hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カチオンアンチポーター作用制御の分子機構の研究

本研究では、細胞膜カチオン交換輸送体の構造・機能相関、細胞内情報伝達系との相互作用、並びに、細胞生理における役割を明らかにする研究を行い、以下の結果を得た。1)従来から行っている増殖因子によるヒトNa^+/H^+交換輸送体(NHE1)活性化の機序の研究を続行し、NHE1が細胞内Ca^<2+>とカルモデュリン(CaM)及び蛋白質燐酸化をルートを介して加算的に活性調節されることを確立した。細胞内Ca^<2+>上昇は、NHE1へのCaM結合を引きおこし、本来この結合部位が待つ活性阻害作用を中和させるが、それにはこの部位のLeu639が重要であり、この部位とNHE1分子内に存在するそのアクセプター部位との相互作用は大変特異性が高いことが示された。また、NHE1の細胞質、ドメインに系統的な欠失変異を導入してNHE1活性の細胞内pH依存性を解析して細胞質ドメインが機能上少なくとも4つのサブドメインからなることを明らかにし、それぞれの機能を検討した。また、他のNa^+/H^+交換輸送体分子種NHE14間でキメラを作成し、ホルモンや増殖因子の作用、細胞体積調節などに関わる各分子種の細胞質ドメインの機能セグメントを明らかにする研究を進めた。Na^+/Ca^<2+>交換輸送体に関しては、血管平滑筋並びに心筋細胞の輸送体(NC×1)が、生理活性因子刺激によりcナーゼを介してリン酸化され、同時に、その輸送活性が増大することを明らかにし、その後、輸送体のリン酸化部位を同定した。また、この輸送体の特異的阻害剤の開発を行い、NC×1のCa^<2+>取り込みモードを選択的に阻害する薬剤(KB-R7943)が開発された。この薬剤は虚血性心筋障害などの治療薬の有望な候補である。また、最近、この新しい阻害薬および2価カチオン(Ni^<2+>やCo^<2+>など)によるこのアンチポーターの活性阻害には分子種特異性があり、NC×1およびNC×3分子種間のキメラを利用した膜イオン輸送通路の研究が可能であることが明らかになり、活性阻害に関与するアミノ酸残基が1部同定された。また、これらの研究に加えて、このNa^+/Ca^<2+>交換輸送体を高発現させることにより細胞膜直下のCa^<2+>濃度上昇を阻止したモデル細胞系を作成し、Na^+/H^+交換輸送体系、Ca^<2+>依存性Kチャネル及び細胞接着などの細胞反応制御におけるCa^<2+>シグナリングの貢献の程度を定量的に評価する研究を行った。a)これまでの研究で、ヒト1型Na^+/H^+交換

輸送系(NHE1)細胞質ドメインにはカルモジュリン(CaM)結合部位が存在し、NHE1のH^+センサーの作用を阻害すること、Ca^<2+>/CaMがこのセグメントの阻害作用を解除できることを示した。今年度はこのCaM結合部位に種々の変異を導入してこの部位の阻害機序について検討し、この部位のLeu639が機能上重要であり、これの変異はCaM結合部位の阻害作用を大幅に低下させること、これを他の疎水性アミノ酸では代替できないことがわかった。従って、この阻害セグメントとNHE1分子内に存在するアクセプター部位は大変特異性の高い相互作用をおこなうものと推定される。b)NHE1の細胞質ドメインの他のセグメントの機能的役割を検討し、この輸送体のpH感受性を生理的な範囲に高く維持するのに必要な部位が細胞質ドメインのN末端約70アミノ酸からなるセグメントに存在することが判明した。このセグメントは、pHセンサーの少なくとも一部を形成する可能性がある。c)NHEアイソフォーム間の機能的差異と構造的差異との関係を明らかにする初期の試みとして、NHE1とヒト3型Na^+/H^+交換輸送系(NHE3)との間で膜ドメインと細胞質ドメインを交換したキメラを作成しその機能を調べた。その結果、NHE3細胞質ドメインはCaMを結合できるにもかかわらず、NHE1の膜ドメインとのミメラでは、intactなNHE3と同様、Ca^<2+/>/CaMによる活性制御が起こらないこと、一方、NHE3の膜ドメインとNHE1の細胞質ドメインのキメラでは、intactなNHE1と同様、Ca^<2+>/CaMによる活性制御が起こることが判明した。従って、1型及び3型の膜ドメインの機能的類似性は高いことがわかった。d)血管平滑筋並びに心筋細胞のNa^+/Ca^<2+>交換輸送体が、エンドセリン-1、PDGFなどの生理活性因子刺激によりCナーゼを介してリン酸化され、同時に、その活性を増大させることを明らかにした。この際、輸送体cDNAを過剰発現させた培養細胞及び大腸菌に融合蛋白質として発現した輸送体細胞質ドメインをリン酸化してそのリン酸化ペプチドマッピング解析を行い、この輸送体の細胞質ドメインがCキナーゼにより直接リン酸化されることを示した。細胞膜Na^+/H^+(NHE)及びNa^+/Ca^<2+>(NCX)交換輸送タンパク分子の構造・機能相関並びに活性制御機序を明らかにする研究を行って以下の結果を得た。(1)普遍型NHE(NHE1)の細胞質ドメインに系統的な欠失変異を導入し、NHE1活性のpH_i依存性に及ぼす効果からこのドメインが少なくとも4つのsubdomainからなることを明らかにした。このうち、subdomain I(aa515-595)は、活性のpH_i依存性を生理的な範囲に維持するのに必須である。興味深いことに、このsubdomainの26個のアミノ酸残基からなるセグメント(aa540-566)を欠損させると細胞内ATP枯渇に伴うNHE1活性阻害(活性のpH_i依存性の酸性側へのシフト)が消失する。(2)NHE3は組織分布及びその機能・性質がNHE1と異なるが、NHE1と同様にカルモデュリン結合タンパク質であることが明らかになった。NHE3のCaM結合部位は細胞質ドメイン内のaa660-690であり、その結合親和性はかなり高い(Kd=50nM)。CaM結合部位の近傍にはPKAのリン酸化部位が存在し、この酸化によってCaM結合が阻害されることが見出された。(3)心筋細胞のNa^+/Ca^<2+>交換
確率論とその応用的側面の研究

確率論とその諸分野への応用について研究を行った。当初、分担者3名(計4名)で研究を始めていたが,10月より早川英治郎を加え計5名で共同研究を行った。研究方法としては、各分担者がそれぞれ専門の分野の研究集会等に参加し,各々の分野における情報・資料を収集し,その専門分野の研究を深めると共に,確率論におけるモデル化,応用等について,その可能性も含めて、討論と研究を行った。研究内容としては、第1に,今までの研究の継続として、非線型微分方程式の解の漸近挙動の研究を行った。種々の非線型微分方程式についての情報・資料を収集し、それらの検討、討論、研究を行った。特に半線型熱方程式のCauchy問題を考え,その解のt→∞における漸近挙動の初期値による分類を試みた。f(u)=u^<1+α>,α=4/(nー2)の場合は初期値a(x)と定常解の大小関数係で漸近挙動が分類できていたので,我々はα〉4/(nー2)の場合を研究していた。昨年11月の研究集会で,WeiーMingNiによってこの場合もα=4/(nー2)と同様の結果が成立することが報告された。現在、我々は初期値と非線型項を共に考慮した条件による(t→∞における)解の漸近挙動の分類について研究を行っている。研究内容の第2として、力学系、関数論の関連分野として、関数反復に関しての情報・資料の収集し研究を行った。この分野ではシミュレ-ションも有効な手段となるが、我々はマウスで簡単に取扱いできるソフトを開発して、数値実験を行っている。研究内容の第3として、解析的整数論に関する分野についても情報収集と討論を行った。この分野に関しては分担者の論文が発表される予定である。
人工抗体ライブラリーの作製とその利用法の確立

本研究は様々な抗原に対してそれをスクリーニングするだけで各々の抗原に特異的に結合する抗体が必ず含まれる抗体ライブラリー作製を実現するために必要な諸条件を検討するために実施された。抗体はHL両鎖のN末端に位置するV領域中のCDRと呼ばれる計6ヶ所が形造る構造を通して抗原に結合する。そこで我々はこのCDR配列のみを多様化した様々な抗体を含むライブラリーを作製する戦略を採用した。ライブラリー作製のためにファージ膜上に抗体を発現する系を用いることとした。最初、抗体の形状としてFab、Fv、scFv型抗体各々について比較検討し、Fab型とした。次にCDRに変異を導入することにより、抗原特異性を変化させる技術開発を行った。更にCDR移植実験を行って、抗原特異性を決定する上でフレームワーク上の数カ所のアミノ酸が重要な働きを持つことを示した。結果として抗原抗体反応に関する様々な知見を得たが、真に役立つ抗体ライブラリー作製には全く別の戦略の方が有効であると結論した。本研究で作製されている抗体ライブラリーは、様々な物質(抗原)に対してそれをスクリーニングするだけで特異的に結合する抗体が容易に取得できる性質を有することが理想である。抗体はFabの形で融合しM13ファージ粒子表面に発現される。平成9年度に次に挙げる3点の成果を得た。ステロイドには様々な誘導体が存在する、そこで抗原特異性の変換実験を行った。抗17-hydroxyprogesterone(17-OHP)抗体をコードする遺伝子を基に、最初コンピューターを用いて抗原結合部の立体構造モデルを構築した。抗原接触部と推定される多くの部位に多様な変異を導入した後cortiaolを抗原としてpanning法により新たにcortisol結合能を獲得したクローンを単離した。この方法は一般性が高く、抗11-deoxycortisol抗体を抗cortiso抗体へ変換することにも成功した。第二の研究は抗原結合力を増加した抗体の単離法の確立である。最初抗チトクロームC抗体であるE8と抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体D1.3の間でCDRの移植実験を行ったところ、フレームワークに位置するV_Hドメインの94番目のアミノ酸がCDRIIIの形造る立体構造に大きな影響を与えることが判明した。更に解析をすすめると27,29,94,101位のアミノ酸の組み合わせが重要であり、とりわけ101のアスパラギン酸(E8)をアスパラギンに変換するだけで数10倍の結合力が獲得された。本研究では、最初マウス遺伝子を基にライブラリー化を進めていたが、平成9年度途中からγ-グロブリン製剤化が可能なように全てヒト型抗体に変化した。それに必要なベクターの作製は終了し、ヒトV_L、V_H遺伝子を大量にクローニングしている。人工抗体ライブラリー作製の正否は、大腸菌中での発現-folding-V_HドメインとV_Lドメインのassemblyが正しく行ったクローンのみからなる多様なライブラリーをいかにして構築するかである。そこでFab型抗体が発現したファージ粒子のみを選別する系を確立した。本研究は、それを特定の抗原と混合してスクリーニングするだけで抗体を単離できる抗体ライブラリーを作製し、その利用法を確立することを目標に進められている。抗体はFabの形でcpIIIタンパクと融合してファージ膜上に発現されている。Bリンパ球に富む臍帯血や扁桃等の数10名の患者手術除去材料を出発材料にして、総数10^<11>個の独立したクローンからなる巨大なレパートリーを持つ抗体ライブラリーの作製を完了した。L鎖については数百種の遺伝子を単離し、全てその塩基配列を決定し、大腸菌中での発現-ホールディング-V_HV_Lドメインの会合が正しく起るクローンを200種用いて、H鎖については片寄りのないようにプライマーを選択し10^9以上のライブラリーを作製して、両鎖をcombinatorialに組み合わせてライブラリーを作製した。ライブラリーに含まれるクローンは、70%以上が正しくFab抗体を発現している。このライブラリーを用いて20種を越える様々な抗原物質に対してスクリーニングを行ったところ、抗原がスクリーニング用のチューブに付着する限り全ての抗原について多種類の抗体が単離できて作製した抗体ライブラリーが優れた性能を有することが示された。それぞれの抗体の抗原結合力は、解析した範囲内では10^65x10^7M^<-1>に分布した。

様々な用途に適した抗体の結合力は10^8M^<-1>以上であることが望ましいので、現在error-prone PCRを用いた変異の導入、抗原結合力の高いクローンのみを選択的に濃縮するスクリーニング法の開発に努めている。このシステム構築を完了した以降は、有用な抗体の単離、抗体ライブラリーを利用した新しい研究分野の開発を実施する。本研究は様々な抗原に対してそれをスクリーニングするだけで各々の抗原に特異的に結合する抗体が必ず含まれる抗体ライブラリー作製を目標に計画された。最初数10名のBリンパ球に富むヒト臨床材料を用いてその中で発現されている抗体遺伝子をRT-PCR法で数多く回収し、遺伝子ライブラリーを構築した。それをFab型の抗体がファージ粒子上にcp3と融合して発現される系を用いて1,000億種の抗体を含む抗体ライブラリーが出来上がった。この抗体ライブラリーを用いて数10種類の様々な性質をした抗原に対してスクリーニングしたところ、いづれの場合も複数種のモノクローン抗体を単離することができた。その中にはWestern blot用の試薬として、又発現プロフィール解析用試薬として役立つものも含まれている。更にタンパクの特定リン酸化部位を認識する抗体単離もスクリーニング法さえ工夫すれば可能であった。ほぼ最初計画した通りの理想的な抗体ライブラリー作製を完了したので、その利用法の開発を進める。
栄養および手術侵襲が肝薬物代謝酵素活性に及ぼす影響に関する研究

TPNモデルで栄養、手術侵襲が肝薬物代謝に与える影響を肝薬物代謝酵素の面から検討した。その結果、標準カロリー、過負荷カロリーのTPN施行によって、P-450含量、7-エトキシクマリン脱エチル化活性、アニリン水酸化活性、GST活性が低下した。低カロリーTPNではアニリン水酸化活性が低下し、アミノピリン脱メチル化活性が上昇した。手術侵襲によって、P-450含量、7-エトキシクマリン脱エチル化活性、アニリン水酸化活性、アミノピリン脱メチル化活性のすべての薬剤代謝活性と、GST活性が低下した。開腹手術後摂食群と開腹手術後TPN群ではP-450含量は減少し、測定した3種の薬剤代謝活性とGST活性が低下したが、開腹手術後に中鎖脂肪酸を含む経腸栄養剤を投与することによってP-450含量は増加し、3種類すべての薬剤代謝活性が上昇した。特に7-エトキシクマリン脱エチル化活性は手術後摂食群に比べて約8倍にも上昇した。脂肪を少量しか含まない経腸栄養剤の投与では、P-450含量と薬剤代謝活性が低下した。栄養や手術侵襲によるGSTの低下においては、GSTの分子種によって影響をうけるものとうけないものがあることが、抗GST抗体による免疫組織染色によって予想された。中心静脈栄養、経腸栄養、侵襲は、肝薬物代謝系や肝解毒系に大きな影響を与えることが示唆された。1. TPNの投与カロリーを変えて肝薬物代謝酵素活性を検討したところ,2日間のTPN施行により標準カロリー(225kcal/day)群と高カロリー(350kcal/day)群では,P-450含量は減少,7-エトキシクマリン脱メチル化活性,アニリン水酸化活性,GST活性は低下した.アミノピリン脱エチル化活性は各群間に差がなかった.体重は摂食群に比べてTPN施行例では各群とも低値で,とくに標準カロリー群がもっとも低値であった.肝体重比は摂食群に比べて低カロリー(100kcal/day)群,標準カロリー群ではやや低下し,高カロリー群では高値であった.2.標準カロリーTPN(225kcal/day)の投与日数で肝薬物代謝酵素活性を検討したところ,4日間施行群で7-エトキシクマリン脱エチル化活性,GST活性がもっとも低下し,8日施行群ではやや回復傾向がみられた.アニリン水酸化活性は1日施行群でもっとも低下した.アミノピリン脱メチル化活性には明らかな変化は認められなかった.体重は1日目に大きく低下するが,4日目で回復し,8日目では上昇していた.肝体重比は8日目で経口群より小さくなった.3.低カロリーTPN(100kcal/day)の投与日数で肝薬物代謝酵素活性を検討した.低カロリーTPNではP-450含量は減少せず,7-エトキシクマリン脱エチル化活性も低下しなかった.GST活性はやや低下,アニリン水酸化活性も低下した.一方,アミノピリン脱メチル化活性は上昇した.体重は減少し,4日目にも術前体重にまで回復しなかった.肝体重比は4日間投与でやや低下した.ラット栄養代謝モデルを用いて実験を継続した。肝薬物代謝酵素系の解析の結果から標準カロリー、過剰カロリーのTPNではP-450含量は減少し、7-エトキシクマリン脱エチル化活性、アニリン水酸化。活性、GST活性が低下した。低カロリーTPNではアニリン水酸化活性が低下し、アミノピリン脱メチル化活性が上昇することが明らかになった。また、開腹や片腎摘出などの手術侵襲によってP-450含量は減少し、すべての薬剤代謝活性とGST活性が低下した。一方、中鎖脂肪酸を含む経腸栄養剤を投与することによってP-450含量は増加し3種の薬剤代謝活性がすべて上昇し特に7-エトキシクマリン脱エチル化活性は手術後摂食群に比べて約8倍にも上昇したが、脂肪を少量しか含まない経腸栄養剤の投与ではP-450含量と薬剤代謝活性がともに低下した。しかし、第二相の反応であるGSTの活性は低下したままであった。

静脈・経腸栄養や手術侵襲が肝薬物代謝系に大きな影響を与え、脂肪の投与がP-450含量・活性に大きく関わることが明らかになった。
準ミリ波帯以上の高周波領域における電圧制御LC発振器の低位相雑音化の研究

本研究では、準ミリ波帯以上の周波数におけるCMOS無線通信用電圧制御発振器(VCO)の低位相雑音化を検討した。具体的には、VCOの増幅器回路の位相雑音に対する寄与と雑音伝搬の経路、およびLC共振器の位相雑音に対する寄与をバラクタとインダクタについて解析・改善を行った。バラクタの解析においてはサイズ依存性を明確にし、高Qバラクタを実現することで位相雑音を約10dB改善した。また、インダクタの解析おいては準ミリ波帯以上において表皮効果が課題になることを解明し、ストライプ構造をとることで位相雑音を約4dB改善した。以上本研究により準ミリ波帯以上のVCOの位相雑音を約14dB改善できることを確認した。1.MOSバラクタのQ値向上とそれによる電圧制御発振器の位相雑音の向上MOSバラクタのQ値向上方法としてゲート長の微細化により、一ユニットあたりの寄生抵抗を低減し、更に一定の容量値を得るためにユニット数を増加(並列接続)する事によって、全体としての寄生抵抗を大幅に削減することが可能となったが、一方、ゲート長が微細になることによって、配線等の寄生容量が増加し、MOSバラクタの容量可変範囲は低減することが見いだされた。具体的には、ゲート長2umから0.26umに低減することにより、Q値は約7倍向上し、容量可変範囲は約40%低減した。そのMOSバラクタを用いて、電圧制御発振器を試作・評価した結果、発振周波数約22GHzの発振器において、1MHz離調の位相雑音が約5dB向上することが可能となった。これは、共振器全体のQ値として約2倍向上したこととなり、MOSバラクタのQ値の共振器全体のQ値に対する寄与率が約40%程度であるためである。なお、本結果は、電子情報通信学会英文論文誌2014年3月号に掲載された。2.インダクタのQ値向上とそれによる電圧制御発振器の位相雑音の向上インダクタを断面積一定のもとストライプ形状とすることによって、期待される表皮効果を抑える効果により、高周波領域における寄生抵抗を低減させ、インダクタのQ値向上とそれを用いた電圧制御発振器の位相雑音の向上を検討した。具体的には、インダクタのメタルを3分割することにより実質的な寄生抵抗を(W + T)/(W + 3T)に低減し(W:メタル配線の幅、T:メタル配線の厚さ)、そのインダクタを用いた電圧制御発振器の位相雑音を評価し、3分割の効果を検討した結果、発振周波数21GHzの電圧制御発振器において、位相雑音を35dB向上することを確認した。この結果を、2013年アジアパシフィックマイクロ波会議において口頭発表した。昨年度の研究成果により、ストライプ形状のインダクタを用いた電圧制御発振器の位相雑音特性の向上が確認されたため、今年度は、(1)ミリ波領域および昨年度と異なる回路形式の場合における位相雑音特性向上の確認、(2)インダクタ自体のQ値向上の確認、(3)三次元的なストライプ形状の検討、(4)ストライプ形状のスペース幅依存性の検討、を目標とした。(1)のミリ波領域および昨年度と異なる回路形式の場合における位相雑音特性向上の確認については、昨年度と同一形状のストライプ形状のインダクタ(一辺50um)を用いた23GHzのPMOS発振器、25GHzのNMOS発振器および、更に小型のストライプ形状のインダクタ(一辺20um)を用いた40GHzのPMOS発振器を設計・試作・評価した結果、通常構造のインダクタを用いた電圧制御発振器に対して1MHz離調における位相雑音特性として、それぞれ3.6dB、1.9dB、3.0dBの位相雑音の改善を確認した。(2)のインダクタ自体のQ値向上の確認については、ストライプ形状のインダクタと通常構造のインダクタを単体で評価できるパターンを設計・試作し、Q値の代替として表皮効果が顕在化するコーナー周波数を評価した結果、ストライプ形状のインダクタのコーナー周波数は通常構造のインダクタに対して約1.5倍高周波化されていることを確認した。(3)の三次元的なストライプ形状の検討については、三次元ストライプ構造のインダクタを用いた電圧制御発振器の設計・試作を行ったが、現在評価中である。(4)のストライプ形状のスペース幅依存性については、スペース幅を24umとしたストライプ構造のインダクタを用いた電圧制御発振器の設計・試作を行ったが、こちらも現在評価中である。なお、(1)および(2)の結果は、2014年アジアパシフィックマイクロ波会議において口頭発表を行った。本研究の目的は、準ミリ波帯以上の周波数におけるCMOS無線通信用高周波電圧制御発振器の共振器回路のQ値、能動回路の雑音パラメータに着目し、その位相雑音の劣化原因を明らかにするとともに、それらの改善方法を提案することである。具体的な研究計画として、共振器回路のQ値については(a)MOSバラクタのQ値の劣化要因を明らかにしその改善方法を提案し、(b)インダクタのQ値の劣化要因を明らかにしその改善方法を提案する、また、(c)能動回路の雑音の位相雑音に対する影響を解析することである。

上記の目的・研究計画の(a)に対応する実績として、MOSバラクタのQ値劣化の要因がゲート側と基板側の寄生抵抗に起因する事を明らかにし、それぞれのパラメータがW/Lに対して逆方向の依存性を持つ、つまり最適点があることを示し、さらにゲートの微細化によりQ値が約7倍向上することを確認した。しかしながらトレードオフとしてMOSバラクタの容量可変範囲が約40%低減することも判明した。(b)に対応する実績として、高周波領域におけるインダクタのQ値の劣化が表皮効果であることを明らかにし、インダクタメタルを3分割したインダクタにより表皮効果が低減できることを示し、インダクタのQ値が約1.3倍向上することを確認した。さらに、発振周波数2124GHzの発振器および40GHzの発振器において、その位相雑音が35dB改善することを示した。(c)に対応する実績として、バイアス電流の増加と共にフリッカ雑音成分の重畳がおおきくなることを明らかにし、(b)でおこなった分割したインダクタの線間距離を広げることによりフリッカ雑音成分を低減できることを示した上記の結果より、申請時に計画した目的・研究計画は全て全うできたと考えているが、近接効果等の新たな問題も顕在化し、インダクタの設計としては更なる検討が必要となった。本研究では、準ミリ波帯以上の周波数におけるCMOS無線通信用電圧制御発振器(VCO)の低位相雑音化を検討した。具体的には、VCOの増幅器回路の位相雑音に対する寄与と雑音伝搬の経路、およびLC共振器の位相雑音に対する寄与をバラクタとインダクタについて解析・改善を行った。バラクタの解析においてはサイズ依存性を明確にし、高Qバラクタを実現することで位相雑音を約10dB改善した。また、インダクタの解析おいては準ミリ波帯以上において表皮効果が課題になることを解明し、ストライプ構造をとることで位相雑音を約4dB改善した。以上本研究により準ミリ波帯以上のVCOの位相雑音を約14dB改善できることを確認した。採択時の平成26年度目標は、平成25年度に設計した電圧制御発振器回路の試作・評価であったが、既に平成25年度中に設計・試作・評価を完了しその効果を確認できたため、平成26年度期初に平成26年度平成27年度の目標として、(1)ミリ波領域および昨年度と異なる回路形式の場合における位相雑音特性向上の確認、(2)インダクタ自体のQ値向上の確認、(3)三次元的なストライプ形状の検討、(4)ストライプ形状のスペース幅依存性、を設定した。それぞれの進行状況については、「研究実績の概要」に記したとおりであるが、達成度という観点より以下にまとめる。(1)のミリ波領域および昨年度と異なる回路形式の場合における位相雑音特性向上の確認については、ミリ波領域および三種類の準ミリ波領域の電圧制御発振器回路において位相雑音特性の向上を確認し学会発表を行った。したがって、この項の達成度は100%である。(2)のインダクタ自体のQ値向上の確認については、インダクタ自体の表皮効果が顕在化するコーナー周波数を評価した結果、ストライプ形状のインダクタが通常構造のインダクタに対して、そのコーナー周波数が高周波化していることを確認し学会発表を行った。したがって、この項の達成度も100%である。(3)の三次元的なストライプ形状の検討については、現在、設計・試作を終了しているが評価中であり、達成度としては70%である。(4)のストライプ形状のスペース幅依存性については、現在、設計・試作を終了しているが評価中であり、達成度としては70%である。以上の事から、平成26年度期初に平成26年度平成27年度の目標として立案した内容としての達成度は85%ということになるが、採択時の全体目標に対しては既に大きく上回り100%以上であるため、計画以上に進展していると考えている。
分子量1300万ダルトンの巨大粒子ボルトの立体構造決定

本研究において、ボルト(vault)粒子の回転対称が39回回転対称であることを明らかにした。この事実に基づいて構造解析を進めることで3.5 A分解能でボルト粒子外殻の全体構造を決定することに成功した。粒子外殻は78個のMVP (Major Vault Protein)で形成されており、粒子長軸が約670Å、胴体部分の最大直径が約400Åであった。MVPには12個のドメイン構造があり、そのうちの1つが脂質ラフトへの結合に重要であるとされるストマチンと非常によく似た構造を持つことが明らかになった。これにより、ボルトが脂質ラフトに結合する可能性を示すことができた。1986年に米国UCLAのRomeLH.らのグループによってラット肝臓より単離されたボルトは、3種類の蛋白質と1種類のRNAによって構成されており、分子量約1300万Daでサイズが約40×70nmという今日までに報告されている中では最大のRNA-蛋白質複合体である。ほとんどの粒子は細胞質内に存在するが、全体量の5%程度が核膜孔複合体(NPC)とその周辺に局在し、核一細胞質間物質輸送に関与しているのではないかと考えられている。しかし、発見から20年以上を経た現在もなお、生理的な輸送基質は明らかになっていない。最近になり、ヒト由来ボルトを構成するRNAが、抗癌剤のミトキサントロンと特異的に結合するという報告があり、ボルトの多剤耐性への関与を示す有力な証拠となっている。また、緑膿菌感染の際、ボルトが肺上皮細胞の脂質ラフトに急速に集まる現象が確認されており、自然免疫反応への関与も示されている。この様な生体超分子複合体の機能は、各構成成分によって巧妙に制御されている事がいため、ボルト粒子全体の立体構造決定は機能解明のための大きな突破口を開くことが期待される。我々はボルトの全立体構造を決定するため、粒子を構成成分にばらさずに生体内に存在するそのままの状態で取り出し、結晶化することに成功した。得られた結晶はSPring-8の生体超分子専用ビームラインBL44XUにおいて3.5ωÅ分解能の反射を示した。現在、ボルト粒子のクライオ電顕モデルを初期位相として用いた分子置換法と非結晶学的対称(NCS)による平均化によって構造解析を進めている。ボルト(vault)は1986年に来国UCLAのL. H. Romeらによって発見された巨大な粒子である。本粒子は3種類の蛋白質と1種類のRNAで構成され、分子量は約1000万、粒子長軸の長さが約700A、胴体部分の最大直径が約400Aで、細胞質内に存在する最大の分子量を持つ蛋白質-核酸複合体粒子である。樽型をした粒子の外殻はMVP(Major Vault Protein)の多量体によって構成され、他の成分は粒子内部に存在している。本粒子については、これまで様々な役割が報告されているが、粒子の発見から20年以上を経た現在もなお、本質的な機能は解明されていない。よって、本研究では、vaultの全体構造決定を機能解明へのbreakthroughにするため、ボルト粒子全体のX線結晶構造解析に着手した。そして、2008年に3.5A分解能でボルト外殻の全立体構造決定に成功した。構造情報からは、機能解明に繋がる非常に興味深い事実が明らかになってきた。粒子外殻を形成する蛋白質であるMVPの12個あるドメイン構造のうちの1つが、脂質ラフトへの結合に重要であると言われるストマチンと類似の構造を持つことが分かったのである。この事実は、2007年に米国・Harvard大学の研究グループによって報告された「ボルトの自然免疫反応への関与」を強力に支持するものであった。彼らは、緑膿菌が肺上皮細胞に感染する際、肺上皮細胞の脂質ラフトにボルトが急速に集まることで、緑膿菌の内部移行が促進され、自然免疫反応への受け渡しがスムーズにわれて免疫抵抗性が高まるという現象を発見したのである。現段階では、ボルトの本質的な機能は解明されていないが、本研究によりボルトが脂質ラフトに結合する可能性を示せたことで、これまで散漫気味であった機能解明の研究において1つのしっかりとした方向性を示すことができた。
脊髄損傷後の歩行機能再獲得のための神経リハビリテーション方法の開発

本研究では脊髄損傷後の歩行機能獲得のkeywordとして歩行運動の発現に貢献すると目される脊髄中枢パターン発生器(CPG)の性質についての神経生理学的研究を行い、新たなコンセプトに基づく神経リハビリテーション方法を提案することを目的とした。脊髄CPGの機能的役割についての検証実験では、歩行運動中の上肢運動に伴って脊髄の異なる髄節問を跨ぐ神経回路が活性化されることを実証した。12週間の動力歩行装置を用いた歩行リハビリテーションの効果を検証した研究では、過剰な痙性麻痺の減弱傾向と歩行中の荷重入力をトリガとした合目的的な筋活動応答の発現を示唆する重要な所見が得られた。これらの知見は、脊髄損傷後の歩行機能回復のkeywordとなる脊髄CPGの性質についての重要な情報を与え得るものであり、本研究の中核となる貴重な知見である。本研究では、近年盛んに行われている中枢神経再生に関する研究成果に呼応して、その後の歩行機能再獲得を円滑に実現するための効果的なリハビリテーション方法を開発することを目指す。具体的には、脊髄損傷後の歩行機能獲得のkey wordとして歩行運動の発現に貢献すると目される脊髄中枢パターン発生器(CPG)の性質に着目、脊髄CPGの性質についての神経生理学的研究を行うと共に、その活動を励起させる手段を検索し、新たなコンセプトに基づく神経リハビリテーション方法を提案する。本研究の目的は脊髄損傷によって歩行機能障害を有する患者に対し、脊髄CPGの活動を励起する適切な神経入力を与えることによりuse-dependent plasticityを促し、合目的的に歩行機能回復を実現する神経リハビリテーション方法を考案することである。【22年度の研究成果】22年度は脊髄CPGの特性についての基礎的検討および脊髄CPGの活動を励起するための効果的な方法の検索を行った。具体的には、左右の下肢間および上肢-下肢間を跨ぐ脊髄神経回路の特定とその機能的意義、さらに体肢協調運動時における高位中枢の活動と上記の脊髄神経回路との連関について検討した。動力歩行装置による受動的歩行運動中に脊髄損傷者の麻痺下肢に発現する歩行様筋活動は、上肢動作の印可や付加的な随意神経指令によって合目的的に調節されることが明らかになった。これらの研究成果は、脊髄損傷後の歩行機能回復のkey wordとなる脊髄CPGの性質についての重要な情報を与え得るものであり、本研究の中核となる貴重な知見である。また、脊髄不全損傷者に対する歩行リハビリテーションの有効性に関する縦断的研究を開始し、22年度中に3名の実験を終了した。【23年度の研究成果】23年度は、脊髄不全損傷者に対する歩行リハビリテーションの有効性に関する縦断的研究を引き続き進め、これまでに6名が終了、1名が現在進行中である。12週間の動力歩行装置を用いた受動ステッピングトレーニングによって、過剰な痙性麻痺の減弱傾向と、歩行中の荷重入力をトリガにした合目的的な筋活動応答の発現を示唆する重要な所見が得られた。また、上肢と下肢間の神経連絡と、その歩行への貢献度についての実験を実施し、上肢運動に伴う随伴的な下肢への神経投射のみならず、脊髄の異なる髄節間を跨ぐ神経回路が活性化される可能性が示唆された。これらの知見は、脊髄損傷後の歩行機能回復のkey wordとなる脊髄CPGの性質についての重要な情報を与え得るものであり、本研究の中核となる貴重な知見である。

本研究の目的は脊髄損傷によって歩行機能障害を有する患者に対し、脊髄CPGの活動を励起する適切な神経入力を与えることによりuse-dependent plasticityを促し、合目的的に歩行機能回復を実現する神経リハビリテーション方法を考案することである。研究期間中に脊髄不全損傷者に対する歩行リハビリテーションの有効性に関する研究を進め、13名の横断的検討、7名の縦断的検討を行った。縦断的検討では、歩行動作と麻痺下肢筋活動の関連性についての重要な知見を得ることができた。12週間の動力歩行装置を用いた受動ステッピングトレーニングの効果を検証した縦断的検討では、過剰な痙性麻痺の減弱傾向と、歩行中の荷重入力をトリガにした合目的的な筋活動応答の発現を示唆する重要な所見が得られた。また、上肢と下肢間の神経連絡と、その歩行への貢献度についての実験を実施し、上肢運動に伴う随伴的な下肢への神経投射のみならず、脊髄の異なる髄節間を跨ぐ神経回路が活性化される可能性が示唆された。これらの知見は、脊髄損傷後の歩行機能回復のkey wordとなる脊髄CPGの性質についての重要な情報を与え得るものであり、本研究の中核となる貴重な知見である。歩行運動に関連した脊髄神経回路についての実験的検討は順調に進んでおり、3年目に新たに脊髄硬膜外刺激を用いた実験に展開できる足がかりを得ることができた。脊髄不全損傷者を対象とした12か月の歩行リハビリテーションの効果を検証する縦断的実験は、震災の影響で予定より実施人数に若干の不足があるが、最終年度までに予定の人数を終えることは十分に可能と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。歩行機能回復のための具体的な方法論確立を目指して、科学的根拠を得る基礎実験的視座と等分に、歩行リハビリテーションを行う際の注意点や患者さんに対するケアなどについても体系的に情報を整理していく予定である。学会発表、論文発表のみにとどまらず、臨床現場でリハビリテーションに携わる理学療法士、作業療法士との意見交換、情報提供を積極的に行うなど、研究成果の還元に鋭意、努力していく予定である。
細胞膜張力がアクチンのパターン制御を通して管状組織の機械的強度を調節する

生体の管構造を支持する細胞内骨格パターンとして、リング状のアクチン繊維が等間隔に配列する現象が報告されている。管状上皮であるショウジョウバエ気管では内径拡張時、内腔側の細胞膜直下に等間隔アクチンリングが出現し、個体の成長に応じてリングの直径と間隔が拡張する。本研究は、この等間隔アクチンリングの形成・調節機構の上流には細胞膜にかかる張力があるという仮説に基づいて行っており、1等間隔アクチンリング形成過程のアクチンパターン、2等間隔アクチンリング形成・調節に必要なアクチン結合分子・膜脂質、3気管アピカル膜にかかる張力によるアクチンパターン及び管構造強度への影響、4ほ乳類培養細胞系での検証、の4点に着目した研究実施計画を立てた。本年度は、上記の1について、超解像顕微鏡技術(Zeiss社のAiryscan)を用いて気管の拡張前後におけるアクチンパターンの遷移を詳細に観察し、定量的に解析する手法を構築した。その結果、気管拡張前は管の長軸方向を向いていた斑点状のアクチンの集合体が、管の拡張とともに周長方向へ向きを変え、次第に長くなりながらアクチンケーブルを構成し、リングになることが明らかとなった。また、各々のアクチン集合体の移動度および移動方向を定量し、それぞれが気管という組織の方向を感知するシステムあるのではないかという示唆を得た。2について、ショウジョウバエのゲノムからアクチン結合分子と推定されている全遺伝子を候補として、アクチンリングに必要とされる遺伝子をRNAi発現系統を用いて網羅的に探索した結果、16の重要な分子を同定した。RNAi系統によるノックダウン時の表現型を比較することで、気管の拡張とアクチンパターンの関係が整理できると考えられる。研究実施計画の1等間隔アクチンリング形成過程のアクチンパターン、2等間隔アクチンリング形成・調節に必要なアクチン結合分子・膜脂質、3気管アピカル膜にかかる張力によるアクチンパターン及び管構造強度への影響、4ほ乳類培養細胞系での検証、の4点のうち、1と2に関しては計画通り遂行できている。2では、さらにそれぞれの分子の局在を調べるため、GFP融合系統をショウジョウバエ系統ライブラリーから取り寄せるか、もしライブラリーに無い場合はGFPを融合したタンパク質の発現系統を作製中である。GFP融合タンパク質発現系統と、RNAi発現系統を組み合わせることで、3へ効率的なアプローチが可能になると考えられる。2の膜脂質に関しては既存のマーカーの輝度が低く、種類も少ないため、まだ信頼のおけるデータが得られていないが、こちらも得られたアクチン結合分子から候補の膜脂質を絞り、検証していきたいと考えている。2年目は、1等間隔アクチンリング形成過程のアクチンパターン、についてアクチン集合体のダイナミクスの定量的な解析を進め、終わらせる。2等間隔アクチンリング形成・調節に必要なアクチン結合分子・膜脂質、については、スクリーニングで同定された必須のアクチン結合分子のGFP融合系統を用いて、それぞれの分子がアピカル膜上のどこで機能しているかを調べ、張力感知システムとして考えられる分子機構を想定する。そして3気管アピカル膜にかかる張力によるアクチンパターン及び管構造強度への影響、に関してアクチンパターンを乱した時の管構造を検証し、その強度を推定する。また、全長の短い変異体や、一部の筋肉活動を阻害して張力のかからない状況にした際に、管構造およびアクチンパターンがどのように変化するかを検証する。3年目は、4に関して、23で想定された分子機構が、ほ乳類細胞に保存されているかどうかを検証する。得られた結果を論文としてまとめ、国内外の学会で発表する。

研究実施計画の1等間隔アクチンリング形成過程のアクチンパターン、2等間隔アクチンリング形成・調節に必要なアクチン結合分子・膜脂質、3気管アピカル膜にかかる張力によるアクチンパターン及び管構造強度への影響、4ほ乳類培養細胞系での検証、の4点のうち、1と2に関しては計画通り遂行できている。2では、さらにそれぞれの分子の局在を調べるため、GFP融合系統をショウジョウバエ系統ライブラリーから取り寄せるか、もしライブラリーに無い場合はGFPを融合したタンパク質の発現系統を作製中である。GFP融合タンパク質発現系統と、RNAi発現系統を組み合わせることで、3へ効率的なアプローチが可能になると考えられる。2の膜脂質に関しては既存のマーカーの輝度が低く、種類も少ないため、まだ信頼のおけるデータが得られていないが、こちらも得られたアクチン結合分子から候補の膜脂質を絞り、検証していきたいと考えている。2年目は、1等間隔アクチンリング形成過程のアクチンパターン、についてアクチン集合体のダイナミクスの定量的な解析を進め、終わらせる。2等間隔アクチンリング形成・調節に必要なアクチン結合分子・膜脂質、については、スクリーニングで同定された必須のアクチン結合分子のGFP融合系統を用いて、それぞれの分子がアピカル膜上のどこで機能しているかを調べ、張力感知システムとして考えられる分子機構を想定する。そして3気管アピカル膜にかかる張力によるアクチンパターン及び管構造強度への影響、に関してアクチンパターンを乱した時の管構造を検証し、その強度を推定する。また、全長の短い変異体や、一部の筋肉活動を阻害して張力のかからない状況にした際に、管構造およびアクチンパターンがどのように変化するかを検証する。3年目は、4に関して、23で想定された分子機構が、ほ乳類細胞に保存されているかどうかを検証する。得られた結果を論文としてまとめ、国内外の学会で発表する。購入予定だったコンピューター及びソフトウェアは、在籍する研究室のものを使用できたため、購入を見送った。また、スクリーニング補助員の雇用に関しても、所属先の雇用する補助員に協力を仰ぐことができたため、今年度は予算を使用しなかった。翌年度の使用計画として、改めて実験補助員の雇用費として、加えて合成DNAや、ショウジョウバエ変異体系統の作製に使用する予定である。
災害被災住民の支援ニーズ変容プロセスと地域精神保健の課題-GHQ30項目版による計量疫学的研究-

1990年11月に始まった雲仙岳噴火災害は、1996年6月に噴火終息宣言が出されるまでに、44人の死者と広大な農耕地や多数の・家屋の焼失・埋没をもたらした。1991年9月から1995年9月までの期間に行われた被災住民の精神的健康に対する支援活動の中で、総計5回の健康調査が実施された。調査によって、次の諸点が明らかになった。(1)General Health Questionnaire30項目版(GHQ)の所見から、(1)GHQ得点8点以上(GHQ高得点者)のハイリスク群は、被災から8年間で66.9%から32.4%へと低下したが、被災地と同じ島原半島にあり、社会・経済状況が類似した対照地域の住民のGHQ高得点者率(12.3%)よりも明らかに高い水準にあった。しかし、(2)「不安感・緊張感」関連症状や「社会的無能力感」関連症状などは、避難生活開始から12ヶ月で改善した。(3)「抑うつ感」関連症状は、避難生活開始から3年4年以上も継続していた。(4)「対人関係困難感」関連症状は、被災から8年後にも継続していた。このように、被災住民の精神状態は時間経過と共に変化することが明らかになった。(2)自宅に戻った後の被災住民の生活実態と精神状態との関連でみると、(1)生活リズムの顕著な変化、(2)家族内役割の顕著な変化、(4)馴染みの人との付き合い減少、(5)健康感の喪失、などは精神的不健康と有意な関係にあった。(3)被災住民の精神的不健康のリスク要因は、(1)女性、(2)中・高齢者、(3)持病で長期間の受療者、(4)初期の頻回避難経験者、(5)自営業的就業者などであった。災害発生時には、被災住民の支援ニーズ変容プロセスを念頭に置いて、支援活動を行うことの必要性が明らかになった。雲仙岳の噴火活動は終息に向かったが、(1)新しい居住地への集団移転、(2)小・中学校の統廃合、(3)家族離散による独居老人の新生活再建、(4)「先祖伝来の土地」が基盤である自営業者や農業従事者の生活復興に対する意見の対立、などの諸問題は残ったままである。このような状況のなかで、「頻回の避難歴」、「仮設住宅での避難生活」、「自営業的職業」、「通院を必要とする身体的問題」などの日常生活要因を時間経過・性別に検討すると、(1)男性の場合はそれらの要因が精神医学的問題に対するリスク要因として作用を及ぼしていなかった。しかし、(2)女性の場合、時間が経過すると共に、「仮設住宅での避難生活」、「自営業的職業」、「通院を必要とする身体的問題」などは精神医学的問題を悪化させるリスク要因として作用していた。更に、女性の場合、それらのリスク要因は時間経過と共に次第に加重されていく特性を有していた。また、(3)女性の場合、20歳代と30歳代の若年者におけるストレス度は時間経過と共に有意に低下していくのに対して、40歳代以降の中・高齢者におけるストレス度は高いまま経過するという傾向が認められた。つまり、年齢が高くなればなるほど、ストレス度も有意に高くなるという線形関係を示した。しかし、男性にはこのような現象が顕著な形で現れることは無かった。つまり、災害ストレスの影響には性差と年齢差を認めた。

これらの所見から、被災住民に対する支援対策は、支援ニーズ変容プロセスを念頭に置いて行わなければならないことが明らかになった。雲仙岳の噴火活動は1996年に終息したが、(1)新しい居住地への集団転移、(2)小・中学校の統廃合、(3)家族離散による独居老人の新生活再建、(4)「先祖伝来の土地」が基盤である自営業者や農業従事者の生活復興に対する意見の対立など、現実的な復興過程には諸問題が残ったままである。本格的な避難生活開始後44カ月が経過した時点までに、(1)不安・緊張感、無能力・社会的機能障害感は早期から有意に改善したが、(2)抑うつ感、対人関係困難感は遷延ないし悪化の傾向をたどった。(3)日本の一般人口におけるGHQ8点以上の高得点者率は1525%という報告が多いが、避難住民の高得点者率は、44ケ月が経過した時点でさえ、約46%と高水準のままであった。これらの所見は、避難生活によって、被災住民個々人の安全性と活動性は早期に改善するが、「同じ被災者」という共有感情が消失した後の対人軋轢は容易に改善し難い性質を帯びていることを示唆している。また、(4)自宅や農耕地などに実害にあった群と無かった群を比較しても、GHQ得点の推移・変動は同様なパターンを示した。このことは、災害によって地域社会が破壊されると、その影響は直接失った財産によらず、地域社会に大きな変動を起こし、地域住民全体に波及することを示している。今回の結果は長期的な避難生活を強いられた被災住民の精神保健的支援ニーズが変容していくプロセスを確実にとらえる必要性と、そのプロセスを踏まえた上で支援対策を行うことの重要性を示唆している。雲仙岳噴火活動は1990年11月に始まり、1996年6月に噴火終息宣言が出された。自宅生活を開始した被災住民の精神的健康状態の追跡調査を1998年11月に行った。今回の調査では、自己評価式質問票General Health Questionnaire30項目版の実施と共に、米国精神医学会の診断基準・DSM-IVの「外傷後ストレス障害(PTSD)」の構造化面接であるClinician Administered PTSD Scale(CAPS)を用いて被災住民137人の面接を行った。137人中の64人がCAPSのA項目を満足していた。64人中で全ての診断基準を満足していたのは16人であり、噴火開始時点から8年間におけるPTSDの生涯有病率は25.0%となった。性別にみると、男性は4人、女性は12人であった。面接時の年齢別にみると、50歳代が5人、60歳代が8人、70歳代が3人となっていた。阪神・淡路大震災から3年9ケ月のPTSD生涯有病率は20.5%、臨床閾値下の事例は23.3%であったとされている。雲仙岳噴火災害の観察期間は8年間であり、阪神・淡路大震災の観察期間の約2倍であるが、PTSD生涯有病率は5%の差異の間に収まっている。両災害における地域メンタルヘルス・サービスは「精神科診断学」を基盤とした活動ではなく、生活支援的色彩が強く、PTSDの全発病例を捉えているとは限らないため、この5%の差は発病率の差とは断定できない。阪神・淡路大震災におけるPTSD不全例が23.3%であったことから判断しても、表に現れない潜在性のPTSDも少なくないと推察される。また、診断基準を満たしていなくても、侵入症状・睡眠障害・不安症状で悩む被災住民は多いと考えられ、その支援ニ一ズをくみ取りつつ、長期的な支援活動を実施する必要がある。
老化抑制遺伝子Klothoを用いた血管及び心移植後の血管内膜肥厚に関する研究

Klotho遺伝子は個体老化と血管障害を抑制する新規遺伝子である.我々は当初,直接klotho遺伝子の血管内皮細胞の保護効果を検討することを研究目標とした.Klotho遺伝子の役割を解明するために,klotho蛋白の標的となりうる血管平滑筋細胞の増殖様式の基礎研究を竹うことを第1の目標とした.平滑筋細胞増殖分子機構においては転写因子レベルで未知の点が多いため,我々はzinc finger型転写因子のbasictranscription factor binding protein 2(BTEB2)に着目した.まず,in vitroの実験において平滑筋細胞の増殖刺激によりBTEB2遺伝子の発現が誘導されることを突き止めた.さらに血管平滑筋の形質変換が誘導され,BTEB2遺伝子は血管病変の形成に関与すると予想された.次いでin vivoにおける検討を行った.我々が用いた動物モデルは,従来のバルーンを用いた血管内膜障害モデルに加え,心移植モデル,血管移植モデル及び外科的侵襲による血管内膜障害の新しいモデル(血管吻合部狭窄モデル)であった.すなわち,PTCA後の再狭窄,移植後の血管内膜肥厚,冠動脈バイパス後の吻合部狭窄など,患者の生命予後を左右する重要な合併症のモデルにおけるBTEB2の発現経過を検討した.なお,血管吻合部狭窄モデルは我々が開発した新しい実験モデルであった.ラット腹部大動脈に対し切開縫合による侵襲を加えた結果2週間目をピークに内膜肥厚が完成するもので,吻合部狭窄の機序解明に有用であると考えている.以上の各モデルで免疫染色およびmRNAレベルで検討を行い,BTEB2が血管平滑筋細胞の増殖過程で経時的に一致して発現し,内膜肥厚の形成に重要な役割を果たす可能性がin vivoでも確認された.以上の実績を上げたが,BTEB2遺伝子とklotho遺伝子の相互関係を検討し,klotho遺伝子の本質に迫るといった更なる目標は達成できなかった.今後の研究が待たれるものである.Klotho遺伝子は個体老化と血管障害を抑制する新規遺伝子である.我々は当初,直接klotho遺伝子の血管内皮細胞の保護効果を検討することを研究目標とした.Klotho遺伝子の役割を解明するために,klotho蛋白の標的となりうる血管平滑筋細胞の増殖様式の基礎研究を竹うことを第1の目標とした.平滑筋細胞増殖分子機構においては転写因子レベルで未知の点が多いため,我々はzinc finger型転写因子のbasictranscription factor binding protein 2(BTEB2)に着目した.まず,in vitroの実験において平滑筋細胞の増殖刺激によりBTEB2遺伝子の発現が誘導されることを突き止めた.さらに血管平滑筋の形質変換が誘導され,BTEB2遺伝子は血管病変の形成に関与すると予想された.次いでin vivoにおける検討を行った.我々が用いた動物モデルは,従来のバルーンを用いた血管内膜障害モデルに加え,心移植モデル,血管移植モデル及び外科的侵襲による血管内膜障害の新しいモデル(血管吻合部狭窄モデル)であった.すなわち,PTCA後の再狭窄,移植後の血管内膜肥厚,冠動脈バイパス後の吻合部狭窄など,患者の生命予後を左右する重要な合併症のモデルにおけるBTEB2の発現経過を検討した.なお,血管吻合部狭窄モデルは我々が開発した新しい実験モデルであった.ラット腹部大動脈に対し切開縫合による侵襲を加えた結果2週間目をピークに内膜肥厚が完成するもので,吻合部狭窄の機序解明に有用であると考えている.以上の各モデルで免疫染色およびmRNAレベルで検討を行い,BTEB2が血管平滑筋細胞の増殖過程で経時的に一致して発現し,内膜肥厚の形成に重要な役割を果たす可能性がin vivoでも確認された.以上の実績を上げたが,BTEB2遺伝子とklotho遺伝子の相互関係を検討し,klotho遺伝子の本質に迫るといった更なる目標は達成できなかった.今後の研究が待たれるものである.Kiotho遺伝子は個体老化と血管障害を抑制する新規遺伝子である.平成11年度はklotho遺伝子の病態生理学的意義を検討するために,klotho蛋白の標的となりうる血管平滑筋の増殖様式の基礎研究を行った.平滑筋細胞増殖分子機構においては転写因子のレベルで未知の点が多いため,我々はzinc finger型転写因子のbasictranscription factor binding protein 2(BTEB2)に着目した.まず,BTEB2がin vitroで平滑筋増殖に重要な役割を担うことを確認した(Watanabe N,etal.Circulation Res 1999;85:182-191.Kawai-Kowase K,etal.Circulation Res 1999;85:787-795).すなわち,平滑筋細胞の増殖刺激により,BTEB2遺伝子は発現が誘導された.その結果血管平滑筋の形質交換が誘導され,BTEB2遺伝子は血管病変の形成に関与すると考えられた.次いでBTEB2がin vivoでも同様の役割を演じていることを確認した。(Ogata T,etal.JThorac Cardiovasc Surg,in press).なおこの時我々が用いた動物モデルは,従来のバルーンを用いた血管内膜障害モデルとは異なる,外科的侵襲による血管内膜障害の新しいモデルであった.このモデルでは,ラット腹部大動脈に対し切開縫合による侵襲を加えた結果,2週間目をピークに内膜肥厚が完成することが確認された.我々は,血管外科における血管吻合部狭窄モデルとして有用であると考えている.以上の実績をもとに,来年度は1)心移植モデルなど,他のモデルでもBTEB2の同様の役割を確認する.2)BTEB