hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発育・発達期における低濃度複合水銀曝露による神経行動毒性に対する遺伝的要因の影響

10週齢ではいずれの曝露群も脳内水銀濃度が対照群に比べ高値にあるにも関わらす行動試験に変化は認められなかった。胎生期メチル水銀曝露を受けた場合、加齢による神経行動異常の発現が報告されていることから、発育期に複合曝露をうけた雌性マウスの1年後(79週齢)の行動試験を行った。体重については、79週齢における対照群と各曝露群の間に差異は認められなかった。行動試験のオープンフィールド(OPF)試験では総移動距離、中心滞在割合ともに対照群と水銀蒸気(Hg0)、メチル水銀(MeHg)、Hg0+MeHg複合曝露群との間に統計的な有意差は認められなかった。受動回避(PA)試験でも訓練および保持時間に対照群と各曝露群間の間に有意な差異は認められなかった。放射状迷路試験では1試行中に「既に獲得したアームを訪れるエラー数」、「試行中に獲得したペレット数」ともに対照群と各曝露群との間に有意差は認められなかった。水銀濃度は大脳で2.6倍、小脳で2.1倍、対照群に比べ高値であり、その差は統計的に有意であった。このことより発育期に低濃度Hg0、MeHgそしてHg0+MeHg複合曝露を受けても加齢による神経行動毒性の発現は認められなかった。次に金属毒性に対し感受性が高いメタロチオネイン-I/II遺伝子欠損雌マウス(以下MT-nullマウス)を用いて、発育期における複合水銀曝露が神経行動機能に及ぼす影響について検討した。OPF試験の総移動距離および中心に滞在する割合、PA試験そして放射状迷路試験の「既に獲得したアームを訪れるエラー数」および「獲得したペレット数」には野生型マウスとMT-nullマウスとの間に統計的有意差に認められなかった。以上の結果より、低濃度複合水銀の曝露による加齢による神経行動毒性に影響は認められなかった。重金属毒性に対し、感受性高いMT-nullマウスを使用して複合水銀曝露を行っても神経行動毒性は認められず、この時期に低濃度複合曝露は胎生期に比べ、水銀に対する感受性は低いことが明らかとなった。環境毒性学平成24年度に行ったHg0曝露群、MeHg曝露群、Hg0+MeHg曝露群の10週齢における神経行動試験と1年後の加齢による各曝露群の神経行動毒性に対する影響を評価することができた。しかし、複合曝露のよる神経行動毒性に対するメタロチオネイン欠損(MT-KO)マウスを用いた遺伝的要因に関する実験が平成24年に行うことができなかった。複合曝露実験を実施するためのMT-KOマウスが動物施設の温度管理機能の故障により、死亡したことにより実験に必要な動物数を確保できなかったためである。我々は胎生期における低濃度MeHg水銀曝露(5ppm給餌)では繁殖適齢期における行動試験ではいずれも異常は認められないが、1年後に行った行動試験においてOPF試験、PA試験、水迷路試験に異常が認められ、加齢による神経行動毒性が発現していた(Yoshida et al 2008)。また授乳期における低濃度Hg0曝露(平均0.057mg/m3)でも繁殖適齢期における行動試験では異常は認められず、1年後の神経行動試験でOPF試験に異常が認められ、遅延性の神経行動毒性が発現することが明らかとなった(Yoshida et al 2013)。今回の授乳後のHg0曝露(平均0.096 mg/m3)、MeHg曝露(5ppm飲料水)、Hg0+MeHg複合曝露実験の曝露条件は過去の結果に基づいて行った。繁殖適齢期に測定した行動試験(OPF試験、PA試験、RM試験)結果は対照群とそれぞれの曝露群の間に統計的な有意差は認められず、Hg0曝露(平均0.096 mg/m3)実験やMeHg曝露(5ppm飲料水)実験結果はこれまでの胎生期におけるMeHg曝露、授乳期におけるHg0曝露実験と同様の結果であった。Hg0+MeHg複合曝露実験ではこの群の水銀濃度は大脳で1.26.6倍、小脳で1.41.9倍、Hg0曝露群やMeHg曝露群に比べ高いにも関わらず神経行動毒性への影響が認められないこと明らかとなった。
単球の高親和性IgEレセプター依存性サイトカインの産性

以上の結果より単球のFc εR IおよびIgE依存性のPGE2の遊離が明らかになった。現在までに単球のFc εRI架橋により、Ca influxが上昇することが知られているが我々は、Fc εR I依存性に単球より遊離されるメディエーターを明らかにした。
運動軌道の解析による生体の制御メカニズムの研究

生体の運動制御の計算モデルを検証し応用するために、ヒトの手や腕の運動軌道を計測するシステムを構築した。計測した運動軌道のデータを解析することによって制御メカニズムを推測するとともに、運動軌道の知覚に関する心理物理実験も行った。主な実験と研究成果は、以下のとおりである。1.運動軌道の生成における運動規範の検証ヒトの腕による2点間到達運動に関して、作業空間の広い範囲で多数の軌道データを計測し、腕の軌道の曲率、加速度、トルクに関する時空間的特徴を解析した。さまざまな運動規範を比較・検討した結果、計測された人腕の運動軌道は指令トルク変化最小モデルの予測する軌道に最も似ていることが定量的・統計的に示された。また、できるだけ速く手先をターゲットに移動するという行動実験を行い、その運動軌道を解析したところ、要求される運動タスクにかかわらず、ヒトは常に滑らかさの規範に基づいて軌道を計画していることがわかった。3.曲線運動の生成と知覚に関する心理物理実験ヒトが手で楕円を描くような曲線運動を行うとき、手先の接線速度は曲率半径の1/3乗に比例するという1/3乗則が見い出されている。計算機シミュレーションによって、1/3乗則が、指令トルク変化最小モデルなどの滑らかさの運動規範で再現できることを確かめた。また、ヒトが行うさまざまな速度プロファイルの楕円運動をコンピュータグラフィックスで被験者に提示する心理物理実験を行い、滑らかさの運動規範が運動の知覚にも適用されることを示唆する結果が得られた。4.リハビリテーションへの応用本研究の応用として、脊髄損傷による下肢麻痺患者のための歩行再建システムを構築した。本システムは、長下肢装具と機能的電気刺激を組み合わせたハイブリッドシステムである。健常者に対して本歩行再建システムのテストを行い、その下肢関節の動きを解析して実用性が高いことを確認した。生体の運動制御の計算モデルを検証するために、今年度は主として、手と腕の運動計測システムの設計と構築を行い、予備実験とデータの収集を始めた。運動環境を人工的に変更する装置として、マニピュランダムと呼ばれる人腕計測装置を構築した。これは、メガスラストモータによって手先に任意の外力を加えることで、腕のダイナミクスなどを変えることができる装置である。本研究では、ヒトの手や腕の運動軌道を解析することによって制御メカニズムを推測するとともに、運動軌道の知覚に関する心理物理実験も行った。具体的な実験と成果は、以下のとおりである。1.ヒト腕の運動タスクと最適軌道に関する研究:できるだけ速く手先をターゲットに移動するという心理物理実験を行い、その運動軌道を解析したところ、要求される運動タスクに拘わらず、ヒトは常に滑らかさの規範に基づいて軌道を計画していることがわかった。2.ヒトの手先位置の能動的知覚に関する研究:ヒトが自ら手を動かす能動性運動と、マニピュランダムによって他動的に手を動かされる受動性運動とを計測・比較することによって、運動情報が手先位置の知覚に重要であることがわかった。3.ヒトの曲線運動の能動的知覚に関する研究:ヒトが手で曲線を描くような運動を行うとき、手先の接線速度は曲率半径の1/3乗に比例するという1/3乗則が知られている。自分の手先が見えない環境で、1/3乗則からずれた速度プロファイルで、マニピュランダムによって他動的に同一の楕円形状を描かせたとき、楕円形状の知覚に錯覚が生じることを見い出した。生体の運動制御の計算モデルを検証し応用するために、昨年度、設計・構築した運動計測システムを用いて、ヒトの手の運動軌道を計測する実験を行った。

1.キネマティクスが変更された環境下での運動学習の計測プロジェクターを用いて、腕の長さや関節角が仮想的に伸縮された視覚環境を準備し、マニピュランダムを用いて、ヒトの手を他動的に移動できる運動環境を設定した。このように人工的に変更された環境で、被験者に、他動的に動かされた手先の位置を答える課題(順キネマティクス)と目標点に手先を移動する課題(逆キネマティクス)を行わせた。2つの課題における長時間の学習後の回答位置と誤差を解析することによって、ヒトの脳内で、順キネマティクスあるいは逆キネマティクスに応じて、別々のモジュールが獲得される可能性が見い出された。2.運動タスクと最適軌道に関する研究昨年度に続いて、さまざまな運動タスクにおいて滑らかさの運動規範が採用されるか否かを、最適軌道の計算機シミュレーションと、ヒトの到達運動の行動実験を通じて検証した。今年度は特に、実験条件を整備して、系統的かつ長期の心理物理実験を行うことによって、運動時間最小タスクのような課題が指示されてもされても、ヒトは滑らかさの運動規範にしたがって軌道を生成することを確認した。3.運動スキルの獲得メカニズムに関する研究とリハビリテーションへの応用本研究のリハビリテーションへの応用として、脊髄損傷による下肢麻痺患者のための歩行再建システムを構築した。本システムは、長下肢装具と機能的電気刺激を組み合わせて歩行を実現するハイブリッドアシスティブシステムである。健常者に対して、機能的電気刺激を用いた歩行運動と随意的な歩行運動における下肢関節の動きを解析し、本歩行再建システムの実用性が高いことを確認した。生体の運動制御の計算モデルを検証し応用するために、昨年度、設計・構築した運動計測システムを用いて、ヒトの腕の運動軌道を計測する実験を行った。具体的な実験と成果は、以下のとおりである。1.運動パターンの生成における最適化原理の検証ヒトの多関節腕による2点間到達運動に関して、作業空間の広い範囲で多数の軌動データを計測し、腕の軌動の曲率、加速度、トルクに関する時空間的特徴を解析した。手先躍度最小規範、関節角度躍度最小規範、指令トルク変化最小規範などを比較・検討した結果、計測された人腕の運動軌道は指令トルク変化最小の予測する軌動に最も似ていることが定量的・統計的に示された。2.運動タスクと最適軌動の研究昨年度に続いて、運動時間最小タスクにおける人腕の運動軌動を計測し、解析した。今年度は特に、1週間連続して到達運動のトレーニングを行ったときの軌動の変化を調べ、ヒトは、常に滑らかさの運動規範にしたがって軌動を生成することを確認した。3.リハビリテーションへの応用昨年度構築した、下肢麻痺患者のための歩行再建システムの改良を行った。本システムは、長下肢装具と機能的電気刺激を組み合わせたもので、今年度は、特に手指につけたジャイロンセンサから電気刺激へと変換するコントローラの設計・検討を行った。4.曲線運動の生成と知覚における運動規範の検証ヒトが手で楕円を描くような曲線運動を行うとき、手先の接線速度は曲率半径の1/3乗に比例するという1/3乗則が見い出されている。計算機シミュレーションによって、1/3乗則が、指令トルク変化最小モデルなどの滑らかさの運動規範で再現できることを確かめた。
骨の機械受容におけるインテグリンの生理機能

骨芽細胞系列細胞、特に骨細胞は力学負荷受容細胞と考えられている。しかしその受容メカニズムの実態についてはほとんど明らかにされていない。インテグリンαv欠損骨芽細胞にシアストレスを負荷し、αv下流にSrc, p130Cas, JNKのリン酸化と、その結果としてYAP/TAZの核移行が誘導されることを明らかにした。さらに個体においてインテグリンαvのメカニカルストレス応答機能を実証するために骨芽細胞系列特異的インテグリンαv欠損マウスを作製した。その前肢に強制負荷を加えSOST遺伝子をreadoutとして、インテグリンαvがメカニカルストレスの受容に必須の生理機能を果たしていることを明らかにした。骨基質中に埋没して存在する骨細胞は、骨表面の破骨細胞や骨芽細胞の機能を調節することにより骨の恒常性を司っている。骨細胞は、メカニカルストレスを受容することで骨代謝を制御していると想定されているが、骨細胞上に存在するメカノセンサーの実体や受容以降に発動される細胞内シグナル伝達機構については不明な点が多い。細胞接着分子インテグリンalpha-vは骨芽細胞や骨細胞に発現しており、細胞周囲の骨基質にそのリガンドが豊富に存在することから、メカニカルストレス受容センサーの候補と考えられる。インテグリンalpha-vを介するメカニカルストレス受容機構を明らかにするために、インテグリンalpha-v floxマウス頭蓋冠由来の初代培養骨芽細胞にシアストレスを負荷し、インテグリン下流のシグナルについて検討した。その結果、インテグリンalpha-vを介してシアストレス応答にかかわるSrc-p130Cas-JNK-YAP/TAZという新たなシグナル伝達経路の存在を明らかにした。さらに、骨芽細胞系列および骨細胞特異的にインテグリンalpha-v欠損させたマウスを作製したところ、個体レベルでは低骨代謝回転と低骨量傾向を示した。alpha-vがメカニカルストレスを受容することをin vivoで証明するために、骨芽細胞系列でインテグリンalpha-v欠損させたマウスの前肢尺骨に強制負荷を行った。Wntシグナル伝達経路のアンタゴニストとして知られるSOSTは骨細胞で発現し、荷重負荷によりその発現が抑制されることが知られているが、alpha-v欠損マウス尺骨では、対照とした対側に比較して、SOSTの発現抑制が見られないことが判明し、インテグリンalpha-vがメカニカルストレス受容機構の中核であると結論づけた。本研究の目的は、細胞接着分子インテグリンalpha-vが骨細胞上でメカニカルストレス受容に関わるとの仮説を立て、個体レベルでメカニカルストレス受容の分子メカニズムを明らかにすることである。骨では、破骨細胞により古い骨が吸収され、骨芽細胞によって新しい骨が形成されることで骨量が維持される。破骨細胞と骨芽細胞の機能は、指令細胞である骨細胞によって制御されると考えられている。骨細胞はメカニカルストレスを受容すると考えられているが、骨細胞上に存在するメカノセンサーの実体や受容後に発動される細胞内シグナル伝達機構については不明な点が多い。近年、古典的Wntシグナル伝達経路のアンタゴニストとして知られるSOSTの発現調節とメカニカルストレス受容機構が関連している可能性が示されているが、骨細胞がどのようにメカニカルストレスを受容し、どのようなシグナル伝達系を経由してSOSTの発現調節をしているかについては未だ十分に明らかではない。接着分子インテグリンalpha-v beta-3は、骨細胞周囲にそのリガンドが豊富に有することから、メカニカルストレス受容センサーの一つと考えられる。骨代謝におけるインテグリンの役割は破骨細胞において盛んに研究されているが、骨芽細胞および骨細胞においては個体レベルでの解析が十分にされていない。その理由は、骨細胞が硬い骨基質に埋没した特殊な環境に存在することにより、これまでその解析が技術的に困難であったためである。昨今、確立された骨細胞特異的に遺伝子発現を調節する系を用いて、骨細胞特異的にインテグリンalpha-vを欠損させるマウスを作製し、個体レベルでメカニカルストレス受容の分子メカニズムを明らかにする。骨細胞上のインテグリンalpha-vがメカニカルストレス受容機構に含まれることを個体レベルで示すために、骨芽細胞系列特異的および骨細胞特異的インテグリンalpha-v欠損マウスを作製した。マイクロCTによって骨の三次元構造を解析すると、両コンディショナルノックアウトマウス(cKO)はコントロールマウスと比較して低骨量傾向であった。骨代謝については、骨形態計測と血清を用いた生化学解析を行い、両cKOにおいて骨代謝回転が低下していることが示された。骨代謝に関わる遺伝子群の発現解析も行ったところ、両cKOにおいて、骨細胞より分泌されるSOSTの発現が高いことが示された。また細胞レベルの解析では、マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞を用いてインテグリンalpha-vを介するシグナル解析を行った。

骨細胞に加わるメカニカルストレスとしてずり応力が考えられるので、培養骨芽細胞にずり応力を加えた後にインテグリンalpha-vを経由して活性化するシグナル伝達系に関して検討した。その結果、インテグリンalpha-vを介してずり応力応答にかかわるSrc-p130Cas-JNK-YAP/TAZという新たなメカニカルストレス伝達系の存在を明らかにした。今後は、メカニカルストレス受容機構を個体レベルで明らかにするために、実験モデルを用いた解析をする予定である。また、細胞レベルの解析で明らかにした、Src-p130Cas-JNK-YAP/TAZシグナル伝達系の存在を個体レベルで明らかにしたいと考えている。骨芽細胞系列特異的および骨細胞特異的インテグリンalpha-v欠損マウスを用いて個体レベルでのメカニカルストレス受容機構の分子メカニズムについて解析する。まず、メカニカル刺激を除いた場合、骨芽細胞または骨細胞におけるインテグリンalpha-vの存在の有無が骨代謝に影響を与える可能性について検討する。具体的には、マウスの尾部を持ち上げ(尾部懸垂モデル)、脛骨や大腿骨への荷重を取り除いた状態での骨解析を行う。この尾部懸垂モデルマウスの脛骨や大腿骨を、通常飼育下のマウスの骨をコントロールとして、メカニカル刺激除去時に見られる遺伝子発現変化を比較検討する。特に注目しているのが古典的Wntシグナル伝達経路のアンタゴニストとして知られるSOSTの発現調節である。SOSTは、骨細胞特異的に発現し尾部懸垂によりその発現が上昇することが報告されている。骨芽細胞系列特異的インテグリンalpha-v欠損マウスおよび骨細胞特異的インテグリンalpha-v欠損マウスにおいてSOSTの発現が上昇していることから、骨細胞上のインテグリンalpha-vがSOSTの発現調節に関与しているのではないかと推測している。次に、前肢尺骨に強制負荷を行い、インテグリンalpha-vが骨芽細胞および骨細胞においてメカニカルストレス受容機構に含まれる可能性について検討する。具体的には、マウスの右前肢に負荷を加え、対肢をコントロールとして、メカニカルストレス受容後に活性化されるシグナル伝達経路と発動される遺伝子発現を比較検討する。SOSTは、前肢強制負荷により発現が抑制されることが報告されているので、特に注目して発現比較解析を行う予定である。また、これらの研究結果を国内外の学会で発表し、国内外の研究者と討論することにより、この研究を更に発展させる予定である。骨芽細胞系列特異的インテグリンalpha-v欠損マウスおよび骨細胞特異的インテグリンalpha-v欠損マウスの骨よりmRNAを抽出し、遺伝子解析をするために必要な試薬等を購入する。また、これまでに細胞レベルで明らかにしたインテグリンalpha-vを介してずり応力応答にかかわるSrc-p130Cas
臨床応用を目的にした音声障害の音響的検査装置の開発

試作した「音声障害の音響的検査装置(以下検査装置と略称)」のハードウエア構成には、2種類ある。一つは、特別に試作した音声入出力及び音声信号処理を高速・高精度で実行するための音声入出力処理装置とパーソナルコンピュータ(PC)で構成される検査装置で、他の一つは市販のサウンドボードとPCからなる検査装置である。両者は、検査装置としてほぼ同じ機能を実現できるが、ピッチ周波数と音圧を同時に実時間で計測・表示するphonetogram機能は、前者だけで可能である。利用者の操作(対話)は、PCで動作するWindowsを介して行うので、利用者にとって使いやすいだけでなく、Windowsで動作する市販のいろいろな表計算・統計パッケージとデータ交換できる。検査装置の機能は、臨床で定型的な検査業務に利用するモードと、音声障害を研究用に多面的に利用するモードからなる。定型的な検査業務では、患者が持続発声した母音から音声障害を客観的(音響的)に評価するために必要な評価パラメータを自動的に計測し、主な評価用音響パラメータを正常/病的の目安となる閾値と一緒にradar chartとして表示する。そのほかのパラメータも含めて、音響的評価に利用する音響パラメータは、同時にreport fileとして保存され、必要に応じて印字する。これらの評価用音響パラメータには、本研究課題で考案された多くのものが含まれている。研究用のモードでは、持続母音だけでなく連続音性も処理できる。音声分析機能としては、ピッチ、フォルマント、FFT/LPCスペクトル、サウンドスペクトログラム、などを備えているだけでなく、音声合成の手法で音声障害を評価することもできる。これらの検査装置は臨床的に、精度や使い易さを評価し、十分実用に耐えられることが分かっている。音声障害のゆらぎの計測法について多くの知見を得た。まず,従来提案されているいろいろなゆらぎパラメータの物理的意味を,周波数領域で統一的に解釈することを試みた。その結果それらは,基本周期あるいは振幅系列の高域通過フイルタの出力の大きさあるいはパワーを測定していることを明らかにした。さらにその解釈に基づいて,適当な遮断周波数をもつ高域通過フイルタに基づく新しいゆらぎパラメータを考案した。喉頭癌,声帯ポリープ,反回神経麻痺などの患者の音声データベースを用いて従来のゆらぎパラメータとわれわれの新しいパラメータについて,耳鼻科医の聴覚的な主観評価との相関という観点から比較検討したところ,われわれの方が優れていることを示した。また,音声(持続母音)の非定常性を考慮して,複数の定常区間に区分化してゆらぎパラメータを評価することの有効性を明らかにした。さらに,基本周期・振幅系列の自己回帰・移動平均分析によって得られる自己回帰パラメータを用いると,音声障害の性質を効果的に表現できることを明らかにした。検査装置のパイロットシステムのハードウエアの設計と製作をほぼ完了し,現在テストを行っているが,平成5年4月中には完成する予定である。ハードウエアの制御と音響検査のための信号処理ソフトウエアについては,上述の新しい知見も組み入れながら,現在鋭意製作を急いでいる。これら第1版を,11月米国加州アナハイム市で開催される米国音声・言語・聴覚学会(American Speech-Language and Hearing Association)の年会で発表するとともに,展示も予定している。昨年度終了した音響的検査装置のハードウエア基本設計に基づいて、パイロットシステムを製作した。これまでの基礎的な検討を踏まえて、検査項目の第1次案を以下のように設定し、検査用ソフトウエアを作成した。1周期性の有無の検査:声帯振動に伴う音声の基本周期が音声信号に存在するかどうかの検査。周期性が認められない場合は音声の平均スペクトルを表示し、周期性がある場合は次の検査に移る。

2音声の基本周期ゆらぎ(ジッタ)の検査:周期変動指数(PPQ)、ジッタパラメータ(JP)、ジッタファクタ(JF)、周期系列の2次AR分析によるゲインと極周波数及び帯域幅の測定。周期系列の平均値、分散、スキューネス、どの統計量の測定。各測定値と正常値の関係の表示(検査)。3音声の振幅ゆらぎ(シマ)の検査:振幅変動指数(APQ)、シマパラメータ(SP)、シマファクタ(SF)、振幅系列の2次AR分析によるゲインと極周波数の測定。振幅系列の平均値、分散、スキューネスなどの統計量の測定。4喉頭雑音の測定:2種類の規格化雑音エネルギー(NNEa,NNEb)の測定。その値と正常値の関係の表示。そのほかに、本検査装置の特徴として、音声障害に限らず正常音声についても基本的な特性である、種々のスペクトル表示、ホルマント周波数・帯域幅の測定、サウンドスペクトログラフの表示も可能とした。また、波形のいろいろな編集機能(切り出し、追加、無音化)や音声の録音・再生機能も備えている。現在、第1次案に基づく装置はほぼ完成し、臨床における評価段階に入っている。「音声障害の音響的検査装置(以下検査装置と略称)」を試作し、その使用説明書を作成した。検査装置のハードウエア構成は2種類ある。一つは、特別に試作した音声入出力及び音声信号処理を高速・高精度で実行するための音声入出力処理装置とパーソナルコンピュータ(PC)で構成される検査装置で、他の一つは市販のサウンドボードとパーソナルコンピュータからなる検査装置である。両者はほぼ同じ機能を有するが、ピッチ周波数と音圧を同時に実時間で計測表示するphonetogram機能は、前者だけで可能である。PCで利用者と対話する部分は、Windows上に開発されているので、利用者にとって使いやすいだけでなく、いろいろなPC機種で動作することができるという利点を有する。検査装置の機能は、臨床で定型的な検査業務に利用するモードと、音声障害を研究用に多面的に利用するモードとからなる。定型的な検査業務では、患者が持続発声した母音から音声障害を客観的(音響的)に評価するために必要な評価パラメータを自動的に計測し、主な評価用音響パラメータを正常/病的の目安となる閾値と一緒にradar chartとして表示する。そのほかのパラメータも含めて、音響的評価に利用する音響パラメータは、同時にreport fileとして保存され、必要に応じて印字する。研究用のモードでは、持続母音だけでなく連続音性も処理できる。音声分析機能としては、ピッチ、フォルマント、FFT/LPCスペクトル、サウンドスペクトログラム、などを備えているだけでなく、音声合成の手法で音声障害を評価することもできる。これらの検査装置は臨床的に、精度や使い易さを評価し、十分実用に耐えられることが分かっている。
APC癌抑制遺伝子産物の中枢神経系における機能

1.抗APC抗体を用いた免疫組織化学法によると、APCはマウスの中枢神経系全域に分布しているが、特に嗅球、海馬、小脳皮質での発現が高い。2.免疫電顕法によると、APCはニューロンの細胞体・神経線維・神経終末に広く分布していた。脊髄神経節や脳神経核のニューロンでは、細胞体部分の細胞質に大量のAPCが存在した。嗅球の僧帽細胞ではAPCは核内にも検出された。またAPCは小脳プルキンエ細胞の周囲に濃縮していたが、これはプルキンエ細胞を取り巻く、かご細胞の神経終末叢への局在であることがわかった。3.中枢神経系全域において毛細血管に一致したAPCの局在が示されたが、免疫電顕法によって詳細に調べたところ、APCは毛細血管の周囲に終わるアストロサイトの終足に局在していることが明らかになった。それに加えて、小脳の顆粒層ではアストロサイトの突起にもAPCの局在が見られた。4. APCとβ-カテニン及びhDLGの共存を二重免疫組織化学法で検索したところ、ニューロンではAPCとβ-カテニン・hDLGが共存していたが、アストロサイトでは共存は認められなかった。5. APCとシナプス伝達の関係を知るために、APCとシナプス関連タンパクPSD-95、DAP-1の分布・局在を検索した。PSD-95はマウス小脳皮質分子層全体に分布すると共に、プルキンエ細胞体を取り巻く、かご細胞の終末神経叢に濃縮しており、これはAPCの局在と一致した。二重免疫電子顕微鏡によってAPCとPSD-95及びAPCとDAP-1の共存の有無を検索したところ、分子層のシナプス後部のpostsynapticdensityにおいてAPCとPSD-95及びAPCとDAP-1の共存が認められた。
日蓮教学における観心の研究

日本仏教の底流にある観心の問題を通して、日蓮の宗教の思想的背景とその特色について明らかにすることが本研究の目的である。本研究を進めるにあたり、次の六項目について検討を試みた。1.天台教学における観心思想、2.日蓮における観心思想の受容、3.観心本尊抄お事具論、4.一念三千の名目出処、5.一念三千と立正安国、6.日蓮教学における観心思想の特色。1では日蓮教学の基盤となっている天台教学の観心思想について検討し、一心三観の観法や法華三昧などの行法が日蓮の観心思想の遠因となっていることを指摘した。2では、天台の観心を一念三千と認識した日蓮の独自な天台教学受容について述べ、これを題目受持お唱題に集約し、教観不二の宗旨を樹立していった日蓮の観心思想について検討した。3では、日蓮が独自な観心法門を論理的に体系づけた『観心本尊抄』の事具論を考察することによって、一念三千法門に立脚した日蓮の独自な観心思想について論述した。4では一念三千の名目出処に関する日蓮の叙述を通して、本門事一念三千に日蓮の観心思想の本質があることを論じた。5では、日蓮の観心思想の本質である一念三千の具現化が立正安国であることを、題目受持の唱題との関連のなかで論じ、日蓮の宗教具体性・現実性について検討した。6では、以上のまとめとして、日蓮教学における観心思想の特色を次の諸点に要約した。(1)時の認識、(2)末法救済のく教法、(3)一念三千の受容、(4)三業円満の唱題、(5)立正安国運動、(6)法華経の実践、(7)地涌の自覚、(8)本時の娑婆世界。これらの点をもって、日蓮の宗教が社会との関わりのなかで極めて具体的・現実的に展開していったことが指摘でき、個人的観念論ではなく、人々の日常生活にそくした日蓮は釈尊の世界をみていたことがわかる。仏教は教相と観心で成り立っている.教相は智慧に立脚して教義を明らかにすること,観心は正しい教義に立脚して仏道を実践することである.この両者が車の両輪のように一つとなって仏教の真髄である涅槃寂静の境地に到達することができるのである.仏教の実践修行である観心は,心の本性を観照して真理を体得することである.中国の天台大師智〓は一念心に空仮中の三諦を観ずる一心三観の観法を説いた.智〓の観心法門を摩訶止観の一念三千に見い出した日蓮は,これを仏教における究極の法門と受けとめ,末法という時代認識の中で,南無妙法蓮華経の題目信仰へと昇華していった.

従来の観心修行が己心を観察する個人的な観念観法であったのに対し,日蓮は法華経を実践し,立正安国を実現するところに一念三千の観心修行があるとし,これを事行の南無妙法蓮華経と称した.日蓮の観心修行は法華経の本門に立脚した事の法門であり,極めて具体性・現実性に富んでいる.題目受持は単に口で南無妙法蓮華経と唱えるものではなく,身をもって法華経を実践し,法華経の世界を現実の歴史社会に実現することである.したがって,南無妙法蓮華経の題目受持は,日蓮にとって,個人的な修行ではなく,社会を仏国化していくための仏行であったのである.本年度は,中国の天台大師智〓から日本の日蓮にいたる,観心思想の流れとその特色について研究を進めた.日蓮の観心思想は、現実的・具体的であることにその特色がある。その要点をあげれば次の通りである。1.時の認識。日蓮は法華経の弘まるべき正しい時を仏滅後末法と受けとめた。それは末法悪世の劣機こそ、釈尊の深い慈悲が寄せられるという法華経が有する歴史的必然であった。2.末法救済の教法。日蓮は、末法の時代を救済しうる教えは法華経の肝心南無妙法蓮華経の五字七字であるとし、これを仏種・大良薬とみなした。末法の人々は仏の教えに違背した謗法の重病者であるため、仏種である妙法五字の大良薬を服し病を治癒するのである。3.一念三千の受容。日蓮は、釈尊の教えの中心は法華経にあり、法華経の肝要は本門寿量品にあり、本門寿量品の真髄は一念三千であるとし、釈尊の極理を一念三千と受けとめた。一念三千は釈尊の真実を証得する行法であると同時に妙法五字の教法、釈尊の久遠因果を結集した仏種でもある。4.三業円満の唱題。個人的な観念観法ではなく、日蓮は身・口・意の三業にわたる題目受持(唱題)に末法の観心をみた。したがって信心に立脚した具体的な法華経の実践を重視したのである。5.立正安国運動。日蓮は現実社会にそくして仏法の真実を見た。したがって現実の社会を仏国土とすることこそ、釈尊の本意であるとして、立正安国の実現を生涯の課題とした。6.法華経の実践。日蓮は釈尊の教えに信順し、経文通りに法華経を実践していった。そのため数々の法難を被ったが、そのことによってよりいっそう日蓮は自覚と使命感を深めた。7.地涌の自覚。法華経に説く仏滅後の弘経者地涌の菩薩を自己の身に主体化することによって、日蓮は法華経を末法の世に弘める師としての自覚を持つにいたった。8.本時の娑婆世界。仏と信仰者が一体となった永遠不滅の浄土を日蓮はこの現実社会(娑婆世界)にみた。以上の通り、本年度は日蓮の観心思想の特色について研究を進めた。
ミトコンドリア活性増進という観点からの変形性関節症治療と分子的基盤の解明

近年、関節軟骨組織における軟骨分化を促進する一方で、骨分化へと繋がる肥大分化を抑制する低分子化合物TD-198946 (TD)が見出されている。我々は磁性ビーズ及びプロテオミクス的手法を用いてTDと直接相互作用するタンパク質の同定を実施し、その結果、TD相互作用タンパク質候補として複数のミトコンドリアタンパク質を同定した。TDによってこれらのミトコンドリアタンパク質間の相互作用が亢進することが軟骨分化に重要であることが示唆されている。また、前年度以前の解析により、これらのミトコンドリアタンパク質のリガンドとして報告されているAという低分子化合物が軟骨分化促進効果及び骨分化促進効果を有することも明らかにしている。今年度においては以下の3件に関して解析結果を得た。1.TDはMAPK (MAPキナーゼ)の活性化を介して、軟骨分化を促進することを見出し、TDによるMAPKの活性化にはTD標的ミトコンドリアタンパク質が関わっていることが分かった。2.TD標的ミトコンドリアタンパク質には、MAPKの活性化・抑制の二重の機能があり、これらのスイッチングが軟骨分化に重要であることが示唆された。3.変形性関節症治療のためにTDを搭載する微小人工骨を開発しており、これらの微小人工骨からの骨軟骨促進因子の適切なリリースの改良に成功した。13に関して、TD及びMAPK、TD標的ミトコンドリアタンパク質の関連を明らかにした。MAPKは骨軟骨分化において、重要な働きをしていることが以前から分かっており、TD標的ミトコンドリアタンパク質の内在的な骨軟骨分化の機能を見出した。3に関して、TDを実用化するために、微小人工骨の改良に取り組んでおり、天然二糖類を用いることによって、微小人工骨の性能を改良することができた。変形性関節症は、関節部に痛みを伴う疾病として代表的なものの一つであり、関節軟骨がすり減ることによって生じる関節部の慢性的な炎症が引き金となって起きる。近年、関節軟骨組織の軟骨分化を促進する一方で、骨分化へと繋がる肥大分化を抑制する低分子化合物TD-198946 (TD)が発見された。しかし、TDの標的因子も含め詳細なメカニズムは未だ不明であった。先行研究において、TDと直接相互作用するタンパク質の同定が磁性ビーズ及びプロテオミクス的手法を用いて実施されたところ、TD相互作用タンパク質候補として、複数のミトコンドリアタンパク質が同定された。その後の解析により、TDによってミトコンドリアタンパク質間の相互作用が亢進することが明らかとなり、この作用がTDの有する軟骨分化促進効果に関与していることが示唆されている。本年度においては、以下の1及び2に関して研究を実施した。1.これまでにこれらのミトコンドリアタンパク質のリガンドとして幾つかの低分子化合物が報告されており、その中の一つであるAFに関して、軟骨分化促進効果を有するかどうかを解析した。2.これらのミトコンドリアタンパク質の軟骨分化への関与を、プラスミドからの過剰発現系によって確認した。1に関して、マウス間葉系幹細胞及びマウス骨芽細胞株をAFで処理し、トルイジンブルー染色法、ALP染色法、RT-PCR法によって解析したところ、軟骨分化マーカー発現や軟骨基質産生の昂進だけでなく、骨分化マーカーの発現昂進が見られることが分かり、TD標的ミトコンドリアタンパク質の結合部位によって、軟骨分化・骨分化の遷移が生じることが示唆された。2においては、マウス間葉系幹細胞株において、ミトコンドリアタンパク質を発現すると、有意に軟骨分化マーカーの発現が上昇することが分かり、これらのミトコンドリアタンパク質が軟骨分化に直接に関与することが示唆された。研究計画においては、新たな軟骨分化促進低分子化合物のスクリーニングを実施することを計画していた。我々は、TD標的ミトコンドリアタンパク質に着目することで、実際に軟骨分化を促進する新たな低分子化合物を同定することに成功した。しかし、新たな軟骨分化促進化合物であるAFは、軟骨分化だけで無く、骨分化促進作用を有することが分かり、我々が注目しているミトコンドリアタンパク質は、軟骨だけでなく骨分化にも関与することが示唆された。TD標的ミトコンドリアタンパク質をマウス間葉系幹細胞株において過剰発現することで、軟骨分化マーカー発現が昂進することが明らかとなり、これらのミトコンドリアタンパク質が直接に軟骨分化に関与することが示唆された。また、これらのミトコンドリアタンパク質をマウス間葉系幹細胞株、ヒト胎児腎由来細胞株などで過剰発現すると、いずれの細胞においても細胞増殖活性が昂進することが分かり、これらのタンパク質の量的な増加によってミトコンドリア活性が大きく変動する可能性が考えられた。また、これらのミトコンドリアタンパク質のリガンドとして報告されている幾つかの低分子化合物に関して、軟骨分化促進効果を有するかどうかを解析したところ、その中の一つであるAが軟骨分化促進効果及び骨分化促進効果を有することも明らかにしている。1.ミトコンドリアタンパク質リガンドAの有する骨分化促進作用はBMP経路依存的であることを見出した。

2.AおよびTDは、軟骨分化に関してお互いに競合的に働き、ミトコンドリアタンパク質の同一部位に結合することが示唆された。3.これらのミトコンドリアタンパク質は軟骨分化に伴い発現が上昇することが分かった。1に関して、Aで処理したマウス骨芽細胞株にBMP阻害剤もしくはBMPを加えることで、骨分化がそれぞれ阻害もしくは促進されることを確認しており、Aによる骨分化がBMP依存的であることが示唆されている。2においては、AおよびTDをマウス間葉系幹細胞株に同時に加えることで、単独で処理したときよりも軟骨分化が抑制されることを確認した。3に関しては、マウス間葉系幹細胞と比して、マウス軟骨前駆細胞においては、これらのミトコンドリアタンパク質の発現が転写レベルで上昇していることが分かり、これらのミトコンドリアタンパク質が内在的に軟骨分化に関与していることが示唆された。本研究においては、軟骨分化促進活性を有する他の低分子化合物のスクリーニングを主要な目的の一つとしているが、TDと結合する他の低分子化合物を解析することで、実際に高確率に軟骨分化誘導性低分子化合物を見つけることが可能であることを示した。しかしながら、今回同定された低分子化合物は軟骨分化だけではなく骨分化も促進することが明らかとなっており、軟骨分化単独の促進効果を有する低分子化合物を引き続きスクリーニングする予定である。既にいくつかの低分子化合物に関して解析を行っており、それらが軟骨分化を促進するという結果を予備的に得ている。また、軟骨分化に伴ってこれらのミトコンドリアタンパク質の発現が上昇することが示唆されており、ミトコンドリアタンパク質の相互作用の安定化と発現上昇がタンパク質レベルでの量的増加に繋がり、これらが軟骨分化を促進するために必要であることが考えられる。近年、関節軟骨組織における軟骨分化を促進する一方で、骨分化へと繋がる肥大分化を抑制する低分子化合物TD-198946 (TD)が見出されている。我々は磁性ビーズ及びプロテオミクス的手法を用いてTDと直接相互作用するタンパク質の同定を実施し、その結果、TD相互作用タンパク質候補として複数のミトコンドリアタンパク質を同定した。TDによってこれらのミトコンドリアタンパク質間の相互作用が亢進することが軟骨分化に重要であることが示唆されている。また、前年度以前の解析により、これらのミトコンドリアタンパク質のリガンドとして報告されているAという低分子化合物が軟骨分化促進効果及び骨分化促進効果を有することも明らかにしている。今年度においては以下の3件に関して解析結果を得た。1.TDはMAPK (MAPキナーゼ)の活性化を介して、軟骨分化を促進することを見出し、TDによるMAPKの活性化にはTD標的ミトコンドリアタンパク質が関わっていることが分かった。2.TD標的ミトコンドリアタンパク質には、MAPKの活性化・抑制の二重の機能があり、これらのスイッチングが軟骨分化に重要であることが示唆された。3.変形性関節症治療のためにTDを搭載する微小人工骨を開発しており、これらの微小人工骨からの骨軟骨促進因子の適切なリリースの改良に成功した。
心筋ミオシン分子における頭部・尾部接合部の機能的意義の検討

本研究では、ニワトリ平滑筋ミオシンをモデル分子として、ミオシン分子の頭部・尾部接合部(subfragment-2,S-2)の機能的意義を検討した。S-2領域の20および49残基の欠失変異体(Δ20およびΔ49)をバキュロウィルス発現系を用いて培養細胞に発現・精製し、変異型および野生型のミオシン分子のモーター機能を以下の方法で解析した。(1)In vitro motility assay :蛍光アクチンフィラメントが、ATPの存在下でミオシン分子上を滑り運動する速度(V)を計測した。(2)アクチンフィラメントの負荷となるαアクチニンの存在下でVを計測し、フィラメントに作用するミオシン分子の張力が負荷とバランスしてV=0となるαアクチニン濃度(ACT)を求めることにより、ミオシン分子の平均張力を計測した。(3)レーザートラップを用いて、1分子のミオシンとアクチンフィラメントの相互作用で生じる変位(Duni ; unitary displacement)と張力(Funi : unitary force)およびその持続時間(Ton)を計測した。VとACTは変異型(Δ20,Δ49)で野生型に比較して低下しており、特にΔ20ではΔ49に比較して欠失長が短いにもかかわらず、低下が大きかった(V,-38% vs.-23%; ACT,-67%VS.-38%)。然るに、変異型のDuni、Funiは野生型と差がなく、一方、Δ20ではTonが26%延長していた。これらの欠失変異体の速度・張力がともに低下していることから、S-2領域はミオシン分子のモーター機能に重要な役割を果たすが、分子の基本性能であるステップサイズや単一分子の発生張力には影響を及ぼさないことが示された。また、欠失長の短いΔ20の速度・張力がΔ49より低いことから、S-2領域の7個のアミノ酸残基の周期性の重要性が示唆された。本研究では、心筋ミオシン分子の頭部・尾部接合部(S-2)領域の機能的意義を検討するものである。初年度では、すでに発現に成功しているニワトリ平滑筋ミオシンを用いてS-2領域の欠失変異体を作製し機能解析した。S-2領域の20および49残基の欠失変異体(S-2Δ20およびS-2Δ49)をバキュロウィルス発現系を用いて発現精製し、変異型および野生型の平滑筋ミオシンの分子機能を以下の方法で解析した。(1)ATP水解活性、(2)In vitro motility assay:蛍光ラベルしたアクチンフィラメントが、ATPの存在下で平滑筋ミオシン分子上を滑り運動する速度(V)を計測した。(3)レーザー・トラップ:1本の蛍光アクチンフィラメントの両端に結合させたポリスチレンビーズを2個のレーザー・トラップで操作し、ATPの存在下で平滑筋ミオシン分子と相互作用させる。1分子のミオシンとアクチンフィラメントの相互作用は、ビーズの微小な変位として高感度4分割光ダイオードで検出される。これより1回の相互作用で生じる変位(Duni ; unitary dispalcement)と張力(Funi : unitary force)およびその持続時間(Ton)を計測した。Vは変異型で野生型に比較して低下しており、特にS-2Δ20ではS-2Δ49に比較して欠失長が短いにもかかわらず、低下が大きかった(38%vs23%)。然るに、変異型のDuni、Funiは野生型と差がなく、S-2Δ20ではTonが26%延長していた。

また、ATP水解活性は変異型と野生型で差がなかった。これらの結果より、S-2領域はミオシン分子のATP水解活性には影響を及ぼさないが、モーター機能には重要な役割を果たすことが示された。また、S-2Δ20の結果より、S-2領域が7個のアミノ酸残基の周期性を有することを考慮すると、この周期性が重要であることも示唆された。本研究では、ニワトリ平滑筋ミオシンをモデル分子とレて、ミオシン分子の頭部・尾部接合部(subfragment-2,S-2)の機能的意義を検討した。S-2領域の20および49残基の欠失変異体(Δ20およびΔ49)をバキュロウィルス発現系を用いて培養細胞に発現・精製し、変異型および野生型のミオシン分子のモーター機能を以下の方法で解析した。(1)in vitromotility assay:蛍光アクチンフィラーメントが、ATPの存在下でミオシン分子上を滑り運動する速度(V)を計測した。(2)アクチンフィラメントの負荷となるαアクチニンの存在下でVを計測し、フィラメントに作用するミオシン分子の張力が負荷とバランスしてV=0となるαアクチニン濃度(ACT)を求めることにより、ミオシン分子の平均張力を計測した。(3)レーザートラップを用いて、1分子のミオシンとアクチンフィラメントの相互作用で生じる変位(Duni ; unitary displacement)と張力(Funi : unitary force)およびその持続時間(Ton)を計測した。VとACTは変異型(Δ20,Δ49)で野生型に比較して低下しており、特にΔ20ではΔ49に比較して欠失長が短いにもかかわらず、低下が大きかった(V,-38% vs,-23% ; ACT,-67% VS,-38%)。然るに、変異型のDuni、Funiは野生型と差がなく、一方、Δ20ではTonが26%延長していた。これらの欠失変異体の速度・張力がともに低下していることから、S-2領域はミオシン分子のモーター機能に重要な役割を果たすが、分子の基本性能であるステップサイズや単二分子の発生張力たは影響を及ぼさないことが示された。また、欠失長の短レΔ20の速度・張力がΔ49より低いことから、S-2領域の7個のアミノ酸残基の周期性の重要性が示唆された。
TGF-βファミリー分子とその中和分子による網膜内領域特異性決定機構の解明

これまでの研究から発生後期の網膜においてVentroptinと逆勾配を持って発現する未知のTGF-βファミリー分子が存在し、この分子とventroptinとの相互作用により前後軸方向における網膜視蓋投射が制御されていることが推測された。そこで、まずVentroptinが網膜において二重勾配をなして発現している発生8日目のニワトリ網膜において、TGF-βファミリー分子の同定を試み、BMP-2、BMP-4、BMP-7、GDF-5、GDF-6、GDF-7の6種類が発現していることを明らかにした。次に、これらTGF-βファミリー分子の発生8日目のニワトリ網膜における発現パターンをin situ hybridizationによって解析したところ、BMP-2が背側・後側で高く腹側・前側で低い勾配を持って発現しており、Ventroptinと相補的な発現パターンを示すことが判明した。またBMP-2の発現開始時期はVentroptinが前後軸方向において勾配を持ち出す時期と一致していた。さらにBMP-2を網膜において異所的に発現させると、Ventroptinの場合とは逆に、ephrin-A2の発現が減少した。以上のことは、前後軸方向における網膜視蓋投射を制御する未知のTGF-βファミリー分子の実体がBMP-2であることを示している。また網膜前側領域特異性決定のマスター遺伝子であるCBF-1の作用機構を解析し、DNA結合依存的および非依存的に他の領域特異的遺伝子群の発現を調節することを明らかにした。特にBMP-2については、CBF-1がBMPシグナルを阻害することにより、BMP-2の発現を負に調節することを示した。
マーク・トウェインの文学における言葉遊びと暗号

本研究の目的は、19世紀米国人作家マーク・トウェインの文学における言葉遊びを使用したテキストの暗号化という表現手法の解明である。まず、トウェインの言葉遊びと暗号に対する関心の痕跡や実践例を彼の出版物、蔵書、ノート、書簡、原稿等を通して調査した。同時に、彼の言葉遊びに対する関心の土壌である19世紀米国社会における言葉遊び文化を調査した。その後、二つの調査結果を統合し、彼の文学を「言葉遊びの暗号的使用」という観点から理解するための批評的枠組みを構築。その枠組みを通して彼のフィクション作品の読解を行った。本研究の目的は、米国人作家マーク・トウェインの文学における言葉遊びを使用したテキストの暗号化という表現手法の解明である。より具体的には、トウェインが言葉遊びと暗号という緻密な形式上の工夫が求められる表現手法を多用していることを示すことで、彼のフォルマリストとしての新たな側面を提示することが目的ある。この目的のために平成28年度に行った研究とその実績の概要は以下の通りである:2)トウェイン、言葉遊び、暗号に関する一次・二次資料の収集と整理:トウェインのフィクション、ノンフィクション、書簡集、雑誌・新聞記事、ノート、小説The Adventures of Tom Sawyerのファクシミリ等といった一次資料及び本研究に必要なトウェイン研究書の一部を収集し、内容の精査を開始した。また、言葉遊びや暗号に関する研究書や文学作品の一部も収集し、内容の精査を開始した。3)収集した資料に基づくトウェイン文学の読解の開始:収集したトウェイン関連の資料及び言葉遊びと暗号の研究を使ってトウェインのフィクションを解読するための批評的な枠組みの構築を開始した。平成28年度に予定していた研究計画をおおむね順調に遂行できている。計画では、トウェイン50年代後期から70年代初期までの雑誌・新聞記事を集中的に調査する予定であった。この予定については、50年代後期から70年代初期の記事を収集し、読解を開始するという形で遂行できている。予定された研究発表については、平成28年3月24日にNEMLA(MLAの支部)において実施した。また、この研究発表に基づいた論文を現在執筆中である。完成次第、国外あるいは国外の学術誌に投稿する予定である。トウェインが言葉遊びと暗号という緻密な形式上の工夫が求められる表現手法を多用していることを示すことで、彼のフォルマリストとしての新たな側面を提示する。上記目的のために2017ー18年度に行った研究内容と実績の概要は以下の通りである。1)資料調査:計画通り米国カルフォルニア大学バークレー校、Mark Twain Project(資料館)にて、2018年2月12日-16日の間に資料調査を実施。Tom Sawyer, Detectiveの原稿とトウェインの使用した辞書・辞典・暗号関連の資料に加え、言葉遊びへの言及や実例を含むノート、手紙、散文作品の原稿を精査し、一部デジタル化。資料はトウェインが様々なジャンルに渡って言葉遊びを頻繁に使用していたことを裏付ける点で重要な意義を持つ。3)批評の枠組み構築と小説読解:計画通り1・2年目の調査結果を整理し、批評的枠組みとして統合。その枠組みを使用したトウェイン作品の読解を開始。読解を進めつつ、研究成果を研究書にまとめる作業を行なっている。2018年度中には研究書の原稿が完成し、出版社選定に入る予定。今後の研究の推進方策は下記の通りである:2)Pudd'nhead Wilson執筆時(1892-1893)に使用されていたトウェインのノートを参照するために、テキサス大学オースティン校Harry Ransom Centerを訪問する。また、同センター所蔵の小説A Murder, A Mystery A Marriageの原稿も参照する。4)統合と批評的枠組みの構築:1・2年目の調査結果を整理し、トウェインのフィクション作品における言葉遊びの暗号的使用の理解に有用な部分を批評的枠組みとして統合した上で、フィクション作品の中でも特に彼の小説の読解を集中的に行なう。29年度が最終年度であるため、記入しない。アメリカ文学29年度が最終年度であるため、記入しない。