hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液透析による赤血球変形能変化の定量評価

本研究では、血液透析により赤血球変形能力が変化するかを定量評価する。本実験では顕微鏡観察下でマイクロピペットを用いて赤血球を引張り、引張から解放された赤血球形状回復時定数(以下、時定数)を元に変形能の評価を行うため、平成28年度では実験装置の整備を主に行った。このときウシ赤血球(5μm)に対応するピペット作製とシステム操作両方に高い技術が必要であることが分かった。平成29年度では、時定数測定の別手法に、流路断面の一辺が4 μmの微小流路を用いて、流路から出た赤血球の時定数測定(MC法)を評価法に取り入れたが、赤血球サイズが原因で時定数測定が不可能であった。また単軸引張法では、ピペット内圧力変化から赤血球ヤング率を算出する予定であったが、本システムで圧力測定が不可能だったため赤血球変形能は時定数から評価した。平成30年度では、サンプルをヒト赤血球(購入)に変更することで赤血球サイズによる問題を改善し、血液透析による赤血球変形能の変化について実験をした。実験には一般に用いられる条件を用い、解析にはKelvinモデルを用いた。実験の結果、透析時間に伴い溶血が生じる一方、両測定方法で時定数は透析時間や透析血流量により変化しなかった。これから、血液透析は赤血球の変形能力に影響しないことが分かった。また単軸引張法では、透析時間が6時間程度になると、引っ張られた赤血球の一部に塑性変形に近い様子が確認された。これは単軸引張法ではMC法よりも大きなひずみを与えるため生じたと考えられる。ただし、保存期間が長い赤血球にも確認されており、購入血液の状態、透析時間、保存期間が複合して影響すると考えられ、透析時間にのみに起因するかを突き止められなかった。以上から現行の血液透析の条件では赤血球変形能が変化することは無く、変形能の視点からは患者QOLにあった透析条件について検討の余地があることが分かった。本研究は、血液透析による赤血球変形能力変化の定量評価を目的とする。そのために、顕微鏡観察下で赤血球を単軸引張し、その引張応力とひずみの関係から得られる見かけのヤング率(弾性の評価)と、引張から解放後の形状回復にかかる時間(形状回復時定数、弾性と粘性の評価)を実験から求める必要がある。平成28年度は、血液透析後の赤血球を対象とする前の基本データ収集のために、(1)実験装置準備と(2)健常赤血球に対する各種測定、(3)解析用モデルの検討を目標とした。(1)研究において最も重要なことに、赤血球を顕微鏡観察下で精度よく微細に操作できるかがある。本研究資金を基に購入したマイクロマニピュレータとその先端のマイクロピペットにより、顕微鏡観察下(対物レンズ100倍)において、ピペット端の微動操作とそこでの微小物の吸い込み・吐き出しが可能なことがわかった。これにより赤血球単軸引張の実施可能性が確認できた。しかしながら、測定されるピペット内圧値が安定しない結果となり、このままでは見かけのヤング率を求められないため、ピペット内圧(引張応力)測定回路の見直しが必要である。(2)生体外で透析回路内を循環させる際にウシ血液を用いることから、装置動作確認ではウシ赤血球を用いたが、血球が小さく、引張時に細長く変形した赤血球がピペット内に全て吸引されてしまう結果となった。実験装置改善と使用する赤血球の見直しが必要である。(3)赤血球変形能力の評価に用いる解析モデルは、弾性と粘性の要素の組み合わせで構成される。粘性要素に対していくつかの組合せパターンを基にモデルを検討したが、以前までの結果を基に解析したところ虚数解などにより数値に妥当性が見られなかった。本研究では実験並びに解析モデルをできるだけ単純化することを目指していることもあり、モデルはこれまでのKelvinモデルを用いることとした。予算を基にマイクロマニピュレータの再検討する必要があったが、実験装置については赤血球操作が可能な状況にすることはできた。しかしながら、赤血球引張り時のピペット内圧(吸引圧)を測定しようとした際、圧力計からの出力値が安定しなかったため、赤血球引張応力を測定できず、変形能力について定量評価をできなかった。測定により得られる圧力値が安定しない原因に、本実験においては測定される圧力値が微小であることからマニピュレータ回路に生じるごく僅かな振動や、回路内での圧力反射が影響していること等が予想されるがこの点に関しては調査中である。なお、圧力計由来の原因(温度ドリフトなど)でその対策をした上でも測定困難な場合も含め、圧力計の見直しを行っている。また、実験に用いたウシ赤血球が小さいため引張時にマイクロピペット内に完全に吸引してしまうことについては、実験装置の改善としてより小さい先端内径のマイクロピペット作製することと、赤血球を把持するための吸引圧をより精密にコントロールできるように調整することが方法として挙げられる。上述の装置・手法の改善においては、一回の測定に時間を長く掛けることにつながるため、実験に用いる血液について再検討し、赤血球サイズがより大きい動物由来のものを使うことで実験を実施しやすい状況にすることも考えている。なお、ヒト血液を用いることが最も良いが、血液透析を生体外で模擬的に行うため一定量の血液が必要となりその場合、ヒト血液は困難である。本研究は、血液透析による赤血球変形能力の変化を定量的に評価することを目的とする。

顕微鏡観察下で赤血球を単軸引張し、そのときに得られる応力とひずみの関係から見かけのヤング率を、そして引張から解放された赤血球の形状回復にかかる時間から形状回復時定数を求め、それらを元に変形能の評価を行う。平成28年度では、主となる実験装置を揃え予備実験を施行したが、問題点として、(1)対象に用いたウシ赤血球が小さく、単軸引張用のピペットの改善が必要であることと、(2)応力測定が困難であることが挙げられた。(1)赤血球を引張るためのピペット(先端内径1μm程度)の作製は可能となり、ウシ赤血球(平均直径56μm)に対して引張実験が可能であった。このとき引っ張りの様子として、赤血球が全体的にひずんで変形する場合と、赤血球膜の一部のみが線上に伸びて変形する場合が観察された。しかしながらピペットが折れやすくまた詰まり易いなどの問題があり、現手法ではサンプル数がほとんど取れないことが分かった。そのため赤血球そのものを見直す方針とした。今後は、ヒト赤血球を外部の業者から購入する方針である。(2)引張応力測定(ピペット内圧測定)については適切な圧力計を見つけることがでていない。現在所有する圧力計による測定が不可能な場合は、変形の指標として形状回復時定数を主として実験を実施する。また、血液透析装置内で実際の血液を循環させて模擬透析を実施した際、透析時間の増加に伴って赤血球が溶血することが観察された。このことから血液透析によって赤血球が変質している(ダメージを受ける)ことがわかり、その過程で力学的な変化(変形能の変化)が生じている可能性があると考えられる。今後は血液透析時間の経過をパラメータに取り、赤血球変形能の測定を行う。本研究では比較的入手が容易なウシ赤血球を用いて、血液透析による赤血球変形能の変化を定量評価することを目的としている。研究の遅れの主な理由として、赤血球を引張るためのマイクロピペット作製及びその量産が困難であったことと、単軸引張の際のピペット内圧測定のための圧力計を見つけることができなかったことが挙げられる。本研究で実験するにあたり、対象となるウシ赤血球の直径が56μm程度ということもあり、引張実験をするためには先端径1μm以下のピペットが必要であったがその加工難易度が非常に高く量産ができなかった。そのため実験に用いることが可能なピペットを作製することに時間を要してしまった。またピペットの作製ができた場合においても、実験開始後から赤血球を1度引張るだけでピペット先端が詰まる、あるいは赤血球を引張る前にピペット内が詰まってしまうことが多く、サンプル数の確保が困難であった。また、赤血球を引張る前にピペットが折れてしまうこともしばしば生じた。マイクロピペットについては市販のものもあるが高額である。本研究では実験環境上でピペットが詰まり易くまた折れやすいということもあり、入手したとしても自作の場合と同様の結果が予想されたため購入はしなかった。本研究で必要な引張応力測定のための圧力計についても適切な製品を見つけることができなかった。そのため予定した実験を実施できなかった。赤血球引張の別の手法として、マイクロチャンネルアレイを用いて、チャンネルから出てきた赤血球の形状回復時間の測定についても試みたが、ウシ赤血球のサイズ(56μm)が小さすぎたためマイクロチャンネル内で赤血球が十分に変形せずほぼ素通りしてしまったため時定数の測定ができなかった。
糖尿病性血管障害における終末糖化産物と慢性炎症の相互作用に関する研究

糖尿病において、全身に生じる合併症の制御が重要である。しかし、血糖制御のみでは合併症を抑止できず、各臓器や病期での機能障害機構など未解明の点が多い。糖尿病性合併症の形成には、全身に分布する血管の機能障害が関わる。しかし、タンパク質の糖化反応で生じる終末糖化産物[Advanced glycation end products (AGEs)]や、慢性炎症の血管機能に対する関与や分子機構は不明である。そこで、本研究では、これらの相互作用に焦点を当てつつ糖尿病時の血管部位特異的な機能にどのように影響を及ぼすかを検証し新たな合併症治療戦略の確立を目指している。AGEsは、腎機能の低下に伴って体内に蓄積する尿毒症物質である。また、インドキシル硫酸(IS)は、食物由来タンパク質由来のトリプトファンから腸内細菌によって生成されてインドールが肝臓で硫酸抱合されたもので、タンパク結合型尿毒症物質として知られ、近年、慢性腎臓病、心血管機能障害や、慢性炎症の惹起あるいは進展因子として注目されている。そこで、本研究では、血管に対するISの直接的影響について検証し、以下の結果を得ることができた。1.ラット摘出動脈におけるIS急性暴露によって、acetylcholine (ACh)誘発内皮依存性弛緩反応が胸部大動脈、上腸間膜動脈において減弱するが、頸動脈、腎動脈では影響を受けないといった動脈部位特異的なISの感受性の違いを見出した。2.ラット摘出胸部大動脈におけるIS急性暴露による弛緩反応の減弱は、内因性リガンドであるAChのみならず、カルシウムイオノフォア、アデニル酸シクラーゼ、transient receptor potential vanilloid 4 agonistといった、様々な経路を介する内皮依存性弛緩反応においても生じることを見出した。さらに、AChやカルシウムイオノフォアによる弛緩反応の減弱は、有機アニオントランスポーターを介して細胞内へISが移行し、酸化ストレスを亢進することで生じている可能性を明らかとした。本年度は、糖尿病性合併症、慢性炎症、そしてAGEsと関係のある腸内細菌由来物質であるISの急性暴露による動脈部位特異的な影響を見出した。また、AGEsを始めとする物質の慢性的な血管機能への影響を検討するために、器官培養法を確立させ、基礎的データを蓄積中である。今後、AGEsの血管への直接的影響と慢性炎症関連分子についての相互作用を検討しつつ、ISを始めとした、近年、AGEsや慢性炎症関連分子との関連が明らかとなりつつある腸内細菌由来物質等との相互作用を血管内皮、平滑筋機能に焦点を当てて詳細に検討していきたいと考えている。複雑な相互作用を検討する前に、基礎的データを収集している段階の課題もあるが、現在、概ね順調に進捗している。上記のように、本年度の研究により、ISが直接血管内皮細胞機能に影響を及ぼすこと、その影響が動脈部位特異的に起こることを明らかとした、今後、時空間的側面で検討するために、器官培養法を用いて、ISや、他の腸内細菌由来物質、AGEsやTLRリガンドの長期暴露の影響を検討することで、急性、慢性の影響を詳細に検討する予定である。また、AGEsとそのシグナル、慢性炎症に関わる分子との相互作用を明らかとしていく予定である。さらに、他の腸内細菌由来物質や、病態モデルを用いて、血管部位特異的なAGEsとTLRsシグナルの内皮細胞への障害分子機構を明らかとする。これにより糖尿病性合併症形成への関与を理解し、部位特異的な治療法の開発のための治療ターゲットとしての位置づけを明確にする。本研究の成果が、糖尿病性合併症の発症・進展の抑止に対する戦略の一助となれるようさらに努力を重ねていく所存である。

さらに、AChやカルシウムイオノフォアによる弛緩反応の減弱は、有機アニオントランスポーターを介して細胞内へISが移行し、酸化ストレスを亢進することで生じている可能性を明らかとした。本年度は、糖尿病性合併症、慢性炎症、そしてAGEsと関係のある腸内細菌由来物質であるISの急性暴露による動脈部位特異的な影響を見出した。また、AGEsを始めとする物質の慢性的な血管機能への影響を検討するために、器官培養法を確立させ、基礎的データを蓄積中である。今後、AGEsの血管への直接的影響と慢性炎症関連分子についての相互作用を検討しつつ、ISを始めとした、近年、AGEsや慢性炎症関連分子との関連が明らかとなりつつある腸内細菌由来物質等との相互作用を血管内皮、平滑筋機能に焦点を当てて詳細に検討していきたいと考えている。複雑な相互作用を検討する前に、基礎的データを収集している段階の課題もあるが、現在、概ね順調に進捗している。上記のように、本年度の研究により、ISが直接血管内皮細胞機能に影響を及ぼすこと、その影響が動脈部位特異的に起こることを明らかとした、今後、時空間的側面で検討するために、器官培養法を用いて、ISや、他の腸内細菌由来物質、AGEsやTLRリガンドの長期暴露の影響を検討することで、急性、慢性の影響を詳細に検討する予定である。また、AGEsとそのシグナル、慢性炎症に関わる分子との相互作用を明らかとしていく予定である。さらに、他の腸内細菌由来物質や、病態モデルを用いて、血管部位特異的なAGEsとTLRsシグナルの内皮細胞への障害分子機構を明らかとする。これにより糖尿病性合併症形成への関与を理解し、部位特異的な治療法の開発のための治療ターゲットとしての位置づけを明確にする。本研究の成果が、糖尿病性合併症の発症・進展の抑止に対する戦略の一助となれるようさらに努力を重ねていく所存である。
暗黒物質アクシオンゆらぎの非線形成長による観測可能性

本研究は、宇宙を満たす謎の粒子である暗黒物質の観測可能性を理論的に明らかにするものである。現在、宇宙の約25%は暗黒物質と呼ばれる未知の粒子から成ることが観測からわかっているが、暗黒物質は他の粒子とほとんど相互作用しないため直接は発見されていない。しかし、密度の高い塊として暗黒物質が宇宙に存在していた場合、その強い重力で周りの銀河などの光を増幅するため、暗黒物質を間接的に検出できる可能性がある。そこで本研究では、暗黒物質の有力な候補であるアクシオンという粒子が、現在の宇宙に塊として存在しているかを数値シミュレーションにより確かめることで、その観測可能性を求める。
難治性上気道炎症性疾患に対する新規治療薬の開発にむけたヘパリンの抗炎症作用の解析

ヘパリンは臨床で抗凝固薬として広く使用されているが、多様な作用を有することが知られている。我々は上気道炎症に対するヘパリンの作用を検討した.ラットにおいて、エンドトキシン点鼻による鼻腔炎症や、卵白アルブミンによるアレルギー性鼻腔炎症による鼻腔の杯細胞化生と粘液産生、好中球・好酸球浸潤はヘパリン点鼻投与により抑制された。培養気道上皮細胞を用いた検討では,ヘパリンは,TNF-α刺激や好酸球性細胞の作用による気道上皮細胞からの炎症性サイトカインやムチン分泌を抑制した。好酸球性副鼻腔炎などの難治性上気道炎症に対する新たな治療手段として抗凝固因子であるヘパリンを利用した局所療法の有効性が期待できる.これまで鼻腔の炎症モデルにおけるヘパリンの作用を検討した報告はない。LPS刺激やアレルギー性炎症によるラット鼻粘膜上皮の炎症に対するヘパリンの作用を検討した。LPS点鼻投与によりラット鼻粘膜上皮に著明な杯細胞化生と粘液産生,好中球浸潤が認められるが,未分画ヘパリンや低分子ヘパリンの点鼻投与は,こうした変化を濃度依存性に有意に抑制した。アレルギー性炎症のラット鼻粘膜モデルは、卵白アルブミン(OVA)で感作した後、点鼻して作成した。OVA点鼻により,ラット鼻粘膜上皮に著明な杯細胞化生と粘液産生が認められ,鼻粘膜に著明な好中球・好酸球浸潤が観察され、低分子ヘパリンの点鼻投与により,こうした鼻粘膜の反応は抑制された。培養気道上皮細胞に対するヘパリンの直接作用を,ヒト気道上皮細胞株であるNCI-H292細胞を用いて検討した。TNF-α刺激によりNCI-H292細胞からIL-8産生やムチン分泌,MUC5ACmRNAの発現亢進が認められるが,未分画ヘパリンはNCI-H292細胞からの,IL-8産生やムチン分泌を濃度依存性に抑制し,MUC5AC mRNAの発現も抑制した.低分子ヘパリンも同様にNCI-H292細胞からのTNF-α刺激によるIL-8産生,ムチン分泌を濃度依存性に抑制した.気道上皮細胞株であるNCI-H292と好酸球性細胞株であるEoL-1の共培養で刺激されたMUC5AC産生やVEGFも未分画または低分子へパリンで抑制される。NCI-H292をIL-1βで刺激した時のMUC5AC産生やTGF-β1も未分画または低分子ヘパリンで抑制される。TNF-α以外の刺激で亢進するMUC5AC産生も未分画ヘパリン、低分子量ヘパリンで抑えられることを証明した。好酸球性副鼻腔炎などの難治性上気道炎症に対する新たな治療手段として抗凝固因子であるヘパリンを利用した局所療法の有効性が期待できる.気道上皮の細胞株であるNCI-H292細胞にTNF-αによる刺激を加えたところ、気道上皮細胞よりサイトカイン(IL-8)、細胞増殖因子(VEGFとPDGF)、粘液(MUC5AC、MUC5B)が産生分泌されることを蛋白レベル(ELISA法)とmRNAレベル(RT-PCR法)で確認した。これらに未分画ヘパリンまたは低分子ヘパリンを添加することで有意に抑制され、その効果は用量依存性であった。NCI-H292細胞とヒト好酸球性細胞株であるEoL-1細胞を共培養したところ、粘液(MUC5AC)、サイトカイン(IL-8)、増殖因子(VEGF、PDGF)が産生されることを蛋白レベル(ELISA法)とmRNAレベル(RT-PCR法)確認した。未分画ヘパリン、または低分子ヘパリンを添加により用量依存性に有意に抑制された。以上より気道上皮細胞へのTNF-α刺激や、気道上皮細胞と好酸球の相互作用による炎症反応を、ヘパリンは抑制することを証明した。私たちはこれまで、好酸球性副鼻腔炎などの上気道炎症に凝固線溶系因子が深くかかわっていることを明らかにしてきた。今回、臨床現場で広く使用されている抗凝固薬であるヘパリンに注目し、上気道炎症に対する作用を検討した。ラットにおける検討では、LPS刺激によるラット鼻粘膜の炎症モデルにおける鼻粘膜上皮の杯細胞化生と粘液産生,好中球浸潤は、未分画ヘパリンや低分子ヘパリンの点鼻投与により濃度依存性に抑制され、卵白アルブミンにより作成したラット鼻粘膜アレルギー性炎症モデルにおいても、鼻粘膜上皮に生じた杯細胞化生と粘液産生やが好中球・好酸球浸潤が、低分子ヘパリン点鼻投与により抑制された。

培養気道上皮細胞での検討では、ヒト気道上皮細胞株であるNCI-H292細胞をTNF-α刺激し産生されたIL-8やムチン,MUC5ACmRNAの発現亢進は未分画または低分子ヘパリンにより濃度依存性に抑制された.さらにNCI-H292細胞とヒト好酸球由来の細胞株であるEoL-1細胞を共培養し産生されるムチン(MUC5AC,MUC5B)やサイトカイン(IL-8)産生が低分子ヘパリン添加により有意に抑制された。以上の結果から、ヘパリンには上気道炎症に対する抗炎症作用があることが考えられる。鼻副鼻腔や中耳腔は点鼻・点耳などにより容易に高濃度の薬剤を局所投与することが可能であり、ヘパリンの点鼻・点耳はこうした難治性上気道炎症に対する新たな局所療法になりうる可能性がある。鼻科学目標としていた動物実験、細胞培養実験でへパリンの抗炎症作用を証明できた。細胞レベルでのヘパリンの抗炎症作用を証明した。気道炎症に対するへパリンの抗炎症作用について、培養細胞での検討を継続する。動物モデルにおける未分画へパリン、低分子ヘパリンの作用を検討する.卵白アルブミンによるアレルギー性炎症によるラット鼻粘膜上皮の炎症モデルを利用して、未分画へパリン、低分子ヘパリン点鼻投与による効果を組織学的に、粘液産生、杯細胞化生、好中球・好酸球浸潤などの面から検討する.動物モデルにおける未分画へパリン、低分子ヘパリンの作用を検討する.卵白アルブミンによるアレルギー性炎症によるラット鼻粘膜上皮の炎症モデルを利用して、未分画へパリン、低分子ヘパリン点鼻投与による効果を組織学的に、粘液産生、杯細胞化生、好中球・好酸球浸潤などの面から検討する.
内因性マリファナ様物質のアナンダミドの代謝酵素に関する研究

アナンダミドは内因性のカンナビノイド受容体アゴニストとして発見され、その構造はアラキドン酸のエタノールアミドと同定されている。アナンダミドは何らかの細胞刺激によって生成し、作用後すみやかに遊離アラキドン酸とエタノールアミンに加水分解されて不活化されるものと考えられているが、アナンダミドの代謝に関与する酵素の性質については不明な点が多い。本研究では、アナンダミドを加水分解する酵素をブタ脳から単離精製し、その性質を明らかにすることを試みた。ブタ脳のミクロソーム画分を1%Triton X-100で処理して得られた可溶化蛋白を、Phenyl-5PW疎水性クロマトグラフィーで分離することにより、加水分解酵素を約20倍に部分精製した(比活性:0.37μmol/min/mg蛋白)。この酵素標品は、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸のエタノールアミドよりもアナンダミドと高い反応性を示した。既知のアミド加水分解酵素であるセラミダーゼやプロテアーゼの活性は、この酵素標品では検出されなかった。また、高濃度のエタノールアミン存在下では、逆にアラキドン酸とエタノールアミンの脱水縮合反応により、アナンダミドが生成した。クロマトグラフィー上での挙動、pH依存性、熱失活曲線、種々の阻害剤(アラキドニルトリフルオロメチルケトン、p-クロロメルクリ安息香酸、フルオロリン酸ジイソプロピル、フッ化フェニルメチルスルフォニル)の効果に基づいて、部分精製標品中のアナンダミド加水分解酵素活性とアナンダミド合成酵素活性は同一酵素蛋白に由来することが示唆された。
マウスゲノムにおける組換え雌雄差領域の検索とその構造解析

減数分裂時における遺伝的組換えは、生物の遺伝的多様性を高める重要な機構の一つである。しかし、その機構に関しては未だ不明な点が多い。我々はC57BL/6で生じた被毛の形態異常を起こす突然変異遺伝子Ca^<Rin>(Kikkawa,Y.etal.,Genetics 165:721,2003)の日本産野生マウス由来の近交系MSMをパートナー系統として用いた連鎖解析の過程で、第15染色体末端近傍で組換え率が雄で雌の数十倍高いという大きな雌雄差のあることを見いだした。この雌雄差を引き起こす原因を明らかにすることは、減数分裂時の組換え機構を探る上で重要な手がかりになると考えられる。我々はこの領域内のマイクロサテライトマーカー一D15Mit40とD15Mit15の問でBACおよびYAC contigを作製してその物理距離を測定した結果、マウスゲノムでの物理距離当たりの平均組換え率と比較して、雌では組換えのcold spotであり、雄ではhot spotであることが明らかになった。我々はこの領域内に新たにDNAマーカーを作製し、詳細に検討を加えた結果D15Mit15近傍にこの領域の雄における組換えの80%を起こしているhot spotの存在が明らかにした。次に、このような組換え雌雄差は測定に用いたマウス系統に依存する現象かどうか明らかにするためにC57BL/6の代わりにBALB/c系統を用いて連鎖解析を行った。その結果、雄に関してはC57BL/6同様D15Mit15近傍において高い組換え率を示したのに対し、雌では現在のところこの領域において組換え体は得られておらず、C57BL/6系統と同様の組換え雌雄差が観察された。これまでの様々な系統を用いた連鎖解析の結果と今回の結果から、日本産野生マウス由来近交系MSMと従来のdomesticus由来実験用マウス系統との間で最も組換え雌雄差の生じることが示唆された。次に、このような組換え雌雄差を示す領域がマウスゲノム中に他にも存在するかどうか、存在すればどのような共通の特徴を持っているかを明らかにすることを計画した。そのため雌雄マウスの全染色体にわたりマイクロサテライトマーカーを用いて連鎖解析を行い、現在明らかになっているマウスゲノム情報と比較することにより検出したいと考えている。現在、雌に関する連鎖解析がほぼ終了し、雄の連鎖解析が進行中である。減数分裂時における遺伝的組換え現象は、生物の遺伝的多様性を高める重要な機構の一つである。我々は被毛の形態異常を起こす突然変異遺伝子(Kikkawa, Y. et al., Genetics 165:721,2003)の連鎖解析の過程で、マウス第15染色体末端近傍で組換え率が雄で雌の数十倍高いという大きな雌雄差のあることを見いだした。

この雌雄差を引き起こす原因を明らかにすることは、減数分裂時の組換え機構を探る上で重要な手がかりになると考えられる。我々はこの雌雄差が雌において組換えが抑制された組換えのcold spotか、あるいは、雄におけるhot spotであるのかを明らかにするために、この領域内のマイクロサテライトマーカーD15Mit40とD15Mit15の間でBACおよびYAC contigを作製してその物理距離を測定した。その結果、マウスゲノムでの物理距離当たりの平均組換え率と比較して、雌では組換えのcold spotであり、雄では、hot spotであることが明らかになった。我々はこの領域内に新たにDNAマーカーを作製し、詳細に検討を加えた結果D15Mit15近傍に、この領域の雄における組換えの80%を起こしているhot spotの存在が明らかにした。現在、この領域を詳細に解析しhot spotを特定することを試みている。次に、このような組換え雌雄差を示す領域がマウスゲノム中に他にも存在するかどうか、存在すればどのような共通の特徴を持っているかを明らかにすることを計画した。そのため雌雄マウスの全染色体にわたりマイクロサテライトマーカーを用いて連鎖解析を行い、現在明らかになっているマウスゲノム情報と比較することにより検出したいと考えている。現在、雌に関する連鎖解析がほぼ終了し、雄の連鎖解析が進行中である。減数分裂時における遺伝的組換え現象は、生物の遺伝的多様性を高める重要な機構の一つである。しかし、その機構に関しては未だ不明な点が多い。我々はC57BL/6で生じた被毛の形態異常を起こす突然変異遺伝子Ca^<Rin>(Kikkawa,Y.etal.,Genetics 165:721,2003)の日本産野生マウス由来の近交系MSM系統をパートナー系統として用いた連鎖解析の過程で、第15染色体末端近傍で組換え率が雄で雌の数十倍高いという大きな雌雄差のあることを見いだした。その結果、マウスゲノムでの物理距離当たりの平均組換え率と比較して、雌では組換えのcold spotであり、雄ではhot spotであることが明らかになった。我々はこの領域内に新たにDNAマーカーを作製し、詳細に検討を加えた結果D15Mit15近傍にこの領域の雄における組換えの80%を起こしているhot spotの存在が明らかにした。次に、このような組換え雌雄差は測定に用いたマウス系統に依存する現象かどうか明らかにするためにC57BL/6の代わりにBALB/c系統を用いて連鎖解析を行った。その結果C57BL/6と同様の組換え雌雄差を第15染色体末端近傍で観察した。
聴覚障害者の学習支援のための情報保障インフラに関する基礎的検討

<平成12年度>携帯電話などのモバイル通信端末を所持する聴覚障害学生を対象に,広い意味での学習情報を提供するシステムを構築し,試験運用と評価を行った.また,キャンパスインフラの在り方に関する検討材料とするため,全学生を対象にアンケート調査を行った.1.情報提供システムの中核となるサーバマシンを購入し,学内LANに接続した.種々のWebアプリケーションをサーバサイドプログラミングにより開発して,電子掲示板,Webメールサービス,学習コンテンツの提供,の3つを実現した.2.学生と教員のモニタに携帯電話を貸与し,本システムを評価・検証してもらった.これらの意見はシステムの改良に役立てられた.3.本学の聴覚障害学生全員を対象に,モバイル活用と情報保障に関する実態調査を行った.その結果,学生は本研究のようなシステムを歓迎しており,多様な情報提供を期待していることが分かった.<平成13年度>自営PHSデータ通信網を構築し,通信コストがかからないモバイル通信環境の有効性を応用展開例とともに明らかにした.また,学生・教職員を対象にした情報保障インフラに関する2回目の調査を行った.1.自営網対応のモバイル通信端末(PHSカード)へ学習情報を提供するシステムを構築した.このため,通信料の負担なしこ,Webサーバからの情報提供が可能となった.2."IT略語辞典"を充実させた.また,携帯電話側で学習教材を動的に利用できるようにするため,一般常識問題集などのJavaアプリケーションを開発・アップし,試験的な配信を行った.3.本研究で構築したインフラの応用展開として,聴覚障害学生の安否確認システム,電光表示パネルを用いた情報提示システムなどを構築・検証した.<平成14年度>携帯電話・自営PHSなど,モバイル通信端末のためのインフラよる情報提供を総合的に検証した.また,本研究の成果を聴覚障害教育に関する国際会議で発表した.<平成12年度>携帯電話などのモバイル通信端末を所持する聴覚障害学生を対象に,広い意味での学習情報を提供するシステムを構築し,試験運用と評価を行った.また,キャンパスインフラの在り方に関する検討材料とするため,全学生を対象にアンケート調査を行った.1.情報提供システムの中核となるサーバマシンを購入し,学内LANに接続した.種々のWebアプリケーションをサーバサイドプログラミングにより開発して,電子掲示板,Webメールサービス,学習コンテンツの提供,の3つを実現した.2.学生と教員のモニタに携帯電話を貸与し,本システムを評価・検証してもらった.これらの意見はシステムの改良に役立てられた.3.本学の聴覚障害学生全員を対象に,モバイル活用と情報保障に関する実態調査を行った.その結果,学生は本研究のようなシステムを歓迎しており,多様な情報提供を期待していることが分かった.<平成13年度>自営PHSデータ通信網を構築し,通信コストがかからないモバイル通信環境の有効性を応用展開例とともに明らかにした.また,学生・教職員を対象にした情報保障インフラに関する2回目の調査を行った.1.自営網対応のモバイル通信端末(PHSカード)へ学習情報を提供するシステムを構築した.このため,通信料の負担なしこ,Webサーバからの情報提供が可能となった.2."IT略語辞典"を充実させた.また,携帯電話側で学習教材を動的に利用できるようにするため,一般常識問題集などのJavaアプリケーションを開発・アップし,試験的な配信を行った.3.本研究で構築したインフラの応用展開として,聴覚障害学生の安否確認システム,電光表示パネルを用いた情報提示システムなどを構築・検証した.<平成14年度>携帯電話・自営PHSなど,モバイル通信端末のためのインフラよる情報提供を総合的に検証した.また,本研究の成果を聴覚障害教育に関する国際会議で発表した.本研究の初年度においては携帯電話などのモバイル通信端末を所持する聴覚障害学生を対象に,広い意味での学習情報を提供するシステムを構築し,試験運用と評価を行った.また,キャンパスインフラの在り方に関する検討材料とするため,全学生を対象にアンケート調査を行った.(1)情報提供システムの構築情報提供システムの中核となるサーバマシン(Windows 2000 Server)及びアプリケーション開発・検証用のクライアントマシンを購入し,学内LANに接続した.種々のWebアプリケーションを開発して,a)掲示板,b)Webメールサービス,c)学習コンテンツの提供,を実現した。(2)掲示板とWebメール掲示板にはいくつかのカテゴリを設定し,教員からの連絡,図書館からのお知らせ,学内イベント情報などを掲示している.また,学内のメールアカウントに着信したメールを携帯電話から読んだり返信するWebメールサービスも提供している.(3)学習コンテンツの作成学生の学習そのものに役立つ情報提供の一例として,"IT略語辞典"を構築した.データベースに登録したIT関連の略語の正式な綴りと意味を,携帯電話やパソコン(PC)のWebブラウザから手軽に検索することができる.(4)システムの検証と評価学生と教員のモニタに計16台のiモ-ド携帯電話(NTTドコモ)を3ヶ月間貸与し,本システムを評価・検証してもらった.モニタからはオンラインアンケートを通して意見・感想を寄せてもらった.これらの意見はシステムの改良に役立てられた.(5)アンケート調査本学の聴覚障害学生全員を対象に,モバイル活用と情報保障に関する実態調査を行った.その結果,学生は本研究のようなシステムを歓迎しており,多様な情報提供を期待していることが分かった.本研究の第2年度の主要実績は以下の通りである.1.ワイヤレス自営網の構築

自営網対応のモバイル通信端末(内線登録可能なPHSカード)へ学習情報を提供するシステムはキャンパスの8箇所に設置されたPHSアンテナからPBX(PHS回線交換機)を経由して,既存の学内LANへ接続されている.このため,モバイル通信端末からの要求に応じて,Webサーバ(前年度購入済)から種々の情報を提供することが可能となった.2.学習情報コンテンツの作成携帯電話及び自営網端末ユーザへ電子掲示板を経由して教務・事務情報を提供するとともに,"IT略語辞典"を充実させた.また,携帯電話側で学習教材を動的に利用できるようにするため,種々のJavaアプリケーションを開発し,サーバにアップした.この結果,端末とサーバ間の通信回数が減るなど,公衆網接続の端末に対しても経済的な情報提供が可能となった.3.学生・教職員を対象にした情報保障インフラに関する調査パソコン及び携帯電話から本研究による情報提供システムを利用している聴覚障害学生に対してオンラインアンケートを実施し,本システムの使用感,提供している学習コンテンツ,モバイル通信端末の活用等に関して調査と評価を行った.また,内線登録したPHS通信カードを学生及び教職員に貸与し,ワイヤレス自営網による情報提供について意見を聴取した.4.海外動向の調査本研究の成果を国際会議で発表するとともに,諸外国の研究者と交流することにより携帯電話等の活用状況を調査した.この結果,この分野での日本の優位性が明らかになった.5.情報保障インフラとしての展開展開研究として,災害などの非常時を想定した聴覚障害学生の安否確認システムを試作し,モバイル通信端末を活用した情報保障インフラが有効であることを確認した.本研究の最終年度の主要実績は以下の通りである.(1)学習情報リソースへの統合的なアクセスWebサーバ上に構築した学習情報提供システムは,(1)公衆網経由による携帯電話ユーザ,(2)PHS自営網経由によるモバイル端末ユーザ,(3)インターネット経由の学内外PCユーザ,のいずれに対しても最適な学習情報コンテンツを配信できるようにした(アクセスしたクライアントの環境変数を取得するサーバサイドアプリケーションを作成し,コンテンツの自動振り分けも可能とした).一方,PCクライアントのブラウザから利用できるFaxサーバソフトをWebサーバにインストールし,LAN経由でFax通信を試みた.この結果,異なるインフラである電話網とLANをシームレスに接続できることを確認した.(2)学習情報コンテンツの作成Javaプログラミングにより就職試験対策のための問題集を開発し,試験的に携帯電話ユーザ(学生)の利用に供した.また,このJavaアプリケーションにサーバとのHTTP通信機能を持たせることにより,サーバのデータベースに学生の得点を記録することや,ランキングを携帯電話側へ通知できるようにした.
新規な脂肪肝増悪因子G０S２蛋白によるインスリン抵抗性発症機序の解明

G0S2蛋白は細胞周期に関する蛋白として発見されたが、近年はATGLを抑制する作用が報告され、脂質代謝における調節因子のひとつとして注目されている。本研究ではアデノウイルスを用いてG0S2蛋白を肝臓に過剰発現させ、G0S2蛋白が肝臓でのインスリン感受性に及ぼす影響及び作用機序について、様々なインスリン抵抗性モデル動物で検討した。昨年度、雌Wistarラットにおいて肝臓でのG0S2過剰発現はインスリン感受性に影響を及ぼさなかったが、卵巣摘出よるエストロゲン欠乏状態のWistarラットでは、肝臓でのG0S2過剰発現は、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させた。本年度は、肝臓におけるインスリンシグナル及び組織学的評価を行った。肝臓のAktセリンリン酸は、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群においてのみ有意な減少を認めた。Oil Red O染色では、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群において、約3倍の脂肪沈着の増加を認め、脂肪肝の悪化を認めた。しかし、線維化を評価するMasson's Trichrome染色法では、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群で、線維化が有意に抑制され、さらにTGF-βおよびSmad2の発現も有意に低下しMasson's Trichrome染色法の結果と一致した。以上の結果より、エストロゲン存在下では、肝臓でのG0S2蛋白の過剰発現はインスリン感受性に影響を及ぼさなかったが、エストロゲン欠乏状態では、肝臓でのG0S2蛋白の過剰発現は、脂肪肝を増悪させ、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させるが、肝線維化を抑制することが明らかになった。脂肪肝を伴ったインスリン抵抗性状態では、G0S2がインスリン抵抗性の増悪因子となるが、肝臓での線維化は抑制する可能性が示唆された。G0S2蛋白は細胞周期に関する蛋白として発見されたが、近年はATGLを抑制する作用が報告され、脂質代謝における調節因子の一つとして注目されている。本研究ではアデノウイルスでG0S2蛋白を肝臓に過剰発現させ、G0S2蛋白が肝臓でのインスリン感受性に及ぼす影響及び作用機序について検討した。6週齢、雄、Wistarラットを通常餌、高脂肪餌で3週間飼育後、G0S2蛋白を過剰発現するアデノウイルス(Ad-G0S2)、コントロールウイルス(Ad-GFP)を投与した。通常餌+Ad-GFP群、通常餌+Ad-G0S2群、高脂肪餌+Ad-GFP群、高脂肪餌+Ad-G0S2群の4群で、アデノウイルス投与1週間後に、経静脈的ブドウ糖負荷試験と高インスリン正常血糖クランプ検査にて、耐糖能及びインスリン感受性を評価した。経静脈的ブドウ糖負荷試験ではAd-G0S2投与により通常餌群で血糖値の有意な変化はなかったが、高脂肪餌群ではコントロールと比較して負荷後15分の血糖値有意に上昇し耐糖能の悪化が認められた。高インスリン正常血糖クランプ検査では、高脂肪餌+Ad-G0S2群でコントロールと比較してGIRが約15%有意に減少し、全身のインスリン抵抗性の増悪を認めた。IS-GDRは有意な差を認めなかったが、cHGOは約30%有意に増加し、肝臓でのインスリン抵抗性の悪化を認めた。Aktのセリンリン酸化については、高脂肪餌+Ad-G0S2群の肝臓でのみコントロールと比較して有意な減少を認めた。Oil Red O染色では高脂肪餌+Ad-G0S2群にてコントロールと比較して2.5倍の脂肪沈着増加を認め、脂肪肝の悪化を認めた。以上の結果より、高脂肪負荷によるインスリン抵抗性状態では、肝臓でのG0S2蛋白の発現は、脂肪肝を増悪させ、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させることが明らかになった。通常餌による正常耐糖能状態および高脂肪餌負荷によるインスリン抵抗性状態で、肝臓でG0S2過剰発現によるインスリン感受性を評価できた。本年度は、6週齢、雌、Wistarラットを両側卵巣摘出手術もしくはSharm手術施行後、高脂肪食にて4週間飼育し、G0S2蛋白を過剰発現するアデノウイルス(Ad-G0S2)、コントロールウイルス(Ad-GFP)を投与した。投与1週間後にインスリン感受性は正常血糖高インスリンクランプ検査にて検討した。以上の結果より、肝臓でのG0S2蛋白は、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させるが、エストロゲンにより抑制する可能性が示唆された。雌の高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性状態では、肝臓のG0S2蛋白はインスリン抵抗性に影響を及ぼさなかったが、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態での高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性状態では、肝臓のG0S2蛋白は肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させることが明らかになったことより、エストロゲンがG0S2蛋白によるインスリン抵抗性増悪作用を予防する可能性が示唆された。

昨年度、雌Wistarラットにおいて肝臓でのG0S2過剰発現はインスリン感受性に影響を及ぼさなかったが、卵巣摘出よるエストロゲン欠乏状態のWistarラットでは、肝臓でのG0S2過剰発現は、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させた。本年度は、肝臓におけるインスリンシグナル及び組織学的評価を行った。肝臓のAktセリンリン酸は、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群においてのみ有意な減少を認めた。Oil Red O染色では、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群において、約3倍の脂肪沈着の増加を認め、脂肪肝の悪化を認めた。しかし、線維化を評価するMasson's Trichrome染色法では、卵巣摘出によるエストロゲン欠乏状態でのG0S2過剰発現群で、線維化が有意に抑制され、さらにTGF-βおよびSmad2の発現も有意に低下しMasson's Trichrome染色法の結果と一致した。以上の結果より、エストロゲン存在下では、肝臓でのG0S2蛋白の過剰発現はインスリン感受性に影響を及ぼさなかったが、エストロゲン欠乏状態では、肝臓でのG0S2蛋白の過剰発現は、脂肪肝を増悪させ、肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させるが、肝線維化を抑制することが明らかになった。脂肪肝を伴ったインスリン抵抗性状態では、G0S2がインスリン抵抗性の増悪因子となるが、肝臓での線維化は抑制する可能性が示唆された。高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性状態で、G0S2過剰発現により脂肪肝が増悪したがその機序について検討する。G0S2蛋白が肝臓でのインスリン抵抗性を増悪させる詳細な機序を解明する。さらにエストロゲンによる抑制効果の可能性及びその詳細な機序を解明する。2016年11月より所属が、福島県立医科大学から順天堂大学に異動に伴い、手続き等に時間がかかり、使用が遅れた。1)消耗品:正常血糖・高インスリン・クランプ検査のマイクロ・カテーテルなどの器具、ラジオアイソトープ(D-[3-3H]glucose)、検査費用(血糖、インスリン、FFA、血清脂質プロフィル、TNFα、レジスチン、レプチン、アディポネクチン、は測定キットの購入など。2)旅費:日本糖尿病学会学術集会及びアメリカ糖尿病学会で研究成果の発表のための宿泊費及び交通費。
水辺景観と水による騒音に配慮した減勢工の水理設計法

山形県内における落差工、急流工等の施設による騒音の事例を調べた。騒音問題は約20例あり、睡眠の妨げになるという苦情内容であった。騒音対策としては、コンクリ-ト等を用いて水路に蓋をし騒音を内封した事例が約半数で、落差工を急流工に改修したという興味深い事例が数例あった。そこで、まず水理基礎実験により、落差工と急流工の流れにおける騒音特性について比較検討した。実験水路は、幅0.25m,全長12mの木製水路で上・下流水路底落差は0.34mである。実験は、下流水路末端設置の可動堰高を変化させ,下流水路の始端付近から露出射流、完全跳水と潜没跳水(急流工の場合には斜面上跳水)の流況で騒音値等を計測した。結果は次のようである。(1)急流工、落差工いずれの場合も従来の実験結果のように,流量が大になるに伴い騒音値は大きくなり、下流水深が大になるに伴い騒音値は減ずる。(2)落差、流量、下流水深が同一の状態で跳水が生じている時には、騒音値は急流工に比べて落差工の方が大きいが、下流水深が大になるに伴い急流工と落差工の騒音値はほぼ同値となる。これより急流工はある条件下では騒音対策工の一つとして機能する。次に,ゲ-トの底部流出時の流況は一つのエネルギ減勢工として機能し,ある流況では著しく騒音が少ない流れがみられる、そこで,山形県鶴岡市に位置する倉脇東西分水工で現地実験を行った。実験は、右岸側水路のゲ-トG_1とその下流側に臨時的に設置したゲ-トG_2ゲ-トを操作し、ゲ-トG_1直下流に種々の流況を実現させ水音の測定を行った。その結果、ゲ-トの底部流出時に伴う騒音は、ゲ-ト直下流の流況によって著しく異なり、これらの関係は音比(潜没跳水時の水音値と完全跳水時の水音値の比)と潜没度Sの関係で表示できた。S【greater than or similar】2の時、ほぼ騒音は発生しないので水理設計が可能となった。まず,山形県内における落差工、急流工等の施設による騒音の事例を調べた。そこで,水理基礎実験により、落差工と急流工の流れにおける騒音特性について比較検討した。実験水路は、幅0.25m,全長12mの木製水路上・下流水路底落差は0.34mである。実験は、下流水路末端設置の可動堰高を変化させ、下流水路の始端付近から露出射流、完全跳水と潜没跳水(急流工の場合には斜面上跳水)の流況で騒音値等を計測した。また、流入水脈上面から一部跳水内まで全幅にビニ-ルをたらした状態での実験も行った。実験結果は次のようである。まず、セキシ水深を始端とする共役水深の関係等についての水理特性を調べ、Rand等による従来の関係が成り立つことを確認した。

次に、騒音測定の位置を流下方向の高さに対しニライン設け,落差工、急流工において流量、下流水深を変え騒音値を計測した。その結果、次のことが判明した。(1)急流工、落差工いずれの場合も従来の実験結果のように、流量が大になるに伴い騒音値は大きくなり、下流水深が大になるに伴い騒音値は減ずる。(2)落差、流量、下流水深が同一の状態で跳水が生じている時には、騒音値は急流工に比べて落差工の方が大きいが、下流水深が大きくなるに伴い急流工と落差工の騒音値はほぼ同値となる。(3)以上の実験結果から、急流工は騒音対策工の一つとしてある条件下では機能する可能性がある。なお、実験における音の相似則等を解明するため、平成2年度に一部現地測定を行ったが、平成3年度により詳細な測定を行うべく準備中である。ゲ-トの底部流出時の流況は一つのエネルギ減勢工として機能し,ある流況では著しく騒音が少ない流れがみられる。この流れを水理的に明らかにするため、既にゲ-トからの流況と騒音の関係についての基礎実験を行っており現地での騒音特性との比較実験を課題としていた。そこで、山形県鶴岡市白山に位置する倉脇東西分水工で現地実験を行った。水路は分岐前で幅4.5m、分岐後の右岸側で幅1.2m,左岸側で幅2.1mのコンクリ-ト水路である。実験は、右岸側水器のゲ-トG_1と堰上げ用にその下流側に臨時的に設置したゲ-トG_2の2ゲ-トを操作し,ゲ-トG_1直下流に種々の流況を実現させて行った。水音の測定はゲ-ト直下流の水路側壁天端で行った。測定値を用い,縦軸に潜没跳水時の水音値と完全跳水時の水音値の比をとり、横軸に潜没度Sを用いてプロットすると、Sが小さいほど音比は大きく,基礎実験と同じ傾向となった。これにより、ゲ-トの底部流出時に伴う騒音は、ゲ-ト直下流の流況によって著しく異なり、これらの関係は音比と潜没度Sの関係でほぼ表示できることが判明した。多少余裕を見込んでS【greater than or similar】2の状態でほぼ騒音は発生しないので、この関係を用いて水理設計を行う次に、ゲ-トの底部流出時の流れを騒音の周波数帯との関係で調べた。全体的には水音値の最大値は400630Hzの間であり、騒音値が減ずると各周波数帯での水音値も全体的に低下していた。この状況を他の水音(砂防ダムからの落下流、湯野浜海岸での砕波に伴う水音等)と比較した。その結果、水音値の周波数帯には差異がみられ,詳細な検討は今後の課題であるが、流況上からは、砂防ダムは鉛直方向の水理現象、落差工の跳水は水平方向の水理現象であり、砕波は両者の合成的流況と位置づけてその差異は説明可能と思われた。
新しい好熱性絶対共生細菌Symbiobacteriumの生育要求因子の解明

Symbiobacterium thermophilum (SM)の生育を指標として共生生育因子の精製を以下のように行った。301の混合培養液より得られたBacillus strainS (BS)の菌体破砕上清から、硫安沈殿、DEAE Toyopearl.Butylcellulofineで精製を行ったところ、生育支持活性が二つの異なるピークとして回収された。各フラクションを続いてMonoQ、Hydroxylapatite、非変性PAGEによって精製した結果、両者とも最終的にSDS・PAGE上で分子量約62kDaの単一バンドを示した。精製した二つの蛋白のN末端アミノ酸配列は同一であったがSDS-PAGE上で分子量がわずかに異なっていることから、何らかの修飾が存在すると予想される。N末端配列をもとにクローン化した約480bpのDNA断片の塩基配列を決定してホモロジー検索を行ったところ、様々なバクテリアの糖の取り込みに関与するホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)のEnzymeIに極めて高い相同性が認められた。BSおよびSMの染色体DNAから16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いて、PCR法で16S rRNA遺伝子を増幅してクローン化、その塩基配列をもとにこれらの菌の分類学的検討を行った。その結果BSは一般分類学的指標からもよく似た性質を示すB.stearothermophilusが含まれている好熱性Bacillus属細菌の枝に位置していた。一方、SMは、低G+Cグラム陽性菌群、Fusobacteria群、および高G+Cグラム陽性菌群を包括する大きなグループに含まれるが、それらのいずれの群ともクラスターをなさなかった。このことから、SMは、従来知られた細菌とは系統学的由来が大きくかけ離れた、新しい属として位置づけられることが強く示唆された。Bacillus sp.strain Sの生産する、Symbiobacteriumの生育に絶対的に必要な共生生育因子の精製は、以下に記した方法で行った。Bacillus sp.strain Sによる共生生育因子の生産性は、本菌を単独で培養したときよりも、これら二種の微生物を混合状態で培養したときの方が約30倍高い。したがって、混合培養から得られるBacillus sp.strain Sより菌体破砕上清を調製し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、DEAE-カラムクロマトグラフィー、native-PAGEからの切り出しを行い、最終的にSDS-PAGE上で分子量60-70kDaのブロードなバンドが得られた。この蛋白質をエンドグリコシダーゼHで処理したところ、SDS-PAGE上で分子量67kDa付近の単一バンドとなった。また、本蛋白のレクチンへの結合性を調べたところ、WGAレクチンへの結合性が認められた。このことから、本蛋白質が原核生物では殆ど例のないN-グリコシド結合を有する糖蛋白質である可能性が示唆された。精製された蛋白質のN末端アミノ酸配列を試みたところ、N末が修飾されていることが判明した。そこで、精製標品を限定酵素分解し、内部アミノ酸配列の決定を行ったが、量的な問題から明確な結果は得られなかった。本蛋白は割合微量な濃度でその生育支持活性を発揮しており、上記の精製方法では最終精製品の量的な確保が困難であった。したがって現在のところ、ジャーファーメンターによる大量培養の条件検討及び精製方法の再検討を行っており、本蛋白質の精製とアミノ酸配列の決定を急ぎ、同蛋白質の遺伝子をクローン化するための条件を整備している最中である。Symbiobacterium thermophilum(SM)の生育を指標として共生生成育因子の精製を以下のように行った。301の混合培養液より得られたBacillus strains(BS)の菌体破砕上清から、硫安沈殿、DEAE Toyopearl、Butyl cellulofineで精製を行ったところ、成育支持活性が二つの異なるピークとして回収された。

各フラクションを続いてMonoQ、Hydroxylapatite、非変性PAGEによって精製した結果、両者とも最終的にSDS-PAGE上で分子量約62kDaの単一バンドを示した。精製した二つの蛋白のN末端アミノ酸配列は同一であったがSDS-PAGE上で分子量がわずかに異なっていることから、何らかの修飾が存在すると予想される。N末端配列をもとにクローン化した約480bpのDNA断片の塩基配列を決定してホモロジー検索を行ったところ、様々なバクテリアの糖の取り込みに関与するホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)のEnzyme Iに極めて高い相同性が認められた。BSおよびSMの染色体DNAから16SrRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いて、PCR法で16SrRNA遺伝子を増幅してクローン化、その塩基配列をもとにこれらの菌の分類学的検討をった。その結果BSは一般分類学的指標からもよく似た性質を示すB. stearothermophilusが含まれている好熱性Bacillus属細菌の枝に位置していた。一方、SMは、低G+Cグラム陽性菌群、Fusobacteria群、および高G+Cグラム陽性菌群を包括する大きなグループに含まれるが、それらのいずれの群ともクラスターをなさなかった。このことから、SMは、従来知られた細菌とは系統学的由来が大きくかけ離れた、新しい属として位置づけられることが強く示唆された。