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血管内皮細胞が産生するグリコサミノグリカン糖鎖の微細構造解析とその代謝調節

本研究の目的は,蛍光標識糖鎖電気泳動法を用いて各種血管内皮細胞が産生するグリコサミノグリカン(GAGs)の微細構造とその合成調節を明らかにすることである。今年度は各種血管内皮細胞を用い,血管の部位の違いによる糖鎖構造の違いを検討するとともに,細胞増殖因子・サイトカインによるGAG微細構造の合成調節を調べ,以下の知見を得た。1.各種血管内皮細胞が産生するGAGsの微細構造解析ウシ大動脈由来血管内皮細胞が産生するヘパラン硫酸(HS)の主な二糖組成は,UA-GlcNAc>UA-GlcNS>UA(2S)-GlcNSであり,ヒト冠動脈内皮細胞およびヒト脳微少血管内皮細胞においても同様の結果が得られた。しかしながら,ヒト大動脈内皮細胞が産生するHSの主な二糖組成の存在比はUA(2S)-GlcNS>UA-GlcNS>UA-GlcNAcの順であった。一方,検討したすべての内皮細胞層において,コンドロイチン/デルマタン硫酸(CS/DS)の主な二糖組成は,UA-GalNAc(6S)>UA-GalNAc(4S)>UA-GalNAc(4S,6S)であった。以上より,ヒト大動脈血管内皮細胞は他の内皮細胞に比べ硫酸化度の高いHSを保持していることが示された。このような糖鎖構造の違いは内皮機能をはじめとする血管組織の機能調節に影響を及ぼすものと推察される。2.増殖因子・サイトカインによる血管内皮細胞GAGsの微細構造調節高細胞密度のウシ大動脈由来血管内皮細胞をFGF-2,VEGF, TGF-β,IL-1βおよびTNF-αでそれぞれ処理した場合,GAGsのトータル量を変化させる増殖因子・サイトカインは存在したが,HSおよびCS/DSの二糖組成を顕著に変化させるものは認められなかった。しかしながら,低細胞密度の内皮細胞において,FGF-2がHSの構成二糖の一つであるUA(2S)-GlcNSの割合を増加させ,その結果UA-GlcNAcの割合を減少させることが示された。一方,CS/DSの二糖組成は,FGF-2による変化は認められなかった。従って,FGF-2は血管内皮細胞の細胞密度に依存した様式でHS糖鎖の微細構造調節に関与することが示唆された。今年度はウシ大動脈由来血管内皮細胞および血管平滑筋細胞が産生するGAGsの微細構造を解析し,以下の知見を得た。1血管内皮細胞GAG微細構造の細胞密度依存性高細胞密度の細胞層ではヒアルロナンおよびコンドロイチン/デルマタン硫酸(CS/DS)に比べヘパラン硫酸(HS)が豊富に存在しており,細胞密度の上昇に伴い細胞層のHSの割合が増加することが示された。内皮細胞が産生するHSの二糖組成は,低細胞密度の場合UA-GlcNAc>UA-GlcNS>UA2S-GlcNS>UA2S-GlcNS6Sであり,高細胞密ではUA-GlcNSの割合が一番高くUA-GlcNAc6SおよびUA-GlcNS6Sも検出された。一方,CS/DSの二糖組成はUA-GalNAc6S>UA-GalNAc4S>UA-GalNAcであったが,細胞密度依存的な変化は認められなかった。以上より,内皮細胞がその細胞密度に依存してHSの細胞層への蓄積とその微細構造を変化させることが示唆された。このような糖鎖構造の変化は内皮機能調節に影響を及ぼすものと推察される。2血管平滑筋細胞が産生するGAGsの微細構造解析本研究の目的は,蛍光標識糖鎖電気泳動法を用いて各種血管内皮細胞が産生するグリコサミノグリカン(GAGs)の微細構造とその合成調節を明らかにすることである。2.増殖因子・サイトカインによる血管内皮細胞GAGsの微細構造調節高細胞密度のウシ大動脈

由来血管内皮細胞をFGF-2,VEGF, TGF-β,IL-1βおよびTNF-αでそれぞれ処理した場合,GAGsのトータル量を変化させる増殖因子・サイトカインは存在したが,HSおよびCS/DSの二糖組成を顕著に変化させるものは認められなかった。しかしながら,低細胞密度の内皮細胞において,FGF-2がHSの構成二糖の一つであるUA(2S)-GlcNSの割合を増加させ,その結果UA-GlcNAcの割合を減少させることが示された。一方,CS/DSの二糖組成は,FGF-2による変化は認められなかった。従って,FGF-2は血管内皮細胞の細胞密度に依存した様式でHS糖鎖の微細構造調節に関与することが示唆された。
Boltzmann方程式の解の境界近傍での特異性解析

定常Boltzmann方程式の境界値問題の解の、境界近傍における特異性および領域内部における正則性をいくつか明らかにした。Boltzmann方程式は希薄気体分子の運動を記述するもので、本研究の結果は原子炉や航空機の設計に資すると考えている。また、同様の方程式である定常輸送方程式に対して、境界値から派生する解の不連続性を記述することに成功した。この結果は、近赤外光を利用した次世代の生体断層撮影技術である拡散ひかりトモグラフィに応用されると期待される。境界を有する領域での気体分子運動論と、その数理モデルとして現れるBoltzmann方程式の定常解との対応を明らかにすることを明らかにすることを本研究の目的としており、平成27年度は特に線型Boltzmann方程式の定常解に関するmacroscopicな量の特異性に焦点を当てて研究に取り組んだ。3次元空間における2枚の平行な平面の間で線型Boltzmann方程式を考え、その定常解の速度成分に関するモーメント量をとったとき、そのモーメント量の空間変数に関する導関数は「境界平面に近づくにつれ対数オーダーで増大する」という特異性を持つことが、台湾大学の夏俊雄氏との共同研究で明らかとなった。このモーメント量は、気体分子の密度や流速、温度等の物理量を表しており、この結果は境界付近での気体分子の挙動の特異性を示唆している。また、microscopicな量である定常解自身については、先の設定の下で、境界平面上で速度成分に関する不連続性をもつことが知られていたが、京都大学の舟金仁志氏、高田滋氏、中華民国中央研究院数学研究所の劉太平氏との共同研究で、その特異性についてより詳しい情報を得ることに成功した。この結果は、平成28年度の研究テーマに掲げていた「平面境界を持つ領域での定常Boltzmann方程式の境界近傍での増大度に関する研究」に寄与するものであると考えられる。以上2つの結果は、平成27年度中に論文の形で出版された。平成27年度は、平面境界をもつ非線型Boltzmann方程式の、定常解のmacroscopicな量に関する特異性の研究に取り組む計画をしていた。特に非線型性が弱い場合についての解析に取り組む予定であったが、それは台湾大学の夏俊雄氏との共同研究により十分な成果を得たと考えている。よって、研究はおおむね順調に進展していると言える。申請者は、境界を有する領域での気体分子運動論と、その数理モデルとして現れるBoltzmann方程式の定常解との対応を明らかにすることを本研究の目的としている。特に、本研究では定常線型Boltzmann方程式の境界値問題における、境界値から派生する解の特異性を研究の対象としている。過去には境界近傍における解の勾配量の増大度に関心を置いていたが、平成28年度は解そのものの境界近傍の挙動を研究し、以下の2つの結果を得ることに成功した。1つは、定常輸送方程式と呼ばれる、定常線型Boltzmann方程式と類似した方程式の境界値問題における、境界値の不連続性の伝播についてである。3次元空間における2枚の平行な平面の間で定常輸送方程式を考えたとき、境界値の不連続性が解の不連続性として直線上に伝播するための十分条件を2つ与えた。この研究は研究協力者である京都大学大学院情報学研究科博士後期課程の川越大輔との共同研究である。もう1つは、有界凸領域での定常線型Boltzmann方程式の境界値問題における、境界値の滑らかさと解の滑らかさとの対応についてである。有界凸領域で定常線型Boltzmann方程式の境界値問題を考えたとき、境界値がヘルダー連続であれば解もまたヘルダー連続で、その2つのヘルダー指数は一致する、というものである。この結果は、定常線型Boltzmann方程式に現れる積分項は、解の滑らかさを下げないことを示唆している。研究計画に沿って、定常輸送方程式の境界値問題における境界値の不連続性の伝播が、定常輸送方程式が有する積分項の性質を利用して証明された。この成果により、申請者が研究の対象としてきた解のモーメント量の性質についての理解が深まった。この観点から、研究はおおむね順調に進展していると判断したい。申請者は、有界領域での気体分子運動論と、その1つの数理モデルとして現れるBoltzmann方程式の定常解との対応を明らかにすることを本研究の目的としている。気体分子運動論は上空の希薄気体や原子炉内の中性子の振る舞いを記述するのに利用され、これを研究することは応用上極めて重要である。一方で、Boltzmann方程式は分子の衝突を記述する積分項を有しており、この積分項のために数学的な解析が困難となっている。そこで、本研究では定常線型Boltzmann方程式の境界値問題に焦点を絞り、特に境界値から派生する解の正則性および特異性を解析の対象としている。平成29年度は前年度までの結果を発展させ、以下の2つの結果を得ることに成功した。1つは、定常輸送方程式の境界値問題における、解の不連続性の伝播についてである。定常輸送方程式は定常線型Boltzmann方程式と類似の方程式である。2次元または3次元の有界凸領域において、入射境界条件を課した定常輸送方程式の境界値問題を考える。このとき、境界値の不連続性が適当な条件を満たしている場合には解の不連続点が境界値の不連続点を起点とする半直線上に伝播することを示した。また適当な条件下では、境界値の不連続点における跳び(jump)は伝播するにしたがって指数函数的に減衰することを証明した。

この結果は京都大学大学院情報学研究科の川越大輔氏との共同研究で得られた。もう1つは、有界凸領域での定常線型Boltzmann方程式の境界値問題における、境界値の滑らかさと解の滑らかさとの対応についてである。平成28年度の段階では入射境界条件下での解のヘルダー連続性を議論するに留まったが、平成29年度にはより複雑な境界条件である拡散反射境界条件下で解の可微分性を議論することに成功した。この結果は川越大輔氏および国立台湾大学数学系の夏俊雄氏との共同研究で得られた。定常Boltzmann方程式の境界値問題の解の、境界近傍における特異性および領域内部における正則性をいくつか明らかにした。Boltzmann方程式は希薄気体分子の運動を記述するもので、本研究の結果は原子炉や航空機の設計に資すると考えている。また、同様の方程式である定常輸送方程式に対して、境界値から派生する解の不連続性を記述することに成功した。この結果は、近赤外光を利用した次世代の生体断層撮影技術である拡散ひかりトモグラフィに応用されると期待される。平成28年度は、平面境界を持つ領域での非線型Boltzmann方程式の定常解の、境界近傍での増大度に関する特異性の研究に従事する予定である。平成27年度の研究において、代表者は非線型Boltzmann方程式の定常解のモーメント量の、導関数の境界付近での漸近評価を得た。また先に述べた研究の過程で、代表者は既に非線型Boltzmann方程式の定常解の導関数について、境界近傍での増大に関する主要項および第2項を得ている。代表者は、この結果の延長として、非線型Boltzmann方程式の定常解の増大度を評価するのにふさわしいノルムを見つけ、非線型Boltzmann方程式の定常解の増大度を記述するのに最適な関数空間を決定する計画を立てている。経費の執行については、平成27年度に準じた研究連絡の他、ノートPCの購入を計画している。また、今後は定常輸送方程式の係数決定逆問題に取り組むことも視野に入れている。定常輸送方程式は定常線型Boltzmann方程式同様、未知関数の方向微分と積分項を含む方程式であり、代表者が線型Boltzmann方程式で培った知識と技術を用いれば、定常輸送方程式の解の境界値の特異性を観測することで、領域内部での係数の不連続性を検知できると筆者は考えている。この問題は、ひかりトモグラフィと呼ばれる、非侵襲的な生体イメージング技術に応用される。散乱を考えないモデルでは、筆者の提案する方法で係数の不連続性を観測できることは明らかである。そこで、代表者はこの散乱の効果がこの方法に影響を与えるかどうか検証したい。代表者は線型Boltzmann方程式の研究結果から、散乱の効果は境界値の特異性に寄与しないと考えている。今後の研究の推進方策として、2つの問題を解決することを考えている。1つは、平成28年度に得られた結果の拡張である。平成28年度の結果では、いわゆるDirichlet境界値問題のみを考察の対象としていたが、定常線型Boltzmann方程式では他の境界条件も提案されている。その中でも申請者は特に拡散反射境界条件に興味があり、この境界条件の下でも今回と同様の結果を得られるのではないかと予想している。
脳磁場解析による立体視およびその上位制御機構の研究

本研究ではヒトの立体視の成立過程およびその知覚形成時における下位からの情報に対する上位からの制御について,脳活動の非侵襲的計測と理論モデル的考察とによって検討を加えた。脳機能の計測手段としては脳波と脳磁気測定を利用した。脳波測定は従来からよく用いられ,豊富な知見の集積がある。一方,脳磁気測定はごく最近の新しい計測手法であり,脳内活動源位置が高分解能で推定できる利点をもつ。そこで両者を併用する形で測定を行った。ついで,測定から得られたデータから,立体視覚を制御する脳内機構についてのモデル構築に必要な諸情報を抽出した。実験はレベルの異なる3種類のタスクについて行われた。まず単なる閃光刺激に対する脳の一次反応を測定し,活動源の時間空間的性質を明らかにした。具体的には2相性の反応が観測され,閃光刺激提示後潜時約100msと約200msでの視覚領での活動が顕著であり,時間とともに異なる移動軌跡を描いた。次に,2次元図形と3次元図形に対する脳の反応を比較検討した。この場合反応は3相性となり,新たに潜時330msの活動が見られた。このうち様子が最も異なるのは潜時約200msの活動であり,この時点で下位からの情報をもとに3次元性の判断に必要な情報処理が行われているものと考えられる。そして第3のタスクとして奥行き多義立体図形の呈示を行い,その反応を測定した。その結果,奥行き多義性の解消に関係すると見られる上位からの情報の流れが観測された。以上から,立体知覚形成時の脳内での情報処理過程におけるおおよその時間-空間要素が得られたが,上位機構と下位機構の相互作用により生成されていると思われる磁界の様子は大変複雑であり,活動源位置の推定にはさらに検討が必要であろう。
金属ナノ粒子層構造の誘電モデルと発色現象の相関

金属ナノ粒子層のユニークな発色現象の解明のために、材料の光学的・電気的特性を計測し最適な誘電関数の検討を行った。特に本研究では銀基板上の硫化銀薄膜層に注目し、発色面の誘電関数に加えて,光電センサとしての可能性を提案した。誘電関数モデルでは、薄膜干渉モデルとDrude-Lorentzモデルを実験値と比較した。さらに充分硫化した硫化銀層では、光透過性をもつ程度の極薄い膜であっても、可視光に対して内部光電効果を示すことを見出した。金属ナノ粒子が凝集した表層では,金属ナノ粒子単体での共鳴や微粒子間における電場の相互作用や散乱など複雑な光学現象の組み合わせによって,もとの金属材料とは異なるユニークな色を発する.このような発色現象を解明するために,1年目は金属表面の物理的特性の分析と発色現象の定量化を行い,実験結果をもとに誘電モデルを検討した.また,開始時の予定にはなかったが,研究の過程で非常に簡便な手法で作成した微粒子層構造の光電効果を見出した.具体的には,100nm以下の銀ナノ粒子層構造と硫化銀粒子層構造について,誘電モデルの検討を行い,強い吸収をもつ微粒子層と基板と一体と仮定する擬誘電関数と薄膜と基板からなるモデルを比較した.いずれのモデルも分光反射率(発色)での比較では有効であったが,今後はより詳細な光・電気的特性に注目し両モデルの比較を行い妥当性と有効範囲を明らかにする.また,塗装技術にも応用される銀鏡反応によって成膜したガラス基板上の銀ナノ粒子層を硫化させることでできた可視光で約40%の光透過性をもつ20nm程度の硫化銀薄膜において光電効果を確認した.白色LEDを光源とし,印加する矩形電圧信号の振幅およびデューティ比を変化させ,光照射のON/OFFに応じた硫化銀膜の抵抗の変化を検出したところ,光源への印加電圧の変化に追従して硫化銀膜の抵抗値が変化した.硫化銀の熱による抵抗値の変化は古くから知られているが,上記の光照射による抵抗値の変化は温度変化による変化よりも大きく,硫化銀薄膜への光・熱照射に対する導電性の変化は,可視光の吸収によって価電帯から伝導体に励起されキャリアが増加する内部光電効果と熱励起によるキャリアの増加によるものと考えられる.金属ナノ粒子が凝集した表層では,金属ナノ粒子単体での共鳴や微粒子間における電場の相互作用や散乱など複雑な光学現象の組み合わせによって,もとの金属材料とは異なるユニークな色を発する.最終年度は,光学的な誘電関数のパラメータと電気的特性の比較および凝集形態による光学特性の差異について検討した.凝集形態に関する実験では,金属ナノ粒子の光学特性を利用し凝集状態の制御の可能性を見出した.本手法において,直径10-30nmの銀ナノ粒子(媒質:純水)では,凝集の成長によって初期状態での吸光係数のピーク(波長405nm)の減少と波長550nm付近での吸収の増加を示した.吸収と同時に測定した散乱光については,波長470nmで最大であった散乱強度が凝集の成長にともなって,強度を増しながら長波長側に強度ピークがシフトした.初期状態の分散液の吸光係数13の範囲において本手法の有効性を確認しており,特許出願の準備と学協会での口頭発表および論文投稿による成果普及の準備を進めている.光計測,機械システム,光物性金属微粒子層構造の分析がやや遅れているが,これは当初1年目の実施予定になかった金属微粒子構造の光電効果の検討を行ったためである.やや遅れている金属微粒子層構造の物理的特性の分析を行い,これまでに構築した誘電モデルを用いて,発色現象(分光反射率)についてモデルから得られる解析値と実験値と比較し,モデルのパラメータと表面の物理的特性(粒形,層厚,酸化膜など)を対応付ける.さらに,電磁場シミュレーションによる微視的な分極状態の考察と実験の両面から,モデルの妥当性を担保する.また,他の金属についても同様にモデルの有効性を検証する.以上から,微粒子層構造の誘電モデルと発色現象の相関を明らかにする.微粒子層構造の分析の外注を予定していた分の未使用と過去に購入した光学素子や計測装置などを活用した結果,次年度使用額が発生した.初年度に見出した光電効果をもつ微粒子層構造をもつ薄膜の作製のための材料および実験装置の購入を予定している.
欧州人権条約の国内実現における欧州人権裁判所による司法的外交の法的基盤

本研究は、欧州人権裁判所と締約国との間における様々なチャネルを通じた対話の法的基盤とその実効性を検討することである。今次変革が著しい欧州人権条約システム、その司法機関たる欧州人権裁判所の機能に対して、対審による争訟管轄のみならず、締約国裁判所に対する諮問機能をも付与されようとしている。こうした人権裁判所の機能の変化は、増加の一途をたどる申立件数への対処として説明されているが、他方で欧州人権裁判所の国際裁判所としての司法機能はこれまでとは異なる次元に進むことが予想される。この点に関する欧州評議会諸機関(閣僚委員会及び議員総会)、さらには締約国の各機関の間における判決およびその執行にかかわる取り組みと対話、さらにはその法的基盤を明らかにしようとするものである。2018年度は、2018年に開催された、欧州人権条約システム改革に関する欧州評議会ハイレベル会合において採択されたコペンハーゲン宣言の採択をめぐる攻防について検討を行い、その一部を欧州人権条約における国際手続きに関する変遷を整理したものをまとめた。ここでは、各国の憲法的伝統と国内事情を考慮しつつも、欧州人権条約の基準とのバランス、さらには欧州人権裁判所の積極主義的活動に対する制約についての攻防があったことがわかった。この点は、2012年ブライトン宣言、さらには第15議定書への流れとの関係を整理しつつ、検討作業を行った。また第16議定書の採択における欧州評議会各政治機関(閣僚委員会及び議員総会)による判決執行に関わる議論的特徴を確認しつつ、欧州人権裁判所の機能変化に対する欧州評議会規程や欧州人権条約上の法的基礎を明らかにする作業を行った。2018年度は、2018年に開催された、欧州人権条約システム改革に関する欧州評議会ハイレベル会合において採択されたコペンハーゲン宣言の採択をめぐる攻防について検討を行い、その一部を欧州人権条約における国際手続きに関する変遷を整理したものをまとめたものの、それをもう一歩進め、各国の憲法的伝統と国内事情を考慮しつつも、欧州人権条約の基準とのバランス、さらには欧州人権裁判所の積極主義的活動に対する制約についての攻防があったことがわかり、この点のまとめを試みていたが、そこまでには到達できなかった。平成31年度は、継続してきた研究成果を踏まえ、研究課題の本格検討作業を行う年度となる。研究主題とのかかわりにおいて、2019年は、欧州評議会設立70周年及び欧州人権裁判所設立60周年という節目に当たる。そのため、欧州評議会などにおいて、改めてこれまでの欧州人権条約をめぐる活動に対する振り返りが予定されているところでもある。この動きについて丹念にフォローをしつつ、研究課題の最終年度であるため、これまでの研究成果の理論化を行う。以上の研究成果を、邦文及び英文にて取りまとめて公表する。本年度は、第15および第16議定書の採択における欧州評議会各政治機関(閣僚委員会及び議員総会)による判決執行に関わる議論的特徴を確認しつつ、欧州人権裁判所の機能変化に対する欧州評議会規程や欧州人権条約上の法的基礎を明らかにする作業を行った。次に、欧州人権裁判所の活動との間に、欧州人権条約上に課せられる義務内容に対するずれに関して、当該締約国の意思が欧州評議会各政治機関の中でいかに現れているかを探る作業を行った。これによって、当該締約国の国内事情が、欧州評議会各機関・欧州人権裁判所における判決やその執行監視に関わる基準策定にいかなるインパクトを与えているのか、又その改善の為の機能としての諮問機能が果たしうるのか、その対立と協働を探ってきた。欧州人権裁判所長官経験者や判事、さらにはマスメディア・表現の自由に関する欧州のNGO(欧州評議会勤務経験者)にもヒアリングを行う機会を得て、いくつかの知見を得ることができたが、これを2017年度においてまとめ上げることができなかった。

この点は、2012年ブライトン宣言、さらには第15議定書への流れとの関係を整理しつつ、検討作業を行った。また第16議定書の採択における欧州評議会各政治機関(閣僚委員会及び議員総会)による判決執行に関わる議論的特徴を確認しつつ、欧州人権裁判所の機能変化に対する欧州評議会規程や欧州人権条約上の法的基礎を明らかにする作業を行った。2018年度は、2018年に開催された、欧州人権条約システム改革に関する欧州評議会ハイレベル会合において採択されたコペンハーゲン宣言の採択をめぐる攻防について検討を行い、その一部を欧州人権条約における国際手続きに関する変遷を整理したものをまとめたものの、それをもう一歩進め、各国の憲法的伝統と国内事情を考慮しつつも、欧州人権条約の基準とのバランス、さらには欧州人権裁判所の積極主義的活動に対する制約についての攻防があったことがわかり、この点のまとめを試みていたが、そこまでには到達できなかった。2018年度は、継続してきた研究成果を踏まえ、研究課題の本格検討作業を行う年度となる。まず、2017年度の研究作業の中で得た知見を早期にまとめ、欧州人権裁判所の法的基盤にかかわる点に関してまとめることを目標とする。平成31年度は、継続してきた研究成果を踏まえ、研究課題の本格検討作業を行う年度となる。研究主題とのかかわりにおいて、2019年は、欧州評議会設立70周年及び欧州人権裁判所設立60周年という節目に当たる。そのため、欧州評議会などにおいて、改めてこれまでの欧州人権条約をめぐる活動に対する振り返りが予定されているところでもある。この動きについて丹念にフォローをしつつ、研究課題の最終年度であるため、これまでの研究成果の理論化を行う。以上の研究成果を、邦文及び英文にて取りまとめて公表する。2017年度末(2018年2-3月)に国外出張を予定し、かつ、旅費の高騰が予想されたため、その予算をできる限り確保する方策をとっていた。ただ、できる限り旅費を抑えることができたことにより、若干の繰り越しが生じた。また、書籍購入につき、納品の遅れが生じていたが、今年度納入の見込みが立っているので、その支払いに充てる。今年度も、同様の活動を予定しているので、そのための計画的執行に努める。年度末(2019年2-3月)に国外出張を予定し、かつ、旅費の高騰が予想されたため、その予算をできる限り確保する方策をとっていた。しかしながら、ヒアリング対象となる研究者の日程の都合と校務事情により、国外出張を実施することができなかった。ただ、書籍購入につき、2019年度納入の見込みが立っているので、その支払いに充てる。
魚類における細胞性免疫を誘導する抗原エピトープの解析システムの開発

これまでに、ニジマスを用いてMHCクラスIを共有するドナー(クローンニジマスC25及びAB7系統)と標的細胞(RTG-2)を選択すると共に、3倍体ギンブナ(S3N)と同系統に由来する細胞株(CFS)を用いて、ウイルス抗原特異的細胞障害試験法を確立した。また、IHNウイルスにおいて主要な感染防御抗原であるGタンパク遺伝子を用い、DNAワクチネーションによるドナーの感作方法を確立すると共に、クローンニジマスC25系統とMHCクラスI遺伝子を共有するRTG-2細胞を用いて、MHCクラスI拘束性ウイルス抗原特異的細胞障害試験法を確立した。さらに、RTE細胞にIHNV-Gタンパクを発現させることに成功した。以上により、細胞性免疫を誘導するワクチン抗原のエピトープを解析するシステムがほぼ確立できたと考えられる。平成14年度は、本システムの効率向上のために、ドナーリンパ球と標的細胞の混合リンパ球培養(MLC)を行い細胞障害率を高めた。先ず、マイトマイシンCで処理した他系統のギンブナ末梢白血球(PBL)とドナーリンパ球のone way MLCにより、ドナーリンパ球が抗原特異的に増殖することを明らかにした。次に、哺乳類の例に準じて、ドナー個体をin vivoで1回感作した後、one way MLCを実施したところ、培養10日後の感作リンパ球を用いた細胞障害試験において高い細胞障害率が得られた。また、細胞障害活性は用いた標的細胞に特異的であった。さらに、クローンニジマスの鰭を用いて長期培養細胞の樹立を試み、現在継代中である。今後、培養細胞が供試したクローン魚に由来することをDNAフィンガープリント法により確認する予定である。1.MHCクラスIを共有するドナーと標的細胞の選択系統が異なるホモ接合体クローンニジマス5尾、野生型ニジマス3系統9尾及び3種のニジマス細胞株より、全長のMHCクラスI遺伝子を単離し塩基配列を明らかにした。構造解析の結果α1及びα2領域における抗原結合に関与する主なアミノ酸は保存されており、ノザンブロット解析により筋肉や肝臓を除く全ての組織で発現していること及び多型性に富むこと等から、単離した遺伝子は抗原提示に関与する古典的クラスI遺伝子と考えられた。また、野生型個体では2個、ホモ接合体では1個の対立遺伝子のみ発現しており、サザンブロット分析からも遺伝子座は1個と推定された。さらに、5系統のうち2系統(C25,AB7)のクローンニジマスとRTG-2,RTH細胞株の対立遺伝子が一致することが明らかとなった。以上のことから、ドナー及び標的細胞として、C25,AB7系統のクローンニジマスとRTG-2,RTH細胞株が適していることが明らかとなった。2.ギンブナにおけるウイルス抗原特異的細胞障害試験法の確立諏訪湖産3倍体ギンブナ(S3N)と同系統に由来する細胞株(CFS)を用いて、伝染性膵臓壊死症ウイルス(IPNV)及びウナギラブドウイルス(EVA)に感染した標的細胞に対する細胞障害性について検討した。その結果、S3Nドナー由来のリンパ球は、事前にドナーの感作に用いたウイルスに感染したCFS細胞にのみ細胞障害性を示すことが明らかとなった。3.クローン魚由来の長期培養細胞の樹立長期培養細胞の樹立のための適切な組織を選定するために、先ず人工雌性発生法により作出したクローンヒラメを用いて検討した。その結果、鰭及び腎臓より100代以上継代が可能な上皮性及び繊維芽様細胞が得られ、RAPD法により、これらの細胞が供試したクローン魚に由来することが確認された。1.抗原遺伝子を用いたドナーの感作方法についての検討1)発現ベクターの構築:IHN

ウイルスのG4株をRTG-2細胞を用いて増殖させ、RT-PCR法によりIHNVのGタンパクをコードしている遺伝子(1.5kb)を単離した。この遺伝子をヒトサイトメガロウイルスのプロモーターを含んだ発現ベクターへ組み込んだ(pCEP4-IHNV-G)。2)DNAワクチネーション:予備実験の結果、以下の感作方法が最適であることが判明した。pCEP4-IHNV-GプラスミドDNA100μgをPBS(-)に溶解し、ニジマスの背部筋肉内に5箇所に分けて注射する。1ヶ月おきに2回感作し最終免疫の10日後にリンパ球を分離する。2.ニジマスにおけるウイルス抗原特異的細胞障害試験法の確立1において感作したクローンニジマス(C25)よりリンパ球を分離し、エフェクター細胞とした。標的細胞としてMHCクラスIを共有するRTG-2細胞及び共有しないRTE細胞(陰性対象)を用いた。これらの標的細胞を96穴マイクロプレートの各ウエルに2×10^4個ずつ入れ、細胞障害試験の18時間前にIHNVにより感染させた。エフェクター細胞と標的細胞を1:170:1の割合で混合し、20°Cで5時間培養し、細胞障害はLDH遊離法により測定した。その結果、感作したエフェクター細胞は、IHNV感染RTG-2細胞のみを障害し(最大約11%)、未感染RTG-2細胞や感染RTE細胞を障害しなかった。また、未感作C25由来のリンパ球はいずれの標的細胞も傷害しなかった。3.標的細胞におけるMHCクラスIおよびウイルス抗原の発現解析1)MHCクラスI対立遺伝子(Onmy-UA^*501)の組み換えタンパクに対するモノクローナル抗体(H9)を用いて免疫組織化学的手法により解析した結果、MHC I分子は、主に免疫関連組織に発現すると共にリンパ球、マクロファージ、好中球、赤血球及びRTG-2細胞に分布していた。これまでに、ニジマスを用いてMHCクラスIを共有するドナー(クローンニジマスC25及びAB7系統)と標的細胞(RTG-2)を選択すると共に、3倍体ギンブナ(S3N)と同系統に由来する細胞株(CFS)を用いて、ウイルス抗原特異的細胞障害試験法を確立した。また、IHNウイルスにおいて主要な感染防御抗原であるGタンパク遺伝子を用い、DNAワクチネーションによるドナーの感作方法を確立すると共に、C25クローンニジマスとMHCクラスIを共有するRTG-2細胞を用いて、MHCクラスI拘束性ウイルス抗原特異的細胞障害試験法を確立した。さらに、RTE細胞にIHNV-Gタンパクを発現させることに成功した。以上により、細胞性免疫を誘導するワクチン抗原のエピトープを解析するシステムがほぼ確立できたと考えられる。平成14年度は、本システムの効率向上のために、ドナーリンパ球と標的細胞の混合リンパ球培養(MLC)を行い細胞障害率を高めた。先ず、マイトマイシンCで処理した他系統のギンブナ末梢白血球(PBL)とドナーリンパ球のone way MLCにより、ドナーリンパ球が抗原特異的に増殖することを明らかにした。次に、哺乳類の例に準じて、ドナー個体をin vivoで1回感作した後、one way MLCを実施したところ、培養10日後の感作リンパ球を用いた細胞障害試験において高い細胞障害率が得られた。また、細胞障害活性は用いた標的細胞に特異的であった。さらに、クローンニジマスの鰭を用いて長期培養細胞の樹立を試み、現在継代中である。
統合的研究手法による眼球・上肢運動制御における大脳運動関連領野の機能解明

サルにおいて一次視覚野の損傷後、1-2カ月で障害視野への眼球のサッケード運動は回復する。その際、視覚情報は上丘を介して処理される。網膜から上丘浅層への視覚入力は状況に応じて直接上丘中間層へ伝達され、さらに脳幹網様体のサッケード制御回路を直接駆動して超短潜時のexpress saccadeを駆動できる。サルにおいて皮質脊髄路から手指筋の運動ニューロンへの直接経路を遮断しても、訓練によって1-2カ月で個々の指の独立制御による精密把持運動は回復する。その場合の機能代償は、運動ニューロンより数髄節吻側の脊髄固有ニューロンを介する経路によって行われる。中枢神経系における視覚伝導路には、外側膝状体から大脳皮質一次視覚野を経る"膝状体系視覚伝導路"と、上丘浅層を介する"膝状体外視覚伝導路"が存在することが知られているが、たとえば眼球のサッケード運動や視覚性注意などの認知機能の制御に後者の経路がどのように関わり得るのかは明らかでない。そこで様々なサッケード課題を訓練した後に一次視覚野を一側性に損傷したサル2頭において障害側視野に向かうサッケード運動の性質を解析した。その結果、障害側に提示された視覚刺激に対するサッケードは、訓練によって、不正確であるものの、成功率は2ヶ月程度でほぼ正常レベルにまで回復した。障害側に向かうサッケードの反応時間は、1頭のサルでは健常側よりむしろ短く、160ミリ秒程度であり、もう1頭のサルでも健常側よりは遅いが、200-250ミリ秒程度だった。注視点の消灯からターゲットの提示まで50-100ミリ秒のGAPを挿入するGAP課題では顕著にサッケード反応時間は短縮し、障害側に対しても80-100ミリ秒程度の大変短い反応時間のサッケードが観察されることが明らかになった。しかし、障害側へのサッケードでは、健常側へのサッケードの場合のようにこのような大変短い反応時間のサッケードが独立した分布のピークを作る(express saccadeと呼ばれている)を形成するのではなく、より遅めの150-200msの反応時間を示すサッケードと同じひとつの分布のピークを形成することが明らかになった。今後これらの障害側に向かう超短潜時のサッケードが健常側へ向かうexpress saccadeと同様な神経機構によって誘発されるのかどうかを、上丘からのニューロン活動記録によって明らかにしたい。霊長類において大脳皮質の一次運動野に由来する皮質脊髄路線維は手指筋の運動ニューロンに直接結合し、手指の巧緻運動の制御に関与するとされている。我々はマカクサルにおいて皮質脊髄路から運動ニューロンに至る直接結合を頸髄C5髄節で側索の背側部を切断することで傷害した後、訓練によって数週間から2-3ヶ月の期間でprecision gripなどの手指の巧緻運動が回復することを見出した(Sasaki et al. 2004)。このような機能代償にはC3-C4髄節に存在する脊髄固有ニューロンを関する間接的な経路(Alstermark et al. 1999; Isa et al. 2006)が関与していると考えられる。このような機能代償の中枢神経機構を知るために大脳皮質一次運動野の手指支配領域の局所フィールド電位と手指筋の筋電図活動を記録し、皮質-手指筋コヒーレンス(cortico-muscular coherence ; CMC)と手指筋同士のコヒーレンス(musculo-muscular coherence ; MMC)が、皮質脊髄路の切断前と切断後の回復過程においてどのように変化するかを解析した。皮質脊髄路の切断前、1頭目のサルは17HzのCMCは観察されたが、MMCは観察されなかった。もう1頭のサルではいずれのコヒーレンスも観察されなかった。皮質脊髄路の切断後、1ヶ月以内にいずれのサルでも30-40HzのMMCが近位筋から遠位筋にいたる広汎な範囲で観察されはじめ、回復に従って増強した。一方でCMCは消失し、回復はみられなかった。以上の結果からMMCが機能回復の過程で増強すること、さらにその生成には運動野や運動野から運動ニューロンへの直接投射は関与していないことが示唆された。近年、我々は、マカクザルにおいて、頚髄C4-C5髄節で側索背側部を切断して外側皮質脊髄路を遮断しても、訓練によって1-2週から1-2ヶ月で手指の精密把持運動が回復することを明らかにした。この回復には皮質脊髄路の信号を運動ニューロンに伝達する脊髄固有ニューロン系や網様体脊髄路系が重要な役割を果たすと考えられる。脊髄損傷からの機能回復過程における上位中枢の果たす役割を明らかにするために、マカクザル3頭に、手指の精密把持運動を訓練した。

そしてその課題遂行中の脳活動を陽電子断層撮影装置(PET)を用いて計測した。すると、手の反対側の一次運動野と一次体性感覚野の上肢領域から頭頂連合野の活動の増加が観察された。そして、その回復初期(1ヶ月)と回復安定期(3-4ヶ月)の脳活動を計測して比較したところ、回復初期においては両側の一次運動野の上肢領域での活動の増加。安定期においては反対側の一次運動野の活動領域が拡大するとともに、両側の運動前野腹側部にも活動の増加が観測された。そして、他2頭のサルにおいてこれらの領域に、ムシモルを注入して局所的に活動をブロックしたところ、回復してきた運動に再度障害が見られたことから、これらの活動増加領域が実際に機能回復に寄与していることが実証された。さらに、これらのサルで障害肢の反対側の側坐核において機能回復過程での活動の上昇が観察された。そこでこの側坐核の活動と同じ一次運動野の活動との課題ブロックごとの血流量の間の相関を解析したところ、損傷前には相関は観察されなかったが、回復過程において側坐核と一次運動野との活動の相関が上昇することが全てのサルで確認された。さらに相関は前頭眼窩回、前部帯状回皮質などとの間でも上昇が確認された。このようにして、いわゆる「モチベーションの中枢」が機能回復過程において運動学習の中心的な役割を果たす一次運動野で機能的結合を強めることが明らかになった。これまでの研究で、サルにおいて皮質脊髄路を頚髄C4/C5レベルで傷害したのち、手指の精密把持運動は一時的に障害されるが、訓練により1-2か月の経過で回復することを見出した(Sasaki, et.al. 2004)。そして、このような機能回復モデルを用いて中枢神経損傷後の機能回復過程を様々な側面から解析してきた。本年度は、健常サル4頭、損傷後2週間のサル4頭、損傷後3か月のサル4頭の両側の一次運動野手指領域、運動前野背側部、運動前野腹側部の組織を採取して、マイクロアレイによって発現遺伝子を解析した。その結果、発現が大きく変動した遺伝子については、損傷反対側一次運動野(M1)においては2週間後にその数が大きく増加した後、3ヵ月後では現象しているのに対して、両側の運動前野背側部(PMd)や運動前野腹側部(PMv)及び同側のM1においては3ヶ月後にかけて大きく発現が変化する遺伝子の数が増大することが明らかになった。また、変化する遺伝子の内容も、両側のPMd, PMv及びそれら同士の間では共通していたが、損傷反対側のM1とは大きく異なっていた。このように損傷直後に反対側M1でおきる変化の内容と運動前野で回復安定期にかけて起きる変化の内容は異なることが明らかになった。また、それぞれの領域全体の遺伝子発現様式に差のみられる遺伝子については、2週間後に大きく減少し、そして3ヵ月後に再度増加すること、そしてその内容は健常サルとは異なるものが多いことも明らかになった。この結果は、損傷後、領域間の遺伝子発現が一度未分化な状態になり、その後再度分化する可能性を示唆している。現在、発現を変化させる遺伝子の内容について詳細に解析している。私たちの研究室は一次視覚野の損傷後、視覚的意識が喪失するのも関わらず、視覚対象への行動が可能であるという「盲視」のメカニズムを明らかに知るために、片側の一次視覚野を吸引除去したマカクザルを用いて研究を行っている。一般に、作業記憶と意識は相互に近い関係にあるとされている。作業記憶があることが意識があることの証明であるとさえ言われている。
自閉症におけるマイクログリア依存的シナプス除去機構の破綻とBDNFによるその回復

神経回路の形成は神経活動依存的なシナプスの形成・競合および除去・成熟という過程を経て完成する。脳が正常に機能するためには、発達期におけるシナプス除去によって適切な数のシナプスが正常な領域に形成される必要がある。シナプス形成機構の不全は神経回路の機能障害をもたらし、自閉スペクトラム症(autism spectrum disorders : ASD)やてんかんなどの神経発達疾患の要因となることが示唆されている(Gatto et al., Front Synaptic Neurosci 2010)。しかし、神経発達疾患においてシナプス除去が不全となるメカニズムは明らかにされていないため、有効な治療法は確立されていない。本研究では、特に罹患率が高く、近年非常に注目されている疾患であるASDに焦点を当て、シナプス除去が不全となっている可能性およびそのメカニズムの解明を目指した。本研究では、poly(I:C)マウスの苔状線維シナプスの構造学的および機能学的な検証を完了し、海馬における興奮性シナプス密度の上昇を発見した。また、各種の行動学的試験により、poly(I:C)マウスにおいて自閉スペクトラム症様行動の上昇を確認した。さらに、成体期のマウスに運動をおこなわせることにより、一部の海馬神経細胞の活動を上昇させ、最終的にはマイクログリアによるシナプス貪食を誘導することに成功した。なお、成体期における運動は自閉スペクトラム症様行動を改善させることを発見し、当初の計画を完了した。27年度が最終年度であるため、記入しない。poly(I:C)-ASDマウスの苔状線維シナプスの構造学的および機能学的な検証をおこなった。poly(I:C)-ASDマウスの海馬CA3野における興奮性および抑制性シナプスの発達時期依存的な変化を、構造学的(免疫染色法等)および機能学的(電気生理学的手法:パッチクランプ法および脳波の解析)な側面から詳細に解析した。その結果、poly(I:C)-ASDモデルマウスのCA3野における苔状線維の興奮性シナプス数が増加することを発見し、抑制性シナプス数にはコントロールマウスと変化がないことが明らかになった。海馬CA3野におけるシナプス除去へのマイクログリアの関与を検証した。まずコントロールマウスで確認された発達時期依存的なシナプス除去(P15-P30)にマイクログリアが関与する可能性を検証した。同時期にマイクログリアの活性化を抑制するミノサイクリンを投与したところ、シナプス除去が阻害され、CA3野におけるシナプス数の上昇することを免疫染色法によって確認した。また、マイクログリアによるシナプス貪食を、免疫染色法と3D画像再構築法を利用して検証したところ、発達時期依存的なシナプス除去にマイクログリアによる貪食作用が関与することが明らかになった。なお、同様の解析により、poly(I:C)-ASDマウスの海馬CA3野ではマイクログリアによるシナプス貪食能力が低下していることを明らかにした。poly(I:C)-ASDマウスの苔状線維シナプスの構造学的および機能学的な検証はほぼ完了した。特に、構造的な観点から、海馬CA3野における興奮性シナプスの数のみが上昇していることを明らかにし、計画の一部が完了した。電気生理学的手法を用いた機能学的な検証に関しては、海馬CA3野における興奮性入力がASDモデルマウスにおいて上昇することを明らかにしつつある。現在は興奮性入力のより詳細な解析を続けている。本件に関しては、当初の計画をほぼ達成したといえる。その結果、マイクログリアによるシナプス貪食作用が発達期の海馬CA3野におけるシナプス除去に関与することを明らかにした。本件に関しては、当初の計画を完了した。なお、マイクログリアの活性化度合いを定義する新しい指標を確立するためにマイクログリアのCa2+動態変化を検証した。

本件に関しては、Iba1-YCnanoマウスを利用して、細胞体におけるCa2+動態変化の検出には成功したが、活性化度合いとの相関性などの検証はおこなっていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。マイクログリアのシナプス除去への神経活動の関与の有無を検証する。具体的には、ASDモデルマウスの一部の顆粒細胞の神経活動の上昇によって、苔状線維シナプス間に活動の強弱を誘導し、活動の弱いシナプスをマイクログリアに除去させることを試みる。また、顆粒細胞の神経活動とマイクログリアの活性化を結びつける因子としてBDNFの関与を検証する。これは、顆粒細胞が特にBDNFの発現量が強い神経細胞であり、活動依存的にBDNFを放出することが知られているためである。まず、顆粒細胞の神経活動を薬理遺伝学的にコントロールすることを試みる。薬理遺伝学的手法としてDREADDシステムを利用する。同システムでは、遺伝子改変を加えたムスカリン受容体と、これらの受容体に特異的なリガンドである「CNO(clozapine-n-oxide)」を処置することにより、in vitroおよびin vivo(腹腔内投与で可能)の実験系でDREADD受容体を発現させた神経細胞のみを、活性化または不活性化させることが可能である。DREADD受容体はAAVウィルスを用いて顆粒細胞に感染させる。上述の実験系を用いて、まずin vivoで苔状線維シナプスの神経活動に強弱を誘導し、マイクログリアが活動の弱いシナプスを選択的に貪食する可能性を免疫染色法によって検証する。次に、海馬切片培養系においてDREADDにより顆粒細胞の活動を変化させた際のマイクログリアによるシナプス除去をタイムラプスイメージング法によって可視化する。マイクログリアを可視化するためには、CX3CR1-GFPマウスを利用する。また、神経活動依存的な、マイクログリアによるシナプス除去にBDNFが関与する可能性を組織培養切片系で検証する。
ヒト免疫応答の遺伝的制御に関する分子生物学的研究

ヒト主要組織適合抗原系(HLA)は、その特定の対立遺伝子と免疫異常に起因する疾病との強い相関より、疾病の遺伝要因として重要であると考えられている。本研究は、HLAによるヒト免疫応答および疾病感受性の個体差の形成機序を、解明することを目的とし、以下の成果を納めた。1)HLA領域の遺伝子構成の解析:21水酸化酵素欠損症の原因として、偽遺伝子と機能的遺伝子との問に生じた遺伝子変換による場合が、存在することを明らかにした。2)HLAーDQの機能に関する研究;各種の抗原に対する免疫低応答性と、特定のHLAーDQ対立遺伝子との強い相関をDNAレベルで明らかにし、低応答性が優性形質であることを集団レベルでも確認した。低応答者にのみDQと抗原を認識するCD4AA+BBT細胞が存在し、これが免疫抑制活性を有するCD8AA+BBT細胞の増殖および活性化を誘導することを明らかにした。3)HLAーDQトランスジェニクマウスの解析;HLAーDw12ハプロタイプに由来するDQw6遺伝子を、B6マウスに導入し発現させた。このマウスは、溶連菌抗原に対する免疫応答性を獲得し、大腸菌抗原に対する応答性を喪失した。つまりDQ遺伝子の発現により個体の免疫応答性を変えることに成功し、in vivoにおけるHLA分子の機能を解析する実験系を確立した。4)疾病感受性遺伝子の解析;インスリン依存型糖尿病、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患と、HLAーDRあるいはDQ対立遺伝子との相関を、DNAレベルで同定した。本研究を通じて、特定のHLAーDQ対立遺伝子が、特定の抗原に対する免疫低応答性を、優性形質として決定することにより、免疫応答の個体差を支配し、これが免疫異常に起因する疾病の遺伝要因となっている可能性を示した。HLAーDQ分子の生物学的機能を解析する目的で、HLAーDw12ハプロタイプに由来するDQw6αおよびβ遺伝子を、C57BL/6マウス(B6)に導入し、主要組織適合抗原としての機能を有するHLAーDQw6遺伝子を、継代的に発現したトランスジェニックマウス(DQw6ーB6)を1系統樹立することに成功した。DQw6分子の発現はIーA分子のそれと同様の組織特異性を示し、IーA陽性脾細胞の約42%がDQw6陽性であった。ILー4により脾細胞におけるDQw6分子の発現は増加したが活性型T細胞には、その発現は認められなかった。二次電気泳動法によるクラスII分子の解析では、IーA分子とDQw6分子との間に雑種クラスII分子の形成は認められなかった。DQw6ーB6はDQw6分子に対して抗体を産生せず免疫寛容を獲得していた。B6は溶連菌抗原に対して低応答を示したが、すべてのDQw6ーB6は溶連菌抗原に対する応答性を獲得し、この免疫応答は抗DQ単クローン抗体により阻止された。HLAクラスII分子に特異的な単クローン抗体によるヒトMLRの阻止実験により、同種MLRではDR分子が主にこれを刺激し、自家MLRではDRおよびDQ分子が同等にこれを刺激していることが明らかとなった。HLAクラスII遺伝子を発現したマウスL細胞は、ヒトMLR反応性のT細胞を活性化できることが確認できたため、これとCD4陽性T細胞をILー2の存在下で混合培養し、限界希釈法によりMLR反応性T細胞の頻度を検討した。その結果、同種あるいは自家DQ分子を認識するT細胞の頻度は同種DR分子のそれに匹敵するほど高いことを明らかにした。一方、単球におけるDQ分子の発現量は、DR分子のそれと比べ著しく小さかった。

DQ分子反応性T細胞の頻度が高いにもかかわらず、自家MLRが小さい、あるいは同種MLRにおけるDQ分子の関与が小さい理由は、刺激細胞におけるDQ分子の発現が小さいためと考えられる。今後これらのDQ反応性T細胞の機能解析は重要な研究課題である。溶連菌に対する免疫抑制遺伝子とHLA-DQ遺伝子との関係を明らかにするため、80名の健常人の溶連菌抗原に対する免疫応答性を、試験管内T細胞増殖反応として定量し、DNAレベルで解析したDQ対立遺伝子の多型と比較した。低応答群でDQA1.2(X^2=4.1),DQA1.3(X^2=4.18)および、DQB1.4(X^2=4.2)の有意の増加を、高応答群でDQA3(X^2=8.72),DQB3.3(X^2=7.4)および、DQB4.1(X^2=4.78)の有意の増加を認めた。HLA領域には、強い連鎖不平衡が存在するので、ハプロタイプとしてみると、DR2-DRw(-)-DQA1.2DQB1.5(DQw6),DR2-DRw(-)-DQA1.3DQB1.4(DQw6)が低応答性を、DR4-DRw53-DQA3DQB4.1(DQw4),DR9-DRw53-DQA3DQB3.3(DQw3)が高応答性を支配していると考えられた。低応答性と相関のあるハプロタイプと高応答性と相関のあるハプロタイプのヘテロ接合体であるDQA1.2またはDQA 1.3/DQA3のドナ-の応答性は、低応答性と相関のあるDQA1.2ないしDQA 1.3のホモ接合体同様、低い応答性を示し、優性形質として低応答性を支配する免疫抑制遺伝子の存在が家系調査同様確かめられた。DR4-DRw53-DQA3DQB4.1(DQw4)を有する高応答者8名及び、DR2-DRw(-)-DQA1.3DQB1.4(DQw6)を有する低応答者8名より得たSCW特異的T細胞株がいずれのHLA分子を抗原提示分子として認識し増殖しているかをDR4,DRw53,DQw4,DR2(AB1),DR2(AB5),DQw6分子をそれぞれ単独に発現した形質転換細胞を用いて検討した。高応答ハプロタイプ:DR4-DRw53-DQA3DQB4.1(DQw4)に関しては、DR4分子が主に関与し、DQw4分子の関与は、認められなかったのに対し、低応答ハプロタイプ:DR2-DRw(-)-DQA1.3DQB1.4(DQw6)に関しては、DQw6分子もDR2分子同様免疫応答に関与していることが明らかになった。今後、このDQw6に拘束されたT細胞が免疫低応答性の発現に関与しているか否かについて、DR4に拘束されたT細胞と比較することにより検討する予定である。溶連菌細胞壁抗原(SCW)に対する免疫低応答性は、HLAと連鎖した免疫抑制遺伝子により決定されている。昨年度低応答者にはHLAーDQ拘束性CD4^+T細胞が存在し、このT細胞がCD8^+T細胞の増殖を誘導することを観察した。本年度は、低応答者から免疫抑制活性を有し、αβ型T細胞受容体を発現したCD8^+T細胞を分離し、解析した。T細胞受容体に特異的な単クロ-ン抗体による解析では、CD8^+T細胞の多くは、T細胞レセプタ-Vα2およびVβ5.2遺伝子を発現していた。また胞体内にパ-フォリン顆粒を有することが、組織化学的検索により明らかとなった。CD8^+T細胞は、抗CD3単クロ-ン抗体の存在
カリオロジーに基づく齲蝕の診断法および治療法の開発

齲蝕は口腔内細菌による感染症で、可及的な歯質の保存が歯の寿命の延長につながるというコンセプトを基本とし、齲蝕の診断法および治療法を総合的に研究した。すなわち、「齲蝕歯質の細菌の同定およびその動態と生死の解明」「齲蝕活性度、感染歯質検知法および除去法の開発」「カリエスリスクの臨床的・免疫学的検討」を行い、以下の成果を得た。齲蝕象牙質の微少切片よりの細菌DNAの抽出法を確立し、細菌種を同定した。齲蝕歯質の客観的評価法として、コンピューター上に齲蝕検知液で染色した齲蝕歯質の画像を取り込み、色調補正と色の数値化を行う「齲蝕歯質の客観的色彩評価法」を考案した。正確かつ客観的な齲蝕診断法を開発する目的で、pHイメージング顕微鏡を用いた表面分析法を考案し、これにより齲蝕と健全部との判別が可能であることを示した。齲蝕部に特異的な自家蛍光反射を利用した齲蝕診断法の開発を目的に、脱灰と自家蛍光反射との相関性を明らかにした。酸性溶液を応用した齲蝕除去法を検討する目的で、クロラミンと次亜塩素酸ナトリウムの齲蝕象牙質に与える影響を走査型電子顕微鏡で示した。窩洞形成時のメカニカルストレスやケミカルストレスによって起こる歯髄細胞のアポトーシスを明らかにした。コンポジットレジン充填の予後に影響するリスク因子を明らかにする目的で、カリエスリスク因子やレジン充填のclinical variableを調べ、それらとレジン充填の経過との関係を明らかにした。齲蝕歯の程度と習慣性租借との関連について検討し、齲蝕を有する患者の咀嚼側と臨床パラメータとの相関性を示した。二次齲蝕の発生機序を検討する目的で、歯科修復材料-唾液界面において形成されるバイオフィルムを共焦点レーザー顕微鏡で分析し、この中の細菌比率を明らかにした。また、長期使用が可能な安全性の高い除菌剤を使用した簡便な除菌システムでのPMTCの効果を明らかにした。本年度の研究は、齲蝕病態の解析、齲蝕診断、齪蝕除去法、そして齲蝕リスクの疫学的解析と予防法について行われ、下記の成果を得ている。1.齲蝕の病態の解析:象牙質歯齲蝕深部の細菌の検索を目的に、歯齲蝕象牙質削片より細菌16SrDNAの抽出に成功した。そして細菌培養法および組織学的検索では同定されなかった細菌種を発見した(尾崎、小松)。2.齲蝕診断の開発:齪蝕象牙質のpH変化を指標とする診断法の確立を目的に、光走査型化学顕微鏡を用いて健全歯質と齪蝕部位のpH分布を調べ、これが齪蝕診断法に応用できる可能性を示した(二階堂、北迫)。また、成人における歯齲蝕のリスク判定を目的に、唾液粘度との関連を検討した(北村)。DIAGNOdentによる齲蝕診断の科学的根拠を検証するため、共焦点走査型レーザ顕微鏡による齲蝕部特異的自家蛍光反射とX線マイクロアナライザーによる同部の成分変化の相関性を検討し、基質変化が起こっている部位に特異的蛍光反射が認められることを示した(岡本)。