hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CAT遺伝子導入マウスを用いた病的自己抗体産生機序の解析

全身性エリテマトーデス(SLE)においては、自己抗体の産生が病態形成に深く関わっている。SLEに見られる代表的自己抗体である抗DNA抗体についてのハイブリドーマ株の樹立や抗体可変領域遺伝子の解析から、自己抗体が病原体を獲得する過程で起こる重要な変化は、抗体のIgMからIgGへのクラス転換、抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異とこれに伴う親和性成熟、高親和性クローンの選択ならびにクローン性増殖であることが明らかとなっている。重要な問題は、病原性を獲得する以前の低親和性IgMクラス自己抗体は、本来正常個体に存在する、自己の老廃細胞処理に働いている自然抗体と性質が同じであるにもかかわらず、この抗体がSLE患者においてのみ可変領域体細胞突然変異をともう病的自己抗体に変換するのは何故かという点である。本研究ではこの点を解析するため、抗体重鎖のプロモーターとイントロンエンハンサーの間にchloramphenicol aoetyltransferase(CAT)遺伝子を繋いだ遺伝子を導入したSLE自然発症New Zealandマウス系の樹立を行い、CAT遺伝子の変異を指標として、抗DNA抗体の可変領域遺伝子の体細胞突然変異の機構を探ることを目的とした。CAT遺伝子導入C57BL/6マウスをNZBおよびNZWマウスと交配し、CAT遺伝子の存在を目安に各々NZBおよびNZWに8代退交配し、このCAT導入NZBをNZWを交配したF1マウスを作製した。このF1マウスには高度のループス腎炎の発症を伴う高力価のIgG抗DNA抗体産生が認められたのでSLEを発症した8ヵ月齢CAT導入F1マウスから抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。現在、抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異の有無とCAT遺伝子変異の有無との相関を検討中である。SLEに見られる代表的自己抗体である抗DNA抗体についてのハイブリドーマ株の樹立や抗体可変領域遺伝子の解析から、自己抗体が病原性を獲得する過程で起こる重要な変化は、抗体のIgMからIgGへのクラス転換、抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異とこれに伴う親和性成熟、高親和性クローンの選択ならびにクローン性増殖であることが明らかとなっている。本研究ではこの点を解析するため、抗体重鎖のプロモーターとイントロンエンハンサーの間にchloramphenicol acetyl transferase(CAT)遺伝子を繋いだ遺伝子を導入したSLE自然発症New Zealandマウス系の樹立を行い、CAT遺伝子の変異を指標として、抗DNA抗体の可変領域遺伝子の体細胞突然変異の機構を探ることを目的としている。現在までにCAT遺伝子導入C57BL/6マウスをNZBおよびNZWマウスと交配し、CAT遺伝子の存在を目安に各々NZBおよびNZWに6代退交配し、このCAT導入NZBとNZWを交配したF1マウスを作製している。このF1マウスではIgG抗DNA抗体産生を伴うSLE病態が発症することが確認されたので、現在このマウスから抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立している。今後、樹立したハイブリドーマ株の抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異の有無とCAT遺伝子変異の有無との相関を検討する予定である。

SLEに見られる代表的自己抗体である抗DNA抗体についてのハイブリドーマ株の樹立や抗体可変領域遺伝子の解析から、自己抗体が病原性を獲得する過程で起こる重要な変化は、抗体のIgMからIgGへのクラス転換、抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異とこれに伴う親和性成熟、高親和性クローンの選択ならびにクローン性増殖であることが明らかとなっている。重要な問題は、病原性を獲得する以前の低親和性IgMクラス自己抗体は、本来正常個体に存在する、自己の老廃細胞処理に働いている自然抗体と性質が同じであるにもかかわらず、この抗体がSLE患者においてのみ可変領域体細胞突然変異をともう病的自己抗体に変換するのは何故かという点である。本研究ではこの点を解析するため、抗体重鎖のプロモーターとイントロンエンハンサーの間にchloramphenicol acetyl transferase(CAT)遺伝子を繋いだ遺伝子を導入したSLE自然発症New Zealandマウス系の樹立を行い、CAT遺伝子の変異を指標として、抗DNA抗体の可変領域遺伝子の体細胞突然変異の機構を探ることを目的とした。CAT遺伝子導入C57BL/6マウスをNZBおよびNZWマウスと交配し、CAT遺伝子の存在を目安に各々NZBおよびNZWに8代退交配し、このCAT導入NZBとNZWを交配したF1マウスを作製した。このF1マウスには高度のループス腎炎の発症を伴う高力価のIgG抗DNA抗体産生が認められたので、本年度はSLEを発症したCAT導入F1マウスから抗DNA抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。現在、抗体可変領域遺伝子の体細胞突然変異の有無とCAT遺伝子変異の有無との相関を検討中である。
V1野局所構造における空間周波数処理のダイナミクス

本研究の目的はV1野局所細胞集団の空間周波数選択性やその時間ダイナミクスの精密計測を行い、局所領域においてどのような空間周波数処理が行われているのか、またそれがどのような神経回路を基盤にしているのかを探ることである。これを解明するための第一のアプローチとして、研究計画段階では、電極点間隔が10ミクロン程度の高密度多点電極アレイを用いて、狭い範囲(0.3ミリ四方程度)の微細構造を調べることを考えていた。しかし低密度電極を用いて2ミリ四方範囲の6層全体から細胞記録を行ったほうが、同一の実験条件(視覚刺激、麻酔状況、脳状態)の下で、多数の局所領域から同時を得ることでき、実験条件の影響を評価しやすいこと、また層間での比較を行うことで神経回路解析をしやすいといった利点があることがのちに判明した。この手法を用いたデータはすでに所有しているので、まずは低密度アレイを用いた局所領域の空間周波数チューニングのデータを詳細に解析することを優先して行うことにした。現在までに、局所領域における空間周波数チューニングダイナミクスの特性とその層構造、V1野全体での空間周波数チューニングとの関連に関して新しい知見を見出すことができた。また、(V1の多くのチューニング特性がコントラスト非依存であるのに対し)空間周波数チューニングダイナミクスはコントラストに大きく依存するという予想外の結果を最近新たに発見した。これらの成果は、H29年度日本神経科学学会(幕張)、視覚科学フォーラム(豊橋)で発表し、平成30年度日本神経科学学会(神戸)、北米神経科学学会(サンディエゴ)で発表してきた。これまで低密度多点電極のデータを用いた解析を中心に行ってきた。これらの成果は、上述のとおり、平成29年度、平成30年度の学会発表を行ってきたほか、現在学術論文にまとめている。この解析の中で空間周波数チューニングダイナミクスがコントラストに大きく依存するという予想外の結果が出たこともあり、この結果の解析に当初予定していたよりも多くの時間を費やすこととなった。このため、高密度アレイによる実験は十分進んでおらず、予備実験を数回行い、高密度電極を用いて安定に細胞活動を記録できることを確認した段階にとどまっている。研究実績の概要で述べた2つのアプローチで本研究を遂行することを考えている。低密度アレイのデータ解析は一通り完了し、論文執筆もほぼ完了している。近いうちに論文を投稿する予定であり、平成31年度中に出版することを目標としている。また平成31年度の日本神経科学学会(新潟)、北米神経科学学会(シカゴ)でも成果発表を行う予定である。高密度アレイのデータ計測については平成31年度前半にネコを用いた2回の記録実験を計画している。平成31年度後半にデータ解析を行い、研究成果をまとめて、学会発表を行えるようにする。本研究の目的は、V1野局所細胞集団活動の空間周波数選択性およびその時間変化の精密計測を系統的に行い、この領野における空間周波数処理の局所構造やコラム構造、その内部でみられる活動同期を詳細に調べることである。この可能性を検討するのに、研究計画段階では、主として高密度多点電極アレイを用いることを想定していた。この方法は、局所微小領域の構造を高解像度で詳しく調べるのに適している。一方で、コラムレベルでの空間周波数の構造を調べたり、離れた層の局所構造を比較することも、本研究の目的から重要なことであり、これには、低密度電極アレイを用いて6層全体から同時記録したデータを詳細に解析することが必要になると考えられる。そこで、以前に低密度電極アレイを用いて記録した細胞集団活動計測データも利用して、今回はじめて、層レベルやコラムレベルで、空間周波数チューニングの局所構造を詳細に分析することを行った。ネコV1野に刺入した低密度電極アレイを用いて6層全体から同時記録した細胞の空間周波数チューニングダイナミクスを解析の結果、どの層にでも空間周波数時間変化を示す細胞が存在することがわかった。また、特に5層においては、空間周波数チューニングの時間変化の異なる細胞が局在化する傾向がみられた。これらの局所細胞集団は、応答初期には、どの細胞も似た最適空間周波数を示すが、応答後期では、異なるチューニングを示す傾向があり、時間がたつにつれて局所細胞集団が空間周波数処理における役割を多様化する傾向があることがわかった。この成果は、平成28年度の日本神経科学学会、ニューロコンピューティング研究会にて発表を行った。研究実績の概要欄に記載の理由により、空間周波数チューニングのV1野構造の解明という目的のために、(1)低密度電極を用いて同時計測した細胞集団データを用いて、コラムレベルの空間周波数構造の解析を詳細に解析することと、(2)高密度電極アレイを用いた局所微小領域の細胞集団の解析、の2つの方向から研究を行う。(1)の低密度電極データの解析は、順調に進んでいる。層ごとに空間周波数チューニングの時間ダイナミクスの比較検討を行って、本研究のテーマである空間周波数チューニングの局所構造に関する新しい知見を得ることができつつある。この成果は論文としてまとめている最中である。このデータ解析を先行させたため、(2)の高密度多点電極アレイを用いたデータ取得、解析は当初予定したよりも遅れている。ただし、32チャンネルの細胞活動記録システムのセットアップは完了させた。そして、ウレタン麻酔科ラットにおける高密度多点電極アレイの刺入実験は行っており、皮質にスムーズに電極を刺入するための間にピュレーの配置、操作方法について検討を行っており、高密度多点電極アレイを用いても安定に細胞活動は記録できることは確認した。しかし、当初は本年度後半に2度実施予定であった、本格的な細胞活動記録には至っていない。

本研究の目的はV1野局所細胞集団の空間周波数選択性やその時間ダイナミクスの精密計測を行い、局所構造においてどのような空間周波数処理が行われているのかを詳細に記述するとともに、それに関する神経回路、神経結合基盤、機能的意義を探ることである。これを解明するための第1のアプローチとして、研究計画段階では、電極点間隔が10ミクロン程度の高密度多点電極アレイを用いて、狭い範囲(0.3ミリ四方程度)の微細構造を調べることを考えていた。しかし低密度電極を用いて2ミリ四方範囲の6層全体から細胞記録を行い「層による空間周波数チューニングダイナミクスの違い」、「局所レベルでの空間周波数チューニングダイナミクスとV1野全体で伝達される空間周波数信号の時間変化との関係」、「V1野の大域的な粗い時空間スケールの神経同期と個々の細胞活動の時間ダイナミクスや空間周波数チューニングとの関係」を調べる手法と合わせることが、上記の問題を解明するうえでより効果的であるとその後考えるに至った。そこで2つのアプローチで研究を進めることとした。後者のアプローチに関しては、すでにデータベースとして所有している低密度多点電極アレイで記録したV1野細胞活動データを利用し、それを今回詳細に分析することで、局所構造をよりマクロに調べることを行う。平成29年度の実績として、神経同期に関する研究成果を日本神経科学学会(幕張)、視覚科学フォーラム(豊橋)で発表し、視覚刺激にたいする個々の細胞活動の応答潜時や応答量が粗い神経同期に影響を受けていることを示した。また局所レベルでの空間周波数チューニングダイナミクスとV1野全体で処理伝達される空間周波数信号範囲の時間変化との関係の詳細な解析も行った。こちらは平成30年度日本神経科学学会(神戸)で発表することが確定している。これまでのところ低密度多点電極を用いた解析を中心に行ってきた。これにより皮質6層と局所空間周波数チューニングダイナミクスとの関係を記述し、その成果は平成28年度のニューロコンピューティング研究会(大阪)で報告している。また、研究実績の概要で述べたとおり、神経同期と細胞応答ダイナミクスの関連や、局所ダイナミクスと集団レベルでの空間周波数信号伝達との関係を解析した。これらの成果は平成29年度、平成30年度の学会発表を行うほか、現在学術論文にまとめている。一方で、低密度アレイデータの解析、論文執筆に大部分の研究時間を費やしたため、高密度アレイによる実験は十分進んでいない。これまでのところ、高密度アレイ電極を用いたデータ記録システムのセットアップを完了させた後、ラットを用いた予備実験を数回行い、高密度電極を用いて安定に細胞活動を記録できることは確認している。しかしながら、ネコを用いた本格的な実験には至っていない。本研究の目的はV1野局所細胞集団の空間周波数選択性やその時間ダイナミクスの精密計測を行い、局所領域においてどのような空間周波数処理が行われているのか、またそれがどのような神経回路を基盤にしているのかを探ることである。
電波掩蔽による金星大気ミクロプロセスの解明

従来の電波掩蔽観測では幾何光学解法が用いられてきたが、多重伝搬が起こるときに解がうまく求まらない、回折効果により高度分解能が粗くなる、といった問題があった。そこで新たな手法である電波ホログラフィ法のうちの一つ、Full Spectral Inversionを金星大気に応用し、これらの問題を解決して、大気重力波にともなう微細な層構造や、対流圏界の急峻な温度極小の構造を明らかにすることができた。従来の電波掩蔽観測のデータ解析では電波を1本の光線として扱う幾何光学解法が用いられてきたが、複数の異なる経路の電波が同時に受信器に届くマルチパスを正しく扱えないこと、回折効果により高度分解能が制限されること、が難点であった。これらを解決する新たな手法として、受信信号の位相と振幅の時系列データ全体を同時にスペクトル解析する電波ホログラフィ法を、惑星大気の電波掩蔽データに適用する。具体的にはホログラフィ法の一つであるFull Spectrum Inversionを欧州の金星探査機Venus Express電波掩蔽のオープンループデータに適用すべく、地球大気のGPS電波掩蔽のために開発されたアルゴリズムをもとにソフトウェアを開発した。この手法は電波源と受信点がともに惑星のまわりのほぼ円軌道上にあることが前提であるが、この前提にあてはまらない金星電波掩蔽で観測された位相データを仮想的な円軌道でのデータに補正した。こうして補正したデータにFull Spectrum Inversionを適用した結果、従来の幾何光学解法とよく似た鉛直大気構造が得られ、そこには幾何光学解法よりも細かな(鉛直スケール数十m)構造が見られた。得られた高分解能温度プロファイルをスペクトル解析した結果から、新たに見いだされた微細構造は内部重力波によって作られた実際の大気構造であるという確証が得られた。こうして惑星大気の微細温度構造をとらえることに初めて成功し、成果を投稿準備中である。これらを解決する新たな手法として、受信信号の位相と振幅の時系列データ全体を同時にスペクトル解析する電波ホログラフィ法の初期検討を行った。今年度はホログラフィ法の一つであるFull Spectrum Inversionを欧州の金星探査機Venus Express電波掩蔽のオープンループデータに適用すべく、地球大気のGPS電波掩蔽のために開発されたアルゴリズムをもとにソフトウェアを開発した。この手法は電波源と受信点がともに惑星のまわりのほぼ円軌道上にあることが前提であるが、この前提にあてはまらない金星電波掩蔽で観測された位相データを仮想的な円軌道でのデータに補正し、これを解決することを試みた。こうして補正したデータにFull Spectrum Inversionを適用した結果、従来の幾何光学解法とよく似た鉛直大気構造が得られ、そこには幾何光学解法よりも細かな構造が見られた。ただし高度方向に1km程度のオフセットが生じており、その原因を明らかにすることが来年度以降の課題である。また、新たにとらえることのできた微細構造が実際の大気構造であるのかノイズであるのかについても検証が必要である。これらを解決する新たな手法として、受信信号の位相と振幅の時系列データ全体を同時にスペクトル解析する電波ホログラフィ法を、惑星大気の電波掩蔽データに適用した。その結果、従来の幾何光学解法とよく似た鉛直大気構造が得られ、そこには幾何光学解法よりも細かな(鉛直スケール100m)構造が見られた。そこでこれまでにVenus Expressによって得られた多くの観測データにこの手法を適用し、地球大気において飽和重力波に典型的に観察されるマイナス3乗の冪乗の波数スペクトルが金星でも存在すること、パワーは高緯度ほど大きいこと、が明らかになった。これは金星の重力波の散逸過程と重力波スペクトルの普遍性に迫る世界初の成果である。

また、マルチパスの影響をうまく除けた結果として対流圏界面(高度65km付近の雲頂付近)の詳細な温度構造も明らかとなり、とくに圏界面において負の温度減率から逆転層に転じるところで従来考えられていたよりも鋭い温度極小が見られることがわかった。これは雲からの熱放射による放射冷却や雲頂のエアロゾルのスケールハイトについて新たな制約を与えるものである。惑星大気科学本研究課題である電波ホログラフィ法の惑星観測への応用に向けて、そのような手法の一つであるFull Spectrum Inversionを実際の観測データに適用し、新たな手法がもっともらしく機能することを確認できた。現在は多くの観測データにこれを適用してグローバルな分布の特徴を抽出しつつあり、最終目標に迫っている。本研究課題である電波ホログラフィ法の惑星観測への応用に向けて、そのような手法の一つであるFull Spectrum Inversionをすでに実際の観測データに適用し、一部に問題を認めながらも新たな手法がもっともらしく機能することを確認できた。来年度以降に詳細な検討を行うことで実用段階に持って行ける見込みが立った。金星探査機Venus Expressにより得られた多くの電波掩蔽データにFull Spectrum Inversionを適用し、鉛直気温分布のスペクトル解析によって微細な大気重力波の伝搬・飽和・砕波のグローバル分布を明らかにする。こうして得られた結果をもとに、重力波による平均流加速と乱流生成、乱流のカスケードによるエネルギー消散、水平乱流による運動量輸送を解明する。金星探査機Venus ExpressのデータにFull Spectrum Inversionを適用した結果明らかになった、幾何光学解法の結果と比較したときの高度オフセットの原因を、シミュレーションデータを解析するなどして明らかにする。Back propagationなど他のホログラフィ法も試し、トレードオフを行う。次に、得られた鉛直気温分布から鉛直波数についてのパワースペクトルを求め、最も小さいスケールまでパワーの上限が大気重力波の理論飽和スペクトルで制限されていることを確認し、結果の信頼性を評価する。このあとVenus Expressの全データをホログラフィ法で解析し、微細温度構造のグローバル分布を明らかにする。こうして得られた結果をもとに、重力波による平均流加速と乱流生成、乱流のカスケードによるエネルギー消散、水平乱流による運動量輸送などを解明する。購入したソフトウェア等の価格が計画時より値下がりしていたため。当初予定よりも国内での打ち合わせ旅費が増える見込みであるため、それに充てる。Venus Expressのデータを新たな手法により解析し、その信頼性を検証する。欧州のVenus Expressチームと緊密に情報交換し議論を行うために、ドイツを中心に欧州に数回の訪問を計画している。成果発表のために欧州の惑星科学の会合に参加する。また大量のデータを解析処理するためにハードディスクなど計算機関係にも支出する。
卵母細胞の翻訳調節に必須なＲＮＡ結合タンパク質Ｄａｚｌの発現調節機構解明

卵子形成は様々な遺伝子の適切な発現によって進行する。本研究では卵の発生に必須なRNA結合タンパク質の一つ、Dazlに着目した。先行研究からDazlは生殖細胞において翻訳促進に働き、その遺伝子欠損マウスは不妊になるため、卵の一生を通じて必須の遺伝子であると考えられてきた。しかし、その生後の卵子における機能は不明であった。申請者はDazlの胎児から生後にかけてのDazl mRNA及びタンパク質の発現を調べた。その結果、mRNAの発現は胎児期から生後まで一貫してみられるが、生後にDazlのタンパク発現は優位に減少していた。加えて生後特異的にDazl発現が消失するコンディショナルノックアウトの雌マウスは正常に子供を産むことができる、という結果を得た。よって本研究では胎児期の雌性生殖細胞の発生にDazlは必須であるというこれまでの通説に反し、生後の卵胞形成においては、Dazlは必須でないことを示した。これに加えて、申請者は3'UTRを介してDAZL発現が抑制されることが受精後の胚発生の正常な進行に必要であることを明らかにした。3'UTRによるDazlの発現抑制が破綻すると一部の受精卵は胚発生を停止し、その結果、産子数が減少するのである。以上の結果から本研究ではDazlは胎児期の卵子では必須であるが、生後においてはむしろ抑制されることで機能的な卵子形成に関与していることを明らかにした。以上の結果は今までのDazlに対する知見に変更をもたらすものでもあり、卵子における遺伝子発現制御ネットワークの一端も明らかにすることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的はDazlの発現調節機構の解明から卵形成に関わる遺伝子の転写後発現制御ネットワークを明らかにすることである。先行研究からDazlは生殖細胞において翻訳促進に働くRNA結合タンパク質であり、卵の一生を通じて必須の遺伝子であると考えられてきた。しかし、申請者は、通説に反し、生後の卵母細胞ではDazlの発現は不必要であり、むしろ3'UTRを介してDAZL発現が抑制されることに重要な意味があることを明らかにした。これに加え、雌マウスにおいてDazlの3'UTRを除き、卵母細胞においてDAZLが過剰発現になると産子数の減少をもたらすことが今までのデータから示唆されている。そこで今後は1.卵母細胞におけるDazlの過剰発現は卵発達段階のどこで異常を生じ、産子数減少を引き起こすのか2.Dazlの下流でどのようなメカニズムに異常が生じたのか3. 3'UTRを介したDazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのか以上三点の疑問に答えることで、卵形成におけるDazlを中心としたmRNA発現調節の分子機構の一端を明らかにしてゆく予定で研究を進めている。特に今年度はDazlの過剰発現が生後の卵の発育に影響を与える時期並びに原因の特定を目指した。生後の卵は卵胞形成、排卵・受精、着床前胚の発生、着床といった4つの過程を経る。このうち、どの段階にDazlの過剰発現が影響し、産子数の減少を引き起こしたのかを特定することを目標とした。卵胞形成や排卵数には違いが見られなかったため、排卵された卵を培養し、1cellからブラストシストまで発生をするか調べた。すると、DAZL過剰発現卵は桑実胚やブラストシストになる胚の割合が非常に低く、受精後の発生に異常が起きている可能性が示唆された。つまり、過剰なDAZLの存在により、着床前胚の発生に異常が生じたことが明らかとなった。当初の計画どおり、今年度は過剰なDAZLの存在によってどの時期に異常が生じているのかをつきとめることができた。また、未受精卵や受精卵のサンプリングに必要な技術も合わせて身に着けることができ、今後の解析においてもマウスが十分量確保できればRNAseq等の解析に必要なサンプルを回収し、速やかに解析に移ることができると考えられる。また今年度は、今まで得ていたデータの再確認も併せて行った。これまでの結果からDazlのconditional knockout(c-KO)の結果から生後にDAZL発現が存在しなくても卵子は発生を進め、最終的に子供を産むことができると分かっていた。これに加えて今年度は新たに、c-KOでは卵胞形成においてもコントロールと差がないこと、c-KOではDazl mRNAの発現が有意に減少しており、c-KOは効率よく起きていることを確認した。これにより、生後にDazlの発現が必須ではないというデータがより強固なものとなった。別の先行研究では生後もDazl発現が必要であるという結果が示されており、先行研究ではモルフォリノを用いたノックダウンが行われていた。今回の解析からこの先行研究での表現型がモルフォリノという方法を用いたことによって生じた異常である可能性が高まった。今後もc-KOの仔どうしを掛け合わせて、もともと報告されているストレートなDazlのKOと同様の表現型を示すか確認するといった作業を行い、裏付けを進めていく。今年度は当初に立てた3つの課題の一つを解決し、過剰なDazl発現の下流で何が起きているのかという2つ目の課題にも着手しはじめることができた。更に、今までのデータをより強固なものとすることで着実に研究を前進させた。以上の理由から今年度の進捗はおおむね順調であると結論付けた。

本研究の目的は卵の発生に必須なRNA結合タンパク質Dazlの制御機構を解明し卵子形成にかかわる遺伝子発現調節機構を明らかにすることである。先行研究からDazlは生殖細胞において翻訳促進に働くRNA結合タンパク質であり、卵の一生を通じて必須の遺伝子であると考えられてきた。しかし、申請者は通説に反し、生後の卵母細胞ではDazlの発現は不必要であり、むしろ3'UTRを介してDAZL発現が抑制されることに重要な意味があることを明らかにした。これに加え、雌マウスにおいてDazlの3'UTRを除き、卵母細胞においてDAZLが過剰発現になると産子数の減少をもたらすことが今までのデータから示唆されていた。そこで1.卵母細胞におけるDazlの過剰発現は卵発達段階のどこで異常を生じ、産子数減少を引き起こすのか2.Dazlの下流でどのようなメカニズムに異常が生じたのか3. 3'UTRを介したDazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのか以上三点の疑問に答えることで、卵形成におけるmRNA発現調節の分子機構の一端を明らかにしてゆく予定で研究を進めている。特に本年度は前年度に挑んだ1つ目の課題である、産子数減少につながる異常が起こる時期を異なる手法でも確認し、裏付けを進めるとともに、2つ目の課題であるDazl下流で何が起きているのか、にも挑むことができた。具体的には少量のサンプルからRNAseqを行う手法を習得し、現在その解析を進めている。今後も残りの課題に挑むことで卵子形成に非常に重要な遺伝子であるDazlを中心とした遺伝子発現調節機構をより詳細に明らかにし、健全な卵子形成に関わるメカニズムの一端を解明していきたい。前年度にはDazlが生後も過剰に発現し続けた胚が発生段階のどこに異常をきたすのか詳細に調べた。結果、受精卵を培地中で発生させ観察することで、ブラストシストになるまでの着床前胚発生に異常が生じていることが分かった。本年度はこの結果に加え、実際に受精後3.5日目の胚を取り出し、ブラストシストへの発生率を調べた。すると生体内で発生を進めた着床前胚でも同様にブラストシストに至ることができない胚があり、おそらくこれが産子数減少の原因である事を確認した。また、Dazlを強制発現するとその下流でどのような異常が起きているのかを明らかにするために少量サンプルからのRNAseq解析法を習得し、結果を得た。現在解析中であるがこの解析によりDazl下流でどのような異常が起き、産子数減少が引き起こされたのかを知る一助となる事が期待される。更に、Dazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのかについても解析を行った。実際にある候補遺伝子のノックアウトマウスではDazl発現が新生児の卵子でも維持されることが明らかとなり、この因子がDazlの上流で働いている可能性が考えられ、現在解析を進めている。加えて、今年度は、今まで得ていたデータの再確認も行った。特に、先行論文では生後にDazlをモルフォリーノを用いてノックダウンするとMII卵において紡錘体形成に異常が出るという知見が知られていた。これに対し、申請者らはDazlを遺伝学的手法によりノックアウトしても生後卵子形成に異常がないという異なる結果を得ている。そこで、現在、申請者らの用いている系でMII卵の紡錘体形成異常の有無を調べる等の実験を行っている。
肝癌に対する複合的免疫遺伝子治療:樹状細胞機能増強による免疫監視システム再構築

1.肝癌における血管新生分子の発現非癌組織、肝癌において増強していた血管新生分子はFGF-βあるいはIL-8である。正常肝細胞株と比較して肝癌細胞株で増強していたのもFGF-βあるいはIL-8であった。2.肝癌におけるサイトカイン分子の発現肝癌において増強していたサイトカイン分子は、activin, CD40,FGF,Glut,IL17 and FGF-・.である。3.肝癌におけるマイクロRNAのプロファイリングマイクロRNA-527は肝癌において極めて減弱しており、そのターゲット遺伝子はglypican-3である。肝癌進展過程において種々のサイトカインの発現異常が報告されている。肝癌における樹状細胞の活性化を誘導させうるサイトカインを同定するため、第一に、慢性肝炎、肝硬変と比較し、肝癌において特異的に発現する分子の同定を540種類の分子を搭載した蛋白アレイを用いて解析し、肝癌において特異的に変動する分子を同定した。方法としては、蛋白アレイ(540分子搭載)解析には、慢性C型肝炎・肝硬変の肝細胞癌5例の癌部・非癌部の組織を使用し、肝細胞癌においての分子の発現レベルについて、各スポットのシグナルを数量化させ網羅的に解析した。変化の見られたサイトカインについては、Western blotおよび、ABC法を用いた免疫染色により確認した。さらに、階層的分類を用いたクラスター解析もおこなった。非癌部の肝硬変と比較し、肝癌において増強していたのは、Activin・CD40・FGF・Glut・IL-17・TGF-betaであり、これらは、Western blotおよび免疫染色により同様の結果であることが確認された。階層的分類法を用いたクラスター解析の結果、癌部、非癌部におけるサイトカインの発現パターンは異なるプロファイリングを形成していた。また、免疫染色の結果から、非癌部より、癌部において樹状細胞が集積していた。肝癌の進展過程において、Activin・CD40・FGF・Glut・IL-17・TGF-betaのサイトカインの上昇が関与している可能性ある。さらに、樹状細胞への集積への影響にも関与している可能性がある。肝癌進展過程において、種々の血管新生分子の発現異常が報告されている。肝癌における樹状細胞の活性化を誘導させる血管新生分子を同定するため、正常肝、慢性肝炎、肝硬変、肝癌において発現している血管新生分子はタンパクアレイを用いて解析した。各肝疾患病態において発現していた血管新生分子については、Western blotおよびABC法を用いた免疫染色により確認した。まず、正常肝においては、Ang1の発現があり、慢性肝炎においては、Ang1に加え、Leptin、FGFαの発現が見られ、肝硬変においては、Ang1、Leptin、FGFαに加え、VEGFの発現が見られた、さらに、肝癌において、Ang1、Leptin、FGFα、VEGFに加えてIL-8、FGFβの発現がみられた。肝癌の進展過程において、Leptin、FGFα、VEGF、IL-8、FGFβの発現上昇が関与している可能性がある。また、マイクロRNA (2125塩基程度のnoncoding RNA)は、複数のターゲット遺伝子を抑制する新たなタンパク質発現制御機構である。最近、種々の癌細胞において、マイクロRNAの発現パターンが著明に変化していることが報告されており、マイクロRNAが、細胞の癌化に関与しているのではないかと推測されている。よって、肝癌の樹状細胞を活性化させるマイクロRNAを同定するため、肝癌において、変動するマイクロRNAも解析した。マイクロRNAチップを用いて、マイクロRNA-527が極めて肝癌において減少していることが見出された。これら血管新生分子、マイクロRNAが樹状細胞への集積にも影響している可能性がある。肝癌進展過程において、種々のサイトカイン分子の発現異常が報告されている。肝癌における樹状細胞の活性化を誘導させるサイトカイン分子を同定するため、肝硬変、肝癌において発現しているサイトカイン分子はタンパクアレイを用いて解析した。このサイトカインアレイは、507分子が搭載されている。肝癌において発現していたサイトカイン分子については、Western blotおよびABC法を用いた免疫染色により確認した。まず、肝癌において、GCSF,sgp130,IL-1a,GROのサイトカインの上昇がみられた。これらのサイトカイン分子は、肝癌の樹状細胞を活性化させる働きがある可能性がある。また、マイクロRNA(2125塩基程度のnoncoding RNA)は、複数のターゲット遺伝子を抑制する新たなタンパク質発現制御機構である。よって、肝癌の樹状細胞を活性化させるマイクロRNAを同定するため、肝硬変と比較し、肝癌において、変動するマイクロRNAを解析した。

肝がんにおいて増強しているマイクロRNAは、調べた338分子のうち、16マイクロRNAあり、減少しているマイクロRNAは、13分子あった。これら肝癌において変動しているサイトカイン分子、マイクロRNAが樹状細胞への集積および活性化に影響している可能性がある。
降雨と融雪が重なって生じる融雪洪水の雪氷学的研究

降雨と融雪が重なって生じる融雪洪水の発生メカニズムを解明するため、20112013年の各融雪期に、母子里において模擬降雨の散水実験を行った。2012年の実験(積雪深170cm)では、散水開始後5090分で積雪底面から流出が始まり、総散水量120170Lに対し総流出量は4648Lであった。散水量と流出量が定常となった時点における流出水に含まれる模擬降水の割合は、水および同位体の収支式から概ね67割と見積もられ、晴天日や弱い降雨時の融雪水とは異なった流出過程をとることが分かった。降雨と融雪が重なると著しい河川洪水が起きる。あたかも降雨が融雪を加速させて洪水となったかのように見えるが、実際には雨が雪を融かす量はさほど大きくない。ではどうして洪水になるのか。積雪内部における降雨浸透水の挙動が鍵となるが、実際の観測例が少ないことが壁となって、この現象の理解が進まず、治水対策面でも懸案になっている。本研究の目的は、積雪水文試験地において、水の安定同位体をトレーサーとした雪面上への降雨散水実験などから、マーキングされた水の動きを追跡することにより、積雪内での水貯留の実態、およびそれらと河川洪水との因果関係を解明することである。1)既往データによる資料解析降雨と融雪が重なって生じる融雪洪水の例として、春先にしばしば大出水が起こる札幌市郊外の定山渓ダム流域を対象に、流出率やその時の積雪量や融雪量との因果関係を抽出した。特に夏期の大雨洪水と比べ、河川増水の起こり方や流出率にどのような特徴が見られるかを吟味した結果、降雨を伴った融雪出水時の流出率は出水毎に大きく変動し、また、晴天日の融雪出水時や秋の降雨出水に比べて大きな流出率も観測された。流出率の大小と積雪深、先行流量、降雨条件との関係は明瞭ではなかったが、大きなピーク流量は先行流量や降雨強度が大きい場合に出現することが明らかになった。2)観測体制の整備と機器設置現地観測は北海道北部の北大雨龍研究林内の気象・水文観測施設において、平成23年及び24年の融雪期を集中観測期間に行なう。本年はそのために必要な大型積雪ライシメーターの設置と、足場パイプや底面の排水路を造作し散水実験用施設を作成した。また、流域内での積雪量分布観測で用いるスノーコースの整備や、既に所有している雪尺・気温計・風速計などの観測機器の整備と更新を行なった。積雪内部における降雨浸透水の挙動が鍵となるが、雨は積雪内を素通りして地面に到達すると言う研究もあり、国内外の研究者の間で見解が分かれている。何よりもまず、実際の観測例が少ないことが壁となって、この現象の理解が進まず、治水対策面でも懸案になっている。本研究では、積雪水文試験地における詳細な現地観測とともに、水の安定同位体をトレーサーとした雪面上への降雨散水実験などから、マーキングされた水の動きを追跡することにより、積雪内での水貯留の実態、およびそれらと河川洪水との因果関係を解明することを目的とした。現地観測は北海道北部の北大雨龍研究林内の実験地(母子里)で行なった。平成23年の融雪期を集中観測期間とし、降雨前後の積雪構造変化を知るための積雪断面観測や同位体分析用のサンプリングを頻繁に実施した。また、積雪表面に供給された降雨によって、積雪重量がどのように変化し、積雪底面からどの位の水が流出し、それによって河川がどの程度増水したかを連続的に自記測定した。さらに、融雪観測室前の露場において、雪面上に著しい大雨があった場合を想定した模擬降雨実験を、降雨継続時間がそれぞれ1時間、3時間、6時間の場合について行なった。3回目の実験では1平方mの雪面上に6時間かけて200Lの模擬降雨を散布した(総雨量200mmの降雨イベントに相当)が、積雪底面からの流出水はほとんど現れなかった。このことから、雪面上に多量の水が供給されると、積雪内における水平方向の水の流れが予想以上に顕著になることが分かった。得られた成果の一部は国内の水関係学会(日本雪氷学会、陸水物理研究会、日本水文科学会)で発表し、総説論文も投稿中(査読中)である。

積雪内部における降雨浸透水の挙動が鍵となるが、本研究では水の安定同位体をトレーサーとした雪面上への降雨散水実験から、マーキングされた水の動きを追跡することにより、積雪内での水貯留の実態、およびそれらと河川洪水との因果関係を解明することを目的とした。現地観測は北海道北部の北大雨龍研究林で行なった。平成23年の融雪期の積雪深が100cmの時に、融雪観測室前の露場において、雪面上に著しい大雨があった場合を想定した模擬降雨実験を、降雨継続時間を変えて3回行なった。特に3回目の実験では、1平方mの雪面上に6時間かけて200Lの模擬降雨を散布した(総雨量200mm)が、積雪底面からの流出水はほとんど現れなかった。このことから、雪面上に多量の水が供給されると、積雪内における水平方向の水の流れが予想以上に顕著になることが分かった。翌年の融雪期に、再度同じ場所で模擬降雨散水実験を行なった。積雪深は昨春の2倍近い170cmであったが、散水開始後5090分で積雪底面から水が出始め、総散水量170120Lに対し4648Lの流出量であった。散水量と流出量が定常となった時点における流出水に含まれる模擬降水の割合は、水および同位体の収支式から概ね67割と見積もられた。これまで、晴天日の融雪や弱い降雨時には、雪面から供給された水が積雪内部に貯留されていた水を押し出すように流出し、積雪底面から流出する水の9割以上がこうした貯留水であると言われているが、多量の降雨時には異なった流出過程となることが明らかになった。得られた成果の一部は国内の3つの水関係学会や積雪ワークショップの場で発表し、原著及び総説論文も執筆した。平成22年度を研究環境の整備にあて、平成23年度及び24年度の融雪期を集中観測期間に設定した。22年度には最も重要な積雪ライシメーターの設置と、足場パイプや底面の排水路を造作し、散水実験用施設を作成した。23年度には降雨強度を変えて3回の模擬降雨散水実験を行ない、ひと通りの実験結果が得られ、国内の関係学会で成果を発表することができた。24年度には更なる実験の積み重ねを行ない、23年度の結果と併せて結果をまとめる予定であり、概ね当初の計画通りに研究が進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り今年も4月から現地での観測研究に入る。しかし、研究の生命線とも言えるデータ通信機器に不具合が生じ、その対策用に新たな測定システムを導入したため、当初予算以上の経費が掛かってしまった。今後はもう少しトラブルに強い観測システムを構築する必要がある。
マルチスケール環境モデルによるセメント系材料・構造と自然環境の強連成解析システム

時間とともに変化するコンクリート構造物の性能を精度よく予測するために、材料構成モデルの適用範囲の拡張と高精度化を行った。混合材を使用した系における水和物の変化を考慮することで、材齢初期の硬化過程を一般的に追跡するモデルである。さらに実構造物の性能予測にとって必要不可欠な環境作用について、風洞試験ならびに現地観測を通じて機構の分析と定量化を試みると同時に、実際の変動環境下におけるコンクリートの時間依存挙動と耐久性に関する予測を行った。本年度において得られた成果は如何に列挙される1.風洞装置を用いて飛来塩分の発生・輸送・付着・浸透の一連のプロセスを再現し,モルタル供試体内部に浸透する飛来塩分の浸透機構の解明を試みた.供試体表面に到達する塩分量と内部に浸透する塩分量を比較したところ,断続的に塩水粒子が噴霧される状況において,相対的に多くの塩化物イオンが内部に浸透することが明らかになった.一方で,持続して塩水噴霧の作用を受ける場合や塩水浸せき時には,塩化物イオンが内部に浸透する速度が低下するという結果が得られた.すなわち,表面の乾燥状態が保持されたまま飛来塩分が作用する環境において,内部への浸透が多くなる現象が実験的に示された.2.塩化物イオンに対して浸透抑制効果があることが知られている高炉スラグ微粉末を用いたコンクリートの物性を高精度に評価するために,水和反応,空隙構造,強度発現に関するモデル化を行うとともに,水和による自己乾燥・自己収縮の程度と強度発現の関連について検討を行った.高炉セメントB種として分類されるセメントを複数取り寄せ実験を行った結果,セメントの種類によって強度発現性状と自己収縮の関連に大きな相違があることが分かった.すなわち初期の強度発現が大きい場合,それに応じて自己収縮量も増大することが明らかとなった。材料設計の観点から,耐久性を損なう初期ひび割れを低減するための考え方を示唆する貴重な実験結果を得た.3.湿気や雨かかりに代表される自然環境条件と,中性化の進行の相互依存性を明らかにするために,既設構造物の調査を行った.その結果,実環境での中性化深さは,雨水等の影響を顕著に受けることが分かった.本年度において得られた成果は如何に列挙される.1.高炉スラグ微粉末を使用したコンクリートの物性を高精度に予測するために,材料特性を左右する水和反応や微細構造形成モデルの高度化を行った.X線回折リートベルト法を高炉セメント硬化体に対して適用し,セメントと高炉スラグ微粉末の2成分系での水和反応を定量化したうえで,微細空隙構造の測定を行った.その結果,高炉セメントの生成するC-S-Hのキャラクターがポルトランドセメントの系と大きく相違し,C-S-Hの保持するゲル水の割合が全水和過程を通じて一定ではなく,水和後期において増加することを見出した.その結果に基づき,高炉セメントの空隙構造形成モデルに対して,C-S-Hの保有空隙率をスラグの水和の進行とともに増加させる新たなパラメーターを導入し,高炉セメントの空隙構造の微細化や長期強度の増進に関する現象を,定量的に再現することに成功した.2.飛来塩分の発生と輸送,および構造物への付着と内部浸透を,一気通貫で取り扱うマルチスケール環境モデルの検証に資するために,新潟県大川橋りょうを対象として,現地観測を実施した.およそ2時間の短期計測を月ごとに行った結果,小窪らの既往研究による飛来量予測モデルを用いて,現地の観測値を概ね再現できることを明らかにした.同時に,風向や風速ならびに波浪条件によって,構造物近傍への飛来塩分到達量は部位によって大きく異なる傾向を示すことが明らかとなった.またモルタル片と綿を同一環境に置いた1ヶ月間の暴露試験を実施した結果,雨雪による洗い流し効果が無い場合には,到達量と浸透量がほぼ等しくなることが分かった.
非線形偏微分方程式の解の特異点に対する漸近解析

研究実績は以下のとおり.研究代表者の小川は分担者の加藤と共同で非線形分散型方程式の一点の強い特異点が瞬時に解消して解が時間と空間両方向について実解析的となることを示した。また分担者の小薗、協力者の谷内と共同で臨界型の対数形Sobolevの不等式(Brezis-Gallouetの不等式)を斉次,非斉次Besov空間に拡張した。またそれを用いて非圧縮性Navier-Stokes方程式、Euler方程式、及び球面上への調和写像流の解の正則延長のための十分条件をこれまでに知られているSerrin型の条件よりも拡張した。また同様の不等式の最良形をLizorkin-Triebel空間のsemi-normを用いて導いた。このことにより、同様な正則性条件を調和写像熱流に対して示すことができた。分担者の川島は輻射気体の方程式系を含む一般の双曲・楕円型連立系の解の漸近挙動を、基本解に基づく手法で詳細に調べた。双曲・放物型連立系に対するLiu-Zengの結果の類似版である。双曲・楕円型連立系の線形化系の基本解をFourier変換により表示し、その主要部分が対応する双曲・放物型連立系の基本解の主要部分と一致すること、すなわち熱核を用いて表されることを確認した。分担者の隠居は分担者の小林と共同で3次元半空間上の圧縮性Navier-Stokes方程式の初期値境界値問題の密度が一定な静止状態を表す定常解の安定性を考察し撹乱の時間無限大でのL^2ノルムの時間減衰オーダーの最良のものを求めた.分担者の伊藤は中間的表面拡散流方程式に対して,拡散係数が無限大になるときの解の挙動,及び,解の自己交差を示し、表面拡散流方程式に対しては,その解曲面の凸性を必ずしも保存しないことを示した.分担者の北は分担者の和田と共同で微分型非線形Schrodinger方程式をゲージ変換により解の高次の漸近展開を求める手法を与えた.研究実績は以下のとおり.研究代表者の小川は分担者の加藤と共同で非線形分散型方程式の一点の強い特異点が瞬時に解消して解が時間と空間両方向について実解析的となることを示した。分担者の隠居は分担者の小林と共同で3次元半空間上の圧縮性Navier-Stokes方程式の初期値境界値問題の密度が一定な静止状態を表す定常解の安定性を考察し撹乱の時間無限大でのL^2ノルムの時間減衰オーダーの最良のものを求めた.分担者の伊藤は中間的表面拡散流方程式に対して,拡散係数が無限大になるときの解の挙動,及び,解の自己交差を示し、表面拡散流方程式に対しては,その解曲面の凸性を必ずしも保存しないことを示した.分担者の北は分担者の和田と共同で微分型非線形Schrodinger方程式をゲージ変換により解の高次の漸近展開を求める手法を与えた.小川は研究分担者の加藤と共同で、KdV方程式の初期値が一点だけディラック測度のような強い特異点を持つ場合に、その解が時間が時刻0以外で時間-空間両変数方向に実解析的となることを証明した。この手法を発展させ、非線形Schrodinger方程式や一般の半線形分散型方程式で非局所作用素を含まない場合に、類似の結果を証明した。また小川は谷内靖と共同で3次元Euler方程式の初期値問題の解の爆発のための新しい十分条件を一般化されたBesov空間の記法で表現した。これにより、逆に渦度が高々対数程度の特異点を持つ場合にはEuler方程式の解は、なめらかに延長できることも示した。川島は西畑伸也と共同で空間1次元の半空間における離散的Boltzmann方程式に対し、純消散的境界条件を課した場合の定常解の存在を示し、それが時間無限大で漸近安定であることを証明した。また、その定常解が空間の無限遠方で空間一様な平行状態に指数的に漸近することを示した。さらに一般の双曲・楕円型連立系のある種の特異極限を論じた。また、輻射気体の方程式系ではこの時異極限は、Boltzmann数とBouguer数の積を一定にしたままBoltzmann数を零に近づける極限に対応していることを明らかにした。

一方、隠居は無限層状領域におけるOberbeck-Boussinesq方程式のある種の定常解に対して、定常解が線形化安定性の臨界状態にあっても、初期撹乱の大きさに関係なく無条件安定であることを示した。研究実績は以下のとおり.研究代表者の小川は研究分担者の加藤と共に,非線型分散系の方程式についてその特異点が時間が経過した後に、時間空間両方向につき、実解析的となることを証明した。これはまずKdV方程式について初期条件を現在その時間局所的な適切性が保証されている、H^<-3/4>よりもわずかに強い正則性の下で特異点が原点のみの一点の場合に限り、時間が正または負となると解が時空両方向に対して実解析的となることを証明した。さらに非線形Schrodinger型方程式についてはgauge不変なべき非線形項を持つ場合はL^2からまたgauge不変性を持たない特殊な非線形項については、負の指数を持つSobolev空間の特異点が実解析的となることを示した。また小川は共同研究者の谷内靖とともに、3次元Euler方程式の解の特異性の発生のための十分条件(爆発条件)を調べ、従来知られていた渦度に対するBeale-Kato-Majdaの条件をゆるめて、Besov空間のノルムにより、条件を与えて、解が対数程度の指数を持つ場合には解が正則となることを証明した。さらに小川は研究分担者の小薗と谷内と共同で、Navier-Stokes方程式、Euler方程式、球面上への調和型熱流に対するSerrin型の正則性条件を、Besov空間における対数型のSobolev不等式を証明することにより、新たな条件に拡張した。この条件により特にNavier-Stokes方程式の弱解の渦度が、対数程度の特異性を持つ解に対しても、解の正則性が保証されることがわかった。川島は一般の双曲・楕円型連立系のある種の特異極限を論じた。この特異極限で双曲・楕円型連立系の解が対応する双曲・放物型連立系の解に収束することを、その収束の速さも込めて証明した。輻射気体の方程式系ではこの特異極限は、Boltzmann数とBouguer数の積を一定にしたままBoltzmann数を零に近づける極限に対応していることを明らかにした。研究実績は以下のとおり.研究代表者の小川は研究分担者の加藤と共に,非線型分散系の方程式についてBenjamin-Ono方程式の初期値問題の解がその初期値に一点のみSobolev空間H^s(s>3/2)程度の特異点を持つ場合に、対応する弱解が時間が立てば、時間、空間両方向につき実解析的となるsmoothing effectを持つことを示した。その過程で、無限連立のBenjamin-Ono型連立系の時間局所適切性を証明した。またKdV方程式とBenjamin-Ono方程式の中間的な効果を表すBenjaminのoriginal方程式に関して、その初期値問題が負の指数をも許すSobolev空間H^s(R)(s>-3/4)で時間局所的に適切となることを示した。さらに、谷内と共同で臨界型の対数形Sobolevの不等式(Brezis-Gallouetの不等式)を斉次,非斉次Besov空間に拡張した。またそれを用いて非圧縮性Navier-Stokes方程式、Euler方程式、及び球面上への調和写像流の解の正則延長のための十分条件をこれまでに知られているSerrin型の条件よりも拡張した。分担者の川島は一般の双曲・楕円型連立系のある種の特異極限を論じた。
イオン輸送系の構造形成過程および活性調節機構の解明

膜電位依存性Kチャネル(Kv)は、基本構造として6回の膜貫通部位(S1S6)を持ち、膜電位センサー(S1S4)のS4には多くの正電荷残基が存在する。本研究では、古細菌のKvチャネル(KvAP)の膜電位センサーの組込み様式について、ウサギ網状赤血球由来タンパク質合成系およびイヌ膵臓由来の粗面小胞体を用いたin vitro解析を行った結果、KvAPの構造形成過程は、植物や昆虫のKvチャネルとは異なる挿入機構を経ることが分かった。生体膜上に存在する膜電位依存性Kチャネル(Kv)は、基本構造として6回の膜貫通部位(S1S6)を持ち、膜電位センサー(S1S4)のS4には多くの正電荷残基が存在する。比較的親水性の高いS4の膜への挿入機構は、これまで不明であった。本研究室では、シロイヌナズナのKvチャネルであるKAT1がS3とS4が一体となって膜へ組込まれること、ショウジョウバエのKvチャネルShakerにおいてはS3がその高い疎水性により自立的に組込まれ、S4には通常の膜挿入機構で組込まれる能力があることを明らかにした。しかし、'古細菌のKvチャネルKvAPのS4は、KAT1やShakerよりも疎水性が高い。本研究では、KvAPの膜電位センサーの組込み様式について、ウサギ網状赤血球由来タンパク質合成系およびイヌ膵臓由来の粗面小胞体を用いたin vitro解析を行った。その結果、KvAPのS3は組込み特性を持たないが、S4はN末端側を小胞体内腔へトランスロケートさせる活性(SA-I活性)を持つことが見出された。このことから、KvAPにおいては、膜に組込まれる特性の低いS3に続いてS4が合成されると、S4が自身のSA-I活性によって膜へ挿入し、S4のN末端側セグメントであるS3が強制的に膜内に引き込まれ、2本のTMが同時に形成されることが推測された。以上より、KvAPの構造形成過程は、KAT1やShakerのそれとは異なる挿入機構によることが分かった。また、KvAPS4のSA-I活性は比較的弱いことが分かってきており、S3-S4部分の膜組込み後の安定化には静電相互作用の寄与が示唆された。膜電位依存性Kチャネル(Kv)は、基本構造として6回の膜貫通部位(S1S6)を持ち、膜電位センサー(S1S4)のS4には数個の正電荷残基が存在する。このためS4は通常は比較的親水性が高く、疎水的環境である膜への挿入機構は不明であった。我々は、ショウジョウバエのKvチャネルShakerにおいてはS3がその高い疎水性により自立的に組込まれ、S4には通常の膜挿入機構で組込まれる能力があるが、シロイヌナズナのKvチャネルであるKAT1のS4はS3と一体となって膜へ組込まれることをすでに報告してきた。本研究では、細菌のKvAPの膜電位センサーの組込み様式について、ウサギ網状赤血球由来蛋白質合成系およびイヌ膵臓由来の粗面小胞体を用いたin vitro解析を行った。その結果、KvAPのS3は組込み特性を持たないが、S4はN末端側を小胞体内腔ヘトランスロケートさせる活性(SA-I活性)を持つことが見出された。しかし、KvAP S4のSA-I活性は比較的弱いものであり、S4のN末端側に大きな水溶性ドメインを融合した場合において、SA-I活性が阻害されることが分かった。このため、S4のSA-I活性によって強制的に膜内に引き込まれたS3が正常な位置で停止するためには、静電相互作用の寄与が示唆された。KvAP S2およびS3内の負電荷残基、S4内の正電荷残基に注目し、電荷を変化させるような部位特異的変異を導入した場合、S2内のAsp72とS4内のArg123およびArg126の静電相互作用が示唆される結果を得た。KAT1やShakerにおいても、相同部位に静電相互作用が検出されていた。従って、KvAP、KAT1およびShakerのS3・S4部位の組込み開始機構は異なっているが、膜貫通部位を安定化するための静電相互作用部位は保存されていることが明らかになった。