hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベロ毒素の高感度迅速検出法の開発研究

腸管出血性大腸菌O-157の産生するベロ毒素は死亡率の高い溶血性尿毒症症候群を引き起こすために大きな社会問題となっている。しかし,その治療には抗生物質,止瀉薬が効果的に作用せず,未だに有効な治療薬の開発には至っていないのが現状である。そこで,O-157による被害を最小限に抑えるためにはベロ毒素を迅速に検出し,原因食品を速やかに特定する必要がある。しかし,従来法のバイオアッセイ法では正確に検出できるが,4日程度の時間を必要とする。また,PCR法や抗原抗体法では数時間から24時間で分析できるものの判定誤差が生じる。従って,より迅速かつ正確にベロ毒素を検出できる方法論の開発が待ち望まれている。そんな中,蛍光標識した低分子化合物とタンパクとの結合は蛍光偏光度測定により瞬時に高感度検出できることが最近明らかになった。また,ベロ毒素が認識結合するヒトの細胞表面の受容体はスフィンゴ糖脂質Gb3の糖鎖部分である。従って,蛍光標識化したGb3糖鎖を用いて蛍光偏光度測定することによって,ベロ毒素を迅速かつ高感度に検出できると考えられる。蛍光標識基としてダンシル基およびフルオレセイン基をGb3,およびGb2糖鎖に導入したベロ毒素検出化合物の合成に成功した。これらのサンプルの内,フルオレセイン基を導入したGb3糖鎖がガラクトース糖鎖認識レクチンBS-1と結合することを,蛍光偏光度測定によって高感度に検出できることが明らかとなった。現在,より毒性の強い2型のベロ毒素の検出評価試験を検討中である。平成16年度までに,蛍光標識基としてダンシル基およびフルオレセイン基をGb3糖鎖に導入したベロ毒素検出化合物の合成に成功した。今後,他の蛍光基を導入した化合物を合成すると共に,蛍光標識化したGb3糖鎖を用いた蛍光偏光度測定によるベロ毒素検出評価試験を行っていく予定である。
多剤耐性癌のin vivo診断法の開発研究

ポジトロン断層(PET)により得られる腫瘍の代謝・増殖の指標と、シングルフォトン断層(SPECT)により得られる腫瘍のP-蛋白の指標を用いて、制癌剤耐性癌のin vivo診断法を開発することが本研究の当初の目的であった。しかし、制癌剤耐性ではなく、放射線耐性の研究に用いる予定の新しいポジトロン標識薬剤の開発の方が、先に進行してしまった。そこで、急遽予定を変更し、放射線療法後の腫瘍再発の診断と、放射線抵抗性の診断の研究を先に遂行した。このため、多剤耐性癌の診断については実験モデルが完成した段階である。1.ラット皮下移植腫瘍を用いて、分割照射による腫瘍再発、制御モデルを作製した。照射後に、^<18>Fフルオロデオキシグルコース(FDG)、^<14>Cメチオニン(Met)、^3Hチミジン(Thd)をラットに静注し1時間後の体内分布、または二重標識オートラジオグラフィを調べ、病理組織所見と比較した。再発しない群では、Met・Thdの腫瘍集積は筋肉と同等まで低下する、FDGでは筋肉よりも高い。FDGは壊死周囲のマクロファージ・肉芽組織に高い集積を示す。再発する腫瘍では、Met・Thdの集積は生存癌細胞に最も高い。FDGはマクロファージにも同様な集積があり区別できない、変性腫瘍細胞にも高い集積がある。以上の結果から放射線治療後の再発の診断にはFDGよりもMetやThdの方が向いていることがわかった。2.^<11>Cメチオニンの欠点である短半減期、複雑な代謝、を克服する新しい薬剤として、アミノ酸輸送の指標である^<18>Fフルオロフェニルアラニン(FPhe)を新たに開発した。FPheのAH109A腫瘍への集積は肝・腎・腸などよりも高く、全身オートラジオグラフィでも腫瘍は明瞭に描出された。放射線治療に対する腫瘍集積の反応も非常に鋭敏であり、腫瘍放射線治療の評価に有用であることがわかった。3.低酸素細胞の指標として知られている18Fフルオロミソニダゾール(FMISO)の合成法を改良し、新たにワンポット法により高収率で合成できるようになった。虚血により放射線抵抗性となった腫瘍には、コントロールよりも高いFMISOの集積があり、放射線抵抗性を診断できる可能性があることがわかった。
フレネル理論の展開による有機EL素子の高効率化の研究

有機EL素子の発光特性を、波動光学に基づくフレネル理論の展開により解析し、発光体を含む波長オーダーの薄膜発光素子の光学設計法とその応用を目指した。具体的には、(1)蛍光青色有機ELの高効率化、(2)光学シミュレータの開発、(3)横伝搬型色変換方式による白色有機ELの開発に取り組んだ。得られた知見および主な成果は以下のようである。[成果1]高色純度青色有機ELの高効率化と横型色変換方式により白色ELの開発蛍光青色ELの高効率化を目的とし、α-NPDを発光層、PVKをホール輸送層とした低分子/高分子複合型構造を提案し、電気的光学的な構造設計による特性改善を進めた。積層方式と光学定数の最適化により、発光効率は従来値の23倍に向上し、パワー効率3.7-lm/W、外部量子効率6.0%、色度座標(0.15,0.08)の高色純度で高効率な青色発光が得られた。これらの値は蛍光青色ELとしては世界最高値であり、蛍光有機材料の理論限界に相当する。更に、同青色ELを独自の横伝搬型色変換方式に組み入れた白色ELを試作し、外部量子効率8.9%の高効率が得られた。[成果2]フレネル理論の展開による有機ELシミュレータの開発と応用フレネル理論と時間分解有限差分法による独自の有機EL光学シミュレータを開発し、ゲスト-ホスト型、マルチレーヤ型、タンデム型、およびブレンド型の有機EL構造に適用した。発光特性の光学的効果を解析し、陰極材料と発光層間の光干渉効果が白色発光に及ぼす影響を定量化した。同シミュレータは白色の色調設計、効率設計に極めて有効で独創的な開発成果であり、産学連携を目的として、既に有機EL関連企業5社に配布した。これらの研究で得られた成果は、来年度の科研費テーマとして新規に採択された"高効率有機EL照明の開発"に繋げる予定である。初年度は申請した実施計画書に従い,[課題1]高分子/低分子複合型有機ELの高効率化、および[課題2]多層構造有機EL用の光学解析ソフトの開発を重点的に検討した。得られた知見および成果は以下のようである。[課題1]最も開発が遅れている青色ELの高効率化を目的とし、α-NPD(Bis[N-(1-naphthyl)-N-pheny]benzidine)発光材料の採用、陰極構造およびキャリアブロック層の電気的な構造設計、後述する解析ソフトに基づく光学的な構造設計を行った。その結果、α-NPD(低分子)の陽極側にPVK(高分子)を配置した複合構造の導入により発光効率が23倍に向上し、視感効率3.7-1m/W、外部量子効率6.0%、色度座標(0.15,0.08)の高色純度で高効率な青色発光が得られた。この結果は高色純度な青色ELとしては世界最高値であり、蛍光有機材料の理論限界に相当する。更に、この青色有機ELを独自の横伝搬型色変換構造(特許出願済み)に組み入れた白色有機ELを試作し、外部量子効率8.9%の高効率が得られている。[課題2]有機EL用の光学解析ソフトは未だ市販されていない。開発には解析速度と実用性を重視し、フレネル理論をベースにして特性伝達関数の行列計算を組合わせた独自のアルゴリズムを用いた。解析対象は輝度、発光スペクトル、光取出し効率、角度特性であり、[課題1]で述べた青色ELの実測結果と合致する理論結果が得られている。

同ソフトは既に幾つかの企業で導入テストを検討して頂いている。以上、今年度の研究成果は、(1)理論限界に達する高効率高色純度の青色ELの開発、(2)独自の色変換方式の採用による理論限界を超える白色発光の実証、(3)有機ELシミュレーションソフトの開発と実証である。来年度は申請計画に従い、(1)燐光有機材料を導入した更なる高効率化、(2)導波理論を組合わせた光学解析の高精度化に取り組む予定である。本年度はフレネル理論に基づく光学設計の展開とその応用を目指し、初年度(H16)に行った(1)高効率(6.0%)な高色純度蛍光青色有機ELの開発、(2)実用的な有機EL光学解析ソフトの開発成果を基にして、独自の横伝搬型色変換方式を組み合わせ、以下に示す2つの課題に取り組んだ。得られた知見および成果は以下のようである。[課題1]緑色燐光有機ELの構造設計および横伝播型色変換方式による高効率化独自の高分子/低分子複合構造を基本とした4種類の構造を提案し、ワイドギャップ正孔輸送層の導入により、外部量子効率19.1%,色度座標(0.29,0.63)の高効率緑色発光を実現した。同構造に独自の横伝搬色変換方式を組み合わせることで外部量子効率を23.5%まで高め,従来の理論限界を超える有機ELを実証した。[課題2]フレネル理論と光電磁波理論を組み合わせた新規な光学解析手法の開発と応用可視光波長の薄膜で構成される有機ELとmmのオーダーで構成される基板・周辺層を含めた光学解析を行うため、フレネル理論に加えて光電磁場理論を導入し、課題1で開発した横伝搬色変換有機ELに適用した。その結果、光伝搬が主として透明電極内で生じていること、高屈折率な厚膜有機層が光伝搬を促進することを明らかにすると共に、光学計算では30%を超える高効率化が可能なことを示した。なお、同解析プログラムは現在、3社の企業から導入依頼を受けている。以上、今年度の研究成果は、(1)理論限界を超える高効率な燐光有機ELの開発、(2)フレネル理論と導波理論を組み合わせた光学解析手法の開発である。最終年度は申請計画に従い、(1)種々の有機EL構造(Top,Bottom,透明)の光学解析と最適設計、(2)横伝搬型色変換による高効率白色ELの実証試作に取り組む予定である。最終年度はフレネル理論の展開による新規な光学設計技術とその応用を目指し、昨年度までの成果である(1)高効率な青色有機EL、(2)有機EL光学シミュレータ、(3)横伝搬型色変換方式を組み合わせ、光学的な構造設計に関する以下の課題に取り組んだ。[課題1]有機EL構造の光学設計に基づく白色化および安定化青色有機機発光層(a-NPD)と黄色ゲスト材料(Rubrene)を組み合わせた独自のゲスト-ホスト型EL構造(ボトムエミッション構造)を提案し、二波長型白色有機ELを試作して発光特性の安定性を調べた。ホストからゲストへのフェルスター型エネルギー移動過程が支配的であり、同過程確率の駆動条件(電流、温度、経時変化)およびゲスト濃度への依存性が小さいことを利用することで、輝度3桁の範囲において変動±3%以下まで低減でき、他の白色化方式に比べて極めて安定な発光が得られた。[課題2]フレネル理論の展開による新規な光学解析手法の開発と応用フレネル理論と時間分解有限差分法による独自の有機EL光学シミュレータを開発し、ゲスト-ホスト型、マルチレーヤ型、タンデム型、およびブレンド型の有機EL構造に適用した。
口腔癌の浸潤・転移を制御する上皮・間葉移行とp63発現機構の解明

口腔癌の浸潤・転移において, EMTを誘導するSnailが重要な役割を果たしており,そのSnailが転写制御するp63依存的な浸潤能の解析をおこなった結果, p63が正の発現調節をしているId3がMMP-2の発現を誘導して浸潤能亢進に寄与していることがわかった.しかしp63が生理的に制御する上皮構造形成と癌の浸潤に直接関わる分子機構はまだ明らかでないため,現在解析を継続している.口腔癌の浸潤・転移において, EMTを誘導するSnailが重要な役割を果たしており,そのSnailが転写制御するp63依存的な浸潤能の解析をおこなった結果, p63が正の発現調節をしているId3がMMP-2の発現を誘導して浸潤能亢進に寄与していることがわかった.しかしp63が生理的に制御する上皮構造形成と癌の浸潤に直接関わる分子機構はまだ明らかでないため,現在解析を継続している.ヒト扁平上皮癌細胞において,転写因子SnailがE-カドヘリンの発現を抑制してEMTを誘導し,癌細胞は高度浸潤能を獲得するが,Snailは癌抑制遺伝子p53のファミリー遺伝子であるp63の発現を抑制する.p63をノックダウンすると癌細胞の浸潤能が亢進し,それにはE-カドヘリンの発現抑制は伴わなかった.これはp63の発現抑制による浸潤能が亢進にはEMTとは別のメカニズムが働いていることが推測され,このメカニズムを解明するためにp63の下流遺伝子を検索した.転写抑制因子IdはbHLH型転写因子であるE2Aを抑制することが知られているが,このファミリー遺伝子のひとつであるId3がp63のノックダウンによって発現が抑制されることを見いだした.そこで高度浸潤能を示すEMT細胞にp63を過剰発現させるとId3が誘導され,さらにEMT細胞にId3を過剰発現させると浸潤能が有意にブロックされた.しかもId3によってE-カドヘリンの発現は誘導されなかった.これはId3がE2AのE-カドヘリンの発現抑制能を抑制するにもかかわらず,つまりIdの過剰発現はE-カドヘリンの発現を誘導するのだが,Snailが有意にE-カドヘリンの発現を抑えることをプロモーター解析で示した.この結果はE-カドヘリン非依存性の浸潤能獲得のメカニズムの一端を示すものであった.またId3は細胞外基質分解酵素MMP2の発現を抑制することを見いだし,現在そのメカニズムを解析中である.ヒト扁平上皮癌細胞において,転写因子SnailがE-カドヘリンの発現を抑制してEMTを誘導し,癌細胞は高度浸潤能を獲得するが,Snailは癌抑制遺伝子p53のファミリー遺伝子であるp63の発現を抑制する.p63をノックダウンすると癌細胞の浸潤能が充進し,それにはE-カドヘリンの発現抑制は伴わなかった.これはp63の発現抑制による浸潤能が充進にはEMTとは別のメカニズムが働いていることが推測され,このメカニズムを解明するためにp63の下流遺伝子を検索した。転写抑制因子IdはbHLH型転写因子であるE2Aを抑制することが知られているが,このファミリー遺伝子のひとつであるId3がp63のノックダウンによって発現が抑制されることを見いだした.そこで高度浸潤能を示すEMT細胞にp63を過剰発現させるとId3が誘導され,さらにEMT細胞にId3を過剰発現させると浸潤能が有意にブロックされた.しかもId3によってE-カドヘリンの発現は誘導されなかった.これはId3がE2AのE-カドヘリンの発現抑制能を抑制するにもかかわらず,つまりIdの過剰発現はE-カドヘリンの発現を誘導するのだが,Snailが有意にE-カドヘリンの発現を抑えることをプロモーター解析で示した.この結果はE-カドヘリン非依存性の浸潤能獲得のメカニズムの一端を示すものであった.またId3は細胞外基質分解酵素MMP2の発現を抑制することを見いだし,そのメカニズムとして転写因子Ets-1依存性であること,そのEts-1依存性Id3発現はp63で抑制されることがわかった.
高温超伝導を用いたナノアンペア級ビーム電流強度の超高感度非破壊測定技術の開発

ナノアンペア級のビーム電流を高感度で検出するため、今年度は高温超伝導を応用した検出器の技術開発に関する研究を実施した。イオンビームエッチングによる超伝導回路を製作するため、チタンスリットを考案し、それをコイル状に製作することを研究した。チタンスリットは厚み0.5mmで10x10mmの面積に10ターンの角型コイル形状を持つもので、Bi2223を密着させてビーム照射する方式とした。この方式はチタンが高温に耐えるため、ステンレスの場合にくらべて大強度ビームを照射することが可能である。特に照射中にスリットが熱塑性により変形し、正しい形状の照射ができなくなる点を避けるよう配慮した。一方、ビームの形状についても研究をした。必要なビーム径は20mmと見積もり、この範囲でビームの平坦度が10%以内に収まるよう現行のイオン源を評価した。このイオン源はECRイオン源であるが、プラズマよりイオンを引き出す際に大強度にした場合、平坦度が犠牲になることが分かった。この結果を受けて20mm径のビームで10%の平坦度を持つイオン源の研究を行った。幸い、我々の研究室では大強度多価イオン源を研究中であったので、その装置を借用し若干の変更を加えて使用する機会を得た。本研究の結果、5kVで500マイクロアンペアの電流を得ることができ、平坦度も満足するものが得られた。試料上のビーム特性を評価するためビーム光学計算を行った。このような経緯で試料のビーム照射実験を行なうことができた。照射した試料の分析を行なった。ナノアンペア級のビーム電流を高感度で検出するため、平成15年度は高温超伝導を応用した検出器、シールドの方式およびそれらの技術開発に関する研究を実施した。検出器は円筒型で直径148mm長さ250mmの酸化マグネシウムの基材に、Bi2223のバルクを形成する製法とした。円筒の内側を通過するビーム電流が発生する電磁界により、対向する円筒内表面に流れる遮蔽電流を円筒外表面に作られた橋絡部に集中的に流す。この部分に流れた電流の発生する電磁界をSQUIDにより効率的に検出する方式を考案した。橋絡部については直線形状とスパイラルコイル形状を比較検討し、シミュレーション計算を行なったほか実物大常伝導モデルを製作しビームテストを行った。この結果、DCビーム電流についてはSQUID素子とコイル化の組み合わせにより1ナノアンペア級の検出感度を実現する解が得られた。このためBi2223のスパイラルコイル化のための研究を行なった。この結果、50keVのアルゴンイオンビームエッチングによりBi2223のバルク上に幅100ミクロンの細線を作ることができた。また、検出部回路の薄型化・多層化のためスパイラルコイルの中心部を外部に引き出すための超伝導スルーホールを研究した。現在までのところ長さ1mm直径1mmのスルーホールのテストを実施し、さらに細線化を目指した研究を行っている。磁気シールドについては円筒形状を基本とし、ビーム通過部に外部環境磁界が侵入しないための形状を研究した。結果的に複雑な形状になるため、あらかじめ製作したバルク状のBi2223を基材にした遮蔽体部品を作り、それらを超伝導ペーストで接着する方式を選択し実物大モデルを開発中である。考案した検出方式については特許を申請中である。
新しく発見したボツリヌスD型毒素受容体PEと毒素との相互作用の解析

ボツリヌス神経毒素(AG型)は型特異的な受容体に結合する。そのうち、ボツリヌスD型毒素は他の型とは異なり、グリセロリン脂質の一つPEに結合する。本研究では、ボツリヌスD型神経毒素とPEの分子間相互作用について調べ、毒素分子内のPE認識に関わるアミノ酸残基を特定した。さらに表面プラズモン共鳴による結合解析の実験系を構築し、蛋白質-脂質の分子間相互作用について定量的に解析することを可能にした。ボツリヌスD型神経毒素の受容体認識に関わる領域をアミノ酸レベルで解析するために、活性の異なる2種のD型毒素(003-9株由来、1873株由来毒素)重鎖C末端領域(Hc)のリコンビナント蛋白を作製し、さらにこれらのキメラ変異体、点変異体を数種調製した。結合活性を比較検討した結果、003・9株由来毒素分子内の1113番目から1138番目の領域が結合親和性を高めるのに重要であることがわかった。この領域内において、2種のHc間では6残基の違いが認められる。そこで、003・9株由来毒素のK1117(1117番目のリジン)、S1127、11129、K1135を1873株由来毒素の対応するアミノ酸残基に点変異させた結果、K1117の変異により結合活性は顕著に減少した。一方、S1127、11129は結合活性に影響しなかった。K1117は1873株由来毒素ではEに置換しており、電荷が正反対になっていることから、003-9株由来毒素分子内のK1117の正電荷が受容体への結合親和性に重要であると考えられた。これまで、他の型では受容体認識に関与するアミノ酸残基はC末端側に局在していると報告されているが、D型では他型とは異なり、C末端から約100残基以上N末端側に、結合親和性に関与するアミノ酸残基が存在していることが本研究により明らかとなった。現在、これらの蛋白の結晶構造解析を進めており、他型との違いをより明確にする予定である。また、リボソームとBIACOREを用いた結合解析実験では、ガングリオシド含有リボソームとC型Hcとの特異的な結合を観察することができた。PE含有リボソームとD型Hcの結合について、現在解析を進めている。本研究では、ボツリヌスC型およびD型神経毒素の受容体認識機構について解析を行い、受容体認識に関わるアミノ酸残基を明らかにした。C型毒素の重鎖C末端領域(Hc)にはA型やB型で報告されているガングリオシド結合領域が一部保存されており、結合に関与することが示唆された。実際にこの領域のアミノ酸残基の点変異体を作製し結合活性を調べたところ、W1257(1257位のトリプトファン)、Y1258、G1270、H1282が受容体結合に関与していることがわかった。特にH1282はC型にのみ特異的に存在するアミノ酸残基であり、ガングリオシドへの親和性を高める要因の一つであると考えられる。一方、D型については、2種の異なる結合活性をもつD型Hcの変異体を用いた解析から、2つのリジン残基K1117、K1135が結合に関与していることが明らかとなった。以上の結果はMicrob. Pathog. (2008. in press)に発表した。C型毒素はガングリオシドGD1b、GT1bに、D型毒素はボスファチジルエタノールアミン(PE)に結合することを既に報告しているが(J. Biol. Chem. 2005)、これらの結合はTLCプレート上で認められただけであり、実際に細胞膜上で受容体になるという証明は得られていない。そこで、より生体膜に近い条件での結合を検討するため、受容体含有リポソームを作製し、表面プラズモン解析機を用いて結合能を調べた。その結果、GT1b含有リポソームに対し、C型Hcのみが結合した。従来からGT1bへの結合が報告されているA型やB型は結合せず、C型毒素はボツリヌス毒素の中でも特にガングリオシドへの結合親和性が高いことが示された。PE含有リポソームに対しては、予想に反してD型Hcはほとんど結合しなかったことから、D型毒素の結合にはPE以外の分子も関与している可能性が示された。本研究では、ボツリヌスC型およびD型神経毒素の受容体認識機構を明らかにするため、表明プラズモン共鳴法(SPR)を用いた新たな結合実験系を構築した。C型毒素に結合性を示すガングリオシドやD型毒素に結合性を示すボスファチジルエタノールアミン(PE)を含有したリボソームを作製し、センサーチップに固定化後、BIACORE2000を用いてリコンビナントHc(毒素の受容体結合ドメイン)との結合を解析した。C型毒素由来HcはGDlb>GTlb>

GQlbの強さで結合することがわかった。このことから、C型毒素とガングリオシドの親和性には、ガングリオシド糖鎖末端のシアル酸が関与し、結合親和性に負に働くと考えられた。PE含有リボソームに対しては、D型毒素はわずかの結合を示し、その結合はGDlbやGTlb共存下で増強されることがわかった。D型毒素はGDlbあるいはGTlbだけを含有させたリボソームには結合しないため、これらのガングリオシドはD型毒素とPEの結合に対して補助的に働いていると考えられる。一方、他の細菌毒素と脂質間の相互作用についても、今回構築した実験系が適用可能かどうか検討した結果、コレラ毒素及びコレラ毒素BサブユニットとGM1との相互作用について解析することができた(論文投稿中)。現在、その他の脂質結合性細菌毒素についても解析を進めている。また、今後、ガングリオシドやPEを介したボツリヌス毒素の細胞内侵入機構についての解析を検討しており、その際用いる蛍光標識Hcの結合活性の評価や分子認識に関わるアミノ酸を特定する上でも、本研究で構築したSPR解析系は有用であると思われる。
遊牧民のエネルギー・環境問題の実態解明と持続可能性の再構築－HEVの有効利用策－

本研究は日本からモンゴル国への中古ハイブリッド自動車輸出の急増を背景として、使用済みHEVの不適正処理による環境汚染やニッケル水素バッテリーの再利用・再生利用の観点からエネルギー問題に関する実態調査を行い、遊牧民の持続可能な生活の再構築に向けた分析方法論の構築および政策提言を行う。遊牧民を対象に、エネルギーの消費構造、中古HEVの保有・廃棄行動などの実態を明らかにし、使用済みHEVとニッケル水素バッテリーの排出量を推計する。また、遊牧民の環境汚染やエネルギー貧困問題の解決に向けて中古HEVの有効利用計画を提案する。最後にニッケル水素バッテリーに含まれる希少資源の有効利用に関する政策提案を行う。
バクテリアの細胞間連係を遮断し感染症を予防する高分子ナノファイバーの開発

緑膿菌などヒトへの健康被害の大きいグラム陰性細菌は、細胞間情報伝達機構クオーラムセンシングを利用し日和見感染症を引き起こす。抗生物質を用いる感染症対策は薬剤耐性菌の出現を誘引することから、新しい感染症予防法が切望される。本研究では、本機構の阻害による病原性発現抑制に着目した。ナノファイバー不織布、多孔性ヒドロゲルシートなどの高分子担体合成に成功した。例えば多孔性を制御したヒドロゲルシートを用いて関連遺伝子の転写をほぼ完全に抑制可能である。高圧電源、可動式シングルノズル、紡糸原液噴霧用の速度可変ポンプ及びドラム式ターゲット電極を装備したエレクトロスピニング法による紡糸装置を用いて、高分子ファイバーの合成条件を検討した。ポリエチレングリコールなど水系に可溶な各種高分子を用いてファイバー合成に適する最適条件を検討し、ポリマーの分子量、濃度、紡糸条件などの基礎的条件を検討し、本研究で用いる装置の性能確認を行った。スピニンクにより得られた高分子ファイバー及び不織布は、走査型電子顕微鏡(SEM)により観察した。SEM像より、合成されるファイバーの平均直径と、ファイバーと共に固定される高分子ビーズの有無を評価した。バクテリアの細胞間連係に利用されている情報伝達物質として、アシル鎖長の異なるN-アシル化ホモセリンラクトンを有機合成し、その構造を^1H-NMRにより確認した。この情報伝達物質を有効にトラップすることが出来れば、バクテリア間の細胞間連係を遮断し、関連する遺伝子発現を制御できると考えられる。一般に、バクテリアの細胞間情報伝達機構は情報伝達物質濃度依存性であり、個々の細胞から放出された情報伝達物質が系中に累積していく。この濃度が閾値に到達すると、細胞密度依存性の本システムが稼動し、緑膿菌などの日和見感染菌では病原性因子の発現が起こる。環状オリゴ糖シクロデキストリンをホスト化合物に選択し、AHL類との包接複合体形成に関する安定度定数を算出したところ、AHLは水溶液中でシクロデキストリン類と安定に複合体を形成可能であることを明らかにした。日和見感染菌による病原性因子の発現プロセスでは、クオーラムセンシングと呼ばれる細菌間の細胞間伝達機構が利用される例が多く報告されている。緑膿菌やセラチア菌などヒトへの健康被害の大きいグラム陰性細菌では、アシル化ホモセリンラクトン(AHL)が細胞間シグナルとして生産され、病原性発現を制御している。これまでの感染症対策では、抗生物質投与により細菌を死滅させる手法がとられるが、時として薬剤耐性菌の出現を誘引し新しい感染症予防法が切望されている。本研究では、本機構を阻害すれば細菌は生存していても病原性発現のみを抑制可能であることを見出し、AHLのトラップにより本機構を抑制することを目指した。環状オリゴ糖シクロデキストリンはAHLと水溶液中で包接複合体を形成可能であることから"高分子担体を用いてシクロデキストリンを固定するなどし、AHLトラップ法を原理とする感染症予防材料を設計した。エレクトロスピニング法を用いて高分子不織布を合成可能である。また、熱誘導相分離法を用いてミクロ相分離した高分子ネットワークを構築し、セラチア菌、緑膿菌培養液中のAHLをトラップすることで本機構を抑制可能である。セラチア菌では抗菌物質プロディジオシン生産量で、緑膿菌では本機構により活性化されるlasB遺伝子のプロモーター下流にβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を配置した転写融合プラスミドを挿入したレポーター株を遺伝子工学的手法により作成し、β-ガラクトシダーゼ活性の低減量によりAHLトラップ法の効果を確認した。
アクリル酸グラフト繊維を用いた新規神経幹細胞培養技術の開発

ナイロン(PA66)メッシュ表面へのラジカル重合によるポリアクリル酸(PAAc)の導入と、そのPAAcのカルボキシル基へのEDC/NHS架橋によるタンパク質(matrigel等)の化学修飾を施し、それらの材料に対する胎齢14日目のマウス大脳由来神経幹細胞の接着性と増殖、分化に対する影響を解析した。PA66メッシュやMatrigel修飾PA66メッシュへの神経幹細胞の接着が確認された。Matrigel修飾PA66メッシュ上へ接着した細胞の増殖率が最も高く、自発的な分化傾向も抑えられた。本研究は中枢神経系をターゲットとした再生医療や創薬に役立つと期待される神経幹細胞の新規培養技術の開発を目的としている。神経幹細胞が未分化を維持したまま接着できる繊維を作製し、繊維に接着した状態の神経幹細胞を培養にすることによって、細胞間相互作用を維持したまま効率良く培養することが研究の狙いである。初年度にはポリアミド繊維表面にγ線照射によるラジカル反応を利用してポリアクリル酸のグラフト鎖を形成させ、さらにカルボジイミドを用いてコラーゲン分子を修飾したが、神経幹細胞の接着、増殖といった点で良い条件が得られなかった。そのため、今年度も細胞の接着、増殖性を改善するためにポリアミド繊維への修飾条件の検討をおこなった。そこで、更に効率良く細胞が接着し、増殖するタンパク修飾条件を得た。接着培養した細胞の分化状態を判断するために、接着細胞凝集塊の切片を作製し、免疫染色によるポピュレーション解析をおこなった。本研究の目的は中枢神経疾患治療に有効とされる神経幹細胞の新規培養技術の開発である。本研究は神経幹細胞の培養に用いられるニューロスフェア培養法を改良し、空間的制限を減らし、細胞培養効率の改善によって生産性を向上させることを目指すものである。具体的には、繊維上にニューロスフェアを接着させ、培養できる繊維材料を開発し、繊維上で培養されたニューロスフェア構成する細胞の生物学的特性を評価し、ニューロスフェア培養に最適な条件を選定することを目的とする。初年度ではおもに繊維材料の開発をおこなった。ポリエステル、ナイロンの織物を基板材料とし、50から200ミクロンの繊維径の材料を試した。さらに、繊維材料に対しガンマ線を照射し、グラフト重合によって繊維上にアクリル酸を導入した。PA66繊維は、アクリル酸濃度60%の水溶液中でポリアクリル酸重合をおこなったものがグラフト率15%と最も高く、また、ガンマ線照射線量依存的にアクリル酸グラフト率も増加した。繊維上に導入されたポリアクリル酸はフーリエ変換赤外線吸収スペクトル-ATR法を用いて1700cm-1付近のカルボン酸由来のピークによって確認することができた。さらに導入されたアクリル酸のカルボキシル基に、水溶性カルボジイミドによる化学架橋反応によって、コラーゲン分子の修飾を試みた。PA66繊維1 cm2あたり5 μg程度のコラーゲン分子が修飾されたことをフルオレスカミン法によって確認した。培養マウス神経幹細胞を用いて、コラーゲン分子修飾アクリル酸グラフト重合PA66繊維への接着、増殖性を検討した。細胞の接着、増殖は培養5日程度で確認できたが、未修飾繊維と大きな差が得られなかったことから、次年度もひきつづき繊維材料表面の改良が必要であると考えられる。本研究は神経幹細胞を効率よく増殖させるために細胞が接着できる繊維材料を開発することを目的としている。ポリアミド繊維表面にポリアクリル酸グラフト鎖を導入し、更にECMタンパク質を修飾したメッシュ状の材料を作製した。マウス神経幹細胞をECM修飾ポリアミドメッシュ上へ播種し、接着した細胞はコントロールに比べて高い増殖率であった。昨年度、解析できなかった接着細胞の免疫染色による細胞種の解析や形態的な特徴の解析をおこなった。ほとんどの細胞がGFAP陽性であったが、神経幹細胞のマーカーであるネスチン陽性の細胞も見られたことから、培養経過に伴ってadultタイプの幹細胞として増殖していると考えられる。一方、TubulinβIII陽性のneuronに分化している細胞はほとんど見られなかった。ECMタンパク質を修飾したポリアミドメッシュでは細胞はメッシュを覆うように広がったのに対し、未修飾メッシュでは繊維上で細胞が集まったスフェロイド状に増殖した。ECMタンパク質を修飾したポリアミドメッシュ上では細胞のスフェロイド形成は見られなかったものの、材料に接着してからの細胞の増殖率が最も高かった。この結果からECMタンパク質修飾ポリアミドメッシュは短期的に細胞を増殖させる材料として適していると考えられるが、三次元的なスフェロイド形成培養法としては利用できない。神経幹細胞の培養基材としてだけでなく、ニューロン新生等を促す薬剤評価用基盤作製など他の用途にも展開できると考えられる。生物工学、幹細胞生物学繊維材料表面へのグラフト鎖導入およびタンパク質修飾に関して初年度で検討しきれなかった研究項目を今年度におこなった。ポリアクリル酸およびポリビニルアルコールのラジカル重合条件やタンパク質修飾条件の改良によって細胞の接着、増殖が改善された。

また、免疫染色法によって蛍光染色された神経幹細胞、神経細胞やグリア細胞のポピュレーション解析によって繊維材料表面に接着した細胞のおおよその割合を知ることができた。しかし、線維表面に接着した細胞凝集塊の整った凍結薄切サンプル作製の難しさや顕微鏡撮影装置の不具合が生じたため、研究予定であった細胞の分布解析までに至らず、今年度の研究計画の9割程度の実施になった。そのために今後延長して研究を実施していく予定である。初年度の研究目的としては神経幹細胞を接着、増殖させるための、繊維材料面の開発が中心であった。高圧蒸気滅菌が可能なPA66繊維を基板材料として選択し、細胞接着や増殖を促すためのタンパク質分子修飾する条件、特にカルボキシル基の導入を目的とした繊維表面へアクリル酸をグラフト重合する条件を調べた。カルボジイミドを用いてタンパク質を化学修飾するため条件までは概ね把握することができた。しかし、神経幹細胞の細胞接着、増殖を促す条件の獲得までには至らなかった。神経幹細胞はMMPの発現が高く、培養液中に多く分泌することをザイモグラフィーによって確認できたことから、修飾したコラーゲン分子を分解してしまった可能性も考えられる。材料表面への修飾タンパク質の適切な種類を選択することが今後必要である。また、ガンマ線架橋PVAゲル上に神経幹細胞が接着することが確認できたことから、新たな細胞培養繊維の作成方法として繊維上へのPVAの導入し、神経幹細胞接着、培養へ応用することも検討している。繊維材料表面に接着した細胞凝集塊の凍結包埋条件の改善により、細胞状態の良い凍結切片を作製し、細胞凝集塊中における神経幹細胞およびその分化細胞、増殖細胞の分布について詳細に解析する。また、培養に増殖した細胞全体の分化・未分化マーカー遺伝子の発現解析も行う予定である。最終的には、これまでに得られた結果をもとに論文にまとめ、学術雑誌に投稿する予定である。神経幹細胞が繊維上へ接着、増殖できるようなタンパク質の修飾やPVA等の新たな合成高分子導入条件を獲得する(8月迄)。また、昨年からの計画どおり繊維上で培養された細胞の1ニューロスフェア形成、2分化率の評価、3繊維に接着した神経幹細胞の高密度培養での細胞の解析といったバイオアッセイを中心に進める。繊維に接着したニューロスフェアの量の比較や、ニューロスフェアの凍結切片を作製、免疫染色を施し、ニューロスフェア内部の神経幹細胞、分化した細胞がニューロスフェアの内部に一様に散在しているのか、部分的に局在しているのか、局在しているのであれば中心部分かもしくは表面部分かといった細胞分布、その細胞密度および分化率といった情報を詳細に解析する。最終的には、神経幹細胞の増殖率を既存のニューロスフェア培養法と比較することによって培養した細胞が神経幹細胞としての多分化能を維持し、かつ増殖率の高い繊維および培養条件を選定する予定である。計画当初に購入予定であった顕微鏡の購入を見送ったために残額が生じた。
『カンタベリー物語』諸刊本の電子テクスト化と比較による非人称構文研究

また、大野は初期写本に見られ、非人称用法を持つ形容詞liefの用法について論文を発表した。テクスト間の比較の前段階となる調査結果である。地村、中尾はそれぞれChaucerの作品の解釈に関する論文を発表した。佐藤はテクスト解析に関する論文を発表した。2018年8月になったが、大野、地村、中尾の入力分担について協議し、2019年7月を目指してPynsonとde Worde版の入力を完成させることとした。分担者との情報交換から約3割の入力である。パラレルテクストの年度内の完成を目指している。同時に、全てのFragmentsにおけるlistenの用法の異動について、2019年7月始めに開催される学会International Medieval Congress(於英国リーズ大学)で口頭発表し、本研究に関する情報を収集する予定である。2018年11月に、それまで予定していなかった2019年7月開催の国際学会International Medieval Congress (Leeds大学)での発表が受理されたため、その出張費が必要となったため。
ドミナントネガテイブ効果を用いたファンコニ・ビッケル症候群モデルマウスの作成

【研究背景】Fanconi-Bickel症候群(以下FBS)は発育遅延、肝腫大、近位尿細管障害(糖尿、汎アミノ酸尿)、空腹時低血糖、食後高血糖を呈する常染色体劣性疾患である。1997年本症の責任遺伝子が促進拡散型グルコーストランスポーターの一つであるGLUT2遺伝子であることが明かとなった。GLUT2遺伝子のノックアウトマウスは著明な尿糖、中程度の高血糖、耐糖能の異常、インスリン分泌低下を示し、生後23週で死亡する。我々は本症3家系の解析を行ない4つのGLUT2の変異(IVS2-2A>G、Q287X、V423E, L389L)を同定した。この内V423E変異をヘテロに持つ保因者において腎性糖尿を認め、この変異がドミナントネガテイブ効果を持つ可能性を考えた。【目的】ドミナントネガテイブ効果が予想されるV423Eを持つ変異GLUT2遺伝子をマウスに導入し、過剰発現させることによりFBSモデルマウスを作成し(機能的ノックアウト)、解析する。【方法】変異GLUT2遺伝子を発現したマウスがGLUT2ノックアウトマウスの様に致死的な性質を持った場合でも再現可能な様にCre-loxP systemを利用した。CAG promoter、loxP、DsRed、IRES、EGFP配列を含んだベクター(CDRE)に人変異GLUT2を挿入、マウス受精卵に顕微注入し、偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。【結果】32匹のトランスジェニックマウスが誕生した。その内8匹が目的の遺伝子(CDRE-GLUT2)を持つマウスであった。全8系統すべてをCreマウスと交配したところ、4系統においてDouble Positive(発現マウス)が得られた。全てについて血糖、尿糖のスクリーニングを行なったが空腹時、随時血糖は発現のないlittermateと差がなく、尿糖も認めなかった。次に、711週のマウスを用いて18時間の絶食後体重1gあたり1gのグルコースを10%溶液として腹腔内に投与し、15、30、60、90、120分後の尿糖、血糖をチェックしたが発現の有無による差は認められなかった。【考察】作成したトランスジェニックマウスではV423Eを持つ変異GLUT2遺伝子の過剰発現による空腹時尿糖の出現や耐糖能の異常は確認出来なかった。V423E変異のドミナントネガテイブ効果は今回の実験では証明出来なかった。発現量が十分でなかった可能性やV423E変異にドミナントネガテイブ効果がない可能性もあり今後の検討課題である。【研究背景】Fanconi-Bickel症候群(以下FBS)は発育遅延、肝腫大、近位尿細管障害(糖尿、汎アミノ酸尿)、

空腹時低血糖、食後高血糖を呈する常染色体劣性疾患である。1997年本症の責任遺伝子が促進拡散型グルコーストランスポーターの一つであるGlut2遺伝子であることが明かとなった。GLUT2遺伝子のノックアウトマウスは著明な尿糖、中程度の高血糖、耐糖能の異常、インスリン分泌低下を示し、生後23週で死亡する。我々は本症3家系の解析を行ない4つのGLUT2の変異(IVS2-2A>G、Q287X、V423E, L389L)を同定した。この内V423E変異をヘテロに持つ保因者において腎性糖尿を認め、この変異がドミナントネガティブ効果を持つ可能性を考えた。【目的】ドミナントネガテイブ効果が予想されるV423Eを持つ変異GLUT2遺伝子をマウスに導入し、過剰発現させることによりFBSモデルマウスを作成し(機能的ノックアウト)、解析する。【方法】変異GLUT2遺伝子を発現したマウスがGLUT2ノックアウトマウスの様に致死的な性質を持った場合でも再現可能な様にCre-loxP systemを利用した。CAG promoter、loxP、DsRed、IRES、EGFP配列を含んだベクター(CDRE)に人変異GLUT2を挿入、マウス受精卵に顕微注入し、偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。【結果】出産させたところ、32匹のトランスジェニックマウスが誕生した。その内8匹が目的の遺伝子(CDRE-GLUT2)を持つマウスであつた。現在3匹のCDRE-GLUT2マウスとCreマウスを交配しており、得られた仔について解析中である。【今後の方針】全8系統すべてをCreマウスと交配し、遺伝子が発現している仔について観察し、血糖、尿糖のスクリーニングを行なう。症状が出現する系統があれば内分泌学的検討、組織学的解析、生理学的解析などを行ないGLUT2の機能やFBSの病態開明を行なう予定である。【研究背景】Fanconi-Bickel症候群(以下FBS)は発育遅延、肝腫大、近位尿細管障害(糖尿、汎アミノ酸尿)、空腹時低血糖、食後高血糖を呈する常染色体劣性疾患である。1997年本症の責任遺伝子が促進拡散型グルコーストランスポーターの一つであるGLUT2遺伝子であることが明かとなった。我々は本症3家系の解析を行ない4つのGLUT2の変異(IVS2-2A>G、Q287X、V423E,L389L)を同定した。【目的】ドミナントネガティブ効果が予想されるV423Eを持つ変異GLUT2遺伝子をマウスに導入し、過剰発現させることによりFBSモデルマウスを作成し(機能的ノックアウト)、解析する。
住民投票における有権者の投票行動

2006年3月12日、政府の発表した米軍再編案に絡んで山口県岩国市で住民投票が行われた。現在厚木基地に配備されている空母艦載機57機の岩国基地への移駐に「反対」が圧倒的多数を占めたこの住民投票について、同年6月から7月にかけて郵送調査を行った。住民投票の有権者であった合併前の旧岩国市内の住民2,101名を対象として行い、最終的な有効回答数は743件、転居・不着分等を除いた調査対象者に占める回答率は35.8%であった。基地を抱える住民の感情は見た目の投票結果以上に複雑であり、「反対」票が全て移駐案の「白紙撤回」の意思表示というわけではない。そこで本調査では、あくまで「白紙撤回」を求めるのか、条件付きで移駐受け入れを望むのかという点について尋ねた。実際の投票行動とのクロスデータを見ると、住民投票で反対票を投じた人の中にも「条件付き受け入れ」を望む回答は約3割に上り、市長選で「移駐反対派」の井原に投票した人で見ても、やはり同様の傾向が確認できる。また、住民投票を棄権した人の多くは「条件付き受け入れ」を求めていることが明らかとなった。すなわち、同一の争点について尋ねた場合でも、その尋ね方、選択肢の提示の仕方によって、「民意」の表れ方が異なることが、本調査のデータから明らかとなった。90年代後半に同じ米軍基地問題に関して沖縄で実施された2つの住民投票などとの比較も踏まえて考慮すると、特定の政策争点に関する「民意」は一回の、一種類の投票によってのみ一義的に決まるわけではないということが理解できる。埼玉県蓮田市・白岡町・菖蒲町で、これら1市2町による合併の是非をめぐり昨年1月30日に同日実施された住民投票について、5月から7月にかけて郵送調査を行った。各市町の有権者1,000名ずつ、計3,000名を対象として行い、最終的な有効回答数は1,377件(蓮田市:465件、白岡町:459件、菖蒲町:453件)、転居・不着分等を除いた調査対象者に占める回答率は46.5%(蓮田市:47.1%、白岡町:46.5%、菖蒲町:45.8%)であった。投票参加をめぐっては、事前の結果予想との相関関係に主に着目して分析を行った。1市2町のうち1つでも反対多数となれば合併が白紙となる状況で住民投票は行われているため、結果を受け合併成立に向かう確率は、単独実施のケースであれば2分の1であるのに対し、1市2町の場合は2分の1の3乗で8分の1となる。したがって、合併賛成・反対のいずれの有権者にとっても投票参加のコストが高まり、そのことが投票率を押し下げる一因となっていた。そうした傾向は、自市町の投票結果を反対多数と予想した有権者において、特に顕著であることが回帰分析の結果から明らかとなった。他方、賛否の投票結果に関して言うと、それぞれの結果をもたらした要因は三者三様である。投票理由などの分析から、合併後の新市役所の位置など白岡中心で合併協議が進められたことから白岡町民は唯一賛成し、それに反発した蓮田市民は反対、また菖蒲町では別の枠粗みでの合併を希望する声が多く反対多数となったことが示された。
体外超分子複合体結晶のための低分解能の高精度X線回折強度データ測定法の開発

生体超分子複合体のX線結晶構造解析における低分解能(30Å分解能より低角側)データは、位相改良における溶媒平滑化法や非結晶学的平均化法を行う上で重要なエンベロープの決定に欠けてはならないデータである。しかし、回折実験の測定系の問題のために、低分解の良質な回折強度データを得るのは困難である。そこで、本研究では、低分解能の回折強度データが高精度に集められる測定系を構築した。超分子複合体結晶は非常に大きな格子(200Å以上)を持つので、平行性の良いX線を取り出すことが重要である。また、低分解能の回折強度データを高精度に収集するためには、入射X線からの散乱を極力抑えることが必要である。入射X線を整形する4象限スリットを2段にすることにより、1段目でビームサイズが決定でき、2段目で1段目のスリットからの散乱X線が抑えられかつ非常に平行性の良いX線を取り出すことが可能となった。結晶試料位置直前にコリメータを置くことにより、上流からの散乱線を取り除け、低角側のバックグラウンドを下げることに成功した。平行性の良いX線でかつ散乱X線を取り除くことができたので、ビームストッパーを結晶試料から遠ざけることが可能となった。本研究で構築した測定系により、これまでビームストッパーに隠れて観測できなかった低分解能(30Å分解能より低角側)の反射を収集することに成功した。構築した測定系を用いることにより、超低角領域側(100Å分解能より低角)で、分子量が13,000kDaもある超分子複合体結晶からの回折像を初めて観測することに成功した。生体超分子複合体のX線結晶構造解析における低分解能データは、位相改良における溶媒平滑化法や非結晶学的平均化法を行う上で重要なエンベロープの決定に欠けてはならないデータである。そこで、本研究では、低分解能の回折強度データが高精度に集められる測定系を構築する。低分解の回折強度データ測定を行う上で最も問題になるのは、ダイレクトビームストッパのサイズと結晶試料からの距離である。ダイレクトビームストッパはサイズを極力小さくし、結晶試料からできるだけ遠く離したところに置けば、低分解能領域の反射は観測できる。しかし、ダイレクトビームストッパのサイズを小さくすれば、結晶の直前に置かれた入射X線のサイズを決めるコリメータのエッジに引っかけた散乱X線がストッパから漏れ、低角側の反射にかぶると共に、低角側のバックグラウンドを上げ、構造解析に用いるのに十分な精度の回折強度データが得られない。そこで、まずは入射X線を整形する部品を試料直前に置くコリメータから、任意の位置に置けかつ任意のビームサイズが作ることが可能な4象限スリットに変えた。スリットを使用しても、エッジに引っかけた散乱X線が起こったので、この散乱線を取り除くために後段の試料直前に、φ0.5mmコリメータを用いた。このことにより、ビームストッパー付近に見られた散乱線をきれいに取り除け、低角側のバックグラウンドを下げることに成功した。また、X線ビームサイズが任意に変えられることから、結晶の大きさに合わせたビームサイズ(0.03mm0.15mmの間)が作れ、結晶サイズに応じた最適の回折強度データ収集が可能になった。
教育的介入を用いた小学生の音素認識能力の発達的変化に関する調査

日本の小学校英語教育においては、2020年度から新学習指導要領が全面実施となり、高学年では教科化され「読むこと」「書くこと」を含めた指導が行われる。本研究は、読み書き能力を習得するために必要不可欠な要素とされる音素認識能力に着目し、日本語を母語とする小学生を対象とした英語の音素認識能力の発達について調査研究を行う。具体的には、文字指導の教育的介入を取り入れた場合、音素認識能力の発達、心理的側面がどのように変化するのかを明らかにするとともに、授業観察やインタビュー調査なども実施し、小学校英語教育における文字指導のあり方を探究する。
マウス神経冠培養系におけるメラノサイトの発達におけるエンドセリンの影響

これまでの研究でSCF/KIT情報伝達およびET-3/ETRB情報伝達がメラノサイトの発達に極めて重要な役割をしていることが判明しているが、両者の相互作用とその時期など不明な点が多い、そこで、我々はET-3がメラノサイトの増殖・分化に及ぼす影響を知ることを目的にマウス神経冠初代培養系にET-3とSCFを単独あるいは同時添加して出現するKITおよびDOPA陽性細胞数を検討した。1)基本培地のみの無添加群(control群)2)SCF単独添加群3)ET-1単独添加群4)ET-3単独添加群5)SCF+ET-1併用添加群6)SCF+ET-3併用添加群7)SCF+抗エンドセリン8)エンドセリン+抗SCF抗体以上の群について、それぞれ、培養6,9,15日目に培養細胞をACK2(抗KIT抗体)を用いた酵素抗体法で染色しKIT陽性細胞の数を測定する。また、培養6、9、15日目に培養細胞にDOPA反応を行い、DOPA陽性細胞を測定した。《結果》KITは無添加では3目以降検出できなかったのに対して、SCF添加群では日数の経過とともに陽性細胞数が増加した。ET3単独では15日に増加した。ET1単独では明らかな増加はみとめられなかった。SCFとETの併用群では陽性細胞の増加は顕著で、特にET3との併用群ではカウント不能であった。DOPA陽性細胞も同様の傾向を示したが、ET単独の15日目はKITと違い、顕著に増加した。また、ET1併用群ではKITの場合と異なり、ET3同様カウント不能となる増加を認めた。平成14年度では、SCF欠損マウスの神経冠について同様の検討をした結果、SCFを培地に添加すれば野生型の場合と同程度の陽性細胞が出現したが、エンドセリンだけではKIT陽性細胞もDOPA陽性細胞も出現しなかった。メラノサイトの発生にはまずSCFがエンドセリンより先行して働くことが示唆された。これまでの研究でSCF/KIT情報伝達およびエンドセリン(EDN)3/ETRB情報伝達がメラノサイトの発達に極めて重要な役割をしていることが判明しているが、両者の相互作用とその時期など不明な点が多い、そこで、我々はEDNがメラノサイトの増殖・分化に及ぼす影響を知ることを目的にマウス神経冠初代培養系にEDNとSCFを単独あるいは同時添加して出現するKITおよびDOPA陽性細胞数を検討した。1)基本培地のみの無添加群(control群)2)SCF単独添加群3)EDN1単独添加群4)EDN3単独添加群5)SCF+EDN1併用添加群6)SCF+EDN3併用添加群以上の群について、それぞれ、培養6、9、15日に培養細胞をACK2(抗KIT抗体)を用いた酵素抗体法で染色しKIT陽性細胞の数を測定する。また、培養6、9、15日にDOPA反応を行い、陽性細胞を測定した。《結果》KITは無添加では3日以降検出できなかったのに対して、SCF添加群では日数の経過とともに陽性細胞数が増加した。EDN単独群ではEDN3群で培養15日にSCF群と同程度出現したが、EDN1単独群では明らかな増加はみとめられなかった。DOPA陽性細胞も同様の傾向を示したが、ET単独群では培養9日迄SCF群より少なかったが、培養15日には逆転した。特にEDN1群ではKITの場合と異なり増加した。また、SCFとの併用群ではEDN3と同様EDN1でもカウント不能となる増加を認めた。以上の結果、SCFとエンドセリンはメラノサイトの増殖・分化に寄与すること、また両者は相乗的に強力な作用をはっきすることおよびSCF単独では分化をそれほど進行しないが、エンドセリン特にEDN1は分化に寄与することがわかった。DOPA

陽性細胞も同様の傾向を示したが、ET単独の15日目はKITと違い、顕著に増加した。また、ET1併用群ではKITの場合と異なり、ET3同様カウント不能となる増加を認めた。平成14年度では、SCF欠損マウスの神経冠について同様の検討をした結果、SCFを培地に添加すれば野生型の場合と同程度の陽性細胞が出現したが、エンドセリンだけではKIT陽性細胞もDOPA陽性細胞も出現しなかった。メラノサイトの発生にはまずSCFがエンドセリンより先行して働くことが示唆された。
ゴキブリによる気管支喘息の検討

616才の気管支喘息児51名において4種のゴキブリ特異igE抗体をRASTおよびCAP-RASTにて測定した。ゴキブリ特異lgE抗体陽性率はRASTでクロゴキブリ17.6%、チャバネゴキブリ29.4%、ワモンゴキブリ19.6%、ヤマトゴキブリ15.7%であり、CAP-RASTではクロゴキブリチャバネゴキブリとも15.7%であった。また、この4種のゴキブリRASTを陰性と陽性に分けて検討すると相関関係が認められた。33名の小児気管支喘息患者ではクロゴキブリRAST陽性と重量/容量で1万倍の皮内テストの結果は有意な相関関係を認めた。クロゴキブリおよびチャバネゴキブリ虫体と糞のRASTは相関関係を認め、2名のゴキブリ陽性患児血清を用いたimmunoblot法ではチャバネゴキブリの虫体と糞にそれぞれ共通の52kdおよび76kdの感作抗原分画を認めたが、2名では感作分画は異なっていた。2家屋においてELISA法で測定した室内塵1gあたりのチャバネゴキブリ抗原Bla gl量は、寝室に比較して台所+居間で有意に高値を示し、月別の変動が認められた(それぞれの家屋塵で寝室0.04.2lU/g dust, 0.10.9IU/g dustに対し台所+居間0.57.5lU/g dust,0.34.3lU/g dust)。ゴキブリ抗原吸入誘発試験では即時型の気道反応を示し、RAST抑制試験ではゴキブリ抗原によりダニRASTは抑制されなかった。以上より小児気管支喘息においてゴキブリはダニとは異なる吸入性アレルゲンとして本邦でも注目すべきと考えられ、ゴキブリの多く生息する台所・居間を中心とした駆除による環境整備が必要である。