hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネ核局在型いもち病菌エフェクターがいもち病菌の病原性に果たす役割の解明

対象とする6種類のいもち病菌エフェクター遺伝子のうち、ME0009およびME0016について遺伝子を破壊したいもち病菌系統を作出した。またこれらを含めた全6種類の遺伝子を恒常的に強発現する組換えイネをそれぞれ3系統以上作出した。このうち遺伝子破壊いもち病菌について病原性の検定を実施したがいずれにおいても野生型と比較して有意な病原性の変動は認められなかった。また、これらの遺伝子を強発現する組換えイネでいもち病抵抗性が有意に抑制されるような結果は認められなかった。これらの遺伝子産物が実際の感染の過程においてもイネ細胞核に移行することを検証するために、自身のプロモーターの下流にタンパク質コード領域と赤色蛍光タンパク質mCherryとの融合遺伝子を持つキメラ遺伝子を作出し野生型のいもち病菌に導入した。これらを、細胞学にGFPが局在するようにした組換えイネの葉鞘に接種し、36時間後に蛍光を観察したところ、ME0008, ME0009, ME0014, ME0032の4種類のタンパク質がイネ細胞核に移行することが証明された。他の2種類は明確な核局在が確認できなかったが、これは自身のプロモーターが強くないために、発現量が低かったことによるのではないかと推察された。細胞外分泌シグナルを有しかつ核局在が予想されるエフェクター候補遺伝子23種類すべてについて、シグナルペプチドを除いた領域のC末にGFPを融合させた遺伝子を35Sプロモーターの下流に連結したプラスミドを作成した。これを順次パーティクルガン法によってタマネギ表皮細胞あるいはイネ葉鞘裏面細胞に導入した。暗黒化、25°Cで24時間保温したのち蛍光顕微鏡によりGFPの局在を解析した。その結果、ME0008, ME0014, ME0032, ME0034についてはタマネギ、イネ両方で明瞭なGFPシグナルのイネ細胞核への局在が観察された。またME0009はタマネギ表皮細胞では核局在傾向が観察できたが、イネ葉鞘裏面では蛍光それ自体が極めて弱く、イネ細胞内で特異的にタンパク分解が起きている可能性が示唆された。この直接導入法によってイネ細胞核に局在すると判断されたエフェクターME0008, ME0014, ME0032, ME0034についてそれぞれ遺伝子破壊のためのバイナリーベクターを作出した。現在順次遺伝子破壊系統の作出を進めており、現在までにそれらのベクターをアグロバクテリウムに導入済で、さらにME0014については多数の独立した遺伝子破壊系統を得ることに成功した。また、ME0008についても少なくとも1系統の遺伝子破壊系統を得た。得られた遺伝子破壊系統を順次イネ葉鞘に接種し、3648時間後における侵入程度を評価したところ、ME0014破壊系統では野生型に比較してほとんど差が見られなかったが、ME0008の破壊系統ではわずかながら侵入の遅延が観察された。また、核局在と判定した4種のエフェクター遺伝子を恒常発現型プロモーター支配下に発現する組換えイネを作出中である。当初方針を若干変更してより短時間でエフェクタータンパク質候補23種類のすべてについてタマネギおよびイネ細胞内における局在解析を終了することができた。よって26年度に計画していたことはすべて終了した。さらに核局在候補として最終的に選定した4種類の遺伝子すべてについてその破壊のためのバイナリーベクターを作出したこと、そのうちの2種類については実際にいもち病菌に導入して遺伝子破壊株を単離することに成功したことは当初27年度に計画していたものであり、予定以上の進捗と判断できる。ME0014以外の5種類のイネ核局在エフェクター候補遺伝子について順次遺伝子破壊株を作出し、その病原性を葉鞘接種法ならびにイネ葉身噴霧もしくは滴下接種法によって評価する。これによって病原性に有意な低下がみられた遺伝子についてはその機能をさらに明らかにするために、その破壊株と正常株を接種したイネの遺伝子発現の差異をイネオリゴアレイによって解析する。

あわせて、今回選抜した6種類の候補遺伝子の産物が実際の感染過程においていもち病菌からイネ細胞核に移行するか否かを明らかにするために、プロモーター領域およびタンパクコード領域までのDNA断片と赤色蛍光タンパク質mCherryとの融合遺伝子を作出し野生型いもち病菌稲86-137に導入して、罹病性イネの葉鞘に接種し蛍光の局在を組織学的に解析する。26年度に作出を開始したエフェクター遺伝子の恒常発現イネについて、イネいもち病菌およびそれ以外のイネ病原に対する応答性を明らかにする。研究の予定以上の進捗により、成果報告をすべての遺伝子破壊系統の病原性評価が終了した時点で行うこととしたため、当初予定していた学会旅費が未使用となった。また、遺伝子破壊用ベクターの作出が予想以上に順調に進捗したのでそれに要する試薬を節約することができた。イネ側の遺伝子発現変化を詳細に解析するためにイネオリゴアレイによる解析をタイムコースを増やすなど一層充実させることとし、その費用に充当する予定である。
形式仕様に基づく適応型ソフトウェア開発に関する研究

本研究では,適応的なソフトウェアを開発するために必要なソフトウェア構造と,開発方法の研究を行う.本研究のソフトウェア構造は,自律的なモジュールの連携によるシステム開発を基礎とする.既存プログラムの環境適応化については,既存の大規模プログラムに対して環境への適合化技術を開発しツールの試作をする.さらに,新規のシステムの開発の方法論の研究では,形式仕様を基本として,増分的な仕様の検証,自律モジュールの生成,及び試験とデバッグについてのツールの試作と評価を行う.今年度は,このうち,自律的なモジュールの動作環境の構築と,既存プログラムの環境不適合部分の切り出しに焦点を当てた.動作環境については,自律モジュール間通信機構としてタプルスペース型通信を採用した.今年度は,タプルスペースの複製配置と一貫性管理方式について,定数合意方式に非同期更新を拡張した方式を提案した.これは,ロック操作の必要のない,既存の方式よりも軽い方式である.また,その性能についてシミュレーションと実装の両面から評価した.現在は,JAVA言語からこれを利用できるように開発を進めつつある.環境不適合部分の切り出しについては,プログラムスライシング技術を採用した.今年度は,これを既存の大規模ソフトウェアに対処できるように並列化する方式について検討し,予備的実験を行なった.並列化にあたっては,まず,複数ある既存のスライス計算アルゴリズムそれぞれを並列化することの特質について検討し,有効だと思われる2つのアルゴリズムについて簡単な実装を行った.次に,実測実験をなうことによって,より効果の高いアルゴリズムを採用することを決めた.現在は,より効率の良いアルゴリズムを開発中である.本研究では,適応的なソフトウェアを開発するために必要なソフトウェア構造と,開発方法の研究を行う.本研究のソフトウェア構造は,自律的なモジュールの連携によるシステム開発を基礎とする.既存プログラムの環境適応化については,既存の大規模プログラムに対して環境への適合化技術を開発しツールの試作をする.さらに,新規のシステムの開発の方法論の研究では,形式仕様を基本として,増分的な仕様の検証,自律モジュールの生成,及び試験とデバッグについてのツールの試作と評価を行う.今年度は,このうち,自律的なモジュールの動作環境の構築と,既存プログラムの環境不適合部分の切り出しに焦点を当てた.動作環境については,自律モジュール間通信機構としてタプルスペース型通信を採用した.今年度は,タプルスペースの複製配置と一貫性管理方式について,定数合意方式に非同期更新を拡張した方式を提案した.これは,ロック操作の必要のない,既存の方式よりも軽い方式である.また,その性能についてシミュレーションと実装の両面から評価した.現在は,JAVA言語からこれを利用できるように開発を進めつつある.環境不適合部分の切り出しについては,プログラムスライシング技術を採用した.今年度は,これを既存の大規模ソフトウェアに対処できるように並列化する方式について検討し,予備的実験を行なった.並列化にあたっては,まず,複数ある既存のスライス計算アルゴリズムそれぞれを並列化することの特質について検討し,有効だと思われる2つのアルゴリズムについて簡単な実装を行った.次に,実測実験をなうことによって,より効果の高いアルゴリズムを採用することを決めた.現在は,より効率の良いアルゴリズムを開発中である.
福島原発事故によりセシウムで汚染した土壌の合理的な処理・処分法

本研究では、福島第一原子力発電所事故で環境中に放出されたセシウムを固定している粒子を明らかにし、それを基に、土壌の減容化を可能とする分級方法や合理的で安全なセメント固化法について提案することを目的とした。その結果、放射性セシウムを多く吸着している粒子は、複数の鉱物の凝集態、有機物と鉱物の複合体、風化雲母片に大別され、これらは多孔質天然材料である珪藻土、あるいは通常の湿式分級法により分級可能であることが明らかとなった。さらに、固定化されていないセシウムはゼオライトで吸着除去した後に処分することが予想されるが、通常のスラグセメントで浸出性の低い安全な固化体となることが明らかとなった。本研究では、福島第一原子力発電所事故で環境中に放出されたセシウムと土壌中の粘土鉱物の関係を処理・処分の観点から明らかにするとともに、汚染土壌から粘土鉱物フラクションを効率よく分離し処分する土壌の減容化を可能とする分級方法を検討するとともに、実施の可能性の高い合理的で安全なセメント固化法について提案することを目的とした。今年度は、福島における汚染土壌の実態調査をおこない現地土壌内のセシウムの存在形態を明らかにするとともに、実汚染土壌を用いた分級実験、珪藻土を用いた懸濁体セシウムの現場捕集実験、実汚染土壌の高分解能透過型電子顕微鏡観察、安全性の高い固化用セメント材料の検討を行った。様々な利用形態の土壌中のセシウムの存在状態を調べたところ、水に可溶および交換性のセシウムは10%程度で、残り90%程度は粘土鉱物に固定化された懸濁体であることが判明した。また、この懸濁体セシウムは、多孔質天然材料である珪藻土によって捕集可能であることが明らかとなった。このセシウムを固定化している粘土鉱物を高分解能透過型電子顕微鏡で観察したところ、放射性セシウムを多く吸着している粘土鉱物はFe含有Al系スメクタイトであることも明らかとなった。さらに、固定化されている粘土鉱物は、通常土壌汚染対策等で採用されている湿式分級法により分級可能で、分級により細粒分を除いてから研磨作用をもたせた処理と分級洗浄を行う方法により,分級洗浄による放射性セシウムの分離効率を著しく向上できることが明らかとなった。以上のことより、土壌中のセシウムの多くはFe含有Al系スメクタイトに固定化され、それを大量に含むフラクションを分級すること、移動するとしてもそれ含んだ土壌粒子が懸濁・移流することによるので捕集すること、これらの技術を合理的かつ効率的に行うことでより効率的な除染が可能であることが明らかとなった。今年度も昨年に引き続き、福島における汚染土壌の実態調査をおこない現地土壌内のセシウムの存在形態を明らかにするとともに、汚染土壌減溶化のための実汚染土壌を用いた化学抽出実験、様々な環境における珪藻土を用いた懸濁体セシウムの現場捕集実験、実汚染土壌の高分解能透過型電子顕微鏡観察、除染に用いた吸着材の固化用セメント材料の検討を行った。河川を流れる懸濁体セシウムのほとんどが水や酢酸アンモニウムにでは抽出できない粘土鉱物等に固定化された状態であることが判明した。また、この懸濁体セシウムは、多孔質天然材料である珪藻土によって捕集可能であるが、流速の早い河川ではほとんど回収できなかった。セシウムを固定化している粘土鉱物を高分解能透過型電子顕微鏡で観察したところ、放射性セシウムの多くは粘土鉱物のエッジの部分に濃集しているだけではなく、広く層間に分布していることも明らかとなった。さらに、セシウムを吸着したゼオライトは、セメント固化により溶出量を抑えられることも明らかとなった。以上のことより、土壌中のセシウムの多くは粘土鉱物に固定化され、それを大量に含むフラクションを分級すること、移動するとしてもそれ含んだ土壌粒子が懸濁・移流することによるので流れが緩やかな河川等で捕集すること、また除染等で使用されたゼオライトは、そのままではセシウムを溶出してしまうが、セメント固化等により安全に処分できること等が明らかとなった。

本研究では、1福島第一原子力発電所事故で環境中に放出されたセシウムと土壌中の粘土鉱物の関係を処理・処分の観点から明らかにし、2汚染土壌から粘土鉱物フラクションを効率よく分離し処分する土壌の減容化を可能とする分級方法を検討し、3実施の可能性の高い合理的で安全なセメント固化法について提案することを目的とした。その結果、以下のことが明らかとなった。1様々な利用形態の土壌中のセシウムの存在状態を調べたところ、水に可溶および交換性のセシウムは10%程度で、残り90%程度は土壌に含まれる細粒な鉱物粒子に固定化された懸濁体であることが判明した。このセシウムを固定化している粒子をイメージングプレートで分離し、高分解能透過型電子顕微鏡で詳細に観察したところ、放射性セシウムを多く吸着している粒子は、複数の鉱物の凝集態、有機物と鉱物の複合体、風化雲母片に大別されることが明らかとなった。また、これらに含まれる鉱物は、バーミキュライト、Fe含有Al系スメクタイト、風化黒雲母であることも明らかとなった。2セシウムを固定化している粒子は、多孔質天然材料である珪藻土によって捕集可能であり、通常土壌汚染対策等で採用されている湿式分級法により分級可能で、分級により細粒分を除いてから研磨作用をもたせた処理と分級洗浄を行う方法により,分級洗浄による放射性セシウムの分離効率を著しく向上できることが明らかとなった。3除染廃棄物のうち容易にセシウムが溶出する焼却灰等は放射能が高い場合があるので、ゼオライト等で吸着除去した後に処分することが予想されるが、通常のスラグセメントで浸出性の低い安全な固化体となることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。環境鉱物学26年度が最終年度であるため、記入しない。実施している内容に関しては、実施後に新たな課題として見出されたものもあるが、そもそも困難な課題を実施していることから想定内のものである。ホームページの作成・公表には時間を要し多少遅れ気味ではあるが、おおむね順調に進展していると判断した。実施している内容に関しては、珪藻土の設置場所によって捕集効率が違うなど、実施後に新たな課題として見出されたものもあるが、そもそも困難な課題を実施していることから想定内のものである。ホームページの作成・公表にはサーバーに問題があり時間を要し多少遅れ気味ではあるが、おおむね順調に進展していると判断した。放射性セシウムを固定化した粘土鉱物の分級方法に関しては、通常土壌汚染対策等で採用されている湿式分級法が使えることが判明したので、今後は森林地帯から懸濁体として流れる放射性セシウムを固定化した粘土鉱物の回収法について現場試験を継続して明らかにしていきたい。また、高分解能電子顕微鏡観察の試料調整法にも改良を加えていきたい。放射性セシウムを固定化した粘土鉱物の分級方法に関しては、通常土壌汚染対策等で採用されている湿式分級法が使えることが判明した。しかし、固定されている鉱物は二次元に広がった扁平な結晶であるので、サイクロンなどの分級技術が使えるかもしれない。また、高分解能電子顕微鏡観察で判明したセシウムを固定する鉱物やセシウムの化学形態が、福島県の他の汚染土壌でも適応可能かどうか、様々なタイプの土壌で確認する必要がある。平成24年度には、セメント固化の候補材料の選定を終了して溶出試験を開始する予定であったが、選定に時間がかかり開始が遅くなった。この試験費を次年度の直接経費として繰越し、早期に試験を開始する予定である。今年度に計画していた試料採集と分析を次年度に行うこととなったため。試料採集と分析のための費用に充当する。
銅結合タンパク質による酸化ストレスの制御の研究

昨年度の研究において脳に豊富に存在するS100bタンパク質が銅イオンを結合する能力を持つことを見出し、ラットのS100bタンパク質をグルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌において発現させる系を確立した。本年度はこの系を用いて銅と過酸化水素による酸化ストレスに対して、S100bタンパク質が防御的に働きうるか否かを中心に検討した。融合タンパク質を発現している大腸菌は、1mM CuCl_2存在下で培養した後、過酸化水素(14mM)で処理した場合、グルタチオンS-トランスフェラーゼのみを発現している大腸菌に比べ有意に菌の生存率が高かった。後者の菌では、銅イオン濃度を0.75mM CuCl_2に下げた条件でも生存率が1mM CuCl_2処理の融合タンパク質発現菌より低く、S100bタンパク質が酸化ストレスに対し強力な防御作用を発揮することを証明できた。また、菌のサイトソ-ルのゲルクロマトグラフィーによってS100bタンパク質が実際銅イオンと結合して存在していることを確認した。さらに、赤血球の銅イオンによる溶血作用に対してもS100bタンパク質が抑制作用を示すことを明らかにした。銅イオンの存在下にS100bタンパク質がジスルフィド二量体を形成すること、またこの反応がアスコルビン酸の共存により阻害を受けることを見出すとともに銅結合部位をタンパク化学的に推定した。動物培養細胞にS100bタンパク質を遺伝子導入によって発現させる実験も試みたが、細胞の増殖が遅くなる傾向を示したので現在誘導発現が可能な培養細胞の実験系の確立を行っている。活性酸素による組織障害における遊離金属イオンの関与の重要性が指摘されている。本研究においては、細胞内で遊離銅イオンを結合するタンパク質が、活性酸素障害の防御に寄与する可能性を追究するため、ウシ脳から銅結合性タンパク質の精製を試みた。まず、タンパク質の銅イオン結合脳をアスコルビン酸の銅イオンによる酸化の促進効果を抑制する力価として測定する簡便な方法を確立した。この方法を用いてウシ脳のアセトンパウダー抽出液中の銅結合性タンパク質をDEAEセルロースとセファデックスG-75を用いるクロマトグラフィーで分離精製を行った。その結果、分子量約20,000のものが高度に純化されたので、これをさらに逆相HPLCによって精製し一次構造の決定を行った。リシルエンドペプチターゼで消化して得られるペプチドのうち2個のもののアミノ酸配列をタンパク質のアミノ酸配列のデータベースで検索したところ、いずれのペプチドも配列がウシ脳のS-100βと完全に一致した。さらに、ウシ脳のS-100bタンパク質(S-100βサブユニットの二量体)の精製標品を上記のアスコルビン酸酸化反応を用いて銅イオン結合脳を定量的に調べ、S-100bタンパク質一分子当り5個の銅イオンが結合することを見出した。これらの結果から従来カルシウム結合タンパク質として研究されてきた本タンパク質が銅イオンを結合する能力をつこが明らかとなった。さらに、組換えS100bタンパク質を得る目的で、ラットのS-100βサブユニットのcDNAをラット小脳のmRNAからRT-PCR法で作製し、pGEX-5X-3(グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質を作るためのベクター)に挿入して大腸菌で高度に発現させることのできる系を確立した。融合タンパク質を発現している大腸菌は、1mMCuCl_2存在下で培養した後、過酸化水素(14mM)で処理した場合、グルタチオンS-トランスフェラーゼのみを発現している大腸菌に比べ有意に菌の生存率が高かった。

後者の菌では、銅イオン濃度を0.75mMCuCl_2に下げた条件でも生存率が1mMCuCl_2処理の融合タンパク質発現菌より低く、S100bタンパク質が酸化ストレスに対し強力な防御作用を発揮することを証明できた。また、菌のサイトソ-ルのゲルクロマトグラフィーによってS100bタンパク質が実際銅イオンと結合して存在していることを確認した。さらに、赤血球の銅イオンによる溶血作用に対してもS100bタンパク質が制御作用を示すことを明らかにした。銅イオンの存在下にS100bタンパク質がジスルフィドに量体を形成すること、またこの反応がアスコルビン酸の共存により阻害を受けることを見出すとともに銅結合部位をタンパク化学的に推定した。動物培養細胞にS100bタンパク質を遺伝子導入によって発現させる実験も試みたが、細胞の増殖が遅くなる傾向を示したので現在誘導発現が可能な培養細胞の実験系の確立を行っている。
土地所有権と女性の経済的地位の変容：ガーナのカカオ生産家計についての実証研究

曖昧で重複した土地権利がアフリカ農業の投資阻害要因となっているとの理論的懸念が共有されてきた一方、実証的な証拠は研究によって異なる。土地所有形態による投資阻害要因の差を吟味した結果、投資阻害要因が働くのは親族から入手した土地にのみであることが明らかになった。実証結果のばらつきは、調査地による親族所有地の比率で説明づけられる。土地権利再整理のための企業介入と公的土地登録は長期投資を促進する。しかし生産性上昇への効果を持つのは企業介入だけであることが分かった。植樹投資、生産性いずれについても耕作者の性別によるバイアスは確認されないが、名目的な女性名義の土地登録は、生産性に対して負の影響を持つ。本研究の目的は、換金作物の導入・普及が貧困削減・所得向上と、農村女性の経済的地位にどのようなインパクトを持ったか、また換金作物導入のインセンティブに対して、伝統的土地所有制度とその変容が、どのように影響しているかを解明することである。質問票に基づいたインタビューでデータ収集し、回帰分析により問題設定に対する回答を導く。調査地選定のため3年前から前年度までにガーナの4地方でプランテーション企業、小規模生産者へのパイロット調査を行っていた:2012年9月アシャンティ地方・カカオおよびオイルパーム;東部地方・パイナップル;2014年3月中部地方・オイルパーム;2014年8月西部地方・ゴム。この過程で、予算申請当初の計画であったアシャンティ地方のカカオから、西部地方のゴムに調査対象を変更した。理由は、小規模生産者の参入による所得上昇効果が、ゴム生産者について最も計測される見込みが大きいこと、また、作物導入が比較的最近の2005年に本格開始し、技術伝播の只中にあることから導入済と未導入が混在しており、回帰分析に必要な家計間のバリエーションが確保しやすいこと、などが判明したからである。2014年度8月から9月にかけてケープコースト大学の研究協力者(「研究分担者」ではない)3人と調査員6人とともにガーナ西部農村8か所でデータ収集を行いゴム生産者を主体とした(食料作物のみの生産者を含む)農業家計230件のデータを収集した。現在、データの入力、回答の質(質問が意図どおり伝わり、分析の用途を満たす回答が得られているか)を精査し、修正箇所の洗い出し作業中。本研究は、1.プランテーション向け換金作物の小規模契約栽培への参加が、農業における女性の経済的地位向上に関してどのような効果をもたらしたか、また、2.その前段階として、女性が管理する農地において換金作物導入がなされる頻度を決定づける要因を特定することを目的としている。分析の経過として、現時点で得られた知見は以下のようなものである。問題1について、食糧作物や、カカオ、オイルパームなど比較的伝統的な換金作物が「男性の作物」としての位置づけがある(女性の管理下にある農地では比較的導入されにくい傾向がある)一方、ゴムでは有意な男女差がないことが分かっている。従来、女性の作物としての位置づけがある食糧作物農地を、プランテーション会社が契約栽培者として勧誘してゴム栽培に取り込むことで、他の換金作物に比べてゴムへの女性の参加率が上昇したというものである。もしくは、ゴム会社が、契約栽培者契約に際して、土地権利の再整理によって、登録上の名義で女性の土地が増加したというものである。説明を統計的に決定することが、完成の要件となる。問題2について、土地権利に対し、長期的な換金作物栽培がどのような影響をもたらしたかを分析している。現在までに、相続人任命権、賃貸に付す権利、借入の抵当に使用する権利、の3つの尺度について、ゴム栽培導入が女性の土地権利拡張に関係していることが分かっている。これは他の商品作物では起きていない。この理由が、長期的な投資を行ったこと自体が権利を増強したのか、ゴムのプランテーション会社が女性の参加を推奨するために行っている政策介入:女性名義での栽培契約と、親族所有による権利関係の混乱を防ぐための所有権再整理への助力、のうち、どれが関係しているのか、もしくは、上述の、元々女性の管理かにあった農地の参加を促したことに起因するのか、統計的に決定することが必要である。2014年8月から9月に本調査で、利用可能データ244件、農地プロット数にして585件を収集した。この後、データの入力と変数生成、研究の問題設定に従った計量分析を進めてき。この過程で、研究の問題設定の根幹に関わる変数の観察値の一部に欠損が生じていることが明らかになった。これらは、回答者への質問意図の伝達エラーにより、また別の場合には調査員の質問意図の把握エラーによって生じたものであることが判明した。前回の回答者の大部分は、携帯電話番号を把握していたので、2015年8月に、3週間ほどをかけて電話による追加調査を行った。前回雇用した調査員6人に依頼し、データ欠損値の多くを補うことができた。ここから現在まで、ほぼ順調に分析を進め、論文の形で執筆を進めつつ、計量分析の試行錯誤により、結果を蓄積しつつある。全体として、蓄積した推定結果の山を整理し、テストしている因果関係が、頑健に「識別」されているという要件を満たし、その上で、語るに足る、秩序だったストーリーを論文上構築することである。現段階で何とかこの段階が視野入ってきたので、これを、本年度の可能な限り早い段階で成立させることを目指している。

アフリカの土地制度改革において、土地所有の制度化が、農業への投資誘引を改善し、換金作物などへの長期的投資を促進するかという問題が活発な議論の対象となっている。調査地のガーナ西部を含むアフリカ諸地域で、個人・家計の土地アクセスは、親族からの割り当てや母系相続などの伝統的土地制度による場合が多い。これは土地を持たない家計とのリスクシェアリングに寄与する反面、土地アクセスが常に再交渉の対象となり得るため長期的安定性に劣る。多年性の換金作物の普及は農業所得向上への役割が期待されるが、それらは初期投資に加え、収穫開始までに数年を必要とするため、植樹投資には土地アクセスの長期的安定が前提となる。この認識に基づき、土地登録制度による土地使用権の私的所有権化がアフリカ各地で試行的に導入されつつある。この研究では、公的な土地登録制度と、ゴムプランテーション企業による土地権利再整理のための介入の効果を評価した。土地登録制度の効果は、研究によって実証的な結論が異なることが知られている。本研究は土地所有形態による投資阻害要因の違いを吟味し、投資阻害要因が働くのは親族から入手した土地にのみであり、それ以外の主要な入手経路:村からの割当や購入、小作借入、私的購入では投資阻害要因がないことが分かった。実証研究間の結論のばらつきは、調査地による親族所有地の比率の違いで説明できる可能性がある。土地制度改革については、土地権利再整理と土地登録の両方が植樹投資を促進すること、しかし生産性上昇への効果を持つのは権利再整理だけであることが分かった。また、耕作者の性別によるバイアスは植樹投資、生産性いずれについても確認されないが、推奨されている女性名義の土地登録は、生産性に対して大きな負の影響を持つ。使用権の確立のための登録・植樹が目的になっており、植樹後の投入が少ないことが主な理由と考えられる。曖昧で重複した土地権利がアフリカ農業の投資阻害要因となっているとの理論的懸念が共有されてきた一方、実証的な証拠は研究によって異なる。土地所有形態による投資阻害要因の差を吟味した結果、投資阻害要因が働くのは親族から入手した土地にのみであることが明らかになった。実証結果のばらつきは、調査地による親族所有地の比率で説明づけられる。土地権利再整理のための企業介入と公的土地登録は長期投資を促進する。しかし生産性上昇への効果を持つのは企業介入だけであることが分かった。植樹投資、生産性いずれについても耕作者の性別によるバイアスは確認されないが、名目的な女性名義の土地登録は、生産性に対して負の影響を持つ。2014年(平成26年度)は実証研究の具体的方法の策定、調査の計画と実行までを予定していた。現時点で順調に達成できている。上の結果1:ゴム栽培導入にのみ、性別バイアスがないという点について、上記の複数の仮説的な説明から、本当の説明要因を統計的に特定すること、また、この商品作物導入の決定要因を推定する関数の中で、重要な説明要因であり、かつ内生性が疑われる変数については、その内生性に対する処理を確実に行い、結果の頑健さを確保することが研究完成のための要件である。具体的には、「女性が主要耕作者である」という農地属性の内生性の解決が最重要課題となる。
モザイク卵の細胞分化における遺伝的制御機構

細胞の分化は遺伝子の差次発現によりもたらされる、と考えられている。典型的なモザイク卵の一つとして知られているホヤ卵では、分化に関与すると思われる細胞質決定因子の存在を示唆する数多くの実験的証拠が得られている。本研究の目的は、そうした自己刺激に応答して、分化に必要な遺伝子の発現がどのように制御されているかをホヤ胚の筋肉細胞に的をしぼり明らかにしようとするものである。そのために、まず、ホヤ幼生のホモジェネートを抗原としてモノクローナル抗体を作製し、その中から筋肉細胞を特異的に認識する抗体を2・3種類得た。RNA合成阻害剤や蛋白質合成阻害剤を使った実験から、これらの抗体の認識する抗原分子は筋肉細胞に特異的に発現する新合成の蛋白質であろうと考えられる。次に、これらの遺伝子に対するcDNAプローブを得るために、尾芽胚(多分これらのmRNAが最も活発に合成されているものと考えられる)からmRNAを単離し、エクスプレッション・ベクターを用いたcDNAライブラリーを作製した。そして、モノクローナル抗体を利用し、そのうちの1つ(多分ミオシンH鎖と思われる)に対するcDNAを捨うことができ、現在サブ・クローニング中である。また、もう1つの抗原分子の遺伝子を捨う努力をしている。さらに、筋肉に特異的な酵素アセチルコリンエステラーゼのcDNAプローブを得るべく、合成ポリヌクレオチドを使って努力しているが、成功していない。一方、決定因子の分子的本質を明らかにすべく、次のような研究を進めている。筋決定因子を含むと思われるマイオプラズムを単離し、その構成成分に対するモノクローナル抗体を作製した。そしてその中から、マイオプラズムと挙動を共にする抗体を12種類得ることができた。現在、これらの抗体の認識する分子を様々な角度から検討している。
腎発生過程における組織間(尿管芽-後腎)相互作用の研究

マウス腎の発生過程では胎齢11.5日頃に濃縮した間葉組織が形成する後腎組織に中腎管から出芽した尿管芽が進入し相互に分化成熟を誘導する。クローズドコロニーddyマウスの中から50世代以上の兄弟交配をへた近交系マウスFUBIマウスはその病理学的解析からこの過程がうまく進行せず、両側正常腎発生:片側腎形成不全:両側腎形成不全=4:5:1の比率で腎形成不全が出現する腎形成不全自然発症マウスである。健常人を有するNFS/Nマウスとの退交配実験系を用いた連鎖解析では、本表現型とマウス2番染色体との間に有意の連鎖を認めた(x2=19.7,D2MIT63)。この知見を元に作成されたFUBIとNFS/Nとの2番染色体に関するreciprocal congenic strainでの表現型の観察においても腎形成不全を認め、2番染色体上に本表現型に影響を与える何らかの遺伝子が存在することは間違いないと思われた。一方で本変異マウスの胎生期11.5の腎原基について器官培養を行ったところ、後腎組織に尿管芽が進入した場合に尿管芽とともに共培養したところ後腎組織の発育が観察されたが、尿管芽を除去したものについては後腎組織の発育はみられなかった。しかしながらこれをspinal cordと共培養することで後腎組織の発育が観察されたことから、本変異マウスにおける異常は後腎組織そのものにあるのではなく、尿管芽が侵入できないことにあること(failure of ureteralbud invasion : FUBI)があきらかとなった。連鎖解析において2番染色体上でLODスコアの最高値を示したポジションの近傍には、その自然変異あるいはターゲッティングにより種々の確立で腎形成不全を引き起こす遺伝子Fmnがあり、このシークエンスを確認したが、原因遺伝子との確証は得られていない。先天的に腎形成不全をみるFUBI系と健常腎をもつ近交系マウスNFS系との退交配世代で、表現型の染色体多型との連鎖解析により責任遺伝子の一つがマッピングされている(MMU2と命名)、MMU2に関してNFS系統との間でコンジェニックマウスを作製した。すなわち連鎖のみられる遺伝子座の近傍にある、microsatellite lociのpolymorphysmをマーカーとし、FUBI由来の遺伝子を背景とし、MMU2上の一部分にNFS由来の遺伝子をホモに持つ系統と、NFSを背景とし、MMU2上の一部分にFUBI由来の遺伝子をホモに持つ系統の二系を作成した。このうち後者に関しては、腎形成不全のマウスは皆無であったが、前者について、FUBI系との間に有意な表現型発生頻度の差が見られた。FUBI系では、約半数(321/650)のマウスにおいて腎形成不全がみられたが、MMU2の一部分のみホモにNFS alleleと置き換えると腎形成不全の発現頻度は2.5%(5/204)と減少し、ヘテロにFUBIとNFS alleleを持つものでは17%(7/41)とその中間の頻度で出現した。以上のことからFUBI系の腎形成不全の原因遺伝子のうち重大なもののひとつがこの染色体に存在することが確認された。マウス胎仔11.5日目からの腎原器の培養においてFUBIでは正常に発生し得ないものがみられ、organ cultureにおいても尿管芽の発育異常が観察された、Institute of Biotechnology, Helsinki Universityを訪問し、技術的なアドバイスを得ることができたが、手技の改良の後も発育異常は認められ、この発育異常はFUBI系に有意な事象であると確認された。

また尿管芽および脊髄を用いた後腎の分化誘導実験では、後腎組織は潜在的に分化能を持つが、尿管芽の分化誘導能がないことが観察されている。既知の遺伝子発現をみるために、NFSとFUBI胎仔11.5日と12.5日における腎原器をmicrodissectionにてRNAを抽出。PAX2、WT1、Wnt4、HS2ST、cRET、GDNF、Integrinα8、についてβアクチンを内部コントロールとしてRT-PCRを試みた。現在のところNFS系とFUBI系との間で発現に有意な差は確認できなかった。この検討では採取組織をさらに詳細に検討することと、organ cultureに対象を広げることで続行する予定である。また胎仔とorgan culture標本のWhole mount in situ hybridizationによっても検討を開始している。未知の遺伝子の検討のため、胎仔11.5日の左右の腎での発現遺伝子の差を蛍光Differenntial Display法により検討を行い、発現に差のある可能性を持ったcDNAからのPCR産物の抽出を開始している。これらのサブクローニングとシークエンス決定を順次並行して行っている。我々の持つ近交系FUBIマウスは,クローズドコロニーddyマウスから近交系化された遺伝的腎形成不全モデルマウスである.本マウスの解析から泌尿生殖器発生に関わる新しい遺伝子の発見あるいは,腎発生における胎生期の腎,尿管の相互作用における新しいメカニズムの解明にせまる。これまでの解剖学・組織学・器官培養学的検討から本マウスの腎形成不全の機序として胎齢11日周辺における尿管芽の後腎間葉組織への侵入不全が重要であり、そのために相互分化誘導がおこらず最終的に後腎組織のアポトーシスに陥ることがわかっている。またNFS/Nマウスとの間で行った連鎖解析から、この表現型の遺伝形式は多因子遺伝であること、マウス第2番染色体上のD2Mit58とD2Mit63の間の13.8cMの領域に99%以上の確率(LODスコア>3)で有意の連鎖を認め、この遺伝子座にFUBIの腎形成不全に影響を与える遺伝子が存在することが判明した。この遺伝子座に存在する候補遺伝子としてはWT1、Fmn(formin gene)が挙げられるが、特に後者の変異で認められる腎形成不全の出現様式はFUBIでのそれと酷似しており重要な候補遺伝子と考えられた。平成12年度はFUBIの腎形成不全原因候補遺伝子としてFmnを解析した。Fmnは500kb以上に及ぶ巨大な遺伝子のため、そのcDNAを用いてコーディング部分のシークエンスを行った。その結果exon9のproline-richregionをコードするCCNの反復配列が1個欠損するpolymorphismが判明した。本変異マウスにおける腎形成異常の原因遺伝子を明らかにすることは困難であったが、自然発症の腎形成不全モデルマウスは非常に貴重であり、本研究期間の成果としてAmerican Journal of Pathologyに報告した。今後はさらに解析を進め原因遺伝子あるいは機構の解明を続けていく予定である。
マイクロ波を用いた環境低負荷型バイオマテリアルの創製

環境負荷が少ない条件で、簡便に人工骨材料を作製することを目的として、触媒に生体由来のリパーゼを用い、エネルギー源にマイクロ波を用いて、水酸アパタイトと生分解性高分子の複合材料を作製した。多孔質の水酸アパタイト中で生分解性高分子を合成することにより、二成分がより一体化した複合材料を得ることができ、マイクロ波の利用によって、短時間での合成が可能であった。また、生分解性高分子の種類により、複合材料の強度と、接触角を制御可能であることが分かった。生体骨の主成分である水酸アパタイト(HAp)を利用した代替骨の開発が盛んに行われている。しかし、HApの機械的特性に着目すると、圧縮強度、曲げ強度は生体骨と比べて、数倍大きく、破壊靱性値は低く、ヤング率は骨よりはるかに大きいなど、生体骨と比べて強度がかなり異なる。生体骨と比べて、著しく強度が異なると、正常骨を破壊してしまうため、生体代替材料の強度としては、生体骨と同等の力学的強度が望ましい。本研究では、HAp多孔体を用いて、その多孔内でIn-situ重合により生分解性高分子を合成することにより、優れた力学的強度と生体適合性を有するバイオマテリアルを作製することを目的としている。特に、残存触媒の生体への影響が無視できる酵素触媒を用い、迅速かつ高収率での重合が期待されるマイクロ波を重合の際の加熱源として利用することにより、生分解性高分子/HAp複合体を作製した。平成22年度は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε-カプロラクトン、ポリω-ペンタデカラクトン(PLLA、PGA、PCL、PDDL)のマイクロ波重合性を確認した。酵素としてリパーゼを利用することにより、分子量1万以上の各ポリマーが収率良くマイクロ波合成可能であることがわかった。また、その重合は熱効率の悪いHAp中でも同様に可能であり、従来の加熱法よりも短時間で同様のポリマーが得られることが分かった。多孔性HAp中でIn-situ重合することにより得られた生分解性高分子/HAp複合体は人工骨材料として利用するのに十分な強度を有し、その強度は高分子の種類、また共重合によって、制御できることが分かった。また、その生分解性も高分子の組成により、調整できることが分かった。平成23年度は、ポリ乳酸、ポリε-カプロラクトン、ポリω-ペンタデカラクトン(PLLA、PGA、PCL、PDDL)を多孔質HApの気孔中で重合し、色々な部位に使用可能な人工骨材料が高分子の種類、また共重合組成を変えることによって得られることを明らかにした。さらに、複合材料を体内に埋入した後、生分解性高分子が分解していく過程で細胞の侵入が可能になるように、細胞のサイズに見合った気孔を有する多孔性のバイオセラミックスの作製を検討した。繊維状HApとDNAを混合焼成することで、ポアサイズを制御した多孔性バイオセラミックスが得られた。DNAがリン酸源としても働くため、HApとβ-TCPを含む二相性のバイオセラミックスとなり、DNAの量を制御することによって、二相比も自在に変えられることが明らかとなった。HApとβ-TCPは強度や生体吸収性が異なるため、これを用いて種々の生分解性高分子との複合化を図ることにより、望みの機械的特性、生分解特性を有するテーラーメイド材料の開発が可能となることが分かった。
川崎病発症機序の解明

川崎病は乳幼児が罹患する血管炎であり、その原因は未だ不明である。本研究は川崎病血管炎発症の機序を川崎病モデルマウスを用いて解明するものである。Candida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS)およびNod-1 LigandであるFK565を用いて川崎病類似血管炎を作成した。抗マウスIL-1βによりCAWS血管炎発症が抑制され、これまでの研究と併せてCAWS血管炎成立にはIL-1βとTNFが重要な役割を担うことが判明した。一方FK565による血管炎では、CAWS血管炎に比し冠動脈により強い血管炎が生じ、血清IL-1β濃度と血管炎重症度が相関していた。CAWS血管炎を組織学的、遺伝子発現プロファイリング、サイトカインプロファイリング、川崎病治療薬による抑制効果について解析を行い、川崎病と比較した。またCAWS血管炎発症にTNFが必須なものかをTNFノックアウトマウスを用いて検証した。CAWS血管炎における組織学的解析では、大動脈基部冠動脈に強い血管炎を認め、さらに頸動脈の大動脈分岐部、腎動脈分岐部に軽度の血管炎を認めた。川崎病治療薬(免疫グロブリン、TNFa受容体阻害薬、ステロイド、免疫抑制剤)はそれぞれ種々の程度にCAWS血管炎を抑制した。特にTNFa受容体阻害剤によるCAWS血管炎の抑制が著名であった。さらに、TNFノックアウトマウスにおいてCAWS血管炎は惹起されなかった。また、遺伝子発現プロファイリングでは、自然免疫とTNFパスウェイに関する遺伝子の動きが著名で、川崎病初期における遺伝子発現プロファイリングと共通点を認めた。さらに、サイトカインプロファイリングではIL-6を中心とする炎症性サイトカインの上昇を認め、川崎病における結果との類似性を認めた。以上からCAWS血管炎と川崎病血管炎は若干の組織学的相違点はあるものの類似性は高く、CAWS血管炎を解析することで、川崎病血管炎の発症機序を解明する手がかりがつかめる可能性があると考えられた。またTNFがCAWS血管炎の発症の中心的役割を果たしていることが強く疑われた。Candida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS)により惹起される川崎病類似の血管炎は、Tumor necrosis factor alpha (TNF)ノックアウトマウスには惹起されないことをIn vivoの動物実験にて確認した。マウス培養脾細胞を用いたIn Vitroの実験において、CAWSがNF kappa Bを活性化することを確認し、またその活性化はTNF受容体阻害剤により抑制されることを確認した。さらにTNFノックアウトマウスの日細胞においてはCAWSによりNF kappa Bが活性化されないことも確認された。さらに他の自然免疫によるCAWS血管炎の発症機序を確認するために、抗IL-1 beta抗体を用いて、IL-1betaのシグナルを遮断した。抗IL-1 beta抗体は容量依存的にCAWS血管炎の発症を抑制することを確認した。この結果、CAWS血管炎が成立するためには、まず最初にIL-1 betaが活性化され、TNF alphaを介してNF kappa Bを活性化する経路が必要であることが判明した。共同研究者の小川の定年退職と研究補助員の辞職に伴う仕事量の増加のためCandida Albicans Water Soluble Fraction (CAWS)のマウス腹腔内注射により惹起させるにより生じる川崎病類似血管炎はTNF受容体を阻害することで血管炎が抑制されることを証明していたが、TNFノックアウトマウスにおいても血管炎が抑制されることを確認した。以上からTNFパスウェイがCAWS血管炎形成には必須であることが証明された。一方、CAWS血管炎は抗IL-1β抗体およびIL-1β受容体阻害剤によっても抑制されることが判明した。このため、CAWS血管炎が惹起されるためにはIL-1βからTNFに至るパスウェイが必要であること、つまり自然免疫が血管炎発生に深くかかわることが証明された。さらに、自然免疫に関わるNod-1リガンドにより川崎病類似血管炎が生じることが発表されており、CAWS血管炎とNod-1リガンドにより生じる血管炎のフェノタイプを比較した。CAWS血管炎は主に大動脈起始部を中心に冠動脈を含む血管炎像を呈していたが、Nod-1リガンドによる血管炎は両側冠動脈により強く発現していた。さらに、血漿中のサイトカインプロファイリングでは、CAWS血管炎はIL-6, IL-13, G-CSF, IFN-γ, TNF-αが有意に上昇しているのに対して、Nod-1リガンドによる血管炎では、IL-1α, IL-1β, IL-5、RANTESが有意に上昇していた。CAWSおよびNod-1リガンドは自然免疫の異常を通じて血管炎を惹起するが、活性化するシグナルによりサイトカインプロファイリングおよび血管炎の特異的部位が異なることが示された。

TNFノックアウトマウスにおけるCAWS血管炎作成の確立までに時間がかかったため。また、TNFノックアウトマウスが予想したようには増えてくれず、実験に供給される頭数の確保に時間がかかったため。CAWS血管炎の発症にはIL-1 betaからTNF alphaに至るパスウェイが必須であることが判明した。同様な血管炎発症機序が川崎病でも起こっているのかを確認する。川崎病患者において、IL-1 betaが活性化されていることを確認する。また、急性期の川崎病患者血清を培養血管内皮細胞に作用させ、惹起される反応が、抗IL-1 beta抗体や抗TNF alpha阻害薬により抑制されるかを確認する。今後新たな川崎病急性期治療薬として、抗IL-1 betaの可能性を探る。小児循環器CAWS血管炎にはTNFパスウェイが必須であることをVitroで証明する。マウスの脾臓を培養し、CAWSによりTNFが誘導されNFκBが賦活されること、その反応がTNF受容体阻害剤にて抑制されること。またTNFノックアウトマウスではCAWSによるTNFの誘導やNFκBの賦活が起こらないことを確認する。共同研究者の定年退職と研究補助員の辞職に伴い、研究計画の進捗が遅れ、消耗品の購入が遅れてしまった。必要な消耗品が4万円程度であるため、次年度に購入することとした。来年度は新しい研究補助員が補充され、研究は推進される。消耗品購入にあてる
翻訳伸長初期における新規翻訳精度維持機構の提唱

バクテリア翻訳系では、翻訳伸長初期段階において、合成中のペプチドがtRNAに結合した状態でリボソームから脱離する現象(drop off)が恒常的に起きている。既存の実験手法ではペプチジルtRNAのペプチド部分を同定することが難しく、そのメカニズムは未だ明らかになっていない。本研究では、質量分析法によってrRNA変異体やtRNA修飾変異体の細胞内ペプチジルtRNAを定性的・定量的に解析を行い、drop offに関わるrRNAやtRNA分子の構造的要素を特定した。その結果、これまで知られていなかったRNA分子の機能を見出すことができ、翻訳過程について新たな知見を提示できたと考えている。本研究では、質量分析法とRNA単離法といった新しい技術を駆使し、タンパク質合成途中でリボソームから脱離(drop off)したペプチジルtRNAの細胞内プロファイリングやキャラクタリゼーションによって得られる知見を基にdrop offに関わるタンパク質・RNA分子構造を特定し、その機能を明らかにする。また、drop offが翻訳精度・効率に与える影響を検証し、新しい遺伝子発現調節機構の提唱を目的としている。平成25年度では、drop offに影響を与えるRNA分子として23S rRNAのペプチド脱出トンネルと16S rRNAの遺伝暗号解読中心を構成する塩基に着目し変異を導入したところ、23Sについては3つ16Sについては8つの変異体についてdrop offの誘発がみられた。このことから、翻訳初期においてぺプチジルtRNAはこれらのrRNA塩基と相互作用しリボソームに留まっていると考えられる。また、tRNA側の影響として修飾塩基に注目し、修飾塩基合成酵素欠損株を用いてdrop offの影響を調べた。合成酵素が既知である30種類の修飾塩基について調べた結果、アンチコドン領域の修飾では2つ、tRNAの3次構造形成に関わる領域に3つのdrop offを誘発する変異体を獲得することができた。今後はこれらの変異体に対して亢進しているぺプチジルtRNAを詳細に調べるとともにレポーター遺伝子を用いてその傾向を捉える予定である。翻訳因子についてはリボソームリサイクル因子であるRRFとそれに関連するEF-Gについて着目した。両因子とも必須遺伝子であるためこれらの温度感受性株を作成し、ぺプチジルtRNAを代謝するPTHの温度感受性形質をそれぞれ導入することに成功した。今後はこれらの株を用いてRRF、EF-G機能抑制下でのdrop offぺプチジルtRNAを解析する予定である。本研究では,質量分析法とRNA単離法といった新しい技術を駆使し,翻訳途中でリボソームから脱離(drop off)したpep-tRNAを詳細に解析することでdrop offに影響する因子を特定し,その機能を明らかにすることを目的とし,そこから得られた知見を元に新しい遺伝子発現制御機構の提唱を目指している.平成26年度は25年度に得られたrRNAとtRNA修飾塩基についてのdrop off変異株における細胞内pep-tRNAの詳細な解析とin vitro系によるtRNA-リボソーム相互作用の評価を行った結果,drop off表現型が亢進したrRNA変異体については野生型rRNA株と比べてdrop off産物pep-tRNAが細胞内で著しく蓄積していることやtRNAの相互作用が低下していることが判明し,これらの塩基はtRNAとリボソームA,P部位が安定的に相互作用するのに機能していることが示唆された.また,drop offを抑制したrRNA変異体についてはその逆の結果が得られたことから,E部位上のこの塩基にはtRNA-リボソーム相互作用を不安定にすることでいち早くtRNAをリボソームから放出する役割があることが示唆された.tRNA修飾塩基欠損体については,3つの3次構造形成に関わる修飾塩基に注目しそれらの各修飾遺伝子の二重,三重欠損株においてdrop off表現型が著しく亢進し,これらの修飾のdrop offにおける冗長性が示唆された.三重欠損株について細胞内のdrop off pep-tRNAを単離し詳細に解析したところ,本来修飾塩基を持つtRNA特異的にpep-tRNAの増加が確認された.このことから,これらの修飾塩基がdrop offの防止に寄与していることが示唆された.このように,本研究では,pep-tRNA drop offという観点で解析を進めた結果,これまで知られていなかったRNA分子の機能を見出すことができ,翻訳過程について新たな知見を提示できたと考えている.分子生物学細胞内drop offぺプチジルtRNAを観察するためにはぺプチジルtRNA代謝酵素である必須遺伝子PTHを抑制する必要がある。当初の計画では平成25年度にRRF、EF-Gがdrop offにどのように作用しているかについての解析を完結する予定であったが、両因子とも必須遺伝子であり、その温度感受性株の作成から行う必要があった。更にPTHの温度感受性形質も導入する必要があったため、作成過程において株の生育能が非常に悪いものとなり各過程の条件検討に長時間有したが、現在はプラスミドによる形質転換など基本的な解析が行える目的株を得ることが出来ている。rRNA

塩基の解析については当初予定していた変異導入可能な塩基ほぼ全てについて変異体を獲得しており、温度感受性能については解析済みである。tRNA修飾塩基については、非必須遺伝子として報告されている全てのtRNA修飾塩基合成酵素についてその欠損株にPTH温度感受性形質を導入した株を獲得し、その温度感受性能の解析は終了し、影響が出たものについては相補実験を進めている。本研究でdrop offに影響がみられたrRNA塩基、tRNA修飾塩基についてはこれまで特に表現型が報告されておらずそれらの機能を解明する初めての知見となることが期待できる。また、平成26年度に予定した翻訳精度・効率の観察使用する複数のエピトープタグを持つレポーター遺伝子発現系や出だしを様々な配列にしたレポーター遺伝子発現系セットを構築済みであり、これらを作成した株に導入しぺプチジルtRNAを観察することでdrop offの詳細なメカニズムを検証する予定である。平成26年度は平成25年度に得られたdrop off変異株を用いて、tRNA種ごとにぺプチジルtRNAを単離し解析を行いぺプチド部分が3残基以上のぺプチジルtRNAについての詳細な解析や、drop offが起きるコドンや出だしの配列を変えたレポーター遺伝子を各変異株内で発現させレポーター遺伝子由来のぺプチジルtRNAを解析することで各変異rRNAや修飾塩基を欠いたtRNAがもたらすdrop offペプチジルtRNAに与える影響について検証していく予定である。また、各変異株内でエピトープタグや配列特異的プロテアーゼサイトを導入したレポーター遺伝子を発現させ解析することで、翻訳の最終産物でタンパク質の合成量や合成精度に与える影響についても検証していく。翻訳因子については、平成25年度に目的の株を得ることが出来たので、平成26年度ではRRF、EF-Gの各因子を抑制した際に翻訳初期段階のぺプチジルtRNAがどの程度リボソームから脱離しているのかあるいはリボソーム内に留まっているのかなど、それらがどのような振る舞いをしているのかについて検証を進めていく予定である。