hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト幹細胞の DNA メチル化に基づいた病理診断システムの構築

22iPS細胞株間で共通の異常メチル化領域は検出できなかった。しかし、各iPS細胞株とES細胞を比較すると、200-300領域においてES/iPS間で異常メチル化領域が検出されたことからiPS細胞における異常メチル化はゲノムDNA上にランダムに起こる現象であることを明らかにした。これら異常メチル化は一過性の高メチル化を経て長期培養と共に消失し、iPS細胞はES細胞に性質が近づいていくことが明らかになった。これらの結果はiPS細胞におけるリプログラミング機構の一端を明らかにしたものである.iPS/ES細胞特異的メチル化可変領域のDNAメチル化状態の測定と異常メチル化領域の数の検定は、ヒトiPS細胞比較評価指標として有用である。これまでに骨髄細胞、子宮内膜、胎盤、臍帯血等を由来とする様々な間葉系細胞の分離・培養に成功し、さらにこれらの細胞からiPS細胞を樹立し、これら希少なヒト間葉系細胞およびそれらから作成したヒトiPS細胞を含む多能性幹細胞を用いてDNAメチル化解析を中心としたエピジェネティクス研究を介して再生医療に向けた細胞の品質の標準化・規格化を行うための有用なデータを得ている。本年度はさらにヒト胎児性がん細胞(EC細胞)3株追加し、網羅的なDNAメチル化解析を追加し、iPS細胞、ES細胞および間葉系細胞の網羅的なDNAメチル化プロファイルとの比較解析を行った。各細胞のDNAメチル化プロファイルの階層的クラスタリング解析ではEC細胞、ES細胞、iPS細胞は、体細胞との間に明確な差があり多能性幹細胞群を形成した。しかし、EC細胞群はES/iPS細胞との間にES-iPS細胞間よりも大きな差があることが明らかになった。ES/iPS細胞と比べてEC細胞特異的に変化のあるDNAメチル化可変領域を同定し、EC細胞特異的DNAメチル化可変遺伝子の中で、特にKRAB box transcription factorがEC細胞における未分化維持に関与している可能性が示唆された。また、人為的DNAメチル化操作技術の開発を目的にiPS細胞、間葉系細胞に脱メチル化剤を添加し、その効果や発現解析を行った。TERT遺伝子はiPS細胞など多能性幹細胞に発現し、間葉系細胞には発現しない。多能性幹細胞および間葉系細胞に脱メチル化剤である5-aza-Cを添加、培養し、TERT遺伝子の発現を解析したところ、脱メチル化剤依存的にTERT遺伝子の発現が変動した。TERT遺伝子がエピジェネティックによって制御されていることを示唆する結果である。本年度は特にヒトiPS細胞の解析結果を加え、iPS/ES細胞特異的メチル化可変領域の同定と異常メチル化領域の詳細な動態を明らかにすることができた。異常メチル化領域のモニタリングは、よりES細胞に近いiPS細胞を同定するための新たなエピジェネティク指標として有用である。これらの結果は、再生医療へのiPS細胞利用に向けて、iPS細胞の評価や品質の規格化に貢献できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は人為的DNAメチル化改変技術の開発を進める。本研究で同定したiPS/ES細胞特異的メチル化可変領域OCT-4、NANOG、TERT遺伝子など未分化関連因子のDNAメチル化を人為的に制御できれば、より高効率で安全なiPS細胞の樹立方法の確立や、iPS細胞から特定の細胞への効率的な分化誘導法の開発に繋がる。
2原子酸素添加酵素の反応中間体結晶構造に基づいた触媒反応機構解析

Extradiol型2原子酸素添加酵素は、芳香族化合物の代謝においてキーとなる酵素で、古くから精力的に研究されてきた。これらの酵素は活性中心に2価のノンヘム鉄を含んでおり、カテコール環に酸素原子を2個付加することで芳香環を開裂する。本研究では、extradiol型2原子酸素添加酵素の反応中間体構造を超高分解能で決定し、extradiol型2原子酸素添加酵素の触媒反応機構を明らかにすることを目指した。まず超高分解能の結晶構造を決定する為に、BphCの精製度を上げて結晶化を行った。その結果、分解能を1.45Åから1.3Å分解能まであげる事に成功した。この結晶を用いることで、活性中心の詳細な構造を決定する事が出来た。特に、低酸素濃度下で決定した構造では、これまで分子種が不明(O_2もしくはO_2^-である可能性を否定できなかった)であった鉄めリガンドが、OもしくはOHである事がはっきりと示された。また、本研究期間中に共同研究者により、4-メチルカテコールや、4-クロロカテコールが、BphCのユニークな阻害剤である事が示された。この知見は、本酵素の工学的応用に重要であるため、これらの阻害剤の触媒反応阻害機構を立体構造に基づき解析した。これらの阻害剤とBphCとの複合体の高分解能結晶構造の決定を行った結果、驚くべき事にこれらの4位置換阻害剤は、通常の基質と結合様式が全く異なっていることが明らかになった(論文準備中)。具体的には、4位置換の阻害剤の場合は、2つの水酸基が鉄イオンを中心としたOctahedralの配位構造中で共にequatorialの位置を占めていることが明らかになった(基質では、1つの水酸基がaxialに、他方の水酸基がequatorialな位置に結合する)。このような阻害形式は、初めて見いだされたもので極めて興味深い。構造を検討した結果、この異常な結合様式は、基質ポケットの形状に起因するとものと考えられた。この結果、基質結合ポケットの形状を変える事で、特定の基質に対して耐性の(失活しにくい)酵素を設計できる可能性があることが示された。本研究では、2原子酸素添加酵素であるBphCの反応中間体の結晶構造を決定し、これをもとに触媒反応機構を決定していくことを目的としている。これまでに、基質非結合型、および基質結合型(酸素濃度100ppm;以後、基質結合型Iと呼ぶ)の高分解能構造(1.45Å分解能)を決定してきた。また、基質結合型(酸素濃度400ppm;以後、基質結合型IIと呼ぶ)の結晶構造も2.0Å分解能で決定している。これらの結果から、触媒反応に必須なHis194が触媒反応の過程で往復運動をしているらしいことが示唆されていた。しかしながら、基質結合型IIの結晶構造の分解能が他に比べ劣るため、これまでは、この構造を他の反応中間体構造と同列に論じることができなかった。そこで、基質結合型IIの結晶構造を他と同様な高分解能で決定することを試み、この構造を1.4Å分解能で決定した。その結果、鉄イオンに対する配位子の違いにより、確かに活性中心のHis194が異なった配置をとることがはっきりと示された。また、本年度は、4-nitro-catechol,4-methyl-catecholの2つの阻害剤とBphCの複合体の結晶構造の決定も行った。その結果、これらの阻害剤は、通常のカテコール(およびその誘導体)と同様に2つの水酸基を使って鉄イオンに配位しているが、その配置が90°回転していることが明らかになった。つまり、基質とは異なる配置で活性中心の鉄イオンに配位することで活性中心を占有し、阻害剤として働いていることが明らかになった。阻害剤と蛋白質分子の相互作用を解析した結果、今回観察された現象は、阻害剤の置換基(ニトロ基やメチル基)と蛋白質分子との間の接触のため、通常の基質と同様な配置で鉄イオンに配位することができなくなり、生じたことが示唆された。

これらの阻害剤とBphCとの複合体の高分解能結晶構造の決定を行った結果、驚くべき事にこれらの4位置換阻害剤は、通常の基質と結合様式が全く異なっていることが明らかになった(論文準備中)。具体的には、4位置換の阻害剤の場合は、2つの水酸基が鉄イオンを中心としたOctahedralの配位構造中で共にequatorialの位置を占めていることが明らかになった(基質では、1つの水酸基がaxialに、他方の水酸基がequatorialな位置に結合する)。このような阻害形式は、初めて見いだされたもので極めて興味深い。構造を検討した結果、この異常な結合様式は、基質ポケットの形状に起因するとものと考えられた。この結果、基質結合ポケットの形状を変える事で、特定の基質に対して耐性の(失活しにくい)酵素を設計できる可能性があることが示された。
植物表皮の幹細胞維持と分化の制御ロジックに関わる内的因子と新奇化合物の探索

植物表皮の通気口である気孔は、一対の孔辺細胞が膨張・収縮することにより開閉し、光合成のためのガス交換と蒸散を調節する。気孔の存在は植物の生長と生存に必須なだけでなく、地球レベルの大気環境に影響を及ぼしている。気孔は、気孔系譜の幹細胞であるメリステモイド細胞から生まれ、メリステモイド細胞の数は様々な外部環境に適合するよう巧妙に調節されている。本研究では、申請者が新規に所属することになった名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の理念である「合成化学と生物学の融合による新奇化合物の創出」を目指し、メリステモイド細胞の維持と分化を司る内的因子、および合成化合物の探索と同定を目的とする。平成27年度末までに、孔辺細胞特異的に強いGFP蛍光を発するシロイヌナズナレポーター植物を用いて現在までに約4200種類の化合物をスクリーニングした。その結果、気孔の数とメリステモイド細胞の数を増やす一群の新奇化合物が同定された。これらの中から効果が高く副作用が少ない候補をさらに選抜し、2つの化合物について詳細な解析を行った。その内の一つはメリステモイド細胞の増殖と気孔の分化の両方を著しく促進した。驚く事に、この化合物は地上部および地下部のバイオマスを増大させた。この効果は、広く作物植物で認められたため、この化合物は気孔の分化とバイオマス生産の両方に共通するプロセスに関わることが示唆された。今後は、合成化学によるアナログ(類似化合物)のレパートリーを増やし、生理活性を担う化合物構造を狭めるとともに、標的因子の同定につなげたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。過去一年間、孔辺細胞特異的に強いGFP蛍光を発するライン(野生型背景)を用いて現在までに約1300種類の化合物をスクリーニングした。そのうち、32種類の化合物の効果の再現性を確認できた。それらは、(i)気孔の数を増やす、(ii)気孔のクラスター化を起こす、(iii)孔辺母細胞の対称分裂異常を起こし気孔の形態が異常になる、というどれかの表現型グループに属していた。現在のところメリステモイド細胞の発生を停止させる化合物は見つかっていない。次に、上記の化合物の中でも今年度は特に、(i), (ii)の両方の効果を持ち、さらに植物体への生育阻害などの影響がない2つの化合物(E2とKC9)に関して、気孔発生に異常を示す突然変異体や形質転換体への影響を調べた。例えば、KC9添加はspchおよびscrm/ice1 scrm2二重変異体のように気孔系譜をまったく作り出さない変異体には効果が見られなかった。その一方、atml hdg2二重変異体ではメリステモイド細胞が高頻度で発生停止するが、KC9添加により、これらメリステモイドメリステモイドは気孔へと分化した。er erl1二重変異体では、気孔密度は高くなることが知られるが、気孔はクラスターを形成しない。しかし、er erl1二重変異体ではKC9に対する感受性が亢進しており、極端な気孔クラスターを形成した。これらの結果から、これら化合物はERECTAファミリー受容体キナーゼを介した、気孔パターンを制御するシグナル伝達経路に作用する可能性が示唆された。昨年度から連携研究者と技術員との二人三脚で、化合物のスクリーニング系を立ち上げた。スクリーニングVersion1としては、孔辺細胞だけ強く緑色蛍光(GFP)を発色する特殊なシロイヌナズナを用いて、蛍光実体顕微鏡を用いる事により効率的に化合物の気孔の数や分布に対する効果を判断出来る系がつくれたと考えている。

スクリーニングのスループットは低いが、学生などにも参加してもらうことにより、また、植物栽培チャンバーなどに投資することにより実験の効率を上げる事を検討する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。最近、ワシントン大学薬理学部のShao En Ong教授のグループが、プロテオミクスの手法を用いて動物細胞からキナーゼ群(キノーム)を簡便にプロファイルする技術を開発した。Ong教授と研究代表者との共同研究により、これまでにシロイヌナズナ芽生えを用いてもこの手法(キノビーズ法)で約600のキナーゼを効率よくpull downできることを見出した。そこで現在、キノビーズ法を用いて、上記の化合物と結合するキナーゼを同定できるか、そしてそれらキナーゼが化合物のターゲットである可能性を探索中である。共同研究者を名古屋大ITbMへ2015年夏に短期招聘する予定である。さらに、化合物の作用の特異性と活性のさらなる向上を目指し、ITbMの合成有機化学グループとの共同研究としてこれら化合物のアナログを多数創出するプロジェクトも開始した。ここから得られる構造活性相関の情報を活用することで、今後は生理活性を維持したままで化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーによるターゲット因子の同定も試みる予定である。同時に、まだ多数残るITbMのケミカルライブラリー、およびITbMと提携関係にある理化学研究所環境資源科学研究センターが多数所有する天然物ケミカルライブラリーのスクリーニングにも着手することにより、候補化合物を増やしたい。最後に、通常の分子遺伝学的手法と異なる化合物の最も大きな利点には、形質転換植物(GMO)を作出する必要のないことが上げられる。予備実験から、我々が同定した化合物は、ナス科作物(タバコ)の芽生えにおいても、気孔の数を増やす効果が確認された。次年度には科・属など幅広く有用作物荷置ける効果を検討する予定である。
咀嚼能力と耐糖能障害の関連とその発症を及ぼす因子について

過去に歯科健診を受診した吹田研究基本健診参加者の中から,4年以上経過し,同意書を得たものを再評価者とし,これらについた縦断分析と,この3年間で初回健診した評価者についての横断分析を行った.その結果,咀嚼能率と耐糖能障害の関連については,縦断分析については母数が少ないものの,耐糖能障害のある対象者ほど咀嚼能力の低下の傾向を認めたものの,横断分析では,その関連が認められなかった.1)データ収集:すでに平成20ー24年にコック率循環器病研究センター予防検診部において歯科検診を受診した吹田研究基本検診参加者(約2000名)の中から、初回歯科検診から4年以上経過し、文書により同意を得たものに再評価を行っている。再評価者は目標400名に対し297名、初回歯科検診は目標100名に対し41名であった。2)DMF指数:年齢が上がるにつれて指数が大きくなり、とくにM(欠損歯数)指数が増加する傾向が見られた。男女差はみられなかった。3)機能歯数、咬合支持:機能歯数では、一般的に咀嚼能率が低下し食品摂取に影響が出ると言われている歯数19本以下の受診者群は、70歳台の占める割合が高くなった。Eichnerの分類による咬合支持では、A群が半数を占め、年齢が上がることにB、C群の占める割合が多くなる傾向があった。4)CPITN:歯周状態を5段階評価で行っているが、全体の半数が4mm以上の歯周ポケットを有して3割が異常なしと評価された。5)歯周病と糖尿病との関連について:男性で耐糖能障害と糖尿病の占める割合が高く、女性よりも糖尿病群が多く見られた。当初の予定より、データ収集が目標数を達していない。再評価者、初回歯科験者共に目標数を達しておらず、さらなるデータ収集が必要である。横断解析についても、医科的項目データの抽出が不十分であるため、それらを整理する必要がある。歯科的項目データより、歯周状態の悪化と咀嚼能率の低下に関連があることが明らかになった。1)データの収集:すでに平成2024年に国立循環器病研究センター予防健診部において歯科検診を受診した吹田研究基本健診参加者の中で初回歯科検診から4年以上経過し、文書により同意を得た者に対して研究期間中に再評価を行った。また、同時に初回歯科検診も行い、ベースライン時の調査者数の増加を図った。平成2728年度内に歯科検診再評価は目標350名に対し、465名であった。初回歯科検診は目標80名に対し、57名であった。累積は、初回歯科検診目標2070名に対し、2093名、再評価は目標1000名に対し1180名と目標数は達したといえる。2)横断解析:咬合支持、機能歯数では、一般的に咀嚼能率が低下し食品摂取に影響が出ると言われている19本以下の受診者群は、前年度と同じく70歳台の占める割合が高かった。Eichnerの分類による咬合支持では、A群が半数を占め、多くの対象者が咬合支持を維持していることがわかった。3)CPITN:歯周状態を5段階評価で行っているが、全体の半数が4mm以上の歯周ポケットを有して3割が異常なしと評価された。4)歯周病と糖尿病との関連について:男性で耐糖能障害と糖尿病の割合は女性に比較して高い。プレ解析より、耐糖能障害と歯周状態との関連が認められた。追跡期間中の変化が、再評価時における耐糖能障害リスク因子に及ぼす影響について、さらなる分析が必要となった。前年度より引き続きデータ収集を行っているが、目標数を達しておらず、さらなるデータ収集が必要である。医科的項目データの抽出が十分でなく、それらの整理、分析が必要である。現在としては歯科的項目データを中心に解析をすすめている。1)データ収集:すでに平成20-24年に国立循環器病研究センター予防検診部において歯科検診を受診した吹田研究基本検診参加者(約2000名)の中から、初回歯科検診から4年以上経過し、文書により同意を得たものに再評価を行っている。同時に初回歯科健診も行い,ベースライン時の調査者数の増加を図った.平成29年度内に歯科樹脂健診再評価は157名であり,初回歯科健診は14名であった.2)DMF指数:年齢が上がるにつれて指数が大きくなり、とくにM(欠損歯数)指数が増加する傾向が見られた。また、ベースライン時に20歯以上を保有する1,425名を対象に、咀嚼能率低値に関連する要因について検討を行った結果、歯周病の悪化、機能歯数と義歯を含めた臼歯部咬合支持域の減少、最大咬合力の低下が関連する事が分かった。咀嚼能率の低下に伴ってグミゼリーの噛みづらさも生じてくる事も明らかとなった。

4)CPITN:歯周状態を5段階評価で行っているが、全体の半数が4mm以上の歯周ポケットを有して3割が異常なしと評価された。5)歯周病と糖尿病との関連について:男性で耐糖能障害と糖尿病の占める割合が高く、女性よりも糖尿病群が有意に多く認められた。過去に歯科健診を受診した吹田研究基本健診参加者の中から,4年以上経過し,同意書を得たものを再評価者とし,これらについた縦断分析と,この3年間で初回健診した評価者についての横断分析を行った.その結果,咀嚼能率と耐糖能障害の関連については,縦断分析については母数が少ないものの,耐糖能障害のある対象者ほど咀嚼能力の低下の傾向を認めたものの,横断分析では,その関連が認められなかった.1)データ収集の継続前年に引き続きデータ収集を継続する。歯科検診再評価者は500名、初回歯科検診者は100名を目標とし、累積者数2400名を目処にベースライン調査者数の増加をはかる。2)横断解析、縦断解析これまでに横断解析で耐糖能障害と関連が見られている歯数、咬合支持、咀嚼能率について、再評価における糖尿病の発症について縦断解析を行い、コホート研究基礎資料を得ることを目標とする。1)データ収集の継続前年に引き続きデータ収集を継続する。歯科検診再評価者は350名を目標とする。累積対象者1000名を目標とする。2)横断解析、縦断解析耐糖能障害と関連が見られる歯数、咬合支持、咀嚼能率について、再評価における糖尿病の発症について横断解析を行い、コホート研究基礎資料を得ることを目的とする。歯科補綴物品の購入がデータ収集の影響から延期していること、また学会発表と論文作成が当初予定していた目標を達せなかったため。早急に必要な物品購入を行い、研究に活用する。また学会発表と論文作成を精力的に行う。
有用土壌微生物の二重共生による根粒着生植物の生育増進とその機構解析に関する研究

マメ科根粒菌とAM菌根菌の2重共生した植物の生育収量の増進に対する2重共生効果を解析し、その機能発現要因を明らかにした。1.無施肥条件下で栽培した根粒着生ダイズの生育収量は根粒非着生ダイズのものに比べて顕著に高く、根粒菌感染効果が菌根菌感染効果を凌驚していた。2.根域の拡大を制限した根粒着生ダイズの生育や窒素固定能は根域制限の強いものほど低下したが、単位根粒重当りの窒素固定活性は逆に高まった。3.土壌中の菌根菌フローラは作付植物の肥培管理によって変動し、畑地ではGlomus ambisporum、草地ではAcaulosporumが優占菌種となり、またスイートコーンを前作としたときに後作植物の菌根菌感染率が顕著に高まることを認めた。4.無機性の土壌物理性改良資材の施用は菌根菌感染率を高め、その中でもモミガラくん炭の施用効果は顕著であった。5.モミガラくん炭の施用によりダイズの根粒着生や共生窒素固定能が高まり、その効果は施肥水準の低いものほど明確に発現した。6.以上の結果から、根粒菌と菌根菌は競合することなく、協調して作物の生育や収量増進に働いていることが明らかにできた。緑肥(クロタラリア)を導入し、その後にキャベツを3ヶ年間、4水準(O、L、M、H)の施肥条件下で栽培した圃場跡地に根粒着生ダイズ(T202)と根粒非着生ダイズ(T201)を作付け、植物体生育、根粒着生、窒素固定能および菌根菌感染を調査したその結果、以下のことが明らかになった。1.ダイズ植物体生育や若莢収量は前作における緑肥導入の有無や施肥水準にかかわらず、T202>>T201となり、ダイズでは着生根粒による固定窒素への依存度がきわめて大きいことが認められた。2.根粒着生ダイズの個体当たりの根粒着生、窒素固定能(ARA)は緑肥導入の有無やキャベツに対する施肥水準によって大きく影響されなかったが、非活性(Specific ARA)は施肥水準の低いものほど高まる傾向を示した。3.根粒着生ダイズにおける菌根菌感染は緑肥導入の有無やキャベツに対する施肥水準によって大きく影響されず、いずれも70%程度の感染率を示した。これに対して、根粒非着生ダイズではいずれも60%程度の感染率しか示さなかった。4.このことは、ダイズにおける根粒着生と菌根菌感染が競合していないことを示唆している。5.現在、上記の植物材料を用いて養分吸収に対する影響、根域を制限した条件下での影響、大気や土壌が酸性化した条件下での影響等について調査を進めている。なお、酸性環境の作出には購入したSO_X測定計を用いている。キャベツに対して施用水準を4段階とり、クロタラリア緑肥ーキャベツの1年2作体の系下で3年栽培した跡地土壌の特性を調査したところ、跡地土壌ではクロタラリア緑肥の導入によって土壌化学性に対する影響は微小であるが、土壌硬度、透水性などの物理性が大きく改善されること、および緑肥導入の有無にかかわらず土壌中の可給態リン酸がキャベツ対する施用水準の増加に対応して高まっていることを認めた。前年度では、その跡地にダイズ(根粒着生ダイズと根粒非着生ダイズ)を無施肥条件下で栽培し、根粒による窒素固定能と菌根菌の二重共生関係を調べたところ、根粒着生ダイズでは根粒非着生ダイズに比べて顕著に良好な生育を示すが、菌根菌の感染率はやや低く、かつキャベツに対する施肥水準が高まるにつれて、やや低下することを認めた。また、適切な施肥水準下では緑肥の導入は菌根菌の感染に効果的であることを見い出した。これに関連して、土壌物理性の改善が菌根菌の感染や機能発現(宿主植物の生長を指導)にどの程度影響するかを検定植物としてマリ-ゴールドを用いてポット試験を行ったところ、いずれの土壌物理性改善資材(パ-ライト、鹿沼土、バ-

ミキュライト、もみがらくん炭)の施用も機能発現に対して促進的に働き、ダイズでみられた上記の現象が検証できた。そこで、土壌改良材として、もみがらくん炭に注目し、ダイズの生育に対する施用効果をポット試験により調査した。その結果、施肥水準の低い処理区ほど施用効果が明確に現れ、根粒着生や窒素固定能が高まることを見い出した。さらに、現在、上述のダイズ栽培跡地に菌根菌非感染植物である3種のアブラナ科植物(サラダナ、コマツナ、オ-タムポエム)を導入し、菌根菌が関与しない植物の生育に対する土壌の可給態リン酸の影響を調査している。本年度は土壌微生物の住み家としての機能を有するとされるくん炭の施用によってダイズの二菌共生がどの程度改善されるかを調査した。1.モミガラくん炭の施用はダイズの根粒着生や窒素固定能を高め、植物生育に対する増進効果を高めること、および、その生育増進効果は施用水準の低い処理区ほど高く発現することを明らかにできた。2.上記のようなモミガラくん炭施用による生育増進効果は根粒非着生ダイズでは認められなかった。3.ダイズの生育に対するモミガラくん炭の施用効果は、くん炭施用量の増加によって高まり、最大の生育増進が2t/10a相当量の施用で得られた。4.菌根菌の感染率は根粒非着生ダイズに比べて根粒着生ダイズにおいてやや高い値を示すが、くん炭施用による感染率の上昇は認められなかった。5.これらの結果から、モミガラくん炭施用によるダイズの生育促進効果は。菌根菌感染によるリン栄養の改善よりも着生根粒による窒素固定を介して発現することを明らかにできた。
偏波による2次元合成開口FM-CW映像レーダの研究

この研究では,電波の持つベクトル性(偏波)を最大限に利用した2次元合成開口FM-CW映像レーダの実現を目標とした。XY方向にアンテナを走査できる2次元走査FM-CWレーダ装置を作成し,合成開口処理法を使って,ターゲットの像を取得した。また,レーダポーラリメトリの概念を導入し,直交偏波を組み合わせた合成開口後の映像ピクセルを偏波散乱行列に対応させ,いかにコントラストの高い偏波イメージングが達成できるかを理論的,実験的に検討した。従来,レーダポーラリメトリの理論は単一周波数を基本に構築されているが, FM-CWレーダは広い周波数を使う広帯域レーダである。そのため,如何にFM-CWレーダにレーダポーラリメトリの理論を組み込むことができるかが最大の問題点であった。ここではFM-CWレーダの掃引周波数帯域の中心周波数での複素反射係数値を散乱行列の要素に対応させた。そして,偏波による物体の散乱特性の違いを偏波イメージングに役立てるために偏波基底変換理論を詳細に調べ,任意の偏波状態でイメージングができることを確かめた。周波数帯はKuバンド, Xバンドで,ターゲットは平板,コーナーリフレクター,ワイヤ,プラスティック製の飛行機モデル等である。そのレーダにより室内での物体イメージングを行なった結果,電力,位相イメージともFM-CWレーダが完全なFull-Polarimetricシステムとして動作することが確認でき,画期的な偏波イメージングレーダを構築することができた。この成果は既に学会の論文,シンポジューム,講演に発表した。今後,物体形状の認識,埋没物体への応用などさらなる発展が期待できる。この研究は、電波の持つベクトル性(偏波)を最大限に利用した2次元FM-CWイメージングレーダの開発とそのレーダによるターゲットの分類・識別が目標である。FM-CWレーダに対してレーダポーラリメトリの概念を導入し、散乱行列によって、いかにコントラストの高い偏波イメージングが達成できるかを理論的、実験的に検討した。従来レーダポーラリメトリの論理は単一周波数を基本に構築されているが,FM-CWレーダは広い周波数を使う広帯域レーダである。そのため,FM-CWレーダにレーダポーラリメトリの理論を組み込むことができるかが最大の問題点であった。この研究ではFM-CWレーダから得られるビ-トスペクトラムを2次元方向に合成開口処理し,ピクセル毎の複素反射係数値を散乱行列の要素に対応させた。また,実験で得られる散乱行列には誤差が含まれるので,それを取り除くべく校正用のターゲットを作成し,システム全体の校正方法を検討した.さらにKuバンドの周波数帯で動作する直交2偏波FM-CWレーダを作成し,そのレーダにより室内での物体イメージングを行なった。ターゲットはプラスティック製の飛行機モデルB747やワイヤ,コーナーリフレクタである。その結果,電力,位相イメージともFM-CWレーダが完全なFull-Polarimetricシステムとして動作することが確認でき,ターゲットの識別も条件付きではあるが一部可能な,画期的なイメージングレーダを構築することができた。この成果は既に学会のシンポジューム講演・論文に発表し,物体形状の認識,埋没物体への応用など今後さらなる発展が期待できる。この研究は,電波の持つベクトル性(偏波)を最大限に利用した2次元合成開口FM-CW映像レーダの実現が目標である。本年度は,XY方向に2次元走査ができるアンテナ装置を作成し,FM-CW合成開口レーダを使って,ターゲットの像を取得した。周波数帯はKuバンド,Xバンドで,ターゲットは平板,コーナーリフレクター,ワイヤ,プラスティック製の飛行機モデル等である。また,レーダポーラリメトリ理論を導入し,直交編波を組み合わせた合成開口後の映像のピクセルを編波散乱行列に対応させ,いかにコントラストの高い偏波イメージングが達成できるかを理論的,実験的に検討した。

偏波による物体の散乱特性の違いを偏波イメージングに役立てるために,偏波基底変換理論,コントラストを最大にする偏波状態,ターゲット固有の偏波状態を詳細に調べ,任意の偏波状態でのイメージングの可能性を検討した。また,そのレーダにより室内での物体イメージングを行なった結果,電力,位相イメージともFM-CWレーダが完全なFull-Polarimetricシステムとして動作することが確認でき,画期的な偏波イメージングレーダを構築することができた。特に,ターゲットのコントラスト強調は偏波レーダ無しにはできないものであり,偏波FM-CWレーダの有用性が確認された。この成果は既に学会の論文,シンポジューム,講演に発表した。今後,レーダシステムの偏波校正を精密に行えば,物体形状の認識,埋没物体への応用など,さらなる発展が期待できる。
CD4+T細胞への分化に必須なキナーゼの発見に基づく新規運命決定機構の解明

我々は近年、未熟T細胞において抗原刺激に伴い強くリン酸化されるセリンスレオニンキナーゼPKDを見出し、T細胞特異的PKD欠損マウスを作製したところ、CD4+T細胞が特異的に消失していることを発見した。当該マウスを用いてPKDの基質を探索することで、未だ明らかとなっていないCD4+/ CD8+T細胞への運命決定の分子メカニズムの解明を目指した。PKD欠損細胞では、TCRシグナルが減弱しており、CD8+に比べCD4+T細胞への分化がより影響を受けていた。また、未熟T細胞におけるPKDの基質分子を数種類同定し、そのうち1種類の分子のPKDによるリン酸化がT細胞分化に寄与することを示唆する結果を得た。胸腺において未熟T細胞は自身が発現するT細胞受容体(TCR)とリガンドであるMHC+抗原複合体との親和性を感知し、正の選択を受けCD4+あるいはCD8+T細胞へと分化するか、負の選択により死に至るかが決定されるが、このように抗原の質を多様な応答に変換する分子機構の詳細は未だに不明である。我々は近年、未熟T細胞において抗原刺激に伴い強くリン酸化されるセリン/スレオニンキナーゼ、PKDを見出した。T細胞に発現する2つのアイソフォームPKD2、PKD3をT細胞特異的に二重欠損するマウスを樹立し、PKDを全く発現しないT細胞の分化を調べたところ、予期しないことにCD4+T細胞のみが特異的に消失していることを見出した。この現象は、これまで報告のない独自の知見であり、当該マウスを用いてPKDの基質を探索することで、未だ明らかとなっていないCD4+/CD8+T細胞への運命決定の分子メカニズムを解明できるのではないかと考えた。本年度は当該マウスの詳細な解析を行った。PKD欠損CD4+T細胞は野生型に比べ生存率が低いことが明らかとなったが、生存シグナルを補ってもCD4+T細胞への分化を回復できなかったことから、CD4+T細胞の消失は、単に細胞の生存率が低いことだけが原因ではないと考えられた。次に、TCR Tgマウスと交配しTCRを1種類に固定することで、CD4+細胞あるいはCD8+細胞への正の選択における影響を調べたところ、CD4+T細胞への正の選択が著しく障害されていることが明らかとなった。また、CD4+T細胞へのcommitmentも障害されていた。これらの結果から、PKD欠損細胞では、TCRシグナルが減弱していることが強く示唆された。PKDのキナーゼ活性がCD4+T細胞分化に重要であることが確認できたため、次にTCRシグナル下流におけるPKDの基質探索を行った。現在までのところ、TCRシグナルに関与することが知られているいくつかの分子のリン酸化が、PKD欠損細胞で減弱していることが明らかとなってきた。我々は近年、未熟T細胞において抗原刺激に伴い強くリン酸化されるセリン/スレオニンキナーゼPKDを見出し、T細胞に発現する2つのアイソフォームPKD2、PKD3をT細胞特異的に二重欠損するマウスを樹立したところ、予期しないことにCD4+T細胞のみが消失していることを発見した。この現象はこれまで報告のない独自の知見であり、当該マウスを用いてPKDの基質を探索することで、未だ明らかとなっていないCD4+/ CD8+T細胞への運命決定の分子メカニズムを解明できるのではないかと考え、本研究を行った。昨年度までの当該マウスの詳細な解析から、PKD欠損胸腺細胞ではTCRシグナルが減弱しており、CD8+T細胞に比べCD4+T細胞への分化がより影響を受けていることが明らかとなってきた。また、TCR刺激によりリン酸化が誘導され、PKD欠損胸腺細胞でリン酸化が減弱する分子をプロテオミクスにより網羅的に解析したところ、いくつかのPKDの基質および下流候補分子を同定した。本年度はまず、候補分子がPKDの直接の基質であるか否かをキナーゼアッセイにより検証した。その結果、4種類のシグナル分子がPKD2、PKD3により直接リン酸化される基質であることが判明した。また、変異体を作製することで、各分子のリン酸化部位を同定した。抗原刺激によりCD4+T細胞への分化を誘導できるCD4+CD8+DP細胞株DPKに基質分子のリン酸化不能変異体を導入したところ、ある1種類の基質の変異体を導入した細胞でのみCD4+T細胞への分化およびCD5の発現上昇に減弱傾向が見られた。このことから、PKDによる当該基質分子のリン酸化は、T細胞分化に寄与していることが示唆された。

一方、昨年度までにPKD結合分子探索のツールとして作製した強親和性Tag付きPKD2 TgマウスをPKD二重欠損マウスと交配しPKD2を再構築したマウスでは、T細胞分化異常が回復することが確認できたが、これまでのところPKD特異的な結合分子は得られていない。免疫学本研究の目的は、我々が新規に樹立し、CD4+T細胞のみが特異的に消失することを見出したセリンスレオニンキナーゼ、PKDのT細胞特異的欠損マウスを解析することで、未だ明らかとなっていないCD4+/CD8+T細胞への運命決定の分子メカニズムを解明することである。我々はまず当該マウスおいてCD4+T細胞が著しく減少している原因を明らかにすることを試みた。【仮説1】CD4+T細胞への正の選択が障害されている、【仮説2】CD4+T細胞へのcommitmentが障害されている、【仮説3】CD8分子の発現低下が障害されている、【仮説4】CD4+T細胞の生存が障害されている、という4つの可能性を想定し、その全てについて検証を行ったところ、【仮説1】と【仮説2】のCD4+T細胞への正の選択およびCD4+T細胞へのcommitmentが共に障害されていることが明らかとなった。この結果から、PKD欠損未熟T細胞ではTCRシグナルが減弱していることが強く示唆された。次に、in vitro T細胞分化系を用いることにより、PKDがアダプターとして働いているのではなく、そのキナーゼ活性がCD4+T細胞生成に必要であることを明らかとした。この前提を受け、抗リン酸化タンパク質抗体を用いた従来の方法により未熟T細胞におけるPKDの基質探索を行ったところ、この方法ではPKD欠損細胞で明らかにリン酸化が低下している分子を見つけることはできなかった。そこで、精製したリン酸化タンパク質を蛍光標識し、二次元電気泳動を行うことにより、PKD欠損細胞特異的にリン酸化が低下しているタンパク質を網羅的に解析したところ、いくつかの基質候補分子を見出した。さらに、マススペクトル解析によりこれらの分子を同定し、そのいくつかはTCRシグナルに関与することが既に知られている分子であることが判明した。よって、予定していた基質候補分子の探索さらには同定まで到達できたため、本年度の研究計画は概ね達成できたと考える。本年度同定した未熟T細胞におけるPKDの各基質候補分子について、まずはTCRシグナルに関与することが既に知られている分子について、PKDの直接の基質であるか否かをキナーゼアッセイにより検証する。また、直接の基質であるならば、PKDによるリン酸化部位をマススペクトル解析により同定する。リン酸化部位の同定に至れば、基質分子のセリン/スレオニンをアラニンに置換したリン酸化されない変異体を作成し、培養細胞あるいはin vitroT細胞分化系に導入することにより、PKDによる基質分子のリン酸化のT細胞分化における生理的意義を検討して行く予定である。具体的には、基質分子の安定性や機能に与える影響、他のシグナル分子との結合に与える影響と、TCRシグナルおよびCD4+T細胞生成に与える影響を調べることを考えている。in vitroの系で検証が難しい場合には、変異体トランスジェニックマウスあるいはノックインマウスの作製も視野に入れる。また、逆にPKD欠損細胞に基質分子のリン酸化をミミックした恒常的活性化型変異体を導入することで、CD4+T細胞への分化を回復できるか否かについても検討する。本研究計画作成時に作製中だったT細胞特異的One-STrEP-tag(強親和性Tag)-PKD2 Tgマウスは、トランスジーンの発現が確認でき、PKD二重欠損マウスとの交配によりPKD2を再構築したマウスがようやく数匹得られてきた。
歯周病治療用足場材料の設計指針の創出

超高齢社会が進行している我が国にとって、全身疾患に関与する歯周病に対する対策は重要な課題である。歯周病治療には、ヒト歯根膜細胞(PDL)などの接着、増殖、分化、機能を制御できるインプラント可能で安全な足場材料の開発が極めて重要である。しかし、ヒト間葉系幹細胞などに比べ、PDL細胞の性質や細胞ー材料間相互作用に関するデータが少なかった。本研究では、この相互作用に強く影響する、細胞接着の足場になる含水時の材料表面のナノ構造変化に着目した。原子間力顕微鏡(AFM)を用いた研究において、生体親和性に強く影響を与える特定の水和構造である中間水を有する高分子/水界面に数十ナノメートルスケールの微細構造が自発的に形成されていることが確認された。このような微細構造は、中間水を有さない高分子においては観測されず、この微細構造の制御が、細胞の接着挙動のカギであることが示唆された。この微細構造は、微細構造は高分子/水界面領域における高分子と水の相分離現象に起因しており、それにより形成された「Polymer-rich相」と「Water-rich相」が、それぞれ微細構造の凸部、凹部として観察されていると考えられる。血清培地中に含まれる血清タンパク質の吸着サイトを調べたところ、微細構造における「Polymer-rich相」に選択的に吸着することが示唆された。以上の結果から、含水時のナノ微細構造のサイズや間隔によるタンパク質吸着サイトの変化を利用した細胞接着挙動制御の可能性が考えられる。ホモポリマー系においても、細胞培養環境である含水状態において、高分子/水界面領域における高分子と水のナノ相分離現象を明らかにしたこと。この現象と、タンパク質レベル、細胞レベルでの挙動に相関性が見られることを提案したのは、世界初である。コーティング膜形成後の乾燥時は、平滑性を維持しているが、含水状態にいおかれた際にのみ起こる現象を見出したことは、特定のタンパク質や細胞などの生体成分を選択的に吸着・接着を行うための足場材料の設計にヒントになると考えれれる。中間水量とタンパク質の吸着、組成・構造変化の相関、中間水量とPDL細胞の接着性の相関、高分子側鎖の構造、側鎖間隔と中間水量、力学物性との関係性を明確にする。また、表面にコーティングした高分子薄膜の表面構造を、最近申請者が見出した原子間力顕微鏡による面内ナノ相分離構造解析および吸着タンパク質のナノ分布や吸着力解析を行う。また、表面物性の異なる材料へのPDL細胞の接着機構に関して、インテグリンの特異的な活性化の観点から考察を行い、水和構造を上位パラメーターとし、非特異的接着機構との差異を材料表面の物性と細胞表面の物性との相関を見出す。これにより、細胞種による接着選択率の高い材料表面設計指針を明確にする。
特徴抽出におけるアマクリン細胞の役割

感覚神経系において側抑制は受けた刺激の輪郭を際立たせ、像や物体の形の認識の上で極めて重要なメカニズムである。視覚系ニューロンは網膜視細胞から外側膝状態のニューロンに至るまで拮抗する同心円状の受容野を持っている。周辺抑制に関与する網膜細胞として水平細胞とアマクリン細胞がある。いずれもGABA作動性の抑制性介在ニューロンである。今年度は受容野周辺部の形成に水平細胞がどのように関与しているかを明らかにする研究を行った。水平細胞は視細胞のシナプス終末にフィードバックするだけでなく、双極細胞への直接入力も否定できない。何故なら、双極細胞の樹状突起にもGABA受容体が存在するからである。しかし、ON型双極細胞とOFF型双極細胞では周辺部応答の極性が全く反対なので、おなじGABA入力がどのようにして双極細胞の周辺部応答を形成できるのかは謎であった。今回、グラミシジン穿孔パッチ法をマウス網膜スライス標本の双極細胞に適用しGABAに対する応答を検討した。その結果、ON型双極細胞では細胞内Cl-濃度が高く、GABAに対する逆転電位が静止膜電位よりも脱分極側にあり、一方、OFF型双極細胞では細胞内Cl-濃度が低いため、GABAに対する逆転電位が静止膜電位よりも過分極側にあった。この結果ON型とOFF型でGABAに対する応答の極性が異なることが説明できる。水平細胞からのGABAの放出は光照射で減少するから、ON型には過分極を、OFF型には脱分極を引き起こし、中心部応答と反対の極性を持った応答が生じることになる。最近、免疫組織化学法を用いてON型双極細胞には細胞内へCl-を取り込むNKCCが、OFF型双極細胞には細胞内からCl-を汲み出すKCC2が発現していることが示された。この組織化学的所見はON型双極細胞とOFF型双極細胞で細胞内Cl-濃度が異なる可能性を示し、今回の研究結果とよく一致する。
膵癌の新規腫瘍マーカーApoC-1蛋白の機能解析-分子標的療法開発へ向けて

本研究は、新規膵癌マーカーの発見とその治療応用を目的とした。まず、SELDI-TOFMSとProteinChipsystemを用い膵癌に対する血清中の特異的蛋白としてApoC-1の同定を行った。同定された蛋白の膵癌組織中での発現を確認、さらに膵癌患者ではApoC-1の血清値および組織発現の高値群の患者では低値群に比べ有意に予後不良であることが判明した。続いて,膵癌細胞株を用い、ApoC-l蛋白の発現を抑制すると、アポトーシスが起こり細胞増殖能の低下が認められた。膵癌患者術前術後のProteinChipSystem解析で得られた蛋白比較(Serum Protein profiling)により見出され、同定された膵癌特異的蛋白であるApoC-1蛋白が膵臓癌の増殖・進展にどのように携わっているかを解明するために、ApoC-1蛋白を発現する膵癌細胞株に対しsiRNA(shortinterfering RNA)を用いてApoC-lmRNAを特異的にknock down L、細胞増殖能、細胞浸潤能に及ぼす効果を検討している。更にその効果を発現するに至るメカニズムを受容体一細胞内シグナル伝達系を検討することにより分子レベルで解明をめざしている。ApoC-1の膵癌発育進展における機能解析を行うため、膵癌細胞の増殖への関与について検討している。ApoC-1蛋白の発現をWestern blot法にて確認した4種類の膵癌細胞株を用いApoC-l特異的siRNAを2種類のoligoを使用し、LipofectamineTM2000reagentをtransfection reagentとしてoligonucleotideとmixtureしたものを細胞内にtransfectionすることでApoC-1発現を抑制する。既にMIA PaCaII、AsPC-1においてApoC-1を抑制すると有意に細胞増殖能が低下することを見出しており、膵癌細胞のApoC-1発現抑制によるapoptosisおよび細胞周期への関与を現在検討している。膵癌患者術前術後のProteinChipSystem解析で得られた蛋白比較(Serum protein profiling)により見出され、同定された膵癌特異的蛋白であるApoC-1蛋白が膵臓癌の増殖・進展にどのように携わっているかを解明するために、ApoC-1蛋白を発現する膵癌細胞株に対しsiRNA(short interfering RNA)を用いてApoC-1mRNAを特異的にknock downし、細胞増殖能、細胞浸潤能に及ぼす効果を検討している。更にその効果を発現するに至るメカニズムを受容体-細胞内シグナル伝達系をより明らかにすることにより分子レベルで解明をめざしている。ApoC-1蛋白の発現をWestern blot法にて確認した4種類の膵癌細胞株を用いApoC-1特異的siRNAを2種類のoligoを使用し、LipofectamineTM 2000 reagentをtransfection reagentとしてoligonucleotideとmixtureしたものを細胞内にtransfectionすることでApoC-1発現を抑制する。既にMIA PaCa II、AsPC-1においてApoC-1を抑制すると有意に細胞増殖能が低下することを見出しており、膵癌細胞のApoC-1発現抑制によるapoptosisおよび細胞周期への関与を明らかにすべく現在各種assayを行っている。膵癌患者術前術後のProteinChipSystem解析で得られた蛋白比較(Serum protein profiling)により見出され、同定された膵癌特異的蛋白であるApoC-1蛋白が膵臓癌の増殖・進展にどのように携わっているかを解明するために、ApoC-1蛋白を発現する膵癌細胞株に対しsiRNA(short interfering RNA)を用いてApoC-1mRNAを特異的にknock downし、細胞増殖能、細胞浸潤能に及ぼす効果を検討し、更にその効果を発現するに至るメカニズムを受容体細胞内シグナル伝達系を検討することにより分子レベルで解明をめざしている。ApoC-1蛋白の発現をWestern blot法にて確認した4種類の膵癌細胞株を用いApoC-1特異的siRNAを2種類のoligoを使用し、Lipofectamine TM 2000 reagentをtransfection reagentとしてoligonucleotideとmixtureしたものを細胞内にtransfectionすることでApoC-1発現を抑制し、MIA PaCa II、AsPC-1においてApoC-1を抑制すると有意に細胞増殖能が低下することを見出し、膵癌細胞のApoC-1発現抑制によるapoptosisおよび細胞周期への関与を明らかにした。今後、さらなる研究にて膵癌に対する分子標的薬開発への一歩を目指している。
イノラートによる多置換複素環状化合物の効率合成

我々が開発したイノラートの生成法は-78度冷却下、ジブロモエステルにブチルリチウムを加えるという簡便な方法であり、これを利用して昨年度までに多置換ピロール等の複素環のワンポット合成を達成した。しかし、プロセス化学に応用する際には短時間とは言え、この低温冷却が問題となる。そこで、マイクロリアクターを活用したイノラートの生成と複素環合成を検討した。マイクロリアクターの流路径が数百μmではリチウム塩が析出し、フローを妨げたので、内径1000μmのステンレスチューブとHPLCで用いられる安価なマイクロミキサーを利用してマイクロリアクターを製作し、イノラートの生成を試みた。その結果、ブチルリチウムとジブロモエステルのTHF溶液を1分間に1.0mLの流速でミキシングすることで、冷却することなく室温で効率よくイノラートが生成することを見出した。さらに、反応時間を確保するため一旦フローを止めチューブ内で反応を進行させた後、再度フローするストップドフロー法を開発し、極端に長いチューブを用いることなく比較的長い反応時間の反応もマイクロリアクターで行うことができるようになった。この方法を用いて多置換ピロールの室温ワンポット合成に成功した。収率はバッチ系に匹敵するほど高く、連続的にフローすることで大量合成にも適用可能である。また、チューブ内での閉鎖空間における反応であるのでアルゴンガスのような不活性気体雰囲気下である必要もない。このようにバッチ系では容易でなかった、ブチルリチウムを用いた無水低温冷却反応のプロセス化学への適用が、マイクロリアクターで実現可能であることを示した。1.イノラートの改良合成法の開発申請者が既に開発している二臭素化エステルを原料とするイノラートの生成法を改良し、無置換のエステルを原料とした改良簡便合成法の開発を検討した。原料エステルに種々の強塩基を作用させる連続脱離法を試みた。その結果、エステルの求電子性を立体障害により抑制するとともに、脱離基の酸性度を上げて脱離性を向上させた2,6-ジ-tert-ブチルフェニルエステルを基質に-78度冷却下ブチルリチウムを2当量加えることで、イノラートを60%ほどの収率で得ることに成功した。本法は非臭素化エステルから直接的にイノラートが生成できる上に、副生成物が求核性や塩基性の低い2,6-ジ-tert-ブチルフェノキシドである点で優れている。2.多置換ピロールの効率合成イノラートを開始剤とする多置換ピロールの合成を検討した。基質としてα-アシルアミノケトンを種々検討したところ、窒素上の置換基をベンジル、パラメトキシフェニル、アリルなどとした場合、イノラートはこれら基質と反応し、ピロールを与えることを見出した。フランの合成の場合と異なり、中間体である縮合β-ラクトンを単離することなく、また酸処理も要せず、一気にピロールが生成することを見出した。反応温度と時間を詳細に検討したところ-20度から室温付近で最も効率よく反応が進行することがわかった。-78度という低温に冷却する必要はない。本反応機構を精査するために、赤外吸収スペクトルで反応をモニタリングしたところ、中間体にカルボキシラートの吸収が観測されたことから、系内に共存する塩基によってβ-脱離が進行しβ-ラクトンが開環し、後処理の段階で脱炭酸及び脱水反応が進行したと考えられる。本合成反応はフラスコの中で6工程が一気に進行する連続反応である。非対称多置換ピロールのワンポット合成の例は少なく、本法は医薬品等の合成に有用である。
尾張・三河武士における歴史再構築過程の研究

1.本研究では、中世近世前期における尾張・三河武士の家を対象とし、事実であった「歴史」と後代に再構築された各家の「歴史」とを個別に分析することによって、後者に通底する時代的心性を考察することを目的とした。2.個別の研究成果は下記の通りである。(1)当該期に成立した尾張・三河武士の家系伝承について系図史料等から、約四十の個別事例を検証した。その結果、軍記物や敗者復活の歴史としての南朝伝説の役割の大きさ、また近世における知行地確保などを企図したさまざまな作為の存在を確認した。(2)尾張熱田の加藤氏に関しては、一定の意図のもとに選択・収集された古文書群の存在について、文書群の内容が示す言説と文書群が家に相伝されたこと自体が示す言説との両面から具体的に分析し、古文書群の存在が物語る加藤家の歴史再構築過程を追求した。(3)三河の吉良氏については、不明な点が多かったため、まず、南北朝内乱期から16世紀初頭までの吉良氏の存在形態の変遷過程を明らかにする作業を行った。この成果により、近世吉良氏によって再構築された「歴史」を事実と比較することが可能となった。3.当初の計画ではデジタル画像データベースの構築を予定した。実際、高知県の山内家宝物資料館など現地調査を実施した際にはデジタル写真を撮影し、その準備をしたが、写真の公開許可を得られなかったこと、また、収集できた史料複製の大半が紙媒体によるものであったことなどから、結果として画像データベースは小規模なものにとどまった。4.本研究の目的からすれば、作業はようやくその一歩を踏みだしたに過ぎない。今後は本研究期間中に着手した、尾張大橋氏等の個別研究をまとめ、尾張・三河における武士の歴史伝承についての総合的な分析を行う予定である。本年度は、史料の検索と収集に重点をおいて作業を進めた。まず、近世に作成された系図・由緒書等から尾張・三河出身の武士関係記事を検出する作業としては、東京大学史料編纂所・土佐山内家宝物資料館・高知県立図書館・名古屋市立鶴舞中央図書館・和歌山県立文書館等において、土佐山内家・尾張徳川家・紀伊徳川家等の藩士について調査した。残念ながら、室町期以前に遡る家伝はあまり見られず、大きな成果は得られなかったものの、尾張横井氏など数氏については、興味深い史料が検出できた。また、他に、愛知県西尾市岩瀬文庫・東京大学史料編纂所・石川県金沢市立玉川図書館・大阪府立中之島図書館等が所蔵する尾張三河関係氏族の系図数十点を複製、収集した。つぎに、古文書・古記録からの検索では、愛知県史編さん室・東京大学史料編纂所・国立公文書館内閣文庫を中心として調査し、尾張の荘園在地代官である坂井氏・海東氏・毛受氏、三河の中条氏・戸田氏などについて多くのデータを得た。また、史料のデジタル化については、土佐山内家宝物資料館架蔵山内系図のうちから数十カ所、三河医王寺の「縁起」(三河小野田氏関係)などを対象におこなった。なお、以上の作業過程において、中世近世前期の尾張・三河武士の家における「貴種流離伝説」「南朝伝説」の存在が浮かび上がってきた。それは伝承の世界から「再構築された歴史」であろう。次年度以降、一つの作業仮説として採用し、その分布エリアと初見年代に着目する予定である。前年度に引き続き、本年度も史料の検索と収集作業を進める一方、作業仮説の検討作業を開始した。第一に、名古屋市立鶴舞中央図書館・名古屋市蓬左文庫・東京大学史料編纂所・国立公文書館内閣文庫・石川県金沢市立玉川図書館近世史料館などにおいて、古文書・古記録、近世資料である系図・由緒書等から南北朝戦国期に活動したと思われる尾張・三河の武士の一族について調査した。