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日韓山岳宗教の比較研究―その聖地観・神観念・宗教的実践をめぐって―

本研究課題は、北部九州の英彦山・朝鮮半島南部の智異山における山岳宗教聖地の調査研究を通して、日韓山岳聖地の構成要素を把握するとともに、日韓双方の山岳宗教の歴史的変遷を明らかにし、地域社会における山岳宗教の民俗的意義について考察することを目的としている。上記の研究課題を達成するため、3年目となる本年度は、韓国智異山の聖地構成・神観念・宗教的実践についての調査研究を集中的に実施した。聖地構成については、智異山東麓の主要寺院(西院・碧松寺・龍遊堂・天王寺等)の構成と景観を把握するとともに、天王峰にいたる山内聖地(法界寺・カルバウィ・マンバウィ等)の踏査を行った。また、神観念については、伝統的な朝鮮半島の神観念と、朝鮮戦争を始めとする近現代の歴史とが併せ語られる状況を伺うことができた。また、宗教的実践については、龍遊譚のクッ堂において巫者の祭祀を実見するとともに、山神信仰と巫者との関係性についての聞き書き調査を実施した。また、智異山と山岳宗教との関係性とその歴史的な変遷を明らかにするため、朝鮮宗教史を中心とした本研究関連に関連する文献資料を収集するとともに、その分析を進めた。なお、本年度の研究成果については、Journal of Mountains and Humanities(Vol.3)、および『宗教研究』90(別冊)に論文・報告を発表した。また、第75回日本宗教学会(早稲田大学)のパネル発表「山岳宗教の再構築」において口頭発表を行った。27年度の韓国でのMERS流行を受け、当初27年度に予定していた韓国調査の一部を、28年度に実施することとなった。本年度は、智異山東麓の山岳宗教関連地の踏査、および宗教職能者への聞き取り調査を実施するとともに、朝鮮宗教史関連資料および図像資料の収集を実施した。これにより、本研究の調査課題としていた日韓の山内・山麓・遠方地域における現地調査を一通り終えることができた。また研究成果の公表については、海外学術誌に学術論文、国内学術誌に学術大会報告をそれぞれ一報ずつ発表するとともに、国内学会において口頭発表を実施するなど、順調に実施することができた。なお、研究の進展に伴って、智異山山頂付近に未踏査の洞窟聖地が存在することが確認できた。これらは韓国山岳宗教の聖地観を知る上でも重要な調査地点であるが、冬季に現地調査を実施することが困難であったため、補助事業期間を1年間延長する申請を行った。期間延長申請の承認を受け、当初冬季に予定していた現地調査を来年度の春季に実施することにより、本研究課題をさらに精緻なものとしていきたい。本研究課題は、北部九州の英彦山・朝鮮半島南部の智異山という日本・韓国を代表する山岳宗教聖地の調査研究を通して、下記の3点を明らかにすることを目的としている。1現地調査に基づく日韓山岳聖地の構成要素の把握、2日韓山岳宗教に関する文献・図像資料調査に基づく山岳宗教の歴史的変遷の解明、3日韓山岳周辺地域の現地調査による山岳宗教の民俗的意義の解明。上記の課題を達成するため、延長年度となる本年度は、主として智異山の山岳宗教の聖地観について、研究をより精緻にするための現地調査を実施するとともに、英彦山の山岳宗教の現地補充調査、および成果発表を実施した。智異山の現地調査は6月の下旬に実施した。当初は智異山頂付近の窟を調査実施する予定であったが、現地研究者のコーディネートにより、儒者・僧・ムーダンといった智異山域で活動する諸宗教者への聞き取り調査が可能になったため、調査の力点をここに置くことにした。また、併せて智異山南麓と北麓の山岳聖地(理明山・寒山寺・青鶴洞・霊源山・上無住庵・仙人窟)の踏査を実施した。
分子内三連続付加反応の開発と生理活性化合物合成への展開

同一分子内に複数のα,β-エノン系とα,β-不飽和エステル系を持つ基質に対して各種塩基を作用させ、分子内及び分子間での三連続反応についての検討を行った。先ず上記の系間における分子内連続反応(分子内二重ミカエル反応)では高立体選択的に反応が進行し、双環性化合物が高収率で得られた。然し乍らキラル補助剤を用いる不斉合成については現在のところその目的を達成するには至っていない。次いで三連続反応の検討を行い、分子内二重ミカエル反応に続くアルドール反応及びアルキル化について成功し、新しい合成方法論を開発し得た。この新反応はtricyclo[6.2.2.0^<1,6>]dodecane,tricyclo[5.3.1.0^<3,8>]andecane系を持つセスキテルペン類の合成へと展開しつつある。
高コレステロール血症治療薬スタチンによる横紋筋融解症発症機序の解明

高コレステロール血症治療薬スタチンは横紋筋融解症や筋力低下などの筋毒性をもつが、その発症機序は不明である。低分子量G蛋白質Rabは、脂質ゲラニルゲラニルピロ燐酸(GGPP)を介してオルガネラ膜に結合し、小胞輸送を制御する。我々は以前、スタチンがGGPPを枯渇させ、Rabを不活性化させて筋空胞変性を起こすと報告した(Sakamoto et al.,2007EASEB J)。しかし、Rabには60以上のアイソフォームがあり、それぞれが固有の輸送経路を制御する。本研究では、スタチンがどのRabアイソフォーム、どの経路を阻害し筋毒性を起こすのか調べた。小胞体・ゴルジ輸送は全小胞輸送系の起点であり、Rab1Aが制御する。初代培養ラット骨格筋線維に1μMフルバスタチン(Flv)を4日間作用させると、Rab1Aは膜から離脱した。GGPP補充で膜への結合は回復した。GGPPは、Flvによる空胞変性と壊死も抑制した。ER-ゴルジ輸送阻害薬ブレフェルジンAはFlvによる毒性を再現した。以上より、スタチンがRab1Aを阻害し、細胞内の物流が停滞して、筋が壊死すると考えられる。さらに、スタチンによる筋収縮低下について検討した。Flv(10μM)存在下で筋線維を3日間培養するとカフェイン誘起性収縮が有意に抑制した。スタチンは、筋原線維には影響しなかったが、筋小胞体Ca^(2+)貯蔵量および筋ATP量を低下させ、これらが収縮抑制の原因と考えられた。スタチンはミトコンドリア障害を起こし、これがATP低下の原因だと思われる。GGPPはスタチンによる収縮抑制、ATP低下を抑制した。本研究より、スタチンによる筋壊死や収縮抑制が低分子量G蛋白質の不活性化が原因であることが分かった。またスタチンの毒性が、GGPP補充で軽減できることも分かった。治療への応用が期待される。
極超微粒子表面電場増大法による赤外発光分光法の感度上昇とその応用

物質の構造による情報を与える振動分光法の代表的な測定法として、赤外分光法が広く用いられている。そのうち特に赤外発光分光法は、赤外光に対して透明ではない試料や、表面が平坦ではないような試料などの実用材料に対して、その場測定が可能であるという優れた特徴を有している。しかし、赤外分光法は感度があまり高くないという面もあった。そこで本研究は、赤外発光分光法の感度増大と、感度上昇のメカニズムの解明を目標として行われた。具体的に実験方法は金属微粒子薄膜を用いることによる、表面電場の増大から赤外発光の信号強度の改善を考えた。その結果、基板層に高反射率層を用いた場合、垂直偏光において70゚80゚の高い取り出し角で測定することによって約4倍程度の感度上昇が認められた。また基板層に透明体層を用いた場合、垂直、平行両偏光において大きな感度増大が認められた。これらの感度増大のメカニズムの解明のために計算によるシミュレーションを行った。金属微粒子薄膜を回転楕円体として近似し内部における分極率の変化を求め、さらに微粒子間の相互作用をBruggemanの有効誘電率近似法を用いて、発光スペクトルをシミュレートした結果、計算値は実験結果とよく一致した。そこから金属微粒子薄膜を用いた場合の発光強度の増大は、金微粒子内の分極率の変化および微粒子間の相互作用による物と考えられる。またこの表面増強赤外発光法の応用例として黒鉛炉原子吸光法の炉内反応について測定を行った。その結果炉内反応について新たな知見が得られたことから、この測定法は非常に有効であると結論された。また、この測定条件が触媒反応のその場測定にすぐ応用が可能なことから今後、さらに実験を行いたい。
十二指腸乳頭部Oddi筋と消化管運動の相関ならびにその機能異常に関する研究

胆道生理学上、基本的かつ重要な事項にもかかわらず不明な点の少なくなかったヒトOddi筋の基本的運動様式そして胆汁排出機転におけるOddi筋の果す生理的役割について体液性、神経性両調節機構の両面から著者創案のPTCDル-トからのOddi筋、十二指腸運動測定を行い検索した。まずOddi筋の運動様式について十二指腸migrating motor complex (MMC)との関連から検索した結果、Oddi筋の運動リズムは決して一様なものではなくMMCの経過において大きく変化することが判明するとともに、両者の間で極めて興味のある臓器相関が認めてれた。このことからも胆道の生理ならびにその病態については他消化管との関連からの総合的観点に立った把握が不可欠なものと考えられた。胆汁排出機転におけるOddi筋のphysiologic roleについて、まずOddi筋運動と胆道35mm cine film撮影の同時2現象記録を行った結果、Oddi筋収縮運動は胆汁排出を促進するのではなく、反対に抑制、阻止することをはじめて具体的に明らかにした。さらにこの重要な問題点を解明すべく、胆汁排出促進が最も要求される食餌期すなわち内因性CCK負荷時のOddi筋運動について体液性調節機構との関連から検索した結果、胆汁排出にはOddi筋収縮運動は不要であり、換言するとOddi筋運動の不在下(弛緩)においてこそ大量胆汁排出が可能になることも確認することができた。Oddi筋運動抑制効果について、神経因子との関連からatropineを投与し検索した結果、Oddi筋弛緩反応については体液性因子が神経因子より優位にあることがうかがわれた。CCK負荷時の空腸運動亢進については定説となっているが十二指腸については定かでない。内外因性CCK負荷時の十二指腸運動について検索した結果、ヒト十二指腸での抑制効果が観察され、この両者におけるparadoxical responceは胆襄収縮とOddi筋弛緩と同様極めて興味ある現象と思われる。胆道から十二指腸への胆汁排出は食餌期のみならず非食餌期(空腹期)においても行われており、食餌期における胆汁排出とOddi筋運動についてはかなり解明されてきているが、空腹期のOddi筋運動については動物実験での報告は散見されるものの、ヒトにおいては全く不明といって過言でない。そこで教室創案のnew approach法によりヒト9例について、十二指腸migrating motor complex(MMC)とOddi筋運動との関連について検索した。測定9例のうち4例でMMC phaseIからphaseIIIまで全経過の記録が可能であった。すなわちこの4例は十二指腸が全く静止期にあるphaseIでもOddi筋は3.8±0.4cycles/minの周期的運動をくり返しており、amplitudeはそれぞれ76±27mmHg、157±67mmHg、67±19mmHg、79±23mmHgであった。十二指腸運動が間歇的に出現してくるphaseIIではOddi筋は良くこれと相関し、そのfrequency2.8±0.6cycles/minと若干低下し、持続時間は19.5±2.5分であり、35個の連続した収縮波群の間歇出現が特徴的であった。

そして1分間に11回前後の著明な十二指腸運動亢進を示すphaseIIIではOddi筋もこれに連動してそのfrequencyは10.0±0.5cycles/minとなり、その持続時間は3.6±0.7分であった。すなわちduodenal phaseIではOddi筋は十二指腸より機能的独立性を有し運動しているが、phaseII、phaseIIIではこれと密接な関連を有していることが判明した。このことは空腹期においてOddi筋は一様なリズムで運動しているのではなくMMC cycleとの密接な関連を示すものである。これを胆汁排出との関連についてみると、肝胆道scintigraphy,35mm cine film撮影分析からphaseIII、そしてphaseIでも胆汁排出抑制が強く示唆された。今回のヒトにおける結果そして欧米でのopossum、イヌで成績はそれぞれ相互にかなり異なっており、種差による影響と思われるがこの点に関しても、生理学の最終目標であるヒトでの検索を引きつづき行う所存である。I内因性CCK負荷時のOddi筋運動(食餌期におけるOddi筋運動)。これまで胆汁排出機転におけるOddi筋運動のphysiologic roleについて、外因性CCK負荷(静注)を行い検索してきたが、より生理的状況下、すなわちCCK血中濃度上昇を惹起する脂肪剤を十二指腸に注入(内因性CCK負荷)を行いOddi筋運動(5例)にいて検索した。この結果、負荷前を100%としたmotility index(%)は15分、30分、45分、60分、75分までについてみると、それぞれ1.0±1.5%、1.3±1.6%、5.4±3.1%、79.3±44.6%、182.8±56.5%であった。すなわち内因性(CCK負荷45分まではOddi筋運動波形は消失しており、このことは胆汁排出促進が最も要求される食餌期においてOdii筋運動が全く不要であることを如実に示すものである。IIOddi筋運動と胆道X線映画の2現象記録(非食餌期のOddi筋運動)。NDS内の波形伝播方向が同時性の5波形について検索した。波形の振幅は79±4mmHg、持続時間4±0.4秒で波形の上昇部分(収縮相)と下降部分(弛緩相)から構成されており、その持続時間はそれぞれ1.3±0.1秒、2.7±0.4秒であった。そして次の波形が出現してくるまでの平均時間は14.1±0.5秒であった。そしてOddi筋運動波形消失時十二指腸へ排出されていた胆管内の造影剤は波形の出現とともに中断され始め、この際のNDS完全閉鎖に要した時間は収縮相の35%に相当した。以後波形は最大振幅に達していて弛緩相に移行したが、造影剤の排出は未だみとめられず波形が基線に復した0.7±0.3秒より次の波形出現まで持続的に観察された。すなわちOddi筋のphasic contractionは胆汁排出を促進するのではなく、抑制することが始めて具体的かつ客観的に明らかとなった。CCK,caeruleinを投与し実際の胆汁排出状況を観察し、4例でOddi筋運動消失時の乳頭部弛緩開大時に多量胆汁の排出を確認した。これまでOddi筋の調節因子として体液性調節機構との関連から内外因性CCK負荷時のOddi筋運動について検索し,胆汁排出機転における同調節機構の重要性について報告した。今回,Oddi筋の神経性調節機構の把握の一環としてatropine(0.01mg/kg)を5例に投与し検索した。
クレソンに含まれるグルコシノレートの分子種分析と脂質代謝改善効果の解析

昨年度の研究により,クレソン(Nasturtium officinale)はフェネチルイソチオシアネート(PE-ITC)及び1,3-ジフェネチルウレア(PE-UR)という抗炎症効果を示す物質を豊富に含むことがわかった。そこで,これらの物質がクレソンの脂質代謝改善効果に寄与するかを動物実験により調べた。まず,ヒト可溶性エポキシヒドロラーゼ(sEH)に対するPE-ITC,PE-URの作用をin vitroで評価したところ,共に阻害活性を示し,特にPE-URはPE-ITCの10倍強い阻害活性を有することがわかった。次に,2物質をそれぞれ経口摂取したWistarラットの末梢血における濃度を継時的に調べたところ,PE-ITC,PE-UR共に摂取量依存的に血中濃度が上昇したことから,これらの物質は消化管から末梢血へと移行することがわかった。最後に,高ショ糖・高脂肪食摂取C57BL/6マウスにクレソン粉末及びPE-ITC,PE-URをそれぞれ4週間自由摂取させ,脂質代謝改善効果を調べた。実験群として,クレソン粉末を2.5%含む餌を摂取するクレソン摂取群,その含有相当量を摂取するPE-ITC摂取群,PE-UR摂取群,及び対照群の計4群を設定した。クレソン摂取群,PE-ITC摂取群,PE-UR摂取群は対照群に比べ肝臓重量や精巣周辺脂肪量が低下したことなどから,PE-ITC,PE-URは経口摂取により脂質蓄積を抑制することがわかった。一方で,PE-ITC摂取群では盲腸内容物重量が他群に比べ著しく少なく,イソチオシアネート類がもつ殺菌効果により微生物量が低減した可能性が考えられた。以上のように,クレソンに特徴的な物質であるPE-ITC及びPE-URは,経口摂取により体内に吸収されsEH阻害活性を有する物質であり,継続的摂取により脂質蓄積を抑制することを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。クレソン(Nasturtium officinale)は健康増進効果の高い微量成分と必須栄養素を豊富に含む魅力的な野菜である(Prev Chronic Dis. 2014Jun 5;11:E95)。近年,クレソンが脂質代謝改善効果を持つことが報告されたが,主因となる機能性成分や作用メカニズムは明らかでなく,普及の妨げとなっている(日本栄養・食糧学会誌2014 67, 4, 185-191)。本研究は,アブラナ科植物に特徴的な機能性成分であるグルコシノレート(GL)及びその誘導体に着目し,クレソンの脂質代謝改善効果を検証することを目的とする。初年度はクレソンに含まれるGLの誘導体分子種を明らかにすることを目的とし,まず,クレソンの超臨界二酸化炭素抽出法(SFE)とGL及び誘導体の一括定量分析法を確立した。次に,クレソン可食部のSFE抽出物に含まれるGL誘導体を定量分析した。GLは酵素により分解された後,残基を有したままイソチオシアネート(ITC)などに構造変化することが知られている。分析の結果,フェネチル基(PE)を残基にもつPE-ITCが33 μmol/g(凍結乾燥物当り)と主要な分子種であることがわかった。さらに興味深いことに,2分子のPEからなる1,3-ジフェネチルウレア(PE-UR)が12 nmol/g存在することがわかった。このような構造をもつウレアはヒト可溶性エポキシヒドロラーゼ(sEH)の阻害活性を有するとの報告があることから,PE-ITCだけでなくPE-URも脂質代謝改善に寄与する可能性が考えられる(PLoS One. 2017 May 4;12(5):e0176571)。特に,体内に蓄積されるトリアシルグリセロール(TAG)の分子種存在比の変動に興味が持たれる。そこで,二次元HPLC-UV-CAD/MSnを用いたTAG分子種網羅的分析法を確立した。SFEでは,モディファイヤーとしてエタノールを加え抽出溶媒の極性を制御することにより,目的物質の選択性と抽出効率を高めることができた。クレソン凍結乾燥粉末を試料とし確立した抽出法は従来の有機溶媒抽出法を比較して必要試料量や抽出時間,作業効率など多くの点で優位性が認められた。一方で,新鮮葉を試料とする場合さらに大容量の抽出管が必要であることがわかった。引き続き検証を行う予定である。GL及び誘導体の一括定量分析法の開発では,検出器としてCharged Aerosol Detector(CAD)とMSの併用を想定していたが,ITCなど比較的低沸点の化合物はCADでの応答性が悪く定量が不可能であった。そこで,使用するシステムをHPLC-MS2とし,まず文献やデータベースを参考に様々な残機のITCについて定性分析を行った。次いで,検出されたITC分子種と同一残基の誘導体を探索し,検出された分子種をSelected Reaction Monitoringにより定量した。標準品には市販試薬あるいは自身の合成品を用いた。この一括定量分析法は構造や物理的性質が大きく異なるGLやITC,イソシアネート,URを1インジェクションで定量分析するもので,類似手法の報告のない新規性の高い分析手法である。最終年度に計画している動物実験のうち,ラットを用いたGL及び誘導体の体内動態に関する研究の動物実験計画書を所属機関動物実験倫理委員会に提出し承認された。現在,動物実験の準備を進めている。この動物実験により得られる結果を元に,病態モデルマウスに対するクレソンSFE抽出物の投与実験の条件を策定する計画である。

昨年度の研究により,クレソン(Nasturtium officinale)はフェネチルイソチオシアネート(PE-ITC)及び1,3-ジフェネチルウレア(PE-UR)という抗炎症効果を示す物質を豊富に含むことがわかった。そこで,これらの物質がクレソンの脂質代謝改善効果に寄与するかを動物実験により調べた。まず,ヒト可溶性エポキシヒドロラーゼ(sEH)に対するPE-ITC,PE-URの作用をin vitroで評価したところ,共に阻害活性を示し,特にPE-URはPE-ITCの10倍強い阻害活性を有することがわかった。次に,2物質をそれぞれ経口摂取したWistarラットの末梢血における濃度を継時的に調べたところ,PE-ITC,PE-UR共に摂取量依存的に血中濃度が上昇したことから,これらの物質は消化管から末梢血へと移行することがわかった。最後に,高ショ糖・高脂肪食摂取C57BL/6マウスにクレソン粉末及びPE-ITC,PE-URをそれぞれ4週間自由摂取させ,脂質代謝改善効果を調べた。実験群として,クレソン粉末を2.5%含む餌を摂取するクレソン摂取群,その含有相当量を摂取するPE-ITC摂取群,PE-UR摂取群,及び対照群の計4群を設定した。クレソン摂取群,PE-ITC摂取群,PE-UR摂取群は対照群に比べ肝臓重量や精巣周辺脂肪量が低下したことなどから,PE-ITC,PE-URは経口摂取により脂質蓄積を抑制することがわかった。一方で,PE-ITC摂取群では盲腸内容物重量が他群に比べ著しく少なく,イソチオシアネート類がもつ殺菌効果により微生物量が低減した可能性が考えられた。以上のように,クレソンに特徴的な物質であるPE-ITC及びPE-URは,経口摂取により体内に吸収されsEH阻害活性を有する物質であり,継続的摂取により脂質蓄積を抑制することを明らかにした。初年度に実施した研究の結果,クレソンにはGL及びその誘導体としてPE-GL,PE-ITC,PE-URが含まれることがわかった。PE-URはヒトのsEH阻害活性を有するとの報告があり,クレソンの健康増進効果に寄与している可能性が考えられる(PLoS One. 2017 May 4;12(5):e0176571)。最終年度ではPE-ITC及びPE-URに着目し,クレソンの脂質代謝改善効果を動物実験により評価することを目的とする。PE-URの生体内における合成経路は明らかではなく,PE-GLやPE-ITCが生体内で化学反応することにより生成する可能性が考えられる。そこで,ラットに対しこれら3化合物をそれぞれ経口投与し,投与後の各化合物の血中量を初年度に確立した一括定量分析法により継時的に調べることで,化合物の血中移行速度及び構造変化の有無を評価する。次に,脂質代謝異常モデルマウスに3化合物及びクレソンSFE抽出物をそれぞれ長期間摂取させ,脂質代謝改善効果に着目した解析を行う。特に,肝臓や血漿に蓄積されたTAGの総量と分子種の存在比を初年度に確立した網羅的分析法により調べ,脂質代謝改善とTAG分子種の相関について検討する。また,TAGの蓄積や分子種存在比に影響を与える遺伝子について肝臓での発現量をreal-time RT-PCR法により調べる。
がん特異的ネルギー代謝を標的とする消化器がん治療法の開発

本研究では,がん細胞の生命源となる糖質・エネルギー代謝に対するGSK3βの病的作用をメタボロームの理論と先進的技法により網羅的に解析する.そして,がん細胞の病理特性とGSK3βの「がん促進機能」の分子基盤を代謝の視点から明らかにする.これにより,がん細胞の生存,増殖,浸潤などの病態と連動する中心エネルギー代謝の特性とGSK3βによる制御の仕組みを明らかにし,GSK3β阻害による“がん細胞特異的代謝の正常化"に基づく新しいがん治療法の標的代謝経路を解明する.本年度は以下の成果を得た.(1)大腸がん細胞のGSK3β阻害により,ミトコンドリア膜電位の回復,シトクロームC含有量の低下とカスパーゼ3活性化が観察され,ミトコンドリア機能の賦活化が示唆された.これに伴い,アポトーシスが誘導された.(2) GSK3β阻害による代謝変動と関連して,がん細胞の生存,増殖,浸潤が抑制され,細胞老化が誘導された.(3)メタボロームデータの再解析の結果,当初予想していたグルタミン異化経路の代謝産物には明らかな変化はみられなかった.(4)大腸がん細胞の動物移植腫瘍の解析により,細胞レベルで観察されたピルビン酸脱水素酵素とミトコンドリアにける酸化的リン酸化(TCA回路)の賦活化を示唆する中間代謝産物の変化が検出された.前年度の結果とともに,GSK3β阻害はがん細胞特有の解糖系(Warburg効果)を是正(正常化)することにより,がん治療効果を示すことが示唆された.なお,前年度の計画の遅れにより,当初予定していたヒト大腸がん病巣のメタボローム解析と,抗糖尿病薬メトフォルミン,乳酸アシドーシス治療薬ジクロロ酢酸(DCA)とGSK3β阻害剤の併用効果については,研究期間内に実施できなかった.本研究では,がん細胞の生命源となる糖質・エネルギー代謝に対するGSK3βの病的作用をメタボロームの理論と先進的技法により網羅的に解析する.そして,がん細胞の病理特性とGSK3βの「がん促進機能」の分子基盤を代謝の視点から明らかにする.これにより,がん細胞の生存,増殖,浸潤などの病態と連動する中心エネルギー代謝の特性とGSK3βによる制御の仕組みを明らかにし,GSK3β阻害による"がん細胞特異的代謝の正常化"に基づく新しいがん治療法の標的代謝経路を解明する.本年度は以下の成果を得た.(1)大腸がん細胞と非腫瘍性細胞の代謝産物をメタボロームの手法により網羅的に比較解析した.その結果,がん細胞では解糖系とエネルギー産生の亢進が観察され,Warburg効果が検証された.(2) GSK3β阻害による大腸がん,膵がん細胞と非腫瘍性細胞の代謝産物の変化を同様の手法により網羅的に比較解析した.その結果,GSK3β阻害剤により,がん細胞では乳酸の低下とともに,ピルビン酸脱水素酵素とミトコンドリアにける酸化的リン酸化(TCA回路)の賦活化を示唆する中間代謝産物の変化が検出された.一方,非腫瘍性細胞の代謝産物はGSK3β阻害剤により変化しなかった.(3)上記の中間代謝産物の一部を同じがん細胞を対象に個別に測定し,メタボロームによる村的解析の結果の一部を検証した.以上の結果から,GSK3β阻害はがん細胞特有のエネルギー代謝を修飾することにより,がん治療効果を示すことが示唆された.細胞レベルの解析から得られた結果を担がん動物で検証するために,大腸がん細胞移植マウスを準備して,GSK3β阻害剤による治療実験を行った.しかし,代謝産物の解析に必要な量の腫瘍組織試料が得られなかったため,次年度に再度,実施することとした.細胞レベルの解析から得られた結果を担がん動物で検証するために,大腸がん細胞移植マウスを準備して,GSK3β阻害剤による治療実験を行った.しかし,代謝産物の解析に必要な量の腫瘍組織試料が得られなかった.個別の中間代謝産物の測定を担当している博士研究員が体調不良であった期間があり,予定していた解析,とくにミトコンドリアの機能解析が遅れた.代謝産物の検出に必要な移植腫瘍組織を得るために,大腸がん細胞移植マウスの治療実験を再度,実施する.中間代謝産物の測定とミトコンドリアの機能解析は,別の博士研究員が継続する.これにより,当初の計画課題を本研究期間内にできるだけ遂行するように努める.メタボローム解析をもとにした個別の中間代謝産物の測定やミトコンドリアの機能解析が予定より遅れている.また,大腸がん細胞移植マウスの治療実験でGSK3β阻害剤の抗腫瘍効果が予想より強く,代謝産物の解析に必要な量の腫瘍組織試料が得られなかった.このため再度,動物実験を実施する.次年度使用額をおもにこれらの解析経費に充てる.
立体画像表示を用いた内視鏡下鼻内手術トレーニングシステムの開発

臨床実験結果からステレオナビゲーションの改良を行った。術中誤差の精度を向上させるため、深部方向の鼻内点に印を付け、術中のレジストレーション点として追加し術中誤差を少なくすることが出来た(当院倫理委員会承認)。複眼硬性斜視鏡の開発を試みたが技術的問題から完成させることはできなかった。そのため単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションのシステムを構築した。複眼硬性直視鏡によるステレオナビゲーションにより、安全かつ的確に高度な手術操作ができた。斜視鏡を必要とする症例に対しては、単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションを使用した。複眼硬性直視鏡によるステレオナビゲーション、単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションの臨床データを蓄積、解析し、バーチャル手術シュミレーションが行えるように試みた。本研究は、ステレオナビゲーションを用いて手術を行い、得られた臨床データから、内視鏡手術のための有効な手術トレーニングシステムを開発することが目的である。本年度はステレオナビゲーションを臨床症例に用いて手術を行い、データの蓄積をした。ステレオナビゲーションを慈恵医大学附属第三病院ハイテクナビゲーション手術室に設置した。ステレオナビゲーションにより立体内視鏡が表示する三次元画像に臓器グラフィックモデルが重ね合わせて表示され、術者は術野のオリエンテーションを確認しながら手術操作が行えた。症例ごとに、セグメンテーション部位、ステレオナビゲーションの誤差、追加が必要な機能などについて議論し、改良をした。術中誤差は34mmであり、より精度を向上させる必要があった。また位置を示す主観画像ナビゲーションだけでなく方向・距離を理解させるための機能も必要であった。そのため、客観画像ナビゲーションを追加した。ステレオナビゲーションにより、安全かつ的確に高度な手術操作ができた。今後もさらなる改良を行い、精度を向上させ、施行できる手術を増やしていく。今後、臨床症例によるデータをさらに増やし、臨床データを解析することにより、バーチャル手術シュミレーションが行えるようにする。バーチャル手術シュミレーションは、現場の体験でしか教えられなかった手術教育を擬似体験させることができ、内視鏡手術に熟練するまでの時間を短縮させる。さらには手術時副損傷を減少させることができると考える。このような手術トレーニングシステムを開発することは、手術手技のトレーニング効率を飛躍的にあげ、より安全に手術を施行できるようにすると期待できる。本年度は昨年度施行したステレオナビゲーション臨床実験結果からステレオナビゲーションの改良をした。ステレオナビゲーションの術中誤差は34mmであり、より精度を向上させる必要があった。そのため術前CT撮影時に深部方向の鼻内点に印を付け、術中のレジストレーション点として追加した(当院倫理委員会承認)。そうすることにより術中誤差を少なくすることが出来た。しかし複眼硬性内視鏡が直視鏡だけでは対応困難な症例があり、複眼硬性斜視鏡の開発を試みた。まずは単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションのシステムを構築した。今後は複眼硬性斜視鏡による手術も施行し、対応可能な症例を増やしていく。そして得られた臨床データを解析することにより、バーチャル手術シュミレーションが行えるようにする。しかし複眼硬性内視鏡が直視鏡だけでは対応困難な症例(前頭洞病変や上顎洞病変)があり、複眼硬性斜視鏡の開発を試みたが技術的問題から完成させることはできなかった。そのため単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションのシステムを構築した.複眼硬性直視鏡によるステレオナビゲーションにより、安全かつ的確に高度な手術操作ができた。

斜視鏡を必要とする症例に対しては、単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションを使用した、複眼硬性直視鏡によるステレオナビゲーション、単眼硬性斜視鏡による透過表示ナビゲーションの臨床データを蓄積、解析し、バーチャル手術シュミレーションが行えるように試みた。バーチャル手術シュミレーションは、現場の体験でしか教えられなかった手術教育を擬似体験させることができ、内視鏡手術に熟練するまでの時間を短縮させる。さらには手術時副損傷を減少させることができると考える。このような手術トレーニングシステムを開発することは、手術手技のトレーニング効率を飛躍的にあげ、より安全に手術を施行できるようにすると期待できる。
森川竹ケイ詞の研究-訳注と整理-

竹ケイの詞集『夢餘稿』を底本として研究を進めたが、『夢餘稿』未収の作品も有り、また『夢餘稿』に収録されていても雑誌掲載時と本文が異なっていることもあって、正確な訳注を作成するためには諸種の雑誌掲載本文との厳密な校訂が必要である。この整理校訂作業はほぼ予定通り完了し、竹ケイ詞の底本を作成することができた。また竹ケイは、友人・知人との贈答や唱酬の作品を多く作っており、それらの綿密な分析を通して竹ケイの事迹を編年化してとらえる作業も進め、竹ケイの前半生を明らかにした。本研究の目的は、日本における唯一の填詞専家と言われる森川竹〓の作品の訳注を作成し、日本詞の一つの頂点を示している彼の作品の文学的な価値の一端を明らかすることである。その作品世界を明らかにすることによって、今後『詞律大成』に代表される彼の詞学研究の成果についても正当な評価を与えていけるものと考えている。本研究は、竹〓の死後に久保天随によりまとめられた詞集『夢餘稿』影印本を底本として訳注作業を進めていくが、ただこの『夢餘稿』には収録されなかった作品も有り、また『夢餘稿』に収録されていても雑誌掲載時と本文が異なっていることもしばしばあって、正確な訳注を作成するためには諸種の雑誌掲載本文との厳密な校訂が必須である。平成22年度は、この各種の漢詩文雑誌に見える竹〓詞の収集と竹〓詞集の整理校訂作業を中心に研究を進めていった。また、竹〓には友人・知人との贈答や唱酬の作品が多くあって、これらの詞を理解するためには彼の周辺人物の伝記などについても詳しく知る必要があり、そのための研究も行った。特に森川竹〓と幼少の頃から交流があった作家・中村花痩について調査を進め、これまで知られていなかった事実を発掘することができた。平成22年度は、こうした研究調査に必要な各種資料や明治期の雑誌、また周辺の詩人・作家等に関する書籍を科研費によって購入した。また国内旅費を使用し、所蔵機関での資料の調査や訳注に協力して下さる宋詞研究会の方々との打合せなども行った。この整理校訂作業は前年度に開始して、予定通りのペースで進めていった。平成23年度は、前年度に行った整理校訂作業をさらに継続して行うとともに、それらを基礎として竹〓の詩詞を読み進める作業も行っていった。竹〓は、友人・知人との贈答や唱酬の作品を多く作成しており、それらの綿密な分析を通して竹〓の事迹を編年化してとらえる作業も進めた。その研究成果として「森川竹〓年譜稿(上)」を発表し、特に竹〓の前半の生涯を明らかにしえた。平成23年度は、こうした研究調査に必要な各種資料や明治期の雑誌、また周辺の詩人・作家等に関する書籍を科研費によって購入した。また国内旅費を使用し、各所蔵機関での資料の調査や訳注に協力して下さる宋詞研究会の方々との打合せなども行った。本研究の目的は、日本における唯一の填詞専家と言われる森川竹ケイの作品の訳注を作成し、日本詞の一つの頂点を示している彼の作品の文学的な価値の一端を明らかすることである。本研究は、竹ケイの死後に久保天随によってまとめられた詞集『夢餘稿』影印本を底本として訳注作業を進めてきたが、この『夢餘稿』には収録されなかった作品も有り、また『夢餘稿』に収録されていても雑誌掲載時と本文が異なっていることもしばしばあって、正確な訳注を作成するためには諸種の雑誌掲載本文との厳密な校訂が必須である。

この整理校訂作業は予定通り完了し、竹ケイ詞の底本を作成することができた。また竹ケイは、友人・知人との贈答や唱酬の作品を多く作成しており、それらの綿密な分析を通して竹ケイの事迹を編年化してとらえる作業も進めた。その研究成果として昨年度の「森川竹ケイ年譜稿(上)」に続いて「森川竹ケイ年譜稿(中)」を発表し、竹ケイの前半生を明らかにした。またこれらの知見をもとに竹ケイの詩詞を読み進める作業も行ってきたが、研究期間中に全作品に訳注を施すことはできなかった。これについては次年度以降も継続して作業を進めていきたい。「年譜稿(下)」及び訳注についてはなお未発表であるが、今後順に発表していく予定である。平成24年度は、こうした研究調査に必要な各種資料や明治期の雑誌・詩集、また周辺の詩人・作家等に関する研究書や中国詞学関連資料を科研費によって購入した。また国内旅費を使用して学会に参加し、専門の研究者と意見交換などを行った。ほぼ予定通りに資料も集まり、竹〓の作品と伝記に関する研究も予定通りに進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。予定通りに竹〓の作品と伝記に関する研究を進め、作品研究については「竹〓詞訳注稿」を、伝記研究については「森川竹〓年譜稿」を、今年度末に研究成果として発表する予定である。
病理学的アプローチより紐解くクラミジア感染症の難治化予測診断マーカーの探索

クラミジア(Ct)は,約10%程度の感染がみられる性感染症のポプュラーな原因菌である.このCtを無治療でいると,一部の感染者に繊維化を伴う卵管閉塞など難治化することが知られているが,その理由は不明である.IL-1やPGE2などの炎症性メディエーターの動態を検索し,Ct感染症の難治化の原因を検討した結果,間質の浸潤細胞にIL-1・IL-1Ra・PGE2の陽性細胞を認めたが,Ct感染の有無による所見の差は無かった.Ct感染患者では,扁平及び腺上皮細胞にIL-1αとPGE2の強く発現されていた.この結果はPGE2が炎症を慢性化し難治化への誘因の1つとして重要な働きをしていること示唆している.クラミジア(Ct)は,約10%程度の感染がみられる性感染症のポプュラーな原因菌である.このCtを無治療でいると,一部の感染者に繊維化を伴う卵管閉塞など難治化することが知られているが,その理由は不明である.IL-1やPGE2などの炎症性メディエーターの動態を検索し,Ct感染症の難治化の原因を検討した結果,間質の浸潤細胞にIL-1・IL-1Ra・PGE2の陽性細胞を認めたが,Ct感染の有無による所見の差は無かった.Ct感染患者では,扁平及び腺上皮細胞にIL-1αとPGE2の強く発現されていた.この結果はPGE2が炎症を慢性化し難治化への誘因の1つとして重要な働きをしていること示唆している.細胞内寄生性細菌クラミジア(Chlamydia trachomatis)は,健康女性の約10%程度の膣頸管部に感染が見られる性感染症の最もポプュラーな原因である.このクラミジアを無治療・放置すると,一部の女性では骨盤内感染症(PID)が起こり,卵管や卵巣組織の繊維化を伴う卵管閉塞や子宮外妊娠のリスクが高まることが古くから知られている.何故一部の女性でのみ難治化が起こるのだろうか.またクラミジア感染症の難治化は予想できないのだろうか.IL-1の過剰産生はIL-6やPGE2を介して繊維芽細胞を組織へ浸潤・増殖させ繊維化を起こすが,IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1Ra)によって強力に抑制制御されている.クラミジア感染に伴い慢性疾患に移行し易い女性ではIL-1とIL-1Raの発現バランスは維持されているのだろうか.そこで実際のクラミジア感染患者生殖器粘膜面でのIL-1とIL-1Raのバランスシートを主に病理学的視点より解析し,クラミジア感染症の難治化予測診断マーカーの探索を試みた.本年度はパピローマウイルス検診後残余パラフィンブロック標本からのクラミジア陽性標本のスクリーニング及び感染細胞とIL-1(αやβ)・IL-1Raなど炎症性メディエーターの検出を行った.その結果,クラミジア感染細胞は子宮頚部の扁平上皮や腺上皮の一部にも認められた.また間質に浸潤したリンパ球(未確認)などの細胞にも多数観察された.クラミジア感染細胞が広く認められた検体では,扁平上皮や腺上皮,間質の浸潤細胞にL-1IL-1αとL-1βの強い発現を認めた.この結果は,これから検索を進めるIL-1RaとIL-1とのバランスシートの乱れの有無を検証するうえで,重要な所見である.今後更に症例を増やし,クラミジア感染症の難治化のマーカーの確立を目差し実験計画を進めていく.細胞内寄生性細菌クラミジア(Chlamydia trachomatis)は,健康女性の約10%程度の膣頸管部に感染が見られる性感染症の最もポプュラーな原因である.このクラミジアを無治療で放置すると,一部の女性で骨盤内感染症が起こり,卵管や卵巣組織の繊維化を伴う卵管閉塞や子宮外妊娠のリスクが高まることが古くから知られている.また,クラミジア感染症で産生誘導されるIL-1は,過剰産生されるとIL-6やPGE2を介して繊維芽細胞を組織へ浸潤増殖させ繊維化を起こすが,IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1Ra)の強力な活性抑制の制御下にある.クラミジア感染に伴い慢性疾患に移行し易い女性ではIL-1とIL-1Raのバランスは維持されている可能性を背景に,クラミジア感染患者生殖器粘膜面でのIL-1とIL-1Raなどのバランスシートの乱れを主に病理学的視点より評価し,クラミジア感染症の難治化予測診断マーカーの探索を実施した.検診後の膣頸管部パラフィンブロックでPCRを用いてクラミジア感染の有無を確認後,炎症性メディエーターの免疫組織化学的検索を行った結果,間質の浸潤細胞にIL-1(αやβ)・IL-1Ra・IL-6?・PGE2の陽性細胞を認めたが,クラミジア感染の有無における所見の差は無かった.クラミジア感染患者では,扁平及び腺上皮細胞にIL-1αとPGE2の強く発現されていることを明らかにした.線維芽細胞に作用しコラーゲンなどの関連遺伝子の誘導を起こして線維化を促進するPGE2が,免疫細胞や炎症の場である上皮や間質組織に高発現していたことは,炎症を慢性化に誘導して,そのことが難治化への誘因の1つとして重要な働きをしていること示唆している.本研究の目的であった難治化予想

マーカーの開発には,今後さらに多数の症例の解析が必要である.病理学『クラミジア感染症の難治化予測診断マーカー』の免疫組織化学的および分子生物学的検索に用いる婦人科検体からのパラフィン切片の作製は,北海道大学の研究分担者らの担当であったが,平成25年に入り分担者らの校舎の耐震工事のため,一時的な実験室の移転を強いられ,事前に予想したよりも移転先のスペースが取れなかったことから,パラフィン切片作製の環境が整わず切片作製が出来ない状況にある,また,東京と北海道と地理的に離れている研究代表者と分担者との連絡も十分に取れなかったことも重なり,早急な対策を打てず過ぎてしまい,現在も免疫組織化学的および分子生物学的検索に遅れが生じている.今後の推進方策については,以下の通りである.1.現在遅れている,婦人科のパラフィンブロックを用いた,クラミジア及び炎症性メディエーター(IM)の免疫組織化学的検討とIM発現の網羅的解析を早急に進めるため,必要ならば研究代表者も北海道大学に出向いて実験を遂行することも含めて積極的に関わって遂行する.2.非淋菌性尿道炎尿検体からのクラミジア遺伝子とIL-1(αやβ)・IL-1Ra・IL-6・PGE2抗原の検索:クラミジア感染時のIL-1RaとIL-1のバランスシートの乱れは,実際の臨床の現場で非侵襲的検査のメルクマールになるか否かを確認するため,クラミジア感染が疑われる非淋菌性尿道炎症例の尿沈渣からPCRでクラミジア遺伝子検索と同時に,上清からは炎症性メディエーター[IL-1(αやβ)・IL-1Ra・IL-6・PGE2]を抗原レベルで検討する.更にクラミジア陽性患者の陰転化と炎症性メディエーターの検出量との関連性についても経時的にモニタリングし,感染の遷延化を助長する因子を模索する.3.IL-1Raがクラミジアのヒト株化細胞内での増殖に与える影響の検討:炎症性メディエーターの沈静化に極めて重要な役割を演じている考えられるIL-1Raが,クラミジアの細胞内での生存・増殖にはどのような影響を与えるかはまだ不明である.そこでIL-1Ra存在下で培養したクラミジア感染マクロファージ内でのインフラマソーム,カスパーゼ1,S1P,S2P,SREBPの細胞内での局在変化を特異的な抗体を用いて可視化検討する.更に膜の生合成を介してクラミジアへの脂質の供給に直接関わると予想されるSREBPを強制的に発現した細胞をもちいて,IL-1Raの存在がSREBPのERからゴルジ体への移行や物理的細胞ストレスからの回避にどのような影響を及ぼすか検討を加える.『クラミジア感染症の難治化予測診断マーカー』の免疫組織化学的および分子生物学的検索に用いる婦人科検体からのパラフィン切片の作製は,北海道大学の研究分担者らの担当であったが,平成25年に入り分担者らの校舎の耐震工事のため,一時的な実験室の移転を強いられ,事前に予想したよりも移転先のスペースが取れなかったこともあり,パラフィン切片作製の環境が整備されない状況が続いており,H25年度の実験は,これらパラフィン切片を用いた免疫組織化学的および分子生物学的検索だったために,その実験に使用する試薬類の支出が減額になり,次年度使用金額が生じてしまった.遅れているパラフィン切片を用いた免疫組織化学的および分子生物学的検索は,H26年度も継続するため,遅れていたH25年度の検体分をH26年度分に追加して実験を進めるので,その為の試薬類の支出も予定より増額するため,その増額分に,今回の次年度使用金額を当てて使用する.
年少者・高齢者・障害者の交通事故分析ためのウォークレコーダーの提案

昨今の歩行者と自転車の交通事故が増加している社会問題に着目すると、自動車のドライブレコーダーが実用化されたように、歩行者のための事故状況記録機すなわち「ウォークレコーダー」の実現が期待される。特に、瞬時の判断力が劣っている年少者・高齢者・障害者などのいわゆる認知弱者が装着して有用性を評価するための試作機を製作した。本研究のウォークレコーダーは、ヘルメットの上部に取り付けたカメラ、GPS、運動センサの情報をノート型パソコンに自主開発したアプリケーションを用いて記録する単純な構成によって、汎用性とフレキシブル性に優れている。また、カメラを車載カメラ、全方位カメラ、Webカメラと取り替えて次のように比較検証した。1、車載カメラ:前・後・左・右方向のカメラ4台の映像信号をハード的に1つの画像に結合することでパソコンの取り込み負担を軽減し、自転車の移動状況を十分に記録することができた。被験者が装着した際の機器の重量の負担が大きい。2、全方位カメラ:カメラが1台のため映像の取得方法をハードとソフトの両面で簡潔にできたので、試作機を年少者に装着して実験することができた。歪補正の処理を行うことで、目視と同じ遠近感で自転車の移動状況を認識することもできた。3、Webカメラ:前・後・左・右方向のカメラ4台を車椅子に装着して用途拡大を試みた。ノート型パソコン1台で撮影する場合、撮影時間間隔を要し、自転車の動きを追跡することが困難で目的を果たせなかった。実施計画にあった小型サーバ5台を用いた測定データの分散処理システムの構築には至らなかったが、カメラや信号処理の工夫により交通事故分析を行える程度の十分な情報を記録することができた。さらに、歩行者の周囲の景観と遠隔地の保護者の間でインターネット中継による映像会話を試行したところ、相互のコミュニケーションによる歩行支援モデルを提案できた。
マッスルインバランスに誘導される股関節恒常性破綻機構の解明

運動器理学療法では、異常な姿勢・運動の繰り返しが微細な組織損傷などの病態を誘発し、症状が出現するという理論に基づいた治療が展開されている。本研究は、筋力低下により生じる股関節の異常な運動が股関節恒常性に影響を与え、最終的に病態を誘発するという仮説の検証を目的としている。前年度は、ラット腸骨筋にボツリヌス毒素(BTX)を投与し、大腿骨・寛骨への影響を評価した。しかし、三次元動作解析による歩行解析において明らかな変化は認められず、大腿骨頭や寛骨臼で検出された形態変化はミクロ・マクロレベルともに僅かであったことから、腸骨筋のみの筋力低下では影響が不十分と判断した。今年度は、右股関節の腸骨筋に加え、長内転筋、恥骨筋、大内転筋にもBTXを投与することで、より広範な筋力低下を惹起した。その結果、トレッドミル歩行で跛行が確認できる程度に股関節運動異常が出現した。8週間後、組織学的解析のため大腿骨および寛骨を採取し、さらにX線CT像より得た三次元データから大腿骨形態を定量的に分析した。その結果、BTX投与側の大腿骨で、対照群及び反対側と比べ骨幹部の弯曲指標減少、大腿骨頚部及び骨幹部の横径減少、骨幹部の骨皮質面積の減少を認めた。このことから、股関節周囲筋筋力低下が大腿骨形態においてネガティブに作用することが示唆された。一方、股関節疾患の危険因子とされる頚体角や前捻角は対照群、反対側との比較で著明な変化を認めず、予想に反する結果となった仮説となった。前年度の研究結果から、当初の計画より若干の変更を余儀なくされたが、モデルを修正(筋力低下の方法を変更)したことで大腿骨形状において興味深い変化が出現し、研究の進展がみられた。加えて、骨形態の定量評価においてX線CTとポリゴンデータの組み合わせによる分析方法を導入して精度が大きく向上した。現在、股関節周囲筋の筋力低下により大腿骨形成に変化が生じたメカニズムを解明するため、大腿骨頭と寛骨臼の組織学的解析を行っている。前年度にある程度手法が確立できた形態定量学的手法と併用し、股関節の骨・軟骨代謝を詳細に調査したい。ラットの股関節屈筋を選択的に弱化させることで筋力不均衡(マッスルインバランス)を誘導し、股関節恒常性の影響を調査すること、さらに筋力不均衡下での走行運動の影響の調査を目的とした。股関節の形成に関して、未成熟を示すY字軟骨存在下では機械的負荷に対する感受性が高い。そこで、予備実験として4-10週齢の雄性ウィスターラットの寛骨を採取し、アルシアンブルーで軟骨を染色し、骨閉鎖の時期を同定した。その結果、4、6週齢では明瞭であったY字軟骨は8週齢で不明瞭であったことから、軟骨が骨に置換されたと判断し、8週齢ラットを使用することとした。本実験では、ラットの右股関節屈筋の一つである腸骨筋に、2U /kgBWのボツリヌストキシン(BTX)を4週毎に計2回投与してマッスルインバランスを誘導した(BTX群)。運動との併用効果を調べるため、BTXを投与した動物の一部にはトレッドミル走行(15 m/min、10分×5回、5日/週)を行った(BTX+走行群)。対照群は無処置とした。最初のBTX投与から8週後、ラットの大腿骨を採取して骨形態を測定した。大腿骨長は対照群で41.6±0.6 mm(右)に対し、BTX群は41.3±1.6 mm vs. 39.3±0.5 mm(右vs.左)、BTX+走行群は38.5±0.4 mm vs. 38.2±0.6 mm(右vs.左)であった。頚体角は対照群では132±4.7°(右)に対し、BTX群は128±6°vs. 133±6°(右vs.左)、BTX+走行群は134±6°vs. 137±3°(右vs.左)であった。大腿骨と寛骨は組織学的解析に使用するため、4%パラフォルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン包埋を行った。当初の予定では、研究実績の概要に記載した内容に加え、小動物用三次元動作解析装置を用いてBTX投与に伴う動作の変化を定量評価する予定であった。しかし、現時点で歩行動作の撮影は終了しているものの、股関節機能の変化を示す股関節可動域、最大・最少屈曲角度の算出が終了していない。さらに、大腿骨頭と寛骨臼の組織学的解析にも着手できていない。

その結果、トレッドミル歩行で跛行が確認できる程度に股関節運動異常が出現した。8週間後、組織学的解析のため大腿骨および寛骨を採取し、さらにX線CT像より得た三次元データから大腿骨形態を定量的に分析した。その結果、BTX投与側の大腿骨で、対照群及び反対側と比べ骨幹部の弯曲指標減少、大腿骨頚部及び骨幹部の横径減少、骨幹部の骨皮質面積の減少を認めた。このことから、股関節周囲筋筋力低下が大腿骨形態においてネガティブに作用することが示唆された。一方、股関節疾患の危険因子とされる頚体角や前捻角は対照群、反対側との比較で著明な変化を認めず、予想に反する結果となった仮説となった。前年度の研究結果から、当初の計画より若干の変更を余儀なくされたが、モデルを修正(筋力低下の方法を変更)したことで大腿骨形状において興味深い変化が出現し、研究の進展がみられた。加えて、骨形態の定量評価においてX線CTとポリゴンデータの組み合わせによる分析方法を導入して精度が大きく向上した。大腿骨頭及び寛骨臼の組織切片を作製し、サフラニンO染色やtype I及びtype II collagenの免疫組織化学を行い関節軟骨や関節唇の恒常性への影響を評価する。さらに、様々な筋にBTXを投与(腸骨筋+大腰筋や内転筋群)して多様なマッスルインバランスを誘導し、股関節や膝関節の恒常性に及ぼす影響についても検討する。現在、股関節周囲筋の筋力低下により大腿骨形成に変化が生じたメカニズムを解明するため、大腿骨頭と寛骨臼の組織学的解析を行っている。前年度にある程度手法が確立できた形態定量学的手法と併用し、股関節の骨・軟骨代謝を詳細に調査したい。動物を注文する予算を計上していたが、予定日に実験が行えなくなったため30年度に延期した。サンプル採取は出来たが組織学的解析まで手が回らず、試薬代が当初の予定ほどかからなかった。また、データが不十分で論文作成にまで至っておらず、英文校正や掲載料といった経費を必要としなかった。今年度は前述した用途に使用する予定である。