hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロビームを用いた重イオン照射細胞内DNA損傷の分布と細胞応答機構の解析

1)細胞への実際のイオンヒット位置・個数を照射後に確認するため飛跡検出用プラスチッグCR-39上に接着させたCHO-K1細胞に対して、互いに同一のLET値を持っようにエネルギーを調整した^<12>Cイオン及び^<20>Neイオンを照射し、細胞核内のDNA損傷領域の広がりを蛍光免疫学的手法で解析、同一LET値を有する重イオンのトラック構造の違いがDNA損傷の生成様式に影響することを明らかにした。2)照射後にCR-39のエッチングによって確認された重イオンヒット位置と一致して抗γH2AX抗体を用いて可視化されたDNA2本鎖切断の局在部位に非相同性末端結合を担うKu80が局在する過程をGFPを用いて観察し、照射の1030分後にγH2AXとKu80が共局在することを確認するとともに、異なるトラック構造を有するイオン種によってDNA損傷に対する修復蛋白質の動態が異なることを明らかにした。3)放射線抵抗性細菌Deinococcusradiodurans由来のDNA鎖切断末端結合蛋白質PprAを用いて哺乳動物細胞内に生じたDNA鎖切断損傷を可視化検出する技術を開発した。4)放射線照射細胞におけるDNA損傷の修復に中心的な役割を果たすDNA-PKcsは、低LETおよび高LET放射線によるバイスタンダー効果で誘発されるDNA損傷の修復にも関与していることを明らかにした。
東北日本における地域自立に関する比較ミニマムの研究

本研究は、昭和64年度から2年間にわたるものであるが、研究目的は、多極分散型国土形成について、東北地方の地域社会を対象に実証するものである。その際、理論的には地域社会発展・自立のミニマムの検討,実証的方法としては地域類型化にもとづく細密化が内容とされていた。しかし12回の研究会で明らかにされたことは、(1)都市ー農村を問わず、今日の地域社会づくりに関する理論的実証的検討は、相当すすんでおり、むしろその整理が必要なこと、(2)対象とした東北地方は、特色ある地域が分散的に存在し、その中でも首都圏との関係で広域都市化しつつ発展する地域と北東北のように過疎化の新時代を迎えている地域など構造的にも多様である。従ってそれを統一的全体的に把握する必要がある、(3)しかし、一部の地域社会の実証も必要,ということであった。上記の研究会にあわせて、今年度は南東北広域都市圏の調査にあわせて,北東北の資料収集につとめた。地域調査については、新潟県燕三条の洋食器産業の技術革新の実態調査を行なった。目下報告書の作成にむけて課題を整理中であるが,その内容は、(1)研究経過と東北地方問題,(2)東北各県の「綜合計画」の検討,(3)東北地方地域開発論の分析(東北地方社会論を含くむ),(4)新潟県洋食器産業の技術革新、(5)内発的地域社会発展理論の検討となっている。地域の実態分析をあわただしくまとめるよりも、問題空間を拡大、研究者の今後の仕事につなげる方が、研究主題の追及にかえってよいとする判断が、そこにはたらいた。本研究は、四全総策定過程で、多極分散型国土の形成を鋭く打ち出した、東北日本を対象に、地域社会発展の論理、地域自立の内在的要件を検証するものである。本年度の実積は以下の通りである。1.東北地方の県庁所在地において、5回の研究会を行こない、四全総以後の地域政策の動向、にもかかわらない地域社会の現実、研究者の批判的論理について検討した。2.東北日本社会の認識については、函館・青森インタ-ブロック構想、FIT構想などの推移を確認しつつ、東北各県の地域開発の現状、地域問題の諸相を、県庁の企画調整課を窓口に実態の認識につとめた。3.東北地方問題は、二重の側面、すなわち国際化を前提に、高度情報化、都市化、先端産業化をめざす動向と、人口流出、高令化、産業の停滞的内容から構成されている。前者については、東北の経済・行政主体がその柱とし展開中である。「第2国土軸論」「東北インテリジェント・コスモス」「重都論」「仙台市の政令指定都市」化、「東北開発促進計画」に焦点をあわせ、内容の認識につとめた。後者は、秋田、青森、岩手に強くみられるものであるが、そのことが県の総合計画に反映していることも検証した。4.市町村レベルにおいては、釜石等の加工貿易型素材産業の停滞状況を追認識するかたわら、地場資源、文化、人づくりを柱に、「町づくり」「村おこし」に成功している多くの自治体の現実の把握につとめた。5.理論的整理、東北地方問題の総合的握、一層の地域社会に下降した事実認識が、今年度の課題である。
DNAの特性を利用した積層型ナノ構造体の構築と光電変換への応用

分子材料としてのDNAの特徴を生かし、センシングや光電変換機能を持つボトムアップ型新規DNAナノ構造体の構築を目的とし、電極に固定したDNA上での機能性分子の集積化に関する研究を行った。光機能性分子を修飾した核酸塩基三リン酸体を合成し、その修飾塩基をポリメラーゼによってテンプレートDNAに対して連続的に取り込ませることでDNA上への機能性分子の集積化を行い、光電応答を示すDNAデバイスの作製を行った。DNAは遺伝情報を司る生体高分子であるとともに、高度な相補塩基認識能から実現されるナノ構造体を構築するための分子材料としての性質も合わせ持っている。さらに、DNAはそのらせん軸に沿って一次元状に電子あるいはホールを輸送することが明らかにされており、導電性材料としての応用も期待されている。本研究では、“生体分子"としてのDNAと“分子材料"としてのDNAの特徴を生かし、空間・配向・距離が制御された機能性分子の集積化を電極上で実現し、センシングや光電変換機能を持つボトムアップ型新規ナノ構造体の構築を研究の目的とする。具体的には、光機能性分子を修飾した核酸塩基三リン酸体を設計し、その修飾塩基をポリメラーゼによってテンプレートDNAに対して連続的に取り込ませることで、DNA上への機能性分子の集積化を行う。この手法により、DNAをホール輸送層、DNA周囲に電子輸送層が形成された同軸型ナノケーブル、電子ドナー分子とアクセプター分子を並べた積層型ナノ構造体の構築を行い、高い効率で光エネルギー捕集と光電変換を実現するDNAナノデバイスの構築を目指す。今年度は、光レドックス活性を有するアントラキノンを光機能分子として選択し、ウリジンの5位にアセチレンを介してアントラキノンを修飾した三リン酸誘導体の合成を行った。合成した三リン酸誘導体のポリメラーゼによるプライマー伸長反応についてゲル電気泳動を用いて検討した結果、アデニンに対して修飾ウリジン三リン酸体が効率よく、選択的に取り込まれることを明らかにした。アデニン-チミン繰り返し配列においても効率よく反応が進行し、本手法を用いることで光機能分子であるアントラキノンを複数、連続的にDNAに導入することが可能であることを示した。生体高分子であるDNAは、高度な自己相補認識能を有しており、DNA配列をプログラムすることでナノ構造体を構築することができるため、ナノ材料としての応用が期待されている。さらに、電子あるいはホールを輸送する分子ワイヤーとして働くことが明らかとなっており、導電性材料としての応用も期待されている。本研究では、生体分子および分子材料としてのDNAの特徴を生かし、機能性分子の集積化を電極上で行うとともに、光電応答を示すDNAナノ構造体を構築することを目的として研究を行った。光によって電子移動を誘起する性質を持つアントラキノン(AQ)およびナフタルイミド(NI)を導入した修飾核酸塩基三リン酸体の合成を行い、テンプレート配列に対応した修飾核酸塩基の配列選択的な導入を試みるとともに、作製した機能性核酸の光電応答について検討した。ポリメラーゼの基質としてデオキシウリジン三リン酸体の5位にアセチレンリンカーを介して、AQおよびNIを導入した修飾三リン酸体を合成した。修飾三リン酸体を基質としたポリメラーゼ反応を行うことで配列情報に基づいた機能分子の導入が可能であることを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて明らかにした。さらに、電極上におけるポリメラーゼ反応を利用してDNAのへの機能分子の連続的な取り込みを行うことで、光電応答を示すDNA修飾電極の作製が可能であることを明らかにした。
採餌行動の脳内機構：多元的価値に基づく意思決定に関する研究

ふ化直後のヒヨコを用いて神経経済学的研究を行った。これまでに競争的な環境で採餌をさせると選択衝動性が著しく亢進することを見出してきた。本研究では大脳線条体と扁桃体相同領域に着目して、意思決定が報酬量・近さ・コスト・リスク・公共情報等多様な価値によってどのように決まるか、を実験的に調べ、次の結果を得た。(1)競争の下では手がかり刺激から報酬量を想起するシステムが抑制を受ける、(2)競争下ではより多くのエフォートを払うが、これは中脳の報酬系(ドーパミン系)ではなく情動系(扁桃体)によって担われている、(3)餌量のリスクと競争が共にある場合に衝動性が亢進する、(4)競争の結果餌の情報は共有される。衝動性は、ヒトを含む動物の行動特性を、経済的価値判断と意思決定に基づいて評価する指標のひとつである。期待される報酬の「近さ」と「大きさ」を独立に操作して、「近くて小さな報酬」と「大きいが遠い報酬」の二者から択一選択をおこなわせるタスクを異時点間選択という。このタスクによって計られる「近さ」を優先する行動形質を、衝動性の一要因として特に選択衝動性と呼ぶのである。我々は競争採餌を経験させることによってヒヨコの衝動性が高まる、という知見を得て、その神経機構を解析してきた。この機構を理解することが、価値の多元性を理解する鍵となるからである。また、大脳線条体(側坐核を含む、腹内側部)に注目するが、それはこの領域の局所破壊が衝動性を高めることを見出していたからである。実際、この領域から自由行動条件の下で単一ニューロン活動を記録すると、報酬の近さを符号化する細胞、量を符号化する細胞などがこの領域に見出された。これらのニューロン活動が競争採餌の文脈でどのような修飾を受けるか検討したところ、以下の知見を得た。(1)競争文脈は、報酬手がかりの提示期に一過的に生じる興奮性活動に対して、抑制的に作用した。(2)競争文脈は、オペラント後の遅延期(報酬の供給に先立つ時期)の活動、また報酬期(餌が与えられてそれを消費する時期)の活動には影響をしなかった。更に、競争採餌に伴う歩行運動量が増加(社会的促進)について解析した。他者が存在すとき、採餌に投資する運動量が増える現象である。従来、動機付けが高まる事によって生じる、と解釈されてきた。そこでセロトニン・ドーパミン等、線条体に作用する一連の神経修飾物質に着目した。その結果、(3)セロトニンの取り込み阻害剤の全身投与は、内側線条体の局所破壊と同様に、運動量を減少させたが、(4)中脳ドーパミンの枯渇(ただし片側性のみ)は効果がなかった。選択衝動性は、ヒトを含む多くの動物において、経済的意思決定の行動特性を評価する重要な指標の一つである。遅延を伴う報酬の価値を、遅延時間に対して如何に強く割り引くか、この時間割引きの高さを現す。具体的には「近くて小さな報酬」と「遠いが大きな報酬」の二者択一選択において、前者を選ぶ割合を以って測る。孵化直後のヒヨコ(ニワトリ雛)が競争採餌を経験することによって、選択衝動性を徐々に高めていくことを見出した。この衝動性発達の神経機構を理解することによって、「近さ」「大きさ」「コスト」「リスク」等、脳内の多様な価値表現について理解を深めることが期待される。我々は大脳線条体(側坐核と近傍の内側線条体)に注目して、研究を進めている。従来の研究によって、この領域の破壊が衝動性を高めること、この領域から記録された単一ニューロン活動が報酬の「近さ」と「大きさ」を符号化していること、などを見出したからである。本研究では、一連の行動実験と神経生理学的実験を行い、以下の知見を得た。(1)競争的文脈は、線条体ニューロンの手掛かり期活動(手掛かりとなる視覚刺激の提示に対して予期報酬に応じた活動を生じるもの)を選択的に抑制する。(2)競争的文脈は、採餌エフォートを亢進し社会的促進をもたらすが、これは中脳ドーパミンから線条体への投射を枯渇させても影響を受けない。(3)社会的促進は、弓外套皮質の両側性破壊によって著しく損なわれる。(4)競争採餌は衝動性発達に対して必要だが十分ではなく、動物が実際に受け取る餌のばらつき(試行毎の良の変動によるリスク)も必要な要件である。(5)競争的個体間の利益相反(獲得報酬の不一致)は、衝動性発達にとって必須ではない。遅延を伴う報酬の価値を、遅延時間に対していかに強く割り引くか、この時間割引きの高さを現す。

従来の研究によって、この領域の破壊が衝動性を高めること、この領域から記録された単一ニューロン活動が報酬の「近さ」と「大きさ」を符号化していること、などを見出したからである。本研究では、一連の行動実験と神経生理学的実験を行い、以下の知見を得た。(1)競争的文脈は、線条体ニューロンの手掛かり期活動(手掛かりとなる視覚刺激の提示に対して予期報酬に応じた活動を生じるもの)を選択的に抑制する。(2)競争的文脈は、採餌エフォートを亢進し社会的促進をもたらすが、これは中脳ドーパミンから線条体への投射を枯渇させても影響を受けない。(3)社会的促進は、弓外套皮質の両側性破壊によって著しく損なわれる。(4)競争採餌は衝動性発達に対して必要だが十分ではない。動物が実際に受け取る餌のばらつき(試行毎の良の変動によるリスク)もまた、必要である。(5)競争的個体間の利益相反(獲得報酬の不一致)は、衝動性発達にとって必須ではない。平成27年度は主に次の研究を進めた。(1)26年度までの予備的な研究の結果、競争採餌が衝動性発達を亢進するに当たって、報酬量の分散(リスク要因)が重要であることを見出していた。27年度はリスク要因の寄与について更に詳細に検討した。その結果、二項分布に基づく報酬量分散が選択肢(SS:近くて小さな餌、LL:遠くて大きな餌)のいずれかにあっても、衝動性亢進が生じることが判明した。衝動性亢進は特定の手掛かりと連合した報酬価値の低減ではなく、時間割引きの強化であることを示唆する。なお、これらの結果はAnimal Behaviour誌に投稿して受理され、現在最終的な修正の段階である。(2)予期された報酬量と実報酬量との差を予期誤差と呼ぶ。標準的な理論として広く受け入れられている強化学習理論では、状態価値関数は大脳外套(皮質)および基底核に分散表現されていると考えられている。さらに、中脳ドーパミン作動性ニューロンが予期誤差を符号化し、その活動が状態価値を更新すると考えられている。平成27年度は基底核(腹側線条体)及び中脳被蓋部(黒質緻密部とその周辺)より単一ニューロン活動を導出し、報酬消去に伴う活動の変化を調べた。その結果、TD学習(temporal difference learning)から予測される価値の部分表現が、これらのニューロンによって担われていることが判明した。さらに、一連の神経解剖学的検討を行い、TD誤差を計算するアルゴリズムについてモデルを構築した。この結果も、現在学術誌に投稿準備中である。選択衝動性は、ヒトを含む多くの動物において同じ手続きによって経済的意思決定の行動特性を評価することができる、重要な行動指標の一つである。報酬の価値を遅延時間によっていかに強く割り引くか、この時間割引きの強さをあらわす指標となる。具体的には「近くて小さな報酬」と「遠いが大きな報酬」の二つの選択肢を動物に与え、前者を選ぶ割合をもって評価する。前者を選ぶ割合が高い時、衝動性が高いという。我々これまで孵化直後のヒヨコ(ニワトリ雛)を対象とした研究を行い、競争採餌の経験が衝動性を亢進する事を報告してきた。他方、競争的他者の存在は餌に向かう労働投資量を著しく高める。衝動性発達と労働投資量亢進の神経機構を理解することによって、「近さ」「大きさ」「コスト」「リスク」「社会的競争」等、多様な価値とその脳内表現について理解を深めることが期待される。これまでは大脳線条体(側坐核と近傍の内側線条体)に着目してきた。
胆膵領域癌における微少リンパ節転移とリンパ流に関する研究

【はじめに】消化器癌のリンパ節転移の診断は通常最大割面のHematoxylin and Eosin (HE)染色で行われるため、最大割面にまで至らないような転移病巣はリンパ節転移陰性と診断される。従ってリンパ節転移陰性と診断されたなかには微小な転移がある程度の頻度で含まれていることを認識する必要がある。消化器癌ではリンパ節転移陽性例は陰性例に比較し予後不良であるが、リンパ節微小転移陽性例が微小転移陰性例と比較して予後不良かどうかは現時点のところ結論は出ていない。一方、胆管系悪性腫瘍でもリンパ節転移は重要な予後規定因子になっているがこの領域での微小転移に関する報告はこれまでに2、3の報告を見るのみである.そこで本研究では胆管系悪性腫瘍におけるリンパ節微小転移の検出頻度と予後との相関を検討し、その臨床的意義を明らかにすることを試みた.【方法】対象は肝門部胆管癌17例、漿膜下浸潤胆嚢癌15例、中下部胆管癌44例.うち最大割面のHE染色でおこなわれ、通常の病理組織検索でリンパ節転移陰性と診断された症例のそれぞれ19例、15例、10例に対し連続切片の作成をおこなった.各切片レベルにつき2枚の切片を作成し、1枚をHE染色、あとの1枚を免疫組織学的染色を施行した.各切片レベルの間隔は40mmとした.1つのリンパ節につき平均17.1レベルで観察を行った.免疫組織学的染色は1次抗体に抗サイトケラチン抗体を用いた.微小転移を来しやすい臨床病理的背景因子およびその予後を検討した.【結果】微小転移の検出率はそれぞれ17.5%、20.0%、0.0%であった.微小転移を微小転移を来しやすい臨床病理的背景に特徴はなかった.微小転移を来した症例は予後不良である傾向を示した.しかし微小転移を来さなかった症例との有意差は認めなかった.【結論】連続切片の作成と免疫染色によって検出された胆管系悪性腫瘍の微小転移の臨床的意義は明らかではなかったが、今後大規模な研究が必要であると考えられた.【はじめに】消化器癌のリンパ節転移の診断は通常最大割面のHematoxylin and Eosin (HE)染色で行われるため、最大割面にまで至らないような転移病巣はリンパ節転移陰性と診断される。一方、胆管系悪性腫瘍でもリンパ節転移は重要な予後規定因子になっているがこの領域での微小転移に関する報告はこれまでに2、3の報告を見るのみである.そこで本研究では胆管系悪性腫瘍におけるリンパ節微小転移の検出頻度と予後との相関を検討し、その臨床的意義を明らかにすることを試みた.【方法】対象は肝門部胆管癌17例、漿膜下浸潤胆嚢癌15例、中下部胆管癌44例.うち最大割面のHE染色でおこなわれ、通常の病理組織検索でリンパ節転移陰性と診断された症例のそれぞれ19例、15例、10例に対し連続切片の作成をおこなった.各切片レベルにつき2枚の切片を作成し、1枚をHE染色、あとの1枚を免疫組織学的染色を施行した.各切片レベルの間隔は40mmとした.1つのリンパ節につき平均17.1レベルで観察を行った.免疫組織学的染色は1次抗体に抗サイトケラチン抗体を用いた.微小転移を来しやすい臨床病理的背景因子およびその予後を検討した.【結果】微小転移の検出率はそれぞれ17.5%、20.0%、0.0%であった.微小転移を微小転移を来しやすい臨床病理的背景に特徴はなかった.微小転移を来した症例は予後不良である傾向を示した.しかし微小転移を来さなかった症例との有意差は認めなかった.【結論】連続切片の作成と免疫染色によって検出された胆管系悪性腫瘍の微小転移の臨床的意義は明らかではなかったが、今後大規模な研究が必要であると考えられた.【目的】肝門部胆管癌における微小転移の有無を免疫組織学的手法を用いて観察し予後との関連を検討した.【方法】組織学的に治癒切除(だだしem1を含む)が行なわれた肝門部胆管癌n0症例18例で、術後2年以上経過したものを対象とした.リンパ節のパラフィン包埋標本から40μm間隔の亜連続切片を作成しHE染色、抗サイトケラチン抗体(CAM5.2, Becton Dickinson社.US)を用いた免疫染色をおこなった.【結果】免疫染色では7/109個,4/18例に転移を認めた.転移部位は12h,12b1,12p1,8a,8pであった.転移巣の大きさは301000μmで,30μm,70μm,130μmの大きさの転移巣は、HE染色による近接切片の観察では同じ転移巣を確認できなかった.HE染色で確認できた他の2例では最大割面から各々440880μm離れた割面に認めた.

微小転移の4例はいずれも再発をきたしており、50%生存期間は13カ月、5生率25.0%であった.再発形式は局所断端再発が1例、腹膜播種2例、大動脈周囲リンパ節転移1例であった.また4例の分化度は中分化1例、低分化2例、未分化1例.深達度はss3例、se1例、神経周囲浸潤はpn0が1例、pn2が1例、pn3が2例であった.em1を含む肝門部胆管癌治癒切除例29例の従来法でのリンパ節転移の有無で生存率を比較(Kaplan-Meier法、Logrank test)すると、転移陽性例11例の5生率は18.2%で陰性例18例の5生率50.0%との有意差はなかった(p=0.07).これに対し微小転移症例を含めて比較すると、5生率はそれぞれ22.2%と56.1%となり、有意差を認めた(p=0.012).【結論】連続切片の作成と免疫染色による検索によりリンパ節転移の診断率が向上した.微小転移の有無は予後を反映した.胆膵領域癌においてもリンパ節転移は予後を予測する重要な因子である.しかしこれまでの検出方法では見逃されてきた微小なリンパ節内の癌病巣が同定されるに至り、その臨床上の意義が問われるようになった.【方法】肝門部胆管癌治癒切除43症例および胆嚢癌治癒切除30症例で従来の代表1切片のHematoxilin Eosin(HE)染色による検索でリンパ節転移陰性と診断された肝門部胆管癌23症例、胆嚢癌19症例のリンパ節を対象に微小癌病巣を検索した.フォルマリン固定パラフィン包埋された摘出リンパ節の亜連続切片を937レベル(平均23レベル)作成した.各レベルの間隔は40μmとした.各レベルにおいて2枚の切片の作成し1枚をHE染色,1枚を抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色を行い検索した.1次抗体はCAM5.2(Becton Dickinson,US)を用い、LSAB法にて染色した.抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色では正常は上皮細胞、形質細胞も染色されるため同レベルにおけるHE染色で癌細胞の存在を確認できるものを転移陽性と判定した.【結果】肝門部胆管癌、胆嚢癌において微小転移の有無を検索した結果それぞれ17.8%、14.2%の症例に微小転移を検出した.転移巣の大きさは25μmから110μmであり、細胞集塊を形成していた.単細胞の形で検出されたものはなかった.微小転移巣を認めたレベルは最大割面の比較的近傍に観察され最大でも440μmの距離であった.その予後であるが前者ではリンパ節転移陽性症例と同様に予後不良であった.後者での生存率は症例数が少なく関連性は検討できなかった.今後症例を集積し、予後との関連を検討する必要がある.また亜連続切片による微小リンパ節の検出では最大割面から500μmの範囲の検索で十分な検出率を得られると思われた.
腸内細菌叢プロファイリングによる肝性脳症の分子機序解明と革新的治療の開発

本年度は、末期肝不全患者の腸内細菌叢の肝移植後のプロファイリングを行う目的で腸内細菌叢とその代謝産物である胆汁酸および短鎖脂肪酸の組成を明らかにし、生体肝移植における腸内細菌叢の組成や術後経過との関連性について検討した。【対象・方法】対象は2017年6月から2018年6月までに当科にて生体肝移植を施行したレシピエント18名と健常人コントロールとしてドナー17名。術前の便と血清を採取した。1)腸内細菌叢の同定:便中の16s rRNAの解析により細菌叢を同定した。2)短鎖脂肪酸・胆汁酸解析:糞便・血清の質量分析により血清中の短鎖脂肪酸及び胆汁酸、便中の短鎖脂肪酸の質量分析を行った。3)臨床因子との関連を検討した。【結果】1)腸内細菌叢の同定:レシピエントではドナーに比してFirmicutes門が有意に少なく(p=0.023)、Proteobacteria門が有意に多かった(p=0.032)。2)短鎖脂肪酸・胆汁酸解析:レシピエントでは、一次胆汁酸値が有意に高く(p=0.0427)、血清短鎖脂肪酸ではレシピエントで血清中のプロピオン酸(p=0.049)がドナー群と比較して有意に高かった。3)臨床因子との関連性:レシピエントの開腹時門脈圧は、Bacteroidetes門及び便中プロピオン酸値と有意に正の相関を示した(R2=0.260、p=0.0307、R2=0.588、p=0.0014)。本解析でレシピエントの腸内細菌叢の組成は、既報での肝硬変患者の腸内細菌叢と同様の傾向を示した。また腸内細菌叢、短鎖脂肪酸および臨床因子間の解析では、Bacteroidetes門とその代謝産物であるプロピオン酸値と門脈圧が互いに正の相関を示した。腸内細菌が代謝産物を介して門脈圧上昇に寄与する可能性を示唆し、肝硬変治療標的開発にむけた新たな知見といえる。臨床肝移植患者での研究であり、初年度より18名の肝移植患者、17名の健常者(ドナー)の便、血清の解析ができた。さらに症例を増やし、腸内細菌叢と短鎖脂肪酸、門脈圧亢進症、肝性脳症との関係につき検討する。(理由)当該年度は、物品費が未執行となり、また旅費による支出が、当初の計画より少なかった。その結果、486,108円が次年度使用額として発生した。(使用計画)次年度は、当初の計画通り、肝不全モデルマウスに対するウアレーゼ低産生性腸内細菌カクテルの開発を行い、肝不全・肝性脳症に対する効果を検証する。
遺伝性血管性浮腫における線溶凝固系の異常の病態解明と早期診断・治療を目指す研究

現在のところ、当院に通院するすでに確定診断が得られている遺伝性血管性浮腫患者の非発作時の血液検体と、発作時の血液検体を合わせて40検体ほど採取完了している。いずれも当院受診時に血液採取し、線溶系・凝固系を中心とした各種項目の測定を行い、結果が得られている(D-dimer、プロトロンビンフラグメントF1+2、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、トロンボテスト、へパプラスチンテスト、活性化全血凝固時間、フィブリノゲン、第VIII因子、第IX因子、第XIII因子、アンチトロンビンIII、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体、フィブリノペプチドA、可溶性フィブリンモノマー複合体、可溶性フィブリン、プロテインC、プロテインS、ユーグロブリン溶解時間、フィブリノゲン/フィブリン分解産物、プラスミノゲン、α2-プラスミンインヒビター、プラスミン・α2-プラスミンインヒビター複合体、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1、t-PA-PAI-1複合体、トロンボモジュリン、血清補体価、C3、C4、C1-インアクチベーター活性、軽カルシウムイオン、末梢血液一般)。また、発作時の発作部位や、重症度、発作頻度、発作のトリガーなどの臨床症状を詳細に病歴を聴取し、記録し保存している。当初予定していたよりも血液検体採取数が少ないため、今後はこれら血液検査データと臨床症状のデータを比較検討しながら、さらなる検体数の増加を目指している状況である。当初予定していたより得られる血液検体採取数が少ない理由としては、発作の発症は予見できず突発的偶発的に起こり得るためと考えられる。遺伝性血管性浮腫発作時の検体採取については、発作を予知することができない点から、採取できる検体を予め詳細に予想することは難しく、現時点で当初想定していた採取検体数よりも少ない状況となっており、今後もデータの解析を行いながら、さらなる検体採取数の増加に努める。今後、目標とする検体採取数に到達したら、それまでに逐次得られている血液検体の測定結果を、臨床情報を交えながらすべて比較検討し、統計学的に集計する。これにより得られる結果を、遺伝性血管性浮腫において認められる線溶凝固系異常の病態を解明する一助となり得るか評価し、適切な学会で成果を発表し、論文化することを目標とする。現在のところ、当院に通院するすでに確定診断が得られている遺伝性血管性浮腫患者の非発作時の血液検体と、発作時の血液検体を合わせて20検体ほど採取完了している。これら、血液検査データと臨床症状のデータを比較検討しながら、さらなる検体数の増加を目指している状況である。遺伝性血管性浮腫発作時の検体採取については、発作を予知することができない点から、採取できる検体を予め詳細に予想することは難しいが、当初想定していた予想通り、概ね順調に進展していると考える。

遺伝性血管性浮腫発作時の検体採取については、発作を予知することができない点から、採取できる検体を予め詳細に予想することは難しく、現時点で当初想定していた採取検体数よりも少ない状況となっており、今後もデータの解析を行いながら、さらなる検体採取数の増加に努める。今後、目標とする検体採取数に到達したら、それまでに逐次得られている血液検体の測定結果を、臨床情報を交えながらすべて比較検討し、統計学的に集計する。これにより得られる結果を、遺伝性血管性浮腫において認められる線溶凝固系異常の病態を解明する一助となり得るか評価し、適切な学会で成果を発表し、論文化することを目標とする。当初予定していた検査費用よりも少ない経費使用となっているが、今後引き続き検体測定を行う予定であり、十分な検体数を検査するために必要な額であり、次年度使用額として妥当である。
イヌ組織球増殖性疾患に対する抗マラリア薬アルテミシニン誘導体の評価

悪性組織球症は、人においてみられるまれな組織球増殖性疾患であり有効な治療法が確立されていない。一方、犬においては同様の病態である組織球性肉腫が比較的好発し、優れた自然発生モデルと考えられる。犬組織球性肉腫および人悪性組織球症では、高フェリチン血症の発生が知られており、腫瘍細胞による鉄の取り込み促進が腫瘍の増殖に関与しているとされる。マラリア治療薬として知られるアルテミシニンは、鉄と反応してフリーラジカルを発生する薬剤である。本研究では、各種犬腫瘍細胞株においてアルテミシニンが抗腫瘍効果を示すことを確認し、各腫瘍細胞株のアルテミシニン感受性と鉄代謝タンパクの発現量との関係を明らかにした。本年度は培養腫瘍細胞株パネルにおけるアルテミシニン類の生体内活性型であるジヒドロアルテミシニン(DHA)の抗腫瘍作用スペクトラムを調査し、細胞毒性効果に関与する細胞側の要因の分析を目的とした。2つの犬組織球性肉腫細胞株を含む8種の犬またはマウス由来腫瘍細胞株および犬/マウスの正常線維芽細胞を用いin vitro試験を実施したところ、犬組織球性肉腫細胞株2種では、他の腫瘍細胞株より高い感受性が認められた。また、正常線維芽細胞では100uMまでの範囲で細胞毒性は認められなかった。正常犬にて血中濃度を測定したところ、IC50には達しなかった。しかしながら、犬組織球性肉腫移植マウスにおいては効果は認められており、in vivoでは効果発現が異なることが示された。上記パネルのうち、最もDHA感受性の低かったマウス扁平上皮癌細胞(IC50>100uM)を用いた移植マウスにおいても、in vivoではDHAによる腫瘍増殖の有意な遅延が認められた。10種の腫瘍細胞株/正常細胞にて、鉄のキレートによりDHAの効果は完全に消失することが確認された。鉄を単体またはホロトランスフェリンの形で添加した場合において各細胞のDHA感受性の変化をみたところ、単体の鉄添加によりIC50の低下を認めた細胞株と、ホロトランスフェリンの添加時にIC50の低下を認めた細胞株が認められた。また、正常線維芽細胞においては、鉄添加によるDHA細胞毒性効果の増強は認められなかった。具体的な鉄代謝関連因子としてトランスフェリン受容体およびフェリチンについて、リアルタイムPCR法を用いて、細胞内mRNAの相対定量を行った。本実験では、単体の鉄添加によりIC50の低下を認めた細胞株ではフェリチンの遺伝子発現量の増加傾向が、ホロトランスフェリンの添加時にIC50の低下を認めた細胞株ではトランスフェリン受容体の遺伝子発現量の増加傾向がそれぞれ認められた。本年度の研究では、犬組織球性肉腫が鉄を多く含有していると推測し、鉄反応性物質であるアルテミシニン類が抗腫瘍効果を持つという仮説に基づいて各実験を実施した。まず、犬組織球性肉腫症例より採材した腫瘍組織を用いて、腫瘍組織内鉄含有量をICP-MS法およびベルリンブルー組織染色法にて定量した。結果、ICP-MS法による定量では血液混入の影響が大きく、他の腫瘍との単純比較は不可能であったものの、ベルリンブルー染色法においてすべての組織球性肉腫で染色陽性であり、犬組織球性肉腫は細胞内に高濃度の鉄を含有することが示唆された。次に、樹立した犬組織球性肉腫細胞株を持ちいて、In vitroにて細胞障害性試験を行ったところ、用いたすべての細胞株においてジヒドロアルテミシニンは細胞障害性を示すことが確認された(IC50=7.6-10uM)。細胞内鉄含有量が細胞障害性に関連しているという仮説の照明のため、犬組織球性肉腫細胞にクエン酸鉄アンモニウム(FeAC)およびヒトホロトランスフェリン(hTf)を作用させ、細胞内鉄量の測定およびジヒドロアルテミシニンに対する感受性の変化を観察したところ、FeAC・hTfどちらの場合でも細胞内鉄含有量は増加し、それに伴ってジヒドロアルテミシニンの細胞障害性も増強されることが示された。逆に、細胞内鉄を減少させる条件を設定したところ、ジヒドロアルテミシニンの細胞障害性はほぼ完全に抑制された。また、上記の細胞障害性は、アポトーシスの誘導によるものであることを、アネキシンV染色法により確認し、鉄添加条件および鉄キレート条件において、ジヒドロアルテミシニンのアポトーシス誘導効果がそれぞれ増強および抑制されることを確認した。現在、犬組織球性肉腫細胞をヌードマウス皮下に移植した担癌マウスモデルを作成し、ジヒドロアルテミシニンのIn vivoでの抗腫瘍効果を確認中である。本年度の研究では、昨年度に引き続き、腫瘍細胞株パネルにおいてジヒドロアルテミシニン(DHA)感受性と鉄代謝タンパク質発現量の関係性について分析した。

また、研究者らが過去に実施した正常犬におけるDHAの薬物動態実験の追試を行った。各細胞株におけるDHAのIC50は8.1654.5uMと感受性に幅があることが確認された。また、犬およびマウス正常線維芽細胞においてDHAが細胞障害性を示さないことが確認された。また、全腫瘍細胞株においてDHAの細胞障害性は鉄のキレートにより抑制され、鉄の添加により増強された。次いで、犬組織球性肉腫細胞株およびマウス扁平上皮癌細胞株の担癌マウスモデルを作成し、in vivoでの抗腫瘍効果の検証を行った。前年度に作成が難航していた血球貪食性組織球性肉腫細胞株の担癌マウスの作成は、本年度も成功せず、in vivoでの試験は日血球貪食性の細胞株でのみ実施された。In vitroにおいて中等度のDHA感受性を示したCHS-4犬組織球性肉腫細胞株では、有意な抗腫瘍効果は認められなかった。一方、in vitroにおいてDHA感受性が認められず(IC50>100uM)、鉄添加により顕著にDHA感受性が増強した(IC50: 1.42uM)細胞株において、担癌マウスモデルでは有意な腫瘍増殖抑制効果が観察された。同細胞においては、トランスフェリン受容体の発現量が、正常線維芽細胞と比較して約10倍に増加していることが確認され、in vivoにおける有意な抗腫瘍効果が、トランスフェリンを介した鉄の細胞内取り込みにより増強されたものと考えられた。In vivoにおいて抗腫瘍効果が認められなかったCHS-4細胞株においては、トランスフェリン受容体発現量は正常線維芽細胞よりも有意に低かった。一昨年度の実験結果から推測された、血球貪食を介した直接的なヘム分子の取り込みによる細胞内鉄含有量の増加がDHA細胞毒性を増強させる可能性については、担癌マウスでの検討ができず、今後の課題と考えられた。腫瘍以上の様に、本研究は、当初の予定に従って概ね良好に進行している。ただし、昨年度計画した、犬組織球性肉腫移植マウスモデルの作成においては、血球貪食性組織球性肉腫細胞株のマウスへの生着が不良であり、現在も作成を試みている。本研究は、当初の予定にしたがって、おおむね順調に進行している。本年度に得られた結果を踏まえて、今後は:1.犬およびマウス腫瘍細胞株と犬/マウス正常繊維芽細胞におけるフェリチン、トランスフェリン受容体の遺伝子発現量とDHA感受性の関連性の検討(継続)2.犬およびマウス腫瘍細胞株と犬/マウス正常繊維芽細胞におけるフェリチン、トランスフェリン受容体の遺伝子発現量と鉄添加方式の違いによるDHA感受性増強効果の関連性の検討(継続)3.血球貪食性犬組織球性肉腫細胞移植マウスモデルの作成(継続)による、生体内でも血球貪食現象の確認およびそれによるDHA感受性の効果の検証4.犬組織球性肉腫に対する新規治療法の模索:アルテミシニン類化合物による従来の化学療法薬の増強効果の検討、新規化学療法薬の模索、細胞介在性免疫療法のin vitroにおける検討を予定している。1および2では、犬組織球性肉腫がアルテミシニン誘導体に感受性を示す機序として、トランスフェリン受容体高発現、フェリチン高発現および直接的赤血球貪食の3つが考えらえれているが、そのうちトランスフェリン受容体発現量およびフェリチン発現量が細胞のDHA感受性に与える影響について検証する。
河川の蛇行形状変化に伴う河床堆積物層厚時系列変化モニタリング手法の開発

本研究に関連して機材を設置した犬上川では,2001年8月に大きな出水があり,このため河川高水敷に設置した機材のデーターロガーまでもが冠水する被害を受けた.しかし,本研究の目的とするような地形変化は,このような大きな出水にこそ生じるものなので,すくなくともセンサー部が不可抗力的に破壊されるまでのデータを良好に記録できなくてはならない.そこで2002年度は2001年のような出水でもデータを良好に記録できるようなロガーの設置方法を検討した.データロガーを収納するボックスを高水敷のなるべく堤防よりでかつ地表面より1.5m程度のところに再設置した.この場合,センサーからロガーまでのケーブル長がこれまでより長くなり,このままでは出水時に断線の危険が高くなる.そこで,同様の機械を北海道パンケナイ川に設置したときの経験から,ケーブルをプラスチック製保護管内に入れ,出水時には水面上に浮けるようにした.また,ロガーの設置は高水敷の河辺林内にし,すこしでも水の衝撃が弱まるようにするとともに,一般人の目に付きにくいようにした.残念ながら2002年度には出水がほとんどなく,河床地形が変化することはなかった.しかし上記のような再設置をおこなったことで,今後も観測を継続することができるので,今後に期待している.また,本研究で使用しているシステムを用いた観測結果の一部を,2002年9月にオーストラリアで開かれた国際会議で発表することができたとともに,この会議のプロシーディングに英文論文を掲載することができた.Kurashige(1999)は改良型プレッシャーピローを用いて河床堆積物層厚を自記測定する手法を開発し,実際に出水中の河床堆積物層厚変化を北海道北部・パンケナイ川で成功させた.このモニタリング方法は,既に滋賀県より特許申請中である(平成11年特許願第240260号).この手法を蛇行河川に応用すれば,出水中における蛇行形状変化の実態を知ることができると期待できる.しかし,蛇行域のどのような場所で計測するのが効果的かを試行錯誤的に決定していかなくてはならない.そこで2000年度には,滋賀県立大学近くを流れる犬上川下流部の蛇行部を一つ選定した.ここは,この数年に一度程度の出水で蛇行形状が大きく変化したことが明らかな地点であり,本研究に好適な場所であると判断した.そして,この蛇行部に形成された砂礫堆の下流側先端部分にプレッシャーピロー一式をセットした.また別途予算により購入できたプレッシャーピロー一式も,この砂礫堆側方に形成されている副流路内に設置することができた.即ち,一蛇行区間の2地点で計測を開始することができた.計測は2000年9月より開始した.ところが2000年には好適な出水に恵まれず,砂礫堆の移動が生じるような出水はなかった.このため,測定データを地形変化との関連で論じることはまだできない.しかし測定そのものは継続中であり,2001年の梅雨期および台風期の出水に期待をしている.滋賀県犬上川の単列砂礫堆で、平成12年度に砂礫堆下流端にプレッシャーピローセンサーをとりつけ、自記計測を開始した。その結果平成13年春から8月にかけ、ここでは徐々に堆積が進行し、約10cmの層圧増加が生じたことを計測できた。また、8月21日の出水ではこの砂礫堆は下流側へ大きく前進したが、このときの計測点での地形変化は急激であり、出水中のある10分間で約80cmの河床上昇を生じさせたことも判明した。ただ、現在のシステムでは洪水中にデータロガー部が浸水等により故障しやすく、このため今年度後半はこの復旧・修理と、より故障しにくい方法の開発に時間をとられることになった。これらの知見をもとに、平成14年度もモニタリング法を改良していく予定である。本研究に関連して機材を設置した犬上川では,2001年8月に大きな出水があり,このため河川高水敷に設置した機材のデーターロガーまでもが冠水する被害を受けた.しかし,本研究の目的とするような地形変化は,このような大きな出水にこそ生じるものなので,すくなくともセンサー部が不可抗力的に破壊されるまでのデータを良好に記録できなくてはならない.そこで2002年度は2001年のような出水でもデータを良好に記録できるようなロガーの設置方法を検討した.データロガーを収納するボックスを高水敷のなるべく堤防よりでかつ地表面より1.5m程度のところに再設置した.この場合,センサーからロガーまでのケーブル長がこれまでより長くなり,このままでは出水時に断線の危険が高くなる.そこで,同様の機械を北海道パンケナイ川に設置したときの経験から,ケーブルをプラスチック製保護管内に入れ,出水時には水面上に浮けるようにした.また,ロガーの設置は高水敷の河辺林内にし,すこしでも水の衝撃が弱まるようにするとともに,一般人の目に付きにくいようにした.残念ながら2002年度には出水がほとんどなく,河床地形が変化することはなかった.しかし上記のような再設置をおこなったことで,今後も観測を継続することができるので,今後に期待している.また,本研究で使用しているシステムを用いた観測結果の一部を,2002年9月にオーストラリアで開かれた国際会議で発表することができたとともに,この会議のプロシーディングに英文論文を掲載することができた.
卵由来物質による精子活性化・走化性現象の分子機構の解明

受精の際、精子が卵に遭遇する確率を高める仕組みのひとつとして精子活性化・走化性現象が知られている。しかし、その精子活性化・誘引物質が微量なため精製が困難であることなどから、この現象の分子機構の研究はほとんど解明されていない。本研究では卵による精子の活性化及び誘引現象の分子メカニズムの全容解明のため、まずユウレイボヤ精子活性化・誘引物質(SAAF)の分子構造の解析を行い、さらに精子走化性における分子機構についての研究を行った。まずSAAFの精製標品についてESI-TOF/MSを用いて分子量解析を行ったところ、m/z=297.132の二価陰イオンの単一ピークを得た。次に3H-NMR解析を行ったところ、この物質の構造はコレスタン骨格を持つ分子量594.256の新規の硫酸化ステロイドであることが推定された。さらにFAB/MSによる分子フラグメント解析を行ったところ、NMRによる推定構造式より予想される分子ピークパターンと良く一致する結果が得られ、また加水分解反応による脱硫酸化により精子活性化・誘引活性は消失することが明らかとなった。以上の結果より、SAAFの構造が実際にNMRによる推定構造を持つことが強く示唆された。また、SAAFによる精子走化性時の分子機構の解析を行った。精子走化性においては細胞外カルシウムが必要であることが解っている。そこでどのようなカルシウムチャネルが関与しているのかを検定した。その結果、電位依存性カルシウムチャネルの特異的阻害剤であるニフェジピン等が全く効果を持たないのに対して容量作動性カルシウムチャネルの阻害剤であるSK&F96365等が効果的に精子の走化性運動を抑制すること、実際に精子中において容量作動型カルシウム流入が見られることから、精子走化性においては容量作動性カルシウムチャネルが働いていると思われる。
蛍光生体イメージング技術を駆使した細胞競合現象の解明

近年、上皮由来がんの発生初期において、変異細胞がその周囲を正常上皮細胞に囲まれた状態で存在し、両者が生存を争う細胞競合現象が生じていることが明らかとなってきた。これまでに細胞競合に関与する細胞間シグナルや蛋白質が数多く同定されてきたが、生体内における細胞競合を制御する分子メカニズムを詳細に解明するためには、in vitroでの哺乳類培養細胞系の解析に加えて、個体を生かしたままin vivoで生きた組織内の生きた細胞を観察し、時空間的な挙動を明らかにすることが大変重要である。本研究では、二光子励起顕微鏡を駆使して、動物個体を生かしたまま生理的な環境を維持しながら、生体腸管組織内の生きた細胞動態を可視化する生体イメージング手法を確立した。さらに、確立した生体二光子励起イメージング技術を用いて、細胞競合モデルマウス(Villin-CreERT2; CAG-LSL-RasV12-IRES-EGFP)の生体腸管組織内を観察し、細胞競合によりRas変異がん細胞が正常上皮細胞層より排除される様子をリアルタイムで可視化することに成功した。一方、Ras変異が誘導されないコントロールマウス(Villin-CreERT2; CAG-LSL-IRES-EGFP)では、EGFP陽性細胞は腸上皮層より排除されなかった。これらの結果から、ショウジョウバエやin vitroの哺乳類上皮培養細胞系で明らかになった細胞競合現象が、哺乳類生体内のin vivoの系でも実際に起こっている現象であることが明らかとなった。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、蛍光生体イメージング技術を活用して、哺乳類の生体内で生じる細胞競合現象を観察する新規の生体イメージング系を確立し、細胞競合により変異細胞が正常上皮層より排除される様子を可視化する。さらに、細胞競合を行う正常上皮細胞と変異細胞を顕微鏡下で選別して抽出し、細胞競合の際に起こる多彩な遺伝子発現変化を個々の細胞レベルで定量的に解析する新たな方法論を構築することで、従来の研究手法では明らかにできなかった細胞競合に重要な分子やシグナルを同定し、細胞競合制御機構を統合的に解明する。平成27年度はまず、マウスを生かしたまま長時間生理的な環境を維持しながら生体腸管組織を観察する新規の生体イメージング系を確立した。さらに、確立した生体イメージング技術を用いて、細胞競合モデルマウス(Villin-CreERT2;LSL-RasV12-IRES-EGFP)の生体腸管組織を観察し、哺乳類における細胞競合現象を経時的に可視化することに成功した。平成28年度は、これらの成果をもとに、細胞競合により変異細胞がどのようにして正常上皮層より排除されるのか時空間的に解析を行うとともに、細胞競合の制御に関わる分子やシグナルを探索し、細胞競合の生理的意義を明らかにする。これまでin vitroの哺乳類上皮培養細胞系で明らかになった細胞競合現象が、マウス生体内のin vivoの系でも観察できることが明らかとなり、平成27年度終了時としては順調に経過している。生体組織内では、個々の細胞の遺伝子発現レベルは周りの環境に応じて経時的に変化する。がんの発症過程において、細胞間相互作用を介して個々の細胞の運命が決定される細胞競合の複雑な制御メカニズムを解明するためには、組織全体の細胞を回収して遺伝子発現レベルを解析する従来の研究手法ではなく、生理学的・病理学的ながん微小環境を維持した上で、1細胞レベルで遺伝子発現を解析する新たな方法論の構築が必要である。今後、蛍光生体イメージング技術の特徴を生かし、細胞競合の制御に関わる分子やシグナルの探索を行う。さらに、得られた分子やシグナルを阻害し細胞競合を破綻させた際に、がん細胞がどのように進展するか解析を行い、細胞競合の生理的・病理的意義を明らかにする。
表面プラズモン励起が金属ナノ構造形成に与える影響の解明

球形の銀コロイド粒子に対する光照射によるナノプリズム等の結晶状ナノ粒子の生成する現象がいくつかの系で報告されており、金属ナノ粒子の形状制御の新たな方法としての利用が期待されている。本課題では、基板上にパターンニングされた金属ナノ格子を金属コロイドのモデルとして用いることによって、ナノ結晶生成現象の機構、特に局所表面プラズモン励起(LSPR)の役割を明らかにすることを目的としている。昨年度まではハロゲン化物溶液中の銀ナノ粒子の光誘起形状変化のメカニズムの解析を主に行い、ハロゲン化物溶液中の金属の酸化反応であるハロゲンエッチングをLSPRが促進する効果を有することを明らかにした。本年度は、本課題のもう一つの柱である、結晶成長過程に対するLSPRの効果についての解析を主に行うこととした。結晶成長について調べる系としては、Mirkin等によって報告されているクエン酸溶液中の銀ナノ粒子を用いることにした。ただし本課題では、コロイド作製に化学合成法ではなく、液中レーザーアブレーション法を用いることとした。実験の結果、24時間程度でナノ結晶生成を観察する為には、溶液中の酸素濃度、粒子径が重要な因子であり、またクエン酸が銀ナノ粒子に吸着していることも反応を促進する効果を有することが明らかになった。さらに、形状変化過程はいくつかの段階に分かれていることが明らかになり、ナノプリズムから多角形ナノ結晶へさらに形状変化が起きることがわかった。一方、銀コロイドクエン酸溶液中に設置した金ナノ格子に光を照射することによって、銀析出反応に対するLSPRの効果の明確化することを試みたが、析出現象は観察されなかった。これは、金ナノ格子上に吸着しているクエン酸の量が不十分であったことが原因であると考えられる。金属ナノ構造の様々な性質がその形状に強く依存することから、形状を精密に制御することは、金属ナノ構造の作製において非常に重要である。光照射によって球形の銀ナノ粒子が、ナノプリズムへと形状変化を起こす現象が見出されており、光を利用したナノ構造体形状制御の新たな方法を拓く現象として注目されている。我々は、ハロゲン化物(NaCl等)水溶液中に分散された銀コロイドにおいて、蛍光灯やキセノンランプの光を照射による、球形からプリズムやロッド等様々な形状の銀ナノ結晶への形状変化を見出している。これまでに、このような反応には銀イオンを生成するハロゲンエッチングが含まれていることを明らかにしているが、光照射の役割は不明である。本課題では、このようなハロゲン溶液中の金属ナノ粒子の形状変化に対する光の役割を明らかにするために、形状や位置が定義された金属ナノブロックを用いて解析を行っている。昨年度の研究で、NaI水溶液中に設置した金ナノ格子が光照射下ではハロゲンエッチングによって形状が変化(縮小)することを見出した。本年度は、この現象に対するプラズモン励起の効果を明確にするために、配向およびギャップ間隔の異なるダイマー構造のナノブロックに光を同時に照射してその形状変化を調べた。実験の結果、長軸が偏光方向に沿った配向のダイマー構造のブロックがより大きくハロゲンエッチングを受けていることが分かった。さらに、このような配向方向による違いは、ギャップ間隔がより小さいダイマー構造でさらに顕著になった。照射光の偏光方向がダイマー構造の長軸に沿った条件では、ダイマー構造のギャップ間に二つのブロックの電場の重ね合わせによる強い電場(ダイマーモード)が生じる。さらに、ダイマーモードの電場強度はギャップ間隔の減少と共に増加する。これらのことから、プラズモン励起がハロゲンエッチングを促進していることが強く示唆される。
聞き手による吃音と正常発話との聴覚認識バウンダリーに関する研究

本研究の目的は,正常な発話の一部に,人工的に吃音の中核症状を挿入し,その重症度を変化させることにより,吃音の中核症状と正常発話との聴知覚バウンダリーを明らかにすることであった。その結果,(1)連発性吃音(繰り返し)については,概して繰り返し数が2ユニット以上になることで,(2)伸発性吃音(引き伸ばし)については,概して引き伸ばしの長さが300msec.以上になることで,(3)難発性吃音(阻止)については,無声ブロック,有声ブロックともにその長さが200msec.以上になることで,聞き手の発話サンプルに対する反応が正常から吃音へと変化した。(1)20年度の計画は,吃音の中核症状の1つである連発性吃音の重症度や、それが発生する頻度が変化した場合、聞き手の発話に対する反応がどのように変化するかを明らかにすることであった。(2))21年度の計画は,吃音の中核症状の1つである伸発性吃音の重症度や、それが発生する頻度が変化した場合、聞き手の発話に対する反応がどのように変化するかを明らかにすることであった。(3))22年度の計画は,吃音の中核症状の1つである難発性吃音の重症度や、それが発生する頻度および発症位置が変化した場合、聞き手の発話に対する反応がどのように変化するかを明らかにすることであった。本年度は, Matlab等のソフトウェアを使用し,吃音症状の発話サンプルを人工的に作成した。音響学的にNaturalな吃音症状の発話サンプルを作成するには莫大な時間がかかり,今年度予定していた実験の開始を遅らせることとなったが,これまで作成したサンプルをもとに,次年度以降は比較的スムーズに実験を遂行できるものと考えられる。なお本年度は,吃音の重症度や発生頻度が変化した場合の聞き手の反応の変化を明らかにするための手続きとして,以下の作業を実施した。1.実験の実施に先立ち,実験刺激としてシュミレートされた吃音の核症状を含む発話サンプルを作成した。非吃音の成人(男性1名,女性1名)の発話を録音し,コンピューター処理により連発性吃音(繰り返し)を人工的に作成した。繰り返しのユニット数を増減させることにより,吃症状の重症度を変化させた発話サンプルを作成し,それらの発生頻度を変化させることにより,吃頻度を変化させた発話サンプルを作成した。また,実験参加者が発話サンプルの評価を行うためのコンピュータソフトウェアを作成した。2.パイロット実験の実施広島大学の学生計4名(男性2名,女性2名)が実験に参加した。そのうち2名(男性1名,女性1名)には,連発性吃音の重症度を変化させた発話サンプルを聞かせ,残り2名(男性1名・女性1名)には,連発性吃音の重症度を一定にし,吃頻度を変化させた発話サンプルを聞かせた。実験は,防音設備の整った広島大学大学院教育学研究科内の音響実験室・聴覚検査室内で実施した。参加者は,発話サンプルの評価を行うための上記コンピュータソフトウェアにより,発話サンプルそれぞれを1=流暢, 100=吃音の尺度で評価を行った。Matlab等のソフトウェアを使用し,人工的に作成した連発性吃音を含む非流暢発話のサンプルを,非吃音成人(男性25名,女性25名)に聞かせた。実験の条件は2つで,(1)異なるユニット数(03ユニット)の連発性吃音と(2)吃音が発症している間(発吃時)の発話速度(倍速,通常,通常の1/2の速度)であった。各実験参加者には,(1)については全ユニット数を聞かせ,(2)についてはそのうちの1つを聞かせた。各サンプルを聞き終えた後,実験参加者には,コンピュータプログラム化されたマグニチュードスケール(1=流暢,100=非流暢)によって各発話サンプルの流暢度を判定させた。この実験を(1)音の繰り返しをするタイプの連発性吃音を含む場合,(2)単語の一部の繰り返しをするタイプの連発性吃音を含む場合,(3)単語を繰り返すタイプの連発性吃音を含む場合に分けて実施した。本研究の結果,音の繰り返しをするタイプと単語の一部の繰り返しをするタイプの連発性吃音を聞いた場合,聞き手は2ユニット数以上の連発性吃音を含み,かつ発吃時の発話速度が通常の発話サンプルを聞いた時,01ユニット数の連発性吃音を含む発話サンプルを聞いた時よりも有意に,その発話サンプルをより非流暢と判定することがわかった。