hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
YACベクターを用いたヒトHLA抗原遺伝子領域の発生分化に関与する遺伝子の同定

HLA領域に存在する、ヒトの発生、分化に関わる遺伝子を同定する目的で、マウスにおいて初期発生や分化に関係するT1t領域に相当するHLA-DP領域よりセントロメア側の領域と、第9染色体との相同性から発生、分化に関与する遺伝子の存在が予想されたクラスII遺伝子とクラスIII遺伝子間の領域についてcDNAクローンやYACクローンの分離と解析、塩基配列の決定などの解析を行った。まず、HLA遺伝子領域を含むYACクローンを分離し、続いてこれらのYACクローンより作製したコスミドライブラリーより、コスミドコンティグを得た。これらのコスミドクローンより、cDNAクローンの単離、マウスプローブとの相同性、塩基配列の決定などの方法により、計11個の新遺伝子を見いだした。すなわち、HLA-DP遺伝子のセントロメア側250kbの領域に、テロメア側に向かってHSET(キネシン様遺伝子)-HKE2(GTP解離促進因子様遺伝子)-HKE3(リボソームS18サブユニット遺伝子)-HKE6(アルコール脱水素酵素様遺伝子)-HKE4(キニノーゲン様遺伝子)-RXRB(レチノイドXレセプターB遺伝子)-HKE5(機能不明)を、また、HLAクラスII遺伝子とクラスIII遺伝子間領域500kbに、テロメア側に向かってNotch3遺伝子-HOX12-RAGE(グリコシル化蛋白レセプター遺伝子)-TN-X(テネイシン様遺伝子)をそれぞれ同定した。これらの遺伝子のうち、Notch3遺伝子は神経細胞をはじめとする分化、HOX12はホメオボックス遺伝子のひとつ、RXRBはレチノイドの一種のリセプターとして機能する転写調節因子であり、それぞれ発生、分化に関与していると考えられ、ジーンターゲッティングなどによる今後の機能解析や疾患との関連が注目される。ヒト主要組織複合体であるHLA遺伝子群は、自己-非自己の識別に関与し、免疫応答の誘導に深く関わる白血球抗原をコードする多重遺伝子族に属している。我々のグループはすでに、4,000kb中2,200kbをコスミドベクター及び、最近ではYACベクターを用いてクローニングを行っていたが、本年度はHLA-DP遺伝子よりセントロメア側でマウスイノヒ領域に相当し、発生分化に関与すると推定される領域、300kb型並びにクラスII遺伝子とクラスIII遺伝子間領域300kbについて、新たにクローニングを行い、8個の新遺伝子を同定した。このうち、最もセントロメア側に位置する遺伝子は、分裂時の染色体の移動に関与していると考えられる、キネシン様の蛋白をコードしていることが明らかになった。また、クラスII遺伝子とクラスIII遺伝子間領域には、グリコシル化蛋白レセプターをコードする遺伝子も同定され、感受性遺伝子がこの領域にマップされる若年性糖尿病との関連が注目された。この領域には、その他にホメオボックス蛋白のひとつであるPBX3様遺伝子と分化や細胞周期の調節に関与しているint-3様遺伝子が同定され、発生や分化への関与が注目された。このラクスII遺伝子とクラスIII遺伝子間領域はGCrich領域からATrich領域への分節点が存在することでも興味ある領域であり、この領域がクローニングされたことにより、この分節点の詳細な構造やGC対AT比の変化の生物的意義も明かにしうるであろう。発生と分化に関与すると考えられる上記2つの遺伝子に関する機能解析やこの近辺に発症遺伝子がマップされる疾患(ナルコレプシー、強皮症、重症筋無力症など)との関係の検索は現在おこなっている。ヒトとマウスの主要組織適合抗原(MHC)領域の高い相同性に注目して、ヒトHLA領域に位置し、T/t遺伝子に相当する遺伝子を分離するためにHLA-DP遺伝子よりセントロア側の領域、300kbについてcDNAクローニングや塩基配列の決定などの詳細な解析を行い、前年度の結果と併せてこれらの領域に合計7個の新遺伝子を同定した。

このうち、retinoid X receptorの1つであり、また同時にマウスH-2クラスI遺伝子の転写調節因子H-2RIIBPでもある。マウスのRxrbeta遺伝子のヒトのホモログ遺伝子RXRBがヒトでもマウスと同様、HKE4とHKE5遺伝子間に位置することが明らかになった。また、HKE2とHKE3遺伝子については、B細胞由来のcDNAライブラリーにより、cDNAクローンを分離し、塩基配列の解析を行った。その結果、KHE3遺伝子は、40SリボソームタンパクS18をコードしていることが明らかになった。このリボソームタンパクサブユニットは細菌から哺乳動物まで高く保存されており、ヒトではこの領域以外にも、数コピーの遺伝子の存在が示唆された。HKE3遺伝子よりセントロメア側に存在するHKE2遺伝子は,既存の遺伝子とは相同性が認められず、現在のところ機能不明の遺伝子である。一方、HLA-DP遺伝子よりセントロメア側の領域のYACクローン、Y42を再クローニングしたコスミドクローンの解析と前年度までに分離したこの領域のコスミドクローンの解析を併せて、HSETCOL11A2間300kbのコスミドコンテイグを作成した。その結果、この領域のヒトの遺伝子構成はH2-Kと-K2遺伝子が欠落している以外、7個の遺伝子に関しては、マウスのH-2K領域周辺と一致していることが確認された。HLA領域に存在する、ヒトの発生、分化に関わる遺伝子を同定する目的で、HLA-DP領域よりセントロメア側の領域と、クラスII遺伝子とクラスIII遺伝子間の領域についてcDNAクローンやコスミドクローンなどの分離と解析、塩基配列の決定などの解析を行い、前年度までの結果と併せて、これらの領域に合計11個の新遺伝子を同定した。HLA-DP遺伝子よりセントロメア側250kbの領域については、HKE2、HKE4、HKE6のcDNAクローンを分離し、塩基配列の解析を行った。その結果、HKE2遺伝子は、低分子量G蛋白質の活性制御蛋白質である数種のGDSと相同性を示した。また、HKE4遺伝子は、マウスKE4のヒトホモログ遺伝子であり、高分子キニノーゲンを含む種々のhistidine rich proteinと、HKE6遺伝子はマウスKE6のヒトホモログ遺伝子であり、アルコール脱水素酵素や酸化還元酵素とそれぞれ相同性を示した。これらの3遺伝子は、いずれも単一遺伝子であり、これらの遺伝子とその周辺の遺伝的多型性は、EcoRI,Pst I,Hin dIII,BamHI,MspI,TaqIの各制限酵素を用いた限り、見いだされなかった。クラスII遺伝子(DRA)とクラスIII遺伝子(CYP21B)領域間430kbについては、コスミドまたはファージクローンの塩基配列の解析から、TN-X(テネイシン様遺伝子)、グリコシル化蛋白レセプター遺伝子、HOX12遺伝子(ホメオボックス蛋白)、Notch3遺伝子(分化や細胞周期の調節に関与)の4個の遺伝子を見いだした。RAGE遺伝子に関しては、その制御領域およびNotch3遺伝子の3′末端を含む全長約4kbの遺伝子の塩基配列を得た。現在、HOX12遺伝子の構造とその制御領域について解析中である。
ハッブル深撮像探査とすばる広領域探査で探る宇宙再電離と初期の銀河形成

本研究では、ハッブル宇宙望遠鏡を用いて観測されるプロジェクトである"Hubble Frontier Fields"のデータから、宇宙再電離期の星形成銀河を調べた。Hubble Frontier Fieldsは6つの銀河団領域を撮像するプロジェクトであり、2016年10月にすべての観測が完了した。本研究は6つの銀河団データすべてを用いた研究として世界に先駆けて論文の発表を行ったものである。ハッブル宇宙望遠鏡の高感度な撮像と銀河団の重力レンズ効果を組み合わせることにより、本研究では赤方偏移6-10の星形成銀河の紫外線光度関数を絶対等級-14等まで見積もることに成功した。紫外線光度関数の暗い側の傾きは-2ほどで、低赤方偏移に比べ非常に小さい値を示した。これは、宇宙再電離期に暗い銀河の個数が明るい銀河に比べ非常に大きかったことを意味する。紫外線光度関数は高赤方偏移に向かって緩やかに減少するが、赤方偏移9ほどでも電離源となる星形成銀河が豊富に存在することがわかった。紫外線光度関数の赤方偏移進化をPlanckによって得られたトムソン散乱の光学的厚みの最新の結果と比較したところ、電離光子脱出率などのパラメータを適切な値に仮定することにより、両者の結果はよく一致することがわかった。このことから、宇宙再電離は星形成銀河からの紫外線の寄与のみにより説明できる可能性があることが示唆された。この結果から、宇宙再電離期の持続期間Δzなどの宇宙再電離に関するパラメータに新たに制限を与えた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
凝集誘発発光物質を利用した高輝度蛍光ビーズの開発とウイルスの高感度検出への応用

【蛍光ビーズの表面修飾と抗体結合】凝集誘起発光化合物を内包した高輝度蛍光ビーズをコアとして、ビーズ表面にカルボキシル基が修飾されるようにコアシェル重合を行った。縮合反応により、抗体へ高輝度蛍光ビーズを結合させた。【市販イムノクロマトキットとの比較】抗インフルエンザ抗体および抗hcg抗体を付けた高輝度蛍光ビーズを標識化抗体に用いて、イムノクロマトキット作成をセットアップ企業に依頼した。作成したキットを用いて、インフルエンザおよびhcg検出試験を行ったところ、いずれも市販のキットに比べ、10倍の高感度化を達成した。検出試験終了後、キット内部を調査したところ、高輝度蛍光ビーズがメンブレン上で目詰まりしていつ部分があった。これは、サンプルパッド、コンジュゲーションパッドおよびメンブレンとの物理的な非特異吸着が原因と考えられる。当初の予定どおり、高輝度蛍光ビーズを使ったイムノクロマトキットの試作品を作成し、市販のイムノクロマトキットと比べて、ある程度の優位性を検証することができたため。研究実績状況に記載したとおり、キット内部での物理的な非特異吸着が原因で感度を低下させていると考えられる。現在の高輝度蛍光ビーズの表面を加工して非特異吸着しないようにすれば、目詰まりせず、テストラインまでより多くの標識化抗体を運ぶことが可能になるため、より高感度化が見込むことができる。
対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭のケアガイドライン開発

対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭の支援とは子どもと家族が直面している体験を理解した上で、子どもと家族との《援助関係を(の)形成》し、子どもと家族が学校生活や地域の中でその人らしく生活していくことができるよう、子どもと家族の生きる力を支える《支援》を行うことである。他職種との連携を推進する上でコーディネーターの役割を担う養護教諭は、「開かれた専門性」をもつ専門職者として子どもと家族がエンパワーメントできるよう支援していくことが重要である。「生きる力」とは、自らの力を「できる」と信じ、「その人らしく主体的に生きること」である。子どもと家族がエンパワーメントできるように支えることが「生きる力」への支援になると考える。【研究課題】対人関係の形成が困難な子どもと家族に対して支援をしている養護教諭の姿勢や臨床判断、ケア行動を明らかにする。発達障害や不登校など対人関係の形成が困難な状況にある子どもと家族に関する既存の研究や論説等から子どもを含む家族を支援するケア行動を抽出した。【成果】援助関係の形成(家族とのパートナーシップの形成、家族の価値観の尊重、家族の強みの強化等)を基盤としながら家族の体験(ニーズ、情緒的反応の把握等)を理解し支援行動をとっている。1.家族の日常生活、セルフケアの強化:(1)子どもの個別指導への保護者の参画支援(2)子どもに対して最善のかかわりを行っていること、誠実な対応を家族に見せる、伝える(3)家族がリラックスできる時間や余裕がもてるようにする。2.情緒的支援の提供:(1)心の揺れを理解し、家族の体験世界に関心をもつ。温かく見まもり、潜在的要請に機敏に応える(2)聞きたいことが聞ける雰囲気づくりをする(添う、保証する、認める、看護る、つながる)(3)肯定的関心を示す(ねぎらいの声かけ)。3.家族教育:(1)ソーシャルスキル教育(2)知識・情報の提供(支援方針や養育の仕方、必要な医療機関へのアクセス方法、子どものかかわり方のモデリング等)(3)子どもの日常を平易に伝える。4.対処行動の調整や対処能力の強化:(1)子どもの良い点を話す(2)家族のストレスマネジメントの支援。5.家族関係の調整・強化、コミュニケーションの活性化:(1)母子相互作用促進の予防的介入(子どもと母親の情緒を最大限に促進する、子どもの発達に対する親の期待を保証する、母子の信頼感を促進する)(2)親子相互作用・愛着形成の促進(子どもから母親へのメッセージの通訳、母親から子どもへのメッセージの与え方の助言)。6.役割調整:両親が協力して養育に取り組むことができるよう助言する。7.地域社会資源の活用:(1)タイムリーな情報提供、活用への助言(サポートグループ、関係機関)(2)ネットワークの強化【研究課題】発達障害や不登校など対人関係の形成が困難な状況にある子どもと家族に関する既存の研究や論説等から抽出された子どもを含む家族を支援するケア行動をもとに、「対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭のケアモデル」(試案)の検討、作成を行う。【成果】「対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭のケアモデル」の作成にあたって以下の視点が導かれた。(1)対人関係の形成が困難な状況にある子どもと家族の体験の理解;「対人関係の形成が困難な状況の背景の理解」「状況の捉えの把握」「情緒的反応の理解」「ニーズの把握」「対人関係の形成困難による影響(生活、関係性、発達等への影響)」(2)子どもと家族との援助関係の形成;「家族とのパートナーシップの形成(中立性の維持)「子ども家族の全体像の把握」「健康的な側面の把握・強化」「迅速な対応」「組織としての対応」「子どもと家族の主体性の尊重」「子どもと家族の意思決定の尊重」「子どもと家族の権利の擁護」「子どもと家族の価値観・家族らしさの尊重」「養護教諭自身の価値観や先入観の自己洞察」(3)子どもと家族のアセスメント;「家族構成・発達段階」「家族内の人間関係・情緒的関係・コミュニケーション」「家族対処行動や対処能力」「家族の適応力、問題解決力」「地域社会との関係、家族の資源」「家族の価値槻」「家族の期待・希望」「家族のセルフケアカ」(4)家族への支援:「情緒的支援の提供:揺れの受けとめ・思いの表出の促し・セルフエスティームの強化・安楽の提供」「家族教育:共感性スキルの強化・アサーティブコミュニケーションスキルの強化・ポジティブ思考スキルの強化」「コミュニケーションの活性化;感受性の強化、を高める支援・認め合うことへの支援

・関係性の確信への支援」「家族の対処行動・能力の強化:ストレとマネジメントスキルの強化」「地域社会資源の活用」「家族のセルフケアの強化:正常な家族生活の維持」【研究課題】既存の文献やこれまでの研究結果をふまえて発達障害や不登校など対人関係の形成が困難な状況にある子どもと家族を支援するケア行動を明らかにし、導かれた結果をもとに『対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭のケアガイドライン(案)』を作成し、評価をもとにさらに洗練化し、最終版のケアモデルを導いた。【成果】家族看護エンパワーメントモデルをもとに対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支えるための効果的な支援を導いた。すなわち対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教論の支援とは子どもと家族が直面している体験を理解した上で、子どもと家族との《援助関係を(の)形成》し、子どもと家族が学校生活や地域の中でその人らしく生活していくことができるよう、子どもと家族の生きる力を支える《支援》を行うことである。子どもと家族との《援助関係の形成》には、〈子どもと家族の尊厳を守り権利を擁護する〉、〈子どもと家族の主体性を尊重する〉、〈関係者とつながり子どもと家族の全体像を描く〉、〈関係を育む〉、〈自己の価値観や先入観を洞察する〉、(健康的な側面を把握し強化する)、〈学校組織でかかわる〉が含まれる。養護教諭は、これらの姿勢をもって子どもと家族との援助関係、すなわちパートナーシップを形成し、支援行動の基盤としている。そして、《介護キャリアの基盤を支える看護》には、〈家族の日常生活・セルフケアの強化〉、〈情緒的支援の提供〉、〈家族教育〉、〈家族の対処行動・能力の強化〉、〈家族関係の調整・強化、コミュニケーションの活性化〉、〈連携の強化〉、(家族の発達課題の達成への支援〉、〈子どもと家族の意思決定の尊重〉が含まれる。すなわち、養護教諭は、子どもと家族が自らの子どもらしさや家族らしさを保持しながら健康的な日常生活を営むことができるよう〈家族の日常生活・セルフケアの強化〉を図る。そしてカウンセリング力を生かしながら計画的に家族と面接を行い、心の安定、セルフエスティームを支え〈情緒的支援の提供〉を行う。家族と協働しながら、共感性スキルやコミュニケーションスキル・ポジティブ思考スキルを強化するなど対人関係に関わるスキルを獲得できるよう〈家族教育〉を行う。さらにストレスマネジメントスキルの強化などの〈家族の対処行動・能力の強化〉や認め合い、関係性の確立を図るよう〈関係性の強化〉を図るよう支援する。また自らの限界を認議し学校組織、他の関連機関とのつながりをもち、コーディネートしながら家族自身の〈連携の強化〉を図る。家族の発達段階を捉えその〈発達課題達成を(への)支援〉しつつ、常に子どもと家族の〈意思決定を(の)尊重〉し、意思決定の歩みに添った支援を行う。以上の結果から、『対人関係形成が困難な子どもと家族の生きる力を支える養護教諭のケアガイドライン』最終版を作成した。
RTNS-核融合中性子被照射材料の欠陥構造と機械的性質の研究

本研究は米国ローレンスリバモア国立研究所の回転ターゲット強力核融合中性子源RTNS-【II】を用いた5ヶ年計画の研究の一主要部分である。東北大学金属材料研究所附属材料試験炉利用施設(大洗)に特設された高分解能電子顕微鏡と各種微小試験片機械試験装置を用いて実験研究を進めてきたもので、昭和60年度中に14人の研究者が延34回,延198日間同施設に赴き出張実験を行った。この内全体の50%が電子顕微鏡による構造変化の観察、30%が機械的性質変化測定、20%が米国よりの返送試料の分類整理にあてられた。昭和59年末に開催された第一回核融合炉材料国際会議での報告は独立した8編の論文として本年度中にJournal of Nuclear Mate-rialsに印刷出版された。また昭和61年度初頭に開催される第2回核融合炉材料国際会議には19編の論文の発表が予定されている。公表論文の内容は多岐にわたるためキーワード的に列挙する。D-T核融合中性子照射によって発生する構造欠陥の種類と量をきめる要因の分析、カスケード損傷後の点欠陥過程を明らかにする低温照射低温観察の実行、高温照射によるカスケード損傷からのボイドの直接発生の確認、繰り返し照射による欠陥構造発達の追跡、サブカスケードからの欠陥発生の臨界値の検討、イオン照射との厳格な比較による臨界PKAエネルギーの決定、He発生の効果と核変換生成物の効果の検討、フェライト鋼における異相間での損傷効果の差異の存在の確認、損傷欠陥の熱的安定性からの照射損傷欠陥の同定、陽電子消滅測定からの極微細空孔型欠陥形成の役割の解析、多種の材料に関する機械的性質変化と微視的欠陥構造変化の相関の実験と解析、であり個々に詳細に機械的強度的性質の変化が検討された材料としてはFe,V,Al合金,Mo,オーステナイト系ステンレス鋼,フェライト・マルテンサイト鋼およびSiC/Al系複合材料があげられる。
高分子多成分系における非晶内相分離と結晶化の競合によるミクロ多相構造の形成と制御

結晶性成分の融点が非晶性成分のガラス転移温度より低い成分鎖から構成される結晶性-非晶性ブロック共重合体の結晶化およびそれらブロック共重合体とその成分に対応するホモポリマーとのブレンドの結晶化と高次構造形成について、小角X線散乱およびDSCを用いて検討した。ポリエチレンーポリスチレンブロック共重合体(PE-PS)の結晶化において、融体のミクロ相分離構造がラメラ状であってもシリンダー状であっても、融体中のミクロ相分離構造はドメインサイズおよび形態の両方とも完全に保たれ、結晶化がナノスケールのミクロ相構造内で生じていることが示された。また、シリンダー状ドメイン内での結晶化においては、アブラミ指数は小さく結晶成長次元が制約されたいることが示唆された。これらブロック共重合体とPEまたはPSホモポリマーとのブレンドにおいて、ホモポリマーの分子量が共重合成分の分子量より小さい組合せでは融体中でマクロ相分離は生じず明確なミクロ相分離を形成した。一方、大きい分子量のホモポリマーとのブレンドにおいてはマクロ相分離が生じ、その相内でミクロ相分離が形成されたがそのドメイン構造は明確に観察されなかった。これらマクロ相分離が生じるか否かにかかわらず、相構造は結晶化によっても完全に保たれた。
聴覚過敏のメカニズムに関する研究

本研究の目的は、耳音響放射(OAE)を外有毛細胞機能の指標として用いて聴覚過敏症状と耳音響放射の関連を検討し、聴覚過敏のメカニズムを明らかにすることである。感音難聴に伴う聴覚過敏症状のメカニズムは未だに明らかにされていないが、外有毛細胞の直接の障害による聴覚の周波数弁別能や時間分解能が破綻や、外有毛細胞への抑制性の遠心系支配の破綻によって、聴覚過敏が生じることが推測される。昨年度にひきつづき今年度は、まず聴覚正常ボランティアを対象に正常コントロールとしてのデータを集積した。すなわち、外有毛細胞機能として歪成分耳音響放射(DPOAE)、誘発耳音響放射(EOAE)の検出の有無とレベル、自発耳音響放射(SOAE)の検出の有無を、遠心系の機能としてEOAEレベルや対側白色雑音によるE0AEの抑制について検討を行った。その結果、正常コントロールにおいてDPOAEは比較的ばらつきなくデータが得られたが、EOAEやSOAEではややばらつきを認め、聴覚過敏の指標となりうるか、更なる検討を行っている。対側刺激によるEOAEの抑制は、EOAEが良好に検出される例では、再現性が比較的良好であった。一方、聴覚過敏症例に対する検討は、病態によりいくつかの群に分けられる見込みがたちつつあるが、いまだ十分な例数に達せず、検討を継続中である。今年度は、耳音響放射測定装置が納品された後に、まず聴覚が正常なボランティアを対象に正常コントロールとしてのデータを集積している。具体的には、外有毛細胞機能としては歪成分耳音響放射(DPOAE)、誘発耳音響放射(EOAE)の検出の有無とレベル、自発耳音響放射(SOAE)の検出の有無を、遠心系の機能としてはEOAEレベルや対側白色雑音によるEOAEの抑制について検討を行っている。一方で、聴覚過敏症例に対しては、聴覚過敏やそれに随伴する自覚症状の性質、難聴の病態、原因疾患との関連を検討するため、上記耳音響放射測定の他、問診表を併用しての症状の詳細な聴取、純音聴力検査、語音聴力検査、自記オージオメトリー、補充現象の検査(SISIなど)、アブミ骨筋反射、聴性脳幹反応を施行する計画であり、現在症例を集めている段階である。
精密な放牧管理に向けたUAV搭載ハイパースペクトルセンシング

精密な放牧管理のためには,時々刻々と変化する圃場内の草量と飼料成分(栄養価)の空間的な分布状況をリアルタイムで診断する管理手法の高度化が必要不可欠である。本研究では,無人飛行機(UAV)とハイパースペクトル(HS)センサを利用して,圃場内の草量と飼料成分の空間分布を簡便かつリアルタイムで表示する草地診断技術の開発を目的としている。広島大学西条ステーション内の放牧地および採草地において,これまでに地上レベルで開発した飼料成分の診断技術,ならびにUAV搭載カメラ画像から草量の空間的分布を簡便に評価する技術を発展し,圃場内の草量に加えて飼料成分の空間的な変動を簡便かつ高頻度で取得可能な空撮システムを開発する。初年度は,UAVに搭載したHSセンサを用いた草量と飼料成分の計測システムの開発を中心に行った。主な調査地は,これまでのデータ蓄積もある広島大学農場内の放牧地(面積1.6ha,人工草地)とイタリアンライグラス採草地(1 ha)を調査地とした。初年度と同様,放牧期間(4-10月)の3時期において,UAV空撮と地上部の調査を実施した。空撮データとの比較を行うため,地上部でも放牧地内に設置した100 mライン上に10 m間隔で設置した10点において,植生調査および刈り取り,HSセンサを用いた分光計測を行った。以上のフィールド調査で得られた計30地点(5,8,,10月×各10地点)のデータセットを用いて,UAV搭載HSセンサおよび地上HSセンサから草量,飼料成分を推定するモデルの開発と地上観測ハイパースペクトルデータとの検証作業を行った。これまでに草量を推定するモデルの開発を行い,地上HSよりは精度は劣るものの,空撮データから圃場内の空間分布図が得られた。本研究では,ハイパースペクトル(HS)センサを搭載した無人ヘリ(UAV)から,圃場内の草量と飼料成分の空間分布を簡便かつリアルタイムで表示する草地診断技術の開発を目的とする。予備試験では,空撮に利用するUAVとHSセンサのシステム仕様に関する調査を行った。地上部の観測対象範囲は,HSセンサの視野角とUAVの飛行高度によって変化するため,まずは,視野角10°と25°,高度5, 10, 20, 30mで飛行した場合の飛行時間,観測点数,地上HSデータとの比較検証作業を実施した。続いて植物が生育する610月の期間のうち春と秋の2回,UAV搭載HSセンサによる空撮と地上調査を実施した。以上のフィールド調査で得られた計20地点(6,11月×各10地点)のデータを用いて,UAV搭載HSセンサから草量,飼料成分を推定するモデルの開発と地上観測ハイパースペクトルデータとの検証作業を行っている。空撮に利用するUAVとHSセンサのシステム仕様に関する予備試験は順調に進んでいる。

一方で,地上検証データのうち牧草の飼料成分(CP, NDF, ADF)の分析に時間がかかってしまったため(2015年3月末に終了),飼料成分を推定するモデルの開発が予定より少し遅れているが,現在解析を進めている。植生の生育状態および家畜の放牧行動は,気象条件等によって季節的・経年的に大きく変化することが予想されるため,H27年度も初年度と同様の調査を継続する。以上の草量と飼料成分の推定マップは,同時期に行われているウシの行動調査で得られた圃場内の空間データ(地形,気象,ウシの放牧行動)の情報を地理情報システム(GIS)上で統合し,草量・飼料成分の面的分布とウシの空間的選択性の関係を明らかにする。これまで申請者らが,夏期の短期間に実施した放牧試験の結果からは,ウシの採食行動と糞排出の空間分布に与える要因(地形と草量,水飲み場までの距離)が明らかになっているが,これらは季節的に大きく変化することが予想される。そのため,新たに加わったデータを追加したモデルの更新作業も実施する。予定していた3回(春,夏,秋)の調査のうち,夏季の調査が天候の関係で実施できなかったために1回分の消耗品および植物サンプルの化学分析費用を使用しなかったため。予定していたサンプル数を確保するため,放牧試験前の調査を追加して,その調査時における消耗品および植物サンプルの化学分析費用にあてる。
症型分類(治療難易度)に基づく補綴治療の診療ガイドラインの策定と妥当性の検証

本研究の目的は、補綴歯科治療の難易度に基づく診療ガイドラインを策定し、その妥当性を検証することである。多施設共同研究の実施によって、新たに考案された多軸診断プロトコルが補綴歯科治療の難易度を計るのに有用であり、信頼性が高いことが確認された。本研究の成果により、エビデンスにもとづいた診療ガイドラインに則った補綴歯科診療の実施が可能になることは、診療の質および安全性の向上と効率化に繋がると考える。本研究の目的は、従来、経験的あるいは主観的な判断のもとに評価されていた欠損補綴歯科治療の難易度(症型分類)について、補綴歯科治療の診療ガイドラインを策定し、その妥当性を検証することである。本研究の遂行により、エビデンスにもとづいた診療ガイドラインに則った補綴歯科診療の実施が可能になることは、診療の質および安全性の向上と効率化につながることは疑いもなく、患者のQOLの向上に大きく貢献できると考える。研究初年度である本年は、多施設臨床研究を進める上での研究実施計画書の策定および各施設での倫理審査手続きを行った。また、社団法人日本補綴歯科学会が、口腔状態、全身の疾患、患者の満足度や心理面等の観点から診察・検査法を設定して策定した症型分類を元に診査票および患者質問票を作成した。平成21年11月より一斉に各施設50名を目指して、術前データを採取し始めた。この術前データの収集率は年度末の時点で目標値の80%に達している。さらにこれらと並行して、補綴歯科治療に関する高いレベルのエビデンスを文献検索により国内外で収集することを開始した。研究プロジェクトを円滑にすすめるために、多施設臨床研究に参加する各施設の代表者との会議を適宜開催し、進捗状況の確認と問題点の話し合いを行った。本研究は、前向きコホート研究であることから、次年度も引き続き補綴治療後の予後データを採取し、術前・術後のデータに対して多変量解析による分析を行い、短期予後と症型分類および治療内容の関係を解明することを目指していく。本年度は、まず昨年度に策定した研究実施計画書に基づき、引き続き術前データを採取した。平成22年7月28日にすべての施設での連続サンプリングを終了し、最終的に422名の解析対象サンプルを得た。次にベースラインでの解析対象患者と術者の基礎データについて分析を行ったところ、患者因子の欠損歯数ならびに精神心理学的評価、ならびに術者因子の主観的難易度判定が口腔関連QOLの低下との間に有意な相関が認められた。さらにこれらと並行して、補綴歯科治療に関する高いレベルのエビデンスを文献検索により国内外で収集することも継続して行った。また、研究プロジェクトを円滑にすすめるために、多施設臨床研究に参加する各施設の代表者との会議を適宜開催し、進捗状況の確認と問題点の話し合いを行った。本研究は、前向きコホート研究であることから、次年度も引き続き補綴治療後の術後データを採取し、術前と術後のデータに対して多変量解析による分析を行い、症型分類および治療内容に応じた短期予後の予測因子を解明することを目指していく。本年度はまず、前年度までに本研究プロトコルにしたがって術前データを採取した422名の解析対象患者に対して、補綴歯科治療を行った後に術後データを採取した。次に、患者立脚型アウトカムである口腔関連QoLを指標として、解析対象患者の術前・術後めデータを比較分析したところ、術者による主観的難易度判定が口腔関連QoLの変化量との間に有意な相関が認められた。さらに、補綴歯科治療の病名と口腔関連QoLとの相関を調べたところ、咀嚼障害群、審美障害群、疼痛群では、口腔関連QoLをあらわすOHIP総得点の分布や治療前後の各サブスケールの変化量に特徴的な傾向が認められたことから、患者立脚型アウトカムを用いた病名のプロファイリングの可能性が示唆された。

また、本年は最終年度であったことから、平成23年11月19日に仙台にて公開の研究成果報告会を開催し、外部からも有識者を招き、それまでの研究成果に関して公開討議を行った。なお、本研究は多施設前向きコホート研究であるため、今回の研究期間内に補綴歯科治療が終了していないなどの理由で術後データのそろっていない解析対象患者についても術後の追跡調査を継続していく。
Ｅ－カドヘリンプロセス分子のＮａｋｅｄＤＮＡを用いた口腔癌遺伝子治療法の開発研究

本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミンの遺伝子導入細胞の,in vivoでの造腫瘍能の著しい低下と形成腫瘍におけるE-カドヘリン発現の抑制を認めた.このことからα2-アンチプラスミン蛋白の発現誘導が,in vivoでの扁平上皮癌における蛋白分解活性のみならず分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制すると推測された.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導することは,新しい遺伝子治療の開発につながる可能性が期待される.プラスミンは細胞外基質蛋白に対し強い分解活性を示すほか,他の不活性型蛋白分解酵素を活性化し,がんの浸潤・転移を制御していると報告されている.本研究者は,プラスミンが,細胞間接着分子であるE-カドヘリンを切断し,がん細胞の分散能を亢進することを明らかにし,プラスミンは細胞外基質蛋白分解系の中心的な役割を果たすほか,E-カドヘリンをプロセシングすることで,がん細胞の分散能を亢進させ,がんの浸潤・転移を促進していることを示してきた.本研究では,in vivoにてプラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導し,扁平上皮癌の蛋白分解活性のみならず細胞分散能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制することを目的としている.実験には口腔扁平上皮癌細胞株と,その細胞株にα2-アンチプラスミン遺伝子を導入した細胞を用いた.まずプラスミノーゲンを含む培地で各細胞を培養し,経時的に増殖細胞数を算定した.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞は低い増殖能を示し,培養7日目の増殖細胞数は親株の約1/2であった.つぎに1000万個の各細胞を,4週齡ヌードマウスの背部皮下に接種し,経時的に腫瘍の大きさを測定した.遺伝子導入細胞は腫瘍を形成するものの増大を認めず,親株にくらべ増殖能が著しく低下していた.さらに,形成した腫瘍におけるE-カドヘリンの発現を免疫組織化学的に検索したところ,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では細胞膜上でのE-カドヘリンの発現が亢進していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白の発現によるプラスミン活性の低下がin vivoにおけるE-カドヘリンの発現を亢進し,口腔扁平上皮癌細胞の浸潤増殖を抑制している可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミンの遺伝子導入細胞の,in vivoでの造腫瘍能の著しい低下と形成腫瘍におけるE-カドヘリン発現の抑制を認めた.このことからα2-アンチプラスミン蛋白の発現誘導が,in vivoでの扁平上皮癌における蛋白分解活性のみならず分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制すると推測された.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導することは,新しい遺伝子治療の開発につながる可能性が期待される.プラスミンは細胞外基質蛋白に対し強い分解活性を示すほか,他の不活性型蛋白分解酵素を活性化し,がんの浸潤・転移を制御していると報告されている.本研究者は,プラスミンが,細胞間接着分子であるE-カドヘリンを切断し,がん細胞の分散能を亢進することを明らかにしてきた.したがって,プラスミンは,細胞外基質蛋白分解系の中心的な役割を果たすほか,E-カドヘリンをプロセシングすることで,がん細胞の分散能を亢進させ,がんの浸潤・転移を促進していると推測している.本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導し,扁平上皮癌の蛋白分解活性のみならず細胞分散能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制することを目的としている.実験には口腔扁平上皮癌細胞株と,その細胞株にα2-アンチプラスミン遺伝子を導入した細胞を用いた.α2-アンチプラスミンの発現誘導が,扁平上皮癌細胞の細胞増殖に与える影響について検討するために,まずプラスミノーゲンを含む培地で各細胞を培養し,経時的に増殖細胞数を算定した.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞は低い増殖能を示し,培養7日目の増殖細胞数は親株の約1/2であった.つぎに1000万個の各細胞を0.1mlの培地に浮遊させ,4週齡ヌードマウスの背部皮下に接種し,経時的に腫瘍の大きさを測定した.遺伝子導入細胞は腫瘍を形成するものの増大を認めず,親株にくらべ増殖能が著しく低下していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白の発現によるプラスミン活性の低下が口腔扁平上皮癌細胞の浸潤増殖を抑制している可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.平成24年度はα2-アンチプラスミンの発現誘導が,扁平上皮癌細胞のin vivoでの浸潤・転移に与える影響およびα2-アンチプラスミン遺伝子をNaked DNAの形状でヌードマウスの正常組織に注射し,その遺伝子発現効率を検討することを予定していた.α2-アンチプラスミン遺伝子を導入した口腔扁平上皮癌細胞ではin vivoでの浸潤増殖を抑制されることが示された.しかしながら,α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,造腫瘍能を検討する実験で培養ディッシュ上での細胞の回収や移植時の手技が安定しておらず,再現性のある結果を得るまで複数回の実験を要し計画が遅れた.

したがって,α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞のin vivoでの転移能の検討やα2-アンチプラスミン遺伝子の正常組織内直接投与による遺伝子発現効率は確認できていない.本研究では,α2-アンチプラスミン遺伝子を,病原性のない安全なプラスミドDNAすなわちNaked DNAの形状で腫瘍組織内へ直接注入することにより,α2-アンチプラスミン蛋白のin vivoでの発現を誘導し,扁平上皮癌における蛋白分解活性のみならず細胞分散能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発を目的としている.α2-アンチプラスミンの発現誘導が,扁平上皮癌細胞のin vivoでの浸潤増殖を抑制することが示された.今後はH24年度の実験で採取した,ヌードマウス形成腫瘍でのE-カドヘリン蛋白の発現を検索する.つぎに,in vivoでのα2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞の転移能の検討を行う.また,α2-アンチプラスミン遺伝子をNaked DNAの形状でヌードマウスの正常組織に注射し,この直接遺伝子注入法によるin vivoでのα2-アンチプラスミン蛋白の発現効率を検索する.その後,ヌードマウスに形成させた口腔扁平上皮癌にα2-アンチプラスミンのNaked DNAを直接注入し,腫瘍組織中でのα-2アンチプラスミンの発現を解析する.α2-アンチプラスミン遺伝子導入による扁平上皮癌のin vivoにおける転移抑制効果を検討する.本研究では,蛋白発現を免疫組織化学的に解析するための試薬.また,細胞培養に関連する器具と試薬,プラスミンインヒビター遺伝子導入の効果判定のための試薬および腫瘍抑制の効果判定に使用する実験動物が必要である.これらの購入費と,成果発表のための旅費,印刷費等を必要な経費として使用する予定である.
iPS細胞を用いた腫瘍血管内皮細胞の病態を規定する新規因子の同定

本研究員は、腫瘍由来の血管内皮細胞(EC)が内皮間葉移行(EndMT)を誘導するメカニズムを、腫瘍由来ECに対してリプログラミングによるエピジェネティックな変化の初期化の手法を用いて、染色体異常によるものなのか、エピジェネティックな変化の違いによるものなのかを明らかにしようと試みた。腫瘍由来のECを入手する実験系を確立させるため、初めにマウスの組織からECマーカーPECAM1に対する抗体による単離を試みたが、間葉細胞の混入により断念した。現在、マウス胎児由来の細胞に対して、middle T antigenによって選択的にECを不活化し、コロニーピックアップを行うことで、EC株の樹立を試みている。この実験系を確立させ、腫瘍由来のEC株を得ることを目指す。一方、繊維芽細胞を用いた系により、iPS細胞樹立の手技は確立させたことを確認した。以上のことから、EC株を得る実験系を確立次第、腫瘍由来ECからiPS細胞を作製することが可能である。また、slugとtwistのEndMTにおける機能を探るために、ES細胞由来のECにおいてslug,twistを発現させた。slug,twistはsnailとともに上皮間葉移行(EMT)において重要な役割を果たしていることから、EndMTにおいても何らかの機能を持つことが示唆された。しかし、snailはEndMTにおいても重要な役割を果たすにも関わらず、ES細胞由来ECにおいてslug,twistを発現させても、EndMI関連遺伝子の発現変動や細胞の形態変化は現在まで観察されていない。
細胞内アスパラギン酸プロテアーゼの機能構造形成と細胞機能制御

カテプシンEおよびDは動物細胞における主要な細胞内アスパラギン酸プロテアーゼである。カテプシンDが典型的な可溶性リソソーム酵素として広く組織・細胞に分布しているのに対し、カテプシンEは非リソソーム酵素として限定的な分布をし、組織・細胞の違いによって細胞質型または細胞膜型、あるいはその両方の存在様式をとる。両酵素は明らかに糖蛋白質であり、その前駆体はシグナルペプチド、プロ部を有していることから、粗面小胞体上のリボソームで合成された後、古典的分泌経路でゴルジ野に運ばれるものと考えられる。しかし、両酵素、とくにカテプシンEの選別・輸送および活性分子への変換機構については不明の部分が多い。本研究では、マウス白血病フレンド細胞やラット胸腺細胞、ラットミクログリア細胞などの種やタイプの異なる細胞を用いて、カテプシンEの生合成や細胞内輸送ならびに局在化機構をカテプシンDのそれらと対比させて解析した。実験は、^<35>S-メチオニンを用いたパルス・チェイス実験により行われた。経時的に細胞と培養上清を回収し、細胞成分は界面活性剤で抽出した後、両酵素に対する特異抗体で免疫沈降を行い、ゲル電気泳動とフルオログラフィーで解析した。得られた結果は以下のとうりである。(1)カテプシンDはいずれの細胞においても同じキネティックスで生合成とプロセシングが行われ、数時間のうちにリソソームへ輸送され活性型酵素へ変換された。一方、(2)カテプシンEの生合成や細胞内輸送ならびに局在化機構は用いた細胞で著しい相違を示した。即ち、ミクログリア細胞では、カテプシンDと同様のキネティックスで生合成とプロセシングを受け、成熟型酵素として酸性コンパートメントへ輸送されたが、フレンド細胞や胸腺細胞では、中間型酵素の段階までしかプロセシングが行われず、この分子はトロンスゴルジあるいはTGNまで輸送されてプールされる形で貯留した。
新規経路を介した持続的NF-κB活性化と炎症と発癌との連関

NF-κBは炎症と発癌に重要な役割を担う転写因子であり、細胞が炎症のシグナルを受容すると、阻害タンパク質IκBのリン酸化と分解によりNF-κBの活性化が誘導される。我々は細胞がストレスを受容すると、IκBがリン酸化非依存性に分解されて持続的にNF-κBが活性化される新規経路が誘導されることを見いだしてきた。本研究では、アセトアミノフェンによる肝障害モデルマウスの解析より、ストレス応答による新規経路を介したNF-κB活性化が生体内においても関与していることが明らかとなった。最近、我々は細胞がストレスを受容すると、IκBがリン酸化非依存性に分解されて持続的にNF-κBが活性化される新規経路を発見した。この新規経路により活性化されたNF-κBは、既知の経路で活性化されたNF-κBとは異なる細胞応答を引き起こす。本研究では申請者らが世界に先駆けて見いだした新規経路に着目し、この分子機構の解明と、新規経路を介したNF-κB活性化と炎症と発癌との連関を明らかにする。本年度は、古典経路および新規経路のみが特異的に駆動される遺伝子改変マウスを作製し、このマウスを用いた炎症モデル実験や化学発癌モデル実験を行い、炎症・発癌における古典経路と新規経路の役割を明らかにすることを目的として以下のとおり実施した。アルブミン遺伝子プロモーターを用いて肝細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するAlb-Creトランスジェニックマウスと、IKKβ^<F/F>マウスを交配して肝細胞特異的に内在性のIKKβ遺伝子を欠損するマウス(IKKβ^<F/F>;Alb-Cre)を用意した。さらに核局在シグナル(NLS)を付加したIKKβ遺伝子(NLS-IKKβ)、および核外移行シグナル(NES)を付加したIKKβ遺伝子(NES-IKKβ)を導入したトランスジェニックマウスを用意した。これらのトランスジェニック(TG)マウスと肝細胞特異的IKKβ遺伝子欠損マウスを交配して。NLS-IKKβ、NES-IKKβ遺伝子が肝細胞で発現するマウスを作製した。これらのマウスにリポポリ多糖(LPS)を投与し、このときに誘発される肝組織における炎症応答や組織障害を解析した。NLS-IKKβTGマウスでは、肝障害の指標である血清中のALT値の増加がみられたことから、新規経路により活性化されたNF-κBは、炎症応答を促進すると考えられた。IκBαキナーゼ(IKKβ)はNF-κB阻害タンパク質IκBαの分解を誘導してNF-κBを活性化するタンパク質である。IKKβはおもに細胞質に存在するが、核内にもわずかに存在することが知られている。腫瘍壊死因子(TNFα)などの炎症性サイトカインは細胞質でIKKβを活性化し、IκBαをリン酸化することによりユビキチンリガーゼβ-TrCPを介してこの分解を誘導する。TNFαによるNF-κBの活性化が一過性であるのに対して、紫外線(UV)照射や活性酸素(ROS)などのストレスは低強度で持続的なNF-κBの活性化を誘導する。我々はUVや酸化ストレスに応答したNF-κBの活性化が核内のIKKβを介して引き起こされることを報告してきた。核内のIKKβはβ-TrCPのアダプターとして機能することによりIκBαの分解を誘導し、持続的なNF-κBの活性化を引き起こす。興味深いことにNF-κBの活性化はTNFαによる細胞死を抑制するのに対して、UVによる細胞死を促進する。本研究では生体内におけるNF-κB活性化と細胞障害の連関を明らかにすることを目的とした。肝細胞特異的にIKKβ遺伝子を欠損させたマウスにコンカナバリンA(ConA)を投与すると肝障害が増悪化する。そこで本研究ではNLSおよびNESを付加したIKKβ遺伝子を肝細胞特異的IKKβノックアウトマウスに導入し、細胞質局在型IKKβおよび核局在型IKKβのみが発現するマウスを作製した。これらのマウスにConAやアセトアミノフェンを投与し、このときのALTなどを指標に肝障害を解析した。NES-IKKβを発現するマウスの肝障害は野生型のマウスと同程度であった。これに対してNLS-IKKβを発現するマウスでは強度の肝障害が誘発されていることが判明した。核内のIKKβを介したストレス応答性の経路が肝細胞死を増強していると考えられた。現在までに遺伝子改変マウスを用いた炎症における古典経路と新規経路の役割については、遺伝子改変マウスを作成し、炎症モデル実験に着手できていることからおおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後もIKKβ遺伝子改変マウスを用いた炎症モデル実験により、新規NF-κB活性化経路の関与を明らかにする。また、ジエチルニトロサミン(DEN)をマウス腹腔内に投与すると、肝臓における細胞死が誘発された後に、数ヶ月後には肝癌を誘発することができる。上記のIKKβ再構成マウスにDENを投与して化学発癌実験を行い、古典経路と新規経路の肝発癌における役割を解明する。最終的に肝臓での炎症・発癌における古典経路と新規経路の役割を明らかにする。24年度が最終年度であるため、記入しない。
臨床応用可能なバイオ再生角膜の作製

臨床応用可能なバイオ再生角膜の作成のためには、角膜上皮、実質、内皮の3層それぞれの組織幹細胞を単離し、使用することが求められる。我々は、まず、ヒト角膜の上皮、実質、内皮いずれの層からも、幹細胞分離法の一つであるスフェア法を用いることにより、組織幹細胞を得られることを明らかにした。次に、こうして得た角膜の組織幹細胞を臨床応用するための技術の開発を動物モデルで検討した。まずヒト角膜内皮より得た内皮スフェアを、ウサギ前房内に投与したところ、内皮面に広がり、角膜の透明性を維持することがわかった。また厚さ40μmのコラーゲンシートの上にヒト角膜内皮スフェアを播種して作成した内皮シートを兎に移植したところ、角膜の透明性が得られた。またヒト角膜実質より得た実質細胞スフェアを40-50μmの有孔性のゼラチンシートの上に播種して作成した再生角膜実質を兎角膜実質内に移植したところ、ラミニンやフィブロネクチンといった細胞外基質を大量に産生し、ゼラチンと徐々に置き換わっていくことがわかった。角膜実質を無細胞化する方法として開発した窒素内密閉法により無細胞化したブタ角膜実質を兎角膜実質内に移植したところ、半年間に渡って角膜の透明性を維持した。こうして得られる無細胞化角膜実質は抗原性や病原性が極めて低く、スフェア法で得られる未分化な細胞と組み合わせていくことでより臨床応用に向いた角膜実質や角膜内皮などを作成することが可能であると考えられた。更に、ニューロスフェア法によって得られる組織幹細胞の数の、家兎角膜での部位による違いを検討した。その結果、1次スフェア、2次スフェアともに、角膜周辺部からのほうが中央部からよりも、同一細胞数の内皮細胞から、より多くの組織幹細胞が得られることがわかった。平成15年度に以下のような研究結果を得ることができた。まずバイオ再生角膜に応用可能な角膜組織からの組織幹細胞の分離を幹細胞分離法の一つであるスフェア法を用いて試みた。アメリカアイバンクのドナー角膜より角膜輪部組織、デスメ膜ごと内皮細胞を採取し、コラゲナーゼを添加した細胞分離用培地で組織を溶解させ、EDTA/PBS溶液で細胞を分散させた。単一細胞に分散した細胞は凝集を防ぐ為、メチルセルロース添加無血清培地中7日間浮遊培養を行った。またDiIによる染色細胞と非染色細胞を1:1で混合し、増殖細胞の単一細胞起源の証明を試みた。分離されたスフェアよりRNAを抽出し、RT-PCR法を用いて遺伝子発現の解析、および免疫染色を行った。その結果、角膜輪部組織および角膜内皮より採取した細胞から浮遊培養中に球状の細胞塊を作るものが存在することを確認した。DiI染色と未染色の細胞を混合した後、浮遊培養により単一細胞から作成された細胞塊がDiI陽性、非陽性に別れたことから、この細胞塊が単一細胞起源のスフェアであることが判明した。スフェア形成率は角膜輪部が10000cellあたり2.8個であった。角膜内皮では15.9であった。角膜輪部由来のスフェアは未分化細胞マーカーであるネスチンがRT-PCR法と免疫染色法で検出された。この結果より、ヒト角膜輪部組織および内皮細胞より単一細胞起源のスフェアが分離でき、組織幹細胞である可能性が示唆された。

ウサギ角膜内皮より同様のスフェア法にて内皮スフェアを作成し、ウサギ前房内に投与したところ、内皮面に広がり機能することが確かめられた。バイオ再生角膜に応用可能なブタ角膜実質の無細胞化は、酵素法などよりも、実質を100%に近い窒素に1週間密閉しておくことで可能のなことが確認された。平成16年度に以下のような研究結果を得ることができた。平成15年度にはヒト角膜の上皮、実質、内皮いずれの層からも、幹細胞分離法の一つであるスフェア法を用いて、組織幹細胞を得ることがわかったが、こうしてえた角膜の組織幹細胞を臨床応用するための技術の開発を今年度は行った。まずヒト角膜内皮より得た内皮スフェアを、ウサギ前房内に投与したところ、内皮面に広がり、角膜の透明性を維持することがわかった。また厚さ40μmのコラーゲンシートの上にヒト角膜内皮スフェアを播種して作成した内皮シートを兎に移植したところ、角膜の透明性が得られた。こうした手術後長期にわたって、眼圧上昇などの有害事象は見られず、臨床応用できる有効な方法であると考えられた。またヒト角膜実質より得た実質細胞スフェアを40-50μmの有孔性のゼラチンシートの上に播種して作成した再生角膜実質を兎角膜実質内に移植したところ、ラミニンやフィブロネクチンといった細胞外基質を大量に産生し、ゼラチンと徐々に置き換わっていくことがわかった。透明性を維持することが今後の課題であるが角膜実質の代替となりうる素材と考えられた。また平成15年度に角膜実質を無細胞化する方法として開発した窒素内密閉法により無細胞化したブタ角膜実質を兎角膜実質内に移植したところ、半年間に渡って角膜の透明性を維持した。こうして得られる無細胞化角膜実質は抗原性や病原性が極めて低く、スフェア法で得られる未分化な細胞と組み合わせていくことでより臨床応用にむいた角膜実質や角膜内皮などを作成することが可能であると考えられた。本研究課題の平成15,16年度の実績として、我々はヒト角膜の上皮、実質、内皮のいずれの層からも、幹細胞分離法の一つであるスフェア法を用いて、組織幹細胞を得ることができる事を明らかにしてきた。平成17年度には、まず、このニューロスフェア法によって得られる組織幹細胞の数の、家兎角膜での部位による違いをまず検討した。家兎角膜を中央6mmと周辺6-10mmの2つに分け、それぞれの領域から得られる角膜内皮細胞にニューロスフェア法を適応し、得られる組織幹細胞の数を比較した。その結果、1次スフェア、2次スフエアともに、角膜周辺部からのほうが中央部からよりも、同一細胞数の内皮細胞から、より多くの組織幹細胞が得られることがわかった。さらに角膜内皮の組織幹細胞を臨床応用する前段階として、家兎の角膜を冷凍凝固することにより角膜内皮細胞を脱落させて水疱性角膜症の状態とし、そのモデルに対して、家兎の角膜内皮細胞からニューロスフェア法により得た角膜内皮の組織幹細胞を前房内に注入する方法の有効性を検討した。その結果、組織幹細胞を注入した群では、術後1ヶ月までに角膜の厚さの正常化、角膜透明性の回復が得られ、角膜内皮の組織幹細胞の有用性が示された。さらに、組織幹細胞を効率よく得るために、角膜内皮細胞を数代継代したのちにニューロスフェア法を適用して得られるスフェアが、家兎の水疱性角膜症モデルに有効であるかどうかを検討した。その結果、培養細胞から得られたスフェアも、初代培養の内皮細胞から得られるスフェアと同等に、角膜透明性の回復に有効である事が分かった。
カシンベック病患者の血清に存在する軟骨破壊遺伝子の作用と性質

1カシンベック病動物モデルの作製病区の食料および水で猿を飼育して、カシンベック病動物モデルを作製して、血清を採取した。2カシンベック病患者より血清を採取した。3カシンベック病についての論議を中国および日本側研究者間で行った。ウサギ成長板より分離した軟骨細胞の培養系にカシンベック病および対照の血清を5%添加して4あるいは8日培養した。その培養液および細胞層をSDS含有緩衝液にて溶解して、ゼラチンザイモグラフィーを行った。細胞層にはゼラチナーゼ(gelatinaseA,B,MMP-2,MMP-9)は検出できなかった。しかし培養液にはMMP-2,-9活性が検出された。しかも培養4日の培養液には、分子量68-72kのMMP-2のみが検出されたが、カシンベック病血清ではMMP-2以外に分子量92kのMMP-9が出現した。培養8日では、対照でもMMP-9は存在したが、カシンベック病血清でMMP-9レベルは3-4培上昇した。この結果は、カシンベック病の血清にはMMP-9の合成を促進する物質が存在することを示唆している。培養8日では、対照でもMMP-9は存在したが、カシンベック病血清でMMP-9レベルは3-4倍上昇した。この結果は、カシンベック病の血清にはMMP-9の合成を促進する物資が存在することを示唆している。