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中欧における体制転換プロセスの到達度

標記「中欧の体制転換プロセスの到達度」の成果は下記の通り。1.平成14年6月の比較経済体制学会全国大会において共通論題『チェコにおける産業政策と産業構造の特色』(単独)と題する発表を行い,チェコをケーススタディーとして旧社会主義国の体制転換プロセスにおける産業構造の転換の特色を歴史的に研究発表し,平成15年6月発行の『比較経済体制学会年報』に「チェコにおける産業政策と産業構造の特色」として発表した。2.また体制転換第2段階の重要課題である社会保障問題に関しては,平成15年9月に発表した「チェコの老齢年金」『海外社会保障研究』において,チェコをケーススタディーとして,付加的年金制度の未整備および財政政策の失敗による年金財政赤字の問題を論じた。3.さらにチェコにおいて対外直接投資がチェコ経済に寄与していること,日系企業が機械工業を中心に近年進出し,チェコ経済(工業生産,輸出,企業統治,リストラ)に大きな影響を与えていることを調査研究した。その成果は平成15年7月の経営行動研究学会全国大会にて『チェコにおける日系企業の投資環境』と題した発表を行い,これらの成果は日本大学経済学会紀要『経済集志』に「チェコにおける産業構造の特色と日系企業の投資環境」(平成15年10月)として論文発表した。4.この2年間の研究実績のまとめとして,チェコの体制転換プロセスを総括した「チェコにおける体制転換プロセス」を『ロシア研究』(近刊)に発表予定であり,また工業セクターの発展と企業改革に関して日本大学経済学会紀要『経済集志』に「チェコの機械工業と企業改革」(平成16年7月刊行予定)として発表した。平成14年度の研究計画のなかで、私有化に次いで問題となっている社会保障制度改革にかんしては、平成14年10月12日に北海道大学スラブ研究センターにて特定領域研究B「世代間の利害調整に関する研究」ワークショップが開かれ、本基盤研究の研究対象である「チェコの年金改革」に関して発表報告した。また平成15年3月に同特定領域研究主催国際ワークショップにて、チェコ人発表の「チェコの社会補償制度」と題した報告に関してコメントした。こうした年金改革の研究を進化させるため、平成14年10月11月にチェコへ現地調査を実施した。また本基盤研究の柱の一つである中欧の国有企業の私有化とリストラに関しては、産業構造の変化という視点から平成14年6月に比較経済体制学会にて共通論題報告「チェコの産業構造の特色」として発表報告を行なった。この成果は平成15年4月刊行予定の『比較経済体制学会年報』(査読付き)に掲載予定である。標記「中欧の体制転換プロセスの到達度」に関して,チェコ,ポーランド,ハンガリーのマクロ経済政策,私有化,(旧)国有企業のリストラ,年金など社会保障政策,対外直接投資などの諸領域を対象に,現地資料など国際機関発行資料に加え,現地調査を実施して,上記3カ国の体制転換プロセスの到達度を比較検討する目的で本研究プロジェクトを実施した。その成果は平成14年6月の比較経済体制学会全国大会において共通論題『チェコにおける産業政策と産業構造の色』(単独)と題する発表を行い,チェコをケーススタディーとして旧社会主義国の体制転換プロセスにおける産業構造の転換の特色を歴史的に研究発表した。その中で1998年以降の対外直接投資が経済発展に大きく貢献し,外資企業を中心に企業リストラが進展することを論じた。この成果は翌平成15年6月発行の『比較経済体制学会年報』に「チェコにおける産業政策と産業構造の特色」として発表した。また体制転換第2段階の重要課題である社会保障問題に関しては,平成15年9月に発表した「チェコの老齢年金」『海外社会保障研究』において,チェコをケーススタディーとして,現在世界的に問題になっている年金制度改革,財政問題に関して,付加的年金制度の未整備および財政政策の失敗による年金財政赤字,さらに世界共通の高齢化問題によって,チェコの年金制度が現在破綻状態になっていることを制度的に論じた。

平成15年には上記産業構造問題研究を発展させ,チェコにおける直接投資に関して重点的に調査・研究し,チェコにおいて対外直接投資がチェコ経済に寄与していること,日系企業が機械工業を中心に近年進出し,チェコ経済(工業生産,輸出,企業統治,リストラ)に大きな影響を与えていることを調査研究した。その成果は平成15年7月の経営行動研究学会全国大会にて『チェコにおける日系企業の投資環境』と題した発表を行い,さらにこれらに成果は日本大学経済学会紀要『経済集志』に「チェコにおける産業構造の特色と日系企業の投資環境」(平成15年10月)として論文発表した。さらに現在,体制転換国,特に中欧を射程に入れた企業統治に関する論文を日本大学経済科学研究所ワーキングペーパーに発表予定であり,同時にチェコの体制転換プロセス14年間を総括した「チェコにおける体制転換プロセス」を『ロシア研究』(近刊)に発表予定である。
発現ピークが異なる新規の頭蓋顔面遺伝子の胚発生における機能解析

『頭顎顔面の初期発生に発現する新規同定遺伝子の役割の解明』顎顔面は、他の器官と同様にダイナミックな上皮と間葉の相互作用のもとに形成される。古典的な両生類の移植実験おいて、歯牙・骨・軟骨の形態形成には口腔外胚葉と頭部神経堤細胞と前腸内胚葉の三つの組織の存在と相互作用が必要であることが示されている。したがって、顎顔原基の形態形成における新規同定遺伝子の役割を解明するためには、それらの3つの組織における新規遺伝子の局在領域とその発生段階を明かにし、さらに、その下流で働く既知の分子を同定することが重要である。(1)胚発生におけるこれらのkrox26の局在とその発生段階Krox26は、FGFRの発現領域に発現することが、あきらかになり、E10までは予定軟骨形成領域の初期マーカー(Sox9とTypeII collagen)と相補的な発現パターンを示し、軟骨を形成する時期(E11.5以降)には消失することが明らかになった。Fgf-signalingを介するearly-response geneであることを示唆している。(2)E9からの下顎器官培養下でランダムとアンチセンスのOligo-nulceotidoを適用した結堰A両者の差は認められなかったが、krox26の遺伝子の過剰発現させるとメッケル軟骨が消失した。(3)組織学的に培養胚や培養器官を解析し、新規遺伝子の強制発現によりsox9とTypeII collagenが低下することが明らかになった。(4)Fgf8の発現を抗体により阻害した結果、顎におけるkrox26の発現が減少した。これらのことは、krox26はFgfsignalingを介する未分化の維持に機能していることを示唆している。「頭顎顔面の初期発生に発現する新規同定遺伝子の役割の解明』顎顔面は、他の器官と同様にダイナミックな上皮と間葉の相互作用のもとに形成される。そこで、現在以下の戦略で研究を行っている。すなわち、(1)in situハイブリダイゼーションを用い、胚発生におけるこれらの新規遺伝子の局在とその発生段階を明らかにし、これまでの研究で明らかにしている口腔外胚葉と前腸内胚葉由来の上皮と神経堤細胞および一次中胚葉などの由来の異なる4つの組織の分布領域と比較し、これらの分子がどの組織で発現し、どの組織によって制御されている可能性があるかを検討する。(2)次に、上述した哺乳類全胚培養法や器官培養法などの方法を応用する。すなわち、培養下でアンチセンスオリゴまたはセンス鎖を発現するアデノウイルスを適用し、新規の遺伝子を抑制または過剰発現させ、(3)組織学的に培養胚や培養器官を解析し、新規遺伝子が制御する発生現象を明らかにする。(4)さらに、培養後の胚や器官からRNAを抽出し、マイクロアレイやリアルタイムPCRを用い、それら新規の遺伝子が制御する下流の遺伝子を明らかにする。(5)最後に、2)の操作によって抑制された発生現象が、4)で明かにした下流の分子でレスキューされるかどうかを確かめる。新規同定遺伝子A(Krox-26)が、E7.75-E10までの胚の間葉で強く発現していることを確認しており、哺乳類下顎培養法を適用し、上述の軟骨の組織分化を遅延させる結果を得ている。現在、下流の遺伝子の解析を行っている。顎(メッケル軟骨を含む)の発生にも口腔外胚葉のFGF8は機能している。そこで、顔面原基ならびに歯胚における口腔外胚葉と頭部神経堤細胞と前腸内胚葉の3つ組織の分布領域とKrox26の発現領域を比較検討し、下顎器官培養法(E9.5E13)を適用し、歯胚の発生と顎顔面の形態形成における役割を解明する。(1)胚発生におけるこれらのkrox26の局在とその発生段階E10までは予定軟骨形成領域の初期マーカー(Sox9とTypeII collagen)と相補的な発現パターンを示し、軟骨を形成する時期(E11.5以降)には消失することが明らかになった。(2)E9からの下顎器官培養下でランダムとアンチセンスのOligo-nulceotidoを適用した結果、両者の差は認められなかったが、krox26の遺伝子の過剰発現させるとメッケル軟骨が消失した。『頭顎顔面の初期発生に発現する新規同定遺伝子の役割の解明』

顎顔面は、他の器官と同様にダイナミックな上皮と間葉の相互作用のもとに形成される。古典的な両生類の移植実験おいて、歯牙・骨・軟骨の形態形成には口腔外胚葉と頭部神経堤細胞と前腸内胚葉の三つの組織の存在と相互作用が必要であることが示されている。したがって、顎顔原基の形態形成における新規同定遺伝子の役割を解明するためには、それらの3つの組織における新規遺伝子の局在領域とその発生段階を明かにし、さらに、その下流で働く既知の分子を同定することが重要である。(1)胚発生におけるこれらのkrox26の局在とその発生段階Krox26は、FGFRの発現領域に発現することが、あきらかになり、E10までは予定軟骨形成領域の初期マーカー(Sox9とTypeII collagen)と相補的な発現パターンを示し、軟骨を形成する時期(E11.5以降)には消失することが明らかになった。Fgf-signalingを介するearly-response geneであることを示唆している。(2)E9からの下顎器官培養下でランダムとアンチセンスのOligo-nulceotidoを適用した結堰A両者の差は認められなかったが、krox26の遺伝子の過剰発現させるとメッケル軟骨が消失した。(3)組織学的に培養胚や培養器官を解析し、新規遺伝子の強制発現によりsox9とTypeII collagenが低下することが明らかになった。(4)Fgf8の発現を抗体により阻害した結果、顎におけるkrox26の発現が減少した。これらのことは、krox26はFgfsignalingを介する未分化の維持に機能していることを示唆している。
ATM高速情報通信ネットワークのAdmission Controlに関する研究

平成15と16度では、ATM高速情報通信ネットワークシステムによく使われている二つのバッファ、複数のINPUTトラヒックと複数のサーバを持つポーリングシステムの理論研究を行うと同時にその移動通信ネットワークへの応用モデルの解析も行いました。研究の内容は次の三つの部分にまとめられました。平成15度では、ATM高速情報通信ネットワークシステムによく使われている二つのバッファと各バッファに複数のINPUTトラヒック及び複数のサーバを持つポーリングシステムに対して、Bernoulli処理方式と優先客に専用サーバを設置する処理方式の下でコンピュータシミュレーションと理論モデルの解析を行いました。システムの安定性、各バッファの仕事量の分布、オーバーフローなどに関するデータを取り、ポーリングシステムのトラヒックの様子をデータから分析しました。これらの結果に基づいて理論モデル:1.複数の到着流、複数のサーバ及び二つのバッファをもつ離散ポーリングモデル;2.二種類の到着流、二つのサーバ及び一つの共同有限容量バッファをもつ待ち行列モデルをたてて理論解析を行いました。具体的に、モデル1に対して、到着トラヒックが一般的な分布に従い、複数のサーバがBernoulli処理方式でバッファのトラヒックを処理するという仮定の下で、大偏差の理論を用い各バッファの仕事量の定常分布を推測し、大偏差の上、下界を求めました。これらの結果を使って、到着がマルコフ変調過程である場合、各バッファの到着トラヒックに対する有効なAdmission Controlアルゴリズムを求めました。モデル2に対して、到着トラヒックがポアソン過程に従い、サービス時間が異なる指数分布に従い、そして、優先客に専用サーバを設ける仮定の下で、共同有限バッファの中に二種類客の人数の定常分布及び待ち時間の分布を求めました。この結果を使って、各種類の客に対してAdmission Controlアルゴリズムを与えて数値計算を行いました。以上の結果を五つの論文にまとめ、そのうち一つは2003年フランスでの「International Network Optimization Conference」国際会議で発表され、一つは雑誌に掲載されました。また、一つは投稿中で後の二つは投稿準備中です。
薬剤耐性のヒトゲノム解析の共同研究

制癌剤耐性に関与する遺伝子群はがん化学療法に対する感受性を左右するだけでなく分化・発生とも密接に関連して重要な機能を有することが示され多大な注目を集めている。本研究は、このうち多剤耐性MDR1遺伝子及びエトポシド耐性関連遺伝子に焦点をしぼり、以下の事項を明かにすることを目的とする。1.遺伝子発現制御領域の単離およびゲノム構造の解析。2.MDR1遺伝子近傍の遺伝子群の同定と共通制御の有無。3.ヒト組織。腫瘍における発現様式。4.ヒト腫瘍における耐性獲得の診断プローブとしての可能性の検索。本研究で得た成果を以下に列挙する。1.ヒトMDR1遺伝子プロモーター領域の解析。ヒトMDR1遺伝子は2つのプロモーターによりその発現が制御されていることが報告されているが相互の役割等、詳細は不明であった。我々は下流制御領域をファージ・ゲノムライブラリーより単離し、制御ドメイン構造を明かにした。これには、制癌剤、紫外線、血清除去などに反応する制御ドメインが含まれ、MDR1遺伝子をストレス応答遺伝子群の1つとして位置づけることができた。上流プロモーターに関しては、遺伝子増幅をともなう多剤耐性細胞でのみ機能していることが示唆された。2.ヒトMDR遺伝子群のゲノムマップの作成。MDR遺伝子領域の構造と機能の全体的な関連を把握し、近傍の未知遺伝子の同定、共通制御の有無を明かにするための第一歩として、この領域のマッピングを試みた。上記制御領域からPCRプライマーを合成し、ワシントン大学のヒト全ゲノムおよび7番染色体特異的酵母人工染色体(YAC)ライブラリーより、YACクローンを20個単離した。エンド・クローンの単離、ヒト-ハムスター雑種パネルによる検定により約半数はキメラでなく7番染色体にマップされた。STS contentマッピング法により現在1メガベースのコンティングが構築され、またMDR1およびMDR3遺伝子を含む600kbについては、rare cutter enzymeによる物理地図を完成した。3.YAC-ヒトゲノムライブラリーの改善。ワシントン大学のライブラリーを含め、現在のYACライブラリーはキメラクローンが3050%、また不安定クローンが1%存在することが問題となっている。我々は、In gel partial fill-in法によりキメラの成因であるコライゲーションを抑え、平均500kbのライブラリーを作製する方法を開発した。さらに不安定YACクローンとして知られているヒト色盲領域を安定化させ得る変異株を単離樹立した。今後、これらの方法により、対象領域の高品質YACライブラリーを構築し、さらにコンティグ、物理地図の作成および未知遺伝子の探索を行ない、診断プローブとしての可能性を検討していく。4.ヒトMDR遺伝子の増幅単位とその機序。MDR1遺伝子の増幅と発現に関与するゲノム領域と構造を決定するため、MDR1と3遺伝子を含む酵母人工染色体をマウス細胞に導入し、抗癌剤ビンクリスチンに対する耐性獲得にともなう遺伝子増幅と発現の機序を検討した。MDR1遺伝子を含む580kbの酵母人工染色体をマウスL細胞に導入した。この導入株をビンクリスチン処理することにより、MDR1遺伝子の遺伝子増幅および発現促進が認められた。しかし、マウスの内在性mdr1aの発現は見られなかった。以上、我々は酵母人工染色体を用い、MDR遺伝子領域の機能的な導入とヒトMDR1遺伝子の選択的増幅、発現をさせることに成功した。5.エトポシド耐性関連遺伝子DNAトポイソメラーゼIIの遺伝子構造と発現。エトポシド耐性関連遺伝子のうち、トポイソメラーゼIIやIを標的とした抗癌剤は近年その有効性から臨床応用へ多くの期待がよせられている。トポイソメラーゼの量的低下が耐性獲得の1つの原因となること、さらに高温処理により、トポイソメラーゼIIの発現が上昇することの2点を明かにした。現在、トポイソメラーゼII発現制御様式について解析を行なうためトポイソメラーゼIIプロモーター領域をファージゲノムライブラリーより単離した。現在、制御領域の一連の欠失変異体を構築し、制御ドメイン構造を明かにしつつある。3.ヒト組織。

上記制御領域からPCRプライマーを合成し、ワシントン大学のヒト全ゲノムおよび7番染色体特異的酵母人工染色体(YAC)ライブラリーより、YACクローンを20個単離した。エンド・クローンの単離、ヒト-ハムスター雑種パネルによる検定により約半数はキメラでなく7番染色体にマップされた。STS contentマッピング法により現在1メガベースのコンティングが構築され、またMDR1およびMDR3遺伝子を含む600kbについては、rare cutter enzymeによる物理地図を完成した。3.YAC-ヒトゲノムライブラリーの改善。ワシントン大学のライブラリーを含め、現在のYACライブラリーはキメラクローンが3050%、また不安定クローンが1%存在することが問題となっている。我々は、In gel partial fill-in法によりキメラの成因であるコライゲーションを抑え、平均500kbのライブラリーを作製する方法を開発した。さらに不安定YACクローンとして知られているヒト色盲領域を安定化させ得る変異株を単離樹立した。今後、これらの方法により、対象領域の高品質YACライブラリーを構築し、さらにコンティグ、物理地図の作成および未知遺伝子の探索を行ない、診断プローブとしての可能性を検討していく。4.ヒトMDR遺伝子の増幅単位とその機序。MDR1遺伝子の増幅と発現に関与するゲノム領域と構造を決定するため、MDR1と3遺伝子を含む酵母人工染色体をマウス細胞に導入し、抗癌剤ビンクリスチンに対する耐性獲得にともなう遺伝子増幅と発現の機序を検討した。MDR1遺伝子を含む580kbの酵母人工染色体をマウスL細胞に導入した。この導入株をビンクリスチン処理することにより、MDR1遺伝子の遺伝子増幅および発現促進が認められた。しかし、マウスの内在性mdr1aの発現は見られなかった。以上、我々は酵母人工染色体を用い、MDR遺伝子領域の機能的な導入とヒトMDR1遺伝子の選択的増幅、発現をさせることに成功した。5.エトポシド耐性関連遺伝子DNAトポイソメラーゼIIの遺伝子構造と発現。エトポシド耐性関連遺伝子のうち、トポイソメラーゼIIやIを標的とした抗癌剤は近年その有効性から臨床応用へ多くの期待がよせられている。トポイソメラーゼの量的低下が耐性獲得の1つの原因となること、さらに高温処理により、トポイソメラーゼIIの発現が上昇することの2点を明かにした。現在、トポイソメラーゼII発現制御様式について解析を行なうためトポイソメラーゼIIプロモーター領域をファージゲノムライブラリーより単離した。現在、制御領域の一連の欠失変異体を構築し、制御ドメイン構造を明かにしつつある。癌の治療における最大の難関の1つは抗癌剤に耐性を示す癌の出現である。この分子機構を明らかにする目的で耐性と関連するヒトゲノム構造の解析を進め,癌の耐性の診断や治療へ貢献したいと考えた。
コメにおけるアレルゲン蛋白質の分布と存在状態の解析

われわれは、これまでにコメの主要アレルゲン蛋白質について研究し、その主要成分は分子量約1400016000の一群の水溶性蛋白質であることを明らかにしている。本研究は、このアレルゲン蛋白質が米粒中にどのような状態で存在するかを明らかにすることを目的としたものである。実験は登熟期のイネ種子摩砕物をショ糖密度勾配超遠心分離機によって、多数の画分に分け、それぞれの画分を解析することによって行った。すなわち、各画分のすべてについては、SDSーポリアクリルアミド電気泳動とウェスタンブロットを行い、単クロ-ン抗体を用いてアレルゲン蛋白質の検出、同定を行った。その結果、アレルゲン蛋白質は低密度のミクロソ-ム画分にのみ検出され、コメの主要貯蔵蛋白質であるプロラミンやグルテリンとは異なる画分に含まれることが明らかとなった。このことは、プロラミンやグルテリンとは異なり、本アレルゲン蛋白質が胚乳中のプロテインボディには含まれず、小胞体に存在することを示唆するものであり興味深い。この点をさらに確かめるために、米粒蛋白質の抽出性におよぼす超音波処理の影響について実験を行った。その結果、一定条件での超音波処理を旋すことにより、粉砕された米粒のみならず、インタクトな米粒からもアレルゲン蛋白質は、可溶化、抽出されることが明らかとなった。この場合に抽出されるアレルゲン蛋白質の量は、抗体を使った免疫学的手法を用いることにより全量の約90%近くであることが明らかになった。一方、このような大量のアレルゲン蛋白質の抽出が行われるにもかかわらず、プロラミンやグルテリンの抽出はほとんど行われなかった。また、このことは同時に行った走査電顕を用いた観察によっても確められている。以上の知見は、学問的に興味あるばかりでなく、米粒を処理してその低アレルゲン化を考える場合においても極めて貴重なものと思われる。
単一細胞での膜界面における細胞外マトリックス分解反応と腫瘍細胞浸潤能の同時計測

細胞を支持する細胞外マトリックスの主要な成分のコラーゲンIV分解反応をリアルタイムで評価できる手法を構築した.本計測法により,カテプシンBのエンドペプチダーゼ活性とエキソペプチダーゼ活性によりコラーゲンIVが分解されることが示唆された.また,コラーゲンIV分解反応の阻害活性を評価する手法を構築した.これら計測法を発展させ,細胞ーコラーゲンIVで形成される微小空間内のカテプシンBによるコラーゲンIV分解反応を可視化するために,表面プラズモン共鳴イメージング装置を開発した.腫瘍細胞の浸潤と,細胞膜界面の微小空間内で生じる細胞外マトリックス分解反応を同時かつリアルタイムで可視化することのできる手法を開発するために,表面プラズモンイメージング装置の開発を行った.清浄なガラスに金薄膜を蒸着したセンサーチップをプリズム上に設置し,平行光(P偏光)を同プリズムに照射した際に反射されてくる光をCCDカメラで撮影した.金薄膜にスクロース溶液を添加した際に得られる画像の輝度が濃度に依存して高くなることから,本計測装置でSPR像を取得できることが確認できた.金薄膜上に規則正しく正方形を配置したPDMS基板のSPR像を取得することで,本計測装置の解像度を評価した.その結果,反射光を集光してから再度,平行光にすると解像度が向上し,100 μm程度であれば質の高い画像を得ることができることがわかった.一方,細胞外マトリックス分解反応に腫瘍細胞から放出されるカテプシンBが深く関与することから,カテプシンBによるコラーゲンIV (細胞外マトリックス主要成分)の分解反応の活性を定量的に評価できる手法を開発し,コラーゲンIV分解反応のメカニズムを考察した.カテプシンBによりコラーゲンIVの末端が分解されるとともにその3本鎖らせん構造が不安定化し,それによって分解反応が亢進するものと示唆された.この知見は腫瘍細胞の細胞浸潤と細胞外マトリックス分解反応の関連性を理解する上で重要になるものと考えられる.さらに,カテプシンB濃度を評価するための低分子プローブの作製にも着手した.さらに,この開発した手法をカテプシンBに対する阻害活性評価法に展開した.阻害活性存在下において,カテプシンB活性に基づき変化するSPRシグナル変化量が減少した.これらは細胞浸潤と細胞外マトリックス分解反応の同時可視化法を開発する際の基礎データになる.細胞および細胞外マトリックスで形成されるナノ空間で生じる細胞外マトリックス分解反応をモニタリングするために,表面プラズモン共鳴(SPR)イメージング装置に着目した.SPRイメージングは数社から販売されているが,単一細胞を観察できるほど,高倍率かつ高空間分解能を有する装置は見当たらない.当該年度では,前年度作製したSPRイメージング装置を改良し,高倍率かつ高空間分解能で画像を取得できることができた.しかしながら,,倍率は固定であり,測定に熟練した技術を要するものであった.そこで,受光部に可変式のズームビームエキスパンダーの設置を試みている.一方,SPRイメージング装置の性能を評価するために,光ファイバー型SPR装置を作製した.両者で感度,精度の比較を行なっている.光ファイバーSPR装置は,SPRによる細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法で得られたデータの確度を評価する上で有用であると考えている.さらに,従来のSPR装置を用いてカテプシンB阻害剤のスクリーニング法を構築した.本法は,数回の計測で,化合物の阻害定数Kiを算出できる手法であった(論文投稿準備中).ソルバトクロミックな蛍光色素であるナイルブルーを利用した,簡便な細胞外マトリックス分解反応のスクリーニング法を構築した.細胞外マトリックスのモデルとしてゼラチンを採用し,ゼラチンに一枚膜のリポソーム(SUV)を封入した.このゲルはマイクロプレート内に作製されており,細胞外マトリックス分解酵素の存在下でゼラチンゲルが分解される.その際,SUVの脂質二分子膜内に二量体であるナイルブルーが自発的に取り込まれ(濃縮効果),単量体に変化することで蛍光を発する.酵素の活性評価は蛍光強度の増強により評価することが可能であった.表面プラズモン共鳴センサーを利用して、コラーゲンIVを基質とし、阻害剤によるカテプシンB活性の阻害効果を評価する手法の検討を行った。実験条件を最適化することにより、CA-074、ロイペプチン、Z-FA-FMKの阻害定数Kiを算出することが出来た。また、ペプチド基質であるZ-Phe-Arg-pNAを用いて得られた阻害定数Ki値との比較を行った。カテプシンBによるコラーゲンIV分解反応では、ぺプチド基質とは異なり、カテプシンBのエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼ活性が関与する。この2つの活性はカテプシンBの立体構造変化に起因するものであり、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼ活性のどちらを阻害するのかは、阻害剤とカテプシンBの複合体形式に基づいている。そのため、エンドペプチダーゼ活性により分解されるPhe-Argのジペプチドを用いた場合とでは、得られたKi値の序列が異なることが示された。本申請課題で開発したカテプシンB阻害活性評価法は、簡便かつ迅速であるだけでなく、コラーゲンIVを基質として用いているため、生体内で生じるカテプシンB阻害活性を強く反映しているものであると考えられる。一方、より簡便な細胞外マトリックス分解反応を評価する手法の構築も検討した。細胞外マトリックスのモデルとしてゼラチンを基質として用いた手法であり、生体内で生じる細胞外マトリックス分解反応をin vitroで評価するするのに利用できるものと考えられる。

リポソームをゼラチンゲルに封入した後、プロテアーゼを添加する。一定時間、静置した後、色素ナイルブルーを添加した。ゼラチン分解反応の進行に伴い、リポソームの脂質二分子膜内にナイルブルーが取り込まれるようになり、H会合体から単量体に解離することで著しい蛍光強度の増大が観測されるようになる。この手法で、カテプシンB活性を評価することにも成功した。細胞を支持する細胞外マトリックスの主要な成分のコラーゲンIV分解反応をリアルタイムで評価できる手法を構築した.本計測法により,カテプシンBのエンドペプチダーゼ活性とエキソペプチダーゼ活性によりコラーゲンIVが分解されることが示唆された.また,コラーゲンIV分解反応の阻害活性を評価する手法を構築した.これら計測法を発展させ,細胞ーコラーゲンIVで形成される微小空間内のカテプシンBによるコラーゲンIV分解反応を可視化するために,表面プラズモン共鳴イメージング装置を開発した.本申請は,SPRによるカテプシンB活性評価法の構築,阻害活性評価法の構築をもとに,単一細胞における細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法を構築することである,カテプシンB活性測定法および阻害活性測定法に関しては,構築することができた.一方,SPRイメージング装置の作製の進展はやや遅れている.本計測装置は,倍率およびステージが可変式であり,顕微鏡に近い性能を有するものである.このような装置は販売されていないだけでなく,世界的にみても投稿論文による発表例もない.そのため,本計測装置は新規なSPRイメージング装置であり,その開発に時間を要している.また,カテプシンB活性プローブの作製に時間を費やしてきたが,現在はゼラチンゲルに封入することで,プローブと同様に,カテプシンB活性を評価できるシステムに変更した.このシステムはほぼ完成している.生体分析化学今後の研究推進方針を下記の通り,テーマ別にまとめて示した.SPRイメージング装置の開発:ステージおよび倍率可変式のイメージング装置を開発する.カテプシンB分解反応のモニタリング法に関しては,これまでに多くのノウハウを蓄積してきた.これらの経験をもとに単一細胞を対象とした細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法を構築していく.カテプシンB阻害活性評価法:阻害活性測定法の開発に成功しているが,23種類の生理活性物質に着目して,阻害定数の評価を行なっていくことが必要である.阻害定数Ki値を算出し,既存の測定法(ペプチド基質による評価法)と比較して確度を評価する.光ファイバーSPRシステムを用いた細胞外マトリックス分解反応の評価:光ファイバーSPRはすでに申請者は確立しており,細胞外マトリックス分解反応の計測へ応用する,SPRイメージング法で得られた結果と比較して確度を評価する.ソルバトクロミック色素(ナイルブルー)を用いる活性評価:SUV封入ゼラチンゲルにより,カテプシンBを活性を簡便に評価できるシステムを構築してきた.本法により,カテプシンBのみならず,マトリックスメタロプロティナーゼ2および9の活性評価も行なう.さらにカテプシンB活性評価に用いる低分子プローブの作製も引き続き検討する.表面プラズモン共鳴イメージングは完成に近づいており,実際にSPR像を取得することができる.
分子性導体の単分子膜およびLB膜に関する研究

BEDO-decylTCNQ錯体を用いて金属的な導電性を有するLB膜を作製し、この膜の物性を詳細に検討した。また、この錯体の水面上の単分子膜について電気伝導度を測定し、膜の構造との関連を明らかにした。LB膜はアラキン酸(C_<20>のカルボン酸)と1:1に混合し作製した。この膜の電気伝導度は室温から250K付近まで温度の低下とともにわずかながら上昇するが、それ以下の温度ではほぼ活性化型の導電挙動を示し、全体の温度依存性は狭ギャップ半導体の式で良く近似することができた。AFMの測定から、この膜はドメイン構造を有していることが判明している。この場合、電気伝導度の温度依存性はドメイン境界に主として支配される。一方、ドメイン内の電気的性質は熱電能測定およびESR測定から金属的であることが示唆された。水面上の単分子膜の電気伝導度をアラキン酸との混合比を変化させながら測定した。膜の表面圧-面積曲線の挙動は錯体の混合率が0.56付近で変化した。それに伴い、膜の導電率-面積曲線も大きく変化し、混合比の大きいところでは比較的高い導電率を与えた。これらの結果は、アラキン酸の含有量が低い場合、単分子膜が一種の超単分子膜構造をとると仮定することで良く説明できた。クラウンエーテルを含む導電性の金属錯体を18-crown-6を中心に系統的に探索した。アルカリ金属としてリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムさらにアンモニウムを用いたが、いずれの場合も導電性の錯体を得ることが出来、X線構造解析を行ったところ、このうち3種については結晶内にイオンチャンネル類似のクラウンエーテルのカラム構造が形成していることが明らかとなった。
臓器移植におけるリンパ球アポトーシス導入による免疫寛容の誘導

平成10年度および11年度前半はBusulfan,FTY投与による前処置を施した後ドナー骨髄移植を併用した腎移植を施工し、リンパ球アポトーシス導入による免疫寛容の誘導を試みた。初期2例にはBusulfanを手術7日前から4日前まで4日間連続4mg/kg/dayで投与し、FTYを手術3日前から1日前まで3日間連続5mg/kg/dayで投与した。しかし骨髄抑制が強すぎたため、いずれも極端な氾血球減少症に陥り、1例目は手術後17日で敗血症により死亡した。そこで次からはFTYの投与法は変更せずに、Busulfanを3mg/kg/day3日間に減量して腎移植を行ったが、今度は十分な骨髄抑制が得られず、ドナー骨髄の生着も認められず全例拒絶された。そこで平成11年度後半はプロトコールを変更して再度免疫寛容の誘導を試みることにした。変更の第1点はbusulfanに代えてCyclophosphamideを骨髄抑制ならびに免疫抑制効果を期待して投与したこと、第2点は骨髄採取法を変更したことである。これまで骨髄細胞はドナーの腸骨から直接穿刺により得ていたが、近年骨髄移植の臨床で盛んに試みられるようになってきた末梢血幹細胞移植と同様に、術前5日間ドナーに対してG-CSFを投与した後アフェレーシスを行ってドナー末梢血幹細胞を採取する方法に変更したことである。その結果より多くの骨髄細胞が採取され、現在までのところどの症例も拒絶反応は認められず、免疫抑制剤中止後1例目は120日以上、2例目も90日以上生存し、移植腎機能も正常に機能している。今後はMLRによるドナー特異的無反応状態となっていることの確認や、ドナー、第3者の皮膚移植を行うことにより、ドナー特異的免疫寛容の確認をする予定である。まず最初にFull mismatchとなるようなドナーとレシピエントの組み合わせを選択するためのスクリーニング検査を10頭のサルについて行った。1)HLA-class I-ドナー陽性、レシピエント陰性となるような組み合わせを選ぶため、HLA-class Iモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより検索した。2)HLA-classII-10頭のサルを用いたリンパ球混合培養試験を施行し、強陽性となるような組み合わせを選別した。以上の2つの検査により、HLA full mismatchの組み合わせを7組決定した。今回実験に使用する薬剤(Busulfan,FTY720)はこれまで使用経験がないため、サルにおける各薬剤の効果、影響について検討する必要があり、実験の第一段階として、まず腎移植をせずに薬剤だけを投与し、サルにおける至適投与量、投与法を検討した。2頭のサルにBusulfan 4mg/kg/day x4(Day-7,-6,-5,-4),FTY7205mg/kg/day x3(Day-2,-1,0)を投与し、投与前、投与中、投与後と連続的に採血し、骨髄抑制の程度、リンパ球アポトーシスの程度、肝障害、腎障害の有無を検索した。その結果以前に行っていた他のプロトコールと同程度の骨髄抑制が得られたため、この投与量、投与法で腎移植、骨髄移植を実施することにした。現在までのところ4組の腎移植が終了したが、1例目は予想以上に骨髄抑制の程度が強く術後16日目に敗血症により死亡した。移植腎磯能、肝機能は正常であった。3例目は術後1日目に術後出血を起こした後乏尿となり、その後の輸液で肺水腫を併発し術後5日目に死亡した。2例目と4例目は現在経過観察中である。

平成10年度および11年度前半はBusulfan,FTY投与による前処置を施した後ドナー骨髄移植を併用した腎移植を施行し、リンパ球アポトーシス導入による免疫寛容の誘導を試みた。初期2例にはBusulfanを手術7日前から4日前まで4日間連続4mg/kg/dayで投与し、FTYを手術3日前から1日前まで3日間連続5mg/kg/dayで投与した。しかし骨髄抑制が強すぎたため、いずれも極端な氾血球減少症に陥り、1例目は手術後17日で敗血症により死亡した。そこで次からはFTYの投与法は変更せずに、Busulfanを3mg/kg/day3日間に減量して腎移植を行ったが、今度は十分な骨髄抑制が得られず、ドナー骨髄の生着も認められず全例拒絶された。そこで平成11年度後半はプロトコールを変更して再度免疫寛容の誘導を試みることにした。変更の第1点はBusulfanに代えてCyclophosphamideを骨髄抑制ならびに免疫抑制効果を期待して投与したこと、第2点は骨髄採取法を変更したことである。これまで骨髄細胞はドナーの腸骨から直接穿刺により得ていたが、近年骨髄移植の臨床で盛んに試みられるようになってきた末梢血幹細胞移植と同様に、術前5日間ドナーに対してG-CSFを投与した後アフェレーシスを行ってドナー末梢血幹細胞を採取する方法に変更したことである。その結果より多くの骨髄細胞が採取され、現在までのところどの症例も拒絶反応は認められず、免疫抑制剤中止後1例目は120日以上、2例目も90日以上生存し、移植腎機能も正常に機能している。今後はMLRによるドナー特異的無反応状態となっていることの確認や、ドナー、第3者の皮膚移植を行うことにより、ドナー特異的免疫寛容の確認をする予定である。
ras発癌遺伝子産物p21の構造と機能

ras発癌遺伝子産物p21と相互作用を示す因子の同定およびp21の生化学的性質の検討を行ない,以下に記す結果を得た.1.p21と直接に相互作用を示す因子としてp21のGTPase活性を顕著に促進する活性を見出した.この活性は,正常型p21に特異的であり,変異型p21に対しては効果を示さなかった.実際に細胞内でp21に結合しているヌクレオチドを分析したところ,正常型p21はほとんどGDPを結合しているのに対し変異型p21ではGTPおよびGDPの両者を結合しており,試験管内で得られた結果と一致した.促進活性の組織特異性とp21の発現量との間に相関関係が認められ, p21の活性を制御している可能性を示した.また細胞増殖との関連性を検討したところ,促進活性は培養細胞密度に比例して増加し,この活性が正常細胞の密度依存性成長停止に関与することを示唆した.2.p21のヌクレオチド交換反応について調べ,単クローン抗体Y13ー259がこの反応を完全に阻害することを見出した.この抗体は,細胞内に微量注入した際にp21の機能を抑制することから, p21がこの反応により再活性化されることを示唆した. 59番目のアミノ酸がスレオニンで置換されたp21は交換反応が著しく早く,再活性化され易いことを示した.硫酸アンモニウムおよびEDTAが協同的に交換反応を促進することを見出し,両者の存在下のゲルろか法によりヌクレオチドを結合していないp21を得ることに成功し,グアニンヌクレオチドとの相互作用を詳細に検討した.3.グアニンヌクレオチドの誘導体を用いた親和性標識によりp21のヌクレオチド結合中心構造を一次構造のレベルで決定し,アミノ末端より16番目のリジン残基がヌクレオチドのリン酸基と近接した位置に存在することを明らかにした.ras発癌遺伝子産物p21と相互作用を示す因子の同定およびp21の生化学的性質の検討を行ない,以下に記す結果を得た.1.p21と直接に相互作用を示す因子としてp21のGTPase活性を顕著に促進する活性を見出した.この活性は,正常型p21に特異的であり,変異型p21に対しては効果を示さなかった.実際に細胞内でp21に結合しているヌクレオチドを分析したところ,正常型p21はほとんどGDPを結合しているのに対し変異型p21ではGTPおよびGDPの両者を結合しており,試験管内で得られた結果と一致した.促進活性の組織特異性とp21の発現量との間に相関関係が認められ, p21の活性を制御している可能性を示した.また細胞増殖との関連性を検討したところ,促進活性は培養細胞密度に比例して増加し,この活性が正常細胞の密度依存性成長停止に関与することを示唆した.2.p21のヌクレオチド交換反応について調べ,単クローン抗体Y13ー259がこの反応を完全に阻害することを見出した.この抗体は,細胞内に微量注入した際にp21の機能を抑制することから, p21がこの反応により再活性化されることを示唆した. 59番目のアミノ酸がスレオニンで置換されたp21は交換反応が著しく早く,再活性化され易いことを示した.硫酸アンモニウムおよびEDTAが協同的に交換反応を促進することを見出し,両者の存在下のゲルろか法によりヌクレオチドを結合していないp21を得ることに成功し,グアニンヌクレオチドとの相互作用を詳細に検討した.3.グアニンヌクレオチドの誘導体を用いた親和性標識によりp21のヌクレオチド結合中心構造を一次構造のレベルで決定し,アミノ末端より16番目のリジン残基がヌクレオチドのリン酸基と近接した位置に存在することを明らかにした.
東京都心部における低未利用地の動向と有効利用の方向性に関する研究

事例地域の低未利用地のうち、その多くが首都高速都心環状線の以東の地域に点在している。これは低地価地域への集中が見てとれるが、複雑に入り組んだブロックの内側とともに比較的広幅員な道路に面した地点にも分布している。代表的な低未利用地であるコイン式駐車場の平均規模は165m2で、6.5台の駐車スペースをもつ。これらの所有者の変遷を登記簿により確認すると、1984年は法人が4、個人が9であっが、2000年にはそれぞれ10、3と一転しており、土地所有の法人化が進展している。1980年代末のバブル経済期における土地投機が活発化し、これはすなわち夜間人口の減少にともなう都心部の空洞化・高齢化を発生させ、都心部における居住環境を悪化させた。高齢者の街と化し、都心部で長年生活を送ってきた高齢者にとっては必ずしも快適な生活空間ではなくなった。個人から法人への所有権の移転は1980年代後半の地価高騰期に生じており、移転原因も売買や相続物納、相続後の競売売却が主なもので、都心部の異常な地価高騰がその背景にある。また、1987年当時の従前の土地利用は、2階建ての低層建築物での印刷工場や飲食店を兼用した住宅、倉庫、などであり、低次な利用が低未利用地として残存していることが明らかとなった。バブル経済崩壊後の不動産不況により、より条件の悪い土地が売れ残り、コイン式駐車場や空地などの低未利用地が生まれた。これらの低未利用地は一部まとまった規模の大きさを持つものの、大部分はブロックの内側に点在している。そのため、低未利用地の統合や一体的な整備、また集約化はきわめて困難な状況にある。さらに権利関係の複雑性が土地の高度利用の阻害要因となっている。1.目的都市空間が抱える課題を検討するための分析として、東京都心部における低未利用地の動向を明らかにすることである。2.方法本研究では都心部の空地の中でコイン式駐車場などに一時的にその姿を変えた低未利用地に着目する。本研究では低未利用地として、コイン式駐車場、材料(資材)置場、廃屋、そして空地の4種類の用途(第1図)を取り上げた。1987年当時の低未利用地データと、2000年に新たに収集されたデータとを比較検討し、さらに当該低未利用地について、東京法務局の登記事項証明書(不動産登記簿)データにより土地所有者の変遷を追及し、その発生要因を分析した。事例地域として、東京駅から隅田川に至る地域を対象とした。3.結果コイン式駐車場事例地域には計8つのコイン式駐車場があり、うち7つが首都高速都心環状線の以東の地域に点在している。低地価地域への集中が見てとれるが、複雑に入り組んだブロックの内側とともに比較的広幅員な道路に面した地点にも分布している。ビル建設用地として取得したものの、小規模さや景気の低迷により現在はコイン式駐車場として運用しているものと思われる。コイン式駐車場の平均規模は165m^2で、6.5台の駐車スペースを有している。これらの所有者の変遷を登記簿により確認すると、1984年は法人が4、個人が9であったが、2000年にはそれぞれ10、3と一転しており、土地所有の法人化が進展している。

また、1987年当時の従前の土地利用は、2階建ての低層建築物での印刷工場や飲食店を兼用した住宅、倉庫、歯科医院、屋外駐車場、事務所などであり、低次な利用であったことが判明した。目的本研究の目的は、東京都都心部における低未利用地の動向を手掛かりとして、都心空間の変容を明らかにするとともに、低末利用地の有効利用の可能性を探ることである。方法都心部の空間利用の中でも低末利用地に着目し、1997年当時のデータと、本研究で新たに収集されるデータとを比較検討することで都心空間の変容を明らかにした。報告者による再度の現地調査を行ってデータベースを作成し、1987年と2000年の2時点、及びぞれらの間の変化をGIS分析し、解析・考察を行った。結果事例地域の低未利用地のうち、その多くが首都高速都心環状線の以東の地域に点在している。これは低地価地域への集中が見てとれるが、複雑に入り組んだブロックの内側とともに比較的広幅員な道路に面した地点にも分布している。代表的な低未利用地であるコイン式駐車場の平均規模は165m2で、6.5台の駐車スペースをもつ。これらの所有者の変遷を登記簿により確認すると、1984年は法人が4、個人が9であったが、2000年にはそれぞれ10、3と一転しており、土地所有の法人化が進展している。個人から法人への所有権の移転は1980年代後半の地価高騰期に生じており、移転原因も売買や相続物納、相続後の競売売却が主なもので、都心部の異常な地価高騰がその背景にある。また、1987年当時の従前の王地利用は、2階建ての低層建築物での印刷土場や飲食店を兼用した住宅、倉庫、などであり、低次な利用が低末利用地として残存していることが明らかとなった。
食品ナノマテリアルの胎児・乳幼児毒性予測法の開発

本研究では代表的な食品ナノマテリアルである非晶質ナノシリカを経鼻曝露した際の生体影響を幼若マウスを用いて評価した。直径100nm以下のナノシリカを経口曝露した幼若マウスでのみ、一過性の体重減少や血液凝固系の活性化や肝障害が増強する傾向が認められた。以上の事実は、直径100nm以下のナノシリカがサブミクロンサイズの従来素材とは異なる生体影響を誘発する可能性を裏付けている。食品中ナノマテリアルの安全性が世界的に危惧され始めていることから、本研究では、食品中ナノマテリアルの物理化学的性状(粒子径・形状・表面電荷等)に起因した胎児・幼若マウスにおける体内吸収性/体内動態と生体影響の連関、ならびに生体に影響を及ぼすのであればその発現機構を明らかにし、最終的にこれらの情報を基盤として安全なナノマテリアルが具備すべき条件の抽出と安全性を予測する方法の開発を試みるものであり、国民の健康確保、安心と安全の保障の観点で、極めて社会的ニーズの高い取り組みである。本観点から代表的な食品ナノマテリアルである非晶質ナノシリカを経口・経鼻曝露した際の生体影響を幼若マウスを用いて評価した。その結果、ナノシリカを経口曝露した幼若マウスでは、一過性の体重減少が認められた。また、ナノシリカを経鼻曝露したマウスでは、血液凝固系が活性化する傾向が認められた。これらの減少は、300nm以上のナノシリカを投与したマウスでは認められなかった。今後は、脳神経系や免疫系などに対する影響を中心に、より詳細な安全性評価を推進する予定である。将来的には、これらの情報を活用することで、食品中ナノマテリアルの胎児・乳幼児に対する安全性を最大限に確保しつつ、ナノマテリアルの社会受容の促進やナノ食品の開発支援を実現するものと期待される。ナノマテリアルは、組織浸透性や電子反応性、強度・硬度の点で従来までのサブミクロンサイズの素材には無い革新的機能を発揮する。このため、種々産業に革命を起こす新素材になり得るものと期待されている。一方で、周知の通り、革新的機能が、逆に、予測しにくい負の生体影響を誘発する可能性が指摘され始めている。従って、ナノマテリアルの安全性評価やそれを基盤とした安全なナノマテリアルの創製が急務となっている。本研究は、食品中ナノマテリアルに焦点を絞って、物理化学的性状(粒子径・形状・表面電荷等)に起因した胎児・幼若マウスにおける体内吸収性/体内動態と生体影響の連関、ならびに生体に影響を及ぼすのであればその発現機構を明らかにし、最終的にこれらの情報を基盤として安全なナノマテリアルが具備すべき条件の抽出と安全性を予測する方法の開発を試みるものであり、国民の健康確保、安心と安全の保障の観点で、極めて社会的ニーズの高い取り組みである。H22年度までに、代表的な食品ナノマテリアルである非晶質ナノシリカを経口・経鼻曝露した際の生体影響を、幼若マウスを用いて評価し、(1)ナノシリカを経口曝露した幼若マウスでは、一過性の体重減少が認められること、(2)ナノシリカを経鼻曝露したマウスでは、血液凝固系が活性化する傾向があること、(3)これらの減少は、300nm以上のナノシリカを投与したマウスでは認められないこと、などを見出している。また、H23年度は、これらを受けて血液生化学検査を実施し、粒子径の減少に比例して肝障害が増強することを見出している。以上の事実は、ナノシリカがサブミクロンサイズの従来素材とは異なる生体影響を誘発する可能性を裏付けている。
脳内プロスタグランジンE2のてんかん発作促進作用に関する研究

本研究は、脳内プロスタグランジンE2(PGE2)が痙攣発作に及ぼす作用の解明を目的としている。本年度は、PGE2のレセプターであり脳内海馬に最も多く分布する、EP3の遺伝子欠損マウス群(EP3[-/-])8匹と野生型マウス群(EP3[+/+])7匹を用いて、てんかん発作の進展過程について両群を比較した。初回発作の誘発閾値、急性キンドリングのいずれも脳内海馬貫通路に埋め込んだ慢性電極から20Hz10秒間のテタヌス刺激を40秒間隔で与え、海馬歯状回において発作脳波を記録し、脳波上の発作について検討を行った。初回発作の誘発閾値はEP3[-/-]が30±8.2(SE)μAに対し、EP3[+/+]が32.9±13.6μAであり、その刺激強度での発作持続時間はEP3[-/-]が6.6±1.2秒に対し、EP3[+/+]が8.3±2.1秒であり、いずれも両群に有意差は認められなかった。しかし、1回目の刺激後の抑制回復過程において刺激を繰り返し、発作を誘発することになる急性キンドリングでは、EP3[+/+]では刺激による発作誘発率は速やかに上昇するのに対し、EP3[-/-]では1回目の刺激直後の発作誘発率はEP3[+/+]同様上昇するにもかかわらず、20分から30分後にかけて発作誘発率の減少があった(EP3[+/+]は75.791.4%の誘発率に対し、EP3[-/-]は37.541.3%の誘発率)。また、最終的に発作が連続して誘発されるまでに要した刺激回数は、EP3[+/+]が137±23.6回に対し、EP3[-/-]は204.4±19.3回と有意に延長した。これらの結果から、EP3[-/-]はEP3[+/+]に比べ、発作後抑制が強く、連続発作が誘発されるまでに時間を要することがわかった。以上よりEP3レセプターを介したPGE2は発作後抑制を弱め、連続発作誘発に促進的に働くことが示唆された。本研究は、痙攣発作に伴う、脳内プロスタグランジン(PG)の合成系の変化およびその作用の解明を目的としている。本年度は、まずキンドリングによる痙攣発作後のマウス脳組織を用いて、PG合成の初期段階に必要な酵素であるシクロオキシゲナーゼ2(COX2)の誘導があるかどうかを、in situ hybridization法を用いて、COX2mRNAの発現からみた。次に、痙攣発作後に、PGE2を合成するPGE2合成酵素(PGEs)が誘導されるかどうかをみるために、ラットを用いてカイニン酸(KA)誘発痙攣、電気ショック(MES)痙攣を起こした動物を作成し、PGEsmRNAの発現をin situ hybridization法で検出した。また、キンドリングによる痙攣発作後のマウスについても同様に、PGEs mRNAの発現をみた。その結果、キンドリング後2時間の、海馬歯状回の顆粒細胞層において、COX2mRNAの発現が認められた。また、KA誘発痙攣後4時間、MES誘発痙攣後2時間において、脳内血管内皮細胞において、PGEs mRNAの発現が認められたが、神経細胞ではその発現が認められなかった。また、キンドリングによる痙攣発作後のPGEs mRNAの発現もKA誘発痙攣、MES誘発痙攣と同部位の一部に見られたが、KA誘発痙攣、MES誘発痙攣に比べると、発現程度は弱いものであった。

これらの結果から、EP3[-/-]はEP3[+/+]に比べ、発作後抑制が強く、連続発作が誘発されるまでに時間を要することがわかった。以上よりEP3レセプターを介したPGE2は発作後抑制を弱め、連続発作誘発に促進的に働くことが示唆された。
HIV-1感染同一個体内でのR5・X4ウイルスの共存に関わる要因の多面的解析

HIV-1にはコレセプターとしてCCR5を使用して感染するR5ウイルスと,CXCR4を使用して感染するR5X4やX4ウイルスがある。一般には感染初期から後期にわたりR5ウイルスが持続感染しているが,感染後期にはCXCR4を利用するウイルスにスイッチするケースがあり,病態の悪化と関連している。本研究では同一個体からコレセプター利用性の異なる複数のウイルスを分離して,それぞれのウイルスがどのような機序で感染個体内で共存・維持されているかを明らかにする。このようなウイルスのスイッチの機序を解明することはHIV-1の感染免疫病態の理解,さらにはHIV-1治療・治癒に貢献することが期待される。
遺伝子ターゲッティング法を用いた紫外線高感受性修復欠損マウス系統の樹立

これまでの研究により研究によりマウス修復遺伝子ERCC5cDNAをクローニングした。本年度の研究によりマウスERCC5cDNAの全領域には対応していないが、ゲノミッククローンを数個得た。この中の1つのゲノミッククローンは全長が約19kbあり、少なくとも700bp以上ある1つのエクソンを含んでいることが判った。よってこのゲノミッククローンを用いてターゲッティングベクターを作製することにした。このターゲッティングベクターは全長約15kbのゲノミックDNAを含み、上記のエクソンの中にある制限酵素サイト(SphI)の部分にプロモーターを含むMC1neo遺伝子を挿入し、さらに約1kb下流にある制限酵素サイト(BglI)の部分にプロモーターおよびPolyAシグナルを持つHSV-TK遺伝子を挿入してあり、Positive-Negative selectionによって相同組み換え細胞を効率的に回収することが可能になっている。さらにMC1neo遺伝子の一部とHSV-TK遺伝子より上流のゲノミックDNAの塩基配列を基にPCRプライマーを設計し、相同組み換えにより遺伝子ターゲッティングが起こった場合に容易に検出できるようにした。このターゲッティングベクターを用いてマウス修復遺伝子ERCC5の遺伝子ターゲティングをES細胞に対して行った。総計で約4.3×10^6個のES細胞にターゲッティングベクターをトランスフェクションし、27,872個のG418耐性細胞を得た。このうちさらに676個のGANC耐性細胞を得た。しかしPCRとサザン法による検討の結果、遺伝子ターゲッティングが起こったと認められる細胞を発見するに至っていない。今後別なエクソン等を用いての遺伝子ターゲッティングを行う必要があると考えられる。