hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
農村における自然再生事業による生物多様性の保全に関する経済評価

本研究は、沖縄県那覇市と豊見城市にある漫湖を対象にして、自然再生による生物多様性の保全に関する研究を行ったものである。漫湖は、国場川の河口に形成された泥の干潟であり、日本の重要湿地500にも、選定基準2、3、4で選定されている。漫湖は渡り鳥の飛来地として重要な役割を果たしており、ラムサール条約に登録された湿地であるが、最近の10年間にマングローブ林が約10ha繁殖しており、渡り鳥の生息地面積の減少、ゴミの不法投棄、土砂の堆積、水質の悪化等の問題が発生している。実際に、漫湖における水鳥の確認種数及び確認羽数ともに減少傾向を示している。このマングローブ林を伐採し、その地域の環境を以前の状態に戻すという自然再生が連絡協議会等で検討されている。しかし、研究代表者が昨年行った調査で明らかになったこととして、マングローブ林を伐採した方が良いという意見と、現状維持が良いという意見が二分していることがある。そこで、本研究では、水鳥の飛来地の環境変化に関連の深いマングローブ林と清掃ボランティアに関する住民意識について、CHAIDやCVMを適用して分析を行った。調査は郵送アンケートによるものであり、対象者は那覇市と豊見城市の住民とした。その結果、マングローブ林の認識については、良いものであると認識する被験者のグループには都市近郊農業地域である豊見城市在住の被験者が多く含まれたこと、清掃ボランティアについては、ラムサール条約について「知っている」と回答した被験者のグループが比較的高いWTPを有していること、マングローブ林に対して良いイメージを有していない被験者グループが比較的高いWTPを有していることが明らかになった。本研究は、沖縄県那覇市と豊見城市の漫湖を対象にして、環境保全に関する研究を行った。漫湖は、国場川の河口に形成された泥の干潟であり、ラムサール条約に登録されるとともに、日本の重要湿地500にも、選定基準2、3、4で選定されている。漫湖は渡り鳥の飛来地として重要な役割を果たしているが、確認種数及び確認羽数ともに減少傾向を示している。平成15年9月上旬に、環境省漫湖水鳥・湿地センター及び沖縄大学にて漫湖に関するヒアリング調査を行った。その中でも特に興味深いこととして、漫湖は数年間でマングローブ林が繁殖して、ゴミの不法投棄、渡り鳥の生息地面積の減少、土砂の堆積、水質の悪化等の問題が発生していたことが明らかになった。以上のことをふまえて、漫湖の環境保全について、渡り鳥を含む生態系、マングローブ林、教育効果、ボランティア等に関するアンケート調査を実施した。アンケートは、郵送法で実施した。まず、漫湖周辺の地区を対象にして、対象となる郵便番号の区域を選択した。その後、その選択した郵便番号の中から、調査する世帯を無作為に抽出した。その結果は以下に示すとおりである。ラムサール条約自体を知っているという回答は約9割、漫湖がラムサール条約に登録されたことを知っているという回答は約7割になった。漫湖の生態系は「保護されている」という回答は約4割、「保護されていない」という回答は約4割を占め、漫湖の生態系の保護については、各個人で認識が異なっていた。漫湖のマングローブ林の伐採に関しては、「すべて残した方がよい」も「一部は伐採した方がよい」も約5割であり、マングローブ林の伐採についても意見が分かれた。
ヒト造血系の動物モデルを利用したHIV感染ならびに発症機構の解析

ヒトIL-3遺伝子とヒトGM-CSF遺伝子のcDNAをchicken albumin promoterの下流に組み込み、マウス受精卵にマイクロインジェクションすることによりそれぞれの遺伝子を発現するトランスジェニックラインを確立した.確立したトランスジェニックマウスではそれぞれ共に約30ng/mlという極めて高濃度のヒトGM-CSFおよびIL-3が血清中に検出されたが、これらのマウスを詳しく解析したところマウスの造血系には全く影響を与えていないことが判かり、ヒトとマウスのGM-CSFならびにIL-3がマウスのそれぞれの受容体と全く交差反応しないことが確認された.今年度はさらにこれらのトランスジェニックマウスをSCIDマウスと交配することによりヒトサイトカイン遺伝子ををホモにもつSCIDマウスを作製した.さらに両方のヒトサイトカイン遺伝子をホモに持つSCIDマウスを作製中である.一方で、β-gal遺伝子、マウスCD8α鎖遺伝子、マウスThy-1遺伝子、あるいはGFP耐性遺伝子を組み込んだT細胞指向性HIVベクターおよびマクロファージ指向性HIVベクターを作製し、COSおよびHeLa由来の細胞株にそれぞれ感染させた。その結果、HeLa由来の細胞株ではT細胞指向性のHIVによるβ-galの発現を誘導することができた。しかし、マクロファージ指向性HIVではβ-galの発現は誘導されず、感染が成立していないことが確認できた.今後は両方のサイトカイン遺伝子を持つトランスジェニックSCIDマウスラインが確立し次第、ヒト造血幹細胞からマクロファージへの分化誘導を試み、マクロファージ指向性HIVベクターを利用してHIV感染およびAIDS発症におけるマクロファージの役割を明らかにしていきたい.ヒトIL-3遺伝子とヒトGM-CSF遺伝子のcDNAをchicken albumin promoterの下流に組み込み、マウス受精卵にマイクロインジェクションすることによりそれぞれの遺伝子を発現するトランスジェニックラインを確立した.確立したトランスジェニックマウスではそれぞれ共に約30ng/mlという極めて高濃度のヒトGM-CSFおよびIL-3が血清中に検出されたが、これらのマウスを詳しく解析したところマウスの造血系には全く影響を与えていないことが判かり、ヒトとマウスのGM-CSFならびにIL-3がマウスのそれぞれの受容体と全く交差反応しないことが確認された.今年度はさらにこれらのトランスジェニックマウスをSCIDマウスと交配することによりヒトサイトカイン遺伝子ををホモにもつSCIDマウスを作製した.さらに両方のヒトサイトカイン遺伝子をホモに持つSCIDマウスを作製中である.一方で、β-gal遺伝子、マウスCD8α鎖遺伝子、マウスThy-1遺伝子、あるいはGFP耐性遺伝子を組み込んだT細胞指向性HIVベクターおよびマクロファージ指向性HIVベクターを作製し、COSおよびHeLa由来の細胞株にそれぞれ感染させた。しかし、マクロファージ指向性HIVではβ-galの発現は誘導されず、感染が成立していないことが確認できた.今後は両方のサイトカイン遺伝子を持つトランスジェニックSCIDマウスラインが確立し次第、ヒト造血幹細胞からマクロファージへの分化誘導を試み、マクロファージ指向性HIVベクターを利用してHIV感染およびAIDS発症におけるマクロファージの役割を明らかにしていきたい.
幕末における洋式海事技術関係書・翻訳書の所在調査と総合目録の作成

本年度は、二之方良右衛門文書(薩摩川内市川内歴史資料館蔵)、佐賀県立博物館・美術館、神戸大学海事博物館、神原文庫(香川大学蔵)、所丁輔文書(長屋吉彦氏蔵、霊山歴史館寄託)を調査して目録を作成した。複写したのは、二之方良右衛門文書、所丁輔文書、渡辺蒿蔵文書(萩博物館蔵)と佐賀県立博物館・美術館、神戸大学海事博物館、神原文庫の所蔵する当該書である。二之方良右衛門は第二次長崎海軍伝習に参加した薩摩藩士であり、船大工添頭という職掌柄、文書は、運用術の講義録1部を除いてすべてが造船の講義録である。また所丁輔は長州藩医所郁太郎の縁者で、文書はすでに京都大学の松田清教授によって紹介されているが、松田説よりも長崎海軍伝習の講義録の写しは多く、蒸気機関の翻訳書の写しを除くすべてが講義録の写しである。昨年度と本年度の調査により、安政元年(1854)に短期間行われたファビウスによる海軍伝習の講義録、安政2年から安政6年まで行われた第1次・第2次海軍伝習の造船、運用術、艦内規則の講義録、幕府の軍艦操練所の講義録を多く収集できたことは本研究の成果の一つである。なお、従来、翻訳書と見なされてきた書の中には、1847年2月のオランダ海軍の祝砲規則の翻訳書である『軍艦恭礼祝砲規則』のように海軍伝習の教科書として用いられたものがあること判明した。また平成17年12月2日から12月25日まで佐賀県立美術館において開催された開館1周年記念佐賀城本丸歴史館企画展(「大艦・巨砲ヲ造ル-江戸時代の科学技術-」)では「江戸のモノづくり」総括班及び佐賀班と連携して「近代造船の曙」に関する展示品の選定、展示解説の執筆を行った。本年度は、国立国会図書館、国立公文書館内閣文庫、近藤海事記念財団文庫(都立中央図書館蔵)、彰考館徳川博物館、黒羽藩校作新館旧蔵図書(芭蕉の館蔵)、豊橋市立中央図書館、住田文庫(神戸大学付属図書館蔵)、神戸大学海事博物館、渡辺蒿三文書(萩博物館蔵)、佐賀県立図書館を調査して、目録を作成した。なお、本研究の対象とする洋式海事関係書・翻訳書は幕末であるが、明治10年代までの当該書もしくは19世紀中期以前の海事関係の洋書が所蔵されている場合には、それもあわせて調査し、目録を作成することにした。複写したのは国立国会図書館、内閣文庫、芭蕉の館の所蔵する当該書である。目録化した資料のうちめぼしいところを挙げておくと、長崎で行われた海軍伝習のノート類として『造船書』・『造船留書』・『軍艦造法』・『船具全書』があり、翻訳書としては『軍艦図解』・『七種軍艦造法論』・『軍艦利尼舶製造伝書』・『造艦全書抄訳』・『蒸気機械全書』・『蒸船新書』・『蒸気機械全書』・『洋外螺機新論』・『造釜論』・『蒸気船造機盤論』・『舶具書』・『船具絵説』・『船具標解』・『艦体分解図』・『帆船図解』・『航海術船具要目』・『船具図解』・『軍艦内則』などがある。翻訳書の底本は『七種軍艦造法論』がL.van Zwijndrecht, Verhandeling van den Hollandschen Scheepsbouw,1757、『軍艦利尼舶製造伝書』がJ.C.Rijk, Handleiding tot de Kennis vanden Scheepsbouw,1882、『蒸気船造機盤論』がH.Huygens, De Scheeps-Stoomketeles,1853、『洋外螺機新論』がH.Huygens, Bijdrage tot de Kennis der Schroef-Stoomwerktuigen,1856であるが、他の翻訳書の底本については、目下、調査中である。なお、幕末の翻訳書の底本は蘭書であるが、維新後はほとんどが英書である。

なお、従来、翻訳書と見なされてきた書の中には、1847年2月のオランダ海軍の祝砲規則の翻訳書である『軍艦恭礼祝砲規則』のように海軍伝習の教科書として用いられたものがあること判明した。また平成17年12月2日から12月25日まで佐賀県立美術館において開催された開館1周年記念佐賀城本丸歴史館企画展(「大艦・巨砲ヲ造ル-江戸時代の科学技術-」)では「江戸のモノづくり」総括班及び佐賀班と連携して「近代造船の曙」に関する展示品の選定、展示解説の執筆を行った。
分泌型レポーター遺伝子発現iPS細胞によるCYP3A発現パターン再現モデルの構築

ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞(肝分化iPS細胞)は、医薬品開発研究での応用が期待されている。本研究では、出生前後に発現量の変化が認められるCYP3A4(成人型)/CYP3A7(胎児型)に着目し、発現パターンを再現することで、機能性肝分化iPS細胞の樹立及び新規転写調節機構の解明を目指した。申請者は、CYP3A4や薬物トランスポーターの新規転写機構を同定し、これに基づく分化誘導法の改良を行った。本年度は、分泌型レポーター遺伝子安定発現iPS細胞(stable iPS細胞)の樹立を目指した検討を行った。また、既に確立している肝分化誘導法の更なる改良も行った。iPS細胞は、ヒト新生児皮膚繊維芽細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、Glis1及びNanogをレトロウイルスを用いて導入(スピンフェクション法)することで作製した。また、CYP3A4遺伝子の上流領域をGaussia及びCypridinaルシフェラーゼ遺伝子とそれぞれに連結し、分泌型レポーター遺伝子安定発現用プラスミドベクター及びレンチウイルスの作製を行った。これらのベクターをHepG2細胞に導入後、薬物処理を行ったところ、十分なレポーター活性の上昇が認められた。しかしながら、高いバックグラウンドが認められたことから、現在使用しているベクター以外のベクターについても今後同様の検討を行うこととした。Stable化については、ヒト新生児皮膚繊維芽細胞及びHepG2細胞を用いて進行中である。近年、我々は、CYP2D6やCYP3A4が細胞周期に依存して発現量が変化することを見出した。そこで、iPS細胞の肝分化誘導過程中に細胞周期に影響を及ぼす種々の化合物を処置し、最終的に得られる肝分化誘導細胞の成熟性が向上するか検討を行った。Indirubin-3'-oxime、RO-3306、Nocodazole、Thymidine等を使用した結果、一部の化合物において、未処置の肝分化iPS細胞と比較してアルブミンやCYP2D6及びCYP3A4の発現量が上昇することを明らかとした。しかしながら、未だ肝細胞としての成熟性が十分ではないことから、次年度以降においても引き続き検討を行う。私は、海外研修中、肝がん細胞の幹様細胞において高発現しているαフェトプロテイン(AFP)や上皮細胞接着分子(EpCAM)の発現調節機構の検討を行った。その結果、クロマチンリモデリング等に関与する遺伝子ファミリーに属する遺伝子Xが、AFPの遺伝子発現調節に関与する可能性を見出した。我々が作製した肝分化iPS細胞においても、成熟肝細胞において発現量が低いAFPが高発現している。このような現象は、他の研究者においても報告されており、成熟性の高い肝分化iPS細胞の作製に至らない要因の一つである可能性がある。したがって、本研究計画に加えて、海外研修中の成果を利用し、より成熟性の高い肝分化iPS細胞を作製したいと考えている。本年度は、AFPの発現調節機構に着目した肝分化誘導法への応用及び肝分化誘導法の改良、そして分泌型レポーター遺伝子安定発現iPS細胞(stable iPS細胞)の樹立に関する検討を行った。昨年度に同定したAFPの発現調節機構に関与する遺伝子Xの発現について、ヒト肝がん患者サンプルのアレイ解析を行ったところ、stem細胞様の性質を有する悪性度の高い肝がん細胞(AFPが高発現)において、高発現していることを明らかにした。また、AFP高発現ヒト肝がん由来細胞株(HepG2細胞、HuH7細胞、Hep3B細胞等)においても遺伝子Xの発現が高いことを確認した。そこで、遺伝子Xのstable knockdownを行った結果、AFP発現量が低下することを見出した。現在樹立した肝分化iPS細胞はAFPが高発現していることから、得られた結果は肝分化iPS細胞の成熟性向上を目指した分化誘導法に応用できることが期待された。既に同定している肝分化iPS細胞の成熟性を改善する可能性がある遺伝子3つのうちRARRES2について検討を行った。RARRES2発現アデノウイルスをHepG2細胞に感染させた結果、低感染時にCYP1A2やCYP3A4の発現が上昇する傾向が認められたが、感染量依存的な上昇は認められず、発現を抑制する傾向が確認された。他の因子(SREBF1あるいはTHRSP)についても同様の検討を行い、HepG2細胞においてCYP等の発現上昇が認められた場合、肝分化iPS細胞に感染させる予定である。stable iPS細胞の樹立に関しては、Gaussia及びCypridinaルシフェラーゼ遺伝子の導入方法の検討を行ったが、レポーター活性のバックグラウンドが高く更なる検討が必要であった。なお、昨年度までに樹立したiPS細胞は、30継代まで維持培養が可能であることを確認した。平成27年8月に、本研究計画の立案時に所属していた東北薬科大学から静岡県立大学薬学部に異動した。そのため、本研究を遂行するために必要な実験機器や試薬等の準備に時間を要し、研究計画通り進めることができなかった。平成26年度の海外研修及び本年度の異動と十分な研究成果を得るための時間の確保が困難な状況にあったため、補助事業期間延長承認申請を行った。一方で、肝分化iPS細胞の成熟性向上に寄与する可能性がある遺伝子Xを新たに同定し、その機能的影響についても検討を行っていることから、今後、十分な成果を得ることができると考えている。本年度は、細胞周期制御因子あるいはストレス応答性シグナルによるCYP3A4を含む薬物代謝関連遺伝子の発現調節機構の解析、及び細胞周期に影響を及ぼす化合物を用いたiPS細胞の肝分化誘導法の改良を行った。

また、レポーター遺伝子安定発現iPS細胞(stable iPS細胞)の樹立に関する検討を行った。細胞周期とCYP3A4発現の関連性を明らかにするため、チミジンによるHepG2細胞の細胞周期の同調化を行った。その結果、G2/M期に細胞が同調化している場合、CYP3A4の発現量が上昇することを見出した。次に、G2/M arrestを起こす化合物RO-3306やPAH等を用いて検討した結果、CYP3A4の誘導が認められ、G2/Mチェックポイント関連因子の活性化が関与していることを見出した。また、CYP2D6やMRP3においても、細胞周期関連あるいはMAPK関連シグナルによる新規誘導機構も明らかにした。iPS細胞の肝分化誘導法の改良は、RO-3306及びチミジンを用いて行った。両化合物を種々の条件で処置した結果、RO-3306を分化誘導過程d15-d18及びd20-22に添加したところ、肝細胞の未成熟マーカーであるAFPの発現量の著しい低下が認められた。しかしながら、CYP3A4発現量の変化は確認できなかった。また、チミジンに関しては、d15-d17に添加することでCYP3A4発現量が上昇する傾向は認められたものの、その程度は小さく、またAFPの発現量に変化は認められなかった。stable iPS細胞の樹立に関しては、Gaussia及びCypridinaルシフェラーゼ遺伝子による検討を重ねてきたが、レポーター活性のバックグラウンドを抑えることができなかった。そこで、fireflyルシフェラーゼ遺伝子をベースとした方法に変更し、iPS細胞への導入条件等の検討を行った。ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞(肝分化iPS細胞)は、医薬品開発研究での応用が期待されている。本研究では、出生前後に発現量の変化が認められるCYP3A4(成人型)/CYP3A7(胎児型)に着目し、発現パターンを再現することで、機能性肝分化iPS細胞の樹立及び新規転写調節機構の解明を目指した。申請者は、CYP3A4や薬物トランスポーターの新規転写機構を同定し、これに基づく分化誘導法の改良を行った。平成26年度は、海外研修へ行ったため、本研究は遅れている。しかしながら、初年度に本研究を行う上で重要となる分泌型レポーター遺伝子安定発現用レンチウイルスの作製やiPS細胞の肝分化誘導効率を上昇させる因子等を同定していることから、今後、十分な成果を得ることができると考えられる。平成28年度は、遺伝子XのノックダウンやSREBF1あるいはTHRSPの導入により、肝分化iPS細胞の成熟性向上や生体におけるCYP3A4/CYP3A7発現パターンの再現が可能であるか検討を行う。また、CYP3A4/CYP3A7の上流領域に結合する転写因子及びその複合体の解析を行うとともに、平成27年度に作製したCYP3A4遺伝子上流約12 kを含むレポータープラスミドを用いて、メカニズムベースで転写調節機構を明らかにする。さらに、既に本研究において明らかにしたCYP発現に影響を及ぼす細胞周期調節因子阻害剤等による肝分化iPS細胞の成熟性向上への寄与も検討を行う。
金属ナノ構造と光の相互作用を利用した生細胞―人工材料界面の分子プロセスの解析

本研究では細胞と人工材料の界面における分子プロセスの解析のために、界面を選択的にラマン分光可能な表面増強ラマン分光装置、及び測定のための基板作製を行った。装置はレーザ光導入系、光学顕微鏡、分光装置からなり、細胞の足場となる細胞外マトリックスのラマンスペクトルを所得する技術の確立に成功した。また、本研究では当初の予定であった上記成果に加え、細胞外マトリックスを形成するタンパク質を同定する技術を確立した。細胞と人工材料界面における分子プロセスを解析するために表面増強ラマン分光法(surface-enhanced Raman scattering)を応用した。特に金属ナノ構造のギャップからではなく、界面からのラマンシグナルを測定するために金属基板のナノ構造を最適化した。ここでは2種類のアプローチを検討した。一つはナノリソグラフィーを用いた金属ナノ構造の作製、二つ目は蒸着基盤を高温でアニールすることで、自己組織化的にナノ構造を作製するアプローチである。これらの構造について実験、理論計算の両面から局所プラズモンの解析を行い、SERSシグナルの強度を最大化するための、最適な条件の検討を行った。表面増強ラマン散乱(Surface-Enhanced Raman Scattering: SERS)分光法は水中で金属表面近傍,数nmの領域の分子を選択的に振動分光解析が可能な非常に有用な手法である.我々はSERS分光法を細胞の振舞い(接着,伸展,細胞死等)に影響を与える足場タンパク質の構造・配向の解析に応用することを目指している.SERS分光法では蒸着基板が広く用いられ,蒸着の際に形成された金属間の微小間隙(ギャップ)からの信号が特に強く観測される.しかしながら,ギャップのサイズは数nm以下と考えられ,タンパク質のサイズ(数数10 nm)に比べ極端に小さいため,通常のSERS基板でタンパク質を測定することは困難である.本研究では測定対象となる吸着タンパク質以外からのシグナルを抑え,吸着タンパク質の解析に最適な基板の作製を試みた.本研究では特に光学系の設計,金属材料の選択,及びギャップが存在しない平坦な基板の作製を行った.レーザー光を対物レンズを通して金属基板に集光照射し,表面に吸着した対象化合物から発生するラマン散乱光を分光器に導入して検出するSERS顕微分光装置を構築した.金属材料としては液中測定においても酸化膜を形成しにくい金を選択した.平坦な基板を作製するために,金とガラス基板の接着層として,その中でも特に金表面のラフネスを減らすことができるゲルマニウムを使用し,真空蒸着によって基板(Au/Ge基板)を作製した.この基板に1 mMのチオフェノール(PhSH)溶液を滴下してSERS測定を行い,比較対照としてゲルマニウムを用いない金基板(Au基板)を用いて,ピーク強度の比較を行うことでこの基板表面のラフネスとギャップの関係について評価を行った.本研究の目的は本研究では顕微ラマン分光法と金属ナノ構造を有する基板を用いて、基板表面近傍5-10 nmの領域を選択的にラマン分光する手法を開発し、生体組織・細胞と人工物表面の界面領域において細胞外マトリックスとして機能するタンパク質などの生体分子の構造・配向の解析手法を確立することである。人工物表面に吸着したタンパク質分子の構造を解析、人工物と接着細胞の会面における分子プロセスを解析するために、表面増強ラマン分光法を応用した。励起用レーザ、顕微鏡、3次元ステージ、分光器を組み合わせ、バイオ界面を3次元的にラマンスペクトルマッピング可能な分光装置を構築した。この装置を用いることで、フィブリノーゲン、アルブミンなどの代表的なタンパクの吸着後の構造・配向を調べた。基板として末端基を変えることで簡便に表面の物理化学的性質(濡れ性、極性、電荷など)を制御可能である自己組織化単分子膜(SAM)を用いた。ラマンスペクトルのAmide IIIIバンドの形状からタンパク質中のαヘリックス構造、βシート構造の割合を求め、タンパク質分子の変性の度合いを解析した。さらに、(FDTD計算で求めた電場強度)x(各アミノ酸残基の溶液のラマンスペクトルのピーク強度)の線形結合でスペクトルをフィッティングし、官能基の基板表面垂直方向の空間的分布を求め、タンパク質分子の配向を決定することに成功した。また、Au, Agの蒸着基板上に形成した単分子膜のラマンスペクトルは測定時間1秒以下で測定可能であるが、基板から数nm以上離れた電場強度が低い領域の観察、スペクトルの2次元マッピングなどの際には、高感度化が必要となる。我々は基板の加熱によってAg,Au界面において選択的に合金を形成することで、プラズモン励起による光吸収の極大波長(電場増強が最も強くなる波長)を調整し、光学特性を最適化する技術を確立した。表面科学本研究計画は(1)測定光学系の構築、(2)基板の製作、(3)固体表面上に吸着したタンパク質の構造・配向の解析手法の確立、(4)細胞接着斑に形成された細胞外マトリックスとしての吸着タンパク質の構造・配向の解析、の4項目からなる。これらに関しては既に測定技術に関しては確立することが出来たことから、概ね順調に進展していると判断した。

バイオインターフェース解析のためのSERS基板の作製から、評価を行い、学術論文の発表(投稿中)、国際会議での発表を行った点に置いて、当初の計画書の目標を達成したと言える。平成25年度では申請書の予定通り、細胞を用いた実験まで発展させることが出来た。しかしながら、細胞の固体細による実験データのばらつきの統計的扱いに関して課題が残された。今後は研究調書に含まれなかった丸剤乏、繊維芽細胞を用いることで、この研究の成果を総括する予定である。よって、平成26年度は細胞と材料のインターフェース解析を行う予定である。当該年度で作製したSERS基板を用いて有機分子、生体分子のラマンスペクトルが観測可能となった。今後は電場強度計算などを利用して,吸着タンパク質のラマン解析が可能な最適なナノ構造を探索し, Au/Ge基板に成形を行う予定である.本年度はおおよその計画通り、細胞と材料の界面の分子プロセス解析のための装置開発に成功した。実際に細胞を用いた実験に関しても一定の成果を上げることが出来た、しかしながら、細胞の個体差による実験でいたのばらつきに関しては課題が残され、ここでは平成26年度まで研究期間を延長し、研究調書に含まれなかったがん細胞、繊維芽細胞を用いた実験を行って、この研究を総括したい。平成26年度は異なるディストリビュータからの細胞株の購入、金属薄膜形成のための蒸着材の購入のために使用する予定である。当該年度はナノリソグラフィー及び自己組織化現象を利用して作製したナノ構造をSERS基板に活用する。特に簡便な作製方法、低コストを意識し、表面増強ラマン分光法をセンシング分野でのアプリケーションを模索する。未使用額も次年度の計画のために使用する。
バクテリオロドプシンのプロトントランスポータとチャネル

本研究の目的は光エネルギーを使ってプロトンを1方向に運ぶ膜蛋白質、バクテリオロドプシンのポンプメカニズムを、シッフ塩基部分(トランスポータ)とプロトン輸送路(チャネル)との相関に焦点を絞って明らかにすることである。特に我々のグループが開発した、赤外分光法により蛋白質に結合した水分子を直接観測する手法を駆使して、トランスポータがどのようにチャネルを制御するかを検討してきた。本年度は以下のように新たな水分子の局在が明らかになり、バクテリオロドプシンにおけるトランスポータとチャネルとの機能的相関に対する理解を深めることができた。(1)プロトンではなくクロライドを輸送するバクテリオロドプシン変異体(D85T)の活性中心では、クロライドが水分子に水和された構造をとることがわかった。活性中心における負電荷の水和はバクテリオロドプシンにもみられ(この場合Asp85)、プロトンポンプとクロライドポンプに共通の構造を示唆する。一方、クロライドポンプの変異体ではシッフ塩基の水素結合の弱いことがわかった。(2)細胞外側ドメインに存在するArg82,Glu204の変異体を用いた研究から、この領域に存在する水分子が同定された。プロトン放出基であるGlu204からのプロトンの解離を制御するArg82は、プロトンポンプの前後でトランスポータ部位との相互作用を変化させること、このとき水素結合構造が重要な役割をはたすことが明らかとなった。(3)細胞質側ドメインに存在するVal49の変異体を用いた実験から、トランスポータと細胞質側のAsp96を結ぶ経路には、Val49のペプチドC=Oを仲立ちとした水素結合ネットワークが存在することが明らかになった。この水素結合には水分子も関与しており、このネットワークが遠隔的な相互作用によるプロトン結合基(Asp96)のpKa変化をもたらすものと考えられる。
変異SOD1のALS病変選択性の分子機序の解明-Dorfinを介して-

運動ニューロンを選択的に障害する神経難病である筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病理学的特徴は、ユビキチン化したタンパク質凝集体が運動ニューロン内の特異的な蓄積が生じていることである。我々はこれまでに孤発性・家族性いずれのALSタンパク質凝集体内にも存在し、家族性ALSの原因の一つである変異SOD1をユビキチン化する活性を有する新規分子Dorfinを同定しクローニングした。本研究により我々は、ALSのモデル動物である変異SOD1トランスジェニック(Tg)マウスにおいて、変異SOD1は臓器を問わず豊富に発現しているにも関わらず、病変の存在する脳幹・脊髄特異的に変異SOD1の経時的な凝集・蓄積増加が見られることと、Dorfinが脳幹・脊髄でのみ変異SOD1を認識し結合することを見出した。すなわち、運動ニューロンにおいて変異SOD1が、Dorfinに認識されユビキチン化される分子異常を病変選択的に起こしていることが判明した。さらに、変異SOD1の遺伝子工学的改変と培養細胞およびALSモデルマウスを用いた検討から、変異SOD1のシステイン残基に病変特異的な酸化が生じ、変異SOD1分子同士の間でシステイン残基を介したジスルフィド結合を形成することにより、変異SOD1のタンパク質凝集体形成が生じていることが明らかとなった。この成果は、変異SOD1によるALSの病変選択性の分子機序の詳細を解明する重要な手がかりとなりうると考えられる。また、我々の開発した分子異常を生じた変異SOD1の有無を簡便に確認できる培養細胞系は、家族性ALS治療薬のスクリーニングと開発にも今後応用可能である。家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因となる変異SOD1タンパク質は、一般臓器においても広く発現しているものの脳幹・脊髄運動ニューロン特異的に病変を引き起こすため、変異SOD1が中枢神経系特異的に毒性を獲得する機序が存在すると考えられる。従って、変異SOD1と中枢神経系特異的に結合する分子を同定することは、変異SOD1の毒性獲得機序を解明するために極めて重要である。本研究において、ALSモデルマウスであるG93A変異SOD1 Tgマウスの脊髄を含む各臓器の経時的な病理学的・生化学的解析を行うことによって、我々が同定した変異SOD1特異的ユビキチンリガーゼであるDorfinが、中枢神経系病変組織の変異SOD1のみを特異的に認識することが明らかになった。さらに、発症とともに変異SOD1凝集体(オリゴマー)が脊髄において経時的に増加したが、Dorfinと結合する変異SOD1の量も変異SOD1オリゴマーの増加と併行して経時的に増加していた。変異SOD1をmisfoldさせる中枢神経系特異的な因子が存在することが推測され、misfoldした変異SOD1をDorfinは特異的に認識しユビキチン化していると考えられた。変異SOD1と中枢神経系特異的に結合するタンパク質の同定のため、培養細胞にFLAGタグを付加した野生型および変異SOD1を発現させ、抗FLAG抗体でコーティングしたビーズによりSOD1に結合したタンパク質を回収し、マススペクトロメトリーによりハイスループット解析することでSOD1結合タンパクを探索した。SOD1と結合するタンパク質候補が複数得られたが、その中で変異OD1と特異的に結合し、かつ神経細胞特異的に発現しているタンパク質を同定することができた。現在この分子が変異SOD1の中枢神経系特異的毒性獲得に果たす役割について解析を進めている。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、大脳の上位運動ニューロンおよび脳幹・脊髄の下位運動ニューロン選択的な変性による球麻痺・呼吸筋麻痺・四肢麻痺を特徴とする、成年期以降に発症して急速に進行する神経難病の一つである。現在のところ有効な治療法はなく、早急な原因究明と治療法の開発が急務である。ALSの病理学的特徴は、ユビキチン化したタンパク質凝集体が運動ニューロン細胞質内に特異的に蓄積していることである。

SOD1変異に伴う家族性ALSやALSマウスモデルにおいては、病変選択的に変異SOD1凝集体がユビキチン化され蓄積しており、変異SOD1が病変特異的に凝集体形成能を獲得する機序がALSの病態に密接に関わっていると推定される。ヒトSOD1分子は4つのシステイン残基を有し、57番目および146番目のシステイン残基間で分子内ジスルフィド結合を形成することにより分子を安定化させている。本年度の研究により、変異SOD1分子のシステイン残基が分子内でなく分子間で誤ったジスルフィド結合を形成することが、変異SOD1の凝集体形成および細胞毒性に強く関与していることが明らかとなった。変異SOD1トランスジェニックマウスを用いた検討により、異常なジスルフィド結合形成は病変選択的に生じており、SOD1のジスルフィド結合形成に病変特異的に関与する因子の存在が示唆された。さらに、我々がこれまでに同定した変異SOD1をユビキチン化しプロテアソームでの分解を促進するユビキチンリガーゼDorfinが、異常なジスルフィド結合を特異的に認識して変異SOD1をユビキチン化することを見出した。今回の研究成果である我々の培養細胞モデルを用いた異常ジスルフィド結合形成の抑制を指標にした薬剤スクリーニングが、SOD1変異に伴う家族性ALSの治療薬の創薬に結びつく可能性がある。
インタラクティブコンピュータグラフィックスによる自然物の表示システムの研究

本研究はコンピュータグラフィックス(CG)技術を応用し、自然物をリアルに表示するものであり、次の研究項目を実施した。(1)自然物の光学特性のモデル化、(2)自然物の動作モデル、さらにより効果的なシステムとするため、(3)インタラクティブシステム、(4)アニメーションを利用した検証を行なった。(1)の光学特性のモデル化に関しては、自然界の存在するものはミクロ的に見ると粒子状物体であるので、粒子状物体の光学的特性をモデル化した。ある程度の対象物に関してはモデル化の基礎は既にある程度判明していたが、本研究ではさらに充実し、それらを統合化しモジュール化をはかった。特に、砂漠の粒子や水の分子による散乱特性を考慮した可視化法を開発した。また、多重散乱の影響も考慮できる方法を試みた。(2)の動作モノデルに関しては、雲、煙を対象にそれらの成長過程を解析しモデル化した。こうしたものは非常に複雑であり、その振る舞いは従来のパラダイムでは困難である。雲に関してはセルオートマトンおよびセルダイナミックス法による動的変化の計算法を開発し、煙に関してはレイノルズ方程式を基本に障害物を考慮した可視化法を開発した。(3)に関しては、近年低廉化が進んだグラフィックスハードウエアを利用することにより高速化を図り、インタラクティブなシステムを実現した。特に多重散乱などの光学的効果を計算する際にもハードウエアを利用できる方法を提案した。(4)については、雲、煙、砂漠、海のダイナミックスを考慮したアニメーションを作成しそのリアルな映像で有効性を確認した。なお、これらの成果は、9件の論文として発表した。本研究では自然科学分野における解析結果の可視化を高精度で実現することで、結果として産業界への応用の実現を目的としている。すなわち、CG技術を応用し、自然物をリアルに表示するものであり、空、雲、水などの自然現象を物理則に基づいて映像化する手法およびそのシステム開発を行なう。本研究は次の研究項目からなる。(1)自然物の光学特性のモデル化、(2)自然物の動作モデル、(3)インターネットを介したインタラクティブシステム、(4)アニメーションを利用した検証本年度は、(1)については、煙、雲の粒子の散乱特性を考慮したボリュームレンダリング手法を開発した。(2)および(3)については、雲、煙などではそれらの成長過程を解析しモデル化を行なった。雲についてはセルオートマトンを利用してその成長過程および風による変形を、煙りについては障害物を考慮した流れを考慮した煙を、リアルなアニメーション映像を生成してその動作を検証した。なお、これら成果は4件の論文として発表した。すなわち、CG技術を応用し、自然物をリアルに表示するものであり、空、雲、水などの自然現象を物理則に基づいて映像化する手法およびそのシステム開発を行う。(1)自然物の光学特性のモデル化,(2)自然物の動作モデル(3)インターネットを介したインタラクティブシステム(4)アニメーションを利用した検証本年度は、(1)については、砂漠の粒子や水の分子による散乱特性を考慮した可視化法を開発した。(2)および(3)に関しては、雲にはセルオートマトンおよびセルダイナミクス法による動的変化の計算法を開発し、煙にはレイノルズ方程式を基本に障害物を考慮した可視化法を開発し、(4)については、雲、煙、砂漠、海のダイナミックスを考慮したアニメーションを作成しそのリアルな映像で有効性を確認した。これらの成果は、昨年度の4件に加え、本年は5件の論文として発表した。
若年妊婦の親役割形成へのドゥーラによる支援システム開発に関する研究

今年度は、2年目に養成したドゥーラが、若年妊婦に対して、妊娠期から出産期、育児期まで個別に、継続的に支援を行うことができるようにフォローアップし、両者の支援関係が成立するための要件を明らかにするとともに、ドゥーラの医療者との連携に必要な要件を明らかにすることを目的に調査を実施した。その結果は以下の通りである。(1)2年目の養成セミナー受講者に活動の希望の有無を確認し、申し出た10名を登録した。ドゥーラ支援活動ができたのは7名であった。(2)協力施設は合計3施設であり、ドゥーラ支援を希望する妊婦の選択を依頼し、同意の得られた妊婦にドゥーラを紹介した。ドゥーラと妊婦の初回面接時は研究者が同席し、それ以降はドゥーラが主体的に妊婦と連絡をとり活動を行った。支援活動は、ドゥーラが妊婦の生活状況を考えて、支援方法の工夫を行っていた。妊娠中は電話やメールで、健診の同行、家族との顔合わせ等を行い、産後は入院中の面会や産後の1ケ月健診の同行、家庭訪問等を行っていた。出産時については、2名が事前に立会いを辞退し、他5名は「夫が立ち会う」「実母が立ち会う」「気持ちの余裕がなかった」「分娩は家族だけで」等の理由によりドゥーラは呼ばれず、7名全員とも立会いはできなかった。(3)ドゥーラ支援活動中のフォローアップとして、ドゥーラから妊婦への支援内容を支援毎に連絡票に記載して提出してもらい、質問事項などがある場合に対応した。また、研究者とドゥーラが参加して懇談会を開催し、ドゥーラからそれぞれの受け持ち妊婦の状況報告や支援内容、困っていることや心配なことなどについて意見交換を行った。そこでは、担当妊婦に対する思いやジレンマ、自分と妊婦(や実母)との価値観の相違などに関する意見が出されていた。ドゥーラ自身が自分の思いを表現することで、感情の整理やストレス発散の機会になっていたと考えられる。(4)今後の課題として、協力妊婦の募集方法やドゥーラの関わりの時期・期間、懇談会などドゥーラのフォローアップ体制、養成セミナーの内容、活動の普及方法などが明らかとなった。今年度は計画通り、(1)文献レビュー、(2)半構成的面接と参加観察、(3)グループフォーカスインタビューを実施した。その結果は次の通りである。1.文献レビュー本研究の関連分野について、過去10年間の文献検索を行い34の文献をレビューした。その中から抽出される、ドゥーラの役割(妊娠中・分娩中・産褥中)や位置付け、家族や友人・医療者との役割の違い(ドゥーラの独自性)、他の専門職との関わり、トレーニングに必要な内容、ドゥーラが関わることの効果等について明らかにしていくための分析を進めている。2.半構成的面接と参加観察初産婦7名に対して、妊娠期に約3回、分娩入院中、産褥入院中、産後1ヶ月目に各1回、面接を実施した。参加観察は分娩第13期に行った。面接では、各期における現在の自分自身のこと、胎児または子供への思い、生育暦に関すること、両親との関係、夫との関係、友人との関係等についてデータを収集した。参加観察では、産婦の言動および家族や医療関係者の言動等についてデータを収集した。これらのデータから、妊産婦のケアニーズとサポート内容について、分析作業中の現段階では下記のような傾向が認められた。(1)家族からのサポートが得られにくいケースでは特に、妊娠中定期的に母親の代理者的ドゥーラが「そばにいて、話を聴く」ことの妊産婦に与える影響は大きい。(2)妊産婦自身は自分の中に「解決する力」を持っており、他者に話をすることでその力が導き出される可能性がある。(3)結婚と妊娠を同時に経験する若年妊婦のケースでは、夫との関係調整へのサポートが必要である、等である。今後は引き続き分析を進め、来年度実施予定であるドゥーラの養成研修プログラムの作成に活用していく予定である。3.グループフォーカスインタビュー出産経験者で4050代の女性、12名(青森で5名、神戸で7名)に対してインタビューを行った。面接では、妊娠・出産の経験とその時の思い、育児の経験とその時の思い、他者の出産への立会いの有無とその時の思い、他者の出産に立ち会うための準備状況として必要と思われること等についてデータを収集した。データは現在質的分析を進めている段階である。今年度は、(1)ドゥーラを養成する研修会、(2)一般日本女性および助産師にドゥーラが受け入れられるか、またそのための工夫点等について把握することを目的とした質問紙調査を実施した。1.ドゥーラを養成する研修会研修会を全6回(週1回、90分の講義を2回)として構成し、青森と神戸で開催した。講義内容は、(1)ドゥーラの役割(2回)(2)コミュニケーション技術(2回)(3)ストレスマネジメント(1回)(4)育児技術(1回)(5)妊娠・分娩・産褥の経過とケア及び産痛緩和法(3回)(6)母子保健医療と制度・社会資源の活用(1回)(7)病院見学(2回)とした。参加者を公募し、青森17名、神戸16名が参加し、全員が修了した。

研修の評価については、現在集計中であるが概ね良好であり、ドゥーラの役割や活動に対するイメージが持て、自分がドゥーラとして活動するために必要な課題が明確になったようであった。2.質問紙調査(1)産後4ヶ月及び1年6ヶ月の女性を対象に615名、(2)病院及び産院で勤務する助産師94名、(3)出産経験のある4060代の女性830名にそれぞれ質問紙を配布した。調査内容は(1)に対しては妊娠・出産の経過、妊娠・出産・育児への他者からの支援状況、看護師・助産師から受けた具体的なケア内容と受けたかったケア内容、ドゥーラの支援に対する考え等、(2)に対しては妊産婦への具体的なケア内容と現在の実施度、ドゥーラの活用に対する考え、ドゥーラに必要な資質等、(3)に対しては妊娠・出産・育児に関する他者への支援経験の有無とその内容、ドゥーラとして活動することについての考え等とした。質問紙は平成19年3月31日現在で(1)234部、(2)34部、(3)318部回収した(現在も回収中)。データは今後分析を進めていく予定である。今年度は、2年目に養成したドゥーラが、若年妊婦に対して、妊娠期から出産期、育児期まで個別に、継続的に支援を行うことができるようにフォローアップし、両者の支援関係が成立するための要件を明らかにするとともに、ドゥーラの医療者との連携に必要な要件を明らかにすることを目的に調査を実施した。その結果は以下の通りである。(1)2年目の養成セミナー受講者に活動の希望の有無を確認し、申し出た10名を登録した。ドゥーラ支援活動ができたのは7名であった。(2)協力施設は合計3施設であり、ドゥーラ支援を希望する妊婦の選択を依頼し、同意の得られた妊婦にドゥーラを紹介した。ドゥーラと妊婦の初回面接時は研究者が同席し、それ以降はドゥーラが主体的に妊婦と連絡をとり活動を行った。支援活動は、ドゥーラが妊婦の生活状況を考えて、支援方法の工夫を行っていた。妊娠中は電話やメールで、健診の同行、家族との顔合わせ等を行い、産後は入院中の面会や産後の1ケ月健診の同行、家庭訪問等を行っていた。出産時については、2名が事前に立会いを辞退し、他5名は「夫が立ち会う」「実母が立ち会う」「気持ちの余裕がなかった」「分娩は家族だけで」等の理由によりドゥーラは呼ばれず、7名全員とも立会いはできなかった。(3)ドゥーラ支援活動中のフォローアップとして、ドゥーラから妊婦への支援内容を支援毎に連絡票に記載して提出してもらい、質問事項などがある場合に対応した。また、研究者とドゥーラが参加して懇談会を開催し、ドゥーラからそれぞれの受け持ち妊婦の状況報告や支援内容、困っていることや心配なことなどについて意見交換を行った。そこでは、担当妊婦に対する思いやジレンマ、自分と妊婦(や実母)との価値観の相違などに関する意見が出されていた。ドゥーラ自身が自分の思いを表現することで、感情の整理やストレス発散の機会になっていたと考えられる。(4)今後の課題として、協力妊婦の募集方法やドゥーラの関わりの時期・期間、懇談会などドゥーラのフォローアップ体制、養成セミナーの内容、活動の普及方法などが明らかとなった。
浸潤突起においてMT1-MMPと相互作用する因子の網羅的解析

浸潤突起においてMT1-MMPと結合する分子としてX4を同定した。X4を発現させるとCdc42、Racの活性化には影響を及ぼさないがRhoA特異的に活性化が亢進した。さらにX4はRhoGDIとは結合しないが、p27^<kiPl>と直接結合しRhoAをp27^<kiPl>から解離させることを見出した。その結果、p27^<kiPl>非結合型RhoAはGEFsが結合可能となり活性化が亢進する。shRNAを用いて内在性X4をノックダウンしたところ、p27^<kiPl>とRhoA複合体が増加し、LPA、PMA刺激によるRhoA活性化が減少した。一方、siRNAにより内在性p27^<kiPl>をノックダウンするとRhoA活性化が亢進し、この際X4を発現させてもRhoA活性化はこれ以上増加しなかった。このことから、X4はp27^<kiPl>経路を介してRhoA活性化を制御していることが明らかになった。一方、X4は浸潤突起においてMT1-MMPと結合する分子として同定されたことから、X4の局在を調べた。X4は浸潤突起でMTI-MMP、コルタクチンと共局在することが明らかになった。さらに、X4発現抑制細胞では浸潤突起形成が有意に抑制された。これらのことから、X4は浸潤突起でRhoA活性化を調節することで浸潤突起形成を制御することが示唆された。浸潤突起は、癌転移に重要な役割を果たすことが多数報告されており、X4は癌転移の治療に大いに貢献する可能性がある。従来の細胞や組織を用いたプロテオミクスでは検出されたタンパク質相互の関係や生命現象との因果関係とを結びつけることが困難であった。そこで解析の対象を限定し、特定の翻訳後修飾の状態、あるいは特定の細胞装置に焦点を当てることで特定の細胞機能情報を精密に得る試みが行われるようになっており、フォーカストプロテオミクスと呼ばれている。本研究では、実際に浸潤の起こる部位である浸潤突起に注目してMT1-MMPと相互作用する因子をフォーカストプロテオミクス解析で網羅的に同定した。まず突起形成が人為的に同調可能であることが望ましいためランダムmigrationの少ない癌細胞を検索し、同細胞に浸潤突起形成を伴ったmigrationを誘導するchemoattractantを検討し、浸潤突起における内在性MT1-MMPと相互作用する因子を抗MT1-MMP抗体カラムによりそれぞれ単離後フォーカストプロテオミクス解析で同定した。さらに、MT1-MMPの酵素活性により分解されてしまう相互作用因子が存在する可能性を考慮し、FLAGタグを融合させた恒常的非活性型MT1-MMPを安定発現させた細胞の浸潤突起から抗FLAG抗体カラムを用いて同様にフォーカストプロテオミクス解析した。解析から得られた因子を(x4)HT1080細胞を用いてノックダウン及びノックインした細胞株を樹立し、matrigelへの浸潤能を調べたところ有意な差が見られた。MT1-MMPは、MMP2の活性化を亢進すること、またx4がMT1-MMPと結合することからMMP2の活性化状態の違いにより浸潤能に有意な差が得られたことが予想された。そこで、プロテアーゼ活性を調べることが可能なゼラチンザイモグラフィーを行ったところ、興味深いことに、MMP2の発現量及び活性化状態に変化が見られなかったが、MMP9の発現量及び活性化状態が亢進していることが明らかとなった。現在、x4、MT1-MMP, MMP9の関係を明らかにしつつある。本研究は浸潤メカニズム解明の基礎的な知見として重要な位置を占めるだけでなく、新たな転移抑制を目的とした治療に役立ちうり、その成果は癌の転移抑制に貢献するため社会的にも非常に重要な情報をもたらすと考えられる。まず突起形成が人為的に同調可能であることが望ましいためランダムmigrationの少ない癌細胞を検索し、同細胞に浸潤突起形成を伴ったmigrationを誘導するchemoat tractantを検討し、浸潤突起における内在性MT1-MMPと相互作用する因子を抗MT1-MMP抗体カラムによりそれぞれ単離後フォーカストプロテオミクス解析で同定した。解析から得られた因子を(x4)、HT1080細胞を用いてノックダウン及びノックインした細胞株を樹立し、matrige1への浸潤能を調べたところ有意な差が見られた。

MT1-MMPは、MMP2の活性化を亢進すること、またx4がMT1-MMPと結合することからMMP2の活性化状態の違いにより浸潤能に有意な差が得られたことが予想された。そこで、プロテアーゼ活性を調べることが可能なゼラチンザイモグラフィーを行ったところ、興味深いことに、MMP2の発現量及び活性化状態に変化が見られなかったが、MMP9の発現量及び活性化状態が亢進していることが明らかとなった。現在、x4、MT1-MMP, MMP9の関係を明らかにしつつある。本研究は浸潤メカニズム解明の基礎的な知見として重要な位置を占めるだけでなく、新たな転移抑制を目的とした治療に役立ちうり、その成果は癌の転移抑制に貢献するため社会的にも非常に重要な情報をもたらすと考えられる。浸潤突起においてMT1-MMPと結合する分子としてX4を同定した。X4を発現させるとCdc42、Racの活性化には影響を及ぼさないがRhoA特異的に活性化が亢進した。さらにX4はRhoGDIとは結合しないが、p27^<kiPl>と直接結合しRhoAをp27^<kiPl>から解離させることを見出した。その結果、p27^<kiPl>非結合型RhoAはGEFsが結合可能となり活性化が亢進する。shRNAを用いて内在性X4をノックダウンしたところ、p27^<kiPl>とRhoA複合体が増加し、LPA、PMA刺激によるRhoA活性化が減少した。一方、siRNAにより内在性p27^<kiPl>をノックダウンするとRhoA活性化が亢進し、この際X4を発現させてもRhoA活性化はこれ以上増加しなかった。このことから、X4はp27^<kiPl>経路を介してRhoA活性化を制御していることが明らかになった。一方、X4は浸潤突起においてMT1-MMPと結合する分子として同定されたことから、X4の局在を調べた。X4は浸潤突起でMTI-MMP、コルタクチンと共局在することが明らかになった。さらに、X4発現抑制細胞では浸潤突起形成が有意に抑制された。これらのことから、X4は浸潤突起でRhoA活性化を調節することで浸潤突起形成を制御することが示唆された。浸潤突起は、癌転移に重要な役割を果たすことが多数報告されており、X4は癌転移の治療に大いに貢献する可能性がある。
実数直交擬似雑音系列を用いたスペクトラム拡散変復調方式の研究

本研究は,M系列などの2値系列よりも相関特性の良い実数直交擬似雑音系列によって情報を符号化・変調し,逆に復調・復号化する具体的な方式を開発し,性能を良いスペクトラム拡散通信方式の実用化を促すことを目的として,平成2年度から平成3年度まで行われた。本方式は従来にない新しい方式であるので,設計から実験までの過程を系統的に究明し,この方面の技術者が納得し易いように留意した。結果として,振幅変調に基づく符号,パルス幅変調に基づく符号の同期式又は準同期式のスペクトラム拡散多重伝送において,多局間干渉はほぼ理論通りの従来にない低い値に抑えられた。実験システムは,低周波帯域でのディジタル信号処理に基づいて構成したが,今後,専用プロセッサの高速化が進めば実用的な伝送速度のスペクトラム拡散通信システムが実現できよう。以下に,研究成果を項目ごとに要約する。1.変復調方式の設計同期式および準同期式のスペクトラム拡散多元接続において多局間干渉を生じないように拡幅変調符号,パルス幅変調符号を構成し,相関処理を行う方式を設計した。量子化誤差,付加雑音,帯域の相関出力への影響を解析とシミュレ-ションによって明らかにした。2.変復調システムの構成周期長256の擬似雑音系列から振幅変調符号,パルス幅変調符号を作り,帯域通過形の伝送路を通し,伝送帯域および基底帯域で高速フ-リエ変換を介したディジタル相関処理を行うシステムを構成した。3.変復調方式の評価実験2チャネルの多重符号に広帯域ガウス雑音を重畳してデ-タ復調実験を行い,復調出力波形,処理利得,必要信号対不要信号比の改善比,ビット誤率はほぼ理論に近い高い性能を示した。本研究は,M系列などの2値系列よりも相関特性の良い実数直実擬似雑音系列で情報を符号化・変調し,逆に復調・復号化する具体的な方式を研究し,性能の良いスペクトル拡散通信方式の実用化を促すことを目的としたものである。本研究は来年度も引き続き行う予定であるが,本年度の研究実績を以下に要約する。1.変復調方式の検討一定のシフト範囲で無相関となる系列であって,絶対値が小さく長さが2のべき乗となるものを開発し,送信器の電力利用効率を高め,相関処理に高速フ-リエ変換が利用でき,而も一定のシフト範囲で無干渉な多重伝送に利用できるようにした。振幅変調,パルス幅変調,位相変調および相関処理をディジタル的に実行できる方式を検討し,量子化雑音が白色ガウス雑音と同様に処理利得によって抑圧できることをシミュレ-ションで確認した。又,伝送帯域,基底帯域での相関処理を検討した。2.変復調方式の予備実験別途校費によって設置した任意波形発生器(横河電機(株)製AG1200,139万円)および本体研究費によって設置したディジタルオシロスコ-プ(横河電機(株)製DL1200,88万円)を用いて,50kHz付近の超音波伝送路,帯域通過模擬伝送路,DC5kHzの低域通過模擬伝送路でのスペクトル拡散通信の予備実験を能率良く行うことができた。この実験では,システムは同一クロックに同期させ,全帯域での相関処理,キャリヤによる復調後の基底帯域での相関処理を行い,相関出力は理論およびシミュレ-ション通りの高いSN比(系列長256のとき60dB以上)で得られた。又,多重伝送の実験でも希望波と不要波が高いDU比(2チャネル伝送のとき60dB)で得られた。以上の実績より,次年度の研究の遂行に十分な見通しが得られた。