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アンチセンスDNA分子によるヒト白血病の遺伝子治療に関する基礎的研究

1992年より文部省科学研究費補助金の援助を受け,白血病特異的な再構成あるいは増幅がん遺伝子に対するアンチセンスDNA分子(AS)により,その増殖抑制が可能であるかどうか検討し,平成6年3月までに以下のことを明らかにした.1.アンチセンスDNA分子(AS)の大量精製方法の確立と血清中での安全性の検討(平成4年度).2.ASの細胞膜透過性の検討(平成4年度).3.ASの細胞毒性に関する検討(平成4年度).4.慢性骨髄性白血病(CML)患者から得られた白血病細胞を,B3A2およびB2A2のmRNAに対するASと培養し,腫瘍細胞の増殖抑制を確認した(平成4,5年度).5.ASの配列特異的アンチセンス効果をCML細胞株BV173を用いて検討し,B3A2とB2A2 ASのあいだにcross reactivityがあることが明らかにした.配列上50%の相同性があること,PS ASは培養条件により標的としないmRNAを切断する可能性があることがcross reactivityの原因と考えられた.アンチセンス効果の発現には,標的mRNAの2次構造を考慮し,どの部位をターゲットにすればより効果的であるのか,どのような培養系や細胞側の条件が影響をおよぼすのかを解明する必要があると思われた(平成5年度).6.B2A2 ASを添加すると,BV173細胞はアポトーシスを介して,その増殖が抑制されることが明らかとなった.さらに,BV173の細胞質が抗c-ablモノクローナル抗体により染色されることを明らかにした.正常のc-abl蛋白は核に存在することから,BV173細胞では抗c-abl抗体はおもにBCR-ABLキメラ蛋白p210を認識しているものと考えられ,その蛍光強度がB2A2 ASにより減少することを確認した(平成5年度).7.現在,ほかの白血病にみられる再構成がん遺伝子に対するASを作製し,その効果を検討中である.また,白血病細胞BV173をマウスに移殖し,ASの効果をin vivoで確認する基礎的実験に研究協力者と取り掛かり始めたところである.1992年より文部省科学研究費補助金の援助を受け,白血病特異的な再構成あるいは増幅がん遺伝子に対するアンチセンスDNA分子(AS)により,その増殖抑制が可能であるかどうか検討し,平成6年3月までに以下のことを明らかにした.1.アンチセンスDNA分子(AS)の大量精製方法の確立と血清中での安全性の検討(平成4年度).2.ASの細胞膜透過性の検討(平成4年度).3.ASの細胞毒性に関する検討(平成4年度).4.慢性骨髄性白血病(CML)患者から得られた白血病細胞を,B3A2およびB2A2のmRNAに対するASと培養し,腫瘍細胞の増殖抑制を確認した(平成4,5年度).5.ASの配列特異的アンチセンス効果をCML細胞株BV173を用いて検討し,B3A2とB2A2 ASのあいだにcross reactivityがあることが明らかにした.配列上50%の相同性があること,PS ASは培養条件により標的としないmRNAを切断する可能性があることがcross reactivityの原因と考えられた.アンチセンス効果の発現には,標的mRNAの2次構造を考慮し,どの部位をターゲットにすればより効果的であるのか,どのような培養系や細胞側の条件が影響をおよぼすのかを解明する必要があると思われた(平成5年度).6.B2A2 ASを添加すると,BV173細胞はアポトーシスを介して,その増殖が抑制されることが明らかとなった.さらに,BV173の細胞質が抗c-ablモノクローナル抗体により染色されることを明らかにした.正常のc-abl蛋白は核に存在することから,BV173細胞では抗c-abl抗体はおもにBCR-ABLキメラ蛋白p210を認識しているものと考えられ,その蛍光強度がB2A2 ASにより減少することを確認した(平成5年度).7.現在,ほかの白血病にみられる再構成がん遺伝子に対するASを作製し,その効果を検討中である.また,白血病細胞BV173をマウスに移殖し,ASの効果をin vivoで確認する基礎的実験に研究協力者と取り掛かり始めたところである.平成5年3月中旬までに得られた知見は以下のごとくである。(1)in vitroでアンチセンス効果を発現させるためには、2.55.0μMの濃度が必要であり、数回の実験のために数百0.D.のDNA分子を精製しなければならないことが明らかとなった。そこで、in vitroの実験に必要なDNA分子の大量精製方法をあらたに確立した。この大量精製方法は、核磁気共鳴法にてプロトンのレベルでみても不純物は混入しておらず、化学的に純粋な物質であることがわかった。また、精製したホスホロチオエート型DNA分子は血清中でもきわめて安定であることがわかった。(2)慢性骨髄性白血病の患者から得られた白血病細胞を、b3a2,b2a2のmRNAに対するアンチセンスDNA分子とともに培養したところ、特異的に腫瘍細胞の増殖を抑制することが確認された。(4)現在の方法で合成、精製されるホスホロチオエート型DNA分子は20μM以上の濃度では、正常の造血幹細胞の増殖を非特異的に抑制することがわかった。この非特異的な増殖抑制はDNA合成や精製の過程で混入したものではなく、ホスホロチオエート型DNA分子自体の作用であると考えられる。

(5)アンチセンスDNA分子の3'端を蛍光色素(FITC)で標識し、細胞膜透過性を検討したところ、37°Cでは細胞質内に到達するが、4°Cでは細胞膜を通過しなかった。すなわち、細胞膜透過性はエンドサイトーシスなど何らかの機構を介しているものであることがわかった。さらに、アンチセンス分子の蛍光は細胞質内にドット状に散在して認められるところから、細胞質内の一部(たとえばリボゾーム)に特異的に局在している可能性が考えられた。以上の研究結果は、第51回日本癌学会総会、第2回アンチセンス・シンポジウム等において発表した。1992年より文部省科学研究費補助金の援助を受け,白血病特異的な再構成あるいは増幅がん遺伝子に対するアンチセンスDNA分子(AS)により,その増殖抑制が可能であるかどうか検討し,平成5年度において以下のことを明らかにした。1.慢性骨髄性白血病(CML)患者から得られた白血病細胞を,B3A2およびB2A2のmRNAに対するASと培養し,腫瘍細胞の増殖抑制を確認した(平成4,5年度)。2.ASの配列特異的アンチセンス効果をCML細胞株BV173を用いて検討し,B3A2とB2A2 ASのあいだにcross resctivityがあることを明らかにした。配列上50%の相同性があること,PS ASは培養条件により標的としないmRNAを切断する可能性があることがcross reactivityの原因と考えられた。アンチセンス効果の発現には,標的mRNAの2次構造を考慮し,どの部位をターゲットにすればより効果的であるのか,どのような培養系や細胞側の条件が影響をおよぼすのかを解明する必要があると思われた(平成5年度)。3.B2AB ASを添加すると,BV173細胞はアポトーシスを介して,その増殖が抑制されることが明らかとなった。さらに,BV173細胞質が抗c-ablモノクローナル抗体により染色されることを明らかにした。正常のc-abl蛋白は核に存在することから,BV173細胞では抗c-abl抗体はおもにBCR-ABLキメラ蛋白p210を認識しているものと考えられ,その蛍光強度がB2A2 ASにより減少することを確認した(平成5年度)。4.現在,ほかの白血病にみられる再構成がん遺伝子に対するASを作製し,その効果を検討中である。また,白血病細胞BV173をマウスに移植し,ASの効果をin vivoで確認する基礎的実験に研究協力者と取り掛かり始めたところである。
ディファレンシャル・ディスプレイ法による根尖性歯根吸収調節因子の解析

7週齢雄性SDラットの上顎臼歯の歯間に矯正用ゴムを挿入して上顎臼歯を近遠心的に移動し,歯根吸収を引き起こした。7日後に灌流固定し,蟻酸にて上顎骨標本を脱灰後,通法通りパラフィン切片を作成した。コラーゲン分解酵素であるマトリックスメタロプロテイナーゼ-1(MMP-1)およびカテプシンKのmRNAを検出するため,ジゴキシゲニン標識RNAプローブを用いたin situ hybridization法を上顎骨脱灰切片に対して行った。また,破歯細胞および破骨細胞の同定のため,酵素組織化学的手法による酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を隣接切片に対して行った。MMP-1のmRNAは線維芽細胞様細胞,セメント芽細胞,骨芽細胞で検出されたが,TRAP陽性の破歯細胞および破骨細胞では検出されなかった。また,MMP-1のmRNAは,破歯細胞近傍に存在するセメント細胞や骨細胞に強く発現していた。すなわち,歯の移動に伴う歯根吸収において,MMP-1によるコラーゲンの分解は,破歯細胞以外の周囲の細胞により行われていると考えられた。一方,カテプシンKのmRNAは破歯細胞および破骨細胞にのみ発現していた。すなわち,歯の移動に伴う歯根吸収の際に,カテプシンKによるコラーゲンの分解は,破歯細胞により行われていると考えられた。以上の結果から,MMP-1およびカテプシンKは,骨吸収と同様に歯の移動における歯根吸収の際にも,重要な役割を果たしていることが明らかとなった。これまで困難とされてきた,歯の移動による根尖部の歯根吸収を引き起こす実験系の完成を試みた。まず,SDラット上顎臼歯を直径0.15mmの加工硬化型Ti-Niワイヤーにて約1gfから10gfの力で近遠心的に移動し,歯根尖を酵素組織化学的に観察したところ,著明な歯根吸収は認められなかった。5gf以下では,硝子様変性も認められなかった。一方,上顎臼歯咬合面にレジンを築盛し,実験的に外傷性咬合を誘発したが,こちらも歯根尖の吸収は認められなかった。ところが,臼歯咬合面にレジンを築盛して,同じTi-Niワイヤーにて歯の移動を同時に行ったところ,1週間後には一部の歯根の根尖部に著明な吸収が認められた。これらの結果の一部は平成10年6月の第74回ヨーロッパ矯正歯科学会で発表した。現在,実験群の根尖性歯根吸収部付近の歯根膜および歯髄組織を採取し,RNAを抽出して,RT-PCR法およびDifferential Display法を行って,歯根吸収の活性化に関与する因子および歯根吸収の抑制に関与する因子を検索している。今後,歯根吸収調節因子が見つかれば,免疫組織化学的手法によりその組織における局在を検討し,in situ hybridization法により産生細胞の同定を行う。また,これら歯根吸収調節因子の阻害剤を用いてその機能の確認を行いたい。さらには,他の各種機械的刺激を歯の移動実験系に加え,刺激と調節因子・歯根吸収の存在との関係を明らかにして,臨床上,注意すべき機械的刺激因子についても示唆を得る予定である。
増幅したがん遺伝子をがん細胞から排出する機構

がん細胞に見られるDMと呼ばれる染色体外遺伝因子は、数メガ塩基対程度の自律複製する環状DNAよりなる。我々は、DMが細胞から排出されるとがん細胞が脱がん化、分化することを見い出したことから、その排出機構に焦点を当てた研究を行ってきた。DMは細胞質に生じた微小核の中に選択的に取り込まれることを介して細胞から排出される。本研究では、このようなDMの細胞内動態と選択的排出機構に関するモデルを細部にわたって完成させることができた。すなわち、DMは分裂期染色体に付着することによって娘細胞に安定に分配されるが、微小核誘導剤をDNA合成期に処理するとその後の分裂期に染色体から離れるDMが増加することを示した。これは、微小核誘導剤がDMのDNAに2本鎖切断を誘導することが原因であると考えられる。一方、分裂期染色体に付着して娘細胞に分配されたDMは分裂終期に核内へ取り込まれるのに対し、分裂期染色体に付着できなかったDMは細胞質に取り残され、塊を作った。このような塊はラミンタンパク質で覆われていないものが多かったが、細胞がS期に進行するとラミンタンパク質の大規模な合成と再編成が生じ、細胞質DMの周囲を覆って微小核が形成されることが示された。細胞質DMはラミンで覆われることによりDNA複製ができるようになる。さらに、DMが細胞内から排出されるのは、このようにして生じた微小核がそのまま細胞外に放出される機構によることを、示すことができた。増幅したかん遺伝子が局在するDM(Double Minutes)は広範ながん細胞に見られる。我々は、DMが排出されることにより、がん細胞が脱がん化、分化することを見い出した。本研究では、DMの細胞内動態と微小核を介する排出機構の解明を目指している。平成10年度には、1)薬剤により誘導されるDMの排出は,DMが細胞質に生じた微小核へ選択的に取り込まれたのちに、それが細胞外に放出されることにより生じることを、詳細かつ定量的に実証することができた(投稿中)。2)DMの間期細胞核内での細胞周期の進行にともなう動態が明らかになってきた。すなわち、DMは、G1期に核膜のすぐ裏側に位置し、DNA合成に依存して核内部へと移行するという極めて特徴的な動態を示すことを明らかにした(I.Cell Science,1998)。さらに、正確な複製タイミングの計測により、DMは複製されるために核内部へ移行すること、および、増幅した遺伝子の局在場所により複製タイミングに大きな違いが生じることを明らかにした.(投稿準備中)。3)DMを選択的に取り込んだ微小核の形成機構が明らかになってきた。すなわち、DMは、染色体末端に付着することにより娘細胞へ分配される(ヒッチハイク機構)。DMを取り込んだ微小核が誘導される条件では、DMはヒッチハイクからはずれ、細胞質へ残る。このような細胞質のDMの多くは、G1期には核膜のすぐ外側に付着するように存在する。S期には、複製に不可欠なラミン蛋白質が大規模に再構成され、核膜外側のDMの周囲にそれが集結するため、核出芽様の構造を形成したのちに微小核形成に至る、という一連の過程が明らかになった(投稿準備中)。DMは細胞質に生じた微小核の中に選択的に取り込まれることが原因で細胞から排出される。本年度は最終年度であり、このようなDMの細胞内動態と選択的排出機構に関するモデルを細部にわたって完成させることができた。すなわち、DMは分裂期染色体に付着することによって娘細胞に安定に分配されるが、微小核誘導剤をDNA合成期に処理するとその後の分裂期に染色体から離れるDMが増加する。

これは、微小核誘導剤がDMのDNAに2本鎖切断を誘導し、p53を欠失したがん細胞ではそのまま分裂期に進行するためであると考えられる。一方、分裂期染色体に付着して娘細胞に分配されたDMは分裂終期に核内へ取り込まれるのに対し、分裂期染色体に付着できなかったDMは細胞質に取り残され、塊を作る。このような塊はラミンタンパク質で覆われていないものが多いが、細胞がS期に進行するとラミンタンパク質の大規模な合成と再編成が生じ、細胞質DMの周囲を覆って微小核が形成される。このような微小核の一部は、そのまま細胞外に放出される。本年度は9月に、清水がソーク生物科学研究所を訪問し、上記のモデルの細部にわたって議論をすることができた。また、今後の友好的な協力関係について話し合いを行い、今後の研究に重要な意味を持つ遺伝子等の供与を受けることができた。
精神科ソーシャルワーカーの実践評価指標の開発

精神保健福祉領域のソーシャルワーク実践評価指標を開発した。実践のために重視されるべき、ソーシャルワーカー(以下PSW)が自身の役割や位置づけをどのように規定するのかという「自己規定」、PSWが対象者であるクライエントをいかに捉えるかという「対象者観」、そしてPSWとクライエントとの「関係性」という概念を測定可能にした。全国調査の結果、それらの概念が実践に影響することを検証し、経験年数といった現任PSWの属性による能力の違いが明らかになったので、属性に合わせた訓練について提言した。3つの先行調査を基に、対象者観、アイデンティティ、クライエントーPSW関係という概念を構成するinventoryを作成した。次に、そこから質問紙を作成し、現任PSW3名に文言の使い方や質問順など回答しやすさと項目の妥当性を検討してもらった。標本集団に結果が左右されない項目反応理論による分析を行うため、まずは研修会参加者とその同僚、研究者の知己の現任PSWを対象に第一回プリテストを実施した。105名分のデータによって因子分析と共分散構造分析をした。対象者観を構成する因子は、自分の人生を決め責任を取る存在と捉えている「責任主体」因子と、経験から学びいきいき生きる力と知恵を持つ存在と捉える「知と力」因子とが抽出された(表2参照)。アイデンティティは、生きる悩みをかかえるクライエントと連帯する者として、共に泣き笑いする素の自分で関わる「脱専門性」因子と、客観的アセスメントを中立的立場から行う「援助者」因子とがちゅうしゅつされた(表3参照)。関係性は、学びあい成長しあう「双方向」因子と、立場や責任の違いのある「専門的援助関係」因子が得られた。次に項目反応理論を用いて、関係性に対象者観とアイデンティティからどの程度の影響を与えているか測ったところ、対象者観から0.688、アイデンティティから0.738の有意な係数が得られた。この結果を受けて、愛知県精神保健福祉士協会に所属するPSW480名を対象に実践項目を含めた質問項目を作成し、アンケート調査を実施した。現在分析中である。2つの質的調査研究と先行研究レビュー、プレ質問紙調査を基に2回の質問紙調査を実施した。1つ目はX県精神保健福祉士協会会員475名を対象に質問紙調査を実施した。プレ調査で明らかになった「アイデンティティ」「対象者観」が「関係性」に影響することに加え、「関係性」が「実践」に影響することを検証した。この結果は協会員全員に報告書で還元した。2つ目は、前回調査結果を基に項目反応理論を用いて項目特性曲線を描き、質問項目を精緻化させて日本精神保健福祉士協会会員5,595名を対象に実施した。前回調査で課題として残された、伝統的な医学モデル的専門職像を示す要素がそれぞれの概念の中に位置づけられ、状況によって関係性が変化する「柔軟性」という下位概念も抽出できた。以上のことから4つの概念の尺度化、「関係性」が「実践」に影響することの検証、「対象者観」が「関係性」への予測要因となりうることの検証ができた。さらに坪上の提唱した「循環的関係」のあり様をモデルとして検証することができた。本研究の意義は、(1)単なる言い伝えではなく「関係性」がソーシャルワークにとって重要であるというエビデンスを提示できたこと、(2)「関係性」、「アイデンティティ」、「対象者観」といった抽象的な概念を尺度によって可視化できたこと、(3)現任者が自らの実践を振り返るための指標を提示できたこと、(4)臨機応変に形成することが要求される「関係性」について、現場における留意点を提示できたことである。精神保健福祉領域のソーシャルワーク実践について、基準を提示することを目的とした研究である。2つの質的調査と3回の量的調査を実施するMixed-Methodの手法を採用した。第一に、精神障害者を調査協力者としてフォーカスグループインタビューを実施し、望まれるソーシャルワーカー像を抽出した。第二に、ベテランソーシャルワーカー13名を調査協力者とするインタビュー調査を実施し、精神保健福祉領域のソーシャルワーク実践の全体像を描写した。これら2つの調査から、実践を支える要素として、本領域のソーシャルワーカー(以下PSW)が自身の役割や位置づけをどのように規定するのかという「自己規定」、PSWが対象者であるクライエントをいかに捉えるかという「対象者観」、そしてPSWとクライエントとの「関係性」を抽出した。そこで、量的調査ではこれら3概念と、PSWの実践行為を測定する指標を作成した。さらに、「自己規定」と「対象者観」が「関係性」に影響すること、「関係性」が「実践」にかなりの影響を与えること、逆に「実践」が「関係性」に影響することを検証した。また、PSWの経験年数や教育年数、研修受講回数といった属性によって、これらの概念に大きな差が出ることが明らかになった。

以上の結果から、本研究の意義は、(1)歴史的に主張されてきた、ソーシャルワークにおける「関係性」の重要性を、量的に検証したこと、(2)「関係性」を可視化する道具を開発したこと、(3)「自己規定」と「対象者観」を測定する指標を開発したこと、またこれらPSW自身の認識の重要性を明確にしたこと、(4)PSWの教育、訓練のために、属性によって異なる強化すべきポイントを明らかにしたこと、(5)研究手法として、量的調査ではカテゴリカル因子分析、項目反応理論といった新しい分析方法を用いている点である。
細胞の不死化に関与するテロメア結合タンパク質TRF1の機能の解析

幹細胞や生殖細胞は無限の増殖能を持っているが、ヒトの組織を形成する正常体細胞の寿命は有限である。一方、ガン細胞は何らかの理由で正常細胞が再び不死化能を獲得したものであり、細胞不死化の機構を明らかにすることは、癌の治療や再生医療と密接につながる重要な課題である。細胞寿命決定機構として最も有力なテロメア仮説では、染色体の末端(テロメア)の構造の安定性を介して細胞の寿命が決定されていると考えられている。我々はこれまで、テロメア配列結合タンパク質TRF1がテロメア構造を形成するのに必要な構成的因子であること、TRF1の発現は不死化細胞では大きく上昇していることを発見し、TRF1がテロメア仮説を担う実体であることを提唱してきた(TRF1仮説)。そこで、本年度は、レトロウイルスベクターを使ってヒト初代培養繊維芽細胞に効率よくTRF1を過剰発現させ、その生理的活性と生化学的性質を検討した。レトロウイルスベクターを使うとほぼ100%の細胞にTRF1を過剰発現させることができる。この細胞を使ってTRF1の生理学的活性の一つである新規テロメア合成活性を測定したところ、もとの親細胞と同一であり、この細胞ではTRF1が機能を持っていないことが明らかになった。そこで過剰発現しているTRF1について、不死化細胞と有限寿命細胞で生化学的な比較を行った。その結果、複合体の分子量や等電点はまったく同一で、TRF1分子自体に違いはないことが明らかになった。一方、核マトリックスとTRF1の結合には大きな違いが見いだされ、不死化細胞では両者は強固に結合しているにも関わらず、有限寿命細胞ではこの結合は弱く、核マトリックス上にあってTRF1を結合する因子が欠損していることが強く示唆された。染色体の末端(テロメア)は、細胞の寿命を決定する時計の役目を果たしていると考えられている。つまり、有限寿命を持つ細胞(臓器を構成する体細胞)では、細胞分裂のたびに染色体末端にあるテロメア配列と呼ばれる反復配列DNAが短くなり。これがある下限に達した時に細胞の老化や細胞死が誘導される。このため、何らかの形でテロメア配列の長さを測る機構があると考えられる。一方、癌細胞ではこのテロメア配列が極端に短いものも多いのに、染色体は安定に保たれているが、その違いは判っていない。我々は、これまでに外部から導入したテロメア配列が染色体を切断して新しいテロメアを作る現象(テロメアシーディング)を指標に使って、この分子時計の構成要素の候補としてTRF1と呼ばれるテロメア配列結合タンパク質を同定した。TRF1は、癌細胞では強く発現しているが、初代培養線維芽細胞では発現が弱く、分裂をしない末梢血リンパ球ではほとんど検出できない。そこで本研究では有限寿命を持つ初代培養線維芽細胞でTRF1を強制発現させた時の細胞老化のタイムコースや細胞寿命の変化について調べた。その結果、TRF1を強制発現させることによって細胞老化の誘導が遅れ、また細胞寿命は有意に(5から20分裂)長くなることがわかった。しかし、テロメラーゼを強制発現させた時のように細胞寿命が半永久的に延びる現象は見いだせなかった。また、TRF1の量はテロメアシーディングの活性と密接な相関があるが、有限寿命の細胞でTRF1を強制発現させてもテロメアシーディングの活性は上昇しないことから、有限寿命の細胞ではTRF1によるテロメア維持機構に欠陥があることが予想された。
近代アメリカの女流史家と出版文化の変容

本研究は、アメリカ革命からアンテベラム期を射程におき、新共和国における印刷文化とジェンダー関係の変容過程を分析した。革命期を境におびただしい数の印刷物を通して合衆国では人種とジェンダーによる重層的な公共圏が生まれ、参政権から排除された中産階層の女性の多くは、教育や編集・出版の分野で重要な役割を担うようになった。本研究はこれらの女性たちの言動が「女性の領域」を擁護する一方で、19世紀前半には慈愛と美徳に基づく「自由な帝国」の膨張を文化的側面から支えたことを明らかにした。平成19年度の前半は、建国初期における社会秩序の変容とジェンダー関係を探るために、基礎文献や史料の収集およびそれらの分析に力点をおいた。その一環として、6月に開催されたアメリカ学会では建国期研究と19世紀史研究を個別の研究領域として扱うのではなく、むしろ連続して捉えることの重要性を指摘する報告を行った。また、夏休暇を利用して、ボストンのマサチューセッツ歴史協会、ハーヴァード大学シュレジンジャー図書館及び北西部ウースターに位置するアメリカ古文書協会において18世紀末から19世紀初めにかけてのアメリカの出版業の状況や女性史家の活動に関して約2週間のリサーチを行った。帰国後、収集した史料の整理・分析に専念したが、当時の幾人かの女流史家の著作やマイクロフィルムなどは入手可能であるものの、歴史書を含めた書物全体の流通システム、出版プロセス、読者層の変化についてはフィラデルフィアやボストンなどの一部の都市に史料が偏在している傾向もあり、全体的にまだよく分からない点も多い。次年度の課題の一つにしたい。夏から秋にかけて報告者は、建国初期に重要な歴史書を刊行した著名なマサチューセッツの女性史家マーシー・ウォレンに関する一次史料や二次文献の分析に集中的に取り組んだ。その成果の一部として、ウォレンの『アメリカ革命史』ガ建国期アメリカ文化とジェンダー関係史の中でどのような意味をもっていたのかを論じる研究論文を執筆した。研究成果は共著としてできる限り早期に刊行したいと考えている。マーシー・ウォレンを革命世代の最初の女流史家と位置づけるならば、19世紀初めには多くの白人中産階級の女性たちが歴史の著述家・編集者として台頭してくる。この背景にあると思われる新しい出版文化や読者層の変化について今後研究の射程を広げていく予定である。平成20年度の春学期には、5月中旬に米国ブラウン大学のJohn Carter Library主催で行われた「初期アメリカ史研究の現状」に関するシンポジウム及び円卓会議に出席し、研究についての意見交換を行った。帰国途中にフィラデルフィアに立ち寄り、全米最古の図書館であるLibrary Companyにおいて初期アメリカの出版事情についての一次資料を調査した。夏休暇期間中に収集した一次史料を整理し二次文献を補いながら、今後の調査に関する計画を再検討した。9月21日に東洋学園大学にて開催された日本アメリカ史学会年次大会で、19世紀前半の西半球世界観と題されたシンポジウムに参加し、「3つの革命とジェファソンの『自由の帝国』」というテーマで報告する機会を得た。印刷文化との関係でもジェファソンの『自由の帝国』の理念をアメリカ市民がどのように受容したのか、今後の研究課題としたい。秋学期には、関連資料の収集と重要文献の整理と並行して、10月初めに東京大学の総合図書館でジェファソン関連の資料を閲覧し、11月下旬には再度米国での現地調査を行った。5日程度の短期間ではあったが再びフィラデルフィアに赴き、18世紀末から19世紀にかけてのフィラデルフィア、ニューヨーク、ボストンなどの建国初期の主要な出版業者についての史料を閲覧・収集した。なかでも、1802年にニューヨークで開催された第1回アメリカ文芸フェアーについての一次史料は、アメリカの出版業者の全米的な協力関係や新共和国の発展への出版業者の貢献をみる上できわめて重要かつ興味深いものであった。女流史家に関しては、サラ・ヘイルやエリザベス・エレットの著作を閲覧・収集できたものの、彼女等と出版業者・出版社との関係にまではまだ十分に調査できていない。今後は女流史家の著作のみならず、彼女らが19世紀前半の印刷文化の変容過程に及ぼした影響についてもより詳しく検討していきたい。なお、この調査の一部は、論文の形で早期の機会で出版する予定である。本研究プロジェクトの最終年度として、私は補足的なリサーチをおこない、研究成果の取りまとめに専念した。本年度は研究課題の重心を、建国初期からアンテベラム期(19世紀前半)に移し、印刷技術の革新およびアンテベラム期における「市場革命」の進展、印刷業者と編集者との職能分担、新しい近代的な出版社の台頭などを中心に研究を進めていった。夏休暇中に2週間ほどであるが、クレイトン大学図書館、マサチューセッツ歴史協会、ハンティントン図書館などを回り、印刷文化と女性史家、編集者に関わる史料の閲覧と収集を精力的におこなった。このリサーチの成果の一部は中・四国アメリカ学会年次大会で報告することができた。一次史料及び二次文献の分析・整理を通して、次の3点の重要な成果を得た。

第一に、当時の広範囲な第二次大覚醒運動のなかで、メソジストなどの福音派教会の出版組織が印刷文化の変容を先導していたこと、特にアメリカ聖書協会(1816)、アメリカ日曜学校連合(1824)、アメリカ・トラクト協会(1815)などの宗教組織は多数の教派を組織化すると同時に、有効な布教手段として安価で大量の印刷物を独自に刊行する出版機関を持った。第二に、こうした福音主義的な運動と並行して、1830年代にはニューヨークや西部新興都市を中心に近代的な出版社が出現し、成長しつつあった出版市場で読者層の獲得にしのぎを削るようになった。第三に、アンテベラム期の印刷文化を考察する上で、女性が重要な役割を担った。教育テキストの執筆者のなかには女子教育のパイオニアとして知られるエマ・ウィラードのような著述家も数多く含まれていた。また、印刷文化は奴隷制廃止運動の展開にも決定的な役割を果たした。アボリショニストの機関誌の編集・執筆に女性たちがどのように参加し、それが「公共圏」の形成にいかなる影響及ぼしたのかを分析することは、今後の優先的な課題としたい。
面外曲げ応力を受ける疲労き裂を対象とした疲労損傷対策技術

鋼橋に生じる疲労き裂は,設計で考慮していない二次応力に起因するものが多い.二次応力には様々なものがあるが,断面内の応力分布に着目すると,面内応力(膜応力)と,面外曲げ応力(板曲げ応力)とに分類することができる.実橋に生じる疲労き裂の多くは,後者の面外曲げ応力の影響を受けているという認識のもと,本研究では,面外曲げによって生じる疲労き裂を対象として,き裂進展挙動の詳細な現象解明を行い,き裂対策技術を明らかにすることを目的としている。実際の板曲げ応力は,鋼板の面に垂直な方向の外力の作用により生じる.そのため,鋼板には,板曲げ応力の他に,せん断応力が同時に発生することになる.面外曲げとせん断力が繰返し作用することによって発生する疲労き裂は,き裂が板厚方向のみでなく板の軸方向に湾曲して進展することがある.このときのき裂の進展挙動には,き裂が主に板厚方向に進展し背面に貫通するケース,ある程度板厚方向に進展した後に軸方向に湾曲し板厚内部で停留するケース,き裂が板厚方向および軸方向に進展した後に背面から新たなき裂が発生して破断するケースといった3種類の進展挙動が見られる.本研究では,繰返し面外曲げおよびせん断力を受ける鋼板から発生した表面き裂に対して,き裂の進展挙動を推定する手法を検討した.ビードオンプレート試験体の板曲げ疲労試験を行い,得られた破面から3次元的なき裂の進展経路を確認した.その後,有限要素解析を用いて,き裂最深部の残存板厚内に生じる応力成分の推定方法を構築した.各き裂形状に対して,残存板厚内に作用する板曲げ応力,膜応力および平均せん断応力を用いて2次元のき裂進展解析を実施し,表面き裂最深部のき裂進展経路を推定できることを示した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.疲労試験による面外曲げ応力下のき裂進展の観察:平板に人口ノッチを入れた試験体に対して,繰り返し面外曲げを与えることにより,疲労き裂を発生させ,その進展経路を観察した.試験の結果,単純な応力状態下であっても,疲労き裂は,初期には板表面に垂直に進展するが,板厚の6割となったあたりから垂直面からずれ,潜り込むような進展経路をたどることがあきらかとなった.試験体から破面を切り出し,印象剤を用いてレプリカを作成し,それとビーチマークの結果から,各進展段階ごとのき裂の形状を詳細に計測した.2.解析によるき裂新手経路の再現:試験体をモデル化した3次元有限要素解析により,き裂先端の応力場を求め.上記のき裂進展挙動が説明できるかを検討した.モデルの作成にあたっては,疲労試験から得られたき裂の形状を忠実に取り込んでいる.解析の結果,き裂が長くなると,曲げ応力に対してせん断応力の寄与が相対的に大きくなり,き裂が垂直面内を進まないことを定性的にではあるが明らかにすることができた.3.2次元解析手法の開発:3次元解析は非常に手間がかかるため,パラメトリックな検討を行うには向いていない.そこで,3次元解析を近似的に2次元解析で実施する手法について検討した.き裂が進展することによる,曲げ応力の応力集中とせん断応力の応力集中の変化の様子が異なるため,単純な2次元化ではうまく応力状態を再現できないことが明らかとなった.き裂が進展した際の応力状態の変化について,2次元解析で近似的に明らかにできないかを検討しているが,見込み通りの結果は得られていない.き裂を大胆に簡易にモデル化するなど,さらなる検討が必要であり,平成29年度に優先して取り組むこととしたい.面外曲げを受ける疲労き裂の進展挙動には,1)片面から発生したき裂が反対面まで貫通する場合,2)片面から発生したき裂が板内で停留する場合,3)片面から発生したき裂が停留し,反対面からき裂が発生する場合,の3種類があることが,実験的に確認されている.どのような条件でこれらが異なるのかを解明することは対策を考える上で重要である.そこで,解析的にこれらの進展挙動を再現し,境界条件との関係を見出すことにより,いずれの進展挙動をとるのかを予測する手法を開発した.具体的には,上記の3つの挙動は,き裂発生位置に作用している曲げモーメントとせん断力の比,および,き裂が発生した面と反対側の表面の応力範囲の大きさによる.これらを正確に反映した3次元き裂進展解析を行うことが直接的な手法であるが,3次元き裂進展解析は非常に手間がかかり,その実施は容易ではない.そこで,曲げモーメントとせん断応力の比のみを3次元有限要素解析によって求め,2次元モデルに対して,その比と同等になるように載荷位置を調整するという手法を新たに編み出し,それによってき裂進展解析を実施した.このような手法によっても実験で得られたき裂進展経路を正確に再現できることが確認できた.また,この手法により,裏側からき裂が発生する条件について,一応の提案を行うことができた.ただし,データ数は十分ではないことから,ひき続き検討を継続し,現在の提案でよいかをさらに確認していく必要がある.疲労試験により,3種類の異なるき裂進展挙動を得ることができ,また新たに工夫を加えた応力解析およびき裂進展解析により,それを再現する手法を見出すことができた.これは当初の予定どおりであり,順調に進展しているといえる.関連する課題として面外曲げ応力の実測技術の開発を挙げているが,これについては,計測の困難さから,十分な検討が行えていない.

鋼橋に生じる疲労き裂は,設計で考慮していない二次応力に起因するものが多い.二次応力には様々なものがあるが,断面内の応力分布に着目すると,面内応力(膜応力)と,面外曲げ応力(板曲げ応力)とに分類することができる.実橋に生じる疲労き裂の多くは,後者の面外曲げ応力の影響を受けているという認識のもと,本研究では,面外曲げによって生じる疲労き裂を対象として,き裂進展挙動の詳細な現象解明を行い,き裂対策技術を明らかにすることを目的としている。実際の板曲げ応力は,鋼板の面に垂直な方向の外力の作用により生じる.そのため,鋼板には,板曲げ応力の他に,せん断応力が同時に発生することになる.面外曲げとせん断力が繰返し作用することによって発生する疲労き裂は,き裂が板厚方向のみでなく板の軸方向に湾曲して進展することがある.このときのき裂の進展挙動には,き裂が主に板厚方向に進展し背面に貫通するケース,ある程度板厚方向に進展した後に軸方向に湾曲し板厚内部で停留するケース,き裂が板厚方向および軸方向に進展した後に背面から新たなき裂が発生して破断するケースといった3種類の進展挙動が見られる.本研究では,繰返し面外曲げおよびせん断力を受ける鋼板から発生した表面き裂に対して,き裂の進展挙動を推定する手法を検討した.ビードオンプレート試験体の板曲げ疲労試験を行い,得られた破面から3次元的なき裂の進展経路を確認した.その後,有限要素解析を用いて,き裂最深部の残存板厚内に生じる応力成分の推定方法を構築した.各き裂形状に対して,残存板厚内に作用する板曲げ応力,膜応力および平均せん断応力を用いて2次元のき裂進展解析を実施し,表面き裂最深部のき裂進展経路を推定できることを示した.1.き裂進展挙動の解明:2次元解析でき裂の進展経路を予測する手法を確立し,それによりパラメトリック解析を実施する.また,それにより,裏側からき裂が発生する条件を明らかにする.結果の妥当性は疲労試験により確認する.2.面外曲げ応力の実測技術の開発:実橋に対する測定結果を基にこれを行おうとする場合には,どの程度の板曲げ応力成分が生じているかを実測することが必要となる.板の両面にひずみゲージを設置することができれば,面内応力成分と面外応力成分の分離は容易であるが,実際には,床版に接している上フランジや,閉空間となっているトラフリブなど,板の両面にゲージを設置することが不可能な場合がある.そうでない部材に対しても,両面にゲージを設置するためには,新たに足場が必要となるなど,困難を伴うことが多い.よって,片面のみの計測から,面外曲げ応力成分を測定できる技術が望まれる.そこで,複数の変位計によって面外方向の変位を計測し,それによって曲率を求めることにより,面外曲げ応力成分を推定する手法を検討する.3.面外曲げにより発生する疲労き裂に対する簡易補修・補強法の適用範囲の明確化すでに提案されているICR処理およびFRP接着による補修工法に着目し,前年度で明らかにしたき裂進展挙動を踏まえ,その適用限界を明らかにする.
強磁性単電子トランジスタ技術の研究開発

本研究課題では、情報通信技術の高度化を達成するための次世代メモリ素子技術の基礎となる、新しい基本3端子素子の開発を目的としている。具体的には、単電子デバイスの利点(単電子帯電効果(電荷)→超低消費電力性)と、磁気記録の利点(スピン依存トンネル効果(スピン)→不揮発性)を組み合わせた、これまでにない新しい素子機能を有する基本3端子素子である強磁性単電子トランジスタ(Ferromagnetic single-electron transistor : FMSET)の提案・開発と、それを用いた新しい高性能磁気メモリシステムの確立を目指している。強磁性単電子系メモリ素子では高集積化においても低消費電力で不揮発な、いわば現在のHDDとDRAMとを融合させたような、新しいメモリシステムを実現できる可能性を秘めている。4種類の変調ゲート構造を有する強磁性単電子トランジスタファミリーの提案と動作特性の理論解析を行った。これら素子群の作製技術として、走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた超微細ナノ加工技術を強磁性金属材料へ世界で初めて適用し、強磁性金属(FM)/酸化物(I)系超微細トンネル接合の作製技術を確立した。本手法をNi及びFe系FM/I/FMダイオードや容量結合型FMSETの作製へ適用し、動作特性の観測に成功した。また、磁気を利用した高性能磁気メモリシステムの基本素子となるRC結合型FMSETメモリ素子の提案を行い、そのメモリ動作特性を明らかにした。以上の結果から、FMSETファミリーの電気的・磁気的な特徴が明らかとなり、それを用いた高性能磁気メモリシステム実現への指針が得られた。本研究提案では、情報通信技術の高度化を達成するための、高性能な次世代メモリ素子技術の基礎となる新しい3端子素子の開発を目的としている。具体的には、単電子デバイスの利点(単電子帯電効果=電荷)と、磁気記録の利点(スピン依存トンネル効果=磁気orスピン)を組み合わせた、これまでにない新しい基本3端子素子としての強磁性単電子デバイス技術の研究開発と、それを用いた新しい磁気メモリシステムの確立を目的としている。平成14年度では、新しいゲート構造を有する強磁性単電子トランジスタに於けるトンネル磁気抵抗効果特性の理論的な検討を行い、メモリ応用の観点からデバイス特性の確立を図った。また、強磁性体材料に対して、走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた局所反応場制御リソグラフィ技術を確立した。本手法を適用することで、強磁性金属/絶縁体接合ダイオードおよび強磁性単電子トランジスタの試作を行い、デバイス特性の初期的な検討を行った。以下、本年度に得られた知見を示す。(1)強磁性体材料に対する超微細SPMナノ加工技術の開発強磁性体であるNi、Fe、および反強磁性体であるCrに対して、世界で初めてSPMを用いた局所反応場制御リソグラフィ技術を適用し、超微細ナノ加工技術として確立した。(2)強磁性金属/絶縁体接合ダイオードの作製と検討NiおよびFe系プレナー型強磁性金属/絶縁体接合ダイオードを作製した。17300Kでの電気的特性より、良好な整流特性が確認された。(3)強磁性単電子トランジスタの作製と検討Ni系容量結合型強磁性単電子トランジスタを作製した。17Kでの電気的特性より、初期的な動作特性が確認された。(4)強磁性単電子トランジスタを用いた磁気メモリの検討磁気を利用した高性能磁気メモリシステムの基本素子となるRC結合型強磁性単電子トランジスタの提案を行い、その動作特性を理論的に明らかにした。
気管支喘息の定義と重症化要因及び対策に関する研究

研究分担者及び研究協力者17名の参集のもとに最近の喘息に関する研究と知見をふまえ,また1958年のチバ・ゲスト・シンポジウム及び1962年のアメリカ胸部疾患学会の喘息の定義を参考にして種々討議を行なった.その結果一応次の様な定義を作ることで合意をみた.すなわち,"気道の反応性亢進という特徴を有し,広範な気道の狭窄によって反復性の呼吸困難の症状をあらわす疾患で,その強さが自然に,または治療によって変化し,かつ類似症状を示す肺,心臓,血管系の疾患によらないもの"とした.もちろんこれは多くの専門家によって評価され定義する必要があると考える.なお重症化の要因についてはアンケート調査のまとめや血液学的な検査結果から1)遺伝的素因が濃厚2)発病年令が1才未満3)中年以降(45才以後)に発症4)アトピーが濃厚5)非アトピーないし感染型の喘息6)皮膚反応が陰性7)アスピリンに過敏8)気道の反応性の亢進9)肺気腔,慢性気管支炎,慢性副鼻腔炎の合併10)ステロイド剤の安易な使用などが考えられる.血清中のIgEの総量, IgE抗体の力値, IgG1やIgG4抗体などとは密接な関係は得られなかった.現在ウイルス抗体や免疫複合体などについても検討中でありその結果については将来まとめて報告する予定である.研究分担者及び研究協力者17名の参集のもとに最近の喘息に関する研究と知見をふまえ,また1958年のチバ・ゲスト・シンポジウム及び1962年のアメリカ胸部疾患学会の喘息の定義を参考にして種々討議を行なった.その結果一応次の様な定義を作ることで合意をみた.すなわち,"気道の反応性亢進という特徴を有し,広範な気道の狭窄によって反復性の呼吸困難の症状をあらわす疾患で,その強さが自然に,または治療によって変化し,かつ類似症状を示す肺,心臓,血管系の疾患によらないもの"とした.もちろんこれは多くの専門家によって評価され定義する必要があると考える.なお重症化の要因についてはアンケート調査のまとめや血液学的な検査結果から1)遺伝的素因が濃厚2)発病年令が1才未満3)中年以降(45才以後)に発症4)アトピーが濃厚5)非アトピーないし感染型の喘息6)皮膚反応が陰性7)アスピリンに過敏8)気道の反応性の亢進9)肺気腔,慢性気管支炎,慢性副鼻腔炎の合併10)ステロイド剤の安易な使用などが考えられる.血清中のIgEの総量, IgE抗体の力値, IgG1やIgG4抗体などとは密接な関係は得られなかった.現在ウイルス抗体や免疫複合体などについても検討中でありその結果については将来まとめて報告する予定である.本年度は気管支喘息の重症化要因を検討する目的で、東京大学物療内科、岩手医大第三内科,東北大学第一内科,群馬大学第一内科,独協医大アレルギー内科,昭和医大第一内科,近幾医大第四内科,広島大学第二内科,名古屋大学第二内科の全国9施設においてアンケート調査を行っている。アンケート用紙を用いて喘息患者の住居地,発症年齢,罹患年数,発作の季節性,喘息のタイプ,気管支拡張剤・きょ痰剤・鎮咳剤・抗アレルギー剤等の使用量ステロイドの使用量,最近一年間の通院回数,過去の治療歴,家族歴などを調査中である。また、血清総IgE値,末梢血白血球数,好酸球数,血沈,CRP,【CH_(50)】,免疫複合体,リンパ球subset,胸部X線所見,気道閉塞の可逆性,非発作時の肺機能(FEV1.0,FEV1.0%,%VC,DLco),気道過敏性試験,アレルゲン吸入誘発試験,皮膚テスト,RASTなどのデータも同時に得ている。現在これらのデータを集計中であるが、難治性喘息の重症化の要因を解析するために喘息患者を難治性群と非難治性群に分け、上記の諸因子について両群間で比較を行う予定である。更に、採取した血清中の免疫グロブリン(IgG,IgM,IgA),特異的IgG抗体のsubclass別測定などを行い、両群間でこれらの因子に関して相違がみられるか否かを検討する予定である。
導電性メソポーラスカーボン中に高活性触媒を担持したナノ複合電極の開発と評価

ガス吸蔵、分離・分析、さらには不均一場における高触媒活性など、多孔性材料に要求される機能は多岐に渡る。必要とされる機能に適した有機基をあらかじめ合成し、その後、それらの有機化合物を「適当な節」を使うことによって繋ぐことができれば、有機基の持つ利点を最大限に生かした多孔性材料の設計が可能になる。本研究では、比較的高い配位数を持ち、かつ扱いやすい遷移金属として銅、亜鉛、コバルトなどを節に見立て、末端にカルボキシル基を有する有機化合物と組み合わせた、秩序性の高い金属-有機骨格(MOF)を構築した。なお、これらの評価には単結晶X線構造解析を主に用いた。MOF類の合成条件は、用いる金属や有機化合物により大きく変化したが、似たような構造を有する有機化合物を用いて、類似の合成を多数行った結果、経験的ながらも、効果的な結晶作製法を確立することができた。また、有機分子に様々な置換基を導入することにより、得られるMOFの構造が大きく変わることも、新たに見いだした。従来、結晶構造にほとんど変化を及ぼさないと考えられていたMe基でさえ、二次元的なMOFを三次元ネットワークへと成長する駆動力になりうることを示した点は、新たなトポロジーを有するMOFを設計する際にも有効な知見になるであろう。現時点では、得られた化合物の比表面積や触媒活性などの評価はできていないが、結晶構造解析の結果がガス分子や比較的小さな有機分子がアクセスしうる十分な空間を有していうることから、ガス吸蔵材料や分離分析用の担体としても利用できる可能性は極めて高いものと予想される。高出力・大容量型バッテリーシステムの開発は、電気自動車の普及を実現する上でも極めて重要な課題だが、出力密度を向上させるには,単位時間あたりに脱挿入可能なリチウム量を増やすことが有効な手段となる。そこで、本研究では、負極として利用可能な電極を作製するために、高比表面積を有するチタニア微粒子をカーボン上に担持した複合化電極を作製した。チタンイソプロポキシドをアンモニア水で加水分解(ゾルゲル法)することにより得たチタニアナノ粒子のサイズは約4nmであり、その比表面積は390m^2g^<-1>に及ぶことが分かった。続いて、複合化電極の合成条件を変えた場合の放電容量を電気化学的に評価することにより、高電流密度下で充放電を繰り返した場合においても、高い充放電容量の実現が可能な電極合成法を確立することができた。これにより充放電電位は約2V(vs.Li^+/Li)で、10A/g程の比較的大きな放電電流下でも120mAh/g以上の容量を示す電極が得られた(チタニアの重量を基準)。さらに複合化電極の構造を、電子顕微鏡観察によって評価したところ、カーボン上のチタニア粒子の分散の程度が高い場合に、大きな充放電容量を示すことも明らかにした。また、複合化電極の電気化学的な性質は、電気化学測定前の熱処理によっても大きく変化した。特に、330度で加熱処理を行った複合化電極が、充放電サイクルの経過に伴う劣化の程度がもっとも小さかったことから、活物質表面の水酸基を減らしつつ、アモルファスチタニア粒子が結晶化しない温度で熱処理を施すことの重要性を示すことができた。
細胞膜上のRGS8/8S反応複合体の分子生物学的解明

我々は、G蛋白質制御因子としてGαGAPの作用をもつRGS8とRGS8S(N端部9残基のみが異なる)をクローニングして解析を行ってきた。そして、RGS8が小脳プルキンエ細胞に特異的に高発現していること、Gαiファミリーに結合してGi系の細胞応答を顕著に加速することなどを明らかにしてきた。さらに、最近の研究によって、RGS8は、プルキンエ細胞ではN端を使い分けて様々な蛋白質分子と相互作用して、RGS8反応複合体とRGS8S反応複合体を形成して、特定の細胞膜への移動や受容体選択的なGq制御を行っているものと考えられるようになってきた。そこで本研究では、これらの反応複合体の実体を明らかにするため、次の二つの方向の研究を行った。(1)タグ付きRGS8及びRGS8Sを発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成し、それぞれの反応複合体をタグを利用してアフィニティー精製する。そして結合タンパク群を見つけ出していく。(2)Gタンパク質以外のGqシグナリングに関わる既知の情報伝達因子で、直接RGS8あるいはRGS8Sと相互作用するものはないか検討していく。結果、(1)については、小脳プルキンエ細胞特異的な発現を導くL7プロモーターを用いて、RGS8およびRGS8SのTgマウスを作成中である。これまでに発現レベルの低いマウスしか得られていない。高発現体が胎生致死となる可能性も考えられるため、G蛋白質制御能を失わせた変異体RGS8のTgマウスも作成中である。また、(2)については、極めて興味深い結果が得られた。まずRGS8とRGS8Sの組み換え蛋白質を作成して、カルモジュリンとの結合性を解析した。すると、RGS8がCa^<2+>依存的にカルモジュリンに結合することが明らかになり、しかもN端9残基のみが異なるRGS8Sは反応性が弱いことが判明した。このことは、RGS8の特異的N端部に直接Ca^<2+>/カルモジュリンが結合することを示唆している。また、M1、M2、M3ムスカリン受容体の第三細胞内ループの組み換え蛋白質を用いて、GqあるいはGi系のGPCRとの反応性を解析すると、RGS8がGq系のM1及びM3受容体とは結合するが、Gi系のM2受容体とは結合しないことが判明した。しかも、N端が異なるRGS8Sは、そのGq受容体結合能が低く、さらにN端がないと受容体結合能が著しく減少することが確認された。このようにRGS8が、その特異的N端を中心に相互作用して、細胞膜上でCa^<2+>/カルモジュリンさらに直接Gq受容体を巻き込んだ複合体を形成して、反応特異性を調節している機構が明らかになってきた。

このようにRGS8が、その特異的N端を中心に相互作用して、細胞膜上でCa^<2+>/カルモジュリンさらに直接Gq受容体を巻き込んだ複合体を形成して、反応特異性を調節している機構が明らかになってきた。
アルギン酸の保水機構の解明

アルギン酸の保水機構を解明する目的で、構成糖のマンヌロン酸(M)とグルロン酸(G)の量比、アルギン酸の分子量がそれぞれ緩和時間で表した水和能力に関連しているのか否かを検討した。その結果、M/G比(0.2_-0.9)は緩和時間T_2値で示す水和能力にはほとんど影響しなかった。さらに、アルギン酸の分子量が44.5_x10^4から11.5_x10^4に小さくなるとアルギン酸の水和能力は激減した。一方、緩和時間で示す水和能力測定法の再検討をした結果、pHなどの外部要因で水和能力が変化することが明らかになったが、溶媒の緩和速度を補正することで構造変化がみられない高分子の水和能力をより正当に評価できることを理論面や実際の測定値から導出した。また、アルギン酸のカルシウム添加によるゲル化の際に、部分的なゲル化の追跡に緩和曲線を用いる方法が有効なことを示した。調理や消化器内での水和能力の変化についてはさらに検討が必要と思われるが、アルギン酸に添加する酢酸濃度が高くなると水和能力が低下する傾向を示す結果を得ている。以上の本年度の結果から、緩和時間を指標として調べたアルギン酸の保水機構はアルギン酸の官能基と水との相互作用だけによるものではなく、構成糖間の結合による部分的な糸まり状態によるものと考えられた。また、低濃度のカルシウムイオンを添加することによる浸透条件や添加溶液のpHなどがその機構に関与していることが示された。