hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光誘起移動を示す有機結晶によるナノ材料運搬および集積化に関する研究

異種原子層材料を積層した複合原子層は単層では得られなかった特性を示すようになるため、近年大きな注目を集めている。また、光捕集効果を持つ金属ナノ粒子と組み合わせた構造体の場合は強い非線形光学効果を生じる。そのため、原子層材料、ナノ粒子といった種々のナノ材料の集積化は様々な微小光電素子の開発、発展に大きく寄与することが期待される。しかし、現在までのところ、集積技術そのものは十分に発達していない。これは基板上の特定位置にナノ材料を配置し、積み重ねていくのが困難なためである。そこで本研究では、光誘起移動を示す有機結晶をナノ材料の運搬に利用することを提案し、簡便なナノ材料集積技術の創製を試みる。本研究では、光誘起移動を示す有機結晶を利用した新規ナノ材料集積技術の開発を目的とする。光誘起移動を示す結晶にナノ材料を吸着または導入させれば、光によって様々なナノ材料を所望の位置(他のナノ構造や電極上)へ簡便に移動させられるため、デバイス作製の幅が飛躍的に向上することが期待される。今年度は、ナノ材料運搬に適した有機結晶を探索する中で、アミノアゾベンゼン系の化合物の一つが単色光の照射のみでガラス基板上をアメーバのように移動することを新規に見出した。光源から遠ざかる方向に移動するため、負の走光性を示したと言える。従来の結晶は、紫外光により光異性化して結晶の融解が促進され、可視光により再結晶化が促進される性質をもつため、それぞれの光を別々の方向から同時に照射することで移動を誘起していた。一方、本系で用いた化合物は電子供与性のアミノ基をもつため光異性化後の熱戻りが速く、光で融解してもすぐに再結晶化するため、光異性化の励起光のみで移動が可能になったと考えられる。移動速度と励起光波長の依存性を調べたところ、紫外光のみでは明確に移動せず、青色の可視光では移動を示した。また、白色LEDの照射によっても移動現象を生じることを見出した。従来の系に比べて非常に簡便に結晶の移動を誘起できるため、ナノ材料等の運搬に適した材料であると考えられる。光から逃げるように有機結晶が移動する本現象は新奇なソフトマテリアル、マイクロモーター、マイクロ流体システム等の発展にもつながることが期待される。当初の目的であったナノ材料運搬を試みる前に有機結晶の新規な光誘起移動現象を見出したことで、その機構と性質について研究を行ったため。今後は、有機結晶の負の走光性について機構解明と一般性について調べるとともに、ナノ材料運搬も実施することで移動現象の応用を試みる。
寒暖流境界領域における遺伝資源の動態と地球環境指標動物の探査

多様な環境を提供し、多様な生物種が生息する沿岸域の生物種の分布と消長およびその環境を経時的・経年的に調査し、遺伝資源としての存在様式を把握することは生物の多様性保全や地球環境の保全にとって重要な情報を与えると共に持続的沿岸生物生産にとっても重要な課題である。本研究は寒暖流境界領域であり、多様な生物種が出現する牡鹿半島を調査フィールドとして、生物種・集団(遺伝資源)の動態を捉え、環境変動の指標動物を探査することを目的とした。調査地点は宮城県牡鹿半島北側の女川町塚浜、牡鹿半島先端部牡鹿町金華山船着き場北側と南側、牡鹿半島南側の石巻市佐須浜の3地域4地点である。平成9年度から3年間の牡鹿半島沿岸域の定点における生物種(集団)の分布を調べた結果、牡鹿半島3地域4地点における生物分布の季節変化および年変化には顕著な変動が認められず、それぞれの場において多くの種が安定した分布を示すものと考えられた。しかし、地域間の比較を行ったところ、牡鹿半島南北では、巻き貝類のクボガイとコシダカガンガラの分布に差が認められた。なお、岩礁域の生物分布調査地域の環境調査をした結果、牡鹿半島南側では5月の水温が高く、塩分濃度は他に比べて低いことがわかった。このことから、環境変動の指標は牡鹿半島南北の地点における動物種の構成の変化をインデックスとすればよいと考えられた。形態的に類似したヒザラガイ類や巻き貝類ではアイソザイム遺伝子を標識として比較した結果、形態が酷似しているヒザラガイ類では明確に遺伝的差異を示し、色彩が多様なチヂミボラは同じ遺伝子を保有していることがわかり、遺伝資源の区分(種の同定)をアイソザイム遺伝子を用いて明確に判定できることがわかった。また、これまで調べられていないイトマキヒトデとキヒトデのアイソザイム分析を行った結果、顕著に高い遺伝子変異性が示された。これら3年間の成果をもとに、牡鹿半島沿岸岩礁域の潮間帯に生息する種の分類と分布についてまとめ、実習書として作製する準備ができた(平成13年度には発行する予定)。本研究は寒暖流境界領域であり、多様な生物種が出現する牡鹿半島を調査フイールドとして生物種・集団(遺伝資源)の動態を捉え、環境変動の指標動物を探査することを全体の目的とする。本年度は牡鹿半島沿岸域の定点を設定し、そこにおける生物種(集団)の分布と環境の経時的変化を明らかにすることを主目的とした。(1)調査地点の設定:牡鹿半島における潮間帯生物の調査定点を設定するために、陸上および海上から現地踏査を行った結果から、周年安定して調査ができる地点として牡鹿半島北側の塚浜、牡鹿半島先端域の金華山2地点、牡鹿半島南側の佐須の浜を定点とした。(2)生物種の分布および環境調査:3地域4地点について5月、7月、9月、11月、2月の5回、岩礁域の動物種の分布とその時の水温、塩分濃度、溶存酸素量等の環境調査を行った。

その結果、時期によって水温に地域差がみられ、種の分布は季節的変化を示す種、地域的差異を示す種、地点的差異を示す種、形態分類が困難な種のリストができた。これらは、軟体動物門のヒザラガイ、カサガイ、クボガイ、コシダカガンガラ、アクキガイの各グループに所属する種であった。(3)遺伝分析:上記の軟体動物についてアイソザイムをデンプンゲル電気泳動法によって分離した結果から、それを遺伝標識としてアイソザイム分析ができることがわかった。(4)過去の動物種分布調査データの収集:牡鹿半島周辺の動物調査に関して、水産実験所を含む近隣の研究機関にも体系的資料がなかった。多様な環境を提供し、多様な生物種が生息する沿岸域の生物種の分布と消長およびその環境を経時的・経年的に調査し、遺伝資源としての存在様式を把握することは生物の多様性保全や地球環境の保全にとって重要な情報を与えると共に持続的沿岸生物生産にとっても重要な課題である。本研究は寒暖流境界領域であり、多様な生物種が出現する牡鹿半島を調査フィールドとして生物種・集団(遺伝資源)の動態を捉え、環境変動の指標動物を探査することを全体の目的とする。本年度は昨年度設定した牡鹿半島沿岸域の定点おいて、生物種(集団)の分布と環境の経年変化を捉えるとともに、指標動物の遺伝的組成をアイソザイム遺伝子を標識として明らかにすること、また北部海域2地点と南部海域2地点における沿岸岩礁性動物の分布について資料収集することを目的とした。(1)生物種の分布調査:昨年度に設定した牡鹿半島の3調査地点において、5月、7月、9月の年3回、潮間帯において動物を採集し、種の同定を行った結果、一部を除いて出現種は昨年とほぼ同じく、出現頻度、季節変化も大きく変化しなかった。(2)環境調査:女川湾内の数地点および分布調査地点の水温、塩分、溶存酸素量等の調査を行った結果、昨年度とほぼ同じ経過を推移した。(3)採集生物種の遺伝的変異性:採集した動物種のうち量的に多く出現するカサガイ類、ヒザラガイ類、巻き貝類についてアイソザイム分析を行った結果、高い変異性が観察され、アイソザイムによる種分化および集団構造の解析ができることがわかった。(4)日本沿岸の動物種分布データの収集:青森県と北海道、京都府と和歌山県の沿岸に出現する動物種の分布データを入手した。本年度は最終年度として過去2年間調査した牡鹿半島沿岸域の定点において、生物種(集団)の分布と環境の経年変化および指標動物の遺伝的組成をアイソザイム遺伝子組成のデータを基本として、牡鹿半島沿岸潮間帯岩礁域に生息する動物相をまとめるとともに、そこから選別した動物種の遺伝的変異性を捉えることによって遺伝資源の動態を明らかにすることを目的とした。その結果、(1)生物種の分布調査:牡鹿半島3地点における生物分布の顕著な季節変化は認められず、それぞれの場において安定した分布を示すものと考えられた。しかし、牡鹿半島南北では、巻き貝類のクボガイとコシダカガンガラの分布に差が認められ、ヒザラガイのヒザラガイとケハダヒザラガイは同じ場所の微小な場の稚貝によって分布を変えていることがわかった。
慢性装置埋め込み犬肝不全モデルの麻酔管理における心血行動態の解析

慢性装置埋め込み犬での肝不全モデル確立が、今年度の計画であったが、肝不全状態でのイヌの生存性が不十分で、現在までに確立してきた慢性装置埋め込み犬健常モデルによる麻酔薬及び麻酔関連薬の相互作用を引き続き検討している。慢性装置の埋め込み体重1015kgの雑種成犬を使用。無菌的な手術操作によって、麻酔下に開胸しプローブとカテーテルを装着した。大動脈と左冠動脈回旋枝には超音波血流プローブを装着、左心室壁に局所収縮率測定用音波クリスタルを埋め込んだ。また、心室腔、大動脈内には圧測定用のカテーテルを留置し頚背部より体外へ露出させ、専用ジャケット内に収納した。手術後、全身状態が回復するまで注意深く飼育を行い、34週間後から測定を開始した。循環動態測定及び解析には、クリスタルバイオテック社製心血行動態総合計測システム"VF-1"および循環動態解析ソフト"HEM"を使用した。研究成果以上の実験系を用いて、平成11年度中には、ダントロレンと静脈麻酔薬であるプロポフォールの相互作用を検討し、ダントロレンがプロポフォールによる陰性変力作用に影響を与えず、冠血管拡張により冠血流を増加させることを1999年アメリカ麻酔学会で発表した。また、β遮断薬であるエスモロールと吸入麻酔薬であるイソフルラン、セボフルランの相互作用を比較し、イソフルラン麻酔下でより強くエスモロールの循環抑制作用が発揮されることを第74回国際麻酔研究学会および第6回日米麻酔学会(2000年3月)において発表する予定である。
明清律諸注釈の基礎的研究

筆者は、前稿「清律」において、康煕13年の自序をもつ王明徳撰『読律佩〓』を「律例の諸問題、特に法理を探求した重要な書」と評したことがある。今回の研究で最大の収穫は、本書が明代の王樵私箋、王肯堂集釈『大明律附例』を補完するものであることが分かった点である。『読律佩〓』凡例に「若茲刻所箋...非若王君因時詳考、備為足法也」とあり、本書が不完全なもので、「推干重関政治、人所易怱、為箋釈所未詳、則従及之」、『大明律附例』を補完するものであることを述べている。また「太倉王君所業律例箋釈、其照律条貫備悉、詮解膾灸人口、巳非一日」というように、この書は、当時明律注釈書の決定版と目されていた。『大明律附例』王背堂序によると、本書は「乃集諸家之説、舎短取長、足私箋之所未備」とあるように、父親の王樵が個人的に著した註(私箋)をほかの明律注釈書を取捨選択して補足するものであった。以上のことから『大明律附例』こそが明律注釈書の到達点であり、清律注釈書の出発点であることが理解される。今年の研究の結論は、今後明清律研究は、『大明律附例』の解読から始めなくてはならないということである。このように本年の研究は、専ら律註に向けられたため、『徽州千年契約文書』、『法林灼見』、『皇明疏議輯略』、『車駕職掌』など律例の具体的運用を示す史料の分析は今後の課題として残った。ただ『法林灼見』は事案を判決文そのままで載せるのではなく、読み物風に翻案して載せている点が興味深かった。その告白に「上附蕭曹、下載案断、二書精選、可称合璧、惟高明者鑑之」とあるように、本書は販売を目的とした俗書なのであるが、その読者層が、『大明律附例』王肯堂序に「士子応挙、必試五判、以観其明律与否」とある科挙受験生であることはほぼ確実である。明後期律学の一面として、今後の研究に値しよう。
トリブチルスズとPCBsの複合作用による内分泌攪乱の解明

我々は、これまでの研究でメダカ(Oryzias latipes)産卵群(雄3尾、雌12尾)にトリブチルスズ(TBT)とPCBsを複合投与すると、相加的に作用して産卵が低下することを報告した。本研究では、この作用機構を明らかにするために以下の実験を行った。メダカペア(雌雄各1尾、12ペア)にTBTとPCBsを餌から1μg/g魚体重の割合で単独もしくは複合投与した。その結果、受精卵数はTBT処理区で有意に低下し、さらにTBT+PCBs処理区では有意ではなかったが相加的に減少した。無暴露の雌に対する雄の性行動を調べた結果、TBTが雄の性行動に影響を与えて放精行動を抑制していた。よって、受精率が低下する原因として放精行動の抑制が原因と推定された。一方、PCBsを投与したメダカでは,平常行動(遊泳,壁面回遊)の持続時間が短くなっており、多動的状態を観察した。さらに、PCBs添加餌料(1,5,25,125μg/g)を投与したメダカ3尾と,PCBs無投与3尾,計6尾で群を形成させ,その群行動を1時間観察したところ、外部からの刺激が無いにもかかわらず,瞬発的にメダカが離散する行動(群の崩壊)が観察された。画像解析により,遊泳速度,転向角を求めてフラクタル次元解析を行ったところ、有意なフラクタル次元の増加が観察された。また,無投与メダカの行動とPCBs投与メダカのそれの間に差はなかった。PCBs混成群において,PCBs無投与メダカはPCBs投与メダカに影響され,群全体が異常な行動を行った。PCBsによりメダカの行動が不安定になることが証明された。以上の結果から、産卵群においてTBTとPCBsが相加的に作用して産卵が低下した原因として、PCBsにより行動が不安定となり、さらにTBTが雄の性行動を抑制したため、相加的に作用して産卵群における繁殖を低下させたと推定された。
サワガニの生息環境の違いによる間性個体の出現と生殖器官と内分泌器官の関係

昨年度、サワガニGeothelphusa dehaani雄の間性個体の造雄腺の微細構造の解析から、造雄腺が二次性徴、即ち外部性徴に影響をあたえていることを示唆し発表した。本年度、それを論文にし、Crustacean Researchの雑誌に投稿し、受理された。本年度は、間性個体、雌と雄の生殖腺について構造解析を行い、正常個体の生殖腺と比較、検討した。さらに生殖腺の調節機能について調べた。間性個体の雌の卵巣には十分に発達していない卵が存在し、発達していても卵の大きさが小さい、一方間性個体雄の精巣は精子形成過程中の、精子への変態前の段階で停止している精細胞が多い。精子に変態している精子の形態が正常の精子の形態と異なっていた。この結果については今秋、弘前の日本動物学会で発表予定である。生殖腺の調節をしていると考えられたX-器官-サイナス腺については現在研究を進めている。本年度の発表サワガニGeothelphusa dehaaniの雌の間性個体の神経内分泌について。日本甲殻類学会第44回大会函館。サワガニGeothelphusa dehaaniのmm雌intersexの生殖腺について。サワガニGeothelphusa dehaaniの雄intersexの生殖腺について。日本甲殻類学会第44回大会函館サワガニGeothelphusa dehaaniは雌雄異体であり、雄は外部性徴として第一腹肢が交接肢となっている。しかし雌の外部性徴である第三歩脚に小さな雌性孔を有した雄のカニの出現をみた。この雄を間性個体(intersex)の雄とよぶことにした。間性個体の雄について、雄の一次、二次性徴を調節していると考えられている造雄腺と生殖腺(精巣)の関係について調べた。造雄腺は甲殻類の雄に特有な内分泌器官であり、サワガニの造雄線は第5歩脚の基部内の輸精管末端部に付着して存在していた。色は乳白色、細長いひも状の形をしている。光学顕微鏡観察では、数10個の細胞からなり、核、細胞質ともヘマトキシリン染色でよく染まった。電子顕微鏡観察では、この腺細胞の微細構造はよく発達した層板状の粗面小胞体、ゴルジ体によって特徴ずけられた。また電子密度の高い顆粒が観察され、これらの構造はペプチドホルモンを分泌する細胞によく似ており、造雄腺ホルモンがペプチドホルモンであることを示していた。一方、intersexのカニの造雄腺はひも状の形が膨潤していた。光学顕微鏡観察では、造雄腺を構成する細胞は、正常な細胞が少なく、核や細胞質の染色性が正常の細胞と異なり、核が異常に濃染したり、細胞質がほとんど染色されなかった。Intersexの造雄腺の微細構造は、核の形が変化し細胞質内に細胞小器官が少なく、正常の造雄腺の細胞とは異なり活性が低い像を示していた。Intersex個体は造雄腺の機能が低下したことにより、二次性徴が影響を受け、雄に雌性生殖孔が生じたと考えられる。即ち、造雄腺の影響がまず二次性徴に現れていることが推測された。さらに一次性徴の精巣への影響を調べているが、多数の精子の中に卵細胞がわずかに混在しているのが観察された。これらの結果は、日本動物学会(2006、筑波)や環境ホルモン学会(2006、東京)で発表した。今後精子形成過程について詳細に調べ、造雄腺の変化が一次性徴、二次性徴に及ぼす影響を明らかにする必要がある。また、造雄腺が変化を起こす原因について、生息環境の調査も必要である
アルツハイマー病アミロイド・ベーター蛋白の毒性発現の抑制機構(メタロチオネイン及びその類似蛋白とアルミニウムの影響)

アルツハイマー病(以下AD)はアミロイド・ベーター蛋白(以下Aβ)が蓄積し,神経細胞の脱落に至る疾患であることが知られている.従来より,アルミニウムやトロンビンの蓄積が様々なAD関連細胞障害を惹起するのではないかと推測されてきたが,詳細は不明であった.最近,細胞内に存在するERAB(endoplasmic-reticulum-associated binding protein)蛋白がAβに直接結合し得る分子として新たに同定され,ERABはAβによる細胞毒性を亢進させることが示された.平成10年度は,我々は、アルミニウムとERAB蛋白の関連性を明らかにする目的で、GOTO細胞(神経芽細胞腫由来)の培養液に硫酸アルミニウムを添加する実験を行った。今回のGOTO細胞の培養にあたっては細胞突起を伸長させる無血清培養液を使用した。ERAB mRNAについては、対照群(金属無添加群)、硫酸アルミニウム添加群(500μM)で発現量に差を認めなかった。従って、アルミニウムがERAB mRNA発現増加を介してアルツハイマー病発症に関与する可能性は否定された。平成11年度はトロンビン,アミロイド前駆体蛋白(APP),ERABの関係を明らかにする目的で,トロンビン受容体を直接的に活性化するペプチド,TRAP(thrombin receptor activating peptide)の添加実験を行った.GOTO細胞を,TRAP(100μM)を添加した無血清培地下で12時間培養したところ,APPについては3倍以上の増加を認めたが,ERABについては変化を認めなかった.従って,TRAPはAPPを誘導するが,ERABを誘導しないことが明らかになった.結論として,アルミニウムやトロンビンが様々なAD関連細胞障害を惹起するにせよ,それはERAB誘導を介するものではないことが明らかになった.アルツハイマー病(以下AD)はアミロイド・ベーター蛋白(以下Aβ)が蓄積し,神経細胞の脱落に至る疾患であることが知られている.従来より,アルミニウムやトロンビンの蓄積が様々なAD関連細胞障害を惹起するのではないかと推測されてきたが,詳細は不明であった.最近,細胞内に存在するERAB(endoplasmic-reticulum-associated binding protein)蛋白がAβに直接結合し得る分子として新たに同定され,ERABはAβによる細胞毒性を亢進させることが示された.平成10年度は,我々は、アルミニウムとERAB蛋白の関連性を明らかにする目的で、GOTO細胞(神経芽細胞腫由来)の培養液に硫酸アルミニウムを添加する実験を行った。平成11年度はトロンビン,アミロイド前駆体蛋白(APP),ERABの関係を明らかにする目的で,トロンビン受容体を直接的に活性化するペプチド,TRAP(thrombin receptor activating peptide)の添加実験を行った.GOTO細胞を,TRAP(100μM)を添加した無血清培地下で12時間培養したところ,APPについては3倍以上の増加を認めたが,ERABについては変化を認めなかった.従って,TRAPはAPPを誘導するが,ERABを誘導しないことが明らかになった.結論として,アルミニウムやトロンビンが様々なAD関連細胞障害を惹起するにせよ,それはERAB誘導を介するものではないことが明らかになった.アルツハイマー病はアミロイド・ベーター蛋白(以下Aβ)が蓄積し、神経細胞の脱落に至る疾患であることが知られている。これまでの疫学的研究、遺伝学的研究、病理学的研究、生化学的研究から、様々な障害機構が示されてきた。最近、細胞内に存在するERAB(endoplasmic-reticulum-associated binding protein)蛋白がAβに直接結合し得る分子として新たに同定された[Yan,SD et al.Nature,389,689-695(1997)]。ERABはAβによる細胞毒性を亢進させる働きを示す実験結果が報告されている。1つは、ERABを強制発現させたCOS細胞において低濃度のAβが細胞毒性を惹起したというものであり、もう1つは、神経芽細胞を抗ERAB抗体で処理するとAβの細胞毒性が抑制されたというものである。一方、従来よりアルミニウムがアルツハイマー病と関連し、またAβの凝集の原因となることが報告されている。今年度は、我々は、アルミニウムとERAB蛋白の関連性を明らかにする目的で、GOTO細胞(神経芽細胞腫由来)の培養液に硫酸アルミニウムを添加する実験を行った。現在、メタロチオネイン及びその類似蛋白がAβの細胞毒性に寄与するか否かに関して検討中である。アルツハイマー病(以下AD)の老人斑はアミロイド・ベーター蛋白(以下Aβ)を蓄積している.このAβこそが神経毒性を有し,ADの発症に関与していることが知られているが,その詳細なメカニズムについてはいまだ不明である.最近,細胞内に存在するERAB(endoplasmic-reticulum-associated binding protein)

蛋白がAβに直接結合し得る分子として新たに同定され[Yan,SD et al.Nature,389,689-695(1997)],ERABはAβによる細胞毒性を亢進させることが示された.一方,従来よりADの老人斑にトロンビンも集積することが知られている。このことは,神経細胞のトロンビン受容体の活性化がAD発症に関与していることを示唆している.そこで今回はトロンビン,Aβ,ERABの関係を明らかにする目的で,トロンビン受容体を直接的に活性化するペプチド,TRAP(thrombin receptor activating peptide)の添加実験を行った.神経芽細胞腫由来のGOTO細胞を,TRAP(100μM)を添加した無血清培地下で24時間培養した.同条件で培養開始後12時間の時点で,アミロイド前駆体蛋白(APP)については3倍以上の増加を認めたが,ERABについては変化を認めなかった.従って,TRAPはAPPを誘導するが,ERABを誘導しないことが明らかになった.現在さらに、他の蛋白(メタロチオネイン及びその類似蛋白など)がERAB蛋白の誘導に関与するか否かについて検討中である。
多元素同位体・分子レベル同位体手法による生態系トレーサビリティー技術の確立

本年度は、前年度の成果である脊椎骨椎体の研究をもとにして、飼育下で餌変え実験を行なった。その結果、どの程度の時系列で炭素と窒素の同位体比が入れ替わるかが示された。本研究結果は、アイソスケープと体成分同位体比を比較して生息履歴研究を行う上での基礎的データとして活用できる。また、メチオニンの窒素同位体比を用いて、食物網における陸域由来と水域由来のアミノ酸窒素同位体比の混合率を計算する方法を開発した。本研究は、アミノ酸窒素同位体比を用いて栄養段階の推定を行う研究と、窒素源(ベースライン)の窒素同位体比を用いてアイソスケープと比較する生物移動研究を行う方法の両方に、新たな応用可能性を与える研究である。本年度から新たに従属栄養植物の研究も追加した。従属栄養植物においては、森林生態系の地下部における複雑な栄養のやりとりの影響を受けて同位体比が変化することが想定される。分析の結果、森林生態系のアイソスケープ活用法について新たな方向性が得られた。本研究は引き続き、測定元素を増やすことで多元素同位体研究と発展させることができる。また、窒素循環研究においては、シミュレーションモデルによる酸素原子交換速度の推定を開始した。平行して酸素原子の亜硝酸イオン・硝酸イオン・水間での交換実験試料測定を開始した。一方、海洋での希土類元素は、滞留時間が短く固液での分配係数が異なる。この特徴を利用することで、海洋生物体内のNd同位体から陸域成分の寄与、REEパターンから体内にもたらされるNdの存在形態を求められることを明らかにした。本年度から残りの2年間、地球研で行なっている「同位体環境学共同研究」の枠組みを活用し、さらに広い共同研究を展開することにした。本年度は、野外研究及び同位体分析に関する室内実験も問題なく行うことができた。新たな研究も開始したので、2019年度に4年間の取りまとめを行えるよう引き続き進めていく。2019年度は研究の最終年度であるので、本研究で行なってきたアイソスケープ(同位体地図)と生物体の部位別・成分別同位体比の比較による生態系構造の研究をとりまとめ、論文化を進める。さらに、本研究をどのように活用するかについて、地球研で行なっている「同位体環境学共同研究」の枠組みで進めていく。2018年度末よりヘリウムの不足が深刻化しており、サンプルの処理に時間がかかっているが、測定プロトコルの改善を通じ、できるだけ速やかに亜硝酸イオンと硝酸イオンの酸素同位体比測定を終了し、交換速度の推定を進めてゆく。高い地質依存性をもつSr-Nd同位体比の生態系を構成する水や生物への適用の一方で、鉛同位体については陸域での分布が不明確であることから、環境鉛と地質鉛の地域性の検討を進める。また前年度から実施している東南アジア地域の水生態系に対する元素・同位体手法の解析を進める。本研究を進める上で必要な超高速液体クロマトグラフUltiMate 3000/Corona Veo RS 4液グラジエントスタンダードシステムを購入し、アミノ酸分離を行った後に、フラクションコレクタを用いて各アミノ酸の窒素同位体比を測定するシステム構築を行った。流路システムの改良など、今後も必要な改造を行いつつ研究利用を進めていく。亜硝酸イオンの窒素酸素同位体比を用いて窒素循環解析を行う際に、亜硝酸イオンと水との間での酸素原子交換速度が必要となる。この速度については現在世界で1例しか報告例がないため、本年度は、交換速度が遅いと報告されているpHが7-9の環境での交換速度の見積もりを行った。実験の結果、既存報告による速度よりもずっと早い速度が認められ、これまでの交換速度を用いた窒素循環解析では亜硝酸イオンの回転速度を過大評価することが示唆された。この結果を基に来年度は、亜硝酸イオンと水との酸素原子交換が速やかに行われているという仮説の元、実際の環境中での亜硝酸イオンと水の同位体比測定を行い、この仮説を検証する。耳石による履歴分析が可能である硬骨魚類では、生物組織分析による履歴研究は主に耳石によって行われてきた。しかし、耳石はほぼ純粋な炭酸カルシウムのため含有元素が限られており、生物の履歴研究には一部の情報しか得られない。そこで、本研究では生物のいろいろな部位がどの程度履歴情報を持っているか研究を行っている。魚類の脊椎骨は履歴情報を得ることができる可能性があり、サクラマスなどを材料にその詳細について研究を進めている。植物体を構成する有機物の酸素・水素同位体比は、水の同位体比と飽差に影響を受けるが、このマップを作成することができれば植物組織の分布と行方を調べることができる。本研究では、種子の分析を進めることで基礎的研究を進めている。本研究の1年目であるので、機器整備や分析システムの整備を中心に進めた。今後は実際の分析を進め、研究を進めていく。

本研究は、アミノ酸窒素同位体比を用いて栄養段階の推定を行う研究と、窒素源(ベースライン)の窒素同位体比を用いてアイソスケープと比較する生物移動研究を行う方法の両方に、新たな応用可能性を与える研究である。本年度から新たに従属栄養植物の研究も追加した。従属栄養植物においては、森林生態系の地下部における複雑な栄養のやりとりの影響を受けて同位体比が変化することが想定される。分析の結果、森林生態系のアイソスケープ活用法について新たな方向性が得られた。本研究は引き続き、測定元素を増やすことで多元素同位体研究と発展させることができる。また、窒素循環研究においては、シミュレーションモデルによる酸素原子交換速度の推定を開始した。平行して酸素原子の亜硝酸イオン・硝酸イオン・水間での交換実験試料測定を開始した。一方、海洋での希土類元素は、滞留時間が短く固液での分配係数が異なる。この特徴を利用することで、海洋生物体内のNd同位体から陸域成分の寄与、REEパターンから体内にもたらされるNdの存在形態を求められることを明らかにした。本年度から残りの2年間、地球研で行なっている「同位体環境学共同研究」の枠組みを活用し、さらに広い共同研究を展開することにした。本年度は、野外研究及び同位体分析に関する室内実験も問題なく行うことができた。新たな研究も開始したので、2019年度に4年間の取りまとめを行えるよう引き続き進めていく。本研究では、生物体に保持された同位体情報と、多元素のアイソスケープ(同位体地図)を比較することによって、生物の移動と生態系レベルでのその影響について研究を行なっている。従来から行われている耳石に加え、魚類における脊椎骨椎体は履歴情報を得ることができる可能性があり、サクラマスなどを材料にその詳細について研究を進めた。耳石のストロンチウム同位体比と椎体のイオウ同位体比を比較することにより、硬骨魚類においても同位体履歴が保存されることを示した。また、本手法は、脊椎動物全体でも活用することができる可能性があり、哺乳類においても同様の切片分析を行った。その結果、哺乳類においても同様の時系列が保存されていることがわかった。植物体を構成する有機物の酸素・水素同位体比は、水の同位体比と飽差に影響を受けるが、このマップを作成することができれば植物組織のアイソスケープとその組織の行方を調べることができる。本研究では、標高別に種子を採取し、高度による酸素同位体比を回帰式として示すことにより、種子散布された種子の母樹の標高に関する推定方法を検討している。また、アイソスケープを決定するための基礎的情報として、亜硝酸イオンと水との間での酸素同位体交換速度を求めるための実験を開始しするとともに、亜硝酸イオン、硝酸イオン、水との間での酸素原子交換速度を推定するためのシミュレーションモデルを作成した。さらに、重元素のアイソスケープを考える上では母岩の性質が重要な寄与を示す。和歌山県南西部の地質は、主要塩基であるカルシウム(Ca)が少なく酸の緩衝能が低い。CaのプロキシとしてSrの安定同位体を用いた検討を行った結果、標高や杉林でのCa動態に有意な違いが見られ同手法の有効性を確認した。本研究の一部分であるHPLCによるアミノ酸分画分析に関して予期しなかったばらつきが生じたため、HPLCの分析手法を改めて検討し直す必要が生じた。
流体中の渦の運動に関するオイラー方程式の研究

流体中の渦の運動に関してオイラー方程式を調べることは、乱流現象の解明とも関連し、興味深い研究テーマの一つである。アメリカのG.K.Vallisらは、人工的な項を加えた非定常オイラー方程式が、また、イギリスのH.K.Moffattは、完全電気伝導度と粘性をもつ非定常電磁流体の方程式系が時刻無限大でオイラー方程式の定常解を生み出し、更に、その解は初期条件と同じ幾何学的構造をもつという主張をした。このアプローチは、従来2次元定常オイラー方程式の可解性の問題に関して用いられてきた変分法とは全く異なったものである。もし彼らの理論が正しければ、複雑な渦線をもつ初期条件を与えることにより、定常オイラー方程式に対する複雑な渦をもつ解を得ることができ、乱流現象の解明に一つの方向性を与えることになる。しかし、彼らの理論を数学的に厳密に直接証明することは難しいように見える。そこで、まずVallisらのアイデアを参考にして新しい方程式を考案し、差分法と組み合わせると、2次元定常オイラー方程式に対する解が構成できることを厳密に証明した。この証明法の特徴は、差分幅を0に近付けるのと時刻を無限大にするのを同時に行うところにある。更に、Moffattの電磁流体方程式系と同じ性質をもつ、より簡便な形の新しい方程式をいくつか提案した。これらにより、3次元の場合、ガレルキン法との組み合わせで、オイラー方程式に対する弱い意味での解を構成できることが厳密に証明される。アメリカのG.K.Vallisらは、人工的な項を加えた非定常オイラー方程式が、また、イギリスのH.K.Moffattは、完全電気伝導度と粘性をもつ非定常電磁流体の方程式系が時間無限大でオイラー方程式の定常解を生み出し、更に、その解は初期条件と同じ幾何学的構造をもつという主張をした。そこで、彼らのアイデアをガレルキン法と組み合わせ、2次元および3次元定常オイラー方程式に対する測度解の存在性を数学的に厳密に証明した。この証明法の特徴は、ガレルキン近似における基底関数の個数と時刻を同時に無限大にするところにある。オイラー方程式の測度解は、R.J.DiPernaにより非定常の場合に導入されたものだが、本研究で碍られたのは、その定常版である。
新規中枢神経系形成不全性疾患：滑脳症・小脳症が同時に発症する分子機構の解明

本研究課題では、滑脳症と小脳症の特徴を同時に併せ持つ小脳滑脳症(microlissencephaly)の発症機構を解明するため、その原因遺伝子であるカタニンp80の機能解析をin vitroとin vivoで行なった。小脳症と滑脳症が同時に発症することは、神経幹細胞の分裂と神経細胞の遊走に共通する領域が存在し、その要にカタニンp80がキー役割を果たすことが考えられる。我々はこのポイントに注目して研究を進め、カタニンp80がNuMAと細胞質ダイニンを介して中心体及びその周辺での微小管ネットワークの再編を制御することにより神経幹細胞の分裂と神経細胞遊走に関わることが証明された。カタニンのサブユニットであるp80の変異が滑脳症と小脳症の特徴を併せ持つ先天性中枢神経形成不全を発症させることが報告されたが、その発症機構に関してはほとんど明らかにされていない。そこで、本研究課題では、カタニンp80の変異がどのようにして、このような重い中枢神経形成不全を引き起こすかを明らかにすることを目指して研究を進めてきた。1.細胞におけるカタニンp80の局在を調べたところ、細胞質のみならず細胞核にも局在していることが分かった。カタニンp80の核移行シグナルを決定するため、いくつかのプラスミドのコンストラクトと滑脳症・小脳症(microlissencephaly)の患者から見つかった4つの変異体を用いて、N末端の156アミノ酸配列上に核移行のシグナルが配置していることを決定した。2.液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて、カタニンp80が神経細胞遊走に関わる細胞質ダイニンと細胞分裂の制御因子であるNuMAと相互作用することが分かった。また、分裂中のヒト細胞におけるカタニンp80の細胞内局在を調べてみると、NuMAと同様な細胞内局在を示していることから、細胞増殖にカタニンp80が深く関わっていることを判明した。3.微小管ネットワーク再編におけるカタニンp80の機能を調べ、神経細胞遊走に関わる細胞質ダイニンと細胞分裂の制御因子であるNuMAと一緒に微小管のアスター形成に必須であることを明らかにし、カタニンp80が細胞分裂における紡垂体形成に関与することを解明した。4.これらの研究成果に基づいて、平成28年度にin uteroの解析を行う予定であったが、今年度の研究が順調に進み、予定より半年も早く成果が出たため、平成28年度に行う予定であったin uteroの研究を半年くらい前倒しにして条件検討のための予備実験を行った。平成27年度に実施する予定であったin vitroとin vivoにおけるカタニンp80の機能解析が予定より半年くらい早く成果が出た。これらの結果を基に、平成28年にはin uteroにおけるカタニンp80の機能解析を行う予定だったのが、半年くらい前倒しにして条件検討のための予備実験を行うことができた。本研究プロジェクトでは、滑脳症と小脳症の特徴を同時に併せ持つ小脳滑脳症(microlissencephaly)を発症させる原因遺伝子カタニンp80の機能解析をin vitroとin vivoで行なった。小脳症と滑脳症が同時に発症することから、神経幹細胞の分裂と神経細胞の遊走に共通する領域が存在することに注目して研究を進め、カタニンp80がNuMAと細胞質ダイニンを介して中心体とその周辺で行なわれている微小管ネットワークを制御することを明らかにした。マウス繊維芽細胞におけるカタニンp80の発現をsiRNAでノックダウンさせたところ、多極の紡錘体形成や中心体の数と形状の異状が確認された。この異状はNuMAをノックダウンさせた細胞でも同様で、両者の欠損がさらに異状の程度が増強し、機能的なつながりがあることが示唆された。また、in uteroでマウス胎児脳におけるカタニンp80とNuMAをノックダウンさせると神経幹細胞の分裂異状と神経細胞への分化促進及び神経細胞遊走の障害が確認された。さらに、microlissencephaly患者由来の神経iPS細胞を用いた解析から、カタニンp80の変異が神経幹細胞分裂時の紡錘体の形成とその形態維持に影響を与えると同時に神経細胞の遊走を著しく抑制することが明らかになった。一方、in vitroの微小管挙動解析実験ではカタニンp80、NuMAの組み替えタンパンク質と精製細胞質ダイニンが微小管をアスターに形成させることが確認できたが、患者由来のカタニンp80の変異体はその機能が失っていた。これらの結果から、カタニンp80はNuMA、細胞質ダイニンを介して中心体及びその周辺での微小管ネットワークの再編を制御することにより神経幹細胞の分裂と神経細胞遊走に関わることが証明された。平成28年度に於いては、マウス胎児脳を用いたin uteroの解析を行い、siRNAによるカタニンp80とNuMAのノックダウンが神経幹細胞の分裂異常と分化を促進、及び神経細胞遊走に異常をもたらすことを明らかにした。また、microlissencephaly患者由来の神経iPS細胞を用いた解析から、カタニンp80の変異が神経幹細胞の分裂時の紡錘体の形成と維持、神経細胞の遊走に影響を与えることが分かった。組換えカタニンp80、NuMAと精製細胞質ダイニン、チューブリンを用いたin vitro微小管挙動解析実験では、カタニンp80がアスターの形成とその形態維持に必須であることを証明した。

これらの結果は、カタニンp80がNuMAと細胞質ダイニンを介して中心体及びその周辺における微小管ネットワークの再編を制御しており、カタニンp80の変異は微小管再編の制御機構の破綻につながり、神経幹細胞の分裂と神経細胞の遊走に異常をもたらすことが明らかとなった。面白いことに、カタニンp80の微小管束化機能がNuMAにより解消されることが新たに明らかとなった。細胞核と中心体を細胞の状態に応じてシャトルするこの二つタンパンク質は、微小管ネットワーク再編へのユニークな機能を明らかにすることができた。これらの研究成果は、すでに学術論文にまとめてScientific Reports誌に掲載した。本研究課題では、滑脳症と小脳症の特徴を同時に併せ持つ小脳滑脳症(microlissencephaly)を発症させる原因遺伝子カタニンp80(p80)の機能解析をin vitroとin vivoで行なった。その結果、p80がNuMAと細胞質ダイニンを介して中心体及びその周辺での微小管ネットワークの再編を制御することにより、神経幹細胞の分裂と神経細胞遊走に関わることを証明した。これらの研究成果はすでに学術論文にまとめてScientific Reports誌に掲載させた。本研究課題を含む我々のこれまでの研究から、滑脳症の原因遺伝子LIS1と小脳滑脳症の原因遺伝子p80がともに細胞質ダイニンの運動活性と細胞内局在を制御することを報告した。さらに、LIS1が神経細胞内において“荷台"となる特殊な微小管フラグメント(PALM画像で確認された長さは1 μm)上に細胞質ダイニンを可逆的に固定することで輸送複合体を形成し、アダプター因子mNudCとキネシンによって順向性に運ばれることを報告した。これらの研究をさらに発展させる形で、末梢神経から細胞質ダイニンの順向性輸送に必要な“荷台"の形成に関わる因子を同定することにした。そのため、結紮したラットの大腿神経を用いたLC-MS/MSの解析と電子顕微鏡法を用いた構造解析を行い、“荷台"となる特殊な微小管フラグメントにはパーキンソン病の原因遺伝子であるα-Synuclein (αSyn)が結合することを発見した。さらに、in vitroでの微小管の重合実験ではαSynが選択的に14本のプロットフィラメント(14-pfs)の微小管に結合することを見出した。これらの結果は、“荷台"は14-pfsの微小管フラグメントであることを示唆する。我々の研究成果は、αSynの変異によって発症する神経変性疾患の発症機構の解明に新しい証拠を提供することになる。本研究課題では、滑脳症と小脳症の特徴を同時に併せ持つ小脳滑脳症(microlissencephaly)の発症機構を解明するため、その原因遺伝子であるカタニンp80の機能解析をin vitroとin vivoで行なった。小脳症と滑脳症が同時に発症することは、神経幹細胞の分裂と神経細胞の遊走に共通する領域が存在し、その要にカタニンp80がキー役割を果たすことが考えられる。我々はこのポイントに注目して研究を進め、カタニンp80がNuMAと細胞質ダイニンを介して中心体及びその周辺での微小管ネットワークの再編を制御することにより神経幹細胞の分裂と神経細胞遊走に関わることが証明された。1.平成27年度の後半に行ったin uteroの予備実験の結果を基に、in uteroにおけるカタニンp80の機能解析を行う。In uteroでマウス胎児脳に遺伝子導入後、脳組織のスライス培養でのカタニンP80の機能解析。
糖鎖認識を基点としたバベシア原虫の赤血球侵入分子機構の解明

バベシア原虫による赤血球侵入時に、"シアル酸やヘパラン硫酸"が赤血球膜上の感染受容体として重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、いくつかの新たな原虫側リガンド候補分子が同定された。原虫リガンド分子と感染受容体の特異相互作用を介入できる糖鎖誘導体やリガンド分子に対する特異抗体の効果は、未だ治療法や予防法のないバベシア症の新規薬剤や新規ワクチンの開発に有用な知見や材料を提供している。バベシア症を克服するためにはバベシア原虫が持つ独自の赤血球侵入分子機構を理解し、治療法・予防法の開発に繋がる重要なそのターゲット分子を同定していくことが急務となっている。本研究の目的は、未だ明らかとされていない糖鎖認識を基点としたバベシア原虫の赤血球侵入機構を分子レベルで解読しようとするものである。平成19年度では、バベシア原虫(Babesia bovis)による赤血球侵入を阻害できる糖鎖誘導体群のパネルの決定を試みた。すなわち、バベシア原虫の培養液中に様々な糖鎖誘導体(α2-3もしくはα2-6シアリルラクトース、ヘパリン、デキストラン硫酸、デキストラン、ケラタン硫酸、プロタミン硫酸、ヘパラン硫酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、及びヒアルロン酸)を添加し、バベシア原虫の赤血球侵入を阻害できる糖鎖誘導体群の探索・同定を行った。その結果、「α2-3シアリルラクトース、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、フコイダン、及びコンドロイチン硫酸」がバベシア原虫の赤血球侵入を有意に介入・阻害することをつきとめた。上記糖鎖誘導体群と構造上類似した感染受容体が赤血球膜上に存在していることが示唆されたとともに、それら糖鎖誘導体は未だ治療薬のないバベシア症の新規薬剤候補となりうることも期待された。上記の知見をもとに、次年度もバベシア原虫による赤血球侵入機構を分子レベルで解明していく予定である。平成20年度までに、"α2-3シアリルラクトース、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、フコイダン、及びコンドロイチン硫酸"がバベシア原虫の赤血球侵入を有意に介入し阻害することをつきとめた。また、シアル酸が欠如した赤血球にはバベシア原虫は侵入できないことも明らかとなった。これらの成果より、上記糖鎖誘導体群と構造上類似しだシアル酸やヘパラン硫酸様多糖"が赤血球膜上の感染受容体として重要な役割を果たしていることが示唆された。また、原虫リガンド分子と感染受容体の特異相互作用を介入できるそれら糖鎖誘導体群は、未だ治療薬のないバベシア症の新規薬剤の候補となりうることも期待された。しかしながら、シアル酸が欠如した赤血球にも侵入できるバベシア原虫株が分離できたことから、バベシア原虫は環境に応じて感染受容体を使い分ける巧みな赤血球侵入の適応能力を持つことが示された。上記の知見をもとに、最終年度もバベシア原虫による赤血球侵入機構を分子レベルで解明していく予定である。最終年度までに、1)"α2-3シアリルラクトース、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、フコイダン、及びコンドロイチン硫酸"がバベシア原虫の赤血球侵入を有意に介入し阻害することをつきとめた。これらの成果より、上記糖鎖誘導体群と構造上類似した"シアル酸やヘパラン硫酸様多糖"が赤血球膜上の感染受容体として重要な役割を果たしていることが示唆された。また、2)新たにP200(B.bigemina)、HSP70(B.gibsoni)、Bv36(B.bovis)、及びBboP67(B.bovis)などが同定され、新たな原虫リガンド候補として加わった、原虫リガンド分子と感染受容体の特異相互作用を介入できるそれら糖鎖誘導体群や特異抗体の効果は、未だ治療法や予防法のないバベシア症の新規薬剤や新規ワクチンの開発に有用な知見を提供していると考える。
非排水地表層を有する液状化地盤の過剰間隙水圧発生機構と地中構造物への影響分析

本研究では以下の4項目について研究の実施と成果を得た。(1)液状化時排水量の計測と消散解析に関する研究静的に過剰間隙水圧を発生させる実験装置を開発して、有効上載圧を変化させながら液状化時過剰間隙水圧比と消散に伴う流出水量について計測した。正確な流出量を計測するために、装置の改良に苦心している。その結果、過剰間隙水圧比の上昇とともに流出量が増加すること、上載有効圧が高いほど流出水量が多くなること、などが知られた。さらに、実験結果を解析的に検討するためにFEM有効応力解析を実施した。実験土槽の変形を除去するようにすれば、実験値と解析値はきわめて良い対応をすることが知られた。(2)液状化を受けるコンクリート橋脚基礎の耐震安定性を検討する目的でFEM解析を実施した。限界状態としての橋脚転倒率を定義し、液状化に伴う転倒率の時間的変化を算出した。直接基礎の場合には、橋脚周辺の地盤が液状化する範囲によって転倒率が大きく変化することが知られ、液状化に伴う沈下も生じることが分かった。また、杭基礎の場合には地盤条件の違いを考慮しても直接基礎の場合よりも液状化しにくく、また、転倒率も小さくなる。これは、橋脚自重による抑え効果が直接基礎の場合より大きいためである。杭基礎では地盤支持力を失うこともなく、橋脚の沈下の心配はないが、群杭の周辺摩擦力の低下によって、水平方向力による不安定現象が引き起こされる可能性のあることが知られた。(3)北海道東方沖地震の際における液状化による地中構造物の被害調査を実施した。釧路市・根室市では液状化浮力にともなう下水道マンホールの浮上が顕著であった。周辺地盤やマンホール埋め戻し土の液状化が関与しているものと考えられる。また、液状化側方流動にともなって水道管路などで被害の生じていることが知られた。(4)液状化時側方流動に伴う地中管路に与える影響を検討するために、第一段階として地盤のみを対象とした振動台加振実験を行った。地盤は3層構造として中間層が液状化し、その上方非液状化地盤が側方に移動する特性を計測した。実験の結果、加振によって、まず液状化地盤が沈下し、ついで液状化地盤の側方流動につれて上層の非液状化地盤が移動する。さらに、加振を続けた場合には最上層の非液状化地盤が液状化砂地盤上を滑動することが知られた。
世界流行を引き起こしている新興家畜由来サルモネラの環境抵抗性と宿主内生残性の解析

我が国では非定型Salmonella Typhimurium(ST)による家畜のサルモネラ症が近年増加傾向にあり、その背景には欧州に起源を有する特定系統の国内侵入があることをこれまでに明らかにしてきた。さらに本系統が多剤耐性を示し、重金属抵抗性に関与するSalmonella genomic island 3(SGI3)を染色体上に保有することなどを明らかにしている。抗菌剤や重金属は家畜の飼料添加物として使用されており、本系統の選択圧となっている可能性が考えられる。そこで本研究では薬剤耐性を規定する遺伝子領域やSGI3の構造と機能を解析することで、本系統の分布域拡大の背景を明らかにする。
T-box遺伝子ファミリー機能解析による先天性心血管疾患発症機構の解明

交付申請書に記載した研究の目的に基づき、T-box遺伝子ファミリーのTbx1、Tbx4およびTbx20に着目して研究計画を実施した。先天性心臓流出路異常モデル動物であるTbx1発現低下マウスにおいて、葉酸により心血管疾患の表現型が変化することを明らかにし、遺伝子発現プロファイルおよびDNAメチル化の網羅的解析により、神経堤細胞の遊走・分化に関与するヘッジホッグシグナルの調節因子であるEfcab7の発現変化を明らかにした。葉酸による神経堤細胞の遊走・分化およびアポトーシスの救済により、Tbx1発現低下マウスの心疾患表現型が軽症化することが示唆された。また、Tbx4の肺血管発生における機能解析により、Tbx4が分泌性増殖因子Fgf10の発現を直接制御することを明らかにした。TBX4は肺動脈性肺高血圧の責任遺伝子として報告されており、この分子機序が肺動脈の発生と病態形成に関与することが示唆された。さらにCRISPR/Cas9システムを用いて、Tbx20のノックアウトマウスを作製した。Tbx20ホモノックアウトマウスの解析により、心臓初期発生の異常により胎生致死となることが確認された。Tbx20とTbx1の遺伝子異常の組合せ(多因子変異)による心血管疾患の発症機序を解析するため、Tbx20変異マウスとTbx1発現低下マウスを交配し、Tbx20/Tbx1複合遺伝子変異(Tbx20+/-Tbx1+/-、Tbx20+/-Tbx1-/-およびTbx20-/-Tbx1-/-)マウスを樹立した。Tbx20+/-Tbx1+/-では、軽微な表現型の変化があるかどうか、Tbx20+/-Tbx1-/-ではTbx1-/-よりも重篤な心血管表現型が見られるかどうか、Tbx20-/-Tbx1-/-では、特に二次心臓領域の発生において、Tbx20-/-よりも重篤な心血管表現型が見られるかどうか検証されている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した研究の目的に基づき、先天性心臓流出路異常モデル動物であるTbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子の作用により心血管疾患の表現型が変化する様子を観察するために、Tbx1発現低下マウスの心血管表現型を改めて詳細に病型を診断し、総動脈幹症の中でもVan Praagh A1A4型のうちA2型であることを明らかにした。さらに、普通餌と葉酸過剰餌で妊娠母マウスを飼育した場合のTbx1発現低下マウスの総動脈幹症の表現型を比較検討した結果、普通餌ではA2型が100%に対し、葉酸餌では約60%でA1型に表現型が変化することを明らかにした。A2型は肺動脈主幹部が形成されないのに対し、A1型は肺動脈主幹部が形成される病型であり、葉酸により、心臓流出路異常の重症度として、表現型の軽症化したと考えられた。流出路の中隔を形成する間葉系細胞の数を比較したところ、普通餌Tbx1発現低下マウス胎仔では野生型に比して細胞数が減少するが、葉酸餌マウス胎仔では細胞数が改善しており、間葉系細胞の発生障害が葉酸により救済されたため、心臓流出路異常の表現型が軽症化したことが示唆された。また、Tbx4の肺血管発生における機能解析について、酵素法で肺分散細胞を得て接着法で間葉系細胞を抽出し、間葉系マーカーを用いて95%以上の効率で分離できる実験系を確立した。Tbx4の発現ピークに合わせて、胎生13日に採取して24時間培養した肺間葉系細胞において、再現性よくTbx4をノックダウン(KD)するRNAiの条件が確立し、血管内皮分化マーカーの発現が有意に低下、未分化幹細胞マーカーの発現が上昇していた。さらに実験系で、細胞外基質上にTbx4をKDした肺間葉系細胞で血管新生・管腔形成能を解析した結果、血管新生能が亢進していた。Tbx4は肺間葉系細胞の未分化維持に機能する可能性が示唆された。上記研究実績概要に記載した結果より、研究目的の1つであるTbx1とepigenetic因子による心疾患表現型の検討については、Tbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子の作用による心血管疾患の表現型の変化を詳細に解析・解明するシステムを確立することができ、次年度以降、葉酸を1つの候補として、心疾患表現型を変化させる複数の環境・epigenetic因子を特定し、その分子機構を解明するための研究に発展させるための進捗状況は良好である。また、Tbx4とTbx1による肺血管発生および異常の検討については、培養細胞系を用いたTbx4の機能解析系が確立し、in vitroの解析が良好に進捗し、次年度以降のin vivoの検討につなげるための基礎データを得ることができている。Tbx20とTbx1による心疾患表現型の検討についても、Tbx1の心疾患表現型の詳細な解析は、上記研究実績概要通り良好に進捗した。一方、Tbx20遺伝子改変マウスについては、樹立に着手したものの、まだ解析には至っておらず、この点においては進捗が遅れているが、以上、全体的には概ね計画書に沿った達成度と考える。交付申請書に記載した研究の目的に基づき、先天性心臓流出路異常モデル動物であるTbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子として葉酸の作用により心血管疾患の表現型が変化することを明らかにした。