hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
各国統計制度分析による国際港湾貨物統計のデータ・エディティング手法の開発

さらに,昨年度にケーススタディとして収集したパナマ運河庁の統計データについて,港湾統計と同様に活用可能であることが確認されたため,米国港湾貨物データと兼ね合わせた分析結果を,土木学会論文集B3(海洋開発,査読付き)にて発表した.加えて,本研究全体のとりまとめとして,各国港湾貨物統計データの現状,精度分析,データ・エディティング,精度向上に向けた国際共通化への分析等を,国土技術政策総合研究所研究報告として発表した.
Exocyst複合体の構造・機能解析による膜融合制御機構の解明

開口放出における分泌小胞の特定の位置への標的膜への繋留は,exocyst複合体と呼ばれる繋留因子よって行われる.しかし,その分子機構は未だに不明である.本研究では,exocyst複合体による小胞の繋留機構を解明する目的で,exocyst複合体サブユニットSec6のホモログタンパク質M-SecのX線結晶構造解析を行った.得られた構造からは,M-Secの構造をとっていないN末端領域を除く領域が繋留因子に特徴的な構造であるヘリックスバンドル構造であることが明らかとなった.N末端領域には,塩基性のアミノ酸残基が多く存在することから,M-SecがN末端領域を介して膜成分であるイノシトールリン脂質と相互作用する可能性が示唆された.このため,in vitroにおいてイノシトールリン脂質との結合実験を行なった.その結果,M-Secがイノシトールリン脂質との結合能を持つことが明らかとなった.そこで,M-Secとイノシトールリン脂質との結合様式を明らかにするため,M-Secとイノシトールリン脂質のヘッドグループとの複合体の構造解析を目指し研究をすすめ,最終的に複合体の結晶化に成功した.開口放出では,細胞内で合成された分子は各オルガネラから産み出される分泌小胞に載り,標的膜へと移動し,最終的に小胞のオルガネラ膜への融合により輸送される.小胞は標的膜へと融合する前段階として一時的に標的膜へと繋ぎ留められ,この段階で適切な場所への輸送であると判断された小胞は標的膜へと融合する.融合は不可逆な過程であるため,繋留の段階は分子が正しく輸送されるための最後の修正可能な過程であると考えられる.繋留過程では,exocyst複合体と呼ばれる分子量約750kDaのヘテロ8量体が小胞や標的膜上の低分子量GTPaseやイノシトールリン脂質による制御のもとで分泌小胞を標的膜に特異的に繋ぎ留める.本研究は、低分子量GTPaseとExocyst複合体による膜融合制御機構の解明を目指す.申請者は,exocyst複合体がどのように標的膜上の低分子量GTPaseやイノシトールリン脂質を認識するのかを明らかにする目的で,出芽酵母由来のexocyst複体の標的膜結合サブユニットSec3と低分子量GTPase Rho1とのX線結晶構造解析を行った.得られた構造からは,イノシトールリン脂質の結合様式を示唆するようなリン酸分子の結合も確認された.結晶構造に基づく変異体を用いたin vitroでの結合実験やin vivoでの局在変化の観察から,出芽酵母のexocyst複合体の標的膜結合サブユニットは低分子量GTPaseとイノシトールリン脂質の相補的な制御のもとで標的膜へと特異的に局在することを明らかにした.開口放出における分泌小胞の特定の位置への標的膜への繋留は,exocyst複合体と呼ばれる繋留因子よって行われる.しかし,その分子機構は未だに不明である.本研究では,exocyst複合体による小胞の繋留機構を解明する目的で,exocyst複合体サブユニットSec6のホモログタンパク質M-SecのX線結晶構造解析を行った.得られた構造からは,M-Secの構造をとっていないN末端領域を除く領域が繋留因子に特徴的な構造であるヘリックスバンドル構造であることが明らかとなった.N末端領域には,塩基性のアミノ酸残基が多く存在することから,M-SecがN末端領域を介して膜成分であるイノシトールリン脂質と相互作用する可能性が示唆された.このため,in vitroにおいてイノシトールリン脂質との結合実験を行なった.その結果,M-Secがイノシトールリン脂質との結合能を持つことが明らかとなった.そこで,M-Secとイノシトールリン脂質との結合様式を明らかにするため,M-Secとイノシトールリン脂質のヘッドグループとの複合体の構造解析を目指し研究をすすめ,最終的に複合体の結晶化に成功した.
ウイルス性肝炎治療抵抗性に関わる新たな宿主因子の解析

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
細菌性リポ多糖類LPSを用いた脳虚血耐性現象における小胞体ストレスシグナルの解析

研究代表者である古屋一英は、2003年度から2004年度の基盤研究(C)(2)において「細菌性リポ多糖類(LPS)を用いた脳虚血耐性誘導現象における小胞体(ER)ストレスシグナルの解析」について3,200(千円)の研究経費にて研究を行ってきた。この実験では、虚血耐性獲得メカニズムのなかで、ERストレスの軽減が関与しているという仮説を立て、実験を行った。具体的には、非致死的虚血刺激は、1)ストレスセンサー蛋白質Irelの活性化を増強し、下流へのシグナル伝達を促進させ、GRP78をはじめとする小胞体分子シャペロン群のup-regulationを起こすことによって神経細胞死を引き起こしにくくさせ、2)ストレスセンサー蛋白質PERKを介する(本実験では、まだ証明されていないが)翻訳開始因子(eIF2α)のリン酸化を抑制することによってERストレス負荷を軽減する、というものである。実験では、2分前脳虚血によるラット虚血耐性モデルを用いて、2分虚血後、2+6分虚血後、6分虚血後海馬CA1領域におけるGRP78、Ire1-α、p-PERK、p-eIF2αの発現をwestern blot法にて検討した。前脳虚血モデルでは、リン酸化eIF-2αの発現が、preconditioning(前処置)群、虚血耐性群で抑制されており、仮説通りERストレスが抑制されていることを強く示唆する実験結果であった。また、局所脳虚血では、Grp74,Grp94共に、LPSによる虚血耐性に関与していることが示唆されたが、特にGrp94の関与が強いと思われた。現在までに我々はラットの局所脳虚血モデルを用いてLPSによる虚血耐性が獲得されることを明らかにしている。またこの機構にスフィンゴミエリンサイクル、特にセラミドが関与することを実証している。このように、これまでの実験結果の蓄積過程でLPSによりセラミド合成の場でもある小胞体にストレスがかかることが示唆され、非致死的なLPS投与による耐性誘導過程で小胞体が果たしている役割が大きいのではないか?と推測するに至った。今回の研究では、局所の脳虚血モデルで得てきたこれらの知見と経験を、より系が単純でシンプルな海馬CA1ニューロン群の細胞死の保護という方向に視点を変えLPSによる虚血耐性現象と小胞体ストレスの関連を明らかにし虚血からの神経細胞保護に向けた経路の解明に迫りたいと考えたが、小胞体ストレスのインデューサー<ツニカマイシン)を1μg/μl,12μg(60μg/kg),24μg(120μg/kg)の容量でスナネズミに経静脈的および、経脳室にて投与したところ、毒性が強いためかすべて死亡した。従って、従来のLPS前処置によるラット局所脳虚血モデルを用いて、小胞体ストレス関連蛋白であるGrp78,Grp94の発現をウェスタンブロット法により調べた。生理食塩水投与のコントロール群と比較して、LPS投与群では投与後48時間から72時間後の丁度、虚血耐性の誘導される期間に一致してGrp94の発現が亢進していた。またその後、局所脳虚血の侵襲後6時間後では一旦発現が減少するものの、24時間後には著しい発現亢進を示した。しかしながら、Grp78に関しては、発現の亢進が見られるものの、コントロール群との差は明らかとはなっていない。今年度は小胞体特異的転写因子IRE1、PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)、ATF6などのカイネティックスをmRNA及びタンパク質レベルで明らかにすることを考えている。またラットを使った、通常の虚血耐性下での海馬CA1の小胞体特異的転写因子を調べていく予定である。

研究代表者である古屋一英は、2003年度から2004年度の基盤研究(C)(2)において「細菌性リポ多糖類(LPS)を用いた脳虚血耐性誘導現象における小胞体(ER)ストレスシグナルの解析」について3,200(千円)の研究経費にて研究を行ってきた。この実験では、虚血耐性獲得メカニズムのなかで、ERストレスの軽減が関与しているという仮説を立て、実験を行った。具体的には、非致死的虚血刺激は、1)ストレスセンサー蛋白質Ire1の活性化を増強し、下流へのシグナル伝達を促進させ、GRP78をはじめとする小胞体分子シャペロン群のup-regulationを起こすことによって神経細胞死を引き起こしにくくさせ、2)ストレスセンサー蛋白質PERKを介する(本実験では、まだ証明されていないが)翻訳開始因子(eIF2α)のリン酸化を抑制することによってERストレス負荷を軽減する、というものである。実験では、2分前脳虚血によるラット虚血耐性モデルを用いて、2分虚血後、2+6分虚血後、6分虚血後海馬CA1領域におけるGRP78、Irel-α、p-PERK、p-eIF2αの発現をWesterm blot法にて検討した。前脳虚血モデルでは、リン酸化eIF-2αの発現が、preconditioning(前処置)群、虚血耐性群で抑制されており、仮説通りERストレスが抑制されていることを強く示唆する実験結果であった。また、局所脳虚血では、Grp74,Grp94共に、LPSによる虚血耐性に関与していることが示唆されたが、特にGrp94の関与が強いと思われた。
虚血性心疾患に対するin situグラフトとしての肋間動脈使用の有用性

肋間動脈はin situグラフトとして用いることができる可能性がある。しかし昨年までの結果によるとヒト肋間動脈の口径は細径でありその血流量は低値であった。またブタ肋間動脈ではpedicleの状態でIn situグラフト化することは可能であったがにじみ出す程度の血流量であった。その内径(0.69mm±0.35mm)及び外径(0.89mm±0.37mm)は内胸動脈に対して狭小であり、等尺性張力測定では収縮弛緩の有意な値が得られず、Length-Tension relationshipにおいてもかなり低い値であった。以上から肋間動脈は容易に攣縮すると考えられ、安定した血流量を維持するIn situグラフトとして使用するには容易に壁機能の傷害がおこるといった問題を有すると考えられた。そこで平成15年度は血管の壁機能が温存される条件を検討した。ラットの胸部大動脈を用いてグラフトの血管壁機能の温存に関する実験を行った。異なった保存液や異なった通気条件について、またAngiotensin II type 1 receptor blocker (ARE)を添加した条件について、そして凍結保存グラフトについて検討した。その結果、37°C保存において保存液としてKrebs-Henseleit Bufferを使用すれば6時間は血管壁機能を良好に温存できることを明らかにした。また通気条件で変化した保存液のpHによる血管壁の機能温存性の検討からは保存液のpHは非常に重要であることが確認された。次にARBによる血管壁機能の温存効果を検討し、Angiotensin IIによる弛緩反応の抑制が阻害されることを証明した。またSucroseとDMSOの同時使用による凍結血管の壁機能温存性を検討し-80°Cにて保存した場合、解凍した血管の収縮反応は経時的に低下することを明らかにした。またARBによる凍結血管の壁機能の温存効果を明らかにした。本年度の実験の目的は1.豚の肋間動脈がどの程度の径を持ち、どの程度まで剥離、使用可能か判断する。2.内胸動脈との外径、流量の比較。の2点である。19kgの豚を使用し、全身麻酔下に実験を開始した。左第5肋間開胸にて胸腔内を観察した。第4肋間、第6肋間の側胸部の肋間動脈は0.3mm程度であり、非常に細く、剥離は非常に困難であった。流量を測定しようと試みるも、ほとんど索状であり、電磁流量計を使用し流量を測定したが径が細すぎるため測定できず、次に切離してのfreeflowの測定を試みたが流量もにじみ出す程度であったため不能であった。続いて2.についての検討のため、胸骨正中切開し、左内胸動脈を剥離し、外径と流量を測定した。左内胸動脈外径3mm、電磁流量計で流量78ml/minであった。この段階で、形態学的、血行動態的には肋間動脈は内胸動脈に比し、径が細く流量も少なく、グラフトとして使用する事は困難であると思われた。先はどの開胸下は他の肋間の動脈の良好な視野が得にくかったので、正中創より肋間動脈を観察したが、心臓、肺が視野を遮り、剥離は困難であった。このため続いて上記の肋間開胸部を正中まで広げ(T字切開)観察したが、肋間動脈の根部の観察、剥離は困難であった。最終的に動物を犠牲にして剖検し下行大動脈の肋間動脈起始部の観察をしたが、大動脈内部よりの計測でも開口部の径でも1mm程度であり、予想以上に細く起始してから34cm程度で1mm以下となり、肋間筋内に埋没するように走行していた。

このためこのような細い血管を剥離することは困難であった。今回の豚を使用した実験において肋間動脈を冠状動脈のグラフトとして使用することは非常に困難であると思われた。今後の計画としては、手術時開胸手術(成人例)の際の動脈の観察等からの再検討を考えている。昨年の実験,研究の反省点として1.ブタ実験では肋間動脈は細計すぎて血管そのものをskeltonizeして採取することはきわめて困難なことが挙げられた.また本年度の方針として手術時開胸手術の際の人体の肋間動脈の観察を計画した.・グラフトとして必要な血流量が得られるか・吻合可能な血管径があるか1.について今回は肋間筋共々pedicleとして採取することで肋間動脈を採取し,肋間動脈の流量の測定,グラフトとして利用できないかを検討した.20kgのブタを用い実験した.全身麻酔下に胸骨正中切開した。前年度の実験で肋間動脈のみを剥離する方法は開胸操作を加えるなど術野確保という点では困難を要したが,pedicleで採取することは正中切開のみで可能であった.左第5肋間筋を肋骨から電気メスを用い切離し流量を測定しようと試みfreeflowの測定を試みたが動脈性の噴出得られず,流量もにじみ出す程度であったため不能であった.2.について開胸手術の開胸肋間の肋間動脈形態の観察,血流量の測定を試みた.開胸肋間の肋間動脈は元々犠牲にされる血管であり結紮前の血流量測定等は倫理的な問題はないと考え,且つ患者には十分なinformed consentを行い同意を得た.(2名)開胸直後に開胸肋間(2例とも第4肋間)の中枢側の大動脈椎骨左縁より15cmの部位で肋間動脈を剥離し,この部位での人体の肋間動脈は0.5mm以下であった.この径は冠状動脈グラフトとしてはかなり細径であり吻合は困難であろう事が予想された.この部位は心に到達できる最短であろうと思われる距離を確保できる部位でありこれより末梢側は益々径が細くなっていくことを考えると,このまま肋間動脈をin situグラフトとして用いる事は不可能であろうと思われた.最初に電磁血流計を用い血流量を測定したが,測定不能なため,続いて肋間動脈を切離しfree flowを測定しようとしたが攣縮するためか噴出するflowは得られず測定できなかった.1.,2.共に今後実験を続けて行くには血管径が細く十分な血流量が得難いという結論であった.肋間動脈はin situグラフトとして用いることができる可能性がある。しかし昨年までの結果によるとヒト肋間動脈の口径は細径でありその血流量は低値であった。またブタ肋間動脈ではpedicleの状態でIn situグラフト化することは可能であったがにじみ出す程度の血流量であった。その内径(0.69mm±0.35mm)及び外径(0.89mm±0.37mm)は内胸動脈に対して狭小であり、等尺性張力測定では収縮弛緩の有意な値が得られず、Length-Tension relationshipにおいてもかなり低い値であった。以上から肋間動脈は容易に攣縮すると考えられ、安定した血流量を維持するIn situグラフトとして使用するには容易に壁機能の傷害がおこるといった問題を有すると考えられた。そこで平成15年度は血管の壁機能が温存される条件を検討した。ラットの胸部大動脈を用いてグラフトの血管壁機能の温存に関する実験を行った。
幼少期身体抑制を経験したラットのストレス反応性亢進と大脳辺縁系及び視床下部の関係

ラット4実験群(A群:生後1週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、B群:生後3週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、C群:生後5週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、対照群(身体抑制を一切経験しない群)について、以下の実験を行った。実験1.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長が異なるか?」A群は他3群に比較して、有意に体重増加率が低かった。実験2.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後のHPA axisのストレス反応性が異なるか?」A群は他3群に比較して、ストレス反応が大きかった。実験3.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の摂食行動が異なるか?」幼少期に身体抑制ストレスを与えた3か月後に行動量を測定した。A群は他の3群に比較して、明期の睡眠が不安定で、暗期の行動にもばらつきが見られた。実験4.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の視床下部のCA代謝回転及びCRH産生機能が異なるか?」A群は他の3群に比較して、新規環境ストレスに対するCAが大きく反応した。さらに、室傍核におけるCRHmRNAの発現量も多かった。実験5.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の視床下部のCA代謝回転及びCRH産生機能が異なるか?」実験日に新規環境ストレスを負荷し、CA量を測定した。A群は他の3群に比較して、CA量が多かった。また、室傍核CRHmRNAの発現量を定量化した。A群は他の3群に比較して、CRHmRNAの発現量が多かった。実験6.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の大脳辺縁系扁桃体、海馬、視床下部のGR発現量が異なるか?」扁桃体、海馬、視床下部のGRの発現を定量化した。A群は他の3群に比較して、扁桃体、海馬、視床下部の全てにおいて、GRの発現量が多かった。幼少期に身体抑制を経験したラットは成長後にストレス反応性が亢進する、ことが知られている。ストレス反応は視床下部-下垂体-副腎皮質系(以下、HPA axis)の亢進を引き起こすが、その上位中枢である視床下部に脳幹から投射する上向性カテコールアミン(以下CA)ニューロンが一般的なストレス反応に重要である。しかし、研究代表者らは幼少期に身体抑制を経験したラットの成長後のストレス反応性亢進には脳幹以外の中枢が関与している可能性を報告した。さらに身体抑制を経験する時期には臨界年齢が存在し、臨界年齢を過ぎた身体抑制は、成長後のストレス反応性亢進を引き起こさないことを報告した。そこで、本研究の目的は、脳幹からの上向性CAニューロン以外のニューロン、特に大脳辺縁系扁桃体から視床下部に投射するニューロンがストレス反応に関与しており、臨界年齢の存在は扁桃体の成熟が関与しているという仮説を検証することである。平成28年度は、ラット4実験群(A群:生後1週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、B群:生後3週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、C群:生後5週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、対照群(身体抑制を一切経験しない群)について、以下の実験を行った。実験1.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長が異なるか?」:A群は他3群に比較して、有意に体重増加率が低かった。実験2.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後のHPA axisのストレス反応性が異なるか?」:A群は他3群に比較して、有意にストレス反応が大きかった。研究計画にもとづいて、順次、順調に実験を行っている。ストレス反応は視床下部-下垂体副腎皮質系(以下、HPA axis)の亢進を引き起こすが、その上位中枢である視床下部に脳幹から投射する上向性カテコールアミン(以下CA)ニューロンが一般的なストレス反応に重要である。本研究の目的は、脳幹からの上向性CAニューロン以外のニューロン、特に大脳辺縁系扁桃体から視床下部に投射するニューロンがストレス反応に関与しており、臨界年齢の存在は扁桃体の成熟が関与しているという仮説を検証することである。平成29年度は、ラット4実験群(A群:生後1週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、B群:生後3週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、C群:生後5週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、対照群(身体抑制を一切経験しない群)について、以下の実験を行った。実験1.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の摂食行動が異なるか?」幼少期に身体抑制ストレスを与えた3か月後に、行動量(明期の睡眠と暗期の摂食行動)をテレメーターシステムにより測定し、幼少期身体抑制ストレスが成長後の行動量にどのように影響しているか、4群間で比較検討した。

その結果、A群は他の3群に比較して、明期の睡眠が不安定で、暗期の行動にもばらつきが見られた。実験2.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の視床下部のCA代謝回転及びCRH産生機能が異なるか?」その結果、A群は他の3群に比較して、新規環境ストレスに対するCAが大きく反応した。さらに、室傍核におけるCRHmRNAの発現量も多かった。研究計画にもとづいて、順次、順調に実験を行っている。ラット4実験群(A群:生後1週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、B群:生後3週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、C群:生後5週齢時に1日1回30分の身体抑制を7回(7日)行う群、対照群(身体抑制を一切経験しない群)について、以下の実験を行った。実験1.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長が異なるか?」A群は他3群に比較して、有意に体重増加率が低かった。実験2.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後のHPA axisのストレス反応性が異なるか?」A群は他3群に比較して、ストレス反応が大きかった。実験3.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の摂食行動が異なるか?」幼少期に身体抑制ストレスを与えた3か月後に行動量を測定した。A群は他の3群に比較して、明期の睡眠が不安定で、暗期の行動にもばらつきが見られた。実験4.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の視床下部のCA代謝回転及びCRH産生機能が異なるか?」A群は他の3群に比較して、新規環境ストレスに対するCAが大きく反応した。実験5.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の視床下部のCA代謝回転及びCRH産生機能が異なるか?」実験日に新規環境ストレスを負荷し、CA量を測定した。A群は他の3群に比較して、CA量が多かった。また、室傍核CRHmRNAの発現量を定量化した。A群は他の3群に比較して、CRHmRNAの発現量が多かった。実験6.「幼少期身体抑制を経験する年齢により、成長後の大脳辺縁系扁桃体、海馬、視床下部のGR発現量が異なるか?」扁桃体、海馬、視床下部のGRの発現を定量化した。A群は他の3群に比較して、扁桃体、海馬、視床下部の全てにおいて、GRの発現量が多かった。研究計画にもとづいて、順次、実験を行っていく予定である。研究計画にもとづいて、順次、順調に実験を行っていく予定である。実験に使用した試薬類などの消耗品の購入価格が当初予定していた価格より、安価に購入できたため。(理由)実験に使用した試薬類などの消耗品の購入価格が当初予定していた価格より安価に購入できたため。(使用計画)翌年分の試薬類などの消耗品購入費および論文作成費(外国語論文校閲費と論文投稿費)として、次年度使用額を使用する予定である。翌年分の試薬類などの消耗品購入費および論文作成経費(外国語論文校閲と論文投稿費)として、次年度使用額を使用する予定である。
発がんによるNKG2Dリガンドの発現機構の解明(特定領域がん(発がん))

生体防御機構は,発がんした細胞を排除すべく免疫監視に当たっている。しかしながら,がん細胞はImmuno-editingと呼ばれる,巧妙に生体防御系から逃れている。我々は,生体防御の最前線で働くNK細胞,特にNK活性化レセプターNKG2Dに着目し研究を進めてきた。興味深いことに,NKG2Dリガンドは,正常組織ではサイレントであり,発現がみとめられないが,がん細胞,特に悪性度の高い腫瘍には広範にかつ恒常的にNKG2Dリガンドの異常発現が認められる。我々は,発がんによるNKG2Dリガンドの異常発現の分子機構を解明することを目的とし,研究を行った。我々は,NKG2Dリガンドのがん細胞における発現調節機構を解明するため,プロモーターのクローニングおよびその解析を進めた。RAE-1 d,eを強く発現しているマウス肺がん細胞であるLL/2を用い,mRNAを調整し5'RACE法によりRAE-1 d,eのmRNAの配列を決定した。その結果,NCBIで公開されているdatabaseでは報告されていなかった新規のexonがRAE-1eにおいて存在することが判明した。このmRNA情報をもとに転写開始点を決定し,その上流のプロモーターと思われる領域をクローニングした。RAE-1eのプロモーター解析により,Sp1,NF-kB,AP-1の結合領域が存在することが明らかとなった。さらに,Sp1,NF-kB,AP-1に対するケミカルインヒビターによる解析で,これら転写因子が,肺がん細胞LL/2においてRAE-1eの発現にかかわっており,特にSp1が重要であることが判明した。さらに,siRNAによるSp1のknockdownにより,RAE-1eの発現が抑制された。以上のことより,がん細胞におけるRAE-1 eの発現は,Sp1が重要な転写因子であることが明らかとなった.がんは、ウイルス感染、DNAの損傷、遺伝子発現制御の異常など種々の要因によって引き起こされる。また、生体防御機構は、発がんした細胞を排除すべく免疫監視に当たっており、その最前線に当たるNK細胞は、がん細胞の排除に深くかかわっている。しかしながら、がん細胞はImmuno-editingと呼ばれる、巧妙に生体防御系から逃れる術をもっていることが示唆されている。我々は、NK細胞の主たる機能を担っているNK活性化レセプターNKG2Dに着目し研究を進めてきた。興味深いことに、NKG2Dリガンドは、正常組織ではサイレントであり、発現がみとめられないが、がん細胞、特に悪性度の高い腫瘍には広範にかっ恒常的にNKG2Dリガンドの発現が認められることを報告してきた。すなわち、がん化、がんの悪性化に伴い、NKG2Dリガンドの遺伝子発現が誘導されると予測され、NKG2Dリガンドの遺伝子発現は、通常は厳格に制御されているものと推察できる。我々は、発がんによるNKG2Dリガンドの異常発現の分子機構を解明することを目的とし、研究を行った。NKG2Dリガンドの転写制御機構を解明するため、我々は、プロモーターのクローニングおよびその解析を進めた。マウス肺がん細胞であるLL/2は、NKG2Dリガンド中でもRAE-1 delta, epsilonを強く発現していることが知られている。そこで、LL/2細胞のmRNAを調整し、5'RACE法によりRAE-1 delta, epsilonのmRNAの配列を決定した。その結果、NCBIで公開されているdatabaseでは報告されていなかった新規のexonが存在することが判明した。このmRNA情報をもとに転写開始点を決定し、その上流のプロモーターと思われる領域をクローニングしており、いくつかの転写制御領域と考えられる候補領域を見いだした。以上のことより,がん細胞におけるRAE-1 eの発現は,Sp1が重要な転写因子であることが明らかとなった.
原子層シリサイド半導体による革新的エレクトロニクス要素技術

Si基板上に形成した遷移金属を内包するSi籠状クラスター凝集膜は、Si結合ネットワークを持ちながら、クラスター構造に起因して、超高密度キャリアドーピングなど、これまでのSi材料科学では実現できない、新しい物性を持つ。本研究では、産業応用を見据えた製膜方法で遷移金属内包Siクラスター膜を作製するプロセスを確立し、クラスター膜の新規物性を活かして、クラスター膜を金属電極とSi基板の間に挟み込むことで接触電気抵抗を大きく低減する技術を中心に、ナノエレクトロニクスの革新的な要素技術を開発した。本研究では、Si表面上にヘテロエピタキシャル形成した遷移金属内包Siクラスター(M@Sin)を単位構造とする数原子層の新規シリサイド半導体の有する高密度ドナー準位(1021 cm-3)の起源を明らかにし、既存のSi材料科学では到達できない、「数原子層の空間に1021cm-3を超えるキャリアを発生する」ことで、極限のドーピング技術を追及する。そのうえで、(1)フェルミレベルコントロール可能な原子層シリサイドとSiとの界面準位を持たない接合形成、(2)電界や電荷注入による原子層シリサイドのバンドギャップ制御を実証する。本年度は、M@Sin層の欠陥密度を低減し膜質を向上する目的で、これまでレーザーアブレーション法からCVD法への移行を行った。WF6、SiH4ガスを原料に、石英基板上にW@Sin膜(n=8-12)を成膜することに成功した。W@Sin膜はアモルファスSiネットワークを持つが、CVDで作製した膜は、レーザーアブレーション膜に比べるとアモルファスネットワークが熱的に安定であることが判明した。第一原理計算による解析から、W@Sin膜の熱的な安定性は、欠陥の一つであるW-Si-W結合の密度に影響を受ける。これは、CVD膜において、W-Si-W結合の形成が抑制されたものと考える。一般的なアモスファスSiは石英基板上で、600°Cの熱処理で多結晶化するものの、W@Sin膜のアモルファスネットワークは800°Cの熱処理でも結晶化しなかった。局所的にW@Sin構造を作ることで、アモルファスSiネットワークがより熱的に安定化することが判明した。研究計画遂行上の必要不可欠なM@Sin層の膜質の向上が、M-Si-M結合の形成密度の低減にあることを見出し、それを克服するためのCVD法を確立した。CVD膜を用いたSi基板上でのヘテロエピタキシャル成長は、Si基板表面の清浄化がカギとなることが判明し、装置改造にも着手した。研究期間内に予定しているM@Sin層を用いたSiナノエレクトロニクスの革新的な要素技術の実証を行う準備が整ったと考える。本研究は、Si表面上にヘテロエピタキシャル形成した遷移金属内包Siクラスター(M@Sin)を単位構造とする数原子層の新規シリサイド半導体の有する高密度ドナー準位(1021 cm-3)の起源を明らかにし、既存のSi材料科学では到達できない、「数原子層の空間に1021cm-3を超えるキャリアを発生する」ことで、極限のドーピング技術を追及する。そのうえで、(1)フェルミレベルコントロール可能な原子層シリサイドとSiとの界面準位を持たない接合形成、(2)電界や電荷注入による原子層シリサイドのバンドギャップ制御、を実証し、Siナノエレクトロニクスの革新的な要素技術の開発を目指している。昨年度までに、これまでレーザーアブレーションで形成していたM@Sin膜をCVD法による高品質な成膜手法を確立できたことを受けて、本年度は、WF6ガスとSiH4ガスを原料にCVD法で作製したW@Sin(n=10ー12)を用いて、Si基板上でのエピタキシャル層の形成実験を行った。レーザーアブレーションで作製したW@Sin膜では、1ー数nmまでしかエピタキシャル膜が成長しなかったのに対して、CVD膜を用いると、700°Cの熱処理で10nmまでエピタキシャル成長した。エピタキシャル膜にミスフェットや面欠陥の形成がみられるものの、レーザーアブレーション法による成膜よりも格段に膜質が向上したことが分かる。このW@Sinエピタキシャル層とSi基板の積層構造に対して、接合特性を評価したところ、エピタキシャル層は、0.3eVのギャップを持ちドナー準位深さ0.1eVの電子状態を持つことが判明した。この特性を用いると、n型Siに対する金属電極のショットキー障壁を低減でき、W電極の場合、障壁高さは0.32eVになることが判明した。これまで、WSinエピタキシャル層は、Si基板上で数nmの膜厚でしか成長できず、革新的エレクトロニクス要素技術のための物性評価のボトルネックとなってきた、CVD法を用いることで、これを克服し、10nm程度までエピタキシャル層を増大することに成功した。これにより、物性評価のために必要な低抵抗な電極形成が可能になり、各種分光スペクトルのS/N比の向上が見られており、最終年度に向けて十分な準備ができていると考える。本研究では、Si表面上にエピタキシャル形成した遷移金属内包Siクラスター(M@Sin)を単位構造とする数原子層の新規シリサイド半導体の有する高密度ドナー準位(1021 cm-3)の起源を明らかにし、既存のSi材料科学では到達できない、「数原子層の空間に1021cm-3を超えるキャリアを発生する」ことで、極限のドーピング技術を追及する。そのうえで、(1)フェルミレベルコントロール可能な原子層シリサイドとSiとの界面準位を持たない接合形成、(2)電界や電荷注入による原子層シリサイドのバンドギャップ制御、を実証し、Siナノエレクトロニクスの革新的な要素技術の開発を目指す。

この目的のために、従来レーザーアブレーションを用いて作製していたM@Sin膜を高品質化することが必要不可欠であり、半導体産業でも用いられるCVD法で、モノシランガスとフッ化タングステンガスを原料にして、タングステン内包Siクラスター膜(W@Sin膜)を製膜した。CVD法で製膜した非晶質のW@Sin膜は、700°Cの熱処理でSi表面上で、W@Sinが配列しおよそ10nmまでエピタキシャル成長し、レーザーアブレーション膜よりも局所的なW@Sinの組成がよく制御されていると考えられる。このW@Sinエピタキシャル膜とSiの積層構造に対して、接合特性を評価すると、エピタキシャル層は、0.3eVのエネルギーギャップを持ち、ドナー準位深さが0.1eVの新しいシリサイド半導体であることが判明した。エピタキシャル層をSiと金属電極の間に挟み込むことで、Siと金属にの間に発生するショットキー障壁を低減でき、原子層薄膜で接合抵抗を低減する技術を開発することができた。これは、Siエレクトロニクスにおけるデバイスの低消費電力化のための革新的な要素技術である。Si基板上に形成した遷移金属を内包するSi籠状クラスター凝集膜は、Si結合ネットワークを持ちながら、クラスター構造に起因して、超高密度キャリアドーピングなど、これまでのSi材料科学では実現できない、新しい物性を持つ。本研究では、産業応用を見据えた製膜方法で遷移金属内包Siクラスター膜を作製するプロセスを確立し、クラスター膜の新規物性を活かして、クラスター膜を金属電極とSi基板の間に挟み込むことで接触電気抵抗を大きく低減する技術を中心に、ナノエレクトロニクスの革新的な要素技術を開発した。欠陥密度の少ないCVD膜を用いて、W@Sin層をSi表面上に形成する。その上で、M@Sin層の2次元的なキャリア輸送特性や、M@Sin/Si接合特性を評価する。2次元キャリア計測では、1021ー1022cm-3レベルの高密度キャリアドーピングの実証を、接合特性評価では、上述した逆バイアス印加でのバンドギャップ変調効果を狙う。また、M@Sin層に堆積した絶縁体層を介してゲート電極を形成し、M@Sin層の電界効果測定を行うことで、狭ギャップ化によるキャリア伝導度の上昇や、ドナー・アクセプター準位の浅エネルギー化による高密度キャリア誘起について調べる。また、電界印加時のM@Sin層の反射スペクトルのその場観察や、M@Sin層の電界効果を解析することで、直接的に外部電界印加によるバンドギャップ変調を観察する。第一原理計算では、絶縁体膜や金属電極との接合を考慮した構造を用い、電界を印加や電荷を注入した場合の構造や電子状態の変化について調べ、バンドギャップの変調効果など新規物性の解析を行う。新たに反射スペクトルを用いたバンドギャップ変調の検出手法を用いることで、想定よりも容易に、電界や電荷注入による原子層シリサイドのバンドギャップ変調の実証が可能になった。計測用のサンプル試作には、産総研内の共用利用設備の試作サービスを利用するなど、効率的に最終年度の研究を遂行する。ナノエレクトロニクス研究遂行に使用しているラマン散乱装置のカメラ表示が故障し、予定になかった修理を行ったため、予算が不足し外注分析(高分解能電子顕微鏡観察)ができなかったため。
腎障害および眼球運動障害、内耳障害を合併する遺伝性疾患の背景

デュアン眼球短縮症候群(DRS)と巣状糸球体硬化症(FSGS)を合併した疾患は本研究チームの解析により責任遺伝子変異が明らかになりました。その1つの遺伝子変異だけですべてが説明がつかないことも多いため、他の遺伝子の関与がないか研究を行うことで、これらの疾患の患者様により良い医療を提供できるように努めたいと思います。
エイジング関係式から見たスピングラスのダイナミクスの研究

エイジング関係式と非平衡緩和法を利用して、スピングラス転移と動的クロスオーバー領域の解析を行った。エイジング関係式によって、動的相関関数のシミュレーションが容易になり、非平衡緩和法と呼ばれる新しい方法を組み合わせて、スピングラス転移の解析を行った。この方法は、秩序化した状態からの秩序変数の非平衡緩和を数値的にシミュレートする方法で、統計平均はMCステップを重ねて行うのではなく独立にサンプリングする。このため、系の平衡化から解放されるのでメモリーが許す最大の格子サイズで計算できる、MCステップは動的性質が判る程度の小ステップで十分、各サンプルは独立なの臨界点でもサンプルは少なくて済む、等の利点がある。従来、30^3程度の格子が限界であったが、今回は最大で160^3の格子の解析が可能になり、これまで曖昧だったサイズ効果の不安を取り除く事ができた。常磁性相、強磁性相、スピングラス相が会合する多重臨界点での動的性質を導出し、動的臨界現象の大域的な変遷を理解することに成功した。残留磁化m(t)は強磁性相では秩序変数に収束し、平衡自己相関関数q(t)はスピングラス相で秩序変数に収束する。両者の緩和指数λ_mとλ_qは、強磁性臨界点ではλ_q=2λ_mの関係にあるが、多重臨界点でλ_q=λ_mと変化することが明らかになった。また、多重臨界点では、強磁性秩序とスピングラス秩序の弱臨界指数(動的指数を含む)が一致する事も示された。これらは動的臨界現象の普遍性の変化であり、今後の研究の端緒となることが期待される。エイジング関係式を利用して、主に動的クロスオーバー領域の解析を行った。エイジング関係式によって、動的相関関数のシミュレーションが容易になった。そこで、二次元及び三次元のIsing模型について、多重臨界点における動的臨界指数を非平衡緩和法を利用したモンテカルロシミュレーションによって計算した。このため、系の平衡化から解放されるのでメモリーが許す最大の格子サイズで計算できる、MCステップは動的性質が判る程度の小ステップで十分、各サンプルは独立なの臨界点でもサンプルは少なくて済む、等の利点があり、高精度な結果を能率良く実現することができた。
Ag添加Sm123超伝導永久磁石材料の性能向上と着磁技術に関する研究

本研究は優れた捕捉磁場特性を持つ大型のAg添加Sm123超伝導体を開発し、それを冷凍機で30K程度まで冷却後、パルス磁場あるいは静磁場を用いて着磁することでNd-Fe-B永久磁石の10倍以上の強い永久磁石を生み出し、それを2個対向させてその空隙に2テスラ以上の磁場を発生させる超伝導永久磁石システムの完成を目標とした。(1)平成11年度(1999年)には36mm径のAg添加Sm123超伝導体を開発しそれを冷凍機で30K程度まで冷却した後パルス磁場で着磁することにより、最大で3.8テスラの捕捉磁場を超伝導体表面で得ることに成功した。また30-77Kの温度領域でパルス磁場により超伝導体に侵入する磁束線のダイナミカルな挙動を解析し低温における磁束線の運動に関する貴重な基礎データを蓄積出来た。(2)35Kの低温で静磁場着磁することで超伝導体表面に6.7テスラの磁場を捕捉させた後、その磁場を使って幅50mm厚さ5mmのNd-Fe-B板上を往復スキャンすることによりNd-Fe-B板が完全に着磁出来ることを示した。これは1999年11月18日付けの中日新聞夕刊に報道され話題を呼んだ。(3)平成12年度(2000年)には36mm径のAg添加Sm123超伝導体を2個対向させた超伝導永久磁石システムを建設した。二つの超伝導体に挟まれた室温空間のギャップを2mmに選んだ場合、中心で2.8テスラの磁場を観測した。これは2000年1月24日の日刊工業新聞に紹介された。Nd-Fe-B永久磁石が発生する磁場0.3テスラの10倍近い磁場が室温空間に得られることで強磁場応用の道が拓けた。(4)平成13年度(2002年1月)には60mm径のAg添加Sm123超伝導体の合成に成功した。これを対向型超伝導永久磁石システムに搭載することでギャップ5mmの室温空間に3.0テスラの磁場を発生させることに成功した。本研究は超伝導体を着磁して得られる超伝導永久磁石で、従来の永久磁石では得られない5-10テスラの安定した磁場を安価に供給するシステムを開発することにある。そのための第1目標はより高い磁場を発生する超伝導材料の開発であり、第2目標はパルス着磁技術の精緻化である。平成11年度の研究では、捕捉した磁力線が生み出す電磁力により試料が破壊することを確かめ、超伝導材料の機械的特性を向上させることが急務であると結論し、クラックの発生を押さえるためボイドの少ない組織を得る研究を行なった。溶融初期待に真空してボイドを消滅させた後、低酸素圧処理する方法及び大気圧に近い酸素圧下で溶解して後、低酸素処理する方法を試みた。いずれの方法でもボイドを著しく低減することに成功したが、超伝導特性の劣化が回避出来ないことが明らかとなり、さらなる検討を加えることとなった。第2に、高い磁場を発生するために超伝導体を着磁する方法の改善を試みた。10テスラを越える磁場は超伝導線材を用いた大型電磁石かパルス法でのみ発生可能である。

前者は静磁場であるが、このような大型磁石で着磁することは超伝導永久磁石を普及する上で不利であり、パルス着磁こそ超伝導永久磁石の開発に不可欠である。しかし、パルス磁場は超伝導体内に侵入した磁束線を高速で運動させるため粘性力による発熱が生じこれが原因となって着磁率を低下させる欠点を持つ。ピン止め力の強いSm(Ag)123超伝導体に対して軟磁性体で出来たヨークを組み込み、しかもイムラ法と称するパルス着磁法を考案して着磁率を50-70%まで高める技術を開発することに成功した。これで、パルス磁場で数テスラの磁場を発生する超伝導永久磁石システムが実現出来る見通しがついた。本年度はSm(Ag)超伝導体の超伝導特性と機械的特性そして着磁技術を中心に研究を遂行した。以下にその実績を示す。(i)直径36mmのSm(Ag)123系超伝導体を酸素雰囲気及び真空下で溶融し空孔のない緻密な材料を合成し、その機械的強度の向上を図るとともにその超伝導特性を評価した。(ii)パルス着磁装置によりSm(Ag)123系超伝導体の捕捉磁場分布を77Kにおいて測定した。超伝導体に十字に走るファセットラインに沿って磁場がより高く捕捉される一方で、それと45°をなす方向では捕捉磁場が低いことが確認された。ファツセトライン上及びそれとと45°をなす方向にホールセンサーを設置し磁束線の侵入と脱離を測定した。この結果を解析することにより、着磁率を向上させるために必要な因子を探り出すことに成功した。(iii)我々が開発したSm123系超伝導体を用いて静磁場着磁及びパルス着磁の両方の技術で着磁特性を比較検討しつつ、対向型超伝導永久磁石システムの建設を進めた。本研究は優れた捕捉磁場特性を持つ大型のAg添加Sm123超伝導体を開発し、それを冷凍機で30K程度まで冷却後、パルス磁場あるいは静磁場を用いて着磁することでNd-Fe-B永久磁石の10倍以上の強い永久磁石を生み出し、それを2個対向させてその空隙に2テスラ以上の磁場を発生させる超伝導永久磁石システムの完成を目標とした。(1)平成11年度(1999年)には36mm径のAg添加Sm123超伝導体を開発しそれを冷凍機で30K程度まで冷却した後パルス磁場で着磁することにより、最大で3.8テスラの捕捉磁場を超伝導体表面で得ることに成功した。また30-77Kの温度領域でパルス磁場により超伝導体に侵入する磁束線のダイナミカルな挙動を解析し低温における磁束線の運動に関する貴重な基礎データを蓄積出来た。(2)35Kの低温で静磁場着磁することで超伝導体表面に6.7テスラの磁場を捕捉させた後、その磁場を使って幅50mm厚さ5mmのNd-Fe-B板上を往復スキャンすることによりNd-Fe-B板が完全に着磁出来ることを示した。これは1999年11月18日付けの中日新聞夕刊に報道され話題を呼んだ。(3)平成12年度(2000年)には36mm径のAg添加Sm123超伝導体を2個対向させた超伝導永久磁石システムを建設した。二つの超伝導体に挟まれた室温空間のギャップを2mmに選んだ場合、中心で2.8テスラの磁場を観測した。これは2000年1月24日の日刊工業新聞に紹介された。Nd-Fe-B永久磁石が発生する磁場0.3テスラの10倍近い磁場が室温空間に得られることで強磁場応用の道が拓けた。(4)平成13年度(2002年1月)には60mm径のAg添加Sm123超伝導体の合成に成功した。これを対向型超伝導永久磁石システムに搭載することでギャップ5mmの室温空間に3.0テスラの磁場を発生させることに成功した。
ブドウ球菌の粘液層（ムチン画分）結合性に関する研究

動物及びヒト消化管に生息し、体外に排泄されるブドウ球菌の実態を解明するために各種検討を行い、以下の結果を得た。[2]某畜産研究施設(匿名希望)の24頭のウシ糞便より内蔵肉の場合と同様にオキサシリン及びセフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に生育する菌を分離した。17頭の糞便よりmecA遺伝子を保有するブドウ球菌属が多数検出された。主な菌種はS. cohnii, S. sciuri, S. fleurettiiであり、S. aureusは見出されなかった。[3]小児科医師との共同プロジェクトとして小児糞便に含まれるMRSAを検討した。倫理委員会許諾後、鼻腔スクリーニングによりMRSA陽性と判定されたNICU入院患児の21名の糞便及び鼻腔より、オキサシリン及びセフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に生育する菌を分離した。MRSA保菌小児糞便中は103-108 CFU/gと多量のMRSAが含まれていた。SCCmecタイプ及びMLSTの決定、POT法により検討した結果から鼻腔に保菌される菌と、糞便中に排出される菌は同一のクローンに属すると推定された(Nakao et al.ARIC in press.)実施計画[1]、[2]に関しては、計画通りに達成された.実施計画[1]ウシ(第1胃、第2胃、第3胃、第4胃)、豚(胃)、ウシ、豚小腸、大腸を購入し、生理食塩水で30分震盪洗浄した菌液をマンニット食塩寒天平板、オキサシリン、セフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に塗布し、生育するグラム陽性球菌を分離する。簡便法によりDNAを抽出しPCRにてmecA及びmecAホモログを保有する菌を同定する。更にrDNAの塩基配列を決定し、菌種を同定する。実施計画[2]糞便及び鼻腔由来入院乳幼児由来MRSA株より簡便法によりDNAを抽出し、PCRにてSCCmecタイプを決定し、PVL及び毒素性ショック症候群毒素などの毒素遺伝子の保有を検討する。POT法を実施し鼻腔に保菌される菌と、糞便中に排出される菌が同一のクローンに属するか検討する。代表株を選定してMLSTを決定する(順天堂医院小児科医師との共同研究)。以下の実施計画[3]は、対象とする畜産研究施設を別の県に変更して実施した。[3]動物糞便はこれまで、群馬県、埼玉県の畜産研究施設(ともに匿名希望)の協力のもとに収集した。再度協力を依頼し、協力が得られれば、保菌の消長の検討も兼ねて追実験を企画する。実施計画[4]の入院患者を対象としたMRSA保菌者の糞便の調査に関しても順天堂病院医師、大学院生との共同研究としてすでに病院倫理委員会に申請し、承認を戴いている。順調に進展した理由としては無理のない実施できる計画とたてたことと考える。今後はムチン画分と結合するブドウ球菌側の因子を生化学的、遺伝学的手法で解明するための検討を中心に行う。[1]豚胃由来ムチン画分を使用して、ムチン画分とブドウ球菌との結合を検出する最適のシステムを構築する。これまでの予備的な検討の結果では一夜培養菌体をELISAプレートに吸着させ、ビオチン標識ムチンとの結合を酵素標識アビジンにて検出する系が有望であると考えている。選定した反応系で、バラエティミート及び糞便から分離されたすべての菌のムチン画分結合性を調べる。最も結合活性の高い菌株を使用し、ムチン画分と結合する菌体成分を同定する。方法としては培養した菌を超音波などで破砕し、成分を可溶化した後1先に開発したELISAにて菌とビオチン標識ムチンとの結合を阻害する物質を探索し、順次精製する方法2固層化したムチンと反応させたのち、結合物質を分離し、アミノ酸解析、質量分析などを行って構造決定を行う方法3ビオチン標識ムチンと結合させたのち、ストレプトアビジン固定ビーズにて結合物を分離し、解析する方法を考えている。タンパクであることが判明した場合は、目的とするタンパクを生化学的に精製するよりも、発現ベクターにクローニングして精製標品を得る方向性を志向する。[2]S. fleurettii及びS. sciuriのムチン画分と結合性の高い株及び低い株を選択し、DNA抽出後、全ゲノム配列を決定する。当初はIllumina MySeqのみ使用する予定であったが、計画を若干変更しロシュ454も使用する。決定された塩基配列の相互比較、及び先のアミノ酸解析の結果を参照してムチン画分と結合する物質を同定する。[3]ブドウ球菌に結合性を示すムチン画分の分子実体を明らかにする。具体的には、菌から得られたムチン画分結合物質(恐らくタンパク)と結合する物質を市販ムチン画分あるいは豚の胃や腸管から分離精製してその実体を明らかにする方向への検討に着手する。初年度の研究に使う費用として見積もった、器具(シャーレ、ピペット、遠心管など)及び試薬(培地、DNA抽出試薬)の大半は順天堂大学細菌学教室に一括して購入してあるものでまかなうことができた。年度末に予定したコンピューターの購入が4月1日と遅れたため、更に多くの額が未使用となった。一方全ゲノムの配列にはやはりロシュ454による解析が必要とされ、こちらは一件あたり80万と多額の費用が必要であることが判明した。

またそれに使用する菌株は次年度の実験を待って決定したほうが良いと判断された。そのため、あえて年度内で予算を使用せず、次年度に先送りした。1316964円の未使用額のうち約20万はすでにコンピューターを購入して使用した。残りの額はロシュ454を使用した全ゲノム配列の決定に主に使用する。動物及びヒト消化管に生息し、体外に排泄されるブドウ球菌の実態を解明するために各種検討を行い、以下の結果を得た。[2]某畜産研究施設(匿名希望)の24頭のウシ糞便より内蔵肉の場合と同様にオキサシリン及びセフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に生育する菌を分離した。17頭の糞便よりmecA遺伝子を保有するブドウ球菌属が多数検出された。主な菌種はS. cohnii, S. sciuri, S. fleurettiiであり、S. aureusは見出されなかった。[3]小児科医師との共同プロジェクトとして小児糞便に含まれるMRSAを検討した。倫理委員会許諾後、鼻腔スクリーニングによりMRSA陽性と判定されたNICU入院患児の21名の糞便及び鼻腔より、オキサシリン及びセフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に生育する菌を分離した。MRSA保菌小児糞便中は103-108 CFU/gと多量のMRSAが含まれていた。SCCmecタイプ及びMLSTの決定、POT法により検討した結果から鼻腔に保菌される菌と、糞便中に排出される菌は同一のクローンに属すると推定された(Nakao et al.ARIC in press.)実施計画[1]、[2]に関しては、計画通りに達成された.実施計画[1]ウシ(第1胃、第2胃、第3胃、第4胃)、豚(胃)、ウシ、豚小腸、大腸を購入し、生理食塩水で30分震盪洗浄した菌液をマンニット食塩寒天平板、オキサシリン、セフォキシチン含有マンニット食塩寒天平板に塗布し、生育するグラム陽性球菌を分離する。簡便法によりDNAを抽出しPCRにてmecA及びmecAホモログを保有する菌を同定する。更にrDNAの塩基配列を決定し、菌種を同定する。実施計画[2]糞便及び鼻腔由来入院乳幼児由来MRSA株より簡便法によりDNAを抽出し、PCRにてSCCmecタイプを決定し、PVL及び毒素性ショック症候群毒素などの毒素遺伝子の保有を検討する。POT法を実施し鼻腔に保菌される菌と、糞便中に排出される菌が同一のクローンに属するか検討する。代表株を選定してMLSTを決定する(順天堂医院小児科医師との共同研究)。以下の実施計画[3]は、対象とする畜産研究施設を別の県に変更して実施した。[3]動物糞便はこれまで、群馬県、埼玉県の畜産研究施設(ともに匿名希望)の協力のもとに収集した。再度協力を依頼し、協力が得られれば、保菌の消長の検討も兼ねて追実験を企画する。実施計画[4]の入院患者を対象としたMRSA保菌者の糞便の調査に関しても順天堂病院医師、大学院生との共同研究としてすでに病院倫理委員会に申請し、承認を戴いている。順調に進展した理由としては無理のない実施できる計画とたてたことと考える。今後はムチン画分と結合するブドウ球菌側の因子を生化学的、遺伝学的手法で解明するための検討を中心に行う。[1]豚胃由来ムチン画分を使用して、ムチン画分とブドウ球菌との結合を検出する最適のシステムを構築する。