hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フルオロチミジンを用いた悪性腫瘍に対する放射線・化学療法後のPET診断

悪性腫瘍に対する術前の化学(+放射線)療法の効果判定目的に、18F-FDG(フルオロデオキシグルコース)と18F-FLT(フルオロチミジン)を用いたPET検査を行い、いずれの所見が治療効果を正確に反映しているかを評価した。対象は全13例であり、最終診断により悪性病変の残存32病変、悪性が証明されなかった6病変が確定した。FDG-PETの感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率、正診率は50%,33%,80%,11%,47%、FLT-PETは38%,67%,86%,17%,42%であった。所見の不一致は10病変(26%)に見られ、これらの病変に対しFDG-PETは6例(真陽性4例、真陰性2例)、FLT-PETは4例(真陽性2例、真陰性2例)に正診し、どちらが正しいとは言えなかった。また鑑別診断、病期・再発診断目的で同時期に両検査を施行した13人、29病変の検討では、FDG-PETの感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率、正診率は62%,33%,89%,9%,59%、FLT-PETは50%,100%,100%,19%,50%であった。所見の不一致は9病変(31%)におこり、FDG-PETで5病変(真陽性5例、真陰性0例)、FLT-PETで4病変(真陽性2例、真陰性2例)に対し正診した。これらの結果に基づき、(1)FDG-PETは偽陽性を呈する一方で、FLTは偽陰性となりやすい、(2)所見の乖離が見られた場合にはそれぞれが約半数に対して正診しており、どちらを優先すべきというものではない、(3)FLT-PETの陽性適中率は比較的高く、FLT-PETが陽性なら悪性(残存)病変の可能性が高い、といえる。FLT-PETは良悪性の鑑別、病期・再発診断としては、その感度の低さから信頼性に劣るが、FDGの集積が低い腫瘍では転移巣の検索に使用できる可能性も示唆された。FLTは多目的合成システムを使用していたが、経年による収量の低下(全く反応が進行しないことも含む)が問題となっていたため、反応器から減圧処理にて溶媒を除去するラインおよび各種電磁弁バルブ等を交換した結果、反応収量も3.1±1.4GBqと安定して得られるようになった。機器の更新後は、1週間以内にフルオロデオキシグルコース(FDG)を用いたPET検査を受け、手術が予定されていた10人に対してFLT-PET検査を施行した。これは、臨床で普及しているFDG-PET検査と対比することで、両検査の間でどの程度の所見乖離がおきるか、どちらの精度がより高いのかを検討するためである。症例は食道癌1例、中咽頭癌1例、下咽頭癌1例、肺癌2例、膵癌1例、子宮頚癌2例、卵巣癌1例、腹膜癌1例であった。10人のうち9人に対して手術が施行され病理組織学的診断が得られた。膵癌の1例は化学療法が継続されたため、臨床所見を最終診断とした。画像診断では28病変が疑われ、うち24病変が活動性のある悪性病変、4ヶ所の集積は良性と考えられた。

感度、特異度、正診率、陽性適中率、陰性適中率は、FDG-PETで67%,25%,61%,84%,Il%であり、FLT-PETではそれぞれ50%,75%,54%,92%,20%であった。所見の乖離は7病変(25%)に見られた。うち5例の悪性病変は、FDG-PETでは4例が真陽性だったが、FLT-PETでは1例であった。また良性と考えられた2ヶ所の集積はFDG-PET偽陽性が1例、FLT-PET偽陽性が1例であった。以上の結果から、FLT-PETはFDG-PETと比較して偽陽性が少ない利点はあるものの、偽陰性の可能性があり、治療効果判定時には留意すべきと思われた。また、FLT-PETの陽性適中率は92%で、FLTの集積を認めた場合には活動性のある悪性細胞の存在が疑われる。悪性腫瘍に対する術前の化学療法あるいは放射線化学療法の効果判定目的として、糖代謝の亢進を画像化する18F-FDG(フルオロデオキシグルコース)および核酸代謝の亢進を画像化する18F-FLT(フルオロチミジン)を用いたPET検査を行い、いずれの所見が治療効果を正確に反映しているかを評価した。対象は全12例、内訳は肺癌3例、食道癌2例、膵癌3例、中咽頭癌1例、下咽頭癌1例、子宮頸癌1例、Ewing肉腫1例であり、いずれかの画像で疑われた計33病変について、病理組織学的あるいは臨床経過に基づいて正誤を判定した。最終診断により悪性病変の残存27病変、悪性が証明されなかった6病変が確定したが、FDG-PETでは27病変中14病変、6病変中2病変をそれぞれ真陽性、真陰性と判断できたのに対し、FLT-PETではそれぞれ真陽性11病変、真陰性4病変であり、FDG-PETの感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率、正診率は52%,33%,78%,13%,48%、FLT-PETは41%,67%,85%,20%,45%であった。所見の不一致は9病変(27%)に見られ、これらの病変に対してはFDG5例(真陽性4例)、FLT4例(真陰性3例)が正診できた。これらの結果に基づき、(1)FDGは偽陽性を呈する一方で、FLTは偽陰性となりやすい、(2)相対的に感度が高いFDGでさえ感度は52%と決して高くはない、(3)所見の乖離が見られた場合にはそれぞれが約半数に対して正診しており、どちらを優先すべきというものではない、(4)FLTは陽性適中率が85%と高く、FLTが陽性なら残存病変の可能性が高い、といえる。結論として治療効果判定においては、FLTの陽性所見は信頼に足るがFDGと大差はなく、陰性所見であった場合には偽陰性の可能性に留意すべきと考えられた。
糖尿病網膜症と血液網膜関門のタイト結合

血液脳関門(BBB)と内側血液網膜関門(BRB)は,血管透過性が極めて低く,非常に類似した構造を持ち,調節にも同様な分子機構が働いていると推測される。このような低い血管透過性は,細胞間接着装置のひとつタイト結合のバリア機能によって維持されている.血管内皮細胞のタイト結合は,膜蛋白としてoccludinとclaudin5が知られており,特にoccludinは,他部位の血管に比べBBBやBRBの血管内皮細胞に強く発現していることが知られている.そこで本研究では,occludinの発現が極めて低いラット肺血管内皮細胞(Rat Lung Endothelial cell ; RLE)に,C末端にFLAGを付加したrat occludinを導入し,occludinとタイト結合機能およびアクチン細胞骨格との関係を検討した.Occludin geneを導入し樹立したRLE細胞株では,明らかにoccludin蛋白量が増加し,免疫細胞化学的に細胞接着部位に局在していた.しかしタイト結合機能を示すtransendothelial electric resistance (TER)や,イヌリンやマンニトールの透過性に変化を認めなかった.アクチン細胞骨格を調べるため,EGFP標識wild type RLE (w-RLE)とOccludin導入RLE (o-RLE)をco-cultureし,アクチンの分布を観察した.その結果,w-RLEとw-RLEの接着部位にアクチンの集積を認めないが,o-RLEとo-RLE, o-RLEとw-RLEの接着部位にはアクチンの集積が認められた.逆に,アクチン細胞骨格を破壊すると,occludinは細胞接着部位から消失した.以上から,occludinは,タイト結合のバリア機能の調節より,アクチン細胞骨格とタイト結合を連結する機能を担っていると考えられた.血液脳関門(BBB)と内側血液網膜関門(inner BRB)は,血管透過性が極めて低く,非常に類似した構造を持ち、調節にも同様な分子機構が働いていると推測される。そこでラットの網膜におけるGDNF、NTN及びそれらのレセプターについて、局在を検討し,ブタ大脳皮質毛細血管内皮細胞(PBEC)を用いて,GDNFとneurturin(NTN)の作用を調べた.[結果]2.NTNとPBECのバリアー機能2)CPT-cAMP及びPDE-Iの存在下で10ng/mlのNTN添加群、[考察]糖尿病網膜症をはじめ眼疾患の多くは、inner BRBの破綻し,血管透過性が上昇していることが多い.今回の結果から、GDNFとNTNが脳血管内皮細胞のバリアー機能を高め、網膜のinner BRBを増強することが示され,糖尿病網膜症の網膜浮腫、黄斑浮腫などに対する予防や治療など、臨床応用の可能性が示唆された。このような低い血管透過性は,細胞間接着装置のひとつタイト結合のバリア機能によって維持されている.血管内皮細胞のタイト結合は,膜蛋白としてoccludinとclaudin5が知られており,特にoccludinは,他部位の血管に比べBBBやBRBの血管内皮細胞に強く発現していることが知られている.そこで本研究では,occludinの発現が極めて低いラット肺血管内皮細胞(Rat Lung Endothelial cell ; RLE)に,C末端にFLAGを付加したrat occludinを導入し,occludinとタイト結合機能およびアクチン細胞骨格との関係を検討した.Occludin geneを導入し樹立したRLE細胞株では,明らかにoccludin蛋白量が増加し,免疫細胞化学的に細胞接着部位に局在していた.しかしタイト結合機能を示すtransendothelial electric resistance (TER)や,イヌリンやマンニトールの透過性に変化を認めなかった.アクチン細胞骨格を調べるため,EGFP標識wild type RLE (w-RLE)とOccludin導入RLE (o-RLE)をco-cultureし,アクチンの分布を観察した.その結果,w-RLEとw-RLEの接着部位にアクチンの集積を認めないが,o-RLEとo-RLE, o-RLEとw-RLEの接着部位にはアクチンの集積が認められた.逆に,アクチン細胞骨格を破壊すると,occludinは細胞接着部位から消失した.以上から,occludinは,タイト結合のバリア機能の調節より,アクチン細胞骨格とタイト結合を連結する機能を担っていると考えられた.
シロイヌナズナ生殖茎頂の形態形成の遺伝学的研究

1)シロイヌナズナの抽苔過程のうちa)生殖茎頂の伸長欠損,b)生殖茎頂先端の形態異常,に注目して突然変異体を30株以上単離した。2)検定交配,相互交配して,下記のグループにつき,以下のような突然変異座位を明らかにした。a)生殖茎頂が伸長欠損する変異。b)生殖茎頂の先端が野生型の総状花序ではなく,散房花序様になる変異。er変異以外はすべて本研究で確立した。er変異も従来の唯一の突然変異遺伝子(allele)から脱却して,5突然変異遺伝子を新たに単離することができた。3)各突然変異座位を地図上に位置付けた。4)走査型電子顕微鏡を用いて茎頂部の観察を行なった。すべての変異体で明らかな形態レベルでの差異は検出できなかった。5)植物ホルモンの影響を調べる第一歩として外から添加したホルモンの効果を調べた。すべての変異体で明確な効果は検出できなかった。内在レベルのホルモンの影響を検定するために、遺伝的交配により種々のホルモン形成関連突然変異を導入した。二重変異体作成の途上である。6)acl2座位の詳細な分子地図を作成した。高等多細胞生物の発生・分化機構の理解は、近年の基礎生物学の重要課題である。本研究では、高等植物の個体レベルにおける発生・分化の調節様式を突然変異体の単離・解析と調節遺伝子の単離・解析によって理解することを目的とする。そのために、発生・分化関連突然変異体の単離・解析と遺伝子単離を目指す。シロイヌナズナから発生・分化、特に植物の特徴であるシュート頂における軸性生長に関連した突然変異体単離を目指した。(1)変異源として、EMS、速中性子線、トランスポゾン、T-DNAを利用して、シロイヌナズナから、下記の突然変異体を得た。EMS:多数のacaulis(花序の伸長に欠損)突然変異体、速中性子線:多数のacaulis(花序の伸長に欠損)突然変異体、T-DNA:erecta-様変異体(2)遺伝子解析を行い、acaulis遺伝子を新たに2つ以上同定し、acl3、acl4とした。acl3遺伝子は、遺伝子地図上での位置も決定した。T-DNA挿入変異体は、表現型どおりerecta変異であることが分かりerecta-104変異と命名した。(3)突然変異体の発生学的解析を行なった。acl変異体は何れも、28°Cで培養すると欠損を回復した。短期間28°C処理すると、調べたacl1-2では少なくとも花芽形成時期に28°Cであれば花序伸長することを示した。多くのerecta変異体を解析して、その変異の実態は花序の節間伸長に欠損のあることを同定した。これらの研究を来年度も続け総合して、高等植物の発生・分化を理解するための第一歩とする。1)シロイヌナズナを用いて抽台過程のうち生殖茎頂の形態形成に欠損のある突然変異体単離を目指した。注目する形質は、a)生殖茎頂の伸長欠損、b)生殖茎頂先端の形状の異常、である。その結果、30株以上の突然変異体を単離した。2)検定交配、相互交配を行った。下記のグループにつき、以下の突然変異座位を明らかにした。a)生殖茎頂が伸長欠損する変異b)生殖茎頂の先端が野生型の総状花序ではなく、散房花序様になる変異erecta(er)変異以外はすべて本研究で確立した。erecta(er)変異も従来の単一突然変異遺伝子(allele)から脱して、5突然変異遺伝子を新たに単離することができた。3)各突然変異座位を地図上に位置づけた。4)走査電子顕微鏡を用いて茎頂部の観察を行った。5)植物ホルモンの影響を調べる第一歩として外から添加したホルモン処理の影響を調べた。内在レベルの植物ホルモンの効果を検定するために、遺伝的交配により種々のホルモン形成関連突然変異を形態突然変異体に導入している。二重突然変異体の作成途上であり、結果は、未だ得られなかった。
高齢者用空間的視点取得能力スクリーニング検査の作成と評価

研究目的とした高齢者用空間的視点取得能力スクリーニング検査の開発にあたって、研究代表者が以前考案した乳幼児用の空間認知能力検査課題(顔回転課題;渡部, 2000)をベースに、ノートパソコン上で実施できる検査プログラムキットとして作製した。さらに、臨床的活用を目指して、認知症・脳卒中後遺症群にも適用可能な検査手続きに改めた。これを脳卒中後遺症患者13名と大学生ならびに健常高齢者の各30名に実施し、反応時間パターンと正答率に基づいて認知度レベルを判定するための指標作りとカットオフ値の決定を行った(研究1)。年齢群間の比較から、正答率と視点移動時間が空間認知能力を示す指標として適していることがわかり、これらのカットオフ値を設定した。この結果を参考に、脳卒中後遺症患者群の顔回転課題における認知レベルと後遺症・症状・病巣やリハビリテーション経過との関連を縦断的に観察・分析し、患者の快復度を示す認知的スクリーニング検査としての顔回転課題の有効性について検討した(研究2)。9名の患者に顔回転課題の継続的な実施に協力してもらった。その結果、年齢の若い者ほど術後経過が良好であり、課題得点により大きな上昇が見られた。さらに、リハビリテーションにおいて「前もたれ端座位」が可能となった時点から3週間の間に、運動・認知機能に関して劇的な改善が生じているとする可能性を示すことができた。空間的視点取得能力のスクリーニング検査として必要とされる,基本仕様の策定を行った.まず,検査手続きに関する仕様を定め,これに基づいて検査の実行と結果の記録を行うコンピュータプログラムの作成を専門的知識を要する業者に委託した.また,ノートパソコンだけで検査ができる簡便性が研究目的の1つであったので,タッチパネル搭載のノートパソコン(NEC VersaPro)を購入した。完成した検査機器を用い,児童から高齢者までの健常者6名と脳卒中後遺症群の8名に協力を依頼して,試験的に検査を実施した.なお,患者群の協力依頼にあたり,片木脳神経外科医院の片木良典氏と石川王泰氏に,共同研究者に近い立場として今後とも参画いただくことになった.また、片木良典氏には脳外科医として医学的観点から、石川王泰氏にはリハビリテーションの専門家としての見地から、それぞれ助言を頂く予定である。結果の分析からは、以下のことが明らかとなった.(1)検査の反応指標として、2種類の反応時間が有効であること(2)これらにおける健常の目安はいずれも1秒以内であること(3)臨床的所見と検査から判定された認知レベルとはよく一致することこのことより,今年度試作した検査が,研究目的とする「高齢者用空間的視点取得能力スクリーニング検査」として十分に機能するものであると確信した.同時に,いくつかの課題も明らかとなった。特に,認知症患者等を対象とする場合に,現行の検査手続きでは難しすぎることがわかったので,この点については次年度に向けて,仕様の改訂とコンピュータプログラムの新規作成を進めていくことにする.研究目的とした空間的視点取得能力スクリーニング検査の開発にあたって、研究代表者が以前考案した乳幼児用の空間認知能力検査課題(顔回転課題;渡部,2000)をベースに、認知症・脳卒中後遺症群に適用可能な検査手続きに改め、さらに検査の簡便性を勘案してノートパソコン上で実施できる検査プログラムキットとして作製した。年齢群間の比較から、正答率と視点移動時間が空間認知能力を示す指標として適していることがわかった。さらに、これらのカットオフ値として、それぞれ80%(正答率)と1800ミリセカンド(視点移動時間)を設定することができた。

さらに、リハビリテーションにおいて「前もたれ端座位」が可能となった時点から3週間の間に、運動・認知機能に関して劇的な改善が生じているとする可能性を示すことができた。前年度までに完成した空間的視点取得能力スクリーニング検査の検査結果と、生活の質(QOL)および他の検査指標との関連について明らかにすることが本年度の研究目的であった。健常者においては課題成績が天井効果を示し、明確な繋がりを示せないことがわかっていたため、脳卒中後遺症高齢者のみを対象とし、空間的視点取得能力スクリーニング検査の検査結果と、リハビリテーション現場における代表的な検査指標(改正長谷川式簡易知的機能検定スケール;HDS-Rならびに障害高齢者日常生活自立度;Jランク)、さらに医学的回復度との関連について検討した。研究協力者の支援のもとで、30名の入院・通院患者を対象として諸検査を実施した。その結果、従来の認知検査であるHDS-Rとの間には明確な関連が見られなかった。一方で、Jランクや医学的回復度との間に興味深い関連が見られた。急性期リハビリテーションにおいて実施されるプログラムの一種である「前もたれ端座位」の開始に伴って、認知機能が大きく改善することが示されたのである。認知機能の回復は、前もたれ端座位開始日の約3週間後に顕著となることも示唆された。さらに、重篤な身体障害により座位姿勢を取ることのできない患者にも、この検査は継続的に実施できることもわかった。これらの結果は、開発した新検査が、従来の検査にはない検出力を持つことを意味している。今後は、十分な数のデータで今回の結果を確かめること、身体重症度の極めて高い患者にも適用可能な手法の開発などが課題として残された。本研究は、研究代表者が以前考案した乳幼児用の空間認知能力検査課題(顔回転課題;渡部,2000)をベースに、ノートパソコン上で実施できる高齢者用の空間的視点取得能力スクリーニング検査の開発を目指すものであった。その際、認知症や脳卒中後遺症患者にまで適用範囲を広げることを視野に、検査の簡便化を目指してきた。こうした患者の認知度レベルの低下や障害の程度を知るために、臨床現場では高い信頼性と機能性を期待できる検査が求められているからである。試作した検査の臨床的有効性を検討し、あわせて後遺症・症状・病巣やリハビリテーション経過との関連を観察・分析して、患者の快復度を示す認知的スクリーニング検査としての課題の有効性について縦断的に検討した。9名の患者に1ヶ月間程度の継続的な課題実施に協力してもらったほか、比較群として大学生と健常高齢者各10名のデータも収集した。その結果、患者群において、リハビリテーションにおいて「前もたれ端座位」が可能となった時点から3週間の間に、運動・認知機能に関して劇的な改善が生じているとする可能性を示すことができた。これは、本検査がリハビリテーション・メニューの策定に役立つことを意味している。これらの結果は、国内外の心理学関連諸学会にて発表したほか、論文にまとめて国際誌に投稿した。
中国広東省の消滅の危機に瀕した言語、ショオ語の緊急調査

本年度は、前年度に引き続きショオ語海豊方言の現地調査(二回、合計五週間)を行い、語彙の記述・意味分析および文法の分析を進めた。このほか、映像資料として現地の結婚式の様子をビデオで記録した。これは言語資料としても民俗資料としても非常に貴重なものであり、将来ウェブ上で公表したいと考えている。本年度の成果としては以下の三点が挙げられる。一、民話資料:前年度に現地のショオ語話者と協同してショオ文字を作成したが、このショオ文字とIPAによって記述した民話四篇を、A03班の「論集3』に「〓語海豊方言故事四則」(中国語)として発表した。この民話四篇は、日本での発表以前に現地でプリントの形で配布してみたところ、資料が民話であり、ショオ文字が中国人が慣れ親しんでいるピンインに基づいていることから、ショオ族の子どもたちも喜んで読んでいた。今後はさらに多くの民話をショオ文字によって記録して、ショオ語民話集を出版したいと考えている。二、語彙集:およそ五千語の語彙をショオ文字とIPAにより記述して、京都大学人文科学研究所より『〓語海豊方言基本詞彙集』(中国語)として出版した。三年間をかけ、同じ語彙を複数の人に何度も尋ねることによって、記憶の彼方に消えかけていた語彙を発掘することもあった。本書もショオ文字を用いており、現地のショオ族の人々も参照することができるので、今後のショオ語保存に向けての一助となることが期待される。ショオ語はミャオ・ヤオ諸語に属するとされるが、蓄積されたデータが少ないためにミャオ・ヤオ諸語における位置付けや方言間また近隣の諸言語との関係といった基本的な問題も未だほとんど明らかにされていない。ところが、ショオ語を母語とする話し手の数は、ショオ族の総人口63万人余り(1990年)のうち、わずかに数百人規模と推定され、包括的な記述・保存への取り組みが急務である。筆者は平成12年度に調整班の依頼により、ショオ語の四方言のうち、記述研究の存在しない海豊方言について予備調査を行った。本年度は、この予備調査に基づいて、二回(合計六週間)の現地調査を行い、4000語程度の語彙と300ほどの例文を音声資料・画像資料と共に記録した。これらの資料のうち、例文の一部を整理したものを、A03班の『論集2』に"200basicsentences of She language"として発表している。この論考では、例文を資料として提供したほか、昨年度『論集1』に発表したショオ語海豊方言の音韻体系に修正を加えた。特に、語末子音(-t,-k)を伴う音節の声調は、先行研究では「ピッチが不安定で昇調で発音されることも降調で発音されることもある」とされており、筆者も『論集1』の論考ではそのように処理していたが、本年度の現地調査によると、これは誤りで、語末子音を伴う音節の声調は二系列四声調に分類できることがわかった。これは、おそらく漢語からの借用時期の違いによるもので、いわゆる「文白異読」を成している。この新たな知見については、近い将来に論文として発表する予定である。また、現地のショオ語話者の希望により、協同してショオ語文字案を作成した。現地への還元の試みの一つとして、収集した民話をこの文字で書き記した小冊子をまもなく出版する。ショオ語保存に向けての一助となることが期待される。
分画化歯根膜細胞とのブレンドによる培養骨膜シートの高機能化と新治療法への展開

骨膜片組織培養における幹細胞様未分化細胞の増幅については、幹細胞様培地を用いることで細胞増殖とECMの蓄積亢進による多層化・肥厚化が促進された。このなかで、CD146陽性の周皮細胞様細胞の占める比率が上昇することを明らかにした。これらの細胞は、in vitroでは骨芽細胞への分化誘導に対する応答性が低いが、ヌードマウスに移植すると異所性に骨様組織を形成した。骨膜シートの血管新生に及ぼす影響については、動物移植ならびに鶏卵漿尿膜の実験系で検証した。後者実験系では、骨膜シートによる血管誘導・新生が顕著であることが確認された。さらに、ヒト血管内皮細胞との複合化を試みたが、協調作用は確認されていない。骨膜片組織培養における幹細胞様未分化細胞の増幅については、幹細胞様培地を用いることで、細胞増殖とECMの蓄積亢進による多層化・肥厚化が顕著に促進された。このなかで、CDI46陽性の周皮細胞様細胞の占める比率が上昇することを明らかにした。細胞の濃縮(高密度化)は骨膜中の骨芽細胞層の形態的特徴からも必須なプロセスと理解されることから、これに続く効率的な分化誘導法の確立によって、骨原性の高い移植物に調製できる可能性が見えてきた。また、骨膜シートの血管新生に及ぼす影響については、動物移植ならびに鶏卵漿尿膜(CAM)の実験系で検証中である。特に後者実験系では、骨膜シートによる血管誘導・新生が顕著であることが確認された。さらに、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)との複合化を試みたが、明らかな協調作用はまだ確認されていない。骨芽細胞へ分化誘導した骨膜シートはヌードマウス移植実験系で、血管新生と破骨細胞の誘導効果が顕著であることを発見したが、上記の実験結果や最近の論文から、移植前のin vitroでの分化誘導が中期的なスパンでの骨再生にとって有効かどうか見極めていく必要がある。一方、歯根膜細胞入手の機会が1回しかなく、貴重なサンプルとして増幅し凍結保存した。共培養に先立って、骨膜シートの培養上清の影響を検討したところ、幹細胞様培地の培養上清が歯根膜細胞の増殖を有意に促進することを確認できた。現在、分画化のための基礎情報を得る目的から、表面抗原の解析を行ない、文献的資料と比較検討している。このなかで、CD146陽性細胞の占める比率が上昇することを明らかにした。この細胞は、in vitroでは骨芽細胞への分化誘導に対する応答性が低いが、ヌードマウスに移植すると異所性に骨様組織を形成した。骨膜シートの血管新生に及ぼす影響については、動物移植ならびに鶏卵漿尿膜(CAM)の実験系で検証中である。特に後者の実験系では、骨膜シートによる血管誘導・新生が顕著であることが確認された。さらに、骨膜シートとヒト血管内皮細胞(HUVEC)の複合化について検討中であるが、いれまでのところHUVECが血管を構成する細胞として直接血管新生に関与している証拠は得られていない。また、血管新生自体を協調的に促進しているというデータも得られていない。ヌードマウス移植実験系で、骨芽細胞へ分化誘導した骨膜シートは短期的に血管新生と破骨細胞の誘導効果が顕著であることを確認している。しかし、上記の幹細胞培地での実験結果や最近発表された論文から、移植前のin vitroでの分化誘導が中期的なスパンでの骨再生にとって有効かどうか見極めていく必要がある。

このなかで、CD146陽性の周皮細胞様細胞の占める比率が上昇することを明らかにした。これらの細胞は、in vitroでは骨芽細胞への分化誘導に対する応答性が低いが、ヌードマウスに移植すると異所性に骨様組織を形成した。細胞の濃縮(高密度化)は骨膜中の骨芽細胞層の形態的特徴からも必須なプロセスと理解されることから、これに続く効率的な分化誘導法の確立によって、骨原性の高い移植物に調製できる可能性が見えてきた。また、骨膜シートの血管新生に及ぼす影響については、動物移植ならびに鶏卵漿尿膜(CAM)の実験系で検証中である。特に後者実験系では、骨膜シートによる血管誘導・新生が顕著であることが確認された。さらに、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)との複合化を試みたが、明らかな協調作用はまだ確認されていない。骨芽細胞へ分化誘導した骨膜シートはヌードマウス移植実験系で、血管新生と破骨細胞の誘導効果が顕著であることを発見したが、上記の実験結果や最近の論文から、移植前のin vitroでの分化誘導が中期的なスパンでの骨再生にとって有効かどうか見極めていく必要がある。一方、歯根膜細胞入手の機会が1回しかなく、貴重なサンプルとして増幅し凍結保存した。共培養に先立って、骨膜シートの培養上清の影響を検討したところ、幹細胞様培地の培養上清が歯根膜細胞の増殖を有意に促進することを確認できた。現在、分画化のための基礎情報を得る目的から、表面抗原の解析を行ない、文献的資料と比較検討している。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯周病学26年度が最終年度であるため、記入しない。歯根膜細胞の入手の機会は予定を下回ったため、分画化を実施するところまで進展しなかった。しかし、骨膜細胞に関する実験計画は概ね実施できた。得られたデータは、次年度の研究計画の見直しに有効に活用できる。また、幹細胞用培地で調製した骨膜シートに関する基礎的な研究成果は論文ならびに学会発表という形で情報発信することができた。また、共培養の結果から、期待したような協調作用を示唆するデータを得られていない。しかし、これらのネガティブなデータは、次年度の研究計画の見直しに有効に活用できる。幹細胞用培地で調製した骨膜シートに関する基礎的な研究成果は論文ならびに学会発表という形で情報発信することができた。骨膜細胞と歯根膜細胞の共培養を実施する。この際、骨膜細胞をフィーダー細胞化することも検討する価値があると考えている。動物移植あるいはCAM実験では、細胞を近赤外蛍光色素でラベルして、経時的・非侵襲的トラッキングを行なうとともに、そのエンドボイントでの細胞の局在から、移植細胞が機能・挙動・運命を明らかにしたい。動物移植あるいはCAM実験では、細胞を近赤外蛍光色素でラベルして、経時的・非侵襲的トラッキングを行なうとともに、そのエンドポイントでの細胞の局在から、移植細胞が機能・挙動・運命を明らかにする予定である。試薬と実験動物を主体とする消耗品購入のための物品費と研究成果の発表ならびに最新情報収集のための学会出張のための旅費に使用する計画である。
粉砕及び再結晶化処理を組み合わせた高水熱安定性ナノゼオライト触媒の新規調製法

ゼオライトを粉砕・再結晶化させ、得られたナノゼオライトの触媒特性評価を行った。粉砕操作及び再結晶化操作を最適化させ、ゼオライトの平均粒径を30200nmで自在にサイズをチューニングできる技術を確立させた。特に、粉砕・再結晶化法は申請者のオリジナルの手法であり、これを深化させる試みも行った。さらに、ゼオライトの高耐久化を目的として、合成後の追加処理に着目、ポスト加熱処理によりゼオライトの耐久性を向上させることに成功した。代表的な触媒であるFAU型、MFI型、BEA型、MOR型、CHA型ゼオライトを研究対象とする。26年度は1粉砕操作の原子レベルでの理解及びその結晶化メカニズム解明、2粉砕及び再結晶化操作を組み合わせたゼオライトの微細化及び高結晶性化の同時両立、の2項目の研究を行った。1及び2の研究は次年度以降に行う触媒特性評価の基礎的知見となる。12の内容は密接に相関関係にある。平成26年度は粒径200nm以下で自在にゼオライトの粒径をコントロールできる粉砕及び再結晶化操作を確立した。BEA型は不純物が生成しやすい傾向があったが、合成条件の精密制御により、当該問題もクリアすることができた。代表的な触媒であるFAU型、MFI型、BEA型、MOR型、CHA型ゼオライトを対象として微細化を試みた。特に目標としていた粒径200nm以下で自在にゼオライトの粒径をコントロールできる粉砕及び再結晶化操作法を確立する事に成功した。BEA型は不純物が生成しやすい傾向があったが、合成条件の精密制御により、当該問題もクリアすることができたため、概ね順調に進展していると判断した。本研究では、1粉砕操作の原子レベルでの理解及びその結晶化メカニズム解明、2粉砕及び再結晶化操作を組み合わせたゼオライトの微細化及び高結晶性化の同時両立、3触媒特性評価及び水熱安定性評価、の3項目の研究を行う。1及び2の研究は3の評価・知見により随時フィードバックさせるため、13の内容は密接に相関関係にある。27年度はゼオライトが粉砕操作(圧縮・せん断・熱応力)に対しどのように非晶質化するか、高エネルギーX線回折法・計算機シミュレーション(RMC法)を中心とした各種構造解析法により明らかにした。特に粉砕挙動は原料ゼオライトのSi/Al比及び含水量に強く影響されることが分かっていたため、上記構造解析法によりその詳細を明らかにした。また、対象とするすべてのゼオライトに対し、平成27年度中に平均粒径50nmのナノ粒子を作製する技術を確立させた。すでに一部のゼオライトに対しては水熱安定性評価に移っており、現在実験を継続している。26年度は合成実験を主として行っていたが、27年度はキャラクタリゼーションにも力を入れて行った。対象とするすべてのゼオライトに対して、おおむね順調に研究は進展していると考えている。平成27年度の段階で、研究対象とするゼオライトに対し、50nm程度まで微細化させる技術を確立していた。28年度の初頭にはこの再現実験を行った。FAU型、及びCHA型ゼオライトは再結晶化操作時に不純物相が混入する問題が生じたが、これを防ぐことに成功した。また、水熱耐久試験はFAU、CHA型ゼオライトを中心に行った。200nm程度の平均粒径を有する微細ゼオライトに関してはほぼ目標を達成した。(FAU:780°C10vol%の水蒸気下で15時間の耐久試験後、結晶性85%以上保持)(CHA:800°C10vol%の水蒸気下で5時間の耐久試験後、結晶性90%以上保持)しかし、50nm品に関しては結晶性が保持できないケースも見られた。これは微細粒子を作製するためには大きな力を加えるため、粉砕衝撃によりひずんだ構造が完全に回復しなかったためと考えられる。なお、同様の粉砕再結晶化操作を脱硝触媒として大きな注目を集めているAFX型ゼオライトに対しても行った。その結果、再結晶化操作により他のゼオライト同様、結晶性が回復することを確認した。再結晶化時間を長くすると焼成操作による耐久性が向上することが確認され、これはFAU,CHA型ゼオライトと同様の結果であった。放射光X線を用いた全散乱解析からもこれを裏付ける結果が得られた。すなわち、より微細なCHA、FAU型ゼオライトの水熱耐久性を向上させるためには、不純物相が生成しない条件でぎりぎりまで再結晶化時間を長くすることが必要であると考えられる。当初目標は基本的に達成したと考えているが、今後さらなる再結晶化条件の最適化も同様に必要であるとの結論に達した。

対象とするすべてのゼオライトに対し、平成27年度半ばまでに平均粒径30200nmで自在にサイズをチューニングできる技術を確立させる。平成27年度以降は、平成26年度の実験で見出した知見をもとに触媒特性評価及び水熱安定性評価に焦点をあてる。炭化水素分子のクラッキング、アルキル化、異性化等、ゼオライトの触媒特性評価に用いられる典型的反応により、その特性を確認する予定である。また、水熱安定性評価を通じて、構造欠陥の少ないゼオライトを調製する方法を見出す。さらに、得られたデータをゼオライト調製条件にフィードバックさせ、欠陥制御・高水熱安定性ゼオライト触媒の調製のための最適条件を解明する。28年度が最終年度であるため、記入しない。ゼオライトセラミックス粉体工学当初予定していたゼオライトナノ粒子化実験が長引いてしまい、結果として水熱耐久試験まで行うことができなかった。よって、当該実験に必要な経費を次年度に繰り越すことにした。とはいえ概ね予定通りに研究が進捗しており、新年度明けすぐに実験に取り掛かる予定である。当初ナノ粒子化を予定していたゼオライト種の実験が遅れてしまい、耐久試験などを行うことができなかった。その分の予算を繰り越すことになった。とはいえ、概ね研究は順調に進んでおり、本年度予定していた実験を行うことができる見込みである。水熱耐久試験に必要な備品などの費用として使用する予定である。もともと当年度に使用予定だったものが単純に時期がスライドするだけである。主にゼオライトの水熱耐久性試験に必要な物品費などに充てる予定であり、単純に使用時期がずれ込んだだけで当初予定と大きな違いはない。
血管障害性痴呆の発症機序解明ならびに神経保護機構の検索に関する研究

血管障害性痴呆の原因となる虚血生神経細胞死の発現機序並びにこれに対する保護機構の検索を脳虚血動物モデルおよび初代培養細胞を用いて行った。【スナネズミを用いた脳虚血動物モデルにおける研究】スナネズミの両側総頚動脈を結紮することにより5分間の全脳虚血を負荷した。この処置により海馬CA1領域の錐体細胞は経日的に脱落した。この一過性脳虚血による海馬錐体細胞の脱落は虚血直後にNMDA受容体拮抗薬のMK-801あるいは一酸化窒素合成酵素阻害薬のL-NAMEを投与することにより有意に抑制された。さらに、アデノシンA1受容体作動薬のCHAおよびA2受容体作動薬のCGS-21680の投与によっても錐体細胞の脱落は有意に抑制された。【初代培養細胞を用いた研究】ラット胎児より調製した初代培養大脳皮質ニューロンを用いて虚血生神経細胞死のin vitro実験系を確立した。溶存酸素を窒素置換したグルコース不含Eagle液で初代培養細胞を処置(以下虚血処置)すると処置時間に依存した神経細胞死が発現した。虚血処置により発現する神経細胞死はMK-801、L-NAMEにより有意に抑制された。さらに、アデノシン、CHA、CGS-21680の投与によっても抑制された。アデノシンの神経保護機構を検索した結果、CHAはA1受容体を介して虚血処置中のグルタミン酸遊離を減弱させることにより、CGS-21680はA2受容体を介してPKAを活性化させることより保護作用を発現していた。さらに、虚血処置中の細胞外アデノシン量は有意に増加していた。以上、本研究成果より、虚血生神経細胞死にはグルタミン酸神経系の過剰興奮による一酸化窒素毒性が重要な役割を果たしていることが明らかになった。このような神経毒性に対してアデノシンはA1、A2両受容体を介して神経細胞を保護することが明らかになった。【実験の背景】これまでの研究成績により、虚血性神経細胞死のin vitro実験系(90分間の低酸素・低グルコース処置により誘発される神経細胞死)では、一部はアポトーシス様の神経細胞死であるが、主としてネクローシス様の神経細胞死であることが示唆されている。またアデノシンが神経保護作用を有していることを見いだしている。【研究実施概要】本年度は、虚血性神経細胞死のin vitro実験系を用いて神経保護作用を有する物質の検索を行った。【実験成績】(1)生体内におけるアデノシンのリソースと考えられるアデニンヌクレオチド類の作用を検討した。ATPおよびAMPは神経保護作用を発現したが、ADPには有意な保護作用は観察されなかった。また、ATPおよびAMPの神経保護作用は一部アデノシンA1受容体拮抗薬のcyclopentyltheophyllineにより減弱された.(2)ノルアドレナリン、セロトニン、ヒスタミンおよびアセチルコリンは有意な神経保護作用を発現しなかった。【考察】虚血性神経細胞死は、虚血中に過剰遊離される興奮性アミノ酸のより惹起されるネクローシス様の神経細胞死である。この神経細胞死に対してATP、AMPおよびアデノシンは神経保護作用を有していることが示唆された。またATPおよびAMPの神経保護作用がA1受容体拮抗薬で減弱されることから、アデノシンと同様A1受容体を介して保護作用を発現していると考えられる。

血管障害性痴呆の原因となる虚血生神経細胞死の発現機序並びにこれに対する保護機構の検索を脳虚血動物モデルおよび初代培養細胞を用いて行った。【スナネズミを用いた脳虚血動物モデルにおける研究】スナネズミの両側総頚動脈を結紮することにより5分間の全脳虚血を負荷した。この処置により海馬CA1領域の錐体細胞は経日的に脱落した。この一過性脳虚血による海馬錐体細胞の脱落は虚血直後にNMDA受容体拮抗薬のMK-801あるいは一酸化窒素合成酵素阻害薬のL-NAMEを虚血負荷30分前に腹腔内投与することにより有意に抑制された。さらに、アデノシンA1受容体作動薬のCHAおよびA2受容体作動薬のCGS-21680の前投与によっても錐体細胞の脱落は有意に抑制された。【初代培養細胞を用いた研究】平成14年度に確立した初代培養大脳皮質ニューロンを用いた虚血生神経細胞死のin vitro実験系を用いてアデノシンの作用を検討した。アデノシンは虚血性神経細胞死に対して有意な神経保護作用を発現した。さらにCHA、CGS-21680も虚血性神経細胞死を抑制した。アデノシンの神経保護機構を検索した結果、CHAはA1受容体を介して虚血処置中のグルタミン酸遊離を減弱させることにより、CGS-21680はA2受容体を介してPKAを活性化させることより保護作用を発現していた。さらに、虚血処置中の細胞外アデノシン量は有意に増加しており、虚血処置中にA1受容体拮抗薬のCTPあるいはA2受容体拮抗薬のDMPXを処置することにより神経細胞死は有意に増悪された。以上、本研究成果より、虚血生神経細胞死に対してアデノシンはA1受容体を介したグルタミン酸遊離抑制、A2両受容体-PKA系を介した2つの系により神経細胞を保護することが明らかになった。
高栄養摂取による肥満環境がDNAメチル化などのエピゲノム変動にもたらす影響の解析

がんは遺伝子の病気であると共に環境からの強い影響をうけて起こる疾患である。近年肥満状態は穏やかな慢性炎症というべき環境を形成しており、そこからがんが発生してくる機序が注目されている。そこで本研究では、高栄養培地での培養を行った培養細胞や、高栄養摂取により肥満状態にしたマウスで、DNAメチル化などのエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるかの検証を行った。その結果、培養細胞レベルの実験で高糖質培地/高脂質培地での長期間培養により、その栄養条件によってDNAメチル化状態に変化が起きうることを明らかにした。動物個体レベルでも同様の実験と測定を現在も継続して行っている。がんは遺伝子の病気であると共に、環境からの強い影響をうけて起こる疾患である。近年メタボリック症候群に代表されるような肥満状態は穏やかな慢性炎症というべき環境を形成しており、そこからがんが発生してくる機序が注目されている。慢性炎症状態が惹起する細胞活性化状態だけでは、がん発生の必要条件となる遺伝子の変異頻度はかなり低いと従来考えられてきたが、最近のエピゲノミクス研究では環境変化に応じてDNAメチル化やヒストンの修飾が有意な頻度で起こりうる可能性が示されている。そこで当研究計画では高栄養摂取により肥満状態にしたマウスや、高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、を直接的/実験的に検証することを研究の具体的目的としている。当該年度では栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養することから開始した。実験の基盤と成る低栄養状態培養条件の検討に予想より時間がかかってしまったが、最終的に培養可能な各種の条件を決定し、高栄養条件下でDNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が起こりうるかの検証を現在行っている。各種栄養条件で培養を行った細胞標品は、継代を追って冷凍保存しており、或る程度の継代数をへた時点でまとめてエピジェネティクス解析を行う予定である。解析は発がん原因と成りうる遺伝子変異を惹起可能なメチル化解析を中心に行う事を予定している。本年度では主に糖質(主としてグルコースを利用)と脂質に関して栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養した試料を経時的に採取/保存した。その各標品における全体的DNAメチル化レベルを測定し、栄養条件によってDNAメチル化状態に変化が起きること、そしてその変化パターンが栄養素によって異なることを見出した。また並行して栄養状態が異なる給餌条件下でマウスを長期飼育し、個体レベルでの栄養状態とエピゲノム変化の相関を解析できる実験を施行中である。当研究計画通り、栄養条件の異なる培地で培養を行った培養細胞で、DNAメチル化変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、の検証から開始している。糖質(主としてグルコースを利用)や脂質といった栄養素成分濃度が異なる種々の培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などの長期間培養を行い、その全体的DNAメチル化レベルに関して経時的に変化を測定した。その過程でH26年度には対照標品である低栄養状態培養条件下での培養において細胞が上手く増殖を行えない、といったトラブルがあったものの、最終的には細胞が無事増殖できる各種培養栄養最低条件の決定を行え、その培地を改変した高栄養条件培地での培養下ではDNAメチル化が漸次低減すること、そしてその低減パターンは栄養素の種類によって異なることを見出した。栄養条件の異なった細胞に対してはDNAメチル化状態誘引の引き金になりうるヒストン修飾といったクロマチンレベルでの定量的エピゲノム変化測定(細胞標品蛋白試料ウェスタンブロッティングからの該当ヒストン蛋白種の定量、免疫沈降産物の定量、もしくはクロマチン沈降を用いたDNAからの間接定量)も予定していたが、鍵となるアミノ酸残基修飾特異的なヒストン抗体が海外輸入品で欠品しており、そのため本国での再生産と輸入を待機せざるを得なかった。修飾特異的ヒストン抗体も、ようやくH27年度後半に輸入され入手出来たので、予定に比べ遅れてしまっているクロマチンレベルでのエピゲノム解析を優先した行うことを考えている。

慢性炎症状態が惹起する細胞活性化状態だけでは、がん発生の必要条件となる遺伝子の変異頻度はかなり低いと従来考えられてきたが、最近のエピゲノミクス研究では環境変化に応じてDNAメチル化やヒストンの修飾が有意な頻度で起こりうる可能性が示されている。そこで当研究計画では高栄養摂取により肥満状態にしたマウスや、高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、を直接的/実験的に検証することを研究の具体的目的としている。本年度では、昨年度実施した培養細胞レベルの実験(糖質(主としてグルコースを利用)と脂質に関して栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞を長期間培養、試料を経時的に採取/保存し、その各標品における全体的DNAメチル化レベルを測定する)において、栄養条件によってDNAメチル化状態に変化が起きることを踏まえ、動物個体レベルでも同様の現象が起こりうるかについての実験を行った。培養細胞と同じく栄養状態が異なる給餌(高糖餌、または高脂肪餌条件下)でマウスを長期飼育し、個体レベルでの栄養状態とエピゲノム変化の相関についての解析を行うべく、実験を施行した。特殊な餌の入手と、個体条件に差異が確認出来る迄の飼育時間が予想より長く成ったため、飼育とサンプル採取を行った時点で研究期間が終了してしまったが、今後継続して栄養状態とエピゲノム変化の相関について測定することを予定している。がんは遺伝子の病気であると共に環境からの強い影響をうけて起こる疾患である。近年肥満状態は穏やかな慢性炎症というべき環境を形成しており、そこからがんが発生してくる機序が注目されている。そこで本研究では、高栄養培地での培養を行った培養細胞や、高栄養摂取により肥満状態にしたマウスで、DNAメチル化などのエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるかの検証を行った。その結果、培養細胞レベルの実験で高糖質培地/高脂質培地での長期間培養により、その栄養条件によってDNAメチル化状態に変化が起きうることを明らかにした。動物個体レベルでも同様の実験と測定を現在も継続して行っている。当研究計画ではまず高栄養培地での培養を行った培養細胞で、DNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が発がん過程を説明しうる様な頻度で起こりうるのか、の検証から開始した。栄養濃度の異なる様々な培地で、大腸がん由来の培養細胞や初代培養細胞に比較的近いと考えられる培養細胞などを長期間培養を目指したのだが、実験の基盤と成る低栄養状態培養条件下での培養で細胞が上手く増殖を行わない、等のいくつかのトラブルが発生し、この栄養条件の検討に当初の予想よりも大幅に時間がかかってしまった。試行錯誤の結果、最終的には細胞が無事増殖できる各種培養栄養条件の決定を行う事が出来、高栄養条件下でDNAメチル化やヒストン修飾といったエピゲノム変化が起こりうるかの検証を、予定よりやや遅れてはいるものの、現在行っているところである。各種栄養条件下で培養を行った培養細胞標品は、現在継代を追って冷凍保存しており、或る程度の継代数をへた時点でまとめてエピジェネティクス解析を行う予定である。
ダブルヒト化マウスによる家族性アミロイドポリニューロパチーの病因・病態解析

マウスRbp4遺伝子を完全破壊し、ヒトRBP4遺伝子で置換したマウスの作製に成功した。このマウスを、すでに作製済みのTtr遺伝子のヒト化マウスと交配し、Ttr及びRbp4遺伝子がともにヒト化されたマウスを作製した。このダブルヒト化マウスを用いて、分子生物学的・生化学的解析を行い、予想通りの結果が得られた。家族性アミロイドポリニューロパチーの最適なマウスモデルとして、アミロイド沈着の解析や治療実験への応用が期待される。昨年度までに、(1)マウスRBP遺伝子の完全破壊マウス(Rbp_tm2)の作製、(2)ヒトRBPcDNAが含まれているreplacement vectorの作製、(3)ヒトcDNAの発現に及ぼす影響についての解析に成功した。具体的には、1.マウスRBP遺伝子の完全破壊マウス(Rbp_tm2)の作製(2)Targetedalleleを持つES cloneの単離上記のtargeting vectorをTT2 ES細胞に電気穿孔法にて導入し、ネオマイシン耐性クローンを選別した。その後、ランダム挿入ESクローンを除去したのち、neo probeを用いてサザンプロット解析を行い、予想したサイズのシングルバンドが検出されたESクローンを選択し、最終的には、5'側及び3'側の相同組み換え領域外のprobeを用いてサザンプロット解析を行い、予想したサイズのバンドが検出されたクローンを選択し、Targeted alleleを持つESクローンと判断した。上記のTargeted alleleを持つESクローンを用いて、アグリゲーション法によりキメラマウスを作製した。キメラ率100%のキメラマウスを用いてC57BL/6Jマウスと交配し、子孫から上記と同様にサザンプロット解析によりF1ヘテロマウスを樹立した。ヒトRBP cDNAが含まれているreplacement vectorを作製した。ベクターの構造としては、下記のとおりである。-[loxKMR3]-[human RBP4 cDNA]-[pA]-[Frt]-[PGK-puro]-[Frt]-[loxP]-3.ヒトcDNAの発現に及ぼす影響についての解析ヒト遺伝子の発現に最適のreplacement vectorについて解析を行い、結局PGK promoterが存在し、IRES等をむしろ有さないほうが、ヒト遺伝子の発現を正常に保つ上で重要であることを明らかにした。(1)置換アレルを持つESクローンの単離すでに作製済みの置換ベクター用いて、TT2 ES細胞に電気穿孔法にて導入し、ピュロマイシン耐性クローンを選別した。その後、ランダム挿入ESクローンを除去したのち、最終的には、5'側及び3'側の置換配列領域外の制限酵素を用いてサザンプロット解析を行い、予想したサイズのバンドが検出されたクローンを選択し、置換アレルを持つESクローンと判断した。(2)置換アレルを持つマウスの作製上記の置換アレルを持つESクローンを用いて、アグリゲーション法によりキメラマウスを作製した。Rbp^<hRBP>ヘテロ同士を交配し、PCR法により子孫からホモマウスを選別した。2.TTR遺伝子及びRBP遺伝子がともにヒト化されたヘテロマウス(Rbp^<hRBP>;Ttr^<hVal30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>)の作製(1)Rbp^<hRBP>ホモマウスとTtr^<hVal30>およびTtr^<hMet30>ホモマウスと交配し、子孫から両遺伝子ともに、ヒト化されたヘテロマウス(Rbp^<hRBP>;Ttr^<hVal30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>)を得られた。(2)ヒト化されたホモマウスを得るために、Rbp^<hRBP>;Ttr^<hV30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>ヘテロ同士を交配中である。1.TTR遺伝子及びRBP遺伝子がともにヒト化されたホモマウスの作製2.分子生物学的・生化学的解析(1)RBP遺伝子のみがヒト化されたマウスを用いて、分子生物学的・生化学的解析マウスRbpとヒトRbp両方の遺伝子を持つヘテロマウス(Rbp^<+/hRbp>)と、ヒトRBPのみを持つホモマウス(Rbp^<hRbp/hRbp>)を比較すると、(1)Northern blot法の解析により、肝臓でのヒトRBPのmRNAの発現量は、予想通りホモ(Rbp^<hRbp/hRbp>)はヘテロ(Rbp^<+/hRbp>)の2倍である。(2)Western blot法の解析により、血清でのヒト

RBPのタンパクの発現量は、予想通りホモ(Rbp^hRbp/hRbp>)はヘテロ(Rbp^<+/hRbp>)の2倍である。(3)HPLC法の解析により、血中のレチノールの量は、予想通りホモ(Rbp^<hRbp/hRbp>)はヘテロ(Rbp^<+/hRbp>)の2倍である。(2)TTR遺伝子のみがヒト化されたマウス、TTR遺伝子及びRBP遺伝子がともにヒト化されたマウスを用いて、分子生物学的・生化学的解析