによる細胞寿命の制御機構

ファイトケミカルによるミトコンドリアとオートファジーの機能と細胞生存・細胞死との関係を明らかにした。レスベラトロール(RSV)はPC12細胞で、ミトコンドリアとオートファジーを腫瘍性細胞では不活性化して殺し、神経性細胞では活性化して生存させる。冬虫夏草とその特異的成分のコルジセピンをDahl食塩感受性高血圧ラットとPC12細胞に作用させると、ラットの寿命を有意に延長させ、ミトコンドリアとオートファジーは脳の神経細胞では不活性化し、その他の器官の細胞では活性化した。PC12細胞ではこれらの物質の作用はRSVの場合と同じであった。ファイトケミカルのヒトの健康寿命の延長効果が期待される。今までPC12細胞を用いて、赤ワインに豊富なファイトケミカルで寿命延長効果が示唆されているレスベラトロール(RSV)の神経保護作用と抗腫瘍作用について解析してきた。PC12細胞は交感神経系の腫瘍細胞で、NGFで神経突起伸展能が誘導され神経細胞に分化するので、RSVの作用を分化度の異なる同じ細胞で解析できる利点がある。RSVは未分化(腫瘍性)細胞には障害的に作用し細胞死を促進し、分化(神経性)細胞には保護的に作用し神経突起伸展能を促進した。このメカニズムにミトコンドリアとオートファジーが関係しており、これらの機能が腫瘍細胞では低下、神経細胞では促進していることがわかった。本研究ではオートファジーの機能変化に注目し、PC12細胞においてオートファゴソームの形成に本質的なタンパク質の遺伝子のLC3mRNAをRNAi法でノックダウンし、RSVのノックダウン細胞(未分化及び分化型)での作用を解析した。コントロール(野生型とモック)細胞と比較して、ノックダウン細胞で以下の結果が得られた。未分化及び分化細胞共に細胞死が促進される傾向にあったが、RSVで未分化細胞は変化がなく、分化細胞は有意に細胞死が増加した。神経突起進展能はRSVの有無にかかわらず両細胞で変化がなかった。ミトコンドリアの数とミトコンドリアATP合成酵素βサブユニットの発現は未分化細胞でRSVと関係なく減少し、分化細胞ではRSVで減少した。オートファゴゾームは、LC3特にLC3IIの発現が極めて低下した状態でも出現し、未分化細胞ではRSVで変化がなかったがRSV非投与で減少し、分化細胞ではRSV非投与で変化がなかったがRSVで減少した。以上より、LC3I/IIの発現が低下してもオートファゴゾームは少数ながら常に検出されるが、その出現変化はRSVと無関係で、LC3の一定レベルの発現がRSVの本来のPC12細胞での上記の正常な作用に必要なことが示唆された。私たちはレスベラトロール(RSV)が神経系細胞株のPC12細胞で、この細胞が、未分化な状態(腫瘍性)では細胞死を引き起こし、分化した状態(神経性)では細胞生存を促進させることを見出した。RSVの細胞死と細胞生存の相反する作用は、細胞の分化度によりミトコンドリアとオートファジーの活性化の違い、すなわちこれら細胞小器官の機能を、未分化細胞では抑制し細胞死に、分化細胞では促進し細胞生存に関与すると考えている。RSVはカロリー制限様作用をもち、オートファジーはカロリー制限で活性化するので、このオートファジー機能に注目し、PC12細胞でオートファジー遂行遺伝子の1つであるLC3mRNAをノックダウンした細胞(LC3KD細胞)を作製し、RSVの効果をそれぞれの未分化及び分化型細胞で解析した。前年度に予備的解析を行い、今年度は実質的に解析した。以下コントロール細胞(野生型及びmock細胞)と比較してLC3KD細胞での有意な変化のみを示す。細胞死は未分化、分化細胞共に増加したが、RSV投与で未分化細胞は変化なし、分化細胞では増加した。オートファゴゾームは未分化細胞ではRSV非投与で減少、分化細胞ではRSV投与で減少した。ミトコンドリアはRSV非投与の分化細胞以外すべての場合で減少した。両LC3KD細胞での細胞生存・細胞死関連タンパク質の発現は以下の通りであった。SIRT1、SOD2、リン酸化Akt及びmTORは増加したが、SIRT3、カテプシンD及びミトコンドリアATP合成酵素は減少した。しかし、リン酸化AMPKは未分化細胞では減少、分化細胞では増加した。これらのタンパク質の発現変化は基本的にRSV非依存的であった。SIRT1ノックダウン細胞ではLC3の発現に変化がなかったので、RSVのより直接の標的はSIRT1よりLC3の可能性があり、LC3がRSVの正常未分化及び分化PC12細胞の適正な作用(癌細胞は殺し、正常細胞は保護し寿命を延ばす)に本質的であることが示された。今年度は古くから薬効能が示唆されている冬虫夏草に注目し、ラットでの寿命延長効果を細胞レベルで解析した。冬虫夏草であるCordyceps militaris(CM)の抗腫瘍、抗肥満、免疫力向上作用などの効果が示唆されているが、寿命延長効果についてはショウジョウバエでしか報告がない。食塩(8%)投与で寿命を短くできる食塩感受性Dahlラット(平均寿命約2.9ヶ月)を用いて、CM投与により寿命に変化があるか解析した。コントロールラットに比較してCM(3%濃度で食餌に添加)投与ラットで有意に寿命が延長することがわかった(p = 0.0001)。このラットの死因は、私たちの今回の観察から高血圧による脳出血による後遺症であると考えている。CMは脳出血を抑制することなしに、脳出血後の寿命を延長させることが推測された。