hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高感度時間分解赤外分光装置の開発と生体系プロトンポンプ機構の解明

タンパク質のプロトンポンプ機構を解明するために、生理条件下(室温・水溶液中)のタンパク質に適用可能な超高感度ナノ秒時間分解赤外分光装置を開発した。本装置はウシ心筋チトクロムc酸化酵素に応用され、このタンパク質の持つ水チャネルの動的ゲーティング機構が明らかとなった。真核生物は、生命活動に必要なエネルギー(ATP)を酸素呼吸によって生産している。呼吸で取り込まれた酸素は、ミトコンドリア内膜に存在するシトクロム酸化酵素によって水にまで還元されるが、この反応と共役して、プロトンが膜の内側から外側ヘポンプされる。その結果生じる膜電位やプロトン濃度勾配がATP合成の駆動力となる。本研究の目的は、シトクロム酸化酵素のプロトンポンプ反応の分子メカニズムを解明するために、フロー法が使用可能な時間分解赤外分光装置を開発することである。本年度の目標は、時間分解測定装置のべースとなる定常測定装置の開発であった。光源には高輝度のフェムト秒赤外レーザーを使用し、光学系に分光器(ダブルモノクロメーター)とシングルチャネルMCT検出器を組み合わせた。信号検出には24bit,1.5MHz samplingのAD変換器を使用し、1kHzで発生する赤外パルス1発1発に対してデータの取得を行った。本年度中に定常測定装置の開発を終え、装置のテストとしてシトクロムc水溶液やシトクロム酸化酵素水溶液の酸化還元赤外差スペクトルを測定した。その結果、フローセルが使用可能な測定条件で(光路長50μm、蛋白濃度0.5mM)、プロトン放出を担うアミノ酸残基(Asp/Glu)1個に由来する信号(COOHのCO伸縮振動)の高感度検出に成功した。しかし測定の効率化のためには、検出器のマルチチャンネル化が必須と判断された。平成22年度には、マルチチャンネルMCT検出器の導入とフローセルの開発を行い、シトクロム酸化酵素に応用する。本研究の目的は、室温水溶液中の蛋白質反応を高精度で追跡できる時間分解赤外分光装置を開発することである。昨年度は定常測定装置を完成させ、シトクロムc酸化酵素(CcO)の酸化還元差スペクトルを室温水溶液中で測定することに成功した。その結果を踏まえ、本年度は時間分解測定に向けた装置の改良を行なった。具体的には、検出器のマルチチャンネル化と回転セルを使用した光学系の構築を行なった。ナノ秒可視パルスレーザー(532nm,25ns)を反応のトリガー光(pump光)として導入し、これとフェムト秒赤外パルスレーザーとを同期させて、時間分解測定を実現した。時間分解能は<50ナノ秒であった。赤外吸収信号の検出は、1kHzの赤外パルス光1発1発に対して行なった。ただし、光チョッパーを用いて可視パルス光を0.5kHzでチョッピングし、赤外吸収信号にpump on/offの変調を0.5kHzでかけた。pump on/offの差スペクトルから蛋白構造の変化を検出した。装置の応用として、CO結合型CcOのCO光解離後の構造変化を観測した。その結果、水チャネルの開閉を担うHelix Xの主鎖構造が、CUBでのCOの脱着と同期して、<50nsと2μsの時定数で変化することが示唆された。スペクトルのS/N比は>10000/1であった。室温水溶液中の蛋白質の光サイクル反応をナノ秒の時間分解能で高精度測定できる装置が完成した。
３Ｄ活性サイト科学のプラットフォーム構築による総括と研究支援

本領域は、触媒、デバイス材料、タンパク質分子等の機能物質において、機能発現を担う特定の原子が、どのように周辺原子と三次元的に協調して機能発現しているのかを探究し、新たな学理「局所機能構造科学」と新規デバイス創出の道筋を切り拓いた。本研究においては、国際シンポジウムの開催、JJAP特集号の出版などによって国内外の研究者に広く学理を発信し、最終成果報告書の作成、ニュースレター最終号の出版、領域ウェブサイトの継続による活性サイト原子構造データベースおよび関連ニュースの発信によって、国民・一般に向けた領域研究成果の取りまとめの広報・アウトリーチ活動を行う。
咬合支持の喪失が唾液中ストレスホルモンと免疫グロブリンに及ぼす影響

臼歯部の咬合支持の消失、下顎位などの変化が全身状態と何らかの関連性を持っていると考えられるが、科学的な裏づけを得るにはいたっていない.そこで唾液中のコルチゾール(Cts)、免疫グロブリンA (s-IgA)濃度およびα-アミラーゼ活性(αAms)の測定により、咬合支持の喪失を補綴装置により回復した場合の身体に及ぼす影響をストレスと免疫機能との関係から調べた.(1)義歯による疼痛との関係が疑われたので、正常有歯顎者19名に床下粘膜の疼痛を想定して、部分的局部加圧できる実験的口蓋床を装着し、疼痛の程度との関係を測定した。(2)医員3名を選び、それぞれ義歯に対して何らかの不満を訴えて来院した患者4名ずつを割り当てた.咬合支持域はEichnerの分類B1縲廝4とC1とした.また義歯を装着していない患者3名ずつを割り当て,義歯製作過程で、唾液の採取を行い中長期の観察を行った.各測定日の最後に特性・状態不安(STAI)を調べた.その結果、口蓋粘膜への局所圧刺激はCts濃度およびαAms活性値を上昇させることが明らかとなった.s-lgAはCts濃度と同様の傾向を示す被験者と一定傾向を示さない被験者があった.不安傾向にある者は,ない者と比較して,同程度の口蓋部への刺激でも,ストレスを生じやすい可能性が示唆された.疼痛のある義歯を装着した患者は、Cts、αAms活性値ともに増加し、不快症状がなくなるとそれぞれ低下した。しかしs-IgAは長期欠損を放置した患者に大きく低下が見られる場合があったが、個人差が大きく有意な傾向を示さなかった.また義歯の非装着時で咬合支持のないときとに比較して義歯装着時では低下傾向が認められたが、個人差が大きかった。これは義歯からの疼痛、不快症状などの影響が大きく影響し、今後被験者の性格、ライフスタイルなどとの関係を検討する必要性がわかった.臼歯部の咬合支持の消失、下顎位などの変化が全身状態と何らかの関連性を持っていると考えられるが、科学的な裏づけを得るにはいたっていない.そこで唾液中のコルチゾール(Cts)、免疫グロブリンA (s-IgA)濃度およびα-アミラーゼ活性(αAms)の測定により、咬合支持の喪失を補綴装置により回復した場合の身体に及ぼす影響をストレスと免疫機能との関係から調べた.(1)義歯による疼痛との関係が疑われたので、正常有歯顎者19名に床下粘膜の疼痛を想定して、部分的局部加圧できる実験的口蓋床を装着し、疼痛の程度との関係を測定した。これは義歯からの疼痛、不快症状などの影響が大きく影響し、今後被験者の性格、ライフスタイルなどとの関係を検討する必要性がわかった.臼歯部の咬合支持を喪失した患者には、機能的、感覚的な障害を訴える者が少なくない.またそのような患者の中には全身随伴症状や不定愁訴を訴える場合があるが、義歯の治療によりそれらが消失または改善することを経験することも事実である.このことは咬合支持の消失、下顎位などの変化が全身状態と何らかの関連性を持っていると考えられるが、科学的な裏づけを得るにはいたっていない.そこで唾液中のストレスホルモンおよび免疫グロブリンAの測定により、咬合支持の喪失を補綴装置により回復した場合の身体に及ぼす影響をストレスと免疫機能との関係から科学的に明確にするのが本研究である.(1)医員3名を選び、それぞれ義歯に対して何らかの不満を訴えて来院した患者のうち研究に対する同意を得られた患者5名ずつを割り当てた.咬合支持域はEichnerの分類B1B4およびC1とした.同一日の下記の時点で唾液の採取を行った.・初診時、研究に対する同意を得られた直後、問診直後、治療直前、不快症状を除く治療直後、帰院直前、後日治療した場合は、治療直前および帰院直前(2)咬合支持域が一部またはすべてが喪失した患者に対する局部床義歯装着による咬合支持回復の効果

上記同様医員3名に対し、義歯を装着していない患者3名ずつを割り当て、義歯製作過程で、アポイントごとに唾液の採取を行い中長期の観察を行っている.上記の(1)、(2)ともに唾液中コルチソール濃度、クロモグラニンA濃度(CgA)および免疫グロブリンA濃度を測定した.来院初日の研究に対する同意を得られた直後が最もコルチソール、CgAともに高い値を示した.来院初日に比較して他の来院日はコルチソール、CgAともに低い値を示し、先の研究と同様の結果を得た.しかし免疫グロブリンは変動が大きく一定の傾向を示さなかった.今後さらに症例を増やし、それぞれの症状の変化との関連を統計的(相関.因子)に検討する予定である.臼歯部の咬合支持の消失、下顎位などの変化が全身状態と何らかの関連性を持っていると考えられるが、科学的な裏づけを得るにはいたっていない.そこで唾液中のコルチゾール、クロモグラニンA(CgA)および免疫グロブリンA(s-IgA)濃度の測定により、咬合支持の喪失を補綴装置により回復した場合の身体に及ぼす影響をストレスと免疫機能との関係調べた.(1)医員3名を選び、それぞれ義歯に対して何らかの不満を訴えて来院した患者5名ずつを割り当てた.咬合支持域はEichnerの分類B1B4とC1とした.同一日の下記の時点で唾液の採取を行った.初診時、研究に対する同意を得られた直後、不快症状を除く治療直後、帰院直前、後日治療した場合は、治療直前および帰院直前(2)咬合支持域が一部またはすべてが喪失した患者に対する局部床義歯装着による咬合支持回復の効果上記同様医員3名に対し、義歯を装着していない患者3名ずつを割り当て,義歯製作過程で、唾液の採取を行い中長期の観察を行った.上記の(1)、(2)ともに唾液中コルチゾール濃度、CgAおよびs-IgA濃度を測定した.来院初日の研究に対する同意を得られた直後が最もコルチゾール、CgAともに高い値を示した。来院初日に比較して他の来院日はコルチゾール、CgA濃度ともに低い値を示した.また疼痛のある義歯を装着した患者は、コルチゾール、CgAともに増加し、不快症状がなくなるとそれぞれ低下した。しかしs-IgAは疼痛がある場合には低下する傾向が見られたが、個人差が大きく有意な傾向を示さなかった.また咬合支持のない義歯を装着していないときと、義歯装着時では一定傾向が認められなかった。これは咬合支持の有無の要因以外のストレスの影響が大きいことが考えられたため、今後さらに症例を増やし、それぞれの症状の変化との関連を統計的(相関.因子)に検討している.
小児科領域における遺伝子多型に基づいたオーダーメイド医療の構築

ゲノム研究の進展に伴い、薬物動態、薬効、副作用発現等の個人差が薬物代謝酵素や薬物標的分子等の遺伝子多型に起因することが明らかになってきた。特に遺伝子上の一塩基多型(SNP)診断は、薬物投与前に患者の薬剤反応性を予測する上で大いに期待されている。本研究の目的は、小児科領域に関連の深い遺伝子多型を対象に、わたしたちが開発した画期的な簡易ベッドサイド遺伝子診断法を用いて、個別化薬物療法(オーダーメイド医療)が実施できる体制を構築することにある。本研究の中心となる新しい遺伝子診断法(CASSOH法:Competitive Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization)は、検体を採取後、PCR反応をおこない、反応液をスポットしたイムノクロマト試験紙上に現れる紫色の判定線によって、肉眼的に遺伝子変異・多型の有無を判定する独自の手法である。本年度は、前年度に引き続いて、薬理学的遺伝子多型のうち日本人集団で臨床的な有用性が高いものを選定した。また、血液より侵襲の少ない検体を用いた遺伝子診断法について検討を行なうとともに、遺伝子増幅段階の高速化を検討した。次に、日本人集団で臨床的な有用性が高い薬理学的遺伝子多型それぞれについて、CASSOH法を用いた簡易遺伝子診断法の確立をおこなった。この際、一般病院の検査室における使用を想定して、キット化を試みるとともに、臨床検査としての評価をあわせて行なった。本研究において達成された遺伝子検査法は、小児科領域におけるオーダーメイド医療に基づいた薬害予防のための検査法として有用と思われる。本研究の目的は、小児科領域に関連の深い遺伝子多型を対象に、簡便迅速な遺伝子診断法を確立し、個別化薬物療法(オーダーメイド医療)が実施できる体制を構築することにある。これまでに私たちは、CASSOH法と命名した独自のSMP検出法を開発した。今回わたしたちはこのCASSOH法をさらに発展させ、CASSOH-ELISA法を開発した。この手法はマルチウェルのフォーマットを用いることが可能で、一度に複数個のSNPを検出することができる。ヒトゲノム研究の成果を臨床に還元するに際して有力な手法になるものと考えられる。さらにわたしたちは、血液検体ではなく、唾液の簡便な処理によって遺伝子診断が行なえる方法を確立した。従来の遺伝子検査には血液検体が用いられることが多く、肝炎・HIV感染の危険が危惧されるだけではなく、採血という小児にとっては侵襲性のたかい検体採取法にとってかわる優れた方法と思われる。これまで頬粘膜から抽出したDNAが使用される場合もあったが、収量が極めて低く、また抽出操作が煩雑であった。以上の手法を用いて、小児科領域の診療に関連が深い遺伝子多型、ミトコンドリア遺伝子1555A>G多型、CYP2C19(*2,*3アレル)、NAT2(*5,*6,*7アレル)およびTPMT(*3Cアレル)の検出系を確立した。本研究において達成された遺伝子検査法は、今後、小児科領域におけるオーダーメイド医療に基づいた薬害予防のための検査法として、汎用される可能性があると思われる。
ラット緑内障モデル網膜神経障害のニューロフィラメント脱リン酸化を指標とした検討

緑内障では網膜神経節細胞およびその軸索が障害されるが,これまでの実験緑内障動物モデルによる評価法は必ずしも感度が高いものではなく,特に,比較的早期の網膜神経節細胞の障害を判定することは困難なことが多い.ニューロフィラメントは,多くの神経細胞に存在している中間系フィラメントであり,その発現およびリン酸化の状態を見ることで網膜神経節細胞およびその軸索の障害を従来の方法に比較して,より鋭敏かつ早期に検出できる可能性がある.本研究ではラットを用いてニューロフィラメントのリン酸化および発現量変化と網膜神経節細胞障害の関連を検討した。まず、ラットの片眼の上強膜静脈を焼灼して持続的な中等度の眼圧上昇モデルを作成し、それに関してニューロフィラメント重鎖(NF-H)リン酸化を指標とした解析ができるかどうかを組織学的手法を用いて検討した。その結果、ある程度、網膜神経節細胞の障害によってNF-Hの脱リン酸化が起きていることが示唆されたが、明瞭な結果は得られなかった。また、ラットNMDA(N-methyl-D-aspartate)硝子体投与モデルにおけるニューロフィラメントの発現変化も検討したところ、本モデルにおいてはニューロフィラメント自体の発現が低下することを免疫組織学的に見いだした。さらに、NF-Hおよびリン酸化NF-H量が測定可能なELISA系を確立し、ラット眼圧上昇モデルにおけるNF-Hおよびリン酸化NF-H量を測定したところ、網膜神経節細胞およびその軸索障害の程度を定量的に判定できることが明らかとなった。ニューロフィラメント重鎖(NF-H)リン酸化を指標として網膜神経節細胞障害が効率よく検出できるかどうかを検討した。ラットの片眼の上強膜静脈を焼灼して持続的な中等度の眼圧上昇モデルを作成した。眼圧は圧トランスデューサーにてキャリブレーションしたトノペンを用いて測定した。もう片眼はシャムオペレーションを行って比較対照とし、両者の比較を行った。まず、確実に本モデルによる網膜神経節細胞障害が、このNF-Hリン酸化を指標として定量できるかどうかを検討するために、眼圧上昇3ヶ月後及び6ヶ月後の時点において過剰量の麻酔薬にて安楽死させ、眼球を視神経とともに摘出してNF-H抗体であるNF-200とSMI31によって染色した。NF-200はリン酔化の有無にかかわらずNF-Hと反応し,SMI31はリン酸化NF-Hとのみ反応するため,この両者を用いることで,NF-Hの半定量およびリン酸化状態の半定量が可能と考えた。それぞれの抗体との反応性を視神経,乳頭,視神経網膜各部位で対側コントロール眼と比較検討した。その結果、本法によって、ある程度までの程度において網膜神経節細胞およびその軸索障害の程度を判定することが可能であったものの、免疫組織染色では定量化が困難であり、再現性ある実験系を確立するためには不十分であることが明らかとなった。そのため、次に、NF-Hおよびリン酸化NF-HをELISAにて定量することにより、より定量的な指標を確立することを試みた。ラットの網膜、視神経から蛋白を抽出し総NF-H量、リン酸化NF-H量の測定を行ったところ、ラット1本視神経、網膜の半分量を下限値として、NF-H量が測定できるELISA系を確立した。前年度に引き続き、ニューロフィラメントに注目して網膜神経節細胞障害が効率よく検出できるかどうかを検討した。前年度ではラットの片眼の上強膜静脈を焼灼して持続的な中等度の眼圧上昇モデルを作成し、それに関してニューロフィラメント重鎖(NF-H)リン酸化を指標とした解析ができるかどうか検討したが、本年度はそれに加え、ラットグルタミン酸硝子体投与モデルにおけるニューロフィラメントの発現変化も検討項目に加えた。その結果、本モデルにおいてはニューロフィラメント自体の発現が低下することを免疫組織学的に見いだした。また、前年度に確立したNF-Hおよびリン酸化NF-H量が測定可能なELISA系を用いて、ラット眼圧上昇モデルにおけるNF-Hおよびリン酸化NF-H量を測定し、本モデルにおけるNF-Hの脱リン酸化の程度について定量的に検討した。

その結果、本法によって、網膜神経節細胞およびその軸索障害の程度を定量的に判定できることが明らかとなった。また、組織学的にNF-Hおよびリン酸化NF-Hの発現量を検討する方法や、従来、網膜神経節細胞障害定量法として報告されている方法である組織切片における網膜神経節細胞層および内網状層の厚み測定およびDiI(1,1'-dioctadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)の上丘注入による網膜神経節細胞数をカウント法等の結果と比較した結果でも、本方法の有用性が証明され今後の応用が十分期待できることが明らかとなった。
石灰化促進作用を有する機能性フィラー配合レジン系覆髄材の開発と直接覆髄への応用

S-PRGフィラーは石灰化促進作用をもつため、このフィラーを配合した接着性レジンを直接覆髄材(歯髄表面を覆う材料)として開発し、ラット露髄面に及ぼす影響について検討した。14日間あるいは28日間後の病理組織学的評価(歯髄組織の変化、炎症性細胞浸潤、象牙質橋の形成)を評価した。試作レジン系覆髄材を用いた実験群では、歯髄組織に炎症性変化を認めず、ほとんどの試料で修復象牙質と象牙質橋(露髄面を覆う象牙質)の形成を認めた。しかし、象牙質橋の形成状態は多様で、象牙質橋が認められない試料も存在した。28日間の観察結果では、S-PRGフィラー含有量が象牙質橋の形成に及ぼす影響は明確には認められなかった。S-PRGフィラーは、SrとBのイオンを徐放する性質があり、これらは石灰化促進作用を有することから、S-PRGフィラーを配合した接着性レジンを直接覆髄材として応用できる可能性がある。そこで、松風社に委託しS-PRGフィラーを配合したワンステップセルフエッチアドヒーシブを新規レジン系覆髄材として開発し、S-PRGフィラー含有量の違いが象牙質接着強さに及ぼす影響について評価した。ヒト抜去大臼歯の咬合面に平坦な象牙質面を形成した。S-PRGフィラーの含有量が異なる4種類のボンドA(0wt%:S-00A、13wt%:S-13A、27wt%:S-27A、40wt%:S-40A)とボンドBを各々混和して被着面に塗布した。20秒間放置後エアブローを行い、10秒間光照射を行った。コントロールとしてフルオロボンドシェイクワンを用いた。その後、ビューティフィルフロープラスF03とビューティフィルIIを積層充填した。接着試料を24時間保管後、接着界面の断面積が1 mm2となる角柱型ビームを作製した(n=20)。小型卓上試験機EZTest 500Nを用いて、クロスヘッドスピード0.5 mm/minで微小引張接着試験を行った。得られたデータは一元配置分散分析を行った後、Tukey法による多重比較検定で実験群間の有意差を検定した(p<0.05)。また、各試料の接着破壊様式を実体顕微鏡EZ4D(Leica)にて判定し、走査型電子顕微鏡S-800(Hitachi)を用いて接着界面を観察した。試作レジンのなかでは、S-PRGフィラー含有量が最も多いS-40Aが最も高い接着強さを示した。一元配置分散分析では実験群間に有意差が認められ、多重比較検定の結果、S-13Aのみがコントロールより有意に低い象牙質接着強さ(p=0.012)を示し、S-13A以外の実験群の間には有意差がみられなかった(p>0.05)。松風社に委託してS-PRGフィラーを配合した4種類の新規レジン系直接覆髄材を試作(S-00:S-PRG0%+Silica40%、S-13:S-PRG13%+Silica27%、S-27:S-PRG27%+Silica13%、S-40:S-PRG40%+Silica0%)し、各試作覆髄材の重合硬化物から蒸留水中へ溶出される各種イオンの溶出量を測定した。モールド(直径15mm,厚さ1mm)を使って試作覆髄材のディスク状硬化体を作製した(n=6)。各試料を蒸留水中に2週間あるいは4週間浸漬した。Sr、Al、Na、BおよびSiの溶出濃度はICP発光分析装置を用いて、Fの溶出濃度はpHイオンメーターを用いて各々測定した。S-PRGフィラーは石灰化促進作用をもつため、S-PRGフィラーを配合した接着性レジンを直接覆髄材として応用できる可能性がある。本研究の目的は、S-PRGフィラー含有レジン系覆髄材のフィラー含有量がラット露髄面に及ぼす影響について検討することである。本研究は、本学動物実験倫理委員会の承認を得て行った(整理番号:671)。89週齢の雄性SD系ラットの上顎第一臼歯近心咬頭頂部を露髄させ、露髄面をADゲルにて5分間処理、次に6%NaClOと3%H2O2による交互洗浄を行った後、直接覆髄を行った。4種類の試作レジン系覆髄材は、フルオロボンドシェイクワンを基本組成とし、各々S-PRGフィラーを0、13、27、40wt%含有している。またコントロールとしてMTAを用いた。直接覆髄後、ビューティフィルフロープラスF03を窩洞に填塞し、Candeluxを用いて光照射を行った。観察期間(14日間と28日間)後に屠殺、4%PFA溶液で固定した。摘出試料は10%EDTA溶液にて脱灰、通法にてパラフィン連続薄切切片を作製した。光学顕微鏡にてH-E染色切片を観察し、病理組織学的評価は歯髄組織の変化、炎症性細胞浸潤、象牙質橋ならびに修復象牙質の形成について各々4段階評価を行った。試作レジン系覆髄材を用いた実験群では、歯髄組織に炎症性変化を認めず、ほとんどの試料で修復象牙質と象牙質橋の形成を認めた。

28日間の観察結果では、S-PRGフィラー含有量が象牙質橋の形成に及ぼす影響は明確には認められなかった。また、歯髄組織内部にはシリカフィラーや象牙質削片の迷入が認められたためこれらが露髄面の治癒態度に何らかの影響を及ぼしたことが考えられる。一方、Controlはほとんどの試料で厚みのある完全象牙質橋の形成が認められた。S-PRGフィラーは石灰化促進作用をもつため、このフィラーを配合した接着性レジンを直接覆髄材(歯髄表面を覆う材料)として開発し、ラット露髄面に及ぼす影響について検討した。14日間あるいは28日間後の病理組織学的評価(歯髄組織の変化、炎症性細胞浸潤、象牙質橋の形成)を評価した。試作レジン系覆髄材を用いた実験群では、歯髄組織に炎症性変化を認めず、ほとんどの試料で修復象牙質と象牙質橋(露髄面を覆う象牙質)の形成を認めた。しかし、象牙質橋の形成状態は多様で、象牙質橋が認められない試料も存在した。平成25年度は、交付申請書で平成26年度に実施予定であった試作レジン系覆髄材の象牙質接着強さの測定を先に実施し、平成26年度は、交付申請書で平成25年度に実施予定であった覆髄材重合体から蒸留水中への各種イオン溶出量を測定した。イオン溶出量の測定は松風社附属の研究施設に赴いて研究員の指導を仰ぎながら行った。また、試作覆髄材の直接覆髄に関する動物実験を本学実験動物施設と本講座実験室にてラットを用いて開始している。なお、実施予定であった覆髄材重合体の重合率測定は実施できなかった。保存修復学平成27年度は、交付申請書通り、ラットを用いた直接覆髄実験を完結する予定である。試作覆髄材の象牙質接着強さ、各種イオンの溶出量および直接覆髄効果等、各実験データを分析し、英語論文を作成して公表する予定である。当初の計画では、平成25年度は、新規レジン系覆髄材として開発したS-PRGフィラーの含有量が異なる4種類のセルフエッチアドヒーシブを光重合して試料を作製し、本年度各々の重合率と各種イオンの蒸留水中への溶出量を本学研究施設にて測定する予定であった。しかし、これらの測定は平成26年度に松風社附属の研究施設に赴いて松風社研究員の指導を仰ぎながら実施することに変更した。また、動物実験を平成26年度早期に実施することを前提に、修復システムの歯髄刺激と関連性の深い象牙質接着強さを前倒しして平成25年度に実施した。ほぼ予定通りに助成金を使用できたが、若干の残金が生じたので次年度に使用することとする。平成26年度は、まず最初に、試作覆髄材の直接覆髄効果について本学実験動物施設と本講座実験室にてラットを用いた動物実験を実施することを計画している。通法にて直接覆髄実験を進め、摘出した試料を脱灰する期間中に、松風社研究施設に赴いて研究員の指導を仰ぎながら各試作覆髄材の光重合体の重合率と各種イオンの蒸留水中への溶出量を測定する予定である。少額なので特別な使用計画はない。あえて言うならば、振込手数料などに充てたい。平成25年度と平成26年度の研究計画の実施内容を入れ替えたため、当初予定の研究経費が大きく異なってしまった。すなわち、平成26年度実施予定の研究経費の方が平成25年度より少なかったため、余剰金が生じた。平成26年度は平成25年度実施予定であった研究を遂行するため、交付金が不足する可能性がある。平成25年度の余剰金でその不足分を補填する予定である。
マインドワンダリングのポジティブな機能に関する多角的検討

本研究課題の目的は,マインドワンダリング(MW)が他の心的活動に対して持つポジティブな機能(機能的意義)を明らかにすることである。これに関し平成30年度は,以下の2つの研究を行った。1)MWと知的好奇心の関係: MWの機能の一つは,関心事について詳しく考え,プランニングをしたり,問題解決など促したりすることである。そうであるならば,様々なことに関心をもつ「知的好奇心」の強い者はMWが多い可能性がある。昨年度までの研究では,質問紙法を用いて,知的好奇心の強さがMWの起こりやすさに与える影響を検証したが,本年度はさらにweb調査によるデータ(327名分)を加えて,知的好奇心,MW傾向,特性不安,実行制御能力の関係をモデル化した。その結果,特殊的好奇心,拡散的好奇心が特性不安や実行制御能力と独立にMW傾向に正の影響を与えていること,ならびに特性不安は,実行制御の弱さを介し,MWに間接的に影響していることを明らかにした。この結果は,昨年度までの成果を補強して,MWが知的好奇心というポジティブ特性と関係することを示すものである(日本心理学会第82回大会で報告)。2)MWが記憶に与える影響:近年,言語刺激などを記銘した後,何もしない状態でいることが記憶の保持を促進することが示されている(Dewar et al., 2012)。本年度は,この現象を再現するとともに,課題負荷の高低が記憶保持に与える影響を実験的に検証した。その結果,何もしない状態は記憶保持を促進したが,課題の存在は負荷の高低にかかわらず,その後の記憶再生に妨害的に影響することを見いだした。この他,日本心理学会第82回大会の公募シンポジウム「イマジネーションの認知機構と脳内神経基盤」において話題提供を行い,直感像,空想傾向,空想の友達などの現象とMWの関係性に関する議論を通じて,MW研究についての新たな視座を得た。交付申請書に記した研究のうち「知的好奇心の個人差がMW生起に与える影響の検討」については,これまでに得られた知見を,調査を重ねて確かなものとしており,順調に進展している。また,「経験サンプリング法を通じた課題無関連思考の機能と個人特性の関係の検討」については,無意図的音楽イメージを題材とした研究により,やはり新奇な知見を見いだしている。さらに本年度は「MWをすることが記憶の働きに与える影響の検討」に取りかかり,先行研究の再現可能性を確認し,また研究手法も確立することができた。一方で「fNIRSによる脳血流測定を通じたMW測定法の検討」「MWをすることが記憶の働きに与える影響の検討」については,未着手に終わってしまった。以上より,これまでの成果をより確かなものとしつつ,新たな研究の足がかりは確立したが,研究課題全体に対し十分な成果が得られたとは言えないため,平成30年度の研究は「やや遅れている」と自己評価した。平成31年度は,平成30年度までの成果を学会や論文誌にて発表するとともに,これまでに得られた成果のうち,より深く検討する必要がある以下の2テーマの研究を重点的に実施し,成果を確実にあげることができるようにする。1)行動データにより測定したMW傾向およびその思考内容(未来思考,過去思考など)と知的好奇心との関係を検討する。それにより,これまでに得られた知的好奇心とMW傾向の関係に関する知見を,MWのポジティブ機能の観点からより詳細に明らかにする(57月に実施予定)。2)MWが記憶の働きに与える影響について挿入課題の種類を操作することで,それが生起する条件を明確にしていく(49月に実施予定)。また,時間的,人的余裕に応じて「fNIRSによるMWの生理計測」「MWが創造的思考に与える影響」の検討を実施する。本研究課題の目的は,マインドワンダリング(MW)が他の心的活動に対して持つポジティブな機能(機能的意義)を明らかにするために,1)MWが記憶の働きに与える影響,2)MWが創造的思考に与える影響,3)課題無関連思考の内容が持つ機能のそれぞれについて,その実在性と特徴を明確にすることである。これに関し平成28年度は,以下の2つの研究を行った。1.MWの機能の一つは,関心事について詳しく考え,プランニングをしたり,問題解決など促したりすることである。そうであるならば,様々なことに深く関心を持つ知的好奇心の強い者はMWが多い可能性がある。そこで本年度は,知的好奇心の強さが,MWのポジティブ機能の基盤としてMWの起こりやすさに影響すると仮説をたて,それを質問紙法により検証した。大学生約200人に,知的好奇心尺度(西川・雨宮,2015),MW質問紙(MWQ:梶村・野村,2016),特性不安尺度(STAI:清水・今栄,1981)に回答を求め,得られた回答を分析したところ,特性不安が低い参加者で「拡散的好奇心」の強さとMW傾向の間に正の相関が見られた。この結果から,新奇な情報を幅広く探し求める動機づけが高い人はMWをしやすい可能性が示唆された。2.意図と無関係に頭の中に音楽イメージが広がる「無意図的音楽イメージ」の生起ならびにその快・不快に影響する個人特性(音楽経験,性格5因子,強迫傾向)を,日常生活における無意図的音楽イメージの経験サンプリングにより検討した。

約100名の学生から得られたデータを分析した結果,無意図的音楽イメージの生起しやすさには音楽経験,および強迫傾向「侵入的思考」が影響すること,その快・不快には,強迫傾向「洗浄強迫」が影響することが示された。また,無意図的音楽イメージは快なものが多く,無意図的音楽イメージが感情状態を快に保つ機能を持つことが示唆された。交付申請書に記載した研究のうち,「fNIRSによる脳血流測定を通じたMW測定法の検討」については,交付申請が11月であったことからfNIRS装置の導入が遅れ,機器のセットアップを済ませたに終わった。これに対し「知的好奇心の個人差がMW生起に与える影響の検討」については,計画通り質問紙調査を行い,一定の成果を得ることができた。また,当初計画に加え,音楽に関するマインドワンダリングと言える「無意図的音楽イメージ」に関する研究を行い,新奇な知見を得ることができたとともに,今後の研究に向けて経験サンプリング法の実施方法を確立することができた。しかしながら,MWが記憶や創造的思考に与える影響については,その具体的検討に取りかかることができなかった。以上より,初年度としては,今後の研究に向けた準備を進めることができたが,研究課題の目的に即し十分な成果が得られたとは言えないため,平成28年度の研究は「やや遅れている」と自己評価した。本研究課題の目的は,マインドワンダリング(MW)が他の心的活動に対して持つポジティブな機能(機能的意義)を明らかにするために,1)MWが記憶の働きに与える影響,2)MWが創造的思考に与える影響,3)課題無関連思考の内容がもつ機能のそれぞれについて,その実在性と特徴を明確にすることである。これに関し平成29年度は,以下の2つの研究を行った。1.MWの機能の一つは,関心事について詳しく考え,プランニングをしたり,問題解決など促したりすることである。そうであるならば,様々なことに広く深い関心をもつ知的好奇心の強い者はMWが多い可能性がある。そこで本年度は,昨年度に引き続き,知的好奇心の強さがMWの起こりやすさに与える影響を質問紙法により検証した。大学生約200人に,知的好奇心尺度,MW質問紙,特性不安尺度,エフォートフルコントロール尺度(注意制御)に回答を求め,得られた回答を分析したところ,新奇な情報を幅広く求めたいと思う傾向である「拡散的好奇心」の強さが,特性不安や注意制御と独立にMWの起こりやすさに正の影響を与えていることが示された。この結果は,昨年度の成果を補強するものであり,MWが拡散的好奇心の強さを介してポジティブな機能を持つことを示唆するものである。2.意図と無関係に頭の中に音楽イメージが広がる「無意図的音楽イメージ」の生起ならびにその快・不快と個人特性(音楽経験,性格5因子,強迫傾向)の関係について経験サンプリング法で調べた昨年度のデータをマルチレベル分析により再分析し,昨年度の結果の妥当性を確認した。また,平成29年9月の日本心理学会大会にて,MWのポジティブ機能についての自主シンポジウムを開催し,関連する研究者から知見の収集,意見交換を行った。交付申請書に記載した研究のうち,「知的好奇心の個人差がMW生起に与える影響の検討」については,計画通り調査を行い,これまでにない新奇な知見を見いだしており,順調に進展している。また,「経験サンプリング法を通じた課題無関連思考の機能と個人特性の関係の検討」については,無意図的音楽イメージを題材とした研究により,やはり新奇な知見を得るとともに,今後の研究の方法論,分析法(マルチレベル分析)についても確立することができた。
対合同変正則写像空間の位相幾何

なお,(ii)の研究実績は高く評価されている.一例として,研究代表者は,2005年7月に東大で開催されたCOE国際会議で主要講演を行った.なお,(ii)の研究実績は高く評価されている.一例として,研究代表者は,2005年7月に東大で開催されたCOE国際会議で主要講演を行った.平成15年度は偶数次元球面の2回ループ空間Ω^2S^<2n>の組合せ的モデルを,正則写像空間により構成することに成功した.Rat_k(CP^n)でS^2からCp^nへの基点を保つdegree kの正則写像空間を表す.S^2の基点を∞,CP^nの基点を[1,...,1]と取ることによりRat_k(CP^n)は共通根を持たない,monicな複素k次多項式の(n+1)組(p_0(z),...,p_n(z))と表示される.白然な包含写像i_k : Rat_k(CP^n)→Ω^2S^<2n+1>の下で,Rat_k(CP^n)はΩ^2S^<2n+1>をかなり良く近似することが知られている.例えばSegalによりi_kはk(2n-1)次元までホモトピー同値であり,Cohen-Cohen-Mann-MilgramによりRat_k(CP^n)の安定分解がΩ^2S^<2n+1>の安定分解因子を用いて記述された.この様に奇数次元球面の2回ループ空間の組合せ的モデルを正則写像空間により構成することは知られていたのである.自然な問題として偶数次元球面の2回ループ空間Ω^2S^<2n>の組合せ的モデルを正則写像空間により構成するということがあるが,この問題はかなり以前から多くの数学者に認識されていたにも拘らず,未解決であった.平成15年度はΩ^2S^<2n>を近似するモデルを構成することに成功した.概略は以下の通りである.G^n_kでmonicな複素k次多項式の(n+1)組(p_0(z),...,p_n(z))で,α∈Cがp_0(z),...,p_<n-1>(z)の共通根ならばp_n(α)【not a member of】Rという性質を満たすものの集合とする.自然な写像j_k : G^n_k→Ω^2S^<2n>が存在する.n【greater than or equal】2のときはj_kに対し上記のSegal型の定理及びCohen-Cohen-Mann-Milgram型の定理が成立する.この定理の重要性は以下の点にある.まず,左辺について述べる.P^l_<k,n>はArnoldによりC上のconfiguration spaceのhomologyを決定するために導入された.ここでP^0_<k,2>はC上のunordered distinct k pointsのなすconfiguration spaceであることに注意する.ArnoldはP^l_<k,n>のhomologyのstabilityなどを証明したが,そのhomologyを完全に決定するにはほど遠かった.ところが,研究代表者の2001年の研究実績によりX^l_<k,n>の安定ホモトピー型は完全に決定されている.従って,上記の平成16年度の研究実績によりP^l_<k,n>のhomologyは完全に決定されるのである.なお,上記の平成16年度の研究実績は既に高く評価されている.一例として,研究代表者は2004年12月にMexicoで開催されたtopologyの大きな国際会議に招待され,主要講演を行った.
21世紀に向けての企業戦略と組織デザイン:データベースの構築と国際比較

流通業、金融業および自動車産業について、企業戦略と組織変革に関するデータベース化を1980年から1997年の期間を対象に図った。本データベースでは、各企業について新聞・雑誌記事の検索を行った後、記事本文の分析を行い、各変革に関する分類と記述を行った。そこでは、各変革の鍵となる特徴を浮き彫りにするために、変革のタイプ、組織内で変革が起きた場所、表明された目標およびその理由が記録された。また、戦略タイプ、戦略方針、組織構造なども記述されている。このデータベースに基づき、以下のようなテーマを分析した。(1)日本企業において経営者交代が戦略および組織の変革に及ぼす影響:全般的にみると、経営者交代は戦略および組織の急進的な変革とは関係がなかった。また、経営者交代とは無関係に、ガバナンス構造が戦略および組織の変革に影響を及ぼしていた。すなわち、企業の業績が著しく悪く、しかもメインバンクが存在する場合には、戦略および組織の変革は促進された。(2)米国と日本の流通業において情報技術が組織デザインに及ぼす影響:米国では、情報技術の導入は組織構造に非常に大きな影響を及ぼしていた。その他の変数をコントロールした場合、情報技術は集権化につながっていた。それに対して、日本では、その他の変数をコントロールしない場合、情報技術の導入は組織構造に影響を及ぼしていたが、その効果は米国と比べると非常に弱く、また方向も逆で分権化につながっていた。(3)アジア危機後ヨーロッパ、日本および米国企業による東南アジアでのマーケティング活動の変化を理解するためのフレームワーク:まず企業のマーケティング活動の変化を「開発」と「活用」の2つに分類し、いずれの国における企業も開発よりも活用タイプの変革に圧倒的に多くかかわっていることを示した。また、その国独特の資本主義形態が企業による変革のタイプと方向性に影響を及ぼしていることを示した。東証一部上場企業のうち流通業について、企業戦略と組織変革に関するデータベース化を1985年から1996年の期間を対象に図った。まず、日経TELECOMを利用し、各企業について、決算報告、新製品発売、役員交代などの記事を除外し、戦略および組織の変革に関連のある記事のみを検索した。また、日経TELECOMでは記事のタイトルは検索できるが、本文がデータベース化されていない雑誌記事について、それら記事をスキャナで読み取り、MOドライブに蓄積した。上記作業と同時並行的に、記事本文の分析を行い、各変革に関する分類と記述を行った。まずそれぞれ4つに分けられた「変革タイプ」と「変革レベル」という2つの次元から、各変革を16のセルに分類するグリッドを作成した。変革タイプは、戦略、組織構造、プロセスおよびヒトに分けた。変革レベルは、企業間、企業内、グループおよび個人に分けた。各変革は、記事の表現をそのまま用いて記述した。ついで、各変革につき、その変革を引き起こすに至った動機ないし理由を、これまた記事の表現を可能な限り用いて記述した。さらに、その変革によって達成された結果もしくはその変革がこれから達成しようとする成果について、量的なものだけでなく、質的なものも含めて記述した。このグリッドは、MS-ACCESSを用いてデータベース化した。その上で、米国で構築されつつあるデータベースと組み合わせて、流通業における情報技術の導入に関すす日米比較を行った。その結果、日米ともに、情報技術導入の先発企業が後発企業に対して競争優位を維持し続けていることが判明した。ただし、米国ではその競争優位が縮小する傾向にあったのに対して、日本では拡大する傾向にあった。昨年に引き続き、企業戦略と組織変革に関するデータベース化を1985年から1997年の期間について図ったが、今年度は昨年作業が終了しなかった流通業と、新たに自動車産業を対象とした。

日経TELECOMを利用し、各企業について戦略および組織の変革に関連のある記事のみを検索した後、記事本文の分析を行い、各変革に関する分類と記述を行った。まずそれぞれ4つに分けられた「変革タイプ」と「変革レベル」という2つの次元から、各変革を16のセルに分類するグリッドを作成した。変革タイプは、戦略、組織構造、プロセスおよびヒトに分けた。変革レベルは、企業間、企業内、グループおよび個人に分けた。その上で、本年度は、日本企業における組織適応、特に経営者交代が戦略および組織の変革に及ぼす影響を分析した。その結果、全般的に見ると、経営者交代は戦略および組織の急進的な変革とは関係がなかった。日本企業はこの間戦略および組織の進化的な変革にはかかわってきたが、それは経営者交代とは無関係にであった。また、これまた経営者交代とは無関係に、ガバナンス・ストラクチャーが戦略および組織の変革に影響を及ぼしていた。すなわち、企業の業績が著しく悪く、しかもメインバンクが存在する場合には、戦略および組織の変革は促進された。また、昨年、流通業における情報技術の導入に関する日米比較を行い、日米ともに情報技術導入の先発企業が後発企業に対して競争優位を維持し続けているが、米国ではその競争優位が縮小する傾向にあったのに対して、日本では拡大する傾向にあったという結果を得た。本年度は、こうした日米の違いをもたらす要因について分析を加えた。この結果については、本年8月にシカゴで開かれるAcademy of Managementの年次大会で報告することになっている。過去2年間に引き続き、流通業、金融業および自動車産業の1980年から1997年の期間について、企業戦略と組織変革に関するデータベース化を図り、今年度は、これまでに作業が終了しなかった部分を対象とした。その上で、本年度は、流通業における情報技術の導入が組織構造に及ぼす影響について、1980年から1997年までの18年間を対象に日米比較を行った。米国は、情報技術の導入は組織構造に非常に強い影響を及ぼしていた。規模、形態および環境不確実性をコントロールした場合、情報技術は集権化につながっていた。特に、取引プロセス型の情報技術と集権化との間に強い関係が示された。それに対して、日本では、その他の変数をコントロールしない場合、情報技術の導入は組織構造に影響を及ぼしていたが、その効果が米国と比べると非常に弱く、また方向も逆で分権化につながっていた。特に、意思決定支援型の情報技術と分権化との間に強い関係があった。この結果については、本年7月に静岡で開かれるAcademy of Management,Western Divisionの次大会で報告することになっている。
ニホンスモモ‘貴陽’における放射線照射花粉の受粉が種子形成と果実品質に及ぼす影響

果樹において種子は光合成産物を果実内に引き込む力(シンク力)を持つ。カンキツ類などでは放射線を照射した花粉の受粉によって種子形成の異常が起こり、果実品質に影響することが確認されている。ニホンスモモ`貴陽'では『味なし果』と呼ばれる低品質果実(糖度10度程度)の発生が問題となっているが、その発生要因はわかっていない。そこで本研究では、『味なし果』発生のメカニズム解明のために、γ線照射花粉の受粉が`貴陽'の種子形成と果実品質に及ぼす影響を調査した。受粉にあたって、γ線照射した`ハリウッド'花粉(受粉樹品種)の稔性を調査した。100Gy照射区(52.5%)、250Gy照射区(53.0%)および500Gy照射区(51.1%)のすべてのγ線照射区で、無照射区(53.2%)と同程度の花粉稔性であることが確認された。それらの花粉を受粉したところ、生理落果後の着果率は、無照射区(4.5%)とγ線照射各区(4.34.6%)で差はなかった。成熟果の種子と糖度を調べた結果、種子がしいなである果実の割合は100Gy処理区(41.2%)と250Gy処理区(47.1%)で無照射区(41.9%)と同程度であったが、500Gy処理区では70.3%であり、高頻度でしいなが発生した。しかし、糖度はいずれの処理区でも様々な値がみられ(7.823.9%)、照射線量の違いや種子の状態にかかわらず分布した。以上より、`貴陽'において種子形態の違いが『味なし果』の直接的な発生要因ではないことが示唆された。今後は、ソース器官である葉に着目し、果実への光合成産物の転流の視点から`貴陽'における『味なし果』の発生要因を検討していく予定である。
単一受容体特異的レクチンの作製とその有用性についての研究

平成29年末時点で最も発現効率が良かった系で大量発現を行い、1 mgのガレクチン9-scFv精製蛋白を得る為に必要なバイオマスの蓄積を行った。動体試験はガレクチン9-scFvに赤外蛍光物質ラベルを行い、ライブイメージで行うのが効率良く、装置を有するオランダ国フローニンゲン大学のEdvin Bremer博士との共同研究で行う予定である。これまで生産性改善のために複数の大腸菌種、分子シャペロン等の共発現、プロモーターの強度の調整、培地組成の変更をテストしてきたが、本来の目的であるin vivo薬効試験を行えるだけの量(13 mg以上)をまかなえる生産性に到達することは出来なかった。ガレクチン9と融合させた一本鎖抗体は25 kDaであり比較的小さいタンパク質であるが、分子内でS-S結合の形成が必要なため細胞質内の還元的環境での発現には不向きである。一方でガレクチン9は細胞質内の発現系においてのみ十分な生産が得られる。多機能分子であるガレクチン9と一本鎖抗体の融合は、抗体をスイッチすれば別疾患にも応用できるため魅力的であったが、非常に生産性が低いことから医療への応用可能性は低いと考えられる。短いペプチドならばガレクチン9と融合しても生産性を保持できる可能性があると考え、ガレクチン9を組織特異的に送達し得るペプチドを検索した。特許出願を予定しているのでペプチドの内容は伏せるが、ホルモンとして働くペプチドで、ある種のガンに受容体が高発現する"ある"ペプチドに可能性を見出した。ガレクチン9とそのペプチドとの融合タンパク質は大腸菌の発現系で合成でき、発現量は本来のガレクチン9の1/3に達した。この融合タンパク質には将来の応用の可能性があると考えている。助成金申請を含めて今後の展開を計画しているところである。ガレクチン9は様々な受容体に結合して多岐にわたる薬理作用を示すが、その複雑さゆえに薬物としての開発は困難である。本研究の目的は大腸ガンに特異的に送達されるガレクチン9を作成し、それが本来のガレクチン9同様に抗ガン作用を示すか調べることにある。この戦略が成功すれば、ガレクチン9の作用を限定的に発揮させることが可能になり、薬物としての開発が容易になると考えられる。またガレクチン9は薬剤耐性のKRAS変異大腸ガンを特異的に殺傷するため、本研究で予定しているin vivo実験で有効性が確認できた場合には、Unmet medical needsを満たす新規シーズとして開発できる可能性がある。ガレクチン9を大腸ガン特異的に送達するために、ヒトEGFRに特異的な一本鎖抗体scFv425を用いた。scFv425は分子量が通常の抗体の1/5(約30,000)であることから、ガレクチン9との融合タンパク質作製に適している。融合タンパク質ガレクチン9-scFv425は大腸菌発現系を用いて調製した。またin vitro結合アッセイ系を作製し、融合タンパク質がガレクチン9によるレクチン活性とscFv425によるEGFR結合活性の両方を併せ持つことを確認した。ところがこの融合タンパク質の大腸ガン殺傷作用は、本来のガレクチン9より劣っており、scFv425による立体障害の影響が疑われた。またガレクチン9-scFv425の生産量は非常に低く、効率の良い発現系を見出すことが求められている。これらの問題が起こる可能性は研究計画当初から想定されており、現在、研究計画に従って問題解決に取り組んでいるところである。予備検討で作製したガレクチン9-scFv425を用いて実験したところ、KRAS変異大腸ガンに対する細胞死誘導活性はガレクチン9よりも劣っていた。ガレクチン9が同ガンに細胞死を誘導する際には、ガレクチン9が細胞内部に取り込まれ、オートファジー関連タンパク質と相互作用することが必要である。ガレクチン9送達用に付加したscFv425がこの過程を阻害している可能性がある。ガレクチン9-scFv425の生産系として現時点で最も有望なのはSHuffleという大腸菌発現系であるが、活性のあるリコンビナントタンパク質の収量は培養液1Lあたり0.2 mgしかなく大幅な改善を要する。この大腸菌発現系は細胞内部でジスルフィド結合を形成させる酵素PDIを発現しており、またそもそもガレクチン9-scFv425の発現量が低い。低発現量であることが反って活性のあるリコンビナントタンパク質の合成に優位に働いている可能性が考えられた。これらの観察よりPDIを大量発現し、且つガレクチン9-scFv425の発現量を段階的に低下させる発現系を作製して検討を始めた。

ガレクチン9と融合させた一本鎖抗体は25 kDaであり比較的小さいタンパク質であるが、分子内でS-S結合の形成が必要なため細胞質内の還元的環境での発現には不向きである。一方でガレクチン9は細胞質内の発現系においてのみ十分な生産が得られる。多機能分子であるガレクチン9と一本鎖抗体の融合は、抗体をスイッチすれば別疾患にも応用できるため魅力的であったが、非常に生産性が低いことから医療への応用可能性は低いと考えられる。短いペプチドならばガレクチン9と融合しても生産性を保持できる可能性があると考え、ガレクチン9を組織特異的に送達し得るペプチドを検索した。特許出願を予定しているのでペプチドの内容は伏せるが、ホルモンとして働くペプチドで、ある種のガンに受容体が高発現する"ある"ペプチドに可能性を見出した。ガレクチン9とそのペプチドとの融合タンパク質は大腸菌の発現系で合成でき、発現量は本来のガレクチン9の1/3に達した。この融合タンパク質には将来の応用の可能性があると考えている。助成金申請を含めて今後の展開を計画しているところである。ガレクチン9に負荷されたscFv425による立体障害がKRAS変異大腸ガンへの細胞死誘導活性を低下させている可能性が考えられる。そこでscFvより小型の抗体であるnanobodyを結合したガレクチン9-nanobodyを作成し、KRAS変異大腸ガンへの作用を調べる。またガレクチン9とscFv425またはnanobodyをつなぐリンカーを、大腸ガンが発現するプロテアーゼで分解されるタイプに代えて活性を調べる。これと並行して大量発現を可能にする発現系の検討を継続する。モデルタンパク質としてガレクチン9-scFv425を用いる。発現系の最適化は本年度末まで行い、その時点までで最良の系を用いて大量発現・精製を行う。最終年度(平成30年度)は精製リコンビナントタンパク質を用いて、KRAS変異大腸ガンへの特異的な送達と、in vivoでの薬効を調べる予定である。学会に参加しなかったためと、謝金を別の助成金より捻出することが出来たために差額が生じた。差額は本年度の物品費に充てる予定である。