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動脈硬化症におけるプラーク形成と安定化に関わる因子と制御機構に関する研究

本研究では,急性冠症候群の誘発因子としての,粥状動脈硬化症に見られるプラークに着目し,その形成に係わるマクロファージの泡沫化,および安定性に係わるマトリックスタンパク質とその分解酵素(MMP)の産生機構について研究し,以下の成績を得た.1.マクロファージの泡沫化の原因となるコレステロールエステルの産生に,ホスホリパーゼA_2(PLA_2)の活性化が関与することを,酸化低密度リポタンパク質(酸化LDL)で刺激したマウス腹腔マクロファージを用いて明らかにした.また,その活性化は酵素の膜移行の促進によることを,さらにそのサブタイプがIVC型PLA_2であることを,IVA型PLA_2ノックダウン細胞,IVA型PLA_2欠損マウス由来のマクロファージ,およびIVC型PLA_2過剰発現細胞を用いて明らかにした.2.ヒト冠動脈平滑筋細胞を酸化LDLで刺激した時のMMP-1の産生機構を検索した結果,酸化LDLが血小板由来増殖因子(PDGF)受容体を介して下流のextracellular signal-regulated kinase 1/2および転写因子AP-1を活性化する機構を明らかにした.一方,ヒト単球性白血病細胞株から分化させたヒトマクロファージを酸化LDLで刺激した時のMMP-9産生にIVA型PLA_2が関与することを,IVA型PLA_2ノックダウン細胞やIVA型PLA_2欠損マウス由来マクロファージを用いて明らかにした.3.プラークの被膜成分であるフィブロネクチンの産生機構をヒトメサンギウム細胞を用いて検索した.その結果,酸化LDL刺激による産生の一部に活性酸素種と,転写因子SP-1の活性化が関与すること,さらにこの産生がIVA型PLA_2阻害剤や,IVA型PLA_2遺伝子欠損マウスから調製したメサンギウム細胞で著明に低下することを見出し,IVA型PLA_2の関与を明らかにした.本研究では,急性冠症候群の誘発因子としての,粥状動脈硬化症に見られるプラークに着目し,その形成に係わるマクロファージの泡沫化,および安定性に係わるマトリックスタンパク質とその分解酵素(MMP)の産生機構について研究し,以下の成績を得た.1.マクロファージの泡沫化の原因となるコレステロールエステルの産生に,ホスホリパーゼA_2(PLA_2)の活性化が関与することを,酸化低密度リポタンパク質(酸化LDL)で刺激したマウス腹腔マクロファージを用いて明らかにした.また,その活性化は酵素の膜移行の促進によることを,さらにそのサブタイプがIVC型PLA_2であることを,IVA型PLA_2ノックダウン細胞,IVA型PLA_2欠損マウス由来のマクロファージ,およびIVC型PLA_2過剰発現細胞を用いて明らかにした.2.ヒト冠動脈平滑筋細胞を酸化LDLで刺激した時のMMP-1の産生機構を検索した結果,酸化LDLが血小板由来増殖因子(PDGF)受容体を介して下流のextracellular signal-regulated kinase 1/2および転写因子AP-1を活性化する機構を明らかにした.一方,ヒト単球性白血病細胞株から分化させたヒトマクロファージを酸化LDLで刺激した時のMMP-9産生にIVA型PLA_2が関与することを,IVA型PLA_2ノックダウン細胞やIVA型PLA_2欠損マウス由来マクロファージを用いて明らかにした.3.プラークの被膜成分であるフィブロネクチンの産生機構をヒトメサンギウム細胞を用いて検索した.その結果,酸化LDL刺激による産生の一部に活性酸素種と,転写因子SP-1の活性化が関与すること,さらにこの産生がIVA型PLA_2阻害剤や,IVA型PLA_2遺伝子欠損マウスから調製したメサンギウム細胞で著明に低下することを見出し,IVA型PLA_2の関与を明らかにした.当該年度では,プラーク形成の原因としてのマクロファージの泡沫化機構,さらに,プラークの安定性に関わるマトリックスタンパク質の産生,およびその分解をつかさどるmatrix metalloproteinase (MMP)の産生の分子機構を検索し,以下の成績を得た.1)マウス腹腔マクロファージ,およびマクロファージ系RAW264.7細胞を用い,酸化低密度リポタンパク質(酸化LDL)の貪食に伴うコレステロールエステル産生に,細胞質型ホスホリパーゼA_2(cPLA_2)が関与する可能性を検索した.その結果,コレステロールのエステル化に必要な脂肪酸を,酸化LDLの貪食により活性化されたcPLA_2が膜リン脂質から遊離して供給することが示され,プラークの成因の一つであるマクロファージの泡沫化にcPLA_2が関与する機構が明らかになった.2)酸化LDLによるマトリックスタンパク質産生のシグナル伝達機構を解析する一つのアプローチとして,腎メサンギウム細胞におけるフィブロネクチンの産生機構を検索した.その結果,酸化LDLは転写因子のSP-1を介してフィブロネクチンを産生すること,この反応の一部に活性酸素が関与すること,さらに酸化LDL中の脂質酸化物である7-ketocholesterolがこの反応を担うことが明らかになった.3)プラークの不安定化に関与する最も重要な因子であるMMPの産生とその分子機構を,血管平滑筋細胞を酸化LDLで刺激して検索した.その結果,MMPの分子種のうち,MMP-1が著明に発現すること,その産生にextracellular signal-regulated kinase 1/2および転写因子のactivator protein-1が関与することが示された.

さらに詳細なシグナル伝達機構について次年度に検索する.マクロファージの酸化LDLの貧食に伴うコレステロールエステル産生に,細胞質型phospholipase A_2(cPLA_2)の寄与を明らかにしたので,その活性促進機構,および本反応に寄与する酸化LDL中の活性物質の検索を行なった.さらに,プラークの破綻に関わるmatrix metalloproteinase(MMP)の産生機構を血管平滑筋細胞を用いて詳細に検索した.以下に成績を示す.1)マウス腹腔マクロファージを酸化LDLで刺激したときのcPLA_2の活性化機構を検索したところ,酵素の活性や発現量には変化はないが,膜画分申の酵素量が著明に増大した.したがって、刺激によるcPLA_2の細胞質から膜への移行が増大し,水解活性が促進されることが判明した.2)上記1)の活性を引き起こす,酸化LDL中の活性物質を検索した.酸化LDL中に存在することが知られている脂質酸化物を種々検索した結果,13-hydroxyoctadecadienoic acid(13-HODE)がcPLA_2の水解反応を亢進させることを見出し,さらにこの亢進が,13-HODEによるcPLA_2の膜への移行の促進によることを明らかにした.動脈硬化巣の形成に関わるマクロファージの泡沫化や,プラークの安定性に関与する因子の産生に対するphospholipase A_2(PLA_2)の寄与をその分子種を含めて検討し,以下の成績を得た.1.マクロファージの酸化low-density lipoproteins(酸化LDL)の貪食に伴うコレステロールエステル(CE)産生に寄与するPLA_2の分子種を検索するため,IVA型PLA_2をノックダウンさせたマクロファージや,IVA型PLA_2遺伝子欠損マウスのマクロファージを用いて検索した.しかしこれら細胞の酸化LDLによるCE産生に影響は見られなかった.そこで,他の型であるIVC型PLA_2を強制発現させたヒト肝癌由来HepG2細胞を用いたところCE産生は増大したことから,IVC型PLA_2の関与が示唆された.2.酸化LDL刺激によるmatrixmetalloproteinase(MMP)の産生機構を検索する目的で,血管平滑筋細胞でのMMP-1産生を誘起する酸化LDL中の活性物質を検索したところ,4-hydroxynonenalがその産生を誘起することが判明した.また,マクロファージを用いて酸化LDL刺激下でのMMP-9産生の分子機構を検索した結果,IVA型PLA_2が関与することを,IVA型PLA_2ノックダウン細胞やIVA型PLA_2欠損マウス由来マクロファージを用いて明らかにした.3.プラークの被膜を形成するフィブロネクチンの,酸化LDL刺激による産生機構を腎メサンギウム細胞をモデルとして検索した.その結果,酸化LDL刺激によるその産生が,IVA型PLA2阻害剤,およびIVA型PLA_2遺伝子欠損マウスから調製したメサンギウム細胞で,その産生が著明に低下することが判明した.したがって,酸化LDL刺激によるフィブロネクチン産生にIVA型PLA_2が関与することが明らかになった.
1941～1953年の米国軍事経済における中小企業の位置

●研究目的第二次大戦期の戦時経済における中小企業の位置を解明することを目的として、第二次大戦期に存在した中小企業支援機関であるSWPC(Smaller War Plants Corporation;中小戦時工場公社)を分析対象とし、SWPCの創設をめぐる立法過程と運営実態を明らかにしようとした。●研究方法関西大学や国会図書館で入手した、連邦議会における委員会の公聴会記録や、SWPCの報告書を主たる資料として、それらを丹念に読み込み再構築するという研究方法を用いた。●研究成果立法過程の分析では、1941年12月の真珠湾奇襲から42年6月11日のSWPC創設法の成立までの時期を対象として、創設法案の形成と修正をめぐる審議過程を解明した。その結果、連邦政府における中小企業の政治的位置を強化するという政策志向と、戦時動員に中小企業を活用するという政策志向をもった「二重の性格」を持つ機関として、SWPCが創設されたことを明らかにした。また、運営実態の分析では、大企業利害を代表する第2代SWPC議長ジョンソンにより、中小企業が意図しない契約配分形態(大企業体制のもとに中小企業を下請再編する)をSWPCが選択することになった点、第3代SWPC議長マヴェリックの下で、SWPCが戦後の再転換問題へと業務を拡張していった点などを明らかにした。本研究は、国内では直接的な研究対象としてこれまで取り上げられてこなかった、SWPCの実態を解明した上で、SWPCを総合的に評価した点がまず重要な成果である。さらに第二次大戦期の戦時経済において、SWPCの主体的な選択を通じて、中小企業が大企業の下請けという従属的な地位を強制されたという事実を解明した点は、米国軍事経済における中小企業の位置が形成された始点を解明したという意義を持つ。
マルチスケールその場観察によるＦｅ基化合物の新規な超弾性挙動の解明

D03型規則構造を有するFe3Al、Fe3Ga化合物、さらにそれらの擬二元系化合物であるFe3(Al,Ga)では、既存の形状記憶合金とは異なり、転位や双晶の可逆運動による新規の超弾性(擬弾性)が発現することが示唆される。しかしながら、その詳細は未だ不明な点が多い。本研究では、TEM、SEM-EBSP、J-PARC中性子回折といった観察スケールの異なる解析手法をシームレスにつないだ「マルチスケールその場観察」とも呼ぶべき手法を用いて、変形中の結晶構造、結晶方位、転位の運動速度および密度等をその場計測することで、上記D03型Fe基化合物における超弾性の発現機構解明を行った。Fe_3Al、Fe_3GaといったFe基化合物の超弾性挙動について、透過型電子顕微鏡(TEMやSEM-EBSD法といったその場観察法を駆使して、調査を行った。とりわけ、本年度は、Fe_3Al単結晶ならびに多結晶の超弾性挙動をSEM-EBSD法でその場観察することに重点を置いた。その結果、Fe_3Al単結晶では、2つの異なる荷重軸方位で変形してもマルテンサイト変態や双晶変形は生じず、転位の運動のみで変形が生じ、歪量が5%以下である場合、除荷時にほぼ完全な形状回復が生じることが明らかとなった。また、多結晶試料についても同様に調査を行ったところ、結晶粒界にて転位による変形が局在化する様子が観察され、特に微細粒の試料ほどその傾向は強い。このため、微細粒試料は除荷後も歪の回復が困難であった。一方、粒径がミリメートルオーダーの粗大粒試料では、結晶粒界のごく近傍では歪回復が生じないが、それ以外の場所では十分な形状回復が生じた。この知見を活かして、再結晶集合組織を利用した組織制御を行ったところ、多結晶試料であっても巨大な歪回復を生じさせることに成功した。また、Fe_3Al単結晶中の転位運動をTEMにてその場観察したところ、逆位相境界(APB)を引きずった1/4<111>超部分転位の応力負荷時・除荷時における運動を捉えることに成功した。例えば、1/4<111>超部分転位は負荷・除荷に伴って単に往復運動しているわけではなく、除荷中に新たな転位が増殖されたり、ある転位の引きずるAPBを他の転位が消去する様子が観察された。以上のように、Fe_3Al単結晶の超弾性につながる転位運動は従来考えられていたモデルよりもより複雑であることが示唆された。平成25年度は、平成24年度に主な研究対象としたFe3Gaを除き、Fe3AlならびにFe3(Al,Ga)化合物に絞って調査を行った。具体的には、本研究課題で購入したSEM内小型引張試験機を用い、変形中の方位変化をEBSD法でその場観察することで、超弾性挙動の解明を行った。Fe3Al化合物ではD03構造特有の転位の可逆運動に由来した超弾性のみが発現し、その挙動は結晶方位に強く依存する。そこで、これまで実施例のない方位での実験データを追加した。例えば、<001>近傍の荷重軸方位でも超弾性の発現が確認されたが、完全な形状回復は生じなかった。このとき、{112}<111>すべりの活動が確認され、荷重軸が{112}すべり面と<111>すべり方向を結ぶ晶帯上を可逆的に変化する様子が確認された。このような特徴から、Fe3Alでは、転位の可逆運動に由来する超弾性が発現していることが改めて確認された。一方、Fe3AlとFe3Gaの擬二元系であるFe3(Al,Ga)では、転位運動に由来する超弾性に加え、変形双晶の形成・消滅を基調とした超弾性の発現も確認された。特に、D03相に十分規則化したx≧0.6のFe3(Al1-x,Gax)では、低温側にて2.2Tタイプ擬双晶の形成消滅に由来する超弾性の発現が確認された。さらに形状回復率は、温度の低下とともに、全変形量に対する双晶の寄与が増加することで増加した。さらに、擬双晶形成に必要な応力は、xの増加ととともに減少した。その原因について、低xではD03相中に規則ドメイン構造が存在し、変形双晶の形成を規則ドメイン境界が抑制するためと考えられる。このことは、熱処理にて規則ドメインサイズを制御した結晶を用いた実験の結果からも裏付けられている。さらに、応力-歪曲線の解析により2.2Tタイプ擬双晶のエネルギーを見積もることにも成功した。Fe3Al、Fe3GaといったFe基化合物の超弾性挙動について、各種その場観察法を駆使して、調査を行った。とりわけ、平成24年6月に、茨城県東海村にあるJ-PARCの中性子回折装置を用いて変形

その場観察実験を実施した。その結果、Fe-23at%Al単結晶では、7%までの変形中もマルテンサイト変態に由来する回折ピークの出現は認められなかった。さらに、引張変形に伴う格子歪の変化は、応力-歪曲線の傾向と一致していたことから、第二相の形成は考えらない。さらに、回折線の半価幅は応力負荷・除荷に伴い可逆的に変化したが、これは転位の導入と消滅に対応している。また、検出器内の回折ピークの位置から、転位運動特有の結晶回転が生じていることがわかった。以上の知見から、Fe3Al単結晶の超弾性は、転位運動に由来することが明確となった。一方、Fe3Gaでは、組成や熱処理条件の異なる多結晶の変形その場観察実験を実施した。その結果、Fe-2325at%Gaの組成で、いずれの場合も変形中に相変態に由来すると思われるピークがわずかに観察されたが、そのピーク強度はGa濃度や試料の熱処理条件に強く依存した。例えば、溶体化処理を施したFe-23at%Ga合金では、相変態に由来する回折ピークが比較的明瞭に観察された。したがって、同組成付近では、転位運動に加え、マルテンサイト変態が超弾性に関与していると考えられる。一方、Fe3(Al0.2Ga0.8)擬二元系多結晶では、変形中の相変態は確認されなかった。以上のように、Fe3Al、Fe3(Al0.2Ga0.8)合金では、転位運動に由来する超弾性が、Fe3Gaでは転位運動とマルテサイト変態に由来する超弾性が生じていることが示唆された。さらに、その場観察以外にも実験を行い、特に、Fe3Ga多結晶の超弾性に及ぼすGa濃度、変形温度、熱処理条件に関する知見を得ている。各種その場観察法によるFe基化合物の超弾性挙動の解明が本課題の主目的であったが、当初の予定通り、TEM、SEM-EBSD法を利用したその場観察実験で、超弾性挙動に関する新規知見が得られたとともに、その知見を活かして、組織制御によりFe_3Al多結晶の超弾性特性を飛躍的に改善することに成功している。また、得られた知見を、ICOMAT2011をはじめとする国際会議で発表し、大きな反響を頂いた。25年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は震災の影響で実験ができなかったJ-PARCのマシンタイムをH24年6月に確保し、変形中の中性子その場回折実験を行うことができたのが大きい。この実験により、超弾性の発現モードに関する決定的な情報が得られたといえる。特に、Fe3Ga合金において、マルテンサイト型の超弾性が発現する組成ならびに熱処理条件を、今回の研究で確定させることができた。なお、得られた知見の一部は、国際的に権威のある論文誌Materials Transactionsに掲載されている。来年度以降は、震災の影響で使用不能となっていたJ-PARC(茨城県東海村)が復旧し、再び施設利用が可能となるため、その中性子回折装置を用いたその場観察実験を実施し、超弾性変形時の結晶内部の構造、方位をその場観察することで、超弾性挙動の解明に繋げる。また、Fe_3Al合金よりもより複雑な挙動を示すFe3Ga合金の超弾性についてより重点的に調査を行う予定である。平成25年度は最終年度となるが、よりマクロな超弾性挙動を捉えるために、SEM-EBSDを用いた変形その場観察実験を中心に実施したい。Fe3Gaの擬弾性挙動については、かなり把握できたため、残りのFe3Al、Fe3(Al,Ga)合金の超弾性の調査に注力したい。
ハイリスク妊娠症例における胎児中枢神経系機能評価の前方視的検討

九州大学病院産科婦人科ならびに総合周産期母子医療センターで妊娠・分娩管理をおこなう症例のうち、研究への協力の同意を文書でえられたものについてデータ採取を行った。対象症例は母体合併症症例(妊娠高血圧症候群、精神・神経疾患、羊水過多・羊水過少)、胎児異常例(胎児脳形態異常、子宮内胎児発育遅延、胎児心拍数モニター異常)である。妊娠35-38週時に超音波断層装置を用いて胎児の行動を観察し、胎児中枢神経系機能評価を行った。本評価法によって胎児脳機能障害と診断し、出生後画像診断により確定診断した症例が存在した。今後、胎児脳機能評価結果を出生後の神経学的検査結果および画像診断所見と検討し、脳機能障害の不可逆的なものと可逆的なものとを判断できる指標の検討を行っていく。このことにより、新生児の脳障害を減少させることが期待される。また、胎児脳機能評価法が臨床応用可能なものであることを検証するために、検者間、施設間の差がないことを確認していく。本評価法によって子宮内で急性の脳機能障害と診断し、出生後画像診断により確定診断した症例が存在した。その他の症例については、今後出生後の神経学的検査を施行し、評価項目と出生後の神経学的異常に関して検討を行っていく。また、プロトコール運用の組織化のための準備として胎児中枢神経系機能評価法の説明資料をDVD等により作成した。説明資料をもとに本スクリーニングを施行する施設を増やすために資料配布を行っている。今後協力施設をふやすことで、研究の精度を高めるのみならず、プロトコール運用組織を設立する。本評価法によって子宮内で急性の脳機能障害と診断し、出生後画像診断により確定診断した症例が存在し、出生後の神経学的検査あるいは、画像診断所見は胎児機能診断の結果と合致した。また、その他にも脳幹機能障害と診断した症例が存在した。今後出生後の神経学的検査を施行し、評価項目と出生後の神経学的異常に関して検討を行っていく。また、プロトコール運用の組織化のための準備として胎児中枢神経系機能評価法の説明資料を作成し本スクリーニングを施行する施設を増やすために資料配布を行っている。今後協力施設をふやすことで、研究の精度を高めるのみならず、プロトコールの随時改良を行って行く。
近似圧縮アルゴリズムによるテキストデータ処理の高速化

本年度は,文字分類写像の概念に基づく近似圧縮アルゴリズムについて,以下にあげる研究結果が得られた.まず,(1)テキストデータの復元不可能な情報損失について近似誤差の定式化を行ったところ,文字分類写像は,文字種数を減らすときに失われるシャノン情報量を最小にするものであることが明らかになった.このことから,文字分類写像の定式化の方法が妥当であることが明確になった.次に,(2)組合せ最適化問題として定式化した文字分類を用いる近似圧縮について,多項式時間近似アルゴリズムの設計を行う上での文字分類写像を求める問題の計算量を解析した.結果として,この問題の近似は文字照合としてとらえると可能であるが,相異なる二つの文字列の集合を混同しないという問題として考えると,多項式時間では困難な問題となることが明らかになった.さらに,(3)近似文字列照合機械として非帰還性のオートマトンを用いる方法が一般的であるが,その場合,入出力を完全に特定しなければ最小状態のオートマトンを作ることが計算量的に困難であることがわかった.また,(4)具体的な適用分野で必要とされる処理に圧縮したデータが適しているかを検証するために,遺伝子情報処理のシステムのプロトタイピングを行い,エンジニアリング・ワークステーションで計算実験をおこなった.結果として,実験対象が文字分類の概念に適したものであれば,厳密な文字列の区別においても非常に効果的であることがわかった.本年度は,文字分類写像の概念に基づく近似圧縮アルゴリズムについて,以下にあげる研究結果が得られた.まず,(1)テキストデータの復元不可能な情報損失について近似誤差の定式化を行ったところ,文字分類写像は,文字種数を減らすときに失われるシャノン情報量を最小にするものであることが明らかになった.このことから,文字分類写像の定式化の方法が妥当であることが明確になった.次に,(2)組合せ最適化問題として定式化した文字分類を用いる近似圧縮について,多項式時間近似アルゴリズムの設計を行う上での文字分類写像を求める問題の計算量を解析した.結果として,この問題の近似は文字照合としてとらえると可能であるが,相異なる二つの文字列の集合を混同しないという問題として考えると,多項式時間では困難な問題となることが明らかになった.さらに,(3)近似文字列照合機械として非帰還性のオートマトンを用いる方法が一般的であるが,その場合,入出力を完全に特定しなければ最小状態のオートマトンを作ることが計算量的に困難であることがわかった.また,(4)具体的な適用分野で必要とされる処理に圧縮したデータが適しているかを検証するために,遺伝子情報処理のシステムのプロトタイピングを行い,エンジニアリング・ワークステーションで計算実験をおこなった.結果として,実験対象が文字分類の概念に適したものであれば,厳密な文字列の区別においても非常に効果的であることがわかった.
慢性関節リウマチ患者滑膜組織のおけるサブスタンスP受容体mRNAの局在

慢性関節リウマチ(RA)において神経ペプチド、特にサブスタンスP(SP)は、RA罹患関節の関節液中に多量に存在し、血管拡張および血管透過性を亢進させ、滑膜細胞の増殖能や、PGE_2産生、コラゲナーゼの活性化を促進するとされている。しかしRA滑膜組織においてSPの受容体が存在するか否か、またどのような局在を示すかという点は未だ不明である。そこで本年度の研究では、ミクロオートラジオグラムによるin situ hybridization組織化学法を用い、RA患者および変形性膝関節症(OA)患者の滑膜組織におけるSP受容体遺伝子の局在と発現強度を解析した。その結果、SP受容体mRNAの陽性率はRAでは滑膜表層細胞および滑膜深層細胞で80%、血管内皮で62%であったが、リンパ濾胞ではSP受容体mRNAの発現はみられなかった。またOAにおける陽性率は滑膜表層細胞、滑膜深層細胞、血管内皮とも60%であったことよりRAの滑膜細胞では高率にSP受容体遺伝子が発現していることが明らかになった。また陽性細胞における単位面積当たりの平均銀粒子数から比較したSP受容体mRNAの発現強度は、RAの滑膜表層細胞および滑膜深層細胞で80個/100μm^2であるのに対し、RAの血管内皮、OAの滑膜表層細胞、滑膜深層細胞、血管内皮とも20個/100μm^2と有意に低かった。以上からRAの滑膜細胞ではSP受容体遺伝子が高率かつ強度に発現していることが明らかになった。これらの結果はRAにおいてSPがRAの関節炎増悪因子であるという従来の知見を裏付け、SPの主要な標的細胞が滑膜細胞であることを示すだけでなく、RAの滑膜細胞でのSP受容体の発現亢進という遺伝子発現制御機構の異常に起因する可能性が考えられた。今回の結果から亢SP受容体抗体を用いたSP受容体のブロック、およびアンチセンスプローブを用いたSP受容体遺伝子発現抑制による滑膜炎の抑制実験を行うための基礎的データーが得られた。
非干渉型位相・蛍光同時３次元イメージング技術とそのバイオ応用

本年度は,強度輸送方程式に基づく蛍光及び位相の3次元計測を行なうシステムを構築し,蛍光ビーズを用いた原理検証実験と,神経細胞を用いたバイオ応用に適用した。強度輸送方程式に基づく蛍光イメージングでは,通常の落射型フルフィールド蛍光顕微鏡の構成を元に,可変焦点レンズによる焦点距離を変更させて3カ所で蛍光像を取得し,位相分布を求める。バイオ応用では,蛍光タンパク質が導入された細胞や細胞核の大きさが数マイクロメートルから10数マイクロメートルであるため,擬似点光源として考えることができ,伝搬後に広がった光波は空間コヒーレンスを有すると考えられる。強度画像と位相分布から複素振幅分布を再構成し,光波伝搬計算によりフォーカスの合った蛍光再生像を得ることに成功した。位相計測では,He-Neレーザー光及びLED光を用いて透過型配置により透過像を異なる奥行き位置で3枚取得した。強度輸送方程式を用いて位相分布を計測した。蛍光ビーズ及びマイクロレンズアレイを計測物体として用いて測定した。空間的な分布に不均一性が残るものの位相分布を計測することができている。得られた研究成果をまとめ学術論文を投稿する準備を整えている。また4月に国際会議で発表し,研究成果の情報発信に努める。位相計測の応用分野を開拓するために,ディジタルホログラフィによる位相計測を実施した。高速記録可能なイメージセンサを用いて,可聴域を超える周波数の音波分布の記録と再生を行なった。スピーカーを用いた実験により周波数が正しく計測可能であることと,超音波の音声データを再構成することに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,強度輸送方程式に基づく,位相と蛍光の同時イメージングの実現に向けて,実験光学系の設計と構築を行なった。はじめに,強度輸送方程式による位相情報を求めるために,波長632.8 nmのHe-Neレーザー光を光源として用い,物体を移動させることで2つの強度分布を取得し,位相分布を算出した。測定対象として解像度チャートを用いて位相計測を行なった。その結果,位相分布形状を得ることに成功した。今後の研究課題として測定した位相分布の精度を評価する必要があるため,計測結果の比較としてオフアクシフディジタルホログラフィー計測を行う光学系を併設した。強度輸送方程式を用いて位相計測を行う系においては,新規に購入した可変焦点レンズを用いて,物体を移動させることなく,2カ所以上での強度画像を取得し,位相及び蛍光像を取得することを目指す。比較対象として用いるディジタルホログラフィー計測に関しては動的位相計測を行うために,位相変化を計測する実時間ホログラム取得と再生ソフトウェアを構築した。構築した系の応用として物体形状の変化を計測する位相計測と物体の構造変化に伴う音を光学的に計測する実験を行なった。特に,スピーカーを利用した音場計測として毎秒2,000フレームの高速イメージセンサによるホログラム情報の高速記録を行うことにより,音の周波数およびガラスをハンマーで破壊するときの構造変化及び発生音を同時記録するマルチモーダル記録を実現した。11月から研究を開始したため,実験系を構築するための設計及び光学部品の購入を行なった。強度輸送方程式を用いて解像度チャートを用いた原理検証実験として位相計測を行なった。その結果,位相分布形状を得ることに成功しているため,研究の進捗状況としてはおおむね順調としている。強度輸送方程式に基づく,位相及び蛍光の3次元同時イメージングを行なう光学系を構築し,レンズアレイや蛍光ビーズ,細胞を用いた実験を実施する。位相計測の検証として,併設しているディジタルホログラフィーシステムを用いる。
地域営農システムの機能と展開方向に関する研究

本研究で提示した地域営農システムは、集落、旧村単位及び市町村等、一定の拡がりをもった地域で住民合意のもとで担い手を育成し、この担い手を中心にして地域農業を維持発展させる仕組みである。本研究では担い手育成のための合意形成プロセスと土地利用調整主体に関する実態調査を実施し以下のような知見を得た。1)集落を単位とした営農は「土地利用調整機能」と「担い手機能」を併せ持っており、そのどちらに重点がおかれているかによって展開方向も違ってくる。一般的に集落という狭い領域の土地利用調整にはきめ細かい気配りが必要であり、まとめにくい要素も多いが、逆にうまく合意できれは、農地の面的集積や団地的利用が一挙に実現されるというメリットがある。ただし、営農主体という側面でみれば、限られたエリアでの展開でスケールメリットを発揮することができない。2)どのような担い手に地域農業をまかせるのか、その経営規模の設定はどのくらいが適当かを決めるには、地域の土地所有者の現況と将来意向を適切に把握し、地域の営農体制のあり方、中長期の土地利用計画を町、農協、土地改良区、集落組織のパートナーシップで策定していくプロセスが大切である。本年度の調査地区では、土地改良区が担い手育成基盤整備事業や21世紀型水田農業モデルは場整備事業の換地業務と関連して6集落にまたがる受益地の集団的土地利用を実現しているケースが見られた(三重県名賀郡青山町上津地区)。3)地域営農システムを支えるのは、認定農業者等の経営体型農業者だけではなく、生活型農業者(兼業主型、高齢者・年金受給型)の層厚い存在であり、農業生産が継続することにより農業・農林地の多面的機能を維持していくためには、両者の相互信頼と連携が必要条件になっていることなどが明らかになった。4)農業・農地の多面的機能が見直されている一方でも、中山間農業地域や都市的農業地域において遊林農地や耕作放棄状態の農地の解消方策が政策課題になっている。農地所有者の耕作者としてのモラルの希薄化が最大の問題であるが、農地本来の環境維持形成的機能をそのような農家家族では維持できなくなってきていることも事実であり、集落営農システムの確立がその面からも期待されている。(青森県黒石市、千葉県千葉市、長野県長野市)本研究で提示した地域営農システムは、集落、旧村単位及び市町村等、一定の拡がりをもった地域で住民合意のもとで担い手を育成し、この担い手を中心にして地域農業を維持発展させる仕組みである。(青森県黒石市、千葉県千葉市、長野県長野市)本研究で提示した地域営農システムは、集落、旧村単位及び市町村等、一定の拡がりを持った地域で、住民合意のもとで担い手を育成し、この担い手を中心にして地域農業を維持発展させる仕組みである。本年度は、この地域営農システムの組織範囲と内部構造の違いに注目して実態調査を実施し以下のような知見を得た。第一は、一般的に集落という狭い領域の土地利用調整はきめ細かい調整が必要であり、まとめにくい要素も多いが、逆にうまく合意できれば、農地の面的集積や団地的利用が一挙に実現されるというメリットがある。ただし営農主体という側面でみれば、限られたエリアでの展開でスケールメリットを発揮することができない。したがって、集落営農体制は安定兼業農家が多く、専業的担い手の希薄なところで主としては展開している。(新潟県吉川町竹直生産組合)第二は、集落をベースにして展開する営農集団であっても、集落を越えて農地利用集積を図る場合もある。

この場合は広域の土地利用調整が必要であり、JA系統が営農センターを設置し、農地保有合理化法人と連携しながら作業委託や農地貸付希望農家の窓口になり広域調整を図っている。(長野県豊科町)第三は、地域営農システムは、地域の担い手をいかに育成し、成長させることができるかということが重要である。この点ではJAとして独自に「集落営農診断システム」を開発し、集落営農ごとのデーターをコンピュタ-に入力し、営農診断プログラムによる診断結果に基づいて集落営農に対する経営指導システムが確立している事例に大きな示唆を受けた。(石川県松任市)地域営農システムの目的は、集落・市町村等の一定の拡がりをもった地域における住民合意のもとで、土地利用型農業の担い手を育成し、またこの担い手を中心にして地域農業を維持・発展させる仕組みである。本年度は地域農業の担い手をどのようなプロセスで選定し、その担い手に農地利用集積を図るためにどのような手法、仕組みが選択されているのか実態調査を実施した。(1)農業の構造改善を図るためには、関係者自らが問題意識を持って個々の農業経営(生活設計)や地域農業(住みやすさの条件のあり方)の改善の方向を地域的な広がりの中で検討し、合意を形成していく仕組みが必要である。どのような担い手に地域農業をまかせるのか、その経営規模の設定はどのくらいが適当かを決めるには、地域の土地所有者の現況と将来意向を適切に把握し、地域の営農体制のあり方、中長期の土地利用計画を町、農協、土地改良区、集落組織のパートナーシップで策定していくプロセスが大切である(新潟県吉川町、上越市)(2)地域農業の担い手が確認されたら、次はその担い手育成のために農地の利用を集積し規模拡大を図ること、また作業効率をあげるために農地の集団化を図ることであるが、これをどのような仕組み、やり方で進めるかである。福島県猪苗代町では担い手育成事業と農地保有理化事業がセットで取り組まれ、町、農地保有合理法人、土地改良区が連携しながら事業地区の地域営農構想を描き、育成すべき担い手への計画的農地集積が合意されている。兼業農家群の中から土地所有意向結果等により三人のオペレーターを育成し、営農改善組合を設立し集落農業を実施するという計画である。(3)育成すべき担い手を少数の農家(営農団地)に絞り込めない地域もあった。山形県遊佐町は土地利用型農業の中核的担い手は35haの稲作に園芸、畜産をプラスした複合経営が主流で、大規模稲作経営をめざす経営体は少ない。そこで将来の営農体制も地域複合経営におかれ、この体制を支えるために水田の基幹三作業の受託作業の担い手を選定し、その担い手による農作業受託組合が集落を超えて、土地改良事業の工区単位に組織されている。また、オール兼業で担い手の特定できないところでは集落農場体制を全員でささえる構想が提起され、特定農業法人化が合意されている。(新潟県吉川町)本年度は担い手育成のための合意形成プロセスと土地利用調整主体に関する実態調査を実施し以下のような知見を得た。1)集落を単位とした営農は「土地利用調整機能」と「担い手機能」を併せ持っており、そのどちらに重点がおかれているかによって展開方向も違ってくる。
遺伝子欠損マウスを用いた自然突然変異の制御機構の解析

活性酸素はDNAやその前駆体ヌクレオチド中のグアニン塩基を酸化して8-オキソグアニンをつくるが、この酸化塩基はシトシンのみならずアデニンとも対合し得るので、その結果突然変異がひき起こされる。MTH1タンパクは8-オキソdGTPを分解する酵素活性を持っており、これによって8-オキソグアニンがDNA中へ入るのが抑えられ、その結果突然変異や発がんが抑制されると考えられた。それを実証するためにMth1遺伝子を欠くマウスを作出したところ、確かに肺や肝での自然発がんの頻度が野生型マウスより有意に増加していることがわかった。Mth1^<-/->細胞株について6-チオグアニン耐性をマーカーとして自然突然変異の頻度を調べたところ、その値は野生型株の約2倍であった。細胞の突然変異率が2倍に上昇したことで生体内の各種臓器における発がんの頻度が上がることは注目に値する。我々が注目する第2の問題はMTH1タンパクが完全に欠損しても自然突然変異率がせいぜい2倍しか上昇しないという事実である。大腸菌はMth1に対応する遺伝子としてmutTを持っているが、大腸菌mutT^-ミュータントの自然突然変異率は野生型株の約1000倍に上昇することが知られている。これらの事実は哺乳動物はMth1に加えて同様な機能を持つ別の遺伝子を持っていることを示唆する。MutT/MTH1に共通する配列を指標としてcDNAライブラリーを検索した結果、それらと共通する配列を持つ遺伝子を分離することができ、それをMth2と命名した。Mth2の産物は8-オキソdGTPを分解する活性を持っており、さらにMth2遺伝子を大腸菌mutT^-株中で強制発現させるとその自然突然変異率を著しく下げることが明らかとなった。現在Mth2ノックアウトマウスを作製中であり、これが得られた時にはMth1 Mth2二重欠損マウスを作出してその自然発がん率を調べることの意義が大きい。我々は先に大腸菌モデル系を用いて、細胞内で生じる活性酸素によって遺伝子DNAが傷害をうけること、生物はそのような傷害を防ぐ機構をもつことを明かにした。そこで主役を演じる遺伝子mutTのホモログMTH1を哺乳動物より分離し、遺伝子ターゲティングの手法によるその遺伝子を欠くマウスを作製した。MTH1^<-1->マウスは外見上は正常であるが、生後1年6ヶ月で解剖して内部の臓器を調べたところ正常マウスに比し高い頻度で肝や肺に腫瘍がみられることがわかった。一方このマウスの細胞を分離してその自然突然変異頻度を調べると、その値は正常マウス由来の約2.5倍だった。しかしこの値は正常の大腸菌とmutT^-変異菌の差(約200倍)に比し著しく低いので,MTH1タンパクは確かに生体内で自然突然変異の抑制に働いてるが、この他にも同様な機能をもつ酵素が存在することを示唆した。このような酵素のcDNAを分離するため、MTH1欠損マウスよりcDNAライブラリーを作製し、それを大腸菌mutT^-株中で大量発現させることによって同様な機能をもつ遺伝子をスクリーニングした。これまでに異なるDNAをもついくつかのクローンを分離することができたので、これらのクローン中のcDNAの解析を行っている。高等生物はさらにDNAに障害をもつ細胞をアポトーシスによって積極的に排除するメカニズムをもっていると考えられるので、MTH1MLH1二重欠損マウスを作製して検討を行っている。

活性酸素が生物の老化や発がんに関わる可能性についてはこれまでも指摘されてきたが、本研究では活性酸素によるDNA障害を防ぐ酵素系に異常をもつマウスを用いてその遺伝子欠損が自然突然変異や自然発がん、さらに老化にいかなる影響を与えるか明らかにすることを目的としている。昨年度n研究で活性酵素によって生じたDNA合成前駆体dGTPの酸化型(8-oxo-dGTO)を排除する酵素を欠くマウス(MTH1-/-)を樹立することに精巧したので、そのマウスの病態を調べた。その結果このマウスは生後1年6ヵ月の耳点で、肝、肺、胃の各臓器に正常型マウスに比べて明らかに有意に多数のがんをしょう実ことが明らかになった。一方、MTH1-/-細胞について自然突然変異率を調べたところそれは野生型の約2倍であった。このことは突然変異をおこす可能性がある細胞をアポトーシスによって排除する機構があることを示唆しており、それをMTH1-/-MLH1+/-マウスおよび細胞株を用いて検討している。またMTH1タンパクと相同な配列を含むcDNAクローンをマウスおよび突然変異抑制作用を調べている。活性酸素はDNAやその前駆体ヌクレオチド中のグアニン塩基を酸化して8-オキソグアニンをつくるが、この酸化塩基はシトシンのみならずアデニンとも対合し得るので、その結果突然変異がひき起こされる。MTH1タンパクは8-オキソdGTPを分解する酵素活性を持っており、これによって8-オキソグアニンがDNA中へ入るのが抑えられ、その結果突然変異や発がんが抑制されると考えられた。それを実証するためにMth1遺伝子を欠くマウスを作出したところ、確かに肺や肝での自然発がんの頻度が野生型マウスより有意に増加していることがわかった。Mth1^<-/->細胞株について6-チオグアニン耐性をマーカーとして自然突然変異の頻度を調べたところ、その値は野生型株の約2倍であった。細胞の突然変異率が2倍に上昇したことで生体内の各種臓器における発がんの頻度が上がることは注目に値する。我々が注目する第2の問題はMTH1タンパクが完全に欠損しても自然突然変異率がせいぜい2倍しか上昇しないという事実である。大腸菌はMth1に対応する遺伝子としてmutTを持っているが、大腸菌加mutT^-ミュータントの自然突然変異率は野生型株の約1000倍に上昇することが知られている。これらの事実は哺乳動物はMth1に加えて同様な機能を持つ別の遺伝子を持っていることを示唆する。MutT/MTH1に共通する配列を指標としてcDNAライブラリーを検索した結果、それらと共通する配列を持っ遺伝子を分離することができ、それをMth2と命名した。Mth2の産物は8-オキソdGTPを分解する活性を持っており、さらにMth2遺伝子を大腸菌mutT^-株中で強制発現させるとその自然突然変異率を著しく下げることが明らかとなった。現在Mth2ノックアウトマウスを作製中であり、これが得られた時にはMth1 Mth2二重欠損マウスを作出してその自然発がん率を調べることの意義が大きい。
関節リウマチの多様な病態はCaMK II deltaの機能異常でどこまで説明可能か?

滑膜細胞と免疫担当細胞におけるCaMKII・PADIs・シトルリン化・細胞機能異常と関節リウマチ(RA)の病態の関わりを解析した。RA滑膜組織でのPADIs発現には一定の報告がない。今回の実験からは滑膜細胞(滑膜線維芽細胞)にはシトルリン化ペプチド基質はあるもPADIs発現は弱く、周囲の免疫担当細胞との相互作用でin vivoでは滑膜細胞由来の蛋白(ペプチド)がシトルリン化される可能性が考えられた。このシトルリン化されたペプチドが環状シトルリン化ペプチド抗体(抗CCP抗体)産生のソースである可能性も考えられた。免疫担当細胞として重要な制御性T細胞機能の低下はRAの病勢悪化を誘導することも示唆された。しかしながら、この事象がprimaryか(原因)?secondaryか(結果)?に関しては今後の検討が必要である。また、制御性T細胞機能とCaMKIIやPADIsの発現および活性化との関連も今後の研究課題である。臨床的には早期RAにおけるMRI骨髄浮腫と抗CCP抗体の相関を明らかとした。現状では検出が困難なシトルリン化ペプチドに関してはイムノコンプレキソーム解析の手法でアプローチを開始した。PADI4発現をRT-PCRで確認した。ヒト末梢血単核球(PBMC)、ヒト細胞株HL-60でのPADI4発現は確認されるもヒト滑膜線維芽細胞(FLS)でのPADI4発現は認めなかった。シトルリン化蛋白発現もPBMC、HL-60では陽性なるもFLSでは認めなかった。シトルリン化蛋白はヒストン分子量の部位に強く検出された。次にPBMCのCaMKII活性化と蛋白シトルリン化を検討した。CaMKII活性化阻害をchemical inhibitor、KN93で誘導しても蛋白シトルリン化の低下は検出されなかった。In vitro実験結果では有意なCaMKII-蛋白シトルリン化経路が不明確ではあるがヒストンがシトルリン化の大きなターゲット分子であると考えられた。そこで関節リウマチ(RA)患者血清とヒストンの反応性を検討した。ヒストンは非シトルリン化ヒストンとin vitroシトルリン化ヒストンを用い患者血清との反応性は抗ヒトIgG-ELISAで検出した。現在までの結果では、1.抗CCP抗体陽性早期RA患者血清のヒストンに対する反応性は抗CCP抗体陰性早期RA患者血清より高い。2.ヒストンに対する反応性は抗CCP抗体陰性早期RA患者血清と健常人血清には差はない。3.抗CCP抗体陽性早期RA患者血清の一部分はシトルリン化ヒストンに対する反応性がより高いことが分かってきた。すなわちin vitroで検出されるヒストンのシトルリン化は抗CCP抗体陽性RAでは免疫反応を誘発していると考えられた。今後はin vitroでのCaMKII-蛋白シトルリン化経路の確認実験を追加し、細胞種でのCaMKIIアイソフォーム機能とRA患者で検出される事象の関連性を追求したい。前年に引き続いてシトルリン化責任酵素のPADI2とPADI4に注目した。滑膜線維芽細胞での直接的なシトルリン化蛋白発現の評価は困難であり、PADI2およびPADI4 cDNAの遺伝子導入細胞株の確立に着手した。いずれの遺伝子導入もtransientな系では遺伝子導入可能であることは確認した。今後はstableな系を確立し、この細胞株を用いてPADI2、PADI4、蛋白シトルリン化、CaMKIIアイソフォーム発現および活性化の評価を行いたい。ヒトサンプルでは抗リウマチ治療経過でのTregサブセットおよび抗CCP抗体値の推移を検討した。TregサブセットはCD4+CD25+CD127-/low細胞に着目したが、これはこの細胞群には非常に強いFoxp-3発現を認めたからである。健常人コントロールと比較して活動性関節リウマチ(RA)末梢血のCD4+CD25+CD127-/low細胞陽性率は有意に低値で臨床的寛解達成RA群は健常人と有意差はなかった。CRP、ESR、DAS28-ESRなどRA疾患活動性の指標はCD4+CD25+CD127-/low細胞陽性率と逆相関を示し、これら細胞サブセットとRA病態との関連性が強く示唆された。抗CCP抗体価の推移を検討すると、抗体値が高値の症例ではRA画像的重症度の指標である骨髄浮腫の出現頻度が高かった。

これらよりin vivoにおいてもT細胞サブセットおよび抗CCP抗体は疾患活動性と相関してダイナミックに変動すると考えられる。今後はこれらin vivoデータにもCaMKIIアイソフォーム発現を追加し、in vitro、in vivoの両面から、蛋白シトルリン化、CaMKIIアイソフォーム活性化とRA病態の関連性を解析する。シトルリン化責任酵素であるPADI2、PADI4とCaMKIIとの関連についてはPADI2とPADI4のin vitro実験系の確立について解析した。これら遺伝子導入系に加え、リコンビナントPADIs(rPADIs)(rPADI2、rPADI4)で滑膜線維芽細胞抽出蛋白のin vitroシトルリン化を誘導させることができた。このin vitro無細胞実験系を用い、関節リウマチ患者血清が如何なるシトルリン化分子を認識するか?また、CaMKII(各アイソフォーム)はこの候補分子か?を確認することが可能となった。それに加え新たな系での解析を免疫複合体の網羅的な解析:イムノコンプレキソーム解析で着手した。これは患者血清に自己抗原抗体複合物(イムノコンプレックス)が存在すればそこから抗原を同定する手法であるが、すでにいくつかの候補分子が同定された。この手法からも関節リウマチ患者血清が如何なるシトルリン化分子を認識するか?また、CaMKII(各アイソフォーム)はこの候補分子か?の課題にアプローチすることが可能となった。臨床的な局面からは抗CCP抗体と関連するMRI骨髄浮腫と抗CCP抗体価を計時的に解析した。初診時から抗CCP抗体が陽性の早期関節リウマチ患者を2年間にわたりMRI骨髄浮腫と抗CCP抗体価をフォローした場合、抗CCP抗体価が高いとMRI骨髄浮腫が検出されやすいことが明らかとなった。これはPADIs(PADI2、PADI4)↑→抗CCP抗体産生→関節傷害のプロセスを想定させる。これらサンプルを用いて上記の検討を加えると、シトルリン化およびCaMKII活性化の動的変動と関節傷害との相関が明らかとなる。
ザンビア農村部における持続発展教育（ＥＳＤ）の理念による環境教育の実践研究

社会や自然の持続可能性への懸念が高まる中、持続可能な開発のための教育(ESD)が、世界規模で推進されている。ESDのねらいは、持続可能な社会づくりに貢献する市民を育てることにある。この理念をもとに、ザンビア農村部の学校の協力を得て、地域に根差した環境教育プログラムの開発を試みた。その結果、授業案4件、環境に関連した地域知に関する副教材及び環境データからなるだけではなく、これらの要素を地域の生活・自然環境と関連付けて構造化した環境教育プログラムを開発した。1.研究実施に関する国内及び現地関係機関(特定非営利活動法人TICO、教育省、地方教育局及び学校等)からの連携・許可及び協力の取り付け(平成26年6月-11月):研究対象地域(中央州モンボシ地区)で活動している特定非営利活動法人TICO(本部:徳島県吉野川市)と連携に関する覚書を交わした。また、ザンビアの教育省及び同地区を管轄する地方教育局長より研究実施の許可及び承諾を得、研究対象校3校の校長より協力の了解を得た。2.試行授業案の作成及びワークショップの実施(平成25年11月2日11月10日)対象校3校の校長及び教員(計13名)を対象にワークショップを実施した。その内容は1ESDについての説明、2国内開発した水をテーマとするSocial Development Studies(以下「SDS])のモデル授業案の提示、3モデル授業案を参考とした現地教員による授業案作成である。なお授業案は、本実践研究の趣旨との関連が強い教科であるSDSを対象とした。対象校でのSDSの授業観察及び対象校2校のの井戸水の水質検査(大腸菌群を含む)を行った。3.作成したSDS授業案による授業観察及び研究代表者によるモデル授業の実施及び各校の状況把握(平成26年3月1日3月7日)11月のワークショップにおいて作成した授業案による授業実践状況の調査(聞き取り及び授業観察)、さらにモデル授業案による授業を現地児童を対象に各校教員が観察する中で3校において、それぞれ実施した。授業観察後の検討会において授業の改善点などについて協議した。またこれら一連の活動を通して、授業に一定のパターンがあることが明らかとなった。また、授業観察時に学校の状況について調査した。4.23の活動成果を踏まえ、環境教育プログラムの構成及び26年度以降の調査研究スケジュールを作成し、TICO関係者及び研究チームで協議の上成案を得た。平成26年度においては、平成26年6月、9月、11月及び平成27年2月の計4回にわたり、「調査対象校3校の教員を対象としたワークショップの実施」、「授業の提示」、「授業観察」「現地調査」を実施した。ワークショップにおいては、授業の観察方法や観察結果の分析方法などについての助言・指導を行うとともに、「水とくらし」及び「水の循環」などをテーマにした授業案の検討及び環境データ(各学校の井戸水の水質及び周辺の気温)を現地教員に還元した。授業の提示では、「水とくらし」、「水の循環」及び「温度計による気温測定法」をテーマとする授業を、調査対象校3校の教員が参観する中、児童・生徒に対して実施し、授業後検討会を実施した。授業観察では、Social Development Studies (SDS)及びIntegrated Science及び算数の授業を参観した。その結果、SDSの授業について、学校や教員によらない授業構成上の類似性が認められた。このことについては、このことについては、国内、国外での学会で口頭発表するとともに、論文としても発表した。このような調査研究による成果は、3件の水や環境の質を知るための方法をテーマとする授業案が作成されたこと、ほぼ1年間にわたる気温や水質などのデータが蓄積され、順次現地教育関係者にも周知されつつあること、ある樹木に関する地域知が、学校の教育活動を通して収集されたことである。また、調査研究の成果を踏まえつつ、本研究において開発を目指す環境教育プログラムの枠組みが作成され、成果を統合するための基盤が確立された。平成27年度には、平成27年7月、11月及び平成28年2月の計3回現地に渡航した。渡航期間は、移動も含めて計23日である。本年度は、期間の最終年度に当たるため、授業の提示、授業観察及び授業後の検討会の実施など、これまでの活動を継続するとともに、研究成果を取りまとめ、現地の地方教育局(District Education Board)の局長、調査研究協力校の校長及び教員と成果報告書を共有した。なお、共有した成果報告書の概要は、第24回南部アフリカ理科、算数/数学及び技術教育学会第24回年次大会(24th Annual Meeting of Association for Science, Mathematics and Technology Education)(Tshwane University of Technology,プレトリア市、南アフリカ共和国、2016年1月12日1月16日)において口頭発表した。7月渡航時には、「水の循環」についての授業提示を行い、さらに、生徒のノート・テイキングに注目した調査研究も同時に行った。これらの授業実践の概要及び調査研究の結果は、同行した鳴門教育大学大学院生により、修士論文として取りまとめられている。11月渡航時には、樹木の観察をテーマとする授業を提示し、提示後、本授業の構成、実施及び課題等について、調査協力校の教員と協議した。調査研究協力校の中の1校では、校庭に木を植える活動が行われており、このような学校全体の活動に、本授業が貢献できることを期待したい。2月渡航時には、これまでの調査研究の成果を取りまとめて作成した冊子により、各学校で開催したワークショップを通して校長及び教職員と共有した。