hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト化蛋白表皮水疱症モデルマウスに対する幹細胞療法の開発

本研究の目的は栄養障害型表皮水疱症に対する根本的治療法として,骨髄由来細胞および幹細胞移植療法の臨床治療の有用性を,ヒト化蛋白モデルマウスを用いて検討するものである。VII型コラーゲンヒト化マウスにGFP+Tgマウスの骨髄細胞を経静脈移植した。創傷治癒部の皮膚を検討したところ、GFP陽性表皮角化細胞は約0. 2%で確認された。マウスCOL7mRNAおよびマウスCOL7蛋白の発現を検討したところ、発現が一部確認されたがわずかであった。そこで、骨髄細胞の皮膚への遊走・分化を促進させると考えられているHMGB1やCCL27、CCL19を併用した移植実験系を施行・解析中である。表皮水疱症は先天的に皮膚構造蛋白に異常を有することで,皮膚の脆弱性をきたす難治性皮膚疾患である。現時点で根本的かつ有効な治療法は確立されていない。本研究の目的は,もっとも頻度の高い表皮水疱症である,栄養障害型表皮水疱症に対する根本的治療法として,骨髄由来細胞および幹細胞移植療法の臨床治療の有用性を,ヒト化蛋白モデルマウスを用いて検討するものである。レシピエントとなる不完全VII型コラーゲンヒト化マウス(hCOL7-RDEBマウス、表皮水疱症モデルマウス)およびCOL7完全ヒト化マウス(K14プロモーターおよびCMV-Tgマウス)を繁殖し、放射線照射の上でGFP+Tgマウスの骨髄細胞を経静脈移植した。生着を末梢血フローサイトメトリーで確認した上で、創傷治癒部の皮膚を検討したところ、わずかにGFP陽性細胞が真皮に確認された。GFP陽性表皮角化細胞は約0.2%で確認された。定性RT-PCRおよびreal-time RT-PCRにてマウスCOL7mRNAの発現を検討したところ、発現が一部確認されたが、negative controlと統計学的有意差を認めなかった。また、免疫染色では8匹中1匹において、ごくわずかにマウスCOL7が基底膜部に発現しているのを確認した。微細構造観察にて移植後皮膚において、係留線維(COL7)の増強と捉えられる所見が観察された。以上より、通常の移植手技においてはCOL17とは異なり、COL7発現は低レベルに留まるであろうことが推測された。そこで、現時点で骨髄細胞および間葉系間質細胞が皮膚への遊走・分化を促進させると考えられているHMGB1やCCL27、CCL19を併用した移植実験系を施行した。移植・生着後に創傷作成を行う時点で、これらの因子を局所塗布、局所注射および経静脈投与し、上皮化部位のGFP陽性細胞の変化を検討する。本実験系については現在解析中である。
地域医療福祉職と協働ですすめる病棟看護師への退院支援教育プログラムの実践と効果

本研究は、地域医療福祉職と協働で実施する、病棟看護師を対象とした退院支援教育プログラムを作成・実施し、1病棟看護師の退院支援実践自己評価尺度(以下DPWN)得点の変化、2平均在院日数、退院支援に関わる加算取得数によりプログラムの効果を評価した。便宜的サンプリングにより、介入群12病院2726名、対照群9病院1975名のデータを分析した。介入群において、DPWNの下位尺度「多職種連携による療養指導」得点の有意な上昇と在院日数の有意な短縮がみとめられた。教育プログラムの効果として、病棟看護師の退院支援に関する意識向上や在院日数の短縮が示唆された。平成24年度の募集により研究協力承諾の得られた、介入群12病院(北海道、石川、東京、長野、山梨、大阪3、兵庫、愛媛、長崎、沖縄)、対照群9病院(北海道、石川、神奈川、新潟2、静岡、奈良、兵庫、愛媛)へ研究を実施した。介入群へは、平成24年度に作成した退院支援教育プログラム研修を1病棟13名の看護師を対象に23日間の日程で実施した。研修プログラムは、1退院支援方法論2医療社会福祉制度3意思決定支援(家族支援)4訪問診療訪問看護の実際5事例検討6地域医療福祉職との意見交換の全6コマより構成される。1コマ90分で4コマ目と5コマ目の研修開催時期は、最低でも1か月以上は空けて実施した。講師は、研究者の他、病院の退院調整看護師、MSW、訪問看護師または訪問診療医に担当を依頼した。事例検討・意見交換のファシリテーターを、日頃研究協力病院と連携している地域の介護支援専門員、訪問看護師等に病院の退院調整看護師等から依頼をお願いした。対照群には、通常の院内看護研修の実施で、介入群とともに以下の評価質問紙の記入を依頼した。*病棟看護師の評価退院支援教育プログラム研修参加者による病棟への波及効果をねらいとして、質問紙調査(病棟看護師の退院支援実践自己評価尺度)は、5月(研修前)と2月(研修後)の2回、全病棟看護師を対象に実施した。質問紙は看護部長あるいは退院調整担当者に郵送し、各病棟に回収箱を設置して、2週間ほどでまとめて返送を依頼した。*病院の退院支援システム評価平成24年4月平成26年3月までの2年間の平均在院日数、入退院数、病床数、病床稼働率、看護必要度、退院調整部署依頼件数、退院調整依頼までの日数、地域連携に関わる加算算定数関するデータを看護部長または医事課より、月別ごとの数値データのみ自記式質問紙により収集した。平成23年度に実施した全国調査の結果分析をもとにして、病棟看護師への退院支援教育プログラムを作成した。1コマ90分で4コマ目と5コマ目の研修開催時期は、最低でも1か月以上は空けて実施する。講師は、1コマ目病院の退院調整看護師、2コマ目MSW、3コマ目看護部教育担当者、4コマ目訪問看護師または訪問診療医に担当を依頼する。5・6コマ目事例検討・意見交換のファシリテーターを、地域の介護支援専門員、訪問看護師、病院の退院調整看護師に依頼する。上記病棟看護師への退院支援教育プログラムを平成25年度に実施するために、平成23年度に実施した全国調査に研究協力の得られた病院の看護部長宛てに、郵送にて研究協力を依頼した。協力内容は「病棟看護師への退院支援教育プログラムの実践と効果」に関する調査(介入群)と2「病棟看護師の退院支援実践能力自己評価尺度を用いた質問紙調査(対照群)の2種類への協力を依頼した。282病院へ郵送を行い、介入研究協力へ27病院、対照群協力へ32病院の回答が得られた。そのうち、研修参加者が20名以上の13病院(北海道、石川、東京、群馬、長野、山梨、大阪3、兵庫、愛媛、長崎、沖縄)へ介入研究を実施することが決定した。各病院へ研修開催の詳細について打ち合わせを行い、平成25年度に各病院2-3日/年間、研修を実施することとなった。対照群は介入病院の病院特性(病床数、加算取得、退院支援体制)をマッチングさせた13病院を選定するために現在調整中である。作成した退院支援教育プログラムを平成25年度に介入病院12病院(北海道、石川、東京、長野、山梨、大阪3、兵庫、愛媛、長崎、沖縄)へ実施し、対照病院9病院(北海道、新潟2、石川、神奈川、静岡、奈良、兵庫、愛媛)へ質問紙調査を実施した。

平成26年度は、実施した退院支援教育プログラムの効果を検証するために、介入前後の期間に病棟看護師の退院支援自己評価尺度(DPWN)、退院支援満足度(VAS)について介入群と対照群で比較分析した。介入前後における質問紙回収数は、介入病院が2085人(回収率76.5%)、対照病院が1483人(回収率75.0%)であった。研究協力者の基本的属性は、平均看護師経験年数11.3±9.5年で、介入群と対照群で差はみられなかった。女性が3313名と9割以上を占めており、スタッフが3087人(86.4%)、主任が317人(8.9%)であった。最終学歴は、専門学校が2723人(76.2%)で最も多く、次いで大学が508人(14.2%)であった。介入期間の前後での、DPWN得点の変化における、各下位尺度と合計得点の前後比較には対応のあるt検定を実施した。さらに介入の有無と介入時間との間に交互作用があるか反復測定による2元配置分散分析を実施した。その結果、介入病院、対照病院ともに介入期間の前後で、DPWN合計得点、下位尺度得点、VASすべてにおいて有意な得点の上昇が認められた(p<0.05)。一方で時間経過による交互作用を検討した結果、下位尺度:多職種連携のみに介入期間前後で介入病院、対照病院間で差が認められ(p=0.03)、介入病院群に有意な得点の上昇がみられた。老年看護学当初の計画通り退院支援教育プログラム研修を介入群12病院すべてに実施したこと。介入群12病院、対照群9病院の病棟看護師への評価質問紙調査を実施したこと。評価指標である退院支援システムデータについても、各病院へ依頼しており、研究協力病院により、データ収集が困難な項目もあるが、概ねデータが収集できていること。介入群12病院、対照群9病院へ研究途中経過の報告書を作成しフィードバックしたこと。平成23年度に全国調査を実施していたため、データとフィールドが確保できていたことが、教育プログラム作成と平成25年度の介入研究実施に向けた準備をスムーズに運ぶことができた要因であると考える。平成26年度は平成25年度に実施した退院支援教育プログラム研修の効果測定分析を実施する。介入群と対照群で、病棟看護師の退院支援実践自己評価尺度得点の推移と病院の退院支援システムデータ(平均在院日数、入退院数、病床稼働率、看護必要度、退院調整部署依頼件数、退院調整依頼までの日数、地域連携に関わる加算算定数)等のデータを比較分析する。介入群12病院、対照群9病院へ研究結果報告書を作成し、フィードバックする。教育プログラム研修介入病院との具体的な打ち合わせも終了しているため、平成25年度は、打ち合わせして計画したように研修計画が遂行できるよう病院看護部長、教育担当者、退院支援部門職員、地域医療福祉職の方と協力してすすめていく。平成26年度所要額を平成25年度に前倒し請求したため、余剰金が生じた。平成26年度は分析、報告書作成にて使用する予定である。次年度、研究費使用計画として以下に記載する。旅費として全国13病院への交通費宿泊費謝金として、研修講師、ファシリテーターへの謝礼人件費として、評価データなどの書類作成、データ入力、分析のアルバイト雇用その他として、質問紙調査のための印刷費、封筒、紙類の文具代
DNAポリメラーゼζ（ゼータ）が誘発する変異の生成・抑制の分子機構

昨年度の解析結果からグアニンのベンツピレン付加体(BPDE-dG)がリーディング鎖の鋳型にある場合とラギング鎖の鋳型にある場合で変異体頻度に有意な差は見られなかったが、さらに追加で解析を行った結果、正確性が低いDNAポリメラーゼζを発現する細胞において、BPDE-dGがリーディング鎖の鋳型にある場合に比較してラギング鎖の鋳型にある場合の方が、変異体頻度が有意に高いことが明らかになった。また、変異スペクトルの解析の結果、損傷近傍に複数の変異が誘発されているプラスミドが多く見られたが、リーディング鎖とラギング鎖で顕著な違いはなかった。また、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したDNAポリメラーゼε及びδを発現する細胞の作製を試みた。はじめにDNAポリメラーゼεあるいはδの変異導入部位付近を標的とするguide RNAとCas9 nickaseを発現するプラスミドと変異導入の鋳型となるドナープラスミドを用いて、SNGD法により作製を試みたが変異導入クローンは取得できなかった。次に、薬剤耐性遺伝子を有するドナープラスミドを用いて作製を試みたがこの方法でもクローンは取得できなかった。そこで、相同組換えを効率的に誘導できる方法を検討したところ、転写鎖にニックを導入することでDNA二本鎖切断と同程度の相同組換えが誘導でき、かつ非相同末端結合を介した欠失・挿入変異はDNA二本鎖切断と比べて低いことが明らかとなったため、今後この方法での細胞の作製を検討することとした。損傷を含むプラスミドの調製に用いていたT4 DNAポリメラーゼがこれまでに使用していたメーカーからの入手が困難となったため他のメーカーのものに変更したところ同じ反応条件で調製できなかったため、反応条件の検討を行った。さらに、2ステップで行っていた反応を1ステップとすることで収量・純度を改善することができた。損傷を含むプラスミドの構築に必要なDNAポリメラーゼがこれまでに使用していたメーカーからの入手が困難となったため他のメーカーのものに変更したところ同じ反応条件で構築ができなかったため、反応条件の検討に時間がかかった。また、リーディング鎖とラギング鎖の違いについて詳細な解析を行うことができたが、一方で様々な方法を試みたもののDNAポリメラーゼε及びδの変異細胞の作製には至らなかったためやや遅れていると判断した。引き続き、複製型DNAポリメラーゼであるDNAポリメラーゼε及びδのエキソヌクレアーゼドメインに位置するアミノ酸に変異を導入し、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したDNAポリメラーゼε及びδを発現する細胞の構築を試みる。転写鎖にニックを導入する方法の他、直線化したドナーDNAを用いるTild法などでの作製の検討も行う。さらに、効率的にノックイン細胞が作製できた方法によりDNAポリメラーゼζのアクセサリータンパク質が相互作用するREV3の部位(REV7は1880、1884、1885番目の3つのプロリン、PolD2、PolD3はREV3の3086番目以降のアミノ酸を含むC末端ドメインを介して相互作用する)の変異細胞の作製を行う。損傷塩基(BPDE-dG)を含むプラスミドをこれらの細胞に導入し、誘発される変異の解析を行う。本研究では、損傷乗り越えDNA合成(Translesion DNA synthesis ; TLS)を行うDNAポリメラーゼ(Pol)の1つであるPolζが損傷を乗り越えた後も数十塩基のDNA合成を行い、損傷部位以外にも誘発する変異の生成と抑制の分子機構を明らかにすることを目的としている。はじめに、損傷塩基に対する部位がリーディング鎖あるいはラギング鎖として合成される2種類のシャトルプラスミドを構築し、さらに、変異スペクトルを正確に解析するために、各プラスミドにランダム配列を導入した。これらのプラスミドを用いて部位特異的に損傷塩基であるグアニンのベンゾピレン付加体(BPDE-dG)を含むプラスミドを構築し、正確性が低いPolζを発現する細胞に導入し、損傷塩基がリーディング鎖あるいはラギング鎖にある時に誘発される変異頻度に違いがあるかを調べた。また、ミスマッチ修復が正常な細胞と欠損している細胞を用いて、PolζによるDNA合成によって形成したミスマッチがミスマッチ修復によって抑制されるのかを調べた。その結果、BPDE-dGによって誘発される変異頻度は、リーディング鎖およびラギング鎖で大きな違いは見られなかった。また、ミスマッチ修復の有無によっても大きな差は見られなかった。また、ノックイン細胞を作製するために、piggyBacトランスポゾンを利用したシームレスに塩基置換をゲノムに導入するためのターゲティングベクターを構築した。リーディング鎖とラギング鎖での誘発される変異頻度の違い、ミスマッチ修復の影響についての検討をある程度達成できた。変異スペクトルの解析までは達成できなかったものの、シャトルプラスミドにランダム配列を導入し、配列解析を効率的に出来るようにしたことやpiggyBacトランスポゾンを利用したシームレスに塩基置換をゲノムに導入するためのシステムを構築できたことから概ね順調に進捗していると判断した。

また、変異スペクトルの解析の結果、損傷近傍に複数の変異が誘発されているプラスミドが多く見られたが、リーディング鎖とラギング鎖で顕著な違いはなかった。また、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したDNAポリメラーゼε及びδを発現する細胞の作製を試みた。はじめにDNAポリメラーゼεあるいはδの変異導入部位付近を標的とするguide RNAとCas9 nickaseを発現するプラスミドと変異導入の鋳型となるドナープラスミドを用いて、SNGD法により作製を試みたが変異導入クローンは取得できなかった。次に、薬剤耐性遺伝子を有するドナープラスミドを用いて作製を試みたがこの方法でもクローンは取得できなかった。そこで、相同組換えを効率的に誘導できる方法を検討したところ、転写鎖にニックを導入することでDNA二本鎖切断と同程度の相同組換えが誘導でき、かつ非相同末端結合を介した欠失・挿入変異はDNA二本鎖切断と比べて低いことが明らかとなったため、今後この方法での細胞の作製を検討することとした。損傷を含むプラスミドの調製に用いていたT4 DNAポリメラーゼがこれまでに使用していたメーカーからの入手が困難となったため他のメーカーのものに変更したところ同じ反応条件で調製できなかったため、反応条件の検討を行った。さらに、2ステップで行っていた反応を1ステップとすることで収量・純度を改善することができた。損傷を含むプラスミドの構築に必要なDNAポリメラーゼがこれまでに使用していたメーカーからの入手が困難となったため他のメーカーのものに変更したところ同じ反応条件で構築ができなかったため、反応条件の検討に時間がかかった。また、リーディング鎖とラギング鎖の違いについて詳細な解析を行うことができたが、一方で様々な方法を試みたもののDNAポリメラーゼε及びδの変異細胞の作製には至らなかったためやや遅れていると判断した。変異スペクトルを解析することで、リーディング鎖とラギング鎖の違いおよびミスマッチ修復の有無の影響について詳細に調べるとともに、複製型DNA PolであるPolεおよびPolδのエキソヌクレアーゼドメインに位置するアミノ酸に変異を導入し、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したPolεあるいはPolδを発現する細胞を構築し、複製型DNA Polの校正機能の影響について解析を行う。引き続き、複製型DNAポリメラーゼであるDNAポリメラーゼε及びδのエキソヌクレアーゼドメインに位置するアミノ酸に変異を導入し、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したDNAポリメラーゼε及びδを発現する細胞の構築を試みる。転写鎖にニックを導入する方法の他、直線化したドナーDNAを用いるTild法などでの作製の検討も行う。さらに、効率的にノックイン細胞が作製できた方法によりDNAポリメラーゼζのアクセサリータンパク質が相互作用するREV3の部位(REV7は1880、1884、1885番目の3つのプロリン、PolD2、PolD3はREV3の3086番目以降のアミノ酸を含むC末端ドメインを介して相互作用する)の変異細胞の作製を行う。損傷塩基(BPDE-dG)を含むプラスミドをこれらの細胞に導入し、誘発される変異の解析を行う。変異スペクトル解析が十分に行えなった分、次年度使用額が生じてしまった。
大規模データに基づく連鎖倒産リスクの推定

本研究の目的は企業間取引ネットワークと倒産情報を組み合わせたデータの統計解析を行うことであり、計算時間短縮のためスパコン上でこの解析を実行する必要がある。平成30年度は当初計画の通り、プログラムをC++とMPIを用いて実装し、スパコン京上で実際に動作することを確認した。このプログラム自体にはまだ効率化のための改善の余地が多くあるが、このプログラムを実際の東京商工リサーチのデータに適用し、取引ネットワーク上の連鎖倒産の発生確率について分析を進めた。その結果、取引先の倒産は企業の倒産確率を統計的に有意に上昇させることを実証的に確認した。しかしその一方で、連鎖倒産が経済全体に広がり、マクロ経済として甚大な影響をもたらすというようなことは生じえないということも発見した。つまり、連鎖倒産はあくまで小規模なものにとどまり、倒産が次から次へと発生する大規模な連鎖倒産は生じないということである。あくまで暫定的ではあるが、以上の実証結果を"Bankruptcy propagationon a customer-suppliernetwork: An empirical analysisin Japan"としてディスカッションペーパーとしてまとめた。またこれらの結果を以下の3つの国際学会(WEFIA, EARIE, CEF)で発表した。また、平成30年度に進めてきた手法は大規模データの統計解析であるが、ここで培ってきた手法がこれまで自身が取り組んできた企業成長に関する分析にも適用できることが分かり、実際に適用した。それらの結果は"Firm growth and Laplace distribution: The importance of large jumps"として学術雑誌Journal of Economic Dynamics and Controlに出版されることが決まった。当初の計画通り、平成30年度はスパコン上での統計解析のためのプログラムの実装に取り組んだ。C++による統計分析の実装、さらにMPIを用いてのプログラムの並列化を行い、スパコン京上で実際に動作するプログラムを開発することが出来た。さらに、実際にこのプログラムを東京商工リサーチの企業間取引ネットワークデータと倒産情報に適用し、取引ネットワーク上の連鎖倒産の発生確率について実証分析を進めた。あくまで暫定的なものであり今後さらに効率化のために改善する必要があるが、プログラムを適用して得られた実証結果を経済産業所のディスカッションペーパーとして論文の形にまとめることができ、加えて当初計画した通り3つの国際学会(WEFIA, EARIE, CEF)で発表を行うことが出来たので、本研究は計画通りおおむね順調に進展していると言える。平成30年度において、取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇を推定するプログラムは開発したものの、まだ非効率な部分が多く、改善する必要がある。さらに研究を進める中で、取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇という局所的な性質と、連鎖倒産のマクロ経済全体への伝播という大域的性質は峻別する必要があるという認識に至った。特に、マクロ経済全体へ悪影響をもたらす大規模な連鎖倒産はネットワークの構造と密接に関連しており、「取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇」の推定のみならず、実際に観察される取引ネットワーク自体の詳細な分析が必要であり、また学術的にも意義が大きいと認識するにいたった。このネットワークの構造に関する分析は、平成30年度中からワークステーション上で統計解析言語の「R」を用いて始めており、今後もさらに進めていく予定である。以上の作業を平成31年度中に完了させることによって、プログラムのホームページ上での公開と論文の学術雑誌への投稿を、平成31年度中に行うことを予定している。

平成30年度において、取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇を推定するプログラムは開発したものの、まだ非効率な部分が多く、改善する必要がある。さらに研究を進める中で、取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇という局所的な性質と、連鎖倒産のマクロ経済全体への伝播という大域的性質は峻別する必要があるという認識に至った。特に、マクロ経済全体へ悪影響をもたらす大規模な連鎖倒産はネットワークの構造と密接に関連しており、「取引先の倒産による企業の倒産確率の上昇」の推定のみならず、実際に観察される取引ネットワーク自体の詳細な分析が必要であり、また学術的にも意義が大きいと認識するにいたった。このネットワークの構造に関する分析は、平成30年度中からワークステーション上で統計解析言語の「R」を用いて始めており、今後もさらに進めていく予定である。以上の作業を平成31年度中に完了させることによって、プログラムのホームページ上での公開と論文の学術雑誌への投稿を、平成31年度中に行うことを予定している。平成31年度も海外への出張(大学でのセミナー・学会発表)を予定しており、平成30年度から繰り越した部分についても旅費として使用する予定である。
膜7回貫通型受容体のX線解析に向けた蛋白質発現と結晶化

膜7回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,Gタンパク質などを介して細胞内にリガンド結合の情報を伝達する糖鎖が付加された膜タンパク質である。本研究は,この膜貫通型受容体の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るため,受容体の大量発現と結晶化の方法の構築を目的とした。研究では,従来はμg/(L培地)オーダーの発現量しか得られなかった受容体の発現量を,ヒトβ2アドレナリン受容体について約2mg/(L培地)程度まで飛躍的に高めることができた。受容体の全長DNAを酵母α-ファクターのシグナルの下流に連結させ,メタノール資化酵母ゲノム内に発現ベクターを組み込んだ。シグナルのペプチドが切断除去され,分子表面に糖鎖が付加した完全長の受容体を発現させた。界面活性剤により受容体を可溶化し,リガンドとの結合活性も確認した。結晶化のためには糖鎖の均一化と短鎖化が有効と考え,糖切断酵素Endoglycosidase HFを用いて効率良く短鎖化する手順も構築した。精製に用いるクロマトグラフィーカラムを検討し,精製を行った。さらに,分離精製のために,受容体と抗体の双方に結合できるリガンドを考案し,受容体と抗体を複合体として検出できる系も開発した。研究では,さらに,ヒトβ3アドレナリン受容体についても,メタノール資化酵母に遺伝子を組み込んで発現株を樹立した。グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質など様々な発現体を試みたが,β3受容体に相当する発現量は得られていない。低発現量の原因を調べた結果,アミノ末端側のポリペプチド鎖領域に由来すると考えられた。構築したβ2受容体の発現系はこれまで最も高い発現量をもたらし,結晶化のための糖鎖の処理と精製の見通しも得られた。今後も結晶化の成功に向けて研究を展開する計画である。膜7回貫通型受容体は,様々なアゴニストと特異的に結合して活性化され,Gタンパク質などを介して細胞内に結合情報を伝達する。本研究は,膜7回貫通型受容体の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにし,その機能の構造生物学的な理解を得るため,受容体の大量発現と結晶化の方法の構築を目的とする。研究初年度では,従来は最大でもμg/(L培地)オーダーの発現量しか得られなかったヒトβ2アドレナリン受容体の発現レベルを,メタノール資化酵母を用いて約2mg/(L培地)程度まで飛躍的に高めることができた。受容体の全長DNAを酵母のα-ファクターのシグナルの下流に連結させ,これらの間には,発現量を高め,かつこの間で切断が生ずるようにペプチド部を設けた。受容体の下流には,アフィニティー精製のためのタグを付した。酵母ゲノムに発現ベクターをエレクトロポレーション法によって組み込み,分子表面に糖鎖が付加した完全長の受容体タンパク質を大量に発現させ,界面活性剤によりタンパク質を可溶化して,リガンドとの結合活性も確認した。結晶化のためには糖鎖の均一化と短鎖化が有効と考えられ,糖切断酵素Endoglycosidase HFを用いて効率良く短鎖化する手順を構築した。タンパク質の精製では,Ni-Chelating,DEAM,Mono Q,CM Sepharose,Blue Sepharose,Hydroxy Apatite,Superoseの各カラムが有効であることを見出した。これらカラムによるクロマトグラフィー操作によってタンパク質を高度に精製できるとの見通しを得た。次年度には,発現した受容体の精製と結晶化を進める計画である。なお,ヒトβ3アドレナリン受容体についても,メタノール資化酵母に遺伝子を組み込んで高発現株の樹立に向けた試行を開始している。

構築したβ2受容体の発現系はこれまで最も高い発現量をもたらし,結晶化のための糖鎖の処理と精製の見通しも得られた。今後も結晶化の成功に向けて研究を展開する計画である。
言語習慣と当事者評価から考える日本の外国人居住者の日本語習得研究

社会のグローバル化と国境を移動する人々の増加に伴い,社会をめぐる言語環境は益々多様化し,複雑になってきている。日本に居住する外国人の言語使用意識もこうした移動の環境とともに変化しつつある.本研究は異なる言語環境をもつ外国人移住者の日本語使用意識と習得問題を明らかにすることを目的とする。外国人居住者の様々な場面における言語使用と評価に関するアンケート調査を行い、また言語バイオグラフィー調査で報告される彼らの共時的・通時的語りを言語管理の視点から分析することで、異なる言語環境をもつ日本の外国人居住者の日本語使用や習得に対する意識、またその変化の方向性を明らかにした。本研究は日本の外国人居住者の日本語使用と習得問題を、「言語習慣」と「評価」という側面から考察する研究である。初年度である昨年度は、多言語環境に暮らす国内の外国人居住者の言語習慣と言語習得研究について準拠枠を得るために関連する研究分野から外国人居住者の日本語使用と習得問題がどのように取りあげられているかを整理・考察した。と同時に、本研究の調査対象となる3つの言語使用グループの諸条件や関連要素の把握のために予備調査に集中した。具体的には研究実施計画に基づき、以下の調査を行った。1.文献調査国内の外国人居住者の言語使用と言語問題に関する先行研究を日本語教育研究、第二言語習得研究、社会言語学研究、言語管理研究など関連する研究分野から収集し、文献のデータベースを作成した。2.日本語使用に関する予備調査調査計画の有効性と問題点を検討するために外国人居住者を対象にアンケート調査とインタビューを行った。まず外国人居住者が日本でどのようにコミュニケーションに参加し、その時どのような言語を使い、また日本語の使用においてどのような言語問題を感じているかを、留学生と社会人の外国人居住者を合わせ63名にアンケート調査を行った。またその結果を本研究で分類した3つの言語グループに分析・考察し、中間報告としてまとめた。次にアンケートでの結果を基にしながら、多言語使用者5名に日本語の使用を含む日本での言語使用に関するインタビュー調査を行った。インタビューはすべて文字化し、現在その内容を分析中である。また、外国人居住者の日本語の習得や支援の現状を知るために外国人居住者が多い浜松市の多文化共生センターを訪れ、担当者に話を伺うなど理解を深めた。本研究は日本の外国人居住者の日本語使用と習得問題を「言語習慣」と「評価」という側面から考察する研究である。2年目である昨年度は、初年度での予備調査から明らかになった問題点を修正しながら、調査協力者をさらに10名増やし、前年度に引き続き、調査協力者の日本での言語環境や言語能力に対する自己評価などの社会言語学要因についてインタビュー調査を行い、3つの言語使用グループの日本における言語環境に対する社会言語学プロフィールを作成した。また言語バイオグラフィー調査から3つ言語使用グループの言語習慣と当事者評価、日本語習得との関連について事例分析を行うと同時に、外国人居住者の出身地域と移住社会での言語環境の変化にともなう言語使用の変化の方向性を、通事的、共時的評価の分析から明らかにすることを試みた。その結果、出身地域の言語環境と現在の言語環境という移動を時間軸にすることで通時的な分析が可能になり、それにより言語意識の変化をとらえることができた。さらに、時間軸の通時的な視点からみていくことにより、日本語使用意識の変化の方向性を読み取るだけではなく、日本語習得に向かう意識も読み取れることを示唆することができた。なお、上記の中間結果については公開研究会(2016.1.22)と社会言語科学会春期研究大会(2016.3.19)にて研究発表(口頭発表)をするとともに研究論文としてまとめた。とくに公開研究会においては、海外の関連研究者を招き、海外の研究状況とも関連しながら中間報告を行った。2年目に計画していた言語バイオグラフィー調査は順調に実施された。それにより外国人居住者の言語使用の全体の傾向を把握することができた。特に日本語の使用が定住外国人にとってどのように捉えられ、また評価されているかを分析・考察し、日本語の使用や習得をめぐる通時的管理の実態の一部を把握することができた。最終年度である本年度は最初に設定した3つの言語使用グループにおける日本語使用を含む言語使用の特徴を比較・分析した。その結果、(1)単言語から2言語使用中心になった外国人居住者の場合は、日本語の規範や習得に対する意識が強く、ホスト言語コミュニティに向かう言語管理を行う傾向があることが分かった。それに対し、単言語から多言語使用環境へ、また多言語環境から日本でも多言語使用環境を維持する言語使用グループの場合、滞在が長くなるにつれて、日本語習得を意識するよりは、自分らしい日本語の使用、つまり、多言語使用者としての言語環境を維持するための言語管理に向かっていることが分かった。(2)また本年度の研究では、異なる言語使用グループの接触場面における実際の日本語使用も分析しているが、A-1の2言語中心の言語使用グループの場合、発話文の種類において他のA-2とBー2の多言語使用グループに比べ、中途終了文の使用が少なく、発話文の種類にバリエーションが見られた。また発話開始表現の使用においても他の多言語使用グループに比べ、使用頻度が高く、その表現形式にもバリエーションが見られた。さらに、A-1の場合、言語使用における逸脱を否定的に評価しており、ホスト言語コミュニティに向かう管理の意識が強い傾向にあることが分かった。一方で、多言語使用グループの場合、文末の処理がパターン化している傾向があり、中でもBー2の多言語使用者の場合は、文末においてとくに特定の表現形式を過剰に使用する傾向も見られた。

また言い淀みや発話調整のためのフィラーの使用も2言語中心の言語使用者に比べ、2倍以上多く使用されていることが分かった。このような結果から多言語使用グループの場合、日本語習得においてはホスト言語コミュニティに向かう管理をする一方で、自分らしい日本語規範に基づく日本語使用の管理も平行して行っていることが分かった。社会のグローバル化と国境を移動する人々の増加に伴い,社会をめぐる言語環境は益々多様化し,複雑になってきている。日本に居住する外国人の言語使用意識もこうした移動の環境とともに変化しつつある.本研究は異なる言語環境をもつ外国人移住者の日本語使用意識と習得問題を明らかにすることを目的とする。外国人居住者の様々な場面における言語使用と評価に関するアンケート調査を行い、また言語バイオグラフィー調査で報告される彼らの共時的・通時的語りを言語管理の視点から分析することで、異なる言語環境をもつ日本の外国人居住者の日本語使用や習得に対する意識、またその変化の方向性を明らかにした。初年度に計画していた文献整理と予備調査は順調に実施された。とくに予備調査として様々な外国人グループに日本でのコミュニケーション参加や日本語使用、問題についてアンケート調査を行っており、その調査結果を通して本研究で立てた問題意識と調査対象の分類の有効性を検証することができた。ただし、個別のインタビュー調査や会話データの収集に関しては、初年度に計画していた量より少なく、次年度への課題となっている。最終年度となる今年度は、昨年度の本研究により明らかになった結果とともに、調査協力者を増やし、昨年度に引き続き、3つの言語使用グループのにおける日本語使用を含む言語使用の特徴を比較・分析する。また言語使用グループの実際の日本語使用場面の会話データも収集し、複数の調査からデータ収集を行うことで量的・質的バリエーションをさらに確保していくとともに。それをもとに、多言語使用者としての日本の外国人居住者の日本語習得の諸相を明らかにしたい。日本語教育前年度の調査で十分なデータが収集できなかった外国人居住者へのインタビュー調査を増やしながら、引き続き調査協力者の社会言語学的プロフィールを作成する。また実際の日本語使用場面を中心に会話データの収集も行う。複数の調査からデータ収集を行うことで言語使用の量的・質的バリエーションをさらに確保していく。具体的には、これまで収集してきた使用場面のデータを基に日本語の使用が外国人居住者にどのように捉えられ、またどのように評価されているかを分析・考察し、日本語の使用や習得をめぐる言語管理の実態を把握する。また調査によって得られた中間結果を、関連する学会や研究会で発表し、関連する研究者と意見交換を積極的に行い、本研究の考察の質を高めていく。昨年度はインタビュー調査と分析のための謝金と、公開研究会のための海外研究者の招聘に多くの予算を使用した。一方で、当初購入を予定していたビデオカメラやICレコーダの物品購入についてはすでに確保している機材で対応できたため、購入を控えていたため、次年度使用額が発生した。
担がん犬における骨髄由来抑制細胞を標的とした新規治療候補薬の探索

本研究では、種々のがんにより誘導されるMDSCによる免疫抑制機構を調節しているシグナル経路を網羅的に解析し、がん種により異なると推測されるそのシグナル経路を阻害することにより種々の犬悪性腫瘍に対する新規治療候補薬を探索することを目的とした。具体的な研究項目としては、1犬骨髄細胞と株化腫瘍細胞を用いたMDSCの分化誘導法の確立およびその機能解析、2キナーゼ阻害剤ライブラリーを用いたMDSCに対する抗免疫抑制効果を有する薬剤の探索、3担がん犬の血中MDSCに対する候補薬剤の抗免疫抑制効果の検討の3つを計画している。
腫瘍細胞と血小板の直接接着による癌血行性転移促進メカニズムの解明

1)洗浄血小板を用いて膜表面に発現しているP-selectinを測定する.Thrombinにて活性化した血小板と活性化していない血小板を用意し,flow cytometerを用いてP-selectinの発現している血小板数countする.2)凝血塊形成による腫瘍細胞の運動能及び血管外浸潤能に対する影響を検討する.腫瘍細胞のフィブロネクチンに対する運動能(chemotaxis)および浸潤能(chemoinvasion)をマトリゲルをコートしたトランスウェル・チャンバーを用いたアッセイで検討し,血小板の腫瘍細胞運動能・浸潤能に対する影響を評価する.3)腫瘍細胞の浸潤能増加の原因として,Matrix Metaroplotease(MMP)の発現の有無を確認する.Gelatin Zymographyを用いて,各腫瘍細胞の培養上清にて,血小板の有無でのMMP発現の差を確認する.4)3)の結果を踏まえ、検出されたMMPが目的とするMMPかをWestern blottingを用いて確認する.5)各種抗血小板剤を用いて、2)のChemoinvasion assayを行い、実際に浸潤率が低下するかを検討する.研究成果:1)のP-selectin測定ではThrombin活性化した血小板では有意にP-selectinの発現を認めることができました.2)において,全ての腫瘍細胞で,活性化血小板を添加した腫瘍細胞は,有意に浸潤能が増加していることが確認できました.さらに,腫瘍細胞間でも浸潤能増加傾向に差があることができました.すなわち,BxPC-3,SW1990の2種のヒト膵癌株では,血小板を添加することによって,非常に強く浸潤能が増加する事がわかりました.3)では,BxPC-3,SW199,MIA PaCa-2,SU.86.86,Capan-2,AsPC-1で,血小板を添加することによってMMP-9の発現が増加することが確認できました.さらに4)ではWestern Blottingを用いてMMP-9であることを確認しております.5)においてはEPA製剤、Cylostazolの2剤を用いた結果が最もよく浸潤能を抑制していることがわかりました.1)洗浄血小板を用いて膜表面に発現しているP-selectinを測定する.Thrombinにて活性化した血小板と活性化していない血小板を用意し,flow cytometerを用いてP-selectinの発現している血小板数countする.2)凝血塊形成による腫瘍細胞の運動能及び血管外浸潤能に対する影響を検討する.腫瘍細胞のフィブロネクチンに対する運動能(chemotaxis)および浸潤能(chemoinvasion)をマトリゲルをコートしたトランスウェル・チャンバーを用いたアッセイで検討し,血小板の腫瘍細胞運動能・浸潤能に対する影響を評価する.3)腫瘍細胞の浸潤能増加の原因として,Matrix Metaroplotease(MMP)の発現の有無を確認する.Gelatin Zymographyを用いて,各腫瘍細胞の培養上清にて,血小板の有無でのMMP発現の差を確認する.4)3)の結果を踏まえ、検出されたMMPが目的とするMMPかをWestern blottingを用いて確認する.5)各種抗血小板剤を用いて、2)のChemoinvasion assayを行い、実際に浸潤率が低下するかを検討する.研究成果:1)のP-selectin測定ではThrombin活性化した血小板では有意にP-selectinの発現を認めることができました.2)において,全ての腫瘍細胞で,活性化血小板を添加した腫瘍細胞は,有意に浸潤能が増加していることが確認できました.さらに,腫瘍細胞間でも浸潤能増加傾向に差があることができました.すなわち,BxPC-3,SW1990の2種のヒト膵癌株では,血小板を添加することによって,非常に強く浸潤能が増加する事がわかりました.3)では,BxPC-3,SW199,MIA PaCa-2,SU.86.86,Capan-2,AsPC-1で,血小板を添加することによってMMP-9の発現が増加することが確認できました.さらに4)ではWestern Blottingを用いてMMP-9であることを確認しております.5)においてはEPA製剤、Cylostazolの2剤を用いた結果が最もよく浸潤能を抑制していることがわかりました.
代数解析学に於ける線型偏微分方程式系の初期値及び境界値問題の研究

(1)佐藤超函数に関して,いわゆる小松・河合及びSchapiraの割算定理は,非特性な場合には単独方程式から方程式系に,更にはLaurent-Monteiro Fernandesによって,Fuchs型の方程式系にまで拡張された.これらは,特に境界値問題の定式化に本質的な役割を果たしており,重要な結果である.これをSchwartz超函数解に取り替えた時も,従来の結果を組み合わせれば,容易に全く同様の結果が得られる,次にGevery ultradistribution解については,非特性の場合,単独方程式の時は,既に小松によって証明されており,方程式系に関しては,この結果から容易に示される.そこで私は,Fuchs型偏微分方程式に対して,同様の割算定理を考察した.その結果,方程式に応じて「非正則度」が定まり,ultradistributionのGevery orderがその非正則度より小さい時は割算定理が常に成立するが,非正則度の条件を満たさない時は割算定理が成立しない例がある事が証明できた.この結果は,東京大学代数解析火曜セミナー(2006年5月)及び京都大学数理科学研究所研究集会「微分方程式系の代数解析と完全WKB解析」(2006年12月)で発表され,今年度,京都大学数理科学研究所別冊シリーズのproceedingで論文として発表された.又,その後の進展として,単独方程式から,方程式系への拡張が可能である事が判った(論文準備中).(2)Gevery函数及びultradistributionの範疇で,Gevrey増大度のクラスに応じた非正則度と呼ばれる条件を方程式系に課せば,境界値を取る事が可能となり,双曲型という条件の下で,Cauchy問題及び境界値問題の一意可解性を証明した(論文投稿準備中).今年度はFuchs双曲系に対する,超函数解及び超局所函数解の初期値問題に対して,一意可解性定理を得る事に成功し、結果を纏めた論文がに公表された.この論文では,更にmild超函数解及びmild超局所函数解についても,一意可解性定理が得られている.これらは,従来知られていた諸結果の大幅な一般化であり,単独方程式に限っても特性指数に付加的条件が無いという点で,従来の結果よりも新しい事に注意する.従来,方程式の解に対する,いわゆる小松・河合及びSchapiraの割算定理は,非特性な場合には方程式系に,更にはLaurent-Monteiro Fernandesによって,Fuchs型の方程式系にまで拡張されている.これらは,特に境界値問題の定式化に重要である.これをSchwartz超函箱数解に取り替えた時も,従来の結果を組み合わせれば全く同様の結果が得られる事が容易に判る.次にGevery型のultradistribution解を考えると,非特性の場合は,単独方程式の時は,既に小松によって証明されており,方程式系に関しては,これから示される.そこで私は,Fuchs型偏微分方程式に対して,同様の割算定理を考察した.結果は,方程式に応じて「非正則度」が定まり,ultradistributionのGevery orderがその非正則度より小さい時は割算定理が常に成立するが,非正則度の条件を満たさない時は割算定理が成立しない例がある事を証明できた.この結果は,現在論文準備中である.佐藤超函数に関して,いわゆる小松・河合及びSchapiraの割算定理は,非特性な場合には単独方程式から方程式系に,更にはLaurent-Monteiro Fernandesによって,Fuchs型の方程式系にまで拡張されている.これらは,特に境界値問題の定式化に本質的な役割を果たしており,重要な結果である.これをSchwartz超函数解に取り替えた時も,従来の結果を組み合わせるで,全く同様の結果が得られる事が容易に判る.次にGevery型のultradistribution解を考えると,非特性の場合は,単独方程式の時は,既に小松によって証明されており,方程式系に関しては,この結果から容易に示される.そこで私は,Fuchs型偏微分方程式に対して,同様の割算定理を考察した.その結果,方程式に応じて「非正則度」が定まり,ultradistributionのGevery orderがその非正則度より小さい時は割算定理が常に成立するが,非正則度の条件を満たさない時は割算定理が成立しない例がある事が証明できた.この結果は,東京大学代数解析火曜セミナー(2006年5月)及び京都大学数理科学研究所研究集会「微分方程式系の代数解析と完全WKB解析」(2006年12月)で発表された.又,後者は京都大学数理科学研究所別冊シリーズで発刊のproceedingで発表される予定である.又,その後の進展として,単独方程式から,方程式系への拡張が可能である事が最近判った(論文準備中).(1)佐藤超函数に関して,いわゆる小松・河合及びSchapiraの割算定理は,非特性な場合には単独方程式から方程式系に,更にはLaurent-Monteiro Fernandesによって,Fuchs型の方程式系にまで拡張された.これらは,特に境界値問題の定式化に本質的な役割を果たしており,重要な結果である.これをSchwartz超函数解に取り替えた時も,従来の結果を組み合わせれば,容易に全く同様の結果が得られる,次にGevery ultradistribution解については,非特性の場合,単独方程式の時は,既に小松によって証明されており,方程式系に関しては,この結果から容易に示される.そこで私は,Fuchs型偏微分方程式に対して,同様の割算定理を考察した.

その結果,方程式に応じて「非正則度」が定まり,ultradistributionのGevery orderがその非正則度より小さい時は割算定理が常に成立するが,非正則度の条件を満たさない時は割算定理が成立しない例がある事が証明できた.この結果は,東京大学代数解析火曜セミナー(2006年5月)及び京都大学数理科学研究所研究集会「微分方程式系の代数解析と完全WKB解析」(2006年12月)で発表され,今年度,京都大学数理科学研究所別冊シリーズのproceedingで論文として発表された.又,その後の進展として,単独方程式から,方程式系への拡張が可能である事が判った(論文準備中).(2)Gevery函数及びultradistributionの範疇で,Gevrey増大度のクラスに応じた非正則度と呼ばれる条件を方程式系に課せば,境界値を取る事が可能となり,双曲型という条件の下で,Cauchy問題及び境界値問題の一意可解性を証明した(論文投稿準備中).
発生工学的手法による生殖系および免疫系機能の解析

動物の初期胚に外来遺伝子を導入して,その動物の生殖機殖や免疫機能を調べることを目的として,メタロチオネィン遺伝子の制御領域とヒト成長ホルモンの構造遺伝子を連結して,マウスの前核期卵に顕微鏡下で注入し,トランスジェニックマウスを作り,またその胎児の発生状況を観察した.染色体への遺伝子の組みこみは成功し,出生したマウスの1個体はヒト成長ホルモン遺伝子を約150コピー直列に組みこんでいることが,ドットブロット法,サザンブロット法により確認された.さらに,トランスジェニックマウスを物質合成系として用いるために,マウス44Kカゼインと乳清の酸性蛋白質のCDNAをクローニングした.また,マウス体外培養卵の2細胞期での発生停止を核移植法により調べたところ,従来示唆されていた卵管因子の関与のほかに,これによって起こる細胞質の変化が重要な意義をもっていることが示唆された.一方,免疫や栄養の実験に用いるため,ヒト腸内細菌を無菌マウスに接種し,ヒトと同様の腸内細菌叢をもつマウスを作りことを試みたが,ほぼヒトと同じ腸内細菌叢をもったノトバイオートマウスを作ることに成功した.今回はこのようなトランスジェニックマウスやノトバイオートマウスを実験に供するには至らなかったが,生殖系機能や免疫系の研究もそれ自体として十分の成果をあげた.まず,プロラクチンのレセプターを精製し,そのモノクローナル抗体を作った.この抗体を用いて調べたところ,プロラクチンのレセプターは2種類存在することが示唆された.また,黄体におけるプロラクチンの作用は20αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの活性の制御にあると考えられるが,この酵素を部分精製した.さらに,プロラクチンの作用がマクロファージを介して発現されることが示唆された.今後はトランスジェニックマウスを蛋白質合成系として利用することが考えられる.動物の初期胚に外来遺伝子を導入して,その動物の生殖機殖や免疫機能を調べることを目的として,メタロチオネィン遺伝子の制御領域とヒト成長ホルモンの構造遺伝子を連結して,マウスの前核期卵に顕微鏡下で注入し,トランスジェニックマウスを作り,またその胎児の発生状況を観察した.染色体への遺伝子の組みこみは成功し,出生したマウスの1個体はヒト成長ホルモン遺伝子を約150コピー直列に組みこんでいることが,ドットブロット法,サザンブロット法により確認された.さらに,トランスジェニックマウスを物質合成系として用いるために,マウス44Kカゼインと乳清の酸性蛋白質のCDNAをクローニングした.また,マウス体外培養卵の2細胞期での発生停止を核移植法により調べたところ,従来示唆されていた卵管因子の関与のほかに,これによって起こる細胞質の変化が重要な意義をもっていることが示唆された.一方,免疫や栄養の実験に用いるため,ヒト腸内細菌を無菌マウスに接種し,ヒトと同様の腸内細菌叢をもつマウスを作りことを試みたが,ほぼヒトと同じ腸内細菌叢をもったノトバイオートマウスを作ることに成功した.今回はこのようなトランスジェニックマウスやノトバイオートマウスを実験に供するには至らなかったが,生殖系機能や免疫系の研究もそれ自体として十分の成果をあげた.まず,プロラクチンのレセプターを精製し,そのモノクローナル抗体を作った.この抗体を用いて調べたところ,プロラクチンのレセプターは2種類存在することが示唆された.また,黄体におけるプロラクチンの作用は20αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの活性の制御にあると考えられるが,この酵素を部分精製した.さらに,プロラクチンの作用がマクロファージを介して発現されることが示唆された.今後はトランスジェニックマウスを蛋白質合成系として利用することが考えられる.本研究はプロラクチンや成長ホルモンなどの遺伝子を導入し、これらホルモンの生殖系機能・免疫系機能における作用を調べるための基礎的研究である。本年度は次下のような成果を得た。1)遺伝子導入:胞胚の内部細胞塊にプリッキング法で成長ホルモン遺伝子を導入し培養した全受精卵は発生を開始したので、子宮へ移植し産子を得た(出生率12%)。この他、出生に至ったが母親の食害のため回收できなかったものも約同数ある。前核期に雄性前核に遺伝子を注入した受精卵は8%が出生に至った。現在、サザンブロット法、ノーザンブロット法による検索を行っているが、プリッキング法は操作が容易な反面、遺伝子導入の効率が低いようである。2)卵子の体外成熟:自然排卵卵子を体外受精させると、卵丘細胞の有無にかかわらず、90%以上の精子侵入率が得られる。一方体外成熟卵子では、卵丘細胞付着卵子で14%、卵丘細胞除去卵子では0%と低い。子中血清を含む培養液中で卵胞卵を成熟させると、精子侵入率がそれぞれ70%、20%と著るしく改善された。この結果より、卵子の成熟には卵丘細胞が何らかの役割を果していると思われる。3)黄体細胞の培養:機能黄体より得た細胞を培養すると最初24時間はプロジェステロンを分泌するが、48時間では20αジヒドロプロジェステロンが多くなる。この培養系に、プロラクチンと共にマクロファージを加えるとプロジェステロンを分泌し続ける。プロラクチンが20αヒドロキンステロイドデヒドロゲナーゼを抑制しプロジェステロン分泌を継続する培養系を作った。4)プロラクチンレセプター:プロラクチンのレセプターを用いてプロラクチンの生物活性を測ることができる。

本研究ではさらに一歩進めてレセプターを部分精製し、その性状を調べた。乳腺のミクロソーム分画より膜に結合したレセプタを可溶化し、DEAEアガロースのカラムを用いて塩化ナトリウムの濃度勾配で3つの画分を分離した。1.受精卵への外来遺伝子の導入成長ホルモンの遺伝子を注入し移殖した受精卵のうち約11%が発生を完了し出生したが、サザーンブロット法で外来遺伝子の染色体への組みこみを検出したものはまだない。この出生率は平均値ではあるが、いま少し改善の余地があり、導入効率の増加も期待される。2.受精卵の体外培養方法の改良マウス胚を前核期から培養すると2細胞に発生を停止する。細胞融合を用いた核移植法により、この発生停止に対する細胞質の重要性を示した。過排卵処理で採取した卵子と精巣上体精子により体外受精を行い、前核期卵を得た。核移植を行う胚をノマルキー微分干渉顕微鏡下でピペットにより除核した後、紫外線で不活性化したHVJを用いて他の核と融合した。細胞質がICR系マウス由来の胚は2細胞期をこえて胚盤胞にまで発生する率が低かったが、細胞質がF1に由来する胚は高率に胚盤胞を形成した。このことからマウス2細胞期での発生停止には、核よりも細胞質の関与が大きいと思われる。3.プロラクチンのレセプターの精製とモノクローナル抗体ウサギ乳腺のミクロゾームに含まれるプロラクチンのレセプターを界面活性剤を用いて可溶化し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により、分子量の異なる2種類の蛋白質を分離した。これらの蛋白質を用いてマウスを免疫し、4種類のモノクローナル抗体を得た。また抗原とプロラクチンとの結合および抗体との結合を調べたが、これら2種類のレセプターは共通の抗原性を有していた。4.黄体細胞の分離ラット黄体細胞をパーコールの連続濃度勾配遠心法により2つの細胞画分に分離した。このうちB画分はhCGに反応してプロゲステロンを産生した。またプロラクチンのレセプターも存在し、その標的細胞であることを示唆している。