hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経回路構築の時間スケジュールを調節する機構

動物の体内で神経回路が作られる時には、細胞分化などの各ステップのスケジュールが厳密に管理されている。本研究では、マウスの体内で遺伝子の働きを人為的に操作する新しい実験系を開発した。さらに、神経細胞の個性を決める遺伝子の働く場所やスケジュールを変えることにより、神経回路の一部のみを狙って限定的な回路異常を作り出し、特定の行動を正常に行えないモデルマウスを効率よく作製することに成功した。研究代表者等が開発した独自の実験系を発展させ、神経細胞の誕生から軸索の伸長とシナプス形成に至る神経回路構築のステップ間のスケジュールを調節する機構を解明すべく、研究代表者等が発見した脊髄の交連神経回路を制御する遺伝子ネットワークを中心に研究を実施した。これまでの研究で交連神経の軸索伸長に重要なネトリンレセプターDccの発現が翻訳レベルで制御されることを明らかにしたが、今年度の研究によりDccのmRNAの5'端の様々な部位をレポーター遺伝子DsRedの5'端に付加したコンストラクトをマウス胎仔で発現させ、DccのmRNAの5'端は特徴的なヘアピン構造をつくり、その構造が胎仔の脊髄における翻訳制御に必須であることを示した。一方、神経回路構築の時間的スケジュールを詳細に解析するためのヘテロクロニック遺伝子発現系に関しては、研究代表者等が開発したマウス胎仔への電気穿孔法と最新型テトラサイクリン遺伝子発現誘導系を組み合わせることにより、マウス胎仔の神経系に遺伝子を導入後、ドキシサイクリン注射により任意の時間に特定の神経細胞で遺伝子発現を誘導できる新しい実験系を構築することに成功した。同時に、この実験系は大脳や小脳、脊髄などの様々な神経細胞にも応用できることを示した。また、脊髄でMbh1(mammalian Barh1)の発現を誘導することにより、細胞分裂の後であっても、本来は交連神経でない細胞を交連神経細胞へ運命転換できることを初めて明らかにした。さらに、Mbh1などの神経分化の方向を制御する遺伝子のゲノム断片をレポーター遺伝子に繋いだ種々のコンストラクトを電気穿孔法でマウス胎仔に導入し、発現制御領域の解析を進めている。研究代表者等が開発した独自の実験系を発展させ、神経細胞の誕生から軸索の伸長とシナプス形成に至る神経回路構築のステップ間のスケジュールを調節する機構を解明すべく、研究代表者等が発見した脊髄の交連神経回路と小脳の神経回路を制御する遺伝子ネットワークを中心に研究を実施した。これまでの研究により、脊髄の交連神経細胞の神経ネットワーク形成においてはネトリンレセプターのDccやセマフォリンレセプターのNrp2などガイダンス分子のレセプターの発現が翻訳と転写のレベルで精巧に制御され、その上流ではbHLH型転写制御因子のMath1からホメオドメイン型転写制御因子のMbh1(mammalian Barh1)とMbh2(mammalian Barh2)を経てLhx2とLhx9へ至る制御が重要であることを示してきたが、今年度の研究により、Lhx2とLhx9の転写を制御する様式が脊髄と小脳では異なることが明らかとなった。脊髄の交連神経細胞と小脳の顆粒細胞が分化する過程の両方で、Lhx2とLhx9の発現にはMath1からMbh1とMbh2に至るカスケードが必須であるが、脊髄ではMbh1やMbh2によりLhx2の発現がLhx9よりも強力に誘導されるのに対し、小脳ではLhx9の方がLhx2よりも強く誘導されることが明らかとなり、同じ転写制御因子の下流遺伝子であっても、神経細胞の種類により発現誘導の仕組みが異なることが示された。さらに、電気穿孔法と組み合わせ前年度に開発したヘテロクロニック遺伝子発現誘導系を用いて、神経回路形成に関わる遺伝子を特定の時間帯のみで限定的に発現させることにより、神経回路に異常を有するモデルマウスを作製することに成功した。神経回路の構築では、神経細胞の誕生から移動、軸索の伸長とシナプス形成に至る一連のステップが時間的に精巧に制御されており、脳神経系が機能を発揮する上で極めて重要であると考えられているが、ステップ間のスケジュールを調節する機構はほとんど不明である。そこで、研究代表者等が開発したヘテロクロニック遺伝子発現誘導法などの独自の実験系を駆使し、分子から細胞、マウス個体のマルチレベルで神経回路構築の機構の研究を実施した。神経回路構築の一連のステップにおける遺伝子発現を詳細に解析することにより、これまで神経細胞の分化の初期のみで働くと考えられてきた遺伝子のいくつかは、細胞移動を終えた後でシナプスを形成するステップでも働くことを発見し、神経細胞の分化の初期からシナプス形成に至るステップの間で遺伝子発現が巧妙に切り替えられていることが明らかとなった。また、これらの遺伝子をヘテロクロニック遺伝子発現誘導法を用い神経回路構築の様々な時期で特異的に発現させ、特定の一時期のみで遺伝子機能のスイッチのオン・オフを制御することにより、神経回路構築の限定されたステップで遺伝子機能を厳密にコントロールすることが、正常な神経回路を構築するために必要であることが明らかとなった。さらに、この時期特異的な遺伝子機能のスイッチのオン・オフ制御システムを研究代表者等が以前に開発したマウス胎仔の部位

特異的な電気穿孔法と組み合わせることにより、神経回路の特定部位のみを狙って限定的な異常を有するモデルマウスを作製することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学26年度が最終年度であるため、記入しない。ヘテロクロニック遺伝子発現系の構築に成功し、Dccの翻訳制御機構や神経分化を制御する遺伝子の発担制御領域の解析など当初の計画通り、順調に進んでいる。独自のヘテロクロニック遺伝子発現誘導系を用いて、計画通り、神経回路に異常を有する新しいタイプのモデルマウスを作製することに成功している。本研究は順調に進み着実に成果も上がっており、計画通りの推進でよい。ヘテロクロニック遺伝子発現系の構築が計画を上回るペースで成功し、マウス飼育などを担当する研究補助員の人件費が抑えられた。次年度は神経回路異常モデルの作製や分化時計の解析に抗体等の高価な研究試薬が必要であり、その購入に用いることにより研究の進展が加速される。人件費で計上していた研究補佐員が異動し人件費の支出が減るとともに、研究推進集中重点化のため海外学会発表を延期したため。本研究の最終年度であり、研究の総括として多くの研究データの総合的解析に用いる。
良質単結晶遷移金属多窒化物の創製と構造物性の解明および機能創出への展開

ダイアモンドアンビルセルを用いた80ギガパスカル程度までのサブメガバール領域での単結晶育成と新しく開発した大容量試料用のマルチアンビル大型プレス高圧発生合成結晶育成装置を用いた単結晶育成を行なった.さらに,結晶構造と電子構造および力学物性や光学物性とそれらの異方性といった基礎物性の精密測定・解析を系統的に行なった.ダイアモンドアンビルセルを用いた単結晶育成では,様々な新しい窒化物の発見と単結晶育成に成功した.例えば,クロムの二窒化物という新しい多窒化物を発見するとともに,その単結晶育成に成功した.さらに,これらの遷移金属多窒化物の研究で得られた手法を典型金属窒化物に適用し,新しいスズの多窒化物の発見に成功した.これらの新しく発見した窒化物の結晶構造や安定性および物性と電子構造を実験と理論計算によって解明した.特に,物性評価研究では,ダイアモンドアンビルセルで得られた微小試料に対して,Spring8放射光施設を利用した反射率測定技術をほぼ確立し,微小試料でも十分に議論に耐えられる反射率の測定結果を得ることに成功した.新しく開発した大容量試料用のマルチアンビル大型プレス高圧発生合成結晶育成装置を用いた単結晶育成では,前年度開発した最適な結晶育成溶媒を用いて様々な物質の単結晶の育成に成功した.例えば,新しい結晶構造を有するタングステンの窒化物の単結晶やタンタル(酸)窒化物のウィスカー結晶の育成に世界で初めて成功した.これらの結晶育成最適条件を見出すとともに.安定性を明らかにした.さらに,関連物質である遷移金属のリン化物や酸窒化物の研究も推進した.その結果,パラジウムのリン化物において新物質を発見し,結晶構造について詳細に調査した.多成分系の酸窒化物については,例えば,MnTaO2N-TaON-MnO2ヘテロ構造体を高圧下で合成し,電位ー光電流特性を明らかにした.本研究では,遷移金属多窒化物の物質科学を格段に進展させるための精緻な研究を推進できる超高圧結晶成長プロセス・手法を開発することを第一の具体的な目的としている.そして第二の目的として,良質単結晶試料を用いた測定による揺るぎない信頼性の高い実験データを取得することとしている.これらの目的に対し,超超高圧領域を対象とするダイアモンドアンビルセル超高圧発生装置を用いた単結晶育成での特筆すべき成果として,例えば二窒化クロムという新しい多窒化物を発見するとともに,世界で初めて遷移金属二窒化物の単結晶育成に成功したことが挙げられる.この成果は,遷移金属多窒化物の結晶構造や物性について単結晶を用いて評価・解析する道を開拓した意味で,同物質群の物質科学のみならず金属窒化物の無機化学や結晶成長学において極めて重要な進展であるといえる.一方,マルチアンビル大型プレス高圧発生装置を用いた単結晶育成の特筆すべき成果として,例えば新しい結晶構造を有する非常に高い体積弾性率を示す超硬質のタングステン窒化物の単結晶やナノサイズのワイヤー状の形態を有するタンタル(酸)窒化物のウィスカー結晶の育成に世界で初めて成功した.また,多成分系の酸窒化物についても展開し,水分解光触媒に関係するマンガンータンタル酸窒化物系の新しいヘテロ構造体を高圧下で合成することに成功しており,このヘテロ構造体の電位ー光電流特性を明らかにしている.これらの成果は,国内外の関連会議や学術論文として発表され,学術上の意義は高い.さらに,これらの成果は,上述のような遷移金属窒化物の基礎物質科学の進展に大きく貢献するのみならず,これらを材料として適用した材料工学,ナノテクノロジーやエレクトロニクス,さらには環境工学へ応用できる可能性もあり工業的な意義も高い.以上より,当該年度の研究は当初の計画以上に研究が進展しているといえる.前年度までと同様に,各分野の専門家が常に有機的に連携して,実験研究に理論計算解析研究を加えて,結晶育成・評価・解析の観点から系統的かつ包括的に研究を進める.結晶育成に関しては,ダイアモンドアンビルセルに加えて,超高圧領域において大型の良質単結晶の育成に用いる新しい大容量試料用の2段式マルチアンビル大型プレス高圧発生合成結晶育成装置の開発に成功し順調に稼働しているため,これを十分に使いこなして,様々な窒化物を対象に研究を推進する.具体的には,遷移金属多窒化物に加えて,これらの物質群の構造物性の理解をより深めるために,多成分系金属窒化物や典型金属窒化物に加えて,酸窒化物やリン化物などの関連物質も研究対象として研究を展開する.対象物質次第で技術的な問題が発生した場合は,超高圧領域の研究などで顕著な業績があり,すでに共同研究の実績がある国内外の研究者に技術的な支援をしてもらい問題を克服する.さらに,これまでも実際に綿密に連絡を取り合っているマルチアンビル大型プレスを製作している企業と今後も連絡をとり,あらゆる技術的ノウハウを駆使して問題を克服する.遷移金属多窒化物の試料を系統的に次々と合成・結晶育成する.高圧その場ラマン測定や高圧その場放射光X線回折測定を行い,相変化や結合の変化および相安定性と結晶構造を解析する.放射光施設を利用したXPS・UPS測定実験を行い,結合状態,特に窒素間結合と電子構造を解析する.

TEM高分解能観察とTEM-EELS測定等を行い,精密結晶構造解析と結合状態解析を行う.結晶構造を基に,win2kなどの第一原理電子構造計算プログラムを用いて電子構造と結合状態を解析し,各実験結果と比較・検討する.遷移金属多窒化物について,窒素間結合状態,メガバール超高圧高温下での相安定性,結晶構造,電子構造,構造物性を包括的に解明し理解する.本研究は4年間で実施するが,前半の2年間特に初年度28年度では,研究代表者と研究分担者に加えて超高圧地球科学が専門の研究者の協力を得て,まず圧力領域に応じた2種類の手法を用いて超高圧高温下で温度と化学反応を十分に制御して結晶成長できる技術の開発を進めた.そして,遷移金属多窒化物の新物質探査と良質単結晶の育成に注力した.まず,ダイアモンドアンビルセルを用いた80ギガパスカル程度までのサブメガバール領域での単結晶育成を中心に取り組んだ.主な開発項目は,単結晶育成用のダイアモンドアンビルセル用ガスケットの設計と最先端微細加工技術を駆使した製作,およびダイアモンドアンビルセル用ガスケット試料室内の温度場の均一性と制御性の実現,並びにガスケット試料室内での結晶成長フラックス剤の最適化とした.そのために,超高圧高温研究に関する様々な高度な要素技術を組み合わせた.そこで,各要素技術に豊富な経験と多くの実績を有する専門家が相互に緊密に協力して研究に取り組んだ.また,上記のダイアモンドアンビルセル用ガスケットの技術開発と並列して,大型の良質単結晶の育成に用いる2段式マルチアンビル大型プレス高圧発生合成装置の詳細な設計を開始するとともに,そのための様々な試行実験を行った.研究の進捗状況に応じて,遷移金属多窒化物の構造物性を解明するためにメンバー全員の専門性を生かして,育成した良質単結晶を用い,結晶構造と電子構造及び電子・磁気・格子物性とそれらの異方性といった基礎物性の精密測定・解析を系統的に行うことを試みた.上記の研究を進めた結果,いくつかの後期遷移金属窒化物の新物質の創製に成功し,結晶構造と電子構造を解明し,力学物性や光学物性,圧縮特性の異方性といった基礎物性を明らかにした.また,一部の前期遷移金属窒化物については,ダイアモンドアンビルセルを用いた超高圧下での単結晶育成に成功した.本研究の最も重要な目的は遷移金属多窒化物の物質科学を格段に進展させるための精緻な研究である.そのためには,遷移金属多窒化物の超高圧結晶成長技術を開発し,良質単結晶試料を用いた測定による揺るぎない信頼性の高い実験データを取得することである.これに対し,今年度では,当初の計画とおり,圧力領域に応じてダイアモンドアンビルセルとマルチアンビルプレスの2種類の超高圧発生装置を用いて,超高圧高温下で結晶成長できる技術の開発と設計を進めることができた.マルチアンビルプレスを用いた同物質群の単結晶育成に関しては,大型の良質単結晶の育成に用いる2段式マルチアンビル大型プレス高圧発生合成装置の詳細な設計を開始するとともに,そのための様々な試行実験を現有のマルチアンビルプレスを用いて行うことができた.試行実験を進める過程において,現有装置の不測の故障が生じたため,修理のために当装置の故障部品の交換と装置の調整が必要となり,開発する装置の詳細な設計計画が少し遅れることとなったが,試行実験は進めており研究全体の進展に大きな影響は与えるものではない.一方,ダイアモンドアンビルセルを用いた手法においては,一部の前期遷移金属多窒化物において新物質の合成に成功するとともに,明瞭な晶癖がみられる単結晶の育成に成功した.そして,単結晶試料を用いて,結晶構造を明らかにするとともに,弾性率などの基礎物性や圧縮特性の異方性などを解明した.また,超高圧力領域での相安定性を超高圧その場測定によって明らかにした.
二重鎖RNAを用いた抗がん免疫療法による腫瘍浸潤CD11c+T細胞の解析

腫瘍内には、制御性T細胞に代表される抑制性免疫細胞が浸潤し、癌微小環境を免疫抑制状態に保っている。二重鎖RNAの合成アナログであるpolyI:Cを担癌マウスに投与すると、免疫抑制環境が破綻し、NK細胞や細胞傷害性T細胞(CD8陽性T細胞)を介して腫瘍退縮が誘導される事が明らかとなっている。本年度は、polyI:C投与前後のCD8陽性T細胞の機能に着目し、免疫抑制/活性状態の変化について検討を行った。PolyI:Cを投与したマウスの腫瘍よりCD8陽性T細胞を単離し、細胞表面マーカーの発現について解析を行ったところ、抑制性CD8陽性T細胞のマーカーであるCD11cを高発現するCD8陽性T細胞が腫瘍内に多く浸潤する事が明らかとなった。また、腫瘍浸潤CD11c陽性CD8陽性T細胞は、腫瘍内のCD11c陰性CD8陽性T細胞に比べ、グランザイムやパーフォリンといったエフェクター分子の発現が高い事も分かった。一方で、抑制性サイトカインであるIL-10もCD11c陰性CD8陽性T細胞よりも高く発現していた。さらに、この細胞はCD8陽性樹状細胞が欠損するBATF3ノックアウトマウスでは、腫瘍内に認められなかった事から、CD8陽性樹状細胞がCD11c陽性CD8陽性T細胞の浸潤またはCD11cの発現誘導に寄与する事が明らかとなった。これらの知見から、polyI:CはCD8陽性樹状細胞を介して、CD11c陽性CD8陽性T細胞を腫瘍内に集積し、腫瘍退縮を誘導することが示唆された。
レーザー駆動陽子線の新「追加速」手法：医学応用可能な１００ＭｅＶ級エネルギーへ

近年のレーザー駆動イオン加速の発展により、既存の加速器の大幅な小型化がみこめる。レレーザー駆動イオン線は、発生点において、既存の加速器の提供するビームとは全く異なる「超小加速領域・高ピーク電流・低エミッタンス」等の優れた特長を持つ。と同時に、「広い発散角・連続したエネルギースペクトル」を持つため、長距離伝搬に伴うビーム密度の低下が避けられない。これまではその効果を無視していた、レーザー駆動プラズマからイオン線に先だって発生する、大電流電子のもつクーロンポテンシャルを、ダイナミックな加速電界として機能させるべく「リサイクル」し、従来のTNSA加速で得られた高エネルギー陽子の追加速/収束を試みた。2000年に核融合用のレーザーを薄膜と相互作用させることで、高エネルギーのイオンが発生することが分かってから、レーザー駆動型のイオン線は、その類まれな特徴より多方面から応用として着目されている。過去の15年ほどの間にその電荷質量比が最大である理由から、陽子の加速のみが着目され続けていて、レーザー駆動型の陽子線の医療用小型加速器も一つの応用先として位置づけられている。しかしながら応用に資するには、さまざまな解決すべき点があり、その中の最も重要な項目は高エネルギー化である。本研究では独自のデザインのターゲットホルダ(繰り返し供給が可能)に薄膜を装着することで、陽子線の高エネルギー化を試みた。ターゲットで発生するイオンにダイナミカルな力を電場の力で与える。そのために、同時に発生する電子を使用するが、電子の挙動を変える目的でターゲットホルダの持つ形状を3種類選び、材質を金属および非金属で実験した。実験には関西研のJ-KARENレーザー(800nmの波長、パルス幅35fs,10乗のコントラストレベル)を用いた。ターゲットに対するピーク強度は1E21Wcm-2で、45度、0度の角度から照射した。ターゲットとしてはアルミの薄膜を用いた。ターゲットホルダを用いる場合とそうでない場合(テープターゲットを用いた)明らかに空間分布が違うイオンが発生した。一方で、最大エネルギーの増加はそれほど認められず、さらなるターゲットホルダの形の最適化、及び追実験が必要であると考えている。レーザー駆動型のイオンはその類稀な特徴より多方面から応用として着目されている。しかしながら、応用に資するには様々な解決すべき問題点があるのも事実である。その中でもっとも重要な項目が高エネルギー化である。大型の核融合用のレーザーを用いた実験結果として、120MeVまでのエネルギーの陽子の加速が確認されてはいるが、応用を考えた際に必要不可欠な、小型のレーザーからの限られたエネルギーによる実験結果としては数十MeVが最高となっている。このエネルギーを飛躍的に伸ばすため、ターゲットホルダの形を工夫して、レーザー駆動の陽子線にプラズマ中における加速場に追加して、ダイナミカルに作用する加速電場を作用させることを実行する。具体的には、ターゲットを保持するターゲットホルダのイオン発生方向の形状に工夫をほどこす事で実現できると考えている。レーザー駆動プラズマからのイオン発生後に、そのイオンが通過するターゲットホルダ上の穴の形を円錐状にすることで、穴の表面垂直方向に電場を立てる。その電場のソースとなるのは、イオンに先だって発生する大量の高速電子の持ちさるチャージである。関西研所有のJ-KARENレーザーを用いて実験を行った。ターゲット上に800nm, 30fs, 10^10のコントラスト,1E21Wcm-2の集光強度でレーザーを45度の角度から集光した。ターゲットはアルミ及びマコール製のターゲットホルダを用いた。穴の形状は、斜面が集光点に対して、45度の傾斜を持つ円錐形状のものである。その結果、発生する電子の温度とイオンの最高エネルギーに差が見られるという兆候がある。この差が、レーザーの不安定性に依るか否かを決定するため精度を上げるべく追実験が必要と考えている。先に書いたように、今年度関西研所有のJ-KARENレーザーを用いて実験を行った。実験を精度よく行うためのレーザーの調整を精力的に行い、1E21Wcm-2の集光強度を定常的に実現できるようなシステムを実現した。さらに、イオンに先駆して発生する電子のもちさるチャージがターゲットホルダの表面に電場を立て、時間的に後に発生してターゲットホルダを通過するイオンに、ダイナミカルに作用させる。その電場のソースとなる高速電子の温度をオンラインで精度よく計測するための電子スペクトロメータを開発し導入し、ショットごとの電子の温度分布を精度よく計測した。さらに、その電場の立ち方はターゲットホルダの素材に強く依存すると考えられる。ターゲットホルダの素材として、アルミ(伝導体)とマコール(比伝導体)を選択して、同じターゲットを装着し、同じレーザーパラメータによって照射した。その際に発生する高速電子の温度と発生したイオンの最高エネルギーを比較した。

その結果限られたショットの範囲で、アルミ製のターゲットホルダを用いた場合に、高いエネルギーまでイオンが加速される兆候が見られることが判明した。以上の進捗状況より、研究はおおむね順調と考えられる。引き続き実験を行って、加速されたイオンのエネルギーの差がターゲットホルダ自身によるものなのか、其れとも他の要因によるものかを調査する。さらに、ターゲット自身として、現状では、アルミの0.8ミクロンメートルの厚みのものを主に使っているが、ターゲットの素材を変化させるなどして、ダイナミカルな電場の立ち方、及びその電場のイオンの追加速に及ぼす影響を調査する予定である。さらに、ターゲットに対して垂直にレーザーを集光するスキームによってイオン加速実験を行い、ダイナミカルな電場の立ち方の影響を調査する。ターゲットの薄膜の購入。検出器としてのCR39、及びエネルギーフィルターのための金属薄膜素材の購入。学会のための旅費。
エピジェネティクスによるNodal遺伝子制御機構の再描画

Nodal遺伝子は胚発生期に必須の役割を果たす一方で、成体では発現が完全に抑制され、再活性化はがんの悪性化に寄与する。我々はエピジェネティクスの観点からNodal遺伝子の制御機構を研究した。マウスNodal遺伝子の転写開始点上流にDNAメチル化可変領域を同定し、EREと命名した。EREは胚性幹細胞においてNodal遺伝子の発現を誘導する新規の制御領域であった。分化した細胞ではEREのヒストンH3K27トリメチル化がNodal遺伝子の発現抑制に必須であることを確かめた。またEREはヒトにも保存されており、がん細胞ではH3K27トリメチル化が減少していた。これまでに、マウスNodal遺伝子の転写開始点上流約3kbにわたる領域が胚性幹細胞(mESC)から分化・発生が進むにつれDNAメチル化が亢進していく組織特異的メチル化領域(T-DMR)であることを見出し、Epigenetic regulatory element(ERE)と命名した。さらにEREはmESCにおいて下流遺伝子の発現を誘導する制御領域であることや、mESCから胚様体に分化する過程でクロマチンが高度に凝縮していくことを示してきた。そこで本年度はEREについてさらなる解析を進めた。EREの中でもmESCでクロマチンが特に弛緩している領域はヒトやその他の哺乳類でも保存されており、Oct3/4結合モチーフが存在した。さらにOct3/4遺伝子のノックダウンによりEREの転写誘導活性が大きく低下することを確かめた。よってEREはOct3/4の制御下にあることが判明した。一方、EREは胚様体への分化に伴いEzh2によるH3K27トリメチル化を受けることを見出した。つまりEREはDNAメチル化、ヒストン修飾、クロマチン凝縮によるエピジェネティック制御の標的であるとわかった。In vivoでの解析として、レーザーダイセクション法により8.5日胚の神経板、右側側板中胚葉、左側側板中胚葉を採集しDNAメチル化状態を比較したところ、EREの上流に神経板で高メチル、両側の側板中胚葉に共通して低メチルとなる箇所を見出し、同じ初期胚でも組織間でメチル化状態が異なることを確認した。EREに加えて、エピブラストや左側側板中胚葉でNodalを誘導するAsymmetric enhancer(ASE)についても解析を行ったところ、DNAは発生を通じてほぼ非メチルであり、クロマチンはmESC・胚様体のいずれにおいても凝縮状態にあった。しかしmESCをエピブラスト幹細胞(mEpiSC)へと分化させたところ、EREのクロマチンが凝縮するのに対してASEのクロマチンは顕著に弛緩していったことから、エピジェネティック機構による制御領域のバトンタッチが起こったと考えられる。昨年度までにマウスNodal遺伝子のエピジェネティック制御領域(Epigenetic regulatory element, ERE)を見出し、EREがOct3/4制御下でNodal遺伝子の発現を誘導することや、細胞分化に伴いDNAメチル化やEzh2によるヒストンH3K27トリメチル化を受けることを明らかにしてきた。そこで本年度は、機能阻害実験によりエピジェネティック制御の役割を検証した。Nodal遺伝子の発現は胚性幹細胞(mESC)から胚様体(EB)への分化に伴い減少するが、Ezh2の阻害剤であるDZNep処理によりEBでの発現が亢進した。より分化が進んだマウス胎児線維芽細胞(MEF)について調べたところ、EREはH3K27トリメチル化を受けており、Nodal遺伝子の発現は完全に抑制されていた。興味深いことに、MEFをDZNepで処理するとEREのH3K27トリメチル化が減少し、Nodal遺伝子の発現が再活性化した。このとき、Oct3/4の発現レベルやEREのDNAメチル化状態に目立った変化は認められなかった。すなわち、分化細胞でのNodal遺伝子の長期にわたるサイレンシングには、Ezh2によるEREのH3K27トリメチル化が決定的な役割を果たしていることが明らかになった。EREはヒトにも保存されていること、またヒトNODAL遺伝子の再活性化ががんの悪性化に関与しているとの報告に基づき、ヒトの正常細胞と3種のがん細胞においてEREのエピジェネティック状態を解析した。NODAL遺伝子は正常細胞では完全に抑制されていたが、2種のがん細胞で発現が確認された。さらに、全てのがん細胞でEREのEzh2およびH3K27トリメチル化レベルが減少していることを見出した。以上より、EREのエピジェネティック異常がNODAL遺伝子の再活性化に寄与している可能性が示唆された。本研究において見出したマウスNodal遺伝子のエピジェネティック制御領域(Epigenetic regulatory element, ERE)について、細胞分化に伴うH3K27トリメチル化がEREの制御ならびにNodal遺伝子発現抑制の鍵であり、ヒトがん細胞ではEREのH3K27トリメチル化が減少することでNODAL遺伝子の再活性化ならびにがんの悪性化に寄与している可能性を示した。本年度はEzh2やその他のエピジェネティック制御因子をEREに呼び込む機構を明らかにするために、ノンコーディングRNAに着目した研究を行った。mESCにおいてEREを含むNodal遺伝子の転写開始点上流領域に、アンチセンス方向に発現するノンコーディングRNAを同定した。Nodal遺伝子が完全に抑制されているマウス線維芽細胞では、このアンチセンスRNAの発現も認められなかった。そこでマウス線維芽細胞株NIH3T3にアンチセンスRNAを強制発現させたところ、ERE上流の特定のCpGメチル化状態が顕著に変化した。すなわち、アンチセンスRNAがEREのエピジェネティック状態を制御している可能性が示された。

また、H3K27トリメチル化の誘導によりがん細胞におけるNODAL遺伝子の異常発現を抑制できないかと考え、ヒストン修飾変化を指標とした化合物スクリーニングを実施した。得られた活性画分より本体を単離精製し、H3K27トリメチル化を顕著に亢進させる天然化合物の同定に成功した。Nodal遺伝子は胚発生期に必須の役割を果たす一方で、成体では発現が完全に抑制され、再活性化はがんの悪性化に寄与する。我々はエピジェネティクスの観点からNodal遺伝子の制御機構を研究した。マウスNodal遺伝子の転写開始点上流にDNAメチル化可変領域を同定し、EREと命名した。EREは胚性幹細胞においてNodal遺伝子の発現を誘導する新規の制御領域であった。分化した細胞ではEREのヒストンH3K27トリメチル化がNodal遺伝子の発現抑制に必須であることを確かめた。またEREはヒトにも保存されており、がん細胞ではH3K27トリメチル化が減少していた。EREに結合する転写因子およびエピジェネティック制御因子について、当初計画では最終年度にかけて実施する予定だった機能阻害実験による生物学的意義の解明を既に達成した。さらに当初は計画していなかったヒト正常細胞・ガン細胞での解析も進め、原著論文として発表することができた。よって本研究は極めて順調に進展していると言える。エピジェネティクスEREが胚発生だけでなくガンにも関与することがわかり、より重要性が増したと言える。そこで最終年度はEREの解析を集中的に進める。これまではmESCをEBへと分化させていたが、これはヘテロな細胞集団であるため、セルソーターを用いて特定の細胞種を回収し、EREのエピジェネティック解析を行う。またEzh2などのエピジェネティック制御因子をEREへとリクルートする機構について、ノンコーディングRNAに着目した研究を行う。さらに、mESCやヒトガン細胞においてCRISPR/Cas9法によりERE中のOct3/4結合モチーフをゲノムから除去し、Nodal遺伝子の発現、細胞分化、増殖、ERE全体のエピジェネティック状態などに与える影響を調べる。本年度に計画されていたin vitro / in vivoでのDNAメチル化解析では一定の成果を得ることができた。加えて、当初は次年度の計画に含まれていたEREの転写因子、エピジェネティック修飾因子を同定することにも成功し、分子制御機構を描き出すことができた。よって研究は極めて順調に進展していると言える。概ね計画通りに使用されたが、当初検討していた国際学会への参加を見送ったために、計上していた外国旅費の相当額が余剰となり、次年度繰り越しとなった。本年度までにEREならびに既知の制御領域のDNAメチル化やヒストン修飾状態の変化を明らかにすることができた。今後はこれらの修飾がNodal遺伝子制御に直接働いていることを実証していく。
脱細胞化した気管・気管支を足場とした気管・気管支再生に関する研究

気管・気管支を脱細胞化した足場を生体内に同所性移植して、生体内でどのように再細胞化されるのかを検討した。9週齢オスのSDラットの気管を脱細胞化して足場とし、組織学的評価・力学的評価ののち、SDラットに同所性に移植した(n=9)。その後気管支鏡検査を行い、4週間後に犠死させ、気管の組織学的検討を行った。脱細胞化した気管では細胞成分は完全に除去されていた。足場の強度は正常気管と比べて1/6程度に減少していた。同所性移植を行った9匹の4週後の生存率は78%(7/9)であった。術後1カ月の組織学的所見として、線毛を伴う円柱上皮は吻合部を介して足場内に再生するが、軟骨細胞の再生は得られなかった。気管を脱細胞化し足場を作成する動物として成体Sprague-Dawleyラットを用いた。全身麻酔下に頚部から胸骨にかけて正中切開を置いて開胸し、左右の主気管支を含む気管全長の組織を採取した。ラット気管は極めて脆弱で組織採取には愛護的操作が必要であり、組織採取法の確立のために期間を要した。採取した気管は氷冷した1%ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含有するPBSに10分間浸漬した。組織採取法を確立した後に、予備実験として採取した気管の頭側半分をnative trachea、尾側半分をdecellularized tracheaとし、脱細胞法の検討を行うこととした。採取した尾側半分の気管の脱細胞のプロトコールについては、JungebluthらがNature protocol 2014において報告した方法に従うこととした。すなわち、4% Sodium deoxycholateで2時間灌流した後に、滅菌蒸留水で10分×2回洗浄を行い、続いてDNase I solution (50 kU/ml)で3時間灌流した後に、滅菌蒸留水で10分×2回洗浄を行う、これを1サイクルとし、各サイクルの間隔は24時間以上あけないように、合計9サイクル行った。灌流中の回転速度は60rpmとした。脱細胞後の肉眼的所見ではdecellularized tracheaはnative tracheaと比較して白色透明に変化を認めた。残存細胞成分の評価のために行ったHematoxylin-Eosin染色では、decellularized tracheaは軟骨の構造を保ちながら軟骨基質内の細胞成分が除去されていることを確認した。引き続き、脱細胞の効果判定および細胞外基質が保たれているかどうかを評価するために、decellularized tracheaとnative tracheaについてサフラニンーO染色、II型・I型コラーゲン免疫組織化学染色による軟骨基質の分布の確認を行う。採取した気管の脱細胞のプロトコールについては、JungebluthらがNature protocol 2014において報告した方法に従った。Hoechst33342を用いた核染色では、decellularized tracheaにおいて陽性細胞がないことを確認した。また軟骨基質の評価のために行ったサフラニンーO染色では、脱細胞化後も軟骨基質が温存されていることを確認した。レオメーターを用いた圧縮強度試験の結果、decellularized tracheaの管腔径保持力はnative tracheaと比較して低下しており、およそ1/3程度であった。現在、decellularized tracheaを足場としたラット同所性気管移植モデルを作成し、生体内における再細胞化について評価を行っている。ラット同所性気管移植モデルの作成に期間を要しているため、実験計画がやや遅れている。本研究課題では、実験動物において気管・気管支を脱細胞化し、この足場を生体内に同所性移植することによって、生体内でどのように再細胞化されるのかについての検証を行った。9週齢オスのSDラットの気管を摘出し、4%sodium deoxycholateとDNase I solutionを用いて脱細胞化を行った。得られた足場について組織学的評価を行った後に、レオメーターを用いて同週齢の正常気管と管腔径保持力の比較実験を行った。次いで、8週齢オスのSDラットにこの脱細胞化気管を同所性に移植した(n=9)。その後、気管支鏡検査を行い、移植4週間後に犠死させ、気管を摘出し、組織学的検討を行った。HE染色およびHoechst33342染色の結果から、作成した脱細胞化

気管において細胞成分が完全に除去されていることを確認した。Safranin-O染色では、軟骨基質グリコサミノグリカンが温存されていることを確認した。足場の強度試験では、脱細胞化気管の管腔径保持力は、正常気管と比べて1/6程度に減少していた。同所性移植を行った9匹のうち2匹が経過観察中に死亡し、4週後の生存率は78%(7/9)であった。気管支鏡所見では、移植片内腔の狭小化を認めた。移植後のHE染色では、足場内腔に線毛を伴う上皮細胞の再生を認め、免疫組織化学染色では、足場内腔に線毛上皮細胞のマーカーであるβ-tubulinおよび杯細胞のマーカーであるMucin5AC陽性の細胞が認められた。一方で、軟骨細胞の再細胞化は認められなかった。術後1カ月の組織学的所見として、線毛を伴う円柱上皮は吻合部を介して足場内に再生するが、軟骨細胞の再生は得られなかった。脱細胞化法の変更や、再細胞化を促す因子の添加等の方法が必要である可能性が示唆された。気管・気管支を脱細胞化した足場を生体内に同所性移植して、生体内でどのように再細胞化されるのかを検討した。9週齢オスのSDラットの気管を脱細胞化して足場とし、組織学的評価・力学的評価ののち、SDラットに同所性に移植した(n=9)。その後気管支鏡検査を行い、4週間後に犠死させ、気管の組織学的検討を行った。脱細胞化した気管では細胞成分は完全に除去されていた。足場の強度は正常気管と比べて1/6程度に減少していた。同所性移植を行った9匹の4週後の生存率は78%(7/9)であった。ラット気管の採取法および評価系の確立のために期間を要しており、実験計画がやや遅れている。今後は、decellularized tracheaを足場としたラット同所性気管移植モデルにおける生体内での足場の変化を内視鏡的、組織学的に評価する予定である。その結果によって、脱細胞化した気管に気管上皮細胞および骨髄間葉系幹細胞を播種するなどし、効率の良い再細胞化を試みる。医歯薬学今後は、脱細胞の効果判定および細胞外基質の評価のために、decellularized tracheaとnative tracheaについてサフラニンーO染色、II型・I型コラーゲン免疫組織化学染色による軟骨基質の分布の確認およびグリコサミノグリカン含有量、エラスチン含有量、総DNA含有量の測定を行う。また、レオメーターを用いて、decellularized tracheaとnative tracheaについて圧縮強度およびヤング率を測定し、物性強度の評価を行う。decellularized tracheaとnative tracheaの評価系を確立し、現行のプロトコールの脱細胞効率の評価を行い、その結果によっては、脱細胞のdetergentの変更や、灌流時間の変更を検討し、脱細胞の方法を決定する。脱細胞化した気管に気管上皮細胞および骨髄間葉系幹細胞を播種し再細胞化を試みる。
悪性グリオーマに対する新しい治療体系の確立

悪性グリオーマ細胞の増殖にグリオーマ細胞由来の各種の増殖因子とそれに対する受容体を介したautocrineloop systemが重要であることが知られている。グリオーマ細胞が依存する増殖因子を同定し、その機能を抑制することはグリオーマ細胞の増殖抑制につながると考え基礎的研究を行った。すでにヒト継代グリオーマ細胞U251MGの増殖が血小板由来増殖因子(PDGF)依存性であることを明らかにしている。このPDGF依存性のグリオーマ細胞に対するPDGF阻害剤トラピジールの増殖抑制効果について検討した。この結果、トラピジールはグリオーマ細胞の増殖を濃度依存性に抑制し、抗癌剤のACNUと相加作用を示した。グリオーマの細胞周期に対する影響について検討するとG_0-G_1 phaseからS phaseへの移行を抑制した。細胞の形態を観察した結果、グリオーマ細胞の分化を惹起することも明らかになった。細胞内情報伝達系に対する影響について検討すると増殖因子で刺激された後のProtein kinase Cの活性化を抑制し、また核内遺伝子のc-fosの発現を抑制することも明らかになった。以上よりトラピジールがPDGF依存性グリオーマ細胞の増殖を抑制することが明らかになったが、増殖因子阻害剤として知られているスラミンについて検討すると、高濃度では増殖を抑制し、低濃度では逆に増殖を刺激することが明らかになった。現在トラピジールの臨床第2相試験を進行中である。悪性グリオーマ髄液腔内播種症例に対して、ACNU髄液腔内潅流を行って副作用、髄液腔内薬物動態および治療効果を検討した。その結果、安全かつ有効なACNU髄液腔内潅流療法を確立した。血小板由来増殖因子(plateletーderived growthfactor:PDGF)は癌細胞の増殖に関与する重要な増殖因子のひとつであるが、私達はヒト継代グリオ-マ細胞U251MGの増殖がPDGF依存性であること、さらにPDGFを産生しないU105MG細胞の増殖はPDGF非依存性であることを既に明らかにした。そこで細胞の増殖に重要な増殖因子の機能の抑制がグリオ-マ細胞の増殖抑制につながると考え、今年度の本研究ではPDGF antagonistであるトラピジ-ルを用いてPDGF依存性のグリオ-マに対する増殖抑制作用およびその機序について検討した。その結果、トラピジ-ルはPDGF依存性のU251MG細胞の増殖をin vitroにて抑制し、一方、U105MG細胞の増殖を抑制しなかった。またこの効果は抗癌剤との併用により増強された。in vivoの実験でもトラピジ-ルの連日の腹腔内投与によりU251MG移植腫瘍の増殖は有意に抑制された。DNAヒストグラムを検討すると、3日間無血清培地にて培養した細胞はほとんどG_0ーG_1期に同調したが、血清を加えた培地に変えることにより、3日目に非処理U251MG細胞でG_0ーG_1期の細胞が67.7%、S期が32.1%、G_2ーM期が0.2%であったが、一方、トラピジ-ル処理細胞ではG_01G_ー期の細胞が82.2%、S期が14.8%、G_2ーM期が3%であり、明らかにトラピジ-ルはS期への移行する抑制すると考えられた。また位相差顕微鏡を用いてトラピジ-ル処理U251MG細胞の形態を観察するとトラピジ-ル処理開始後、4時間頃より細胞の突起が伸び、9時間目になるとさらに顕著になった。またGlial Fibrillary Acidic protein(GFAP)に対する抗体を用いて免疫染色を行うと、細胞突起まで強く陽性所見を示し、またGFAP抗体を用いてWestern blottingを行うと、トラピジ-ル処理細胞でGFAPの増加が認められた。

このことよりトラピジ-ルはグリオ-マ細胞の分化を惹起することが示唆された。ヒト継代グリオーマ細胞U251MGの増殖がPDGF依存性であること、PDGF anta-gonistであるトラピジールが、このU251MG細胞の増殖を抑制すること、この機序としてトラピジールはU251MG細胞のG_0-G_1期からS期への移行を抑制し、分化を誘導することを明らかにした。今年度は、PDGF依存性グリオーマにおける細胞内情報伝達系、核内遺伝子の変化に対するPDGFantagonistの作用について検討し、トラピジールによりU251MG細胞のprotein kinase C(PKC)活性の細胞質分画から細胞膜分画への移行が抑制されること、およびU251MG細胞の核内癌遺伝子であるfosの発現が抑制されることを明らかにした。一方、トラピジールと同様にPDGF antagonistであるスラミンは、低濃度(100ug/ml)では各種グリオーマ細胞の増殖を促進し、高濃度(200ug/ml,500ug/ml)で増殖を抑制したが、低濃度のスラミンはグリオーマ細胞の細胞周期においてS期、G_2-M期への移行を促進し、また細胞内のPKC活性の増加をきたすことを明らかにした。また、悪性グリオーマ髄腔内播種症例に対して、ANCU髄腔内灌流を行って副作用、髄腔内薬物動態および治療効果を検討した。その結果、10mgのACNUによる髄腔内灌流で副作用なく有効な髄液中ACNU濃度を達成できることを明らかにし、治療効果判定可能であった11例中6例に有効症例がみられ、悪性グリオーマ髄腔内播種に対してACNU髄腔内灌流療法が有効な治療法になり得ることを明らかにした。悪性グリオーマに対する新しい治療体系を確立する目的で、グリオーマ細胞が依存する増殖因子を同定し、その増殖因子の機能を抑制することでグリオーマの増殖を抑制するという新しい治療法の開発について一連の実験を行った。その結果、ヒト継代グリオーマ細胞U251MGの増殖がPDGF依存性であること、PDGF antagonistであるトラピジールがこのU251MG細胞の増殖を抑制し、細胞の分化も誘導することを明かにした。この機序としてトラピジールはU251MG細胞のG_0-G_1期からS期への移行を抑制すること、また細胞内情報伝達系において重要な役割を示すprotein kinase C活性を抑制し、また増殖因子の作用により誘導される核内遺伝子の一つであるc-fosの発現も抑制することを明らかにした。グリオーマ細胞がmonocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)を産生し、グリオーマ局所にマクロファージを浸潤させることを明かにしてきた。このMCP-1に反応したマクロファージがグリオーマ細胞の増殖に何らかの影響を与えていると思われるが、トラピジールがグリオーマ細胞からのMCP-1の産生を調節していることを、ELISAimmunoassay,Northen blot法にて明かにした。現在その意義について検討中である。悪性グリオーマの髄液腔内播種に対する新しい治療法として髄液腔内ACNU灌流療法を開発し、その臨床応用について報告してきた。さらに臨床症例を増やし、その有効性・副作用について検討中である。
ヒトがん細胞におけるゲノムの異常なメチル化の機構の解明

申請者らは以前テトラサイクリン感受性のU6プロモータを用いて,テトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAの発現システムを構築し,DNA methyltransferase 1(DNMT1)を標的として,ウェスタンブロットで検出不能となる程度まで発現が抑制される事を示した.本課題では,ほ乳類で活性が確認されているこのほかのDNMTである,DNMT3A, DNMT3Bをテトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAを用いてノックダウンし,その機能の解析を行うことを目指している.本年度はベクターの改良ならびにヘアピンのループの及ぼす転写抑制に対する影響を検討しつつ,DNMT3A, DNMT3Bに対するヘアピンsiRNAベクターの構築を行った.まず,ヘアピンsiRNAベクターの構築については,最近報告された,いくつかの点を参考に改良を行った.まず,以前我々が構築したU6プロモーターのベクターは,Promega社pGEM-TEasyを骨格としているため,ヘアピンをコードするオリゴDNAの挿入について用いることのできる制限酵素認識配列が,AatIIおよびApaIしかなく,また,AatIIがスター活性を有するため,ヘアピンsiRNAベクター構築時のオリゴDNAの挿入にはしばしば難渋した.このため,プロモーターの下流に50塩基のオリゴDNAを挿入,新たに9つの制限酵素認識配列(XmaI,NarI,XhoI,BglII,XbaI,HindII,AflII,BamHI,MfeI)を構築した.DNMT3Aについては5つの異なる部位を標的とするベクターを構築し,ウェスタンブロットを用いて,その効果を検討したところ,2つのヘアピンsiRNAで,発現量が50%まで抑制されるベクターが得られた.ヘアピンのループについてはBrummelkampらの報告[Brummelkamp et al.,science 296(5567):550-3(2002)]に則りTTCAAGAGAの9塩基を用いた.また,最近のMiyagishiらのGTGTGCTGTCC[Miyagishi et al.,J Gene Med.;6(7):715-23(2004)],以前申請者らが報告したAatII配列GACGTCについても,同じ標的配列を用いて比較をしたところ,予想に反して,AatII配列が最も,発現抑制効果が強く,siRNAの転写量等について,現在検討の準備を行っている.一方DNMT3Bについては,ウェスタンブロットで,これまでのところ構築したヘアピンsiRNAベクターでは発現量が70%程度にまで抑制されるベクターを得ている.申請者らは以前テトラサイクリン感受性のU6プロモータを用いて,テトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAの発現システムを構築し,DNA methyltransferase 1(DNMT1)を標的として,ウェスタンブロットで検出不能となる程度まで発現が抑制される事を示した.本課題では,ほ乳類で活性が確認されているこのほかのDNMTである,DNMT3A, DNMT3Bをテトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAを用いてノックダウンし,その機能の解析を行うことを目指している.本年度はベクターの改良ならびにヘアピンのループの及ぼす転写抑制に対する影響を検討しつつ,DNMT3A, DNMT3Bに対するヘアピンsiRNAベクターの構築を行った.まず,ヘアピンsiRNAベクターの構築については,最近報告された,いくつかの点を参考に改良を行った.まず,以前我々が構築したU6プロモーターのベクターは,Promega社pGEM-TEasyを骨格としているため,ヘアピンをコードするオリゴDNAの挿入について用いることのできる制限酵素認識配列が,AatIIおよびApaIしかなく,また,AatIIがスター活性を有するため,ヘアピンsiRNAベクター構築時のオリゴDNAの挿入にはしばしば難渋した.このため,プロモーターの下流に50塩基のオリゴDNAを挿入,新たに9つの制限酵素認識配列(XmaI,NarI,XhoI,BglII,XbaI,HindII,AflII,BamHI,MfeI)を構築した.DNMT3Aについては5つの異なる部位を標的とするベクターを構築し,ウェスタンブロットを用いて,その効果を検討したところ,2つのヘアピンsiRNAで,発現量が50%まで抑制されるベクターが得られた.ヘアピンのループについてはBrummelkampらの報告[Brummelkamp et al.,science 296(5567):550-3(2002)]に則りTTCAAGAGAの9塩基を用いた.また,最近のMiyagishiらのGTGTGCTGTCC[Miyagishi et al.,J Gene Med.;6(7):715-23(2004)],以前申請者らが報告したAatII配列GACGTCについても,同じ標的配列を用いて比較をしたところ,予想に反して,AatII配列が最も,発現抑制効果が強く,siRNAの転写量等について,現在検討の準備を行っている.一方DNMT3Bについては,ウェスタンブロットで,これまでのところ構築したヘアピンsiRNAベクターでは発現量が70%程度にまで抑制されるベクターを得ている.
マラッカ・ジョージタウン世界遺産のボトムアップ保存手法構築のための調査研究

歴史的都市の価値そのものである生きている生活文化とその都市組織に対し、マラッカ・ジョージタウンが世界文化遺産登録により、保存と破壊の衝突が激化している。世界遺産公社の設立、歴史環境保全補助金の導入が民間有識者の活躍する場の構築に貢献している一方、指導の責任と権限所在の曖昧さにより、破壊行為を効果的に防ぐことができていない。民間有識者の直訴が行政に反映できる環境を維持・強化しつつ、シンプルな組織でも効果的な都市保存を実現するために、行政担当者-生活者の連携と価値共有を実現する多岐にわたる活動展開が要請されている。マレーシアのマラッカ・ジョージタウンは、2008年に世界文化遺産として登録された。政府や地方自治体はその保存手法を模索している段階にある。長年にわたりBWM、PHTなどの民間団体やNGOまたは個人で行ってきた建築保存運動、ガイドライン検討、研究活動の成果があるにもかかわらず、世界遺産登録後、政府の施策は保存理念を十分に反映し機能していると言えず、民間団体の誘導・是正・監視・補完諸役割を効果的に発揮できる土壌ができていると言い難い。世界遺産登録のインパクトを受けながら、東西文化の交流、多民族共存の歴史が重層的に刻印されているマラッカ・ジョージタウンの建築と市街地と、生きている多民族社会の伝統生活文化を守っていくために、新しい都市保存システムの構築が緊急課題になっている。本研究では、既存システムの長短所の整理、人材組織の把握・活用検討、遺産管理の仕組みに関する情報交換を行い、現地の民間団体、諮問組織、自治体に対し基礎的な情報を収集し、日本の文化遺産管理、観光地管理、文化財保存諸経験を生かし助言する。21年度の調査では、ジョージタウン世界遺産の管理に携わっている民間団体CHAT、arts-EDのメンバー、世界遺産管理局担当者、マラッカの保存活動にかかわっている活動家から、保存活動の実態、保存システムの問題点についてヒアリングを行った。また、住民、経営者、開発業者に対し、世界遺産への思いや認識について確認を試みた。世界遺産の管理・観光活用のあり方について、民間団体と九州大学西山徳明教授との意見交換会を行った。世界遺産管理局の行政的位置付け、民間団体の活動から、ジョージタウンは今まで困難とされている「生きている伝統生活文化の継承」を民間の力で、教育活動・建築保存・歴史研究・情報発信を通してその実現を試みている。マラッカはトップダウン的性格が強く、保存理念の共有をはじめ緊急課題が多い。ジョージタウン世界遺産公社(George Town World Heritage Incorporated)の要望に応じ、ジョージタウンにて日本の世界遺産の管理制度について勉強会を開いた。ペナン州首長をはじめ、世界遺産サイト関係者20名程度が参加し、文化財保存のシステム、人的資源の配置、住民参加の仕組み等について情報交換を行った。また、伝統的な生活文化の保存活動を行っている民間組織arts-EDとPenang Heritage Trustのメンバーが来日し、住民主導の保存活動の実例として白川郷、妻籠宿に訪れた。両地域の保存運動の歴史、仕組みと現状問題について学習した。京都市景観・まちづくりセンターを訪問し、京都市の景観・京町家の保存活動にかかわる、センターの組織・役割について学習、情報交換をした。その他、遺産の管理・運用、保存推進に携わっているGeorge Town World HeritageIncorporatedの責任者、世界遺産サイトの政府補助金を管理するThinkCityの担当者、ショップハウスを活用している若手経営者、コンサルタント、Melaka Heritage Trust等の組織やステークホルダーに対しヒアリング調査を行い、各視点から遺産サイト管理の現状と問題点の把握を試みた。ジョージタウン世界遺産サイトの管理模索期である200809年に、民間の力が比較的に効果的に活用されていたと言える。200910年には、財源の拡充、管理組織の設立など仕組み形成面において前進したが、保存方針や調整のためのプラットホーム・仕組みが明確的でないため、有益なはずの諸働きの相乗効果を十分に引き出せていない。ボトムアップの力は、自覚されていない状況に弱体化していく恐れがある。2008年の世界遺産登録以降、マラッカとジョージタウンにおける世界遺産公社(Worldb Heritage Incorporated:WH1)の設立は、両地の遺産サイト保存・管理に対応した行政側最大の動きと言える。WHIは自治体の外郭機関として、事務局、管理システムの提案、開発コントロールの提言などの機能を有するが、オーソライズ権限をもっていない。開発コントロールは、従来の都市計画・建築行政部門が対応し、世界遺産の歴史・文化解釈に基づいた指導を可能にする積極的な行政内部の変革はまだ見られない。ジョージタウンWHIの諮問業務は主に民間有識者の会合をもって、遺産サイトにおける建築申請の内容をチェックし、SAP草案の作成などを助言する。しかし、建築申請件数が多い、改築・転用への監視も対応しきれない問題が顕在している。世界遺産登録以降のこの3年間、世界遺産サイト管理に対するWHI、地元有識者の関心は、1)住民や役人の態度・意識改革、自治体レベルの制度づくり→2)住民を巻き込むまちづくり活動に対する行政の取り組み→3)遺産価値を維持・保全するための持続的な草の根活動ネットワーク構築、に移行している。