hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗心筋膜受容体による心筋傷害:抗体吸着療法の開発と創薬の試み

β1受容体抗体に対する選択的自己抗体吸着体を用い、実験的自己免疫性心筋症家兎に対する吸着実験を行った。その結果、吸着実験3ヶ月後には心肥大ならびに心拡大の改善と心機能の回復を認め、自己抗体吸着療法の有効性が確認された。また、抗β1受容体抗体による心筋障害の発症メカニズムとしては、抗β1抗体による細胞障害はオートファジィーによる可能性が高いこと、および、抗体自体が直接心筋細胞にはたらくためでないことが明らかとなった。これらの研究に関連して、β1およびM2受容体に対するモノクローナル抗体を作成し、診断薬や治療薬としての可能性を検討中である。鐘淵化学工業株式会社との共同研究にてβ1受容体抗体に対する選択的自己抗体吸着体を開発した。その吸着体を用い、我々が世界に先駆けて作成に成功した実験的自己免疫性心筋症家兎に対する吸着実験を行った。合成β1ペプチドにて免疫し、心エコー法にて心筋症の発症を確認した後、共同開発した吸着体を用い吸着実験を行った。その結果、吸着実験3ケ月後には心肥大ならびに心拡大の改善と心機能の回復を認め、自己抗体吸着療法の有効性が確認された。今後は、この成果をもとに拡張型心筋症患者への自己抗体吸着療法として臨床応用を目指す予定である。これらの研究に関連して、抗β1受容体抗体ならびに抗M2受容体抗体がそれぞれの受容体に対し結合能を有するとともに刺激作用を有することを利用し、β1およびM2受容体に対するモノクローナル抗体を作成し、臨床診断薬や治療薬としての可能性を検討中である。また、β1受容体に対する自己免疫機序による心筋障害の発症メカニズムを解明する目的で、β1ペプチドで免疫された家兎血清の初代培養ラット心筋細胞に対する細胞障害作用を検討した。培養ラット新生児心筋細胞培養液中に免疫血清添加数日後に、光顕にて培養細胞質に多数の液胞が、電顕にて2重膜や内部に細胞構造体を含んだ液胞が多数認められた。Oil Red-O染色にてこれらの培養心筋細胞質に多数の脂肪滴がみられた。一方、培養細胞数は免疫家兎血清添加数日後には減少し、かつ、死細胞の割合が増加した。この変化は、精製された抗β1抗体やイソプロテレノールでは誘発されなかった。以上の成績は抗β1抗体による細胞障害はオートファジィーによる可能性が高いこと、および、抗体自体が直接心筋細胞にはたらくためでないことが明らかとなった。我々の開発した吸着体を用い、実験的自己免疫性心筋症家兎に対する自己抗体吸着実験を行った。その結果、吸着実験3ヶ月後には心肥大ならびに心拡大の改善と心機能の回復を認め、吸着療法の有効性が確認された。これらの研究に関連して、β1およびM2受容体に対するモノクローナル抗体を作成し、臨床診断薬や治療薬としての可能性を検討した。その結果、両モノクローナル抗体を用いることにより、心筋細胞における各受容体の良好な染色像が得られ、診断薬への応用が可能と考えられた。また、これらモノクローナル抗体を標準試薬とする抗体価定量用のELISA測定法も開発した。
情報理論的安全性をもつマルチキャスト通信の構築とその安全性解析

放送型暗号(BE)とセキュアネットワーク符号化(SNC)を融合する方法について検討し,(t,d)-組み合わせネットワーク(ソースノードがt個の中間ノードに接続され, n人の受信者それぞれが,d個の中間ノードと接続されているネットワーク)に対しては非常に効率よく暗号化が実現できることを示した.具体的例として(≦100, ≦3)-BEを考えると,これを従来の最適な放送型暗号で実現する場合,5GBのデータを送るために約834TBの暗号化鍵,809TBの復号鍵が必要であった.(5,3)組み合わせネットワークに対して符号化を行うと,暗号化鍵2.6TB,復号鍵75GBでBEが実現できる.今年度は本研究を進めるための基盤技術である,秘密分散法(SSS)に関して幾つかの成果を得た.まず,SSSにおける,情報理論的安全性の実現手法について新しい知見を得,国際会議ISIT2014で発表を行った.本研究では,通常の完全秘匿性ではなく,平均化された条件付き最小エントロピーの意味で安全なSSSを新しく定義した.この安全性は,非一様な確率分布に従う秘密情報を(データ圧縮などを経由せずに)直接暗号化する場合には自然な安全性規準の一つといえる.さらに,定義した安全性を満たすシェアサイズの下界を導出し,その下界を等号で達成する実現手法を示した.完全秘匿性に基づく従来の安全性定義と提案した新しい定義を比較すると,後者の方が安全性が緩和されていると考えられるが,実際に,最小エントロピーに基づく安全性規準で達成できるシェアサイズは,完全秘匿性を満たす場合の理論限界より小さく出来ることを明らかにした.次に,秘密分散法の画像を用いた実現手法である,視覚復号型秘密分散法(VSSS)の現実的な設定下での能動攻撃の可能性を議論した.ここで得られた成果は国際会議ISITA2014にて発表した.本研究では,VSSSに特有の現実的な設定「秘密情報(画像)を計算機ではなく,人間が復号する」という事実に着目した.この設定下で改竄攻撃を考えると,暗号理論の基本法則であるケルクホフスの法則よりも,秘密画像が視認されるとそれを復号画像と考えざるを得ない,という現実的なシナリオの元で解析した.この状況下では,Horngらによって提案された改竄攻撃耐性をもつVSSS [Designs, Codes, and Cryptograhy, 2006]が,容易に(確率1で)改竄できることを示した.また,SSSとVSSSに関する安全性の関係を考察し,IEICE EMM研究会においてチュートリアル講演を行った.今年度は,研究当初の主要な課題(a1)ネットワーク上でノードに演算を許すと,放送型暗号よりユーザ鍵を短くしたり,平文サイズを長く出来るか(a2)共有鍵がない状況で,セキュアネットワーク符号の受信者制御が可能か(a3)共有鍵をもたせると,セキュアネットワーク符号で安全に送信できるデータ量を増やせるか,のうち(a1)(a3)はYes, (a2)は安全性規準が弱い場合にはYesで,安全性規準を最も強くしたければNoとなるネットワークが存在することを示した.当初は全て肯定的に解決できると予想したが,部分的にはそうでないことが具体例を通して明らかになり,その意味で当初設定した課題に対する重要な知見が得られた.(a2)については,予想とは異なる結果となったものの,Noであった部分にこの問題特有の新しい安全性条件が関連する事が分かったことは大きな進展であると考えている.しかし,上記(a1)(a3)に関する現在の結果は,基本的なしきい値型ネットワークに基づくものであり,より一般のネットワークではまだ結論が出ていない.そこで,今後は予想と異なった(a2)を中心により一般的・定量的な評価が必要になると考えられる.なお,現在の所はアドホックに実現されているが,符号化を考えるに際し,どのような技術が方式実現に寄与するかの見通しは得られている.上記の成果は,暗号と情報セキュリティシンポジウムにて研究速報として報告した.学会等での発表は平成28年度に行う予定である.また,上記以外に,本研究と非常に関わりが深い秘密分散法,情報理論的暗号理論に関する成果を幾つか得ることが出来た.今後は,上記(a1)(a3)の課題を,任意のネットワークに対して解決することが必要となる.あわせて,秘密分散法など,関連する情報セキュリティ技術の開発も行う.今年度は,ネットワーク符号化を用いた放送型暗号についての基礎的な知見を得ることに成功し,アドホックながら実際の構成例を得ることが出来た.この課題は暗号理論と情報理論の境界領域に属するため,先行研究が存在しせず,具体例から検討を行った.そこで,ネットワーク符号の特殊ケースである(2,3)しきい値型の秘密分散ネットワークに対して,実際に符号化が可能であるかを検討した.その結果,概ね当初の予想通り,ネットワークの存在を仮定し,ネットワーク符号化の技術を用いることで,通常の放送型暗号よりも送信データのレートや鍵サイズの改善が可能であることを明らかにした.現在検討している秘密分散型のネットワークに比べて,ネットワーク符号はにおけるネットワークのグラフ構造はより一般的なので,今後の研究によって,より効率的な放送型暗号が実現できる可能性が示唆された.今回の検討において,ネットワーク符号を放送型暗号に応用する場合には,ネットワーク符号における盗聴と,放送型暗号におけるユーザの結託に加えて,結託者による盗聴という,両者の方式を融合した場合にのみ表れるタイプの攻撃を考慮する必要があることが分かった.

我々の成果に依れば,送信側の符号化を工夫することで,このタイプの攻撃も含めた考えられる攻撃全てに対して,安全かつ高効率な方式が実現できることが出来る.符号化の構成方法は,強安全なネットワーク符号化に関する符号化方式をベースとし,現在の所はアドホックに実現されているが,符号化を考えるに際し,どのような技術が方式実現に寄与するかの見通しを得ることには成功している.なお本研究は,暗号と情報セキュリティシンポジウムにて研究速報として報告した.学会等での発表は平成28年度に行う予定である.また,上記以外に,本研究と非常に関わりが深い秘密分散法,情報理論的暗号理論に関する成果を幾つか得ることが出来た.今年度は,秘密分散型のネットワークを用いて放送型暗号が実現できるかを議論し,既存の放送型暗号の鍵長を大きく削減する放送型暗号が構成できることを示した.具体的に例えば,100人以下の任意のグループに対して鍵が配送でき,3人以下の結託に対して安全な放送型暗号((≦100, ≦3)-one time secure放送型暗号)を考える.これを従来の最適な放送型暗号で実現する場合,5GBのデータを送るために約834TBの暗号化鍵,809TBの復号鍵が必要であったが,(5,3)型組み合わせネットワーク(ソースが5個の中間ノードにノイズのない通信路で接続され,各ユーザがそれぞれ3つの中間ノードと接続されているネットワーク)に対して符号化を行うと,暗号化鍵2.6TB,復号鍵75GBで放送型暗号が実現できることを示した.このように,単純な放送型通信路を用いるより,ネットワークの特性を活かすことで情報理論的安全性を達成しつつ,比較的現実的な鍵サイズで放送型暗号が実現できることが明らかに出来た.この意味で,当初の研究計画は概ね達成できたといえる.特に,組み合わせネットワークでは従来(最適な構成法であっても)非現実的だと思われていた放送型暗号が現実的なレベルで構成できることを明らかにしたことは理論的にも実用的にも意味があると考えられる.組み合わせネットワーク以外の一般的なネットワークに対する一般化や提案手法の最適性証明など,今後の課題も存在するため,今後も研究を進める予定である.また,本研究に関連して,秘密分散法やマルチパーティ計算に関する成果も幾つか得られた.放送型暗号(BE)とセキュアネットワーク符号化(SNC)を融合する方法について検討し,(t,d)-組み合わせネットワーク(ソースノードがt個の中間ノードに接続され, n人の受信者それぞれが,d個の中間ノードと接続されているネットワーク)に対しては非常に効率よく暗号化が実現できることを示した.具体的例として(≦100, ≦
臓器移植における再灌流障害発生に関する研究-組織因子の役割とその制御について-

今回はラットのTF mRNAを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)を作製し,ラット肝虚血再灌流障害モデルに投与しその効果を検討した.ラットTFの開始コドンに対応してantisense (AS)-1,-2/TFを作製した.比較対象ODNとしてsensecontrol(S)/TF, scrambled control(Sc)/TFを作製した.雄Lewisラット(230280g)に上記ODNを2.8mg/kg静脈内投与し10時間後に全身麻酔下開腹,肝臓の70%にあたる正中葉,左葉,尾状葉にいたる肝動脈と門脈を3時間クランプしたのち再灌流し,5日間生存率を比較した.また正常ラットにfluoresceinisothiocyanate (FITC)で標識したAS-1/TFを投与し,0,6,10,24時間後に肝臓を摘出し肝組織内への取り込みを蛍光顕微鏡で観察,検討した.5日間生存率は無投与群では10匹中1匹(10.0%)だったのに対しAS-1/TF投与群では7匹中6匹が生存(83.3%)し改善が認められた.コントロール群では改善は認められなかった(p<0.05).ALT, HA, TATは各群で5時間後に最高値となり,AS-1/TF群で有意に改善していた(p<0.01).虚血肝組織は5時間後では無投与群,S/TF群,Sc/TF群でHE染色上肝細胞の局所的壊死が観察された.免疫組織学染色ではTFが類洞上皮細胞上で強く染色されたがAS-1/TF群では肝細胞壊死やTF染色はほとんど認められなかった。12時間後においては前3群では壊死がさらに進行しTF染色もより明瞭であったが、AS-1/TF群では壊死もTF染色も進行していなかった.FITC標識AS-1/TFは投与直後では肝組織内にほとんど認められなかったが6時間後には血管内皮に局在しており一部は肝細胞内にも取り込まれていた.10時間後には認められなくなったが,血管内皮への取込みは認められ24時間後でも同様てあった.今回はラットのTF mRNAを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)を作製し,ラット肝虚血再灌流障害モデルに投与しその効果を検討した.ラットTFの開始コドンに対応してantisense (AS)-1,-2/TFを作製した.比較対象ODNとしてsensecontrol(S)/TF, scrambled control(Sc)/TFを作製した.雄Lewisラット(230280g)に上記ODNを2.8mg/kg静脈内投与し10時間後に全身麻酔下開腹,肝臓の70%にあたる正中葉,左葉,尾状葉にいたる肝動脈と門脈を3時間クランプしたのち再灌流し,5日間生存率を比較した.また正常ラットにfluoresceinisothiocyanate (FITC)で標識したAS-1/TFを投与し,0,6,10,24時間後に肝臓を摘出し肝組織内への取り込みを蛍光顕微鏡で観察,検討した.5日間生存率は無投与群では10匹中1匹(10.0%)だったのに対しAS-1/TF投与群では7匹中6匹が生存(83.3%)し改善が認められた.コントロール群では改善は認められなかった(p<0.05).ALT, HA, TATは各群で5時間後に最高値となり,AS-1/TF群で有意に改善していた(p<0.01).虚血肝組織は5時間後では無投与群,S/TF群,Sc/TF群でHE染色上肝細胞の局所的壊死が観察された.免疫組織学染色ではTFが類洞上皮細胞上で強く染色されたがAS-1/TF群では肝細胞壊死やTF染色はほとんど認められなかった。12時間後においては前3群では壊死がさらに進行しTF染色もより明瞭であったが、AS-1/TF群では壊死もTF染色も進行していなかった.FITC標識AS-1/TFは投与直後では肝組織内にほとんど認められなかったが6時間後には血管内皮に局在しており一部は肝細胞内にも取り込まれていた.10時間後には認められなくなったが,血管内皮への取込みは認められ24時間後でも同様てあった.我々は肝臓の虚血再灌流障害におけるTFの関与を報告してきた。即ち、免疫組織化学的に再灌流後は時間経過とともに肥大化したKupffer細胞や血管内皮細胞にTFが強く染色され、同部に一致してフィブリンの沈着、壊死が認められた(Transplantation、1998)。またTFに対する特異的抑制物質(Tissue Factor Pathway Inhibitor、TFPI)のcDNAがクローニングされ、それを基に合成TFPIが使用可能となっているので、ラット肝虚血再灌流モデルにTFPIをin vivo投与したところ、生存率、TFの発現抑制および肝壊死領域の狭小化を認めた。このことは、虚血再灌流後の細胞壊死巣の形成、進展に、TF発現による微小血栓形成および循環不全が強く関与していることを示している。今回の研究では、TFの発現を遺伝子レベルで制御可能か否か、を検討し臓器移植への応用可能かを検討した。TFに対するアンチセンスを合成し、対象としてセンスTF、スクランブルTFも作成、ラット虚血再灌流障害モデルにin vivo投与し(1)アンチセンスの細胞内の局在(2)肝組織の変化(3)生存率を検討した。その結果(1)作成したアンチセンスは有意にラット生存率を向上させた。

(2)蛍光色素をラベルアンチセンス投与実験で肝細胞核内での取り込みが確認された。(3)組織学的にも有意に壊死部分の縮少を確かめた。これらことからドナーの側でTFの発現を制御することが可能であれば、臓器移植における新しいGene Engineering法の開発につながる可能性が期待される。我々は肝臓の虚血再灌流障害におけるTFの関与を報告してきた。即ち、免疫組織化学的に再灌流後は時間経過とともに肥大化したKupffer細胞や血管内皮細胞にTFが強く染色され、同時に一致してフィブリンの沈着、壊死が認められた(Transplantation,1998)。また、TFに対する特異的抑制物質(Tissue Factor Pathway Inhibitor, TFPI)をラット肝虚血再灌流モデルにin vivo投与したところ、生存率、TFの発現抑制および肝壊死領域の狭小化を認めた。このことは、虚血再灌流後の細胞壊死巣の形成、進展に、TF発現による微小血栓形成および循環不全が強く関与していることを示している。今回の研究では、TFの重要性が普遍的なものか否かを検討する目的で腎臓の再灌流障害において検討した。片側腎を摘出した再灌流障害モデルを作成し、肝の場合と同様に(1)生存率(2)腎組織の変化(3)TFの局在(4)TFPIの結果等を検討した。その結果(1)腎組織障害が時間経過とともに進行したが、TFは時間経過とともに糸球体内皮細胞に強く発現された。(2)120分虚血で全例死亡していたラットがTFPIの投与で全例生存した。(3)組織学的にTFPI投与で有意に壊死部分の縮小を認めた。これらのことからTFは各種組織再灌流障害に重要な役割を担う事が明らかになった。本年度はアンチセンスTF(AS-1/TF)を投与し、ラット腎虚血再灌流モデルにてその効果を調べた。【方法】阻血8時間前にAS-1/TF 4mg/kgを投与した雄Lewisラット(180230g)の右腎を摘出し,左腎動静脈を一括にヘモクリップにて90分阻血した。その後、再灌流を行い、5日間生存率を測定した(a群)。また再灌流後0、1.5、5、12、24時間後に、虚血腎をHE染色、抗TF抗体を用いた免疫染色にて検討した。また再灌流0、5、12、24時間後に尿細管壊死の指標としてBUN, Kを測定した。対照としてb群:非投与虚血群、c群:センスTF投与、d群:スクランブルTF投与を作成し同様の実験を行った。【結果】5日間生存率は、b、c、d群とも0%であったのに対して、a群では55%と著明な生存の延長を認めた。b、c、d群において再灌流12時間後、HE染色でほぼ組織全体の壊死が認められ、免疫組織染色において壊死尿細管ではTFの発現は認められなかったものの、遠位尿細管、血管内皮細胞、血管に強くTFの発現が認められた。BUN、Kも再灌流12時問後に有意な上昇を認めた。しかしながらa群では壊死領域の減少やTF発現の減少が認められた。【結語】本研究ではAS-1/TF投与が細胞表面上のTF発現を抑制し腎組織壊死の著明な改善および有意な生存の延長を認めた。AS-1/TFの投与はTFの発現に引き続いて起こる微小血栓形成の予防や治療に有効であり、ドナー臓器の虚血再灌流障害を軽減させる有効な治療法である可能性が示唆された。
血管‐神経ワイヤリングにおける介在細胞の役割とＥＭＰ‐神経幹細胞間生物活性の解析

血管内皮細胞と神経幹細胞との共培養系を確立し、幹細胞マーカーの発現を解析した。血管内皮細胞と神経細胞を共培養すると、興味深いことに、神経幹細胞のstemness保持が促進され、神経分化が抑制される傾向がmicroarray解析、免疫細胞化学的解析の結果明らかとなった。血管内皮細胞が産生するendothelial microparticles (EMP)が神経幹細胞の分化をコントロールしている可能性が考えられたため、共培養系におけるmicroparticle画分のmiRNA array解析を行った結果、神経幹細胞の分化を抑制するmiRNA群の発現が観察された。以上の結果から、血管内皮細胞が形成する神経幹細胞nicheの一つとして、EMPに包含されるmiRNAが重要であることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究から、血管-神経ワイヤリングにおける介在細胞と考えられるmacrophage系細胞はF4/80陽性であり、更にVEGF receptor陽性であることを確認している。我々はmacrophage系細胞が欠損しているop/opマウスの解析を行い、我々が独自に開発した創傷治癒モデルにおいて血管新生のドラスチックな障害がみられることを見出した。また、op/opマウス創傷治癒モデルで神経再生に障害がおこるのかを免疫組織化学的手法により精査しつつある。さらに我々は、in vitroの系で血管-神経ワイヤリングを再現する系の開発に着手している。In vitroの血管-神経ワイヤリング構築系でF4/80^+VEGF receptor^+の細胞をflow cytometryで分画した後、血管-神経ワイヤリングに介在するかを検討の後、発現遺伝子解析等に移行し、血管-神経ワイヤリングの形成にmacrophage系細胞のどのような因子が重要であるかを同定することに着手している。血管が提供する神経幹細胞に対するニッチの研究では、現在まで、血管内皮細胞と神経幹細胞との共培養系の確立を鋭意推進中であり、血管内皮細胞と神経細胞を共培養すると、神経幹細胞の保持と神経分化に変化があることが明らかになった。血管内皮細胞が産生するendothelial microparticles(EMP)が神経幹細胞の分化をコントロールしている可能性が示唆されるため、共培養系に存在するEMPおよびその他の蛋白質などの詳細な解析に着手しているところである。In vivoの評価系の確立と評価の進捗、in vitroでの評価系の確立と評価の開始ができたため、おおむね順調に進展していると判断した。非常に新規性の高い血管-神経ワイヤリングのin vivoにおけるde novo評価系が確立できたことより、血管と神経とのインタラクションに関与する細胞群を同定することが今後の目的になる。また、血管性ニッチの研究では、おおむね評価系の確立が完成したので、今後は神経幹細胞のstemness維持や神経への分化に対する作用に対してEMPがどれほど関与しているかを検討することとなる。本研究はおおむね順調に進行しており、研究の大きな変更は無い。
糖代謝異常が左房形態および機能に与える影響と新たな心房細動治療への応用

糖尿病は心房細動の独立した危険因子である。これまでの基礎研究において、耐糖能異常(IGT)を含めた糖代謝異常は炎症や活性酸素の産生などを介して心筋の繊維化を惹起することが示されてきている。しかし、これまで心房細動症例におけるIGTの分布やIGTを含めた糖代謝異常が左房形態や機能に与える影響は検討されていない。本研究では、近年新たに開発されたスペックルトラッキング心エコー法を用いて、従来は評価できなかった左房の3つの機能(リザーバー機能・導管機能・ポンプ機能)を評価し、IGTを含めた糖代謝異常が左房形態や機能に与える影響を詳細に検討する。
大脳皮質形成におけるGタンパク質共役受容体シグナルの機能抗体を用

大脳皮質形成時におけるGタンパク質共役受容体シグナルを解明するために、神経前駆細胞特異的なGPCRに対する機能抗体を用いて、神経前駆細胞の機能に対する作用およびシグナル伝達系の解析を行った。その結果、GqおよびG12/13シグナルが神経前駆細胞の遊走を阻害するのに対し、Gs-PKAシグナルがdoublecortinのリン酸化を介してラメリポディア形成を誘導し、神経前駆細胞遊走を促進する新規の機構を解明した。大脳皮質組織培養による神経前駆細胞アッセイシステムを用いて、神経前駆細胞のradial migrationにおけるGPCRの機能を解析した。われわれはすでに培養神経前駆細胞を用いてエンドセリンがGqシグナルを介して細胞遊走を抑制することを報告しているが、細胞遊走のどの過程に作用して遊走を阻害しているのか明らかになっていない。本研究において、培養神経前駆細胞および大脳皮質組織培養によるタイムラプス顕微鏡を用いた解析により、神経前駆細胞の細胞同士の接着性を高めることで遊走を阻害していることが示唆された。また、リガンド未知であるGPR56は、機能抗体によりG12/13を介して同様に遊走を阻害するが、その機構も検討中である。一方、Gsシグナルは神経前駆細胞の遊走を促進することを見出した。Gタンパク質サイクルを調節する因子として、Ric-8が報告されている。Ric-8AはGqやGiと相互作用し、グアニンヌクレオチド交換因子として作用することが報告されているが、Gsと相互作用するRic-8Bの機能はまだ不明であった。われわれは、Ric-8BはRic-8Aとは異なり、Gsと相互作用することでプロテオソーム系におけるGsの分解を阻害する働きがあることを新たに見出し、Gsシグナルの調節に関与することを報告した。また、Gsシグナルからどのような機構で神経前駆細胞の遊走を促進するかを検討するため、微小管結合タンパク質Doublecortinに注目して解析を行った。その結果、Gs、cAMP, PKAの経路によりDoublecortinがリン酸化され、遊走を促進することが示唆された。また、Gs、Gq、G12/13と共役し、神経前駆細胞の遊走を制御する可能性のあるGPCRに関して、発現の確認、また機能を解析するとともに、抗体作製を遂行中である。大脳皮質形成期の神経前駆細胞遊走におけるGPCRの機能を解析することを目的に、本年度は培養神経前駆細胞を用いてGsシグナルが細胞遊走を促進する機構を解明することに重点をおき実験を進めた。ます微小管結合タンパク質Doublecortin(DUX)に注目して解析を行った。神経前駆細胞の内在性DCXをアデノウィルスを用いてshRNAによりノックダウンし、さらに、DCXの疑似リン酸化型変異体および非リン酸化型変異体を神経前駆細胞を過剰発現させ、ボイデンチャンバー法により遊走能を評価した。その結果、野生型DCXを発現すると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤であるForskorin(Fsk)依存的な遊走促進がみられ、その効果はPKA阻害剤により抑制された。一方、非リン酸化型変異体ではFskによる遊走促進がみられなかった。疑似リン酸化型変異体はFskによる刺激がなくても遊走促進がみられ、さらにPKA阻害剤はこの促進効果を抑制しなかった。このことから、Gs、cAMP,PKAの経路によりDCXがリン酸化され、遊走を促進することが示唆された。次にDCXリン酸化の微小管における機能を解析した。その結果、PKAシグナルはDCXの微小管への親和性を減少させ、また野生型に比べ、リン酸化型変異体はチューブリン重合能が減少していることが明らかとなった。しかし、PKAシグナルによるリン酸化DCXの微小管に対する効果だけでは、遊走能促進効果が説明できず、アクチン系に対する効果を調べたところ、リン酸化DCXは、ラメリポディア形成を促進し、さらにその運動性を増加させることがわかった。われわれは、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化因子PACAPがGsシグナルを介してタンパク質リン酸化酵素(PKA)活性化し、微小管結合タンパク質Doublecortin(DCX)をリン酸化することが細胞遊走促進を引き起こす要因であることを見いだした。DCXリン酸化の微小管における機能を解析したところ、PKAシグナルはDCXの微小管への親和性を減少させ、また野生型に比べ、DCXリン酸化型変異体はチューブリン重合能が減少しているごとが明らかとなった。ラメリポディアの形成は、Racの活性化によって行われる。Racの優性抑制型変異体を発現させたところ、リン酸化DCXによるラメリポティアの形成は阻害された。さらにRacの活性化をPAK-CRIBを用いたプルダウン法により検出した。

培養神経前駆細胞をPACAPで刺激するとRacの活性化がみられ、この活性化はPKA阻害剤により抑制された。またPACAPによるRacの活性化はDCXのノックダウンにより抑制された。また、Racの活性化はDCXリン酸化変異体によってもみられた。これらの結果から、Gs-PKAシグナル伝達系がDCXのリン酸化を介してRacを活性化することがわかった。さらに、リン酸化DCXがRacのグアニンヌクレオチド交換因子であるAsef-2と相互作用することを見いだした。以上の結果から、微小管結合タンパク質として微小管の機能を調節するDCXが、Gタンパク質シグナルによりリン酸化されることで、微小管から離れ、Racを介してアクチン繊維のダイナミクスを調節するという新しい機構を見いだした。
耳下腺腫瘍におけるヘテロ接合性の消失について

耳下腺多型腺腫は、耳下腺に発生する腫瘍の中で最も頻度が高く、その臨床的重要性はきわめて大きい。病理学的には良性腫瘍の性状を示すが、高い再発傾向と、10%程度では悪性転化して様々な上皮性・間葉系悪性腫瘍の母体となることが報告されている典型的な前癌病変である。この耳下腺多型腺腫にはしばしば染色体欠失が伴うことが形態的な研究で報告されており、比較的高頻度に見られる染色体領域として8番、12番染色体が報告されている。こうした前癌病変や癌における染色体の異常からは、しばしばその発症や病態の解明に重要な遺伝子が発見されることが白血病などの研究で経験されており、我々はこうした染色体変異を、ゲノムデータ上の遺伝子情報に置き換えるためにヘテロ接合性の消失(LOH)の実験を行った。今まで、我々の研究施設で蓄積されてきた耳下腺多型腺腫のサンプルからDNAを抽出し、LOH領域について検討すると、3番、6番、10番、12番、13番、17番染色体について高い頻度で染色体の欠失が確認できた。このデータについては、近い将来に論文化による結果の公表を予定している。耳下腺多型腺腫は、耳下腺に発生する腫瘍の中で最も頻度の高いものであり、わずかな残存組織から容易に再発し、また時に悪性転化して様々な上皮性・間葉性悪性腫瘍を発生することが知られている。この耳下腺多型腺腫には以前から細胞学的に染色体欠失が伴うことが報告されており、第8番、12番などの染色体がしばしば欠失していることが知られている。今年度は、今までに蓄積していた耳下腺多型腺腫症例から抽出したDNAを元に、3番、6番、8番、10番、12番、13番、17番染色体について、それぞれdinucleotide repeatを用いたマーカーでのヘテロ接合性の消失(LOH)実験を行った。その結果、特に第3番染色体の一部(D3S966)で、非常に高頻度にLOHが確認される領域が明らかになった。今後、さらに検討する染色体領域を増やすと共に、3番染色体の領域のfine deletion mappingを行い、その検討を行っていく予定である。
異種神経吻合、神経端々縫合における中枢および末梢神経の再生に関する研究

聴神経腫瘍手術、耳下腺腫瘍手術、頭部外傷に併発する顔面神経の障害に対して、神経の端々縫合術、神経移植術、舌下神経や副神経との吻合術、遊離神経血管筋移植など種々の修復術が行われている。これらの神経修復術の選択は術者の経験により選択されており、科学的な裏付は十分ではない。本研究では顔面神経麻痺における再建手術としての舌下神経-顔面神経吻合と舌下神経-副神経吻合の有用性を比較検討した。まず、モルモットを用いて舌下神経-顔面神経モデルを作製し、その中枢および末梢神経における神経再生を電気生理学的、組織学的に、また再生繊維の舌下神経核、顔面神経核における分布についても比較検討した。さらにYチューブを用いて顔面神経の末梢端に舌下神経と副神経の中枢端を同時に接合させ、両神経の再生力の相違を組織学的に比較検討した。その結果、モルモットにおける舌下神経-顔面神経吻合術は6ヶ月でほぼ完了し、しかも術前とほぼ同じ程度まで回復することが電気生理学的および組織学的に明らかになった。HRPを用いた実験では8割の動物において舌下神経-顔面神経吻合術後に顔面表情筋が舌下神経と二重神経支配を受けていることが明らかになった。また、Yチューブを用いた研究から舌下神経-顔面神経吻合術の方が再生神経繊維数とその大きさにおいて舌下神経-副神経吻合術より優れていることが明らかになった。本研究により舌下神経-顔面神経吻合術が顔面神経障害後の神経修復術として、その神経再生、再支配の面で副神経との吻合によるも優れていることが動物実験でも証明された。平成6年度は聴神経腫瘍手術などで顔面神経の中枢側が切断された場合に、最も良く臨床で用いられている舌下神経-顔面神経吻合モデルも作製し、神経の再生時期と程度について電気生理学的および組織学的に検討した。(方法)成熟モルモットを用いて舌下神経-顔面神経吻合モデル作成し、術後2、4、6ケ月に上眼窩神経を電気刺激し、口論筋から筋電位を導出した。その後、吻合部より末梢の顔面神経を採取し、神経横断切片を作成、トルイジンブルー染色を行い神経線維の数と大きさについて光学顕微鏡と画像解析装置(購入備品)を用いて検討した。(結果)三叉神経-顔面神経反射は術後2カ月目より検出可能であった。この筋電位は術後4ケ月、6ケ月経過するにつれ、潜時が短縮し振幅も増大した。再生線維は術後2ケ月で術前の約50%,4ケ月で60%,6ケ月で90%の再生を示した。再生線維の大きさも6ケ月ではほぼ術前の大きさにまで回復した。また、8割のモデル動物において切断した顔面神経の中枢端から細い神経束が吻合部に再生していることが明らかになった。(考察)本研究により舌下神経-顔面神経吻合術は動物モデルにおいては、術後6ケ月でほぼ再生が完了することが明らかになった。また、上眼窩神経を電気刺激し、口論筋から筋電位が導出されたことにより、三叉神経-舌下神経反射も存在することが明らかになった。さらに、吻合部に顔面神経の中枢切断端から再生がみられたことは、顔面神経の再生力の強さを示唆するものと考えられた。次年度は、本モデルにおいて顔面神経核と舌下神経核の神経細胞の再生を検討するとともに、HRPを用いて顔面神経核と舌下神経核との線維連絡につき検討する予定である。

本研究では顔面神経麻痺における再建手術としての舌下神経-顔面神経吻合と舌下神経-副神経吻合の有用性を比較検討した。まず、モルモットを用いて舌下神経-顔面神経モデルを作製し、その中枢および末梢神経における神経再生を電気生理学的、組織学的に、また再生線維の舌下神経核、顔面神経核における分布についても比較検討した。さらにYチューブを用いて顔面神経の末梢端に舌下神経と副神経の中枢端を同時に接合させ、両神経の再生力の相違を組織学的に比較検討した。組織学的解析には本研究にて購入した顕微鏡TVカメラとパーソナルコンピューターを用いた。その結果、モルモットにおける舌下神経-顔面神経吻合術は6ヶ月でほぼ完了し、しかも術前とほぼ同じ程度まで回復することが電気生理学的および組織学的に明らかになった。HRPを用いた実験では8割の動物において舌下神経-顔面神経吻合術後に顔面表情筋が舌下神経と顔面神経の二重神経支配を受けていることが明らかになった。また、Yチューブを用いた研究から舌下神経-顔面神経吻合術の方が再生神経線維数とその大きさにおいて舌下神経-副神経吻合術より優れていることが明らかになった。すなわち、本研究により舌下神経-顔面神経吻合術が顔面神経障害後の神経修復術として、その神経再生、再支配の面で副神経との吻合によるも優れていることが動物実験でも証明された。
ストレス脆弱性指標ががん患者の予後に与える影響に関する前向きコホート研究

[目的]本研究は、日本のがん患者に対し、ストレス脆弱性指標(24時間尿中コルチゾール量、抑うつ、コーピング)と予後の関連を前向コホート研究により検討することを目的とした。本年度は、抑うつとコーピングに焦点を当てた。[方法]本研究では、1996年6月から1999年4月まで国立がんセンター東病院呼吸器外科で切除術を受けた非小細胞がん患者303例が対象であった。べ一スライン調査は、肺がん患者の生活習慣、医療記録、24時間蓄尿、うつ病(DSM-IVによるうつ病診断)、抑うつ-落胆(Profile of Mood States)、コーピング(Mental Adjustment to Cancer scale)による評価を行っている。2004年1月末までの追跡調査により、56例の死亡例、2例の転出を確認した。統計解析は、DSM-IVによるうつ病の無群に対する有群の相対危険度を算出した。また、抑うつ-落胆のスコアを3分割し、最小3分位群に対する他の群の相対危険度を算出した。エンドポイントは死亡とした。共変量は、性、がん診断時年齢、臨床進行度、PS、組織型、BMI、教育歴、婚姻状況、喫煙、飲酒、疾患既往歴、痛み、呼吸困難感とした。[結果及び考察]肺がん患者の治療後3ヶ月時に評価したDSM-IVによるうつ病の有群の多変量補正相対危険度(95%信頼区間)は、2.0(0.8-6.0)と高いリスクを示したが有意な関連は示されなかった(p=0.14)。同様に、抑うつ-落胆のスコアの最大3分位群の相対危険度は、1.4(0.7-2.6)と高いリスクを示したが有意な関連は示されなかった(p trend=0.0502)。また、コーピングに関しては、下位尺度である「前向き」、「無力感-絶望感」のスコアとがん予後の関連は示されなかった。したがって、日本のがん患者におけるストレス脆弱性指標が予後に与える影響は小さいと考えられた。本研究の目的は、日本のがん患者に対し、ストレス脆弱性指標(24時問尿中コルチゾール量、コーピング、抑うつ)と生命予後の関連を前向コホートデザインにて検討することである。平成17年度は、がん患者の24時間尿中コルチゾール量と生命予後との関連を検討した。本研究対象者は、1996年6月から1999年4月まで国立がんセンター呼吸器外科に受診した手術適用の非小細胞がん患者226例とした。本研究プロトコールは、対象者の手術施行前に蓄尿を含む医学的データ及び心理的質問票に関する調査を実施した。追跡調査は1996年6月1日から2004年1月まで行い、56例の死亡および2例の転出を確認した。24時間尿中コルチゾール量は、蓄尿試料により放射免疫定量法キットを用い1日当たりの尿中コルチゾール量を測定した。24時間尿中コルチゾール量は、対象数が均等になるように3分割した。統計解析はCox比例ハザードモデルを用い、曝露要因を24時間尿中コルチゾール量、死亡をエンドポイントとした時の相対危険度を算出した。共変量は、性、年齢、ステージ等とした。本研究結果より、手術適用非小細胞肺がん患者の24時間尿中コルチゾール量が生命予後に与える影響は小さいと考えられる。
生産活動空間の規模拡大と自然の改変

本年の最終目標は東京大都市圏(20万分の1地勢図・東京とその隣接5万分の1地形図の範囲)の工業化、都市化、緑被変化の状況をGIS手法で地図に表現することであった。同時に、この手法を広域に適用するため、上記地域以外でも工業分布・人口密度・植生の変化を位置情報として地図化し、産業空間の拡大と環境改変にかかわる基礎情報を整理した。最大の目的は地表に現れる自然、人文、社会の多様な地理情報を、研究・教育両面で活用できるGISパイロットシステムの開発であるから、作図結果から新しい事実の発見を急ぐのではなく、より汎用性の高い情報を提供できるかどうか、環境変化の分析にいかに役立てられるかの検討に力点をおいた。結果は以下の通りに要約できる。1)緑被の減少はもちろん工業化、都市化の結果であるが、その時期、速さ、規模は場所によって異なる。とくに第二次大戦前と後では様相を異にする。今後、工業の立地選好事情、事業所施設の実態、新しい住宅地住民の所得水準などの工業化・都市化の質にかかわる諸要素と、変化した緑被の規模・種類との関係を明らかにすれば、環境変化の過程を社会経済的側面からより精緻に把握できる。2)従来は工業化、都市化による環境改変が主要交通路線に沿って面的に進行したが、今日は高速交通手段の発達により、大都市圏から遠いところへ点状に拡散している。しかし、その点状変化がやがて連続して面的になるかどうかの予測は、新規立地工業の周辺地域への経済的波及効果にかかっている。地方分散型の工業は大都市圏の管理中枢機能、研究開発機能によって存立基盤を決定されており、foot-looseの性格をもっているから、東京大都市圏型の工業化、都市化が日本全国に普及するとはいえない。地方中小都市の環境変化はこの観点から検討すべきである。3)上記の結果と予測は、日本の一極集中型の産業構造、都市機能に由来するか否かの検討を必要する。その検討を通じて、日本の事例がグローバルな考察に役立つかどうかを論議できる。
看護学科における英語教育のニードアナリシスとカリキュラムへの示唆

1.英語ニーズと使用現況に対する全国アンケート調査(20項目)の結果:全国の臨床看護師と看護系大学等の専任看護教員からの有効回答3798名分をSPSS11.5J for Windowsで分析。(1)ニーズは全ての項目で高いが、(2)現在の英語使用頻度は80%がほとんどないで、ニーズとの間に差があった。(3)ESP的「看護英会話」や「看護専門用語」の授業に関しては、ニーズは教育系が高いが、履修形態と担当者に関しては、臨床系は「全て看護系科目の授業の中に設定」と「外国人」であったが、教育系は「選択と必修との組み合わせ」と「外国人とは限らない」であった。(4)臨床管理系と教育系のニーズには共通の傾向があった。2.国立・公立・私立の4年制看護学部・学科の現行カリキュラムやシラバスの調査結果(36校):共通教育あるいは基礎教育の卒業となる英語の必修・選択の単位数、セメスター配分と内容を中心に調査した結果、3つのタイプに分類された。I.国立総合大学・私立総合大学タイプ(共通教育、必修4単位)、II.公立医療系・看護単科大学タイプ(多言語も含む必修選択の組合せ)、III.私立医療系看護(単科)大学タイプ(IIにやや近い)3.カリキュラムへの示唆:アンケート調査のニーズアナリシスと上記のカリキュラウム調査を基礎データとして、今後の看護教育における英語のカリキュラムに関して、具体的な示唆として次のような提案を行なった。(1)ESP的授業の設定(2)短期海外研修プログラムの開発(3)カリキュラムのタイプ別対応と目標レベル(4)English for Academic Purposes(EAP)への対応(5)卒業後のトレーニングプログラムなど。この研究の目的は看護職に必要とされる基本的英語力を考慮しながら、専門分野における英語へのニーズを広く調査分析することで、看護教育の中での今後の英語教育の方向性を探ることである。できればカリキュラム構築などへの示唆をも期待している。今年度の主要研究経過は以下の通りである。1、先ず先行研究文献に当ったが、大規模な英語使用実態や必要度に関する調査報告がないことが判明した。2、調査アンケートを作成するため、大学英語教育学会のESP部会に所属し動向をさぐり、看護系大学・短大、看護専門学校の教員と臨床看護婦・士とを対象に、英語の使用頻度や必要度を測るための質問項目を検討した。集団特性として、医師などと比べて教育背景や資格に差があることや、職域が広いことなどが判明した。3、その後、本学の倫理委員会に研究計画書を提出し、アンケート調査の前に協力同意を得ることや、倫理的配慮を行うことで、研究実施許可を得る。4、プレテストを本学教員・病院関係者や中央区保健所、訪看護センターを中心に35名に実施し、その結果を項目別と一部クロス集計し、それを基にアンケートの修正変更を行った。回収率など考慮し、調査対象を病院看護婦と看護教員に絞ることにした。5、アンケート見本と協力同意を問う返信用ハガキを同封し、全国病院一覧から等間隔抽出した200床以上の病院205と151の看護系大学・短大、専門学校に、アンケート依頼書を送った。6、その結果65院、90校から同意の回答を得て、1月から順次に大学716通、病院は予想以上に協力的で,4822通を発送し現在もまだ対応している。回答者個人から順次回答が寄せられており、すでに3600通を越している。7、回収が終了したら、次年度は集計分析に入る予定である。1.郵送で回収した調査アンケート5,539名分を整理し,有効回答3,798名(有効回収率68,6%)分を入力した。

2.英語教育に関する感想・要望項目の自由記載分931件も入力し、内容を検討し、「受けた英語教育への批判と反省」「英語教育への要望と提言」に分類した。3.各項目のデータ分析にはSPSS11.5J for Windowsを用い、単純集計後クロス集計などを行なった。4.分析結果の概要(1)英語必要度に関してはほとんどすべての項目で高い数値を示した。(2)現在の英語使用頻度に関しては予想外に低く、必要度との間に大きな差が見られた。(3)t検定やχ^2検定の結果、臨床系と教育系という職種間に「英会話授業の必要性」、「専門用語の英語授業の必要性」に関して有意な差が認められ、平均点が高かったのは教育系であった。英会話授業の必要性があると答えたものに限定し希望する履修形態及び希望担当者を分析した結果、臨床系と教育系の間には、希望する履修形態方法と担当者には有意に違いが認められた。傾向として、臨床系は「すべて看護系科目の授業の中に設定する」であり、教育系は「選択と必修の組み合わせ」であった。担当者については、臨床系は「外国人」を選び、教育系は外国人に限らないとする傾向であった。分析継続中で、詳細な結果は報告書で公表予定。5.国立・公立・私立の看護学部・看護学科の現行カリキュラムやシラバスを25校収集し、その特徴を整理分類中。6.分析結果の一部をJACET2003年度全国大会に研究発表申請中1.昨年度からのニーズの継続分析の結果:昨年度の教育系、臨床系とは別に、臨床系でさらに管理系(看護師長、主任以上)と臨床スタッフ間に項目により有意差が見られた。また、「英語の現在、将来へのニーズ」、「入試英語のニーズ」などほぼ全般的に,教育系と臨床管理系がよく似た傾向を示し、臨床スタッフより高かい傾向があった。しかし、「卒業後の看護に関する英語のトレーニング」に関しては、臨床スタッフの方が「受けたい」の平均値が臨床管理系より高かった。2.国立・公立・私立の4年制看護学部・学科の現行カリキュラムやシラバスの調査結果(36校):調査項目として共通教育あるいは基礎教育の中での卒業要件となる英語の必修単位数、選択単位数、セメスター配分と内容(一般英語か、教材として医療看護系のものを使用か、専門科目の中に設定か)を中心に調査した結果、下記のようなそれぞれ特徴を持つ、3つのタイプに分類された。I.国立総合大学・私立総合大学タイプ(共通教育、必修4単位)II.公立医療系・看護単科大学タイプ(多言語も含む必修選択の組合せ)III.私立医療系看護(単科)大学タイプ(IIにやや近い)3.カリキュラムへの示唆:アンケート調査のニーズアナリシスと上記のカリキュラウム調査を基礎データとして、今後の看護教育における英語のカリキュラムに関して、具体的な示唆として次のような提案を行なった。(1)ESP的授業の設定(2)短期海外研修プログラムの開発(3)カリキュラムのタイプ別対応と目標レベル(4)English for Academic Purposes(EAP)への対応(5)卒業後のトレーニングプログラムなど。4.口頭発表:(1)園城寺康子、成沢和子、川越栄子、田代順子、(シンポジウム)「4年制看護教育における英語教育の現状と問題点」、日本医学英語教育学会第6回学術集会、2003年月7月12日(2)園城寺康子、成沢和子、宇城令、(研究発表)
クラミジアの病原性に関する分子生物学的研究

オウム病クラミジアは偏性細胞内寄生性病原性微生物で,不顕性感染から致死性全身感染まで様々な疾病を引き起こす.病原性発現のメカニズムは不明である.本課題において,我々はオウム病クラミジアの病原性発現に関与する分子を同定し,発現のメカニズムを分子レベルで明らかにしようとした.はじめに,比較生物学的に鍵となる分子の検索を試みた.主要外膜タンパク質および熱ショックタンパク質GroELの塩基配列を解読し,株間の比較を行なった.熱ショックタンパク質の解析により宿主指向性に関連した変異が認められた.一方,主要外膜タンパク質の変異率は種や生物型により異なっていたことから,各種や生物型において機能や免疫応答における役割が異なることが示唆された.血清疫学的調査からネコにおいてクラミジア感染症が日本に存在していることを示唆した.さらに,各血清の反応性から猫由来クラミジアに血清型が存在している可能性を示唆した.猫由来株のMOMPは均一であることから型特異抗原はGroELなどMOMP以外の分子であることが示唆された.以上の結果から,病原性発現に関与する分子は各種や生物型により異なることがわかった.オウム病クラミジアは偏性細胞内寄生性病原性微生物で,不顕性感染から致死性全身感染まで様々な疾病を引き起こす.病原性発現のメカニズムは不明である.本課題において,我々はオウム病クラミジアの病原性発現に関与する分子を同定し,発現のメカニズムを分子レベルで明らかにしようとした.はじめに,比較生物学的に鍵となる分子の検索を試みた.主要外膜タンパク質および熱ショックタンパク質GroELの塩基配列を解読し,株間の比較を行なった.熱ショックタンパク質の解析により宿主指向性に関連した変異が認められた.一方,主要外膜タンパク質の変異率は種や生物型により異なっていたことから,各種や生物型において機能や免疫応答における役割が異なることが示唆された.血清疫学的調査からネコにおいてクラミジア感染症が日本に存在していることを示唆した.さらに,各血清の反応性から猫由来クラミジアに血清型が存在している可能性を示唆した.猫由来株のMOMPは均一であることから型特異抗原はGroELなどMOMP以外の分子であることが示唆された.以上の結果から,病原性発現に関与する分子は各種や生物型により異なることがわかった.クラミジアは家畜・愛玩動物をはじめ人を含む幅広い宿主域を有し,これら感染動物に不顕性感染から致死性全身感染まで様々な病原性を発揮する.しかしながら,その病原性発現の機構は未だ不明である.今回,我々は鳥由来および哺乳動物由来C.psittaciとC.pecorumのgroELの構造を比較し,また,生物学的性状との関係を明らかにしようとしている.今年度は各種株間の構造を比較するためPCR法によりgroEL断片を増幅し,制限酵素切断像および塩基配列解読による比較を行った.GroELの遺伝子をクローニングするためC.trachomatis,C.pneumoniaeおよびモルモットC.psittaciのgroEL塩基配列を比較しPCR用のプライマーを設計した.このプライマーを用いPCRを実施したところ猫由来C.psittaciのgroELを増幅できたが、他の鳥由来C.psittaciおよびC.pecorumのgroELを増幅できなかった.そこで,条件をより緩やかにしたところ鳥由来C.psittaciのgroELを増幅することができた.しかし,C.pecorum groELは増幅できなかった.この結果はgroELの構造に種間で違いがあること,また,猫由来C.psittacigroELはモルモット由来C.psittacigroELと類似した塩基配列を有することを示唆した.増幅産物について制限酵素切断像を比較したところ,以前の我々の染色体DNAの結果とよく一致した.さらに猫由来C.psittaci groELでは株間に差がみられた.この猫由来株は主要外膜蛋白質遺伝子の解析では差がみられなかったものである.現在,塩基配列解読を進めており,増幅できなかったC.pecorum groELについても遺伝子ライブラリーからのクローニングも含め構造解析を行っている.これらの研究結果は平成6年度クラミジア研究会および第8回国際クラミジア感染症シンポジウムで発表する予定である.鳥・ヒトオウム病・哺乳類由来C.psittaciおよびC.pecorumの主要外膜蛋白質遺伝子ompAおよび熱ショック蛋白質遺伝子groELのDNA多形性をPCR法と制限酵素切断像解析の組合せから明らかにした.これらの遺伝子のDNA多型性は以前に我々が報告したゲノムDNAの多型性と一致し,さらに今回の結果はゲノムDNA解析ではわからなかった株間の差異を明らかにした.この結果はゲノムDNA解析ではわからなかった株間の差異を明らかにした.この結果を第8回国際クラミジアミーティングで報告した。さらに,Random Amplified PCR Diversity(RAPD)解析を行い,種および型,さらに個々の分離株に固有な断片が増幅されることを明らかにした.この結果からRAPD解析がクラミジア感染症の分子疫学的研究に有用であり,また,病原性の指標としても用いられうることがわかった.さらに代表的なクラミジア株のgroELおよび16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した.以上の成績からC.psittaciおよびC.pecorumはC.trachomatisと異なった遺伝学的性質をもっていること,および病原性と関連した遺伝型の存在を示唆した。病原性に関与する因子として熱ショックタンパク質(heat shock Protein,hsp)に注目し,比較分子生物学的解析を行った.hspには種々の分子が他の細菌において知られているが,今回は分子量約60kのhsp60,いわゆるGroELの一次構造を比較解析した.トリ由来2株,オウム病患者由来1株,ネコ由来3株およびヒツジ由来1株を用いた.

各株のGroELをPCRにより増幅し,常法にしたがって塩基配列を決定した.増幅産物は予想された1272塩基対(bp)より構成され,挿入や欠失は観察されなかった.これまでに報告されているモルモット封入体結膜炎(GPIC)株を含め相同性を比較したところ,塩基配列およびアミノ酸配列において88.8%から100%および97.9から100%だった.由来宿主により異なるアミノ酸残基が5カ所に認められた.また,C末端領域には種特異的アミノ酸配列が認められた.クラミジアにおけるGroELの機能を推定するため,解析が最も進んでいるEsherichia coliのGroELと比較した.活性発現に必須な27アミノ酸残基中24残基がクラミジアGroELにおいても保存されていた.これらの保存アミノ酸残基はヌクレオチド結合部およびGroESとの相互作用に関与するとされている.残る3残基は性質のことなるアミノ酸に置換していた.今回の成績からクラミジアGroELは由来宿主と関連したグループにまとめられることがわかった.C.trachomatisではGroELが宿主であるヒトのGroELとの免疫学的類似性による自己免疫反応を惹起することが病原性の一因であるとされている.C.psittaciにおいては各宿主のGroELに関する情報が乏しいため,クラミジアGroELと宿主GroELの関係を解明することが必要である.これまでの制限酵素多型性解析では宿主に対する病原性との関連性を明確にできなかったが,一次構造解析によりクラミジアGroELが病原性に関与する可能性が示唆された.