hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳幼児および成人心疾患における肥大心筋の変容とそのメカニズムに関する研究

平成6年度は、実験的圧負荷心として、ラットの肺動脈絞約を行って得られた右室負荷心を用いて、心筋細胞の細胞骨格の免疫組織学的ならびに分子生物学的検討を行った。10週のウィスター・イマミチラットの肺動脈を絞約して、7日後に右心室圧の上昇を確認したのち心臓を摘出した。右心室重量は対照群に比べて有意に大きく、また組織学的にも、心筋細胞の有意な肥大が認められた。この心臓の心室水平断組織切片について、抗デスミン抗体、抗テュブリン抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、負荷のかかった右心室では、負荷のない左心室に比べてデスミンの染色性が明らかに強く、密であること、テュブリンの構築の変化が認められるなどの結果を得た。さらに、human desmin cDNAから作製したantisense/sense RNA probeを用いてin situ hybridization法により、心筋組織上のmRNAの分布を検討したところ、負荷のかかった右心室心筋で明らかな発現増加が認められた。また、cardiac α-actin、skeletal α-actinのmRNAの量的変化を、それぞれのcDNA probeを用いたnorthern blot法で分析し検討したところ、cardiac α-actin mRNAは負荷心と対照(sham op)群で右心室、左心室とも差がみられなかったが、skeletal α-actin mRNAは、負荷心右心室では対照群に比べて有意な増加(平均9倍)を認めた。左心室心筋ではskeletal α-actin mRNAはほとんど認められなかった。今後は、ヒト心疾患の心筋標本を用いて、同様の検討を行ない、さらに心筋間質の変化についても形質転換の有無などについて検討をすすめていく予定である。本年度は乳幼児および成人の種々の心筋症および心筋疾患における肥大心筋の形態学的変化、デスミンなどの細胞骨格の変化および間質細胞の変容について光顕、電顕、免役組織化学および分子生物学的手法を用いて検討を行なった。その結果、乳幼児、小児の拡張型心筋症では、残存心筋の肥大、配列の乱れとともに、電顕的には筋原繊維の粗しょう化、ミトコンドリアの増加、大小不同、変形、などの所見のほか、粗面小胞体の増加、ゴルジ装置の増生など蛋白合成能増加を示唆する所見を認めた。一方、左室圧負荷のかかるファロ-四微症の右室心筋では、筋原繊維の粗しょう化は余り目立たず、むしろ充実性増生をみるが、ミトコンドリアの増加、粗面小胞体の増加、ゴルジ装置の増生などやはり蛋白合成能増加を示唆する所見を認めた。さらに拡張型心筋症の心筋細胞内のデスミンの分布を免役組織化学およびin situ hybridization法により検討した結果、デスミンは正常心筋では介在板およびZ帯に規則正しく染色されたが、心筋症の心筋細胞では、不規則に強い染色性を示した。免役電顕による検討では、心筋症でのデスミンは増殖したミトコンドリアの間隙に強い陽性反応を示した。さらに心筋症の心筋におけるナトリウム利尿ホルモンの発現とデスミンの変化を比較したところ、デスミンが正常の配列を呈している心筋細胞ではナトリウム利尿ホルモンの発現がまったくみられなかったが、ナトリウム利尿ホルモンの発現がみられる心筋細胞では、デスミンの著しい配列異常がみられた。In situ hybridizationによる検討では、デスミンのmRNAレベルは比較的均一に増加していることがわかった。また、心筋間質細胞の形質転換について検討すると,拡張型心筋症、拡張相肥大型心筋症、急性および陳旧姓心筋梗塞、心室拡張を示す先天性心疾患の心筋間質に平滑筋アクチン陽性の紡錘形細胞を認め、この細胞は非筋型ミオシン重鎖アイソザイム胎児型が陽性であった。
競技引退後の同一性再確立の過程

スポーツ競技者の現役引退並びに運動部集団からの離脱後の適応過程について、主に、自我同一性の再確立に着目して以下のような側面から研究を行った。(1)部離脱に関する相談事例の提示:研究者が心理相談室で担当した運動部離脱に関する6事例をまとめ、部離脱が危機的状況あるいは同一性再確立の困難な状況もたらしていることを示した。(2)退部後の再適応に寄与する要因:退部後かなりの時が経過し、現在、比較的適応状態にある元大学スポーツ競技者10名ドロップアウトならびにトランスファー者)への面接調査により、再適応を促進したと考えられる心理社会的要因を明らかにした。(3)引退後の再適応過程の統合モデルの構築:わが国を代表する元アマチュア競技者8名への面接調査を行い、具体的な事例提示並びに、それらの資料から再適応過程を説明する一般化された「統合モデル」を提示した。(4)各同一性再体制化のタイプごとの特徴:T大学時代に活躍し、さらに卒業後何年か引き続き現役競技者としての競技経験を有する元スポーツ競技者115名に対して調査を試みた。ここでは、それまでの事例研究で主張したことを中心に、操作的な方法により確かめた。(5)再適応への心理的援助の方法:本研究の一貫として行った文献研究の中から、すでに開発されているいくつかの心理的援助プログラムの紹介を行った。今後は、プスポーツ選手に対象を拡げ,同種の研究を試みる予定である。また、それまでの研究成果を踏まえて、再適応を促進するための援助プログラムの開発を行いたい。2年計画の一年目として今年は、以下のような研究を行った。(1)「競技引退」に関する先行研究の概観並びにモデルの設定この種の研究は北米を中心に行われており、実証的研究の少ないことが認められた。また、理論モデルとして、社会的老年学理論・死学的理論・中年期における移行理論、等が個別に援用されている。そこで、本研究では、競技期・引退期・再適応期の3期からなる「統合モデル」の構築を行った。(2)相談ケースのまとめ心理相談室で出会った競技スポーツ離脱者の面接記録の分析を行った。現時点では次の5事例である。「情緒面での一時的な混乱を呈した女子剣道選手」「内科疾患による競技継続不能を受容するまで」「同一制の再確立を迫られ、たじろいでしまったケース」「バーンアウトしてしまったある競泳選手」「いわゆる外傷体験を招いた退部の例」といった事例である。いずれも、離脱後の適応過程では、同一性の再確立が中心テーマとなっている。(3)質問紙調査T大学を中心に、学生時代並びに卒業後も一定期間、高いレベルで競技を継続し、その後現役を退いた者110名に対して、質問紙調査を行った。質問紙の構成では、先に述べた統合モデルの検証をも兼ねている。現時点での回収は40部ほどであり、それらの資料の分析を進めているところである。また、調査対象者の一部に対しては、さらに面接により詳細な情報収集を行っているところである。スポーツ競技者の現役引退並びに運動部集団からの離脱後の適応過程について、主に、自我同一性の再確立に着目して以下のような研究が行われた。(1)部離脱に関する相談事例の提示:研究者が心理相談室で担当した運動部離脱に関する6事例をまとめ、部離脱が危険的状況あるいは同一性再確立の困難な状況もたらしていることを示した。(2)退部後の再適応に寄与する要因:退部後かなりの時が経過し、現在、比較的適応状態にある元大学スポーツ競技者10名への面接調査により、再適応を促進したと考えられる心理社会的要因を明らかにした。(4)各同一性再体制化のタイプごとの特徴:

T大学時代に活躍し、さらに卒業後何年か引き続き現役競技者としての競技経験を有する元スポーツ競技者115名に対して調査を試みた。ここでは、それまでの事例研究で主張したことを中心に、操作的な方法により確かめた。再適応への心理的援助の方法:本研究の一貫として行った文献研究の中から、すでに開発されているいくつかの心理的援助プログラムの紹介を行った。
ヒトの各種体性感覚（特に痛覚と痒み）の脳内認知機構の解明

痛みに関しては、世界で初めての痛覚選択刺激が可能な電気刺激電極を開発した。既に臨床研究も多施設で開始されており,痛覚研究のみならず臨床研究や臨床検査においても有効に活用されると期待される。痒みに関しては、他人の痒みを見たら、痒くなったり、体を掻いてしまったりする場合の脳内メカニズム、痒いところを掻くと快感が生じる場合の脳内メカニズムを明らかにした。もしこのような脳活動を上手にコントロールできれば、アトピー性皮膚炎などで問題となっている制御困難な掻破欲求・掻破行為を制御する新たな治療法開発につながることが期待される。本年度は4編の英文原著論文を発表した(印刷中を含む)。主要な2論文について内容を紹介する。(1)私の研究室では、皮膚の表皮に存在する自由神経終末を選択的に刺激して痛覚刺激とする「表皮内電気刺激(Intraepidermal stimulation (IES)電極」を独自に開発している。今回は、IES電極が本当に痛覚を選択刺激しているかどうかを確認するために、皮膚に局所麻酔剤であるリドカインテープを貼り、その効果を確かめた。すると、触覚刺激に対しては正常な反応が見られたのに比し、IES刺激による痛覚刺激に対しては、自覚的にも痛みは全く感じず、痛覚に特異的な誘発脳波も全く記録されなかった。この結果は、IES電極が痛覚受容体を選択的に刺激している事を明確に示したものである(Otsuru N, Kakigi R etal : J Pain, 11 (7) : 621-627, 2010).(2)以前より、ニコチン(喫煙)が痛覚を抑制する可能性が示唆されていたが、ヒトを対象とした研究は十分では無かった。私達は、喫煙者に12時間の禁煙をさせた後に、痛み刺激を与え、喫煙前、喫煙後の、自覚的な痛み程度(VAS)、痛覚関連誘発脳波、血中ニコチン濃度を計測した。すると、ニコチン濃度の上昇に伴って、有意にVASの低下と脳波反応の低下が見られた。この結果は、ニコチンが痛覚を有意に抑制する事を示す所見であった(Miyazaki T, Kakigi R etal : Brain Res, 1313 : 185-192, 2010)。本年度は7編の英文原著論文を発表した(印刷中を含む)。主要な論文について内容を紹介する感覚刺激が入力される空間に注意を向けると、その刺激に対する行動反応が促進するとともに神経活動が増大することがよく知られている。私たちは先の研究で視覚性空間的注意による体性感覚誘発脳磁場の増大を認め、空間的注意には視覚から触覚へと感覚系を超える影響があることを明らかにした。本研究では逆方向すなわち触覚から視覚への影響について視覚誘発脳磁場を用いて検証した。視覚刺激と触覚刺激を右視野(右手)と左視野(左手)に約1秒間隔でランダム順に提示した。注意条件は右触覚注意、左触覚注意、右視覚注意、左視覚注意の4条件であった。視覚刺激後150msで後頭側頭部(M150ot)に、180msで外側前頭部(M180f)に脳磁場反応が認められた。M150ot反応は視覚系内空間的注意と感覚系間注意によって増大するだけでなく、視覚刺激が入力される空間と同じ場所に触覚性注意を向けたときにも増大した。一方M180f反応は視覚系内空間的注意と感覚系間注意によって増大したが、触覚性空間的注意の影響を受けなかった。等価電流双極子推定法と最小ノルム推定法により、M150ot反応は中後頭回(MOG)と側頭頭頂接合部(TPJ)から、M180f反応は中前頭回(MFG)と下前頭回(IFG)から生じると考えられた。以上より、空間的注意に関して視覚と触覚の間には双方向性の連関があり、後頭側頭部の脳磁場反応に反映されることが明らかとなった。平成24年度から25年度の代表的な研究成果として2つをあげる。痛みに関しては、最近我々が新たに開発した新しい電気刺激法を用いた刺激によって研究を行う事を本年度の研究目標としていた。研究は順調に進み、世界で初めて、電気刺激法を用いて末梢神経C線維を選択的に刺激する事に成功した(Kodaira, Kakigi et al. 2014)。これにより、糖尿病による末梢神経障害のように、小径線維が選択的に障害される疾患の生理学的解析が可能となる画期的な成果であった。痒みに関しては、他人の皮膚が痒そうに見える時や他人が実際に掻いている時に、思わず自分も痒くなる現象(痒みの伝染効果)の脳内メカニズムを、機能的MRIを用いて世界で初めて明らかにした(Mochizuki, Kakigi et al. 2013)。

痒み画像を見た時には、中脳と基底核の活動が増加し、その活動は島回と高い相関関係を有する事を明らかにした。痒い部分を掻くと快感を覚える。しかし、なぜ気持ちが良いのかは今まで明らかになっていなかった。その脳内メカニズムを、機能的MRIを用いて世界で初めて明らかにした(Mochizuki, Kakigi et al. 2014)。痒いところを掻いて快感を覚える場合には、痒くないところを掻いて全く快感を覚えないときに比べて、「報酬系(快感中枢)」と考えられている線条核と中脳が活動する事を明らかにした。また運動に関連する部位の活動も増していた。「快感中枢が活動し」、「掻くという運動に結びつく」メカニズムを明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。現在、研究は順調に進展しており、来年度も5編以上の英文原著論文の発表を予定している。毎年、5編以上の英文原著論文の発表というのは、十分に基盤研究(B)としての水準を満たしていると考えている。
磁気光学効果を用いた高分解能局所磁場測定装置による高温超伝導体の磁気特性に研究

本研究では、高分解能局所磁場測定装置を用いることによって、高温超伝導体の磁気特性について新たな知見を得ることを目的としたが、今年度の研究により、以下のような成果が得られた。まず、高分解能局所磁場測定装置について、小型電磁石を液体窒素で冷却できるようにクライオスタットを改良した。これにより電磁石の抵抗を抑えることができ、前段階で700Gに限られていた磁場範囲が2.5kGにまで広がった。また、画像取込ボードの導入により、二次元磁場分布の元となる画像を計算機に取り込み、局所磁場分布の定量的な解析を行うことが可能となった。つぎに、高温超伝導体の単結晶について、Y系およびBi系の良質な単結晶を得ることに成功し、特に表面にフラックスなどの付着していない、解析が容易な形状(平板状の直方体)のもの取り出すことができた。さらに、得られた単結晶について、低温における局所磁場分布を磁場を変化させながら測定し、定量解析を行った。まず、Bi系の単結晶については、その形状を反映して、磁場に垂直な平面でみると辺の部分から磁束が侵入し、頂点部分は磁束が侵入しにくい様子が観測された。この効果は反磁場の効果であり、平板状の形状の場合にはこの効果を考慮しなければいけないことを示している。また、双晶境界を持つY系の単結晶については、8.5Kという低温において、双晶境界上で増磁過程で磁束が侵入しやすく、また減磁過程で磁束が外部に排出されやすいことが明らかになった。すなわち、双晶境界のピン止め役割は、より高温で報告されているような磁束のピン止めバリアであるというよりは、低温では磁束のガイドラインとなっており、双晶境界のピン止め機構が温度とともに変化することを示唆している。このような振る舞いについて、試料全体にわたって積分した磁化の測定は無力であり、局所磁場分布の測定の重要性が明らかになった。本研究が、高温超伝導体のピン止め機構を解明する上で、重要なてかがりとなると信じる。
AIDS粘膜ワクチン:Th1/Th2型細胞によるHIV特異的粘膜免疫の誘導

AIDS予防対策を考えたとき、現在最も問題になるのが性行為を介したHIV感染である。HIVの最初の侵入が上皮細胞層でおき、そして全身系の免疫システムの破壊につながっていく。AIDSワクチン開発を進めるにあたってはHIVのこれらの感染経路を考慮した粘膜系と全身系両者の免疫機構を使った二段構えの防御システムを宿主側に成立させる必要がある。その目標に向かって本研究班は、粘膜免疫を応用したAIDS粘膜ワクチン開発のための基礎的新情報の収集を推進している。マウスを使用して、HIV/SIVを含めたタンパク質抗原やペプチドを粘膜免疫調節因子/粘膜アジュバントであるcholeraroxin(CT)と併用して経口免疫すると抗原に特異的なIgG1とIgAが血清中と分泌液中に誘導される。さらに抗原特異的CD4^+T細胞のサイトカイン産生パターンを解析すると、IL-4、IL-5、IL-6に代表されるTh2型サイトカインが顕著に誘導されていることが解った。つまり、経口免疫(抗原プラスCT)により誘導されたTh2型CD4^+T細胞がIgG1とIgAを誘導している。これらの実験結果を基に、ヒトにより近い霊長類のモデルとして、SIV感染モデルに使われるアカゲザルをSIVp55抗原とCTの混合ワクチンで経口免役し、抗原特異的Th1/Th2型と抗体免疫応答を細胞・分子レベルで解析した。経口免疫後、SIV特異的IgGとIgAが血清中と分泌液中に誘導され、二重の免疫が成立していることが示唆されている。さらに抗原特異的CD4^+Th細胞の解析では、分泌型IgAを誘導するために必要なTh2型細胞だけではなく、HIV感染阻止を考えたときに必要な細胞性免疫の誘導を示唆するIFN-γ産生Th1型細胞も誘導されていた。HIVの侵入門戸である粘膜面に抗原特異的な細胞性免疫と液性(分泌型IgA)免疫の両方が経口免疫により誘導出来る可能性が強く示唆された。
日本におけるマイノリティー言語に関する実態調査と言語支援開発

次の3点に注目する。(1)現地調査のためのアンケート及びインタビューの調査票の作成と検討、(2)10の地方都市地域における外国人住民のための言語支援の実態の把握のため地方自治体の取り組みと外国人住民が直面している日常生活での諸問題問題の把握、(3)国際学会における研究の中間と成果発表である。調査の結果、様々な問題や不便さの中でも特に「表現の平易化」と情報が行き届いていないことが明らかになった。従って、地方自治体をはじめ、教育関係者や個々の日本人が外国人住民が健全にそして十分に参加できる共生社会づくりに向けて簡略化した言語の提供と生活に必要な情報の普及に関して対応策を打ち出すことを提言する。2012年度に実施した本研究の成果について、特に主要実績として2点挙げたい。一つ目は調査対象の地方都市における調査のデーター収集とその結果分析、そして、もう一つは国際学会で当該調査の結果を報告したことである。内訳はつぎのとおりである。1. 2013年12月15日、タイ国・チェンマイで開催された国際学会で成果報告:多言語社会と言語政策の観点から(1) "a multilingual society"としての日本、(2)広島県福山市の言語支援についての現状、そして(3)兵庫県神戸市の言語支援についての取り組みと実態という3つの事例に焦点を当て、日常生活、さらに子供たちの教育という面での母語維持とアイデンティティーの重要性を提示した。他国の聴衆に「多言語・多文化社会の日本」を伝えることができたことは情報価値があると見る。また、多言語社会の日本の現況を示すことは言語教師をはじめ、教育に携わるひとたちが担う役割のひとつであることも認識できたことは意義深い。2.言語支援の実態把握のための聞き取り調査及びアンケート調査によるデータ収集:特に、広島県と兵庫県に住む外国人居住者への言語支援の一事例として、神戸市における言語支援の取り組みについての実態を概ね把握することができ、本研究の究極的な目的である「言語支援開発」への重要な指針となる。さらに、これらの地方都市における言語支援の現状を考察することで「やさしい英語・日本語」への意識向上と「やさしい言語」に対する具体的な対応策を築きあげる切り口を見出すことができたことは意義深い。3.京都府に在住する外国人への聴き取り調査実施:在留外国人のうち、大学などが集積する大都市圏の都府県のひとつである京都府での本研究の調査対象が英語母語者が大半を占めるという結果を出している。子供たちに対する言語支援の重要性を見出すことができた点に注目したい。最終年度に当たる本年度の成果について3件の事例(京都市・三重県津市・東京都豊島区)から以下に述べる3項目(1)情報の流通、(2)平易表現、(3)少数言語への対応を重要課題として検証した。1つ目の情報の流通については上記の3地域に共通問題として見出され、外国人市民へ情報が十分に行き届いていないという実態が把握された。市から提供される情報量の多さや提供方法の多様化が伺える反面、専門用語の多使用のために生じる言語的不利益をはじめ情報の入手方法の困難さを示す回答が目立つ。情報の入手方法として多くの回答者が「友人」と示している。2つ目の平易表現に関して特に英語を母語としない外国人住民が言語的・社会的問題を抱えていることが目立った。例えば年金制度や医療問題に関する専門用語理解の問題が著しく重要課題となる。3つ目は少数言語に関する言語支援である。上記3つの地域の情報内容を検証すると日本語を含む英語が中心であり、他の言語を母語とする市民への対応は十分でないことが把握できた。例えば製造業地域として特徴づけられる津市ではブラジル人住民が多いことから市内の掲示板や標識は主に日本語、英語、ポルトガル語で提示されており他の国籍を持つ市民に向けた情報提供にも配慮したい。さらに英語圏の外国人市民が多くを占める京都市では日本語・英語による表示が標準であり、各市が掲げる国際都市推進対策に追いついておらず今後の取り組みが急務である。東京都豊島区の場合、特に池袋を拠点とした情報提供は主に日本語と英語の2言語であり、中国人が多く住む池袋周辺においては中国語と日本語の使用が目立つ。こうした基準は外国人登録者数の国籍比を根拠とする場合が考えられる。但し豊島区の報告によると外国人住民も参加する参画型会議の実践があり意義深い支援対策として注目したい。以上3項目を直視した言語支援開発のさらなる課題解明が求められる。次の3点に注目する。当該年度に行った研究内容を本研究目的に基づいて次のように概観する。本研究の目的は、日本在住の外国人が直面する言語関連の問題の現状を把握し、外国人住民のための言語支援対策を検討し、言語支援モデルを構築することである。

この目的達成のため、当該年度では、文献調査、現地視察、学会発表、そして調査項目の検討と作成に取り組んだ。実績として具体的には次の7点を挙げる。(1)「マイノリティー言語」関連の文献調査([例]"Easy English"の概念と定義)、(2)(1)の資料調査各自治体の外国人住民への言語支援に温度差を見る。結果,国籍や文化間の相違も考慮に入れた対策を打ち出すことは必須であり、本研究推進の重要な位置づけとなった。( [例1]福山市の外国人居住者に対する言語支援)、(3)外国人住民と市民によるフォーラム:福山市で開催された『多文化理解共生』と題した講演を聴講した。(4)韓国の言語支援の実情調査:2012年3月に韓国ソウル市内を訪問し、外国人向けの掲示を調査した。(5)日本言語政策学会緊急研究報告会:英語以外の言語の重要性を強調:2011年11月に大修館書店の『英語教育』第60巻第10号で、大木充・西山教行編『マルチ言語宣言』の書評をした。(6)日本言語政策学会緊急研究報告会:2011年5月、「災害・震災時、情報弱者のための言語政策について考える」『自治体の言語サービス』という題目で発表した。災害地の外国人市民への言語支援の提供について提言した。(7)調査項目の検討と作成以上、当該年度の実績に関して、今まさに日本の社会が抱えている外国人住民への言語支援を促進していく上で、日本の言語支援対策づくりの一助として意義深い研究に膨らんでいくものと確信する。当該研究の目的の達成については概ね順調に進んでいると判断する。その理由を以下に示す。理由のひとつ目は、各地域(福山、神戸、京都、金沢)における聞き取り調査及びアンケート調査のデータ収集から分析へと経て、得られた結果の検証を着々と行っていることである。二つ目は、各地域担当の研究分担者が各地域の地方自治体制による異なる支援対策・教育環境・文化によって独自の調査内容を築くことができるという方向性を見出していると言う点が挙げられる。次に、聞き取り調査および地方自治体での観察による調査実施をすることで外国人居住者が抱える諸問題の実態を見出すことができたこと、次に、外国人居住者が直面する問題には調査対象となったどの地方にも共通する問題と各地方の環境や政策(言語政策)によって異なる問題の存在を確認できてきたことである。例えば、共通点として医療に関する不安、隣人とのコミュニケーションに対する不安、地震などの緊急事態発生時の際の言語や子供の教育に関する不安があることが確認できている。その一方で、地方による特徴として、就業地という観点から見る生活に関するの問題を見出すことができた。一事例として、東京都豊島区にある中国人のコミュニティーに見る就業は「エスニック・ビジネス」として特徴づけられ、多くの中国人住民が抱える問題は仕事関係にあることが分かる。最後に、本研究の各対象地方都市にも見られる共通問題として、デジタル化した情報交換が地方自治体の工夫と努力で開発されているものの、提供されている情報が「言語支援」として外国人居住者たちにしっかり行き届いていないという問題があるということを見出すことができた。
微小重力環境を用いた下垂体幹細胞の培養技術の開発―人工下垂体への応用を目指して

下垂体腫瘍幹細胞の分離培養、機能の解析を目的に研究をおこなった。非機能性下垂体腺腫60例を確保し、解離処理後に凍結保存し、サンプルの同時測定を可能とした。非機能性下垂体腺腫のホルモン分泌能を詳細に検討すると、70%以上で少量ではあるが、2つ以上の下垂体前葉ホルモンを産生していることが判明した。フローサイトメトリーにより、幹細胞マーカーであるnestinを解析し、多くの細胞で発現していることが判明した。下垂体腺腫細胞の多分泌能は、幹細胞としての性格の可能性も示唆された。今後、下垂体腫瘍細胞の多分泌能の機序を調べることで、腫瘍幹細胞につながる糸口が判明するかもしれない。本年度の目標として、下垂体幹細胞の手法の確立がある。そこで、ラット培養細胞を無血清培地で培養してみた。すると細胞塊(sphere)は形成され、ホルモン産生能の低下を示した。しかし、他のホルモン産生細胞への分化はされなかった。つぎに3Dクリノスタットを用いた微小重力環境(0G)下と通常の環境(1G)で培養した下垂体細胞(ラット下垂体腺腫培養細胞GH3、ATt-20)が、生物学的に変化するかどうかについて、検討した。すると、ホルモン産生能や細胞分裂能において、有意な差を認めなかった。そこで、現在、細胞濃度や微小重力環境の期間を調整するなどの再検討をおこなっているところである。同時に下垂体腺腫の手術摘出組織から下垂体幹細胞の培養手法の確立を目指している。良性腫瘍である下垂体腺腫はprimary cultureが一般的に難しいとされているが、現在、効率的な細胞の解離・回収が可能となり、pirmary cultureの手技が確立されつつある。また、下垂体の分化過程に関係あるとされるLIF(leukemia inhibitor factor)のヒト下垂体における役割を検討した。するとLIFによりプロラクチンの産生が抑制されていることがわかり、非機能性下垂体腺腫における高プロラクチン血症は、LIFが関与している可能性が示唆された。手術により摘出された下垂体腺腫組織には、多数の赤血球が混在しており、解離処理後には赤血球の除去操作が必要となる。当初は、この除去操作を行わず培養を開始しており、赤血球と下垂体腺腫細胞が混在した状態であった。研究途中で、血球除去操作を加えることとし、in vitroでの下垂体腺腫細胞1個あたりの正確なホルモン分泌能を測定することが可能となった。過去の報告を参考にし、適切な培養条件を検討したところ、下垂体腺腫からのホルモン分泌は経時的に減弱することが判明し、数時間の培養が適切であることが判明した。現在、手術による摘出症例を積み重ねており、50例以上を目標にサンプルを確保している。サンプルはすべて、解離処理後に凍結保存したのちに、すべてのサンプルを同時に測定することで、サンプル間の誤差を少なくすることが可能となった。さらに、下垂体腺腫の多系統にわたるホルモン分泌能を詳細に評価し、臨床データとあわせて解析を行っている。本年度の目標として、下垂体腺腫の手術摘出組織から下垂体腺腫幹細胞の培養手法の確立を目指している。下垂体良性腫瘍である下垂体腺腫はprimary cultureが一般的に難しいとされているが、現在、効率的な細胞の解離・回収が可能となり、pirmary cultureの手技が確立されつつある。下垂体腺腫幹細胞からはさまざまな下垂体ホルモンが分泌されることが予測されるが、現在、摘出された腫瘍細胞からの下垂体ホルモン分泌能を詳細に検討しているところである。手術摘出標本から下垂体腺腫細胞を採取し、下垂体腫瘍幹細胞の分離培養、機能の解析を目的に研究をおこなった。まず非機能性下垂体腺腫60例のサンプルを確保し、すべて解離処理後に凍結保存した。凍結保存により、多サンプルの同時測定を可能とした。非機能性下垂体腺腫の多系統にわたるホルモン分泌能を詳細に検討すると、70%以上で少量ではあるが、2つ以上の下垂体前葉ホルモンを産生していることが判明した。フローサイトメトリーにより、幹細胞マーカーの1つであるnestinの解析をおこなったところ、殆どの細胞で発現していることが判明した。下垂体細胞の多分泌能は、幹細胞としての性格の可能性も示唆される。今後、下垂体腫瘍細胞の多分泌能の機序を詳しく調べることで、腫瘍幹細胞につながる糸口が判明するかもしれない。27年度が最終年度であるため、記入しない。浮遊系細胞である下垂体腺腫細胞の効率的な分離培養が接着系細胞と比べ、技術的に困難な点があるため。

H25年度に下垂体腺腫幹細胞の分離・培養方法の開発を試みたが、その過程で下垂体腺腫は悪性脳腫瘍における腫瘍幹細胞とは異なり、腫瘍幹細胞の性質を多数の細胞で持ちあわている可能性が示唆され、分離培養が困難となっている。浮遊系細胞である下垂体腺腫細胞の効率的な分離培養が接着系細胞と比べ、技術的に困難な点があるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。さらに下垂体腺腫症例を追加し、下垂体腺腫の多系統にわたるホルモン分泌能を詳細に検討する。合わせてフローサイトメトリーを用いて、幹細胞マーカーの解析をおこない、ホルモン分泌能と幹細胞マーカーの発現量との相関を検討する。また、下垂体腺腫における多系統のホルモン分泌能が、腫瘍の性状、浸潤度と関連があるかを検討する。
ビヘイビアコンポーズドによる人工生物の複合・複雑行動の獲得

本研究では,現実の物理法則に基づいた三次元物理環境における生物モデルとして犬モデルを取り扱い,モデルの歩様リズムの生成に神経振動子(CPG),制御コントローラに人工ニューラルネットワーク(ANN),コントローラの進化学習に実数値遺伝的アルゴリズム(RCGA)を用いてニューロイボリューション(neuro-evolution)による自律行動の獲得を陸環境と水環境で行った.また,獲得された行動をビヘイビアコンポーズドによる複雑な一連の行動として開発した.本研究では,単に人工魚などの遊泳という一つの行動獲得を行うのではなく,遊泳であっても身体の泳動,推進力を利用した単なる慣性による前進,ヒレによる遊泳,等の複数の行動を自身と環境の状況に合わせて選択しながら行動する複雑な行動獲得を目指すものである.一つ一つの単一のプリミティブな行動をビヘイビアシンプルと名付ける.ビヘイビアコンポーズドは,ビヘイビアシンプルを複雑に組み合わせた複合行動といえる.ビヘイビアコンポーズドを実現するには,ビヘイビアシンプルをニューロイボリューションで獲得する必要がある.その上で,スイッチングニューロンをニューロイボリューション(EANN)で学習・進化させる.スイッチングニューロンは,各EANNへの選択プライオリティを出力するように学習が行われる.生物は,体内に何らかのリズム生成機構を持っていることが知られている.これ迄のEANNによって獲得される人工生物の行動には,周期関数となる出力が得られる結果が殆どである.これらの経験を踏まえて,あらかじめリズムの生成を行う人工ニューラルネットワークを従来のコントローラとして使用している人工ニューラルネットワークと組合せ,その両者を同時にEANNで学習させる新しいコントローラの導入が必要である.本年度は,25年度の研究を引き続き行うと同時に,セントラルパターンジェネレータ(CPG)とニューラルネットワークをユニット化した,リズム生成をもつニューロコントローラの実装を試みた. CPGの結合ウエイトは多くの研究では予め決められたものを使用するが,本研究ではCPGの結合ウエイトの大きさもEANNによって学習する点が独創的である.このようなCPGをもつニューロユニットを組み込むことにより,二足歩行や四足歩行の人工生物モデルのビヘイビアシンプルのスムーズな行動獲得及び学習時間が短縮されることを検証した.本研究では,現実の物理法則に基づいた三次元物理環境における生物モデルとして犬モデルを取り扱い,モデルの歩様リズムの生成に神経振動子(CPG),制御コントローラに人工ニューラルネットワーク(ANN),コントローラの進化学習に実数値遺伝的アルゴリズム(RCGA)を用いてニューロイボリューション(neuro-evolution)による自律行動の獲得を陸環境と水環境で行った.また,獲得された行動をビヘイビアコンポーズドによる複雑な一連の行動として開発した.これ迄の研究は,人工魚が胴体をくねらせることにより遊泳する魚モデル,足の運びの位相を伝搬することで歩行を可能にする多足歩行モデルなど単一タスク単一行動の獲得実験である.これらの生物は,遊泳あるいは歩行という単一のタスクを実現するニューロイボリューションの結果である.本研究では,単に遊泳という一つの行動獲得を行うのではなく,遊泳であっても身体の泳動,推進力を利用した単なる慣性による前進,ヒレによる遊泳,等の複数の行動を自身と環境の状況に合わせて選択しながら行動する複雑な行動獲得を目指すものである.一つ一つの単一のプリミティブな行動をビヘイビアシンプルと名付ける.ビヘイビアコンポーズドは,ビヘイビアシンプルを複雑に組み合わせた複合行動といえる.ビヘイビアコンポーズドを実現するには,ビヘイビアシンプルをニューロイボリューションで獲得する必要がある.その上で,スイッチングニューロンをニューロイボリューション(EANN)で学習・進化させる.スイッチングニューロンは,各EANNへの選択プライオリティを出力するように学習が行われる.本年度は,このような概念と階層型EANNが複合行動の獲得に有効であるかを二足歩行や四足歩行の人工生物モデルを用いて検証した.このような学習法は計算時間の増大が考えられるが,最近のビヘイビアシンプルの行動獲得の実験では,ビヘイビアコンポーズドを実現するANN構造を用いた時に,不完全な学習でもビヘイビアコンポーズドが実現可能なことが分かりかけてきている.逆に,ビヘイビアコンポーズドの構成を行った方が,単一な行動獲得を行うよりも早く学習が終えることも判明してきている.これはローカルミニマム(評価関数の極小値)の組合せでも行動獲得ができる新しい成果でもある.こうしたことも含めてビヘイビアコンポーズドの方法論の有効性を二足歩行や四足歩行の人工生物モデルで検証した.本研究では,人工生物の複数の行動を自身と環境の状況に合わせて選択しながら行動する複雑な行動獲得を目指すものである.ここで,単一のプリミティブな行動をビヘイビアシンプルと名付ける.ビヘイビアコンポーズドは,ビヘイビアシンプルを複雑に組み合わせた複合行動といえる.ビヘイビアコンポーズドを実現するには,ビヘイビアシンプルをニューロイボリューション(EANN)で獲得する必要がある.その上で,スイッチングニューロンをEANNで学習・進化させる.スイッチングニューロンは,各EANNへの選択プライオリティを出力するように学習が行われる.生物は,体内に何らかのリズム生成機構を持っていることが知られている.これ迄のEANNによって獲得される人工生物の行動には,周期関数となる出力が得られる結果が殆どである.これらの経験を踏まえて,あらかじめリズムの生成を行う人工ニューラルネットワークを従来のコントローラとして使用している人工ニューラルネットワークと組合せ,その両者を同時にEANNで学習させる新しいコントローラの導入が必要である.犬モデルと恐竜モデルの歩行生成には,セントラルパターンジェネレータ(CPG)とニューラルネットワークをユニット化し,リズム生成をもつニューロコントローラの実装を試みた.

その結果,犬モデルの四足歩行,恐竜モデルの尾と二足歩行と完全二足歩行のリズミカルな歩行動作をビヘイビアコンポーズドとして実現することができた.このCPGをもつニューロユニットを組み込むことにより,二足歩行や四足歩行の人工生物モデルのビヘイビアシンプルのスムーズな行動獲得及び学習時間が短縮されることが検証された.本研究では,ビヘイビアコンポーズドを実現するためにCPGを内蔵したビヘイビアシンプルとスイッチングニューロンをEANNで学習・進化させる方法を提案し,数値実験により有効性を検証した.工学現在までの研究では,四足歩行の犬モデルや二足歩行の恐竜モデルを三次元物理空間内にモデリングし,単一タスクを実現するためにニューロイボリューションで様々な行動獲得を行った.具体的に犬モデルでは,1)犬モデル自身の体重を支えながら四足で立っている状態,2)身体のバランスを崩さずに歩行行動をしている状態,3)身体のバランスを崩して地面に転んだ状態,4)転んだ状態から起き上がって四足で立っている状態,5)リラックスして地面に寝転がっている状態から起き上がって四足で立っている状態,6)四足歩行で自律的に目的地へ向かって歩行する状態などが挙げられる.また,恐竜モデルでは,1)巨大生物の恐竜モデル自身の体重を支えながら尾と二足で立っている状態や完全に二足で立っている状態, 2)恐竜モデルの身体のバランスを崩さずに歩行行動をしている状態,3)身体のバランスを崩して地面に転んだ状態,4)転んだ状態から起き上がって立っている状態,5)恐竜モデルの尾と二足,あるいは二足のみで自律的に目的地へ向かって歩行する状態などが挙げられる.ここで獲得された単一のプリミティブな行動をビヘイビアシンプルとし,これらを複雑に組み合わせることで複合行動が得られるビヘイビアコンポーズドが構成される.その結果,犬モデルや恐竜モデルが地面から立ち上がって,目的地に向かって歩き,途中で転んで,再び起き上がり,再び目的地へ向かって歩き,最終的に目的地へ到着するなどの行動獲得が実現可能となった.本年度は,セントラルパターンジェネレータ(CPG)とニューラルネットワークをユニット化し,四足歩行の犬モデルと二足歩行の恐竜モデルにリズム生成をもつニューロコントローラを実装することでスムーズな歩行行動が獲得されることを検証した.また,CPGの結合ウエイトの大きさもEANNによって学習した.現在までの研究では,三次元物理空間内に四足歩行の人工犬をモデリングし,1)この犬モデルの体重を支えながら四足で立っている状態,2)身体のバランスを崩さずに歩行行動をしている状態,3)身体のバランスを崩して地面に転んだ状態,4)転んだ状態から起き上がって四足で立っている状態,5)リラックスして地面に寝転がっている状態から起き上がって四足で立っている状態,6)四足歩行で自律的に目的地へ向かって歩行する状態などの単一タスク実現するためにニューロイボリューションで行動獲得を行った.
扁桃病巣疾患における病態解明と扁桃摘出術の有用性に関する基礎的エビデンス

IgA腎症はその20%が透析に陥る予後不良の慢性糸球体腎炎である。以前より本疾患は扁桃病巣疾患の代表的疾患とされ、扁桃摘出術で尿所見が改善する。しかし、本疾患概念は他科の医師にはあまり浸透していない。我々はIgA腎症と口蓋扁桃の関連を基礎的に証明し、他科医師への疾患概念の啓蒙、扁桃摘出の有効性を予測する因子の解明を目指している。今回の検討ではIgA腎症扁桃から産生されるAPRILが本疾患の病因となるIgAの過剰産生に寄与していること、扁桃T細胞がCXCR3と言うケモカインを介して直接腎糸球体へ移行し腎炎を増悪させていることを明らかにした。今後もさらなる検討を進めるつもりである。1.ホーミングレセプターを介した病巣へのT細胞の浸潤IgA腎症扁桃におけるTリンパ球上のケモカインリセプターについて検討した。CCR4、CCR5、CCR6陽性T細胞の割合は習慣性扁桃炎群、IgA腎症群にて変化は認められなかった。しかし、CXCR3の発現はIgA腎症群にて有意に高い結果となった。次にCpG-ODN刺激後のCXCR3発現の変化では、IgA腎症群にて有意に扁桃T細胞におけるCXCR3陽性細胞の割合が増強していた。更に末梢血におけるT細胞上のCXCR3の発現を検討し、習慣性扁桃炎群と比較してIgA腎症群にて有意に発現が強いことを確認した。またその発現は扁桃摘出術後に有意に低下していた。IgA腎症の腎生検組織では腎糸球体浸潤CXCR3陽性細胞が存在し、その程度と扁桃でのT細胞上のCXCR3発現度に相関が認められた。2.IgA腎症扁桃におけるIgA過剰産生T細胞非依存的にIgAの産生を促すAPRIL(a proliferation-inducing ligand)について検討した。無刺激下では習慣性扁桃炎群もIgA腎症群も差は認められなかった。しかし、CPG-ODN刺激下では、習慣性扁桃炎群に比べ、IgA腎症扁桃群では有意にAPRILの産生亢進が認められた。次に、CpG-ODN刺激後のB細胞におけるAPRIL受容体の発現は、IgA腎症群において有意に亢進していた。更にIgA腎症扁桃B細胞にてCpG-ODNと同時にAPRILも追加刺激し、IgAの産生亢進を確認した。また、IgA腎症扁桃リンパ球をCpG-ODNと同時にAPRIL受容体阻害抗体存在下で培養し、IgAの産生低下を確認した。末梢血における血清APRILを測定し、習慣性扁桃炎群と比較してIgA腎症群にて有意に値が高く、扁桃摘出術後は有意に低下した。1.IgA腎症腎糸球体への扁桃T細胞の浸潤IgA腎症扁桃におけるTリンパ球上のケモカインリセプターについて検討したところ、CCR4、CCR5、CCR6陽性T細胞の割合は習慣性扁桃炎群、IgA腎症群にて変化は認められなかった。次にCpG-ODN刺激後の扁桃リンパ球におけるCXCR3発現の変化を検討したところ、IgA腎症群にて有意にCXCR3陽性細胞の割合が増強していた。さらに末梢血におけるT細胞上のCXCR3の発現を検討したところ、習慣性扁桃炎群と比較してIgA腎症群にて有意に発現が高いことを確認した。またその発現は扁桃摘出術後有意に低下していた。2.IgA腎症扁桃におけるIgA過剰産生の機序T細胞非依存的にIgAの産生を促すAPRIL(a proliferation-inducing ligand)に着目し検討した。無刺激下において、IgA腎症扁桃リンパ球は習慣性扁桃炎扁桃リンパ球と比較して有意にAPRILを過剰に産生していた。しかし、CPG-ODN刺激下での産生亢進は両疾患群とも認めなかった。次に、CpG-ODN刺激後のB細胞におけるAPRIL受容体の発現は、IgA腎症群において有意に増加していた。また、IgA腎症扁桃B細胞にてCpG-ODNと同時にAPRILも追加刺激し、IgAの産生が亢進するのを確認し、さらにIgA腎症扁桃リンパ球をCpG-ODNと同時にAPRIL受容体阻害抗体存在下で培養し、IgAの産生が低下するのを確認した。また、末梢血における血清APRILを測定し、習慣性扁桃炎群と比較してIgA腎症群にて有意に値が高く、扁桃摘出術後は有意に低下することを確認した。

今回の検討ではIgA腎症扁桃から産生されるAPRILが本疾患の病因となるIgAの過剰産生に寄与していること、扁桃T細胞がCXCR3と言うケモカインを介して直接腎糸球体へ移行し腎炎を増悪させていることを明らかにした。今後もさらなる検討を進めるつもりである。今回の科研申請において、無駄のない、かつ余裕を持った研究計画を提出した。そのため、途中で計画の変更がなくスムーズに計画を遂行できた。また、本研究は扁桃摘出術がないと検体が得られず、研究自体が滞るが、昨年度から長年の演題発表や総説執筆などの効果が現れたのか、症例が増え、検体が得られる機会が増加した。今年は今までの結果を論文としてまとめ、報告する予定である。また、本研究は扁桃摘出術がないと検体が得られず、研究自体が滞るが、本年度は長年の演題発表や総説執筆などの効果が現れたのか、症例が増え、検体が得られる機会が増加した。2.新たにIgA腎症の血管炎の要因として、血管内皮細胞のフラクタルカイン(CX3CL1)とCD8T細胞などのCX3CR1結合が関与していることが報告されており、扁桃のCX3CR1陽性T細胞がホーミングしている可能性も示唆される。よってIgA腎症と習慣性扁桃炎群の扁桃T細胞上のCX3CR1発現を測定し、比較検討する。3.IgA腎症扁桃におけるIgA過剰産生においては、濾胞ヘルパーT細胞から分泌されるIL-21がIgAの産生を増強させることが知られており、それに関して検討を進める。実際には扁桃濾胞ヘルパーT細胞数(CD4CXCR5陽性細胞数)をIgA腎症と習慣性扁桃炎群で測定し、比較検討する。また、扁桃単核球培養上清におけるIL-21発現を測定し、疾患群間で差が認められるか検討する。1.ホーミングレセプターを介した病巣へのT細胞の浸潤末梢血におけるT細胞上のCXCR3の発現を検討し、疾患群間で差があるかどうか検討する。さらに扁桃摘出術前後で測定し、手術後発現の低下が認められるかどうか検討する。さらに、腎生検組織を用い、腎糸球体浸潤CXCR3陽性細胞を検討し、その程度と扁桃でのT細胞上のCXCR3発現度に相関があるか検討する。2.IgA腎症扁桃におけるIgA過剰産生IgA腎症扁桃B細胞にてCpG-ODNと同時にAPRILも追加刺激し、IgAの産生亢進が認められるかどうかを検討する。また、IgA腎症扁桃リンパ球をCpG-ODNと同時にAPRIL受容体阻害抗体存在下で培養し、IgAの産生低下が認められるかどうかを検討する。さらに、末梢血における血清APRILを測定し、疾患群間で差があるかどうか、手術後産生の低下が認められるかどうか検討する。リアルタイムPCR試薬、各種抗体、磁気細胞分離システム、免疫染色関連試薬、フローサイトメトリー試薬、ELISA試薬、CpG-ODNなどの消耗品が主となる。本大学には上記の実験に必要な設備自体は整っており、消耗品費のみの経費で研究が遂行できると考える。
法医剖検画像のディジタル画像検索システムの開発

法医学分野では法医解剖の際に写真等による客観的な資料の保存が必要となる。一方、画像処理システムを用いれば、剖検画像の半永久的保存が可能となる。本研究では、剖検例画像をディジタル化・圧縮・変換し、大型計算機上に記憶させ、画像を検索するための剖検例画像データベースの構築を目標として検討した。NEXUS 6410画像処理システムによってVTRから剖検画像の細密なカラーでのディジタル化が可能となった。このディジタル画像をコンピュータのフロッピィディスク上に保存したが、膨大なデータ量となることからデータの圧縮が必要となった。圧縮に際しては死斑や皮下出血等の微妙な色調の違いや損傷等の細部にわたる形態や制御用コンピュータの処理速度,通信回線による画像の転送等を考慮し、基本画像を1画像あたり128×120画素、一画素あたりRGB各6ビットの文字コード形式(20Hから5FHまで)とし、1画像あたり東北大学大型計算機センターのファイル上では43L.LlNKS,フロッピィディスク上では約46Kバイトのデータとした。これを大学間コンピュータネットワークによってフロッピィディスクに転送し、NEXUSの画面上に再現させた。今回の通信には300bpsの音響カプラー、公衆電話回線を用いたが、1画像の転送時間は約25分であった。フロッピィディスク・NEXUS間の転送には1画像約4分を要したが、このような速度の問題は将来的には解決されるものと推定された。フロッピィディスク上に記録された画像のファイル名をもとに実際に剖検例を検索した。現状では一枚のフロッピィディスクあたり20画像程度しか保存できないので、本格的なオフラインでの画像データベースの実用化には大容量外部記憶装置の増設が必要と考えられた。最終目標であるオンライン画像データベースの大型計算機センター上への構築には、通信速度という物理的な問題点が残されたが、通信機器の充実によって改善がみこまれた。
脳橋網様体てんかん焦点モデルを用いた全般てんかんの基礎的研究

定位脳手術を行い、脳橋網様体にカイニン酸注入用のカニューラを刺入し、さらに視床および大脳皮質感覚運動領に電極を刺入して慢性ネコを作成した。術後7日以上経過してから、カニューラの内筒を介して、カイニン酸を1μg注入した。行動および脳波の変化はVideo-EEG monitoringに記録し詳細に観察した。注入後30分経過すると、注入部の脳橋網様体にスパイク波が出現し、focal seizure statusとなった。猫は、注入側の後上方に首を進展しじっとしている奇妙な体位を示した。約1時間後には、大脳皮質感覚運動領に発作波が伝播し、全般発作の重積状態となった。発作は約10分おきに出現し、常に再現性をもって、首の注入側後方への伸展、左への数回の回転および上肢に伸展発作で終了する奇妙な二次性全般化発作を示した。病理学的検査では、カイニン酸注入部の脳橋網様体のpars gigantocellularisに、約2-3mmの壊死巣を認めた。以上の結果より、脳橋網様体の過度の興奮は、脳波上は、focal seizureからgeneralized seizureに至る二次性全般化発作の重積状態を誘発した。しかし、行動上の変化は、ipsilateral tonic head turningが主体であり、発作が大脳皮質に波及すると同側への回転と最後に上肢のtonic extensionが認められた。我々が、これまでに報告した脳幹網様体のカイニン酸焦点の場合の速やかな全般化発作の発展の場合と異なり、脳橋網様体の興奮時の働きは発作の促進よりも、姿勢の保持が主な作用であることを明らかにした。得られた実験結果を脳代謝の面から検討するために、ラットの脳橋網様体にカイニン酸誘発焦点を作成し、発作重積時にautoradiogramを作成した。結果は、まだ1匹の画像しか得られていないが、脳橋網様体にカイニン酸誘発による高代謝域があり、この高代謝域は、上丘、同側の海馬、視床網様核、中隔野に認められた。1匹の結果より結論は得られないが、脳幹網様体の発作の速やかな全般化に比較して、脳橋網様体は明らかに異なる作用を持つことを明らかにした。
歯の色素沈着に関与する唾液ペプチドのプロテオーム解析

歯周病菌の中でもActinomycesとブラックステインの関連はすでに報告されているが、他の歯周病菌の関連は解明されていない。そのため、平成27年度より、ブラックステインを有する患者と歯周病菌の保菌との関与および歯冠色と歯周病菌と色素沈着の関連の解明を行っていた。これまで、【ブラックステインと歯周病菌の関連】として、ブラックステインを有する患者より唾液およびプラークを採取し、PCRにて歯周病菌(5種類)の発現の確認を行い、保菌の有無を検索分析した。そして、【歯冠色と歯周病菌と色素沈着の関連】として、同年代の女性を対象とし、上顎右側第一大臼歯頬側よりプラークを採取し、サンプルとした。サンプルはDNAを抽出し、PCRにて歯周病菌の発現を確認した。歯冠色と色素沈着の有無にて、無着色群と着色群に分け、歯周病菌の保菌の違いを検討した。この研究結果は原著として、J Dent Sci Ther.に掲載された。現在もさらなる追求を行っている。本年度は、【色素沈着に関連する唾液ペプチドの検索】を開始しており、ブラックステインを有する口腔内の唾液の網羅的検索を目的とし、唾液プロテオーム解析を行った。当初予定していたサンプルから、よりよい条件のサンプルが見つかったため、ブラックステインを有する口腔内だけでなく、ブラックステインを有しない口腔内の唾液も一緒に解析し、比較も同時に行える計画へ変更した。サンプル対象がブラックステインの有無以外のことで左右されないように様々な条件をそろえて採取した。条件をそろえるため、解析時期は予定よりも遅くなった。解析はiTRAQ試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析を外注委託にて行った。現在その解析結果を分析中である。今後は、正常児と患児の発現量を比較して色素沈着と関連性があるか否かを検討する予定であり、国際誌への論文掲載を目指している。予定していた解析は終えているが、今回、外注委託するためのサンプルを変更したため、解析終了まで時間がかかってしまった。サンプルを変更したのは、新たに、生活環境(主に食生活、口腔衛生に対する行動(ブラッシングや歯磨剤の内容や使用量など)、睡眠など)にほぼ差がないにも関わらず、ブラックステインがある口腔内とブラックステインのない口腔内から採取可能であったこと、さらにかつてはブラックステインを有していたが現在はブラックステインが顕著でなくなった口腔内を有している患者もおり、同じ生活環境であるため、サンプルとしては良好であった。このサンプル採取のため、新たな齲蝕発生しないこと、PMTCの間隔など条件を揃えるのに期間を有したため、予定より遅くなってしまった。しかし、取得したデータは非常に質の高いものであると確信している。実験計画が前後しており、標的とした唾液プロテインの詳細な研究が遅れているため、やや遅れていると判断した。現在の解析結果を分析後、ブラックステインの有無と色素沈着の関連を明らかにすべく、唾液中のヒスタチンとPRPsのQuantitative Westerns(定量的ウェスタンブロッティング)、あるいはELISA法を行う。さらに細菌との関連性も追求していく予定である。平成27年度は当初、ブラックステインを有する口腔内の唾液の網羅的検索を目的とし、唾液プロテオームを行う予定で計画していた。しかし、ブラックステインとActinomycesの関連はすでに報告されているが、他の歯周病菌の関連は解明されていないため、ブラックステインを有する患児と歯周病菌の保菌との関与および歯冠色と歯周病菌と色素沈着の関連の解明を先に行った。【ブラックステインと歯周病菌の関連】ブラックステインを有する患児より唾液およびプラーク(バイアスを除くため、プラークは採取する歯種と部位を統一してある)を採取し、PCRにて歯周病菌(5種類)の発現の確認を行い、保菌の有無を検索した。【歯冠色と歯周病菌と色素沈着の関連】同年代の女性を対象とし、上顎右側中切歯の歯冠色をシェードガイドにて測定し、色素沈着の有無を診査した。その後、既定の期間ブラッシングおよび含嗽を禁止した後、上顎右側第一大臼歯の頬側よりプラークを採取し、サンプルとした。歯冠色と色素沈着の有無にて、白色群と着色群に分け、歯周病菌の保菌の違いを検討した。現在、この研究結果は原著にし、国際雑誌にて投稿中である。当初の予定であったブラックステイン保有者の唾液プロテオーム検索を最初に行う予定であったが、歯周病菌との保菌の関連の検索を先に行ったため、今年度に唾液の網羅的検索が行えなかった。また、唾液プロテオーム検索の中でもTOFーMS解析および網羅的解析は委託で行う予定であり、費用が高額であったため、今年度の繰越金を次年度と合わせ、そちらより捻出して行うことが可能であり、歯周病菌との関連も追及できているため、少しの遅れはあるが、問題ないと考える。また、唾液中のヒスタチンのウエスタンブロティングを行っているが、実験結果が芳しくなく、テクニカル的な見直しおよび検討を行っているが、こちらも次年度には問題なく遂行できるところまで来ている。平成27年度はブラックステインを有する口腔内の唾液の網羅液検索を目的とし、唾液プロテオームを行う予定で計画していたが、ブラックステインとActinomyces以外の歯周病菌の関連性を検索するため、ブラックステインを有する患児と歯周病菌の保菌との関与および歯冠色と歯周病菌と色素沈着の関連の解明を先に行った。【ブラックステインと歯周病菌の関連】