hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉緑体翻訳系に於ける5'非翻訳領域とコード領域の適合性を決める要因の探索

植物細胞の中で光合成を行う葉緑体は盛んにタンパク質も作っている。そこで、葉緑体で有用タンパク質を生産する試みがなされたが、必ずしも成功しなかった。このことは、葉緑体のタンパク質合成の機構が動・植物の細胞質や細菌の機構とは違っていることを意味する。本研究で、葉緑体でのタンパク質合成にはメッセンジャーRNAの上流部分のみならずタンパク質のアミノ酸配列を規定する部分の一部も必要なことを明らかにした。葉緑体mRNAの翻訳開始に、5'非翻訳領域(5'UTR)と共にタンパク質コード領域も関与するという「5'UTRとコード領域の適合性」の仮説を検証するため、我々の高活性タバコ葉緑体in vitro翻訳系を用いて実験を進めた。光化学系IIのD1コード領域はリジンを含まない。葉緑体では翻訳できない外来遺伝子TATは9個のリジンを含む。蛍光リジンtRNAを含むin vitro系で反応させると、リジンはTATだけに取り込まれるので、TATコード領域の翻訳のみを検出できる。そこで、D1コード領域を3'末から決失させたmRNAの翻訳速度を測定し、TATを翻訳可能とさせるD1コード領域として5'末端から50ヌクレオチド内の範囲にあることを明らかにした。光化学系IIのサブユニットをコードするpsbAとpsbNの5'UTR内のシス配列に作用するトランス因子をゲルレターデーション法とUVクロスリンク法で調べたところ、psbAとpsbNともそれぞれ2種の因子が存在することを示した。NADHデヒドロゲナーゼのCとKサブユニットをコードするndhCとndhKはオーバーラップしており、両サブユニットは一本のmRNAから翻訳される。実験開始後に、このmRNAが適合性仮説の検証のよいモデルになると思いつき、このmRNAの翻訳を調べた。後方のndhK mRNAのAUGが存在しているのでin vitro系で調べたところ第3番目のAUGが真の翻訳開始コドンであることを示した。次いでこの翻訳には前方のndhC mRNAの翻訳停止コドンが必要であることを発見した。葉緑体mRNAの翻訳開始に、5'非翻訳領域(5'UTR)と共にタンパク質コード領域も関与するという「5'UTRとコード領域の適合性」の仮説を検証するため、我々の高活性タバコ葉緑体in vitro翻訳系を用いて実験した。1.psbA mRNAを用いて適合性に関与する配列の探索(中邨、湯川)psbA mRNAのD1コード領域に葉緑体では翻訳できない外来遺伝子TATを結合して、Dlコード領域を3'末から欠失させ、TATを翻訳可能とさせるDlコード領域としてN末端から30コドンが最適であることを明らかにした。2.psbA mRNAやpsbN mRNAなどの翻訳のトランス因子の同定(黒田)光化学系IIのサブユニットをコードするpsbAとpsbNおよびリボソームタンパク質をコードするrps2の5'UTR内のシス配列に作用するトランス因子をタバコ葉緑体よりRNAカラムで精製した。得られたタンパク質群のアミノ酸配列分析から、rps2mRNAのトランス因子はリボソームタンパク質S1であることを明らかにした。他の解析は完了していない。NADHデヒドロゲナーゼのCとKサブユニットをコードするndhCとndhKは重複しており、CとKは一本のmRNAから翻訳される。後方のndhKの開始コドンAUGの後ろに前のndhCの終止コドンがあり、このコドンがndhKの翻訳に必須のことを発見した。これは、上流のndhCを翻訳したリボソームが終止コドンから戻ってndhKも翻訳することを意味する。次に、このndhCK mRNAの5'UTRを欠失させてもndhKがかなり翻訳されることを発見した。このことは、ndhKの翻訳が2種の異なる経路で翻訳されるという全く新しいもので、国際学会と論文で発表した。
円頭精子症候群の新規原因遺伝子の解析とその修飾遺伝子群を探る試み

造血幹細胞発生に必須のRunx1の細胞運命決定への効果を検討するために、Runx1を発生初期の血管内皮細胞に強制発現させたところ、血管網形成が異常となった。この血管網形成異常はこれまでに知られているものと異なっていることから、新しいメカニズムによって血管細胞の運命決定へ影響があったと推察された。現在、造血幹細胞発生が変化していないかを検討中である。一方で、Runx1を造血幹細胞に過剰に発現させた場合には、その個体では外見上異常が見られなかった。現在、造血幹細胞の再建活性能への効果を見ようと準備している。造血幹細胞特異的なRunx1のアイソフォームの特異的Runx1 KIマウスのキメラマウスが得られた。しかし150匹の子供を解析したが生殖系列への伝播がまだ見られてない。一方Runx1の標的遺伝子候補のconditional KOマウスは生殖系列への伝播を確認した。現在順次Creマウスとの交配を行っている。培養T細胞を用いて、100bpのRunx1発現制御領域を同定した。さらに、これまでの一般の予想とは異なり、Runx1が自分自身の発現を負に制御することと、Runxファミリー間での相互抑制機構があることを培養細胞を用いて発見した。内在性のRunx1の発現を再現する発現制御領域検定用のTgマウスは、1系統を樹立したが、培養細胞での解析から決めた発現制御領域では内在性の発現の全ては再現できなかった。現在より広い領域での検討を行うために、組み換え体を作製している。さらに、造血幹細胞細胞の形態変化(細胞骨格の変化)により造血幹細胞発生が制御されている可能性を見いだし、手始めとして、アクチン結合タンパク質のfilamin AによるRunx1の活性制御機構を明らかにして、その成果を論文として公表した。新規のARF-GAP遺伝子(SMAP-2)の組み換え体蛋白質を大腸菌で作製し、6種類のARF1-6のどれに対してARF-GAP活性をもつかを検討した。その結果、SMAP-2はARF6にのみGAP活性をしましたことから、新規のARF6-GAPであることを明らかにした。作製したSMAP-2特異的な抗体を用い、脳、腎臓、精巣で蛋白質が発現していることを明らかにした。細胞内に導入したSMAP-2の分布を様々な細胞内オルガネラマーカーと比較検討をしたところ、ゴルジ体とエンドソームの小胞輸送系にSMAP-2が存在していると思われる知見を得ている。SMAP-2と相互作用する因子を酵母のtwo hybrid法で検索し、精子形勢過程で働いていると思われる幾つかの遺伝子や、被覆小胞形成に重要なクラスリン関連蛋白質が取れて来た。現在その結合の意義を解析している。一方、SMAP-2のKOマウスは、精子の頭部が丸くなる円頭精子症を含み幾つかの異常を精子形成時に示す。脳、腎臓では組織構築の異常は見られず、正常な飼育環境下では機能的にも異常は認められない。電顕観察を含む組織化学的な解析を行い、精子形成時における機能破綻の原因究明に不可欠なその発現部位を、細胞レベル、細胞内分布レベルで明らかにする努力を続けている。円頭精子症の原因遺伝子を修飾するmodifier遺伝子を探索するB6との戻し交配体のSMAP-2ホモ欠損体の作製と、129への戻し交配を行っている。現在のB6と129とが混ざった状態では代を重ねると1-2匹と少ないながら生まれて来る個体があるので当初の予想よりも複雑な可能性も考えられる。
日中韓の制度的経済統合とTPP

環太平洋経済連携協定(TPP)は東アジアの制度的経済統合の動きに大きな影響を与えている。本研究においては日中韓のFTA政策の分析を通じてこの実態を明らかにした。研究手法としては、関係各国で実施したヒアリング調査、文献調査、応用一般均衡(CGE)モデル分析などを採った。東アジア及びアジア太平洋地域における工程間分業の進展の実態について、ヒアリング調査結果をもとに論文を発表した。自由貿易協定(FTA)締結に伴う影響への対応である貿易調整政策(TAA)の導入の実態について、ヒアリング調査等に基づいた論文を発表した。FTA締結の経済効果についてはCGEモデルのシミュレーション結果を論文として発表した。第一に日中韓3カ国を含むこれまでの経済統合の動きの整理については、以下のような研究実績を達成した。韓国で実施した二回のヒアリング調査をもとに、韓国におけるFTA等の経済統合の効果について分析を行った。その成果物としては、まず最近の韓国のFTA政策の全体的な内容を、韓国経済に関する単行書の一章としてまとめた。また、特にFTAの締結による国際分業の変化の影響を大きく受ける部品・素材産業について、雑誌論文(査読付)としてまとめた。第二に制度的統合が遅れている日中韓の現状に対する政治経済的アプローチについては、以下のような研究実績を達成した。当初予定していた韓国におけるインターネット・アンケートの実施が、現地の状況により困難となったため、主に有識者、FTA研究者に対するヒアリング調査で情報の収集を行った。さらに、韓国以外については文献調査によって情報収集を行った。それらの内容は、貿易調整支援政策(TAA)導入の意義と課題を中心に雑誌論文としてまとめた。第三にGTAP(Global Trade Analysis Project)データベースによる応用一般均衡分析(CGE)モデルを用いた、日中韓を含むFTAのマクロ経済効果及び産業別効果の分析については、以下のような研究実績を達成した。提供されている中で最新のデータベースである2007年を基準年次とするGTAP Version 8を用い、同バージョンで初めて一国として独立したデータが提供されたモンゴルを含め、北東アジア地域におけるFTAについてシミュレーション分析を行った。その内容は雑誌論文としてまとめた。本年度は日中韓の制度的経済統合に大きな影響を与えると見られているTPPに関連し、その主要な構成メンバーである米国においてヒアリング調査を実施した。調査内容としては、TPPのFTAとしての特徴、米国におけるTPP参加への政治経済的条件に加えて、FTAに関わる貿易自由化の国内的摩擦を緩和する貿易調整支援政策(TAA)に関する調査を行った。また、予定していた中国ヒアリングは実施できなかったが、環日本海経済研究所の主催する国際会議(2015北東アジア経済発展国際会議(NICE)イン新潟)等の機会を活用し、中国のFTA研究者との意見交換を行った。こうした調査の成果は、昨年度に引き続き本年度においても、単行書及び雑誌論文として刊行した。本年度は日中韓の制度的経済統合に大きな影響を与えると見られているTPPについて、非メンバー国となる中国及び韓国に焦点をあて重点的に調査を行った。調査内容としては、韓国についてはFTAの進展による、生産ネットワークの構築を中心に現地調査を実施した。中国については環日本海研究所が主催する国際会議(2016北東アジア経済発展国際会議(NICE)イン新潟)の機会を活用し、FTA研究者に対してヒアリング調査を実施した。こうした調査の成果は、単行書及び雑誌論文として刊行した。本年度はアジア太平洋地域の制度的経済統合の動きの中で、その実現に向けて具体的な進展の見られるTPPについて、その主要構成国である米国においてヒアリング調査を実施した。シンクタンク、政策関係者を対象とした調査により、21世紀型FTAと呼ばれるTPPの実態、TPPを通じた米国と北東アジアを含むアジア太平洋地域の関係の変化について、新たな知見を得ることができた。国際経済学本年度、当初計画になかった米国におけるヒアリング調査を行ったため実施できなかたった中国におけるヒアリング調査を平成27年度に実施する。対象となる分野としては、北東アジアにおける制度的経済統合の推進のために必要となる政策的条件の一つとして、重要性を増している国有企業問題に焦点を当てる。本研究では、FTAAP、TPP、RCEPなどの大規模FTA構想が提示され、アジア太平洋地域の制度的経済統合が進展する中で、日本、中国、韓国を含む北東アジアにおける統合が遅れている実態について、主に政治経済学的視点から分析を行い、経済統合推進の政策的条件を提示することを目的としている。本年度では現状の把握については、韓国においてヒアリング調査を中心にFTA政策の現状と課題を分析した。また政策的条件の提示については、その第一段階として韓国等における先行事例を参考に、日本版貿易調整支援政策(TAA)の導入の意義と課題についてまとめた。したがって、研究計画の第一年度として、いずれも十分な成果を上げたと考える。当初予定していなかった米国ヒアリング調査を前年度からの繰り越し予算で実施し、そのため本来予定していた中国ヒアリング調査が、日程的に実施できなくなったため。

本年度実施を予定していた韓国におけるインターネット・アンケートは、韓国独特のインターネット利用環境の中で、予定していた条件でアンケートを受託する調査会社を見つけることができず、結果的に断念せざるを得なかった。この部分は韓国における専門家に対するヒアリング調査を補強し、情報収集を補った。平成26年度は予定している中国におけるヒアリング調査に加え、TPPの主要メンバーである米国においてFTA政策及び貿易調整支援政策(TAA)に関するヒアリング調査を予定する。27年度において中国ヒアリング調査を実施する予定。本年度実施予定だった韓国におけるインターネット・アンケート調査が、韓国のインターネット利用環境の実態から、実施ができなかったため。26年度において、TPPの主要メンバーである米国でFTA政策及び貿易調整支援政策(TAA)に関するヒアリング調査を予定する。
脳の髄鞘化障害の発症機序に関する研究-ミュータントマウス磁気共鳴による拡散画像法-

動物用MRI機器を用いて拡散強調MRIパルスシーケンスの開発をおこなった。二次元マルチスライス法とともに、高速三次元拡散強調MRIパスルシーケンスを開発し、ラットに対して生体応用した。さらに、マウスの頭部用コイルを開発し、拡散強調MRIを撮像することができた。MBP遺伝子異常を有する環状18番染色体について、大脳半球白質はKB染色、抗MBP抗体免疫組織化学染色で白質が明瞭に染色された。電子顕微鏡所見でも十分に圧縮された髄鞘を有する神経線維が集簇していた。Holzer染色で大脳白質は全体に染色され、glial fibrillary acidic protein陽性アストロサイトが増加しており、グリオーシスが認められた。これまで、18q-症候群でみられる頭部MRIの大脳白質信号異常の成因は、MBP蛋白発現量の減少に伴うdysmyelinationが原因と推測されていたが、病理学的検索からグリオーシスの関与が示唆された。本研究によって、ミュータントマウスに対する拡散強調MRIを用いた疾患の病態生理学的解明にむけた準備がなされた。MRI画像の異常を判断するには、その背景となる病理学的異常を確定していくことが重要であると考えられた。本年度はマウスのMRIの計測機器を作成、並びに、ヒトとマウスのモデルの病理学的評価をおこなった。1)マウスの磁気共鳴画像法の開発マウスの鮮明な拡散画像を得るために、予備実験において用いたコイルを改良し精度の高いMRIプローブの開発を行った。である。磁場の均一性と高い信号強度の得るために直径27mmの円形コイルを2個組み合わせたサドルコイルである。動物用磁気共鳴装置(ブルカー社BIOSPEC BMT24/40 2.4Tesla)を用いwild typeのマウスに対して施行した。拡散強調画像法として既に独立行政法人産業技術総合研究所でラットに対して用いられているパルスシーケンスをマウスMRIに応用した。実用的な画像が得られ、今後、パルスシーケンスの調整を行っていく予定である。さらに、髄鞘の質的解析をするために、みかけの拡散係数(apparent diffusion coefficient : ADC)を測定するためのパルスシーケンスを開発する。本年度はマウスのMRIの計測機器を作成調整し、shiverer mouseに対して応用し、ヒトとマウスのモデルに関して超微細構造を含めた病理学的評価をおこなった。1)マウスの磁気共鳴画像法の開発本年度はマウスのMRIの計測機器を調整し、拡散画像法の精度を高めた。また、shiverer mouseと18番染色体長腕欠失(18q-)症候群対して、病理学的検索を加え、画像異常の原因についてさらに追及した。1)マウスの磁気共鳴画像法の開発マウスの鮮明な拡散画像を得るために、磁場の均一性と高い信号強度が得られる、直径27mmの円形コイルを2個組み合わせたサドルコイルの開発をおこなった。動物用磁気共鳴装置(ブルカー社BIOSPECBMT24/40 2.4Tesla)を用い、拡散画像法として既に独立行政法人産業技術総合研究所でラットに対して用いられたパルスシーケンスを調整し、マウスMRIに応用した。本年度はさらに拡散画像法についてラットを用いて精度を上げトラクトグラフィ作成をおこなった。shiverer mouseのうちnull mutant(mbp-/-), heterozygous mutant(mbp+/-), wild typeについて、血液を採取しMBP遺伝子をPCR法で検出し遺伝形質を評価した。さらに、生後14,21,35,42日のマウスの脳の病理学的評価を行った。昨年度におこなった一般病理学的検索、免疫組織化学的検索、電子顕微鏡を用いた超微細構造のほかにさらに、Holzer染色およびGFAP抗体による免疫染色をおこなった。グリオーシス並びにGFAP陽性細胞の白質内の増生は認められなかった。3)18番染色体長腕欠失(18q-)症候群の病理学的検索18番染色体長腕欠失している環状18番染色体(46XY、r(18)(p11.2、q21.33))の剖検脳について分析した。昨年度の電子顕微鏡を用いた検討では超微細構造では周期線の形成障害はみられなかった。

さらに、本年度はHolzer染色およびGFAP抗体による免疫染色を追加したところ、グリオーシス並びにGFAP陽性細胞の白質内の増生がみとめられた。以上から、18q-症候群にみられる頭部MRIでの大脳半球の信号異常の原因はは、これまで一般的に想定されているミエリン形成障害ではなく、グリオーシスを反映している可能性が本研究で始めて明らかになった。
癌関連抗原Melkの免疫学的検討

Melkの遺伝子導入癌細胞株を作製した。現在それを通常の培養条件の他、無血清、高温、紫外線照射などのストレス条件下でも培養し、細胞増殖やアポトーシスについて検討中である。また頭頚部扁平上皮癌の病理標本を使用してMelkの免疫染色を行い、舌癌や喉頭癌などで発現していることを確認し、予後などとの関連について解析中。研究の目的頭頚部癌はその90%近くが扁平上皮癌であり放射線療法、化学療法も比較的効果的であるが、進行癌においてはその治療成績もあまり良くなく、また頭頚部という部位は術後の機能上、審美上の問題も重要である。そのような現状で新たな治療法として注目されている免疫療法を取り上げ、まずその第一歩としてSEREX法という新しい方法を用いて、頭頚部扁平上皮癌関連抗原であるMelk(Maternal embryonic leucine zipper kinase)を同定した。Melkの頭頚部癌における発現様式や予後などとの関連について免疫組織学的に検討し、癌細胞における機能についてもあきらかにしたい。本年度(平成20年3月31日)の研究実施Melkの遺伝子導入癌細胞株を作製中。遺伝子導入株については再現性を確実にするため、薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドベクターにMelk遺伝子を組み込んだものを作製した。現在それを通常の培養条件の他、無血清、高温、紫外線照射などのストレス条件下でも培養し、細胞増殖やアポトーシスについて検討している。頭頚部扁平上皮癌の病理標本を使用してMelkの免疫染色を行い、発現様式などを検討中。舌癌や喉頭癌などで発現していることを確認し、予後などとの関連について解析中。本年度(平成21年3月31日)の研究実施Melkの遺伝子導入癌細胞株を作製した。
溶融急冷法による高温超伝導線材の作製と結晶配向の制御

本研究は,溶融急冷法(ガラスセラミックス法)を用いて緻密でかつ結晶が配向しているBi-Pb-Sr-Ca-Cu-O系(Bi系)の条伝導ガラスセラミックファイバ-を開発することを目的とする。得られた研究成果をまとめると次のようになる。1.Bi_<2-X>Pb_XSr_2CaCu_2O_y系のガラス化範囲およびファイバ-可能領域を明らかにした。x=0.5までファイバ-を引くことが可能であった。特に,x=0.4のガラスファイバ-は通常の1段熱処理によって容易に臨界温度Tc=86Kの超伝導ファイバ-になった。Pb無添加の場合に比べて,Pbを添加することによって超伝導結晶の粒成長が促進され,しかも粒界の弱結合が大いに改善されることがわかった。2.Bi系のガラス形成能はCuの価数に大いに依存し,特に1価の割合が多い方がよりガラス化することを見い出した。還元状態で溶融することによって,これまでガラスファイバ-を作製することが不可能であった(Bi,Pb)_2Sr_2Ca_2Cu_3O_y組成のファイバ-化に初めて成功した。ただし,熱処理中にPbが蒸発するため高温相の生成は非常に少ない。3.ガラスからの超伝導結晶の生成機構や酸素雰囲気での熱処理による超伝導結晶の配向状態などを明らかにした。特に,780°C付近で試料内部に液相が生成し,この液相が引金となって超伝導結晶の生成が顕著になることを見い出した。結晶化機構に基づく2段熱処理法(1段目はCuの2価への酸化,2段目は超伝導結晶の生成)を提案し,実際に非常に緻密でかつ均一な超伝導結晶の集合組織を有するガラスセラミックスの作製に成功した。4.低温相および高温相の超伝導結晶の生成はいずれも液相からの生成が主要な機構で,いわゆるintergrowthではないため,熱処理だけで結晶配向を出現させることは非常に難しいということがわかった。なお,冷間プレスの併用により結晶が配向した超伝導ガラスセラミックスの作製に成功した。
新規転写因子Headgearによる形態形成機構の解明とレチノイン酸による転写制御

ゼブラフィッシュ胚より、新規転写因子をクローニングし、Headgearと命名した。Headgearのアミノ酸配列にはzinc-finger domainとhomeodomainの二つの保存された領域があることから、δEF1/ZFHファミリーに属する転写因子であることが明らかになった。Whole mount in situ hybridizationにより発生過程でのHeadgearの発現を検討したところ、神経外胚葉領域全体に発現することがわかった。また、背側化因子・腹側化因子により受精卵を処理すると、Headgearの発現はそれぞれ拡大・縮小し、これらの因子の下流で作用する因子であると考えられた。発生過程における発現様式から、Headgearは神経外胚葉の発生に重要な役割を持っていることが予想され、RNAを合成し、受精卵にマイクロインジェクションして過剰発現させた後、神経外胚葉特異的遺伝子の発現を観察することにより神経外胚葉の変化を検討した。その結果、神経外胚葉が拡大することが解った。さらに、内在性Headgearの機能を阻害するドミナントネガティブHeadgearを受精卵に発現させると、野生型の過剰発現のときとは逆に神経外胚葉の発生が阻害された。これらの結果から、Headgearはゼブラフィッシュの神経外胚葉の発生に必須の役割をもつ転写因子であることが明らかになった。尚、この遺伝子の名前は雑誌投稿の際にHeadgearからKheperと改名した。Headgearの合成RNAを受精卵にマイクロインジェクションとして過剰発現させると、背側化した胚と似た形態を示すことがわかっていた。組織特異的遺伝子マーカーと用いて解析したところ、神経組織の原器である神経外胚葉が拡大していたが、背側中胚葉の組織は拡大していなかった。これまでに知られている背側化因子は外胚葉と中胚葉をともに背側化する。ところが、Headgearは外胚葉だけを背側化し、神経外胚葉を拡大させる。またこの作用は、既知の腹側化因子BMP4の過剰発現によっても抑制されないことから、BMPとそのアンタゴニストである背側化因子を介するものではないことが明らかになった。HeadgearはN末端とC末端にzinc-fingerモチーフと中央にホメオドメインをもっている。これらのうち、どのドメインがHeadgearの活性に必要なものであるのかを知るために各種の変異体を作って調べた。この結果、ホメオドメインが必須で、このドメインを欠失させた変異体では、野生型と反対の活性があり、dominant-negative変異体として作用することがわかった。このdominant-negative変異体を胚に過剰発現させると、頭部の構造が失われ、神経外胚葉も縮小していた。この結果、Headgearは神経外胚葉の正常な発生に必須の遺伝子であることがわかった。さらに免疫沈降の実験から、Headgearはcorepressorとして知られる、CtBPと結合することも明らかになった。これらのことから、Headgearは転写抑制因子として働き、神経外胚葉の発生に必須の遺伝子であることが明らかになった。
昆虫の社会行動を統御するための脳分化の解析

本年度は,昨年度同様,社会性昆虫であるオオシロアリを材料にして,ワーカーとソルジャーの分化に伴う脳機能の分化の解析を行った.行動観察により,カーストによる行動走性の相違を検証し,分子基盤や神経生理の解析を後に行う際の機能マッセイ系が構築された.また,この2つのカースト間において,脳の解剖学的相違,組織切片作成による詳細な細胞学的解析により食道下神経節に存在する大顎筋運動ニューロンが兵隊分化に伴い巨大化することを明らかにした.さらに,行動多型を維持する分子基盤の解明を具体的に推し進めるため,2者間の脳における遺伝子発現の相違をディファレンシャルディスプレイ法などにより検出した.その結果発現量に差のある有力な候補遺伝子がいくつか同定された.現在,遺伝子候補に関して,リアルタイムqPCRなどにより発現動態や発現部位の特定を試みるに至った.また,分担者の尾崎は,クロオオアリを用いて,巣仲間認識に関わる体表炭化水素組成の分析およびこの組成を認識する感覚毛における生理学的解析を進め,脳内の触角葉の糸球体において,感覚毛からの情報が集積されることが明らかとなった.また,分担者の竹内はミツバチのキノコ体特異的に発現する遺伝子の解析を精力的に進めた.その結果キノコ体ではエクダイソンシグナルに関わる遺伝子の発現が分業などにより特異的に変化することが突き止やられた.また行動アッセイ法を確立した.これらの知見を集積し,昆虫の高度な社会性を構築する脳内の分子基盤について詳しい考察がされ,成果を国際誌に投稿した.本研究では,昨年度同様,社会性昆虫であるオオシロアリHodotermopsis sjostedtiを材料にして,ワーカーとソルジャーの分化に伴う脳機能の分化の解析を行う.18年度は行動観察により,カーストによる行動走性の相違を検証し,分子基盤や神経生理の解析を後に行う際の機能アッセイ系の構築を試みた.また,この2つのカースト間において,脳の解剖学的相違,組織切片作成による詳細な細胞学的解析により食道下神経節に存在する大顎筋運動ニューロンが兵隊分化に伴い巨大化することを明らかにした.さらに,行動多型を維持する分子基盤の解明を具体的に推し進めるため,2者間の脳における遺伝子発現の相違をディファレンシャルディスプレイ法などにより検出することを始めた.今後は,発現に差のある遺伝子候補に関しては,in situハイブリダイゼーションにより特異的遺伝子発現の生じる脳内の部位を特定する.また,分担者の尾崎は,クロオオアリCamponotus japonicusを用いて,巣仲間認識に関わる体表炭化水素組成の分析およびこの組成を認識する感覚毛における生理学的解析を進めた.その結果,脳内の触角葉の糸球体において,感覚毛からの情報は集積されることが明らかとなった.また,分担者の竹内はミツバチApis merifellaのキノコ体特異的に発現する遺伝子の解析を精力的に進めた.その結果キノコ体ではエクダイソンシグナルに関わる遺伝子の発現が分業などにより特異的に変化することが突き止められた.次年度以降は,これらの知見をもとに昆虫の高度な社会性を構築する脳内の分子基盤の解明を目指す.本年度は,昨年度同様,社会性昆虫であるオオシロアリを材料にして,ワーカーとソルジャーの分化に伴う脳機能の分化の解析を行った.行動観察により,カーストによる行動走性の相違を検証し,分子基盤や神経生理の解析を後に行う際の機能マッセイ系が構築された.また,この2つのカースト間において,脳の解剖学的相違,組織切片作成による詳細な細胞学的解析により食道下神経節に存在する大顎筋運動ニューロンが兵隊分化に伴い巨大化することを明らかにした.さらに,行動多型を維持する分子基盤の解明を具体的に推し進めるため,2者間の脳における遺伝子発現の相違をディファレンシャルディスプレイ法などにより検出した.その結果発現量に差のある有力な候補遺伝子がいくつか同定された.現在,遺伝子候補に関して,リアルタイムqPCRなどにより発現動態や発現部位の特定を試みるに至った.また,分担者の尾崎は,クロオオアリを用いて,巣仲間認識に関わる体表炭化水素組成の分析およびこの組成を認識する感覚毛における生理学的解析を進め,脳内の触角葉の糸球体において,感覚毛からの情報が集積されることが明らかとなった.また,分担者の竹内はミツバチのキノコ体特異的に発現する遺伝子の解析を精力的に進めた.その結果キノコ体ではエクダイソンシグナルに関わる遺伝子の発現が分業などにより特異的に変化することが突き止やられた.また行動アッセイ法を確立した.これらの知見を集積し,昆虫の高度な社会性を構築する脳内の分子基盤について詳しい考察がされ,成果を国際誌に投稿した.
1,3-ジオキシン体の環開裂反応を用いるケテン及びチオケテン体の合成

ケテン誘導体は特異な反応性を示すため,合成中間体として注目されるが,異常に高い反応性のため合成法は限られていた.著者は1,3-ジオキシン-4-オン体の熱的[4+2]環開裂により,ジエン成分としてアシルケテン体を定量的に生成することを既に見いだしている.本法は中性条件下で容易にケテン体を生成できることを特徴とする.本研究はこの方法の展開による新規ケテン体の合成法の開発とそれらを用いる効率的有機合成法の開発を主目的とした.本研究の成果は以下の3項目にまとめられる.1アシルチオケテン体を利用する含硫化合物合成法1,3-ジオキシン-4-チオン体の熱的環開裂反応により生成するアシルチオケテン体を求核試薬でトラップし,合成困難な含硫β-ケトエステル及び複素環化合物の新合成方法を確立した.2アルコキシカルボニルケテン体の簡便な生成と非対称マロン酸体合成への利用入手容易なMeldrum酸体のカルボニル酸素をアルキル化し,6-アルコキシ-1,3-ジオキシン-4-オン体を合成できた.本化合物は室温下で開環し,アルコキシカルボニルケテン体を生成することを見いだした.このケテン体と各種求核剤の反応により非対称マロン酸体を効率良く合成できた.3カルボキシケテン体の簡便な生成法2の知見等に基ずき,Meldrum酸体がその互変異性体である6-ヒドロキシジオキシノン体を経て開環し,合成中間体として有用なカルボキシケテン体を生成することを見い出した.ケテン誘導体は特異な反応性を示すため,合成中間体として注目されるが,異常に高い反応性のため合成法は限られていた.著者は1,3-ジオキシン-4-オン体の熱的[4+2]環開裂により,ジエン成分としてアシルケテン体を定量的に生成することを既に見いだしている.本法は中性条件下で容易にケテン体を生成できることを特徴とする.本研究はこの方法の展開による新規ケテン体の合成法の開発とそれらを用いる効率的有機合成法の開発を主目的とした.本研究の成果は以下の3項目にまとめられる.1アシルチオケテン体を利用する含硫化合物合成法1,3-ジオキシン-4-チオン体の熱的環開裂反応により生成するアシルチオケテン体を求核試薬でトラップし,合成困難な含硫β-ケトエステル及び複素環化合物の新合成方法を確立した.2アルコキシカルボニルケテン体の簡便な生成と非対称マロン酸体合成への利用入手容易なMeldrum酸体のカルボニル酸素をアルキル化し,6-アルコキシ-1,3-ジオキシン-4-オン体を合成できた.本化合物は室温下で開環し,アルコキシカルボニルケテン体を生成することを見いだした.このケテン体と各種求核剤の反応により非対称マロン酸体を効率良く合成できた.3カルボキシケテン体の簡便な生成法2の知見等に基ずき,Meldrum酸体がその互変異性体である6-ヒドロキシジオキシノン体を経て開環し,合成中間体として有用なカルボキシケテン体を生成することを見い出した.
舗装構造における粒状材料の力学的解析および評価に関する研究

本研究の目的は,現在の舗装の設計においてその力学特性が低く評価されている粒状路盤の性状について,力学的解析に基づいた合理的な評価法ならびに力学モデルの開発にあった.この目的のために,研究代表者ならびに研究分担者を以下のようなグループに分け,それぞれ研究を実施した.それぞれのグループにおける研究成果の概要を述べるA.粒状路盤の構造モデルの開発(西澤):3次元有限要素法に基づいた舗装構造解析プログラムパッケージPave3Dを開発した.グループBの研究成果である拡張SMP基準修正Cam-clayモデルを組み込み,コンクリート舗装の粒状路盤の塑性変形を予測するモデルを開発した.B.粒状材料の力学特性のモデル化(小梁川,竹内):コンクリート舗装における粒状路盤の塑性変形を実験的に確認した.そこで粒状路盤材料の3軸圧縮試験結果に基づいて,拡張SMP基準修正Cam-clayモデルの適用を検討し,そのために必要なパラメータの同定を試みた.C.粒状材料のミクロな挙動(村井):2次元光弾性実験を用い,粒状材料の圧縮試験およびせん断試験における応力伝達経路について可視化を試みた.その結果より粒状材料の粒度による応力経路の差について考察した.D.流氷路盤の施行面の検討(八谷):再生アスファルト材料を用いた新しい路盤構造を開発した.その際に配合,締め固め方法などについて検討した.粒状路盤層を施行するにあたって,重要な含水比,締め固め度,層厚の影響について検討した.その結果,締め固めが十分であれば,含水比の影響は少ないことが判明した.E.粒状路盤の舗装における評価法(上浦):小型FWDやPS検層法などによって,粒状路盤の力学性状を評価する方法について検討した.さらに,両者による評価には大きな差がないことを明らかにした.本研究の目的は,現在の舗装の設計においてその力学特性が低く評価されている粒状路盤の性状について,力学的解析に基づいた合理的な評価法ならびに力学モデルの開発にあった.この目的のために,研究代表者ならびに研究分担者を以下のようなグループに分け,それぞれ研究を実施した.それぞれのグループにおける研究成果の概要を述べるA.粒状路盤の構造モデルの開発(西澤):3次元有限要素法に基づいた舗装構造解析プログラムパッケージPave3Dを開発した.グループBの研究成果である拡張SMP基準修正Cam-clayモデルを組み込み,コンクリート舗装の粒状路盤の塑性変形を予測するモデルを開発した.B.粒状材料の力学特性のモデル化(小梁川,竹内):コンクリート舗装における粒状路盤の塑性変形を実験的に確認した.そこで粒状路盤材料の3軸圧縮試験結果に基づいて,拡張SMP基準修正Cam-clayモデルの適用を検討し,そのために必要なパラメータの同定を試みた.C.粒状材料のミクロな挙動(村井):2次元光弾性実験を用い,粒状材料の圧縮試験およびせん断試験における応力伝達経路について可視化を試みた.その結果より粒状材料の粒度による応力経路の差について考察した.D.流氷路盤の施行面の検討(八谷):再生アスファルト材料を用いた新しい路盤構造を開発した.その際に配合,締め固め方法などについて検討した.粒状路盤層を施行するにあたって,重要な含水比,締め固め度,層厚の影響について検討した.その結果,締め固めが十分であれば,含水比の影響は少ないことが判明した.E.粒状路盤の舗装における評価法(上浦):小型FWDやPS検層法などによって,粒状路盤の力学性状を評価する方法について検討した.さらに,両者による評価には大きな差がないことを明らかにした.本研究は,舗装構造における粒径数十mmからなる粒状材料層の合理的な設計法を確立することである.そのために粒状材料の力学的な挙動をモデル化し,構造モデルに組み入れなければならない.この目的のために本年度実施した研究作業は以下のようである.1.路盤を含めた舗装構造を合理的に解析するためには,各層の3次元的な応力状態を正確に知ることが第一である.そのためのツールとして3次元有限要素法に基づいた舗装構造パッケージを開発した.舗装各層は3次元ソリッド要素に分割し,各層の境界面の接着状態をモデル化するために,汎用境界面要素を開発した.そこではすべり,はがれを含めた多様な状態を考慮することができる.また,コンクリート舗装の横目地を考慮するために,新たにダウエルバー要素を組み入れることとした.2.光弾性実験によって,層構造における粒子同士のミクロな応力状態を視覚的に検討した.本実験では粒子をアクリル樹脂によってモデル化し,粒度を変化させてパッキングした.そこに荷重を作用させて,粒子内の応力,荷重の伝達分布を観測した.その結果,樹枝状の応力伝達経路を確認した.その様子は粒度によって大きく異なるため,現在粒度を変えて,樹枝状の応力伝達経路を定量化することを試みている.3.研究分担者の上浦が英国において開催された道路建設における粒状材料に関する国際会議に出席し,情報収集を行った.それらを含め,海外の研究動向についてのレビューを行った.本年度実施した研究内容は以下のとおりである.(1)粘性土の弾塑性解析に使われている修正Cam-Clayモデルを,粒状路盤材料に適用できるように拡張SMP基準を用いて改良を行った.その結果3軸試験結果と良い対応を見せた,ただ,体積ひずみの測定データがないため,これによる検証ができなかった.(2)路床の弾性係数

Mrに及ぼす主応力和の影響について,室内モデル実験とFWDによる現場での実測結果を用いて検討した.その結果,その影響は室内試験のものと現場でのものとはよく対応した.このことから,現場においても確かにMrの応力依存'性があることが確認できた.(3)東京国際空港での廃アスファルトコンクリートを4種類の路盤材料(粒状体,セメント安定処理材,セメント乳剤安定処理材,加熱混合アスファルト安定処理材)として使用する場合の可能性について評価した.室内試験の結果から,用いた廃アスファルトコンクリートは上層路盤ならびに下層路盤として使用可能であること,再生路盤材料は温度ならびに水分の影響を受けることなどが明らかとなった.(4)盛土工事における締固め方法の違いが乾燥密度とCBRに及ぼす影響について調べた.その結果,振動締固めによる方法の場合,振動周波数の影響が顕著であることがわかった.締め固め方法の違いとしては,突固め法でも振動締固め法でも乾燥密度の増加に伴いCBR値がほぼ一様に増加しており,両者に差はなかった.(5)アスファルト材料,路盤材料の動的非線形挙動を解析できるように,昨年開発した3次元FEMを拡張した.アスファルト材料の粘弾性挙動を扱えるような定式化を行い,プログラムに組み込んだ.本研究の目的は,現在の舗装の設計においてその力学特性が低く評価されている粒状路盤の性状について,力学的解析に基づいた合理的な評価法ならびに力学モデルの開発にあった.この目的のために,研究代表者ならびに研究分担者を以下のようなグループに分け,それぞれ研究を実施した.それぞれのグループにおける研究成果の概要を述べるA.粒状路盤の構造モデルの開発(西澤):3次元有限要素法に基づいた舗装構造解析プログラムパッケージPave3Dを開発した.グループBの研究成果である拡張SMP基準修正Cam-clayモデルを組み込み,コンクリート舗装の粒状路盤の塑性変形を予測するモデルを開発した.B.粒状材料の力学特性のモデル化(小梁川,竹内,野田):コンクリート舗装における粒状路盤の塑性変形を実験的に確認した.そこで粒状路盤材料の3軸圧縮試験結果に基づいて,拡張SMP基準修正Cam-clayモデルの適用を検討し,そのために必要なパラメータの同定を試みた.C.粒状材料のミクロな挙動(村井):2次元光弾性実験を用い,粒状材料の圧縮試験およびせん断試験における応力伝達経路について可視化を試みた.その結果より粒状材料の粒度による応力経路の差について考察した.D.粒状路盤の施工面の検討(八谷,高橋):再生アスファルト材料を用いた新しい路盤構造を開発した.その際に配合,締め固め方法などについて検討した.粒状路盤層を施工するにあたって,重要な含水比,締め固め度,層厚の影響について検討した.その結果,締め固めが十分であれば,含水比の影響は少ないことが判明した.E.粒状路盤の舗装における評価法(上浦):小型FWDやPS検層法などによって,粒状路盤の力学性状を評価する方法について検討した.さらに,両者による評価には大きな差がないことを明らかにした.
鉄化合物処理による青枯病に対するトマトの抵抗性誘導に関する研究

トマトの青枯病に対し、発病抑制効果が示唆された3種類の鉄化合物、すなわち塩化鉄(FeCl_2・4H_2O)、硫酸鉄アンモニウム(FeNH_4(SO_4)_4・12H_2O)および硫酸第一鉄アンモニウム(FeSO_4(NH_4)_2SO_4・6H_2O)の水溶液をトマト品種「桃太郎」の幼苗の根にあらかじめ48時間浸漬処理した後、本病細菌を漬根接種して、接種トマトの茎内での接種細菌の増殖を検討した。その結果、鉄処理トマトでも対照の水処理トマトと同様に茎内接種細菌が検出され、明らかに侵入するが、その後の増殖については処理トマトでは明らかに遅れ、このことが本病の発病抑制の理由と考えられた。また、根に鉄処理をしたトマトの地上部に騎馬穿刺接種を行った結果、本病の発病が遅延したことから鉄処理は全身的に抵抗性を誘導すると考え、誘導抵抗性に関与するとされている酸素パーオキシダーゼ(PO)、キチナーゼ、リポキシゲナーゼ(LOX)の活性変化を検討した。POは前処理終了時から酸素活性が対照区に比較して高くなり、処理鉄化合物の種類により活性の変動パターンが多少異なったが、総合的には処理23日目に活性のピークが見られるが、4日目には一時的に低下する傾向が認められた。その後は再び活性が増加し、5日目には対照区の数倍の活性増加が観察された。一方、キチナーゼは、3化合物処理直後から活性の連続的な増高が観察され、POに見られるような一時的な活性の低下は認められなかった。また、LOX活性についてはPOの活性変動と良く似たパターンが得られたが、POの変化よりは活性の増加の変化が緩やかで、一時的な活性低下の時間も遅れる傾向が認められた。これらPOとLOXの鉄化合物処理後の経時的な酸素活性の変動は、鉄化合物処理トマトに本病菌を接種した場合に茎内で菌密度が一時的に検出限界以下に低下し、その後再増殖する現象と関連がある可能性が示唆された。なお、トマトの特性かどうかは明らかではないが、すべての化合物処理区で同一処理トマトでも個体間で酸素活性の測定値にかなりのばらつきが見られたことから、後者2種類の酸素活性変化については現在も検討中である。本研究は、鉄化合物水溶液前処理によりトマトに青枯病に対して、抵抗性の誘導が起こる可能性を探る目的で、平成8年度は、市販の3種の鉄化合物水溶液の浸漬処理による本病発病抑制作用の再確認と、鉄処理が接種後のトマト茎内への細菌の感染、増殖に及ぼす影響を経日的に検討すること、加えて鉄処理トマト茎内での抵抗性関連酵素の発現様相について検討した。トマト品種“桃太郎"を園芸用培土(クレエ-ス)をつめたポットで56本葉期まで育苗し、根を水洗いして用いた。鉄化合物は塩化鉄、硫酸鉄アンモニュウム、硫酸第一アンモニュウムであり、いすれも脱塩水で250ppmに溶解して48時間浸根処理した。処理終了後、あらかじめ培養しておいたスレトプトマイシン耐性青枯細菌の懸濁液に浸根接種し、ただちにポットに移植した。

接種後、トマトは温室で育て、毎日を観察して発病を調べた。同時に茎内部の本病細菌の感染、増殖を検討するために、接種後経日ごとに、トマト苗の子葉の付着部から丈夫の茎組織を1gサンプリングして、表面殺菌後、滅菌水10mlと磨砕して、その上澄液100mlをとり、ストレプトマイシン添加TCA培地に塗沫して30°Cで培養した。この結果、いずれの鉄化合物を処理したトマトでも発病開始日が水処理の対照区に比べて35日遅れ、特に硫酸鉄アンモニュウム処理トマトで明確であった。また、トマト茎内での細菌の動向は、水処理区と、塩化鉄処理を除いた2化合物処理区トマトでは接種2日目に茎内に接種菌が検出されたが、34日目に一時的に検出できなくなった。その後、本細菌が再び検出されるようになったが、その検出量は水処理トマトに比べて鉄処理区で低下する傾向が見られた。抵抗性関連酵素活性についてはPOに関してのみ検討したが、塩化鉄以外の鉄処理トマトは対照区のそれに比較して高くなる傾向が見られた。トマトの病害抵抗性を誘導することが示唆された3種類の鉄化合物、すなわち塩化鉄(FeCl_2・4H_2O)、硫酸鉄アンモニウム(FeNH_4(SO_4)_4・12H_2O)および硫酸第一鉄アンモニウム(FeSO_4(NH_4)_2SO_4・6H_2O)の水溶液をトマト品種「桃太郎」の幼苗の根にあらかじめ48時間浸漬処理した後、トマト茎内における植物の誘導抵抗性に関与すると考えられている酵素の活性変動を経時的に検討した。調べた酵素はパーオキシダーゼ(PO)、キチナーゼ、リポキシゲナーゼ(LOX)の3種類である。POについては前処理終了から酵素活性が水処理対照区に比較して高くなり、処理した鉄化合物の種類により酵素活性の変動パターンが多少異なったが、総合的に見ると処理23日目に活性のピークが見られるものの4日目には一時的に低下する傾向が認められた。その後は再び活性が増加し、5日目には対照区の倍数の活性増加が観察された。一方、キチナーゼは、PO活性と同様に3化合物処理直後から活性の増高が観察されたが、POのような一時的な活性低下は認められず、時間の経過に伴った活性の増加が続いた。また、LOX活性についてはPOの活性変動と良く似たパターンが得られたが、PO変化よりは活性の増加の変化が穏やかで、一時的な活性低下の時期が時間的に遅れる傾向が認められた。これらPOとLOXの鉄化合物処理後の経時的な酵素活性の変動は、鉄化合物処理トマトに本病菌を接種した場合、茎内での菌密度が接種後45日目に一時的に検出限界以下に一時的に低下し、その後再増殖する現象と関連がある可能性が示唆された。なお、トマトの植物的な特徴かどうかは明らかではないが、すべての化合物処理区で同一処理トマトでも固体間で測定値にかなりのばらつきが見られたことから、後者2種類の酵素活性変化については現在も検討中である。この理由から本研究の結果の公表には多少時間が必要である。
慢性好中球性気道炎症のエンドタイプ解明に向けた基盤研究

本研究は,慢性の好中球性気道炎症を呈し,ときに非好酸球性喘息やCOPDとの鑑別が困難な臨床症状を呈する遺伝性疾患(1.嚢胞性線維症、2.α1-アンチトリプシン(AAT)欠乏症、3.原発性線毛機能不全症)に着目することで,喘息やCOPDの分子病態の多様性を理解し,特に好中球性炎症をドライブする新たなエンドタイプの発見を試みる.本研究の結果はエンドタイプに関連したバイオマーカーや新規治療ターゲットの探索など、病名ではなくエンドタイプに基づいたPrecision Medicineを可能とするための基盤データとなる.本研究は,慢性の好中球性気道炎症を呈し,ときに非好酸球性喘息やCOPDとの鑑別が困難な臨床症状を呈する遺伝性疾患(1.嚢胞性線維症、2.α1-アンチトリプシン(AAT)欠乏症、3.原発性線毛機能不全症)に着目することで,喘息やCOPDの分子病態の多様性を理解し,特に好中球性炎症をドライブする新たなエンドタイプの発見を試みる.本研究の結果はエンドタイプに関連したバイオマーカーや新規治療ターゲットの探索など、病名ではなくエンドタイプに基づいたPrecision Medicineを可能とするための基盤データとなる.
細胞間接着に依存しない始原的な上皮極性形成の機構

上皮細胞の極性の分子機構の解明を目指した。さまざまな極性に関与する遺伝子やアクトミオシン張力発生に関与する遺伝子などのノックダウンにより、従来知られていた因子の重要性は確認され、また上皮極性に沿った細胞間接着装置の位置決めにミオシンモーターの活性が重要であること、細胞外基質の偏りは上皮極性形成には不要であるが、極性を一方向に揃えるためには重要であることを見いだした。本年度の目標の一つはR2/7細胞におけるアピカル、バソラテラル、細胞接着装置マーカーの局在を決定し、R2/7細胞がαカテニンを発現しないために接着装置は作ることができないものの極性を確立していることを示すとともに、使いやすい抗体を選び出すことである。現在のところ、アピカルマーカーとして、PKC zeta, ezrinについてはR2/7の頂部にお椀上に濃縮することがわかった。また、微細構造的ににもアピカル面特有の短い、均一な太さ、長さの微絨毛が生えていることが走査電顕によって確認された。Cdc42,Crumbsについてはアピカルマーカーとも考えられるが、実際にはアピカルとバソラテラルの境界に濃縮していた。バソラテラルマーカーとしてScribbleとNa+/K+ATPaseは頂部よりも下の領域の膜に局在し、R2/7細胞が膜領域に関して明瞭に極性を持っていることを示すことができた。またその境界にはZO-1,afadin,Par3,occludinなど、細胞接着装置を形成する因子が濃縮していることがわかった。Par6,syntaxin3,PTEN,Lg1,KLB1については市販の抗体を用いても正しいと確信できる染色は得られていない。もう一つの目標は極性化に必要であると既に他の系で報告されている遺伝子に関してノックダウンを開始することである。まず、Par複合体(Par6/aPKC/Par3/Cdc42)についてノックダウンを行った。どの遺伝子のノックダウンを行っても結果はほぼ同じで、細胞のアピカル面が小さくなり消失した。R2/7細胞は極性形成に関して感受性が高く、この研究に適した材料であることがわかった。本年度の目標の一つは極性化に必要であると既に他の系で報告されている遺伝子に関してさらにノックダウンを行っていくことである。Basolateral形成に重要と考えられる、Lglのノックダウンではapical面の増大が見られた。そのとき細胞が扁平化するので、細胞内のミオシンの活性がapical面積の調節に重要化と考え、ミオシンIIやそのリン酸化を行うROCKのノックダウンも行ったところ、ミオシンIIが存在しなければ、あるいはミオシンIIのリン酸化が効率よく起こらなければ、apical面積が広がってくることがわかった。また、別の観点から、apicalとbasolateralとのバランスを調節しうる要因として膜輸送による細胞膜の挿入、取込みについても検討をおこなった。16°Cと言う低温の処理を行い、エンドサイトシスは起こるがエキソサイトシスとリサイクリングとを抑制された状態にするとapical面積は小さくなった。これはapical面でのエンドサイトシスとエキソサイトシスがapical面積の調節に重要であるが、エキソサイトシスが阻害されたためにエンドサイトシスが優勢となり、apical面積が小さくなったと解釈される。さらにR2/7では分裂期に入ると明確な極性が見られなくなることがわかった。これらの特徴はR2/7にαカテニンを導入し、正常な上皮シートを形成できるようにした細胞では全く見られず、細胞間接着は上皮極性を乱すようなさまざまな要因に対して、極性の保持を支える役割があるということが明確になった。上皮極性に強く関わる因子について、さらに知るためには網羅的なRNAiをする必要があり、それは予算の点で現段階では不可能である。そのため、上皮極性の性質をさらに追求する実験を行った。1: R2/7細胞を培養プレートに吊るした液滴の中で培養すると、重力に従って細胞が液滴の底である、培養液と空気との界面に集合する。その界面は固い基質ではない。このとき、R2/7細胞は、一つ一つがめいめい勝手な方向に極性を形成していた。上皮極性の形成に細胞外基質が重要であることは知られていたが、この実験から、上皮極性の形成自体には細胞外基質の位置情報は不要であることがわかった。しかし、細胞外基質が培養基質表面にコートされていれば、上皮極性は綺麗に揃うのだから、細胞外基質はそれぞれの細胞が持っている上皮極性の軸を揃える役割を果たすということが明瞭になった。2: R2/7細胞をノコダゾール存在下で培養し、微小管を破壊したところ、上皮極性を示すリングが消失する傾向を示した。このことは、微小管が上皮極性の形成に重要なことを示し、細胞周期の分裂期において上皮極性が消失するのは、1の実験から基質との接着が弱くなるためでなく、微小管のネットワークの様態が分裂期に変化するためと考えやすいと思われた。3: R2/7細胞のアクチン繊維をイメージングするためにLifeAct-

TagRFPを遺伝子導入し、安定発現株を得た。そのライブイメージングにより、上皮細胞極性を示すリングは常にアクチン繊維が細胞周辺から細胞中央へ動いていき、環状に集まる結果であることがわかった。リングは動的なものである。新たな知見が次々にえられているため。ただし、本研究課題で用いている培養細胞株が各種蛍光蛋白質の安定した発現には不適当であることがわかってきたので、ライブイメージングから多くのデータを取ることに関しては計画を縮小し、替わりに12に記すような細胞外基質からのシグナルについての解析を加えていきたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題を遂行しながら、上皮極性をもっとも最初に決定するはずの、細胞外基質からのシグナルというものが、実はあまりはっきりしていないことがわかった。現在のところ、細胞外基質からシグナルが細胞の中に入ってしまってからのことを研究しているが、この初期段階のシグナルについて解析を行わないと全体の理解を深めることができないと考えるに至った。今後は細胞外基質からのシグナルについても解析を行っていきたい。