hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ワーク・ライフ・バランス支援制度による従業員のアイデンティティ形成に関する研究

本研究は,ワーク・ライフ・バランス支援制度が従業員の仕事と生活におけるアイデンティティ形成に及ぼす影響について明らかにすることを目的としている。具体的には,1ワーク・ライフ・バランス支援制度と従業員のアイデンティティ形成の関係についての理論的研究と,2ワーク・ライフ・バランス支援制度の導入事例を対象とした経験的研究を同時並行で実施するものである。以上の目的に沿って,研究初年度にあたる平成30年度は以下の通りに研究を実施した。まず,1理論的研究としては,ワーク・ライフ・バランス支援制度に関する先行研究について整理し,ワーク・ライフ・バランスにおける仕事と生活の境界決定について考察した。その内容については,2019年2月に開催された日本労務学会中部部会にて報告した。次に,2経験的研究としては,トヨタ自動車株式会社における働き方変革の取り組み,および北九州市役所におけるイクボス実践の取り組みの2事例について定性的調査を実施した。これらの調査の成果として,前者については2018年12月発行の『中京企業研究』第40号に掲載し,後者については2019年3月発行の『中京経営研究』第28巻に掲載した。平成30年度の調査内容は主にワーク・ライフ・バランス支援制度や人事制度の設計・運営者を対象としたものであったため,平成31年度(令和元年度)以降はそれらの制度を利用した従業員・職員を対象とした調査を実施する予定である。平成30年度の研究を遂行する上での最大の懸念は調査の遅滞であったが,幸いにも調査先から十分な協力を得ることができたため,経験的研究に関しては順調に進展している。そのため,当初の計画では平成30年度内に調査内容を含めた研究成果を公表する予定はなかったものの,十分な調査データが得られたことから2つの研究成果を公表することができた。一方で,平成30年度は当初の計画以上に調査に多くの時間を費やすことになったために,年度内に公表予定であったワーク・ライフ・バランス支援制度の先行研究についてのレビュー論文が完成には至らなかった。理論的研究には若干の遅れが生じているものの,それ以上に経験的研究が計画以上に進展していることから,総合的に見て本研究はおおむね順調に進展していると言える。平成31年度(令和元年度)以降の1理論的研究については,ワーク・ライフ・バランス支援制度と従業員のアイデンティティ形成の関係を捉えるための枠組みの構築を試みる。近年では,海外のトップジャーナルにおいて,仕事と生活それぞれのアイデンティティが相互に影響を及ぼし合うダイナミクスが考察されている。また,ワーク・ライフ・バランス研究においてアイデンティティ概念が着目されるようになっている。こうした研究動向を踏まえ,引き続き関連する文献の収集に努めながら先行研究レビューを進め,理論的枠組みを構築する。2経験的研究については,すでに着手している2つの調査先に加えて新たな調査先を確保することができたため,合計3つの調査を進めながら,その調査結果を分析していく。平成31年度(令和元年度)以降は,特にワーク・ライフ・バランス支援制度を利用した従業員・職員を対象とした調査を行い,そこから得られた調査結果を理論的研究によって構築された枠組みに基づいて分析していく。

また,ワーク・ライフ・バランス研究においてアイデンティティ概念が着目されるようになっている。こうした研究動向を踏まえ,引き続き関連する文献の収集に努めながら先行研究レビューを進め,理論的枠組みを構築する。2経験的研究については,すでに着手している2つの調査先に加えて新たな調査先を確保することができたため,合計3つの調査を進めながら,その調査結果を分析していく。平成31年度(令和元年度)以降は,特にワーク・ライフ・バランス支援制度を利用した従業員・職員を対象とした調査を行い,そこから得られた調査結果を理論的研究によって構築された枠組みに基づいて分析していく。当初の計画では年3回の研究会への参加を予定していたが,平成30年度は2回の開催となったために計上していた研究会への参加旅費が1回分余り,次年度使用額が生じた。未使用分に関しては,平成31年度(令和元年度)の研究会および学会への参加旅費に充てる予定である。
抗癌剤による造血器腫瘍の活性化チロシンキナーゼ変異体分解誘導機構と治療応用

骨髄球系腫瘍の病態に深く関与する活性化型Jak2変異体Jak2-V617Fによる生存維持や細胞増殖誘導の機序を明らかにするため、新規樹立Jak2-V617F発現白血病細胞株PVTL-1を用いて、細胞内シグナルの解析を行い、Jak2-V617FはSTAT5を活性化する以外に、恒常的に活性化されたLynと共にGSK3抑制とmTOR/4EBP1経路の活性化をもたらすことで生存と増殖に寄与することを示した。また難治性悪性リンパ腫患者検体から細胞内アダプター因子MYD88の未報告の変異を新規に同定し、導入実験によりこの変異がNF-kB系の恒常的な活性化とアポトーシス抵抗性をもたらすことを示した。慢性骨髄増殖性腫瘍の病態や白血病発症と進展に関与する活性化型変異Jak2-V617Fが、キナーゼ阻害薬による活性抑制と抗癌剤誘発性のDNA損傷ストレス下に、ユビキチン/プロテアソーム系(UPS)やカスパーゼによる分解を受ける分子機構の詳細を明らかにすべく検討を進めた。Jak2-V617Fの白血病細胞における分解機構を詳細に検討する目的で、真性多血症から急性骨髄性白血病に転化した症例の臨床検体からJak2-V617F依存性に増殖する細胞株PVTL-1を樹立し、この細胞株においてJak2-V617FはSTAT5を活性化する以外に、恒常的に活性化されたLynと共に、GSK3抑制とmTOR/4EBP1経路の活性化をもたらす事で生存維持と増殖に重要な役割を果たすことを見出し、学会および論文にて報告した。またpreliminaryなデータながら、この細胞株は骨髄線維症に対する治療薬として欧米で広く用いられているJak2阻害薬Ruxolitinibに耐性であることが示唆されており、上記した機序とこの耐性メカニズムの関連を含めた詳細な解析が、Jak2-V617F分解機構の解明や次世代のJak2阻害薬の開発につながることが期待できる。また活性化チロシンキナーゼと共に造血器腫瘍の治療抵抗性に深く関与する因子としてNF-kB系の活性化が知られるが、今回付随研究として悪性リンパ腫症例からこの経路の構成的な活性化をもたらすアダプター因子MYD88の未報告の変異を同定し学会報告した。これら両経路のクロストーク、相互作用の詳細な解析およびキナーゼ阻害薬による調節の検討が、難治性造血器腫瘍の治療における新たなアプローチとなり得ると考える。白血病発症と進展に関与するJak2-V617F、Flt3-ITD等の恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体が、キナーゼ阻害薬による活性抑制と抗癌剤誘導性のDNA損傷ストレス下に、ユビキチン/プロテアソーム系(UPS)やカスパーゼによる分解を受ける分子機構の詳細を明らかにすべく検討を行い、まずFlt3-ITDに関してsorafenibにより活性を阻害しetoposideにて処理することにより55-60kDaの切断片を生じる事を見いだした。また、同様の現象はPI3K阻害薬GDC-0942の処理にても生じ、PI3K/Akt経路の活性化によりFlt3-ITDの分解が負に制御されている事が判明した。多発性骨髄腫等の治療に用いられるproteasome阻害薬bortezomibによっても、Flt3-ITDはカスパーゼの活性化と供に同様の分解を受ける事が明らかとなり、この分解機構はUPSではなくカスパーゼの活性化を介して生じるものと考えられる。Jak2-V617Fの白血細胞における分解機構を詳細に検討する目的で、真性多血症から急性骨髄性白血病に転化した症例の検体からJak2-V617F依存性に増殖する細胞株PV-T1を樹立し、SrcファミリーのLynがJak2と供に恒常的に活性化していることを見いだした。これらの結果は、Flt3-ITDの細胞内分解機構解明へ向けて貢献しうる意義を有するのみでなく、既に臨床応用されていたり臨床開発中の阻害薬を用いた結果であることから、治療抵抗性急性骨髄性白血病に対する新規治療法の開発へもつながる重要な意義を有する。また、新規に樹立したPV-T1細胞株はJak2-V617の細胞内分解機構やシグナル伝達機構の解析のみでなく、Jak2-V617F陽性骨髄増殖腫瘍から急性骨髄性白血病への進展機構解明の為の研究にも役立ちうる意義を有する。

急性骨髄性白血病の治療抵抗性の最も重要な要因であるFlt3-ITDが、抗癌剤誘導性のDNA損傷ストレスやproteasome阻害薬処理による細胞ストレス化にカスパーゼによる分解を受け、これをPI3K/Akt経路の活性化を介して負に制御する分子機構を見いだした事により、白血病発症と進展に関与するJak2-V617F、Flt3-ITD、BCR/ABL等の恒常的活性化チロシンキナーゼ変異体が、キナーゼ阻害薬(TKI)による活性抑制と抗癌剤誘導性のDNA損傷ストレス下に、ユビキチン/プロテアソーム系(UPS)やカスパーゼによる分解を受ける分子機構の詳細を明らかにするとの目標の一部を達成する事が出来た。また、新規にJak2-V617F依存性の白血病細胞株を樹立することが出来た事も、今後のJak2-V617Fの分解機構の詳細解明との目標達成に向けて研究を発展させる上での着実な成果である今後更に抗癌剤とチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)存在下でのJak2-V617F、Flt3-ITDおよびBCR/ABLのユビキチン/プロテアソーム系(UPS)での分解機構に関して、GSK3ß、Cbls、HSP90および脱ユビキチン化酵素(DUB)の阻害薬や変異体またはノックダウン法を用いた抑制の効果を臨床検体を含めた造血細胞系でin vivoの効果も含めて検討し、治療抵抗性獲得機構における役割と治療応用の可能性を評価すし、ユビキチン化の様式と関与するリガーゼを同定しその意義を明らかにする。また、カスパーゼによる切断分解機構に関して、293T細胞での一過性発現系で一連のカスパーゼおよびその変異体との供発現により関与するカスパーゼを同定し、MALDI-TOFMSを用いて切断部位を同定し、さらに切断部位を改変し切断不能とした変異体および切断片に対応する変異体を作成し造血細胞系細胞に発現させ、相乗的アポトーシス誘導機構における意義を明らかにする。該当なし
TNFα変換酵素による白色脂肪細胞ブラウニング制御を応用した生活習慣病治療法構築

昨年度WATの成熟脂肪細胞画分とstromal vascular fraction(SVF画分)の両画分においてTNFαとTACEの両分子の発現が肥満の進行により上昇することを明らかとした。今年度、SVF画分内からマクロファージを単離、本細胞において両分子が高発現していることを見いだした。マクロファージにおけるTACEの作用を明らかとするため、マウス骨髄由来マクロファージあるいはマウス腹腔マクロファージを用いた実験を行った。これらの初代培養マクロファージにおいてTACE阻害剤によりTACE活性が抑制されることを確認した他、短鎖脂肪酸である酢酸および酪酸がマクロファージの増殖を抑制することを明らかとした。肥満動物に酢酸及び酪酸を経口投与しVATに局在するマクロファージの性状については今後免疫染色などの解析を進める予定である。TACEのsiRNAを導入したマクロファージにおける細胞機能の解析についても今後検討を進める。本年度は、肥満で誘導されるWATにおけるTNFαとTACEの局在を調べ、動物および細胞レベルにてTACE活性亢進がWATのBrowningを阻害、逆にTACE活性の抑制がWATのBrowningを促進するか検討するため、肥満動物にTACE活性化剤および阻害薬を投与する計画であった。熊本地震による実験室の被災の他、実験室移転を伴う居室(医局)の移転もあり、本実験系による解析(動物へのTACE活性化剤および阻害薬の投与実験)を円滑に進めることが出来なかった。そのため、本年度は薬剤非投与の条件下での実験に制限された。実際には、薬剤非投与下の肥満糖尿病動物由来WATを、コラゲナーゼ処理後にフィルター処理し、遠心分離を加え、前駆脂肪細胞、血管構成細胞、マクロファージ等から構成されるSVFと成熟脂肪細胞分画とに画分、得られたそれぞれの分画におけるブラウニング関連分子、TACE活性、TNFαのmRNA発現および蛋白発現を解析した。4月の熊本地震被災や12月の医局移転により実験施設の充分な利用ができず、実験動物にTACE活性化剤および阻害薬を投与する実験を進めることができなかったため。今年度、WATにおけるTNFαとTACEの局在を解析し、両分子が成熟脂肪細胞画分とstromal vascular fraction(SVF画分)の両画分に存在すること、肥満の進行により両分子の発現が上昇することを明らかとした。動物レベルにてTACEの活性状態がBrowningに如何に影響するか調べるため、TACE活性化薬および阻害薬を肥満および対照マウスに投与しWATを含む各種の臓器を単離した。細胞レベルでは、3T3-L1細胞あるいはマウス脂肪組織SVFから分化・誘導させた脂肪細胞を短鎖脂肪酸の存在・非存在下に培養し、TACE活性化薬あるいは阻害薬を添加して、Browningに如何に影響するか解析した。TACE shRNA Lentiviral Particlesを脂肪細胞に導入し、短鎖脂肪酸によるBrowningに如何に影響するか検討した。さらに、培養マクロファージ細胞に対照およびTACE shRNA Lentiviral Particlesを導入し、トランスウェルにて隔てたマウスSVF由来脂肪細胞の短鎖脂肪酸によるBrowningに如何に影響するか検討した。TACE阻害薬によるブラウニングの促進がmRNAレベルおよび蛋白レベルで確認できており、順調に進展していると思われる。動物実験施設の改修、移転した新しい実験室の整備もほぼ完了しているため、実験動物にTACE活性化剤および阻害薬を投与する実験系を進める。また、本研究に従事する人員を増やすことで対応する。今後も研究計画に従い、実験を進めていく。コンディショナルTACEノックアウトマウスおよび対照マウスの入手を進め、イソプロテレノール、短鎖脂肪酸、寒冷刺激、等によるブラウニングへのTACEの関与を解析していく。今回使用できなかった金額は7,733円と僅かであり、実験に必要な試薬等の必要物品購入には不足したため。理由:今回使用できなかった金額は82円と僅かで、試薬等の必要物品購入には不足したため。使用計画:今回使用できなかった金額82円は、次年度助成金と合わせ、必要物品等の購入に当てる。今回使用できなかった金額7,733円は、次年度助成金と合わせ、必要物品等の購入に当てる。
遺伝子増幅法を用いた植物ウイルス・ウイロイドの高感度遺伝子診断法の実用化

1)種々のウイルス・ウイロイド,既ちイネ萎縮ウイルス・イネ黒条萎縮ウイルス・イネラギッドスタントウイルス・ジャガイモYウイルス・カブモザイクウイルス・ジャガイモ葉巻ウイルス・ダイズモザイクウイルス・インゲン黄斑モザイクウイルス・キク矮化ウイロイド・ポップ潜在ウイロイド・ホップ矮化ウイロイドの数変異株の塩基配列を解析してこれら配列を基にしたPCR用プライマーを設計した。2)PCRによる遺伝子診断の鋳型となるCDNAをウイルスゲノムRNAより調製する方法を種々のウイルス・ウイロイドで確立した。3)ウイロイドでは、従来の電気泳動法やハイブリダイゼーション法より感度よくPCR法で検出できた。4)ウイルスにおいても、ELISAやゲノムのハイブリダイゼーション法より感度よくPCR法で検出できた。5)PCRで増幅したDNAを液相でハイブリダイゼーションするマイクロプレートハイブリダイゼーション法を開発した。本法はPCRより更に10倍高感度であり、同時にハイブリダイゼーションで増殖DNAの塩基配列特異性も確認できる優れた方法であった。6)本研究過程でPCR反応液にウイロイド配列が混入する汚染問題が生じた。最も大きな汚染は、検定試料よりウイロイドRNAを抽出する過程で生じることが明かとなり、汚染防止対策を確立した。7)形質転換植物に導入された外来遺伝子をPCR法で検出する方法を確立した。従来のサザーンハイブリダイゼーション法より簡便で迅速な方法であった。1)種々のウイルス・ウイロイド核酸についてcDNAを作成し、塩基配列を決定して増幅用プライマ-及び検出用プロ-ブを設計した。イネウイルスでは、イネ萎縮ウイルスのゲノムセグメントS1,S3,S4,イネ黒条萎縮ウイルスのゲノムセグメント10,イネラギッドスタントウイルスのゲノムセグメント9,マメ類ウイルスでは、インゲンマメ黄班モザイクウイルス,クロ-バ-yellow veinウイルス,ダイズモザイクウイルスの3'末端近傍領域,ジャガイモウイルスでは、ジャガイモYウイルスの外被蛋白質領域,ウイロイドでは、セイヨウナシくぼみ果ウイロイドについてcDNAを作成し、その塩基配列を決定した。2)これらの塩基配列を基にして、RNAからcDNAを合成し増殖する(RTーPCR)種々の条件を検討した。PCRプライマ-の設計と合成,それらプライマ-を用いた標的遺伝子の増殖試験の行っておおよそ期待した結果が得られた。3)RTーPCR操作に伴うコンタミネ-ションの防止に就いては、必要な操作基準を確立した。4)ハイブリダイゼ-ションによる遺伝子診断を32P標識プロ-ブと酵素標識プロ-ブ(DIG)を併用し検出感度を比較したところDIG法は、アイソト-プ標識に較べて10倍高かった。1)RCRとマイクロプレ-トを用いた液相ハイブリダイゼ-ションによる遺伝子診断法を試みた。本法によってジャガイモYウイルスでは5fgのゲノムが検出可能であり、従来のナイロンメンブレンを用いたハイブリダイゼ-ションよりはるかに鋭敏であった。本法は、プロ-ブにDIG標識法を用いるのでアイソト-プ標識より安全なので、放射性物質取扱い規制を受けずに一般実験室で遺伝子診断が出来るようになった。更にホップ潜在ウイロイドとキク矮化ウイロイドでも本法による遺伝子診断が可能となった。2)イネ萎縮ウイルスゲノムセグメント1と12、イネ黒条萎縮ウイルスゲノムセグメント7と8、イネラギッドスタントウイルスゲノムセグメントS9と10、ジャガイモYウイルスの非翻訳領域、ダイズモザイクウイルスの3'未端領域、キク矮化ウイロイド、ホップ潜在ウイロイドの塩基配列を決定し、これらの特異領域を基にして増幅用および検定用プライマ-を合成できるようにした。3)RCR反応におけるDNA汚染対策を検討した。検体植物より全核酸を抽出する際に最も汚染しやすいことが明らかとなった。4)植物レオウイルス遺伝子を簡易迅速に抽出し、PCR法によってcDNAクロ-ニングする方法を開発した。本法によって、特定の遺伝子変異を迅速に検定できるようになった。1)ジャガイモYウイルスとホップ潜在ウイロイドについて、PCRとDIG標識核酸プローブを用いたマイクロプレートハイブリダイゼーション法による遺伝子診断を確立した。

圃場でジャガイモYウイルスに感染したジャガイモを常法のELISA、PCR、およびマイクロプレート法で検定。ELISAで検出できない感染株でもPCRとマイクロプレート法で検出できた。更にマイクロプレート法はPCRより検出感度が10倍優れていた。2)イネラギッドスタントウイルス変異株の変異遺伝子(ゲノムセグメント9)をRTーPCRとSSCP(Single-strand conformation polymorphisms)によって識別・検出する方法を確立した。保毒虫ー頭から抽出した核酸の1/2量より合成したcDNAの1/100量あるいは感染イネ1mg分より合成したcDNAの1/50量からでも充分にPCR検定が可能であった。3)ジャガイモ葉巻ウイルス外被蛋白質で形質転換したジャガイモより抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRとマイクロプレートハイブリダイゼーションで、導入された遺伝子の検出に成功した。4)PCR法増幅の鋳型はDNAなので、検定植物よりウイルスRNAを抽出してより簡便にcDNAを調製する方法を確立することがPCRによる遺伝子診断法の基本となる。ジャガイモYウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス、イネ萎縮ウイルス、クローバーイエローベインウイルスについてウイルスゲノムRNAの直接簡易抽出法とcDNA調製法を確立してPCRによる遺伝子診断法を確立した。
Next-Generation of Urban Emergency Management: When human mobility prediction meets Big Data

近年、自然災害の頻度と被害の規模は拡大の傾向にあり、このトレンドは続くと考えられている。今後の災害への人道支援、交通、復興の効率的な計画のためには、群衆の避難行動のモデリングと予測は非常に重要となる。異種混在のビッグデータのマイニングにより、本プロジェクトでは都市規模の災害を対象に群衆の避難行動・移動を予測してシミュレートするいくつかのモデル、システムを開発した。加えて、本プロジェクトでは次世代都市危機管理システムのためのキーとなるモデルの開発を行った。人間情報学
急性骨髄性白血病におけるヌクレオフォスミンの新たな機能損失の分子基盤

核小体タンパク質ヌクレオフォスミンはC末端領域を介してリボソームタンパク質RPL22と結合していた。この結合は直接的ではなく、RNAを介したものであった。また、ヌクレオフォスミンのC末端領域のリン酸化は、細胞内局在およびRPL22との結合のいずれにも影響を与えなかった。しかし、フレームシフト変異型ヌクレオフォスミンはRPL22と結合することができなかった。本年度は、核小体タンパク質NPM1のC末端領域に結合するタンパク質の同定を試みた。NPM1のC末端約100アミノ酸をコードする遺伝子をHeLa細胞に導入し、NPM1タンパク質をゲルろ過およびアフィニティーカラムにより精製し、質量分析をおこなった。その結果、60Sリボソームの構成因子であるリボソームタンパク質RPL22を同定した。NPM1/RPL22複合体は培養細胞においても認められ、細胞周期間期の核内でrRNAを介して形成されることが明らかとなった。また細胞分裂期では、活性化したCDK1によりNPM1がリン酸化されてrRNAとの結合能を失うため、結果的にNPM1/RPL22複合体が解離することが明らかとなった。分裂期におけるNPM1のRNA結合能制御には、オーロラによるリン酸化は関与しなかった。よって、初年度の研究成果と考え合わせると、分裂期におけるNPM1のS293のリン酸化はNPM1の核小体への局在とRNA結合能のいずれにも関与しないことが明らかとなった。急性骨髄性白血病患者の約3割に認められる変異型NPM1(NPM1c)は、核小体移行シグナルが消失し、新たに核外移行シグナルを獲得しているため、細胞質に局在する。試験管内における再構成実験から、NPM1cはRNA結合能を完全に失っており、培養細胞を用いた実験においても間期でのNPM1/RPL22複合体を形成しなかった。この結果は、NPM1cがRPL22と複合体を形成できないのは、NPM1cが細胞質に局在することに加えて、本質的にRNA結合能を失っていることが原因と考えられた。S293のリン酸化が、NPM1の細胞内局在に及ぼす影響を検討した。野生型、非リン酸化型およびリン酸化模倣型NPM1遺伝子にFlag-His-EmGFP(FHG)遺伝子を融合した。レトロウイルスベクターを用いてHeLa細胞に導入後、EmGFPの蛍光を指標に細胞をソーティングし安定発現細胞株を樹立した。野生型および変異型FHG-NPM1の細胞内局在を検討したところ、すべて核小体に局在し、変異の影響は認められなかった。また、細胞増殖および細胞周期の進行への影響も認められなかった。NPM1は、N末端領域を介して5量体を形成するが、実際、FHG-NPM1と内在性NPM1との結合が確認された。また、内在性NPM1のタンパク質レベルはFHG-NPM1に比べて約5倍高かった。このため、内在性NPM1との結合により、変異型NPM1の効果が相殺された可能性が考えられた。そこで内在性NPM1の3'UTRに対するsiRNAを用いて、内在性NPM1のみをノックダウンした。しかし、内在性NPM1のタンパク質レベルが半分程度に低下しただけでも、細胞の生存率が著しく低下した。この際、FHG-NPM1のタンパク質レベルは内在性NPM1より低く、変異型NPM1の細胞内局在への影響を検討するのは困難であると判断した。そこで、5量体形成に関わるN末端領域を欠損したNPM1を用いて細胞内局在を検討した。N末端領域を欠損したNPM1の局在はS293の変異の有無に関係なく同じであった。次に、試験管内において蛍光色素標識した全長の組み換えNPM1タンパク質をビーズと混合し培養細胞に加え、物理的衝撃を加えることでNPM1タンパク質を細胞内に導入した。導入したNPM1タンパク質は、S293の変異の有無にかかわらず5分以内に核小体に移行した。以上の結果から、S293のリン酸化はNPM1の細胞内局在に影響しないことが示唆された。平成23年度の研究計画は、外来性に導入したNPM1の安定発現細胞株の樹立と、S293のリン酸化の細胞内局在への影響を明らかにすることであった。安定発現細胞株の樹立は予定通り完了したが、S293の細胞内局在への影響に関しては、当初想定していたように、内在性NPM1タンパク質の存在がノイズとなり得るという問題が生じた。そのため、予定通り内在性NPM1タンパク質をノックダウンすることで問題の回避を試みた。しかし、外来性NPM1のタンパク質レベルが予想以上に低かったため、siRNAによる内在性NPM1レベルの低下を量的に相補できずに細胞が死んでしまう、というあらたな問題に直面した。このため、異なるアプローチをとることによってリン酸化と局在の関係を検討することになった。この意味で、現在までのところおおむね順調進展していると考えている。

平成24年度の計画通り、NPM1の結合タンパク質を同定する。特に、急性骨髄性白血病患者で消失しているS293のリン酸化が制御する因子の同定を考え、N末端領域を欠損したNPM1を用いる。外来性NPM1を安定発現するHeLa細胞より、抗Flag抗体、Ni-beads、ゲルろ過を組み合わせてNPM1タンパク質を精製する。結合タンパク質を質量分析により同定し、その結合が直接的か間接的なものか、間接的であればその介在因子を明らかにしていく予定である。遺伝子クローニング、細胞培養およびタンパク質精製に必要な消耗品の購入費用が中心となる。
イネ穎果の登熟優先度の決定機構に関する研究

source/sink比が低いような条件下では,イネの一穂の中でも下部の穂上位置に着生し,開花も遅い弱勢な穎果が初期生長の遅延を起こし易いこと,さらにこの遅延は炭水化物の供給が不足して生じるのではないこと,そしてこの遅延は穎果の最終粒重や胚乳細胞数の低下を伴うことが明らかとなっている.サイトカイニンであるzeatinを登熟期の根に与えると,弱勢な穎果の初期生長は促進され,さらに最終粒重と胚乳細胞数も増加した.また,比較的低濃度のアブシジン酸(ABA)を若い穎果に滴下処理すると,サイトカイニンと同様に,穎果の初期生長の促進,並びに最終粒重と胚乳細胞数の増加が認められた.これら両植物ホルモンによる初期生長の促進は炭水化物供給の増加によるものではなかった.したがって,これらの効果はsource/sink比を増加した処理と全く同じ効果であった.登熟初期の穎果のサイトカイニンとABAを分析した結果,ABAレベルは生長の遅い弱勢な穎果よりも生長の速い強勢な穎果で高いこと,穎果間引き処理により残された弱勢な穎果の初期生長が速まり、ABAレベルも増加した.一方,サイトカイニンレベルに違いは見られなかった.これらのことから,イネ自身の登熟促進要因としてABAが働いていることがわかった.また,登熟初期のABAの茎葉散布処理も弱勢な穎果の初期生長を促進し,最終粒重を増加させたことから,穎果の内生ABAは葉が起源である可能性が示唆された.登熟初期における止葉の,ABAを測定した結果,遮光によってABAレベルが減少したことから,葉でのABA生産は光の強さに依存し,葉のABA生産が低いような条件下では特に弱勢な若い穎果へのABA輸送が低下し,初期生長の遅延が生じると考えられた.このように,イネでは,植物ホルモンであるABAが一穂内の穎果の登熟優先度を決定していることが明らかとなった.source/sink比が低いような条件下では,イネの一穂の中でも下部の穂上位置に着生し,開花も遅い弱勢な穎果が初期生長の遅延を起こし易いこと,さらにこの遅延は炭水化物の供給が不足して生じるのではないこと,そしてこの遅延は穎果の最終粒重や胚乳細胞数の低下を伴うことが明らかとなっている.サイトカイニンであるzeatinを登熟期の根に与えると,弱勢な穎果の初期生長は促進され,さらに最終粒重と胚乳細胞数も増加した.また,比較的低濃度のアブシジン酸(ABA)を若い穎果に滴下処理すると,サイトカイニンと同様に,穎果の初期生長の促進,並びに最終粒重と胚乳細胞数の増加が認められた.これら両植物ホルモンによる初期生長の促進は炭水化物供給の増加によるものではなかった.したがって,これらの効果はsource/sink比を増加した処理と全く同じ効果であった.登熟初期の穎果のサイトカイニンとABAを分析した結果,ABAレベルは生長の遅い弱勢な穎果よりも生長の速い強勢な穎果で高いこと,穎果間引き処理により残された弱勢な穎果の初期生長が速まり、ABAレベルも増加した.一方,サイトカイニンレベルに違いは見られなかった.これらのことから,イネ自身の登熟促進要因としてABAが働いていることがわかった.また,登熟初期のABAの茎葉散布処理も弱勢な穎果の初期生長を促進し,最終粒重を増加させたことから,穎果の内生ABAは葉が起源である可能性が示唆された.登熟初期における止葉の,ABAを測定した結果,遮光によってABAレベルが減少したことから,葉でのABA生産は光の強さに依存し,葉のABA生産が低いような条件下では特に弱勢な若い穎果へのABA輸送が低下し,初期生長の遅延が生じると考えられた.このように,イネでは,植物ホルモンであるABAが一穂内の穎果の登熟優先度を決定していることが明らかとなった.まず,ABAがイネの登熟に及ぼす影響を穂上位置別に検討した.品種ササニシキを用い,昼/夜温が24/19°C,50%の遮光条件下で実験を行った.出穂期およびその1週間後にABAを茎葉散布した結果,10^<-7>M付近の低濃度処理により,登熟歩合が増加し,収量も増加した.最終粒重は,強勢な頴果では変わらなかったが,弱勢な頴果で増加したので,処理による登熟歩合の増加は弱勢な頴果の粒重増加によることがわかった.また,処理により弱勢な頴果の初期生長は促進された.次に,開花1日後,3日後の2回,弱勢な頴果にABAを直接処理した結果,低濃度側で最終粒重の増加や初期生長の促進が,また高濃度側では最終粒重の低下や初期生長の遅延が観察された.サイトカイニンであるzeatinを登熟期のイネの水耕液に投入すると,弱勢な頴果に対してのみABAと同様な促進効果が見られた.これら両者の促進効果はsource/sink比を高めるような処理と同様であることから,ABAやサイトカイニンがイネ自身の登熟制御の促進要因として働いている可能性が示唆された.したがって,イネ頴果のABAやサイトカイニンを分析する必要があると考えられた.

そこで,生長初期の頴果のABAやサイトカイニンの分析法を検討した.穂上位置を固定し,生育の揃った頴果を多く採取することは困難であるため,試料が微量でも分析可能なELISAにより最終的に分析することにした.抽出液を簡単なODSミニカラムを通すことにより,zeatin, zeatin riboside, ABAを高い回収率で分離,回収することができた.また,夾雑物も十分除かれること,試料は24粒で分析可能であることがわかった.source/sink比が低いような条件下では,一穂の中でも,開花の遅い弱勢なイネ穎果は初期生長の遅延を起こすこと,さらにこの遅延は最終粒重や胚乳細胞数の低下を伴うことが明らかとなっている.昨年度の研究結果より,植物ホルモンであるサイトカイニンと±ABAの処理は,特に弱勢な穎果の初期生長を速めること、そしてサイトカイニン処理は,胚乳細胞数を増加させることがわかった.ABAは一般的には種子の生長や細胞分裂の抑制ホルモンと考えられ,昨年度の結果とは異なるので,今年度は,±ABAに加え天然型の+ABAの処理も行い,穎果の初期生長への影響を確認するとともに,胚乳細胞数に及ぼす影響も調査した.その結果,+ABAにも弱勢な穎果の初期生長を促進する効果があること,さらにこの促進は胚乳細胞数や最終粒重の増加を伴うことが明らかとなった.これらの効果は,source/sink比を増加させるような処理(穎果間引き処理など)と全く同じであることから,サイトカイニン同様,ABAもイネの登熟の促進要因として働いている可能性が示された.次に,昨年度に検討・確立した方法で初期生長期における穎果のサイトカイニン(zeatinおよびzeatin riboside)とABAを定量した.その結果,ABAレベルは生長の遅い弱勢な穎果よりも生長の速い強勢な穎果で高いこと,穎果間引き処理により残された弱勢な穎果の生長が速まり,ABAレベルも高まることがわかった.一方,サイトカイニンレベルに違いは見られなかった.以上より,イネ自身の登熟促進要因としてABAが直接的に働いていることが明らかとなった.日射不足などsource/sink比が低い条件下では,一穂の中でも開花が遅く穂の基部側に着生する弱勢なイネ穎果の初期生長が遅延する.昨年度までの結果から,この遅延は単に栄養的な問題から生じるのではなく,植物ホルモンであるアブシジン酸(ABA)により生じること,そしてABAはイネ穎果の初期生長や登熟の促進要因として働いていることが明らかとなった.このことから,イネ穎果の初期生長の制御はイネにとってはむしろ積極的な制御であると考え,その意義を明らかにすることを試みた.その結果,登熟初期の日射量が多く,弱勢な穎果の初期生長の遅延が少なく,1穂内のほとんどの穎果がデンプン蓄積に入った時に日射量を制限すると登熟はかなり悪化することが明らかとなった.一方,登熟初期から日射量を制限した場合は,強勢な穎果の登熟が優先的に進み,大部分の弱勢な穎果は生長初期段階で生長能力を失うことなく生長を停滞していることが明らかとなった.したがって,弱勢な穎果の発達初期段階での生長停滞は,穎果のデンプン蓄積期に光合成産物の穎果間の競合を回避するための,むしろイネにとっては自己防衛的戦略機構であると考えられた.また,ABAは弱勢な若い穎果に直接処理した場合でも,茎葉散布した場合でも,弱勢な穎果の初期生長を促進するという昨年度までの結果から,若い穎果のABAの起源は葉である可能性が示された.そこで,登熟初期における止葉のABAを測定した.その結果,遮光によってABAレベルが減少したことから,葉でのABA生産は光の強さに依存し,葉のABA生産が低いような条件下では特に弱勢な若い穎果へのABA輸送が低下し,初期生長の遅延が生じると考えられた.
ザンドホッフ病発症前早期に潜在する神経系分化発達異常の分子機構解明と創薬への応用

ザンドホッフ病(SD)モデルマウス由来iPS細胞(SD-iPS細胞)を神経系へ分化誘導すると、野生型マウスiPS細胞に比べて、SD-iPS細胞由来の神経幹細胞からのニューロンへの分化能が低下し、アストロサイトへの分化能が増大することをすでに明らかにしている。グルコシルセラミド合成酵素阻害薬であるミグルスタットによりGM2ガングリオシド等の蓄積を阻害すると、この分化異常が改善されることから、SD-iPS細胞における分化異常はGM2ガングリオシド等の蓄積に起因することが示唆された。そこで、レトロマー複合体に担われる逆行性輸送経路を亢進することで、リソソームへのGM2ガングリオシド等の蓄積を回避し、これが神経系への分化異常を改善するかを検討した。SD-iPS細胞における分化異常が逆行性輸送の亢進によって改善されるかを検討する目的で、SD-iPS細胞にレトロマー複合体構成因子であるVPS35遺伝子を強発現したVPS35-iPS細胞を樹立し、これを神経系へ分化誘導した後、Tuj1及びGFAP抗体を用いて免疫抗体染色により検討した。SD-iPS細胞にGFP遺伝子を導入したGFP-iPS細胞と比較して、VPS35-iPS細胞ではニューロンへの分化が増加し、アストロサイトへの分化が減少した。次に、SD-iPS細胞における分化異常が、ケミカルシャペロンによって改善されるかを検討する目的で、VPS35を安定化させるレトロマー複合体安定化シャペロン化合物のR33を用いて同様に解析した。R33を処理したSD-iPS細胞では、非添加群と比較してニューロンへの分化が増加し、アストロサイトへの分化が減少した。同様の結果は、SDマウス由来の神経幹細胞でも得られた。以上のことより、レトロマー複合体安定化シャペロン化合物は、SDの新規治療薬として有力な候補である可能性が示された。「ザンドホッフ病(SD)は、発症前早期に潜在する神経系の分化・発達異常が原因となり、脳神経系の機能が障害され発症する。」とする申請者独自の作業仮説を立証する目的で、当該年度ではまず、SDの発症前早期に神経系の分化・発達異常が生じているのかSDマウスとSD-iPS細胞を用いて検討した。SDマウス胎仔由来神経幹細胞の神経系への分化異常を検討する目的で、SDマウスの胎生期12.5日齢の胎仔脳より神経幹細胞を培養し、神経幹細胞の神経系への分化能を比較検討した。SDマウスはコントロールと比較してニューロンへの分化能が有意に低下し、アストロサイトへの分化能が有意に増加していた。次に、大脳皮質様神経組織を分化誘導できる方法であるSFEBq法を用いて、SD-iPS細胞を神経系へ分化誘導し検討した。SDマウス胎仔由来神経幹細胞での結果と同様に、ニューロンへの分化能が有意に低下し、アストロサイトへの分化能が有意に増加していた。次に、観察された変化がHexb遺伝子の欠損によって直接引き起こされたのかを検討するため、SD-iPS細胞にHexb遺伝子を強制発現させた細胞(HEXB-iPS細胞)で回復するか検討した。SDIA法を用いて神経幹細胞コロニーを分化誘導すると、SD-iPS細胞はwild type-iPS細胞に比べてコロニーの数と面積が有意に減少していた。HEXB-iPS細胞ではSD-iPS細胞で見られたコロニー数と面積の減少が有意に回復していた。また、グルコシルセラミド合成酵素阻害薬のミグルスタットはSD-iPS細胞で見られたコロニー数と面積の減少を有意に回復した。以上のことより、神経系へのin vitro分化異常はSDの病態を反映したものであることが明らかとなった。したがって、SDでは神経系の分化・発達異常が生じていることが示唆される。SDの発症前早期に神経系の分化・発達異常が起こることを、in vitroとin vivoで明らかにすることを目的として、1SDマウス胎仔由来神経幹細胞の神経分化異常の検証、2SD-iPS細胞の神経分化異常の検証、3SDマウス脳内での神経分化・発達異常の検証、の3項目について検討した。1と2については神経系へのin vitro分化異常が観察され、SDの病態を反映したものであることを示すことができた。3については、15週齢のSDマウス海馬で新生ニューロンの数が有意に減少していることを観察した。その一方で、SDの発症前早期の胎生期12.5日齢での検討には至っていない。この点については次年度に残された検討課題となった。平成28年度では、SDの発症前早期のSDモデルマウス(Hexb-/-)脳内での神経分化・発達異常の検証について検討を加えた。E13.5日齢に産生された新生神経を生後14日齢で解析したところ、コントロールマウスでは大脳皮質IV層に新生神経が最も多く局在していた。一方、SDマウスではVI層に新生神経が最も多く局在していた。このことより、SDマウスではコントロールと比較して胎仔期での神経の発生・分化の時期が異なっている、もしくは、新生神経細胞の移動が遅いことが示唆された。次に、どのような遺伝子・シグナル分子が関わって神経系の分化・発達異常が起こり、SDの発症につながっていくのかを明らかにする目的で、Hexb遺伝子の欠損によって変化を受けた神経系への分化能低下に関わる特異的分子を解析した。

SDマウス胎仔(E12.5)脳から調整した神経幹細胞をqPCRにて解析した結果、神経幹細胞の未分化維持やニューロンへの分化抑制に働くNotch1の発現が有意に減少していた。同様の結果は、5週齢のSDマウス脳海馬でも観察された。次に、自己抗体を介した免疫応答の活性化やアストログリオーシスとの関連性を明らかにすることを目的として、SDモデルマウス(Hexb-/-)と免疫反応抑制マウス(FcRγ-/-)を組み合わせることで解析を行った。その結果、SDマウスでは、FcRγを介した免疫応答によりアストログリオーシスが発症前早期から起こっていること、そして、アストログリオーシスと運動障害は免疫抑制薬によって抑制できることが明らかとなった。以上のことより、胎生期での神経幹細胞の分化・発達異常が無症状期での活性化アストロサイトの増加やミクログリアなどの免疫系細胞の活性化を引き起こし、神経変性や神経細胞死が継時的に生じ発症する可能性が示された。SDの発症前早期に神経系の分化・発達異常が起こることを、in vitroとin vivoで明らかにすることを目的として、1SDマウス胎仔由来神経幹細胞の神経分化異常の検証、2SD-iPS細胞の神経分化異常の検証、3SDマウス脳内での神経分化・発達異常の検証、の3項目について検討した。1と2については神経系へのin vitro分化異常が観察され、SDの病態を反映したものであることを示した。3については、生後14日齢においてSDマウスの大脳皮質ではコントロールと比較して胎仔期での神経の発生・分化の時期が異なっており、新生神経細胞の移動が遅いことを示した。また、15週齢のSDマウス海馬で新生ニューロンの数が有意に減少していることを観察した。次に、どのような遺伝子・シグナル分子が関わって神経系の分化・発達異常が起こり、SDの発症につながっていくのかを検討した。その結果、神経幹細胞の未分化維持やニューロンへの分化抑制に働くNotch1の関与の可能性を示した。しかし、Notchシグナル伝達系の機能解析には至っていない。この点については次年度に残された検討課題である。次に、胎生期での神経幹細胞の分化・発達異常とアストログリオーシスとの関連性を解明することを目的として、SDモデルマウス(Hexb-/-)と免疫反応抑制マウス(FcRγ-/-)を組み合わせることで解析を行った。その結果、SDマウスでは、FcRγを介した免疫応答によりアストログリオーシスが発症前早期から起こっていること、そして、アストログリオーシスと運動障害は免疫抑制薬によって抑制できることが明らかになった。以上の結果は、「SDは、発症前早期に潜在する神経系の分化・発達異常が原因となり、脳神経系の機能が障害され発症する。」とする申請者独自の作業仮説を支持するものである。ザンドホッフ病(SD)モデルマウス由来iPS細胞(SD-iPS細胞)を神経系へ分化誘導すると、野生型マウスiPS細胞に比べて、SD-iPS細胞由来の神経幹細胞からのニューロンへの分化能が低下し、アストロサイトへの分化能が増大することをすでに明らかにしている。グルコシルセラミド合成酵素阻害薬であるミグルスタットによりGM2ガングリオシド等の蓄積を阻害すると、この分化異常が改善されることから、SD-iPS細胞における分化異常はGM2ガングリオシド等の蓄積に起因することが示唆された。
サヤダイコンの低温発芽性制御の遺伝的メカニズム解析

タイ北部で栽培されるサヤダイコン'パッキフッド'が示す開花に対する低温要求性,低温発芽能力について検討した.ダイコン種子内のABA量は種子の乾燥とともに増加し,その後の減少と葉の黄化の進展とに密接な関連が認められた.低温発芽性に関する5箇所の遺伝子領域が見出された.低温発芽性程度と開花に対する低温要求の程度には負の相関が認められた.パッキフッドの種子は低温下で吸水とともに低温ストレス応答に関係する遺伝子群が働き,その後,発芽促進にともなって基礎代謝に関わる遺伝子群が働くと考えられた.タイ北部で栽培されるサヤダイコン'パッキフッド'が示す開花に対する低温要求性,低温発芽能力について検討した.ダイコン種子内のABA量は種子の乾燥とともに増加し,その後の減少と葉の黄化の進展とに密接な関連が認められた.低温発芽性に関する5箇所の遺伝子領域が見出された.低温発芽性程度と開花に対する低温要求の程度には負の相関が認められた.パッキフッドの種子は低温下で吸水とともに低温ストレス応答に関係する遺伝子群が働き,その後,発芽促進にともなって基礎代謝に関わる遺伝子群が働くと考えられた.サヤダイコンの一品種パッキフッドならびに日本で栽培されるダイコン品種を用いて,種子形成期から発芽期における遺伝子発現のパターンと発芽の低温に対する反応を解析することにより,低温発芽能に関連する遺伝子を検索し,開花に対する低温要求性との関係について検討した.開花30日後の種子水分含量は両品種とも約80%であった.パッキフッドではその後は低下し続け,60日後に9%,聖護院では5060日後に停滞がみられ70日に9%にまで低下した.分岐枝基部の葉の葉緑素含量変化をSPAD値により測定した.分岐枝基部の花の開花20日後まではほぼ一定の値を保った.パッキフッドではその後急激に低下し,45日後には緑色は完全に失われた.聖護院では徐々に低下し,45日後でもわずかに緑色が保持された.ABA合成の律速酵素NCED遺伝子の種子成熟期間における発現をRT-PCRによって検出した.パッキフッドは開花直後から40日後まで,聖護院では60日後まで発現が認められ,その後は発現がみられなかった.イムノアッセーにより開花後各時期の種子中のABA量を測定した.両品種とも開花直後極めて多量のABAが認められ,30日後まで急激に減少した後,パッキフッドでは40日後,聖護院では60日後に増加のピークが認められた.開花10日後から80日後まで10日ごとに種子を採取し,25ならびに3°Cにおけるシャーレー湿室内での発芽率を調査した.パッキフッドでは,25°Cにおいて,開花30日後の種子でわずかに発芽が認められ,発芽率は徐々に上昇し,80日後に80%以上の発芽率となった.3°Cにおいては,80日後まで高い発芽率を示さなかった.一方,聖護院では,25°Cにおいて開花30日後から高い発芽率を示した.以上の結果から,ダイコン種子内のABA量は種子の乾燥とともに増加し,その後の減少と葉の黄化の進展とには密接な関連が認められるが,発芽能の獲得ならびにパッキフッドの低温発芽能の獲得はABA量の変化では説明できないことが示された.分子マーカーによる連鎖地図を作成し,パッキフッドを特徴づける形質に関するQTL解析を行った.RAPDマーカー104,SCARマーカー15を用いてMAPMAKER3.0bによる連鎖地図を作成した.各個体からそれぞれ10莢を無作為にサンプリングし,莢長および一莢粒数を測定した.F_3種子の3°Cにおける発芽率の25°Cにおける発芽率に対する比の逆正弦変換値をF_2各個体の低温発芽性程度とした.QTL解析にはQGene ver3.06を用いた.低温発芽性程度はPK1で0.81と高く,GSK3-1で0.02と低い値を示した.F_1は0.18でGSK3-1に近い値を示した.平均莢長はPK1で10.9cm,GSK3-1で4.3cmであった.F_1の平均莢長は5.0cmでGSK3-1に近い値を示した.F_2における莢長の分布は,ピークが2ヶ所にみられた.一莢粒数の平均はPK1が6.2粒,GSK3-1が4.0粒であり,F_1は5.3粒と両親の中間的な値を示した.9連鎖群(LG19)からなる連鎖地図が得られた.全長は1469.9cM,平均マーカー間距離は13.6cMであった.低温発芽性については,LG1に2ヶ所,LG5に2ヶ所,LG8にLOD値2.5以上の有意なQTLs(qLTG15)が認められた.表現型変異に対する寄与率はそれぞれ11.2%,9.6%,10.9%,10.7%ならびに8.5%であった.qLTG2はGSK3-1の,それ以外のQTLsはPK1の対立遺伝子が低温発芽性を高める効果を示した.莢長については,LG7に2ヶ所,LG9に1ヶ所のQTLs(qLP13)が認められた.寄与率はそれぞれ8.3%,8.7%ならびに7.9%であった.これら3つのQTLsはいずれもPK1の対立

遺伝子が莢を長くする効果を示した.一莢粒数については,LG3に1ヶ所とLG5に1ヶ所にQTLs(qNSP1,2)が認められた.寄与率はそれぞれ8.9%,15.9%であった.qNSP1はGSK3-1の,qNSP2はPK1の対立遺伝子が粒数を増やす効果を示した.タイ北部から導入されたサヤダイコン`パッキフッド'の種子成熟過程における種子水分含量,葉の葉緑素含量,NCED遺伝子発現量ならびにABA量の推移について測定し,低温発芽能獲得との関連について検討した.開花30日後の種子水分含量は両品種とも約80%であった.パッキフッドではその後は低下し続け,60日後に9%,聖護院では5060日後に停滞がみられ70日に9%にまで低下した.分岐枝基部の葉の葉緑素含量は分岐枝基部の花の開花20日後まではほぼ一定の値を保った.パッキフッドではその後急激に低下し,45日後には緑色は完全に失われた.聖護院では徐々に低下し,45日後でもわずかに緑色が保持された.ABA合成の律速酵素NCED遺伝子の種子成熟期間における発現をRT-PCRによって検出した.パッキフッドは開花直後から40日後まで,聖護院では60日後まで発現が認められ,その後は発現がみられなかった.イムノアッセーにより開花後各時期の種子中のABA量を測定した両品種とも開花直後極めて多量のABAが認められ,30日後まで急激に減少した後,パッキフッドでは40日後,聖護院では60日後に増加のピークが認められた.開花10日後から80日後まで10日ごとに種子を採取し,25ならびに3°Cにおけるシャーレー湿室内での発芽率を調査した.パッキフッドでは,25°Cにおいて,開花30日後の種子でわずかに発芽が認められ,発芽率は徐々に上昇し,80日後に80%以上の発芽率となった.3°Cにおいては,80日後まで高い発芽率を示さなかった.一方,聖護院では,25°Cにおいて開花30日後から高い発芽率を示した.以上の結果から,ダイコン種子内のABA量は種子の乾燥とともに増加し,その後の減少と葉の黄化の進展とには密接な関連が認められるが,発芽能の獲得ならびにパッキフッドの低温発芽能の獲得はABA量の変化では説明できないことが示された.
アスパラガス不定胚を用いた花芽誘導機構の解明

食用アスパラガス(Asparagus officinalis L.)の種子をチオカ-バメート系化合物で処理することにより1ケ月のアスパラガス実生約70%に花芽が誘導される。しかしこの現象は、発芽種子の生育状態に大きく依存する傾向が認められた。そこでアスパラガス不定胚培養を試み、不定胚における薬剤の花芽誘導作用について検討した。アスパラガス(ヒロシマグリーン品種)の雄株を培養に用いた。茎頂部を10mg/Lのアンシミドールを含むMS液体倍地に移植し1ケ月毎に継代培養を行ない、約3ケ月後に多芽集塊を得た。これを2mg/Lの2,4-D(オーキシン類)を含むMS寒天倍地に置床したところ、1ケ月後にEmbryogenic(EC:不定胚形成能力のある培養細胞)の誘導が開始された。2週間毎に継代を行ない2ケ月を経て安定したECが得られた。ECをオーキシン無添加のMS液体倍地で振盪培養したところ、2週間2ケ月で不定胚の第一ステージである球状胚が誘導された。次に得られた球状胚は細胞の大きさ(Xmum)によりX<108、108≦X<500、500≦Xの3試験区に分類した後、MS寒天倍地(2.5%の寒天を含む)に置床し、2週間後に不定胚の第二ステージである魚雷胚に発達した。魚雷胚はMS寒天倍地(1%の寒天を含む)に置床し、1ケ月後に再分化個体が確認された。この不定胚分化の各過程でチオカ-バメート系化合物を倍地に添加し花芽形成率を調べた。その結果、適当な発達ステージの不定胚即ち球状ステージで108≦X<500の細胞に薬剤処理を行なえば種子胚同様、幼植物に花芽が誘導されることが証明された。