hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性肉腫を選択的に破壊する新規複製・発現ベクターを用いた標的遺伝子療法の開発

正常細胞には影響を与えず、肉腫細胞のみを選択的に破壊する増殖型、弱毒化単純ヘルペスウイルスI型d12.CALPΔRRを作製した。平成15年度はヒトへの応用を目指して、安全性試験を行った。d12.CALPΔRRに搭載したEGFP遺伝子がカルポニン遺伝子を発現しかつ活発に増殖している肉腫細胞で発現し、ウイルスの増殖により腫瘍溶解活性を示すことを確認した。また、in vitroの培養細胞系で、d12.CALPΔRRの増殖が抗ヘルペスウイルス剤であるganciclovirの添加により容量依存性に抑制されることを確認した。次に、EGFPの代わりにヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子cDNAを挿入し、相同組換え体を得た。次に、d12.CALPΔRRベクターをヌードマウス(♀)眼窩下静脈より2×10^7 p.f.u./マウスで投与し、経時的に血液、脳、心臓、大動脈、肺、肝臓、腎臓、脾臓、卵巣、膀胱を採取した。マウス血清中の複製可能なd12.CALPΔRRは24時間でほぼ消失した。また、肝、脾、肺組織から複製活性のあるd12.CALPΔRRは検出されなかった。投与後4日目およびそれ以降では、これらの組織でLacZ、ICP4ともに発現は認められず、病理学的にも明らかな組織障害は認められなかった。また投与後の血液生化学検査(肝・腎機能、糖・脂質代謝機能)では、d12.CALPΔRR投与による異常は認められなかった。d12.CALPΔRRを用いた平滑筋肉腫遺伝子治療の臨床応用にむけて、GMPレベルのウイルス精製を行うために、無血清培地を用いた組換えウイルスの精製を試みた。本研究では、d12.CALPΔRRがICP4欠失変異体であるd120を親株とするため、Vero細胞にあらかじめICP4 cDNAを遺伝子導入したVeroE5細胞を用いて、無血清培養条件下でのVirus stockの作製を試みた。無血清培地VP-SFM(Invitrogen)を用いて、Single Step Growth Assay法でd12.CALPΔRRの増殖を1%CS/DMEM培地と比較した。d12.CALPΔRRは、感染後24時間までは、無血清、血清培地ともに同程度の増殖を示した。24時間以後96時間では無血清培地では、血清培地の約100分の1のウイルス産生量であった。培養液にすべて無血清培地を用いても、d12.CALPΔRRのLarge scale精製は可能であり、10^9PFUにまで濃縮可能であった。無血清培地を用いて精製したd12.CALPΔRRは、平滑筋肉腫に対する細胞傷害活性、熱やガンシクロビルに対する感受性など、血清存在下で精製したlotと変わりはなかった。In vitroの培養細胞を用いたTitration assay(MOI 0.01-0.1)で、d12.CALPΔRRは7例のカルポニン陽性ヒト平滑筋肉腫および4例の平滑筋腫で選択的に増殖し細胞傷害活性を示し、その増殖はガンシクロビルにより抑制された(IC50=1,3ng/ml)。さらに、SCIDマウス背部移植腫瘍に対する腫瘍内および尾静脈内投与(2x10^7PFU/マウス)で、ヒト手術標本より得た子宮平滑筋肉腫に対して顕著な抗腫瘍効果を示した。
医療制度への平等アクセスに関する日仏の比較法的研究

日本においては、高齢者医療、医師不足などの医療供給体制、国民健康保険料の地域格差など、社会保障の中でも医療保障の分野の劣化が急速に進行している。今こそ「皆保険」というフィクションに対して、社会構成員の自覚的なコンセンサスが求められている。研究初年度にあたり、主として、国内外の資料収集という面に多くの作業を費やした。現代国家の社会保障においては、国家の介入がどのような効果をもたらすかについて、慎重に検討する必要がある。すなわち、社会保障財政については財源の租税代替化、社会保障への国家によるコントロール、とりわけ支出抑制については、社会保障財政法律において総枠規制が為されたことは、日本においても示唆が大きい。このような観点から、フランスにおける一般化社会拠出金と社会保障法財政法律に力点を置いて、資料収集を行い、基礎的な理解に努めた。また、普遍的医療制度については、地方自治体によって上積み給付をするところもあり、財源によって、裁判管轄が分かれるなどかなり複雑な様相を呈していることを見ることができた。平成20年度は、本格的に医療への平等アクセスに切り込んでいくので、その準備として、私保険代行部分など、制度の基礎的な理解、フランスにおける学界の評価などを中心に見てきた。日本においては、年齢で保険集団を画するという、世界に例をみない制度として、後期高齢者医療制度がスタートしたが、こうした新制度に対する法的評価も与えていく。平成20年度は、研究の総括として、本テーマの本質的な課題の検討に取り組んだ。具体的には、日仏の社会保険の制度設計が労働者保険として始まったことが、現在においては、制度アクセスへの敷居として機能していることである。近年の日本においては、非典型雇用従事者が飛躍的に増加したことにより、地域保険であるところの国民健康保険(国保)に、当初予定していなかった人々が加入するようになった。「被用者の自営業者化」とでもいうべき現象である。このように、国保が当初の制度設計から逸れていくなかで、保険集団の姿は大きく変化した。すなわち、国保という制度に、当初の設計以上の負荷が課されることによって、安定的な財源の確保、被保険者の負担の適正化、ならびに、医療機関へのアクセスを並立させることが危機に瀕している。他方、フランスでは、学生や失業者なども、商工業被用者を対象とする一般制度に組み入れるという選択をした。このことが意味するところ、フランスの社会的保護において、大規模なフィクションを描き直した、ということである。昨今の一般制度の財源において租税の割合が小さくないにせよ、被用者でない者を被用者と連帯させるという国家的選択は注目されよう。日本において、皆保険というフィクションは、一応、時代の役割を終えたと言える。この先、描かれるべきフィクションは、国保が一定の歴史を踏まえてきたことを見れば、地域保険としてのアイデンティティーの確立に他ならない。また、私生活における疾病をカバーする医療保険において、保険料に使用者負担分が存在することの意義について考えるとともに、被保険者以外が拠出する租税財源の意義付けを行われなければならないであろう。
最新機器を用いた肺がんの高感度診断マーカーの確立、治療標的分子の同定

われわれは、これまで肺がんの遺伝子発現情報をもとに、肺がんで高発現し、正常で発現のほとんどないタンパクを標的にして、肺がんの腫瘍マーカー、治療標的分子として報告してきた。最近では、次世代シークエンサー、digital PCRなど、これまで検出できなかったわずかな変化を検出することが可能となっているため、容易に行え、少ない負担で採取可能な血液検体を用いて、近年開発された検出器を用いて、高感度に肺がんの早期診断や予後予測を行うマーカーを同定し、更にはがんの前段階での診断や予防を目標としている。またがん特異的マーカーを新規治療標的分子とした開発も並行して行う。
咬筋筋活動におけるヒスタミンの役割

筋活動の持続による疲労・疼痛の解明を行うために,HDC活性を指標とした筋活動モデルを定義し,筋活動の程度による慢性疼痛発現因子としてのIL-1β-HDC-ヒスタミンのメカニズムの解明を行うことを目的とした.強制歩行実験の結果、IL-1-KOマウスの方が脱落するマウスが多かったが,HDC活性に有意な差は見られなかった.低強度の電気刺激によるHDC活性において,優位な差は得られなかった.強制歩行後のvon Frey試験による実験では有意な差は得られなかった.NGFを咬筋投与2時間後には咬筋筋活動に大きな差は見られなかったが、1日後には咬筋筋活動が低下する傾向が見られた.顎関節症における咀嚼筋障害の治療法はスプリント療法や投薬などの対処療法である.我々はこれまでに,咀嚼筋活動の上昇がマスト細胞においてIL-1βの作用を介してヒスタミン合成酵素(HDC)活性の上昇をもたらすことを示した.抗ヒスタミン薬投与が顎関節症患者で鎮痛効果を示すことから,顎関節症I型の病態形成においてHDCやヒスタミンが重要な役割を担っていると考えられる.これらから,持続的な筋活動によって引き起こされる疲労・疼痛の解明を行うために,HDC活性を指標とした筋活動モデルを定義し,筋活動の程度による慢性疼痛発現因子としてのIL-1β-HDC-ヒスタミンのメカニズムの解明を行うこととした.まず,IL-1βが筋活動に影響を与えることを確認するためIL-1-KOマウスとコントロール野生型マウスにて強制歩行実験を行ったところ,IL-1-KOマウスの方が脱落するマウスが多かった.IL-1βが筋活動に関与することが確認できたため,マスト細胞のHDCの活性を指標として,「適切な」筋活動と「過剰な」筋活動を定義するために,強制歩行実験と大腿四頭筋の電気刺激によるHDC活性とIL-1mRNAの上昇を調べた.以前の研究にて高強度電気刺激で優位に上昇していることとから,今回は低強度の電気刺激で実験を行ったところ,優位な差は得られなかったが増加傾向は見られた.しかしながら,強制歩行と低強度電気刺激でHDC活性とIL-1mRNAのバラツキが大きく,相関が得られなかったため,新たに筋活動の指標となる物質の検討を行った.大腿四頭筋の電気刺激と強制歩行実験のIL-1β-HDCの相関を関連させることが難しかったため,新たに筋活動の指標となる物質の検討を必要がでたため.顎関節症患者に対する抗ヒスタミン薬投与が鎮痛効果を示すことから、顎関節症I型の病態形成においてHDCやヒスタミンが重要な役割を担っていると考えられる。これらのことから持続的な筋活動によって引き起こされる疲労・疼痛の解明を行うために、HDC活性を指標とした筋活動モデルを定義し、筋活動の程度による慢性疼痛発現因子としてのIL-1β-HDC-ヒスタミンのメカニズムの解明を行うこととした。IL-1βが筋活動に影響を与えることを確認できたが、既に報告のある強度で電気刺激を行うとHDC活性が増強するが、低強度の電気刺激ではHDC活性とIL-1mRNAのバラツキが大きく、相関が得られなかった。このため、新たに筋活動の指標となる物質の検討を行い、神経成長因子(NGF)に関して咬筋筋活動に対する影響の検討を行った。その結果、NGFを咬筋投与直後には咬筋筋活動に大きな差は見られなかったが、1日後には咬筋筋活動が低下した。更に、NGFを筋肉に投与すると筋肉痛に似た症状がでることが知られていることから、マウスの咬筋にNGFを投与した後、疼痛閾値がどのように変化するかを確認するため、von Frey hairを用いて実験を行った。しかしながら、von Frey hairによる刺激では有意な差は得られなかった。これはvon Frey hairは刺激を与える強さを、フィラメントの径の大きさによって変化させているため、接触面積の変化が影響も考えられることから、深部組織の疼痛閾値変化に多く用いられているRandall Selitto試験等の検討を行うこととした。大腿四頭筋の電気刺激と強制歩行実験のIL-1β-HDCの相関を関連させることが難しかったため,新たに筋活動の指標となる物質の検討し、さらにRandall Selitto試験を行うため新たな機器の購入を必要としたが、科研費の予算内での購入が難しく他の方法を検討する必要があったため。顎関節症患者に対するこれまでの報告において抗ヒスタミン薬投与が鎮痛効果を示すことから、咀嚼筋を中心とした顎関節症I型の病態形成において。ヒスタミンやその合成酵素でヒスチジン脱炭酸酵素が重要な役割を担っていると考えられる。これらのことから筋活動の持続によって引き起こされる疲労・疼痛の解明を行うために、HDC活性を指標とした筋活動モデルを定義し、筋活動の程度による慢性疼痛発現因子としてのIL-1β-HDC-ヒスタミンのメカニズムの解明を行うこととした。これまでの研究に関しての解析を行い、IL-1βが筋活動に影響に関して,強制歩行実験の結果から、IL-1-KOマウスの方が脱落するマウスが多い傾向が見られた。IL-1βが筋活動に関与する可能性が示唆されたことから、運動に関する定義を行うため、マスト細胞のHDCの活性を指標として、強制歩行実験と大腿四頭筋の低強度の電気刺激によるHDC活性とIL-1mRNAの変化に関して解析を行った結果、優位な差は得られなかったが,低刺激群で増加傾向がみられた。

また、神経成長因子(NGF)の咬筋筋活動に対する影響は、NGFを咬筋投与直後には咬筋筋活動に大きな差は見られなかったが、1日後には咬筋筋活動が低下を示した。NGFを筋肉に投与すると筋肉痛に似た症状がでることが知られていることから、マウスの咬筋にNGFを投与した後、疼痛閾値がどのように変化するかを確認するため、von Frey hairによる実験を行ったが有意な差は得られなかった。今回の研究で「適切な」筋活動と「過剰な」筋活動を定義することはできなった、が筋の慢性疼痛へとつながるような筋活動において,IL-1およびHDC、NGFの関与する可能性が示唆された.筋活動の持続による疲労・疼痛の解明を行うために,HDC活性を指標とした筋活動モデルを定義し,筋活動の程度による慢性疼痛発現因子としてのIL-1β-HDC-ヒスタミンのメカニズムの解明を行うことを目的とした.強制歩行実験の結果、IL-1-KOマウスの方が脱落するマウスが多かったが,HDC活性に有意な差は見られなかった.低強度の電気刺激によるHDC活性において,優位な差は得られなかった.強制歩行後のvon Frey試験による実験では有意な差は得られなかった.NGFを咬筋投与2時間後には咬筋筋活動に大きな差は見られなかったが、1日後には咬筋筋活動が低下する傾向が見られた.強制歩行と低強度電気刺激での筋活動量とHDC-IL-1との関わりについて検討するとともに,マスト細胞欠損マウスでのIL-1産生の変化,ILー1欠損マウスでのHDC活性を検討し,適切な運動モデルの構築を目指す.それらの結果から,トレーニングモデルと筋疲労モデルを定義し,ILー1をmRNAとタンパクレベルで比較を行う.今後の課題として、NGFの投与にて低下する咬筋筋活動の疼痛による影響について実験を行い、ヒスタミンおよびIL-1との関連性について検討する。それ以外の発痛物質としてヒスタミンと同じく血管系の作用をもつセロトニン、ブラジキニンの影響に関しても、筋組織中のセロトニン、ブラジキニンの測定、アンタゴニスト投与による筋活動の測定を行い調べる。また、過剰な筋活動の影響によりHDCの誘導が起こり多量のヒスタミンが放出されると、血管系の作用として微小循環の障害を引き起こし、組織障害をもたらすと考えている。そのため、筋組織障害が起これば血管透過性の亢進が引き起こされると考えられる。そのことから上記物質を指標としながら、血管透過性を比較し検討する。さらに得られた結果を取りまとめ、咬筋筋活動におけるヒスタミンの役割について成果の発表を行う。歯学高価な試薬等を用いる実験を見送りにしたため,次年度の使用額が生じた.新たな実験として、Randall Selitto試験用の機器の購入を検討してが、予算の段階で科研費での購入が難しく、他の機器を検討しているため。筋活動量の定義のため,新たに購入する必要がある材料と試薬にあてる予定である.Randall Selitto試験用の機器に変わる他の機器を検討し、使用するための資金とする。また、今後の実験の中で必要とされる試薬、試験キットの購入費にあてる予定である。
分散環境における異種メタデータの横断利用および学術機関リポジトリ運用に関する研究

近年、情報資源共有のための手段としてメタデータが期待されているが、メタデータ流通のための仕組みが確立していないため、作成したメタデータを有効活用できていない状況にある。また、新たな情報発信の仕組みとして機関リポジトリが注目を集めているが、システム運用上の問題点が明らかになっていない。そこで本研究では、これらの状況を踏まえ、異種メタデータを統一的に扱うフレームワークの構築を目指した。1.日本図書館情報学会の文献目録データベースBIBLISと筑波大学知的コミュニティ基盤研究センターのメタデータ、Open Archive Initiativeに登録されている機関からハーベストしたメタデータの3種類を統合的に検索できるシステムを構築した。2.非専門家でも容易にメタデータスキーマを設計できる環境構築を行った。スキーマ設計には専門的知識と技術が必要であるが、これらのスキルは一様ではないため、専門家と非専門家の間でスキルギャップが生じる。システムがスキルギャップをある程度埋めることができれば、非専門家でもスキーマ設計が容易になる。本システムでは、スキルギャップはa)オブジェクトプロファイル、b)読解支援、c)スキーマ推薦の3手法から解消した。3.国内で公開されている機関リポジトリを横断的に検索するシステムを試験的に運用し、その効果をはかった。機関リポジトリは機関ごとにコンテンツが蓄積されるが、利用の観点からすると、機関ごとにコンテンツを閲覧するより、主題にしたがって関連コンテンツを探せるほうが便利である。そこで本研究では複数の機関リポジトリを横断的に検索できるシステムを構築した。本研究によって、異種メタデータおよび機関リポジトリ運用に関わるシステム上の問題点を把握することができた。また、一定以上の解決を与えることができた。平成17年度は複数の機関リポジトリのメタデータを収集し、横断検索するための実験環境を構築した。実験環境には機関リポジトリ構築において広く使われているソフトウェアDSpaceを用い、メタデータハーベスティングプロトコルOAI-PMH(Open Archive Initiative : Protocol for Metadata Harvesting)を介してメタデータを収集した。Dspaceはマサチューセッツ工科大学(MIT)とヒューレットパッカードが共同開発したオープンソースのリポジトリ構築ソフトウェアである。DSpaceでは、標準で各種データ(PDF/HTML/JPEG/MP3等)の投稿機能、投稿の際に付与されたメタデータの検索に対応し、OAI-PMHに基づいたメタデータハーベスティングが可能である。メタデータの収集先は原則OAI-PMHに則った機関とするが、その他のメタデータ、例えば書誌データ的なものも取り込めるようにした。今回は実験的に日本図書館情報学会作成の文献目録データベースBIBLISと筑波大学知的コミュニティ基盤研究センター作成のULIS COREを対象とした。OAI-PMHでメタデータを収集できる機関は、400以上あり、Open Archive Initiativeのサイトにそのリストがある。DSpaceには自動的にメタデータを収集する機能はないので、この部分は新規に作成した。メタデータの収集先は必要に応じて登録、削除が行えるようにし、一旦登録したなちば、定期的にメタデータを収集するようになる。収集の周期も日にち単位で指定できる。収集したメタデータはDSpace内のDBMS PostgreSQLに格納するが、この際、メタデータスキーマを統一する必要があるため、各機関のメタデータスキーマをDSpaceのスキーマに変換する機能を実装した。収集および変換の結果(成功/失敗)は収集先ごとに電子メールで管理者に通知する。平成18年度は非専門家でも容易にメタデータスキーマを設計できる環境構築を行った。スキルギャップは1)オブジェクトプロファイル、2)読解支援、3)スキーマ推薦の3手法から解消する。

オブジェクトプロファイルはメタデータの記述対象に関するデータを記述したもので、データベース内に登録しておく。読解支援とはメタデータやオブジェクトに関する専門用語を平易な用語に置き換えることである。スキーマ推薦とはユーザの属性に応じてデータベース内のオブジェクトプロファイルを候補として提示することである。メタデータ作成にはオブジェクトの認識、スキーマの探索、スキーマの設計、スキーマの適用、オブジェクト情報の抽出、メタデータ付与の6段階があるが、それぞれの段階ごとにスキルギャップが生じる。スキルギャップを解消するためには、ユーザがどの段階のギャップに相当するのかを見極めたうえで、適切な情報提示を行うことが重要である。今後の課題はスキルギャップ解消の効果を評価することである。本システムと既存メタデータエディタ等の間で、作成されるメタデータの質、作成にかかる時間などを比較することで定量的に評価するとともに、インタビュー調査によってシステムの使い勝手等を定性的に評価したいと考えている。平成19年度は国内で公開されている機関リポジトリを横断的に検索するシステムを試験的に運用し、その効果をはかった。機関リポジトリはその性格上、機関ごとにコンテンツが蓄積される。しかしながら、利用の観点からすると、機関のコンテンツを閲覧すより自らの研究に関連するコンテンツを探すほうが多いと思われる。そこで本研究では複数の機関リポジトリを横断的に検索できるシステムを構築した。なお、検索エンジンは既存のものを流用した。本システムは質問文から自動抽出された単語群と検索対象との類似性を計算して、類似度の高いものから順に返す。検索結果はヒットした検索語の「重み」を合算した文書スコアのソート結果で検索語、文の数、文書長という3つのファクタからランキングされる。本システムを図書館職員および大学院生に評価してもらったところ、関連文献を一度に検索できる点は便利であるが、全野に偏りがある点、検索エンジンの性格が機関リポジトリ向けではないといった意見がだされた。引き続き、機関リポジトリに対する検索実験を行い、電子図書館サービスの一つとして提供する予定である。最後に、最終年度として本研究を総括する。研究申請書では、メタデータの収集、異種メタデータの統合、サブジェクトゲートウェイ構築、学術機関リポジトリへの応用という4つの領域を段階的に実施する計画を立てたが、概ね予定どおりに遂行できた。
摘出肺組織を用いたヒト肺アレルギー炎症モデルの作成と新規抗喘息薬の開発への応用

動物種差の問題解決のためヒト組織を用いた炎症モデルの作製を試みた。肺癌患者から手術で摘出された肺を検査後に残存する正常と思われる組織を切り出し用いた。肺組織を試験管内でヒトIgEで受動感作し抗IgE抗体で刺激するとシステイニルロイコトリエン(CysLTs)が産生されたが溶媒だけのコントロールでは産生されなかった。補体滑性化産物のC5aまたは(髄単独刺激ではCysLTs産生はみられなかったが、C5aの微量存在下に抗IgE抗体で刺激すると抗体単独に比し更にCysLTs産生が増加した。以上の様に、微量の補体活性化産物を加えてアナフィラキシー反応を起こすことにより、補体が関与するアレルギー炎症モデルを作製できた。このモデルを用いて現在開発中のC5a阻害薬並びにC5a受容体拮抗薬を添加してCysLTs産生への効果を調べると両薬とも濃度依存的に抑制した。補体系の蛋白は種差が大きいことが知られているのでヒト組織を用いた実験系は有用であると考えられる。一方、ヒト組織は貴重な為保存法の改良が望まれている。ごく最近、開発された氷点下でも水が凍らない過冷却器を用いてヒト肺組織を4°Cに、一方は過冷却機で-5°Cに5日間保存後病理組織学的に比較検討すると4°Cでは破壊像が認められたが、-5°Cではほぼ常の構造を保っていた。免疫染色でもDNAの障害が抑制されていた。更に両条件下で3日間保存した組織を、IgEで受動感作した後抗IgE抗体で刺激すると-5°C保存ではCysLTs産生が有意に増加したが、4°Cのそれは反応しなかった。新薬の開発では動物種差が大きな障壁になることがあり、ヒトの組織での効果の判定が重要である。ヒト組織を用いて炎症の研究を進めるために、肺癌患者から手術で摘出された肺を臨床検査に用いた後に残存する部分から、肉眼的に正常と思われる組織を用い、炎症モデルの作成を試みた。肺組織を試験管内でヒトIgEで受動感作した後抗IgE抗体で刺激し産生されるシステイニルロイコトリエン(CysLTs)を測定するヒト肺アレルギー性炎症モデルを作製した。コントロール(溶媒だけ)に比し抗IgE抗体で刺激すると有意にCysLTs産生が増加した。この系に補体活性化産物のアナフィラトキシンC5aまたはC3aを微量加えて抗IgE抗体で刺激すると抗IgE抗体単独に比し更にCysLTsも産生が増加した。しかしながら、C5aまたはC3a単独刺激ではCysLTs産生はみられなかった。このモデルは近年薬物による過敏反応として注目されているPseudoallergy(補体活性化を伴う)のモデルとしても有用性があると考えられる。とくに注目すべきは、用いたC5a受容体拮抗薬は種差があることが報告されており、ヒトや猿には効果を示すが、モルモット、ラット、マウス、ウサギ等では無効である。従って、ヒト肺アレルギー性炎症モデルの有用性を検討する為に、種を変えて実験をおこなった。

即ち、ラットを抗原で感作し、摘出した肺組織を試験管内で抗原刺激するとCysLTs産生がみられ、この系に微量のC5aを加えてアナフィラキシー反応を起こすと同様にCysLTs産生の増加がみられ、このモデルにC5a受容体拮抗薬を添加して刺激しても、CysLTs産生の抑制は認められなかった。補体系の蛋白は種差が大きいことで知られているのでヒト組織を用いた実験系は新薬の開発に有用であると考えた。新薬の開発では動物種差が障害になる為、ヒト組織を用いた炎症モデルの作製を試みた。肺癌患者から手術で摘出された肺を検査後に残存する組織を用いた。細切した組織を試験管内でヒトIgEで受動感作し、抗IgE抗体で刺激して産生されるシステイニルロイコトリエン(CysLTs)を測定すると、コントロール(溶媒だけ)に比し抗IgE抗体では有意に産生が増加した。この系に補体活性化産物のアナフィラトキシンC5aまたはC3aを微量加えて抗IgE抗体で刺激すると抗体単独に比し更にCysLTs産生が増加した。一方、C5aまたはC3a単独刺激ではCysLTs産生はみられなかった。以上の様に、微量の補体活性化産物を加えてアナフィラキシー反応を起こすことにより、補体が関与するアレルギー炎症モデルを作製できた。このモデルで開発中のC5a阻害薬並びにC5a受容体拮抗薬を添加して効果を調べると、両薬とも濃度依存的にCysLTs産生を抑制した。とくに本研究に用いたC5a受容体拮抗薬は種差が顕著であることが報告されており、ヒトや猿以外のモルモット、ラット、マウス、ウサギでは無効とされている。従って、本モデルの有用性を検討する為に、種を変えてラットで行った。ラットを抗原で感作し、摘出した肺組織を試験管内で抗原刺激し産生されるCysLTs量はこの系に微量のC5aを加えておくと同様にCysLTs産生の増加がみられた。しかしながら、ラットモデルではC5a受容体拮抗薬はCysLTs産生を抑制しなかった。一方、ヒト組織は貴重な為、組織保存法の検討も行った。氷点下でも水が凍らない過冷却装置を用いて、摘出ヒト肺組織を臓器保存液に浸け-5°Cに一方は通常の4°Cで5日間保存し、固定後HE染色して病理学的に比較すると、後者では肺胞、気管支、および血管組織の破壊像が認められたが前者では明らかに良好に保存され、とくに気道上皮の繊毛は明瞭に残存していた。またDNAの断裂を示唆するstngle-stranded DNA抗体で免疫染色すると4°Cで保存した組織では陽性像が多数認められたが、-5°Cではほとんど認められなかった。一方、機能的に反応するかどうかを検討するため肺組織を両条件下で3日間保存し、IgEで受動感作後抗IgE抗体で刺激して産生されるCysLTsを測定すると-5°C保存では抗体刺激により増加したが、4°Cで保存した組織は反応しなかった。
人口動態統計による精神障害者(特に統合失調症)の自殺死亡の疫学的研究

人口動態死亡票の記載内容を調査集計することで、自殺死亡における精神疾患の実態を明らかにすることを目的とした。調査対象は平成20年人口動態統計の自殺死亡30229人であり、方法は目的外使用による死亡票閲覧であった。その結果、なんらかの精神疾患の記載があった者は、確認ができた29799人中2964人であった。主な記載は、認知症55人、統合失調症550人、躁うつ病101人、うつ病1913人であった。1977年にMilesは34の論文をレビューし、"統合失調症の生涯自殺死亡率は10%"と推定した。その後多くの研究者に引用されることとなり、日本においても現在も広く「統合失調症の約10%は自殺する」とされている。しかし、近年、いくつかの新しい研究では、これより低い値が示されている。例えば、スウェーデンのOsbyらの研究では「男性統合失調症者3929人中212人(5.4%)が、女性3855人中168人(4.4%)が自殺した」と報告している(Osby,et.al.2000)。また、アメリカのPalmerらは、1966年からの632論文をレビューし、それより得られた61研究に対してメタアナリシス分析を行うことによって「統合失調症者の4.9%はその生涯で自殺をする」とした(Palmer,et.al.2005)。さらにCohenらは、10年間以上の継続調査がなされた国々の信用される過去の研究より、途上国や中進国の統合失調症の自殺死亡率を次のように報告した。インド7.8%、ブルガリア3.6%、中国2.2%、コロンビア1.0%。(Cohen,et.al.2008)。しかし、日本において統合失調症の自殺の実態を明らかにした論文は2つしかなく(藤田ら1992,太田ら1991)、十分な状況でない。統合失調症の自殺リスクは高いだけに、実態を正しく把握することが地域における精神障害者の自殺予防へとつながる。近年は警察統計で原因動機別の自殺死亡数が詳細に示されるようになったが、人口動態統計を用いた疫学研究によるさらなる解明が求められている。平成22年度は人口動態統計の精神疾患の自殺死亡の実態を明らかにすることを目的に、基幹統計の目的外使用の申請を行い、承認後、厚生労働省にて死亡票の閲覧・転写入力を行った。なお、当初は青森県の過去3年間を研究対象としていたが、最終的に平成20年の全国が調査分析対象となった。調査方法は死亡票とオンラインデータにある精神疾患の記載の集計であるが、死亡票の「死亡の原因」欄のほか、「外因死の追加事項」「その他付言すべきことがら」の各欄に記載があった場合も有効とした。なお、平成20年自殺死亡30299人のうち確認できたものは29799人(98.3%)であった。調査結果は以下の通りである。認知症53人(うちアルツハイマー型認知症は12人)、器質性精神病4人、アルコール依存症(アルコール精神病も含む)116人、薬物依存症4人、統合失調症550人、統合失調感情障害2人、妄想性障害6人、その他(F20-29)9人、うつ病1913人、躁鬱病(双極性障害)101人、持続性気分障害(抑うつ神経症)11人、老人性うつ病16人、恐怖症性不安障害5人、パニック障害(不安抑うつ、不安神経症も含む)63人、PTSD2人、適応障害22人、強迫性障害13人、解離性障害10人、身体表現性障害4人、神経症36人、心身症3人、摂食障害14人、境界性人格障害14人、情緒不安定型人格障害4人、その他の人格障害9人、知的障害5人、自閉症・アスペルガー障害8人、不眠症・睡眠障害49人、てんかん12人、自律神経失調症9人などであった。なんらかの精神疾患の記載があった者は29799人中2965人で、また統合失調症でかつうつ病であった者は21人など、複数の診断がある者はこのうち125人いた。これ以外では、向精神薬の過量服薬138人、自殺未遂45人、リストカット6人、自殺念慮(自殺願望)41人、病名不明(通院中、加療中など)135人があった。平成23年度は、前年度に実施した調査(厚労省への目的外申請による人口動態調査死亡票の転写入力)で得られたデータを集計分析し学会発表および論文執筆を行った。平成20年自殺死亡30299人のうち確認できた29799人を解析対象としたが、精神疾患の記載のあった者は2964人であった。

これら2964人に占める主な疾患の人数(割合)は、うつ病1913人(64.5%)、統合失調症550人(18.6%)、躁うつ病101人(3.4%)、パーソナリティ障害24人(0.8%)であった。先行研究との比較では、うつ病と統合失調症の割合は2倍高いが、パーソナリティ障害は16分の1と極めて少なかった(Bertoloteら2004)。次に精神疾患別の自殺手段を検討したところ、統合失調症の51.1%は縊首(X70)、21.3%は飛び降り(X80)、4.5%は溺死(X71)、4.2%は鋭利な物体での自傷(X78)、3.8%はガス(X67:一酸化炭素または硫化水素)であった(※カッコ内はICD-10コード)。同様に、うつ病の69.0%は縊首、飛び降り7.2%、溺死3.5%、自傷2.1%、ガス9.0%、また、躁うつ病では59.4%が縊首、飛び降り16.8%、溺死4.0%、自傷4.0%、ガス4.0%であった。この年の自殺死亡の全体では、縊首64.8%、飛び降り7.8%、溺死2.8%、自傷2.3%、ガス14.4%であることから、統合失調症、うつ病、躁うつ病ではガスによる自殺手段が少なく、溺死がやや多かった。また、統合失調症と躁うつ病では縊首が少なく飛び降りが多い傾向がみられた。これら傾向の多くは先行研究と一致した(Huntら2006、Chenら2009)。死因究明においては犯罪死の見逃し防止だけでなく、自殺対策の視点も必要である。死体検案書に自殺の精神疾患の記載をすることは自殺対策上重要であると考えられる。
エピトープ組み込みウイルス様中空粒子をベクターとした経口DNAワクチンの開発

我々は経口感染を示すE型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス様中空粒子(VLP)表面に異種ウイルスエピトープを発現できることを報告し、更にそのエピトープに対し経口投与で粘膜および全身に特異的免疫反応が誘導されることを報告した。またVLPがCaイオン依存的に粒子を構成していることを利用してVLP溶液内のCaイオンをキレートしVLPの分子間を広げDNAワクチンを封入した。これを用いると細胞内にDNAを導入可能であることがin vivo、in vitroで確認され、経口投与でDNAワクチンによる特異的免疫反応も粘膜および全身に誘導されることを報告した。本研究ではこの2つの利点を生かし、エピトープ表出VLPにDNAワクチンを封入し、エピトープに対する免疫反応と封入されたDNAワクチンにより誘導された免疫反応を同時に誘導する多機能的経口ワクチンの開発の基礎的研究を行った。用いられた対象は粘膜免疫の誘導が重要であるヒトエイズウイルス(HIV)とし、表出するエピトープはHIVenv、封入するDNAワクチンはHIVgagとした。このHIVgag DNAワクチン封入HIVenv表出VLPをマウスに経口投与したところ、HIVenv,gag特異的IgGが血清中に、特異的IgAが糞便中に検出された。更にHIVenv,gag特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板において誘導された。またこれら免疫反応がin vivoにおいてもHIV特異的にウイルスを抑制することが認められた。以上のように本研究で用いた手法により多種類の抗原に対する免疫反応が経口投与により粘膜および全身に液性、細胞性免疫が誘導されることが示された。
東南アジア地域の乳牛における暑熱ストレス耐性の遺伝学的背景の探索

近年、地球温暖化に伴う夏季の猛暑が顕著であり、乳用牛が受ける暑熱ストレスによる生産性低下は解決すべき最も重要な課題のひとつとなっている。アジアなどの熱帯地域にはその土地の環境に適応した在来種のウシが存在し、それらは暑さに強い特徴をもつ。本研究は、東南アジア地域で飼育されているウシの生理学的および遺伝学的解析を行い、それらのウシが暑熱ストレス耐性を有するメカニズムを解明することを目的とする。本年度は、前年度に引き続き、名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を対象として、ホルター心電計を用いた心拍変動解析により、ウシに負荷される暑熱ストレスの評価を行った。また、飼育環境の環境温度、相対湿度および直腸温度を記録した。直射日光に曝露されているとき(暑熱環境下)、環境温度、温度ー湿度指数およびウシの直腸温度が有意に上昇し、直射日光の曝露によりウシには暑熱ストレスが負荷されていることが確認できた。このとき、心拍変動解析により、交感神経系活性が上昇し、かつ、副交感神経系活性が低下する個体と、これらが明確に変動しない個体の2群に分けることができた。前者は暑熱ストレスに対してストレス反応を示した群、後者は暑熱ストレスに対してストレス反応を示さない耐性個体の群と考えられた。これらの結果から、ホルター心電図記録による心拍変動解析法により、暑熱ストレス耐性を有する個体を選抜できることが明らかとなった。また、心拍変動解析法を用いて暑熱ストレスへの適応度が異なる個体を抽出し、ウシSNPアレイを用いた網羅的遺伝子多型解析を行うための事前準備を、カンボジア、タイおよびフィリピンにおいて実施した。次年度以降に心拍変動解析およびゲノムDNA試料を収集し、東南アジア地域の乳用牛において暑熱ストレス耐性に関与するSNPの抽出に着手する予定である。本年度の研究計画では、まず、東南アジア地域(カンボジア、タイおよびフィリピン)で飼育されているウシを対象として、ホルター心電計を用いた心拍変動解析により暑熱ストレス耐性評価を行うことを目的とした。名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を用いて、ウシのホルター心電図を記録する手技を確立し、暑熱環境下における心拍変動の解析から、心拍変動の周波数成分パラメータを用いて暑熱ストレス耐性を有する個体を選抜できることを明らかにできた。次年度以降には、ホルター心電図記録による心拍変動解析法を用いて、東南アジア地域で飼育されている乳用牛の暑熱ストレス耐性を評価し、暑熱ストレス耐性に関与すると考えられるSNPの抽出に着手する。これにより、暑熱ストレス耐性の原因となる候補遺伝子の同定をめざす予定である。本研究では、東南アジア地域のウシが暑熱ストレス耐性を有するメカニズムを解明することを目的として、1心拍変動解析による暑熱ストレス耐性評価法を確立して、暑熱環境下にあるウシの生理学的特徴を明らかにし、2カンボジア、タイおよびフィリピンの乳用牛を多数用いて、暑熱ストレス環境への適応度が異なる個体(暑熱耐性個体および暑熱非耐性個体)を抽出する。さらに、3ゲノムDNA試料を採取して網羅的遺伝子多型解析を行い、暑熱ストレス耐性の原因となる遺伝子の候補を同定することをめざしている。本年度までに、心拍変動解析による暑熱ストレス耐性評価法の確立が完了した(1)。今後はこの評価法を用い、年次計画に基づいて暑熱ストレス環境への適応度が異なるウシ個体の抽出(2)と、ウシSNPアレイを用いた網羅的遺伝子多型解析(3)に着手し、東南アジア地域のウシの暑熱ストレス耐性の原因遺伝子の解明に全力をあげる。近年、地球温暖化に伴う夏季の猛暑が顕著であり、わが国の乳用牛が受ける暑熱ストレスによる生産性低下は解決すべき最も重要な課題のひとつとなっている。本研究は、東南アジア地域で飼育されているウシについて生理学的および遺伝学的解析を行い、それらのウシが暑熱ストレス耐性を有するメカニズムを解明することを目的とする。本年度は、名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を対象として、ホルター心電計を用いた心拍変動解析により、ウシに負荷される暑熱ストレスの評価を行った。また、飼育環境に関するパラメーター(気温、湿度)およびウシ個体の生理状態に関するパラメーター(体温、呼吸数)の記録を行い、心拍変動解析による自律神経機能の評価との相関を検討した。暑熱環境下では体温が顕著に増加するとともに、心拍変動解析により交感神経系活性の上昇と副交感神経系活性の低下が認められた。これらの結果から、ホルター心電図記録による心拍変動解析法は、ウシに負荷される暑熱ストレス強度を評価するための非侵襲的手法として有効であることが明らかとなった。また、心拍変動解析により得られる各個体の暑熱ストレス耐性を指標として暑熱環境への適応度が異なる個体を抽出し、ウシSNPアレイを用いた網羅的遺伝子多型解析を実施するための事前準備を、カンボジア(王立農業大学)およびタイ(カセサート大学)において実施した。次年度以降に心拍変動解析およびゲノムDNAサンプルの収集を行い、カンボジアおよびタイの乳用牛との比較により、暑熱ストレス耐性に関与すると考えられるSNPの抽出に着手する予定である。

名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を用いて、ウシのホルター心電図を記録する手技の確立が完了し、暑熱環境下における心拍変動の解析からウシに負荷される暑熱ストレス強度を評価することが可能であることを明らかにできた。次年度以降には、ホルター心電図記録による心拍変動解析法を用いて、東南アジア地域で飼育されている乳用牛の暑熱ストレス耐性を評価し、暑熱ストレス耐性に関与すると考えられるSNPの抽出に着手する。これにより、暑熱ストレス耐性の原因となる候補遺伝子の同定をめざす予定である。近年、地球温暖化に伴う夏季の猛暑が顕著であり、乳用牛が受ける暑熱ストレスによる生産性低下は解決すべき最も重要な課題のひとつとなっている。アジアなどの熱帯地域にはその土地の環境に適応した在来種のウシが存在し、それらは暑さに強い特徴をもつ。本研究は、東南アジア地域で飼育されているウシの生理学的および遺伝学的解析を行い、それらのウシが暑熱ストレス耐性を有するメカニズムを解明することを目的とする。本年度は、前年度に引き続き、名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を対象として、ホルター心電計を用いた心拍変動解析により、ウシに負荷される暑熱ストレスの評価を行った。また、飼育環境の環境温度、相対湿度および直腸温度を記録した。直射日光に曝露されているとき(暑熱環境下)、環境温度、温度ー湿度指数およびウシの直腸温度が有意に上昇し、直射日光の曝露によりウシには暑熱ストレスが負荷されていることが確認できた。このとき、心拍変動解析により、交感神経系活性が上昇し、かつ、副交感神経系活性が低下する個体と、これらが明確に変動しない個体の2群に分けることができた。前者は暑熱ストレスに対してストレス反応を示した群、後者は暑熱ストレスに対してストレス反応を示さない耐性個体の群と考えられた。これらの結果から、ホルター心電図記録による心拍変動解析法により、暑熱ストレス耐性を有する個体を選抜できることが明らかとなった。また、心拍変動解析法を用いて暑熱ストレスへの適応度が異なる個体を抽出し、ウシSNPアレイを用いた網羅的遺伝子多型解析を行うための事前準備を、カンボジア、タイおよびフィリピンにおいて実施した。次年度以降に心拍変動解析およびゲノムDNA試料を収集し、東南アジア地域の乳用牛において暑熱ストレス耐性に関与するSNPの抽出に着手する予定である。本年度の研究計画では、まず、東南アジア地域(カンボジア、タイおよびフィリピン)で飼育されているウシを対象として、ホルター心電計を用いた心拍変動解析により暑熱ストレス耐性評価を行うことを目的とした。名古屋大学カンボジアサテライトキャンパス内実験農場で飼育されているカンボジア由来およびタイ由来の乳用牛を用いて、ウシのホルター心電図を記録する手技を確立し、暑熱環境下における心拍変動の解析から、心拍変動の周波数成分パラメータを用いて暑熱ストレス耐性を有する個体を選抜できることを明らかにできた。
BNCTに関連した患者体内ホウ素濃度分布の非侵襲的計測機器の開発

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)では、加速器を使用して発生させた熱中性子が、患者体内のがん細胞に集中的に集積されるホウ素薬剤中のホウ素10原子と特異的に反応を起こし、熱中性子ががん細胞を選択的に攻撃してその際に発生するα粒子とリチウム粒子がそのがん細胞のみを死滅させられるがん治療法である。この治療法で最も重要な要素に熱中性子の強度とホウ素濃度があり、これらの積は細胞を死滅させる確率に関係するホウ素線量と呼ばれる最も重要な量の一つで、治療計画で決定されたホウ素線量の総量に達するまでの治療(照射)時間の決定に使用する。治療中にがん細胞内で発生するα粒子とリチウム粒子ががん細胞を死滅させるためのメスの役割を担うのに加え、それらと同反応で同時に発生する特定エネルギー(478 keV)を持つ特定γ線は患者体外に放出され、その発生頻度は治療照射におけるホウ素線量に比例する。この特定γ線の発生頻度を治療中にリアルタイムで測定し、治療照射時間、即ち、総ホウ素線量の精度向上を実現することをこの研究の目的としている。前年度までに、鉛とフッ化リチウムブロックを用いたテレスコープ型遮蔽コリメータによるγ線と中性子線の高いバックグラウンド計数率の低減、及び、信号の重なり合うパイルアップ現象の解消を実現した。本年度では、更にカドミウムシートによる熱中性子の遮蔽を強化し、照射口直下の標的位置からビーム軸に垂直方向に110 cm離れた位置で、ホウ酸溶液を標的に使用したホウ素濃度計測にて、100 ppmの濃度までの溶液から発生する特定γ線の検出に成功した。しかし、今年度実施した実験における新たな課題として、γ線のエネルギー測定値が時間と共に僅かにシフトする現象、を確認した。原因は信号読出し回路の温度変化と考えられ、系統的誤差として評価・補正し、ホウ素線量の精度を更に向上させる。実施計画で示したいばらき中性子医学研究センター(茨城県東海村)のBNCT治療用中性子ビームラインを用いた本γ線検出器に対するビーム試験は、加速器側の中性子ビームラインの調整が大幅に遅延し、平成29年9月まで実施できなかった。その後、加速器からの陽子線出射ビーム強度はほぼ安定し、1時間以内にBNCT治療が可能な熱中性子線束が得られるようになった。ビーム試験は平成29年10月より開始され、平成31年3月現在、計11回実施した。開発した2種類(単チャンネルと複チャンネル)のγ線検出器のうち、単チャンネルγ線検出器を用いて、照射室内の中性子及びγ線のバックグラウンド調査を詳細に行った。その結果、鉛とフッ化リチウムブロック、及びカドミウムシートを用いたテレスコープ型遮蔽コリメータを照射口直下の標的位置からビーム軸に垂直方向に設置し、その中のビーム軸から110 cm離れた位置にγ線検出器を設置することで、γ線と中性子線の高いバックグラウンド計数率は低減し、信号のパイルアップ現象は解消し、ホウ酸溶液を標的に使用したホウ素濃度計測にて、100 ppmの濃度の溶液から発生する478 keV特定γ線の検出に成功した。100 ppmのホウ素濃度の検出に成功したが、実際の治療では30 ppm以下のホウ素濃度測定が要求されている。そのため、今後は478 keV特定γ線の幾何学的な検出効率の向上のために検出位置を更に標的に近づけ、それに伴うバックグラウンド計数率の増加に対する対策をする。具体的には、新たに信号の波高値を速く選別、取捨選択可能にする電子回路(Amplifier-Discriminator)の導入で、不要な低エネルギーγ線の早い段階での廃棄と信号幅の短縮化によるパイルアップ発生確率の減少を可能にし、ホウ素濃度の測定可能限界を治療時の想定濃度(30 ppm)まで向上させる。加速器を用いたホウ素中性子捕捉療法(加速器BNCT)において、ホウ素線量をリアルタイムで計測するために、高いエネルギー分解能を持つ結晶シンチレータを用いたγ線検出器を、以下の項目に従い開発した。(a)結晶シンチレータをCsI結晶から4%程度のエネルギー分解能をもつLaBr3結晶に置き換えて、新たな1X3モジュール型γ線検出器を開発した。(b)PHITS(粒子と重イオンの輸送ソフトコードシステム)シミュレーションの結果を基に、フッ化リチウムブロックによる中性子遮蔽と鉛ブロックによるγ線遮蔽の最適な形状、大きさ、配置の設計、製作を行った。(c)データ収集ソフトの基本機能に解析モニターを加えた。(d)データ収集ソフトに対して、ホウ素濃度測定に関係する478 keV即発γ線を検出するためのフィルターをリアルタイムで付け加えられるモジュール構造を構築した。(e)患者ファントムを用いたPHITSシミュレーションを行い、患者体内から発生するγ線スペクトラム、γ線発生レート、水素原子核と中性子との反応で発生する2.221 MeVのγ線と熱中性子線束との関係を調査した。ただし、実施計画で示したいばらき中性子医学研究センター(茨城県東海村)のBNCT治療用中性子ビームラインを用いた本γ線検出器のビーム試験は、加速器側の中性子ビームラインの完成遅延のため、平成28年度中には実施できなかった。そのため、ビーム試験とともに開発を行う予定であった研究実施項目の一部については、平成29年度の研究実施計画に加える。実施計画で示したいばらき中性子医学研究センター(茨城県東海村)のBNCT治療用中性子ビームラインを用いた本γ線検出器のビーム試験は、加速器側の中性子ビームラインの調整が大幅に遅延したため、平成28年度中には実施できなかった。

この遅延理由に伴い、ビーム試験で得られるデータに基づく開発項目についても遅延が生じる事態となった。微弱な信号を高レートのバックグラウンドから区別するには、正しいバックグラウンドの計測とその理解が最も重要な課題の一つである。本研究では、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)において、患者体内の微量のホウ素濃度を照射場の熱中性子線との反応で発生する478 keVの即発γ線の計測数率を熱中性子線と水との反応で発生する2221 keV即発γ線の計測数率との比(計測数率比R)を測定することで計測し、リアルタイムで患者体内のホウ素濃度とそれに関連して得られるホウ素線量と治療照射時間の高精度な決定を目的としている。予測される患者体内のホウ素濃度は約30 ppmと極めて微量で、この極めて困難な課題を解決するには、如何に高レートの熱中性子線とγ線のバックグラウンドを計測して理解し、軽減することが重要である。そのために、当該年度では、単チャンネルγ線検出器を用いて、照射室内の中性子線及びγ線のバックグラウンド調査を詳細に行った。その結果、(1)検出器をビームラインに対して90度方向に設置するのが最もγ線バックグラウンドの計測数率を低減する、(2)照射口直下流に被照射体を設置した場合、被照射体から検出器までの間を鉛のブロックでトンネル(コリメータ)状に遮蔽する、所謂、テレスコープ型の遮蔽が最もγ線バックグラウンドの計測数率を低減する、(3)これらのバックグラウンド対策により、高レートのγ線が重なり合う現象(パイルアップ現象)は解消し、γ線のエネルギー計測によるスペクトル解析が可能な状態を実現した、(4)計測したγ線のエネルギースペクトラム中に、目的の2つの即発γ線(478 kevと2221 keV)と近接γ線(511 keV)の3種類の特別γ線を検出した。以上の結果から、平成30年度において、更なる中性子線遮蔽体の増強と共に、被照射体内ホウ素濃度と計測数率比Rの関係を測定するための準備ができた。実施計画で示したいばらき中性子医学研究センター(茨城県東海村)のBNCT治療用中性子ビームラインを用いた本γ線検出器に対するビーム試験は、加速器側の中性子ビームラインの調整が大幅に遅延し、平成29年9月まで実施できなかった。加速器からの陽子線出射ビーム強度はほぼ安定して、1時間以内にBNCT治療が可能な熱中性子線束が得られるようになった。ビーム試験は平成29年10月より開始され、平成30年3月現在、計5回実施した。開発した2種類(単チャンネルと複チャンエル)のγ線検出器のうち、単チャンネルγ線検出器を用いて、照射室内の中性子及びγ線のバックグラウンド調査を詳細に行った。照射室内の極めて高い中性子線とγ線の発生率のため、照射口から約1.1 mに設置したγ線検出器からの信号は複数重なり合い(パイルアップ)、正確なγ線エネルギーの計測は困難な状態であった。しかし、検出器の設置位置、向かう方向の最適化、鉛ブロックによるγ線遮蔽、LiFブロックによる中性子線遮蔽、に対し改善を加え、現在ではパイルアップ現象は解消し、γ線のエネルギー計測によるスペクトル解析が可能な状態を実現している。
心筋症ハムスターにおけるADP/ATP担体蛋白の分子生物学的解析

心筋症の動物モデルであり、当研究室で繁殖飼育しているJ2N系心筋症ハムスター、およびBio14.6系ハムスター、またコントロールハムスターとしてゴールデンハムスターを用いてADP/ATP担体蛋白質に関して分子生物学的手法を用いて解析を行なった。このADP/ATP担体蛋白質、以下AACはミトコンドリア内膜に存在し、ミトコンドリア膜の内外へADP/ATPの交換輸送を行なう重要な蛋白質である。AACのクローニングはゴールデンハムスター心筋よりmRNAを抽出し逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。cDNAよりλgt10 phagevectorでcDNA libraryを作成した。またヒトfibloblast由来のcDNA liblaryよりヒトのAACcDNAの塩基配列をもとにして設計したプライマーを用いて、PCR法にてAAC cDNAクローンを得た。これをプローブとして、cDNA libraryよりplaque hybridization法を用いてAAC cDNAをisoenzymeについてクローニングを行った。次にAACのmRNAのレベルにおいての発現をdot blot hybridyzationを用いて調べた。AACのmRNAレベルでの発現は正常ハムスターが最も強く、心筋症の程度が強いハムスターほどAACの含有率が低下していた。さらにAACの減少と共にmRNAレベルでの発現低下が存在していた。これらより心筋症の病因の一つにAACの異常が存在していると判断される。拡張型心筋症hamsterであるJ2N,Bio14.6を用いてADP/ATP担体蛋白質に関して分子生物学的手法を用いて解析を行なった。ADP/ATP担体蛋白質、以下AACはミトコンドリア内膜に存在するADP、ATPの交換輸送を行う重要な蛋白質である。まずAACのクローニングはGolden hamsterの心筋よりmRNAを抽出し逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。またヒトfibloblast由来のcDNA liblaryよりヒトのAAC cDNAの塩基配列をもとにして設計したプライマーを用いて、PCR法にてAAC cDNAクローンを得た。これをプローブとして、hamsterのcDNA libraryよりplaque hybridization法を用いてAAC cDNAをisoenzymeのT1についてクローニングすることに成功した。次にAACのレベルにおいての発現をdot blot hybridizationを用いて検討したところ、mRNAレベルでの発現はNormal hamsterが最も強く心筋症の程度が強いhamsterほどAACの量的異常と共にmRNAレベルでの発現低下が存在していた。現在さらに心筋症hamsterのADP/ATP担体蛋白質の遺伝子異常に関し検討中である。平成7年度は、心筋症ハムスターJ2Nを用いて心筋ミトコンドリアを分離しADP/ATP担体蛋白、以下AACの蛋白含有率を測定。J2NにはAACの量的異常が存在していることを確認した。このAACはミトコンドリア内膜に存在するADP、ATPの輸送を行う重要な蛋白質であるが、分子生物学的手法を用いてさらにAACに関して検索した。cDNAよりphage vectorでcDNA libraryを作成した。またヒトfibloblast由来のcDNA liblaryより、PCR法にてAAC cDNAクローンを得た。これをプローブとしてハムスターcDNA libraryよりplaque hybridization法を用いてAACのisoenzymeのクローニングを行った。次にAACのmRNAのレベルにおいての発現をdot blot hybridizationを用いて測定したところ、AACのmRNAレベルでの発現は正常ハムスターが最も強く発現していた。以上のように心筋症の程度が強いハムスターほどAACが低下しており、さらにAACの減少と共にmRNAレルでの発現低下の存在が認められた。