hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
浸透圧調節の特殊性から探る紅藻ウシケノリの低塩類濃度耐性機構の研究

海産紅藻ウシケノリは、淡水中で生存可能であり、そのとき細胞生理学上の常識に反して細胞収縮を引き起こす。そのような特殊な淡水適応の制御について研究を行った。その結果、淡水中では遊離アミノ酸含有量が減少していたが、細胞形態の変化から予測された膜脂質脂肪酸の組成変化は観察されなかった。また、トランスクリプトーム解析により、淡水中ではF-アクチン再構成に関わる遺伝子の発現が低下し、ミトコンドリアにおいてATP生産に関わる遺伝子の発現が上昇していた。以上のことから、ウシケノリは細胞内浸透圧を低下させることで細胞の膨張を抑え、生存を可能にするため増殖を停止してエネルギーを蓄えていることが明らかとなった。本研究の契機となった予備実験データは、海産紅藻ウシケノリが淡水中でも生存可能であり、その場合低浸透圧環境において細胞収縮が行われていることを示唆していた。平成25年度では、ウシケノリを淡水中で培養し、細胞形態の変化、遊離アミノ酸含有量の変化(連携研究者・横山担当)、イオン放出解析、およびナトリウム・ポンプの機能解析(連携研究者・加藤担当)を行った。いずれの項目についても以下のように成果が上がっているが、電子顕微鏡を用いた形態変化の観察のみが実行できなかった。淡水処理したウシケノリ細胞は、上記の知見と同じように、縦方向につぶれるように収縮していた。従ってウシケノリの浸透圧変化への応答は予想通り特殊なものであることが確認された。このような形態変化は淡水処理後2週間位で顕著になるが、海水に戻した場合、4日前後で元の形態が復活していた。よって、細胞形態の変化は可逆的である。また、細胞収縮に伴って細胞外へのイオン流出と遊離アミノ酸量の低下が見られ、細胞内部の低張化が行われていると考えられた。注目される知見として、葉緑体の形態変化があげられる。共焦点レーザー顕微鏡により葉緑体の自家蛍光を観察したところ、海水中では大きな中心部から細長い足のようなものが多数出ているが、淡水処理によりその形態が多数のヒダが重なったようにダイナミックに変化していた。シロイヌナズナを用いたスサビノリのナトリウム・ポンプの機能解析については、形質転換用プラスミドを作成し数ラインの形質転換体を得ている段階である。加えて平成26年度以降の計画であったトランスクリプトーム解析を行うことができた。海水培養および淡水処理2週間のウシケノリの比較を行った。解析はBGI Japan社への委託で行い、データはすでに入手できている。現在その分析を進めているが、両処理条件で発現している遺伝子がかなり異なってことは確かである。前年度、ウシケノリ細胞において淡水中で遊離アミノ酸含有量の減少と葉緑体の形態変化が生じることが判明した。これらの現象と高い低塩類濃度耐性には関連があると考えられる。これらを背景として、今年度では膜脂質脂肪酸組成の分析とナトリウム・ポンプの機能解析について研究を進めることができた。まず、予想外の結果として、低塩類環境下において膜脂質脂肪酸組成は全く変化しないことを見出した。これは、細胞および葉緑体の形態変化に伴う膜機能の維持のため膜脂質脂肪酸組成に変化があるのではとの予測とは全く異なる結果であった。しかし、膜機能維持に関わる植物ステロール類が塩類環境に応じてその量を変化させる可能性を見出すことができ、これは今後の重要な解析項目となった。ナトリウム・ポンプの機能解析については、昨年度得られたスサビノリ遺伝子導入シロイヌナズナのスンストレス耐性を調べたところ、様々な条件で野生株と比較したが、違いは見られなかった。すなわち、ナトリウム・ポンプが低塩類濃度ストレス応答に関わるかどうかは、この方法では解析不能であることが確かめられた。そこで、直接ウシケノリにおけるナトリウム・ポンプ活性を調べることにした。予備実験では、野生株において安定的な活性測定ができるようになったので、今後は実際にストレス応答時における測定を行う予定である。前年度から引き続きナトリウムポンプの機能解析を行ったところ、スサビノリのナトリウムポンプの発現がシロイヌナズナの塩ストレス耐性を低下させていることが判明した。これは、ナトリウムの排出強化により塩ストレス耐性が向上するという当初の予想に反することであった。最近の研究により、陸上植物の根でナトリウムを細胞内に隔離することで地上部の生育を可能にしているトランスポーターの存在が明らかとなった。そのため、スサビノリのナトリウムポンプが、そのトランスポーターが細胞内に取り込んだナトリウムイオンを道管に排出してしまい、そのため地上部で塩の蓄積が起こるため枯死してしまうことが考えられた。よって、シロイヌナズナでスサビノリ遺伝子が機能的に発現することは判明したが、陸上植物の性質により塩ストレス耐性獲得おける機能を証明できないことが明らかとなった。ただ、この結果は、陸上植物の塩ストレス耐性機構の最新の知見を直接的にサポートする重要な知見と考えている。初年度行ったトランスクリプトーム解析のデータ分析からは、淡水処理によってアクチンやプロフィリンなど、F-アクチンの再構成に必要な遺伝子の発現が低下していた。このことは、ウシケノリが淡水中で細胞分裂を抑制し、無駄なエネルギーを使わないようにしていることを示している。また、ミトコンドリアにおけるATP生産関連遺伝子の発現が上昇しており、淡水中で生存するためのエネルギー生産を活発化していることを示している。これらのことから、ウシケノリが淡水中で生存するためにエネルギーを蓄えていることが判明した。しかしながら、遺伝子発現の解析で、なぜ低張環境で細胞収縮するのかを予測することはできなかった。

海産紅藻ウシケノリは、淡水中で生存可能であり、そのとき細胞生理学上の常識に反して細胞収縮を引き起こす。そのような特殊な淡水適応の制御について研究を行った。その結果、淡水中では遊離アミノ酸含有量が減少していたが、細胞形態の変化から予測された膜脂質脂肪酸の組成変化は観察されなかった。また、トランスクリプトーム解析により、淡水中ではF-アクチン再構成に関わる遺伝子の発現が低下し、ミトコンドリアにおいてATP生産に関わる遺伝子の発現が上昇していた。以上のことから、ウシケノリは細胞内浸透圧を低下させることで細胞の膨張を抑え、生存を可能にするため増殖を停止してエネルギーを蓄えていることが明らかとなった。今年度、膜脂質脂肪酸組成の分析とナトリウム・ポンプの機能解析を進めることができた。しかし、他に予定していた葉緑体形態変化の詳細な解析やトランスクリプトームのデータ解析については進めることができなかった。主な理由は、膜脂質脂肪酸組成の分析に多くの時間が必要だったからである。当初、分析が簡単な総脂質中における脂肪酸変化をみることで何らかの知見が得られると考えていたが、予想に反して脂肪酸組成の変化が見られなかった。そのため、各脂質クラスにおいては変化しているのではと考え、MGDG, DGDG, SQDG, PGなどの葉緑体膜を構成する脂質やPCのように細胞膜を構成する脂質を精製し、そこでの脂肪酸組成の変化や各脂質クラスにおける光学異性体の量的変動などに着目した分析を行ったが、全く変化はなかった。これらの実験にかなりの時間が費やされた。また、各脂質クラス自体の量的変動も分析したが、やはり変化はなかった。ただ、この分析の過程で、脂肪酸と同様に各機能の維持に関わる植物ステロールの量が変動することを見出すことができたので、上記のように時間をかけた分析は無駄ではなかったと考えている。海洋植物学本研究の契機となったウシケノリにおける低塩類環境下での細胞収縮は常識では考えられない生理応答であることから、その浸透圧調節機構は極めて特殊であることが予想される。そのため、その仕組みの解明はこれまで知られていない環境応答機構の発見につながることが期待できる。その実現をめざし、今後は、これまで得られた成果を踏まえて、ナトリウム・ポンプ活性の測定、植物ステロールの分析、およびトランスクリプトームのデータ解析を進めたい。ナトリウム・ポンプ活性の測定は、低塩類ストレス処理したウシケノリと、コントロールとしてのスサビノリについて行い、細胞内のイオン強度を調節する上でナトリウム・ポンプがどのような役割を果たしているのかを明らかにする。この場合、同時に細胞内のナトリウム・イオンおよびカリウム・イオンの動態も測定する。トランスクリプトームのデータ解析では、低塩類ストレスで発現が上昇する遺伝子と低下する遺伝子を見出し、続いて各々の発現解析を定量的PCR法にて行う。また、各遺伝子のプロモーター領域をクローン化し、共通の制御配列があるかどうかを検討する。
自律的欠陥探索・分裂型マルチ近接場プローブによる超平滑加工表面ナノ異物一括計測

従来半導体プロセスにおいて現場適用されていた光学的散乱型計測法原理では物理的検出限界となっていた超平滑加工表面のナノ付着異物計測法について新概念手法の提案,開発を目指した.具体的には,基板上に滴下した揮発性不活性溶媒の液相界面とナノ異物との近接場における力学的・光学的相互作用を,並列情報処理性,現場適用性の高い遠隔場光学技術で取得することで,非破壊性,高速性を維持したまま,従来異物サイズ検出限界を打破可能な新概念近接場計測プローブ法の開発を目指した.理論・実験の両面から研究推進を行い,提案概念の妥当性,有用性について検証した.従来半導体プロセスにおいて現場適用されていた光学的計測法原理では物理的検出限界となっていた超平滑加工表面のナノ付着異物計測法について新概念手法を開発する.具体的には,基板上に滴下した揮発性不活性溶媒の液相界面とナノ異物との近接場における力学的・光学的相互作用を,並列情報処理性,現場適用性の高い遠隔場光学技術で取得することで,非破壊性,高速性を維持したまま,従来異物サイズ検出限界を大幅に向上可能な新概念近接場計測プローブ法の開発を目指した.FDTD法を用いた近接場電磁場解析により,提案手法を適用することで,50nm異物検出時に約6倍の感度向上が期待されることが分かった.さらに,従来手法では検出が不可能だった10nm異物においても,約1.1%の光量変動をモニタリングできれば,スポット走査を要さず,一括計測が可能であることを明らかにした.また,パーフルオロカーボンを揮発性不活性溶媒プローブとして適用して,実際にベアシリコンウエハ上の標準粒子からの応答を観察し,上述のFDTD法を用いた近接場電磁場解析の妥当性を確認した.FDTD法を用いた近接場電磁場解析により,提案手法を適用することで,50nm異物検出時に約6倍の感度向上が期待されることを示した.さらに,従来手法では検出が不可能だった10nm異物においても,約1.1%の光量変動をモニタリングできれば,スポット走査を要さず,一括計測が可能であることを明らかにした.従来,半導体プロセス等において現場適用されていた光散乱型計測法では物理的検出限界に近づいている超平滑加工表面(半導体シリコンベアウエア加工表面等)のナノ付着異物計測法について新概念手法を開発する.具体的には,基板上に滴下した揮発性不活性溶媒の液相界面とナノ異物との近接場における力学的・光学的相互作用を,並列情報処理性,現場適用性の高い遠隔場光学技術で取得することで,非破壊性,高速性を維持したまま,従来異物検出可能サイズ限界を大幅に向上可能な新概念近接場計測プローブ法の開発を目指した.H27年度において基礎実験により,理論的に,1.1%の光量変動値において,10nm異物検出の可能性を示すとともに,パーフルオロカーボン揮発性不活性溶媒を近接場力学応答検出液相プローブとして適用した実証実験により,提案の自律的欠陥探索・分裂型マルチプローブとしての基本機能検証を行った.提案研究の厳密な実証のためには,ナノ標準粒子の厳密な位置同定が不可欠であるため,引き続きH28年度において,電子顕微鏡を用いたナノ標準粒子検出特性実験を実施した.特に,一般に標準粒子が凝集して存在している場合に,異物検出感度評価が適切に行われない問題に注意して実験実施を行った.その結果,40nm-60nmシリカ粒子が単粒子の状態でも,提案手法の液相プローブが,自律的に複数に分裂しながら欠陥探索し,光学的に遠隔から欠陥検出を実現できることを明らかにした.従来半導体プロセスにおいて現場適用されていた光学的散乱型計測法原理では物理的検出限界となっていた超平滑加工表面のナノ付着異物計測法について新概念手法の提案,開発を目指した.具体的には,基板上に滴下した揮発性不活性溶媒の液相界面とナノ異物との近接場における力学的・光学的相互作用を,並列情報処理性,現場適用性の高い遠隔場光学技術で取得することで,非破壊性,高速性を維持したまま,従来異物サイズ検出限界を打破可能な新概念近接場計測プローブ法の開発を目指した.理論・実験の両面から研究推進を行い,提案概念の妥当性,有用性について検証した.理論的観点より,提案手法の有効性を定量的に検証できたため,実験的に,感度向上を実証する.厳密な実証のため,電子顕微鏡座標系との自動位置同定法の確立,およびカーボンコンタミネーション汚染による計測擾乱が最小限に抑えた計測評価法の確立を進め,単粒子異物に対する提案光学応答の取得を目指す.光製造科学本研究におけるナノ異物計測法の厳密な実証のためには,他観察法による妥当性確認が望ましい.基礎実験により基本的な有効性検証は実現できたが,本申請研究有効性の評価をより精緻に達成するために,電子顕微鏡による単粒子同定をより厳密に実施することが望ましいことから次年度使用額を計上した.電子顕微鏡による厳密な単粒子同定を実現するために,複数座標系からの自動位置同定法の確立,およびカーボンコンタミネーション汚染による計測擾乱が最小限に抑えた計測評価法の実現を目指す.
呼吸性移動による変形を再現する胸部ファントムの作成

粒子線治療において、呼吸による胸部の変形及び腫瘍の移動は飛程を変化させ、線量分布に時間的構造を与えてしまう。本研究は呼吸による変形・移動を再現することで、線量分布の変動を正確に計測可能な人体模擬ファントムを作成することが目的である。圧空制御による空気流量の変化のみで呼吸による変形・移動の再現を予定していたが、全関節の可動領域の再現及び横隔膜位置の変化に伴う肋骨位置の動きを再現することが困難であったため、呼吸による変形の一部を腫瘍の移動でカバーすることとし、それぞれの動きを再現するための機構を独立で準備することとした。そのため、呼吸による胸部の変形については再現が不十分な点があるが、腫瘍に対する呼吸性移動による線量変化については問題なく計測可能である。呼吸による胸部の変形については3Dプリンタを用いた造形による胸部形状の再現と呼吸波形に基づいた圧空制御を採用した。胸部形状についてはCT画像をもとに骨部分を石膏で造形し、それ以外をウレタン樹脂で作成した。圧空制御については電空レギュレータを用いて毎分の呼吸数に応じた空気圧制御により肺野内に空気を送り込むことが可能である。呼吸による腫瘍の移動については横隔膜と肺野、腫瘍を模擬したうえで、呼吸波形に合わせて駆動させることで再現した。横隔膜はシリコンゴムを採用し、腫瘍はABS樹脂とした。これらの組み合わせにより胸部ファントムを作成し、ラジオクロミックフィルムを用いて腫瘍における呼吸性移動の影響を評価できることを確認した。本研究の目的は強度変調陽子線治療における呼吸性移動を伴う領域に対する線量評価用人体模擬ファントムの作成である。呼吸による胸部及び体表面の変形を再現することで、水等価長の変化が粒子線治療における線量分布に及ぼす影響を評価することが可能となる。平成28年度は胸部骨格の素材の検討を行った。呼吸による胸部骨格の動きと可動領域については肋椎関節の再現が重要であり、駆動方向と領域が適切に再現される必要がある。また筋肉の収縮による骨格の動きの再現は困難であることから、造形する肺と関節部に構造の再現性を持たせることで、疑似的に呼吸時の筋肉の収縮を再現することを想定している。胸部骨格における肋骨等の骨構造ついては、ABS樹脂を利用した3Dプリンタで造形した肋骨をシリコンで型取りし、石膏を流し込むことで造形することとした。関節部分についてはMRI画像を基に、必要となる関節部分を描出し、胸部骨格同様に3Dプリンタによる造形と型取りを行い、ウレタンゴムによる造形を採用することとした。ただし、この手法で再現した胸部骨格では関節の駆動方向へ制限がかからないため、呼吸による骨格の動きを正しく再現できておらず、ウレタンゴムのみによる関節の作成に変更を加える必要がある。具体的手法については検討中であるが、ウレタンゴムで作成した関節とABS樹脂等の水等価なサポート材を併用することで関節の駆動方向に制限を加えることが出来ると考えている。骨及び関節以外の領域についてはゼラチンによる造形を想定していたが、高濃度ゼラチンでも形状の復元が難しいことから、別の素材の選定が必要となった。こちらも軟質のゴムの利用を検討しており、素材の検証を行っている。平成28年度に予定していた胸部骨格の作成において、関節部分の造形及びその保持について依然改善の余地が残されており、もう少し時間が必要である。また筋肉等の水等価領域において、呼吸性移動による骨格形状の変化を吸収、形状の復元は必要であるが、ゼラチンの濃度のみではその機能を実現することが難しく、素材を再度選定する必要が発生しているため。粒子線を用いたスキャニング照射法において、呼吸による体輪郭、骨構造の変形は飛程の変化としてあらわれ、意図しない線量分布の変化を引き起こす要因である。本研究の目的は呼吸性移動を伴う領域における線量分布検証を目的とした人体模擬ファントムを作成し、強度変調陽子線治療における呼吸性移動の影響を正確に検証することである。平成29年度は胸部における肺、気管部を含む換気機構について検討するとともに、前年度に引き続き、照射野を含む一部領域における胸部骨格と内部構造の作成について研究を進めた。3Dプリンタで製作したモデルを基に椎体と肋骨を作成し、胸部のファントムの造形について検討を行ったが、製作領域を限定した場合には複数の関節部による従来の呼吸性変化の再現が難しく、製作領域の変更が必要であることが分かった。特に肋骨の上下方向への移動が再現できなくなるため、肋骨位置による線量分布の変化を検証することが難しい。肋骨位置の変化を再現するためには頭尾方向により広い領域と横隔膜位置の変化を含む製作が必要となる。また、換気機構については予定していた気管部経由での換気ではなく製作した肺野を直接換気する機構へ変更することとした。これにより製作領域の自由度が高まり、柔軟な造形が可能となる。これらの計画変更点をもとに胸部ファントムの作成を進めており、完成後にCT撮影等の動作検証と線量計及びフィルムを利用した測定を行う予定である。本研究においては照射野を含む一部領域のみを造形を検討していたが、呼吸性変化を十分に再現することが難しく、製作領域の変更が必要となったため。

圧空制御による空気流量の変化のみで呼吸による変形・移動の再現を予定していたが、全関節の可動領域の再現及び横隔膜位置の変化に伴う肋骨位置の動きを再現することが困難であったため、呼吸による変形の一部を腫瘍の移動でカバーすることとし、それぞれの動きを再現するための機構を独立で準備することとした。そのため、呼吸による胸部の変形については再現が不十分な点があるが、腫瘍に対する呼吸性移動による線量変化については問題なく計測可能である。呼吸による胸部の変形については3Dプリンタを用いた造形による胸部形状の再現と呼吸波形に基づいた圧空制御を採用した。胸部形状についてはCT画像をもとに骨部分を石膏で造形し、それ以外をウレタン樹脂で作成した。圧空制御については電空レギュレータを用いて毎分の呼吸数に応じた空気圧制御により肺野内に空気を送り込むことが可能である。呼吸による腫瘍の移動については横隔膜と肺野、腫瘍を模擬したうえで、呼吸波形に合わせて駆動させることで再現した。横隔膜はシリコンゴムを採用し、腫瘍はABS樹脂とした。これらの組み合わせにより胸部ファントムを作成し、ラジオクロミックフィルムを用いて腫瘍における呼吸性移動の影響を評価できることを確認した。平成29年度は引き続き胸部骨格の作成及び水等価領域の材質の選定を行い、平成28年度に予定していた内容を完了させる。その後、気管及び肺の造形を進め、平成29年度に予定していた研究内容の完了を目標とする。製作領域の変更に伴い内容に遅れが生じているが、当初予定通り研究を継続する。領域の変更については、予定していた照射野周辺の造形から片肺もしくは一部両肺の造形を検討し、可動域及び呼吸性変化の再現性を高める。試作段階で水等価領域の素材に変更が生じたこと、関節部の作成に課題が残っており、その検討段階であるため、当初想定していた試作品を作成する段階に至っていないため。(理由)胸部ファントムの作成において製作領域及び構造上の変更が必要となり、最終的な造形を延期したため。(使用計画)胸部ファントムの作成費用と成果発表のため費用とする。平成29年度に引き続き胸部骨格の作成を行うため、平成28年度に使用しなかった試作費用が必要となる。それ以外は予定通り研究を進めていく予定である。
ヒトパルボウイルスB19感染症における病態多様性とウイルスゲノム変異との関連性

ヒトパルボウイルスB19は伝染性紅斑の原因であるが、伝染性紅斑以外にも(先天性溶血性貧血における)無形性発作、(免疫不全における)慢性骨髄不全、(妊婦への感染による)胎児水腫などの血液疾患をはじめ、急性・慢性関節症、急性脳症、急性肝炎など、多彩な臨床像を呈することが知られている。その感染宿主はヒト骨髄中の赤血球前駆細胞のみとされている。B19ウイルスの感染許容細胞が極めて限局的である一方で、B19ウイルスはゲノム変異が少ないとされるDNAウイルスにもかかわらず、RNAウイルスにも匹敵するほどの比較的高率の変異が生ずることが近年わかってきた。特定の部位における変異と病態との間に関連性がないかを検討することが今回の研究の目的である。B19ウイルスはいまだにウイルス培養系が確立していないため、ゲノム変異のあるウイルスの転写や翻訳に関しては、工夫が必要となる。臨床症状が通常の経過と異なる症例のウイルスゲノムをプラスミドに導入して、in vitroにてRNAの転写の時間的経過や構造タンパク領域と調節タンパク領域の割合(比率)が通常の株とどのように相違があるかを分析することが最終的な目標である。今年度は、まずヒトパルボウイルスB19の標準的なゲノムを含むプラスミドpC1B19を使用する。このプラスミドはSV40 oriを持ち、COS7細胞に感染させるとゲノム複製、転写物作製、タンパク発現を生じさせることができる。それぞれ変異のある株の塩基配列を導入することより実験を開始することとした。ヒトパルボウイルスB19の標準的なゲノムを含むプラスミドpC1B19を使用するが、このプラスミドはSV40 oriを持ち、COS7細胞に感染させるとゲノム複製、転写物作製、タンパク発現を生じさせることができる。Overlapping PCRを用いて、ゲノム変異を導入することにしたが、PCRによる増幅が不安定であり、現段階でゲノム変異の導入に難渋している。各変異が導入できた後に、pC1B19変異プラスミドをリポフェクタミンを用いてCOS7細胞にトランスフェクトする次の段階に入っていく予定である。pC1B19変異プラスミドをリポフェクタミンを用いてCOS7細胞にトランスフェクトする。その後、時間を追って(24時間後および48時間後、および時間的変化が顕著であればその間の時間にも)細胞を回収していき、RNAを抽出する(Qiagenのキットを使用)。Real time PCRによりNS1領域、VP1領域、VP2領域を各領域を区別できるプライマーを用いて定量する。調節タンパクNS-1をコードするmRNAはDonor1とAccepter1-1, 1-2の間でsplicingしないのに対して、構造タンパクVPをコードするmRNAは同部位にてsplicingするため、イントロン内と外にプライマーを設定することにより両mRNAを定量的に比較することが可能となる。この方法で症例ごとに転写物の時間的推移、量的な比較することが可能である。論文13ではRNA分析をRNase protection assayにて行っているが、Real-time PCRによっても、同様にRNAごとの定量が可能である。この症例以外にも、特異的な経過をとった症例のゲノム変異をpC1B19プラスミドに導入して(Overlapping PCRを応用できないほど変異が多い場合は血清サンプルをPCRで増幅して制限酵素を用いてpC1B19に組み込んで)、同様にトランスフェクション、RNA抽出、Real-time PCRによる定量を行っていく。

各変異が導入できた後に、pC1B19変異プラスミドをリポフェクタミンを用いてCOS7細胞にトランスフェクトする次の段階に入っていく予定である。pC1B19変異プラスミドをリポフェクタミンを用いてCOS7細胞にトランスフェクトする。その後、時間を追って(24時間後および48時間後、および時間的変化が顕著であればその間の時間にも)細胞を回収していき、RNAを抽出する(Qiagenのキットを使用)。Real time PCRによりNS1領域、VP1領域、VP2領域を各領域を区別できるプライマーを用いて定量する。調節タンパクNS-1をコードするmRNAはDonor1とAccepter1-1, 1-2の間でsplicingしないのに対して、構造タンパクVPをコードするmRNAは同部位にてsplicingするため、イントロン内と外にプライマーを設定することにより両mRNAを定量的に比較することが可能となる。この方法で症例ごとに転写物の時間的推移、量的な比較することが可能である。論文13ではRNA分析をRNase protection assayにて行っているが、Real-time PCRによっても、同様にRNAごとの定量が可能である。この症例以外にも、特異的な経過をとった症例のゲノム変異をpC1B19プラスミドに導入して(Overlapping PCRを応用できないほど変異が多い場合は血清サンプルをPCRで増幅して制限酵素を用いてpC1B19に組み込んで)、同様にトランスフェクション、RNA抽出、Real-time PCRによる定量を行っていく。予定より実験に使用する費用がかからなかったため、予算を次年度使用に回しました。今後は、実験に使用するポリメラーゼ酵素などの試薬に予算が予定より多くなる可能性が高く、そこに次年度に回した予算を充当する計画です。
Bacteroides gingivalisの増殖に及ぼすトランスフェリンの影響

本研究では、Bacteroides gingivalisが歯周ポケット内で生息するために必要な鉄源として歯肉溝浸出液由来のトランスフェリンを利用している可能性を調べ、さらにB.gingivalisとトランスフェリンとの結合機構を明らかにすることにより、本菌のポケット内での増殖におけるトランスフェリンの役割を明らかにすることが目的である。トランスフェリンを種々の濃度に調整した培地にて、口腔由来のBacteroides種8株を培養し、分光光度計をもちいてその増殖曲線を求めたところ、B.gingivalis3株とB.denticola1株は増殖したが、B.intermedius,B.melaninogenicus,B.loescheiiではほとんど増殖がみられず、口腔由来のBacteroides種のなかでもトランスフェリンの利用に差があることが明らかとなった。さらに、B.gingivalis381株は、鉄約35%飽和のトランスフェリン添加培地で増殖したが、アポトランスフェリン添加培地、ジピリジルや塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄などの遊離の鉄イオンを添加した培地では増殖しなかった。また、B.gingivalisとトランスフェリンとの相互作用を調べるために、トランスフェリンーペルオキシダ-ゼ複合体を用いて菌体トランスフェリンとの結合性を調べた結果、B.gingivalisはトランスフェリンと特異的に結合することが示めされた。以上の結果より、口腔由来のBacteroidesのいくつかの菌種は、歯周ポケット内で鉄源として歯肉溝浸出液中に含まれているトランスフェリンを利用して増殖しうることが示唆された。
地域から考える多文化共生

研究の目的は、高校生に自分達の身近な地域に居住する外国人との交流により彼らの課題や共生のあり方を理解、認識させることとした。この目的のもとに、本研究では、まず最初に、6月12日13日に愛媛大学教育学部総合人間形成課程の学生、教員と連携して、研究発表や地域に住むアメリカ人やアルゼンチン人との交流を含むセミナーを実施した。次に7月1月にかけて6回、広島県安芸郡府中町の日本語教室に通い、ラオス人女性からの聞き取り調査を行った。8月10日には岡山県総社市のブラジル人学校を訪問し、在日ブラジル人に関する学習とそこに学ぶブラジル人の子供たちと交流した。翌11日には、神戸のモスク見学、大阪大学で高等学校教員と大学教員による「地域から考える世界史、世界史から考える地域」と題する高等学校と大学教員による研修会に参加し、自分達の活動の意義を再確認した。10月22日に本校で、立命館大学院生による「反地雷運動の取り組み」を通じて全校生徒対象の人権教育LHRが開催された。そのことを契機として、1月19日に生徒会やユネスコ=ボランティア部などと連携して、ポル=ポトの政権下で少年期を過ごしたカンボジア人(現在は日本国籍)による学習会を開催した。また、申請者は、在日外国人の教育の現状を学ぶために、申請者は、7月28日に愛知県豊明市の愛知教育大学が運営する豊明日本語教室「プラスエデュケート」や7月30日に在日外国人生徒の支援を行っている神奈川県立鶴見総合高等学校を学校訪問して研修した。このような一連の活動に参加した高校生達は、大学進学後も国際理解や国際関係論を学びたいという意向を持つようになってきた。また、ある生徒は「これまでの活動を通して多面的な思考ができるようになった」と感想を述べ、多様な文化を理解する気持ちも持てるようになってきた。
オートファジー欠損による造血幹細胞機能不全の機構解明

造血幹細胞は全ての血液細胞の源となる細胞である。自己複製分裂または分化分裂を介して自己の維持と血液細胞の産生を担っている。近年、造血幹細胞の運命(自己複製、分化)にミトコンドリアの質・機能が寄与していると報告されている。ミトコンドリアは細胞内小器官の一つで細胞のエネルギー代謝を担っている。また、ミトコンドリアの質が低下すると、造血幹細胞は分化傾向へ分裂傾向を変化させるが、ミトコンドリアの質の維持にはオートファジーが重要な役割を果たし造血幹細胞の維持に寄与していると考えられる。実際にオートファジーを欠損させた造血幹細胞では幹細胞性維持が阻害されると報告されている。しかし、詳細な阻害機構は未だに明らかになっていない。一方で幼児期造血幹細胞は成体型造血幹細胞よりもよく分裂しているが、幹細胞性はよく保たれている。実際に幼児期造血幹細胞のミトコンドリアに焦点を当て解析を行うと、ATP産生速度が速く、ミトコンドリアの膜電位が成体造血幹細胞に比べ10倍程度高値を示すが、ミトコンドリア内の活性酸素種の産生は成体造血幹細胞と同程度を示すなどミトコンドリアの質がよく保たれていることを明らかにした。申請者は、オートファジー関連遺伝子欠損マウス(Atg7KO)マウスを用い、ミトコンドリアの機能中心に解析を行ったところAtg7KOは年齢依存的に造血幹細胞の機能を阻害していることを確認した。また、Atg7KOは骨髄環境を変化させ、間接的に造血幹細胞の枯渇を誘導していることを明らかとした。現在以上の内容で論文執筆中である。造血幹細胞は自己複製能、多分化能の二つを大きな特徴とするすべての血液細胞の根源となる細胞である。近年、加齢により、自己複製能・多分化能を消失することが明らかになってきた。一方で、オートファジーは飢餓への応答、障害のある細胞小器官、タンパク質を分解、細胞の恒常性維持に関わっている。近年オートファジーが造血幹細胞維持に重要であると考えられており、オートファジーを欠損した造血幹細胞では、造血能が阻害されることが報告されている。また、ミトコンドリアの形態、膜電位の活性、活性酸素の量と細胞周期が関連している事はよく知られており、申請者は、オートファジー欠損による造血幹細胞機能不全は機能不全に陥ったミトコンドリアを分解できないことによる酸化ストレス、もしくは、オートファジーにより異常のあるミトコンドリアが分解されないため、異常なメタボライトの蓄積によることに起因すると推測する。また、胎生期(増殖期)の造血幹細胞のミトコンドリア膜電位は成体(静止期)の造血幹細胞の約10倍であり、発生段階でミトコンドリア膜電位を抑制することが成体型の造血幹細胞への変化で重要であると考えられる。本研究では、オートファジー欠損による造血幹細胞の機能不全、発生期における胎生期(増殖期)から成体(静止期)への変化が共にオートファジーによるミトコンドリア膜電位の抑制が中心になり作用していると考え詳細な分子機構の解明を行っている。申請者はコンディショナルAtg7KO(Atg7flox/flox-Mx1-Cre)、胎生期からのAtg7KO(Atg7flox/flox-Vav-Cre)の間で比較解析を行った。生後8週目にコンディショナルKO(生後4週目からAtg7をKO)マウスHSCsでは、ミトコンドリア膜電位(JC1-red)が約1.5倍、ミトコンドリア内活性酸素種(=ROS)が約1.2倍増となることを明らかにした。一方で胎生期からAtg7KOを誘導したマウスHSCsではミトコンドリア内ROSが野生型に比べ約4倍とコンディショナルにAtg7KOを誘導したマウスHSCsに比べ顕著に高値を示すことを明らかにした。申請者らは、生後30日目の野生型マウスHSCsのミトコンドリア膜電位を解析した結果、膜電位が高値を示すもの、低値を示すものの2集団が出現していることを明らかにした。コンディショナルAtg7KOマウスは生後4週目にpIpCを投与しKOを誘導する。生後8週目での解析結果ではコンディショナルAtg7KOに比べ、胎生期からAtg7KOを誘導したマウスでミトコンドリア内ROSの量が顕著に多いことから、オートファジーは生後4週以前のHSCsのイベントで大きな役割を果たすことが示唆された。オートファジーは通常時のHSCs維持にも役割を果たすが、コンディショナルAtg7KOマウスは生後4週目でのKOから1年以上生存することを確認している。一方で胎生期からAtg7KOを誘導したマウスは生後9週目で重度の貧血、HSCsの枯渇などにより死亡することを確認した。この事実からもオートファジーが生後4週齢以前のイベントで大きな役割を果たすことが示唆される。申請者らは生後3週目から4週目にかけて起こる新生児期(増殖期)の造血から成体型(静止期)の造血への切り替わりにオートファジーが重要となると考え次年度も解析を行う。

また、ミトコンドリアの質が低下すると、造血幹細胞は分化傾向へ分裂傾向を変化させるが、ミトコンドリアの質の維持にはオートファジーが重要な役割を果たし造血幹細胞の維持に寄与していると考えられる。実際にオートファジーを欠損させた造血幹細胞では幹細胞性維持が阻害されると報告されている。しかし、詳細な阻害機構は未だに明らかになっていない。一方で幼児期造血幹細胞は成体型造血幹細胞よりもよく分裂しているが、幹細胞性はよく保たれている。実際に幼児期造血幹細胞のミトコンドリアに焦点を当て解析を行うと、ATP産生速度が速く、ミトコンドリアの膜電位が成体造血幹細胞に比べ10倍程度高値を示すが、ミトコンドリア内の活性酸素種の産生は成体造血幹細胞と同程度を示すなどミトコンドリアの質がよく保たれていることを明らかにした。申請者は、オートファジー関連遺伝子欠損マウス(Atg7KO)マウスを用い、ミトコンドリアの機能中心に解析を行ったところAtg7KOは年齢依存的に造血幹細胞の機能を阻害していることを確認した。また、Atg7KOは骨髄環境を変化させ、間接的に造血幹細胞の枯渇を誘導していることを明らかとした。現在以上の内容で論文執筆中である。前年度で、オートファジーが生後4週目までのイベントで役割を果たすことを示唆する結果を得られたため、本年では、まず胎生期からAtg7KOを誘導したマウスHSCsにおいて生後4週目のHSCsのミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア内ROS量、細胞周期を解析する。また、野生型マウス生後30日目のミトコンドリア膜電位上位20%、下位20%のHSCs、胎生期からAtg7KOを誘導したマウスHSCsにおいてRNAseqを実施し、オートファジーが増殖期から静止期への移行に役割を果たすのかをミトコンドリア周辺因子を中心に解析明らかにする。さらにマスサイトメーターによる解析を実施、RNAseqの解析から得られた結果をタンパクレベルで確認する。コンディショナルAtg7KOマウスにおいても、HSCsを培養、増殖を開始させ、その後移植することでオートファジーの増殖期から静止期への移行への貢献度を重ねて確認する。コンディショナルAtg7KOにおいてpIpCを投与する時期を変化させ、オートファジーが最も影響を発揮する時期を決定する。また、RNAseq、マスサイトメーターから得られた解析結果より、オートファジー欠損による造血不全の原因を究明し、オートファジー欠損による造血不全からの回復法の開発を行う。研究に用いる予定のマウスの準備が遅れ、大きな費用のかかる実験の実施が遅延したため。海外の学会に不参加のため。次年度は、本年度実施予定の実験を加え、円滑に、効率よく研究を進め、適切に助成金を使用していく。
ヒドロキシメチルシトシンの塩基単位での同定法の確立

哺乳類ゲノムのエピジェネティックな調節においてDNAのメチル化は重要な役割を果たしている。最近、メチルシトシンがヒドロキシメチルシトシンへ酸化される反応が存在することが示され、脱メチル化の中間産物として注目されている。そこでヒドロキシメチルシトシンの1塩基単位での解析法が重要であるが、これまで提案されてきた手法は十分なものではなかった。そこでDNMT1酵素を用いた単純な原理を用いて、比較的微量のDNAから1塩基単位でメチルシトシンとヒドロキシメチルシトシンを区別して解析する手法を考案し、実際に96%という高精度でヒドロキシメチルシトシンを同定することが可能であることを示した。しかし、現在修飾されていないシトシン(C)、メチルシトシン(mC)、ヒドロキシメチルシトシン(hmC)を1塩基レベルで同定する手法は確立されていない。本研究ではこれまでメチルシトシンを1塩基レベルで同定するシークエンス法としてもっとも一般的に用いられてきたbisulfiteシークエンス法を応用して1塩基レベルでC、mC、hmCを区別してシークエンスする新しい手法を開発することを目的としている。C、mC、hmCを区別して同定する手法として、DNMT1産物がhemi-methylatedCpGの反対鎖のCを効率的にメチル化するが、hemi-hydroxymethylatedの場合はメチル化を行わないことを利用して、これらを区別する手法を検討した。具体的にはゲノムを適当な制限酵素で切断後、ヘアピンを形成する合成DNAを末端に結合し、これをプライマーとして逆鎖に新たにDNAを合成する。その後、このDNAをDNMT1酵素で処理することによりメチル化を行うと、元のDNA鎖がmCであれば対応する部分もメチル化されるが、hmCである場合はメチル化されない。処理後のDNAをbisulfite処理して全体をPCRで増幅し配列を決定すれば、元の配列と連結された逆鎖の対応部分のメチル化状態をあわせて解析することでC、mC、hmCを同定することが可能になるという原理である。mC、hmCの修飾をもつモデル基質を用いて本法が有効であることを明らかにした上で、更にDNMT1酵素の反応条件の検討を詳細に行った。その結果、再現性よく98 %程度の精度でmCとhmCを同定できることを示した。この手法は、単純な原理で効率よくhmCの解析が可能であることから、エピゲノム解析の新しい手法として、有力なツールになることが期待できる。最近ゲノムDNAの修飾として注目を集めているシトシンのヒドロキシメチル化がある。C、mC、hmCを区別して同定する手法として、Dnmt1産物がhemi-methylated CpGの反対鎖のCを効率的にメチル化するが、hemi-hydroxymethylatedの場合はメチル化を行わないことを利用して、これらを区別する手法を検討した。その後、このDNAをDnmt1酵素で処理することによりメチル化を行うと、元のDNA鎖がmCであれば対応する部分もメチル化されるが、hmCである場合はメチル化されない。これまでにmC、hmCの修飾をもつモデル基質を用いて本法により実際に解析が可能であることを明らかにするとともに、その判別の精度を検定している。配列中のCpGのシトシンがC、mCあるいはhmCである合成基質を作成し、実際に本法を用いてシトシンの修飾状態を1塩基単位で同定できることを実際に示した。また、解析するDNA量を減らしてゲノムDNA 1 ug相当からも解析が可能であることも明らかになったことから、基本的な原理としてヒドロキシメチルシトシンの1塩基単位での同定が十分可能であることを示すことが出来たと考えている。本法はゲノム上の特定の部分のシトシンの修飾を解析することが可能であり、次世代シークエンサを用いることでwhole genome shotgunsequenceへの応用も可能である。

平成25年度は当初の計画通りES細胞などをモデルとして用い、全ゲノムのC、mC、hmCをゲノムワイドに同定することを試みる。また、そこから得られた結果と、これまでMeDIP法、hMeDIP法などの抗体を用いた手法による全ゲノム解析の結果との比較を行う。全ゲノム解析にあたっては、非常に多くのDNA断片を同時にhairpin構造としてPCR増幅する必要があり、通常のPCRより配列による増幅効率のバイアスが大きくなることが予想される。十分なcomplexityを保ったままbisulfite反応後のゲノムDNAの増幅を行うよう、十分な検討を加え、実験手法の確立を目指す。また、次世代シークエンサからのシークエンスリードについて、Dnmt1での修飾が行われたか否かを判定するために合成したDNA部分がメチル化されているか否かでデータを採用するかどうかを判定するなどの処理が必要となる。これらを全ゲノムについて行うことは単純な作業ではあるが膨大な量の判定が必要であるため、これを自動的に行うためのコンピュータ処理のパイプラインの構築を試みる。当初の計画通り、本法をゲノム全体のシトシンの修飾状態を網羅的に解析する手法へ応用するために、初年度に確立した手法を元にbisulfite反応したDNAを次世代シークエンサーを用いて解析する。このため、研究費の多くの部分は次世代シークエンサー用の試薬として使用することを計画している。
免疫不全マウス(CTS)の末梢Tリンパ球減少機構の解析-特に胸線の生後発生における変化について-

CTSマウスは先天的にTリンパ球依存性免疫が著しく低下しているが、それは末梢リンパ組織内のTリンパ球の数的低下によることがこれまで明らかにされた。さらに、CTSマウスのTリンパ球減少の原因を胸線に注目し検索したところ、CTSマウスの胸線には成熟型のTリンパ球が正常マウスに比し、著しく多く、胸線皮髄境界領域のperi-vascularspaceに蓄積している像も観察された。また、CTSマウスにおいて末梢リンパ節へのホ-ミングレセプターであるMEL-14を高発現する細胞が胸線に多いことやCTSマウスの胸線リンパ球が高いホ-ミング活性を有することから、胸線リンパ球のホ-ミング能の欠如によるものでないことが示された。一方、胸線からのリンパ球の移出能を検索したところ、正常マウスに比べ、著しく低いことが判明した。従って、CTSマウスのTリンパ球減少の原因としては胸線から末梢への移出能の欠損が推定された。次に、この異常が固体発生のどの時点で生じるのかを検討するために、CTSマウスの胸線を用い生後発生について検索を加えた。胸線リンパ球の細胞数の生後発生における変化は他の正常マウスと比較して有意な差は認められなかった。しかし、サブセットの変化、すなわち、成熟型Tリンパ球の増加(蓄積)は生後10日齢以降におこることが判明した。またこの変化はMEL-14でも同様に観察された。以上より、このマウスの胸線内の成熟型リンパ球の増加(蓄積)は生後胸線内に成熟型リンパ球が生成されてから確認されることが判明した。
カオスと乱流の統計物理学的研究

非平衡解放系の非線形ダイナミックスを散逸力学系の立場から作る気運が1980年前後から急速に高まってきた.その契機は運動形態の転移(分岐現象)に対する力学系理論の発展と,閉水路系の流体乱流,非線形化学反応,非線形振動子等におけるカオス発生の物理的実験の登場である.周期運動から非周期運動(カオス)が発生する普遍的シナリオとして,周期倍化のカスケードによるもの,バーストが間歇的に現われることによるもの,準周期運動を表わすトーラスが崩壊することによるもの,の3つが明らかになってきた.これら3つのシナリオによって発生したカオスを,それぞれ,周期性カオス,間歇性カオス,準周期性カオスと呼ぶ.カオスの際立った性質(挙動と応答)は,時間及び空間のスケールについて,諸種のスケーリング則を示すことと, order in chaosと言われるように,著しい時間相関・コヒーレンスを示すことである.本研究は,上記の3種のカオスのみならず,カオスの諸種の運動形態間の転移(バンド分裂,クライシス等)を解明することを目的とした.これが,非線形非平衡系の統計物理への第一歩と考えられるからである.したがって,非線形平衡系の普遍的運動形態であるカオスと乱流に対する統計力学的パラダイムの構築を目指して,次の研究を行った.1)タイプI及びIIIの間歇性カオスの大域的パワースペクトルの統計物理的理論. 2)カオスの奇妙なアトラクターのスケーリング構造の理論.特に,(1)奇妙なアトラクターの特異点のスペクトルf(α),(2)カオスに内在する不安定周期点とf(α), Ψ(Λ)スペクトル, 3)カオスのスケーリング構造を時間的スケーリング関数における相転移(q-相転移)によって特徴づける方法の発見とその展開.特に,カオスの粗視化された軌道拡大指数及び回転数の異常なスケーリング則,等である.非平衡解放系の非線形ダイナミックスを散逸力学系の立場から作る気運が1980年前後から急速に高まってきた.その契機は運動形態の転移(分岐現象)に対する力学系理論の発展と,閉水路系の流体乱流,非線形化学反応,非線形振動子等におけるカオス発生の物理的実験の登場である.周期運動から非周期運動(カオス)が発生する普遍的シナリオとして,周期倍化のカスケードによるもの,バーストが間歇的に現われることによるもの,準周期運動を表わすトーラスが崩壊することによるもの,の3つが明らかになってきた.これら3つのシナリオによって発生したカオスを,それぞれ,周期性カオス,間歇性カオス,準周期性カオスと呼ぶ.カオスの際立った性質(挙動と応答)は,時間及び空間のスケールについて,諸種のスケーリング則を示すことと, order in chaosと言われるように,著しい時間相関・コヒーレンスを示すことである.本研究は,上記の3種のカオスのみならず,カオスの諸種の運動形態間の転移(バンド分裂,クライシス等)を解明することを目的とした.これが,非線形非平衡系の統計物理への第一歩と考えられるからである.したがって,非線形平衡系の普遍的運動形態であるカオスと乱流に対する統計力学的パラダイムの構築を目指して,次の研究を行った.1)タイプI及びIIIの間歇性カオスの大域的パワースペクトルの統計物理的理論. 2)カオスの奇妙なアトラクターのスケーリング構造の理論.特に,(1)奇妙なアトラクターの特異点のスペクトルf(α),(2)カオスに内在する不安定周期点とf(α), Ψ(Λ)スペクトル, 3)カオスのスケーリング構造を時間的スケーリング関数における相転移(q-相転移)によって特徴づける方法の発見とその展開.特に,カオスの粗視化された軌道拡大指数及び回転数の異常なスケーリング則,等である.非平衡開放系の非線形ダイナミックスを散逸力学系の立場から研究する場合、最も重要な課題はカオスの発生及び発生したカオスの挙動と応答を解明することである。現在カオス発生のシナリオとして、周期的カオス,間欠的カオス,不整合カオスの3つが知られている。それらの挙動及び応答の動的特性に関する知見を得るために、スペクトル構造の統計物理学的理論を構築し発展させた。間欠的カオスの発生点近傍での時系列は極めて規則的な周期運動(ラミナー運動)がバーストによって不規則に切断されたものである。ラミナー運動の継続時間に比べて、バーストの継続時間が無視される程に短かいときには統計理論の適用が可能となる。即ち、統計量として、ラミナー運動の継続時間τn及びその周期振動の波形a(t)と振幅変調χs,及びバーストの前後での周期振動の位相の飛びξnの特性関数を用いて、パワースペクトルを統計物理学的に構成した。1.タイプ【I】の間欠的カオス:鞍点・結節点崩壊を2次接触写像によってモデル化し、パワースペクトルの大域的構造を明らかにした。その特徴はω=m【ω_ο】(m=0,1,2,...),(【ω_ο】はラミナーな周期運動の振動数)の各近傍に顕著なピーク列構造を示し、そのピーク列の包絡線は逆ベキ則に従う。即ち、S(ω)∞【|ω-mωο|^(-ζm)】,ζο=1,ζm=2,or3,(m≧1)である。2.タイプ【III】の間欠的カオス:逆周期倍化分岐により発生する。

そのパワースペクトルの大域的構造はω=mωο,m=1/2,1,3/2,2,...において顕著な単峰のピーク構造を示す。mの半整数値に対応するピークは逆周期倍化分岐によるものである。更に、これらのピークの漸近形は逆ベキ則に従っており、S(ω)∞【|ω-mωο|^(-ζm)】で与えられる。mが半整数のときζm=1/2,mが自然数のときζm=3/2となる。3.ロデステック写像の周期3の窓の直前に見られるカオス(省略)。4.タイプ【II】の間欠的カオス:(次年度に研究予定)。
新規Exophilin複合体の同定

膵β細胞に発現するExophilinのうち、インスリン分泌を制御する低分子量Gタンパク質Rab27aと最も多く結合しているのはGranuphilinであった。Granuphilinはインスリン分泌を抑制する分子であり、膵β細胞に強く発現している。そこで、Granuphilinの新規複合体を同定した。同定された新規複合体はGranuphilinによる抑制を解除していることが分かった。まず、複数あるRab27aエフェクターのうち、いずれがRab27aと最も強力に結合しているか調べるためにRab27aによる免疫沈降法を用いた結合タンパク質の探索を行った。その結果、膵ベータ細胞内に存在するもっとも強力なRab27aエフェクターはGranuphilinであることが分かった。そこでさらに、Rab27aエフェクターを探索するのに用いた実験系と同様の手法によって新規Granuphilin結合タンパク質の探索を行った。その結果、複数のGranuphilin結合タンパク質が得られた。これらはいずれも、これまでに結合タンパク質として知られているMunc18やSyntaxin-1aと比べて、同等もしくはそれ以上の結合活性を示した。しかし、その結合活性はGranuphilin-Rab27a間よりは弱く、新規結合タンパク質はGranuphilinの制御因子であると考えられた。Granuphilinの新規結合タンパク質との結合力が減弱する変異体を作成して解析したところ、これまでに知られているMunc18やSyntaxin-1aとの結合力も減弱していることが分かった。これまでの我々の研究室における研究によってGranuphilinは細胞膜に存在するMunc18とインスリン顆粒上に存在するRab27aとの間を橋渡しすることによってインスリン顆粒を細胞膜上に留める(ターゲティングする)ことが分かっている。今回新規に同定したGranuphilin結合タンパク質はGranuphilinによるインスリン顆粒のターゲティング活性の制御因子である可能性がある。今後、当初の計画どおりGranuphilinと新規結合タンパク質を用いたインスリン顆粒の動態観察を行っていく予定である。初年度の計画研究によって膵beta細胞内でインスリン分泌を制御している低分子量Gタンパク質Rab27aの結合タンパク質を探索したところ、最も強力なRab27aエフェクタはGranuphilinであることが分かった。我々はGranuphilinがインスリン顆粒を細胞膜近傍にターゲティングしインスリン分泌を抑制することを報告している。膵beta細胞におけるRab27aエフェクタの大部分がGranuphilinであったことから、Granuphilin結合タンパク質を探索した。その結果、これまでに知られていないGranuphilin結合タンパク質が複数得られた。これらの新規Granuphilin結合タンパク質はGranuphilin-Rab27a複合体を介してインスリン分泌を制御している可能性がある。そこで、これらのタンパク質のGranuphilinを介したインスリン分泌への影響を調べるため、結合タンパク質のGranuphilin結合部位を決定した。さらにこれらの結合タンパク質と結合できなくしたGranuphilin変異体を発現するレトロウイルスを作成しGranuphilin欠損マウス由来の膵beta細胞に発現させてインスリン分泌能とターゲティング活性を調べた。その結果、ターゲティング活性にはRab27a以外のタンパク質結合が必要でないこと、変異型Granuphilinは野生型に比べてよりインスリン分泌に抑制的に働くことが分かった。Granuphilinはインスリン顆粒を細胞膜にターゲティングするだけでなく、膜近傍では結合タンパク質によってインスリン分泌を正に制御しているものと考えられる。現在、ターゲティングしているインスリン顆粒を詳細に解析できる全反射顕微鏡を用いて調べている。