hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織誘導再生法を応用した難治性脊椎感染症に対する新しい治療法の開発

超音波溶解析出法により市販多孔性バイオセラミックスを部分溶解後、材料表面にリン酸カルシウム微結晶を析出させ、骨形成蛋白質(rhBMP-2)の吸着徐放性を制御し、生体吸収性と骨誘導能に優れたリン酸カルシウム系セラミックスを開発した。バイオセラミックスの表面改質方法として、輸液中の超音波処理技術を確立し、その抗生物質(セファゾリン)吸着徐放性を解明した。組織誘導再生に適当な生体模倣性アパタイト/コラーゲン複合材料を合成し、良好な生体吸収性を立証した。臨床感染巣の新しい定量的評価法の確立には、8例の難治性脊椎感染患者に対して、FDG-PETCTによる感染重症度マッピングの作成を行った。難治性感染症等の治療に有効な生体材料開発の基礎を構築するため、本年は脊椎感染症を制御する抗生物質ならびに骨新生を促進する骨形成因子(rhBMP-2)を吸着・徐放するリン酸カルシウム系セラミックスを作製し、組織誘導再生に及ぼす固液界面機能の影響を評価した。まず、抗生物質や骨誘導因子のキャリアーとなるリン酸カルシウム系セラミックスの表面改質と機能設計を超音波や攪拌溶解析出法を用いて行った。市販多孔性リン酸カルシウム系セラミックスを部分溶解後、ナノ結晶を再析出・複合化したセラミックスを作製し、その物理化学的特性を評価した。その結果、部分溶解と超音波溶解の調整により、セラミックスのキャリアーとして有効なマクロ・ミクロ細孔やマイクロクラックを作製できることが判明した。次に、リン酸カルシウム系セラミックスを用いたrhBMP-2用量依存性骨誘導に関する実験を、部分溶解析出法により作製した生体模倣セラミックスを用いて、骨形成蛋白質の用量依存性を調べ、その徐放性と骨誘導の関係を評価した。その結果、市販リン酸カルシウム系セラミックスは、部分溶解析出や超音溶解析出条件により、体液浸透性と骨伝導に優れた生体模倣セラミックスとなる可能性が示唆された。次いで、リン酸カルシウム系セラミックスにおける抗生物質の吸着特性を行った。バッチ法により、アパタイトセラミックス顆粒と抗生物質の水溶液を混合し、顆粒表面上の抗生物質の吸着量を測定し、生体模倣環境中の吸着機構を評価した。抗生物質にはセファメジン(CFZ)を採用した。CFZの吸着・徐放挙動は、セラミックス表面上に存在する吸着サイトが、温度、pH、流速に依存した溶解析出反応により変動した。セラミックス顆粒サイズと細孔分布の設計・制御の重要性が示唆された。また、手術領域では、後側方脊椎内視鏡を用いた手術アプローチと麻酔法について検討し、アプローチの困難な胸椎や腰仙椎への手術手技を開発した。抗生物質や骨成長因子の吸着徐放性セラミックスの界面機能設計・制御として、水酸アパタイト(HAp)の微細構造と細胞接着特性の関係、骨形成蛋白質担持HApの同所性骨誘導、HAp顆粒の抗生物質セフェメジン(CFZ)吸着徐放性を検討した。HApの表面改質では、HOYA社製CELLYARD、G-S-10を用いて、G-S-10をHNO_3に完全溶解後、CELLYARDを浸漬、超音波部分溶解したPD-HApを作製した。CELLYARDのディスク形状は維持され、キャビテーションに起因するクレーター状のミクロ細孔と微小亀裂が観察された。それらに骨芽細胞様細胞を播種、309.5Kで3日間静置培養した。PD-HAp上の細胞数は、市販品に比べ有意に増加し、細胞形態は多層膜状に接着した。HApの同所性骨誘導では、HOYA社製AXを切断加工、HNO_3に超音波部分溶解後、NH_3水を添加、pH9-10で析出処理SPDP-HApを作製した。それにrhBMP-2を添加、ラット頭頂骨骨膜上へ埋入、摘出後、形態学的組織観察を行った。SPDP-HApは、埋入4週で細孔内に硬組織形成が認められ、8週で辺縁部に梁状骨が形成された。HAp顆粒のCFZ吸着徐放性では、HOYA社製顆粒をアミノフリード輸液に浸漬、撹絆や超音波処理し、電解質・アミノ酸が吸着したAmino/HAp顆粒を調製した。それをCFZ生理食塩水へ添加、309.5K撹絆混合、遠心分離によりCFZ/Amino/HAp顆粒を作製した。それを擬似体液へ浸漬、撹絆後、遠心分離、CFZ徐放量を測定した。CFZ吸着前後ではHAp単一相が得られ、溶液pHは上昇し、Amino/HApのCFZ吸着量が高い値を示した。また、脊椎感染症の活動性の定量的評価を目指しFDG-PETによる分子イメージングの手法を用いた臨床評価のパイロットスタディーも開始した。

従来のMR画像では評価ができなかった細胞の活動性を数値化することにより、脊椎感染巣の活動性評価の新しい指標となる可能性があることが示唆された。平成22年度の研究結果を踏まえ、異種輸液中超音波処理により表面修飾水酸アパタイト(HAp)顆粒を作製し、生体模倣環境中で抗生物質の吸着徐放性に及ぼす微細構造の影響を検討した。HAp球状顆粒を輸液(アミノ酸(A-U)、糖質と電解質(A-D)、混合液(A-C))中で超音波処理し、A-U、A-D、A-C/HAp顆粒を作製した。室温乾燥では、球形状が保持、表層に輸液由来の付着凝集物が観察された。それらをセファメジン(CFZ)生理食塩水溶液へ添加、309.5Kで72h攪拌後、遠心分離、CFZ吸着量を測定した。A-C/HApのCFZ吸着量はHApより多少高い値になった。その乾燥顆粒を擬似体液へ浸漬攪拌後、CFZ徐放率を測定した。徐放率の序列はA-D/HAp、A-C/HAp、A-U/HApとなり、アミノ酸を吸着HAp表面の強いCFZの吸着強度が示唆された。更に、組織誘導による骨再生に適した足場材料として魚由来アパタイト/コラーゲン複合材料を作製し、微細構造と生体親和性・吸収性の関係を検討した。鮭骨の焼成、酸溶解によりアパタイト水溶液を、鮭皮の脱脂、酸抽出、消化、塩析、透析によりアテロコラーゲン水溶液を調製した。それらを所定比(H/C)で混合後、pH7.5-7.9で熟成、アパタイト/コラーゲン(HA-C)複合材料を合成した。H/C=3.5でHAp凝集粒子が、H/C=2でコラーゲンに配向した柱状HAp粒子が観察された。生物検定では、HA-C粉末をラット背部皮下組織内へ埋入2週後で、HAp微粒子内へ体液がよく浸透し、巨細胞浸潤が認められ、良好な生体吸収性が検証された。臨床応用の基盤となる感染巣の定量的評価法の確立に関して、FDG-PETを用いた感染重症度マッピングの作成を、8例の難治性脊椎感染患者で施行した。これらの内容は、平成24年度の国際学会や全国学会での講演に採択された。
脂肪分化関連転写因子PPARγ,C/EBPαの軟部腫瘍での発現と鑑別診断への応用

【はじめに】PPARγおよびC/EBPαの軟部腫瘍における発現の検討と臨床的鑑別診断への応用について検討した.【対象と方法】軟部腫瘍72例を検討.脂肪肉腫(LPS)23,良性脂肪性腫瘍(BLT)13,血管筋脂肪腫(AML)4,MFH11,横紋筋肉腫5,平滑筋肉腫5,DFSP4,線維肉腫1,悪性神経鞘腫4,血管肉腫1,粘液腫1.ホルマリン固定パラフィン包埋検体を用い,免疫組織化学的にPPARγおよびC/EBPαの発現を検索.粘液/円形型MR,高分化型W-LPS及びMFHでの両者の発現の相関について単回帰分析にて検討.間葉系マーカーの免疫組織化学的検索を行い,陽性細胞の特徴を検索.脂肪性腫瘍のパラフィン包埋材料からのRNA抽出法についてRT-PCR法を用い,GAPDHの発現について検討.【結果】PPARγとC/EBPαはAMLを除く脂肪性腫瘍で共発現があり,MR-LPSでは全例でび漫性に陽性.W-LPSとBLTとの間に差がない.MFHの58%でPPARγが陽性,C/EBPαとの共発現が29%であった.脱分化型脂肪肉腫では脱分化巣と高分化部分で両者の陽性率に差異はなかった.MR-,W-LPSでは両者の発現に相関が認あった(r=0.977および0.856)が,MFHでは低かった(r=0011).C/EBPα単独で発現する腫瘍はなく,他腫瘍では共発現はなかった.脂肪性腫瘍で抽出可能なRNAは通常の組織切片より微量で,結果が不安定であった.【結論と考察】脂肪性腫瘍のPPARγとC/EBPαの発現が明らかになり両者の共発現が脂肪性腫瘍の分化に必要と考えられた.また,その発現は脂肪分化マーカーとして鑑別診断に応用可能と考えられた.MFHは潜在的に脂肪細胞への分化傾向を持つ細胞が含まれている可能性が示唆された.今後はmicrowaveを用いたRNA抽出法などを適用し,核酸レベルで解析する.脂肪肉腫23例,良性脂肪性腫瘍13例,血管筋脂肪腫4例,悪性線維性組織球腫(MFH)11例,横紋筋肉腫5例,平滑筋肉腫5例,隆起性皮膚線維肉腫4例,線維肉腫1例,悪性神経鞘腫瘍4例,血管肉腫1例,粘液腫1例のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いた検討を行った.1.各腫瘍のPPARγ,C/EBPαの陽性細胞数を計測し,各腫瘍内での陽性率,標準偏差を求めた.2.粘液,円形型及び高分化型脂肪肉腫,MFHについてはPPARγ,C/EBPαの発現の相関性について,単回帰分析を行い検討した.3.免疫組織化学的に及び筋系,神経系,間葉系マーカーの免疫組織化学的検索及び特種染色の検索を行い,陽性細胞の形態的,免疫組織化学的特徴について検討した.その結果,粘液円形型は全例でPPARγ,C/EBPαともびまん性に陽性で,症例間のばらつきは少ない一方,高分化型ではいずれの陽性率も低く,ばらつきが大きかった.一方,MFHについては8例(58%)でPPARγが陽性,そのうち,4例(29%)でC/EBPαとの共発現が認められた.C/EBPαが単独で陽性となる症例は認められなかった.組織学的には陽性細胞には形態的な脂肪への分化は確認できず、他のマーカーの発現との関連性は乏しいと考えられた.脂肪系腫瘍、MFH以外の症例ではPPARγ、C/EBPαは検出できなかった.単回帰分析では,粘液型円形細胞型及び高分化型脂肪肉腫では両者の発現に高い相関性が認められた.一方,MFHには有意な相関性は認められなかった.以上から,PPARγ,C/EBPαは脂肪分化のマーカー,特に粘液円形型脂肪肉腫と他の粘液性肉腫との鑑別に応用可能と考えりれた.両者の高発現の見られる脂肪肉腫及び両者のアンバランスな発現の見られるMFHについては今後、核酸レベルでの発現やその異常について検討を進める必要があると考えられる.【はじめに】PPARγおよびC/EBPαの軟部腫瘍における発現の検討と臨床的鑑別診断への応用について検討した.【対象と方法】軟部腫瘍72例を検討.脂肪肉腫(LPS)23,良性脂肪性腫瘍(BLT)13,血管筋脂肪腫(AML)4,MFH11,横紋筋肉腫5,平滑筋肉腫5,DFSP4,線維肉腫1,悪性神経鞘腫4,血管肉腫1,粘液腫1.ホルマリン固定パラフィン包埋検体を用い,免疫組織化学的にPPARγおよびC/EBPαの発現を検索.粘液/円形型MR,高分化型W-LPS及びMFHでの両者の発現の相関について単回帰分析にて検討.間葉系マーカーの免疫組織化学的検索を行い,陽性細胞の特徴を検索.脂肪性腫瘍のパラフィン包埋材料からのRNA抽出法についてRT-PCR法を用い,GAPDHの発現について検討.

【結果】PPARγとC/EBPαはAMLを除く脂肪性腫瘍で共発現があり,MR-LPSでは全例でび漫性に陽性.W-LPSとBLTとの間に差がない.MFHの58%でPPARγが陽性,C/EBPαとの共発現が29%であった.脱分化型脂肪肉腫では脱分化巣と高分化部分で両者の陽性率に差異はなかった.MR-,W-LPSでは両者の発現に相関が認あった(r=0.977および0.856)が,MFHでは低かった(r=0011).C/EBPα単独で発現する腫瘍はなく,他腫瘍では共発現はなかった.脂肪性腫瘍で抽出可能なRNAは通常の組織切片より微量で,結果が不安定であった.【結論と考察】脂肪性腫瘍のPPARγとC/EBPαの発現が明らかになり両者の共発現が脂肪性腫瘍の分化に必要と考えられた.また,その発現は脂肪分化マーカーとして鑑別診断に応用可能と考えられた.MFHは潜在的に脂肪細胞への分化傾向を持つ細胞が含まれている可能性が示唆された.今後はmicrowaveを用いたRNA抽出法などを適用し,核酸レベルで解析する.
間葉系幹細胞を利用した膵島移植によるＩ型糖尿病治療の確立

(1) C57BL/6由来骨髄細胞(BMCs)からPI(-)CD45(-)Ter119(-)Sca-1(+)PDGFR-α(+)細胞群をsortingし、これらを培養することにより比較的均一な間葉系幹細胞が分離されることを明らかにした。(2)糖尿病未発症NODマウスにtemsilorimusを-d7, -d1に、cyclophosphamideを-d4から-d1まで連日投与し、d0に2Gy放射線照射とC57BL/6由来BMCsを2 x 10^7個投与することにより、移植後1ヵ月の末梢血で血液キメラが誘導され糖尿病発症が抑制されることを証明した。まず、C57BL/6骨髄(BMC)から接着細胞のみを継代し、5継代(P5)以降の細胞を間葉系幹細胞(MSC)としin vitroの実験に利用した。分化誘導メディウムを用い、(1)脂肪細胞、(2)骨細胞、(3)軟骨細胞に分化誘導されることを確認した。抗体を用いた表面マーカーの探索では、c-kit, CD34, CD45, CD11b, CD40L, FAS-Lが陽性、Sca-1, CD80が陰性でほぼ文献どおりであった。続いて、活性化させたBALB/c由来の脾臓細胞とC57BL/6由来のMSCを混合培養しリンパ球混合試験(MLR)を行った。脾臓細胞単独培養群と比較し、混合培養群では有意に脾臓細胞(リンパ球)の増殖が抑制されることを確認した。以上、マウスMSCのcharacterizationを行った。昨年度から本年度にかけてはin vivoの実験系を確立させるべく研究を進めた。現在、C57BL/6マウスから膵臓を採取し膵島細胞(islets)の分離を最適化している。また、C57BL/6-MSCとBMCを用いてBALB/cレシピエント門脈に移植する予備実験を行い手技の安定化に努めている。これらと同時平衡で、新たにレシピエントの免疫抑制を最適化するため、2011年「Pancreas」にpublishした糖尿病未発症のNODマウスに尾静脈からC57BL/6-MSCとBMCを投与し、糖尿病の発症を抑制する実験系をリピートしている。NODレシピエントの免疫抑制に、従来通りanti-CD3 mAbを使用するレジメンと実際の臨床に即したanti-thymocyte globulin (ATG)を用いるレジメンを新たに作成し、BMC移植に必要な放射線照射量とともに、その投与量の最適化を行っている。研究の全体構想は、アロ抗原である骨髄細胞(BMCs)、間葉系幹細胞(MSCs)、膵島細胞(Islets)を1型糖尿病レシピエントに移植し、生体内でGraft vs. Host Disease (GVHD)を惹起することなく安定したドナー抗原ならびに自己抗原特異的免疫寛容を誘導し、免疫抑制剤を使用することなく1型糖尿病を治癒に導くことである。平成24年度は、糖尿病発症NODマウスにアロ(C57BL/6)由来のMSCs + BMCs + Isletsを移植し、1型糖尿病が治癒することを証明することである。現段階では、B6マウス由来のBMCsからMSCsを効率よく採取できるよう、メディウム、Fetal Bovine Serum (FBS)、成長因子の種類や濃度を最適化しながら培養を行っている。新しい知見として、MSCsを継代していく際stem cell用の形質維持にはFBSのLot numberが重要である、ということが考えられた。また、保存目的で凍結すると形質の維持が困難であることが判明した。Isletsの分離についてもアメリカ留学時代に行っていたプロトコールを追試し最適化している。さらに、移植前にレシピエント投与する免疫抑制、Anti-CD3 mAbをハイブリドーマから作成中である。また、MSCs、BMCs、Isletsの細胞を混合すると、これらの細胞が凝集し門脈塞栓が起きる可能性があることが判明した。できるだけ早期に安定した移植モデルを確立し、BMCs + Islets群と比較することにより、MSCsのグラフト生着に関わるメカニズムを解明して行きたい。(1)C57BL/6骨髄細胞由来間葉系幹細胞の新たな分離培養方法の確立骨髄細胞(BMCs)からPI-CD45-Ter119-gated Sca-1+PDGFR-α+細胞をsortingし、この細胞群だけを培養継代することにより比較的均一なMSCsが分離されることを明らかにした。

抗体を用いた表面マーカーの探索ではc-kit, Sca-1, CD34, CD45, CD11b, H-2Kb, I-Ab, CD86がいずれも陰性、CD29, CD44が陽性で文献報告と一致していた。分化誘導実験では、この細胞群が骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞いずれにも分化することを確認した。リンパ球混合試験では、リンパ球単独培養群と比較し、MSCs混合培養群では有意にリンパ球の増殖が抑制されることを確認した。より臨床に即した免疫抑制剤を使用することによりGVHDを発症しないmixed hematopoietic chimerismの誘導方法を確立した。NODマウス(6週齢)にtemsilorimus(5mg/kg)を-d7, -d1に、cyclophosphamide(100mg/kg)を-d4から-d1まで連日投与したのち、d0に2Gyの放射線照射とC57BL/6由来BMCsを2 x 107個投与することにより、移植後1ヵ月の末梢血で安定したmixed hematopoietic chimerismが誘導されることを証明した。さらにmixed hematopoietic chimerismが誘導されたNODマウスでは、糖尿病発症が抑制されることを明らかにした。(3)C57BL/6マウス膵臓からの膵島分離方法の確立消化器外科学本研究は、神戸大学肝胆膵外科で新たに開始したものである。遅れている理由として、(1)実験を遂行するマンパワーの不足(2) C57BL/6骨髄からMSCの分離培養とその最適化が困難(3)マウス膵臓から膵島細胞の単離とその最適化が困難(4)マウス門脈から細胞を投与する手技が煩雑(5)レシピエントに対する免疫抑制剤(anti-CD3 mAb)の作成とその投与量の最適化が困難が考えられる。(2), (3), (4), (5)は、最終的に(1)に集約される。1臨床にたずさわりながらの研究であるため、現在十分な研究時間が確保出来ない状況にある。また、並列で進行予定していた研究がマンパワー不足により進まない状況にある。特に、MSCs, Isletsの培養分離ならびにAnti-CD3 mAbの作成については同時進行を予定していたが、実際には一つずつ最適化を行っている。特に、予測されていたことではあるがマウスMSCsの分離に時間を要している。2神戸大学で実験1年目ということもあり、動物実験を行う上で必要な種々の申請(動物実験講習会や遺伝子組み換え講習会など)に時間を要することである。実験系(移植モデル)が確立すれば、解析に用いるアッセイは一般的なものであるのでスムーズに進行すると考えている。研究の最終目標に変更はないので方向性を変更する予定はない。余力があれば、この移植実験系でMSCの免疫寛容の誘導に関わる抗原特異的抗体産生抑制現象を解析し、そのメカニズムを明らかにしたい。上記課題の対応策として、(2)に関しうまく推進しない場合は、神戸大学大学院iPS細胞応用医学講座に人材を派遣し、幹細胞のbiologyを学習し解決策を考慮する予定である。(3), (4), (5)に関しては、臨床で膵島移植を行っている東北大学大学院外科病態学講座消化器外科学分野に人材を派遣し、そのノウハウを学習する予定である。平成24年度に引き続き、できるだけ早期に安定したBMCs + Islets+MSCs移植モデル群を確立する。BMCs + Islets群と比較することにより、MSCsの上乗せ効果ならびにグラフト生着を促進させるメカニズムを解明する。
古代中国人類集団の遺伝的多様性とその変遷ならびに生活史の解明

2500年前から2000年前にかけて古代中国の人類集団の遺伝的構成が大きく変化したことを示した我々の先の研究成果を発展させるため、黄河中流(中原)の3000年前ならびに3500年前の遺跡から出土した古人骨のDNA分析をおこなった。その結果、(1) 3500年前から3000年前にかけても変化が起きていたこと、(2) 3500年前と現在の人類集団の遺伝的多様性には違いがみられないこと、が明らかになった。2500年前より古い時代の古代中国における人類集団の遺伝的構成は2000年前(漢代)以降と大きく異なっていることを示した、我々自身による研究成果を一段と発展させることを大きな目的とし、(1)"現代ヨーロッパ人類集団と遺伝的に近縁な人類集団"がいつ頃、黄河中下流に移動してきたのかを明らかにすることを目的とした黄河中流の様々な遺跡から出土した古人骨のDNA分析により、中原の古代中国人類集団の遺伝的多様性とその変遷を明らかにする。(2)中原の様々な遺跡から出土した古人骨の病理学的、法医学的な分析により、古代中国の人々の"病や死"を明らかにする。(3)古代中原の遺跡から出土した動植物遺骸のDNA分析をおこなうことにより、古代中国の人々の生活を支えた動植物の様態を明らかにする。以上の解析によって、世界を代表する古代文明の一つである黄河文明を担った人々の遺伝的多様性とその時代的変遷、人々の生活を支えていた動植物、また、人々を取り巻いていた環境を明らかにする。2500年前より古い時代の古代中国における人類集団の遺伝的構成は2000年前(漢代)以降と大きく異なっていることを示した、我々自身による研究成果を一段と発展させるために、古代中国人類集団の遺伝的多様性とその変遷を明らかにするための古DNA分析に必要な遺跡出土古人骨の収集をおこなった。当初は中国河南省の商代前期(約3500年前)の偃師遺跡を予定していたが、古代中国における重要な地理的位置にある四川省での緊急調査が可能となり、同・金沙遺跡(約3000年前の古蜀国の都の跡)からの出土古人骨を収集した。これまでに、DNA分析のための前処理としての古人骨試料のクリーニング作業を進めると共に、前処理を終えた古人骨試料から順次、DNAの抽出と精製をおこなった。また、遺跡から出土した動植物遺骸のDNA分析をおこなうことにより、古代中国の人々の生活を支えた動植物の様態を明らかにするために、動植物遺骸の収集をおこなった。しかし、動植物遺骸DNAデータを解釈するためのレファレンスデータとしての現生種の遺伝的多様性に関するデータが極めて貧弱である。そこで、主要穀物であるコメに関して、栽培種ばかりでなく野生の現生イネを用いてOryza属の遺伝的多様性に関する実験ならびにバイオインフォマティックス分析をおこなった。Oryza属に属する20種47コレクションの葉緑体ゲノム情報解析により、Oryza sativa japonica, O.s.indica, Oryza nivaraの分子系統分析に有用な、すなわち、遺伝的多様性に富むと同時に、それぞれの系統に独立な変異部位であるインフォーマティブ・サイトの抽出に成功した。昨年度緊急調査を実施し収集に成功した四川省,金沙遺跡出土古人骨の一部についてDNA分析を実施し,約三分の一に試料に関してPCR法によるミトコンドリア・Dループ領域のDNA増幅に成功した。また,本研究課題で当初に予定していた河南省,商代前期の偃師遺跡から出土した古人骨の収集を終え,約半数の試料に関してDNAの抽出・精製ならびにミトコンドリアDループ領域の増幅を実施した。増幅に成功した約三分の一の試料についてPCR-direct sequencing法による塩基配列の決定をおこなつた。これらDループ領域のDNA増幅とその塩基配列の決定に成功した古人骨に関してコーディング領域のSNPサイトの分析をおこない,ミトコンドリア・ハプログループを推定したところ,東アジアに特徴的なハプログループが多く存在した。これは,本研究の目的である古代中国における人類集団の遺伝的多様性の時代的変遷に関して重要な意味をもっ知見であり,次年度以降,分析手法の改良等を加えながら本格的な解析を進めることとした。また,遺跡から出土した動植物遺骸のDNA分析をおこなうことにより古代中国の人々の生活を支えた動植物の様態を明らかにすることも重要であり,本年度は黄河中下流域の遺跡から出土した穀類遺骸の収集をおこなった。動植物遺骸DNAデータを解釈するためのレファレンスデータとしての現生種の遺伝的多様性に関するデータが極めて貧弱であるため,昨年度に主要穀物であるコメに関して遺伝的多様性に富むと同時に,それぞれの系統に独立な変異部位である葉緑体DNAのインフォーマティブ・サイトの抽出をおこなったが,本年度はその結果に基づきOryza属20種の遺伝的多様性ならびに系統関係を明らかした。さらに,現生栽培イネの遺伝的多様性の詳細な分析によって,稲作の伝来の解明に重要な炭化米DNAマーカーの抽出に成功した。

古人骨DNA研究では、古人骨から得られるDNAは超微量かつ断片化されているため、(1)最大でも250塩基長の短いDNA領域をPCR法により増幅し、(2)増幅に成功した試料に関して、その塩基配列を決定する、(3)続いて、他のDNA領域に関してPCR増幅と塩基配列決定をおこない、(4)より多くの塩基配列情報を得る、という極めて非効率な(多大な時間と労力を必要とする)実験に依存してきた。特に問題となるのは、PCR増幅の効率がDNA領域ごとに異なるため、得られた古人骨DNA塩基配列を古人骨間で整列させると虫食い状になる。このため、個体数を必要とする集団解析では共通最大長の配列データを用いることとなるため、ただでさえ短い配列データを短くして次の分析ステップである数理解析を実施せざるを得なかった。この問題を解決することを目的とし、本研究では次世代シーケンサをもちいた古人骨DNA分析に挑戦した。古人骨は通常土中から取り出されるため、毛髪などの特殊な試料でない限り、現代人と同じ実験操作をおこなったのでは、次世代シーケンサによって得られる塩基配列の99%以上は土中のバクテリア由来の配列であることが予備実験から明らかとなった。そこで、目的とする古人骨由来のDNAのみを選択的に分離するために、合成RNAをベイト配列とした液相でのターゲット・キャプチャーをおこなった。その結果、今回ターゲットとしたミトコンドリアDNAの約80%の領域を平均5以上のカバレッジとなるユニークリードを得、古人骨DNA分析の問題点を劇的に改善することに成功した。さらに、従来の塩基配列決定法であるサンガー法と比較して得られる塩基配列の精度が劣る次世代シーケンサの欠点で補うためにユニークリードを効率よく得るための方策等を種々に施し、現代人のDNA分析と同程度の塩基配列を古人骨からも得ることが出来るという大躍進を収めた。
In Vivo/In Vitro両環境下におけるレジン修復システムの歯質接着評価

2.Micro-tensile bond test法におけるヒト歯を用いたダンベル状試料形態においては、最狭窄部断面形態が正方形(1.0×1.0mm)を呈し、彎曲度0.65、平行部長さ1.0mm設定が適正な接着強さと優れた信頼性の獲得に有効であることが判明した。また、角柱状試料形態においては、断面形態を正方形(1.0×1.0mmに設定することが有効であった。3.Er : YAGレーザー(L)または回転切削器(R)を用いて最終形成した歯頸部規格化V字状窩洞修復の複合ストレス負荷後の歯頂側漏洩は、最終形成器・システムの違いにかかわらず同等であった。一方、歯肉側漏洩は、L修復の漏洩がR修復の漏洩に比べ有意に大きかった。4.複合ストレス:負荷後の歯頸部L/R修復の歯肉側壁象牙質に対するμ-TBS値は最終形成器の違いによる有意な影響を受け、システムの違いによる影響は受けなかった。5.代表的な3種セルフエッチングプライマー系レジン接着システムのエナメル質初期接着強さは、代表的なセルフプライミングアドヒーシブシステムと同等の値を示した。また、これらシステムの象牙質値はセルフプライミングアドヒーシブシステムに比べ同等あるいは有意に大きな値を示した。6.接着試験後の試料破壊様相とF-TBS値との間に明瞭な関係を特定することは困難であった。7.接合界面部における網目状様相の程度と幅は、レジン接着システム固有の脱灰・浸透能が影響しているものと推察された。Micro-tensile bond testにおけるヒト歯に適した試料の形態と寸法の規格化を目的に、断面形態が方形である試料に焦点を絞り、狭窄部調整のための彎曲度(R)、最狭窄部長さ(L)、最狭窄部断面形態の幅(W)×厚さ(T)の異なる17種試料形態がMicro-tensile bond strength(μ-TBS)に及ぼす影響について検討し、以下の結論を得た。1.ダンベル状試料形態においては、Rに比べLによる効果がμ-TBS値に影響し、試料最狭窄部に対する平行部設定が重要であった。2.最狭窄部断面形態が正方形(1.0×1.0mm)を呈するダンベル状試料は、長方形(0.8×1.2mm)を呈する試料に比べ大きなμ-TBS値を示し、R0.65とL1.0mmの設定が接着強さと信頼性の獲得に有効であった。3.断面形態が長方形を呈するダンベル状試料の長辺部に彎曲を付与した場合には、μ-TBS値がR値によって強い影響を受けた。また、Er:YAGレーザー(L)または回転切削器(R)を用いて最終形成した歯頸部規格化V字状窩洞に対し、試作抗菌性セルフエッチングプライマー接着システム(ABF)と市販接着システム(CMB)を用いてコンポジットレジン修復を行い、口腔内環境想定の複合ストレス負荷後における接着性について検討し、以下の結論を得た。1.L/R修復の歯肉側壁中央部象牙質に対するμ-TBS値(MPa)は、ABFが6.96/12.43、CMBが9.02/15.3を示し、最終形成器の違いは同値に対し有意な影響を与えるものの、システムの違いは影響を与えなかった。2.μ-TBS測定後の試料破断面は、最終形成器・システムの違いにかかわらず混合破壊が主体であったが、L修復試料では樹脂含浸層の全層に及ぶ破断面が認められ、R修復試料では樹脂含浸層の表層部における破断面が多く観察された。1.正方形(1×1mm)の断面形態を有する角柱状試料は、長方形断面形態試料(1.2×0.8mm,0.8×1.2mm)に比べ、本来の接着強さ獲得と実験系の信頼性向上に有効であることが示唆された。2.μ-TBS測定後の破断面は、試料形態の違いにかかわらず、接着材層と象牙質間における界面破壊と接着剤層内における凝集破壊による混合破壊が主体であった。

セルフエッチングプライミング系接着システム3種、すなわち代表的な2ボトル2ステップ型システム(M)、抗菌性・フッ素徐放性同システム(P)、およびオールインワン型システム(T)の歯頸部歯質接着について、口腔内環境想定の複合ストレス負荷後におけるMicro-tensile bond strength(μ-TBS)の点から検討し、下記の結論を得た。1.3種接着システムM/P/Tそれぞれのμ-TBS値は、15.4/12.4/13.7MPaであり、3システム間の接着強さ獲得能は同等であった。2.3システムそれぞれ固有の接着強さを得るための信頼性には有意差が認められ、Tシステムは、M・Pシステムより有意に優れた信頼性をもってシステム固有の接着強さを獲得できるシステムであることが示唆された。○セルフエッチングプライマー系接着システムの歯質接着性を明らかにするために、歯頸部の切削エナメル質・切削象牙質に対する初期接着強さを測定後、評価検討し、以下の結論を得た。1.本実験で検討した3種セルフエッチングプライマー系接着システムのエナメル質初期接着強さは、安定したエナメル質接着が得られるとの評価を得ている代表的なシステムと同等の値を示し、信頼性に長けたエナメル質接着能を有していることが示唆された。2.これら3システムの象牙質初期接着強さは、セルフプライミングアドヒーシブシステムに比べ同等あるいは有意に大きく、特に新規試作1ボトル1ステップ型オールインワンアドヒーシブシステムは優れた象牙質接着性も具備していることが推察できた。○3種オールインワンアドヒーシブシステムの歯質接着性における特徴を明らかにするために、無切削エナメル質、切削エナメル質・象牙質に対する初期接着強さを測定後、評価検討し、以下の結論を得た。1.本実験に用いた3種オールインワンアドヒーシブシステムと代表的1種セルフエッチングプライマーシステムは、被着面歯質が変化した場合であっても、各システム固有の一定レベル初期接着強さを獲得できた。2.これら4システムの対切削象牙質接着強さは、積極的酸処理を行うシステム値より大きく、象牙質接着においてはマイルドエッチング効果のセルフエッチングプライマー系システムの優位性が示唆された。○FE-SEMを用いた各種システムの歯質接合状態の観察によって歯質接着機構の実態について評価検討し、以下の結論を得た。1.象牙質接着に際しては、レジン接着システムの種類によって、いわゆる樹脂含浸層の生成とその接着への寄与が一律普遍的ではないということが示唆された。2.接合界面部における網目状様相の程度と幅は、特にレジン接着システム固有の脱灰・浸透能が影響しているものと推察された。
レトロウイルスのToll様受容体を利用した免疫回避機構の解明

本研究ではレトロウイルス感染制御におけるB細胞TLR7の関与を調べた。B細胞のTLR7を欠いた個体ではレトロウイルスに対する中和抗体を誘導できないが、Th細胞認識ペプチド(i18)によりウイルス特異的Th細胞を予め活性化しておくと、B細胞TLR7欠損下でも中和抗体の産生を認めることから、抗体誘導の初期反応にB細胞TLR7が必要であると考えられた。しかし抗体を欠くにも関わらず、B細胞TLR7欠損個体ではレトロウイルス誘発白血病の発症は遅延した。またi18免疫個体における白血病発症がTLR7欠損B細胞の移入により遅延することからも、B細胞TLR7が白血病発症の促進に関与している可能性が示唆された。HIV感染症を含む慢性持続性感染症において、病原体による免疫回避機構の解明は、その治療・予防法を開発する上で重要な課題のひとつである。Toll様受容体(TLR)を代表とする自然免疫受容体は、病原体の初期認識ならびに獲得免疫反応の誘導に重要であるが、その一方でその異常が自己免疫疾患や免疫不全の原因となる。本研究は、病原体がその自然免疫システムを利用することで宿主の免疫監視を回避する仕組みを有する可能性を示唆し、それを検証するものである。我々は、マウスレトロウイルスの一種であるフレンドウイルスをTLR7欠損マウスに感染させると、ウイルス誘発白血病の発症が野生型マウスに比べて遅延することを見出した。TLR7欠損個体における感染後の中和抗体価は野生型より低いことから、TLR7欠損下で認められる白血病発症遅延は、液性免疫以外の免疫反応によるものと推測された。さらに、B細胞欠損マウスを用いた骨髄移植法により、B細胞特異的にTLR7を欠失したキメラマウスを作製し、同様に感染実験を行ったところ、これらマウスにおいてもレトロウイルス誘発白血病発症の遅延が認められた。現在、B細胞におけるTLR7シグナルがレトロウイルス誘発白血病発症過程に及ぼす影響を明らかにするために、サイトカイン等の検出を含めた解析を実施している。一方、B細胞特異的TLR7欠損個体を予めCD4陽性T細胞認識ペプチドで免疫しておくと、野生型マウスと同程度の中和抗体が誘導されるものの、それら個体は野生型と異なり白血病死に至った。この結果は、B細胞におけるTLR7シグナルが、産生される中和抗体の質、あるいは細胞性免疫反応に影響を及ぼすことを示唆した。病原体による免疫回避機構の解明は、慢性持続性感染症の治療法や予防法を開発する上で重要な課題である。病原体を感知するToll様受容体(TLR)は免疫細胞の活性化や獲得免疫の誘導に重要な役割を担っていることは明らかであるが、本研究は、その異常がウイルス感染に有利に働く可能性について検証することを目的とする。B細胞におけるTLR7を欠いたマウスでは、レトロウイルス感染後に中和抗体が産生されていないにもかかわらず、白血病発症までの期間は野生型マウスに比べて同等もしくは遅延傾向にあった。またB細胞を欠失させた個体にTLR7欠損個体由来のB細胞を移入すると、白血病の発症が著しく遅延した。以上の結果は、B細胞におけるTLR7がレトロウイルス誘発白血病発症に有利に働いている可能性を示唆するものであり、現在その機構解明に取り組んでいる。さらにB細胞のTLR7を欠くマウスを予めCD4陽性T細胞認識エピトープで感作することで、中和抗体の産生が誘導された。しかし、それらの個体は白血病死に至ることから、B細胞のTLR7シグナルは必ずしも中和抗体産生に必要ではないが、ウイルス誘発白血病の制御には必須であることが明らかとなった。病原体による免疫回避機構の解明は、慢性持続性感染症の治療・予防法を開発する上で重要な課題である。本研究は、レトロウイルスがToll様受容体(TLR)7を利用することで宿主の免疫監視を回避する仕組みを有する可能性を検証するものであり、本年度は主にB細胞に発現するTLR7の役割を複数の側面から解析した。フレンドレトロウイルス(FV)感染後、野生型マウスではIgMのみならずIgG型の中和抗体及び抗FV抗体が誘導される。しかし、B細胞のみのTLR7(B-TLR7)を欠いたキメラマウスでは、FVに対するIgM型の抗体も誘導されないことから、レトロウイルス感染後の抗体産生誘導の初期反応にB細胞のTLR7が必要であると推測された。実際、Th認識Envペプチドワクチン(i18)を接種することでFV特異的なTh及びTfh細胞を予め活性化しておくと、B-TLR7を欠いたマウスにおいても抗FV抗体の産生誘導とそれら抗体のクラススイッチを認めた。しかしながら、ウイルスに対する抗体が誘導できないにもかかわらず、B-TLR7欠損マウスでは、FV誘発白血病を発症するまでの期間が野生型マウスより長いという結果となった。さらに、B細胞を欠いた個体への細胞移入実験では、TLR7欠損B細胞を移入した個体に較べて、野生型B細胞を移入した個体の方が早くに白血病死に至った。また、TLR7欠損B細胞移入マウスでは、i18免疫により中和抗体が誘導されたが、野生型B細胞移入個体では中和抗体の産生誘導を認めなかった。以上の結果から、B細胞のTLR7シグナルはレトロウイルスに対する抗体産生誘導の初期反応に重要であるが、その一方で、ウイルス誘発白血病に対する免疫反応の抑制にも関与している可能性があると考えられた。

B細胞のTLR7を欠いた個体ではレトロウイルスに対する中和抗体を誘導できないが、Th細胞認識ペプチド(i18)によりウイルス特異的Th細胞を予め活性化しておくと、B細胞TLR7欠損下でも中和抗体の産生を認めることから、抗体誘導の初期反応にB細胞TLR7が必要であると考えられた。しかし抗体を欠くにも関わらず、B細胞TLR7欠損個体ではレトロウイルス誘発白血病の発症は遅延した。またi18免疫個体における白血病発症がTLR7欠損B細胞の移入により遅延することからも、B細胞TLR7が白血病発症の促進に関与している可能性が示唆された。実験系により多少矛盾する結果があるものの、B細胞のTLR7を介するウイルスの免疫回避機構の存在を示唆する結果を得た。また、中和抗体誘導におけるCD4陽性T細胞の重要性を示した。感染制御平成26年度までに得られた結果をもとに、平成27年度は、レトロウイルスの免疫回避に関与するB細胞の条件、ならびにB細胞のTLR7シグナルと白血病発症の関係について明らかにする。B細胞特異的TLR7欠損キメラマウスの作製、およびキメラマウスとノックアウトマウスを用いたレトロウイルス感染実験は当初の計画通りに進み、感染後の白血病発症経過、中和抗体の産生、ウイルス特異的抗体産生細胞の検出等は順調に遂行できた。しかし、中和抗体価に関して予備検討と異なる結果が出たこと、また、TLR7欠損個体での白血病発症経過がアジュバント投与の有無で異なる可能性が考えられたことから、これらの確認実験を優先したことにより、TLR7欠損下で認められる白血病発症遅延に関与する細胞および分子機序の解析が遅れている。一方で、B細胞におけるTLR7シグナルの有無が、誘導される抗体の質、あるいは細胞性免疫反応に影響することを示唆する結果を得た。これは、レトロウイルスセンサーであるTLR7からのシグナルがB細胞機能にいかなる変化を与えるかを理解する上で重要な知見であると考えられ、本年度の達成度としては概ね順調と評価する。発注済み消耗品の一部が納品までに時間が掛かったため、それを次年度に繰り越すこととなった。基本的には当初の実験計画に従って今後も本研究を実施するが、以下の点を変更並びに追加する。TLR7欠損個体でのフレンドウイルス誘発白血病の発症遅延は、アジュバント(完全フロイントアジュバント)の投与下で顕著に認められ、またそれはB細胞のTLR7シグナルに依存しているという結果を得た。そこで、レトロウイルス誘発白血病発症経過とB細胞のTLR7シグナルとの関係を、アジュバントの影響を含めて明らかにする。また、レトロウイルス感染後の中和抗体産生は、B細胞のTLR7シグナルに大きく依存するが、ウイルス特異的CD4陽性T細胞を予め活性化することで、B細胞特異的にTLR7を欠損した個体においても高い中和抗体価を認めたことから、本研究に、TLR7シグナルを欠いてもB細胞が中和抗体産生形質細胞へと分化できる条件を探索するための解析を追加する。次年度に予定している研究経費とあわせて、実験試薬や抗体の購入にあてる。
有機物供給経路の複雑性が生食・腐食連鎖構造を介して捕食者群集へ与える影響の解明

先行研究から、地上部の食物網において、地下部の腐食連鎖系から供給されるエサ資源が大きな割合を占めることが知られている。申請者が学振特別研究員として取り組む課題は、特に地上部で優占する捕食者としてクモに着目し、生態系への撹乱を原因として生じる植生遷移が、食物網構造の変化を通じて捕食者群集に及ぼす影響を明らかにすることである。この課題に取り組むために、今年度は同位体手法による腐食連鎖起源のエサの寄与率推定と、遷移段階に応じたクモ群集組成変化の情報を統合した研究をおこなった。まず、主要な4摂食機能群に属するクモの^<13>C,^<15>Nの天然存在比を分析し、各調査地で採集されたクモの種ごとに、優占するエサについての寄与率を求めた値を解析した。遷移に伴う変化は、互いに近接し、伐採後の林齢が異なる温帯落葉性林間を比較することにより明らかにした。クモ群集変化の解析では、最も大きなクモ群集組成の変化が見られた伐採後10年前後を境として、これ以前を遷移初期群集、以降を遷移後期群集と定義した。さらに、遷移初期・遷移後期群集間で個体数比率に有意な差の見られた種をそれぞれ遷移初期・遷移後期種とした。以上のようなクモ群集の変化を受けて、δ^<13>C・δ^<15>N値を用いた混合モデルに基づいて得られた主なエサのクモへの寄与率はクモ群集の変化とどのように関係していたのかを検討した。腐食連鎖起源のエサの可給性が植生遷移と共に増大し、これに伴ってそれらのエサの寄与率が増大した。加えて、遷移初期種は後期種より双翅目寄与率が低かったことから、クモの種交替の結果、双翅目選好種が優占したことが示された。解析結果から、植生遷移に伴う腐食連鎖起源のエサの増大に対してクモ群集が応答し、種組成を変化させることが明らかになった。本研究上を遂行するうえで手法的に最も重要な課題は、クモが利用する各エサ資源を定量することと、それらエサ資源が、生食・腐食連鎖のいずれに起源しているかを明らかにすることである。主要なデータである、食物連鎖起源の分離に関わる研究に関しては既に投稿論文として受理されている。また、主に個々のエサ資源の寄与率を解析した研究に関しては、解析および執筆を既に終えている。従って、今後とも着実に成果として発表する事ができるような研究結果を得ることができたと評価している。植生の撹乱とその後の遷移過程では、食物網に加入する光合成産物の量や堆積リター量・環境構造に大きな変化が生じる。このような、植物に関わる生態系の変化が動物群集の組成にどう影響するのかを理解することは群集生態学および生態系管理の観点から大きな課題だが、その際動物の生存基盤としてエネルギー源、即ちエサの要素を無視することは出来ない。生食・腐食連鎖に区分される食物網の各ユニットは、様々なエサを食べる捕食者によって連結されており、複雑な構造を形成する。しかし、捕食者が植生遷移に対応した群集組成を示す理由を検討するために、生食・腐食連鎖の両者の供給バランスの変化を明らかにする必要がある。クモは主要な樹上捕食者であり、植食者と腐植食者(地下部からの羽化昆虫)の両方を捕食することから、生食・腐食連鎖の結節点となる捕食者の代表例である。本研究は、樹上のクモを頂点とする食物網を題材として、1.人為的撹乱後の遷移過程で捕食者の利用する生食・腐食連鎖由来のエサ比率に生じる変化を明らかにし、2.エサ源の変化が捕食者の生息に及ぼす影響を明らかにする。本年度は実施計画の通り、主にサンプル採取・化学分析を行った。茨城県北茨城市の伐採地を選定し、調査地間の時系列的な比較によって植生遷移過程での変化を調べた。1.を明らかにするために安定同位体分析を用いて個々の種のクモが腐食連鎖由来のエサにどれくらい依存しているのかを算出した。また、種毎のクモのバイオマスを乾燥重量ベースで測定した。これらから、クモ群集のバイオマスの何割が腐食連鎖起源なのかを調査地ごとに求めた。その結果、林齢が高いほどクモ群集の腐食連鎖への依存率が高まる傾向が見られた。また、2.に関連して、様々な林齢の調査地で樹上クモ類の採集を行い、クモ群集の違いを調べた。予備的解析では伐採初期にクモ類の群集が大きく変化し、群集の変化には林齢との対応関係が見られた。生態系撹乱とその後の植生遷移過程では、食物網に加入する有機物量や堆積リター量・環境構造が変化する。生態系の変化が動物群集にどう影響するのかを理解することは群集生態学・生態系管理の両面から大きな課題だが、その際動物の生存基盤としてのエネルギー源、即ちエサを介した影響を無視することは出来ない。本研究課題の目的は、遷移に伴う生食-腐食連鎖系への炭素供給バランスの変化が食物網構造の変化を通じて捕食者群集に影響を与えることの検証である。クモは主要な樹上捕食者であり、植食者と腐植食者を捕食することから、生食・腐食連鎖の結節点となる。そこで、クモを頂点とする食物網を題材として、撹乱後の遷移過程で捕食者の利用する生食・腐食連鎖由来のエサの寄与率に生じる変化および、寄与率変化が捕食者の生息に及ぼす可能性を検討する。

本年度は、主に昨年採集した標本の同定および化学分析情報の統計解析を実施した。まず、1.炭素放射性同位体の天然存在比(Δ^<14>C)の分析によって、生態系内を流れる炭素の滞留時間という尺度から食物網内の炭素動態を分析した。1はΔ^<14>Cを用いて複数栄養段階からなる陸域食物網の構造を明らかにしようとする初の試みである。この手法によって、腐食連鎖系からのエサとして双翅目の寄与が示された。続いて2.CN安定同位体を用いて、森林生態系に優占するエサ画分の寄与を推定し、遷移に伴うエサ可給性変動と捕食形質の違いがどのようにクモのエサ利用に影響するのか調べた。その結果、遷移過程で双翅目の個体数比率や、クモへの双翅目のエサ寄与率が増大する・林齢の効果を除去した場合に、捕食ギルドと体長がクモのエサを決定する要素として関与することを示した。最後に、3.クモ群集の定量採集により、林齢に応じたエサ群集の変化と、クモ群集の変化に対応が見られるかどうかを検討した。昨年度の解析から、クモの種組成は林齢と対応する一方、クモの捕食ギルド組成は林齢を通じて変化が少ないことが分かった。先行研究から、地上部の食物網において、地下部の腐食連鎖系から供給されるエサ資源が大きな割合を占めることが知られている。申請者が学振特別研究員として取り組む課題は、特に地上部で優占する捕食者としてクモに着目し、生態系への撹乱を原因として生じる植生遷移が、食物網構造の変化を通じて捕食者群集に及ぼす影響を明らかにすることである。この課題に取り組むために、今年度は同位体手法による腐食連鎖起源のエサの寄与率推定と、遷移段階に応じたクモ群集組成変化の情報を統合した研究をおこなった。まず、主要な4摂食機能群に属するクモの^<13>C,^<15>Nの天然存在比を分析し、各調査地で採集されたクモの種ごとに、優占するエサについての寄与率を求めた値を解析した。遷移に伴う変化は、互いに近接し、伐採後の林齢が異なる温帯落葉性林間を比較することにより明らかにした。クモ群集変化の解析では、最も大きなクモ群集組成の変化が見られた伐採後10年前後を境として、これ以前を遷移初期群集、以降を遷移後期群集と定義した。さらに、遷移初期・遷移後期群集間で個体数比率に有意な差の見られた種をそれぞれ遷移初期・遷移後期種とした。以上のようなクモ群集の変化を受けて、δ^<13>C・δ^<15>N値を用いた混合モデルに基づいて得られた主なエサのクモへの寄与率はクモ群集の変化とどのように関係していたのかを検討した。腐食連鎖起源のエサの可給性が植生遷移と共に増大し、これに伴ってそれらのエサの寄与率が増大した。加えて、遷移初期種は後期種より双翅目寄与率が低かったことから、クモの種交替の結果、双翅目選好種が優占したことが示された。解析結果から、植生遷移に伴う腐食連鎖起源のエサの増大に対してクモ群集が応答し、種組成を変化させることが明らかになった。本年度は実施計画の通り、主に昨年採集した標本の同定および化学分析情報の統計解析・論文執筆をおこなった。1の内容に関してはOecologiaに投稿中である。また、2.の内容に関しては昨年度中に同位体分析および統計解析を実施した。また、EAFESにて発表を行い、様々な分野の研究者よりいただいたコメントをうけて改善中である。3に関しては、昨年度中に得られた標本の同定をおこなった。3は日本クモ学会・森林学会で発表し、解析上のアドバイスや結果の解釈などについてのコメントをうけた。
論理的認識能を有する新規芳香族ホスト化合物の分子設計

ルミノール誘導体のアミノ基へ分子認識素子を導入するモデルとしてアニリン性アミノ基をアミド、2級アミンへの変換を試みた。ルミノール骨格のアミノ基は反応性が低く、変換は困難であった。さらに少量得られたモデル化合物で、発光性能を検討したところ、殆ど発光しないことが判り、分子素子としての応用が困難であると判断した。次に、分子認識部位をヒドロキシメチル-12-クラウン-4として、比較的簡単な環構造で蛍光を有する、ナフタレン・アントラセン・ピレン・アクリジン・カルバゾール・フルオレンなどとのエステル誘導体を合成した。これらの新規ホスト分子に、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の各種塩を添加したところ、そのカチオンやアニオンの組み合わせで、蛍光強度に変化が見られた。いずれの場合も紫外可視吸収スペクトルや、蛍光スペクトルのスペクトルパターンに変化は見られず、蛍光スペクトルの強度のみ変化が観測された。これらの化合物はある一定波長の蛍光強度を出力信号とすると、カチオン(Na・K・Ca・Ba)、アニオン(SCN・ClO_4・NO_3・I)の入力信号に対して論理的分子認識(AND・OR・NOT)を示すホストとしての機能を有することが明らかとなった。