hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非ステロイド性抗炎症薬による小腸粘膜傷害でのガレクチン－３および腸内細菌の役割

このため同じ実験系での検討を予定していたCCR9欠損マウスを用いた実験を優先した。本マウスも野生型マウスに比べて強い潰瘍を起こすこと、潰瘍が形成されるまでの時間も早いことなどがわかった。これは独自に確立した血便の検出方法により明らかとなった成果である。インドメタシンの代謝には腸内細菌が関わっていることが報告されている。いくつかの細菌が持つグルクロニダーゼという酵素は水酸化を受け無毒化されたインドメタシンを再びインタクトなものに戻しインドメタシンの効果が回復する。糞便中の細菌による本酵素活性がCCR9欠損マウスで非常に高いことが分かった。また腸内細菌の同定も進行している。ガレクチンー3欠損マウス、CCR9欠損マウスおよび各々の野生型マウスの糞便及び回腸内容物を回収し、細菌の同定を実施するサンプルを調製した。本研究は消化管表面に発現しているガレクチン-3や腸管免疫に働くケモカインのNSAIDsに対する生体防御的役割を明らかにする事を目的としている。NSAIDの1つであるインドメタシンによって急性小腸炎が起こるが、この炎症は腸管バリアの低下とそれに伴う細菌の侵入による。申請者はガレクチン-3欠損マウスで野生型と異なる反応性が得られたことからそのメカニズム解明を目的に研究を進めてきた。ガレクチンー3欠損マウスではインドメタシン投与による炎症反応が弱いことが明らかとなった。ガレクチンー3は小腸突起の表面上部1/3及びマクロファージに強発現している。いずれかもしくは両方のガレクチンー3が症状悪化に関与している可能性が考えられた。そこで、野生型マウスにマクロファージを除去するクロドロン酸ーリポソームを投与し、マクロファージを減少させた後インドメタシンを投与し炎症レベルを調べた。その結果、クロドロン酸投与群で炎症が軽減されることがわかった。マクロファージにおけるガレクチンー3は炎症反応を惹起させるデンジャーシグナルとしての働きを持つ。こういったことから、ガレクチンー3欠損マウスではインドメタシン投与による炎症反応がマクロファージの活性化が弱いことによって減弱している可能性が示唆された。一方で、小腸上皮に多量に存在するガレクチンー3の機能についても興味深い結果が得られた。小腸におけるフローラを野生型マウス(CD1)とガレクチンー3欠損マウスで比較した。ガレクチンー3と野生型の比較では、それぞれのマウスで大半を占める細菌はラクトバチラス属で違いはなかったが、次いで多い属が異なっていることがわかった。野生型ではバクテロイデス属であり、ガレクチンー3欠損マウスはクロストリジウム属であった。この意義については今後さらなる検討が必要であるが、小腸フローラの違いも炎症反応に大きく影響している可能性が考えられる。本研究は痛み止めによって起こる副作用の消化管潰瘍でも特に小腸潰瘍におけるガレクチン-3の役割を明らかにすることを目的とした。ガレクチン-3欠損マウスを使った研究から、痛み止め服用によって起こる小腸潰瘍をガレクチン-3が悪化させることが分かった。そのメカニズムは主に2つの可能性が考えられる。1つは活性化されたマクロファージが危険シグナルとしてガレクチン-3を産生し、これが過剰な炎症反応を引き起こしていることである。
ELISAの法医学的応用

3.血液型自動判定システムの開発:血痕からの可溶化抗原を固定化したプレートの反応ユニットと自動読み取りユニットより成る自動判定システムを組み立て、その稼動専用プログラムを開発した。これにより、18年経過した微量血痕のABO型を4時間で判定することができる。4.GM型判定:MoAbの作製と導入で、Dot-Immunobinding(ELISA)によりきわめて簡単にGM型判定ができた。5.MoAbを用いる、パラコート定量のための抗原固相ELISA(競合法)を開発し、1-10ng/mlの微量定量を可能にした。6.抗唾液、抗精液、抗赤血球膜抗体を固相化したプレートを用いるCapture-ELISAによって対応体液のABO型判定が可能になったが、膣液との交差反応をもう少し検討する余地がある。しかし、抗α2SGP-MoAbによって混合体液から精液のABO型を分離判定できるまであと一歩に迫り、検討を続けている。7.今後の計画:抗G1MXと抗G1MFを作れば、前記2種のGMMoAbと合わせて、日本人のGM型判定がだれにも容易にできるようになる。また、二重特異性MoAb(作製中)の導入により、酵素標識抗体が改良されELISAがさらに改良されるだろう。2.人尿斑の同定:抗ウロムコイド固相サンドイッチELISAによってチンパンジー以外のサル以下の動物とヒトの尿斑を鑑別することができた.3.ELISA用モノクローナル(Mc)抗体(Ab)の作製:細胞融合法により,マウスMc抗A,抗B,抗H,抗M,抗G3MG/21の他,抗AーB抗体を作製した.抗AーBは,A抗原とB抗原との共通部分を認識する抗体で,O型以外のヒト赤血球と反応する性質を示した.4.ELISAによる体液斑のABO型判定:抗唾液,抗精液,抗赤血球膜を固相化したプレートを用いる,サンドイッチELISAによって,対応体液のABO型判定が可能であったが,腟液との交差反応は完全になくすためには,もう少し検討を続ける必要がある.精液のABO判定には,分泌型非分泌型に関係なく反応するロットの市販Mc抗A,抗B,抗Hが適した.5.パラコートの微量定量のための抗原固相ELISA(競合法)を確立した.6.ドットELISAによるGm型判定:ニトロセルロース膜を用いるドットELISAによって,G3MG/21型判定が可能になった.きわめて簡易な方法で,さらに数種のMc抗Gm抗体ができれば,法医の実務に最適のGm型判定法になるであろう.3.血液型自動判定システムの開発:血痕からの可溶化抗原を固定化したプレートの反応ユニットと自動読み取りユニットより成る自動判定システムを組み立て、その稼動専用プログラムを開発した。1.モノクローナル抗体(MoAb)の作製と応用。抗M、抗N、抗グリコホリンAおよびB、抗パラコート、抗G3MG、抗G3MT、抗α2SGPを作製し、ELISAのほか骨髄移植生着の判定にも応用した。2.体液(斑)の種属鑑別:抗ウロムコイド抗体を作製し、サンドイッチELISAにより、3ヵ月放置の人尿斑を同定することができた。3.血液型自動判定システムの開発:血痕からの型物質可溶化剤としてクロロホルム・メタノール、Octyl-β-D-glucopyranoside,Deoxy-BIGCHAPがすぐれていることがわかった。可溶化抗原固相化プレートの反応ユニットと自動読み取りユニットより成る自動判定システムを組み立て、その稼働専用プログラムを開発した。これによって16.5ng/mlの微量ABO型物質を18年経過した人血痕から4時間で正確に検出することができた。4.Dot-Immunobinding(DIB)によるGM型判定最も簡単なELISAであるDIBによるGM型判定はMoAbの作製によってはじめて可能になった。本法はニトロセルロース膜にdotした血清(血痕浸出液)中のGM因子をMoAbと酵素標識第2抗体で検出同定するものである。5.パラコート定量のためのELISA:MoAb産生3クローンを確立した。競合ELISAによって、1-10ng/mlのパラコートが検出できた。6.Capture-ELISAによる精液のABO型判定:モノローナールおよびポリクローナル抗α2SGPの作製応用により、精液のABO型が正しく判定された。
近畿中央部方言における社会言語学的研究

本研究で行ったことは次の通りである。一つ目は、これまで2年にわたって行ってきた河内地方のフィールドワークを継続した。具体的には、松原市、藤井寺市、羽曳野市、美原市の4市町6地点について、一地点につき、20、40、60才台の3世代男女6名づつ、計36名の方言面接調査を実施した。また、このデータを統計処理したり、言語地図化するためにコード化を行い、コンピュータに入力した。二つ目には、近畿中央部においてアンケート形式の調査を行った。2世代男女各120名づつ計480名分を収集した。これまで4年間にわたって続けてきた調査を含め、計2000名分のデータについても、コード化、入力が完了した。現在、集計作業を進めている段階であるが、具体的な成果の公開は来年度になる予定である。三つ目に、収集した音声資料については、データベース化すべく、今年度購入した音声ボードを使用してコンピュータに入力し、編集作業をおこなった。また、この段階でのノウハウを『パソコン国語国文学』(共著)の一つの章「音声情報データベース」として発表した。
都市部及び農村地域における高齢者の孤立化に関する実証的・文献学的研究

独居高齢者に関しては、自立した生活を強く意識していこうとする側面だけではなく、さまざまな交渉を通じて紆余曲折を経ながら何とか現状に折り合いをつけていこうとする側面が注目されなくてはならない。独居高齢者はお互いの弱点も受け入れ合い、何でも気兼ねなく言い合えるような周囲との関係性を求めている。そうした高齢者が精神的に満足した生活を送るためには、自立能力を強調するだけではなく、人間の喪失、病気等による脆弱性を受け入れ合うような周囲のあり方が検討されるべきだと考える。本研究の目的は、1.北海道札幌市(都市部)及び留萌市(農村地域)在住の独居高齢者に関する実態調査と、2.国内外の文献学的研究を融合することにより、高齢者の孤立化に関して深化した考察をすることである。平成25年度(初年度)は、研究実施計画に従って研究を進めた。まず(1)研究代表者である船木祝が研究分担者の旗手俊彦、山本武志、粟屋剛の意見を聞き、かつプレ調査をし、調査票のアンケート項目を確定した。次に(2)札幌医科大学倫理委員会に倫理審査を申請し、8月に承認を得た。(3)「NPO法人るもいコホートピア」及び「月寒ファミリークリニック」の協力を得て、調査対象者を選定し、調査依頼を開始した。(4)高齢者孤立化問題に関する倫理学、法学、社会学に関する文献を収集し、各研究者で情報を共有した。(5)それぞれの研究者が専門の視点に立って文献研究を開始した。(6)8月に粟屋司会のもと、船木、旗手、山本が北海道生命倫理研究会夏季セミナーにおいて文献学的研究の中間成果を発表した。また、外部講師として、東洋大学教授長島隆を講演のため招待した。(7)9月から、承諾を得た調査対象者への個別面接を開始した。(8)平成26年2月に、粟屋司会のもと、船木、旗手、山本が北海道生命倫理研究会冬季セミナーにおいて文献学的研究の最終成果を発表した。(9)本研究は船木、旗手が主催する北海道生命倫理研究会をプラットホームとする。文献学的研究の成果は、北海道生命倫理研究会発行の『北海道生命倫理研究』Vol.2(2014.3.)において公表されている。平成26年度(2年目)は、独居高齢者の孤立化問題に対する指針を見出すため、前年度の文献学的研究を踏まえて、札幌市及び留萌市在住の独居高齢者に関する実態調査を行った。(1)その結果、独居高齢者が現状に折り合いをつけ、前向きに生きていくに至るには、一人暮らしの解釈、言葉、行動、過去の解釈、自分の性格の分析といった自己との交渉、及び信頼できる人間関係の構築や周囲への働きかけといった他者との絶え間ない交渉プロセスが必要であることが明らかになった。(2)船木は7月、ドイツでの高齢者孤立化の状況の調査のため、ドイツを訪問した。ビーレフェルト大学公衆衛生学講座Kerstin Haemel教授からは、施設での孤独感、高齢者のボランティアなどの社会参加、老年教育の必要性などの指摘があった。Mobarak Khan講師へのバングラデッシュの独居高齢者についてのインタビューを通じて、独居高齢者が安心を得るためには、移動の援助、経済的支援、精神的支援など様々な側面からの援助が必要であるとの認識が得られた。トリーア大学心理学講座Sigrun-Heide Filipp教授からは、老年が先の見通しのしにくい時期であること、少数でも親密な人間関係が重要であるといった指摘を得ることができた。(3)8月に北海道生命倫理研究会夏季セミナーにおいて、芝浦工業大学小出泰士教授を講演のため招待した。フランスの終末期医療においては、死の一点に議論が集中しているのではなく、緩和ケアや寄り添いを通じて、よりよい死に至るまでの生のプロセスを重視しているとの指摘を得ることができた。(4)平成27年3月、シカゴでのアメリカエイジング学会において、2年間の研究成果を報告した。わが国の高齢者の現状・生活・QOL・幸福感について報告するとともに、学会参加を通じて、老年社会学研究の最先端の知識を得ることができた。3年目となる平成27年度は、これまでの研究の集大成の年として、昨年度の海外での調査及び学会報告をまとめるとともに、研究成果を医療者、研究者及び市民に発信することを目指した。(1)7月、船木と旗手は北海道生命倫理研究会第7回セミナーにおいて、「老いとともに生きるために」という演題で研究報告をした。(2)8月、日本生命倫理学会ニューズレターNo.58で、本研究を含む「北海道生命倫研究会」の活動内容が掲載された。(3)8月、釧路国際生命倫理サマースクールにおいて、船木は、市民向け公開シンポジウム「老いを考えるー高齢者医療・福祉の問題ー」を企画し、報告した。当サマースクールの内容は、8月30日付けの北海道新聞で紹介された。(4)本調査研究の成果が、8月21日付けの北海道医療新聞において、「独居高齢者を支えている精神的・社会的状況」という標題で紹介された。(5)10月『北海道生命倫理研究』特集号において、山本は、昨年度のシカゴにおけるアメリカエイジング学会での報告を最新の老年社会学の観点からまとめた。船木は、昨年度のドイツ及びバングラデシュの独居高齢者の現状に関する調査インタビューの内容を翻訳、及び解説した。(6)11月、船木は第12回東区北区内科臨床談話会における招待講演において、「老いを考えるー慢性疾患と高齢者医療・福祉」という演題で報告した。

(7)11月、船木は第21回日本臨床死生学会大会シンポジウム「遺された人と『悲しみ』を分かち合うために」において、パネリストとして、死別に苦しむ一人暮らし高齢者を支える社会について報告した。(8)11月、本研究グループは第27回日本生命倫理学会年次大会において、シンポジウム「独居高齢者問題に関する哲学、倫理学的、社会学的、法学的考察」を企画し、報告した。(9)12月、医療従事者および市民の参加を募り、北海道生命倫理研究会主催の公開セミナー「老いとともに生きる社会」を企画し、報告した。独居高齢者に関しては、自立した生活を強く意識していこうとする側面だけではなく、さまざまな交渉を通じて紆余曲折を経ながら何とか現状に折り合いをつけていこうとする側面が注目されなくてはならない。独居高齢者はお互いの弱点も受け入れ合い、何でも気兼ねなく言い合えるような周囲との関係性を求めている。そうした高齢者が精神的に満足した生活を送るためには、自立能力を強調するだけではなく、人間の喪失、病気等による脆弱性を受け入れ合うような周囲のあり方が検討されるべきだと考える。札幌市、及び留萌市の協力団体から、快く協力を得ることができ、12名の研究参加者へのインタビュー調査を滞りなく終えることができた。独居高齢者の置かれている状況について哲学・倫理学的観点、法学的観点、社会学的観点から分析を進め、船木、旗手が主催する年2回の北海道生命倫理研究会で研究成果を報告することができた。8月には北海道生命倫理研究会夏季セミナーにおいて、船木は、自立した・自由な生活スタイルの享受だけではなく、現実の受容が独居高齢者には重要であることを報告した。旗手は、独居高齢者をサポートする介護保険制度の仕組みについて報告した。10月、第26回日本生命倫理学会年次大会の報告の後、共同研究者間で逐語録を再度読み返し、さらに分析結果を精査した。その結果、独居高齢者は、自己との関係、及び他者との関係において紆余曲折を経たプロセスを歩んでいるとの重要な認識に至った。前者においては、一人暮らしのとらえ方、楽しみや生きがいを見出すための姿勢、辛い時期を乗り越えるための姿勢、過去を振ること、自分の性格を分析することにおいて様々な工夫が認められた。後者においては、支えとなる存在をもつこと、人に必要とされることへの試行錯誤が認められた。国外(ドイツ)においては、ビーレフェルト大学公衆衛生学講座、及びトリーア大学心理学講座から、インタビュー調査のための準備、場所の確保、資料の収集等のため、快く協力を得ることができ、ドイツの事情だけではなく、バングラデッシュといった南アジアの高齢者の状況についてもインタビュー調査をすることができた。こうしたドイツでのインタビュー調査と、シカゴでのアメリカエイジング学会での報告は、次年度、独居高齢者問題さらに焦点化、明確化するための重要な視点を提供している。哲学・倫理学生命倫理学従来通り、研究代表者及び研究分担者間で随時メールで意見交換するとともに、班会議を重ねることにより、研究における諸課題をその都度解決しつつ、研究を進行させたい。平成27年度は、昨年度のヨーロッパ(ドイツ)、南アジア(バングラデッシュ)でのインタビュー調査を分析し、国際的観点と日本の状況との比較検討をする。
ＩｄーＮｏｔｃｈシグナル連関による時空間的血管新生制御機構の解明とその治療応用

本研究では、血管が新生される際の細胞動態におけるHLH型転写因子IdとNotchシグナルのクロストークの重要性を検討した。培養モデルを用いた4次元動態解析から、VEGF誘導性に血管が新生される際にみられる個々の内皮細胞の運動スピードや方向性の変換の制御に、IdとNotchシグナルのクロストークが関連する可能性が示唆されてきた。しかし、その制御機序として細胞選別現象の関与は否定的であった。さらに、その制御機序を今後検討する際に有用となる、血管伸長時の細胞動態を表す数理モデルの基礎を構築した。出芽的血管新生を模す3次元組織培養モデルを用いた昨年度までの検討において、伸長や分岐などの血管のかたちをつくる際の内皮細胞の集団的運動は、これまでの想定以上に極めて複雑であることが分かってきた。血管構造が成長する際には、血管内皮細胞はお互いの細胞の位置関係を時々刻々と変化させることで位置的に混ざり合い(細胞の混ざり合い現象)、しかし全体としては秩序だった樹状様の血管構造をつくっていくことが明らかとなった。本年度においては、血管内皮細胞動態の制御システムをより体系的に理解していくために数理モデル化を進めた。タイムラプス観察から捉えられた細胞運動動態に基づき、血管伸長時の細胞運動の状態を方向性とスピードで規定し、それらの状態が確率的に遷移する一次元離散モデルを組んだ。血管伸長因子VEGFによる血管伸長をシミュレーションした結果、この単純な組み込み仮定によってVEGFによる血管伸長とその際の細胞動態の特徴をある程度再現できた。また、VEGFは細胞の運動状態の遷移確率に作用している事が明らかとなってきた。次に、これまでにId1の下流候補分子としてEphrinB2を同定していることから、1)HLH転写因子Id1が細胞の運動方向性の時空間的制御に関与していること、また2)その制御様式として細胞選別現象(セルソーティング)を想定し、培養細胞実験によりその作業仮説の検証を行った。血管内皮培養細胞にId1の過剰発現、ノックダウンによる発現抑制処理を施し、それぞれQーDotでマーキングした上で両処理群を混ぜ、24時間タイムラプス観察し細胞選別現象の有無を定量的に検討した。結果、予想に反してId1による明らかな細胞選別現象は起こっていないことがわかってきた。現在、他の集団的細胞運動の制御機構やその機能分子に関してさらなる検討を行っている。これまで、血管新生促進因子の一つであるHLH転写因子Id1の新生血管内皮細胞における発現は、空間的に均一でなく個々の細胞によって様々なレベルで発現していることを、発生時期のマウス網膜や脳のサンプルを用いること、試験管内の血管新生モデルを用いることで示した。また、血管新生内皮細胞におけるId1のモザイク発現パターンの機能的意義を理解するために、in vitro血管新生における内皮細胞動態を選択的に解析する技術を開発した。それにより、血管新生を行う個々の内皮細胞の動きは時空間的に均一でなく、個々の細胞レベルで時々刻々とその運動性の状態を変え、全体として非常に複雑に動きながらも秩序ある血管の形やパターンを形成していくことが分かってきた。さらに、血管新生における枝の伸長現象を得られた細胞動態に基づき数理モデル化することを通して、その複雑な動態は、個々の内皮細胞運動状態の確率的変化としてある程度理解しうることも分かった。本年度は、数理モデル化を進めることで血管新生を担う多細胞動態の制御機構をより理解すること、Id1の発現パターンと内皮細胞動態の不均一性の関連性を検討する実験系を構築することを目指した。結果、先端の内皮細胞動態は、個々の細胞運動性の確率的な状態変化のみでは十分に説明できず、後続の細胞との細胞間相互作用といったより決定論的な制御機構が重要であることがわかった。一方、Id1遺伝子操作によりId1発現パターンの人工的再現や撹乱が可能で、Id1の機能的役割を解析することが出来る構成的実験系を現在確立できつつある。本研究においてId1遺伝子の血管新生における役割を検討していくことを通して、個々の細胞の遺伝子の発現および細胞状態の不均一性がどのように統合され秩序ある集団細胞運動や形態形成に繋がっているのかという重要な一般的命題の解明や血管新生の新しい治療法の開発に貢献できる。本年度において、1)血管内皮細胞を選択的かつ経時的に追尾することができる解析システムを確立したことで、これまで捉えられてこなかった血管内皮細胞が樹状様のネットワーク構造をとる過程の血管内皮細胞動態を明らかにした。出芽的血管新生を模す培養モデルを用いて解析した結果、血管の伸長や分岐形成を担う細胞動態は、これまでの想定以上に極めて複雑であることが分かった。血管内皮細胞は細胞の相対的位置関係を経時的に変化させ、細胞が位置的に混ざり合い(細胞の混ざり合い現象)、しかし全体としては秩序だった樹状様の構造を形成していくことが分かった。また、これまで特別な細胞と位置づけられてきた先端細胞に関しても同様に入れ替わりが起きていた(先端細胞の入れ替わり現象)。

さらに、マウス網膜血管新生において同様の現象が生じていることも分かった。2)次に、ここで捉えられてきた細胞動態の特性を説明する指標を設定し、その動態を定量評価できる解析系を構築した。薬理学的介入時の細胞動態と血管形態の変化を定量的に解析することで、血管伸長時の血管内皮細胞動態を制御する分子実態の一端を明らかした。血管新生促進因子VEGFは、血管内皮細胞の平均速度の増加や方向性運動の質的な向上、さらに先端細胞の遊走距離の増加を介して、血管伸長に対して促進的に作用していること、VEGFによる血管伸長の一部は、Dll4-Notchシグナルを介した内皮細胞間相互作用により負に制御され、また内皮細胞-壁細胞間の相互作用により正に制御されていることが分かった。今後、Id1分子による遺伝的な介入を行い上述の解析を行うことで、個々の血管内皮細胞におけるId1発現のばらつきや経時変化が、血管内皮細胞の集団的な運動そして形態形成へ、いかに有機的に繋がるのかを明らかにし、血管内皮細胞が血管の"かたち"をつくる際の巧妙なしくみの一端を理解する。当初の研究計画の中で想定したId1の標的機能分子・軸を中心に解析してきたが、検討の結果、他の下流分子の模索等、研究計画の見直しも必要となってきた。また、Id1の遺伝子改変マウスの作製が遅れている。しかし、分子レベルを含む生物学的実験以外での解析においては(モデル化による細胞動態の体系的理解など)進んできており、今後分子的解析と融合させる事により、研究計画をより効率的に遂行できると考えられるため、現在までの達成度を“やや遅れている"と自己評価した。本年度の当初の研究計画の中心に、1)血管新生過程における血管内皮細胞動態の同定・定量化、2)アデノウイルによるId1遺伝子操作時の血管内皮細胞動態と血管形態の変化の解析、3)Id1遺伝子改変マウスの作製を掲げた。本年度において、1)の計画は十分実行できていると考えられるが、2)においては、これまで用いてきた培養系において、アデノウイルスによる感染効率が当初の予想に反して非常に低かったため、同遺伝子介入法は血管形態変化の解析には不適切と判断し、方法論の変更を余儀なくされた。並びに、Id1の遺伝子改変マウスの作製が遅れていることも合わせ、全体としての研究目的の達成度は、現時点においてやや遅れていると判断した。今後、Id1の時空間的発現が、血管内皮細胞の集合的運動の制御と血管形態変化にいかに結びつくのかを、現在確立中である新しい血管新生実験モデルや樹立中であるId1の遺伝子改変マウスを用いて、本年度と同様な解析手法にて検討する。また、本年度において中心的に進めてきた数理モデルを使ったin scilico解析を組み合わせる事で、生物学的実験のみでは見えてこない、もしくは不得手な部分に踏み込んでいく。さらにマウス個体でも検証することで、Id1による血管内皮細胞動態の制御を担う中枢の分子や制御機序を分子生物学的に明らかにする。今後、Id1発現が、血管内皮細胞の集合的運動とそれによる血管形態形成といかに結びつくのかを、現在実験系を確立中である新しい血管新生モデルや、現在樹立中であるId1の遺伝子改変マウスを用いて本年度と同様な解析手法にて検討する。
嚥下造影検査時の新型放射線防護具の開発

嚥下造影検査時の術者被ばく防護のための「散乱線防護Box」と「スライド式防護板」を自作開発した。この2つに追加付加フィルタ(1.0、2.0、3.0 mmAlおよび0.5 mmCu)を組み合わせて、人体ファントムを用いて散乱線防護効果を検討した。その結果、床上150cmにおける散乱線除去率はそれぞれ65.4%79.4%。また、床上90 cmにおける散乱線除去率はそれぞれ30.1%62.8%であり、術者位置における散乱線防護効果がみられた。散乱線防護Box、スライド式防護板、追加付加フィルタを組み合わせて使用することが、術者被ばく防護に非常に効果的であると考える。この結果を論文化し報告した。透視台横置き状態での追加防護具(既存)の有無の状態でアクリルファントム(厚さ20cm)とサーベイメータ(日立アロカ社製ICS-321)を用い散乱線量を比較した。その結果、追加防護具を使用した場合、床上高さ90cm(生殖腺位置を推定)では、術者位置にて86.1%、床上高さ150cm(水晶体位置を推定)では、術者位置にて88.9%散乱線を除去することができた。また、術者被ばく線量では(個人線量計の結果から)追加鉛防護具導入前に比べ導入後では、実効線量で28.6%、等価線量で64.3%を低減することができた。この結果を関連学会にて発表した。また論文化にむけて準備中である。次に、嚥下造影検査の1回あたりの透視時間(n=56)を調べた結果、平均8.2分であった(調査期間2014.42015.4)。透視台を嚥下造影検査の状態(縦置き)でX線照射口に取り付け可能な付加フィルタを用い、人体ファントム(京都科学社製PBU-50)の甲状腺位置に線量計を貼り付け患者の皮膚表面線量の推定をおこなった。フィルタの種類はアルミニウムフィルタを1.0mm、2.0mm、3.0mmと銅フィルタ0.5mmの4種類を使用した。その結果、フィルタなしでの表面線量(7.8mGy/5min)に比べて、1.0mm、2.0mm、3.0mmアルミニウムフィルタはそれぞれ15.4%、30.8%、43.6%また、0.5mm銅フィルタでは55.1%皮膚線量を低減することができた。ただし、3.0mmアルミニウムフィルタと0.5mm銅フィルタでは透視条件が厳しく(見えずらく)、実際の検査で患者に使用するには問題が残った。この結果から現段階での患者皮膚線量は1検査あたり12.79mGy(7.8/5×8.2)と推定されるが、追加のフィルタを適切に用いることで患者皮膚線量は低減できると思われる。寝台横置きの状態での追加防護具導入前後における散乱線量の評価、嚥下造影検査1回あたりの、平均透視時間や患者皮膚線量の推定、追加フィルタにおける、皮膚線量の低減の予測などはこの1年で順調に進めることができた。しかし、透視台縦置き状態で使用可能な追加防護具の試作がまだ進んでいない。形状や材質など研究段階である。しかし、ある程度方向性は見えているので、今後は関連企業とさらに連携して開発を進めたい。昨年、寝台横置きの状態で使用する追加防護具の散乱線除去効果について報告した。今年は寝台縦置きの状態で使用可能な追加鉛防護具を関連企業と連携して開発した(散乱線防護BOX:1.0mmPb当量)。形状としては、透視X線管を覆う構造であり、縦32cm、横26cm、長さは40cmの立体構造である。主にX線照射口からの散乱線を防護するために開発された追加鉛防護具である。新たに開発した防護具の有無にて、透視装置(ZEXIRA:東芝メディカル社製)と人体ファントム(京都科学社製PBU-50)とサーベイメータ(日立アロカ社製ICS-321)を使用し、術者位置(床上90cm:生殖腺位置推定、床上150cm:水晶体位置推定)の散乱線量を測定した。その結果、追加防護具を使用した場合、床上90cmの位置では9.0%、床上150cmの位置では7.8%散乱線量を除去することができた。また、昨年、患者皮膚線量低減のためのフィルタ(1.0mm、2.0mm、3.0mm、アルミニウムフィルタと0.5mm銅フィルタ)を使用し、患者被ばく低減について報告したが、このフィルタと追加防護具を組み合わせて使用したところ、11.3%44.7%散乱線を除去することができた。この研究の新規性として、フィルタを患者被ばく低減ではなく、散乱線防護に使用した報告である。この結果を関連学会(日本摂食嚥下リハビリテーション学会)で発表した。また、嚥下造影検査時の患者の被ばく線量測定は現在進行中である。この1年で寝台縦置きでも可能は追加鉛防護具を開発した。しかし、防護具単独では散乱線は約10%しか除去できなかったので、さらなる防護具の開発し、散乱線量の評価を行う。方向性は見えているので、継続して研究を進める。過去2年間の研究で、嚥下造影検査時の患者被ばく線量の推定と術者被ばく防護のための自作の防護具

「散乱線防護Box」を作製し、結果を報告した。3年目は実臨床で患者に協力いただき、患者皮膚線量と術者の被ばく線量を測定(n=20)と、さらに新たに「スライド式防護板」(50 cm×50 cm×0.8 mmで鉛当量は0.3 mmPb、重量は約6 kg)を自作開発し、これまで使用した「散乱線防護BOX」と追加付加フィルタ(1.0、2.0、3.0 mmAlおよび0.5 mmCu)を組み合わせて、人体ファントムを用いて乱線防護効果を検討した。その結果、患者皮膚線量は被験者20名の平均透視時間は4.26±1.4分、平均線量は18.62 mGy、術者被ばく平均線量は4.75μSvであった。この結果は、ファントム実験による皮膚線量推定値(12.79 mGy)に比べやや高い値を示した。その理由として、ファントム実験より、実臨床ではX線管と患者皮膚表面までの距離が近かったためであると推測される。さらに、透視条件は実臨床の方がファントム実験に比べ高かったことが考えられる。次に、これまで、床上150 cmにおける「散乱線防護Box」を取り付けた場合の術者位置での散乱線除去率は7.8%と報告したが、これに新たな「スライド式防護板」使用した場合は60.3%であった。さらに追加付加フィルタ(1.0、2.0、3.0 mmAlおよび0.5 mmCu)を使用した場合の散乱線除去率は65.4%79.4%であった。また、床上90 cmにおける「散乱線防護Box」を取り付けた場合の術者位置での散乱線除去率は9.0%であった。さらに追加付加フィルタを使用した場合の散乱線除去率はてそれぞれ30.1%62.8%であった。「散乱線防護Box」のみでは、散乱線防護効果はあまり得られなかったが、「スライド式防護板」、追加付加フィルタを組み合わせて使用することで、術者被ばく防護に非常に効果的であると考える。嚥下造影検査時の術者被ばく防護のための「散乱線防護Box」と「スライド式防護板」を自作開発した。この2つに追加付加フィルタ(1.0、2.0、3.0 mmAlおよび0.5 mmCu)を組み合わせて、人体ファントムを用いて散乱線防護効果を検討した。その結果、床上150cmにおける散乱線除去率はそれぞれ65.4%79.4%。また、床上90 cmにおける散乱線除去率はそれぞれ30.1%62.8%であり、術者位置における散乱線防護効果がみられた。散乱線防護Box、スライド式防護板、追加付加フィルタを組み合わせて使用することが、術者被ばく防護に非常に効果的であると考える。この結果を論文化し報告した。透視台縦置き状態で使用可能な追加防護具の開発を進める。研究を進めるにあたり、関連企業のみならず、連携研究者の意見も聞き遂行していく。新たな追加防護具の評価を行う。また、実際の患者さんの被ばく線量を測定し(進行中)、昨年実施た推定値と比較する。関連企業のみならず、連携研究者の意見を聞き遂行していく。放射線被ばく防護透視台縦置き状態で使用可能な追加防護具の作製が進んでおらず、作製した際に術者に使用してもらう予定であったポケット線量計、リアルタイム線量計の購入にも至っていないことが理由として挙げられます。次年度使用額が生じたが、2年終了時は概ね使用限度内で使用できた。術者被ばくの際に使用していただく予定のポケット線量計の購入に至っていないことが考えられます。追加防護具の試作を進め、ポケット線量計やリアルタイム線量計を購入し、臨床の場で術者に使用してもらい、防護具導入前後の被ばく線量の評価を実施する。寝台縦置き防護具のさらなる開発を進め、ポケット線量計などを購入し、術者線量の測定等に使用したい。
ナノテクノロジーを用いた機械的性質に優れる黒変しない歯科鋳造用銀合金の創製

12%金パラジウム銀合金の黒変の原因と合金組織との関係について検討した.本合金の黒変はAgの硫化が原因と考えられることから、以前にAgにRuを微量添加して高周波溶解でAg-Ru系二元合金を溶製したところ、Ag-Ru固溶体合金ができ、その合金は良好な耐食性を示した.この事実から、再度浮揚溶解装置によってAg-Ru合金の溶製を実施し、その耐食性や変色試験を目指した.しかしながら、浮揚溶解装置で再度Ag-Ru合金の溶製を試みたところ、以前できた合金を溶製で機内.この理由はAg-Ru系の合金状態図で報告されているように非固溶系であり、RuはAgの沸点より高い融点を有していることに起因していると考えている.この問題を解決するために、原点に戻り市販の12%金パラジウム銀合金が急速冷却法で均一な単組織が得られるかどうかを実験した.この結果、12%金パラジウム銀合金は800°C以上の高温で加熱急速冷却する、ガラス急速冷却法の応用によって、ナノサイズの結晶粒径からなる均一単一相組織が得られることが、TEM観察から示唆された.このことから、急速冷却法によりAg-Ru系合金の溶製の可能性が考えられた.そこで、この急速冷却法の応用であるメカニカルアロイング法および急速凝固法によるAg-Ru合金の溶製を試みたところ、一部分でAg中にRuが混ざったが、全体的に混ざらず均一な固溶体合金を創製するに至らなかった.この系は不可解なことがおおく、実施した実験から統一して理解することが現状では難しい.しかし、なにか見落としていることが考えられるので、再度メカニカルアロイング法による合金化に再挑戦する。従来から口腔内の機能回復に使用されている歯科修復用合金は保険適用合金としての12%金パラジウム銀合金および保険適用外の金合金およびCo-Cr合金、チタン合金が応用されている。しかしながら、生活環境の変化から生体内の免疫反応にもその影響が出現し、近年、12%金パラジウム銀合金の黒変や合金成分の金属イオン溶出によるアレルギー発症が増大し、歯科医療界では大きな問題となっている。また、合金の黒変は審美性の問題を惹起させる。本年度は金属アレルギー発症を惹起させる歯科修復用合金のイオン化に及ぼすミクロ組織と溶出挙動との相関について検討すると共に修復物表面の粗さがイオン化挙動に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした。Ag-Ru系合金が過去の経験から、耐食性に良好な結果を示した事実から、浮揚溶解装置によってAg-Ru合金の溶製を実施した。しかし、RuはAgの沸点より高い融点を有していることから、現在のところ本溶解法ではAgに均一に混合することは出来ていない。また、Ag-Ruは報告されているでは状態図では非固溶系である.これと併行して、急冷凝固法や固相合成法など非平衡プロセスを応用することによって、Ag-Ru系合金の溶製についても実験をしている。その結果、Ag-Ru2元系合金はいまだ溶製できていないが、この2元系に第三元素を転嫁した方法を試みており.その合金の耐食性について検討している.この結果、第3元素の添加によってAg-Ru-X固溶体合金の溶製の可能性が示唆された。昨年度に引き続き、12%金パラジウム銀合金の黒変原因と合金組織との関係について検討している。本合金の黒変はAgの硫化が原因と考えられることから、本年度は合金の溶体化処理によるミクロ組織と硬さとの関係から検討することを目的に各熱処理における合金組織と硬さの関係を検討した。さらにそれに伴うフレティング摩耗試験を行った。

一方、Ag-Ru系合金溶製が過去に良好な耐食性を示した事実から、浮揚溶解装置によってAg-Ru合金の溶製を実施したが、未だ溶製に成功していない。この原因はRuはAgの沸点より高い融点を有しているためであり、現在のところ本溶解法ではAgに均一に混合することは出来ていない。Ag-Ru系の合金状態図で報告されているのは非固溶系である.したがって、急速冷却法などを応用することが考えられる。この急速冷却法の効果を確認するため、12%金パラジウム銀合金を800°C以上の高温で加熱急速冷却する非平衡プロセスを応用して実験した。この結果、12%金パラジウム銀合金を800°C以上の高温で加熱急速冷却する、ガラス急速冷却法を応用することによって、リボン状の試験片を作製し、その組織構造を観察した。その結果、急速冷却組織はナノサイズの結晶粒径からなる均一単一相組織が得られることが、TEM観察から示唆された。現在、得られた組織が種々の性質にどのような影響を与えるかを検討しているところである。一昨年度、昨年度に引き続き、12%金パラジウム銀合金の黒変原因と合金組織との関係について検討している.本合金の黒変はAgの硫化が原因と考えられることから、以前にAgにRuを微量添加して高周波溶解しAg-Ru系二元合金を溶製したところ、良好な耐食性を示した事実から、浮揚溶解装置によってAg-Ru合金の溶製を実施し、その耐食性や変色試験を目指した.しかし、浮揚溶解装置による均一に固溶したAg-Ru合金の溶製は未だ成功していない.Ag-Ru系の合金状態図で報告されているのは非固溶系であり、RuはAgの沸点より高い融点を有していることに起因していると考えられる.この問題を解決するために、まず市販の12%金パラジウム銀合金が急速冷却法で均一な単組織が得られるかを確認した.この結果、12%金パラジウム銀合金を800°C以上の高温で加熱急速冷却する、ガラス急速冷却法を応用することによって、ナノサイズの結晶粒径からなる均一単一相組織が得られることが、TEM観察から示唆された.このことから、急速冷却法によりAg-Ru系合金の溶製の可能性が示唆された.本年度は12%金パラジウム銀合金の熱処理によるミクロ組織と硬さとの関係を検討して、合金組織と硬さの関係およびそれに伴うフレティング摩耗試験を行った.
Galectin-8蛋白質の肺における機能の解明

現在までに、ほ乳類組織内にガラクトースを認識結合するレクチン様蛋白が最低10種存在することが判明している。その糖結合部位のアミノ酸配列の相同性から1つのprotein familyをなすと考えられ、最近galectinsと名ずけられた。このgalectinsのうち、galectin-4,6,8,9は1つの分子内に2ケの糖結合ドメインを持つユニークなレクチンであり、本研究はこれら蛋白群の機能解明に的を絞った。研究初年度にgalectin-8の組み替え蛋白を作成しポリクロ抗体を作成したところ、得られた抗体はgalectin-3とも交叉することが判明した。多分、両者のシークエンスに極めて類似した所があるためと考えられる。このため、研究方法を一部転換し、galectin-8がいかなる相補的な物質を認識するのか?との疑問に答える方法として、galectin分子にextra epitope sequence(以下EESと略す)を遺伝子工学を用いて繋ぎ、このEESに対する特異抗体により、間接的にgalectinの組織・細胞内での付着部位を形態的に検索する事とした。以前に、そのN,Cドメインをクローニングしていたgalectin-4をそのモデルとして、そのcDNAをglutathione S transferase(GST)fusionvectorのMCS siteに差し込み、galectin-4蛋白分子の上流にEESとしてのGSTが繋がったGST-galectin-4fusion proteinを作成した。このfusion proteinで組織を染色し、ついで抗GST抗体(ヤギ)、ついて蛍光ラベルした抗ヤギIgG(ウサギ)の3段階法で間接的に組織内でのgalectin-4の結合部位が検索したところ、上皮の特異的な構造が強染し、fusion proteinをomitするか拮抗糖で吸収すると染色が消失することから、galectin-GST fusion proteinの使用はgalectinの機能解明に極めて有用であることが判明した。この方法論はすでに権威ある外国誌に発表した。実験1、galectin-8組み換え蛋白の作成。galectin-8 cDNAの全reading frameを挟み込む2 primerを合成し、新鮮肺組織からguanidine法にて抽出したpolyARNAを鋳型とし、逆転写-PCR反応をおこなった。その結果、galectin-8のcDNA分子量と完全に一致する950塩基対のdsDNA産物を得た。次にこの産物をplasmid pGEM-Tに繋ぎこみ増幅した後、expression vector pET-11dに挿入し、BL21(DE3)PLys大腸菌株を宿主とし、IPTGにて組み換え蛋白を発現させた。粗な大腸菌抽出物をPAGE電気泳動で解析したところ、非発現コントロールには見られないgalectin-8の分子量に一致する36kDの蛋白バンドの生成を確認した。このクル-ドな抽出物をlactoseアフィニチイカラムに流し、カラムに結合した蛋白を溶出したところ、36kDのシングル蛋白バンドを得た。以上の実験から、RT-PCRによって得られた塩基対はgalectin-8をcodeするcDNAであり、組み換え法によって生成された人工galectin-8蛋白は糖を認識する生物活性を保持する事が確認された。現在、このgalectin-8に対する抗体を作成し、肺組織内での同蛋白の局在を免疫組織化学法により検索している。

galectin-8がいかなる相補的な物質を認識するのかとの疑問に答える方法として、galectin分子にextra epitope sequence(以下EESと略す)を遺伝子工学を用いて繋ぎ、このEESに対する特異抗体により、間接的にgalectinの付着部位を形態的に検索する目的のため、実験1で得たgalectin-8cDNAをglutathione S transferase(GST)fusionvectorのMCS siteに差し込み、galectin-8蛋白分子の上流にEESとしてのGSTが繋がったGST-galectin8fusion proteinを作成した。このfusion proteinで組織を染色し、ついで抗GST抗体(ヤギ)、ついで蛍光ラベルした抗ヤギIgG(ウサギ)の3段階法で間接的に組織内でのgalectin-8の結合部位が検索したところ、肺の特異的な構造が強染し、fusion proteinをomitするか拮抗糖で吸収すると染色が消失することから、galectin-GST fusion proteinの使用は実験2の目的達成に極めて有効であることが判明した。現在までに、ほ乳類組織内にガラクトースを認識結合するレクチン様蛋白が最低10種存在することが判明している。その糖結合部位のアミノ酸配列の相同性から1つのprotein familyをなすと考えられ、最近galectinsと名ずけられた。このgalectinsのうち、galectin-4,6,8,9は1つの分子内に2ケの糖結合ドメインを持つユニークなレクチンでり、本研究はこれら蛋白群の機能解明に的を絞った。研究初年度にgalectin-8の組み替え蛋白を作成しポリクロ抗体を作成したところ、得られた抗体はgalectin-3とも交叉することが判明した。多分、両者のシークエンスに極めて類似した所があるためと考えられる。このため、研究方法を一部転換し、galectin-8がいかなる相補的な物質を認識するのか?との疑問に答える方法として、galectin分子にextra epitope sequence(以下EESと略す)を遺伝子工学を用いて繋ぎ、このEESに対する特異抗体により、間接的にgalectinの組織・細胞内での付着部位を形態的に検索する事とした。以前に、そのN,Cドメインをクローニングしていたgalectin-4をそのモデルとして、そのcDNAをglutathione S transferase(GST)fusionvectorのMCS siteに差し込み、galectin-4蛋自分子の上流にEESとしてのGSTが繋がったGST-galectin-4fusion proteinを作成した。
新規病原性関連遺伝子産物SEp22がサルモネラの環境における生残性に及ぼす影響

本年度は、養鶏場の環境から分離した病原性のサルモネラ(Salmonella Enteritidis ; SE)におけるSEp22の発現調節機構をさらに詳しく解析した。その結果、SEp22の発現はLB培地のような栄養の豊富な培地中では菌の増殖に依存して起こり、対数増殖期では発現が少なく、対数増殖期後期から静止期にかけて発現が急速に誘導されることが示された。菌体からmRNAを抽出してNorthern blot解析およびRT-PCRによる解析を行った結果、SEp22タンパク質の生合成の上昇に先行して、SEp22 mRNAの合成が誘導されることが示された。さらに、RNAポリメラーゼのσ因子の発現をWestern blottingによって解析した結果、このSEp22 mRNAの生合成はσ38の発現より少し遅れて起こるが、σ70は変動しないことが示された。また、このようなSEp22の細菌の増殖期による誘導は、LB培地中ではくり返し観察された。これに対し、M-9培地のような栄養の低い培地中では、菌の増殖期が静止期になってもSEp22は誘導が見られず、増殖そのものがSEp22の誘導を制御しているのでは無いことが示唆された。さらに、M-9培地にLB培地の成分を一部添加することによってSEp22の誘導が見られるようになった。現在、そのLB培地中の成分を検索中であるが、これまでに調べた結果、各種アミノ酸やグルコースの添加では誘導が起こらないことが示された。この結果は、環境中に分布する病原性のSEがSEp22を発現するためには、貧栄養の環境中で増殖するだけでは充分では無く、LBに含まれる未知の物質のような、栄養豊富な培地中の成分の存在下で増殖することが重要であることを示唆する。現在、多摩川の河川水を採取してSEを培養し、どのような物質が添加されればSEp22が誘導されるのかを解析中である。本年度はまず、養鶏場の周辺環境から分離したSEp22を発現するSEの病原性菌株Cl.#15-1を親株にして、sep22遺伝子の転写開始点直後にカナマイシン耐性遺伝子と終止コドンを挿入したsep22遺伝子欠損株を4株、作成した。これらの変異株(KO-2,3,4,5)と親株の、過酸化水素耐性を調べた結果、変異株はいずれも感受性を示し、環境から分離されたSEp22発現しない非病原性菌株Cl.#16-1等と同様の性質を示した。また、マウスに対する経口感染実験においても、これらの欠損変異株は病原性を示さなかった。つぎに、SEp22と水系におけるサルモネラの生残性の関係を調べるため、対数増殖期中期のそれぞれの菌株を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を(1/2)^n段階希釈して一晩放置して浸透圧ショックをかけ、生菌数をLB寒天培地上のコロニー数を計測して求めた。その結果、SEp22欠損変異株はいずれも、親株に比べて有意に低浸透圧に抵抗性を示した。この結果は、SEp22それ自体か、あるいはその影響下にある因子によって、サルモネラの浸透圧感受性が左右されることを示唆する。SEp22の大腸菌ホモログであるDpsに関してもこのような報告は無く、本研究の結果はSEp22(Dps)の新たな機能の解明につながるものと期待される。また、SEp22の過酸化水素以外の活性酸素に対する抵抗性について、これらの親株と変異株を用いて検討した。

その結果、親株、変異株とも、LB培地中での増殖は、一酸化窒素ラジカル、ペルオキシナイトライトには同様の抵抗性を示し、次亜塩素酸に対しては同様の感受性を示した。以上の結果から、われわれが見い出した新たなサルモネラの病原性関連遺伝子産物SEp22は、活性酸素分子種のうちで過酸化水素に選択的な抵抗性を示すこと、ならびに、環境中における水系での浸透圧に関しては逆に、感受性を示すことが示唆された。本年度は、養鶏場の環境から分離した病原性のサルモネラ(Salmonella Enteritidis ; SE)におけるSEp22の発現調節機構をさらに詳しく解析した。その結果、SEp22の発現はLB培地のような栄養の豊富な培地中では菌の増殖に依存して起こり、対数増殖期では発現が少なく、対数増殖期後期から静止期にかけて発現が急速に誘導されることが示された。菌体からmRNAを抽出してNorthern blot解析およびRT-PCRによる解析を行った結果、SEp22タンパク質の生合成の上昇に先行して、SEp22 mRNAの合成が誘導されることが示された。さらに、RNAポリメラーゼのσ因子の発現をWestrern blottingによって解析した結果、このSEp22 mRNAの生合成はσ38の発現より少し遅れて起こるが、σ70は変動しないことが示された。また、このようなSEp22の細菌の増殖期による誘導は、LB培地中ではくり返し観察された。これに対し、M-9培地のような栄養の低い培地中では、菌の増殖期が静止期になってもSEp22は誘導が見られず、増殖そのものがSEp22の誘導を制御しているのでは無いことが示唆された。さらに、M-9培地にLB培地の成分を一部添加することによってSEp22の誘導が見られるようになった。現在、そのLB培地中の成分を検索中であるが、これまでに調べた結果、各種アミノ酸やグルコースの添加では誘導が起こらないことが示された。この結果は、環境中に分布する病原性のSEがSEp22を発現するためには、貧栄養の環境中で増殖するだけでは充分では無く、LBに含まれる未知の物質のような、栄養豊富な培地中の成分の存在下で増殖することが重要であることを示唆する。現在、多摩川の河川水を採取してSEを培養し、どのような物質が添加されればSEp22が誘導されるのかを解析中である。
受動喫煙が誘導する歯・歯周組織関連遺伝子のエピジェネティック制御 機構

本研究課題では、ヒト歯周病病変部と類似した病態を示すマウス実験的歯周病モデルを構築し、そのマウス実験的歯周病モデルを用いて、タバコ煙構成成分が歯周病病態に及ぼす影響を検討した。その結果、タバコ煙構成成分の腹腔投与によりマウスの歯槽骨吸収が亢進することが明らかとなった。これらの結果は、ヒト口腔疾患に対する喫煙の影響を検討する上で、有益な動物モデルを提供するものと考えられる。前年度は、歯科疾患感受性に対する副流煙成分によるエピジェネティック制御の可能性を検討する実験的歯周病モデルマウスの作成を試み、マウスの口腔内に歯周病原性細菌の一つであるP. gingivalis W83株を感染させることにより、マウス歯槽骨吸収が顕著に誘導されることを確認した。しかしながら、前年度に試作したモデルマウスでは、歯槽骨吸収は生じるものの、歯周病の局所病変部に通常認められる歯周組織中の炎症性細胞浸潤をほとんど認めなかった。このため平成24年度は、ヒトの歯周病病変部により近い病態をマウス口腔内に再現するため、前年度に試作したマウス歯周病モデルの改良を最初に行った。その結果、マウス上顎臼歯を絹糸で結紮することにより、その一週間後に歯周組織に炎症性細胞浸潤を伴う歯槽骨吸収が誘導されることが明らかになったことから、このマウス臼歯結紮誘導性歯周組織破壊モデルを、本課題の実験的歯周病モデルと位置づけて以後の研究を行った。すなわち、臼歯結紮を行う3日前にタバコの煙において主要構成成分とされているニコチン、あるいはタバコの煙成分の濃縮物(cigarette smoke condensate: CSC)をマウス腹腔投与し、臼歯結紮一週間後における歯周組織破壊をマイクロCTとHE染色にてX線的および病理学的に検討した。その結果、マイクロCTではニコチン投与群およびCSC投与群の両群において、陰性対照のPBS投与群と比較して有意な歯槽骨吸収を認めた。しかしながら、HE染色では全群に炎症性細胞浸潤像は存在するものの各群間で大きな差異は認められなかった。現在、炎症細胞浸潤部における免疫担当細胞の局在について免疫組織化学的手法を用いて検討中である。そしてさらに、マウス臼歯結紮誘導性歯周組織破壊モデルで生じた炎症歯周組織からゲノムを抽出し、DNAメチル化の検出を今後行う予定である。平成23年度は副流煙成分の歯科疾患感受性に対するエピジェネティック制御の可能性探索に用いる実験的歯周病モデルマウスの作製に着手した。マウス口腔内に歯周病原性細菌の一つであるPorphyromonas gingivalis(Pg菌)の各種菌株であるATCC33277、381、W50、2561、53977、W83から最も強力に宿主細胞内に侵入する線毛遺伝子をもつW83株を選択し、この菌株をC57BL/6マウスに投与し、歯周組織破壊を効率的に生じさせる感染方法(感染頻度、感染期間)を検討した。その結果、C57BL/6マウスに抗生物質含有飲料水を一週間投与したのち、3日間抗生物質非含有飲料水におきかえ、その後Pg菌W83株を3日毎に10回感染させることで、最も顕著にマウス歯槽骨の吸収が誘導されることがマイクロCT解析により明らかとなった。次に、この条件下でマウスにPgを感染させたのち、血清を回収して血清中の炎症性サイトカインの発現をELISA法にて検討したところ、Pg感染群は非感染群と比較して血清中のIL-6の発現が亢進していた。このことからPgの口腔感染により全身的な炎症状態が誘導されていることが示唆された。今回確立したPg誘導実験的歯周病モデルマウスでは、骨吸収は誘導されたものの病理組織学的検討を行ったところ、歯肉組織に炎症性細胞の顕著な浸潤を認めなかった。そのため、今後はこのマウス歯周病モデルを用いて、歯槽骨の骨吸収の程度を歯周炎進行の指標として研究を進めていくこととした。平成23年度は実験的歯周病モデルマウスの確立を目指した。しかしながら、歯周病モデルマウスの作製は容易ではなく、モデルマウスにおいて歯槽骨の吸収は誘導されたもののヒト歯周病病変部の病態、とりわけ歯肉組織の炎症性細胞浸潤を完全に復元することは出来なかった。歯周病モデルマウスの作製に時間を費やしたため、研究課題の一つであるマウス胎児歯胚を副流煙成分存在下で器官培養したのち組織学的検索する件に関してはほとんど着手できなかった。平成23年度に作製手順を確立したPg誘導マウス歯周病モデルを用いて、マウスに副流煙成分を腹腔投与し、副流煙成分が歯槽骨吸収にどのような影響を及ぼすかを検討する。副流煙曝露マウスが、副流煙に曝露されていない対照群と比較して歯槽骨の重症化を示せば、疾患感受性を上昇させるエピジェネティクス制御が存在する可能性が考えられる。