hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ルイス酸―塩基相互作用を利用した遠隔位選択的な炭素―水素結合変換反応の開発

本年度以降、ルイス酸塩基相互作用部位に焦点を当て、目的である遠隔位選択的なC-H結合変換反応に取り組む予定である。昨年度の研究計画としては、次のようなものを考えていた。「一昨年度に開発した新規ピコリン酸アミド骨格をリガンドに組み込むことで、当初の目的である遠隔位選択的なC-H変換反応の開発に取り組む」しかし、一昨年度に見出したパラジウム/ピコリン酸アミド触媒を用いた新規ケトン合成法の開発において、ヘテロアリールケトンやビスヘテロアリールケトンが低収率ながら得られることが分かった。これらの化合物は医薬品などの機能性有機化合物に広く見られる有用な骨格である一方で、その合成には多段階を要していた。そこで私はピコリン酸アミド部位をさらにチューニングすることで収率の向上に取り組むこととした。その結果、ピリジン環平面上に窒素原子が2つ固定された電子供与性が非常に高いピコリン酸アミドを用いた際に、これらの化合物の効率合成に成功した。また、本パラジウム/ピコリン酸アミド触媒系は興味深い反応性を有していたので、計算化学も用いて反応機構の解析を行った。その結果、アルデヒドのC-H結合が活性化されていることを見出し、この触媒系の更なる発展を示唆する結果を得ることに成功した。本研究成果は、ACS Catal.誌に掲載されている。最終年度は、昨年度までに開発した新規ピコリン酸アミド配位子を触媒に組み込み、位置選択的なC(sp3)-H変換反応の開発研究を進める予定であった。しかし、この数年で光触媒/水素原子移動(HAT)触媒のハイブリッド触媒系を用いたC(sp3)-H結合変換反応が開発され、研究計画を見直す必要が出てきた。この方法では、可視光室温という穏和な条件下に、これまで困難であったC(sp3)-H結合の変換を達成できるからである。そこで私は、光触媒/HAT触媒のハイブリッド触媒系を用いることで、遠隔位選択的なC(sp3)-H変換反応の開発に取り組むこととした。まず、私は新規HAT触媒の開発に挑戦した。私は、DNAの光開裂におけるリン酸ラジカルの働きに注目し、リン酸がHAT触媒として機能するのではないかと考え、研究を行った。その結果、光触媒/リン酸HAT触媒の新規ハイブリッド触媒系の開発に成功し、可視光室温という穏和な条件下にC(sp3)-H結合シアノ化反応の開発に成功した(Chem. Eur. J. 2018, 24, 8051.)。リン酸は容易にチューニングできるため、分子認識部位をリン酸に組み込むことで位置選択的なC(sp3)-H変換反応の開発が期待できる。本年度開発した二座配向基をルイス酸ー塩基相互作用を有するリガンドに組み込み反応の検討を行う予定である。また同時に、より強力な二座配向基の合成も続けていく予定である。当初の計画からはだいぶ離れてしまったが、これまでに得られた配向基部位の性質の知見を活かし、本年度は基質と配位子間のルイス酸塩基相互作用部位の構築に力を入れて当初の目的であるルイス酸塩基相互作用を用いた遠隔位選択的なCーH変換反応を達成する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ショウジョウバエで発見された新規の性比異常現象の原因因子とその機構の解明

我々はヤマカオジロショウジョウバエ(Drosophila biauraria)において、北海道から採集した複数の系統では子供が全て雌になる性比異常象を示すことを発見した。PCR実験、テトラサイクリン処理、RNA-seqによる解析等から、D. biaurariaにおける性比異常現象の要因は、RNAウイルスとボルバキアが候補であること明らかになった。また、RNAウイルスによる雄殺しの系統では、未交尾の雌でも産卵が活発であり、RNAウイルスの作用は雄殺しだけでなく、産卵数の増加にまで影響を与えることが明らかになった。一方、ボルバキアによる全オス系統では、産卵数に与える特別な影響は見られなかった。ヤマカオジロショウジョウバエの子のみがメスになる系統(全雌系統)は、細胞内共生菌による雄殺しと同様に母から子に確実に伝達する。しかし、分子遺伝的解析や抗生物質処理、及び電子顕微鏡観察では原因となる細菌類が検出されなかったことから、この性比異常現象の原因はウイルス様因子が原因ではないかと考えられるようになった。本研究では平成27年度において以下の実験を行った。最初の系統が発見された北海道でヤマカオジロショウジョウバエの採集を行った。採集されたヤマカオジロショウジョウバエ55系統のうち、3系統が性比異常の系統であり、その頻度は2011年の5%と同様な5.5%になった。全雌系統の細胞物質をヤマカオジロショウジョウバエとキイロショウジョウバエの雌にインジェクションし、その雌の子に雄が出るかどうかで判断する形質転換の実験を行った。結果は一部のヤマカオジロショウジョウバエでのみ形質転換がおこり、キイロショウジョウバエでは現在のところ形質転換体は得られていない。2011年に採集された全雌系統、及び形質転換により全雌系統になった系統を用いて、雌雄が産まれる正常な系統の雌雄をコントロールとしてRNA-seqによりトランスクリプトームの比較実験を行った。その結果、複数のウイルス遺伝子が検出された。コントロールでは全く検出されなかったが、2つの全雌系統で共通に検出されたのは、RNAウイルスであるPartitivirusの遺伝子であった。全雌系統に複数のウイルスが存在することがRNA-seqの結果、明らかになったので超遠心機によるウイルス粒子の精製は行わないことになった。本研究の結果、野外から複数の全雌系統が得られ、今後の研究に使用することが可能になった。また、RNA-seqの解析の結果、性比異常をおこすウイルスをその候補としてあげることができた。平成27年度に実行された北海道における野外採集では、新たに3系統の全雌系統を得ることができた。これらの系統は今後、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析に用いることにより、性比異常現象をおこすウイルス同定のための実験材料として使用することができる。全雌系統の細胞物質をヤマカオジロショウジョウバエとキイロショウジョウバエの雌にインジェクションし、その雌の子に雄が出るかどうかで判断する形質転換の実験では、一部のヤマカオジロショウジョウバエでのみ形質転換がおこり、キイロショウジョウバエでは形質転換体は得られなかった。いずれの形質転換の実験でも、形質転換を試みたサンプル数は少なかったので、今後サンプル数を増やすことでヤマカオジロショウジョウバエ以外の種へも形質転換が可能かどうか検討することができる。正常な系統の雌雄をコントロールとして行ったRNA-seqによるトランスクリプトームの比較実験では、コントロールでは全く検出されないが、2つの全雌系統で共通に検出された性比異常の原因因子として、RNAウイルスであるPartitivirusを候補に挙げることができた。ヤマカオジロショウジョウバエのメスになる系統(全メス系統)は、細胞内共生菌による雄殺しと同様に母から子に確実に伝達する。本研究での分子遺伝的解析や抗生物質処理、及び電子顕微鏡観察では原因となる細菌類が検出されなかったことから、この性比異常現象の原因はウイルス様因子が原因ではないかと考えられ、昨年のRNA-seqの解析結果から現在ではRNAウイルスであるPartitivirusが原因であることが示唆されている。Partitivirusによる全メス現象が雄殺しであるかどうかを確認するために、全メス系統及び雌雄が産まれる正常系統で孵化率と卵から成虫までの生存率を調査したところ、全メス系統では卵から成虫までの生存率は孵化率の半分で、この現象が雄殺しであることが示唆された。さらに、Partitivirusによる全メス系統は、正常系統と比較して産卵数の増加やミトコンドリアの形態異常の増大も引きおこすことが観察された。インジェクションによる正常系統から全メス系統への形質転換の割合は大変低く、再現性がほとんどなかった。そこでインジェクションする体液を濃縮する方法を開発した結果、インジェクションの成功率を上げることができ、より多くの形質転換体を得ることができた。平成27年に北海道で採集されたヤマカオジロショウジョウバエの3系統の性比異常系統は、PCR法による調査でPartitivirusによるものでなく、ボルバキアによるものであることが明らかになった。本研究の結果、ショウジョウバエでは初めて1つの種で2つの要因による性比異常現象があることが明らかになった。平成27年度に実行された北海道における野外採集では新たに3系統の全雌系統を得ることができたが、これらの系統の性比異常現象はボルバキアによるものであることが明らかになった。そのためこの3系統を用いてRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行うことはできなかった。

しかし、この発見によりショウジョウバエでは初めて、1つの種で2つの要因による性比異常現象があることが明らかになった。また、Partitivirusによる全メス系統では、孵化率と卵から成虫までの生存率の調査から、この現象が雄殺しによるものであることが示唆されただけでなく、正常系統と比較して産卵数の増加やミトコンドリアの形態異常の増大も引きおこすことが観察された。インジェクションによる正常系統から全メス系統への形質転換の割合を増加させるためにインジェクションする方法を改良し、体液を濃縮する方法を開発した結果、インジェクションの成功率を上げることができた。インジェクションによる新たな形質転換系統は、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析に使用する予定である。今年度に北海道から採集したヤマカオジロショウジョウバエ(Drosophila biauraria)の新たな系統では、ボルバキアによって子供が全て雌になることを発見した。すなわち、D. biaurariaにおける性比異常現象の要因はウイルスとボルバキアの2つがあることが判明した。RNAウイルスによる全メス系統で、リボソームを除去したRNAを用いてRNA-seqを行ったところ、以前得られたPartitivirusのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)に相同な配列以外に3本の遺伝子が全メス形質にリンクして高発現を示していることがわかった。これら3本の遺伝子(ここではMKV1, MKV2, MKV3とする)はタンパクをコードしていると推定されるが相同性検索からは既知の配列は見つからなかった。Partitivirusは植物や菌類で知られる2本鎖RNAウイルスであり基本的に2分節のゲノムをもち、RdRpとコートタンパクがコードされている。今回見つかった4本の配列が、1つのPartitivirusが持つ遺伝子なのか、それとも複数のウイルス(様因子)が共存しているのかは不明である。また、正常系統に全メス系統の磨砕物をインジェクションし全メス系統を確立する際に、一部の系統でこれら4本の遺伝子のうち、一部の遺伝子が抜け落ちた系統を得ることができた。これらの系統の性比から特定の配列(MKV1)がオス殺しに必要な遺伝子であることが推定された。さらにRNAウイルスによる雄殺しの系統では、未交尾の雌でも産卵が活発であり、RNAウイルスの作用は雄殺しだけでなく、産卵数の増加にまで影響を与えることが明らかになった。一方、ボルバキアによる雄殺しの系統では、産卵数に与える特別な影響は見られなかった。以上の事より、雄殺しのメカニズムは同一でないことが示唆された。我々はヤマカオジロショウジョウバエ(Drosophila biauraria)において、北海道から採集した複数の系統では子供が全て雌になる性比異常象を示すことを発見した。PCR実験、テトラサイクリン処理、RNA-seqによる解析等から、D. biaurariaにおける性比異常現象の要因は、RNAウイルスとボルバキアが候補であること明らかになった。また、RNAウイルスによる雄殺しの系統では、未交尾の雌でも産卵が活発であり、RNAウイルスの作用は雄殺しだけでなく、産卵数の増加にまで影響を与えることが明らかになった。
神経突起ガイダンスシグナルのインテグレーションにおけるG蛋白質の機能の解明

神経突起形成に重要な役割を果たしている低分子量G蛋白質R-Rasサブファミリー、R-Ras、M-Ra s、TC21の情報伝達機構を分子レベルで明らかにするため、R-Rasサブファミリーの下流のエフェクター分子の探索とその作用機構について研究を進めた。TC21の神経細胞の形態形成における機能を解析し、TC21がスパイン形成時に強く発現ししており、スパイン形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。一方、R-Rasサブファミリーの上流の情報伝達経路について解析し、RasGRF1がBDNFの刺激でR-Rasを活性化し、神経軸索の伸長と分枝化の促進することを明らかにした。神経突起形成に重要な役割を果たしているR-Rasファミリーの情報伝達機構を分子レベルで明らかにするため、R-Rasファミリーの下流のエフェクター分子の探索とその作用機構について研究した。R-Rasは軸索の分枝化を促進するが、この作用は活性型R-Rasが結合するエフェクター分子、afadinを介することを明らかにしてきた。afadinには、選択的スプライシングにより生成される2種類のアイソフォーム、s-afadinとl-afadinが存在する。そこで、これら2種類のアイソフォームのR-Rasの下流での機能の役割について解析した。海馬初代培養神経細胞で、軸索の分枝化が盛んな培養初期では、l-afadinの発現が主であったが、3日以降の軸索の分枝化が減弱する時期でs-afadinの発現が増加してきた。神経細胞で、s-afadin過剰発現させるとR-Rasによる軸索の分枝化が抑制され、s-afadinの発現をを特異的に抑制するshRNAを発現させると、R-Rasによる分枝化が促進された。また、発現培養細胞で、s-afadinはR-Rasによるl-afadinの細胞質から細胞膜への移行を阻害した。これらのことから、s-afadinはl-afadinのドミナントネガティヴ体として働くアイソフォームで、R-Rasによるl-afadinの細胞膜への移行を阻害することにより、R-Ras-l-afadinによる軸索の分枝形成を抑制的に制御していることが考えられる。また、神経細胞の軸索形成において、軸索の分枝化の時期と2つのafadinアイソフォームの発現パターンが一致しており、s-afadinの発現の変化で、分枝化が調節されていることが示唆される。当初の計画通り、神経軸索形成に重要な役割を果たしているR-Rasのエフェクターの作用機構について、全体像がつかめるようになった。神経突起形成に重要な役割を果たしている低分子量G蛋白質RasファミリーのサブグループであるR-Rasサブファミリー、R-Ras、M-Ras、TC21の情報伝達機構を分子レベルで明らかにするため、R-Rasサブファミリーの下流のエフェクター分子の探索とその作用機構について研究を進めた。これまでに、R-Rasは神経軸索に局在し、PI3キナーゼ経路を介して軸索の伸長、分枝化を促進すること、M-Rasは樹状突起に局在し、MAPキナーゼ経路を介して軸索の伸長を促進することを明らかにしてきた。一方、TC21に関しては、その神経細胞における機能はほとんど不明であった。その神経細胞の形態形成における機能を解析し、TC21がスパイン形成時に強く発現して着ることを発見した。また、TC21の強制発現や、ノックダウン実験により、TC21がスパイン形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、TC21によるスパイン形成促進作用における、下流のエフェクター分子を解析した結果、Fアクチン結合蛋白質であるafadinにTC21活性型が特異的に結合し、TC21は活性化されると、afadinを細胞質から細胞膜に移行させ、細胞膜嬢でフィロポディア形成を促進し、最終的にスパイン形成を促進することがわかった。これらのことから、3つのR-RasサブファミリーG蛋白質、R-Ras、M-Ras、TC21はそれぞれ軸索、樹状突起、スパインと異なる領域に局在し、異なる神経突起形成に関わることを明らかにした。当初の計画通り、神経細胞のスパイン形成に重要な役割を果たしているTC21のエフェクターの同定と、作用機構について、全体像がつかめるようになった。神経突起形成に重要な役割を果たしている低分子量G蛋白質RasファミリーのサブグループであるR-Rasサブファミリー、R-Ras、M-Ra s、TC21の情報伝達機構を分子レベルで明らかにするため、R-Rasサブファミリーの下流のエフェクター分子の探索とその作用機構について研究を進めた。これまでに、R-Rasは神経軸索に局在し、PI3キナーゼ経路を介して軸索の伸長、分枝化を促進すること、M-Rasは樹状突起に局在し、MAPキナーゼ経路を介して軸索の伸長を促進すること、TC21はスパインに局在し、afadinを介してスパインの成長を促進することを明らかにしてきた。一方、R-Rasサブファミリーの上流の情報伝達経路については全く不明であった。そこで、R-Rasによる神経軸索の伸長作用の上流の経路を探索した。

RasファミリーのGたんぱく質を活性化するGEFには様々な分子が知られているので、それらの分子で神経細胞に発現しているものをリストアップし、可能性のあるRasファミリーGEFの関与をスクリーニングした結果、R-Rasを活性化できるGEFの1つであるRasGRF1が神経軸索成長因子であるBDNFの刺激でR-Rasを活性化し、神経軸索の伸長と分枝化の促進を行なっていることを明らかにした。また、BDNFの受容体、TrkBはcAMPを上昇させて、RasGRFのリン酸化により活性化することを明らかにした。これらのことから、R-Rasの上流と下流の嬢伝達経路が明らかとなり、その全体像が明確になった。神経突起形成に重要な役割を果たしている低分子量G蛋白質R-Rasサブファミリー、R-Ras、M-Ra s、TC21の情報伝達機構を分子レベルで明らかにするため、R-Rasサブファミリーの下流のエフェクター分子の探索とその作用機構について研究を進めた。TC21の神経細胞の形態形成における機能を解析し、TC21がスパイン形成時に強く発現ししており、スパイン形成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。一方、R-Rasサブファミリーの上流の情報伝達経路について解析し、RasGRF1がBDNFの刺激でR-Rasを活性化し、神経軸索の伸長と分枝化の促進することを明らかにした。本研究は、計画通り進め、次年度以降で、Rhoファミリーを含めた低分子量G蛋白質の情報伝達機構の複雑な連携システムの解明を進めていく。本研究は、計画通り進め、次年度以降で、R-Rasサブファミリーを含めた低分子量G蛋白質の情報伝達機構の複雑な連携システムの解明を進めていく。医歯薬学
混相流の多重スケール構造に対する数値解析手法の開発

液体中に多数の気泡や液滴・粒子を含む流れは、液体機械を始め、化学反応器、熱交換器、エンジンの燃料噴射部、汚水処理のための曝気槽など、工学上重要となるさまざまな装置で見受けられる。これらの流れにおいては、個々の気泡の表面における界面活性剤の存在など分子スケールのミクロな現象から、流れ場全体の大域的構造(マクロな構造)に到るまで、ミクロ・メゾ・マクロの様々なスケールの現象が複雑に干渉し合いながら流動構造が決定されている。本研究では、液体中に多数の気泡を含む流れに関して、より信頼できる平均化方程式モデルの構築のために必要となる知見について考察し、それらを解析するための数値計算手法を開発した。開発された数値計算手法は、特に気泡間距離を代表スケールとして持つ気泡流のメゾスケールの現象に着目し、多数の気泡や粒子群を直接計算することができる特徴を持つ。この手法により計算された気泡周りの流れ場を、気泡流のマクロ構造と関連づけるため、乱流のラージ・エディー・シミュレーションの概念に基づいてサブグリッドスケールのモデリングを行った。提案されたモデルは、従来型のモデルの問題点を克服し、精度良く流れ場を再現できることを示した。さらに本研究では、既存の分散性二相流の数値計算手法の持つ本質的な問題点を、圧力のポアソン方程式に対する境界値問題としての数学的視点から指摘し、その問題を解決するための新しい数値計算手法の提案を行った。
性差が顎関節円板の細胞外マトリックスに及ぼす影響に関する分子生物学的検討

本研究では、性ホルモンが顎関節組織の細胞外マトリックスの組成あるいは組織の強度にどのような影響を及ばすのかについて、異なる性差、精巣卵巣の摘出、性ホルモン投与のラットを用いることにより、顎関節の細胞外基質(プロテオグリカン)の組成にどのような影響を及ぼしているのかを、解明することを目的としていた。精巣卵巣の摘出、性ホルモン投与の動物実験を行い、雄性正常群、雌性正常群、雄性精巣摘出群、雌性卵巣摘出群、雄性精巣摘出女性ホルモン剤投与群、雌性卵巣摘出男性ホルモン剤投与群の、それぞれ免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、in situハイブリダイゼーションのための資料作成を行なった。免疫組織化学による顎関節円板におけるプロテオグリカン分布:本研究では、各群をそれぞれ抗デコリン、抗バイグリカン、抗バーシカン抗体に対する反応を観察した。結果、各抗体間での分布変化は認められたものの、各群においてプロテオグリカンの分布は、大きな差異を認めることが出来なかった。ウェスタンブロッティングによる各プロテオグリカンの定量:顎関節円板よりグアニジンを用いて抽出したタンパク質を、透析、凍結乾燥し、乾燥重量を一定としてウエスタンブロッティングにより、抗デコリン、抗バイグリカンに対する反応を観察した。その結果、デコリン、バイグリカンは雌性において雄性と比較し反応性が少なかった。精巣摘出群、卵巣摘出群では、反応性の違いを確認できなかった。また、女性ホルモン剤投与群、男性ホルモン剤投与群においても、わずかに女性ホルモン剤投与群の方が反応性が少なかった。以上より、性差が顎関節円板のプロテオグリカンに何らかの作用を及ぼしていることが示唆された。今後は遺伝子レベルでの解析を行ない、性ホルモンが細胞外マトリックスへどのような影響を及ばしているのかを検討していく予定である。細胞外マトリックスは、皮膚、腱、靭帯、軟骨、骨等の結合組織に、大量に存在し、組織特有の強度と弾力性に寄与している。その主成分はコラーゲンとプロテオグリカンであり、コラーゲン線維は牽引に対する抵抗性を、またプロテオグリカンは勇断、圧縮に対する耐性を組織に与える。関節組織においても、軟骨にはII型コラーゲン、アグリカンが、関節円板にはI型、III型コラーゲン、バーシカン、バイグリカン、デコリンが存在し、各組織における強度やメカニカルストレスに対する抵抗性に関与している。そこで性ホルモンが顎関節組織の細胞外マトリックスの組成あるいは組織の強度にどのような影響を及ぼすのかについて、異なる性差、精巣卵巣の摘出、性ホルモン投与のラットを用いることにより、顎関節の細胞外基質(プロテオグリカン)の組成にどのような影響を及ぼしているのかを、解明することを目的としている。現在、精巣卵巣の摘出、性ホルモン投与の動物実験を行い、雄性正常群、雌性正常群、雄性精巣摘出群、雌性卵巣摘出群、雄性精巣摘出女性ホルモン剤投与群、雌性卵巣摘出男性ホルモン剤投与群の、それぞれ免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、in situハイブリダイゼーションのための資料作成を行っている。また、バーシカンの定量化のためにウエスタンブロッティングによる、成長によるラットの顎関節円板における大型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるバーシカンの局在およびisoformの発現を、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーションによって検討したところ、成長変化を表わすことが明らかになった。これらの変化は顎関節に生ずる複雑な生力学的力を反映していることが示唆された。今後も実験を遂行し性ホルモンの細胞外マトリックスへの影響をを解明していく予定である。
膜型MMP(MT1-MMP)遺伝子発現に及ぼすHMGI-Cの作用機構

本研究課題で得られた主な研究成果は、以下の4点である。(1).ヒト甲状腺癌、口腔癌における膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT1-MMP)発現と潜在型MMP-2活性化を検討した結果、潜在型MMP-2活性化率とリンパ節転移が正の相関を示し、その活性化にMT1-MMP発現が関与することが示された。MT1-MMPは、in situ hybridizationと免疫組織染色により癌細胞とそれに近接した間質細胞に局在し、in situ zymographyにより癌細胞巣にゼラチン分解活性が証明された。ヒトグリオーマの髄膜播種陽性群では、陰性群に比較して、MT1-MMP発現と潜在型MMP-2活性化率の有意な上昇があり、インヒビターであるTIMP-2低下が髄膜播種の決定因子として作用していた。グリオーマでのHMGI-C発班を検討中であり、MT1-MMP発現との関連をさらに解析している。また、慢性関節リウマチ滑膜組織においても、潜在型MMP-2活性化にMT1-MMPが直接的に関わることを証明した。(2).MT1-MMPタンパクの産生を高感度で検出できるイムノアッセイを開発し、頭頚部癌組織では非癌部より産生が高いことを示すとともに、肺癌ではリンパ節転移陽性群が陰性群に比較して有意に高いことを証明した。(3).マクロファージで発現するMMP-1遺伝f導入マウスをApoEノックアウトマウスと交配し、高脂肪食負荷による動脈硬化巣の変化を観察した結果、MMP-1遺伝子発現は粥状硬化症を軽減した。(4).マウス組織ではMT1-MMPとHMGI-Cに明らかな共発現はみられなかった。また、正常マウスとHMGI-C遺伝子欠損マウスにおける2ステップ化学発癌実験では、皮膚腫瘍部でのMT1MMPとHMGI-Cの発現に十分な関係が示されなかった。膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT1-MMP)は、潜在型MMP-2活性化と本酵素自身の細胞外マトリックス分解活性によりヒト癌細胞の浸潤・転移に関与すると考えられている。一方、HMG遺伝子ファミリーはDNAの立体構造変化を通して転写因子の作用を助ける転写構造構築因子である。本研究課題では、MT1-MMP遺伝子とHMGI-C遺伝子のヒト癌組織での発現を検討するとともに、HMGI-CタンパクによるMT1-MMP遺伝子発現制御の分子機構を解析する。また、HMGI-C遺伝子欠損マウスでの実験的腫瘍の解析から、MT1-MMP遺伝子発現制御におけるHMGI-Cの関与を決定する。本年度の成果と研究の現状は以下の3点にまとめることができる。(1).ヒト甲状腺癌、口腔扁平上皮癌、胃癌およびグリオーマ組織におけるMT1-MMP発現と潜在型MMP-2活性化を検討した。その結果、これらの悪性腫瘍では潜在型MMP-2活性化率と転移が正の相関を示し、その活性化にMT1-MMP発現が関与することが示された。MT1-MMPは、in situ hybridizationと免疫組織染色により癌細胞と癌細胞周囲の間質細胞に局在した。現在、同腫瘍でのHMGI-C発現と局在を検討中であり、MT1-MMPとの関連を調べる。(2).ヒトMT1-MMP遺伝子プロモーターを単離したので、これをプローブとしてより長いプロモーター領域をクローニング中である。

(3).マウス胎児発生期におけるMT1-MMPの組織内発現をin situ hybridization法と免疫組織染色法で検討しており、同マウスにおけるHMGI-Cの局在所見と比較・検討する予定である。膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT1-MMP)は、潜在型MMP-2活性化と本酵素自身の細胞外マトリックス分解活性によりヒト癌細胞の浸潤・転移に関わっており、その遺伝子発現は上皮細胞の悪性形質転換に伴って生ずることが明らかとなってきた。一方、HMGI-CはDNAの立体構造変化を通して転写因子の作用を助ける転写構造構築因子であり、悪性形質転換に伴って過剰発現されることが知られている。本研究課題では、MT1-MMP遺伝子の癌組織を中心とした病的組織での機能解析を行い、HMGI-CによるMT1-MMP遺伝子発現制御機構を解析する。本年度の成果と研究の現状は、以下の3点にまとめられる。(1).ヒト口腔扁平上皮癌と肺癌では、潜在型MMP-2活性化率とリンパ節転移が正の相関を示し、その活性化にMT1-MMP発現が主役を演じることが示された。グリオーマの髄膜播種にも、MT1-MMP発現と潜在型MMP-2の活性化が上昇しており、インヒビターのTIMP-2低下が播種の決定因子として作用していた。現在、これら腫瘍でのMT1-MMP発現とHMGI-Cとの関連を調べている。慢性関節リウマチ滑膜組織においても、潜在型MMP-2活性化にMT1-MMPが直接的に関わることを証明し、HMGI-C発現との関連を検討中である。(2).MT1-MMP遺伝子プロモーターへのHMGI-Cタンパクの結合能を調べる目的で、MT1-MMP遺伝子プロモーター領域を単離し、ゲルシフトアッセイで検討中である。(3).胎児期から成熟期マウス組織では、MT1-MMPとHMGI-Cに明らかな共発現はみられなかった。正常マウスとHMGI-C遺伝子欠損マウスで2ステップ化学発癌実験を行い、皮膚腫瘍部でのMT1-MMP発現とHMGI-Cとの関連を現在検討中である。膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MTI-MMP)は、潜在型MMP-2を活性化するとともに本酵素自身が線維性コラーゲンやゼラチンに対して分解活性を有し、ヒト癌細胞の浸潤・転移をはじめとする多くの疾患における組織破壊に関わっている。本研究課題では、HMGI-CのMTI-MMP遺伝子発現への関わりを調べるとともに、MTI-MMPや同様な活性をもつMMPの病的組織での機能解析を行った。本年度の研究成果は、以下の3点にまとめられる。(1).ヒトグリオーマの髄膜播種症例群では、非播種群に比較して、MT1-MMP発現と潜在型MMP-2活性化率の有意な上昇があり、インヒビターであるTIMP-2低下が髄膜播種の重要因子として作用していた。現在、グリオーマでのHMGI-Cの発現を検討中であり、MTI-MMP発現との関連をさらに解析している。(2).MT1-MMPに対するモノクローナル抗体を作成し、MTI-MMPタンパクの産生を高感度で検出できるtwo-stepsandwich enzyme immunoassayを開発した。本アッセイを用いて、頭頚部癌組織では非癌部よりMTl-MMPの産生が高いことを示すとともに、肺癌では癌組織での高値のみならずリンパ節転移陽性群での産生が陰性群に比較して有意に高いことを証明した。
ｉＰＳおよびＥＳ細胞における新たなサイトメガロウイルス感染抑制因子の解析

CMVは多能性幹細胞には感染抵抗性を示す。我々はヒトiPS細胞の樹立に成功し、ヒトiPS細胞ではHCMVに対する感染感受性は著明に低下した。これは申請者がPlos One(2011)で発表したマウスES/iPS細胞でのCMV感染実験結果と同様であった。未だ新規レセプターへの発見には至っていないが、現在は既知のレセプターであるintegrinβ1を中心にマウス大脳におけるMCMV急性感染期感受性の機序を調べている。急性期MCMV血行性/髄腔内感染どちらにおいてもintegrinβ1高発現細胞にMCMV感染感受性があった。日本では毎年約1000人の難聴や神経障害をもった症候性サイトメガロウイルス(CMV)患者が発生している。ダウン症につぐ大きな先天異常であり毎年膨大の医療費を必要とする。いまだに実用ワクチンはなく、CMV先天異常の新たな感染機序を解明することは将来の先天CMV感染の予防・治療、ワクチン開発にとって必要不可欠である。本研究はES細胞/iPS細胞がCMV感染に対して高度の抵抗性を示すという実験結果を基礎に、新たなCMV感染感受性因子を探索することを目的とする。そしてヒト先天CMV感染の予防と治療、ヒトES/iPSを用いた再生治療におけるCMV感染の予防へとつなげていくことが目的であった。マウスES/iPS、マウス線維芽細胞の感染感受性の差がウイルス侵入機序に依存していることを蛍光変異MCMVウイルスで再確認し、そしてウイルス粒子の細胞接着や侵入に関わる未知のreceptor因子を探索する予定である。膜蛋白の分画をそれぞれのES,iPS,MEFの細胞から採取し、VOBPA法(Virus overlay protein blotting assays)法、質量分析法によりウイルスレセプターを同定する。その後既知、未知の因子がES/iPS細胞、胎児の成長過程でどのような分布が変化し、CMVの局在と一致しているか否かをflow cytometry,免疫染色、in situ hybridizationで確認していく予定である。また新規に同定された因子をヒトES/iPS細胞、ヒト線維芽細胞を用いてHCMVでも追試していく計画であった。平成24年度はヒト線維芽細胞からヒトiPSをセンダイウイルスを用いて作製に成功しており、平成25年度はHCMVの感染実験をすすめていく予定である。A.当初の研究計画本研究はES/iPS細胞がCMV感染に対して高度の抵抗性を示すという実験結果を基礎に、新たなCMV感染感受性因子を探索することを目的とした。そしてヒト先天CMV感染の予防と治療、ヒトES/iPSを用いた再生治療におけるCMV感染の予防へとつなげていくこと計画であった。当初の予定で新規のレセプター因子が同定されなかった場合は、胎生期の発達段階で、ウイルスゲノムが入りやすい細胞が如何なる細胞であるのかを既知の因子の分布をin vivoで解析していく予定であった。B.研究経過および研究成果ヒトiPS細胞の樹立に成功し、ヒトiPS細胞ではHCMVに対する感染感受性は著明に低下した。MCMVの髄腔内/静脈内投与による超急性期感染大脳では、MCMV粒子・蛍光microbeads(ウイルス粒子とほぼ同径のbeads)とMCMV感染分布は大まかには一致したが、microbeads粒子の分布と感染細胞の分布には有意な差がみられた。これはウイルス感染感受性を規定する因子はウイルス粒子の大きさ以外に存在することを示している。急性期血行感染におけるCMV感染細胞は血管内皮細胞、血管周皮細胞、髄膜細胞であった。髄腔内感染においてMCMV感染部位は主に髄膜、脈絡叢であった。さらに大脳スライスにおいてもintegrinβ1発現部位とMCMV感染部位はほぼ一致した。超急性期のCMV大脳感染分布を規定する因子はintegrinβ1の分布に強く関連していることがわかった。この結果は現在論文作成中で近々投稿予定である。

そしてヒト先天CMV感染の予防と治療、ヒトES/iPSを用いた再生治療におけるCMV感染の予防へとつなげていくことが目的であった。今回はマウスES/iPS、マウス線維芽細胞の感染感受性の差がウイルス侵入機序に依存していることを蛍光変異MCMVウイルスで再確認する。そしてウイルス粒子の細胞接着や侵入に関わる未知のreceptor因子を探索する予定である。膜蛋白の分画をそれぞれのES,iPS, MEFの細胞から採取し、VOBPA法(Virus overlay protein blotting assays)法、質量分析法によりウイルスレセプターを同定する。その後既知、未知の因子がES/iPS細胞、胎児の成長過程でどのような分布し、CMVゲノムの局在と一致しているか否かをflow cytometry,免疫染色、in situ hybridizationで確認していく予定である。また新規に同定された因子をヒトES/iPS細胞、ヒト線維芽細胞を用いてHCMVでも追試していく計画であった。当該年度は蛍光で光るMCMV粒子の作製を中心に行い、大臣申請とともに現在実験をすすめている。本研究はES細胞/iPS細胞がCMV感染に対して高度の抵抗性を示すという実験結果を基礎に、新たなCMV感染感受性因子を探索することを目的とする。そしてヒト先天CMV感染の予防と治療、ヒトES/iPSを用いた再生治療におけるCMV感染の予防へとつなげていくことが目的である。Receptor関係で当該年度は当初の計画にない大脳のintegrin β1の発現とMCMVの関係を調べることにした。CMV大脳急性感染において如何なる因子が感染感受性を規定するか未だ不明な部分が多く、今回はウイルス粒子の動態とreceptorの両方の因子から調べることにした。Murine cytomegalovirus(MCMV)で報告されている主なreceptorはintegrin β1(CD29)で、大脳におけるCD29の発現と大脳MCMV超急性期感染の関係を解析した。その結果MCMVの頭蓋内直接投与と静脈内投与では初期の感染部位と脳内での感染の広がり方は異なっていた。そしてMCMVの大脳急性感染においてはマイクロビーズの動態とウイルス感染分布はほぼ一致することがわかった。またCD29をknockdownしたNIH3T3細胞に対して行うとMCMV感染感受性は低下した。そして超急性期の大脳MCMV感染において、CD29の発現部位とMCMV感染部位と相関があることが示唆できた。大脳スライスで全体にMCMVを感染させても、CD29とMCMV IE1の相関を認めることができた。当該年度はヒトiPSの作製にも成功し、ヒトCMVの感染感受性の機序の解析を進めていく予定であるが、当初の計画よりやや遅れがでている。
リサイクルを対象としたペットボトル内のDLC膜の除去技術開発

炭酸飲料の劣化を防ぐためにPET (Polyethylene Terephthalate)ボトル内側へガスバリア性の高いダイヤモンド状炭素(DLC)膜をコートする方法が、開発されている。しかし、PETボトルの実用的なリサイクリング工程を考慮するとDLC膜は不純物(汚染物質)として作用し、PETのリサイクリング効率を大きく低下させる要因となる。そこで、PET上に堆積したDLC膜を効率よく除去し、PETのリサイクル価値を向上させることが必要である。高周波型プラズマCVD (Chemical Vapor Deposition)装置を用い、気相反応を利用してPET上に存在するDLC膜のエッチングを試みた。このエッチング反応には、DLC膜の基本組成である炭素との反応性が高い酸素ガスを用いた。ガス圧力:10Pa、供給電力:100Wの条件では、時間の増加とともにDLC膜はエッチング深さが増える結果が得られた。エッチング時間に対するDLCのエッチング膜厚を評価すると、上記の条件では50nm/minのエッチング速度が得られた。さらに、反応表面の顕微鏡観察および光学的分光特性(Raman分光特性)よりエッチングは均一に進行していることが認められた。特に、AFM (Atomic Force Microscopy)による表面観察では、エッチング処理後の表面粗さと標準的PETの表面粗さには違いが無く、ガスによる気相反応はPET試料に対して良好なエッチング方法であることが示唆された。これらの実験結果から、DLCの除去にはプラズマエッチングが有効であることが確認された。ETボトルへの実用的なDLC膜の厚さは、数10nm程度であるので、本実験結果推定されるエッチング時間は数分であることが見積もられる。工業化を目的とした場合、ランニングコストや処理時間を考慮すると実用的な可能性が評される。PET (Polyethylene Terephthalate)ボトル内壁へガスバリア性の高いダイヤモンド状炭素(DLC)膜をコートする方法が、実用化段階に達している。初期的な実験として、高周波型プラズマCVD (Chemical Vapor Deposition)装置を用い、気相反応を利用してPET上に存在するDLC膜のエッチングを行った。エッチング反応にはDLC膜の基本組成である炭素との反応性が高い酸素ガスを用いた。次年度には、エッチング条件を変化させ最適な条件を模索し、PETのリサイクルに対してDLCが不純物として混入しないエッチング技術の確立を目指す。さらに、工業化を目的とした場合、装置の簡素化、ランニングコストの低コスト化、処理時間の短縮化が必要となるため、実験装置の改良や反応パラメータの検討を進めて行く。炭酸飲料の劣化を防ぐためにPET(Polyethylene Terephthalate)ボトル内側へガスバリア性の高いダイヤモンド状炭素(DLC)膜をコートする方法が、開発されている。

そこで、PET上に堆積したDLC膜を効率よく除去し、PETのリサイクル価値を向上させることが必要である。高周波型プラズマCVD(Chemical Vapor Deposition)装置を用い、気相反応を利用してPET上に存在するDLC膜のエッチングを試みた。このエッチング反応には、DLC膜の基本組成である炭素との反応性が高い酸素ガスを用いた。ガス圧力:10Pa、供給電力:100Wの条件では、時間の増加とともにDLC膜はエッチング深さが増える結果が得られた。エッチング時間に対するDLCのエッチング膜厚を評価すると、上記の条件では50nm/minのエッチング速度が得られた。さらに、反応表面の顕微鏡観察および光学的分光特性(Raman分光特性)よりエッチングは均一に進行していることが認められた。特に、AFM(Atomic Force Microscopy)による表面観察では、エッチング処理後の表面粗さと標準的PETの表面粗さには違いが無く、ガスによる気相反応はPET試料に対して良好なエッチング方法であることが示唆された。これらの実験結果から、DLCの除去にはプラズマエッチングが有効であることが確認された。PETボトルへの実用的なDLC膜の厚さは、数10nm程度であるので、本実験結果推定されるエッチング時間は数分であることが見積もられる。工業化を目的とした場合、ランニングコストや処理時間を考慮すると実用的な可能性が評価される。
非可換確率論の基本構造－独立性概念の構成と分類

本研究の目標は、非可換確率論における独立性の概念の構成と分類を行うことである。前年度までは、非可換確率論における独立性概念の個別の具体的例を構成することを目標とし、Bozejko-Speicherのq-Fock空間に付随すると考えられる仮想的な独立性としてq-独立性を構成しその基本的な性質を、特に非コンパクト台の場合を中心に調べ、また、Pusz-Woronowiczの捻じれFock空間に付随しうると考えられる捻じれ独立性をについて同様の考察を進めたのであったが、本年度は、将来の独立性概念の一般論の構築を念頭に置き、上記の1径数変形Fock空間たちとは少し毛色の異なる空間として、Accardi-Bozejkoの相互作用Fock空間を取り上げ、これがいつ独立性の概念を持つのかその条件について調べた。その結果、相互作用フォック空間は無限個のパラメータ持っているがそのほとんどの値について、相互作用フォック空間はどんな普遍積からの汎関数中心極限としても生じないことがわかった。このことは、相互作用Fock空間は一般には独立性を持てないことを意味している。また、さらに研究を推し進めた結果、相互作用Fock空間は、普遍積の概念を弱め射に関する*同型という条件を弱めてやれば、この弱い意味での独立性概念に関しては、これを構成することができそうであるという感触が得られた。現在、この構成について細部を検討しているところである。本研究は、非可換確率論における独立性の概念の構成と分類を行うことが目標である。本年度は以前から研究を続けているq-変形独立性について、その基本的な性質を探求した。特に、q-変形畳み込みの性質を調べた。q-変形畳み込みをすべてのモーメントが有限な確率測度に対して定義することは形式的には可能である。そして、特にコンパクト台の確率測度に対してはモーメント問題がdeterminateとなるためq-変形畳み込みを確率測度として定義できる。しかしながら、モーメント問題がdeterminateでない場合は、組合せ論的な方法ではq-畳み込みを定義できないため別の方法を工夫する必要がある。この問題意識の元で、2次のモーメントが有限な確率測度に対してq-畳み込みを定義することを試みた。具体的には、確率変数のヒルベルト空間における標準的な実現に基づいてq-畳み込みを定義することを考察中である。この議論がうまくいくかどうか未知の部分もあるため、もう少し詳しく調べることが必要であり、このことは次年度の課題としたい。このq-変形独立性は、q-積という筆者が構成した普遍積により実現できるのであるが、実はこのq-積は結合法則を満たしてはいない。そこで、このq-積の構成を足がかりにして、結合法則を満たすとは限らない一般の普遍積の構成法を見出すことを現在試みている最中である。一般の普遍積の構成法とそれに伴う独立性概念を見出すことは、非可換確率論にとり基礎的な仕事であり、重要な意味を持っていると考える。計画通り順調に進行していると自己評価できるため。本年度は、昨年度に引き続き、qー変形独立性の構成とその基本的な性質を探求した。ここでいうqー変形独立性とは、自由独立性と古典独立性を補間する独立性概念の1径数族である(q=0で自由独立性、q=1で古典独立性と一致する)。この「q-変形」は、Bozejko-Speicherのq-Fock空間とq-正準交換関係の概念に整合的であるというの意味でのq-変形である。このq-変形独立性はその存在が証明されてはいない仮想的な独立性概念である。筆者は、ここ数年来このqー変形独立性の構成について研究しており、Speicherの定義による普遍計算規則という意味での独立性概念から結合法則の要請を落とした形で、この独立性概念を構成できたと考えている。しかし、細部について詰めが甘い部分があるため、昨年度は、細部について厳密な証明を与える作業を行った。今後も論理的に詰める作業を引き続き行う予定である。また、このqー変形独立性概念を出発点として、古典確率論の幾つかの基本概念をq-変形することを試みた。特に、qー変形畳み込みについて、結合法則や、レヴィ=ヒンチン型の表現定理、そして極限定理について探求した。これらの性質は、確率測度の台がコンパクトな場合には成立するであろうとの論拠を得ているが、きっちりと論証の細部を詰めることは今後の課題である。また、確率測度の台が非コンパクトな場合について、これらの結果を拡張することも今後の課題である。計画通り順調に進行していると自己評価できる。本年度は、数年前に発見した捩れ独立性の概念について、これに付随する確率論的な構造の研究を推し進めた。ここでいう捩れ独立性とは、Bozejko-Speicherによって導入されたq-Fock空間(Fock空間のある1径数族)がBoson Fock空間とFermi Fock空間を補間していることと類似的して、別の構造を持つFock空間の1径数族ではあるけれどもやはりBoson Fock空間とFermi Fock空間を補間するものとしてPuszにより導入された捩れFock空間というものがあり、これに付随する独立性概念である。Puszの捩れ

正準交換関係を利用することにより、C*確率空間の任意の族に対して、ある種のテンソル積(捩れテンソル積)を構成することができる。この捩れテンソル積は、通常のテンソル積をその特別な場合として含むものであり、テンソル積から通常の独立性概念を導くことができるように捩れテンソル積から捩れ独立性の概念を導くことができる。この捩れテンソル積と捩れ独立性の概念から導かれる導かれる確率論的な構造について研究を推し進め、その結果、有界な非可換確率変数たちに対して、捩れガウス分布と捩れ中心極限定理、捩れポアソン分布と捩れ少数の法則を見出した。また、数直線上のコンパクト台の確率測度に対して、捩れ畳み込み、捩れキュムラント等を構成できることを見出した。現在、これらの構成に関して、厳密な証明を与えることを試みているところである。非可換確率論における新しい独立性概念である捩れ独立性を構成しその基本性質を現在調べているところであり、研究はおおむね順調に進展している。本研究の目標は、非可換確率論における独立性の概念の構成と分類を行うことである。前年度までは、非可換確率論における独立性概念の個別の具体的例を構成することを目標とし、Bozejko-Speicherのq-Fock空間に付随すると考えられる仮想的な独立性としてq-独立性を構成しその基本的な性質を、特に非コンパクト台の場合を中心に調べ、また、Pusz-Woronowiczの捻じれFock空間に付随しうると考えられる捻じれ独立性をについて同様の考察を進めたのであったが、本年度は、将来の独立性概念の一般論の構築を念頭に置き、上記の1径数変形Fock空間たちとは少し毛色の異なる空間として、Accardi-Bozejkoの相互作用Fock空間を取り上げ、これがいつ独立性の概念を持つのかその条件について調べた。その結果、相互作用フォック空間は無限個のパラメータ持っているがそのほとんどの値について、相互作用フォック空間はどんな普遍積からの汎関数中心極限としても生じないことがわかった。このことは、相互作用Fock空間は一般には独立性を持てないことを意味している。また、さらに研究を推し進めた結果、相互作用Fock空間は、普遍積の概念を弱め射に関する*同型という条件を弱めてやれば、この弱い意味での独立性概念に関しては、これを構成することができそうであるという感触が得られた。現在、この構成について細部を検討しているところである。計画通り研究を進めるため数学計算のためのソフトであるMathematicaを購入することを考えている。紙の上での手計算による研究とMathenmatica使用による数学実験を併用し、効率的に研究を進めることを考えている。また、国内国外での研究集会に参加し、最新の研究動向にも目を配らせたい。2016年度に購入したMathematicaを活用し、必要に応じて数学実験を行い必要なデータを入手し研究を進める。紙の上での手計算による研究とパソコンによる計算を併用し効率的に研究を推進する。また、国内、国外で開催される研究集会に参加し最新の研究動向に目を配り、研究を遂行する上での新しいヒントを得て多角的な視点から問題にアプローチしていく。必要に応じて書籍やパソコンを購入し研究体制を強化しつつ、研究を遂行していく。Mathematica等を用いて必要に応じて数学実験を行いながら捩れ独立性の基本性質を探求していく。
徐放化多血小板血漿による血管新生療法の開発

当研究の本実験を行うにあたり、まず、1胸骨正中切開後の胸骨虚血モデルの作成とその確立、2Platelet Rich Plasma(PRP)の作成とその確立について研究を進めることにした。1モデルの確立:日本医科大学の動物実験倫理委員会の指導要領に則り、麻酔はケタミン、キシラジンにより行い、酸素マスクによる呼吸管理を行った。胸骨正中に皮膚切開を置き、皮下の筋層をメスで切開した後に胸骨を露出した。メイヨーで胸骨正中切開を行い、出血に対しては電気メスを使用した。胸骨胸壁側から両側の内胸動脈を剥離し側枝をすべて結紮し、サージカルクリップで内胸動脈中枢・抹消の両側を遮断し、胸骨の虚血モデルを作成した。2-0非吸収性縫合糸で胸骨を数針縫合固定し、止血を確認後3-0吸収性縫合糸で筋膜、表皮を縫合し手術終了とした。モデル作成後にランダムに群分けされ、投与内容を決定する方針とした。モデル作成に4週間の観察期間を設け、その後、屠殺後に評価していく予定である。初期には胸骨切開部の接合部ずれによる創部離開、感染による創傷治癒不全などを併発し、ラット胸骨正中切開モデルにばらつきが見られたが、ラーニングカーブとともにモデル作成が安定してきた。2PRPの作成:ラット股動脈を露出し、20Gのインサイトを挿入して動脈血を採取した。ACD-A入り真空管に血液を注入後、遠心分離を施行した(14°C, 1000G, 10分)。さらに上層の血漿成分とbuffy coatを吸引し、2回目の遠心機にかけた(4°C, 2100G, 10分)。最後に残存したbuffy coatを吸引しPRPとした。諸文献の遠心分離条件を検討した上で、上記条件でPRP作成した結果、全血血小板が17.0±2.9万/μlに対して、PRP血小板174.3±33.3万/μlであり、約10倍のPRPが得られた為、十分使用できるPRPと判断した。1)PRP作成:Japanese White Rabbitの大腿静脈より静脈血を採取し、二回遠心分離法でPRPを作成する為に様々な遠心条件を検討した。全血と遠心分離にて得られたPRPを血球計数測定装置にて測定し、PRP/全血が5以上を使用基準とした。最終的に一回目:4°C, 1000G, 10分、二回目:4°C, 2100G, 10分の条件で作成した結果、PRP4検体の<PRP/全血>平均値が10.6と最も高値であった。その後、塩化カルシウムを投与し、アクチベートした後に、細かく切開したゼラチンハイドロゲルと撹拌し、投与を行った。2)胸骨虚血モデルの作成:Japanese White Rabbit24検体を、以下の3群に無作為に分けた。1胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮した群、2胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮し、PRPを胸骨および胸骨周囲に投与する群、及び3胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮し、ゼラチンハイドロゲルによる徐放化PRPを胸骨および胸骨周囲に投与する群。モデル作成後、後述する検討項目データを採取し、4週間後に屠殺し、評価を行った。3)病理学的及び力学的評価:胸骨周囲の血管新生の評価の為、Anti Rabbit CD31及びCD34抗体を使用した免疫染色により微小な血管の染色が可能であり血管数のカウントが行えた。しかしながら、同種抗体であり、疑陽性率が高くなることが懸念されたため、HE, Masson染色により血管数のカウントを行う方針とした。また、骨癒合の評価として胸骨CTを撮影し、BMC(bone mineral content), BMD(bone mineral density)を解析する予定である。また、骨の張力テストとして、胸骨に独自に作成した治具を取り付け、オートグラフにかけて切開線に対して垂直に引っ張りその強度を測定することも検討している。1)PRP作成:Japanese White Rabbit(雄、週齢22)の大腿静脈より静脈血を採取し、二回遠心分離法でPRPを作成。諸条件を施行検討し、最終的に一回目:4°C、1000G、10分、2回目:4°C、2100G、10分の条件で作成した結果、PRP/全血の値が10.6と最も高値であったため、この条件を採用した。現在、採取手技は確立し、平均10倍以上のPRPを作成できている。2)胸骨虚血モデルの作成:同Rabbit18検体を、以下の3群に無作為に分ける。1胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮した群、2胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮し、PRPを胸骨及び胸骨周囲に投与する群、及び3胸骨正中切開後、両側内胸動脈を結紮し、ゼラチンハイドロゲルによる徐放化PRPを胸骨周囲に投与する群。3)病理学的及び力学的評価、及び画像による骨癒合評価:HE及びMasson染色により血管数のカウントを行う。骨癒合の評価として、胸骨CT(LCT200,aloka社製)によるBMD(Bone Mineral Dencity)評価等も行っている。