hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高強度マグネシウム合金のミクロ組織安定性と強度改善

Mg-AlおよびMg-Zn二元系では組織安定性が低いため,Mg-Al-CaおよびMg-Y-Zn三元系においてクリープ試験を行い,そのクリープ強度と組織安定性を評価した.上記合金をダイキャストおよびチクソモールディング法で実現される冷却速度で作成すると,粒界内部に大量の欠陥を有する共晶化合物が連続的に晶出した特異な組織を持つ.この合金に高温での熱処理を施すと,粒界上の晶出物は最終安定形状を持つ球状Al_2Caへと変化する.しかしながら両者にクリープ試験を施すと熱的には安定な球状Al_2Caは強度にほとんど寄与せず,熱的にはむしろ不安定な,連続的な粒界第二相を持つ組織を持つ試料が100倍以上高い強度を示した.連続した粒界第二相は粒内の転位運動を拘束し,高強度を実現すると考えられる.Mg-Al二元合金でも粒界を連続的に被覆する晶出物は得られるが,この晶出物はAlの拡散を促進させるために強度を低下させる方向に働く.従ってAlとCaの同時添加により,粒界を連続的に被覆し,かつ高速拡散パスを作らないミクロ組織を導入することが可能となる.MgにYとZnを同時添加すると粒内に大量の積層欠陥が導入され,更に積層欠陥部分にYとZnが偏析することで積層欠陥が高温下で安定化する.この条件でクリープ試験を行うと,積層欠陥が転位運動の障害物となるだけではなく,一次すべり面での転位の拡張幅を著しく上昇させるために,元々変形の異方性の大きなMgにおいて転位の運動が効果的に抑制され,高い強度を示す.従ってYとZnの同時添加により,積層欠陥という転位運動に対しての第二相に準ずる障害物を導入するだけでなく,母相の物理定数を変化させ基底強度の上昇が実現可能となる.Mgに希土類元素を添加するとその機械的性質は著しく向上し,特にY(イットリウム)は大きな強度改善効果をもち,実用耐熱マグネシウム合金に必須の元素である.多くのMg-Y基合金には分散強化を狙って析出物が含まれているが,クリープ条件下では時間経過と共に析出物の粗大化が生じ,材料弱化の原因となる.本年度はMg-Y合金の析出物の熱的安定性と,それらの析出物がクリープ挙動に与える影響を調査した.(1)Mg-Y合金の強化相の一つである準安定相β'は,粒内に転位や双晶界面が存在する場合,それらを核生成サイトとして速やかに析出する.そのため,あらかじめ予クリープを施した試料に時効処理を行うと,静的時効では析出が生じないような条件下でも粒内に多数の析出物が導入される.そのため,予変形と時効処理の組み合わせで,短時間の熱処理で微細なβ'相粒内に分散することが可能となる.(2)(1)の方法で粒内を強化した材料をクリープ試験に供すると,変形のごく初期から非常に低いひずみ速度が得られ,5%クリープひずみに達する時間は過飽和固溶体をそのまま試験に供した場合の約10倍となる.しかしながら得られる最小ひずみ速度は,過飽和固溶体をそのまま試験に供した場合とほぼ同等であった.(3)高濃度のYを含むMg-Y合金のクリープ中には転位上への動的析出と,析出物の粗大化が同時に進行する.析出過程は変形のごく早い段階で終了し,変形後半はそれらの析出物の粗大化が弱化の要因となる.Mg-Y合金系の準安定相β'の熱的不安定性は本質的なものであり,これらを制御することで破断までのクリープ寿命そのものを画期的に改善することは難しいが,実用上重要な遷移域のクリープ挙動は初期の粒内の強度に大きく依存する.予変形と熱処理の組み合わせで微細なβ'相を効率的に導入することが可能となる.Mg-AlおよびMg-Zn二元系では組織安定性が低いため,Mg-Al-CaおよびMg-Y-Zn三元系においてクリープ試験を行い,そのクリープ強度と組織安定性を評価した.上記合金をダイキャストおよびチクソモールディング法で実現される冷却速度で作成すると,粒界内部に大量の欠陥を有する共晶化合物が連続的に晶出した特異な組織を持つ.この合金に高温での熱処理を施すと,粒界上の晶出物は最終安定形状を持つ球状Al_2Caへと変化する.しかしながら両者にクリープ試験を施すと熱的には安定な球状Al_2Caは強度にほとんど寄与せず,熱的にはむしろ不安定な,連続的な粒界第二相を持つ組織を持つ試料が100倍以上高い強度を示した.連続した粒界第二相は粒内の転位運動を拘束し,高強度を実現すると考えられる.Mg-Al二元合金でも粒界を連続的に被覆する晶出物は得られるが,この晶出物はAlの拡散を促進させるために強度を低下させる方向に働く.従ってAlとCaの同時添加により,粒界を連続的に被覆し,かつ高速拡散パスを作らないミクロ組織を導入することが可能となる.MgにYとZnを同時添加すると粒内に大量の積層欠陥が導入され,更に積層欠陥部分にYとZnが偏析することで積層欠陥が高温下で安定化する.

この条件でクリープ試験を行うと,積層欠陥が転位運動の障害物となるだけではなく,一次すべり面での転位の拡張幅を著しく上昇させるために,元々変形の異方性の大きなMgにおいて転位の運動が効果的に抑制され,高い強度を示す.従ってYとZnの同時添加により,積層欠陥という転位運動に対しての第二相に準ずる障害物を導入するだけでなく,母相の物理定数を変化させ基底強度の上昇が実現可能となる.
多能性幹細胞からの中胚葉誘導マスター因子の同定と、選択的心臓中胚葉誘導法の確立

多能性幹細胞から心筋細胞を誘導するためには、複数の液性因子を使用し、心臓中胚葉を誘導してから心筋に分化させる方法が一般的である。しかし、この方法には1)誘導の工程が煩雑、2)誘導効率が不安定、3)液性因子が高価であるという課題がある。心臓中胚葉誘導の分子機構や心臓中胚葉誘導因子は同定されておらず、この機構を解明し誘導因子を同定することで、因子発現のみで多能性幹細胞から選択的に心臓中胚葉細胞の誘導が可能になりうると考えた。ダイレクトリプログラミングを応用したスクリーニングにより線維芽細胞から心臓中胚葉細胞を直接誘導する遺伝子Tbx6を発見し、Tbx6をマウスES細胞・ヒトiPS細胞といった多能性幹細胞に導入することにより、液性因子を使用せずに心臓中胚葉細胞を誘導できることを発見した。さらにTbx6の発現期間を調整することで、同じく中胚葉から分化する骨格筋や軟骨細胞も誘導が可能であることを見出した。発現期間の変化による分化制御機構の解明のため、我々は沿軸中胚葉発生に関与し、かつ心臓中胚葉以降の心血管系分化を阻害するシグナルであるWnt3と、その下流の因子であるMsx1, Cdx2の遺伝子発現を解析した。その結果、一過性のTbx6発現と比較し、Tbx6の持続的な発現によりWnt3の発現が誘導され、その後にMsx1, Cdx2の発現が誘導されていることが明らかとなった。このMsx1, Cdx2を3日間のTbx6発現により分化させた心臓中胚葉細胞に過剰発現させたところ、心筋誘導が著明に抑制され、Tbx6の持続発現によるWnt3, Msx1, Cdx2発現の誘導が、心血管系への分化を阻害する機序の一部分を担うことが判明した。目標としていた多能性幹細胞からの選択的な中胚葉細胞誘導に成功し、その機序を解明することが出来た。ここまでの実験結果を論文として投稿し、Cell Stem Cell誌に掲載された。本研究で判明したTbx6遺伝子の心筋再生における機序の更なる解明を検討していく。当初の予定より研究が進行しており、次年度以降の解析に研究費を使用し、大規模な遺伝子解析などの予定を検討しているため。
アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営

本研究は、制度と国際経営に関して、アジアフロンティア地域であるカンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、ベトナム(CLMVT)、および中国を中心として研究したものである。具体的には、制度とは何か、地域統合としてAFTA(アセアン自由貿易地域),地域協力としてのGMS(大メコン圏開発),CLMVTの企業経営環境、および制度としてのアジアフロンティア地域の会社法とコーポレートガバナンス、労働関連法と人的資源管理、外資法と外資政策、などについて研究した。「アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営」に関して、3つのアプローチにより研究する。(1)アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営に関する理論的研究である。アジア太平洋のフロンティア地域として、ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、中国などを重点的に取り上げる。国際経営の理論的視点として、国際比較経営、特に制度分析の視点を重視した理論的研究を行う。すなわち、特に国際経営環境としての各国の制度、経済制度、政治制度、法制度、外資制度、企業制度、コーポレートガバナンス制度、人的資源管理制度などの研究を行う。さらに、日本企業のアジア太平洋フロンティア地域への企業戦略について、理論的研究を行う。(2)アジア太平洋のフロンティア地域の現地調査である。アジア太平洋のフロンティア地域として、ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、インドネシア、マレーシアなどの東南アジア諸国、中国などを取り上げる。各国での日系企業、現地企業、現地機関を中心とした聞き取り調査、資料収集を実施し、国際比較経営の視点で分析する。(3)アジア太平洋のフロンティア諸国の地域研究の視点での研究である。アジア太平洋地域での最新の政治、国際関係、経済、人的資源、社会、文化などの視点で各国の分析を行う。さらに、アジア太平洋のフロンティア地域での地域連携、貿易関係、投資関係などについても研究する。「アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営」の研究課題について、3つのアプローチにより研究した。第1は、アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営に関する理論研究である。平成18年度は、アジア太平洋のフロンティア地域として、特にベトナムと中国を重点的に研究した。ベトナムと中国の国際経営に関して、経営環境や制度といった外部的要因をも考慮して研究した。すなわち、企業経営環境としての政治・経済・産業政策・社会・文化などであり、また内部要因としては企業内の経営管理システムである。これらの要因を基に経営管理と戦略について理論研究を通して国際比較経営の視点から理論的に考察した。環境要因として経済、人口問題、貧困問題、教育制度、雇用構造、文化、社会の解明であり、また内部要因としての企業内の経営管理と戦略の解明である。第2は、アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営に関する現地調査である。平成18年度は、アジア太平洋のフロンティア地域として、ベトナムと中国を重点的に調査した。研究の方法としては、ベトナムや中国において活動している日系企業、現地系企業に対して聞き取り調査、現地工場での参与観察を行い、国際比較経営の視点から研究した。これらの調査結果から、日系企業や現地企業の人的資源管理、経営戦略などを実証的、理論的に比較分析した。第3は、アジア太平洋のフロンティア諸国の地域研究によるアプローチである。ベトナムや中国は、近年海外からの直接投資が増大し、現在、国際的に認められた魅力溢れる国という評価を得ている。しかし、政治・経済・社会では問題点もまだ多い。本研究では、地域研究の視点から、理論的・実証的にベトナムや中国を解明した。本年度は、アジア太平洋のフロンティア地域としてのベトナムと中国の国際経営に関する研究を重点的に行った。平成19年度は、アジア太平洋のフロンティア地域として、特にベトナム、カンボジア、ラオスのインドシナ3国を重点的に研究した。ベトナム、カンボジア、ラオスの国際経営に関して、経営環境や制度といった外部的要因をも考慮して研究した。研究の方法としては、ベトナム、カンボジア、ラオスにおいて活動している日系企業、現地系企業に対して聞き取り調査、現地工場での参与観察を行い、国際比較経営の視点から研究した。平成18年度は、アジア太平洋のフロンティア地域として、特にベトナム、カンボジア、ラオスを重点的に研究した。

ベトナム、カンボジア、ラオスのインドシナ3国は、近年海外からの直接投資が増大し、現在、国際的に認められた魅力溢れる国という評価を得ている。しかし、政治・経済・社会では問題点もまだ多い。本研究では、地域研究の視点から、理論的・実証的にベトナム、カンボジア、ラオスを解明した。本年度は、アジア太平洋のフロンティア地域としてのベトナム、カンボジア、ラオスの国際経営に関する研究を重点的に行った。「アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営」について、3つのアプローチにより研究した。第1は、アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営に関する理論的研究である。平成20年度は、アジア太平洋のフロンティア地域として、特にベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマー、およびタイと中国を重点的に研究した。ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、中国の国際経営に関して、制度分析の視点から考察した。すなわち、制度としての法律、特に企業法、外国投資法、労働法を重点的に研究した。さらに、企業法・外国投資法とコーポレートガバナンス、労働法と人的資源管理について、国際比較経営、制度分析の視点から理論的に考察した。第2は、アシア太平洋のフロンティア地域の国際経営に関する現地調査である。平成20年度は、アシア太平洋のフロンティア地域として、ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマーを重点的に調査した。研究の方法としては、ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマーにおいて活動している日系企業、現地系企業、および現地機関に対して主に聞き取り調査を行い、国際比較経営の視点から研究した。これらの調査結果から、日系企業や現地企業の人的資源管理、コーポレートガバナンス、経営戦略などを実証的、理論的に比較分析した。第3は、アシア太平洋のフロンティア諸国の地域研究によるアプローチである。平成20年度は、アシア太平洋のフロンティア地域として、特にベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマーを重点的に研究した。ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマーのインドシナ4国は、近年直接投資国としそ注目されており、地域研究の視点から最新情勢を分析した。本年度は、研究の総括として、「アジア太平洋のフロンティア地域の国際経営」に関して、制度理論研究、およびカンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、ベトナム(CLMVT)、中国を中心として研究した。その成果として、単著『アジアフロンティア地域の制度と国際経営』(文眞堂)を出版した。
葉の形態形成における遺伝子発現制御ダイナミクス

Athb1はアラビドプシスのホメオドメイン蛋白質に属する転写因子である。これまでの研究により、構成的に強い転写促進能を有する改変Athb1(Athb1-VP16)を発現する形質転換タバコ株では、1)葉の柵状組織の形成が阻害される、2)暗所で発芽させた場合にも葉の展開が起こるなど、葉に特異的な形態的変化が観察されている。このAthb1-VP16にヒトのグルココルチコイドレセプター(GR)のレセプタードメインをつないだ改変転写因子(Athb1-VP16-GR)を形質転換タバコ内で発現させることによって、上記の形態的変化がグルココルチコイドの投与によって誘導される系(GR誘導系)が開発された。このGR誘導系を利用し、まず上記の形態的変化の人為的な誘導を植物形態形成上の様々な段階で行うことによって、それらが生じる原因が詳しく解析された。その結果、Athb1-DNA結合ドメインを持つ改変転写因子は葉のL2細胞の柵状組織細胞への分化を阻害することがわかった。つぎに、Athb1-DNA結合ドメインの標的遺伝子を同定するため、Athb1-VP16-GR遺伝子を導入したタバコ培養細胞BY-2株を確立した。この培養細胞を蛋白合成の阻害剤で処理した後、グルココルチコイド処理及び無処理のものに分けてmRNAが抽出された。GR誘導系においては蛋白質合成の阻害剤を併用することにより、Athb1-VP16-GRにより誘導された遺伝子産物がもたらす二次的な転写誘導を除外することができる。それぞれのmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、それらをディファンシャル・ディスプレイ法を用いて比較した結果、グルココルチコイド処理した検体に特異的なcDNA断片が多数見出された。これらcDNAの塩基配列を決定し、Athb1-DNA結合ドメインの標的遺伝子を同定することは葉の形態形成に関わる遺伝子発現の制御を理解する上で有用であると期待される。
血管吻合部における内膜肥厚発生機序と予防に関する実験的・臨床的研究

バイパス手術などの血行再建の遠隔成積を不良とする晩期閉塞の原因の一つとしてある血管吻合部における内膜肥厚の発生機序を探るとともに、これを防止するために要求される人工血管と宿主動脈との間の物性的適合性、縫合方法、材料、血液とくに血小板凝集と薬剤による肥厚防止効果について雑種成犬への人工血管移植実験と臨床例における晩期閉塞例の分析を行った。下記の結果を得た。1.物性の異なる小口径人工血管を犬頸動脈へのべ30本移植して長期間に渡って吻合部を観察し、遠隔開存率と比較した。柔軟性に乏しい人工血管では移植中期に吻合部内膜肥厚により閉塞したが、柔軟な人工血管では一年以上、肥厚を来さず良好な開存を示す例も認められ、物性の違いが肥厚発生の一因と考えられた。2.物性が近似で表面構造の異なる人工血管の移植実験では多孔構造のものが良好な開存成積を示し、同時に行った血小板シンチによる人工血管表面に附着する血小板の検索でも、開存率、内膜肥厚の程度と血小板沈着特性の間に関連性が見い出された。吻合部内膜肥厚の要因として血小板沈着の程度が推測された。3.縫合材料、縫合方法の検討では縫合糸による従来の吻合法よりレ-ザ-吻合がより吻合部における治癒は良好であり、肥厚も認められなかった。吻合部における内膜傷を減じ、円滑な血管治癒を得られる吻合法は内膜肥厚を防止する一手段として有効であることが示唆された。4.臨床例の分析では使用人工血管,血流状態の違いによって内膜肥厚発生の頻度は異なり、抗血小板製剤の投与によって肥厚の発生、進展はある程度抑制される傾向は認められるものの、完全に防止するには至らなかった。吻合部内膜肥厚の発生機序については以上の研究よりかなり明らかとなったが、今後、防止策につき更に検討を要する。下記の結果を得た。人工血管移植による血行再建手術術後遠隔期における人工血管閉塞の最も大きな原因となっている血管吻合部における内膜肥厚(anastomotic neointimal hyperplasia:ANH)の発生機序を解明し、その予防法を確立するために実験的・臨床的検討を行った。実験として雑種成犬20頭の頚動脈にComplianceが低く、ANHを発生し易いとされるEPTFE人工血管(5cm長)を移植するとともに生体血管とほぼ同様の物性をもつ新たに開発された柔軟なsegmented polyurethane人工血管を対照とし移植、吻合部におけるANHの発生を経時的に観察した。移植後3ヵ月の時点においてEPTFEの吻合部ではANHが40%に認められ、いずれも吻合部より35mmの宿主側を中心とした肥厚であった。plyurethane人工血管ではANHの発生頻度はEPTFEと比較して低値(12%)であったが、同様に宿主動脈側の肥厚として認められた。このことから、ANHの発生要因として従来、推測されていたcomplianceの違いはANH発生とは直接的に結びつかないことが結論付けられた。次に血管吻合部に附着する血小板がANHの発生に関与する可能性を探るために人工血管および吻合部における移植早期の血小板動態をインジウム血小板シンチを用いて検索した。雑種成犬に同様にEPTFE、polyurethane人工血管を移植し、48時間の時点でラベルした血小板を注入、人工血管表面と吻合部への集積をカウントした。

polyurethaneはEPTFEに比較し、約2倍の集積を示したが、ANHの発生頻度は低く、人工血管表面に集積、凝集した血小板の多少によりANHが影響をうける可能性は低いものと推測された。今後血小板由来成長因子がANH発生に如何に関与しているかを検討すべく検討中である。代用血管を用いた血行再建の遠隔成積を不良とする晩期閉塞の原因に吻合部内膜肥厚があるが、この発生機序を解明して予防法を確立するために犬の頸動脈に小口径人工血管を移植し、様々な条件下に内膜肥厚の発生様式を観察するとともに、人工血管の移植を行った。臨床例を対象に長期開存成積と内膜肥厚との関連性について分析した。本年度は下記の研究結果を得た。1.物性が近似で表面構造の異なる人工血管の移植実験では多孔構造のものが良好な開存成積を示し、吻合部内膜肥厚も軽度であった。同時に行った血小板シンチによる人工血管表面に附着する血小板の検索で、血小板集積の少ない人工血管は開存率、内膜肥厚抑制共良好であり、肥厚発生の一因として人工血管の構造によって規定される抗血栓性、即ち血小板集積程度の関与が示唆された。2.縫合材料,縫合方法による吻合部組織治癒と内膜肥厚との関連性を検討するため、従来法による吻合とレ-ザ-吻合との比較を行った。レ-ザ-吻合では吻合部創治癒は良好で早期に内、中膜の円滑な治癒が認められ、縫合操作による宿主動脈の内皮細胞損傷を少なくして内膜肥厚を防止する方法として有効である可能性が推測された。3.臨床例の分析では内膜肥厚の発生要因として使用人工血管,血流状態の違いなどが考えられた。肥厚防止の薬物療法として抗血小板剤の効果の検討では、抗血小板剤の投与によって内膜肥厚はある程度抑制される傾向はあるが、完全には抑制し得なかった。4.吻合部内膜肥厚は生体と移植人工血管との間の相互作用の結果発生し、人工血管の特性、吻合法による宿主動脈内皮細胞障害、血小板集積、などが要因として考えられた。
アファディンとネクチンによるシナプス形成過程の分子機構

シナプスの正常な発達と機能的成熟は、学習や記憶に代表される高次脳機能の発現の基盤であり、その破綻は様々な精神・神経疾患を誘発することから、その分子機構を理解することは重要である。興奮性シナプスは非対称な接着構造であり、その形成過程には様々な接着分子が重要であることが明らかにされている。本研究では接着の裏打ちをになうタンパク質アファディンを欠損したマウスの神経細胞を調べることで、アファディンが接着構造のみならず、広範なシナプスの形態と機能を制御していることを明らかにした。この結果は学習や記憶の新しいしくみを理解し、種々の精神・神経疾患の治療法の開発戦略をたてるために役立つと期待される。平成25年度は、培養海馬分散神経細胞におけるアファディンのシナプス形成への役割を示し、この結果の一部を論文発表した。さらに、これまでに所属研究室で、アファディンやネクチンに結合することが示されている複数の分子に対する免疫染色を実施した。この結果、上皮細胞においてはアファディンとアドヘレンスジャンクションで共局在する分子においても、神経細胞のシナプス近傍では共局在する場合としない場合があることが明らかになった。これをさらに詳しく調べるため、培養系にTTXを添加して特定の神経細胞の近傍に巨大かつ、プンクタアドヘレンティアとシナプス結合が分離したシナプスが生じる実験系を、文献を参考に確立することが出来た。現在、これらについての解析を継続中である。また、アファディン特異的抗体カラムを作製し、脳から生化学的にアファディン複合体を精製した。具体的には、ロングフォームのアファディンを特異的に認識する抗体カラム、ロング・ショート両フォームを認識する抗体カラム、さらにはコントロールIgGカラムより調整した免疫沈降産物との比較質量分析法を行うことにより、特異的結合分子の網羅的同定を試みた。その結果、少なくとも数十種類の分子群が同定された。これらのうち数種類について、特異的抗体とcDNAを用いたin vivo, in vitroの結合確認実験を行い、ポジティブな結果を得ている。1つの分子については、新たに抗体を作製し、ノックアウトマウスの作成にも着手した。現在引き続き解析中である。また、既知のシナプスオーガナイザーを用いた非神経細胞と神経細胞間の人工シナプス再構成実験を行ったところ、分子種によってアファディンの関与が異なることが明らかになり、これについても解析を継続中である。平成26年度は、当初の計画通り、シナプス形成、形態の成熟過程およびグルタミン酸受容体の集積という機能的側面を、アファディン欠損マウスより確立した海馬分散培養系にTTXを添加して誘導した顆粒細胞ーCA3錐体細胞間の巨大シナプスおよびスライス培養系におけるそれをモデル系として解析した。その結果、予想通り、アファディン欠損マウスの巨大シナプスにおいて、シナプス電流の有為な低下を認め、シナプス前部の異常とともに、グルタミン酸受容体集積も阻害されているという予備的な結果を得た。これをさらに詳しく解析するために、直接シナプス後部のグルタミン酸受容体の数を算定するためのアンケージングレーザーを購入し、実験を開始している。また、各種シナプス分子、パンクタアドヘレンシアジャンクション集積分子の集積が阻害され、それが少なくともl-afadinの入れ戻しによって回復することを見いだした。関連して、脳におけるアファディンの2つの主たるスプライスバリアントであるl-afadinとs-afadinが、ネクチンや他の分子との結合能に大きな差異を示すことを見いだした。前年度に同定した、マウス脳膜分画におけるアファディンを核とする複合体内にも同様の性質を示す分子を複数見いだし、スプライスバリアントによる機能的多様性獲得メカニズムの比類ないモデルを得ることが出来た。現在、スプライスバリアントの生成メカニズムおよび機能的重要性について解析を始めており、本研究課題の遂行により、論文としての成果に加えて、新しい研究分野を開拓することが出来た。神経細胞生物学本研究の提案時点でまとまりつつあった、神経特異的ノックアウトマウスを用いたアファディンのシナプス形成における役割に関する研究の一部を、論文という形で発表出来た。また、上記結果を発展させるべく所属研究室で発見されていたアファディン結合分子のシナプスにおける局在の解析を行った結果、上皮細胞と神経細胞では、アファディンを核とする超分子複合体の分子構成が異なっている可能性を見いだし、より詳細に接着構造を解析することが出来る系の確立にも成功した。さらに、マウス脳における新規のアファディン超分子複合体構成分子を多数見いだすことに成功した。また、直接的にシナプスオーガナイザーとの連関も、明らかにしつつある。これらの基礎的な知見をもとに、抗体やノックアウトマウスなど、機能に踏み込む研究を開始することが出来、これらは研究計画で想定していた通りの進展であり、研究はおおむね順調に進展しているということが出来る。

25年度までに得た知見をもとに、本年度はシナプス形成、形態の成熟過程およびグルタミン酸受容体の集積という、機能的側面とアファディン超分子複合体の連関を、分散培養系を用いて詳細に解析する。さらに、ノックアウトマウスの解析により、アファディン結合分子のin vivoにおける役割と、アファディンとの機能連関を明らかにすることを目標として研究を推進する。本年度の研究は予想以上に試行実験が順調に進行した為、必要経費が少なく済んだが、次年度以降、多くの支出が必要となる為、次年度使用額を生じることとなった。抗体の作製やノックアウトマウスの維持、また必要な試薬や培養用品などの購入に使用する。
コリアン・ディアスポラの生活戦略とアイデンティティに関する国際社会学的研究

本年は主に以下の3点において成果を挙げた。1.在日朝鮮人研究の新展開これまで蓄積してきた研究を、在日朝鮮人研究における新たな展開として位置づける作業を行った。在日朝鮮人のエスニシティの多様化に関する研究を第一の潮流、社会構築主義的な立場から民族本質主義を批判した研究を第二の潮流としたとき、筆者による研究は、在日朝鮮人個人によって語られる「民族」概念の分析や、在日朝鮮人をめぐるミクロなコミュニケーションのあり様に着目した第三の潮流に位置付けることができることが明らかになった。2.「ダブル」研究の再検討在日朝鮮人と日本人のあいだに生れたいわゆる「ダブル」のアイデンティティに関する問題を、新たに人種主義の文脈から再検討・再定位することを試みた。エスノセントリックな人種主義として姿をあらわす排外的なコミュニケーション様式を根本から否定する力を持つようなオルタナティヴが、加害と被害の一方に依拠できない立場にある「ダブル」や、その存在を目の当たりにしながら自らの歴史観の更新を迫られる在日朝鮮人をめぐるコミュニケーションから生まれる可能性について言及した。3.サハリン韓人青年へのき取り調査ロシア・サハリンにおいて、サハリン韓人青年に対する聞き取り調査を実施した結果、特に着目すべき点として、1コミュニティの存在が個人のエスニシティのあり方に与える影響、2「差別」の認識のされ方、3バックボーンがライフイベントや人生設計に及ぼす影響、4歴史認識に関する世代間の認識の違いへの言及、などが浮かび上がってきた。今後も継続的に調査を行いながら、個人のエスニシティ形成においてコミュニティが果たす役割や、ナショナル・アイデンティティの複層性、歴史性をめぐる世代間の相互作用のあり方を解明していく。(抄録なし)1本研究のキー・コンセプトである「ディアスポラ」という概念を用いることが、在日朝鮮人研究においていかに有用であるのかを、関連する先行研究の整理・検討を通して明らかにした。初期のディアスポラ論は、「ホームランド」の存在が、「変わっていく同じもの(changing same)の生きた記憶として再定義される伝統であり、むしろ「異種混淆化と相互混合の物語のなかのまとまりのない要素であって、その源泉が何であろうと、文化的で人種的な純粋性への欲望を必ず挫折させるもの」として捉えるものであった。この点で、ディアスポラ論は、「国家」や「民族」といった概念を分析の俎上に載せながら、なおかつカテゴリー化言説に対する批判的実践の理論となる可能性を有していると考えられる。2本年度は特に、「民族」とジェンダーの交点に存在する問題に焦点を当てた研究に力を注いだ。まず、二組の「国際結婚」カップルの語りから、歴史的断絶に伴う困難に直面しながらも、日常における民族実践-周囲の在日朝鮮人との民族的紐帯を維持し、祖父母との接触などを通して獲得した歴史性を継承することを目指す様子-を明らかにした。ただし、「継承」とはいっても、実際には、「国際結婚」家族を営んでいくうえでの葛藤を回避するための独自の「民族」観が構築されていた。また、渡韓した20代前半の在日朝鮮人2名の語りの分析を行った。両者による渡韓は、単に語学の習得や本国文化への接触を目的としたものではなかった。かれ/かのじょらにとっての「民族」は、民族差別と真っ向から闘う勇敢さや、特定の性役割を強いるような「家父長制的民族主義」として体験されており、それが「渡韓」の背景にあることが明らかになった。(1)サハリン韓人の生活と経験に関する調査...在日朝鮮人研究において得られた知見を生かし、より広くコリアン・ディアスポラに研究対象を拡大すべく、昨年度の文献調査に続き、本年度は実際にサハリンにおいて予備調査を行った。サハリンにおいては、サハリン韓人協会と老人会を訪れ、サハリンに渡航・定着するようになった経緯と、現在の生活に関する簡単な聞き取り調査を行った。この調査により、サハリン韓人のナショナル・アイデンティティもやはり、朝鮮民主主義人民共和国・大韓民国・日本・ロシアなどの各ネイションのはざまで複雑な様相を見せており、その意味では、朝鮮籍在日朝鮮人のナショナル・アイデンティティの複数性に着目した研究の成果を活かすことが可能であることを確認した。(2)新興の在日朝鮮人団体における参与観察調査...在日朝鮮人研究の新たな展開として、民族的紐帯の弱化に伴う共同性のあり方の変化を具体的に捉えるために、1991年に結成された「在日コリアンの集い」(仮名)における参与観察を実施した。2012年4月から1年間、定期的に行われる学習会に参加し、かれ・かのじょたちが「民族」あるいは「在日」といった概念をいかに理解し、その理解が会の運営や学習会の内容にいかなる影響を及ぼしているのかを観察した。特に興味深かったのは、たとえば、「いまどきの在日コリアン?-ありがちなイメージと私たちのリアル」という学習会タイトルからも分かるように、従来の運動団体とは異なり、メンバーの語りの宛先が主に日本人ではなく在日朝鮮人に向いており、在日朝鮮人という存在を紋切り型のイメージから捉えるのではなく、メンバーのエスニック・アイデンティティの複数性を明らかにしていくことに重点が置かれていた点である。

在日朝鮮人のエスニシティの多様化に関する研究を第一の潮流、社会構築主義的な立場から民族本質主義を批判した研究を第二の潮流としたとき、筆者による研究は、在日朝鮮人個人によって語られる「民族」概念の分析や、在日朝鮮人をめぐるミクロなコミュニケーションのあり様に着目した第三の潮流に位置付けることができることが明らかになった。2.「ダブル」研究の再検討在日朝鮮人と日本人のあいだに生れたいわゆる「ダブル」のアイデンティティに関する問題を、新たに人種主義の文脈から再検討・再定位することを試みた。エスノセントリックな人種主義として姿をあらわす排外的なコミュニケーション様式を根本から否定する力を持つようなオルタナティヴが、加害と被害の一方に依拠できない立場にある「ダブル」や、その存在を目の当たりにしながら自らの歴史観の更新を迫られる在日朝鮮人をめぐるコミュニケーションから生まれる可能性について言及した。3.サハリン韓人青年へのき取り調査ロシア・サハリンにおいて、サハリン韓人青年に対する聞き取り調査を実施した結果、特に着目すべき点として、1コミュニティの存在が個人のエスニシティのあり方に与える影響、2「差別」の認識のされ方、3バックボーンがライフイベントや人生設計に及ぼす影響、4歴史認識に関する世代間の認識の違いへの言及、などが浮かび上がってきた。今後も継続的に調査を行いながら、個人のエスニシティ形成においてコミュニティが果たす役割や、ナショナル・アイデンティティの複層性、歴史性をめぐる世代間の相互作用のあり方を解明していく。博士論文執筆のため、国内での朝鮮籍在日朝鮮人と、ローカル・アクティヴィズムに関する調査が予定よりもやや遅れている。ただし、執筆の過程で、渡韓した在日朝鮮人にとっての本国との接触の意味に関する概究と、ディアスポラ論の整理・検討に関して、予定よりも大幅に作業をすすめることができたので、来年度は遅れている調査に、より多くの時間を割くことができるだろう。昨年度、博士論文執筆のために停滞していた新興の在日朝鮮人運動と、サハリン韓人に関する調査・研究を大きく進展させることができた。その結果を本年度中に論文にまとめることはできなかったが、来年度はより本格的な調査を行いつつ、これまでに得られた調査の結果を整理し、論文執筆作業にとりかかることができるだろう。1本年度の研究の成果を論文にまとめ、雑誌に投稿する。2在日朝鮮人のエスニシティ研究の動向と問題点、今後の展望をまとめ、韓国の学会誌に論文を投稿する。3朝鮮籍在日朝鮮人のナショナル・アイデンティティ、および在日朝鮮人の地域活動に関する本格的な調査を行い、論文の準備を行う。4中国・延辺朝鮮族自治区に加え、計画にはなかったが新たにサハリンにおいて、現地に在住する朝鮮人のエスニシティに関する調査を行う。2日本・韓国における在日朝鮮人のエスニシティ研究の動向と問題点、今後の展望をまとめ、韓国の学会誌に論文を投稿する。3セルフヘルプを主たる目的とする新興の在日朝鮮人団体に関する本格的な調査を行い、論文を執筆する。4サハリン国立大学日本語学科・韓国語学科において、現地に在住するサハリン韓人青年のエスニシティに関する調査を行う。(抄録なし)
高精度RNAオミクスに資する基盤技術開発

miRNAの定量解析系構築のための分離性能と質量分析精度の向上を達成した.マイクロ流路系を用いた濃縮系を最適化するとともに,LCにおいて,移動相,充填剤,カラムを最適化し,性能向上に成功した.精密質量MS(N乗)を達成するためにイオントラップ飛行時間型ハイブリッド質量分析系を運用し,20塩基以上のmiRNAのde novo配列決定に成功した.さらに,イオンモビリティー分光法を運用し,配列異性体の分離に成功した.加えて,質量分析感度向上のためのプローブの合成に成功したmiRNAの定量解析系構築のための分離性能と質量分析精度の向上を達成した.マイクロ流路系を用いた濃縮系を最適化するとともに,LCにおいて,移動相,充填剤,カラムを最適化し,性能向上に成功した.精密質量MS(N乗)を達成するためにイオントラップ飛行時間型ハイブリッド質量分析系を運用し,20塩基以上のmiRNAのde novo配列決定に成功した.さらに,イオンモビリティー分光法を運用し,配列異性体の分離に成功した.加えて,質量分析感度向上のためのプローブの合成に成功したmiRNA定量分析に資するナノLC/MS分析系の改良を行った.75μm内径の石英粗管をレーザーキャピラリープラーで先端加工し,8μm先端内径のカラムを作成し,粒径3μmのODSシリカゲル粒子を充填し,質量分析チップ一体型のナノLCカラムを作成し,イオントラップ型質量分析計に連結し,超微量定量分析系を確立した.ゼブラフィッシュの発生胚を材料として,miRNAの抽出・精製法の最適化検討を行った.ゼブラフィッシュの発生胚(24hpf)100個(130mgFW)から、total RNAは39±8・g(mean±SD)、miRNAは0.39±0.02・g回収され、total RNAに対するmiRNAの割合は約1%であった.miRNA前駆体定量システムの開発に向けて、質量分析用のプローブとなる修飾オリゴDNAの合成を行った.プローブは質量標識部位、リンカー部位、核酸部位(塩基配列認識部位)の3つより構成される。質量分析器によって感度良く検出できるプローブを開発するために、質量標識部位およびリンカー部位の化学構造の最適化を検討し含窒素化合物を有する誘導体が高感度に検出されるなど分子設計の指針となる知見を得た.miRNAおよびpre-miRNAの精製濃縮システムの開発として,細胞からRNAを抽出するための条件の精査を行った。特に今回は、精製濃縮の後質量分析することを考慮し、なるべく余計な分子がRNAに結合しないように、変性剤を用いないでRNAをトラップする条件を求めこと、及びその効率を高めることに注力した。その結果、70°Cで10分保持後、氷上で5分保持する熱処理によって、それまでの変性剤を用いないでも、ssRNAをトラップできること、トラップするための狭小部の幅は8μmがよいこと等が分かった。ナノLC/MSによる精密微量定量システムを実用化した.質量分析によるmiRNAの検出システムの開発を実施した.高分解能,高質量精度を有し,かつ,MS(n乗)測定が可能であるハイブリッド型質量分析計であるイオントラップ飛行時間型質量分析計(IT-TOF-MS)を用いた.一塩基置換の配列の検出も可能とした.同位体パターンを解析することにより,各多荷イオン価数を確認し,分子量の精密推定を可能とした.miRNA前駆体定量システムの開発に向けて,質量分析用のプローブとなる修飾オリゴDNAの合成を行った.これまでの研究で,質量標識部位にはある種の含窒素化合物を有する誘導体が高感度に検出されることが明らかにしたため,その知見に基づく分子設計を行い,複数のDNAプローブをポスト修飾法によって合成した.miRNAの濃縮精製を指向し,トラップ条件とトラップ確率の関係を精査し,トラップ確率が,電圧と流速の比率でのみ決まり,その絶対値には影響しないことを見出した.これは,本トラップが,誘電泳動によるものではなく,新しいものであることを示している.現在この情報を元に,トラップメカニズムを解析するための,数値シミュレーションを試みている.また,細胞の解析実験では,1細胞のDNA・RNA解析を容易にできるように,細胞を1つずつ自動的に配列させて,トラップ部へ導入する機構を完成させた.また,チップ上でPCR解析を行うために,Polydimethylsiloxaneのガス透過性を積極的に利用した手法を考案し,有効性を実証した.LC分離の向上と,全く異なる分離手法との組み合わせという2つのコンセプトのもと,現状分離が難しいような配列同士を分離できる,高い分離性能を持つmiRNA分析系の開発をおこなった.まず,現状のLC分離性能の向上を目指し,移動相,移動相の濃度勾配,カラム等,分析条件の最適化を主に行った結果,逆相系のODSカラムで,移動相条件,移動相の濃度勾配を最適化することにより難分離性の類似配列もピークトップ分離できる可能性を示した.続いて,質量分析において,まったく新しい分離モードとして注目されているイオンモビリディースペクトロメーター(IMS)の運用を試みた.IMSは気相中で電気泳動を行う分離装置で,イオンの形,大きさ,電荷により分離されるため,保持時間,質量で分離できない配列の分離が期待された条件を種々検討することにより,難分離性の類似配列をもつ二種のマイクロRNAを分離することに成功した.加えて,本研究では、TaqManプローブを改良した幾種かの新規修飾核酸プローブの設計・合成を行った。

これらは、プローブの5'末端に蛍光標識ではなく、イオン化効率の優れた質量タグを修飾し、3'末端にリン酸を付加したものである。このプローブを用いてPCRを行い、DNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によって生じた質量タグ+ヌクレオシド1残基を質量分析装置を用いて検出することで、目的の遺伝子を定量的測定が可能であることを確認した。さらに,テーパ状流路を用いたRNAの抽出では、これまでは2次元パターンで流路断面積を変化させていたが、本年度は3次元的に変化させることにより、処理量の大幅な向上を目指した。板に孔を開け、上下から流路で挟む構造で、孔数を増やすことで超並列化も可能である。穴のパターンニングには電子ビーム露光装置を用いた。数値シミュレーションにより電場と流体場を見積もった。3次元流路でもトラップは確認され、ほぼ予想した通りの性能を得た。
網膜色素変性の病因解明のための分子生物学的検討

今年度は、X染色体劣性網膜色素変性の候補遺伝子であるRP2遺伝子を用いて検索を行い、世界で初めての遺伝子異常、およびその臨床像の報告を行った。さらに、また、RDH5遺伝子1085delC/insGAAG変異が日本人眼底白点症の高頻度変異であり、Gly35Ser変異は進行性網膜変性を起こすことを報告し、眼底白点症の病態に関して新たな知見を与えた。また、今年度のもっとも強調したい実績は、日本人に特異的に網膜色素変性の原因遺伝子異常が存在するという観点から、現在までに網膜色素変性を起こすと報告されていない遺伝子に対して日本人患者でスクリーニングを施行した結果、日本人に高頻度に認められる遺伝子異常を発見し、さらにその臨床像の検討をおこなった。その結果、FSCN2遺伝子208delG変異は、日本人常染色体優性網膜色素変性の高頻度変異であるばかりでなく、この変異は。錐体桿体ジストロフィーを起こすことも見いだした。これらの業績は、平成13年アメリカで行われた国際学会で報告し、大きな反響を呼んだ。また、遺伝子異常とその臨床像のデーターベース化を行い、臨床像から、原因遺伝子へアブローチできるような体制を作製し、現在も進行中である。当教室は本邦における網膜色素変性の研究センター的機能を果し、全国の大学より本症患者の血液を集め、すでに1000例以上のゲノムDNAを保管しており、本研究をさらに発展できる準備は十分整っている。また、今年度のもっとも強調したい実績は、日本人に特異的に網膜色素変性の原因遺伝子異常が存在するという観点から、現在までに網膜色素変性を起こすと報告されていない遺伝子に対して日本人患者でスクリーニングを施行した結果、日本人に高頻度に認められる遺伝子異常を発見し、さらにその臨床像の検討を行っている。これらの研究により、現在までに報告のないFSCN2遺伝子が網膜色素変性を起こすことを初めて証明し、さらに日本人の高頻度変異であることも証明した。
Gタンパク共役型脂質受容体の消化管炎症の調節における役割の解明

GPR35の活性化は大腸上皮細胞の修復を促進し、さらに大腸炎を抑制することが判明した。その作用機序として、GiタンパクカップリングによるcAMP低下、フィブロネクチンおよびインテグリンα5発現亢進およびERK活性化作用を介すると推察された。一方、GPR40活性化はDSS誘起大腸炎の発生および治癒に対して保護作用を発揮することが判明した。この作用は、GLP-2産生の増大を介するものと推察される。これらの結果より、GPR35およびGPR40を代表とするGタンパク共役型脂質受容体は炎症性腸疾患の新規治療標的として有用であると考えられる。本研究の目的はGタンパク共役型脂質受容体の消化管炎症の調節における役割の解明であった。GLP-2分泌に関与するGPR40およびGPR120、およびその他のGタンパク共役型脂質受容体をターゲットとして検討を行った。本年度中、GPR40に関しては炎症性腸疾患の動物モデルであるマウスDSS惹起大腸炎にてagonist、antagonistを用いて有効性評価を行った。その結果GPR40は同大腸炎において重要な役割を果たすことを見い出した。またそのメカニズムについても一部検討し、GPR40刺激により内因性GLP-2分泌が誘導され、その結果大腸炎を抑制することを見出した。今後さらなるメカニズム解析を行う予定である。一方GPR120についてはantagonistやノックアウトマウスなどの実験材料の入手が難しく、当初の予定であった消化管炎症動物モデルでの有効性評価を実施できていない。それ以外のGタンパク共役型脂質受容体については、消化管炎症性疾患との関連が示唆されるターゲットを検索し、その中で特にLPAの受容体であるGPR35に注目した。最近、GPR35の遺伝子変異がクローン病や潰瘍性大腸炎のリスクファクターであることが数々報告され、炎症性腸疾患においてGPR35が注目されている。しかしながら、これまでGPR35の炎症性腸疾患における基礎的な検討は十分に報告されていない。そこで研究代表者は特にGPR35の消化管上皮細胞(YAMC、IEC-6)における役割について検討したところ、GPR35が強力な正常消化管上皮細胞の遊走促進因子であり、創傷治癒に重要な役割を果たす可能性を見出した。今後、さらなるメカニズムおよび大腸炎モデルを用いた検討を行う予定である。研究スケジュールに沿った実施がほぼ実施できている。GPR40刺激によりマウスDSS惹起大腸炎にて有効性が確認できたため、現在はそのメカニズムについて検討している。当初の計画通りである。他のGタンパク共役型脂質受容体については、GPR35について検討を進めている。GPR35は正常消化管上皮細胞(YAMC、IEC-6)の遊走に関与していることを確認した。現在はそのメカニズムについて検討している。また動物実験で使用可能なGPR35 agonistであるPamoic acidのin vitroでの正常消化管上皮細胞(YAMC、IEC-6)の遊走促進反応も確認しているので、同agonistを用いて炎症性消化管疾患のマウス病態における役割について検討中である。本研究ではGタンパク共役型脂質受容体の消化管炎症の調整における役割を明確化することを目的に検討を行った。ターゲットとしては前年度で効果が認められたGPR35およびGPR40とし、そのメカニズムを含めた詳細について検討を加えた。GPR35は炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)患者においてその遺伝子変異が発症のリスクファクターであり、その作用の欠如が病態に関与している可能性が強く示されている。しかしながら、GPR35の炎症性腸疾患における基礎的な検討は十分に報告されていない。研究代表者は、正常消化管上皮細胞株(YAMC、IEC-6)を用いて、GPR35の活性化が創傷治癒を促進することを既に確認していたが、その作用はGiタンパクのカップリング亢進、cAMP産生低下、フィブロネクチンおよびインテグリンα5産生増加、およびERK活性化を介することを新たに見出した。加えて、GPR35活性化が炎症性腸疾患モデルであるDSS誘起マウス大腸炎の発症を抑制することも見出した。一方で、GPR40は消化管粘膜再生作用を有するGLP-2の産生を促進する受容体であることが報告されている。研究代表者はGPR40活性化がDSS誘起マウス大腸炎の発症を抑制することを既に確認していたが、その作用が大腸粘膜での局所的な内因性GLP-2分泌の増加作用を介することを見出した。さらに、DSS誘起大腸炎の治癒モデルを新たに作製し、GPR40の治癒過程における役割を検討した結果、GPR40活性化は発症だけでなく治療効果も併せ持つことを見出した。研究代表者が示した新しい知見は、炎症性腸疾患の新たなる治療標的を示唆するものであり、創薬の観点からは非常に有用であると考えられる。

今後の予定としてGタンパク共役型脂質受容体の各種炎症性消化管疾患の病態モデルにおける有効性評価を中心に、発現部位およびパラメーター変化、ならびにin vitro細胞レベルでの検討を並行して行う。1炎症性消化管疾患のマウス病態におけるGPR35およびGPR40の関与およびそのメカニズム検討を行う。IBDモデルとしてDSS惹起大腸炎モデルおよびTNBS惹起大腸炎モデル、NSAID惹起腸炎モデル、抗がん剤誘起腸炎モデルを用いて、GPR35およびGPR40の役割について検討する。また病態モデルでの腸管組織におけるGPR35及びGPR40、上皮系マーカー(MUC1、E-cadherin、Lgr5など)、fibronectinおよびα5-integrinについて、またGPR40については血漿中もしくは腸管組織中GLP-2量の測定を行う。2正常腸上皮培養細胞の遊走促進におけるGPR35の役割についてより明確化するため、そのシグナルについて検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。消化器内科学、薬理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
がん微小環境における筋線維芽細胞の役割と分子機構の解明

【背景・目的】がんの悪性化には,筋線維芽細胞などで構成されるがん微小環境が重要であると考えられているが,その分子機構の詳細は明らかになっていない。本研究は,世界的に罹患率の高い大腸癌において,その悪性化における腸筋線維芽細胞(IMFs)のがん微小環境としての役割とその分子機構を解明することを目的とした。具体的には,「がん細胞がIMFsを制御して微小環境を維持し,維持されたIMFsががんの悪性化に寄与する」という仮説を立て,がん細胞がIMFsに与える影響を検討した。【方法】実験には,マウス結腸より単離したPrimary-IMFsと我々が樹立したIMFs細胞株LmcMFを用いた。がん細胞モデルとして,KRas遺伝子の活性型変異体(KRasV12)をマウス結腸上皮細胞株であるaMoC1細胞に安定発現させた細胞(KRasV12-aMoC1)を作製し使用した。【結果・考察】昨年度までの結果より,KRasV12-aMoC1の培養上清(KCM)に含まれるヘパリン結合性上皮細胞成長因子(HB-EGF)がIMFsの遊走を促進することが示唆された。そこで,western blottingにより様々なシグナル伝達関連因子の活性化レベルを検討したところ,KCMおよびHB-EGFにより共通して活性化される因子としてERKおよびJNKが見出された。さらに,ERK阻害剤およびJNK阻害剤がKCMによるLmcMFの遊走促進を阻害した。また,KCMによるERKおよびJNKの活性化は,HB-EGF受容体阻害剤により阻害されたことから,KCM中のHB-EGFが,ERKおよびJNKシグナルを活性化することでIMFsの遊走を促進することが示唆された。以上の結果から,KRas変異がん細胞はHB-EGFを介してIMFsの遊走を促進し,IMFsを自身の近くに引き寄せることで微小環境の形成に利用している可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。近年,がんの悪性化には,筋線維芽細胞などで構成されるがん微小環境の重要性が示差されているが,その詳細は明らかになっていない。本研究は,腸筋線維芽細胞(IMF)の大腸癌微小環境としての役割と分子機構の解明を目的に実施している。(A)3次元培養大腸癌モデルの確立自然発症がんは,遺伝的バックグラウンドの多様性から解析が困難である。そこで,マウス単離消化管上皮細胞に遺伝子操作を加え,3次元培養がんモデル(オルガノイド)を作製し研究を行っている。すでに,正常細胞由来のオルガノイドの作製に成功し,大腸癌において高頻度で抑制性変異が認められるAPC発現を抑制するshRNAを作製し,shRNA安定導入細胞を用いたがん化オルガノイドを作製中である。大腸癌細胞ではSphingosine-Kinase(SphK)が高発現しており,S1Pを産生することで微小環境との相互作用に利用していると考えられているが,S1PがIMFの増殖や遊走に与える影響など,その詳細は不明である。そこで,大腸癌における上皮細胞とIMFのS1Pを介した相互作用の解明を目的に研究を行った。S1PがIMFに与える影響の検討から,S1PはIMF増殖には影響せず,IMF遊走を抑制することが明らかになった。さらに,マウス結腸上皮細胞株であるaMoC1にSphK1を安定的に過剰発現させ,IMFとの相互作用を検討したところ,SphK1過剰発現細胞はS1P産生を介して,IMF増殖には影響を与えず,遊走を抑制することが示唆された。これらの結果から,大腸癌細胞ではSphK1の発現が上昇し,S1Pを産生することで周囲のIMFの遊走を抑制し,自身の近くにとどめることでがんの悪性化に利用している可能性が示唆された。【背景・目的】がんの悪性化には,筋線維芽細胞などで構成されるがん細胞周囲の微小環境が重要であると考えられているが,その分子機構の詳細は明らかになっていない。本研究は,発症患者数の多い大腸癌をターゲットとして,その成長と悪性化における腸筋線維芽細胞(IMF)のがん微小環境としての役割とその分子機構を解明することを目的としている。具体的には,「がん細胞がIMFの増殖や遊走を制御して微小環境を維持し,維持されたIMFががんの悪性化に寄与している」という仮説を立て,本年度はがん細胞がIMFに与える影響について検討した。【方法】実験には,マウスの結腸より単離したPrimary-IMFと我々が樹立したIMF細胞株LmcMFを用いた。また,がん細胞モデルとして,多くの大腸癌で活性型変異が認められるKRas遺伝子の活性型変異体(KRasV12)をマウス結腸上皮細胞株であるaMoC1細胞に安定発現させた細胞(KRasV12-aMoC1)を作成し使用した。【結果・考察】KRasV12-aMoC1細胞の培養上清がIMFの増殖および遊走に与える影響を検討したところ,KRasV12-aMoC1細胞の培養上清はIMFの増殖には影響せず,遊走を促進した。