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セルロースのマクロ構造における吸着水の影響について

1方法(1)セルロースの結晶及び非晶領域における水の存在状況についてX線の小角,広角散乱法を用いた.(2)小角散乱強度が最大になる水分率以下の水分率におけるセルロースのDSC曲線を求め,これからセルロースと水との結合形態をしらべた.(3)CellI,CellIIに対し水が結晶部,非晶部の分子鎖形態へ及ぼす影響をしらべるため,固体高分解能13/CNMR法を用いた.2結果(1)小角散乱強度は試料の処理水温の変化により最大散乱強度に至る時間は異るが,最大散乱強度は等しい.(2)広角散乱強度も同様に処理水温によらず等しい値を示すが,そこに至る時間は小角に比べ小さい.(3)この最大散乱強度の水分率は試料固有の値を示している.(4)DSC曲線の測定結果は, 0°C付近の鋭い吸熱ピークは自由水としての存在を示している.(5)DSC曲線からエンタルピー△Hと水分率を求めた.その結果CellIは0.98モル, CellIIは1.1モルとなり両者とも非晶部セルロースOH基に一個ずつ水分子が"tightly-bound water"として結合していることが解る.(6)13/CNMRの測定結果によるとCellIのC_4共鳴線の線巾はCellが高くなるにつれてシャープになりCellIIのC1には水分率の変化は認められない.このことから水分率Iは小量含水することにより結晶内歪が緩和され規則性の高いコンフォメーションに変ると思われ,これがCellIの強度が気乾より含水状態において高くなる原因の1つと思われる.1方法(1)セルロースの結晶及び非晶領域における水の存在状況についてX線の小角,広角散乱法を用いた.(2)小角散乱強度が最大になる水分率以下の水分率におけるセルロースのDSC曲線を求め,これからセルロースと水との結合形態をしらべた.(3)CellI,CellIIに対し水が結晶部,非晶部の分子鎖形態へ及ぼす影響をしらべるため,固体高分解能13/CNMR法を用いた.2結果(1)小角散乱強度は試料の処理水温の変化により最大散乱強度に至る時間は異るが,最大散乱強度は等しい.(2)広角散乱強度も同様に処理水温によらず等しい値を示すが,そこに至る時間は小角に比べ小さい.(3)この最大散乱強度の水分率は試料固有の値を示している.(4)DSC曲線の測定結果は, 0°C付近の鋭い吸熱ピークは自由水としての存在を示している.(5)DSC曲線からエンタルピー△Hと水分率を求めた.その結果CellIは0.98モル, CellIIは1.1モルとなり両者とも非晶部セルロースOH基に一個ずつ水分子が"tightly-bound water"として結合していることが解る.(6)13/CNMRの測定結果によるとCellIのC_4共鳴線の線巾はCellが高くなるにつれてシャープになりCellIIのC1には水分率の変化は認められない.このことから水分率Iは小量含水することにより結晶内歪が緩和され規則性の高いコンフォメーションに変ると思われ,これがCellIの強度が気乾より含水状態において高くなる原因の1つと思われる.1方法水分共存下に於るセルロース及び水の性質の変化について熱分析(DSC)X線解析(広角,小角散乱)を用いて検討を試みている。(1)Cell I型の試料として主に綿糸、麻糸を用いた。水分率(Wc)は、水分率=(水の重量/乾燥試料重量)で表わした。(2)綿糸及び麻糸中の水分率を変化させたときのDSC融解曲線を-60°C100°Cの間で求めた。水の蒸発が起らないよう密閉型試料パンを用い、昇温連度10k/min、試料量約10mgで測定した。2結果(1)水分率0.07の場合、-30°C,-10°Cの夫々にA,Bピークが認められた。水分率0.15になるとCピークも認められた。(2)A,Bピークは水分率の上昇と共に高温例に移動し水分率0.25になるとCピークと重なる傾向にある。(3)Cピークは2°Cに現れ、水分率上昇につれ強度が急激に増加するが、位置は変化しない。純水について測定すると、ピーク位置が異るので、このピークは自由水と考えられ、A,Bピークは束縛水によるものと思われる。(4)X線解析から得られた綿糸(002)面が最大強度を示す水分率も0.15近傍にあることから、セルロース【I】の物性に影響を与えているのは、かなり小量の水であると思われる。3今後水分率を変化させ詳細な測定を行い、セルロース【I】と水との関係を明らかにする予定である。1方法(1)セルロースの結晶及び非晶領域における水の存在状況についてX線の小角,広角散乱法を用いた.(2)小角散乱強度が最大になる水分率以下の水分率におけるセルロースのDSC曲線を求め,これからセルロースと水との結合形態をしらべた.(3) CellI,CellIIに対し水が結晶部,非晶部の分子鎖形態へ及ぼす影響をしらべるため,固体高分解能13/cNMR法を用いた.2結果(1)小角散乱強度は試料の処理水温の変化により最大散乱強度に至る時間は異るが,最大散乱強度は等しい.

(2)広角散乱強度も同様に処理水温によらず等しい値を示すが,そこに至る時間は小角に比べ小さい.(3)この最大散乱強度時の水分率は試料固有の値を示している.(4) DSC曲線の測定結果は,0°C付近の鋭い吸熱ピークは自由水としての存在を示している.(5) DSC曲線からエンタルピー△Hと水分率を求めた.その結果CellIは0.98モル,CillIIは1.1モルとなり,両者とも非晶部セルロースOH基に1個ずつ水分子が"tightlyーbound water"として結合していることが解る.(6) 13/cNMRの測定結果によるとCellIのC_4共鳴線の線巾は水分率が高くなるにつれてシヤープになりCellIIのC_2には水分率の変化は認められない.このことからCellIは小量含水することにより結晶内歪が緩和され規則性の高いコンフオメーションに変ると思われ,これがCillIの強度が気乾より含水状態において高くなる原因の1つと思われる.
低温STMによるシリコン(100)清浄表面及び吸着表面の研究

Si(111)7x7及びSi(100)2x1表面に於るC_<60>とC_<84>の吸着をFI-STM/STSにより詳しく調べ、Si(111)とSi(100)面においてC_<60>は、Siのダングリングボンドとの強い結合により、室温に於て分子回転をせずに安定に吸着、その結果、C_<60>の局所電子状態密度分布を反映した内部構造がSTMにより観察された。Si(100)表面においてC_<60>を薄膜成長させると、Stranskl-Krastanov型の島状成長を示すが、第1層目と第2層目は局所的なP(4x4)及びC(4x3)の規則性をもち、第3層目からfcc(111)面方位を持つ単結晶が成長する。Si(100)表面におけるC_<84>は基板を100°C程度に加熱し蒸着をすることにより、世界で初めて単結晶生成に成功し結晶構造がfccであることをSTMにより明かにした。C_<60>の内部構造とバンド計算(川添グループ)を比較することにより、フラーレン分子の吸着位置の対称性を決定できることがわかった。アルカリ金属の半導体表面吸着研究において、本年度は特に、Si(111)7x7表面でNaを300°Cで飽和吸着して得られるSi(111)-3x1Na構造を詳細に調べた。この表面構造を決定するとともに、STS、仕事関数変化の実験結果から、この表面が半導体的でありその結果酸素吸着に対する活性が低いことを説明した。1983年にBinning,Rohrerによって発明された走査トンネル顕微鏡(STM)は、実空間で個々の原子一つ一つを解像できる画期的な表面研究法として注目をあび、理学・化学・工学の広い分野で用いられている。本研究の目的は、(1)現在の高性能FIーSTMをもとに低温で稼働する低温FIーSTMを開発しこれを用いて(2)Si(100)表面の相転移前後の原子像を温度と欠陥密度の関数として調べる(3)原子状水素・アルカリ金属(Li,Na,K,Cs)を吸着させバックリングを安定化した表面の温度変化を総合して、バックリングのダイナミクスと理論的な結果を比較するところにある。本年度、既存のFIーSTM装置を改造して低温で稼動するFIーSTMの製作を行った。装置の、超高真空槽、ポンプ類、除振台、エレクトロニクス、FIM部等のほとんどの部分は現有のものをそのまま利用し、新たに購入したヘリウム循環式極低温冷凍機を改造した低温STMヘッドにより、トップフランジからつり下げられたSTM本体だけを、効率良く、しかもSTMの動作を妨げることなく冷却する事が出来る設計になっている。また、試料、探針交換装置や他の表面分析法との互換性を失わないよう注意してある。この装置のSTMとしての性能を調べるために、Si(111)7x7再構成表面、Si(100)2x1再構成表面、Cu(111)1x1,Ag(110)1x1金属表面などを用いて、まず、室温における動作を確認した。冷凍機からのコ-ルドフィンガ-により伝えられる機械的振動を極力抑えるために装置の除振には特に注意を払ったため、逆に室温における除振特性が向上し、表面における凹凸が極めて小さい(0.01A^^°)金属表面の個々の原子をより鮮明にとらえることが出来た。次に、低温における性能のテストを開始し、現在も進行中である。
マルチスライスCTによる大動脈弁および弁周囲組織の非侵襲的評価-心エコーとの比較

大動脈弁狭窄症(AS)において、大動脈弁および弁周囲組織の評価を非侵襲的にマルチスライスCT(MSCT)および心エコー図検査(UCG)を用いて比較検討した。2010年4.月から2013年3月までの期間内、冠動脈精査された連続400例のMSCT検査中ASは11例で、そのうちMSCTにて50%以上の冠動脈狭窄病変を有したのは8例、3例には冠動脈狭窄を認めなかった。MSCTにおいて大動脈弁性状は全例石灰化が重度、弁尖の数はMSCTでは11例とも判定可能であったが、UCGでは7例のみ判定可能であった。大動脈弁弁口面積(AVA)は、MSCTは平均0.77 cm^2であったのに対し、UCGでは平均0.65cm^2とUCGによるAVAが有意に小さかった(p<0.05)。MSCT、UCGではそれぞれ大動脈弁輪径は平均23.9mmと22.1mmとMSCTよりもUCGの方が小さかったが有意差は認めなかった(p=0.45)。左室駆出率に関しては、MSCTおよびUCGともに45%前後でありほぼ同等の値であった。以上の結果より、MSCTはASの評価方法として大動脈弁置換術および冠動脈バイパス術に役立っことが示唆された。マルチスライスCT(MSCT)の登場と機器の進歩により高い空間分解能が得られるようになり心臓MSCTは普及してきた。心臓MSCTで最も求められることは冠動脈の描出とその解析であるが、同じ検査データ内に心筋灌流や心機能の情報も含まれており、冠動脈病変のみならず心筋や弁周囲組織、心機能の評価を同時に行うことは重要である。本研究の目的は、高齢化社会を反映し増加している大動脈弁狭窄症(AS)の重症度評価における心エコー図検査の問題点を究明し、MSCTにより大動脈弁、弁周囲組織等を冠動脈と同時に一期的に評価・検討することである。H22年4月からH23年2月の11ヶ月の間に、冠動脈狭窄が疑われ心臓MSCTを施行した連続131例(男性80例、女性51例、平均年齢65.1歳)が対象症例となった。うちASを合併した症例は4例(男性2例、女性2例、平均年齢76.0歳)であった。AS4例のうち、MSCTにて50%以上の冠動脈狭窄病変を有したのは3例であり、1例には冠動脈狭窄を認めなかった。大動脈弁形態は全例石灰化が強く3例が三尖弁、1例が二尖弁であった。弁尖の数はMSCTでは4例とも判定可能であったが、心エコー図検査では2例のみ判定可能であった。大動脈弁弁口面積は、MSCTはプラニメトリ法で計測し平均0.78mm^2であったのに対し、心エコー図検査では連続の式を用いて計測したが0.56mm^2と心エコー図検査の方が小さい傾向にあった。大動脈弁輪径、バルサルバ洞径および大動脈流出路径はいずれもMSCTよりも心エコー図検査の方が小さい傾向にあった。左室駆出率に関しては、MSCTおよび心エコー図検査ともに45%前後でありほぼ同等の値であった。ASの症例数がまだ少ないため、今後はASの症例数を増やしてさらに評価、検討を行う予定である。

H22年4月からH24年3月の24ヶ月の間に、冠動脈狭窄が疑われ心臓MSCTを施行した連続268例(男性166例、女性102例、平均年齢65.3歳)が対象症例となった。うちASを合併した症例は7例(男性4例、女性3例、平均年齢78.4歳)であった。AS7例のうち、MSCTにて50%以上の冠動脈狭窄病変を有したのは6例であり、1例には冠動脈狭窄を認めなかった。大動脈弁形態は全例石灰化が強く6例が三尖弁、1例が二尖弁であった。弁尖の数はMSCTでは7例とも判定可能であったが、心エコー図検査では5例のみ判定可能であつた。大動脈弁弁口面積は、MSCTはプラニメトリ法で計測し平均0.82cm^2であったのに対し、心エコー図検査では連続の式を用いて計測したが0.64cm^2と心エコー図検査の方が小さい傾向にあった。大動脈弁輪径、バルサルバ洞径および大動脈流出路径はいずれもMSCTよりも心エコー図検査の方が小さい傾向にあった。左室駆出率に関しては、MSCTおよび心エコー図検査ともに40%前後でありほぼ同等の値であった。本研究の目的は、高齢化社会を反映し増加している大動脈弁狭窄症(AS)の重症度評価における心エコー図検査の問題点を究明し、MSCTにより大動脈弁、弁周囲組織等を冠動脈と同時に一期的に評価・検討することである。H24年4月からH25年3月の12ヶ月の間に、冠動脈狭窄が疑われ心臓MSCTを施行した連続132例(男性89例、女性43例、平均年齢63.6歳)が対象症例となった。うちASを合併した症例は4例(男性2例、女性2例、平均年齢67.8歳)であった。AS4例のうち、MSCTにて50%以上の冠動脈狭窄病変を有したのは2例であり、2例には冠動脈狭窄を認めなかった。MSCTにおいて、大動脈弁性状および形態は全例石灰化が重度で2例が三尖弁、2例が二尖弁であった。弁尖の数はMSCTでは4例とも判定可能であったが、心エコー図検査では2例のみ判定可能であった。大動脈弁弁口面積(AVA)は、MSCTはプラニメトリ法で計測し平均0.79 cm2であったのに対し、連続の式で計測した心エコー図検査では平均0.63cm2と心エコー図検査によるAVAが小さい傾向にあったが有意差はなかった(p=0.0694)。MSCT、心エコー図検査ではそれぞれ大動脈弁輪径は平均23.9mmと21.8mmとMSCTよりも心エコー図検査の方が小さかったが有意差を認めなかった(p=0.32)。バルサルバ洞径は平均33.6mmと31.8mmとMSCTよりも心エコー図検査の方が小さくかつ有意差を認めた(p<0.05)。ST junction径は平均28.6mmと28.9mmで両群間に有意差を認めなかった(p=0.90)。左室駆出率に関しては、MSCTおよび心エコー図検査ともに45%前後でありほぼ同等の値であった。本研究では造影剤を使用したマルチスライスCTにて、冠動脈病変のみならず心筋や弁周囲組織等を評価することになっているが、AS症例の中には高度腎機能障害を合併しているものも多く、このためマルチスライスCTが施行できない症例があり、当初の計画よりASの症例数が少ないことが理由として考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。ASの症例数が少ないため、今後はASの症例数を増やしてさらに評価、検討を行う予定である。
がん遺伝子治療の基盤となる遺伝子in vivoデリバリー法の開発

癌治療において、遺伝子を直接体内に投与し標的の癌細胞に送り込むことにより治療を行うin vivo癌遺伝子治療法が注目を集めているが、本治療法の確立に必要な遺伝子/キャリアー複合体の物理化学的性質と生体適用後の体内動態、および発現効率の関係等に関する基礎的情報は極めて乏しい。そこで本研究では、DNA/カチオン性リポソーム複合体の物理化学的性質と投与された遺伝子医薬品が標的細胞に到達するまでの一連の過程、さらには最終的な遺伝子発現との関連について検討した。ここでは、カチオン性脂質DOTMAと中性脂質DOPEもしくはCholからなる代表的なカナオン性リポソームで検討を行った。原子間力顕微鏡およびX線小角散乱法で構造解析を行ったところ、Cholを含む複合体では脂質成分が安定なラメラ構造を保っていたのに対し、DOPEを含む複合体では脂質成分が曲率の高い不安定な構造を持つものと推察された。さらに、赤血球との相互作用、レポータ遺伝子でのin vivo発現実験の結果とを総合すると、DOPEを含む複合体ではその不安定な構造により、赤血球同士の融合及び凝集を引き起こされ、遺伝子発現効率が低下することが明らかになった。これらの情報よりCholを含む複合体の有効性が証明されたので、抗腫瘍効果が期待できるIFN-β遺伝子を転移性肺癌モデルマウスヘ導入する治療実験を行った。その結果、IFN-β遺伝子あるいはIFN-βのインデューサーであるpoly I:polyCの投与により、肺における有意なIFN-β産生および抗腫瘍効果が認められた。以上の結果はDNA/カチオン性リポソーム複合体を用いたin vivo遺伝子治療の実現に向けて複合体設計の有用な基礎的知見になるものと思われる。
硬組織におけるカルシウム代謝の微細構造的研究

骨や歯をピロアンチモン酸法で固定し、0.3N塩酸の70%エタノール溶液で脱灰した。この方法による脱灰は急速で、塩化アンモニウム法では効果が無かった歯や成熟動物の骨にも有効であった。包理した試料の薄切は、軟部組織の様に容易であった。脱灰処理した試料の準超薄切片をトルイジンブルーで染めると、軟骨内骨化部位や、歯のエナメル質および象牙質にきれいなメタクロマジ-を呈する部分が観察された。各種細胞の微細構造や染色性も良好であった。電顕では、メタクロマジ-の部分に一致してピロアンチモン酸カルシウムの沈殿が観察され、沈殿の量は以前塩化アンモニウムで脱灰した試料を観察したときとほとんど同じで、塩酸エタノールによる脱灰で失われる沈殿は少量と考えられた。また、沈殿の局在は非脱灰のものと比較して差異は見られなかった。沈殿にカルシウムが含まれているかどうか調べるためにX線微小部分析すると、明瞭にカルシウムが検出され、ピロアンチモン酸と結合したカルシウムだけが選択的に保存されていることが確認された。本研究では、塩酸のエタノール溶液を用いることにより、すべての硬組織において、ピロアンチモン酸とカルシウムの沈殿を残しつつ脱灰できるようになった。現在この方法を使って、1.歯のエナメル質や象牙質形成時におけるカルシウム輸送と石灰化のメカニズム、2.膜内骨化におけるカルシウムイオンの局在、3.軟骨内骨化におけるカルシウムイオンの分布と骨化の機序、などについて追求している。
分子クラスターの内殻吸収と内殻励起光化学反応

内殻励起イオン性解離過程では解離イオンが比較的大きな運動エネルギーを持ち、従来の直線型飛行時間型質量分析器では十分な質量分解能が得られないため、メチル基を含む有機分子や有機分子クラスターに関する内殻励起イオン性解離過程の研究では詳細なイオンの分岐比やエネルギー分布が求められていない。本研究では、質量分解能とエネルギー分解能を併せ持つメッシュレスリフレクトロンを開発し、偏光面に対して回転可能な真空槽に取り付けた角度可変リフレクトロン型質量分析装置を製作した。この装置では10eVまでの運動エネルギーを持つ解離イオンを質量分解能80で検出することができ、運動エネルギーを持たない解離イオンに対する質量分解能は1500程度である。この装置と単色化した放射光を内殻領域励起の軟X線源として用い、アセトニトリル(CH_3CN)分子の窒素原子、炭素原子の1s内殻電子を種々の電子状態に励起して、解離イオンの分岐比とエネルギー分布、およびそれらの偏光面に対する検出角度依存性を測定した。いくつかの質量数では運動エネルギーの小さい解離イオンによる中心ピークと運動エネルギーの大きい解離イオンによる左右のウィングが観測され、ウィングの構造から運動エネルギー分布を求めた。検出角度依存性も含めて実験結果を解析することにより、2価イオンCH_2CN^<2+>の生成や、メチル基とニトリル基およびニトリル基のCN三重結合の運動エネルギーを伴う解裂はπ^*状態励起によって選択的に起きるという、顕著な励起状態依存性を発見した。クラスターを対象とした測定のためのクラスター発生部を製作し、パルス電場引き込み法による計測効率と質量分解能をシミュレーションによって求め最適化したパルス電源部を作成し、調整試験を進めている。
三叉神経領域の神経因性疼痛におけるCOX-1、2、3の発現とその役割について

痛みの中枢性感作にCOX-や最近cloningされたCOX-3が関与していることが報告された。そのため、近年、COX-2,COX-3 inhibitorにより痛みの中枢性感作が制御できる可能性が注目されている。そこで、以下について検討を行った。(3)神経因性痙痛における中枢神経の可塑性変化について中枢神経における神経因性疼痛の病態として末梢神経系から中枢神経系の可塑的変化が起こっていると考えられる。三叉神経損傷モデルを用いて、この変化に関わりがあると思われるNGF、BDNF、NT-3、neurokinin receptor、COX-2、COX-3の発現と疼痛時に発現する脳内のimmediate early geneであるc-fosを比較・検討する。現在、追加実験中。しかし、三叉神経を介した侵害刺激に対する中枢神経のCOX-2,COX-3発現やその詳細なメカニズムについては、基礎実験による解析がほとんど進んでいないのが現状である。これを明らかにするため、ラット眼窩下神経結紮モデルを用いて、神経因性疼痛とCOX-2,COX-3の発現・役割について実験を行った。ラットの眼窩下神経を結紮切断後、経時的に観察し、脳幹を取り出し連続薄切片を作成した。脳内のCOX-1、COX-2、COX-3、および疼痛時に発現するimmediate early geneであるc-fosの発現について、モノクロナール抗体を用いてSAB法で免疫組織染色行った。現在、それぞれの発現部位・強度を比較・検討することで解析を行っている。現在、それぞれの発現部位・強度を比較・検討することで解析中である。また、COX-1、COX-2、COX-3、c-fos遺伝子の発現量についてもlight cyclersystemを用いて併せて検討を行っている。現在、追加実験中。
InSAR/GPS/重力の統合観測による急激な火山性地殻変動の検出手法

本研究の大きな目標は、新しい急激な地殻変動の観測手法として、差分合成開口レーダー干渉法(C-InSAR)と精密な重力変動および稠密なGPS観測とを統合することのよって、急激な地殻変動の新観測手法の有効性を示すことにある。そのためには、一定限の観測期間が必要であり、2年間を研究期間と考え、現象にそくした適切な場での検証を行うことを主眼とした。この研究の独創性はD-InSAR解析の地上基準点、稠密GPS観測基準点と精密重力変動観測点とを結合する事で従来より高精度で地下の物質移動の推定法となることを示すことである。そして、群発地震の多発している神津島周辺や伊豆半島、測地学的観測が密になされている御前崎周辺などを両者の有効性を実証するのに適切な場所として選んだ。とくに、測地学の分野で近年注目され積極的に検討されてきたGPS観測と精密重力変動観測網の結合は、火山性地殻変動のような大きな変動では非常に有効である。主な成果は、次のようである。(1)稠密GPS観測基準点とD-InSAR解析の地上基準点との結合群発地震の多発している神津島周辺では東京都や東京大学地震研究所、国土地理院などにより、GPS観測点や重力基準観測点が設置され年間数cmに達する変動が検出されているが、山頂付近のデータは不十分である。D-InSARの地上基準点を確立するために新たに一周波の簡易型GPS受信装置を神津島の島内に稠密展開しGPS観測を結合をはかった。また、地下物質移動の検出の可能性を実証するために、今後の変化検出を期待して精密重力観測網の測定点拠点を確保した。式根島におけるGPS観測との結合の結果、神津島の北方2kmの所にソースを持つ圧力源がこの2年間の間に膨張したことが分かった。(2)稠密GPS観測点と精密重力変動観測網の結合による地下の物質移動の推定法本計画により新たに購入した可搬型重力計と現有の重力計を用いて、精密な重力の時間変化を上記の基準観測点を中心に観測し、可搬型重力計のドリフトや気圧などの補正償法を検討し数マイクロガルの精度が得られた。なお、本研究において当初計画していたリピートパス航空機合成開口レーダー干渉法(RP-Air InSAR)は、平成9年度にのみ実証のための試験飛行を行った。そして、平成10年度は、実際のデータを取るのではなく解析技術の向上を主眼として研究を行い、少なくとも数日間の間隔で天候が激しく変化しないならば、地上に反射板を適切に配置することにより十分実用に耐えるデータが得られることが分かった。本研究の大きな目標は、これまでにない全く新しい急激な地殻変動の観測手法として、リピートパス航空機合成開口

レーダー干渉法(R-Air InSAR)と精密な重力変動および稠密なGPS観測とを統合することによって、急激な地殻変動の新観測手法の有効性を示すことにある。そのためには、一定限の観測期間が必要であり、平成9,10年の2年間を研究機関と考え、現象にそくした適切な場での検証を行うことを主眼とする。そして、(1) D-GPS航法システムによるR-Air InSARと稠密GPS観測基準点の結合と(2)稠密GPS観測点と精密重力変動観測網の結合による地下の物質移動の推定を2本の柱として、とくに、測地学の分野で近年注目され積極的に検討されてきたGPS観測と精密重力変動観測網の結合は、火山性地殻変動のような大きな変動ではもっと有効である。本年度は、その第1年度として、まずテストフィールドとして神津島を選び、次のような観測ノ準備を行った。(1) GPS基準観測点とD-GPS航法システムによるR-Air InSARとの結合神津島では東京都や地震研究所そして国土地理院などにより、GPS観測点や重力基準観測点が設置され、年間数cmに達する変動が検出されているが、山頂付近のデータは不十分である。R-Air InSARの基準点を確立するため新たに一周波を利用する簡易型GPS受信装置を神津島に稠密展開することにより、航空機による観測とGPS観測を結合をはかった。(2)面的な地殻変動観測手法と精密重力/GPS観測との結合本計画により新たに購入した連続記録のできる可搬型重力系と現有の重力系を用いて、精密な重力の時間変化の観測を上記の基準観測点を中心にR-Air InSARの観測にあわせて測定する目的で、可搬型重力計のドリフトや気圧などの補償法について検討した。本研究の大きな目標は、新しい急激な地殻変動の観測手法として、差分合成開口レーダー干渉法(D-InSAR)と精密な重力変動および稠密なGPS観測とを統合することによって、急激な地殻変動の新観測手法の有効性を示すことにある。そのためには、一定限の観測期間が必要であり、平成9,10年の2年間を研究期間と考え、現象にそくした適切な場での検証を行うことを主眼とした。そして、(1)D-InSARと稠密GPS観測基準点の結合と(2)稠密GPS観測点と精密重力変動観測網の結合による地下の物質移動の推定を2本の柱として、とくに、測地学の分野で近年注目され積極的に検討されてきたGPS観測と精密重力変動観測網の結合は、火山性地殻変動のような大きな変動ではもっと有効である。本年度は、最終年度のため、昨年から引き続いて神津島について次のような観測を行った。(1) GPS基準観測点とD-GPS航法システムによるD-InSARとの結合神津島では東京都や地震研究所そして国土地理院などにより、GPS観測点や重力基準観測点が設置され、年間数cmに達する変動が検出されているが、山頂付近のデータは不十分である。D-InSARの基準点を確立するため新たに一周波を利用する簡易型GPS受信装置を神津島に稠密展開することにより、航空機による観測とGPS観測を結合をはかった。式根島との結合の結果、神津島の北方2kmの所にソースを持つ圧力源がこの2年間の間に膨張したことが分かった。(2)面的な地殻変動観測手法と精密重力/GPS観測との結合本計画により新たに購入した連続記録の出来る可搬型重力計と現有の重力計を用いて、精密な重力の時間変化の観測を上記の基準観測点を中心にD-InSARの観測にあわせて測定した。その際、可搬型重力計のドリフトや気圧などの補償法について検討した。なお、本年度において当初計画していたリピートパス航空機合成開口
植物細胞の液胞タンパク質の大量集積に関与するメンブレントラフィック

高等植物の種子には発芽後の窒素源として、種子貯蔵タンパク質が大量に蓄積している.これらの貯蔵タンパク質は種子の登熟期に小胞体でプロ型前駆体として合成され,タンパク質蓄積型液胞に運ばれ,プロセシングを受けて成熟型になる.私達はタンパク質蓄積型液胞への輸送には選別輸送レセプターAtVSR1が機能することを明らかにしている.本研究ではシロイヌナズナ変異体を用い,大量に合成・輸送される種子貯蔵タンパク質のメンブレントラフィック機構の解析を行った.AtVSR1のノックアウト変異体と同様に貯蔵タンパク質の前駆体を細胞外に異常分泌するmag1変異体の原因遺伝子はVPS29ホモログであった.VPS29はレトロマー複合体の構成因子の1つであり,データベース検索の結果,シロイヌナズナゲノムにレトロマー構成因子は保存されていた.別の構成因子であるVPS35はシロイヌナズナに3つ遺伝子が存在し,そのうち特定の二重変異体でmag1変異体と同様の表現型が観察された.植物においてもレトロマーが機能し,AtVSR1のリサイクルを介して貯蔵タンパク質の輸送に関与していることが判明した.一方,細胞内に貯蔵タンパク質前駆体を蓄積するmag2変異体の原因遺伝子は酵母TIP20/動物RINT1のホモログであった.酵母TIP20はtethering factorでゴルジ体から小胞体への逆行輸送に関わる因子である.酵母ツーハイブリッド法により,MAG2タンパク質が小胞体SNAREであるAtUfe1及びAtSec20と相互作用することが判明した.さらに,これまでに単離した4種類の変異体種子の電子顕微鏡観察を行った。これらはmag2変異体と同様に,貯蔵タンパク質の分泌は見られず,細胞質に電子密度の高いコアを含む新規構造体が観察された.この構造体の周囲にはリボソームが付着しており,小胞体由来であると考えられた.これらの変異体では貯蔵タンパク質の小胞体からの輸送過程に異常があると考えられた.種子貯蔵タンパク質は液胞タンパク質の一種であり,種子細胞のタンパク質蓄積型液胞に存在している.小胞体で合成された貯蔵タンパク質前駆体はメンブレントラフィックにより液胞まで輸送され成熟化する.大量に合成される貯蔵タンパク質は植物の液胞タンパク質の輸送機構を解析する好いモデル系である.本年度は貯蔵タンパク質の生合成に異常を示すシロイヌナズナ変異体の解析を行った.貯蔵タンパク質に対する特異抗体を用いたイムノブロティングにより,約28,000のT-DNAタグラインから貯蔵タンパク質の前駆体を異常に蓄積するラインを8ライン取得した.前駆体を蓄積する変異体は輸送過程に何らかの異常が起きていると考えられる.免疫電子顕微鏡観察の結果,A06変異体は一部の貯蔵タンパク質が細胞外に分泌されていた.これは選別輸送レセプターAtVSR1のノックアウト変異体と同一の表現型であり,A06変異体の原因遺伝子がAtVSR1の関与する輸送経路で機能している可能性を示唆している.また,A02及びA03変異体は共通の表現型を示し,貯蔵タンパク質の分泌は認められないが,細胞内に小胞体由来であると考えられる異常な構造体が形成されていた.これはメンブレントラフィックの初期に欠損があるためと考えられた.一部の変異体については原因遺伝子の特定を行い,分裂酵母の液胞タンパク質輸送に関る因子と相同性が見られた.さらに,これらの遺伝子産物と相互作用すると予測される因子のノックアウト変異体を解析した.一部の変異体については予測通りに貯蔵タンパク質の輸送異常が観察された.高等植物の種子には発芽後の窒素源として、種子貯蔵タンパク質が大量に蓄積している.これらの貯蔵タンパク質は種子の登熟期に小胞体でプロ型前駆体として合成され,タンパク質蓄積型液胞に運ばれ,プロセシングを受けて成熟型になる.私達はタンパク質蓄積型液胞への輸送には選別輸送レセプターAtVSR1が機能することを明らかにしている.本研究ではシロイヌナズナ変異体を用い,大量に合成・輸送される種子貯蔵タンパク質のメンブレントラフィック機構の解析を行った.AtVSR1のノックアウト変異体と同様に貯蔵タンパク質の前駆体を細胞外に異常分泌するmag1変異体の原因遺伝子はVPS29ホモログであった.VPS29はレトロマー複合体の構成因子の1つであり,データベース検索の結果,シロイヌナズナゲノムにレトロマー構成因子は保存されていた.別の構成因子であるVPS35はシロイヌナズナに3つ遺伝子が存在し,そのうち特定の二重変異体でmag1変異体と同様の表現型が観察された.植物においてもレトロマーが機能し,AtVSR1のリサイクルを介して貯蔵タンパク質の輸送に関与していることが判明した.一方,細胞内に貯蔵タンパク質前駆体を蓄積するmag2変異体の原因遺伝子は酵母TIP20/動物RINT1のホモログであった.酵母TIP20はtethering factorでゴルジ体から小胞体への逆行輸送に関わる因子である.酵母ツーハイブリッド法により,MAG2タンパク質が小胞体SNAREであるAtUfe1及びAtSec20と相互作用することが判明した.さらに,これまでに単離した4種類の変異体種子の電子顕微鏡観察を行った。これらはmag2変異体と同様に,貯蔵タンパク質の分泌は見られず,細胞質に電子密度の高いコアを含む新規構造体が観察された.この構造体の周囲にはリボソームが付着しており,小胞体由来であると考えられた.これらの変異体では貯蔵タンパク質の小胞体からの輸送過程に異常があると考えられた.
胎仔を用いた肺高血圧症モデルによる肺血管病変の発生機序

妊娠100120日の羊5頭をおよび、妊娠山羊2頭を用いて、合計7回の実験をおこなった。胎仔に対して子宮内手術により左肺動脈を下行大動脈に端側吻合をおこなった。胎仔の体重は約1500グラムと極めて小さく、子宮内操作であるために視野が大変狭く、手術操作には新生児用の特殊な器機を必要とした。胎仔に対する手術を完了し母羊および母山羊の子宮内に還納し経過を観察したが、7頭とも術後17日で子宮内死亡、死産であった。子宮内手術手技に習熟する必要性が痛感されるとともに、胎仔に対する手術侵襲が過大であった可能性もあると考えられた。生存モデルが得られなかったために、当初の目的である肺血管床の組織学的検索はおこなえなかった。しかし、妊娠羊ばかりではなく妊娠山羊を実験動物として用いることが可能となり、また大動物の子宮内手術に対する幾多の知見を得ることができた。今後の実験の進展を期待出来るものとかんがえられた。妊娠100120日の羊2頭を用いて、胎仔に対して子宮内手術により左肺動脈を下行大動脈に端側吻合をおこなった。胎仔の体重は約1500グラムと極めて小さく、子宮内操作であるために視野が大変狭く、手術操作には新生児用の特殊な器機を必要としたため、補助金で購入し、今後の手術の便に供した。胎仔に対する手術を完了し母羊の子宮内に還納し経過を観察したが、2頭とも術後1日で子宮内死亡となった。実験数をふやし手術手技に習熟する必要性が痛感された。今年度の実験数が2頭であったのは妊娠羊の供給が極めて悪かったのも、その一因である。実験動物として、妊娠羊ばかりでなく4月以降も入手可能な妊娠山羊を用いての実験の継続を検討している。実験動物として羊と山羊の両者を用いることが可能となれば、羊を用いた実験では3ヵ月しかとれなかった実験期間を大幅に延長することが可能となるものと期待される。胎仔に対する手術を完了し母羊および母山羊の子宮内に還納し経過を観察したが、7頭とも術後130日で子宮内死亡、死産であった。しかし、妊娠羊ばかりではなく妊娠山羊を実験動物としての子宮内手術を行うことが可能となり、今後の実験の進展を期待出来るものとかんがえられた。
哺乳類細胞のDNA修復とアポトーシスの経路選択機構

アポトーシスは現在のところ、細胞の縮小、クロマチンの核膜周辺への凝縮、核の断片化、微絨毛の消失などの形態学的変化、及び生化学的変化であるDNAの断片化によって定義されている。しかし、アポトーシスの定義の一つともなっているDNAのヌクレオソーム単位での断片化を司るエンドヌクレアーゼの実体は不明のままであった。我々は実行過程の中心的酵素であるDNAの断片化を司るエンドヌクレアーゼに着目して研究を行い、その実体を同定することに成功し、これをDNaseγと命名した。DNaseγは中性領域に至適pHをもつCa^<2+>/Mg^<2+>-要求性でZn^<2+>によって阻害される酵素である。さらにDNA切断様式は3'-OH/5'-P型であり、細胞レベルにおけるアポトーシスのDNA断片化の様式と一致することを見出した。さらに我々はDNaseγの部分アミノ酸配列を決定するため、ラット脾臓よりDNaseγの大量精製を行い、N末端及びいくつかの内部アミノ酸配列を気相アミノ酸シークエンサーを用いて決定した。ホモロジー検索の結果、DNaseγは新規の酵素であった。次にこれらのアミノ酸配列から予想される塩基配列をもとにDNAオリゴヌクレオチドプローブを作製し、λgt11ラット脾臓cDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行いDNaseγ遺伝子をコードするクローンを単離することに成功した。また、DNaseγcDNAの解析から、本酵素は前駆体から成熟型への変換が起こることが明らかとなった。
翼の誘導抵抗及びその測定法の研究

1921年に出されて以来、航空機の空力学理論の基礎になってきたMunkの定理によれば、誘導抵抗は後退/前進角に依らない。しかし、わが国の代表的な航空機の開発機関による此れ迄の実験によれば、誘導抵抗は後退/前進角に依って大きく異なる。Munkの定理か、此れ迄の実験かのどちらかが間違っているが、どちらが間違いであっても航空機の空力設計に把手大問題である。この点を確認する目的で以下の研究を行った。1.新しい天秤を作り後退/前進翼の実験を行った。2.航空宇宙技術研究所にあるわが国で唯一の複合較正装置において、天秤の検定を行った。ここで得られた較正係数を用いて実験結果を整理した結果、後退角が大きいほど誘導抵抗が大きい結果が得られた。3.天秤製作者が行った、略式の複合荷重較正装置に依ってえられた較正係数を用いて実験結果を整理した結果、従来通り後退角が大きいほど誘導抵抗が小さい結果が得られた。4.本実験天秤は航空宇宙技術研究所の複合荷重較正装置の荷重範囲の下限にあること、同装置は稼働を始めてから間がなく、較正手順が確立されていない事等により、同装置による較正係数の制度については検討の余地がある。5.現在、航空宇宙技術研究所に於いて、較正作業を再度行っており、本実験の最終結論は正しい較正結果が出た上でだす予定である。平成7年度は複合荷重較正を行なうための六分力天秤の製作を計り、日章電機の協力で設計から始めて新規に複合荷重較正天秤を製作した。この天秤の較正装置への取り付け機器装置はみずほ製作所で製作した。この間、日章電機、みずほ製作所および航空宇宙技術研究所へ打ち合せと制作に関する指導を行なってきた。その結果、期待した天秤が製作されたので、此の天秤に関する較正試験が始められる準備に入っている。この試験は航空宇宙技術研究所への依頼試験として、6分力天秤の複合荷重較正を行なう準備を整えることが出来た。本年は航空宇宙技術研究所の低乱風洞を用いて基本試験を行い、従来の天秤のデータを採る試験を行なった。6分力天秤の航空宇宙技術研究所での較正試験が行なわれ次第、この天秤は信頼できるものとなるので、これを用いて複合荷重較正の為の再度風洞試験を行なう準備が整えられたことになる。平成8年度は、先ず航空宇宙技術研究所に依頼して、前年度に製作した天秤の複合荷重較正試験を行い、較正係数を得た。それは従来の複合でない単荷重較正試験による較正係数とは異なるものであった。次に航空宇宙技術研究所の遷音速風洞において、本天秤を用いて前進/後退翼の空力特性の測定を行った。前記複合荷重較正係数を用いてデータ整理を行った結果、従来とは異なる試験結果が得られた。これは同時にパネル方を用いた計算結果とも一致した。実験、計算両結果を合せて新しい知見を得ることが出来た。現在結果を整理し、報告書を作成中である。
腫瘍血管新生を標的とした高濃度レスベラトロールオリゴマー含有食品の癌予防効果

In vitro血管新生モデルを用いて、東南アジア原産のメリンジョ(Gnetum gnemon L.)種子抽出物とその主要構成成分であるレスベラトロール二量体、グネチンCが血管内皮細胞の増殖,遊走及び管腔形成を顕著に阻害することを見出した。さらに、メリンジョ種子抽出物は腫瘍血管新生,腫瘍の増大,及び転移も抑制した。また、遺伝子発現情報解析によって、メリンジョ種子抽出物とグネチンCの作用機序が、topoisomeraseやCDK阻害剤等と類似していることを明らかした。近年、レスベラトールオリゴマーが様々な植物に存在することが報告されているが、その生理活性に関する知見は極めて限られている。それ故、レスベラトールオリゴマーを含む植物資源の有効利用は殆ど進んでいない。そこで本研究では、レスベラトールオリゴマーおよびそれらを含有する植物抽出物の生理活性を癌の悪性化を制御する腫瘍血管新生に焦点を当て、動物、細胞および分子レベルで解析することで、癌予防食品および癌予防成分としての有用性を検証することを目的とした。本年度は、東南アジア原産のある植物種子エタノール抽出物、およびその主成分であるレスベラトロールダイマーの血管新生に対する作用を検証した。その結果、1 .種子抽出物及びレスベラトロールダイマーが、vascular endothelial growth factor及びbasicfibroblast growthfactor誘導性の血管内皮細胞の細胞増殖、遊走、管腔形成を濃度依存的に抑制することを見出した。2.レスベラトロールダイマーの管腔形成抑制作用が、レスベラトロールと比較して約11倍程度強いことが確認された。3. Westernblottingによるシグナル伝達経路の解析により、種子抽出物及びレスベラトロールダイマーは、ERK1/2の活性化の抑制を介して、血管新生抑制作用の一端を発揮しているという知見が得られた。さらに、4.in vivo腫瘍血管新生モデルであるマウス背部皮下法において、種子抽出物を含んだ食餌を与えた群では、腫瘍細胞が誘導する血管新生が有意に抑制されることを確認した。以上の成果から、今年度解析した植物種子抽出物は、腫瘍血管新生に対して経口摂取で抑制効果を発揮し、その作用の一端は血管新生に関わる複数の内皮細胞の抑制に起因することが示唆された。さらに、その種子抽出物の主成分であるレスベラトロールダイマーが、in vitroで顕著な血管新生抑制作用を発揮することを見出した。近年、レスベラトールオリゴマーが様々な植物に存在することが報告されているが、その生理活性は不明な点が多く、それ故レスベラトールオリゴマーを含む植物資源は有効利用されていない。そこで本研究では、癌の悪性化に関わる腫瘍血管新生に対するレスベラトールオリゴマーおよびそれらを含有する植物抽出物の作用を解析することで、癌予防食品および癌予防成分としての有用性を検証することを目的とした。本年度は、東南アジア原産メリンジョ(Gnetum gnemon L.)種子エタノール抽出物、およびその主成分であるレスベラトロールダイマー(gnetin Cなど)の血管新生に対する作用を検証した。その結果として、1.メリンジョ種子抽出物が、VEGF及びbFGF誘導性の血管内皮細胞の細胞増殖、遊走、管腔形成を顕著に抑制することを見出した。2.Gnetin Cがレスベラトロールに比べて約11倍程度強い管腔形成抑制作用を発揮することを見出した。3.メリンジョ種子抽出物及びgnetin Cは、ERK1/2の活性化の抑制を介して、血管新生抑制作用の一端を発揮しているという知見が得られた。4.In vivo腫瘍血管新生モデルであるマウス背部皮下法において、メリンジョ種子抽出物摂取群では、腫瘍血管新生が有意に抑制されることを確認した。以上の成果から、メリンジョ種子抽出物は、腫瘍血管新生に対して経口摂取で抑制効果を発揮し、その作用の一端は血管新生に関わる複数の内皮細胞の抑制に起因することが示唆された。さらに、その種子抽出物の主成分gnetin Cが、in vitroで顕著な血管新生抑制作用を発揮することを見出した(論文投稿中)。近年、レスベラトロールオリゴマーが様々な植物に存在することが報告されているが、その生理活性は不明な点が多い。それ故、レスベラトロールオリゴマーを含む植物資源は有効利用されていない。そこで本研究では、がんの悪性化に関わる腫瘍血管新生に対するレスベラトロールオリゴマーおよびそれらを含有する植物抽出物の作用を解析することを目的とした。昨年度は、インドネシア原産メリンジョ(Gnetum gnemon L.)の種子エタノール抽出物およびその主要構成成分gnetinC(レスベラトロールダイマー)の血管新生抑制作用をin vivo及びin vitroモデルで明らかにした。そこで本年度は、それらの血管新生抑制分子機序を解析した。その結果、メリンジョ種子抽出物及びgnetin Cは、1)VEGF及びbFGFが誘導するERK1/2のリン酸化は有意に抑制するが、VEGFR2およびSTAT3のリン酸化には影響を与えない(Western blot解析)、および2)細胞外マトリクス分解酵素であるpro

*およびactive-matrix metalloproteinase-2レベルには影響を与えない(Gelatin zymography)、ことを確認した。また、MEK1/2阻害剤U0126を用いた検証実験により、メリンジョ種子抽出物やgnetinCのERK1/2抑制作用が、管腔形成の抑制や細胞生存率の低下の主要因である一方で、遊走抑制作用には全く貢献しないことが明らかになった(Kunimasa K, et al., MolNutr Food Res 2011)。レスベラトロールオリゴー自体やそれらを含有する植物抽出物が一般的に販売されていない為、それらの入手が非常に困難であり、メリンジョ抽出物以外の研究が遅延している。一方で、メリンジョ抽出物やそのレスベラトロールダイマーgnetin Cに関する研究は順調に進展しており、現在、in vivoでがん抑制作用や転移抑制作用を検証している。24年度が最終年度であるため、記入しない。先の薬学会で、レスベラトロールオリゴーやそれらを含有する植物抽出物を豊富に所有する先生方と交流を深めることができ、もし可能であるならばそれらの素材を入手し、研究を展開していく予定である。また、メリンジョ抽出物やそのレスベラトロールダイマーgnetin Cに関しては、がん予防効果を検証する為にも、in vivoでのがん抑制作用や転移抑制作用を検証していく方針である。
新規ペプチド、メタスチン/キスペプチンによる生殖の中枢制御機構

ほ乳類における生殖機能は、視床下部からの性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)のパルス状分泌およびサージ状分泌によって制御される。本研究では、脳内の前腹側室周囲核(AVPV)および弓状核(ARC)に局在するメタスチン・キスペプチンニューロンが、それぞれサージ状およびパルス状GnRH/性腺刺激ホルモン分泌を調節することにより、卵胞発育および排卵を制御する可能性を示した。ほ乳類の生殖機能を制御する中枢機構を明らかにすることを目的とし、脳内メタスチン/キスペプチンニューロンによる生殖制御に注目して以下の実験を行ったメタスチン/キスペプチンニューロンの細胞体が、前腹側室周囲核(AVPV)とおよび視床下部室傍核(ARC)に局在するとの過去の実験より、これらの2つのメタスチン/キスペプチンニューロン群の生理的役割を明らかにするため、AVPVはエストロジェンのポジティブフィードバックによる性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)/黄体形成ホルモン(LH)サージを制御する本体であり、ARCに局在するメタスチン/キスペプチンニューロンが、パルス発生機構そのものであるとの仮説を立て、これを支持する結果を得た。具体的には、成熟後に卵巣除去(OVX)を施したラット、および生後24時間以内に精巣除去(CAST)を施したラットにおいて、高濃度のエストロジェン処置がAVPVのメタスチンニューロン発現およびLHサージを誘起することを示した。一方、成熟後に精巣除去した雄ラットおよび生後5日目にエストロジェン処置した雌ラットにおいては、高濃度エストロジェン処置は、AVPVメタスチンニューロン発現およびLHサージを誘起できないことを示した。メタスチン受容体であるGPR54の遺伝子発現については、以上の処置は何ら効果を示さないことから、高濃度エストロジェンはAVPVメタスチンニューロンにおけるメタスチン発現の増加を促すことにより、エストロジェンのポジティブフィードバック制御することを示唆した。また、ARCのメタスチン遺伝子およびタンパク発現は、エストロジェン処理により抑制されることから、ARCメタンチンニューロンはエストロジェンの規程的LH分泌に対する負のフィードバック効果を仲介する可能性が高いことを示した。ほ乳類の生殖機能を制御する中枢機構の解明を目的とし、脳内メタスチン/キスペプチンニューロンによる生殖制御に注目して実験を行った。メタスチン/キスペプチンニューロンの細胞体は、前腹側室周囲核(AVPV)とおよび視床下部室傍核(ARC)に局在する。AVPVのメタスチン/キスペプチンニューロンはエストロジェンのポジティブフィードバックによる性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)/黄体形成ホルモン(LH)サージを制御する本体であり、ARCに局在する同ニューロンが、パルス発生機構そのものであるとの仮説を立てた。成熟後に卵巣除去(OVX)を施したラット、および生後24時間以内に精巣除去(CAST)を施したラットにおいて、成熟後の高濃度のエストロジェン処置がAVPVのメタスチンニューロン発現およびLHサージを誘起することを示した。一方、成熟後に精巣除去した雄ラットおよび生後5日目にエストロジェン処置した雌ラットにおいては、高濃度エストロジェンを処置しても、AVPVメタスチンニューロン発現およびLHサージを誘起できないことを示した。さらに、AVPVに存在する他の神経伝達物質(GABA,グルタミン酸など)遺伝子の発現の多寡は、GnRH/LHサージの有無と同期しないことを明らかとし、AVPVのメタスチン/キスペプチンニューロンが第一義的にGnRH/LHサージを制御することが示唆された。さらに、新生児期のラットに長期間エストロジェンを投与すると、ARCのメタスチン遺伝子およびタンパク発現は顕著に抑制され、LHパルスもまた同様に顕著に抑制されることから、ARCメタスチンニューロンがGnRH/LHパルス発生機構である可能性を強く示唆した。脳内メタスチン/キスペプチンニューロンに注目し、前腹側室周囲核(AVPV)および視床下部室傍核(ARC)に局在するメタスチン/キスペプチンニューロンが、それぞれ性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)/黄体形成ホルモン(LH)サージ、およびGnRH/LHパルス制御を介して排卵および卵胞発育を支配するとの仮説を証明することを目的として実験を行った。成熟に卵巣除去を施した雌ラット、および出生直後に精巣除去を施した雄ラットにおいて、成熟後の高濃度のエストロジェン処置がAVPVのメタスチンニューロン発現およびLHサージを誘起することを示した。この結果より、AVPVメタスチン/キスペプチンニューロンがGnRH/LHサージと排卵を制御する一義的なニューロンであることを示唆した。

一方、新生児期のラットに長期間エストロジェンを投与すると、ARCのメタスチン遺伝子およびタンパク発現は顕著に抑制され、LHパルスもまた同様に顕著に抑制されることから、ARCメタスチンニューロンがGnRH/LHパルスと卵胞発育を制御するニューロンである可能性を強く示唆した。また、ヤギを用いた研究によりARCの同ニューロンがGnRH/LHパルス発生機構そのものである可能性を示唆した。さらに、ブタにおいても、AVPVと相同な神経核にエストロジェン依存性に同ニューロンの発現とGnRH/LHサージが誘起され、OVXブタではARCに多数のキスペプチンニューロンが発現することから、これらのメタスチン/キスペプチンニューロンが家畜においても排卵・卵胞発育を制御する可能性を示した。
VEGFに誘導される細胞間接着崩壊におけるコフィリン活性調節機構とその役割

血管新生誘導因子であるVEGFは血管内皮細胞どうしの細胞間接着を崩壊させ、血管新生の第一段階である血管内皮細胞の遊走や、血管透過性の亢進により血管内外へのガン細胞等の浸潤促進を引き起こすことが知られている。しかし、VEGF刺激による細胞間接着崩壊へのシグナル経路は未だ良くわかっていない。細胞の免疫蛍光染色により、細胞間接着部位にはコフィリンおよびそのホスファターゼであるSlingshot1(SSH1)が集積し、LIMキナーゼ1(LIMK1)はその部位にだけ存在しないこと、また、VEGF刺激により細胞間接着崩壊後の細胞先導端でコフィリン、SSH1およびLIMK1が共局在するようになることが観察された。以前にVEGFはMAPKAPキナーゼ2(MK2)を介したLIMK1の活性化を誘導するが、細胞内でSSH1、LIMK1およびMK2は三分子複合体を形成しており、精製タンパク質を用いた実験からLIMK1とSSH1は直接結合していないことがわかった。これらは細胞内においてVEGF刺激により結合量が変化し、それはVEGF刺激に誘導されるLIMK1およびSSH1の活性化と相関していた。そしてMK2はSSH1のカルボキシル末端側に結合し、SSH1のアミノ末端側をリン酸化し、MK2はSSH1を活性化させるが、LIMK1はSSH1をリン酸化せず、活性には影響しなかった。一方、SSH1はMK2およびLIMK1を脱リン酸化しないことが明らかになった。これらの結果から、VEGF刺激に誘導される細胞間接着崩壊時にMK2とSSH1およびLIMK1が結合し、MK2によりSSH1とLIMK1が活性化されることで、細胞先導端でコフィリンのリン酸化・脱リン酸化のサイクルが早くなり、アクチンのターンオーバーが促進されて細胞形態のダイナミックな変化や細胞遊走が促進されると示唆された。まず血管内皮細胞において、VEGFにより細胞間接着を崩壊させた時のLIMキナーゼ1(LIMK1)およびslingshot1(SSH1)の活性変化を調べた結果、どちらもほぼ同時に活性が変化することがわかった。次にLIMK1、SSH1、コフィリンおよびリン酸化コフィリンの細胞内局在を細胞染色によって観察した。その結果、LIMK1は細胞間接着部位には無く、それ以外の細胞全体に局在していたが、対照的にSSH1は細胞間接着部位に集積していた。またコフィリンは細胞間接着部位に集積していたのに対し、リン酸化コフィリンの染色は細胞間接着部位が抜けてみえた。これらの結果から細胞間接着部位には非リン酸化型コフィリンが必要で、そこにSSH1が局在化することで局所的にコフィリンが脱リン酸化されていることが示唆された。一方、VEGFによって細胞間接着を崩壊させると、細胞の先導端部位でのLIMK1およびSSH1の共局在化が観察された。次に過剰発現系の共沈実験において、VEGFの下流でLIMK1を活性化させるMAPKAPキナーゼ2(MK2)が、細胞内でLIMK1およびSSH1と結合することがわかった。また精製タンパク質を用いた実験により、LIMK1とSSH1は直接結合しないが、これらはMK2との結合を介することで3重複合体を形成することがわかった。そしてSSH1はMK2によりリン酸化された。これらの結果から、VEGFにより細胞間接着が崩壊する時にMK2がLIMK1およびSSH1の活性を時空間的に制御している可能性が示唆された。