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亀鈕印の分析に基づく漢王朝による諸地域制度の統合に関する研究

本研究は、亀鈕印の形状分析をとおして、漢王朝による諸地域制度の統合過程を検討したものである。結果として、漢の亀鈕印は戦国楚の文化的影響を受けたものであり、前漢武帝期に正式に制度化され、亀を臣下の象徴とする思想とともに、前漢末に造形形式が固められていったことが明らかになった。武帝期以降の漢王朝は、楚に代表される南方の文化をも取り入れながら、秦とは異なる新しい制度を創りあげていったのである。データベースの作成については、昨年度から継続して、各種美術書や図録に掲載されているデータを追加入力し、充実に努めた。出張を伴う学会報告や各種調査については、年度の後半を中心に実施した。11月、「出土資料与戦国秦漢社会転型研究」国際学術研討会(中国社会科学院主催、於杭州)において研究成果を発表するとともに、復旦大学中古史読書班の諸氏と江蘇省各地で調査を実施し、徐州博物館・淮安市博物館・南京市博物館で漢代を中心とする亀鈕印を多数実見したほか、当地の主要な諸侯王墓をすべて訪れ、発掘中の大雲山漢墓にも入ることができた。12月には、上海博物館の葛亮・孔品屏両氏の協力で、当館所蔵の主要な戦国魏晋の亀鈕印の詳細な調査(一部計測を含む)を実施した。3月には、「皇帝・単于・士人:中古中国与周辺世界」工作坊(南京大学高等研究院主催、於南京)で研究成果を報告し、南京博物院や南京市内・近郊において現地調査を実施した。また、訪中を重ねる過程で、上海博物館の孫慰祖研究員・湖南大学の陳松長教授・徐州博物館の呂健氏ら印章・封泥に造詣の深い諸氏と意見交換を行い、大いに知見を深めたほか、復旦大学の周振鶴教授・李暁傑教授(歴史地理学)や南京大学の張学鋒教授(考古学)から、本研究の発展方向について助言を得ることができた。〔データベースの作成〕国内外の博物館・美術館の図録本や印譜を活用して、現存する亀鈕印のデータベース化を進めている。本年度は羅福頤〔編〕『秦漢南北朝官印徴存』(文物出版社、1987年)・孫慰祖〔主編〕『両漢官印匯考』(上海書画出版社・大業公司、1993年)両書所掲のものを中心に、入力作業を行った。〔図録本の活用〕『中華五千年文物集刊』璽印編(中華五千年文物集刊編輯委員会、1985年)・『中国美術全集』書法篆刻編7「璽印篆刻」(上海書画出版社・上海人民美術出版社、1989年)に掲載された亀鈕印の写真を整理し、今後の形状分析のための基礎的なデータを蒐集した。これによって、時代ごとの形状の変化に関する初歩的な見とおしを得たが、確定・公表できる段階には至っていない。〔実見調査〕8月、南京市博物館および東晋博物館・江寧博物館(いずれも江蘇省南京市)において、先秦魏晋期の亀鈕印を実見した。また、3月には湖南省の湘西地域を訪れて、亀鈕印を生み出したと目される中国南方の(現在では少数民族とされている人々の)文化・風俗をつぶさに調査するとともに、慈利博物館(湖南省張家界市)・荊州博物館(湖北省荊州市)をはじめとする各地の博物館において、先秦魏晋期の印章を実見した。その中には、これまで注目されていなかった貴重な遺物も含まれている。〔成果の公表〕3月、武漢大学簡帛研究中心において、「日本所蔵漢代印章和封泥ー以諸侯王印、少数民族印為中心」と題する講演を行い、亀鈕を含む動物鈕の起源や制度化・変遷のプロセスについて、現地の研究者と意見を交換した。亀鈕印を含めた漢印の検討、ならびにそれに基づく漢代の天下秩序・国家秩序に関する考察の成果を2篇の論稿にまとめ、国際学会において報告した。これらはいずれも、2015年度中に中国で公刊される予定である。また、湖南大学岳麓書院の陳松長教授とは、3月に1回(於長沙)・8月に2回(於成都・長沙)面会し、研究遂行上の貴重な示唆を得たほか、湖南出土の亀鈕印に関して具体的な意見交換も行った。湖北出土の異民族印については、武漢大学の魏斌教授と継続的に情報交換を重ね、出土地点の歴史地理学的意義も含めた多角的な検討を続けている。〔最終年度に実施した研究の成果〕(1)調査の実施6月、中国の山西省・内蒙古自治区において、漢印ならびに漢代の遺物・遺跡の実見調査を実施した。このほか、2月3月にかけて、和泉市久保惣美術館、岩手県立博物館、篆刻美術館(古河市)、国立歴史博物館(台北)、中央研究院文物陳列館(台北)でも漢印・漢代遺物の調査を行った。これらの調査をとおして、漢印(亀鈕印)の造形や制度の変遷について、いっそう具体的な知見を得ることができた。(2)成果の公表8月、第9届中国中古史青年学者国際会議(於武漢大学)において、研究成果の一部を報告した。また、大同市博物館(6月)・広西師範大学(11月)

・武漢大学(11月)でも、本研究の成果を取り入れた学術講演を行った。〔研究期間全体を通じて実施した研究の成果〕漢代亀鈕印の成立・展開に関しては、1武帝期以前から私印に亀鈕を用いる習慣が広範囲に存在していたこと、2王莽期に造形上の新しい展開がみられ制度が充実してくること、3造形のバラエティについては地域差よりも時代差のほうが強く影響していること、の3点が明らかになった。このうち23に関しては、研究開始前には武帝期における大きな変化を想定していたが、研究の結果、むしろ前漢後半期の変化のほうが重要であったらしいことが示唆された。これは、印制と関わる政治思想・官僚制度の展開過程とも合致しており、両者を結びつけたさらなる検討が急がれる。とりわけ、王莽期における亀鈕印には、王莽の行った官制改革と連動した独特の運用がみられ、注目に値する。この問題に関しては、現在、学術論文の形で成果の公表を準備しているところである。本研究は、亀鈕印の形状分析をとおして、漢王朝による諸地域制度の統合過程を検討したものである。結果として、漢の亀鈕印は戦国楚の文化的影響を受けたものであり、前漢武帝期に正式に制度化され、亀を臣下の象徴とする思想とともに、前漢末に造形形式が固められていったことが明らかになった。武帝期以降の漢王朝は、楚に代表される南方の文化をも取り入れながら、秦とは異なる新しい制度を創りあげていったのである。年度途中に入院を伴う長期に亙る体調不良があり、海外での研究成果報告や調査を見合わせなければならない事態が複数回あった。現在はすでに回復しており、2015年度の研究実施に支障はないが、現地(とくに北京)における印章の実見調査が遅延したことの影響は免れない。また、調査先として予定していた湖南省博物館(本研究にとって決定的な意味をもつ、初期の亀鈕印が収められている)が長期改修中であることも、遅れの原因として挙げられる。中国古代史北京ならびに山東・山西・湖北・陝西における遺物・遺跡の現地調査に関しては、すでに現地との折衝を進めており、山西・湖北については具体的な時期もおおよそ決まっているため、今後は概ね順調に進められるものと思われる。湖南についても、調査先との交渉は済んでいるが、博物館の改修じたいが2015年度内には終わらないとの情報を得ており、研究期間内に実現しない可能性が高い。これについては、現在のところ、写真版の入手によって当面の解決を図ることを検討している。8月に大型国際学会を主催したことや、身辺で不測の事態が発生したことなどから、年間を通じてコンスタントに研究を進めることはできなかったが、技術的にもっとも困難を伴う印章の実見調査は順調に進行しており、次年度以降の実施に関しても下準備が整い、最終年度までに計画以上の成果を挙げることができる見込みである。データベースの作成・図録本の活用については、計画どおり順調に進行している。成果の公表については、予定より多くの口頭報告を実施することができたほか、現在待刊中の論考が1本あり、計画にほぼ沿う形で進んでいる。データベースの作成・図録本の活用については、計画にほぼ沿って進行中である。博物館での実見調査に関しては、日程の確保や関係機関との調整が順調に進まず、当初計画していたかたちでは進まなかった。とりわけ南京博物院については、改修工事が終了する2014年までは調査の実施が不可能であることから、延期を余儀なくされている。が、その一方で、計画していなかった場所において調査の機会を得ることができたことから、トータルでみれば順調に進んだということができる。また、今年度実施できなかった上海博物館の調査については2013年11月に実施できることが決まり、その他の場所での調査についても今年度のうちにおおよその目途がついたことから、将来に向けた準備は計画以上に進行したものと考える。成果の公表については、予定どおりに口頭報告を実施することができた。
内軟骨性骨化における後縦靭帯骨化症関連遺伝子STK38Lの役割と標的分子の解析

後縦靭帯骨化症(OPLL)臨床サンプルにおけるSTK38Lの発現について、免疫組織化学染色(IHC)による検出が、条件検討の末可能となった。その結果、OPLLは靭帯が変性して内軟骨性骨化様のプロセスを経て骨化に至ることが指摘されているが、STK38Lは、その軟骨様変性靭帯に発現を認めた。一方で、変性のない正常靭帯部の細胞には染色性を認めなかった。このSTK38L陽性細胞は、リン酸化SMAD2/3抗体も陽性という結果になり、後縦靭帯の軟骨様変性にはTGF-βシグナルが関わっていること、その時STK38Lも出現することから、なんらかの関連が疑われた。STK38LのIHCの結果から、軟骨変性における役割が強く示唆されたので、in vitro実験としてより軟骨の表現型を反映するATDC5細胞のmicromass culture実験を行なった。その結果、monolayer cultureではSTK38Lの発現は分化誘導前後で変わらなかったが、micromassでは分化誘導によって発現が増加した。この時STK38LのsiRNAノックダウンにより、軽度分化が亢進した。したがって、臨床サンプルのIHCの結果と併せて考えると、STK38Lは靭帯細胞の軟骨変性によって発現が増えて、機能的には軟骨分化を抑えるブレーキ役になっている可能性が示唆された。一方、STK38Lはp21蛋白をリン酸化して不安定化させる事で、細胞周期のG1/S期移行を促進する事が報告されていたので、ノックダウンしてWST assayで確認すると、確かにcell growthは抑制された。軟骨細胞が分化成熟して骨化へ移行するためには、細胞分裂を止めて肥大軟骨になる必要があるので、STK38Lはここを阻害する事でOPLL形成に負に働いている可能性が示唆された。1)間葉系細胞の分化決定と成熟過程におけるSTK38Lの機能解析靭帯細胞のモデルとして線維芽細胞NIH3T3、前駆軟骨細胞にC3H10T1/2、分化決定後軟骨細胞にATDC5、前駆骨芽細胞として骨髄ストローマ細胞ST-2、分化決定後骨芽細胞にMC3T3-E1(clone 4)に対して、Stk38l siRNAを作用させ、それぞれの分化系における変化を解析した。分化の方向と程度の評価は、それぞれの分化マーカーを主にqRT-PCRで評価した。具体的には、線維芽細胞はCol1a1やCol3a1等、軟骨細胞は、Sox9, Col2a1, Acan, Col10a1, Mmp13等、MSC様細胞への脱分化にはCD44, Endoglin, Nucleostemin, STRO-1等、骨芽細胞分化はRunx2, Sp7, Col1a1, Alpl, Bsp, Osteocalcin等を検討した。また、軟骨細胞分化は、monolayer cultureとmicromass cultureを用いて、アルシアン・ブルー染色で軟骨基質を、成熟石灰化はvon Kossa染色でも検出した。骨芽細胞分化は、ALP染色で初期分化を、後期基質石灰化をvon Kossa染色で評価した。基質染色でマーカー発現との整合性を常にモニタリングすると共に、分化過程におけるStk38l自体の発現変化も追跡した。2)OPLL組織切片に対してSTK38Lの免疫組織化学染色を行った。LSBio社の抗体は、ウエスタン・ブロットと免疫染色に使える事を確認しているが、OPLL組織における明らかな染色性は得られなかった。3)C57BL/6Jマウスの胎生16.518.5日、および生後3日までの発生期と、3ヶ月から6ヶ月齢のadultの骨リモデリング期の大腿骨遠位1次骨化中心部(内軟骨性骨化)と頭蓋冠(膜性骨化)を採取し、Stk38l蛋白レベルの局在を解析した。また各種臓器からのRNA解析により、Stk38lの発現分布(ユビキタスか骨格特異的か)を確認した。OPLL組織採取とそこからの初代培養細胞樹立であるが、OPLLの手術症例に関して前方アプローチにより充分に採取できる症例がなかった為にできていないが、来年度以降に施行予定である。また、STK38Lのアデノウイルス作成は、293細胞の調子が悪く満足できる力価が得られていないので、条件設定を行なっている。マウス各種細胞株を用いてStk38lのsiRNAノックダウンを行なった結果、骨芽細胞分化成熟は亢進した。しかしST-2やC3H/10T1/2などの未分化細胞で検討すると、骨芽細胞へのcommitは抑制され、軟骨細胞分化は促進した。すなわちSTK38Lは骨軟骨分化ポテンシャルを有する未分化細胞の分化を骨芽細胞方向にシフトする機能が予測された。後縦靭帯骨化症(OPLL)の病因として、後縦靭帯が肥厚・変性し軟骨細胞様に分化し、内軟骨性骨化に似た形態を取ることも指摘されていることから、STK38LがOPLL発症初期(軟骨様変性期)には抑制的で、OPLL形成期(骨芽細胞分化期)には促進的にはたらく事が予測された。STK38Lはセリン・スレオニン・キナーゼ(リン酸化酵素)であるが、骨と軟骨の分化に促進的な骨形成蛋白(BMP)シグナルも受容体および下流伝達因子SMADのセリン残基のリン酸化を介してシグナル伝達が進む事から、STK38Lの分化調節効果は、BMPシグナルを介する可能性を考えた。

軟骨細胞ATDC5においてBMP-6刺激によるSmad1/5/8のリン酸化へのsiStk38lの影響をウエスタン・ブロットで解析すると、十分なノックダウンが得られたにも関わらず、Smadのリン酸化レベルは変わらなかった。そこで、STK38LのSMAD以外のリン酸化基質を検索する為に、セリン・スレオニン・キナーゼ基質ペプチド・アレイ(CelluSpots)解析をCOS-7細胞におけるtransient transfectionでの強制発現系で行なった。その結果、tau蛋白のリン酸化レベルの低下を検出した。tauはアルツハイマー病と関連の深い蛋白であるが、骨軟骨細胞分化との関わりは全くなく、さらなる解析が新たな知見を導く可能性が浮上した。STK38L発現アデノ・ウイルスは完成している。In vitroにおけるノックダウンによる骨軟骨細胞分化へのSTK38Lの影響の評価はほぼ終了している。そもそもSTK38LがOPLL発症に関与するのか、それはOPLL臨床組織における発現の有無にかかっており、これについて最終的な評価をする。具体的には、STK38Lの免疫組織化学染色であるが、その条件設定は終了している。後縦靭帯骨化症(OPLL)臨床サンプルにおけるSTK38Lの発現について、免疫組織化学染色(IHC)による検出が、条件検討の末可能となった。その結果、OPLLは靭帯が変性して内軟骨性骨化様のプロセスを経て骨化に至ることが指摘されているが、STK38Lは、その軟骨様変性靭帯に発現を認めた。一方で、変性のない正常靭帯部の細胞には染色性を認めなかった。このSTK38L陽性細胞は、リン酸化SMAD2/3抗体も陽性という結果になり、後縦靭帯の軟骨様変性にはTGF-βシグナルが関わっていること、その時STK38Lも出現することから、なんらかの関連が疑われた。STK38LのIHCの結果から、軟骨変性における役割が強く示唆されたので、in vitro実験としてより軟骨の表現型を反映するATDC5細胞のmicromass culture実験を行なった。その結果、monolayer cultureではSTK38Lの発現は分化誘導前後で変わらなかったが、micromassでは分化誘導によって発現が増加した。この時STK38LのsiRNAノックダウンにより、軽度分化が亢進した。したがって、臨床サンプルのIHCの結果と併せて考えると、STK38Lは靭帯細胞の軟骨変性によって発現が増えて、機能的には軟骨分化を抑えるブレーキ役になっている可能性が示唆された。一方、STK38Lはp21蛋白をリン酸化して不安定化させる事で、細胞周期のG1/S期移行を促進する事が報告されていたので、ノックダウンしてWST assayで確認すると、確かにcell growthは抑制された。軟骨細胞が分化成熟して骨化へ移行するためには、細胞分裂を止めて肥大軟骨になる必要があるので、STK38Lはここを阻害する事でOPLL形成に負に働いている可能性が示唆された。OPLL組織の採取、STK38Lアデノウイルス作製に引き続き挑む。STK38Lのリン酸化標的分子の検索と同定について、Intavis社のCelluSpots-serine/threonine kinase substrate peptide arrayを用いて、serine/threonine kinaseであるStk38
横光利一と大正文学の象徴主義―草稿に基づいて―

(I)草稿研究による横光利一の文体・作品分析初年度に収集した草稿類は本人によって塗りつぶされるなどしており有効に分析を行えなかった。そのため、昨年度と同様、材源から作品の生成過程を明らかにするというアプローチを採った((III))。(II)近代小説における象徴主義昨年度に収集した象徴主義に関する資料を分析し次のような点を明らかにした。1、明治期における日本の自然主義はそれ自身が象徴主義へと深化しようとしたので、日本では自然主義に抗するという形での象徴主義は生じ得ず、自然主義の衰退に伴ってその内部に含まれた象徴主義も開花の機を失った。2、大正期の文壇では再び様々な形で象徴主義の必要性が叫ばれたが、横光ら新感覚派の登場はその状況と密接に関係していた。なお、この研究は論文にまとめて学会誌に発表した。(III)横光利一「ナポレオンと田虫」の構成この研究では第一に、横光の「ナポレオンと田虫」が少なくとも『大奈翁伝』と『ナポレオン物語』とを材源にしていることを明らかにした。次に材源との比較によってこの作品で横光が以下のような点を虚構化して描いていることがわかった。1、ナポレオンが皮膚病に伝染したのを、彼の出世の端緒となったロジの戦いの出来事とした。2、すぐに完治したはずの皮膚病をロシア遠征の頃まで悪化させ続けた。3、ナポレオンが患った皮膚病を、疥癬ではなく田虫にした。4、ナポレオンの皮膚病を嫌忌する人物を前妻ジョセフィーヌではなく新皇后ルイザにした。これらをもとに考察した結果、報告者はこの作品が階級闘争に目を奪われるプロレタリア文学陣営をナポレオンに見立てて描いたものであるという結論を得た。なお、この研究は研究発表として学会で報告した。(I)草稿研究による横光利一の文体・作品分析初年度は『時間』『上海』について、その草稿の写真を入手した。加えて、『寝園』・『家族会議』の創作メモ(宇佐市民図書館蔵)の撮影を行った。結果として、初年度に予定していた資料収集については期待以上の収穫を得ることができた。(II)近代小説における象徴主義研究計画で予定していた以上に調査範囲を広げ象徴主義に関する近代の言説を探査した。結果、明治期では片山正雄、島村抱月、岩野泡鳴、田山花袋などに、大正期では本間久雄、村松正俊、宮島新三郎、前田晃、西宮藤朝などに、象徴主義への重要な言及が見られた。調査の限りで言えば象徴主義待望論の散見するのは明治三十年代末と大正六九年頃との二つの時期であり、前者は西欧文学史を参照した外発的な運動、後者は国内の自然主義爛熟の末に生じた内発的な運動であろうと考えられる。(III)横光利一「蠅」の主題横光利一の初発期の象徴的作品として広く知られる「蠅」について論文を発表した。「蠅」がリルケ「駆落」の多大な影響のもとに創作されたことを指摘し、両者の比較を通じて「蠅」の主題を「認識主体の相対性」であると読んだ。またこの解釈の蓋然性を示すため、「蠅」の執筆された大正十年前後の言説を調査し、当時「相対性理論」が流行していたことや横光がアインシュタインや「相対性理論」に関心を持っていたこととを指摘した。この研究では横光の小説における「象徴主義」の具体的な現れと横光文学と近代科学との関係の一端を示すことができた。
細胞膜脂質二重層の内層で見られる脂質集合体の挙動と相関についての電子顕微鏡解析

細胞を周囲から区切る境界である細胞膜は、様々な脂質種が一層に並び、それら2つがお互いに向き合ってできた脂質二重層にタンパク質を含んだ構造をしている。脂質二重層に注目した場合、外層と内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。この非対称分布は、外層の脂質は電気的に中性であり細胞外にある物質との不用意な相互作用を避けることができる反面、内層の脂質は細胞内にある様々な物質との相互作用ができるという点で、細胞膜の機能に重要な役割を果たしていると考えられる。ところが、ほとんどの細胞で外層と内層における脂質分布の非対称の程度は、曖昧なままである。その理由は、細胞膜だけを単離することが困難なだけでなく、二重層の各層を区別することがきわめて難しいためである。そこで本研究では、免疫電子顕微鏡法を用いて細胞膜を構成する主要な脂質の分布を明らかにすること、またそれらの相互関係についての解析に挑むことで、細胞膜の機能における脂質の役割を明らかにする事を目的としている。本年度は、非対称分布を制御する活性をもつ酵素を欠損変異させたショウジョウバエの培養細胞を用いて、細胞膜内外層におけるホスファチジルエタノールアミン(PE)およびホスファチジルセリン(PS)の分布について解析を行った。内外層の脂質を反転させるスクランブラーゼ、外層の脂質を内層に移行させるフリッパーゼの欠損変異体を用いて解析したところ、PEではどちらの変異体においてもコントロールと大差がなかったのに対して、PSではフリッパーゼ欠損変異体でコントロールよりも外層に多く分布していることが明らかとなった。これらのことから、ショウジョウバエの細胞では、少なくともPSの内外層における分布にフリッパーゼが関与している事が推測される。細胞を周囲から区切る境界である細胞膜は、数多くの脂質種が一層に並び、それら2つがお互いに向き合ってできた脂質二重層にタンパク質を含んだ構造をしている。脂質二重層に注目した場合、外界に向いた面を持つ外層と細胞内に向いた面を持つ内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。この非対称分布は、外層の脂質は電気的に中性であり細胞外にある物質との不用意な相互作用を避けなければならない一方で、内層の脂質は細胞内にある様々な物質との相互作用を必要に応じて行なう必要があるといった、細胞膜の機能そのものに重要な役割を果たしていると考えられている。その理由は、細胞内小器官の膜から細胞膜だけを単離することが困難なだけでなく、二重層の各層を区別することがきわめて難しいためである。そこで本研究では、免疫電子顕微鏡法を用いて細胞膜を構成する主要な脂質の分布を明らかにすること、およびそれらの相互関係についての解析に挑むことで、細胞膜の機能における脂質の役割を明らかにする事を目的としている。本年度は、新たに開発されたスフィンゴミエリンに結合するプローブを用いて、培養細胞の細胞膜におけるスフィンゴミエリンの分布について解析を行った。その結果、細胞の状態や極性の違いによって細胞膜を構成する脂質分子の2次元的な分布を変化させていることが示された。培養細胞の細胞膜におけるスフィンゴミエリンの分布を、SDS処理凍結割断法やrip-off免疫電子顕微鏡法を用いて解析した。その結果、上皮構造を形成させたMDCK細胞のアピカル膜とバソラテラル膜や、A型ニーマンピック病の患者に由来する細胞とそのコントロールとしてのノーマルの細胞の細胞膜では、スフィンゴミエリンの分布状態が異なっていることが明らかとなった。これらのことから、細胞の分化状態や極性の違いに応じて細胞膜を構成する脂質分子種の分布に変化が起こっていることが明らかとなった。脂質二重層に注目した場合、外界に向いた外層と細胞内に向いた内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。この非対称分布は、外層の脂質は電気的に中性であり細胞外にある物質との不用意な相互作用を避けることができる反面、内層の脂質は細胞内にある様々な物質との相互作用を必要に応じて行なうことができるという形で、細胞膜の機能に重要な役割を果たしていると考えられている。本年度は、ショウジョウバエの培養細胞の細胞膜内外層におけるホスファチジルエタノールアミン(PE)の分布について、脂質転移酵素の欠損変異体も利用して解析を行った。その結果、ヒトではほぼ内層に限定して分布しているPEが、ショウジョウバエでは外層により多く分布していることが示された。また、外層に移動したPEを内層に戻すフリッパーゼの欠損変異体においては、PEの内外層における分布比はコントロールと大差がなかった。

一方、内外層の脂質分子を非特異的に両方向へ移動させるスクランブラーゼの欠損変異体においては、PEはコントロールに比べて外層にやや多く分布していることが示された。培養細胞の細胞膜におけるホスファチジルエタノールアミンの分布を、SDS処理凍結割断法を用いて解析した。これまでの研究においてヒトの培養細胞や血球系細胞ではほぼ内層に限定して分布していることが示されてきたが、今回、ショウジョウバエの血球系細胞では外層により多く分布していることが示された。このことから、細胞膜を構成する脂質分子種の分布は、動物種によって大きく異なっている場合があるものと考えられる。さらに、細胞膜に局在する脂質転移酵素の欠損変異体では、この分布が劇的には変化しないことも明らかとなった。すなわち、細胞膜における脂質の非対称分布は、細胞膜においてのみ形成されているものではないことが示唆された。細胞を周囲から区切る境界である細胞膜は、様々な脂質種が一層に並び、それら2つがお互いに向き合ってできた脂質二重層にタンパク質を含んだ構造をしている。脂質二重層に注目した場合、外界に向いた外層と細胞内に向いた内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。この非対称分布は、外層の脂質は電気的に中性であり細胞外にある物質との不用意な相互作用を避けることができる反面、内層の脂質は細胞内にある様々な物質との相互作用を必要に応じて行なうことができるという形で、細胞膜の機能に重要な役割を果たしていると考えられている。ところが、ほとんどの細胞で外層と内層における脂質分布の非対称の程度は、曖昧なままである。その理由は、細胞膜だけを単離することが困難なだけでなく、二重層の各層を区別することがきわめて難しいためである。そこで本研究では、免疫電子顕微鏡法を用いて細胞膜を構成する主要な脂質の分布を明らかにすること、およびそれらの相互関係についての解析に挑むことで、細胞膜の機能における脂質の役割を明らかにする事を目的としている。本年度は、ショウジョウバエの培養細胞の細胞膜内外層におけるホスファチジルエタノールセリン(PS)の分布について、脂質転移酵素の欠損変異体も利用して解析を行った。その結果、ヒトでは厳密に内層に限定して分布しており、アポトーシスを起こすなど細胞が通常の状態から逸脱した場合にはそのシグナルとして外層にも分布することが知られているPSが、ショウジョウバエでは通常の状態でも外層に分布していることが示された。このことから、ショウジョウバエの細胞では、アポトーシスを起こした細胞の認識機構がヒトなどの哺乳類とは異なっていることが推測された。脂質分子の局在を解析するために使用してきた脂質結合プローブの一部が、当初の予測に反し、非特異的結合を多く生み出してしまった。そこで、プローブの反応条件を新たに検討し直しただけでなく、細胞を凍結する際やレプリカ膜を作成する際の条件を検討したところ、この問題を解決できることが明らかになった。それらを踏まえた新しい条件下で、局在解析を行なうこととなったため。脂質二重層に注目した場合、外層と内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。
ス-パ-オキシドディスムタ-ゼmRNA発現細胞の観察ーIn situ hybriolization法による同定と解析

最近、各種疾患の病因の一因として、活性酸素やフリ-ラジカルの役割が注目されている。これらの疾患は脳、心筋虚血性疾患のみならずストレス性胃潰瘍など多岐にわたっている。このような活性酸素分子種の消去酵素の一種であるヒトス-パ-オキシドディスムタ-ゼ(SOD)のcDNA(Eco RIーSal I部分)より^<35>SラベルしたRNAプロ-ブを作成し初年度には、正常ラットの各組織におけるSODの発現をin situハイブリダイゼ-ション法(ISH)により調べ、あわせて非放線性標識RNAプロ-ブを利用したISHについても検討した。この結果、脳虚血の際著明な変化を示すことが知られている海馬領域をはじめ小脳のプルキンエ細胞、肝臓、肺気管支上皮などに発現が観察され、また好酸球に強い発現を認めた。好酸球が活性酸素分子種の強力な産生細胞であることからも興味ある知見であり、この細胞の機能の考察に重要な手がかりを得た。また、非放射性標識RNAプロ-ブによるISHについても、digoxigenin(DIG)ラベルしたプロ-ブを、抗DIGーアルカリフォスファタ-ゼ複合体とアルカリフォスファタ-ゼ反応とで検出する方法により、アクタンmRNAのシグナルは、一部、電子顕微鏡レベルにおいても検出でき、DOD mRNAのシグナルもパ-コ-ルにより分離した好酸球に弱いながらも検出できた。今年度、虚血再潅流における投与SOD誘導体の影響を肝で観察し、また同時にISHでSODの発現を観察したところ、虚血再潅流により肝細胞は著明な障害を来たし、またSOD誘導体は、この変化を阻止することができたが、細胞内のSOD発現変化はそれほど顕著ではなかった。また、ラットをO_2負荷すると一週間以内に肺浮腫により死亡するが、この間の肺組織における細胞内SOD発現に著明な増加は認められなかった。今回用いたプロ-ブはCu/Znタイプのものであり、MNタイプのSODの発現を観察する必要性が示唆された。従来より酸素分子が新生児網膜症のような重篤な障害を起こすことはよく知られていましたが、近年、活性酸素分子種が虚血性疾患の発生に重要な役割を演じていることが示唆されてきました。このような活性酸素を防御する機構の一つにス-パ-オキシドディスムタ-ゼ(SOD)があります。著者は主としてラットを用いて正常組織におけるSODの発現をIn situハイブリダイゼ-ション(ISH)法により観察しました。ヒトSODのcDNAより^<35>SーUTPを組み込んだRNAブロ-ブを作成し実験に供しました。その結果、脳虚血の際著明な変化を示すことが知られている海馬領域をはじめ小脳のプルキンエ細胞、肺気管支上皮などに発現が観察されました。また好酸球に強い発現が認められ、この細胞の機能の考察に重要な手がかりが得られました。ISH法には、従来より放射性標識プロ-ブを用いた方法と、非放射性標識プロ-ブを用いた方法があります。放射性標識プロ-ブを用いた方法は、シグナルの検出感度が高い優れた方法ですが、いくつかの欠点があります。フィルタ-ハイブリダイゼション等に用いられる非放射性標識RNAプロ-ブ作成のためのキットが発売されたのを機会にIn situハイブリダイゼ-ションへ応用を試みました。digoxigeninーUTPの存在下RNAプロ-ブを作成し、ハイブリダイゼ-ションを行った後、抗digoxigeninーアルカリフォスタ-ゼ複合体を結合させ、アルカリフォスファタ-ゼ反応により検出する方法です。

アクチンのmRNAの発現の検出を目安にしたところ、光学顕微鏡レベルのみならず、一部、電子顕微鏡レベルにおいてもシグナルを検出でき、SODのmRNA発現についてもパ-コ-ルにより分離した好酸球に弱いながらもシグナルを検出できました。最近、各種疾患の病因の一因として、活性酸素やフリ-ラジカルの役割が注目されている。これらの疾患は脳および心筋虚血性疾患、ストレス性胃粘膜病変ほか多岐にわたっている。このような活性酸素分子種は細胞内では種々の過去酵素により不活化されるが、細胞外に漏出したときには細胞障害を引き起こす。活性酸素分子種の消去酵素の一種である合成されたス-パ-オキシドディスムタ-ゼ(SOD)の病巣指向性誘導体を用いることにより病態とス-パ-オキシドの相関性を探ることが出来る。また、種々の病態を想定したモデル実験において細胞内のSODの発現を検索するために、in situハイブリダイゼ-ション法を用いた。初年度には、ヒトSODのcDNAより^<35>SーUTPを組み込んだRNAプロ-ブを作成し実験に供し、脳虚血の際著明な変化を示すことが知られている海馬領域をはじめ小脳のプルキンエ細胞、肺気管支上皮などに発現を観察し、また好酸球に強い発現を認めて、この細胞の機能の考察に重要な手がかりを得た。今年度、虚血再潅流実験における投与されたSOD誘導体の影響を肝で観察し、またIn situハイブリダイゼ-ションで肝細胞内SODの発現を観察したところ、虚血後再潅流により肝細胞に生じた著明な障害をSOD誘導体は阻止することができたが、細胞内のSOD発現変化はそれほど顕著ではなかった。また、ラットをO_2負荷すると一週間以内に肺浮腫により死亡するが、この間の肺組織における細胞内SOD発現に著明な増加は認められなかった。今回用いたプロ-ブはCu/Znタイプのものであり、MnタイプのSODの発現を観察する必要性が示唆された。
ナノバブルを用いた逆浸透膜における多様なファウリングの制御

本研究では、逆浸透(RO)膜における生物膜と無機粒子による複合ファウリングの制御のため、次亜塩素酸(以下、塩素)とナノバブルを併用した新しい洗浄方法を検討した。1 μm以下の気泡径を持つナノバブルは生物膜や粒子の間隙に侵入でき、同時に塩素洗浄することにより剥離性を向上させることが期待される。生物膜と粒子による複合ファウリングの制御において塩素+ナノバブル洗浄の洗浄効果は塩素洗浄より2倍高かった。塩素+ナノバブル洗浄は複合ファウラントをその浮上性の向上を伴って剥離させた。さらに、複合ファウラントの密度がファウリング制御に影響することが明らかとなった。本研究では、逆浸透膜(RO膜)を利用した水処理において課題となっている膜上に形成される粒子による粒子ファウリングと生物膜によるバイオファウリングの制御を目的としている。この制御方法として、近年、次世代のRO膜として開発が進められている塩素耐性を持つ膜の利用を想定した次亜塩素酸ナトリウム(以下、塩素)を使用したバイオファウリング制御と無機粒子や微生物よりもサイズが小さいナノバブルの利用を考え、ナノバブルを塩素と併用することで剥離が困難な粒子と生物膜のマトリックス形成を阻害し、剥離性を高め、粒子、生物膜両方を完全に除去できる洗浄方法の確立を目指している。本研究の計画および方法として、ナノバブルの堆積粒子の剥離性評価、ファウリング制御に向けた洗浄条件の検討、実証プラントによる粒子やバイオファウリングへの評価と適用の3項目を設定し、実施した。H28年度は、ナノバブルによる堆積粒子の剥離性およびその効果をフローセルによるラボスケールの連続ろ過試験で評価し、粒子ファウリング制御のための洗浄方法を確立した。さらに、確立した洗浄方法をもとに、粒子やバイオファウリング制御におけるナノバブルと塩素の併用による洗浄方法の確立と洗浄条件の最適化を行い、これらの併用洗浄により膜上に形成させた粒子とバイオフィルムの複合ファウリングを効果的に除去可能であることを明らかにした。本研究で得られた成果は、第51回日本水環境学会年会で発表済みである。さらに、国際会議として7th IWA-ASPIRE Conference 2017およびWater and Environment Technology Conference 2017において発表を予定している。これらの発表に関連した論文を執筆中でありDesalination誌に投稿予定である。本研究では、RO膜上に形成される粒子ファウリングとバイオファウリングの制御を、塩素による殺菌効果とナノバブルによる剥離性の向上効果を期待して塩素とナノバブルの併用により粒子、生物膜両方を完全に除去できる洗浄方法の確立およびその実証を目的としている。本研究の計画として、ナノバブルの堆積粒子の剥離性評価、ファウリング制御に向けた洗浄条件の検討、実証プラントによる粒子やバイオファウリングへの評価と適用の3項目を設定し、実施した。平成28年度は、ナノバブルの堆積粒子の剥離性評価について、当初の研究計画を達成した。ここでは、膜上堆積粒子の洗浄・除去をラボスケールの連続ろ過試験で評価した。膜上堆積粒子を純水のみでも0.1MPaの低圧力と50 mL/minの流量の物理洗浄において8割以上除去できることを確認した。また、ファウリング制御に向けた洗浄条件の検討についてもほぼ計画を達成した。ここでは、上記の確立した洗浄方法をもとに、粒子やバイオファウリング制御におけるナノバブルと塩素の併用洗浄方法の確立と洗浄条件の最適化を行った。具体的には、カオリンとPseudomonas aeruginosaから調製したモデル水をRO膜に通水し、膜上に粒子と生物膜の複合ファウリングを形成させ、ナノバブルと塩素の単独及び併用洗浄によってファウリング制御を試みた。各洗浄による制御効果は膜上堆積物量と純水透過流束の変化により評価した。複合ファウリングは粒子のみでは除去可能であった純水やナノバブル洗浄では26割程度しか除去できず、塩素とナノバブルの併用洗浄では9割程度除去可能であった。また、洗浄時の圧力の有無による洗浄効果への影響を検討し、加圧時の洗浄より無圧時の洗浄の方が塩素とナノバブルによる洗浄効果が20%程度高いことが示され、加圧時には粒子やバイオフィルムの間隙にナノバブルが入り込めない可能性が示唆された。逆浸透膜(RO膜)を利用した水処理においては、モジュール構造および材質の問題から一旦堆積した粒子や膜面上の生物膜が除去できないことから、ほぼ完全な除濁と殺菌が前処理として要求されることと、それでも形成される生物膜によるバイオファウリングの制御が課題となっている。塩素耐性を持つ次世代RO膜の開発が進んでおり、次亜塩素酸ナトリウムを使用したバイオファウリング制御が可能になりつつあるが、それでも一旦形成された生物膜や堆積粒子の剥離・除去は課題として残る。無機粒子や微生物よりもサイズが小さいナノバブルは、水とともに堆積粒子や生物膜内やこれらと膜の境界面に侵入し、剥離性を高めることが期待できる。本研究では、ナノバブルを次亜塩素酸ナトリウム(以下、塩素)と併用することで剥離が困難な粒子と生物膜のマトリックス形成を阻害し、剥離性を高め、粒子、生物膜両方を完全に除去できる洗浄方法の確立を目的とした。RO膜上において、生物膜なしの粒子ファウリングは塩素もナノバブルも用いない純水の通水のみの簡単な洗浄でほとんど制御できたが、生物膜の存在は膜上に堆積した粒子の除去を困難にした。これに対し、塩素洗浄はバイオファウリングの制御に有効であり、塩素+ナノバブル洗浄は生物膜層と粒子層の積層から成る多層ファウリングで最も高い洗浄効果を示した。しかし、塩素なしのナノバブル洗浄は有効でなかった。

これにより、ナノバブルが粒子や生物膜の間隙に侵入し、同時に塩素洗浄することにより膜と生物膜の間の剥離性を向上させることが示唆された。さらに、生物膜と粒子が複合した堆積物の密度がファウリング制御に影響することが明らかとなった。塩素とナノバブルを併用した新しい洗浄方法はRO膜における粒子と生物膜による複合ファウリングの制御に有用であった。本研究では、逆浸透(RO)膜における生物膜と無機粒子による複合ファウリングの制御のため、次亜塩素酸(以下、塩素)とナノバブルを併用した新しい洗浄方法を検討した。1 μm以下の気泡径を持つナノバブルは生物膜や粒子の間隙に侵入でき、同時に塩素洗浄することにより剥離性を向上させることが期待される。生物膜と粒子による複合ファウリングの制御において塩素+ナノバブル洗浄の洗浄効果は塩素洗浄より2倍高かった。塩素+ナノバブル洗浄は複合ファウラントをその浮上性の向上を伴って剥離させた。さらに、複合ファウラントの密度がファウリング制御に影響することが明らかとなった。平成29年度の計画として、28年度にファウリング制御に向けた洗浄条件の検討において確立した洗浄方法のうち未達成であるナノバブル生成時の気体成分を変化させることで、堆積粒子や生物膜の除去量が関係するか評価しつつ、最適な洗浄条件を見出す。さらに、粒子やバイオファウリングにナノバブルと塩素を併用した洗浄を適用するため、4インチのROモジュールを搭載した膜評価装置を用いて上記までで見出した最適な洗浄条件をもとにより実際の処理現場に近い長期間のパイロットスケールの実証試験を行い、膜評価装置で自然水に対してもファウリング制御を実証レベルで証明する。ここでは、膜評価装置にフローセルを並列で装着し、必要に応じて回収することで、試験期間中は確認することのできない膜モジュール内の堆積粒子や生物膜の経時的な変化や制御の効果を評価する。貯水池等の自然水や下水二次処理水及び実験廃水のような人工水を原水としたファウリングの起こり易さにバリエーションを持った水源や水温の低い冬期にバイオファウリングの起こりにくい条件下で貯水池水を原水とした粒子ファウリング挙動の把握とナノバブルと塩素の併用による制御を試みる。また、粒子ファウリング制御へのこれらの併用洗浄の効果の有効性を明確に示すため、実証試験装置の前段にカートリッジフィルターによる除濁のための前処理を組み、フィルターの公称孔径を変化させることで、ナノバブルと塩素の併用洗浄によりどの程度の水質レベルまで従来の前処理を簡略化または緩和できるかを評価する。実証試験によって得られた結果から粒子やバイオファウリングへのナノバブルと塩素を併用した洗浄方法について、現行の酸やアルカリによる薬品使用時とファウリング制御、洗浄に伴う処理システムの違いや膜交換頻度等の水処理システムの面から比較し、開発した本方法の優位性を評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。環境負荷低減29年度が最終年度であるため、記入しない。
血管内皮前駆細胞異常に注目した強皮症の病態解析と新規治療法の開発

本研究ではヒト血管内皮前駆細胞(EPC)として知られている循環血管内皮前駆細胞(CEP)と単球系EPCの強皮症病態との関連を追究した。強皮症患者ではCEPの減少と分化障害があり、それを代償するために動員されたMEPが局所のMCP-1濃度を高めることで線維化を促進する機序が明らかにされた。本研究成果によりEPCの機能異常が強皮症特有の血管病変と線維化病態の両者を誘導することが証明され、EPCを標的とした手法が強皮症に対する新たな治療となりえることが示された。本研究テーマは『血管内皮前駆細胞(EP)異常により強皮症の線維化・血管病変が一義的に説明できる』という申請者が提唱した新しい概念を検証し、その成果を新たな治療法の開発につなげることを目的としている。ヒトEPには、起源が異なる循環血管内皮前駆細胞(CEP)と単球系血管内皮前駆細胞(MEP)の2つのサブセットが存在するため、本年度はそれぞれのサブセットについて強皮症の病態との関連を重点的に検討した。(1)CEP-従来の研究成果により強皮症患者末梢血中のCEPは減少し、さらに成熟血管内皮への分化能が障害されていることが示されている。そこで、骨髄レベルでのCEPの分化を調べたところ、強皮症患者骨髄では幹細胞からCEPへの分化が障害されていることが明らかとなった。(2)MEP-強皮症末梢血における単球系血管内皮前駆細胞(MEP)を定量したところ、予想に反して関節リウマチや健常人比べて増加していた。さらに、強皮症由来MEPはin vitro、in vivoいずれにおいても血管内皮細胞による血管新生を促進する能力が高かったが、管腔構造への取りこみが悪く、それ自身が血管内皮へと分化する脈管形成能は高度に障害されていた。以上の結果から、強皮症患者では骨髄におけるCEPの分化障害があり、それに対して代償性に動員されたMEPは病変部での強い阻害機転により血管新生、脈管形成いずれの経路を介しても有効に血管修復・新生を促すことはできない。本研究成果によりEPサブセットであるCEPとMEP両者の機能異常が強皮症の末梢循環障害を誘導することが明らかとなり、それらを標的とした治療が末梢循環障害に対する新たな治療法となりえることが示された。本研究では、申請者が提案した『血管内皮前駆細胞(EP)異常により強皮症の線維化・血管病変が一義的に説明できる』という新たな概念を検証した。末梢血中のEPの存在についてはコンセンサスが得られているが、そのフェノタイプにはいまだ議論がある。そこで、ヒトEPとして広く認識されている2つのサブセットそれぞれに着目し、強皮症病態との関連を追究した。(1)循環血管内皮前駆細胞(CEP)-私たちは強皮症患者末梢血中のCEPの減少と成熟血管内皮への分化能障害を示したが、その後にそれを支持する報告と否定する報告が各国からなされた。そこで、既報で用いられた測定法間の相関と問題点について検討した。その結果、末梢血中のCEPは単核球10^6に1個程度と極端に少ないことからフローサイトメトリー解析前にソーティングが必要なこと、フローサイトメトリーで再現性のある定量のために蛍光ビーズを用いた解析が必要なことを明らかにした。多数例の再検討の結果、強皮症におけるCEPの減少と分化障害が確認された。(2)単球系血管内皮前駆細胞(MEP)-強皮症末梢血における単球系血管内皮前駆細胞(MEP)を定量したところ、予想に反して関節リウマチや健常人比べて増加していた。さらに、強皮症由来MEPはin vitro、in vivoいずれにおいても血管内皮細胞による血管新生を促進する能力が高かったが、管腔構造への取りこみが悪く、それ自身が血管内皮へと分化する脈管形成能は高度に障害され、線維芽細胞や平滑筋細胞への分化傾向を示した。以上の結果から、強皮症患者ではCEPの減少と分化障害があり、それを代償するためにMEPが動員される。しかし、病変部での強い阻害機転によりMEPは血管新生、脈管形成いずれの経路を介しても有効に血管修復・新生を促すことはできず、むしろ線維化細胞へと分化することで血管瘢痕化を促進する。本研究成果によりCEPとMEP両者の機能異常が強皮症特有の血管病変を誘導することが明らかとなり、それらを標的とすることが難治性血管障害に対する新たな治療の開発につながることが示された。
金属支台から溶出する金属イオンの歯質透過性及び歯根膜細胞の抗原提示能に関する検索

本研究の目的は、直接口腔内に露出していない金属から溶出した金属イオンがどの程度歯質を透過するのかを検索し、臨床における金属アレルギー治療の指針とすることであった。当初は、もし金属イオンが歯質を透過するとしたら、歯根膜細胞や歯髄細胞に抗原提示能があるか否かを検索することも目的としていたが、後述するように金属イオンの歯質透過性は低いことが判明したので、これを重点的に検索した結果、抗原提示能の検索には至らなかった。実験はまず、治療歴がはっきりしており、何らかの理由で抜去に至った歯牙で、金属ポストによる修復がなされているものを、EPMAによって分析することで、ポストからの金属イオンの溶出を検索した。次に、矯正的な理由で抜去された下顎小臼歯を用いて、各種条件の下で実験を行い、ポストから溶出した金属イオンがどの程度歯質に滲入するかを検索した。その結果、全体として銀イオンに関しては、象牙質に700μm程度滲入している状況が検出されたが、銅イオンやパラジウムイオンに関しては、象牙質表層のごくわずかの領域を除いてほとんど検出されなかった。銀イオンの象牙質への浸透性は一番高いと考えられる。確かに現段階で、鋳造金属ポストから溶出した金属イオンが歯根表面に到達しないと結論付けることはできない。しかし、少なくともポストから300μm離れた象牙質中では溶出した金属イオンの量がかなり少なく、特に銅イオンやパラジウムイオンに関しては現在の技術では検出することはできないことを考えると、口腔内に露出していない金属を除去するか否かの判断に迷う場合には、そのアレルゲンとしての可能性が非常に低いとの判断で決定しても差し支えないと言えるのではなかろうか。現在のところ、銀イオンに対するアレルギーはきわめて稀である。歯科金属アレルギーの最終的な治療はアレルゲンとなっている金属元素の完全除去である。本研究の目的は、口腔内に使用されている歯科用合金の内、口腔内に直接露出していない金属支台等が金属アレルギーの原因になり得るか否かを検索することである。平成12年度は、実際に口腔内において機能していた抜去歯のうち、金属充填物または金属補綴物を持つ歯を用いて、金属イオンがどの程度歯質内に浸透しているかを観察した。抜去歯はPBSにて洗浄後、レジンに包埋して半割し、割面を研磨してEPMAにより観察した。その結果、金パラジウム銀合金の場合、合金より1mm程度はなれた歯質にまで銀イオンおよび銅イオンが検出され、経時的に歯科用合金より溶出した金属イオンが歯質に浸透する可能性が示唆されている。しかし、臨床での抜去歯はその治療履歴やそれぞれの治療内容が不明であることが多く、金属イオンの歯質への浸透が、どの程度の期間で、またどのような条件下で起こるのかはわからない。そこで、現在金属による処置が施されていない抜去歯を用いて、保存期間、各種条件を統一した形で金属イオンの歯質への浸透を観察するための実験準備しているところである。具体的には、抜去後乾燥した履歴が無く、またホルマリン等の薬剤による蛋白質の固定をされていない抜去歯に対し、一定条件で根管充填、ポスト形成を行って、金属支台を合着し、数ヶ月から1年にわたって37°C液体中に放置するなどの実験条件を考えている。本研究の目的は口腔内に使用されている歯科用合金のうち、口腔内に直接露出していない金属支台等が金属アレルギーの原因になり得るか否かを検索することである。平成12年度には、実際に口腔内で機能していた、金属を有する抜去歯を用い、金属イオンがどの程度歯質内に浸透しているかをEPMAにより観察したが、これら抜去歯の治療履歴が不明であったため、その結果は必ずしも明確ではなかった。

そこで、平成13年度にも引き続き同様の抜去歯を対象に検索を続けたところ、治療履歴がはっきりした抜去歯において、以下のような結果を得た。金属支台適用後10年から12年経過した抜去歯でも、根管内壁表面から歯根表面(歯質内)方向へ最大約300μmの深さまでしか金属イオンは検出されず、またこのイオンは銅イオンのみであった。そこで、健全天然抜去歯を用いて実験的に根管充填の後、ポスト孔を形成して金属(金パラジウム銀合金)ポストを装着し、これに溶液中で300mVの電圧を1週間かけて、同様に断面をEPMAで観察したが、ここでも歯質内わずか10μm程度の範囲で銅イオンが検出されたにとどまった。以上の結果より、金パラジウム銀合金をポスト付き支台として歯に適用しても、銅イオンがわずかに歯質内に滲入するにとどまる可能性が考えられる。これを、より確実なものとするため、また根尖方向への金属イオン流出の可能性を検索するため、現在以下の2種類の実験を行っており、まもなく結果が得られる予定である。一つは、健全天然抜去歯に金属ポストを装着し、溶液中37°Cで6ヶ月放置するもの。この際、金属は直接溶液に触れないよう、接着性レジンでシールしている。もう一つは、同じく健全抜去歯を根管充填後、歯髄腔内に特定の金属イオン溶液を封入し、溶液中37°Cで6ヶ月放置するものである。これらの試料をEPMAにより検索する予定である。本研究の目的は、直接口腔内に露出していない金属から溶出した金属イオンがどの程度歯質を透過するのかを検索し、臨床における金属アレルギー治療の指針とすることであった。当初は、もし金属イオンが歯質を透過するとしたら、歯根膜細胞や歯髄細胞に抗原提示能があるか否かを検索することも目的としていたが、後述するように金属イオンの歯質透過性は低いことが判明したので、これを重点的に検索した結果、抗原提示能の検索には至らなかった。今年度は従前の結果を踏まえ、根尖方向への金属イオンの流出を検索するために、2種類の実験を行った。一つは、抜去歯に金属ポストを装着し、生理的食塩水中37°Cで半年放置するもの、もう一つは根管充填後にポスト孔を形成し、その中に金属イオンを含む溶液を封入して生理的食塩水中37°Cで半年放置するものである。しかしながら、どちらの実験においても、EDSならびにEPMAによっては歯質内に深く滲入するイオンや、根尖より流出するイオンは観察されなかった。平成12年度、13年度の結果と今年度の結果を総合すると、全体として銀イオンに関しては、象牙質に700μm程度滲入している状況が検出されたが、銅イオンやパラジウムイオンに関しては、象牙質表層のごくわずかの領域を除いてほとんど検出されなかった。銀イオンの象牙質への浸透性は一番高いと考えられる。確かに現段階で、鋳造金属ポストから溶出した金属イオンが歯根表面に到達しないと結論付けることはできない。しかし、少なくともポストから300μm離れた象牙質中では溶出した金属イオンの量がかなり少なく、特に銅イオンやパラジウムイオンに関しては現在の技術では検出することはできないことを考えると、口腔内に露出していない金属を除去するか否かの判断に迷う場合には、そのアレルゲンとしての可能性が非常に低いとの判断で決定しても差し支えないと言えるのではなかろうか。
腫瘍間質のテネイシン-Cは癌の進展を捉進するか

本研究では、乳癌細胞の産生するTN-Cの役割をin vtroで検討すると共に、遺伝子欠失マウスなどから樹立した乳癌細胞を種々の遺伝子型の宿主に移植し、宿主側のTN-Cの癌進展における役割を明らかにしようとした。1.GR S/A系にバッククロスしたTN-C遺伝子欠失(TN-C-/-)マウスおよびヘテロ(TN-C+/-)マウスに自然発生する乳癌から乳癌細胞株を樹立した。また、TN-C-/-マウスから樹立した乳癌細胞株にTN-C cDNAを導入し、ベクターのみを導入した細胞と形質を比較した。2.TN-C+/-乳癌細胞とTN-C-/-細胞の傷つけアッセイ法で遊走能を比較したところ、TN-C+/-細胞で有意に速い遊走を認めた。また、TN-C cDNAを導入した細胞では、ベクターのみを導入した細胞と比較し、遊走能を高かった。3.野生型GR S/Aマウスから樹立した乳癌細胞株、TN-C-/-マウスから樹立した細胞株を、野生型、TN-C+/-型、TN-C-/-に移植し、腫瘍増殖、浸潤性について比較した。両細胞ともに、宿主のTN-C産生能の差によると考えられる明らかな増殖、浸潤、転移の差異は見られなかった。4.これらの結果から、TN-Cは癌細胞自体の遊走に関連していると考えられるが、移植腫瘍では増殖、浸潤においてredundantな分子であると推測される。