hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1分子の分離、機能評価が可能なマイクロシステムを用いた高機能蛋白質の創製法

タンパク質相互作用解析を明らかにする有効な手段として、オルガネラなどの超分子複合体の単離・精製を行い、構成生体分子の同定する方法がある。これを実現するため、超分子複合体の検出・単離を微小流路(入り口が1つ、出口が2つのT字型流路、流路幅30μm、深さ5μm)で行う生体分子ソーターを開発した。微細加工技術でチップ内に作られた従来のバルブは開閉に数秒の時間を要し、しかも可逆的でないなど、実用的ではなかった。この問題を解決するために、キャリア溶液に37°Cを境に高温でゲル、低温でゾルと可逆的な相転移を起こす熱感受性ハイドロゲルを加えておき、赤外レーザー(1480nm:水の極大吸収波長)の局所加熱によって分岐した流路の一方にゲルによる栓(ゲルバルブ)を形成させ、それを切り替えることによって流れの制御を可能とした。単離する超分子複合体をGFPなどの蛍光物質で標識しておき、それらが発する蛍光を光電子倍増管によって検出し、バルブを切り替えた。ゲルバルブの開閉に要する時間は4msであり、ビデオでは撮影できないほど高速な流体制御が可能になった。連続な自動運転が可能であり、十万個の粒子を分離することが可能であった。さらに、この流路に分離した生体試料を回収するために流路を組み込むことにより、回収することに成功した。実際に生体分子や細胞の検出・分離・精製が可能であることを、蛍光標識したaファージDNA、大腸菌、好中球などで確認した。ポストゲノムでは重要な機能を有する未知のタンパク質をいち早く見つけだし、その機能を解析することが求められている。このため、生体分子を高純度に分離・回収するシステムを一枚のマイクロチップ上で実現する装置の開発を目指している。このシステムを実現する上で最大の問題点は、現時点では、微少バルブを作る技術が未発達なことである。微細加工技術でチップ内に作られたバルブは開閉時間に5秒以上を要し、しかも可逆的でないなど実用的ではない。この問題を解決するため、1%のメチルセルロースを含む試料をマイクロシステム(2cm四方のシリコン基板に入り口が1つ、出口が2つの逆Y字型流路。分岐前後の流路幅は、それぞれ50、25μm、深さは10μmである)に流し、分岐部を局所的に加熱することによって可逆的にゾル・ゲル相転移を起こし、バルブとして機能させた。本年度は、分岐部位を局所的に加熱するための赤外レーザ(波長1480nm)システムを顕微鏡に組み込み、実際に分岐部でゾル・ゲル相転移を引き起こすことに成功した。可逆的な相転移は、約100ミリ秒で起こり、現在知られているスイティング速度としては、最速の結果を得ることができた。ポストゲノムではプロテオーム解析とタンパク質相互作用解析が求められている。そのためのアプローチとしてオルガネラなどの超分子複合体の単離・精製を行い、構成生体分子の同定を行おうと考えている。これを実現するため、超分子複合体の検出・単離を微小流路(入り口が1つ、出口が2つのY字型流路、流路幅30μm、深さ4μm)で行う生体分子ソーターを開発している。キャリア溶液には37°Cを境に高温でゲル、低温でゾルと可逆的な相転移を起こす熱感受性ハイドロゲルを加えておき、赤外レーザー(1480nm:水の極大吸収波長)の局所加熱によって分岐した流路の一方にゲルによる栓(ゲルバルブ)を形成させ、それを切り替えることによって流しわけを可能とした。分離作業を自動化するため、単離する超分子複合体を蛍光標識しておき、それらが発する蛍光を光電子倍増管によって検出して、バルブを切り替えた。この生体分子ソーターを評価するため、直径1μmと0.2μmの蛍光ビーズを蛍光強度の違いで分離した。下の図は実際に2種類の蛍光ビーズを分離している様子である。

我々が開発したソーターはスイッチング時間120msで検出・分離を行うことができた。また、6時間以上の長時間運転も可能であった。さらに生体分子の検出・分離も可能であることを蛍光標識したλファージDNAで確認した。タンパク質相互作用解析を明らかにする有効な手段として、オルガネラなどの超分子複合体の単離・精製を行い、構成生体分子の同定する方法がある。細胞を分離する技術は既に確立され行なわれているが、生体分子や超分子複合体を分離する技術は未だに開発されていない。これを実現するため、超分子複合体の検出・単離を微小流路(入り口が1つ、出口が2つのT字型流路、流路幅30μm、深さ4μm)で行う生体分子ソーターを開発した。キャリア溶液に、37°Cを境に高温でゲル、抵温でゾルと可逆的な相転移を起こす熱感受性ハイドロゲル(メビオールゲル)を加え、生体試料とともに微細流路に流した。赤外レーザー(1480nm:水の極大吸収波長)の局所加熱によって分岐した流路の一方にゲルによる栓(ゲルバルブ)を形成させ、それを切り替えることによって流しわけを可能とした。さらに、分岐部に金属を蒸着することにより、800-1000nmの波長の赤外レーザでも効率的に加熱し、分離できることを確認した。ゲルバルブの開閉は4msであり、ビデオよりも高速な流体制御が可能になった。単離すべき超分子複合体を蛍光で標識しておき、それらが発する蛍光を光電子倍増管によって検出して、バルブを切り替えた。一連の操作をコンピュータで自動化し、10時間以上の自動運転を可能とした。実際に生体分子の検出・分離が可能であることを蛍光標識したλファージDNA、大腸菌、好中球などで確認した。
帰国子女の適応に関する追跡研究

本研究の目的は,研究代表者らが10年前に行った「海外・帰国子女の適応に関する調査研究」の対象となった655名の「帰国子女」のうち,現在調査可能なものについて質問紙調査と面接調査を行い, 1)幼・少年期に海外で生活した成人「帰国子女」は,現在どのようなパーソナリティーや文化的帰属意識をもち,また2)それがどのような過程を経て形成され,その際とくに在外中および帰国後の「異文化体験」によって,どのような影響を受けたかを調査研究し,その結果にもとづいて, 3)「帰国子女」の日本の社会および学校での適応の個人的・社会的意義を検討することである.上記の諸調査研究および文献研究の結果,次の諸点から明らかになった.1)幼・少年期に海外で生活した成人「帰国子女」の帰国後のパーソナリティ形成には,海外体験の有意義性,滞在期間,語学力(外国語),アイデンティティの確立度,日本社会への親和度などの要因が大きく作用している.2)全体としてみれば,幼・少年期における海外生活に対する帰国直後の評価と, 10年後の現在の評価との間に大きな違いはみられない.しかし個々の「帰国子女」の適応過程は多様であり,それに伴って評価も変動するので,「異文化体験」の意義は長期的な視点から明らかにする必要がある.3)「帰国子女」は一般に,「異文化体験」,とくに在外中の生活経験を肯定的にとらえている.大学進学をはじめ,帰国後の日本社会への「適応」も比較的スムーズであり,「異文化体験」をふまえた広い視野を身につけている.4)しかしアイデンティティ形成にとくに顕著にみられるように,「帰国子女」がその異文化体験を十分に生かすには,親や兄弟を含めた家族関係だけでなく,学校生活や交友関係などの「公的な」環境条件をいっそう整備し,きめ細かな制度的な配慮を充実することが望まれる.本研究の目的は,研究代表者らが10年前に行った「海外・帰国子女の適応に関する調査研究」の対象となった655名の「帰国子女」のうち,現在調査可能なものについて質問紙調査と面接調査を行い, 1)幼・少年期に海外で生活した成人「帰国子女」は,現在どのようなパーソナリティーや文化的帰属意識をもち,また2)それがどのような過程を経て形成され,その際とくに在外中および帰国後の「異文化体験」によって,どのような影響を受けたかを調査研究し,その結果にもとづいて, 3)「帰国子女」の日本の社会および学校での適応の個人的・社会的意義を検討することである.上記の諸調査研究および文献研究の結果,次の諸点から明らかになった.1)幼・少年期に海外で生活した成人「帰国子女」の帰国後のパーソナリティ形成には,海外体験の有意義性,滞在期間,語学力(外国語),アイデンティティの確立度,日本社会への親和度などの要因が大きく作用している.2)全体としてみれば,幼・少年期における海外生活に対する帰国直後の評価と, 10年後の現在の評価との間に大きな違いはみられない.しかし個々の「帰国子女」の適応過程は多様であり,それに伴って評価も変動するので,「異文化体験」の意義は長期的な視点から明らかにする必要がある.3)「帰国子女」は一般に,「異文化体験」,とくに在外中の生活経験を肯定的にとらえている.大学進学をはじめ,帰国後の日本社会への「適応」も比較的スムーズであり,「異文化体験」をふまえた広い視野を身につけている.4)しかしアイデンティティ形成にとくに顕著にみられるように,「帰国子女」がその異文化体験を十分に生かすには,親や兄弟を含めた家族関係だけでなく,学校生活や交友関係などの「公的な」環境条件をいっそう整備し,きめ細かな制度的な配慮を充実することが望まれる.10年前に行った「海外・帰国子女の適応に関する調査研究」の対象者655名の追跡調査を行い、確認のできた110名について質問紙による調査を行い、さらにそのうちの60名について面接調査を行った。また統制群として京都市内5大学の学生300名に対して類似の質問紙調査を行った。これらの結果の集計、分析は現在なお進行中であるが、これまでに判明した2点について報告する。1)110名の青年期の「帰国子女」を対象の調査において、主観的評価を統合的・包括的に抽出する軸を設定レクロス分析を行なった。更、に統制群として大学生を対象に比較した。その結果、男女差、海外体験の有意義性、語学力(外国語)、アイデンティティの確立度、滞在期間、日本社会への親和度などの要因の効果が大であった。更に、男女別に異なった要因が作用していることがわかった。特に女性群では、男性群に比べて統制群との違いが大きく現われている。2)帰国後のアイデンティティの型を、(1)滞在国に帰属意識があり日本社会にあまりなじめない「外国型」、(2)滞在国で身につけた文化を捨てていく「削除型」、(3)滞在国と文化と日本の文化の両方を使いわける「両立型」、(4)日本文化に基準のある「日本型」、(5)どのような文化にも親しみがもて実際そこで生活できるとする「普遍型」に分類し、帰国から今日にいたる10数年間にこれらの型がどのような変遷を経たのか、また各々の型の出現を促す要因は何かを調べた。

例えば、「帰国子女学級」の中の準拠集団については、「外国型」を長期化させ、「両立型」・「普遍型」への転化を促し、「両立型」・「日本型」・「普遍型」の維持をはかる一方、「帰国子女学級」についても準拠集団のない生徒は、「削除型」を出現させていることなどが判明した。本研究の目的は,研究代表者らが10年前に行った「海外・帰国子女の適応に関する調査研究」の対象となった655名の「帰国子女」のうち,現在調査可能なものについて質問紙調査と面接調査を行い, 1)幼・少年期に海外で生活した成人「帰国子女」は,現在どのようなパーソナリティや文化的帰属意識をもち,また2)それがどのような過程を経て形成され,その際とくに在外中および帰国後の「異文化体験」によって,どのような影響を受けたかを調査研究し,その結果にもとづいて, 3)「帰国子女」の日本の社会および学校での適応の個人的・社会的意義を検討することである.本年度は,前年度に行った「帰国子女」及び〓制群についての質問紙調査についてのコンピューター分析と,面接調査の結果についての分析を行った.その結果,明らかになった諸点は以下の通りである.1)幼,少年期に海外で生活した成人「帰国子女」の帰国後のパーソナリティ形成には,海外体験の有意義性,滞在期間,語学力,アイデンティティの確立度,日本社会への親和度などの要因が大きく作用している.2)幼,少年期における海外生活に対する帰国直後の評価と, 10年後の現在の評価との間に大きな違いはみられないが,個々の「帰国子女」の適応過程は多様であり,それに伴って評価も変動するので,「異文化体験」の意義は長期的な視点から明らかにする必要がある.3)「帰国子女」は一般に,「異文化体験」をふまえた広い視野を身につけている.4)しかし「帰国子女」がその異文化体験を十分に生かすには,親や兄弟を含めた家族関係だけでなく,学校生活や交友関係などの「公的な」環境条件をいっそう整備し,きめ細かな制度的な配慮を充実することが望まれる.
自己反応性Th17ヘルパーＴ細胞の長期生存機構の解析

乾癬、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症といった自己免疫疾患は近年増加の一途をたどり、この病態解明は社会的に緊急かつ重要な課題である。自己免疫疾患の多くは、IL-17産生性ヘルパーT細胞(Th17)によって起こり、寛解と再燃を繰り返す特徴がある。本研究ではTh17依存性自己免疫疾患モデルを用いて、自己反応性Th17が体内において長期間生存し、再活性化して炎症の再燃を起こすメカニズムを探求する。
ペプチドの新しい超高感度非競合測定法の開発と応用

1987年、ハプテンを非競合法により高感度で測定する一般的原理を創案し、ハプテンのビオチン化によりこの原理を具体化した。つまり、N末端のみにアミノ基を有するペプチドをビオチン化し、酵素標識抗ペプチド抗体、ストレプトアビジン不溶化固相などを用いてattomole量のペプチドの測定を可能にした。これを更に発展させるため、次のような研究を進めた。1.ヒスチジン残基チロシン残基などを有するペプチドをビオチン化して測定するために、次の基礎実験結果を得た。(1)血漿などのサンプル中には、測定すべきペプチド中のヒスジン残基、チロシン残基の他にジアゾ化されうる多量のアミノ基、アルギニン(残基)が共存するが、この場合でも、ヒスチジン残基、チロシン残基が優先的にジアゾ化されることがわかった。(2)ビオチンは、ジアゾ化反応によりアビジンとの結合能を失わないことがわかった。2.ビオチン化反応後の不要なビオチン化合物を除去するために、ビオチン化ペプチドを2,4-ジニトロフェニル化酵素標識抗ペプチドFab'と反応させ、抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化ポリスチレンボールにトラップ、洗浄後溶出して、ストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールにトラップする方法を試みた結果、用いたN-ヒドロキシサクシニミドビオチンにより2,4-ジニトロフェニル化酵素標識抗ペプチドFab'がビオチン化されないためには、ビオチン化反応後長時間放置する必要のあることがわかった。3.従来用いてきたウシ血清アルブミンの代りにゼラチンを用いて、ストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールを調製することにより、酵素標識抗ペプチドFab'のストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールへの非特異吸着を低下させ、一層の高感度化が達成できる場合のあることがわかった。しかし、これですべてのハプテンの測定の高感度化が可能になるわけではないこともわかり、さらに検討中である。申請者は、抗原のattomole量を非競合法により検出した経験から、1987年、ハプテンを非競合法により高感度で測定する一般的原理の考え方をまとめた。ハプテンに何らかの標識を有機化学的に結合し、ハプテンに対する抗体と標識に対する特異結合物質とを用いて測定する。この原理に従って、N末端のみにアミノ基を有するペプチドをビオチン化し、酵素標識抗ペプチド抗体とストレプトアビジン不溶化固相あるいは酵素標識アビジンと抗ペプチド抗体不溶化固相を用いてattomoleレベルのペプチドを測定することができた。1.アミノ基をもたないペプチドのうち、ヒスチジン残基、チロシン残基などを有するペプチドをビオチン化して測定するために、次の基礎実験結果を得た。(1)血漿などのサンプル中には測定すべきペプチドの他に、ジアゾ化されうる多量のアミノ基、アルギニン(残基)が存在するので、いずれがジアゾ化され易いかを検討した結果、ジアゾ化されうる残基が共存する場合にはヒスチジン残基、チロシン残基が、アミノ基、アルギニン(残基)より優先的にジアゾ化されることがわかった。(2)ビオチンが、ジアゾ化反応によりアビジンとの結合能を失わないことがわかった。2.ビオチン化反応後の不要なビオチン化合物を除去するために、ビオチン化ペプチドを2,4-ジニトロフェニル化酵素標識抗ペプチドFab

'と反応させ、抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化ポリスチレンボールにトラップ、洗浄後溶出して、ストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールにトラップする方法を試みた結果、用いたN-ヒドロキシサクシニミドビオチンにより2,4-ジニトロフェニル化酵素標識抗ペプチドFab'がビオチン化されないためには、ビオチン化反応後長時間放置する必要のあることがわかった。一般に競合法より非競合法を用いることにより高感度化が可能であるため、ペプチドを測定するための非競合法の原理を創案すると同時に、ペプチドのビオチン化により非競合法の原理を次のように具体化した。N-hydroxysuccinimidobiotinを用いて直接あるいは間接的にビオチン化を行う。ビオチン化ペプチドを抗ペプチドIgG不溶化ポリスチレンボールの上にトラっプし、ポリスチレンボールを洗浄した後、酸性条件下でビオチン化ペプチドを溶出する。溶出液を中和した後、酵素標識抗ペプチドFab'を反応させ、酵素標識抗ペプチドFab'とビオチン化ペプチドの複合体をストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールの上にトラップする。最後のポリスチレンボールを洗浄した後、ポリスチレンボールに結合した酵素活性を測定する。その結果、一部のペプチドについては競合法と比べ約100倍高感度化され10amolのペプチドの測定が可能となった。これは、酵素標識抗ペプチド抗体のストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールへの非特異吸着が十分低下したためである。しかし、必ずしも充分低下せず、高感度化が困難な場合のあることもわかった。そこで、測定操作の各ステップに用いる緩衝液中に加えるたんぱく質として、従来用いてきたウシ血清アルブミンの代りにセラチンを用いた。その結果、ストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールの調製時にのみゼラチンを使うことにより、問題の非特異吸着が充分低下し、高感度化できる場合のあることがわかった。7-MSHがその例である。しかし、これですべてのハプテンの測定を高感度化できるわけではないこともわかった。殊にストレプトアビジン不溶化ポリスチレンボールの調製法のうち、非特異ウサギIgGのビオチン化方法に問題のある可能性が浮上した。現在、非特異ウサギIgGおよびウシ血清アルブミンを種々の方法でビオチン化して、いずれが有効か検討中である。
GeneChipを用いた躁うつ病および精神分裂病関連遺伝子の同定

スタンレー財団脳バンクの双極性障害、うつ病、統合失調症、対照群、各15名ずつの死後脳、前頭前野から、RNAを抽出し、オリゴdTプライマーでcDNAを作成し、cDNADNAマイクロアレイ(GeneChip)を用いて、遺伝子発現の網羅的解析を行った。これまでに報告されている加齢に伴う遺伝子発現変化が確認されたこと、すでに報告されている、統合失調症死後脳において発現量が変化していた遺伝子のリストを用いてクラスター分析を行ったところ、良好な分離ができたことなどから、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現の測定は信頼できるものであると考えられた。各疾患で変化している遺伝子群を比較したところ、予想に反し共通部分は少なく、各疾患毎に特徴的な遺伝子発現変化が見られた。双極性障害では、神経伝達関連遺伝子の発現低下、分子シヤペロンや転写因子の発現増加などがみられた。これらのうち、多くはRT-PCR法により発現変化が確認できたが、確認できない遺伝子も多く見られた。双極性障害において発現が上昇していた53個の遺伝子を用いて、クラスター解析を行ったところ、ほぼ完全に両群が別のクラスターとして分類されることがわかった。無投薬の患者も、服薬中の患者と同じクラスターに分類されたことから、これらの発現変化の見られた遺伝子群に関して、服薬の影響は少ないものと考えられた。今後はこの方法により、死後診断が可能となるかも知れない。また、今回遺伝子発現変化を見出した遺伝子は、双極性障害の候補遺伝子として、更に検討を行う必要がある。スタンレー脳バンクより、躁うつ病患者、精神分裂病患者、うつ病患者、対照群、各15例、合計60例分の前頭前野の凍結脳サンプルの供与を受けた。このサンプルよりRNAを抽出し、その品質を変性アガロースゲル電気泳動にて確認した。更に、cDNAを合成し、in vitro転写によりcRNAを得た後、これを断片化し、ハイブリダイズを行って、GeneChip解折を行った。まず、test2チップによりRNAの品質を確認し、電気泳動の結果と合わせて検討したところ、測定に用いることができるサンプルは50検体と考えられたため、これらの検体につき、12651個の遺伝子の発現量を測定できるU95Aチップを用いて、GeneChip解析を行った。これらのサンプルを、その由来に関して盲検的に、既報の精神分裂病において発現が変化している遺伝子のリスト(Hakakら2001)を用いてクラスター解析を行い、16サンプルを精神分裂病患者と推定した。これを実際の由来と照合したところ、16名中半数は実際に精神分裂病患者の検体であり、精神分裂病における遺伝子発現変化に特定のパターンがあることが推定された。また、スタンレー脳バンクの躁うつ病患者サンプルを混合してDNAマイクロアレイ解折を行った結果(Bizchlibnykら2001)は、特定の1名における大きな遺伝子発現変化に影響されている可能性が考えられた。躁うつ病群で有意に発現が変化し、投薬、死因、性別、年齢などの交絡因子の影響が否定されるような遺伝子を深索したところ、3つの遺伝子が同定された。今後、これらの結果を更に詳細に検討すると共に、EST(expressed sequence tag)を搭載した他のチップについても検討していく予定である。スタンレー財団脳バンクより得た凍結死後脳(前頭葉皮質)50名分から、Trizol(Gibco BRL)キットを用いてtotal RNAを抽出した。RNAの品質をゲル電気泳動により検定した後、Superscript Choice system(Gibco BRL)にてcDNAを作製し、さらにRNA Transcript Labelling Kit(ENZO)を用いてビオチン化cRNAを合成しDNA microarray実験に供した。DNA microarrayは、Affymetrix社のGeneChip protocolに従って行った。Test2chipにてRNAのqualityを検定後、Hu95FLチップを用いハイブリダイゼーションを行った。得られたデータの解析は解析ソフトGenespring(Silicon Genetics)を用いて行った。Rawデータをチップごとに中央値で補正した。

発現が大きく変化していた遺伝子については、定量的RT-PCR法により、発現変化を確認した。双極性障害に特異的に変動している遺伝子群、統合失調症またはうつ病群と同じ変化が見られる遺伝子群について、遺伝子の特徴を検討したところ、双極性障害では、カルシウム関連遺伝子が低下していることがわかった。また、得られたGeneChipデーターを元に、判別分析を行った。40の選択された遺伝子を用いた場合、49サンプルで作成した判別関数を用いて残りの1サンプルの診断を予測すると、100%正しい診断が得られることを見出した。
クロマチン構造転換因子が関与する肺神経内分泌細胞の分化機構の解析

肺神経内分泌細胞は胎生中期に気道上皮に現れ、セロトニンおよび神経ペプチドなどを分泌し、上皮細胞の増殖と気道の分枝形成に重要な役割を果たしている。また、肺神経内分泌細胞は肺上皮の形成と維持に重要な機能を担っており、神経内分泌細胞への分化機構の解明は、正常な肺発達や肺疾患の病因の理解と治療法の開発に重要と考えられる。我々は、ATF5がクロマチン構造転換因子複合体を形成することを示し、神経内分泌細胞への分化に本複合体が重要な役割を果たすことを示唆した。また、肺障害の修復過程で肺神経内分泌細胞が増加することを示した。そこで、肺神経内分泌細胞への分化メカニズムを解析するため、分化培養系を確立し、Ash1の2段階の誘導が神経内分泌細胞の分化に関わること、また、Ash1はNotchおよびShhシグナルとクロストークする可能性を示した。この分化過程におけるATF5の機能を解明するために、ATF5に対するモノクロナール抗体の作成を試みた。また、ATF5遺伝子発現の調節機構について検討を加えた。ATF5は転写調節因子であり、アミノ酸末端側に転写活性化ドメイン、カルボキシル末端側にbZIPドメインが存在する。そこで、ATF5の全長を抗原としてモノクロナール抗体を作製したところ、ATF5の立体構造を特異的に検出するモノクロナール抗体を得ることが出来た。しかし、内在性の抗原を検出することは出来なかった。これらの結果から、内在性のATF5タンパク質は分解が早く、分解スピードの制御が機能発現と関連していることが予想された。そこで、ATF5の各種欠失変異体を作製し分解制御部を検索した結果、ATF5にはタンパク分解制御領域が存在し、酸化的なストレスがATF5タンパク質の分解を制御することが明らかとなった。従って、オゾン等の酸化的なガス暴露による神経内分泌細胞増殖に、酸化ストレスによるATF5タンパク質の発現制御が関与することが示唆された。肺神経内分泌細胞は肺上皮の形成と維持に重要な役割を担っている。また、肺障害からの修復時に、一過性に増殖すること、さらに、突発性間質性肺炎の患者に肺神経内分泌細胞が増加していることが、報告されている。肺神経内分泌細胞への分化過程に関わる、転写因子複合体の構成と機能を明らかにする目的で、先ず、細胞培養系を用いて、神経内分泌細胞への分化を促進する培養条件を検討した。ハムスターおよびヒトの胎仔肺由来の細胞を、低密度で培養し、その後、低酸素環境で培養を続けることにより神経内分泌細胞へ分化することを、カテコールアミンの蓄積を、また、クロモグラニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドの発現量を指標として確認した。またこの細胞分化過程にNotch, Hes因子が関わることを示した。また、Mash1の発現をSiRNA法を用いて抑制した。その結果、神経内分泌細胞への分化が抑制された。さらに、Notch1の発現が抑制され、MashからNotch系への情報伝達経路の存在が示唆された。本細胞分化系にATF5の関与をしょうさいに検討中である。また、ATF5欠損マウスを作製し、肺神経内分泌細胞の分化状態、さらに、ナフタレン暴露による肺障害とその修復に関与するATF5の関連をノックアウト動物の使用により解析中である。肺神経内分泌細胞(PNEC)は胎生中期に気道上皮に現れ、セロトニンおよび神経ペプチドなどを分泌し、上皮細胞の増殖と気道の分枝形成に重要な役割を果たしている。

また、肺神経内分泌細胞は肺上皮の形成と維持に重要な機能を担っており、神経内分泌細胞への分化機構の解明は、正常な肺発達や肺疾患の病因の理解と治療法の開発に重要と考えられる。我々は、ATF5を含むクロマチン構造転換因子の作用が、神経内分泌細胞への分化に重要な役割を果たすことを示し、その機能を解明するために、ATF5に対するモノクロナール抗体の作成を試みた。また、ATF5遺伝子発現の調節機構について検討を加えた。ATF5は282アミノ酸からなる塩基性ロイシンジッパー(bZIP)型の転写調節因子であり、アミノ酸末端側にプロリンに富む転写活性化ドメイン、カルボキシル末端側にbZIPドメインが存在する。はじめに、ATF5の全長を抗原としてモノクロナール抗体を作製したところ、N末端側に対する抗体のみが単離された。そこで、次に、bZIPドメイン近傍を抗原としてモノクロナール抗体を作製した。作製された抗体は、ATF5と特異的に反応した。しかし、内在性の抗原を検出することは出来なかった。そこで、現在ATF5遺伝子を破壊したATF5ノックアウトマウスを用いて、内在性の抗原を検出可能なモノクロナール抗体の作製を試みている。また、ATF5タンパク質は分解が早く、分解スピードの制御が機能発現と関連していることが予想された。そこで、ATF5の各種欠失変異体を作製し分解制御部を検索した結果、プロリンリッチドメインにタンパク分解制御領域が存在し、酸化的なストレスがATF5タンパク質の分解を抑制することが明らかとなった。従って、オゾン等の酸化的なガス暴露による神経内分泌細胞増殖に、酸化ストレスによるATF5タンパク質の安定化が関与することが示唆された。
微細緑藻の葉緑体退化に伴う原油成分の分解・資化代謝系誘導に関する研究

これまでの研究で、1.疎水性担体への藻細胞固定化、2.耐熱性株の使用が、本藻種による混合炭化水素分解の促進に有効であることを明らかにした。今年度は、上記2手法の組み合わせが、本藻の炭化水素分解能向上に及ぼす相乗効果を検討した。発泡ポリウレタン担体へ固定化を行った耐熱性P.zopfii株は、その混合炭化水素(n-alkane+多環芳香族)中に含まれるn-alkaneの分解能を、36日間の連続培養の間、高水準に維持した。なお、この条件下(耐熱性株細胞を固定化)で培養を行った場合の分解速度は(温度条件は30°C一定とした)、上記1.または2.の片方だけの工夫を行った培養に比較して、2-2.5倍と有意に高かった。n-alkaneについては、その定期的な供給(6日おき)以前に、前回投入しておいた全体量が完全分解された。他方、多環芳香族炭化水素(PAHs)は、定期的供給が行われる毎に蓄積を認めた(毎供給時に、前回投入したPAHsのほぼ全量が残存するため)。これは、担体への固定化を行わない浮遊細胞の回分培養で、初期投入量(900mg/L)の50-60%のPAHsが分解された結果と大きく異なった。PUFに吸着されたPAHsは、藻細胞による分解を受けにくくなったものと推察された。PAHsの示すPUF担体中への蓄積は、PUFとPAHsの間に認められる疎水性物質同士の相互作用に起因することが示唆された。PAHsは、一度PUFに吸着されると、たとえその蓄積が進行して2.2g/Lの濃度に達した場合でも、P.zopfiiの増殖に影響を与えなかった。PAHsは、藻細胞に悪影響を与えない状態でPUFに吸着され続けるので、耐熱性P.zopfii株を用いたn-alkaneの生物分解終了後、担体を水域から取り出すことによって集中的に除去可能と考えられた。B:前年度までに行った、P.zopfiiの炭化水素分解・資化代謝能の獲得経路に関する分子系統学的な研究結果と併せて研究取りまとめ(論文投稿)を行い、2報文を作成した(うち1報は出版済み)。光合成色素を欠く微細藻Prototheca(プロトテカ)属には,Prototheca zopfiiという種が存在する。本種は炭化水素を資化して生育する唯一の緑藻であり,原油中のn-アルカンを資化,芳香族炭化水素を分解する.その中でも炭化水素減少能が高い株としてATCC30253株(以下ATCC株)が知られる.ATCC株はpH/塩分の変化に対して耐性が高く,これら環境要因の変動が著しい水圏での炭化水素分解用微生物製剤として期待されるが,一方で25°Cを超える高温域でn-アルカン資化能を完全に失うという問題点がある.そこで本研究さは,ATCC株と当該研究者が温泉環境より分離したRND16株(耐熱性株)の炭化水素減少能を比較した.炭素源として4種のn-アルカンと3種の多環芳香族炭化水素を加えた最少培地中で,各株を25または35°C下,4週間培養した.35°C下でATCC株は炭化水素を減少させることができず増殖不能であったが,RND16株は高い炭化水素素減少能と増殖能を示した.さらに常温の25°Cでも,RND16株はATCC株と比較して高い増殖速度と約10倍の定常期藻濃度を示し,3.3倍の炭化水素減少量を示した.このようにRND16株は従来のP.zopfiiの弱点である高温での活性消失が無いばかりか常温でも高活性なので,夏期や熱帯水圏における炭化水素分解に使用可能と考えられた.次に原油分解藻P.zopfiiの分子進化上の位置を推定するために,本種を含むプロトテカ属全種のSSU rDNA全長とLSU rDNA・D1/D2領域についてDNA塩基配列を決定,分子系統解析を行った。光合成を行う緑藻で,プロトテカと関連する種は,トレボウクシア藻綱のオキセノクロレラのみであった。また,解析したP.zopfiiの3株は全てn-alkane資化能を持つが,n-alkane資化能を持たない近縁種P.moriformisとの遺伝的距離は短く,同種として扱うべきレベルにあった.炭化水素類の資化能をもつ酵母や細菌のグループは,その能力を持つ系統を分子系統樹上で確認できるが,プロトテカではP.moriformisとP.zopfiiの間で突然その能力を得ているから,本種の炭化水素資化能は,特定遺伝子群の水平移動により獲得された可能性がある.A:酵母様藻類プロトテカ(原油分解藻)、クロレラ、および殺虫藻の分子系統解析【目的】光合成色素を欠く2種の微細緑藻Prototheca zopfii(原油を分解資化する)と、Helicosporidium sp.(伝染病を媒介する昆虫を死滅させる)は、核および白色体由来rDNA塩基配列に基づく分子系統解析から類縁関係にあると推定されている。本研究の分子系統解析では、これら2種と類緑関係にあると予想されるPrototheca属から数株のrDNA塩基配列情報を加えることによって、原油分解藻と殺虫藻の分子系統学的関係をより高い精度で推定する。【方法】

各Prototheca属藻株の核由来SSU rDNA全長とLSU rDNA D1/D2領域をゲノムからPCR増幅した。各増幅DNA断片をサブクローニング後、塩基配列を決定した。分子系統樹は、各々のデータセットに最適な塩基置換モデルをhierarchical likelihood ratio test(hLRT)の結果に基づき選定後、最尤法を用いて構築した。【結果】Helicosporidium sp.とP.zopfiiが、直接同じ祖先を共有する関係として解像されることはなかった。しかし、P.zopfiiを含むPrototheca属全体とHelicosporidium sp.が同じ緑藻祖先(現存するクロレラでは"Chlorella" protothecoides)に由来している可能性は極めて高かった。Helicosporidium sp.は、進化の過程でP.zopfiiを含むPrototheca属藻種を生んだ系統とは分岐して、独自の進化を遂げたものと考えられた。Helicosporidium sp.は、いずれのPrototheca属藻株からも著しく長い遺伝的距離を示すことから、本藻がいつPrototheca属に認めない殺虫能力を獲得したか推定することは困難であろう。【目的】光合成色素を欠く微細藻Prototheca zopfiiは原油中の炭化水素を分解資化する唯一の緑藻種である。本藻種の炭化水素分解能を高める方法として1.疎水性担体であるPUFへの細胞固定化、2.耐熱性株の使用が有効であることが知られる。本研究では、これら2つの方法を組み合わせることによって、さらなる炭化水素分解の最適化を試みた。【方法】P.zopfiiの耐熱株RND16および中温性株ATCC30253の細胞をPUF担体に固定化、または非固定の状態で1%(v/v)炭化水素(n-アルカン:C_<14>-C_<17>各37.5mg,多環芳香族:ナフタレン、フェナントレン、ピレン各2mg)を含む20mLのYNB培地に添加して、培養中の炭化水素分解速度および炭化水素分解量を比較した。本実験は、25,30,35°Cの各温度で行った。【結果】耐熱性株細胞をPUF担体へ固定化した場合、中温性株を固定せずに使用した条件と比較して、n-アルカンの分解速度および分解量の値は、それぞれ4.6倍、2.6倍高く(25°C)、同様の傾向は30°Cでも認められた。また、耐熱性株による分解では、固定化を行うと炭化水素分解が始まるまでのtime lagが短縮した。他方、多環芳香族炭化水素の分解は固定化を行うと著しく抑制され、その傾向は炭化水素分解能が高い耐熱性株で顕著に認められた。すなわち、P.zopfiiによる炭化水素分解において、耐熱性株の利用とPUF担体への細胞固定化の相乗効果は、n-アルカン分解で認められるが、芳香族炭化水素の濃縮を引き起こすことがわかった。これまでの研究で、1.疎水性担体への藻細胞固定化、2.耐熱性株の使用が、本藻種による混合炭化水素分解の促進に有効であることを明らかにした。今年度は、上記2手法の組み合わせが、本藻の炭化水素分解能向上に及ぼす相乗効果を検討した。発泡ポリウレタン担体へ固定化を行った耐熱性P.zopfii株は、その混合炭化水素(n-alkane+多環芳香族)中に含まれるn-alkaneの分解能を、36日間の連続培養の間、高水準に維持した。なお、この条件下(耐熱性株細胞を固定化)で培養を行った場合の分解速度は(温度条件は30°C一定とした)、上記1.または2.の片方だけの工夫を行った培養に比較して、2-2.5倍と有意に高かった。
社会の合理化・世俗化を前にしたキリスト教ーその対応と変質ー

本研究の課題は、キリスト教が社会の合理化や世俗化に直面して、どのようにそれに対応し、また自らを変質させていったかを考察することにあった。換言すれば、聖と俗の交錯する場面を、キリスト教という一宗教を例として具体的に描き出そうとする試みであった。この課題に対して、(1)土屋博は初期キリスト教におけるマリア伝承を題材として、その由来、その歴史的展開をあとづけながら、本研究全体を特徴づける問題意識を明らかにした。(2)宇都宮輝夫は近世プロテスタンティズムの解明に際して、M・ウェーバーの宗教理論を踏襲しつつ、さらにサン・シモン,デュルケームなどの宗教理論、社会学的方法論にまでさかのぼって、よりいっそうの理解を試みた。(3)大道敏子は中世カトリシズムの礼典主義にその本質を見い出し、それがキリスト教的歴史観の一つの世俗化した形態であることを示そうと試みた。これらの成果は、本報告書中の11頃に挙げた論文、図書において、具体的に示されている。本研究は、初期キリスト教、中世カトリシズム、近世プロテスタンティズムというキリスト教全史に及ぶ歴史的視野をもつものであるが、いわゆる概説的キリスト教史という神学的アプローチによるものではなくあえて神学における中心的テーマを離れてその周辺に、聖と俗のダイナミックな交錯を積極的にとりあげようとした。この点において、キリスト教を主題とした、聖俗問題へのひとつのとりくみを試みたのである。
誘導型ヒト人工がん幹細胞を用いたがん再発モデルの構築ならびに再発責任分子の同定

がんの再発・転移の原因は治療後に残存するがん幹細胞であると考えられている。本研究ではマウス神経幹細胞(NSCs)に活性化型ALKを導入してマウス脳内に移植する発がんモデルを応用し、移植後にマウス脳内で遺伝子発現を誘導/消失できる誘導型発がんモデルを構築した。また、活性化型ALKならびに活性化型H-RAS導入によるNSCsの染色体異常を解析したところ、導入遺伝子毎に特徴的な染色体毎のコピー数異常が検出された。今後、誘導型発がんモデルを用いてコピー数異常の変化を解析し、発がん・再発時における責任分子の同定を目指したいと考えている。がんの再発・転移はがん死要因の約9割を占めており、再発・転移性がんに対する効果的な治療が求められる。近年、がんの再発・転移の原因は治療後に残存するがん幹細胞であると考えられており、幹細胞様性質に加えて治療抵抗性を有することなどが報告されているが、がん幹細胞による再発・転移機構については未だ不明な点が多い。本研究では、これまでに申請者らが構築してきた人工がん幹細胞(induced Cancer Stem Cells; iCSCs)を用いたマウス発がんモデルを応用し、マウスがん再発モデルを構築する。マウス生体内で腫瘍を発生・退縮させた後に再発する腫瘍について経時的に詳細な解析を行うことで、がん再発機構の責任分子を同定することを目的とした。ALK R1275Q活性型変異体の単一遺伝子導入によりマウスおよびヒトNSCからiCSCを誘導し、iCSCをマウス脳内へ移植することで悪性脳腫瘍を作製することに成功しており、このシステムを応用して誘導型発がんモデルを構築するために、Tet-On systemを用いてDox投与依存的にALK R1275Q遺伝子を発現誘導できるTet-On-ALK R1275Q-Luc-hNSCの樹立を行っている。これまでに樹立した細胞をヌードマウス脳内に移植し、移植後当日よりDox含有餌を投与することでALK R1275Q-Luc-hNSCと同様に腫瘍形成を確認できており、さらに安定的な誘導型発がんモデルの構築を行っている。具体的には遺伝子発現ベクターを改変し、EF1-aプロモーターやP2A配列を使用することでALKや蛍光タンパク質、薬剤耐性遺伝子を同時に安定高発現させ、短期間で薬剤選択できる蛍光タンパク質陽性の細胞を樹立することができた。これらを使用することで実験条件を最適化し、細胞移植後の発がん過程における各種イベント発生の高い再現性が期待できる。腫瘍形成後に遺伝子発現を消失できる誘導型発がんモデルを構築するために、Tet-On systemを用いて神経幹細胞(Neural Stem Cells; NSCs)にDox添加/除去依存的にALK R1275Q遺伝子を発現誘導/消失できるTet-On-ALK R1275Q-Luc-NSCを樹立した。また、発がん過程における遺伝子・染色体異常を解析することを目的に、ALK R1275QならびにH-RAS V12を遺伝子導入したNSCsからゲノムDNAを抽出し、エクソーム解析を行ったところ、それぞれのゲノムDNAより様々な遺伝子で点変異が検出された。ゲノムDNAのコピー数に注目して解析を行ったところ、ALK R1275QならびにH-RAS V12発現NSCsそれぞれに特徴的な染色体毎のコピー数異常が検出された。今後、誘導型発がんモデルを用いて遺伝子の発現誘導/消失によってコピー数異常が変化するかを解析し、発がん・再発時におけるがん細胞の機能解析を行うことで責任分子の同定を目指したいと考えている。腫瘍生物学本研究の目的であるマウス発がんモデルの応用によるマウスがん再発モデルの構築ならびにがん再発機構の責任分子同定にあたり、in vitroやin vivoにおいて再現性が確保できる安定した実験系の樹立は必須であり、これまでの成果から実験系の最適化は順調に進展していると言える。マウスがん再発モデルの最適化を進めつつ、マウス生体内で発生させた腫瘍ならびに退縮させた後に再発する腫瘍の解析を行う準備を整え、がん再発機構の責任分子の同定を目指す。
ユビキチンが形成するT細胞抑制性シグナルソームの分子イメージング解析

T細胞が活性化する際、T細胞は抗原提示細胞と共に「免疫シナプス」を作り、抗原ペプチドとMHCの情報をT細胞受容体(TCR)から受け取る。免疫シナプスは、TCRとその下流のシグナル伝達分子から成るシグナルソーム「TCRマイクロクラスター」で構成され、TCRマイクロクラスターは活性化の単位として機能する。本課題研究では、活性化シグナルの単位でもあるTCRマイクロクラスターが、抑制性のシグナルソームとしても機能し、TCRとその下流のシグナル伝達分子のインターナリゼーションと分解に重要であることを目的としている。昨年度まで、TCRのインターナリゼーションに必要なE3ユビキチンリガーゼCblファミリー分子を可視化し、1Cbl-bがTCRと共にマイクロクラスターを形成すること、2TCRマイクロクラスターにユビキチン修飾が起こっていること、3ユビキチン修飾はシグナル伝達やエンドサイトーシスを示唆するリジン63連鎖の結合様式を示すこと、などを明らかにした。本年度、新たにTCRのエンドサイトーシス関連分子であるクラスリン軽鎖、ダイナミン、エンドサイトーシス蛋白EPS15の挙動をイメージングしたところ、全てがTCRマイクロクラスターに共局在することが分かった。しかし、どの分子もCbl依存的であるかは明らかでなく、Cbl-b遺伝子欠損マウスから調整したT細胞を用いた場合も、野生型との差違は認めなかった。よって、今後、詳細なイメージング解析によって、TCRシグナルの終焉とCbl-エンドサイトーシス関連分子との機能の共通性、独立性、補完性の検討を行い、T細胞を抑制的に制御するシグナルソームの実体解明の継続的研究を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。T細胞が活性化する際、抗原提示細胞と接着し、抗原ペプチドとMHCの情報を受け取る。その際、2つの細胞の接着面は「免疫シナプス」と呼ばれ、T細胞受容体(TCR)とその下流のシグナル伝達分子から成る凝集塊「TCRマイクロクラスター」で構成される二次元平面である。TCRマイクロクラスターは活性化の単位でもあるが、抑制性分子が会合することや、最終的にインターナリゼーションされることから、シグナル終焉の単位とも考えられる。本課題研究では、TCRのインターナリゼーション・分解に重要なE3ユビキチンリガーゼc-ClbおよびCbl-bを可視化し、TCRシグナル終焉のメカニズムを明らかにすることを目的とした。1)ユビキチンのイメージング解析:Cblファミリー分子とユビキチンを可視化するため、それぞれの分子とのGFPキメラ分子を作製し、免疫シナプス内でTCRと共にクラスターを形成することを示した。2)エンドサイトーシス分子との関連性の解析:クラスリン依存的エンドサイトーシス経路との関連性を示すため、クラスリン軽鎖、ダイナミン、エンドサイトーシス蛋白EPS15の挙動をイメージングし、それらがTCR直下のシグナル伝達分子が会合するより30秒遅く、TCRマイクロクラスターにリクルートすることを明らかにし、TCRシグナル活性化に対するネガティブフィードバックの過程であると考えられる。3)特異的ユビキチン鎖の同定:TCRマイクロクラスターに凝集するユビキチンが、K63優位であることを、特異的ユビキチン鎖に対する抗体にて同定した。4)遺伝子欠損マウスを用いたイメージング解析:Cblファミリー分子の遺伝子欠損マウス由来から末梢T細胞を調整し、TCRのエンドサイトーシスとユビキチン化をイメージングした。その結果、Cbl-b依存的にK63ユビキチン修飾とTCRのエンドサイトーシスが誘導されることを発見した。TCRマイクロクラスター、E3ユビキチンリガーゼおよびユビキチンの同時イメージングに成功し、これまで生化学でしめされていたTCRのインターナリゼーションと分解の減少を追従し、さらにその新たなメカニズムの解明に至り、本年度の研究実施計画を沿った実験が行うことが出来ている。

特異的ユビキチン結合のイメージングを、特異的抗体だけでなく、2015年に4報報告された特異的ユビキチン血追うのイメージングプローブを使い、また、まだ報告されていないK48結合のプローブを作製し、本年度のデータの正当性を再評価する。また、本年度は末梢T細胞に関する研究を進めたが、Cblファミリーの機能的差があると考えられている中枢(胸腺)T細胞のCbl分子およびユビキチンの可視化を行い、末梢T細胞を比較することで、一般に自己免疫に関わるとされるCblファミリー分子の疾患発症機序の解明へと繋げる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
腫瘍分泌エクソソームを標的とした骨軟部肉腫における新規診断システムの開発

腫瘍分泌エクソソームを標的とした血中バイオマーカーの探索を目的としている。特異的な融合遺伝子の発見により骨軟部肉腫における診断に大きな進展がみられたように、肉腫特異的分子の特定により早期発見だけでなくモニタリングに使用できることが期待される。当研究施設では以前から骨肉腫や粘液型線維肉腫、滑膜肉腫などの研究・発表を行っており、これらの肉腫を中心に特異的分子の特定を行う予定である。そして脂肪肉腫など骨軟部肉腫において頻度の高い肉腫に加え、明細胞肉腫など特異的な融合遺伝子が発見されているがモニタリングが困難である様々な組織型も網羅していく。
火炎と壁面の熱的・化学的干渉機構の解明と制御

壁面は,流体力学的・熱的な境界条件を規定することによって火炎に影響を及ぼしているが,同時に壁面の化学的境界条件も大きな影響因子である.化学的境界条件は表面反応に依存し,ラジカルの吸着による化学的消炎,ラジカルの脱離による気相反応・自着火促進などを通じて,燃焼場において重要な役割を果たすことが近年明らかになりつつある.本研究では,壁面の化学種を変化させた場合の壁近傍の燃焼機構を,火炎温度・ラジカル分布の顕微PLIF計測,ラジカルの放電生成による非燃焼場での表面反応計測,気相詳細反応と表面反応を組み込んだ数値解析を用いて詳細に検討し,火炎と壁面の熱的・化学的な干渉効果の物理現象を明らかにした.火炎と壁面の干渉効果を考えるとき,壁面の化学的境界条件も大きな影響因子である.化学的境界条件は表面反応に依存し,その活性度に応じて,ラジカルの吸着による化学的消炎,ラジカルの脱離による気相反応・自着火促進などを通じて,燃焼場において重要な役割を果たすことが近年明らかになりつつある.本研究では,壁近傍の燃焼機構を,PLIF計測および数値解析を用いて詳細に検討し,火炎と壁面の熱的・化学的な干渉効果の物理現象を明らかにし,それを制御することを目的としている.初年度は,流れ方向に温度分布を印加した石英流路(流路幅1.5mm)内に形成される火炎を,PLIFを用いて計測し,壁面の化学的効果について定量的データを取得した.まず,DME・空気のWeak flameの熱炎領域においてOH-PLIFを適用し,壁面が石英,アルミナ,SUS321の場合のOH分布を取得した.そして,詳細な気相反応,表面反応を組み込んだ数値解析と比較を行い,SUS321では石英,アルミナに比べて顕著に壁面近傍でのOH分布が減少することを示した.また,DME・空気のWeak flameの冷炎領域においてHCHO-PLIFを適用し,壁垂直方向にはHCHOは分布を持たないが,流れ方向分布がSUS321壁では変化することを初めて明らかにした.SUS321壁において,HCHO分布は冷炎領域でより低温側に現れ,触媒反応的な効果が伺える.一方,絶対値としては石英壁に比べて小さく,また熱炎領域には第2のピークが形成される.これらは,従来の化学吸着のみに基づく表面反応モデルでは説明することができず,新たなモデル構築の必要性が示唆される.さらに,TALIF(2光子吸収LIF)を用いたH原子の計測,H原子ビームをプラズマ放電で発生させて壁面での吸着現象の検討などの準備も進めており,次年度において具体的な計測に移る予定である.計測については,OH,HCHO,H原子のLIF計測は順調に進みつつある.熱炎に対しては,Normal flame,Weak flameにおける壁面の化学的効果の相違について,OH-PLIF計測と数値解析の両面から検討を進めている.冷炎に対しては,Weak flameにおけるHCHO-PLIF計測を行い,初めて定量的な情報を明らかにし,壁面の触媒反応的な見られるなど,極めて興味深い結果も得られるある.全体として,研究計画は順調に進行していると考えている本研究では,壁近傍の燃焼機構を,PLIF計測および数値解析を用いて詳細に検討し,火炎と壁面の熱的・化学的な干渉効果の物理現象を明らかにし,それを制御することを目的としている.第2年度は,まず,TALIF(2光子吸収LIF)を用いたH原子の計測系を構築した.Dual Wave Plateと2種類のBBO結晶を用いた光学系により,色素レーザー出口の615nmから205nmへの変換効率を従来の4倍以上に相当する8.6%に向上させることに成功した.また,それを用いた平行平板間のメタン火炎の計測により,壁温が800°C以上ではH原子も壁面近傍で大きく減少することを明らかにした.そして,数値解析を用いた感度解析から,OH原子よりもH原子の方が熱炎での化学的効果に影響が大きいことを示した.また,プラズマ放電によりH原子ビームを発生させ,高真空中での壁面散乱を計測して,初期吸着計測を算出し,LIF計測結果との関係について検討を進めている.さらに,流れ方向に温度分布を印加した石英流路(流路幅1.5mm)内に形成される火炎を,PLIFおよびGC-MSを用いて計測し,壁面の化学的効果について定量的データを取得した.壁面としては,活性度が低いと考えられる石英,熱炎で比較的大きな化学的効果があることが明らかになったSiC,およびSUS321を用いた.その結果,DME・空気のWeak flameの冷炎領域において,石英およびSiC壁上のDME, CO, CO2の流れ方向分布は同様であるのに対し,SUS321ではいずれも流れ方向下流にシフトし,DMEでは一旦下がった後にやや上昇するという特異的な分布が現れることを明らかにした.そして,従来の吸着モデルでは再現できないこと,HCHOの吸着,DMEの再生成を仮定したモデルが考えられ,その検証にはHCHO,CH3OHの計測が今後重要であることを示した.計測については,1.5mm幅流路におけるOH,HCHO,H原子のLIF計測手法を構築した.熱炎に対しては,アルミナ,石英,SiC,SUS321の順で化学的効果が強くなることが本研究の計測から明らかになった.冷炎に対しては,Weak flameにおけるHCHO-PLIF計測およびGC-MS計測を行い,初めて定量的な情報を明らかにし,特にSUS321での特異的な化学的効果を示すなど,極めて興味深い成果も得られている.また,数値計算,およびモデリングについても,カールスルーエ大学のO. Deutchmann教授の研究室に博士課程の学生を指導委託という形で派遣して検討を進めた.

さらに,プリンストン大学のY. Ju教授の研究室に博士課程の学生を6ヶ月派遣して,Head on Quenchingの場合の壁面の化学的効果を検証するための実験について,数値解析により実現可能性を確認した.全体として,研究計画は順調に進行していると考えている本研究では,壁近傍の燃焼機構を,PLIF計測,ガス濃度計測および数値解析を用いて詳細に検討し,火炎と壁面の熱的・化学的な干渉効果の物理現象を明らかにし,それを制御することを目的としている.最終年度は,まず,流れ方向に温度勾配を印加した石英流路(流路幅1.5mm)内に形成されるDMEのweak flameについて,GC-MSを用いたガス種計測と,冷炎の特徴的中間生成物質であるHCHOのLIF計測を行った.壁面材料としては,石英,SiC,SUS321,Inconelに加えて,Ni,Fe,Crの純金属を用いた.その結果,SiCは比較的大きな壁面活性を持っているにも関わらず,石英と同様の分布を示すこと,一方,SUS321,Inconelでは,HCHOが冷炎領域で大幅に減少し,燃料であるDMEがむしろ増大する特異的な分布を示すことが明らかになった.また,それに伴い,熱炎の位置が高温側にシフトし,火炎構造全体が壁面の化学的効果により大きな影響を受けることが明らかになった.この傾向はNi,Feでさらに顕著であり,SUS321を構成する金属のうち,Ni,Feの影響が大きいことが示唆された.次に,新しい定常冷炎を実現する系として,加熱壁面に燃料と純酸素の混合気体の噴流を衝突させる系を提案した。一次元数値解析により、壁温が700K以上、歪み速度が242 s-1以下のとき、冷炎着火が保証される領域が現れることを明らかにした.そして、HCHO-LIFにより、一次元解析で冷炎の存在が予測される実験条件において,冷炎が安定化されることを明らかにした.そして、Ni壁面上で形成された冷炎は,SiO2表面の場合と比べ,HCHO濃度と火炎温度が低く,Ni壁面の化学的効果により低温酸化反応が阻害されていることを明らかにした.壁面は,流体力学的・熱的な境界条件を規定することによって火炎に影響を及ぼしているが,同時に壁面の化学的境界条件も大きな影響因子である.化学的境界条件は表面反応に依存し,ラジカルの吸着による化学的消炎,ラジカルの脱離による気相反応・自着火促進などを通じて,燃焼場において重要な役割を果たすことが近年明らかになりつつある.