hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安定な有機アンチモン化合物を利用した位置、官能基選択的な反応の開発

テトラフェニルスチボニウムトリフラ-ト(以下、Ph_4SbOTf)は、安定な五価有機アンチモン化合物である。特に、アミンなどの塩基によっても失活しない点は従来の酸触媒にはない特微であり、新分野での利用が期待される。本年度の研究概要は以下に示す通りで、エポキシドのアルコ-ルによる開環反応と、生理活性物質の重要な中間体である環状1、3ージケトンの2位のアルキル化反応を開発することが出来た。溶媒を用いる必要はなく、少過剰量のアルコ-ルと直接反応させることにより、対応する生成物が高収率で得られた。また、生成物の単離に際しても、触媒の除去は必要でなく、直接蒸留する事が可能である。適用できるオキシランも、一置換、二置換ともに可能であり、アルコ-ルは3級のものを除けば実用上問題が無いものとの感触を得た。本アンチモン化合物触媒は、不安定なオキシラン、例えばスチレンオキシド、に対しても重合活性は示さず、従って反応に際しての幅反応を考慮する必要はない。2)環状1、3ージケトンの選択的Cーアルキル化反応シクロペンタンー1、3ージオンの2位のアルキル化がPh_4SbOMeを用いる事により、40°C程度の温和な条件で進行した。アルキンハライドは、エステル基、不飽和結合などを有していても幅反応の起こらない点は、本反応系の重要な特長の一つである。シクロヘキサンー1、3ージオンも同様にアルキル化が可能である。
バナッハ環上の位相的な量を保存する写像の代数的性質の研究

関数環をはじめとする半単純可換バナッハ環やヒルベルト空間上の作用素からなるバナッハ環に関係した集合で乗法的にスペクトルを保存する写像や非対称に乗法的にスペクトル半径を保存する写像,またある種の距離を保存する写像の代数構造を研究し,それが線形であることや乗法的となる現象について研究を行った。このことによりバナッハ環の間の写像の保存問題についての新たな知見を得ることができた。局所コンパクトHaussdorff空間上の複素数値連続関数で無限遠点で消えるものからなる一様ノルムに関して閉じたバナッハ環を一般化関数環という。バナッハ環としては同形ではない2つの一般化関数環でその間に乗法的にスペクトルを保存する写像が存在するようなものを構成した。これは、単位元のある関数環では乗法的にスペクトルを保存する写像で結ばれる関数環はバナッハ環として同形であることと対比される結果で、単位元の有無がバナッハ環としての同型性に関しては異なった結果を導くことを示している点で興味深いといえる。このことから一般化関数環から一般化関数環への乗法的にスペクトルを保存する写像の形を決定すること、またそのような一般化関数環のあいだの関係は何か、に興味が持たれる。本研究により、一般化関数環から一般化関数環への乗法的にスペクトルを保存する写像はバナッハ空間としての同形写像を与えることが証明され、従ってこのような2つの一般化関数環はバナッハ環として同形といえるとは限らないが、バナッハ空間としては同形であることが分かった。つまり、乗法的にスペクトルを保存すると線形演算は保存されるが、一方では積が保存されるとは限らないという一見ら可換バナッハ環への写像で乗法的にノルムを非対称に保存する写像の研究については来年度以降に発展できると考えている。関数環から関数環への全射Tで単項式的に抹消スペクトルを保存するものの形を決定した。これは、乗法的に抹消スペクトルを保存する写像の結果の一般化である。対象の2変数単項式がm乗n乗の形でmとnの最大公約数が1であれば、対象の写像は荷重合成作用素であることが分かった。またmとnの最大公約数dがlより大きい場合はTのd乗がある荷重合成作用素のd乗であることを示した。この場合にT自身が荷重合成作用素となるとは限らず、線形でも乗法的でもないような例を示した。また、実バナッハ関数空間に対するStone-Weierstrass型の定理を証明した。その際に対象のバナッハ関数空間の分離条件が大切で、既に知られている条件を緩めた条件のもとで作用関数がアファインのみであることを特徴付けた。また、商的にノルムを非対称に保存する写像についてもその形を決定することができた。これは乗法的にノルムを非対称に保存する写像に関する結果を含むものでより一般的なものである。特に対合に対象性を仮定して述べられた半単純可換バナッハ環の間の写像の代数的性質に関する定理を、非可換のバナッハ環の場合も含めて対合の対象性の仮定なしに述べることの可能性を示した点で興味深いものである。また、単位的バナッハ環の可逆元からなる群の位相構造と代数構造の研究を行い,ある種のバナッハ環の可逆元からなる開部分群どおしが距離空間として同形であることと距離付け可能群として同形であることの同知性を示すことができた。この結果はつくばセミナーで発表されまた来年度に行われるアメリカ数学会のスペシャルセッションで講演する予定であり、さらに論文を作成しているところでもある。単位的半単純可換バナッハ環の可逆元からなる群の開部分群から単位的バナッハ環の可逆元からなる群の開部分群への等距離写像Tが単位元を保存するとき,Tはそのバナッハ環の間の実元環としての等距離同形写像に拡張できることを示し,従って対応する可逆元からなる群の間の等距離(群)同形写像であることが示された。Mazur-Ulamの定理を拡張した。その際に亜距離空間を導入し,強鏡映的亜距離空間や超鏡映的亜距離群の間の亜距離を保存する写像の代数構造を決定した。特にコンパクトHausdorff空間X上の正値連続関数からなる群から他のコンパクトHausdorff空間Y上の正値運続関数からなる群へのある種の亜距離を保存する写像の構造を決定した。これは単位的C*環の可逆正要素全体の集合の間のThompson距離保存写像に関するMolnarの結果の可換版と見ることもできる。AとBを単位的な半単純可換バナッハ環とし,SとTをAからBへの単位的な全射でスペクル半径を非対称積的にうつす写像とする。このときSとTは一致して,それらはAからBの上への実同形写像であることを示した。

また関数環AとBとAの適当な条件をみたす部分集合Iを考えてr,tをIからAへの写像で,S,TをIからBへの写像としてIの任意の関数f,gについてS(f)T(g)の末梢スペクトルがr(f)t(g)の末梢スペクトルに含まれるときBのChoquetからAのChoquet境界への同相写像φが存在してS(f)(y)=r(f)(φ(y))とT(f)(y)=t(f)(φ(y))がIの任意の関数fとBのChoquet境界の任意の点yについて成立することを示した。この結果は乗法的に末梢スペクトルを保存する写像の代数構造に関する既存の結果の拡張になる。また極大イデアル空間の第1Cechコホモロジー群がつぶれている可換C*環ではr(f)=fのm乗やt(f)=fのn乗は全射となるため,この場合には既存の結果を含むことが分かる。
脳腫瘍治療前後の拡散強調像を用いた画像解析による早期治療効果判定の有用性

これまでに蓄積してきた脳腫瘍治療前後の拡散強調画像に対し、fDMによる解析を行った。解析にはI-responseを用い、DICOM画像の解析編集はOsiriXを利用した。硼素中性子捕捉療法により治療を行った悪性神経膠腫を対象として、生存期間とfDMの経時的変化を検討した。BNCTでは治療後早期(7日以内)のADC値減少容積(%Vd)が予後との相関を示し、超早期の効果判定の可能性を示した。これまでに当施設で蓄積してきた脳腫瘍治療前後の拡散強調画像に対し、fDM(Rossほか、Proc Natl Acad Sci USA 2005 ; 102 : 5524-5529)による解析を行った。解析にはI-response fDM analysis(Windows)を用い、DICOM画像の解析編集はOsiriX(Macintosh)を利用した。最初に、悪性神経膠腫症例での標準治療(X線分割外照射+化学療法(テモゾロミド))により治療を行った例で、本解析法を用いたRossらの報告(J Clin Oncol. 2008 Jul 10 ; 26(20) : 3387-94)と対比し、同等の結果が得られ、早期の治療効果・予後判定が可能となることがわかった。そこで次に、当施設で治療を行った症例のうち、棚素中性子捕捉療法(BNCT)により治療を行った悪性神経膠腫を対象として、生存期間などの情報とfDMの経時的変化を検討した。通常の放射線治療(分割外照射)では、腫瘍のADC値は治療が進むにつれADC値上昇の容積(%Vi)が増加し、予後との相関が見られていたが、BNCTでは治療後早期(2, 7日目)のADC値減少の容積(%Vd)が予後との相関を示し、超早期の効果判定の可能性を示した。BNCTでは単回局所高線量の粒子線治療であるごとから、別の機序での細胞死が関与しているものと考えられ、動物実験等による詳細な病理組織学的検証が必要と考えられる。さらに本年度、拡散強調像を用いた病態解析手法として、拡散テンソル画像(FA値解析)を開始し、fDMとの対比を試みており、PETと同時に解析を追加・検証中である。また本年度は、動物実験の開始に先立ち、ラット脳腫瘍モデルを用いて拡散強調画像等のMRI画像を取得し、脳腫瘍モデルが画像上、実際の臨床所見に合致することを確認し、得られた画像を用いてfDM解析が可能であることを確認した。これまでの当施設における脳腫瘍治療例を対象に、治療前後のMRIガドリニウム増強T1像等をもとに、拡散強調画像に対し、fDM(PNAS 2005;102:5524-5529)による解析を行った。最初に、悪性神経膠腫症例での標準治療(X線分割外照射+化学療法(テモゾロミド))により治療を行った例で、本解析法を用いたRossらの報告(J Clin Oncol.2008 26:3387-94)と対比し、同等の結果が得られ、早期の治療効果・予後判定が可能となることがわかった。そこで次に、当施設で治療を行った症例のうち、細胞選択性を有する高線量粒子線治療であるホウ素中性子捕捉療法(BNCT)により治療を行った悪性神経膠腫を対象として、生存期間などの情報とfDMの経時的変化を検討した。通常の放射線治療(分割外照射)では、腫瘍のADC値は治療が進むにつれADC値上昇の容積(%Vi)が増加し、予後との相関が見られていたが、BNCTでは治療後早期(2,7日目)のADC値減少の容積(%Vd)が予後との相関を示し、超早期の効果判定の可能性を示した。BNCTでは単回局所高線量の粒子線治療であることから、別の機序での細胞死が関与しているものと考えられ、動物実験等による詳細な病理組織学的検証が必要と考えられる。さらに本年度、拡散強調像を用いた病態解析手法として、拡散テンソル画像(FA値解析)を開始し、fDMとの対比を試みており、PETと同時に解析を追加した。治療効果の判定方法として、いずれの画像診断も高感度であったが、fDMによる解析は最も簡便で、頻回の観察に優れていた。全体を通じて結果は良好で、今後の臨床応用に向け有意義な成果を見いだせた。
光の描材・ライトストリークの実用的教材開発と普及

本研究は単なるお絵かき(落書き)になりがちなペンライトアートを発展させ,現行の学習指導要領にも対応し,加法混色など光の性質を学ぶこともできる教材として開発した。なお,本研究において開発された教材を便宜上「ライトストリーク」と名づけた。そして、学会での発表や公開講座を通じて教材の普及をおこなった。当該年度は本事業の2年目であり、1年目の試作および教材開発をベースに、学会での研究発表や教育現場での試行をすすめた。まず教材企画販売会社の協力により、教材の試作品は年度はじめに完成した。その成果については、学術論文としてまとめ、8月に2013アジア基礎造形連合学会天津大会(中国)で発表し、海外研究者からの意見も得ることができた。前年度同様に、7月に教材販売会社が主催する造形ワークショップ(主に都内で図画工作や美術を担当している教諭を対象とした研修会)に講師として参加し、ワークショップを通じて光の描材としての研究をすすめることができた。また、千葉大学教育学部との共同により、10月に同大学附属小学校で児童を対象に教材の試行を実践的におこなった。そういった試作品完成および授業実践を通じて、教材の可能性や可能性や改善点をさらに探求することができた。当該年度は本事業の1年目であるが、主に教材企画販売会社の協力を得て、光の描材「ライトストリーク」の教材開発を着実にすすめた。申請書に記載していた通り、先行研究において、ライトストリークの基本的かつ概念的な仕組みは既に出来ていたが、それを実用化(教材化として普及させる完成度)には至っていなかったことが問題であった。ゆえに、本事業では全国の学校に美術教材を販売している教材企画販売会社に協力してもらうように先ず協議した。その結果、具体的な商品化を目指し、数度の試作品づくりを繰り返した。教材企画販売会社を通じて玩具メーカーの協力も得て、本研究者が手作りでつくったプロトタイプでは限界だった問題点を改善することができた。例えば、消耗が激しかったニッケル電球を、使用時間が長いLED電球に変えたりするなど、実際の教育現場で耐えられるような再設計をすることができた。設計を見直したりしたため、試作品づくりは平成24年度中には終わらなかったが、研究実施計画で予想していた通り25年度中には完成する見込みである。同時に、教材販売会社が主催する造形ワークショップ(主に都内で図画工作や美術を担当している教諭を対象とした研修会)に講師として参加し、ワークショップを通じて光の描材としての可能性や改善点を探求することができた。また、本研究の派生として光の加法混色にも着目し、効果的な加法混色の教材化についても研究することができた。研究成果は日本基礎造形学会第23回大会で発表したが、本事業にもフィードバックすることができた(再設計において、混色もできる色光に配色することにした)。本事業の1年目および2年目(平成24年度および25年度)は学会発表をしながら、主に教材の開発をすすめてきた。さらに光の軌跡を表現した作品発表もしながら教材開発をすすめたが、本事業の3年目には平成26年度科研費「ひらめき☆ときめきサイエンス」に採択され、公開講座「光の描材・ライトストリークで、絵を描いたり混色をつくってみよう」(整理番号HT26041)を実施した。講座は平成26年8月9日、会津大学短期大学部体育館にて受講者28名が受講した。なお、プログラムの主な内容は次の通りである。(1)講義「光の絵を描いたり、光の混色をつくる」、(2)実験「光の描画、光の混色」、(3)グループごと光の絵(ライトアート)を制作、(4)完成したライトアート作品の鑑賞および講評、(修了式(児童・生徒に未来博士授与)。また、本研究成果は色彩教育の図書として平成27年6月に発行された「色のまなび事典」(株式会社星の環会発行、茂木一司主著、高橋延昌他共著)では『光であそぶ1光の軌跡』の事例としても掲載された。なお、本事業は教材の開発と普及が主な内容であったが、普及させる目的で予定していた公開講座の部分を上述した平成26年度科研費「ひらめき☆ときめきサイエンス」の予算で消化することができたため、全体収支において残額が増えてしまった。グラフィックデザイン光の描材「ライトストリーク」の教材開発および普及が本研究の目的であるが、教材企画販売会社の協力により、教材モデルそのものの試作は完成に至った。今後は、実際の教育現場で活用するための運用モデルの構築および普及活動が課題となる。ただし、当初計画では試作品を教材として活用するための方法を学生アルバイトで試行しようと考えていたが、より良い完成度を目指して再設計をしたため、そういった研究補助はあまり活用できなかった。光の描材「ライトストリーク」の教材開発および普及が本研究の目的であるが、教材企画販売会社の協力により、教材モデルそのものは商品化した場合の製造コストも考慮され、当初予想していた以上に具体的かつ実用的にすすめられている。ただし、当初計画では試作品を教材として活用するための方法を学生アルバイトで試行しようと考えていたが、より良い完成度を目指して再設計をしたため、そういった研究補助は活用できなかった。

次年度で活用する。今後も教材販売会社の協力を得たり、千葉大学教育学部との共同により教育現場での活用を視野に入れながら教材化をすすめる。また、この研究成果をもとに独立行政法人日本学術振興会の「平成26年度ひらめき☆ときめきサイエンスようこそ大学の研究室へ」(プログラム名:光の描材・ライトストリークで、光の絵を描いたり、光の混色をつくってみよう)に採択された。その関連事業との連携により、本研究成果の普及もすすめる。今後も教材販売会社の協力を得て、教材化をすすめる。また、教材の試作については平成25年8月に中国天津で開催されるアジア基礎造形連合学会天津大会で研究発表する予定であり、その成果を本事業へさらにフィードバックする。また、教育現場での具体的な活用を目指して、学生アルバイト等を通じて試行を繰り返しながら、普及に至るノウハウを蓄積する。当初計画では1年目で完成した試作品を教材として活用するための方法を学生アルバイトで試行しようと考えていたが、より良い完成度を目指して再設計をしたため、とくに人件費については研究補助をあまり活用できなかった。教材開発および普及については学生アルバイトを活用する。1.教材企画販売会社や研究分担者との打ち合わせ(国内旅費)2.アジア基礎造形連合学会天津大会での研究発表(海外旅費)3.試作品を試行する学生アルバイト(人件費)4.教材企画販売会社への開発委託費5.データ記録やプリンタ消耗品など(物品費)
ミスマッチ修復欠損大腸癌の化学療法確立の基礎的検討:DNA損傷特異性と薬剤感受性

大腸癌の発生機構には多くのがん遺伝子やがん抑制遺伝子の異常の累積が重要な役割を演じている。遺伝子異常の蓄積を誘発する機構の1つとしてDNA mismatch repair(MMR)systemの欠損が知られており、ヒトMMR遺伝子はこれまでにhMLH1やhMSH2など7種が報告されている。また、MMR欠損細胞はシスプラチン(CDDP)などの化学療法剤に抵抗性を示すことが知られている。しかしながら、大腸癌の化学療法に用いられる多くの抗癌剤に対するMMR欠損腫瘍の感受性並びに化学療法後のMMR欠損腫瘍の出現頻度やどのような化学療法剤によって誘起されるのかは不明である。そこで、MMR欠損細胞の抗癌剤感受性とMMRの生理学的意義の解明を中心に以下の検討を行った。1)MMR欠損細胞の薬剤感受性ヒト大腸癌由来細胞株4株2系統の細胞株を用いてclonogenicassayを行い、大腸癌に多用される抗癌剤を中心にそれらの細胞毒性を比較した。その結果、5-FUやirinotecanなどにMMR欠損細胞が抵抗性を示すことならびに感受性に差のない薬剤や欠損細胞に強い細胞毒性を示す臨床応用可能な抗癌剤を見い出した。2)高感受性の作用機作MMR欠損細胞がある種の抗癌薬に高感受性を示す理由を明らかにするためにaphidicolinやhydroxyurea等を用いて解析を行ったところ、MMRは細胞周期のDNA replicatlon completion checkpointに深く関与し、MMR機構はアポトーシスを抑制していることを強く示唆する結果を得た。3)薬剤の迅速なスクリーニング系の開発感受性試験の迅速化を図るため従来の3分の1の期間で評価可能な大腸菌を用いた測定法を確立した。4)臨床検体におけるMMR蛋白の有無の検討大腸癌患者の腫瘍組織の免疫組織化学染色を行い、現在までに数例の非染色検体を見いだしているが、全て初発例であった。再発症例については今後の検討課題となった。消化器癌、特に大腸癌の発癌機構には多くのがん遺伝子やがん抑制遺伝子の異常の累積が重要な役割を演じている。また、MMR欠損細胞はシスプラチン(CDDP)などの化学療法剤にlow levelの抵抗性を示すことが知られている。そこで、本年度はMMR欠損細胞が大腸癌治療に用いられる化学療法剤にどのような感受性を示すかを中心に以下の検討を行った。1)MMR欠損細胞の薬剤感受性ヒト大腸癌由来細胞株HCT116およびHCT116+ch3を用いたクロノジェニックアッセイを行い、大腸癌に多用される化学療法剤の細胞毒性を比較した。その結果、5-FUやtegafurといった代謝拮抗薬やカンプトなど多くの抗癌剤に対し、MMR欠損細胞が抵抗性を示すことが明らかとなった。2)高感受性の作用機作MMR欠損細胞が高感受性を示すDNA polymerase阻害剤の作用機作の解明を行ったところ、これら阻害剤はMMR欠損細胞のapoptosisを選択的に誘導することが判明した。3)薬剤の迅速なスクリーニング系の開発感受性試験の迅速化を図るため、GFP標識細胞の樹立に取り組んでいるが、現在のところ樹立には至っていない。4)臨床検体におけるMMR蛋白の有無の検討

大腸癌患者の腫瘍組織の免疫組織化学染色を行い、現在までに数例の非染色検体を見いだしている。これらの症例について、治療歴など詳細については検討中である。消化器癌、特に大腸癌の発癌機構には多くのがん遺伝子やがん抑制遺伝子の異常の累積が重要な役割を演じている。遺伝子異常の蓄積を誘発する機構の1つとしてDNA mismatch repair(MMR)systemの欠損が知られており、ヒトMMR遺伝子はこれまでにhMLH1やhMSH2など7種が報告されている。また、MMR欠損細胞はシスプラチン(CDDP)などの化学療法剤にLow levelの抵抗性を示すことが知られている。しかしながら、大腸癌の化学療法に用いられる多くの抗癌剤に対するMMR欠損腫瘍の感受性並びに化学療法後のMMR欠損腫瘍の出現頻度やどのような化学療法剤によって誘起されるのかは不明である。そこで、本年度は昨年度に引き続きMMR欠損細胞の抗癌剤感受性とMMRの生理学的意義の解明を中心に以下の検討を行った。1)MMR欠損細胞の薬剤感受性ヒト大腸癌由来細胞株HCT116およびHCT116+ch3とLoVoおよびLoVo+ch2を用いたクロノジェニックアッセイを行い、大腸癌に多用される抗癌剤の細胞毒性を比較した。その結果、topotecanに対するMMR欠損細胞と非欠損細胞の感受性に差は見られず、また、gemicitabineは欠損細胞に強い細胞毒性を示した。これらの結果から、両薬剤ともにMMR欠損癌細胞の化学療法に有効であることが示唆された。2)高感受性の作用機作MMR欠損細胞がある種の抗癌薬に高感受性を示す理由を明らかにするためにaphidicolinやhydroxyurea等を用いて解析を行ったところ、MMRは細胞周期のDNA replication completion checkpointに深く関与していることを強く示唆する結果を得た。3)薬剤の迅速なスクリーニング系の開発感受性試験の迅速化を図るため、大腸菌を用いた測定法の確立を行い、現在、薬剤の種類を増やして、その評価を行っている。4)臨床検体におけるMMR蛋白の有無の検討大腸癌患者の腫瘍組織の免疫組織化学染色を行い、現在までに数例の非染色検体を見いだしているが、全て、初発例であった。再発症例については、今後の検討課題となった。
HtrA2ノックアウトマウスにおけるHtrA2基質蛋白蓄積と基底核回路断裂の解析

われわれは当該研究にて、HtrA2ノックアウト(KO)マウスが生後30日で死亡すること、線条体ニューロンが脱落し、ユビキチン陽性蛋白が蓄積すること、COXIおよびCOXIV、parkinタンパク量が低下し、LC3-IIが増加すること、骨格筋・心筋が萎縮すること、を見出した。さらにHtrA2 KOマウスをParkin KOマウスと掛け合わせたdouble KOマウスはHtrA2 KOマウスよりも寿命が短縮することを示した。さらにわれわれは、アルツハイマー病の老人斑と神経原線維変化・ALSの脊髄前角細胞の細胞質に出現する封入体にHtrA2免疫反応が見られることを明らかにした。本研究の目的は、第13番遺伝性パーキンソニズム(PARK13)の感受性遺伝子と考えられるHtrA2が細胞死を惹起する機序を解明することである。この目的のため、われわれはHtrA2ノックアウトマウスを作成し、その行動解析と病理学的・生化学的解析を行う計画を立てている。平成21年度においてわれわれはまず、HtrA2ノックアウトマウスのheterozygoteをオス1匹に対しメス2または3匹の割合で10組かけ合わせ、91匹の仔を得た。遺伝子型の内訳はwild type(wt:+/+)は25匹(オス:15匹、メス:10匹)、ノックアウト(ko: -/-)は16匹(オス:9匹、メス:8匹)、heterozygote(ht: +/-)は49匹(オス:26匹、メス:23匹)であった。生後10日目から体重測定を開始したが、14日目以降からkoにおいてのみ体重増加が認められず、生後30日でサンプリングするまで7.5g前後で推移した。これに対し、htはwtと同様の体重増加を示した。生後30日の時点でsacrificeし、脳・肝臓・心臓・骨格筋を免疫組織学的および生化学的解析の為に採取した。現在までに行ったパイロット研究の結果、koマウスの脳においてミトコンドリア呼吸鎖複合体IVのサブユニットCOX IおよびCOX IVのタンパク量の顕著な低下が認められた。これらのタンパクはミトコンドリアDNA(mtDNA)によってコードされているが、核がコードする複合体IのサブユニットNDUFA9の発現量には変化が見られなかった。脳から単離したmtDNAの解析でもkoマウスにおいてのみ、その異常を示唆する結果が得られつつあることから、今後はHtrA2の欠損によるミトコンドリアの異常およびそのmtDNAに及ぼす影響について解析を進める予定である。当該年度においてわれわれはHtrA2ノックアウトマウスにおける経時的な神経細胞脱落の評価・POLG蓄積部位の検討・大脳基底核マーカーの局在の検討、および、アルツハイマー病におけるHtrA2の分布の検討を行った。HtrA2ノックアウトマウスは生後1ヶ月で死亡するため、生後10日、20日、およひ30日齢において、エーテルによる深麻酔下に断頭して採取した新鮮脳組織、およびパラホルムアルデヒドにて灌流固定した脳組織から、前頭葉・海馬・線条体・視床・中脳を切り出し、7μm厚の切片を作成して、H & E、K-B、Bielschowsky染色、および、GFAP、Iba-1、CD68に対する免疫組織化学染色を施行した。その結果、このマウスでは生後10日目からすでに線条体ニューロンの著明な脱落が認められた。その他の部位の変性については現在検討中である。また、われわれはPOLGに対する免疫組織化学染色を行ったが、残念ながら有意な免疫反応は認められなかった。この結果はPOLGの異當蓄積が認められないことを意味するわけではなく、抗体の感度に問題があると考えられた。一方、HtrA2ノックアウトマウスにおける太脳基底核回路の断裂を検討するため、線条体・淡蒼球を含む切片において、DAT、calcineurin、calbindin、met-enkephalin、substance Pに対する抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、HtrA2ノックアウトマウスの基底核ではこれらのマーカーがすべて著明に脱落していた。この結果は、このマウスでは線条体の中型有棘細胞が脱落していることを示唆している。さらにわれわれは生化学的解析によって、HtrA2ノックアウトマウスの脳においてはユビキチンリガーゼParkinの発現低下が生じていることを明らかにした。最後にわれわれは、アルツハイマー病においてHtrA2免役組織化学を行い、アルツハイマー病の特徴的病理所見である老人斑と神経原線維変化にHtrA2免疫化学反応が見られることを見出し、アルツハイマー病の病因にKtrA2が関与している可能性を指摘する論文発表を行った。最終年度ではHtrA2ノックアウト(KO)

マウスの病理学的解析をさらに進め、(1)残存線条体ニューロンの細胞質にユビキチン陽性蛋白が蓄積し、autophagyのmarkerであるLC3の免疫反応が増強、(2)黒質を含めその他の部位は異常なし、(3)骨格筋・心筋の萎縮、を明らかにした。さらに、(4)western blot解析によりHtrA2 KOマウス脳ではautophagy活性化のmarkerであるLC3-IIが増加し、(5)HtrA2 KOとParkin KOの掛け合わせマウスではHtrA2 KOマウスより生存日数が10日短縮することを明らかにした。研究期間全体を通じてわれわれは、(1)HtrA2 KOマウスを作製し、このマウスでは(2)生後14日目から体重増加が見られず、生後30日で死亡、(3)線条体ニューロンが脱落し、残存ニューロンの細胞質にユビキチン陽性蛋白が蓄積し、autophagyが亢進、(4)ミトコンドリア呼吸鎖複合体IVのサブユニットCOX IおよびCOXIVの低下、(5)Parkinタンパク量の低下、(6)LC3-IIの増加、(7)中枢神経では線条体以外の部位に変性なし、(8)骨格筋・心筋の萎縮、を明らかにした。これらの結果から、HtrA2 KOマウスではHtrA2の基質であるPOLGの機能が障害され、ミトコンドリアDNAの発現が障害されることによりCOXI・COXIVが低下してミトコンドリア機能が障害され、線条体や心筋・骨格筋障害が生じると考えられた。さらにわれわれは、(9)HtrA2 KOマウスをParkin KOマウスと掛け合わせたdouble KOマウスはHtrA2 KOマウスよりも寿命が短縮することを明らかにした。これは、doubleKOマウスではHtrA2KOマウスで蓄積した異常ミトコンドリアを、parkin欠損のために除去できず、細胞死が促進されたと考えられる。すなわちこの結果は、parkinが異常ミトコンドリアのmitophagyに関与していることをin vivo実験系で明らかにした初めての成果である。さらにわれわれは、アルツハイマー病の特徴的病理所見である老人斑と神経原線維変化にHtrA2免疫反応が見られること、脳幹型および皮質型Lewy小体においてXIAPとHtrA2が共存していることを明らかにし、アルツハイマー病、パーキンソン病、Lewy小体型認知症の病因にHtrA2が関与している可能性を指摘した。
細胞ストレスからβ細胞不全、インスリン抵抗性へ：新たなメカニズムの探究

小胞体ストレス、酸化ストレスなどの細胞ストレスは細胞機能に種々の変化をもたらし、臓器障害、疾病へと繋がる。本研究では、糖尿病の成因としての細胞ストレスによるβ細胞不全、インスリン抵抗性へのメカニズムの解明を目指す。β細胞においては細胞ストレスによるβ細胞不全への脱分化・運命転換の役割とそのメカニズムを探究する。インスリン抵抗性においては、細胞ストレスによる生体時計の撹乱、なかでも出力系時計遺伝子であるDBP・E4BP4に着目し、肝細胞、マクロファージ(脂肪組織)でのそれらの役割とインスリン抵抗性への関連を探究する。さらには、糖代謝と時計遺伝子の関連をヒトを対象とした臨床研究で明らかにする。
食事調査のための食物・栄養データベース構築に関する研究

既存の食事記録データから、日本人が日常的に摂取する複数の食品が混在する料理として野菜炒めを選び、典型的なレシピを作成して調理した。その料理を撮影すると共に、体積を測定した。また、調理前後に食材の重量を測定し、調理による食品の重量変化係数を算出した。これらの基礎データを用いて、料理100ml当りの栄養素成分表の作成を試みた。さらに、パソコンの画面上に取り込んだ料理写真から料理の体積を推定する方法を検討した。【目的】対象者の負担が少ない食事調査法として、近年携帯電話のカメラ機能を活用した画像で食事内容を記録する方法が利用されるようになってきた。しかし、写真から料理ごとに個別の食材重量を推定することは非常に困難な作業である。欧米諸国では保持係数(Retention factors)、水分調整(Moisture adjustment)、脂肪調整(fat adjustment)、料理による食物の重量変化係数(Yield factor)等を用いて料理のレシピデータから栄養素等含有量を算出している。しかし、我が国においては調理による重量変化率が示されている食品は主として野菜類や魚類で、すべての野菜について公表されている訳ではなく、しかも調理方法は「ゆで」や「水煮」がほとんどである。日本の食文化に対応した調理方法別重量変化係数を整備するための基礎資料の集積を本研究の目的とした。【方法】過去に実施した地域住民の秤量記録法による食事調査データに基づき、出現率の高い料理として野菜妙め用いた。使用頻度の高い材料としてにんじん、キャベツ、ピーマン、豚肉を選定した。調理方法は、上述の食材を2種類又は3種類の材料を組み合わせ、加熱時間は予備実験の結果から生の食材重量の約80%まで妙めることとし、家庭用フライパンに材料重量5%の油、0.8%の食塩を用いて加熱調理(IH調理器3.0kW出力レベル4)した。加熱終了時及び終了後3分・5分・20分の重量を測定した。【結果】複数材料の調理では、重量が80%になるまでに要した妙め時間は3分30秒5分50秒であった。また、加熱終了後の重量変化は、放置5分後にほぼ一定になり、調理終了時の重量からさらに5%減少した。【結論】加熱調理終了時には食材重量は8090%に減少した。調理後の重量変化も考慮すると、複数食材を使用する日本の野菜妙めについては、食材生重量の7580%の重量変化係数が適当と考えられた。野菜妙めの調理操作による食材(生)の重量変化率(加熱終了後20分時点)は、単品調理ではにんじん:7178%、キャベツ:7889%、ピーマン:8690%、豚肉:7278%と調理により重量が減少することが示された。複数食材を組み合わせると、(豚肉50g+にんじん100g)で7176%、(豚肉50g+ピーマン100g)で8285%に減少した。単品調理による重量変化率から複数食材を用いた野菜妙めの重量変化率を算出すると、複数食材を実際に調理した時の重量変化率より若干重量変化率は大きかったが、実測値と計算値に有意差は認められなかった。煮物では、かぼちゃの煮物は4人分102108%、2人分で110113%と調味料と水を入れて加熱したため、煮物としての重量は生重量よりやや増加した。肉じゃがでは、かぼちゃと同様調味料と水を加えて加熱したが、過熱時間がかぼちゃより長くかかるため、4人分で92%、2人分で89%と減少した。肉じゃがの食材を単品で煮た時の重量変化率を利用して肉じゃがの料理としての重量変化率を算出して実測値と比較すると、両方法の重量変化率に大差は認められなかった。これらの結果から、妙め物、煮物では、単一の食材の重量変化率を利用して複数の食材を用いた料理の重量変化率を推定できる可能性が示された。料理の体積測定は、(1)料理を食器に盛り付けた状態で赤外線を利用して3D測定器により料理の体積を描出する方法、(2)食器に盛り付けた状態で撮影した画像から体積測定システムを利用して体積を推定する方法、(3)料理を食器から計量カップに移し、表面をならした状態で目盛りを読む簡易法、の3法を検討した。それぞれ短所と長所があるが、(2)の方法が精度と共に実用性も高いと考えられた。しかし、体積測定システムの操作が測定値に影響を及ぼすので、測定者の訓練方法の確立が急務であることが示された。本研究の主目的である2項目について説明する。(1)料理の画像からその料理の体積を推定する方法の妥当性の検討:3次元スキャナ(DAVID Vision Systems GmbH)と3次元画像統合ソフトを用いて3次元座標データを作り、体積の計算にはExcel VBAにより作成したシステムを用いた。測定検討用の立体は1つ当たり7.3mm×2.25mm×1.25mmの消しゴムとし、これを8個組み合わせて数種の立体を作り測定した。

測定条件決定後、測定者、測定順、立体の形、1つの角度でのデータの読み取り(撮影)、立体を回転させ複数回読み取ったデータ(スキャン)、交互作用について、体積測定精度(測定体積/実体積)を指標にして検討した。精度は常に1より大きく、測定者と測定順の体積測定への影響は認められず、撮影枚数及び形の違いに有意差を認めたが、補正の可能が示唆された。(2)料理を調理する際の加熱調理による素材食品の重量変化率データ蓄積:現在わが国で公表されている調理の食品別水分調整係数は、調味料を使用しない調理法であるので、食塩(食材の0.8%)と植物油(食材の5%)を用いた加熱調理の水分調整係数を野菜炒めについて検討した。根菜として人参、葉菜としてキャベツ、果菜としてピーマン、肉類として豚肉を用いて食塩、植物油の使用の有無別に、食材の重量、水分含有量、脂質含有量の調理による変化を測定した。植物油の付着は、野菜の種類と食塩添加の有無にかかわらず野菜炒めの4.04.5%であった。調理による食材の重量減少量と水分減少量は、食塩、植物油の使用の有無にかかわらずほぼ一致した。一方、豚肉(こま肉)は、重量減少量と水分減少量は食塩と植物油の添加の有無にかかわらずほぼ一致したが、豚肉の脂身の分布が一様ではないため、豚肉の脂質含有量のばらつきは調理条件の差よりも大きく、一定の傾向が認められなかった。料理の体積を推定する方法の目途はついたが、まだ測定者の訓練方法が確定していない。しかし、訓練方法が決定されれば、調理実験はおおむね順調に進めることが可能になる。24年度が最終年度であるため、記入しない。画像から体積測定システムを利用して料理の体積を測定する者の訓練方法を決定すれば、その後は一般の日本人が家庭で食べる料理で出現頻度が高い料理を選定し、順次調理して重量と体積のデータを蓄積することができる。
漁種交替を伴う浮魚類の最適漁獲政策

非定常な海洋生態系を漁業によって有効かつ持続的に利用するには、多魚種を一括して管理することが重要である。本研究では、特に資源変動が著しい浮魚類を取り上げ、マイワシ、マサバ、カタクチイワシ、マアジ、サンマ、スルメイカなどの主要魚種を効率的に利用する漁獲政策を検討した。その結果、以下のことが明らかになった。(1)複数の独立に変動する資源がある場合、その時点で優先する魚種を集中して漁獲するスイッチング漁獲という管理方策を検討した。この方策は長期的な草漁獲量を増やすことができ、資源が減ったときの乱獲を防ぎ、保全に有効であり、資源変動幅も小さくなることが理論的に示された(Katsukawa 2002)(2)コホート解析の結果、1990年代のマサバ太平洋系群を以前のように成魚中心に漁獲していれば、資源が回復していた可能性が示唆された。さらに、今後も90年代と同じ漁獲圧をかけ続けた場合、今後資源が回復する可能性がきわめて低いことが示唆された。(松田ら2002)(3)成長乱獲と加入乱獲が将来の漁獲量に与える負荷を現在の漁獲量と比較する統一的な理論を構築した(Matsuda et al. 1999)。さらに、乱獲と保全を繰り返したミナミマグロのような魚種について、齢構成の歪みから今後も単調に資源が回復するのではなく、振動しながら回復し、成魚資源量が一時的に減少する可能性があることを示した(Mori et al. 2001)。なお、本研究の途中で松宮義晴教授が急逝し、その課題を勝川俊雄が引き継いだ。日本近海の各魚種の漁獲量の年変動をデータベース化した。また、漁獲物の年別齢別漁獲尾数から過去の資源尾数を推定する方法について、噛乳類学の分野で新たな研究の展開があり、その方法を取り入れつつ、最尤法を用いて資源尾数を推定する方法を考案した(次年度発表予定)。また、不確実性、非定常性を取り入れた資源管理政策は近年欧米でadaptive managementと呼ばれる方法が定着しつつあり、その紹介を行うとともに(鷲谷・松田1998)、その手法と日本の水産資源学でかって提唱されていたフィードバック管理の類似性を指摘し、後者に基づく管理方策を道東地域エゾシカ保護管理政策に応用した(Matsuda et al.1999:Res.Pop.Ecol.)。これらの管理政策を水産資源管理に応用した場合の有効性と問題点について紹介した(松田1998)。また、浮魚類の過度の利用がどの程度絶滅の恐れを招くかについて解析し(Matsuda et al.1998)、持続可能な漁業と生物多様性保全の関係について論じた(Matsuda1998)。生態系が定常状態になく、短期的にも長期的にも非定常であると言う前提のもとで、漁業資源の有効利用を図る指標として、生態学の繁殖価を応用した収穫価という概念を提唱した(松田、山内ら1999)。また、非定常系における野生生物管理という側面は、水産資源だけでなく、陸上動物にも共通している。北海道から水産学の成果を応用するよう求められ、道東地区エゾシカ保護管理計画策定にかかわり、その理念を発表した(松田・梶ら1999)。これは、生態学的情報の不確実性と非定常性を考慮しつつ、管理に失敗するリスクを最小にするという考え方に基づいている。さらに、資源保護上の問題点として、共有の悲劇を招くことで知られる公開漁場の自由競争下のゲームで、必然的に不平等な分配が行われてしまう可能性について指摘した。

これは多くの多細胞生物に見られる異型配偶、つまり精子と卵子の大きさの不平等をもたらす収束不安定性という概念と、同値であることを示した(松田、Abrams1999)。総じて、浮魚資源は人為的な影響がなくても非定常性で、マイワシ、マサバ、カタクチイワシが交替で卓越するが、魚種交替の時期については不確実性がある。このような複雑な浮魚資源を持続的かつ有効に利用するには、来年度には以下のことを実証する。(1)市場の柔軟性(時代によりマイワシ、カタクチイワシなど魚種を替えて流通、消費すること)、(2)漁海況の継続的、科学的監視(魚種交替の時期や、来遊量・加入量の年変動などは海況に左右されるので、それを監視する)、(3)漁獲対象の十年名切り替え(高水準期の魚種を取り、低水準期の魚種を保全する)が必要である日本近海太平洋側のマサバ資源は,1990年代の低迷期に92年と96年の2度にわたり、卓越年級群が発生した.しかし,これらの年級群は未成魚のうちに強い漁獲圧を被り、成魚になる前に減耗し,産卵親魚量の回復には繋がらず、マサバ資源は以前低迷を続けている.1970年代から80年代にかけては成魚を中心に漁獲していたが,1993年以降未成魚の漁獲圧が高まった.1999年の資源状況から出発して,1990年代と同じ頻度で卓越年級群が各年独立に発生すると仮定した数理モデルにより,今後の資源回復状況を予想する数理モデルを開発した。卓越年級群の翌年に未成魚の漁獲を控えた場合,1970-80年代の漁獲圧で獲りつづけた場合に資源がどれだけ回復し,漁獲量が現実より多いか少ないかを,再生産関係の年変動を考慮した個体群生態学モデルを用いて検討した.その結果,90年代の漁獲圧を今後も続けた場合,マサバ資源が回復する可能性はほとんどないこと,70-80年代の漁獲圧を続けた場合,2020年までにマサバ資源が1980年代の水準にまで回復する可能性は5割以上であることが示唆された.また、現在の漁獲圧では卓越年級群直後は漁獲量が増えるものの、成魚資源量の回復に繋がらず,結果として長期的な漁獲量を増やすことができないことがわかった。非定常な海洋生態系を漁業によって有効かつ持続的に利用するには、多魚種を一括して管理することが重要である。本研究では、特に資源変動が著しい浮魚類を取り上げ、マイワシ、マサバ、カタクチイワシ、マアジ、サンマ、スルメイカなどの主要魚種を効率的に利用する漁獲政策を検討した。その結果、以下のことが明らかになった。(1)複数の独立に変動する資源がある場合、その時点で優先する魚種を集中して漁獲するスイッチング漁獲という管理方策を検討した。この方策は長期的な草漁獲量を増やすことができ、資源が減ったときの乱獲を防ぎ、保全に有効であり、資源変動幅も小さくなることが理論的に示された(Katsukawa2002)(2)コホート解析の結果、1990年代のマサバ太平洋系群を以前のように成魚中心に漁獲していれば、資源が回復していた可能性が示唆された。さらに、今後も90年代と同じ漁獲圧をかけ続けた場合、今後資源が回復する可能性がきわめて低いことが示唆された。(松田ら2002)(3)成長乱獲と加入乱獲が将来の漁獲量に与える負荷を現在の漁獲量と比較する統一的な理論を構築した(Matsuda et al. 1999)。さらに、乱獲と保全を繰り返したミナミマグロのような魚種について、齢構成の歪みから今後も単調に資源が回復するのではなく、振動しながら回復し、成魚資源量が一時的に減少する可能性があることを示した(Mori et al. 2001)。なお、本研究の途中で松宮義晴教授が急逝し、その課題を勝川俊雄が引き継いだ。
DNAメチル化が支配する造血幹細胞の自己複製能

本研究では幹細胞発生におけるDNAのメチル化の役割を明らかにするため、DNAメチル化酵素であるDnmt3aまたはDnm3b欠損マウスより胎仔肝を分離後、造血幹細胞を解析し、Dnmt3bが造血幹細胞における自己複製能獲得と維持に必須であることを見出した。Dnmt3aまたはDnmt3b欠損造血幹細胞の多分化能には問題なかった。再構築能と自己複製能についてはDnmt3a欠損造血幹細胞では異常なかったが、Dnmt3b欠損造血幹細胞では障害されていた。造血幹細胞の自己複製には適切な遺伝子発現とゲノムの安定化が必要であることが示唆された。造血幹細胞は自己複製能と多分化能を併せ持ち、個体の一生にわたってクローナルにすべての血球系を産生し続けることができる。自己複製とは親細胞が分裂を介して自分と全く同じ能力を持つ娘細胞を産生することであるが、どのような分子基盤があればこれを繰り返すことができるのかよく分かっていない。申請者らは以前de novo DNAメチル化酵素であるDnmt3aとDnmt3bのいずれも造血幹細胞の分化には必須ではないが、どちらか一方が自己複製の維持に必須であることを報告した。これは成体骨髄の造血幹細胞を対象にした研究であったが、本研究ではこれらの酵素の造血発生における役割を明らかにすることを目的とした。Dnmt3a+/-マウス同士の交配あるいはDnmt3b+/-マウス同士の交配によって野生型、ヘテロ型、ホモ型の胎仔を得た。それぞれの胎仔から胎生13.5日の肝臓を分離し、致死量の放射線照射したマウスに移植して長期骨髄再構築能を解析した。その結果、Dnmt3a欠損マウスでは造血幹細胞の機能に全く異常がないが、Dnmt3b欠損マウスの造血幹細胞では長期骨髄再構築能が著しく低下していることが明らかとなった。このことは造血幹細胞の発生にDnmt3bが必須であることを示している。胎仔肝臓から造血幹細胞を高度に濃縮したCD48-c-Kit+Sca-1+Lin-細胞を分離し、これらの細胞からgenomic DNAを抽出した。これを用いてDNAメチル化解析を行った。その結果、Dnmt3aおよびDnmt3b特異的DNAメチル化部位が明らかとなった。Dnmt3bによってメチル化されるDNAの部位と造血幹細胞の自己複製能との関連が興味深い。自己複製とは幹細胞が分裂を介して自分と全く同じ能力を持つ娘細胞を産生することであるが、どのような分子基盤があればこれを繰り返すことができるのかよく分かっていなかった。申請者らは以前de novo DNAメチル化酵素であるDnmt3aとDnmt3bのいずれも造血幹細胞の分化には必須ではないが、どちらか一方が自己複製の維持に必須であることを報告していた。以前の経験から、コンディショナルノックアウト用いて、これらの遺伝子を完全の欠損させることが容易にでないことが判明していたため、本研究ではその点を憂慮することなく、Dnmt3aまたはDnmt3bの完全欠損による造血幹細胞機能の変化を解析した。Dnmt3a+/-マウス同士の交配あるいはDnmt3b+/-マウス同士の交配によってE13.5胎仔を得た。そして、PCR genotypingによりDnmt3a^<+/+>、Dnmt3a^<+/->、Dnmt3a^<-/->、Dnmt3b^<+/->、Dnmt3b^<+/->、Dnmt3b^<-/->マウスを識別した。一定数の胎仔肝細胞と野生型骨髄細胞を用いて競合的移植実験を行った。また、連続移植によって自己複製能を解析した。その結果、Dnmt3a欠損造血幹細胞の自己複製と分化に異常を検出しなかった。一方、Dnmt3b欠損造血幹細胞の分化に異常を検出しなかったが、自己複製能が著名に低下していることが明らかとなった。Dnmtb3欠損に伴うゲノムの不安定化を検討するするため、CD150^+CD48-c_-Kit^+Sca-1^+Lin-胎仔肝細胞を分離して、gamma H2AX抗体を用いたfoci解析を行っている最中であり、DNAメチル化とゲノムの安定化の関連性が興味深い。組織特異的幹細胞は臓器発生において重要な役割を果たすと考えられてきた。

しかし、幹細胞がどのような機序で発生し、機能的に成熟するのかよくわかっていなかった。DNAのメチル化は代表的なエピゲノム制御のひとつであり幹細胞発生にも関与する可能性が考えられた。本研究では造血幹細胞発生におけるDNAのメチル化酵素の役割を明らかにすることを目的とした。de novoのDNAメチル化酵素であるDnmt3aまたはDnmt3bを欠損した胎仔期マウスから肝臓細胞を分離し、移植実験によって造血幹細胞活性を定量的に解析した。in vitroコロニーアッセイとin vivo競合的再構築実験によってDnmt3aまたはDnmt3b欠損造血幹細胞の多分化能には問題がないことが明らかとなった。一方、再構築能と自己複製能についてはDnmt3a欠損造血幹細胞では異常なかったが、Dnmt3b欠損造血幹細胞では顕著に障害されていた。Dnmt3b欠損造血幹細胞ではp21発現上昇に伴い、アポトーシスが亢進していた。また、生殖系に発現すべき遺伝子が発現していた。さらに、造血幹細胞においてgammaH2AXフォーカス形成によって検出されるDNA損傷の蓄積が認められた。これらより、造血幹細胞が高い自己複製能を獲得するためには適切な遺伝子発現とゲノムの安定化が必要であることが示唆された。以上より、造血幹細胞が繰り返し自己複製を起こすために、Dnmt3aではなく、Dnmt3bによるDNAのメチル化が必須であると結論した。2012年1月、別の研究グループによってDnmt3a欠損造血幹細胞には分化異常があることが報告された(Nat Genet 44:23)。私たちのこれまでの研究結果はDnmt3a欠損造血幹細胞には分化異常も自己複製異常もなく、Dnmt3b欠損造血幹細胞には分化異常はないが、自己複製能の顕著な低下があることを示している。彼らの報告結果と私たちの研究結果とは全く異なり、この不一致の原因を調べる必要が新たに出てきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。より定量性の高い方法を用いて、深重に移植実験を繰り返す。Dnmt3a+/-マウス同士の交配あるいはDnmt3b+/-マウス同士の交配によって得たE13.5胎仔から肝臓を分離する。PCR genotypingによりDnmt3a^<+/+>、Dnmt3a^<+/->、Dnmt3a^<-/->、Dnmt3b^<+/->、Dnmt3b^<+/->、Dnmt3b^<-/->マウスを識別する。一定数の胎仔肝細胞と野生型骨髄細胞を用いて競合的移植実験を行う。また、連続移植も行う。さらに、各胎仔肝より造血幹細胞を高度に濃縮したCD150^+CD48-c_-Kit^+Sca-1^+Lin-細胞を分離して、これらをテストドナー細胞とし、一定数の野生型骨髄細胞に対して同様な競合移植、連続移植を行う。