hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周組織再生治癒促進のための注入型キャリアに関する研究

本研究は、歯周病で破壊された歯周組織の治癒及び再生を促進し、かつ簡易な治療方法の開発に通ずる投与方法の検討を目的として行われた。前者の目的では細胞外マトリックスの産生及び血管新生を促すことが知られている軟骨増殖因子を用い、後者の目的にはリコンビナント・ヒト型コラーゲンゲルを用いた。一度の注入によって硬組織形成が促進され、その過程を組織学的及び分生生物学的に解析すると、血管新生を伴う骨・軟骨関連の細胞外マトリックス産生の増加が観察された。平成19年度は、リコンビナント・ヒト型ロラーゲンゲル注入部位内での細胞の移動、増殖、分化、血管薪生過程に対して、特に動物組織内での解析を中心に研究を推進した。その際、特に細胞外マトリックスによる細胞機能制御機構の解析に重点をおいた。硬組織の誘導形成について、注入後経時的に(3日後、1週間後、2週間後)マイクロCT(ScanXmate-E080)で解析を行ったところ、3日後および1週間後には、注入部位及び対照群ともに骨の誘導を認めなかったが、2週間後においては明瞭な骨様不透過像の形成を認めた。組織学的な所見より、注入後3日後においては細胞様構造物が疎な部位が認められ注入したコラーゲンゲルの残留がうかがわれるものの、1週間後には線維芽細胞様細胞の存在が認められ、かつ活発な細胞増殖を示す抗PCNA抗原陽性細胞の増加が顕著であった。形成された骨様硬組織は多くの場合既存の頭蓋骨に連続していた。新生骨および既存骨ともに抗I型・II型コラーゲン染色に陽性であったが、抗オステオカルシン染色を行ったところ新生骨骨髄腔壁ではオステオカルシン陽性細胞が多数確認されたが、既存骨骨髄腔壁には認められなかった。新生骨においては活発な骨形成のための細胞外マトリックス産生が行われているものと推察された。新生骨付近においては管腔構造物が確認され、血管新生を想像させる。血管因子の解析に着手した(継続中)。また、骨膜付近の細胞において特に強いH型コラーゲンの発現が認められた。また一部軟骨細胞様構造を認めたため、軟骨細胞のレギュレトリー転写因子であるSoxの検出に着手した(継続中)。一方、細胞培養系において血管因子の発現を解析した。マウス頭蓋より分離した線維芽細胞をGDF5で刺激することにより、血管成長因子であるVEGFの産生が上昇する結果を得た。現在、刺激条件(濃度条件)や発現時間等の解析を進めている。平成20年度は、リコンビナント・ヒト型コラーゲンゲル注入部位内での細胞の移動、増殖、分化、血管新生過程に対して、特に動物組織内での血管新生を伴う骨化機構の解析を中心に研究を推進した。組織学的な所見より、1週間後には線維芽細胞様細胞の存在が認められ、形成された骨様硬組織は多くの場合既存の頭蓋骨に連続していた。しかし、ヘマトキシリン・エオジン染色およびアルシアンブルー染色によって新生骨と既存骨の境は明瞭であることが明らかであった。新生骨では抗I型・II型コラーゲン染色に陽性であり、軟骨細胞様分化に必須の転写因子であるSox-9に対する免疫染色を行ったところ、新生された骨様構造物において抗Sox-9抗体陽性細胞が多数確認された。一方、新生骨付近においては管腔構造物が確認され、血管新生を想像させる。一般的には軟骨が骨に置換される過程では血管侵入を伴うが、新生骨様構造物の中心部分では血管マーカーであるVon Willebrand Factor(VWF)に対して免疫組織学的に陽性である細胞からなる管腔構造が認められた。一方、細胞培養系において血管因子の発規を解析したところ、マウス頭蓋より分離した線維芽細胞をGDF5で刺激することにより、血管成長因子であるVEGFの産生が上昇する結果を得た。48時間刺激の条件下で、無刺激に対して約2倍のVEGF産生が確認された。
RACプロテインキナーゼ PH領域とプロテインキナーゼCの相互作用に関する解析

PH領域は細胞情報伝達に関与する種々の蛋白質中に存在する機能領域と考えられ、三次元構造解析や生化学的研究結果から、PH領域には三量体GTP結合蛋白質βγサブユニット(Gβγ)、イノシトールリン脂質、プロテインキナーゼC(PKC)などが結合することが明らかとなっており、それらがPH領域を含む蛋白質の機能調節に関与していると考えられている。しかし、PH領域の生理的な役割については未知な部分が多い。セリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素RACプロテインキナーゼ(RAC-PK)はアミノ末端側にPH領域を有し、増殖因子刺激後細胞内で活性化される。これは増殖因子刺激後のフォスファチジルイノシトール3キナーゼの活性化にともない産生されるイノシトール3リン酸がRAC-PK中のPH領域に作用することにより起こるとされている。これまでに報告者らはラット由来の3種類のRAC-PK分子種(α,β,γ)をクローニングし、その酵素学的解析を行った。さらに、RAC-PK分子種由来のPH領域にPKC分子種およびGβγが結合することを明らかにした。このことから、増殖因子刺激によるRAC-PKの活性化以外にもあらたな活性化機構の存在が考えられ、細胞レベルでのRAC-PKの活性におけるPKC分子種およびGβγの影響について検討を行っている。また、RAC-PK細胞内での基質蛋白質を同呈する目的で、PKC分子種およびGβγ以外のRAC-PK中のPH領域結合蛋白質の検索を行った結果、繊維芽細胞中に分子量約200kDの結合蛋白質の存在を確認した。今後、その構造決定を行い、RAC-PKとの関連について検討する予定である。
英国における大手食料小売企業のロジスティクスマネジメントに関する比較制度分析

1990年代初頭の東欧民主化革命以降、旧社会主義・計画経済諸国における青果物市場再編および青果物流通再編が急速に進展している。その中でも特に注目されるのが、英国のtesco、ドイツのMACRO、フランスのカルフールなど大手食品小売企業である。しかし青果物流通再編の動向は、旧社会主義諸国の中で一様ではない。各国の農業の近代化(生産の規模・集中度)、卸売業者の規模、小売形態、消費者の購買行動、輸入青果物の割合と輸入業者の規模等が異なるため、再編の方向や速度が異なるのである。この点において、例えばハンガリーやチェコ共和国では、都市の発達は消費者の購買行動が比較的西欧諸国のそれに近い。この場合ロジスティクスマネジメントとしては、その国のロジスティクス企業を利用する場合と、もとの国からロジスティクスを担当する企業(サードパーティ)を引き連れて乗り込む場合とが確認されている。これら国では都市の発達と農業以外の産業の発達が、集団農場に土地を供出していた地主の土地所有意識を希薄化させ、大規模企業的借地農場が広範に展開することを可能としている。他方ポーランドやルーマニアなど、流通の近代化の進展水準が低い国々においては、伝統的な小売形態が支配的である場合が多い。ポーランドなどでは政府が卸売市場の近代化を進めようとしているが、卸売形態がそれを必要とはしておらず、卸売市場が十分機能しているとは言い難い状態にある。しかしこれらの国にも西欧発の小売企業は進出してきている。この場合地元の比較的大規模な農場と青果物の取引契約を結ぶ。注目すべきはその農場が次第に卸売り機能を備えるようになることであり、量販店に納入するロットをそろえるために、他の農場等から荷を買い集めるようになる。市場の成熟度、量販店の展開に対応する形で、農場の高度化、近代的卸売企業の成立が触発されることが確認される。従来の物流管理Distribution managementの概念は,ロジスティクスマネジメントlogistics managementに置き換わり,現在では,サプライチェーンマネジメントsupply chain managementが大手小売企業における企業戦略にとって重要な概念および実践となってきている.1980年代の初期に,小売企業は小売活動を円滑化させるために物流部門の改善に取り組まざるを得なかったが,これを物流専門企業に委託することによって本業に専念することが可能になった.さらに1980年代中頃には,RDC(地域物流センター)の登場によってJITが一般化し,店舗における在庫管理の必要がなくなることによって売り場面積の拡張が可能となった.多くの場合,RDCは物流専門企業によって運営されている.このようにサプライチェーンマネジメントの展開には物流企業の役割に注目しなければならない.近年ではこれら物流専門企業が,戦略的なプランニング,倉庫および在庫管理,情報システムの開発,その他コンサルティングなど,より幅の広いサービスを製造業および小売業双方の企業に提供し始めている.「東欧」民主化以降,西欧諸国における主要小売企業が中欧もしくは東欧に進出し始めているのであるが,その場合多くの企業は自国における物流企業との関係を進出先でも維持し,サプライチェーンマネジメントを委託している場合がみられる.これは諸外国における物流企業の活動のありようが,小売企業の国際化(globalization)の展開について重要な要因になっていることを意味している.従来,サプライチェーンのイニシエーターとしての小売企業が注目されてきていたが,小売企業の本業専門化に伴って,物流専門企業のサプライチェーンマネジメント機能が重要になってきていることが明らかになった.近年の英国における大規模食料品小売企業の動向は、本国における寡占化の強化と、グローバル化の進展を特徴として指摘することができる。シェア拡大に成功した代表的企業であるTESCOは英国内での事業展開の一方で他国での店舗展開にも積極に取り組んでいる。その代表的地域が中欧諸国(旧社会主義計画経済諸国)であるチェコ共和国、ポーランド、ハンガリーなどの国々である。本研究第2年次では、これら中欧諸国における英国大規模食料品企業の展開を主として分析した。その理由は、第一に社会主義計画経済下にあった中欧諸国であっても、現在の食料品小売店の展開や青果物流通システムは各国によって大きく異なり、本研究の特徴である比較制度分析の対象として的確であると判断されたからである。第二に、これら諸国における英国の大規模食料品小売企業の展開は、その歴史が本国に比べて浅いため、その展開、とくにロジスティクスマネジメントの変遷をトレースすることが容易であると判断されるからである。本年度は、ロンドンにおいて開催された第4回グローバルリティリング大会に出席し、TESCO、Carrefour等のグローバル化戦略について必要な情報を収集するとともに、チェコでの実態調査と、おもにポーランドにおけるTESCOの事業展開に関する情報収集を行った。その結果、中欧におけるTESCOの事業展開は、青果物流通制度が未発達な国では当初は地元大規模青果物生産農場との間に、その農場生産物の納入と他農場からの集荷を任せるという、卸売機能も持たせた契約を結ぶが、店舗の増加とともに独自の地域物流センターを設置し、集約的なロジスティクスマネジメントを展開することが明らかになった。他方、食料品流通の担い手が一定程度展開している国では、それら企業をロジスティクスのアウトソーサーと利用し、急速に事業を展開していることが明らかになった。

各国の農業の近代化(生産の規模・集中度)、卸売業者の規模、小売形態、消費者の購買行動、輸入青果物の割合と輸入業者の規模等が異なるため、再編の方向や速度が異なるのである。この点において、例えばハンガリーやチェコ共和国では、都市の発達は消費者の購買行動が比較的西欧諸国のそれに近い。この場合ロジスティクスマネジメントとしては、その国のロジスティクス企業を利用する場合と、もとの国からロジスティクスを担当する企業(サードパーティ)を引き連れて乗り込む場合とが確認されている。これら国では都市の発達と農業以外の産業の発達が、集団農場に土地を供出していた地主の土地所有意識を希薄化させ、大規模企業的借地農場が広範に展開することを可能としている。他方ポーランドやルーマニアなど、流通の近代化の進展水準が低い国々においては、伝統的な小売形態が支配的である場合が多い。ポーランドなどでは政府が卸売市場の近代化を進めようとしているが、卸売形態がそれを必要とはしておらず、卸売市場が十分機能しているとは言い難い状態にある。しかしこれらの国にも西欧発の小売企業は進出してきている。この場合地元の比較的大規模な農場と青果物の取引契約を結ぶ。注目すべきはその農場が次第に卸売り機能を備えるようになることであり、量販店に納入するロットをそろえるために、他の農場等から荷を買い集めるようになる。市場の成熟度、量販店の展開に対応する形で、農場の高度化、近代的卸売企業の成立が触発されることが確認される。
分子ローター型強誘電体の開拓

分子回転に伴うdipoleのflip-flopを利用した誘電性の発現について、アリールアンモニウムおよびcrown-ether部分を変えて系統的に検討した。ベンゼン環誘導体から、C3軸をもつアダマンタン誘導体等への展開を図った。また、特定の回転軸をもたずに、ケージ状の超分子構造の中である程度自由な回転を発現する系としてピリダジニウム誘導体検討した。水素結合により弱く固定された分子の向きを外部場で変化させ、大きな誘電応答に繋げることができた。さらに、回転子に複数のプロトン受容部位を導入し、水素結合におけるプロトン移動と分子回転に伴う誘電応答などの複合化に向けた足がかりを得た。以下の項目について検討を行った。既にm-fluoroanilinium/dibenzo[18]crown-6において、分子回転に伴うdipoleのflip-flopを利用した強誘電体を実現している。それを基に、他のアニリニウム等の回転子および種々のクラウンエーテルの組み合わせから結晶を作製し、分子回転および強誘電性について系統的に精査した。対アニオンは主として[Ni(dmit)2]を用いた。filp-flop運動に基づく誘電応答を示す系を複数見出した。2.ケージ内の分子回転に基づく強誘電性発現の探索特定の回転軸をもたずに、ケージ状の超分子構造の中である程度自由な回転を発現する系を探索する。クラウンエーテルにサンドイッチされた空間にpyazineが包接された系をターゲットとし、複数の結晶を得た。プロトンを介してpyazineはクラウンエーテルと弱く水素結合しており、これを軸としてflip-flop運動や振り子運動を示し、外部電場に応答する事を明らかにした。3.球状分子の回転に基づく強誘電性発現アダマンタンを利用した回転が可能な新規分子系を開拓した。まず、フルオロアダマンタンアンモニウム(FADH)の単純塩の合成を開始した。4.ポテンシャル曲線の設計による分極軸の複数化回転子がある程度高い対称性をもつFDAHを用いて3極小ポテンシャルを実現した。誘電応答にリラクサー的な傾向がみられ、精査を開始した。5.複合回転系の実現および6.回転子への機能付与と複合機能化この2項目については、予備実験から通常の分子設計では実現が困難である事が判明したので、新たな分子設計に向けた検討を開始した。但し項目5について、fluoroadamantane carboxylic acidの銅錯体系については有望であると判断し、今後検討を進める。(m-fluoroanilinium)(dibenzo[18]crown-6)[Ni(dmit)2]において実現している、分子回転に伴うdipoleのflip-flopを利用した強誘電性の発現について、アリールアンモニウムおよびcrown-ether部分を変えて系統的に検討した。C2回転軸をもつベンゼン環の誘導体については、誘電物性に与える置換基効果を検討するため、敢えて、フッ素より大きなハロゲン元素を導入した、(m-X-anilinium)(dibenzo[18]crown-6)[Ni(dmit)2] (X = Cl, Br, I)を合成し、その構造と物性を明らかにした。C3軸をもつアダマンタン誘導体として、3-fluoroadamantylammonium (FADNH3+)と[18]crown-6からなる超分子ローター構造を導入したところ、室温付近で明らかに分子回転が生じていることが分かった。その結果、c軸方向に周波数依存性とともに大きな誘電応答が得られ、アダマンタン誘導体の有用性が示された。また、NH3をアンカーとしてクラウンエーテルの空孔に水素結合で固定し、C-N軸周りの分子回転を利用したdipoleの反転行うのでは無く、特定の回転軸をもたずに、ケージ状の超分子構造の中である程度自由な回転を発現する系として、水素結合部位をもち、かつ対称性が高いピリダジニウムを導入した。水素結合により弱く固定された分子の向きを外部場により変化させることで、大きな誘電応答が得られた。さらに、回転子に複数のプロトン受容部位を持つ4-aminopyridiniumカチオンを導入し、水素結合におけるプロトン移動に基づく誘電応答を評価した。複数の誘電応答機構をもつ結晶の構築に向けた足がかりが得られた。クラウンエーテルに基づく超分子ローター構造を利用することで、強誘電性を基礎とした新規機能開拓ならびに複合機能開拓を行い、分子回転に基づく強誘電体の基盤を確立することを目的に、以下の項目について検討を行っている。材料開拓:1.分子のfilp-flop運動に基づく強誘電性発現・2.ケージ内分子回転に基づく強誘電性発現の探索・3.球状分子の回転に基づく強誘電性発現機能開拓:4.回転ポテンシャル設計による分極軸の複数化・5.複合回転系による分極軸の自在制御・6.回転子への機能付与と複合機能化

平成24年度までの研究において、13の項目について当初の予定通りの成果を得た。まず、項目2においてはピラジン系ローターを用いることにより強誘電性発現の可能性を見出した。複素環化合物であるピラジンはプロトン化することでアンモニウム基を持たないにもかかわらず、[18]crown-6誘導体と水素結合を介して超分子構造を形成し、結晶中へ導入することが可能であった。結晶中での分子運動に伴う大きな誘電応答を観測することができた。また、項目3についてはフルオロアダマンタンアンモニウムを用いて有望な系を見出した。C3対称軸を持つアダマンタンアンモニウムは結晶内でスムーズに回転子、その回転はフッ素基を導入することでもある程度保たれた。回転のポテンシャルは複雑な形を与えた。3種類の[18]crown-6誘導体と複合化させることで、種々の結晶を合成し、その誘電応答を評価することで、有望な材料系であることを確認した。さらに項目1では分子回転に伴うdipoleのflip-flopを利用した強誘電体について精査し、当初の目標のみならず、特に、混晶系において興味深い結果が得られた。研究はほぼ計画通りに進捗している。そのなかで、リラクサー類似の応答を見出すなど、当初は予測していなかった結果も得られている。一方で、いくつかの研究項目において、改めて分子設計を行う必要性が生じるなど、やや進捗が遅れている部分がある。予定よりも進捗している部分が多く、全体的には、おおむね順調に進展していると判断した25年度が最終年度であるため、記入しない。項目2においてはピラジン系ローターを用いることにより強誘電性発現の可能性をみいだした。本年度はこれらの結果を論文にまとめる。さらに項目1では分子回転に伴うdipoleのflip-flopを利用した強誘電体について精査し、当初の目標のみならず、さらに興味深い結果が得られている。研究は概ね順調に推移していることから、平成24年度についても殆どの研究項目について、当初の予定通り研究を遂行していく予定である。ただ、リラクサー類似の応答が見られた事から、この部分についてより精査することを計画している。リラクサーは応用面においても重要な材料であり、検討する必要性がある。一方、項目6および7については分子設計の進捗状況を見つつ、これらに費やすエフォートをリラクサー研究に振り向ける事も考慮する。それにより、研究全体としてよりインパクトのあるものに仕上げていく25年度が最終年度であるため、記入しない。項目13を引き続き推進する。特に項目1について当初の予定にはない興味深い結果が混晶系において得られているので、その系についても検討を進める。項目4,5のについては、かなり研究は困難であることが判明しつつある。しかしながら、分子設計を改めて行い、複合回転系においては分極軸の制御に向けて有望な系を見出しつつある。
「移動」から見た女性美術家と視覚表象の研究

このプロジェクトでは周縁化されてきた女性アーティストに焦点を絞り、ジェンダーの視点から、戦時中の女性画家の移動や、移民として国外に出た女性美術家について、包括的な調査研究を行った。研究は次の3本の柱から成る。1戦争・植民地体験と女性アーティストの実証的調査(長谷川春子、赤松俊子、谷口富美枝ら)、2東アジア圏の美術をめぐるネットワーク的移動の解明(朝鮮美術展・台湾美術展・満州国美術展など)、3現代美術における女性美術家の調査。これらの研究の成果は、「アジアをつなぐ境界を生きる女たち1984-2012」展や「官展に見る近代美術」展などにも生かされた。本プロジェクトは、美術(史)研究では周縁化されてきた女性アーティストに焦点を絞り、ジェンダーと「移動」の視点から、戦時中の女性画家の移動や、移民として国外に出た女性美術家について調査研究を行うものである。H23年度は(1)【国内調査】女性アーティストの「移動」と表現に関する以下の調査を実施。呉夏枝、琴仙姫、山城知佳子、阪田清子、井上廣子、富山妙子、ソ・ヒョンスク、荒木高子、松井冬子、草間彌生、イ・ブル、イトー・ターリらについて、インタビューもしくは資料調査を実施(全員が分担、一部は海外調査とも重複)。(3)【海外調査(繰越)】オーストラリア国立大学(ANU)においてテッサ・モーリス・スズキらとともに研究発表会を開催。坂上香のドキュメンタリー「ライファーズ」上映と講演会を行った。(4)【発表】上記の調査に伴う講演・発表のほか、1「東アジアの視覚文化とジェンダー」研究会開催(於・大阪大学)(ラワンチャイクン寿子、原舞子ほか報告)、2ジェンダー史学会での発表(2011年12月、北原・小勝)以上、交付から短期間ではあったが、調査・研究・交流を進めることができた。平成24年度は、1大学と美術館の現場の連携、2研究成果の公表(HP作成)で顕著な成果を上げることができた。(1)【大学と美術館との連携】本科研で調査協力を行ってきた「アジアをつなぐー境界を生きる女たち1984-2012」展の開催が始まり、福岡アジア美術館、沖縄県立博物館美術館、栃木県立美術館を巡回した。それに合わせて本科研の公開シンポジウムや研究会を行った。1シンポジウム「アジアの女性アートを考える」(2013年2月栃木県立美術館)2ワークショップとフォーラム「アジアをつなぐわたしたちがつなぐ」では、フィリピンから美術家のアルマ・キントを招きワークショップを行ったのち(ワークショップでの作品は、「アジアをつなぐ」展で展示)、シンポジウムを実施(2012年10月大阪大学)3ファブリス・ヴィルジリ講演会「愛、戦争、セクシュアリティー欧米における戦争と性の表象」(2012年10月大阪大学)(2)【ホームページ開設】http://www.genderart.jp/研究成果のほか、プロジェクトに関係する研究会・展覧会のニュース、戦時下の女性美術家に関する文献アーカイブの欄を設け、研究者だけでなく広く社会に役立つHPを創出した。(3)【国内出張】前年の調査に加えて、やなぎみわ、塩田千春も調査。特に、生誕100年を迎えた丸木俊(赤松俊子)について重点的に調査した。原爆記念資料館、広島での戦争画関連展の聞取り・資料調査、丸木美術館での戦争画企画展調査・発表を行った。(4)【海外調査】ドイツ在住のソン・ヒョンスク聞取り調査(金)。ソウル・光州ビエンナーレ(韓国:北原・小勝他)3年目の最終年度は、1・2年目の研究調査を引き続き行いつつ、以下のことを行った。1女性アーティストの作品上映会・講演・ワークショップなどの開催(於・阪大)、2海外調査(韓国・シンガポール・中国)、3女性美術家調査(東京都現代美術館・桂ゆき展、「熱々、東南アジアの現代美術」展・横浜美術館、谷口仙花遺族の聞き取り、「EARTH MANUAL PROJECT」展(アルマ・キント、神戸KIITO)、あいちトリエンナーレ(名古屋市、岡崎市内各所))、4戦時期中国を描いた戦争画調査(早稲田大学)、5関連学会・研究会での発表、6「官展にみる近代美術展」(福岡アジア美術館ほか)の協力、7関連文献・資料の収集、8最終年度のとりまとめ(科研報告書出版)など。さらに、繰越として、平成26年6月にはオランダで開催された、ワッセナーNIAS「第二次大戦下および戦後のアジア・ヨーロッパにおける戦う女性」をテーマにした国際研究会に出席。主催はNIOD(Institute for War, Holocaust and Genocide Studies)と関西学院大学。

さらにライデン大学東アジア研究の図書館訪問・調査、イギリスにおける戦争関係の展示なども調査した。本科研プロジェクト期間中にメンバーによって出版された著作物は多数ある。北原恵編著『アジアの女性身体はいかに描かれたかー視覚表象と戦争の記憶』(日本学叢書4、青弓社、2013年1月)は、メンバーの多数が論考を寄せているが、各自の研究発表の多くは、2010年7月に大阪大学で開催されたシンポジウム「視覚メディアに描かれた「日本」/「アジア」女性の身体」がもとになっている。26年度が最終年度であるため、記入しない。複合新領域26年度が最終年度であるため、記入しない。交付の通知が2011年11月であり、年度内の他のプロジェクトの計画が大部分決定していたので、この時点からあらたなスケジュールを組み直すのはかなり苦労した。しかし、分担者や連携者、協力者の協力によって、研究会の開催や調査を実施することができた。したがって、平成23年度の達成については、国内外の女性アーティストの調査を進めており、おおむね順調に進展していると言える。国際研究会については平成24年度に繰越になったのでその分が交付時よりも遅れたが、2012年度に実施することができた。海外から研究者やアーティストを招いた講演会、国際シンポジウム、ワークショップを開催し、研究成果を社会に広く公表するためのホームページを開設した。海外調査はあまり進まなかったが、繰越にして次年度に行う予定である。以上から「おおむね順調に進展している」と言える。今度の推進方策については、成果を随時公開できるように、平成24年度にはホームページの構築を行う。平成25年度は、本科研の最終年度であるので、研究成果をまとめる。国内調査・海外調査に加えて、報告書作成などを行う。
住血マイコプラズマの試験管内人工培養から迅速同定まで

ヘモプラズマ(hemoplasma)は哺乳動物の赤血球に寄生して増殖するマイコプラズマの総称で,感染した動物に溶血性貧血を引き起すことが知られており、ウシには2菌種のヘモプラズマが感染する。しかし,わが国のウシにおける感染状況はこれまでに明らかにされていない。そこで,国内におけるウシヘモプラズマの浸潤状況を調査し,広く感染がみられることを明らかにした。ヘモプラズマは哺乳動物の赤血球に寄生して増殖するマイコプラズマの総称で,感染した動物に溶血性貧血を引き起すことが知られている。ウシには2菌種のヘモプラズマが感染することが知られている。そこで,本年度は国内におけるウシヘモプラズマの浸潤状況を調査した。ウシに感染する2種類のヘモプラズマのうち、Mycoplasma wenyoniiのTm値は82.04±0.27°Cであり,一方`Candidatus Mycoplasma haemobos'のそれは86.86±0.12°Cであることから,これを基準にして菌種を同定した。その結果,広島県と宮崎県においてそれぞれ69.4%(25/36),93.8%(30/32)のウシのヘモプラズマ感染が見つかった。広島県のウシ36頭のうち18頭は1歳から2歳で残りの18頭は成牛であったが,年齢とヘモプラズマ感染を関連づける証拠はみつからなかった。宮崎県では非常に高いヘモプラズマ感染がみられ、生後3ヶ月以内で冬に生まれたウシからもヘモプラズマが検出された。本研究において,へモプラズマに感染しているウシはヘモプラズマ感染による顕著な臨床症状を示さなかった。PCRによりヘモプラズマ感染陽性と判定されたウシのうち,重篤な貧血を起こしていた個体はおらず,またすべてのウシがヘモプラズマ症とは関連のない症状を現しており,臨床所見等からこれ以上詳細な分析は不可能であった。本研究により,広島県と宮崎県において飼育されており貧血の症状が顕著ではないウシの間で`Candidatus M.haemobos'が広汎に存在しており,感染個体は臨床症状が消失した後も慢性的にキャリアとなっている可能性が高いと考えられた。また,ベクターのいなくなる期間における新生子への感染は垂直感染の可能性を示していた。住血マイコプラズマはヘモプラズマとも呼ばれ赤血球表面に特異的に寄生し,宿主動物に溶血性貧血をもたらすのみならず,その免疫系を撹乱させて,他の感染症との混合感染をより重篤なものとし,また自己免疫疾患を誘発するなど,宿主個体へ悪影響を及ぼすことが知られている。これにはかつてリケッチア目アナプラズマ科のヘモバルトネラ属あるいはエペリスロゾーン属に属していた菌種のほか,新たに発見された菌種が含まれる。これら住血マイコプラズマ菌種はいずれも,16S rRNA遺伝子の相同性,細胞外での増殖,および細胞壁ペプチドグリカンの欠如などの性状からマイコプラズマ属の菌種として認定されたものであるが,試験管内での人工培養が成功しないため性状解析ならびに分類学的な検討が遅れている。マイコプラズマは種特異性が比較的強く,感染した宿主哺乳類に貧血,発熱,食欲不振,黄疸等をもたらすが,その発症機序も充分解明されていない。本研究は,これまで世界中で誰も成功していない,住血マイコプラズマの試験管内純培養を行い,それに基づいて迅速同定法を確立し,本感染症の治療・予防に資することを目的としている。申請者はこれまでにリアルタイムPCRに熱融解曲線の解析を併用することで複数のマイコプラズマ菌種による混合感染の場合でもそれらの菌種を鑑別同定できる方法を発表してきた。また申請者はすでに通常のマイコプラズマにおいてリボソームRNA遺伝子間スペーサー領域が菌種の同定基準として有用であることを明らかにしている。そこで,本年度申請者は純培養した住血マイコプラズマ菌種についてこの領域を解析し,それを用いてリアルタイムPCRと熱融解曲線解析を併用することで,迅速同定法を確立することに成功した。東日本大震災により機器が破損し、その修理に日時を要したため研究がおくれた。本来であれば、ヘモプラズマの人工培養に着手すべきところ、破損した培養装置の修理に歳月を要したためである。できるだけ早急に人工培養実験に取りかかり、ヘモプラズマを試験管内で増殖できるようにしたい。申請者はこれまでに,難培養性マイコプラズマを細胞培養を用いて分離し,これをさらに人工培地で増殖できるように順化させる研究をしてきており,本計画調書を実行するための基本的知識と技術を所有している。現在人工培養可能とされているマイコプラズマ菌種のほとんどは血清添加培地が考案されるまでは,培養不能な微生物として扱われていた経緯がある。したがって,培養に必須な増殖因子を検索することで試験管内培養を成功させることができると確信している。

大半は試薬類の購入に使うが、本年度にフランスで開催される国際マイコプラズマ学会において、これまでの成果を発表する予定なので、旅費としての使用も計画している。したがって、研究費は試薬類と旅費に使うことになる。
ヒト幹細胞培養システムを基盤とした小児重症心不全に対する新規治療法の構築

本研究においては、現在の使用可能なリソースを用いて、現状の法体系のもとで、可及的速やかに小児心不全の新しい治療体系を確立することを目標とした。小児を取り巻く環境は、成人における重症心不全の治療として、心臓移植、人工心臓治療、更には再生医療などが臨床において実施されているのとは対照的である。本研究の成果は、小児心不全治療に対する臨床研究への橋渡しとして、再生医療を実施する基盤となる。脳死移植法が施行されて以来、成人の重症心不全に対しては心臓移植が行われるようになっているが、小児に関しては海外に頼らなければならない状況が続いている。また、小児用人工心臓も本邦では使用可能とはなっていない。本研究においては、現在の使用可能なリソースを用いて、現状の法体系のもとで、可及的速やかに小児心不全の新しい治療体系を確立することを目標とする。小児重症心不全に対して、人工心臓治療・細胞治療・細胞バンキングシステムの3領域を研究開発し、有機的に融合・昇華させることで、現状では日本で行いえない心臓移植に代わりうる新しい治療体系を構築する。小児に対する人工心臓治療、胎盤もしくは羊膜由来細胞をドナー細胞とする移植治療、これら細胞のバンキングシステムのいずれもが、完全に未着手の領域である。現在の研究基盤の延長線上にそれらをより強化することにより、治療選択肢の限られた小児心不全に対する強力な治療戦略を創出することができる。本年度は特に、小児重症心不全の人工心臓治療に用いる細胞のバリデーションとそれらのバリデーションされた細胞(胎盤・羊膜由来細胞)を用いた動物実験、胎盤・羊膜由来細胞のバンキングを行った。ブタを用いた前臨床研究においては、心筋梗塞モデル動物の作出から、細胞治療の効果判定までを一貫して出来る体制を構築できたことは大きな成果である。小児重症心不全に対して、人工心臓治療・細胞治療・細胞バンキングシステムの3領域を研究開発し、有機的に融合・昇華させることで、現状では日本で行えない心臓移植に代わりうる新しい治療体系を構築する。本年度は前年度に引き続き、小児重症心不全の人工心臓治療に用いる細胞のバリデーションとそれらのバリデーションされた細胞(胎盤・羊膜由来細胞)を用いた動物実験、胎盤・羊膜由来細胞のバンキングを行った。前年度に構築したブタの実験系を用いて、細胞移植における細胞漏出と、中心壊死が起こらない効率的な移植・生着の検討を行った。これらの基盤技術は、細胞のバリデーションとともに欠くことのできない重要なものであり、平成24年度以降も引き続き検討していくべき課題である。

平成25年度は再生医療関連法案が国会を通過し、再生医療に関する法整備がなされ、それに伴う規制等の見直しが行われた。本年度はそれらの法令、規制が要求する検証項目を充足する基盤データとして、小児重症心不全の人工心臓治療に用いる細胞のバリデーションとそれらのバリデーションされた細胞(胎盤・羊膜由来細胞)を用いた動物実験、胎盤・羊膜由来細胞のバンキングを行った。これらの基盤技術は、細胞のバリデーションとともに欠くことのできない重要なものであり、最終年度の総括に向けて引き続き実施していく課題である。本年度は小児重症心不全の人工心臓治療に用いる細胞のバリデーションとそれらのバリデーションされた細胞(胎盤・羊膜由来細胞)を用いた動物実験、胎盤・羊膜由来細胞のバンキングの充実と、大動物(ブタ)の実験系を用いて、細胞移植における細胞漏出と、中心壊死が怒らない効率的な移植・生着の検討を継続した。これらの基盤技術は、細胞のバリデーションとともに欠くことのできない重要なものである。脳死移植法が施行されて以来、成人の重症心不全に対しては心臓移植が行われるようになっているが、小児に関しては海外に頼らなければならない状況が続いている。また、小児用人工心臓も本邦では使用可能とはなっていない。小児を取り巻く環境は、成人における重症心不全の治療として、心臓移植、人工心臓治療、更には再生医療などが臨床において実施されているのとは対照的である。本研究においては、現在の使用可能なリソースを用いて、現状の法体系のもとで、可及的速やかに小児心不全の新しい治療体系を確立する。小児重症心不全に対して、人工心臓治療・細胞治療・細胞バンキングシステムの3領域を研究開発し、有機的に融合・昇華させることで、現状では日本で行えない心臓移植に代わりうる新しい治療体系として期待が大きい。本研究を遂行することで小児に対する人工心臓治療、胎盤もしくは羊膜由来細胞をドナー細胞とする移植治療、これら細胞のバンキングシステムに着手することができ、これらの研究基盤の延長線上にそれらをより強化することにより、治療選択肢の限られた小児心不全に対する強力な治療戦略を創出することが可能となる。最終年度において、小児重症心不全治療に用いる細胞のバリデーションに関する検討を引き続き実施した。再生医療関連法案が国会を通過し、再生医療に関する法整備がなされ、それに伴う規制等の見直しが行われた。本年度はそれらの法令、規制が施行となり、要求する検証項目を充足する基盤データの明確化が重要な課題となった。小児重症心不全の人工心臓治療に用いる細胞のバリデーションとそれらのバリデーションされた細胞(胎盤・羊膜由来細胞)を用いた動物実験、胎盤・羊膜由来細胞のバンキングを引き続き実施した。これらの基盤技術は、細胞のバリデーションとともに欠くことのできない重要なものであり、研究期間終了後も引き続き実施していく課題である。
アリ類における外分泌腺構造のカスト間比較と女王シグナルの進化

昨年度に引き続き、外分泌腺構造のカスト間差の調査を継続した。特に昨年度の研究から明らかになった後胸側板腺のサイズ差に注目し調査した。後胸側板腺のカスト間のサイズ差は女王の形態と関係があった。有翅女王種では、そのサイズ差は顕著で、有翅女王は働きアリに比べて分泌細胞の数が非常に多く、それぞれの細胞サイズも大きかった。一方、無翅女王種のLeptogenys属ではいずれの種でも女王と働きアリ間の差は顕著ではなかった。一見有翅女王に似た胸部形態をもつが無翅であるOdontomachus属の1種では、有翅女王種とよく似たカスト間差を示した。後胸側板腺はアリに特有の分泌腺で、抗菌物質を分泌していると考えられているが、その機能はまだ明確ではない。この分泌腺の女王シグナルとしての機能を検討するため、有翅女王をもつOdontomachus属の1種の多女王コロニーで一部の女王の後胸側板腺分泌口を人為的に塞ぎ、働きアリの女王に対する行動を調査したが、塞がなかった個体との間で明確な違いはなく、シグナルとしての機能は明らかではなかった。様々な社会構造をしめすハリアリ類の女王(あるいは受精産卵働きアリ)と働きアリ間の外分泌腺およびそのほかの内部形態の比較を行った。まだ種数が十分ではなく、一般論として述べることはできないが、形態的女王は以下の外分泌腺の大きさが働きアリよりも著しく大きかった。(1)後胸側板腺後胸側板腺はハチ目のなかでアリだけにみられる特有の分泌腺で、抗菌物質を分泌しているといわれているが、その機能はまだ明確ではない。今回明らかになったカスト差はその機能を考えるうえで非常に興味深い。(2)デュフォー腺Leptogenys diminutaについては分泌物質の化学組成も検討し、女王と働きアリ間ではサイズだけではなく、分泌物も異なることが明らかになった。この結果は同じ分泌腺でもカスト間で機能差があることを示唆している。(3)受精嚢腺。受精産卵働きアリを持つ種での産卵個体と労働個体間の比較をトゲオオハリアリでおこなった。本種では受精嚢と受精嚢腺の大きさが機能的カスト間で著しく異なり、これらは受精の可能性と無関係に卵巣発達とともに発達することが示唆された。本種では、羽化後に翅芽を噛りられると働きアリになり、翅芽を持った個体がコロニー内にいない状況で羽化した個体のみ翅芽を保持し続け、その個体だけがオスと交尾できることが知られている。この機能的カスト分化のプロセスを詳しく検討したところ、翅芽保持個体は羽化後に腹部末端節にオス交尾器を受け入れる器官を発達させるが、翅芽を噛り取られた個体はそのような器官が発達しないことが明らかになった。この器官は、いくつかのハリアリ類の女王でも観察されており、トゲオオハリアリは「女王のいないハリアリ」ではなく、形態分化が羽化後に生じる著しくユニークなアリであることが明らかになった。
ベトナムの実験農場における高病原性鳥インフルエンザウイルス浸淫状況調査

ハノイ近郊農家の家禽、ブタから検体を採取した。平成20年度は豚13.3%(8/60)、アヒル8.6%(126/1470)から、21年度は豚80.9%(242/299)、アヒル87.8%(527/600)、鶏55.4%(332/599)から、22年度は豚30.7%(92/300)、アヒル18%(108/599)、鶏22.7%(136/599)からインフルエンザウイルスA型遺伝子が検出された。その内20年度検体からはH6N1亜型、H9N2亜型を分離したものの、H5N1亜型は分離されなかった。解析の結果、ベトナム株は日本を含む極東地域の株に近く、渡り鳥が伝搬に関与する可能性が示された。15年17年に流行したH5N1亜型は、現時点では北部ベトナムでは顕著な侵淫は認められない。ベトナム獣医師会(VVA)、ベトナム国立衛生疫学研究所(NIHE)の協力を得、北部ベトナムハノイ近郊にあるタンオアイ地区リンチャウ村にある家畜肥育農家のうち野鳥の飛来に有利となる水源(河川、湖沼)に近接し、かつ家禽とブタとを近接飼育する農家10戸からインフルエンザが流行する冬季および春先(本年度2月、および3月)にかけて連続して家禽およびブタからサンプリングを行った。ブタは調査期間中同じ個体からサンプリングを行い、家禽は同様に同じ家禽群(herds)からサンプリングを行った。合計20頭のブタより鼻腔ぬぐい液および血清各々約80検体採取した。家禽合計約1,000個体より咽頭ぬぐい液および総排泄腔ぬぐい液各々約1,000検体を採取した。調査の期間家禽およびブタに大きな損耗は見られなかった。それぞれのぬぐい液をリアルタイムPCR法(タックマン法)を用いて検討したところ調査期間中肥育された家禽およびブタにおいてはH5N1ウイルス感染を確認できなかった。また同検体をRT-PCR法にて検討したところ家禽(アヒル)においてはほぼ前例が何れかのInfluenza Aウイルスの感染が示唆された。一方ブタは肥育開始時(2月)では全例がInfluenza A陰性であったものが、3月においてはそのうち約25%が陽性となった。以上の結果は途中経過であり現在も検討を進めている。また陽性となったInfluenza Aの亜型の検討も進めている。H21年度はベトナム獣医師会(VVA)、ベトナム国立衛生疫学研究所(NIHE)の協力を得、北部ベトナムハノイ近郊にあるダンフオン村にある家畜肥育農家のうち野鳥の飛来に有利となる水源(河川、湖沼)に近接し、かつ家禽とブタとを近接飼育する農家10戸からインフルエンザが流行する冬季(1月、2月、3月)に連続して家禽およびブタからサンプリングを行った。アヒル、鶏、ブタそれぞれ600羽、600羽、および300頭から、家禽は咽頭ぬぐい液および総排泄腔ぬぐい液、ブタは鼻腔ぬぐい液をそれぞれ採取した。そのうち、アヒル由来検体の約80%、鶏由来検体の約50%、ブタ由来検体の約80%からインフルエンザM遺伝子が検出された。それらの検体からインフルエンザウイルス分離を試みる。一方H20年度に採取したアヒル由来検体2,919検体中253(8.7%)検体からM遺伝子が検出され、そのうち22検体(0.75%)からインフルエンザウイルスが分離された。その内訳は1株がH9N2亜型、21株がH6N1亜型であった。採取した検体を用いたRT-PCR法にて得られたインフルエンザ亜型は、その検体から分離したウイルス亜型とほぼ一致した。本年度は引き続き全塩基配列を決定する。H5N1亜型は分離されなかった。ブタ由来検体60検体中8(13%)検体からM遺伝子が検出されたものの、ウイルス分離には至らなかった。ブタ由来検体より直接RT-PCR法を用いてHA亜型決定を試みた処、季節性インフルエンザH1N1(ヒト型)が検出された。

H22年度はベトナム獣医師会(VVA)、ベトナム国立衛生疫学研究所(NIHE)の協力を得、北部ベトナムハノイ近郊にあるダンフオン村にある家畜肥育農家のうち野鳥の飛来に有利となる水源(河川、湖沼)に近接し、かつ家禽とブタとを近接飼育する農家10戸からインフルエンザが流行する冬季(12月、1月、2月)に連続して家禽およびブタからサンプリングを行った。アヒル、鶏、ブタそれぞれ600羽、600羽、および300頭から、家禽は咽頭ぬぐい液および総排泄腔ぬぐい液、ブタは鼻腔ぬぐい液をそれぞれ採取した。そのうち、アヒル由来検体の約18%、鶏由来検体の約23%、ブタ由来検体の約30%からインフルエンザM遺伝子が検出された。こられの陽性検体からウイルス分離を試みた。H21年度に採取したアヒル由来検体1,197検体中916検体、ニワトリ由来検体1,193検体中549検体、ブタ由来検体299中235検体からM遺伝子が検出された。昨年度はそれらの検体から、インフルエンザウイルスは分離されなかった。一方H20年度に採取したアヒル由来検体から分離された、H9N2亜型1株、H6N1亜型21株の全ての株のHA、NA遺伝子を決定し、うち9株に関して全塩基配列を決定した。系統樹解析の結果、ベトナム分離株は日本を含む極東地域からの分離株に近く、East Asian Flywayを通る渡り鳥がウイルスの伝搬に寄与している可能性が示唆された。
閉口筋筋紡錘及び歯根膜機械受容器を支配する三叉神経中脳路核ニューロンへの入力様式

コネキシン(Cx)ファミリーはギャップジャンクションを形成するタンパク質であり多くの脊椎動物の組織に広く認められている。ギャップジャンクションは神経回路の発達において重要な役割を果たすことが近年の研究より明らかとなってきた。これまでに16種類のコネキシンタンパクが報告されているが、その中でも発育中あるいは成獣マウスの脳に認められる主なものとしてCx26,32,36,43が挙げられている。本年度の研究ではこの4種類の抗体を用いた免疫電顕を行い、コネキシンタンパクの細胞内での分布様式を検索するとともに、幼若動物でのギャップジャンクションの存在を明らかにする。動物は生後1、6、14、21日齢および成獣マウスを用いた。三叉神経中脳路核および運動核を含む断面の切片を作製し、Cx26,32,36,43に対するポリクロナル抗体を用いて免疫組織化学的検索を行い光学顕微鏡ならびに電子顕微鏡にて観察した。Cx32は三叉神経中脳路核ニューロン、三叉神経運動ニューロンともに幼若動物では約5割のニューロンに認められ、その後成長に伴って陽性細胞の割合はさらに増加した。Cx26,36,43は逆に幼若ニューロンに多く認められ、成長に伴って陽性細胞の割合は減少した。電子顕微鏡による観察の結果、Cx26,36はニューロンの細胞体全体に広く陽性反応が認められた。Cx32は細胞体および核内にも陽性反応が認められ、Cx43は細胞体内に弱い陽性反応と、核内に強い陽性反応が認められた。また咬筋に逆行性トレーサーを注入し、標識されたニューロンを電子顕微鏡にて観察することにより、生後5日齢の咬筋運動ニューロン間でのギャップジャンクションの存在が形態学的にも明らかとなった。以上のことより、コネキシンタンパクの細胞内における局在はisoformの違いにより異なること、また成長とともに強く発現するisoformの種類も異なることが示唆された。これまでに16種類のCxタンパクが報告されているが、その中でも発育中あるいは成獣マウスの脳に認められる主なものとしてCx26,32,36,43が挙げられている。Cx36およびCx26はニューロンに存在し、Cx32およびCx43はダリアに認められる。本研究では三叉神経中脳路核ニューロンと三叉神経運動ニューロンにおけるCx26およびCx36の発現を免疫組織化学的手法を用いて生後経日的に観察し、三叉神経ニューロンへの多様な入力様式の変化についての検索を行った。三叉神経中脳路核および運動核を含む断面の切片を作製し、Cx26、Cx36に対するポリクロナル抗体を用いて免疫組織化学的検索を行い光学顕微鏡にて観察した。Cx26は三叉神経中脳路核ニューロン、三叉神経運動ニューロンともに観察に用いた全ての齢で認められた。生後1日、6日齢のマウスでは強い免疫反応を示したが免疫反応の強さは発育に伴い減少した。三叉神経運動核におけるCx36の発現は生後1日齢で最も強く認められるが次第に減少し、生後14日齢では三叉神経運動核では運動ニューロンに非常に弱い免疫反応が認められ、小型のインターニューロンにやや強い免疫反応が認められた。成獣ではインターニューロンにのみCx36の免疫反応が認められた。三叉神経中脳路核ニューロンにおけるCx36の発現は生後1日齢で最も強く発育とともに減少し、成獣では非常に弱い免疫反応が認められた。以上の結果より、Cx26およびCx36は生後すぐに強い発現を示すことが明らかとなった。さらに離乳の時期にCx36が三叉神経運動核内のインターニューロンに発現することが明らかとなった。これらのことよりギャップジャンクションの形成が出生後早い段階での顎運動の神経回路発達に大きく関与することが示唆される。また、成獣三叉神経中脳路核ニューロンおよび三叉神経運動核内のインターニューロンにおけるCx36の発現は、ギャップジャンクションが顎運動の神経回路形成の成熟にも関与していることを示唆している。

電子顕微鏡による観察の結果、Cx26,36はニューロンの細胞体全体に広く陽性反応が認められた。Cx32は細胞体および核内にも陽性反応が認められ、Cx43は細胞体内に弱い陽性反応と、核内に強い陽性反応が認められた。また咬筋に逆行性トレーサーを注入し、標識されたニューロンを電子顕微鏡にて観察することにより、生後5日齢の咬筋運動ニューロン間でのギャップジャンクションの存在が形態学的にも明らかとなった。以上のことより、コネキシンタンパクの細胞内における局在はisoformの違いにより異なること、また成長とともに強く発現するisoformの種類も異なることが示唆された。
ホウ素欠乏による障害発生メカニズムの解明

ホウ素は植物の微量必須元素である。ホウ素を含まない培地にシロイヌナズナを移植すると1時間以内に根端伸長領域で細胞死が発生する。ホウ素は細胞壁でペクチンを架橋してゲル化させ、細胞壁構造を安定化させる役割を担う。したがってこの迅速な細胞死は細胞壁の構造異常が原因で発生すると推定されるが、具体的なメカニズムは不明である。そこでホウ素欠除処理に対するシロイヌナズナの応答の詳細な解析を進めている。前年度までの検討で、ホウ素欠除処理による細胞死と病原菌感染時にみられるプログラム細胞死(PCD)の間では、いずれも活性酸素分子種(ROS)および一酸化窒素の蓄積を伴うこと、新規タンパク質の合成が必要であること等の共通点が見出される。しかし30年度に行った検討では、ホウ素欠除に伴う細胞死においてはTUNEL法で検出されるDNA断片化は観察されなかった。またPCDでは液胞に局在するcaspase-1様タンパク質VPEが必須の役割を果たしており、vpe欠失変異株ではPCDは生じない。しかしホウ素欠除による根端細胞の細胞死は、vpe欠失変異株でも野生型株に比べ軽減されなかった。これらの結果から、ホウ素欠除に伴う根端細胞の急速な細胞死は病原菌感染時のPCDとは異なる機構で進行すると推定した。ホウ素欠乏で特異的に誘導される遺伝子の探索については、トマトおよびソルガムにおいて、ホウ素欠乏とカルシウム欠乏で共通の遺伝子が誘導されることを前年度までに見出していた。30年度は更にセロリを材料として検討を行った結果、同様に両元素の欠乏で類似した遺伝子発現変化が誘導されることが示された。複数の植物種で同様の結果が得られたことは、両元素の欠乏が細胞にもたらすインパクトが共通であることを示唆し、ホウ素欠乏障害の発生機作解明に資する知見が得られたと考える。本研究課題の主目的であるホウ素欠乏による障害発生メカニズムの解明については、当初の予想に反する結果ではあるが、急速な細胞死は病原菌感染時のPCDとは異なることを明らかにし、細胞壁強度の測定についても原子間力顕微鏡を用いた実験系がほぼ確立されたことから、最終年度終了時までに一定の結果を得られる見込みである。このためおおむね計画通りに進行していると判断した。30年度までの研究により、ホウ素欠除処理に伴うシロイヌナズナ根の細胞死は、病原菌感染に伴う典型的なPCDではないものの、その誘導にはROSの蓄積が不可欠であることが確認された。したがって、ホウ素欠除による細胞死誘導機構の解明とは、ホウ素欠除時にROSがなぜ・どのように急速に生成蓄積するか理解することと同義と考えるに至った。そこで今後は、ROSを生成する分子装置の同定を目的として、ペルオキシダーゼ、NADPHオキシダーゼの欠失変異株における細胞死について検討を進める。またROS生成をもたらす直接の刺激は細胞壁の強度低下に伴う細胞膜の局所的変形であるとの仮説を検証する。細胞壁の強度変化を定量的に評価するため、現在原子間力顕微鏡を用いて細胞壁強度の測定を進めている。ホウ素欠乏特異的に誘導される遺伝子の探索については、カルシウム欠乏誘導遺伝子との重複が多く容易ではないことが改めて確認された。そこで最終年度においては、ホウ素欠乏特異的遺伝子を新規に探索するのではなく、カルシウム欠乏との共通性が具体的にどの程度であるか明確にすることに注力する。ホウ素を含まない培地にシロイヌナズナを移植すると、1時間以内に根端伸長領域で細胞死が発生する。そこでホウ素欠除処理に対するシロイヌナズナの応答の詳細な解析を行った。ホウ素欠除処理を行った根端組織には活性酸素分子種(ROS)および一酸化窒素(NO)が蓄積する。29年度は、これらの分子種と細胞死との関連について検討した。ホウ素欠除処理と同時にラジカル消去剤を添加すると細胞死は抑制された。またNO生合成変異株では、ホウ素欠除処理に伴う根端へのNO蓄積が著しく抑制されるとともに、細胞死も軽減された。これらの結果から、ROSおよびNOがホウ素欠除処理で誘導される迅速な細胞死に直接関与していることが示された。ホウ素欠除処理時の遺伝子発現変化をRNAシークエンシングにより解析した結果、病原菌感染応答との類似度が高かった。病原菌感染時には過敏感反応のひとつとしてプログラム細胞死(PCD)が誘導され、その過程にはROSおよびNOが必要である。したがって、ホウ素欠除処理で誘導されるシロイヌナズナ根端の細胞死も、過敏感反応と同様の機構で誘導されるPCDである可能性が示唆された。シクロヘキシミド添加により新規タンパク質の合成を阻害するとホウ素欠除で誘導される細胞死が軽減されたことは、この仮説を支持する。現在、PCDの関与について更なる証拠を得るため、DNA断片化等の特徴が見られるか検討を進めている。本研究課題の主目的であるホウ素欠乏による障害発生メカニズムの解明については、欠除処理に伴う迅速な細胞死に一酸化窒素分子が関与することを明確に示すことができた他、プログラム細胞死であることを示唆する結果も得られつつあり、迅速な応答の背景にあるメカニズムの解明に向け順調に進展していると考える。研究計画に掲げたもう一つの目標であるホウ素欠乏