hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老化関連骨軟骨疾患におけるklotho遺伝子の関与

ヒトPPAR-γ遺伝子多型と閉経後女性の骨密度との相関については今後の課題であり、現在、ヒトPPAR-γ遺伝子におけるSNP検索を行っている。1.現在までの検討で、klotho遺伝子プロモーター領域のSNPである-395G->Aが人種差を超えて高齢女性において骨密度と有意な相関を示すこと、このG->A変異は核内転写因子との結合能に影響を及ぼすことを公表した[Kawano K, etal. J Bone Miner Res 17:1744, 2002]。ルシフェラーゼアッセイにおいてこのG->A置換はklothoの発現効率に大きな変化を及ぼさなかったが、この近傍でdeletion studyを行ったところ、-410と-370の間で有意なルシフェラーゼ活性の低下が見られ(p=0.04)、転写制御因子の同定の糸口となる可能性が示された。2.PPARγ欠損マウスの骨組織の解析より、PPARγの抑制は生体内において骨髄前駆細胞からの骨芽細胞の分化を促進することによって骨量を増加させることを示した。今年度はforwardgenetics approachとして、日本人のヒトPPARγ遺伝子に3カ所のSNPsを同定して骨密度との相関を検討したが、閉経後女性(n=501,1002 allele)において、現在のところ有意な相関は見いだしていない。3.骨芽細胞を取り巻く局所因子としては、autocrine/paracrine factorとして働く骨にアナボリックな作用を持ったサイトカイン・成長因子が考えられている。これらの中でも最も老化との関与が従来指摘されてきたのはIGF-Iの産生および機能の低下である。そこで、IGF-Iの細胞内シグナル分子であるIRS-1およびIRS-2についてreverse geneticsの解析を行った。両KOマウスの解析から、IRS-1が骨形成と骨吸収を共に上昇させることで骨代謝回転の維持に重要なシグナルである[J Clin Invest 105:935, 2000]のに対し、IRS-2はこの両者のバランスを骨形成優位の状態に保持するために重要なシグナルであること[J Cell Biol 159:147, 2002]を明らかにした。この両シグナルの総和として、IGF-Iによる骨代謝に対する強力な同化作用が実現されていると考えられた。老化に伴ってIGF-Iが減少することによってこの骨形成促進シグナルが抑制を受け、骨量減少が起こるものと推察された。1.昨年までの研究で、ヒトklotho遺伝子プロモーター領域のSNPである-395G->Aが人種差を超えて高齢女性において骨密度と有意な相関を示すこと、このG->A変異は核内転写因子との結合能に影響を及ぼすことを報告した。しかしながら本年度の検討で、骨密度と有意な相関を示したSNPsと、変形性脊椎症の重症度および脊椎靱帯骨化症とは有意な相関を示さなかった。また、ヒトklotho遺伝子の転写活性について検討を行ったところ、このG->A置換はklothoの発現効率に大きな変化を及ぼさなかったが、この近傍でのdeletion studyの結果-410と-370の間で有意なルシフェラーゼ活性の低下が見られた。
公共部門の財政規律のインフラとしての発生基準会計の意義

この期間には、財政規律のインフラとしての公会計、特にそこでの発生基準の果たす役割を次の2点から検討した。1.地方公共団体における財政の早期是正措置のインフラとしての財務指標の作成・利用にあたっての現金基準会計情報の限界・欠陥と対比した発生基準会計情報の有用性・目的適合性の実証ここでは、現金基準会計に準拠した従来の実質赤字比率が積立金への繰り入れ、取り崩しや地方債の繰上償還の調整などによって裁量的に操作される余地があることを実証し、そうした操作可能性を排除する発生基準会計の意義を導いた。2.国の特別会計の財政規律を検査・促進するにあたっての発生基準会計の役割ここでは、昨今、議論されている特別会計のいわゆる「埋蔵金」論争に焦点を当て、いくつかの特別会計に不要不急の余剰金(歳出予算の連年にわたる不用額、必要水準を超えて繰り越される歳計剰余金)が生じるメカニズムを分析するとともに、その根底には、使途が不明のまま多額の歳出予算が翌年度に繰り越されている実態、見合いの歳出繰越がないまま多額の歳計剰余金が翌年度の歳入に繰入られている実態があることを検証した。そして、こうした財政規律の弛緩を是正するには、歳出予算や歳計剰余金の次年度繰越が発生の可能性が高い支出に見合うものかどうかを検証する発生基準の考え方を適用することが必要との結論を導いた。本年度は公共部門の財政規律を促すインフラとしての会計の機能の中で主要な情報になり得ると考えられる負債情報の認識・開示のあり方を理論的側面から研究してきた。その場合、政府負債の概念・範囲、認識要件に関しては、発生基準を公共部門の会計に適用することで負債の認識範囲と認識時点(タイミング)がどのように適正化され、財政規律のモニタリングを改善する効果が期待できるのかという視点から、内外の文献を調査・検討した。そこから得られた主な知見は以下のとおりである。政府負債の認識にあたっては、法律や契約で裏付けられた明示的債務(Explicit liabilities)と区別される非明示的債務(Implicit liabilities)の認識が重要な意味を持つ。後者の典型例としては公的年金に係る将来債務が挙げられるが、その多くは、発生の可能性が不確定な将来の特定の事象に依存する条件付債務(Contingent liabilities)といえる。この「条件付債務」概念をわが国の中央・地方の政府活動に適用すると、該当する負債として、公的年金に係る政府債務、環境負債、いわゆる交付税措置に関わる国の対地方債務などが挙げられる。いずれも、発生基準会計によって捕捉される将来債務であり、その認識いかんで財政赤字の多寡に大きな影響を及ぼす。にもかかわらず、現状では、これら負債の認識要件(認識の範囲、金額の算定方法など)はいまだ確立されていない。また、近年、わが国の政府部門の民営化、特殊法人等が発行する非政府保証債と絡んで、「暗黙の政府保証」の存在が財政規律に及ぼす影響が注目されていることも確かめられた。次年度は、こうした政府負債の認識をめぐる会計問題を財政運営のインフラとしての発生基準会計(広くは公会計)の役割という視点から、諸外国における制度、研究文献を渉猟しながら、研究していく予定である。本年度も昨年度に続き、公共部門の財政規律を促すインフラとしての公会計の機能に焦点を充て、その中で主要な情報になると考えられる負債情報の認識・開示のあり方を理論面国際比較の面から研究した。特に、本年度は、(1)先進主要国で進行している予算制度改革-複数年度予算制度の検討・導入、予算外項目(オフ・バジェット)の透明化のための開示制度の検討なとに注目して1998年に発表されたIMFコードや1999年に発表されたOECDコードが、オフバジェット項目の透明化と財政赤字の削減の相関性に着目して、(最)優良慣行を定め、それの普及を試みている実態の調査・検討を進めた。(2)また、交付税措置に係る国と地方の債権・債務関係や債務負担行為をめぐるわが国での開示の現状、総務省による新しい起債制限方式の検討、これらをめぐる研究動向を調査・サーベイした。

その上で、公的債務に対するモニタリングを実効あるものにするには、公会計上での負債の認識を債務の確定性に固執した方法から期末時点でのBest Estimateを基本とする方法に切り替えることが必要であるとの暫定的結論を得た。具体的には、交付税措置に係る国の地方に対する債務を例にして吟味した結果、数々な不確定要素を孕むとはいえ、その金額的重要性に鑑みると、膨大な算定要素を財政力指数に集約して、毎期、被交付団体のこの指数の変動にスライドさせて国の債務を洗い替えしていく方式が測定の信頼性と有用性を均衡させる最善の方法ではないかとの暫定的結論を得た。ただ、その場合でも、交付税措置に係る国の債務が各種国税の一定割合に制限され、地方公共団体全体の基準財政需要に対するマクロベースの財源保障を意味するのに対して、交付税措置に係る地方公共団体の債権はミクロベースの債権の積み上げであるというねじれ現象をどう評価し、この乖離にどう対応するかは今後に残された重要な研究課題である。以上のような研究を踏まえ、2006年12月16日(土)に財政学研究者と共催で「予算制度改革と公会計の役割」と題するシンポジウムを開催し、そこで「財政運営のインフラとしての公会計の役割」という論題の研究報告を行った。本年度は公共部門の財政規律を促すインフラとして公会計を活用する趣旨で近年、改革あるいは法制度化が図られた次の2つの分野を対象に研究を進めた。(1)地方財政健全化法における財務指標の利用のあり方、(2)特別会計改革の動きと特別会計における積立金の活用のあり方をめぐる議論。このうち、(1)については、(1)近年、急増している積立金・基金の取り崩しを収入に含めた実質収支を地方財政健全化法の発動要件の一つとしている点、(2)一般会計の債務負担行為や第三セクターに対する債務保証、損失補償等を将来負担比率に的確に反映していない点、(3)自治体病院等、当該団体の自助努力だけでは収支の均衡を期しがたい特別会計や外郭団体の赤字も一律に連結実質収支の赤字に含め、財政健全化指標に反映させる地方財政健全化法の問題点を指摘した。(2)については、旧電源開発対策特別会計、外国為替資金特別会計を事例に取り上げ、国の多くの特別会計で連年、多額の不用額、繰越金が発生し、積立金が累増している実態を調査するとともに、その原因が見合いの支出予定額が定かでないまま、不用額=剰余金が繰り越されている点にあることを指摘した。その上で、こうした過剰な剰余金を積立金として任意に繰り越すのではなく、負債性引当金の要件に照らし、それを満たすものに限定して特定の負債性引当金として繰り越すよう会計制度を改めることを提唱した。
中国新彊トルファンヤールホト古墳群の総合研究

3年目の今年度はこれまで収集したデータの整理,さらにはその分析に主眼をおいた。当該研究では,基礎データの整備を急務と考え,500分の1の地形測量図と250mグリッドによる墳墓分布図の作成を計画し,昨年度までに全域の分布図をほぼ完成し,今年度は追加調査を実施し修正を加えた。地形図・分布図の作成によって,墓域内の分布の偏りや造営の傾向の把握が可能となった。現地で記録した個々の墳墓のデータ(立地,封土の有無,葺き石の有無,既掘・盗掘の有無,墳丘長・幅,墓道の状態,墓道長・幅,墓道方向など)をコンピュータに入力し,画像をあわせてヤールホト古墳群データベースを作成した。ここに当初の目標であるデータベースを、ひとまず完成させることができた。分布図とデータベースの作成,それに発掘調査の成果をあわせてヤールホト古墳群の造営に関していくつかの傾向を把握することができる。以下にデータベースをもとにした分析から得た幾つかの傾向を指摘し,当該研究の今後の可能性を示すことにする。麹氏高昌国時代の墳墓は,各群単位で塋域数と墳墓数の相関関係,塋域開口方向,塋域の造営方法などを検討すると,(1)墳墓の構築場所をみると城南区の北西側ほど塋域内に墳墓がつくられる例が多く,南東側ほど塋域外につくられる墳墓の割合が高まる,(2)塋域の開口方向は,ほぼ南東向きか北東向きであり、全体の9割近くをしめる,(3)塋域の規模は北西側の地域が大きく,南東側ほど規模が小さい,(4)塋域の半数以上が塋域内の全域をみたすことなく造営を終了する,(5)一定期間続けて2列以上墳墓が作られた塋域では、6割以上の率で,もっとも奥に最大規模の墳墓をもつ傾向を導き出すことができる。唐の西州時代の墳墓は,640年に麹氏高昌国を唐が滅ぼし,安西都護府が設置されて以降に見られる。墓誌の紀年銘をあわせ見ると,唐の支配下となったあとも引き続き同じ塋域内に墳墓を構築していることがわかる。唐によって麹氏高昌国が滅ぼされた後,統治機構などには大きな変化を被りながら,墓葬は従来の伝統を踏襲しつつしだいに中原風の埋葬習俗を受け入れたことが解る。今後はあしかけ10年におよぶこの調査成果を基礎にして、60年前に調査した黄文弼の墳墓との比定、ヤールホト古墳群の発掘調査、周辺地域の墳墓との対比などが要請される。また交河故城や高昌故城など都城遺跡との関係や甘粛省や中国内地の墳墓との比較研究が必要になろう。そのための基礎的なデータは、今回の研究によって十二分に蓄積されたと考えている。

今後はあしかけ10年におよぶこの調査成果を基礎にして、60年前に調査した黄文弼の墳墓との比定、ヤールホト古墳群の発掘調査、周辺地域の墳墓との対比などが要請される。また交河故城や高昌故城など都城遺跡との関係や甘粛省や中国内地の墳墓との比較研究が必要になろう。そのための基礎的なデータは、今回の研究によって十二分に蓄積されたと考えている。早稲田大学シルクロード調査隊は、19941997年にかけて、主に文部省科学研究費により中国新彊ウイグル自治区トルファン地域で歴史学・考古学・美術史学の分野から総合的な調査を行ってきた。特に著名な都城遺跡交河故城の墓地であるヤールホト古墳群を対象の中心とし、発掘および悉皆調査を行い重要な成果を挙げた。その他周辺地域の遺跡の踏査も行い、同時代の墓地や貴重な壁画の残る石窟寺院等の調査を実施した。遺跡の現地調査の他に新彊文物考古研究所や新彊ウイグル自治区博物館において土器や墓誌等の出土毒物の資料調査も行ってきた。その成果もあり基礎的なデータを蓄積しつつある。引き続いて1998年度からは本科学研究費により研究を継続している。科学研究費以外にも他財団からの助成金を得ているが、それらは海外での現地調査を行うための資金として使用し、科学研究費では得られた成果を国内にて整理・考察する作業を行うために活用している。これまでに得たデータの量は膨大であり早急な整理が必要である。トルファン地域はシルクロードの要衝で東西南北からの各文化が行き交う場所であったため、中国のみならず、西アジアや東南アジアなど、広い範囲での比較研究が不可欠となる。そのため現在は現地での調査とともにその他の地域の資料の収集・整理を行っている。今年度の科研費では、特に中国での関連する地域の報告を収集して抜き出し、主に中国北方における遺跡発掘報告の資料を中心に整理してデータベース化ができた。特に文化交流を考察するためには基礎的な資料を多く集めることが不可欠であり、今後のさらなる研究のためにも重要である。最終的には、収集したデータはデータベース化し、シルクロードの東西交渉史研究や今後の調査の基礎資料として有効に利用できるよう広く公開する事を目的としている。今後もトルファン地域に重点を置いて調査・研究を進めていく予定である。早稲田大学シルクロード調査隊は1994年度から1996年度にかけて、中国新彊ウイグル自治区トルファン地域において、主に文部省科学研究費により様々な分野から総合的な調査を行ってきた。特に交河故城の墓域であるヤールホト古墳群を対象の中心とし、発掘および悉皆調査を行い重要な成果を挙げた。また遺跡の現地調査の他に土器や墓誌等の出土遺物の資料調査も行ってきた。それらの成果によりすでに基礎的なデータは蓄積している。今年度も引き続きデータの整理作業を押し進めた。ヤールホト古墳群では2000基を越す古墳が現在も残っており、これら全てに関して基礎的なデータを収集している。データは地形図を使用した墓葬の分布図および悉皆調査によって収集した各古墳の計測データ、さらに個々の墓葬の写真がある。これらのデータおよび、過去において行われた発掘の資料を合わせると、現時点ではほぼ完全なデータベースが完成する。今年度は1996年に整理を行ったデータに加え、1997年以降に収集したデータを追加・修正し、整理を行っている。また昨年度に引き続いて中国での関連する地域の報告を収集して抜き出し、主に中原における遺跡発掘報告の資料を中心として整理を行った。ヤールホト古墳群では大きくわけて車師前国時代と麹氏高昌国時代の2つの時代の墓葬があり、いずれも中国中央との関係が深いことから、これらの資料の整理は最終的な考察の際に重要となってくる。さらに新疆文物考古研究所において墓葬のデータに関する情報を得た。この結果、ヤールホト古墳群の全体像をとらえることが可能になっている。最終的な目的は、シルクロードの東西交渉史研究や今後の調査研究に利用可能なデータベースを公開する事であり、学術・教育的な面でも大きな効果を期待できる。
TRAIL/DR5を介する急性冠症候群の免疫学的機序の解明

動脈硬化進展と粥腫(プラーク)の不安定化が急性冠症候群(ACS)発症をもたらし、その原因には炎症・免疫学的機序が深く関わっている。本研究で以下のことが明らかとなった。(1)不安定粥腫にはTRAIL陽性CD4 T細胞とTRAILレセプター(DR5)陽性血管平滑筋細胞・血管内皮細胞が多数認められ、TRAIL/DR5シグナルを介して標的細胞にアポトーシスが誘導される。(2) CD4 T細胞から産生される炎症性サイトカインTNFαはDR5を増強し粥腫を不安定化する。(3)患者血中sTRAIL測定は、粥腫不安定性や重症度を予測可能であり、新たな免疫学的バイオマーカーとなりえる。本年度は、まず急性冠症候群(ACS)発症をきたす不安定粥腫形成に重要な役割を担うと考えられるCD4 T細胞のphenotypeを検討した。ACS末梢血より単離したCD4 T細胞はERKリン酸化を介しT細胞活性化マーカーCD69を強く発現、T細胞レセプター刺激によりTRAIL発現も正常群に比し増強していた。また血管内皮細胞にはTRAIL receptor(DR5)が冠動脈平滑筋細胞、大動脈平滑筋細胞よりmRNAおよび蛋白レベルともに強く発現していた。ACS CD4 T細胞はTRAIL/DR5を介し血管平滑筋細胞のみならず血管内皮細胞にもアポトーシスを誘導することが中和抗体を用いたアポトーシスアッセイで明らかとなり、血管糜爛さらには粥腫不安定化に寄与すると考えられた。一方、スタチンには脂質低下作用によらない心血管イベント抑制効果が知られているが、急性期ACS CD4 T細胞のCD69発現、TRAIL発現およびCD4 T細胞による血管内皮細胞アポトーシスがスタチンで抑制され、スタチンの心血管保護作用の免疫学的機序のひとつを明らかとした(Atherosclerosis 2010, in press)。また、ACS急性期に血栓吸引療法で得た冠動脈血CD4 T細胞は末梢血CD4 T細胞より血管内皮細胞障害性が強く、責任冠動脈病変の粥腫組織にCD4 T細胞は非常に多く浸潤していた。急性期および慢性期血中soluble TRAIL測定を行ったところ、soluble TRAILは病状に応じて急性期に非常に低値を示し、血管内皮細胞障害性の程度と逆相関を認めた。soluble TRAIL測定は高感度CRP測定よりもACS診断において感度・特異度ともに優れ、新しいバイオマーカーとなる可能性が示唆された。次年度は本年度の結果を踏まえ、冠動脈組織評価、soluble TRAIL測定意義の検討、およびTRAIL発現調節機序の研究を進める。まず前年度研究結果で明らかとなった、スタチンの脂質低下作用によらない心血管イベント抑制効果の免疫学的機序をAtherosclerosis, 213 ; 33-39, 2010に発表した。スタチンは、急性冠症候群(ACS)患者CD4T細胞のERKリン酸化を阻害することで、T細胞活性化(CD69)とTRAIL発現、さらに血管内皮細胞アポトーシスを抑制して粥腫安定化をもたらすと考えられた。本年度は、動脈硬化モデルであるApo Eノックアウトマウスにスタチンを投与し、動脈硬化進展抑制と粥腫でのCD4 T細胞浸潤の減少、TRAIL陽性CD4 T細胞発現の低下を確認した。また、ACS患者末梢血soluble TRAILは急性期や重症例で低値を示し、血管内皮細胞障害の程度と逆相関を認めた。末梢血soluble TRAIL測定はACS診断において、高感度CRP測定よりも感度・特異度ともに優れており、新しいバイオマーカーとなる可能性があることを現在論文準備中である。さらに、ヒト冠動脈・頚動脈における粥腫を病理学的に安定粥腫と不安定粥腫に分類し、TRAIL/TRAIL receptor(DR5)発現とCD4 T細胞の形質を比較検討した。不安定粥腫ではTRAIL陽性CD4 T細胞浸潤、DR5発現、接着分子PSGL-1陽性CD4 T細胞、アポトーシスを多く認めた。マクロファージやCD4 T細胞より産生されるTNFαは、血管平滑筋細胞にDR5発現の増強とアポトーシスを誘導し、抗TNFα抗体処理によりDR5発現とアポトーシスは抑制された。次年度は本年度の研究結果を総括の上さらに研究を進めると共に、マウスを用いてPSGL-1発現CD4 T細胞の粥腫不安定化やTRAILを含むアポトーシスシグナルへの関与を解明し、今までの研究結果を総括する。前年度に引き続き、ヒト冠動脈・頚動脈における粥腫を病理学的に安定粥腫と不安定粥腫に分類し、TRAIL/TRAIL receptor(DR5)発現とCD4T細胞の形質を比較検討した。不安定粥腫ではTRAIL陽性CD4T細胞浸潤、DR5発現血管平滑筋細胞、アポトーシスを多く認めた。

マクロファージやCD4T細胞より産生されるTNFαは、血管平滑筋細胞にDR5発現の増強とアポトーシスを誘導し、抗TNFα抗体処理によりDR5発現とアポトーシスは抑制された。さらに急性冠症候群(ACS)患者の血栓吸引療法で得た責任冠動脈血中や粥腫には、接着分子PSGL-1陽性CD4T細胞を末梢血より多く認め、血管内皮細胞に強力にCaspase3を活性化してアポトーシスを誘導した。高脂肪食負荷ApoE^<-/->マウスで認めた著名な動脈硬化進展は、ApoE^<-/->/PSGL-1^<-/->マウスで強く抑制され、CD4T細胞浸潤も減少していた。また、ApoE^<-/->マウスでは、T細胞サブセットのうちTh1,Th17が増加し、Th2は不変でTregが減少していた。現在、ApoE^<-/->/PSGL-1^<-/->ダブルノックアウトマウスで動脈硬化が著明改善した機序について、詳細に検討を行っている。また、昨年に引き続き、ACS患者、安定狭心症患者、コントロール患者における末梢血soluble TRAILの検討を行った。冠動脈正常なコントロール患者、安定狭心症に比較し、急性期や重症例ではsoluble TRAILは低値を示し、血管内皮細胞障害の程度と逆相関を認めた。末梢血soluble TRAIL測定はACS診断において、高感度CRP測定よりも感度・特異度ともに優れており、新しいバイオマーカーとなる可能性があると考えられた。日本人ACS患者の適正脂質管理を明らかにするため、現在当院循環器内科で登録中の大規模臨床試験HIJC-PROPER患者血清を、今後解析する予定である。
制菌性を有する歯科用チタン合金の開発

生体適合性に優れ、かつ口腔内細菌に対する制菌作用を兼ね備えた新しい歯科生体材料の開発を目的とし、チタン銀合金を設計、試作した。平成19年度は、前年度のアノード分極試験で耐食性の良好であったチタン銀合金(525mass%Ag)の溶出試験と自然電極電位の測定を行った。チタン銀合金のα相および金属間化合物から溶出するイオン量を調べることで、耐食性を溶出イオンの面から評価した。また、齲蝕原性細菌(Streptococcus mutans)をチタン銀合金上でフィルム密着法により培養し、その後に試験菌を洗い出し、10倍希釈法で生菌数を求めた。純チタンや純銀の結果と比較し、チタン銀合金のS.mutans菌に対する制菌性を評価した。耐食性:0.9%NaCl水溶液では、チタン銀合金(520mass%Ag)からはいずれの溶出イオンも検出されなかった。22.5mass%Agと25mass%Agのいくつかの試料ではTiAgが優先溶解したが、その溶出イオン量は従来の歯科用合金から溶出するイオン量よりはるかに少なかった。1%乳酸水溶液ではAgの添加によりα相からのTiイオンの溶出が抑制された。溶出イオンの面からも、チタン銀合金の耐食性は良好であることが分かった。自然電極電位の結果から、特にチタン銀合金(520mass%Ag)の耐食性は純チタンと同等以上であると考えられた。制菌性:フィルム密着法によるS.mutans菌への制菌性試験で、25mass%Ag合金における生菌数は純チタンと比較して相対的に減少していた。純銀における生菌数は0であった。Ag添加の効果により、チタン銀・合金は細菌の増殖を抑制している可能性が示唆された。制菌性の評価方法としてフィルム密着法は有効であると考えられた。平成18年度は試作チタン銀合金のアノード分極曲線の測定を行い、電気化学的腐食挙動を調べ、チタンの優れた耐食性を維持することのできるチタン銀合金の組成範囲を明らかにした。また耐食性の良好であったチタン銀合金について、制菌性を評価するための実験方法を検討した。アノード分極曲線の測定:0.9%NaCl水溶液と1%乳酸水溶液における試作チタン銀合金(40mass%Ag)のアノード分極曲線の測定を行い、組成により耐食性が変化する機構について金属組織学的に検討した。その結果、α単相のチタン銀合金(17.5mass%Ag)はいずれの溶液でも純チタンに準ずる耐食性を持つことが分かった。銀添加量が増加すると、固溶限を超えた銀が金属間化合物Ti_2AgまたはTi_2Ag+TiAgとしてαチタンの結晶粒界部にわずかに析出した。それら金属間化合物は0.9%NaCl水溶液中で低電位溶解を示したが、α+Ti_2Agのチタン銀合金(2025mass%Ag)は表面のTi_2Agが溶解した後すぐに再不動態化するため、耐食性はチタンより若干低下する程度と考えられた。1%乳酸水溶液中ではTi_2Agは溶解しなかったが、TiAgは優先溶解した。制菌性試験:耐食性の良好であった試作チタン銀合金(20,25mass%Ag)のS.mutans菌への制菌性調べるため、ハロー法で評価した。その結果、明確な生育阻止円は観察されなかったが、試料接触面に菌の生育が見られなかった。このことから、チタン銀合金は制菌性を有する可能性が高く、フィルム密着法による評価がより有効と考え、現在検討している。
植物ダニの紫外線損傷と保護修復機構の解明

施設栽培におけるUVBを利用した新しいハダニ管理技術への反映を目的として、ダニ類の1UV損傷の発症に関する分子メカニズムと2抗酸化物質による生体保護機能について検証した。1ではDNA損傷と死亡または光回復との相関を立証した。幼虫期にUVBに暴露された個体は静止期に特異的に死亡し、その原因として形態形成遺伝子の損傷が示唆された。また、気温の低下によるハダニ防除効果の増大が明らかになった。2ではハダニが持つカロテノイド類の同定と共にUVBや高温による過酸化脂質生成の抑制などの保護効果が明らかになった。さらに、カブリダニが花粉食を通じて抗酸化物質による保護効果を獲得していることが分かった。1. UV損傷の発症と光回復に関する分子メカニズムの解明これまでの研究により、ハダニにおけるUV損傷の主要な原因としてDNA損傷が考えられていた。しかし、DNAにおける損傷とその回復に関する証明ができていなかった。そこで、モノクローナル抗体によるELIZA(固相酵素免疫検定)法を用いて、光回復により修復されると考えられるピリミジンダイマー(CPD)の定量法を検討した。その結果、ナミハダニにおけるCPD量がUVB照射量と相関し、また光回復によってCPDが修復されていることが確認できた。2.ハダニの生体保護機能の解明ミカンハダニ野生型・アルビノ型およびナミハダニの非休眠・休眠個体について、カロテノイド組成を詳細に分析した。その結果、ミカンハダニの野生型では、ネオキサンチン、ビオラキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、α-カロテン、β-カロテンならびにビオラキサンチンエステル、アスタキサンチンエステル、ビオラキサンチンジエステル、アスタキサンチンジエステルが同定された。これらの内、ネオキサンチンとビオラキサンチンの存在はこの分析により初めて明らかになった。これらの内、アスタキサンチンはほぼ80%以上がエステル体として存在することが示唆された。また、コレステロールエステラーゼを用いた加水分解処理による増加から、ルテインもエステル体として保存している可能性が示唆された。アルビノにおいても、ルテインやカロテン、また微量のネオキサンチンやビオラキサンチンが検出されたが、アスタキサンチンは検出されなかった。ナミハダニの休眠個体からはアスタキサンチン、ルテイン、3-ヒドロキシエキネノン、β-カロテンが検出された。一方、非休眠個体からはルテイン、cis-ルテイン、β-カロテンと2種類の未同定のカロテノイドが検出された。これらをもとに、今後、抗酸化活性の評価を進める予定である。1. UV損傷の発症と光回復に関する分子メカニズムの解明UVBによるDNA損傷は、損傷を受けた遺伝子が発現しない発育ステージでは大きなコストにならず、遺伝子発現までに光修復が完了すればハダニはUVによる致死的ダメージから回復できるという仮説に基づき、UV照射の有無によるDNA損傷の差異が幼虫の遺伝子発現に及ぼす影響について、次世代シーケンサーによる網羅的発現遺伝子解析(RNA-seq)を行った。今後、RNA-seqを反復することにより、UVによるDNA損傷と可視光による光回復の実態を解明する。一方、DNA修復酵素の発現のタイミングについて、昨年度のナミハダニ幼虫における検証では、30分間のUVB・可視光照射によってCPDフォトリアーゼ遺伝子発現量は30分間以内では変化しなかった。そこで、UVB照射からタイムラグを経て発現が誘導されるかどうかを検証するとともに、昨年度は知られている4遺伝子のうち3遺伝子に共通のプライマーを用いて解析していたものを、現在、遺伝子特異的プライマーに変更してさらに解析を進めており、今後、RNA-seqの結果と合わせてハダニにおけるUV損傷と生物影響、その回復機構に迫る予定である。2.ハダニの生体保護機能の解明昨年度の分析から、ミカンハダニの野生型とアルビノ型のカロテノイド組成は、寄主植物由来のものを除けば野生型でアスタキサンチンとそのエステル体が存在する点においてのみ系統間の際があることが判明した。本年度の分析では、主にカロテノイドの働きによる一重項酸素除去能力が野生型で高いのに対して、主に代謝的反応による酸素ラジカル吸収能では系統間に際がないことが明らかになった。さらに、UVおよび高温ストレス下で飼育した場合には、野生型に比べてアルビノ型で顕著に高い過酸化脂質の蓄積が起こることが明らかになった。UV損傷と光回復については、ほぼ想定通りの進展が得られている。一方、カロテノイドの生体保護機構については、本年度に予定していた培養細胞系を用いたハダニのカロテノイドの保護効果の検証はできなかった。しかし、活性酸素種とアスタキサンチンの効果の検証については想定以上に進展したため、このデータを参考にすることにより、今後の研究が進めやすくなったと考えている。UVBによるDNA損傷は、損傷を受けた遺伝子が発現しない発育ステージでは大きなコストにならず、遺伝子発現までに光修復が完了すればハダニはUVによる致死的ダメージから回復できるという仮説を検証するため、ナミハダニ幼虫にUVBを照射(2.088 kJ/m^2)し、その後の発育状況を調査した。最終的にすべての個体が死亡し、75%の幼虫は第一静止期まで発育した。しかし、対照区に比べて発育が遅延し、全ての発育個体は第一静止期のままか、もしくは脱皮の失敗により死亡した。このことから、UVBによる死亡は静止期に集中することが明確になると同時に、形態形成が阻害されていることが示唆された。

また、昨年度の光回復におけるDNA修復の結果と合わせて、DNA損傷の修復が行われない一方、幼虫のまま死亡した25%の個体は、照射の1日後には正常に活動していたが、その後苦悶する様子が見られ、徐々に死亡していった。幼虫期の発育遅延および死亡には昨年度ミカンハダニで確認したUVBにより発生した活性酸素による脂質の酸化が影響している可能性が考えられる。次に、幼虫期にUVBを照射した後に第一静止期に入った個体を集めてRNAを抽出して、次世代シーケンサーによるRNA-seqを行い、UVB無照射の個体と遺伝子発現量を比較した。この結果、myosin heavy chainやcuticle proteinなどの顕著な発現低下が明らかになった。さらに、UVBの生物影響に対する気温の影響を、夜間のUVB照射と日中の光回復という条件下で検証した。その結果、気温の低下により、ハダニに対する生物影響が高まることが明らかになった。一方、ハダニの天敵であるカブリダニに対しては気温の低下による生物影響の増大は認められなかった。これらの違いには、発育速度が影響している可能性が考えられる。本研究では、DNA損傷による致死効果の確認から、DNA損傷の影響による致死メカニズムの解明とカロテノイドの生体保護機能の検証を目指している。これまでにDNA損傷と修復パターン、致死と光回復のタイミング、カロテノイドによる過酸化脂質蓄積の抑制などが分かってきた。さらに、昨年度、発育ステージ特異的な死亡とUVB照射区の死亡ステージにおいて、キューティクルなど脱皮や形態形成に関連する興味深い遺伝子の発現低下がRNA-seqによって明らかになった。また、気温の低下がハダニに対するUV影響を強めることと、一方で天敵であり発育速度が速いカブリダニにおいてはそのような影響が見られないことが明らかになった。本年度は、これらの現象を検証していく予定であり、それによって当初の目的が達成されるものと思われる。ミカンハダニの野生型に対して、アスタキサンチン合成能力を持たないアルビノ系統では活性酸素除去能力の低下、UVBおよび高温による過酸化脂質の蓄積、高温耐性の低下が認められる。ナミハダニの野生型とアルビノ系統のゲノム比較からカロテノイド合成酵素領域(フィトエン不飽和化酵素)に変異が見つかり、ナミハダニおよびミカンハダニのオルソログではアルビノ系統で不活性化していることが分かった。さらに、ゲノム編集によってこの遺伝子を不活性化することにより、体色の発現が起こらなくなることから、この遺伝子がミカンハダニにおける恒常的なアスタキサンチン合成に重要な役割を果たし、それによってUVBおよび高温耐性に関与していることが示唆された。ナミハダニでは、成虫休眠時にβカロテンからケトカロテノイドを合成して蓄積することにより赤色の体色を呈する。また、休眠誘起にはβカロテンの代謝によって生成したビタミンAが不可欠である。一方で、短日定温によって休眠が誘起された雌成虫においても、成虫化後の摂食を制御することにより休眠が停止する。したがって、休眠導入時において必要なβカロテンの由来および成虫化後摂食の必要性の意味については今後さらに検討が必要である。
振動・騒音に着目した伝動装置の診断システムの開発

伝動装置の異常は内部の機械要素の損傷発生に起因する場合が多い.装置内部にセンサを設置できない場合は,装置の外側で測定できる振動と発生音は装置の健全性評価の重要な情報である.しかし,歯車のかみあい振動が軸・軸受を伝播してハウジングを励振し固体音を発生させるから,その伝達系の状態が伝動装置の評価と診断のための情報に大きく影響する.この観点から,本研究では,振動に着目した伝動装置の診断システムの開発をめざして基本システムを構成し,診断の基礎となる損傷発生にともなう特徴的な信号の収集と解析を行うことを目的として実験と解析を試みた.まず,伝動装置の振動の特徴を周波数領域および時間領域で抽出するためのソフトウェアとニューラル認識システムを含む計測・解析装置を購入してその基本的な動作を確認した.歯車対の振動解析プログラムを作製し,接触変形量の計算において歯車の表面損傷によって接触面積が減少するというモデル化を行い,損傷の発生と進展にともなう動荷重の変化を計算して周波数領域および時間領域の特徴をマップ化した.上記のモデル化の妥当性を検討するために,動力循環式歯車試験機による表面損傷発生と振動の変化を計測する実験を計画した.損傷を発生させるに十分な荷重を加えるための試験機の改造を済ませ,浸炭焼入後研削した試験歯車も設計・試作したが,損傷発生を実現するまでには至っていない.この実験を行い,当初目的とした振動波形の解析と異常診断システムの開発・評価を継続したいと考えている.伝動装置の異常は内部の機械要素の損傷発生に起因する場合が多い.装置内部にセンサを設置できない場合は,装置の外側で測定できる振動と発生音は装置の健全性評価の重要な情報である.しかし,歯車のかみあい振動が軸・軸受を伝播してハウジングを励振し固体音を発生させるから,その伝達系の状態が伝動装置の評価と診断のための情報に大きく影響する.この観点から,本研究では,振動に着目した伝動装置の診断システムの開発をめざして基本システムを構成し,診断の基礎となる損傷発生にともなう特徴的な信号の収集と解析を行うことを目的として実験と解析を試みた.まず,伝動装置の振動の特徴を周波数領域および時間領域で抽出するためのソフトウェアとニューラル認識システムを含む計測・解析装置を購入してその基本的な動作を確認した.歯車対の振動解析プログラムを作製し,接触変形量の計算において歯車の表面損傷によって接触面積が減少するというモデル化を行い,損傷の発生と進展にともなう動荷重の変化を計算して周波数領域および時間領域の特徴をマップ化した.上記のモデル化の妥当性を検討するために,動力循環式歯車試験機による表面損傷発生と振動の変化を計測する実験を計画した.損傷を発生させるに十分な荷重を加えるための試験機の改造を済ませ,浸炭焼入後研削した試験歯車も設計・試作したが,損傷発生を実現するまでには至っていない.この実験を行い,当初目的とした振動波形の解析と異常診断システムの開発・評価を継続したいと考えている.
災害時の傷病者搬送計画に関する研究

本年度は、傷病者搬送システムの評価モデルを構築し、傷病者発生から搬送までの一連のプロセスを定式化して評価を行い、次のような知見を得た。・傷病者搬送活動に関わるリスクは、「留置リスク」「長時間搬送リスク」「医療混乱リスク」に分類され、これらのリスクは相互に関係していることを明らかにした。・「医療混乱リスク」は、医療機関における傷病者の受入速度として定義することにより、過去の事例との相対的評価が可能となることを指摘した。・ケーススタディとして、航空機事故(ガルーダ・インドネシア航空機火災)および列車事故(信楽高原鉄道事故)をとりあげた。搬送時間を政策変数とした場合、全体のリスク低減は難しいがリスクの性質を変えることは可能であることを指摘した。・阪神・淡路大震災において、医療機関混乱の原因となった傷病者の医療機関への集中について、予測モデルを構築し、医療機関のロケーションが重要であることを指摘した。・名古屋市およびその周辺の災害拠点病院について、周辺地域の現状を調査し、それぞれの医療機関の立地状況に即した対策立案が必要と考えられることを指摘した。これら一連の研究は、災害医学分野と土木工学・交通工学分野の研究者・担当者がリスクに関する認識を共有して対応を話し合うための理論として、有用であると考える。課題としては、リスクを低減する災害情報システムの提案、具体的には、指令システムの改良、地理情報システムを用いたリスク評価システムなどが挙げられる。災害が発生した場合に、傷病者がどのような基準で医療機関を選択して行動するかを明らかにすることは、防災計画を策定する際の重要な情報になると考えられる。そこで本研究では、阪神・淡路大震災における傷病者の行動特性を明らかにするための調査分析を行った。具体的には、文献調査および医療機関への聞き取り調査によって、兵庫県西宮市の震災当日における医療機関への来院傷病者数を推計した。次に市域のゾーニングを行い、地区ごとの発生傷病者数を推計し、これらのデータを用いて、高架構造物の倒壊、傷病度、移動距離、搬送手段を考慮した傷病者行動モデルを構築した。なお、計算には表計算ソフトExcel(Microsoft社)を、プログラム言語にはVBA(Visual Basic Application)を用いた。その結果、比較的高い精度で各医療機関へ来院する傷病者数を予測することが可能となった。また、本モデルは傷病者の移動距離が主要なパラメータとなっており、従来から言われている「傷病者はより近い医療機関を選択する」という傾向を裏付ける結果が得られた。さらに、本モデルを他都市へ適用し、高架構造物の倒壊による傷病者行動への影響を予測するとともに、都市構造の違いから生じるいくつかのモデル上の問題点を明らかにした。今後の課題としては、他都市へ適用する場合の補正方法を提案すること、西宮市における震災当日の被害状況をより詳細にモデル式に取り込んで分析精度を向上させること、医療機関の対応能力を超えた傷病者を後送する搬送システム開発への応用、リスクマネジメントの概念を用いた評価などが挙げられる。
C=O二重結合を利用した金属－CFRPの接着剤フリー高信頼性接合技術の構築

熱可塑性プラスチックと金属の接合界面における解析を通じて,1C=O基の熱分離に伴う分子構造変化による金属錯体の形成と,2酸素原子を失ったC=O基の炭素原子とNH2基より熱分離した水素原子の化学結合によるC-H基の形成の2つの事象で化学結合を呈するという仮説の立証を試みた.1についてPA66のC=O基由来の酸素原子による反応層をTi-PA66の接合界面に確認すると共に,赤外線分光分析からC=O基のスペクトルシフトを捉え,C=O基が有する酸素原子の熱分離と炭素原子への金属原子の配位結合で金属錯体が形成されたことを確認した.2では,X線光電子分光分析によるTi-PA66の接合界面でのTiN生成と赤外線分光分析によるC-H基のスペクトルを検出し,NH2基の窒素原子は金属と反応すると同時に酸素原子が解離したC=O基の炭素原子とNH2基由来の水素原子が結合してC-H基へと構造変化したことを明らかにした.上述の結果よりC=O基およびNH2基を含む熱可塑性プラスチックと金属の直接接合界面において化学結合に基づく両者の接合機構が作用することを実証した.次に,金属と熱可塑性プラスチックの接合界面の構造解析および力学特性評価を通じて,被金属接合面の組成および表面構造に起因する界面での化学的結合の違いが接合強度に与える影響について検討した.鏡面研磨によりアンカー効果の影響を排除したTi,Fe,Cu,Mg,Alの各金属とPA66の接合材でのせん断強度と接合温度の関係を調査した結果,接合可能な温度域は同等であるが,Al,MgはTiに比べて低い接合強度を示した.原因の一つとしてAlやMgでは70100 nmの安定な酸化皮膜が接合界面に存在することで上述した反応層の形成を抑制すると共に,C=O基の熱分離に伴い発生する酸素が接合界面で瞬時に強固な酸化皮膜を形成することで直接接合が阻害されたと考える.熱可塑性プラスチックと金属の接合界面における解析を通じて,1C=O基の熱分離に伴う分子構造変化による金属錯体の形成と,2酸素原子を失ったC=O基の炭素原子とNH2基より熱分離した水素原子の化学結合によるC-H基の形成の2つの事象で化学結合を呈するという仮説の立証を試みた.1についてPA66のC=O基由来の酸素原子による反応層をTi-PA66の接合界面に確認すると共に,赤外線分光分析からC=O基のスペクトルシフトを捉え,C=O基が有する酸素原子の熱分離と炭素原子への金属原子の配位結合で金属錯体が形成されたことを確認した.2では,X線光電子分光分析によるTi-PA66の接合界面でのTiN生成と赤外線分光分析によるC-H基のスペクトルを検出し,NH2基の窒素原子は金属と反応すると同時に酸素原子が解離したC=O基の炭素原子とNH2基由来の水素原子が結合してC-H基へと構造変化したことを明らかにした.上述の結果よりC=O基およびNH2基を含む熱可塑性プラスチックと金属の直接接合界面において化学結合に基づく両者の接合機構が作用することを実証した.次に,金属と熱可塑性プラスチックの接合界面の構造解析および力学特性評価を通じて,被金属接合面の組成および表面構造に起因する界面での化学的結合の違いが接合強度に与える影響について検討した.鏡面研磨によりアンカー効果の影響を排除したTi,Fe,Cu,Mg,Alの各金属とPA66の接合材でのせん断強度と接合温度の関係を調査した結果,接合可能な温度域は同等であるが,Al,MgはTiに比べて低い接合強度を示した.原因の一つとしてAlやMgでは70100 nmの安定な酸化皮膜が接合界面に存在することで上述した反応層の形成を抑制すると共に,C=O基の熱分離に伴い発生する酸素が接合界面で瞬時に強固な酸化皮膜を形成することで直接接合が阻害されたと考える.
多振動細胞システムにおける生休リズムの同調機構の生理学的研究

カイコガ蛹の4対のボンビキシン分泌細胞系の各細胞発火周期は2060分と大きく異なるにも関わらず、大部分の細胞の活動リズムが同調または協調する期間が日に何度も見られ、細胞集団全体として独特な部分同調パターンを示した。この発火パターンとボンビキシンの分解速度曲線からボンビキシンの血中濃度の変動パターンを推定し、そのパワースペクトラムを計算したところ、広い周波数領域でパワーは周波数(f)に逆比例し、いわゆる1/fゆらぎに近い分布を示した。従って、ボンビキシン分泌細胞群は、最も効率的なホルモン濃度変動パターンを生み出すために、固有振動を有する個々の細胞が互いに影響しあいながら全体として独特な活動リズムを作る一つの機能的モジュールであると考えられる。カイコガ幼虫の脳-側心体-アラタ体複合体を切り出し、生理的塩類溶液またはグレースの昆虫培養液で器官培養を行った。このようなin vitro条件下においてもin vivoで観察されると同様なボンビシン分泌細胞の発火パターンが観察され、各細胞は自律振動体であることが強く示唆された。この発火はアトロピンを加えることによってほ完全にまたは部分的に消失し、脳のアセチルコリン作動性のニューロンによって分泌細胞の活動レベルの調節がなされていることが示唆された。以上のようにボンビキシン分泌細胞系は、多振動細胞システム(weakly-coupled multi-oscillator system)の構築原理とその機能的意義を解析する上でのシンプルモデルとなり、他の大多数の細胞からなる同様なシステムの構築原理やその振る舞いについての理解に役立つと考えられる。カイコガ蛹の4対のボンビキシン分泌細胞の電気的活動を数日間連続記録し、各細胞の発火パターンを解析した。各細胞は816分続く一連の発火活動を2060分毎に繰り返すウルトラディアンリズム振動体であるが、全ての細胞間で明らかなスパイク同期があり、ボンビキシン分泌細胞群は互いにカップリングして多振動体システムを形成していた。各細胞問の相互相関から以下のような神経システムの構築様式が示唆された。(1)カップリングの強さはみな同じではなく、1個の細胞は反対側のおよそ2個から3個の細胞と比較的強くカップリングしている。(2)カップリングが比較的強い細胞問の平均周期はほぼ同じである。(3)たくさんの細胞とカップリングし、相関係数も大きい細胞の周期は長く、周期の安定性は低い。(4)カップリングする相手細胞が少なく、相関係数も低い細胞の周期は比較的安定している。おそらく脳内での各細胞の空間的な位置関係が同等ではなく、集団の中心に位置する細胞と周辺に位置する細胞でカップリングする細胞数やその強さが異なるために、このようなヘテロな集団構造が形成されたものと考えられる。カイコガ蜻のアラタ体から数日間連続記録を行ったが、発火活動が概日リズムを示す神経分泌細胞は見られなかった。このことから、PER免疫染色陽性細胞など概日時計細胞の候補と考えられる細胞の軸索はアラタ体ではなく、側心体で終末することが示唆された。カイコガ蛹の4対のボンビキシン分泌細胞の発火活動を連続記録し、各細胞の発火パターンを比較解析した。各細胞の発火周期は2060分と大きく異なるにも関わず、大部分の細胞のリズムが同調(協調)する期間が日に何度も見られ、細胞集団全体としての発火パターンにもユニークなウルトラディアンリズムが観察された。この発火パターンとボンビキシンの分解速度(名古屋大学で測定)からボンビキシンの血中濃度の変動パターンを推定し、そのパワースペクトラムを計算したところ、広い周波数領域でパワーは周波数(f)に逆比例し、いわゆる1/fゆらぎに近い分布を示した。このようなボンビキシンの血中濃度のゆらぎは効率の良いホルモン作用に重要であると考えられる。

このようなin vitro条件下においてもin vivoで観察されると同様なボンビシン分泌細胞の発火パターンが観察され、各細胞は自律振動体であることが強く示唆された。この発火はアトロピンを加えることによってほ完全にまたは部分的に消失した。おそらく脳にあるアセチルコリン作動性のニューロンによって分泌細胞の活動レベルの調節がなされていると考えられた。ボンビキシン分泌細胞間のカップリングメカニズムを調べるために、in vitro条件下で2つの細胞に微小電極を刺入し相互に通電刺激を行ったが、シナプス電位は見られなかった。In vivoでの検討が必要であると考えられる。
花葉化遺伝子のクローニングとその解析

本研究はファイトプラズマゲノムのライブラリーを作製し、その中から花器官分化抑制能を植物寄生性細菌を用いた発現系および植物発現系を用いてスクリーニングすることにより、花器官分化抑制に関与するクローンを突き止め、花器官分化抑制遺伝子を解明し、植物の花器官分化のメカニズムを明らかにするための基礎的知見を得ることを目的として行った。本研究ではまず、Phytoplasma asteriに感染した植物に媒介昆虫のleafhopper(Macrosteles orientalis)を吸汁させ、潜伏期間を経た後、保毒虫となったことを確認した時点で、periwinkle(Catharanthus roseus)あるいはgarland chrysanthemum(Chrysanthemum coronarium)に感染・発病させた。発病植物より全DNAを抽出した後、ファイトプラズマゲノムDNAのAT含量の違いを用いて、ATペアのみに結合する色素(bisbenzimide)を全DNA試料に加え、AT含量の高いDNAの比重を減少させてこの違いに基づき平衡密度勾配遠心によりファイトプラズマゲノムを分離する技術を確立した。一方、P.asteriの野生株より突然変異の弱病原性変異株を作出することに成功し、このファイトプラズマゲノム精製試料を用いてパルスフィールド電気泳動を行い、ゲノムサイズを測定した結果、両者の間に大きな差のあることが判明した。
微生物による2,4―ジメチルベンゾチオフェンの環開裂型分解機構の解明と応用

TZS-7の遺伝子ライブラリーの構築に成功した結果,2種類の環開裂遺伝子が取得された。1つは,多環系の開裂酵素に見られる2,3-dihydroxybipheny 1,2-dioxygenaseで,もう一方は単環系の開裂酵素のcatechol 2,3-dioxygenaseであることが示された。それぞれの菌体粗酵素を用いた,ジヒドロキシビフェニル(二環)及びカテコール(単環)の基質に対しての特異性はそれぞれの遺伝子の特徴をよく反映していた。DNAの配列から多環芳香族を開裂するDmdCと示された遺伝子を発現させた方は,基質としてジヒドロキシビフェニル(二環)を効率よく速い速度で分解したが,カテコール(単環)の分解はほとんど無かった。一方,同じくDNAの配列から単環芳香族を開裂するCatAと示された遺伝子を発現させた方は,基質としてカテコール(単環)を効率よく速い速度で分解したが,ジヒドロキシビフェニル(二環)の分解は遅かった。また,様々なメチル化カテコールについての活性を調べたところ,興味深いことに,4-methylcatecholの分解能が著しく高かった。現在までに,多くのcatechol 2,3-dioxygenaseの基質特異性が報告されているが,4-methylcatechol分解能は特に高かったのが本研究は初めてである。また、本研究の特色であるジアルキル芳香族の分解において、変異解析の結果、その分解特性が初発酵素に存在することが、示唆された。今後、これらの遺伝子さらに酵素学的諸性質について詳細に解析することは、超難分解性芳香族の分解において重要な知見をもたらすと考えられる。TZS-7の遺伝子ライブラリーの構築に成功した(平均インサートDNA断片10kbx約6000個)。これは,Shingomonasの全塩基配列が3-4Mbpと推測されているので,10kbx400個が最小必要数と考えられ,よって10kb×5000個のライブラリーは十分なものである。そこから,芳香族環開裂遺伝子の獲得をジヒドロキシビフェニルの分解活性を指標にして行った。その結果,2種類の環開裂遺伝子が取得された。それらのDNA塩基配列から,1つは,多環系の開裂酵素に見られる2,3-dihydroxybipheny1,2-dioxygenaseで,もう一方は単環系の開裂酵素のcatechol2,3-dioxygenaseであることが示された。多環芳香族の分解においては,まず1つのベンゼン環の開裂を行い一連の反応後,単環になり続いてcatechol分解経路により開裂し分解していく。よって,それら2つの酵素をコードする遺伝子の存在は,TZS-7においても同様な系で多環芳香族を分解することを示している。また,それぞれの菌体粗酵素を用いた,ジヒドロキシビフェニル(二環)及びカテコール(単環)の基質に対しての特異性はそれぞれの遺伝子の特徴をよく反映していた。DNAの配列から多環芳香族を開裂するDbp Aと示された遺伝子を発現させた方は,基質としてジヒドロキシビフェニル(二環)を効率よく速い速度で分解したが,カテコール(単環)の分解はほとんど無かった。一方,同じくDNAの配列から単環芳香族を開裂するCat Bと示された遺伝子を発現させた方は,基質としてカテコール(単環)を効率よく速い速度で分解したが,ジヒドロキシビフェニル(二環)の分解は遅かった。現在までに,多くのcatechol2,3-dioxygenaseの基質特異性が報告されているが,4-methylcatechol分解能は特に高かったのが本研究は初めてである。