hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
妊娠中のＨＴＬＶ－Ｉプロウイルス量測定法の開発とその臨床的意義に関する研究

1)WB法で判定保留の例に定量的リアルタイムPCR法を導入することで陽性と陰性の判定を行うことができた。2)妊娠に伴いHTLV-1ウイルス量が変化することが明らかになった。一方、HTLV-1ウイルスの標的細胞であるCD4陽性CD25陽性T細胞は変化しておらず、ウイルス量の変化は妊娠に伴う免疫学的寛容との関連が示唆された。3)臍帯血からHTLV-1プロウイルスが検出される例が確かに存在し、母乳による感染経路以外に、臍帯血を介した胎内感染の可能性が示唆された。本年度は以下の検討を行った。1)新たなHTLV-1母子感染経路についての検討: HTLV-1キャリア妊婦135例の分娩時に母体血、臍帯血および胎盤を採取しHTLV-1プロウイルス量を定量した。母体血には全てにHTLV-1抗体およびHTLV-1プロウイルスを検出し得た。臍帯血では全てにHTLV-1抗体を検出したが、HTLV-1プロウイルスを検出し得たのは6例(4.4%)であり、そのウイルス量はリンパ球の0.03%程度と微量であった。また、116例の胎盤組織うち51例(44.0%)にHTLV-1プロウイルスを検出した。2)妊娠がHTLV-1キャリアに及ぼす影響についての検討:キャリア妊婦124例について妊娠中のプロウイルス量の中央値は25.8/104 cellsであった。一方、分娩後のプロウイルス量の中央値は19.9/104 cellsであった(p<0.05)。以上より、新たな母子感染経路として、胎盤を介した胎内感染の可能性が示された。また、妊娠に伴いHTLV-1ウイルス量が増加している可能性が示唆され、引き続き、妊娠がHTLV-1キャリアへ及ぼす影響について調査することの重要性が認識された。1.検体集積およびHTLV-1プロウイルス量測定法の有用性の確認:長崎県において、リアルタイムPCR法を導入した妊婦HTLV-1スクリーニングシステムを確立した。22039例の妊婦をPA法もしくはCLEIA法で一次スクリーニングし、陽性227例、疑陽性35例および陰性21777例であった。陽性/疑陽性262例にWestern blot(WB)法で確認検査を実施し、陰性30例、陽性195例であった。WB判定保留37例(14.1%)について、リアルタイムPCR法で陰性14例、陽性30例と診断した。WB法と定量的PCR法によるHTLV-1感染の判定結果をみると、WB法で陰性例にはプロウイルスは認められず、陽性例には全てプロウイルスの存在を確認し得た。一方、WB法で判定保留例には、プロウイルスが存在しないものから、WB法で陽性例と同等のウイルス量を認めるものまで様々であった。WB法で判定保留例のうち、PCR法で陰性例の抗体価は、陽性例のそれと比較していずれも低値であった。PCR法による確認検査実施のカットオフ値は、CLEIA法によるHTLV-1抗体価が0.5-1.7の間に存在することを示唆した。2.妊娠経過に伴う母体血中HTLV-1プロウイルス量の変化の同定:妊娠中および分娩後のHTLV-1キャリア妊婦における血液中のプロウイルス量(平均値:最小値ー最大値)をリアルタイム法で測定し比較検討した。妊娠中のプロウイルス量は50.4 (0-520.93)/10000cell、一方、分娩後のそれは18.9(0-134.95)/10000cellであり、分娩に伴い血中HTLV-1プロウイルス量が有意に低下することが明らかになった(Wilcoxon signed rank test, p<0.001)。また、HTLV-1キャリア妊婦42例のうち1例の臍帯血液中にプロウイルスの存在を確認した。H24年度の研究計画と明確な研究目標は以下の通りであった。TaqManPCR法を応用した母体血中HTLV-Iプロウイルス量測定法の有用性を確認し、妊娠経過に伴う母体血中HTLV-1プロウイルス量の変化を明らかにする。1)検体集積(三浦):長崎大学病院倫理委員会の承認を得て、長崎県HTLV-I抗体スクリーニングシステムを活用して225例のHTLV-1キャリアの検体を集積した。妊娠経時的に産後一ヶ月検診時まで母体血液を採取し、また分娩時に臍帯血および胎盤を採取した。それぞれの検体から血球を採取して、DNA/RNA抽出キットを用いて、DNAおよびRNAを採取し、-80度フリーザーに検体を保管した。

2)HTLV-Iプロウイルス量測定法の有用性の確認(三浦):定量的PCR法は、長崎大学病院中央検査室(上平教授)が開発しているPCRプローブを活用し、測定機器はLightCycler®480を用いた。長崎県における妊婦HTLV-Iスクリーニングシステムのデータを利用して、抗体検査法(PAもしくはCLEIA法、およびWB法)の検査結果とTaqManPCR法を応用した母体血中HTLV-Iプロウイルス量測定法の結果とを比較検討することにより、妊婦における母体血中HTLV-Iプロウイルス量によるHTLV-I感染症の判定基準を決定した。また、臍帯血についても同様の方法でHTLV-Iプロウイルス量を測定した。以上のデータは、全てデータベース化した。3)妊娠経過に伴う母体血中HTLV-Iプロウイルス量の変化の同定(三浦):妊娠経過に伴い経時的に採血した検体を用いて、分娩前後に伴う母体血中HTLV-Iプロウイルス量の変化を明らかにした。また、キャリア妊婦の臍帯血におけるプロウイルスに検出頻度に関する知見も得ることができた。以上、研究計画は順調に進展している。平成24年度の研究計画は順調に進展したため、平成25年度の研究計画も当初の計画通りに推進する。これまで定性的にHTLV-1プロウイルスを検出するコンベンショナルPCR法では、母子感染が成立した4例の臍帯血液を解析したが、HTLV-1プロウイルスが検出されなかったことから、胎内感染の可能性は否定的とされてきた。そこで、平成24年度に有用性が確認された検出感度の高い定量的PCR法を導入することで臍帯血液中のプロウイルスの存在あるいは母体におけるHTLV-Iウイルス量と母子感染との関連を検討する。1)検体集積(三浦):平成25年度もHTLV-Iキャリア妊婦の血液サンプルおよび臍帯血サンプルを採取する。2)胎内感染の存在の有無を明らかにする(三浦):平成24年度に確立したHTLV-I感染症のPCR検査・診断法を用いて、臍帯血におけるHTLV-Iウイルスの定量実験を行い、母乳以外の感染経路の存在の有無を明らかにする。3)HTLV-Iプロウイルス量と母子感染成立との関連を明らかにする(三浦):平成21年度および平成22年度に検体を採取しているHTLV-Iキャリア約300例については、平成25年度までに児が3歳になりHTLV-I抗体スクリーニングを受けて母子感染の有無が明らかになるので、母体血中あるいは臍帯血液中のHTLV-Iウイルス量、母体が選択した栄養法と母子感染成立との関連を比較することによりを明らかにする。また、1987年以降にHTLV-I抗体スクリーニングをうけた妊婦の中にATLを発症しているものが報告されており、妊娠時に採取され保管されている血液検体から血中ウイルス量とATL発症の有無との関連についても検討を行う。平成24年度は研究に使用ために集積した検体の管理システムおよび研究結果のデータベース化に研究費を使用し、PCR試薬に使用する研究費が当初の計画よりも少なかった。計画通りに検体は集積されており、妊娠に伴うHTLV-1プロウイルス量の推移と母乳感染・胎内感染の可能性など母子感染ルートとの関連を明らかにするため、平成25年度は、母体血に加えて、臍帯血および胎盤などの検体もPCRによる解析を進める予定であり、当初の計画より多くの研究費をPCR試薬とプライマーに使用する予定である。
韓国語母語話者による縦断的日本語会話と対訳コーパス構築

本研究では、日本国内で日本語を学習する韓国語母語話者と日本語母語話者との日本語会話データを取り、さらに、韓国語母語話者にその会話の部分を韓国語に訳してもらった。目的は、対訳のある日本語会話コーパスを構築することである。韓国語の対訳を書いてもらったのは、会話誤用分析の際、韓国語母語話者の意図や誤用の原因が日本語だけではわからないことが多く、対訳がその分析に非常に役に立つと考えたからである。韓国語の対訳がある会話コーパスは、今まで構築されたことがないものである。会話対訳コーパス構築により、日本語習得が他の言語の母語話者に比べて容易であると考えられている韓国語母語話者の習得困難な部分がより明らかになると期待される。また、韓国語母語話者に特化したより効果的な日本語教育シラバス構築に貢献できると考えられる。日本国内で日本語を学ぶ韓国語母語話者35人と日本語母語話者との日本語会話のデータを取った。その後、会話の音声データの文字起こしを行い、韓国語母語話者には自分の発話の部分を韓国語に翻訳してもらった。その際、翻訳は直訳ではなく、自分が言いたかったことがわかるような自然な韓国語にするように頼んだ。この会話データと対訳採取を1年に2回行った。会話データの採取は、自由会話とロールプレイにより行った。ただし、日本語能力のレベルを判定する目的を持った会話ではなかったので、KYコーパスで行われているいわゆる「つきあげ」は行わなかった。データの協力は全員日本語能力試験N1合格者にお願いした。既存のものと異なったコーパスであり、今後多くの分野での貢献が期待できる。
行政法における法概念と、専門職自主法におけるその動態化

本研究は、「私的主体の有する『専門知』や『暗黙知』が、法概念のなかに盛り込まれていく」という新しい法現象について、この法現象が、国家法である行政法上の法概念との関係のなかでいかなる法構造を有しているかを明らかにするものである。初年度である平成30年度は、法構造分析の出発点を明確にする作業を行った。第一に、法を定立・運用する主体に焦点をあて、ある公共的業務(鉄道事業)を私的主体が遂行する場合と公的主体が遂行する場合とでは、これを規律する国家法の有効性にどのような差異があり限界があるのかの分析を行った。第二に、行政法上の法概念に焦点をあて、アメリカ合衆国・日本・フランス・韓国といった市場経済国の行政法の行政法上の法概念と、ロシア・ラトビアといった市場経済移行国の行政法上の法概念との比較を通して、そのコトバ・意味・機能を分析し、今後の研究の鍵となる法概念を抽出した。第三に、アメリカ行合衆国において、私的主体が定立した法(=非国家法。以下「自主法」という。)が有効なものとして通用しているという事実およびその理由に関する調査を行った。上記の作業は、ロシア・モスクワ大学、フランス・ランス大学、韓国・韓国法制研究院で行われた国際シンポジウムでの研究報告および質疑応答、ラトビアの憲法裁判所・行政裁判所・ラトビア大学等への訪問、アメリカ合衆国からの行政法研究者の招聘等を通して行った。初年度である平成30年度に、本研究が目的とする法構造分析の出発点を明確にすることができた。第一に、鉄道事業を検討素材として、(旧)国鉄とその完全民営化後のJapan Railway(JR)の組織・運営、事業、資材調達、資材調達における不正腐敗について、これらを規律する国家法の有効性とその限界を分析することができた。第二に、大陸法系および英米法系の行政法とソビエト行政法との比較を通して、行政法上の鍵となる法概念を抽出し、また法概念の意味の共通性と差異とを分析することができた。第三に、アメリカ合衆国において、非国家法であるに自主法が、非国家法であるにも拘らず一定の「法源」として通用している理由について考察を加えることができた。第一に、アメリカ合衆国の私的主体である医療専門職が定立した自主法が、どのような手続で定立され、また、この自主法に基づく運用および紛争解決がどのようになされているかの調査、分析を行う。第二に、上記自主法がアメリカ合衆国の国境を超えて通用する状況を調査、分析する。調査費(渡航費、謝金等)が見込みよりも安価であったため。
二枚貝胚極葉に局在する細胞分化決定因子のモノクローナル抗体を用いた解析

本研究では、マガキとムラサキイガイの卵や胚を抗原にしたモノクローナル抗体を作成することを目的としていたが、昨夏、採集してきたマガキがほとんど卵を持っておらず、持っていても正常に発生しなかったので抗原を集められなかった。また、ムラサキイガイもこれまで採集してきた大部分の地域で親貝がほとんど全滅した。これは昨夏の猛暑で海水温が上昇したためと思われる。さらに震災以降、大阪湾の神戸側や明石で見つけてあった生息地での採集が無理になった。かろうじて採集できたムラサキイガイから得た卵と胚を抗原に免疫を行い、3月半ばにようやく細胞融合にこぎつけたが、スクリーニングはこれからなので、報告できる結果は残念ながらまだ得られていない。一方、マウスに免疫している間に、得られたムラサキイガイ卵の一部を用いて、NBD-ファラシジンにより極葉形成前後のF-アクチンの分布を調べたところ、未受精卵では卵表層全体に均一に分布しているF-アクチンが、受精後、第一極体放出までに卵の植物極表層に局在するようになり、それは極葉形成が始まるまで持続することが判明した。極葉形成中にはこの局在は消失するが、細胞質分裂が終わって極葉がCD割球に吸収されると、CD割球の植物極表層に再びF-actinの局在が現れた。しかし第二極葉が形成される際にこの局在は消失し、その後D割球の植物極等には再び現れなかった。これまでのところ軟体動物卵において、このようなF-アクチンの植物極表層への局在は報告されていない。このような発生に伴って変化するF-アクチン細胞骨格の局在は細胞分化決定因子の局在と極めて密接な関係を持っていることが予想され、この局在に対応するモノクローナル抗体のクローニングが期待される。また、卵よりアクチンを抽出し、それに対するモノクローナル抗体を作成して切片によるアクチン構造の解析を行いたい。
テロメア消失ストレスによる染色体適応に関係する新規蛋白質の探索とその機能解析

真核生物は線状染色体であるが、突然変異などで環状染色体が形成されることがある。この環状染色体は酵母から人まで広く見つかっている。特に環状染色体を持ったヒトは、精神発達の遅れなどの遺伝病を引き起こしたり、環状染色体を失うことでがんになりやすいことなどがわかっている。しかしヒト環状染色体がなぜ不安定なのかはわかっていない。分裂酵母pot1 rqh1二重破壊株が合成致死になることは報告されているが、その原因はわかっていなかった。pot1破壊株は環状染色体を持つこととから、Rqh1は環状染色体の維持に必要ではないかという仮説をたて、その検証を試みた。まず環状染色体をもつpot1破壊株のRqh1の発現を低下させると染色体分配異常の頻度が上昇することを発見した。また、pot1 rqh1二重破壊株の合成致死は、相同組換え時のクロスオーバーの頻度を減少させる遺伝子変異によって抑圧されることを発見した。環状ゲノムを持つ大腸菌は相同組換え時のクロスオーバーによって、環状ダイマーが形成され、染色体分配が異常になることがわかっている。これらのことを総合すると、Rqh1は環状染色体ダイマーの形成を抑制することで、環状染色体の安定な維持に貢献していることが示唆された。この研究結果を応用すると、ヒト環状染色体を持つ患者のクロスオーバーを抑制することができれば、環状染色体を失いにくくなることで、がんになりにくくすることができる可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、分裂酵母テロメア結合因子pot1の破壊株とヘリケースRqh1の点変異株(rqh1-hd株)との二重変異株(pot1 rqh1-hd株)では、テロメアが組換えで維持されることや、微小管阻害剤感受性になることなどを報告している(Mol. Cell. Biol. 2011)。一方、pot1の破壊株とrqh1の完全欠損株(rqh1株)との二重変異株(pot1 rqh1株)は、生育不可能であることが報告されている。しかしなぜこの株が生育できないかはわかっていない。そこで、本研究では、この株が生育できない原因を解明することで、Pot1やRqh1の新しい機能の発見を試みる。本年度は、Pot1の機能のオンとオフを容易制御できる株の構築を試みた。まず、Pot1のプロモーターをチアミンという薬剤添加で発現を抑制できるプロモーター(nmt81)に置き換えた株を作成し、次にこの株のPot1のC末にaidタグを導入し、オーキシンという薬剤の添加でPot1を分解できる株を構築した。その結果、チアミンとオーキシンの両方を加えたときにRPAフォーサイが急増し、テロメアが急激に消失することがわかった。来年度はこの株とrqh1の破壊を組み合わせた場合の表現型を解析することで、pot1 rqh1株が生育不可能になる原因の解明を試みる。次に、pot1 rqh1株の生育不可能を抑圧する遺伝子を探索した結果、pot1 rqh1 rad51三重破壊株と同様に、pot1 rqh1 exo1三重破壊株が生育可能で、環状染色体を維持できることを発見した。pot1破壊と同様にテロメラーゼをコードした遺伝子trt1破壊株もテロメアが消失する。そこで、trt1 rqh1完全欠損株が生育できるかどうかを調べた。その結果、pot1 rqh1株と違って、trt1 rqh1株は生育可能であることを発見した。このことから、trt1 rqh1完全欠損株ではPot1がテロメア末端を保護し、それが生存を可能にしていることが示唆された。現在までにpot rqh1株の生育不可能を抑圧する遺伝子の探索については、当初予定していた新しい因子(exo1)の発見に成功している。さらに、Pot1の機能のオンとオフを制御できる株の構築にも成功した。

24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、Pot1の機能のオンとオフを制御できる株を使って、Rqh1があるときとないときで、テロメア末端の構造変化にどのような影響を与えるのかを明らかにする予定である。
近代地域社会における司法機構の法社会史的研究--制度・人物・事件を中心に

本研究は、静岡県をフィールドとして、おもに明治維新から明治10年頃までの時期の(1)法学教育、(2)裁判所制度のあり方、(3)訴訟と代言人活動の実態を解明することを目的とした。そのうち研究目的(1)「法学教育」については論文(5)を、研究目的(2)「裁判所制度」については論文(1)と(2)を、研究目的(3)「代言人」については論文(3)をそれぞれ執筆した。本研究は、「近代地域社会における司法機構の法社会史的研究-制度・人物・事件を中心に-」という全体構想のもと、当該研究期間において、静岡県最初の免許代言人前島豊太郎に焦点を当て、(1)当時の法学教育、(2)彼が活躍した時代の裁判所制度のあり方、および(3)訴訟と代言人活動の実態を解明しようとするものである。計画初年度に当たる今年度は、とくに(1)について、前島豊太郎が免許代言人となる以前に東京でどのような法学教育を受けたのかという点について、現時点で可能な限りの実証研究を行った(拙稿「明治初年の代言人と法学教育」)。その結果、従来の法学教育史に若干の新知見を加えることができたと考えている。さらに(3)に関しては、前島が免許代言人として登場した時期の大審院法廷において活発に活動していた免許代言人と無免許代言人の人物像をおもに判決資料を用いながら具体的に解明した(拙稿「大審院法廷における代言人・代人」)。その結果、かつて拙著『在野「法曹」と地域社会』で示した仮説(明治10年代前半の大審院法廷では無免許代言人が活発に活動していた)の妥当性を再確認することができた。また、これまでの研究史の流れを振り返りながら、今後の課題を整理するという作業も行った(拙稿「再論・在野『法曹』と地域社会」)。その一方で、今年度の研究課題として挙げていた「静岡地方裁判所制度の整備」については、ほとんど手をつけることができなかった。次年度の課題としたい。計画二年目に当たる今年度は、とくに(2)について、県内史料の収集に努めた。その過程で以下の二点を確認した。第一に、県内の残存史料はごく限られているため、とくに明治初年における裁判制度の変遷を解明するためには他府県史料に依拠し、推測せざるを得ない。第二に、明治四年廃藩置県以前における中央政府の裁判制度についても、地方と同様になお未解明の点が多い。静岡県における裁判制度史を解明するためには、あわせて中央政府の制度史分析を行うことも避けて通れない。そこで、今期は、年度の途中から研究計画を若干変更し、静岡県史料だけでなく、中央政府の史料や他府県史料の収集も行うこととした。そうした作業の一端をまとめたものが、拙稿「明治初年における聴訟事務-民部官・民部省を中心に-」(『静岡大学法政研究』15巻2・3・4号、2011年3月、1136頁)である。それは、従来の研究では明治政府における聴訟事務担当機関に関する分析が不十分であったことを確認した上で、現時点で可能な限り史料を渉猟し、当時の聴訟制度の全体像を描こうとしたものである。また、その一方で、他府県の史料収集として島根藩郡奉行所文書の史料調査を行った。同文書群は近世後期の貴重な裁判史料であるが、そこには明治期(廃藩置県まで)の史料も含まれている。今期はそれら数千点の史料を複写することができた。なお、史料読解と分析は次年度以降の課題としたい。本研究は、「近代地域社会における司法機構の法社会史的研究-制度・人物・事件を中心に-」という全体構想のもと、昨年度から本来のフィールドである静岡県だけでなく、中央政府の関係史料や他府県史料の調査・分析も行ってきた。そうした作業の一端をまとめたのが、拙稿「明治初年における聴訟事務-民部官・民部省を中心に-」(『静岡大学法政研究』15巻2・3・4号、2011年3月)である。今年度は、そうした成果を踏まえてさらに視点を地方に移し、島根藩郡奉行所文書の史料調査・分析を行った。同文書群は近世後期から明治維新期にかけて貴重な裁判史料を擁するが、今回の作業はそのうちとくに明治初年(王政復古から廃藩置県まで)の史料を対象とした。その分析結果をまとめたのが、拙稿「明治初年の聴訟事務-松江藩郡奉行所文書を手がかりに-」

『法制史研究』61号、2012年4月)である。拙稿がとくに明らかにしたのは以下の諸点である。(1)維新政府の裁判権が次第に制度的に一元化されていったにもかかわらず、実際の裁判実務のあり方を見ると、大阪以西の西日本では近世以来の「大坂法」が依然として独自に(実体法的にも手続法的にも)機能していた。(2)その近世大坂法にもとづく金銭債権訴訟の手続を見ると、被告に対する召還手続は同時に内済成立に向けた処理手続(返済金の調達、分割弁済案のとりまとめ、家財処分などの強制執行手続など)を含むものであった。それは明治期に導入された勧解手続と本質的に同一のものであった。その意味で、近世法と近代法は連続的に展開していたといえる。さらに、(3)当事者に代わって訴訟場面に登場する「代人」たちの多様な活動ぶりも明らかにした。本年度は、研究計画の最終年度として、これまで蒐集してきた中央(太政官・民部官・民部省・司法省)と地方(静岡県)における司法制度資料(立法資料、伺・指令、判決文、新聞資料など)を「資料年表」という形に取りまとめ、明治元(1868)年から明治10(1877)年までの分をweb上で公開した(明治初年司法史年表(1868-1877)https://sites.google.com/site/fazhishinobuwu/de-yu-shi-yan-jiu)。この年表によって、中央に関しては現在蒐集できる限りの法令資料を網羅的に整理したので、これを時系列的に読み進めていけば、当時の改革の進展状況を資料に即して具体的に把握することが可能になった。同時に、どの時点に資料上の欠があるかも理解することができるようになったといってよい。また、この年表では、当該時期における静岡県司法制度資料も網羅的に蒐集した。これを中央資料と並行して読み進めていけば、中央の改革方針が地方においていかに具体化されていったのかを(こちらも資料に即して)把握することが可能になった。さらに内容的な面でいえば、この年表は単に裁判所制度の確立過程だけでなく、司法警察や行刑制度(地方監獄等)の確立過程についても目配りしているので、捜査から起訴、公判、刑の執行に至る一連の司法過程の急速な整備過程を総体的に把握することが可能となっている。静岡県では、明治初年(元年4年)の史料がほとんど残存していなかったため、やむなく他府県の史料によって当該時期の分析を行ったが、そこで得られた歴史認識は、今後の(明治4年以降の)静岡県における司法史研究においても当然踏まえるべき前提になるといってよい。その意味で、今年度も着実な成果が得られたものと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までの作業により、明治元年から同4年までの史料調査・分析はほぼ完了した。そこで最終年度では、おもに明治4年以降の静岡県域を中心に調査を実施する。そして、これまで収集してきた歴史資料を整理することを目的として、資料年表(明治元年10年頃)を作成し、webページで公表する予定である。その作業を通して今後の研究上の課題を明らかにし、さらに次の段階へと研究を進めていきたいと考えている。
口腔癌のCXCR4システムを介した転移機構における分泌型miRNAの役割

われわれは、ケモカインレセプターCXCR4が口腔癌の転移システムの一つであること、CXCR4シグナルの標的マイクロRNA (miRNA)として同定したmiR-518c-5pが、口腔癌細胞の増殖・転移を促進することを明らかにした。近年,癌微小環境に対するexosome包埋型の分泌型miRNAの重要性が明らかにされており、miR-518c-5pが分泌型の転移促進miRNAとして癌微小環境へ作用している可能性を検討した。しかしながら、miR-518c-5pの作用は、口腔癌細胞への直接的作用が主であり,転移に重要とされる癌微小環境への影響を明らかにすることができなかった。そこで、本研究ではCXCR4シグナルの下流に存在する分泌型miRNAを同定し、CXCR4シグナルの癌微小環境への作用機序を明らかにすることを目的とした.昨年度は,CXCR4高発現株であるB88をリガンドSDF-1処理後、培養上清を回収し、exosome中のmiRNA(ex-miR)の抽出したが,抽出したRNAの品質が悪く,miRNAアレイ解析行うことができなかった.そこで,本年度は試薬を変更し,再度抽出を試みたが,exosome miRNAの抽出量が少なく,品質も前回と同程度のものしか得ることができなかった.現在異動した愛媛大学は,exosomeの研究経験が豊富であり,新たな方法でexosome RNAの採取を行っている.exosome抽出キットを変更したにも関わらず,十分な量と品質のexosomeを回収することができなかった.現在異動した愛媛大学は,exosomeの研究経験が豊富であり,新たな方法でexosome RNAの採取を行っている.われわれは、ケモカインレセプターCXCR4が口腔癌の転移システムの一つであること、CXCR4シグナルの標的マイクロRNA (miRNA)として同定したmiR-518c-5pが、口腔癌細胞の増殖・転移を促進することを明らかにした。そこで、本研究ではCXCR4シグナルの下流に存在する分泌型miRNAを同定し、CXCR4シグナルの癌微小環境への作用機序を明らかにすることを目的とした.本年度は,CXCR4高発現株であるB88をリガンドSDF-1処理後、培養上清を回収し、exosome中のmiRNA(ex-miR)の抽出を試みた.exosomeの回収を行うことはできたが,抽出したRNAのA260/280比が1.6程度であり,miRNAアレイ解析に十分なRNAの品質を得ることができなかった.現在,抽出試薬の変更を行うことで品質改善をはかっている.その間,経口投与可能なCXCR4特異的阻害剤であるAMD070が,口腔癌細胞のin vitroでの遊走とマウス転移モデルでの転移を抑制することを明らかにした.本研究成果はOncology Reportsに投稿中である.われわれは、ケモカインレセプターCXCR4が口腔癌の転移システムの一つであること、CXCR4シグナルの標的マイクロRNA (miRNA)として同定したmiR-518c-5pが、口腔癌細胞の増殖・転移を促進することを明らかにした。そこで、本研究ではCXCR4シグナルの下流に存在する分泌型miRNAを同定し、CXCR4シグナルの癌微小環境への作用機序を明らかにすることを目的とした.昨年度は,CXCR4高発現株であるB88をリガンドSDF-1処理後、培養上清を回収し、exosome中のmiRNA(ex-miR)の抽出したが,抽出したRNAの品質が悪く,miRNAアレイ解析行うことができなかった.そこで,本年度は試薬を変更し,再度抽出を試みたが,exosome miRNAの抽出量が少なく,品質も前回と同程度のものしか得ることができなかった.現在異動した愛媛大学は,exosomeの研究経験が豊富であり,新たな方法でexosome RNAの採取を行っている.exosome抽出キットを変更したにも関わらず,十分な量と品質のexosomeを回収することができなかった.現在使用しているRNA抽出試薬を変更することで,RNAの品質改善をはかっている.現在異動した愛媛大学は,exosomeの研究経験が豊富であり,新たな方法でexosome RNAの採取を行っている.exosomeから抽出したRNAの品質が悪く,miRNAアレイ解析に至らなかったため.exosomeから抽出したRNAの量と品質が悪く,miRNAアレイ解析に至らなかったため次年度使用額が生じた.本年度はexosome抽出キットの購入とmiRNAアレイに対する使用を予定している.
人工内耳装用者における言語理解時の視聴覚の寄与に関する研究

人工内耳(CI)は、高度難聴者に対する医療として一般化しているが、成績に個人差が大きく、読話や手話を併用している例も多い。しかし、CI装用による情報伝達について、聴覚入力と視覚入力の両方から検討した報告は少ない。そこで本研究ではCI装用者の聴覚理解力と読話理解力とを利用した検査バッテリーを作成し、装用者における情報処理の特異性の解明を目的とした。対象はCI装用後1年以上が経過した中途失聴の成人CI装用者30名と小児CI装用者40名、健聴成人10名と健聴小児11名とした。母音の音声と口形画像を用い、視聴覚一致、視聴覚不一致、聴覚のみの3条件で提示した。被検者にはどの母音が聴こえたか判断するよう指示し、正答率と応答時間を測定した。その結果、成人、小児とも装用者の正答率は健聴者より有意に低く、応答時間は有意に長かった。また、装用者では視聴覚不一致条件は他の条件より有意に正答率が低く、応答時間は有意に長かった。成人装用者では語音聴取能と視聴覚不一致条件正答率の間に有意な相関を認めた。小児装用者を就学前のコミュニケーションモードで2群に分けて検討したところ、聴覚口話群は成人と同様に語音聴取能と視聴覚不一致条件正答率の間に有意な相関を認めたが、トータルコミュニケーション群では相関を認めなかった。本研究で作成した検査は健聴者にとっては非常に容易だが、CI装用者では特異な応答パタンを示し、視覚情報への依存の度合と聴取能との関連が示された。視覚情報も併用する装用者においては、健聴者では容易に検出できる視聴覚不一致条件でも、情報の整合性を検討する過程に時間を要すると考えられた。また小児では、就学前に聴覚口話で療育を受けた装用者の視聴覚情報処理は、聴覚を通して言語獲得した中途失聴成人に近いことが示唆された。
アポトーシス細胞のホスファチジルセリン露呈機構

アポトーシス細胞のホスファチジルセリン(PS)露呈機構を明らかにすることを目的として研究を進めた。アポトーシス時のPS露出にはカルシウムの上昇が必要なことから、カルシウムイオノフォアA23187を用いた実験系を構築し、その系において「細胞が生きたままPSを露出する」条件を見つけた。この特徴をいかして、A23187処理によりPSを強く露出した細胞をフローサイトメーターを用いてソーティングし、このA23187処理とソーティングの操作を19回繰り返すことで、PS露出に感受性のある細胞を樹立した。その細胞からcDNAライブラリーを作成し、親細胞に発現させPS露出に感受性を獲得させる遺伝子を探索したところ、8回膜貫通タンパク質のTMEM16Fを同定することができた。同定されたTMEM16Fは細胞内領域に変異が導入されており、その変異体を発現させると細胞が生きたままPSを露出した。野生型のTMEM16Fの発現はカルシウム刺激により対照よりも速やかにPSを露出した。PSを外側に露出する分子として、リン脂質を双方向に区別なく輸送するスクランブラーゼというタンパク質の存在が古くから仮定されていたが、TMEM16FはPSの露出だけでなく、通常は外側に存在するホスファチジルコリンの取り込みも促進することが分かった。以上より、TMEM16Fがスクランブラーゼそのもの、もしくはそのコンポーネントの一つであると結論した。また、血小板がPSを露出できないために血液凝固に異常をきたすスコット症候群の患者において、TMEM16Fを機能不全にさせる点変異があることを見つけた。
CPSのためのモデル検査・実行テスト統合試験環境の構築

非決定的要素を含むシステム試験の高効率化・高信頼化を実現するために、決定的/非決定的な試験ケースの実行が可能かつ実機あるいはエミュレータ上で動作が直接可能な統合的評価試験環境を構築する。2018年度は、過去2年間の成果をもとに以下の開発を行った。(1)統合評価試験環境上で動作する試験ケース自動生成方式の開発:自然言語で記載された機器仕様書から、機能試験ケースを自動生成するツールを開発した。本ツールを協力会社(2社)の9事例に適用し、ツールを精緻化した。また、動作仕様書から生成した機能試験に加え、製品ドメイン要求に基づき実施する品質試験ケースの生成を支援するため、協力会社での品質試験ケースの事例調査を実施し、品質試験事例をパターン化した。パターン記述に、機能試験ケース記述言語と同じものを適用することで、機能・品質試験を融合した試験ケースを自動生成するツールを実現した。(2)試験ケースおよび市場不具合ログからの実行可能プログラム生成支援ツールの開発:前項で生成された機能・品質試験ケースから、統合評価環境上で直接動作させることができるプログラムの生成ツールを開発した。併せ、市場不具合の動作ログからも、プログラムを生成するツールを開発した。統合評価環境用試験プログラム言語(Promela)の知識がないエンジニアにもテストプログラムの生成ができるようにした。また、これらツールを、協力会社製品に適用し、その有用性を評価した。(3)試験自動実行・試験結果の自動評価の実行環境の構築:テスト対象機器のプロセッサのエミュレータと統合評価環境の実行エンジンとのインタフェースを開発し、ソフトウェアブラックスボックス試験に対応できるよう拡張した。この結果、協力会社における従前のシステム評価では、再現が難しいとされていた3つの事例を、本統合評価環境上で再現できることを確認した。研究計画に記載した13年次に実施する項目および左記を実現するなかで顕在化した新規課題に対し、解決策の検討・実装・評価を実施した。新規課題の解決に注力したため、協力会社での実務適用が十分に実施できなかった。このため研究期間を1年間延長し、実運用の評価結果とこれら成果の外部発表を行う。非決定的要素を含むシステム試験の高効率化・高信頼化を実現するために、決定的/非決定的な試験ケースの実行が可能かつ実機あるいはエミュレータ上で動作が直接観察可能な統合的評価試験環境を構築する。2016年度は以下の項目を実施した。(1)実行動作可能なモデル検査機の構築:ネットワーク接続用のドングルを介して、実機とのメッセージ交換ができるモデル検査実行環境(ソフトウェア)を構築した。さらに、左記モデル検査機用のソフトウェアエミュレータを開発し、ソフトウェアの内部イベントの交換ができるように拡張した。これにより、システム外部試験、プログラム試験の両方に対応できる実行可能なモデル検査を実現した。(2)資産性の高い試験ケース記述言語の開発:試験ケースの資産性を向上するため、機能と試験対象システム構成を独立して記述可能とし、種々のシステム構成に対し、動的に試験ケースを生成する試験ケース記述言語の開発を行った。これらを用いてビル空調システムのシステム試験ケースを複数記述し、記述性を評価した。(3)これら開発したモデル検査機および試験ケースを用いて、共同研究先のシステム試験を事例として、非決定的な試験ケースを実行し、非決定的な試験により、通常のシステム試験では抽出しにくいシステム不具合を再現できることを確認した。研究計画に記載した初年度実施事項につき開発・評価を完了したことから。2017年度は、2016年度の成果を元に、以下の項目を実施した。(1)統合評価試験環境上で動作する試験ケースの自動生成方式の開発:自然言語で記載されたシステム仕様書から、2016年度に開発した試験ケース記述言語で記述された統合評価試験環境上で動作可能な機能・非機能試験ケースを自動生成するプロセス・ツール群を開発した。これにより、記載が難しいとされる非決定要素を含む試験ケースの記述を容易化した。(2)試験自動実行、試験結果の自動評価の実行環境の構築:膨大なレグレッション試験の効率化のために、検査式をLTL式で記載することで、統合評価環境上で自動評価することが可能な機能を開発した。さらに、このLTL式を用いて、不具合事例を再現するために必要となる膨大な動作ログから試験ケースを抽出する方法を開発した。(3)非決定的手順を含むテストのカバレッジの算出方法の開発:非決定手順を含むテストを実施すべきスコープを決定するために、システム機能・プログラムコードの実行順序制約の図式表現を開発し、この図式表現された実行順序制約から試験ケースを生成する機能を開発した。(4)本統合評価環境を協力企業2社の事例(空調システム、AVシステム等)に適用し、プロセスの妥当性とツールの有用性を確認した。研究計画に記載した2年目実施事項につき開発・評価を完了したことから。

本ツールを協力会社(2社)の9事例に適用し、ツールを精緻化した。また、動作仕様書から生成した機能試験に加え、製品ドメイン要求に基づき実施する品質試験ケースの生成を支援するため、協力会社での品質試験ケースの事例調査を実施し、品質試験事例をパターン化した。パターン記述に、機能試験ケース記述言語と同じものを適用することで、機能・品質試験を融合した試験ケースを自動生成するツールを実現した。(2)試験ケースおよび市場不具合ログからの実行可能プログラム生成支援ツールの開発:前項で生成された機能・品質試験ケースから、統合評価環境上で直接動作させることができるプログラムの生成ツールを開発した。併せ、市場不具合の動作ログからも、プログラムを生成するツールを開発した。統合評価環境用試験プログラム言語(Promela)の知識がないエンジニアにもテストプログラムの生成ができるようにした。また、これらツールを、協力会社製品に適用し、その有用性を評価した。(3)試験自動実行・試験結果の自動評価の実行環境の構築:テスト対象機器のプロセッサのエミュレータと統合評価環境の実行エンジンとのインタフェースを開発し、ソフトウェアブラックスボックス試験に対応できるよう拡張した。この結果、協力会社における従前のシステム評価では、再現が難しいとされていた3つの事例を、本統合評価環境上で再現できることを確認した。研究計画に記載した13年次に実施する項目および左記を実現するなかで顕在化した新規課題に対し、解決策の検討・実装・評価を実施した。研究開発者である企業の研究者2名が、別組織(工場・間接部門)に異動となった。一方で、開発した評価環境の実用性を高めるためには、実開発現場でのフィールド評価が重要であることから、これらフィールド評価を実施できる体制作りを、開発と並行して進めている。現在、共同研究者が所属する企業のソフトウェア開発設計部門、および民生機器関連企業の評価部門と2件の共同プロジェクトを立ち上げ中である。これら共同プロジェクトを通じ、獲得した課題を、本評価環境仕様へフィードバックし、評価環境の実用性をさらに向上していく計画をたてている。開発した評価環境の実用性を高めるためには、実開発現場でのフィールド評価とフィードバックが重要であることから、これらフィールド評価を実施できる体制作りを開発と並行して積極的に推進した。その結果、現在、(1)共同研究者が所属する電機機器メーカの研究部門および設計部門と大学の3社からなる共同プロジェクト(2)民生機器の評価を請け負うエンジニアリング会社の評価部門との共同プロジェクトを2017年度半ばから発足させることができた。今後は、研究開発計画書に沿って機能を充実させるとともに、これらのプロジェクトを通じて、実開発現場への適用・フィードバックを得て、統合評価環境の完成度を向上させて行く計画をたてている。新規課題の解決に注力したため、協力会社での実務適用が十分に実施できなかった。
天文学用語標準化の調査研究

天文学の近年の発展は,新しい専門用語の洪水となってあらわれている。これは新しい技術の開発と相まって,幾つもの周辺分野との合作の結果である。それらの新しい研究成果は,報道,出版,教育活動を通して,一般知識人の関心を集めて,広く文化に影響を及ぼしている。このような中で,天文学用語を,新しい概念を創り出した小さい専門家集団の中でのみ用いられる符号としてではなく,先ずは天文学の研究者間で共有して用いられる符号とするための調査研究をすることになった。作業の第1段階は,高いひん度で近年用いられている天文学用語の採集からはじめた。各種文献から英語で約2万語を採集した上で,重複を取り除いて約1万2千語とした。作業の第二段階では,それらの用語を取り除いて約1万2千語とした。作業の第二段階では,それらの用語を約20の分野等のファイルに分割して,多数の分担者,協力者に分配して(1)日本語の記入と,(2)用語としての採否の記入を依頼して,各分野等のファイルにそれぞれ3ー5名が意見の記入をした。その結果をファイルに入力し,分野等に分割したファイルを合体して,英語のアルファベッド順に並べ替えて,一応の用語集の案とした。この案に対して広く意見をつのるために,日本天文学会発行天文月報平成2年3月号学会だより欄に「天文学用語集」の改訂について(2)の記事を載せて,公開検討会(5月7日京大,第四次資料配布,第五回全体会議)を開催した。その意見をまとめて,ファイル修正(6月),世話人等(8名)が各自で全体の検討(7ー8月),ファイル修正をして,第六回全体会議(10月16日仙台,第五次資料配布),再度ファイルを分割して最初に日本語の記入をした分担者等の意見を徴した。そのあと代表者等がファイルに検討を加えて,2月14日の12時間検討会(6名)で遂語に検討を加えて,約5200語の用語案を決定した。天文学用語の標準化の調査研厚の3年計画の2年次である。学術論文等に使用されている用語(英語)を、約1200語採集して、パソコン入力をした。天文学の中の分野別に分けて、アルファベット順に並べて、重要な専門的概念に対応している用語(英語)約6000語を選定した。その作業のために、第一次資料(B5版、200頁、70部、1989年3月24日)、第二次資料、第一分冊アルファベット順(B5版、260頁、120部、1989年8月25日)、第二次資料、第二分冊分野別アルファベット順(B5版、261頁、120部、1989年8月25日)を印刷して、本研究分担者および協力者に配布した。第二会議(8月25日,東大山上会館、16名出席)、第三回会議(10月16日、福岡県宗像市宗像ユリックス内会議室15名出席)、第四回会議(平成2年3月31日、東大山上会館)を開催して、意見交換をした。本研究は昭和49年の用語集(丸善出版、日本学術振興会発行)の改訂作業の側面を持つ。従って、天文学用語の日本語として、既刊の用語集に載っている用語をそのまま認め、改め、或いは削除し、更に追加する用語を新規に選定することになる。既刊の用語集が約2500語採録しているのに対して、今回は約6000語となる。それらの用語の英語と日本語の対照表をもって用語集としているのであるが、別に天文学用語辞典の出版をするための用語選定も進めた。今後は、用語の日本語を選定して、その発音をロ-マ字で記入し、英語引きと日本語引きとを作る。このような中で,天文学用語を新しい概念を創り出した小さい専門家集団の中でのみ用いられる符号としてではなく,先ずは天文学の研究者間で共有して用いられる符号とするための調査研究をすることになった。作業の第二段階では,それらの用語を約20の分野等のファイルに分割して,多数の分担者,協力者に分配して(1)日本語の記入と(2)用語としての採否の記入を依頼して,各分野等のファイルにそれぞれ3ー5名が意見の記入をした。その結果をファイルに入力し,分野等に分割したファイルを合体して,英語のアルファベット順に並べ替えて,一応の用語集の案とした。

その意見をまとめて,ファイル修正(6月),世話人等(8名)が各自で全体の検討(7ー8月),ファイル修正をして9月13日の12時間検討会(6名),ファイル修正をして,第六回全体会議(10月16日仙台,第五次資料配布),再度ファイルを分野等に分割して最初に日本語の記入をした分担者等の意見を徴した。そのあと代表者等がファイルに検討を加えて,2月14日の12時間検討会(6名)で遂語に検討を加えて,約5200語の用語案を決定した。天文学の近年の発展は,新しい専門用語の洪水となってあらわれている。これは新しい技術の開発と相まって,幾つもの周辺分野との合作の結果である。それらの新しい研究成果は,報道,出版,教育活動を通して,一般知識人の関心を集めて,広く文化に影響を及ぼしている。このような中で,天文学用語を,新しい概念を創り出した小さい専門家集団の中でのみ用いられる符号としてではなく,先ずは天文学の研究者間で共有して用いられる符号とするための調査研究をすることになった。作業の第1段階は,高いひん度で近年用いられている天文学用語の採集からはじめた。各種文献から英語で約2万語を採集した上で,重複を取り除いて約1万2千語とした。作業の第二段階では,それらの用語を取り除いて約1万2千語とした。作業の第二段階では,それらの用語を約20の分野等のファイルに分割して,多数の分担者,協力者に分配して(1)日本語の記入と,(2)用語としての採否の記入を依頼して,各分野等のファイルにそれぞれ3ー5名が意見の記入をした。その結果をファイルに入力し,分野等に分割したファイルを合体して,英語のアルファベッド順に並べ替えて,一応の用語集の案とした。この案に対して広く意見をつのるために,日本天文学会発行天文月報平成2年3月号学会だより欄に「天文学用語集」の改訂について(2)の記事を載せて,公開検討会(5月7日京大,第四次資料配布,第五回全体会議)を開催した。その意見をまとめて,ファイル修正(6月),世話人等(8名)が各自で全体の検討(7ー8月),ファイル修正をして,第六回全体会議(10月16日仙台,第五次資料配布),再度ファイルを分割して最初に日本語の記入をした分担者等の意見を徴した。
細菌検査を用いたインプラント周囲炎の治療予後診断法の開発

歯周炎、インプラント周囲炎罹患部位より細菌DNAを抽出し、歯周病原細菌及びインプラント周囲炎への関与が示唆される細菌のプライマーを用いて、病原細菌候補となる細菌種の有無と量的変化を調べたところ、菌量に比べて、機能遺伝子を多く担っている菌がKeystone pathogenとなる可能性が高い可能性が示唆された。また、インプラント周囲炎の方が歯周炎と比較すると多くの細菌と共起関係にある活動性の高い細菌が多いことがわかった。インプラント治療は欠損補綴の治療法の一つとして、頻繁に活用されるようになり、口腔機能回復に重要な役割を果たしている。一方で、インプラント治療後のトラブルも増え続けており、なかでもインプラント周囲炎はその頻度が高い。現在、様々な治療法が試みられてはいるが、治療法が確立されているとは言い難い。本研究では、インプラント周囲炎治療を通じて、原因となる細菌叢と臨床的パラメーターを記録し、細菌叢の変化と治療効果との関連を検討すると共に、インプラント周囲疾患の診断・治療上の指標となる細菌学的因子を解明し、新たな治療プロトコールを開発することを目的とする。本年度は10人程度の被験者のインプラント周囲炎、歯周炎部位より、ペーパーポイントを用いて歯肉縁下プラークの採取、歯周組織検査(歯周ポケットの深さ、歯肉からの出血の有無、X線写真上での骨吸収度の測定)を行った。インプラント周囲炎への関与が示唆される特定細菌のプライマーを用いて、細菌種の有無と量的変化をいくつかのサンプルに関してはreal-time PCR法を使用して調べ、細菌の解析データを収集している。臨床的な側面からもインプラント周囲炎の治療を模式図に示した通りに進めている。現在、治療前サンプルを採取した被験者においては段階的に治療が終了し、再評価時の臨床パラメーターの記録および細菌サンプルの採取を行っている。何名かの被験者に関しては累積的な治療が終了し、メインテナンスを行うとともにメインテナンス時の細菌サンプルの採取も行った。当初計画していた通り、今年度は細菌サンプルの採取および臨床データの収集を行い、いくつかのサンプルにおいては細菌の解析データも収集できている。サンプル数は当初予定していた数よりは少ないものの、今後も引き続きサンプル採取は可能であるため、順調に進展していると考えられる。また、臨床的側面からも何人かの被験者ではすでに累積的な治療が終了しており、こちらも順調に進展していると考えられる。本年度はさらなるサンプル数の増加のため、東京医科歯科大学歯周病外来とインプラント外来にて、倫理申請をおこなって同意を得られた患者から、同一口腔内の歯周炎部位、健常歯部位、インプラント周囲炎部位、健常インプラント部位を対象に臨床データと共にプラークの採取を行なった。プラークからDNA、RNAを抽出・精製後、次世代シークエンサー(Illumina Miseq)を用いて、塩基配列の解読を行なった。現在は、取得したデータからスーパーコンピューターを用いてメタゲノム解析、メタトランスクリプトーム解析を行なっている。治療前サンプルを採取した被験者においては段階的に治療が終了し、再評価時の臨床パラメーターの記録および細菌サンプルの採取を行っている。何名かの被験者に関しては累積的な治療が終了し、メインテナンスを行うとともにメインテナンス時の細菌サンプルの採取も行い、塩基配列の解読を行った。当初の計画通り、治療前後における細菌データの収集、解析を行った上で細菌学的診断マーカーの検討を行っていく予定である。当初予定していたサンプルの収集数が予定より下回ったため、解析に必要な物品費に差異が生じた。次年度、当初計画していた通りのサンプル数を引き続き採取するため、サンプル採取後の解析に必要な物品費として使用する予定である。
ペルオキシソームの脂質代謝異常を伴う自閉症スペクトラムの治療に向けた基盤研究

近年、自閉症スペクトラム患者で、ペルオキシソームの脂質代謝機能低下やペルオキシソーム病の原因遺伝子に変異が見つかったという報告がある。申請者らは、これまでに、ペルオキシソームタンパク質のひとつであるTysnd1 (Trypsin domain containing 1)の欠損マウスの用いて解析した結果、Tysnd1欠損マウスでは自閉症様の行動異常が見られたため、Tysnd1欠損によるペルオキシソームの脂質代謝異常は、自閉症となんらかの関係があると考えられた。そこで本研究では、ペルオキシソームの脂質代謝異常と自閉症スペクトラムの発症メカニズムとの関係を明らかにすることを目的とした。ペルオキシソームは、超長鎖脂肪酸のβ-酸化やフィタン酸の酸化、プラスマーローゲン合成などの重要な脂質代謝を担う。このペルオキシソームで働くプロテアーゼであるTysnd1を欠損したマウスでは、ペルオキシソームの脂質代謝異常を示す事をこれまでに報告した(Mizuno Y. et al.2013)。このTysnd1欠損マウスを使い、網羅的行動解析を行った結果、不安様行動の低下、社会的行動の低下、文脈記憶の低下が見られ、ペルオキシソームの脂質代謝異常と自閉症の発症には何らかの関連があると考えられた。ICRマウス脳の免疫組織染色の結果から、Tysnd1は、海馬歯状回と小脳、嗅球に多く発現していた。そこで本年度は、歯状回と小脳の病理解析を進めた。Tysnd1欠損マウスの歯状回ではPSA-NCAM抗体陽性細胞が減少していた。また、小脳プルキンエ細胞の形態的な変化が観察された。以上の結果から、Tysnd1欠損によるペルオキシソームの脂質代謝異常は、歯状回と小脳の形態学的な異常をもたらしており、歯状回と小脳の異常が自閉症様の行動異常につながった可能性が考えられた。本年度は、自閉症用の行動異常を呈するTysnd1欠損マウスを用いて、ペルオキシソームの脂質代謝異常がなぜ自閉症様の症状を呈するかについてを中心に研究を行った。Tysnd1は、ペルオキシソームで行われる重要な脂質代謝を担う酵素を切断することで、ペルオキシソームの脂質代謝の活性維持に役立つ。Tysnd1が欠損したマウスでは、ペルオキシソームの脂質代謝活性が減少していることをこれまでに報告した。脳で神経保護などの重要な働きをすると言われているプラスマローゲンは、ペルオキシソームで初期の合成が行われる。そこでプラスマローゲンに着目して測定を行ったところ、Tysnd1欠損マウスの脳では、野生型マウスと比べてプラスマローゲン量が減少する傾向が見られた。また、プラスマローゲン前駆体についても減少する傾向が見られた。前年度に海馬歯状回に形態学的な変化が見られたため、海馬歯状回の顆粒細胞軸索を亜鉛を多く含む神経線維を選択的に染色するTimm染色を行い、神経線維の量を間接的に定量したが、Tysnd1欠損マウスでは平均値で野生型マウスよりも増加する傾向が見られたものの、有意差は得られなかった。ペルオキシソームは肝臓に特に多く見られることから、肝臓での脂質代謝異常が脳に影響することも考えられた。そこで、Tysnd1欠損マウスの肝臓での脂質代謝機能の詳細を解析したところ、高脂肪食投与では、ペルオキシソームの脂質代謝活性は低下するのに対し、ミトコンドリアの脂質代謝活性は亢進していることがわかった。ミトコンドリア関連疾患でも神経症状が見られることから、Tysnd1欠損による自閉症様行動異常の表現型は、ミトコンドリア機能との関連も視野に入れるべき可能性が考えられた。自閉症患者血液を用いたエクソーム解析を予定していたが、本学小児科のみでは予定していた患者数に満たないため、精神・神経科にも協力をお願いしている。このため、IRB申請、倫理申請を再度申請する手続きなどが生じ、エクソーム解析の面ではやや遅れが生じている。マウスを使った実験の方は、ほぼ順調に進んでいる。マウス実験に関しては、脳の病理解析を進めておりおおむね順調である。ヒトの遺伝子解析については、エクソームシーケンスは、ある程度の検体数をそろえた方がシーケンスコストを抑えられるため、現在、検体を収集中であることからやや遅れている。平成28年度は、自閉症患者のエクソーム解析を中心に研究をすすめ、自閉症とペルオキシソームの脂質代謝異常との関連を明らかにしたい。また、Tysnd1欠損マウスを使った実験では、脳でのプラスマローゲン合成異常を補填する役割のある物質を同定し、効果を試みていきたい。生化学・分子生物学引き続き、Tysnd1欠損マウスの脳の解析を行う。形態異常の見つかった歯状回と小脳で、自閉症発症のメカニズムを明らかにするため、神経細胞の観察や遺伝子発現解析などを行う。また、自閉症患者および、ペルオキシソーム病、軽度ペルオキシソーム病患者の血液サンプルの収集を行う。

エクソームシーケンスにより、責任遺伝子の同定を行う。自閉症患者サンプルが当初予定していた小児科だけでは集まらないことがわかり、精神・神経科にも協力を仰ぐこととなり、IRB申請、倫理申請などの手続きに時間を要したため、本来予定していたエクソーム解析を次年度に行うことになった。エクソームシーケンスを行うにあたり、ある程度のサンプル数まで増やしてから行う方が効率的がよいため、次年度に繰り越した。前年度に使用するはずだった額は、本年度のエクソーム解析費用と合わせて使用予定である。次年度のエキソームシーケンス予定額と合わせてまとめて解析を行う予定である。