hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発がん感受性に寄与する表皮細胞とランゲルハンス細胞間の相互作用解析

これまでに申請者は、多段階皮膚発がんモデルと順遺伝学的手法により、マウス染色体上にがん感受性遺伝子座(Stmm1-12)をマップしている。さらに、遺伝子改変マウスの解析から表皮樹状細胞のランゲルハンス細胞にと表皮細胞の相互作用が皮膚がんに重要である可能性を得た。そこで、本申請は発がん感受性に寄与する表皮細胞とランゲルハンス細胞間相互作用の遺伝学的解析をStmmに焦点を当て実施し、発がん感受性に差が生じる機構を明らかにする。
高潮の氾濫により社会基盤施設の破壊と被害予測法に関する研究

1.高潮災害の変遷と新たな災害形態の予測臨海巨大都市圏人口集中域での氾濫災害が、家屋などの破壊・流失被災にともなう在来形のものに加えて、地下街とエネルギ-・情報関連共同溝等の地下空間への氾濫水の流入が、大規模かつ長期にわたる社会・経済的被害をもたらす、新たな災害形態となる危険度が高いことを示した。2.巨大台風の特性と高潮・豪雨の極値上陸台風数と中心気圧深度との経年的関係をモデル化し、台風中心気圧深度の非定常年最大値分布を推定する手法を開発・提案すること共に、台風の経年変動を考慮した高潮と降雨量の非定常同時年最大分布を検討した。また確率モデルにより台風経路と中心気圧を予測し、下層風速の推算法を開発した。3.高潮・波浪・洪水氾濫による社会基盤施設の破壊幅広潜堤被覆部材の安定重量の力学モデル算定法を提案した。潜堤の波浪減衰推算に、のり面上の砕波条件が重要である。高潮氾濫の原因となる越波量に及ぼす入射波浪と防潮構造物の反射特性との関係が明かとなった。また、洪水氾濫時の河川堤防のすべり破壊は、降雨強度の時間的変化率の増加と共に安全率が直線的に低下することが示された。4.高潮・洪水の氾濫機構と制御高潮と波浪とを同時に計算するモデルを開発し、東京湾沿岸の現状と将来の高潮・波浪分布図を作成した。河川氾濫に関しては、改良有限要素モデルによって、1938年山陰豪雨災害を受けた浜田川下流域での洪水氾濫過程が良好に再現できた。5.社会基盤施設の被災形態と被害予測法伊勢湾台風記録より、堤内地形と侵入水量とが被害額にどの様な影響を持つかを氾濫シミュレイションにより検討し、高潮・洪水氾濫水の挙動とそれによる災害リスクに及ぼす堤内地の地勢・地物条件の影響についての検討を進めている。衝撃波力による沿岸構造物の局所破壊が全面崩壊に進展する可能性を、波力特性と波浪条件とによって検討した。
妊娠期におけるフルクトース過剰摂取が仔の海馬に及ぼす影響

フルクトースは清涼飲料水などに利用され、誰しもが日常的に摂取する天然甘味料である。近年のフルクトース摂取量の爆発的な増加に伴い、妊婦のフルクトース摂取量も増加の一途をたどっている。妊婦の栄養状態は児の海馬機能に大きく影響するため、フルクトース過剰摂取による影響が懸念される。本研究の目的は妊娠母獣のフルクトース過剰摂取による仔海馬に及ぼす悪影響とその分子メカニズムを明らかとすることである。フルクトースを過剰に摂取した妊娠母獣から生まれてきた仔を対象に行動試験を行ったところ、海馬に依存した認知機能の低下が認められた。さらに記憶の形成を担うとされる海馬における神経新生数の減少が認められた。母獣のフルクトース摂取による仔の認知機能の低下と神経新生の減少のメカニズムを明らかとするために遺伝子発現解析を行ったところ、海馬機能において重要なタンパクであるBDNF (brain derived neurotrophic factor;脳由来神経栄養因子)が幼少期から成熟期にかけて持続して低発現を示すことが明らかとなった。タンパク量も同様に低下していた。BDNFの遺伝子発現を制御しているプロモーター領域のDNAメチル化率をパイロシーケンサーで定量解析すると、遺伝子発現解析の結果と一致して幼少期と成熟期ともにDNA高メチル化が認められた。これらの結果から母獣のフルクトース水摂取はDNAメチル化を介して持続したBDNFの遺伝子発現低下をもたらし、結果として認知機能の低下および神経新生の減少を引き起こしたことが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、妊娠母体のフルクトース摂取がどのように児の海馬機能に影響するかは不明な点が多い。そこで本研究ではフルクトースを過剰摂取した妊娠母獣から生まれた仔を用いて海馬表現型への影響を評価することを目的とした。平成29年度は、妊娠0日目からフルクトース水を摂取した母獣から生まれてきた仔を用いて以下の実験を行った。新生児にBrdUを投与し、海馬で新生されるニューロン数を計測したところ、母獣のフルクトース摂取によって神経新生が減少することが明らかとなった。海馬の神経新生は学習による記憶獲得に重要であるため、成熟仔を対象に海馬に依存した記憶を評価する行動学的試験(新規物体認識試験と恐怖条件づけ試験)を用いて記憶獲得を解析した。フルクトース過剰摂取母獣からうまれた仔は両試験とも低成績を示し、海馬神経新生の減少と一致した結果が得られた。以上より、妊娠期に母獣ラットがフルクトースを多く摂取すると仔の海馬機能が低下することが示唆された。現在、この分子メカニズムを明らかとするために海馬神経新生や認知機能に重要なタンパク(BDNFなど)に着目して解析中である。当初の計画通り、フルクトースを過剰に摂取した母獣から生まれてきた仔の海馬表現型のデータが得られた。海馬組織の遺伝子発現解析やタンパク質解析も順次進んでおり、実験計画はおおむね順調に進展していると考える。妊娠期におけるフルクトース過剰摂取が仔の海馬表現型に悪影響を及ぼす分子メカニズムを明らかとするために、海馬組織における遺伝子発現やタンパクを解析する。さらに遺伝子発現のエピジェネティック制御にも焦点をあて、DNAメチル化変化の解析をする。
胚中心における末梢性自己免疫寛容誘導機序

胚中心B細胞おける抗体遺伝子の体細胞突然変異により、新たに自己反応性B細胞が出現する。しかし、この自己反応性B細胞に対する免疫寛容誘導機序の分子レベルでの詳細は未だ不明である。そこで本研究は、胚中心で自己反応性B細胞がアポトーシスにより排除される機序を、濾胞ヘルパーT(Tfh)細胞や濾胞樹状細胞(FDC)などから放出されるIL-21と、その刺激により胚中心B細胞に誘導されるBCL6の機能を中心として分子レベルで明らかにする。平成21年度はIL-21R-KOマウスを用いた高親和性IgGB細胞の分化メカニズムの解析を行い、以下のようなことを明らかにした。1.IL-21R-KOマウスをNP-OVAで免疫して経時的に抗体価を測定したところ、IgG1抗NP抗体価が正常マウスの1/10に低下しており、NP抗原に対する親和性も著しく低下していた。2.しかし、このIL-21R-KOマウスの脾臓における胚中心の形成は正常マウスと変わらなかった。3.さらに、このIL-21R-KOマウスの脾臓から胚中心B細胞を分離してNP特異的なV186.2遺伝子における体細胞突然変異を解析したところ、変異の頻度は正常B細胞と同程度にみられていたが、高親和性を示す変異の比率が著しく低かった。以上の結果からTfh細胞やFDCなどから放出されるIL-21は、胚中心B細胞の分化段階における抗体V領域遺伝子の体細胞突然変異により誘導される自己反応性B細胞や低親和性B細胞にアポトーシスを誘導していることが示唆された。上記の研究成果は、ワクチン療法の開発へ向けた新しい研究の展開に道を拓くものである。平成20年度は活性化IgG1 B細胞の分化誘導メカニズムの解析を行い、以下のようなことを明らかにした。1)成熟B細胞を抗IgM抗体、抗CD40抗体、IL-4で刺激した後48時間後にIL-21で刺激する系に、Tfh細胞やFDC由来の様々なサイトカインを追加刺激することで、活性化B細胞の長期生存能を解析したところ、IL-2の追加刺激により活性化B細胞がより長期問生存することを明らかにした。2)正常B細胞を上記1)の刺激系で活性化してB細胞の分化を検討したところ、IL-4の刺激ではCXCR4陽,性のCentroblast様の細胞が、またIL-21の刺激ではCXCR4陰性のCentrocyte様の細胞が分化することを明らかにした。3) BCL6-KO B細胞(胚中心B細胞が分化できない)を上記1)の刺激系で活性化してB細胞の分化を比較したところ、IL-4の刺激ではCXCR4陽性のCentroblast様の細胞が分化するが、IL-21の刺激ではアポトーシスが誘導されてCXCR4陰性のCentrocyte様の細胞が分化できないことを明らかにした。上記の研究成果は、生体内における胚中心B細胞の分化をIn vitor系で再現できることを示唆するものであり、ワクチン療法の開発へ向けた新しい研究の展開に道を拓くものである。
C/Cの界面アロイ構造が破壊機構に及ぼす影響の分離解析と最適化

本研究では,焼成温度によって繊維の特性の変化が少ない黒鉛化糸を炭素繊維として採用し,界面アロイ構造を,繊維にイミド系樹脂をコーティングすることと焼成温度を変化させることにより大きく変化させたC/C複合材料を対象として,切欠き材の破壊挙動に及ぼすマトリックス及び界面構造の影響を実験的に分離解析する.次に,その場観察による微視的な破壊過程の観測,界面強度等のメゾ構造物性の変化の直接測定に基づき,実測値を用いたメゾ的な数値シミュレーションにより破壊機構を再現する.さらに層間の特性を評価し,面内特性とのバランスを考慮することにより,切欠き感受性を最適化するための界面構造条件を提案する.本年度の成果は次のように要約される.(1)焼成温度の高い黒鉛化糸の朱子織の強化材を用い,これにビスマレイミドートリアジン共重合樹脂をコーティングしたの後,フェノール樹脂を含浸し,2500°Cで最終焼成してC/C複合材料の積層板を作製した.得られた材料の強度は,コーティングを施さなかった材料より高くなった.また,焼成温度1600°Cと比べ強度が向上するとともに切欠きの影響が少なくなった.(2)層間特性として,モードII破壊靭性値を評価した.コーティングにより界面強度が低下すると,モードIとは異なり破壊靭性値が低下することを明らかにした.本研究では,焼成温度によって繊維の特性の変化が少ない黒鉛化糸を炭素繊維として採用し,界面アロイ構造を,繊維にイミド系樹脂をコーティングすることと焼成温度を変化させることにより大きく変化させたC/C複合材料を対象として,切欠き材の破壊挙動に及ぼすマトリックス及び界面構造の影響を実験的に分離解析する.次に,その場観察による微視的な破壊過程の観測,界面強度等のメゾ構造物性の変化の直接測定に基づき,実測値を用いたメゾ的な数値シミュレーションにより破壊機構を再現する.さらに層間の特性を評価し,面内特性とのバランスを考慮することにより,切欠き感受性を最適化するための界面構造条件を提案する.本年度の成果は次のように要約される.(1)焼成温度の高い黒鉛化糸の朱子織の強化材を用い,これにビスマレイミドートリアジン共重合樹脂をコーティングしたの後,フェノール樹脂を含浸し,2500°Cで最終焼成してC/C複合材料の積層板を作製した.得られた材料の強度は,コーティングを施さなかった材料より高くなった.また,焼成温度1600°Cと比べ強度が向上するとともに切欠きの影響が少なくなった.(2)層間特性として,モードII破壊靭性値を評価した.コーティングにより界面強度が低下すると,モードIとは異なり破壊靭性値が低下することを明らかにした.
ネットワークを利用した教員養成系学部のための情報教育教材の開発

本研究は、教員養成大学・学部である愛知教育大学の入学生全員を対象とし、1年生時に受講するコンピュータリテラシ教育「情報教育入門」において派生する様々な問題を解決するため、分散・非同期の環境で生起する様々な情報を「情報活用」のための生きた教材として,Web上に集積・整理し,再発信することを目的として研究を実施した。平成13年度の研究によって得られた知見は、以下の通りであった。1.ノートPCのウィルス対策と自己防衛の徹底をはかった。本研究の実施期間中、Nimda、BadTrans等のコンピュータウィルスが蔓延したため、ノートPCのウィルス対策と自己防衛を万全とする必要が生じた。そこで、受講生全員のノートPCへウィルス対策ソフトウェアの導入をはかるとともに、その導入方法やメンテナンス情報を教材として使用し、Webで再発信し、上級学年の学生に対しても持続的なサポートを行なえるようにした。2.「情報教育入門」の教科書データと用語集のWeb化の実施。「情報教育入門」受講後の学生が、情報教育に関わる基本的な知識を適切に獲得し、情報教育に関わる基本用語の確認ができるよう「情報教育入門」の教科書に含まれるデータと用語集をWeb化し、かつFAQ集の整備等を行った。これらの成果を「情報教育入門受講者のためのページ」(http://www.jkn.auecc.aichi-edu.ac.jp/)上での公開を行った(一部は学内のみでの公開である)。3.イメージデータの作成。「情報教育入門」の教科書に含まれる用語集データにイメージデータを作成した。これらの成果の一部は、いくつかの学会等において発表した。
脳由来の新しいセルピン様蛋白質の構造と機能に関する研究

牛脳ホモジネートの上清画分から、熱処理、イオン交換クロマト、ゲル濾過等の操作によって新しいSerpin(B-43)を精製した。精製蛋白は分子量43kD、等電点5.3-5.4で、部分アミノ酸配列は他のSerpin family蛋白と高い相同性を有していた。B-43はヘパリンアフィニティカラムには結合せず、同じく脳から精製されているProtease nexin-1とはヘパリン親和性において異なっていることがわかった。また標的プロテアーゼの検索のために行ったプロテアーゼとの結合実験では、ウシトロンビン、ブタエラスターゼ、ヒトプラスミン、ヒトウロキナーゼといずれもSDS安定性の複合体を形成しなかった。従って現在のところ、標的プロテアーゼの性質については不明である。得られた内部アミノ酸配列からヌクレオチドプライマーを合成し、PCR反応によりcDNAフラグメントを得た。得られたシークエンスは,Serpinに共通するアミノ酸配列を含んでおり、目的とするフラグメントであると考えられた。これをプローブとして、牛脳cDNAライブラリーをscreeningし、ほぼ全長をコードするクローンが得られたので現在、シークエンスを行っているところである。一方、B-43に対するウサギポリクローナル抗体によって細胞局在について検討したところ、ウシ大脳皮質、海馬、線条体小脳のGFAP陽性アストログリア細胞が陽性細胞として同定された。その陽性突起はしばしば血管壁まで追跡することができた。また大脳皮質第VI層錐体細胞、線条体ニューロン、海馬CAI、CA2領域に多数陽性神経細胞が存在した。これらの結果はB-43が、アストログリア、神経細胞の両方の機能に関与することを示唆する重要な知見である。
骨密度の減少が骨折の治癒に及ぼす影響

雌の日本白色家兎20羽を用い、卵巣摘出後低Ca飼料(0.15%Ca含有)で飼育したものを実験群(低骨塩群)とし、通常の飼料で飼育した対照群と合わせて顎骨の骨密度をDEXA(Dual Energy X-Ray Absorptiometry)で測定した。その結果対照群と比較した実験群の骨密度の減少は20%程度であった。各群の兎の下顎骨を露出させ、直視下で骨体部を電気エンジンと骨ノミを用いて人工的に骨折させ、骨折部を徒手整復した後、4穴のチタン製マイクロプレートとネジを用いて固定を行った。術後、1、2、4、8週にて動物を屠殺し実験群と対照群との骨折の治癒経過の違いについて、X線学的検討及び非脱灰研磨切片による組織学的検討を合わせて行った。その結果、X線学的には両群ともに1、2週ではX線透過性に大きな差は認められないが、4、8週では低骨塩群は透過性が高い傾向であった。組織学的には低骨塩群、対照群ともに骨折部は骨折断端より骨の新生が行われ、2週から4週にかけて著しく骨梁が形成される。4週では骨折部の癒合は骨梁の配列が不規則な類骨で完成しつつあり、8週には層板骨の配列は不規則ではあるが健常部の層板構造と変わりがない程度の修復が認められるが、低骨塩群で層板構造がやや粗造な傾向であった。組織学的に低骨塩群の方が骨の形成が対照群に比べやや劣る傾向にあり、X線学的所見の透過性の差と一致する。以上のことから低骨塩状態の顎骨骨折の治癒はやや遅延することが示唆され、臨床的には治療時の固定期間の延長を考慮する必要があると考えられる。本研究の目的は、骨密度の減少が骨折の治癒経過に及ぼす影響を検索することで、これまでに雌の日本白色家兎20羽を卵巣摘出後、2か月経過した後1か月間低Ca飼料で飼育したものを実験群とし、通常の飼料で飼育した対照群と合わせて顎骨の骨密度をDEXAで測定した。その結果対照群と比較した実験群の骨密度の減少は10%程度であった。当初の実験計画では脛骨を骨折させて実験を行う予定であったが、これまでの経験から手足に傷害を受けて動けなくなると、兎は健康状態を非常に悪化させる可能性があり、また口腔外科医として、日常診療の対象としているのが顎骨であるため今回の実験部位は顎骨に変更して実験を行った。各群の兎に左側下顎下縁に沿って皮膚切開を行い、下顎骨を露出させ、直視下で骨体部を電気エンジンと骨ノミを用いて人工的に骨折させる。骨折部を徒手整復した後、4穴のチタン製マイクロプレートとネジを用いて固定を行った。現在までに実験群8羽、対照群8羽、計16羽の手術を行っており、今後更に20羽程度の手術を引き続き行う予定である。その後に各群共に手術後1、2、4、8週目に4羽づつ、骨の接合部の骨密度の測定を行ってから屠殺し、固定に用いたチタンプレートを除去後骨折部の破断強度の測定と非脱灰研磨切片による組織学的観察を行う予定である。最終的には集めたデーターを比較して、骨折部の治癒が組織学的にあるいは強度的に、骨密度の低下による影響がどのようにかかわってくるかの検討を行っていきたいと考えている。前年度に引き続き、日本白色家兎を用い、OVX後低カルシウム飼料を与えた群(低骨塩群)と一般的な飼料で飼育した群(対照群)に分け、左側下顎骨をオトガイ孔後方で骨折させ、徒手整復後チタンマイクロプレートとネジで固定した。

術後1、2、4、8週にて下顎骨を摘出し、X線撮影後非脱灰研磨切片作成して光学顕微鏡にて観察した。低骨塩状態での顎骨骨折の治癒過程を対照群と比較してX線学的、組織学的に検討し以下の結果が得られた。1. X線学的に両群とも1、2週ではX線透過性に大きな差は認められないが、4、8週では低骨塩群は透過性が高い傾向であった。2.組織学的に低骨塩群、対照群ともに骨折部は骨折断端より骨の増生が行われ、2週から4週にかけて著しく骨梁が形成される。4週では骨折部の癒合は骨梁の配列が不規則な類骨で完成しつつあり、8週には層板骨の配列は不規則ではあるが健常部の層板構造と変わりがない程度の修復が認められる。3.組織学的に低骨塩群の方が骨の形成が対照群に比べやや劣る傾向にあり、X線学的所見の透過性の差と一致する。以上のことから、低骨塩状態の顎骨骨折の治癒は遅延することが示唆され、臨床的には治療時の固定期間を延長させることが必要と考えられる。当初の計画では破断強度の測定も合わせて行い、組織学的な変化と対応させた機械的な強度の違いも計測する予定であったが、試料が不足したため今回は見合わせた。
カビ菌糸生長の細胞外シグナルに応答した環境適応

糸状菌の菌糸生長において菌糸先端でのアクチンの重合・脱重合とエキソサイトーシスが必須である。近年、私たちは細胞内のカルシウムイオン濃度の変化により、これらアクチンの重合・脱重合とエキソサイトーシスが協調的に制御されていることを示した。このように周期的に徐々に菌糸を伸ばす一連の動的機構を、ここでは菌糸生長の躍動性と呼ぶ。Ca2+の流入に関わるチャンネルの破壊株の表現型から、この躍動性が正常な形態の菌糸生長に必要であることが示された。この躍動性の生物学的意義として、外的シグナルにより早く応答し、菌糸生長の速度や方向が制御されるのではないかという仮説に至った。この仮説を検証することを目的とし、その分子機構について、また外的シグナルに対する躍動性の変化について解析することで、仮説を検証する。1躍動性に関わる分子機構Ca2+の一時的な流入によりCamKの標的がリン酸化され、アクチンの重合、エキソサイトーシスに関わる可能性があるため、Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築する。それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製する。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkA, CmkB, CmkCと相互作用するタンパク質群(リン酸化ターゲット)を明らかにする。2外的シグナルに応答した躍動性の変化Ca2+チャンネルの活性化における膨圧を想定した浸透圧ストレス、Ca2+濃度、マイクロマニピュレーターによる物理的接触などを与え、菌糸生長の躍動性、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより測定する。1躍動性に関わる分子機構Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築した。それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製した。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkA-GFPと相互作用するタンパク質群を明らかにした。CmkB-GFP, CmkC-GFPを発現する株でも同様の実験を行ったが、タンパク質量が少ないことが原因で相互作用するタンパク質群を同定することは出来なかった。qRT-PCRによりCmkA, CmkB, CmkCの発現量を調べたが、それぞれ同程度に発現していた。2外的シグナルに応答した躍動性の変化浸透圧ストレスとCa2+濃度変化による躍動性の変化について解析を行った。また、共焦点顕微鏡ベースでポイントレーザーを使う事で細胞の目的部位にストレスを与えることが可能になった。その際の、躍動性の変化、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより観察し、解析している。実験系は確立できたので、データ量を増やしてさらに解析を深めていく。CmkB-GFP, CmkC-GFPでGFP-trapが上手くいかない理由は不明であるが、スケールアップしタンパク質量を計りながら質量分析に回していく予定である。マイクロマニピュレーターによる物理的接触を試みたが、予想していたよりも作業が難しいため、中止している。その代わり、共焦点顕微鏡ベースでポイントレーザーを使う事で細胞の目的部位にストレスを与えることが可能になった。

1躍動性に関わる分子機構Ca2+の一時的な流入によりCamKの標的がリン酸化され、アクチンの重合、エキソサイトーシスに関わる可能性があるため、Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築する。それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製する。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkA, CmkB, CmkCと相互作用するタンパク質群(リン酸化ターゲット)を明らかにする。2外的シグナルに応答した躍動性の変化Ca2+チャンネルの活性化における膨圧を想定した浸透圧ストレス、Ca2+濃度、マイクロマニピュレーターによる物理的接触などを与え、菌糸生長の躍動性、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより測定する。1躍動性に関わる分子機構Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築した。それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製した。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkA-GFPと相互作用するタンパク質群を明らかにした。CmkB-GFP, CmkC-GFPを発現する株でも同様の実験を行ったが、タンパク質量が少ないことが原因で相互作用するタンパク質群を同定することは出来なかった。qRT-PCRによりCmkA, CmkB, CmkCの発現量を調べたが、それぞれ同程度に発現していた。2外的シグナルに応答した躍動性の変化浸透圧ストレスとCa2+濃度変化による躍動性の変化について解析を行った。また、共焦点顕微鏡ベースでポイントレーザーを使う事で細胞の目的部位にストレスを与えることが可能になった。その際の、躍動性の変化、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより観察し、解析している。実験系は確立できたので、データ量を増やしてさらに解析を深めていく。CmkB-GFP, CmkC-GFPでGFP-trapが上手くいかない理由は不明であるが、スケールアップしタンパク質量を計りながら質量分析に回していく予定である。
新たな戦略による神経細胞の接線方向への移動に関与する制御機構の解明

大脳皮質には、興奮性と抑制性神経細胞が存在し、皮質内をそれぞれ法線及び接線方向に移動して大脳皮質を形成している。本研究は、転写因子Ptf1aにより誘導される興奮性神経細胞の細胞移動の変化を利用して、接線方向への細胞移動に関わる分子の解明を目的とした。Ptf1aの標的遺伝子の解析から、幾つかの候補分子を見出したが、明確に接線方向への移動に関わる分子を見つけるには至らなかった。この為、Ptf1a以外の転写因子で神経細胞の移動を変化させる因子の検索を行ったところ、抑制神経細胞の発生に関わる転写因子の幾つかが神経細胞の移動に影響を与えることを新たに見出した。胎生期おける細胞の移動は正常な組織を構築する上で非常に重要である。大脳皮質には、興奮性と抑制性神経細胞が存在し、それぞれ異なる部位で生じた後、皮質内をそれぞれ法線及び接線方向に移動して6層から成る大脳皮質を形成している。最近、神経細胞の移動を制御する分子の解析が進んできたが、未だ不明な点も多く残されている。本研究はこれまでとは異なる方法で神経細胞の移動に関与する分子を見出し、大脳皮質における神経細胞の移動を解明することを目的としている。既に、転写因子Ptf1aを興奮性神経細胞に導入すると、細胞の移動が法線方向から接線方向へと変化することを見出しており、この細胞移動の変化を緒とし、抑制性神経細胞の接線方向への細胞移動を制御する分子機構や遺伝子カスケードを明らかにする。これまでに、転写因子Ptf1aにより誘導され、GAD67-EGFPマウス及びvGAT-Venusマウスの胎児脳より単離したGAD67陽性及びvGAT陽性細胞においても発現している遺伝子をマイクロアレイ解析により見出している。今年度は、これまでに同定した遺伝子が接線方向への細胞移動に必要な遺伝子である事を、標的遺伝子のshRNA発現ベクターと同時にPtf1aを胎児脳に導入し、細胞移動の挙動変化を指標にして確認を行った。同定した幾つかの標的遺伝子の発現抑制により、Ptf1aにより誘導された神経細胞の移動に影響を与えるものを見出したが、細胞移動への影響はごく僅かであった。この為、Ptf1a以外の神経細胞の移動に変化を与える転写因子の検索を行い、GABA抑制神経細胞の発生に関わる幾つかの転写因子が興奮性神経細胞の移動に影響を与えるものを見出した。今後は、新たに見出した興奮性神経細胞の移動に影響を与える転写因子を含めて解析を進めていく予定である。胎生期における細胞の移動は正常な組織を構築する上で非常に重要である。初年度は、Ptf1aを胎生期の大脳皮質の興奮性神経細胞に導入し、Ptf1aを強制発現した細胞を単離し、トータルRNAを精製してマイクロアレイ解析を行った。またGAD67-EGFPマウス及びvGAT-Venusマウスの胎児脳よりGAD67陽性及びvGAT陽性細胞も単離し、同様にトータルRNAを精製してマイクロアレイ解析を行った。最終的に転写因子Ptf1aにより誘導され、神経細胞の移動に関与する分子の候補を複数見出した。次の段階で行うshRNAを用いたin vitroでの解析を効率よく進める為に更なる標的遺伝子の絞り込みを継続中である。1) Ptf1a等の発現ベクター又はコントロールベクターと共に蛍光タンパク質GFPを発現するベクターを胎児脳(E14.5)に子宮内エレクトロポレーション法で導入後、胎児脳(E17.5-18.5)を取り出し、蛍光実体顕微鏡下で蛍光タンパク質の陽性(+)部位を摘出した。また抑制性神経細胞で蛍光タンパク質を発現するGAD67-EGFP及びvGAT-Venusマウスの胎児脳(E17.5-18.5)からも大脳皮質を摘出した。これらの摘出した脳組織をタンパク分解酵素パパインにより処理し、得られた細胞懸濁液を細胞ソーター(FACSAria II, Becton Dickinson)を用いて蛍光タンパク質を発現する細胞を単離した。単離した少量の細胞からのRNA調製は、TRIzol試薬とスピンカラムを併用した方法により行い、マイクロアレイ解析に必要な量のトータルRNAが得られた。

2)調製したトータルRNAはThe Ambion WT Expression Kit (Life Tech.)を使用してマイクロアレイ解析に用いるプローブを作成した。Ptf1a陽性細胞、GAD67-EGFP陽性細胞及びvGAT-Venus陽性細胞において発現する遺伝子の解析はMouse Gene 1.0 ST Array (Affymetrix)により行った。3)マイクロアレイ解析は個々の遺伝子の発現をサンプルごとに比較し、抑制性神経細胞とPtf1aで誘導され、コントロールで発現されない遺伝子、またはコントロールのみで発現する遺伝子を候補として絞り、接線方向への移動に関与する候補遺伝子の検索を行った。しかし予想より多くの候補遺伝子が見出され、次の段階で行うshRNAを用いたin vitroでの解析を効率よく進める為に更なる標的遺伝子の絞り込みを進めている。1) Ptf1aの直接の標的遺伝子の同定を行うためにクロマチン沈降法(ChIP)を用いる。胎児脳より細胞を単離し、ゲノムDNAとPtf1aタンパク質の固定を行い、超音波でゲノムDNAを切断し、抗FLAG抗体とProtein Gマグネットビーズを用いてPtf1a-ゲノムDNA複合体を濃縮する。マイクロアレイの解析より得た候補遺伝子の発現調節領域内でPtf1aの結合配列(CANNTG)を含む領域を検索し、PCRにより同定した標的遺伝子の転写制御領域へのPtf1aの結合を確認する。2)同定した遺伝子が接線方向への細胞移動に必要な遺伝子である事を、標的遺伝子のshRNA発現ベクターと同時にPtf1aを胎児脳に導入し、細胞移動の挙動変化を指標にして確認する。標的遺伝子の抑制に用いるshRNAの配列は、The RNAi Consortium (Broad Institute, US)より公開されているものを利用し、pSuperRetroベクター(H1プロモーター)に組み込んで作成する。最終的には同定した遺伝子のshRNAに抵抗を持つ分子を作製し、細胞移動の変化が回復するのかを指標にし、同定を進める。3)マイクロアレイ解析で同定したPtf1aの標的遺伝子の解析にはLattice assayを用いて行い、レンチウイルス等により遺伝子やshRNAを神経細胞に導入して細胞移動に与える影響を解析する。4)これまでに同定した遺伝子のKOやcKOマウスが有れば入手する。存在しない場合は、IKMCよりES細胞を入手し、当大学の動物実験施設でキメラマウスを作製してKOマウスを得る。作製したKOマウスは、まず胎生期において大脳皮質の構造を調べ、生後も解析可能なら行動異常等を含め網羅的に解析を行う。cKOマウスに関してはEmx1-Creマウス等と交差し、KOマウスと同様に解析を行う。現有の設備で実施可能であるので、設備備品費は計上していない。実験用動物に関しては、子宮内エレクトロポレーション法にて遺伝子を胎児の脳に導入する為、多数の妊娠マウス(1匹7,000円程度)が必要とされる。それ故に実験用動物の購入に多額の費用を計上している。さらにノックアウトマウスの作成において、ES細胞をIKMCから購入する費用を輸送費も含めて計上している。またES細胞の購入を最終年度で行うのは、同時に作製出来るキメラマウスの数等に限度が有るためである。
小細胞肺癌の新規骨転移モデルの開発とそれを活用した転移機構の解析

小細胞肺癌はその強力な転移能ゆえに最も予後不良な癌の一つとなっており、転移機構の解明は治療成績改善のために極めて重要である。本課題では、ヒト小細胞肺癌をマウス肺に接種して多臓器に遠隔転移させるモデル系を新たに開発し、転移機構の解析を行った。その結果、本モデルに用いた小細胞肺癌由来細胞株が、細胞の運動を促進する因子HGFを自己分泌することが判った。HGFの自己分泌は臨床の小細胞肺癌でも見られる現象であり、本モデルの妥当性を示している。また、転移巣から癌細胞を回収して再度接種することを繰返し、より転移能が高い亜株も樹立した。この亜株を利用して、モデルの遠隔転移頻度を向上させることが出来た。これまでに大別して2種類の転移性亜株を得ている。すなわち、転移巣からのクローニングにより得られた接着型と、同所移植→転移巣からの回収→同所移植のサイクルを繰返すin vivo選択法により得られた浮遊型である。このうち接着性亜株については、培養上清のサイトカインアレイ解析から、HGFを産生していることが判った。Transwellチャンバーを用いたアッセイにHGF中和抗体を加えると、高転移性亜株のマトリゲル浸潤能が抑制された。これらのことから、HGFの受容体であるMETキナーゼの特異的阻害剤ARQ197について、in vivoモデルでの転移頻度や造腫瘍能に対する効果を検討した。腫瘍接種後3日目から週5回投与(120mg/kg)を3週行い、接種後2ー25日で犠牲死させ、同所移植巣の大きさ及び転移頻度を測定した。その結果、ARQ197投与群はコントロール群と比較して同所移植巣の大きさに変化は無かったが、転移頻度は顕著な低下が認められた。HGF/METシグナルは小細胞肺癌においても重要な因子であることが知られており、本モデルが小細胞肺癌の臨床像を反映し、かつ化合物評価にも有用な系であることが示唆された。また、転移に影響する可能性がある癌の形質・現象について調べる目的で、神経内分泌性、上皮間葉転換、癌幹細胞について、それぞれ関連する遺伝子群の発現を検討したが、いずれの形質に関しても典型的な遺伝子の発現を認めることが出来なかった。小細胞肺癌はその強力な転移能ゆえに最も予後不良な難治性癌の一つとなっており、転移の制御が治療成績改善のために極めて重要である。しかし、転移を制御する上で不可欠な知見である転移の分子機構については、未だ不明な点が多く残されている。そこで本課題では、新たに「ヒト小細胞肺癌のヌードマウスへの同所移植による自然転移モデル」を確立し、これを活用して小細胞肺癌の転移の分子機構を解明することを目的とした。本課題開始時点で既に樹立していたヒト小細胞肺癌細胞株由来の転移性亜株をin vitroで解析したところ、これらの転移性亜株はHGFを自己分泌しており、受容体METを介して自身の運動能を亢進させていることが判った。さらにin vivoでも、免疫組織化学的解析により腫瘍部においてMETが活性化していることが明らかになった。HGFの自己分泌は実際の臨床の小細胞肺癌においてもしばしば観察されており、HGF/METシグナルは小細胞肺癌の有望な治療標的候補と考えられている。そこでMET阻害活性を有する低分子化合物を本モデルマウスに投与したところ、遠隔転移の頻度が有意に抑制された。また、新たな転移性亜株を樹立するために、in vivo選択法(マウスへの移植→転移巣からの癌細胞の回収→マウスへの再移植を5回繰返した)を行い、より高転移性の亜株を得た。新しい亜株は親株や従来の転移性亜株と比較して足場非依存性増殖能が亢進していた。マイクロアレイにより亜株群の遺伝子発現プロファイルを解析し、足場非依存性増殖能と発現量が相関する遺伝子を複数同定した。さらに、この亜株を用いて種々の条件検討を行い、従来よりもさらに高率に遠隔転移が観察できる移植プロトコールを作成した。平成23年度は、既に保有していた転移能の異なる複数の亜株の解析を中心に行った。in vitroでの細胞外基質に対する結合能や、化学療法剤への感受性を検討したが、亜株間での顕著な差は認められなかった。一方、transwellチャンバーを用いたアッセイによりマトリゲル浸潤能を検討したところ、高転移能を示す亜株が浸潤能も高いことを見出すことが出来た。そこでDNAマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行い、高転移性亜株と低転移性亜株の間で発現量に顕著な差を示す遺伝子群を同定した。

その中から主に転写因子を中心にsiRNAノックダウンを行ない、高転移亜株のマトリゲル浸潤能に与える影響を検討したところ、高転移性亜株で高発現している遺伝子がマトリゲル浸潤能に重要であることが判明した。この遺伝子について現在shRNAにより持続的にノックダウンした細胞の樹立を行っている。また、現有する転移性亜株群の解析に加えて、より多くの転移関与因子の同定ができるように、in vivo selection法による新しい転移性亜株の樹立を試みた。具体的には、親株をヌードマウスの肺実質に同所移植し、骨あるいは副腎に転移した細胞を回収して、さらに同所移植を行うというサイクルを繰返した。その結果、形態が親株と著しく異なる亜株が得られた。この亜株の性質をin vitroで解析したところ、親株と比較して足場非依存性増殖能が亢進する一方、マトリゲル浸潤能は低下していることが判った。今年度は、主にHGFシグナルについて解析を行い、HGFシグナルに対する阻害剤の効果をin vivoで検討し、系の有用性を確認することができた。また、転移に関与する可能性のある癌の形質/現象についての検討も行った。一方、マイクロアレイ実験により得られた転移因子候補遺伝子についてshRNAによる持続的なノックダウン細胞の樹立を試みているが、クローン間で表現形が安定していない。このために、転移因子候補についてin vivoでの転移への寄与について検証することが現時点では出来ていない。上記の進捗状況から、「やや遅れている」と自己評価した。既存の転移性亜株群の解析はin vitroのアッセイ系を中心に進めており、高転移性亜株はマトリゲル浸潤能が亢進していることを明らかにし、さらに網羅的遺伝子発現解析と遺伝子ノックダウン法により、マトリゲル浸潤能の亢進に重要な転移因子候補を見出すことが出来た。また、新しい転移性亜株の樹立でも、形態や足場非依存性増殖能が亢進した亜株を得ることが出来、新しい研究の展開が期待される。一方、in vivoでの組織学的な検討等は、現状では計画ほどは進んでいない。以上の様な進捗状況から、「おおむね順調に進展している。」と自己評価した。今年度は以下の点を中心に研究を進めて行く。・転移候補因子のin vivoでの評価・浮遊型転移性亜株における足場非依存性増殖能亢進のメカニズム・同所移植巣と転移巣での遺伝子発現プロファイルの比較既にマイクロアレイ解析によって、幾つかの転移因子候補を得ているが、持続的にノックダウンした細胞を樹立する段階で表現形が安定しないと言う問題がある。そこで今年度はTet誘導性shRNA発現システムによるノックダウン細胞の樹立をまず行い、in vivoでの評価を可能にしたい。次年度以降は以下の点を中心に研究を進めていく。・高転移性亜株より見出した転移因子候補のin vivoでの評価・小細胞肺癌など一部の癌に特徴的な形質である神経内分泌性の転移での意義の検討・新たに樹立した転移性亜株の足場非依存性増殖能亢進のメカニズム・同所移植巣と骨転移巣での遺伝子発現プロファイルの比較昨年度は持続的ノックダウン実験が上手く行かなかったために、それに用いる分子生物学実験用の試薬の購入額が予定より下回った。今年度は新しいノックダウンシステムに取り組むため、それに用いる分子生物学実験用試薬の購入に当てる。それらに加え、「転移候補因子のin vivoでの評価」に用いるヌードマウスや細胞培養試薬・器具購入の費用を計上した。
持家共同住宅の部分的再編に関する実態・課題・可能性

国内調査大阪市と東京都港区は、「共同住宅の2戸1化設計指導指針」を1985年から設けている自治体である。これは、良好な住宅ストック形成のため、マンションの比較的小規模な住戸が将来容易に2戸1化できるよう、行政があらかじめ事業者に対応を指導するものである。なかでも大阪市は、この指針が適用されたもののうち、2戸1化可能な設計がなされているものと認められた物件について、その名称等をホームページ上で公開している。2018年度は、それらの物件(65件)のリスト化と各種属性に関する情報整理を行った。さらに、それらの設計者に対して、建物の概要や2戸1化対応の中身、購入者の反応、規約等への記載方法などに関するインタビューを行った。また、2017年度に行った管理組合へのインタビューのうち、数多くの2戸1化工事の実績のあるマンションについて、法務局で該当住戸の登記簿調査を行った。さらに、神奈川県住宅供給公社が相武台団地の賃貸住棟で実施した2戸1化リノベーションの事例視察を行い、担当者との意見交換を行った。海外調査韓国における共同住宅の2戸1化に関する実態調査を行った。具体的には、韓国土地住宅公社(LH)および韓国建設技術研究院(KICT)の関係者、設計事務所、建設会社に対するインタビュー調査、特徴的な事例視察を行い、2戸1化や増築等、住戸規模の変更、性能向上を伴うリモデリングの現状と課題について情報収集、意見交換を行った。応募時の2018年度の計画は以下の通りだった。国内調査:2017年度のアンケートで協力が得られたマンションのうち、典型的・特徴的な部分的再編事例が見られるものを現地訪問し、利用法・構法・体制・法制度・市場の各視点に即して、その詳細に関するインタビューを行う。海外調査:アジア・アフリカにおける部分的再編事例の収集と課題・可能性の整理を行う。調査対象は、アジアは金の母国である韓国と廖が在住する台湾を、アフリカは前島がこれまで研究対象としてきたザンビアなどを想定している。韓国では、近年、バルコニーの室内化が合法化され、この空間を通じた二戸一化が比較的容易になっている一方、壁式構造の共同住宅における戸境壁の穿孔を禁止する条項が住宅法のなかに現れており、過去の事例がもたらした課題の存在がうかがえる。以上のうち、国内調査について、マンション管理組合のインタビューは2017年度までに完了している。2018年度は、前述の登記簿調査を行い、インタビューで得た証言の裏付けをとっている。海外調査について、台湾調査は予定に先立ち2017年に実施したため、2018年度は研究チームで韓国を訪問した。アフリカ調査は前島が継続的に実施している。応募時の2019年度の計画は以下の通りであり、現時点での推進方策としてもそのように考えている。必要に応じて、国内調査または海外調査を補足的に行う。最後に、マンションの管理・構造・法律等の専門家を招き、国内調査で得られた区分所有マンションの部分的再編に関する実態・課題・可能性、海外調査で収集した持家共同住宅の多様な再生手法の日本への応用可能性について意見交換し、成果をとりまとめる。意見交換は、日本建築学会の関連小委員会での企画として開催することを想定している。本研究の目的は、国内外の持家共同住宅の部分的再編(二戸一化、増築・減築、用途変更など)に関する実態・課題・可能性を、1空間の利用法、2構法、3管理・合意形成の体制、4関連する法制度、5市場でのニーズ・評価、の各視点から明らかにし、修繕や大規模改修による「現状維持」と建て替えによる「一斉更新」の間に潜在する多様な建築再生のあり方を探ることである。国内調査初年度となる2016年度は、行政が二戸一化設計指導指針(良好な住宅ストック形成の観点から比較的小規模な住戸に対して将来の二戸一化が容易な設計とするよう指導する)を1985年から設けている東京都港区において、民間の分譲マンション(50平方メートル未満の住戸を持つもの)に対する管理組合単位のアンケートおよびヒアリング調査を実施した。回答の得られたマンションのうちこの指針を受けたものは見られなかったが、二戸一化の実例があると答えたマンションはおよそ1/4を占めた。そうしたマンションは、分譲年の古く、戸数の多いものほど増える。二戸一化の主な方法は戸境壁に開口を設けるものであり、利用法は「より広い住宅として自己利用」「賃貸物件として運用」「仕事場などとして利用」の順に多かった。なお、複数の住戸を所有している区分所有者のいるマンションは、全体のおよそ8割を占める。海外調査次年度以降の海外調査の実施に向け、台湾とヨーロッパにおける集合住宅のリノベーション事例の視察を行った。また、台湾から研究協力者を招き、情報交換会を開いた。2017年度に実施予定だった港区でのアンケート調査を前倒しで実施することができた。海外調査については、アメリカ調査を延期し、台湾・ヨーロッパの予備調査にとどめた。国内調査2016年度の東京都港区調査に引き続き、2017年度は大阪市内の分譲集合住宅の管理組合を対象に、2戸1化改修の可否や事例の有無などの実態に関するアンケートとインタビュー調査を行った。この2市区は、ともに1985年から「共同住宅の2戸1化設計指導指針」を設けている自治体でもある。この指針は、良好なストック形成のため、マンションの比較的小さな住戸(分譲は50m2未満)が将来容易に2戸1化できるよう、行政が事業者に対応を指導するものである。

今回の調査では、1この指針はほとんどのマンションで認知されておらず、また実際に指導を受けたマンションも回答を得た範囲では見られないこと、22戸1化改修が可能というマンションもほとんどないこと、3ただし、2戸1化改修した事例があるマンションは2割ほど存在すること、4それらは「より広い住宅として」「仕事場などとして」など様々なかたちで利用されていること、などが明らかになった。すべてのマンションが多用途展開を図る必要はないが、住宅が余る今後の社会では、住戸の利用法を含めた柔軟な集合住宅のマネジメントのあり方を考える価値はあるといえる。海外調査台湾、スペイン、イギリスにおいて、12戸1化など共用部分に手を加える住戸改修の法的扱いなどに関するインタビュー、2特徴的/典型的な住戸改修事例の訪問調査、などを行い、日本の分譲マンションの住戸改修を取り巻く各種状況の他国との共通性と特殊性を整理した。2018年度までに実施する予定だった国内アンケート・インタビュー調査は、2017年度までに終えることができた。海外調査は、2016年度に行う計画だったアメリカ調査が未着手のままのため、今後の実施を検討する。国内調査大阪市と東京都港区は、「共同住宅の2戸1化設計指導指針」を1985年から設けている自治体である。これは、良好な住宅ストック形成のため、マンションの比較的小規模な住戸が将来容易に2戸1化できるよう、行政があらかじめ事業者に対応を指導するものである。なかでも大阪市は、この指針が適用されたもののうち、2戸1化可能な設計がなされているものと認められた物件について、その名称等をホームページ上で公開している。2018年度は、それらの物件(65件)のリスト化と各種属性に関する情報整理を行った。さらに、それらの設計者に対して、建物の概要や2戸1化対応の中身、購入者の反応、規約等への記載方法などに関するインタビューを行った。また、2017年度に行った管理組合へのインタビューのうち、数多くの2戸1化工事の実績のあるマンションについて、法務局で該当住戸の登記簿調査を行った。さらに、神奈川県住宅供給公社が相武台団地の賃貸住棟で実施した2戸1化リノベーションの事例視察を行い、担当者との意見交換を行った。海外調査韓国における共同住宅の2戸1化に関する実態調査を行った。具体的には、韓国土地住宅公社(LH)および韓国建設技術研究院(KICT)の関係者、設計事務所、建設会社に対するインタビュー調査、特徴的な事例視察を行い、2戸1化や増築等、住戸規模の変更、性能向上を伴うリモデリングの現状と課題について情報収集、意見交換を行った。応募時の2018年度の計画は以下の通りだった。国内調査:2017年度のアンケートで協力が得られたマンションのうち、典型的・特徴的な部分的再編事例が見られるものを現地訪問し、利用法・構法・体制・法制度・市場の各視点に即して、その詳細に関するインタビューを行う。海外調査:アジア・アフリカにおける部分的再編事例の収集と課題・可能性の整理を行う。調査対象は、アジアは金の母国である韓国と廖が在住する台湾を、アフリカは前島がこれまで研究対象としてきたザンビアなどを想定している。
バイオ３Ｄプリンティング技術、幹細胞技術を用いた冠動脈バイパス用人工血管の開発

3次元培養での細胞凝集塊=スフェロイドを一つの単位として、細胞のみで任意の立体構造体を構築する組織工学技術を用いた血管再生の研究を進めてきた。血管新生は組織の酸素・栄養供給そして代謝産物や老廃物の運搬のために欠かせない。従って組織工学において血管新生は重要な役割を担うとされる。今回、ヒトiPS由来血管内皮細胞(HiPS-EC)とHNDFBの3次元混合型スフェロイドを作成しHNDFBのみのスフェロイドとVEGFの発現の変化を検討した。HiPS-ECとHNDFBの混合型スフェロイド(20000/spheroid)、HNDFBのみのスフェロイド(20000/spheroid)を作成し、VEGF1をプライマーとしRT-PCRを行いmRNAの測定を行った。結果はHNDFBのみのスフェロイドと比較するとHiPS-ECを混合したスフェロイドではVEGF1の発現は優位に減少していた。今後VEGF1の減少に伴うVEGFのタンパク量の変化をWestern Blotによる検討、病理学的検討を行うことで線維芽細胞と内皮細胞の相互作用を検討していきたい。また線維芽細胞を主体とする構造体で、作成する口径や移植部位は当初の予定と異なるが、大動物実験において3か月以上の血流開存を得た。今後さらに血管組織型スフェロイドの最適化や血管様構造体の構築法、成熟方法を確立することで、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。ヒトiPS由来血管内皮細胞(HiPS-EC)とHNDFBの3次元混合型スフェロイドを作成し、HNDFBのみのスフェロイドとVEGFの発現の変化を検討できた。線維芽細胞を主体とする構造体であるが、これまで成し得なかった大動物への長期移植実験(3か月以上)に成功しており概ね順調に経過していると判断した。本年度の成果を踏まえ、冠動脈バイパス術に用いるグラフトとして適正な血管組織型スフェロイドの条件(細胞ソース、細胞配合率、培養期間)を絞りたい。また線維芽細胞を主体とする血管様構造体での長期移植実験の成功結果を参考にした上で、混合スフェロイドを用いた構築法、成熟法の改良を引き続き行い、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。外来異物を用いて作成した血管は、抗血栓性、抗感染性の面で、自己血管より劣るのは周知であり、未だ冠動脈バイパスに臨床応用できる口径3mm以下の小口径人工血管は存在しない。我々は3次元培養での細胞凝集塊=スフェロイドを一つの単位として、細胞のみで任意の立体構造体を構築する組織工学技術を用いた血管再生の研究を進めてきた。まず血管組織型スフェロイドの最適化に向けて、iPS-ECs(ヒトiPS由来内皮細胞)とHDFB(ヒト皮膚線維芽細胞)の混合型スフェロイドを作成し、共焦点レーザー顕微鏡で内皮細胞の分布を観察した。スフェロイドはあらかじめiPS-ECとHDFBをCell tracker violetで染色し、固定後に組織を透明化することで中心まで共焦点レーザー顕微鏡での観察が可能であった。スフェロイド内で一部中心から外側へと内皮細胞が遊走する所見を認め、また、内皮細胞を混合させるタイミングや手法により異なった細胞の挙動が観察された。これらの所見は組織の大型化の際の中心部への血流維持や壊死の予防のみならず、ヒトiPS由来内皮細胞の特性、挙動を把握する上で重要な結果と考えられた。また血管様構造体の作製においては、線維芽細胞を主体とする構造体をバイオリアクターで成熟させることで、ヒト正常血圧の10倍以上の力学的強度(圧力破砕試験)を確認し、大動物実験において1か月以上の血流開存を得た。iPS由来血管内皮細胞を用いて血管組織型スフェロイドを作製し、組織内での血管内皮細胞の挙動を確認した。細胞凝集現象は我々の組織工学の基盤となるものであり、細胞種や細胞比率に限らず培地成分などの条件設定により、目的とする構造体に応じてスフェロイドの最適化が可能であると考えている。線維芽細胞を主体とする構造体では、改良を加えたバイオリアクターにより成熟させることで、ヒト正常血圧の10倍以上の力学的強度(圧力破砕試験)を有する血管様構造体の作製、及び大動物への短期移植実験に成功しており概ね順調に経過していると判断した。

今後VEGF1の減少に伴うVEGFのタンパク量の変化をWestern Blotによる検討、病理学的検討を行うことで線維芽細胞と内皮細胞の相互作用を検討していきたい。また線維芽細胞を主体とする構造体で、作成する口径や移植部位は当初の予定と異なるが、大動物実験において3か月以上の血流開存を得た。今後さらに血管組織型スフェロイドの最適化や血管様構造体の構築法、成熟方法を確立することで、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。ヒトiPS由来血管内皮細胞(HiPS-EC)とHNDFBの3次元混合型スフェロイドを作成し、HNDFBのみのスフェロイドとVEGFの発現の変化を検討できた。線維芽細胞を主体とする構造体であるが、これまで成し得なかった大動物への長期移植実験(3か月以上)に成功しており概ね順調に経過していると判断した。本年度の成果を踏まえ、冠動脈バイパス術に用いるグラフトとして適正な血管組織型スフェロイドの条件(細胞ソース、細胞配合率、培養期間)を絞りたい。また血管様構造体の構築法、及びバイオリアクターを用いた成熟法の改良を引き続き行い、移植グラフトとして適正な強度、機能をもった構造体を作製し、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。また線維芽細胞を主体とする血管様構造体での長期移植実験の成功結果を参考にした上で、混合スフェロイドを用いた構築法、成熟法の改良を引き続き行い、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。
甲状腺細胞診検体を用いた濾胞癌におけるゲノムワイド分子診断マーカーの探索

甲状腺癌の約5%を占める濾胞癌は、一般的に予後は良好であるが、中には生命予後に影響を与える危険度の高い群が存在する。しかし、現状では良・悪性の鑑別は病理組織診断でさえ困難なこともある。そこで、これらの問題を解決する高感度かつ特異的な診断バイオマーカーの開発が期待されている。本研究では、術前細胞診検体から抽出したRNAを用い、マイクロRNA等の非蛋白質コードRNAも対象に含めたゲノムワイドトランスクリプト解析を実施し、臨床応用可能な甲状腺濾胞癌の癌死危険度診断マーカーを同定することを目指す。なお、蛋白質をコードするmRNAが同定された場合には、当該蛋白質の発現変動についても合わせて解析する。