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高静水圧印加・非凍結超低温下での革新的肺保存法のミニブタモデルによる開発

高圧の印加により、液体を不凍結状態に保ったまま液体を超低温に保つことが可能であることは、水の固液平衡曲線から示されている。本研究ではこの自然現象の移植医療への応用を目指し、圧力印加・不凍結状態(過冷却状態)で、従来よりも長時間の肺の低温保存方法の確立を目指す実験を、前臨床研究としてMHC確立クラウン系ミニブタを用いたMHC不適合間肺移植実験により行った。30-60MPaを一過性に肺に印加した後に肺移植を行ったものの、組織学的にも肺胞内出血や浮腫などの虚血再灌流障害を呈する急性移植肺機能不全状態に陥り、末梢気管支に残存する空気に対する圧力の影響を回避する方法の確立が必要であることが示唆された。現在の冷却浸漬保存法では、臓器摘出から移植後血流再開までの臨床的な虚血許容時間は肺では8時間と短く、提供臓器を移植に用いる機会を失うこと、急性・慢性臓器不全発生の危険性を高める等の問題を伴う。臓器保存時間の延長はこれらの問題解決に大きく寄与し、より安全かつ高品質の移植医療に直結することが期待される。そこで本研究では、高圧付加により、非凍結状態のまま液体を超低温に保つことが可能である現象を応用し、高圧下・非凍結状態での長期臓器低温保存方法の確立を目指す研究として、ミニブタ肺移植モデルを用いた前臨床実験によって、各種圧力条件、温度条件、臓器保存時間に設定した臓器移植を行い、各種保存条件下での臓器の機能評価をはかる。平成26年度は、目的1に掲げる【高圧による肺損傷が生じない圧力レベルを明らかにする】実験に着手した。60MPaを一過性に肺に付加した際は、組織学的に肺実質は正常に保持されていたため、まず60MPa負荷後の肺をMHC適合のミニブタに同所性左肺移植を行った。その結果、移植肺再灌流60分後に移植肺から泡沫状痰の排出が生じ、組織所見では肺胞内出血や浮腫などの虚血再灌流障害を認めた。この実験では、肺に含気を保持したままで圧力を付加していたが、圧力による気体の体積変化は大きく、これが肺損傷の誘因となった可能性がある。今後、含気を保持した肺と虚脱させた肺の耐圧能を比較する実験を行う必要性が示唆された。上記実験に加え、平成27年度に予定する【高圧下非凍結状態で長期間の超低温保存を行った臓器は移植後に正常に機能するか?(目的2)】の対照実験として、クラウンミニブタ肺移植モデルでの肺保存時間の限界を評価する実験に着手した。この結果、24時間、18時間保存肺を用いた移植ではいずれも重度虚血再灌流障害を呈したことから、引き続き保存時間の限界を明らかにする実験の必要性を認識する結果となった。現在の冷却浸漬保存法では、臓器摘出から移植後血流再開までの虚血許与時間は肺では8時間と短く、提供臓器を移植に用いる機会を失うこと、急性・慢性臓器不全発生の危険性を高める等の問題を伴う。臓器保存時間の延長は、これらの問題解決に大きく寄与し、より安全かつ高品質の移植医療につながることが期待される。そこで本研究では、高圧負荷により、非凍結状態のまま液体を過冷却状態に保つことが可能である自然現象を応用し、高圧下・非凍結状態での長期臓器低温保存方法の確立を目指す研究として、ミニブタ肺移植モデルを用いた前臨床研究によって、各種圧力条件、温度条件、臓器保存時間に設定した臓器移植を行い、あらたな臓器保存法の開発を行う。平成26年度は60MPaを一過性に付加した肺を移植に用いた際は、急性期に高度の虚血再灌流障害を呈することを明らかにした。この結果をもとに、平成27年度を30MPaを一過性に肺に付加した後に肺移植を行ったが、60MPaの際と同様に、組織学的にも肺胞内出血や浮腫などの像を呈し、30MPaの圧力下であっても肺保存は困難であった。一方、腎臓や心臓などの実質臓器では30-60MPaの一過性圧力負荷後であっても移植臓器は正常に機能するという点を踏まえ、肺の特性である空気含有条件により圧力の影響がどのように変化するかを評価した。気管に空気を含有させた状態で圧力を付加しても、肉眼的にも気管の断裂所見はなく、また組織学的にも異常は認めなかったものの、肺実質では圧力負荷前後で末梢気道主体の病変が生ずることから、末梢気道に残る空気の影響を回避する手法の確立が必要と考えられた。

平成26年度の研究によって、目的1に示す耐圧能の解明(肺損傷を生じない圧力レベルの解明)という点からは明確な結論を得ることができていない。しかし、肺を通常のように含気を保持した状態で保存するか、あるいは虚脱させた状態で保存するかによって、高圧保存の際には移植後の虚血菜館るう障害の程度が異なる可能性を示す結果が得られていることから、継続実験により課題の達成は近いと考える。更に平成26年度には、平成27年度実施予定の実験を先駆けて行っていることから(高圧保存に対する対照実験として、クラウンミニブタ肺移植モデルにおける冷却浸漬保存時間の限界を評価する実験)、総合的には研究課題はおおむね順調に進展しているものと判断する。呼吸器外科学平成26年度は、目的1に掲げる【高圧による肺損傷が生じない圧力レベルを明らかにする】実験として、60MPa負荷後の肺(肺は含気した状態で維持)を、MHCが適合した他のミニブタに対し同所性左肺移植を行ったところ虚血再灌流障害所見を認めたということから、圧力による気体の体積変化は大きいことを鑑みると、含気を保持した肺と虚脱させた肺との違いにより圧力による肺損傷の程度が異なる可能性が示唆される結果を得ている。そこで平成27年度は、肺の含気の有無により耐圧能が異なるかについて、平成26年度と同様にMHC適合間クラウン系ミニブタ肺移植モデルを用いて評価を進める。並行して、【高圧下非凍結状態で長期間の超低温保存を行った臓器は移植後に正常に機能するか?(目的2)】を推進するため、通常の冷却浸漬保存におけるクラウン系ミニブタ肺の保存時間の限界を明らかにする実験を進める(まずは12時間保存の限界を評価)。この結果と、目的1に掲げる肺の耐圧能評価の結果を総合し、高圧保存によってどれだけの臓器保存時間延長効果が見込まれるかについて、検討を行う。
湿式クラッチ用多孔性フェーシング材の定常及び過渡的摺動条件下における油膜圧力測定

自動車自動変速機に多用されている湿式フェーシング材の摩擦特性は,流体潤滑的特性と境界潤滑好特性の両方を併せ持っている.本研究はこのような潤滑条件下において重要な役割を果たす摺動面に発生する油膜圧力を種々の条件の下において測定した.本試験機は,試作後すでに7年を経過し,種々の研究成果を挙げてきた.それらの摩擦特性と摺動面に生ずる油膜圧力の測定結果と対比させて検討した.その結果,摺動初期には,摺動面において正圧が発生するが,時間経過とともに圧力は減少し,やがて負圧に転ずることを明らかにした.これらは,圧力測定孔径を0.5mm,0.18mmの2種類に選び,いずれも同様の測定結果を実証した.これらの測定を自動変速機油及び,その基油相当油を用いて行い,類似の現象の生ずることを確認した.摩擦特性は,油膜圧力の測定結果とは相関関係を示さず,多孔性ペーパ系摩擦材の摩擦特性において,流体摩擦の占める位置に比較して境界摩擦の占める役割が極めて大きいことを実証し,同摩擦材の摩擦力発生機構解明の重要なデータが取得できた.自動車自動変速機に多用されている湿式フェーシング材の摩擦特性は,流体潤滑的特性と境界潤滑好特性の両方を併せ持っている.本研究はこのような潤滑条件下において重要な役割を果たす摺動面に発生する油膜圧力を種々の条件の下において測定した.本試験機は,試作後すでに7年を経過し,種々の研究成果を挙げてきた.それらの摩擦特性と摺動面に生ずる油膜圧力の測定結果と対比させて検討した.その結果,摺動初期には,摺動面において正圧が発生するが,時間経過とともに圧力は減少し,やがて負圧に転ずることを明らかにした.これらは,圧力測定孔径を0.5mm,0.18mmの2種類に選び,いずれも同様の測定結果を実証した.これらの測定を自動変速機油及び,その基油相当油を用いて行い,類似の現象の生ずることを確認した.摩擦特性は,油膜圧力の測定結果とは相関関係を示さず,多孔性ペーパ系摩擦材の摩擦特性において,流体摩擦の占める位置に比較して境界摩擦の占める役割が極めて大きいことを実証し,同摩擦材の摩擦力発生機構解明の重要なデータが取得できた.
力覚とアクチュエータの統合による直感的オブジェクトハンドリングシステムの開発

本研究は,バーチャルリアリティの分野で多く用いられている力覚提示技術を,非接触浮上技術と実世界において統合的に用いることで,直感的な非接触ハンドリングを実現することをめざして実施した.磁気浮上および静電浮上が最も不安定となるピック・アンド・プレース作業が力覚の補助によりきわめて直感的かつ安定に実現できることを示したほか,浮上システム全体をユーザ操作と連動して傾斜させることにより安定かつ高速な水平物体搬送が可能となることを示した.本研究は,バーチャルリアリティの分野で多く用いられている力覚提示技術を,非接触浮上技術と実世界において統合的に用いることで,直感的な非接触ハンドリングを実現することをめざして実施した.磁気浮上および静電浮上が最も不安定となるピック・アンド・プレース作業が力覚の補助によりきわめて直感的かつ安定に実現できることを示したほか,浮上システム全体をユーザ操作と連動して傾斜させることにより安定かつ高速な水平物体搬送が可能となることを示した.本研究では,バーチャルリアリティの分野で多く用いられている力覚提示(ハプティックディスプレイ)の技術を,非接触浮上などのアクチュエーション技術と実世界において統合的に用いることで,製品組立工程や研究開発環境における微小/精密部品のハンドリングを支援するツールを実現することを目的として実施した.ツールへの付着が問題となる微細なパーツや,表面の高いクリーン度を要求されるパーツ(シリコンウェハ,液晶用ガラス基板,ハードディスク用基板など)においては,磁気浮上機構や静電浮上機構などの非接触浮上機構により,パーツを非接触でハンドリングすることが有効であると考えられる.しかし,磁気・静電浮上機構は,本質的に不安定な力を制御により安定化しているシステムであるため,機構を手で動かすなどした場合に,システムの安定性が損なわれ非接触状態が維持できない場合がある.そこで,本研究で提案研究するシステムでは,磁気・静電浮上機構と力覚提示装置を組み合わせ,浮上機構の内部状態に応じて力覚提示機構が機構を動かす操作者に対して適切な力フィードバックをかける.これにより,操作者は,非接触浮上状態を維持ししたままシステム(=ハンドリングツール)を自由に動かして,物体の非接触ハンドリングを行うことができる.本年度の研究においては,ミリメートルオーダの磁性物体に対する1自由度の磁気浮上ハンドリングシステム,ハードディスク用アルミ基板に対する1自由度の静電浮上ハンドリグシステムを,それぞれ上記のコンセプトに基づき実現した.また,これらの実現に際し,浮上制御系に存在する積分器が,直感的な物体プレーシングを実現するための重要な役割を果たしていることを明らかとした.本研究は,バーチャルリアリティの分野で多く用いられている力覚提示(ハプティックディスプレイ)の技術を,非接触浮上などのアクチュエーション技術と実世界において統合的に用いることで,製品組立工程や研究開発環境における微小/精密部品のハンドリングを支援するツールを実現することを目的とする.具体的には,ツールへの付着が問題となる微細なパーツや,表面の高いクリーン度を要求されるパーツ(シリコンウェハ,液晶用ガラス基板,ハードディスク用基板など)に対して静電/磁気浮上による非接触浮上技術を適用し,それを作業者が自在に動かせるようハプティックデバイスによる力覚支援と統合することをめざしている.本年度の研究では,静電浮上システムの開発および性能向上に注力した.具体的には,(1)ミリメートルオーダの導電体に対する1自由度の静電浮上システム,(2)ハードディスク用アルミ基板に対する2自由度の静電浮上搬送システムに関する研究を主に実施した.(1)のマイクロ静電浮上システムにおいては,光学式変位計と球状電極を用いることで直径数mmの導電体を非接触で浮上させることに成功したさらに浮上した導電体を上下左右に搬送することも可能であった.(2)のアルミ基板用静電浮上システムでは,特に水平方向の搬送性能を向上させるための検討を行った.静電浮上では,水平方向の拘束力が弱いことから,搬送時には水平方向の加速度に制約を受けるという問題があった.この点を改善するため,搬送時に浮上用電極を傾斜させることで,搬送方向にも静電吸引力を発生させ,搬送加速度を大幅に向上させることに成功した.本研究は,バーチャルリアリティの分野で多く用いられている力覚提示(ハプティックディスプレイ)の技術を,非接触浮上などのアクチュエーション技術と実世界において統合的に用いることで,製品組立主程や研究開発環境における精密部品のハンドリングを支援するツールを実現することを目的としている.具体的には,表面の高いクリーン度を要求されるパーツ(シリコンウェハ,ガラス基板等)などに対して静電/磁気浮上による非接触浮上技術を適用し,それを作業者が自在に動かせるようハプティックデバイスによる力覚支援と統合することをめざしている.本年度の研究では,薄板を対象と.した静電浮上および磁気浮上システムにおいて,水平方向の搬送性能向上をめざした研究を進めた.昨年度,静電浮上において電極を傾斜させることで搬送加速度を向上させる手法を報告しているが,本年度は,これをさらに進めて,磁気浮上機構にも適用を試みた.磁気浮上においても搬送対象物が板状の場合には,静電浮上と同様に水平方向の拘束力が弱く,浮上機構そのものを傾斜させるというアプローチが有用である.磁気浮上機構全体を傾斜させる搬送装置を試作し,傾斜搬送を試みた結果,搬送加速度を大幅に向上できることを確認した.また,これら傾斜搬送の技術をハプティックデバイスと組み合わせ,水平搬送を自在に行うシステムを構築した.ハプティックデバイスの制御方式としてアドミタンス方式を用いることで機構の水平加速度が正確に予測できることから,予測加速度に基づいて浮上機構を傾斜させることで,自動搬送時と同程度の安定性で,ユーザが自在に水平搬送を行えることが確認できた.
多変数多項式系の主変数消去法の革新的高速化の研究

●本研究は、筆者の前課題「基盤研究(C) (一般),課題番号15K00005 (平成2729年度)』で得られた成果に基づき、それを飛躍的に発展させるものである。前課題で得られた最大の成果は、『GとHが互いに素な多変数多項式のとき、イデアル<G,H>の辞書式順序でのグレブナー基底では従変数のみの元はただ一つで、それはGとHから出発する多項式剰余列の最終要素を余因子で規格化することで、極めて高速に計算できる』、という簡単で強力な定理である。●本年度は、前課題の成果である定理を基礎に、従来行われていた方法に従って、与えられたm+1個の多項式から1個を選びそれを使って第一主変数を消去したm個の多項式を生成し、これを繰り返して最後に従変数のみの一つの多項式を計算してみた。だが、得られた多項式は求める多項式を因子として含むが、余計因子の方が遥かに大きかった(即ち、消去イデアルの最小元を求めるには、古典的算法は全く役に立たない)。そこで、m+1個の入力多項式を二つづつ平等に組み合わせて、第一主変数が消去されたm+1個の多項式を生成し、これを繰り返してm個の主変数全てを消去したm+1個の多項式を生成した。これらはいずれも求める多項式の何倍も大きかったが、それらの最大公約子は求める多項式よりほんの少し大きいだけだった。後は、このことの背景にある定理を見つけるだけだった。◯実は上記の定理は常に成立する訳ではなく、扱う多項式系を制限する必要があるが、その制限は自然なもので、筆者はそれをHealthy systemと命名した。論文は当初疑問視され、5名もの査読者がついたが、初等的証明に変更したら、全員から「受理」と判定された。本研究の最終目的は、主変数消去を剰余列法で実行すれば計算は高速だが得られた結果式が最小性を持たず、グレブナー基底法で実行すれば結果式の最小性は保証されるが計算が異常に遅い、というジレンマを新しい定理と算法の発見で解決することである。主変数消去は重要な演算で、グレブナー基底は計算代数における最重要演算だが、このジレンマは長い間、世界中の誰も解決できなかった。科研費申請時には、前課題の主定理の証明中に得た『主項どうしを消去するのに最小の乗数多項式を掛けて行う『臨界主項消去』法で何とかなると思っていたが、それは見当違いで、その代りにもっと衝撃的な定理が証明できた。そして、その定理により、当該分野の専門家の誰も予想しえなかった革新的な消去法が発見できたのである。現在、3個以上の多変数多項式系の消去イデアルの最小元に関する定理に基づき、辞書式順序のグレブナー基底を従来とは全く異なる方法で、しかも非常に効率的に消去する算法を理論化するとともに、算法をパソコンにインプリメントしている。今年度は、プログラムを完成させるとともに、拡張ヘンゼル法による疎は多変数多項式の因数分解等に応用していくつもりである。

科研費申請時には、前課題の主定理の証明中に得た『主項どうしを消去するのに最小の乗数多項式を掛けて行う『臨界主項消去』法で何とかなると思っていたが、それは見当違いで、その代りにもっと衝撃的な定理が証明できた。そして、その定理により、当該分野の専門家の誰も予想しえなかった革新的な消去法が発見できたのである。現在、3個以上の多変数多項式系の消去イデアルの最小元に関する定理に基づき、辞書式順序のグレブナー基底を従来とは全く異なる方法で、しかも非常に効率的に消去する算法を理論化するとともに、算法をパソコンにインプリメントしている。今年度は、プログラムを完成させるとともに、拡張ヘンゼル法による疎は多変数多項式の因数分解等に応用していくつもりである。次年度使用額は5889円と少額なので、雑費に使用する。
悪性腫瘍におけるCD169の役割解明と予後予測因子としての有用性

癌免疫療法への期待が高まるにつれ、癌免疫モニタリングの重要性が増している。私達は癌免疫におけるリンパ節マクロファージの重要性に注目し、以下の解析を行った。メラノーマ、子宮体癌、膵臓癌、乳癌患者を対象に、リンパ節マクロファージのCD169発現を解析した。その結果、CD169発現が高い症例でCD8陽性T細胞を介した癌免疫が亢進しており、術後の生存率が良好であることを明らかにした。また培養実験にて、CD169高発現マクロファージはリンパ球活性化作用を有するCCL8, CXCL10を高発現していることを明らかにした。本研究は、悪性黒色腫・子宮体癌・膵臓癌・乳癌の所属リンパ節マクロファージと抗腫瘍免疫との相関を、特にCD169に着目して解析し、この分子が予後マーカーとしての有用性を明らかにすることが目的である。この方針に従い、以下の解析を行った。まずはヒトリンパ節においてCD169陽性マクロファージの分布を免疫組織学的に解析したあところ、洞マクロファージの数は概ね一定であるのに対し、CD169陽性率は症例毎にかなり変動があることが明らかとなった。私達はCD169がヒトの炎症性(M1-like)マクロファージのマーカーとして有用であることを報告している(Ohnishi et al. Cancer Sci 2013)。そのため、CD169陽性マクロファージが特にT細胞やNK細胞を介した抗腫瘍免疫を賦活化していると予想し、リンパ球との相関を解析した。リンパ節においてCD169陽性マクロファージはCD8陽性Tリンパ球やCD57陽性NK細胞と直接接触しており、さらに腫瘍組織内へのT細胞やNK細胞の浸潤と正の相関を示した。次に所属リンパ節のCD169陽性マクロファージと悪性黒色腫・子宮体癌・乳癌症例の臨床予後との相関を解析した。悪性黒色腫と子宮体癌では、CD169陽性マクロファージが多い症例では少ない症例と比較して全生存率が有意に良好であった。さらに多変量解析を行った結果、悪性黒色腫においてCD169陽性率は独立した予後因子となることを明らかにした。対して、乳癌ではCD169陽性マクロファージと生存率に相関性を認めなかった。膵臓癌については、現在解析中である。即ち、悪性黒色腫と子宮体癌においては、リンパ節マクロファージにおけるCD169に発現はT細胞やNK細胞を介した抗腫瘍免疫や臨床予後を反映するマーカー分子として有用であると考えられた。本研究は、悪性黒色腫・子宮体癌・膵臓癌・乳癌の所属リンパ節マクロファージと抗腫瘍免疫との相関を、特にCD169に着目して解析し、臨床予後を反映する分子マーカーとしての有用性を明らかにすることが目的である。前年度での解析では、リンパ節のCD169陽性マクロファージは抗腫瘍免疫に主体的に関わるCD8陽性T細胞やCD57陽性NK細胞と直接接触しており、さらに腫瘍組織内へのT細胞やNK細胞の浸潤と正の相関を示すことを明らかにし、さらに悪性黒色腫と子宮体癌では、所属リンパ節のCD169陽性マクロファージが多いほど、予後良好であることを明らかにした。今年度は、膵臓癌と乳癌を対象に同様の解析を行った。その結果、膵臓癌においてもリンパ節におけるCD169の発現は、生命予後とT細胞による抗腫瘍免疫を反映する分子マーカーとして有用であることを明らかにした。対して、乳癌ではCD169の発現と生命予後に有意な相関を認めなかったが、リンパ節のCD169陽性マクロファージが多い乳癌症例では、リンパ節転移が有意に少ない傾向がみられた。即ち、悪性黒色腫・子宮体癌・膵臓癌では、リンパ節マクロファージにおけるCD169の発現は、T細胞やNK細胞を介した抗腫瘍免疫や臨床予後を反映するマーカー分子として有用であると考えられた。今年度では、マクロファージにおけるCD169発現のメカニズムを詳細に解析するため、培養実験を行った。その結果、1型IFN(IFN-alpha, IFN-beta)の刺激により、CD169の発現が特異的および強力に誘導されることが明らかとなった。さらに、がん患者のリンパ節においてもCD169陽性マクロファージの近傍に、IFN-alphaを産生する組織球や形質細胞様樹状細胞が局在することを明らかにした。今後はCD169陽性マクロファージの性質について、詳細に解析していく予定である。臨床検体を用いた臨床病理学的解析は予定通り全て終了した。年次計画に従い、ヒトマクロファージを対象とした培養実験をさらに進めて行く予定である。本年度では、リンパ節マクロファージにおけるCD169陽性率と子宮体癌、膵臓癌患者の予後を分析し、いずれもCD169陽性率が高い症例ほど予後良好であることを明らかにした。一方で、乳癌患者ではリンパ節におけるCD169陽性率が高いほどリンパ節転移が少ない傾向が見られたが、術後生存率との有意な相関は認めなかった。私達はリンパ節CD169陽性マクロファージが腫瘍組織内へのCD8陽性T細胞の浸潤増加と相関することをすでに明らかにしているが、子宮体癌ではCD57陽性NK細胞の浸潤増加とも相関することを明らかにした。また、CD169陽性マクロファージによるリンパ球活性化メカニズムを詳細に明らかにするため、IFNa刺激で誘導したCD169陽性マクロファージを用いて培養実験を行った。

DNAマイクロアレイによる網羅的解析にてCD169陽性マクロファージが特異的に発現する分泌タンパクを複数同定した。その中でリンパ球活性機能を有し、非常に高い発現を認めた分子としてCCL8とCXCL10の2つのケモカインに着目した。IFNa誘導性CD169陽性マクロファージを培養すると、いずれのケモカインも強く分泌することを明らかにした。CD169発現と予後との関係をすでに明らかにしている大腸癌症例において、リンパ節マクロファージが特にCCL8を発現していることを明らかにした。血清中のCCL8とCXCL10濃度とCD169発現との相関も分析したが、CCL8濃度はCD169発現が高い症例で若干高い傾向が見られたものの、有意な相関性は認めなかった。癌免疫療法への期待が高まるにつれ、癌免疫モニタリングの重要性が増している。私達は癌免疫におけるリンパ節マクロファージの重要性に注目し、以下の解析を行った。メラノーマ、子宮体癌、膵臓癌、乳癌患者を対象に、リンパ節マクロファージのCD169発現を解析した。その結果、CD169発現が高い症例でCD8陽性T細胞を介した癌免疫が亢進しており、術後の生存率が良好であることを明らかにした。また培養実験にて、CD169高発現マクロファージはリンパ球活性化作用を有するCCL8, CXCL10を高発現していることを明らかにした。臨床検体を用いた臨床病理学的解析は、あと膵臓癌を残すのみで、ほぼ終了した。ヒトマクロファージを用いた培養実験も併せて進めており、本研究は年次計画の予定通りに進展している。今後の研究は、ヒトマクロファージを用いた培養実験が主体となる。また、CD169陽性マクロファージの活性化を反映する血清中分子マーカーの同定も重要な目標であり、すでに熊本大学倫理委員会による研究計画承認とサンプルの収集を行っている。病理学今後の研究はヒトマクロファージを用いた培養実験が主体となる。また、CD169陽性マクロファージを反映する血清分子マーカーを同定することも重要な目標であり、外科学講座の協力を得て、研究を進める準備を行っている。
輸送ハブ形成メカニズムの解明－東アジアの空港・港湾間競争と我が国への政策提言－

本年度(平成30年度(2年目))は、主に、以下の3つの研究課題に取り組んだ。1.【国際航空流動と高次ビジネス・サービス企業の集積に関する研究】アジア地域における国際航空流動と高次ビジネス・サービス(金融、銀行、会計、保険、法律、コンサルタント、および広告)企業の集積に焦点を当て、その共進化について定量的に検証した。すなわち、GDPと人口、距離から構成される基本的な重力モデルに、高次ビジネス・サービス企業の集積を表す変数を導入した結果、アジア地域の都市間国際航空旅客流動数・貨物流動量は、高次ビジネス・サービス企業の集積の程度によって最も説明できると同時に、その重要性は経年的に大きくなっていることが明らかとなった。2.【航空ネットワークの評価に関する研究】アムステルダム大学附属SEO Amsterdam Economicsと共同で、アジア主要国際空港における航空ネットワークの多角的な評価に取り組んだ。NetScanモデルによる分析結果からは、中国の空港をはじめ、アジア主要国際空港の航空ネットワークは急速に拡大している一方で、我が国の国際拠点空港は、その航空ネットワークを相対的に縮小させていることが明らかとなった。しかしながら、東京国際空港については、再国際化以降、充実した国内路線と新たに開設された国際路線の接続が実現した結果、その航空ネットワークは急速に拡大していた。3.【航空製造部門と海事製造部門における集積の経済効果に関する研究】我が国の航空製造部門と海事製造部門を分析対象として取り上げ、その集積の経済効果について定量的に検証した。すなわち、資本と労働から構成される基本的なコブ=ダグラス型生産関数に、産業の多様性、地域特化、および地域競争を表す変数を導入した結果、航空製造部門ではJacobs型外部効果の存在が、そして海事製造部門ではMAR型外部効果の存在が示唆された。本年度(平成30年度(2年目))においては、合計10編(有審査英文ジャーナル論文2編(Impact Factor:2.357)、有審査和文ジャーナル論文1編、国際学会プロシーディングス論文5編(うち、フルペーパー審査2編、アブストラクト審査3編)、そして招待論文2編)の論文を対外的に公表した。特に、交通分野で評価の高い国際学術誌への掲載は、本研究成果が国際的にも高く評価された証左であるといえる。以上の理由から、本研究課題の現在までの進捗状況は、「おおむね順調に進展している」と判断した。昨年度(平成29年度(1年目))および本年度(平成30年度(2年目))の研究成果を踏まえた上で、最終年度(令和元年(3年目))においては、輸送ハブと都市成長に関する実証分析、および、輸送ハブ形成メカニズムを内生化した学際的モデルの開発に取り組む。そして、本研究課題の総括として、日本の国際空港・港湾政策に対する戦略的提言を行う予定である。本研究課題を上記の方針に従って遂行するために、引き続き、オランダ人、オーストラリア人、そしてベルギー人研究者との緊密な協力関係の下で取り組む。本年度(平成29年度(1年目))は、本研究課題の基礎研究および現状分析と位置付けた上で、主に、以下の2つの研究課題に取り組んだ。1.【基礎的データ・ベースの構築(基礎研究)】1都市間国際航空旅客・貨物流動量データ、2港湾間国際コンテナ貨物流動量データ、3企業管理機能集積データ、そして4輸送産業集積データを収集・加工して、本研究課題を遂行するために必要な基礎的データ・ベースを構築した。その際には、1はICAOデータ、2は国際輸送ハンドブック、3はベルギー人/オーストラリア人研究協力者からの提供、そして4は工業統計調査(経済産業省)を利用した。2.【都市間国際航空旅客・貨物流動の分析(現状分析1)】アジア地域を分析対象として取り上げ、重力モデルによって、国際航空輸送からみたアジア主要都市の拠点性(ハブ効果)を検証した。その結果、中国本土の3都市に加えて、特に貨物に関しては、クアラルンプール、ソウル、ジャカルタ、バンコクをはじめ、第2階層都市が急速に成長していると判断できた。そして、旅客および貨物ともに、新空港を開港した都市、貨物については、3大インテグレーターが貨物ハブを開設した都市の拠点性は、基本的に上昇していることが明らかとなった。3.【航空機部品産業と海事産業の空間的集積の検証(現状分析2)】我が国における航空機部品産業と海事産業の製造部門を分析対象として取り上げ、その空間的集積の現状を把握した。まず、航空機部品産業については、特化係数による分析からは、中部地域と東京都多摩地域に集積していることが観察された。次に、海事製造業に関しては、瀬戸内海沿岸と九州北部が、我が国において最も海事関連産業が集積した地域であると判断できた。同時に、工業地区を分析対象とした特化係数を用いた分析からも、瀬戸内海沿岸や九州北部の工業地区において、特化係数が高いことが判明した。本年度(平成29年度(1年目))においては、合計10編(有審査英文ジャーナル論文1編(Impact Factor:2.357)、有審査和文ジャーナル論文3編、国際学会プロシーディングス論文5編(うち、フルペーパー審査3編、アブストラクト審査2編)、そして招待論文1編)の論文を対外的に公表し、併せて、日本海運経済学会からは、国際交流賞を受賞した。このことは、本研究成果が、国際的にも高く評価された証左であるといえるだろう。1.

【国際航空流動と高次ビジネス・サービス企業の集積に関する研究】アジア地域における国際航空流動と高次ビジネス・サービス(金融、銀行、会計、保険、法律、コンサルタント、および広告)企業の集積に焦点を当て、その共進化について定量的に検証した。すなわち、GDPと人口、距離から構成される基本的な重力モデルに、高次ビジネス・サービス企業の集積を表す変数を導入した結果、アジア地域の都市間国際航空旅客流動数・貨物流動量は、高次ビジネス・サービス企業の集積の程度によって最も説明できると同時に、その重要性は経年的に大きくなっていることが明らかとなった。2.【航空ネットワークの評価に関する研究】アムステルダム大学附属SEO Amsterdam Economicsと共同で、アジア主要国際空港における航空ネットワークの多角的な評価に取り組んだ。NetScanモデルによる分析結果からは、中国の空港をはじめ、アジア主要国際空港の航空ネットワークは急速に拡大している一方で、我が国の国際拠点空港は、その航空ネットワークを相対的に縮小させていることが明らかとなった。しかしながら、東京国際空港については、再国際化以降、充実した国内路線と新たに開設された国際路線の接続が実現した結果、その航空ネットワークは急速に拡大していた。3.【航空製造部門と海事製造部門における集積の経済効果に関する研究】我が国の航空製造部門と海事製造部門を分析対象として取り上げ、その集積の経済効果について定量的に検証した。すなわち、資本と労働から構成される基本的なコブ=ダグラス型生産関数に、産業の多様性、地域特化、および地域競争を表す変数を導入した結果、航空製造部門ではJacobs型外部効果の存在が、そして海事製造部門ではMAR型外部効果の存在が示唆された。本年度(平成30年度(2年目))においては、合計10編(有審査英文ジャーナル論文2編(Impact Factor:2.357)、有審査和文ジャーナル論文1編、国際学会プロシーディングス論文5編(うち、フルペーパー審査2編、アブストラクト審査3編)、そして招待論文2編)の論文を対外的に公表した。特に、交通分野で評価の高い国際学術誌への掲載は、本研究成果が国際的にも高く評価された証左であるといえる。以上の理由から、本研究課題の現在までの進捗状況は、「おおむね順調に進展している」と判断した。本年度(平成29年度(1年目))の研究成果を踏まえた上で、まず、次年度(平成30年度(2年目))においては、企業管理機能・輸送産業の集積と集積の経済効果の検証を行い(事例検証)、そして、輸送ハブと都市成長に関する実証分析に取り組む(実証研究)。次に、次々年度(平成31年度(3年目))においては、輸送ハブ形成メカニズムを内生化した学際的モデルの開発に取り組み(理論研究)、最終的には、日本の国際空港・港湾政策に対する戦略的提言(政策提言)を行う予定である。本研究課題を上記の推進方策に従って取り組むために、今後は、特に、オーストラリア人、ベルギー人、そしてオランダ人研究者との綿密な協力関係の下で取り組む予定である。
IL-10の機能制御を目的とした分子標的薬の構築

皮膚癌における悪性度が最も高いとされている悪性黒色腫の新規治療法の開発を目標とし,悪性黒色腫の重篤化に関与しているIL-10を標的としたIL-10デコイを悪性黒色腫選択的に「送達・集積」させる非侵襲的同定法と共に,内包するIL-10デコイの放出を伴った光線力学温熱療法を可能とするDDS製剤としての分子標的薬の構築を行った.皮膚癌における悪性度が最も高いとされている悪性黒色腫の新規治療法の開発を目標とし,悪性黒色腫の重篤化に関与しているIL-10を標的としたIL-10デコイを悪性黒色腫選択的に「送達・集積」させる非侵襲的同定法と共に,内包するIL-10デコイの放出を伴った光線力学温熱療法を可能とするDDS製剤としての分子標的薬の構築を行った.本研究者は,これまでに,皮膚癌における悪性度が最も高いとされている「悪性黒色腫」の治療に有効な分子標的薬の開発を目標としている.これまでに,「悪性黒色腫」の重篤化に関与しているIL-10を標的としたIL-10デコイ(IL-10R1の細胞外領域を抗体の不変領域に融合させたタンパク質分子標的薬)を創出し,その物性と機能を評価してきた.本年度は,IL-10デコイに関するこれまでの研究成果(Cancer Immuno Immunother.(2009)58,1307.,PCT/JP2004/013090,特許第4635255号)を踏まえて,「IL-10活性阻害剤」としての機能に更なる改良を施した.具体的には,悪性黒色腫の縮小と免疫賦活効果が確認されているIL-10デコイの機能を保持したまま,発現・精製の簡便性と生体内での安定性を向上させるため,多角体タンパク質にIL-10を融合させた「多角体IL-10デコイ」を新たに創出した.次に,「多角体IL-10デコイ」が有する物理化学的評価(標的タンパク質であるIL-10との結合特異性,結合速度,結合常数等の算出)を生体分子間相互作用解析装置(BIACORE T-100)によって行った.しかしながら,「多角体IL-10デコイ」の多角体タンパク質部位に由来すると思われる物性により,BIACORE T-100を用いてのIL-10デコイが有する物理化学的評価を得るには至らなかった.次年度は,「多角体IL-10デコイ」が有する物理化学的評価を引き続き検討するとともに,「IL-10活性阻害剤」としての腫瘍組織の縮小化と免疫賦活効果に関する検討を並行して行う.本研究者は,皮膚癌における悪性度が最も高いとされている「悪性黒色腫」の治療に有効な分子標的薬の開発を目標としている.これまでに,「悪性黒色腫」の重篤化に関与している1L-10を標的としたIL-10デコイ(IL-10R1の細胞外領域を抗体の不変領域に融合させたタンパク質分子標的薬)を創出し,その物性と機能を評価すると共に,IL-10デコイに関するこれまでの研究成果(Cancer 1mmuno Immunother.(2009)58,1307.,PCT/JP2004/013090,特許第4635255号)を踏まえて.「IL-10活性阻害剤」としての機能に更なる改良を施してきた.具体的には,悪性黒色腫の縮小と免疫賦活効果が確認されているIL-10デコイの機能を保持したまま,発現・精製の簡便性と生体内での安定性を向上させるため,多角体タンパク質にIL-10を融合させた「多角体IL-10デコイ」を新たに創出した.次に,「多角体IL-10デコイ」が有する物理化学的評価(標的タンパク質であるIL-10との結合特異性.結合速度.結合常数等の算出)を生体分子間相互作用解析装置(BIACORE T-100)によって行うと共に,生化学的評価(標的タンパク質である1L-10との結合特異性,結合強度等の算出)をEuSAアッセイ等により検討している-次年度も引き続き,「多角体置IL-10デコイ」が有する物理化学的,生化学的評価を引き続き検討するとともに,IL-10デコイのドラッグデリバリーシステム(DDS)の構築に取り組む.具体的には,IL-10デコイを悪性黒色腫の組織選択的に「送達・集積」させる"非侵襲的同定法"と共に.内包するIL-10デコイの放出を伴った"光線力学温熱療法"を可能とするDDS製剤の開発とその機能評価を行う.IL-10活性阻害剤」としての腫瘍組織の縮小化と免疫賦活効果に関する検討を並行して行う.本研究者は,皮膚癌における悪性度が最も高いとされている「悪性黒色腫」の治療に有効な分子標的薬の開発を目標としている.これまでに,「悪性黒色腫」の重篤化に関与しているIL-10を標的としたIL-10デコイ(IL-10R1の細胞外領域を抗体の不変領域に融合させたタンパク質分子標的薬)を創出し,その物性と機能を評価すると共に,IL-10デコイに関するこれまでの研究成果(Cancer Immuno Immunother.(2009)58,1307., PCT/JP2004/013090,特許第4635255号)を踏まえて,「IL-10活性阻害剤」としての機能に更なる改良を施してきた.具体的には,悪性黒色腫の縮小と免疫賦活効果が確認されているIL-

10デコイの機能を保持したまま,発現・精製の簡便性と生体内での安定性を向上させるため,多角体タンパク質にIL-10を融合させた「多角体IL-10デコイ」を新たに創出した.次に,「多角体IL-10デコイ」が有する物理化学的評価(標的タンパク質であるIL-10との結合特異性,結合速度,結合常数等の算出)を生体分子間相互作用解析装置(BIACORE T-100)によって行うと共に,生化学的評価(標的タンパク質であるIL-10との結合特異性,結合強度等の算出)をELISAアッセイ等により検討した.さらに,「多角体IL-10デコイ」が有する物理化学的,生化学的評価を引き続き検討するとともに,IL-10デコイのドラッグデリバリーシステム(DDS)の構築に取り組んだ.具体的には,IL-10デコイを悪性黒色腫の組織選択的に「送達・集積」させる“非侵襲的同定法"と共に,内包するIL-10デコイの放出を伴った“光線力学温熱療法"を可能とするDDS製剤の開発とその機能評価を行い,「IL-10活性阻害剤」としての腫瘍組織縮小と免疫賦活効果に関する検討を行った.IL-10デコイの機能に関する基礎的検討(物理化学的,生化学的評価)を進めると共に,応用検討(DDSの構築)を推進することができたから.24年度が最終年度であるため、記入しない。IL-10デコイの物理化学的,生化学的機構評価を終えると共に,DDSの構築に取り組み,分子標的薬としての有用性を確認する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
シンクロトロン放射光を用いたミリ波分光研究

従来の発振管の代わりに波長連続可変なミリ波光源として電子蓄積リング(分子科学研究所所属のUVSOR)から得られる放射光を用いたミリ波分光研究を行った。初年度の昭和63年度はUVSOR施設に設置されている遠赤外分光用装置をミリ波分光用に改良し、放射光が高輝度のミリ波光源であることを実証した。計画の最終年度である平成元年度では、この装置を用いてゲルマニウム(Ge)のミリ波吸収実験を行い、約5cm^-にピ-クを持つ幅広い吸収帯を初めて検出した。本研究によって放射光を用いたミリ波分光研究が世界で初めて実施され、放射光がミリ波分光研究用の新しい光源として有用であることが明らかとされた。今後は、ミリ波領域にのみ固有の感度をもつ高感度ミリ波検出器(例えば、液体ヘリウム3(He^3)で冷却したボロメ-タ-)を採用することにより更に将来の発展が期待できる。シンクロトロン放射光を光源として用いたミリ波分光研究を行った。先ずシンクロトロン放射光がミリ波領域において完全に連続な高輝度光源であることを明らかとするため、分子科学研究所の放射光施設(UVSOR)に既設の分光装置をミリ波用に改良した。次に、その装置を用いて、ミリ波領域の放射光の基本的特性を明らかとするため強度・偏光特性・光強度の蓄積電流依存性等を測定した。これにより、放射光が従来の熱輻射型光源よりもはるかに高輝度性を有するミリ波光源であることを明らかとした。現在、エネルギーにして2.5cm-1(波長4mmの光に相当)以上の領域での分光研究が可能であり、将来は、ミリ波領域のみに固有の感度を持つ検出器を併用することにより更に有効波長域を長波長側に拡張することも可能である。分子科学研究所の放射光施設UVSORから得られるシンクロトロン放射光を後輝度のミリ波光源として用いたミリ波分光研究を行った。先ず、UVSORに既設の分光装置をミリ波分光用に改良し、放射光が高輝度のミリ波光源であることを立証した。(昭和63年度の一般(C)の交付金による成果)。現在、エネルギ-にして2.5cm^<-1>(波長4mmに相当)以上の領域で分光研究が可能となっている。次に、こん装置を用いて半導体であるゲルマニウム(Ge)のミリ波吸収実験を行い、この物質が約5cm^<-1>にピ-クを持つ吸収帯を示すこと明かとした。Geは等極性物質であるので一次の光学フォノン過程が禁止であるので、これまではGeはミリ波領域に吸収を示さないと信じられてきた。本研究では更にミリ波吸収スピクトルの温度依存性を観測することによりこの吸収帯が2音子過程の内の差の過程によるものであることを明かとした。これらによりシンクロトロン放射光を光源とするミリ波分光法を開発するという本研究の目的がほぼ達成されたと思われる。今後は、ミリ波領域にのみ固有の感度を持つ検出器、例えば、液体ヘリウム3(He^3)で冷却したボロメタ-により更に有効波長領域を長波長側に拡張することが望まれる。
ジベレリン受容体解析を目的とした光アフィニティー並びに蛍光標識ジベレリンの合成

1.活性型天然ジベレリンであるGA_4の17位に種々のアルキルジチオールをラジカル付加してスペーサーとし、その末端チオールを利用して蛍光標識部位としてfluorescein骨格を導入、数種の蛍光標識GA_4を合成した。これらについて大麦の半切種子及びアリューロン細胞プロトプラストを用いたα-アミラーゼ生合成誘導活性試験を行い、最も活性の高いものとしてFLGA_4-1を選択した。又、これと並行して、先に合成法を確立した17-ハイドロキシGA_4を原料として光アフィニティー標識GA_4並びに蛍光標識GA_4の合成を検討した。その合成迄には至っていないが、合成中間体のα-アミラーゼ生合成誘導活性試験の結果より、化学的安定性並びに活性の面から、GA_4とスペーサーの接合部はFLGA_4-1のイオウ原子よりも酸素或いは炭素原子の方が優れているとの知見を得た。2.カビの培養により工業的に生産され大量に入手できる天然ジベレリンGA_3をGA_4並びにGA_1誘導体に短工程かつ好収率にて変換する方法を確立した。これにより、原料の量的な確保が可能となり、プローブ分子の合成研究を効率的に進めることができるようになった。又、本変換法の開発過程において、α-ジケトンと酸素の光照射によるエーテルの新酸化反応を見出した。3.大麦種子のアリューロン細胞プロトプラストを1で合成したFLGA_4-1で処理し、その相互作用をセルソーター及びレーザー共焦点顕微鏡を用いて観察、α-アミラーゼ生合成誘導に関わるジベレリン受容体が細胞膜上にあるとの知見を得た。4.光アフィニティー標識GA_4及びGA_1の合成は現在検討中である。以上の結果に加えて、本研究の手法を、近年、植物生長調節物質として注目されているジャスモン酸の受容体機構解明にも拡大すべくその構造活性相関研究を開始した。その過程で、天然ジャスモン酸の定量に有用な重水素標識ジャスモン酸の合成に成功した。
イネ雑種弱勢原因遺伝子ＨＷＣ１とＨＷＣ２の分子相互作用による免疫応答誘導の解明

温帯ジャポニカ品種とペルーの品種Jamaicaの間で見られるイネ雑種弱勢は2つの原因遺伝子HWC1とHWC2の相互作用によって生じる.本研究課題の研究によってHWC1はホモ複合体を形成して転写調節の抑制因子として機能しており,雑種弱勢の原因となるアミノ酸置換はHWC1ホモ複合体形成の親和力を弱め,HWC1の抑制機能を阻害していることを示唆する結果が得られた.この結果からHWC1の抑制機能の欠損が雑種弱勢の引き金となる可能性が示された.雑種弱勢原因遺伝子HWC1と相互作用する因子をYeast Two-Hybrid法を用いて探索し、HWC1タンパク質と結合するタンパク質をコードする遺伝子の候補が17個検出された。そのうち核に存在しHWC1と相互作用する可能性のあるものとしてWD40タンパク質やGTPase活性化タンパク質などが含まれていた.また、HWC1の機能解析のため、Tilling法によりHWC1変異体を選抜したところ、538番目のアミノ酸残基がAlaからThrに置換された変異体(hwc1-A538T)が得られた.この変異体の,草丈は6598cmと個体差が見られ、花粉稔性は70%以下、稔実率は12%42%であった。表現型に幅があったため現段階ではアミノ酸置換と表現型の関連性は不明である。さらにHwc1-1を持つJamaicaにHwc2-1がTos17の挿入により機能を失った日本晴の変異体NC1670を戻し交雑して得られたBC4F2の生育を調査した.播種後30日の草丈ではHwc1-1ホモ型とヘテロ型・hwc1-2ホモ型の間に有意差があったが,播種後163日の草丈では、有意差は見られなかった。これらの結果からHwc1-1が初期生育に負の影響を与えていることが示唆された。一方HWC2と相互作用する因子についてもYeast Two Hybrid法を用いて探索した.その結果,6つの遺伝子が検出された.そのなかには,熱ショックタンパク質やβ-1,3-エンドグルカナーゼといった病害抵抗性に関係するタンパク質が含まれた.また,日本晴とJamaicaの受精卵をγ線照射したことにより得られた雑種弱勢緩和個体の後代とKasalathとの交配を行い,緩和の原因遺伝子のマッピングを試みた.F1では弱勢の緩和を示す個体は現れず, Kasalathの遺伝的背景では緩和遺伝子が働ないと考えられた.温帯ジャポニカ品種とペルーの品種Jamaicaの間で見られるイネ雑種弱勢は2つの原因遺伝子HWC1とHWC2の相互作用によって生じる.本研究課題の研究によってHWC1はホモ複合体を形成して転写調節の抑制因子として機能しており,雑種弱勢の原因となるアミノ酸置換はHWC1ホモ複合体形成の親和力を弱め,HWC1の抑制機能を阻害していることを示唆する結果が得られた.この結果からHWC1の抑制機能の欠損が雑種弱勢の引き金となる可能性が示された.酵母ツーハイブリッド法によってHWC1タンパク質同士が結合することが明らかになり,さらに雑種弱勢を起こす対立遺伝子ではこの親和性は低下することが明らかになった.これらの実験結果より雑種弱勢を引き起こす対立遺伝子ではHWC1が本来持つ機能が低下していると考えられた.また,発現解析においてHwc2-1とHwc1-1の相互作用はHWC1の発現レベルを上昇させ,HWC2の温度応答性を低下させていることが明らかになった.弱勢を生じた雑種においてHWC1の発現レベルが上昇していたということはHWC1が自分自身の発現レベルの維持に関与している可能性を示唆するものであった.さらに,HWC1の機能を解明するためにTilling法により突然変異体の選抜を試み2728系統中26系統で変異を検出した.コード領域で変異がみられたのは6系統で、唯一表現型に変化が見られた1系統では変異をホモ接合で持つものは致死となったので現在,ヘテロ接合体での維持を試みている.HWC1の一過性発現による遺伝子の発現抑制について正しく評価するためにはHWC1に影響を受けず恒常的発現をする内部標準遺伝子を同時に一過性発現する必要がある.そこで,35S以外のプロモーターを検討したところユビキチンプロモーターに連結したGFP遺伝子はHWC1によって抑制を受けないことが判明し,今後はこのレポーター遺伝子を内部標準に用いることが可能となった.また,一過性発現実験によって,HWC1とGFPを融合したタンパク質が核に局在することが確認され,HWC1が核局在性タンパク質であることが判明した.さらに,今年度は酵母ツーハイブリッド法によるHWC1結合タンパク質遺伝子の選抜,弱勢緩和遺伝子の解析,Hwc1-1準同質系統作出に関しても研究を進めた.ペルーの品種Jamaicaと多くの温帯ジャポニカ品種との間に見られる雑種弱勢は,LEUNIG相同遺伝子をコードするHWC1の対立遺伝子Hwc1-1と,NB-LRR遺伝子をコードするHWC2の対立遺伝子Hwc2-1のエピスタティクな相互作用によって生じる.HWC1はコリプレッサーとして知られるGroucho/Tup1遺伝子ファミリーに属しHWC1の日本晴対立遺伝子をイネの葉身で一過性発現するとカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターに連結したレポーター遺伝子(蛍光タンパク質mVenus)の発現を抑制する効果があった.ところが,日本晴とは1つの非同義置換を持つJamaicaのHWC1対立

遺伝子は35Sプロモーター発現抑制効果が低く,日本晴対立遺伝子と共に発現させた場合,35Sプロモーターによる蛍光の抑制効果は打ち消された.この対立遺伝子による相違はイネのユビキチンプロモーターでレポーター遺伝子を発現させた場合には見られず,HWC1による遺伝子発現抑制はプロモーターに対する特異性を持つことが明らかになった.一方,本研究課題において酵母ツーハイブリッド法(Y2H)によりHWC1タンパク質が二量体以上のホモタンパク質複合体を形成する結果が得られた.このHWC1どうしの親和力を酵母ツーハイブリッド法においてガラクトシダーゼの活性として評価したところJamaica対立遺伝子を含む組み合わせでは,日本晴対立遺伝子同士の組み合わせと比較して親和力が3分の2程度であった.HWC1のJamaica対立遺伝子による35Sプロモーター発現抑制効果は日本晴対立遺伝子に比べ低く,親和力の低下はHWC1タンパク質の機能に負の影響を与えていると推察され,HWC1タンパク質の遺伝子発現抑制機能低下が雑種弱勢の誘因となっていると推定される.植物育種学HWC1やHWC2タンパク質と相互作用する因子の候補を見つけることが出来た.しかし,HWC1とHWC2の相互作用の仲立ちをする因子についてはまだ明らかにすることが出来なかった.HWC1の突然変異体を選抜することができたため,今後のHWC1機能解明に期待が持てる.HWC1-1の準同質系統を使ってHWC1-1の表現型の解明を行った.また,準同質系統の戻し交雑も順調に世代を重ねている.弱勢緩和遺伝子についてはマッピングの試みは成功しなかったが,遺伝的背景が重要であることが明らかになった.今年度は実験計画に書かれた実験の多くを実施した.HWC1突然変異体を得る努力は困難であったが,維持可能な変異体を得られる可能性がある.また,酵母ツーハイブリッド法によるHWC1同士の結合やHWC1と結合するタンパク質をコードする遺伝子の選抜については期待通りの成果が得られている.雑種弱勢緩和遺伝子については連鎖解析を実施するために交配を行い,分離世代の育成を進めており,Hwc1-1を持つ日本晴準同質系統の作出もBC4F1まで育成されている.また一方で,HWC2プロモーター領域にHWC1が結合するかどうかを検証するクロマチン免疫沈降法による実験は行わなかった.当初の推定では病害抵抗性遺伝子に相同なNB-LRR遺伝子HWC2の発現レベルが変化して雑種弱勢が生じるというものであったが,実際には雑種弱勢においてもHWC2の発現レベルに変化はなかったため,HWC2プロモーター領域とHWC1の相互作用に関する一連の実験を行う理由が失われた.一方,HWC1については雑種弱勢で発現が上昇するという結果となり,むしろHWC1プロモーター領域をHWC1複合体がどのように活性化するのかを調査することが重要であると考えられた.以上の研究の経緯より平成24年度は着実に研究成果が得られ,今後の発展が期待されると自己評価を行った.Tilling法によって得られたHWC1の突然変異体hwc1-A538Tの表現型を調査するために平成25年度に得た雑種を播種しF1自殖種子を得る.
細胞膜由来ナノフラグメントを用いた新骨誘導材料の開発

顎顔面領域において骨再建、再生は様々な治療における大変重要なことである。既存の治療法では長期にわたる骨再生期間やコスト、治療手技の煩雑さなど、依然解決が必要な問題点が残っている。こういったことから、短期間、安価かつ簡便に骨再生を実現する医用材料の創製が期待されている。我々はこれまで、生体内(マウス大腿骨骨端部)における最初期石灰化過程を生物学的・材料学的に検討してきた。興味深いことに、初期石灰化部位の肥大軟骨細胞の破裂から生じる細胞膜ナノフラグメントから骨形成が開始することを見出した。さらに、培養細胞から単離した細胞膜ナノフラグメントを用いることで、わずか2日で石灰化を誘導することに成功した。このナノフラグメントは安価なだけでなく、早期の骨再生を誘導する骨再生材料としても期待できる。そこで、本研究では、1細胞膜ナノフラグメント作製方法の確立、ならびに2細胞膜ナノフラグメントを用いた骨再生におけるナノフラグメント使用方法の最適化を目指す。初年度では、細胞膜ナノフラグメントの作製・単離法について、いくつかの方法を検討た。単離した細胞膜ナノフラグメントの形態・成分を材料学・分子生物学手法にて確認した上で、ソニケーションによってより微小かつ均一なナノフラグメントサイズが得られることができた。また、新規材料の開発について、これまでいくつかの実験を行ってきたが、条件の最適化やin vivo移植実験などをすすめる。In vivo実験の最適化のため、生体内骨形成をさらに詳細に理解する必要があったため、マウス大腿骨骨端部における初期石灰化を解析し、pHが初期石灰化に大変重要な因子であることが分かった。(Hara ES, et al., J. Mater. Chem. B,2018,6, 6153-6161)。最初の計画通り、細胞膜ナノフラグメントの作成方法を確立した。また、細胞膜ナノフラグメントを核とした新規材料の開発を進めている。市販のリン脂質系材料を用いた新規材料の開発を進める。また、細胞膜由来又は市販のリン脂質系材料のin vivo骨形成能を組織学的に評価する。予定通りより消耗品を安価で購入することができた。次年度、新規材料の開発のための消耗品に応当する。