hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視線解析を用いた高機能自閉症スペクトラム障害の早期発見法と社会適応訓練法の開発

近年高機能自閉症スペクトラム障害(HFASD)児の眼球運動解析が行われており、HFASDと定型発達(TD)の比較では人の顔や人の動きを見た際に違いがあるとされているが、学校や園の場面を視覚刺激とした報告はない。本研究で学校の授業の画面を見た際のASD児とTD児の視線解析の結果、ASD児は教師の指さしの対象や指の領域への視線滞留時間が有意に短かった。このような特徴が、ASD児が授業内容や教師・級友の意図を理解するのを困難にしていると考えられた。よってどこを見たらよいのかを指導することが集団適応が改善すること、関心領域への視線滞留時間はASD児の早期発見法となることとの可能性が示唆された。視線計測法を用いた発達障害の研究では、人の顔を提示した際に定型発達(TD)青年は眼を見るのに対し、自閉症スペクトラム(ASD)障害者は口を見ると報告されている。しかし小児では10歳程度のTDでも口を見るという報告もあり、知見は一定していない。また視覚刺激の多い学校や幼稚園での日常生活場面を視覚刺激として用いた報告はない。本年度は日常生活場面でのTD児の視線の滞留時間を就学前児と思春期児とで比較し、発達障害児の早期発見法確立のための基礎的データを収集した。対象は就学前(36歳、男児7名)22名と思春期13名(1215歳、男子9名)のTD児である。視線計測は、iView Xを用い、視覚刺激として人の顔ならびに子どもの日常生活における社会的場面を8秒間提示した際の眼球運動を記録し、人の顔では目、社会的場面では顔と指し示す先に滞留する時間を、2群間で比較した。統計学的解析にはMATLAB R2013aを用い、Mann-Whitney検定にて検定した。その結果、人の顔では、就学前群でも思春期群と同様に目に集中していた。社会的場面の学校の教室では両群とも教師の顔と指し示す先を見ていたが、黒板の漢字への滞留時間は思春期群で有意に長かった。TD児では学校の教室を経験していない就学前児でも、生得的に教師の顔と指し示す先を見ており、それにより人の意図が理解できると考えられた。乳幼児思春期の発達障害児と定型発達障害児の視覚刺激に対する眼球運動測定を分析し、発達障害の早期発見ならびに療育指導に資することを目的とし、乳幼児思春期の自閉症スペクトラム障害(ASD)児30名、年齢をマッチングした定型発達児30名を対象として、視覚刺激場面に対する眼球運動を記録し分析した。視覚刺激場面として、1人の顔(喜怒哀楽)、2教室の風景4種類、3保育園の風景、4人のいる公園、5スポーツ選手の競技場面などを提示し、iView Xにより視線の動きを測定し、刺激場面でのオブジェクトへの停留時間と移動のパターンを解析した。その結果、ASD児では定型発達児と比較して、人の顔を視覚刺激として際の目に注目する時間、教室場面を視覚刺激とした際に教師が指差す先の黒板に注目する時間が、有意に短かった。特に教室場面に関しては、定型発達児では今だ教室を経験していない未就園児でも教師の顔と指差す先を見ているが、ASD児では義務教育の終了に次回中学生でも教師の顔や指差す先をしないことがわかった。これらの結果から、ASD児ではヒトがコミュニケーションの際に言葉以外に意志を伝える目や顔の表情、何らかの課題を説明する際の指差しをみないために、他者の意図や課題の意味が理解できないと考えられる。この結果から導かれた今後の発展性として、今回用いたような視覚刺激画面を発達障害児の療育訓練に用い、社会におけるソーシャルスキルトレーニング法を開発したい。高機能自閉症スペクトラム障害(HFASD)児は早期介入により予後か改善することが知られているが、早期発見の方法は確立していない。元来ASD児と定型発達(TD)児では、視線解析において見る対象や滞留時間が異なり、視覚刺激として「人の顔」を提示した際にTD青年は「眼」を見、HFASD者は「口」を見ると報告されている。しかし学校や園の日常生活場面を視覚刺激とした報告はない。本研究では学校や幼稚園などの日常生活場面を刺激画面として、就学前と思春期のTD児とHFASD児の視線運動を比較した。静止画を視覚刺激として用いた解析では、「人の顔」と「学校の教室場面」を提示した際、就学前のHFASD児は人の「目」を見る時間、教室で教員の「指し示す先」を見る時間が短く、このことが、HFASD児が会話を理解し場面を読むのを困難にしていると考えられた。視線解析は就学前のHFASD児の早期発見に利用でき、年長児のソーシャルスキルトレーニングにも役立つと考えられた。またより児童生徒の日常に近い設定として、学校教室の授業場面の刺激画面として用い、教師の「視線の先」や「指し示す先」への視線滞留時間を分析した結果、HFASD児はTD児よりも動画の授業場面において教師の「視線の先」や「指し示す先」を見る時間が短く、それにより指示や授業の理解が難しいと考えられた。動画を用いた視線解析はASD児の早期発見に有用であり、さらに教室での直接的支援にも応用可能と考えられた。当初の計画の3年間でデータ収集は終了したが、解析に予想以上の時間を要した。

平成28年4月現在、解析は終了しており、論文化を進めている。第一報の論文は平成28年2月に掲載されており、平成28年度に成果を発表し汎化活動に務めたい。現在決定している発表予定は以下のとおりである。【演題発表、パネル、ブース設置】第119回日本小児科学会学術集会(北海道5月)、第39回日本神経科学大会(横浜7月)、第59回日本心身医学会近畿地方会(大阪7月)【演題申し込み予定】神経科学会議SFN2016(San Diego 11月)高機能自閉症スペクトラム障害(HFASD)児は早期介入により長じた後の社会適応か改善することが知られているが、早期発見の方法は確立していない。眼球運動は視覚的探索行動の解析に用いられ、人の顔の静止画や人の動きの動画を見た際のHFASDと定型発達(TD)との視線のパターンには違いがあることが報告されているが、学校や園の日常生活場面を視覚刺激とした報告はない。今回は教室の授業場面の動画を視覚刺激としてHFASD児の視線解析を行った。ASD児26名とTD児27名を対象とし、小学校の授業場面を撮影した動画を見た際の眼球運動を記録した。解析では、教師の顔と指さしをしている指、指さしの対象、何も貼られていない教室の壁を関心領域として設定し、領域における視線滞留時間と共同注視の頻度についてASD児とTD児とで比較した。その結果、TD児と比較してASD児は、教師の指さしの対象領域や指さしの指の領域への視線滞留時間が有意に短かった。さらに、ASD児は共同注視の頻度が有意に少なかった。一方で、TD児と比較してASD児は、指さしとは関係がなく掲示物などが何も貼られていない壁の視線滞留時間が有意に長かった。教師の顔においてはTD児とASD児とで有意な差は見られなかった。本研究からASD児は教室の授業場面において、教師の視線や指さしの対象物を見る時間が短く、共同注視の頻度が少ないことが明らかになった。ASD児の日常生活の授業におけるこのような視線運動の特徴が、授業内容や教師・級友の意図を理解するのを困難にしていると考えられる。よって視覚刺激画面を用いて教室などの対人場面で、どこを見たらよいのかを指導することにより、場面の理解が進み、集団適応が改善する可能性があると考えられた。また関心領域への視線滞留時間の測定を応用し、ASD児を早期発見するツールの開発が可能になると考えられた。近年高機能自閉症スペクトラム障害(HFASD)児の眼球運動解析が行われており、HFASDと定型発達(TD)の比較では人の顔や人の動きを見た際に違いがあるとされているが、学校や園の場面を視覚刺激とした報告はない。本研究で学校の授業の画面を見た際のASD児とTD児の視線解析の結果、ASD児は教師の指さしの対象や指の領域への視線滞留時間が有意に短かった。このような特徴が、ASD児が授業内容や教師・級友の意図を理解するのを困難にしていると考えられた。よってどこを見たらよいのかを指導することが集団適応が改善すること、関心領域への視線滞留時間はASD児の早期発見法となることとの可能性が示唆された。初年度、2年度で約200名の研究参加者を得、データを蓄積した。うち100名は静止画を用いて、研究概要の成果を経ている。研究成果の一部は学会発表し公表したが現在、論文化に向けて詳細なデータ解析中である。さらに静止画での結果から視覚刺激として動画を導入した。残りの100名は動画を用いてデータを集積している。引き続きデータを解析中である。視線解析に供するデータは予定していた被験者数の通り、終了している。
固体水素中のオルソ水素核スピンコヒーレンスの量子制御

オルソ水素の核スピン量子コヒーレンス制御の基本を確立すべく研究を実施した。また、光導入法として提案した極細光ファイバー(ナノファイバー)の近接場を用いる原子・光系のコヒーレント相互作用について物理的な基盤を確立することを目指して実験・理論の両面で研究を行った。オルソ水素計測用高安定レーザー(波長2.4μ)を2重共鳴OPO方式により完成させ、オルソ水素の振動遷移を系統的に計測した。そのスペクトル線幅は半値半幅で1.6MHzと常識破りのシャープなものであることを示した。非線形分光技術も何も用いずにただの吸収測定としては記録的な値である。オルソ水素の濃度は40ppmと極めて少ないが、線幅が細いため、1cmの厚さの結晶による吸収のピークは60%にも達する。更に、良質の結晶については振動回転スペクトルが3本に分裂することを見出した。分裂の間隔は10MHz程度である。この分裂はオルソ水素の磁気量子数が結晶場により分裂した効果によるものである。これらの観測結果は、オルソ水素の振動回転遷移が強結合を用いた光学応答の操作の研究に最適であることを示すものである。分裂遷移を用いて磁場無しでの新しいタイプの強結合共鳴ラマン3準位系としても有望である。固体水素中に強いレーザー場を実現するためのナノファイバー技術及びその物理の研究は大きく進展した。現在では、直径1μmから400nmの光ファイバーを透過率80%以上でルーチン的に作製できる。ナノファイバー近傍では光のモードは伝播モードに集中するため、光と原子・分子の双方がサブミクロン領域に閉じ込められるため、自由空間の光学過程とは異なる新しい光学過程が実現できる。実験的にもナノファイバー近傍の光応答を測定し、自由空間とは大きく異なる特性の観測に2006年2月に成功した。この観測はナノファイバーに関わる研究を固体水素から、更により普遍的な量子光学の研究に展開する重要な契機となりえる。計画初年度にあたる15年度においては、オルソ水素の核スピン量子コヒーレンス制御の基本事項を確立すべく研究を実施した。また一方、光導入法として提案した極細光ファイバーの近接場を用いる原子・光系のコヒーレント相互作用について物理的な基盤を確立することを目指して実験・理論の両面で研究を行った。オルソ水素核スピン制御については、制御用高安定レーザー(波長2.4μ)を2重共鳴OPO方式により完成させた。このレーザーを用いてオルソ水素の振動遷移を計測し、スペクトル線幅が5MHzHWHM程度と極めて狭く、その幅も結晶の不均一性により決まっていることを示した。また、軸磁場として2テスラの超伝導磁石を組み込んだクライオスタットをほぼ完成させた。このクライオスタットは温度制御・冷却方式を固体水素結晶作成と光学実験の双方の目的に適宜選択できる。良質の結晶作成と高精度の光学実験が実現可能になると思われる。極細光ファイバーの近接場を定量的に理論的に解析した。その結果、極細ファイバーとして直径0.4ミクロン程度の波長以下のサイズのものが準備することが必要であることを示した。また、市販のファイバーカップラー作成装置を転用し最適化することにより0.5ミクロン以下の極細ファイバーを作成できることを示した。なお、当初予測していなかった成果も得られた。それは極細ファイバーの近接場の系統的な研究から、この近接場と極低温原子を組み合わせれば従来にない新しいタイプの原子トラップが実現できることを示したことである。要点は極細

ファイバーの近接場(赤方離調)は動径方向に急速に減衰するのでこの領域に侵入した原子には大きな引力型の双極子力が働く。一方、原子は有限な初速度を持っているので動径方向に遠心力も働くのでその釣り合いとしてファイバー近傍を周回する原子軌道が実現できることである。平成16年度において実施した、固体水素作製システム開発、固体パラ水素中のオルソ水素の高分解能分光、超微細光ファイバー作製技術の開発、について進捗状況を報告する。固体水素結晶作製には14K近傍での精密な温度制御が必須であり、冷却力を抑える必事がある。一方、非線形光学などのレーザー実験ではレーザー光による加熱を避けるために、大きな冷却力が必要である。従来はこの相反する要求のため結晶作製とレーザー実験の双方を最適化することはできなかった。今回開発したクライオスタットでは、冷却容器と結晶作製セルの間にいわば熱接触スイッチを設け、結晶作製とレーザー実験のそれぞれを最適に制御できる。昨年度に開発した波長2.4ミクロンのレーザーにより、オルソ水素の振動回転スペクトルを偏光依存性を含めて測定した。その結果は、スペクトル線幅は半値半幅で,1.6MHzと常識破りのシャープなものであった。非線形分光技術も何も用いずにただの吸収測定としては記録的な値である。オルソ水素の濃度は40ppmと極めて少ないが、線幅が細いため、1cmの厚さの結晶による吸収のピークは60%にも達する。このことは、予測どおりにオルソ水素の振動回転遷移が強結合を用いた光学応答の操作の研究に適していることを示すものである。上記の観測結果と共に、良質の結晶についてはオルソ水素の振動回転スペクトルが3本に分裂することを見出した。分裂の間隔は10MHz程度である。この分裂はオルソ水素の磁気量子数が結晶場により3本に分裂した効果によるものであることが考えられる。ただし、既存の理絵では説明できない。実際、今まではこのような低オルソ水素濃度で超高分解能の測定はなされていなかったため、理論展開も不十分であった可能性もある。今後、更に系統的な測定がなされるべきである。固体物理学としても重要な知見が得られる可能性がある。超微細光ファイバー作製技術は、直径400nmのレベルでは透過率80%以上をルーチン的に達成できるレベルに達した。また、超微細光ファイバーよる原子操作の方法を理輪的に発展させつつある。波長2.4ミクロンのレーザー単一周波数OPOレーザーにより、オルソ水素の振動回転スペクトルを偏光依存性を含めて系統的に測定した。測定温度3Kでのスペクトル線幅は半値半幅で1-2MHzであり固体のスペクトル線幅としては異例に狭く、気相のレーザー冷却原子の線幅に匹敵するものである。また、スペクトルは間隔が約10MHzの3本のスペクトル線に分裂する。スペクトル幅及び分裂間隔は固体水素結晶の作製条件により大きく異なり、結晶成長温度14K近傍での温度と圧力の管理が極めて重要である。この分裂は定性的にはオルソ水素の磁気量子数が結晶場により3本に分裂した効果によるものであると考えられる。しかしながら、定量的な解釈には未だ到達していない。
制震装置を兼ねた屋上緑化システムによる既存不適格建物の最適エコ耐震補強法

既存不適格建物を対象に、制震装置付き屋上庭園システムがヒートアイランド現象を解決しながら耐震性能を向上させることが出来るか、種々のパラメータを使った地震応答解析により検討を行った。その結果、建物の状況によっては20%程度の耐力不足ならば、耐震補強を行わなくても耐震性能を確保できる最適エコ耐震補強法があることを確認した。一方、不適格建物ではなくても、補強をせずに、屋上庭園を設置できる可能性を示した。本研究は、屋上緑化を制震装置とすることにより、耐震補強コストを削減し、既存不適格建物の耐震改修の推進と同時に地球環境問題に貢献する構造システムの提案を行うことを目的とする。本年度の目的は、建物種類(固有周期)別に既存建物への地震力増加を起こさせない屋上庭園の重量、および屋上庭園を支える制震装置の剛性、減衰、耐力を明らかにすることである。そのために、既存建物だけの場合(1質点モデル)と屋上庭園を設置した場合(2質点モデル)で地震応答解析シミュレーションを行った。シミュレーションに用いるパラメータは、既存建物の固有周期、構造特性係数、ひび割れ耐力比,降伏時剛性低下率、屋上庭園部については、既存建物との周期比・剛性比・耐力比、減衰比等であり、多くのシミュレーションを行い、1質点モデルと2質点モデルでの最大応答せん断力を比較し、各建物に対して、屋上庭園を設置することにより地震力が低減する屋上庭園の重量、および屋上庭園を支える制震装置の剛性、減衰、耐力を明らかにした。具体的成果としては、下記の点を明らかにし、制震装置付き屋上庭園の有効性を示した。1)低層建物については、制震装置付き屋上庭園には耐震補強効果はないが、耐震補強しなくても屋上庭園を設置することは可能であり、ヒートアイランド現象等の地球環境問題に貢献することが出来る。2)中高層建物については、耐震補強効果と地球環境問題の両方に貢献することが出来る。この成果の一部は、第33回情報・システム・利用・技術シンポジウムで発表した。本年度の成果は、8月に開催される日本建築学会大会と9月の国際会議(ASEM11)で発表予定である。地球環境問題、特に都市部でのヒートアイランド現象に対しては屋上緑化が有効な手段であり、新築物件では徐々に計画されてきているが、都市部の大部分を占める既存建物については、構造上の問題(荷重の増加)もあり進展していない。一方、1981年以前に建てられた既存不適格の建物も多数存在し、耐震補強が必要にもかかわらず実施されていない物件が多数存在する。本年度は、屋上庭園装置が耐震補強効果と同時に地球環境問題にも貢献できる中高層建物を対象に、具体的な建物を設定し、多質点系地震応答シミュレーションを行い、各杭の余裕度に見合った重量の最適配置、制震装置の最適配置を検討した。さらに、セットバックや耐震壁の偏在によるねじれ振動が生じる偏心建物についても制震装置付き屋上庭園がねじれ振動低減効果について有効かどうか検討を行った。ねじれ振動については、多柱列多質点モデルに対して、屋上庭園の重量、制震装置の配置をパラメータとしてシミュレーションを実行し、ねじれ振動を引き起こす偏心建物についても制震装置付き屋上庭園はねじれ振動低減に有効であることを確認した。また、外部発表として、前年度の研究成果発表を8月の日本建築学会大会と9月の国際会議(ASEM11)で発表をおこなった。本年度の成果の一部は、第34回情報・システム・利用・技術シンポジウムで発表した。また、6月モスクワで開催される国際会議(ICCCBE14)と9月に開催される日本建築学会大会で発表予定である。本・最終年度は、既存建物の中でも耐震性能に特に課題がある下記の2ケースを対象とした。1立面的な剛性バランスがわるいピロティ形式を持つ5層建物と10層建物2平面的に剛性バランスのわるい7階建てセットバックや7階建てL型平面を持つ建物これらの建物を対象に、免震装置、ダンパーの種々の組み合わせに対して、大地震(レベル2地震)を対象とした弾塑性地震応答解析を行い屋上庭園装置が耐震補強効果と同時に地球環境問題にも貢献できる可能性があることを明らかにした。また、外部発表として、前年度の研究成果発表を2012年6月の国際会議(ICCCBE14)、8月の日本建築学会大会で発表をおこなった。

本年度の成果の一部は、12月の第35回情報・システム・利用・技術シンポジウムで発表した。また、2013年8月に開催される日本建築学会大会で最終成果を発表予定である。当初計画の部材レベルでの地震応答シミュレーションは実施できていない。その理由は、より優先度の高い、ねじれ振動を引き起こすセットバックや耐震壁が偏在する建物への制震装置付き屋上庭園の有効性を検証し・確認したためである。当初計画とは多少異なるが、おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。東日本大震災の影響を受け、首都圏での大地震発生確率も高まっている。既存不適格建物への耐震補強は急務である。特に偏心率や剛性率に問題がある建物への対策は急務である。そこで、当初計画に対して、これら偏心率や剛性率に問題がある建物について、追加検討を行い、制震装置付き屋上庭園の有効性を検証・確認する。さらに、当初計画にある柱・梁・杭部材の余裕耐力、付加される屋上庭園重量とその配置、耐震補強部材の配置組み合わせの中から、最小コストとなるエコ耐震補強法を提案する。
ウイルスにコードされるジーンサイレンシング抑制遺伝子による植物遺伝子発現修飾機構

植物のサイレンシング(PTGS)はウイルスに対する普遍的な防御機構である。PTGSがウイルスの病原性にどのように関与するか解析し、以下ことを明らかにした。(1)HC-Pro遺伝子のPTGS抑制能がクローバ葉脈黄化ウイルス(ClYVV)によるえそ病徴発現に必要であること。(2)タバコのカルモジュリン様タンパクrgs-CaMは多くのPTGS抑制遺伝子と親和性を有し、それら結合タンパク質を不安定化することで、宿主のPTGS活性を高めること。(3)キュウリモザイクウイルスのサテライトRNA(CMV Y-satRNA)がキュウリモザイクウイルス(CMV)感染タバコの緑色モザイクが鮮黄色モザイクに変化させる分子機構。植物のジーンサイレンシング(PTGS)はウイルスに対する普遍的な防御機構であり、多くのウイルスはサイレンシング抑制遺伝子を持ち対抗している。(1)本研究では、ウイルスによる病害がサイレンシングを介した植物-ウイルスの相互作用でどこまで説明できるのか検証する。(2)複数の宿主・PTGS抑制遺伝子やその変異遺伝子を用いて、PTGS抑制遺伝子が作用する植物のターゲット因子を特定して、その影響を解析する。これらの成果により植物の遺伝子発現制御と耐病性機能の強化につなげていく。以前の我々の研究で、ジーンサイレンシング抑制能が低下した変異HC-Proを持つクローバー葉脈黄化ウイルス(CIYVV-193MM)はマメ科植物に対する病原性(えそ病徴や矮化)も低下することが分かっている。そこで、CIYVV-193MMに他のウイルスのサイレンシング抑制遺伝子P19と2bを挿入した組み換えウイルスを作成し相補試験をしたところ、少なくともエンドウに対しては野生型CIYVVと同様の病徴を示したことから、CIYVVの病原性の発現にHC-Proのサイレンシング抑制能が必要なことが示唆された。ショウジョウバエのS2培養細胞ではCIYVVのHC-Proはジーンサイレンシング抑制能を示さなかったが、HC-Proと相互作用することが知られるタバコのrgsCaMはS2細胞においてもサイレンシング抑制能を示した。また、その抑制はsiRNA形成後の過程であることが分かった。一方S2細胞で安定発現する外来遺伝子はジーンサイレンシングによる部分的な発現抑制を受けることが知られている。意外にも、rgsCaMとGIYVVのHC-Pro両方がこの外来遺伝子の発現を上昇させることが新たにわかった。キュウリモザイクウイルス(CMV)の2bタンパク質によるPTGSサプレッサー活性にCMVサテライトRNA(satRNA)が及ぼす影響を解析するため、プロトプラストによるin vitroのアッセイ系を構築することに成功した。この系に任意の2本鎖RNA(dsRNA)(GFP dsRNAなど)を加えた場合、リポーター遺伝子(ルシフェラーゼ、LUC)のPTGSは相対的に低下した。しかし、satRNAのdsRNA(ds-satRNA)を加えた場合にはLUCのPTGSが低下しなかったことから、ds-satRNAはPTGSを受けていない可能性が示唆された。クローバ葉脈黄化ウイルス(CIYVV)がマメ科作物に引き起こす致死性のえそ病徴にCIYVVがコードするHC-Pro遺伝子のジーンサイレンシング抑制能が必要なことが昨年の研究で示唆された。そこで逆に、宿主植物側のサイレンシングを担う遺伝子もえそ病徴発現に関わっている可能性が考えられる。本年度はこの宿主因子を解析するための3つの成果を得た。マメ科のモデル生物Medicago truncatulaに近縁のMedicago llittoralisでCIYVVの感染によりえそ病徴を示す系統と示さない系統が得られた。シロクローバモザイクウイルスをベクター化して、エンドウやMedicago llittoralisで外来遺伝子の発現および宿主遺伝子のウイルス誘導型ジーンサイレンシングが可能であることを確認した。さらにエンドウから抽出したタンパク質の2次元電気泳動によりえそ病徴に関わる可能性のある10個のスポットが得られ、質量分析により遺伝子を同定した。一方、キイロショウジョウバエ培養細胞を用いた解析ではCIYVVのHC-ProおよびタバコのrgsCaMによる外来遺伝子の発現増強はmRNAの蓄積と翻訳の両方を促進しているからであることが分かった。HC-Proに結合するショウジョウバエタンパク質を免疫沈降法により分画して質量分析した。キュウリモザイクウイルス(CMV)のサイレンシングサプレッサーである2bタンパク質(2b)については、一般に大腸菌に毒性を示し、インクルージョンボディを形成するため大量生産することが困難であった。しかし、我々はCMV-HLの2bを使用して大腸菌で発現させることに成功し、2本鎖RNA(dsRNA)とin vitroで結合することを明らかにし、2bのサプレッサー活性のメカニズムがdsRNAとの結合であることを証明した。

CMV2bと結合する宿主因子の探索に関しては、酵母two-hybrid法によって2bと結合することが判明しているシロイヌナズナのカタラーゼについて2bのC末端側半分に結合することを明らかにした。また、タバコのプロトプラストを用いてサプレッサー活性をモニターするシステムを構築し、2bとカタラーゼの結合が2bのサプレッサー活性に影響することを明らかにした。1.エンドウのえそ病徴発現には半優性の対立遺伝子とサリチル酸経路の活性化が必要であることを明らかにし、この活性化にHC-Proのサイレンシング(PTGS)抑制能が関与していることも示した。クローバ葉脈黄化ウイルス(C1YVV)が誘導する細胞死は、過敏感反応細胞死(HR)と類似した機構で誘導されると考え、抵抗性反応が起きているかを調べた。その結果、抵抗性反応に重要なサリチル酸経路のマーカー遺伝子(SA-CHI)とHR関連経路のマーカー遺伝子(HSR203J)の発現量が顕著に上昇していた。PTGS抑制能が低下した変異株C1-CBとC1-D193YはHRを誘導する能力が低下しているが、SA-CHIとHSR203Jの発現を誘導する能力も低下していた。さらに、サリチル酸経路を活性化する薬剤を処理したところ、C1-CBおよびC1-D193Yの細胞死誘導能が部分的に回復した。以上から、C1YVVの強毒性にはサリチル酸経路が関与し、これをPTGSが制御していることを示した。3.プロトプラストで弱毒CMV2bタンパク質遺伝子とsat RNAを同時導入し、2bのPTGS抑制能を測定したところ、2bのPTGS抑制能をsat RNAのプラス鎖、マイナス鎖ともに阻害的に作用することを観察した。1.タルウマゴヤシのゲノムデータベースをもとに、リンケージグループIIIのRGA部分配列で保存されている領域を基に、エンドウから、RGA配列をクローニングして、えそ病徴をおこす系統とモザイクをおこす系統間の多型を検索したが、多型は認められなかった。プロテオーム解析で、えそ病徴をおこすエンドウで特異的に増加するタンパクとして、3種を同定した。ホワイトクローバモザイクウイルス発現ベクターを利用して、エンドウで発現させ、VIGSを誘導し、これにクローバ葉脈ウイルスを接種してエソ病徴の変化を観察したが、大きな変化は認められなかった。2.rgs-CaMはPTGS抑制遺伝子のsiRNAもしくは2本鎖RNA結合部位に親和性を持つことにより普遍的にPTGS抑制遺伝子に結合していることが次の実験、1)CMVのPTGS抑制遺伝子2bに1アミノ酸変異によりsiRNA結合能およびPTGS抑制能が低下した変異2bに対するrgs-CaMの結合能も低下したこと、2)2b-rgs-CaM複合体のsiRNA結合能は2b単独と比べて弱かったこと、3)ヒト免疫不全ウイルスのTat遺伝子に由来するのsiRNA結合性のペプチドとrgs-CaMの間にも親和性が確認されたこと、により示唆された。3.サテライトRNA(sat-RNA)は宿主サイレンシングを受けてsiRNAを大量に生成する。
富山県砺波平野の主要都市における地域言語の動態と要因の研究

フィールドワークは、平成6年9月に、砺波市出町地区の老年層・中年層・青年層を対象として、/′i/と/′e/の統合現象・ガ行鼻音濁音・アクセント・イントネーション等の項目について、質問方式・自然傍受方式といった従来一般的に行なわれている方法の他に、合成音声による知覚実験・意識調査を加えて実施した。現在新たに高岡市の調査に着手したところである。音声資料収集には、購入した高性能デジタル録音器DAT及びDAT対応高性能マイクを用いた。知覚実験に用いる合成音声の作成は、東北大学日本語学科所有のCSLを使用させていただいた。録音資料は、購入したハードディスクに蓄積し、現在音声分析器により分析中である。音声分析には、既存の備品である音声分析器『音声工房』と新たに購入した『音声録聞見』を併用している。なお、全体的傾向を把握するための予備分析は、一部学生アルバイトを採用して行った。統計分析は、音声分析器による分析が終了した段階で、主に社会言語学的視点から行なう予定である。本研究は、分析途中ではあるものの、既に、音声分析器を用いたからこそ見出せた方言音声研究上の新たな知見がいくつか得られている。分析が済み次第随時発表していきたい。
プレジャーボ-トの海洋汚染防止を目的とした無公害塗料による船底塗装システムの確立

プレジャーボ-トの船体汚損防止として塗装され,その成分の海中への溶出がマリ-ナや狭湾内での海洋汚染を引き起こしている従来型毒性塗料に代わり,公害物質を全く含有しないシリコーン系防汚塗料(A社製)をFRP船体に適用するため,試験板浸漬実験やFRPボ-トの船走実験を行って,その可能性について検討した。以下に,これらの実験で得られた結果を要約する。1.各種塗装システムのFRP試験板を対象に,高速回転実験及び高圧射水実験によるシリコーン塗膜の密着性調査,そして海中浸漬実験による塗膜の防汚調査の結果,(1)B社塩化ゴム外舷塗料を下塗りに採用したもの,(2)A社塩化ゴムAC塗料を下塗りに,B社塩化ゴム外舷塗料を中塗りに採用したものが,総合評価として最も優れていた。2.B社塩化ゴム外舷塗料とA社塩化ゴムAC塗料の混合比率を替えた下塗り塗料が上塗りのシリコーン塗膜の防汚性能に及ぼす影響は認められなかった。3.各種塗装システムのFRP試験板の塗膜面上の水滴の接触角と滑り角を測定し,塗膜の防汚指標であるはっ水性と滑性について比較調査した結果,いずれも下塗りにB社の塩化ゴム塗料を使用した塗装システムが他の塗装システムより優れていた。4.塩化ゴム塗料に含有される可塑剤の影響を調査した結果,可塑剤が上塗りシリコーン塗膜の防汚性能及び塗膜のはっ水性,滑性に影響を及ぼすことが判明した。したがって,可塑剤が防汚性能向上の一要因と考えられる。しかし,第一成分である塩化ゴム樹脂による影響は認められなかった。5.シリコーン塗膜の防汚性能は,塗膜面上の水滴の接触角よりも滑り角との関連が大きいことが判明した。又,着色水噴霧による塗膜面のはっ水模様の観察によって,実海水中での防汚性能の良否の予測が可能である。6.モーターボ-ト,ヨット及び小型釣りボ-トの実稼働実験によって,無公害防汚塗装システムの防汚効果が検証され,その有効性が確認できた。7.本塗装システムの防汚効果の持続期間はほぼ一年程度である。冬季において月1回,夏季においてはそれ以上の航走により,船体のより一層の清浄維持が期待できる。今後の研究課題としては,シリコーン系塗料中に可塑剤を直接混入することにより防汚性能の向上が期待できるかどうか,またシリコーン塗膜の接触角と滑り角の経年変化と防汚効果との関連について検討の必要がある。
3d遷移金属水酸化物ナノシート・グラフェンの複合材料を用いた貴金属代替触媒の開発

異種遷移金属組成(Ni2+-Mn3+等)層状複水酸化物(LDH)ナノシートを合成し、反対電荷をもつ酸化グラフェン(GO)または還元型酸化グラフェン(rGO)と直接混合して、自己組織化的に超格子構造を形成できることを明らかにした。超格子構造を有する複合材料を電極触媒として水の電気分解による酸素発生反応を考察した。酸化グラフェンは触媒活性を殆ど示さなかったのに対し、遷移金属LDHナノシートは酸素発生を高効率的に促進することが明らかになった。特に、組成及び構造を最適化したLDH/rGO複合材料は過電圧が約0.26 V、Tafel勾配が約46 mV/decadeに達する優れた触媒性能が得られた。ヘキサメチレンテトラミン(HMT)の加水分解及び過酸化水素(H2O2)のその場酸化などの手法を駆使することにより、Ni2+-Mn3+系LDH結晶の合成に初めて成功した。陰イオン交換した後、単層ナノシートに剥離した。Ni-Mn系LDHナノシートと酸化グラフェン(GOまたはRGO)を分子レベルでヘテロ複合化する簡便な溶液プロセスを開発した。2種類のナノシートを交互に積層したヘテロ複合材料を水の電気分解による酸素発生反応を調べたところ、過電圧が0.26 Vまで非常に小さく抑えられ、ターフェル勾配も46 mV/Dec程度で電極触媒として有効に働くことが分かった。LDHナノシートとグラフェンとの超格子構造を形成したことによって、電荷および反応物・イオンの移動/転送が容易になり、触媒反応を促進することが電気化学的活性表面積とインピーダンスの分析から明らかになった。さらに、このハイブリッド電極触媒を用い、単三乾電池(1.5V)一本だけで水の電気分解実験を行い、酸素と水素を効率的に発生することを実証した。高導電性グラフェンと水酸化物ナノシートをナノレベルで接合することにより協同効果が発現し、優れた電極触媒性能につながったためと考えられる。Ni-Mn系LDHナノシートを新たに合成し、グラフェンとの複合材料を試作できた。この複合材料は水の電気分解による酸素発生反応に高い触媒活性を示すことが確認された。ヘキサメチレンテトラミンの加水分解反応を用いた均一沈殿法により、遷移金属元素Co2+, Ni2+の組み合わせにおいて、高結晶性Co1-xNix (x = 0, 1/4, 1/3, 1/2)水酸化物ナノプレートレットに適した合成条件を確立した。合成したナノプレートレット結晶に臭素(Br2)酸化剤を作用させてCo2+イオンの一部をCo3+に酸化し、オール遷移金属からなるNi2+-(Co2+)-Co3+層状複水酸化物に変換した。さらに、層間のBr-イオンをドデシルサルフェイトに交換させた後、ホルムアミド中で振蘯することにより単層剥離し、各種組成のNi2+-(Co2+)-Co3+層状複水酸化物ナノシートを誘導した。代表的原子間力顕微鏡像から、ナノシートの平均厚みは約0.8nmであり、ホスト層結晶学的厚さ(0.48nm)によく一致し、単層であることが確認された。得た水酸化物ナノシートを酸化グラフェン(GO)または還元酸化グラフェン(rGO)と溶液中で混合し、再凝集した生成物を得た。X線回折結果から2種類のナノシートが交互に積層していることが分かった。水酸化物ナノシートとグラフェンとの複合材料をグラッシーカーボンディスク電極上にロードし、アルカリ溶液中で白金対極、Ag/AgCl参照電極を用いたサイクリックボルタンメトリー予備実験を行った。Co-Ni水酸化物・グラフェン複合材料は酸素発生触媒として非常に有望であることが示唆された。これは、水酸化物ナノシートとrGOが交互に積層することによって、高導電性rGO層を介して電荷移動を改善し、優れた触媒性能につながったと考えられる。Co1-xNix (x = 0, 1/4, 1/3, 1/2)水酸化物前駆体から各種組成のNi2+-(Co2+)-Co3+層状複水酸化物ナノシートを合成し、グラフェンとの複合材料を試作できた。水酸化物ナノシートとグラフェンはともに1nm厚以下であり、効率よく界面を形成することによって、より高い活性を持つ触媒材料の開発に結びつくものと期待される。遷移金属水酸化物系において高品質のCo5/6Fe1/6(OH)2板状結晶を合成し、さらに酸化処理などによってCo(II)5/6-Fe(III)1/6層状複水酸化物に変換することができた。化学剥離処理から得られたナノシートはこれまで研究されてきた単層水酸化物ナノシートM(II)2/3-M(III)1/3と異なる2層単元構造を持つことが分かった。この上で、Co(II)5/6-Fe(III)1/6水酸化物ナノシートをナノビルディングブロックとし、溶液自己組織化プロセスなどを利用して、酸化グラフェンとのヘテロ複合化を図り、ナノからマクロスケールでイオン・電子移動が制御された構造体を構築し、電極触媒としての電気化学特性を評価した。特に、水酸化物ナノシートの遷移金属組成(Co-Fe-Ni-Mn等)の最適化を重点的に行い、ヘテロ金属イオンの間の電荷移動を誘導することによって、還元型酸化グラフェンとヘテロ複合したナノ電極触媒がアルカリ性環境における0.3V以下の過電圧を達成した。

回転電極触媒測定法などの分析・評価手段を活用することにより過電圧、反応電子数などを解析した結果、遷移金属の配位環境及び電子状態が触媒活性に大きく影響することが分かった。多くの遷移金属酸化物や水酸化物が電極触媒として研究されてきたが、6配位化合物にほぼ限定されている状況である。新しい触媒材料系を開発するため、高度な配位制御によるユニークな配位構造を持つナノ物質の創製が触媒活性の大幅な向上につながる実験結果を得た。異種遷移金属組成(Ni2+-Mn3+等)層状複水酸化物(LDH)ナノシートを合成し、反対電荷をもつ酸化グラフェン(GO)または還元型酸化グラフェン(rGO)と直接混合して、自己組織化的に超格子構造を形成できることを明らかにした。超格子構造を有する複合材料を電極触媒として水の電気分解による酸素発生反応を考察した。酸化グラフェンは触媒活性を殆ど示さなかったのに対し、遷移金属LDHナノシートは酸素発生を高効率的に促進することが明らかになった。特に、組成及び構造を最適化したLDH/rGO複合材料は過電圧が約0.26 V、Tafel勾配が約46 mV/decadeに達する優れた触媒性能が得られた。今後は水酸化物ナノシートの組成チューニング及び複合構造を最適化することにより電極触媒としてさらなる機能アップを目指し、研究を精力的に進める。酸素発生反応に限らず、酸素還元においても貴金属代替できる安価な3d遷移金属系電極触媒の開発を推進していく。3d遷移金属系触媒の活性は、遷移金属イオンの電子の数、低い酸化状態から高い状態に遷移するエンタルピー及び表面酸素の結合エネルギーなどに密接に関係することが知られている。特に、異種遷移金属の間の電荷移動を意図的に誘導することにより、その電子構造に影響を与えることが可能となり、触媒活性を高めることが期待される。今後はNi2+-(Co2+)-Co3+層状複水酸化物ナノシートの金属組成が酸素発生反応における電極触媒活性に及ぼす影響を重点的に考察する。また、酸素還元反応においても、3d遷移金属水酸化物ナノシート・グラフェン複合材料の電極触媒特性を考察する。詳細な反応機構を明らかにするとともに、低い過電圧と高い安定性を持った非貴金属触媒の開発に挑戦する。材料化学年度当初は燃料電池セル(50万円)の購入を計画し、電極触媒実験に活用する予定であったが、別の予算確保で購入できたので、助成金からの購入を見送りすることになった。よって、未使用額が生じた。年度当初は触媒性能を評価するための回転電極装置の回転軸シャフト等の修理を計画したが、別の予算確保できたので、助成金からの修理費用支出を見送りすることになった。よって、30万ほど未使用額が生じた。購入した燃料電池セルのリペアキット及び触媒性能を評価するための回転電極装置に使う電極消耗品に充てる計画である。電極触媒性能を評価するための電気化学セル及び電極消耗品(グラッシーカーボンディスク電極、白金対極、Hg/HgO参照電極)の購入に充てる計画である。
昆虫-バキュロウィルス相関におけるアポトーシスの分子機構解析

核多角体病ウイルス(NPV)感染が誘導するアポトーシスは、細胞の抗ウイルス応答であり、NPVの宿主特異性を決定するための重要な要因であると考えられる。本研究では、マイマイガ由来のLd652Y細胞が、5種の異なる昆虫から分離されたNPV、すなわちカイコNPV、アメリカシロヒトリNPV(HycuNPV)、シロイチモジヨトウNPVおよびハスモンヨトウNPV感染によって、容易にアポトーシスを誘導することを見出した。アポトーシス様形態を示したこれらのNPV感染Ld652Y細胞において、実際にアポトーシスが誘導されていることは、細胞DNAの断片化、およびアポトーシスの実行に与るプロテアーゼであるcaspaseの活性上昇によって確認した。特に著しいアポトーシスを誘導したHycuNPV感染Ld652Y細胞におけるウイルス増殖様相を詳細に調べたところ、ウイルスDNAの複製は認められたが、出芽ウイルスとポリヘドリンの産生は認められなかった。また、HycuNPVがコードするアポトーシス抑制因子であるHycu-IAP3のLd652Y細胞における発現量は、アポトーシスを誘導しないHycuNPV感染SpIm細胞におけるそれと同程度であった。これらの結果より、NPV感染が誘導する抗ウイルス応答としてのアポトーシスは、一般にウイルスの特性よりも、細胞の特性に大きく依存していることを示唆した。また、caspaseの阻害剤であるzVAD-FMK処理により、HycuNPV感染が誘導するLd652Y細胞のアポトーシスは抑制されたが、Ld652Y細胞におけるHycuNPVの増殖は促進されなかった。このことから、Ld652Y細胞におけるHycuNPVの増殖は、アポトーシスとは異なる機構によって制限されていることを示唆した。本研究では、Ld-hrf1が、Ld652Y細胞におけるNPVの増殖をレスキューするか否かを、Ld652Y細胞において不全感染となる5種のNPVを用いて検討した。AcMNPV、カイコNPV(BmNPV)、アメリカシロヒトリNPV(HycuNPV)、シロイチモンジヨトウNPV(SeMNPV)およびハスモンヨトウNPV(SpltNPV)のゲノムDNAと、Ld-hrf1の発現ベクターをそれぞれLd652Y細胞にコトランスフェクションし、ウイルスの増殖性を調べた。その結果、Ld652Y細胞において感染がウイルスDNAの複製まで進行するAcMNPV、BmNPVおよびHycuNPVは、いずれもウイルス構造たんぱく質とポリヘドリンを発現し、出芽ウイルスを産生した。一方、Ld652Y細胞において感染がウイルスDNAの複製まで進行しないSeMNpvとSpltMNpvでは、出芽ウイルスの産生もウイルス構造たんぱく質とポリヘドリンの発現も認められなかった。以上の結果から、Ld-hrf1は、Ld652Y細胞においてウイルスDNA複製以降に不全感染となるNPVの増殖を、普遍的にレスキューする可能性があることが示唆された。アメリカシロヒトリ核多角体病ウイルス(HycuNPV)のゲノムには,hycu-iap1,hycu-iap2,hycu-iap3遺伝子が存在する.これまでに,hycu-iap3遺伝子産物(Hycu-IAP3)が,ウイルス感染およびアクチノマイシンDによって誘導されるアポトーシスに対して阻害活性のあることを示した.一方,hycu-iap1およびhycu-iap2遺伝子産物(Hycu-IAP1,Hycu-IAP2)にはアポトーシス阻害活性が認められず,その機能は明らかでない.アポトーシス阻害遺伝子(p35遺伝子)欠損AcMNPV(vΔp35)感染によるアポトーシスに対する阻害活性を調査する中で,vΔp35感染と同時にHycu-IAP1を発現させることよって,vΔp

35感染のみと比較してより強いアポトーシスが誘導され,Hycu-IAP1にはアポトーシスを促進するはたらきのあることが予想された.そこで今回は,Hycu-IAP1のアポトーシス誘導活性について検討した.hycu-iap1遺伝子を挿入した発現プラスミドを種々の昆虫培養細胞にトランスフェクション法により導入し,アポトーシスの誘導を顕微鏡観察およびカスパーゼ活性測定により調べた.その結果,Hycu-IAP1の発現によって,Sf9,Ld652Y,High5,S2細胞でアポトーシス小体が観察され,カスパーゼの活性化が認められた.また,Hycu-IAP1と同時にHycu-IAP3をSf9細胞で発現させると,アポトーシスは抑制された.以上の結果から,Hycu-IAP1にはアポトーシス誘導活性のあることが示唆された.カイコ核多角体病ウイルス(BmNPV, Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)の宿主域決定にgp64遺伝子が関与しているか否かを明らかにするために、gp64遺伝子組換えたBmNPVを作出し、BmNPVの非許容細胞であるSf9細胞およびHighFive細胞に接種し、組換えウイルスの感染特性を調査した。以上の結果より、BmNPVは、AcMNPVのgp64遺伝子を獲得することにより、非許容細胞系であるSf9細胞とHighFive細胞の核への侵入能を獲得することが示された。また、HighFive細胞でgp64遺伝子組換えBmNPVの複製が認められたことから、gp64遺伝子はBmNPVの宿主特異性の決定に関与していることが明らかとなった。核多角体病ウイルス(NPV)感染が誘導するアポトーシスは、細胞の抗ウイルス応答であり、NPVの宿主特異性を決定するための重要な要因であると考えられる。本研究では、マイマイガ由来のLd652Y細胞が、5種の異なる昆虫から分離されたNPV、すなわちカイコNPV、アメリカシロヒトリNPV(HycuNPV)、シロイチモジヨトウNPVおよびハスモンヨトウNPV感染によって、容易にアポトーシスを誘導することを見出した。アポトーシス様形態を示したこれらのNPV感染Ld652Y細胞において、実際にアポトーシスが誘導されていることは、細胞DNAの断片化、およびアポトーシスの実行に与るプロテアーゼであるcaspaseの活性上昇によって確認した。特に著しいアポトーシスを誘導したHycuNPV感染Ld652Y細胞におけるウイルス増殖様相を詳細に調べたところ、ウイルスDNAの複製は認められたが、出芽ウイルスとポリヘドリンの産生は認められなかった。また、HycuNPVがコードするアポトーシス抑制因子であるHycu-IAP3のLd652Y細胞における発現量は、アポトーシスを誘導しないHycuNPV感染SpIm細胞におけるそれと同程度であった。これらの結果より、NPV感染が誘導する抗ウイルス応答としてのアポトーシスは、一般にウイルスの特性よりも、細胞の特性に大きく依存していることを示唆した。また、caspaseの阻害剤であるzVAD-FMK処理によりHycuNPV感染が誘導するLd652Y細胞のアポトーシスは抑制されたが、Ld652Y細胞におけるHycuNPVの増殖は促進されなかった。このことから、Ld652Y細胞におけるHycuNPVの増殖は、アポトーシスとは異なる機構によって制限されていることを示唆した。
簡易凍結徒手切片法を用いたマウス等哺乳類の代替動物実験(分裂細胞の検出等)の考案

新たに開発した「簡易凍結徒手切片法」を用いて、高等学校生物で、動物組織の観察を伴う新規の実習を開発し、生物が知識に偏ることなく「動物・生命そのものに立脚し、実感を伴う学習」となるようにする。実験動物は広く哺乳類マウスが用いられてきたが、「動物愛護管理法の改正」から生命系の大学を別にして、哺乳類のマウスや爬虫類・鳥類など有羊膜類を用いた実験は簡単に実施できない。H25H27年度の科研費で、様々な動物を用いマウスに劣らない組織実験が開発できた。そこで、本科研費では、生物にとって重要な細胞分裂を組織的に観察する実験として、マウスの代替動物として、アフリカツメガエル、キンギョが適用できるか検討した。ブロモデオキシウリジン(BrdU)、抗BrdU抗体を用い、学校に設置される生物顕微鏡で観察できる実験とした。その結果、アフリカツメガエル幼生の変態期(st.54)、発達中の後肢には多数の分裂細胞が含まれていることがわかった。指原基内は褐色を呈した細胞で満たされており、それらの染色状況もマウスの小腸や精巣の陽性細胞と変わりはないことから、本実験法が両生類でも適用でき、マウスの代替動物となることがわかった。さらに、マウスでは、小腸上皮細胞の分裂細胞は、柔毛底部のクリプト付近から活発に生じるが、両生類や魚類では小腸襞(柔毛を形成していない)に散在していた。両生類の精巣では、分裂細胞はクラスター状にシストを形成し、マウスと大きく異なっていた。また、本手法はミミズには適用できなかった。これまで様々な動物の組織を観察する実験例を示してきた。本報告では細胞分裂という生物に重要な現象も観察できる実験を示した。これら観察対象の拡大や新しい実験手法の開発、学校で扱いやすい実験動物の検討は、生徒が調べる活動の機会を広げ、課題設定を容易にすることで、「理数探求基礎」「理数探求」の充実に資すると考える。従来、動物を用いた実習はマウスが多く用いられた。しかし、「動物愛護管理法の改正」から生命系の大学等を別にして、哺乳類のマウスを用いた実験は簡単に実施できない。しかし、生物教育において実物を用いた実験は必要不可欠で、新課程で内容が増した高等学校や大学初期課程で実施できる「マウスの代替動物実験」の開発を目的とする。「本研究室で開発した簡易凍結徒手切片法」を用いると、これまで難しかった動物の組織標本を短時間で作成できる。この手法を用いて、従来マウスを用いて行われたブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた分裂細胞の標識実験についてツメガエルを代替動物として確立する。(2)チロキシンで誘発した幼生の変態に伴う細胞死・分裂細胞の変化など、学校現場で簡便に実施できる代替動物の生理実験を開発する。多細胞動物における細胞の増殖は、成体の発生・維持に重要な役割を持つ。代表的な例として、小腸上皮の置換がある。小腸底のクリプトと呼ばれる穴には小腸上皮細胞の幹細胞が存在する。幹細胞由来の分裂活性の高い細胞が増殖して上皮細胞を産生し、上部へと押し上げる。その結果、ヒトでは7日、マウスでは3日で上皮細胞が置換される。BrdUは、S期のDNAにチミジンの代わりに分裂細胞に取り込まれ標識できる。この手法を参考に、マウスの代替動物として、ツメガエルの子ガエルと幼生を、マウスに準じたBrdU濃度で48時間標識した。簡易凍結徒手法で標本を作成し、抗BrdU抗体・酵素抗体法で検出した。その結果、子ガエルの、腸上皮に散在、皮膚下部の組織中に多数、また、変態中の幼生の、腸上皮に散在、発達中の肢芽に密に陽性細胞が検出できた。特に、皮膚下はケラチノサイト幹細胞由来の分裂細胞、後肢芽は間充織の分裂細胞と思われる。これらの結果から、カエルを代替動物として、分裂細胞を標識・検出する実験が開発できたと判断できる。高等学校生物では、細胞分裂を観察する実験は、タマネギ根端の体細胞分裂、ムラサキツユクサやバッタの減数分裂の観察が一般的である。それらは分裂期における染色体に注目したものである。一方、植物や動物を多細胞生物として捉えた場合、細胞分裂・増殖は、成体の発生・維持に重要な機能をもち、体のどの部分に増殖細胞があるかは大切な視点となる。例えば、マウスの小腸上皮細胞は幹細胞から連続して作られ3日で代謝する。また、生物基礎においても、AGTCの塩基を持つヌクレオチドが相補的に重合しDNAが複製されることを学ぶ。しかし、この現象を確かめる実験は一般的でない。先の小腸上皮の分裂細胞の検出のように、生命科学の材料としてマウスが代表的であるが、動物愛護法により羊膜類以外の動物への代替が推奨される。そこで、マウスの代替として、アフリカツメガエルを用いた代替実験を検討している。本科研費の最初に当たるH28年度で、(1)ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いることで、子ガエル、変態中の幼生の分裂細胞が検出できた。(2) BrdU濃度、標本作成法、酵素抗体による陽性細胞の検出法が確定できた。

(3)小腸上皮における分裂細胞がカエルとマウスでは異なること、表皮のケラチノサイトには分裂細胞が多数存在すること、変態中のオタマジャクシ後肢芽の間充織には密に分裂細胞が存在すること、などの知見を得た。これらの結果から、高等学校や大学初期課程で実施可能な、マウスなど哺乳類の代替動物実験としてカエルが有効であることが示せた。また、多細胞動物の体内で細胞分裂の分布を見ることで、それぞれの組織における細胞分裂の生理的な意義を考察する実験、生物基礎の分子生物学の単元で、これまで一般的でなかったヌクレオチドを用いたDNAの複製実験として利用できる可能性が示せた。このような進捗状況から、概ね順調と考えられる。生物・生命系の実験では従来、マウスが一般的に用いられてきた。しかし、「動物愛護管理法の改正」から動物施設等が整備された生命系の大学などを別にして、哺乳類のマウスを用いた実験は簡単に実施できない。しかし、生物教育において、「生きている」生体内の現象を探るには実物を用いた実験は必要不可欠であり、高等学校や大学初期課程で実施できる「マウスの代替動物実験」の開発を目的とする。本研究室で開発した「簡易凍結徒手切片法」を用い、これまで難しかった動物標本を簡単に作成し、従来マウスが用いられてきたブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた分裂細胞の標識実験について、アフリカツメガエルの幼生・子ガエルを代替動物として検討した。H28年度・H29年度の結果から、(1)簡易凍結徒手切片法でも、マウスの小腸上皮細胞や精巣の精原細胞をBrdUで標識できること、(2)アフリカツメガエル幼生を用いた実験から、変態中の後肢内の間充織細胞に多数の陽性細胞が存在し、核の染色がマウスと同様であり、この領域は分裂活性が高いことから、確かにS期のDNA複製にBrdUを取り込ませ、組織標本内で検出できることが示された。(3)アフリカツメガエル子ガエルの小腸上皮には分裂細胞が散在し、マウスの分布と大きく異なっていた。このことは、マウスの小腸上皮細胞の分裂幹細胞が小腸底内のクリプトに局在するのに対して、カエルでは小腸が柔毛を形成せず、小腸襞内に散在することが原因と考えられる。(4)アフリカツメガエル子ガエルの精巣内に分裂細胞が細胞塊状に存在し、精巣においてもBrdU標識が可能であること、分裂細胞の存在がマウスと異なることが示された。(5)他の代替動物として安価に入手できるシマミミズや再生ミミズを用いて、BrdUの標識実験を行なった。麻酔、ミミズへの投与はできたが、組織標本中に陽性細胞を見つけることはできなかった。細胞分裂は生物の最も重要な現象である。また、ヒトを含む多細胞動物は単細胞の受精卵から細胞分裂を繰り返し成体となる。成体においても、分裂が盛んな組織には幹細胞が存在し、幹細胞の概念は再生医科学にもつながる。しかし、高等学校の生物では、細胞分裂は単にタマネギの根端細胞やムラサキツユクサの減数分裂の観察が一般的である。また、細胞周期のS期にヌクレオチドからDNAが複製される現象は図による説明が一般的で、動物を用いた実際の実験はほとんどない。この視点から、哺乳類のマウスを用いたブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた分裂細胞の検出は最適な実験の一つであるが、哺乳類のマウスは動物愛護管理法の遵守から、他の代替動物の検討が必要である。そこで、実験動物として一般的な両生類のアフリカツメガエル幼生・子ガエルを利用して、BrdUの標識、検出実験を行なった。その結果、変態中の幼生・後肢内の間充織細胞がほとんど陽性細胞であり、顕著な細胞分裂により後肢が成長する現象と一致した。また、マウスでは小腸上皮のクリプト