hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非対称爆縮における高密度コアプラズマの形成と加熱のダイナミクス

本年度は以下の項目について研究開発を行った。特に非対称爆縮に関する日米協力により、米国ロチェスター大学レーザーエネルギー研究所のオメガレーザーを用いた実験を行い、本来大阪大学の激光XII号レーザーで行う計画であった実験の一部をより高出力・高性能のオメガレーザーでの実験に置き換えた。平成16年度の成果・X線ストリークカメラを用いた超高速X線画像計測装置MIXS(マルチイメージX線ストリークカメラ)の結像系の改造・オメガレーザーでの爆縮実験への改良型MIXS導入およびX線バックライト計測への導入・核反応粒子計測のための多チャンネル中性子検出器の較正・2次元シミュレーションコードによる非対称爆縮ダイナミクスのシミュレーション・2次元シミュレーションコードによる爆縮プラズマとコーン先端との相互作用のシミュレーションこれらにより、コーンシェルターゲットの爆縮実験結果を解析し、2次元コード結果との比較から、コアからコーン先端への衝撃波伝搬、爆縮コアからコーン先端へのプラズマジェット流の動きを評価し、コーン先端の破壊に関する知見を得た。非対称コアの爆縮ダイナミクスを考慮した爆縮設計を行った。大阪大学レーザーエネルギー学研究センターでは、コーン付きシェルターゲットを爆縮し超短パルス高強度レーザーによりこれを加熱する高速点火核融合方式の研究を推進している。コーンシェルターゲットの爆縮では、コーンの存在により爆縮は必然的にモード1の非対称性を有するため、爆縮過程および形成されるコアプラズマは非対称な構造を持つことになり、球対称爆縮とは大きく様相を異にする。従って、そのダイナミクスは核融合点火・燃焼設計に向けて核融合利得を左右する重要なファクターとなる。H17年度は、(1)コア形成ダイナミクス・加熱計測法の開発、(2)爆縮ターゲット実験、(3)2次元シミュレーションコードによる解析、を行い本課題研究の総括を行った。今年度の研究成果は以下の通りである。・2次元サンプリング結像X線ストリークカメラ(2D-SIXS)法を開発実用化し、コアプラズマ内部に流れが存在するなど非対称爆縮コアのダイナミクスの観測に成功した。・1次元結像とマルチイメージX線ストリークカメラ(MIXS)法を組み合わせた手法を開発し、爆縮シェル全体のダイナミクスと爆縮コアのダイナミクスを同時に精度よく計測することに成功した。・2次元シミュレーションコードを用いた解析により、爆縮コアとコーン先端の間隙でのプラズマ流により、コアとコーンの相互作用が大きく影響を受けることを見いだした。重水素化プラスチックシェル球殻ターゲットを用いた爆縮実験に加え、フォームクライオ重水素平板ターゲットの加速実験およびPWレーザーによる加熱実験に分解した要素実験を行った。
救急医療の向上に関する研究-画像伝送による救急医療施設の医療資源の節約と向上-

救急医療支援策として画像伝送システムで救急医療施設を一体化すると、専門医数不足解消、医療資源の節約、救命率の向上に期待される。佐賀医科大学救急部を中心に5カ所の病院間に画像伝送システムで救急医療ネットワークを作り、救急患者の情報交換と医療資源の節約に画像伝送システムが有益性であるか調査した。画像伝送装置の使用方法を、装置の病院内設置場所、病院内担当者、及び救急患者の紹介・転院状況などに分けて検討し、伝送操作の煩雑さを解消するために伝送用・受信用のコンピュータープログラムを改良試作した。本研究では、画像伝送システムは同一者により作成し、簡単な操作にするソフトと厳密なソフト管理、並びに救急外来かX線室に設置して救急医ないしX線技師による管理が大切であることが示唆された。また、本画像伝送システムが医療資源節約に有益であることが明かとなった。新しい試みとして、在宅患者の部屋や救急車内に設置し、在宅患者の病状監視や救命士活動の支援策としても有用であることが推察された。救急医療に積極的な病院間に画像伝送装置を設置し、佐賀医科大学救急部を中心とした病院間に画像伝送システムを整備し、救急患者の検査資料を画像伝送装置で伝送し、救急患者について情報交換を開始した。この画像伝送システムの運用に先駆けて、研究者と協力施設との間で画像伝送装置の使用方法や交信記録について検討し、画像の収録、伝送用、受信用のコンピュータープログラムを組み、その使用方法と交信内容の記録についての画像伝送マニュアルを作成した。一方、「画像伝送による救急医療システム」研究会を発足させ、今までに4回の研究会を開催し、画像伝送システムの運用について討論して、受信側の24時間体制が可能か、画像が診断的に充分か、受信側の助言にどの程度の責任があるか、費用は誰が負担するのかという問題点を検討した。更に、既に画像伝送システムを運用している長崎中央病院と都立広尾病院での運用状況を調査し、整形外科的な疾患の骨折のX線写真や脳外科的な疾患の頭部CT写真の画像伝送は治療方針や手術適応の判断に有益であることが推察され、胸部X線写真や皮膚科疾患の皮膚の写真については難しいことがわかった。3カ所の病院間に画像伝送装置を設置し、佐賀医科大学救急部を中心とした病院間画像伝送システムを整備し、救急患者の検査資料を伝送し、救急患者について情報交換の効率を調査した。この画像伝送システムの運用によって、救急医療施設の医療資源の節約ができているか調査目的に、装置の病院内設置場所、病院内担当者、及び救急患者の紹介・転院状況を調査した。また、研究者と協力施設との間で画像伝送装置の使用方法や交信記録について検討し、問題点の解消に画像の収録、伝送用・受信用のコンピュータープログラムを試作し、その使用方法と交信内容の記録についての画像伝送マニュアルを改訂した。一方、「画像伝送による救急医療システム」研究会では、本年は2回の研究会を開催し、画像伝送システムの運用について討論し、更に、既に画像伝送システムを運用している利尻島国保中央病院とNTT九州病院での運用状況を調査し、整形外科的な疾患の骨折のX線写真や脳外科的な疾患の頭部CT写真の画像伝送は治療方針や手術適応の判断に有益であることが推察され、また、新しい試みとして、在宅患者の部屋に設置し、在宅患者の病状監視に有用であることが推察された。3カ所の病院間に画像伝送装置を設置し、佐賀医科大学救急部を中心とした病院間画橡伝送システムを整備し、救急患者の検査資料を伝送し、救急患者について情報交換の効率を調査した。また、研究者と協力施設との間で画像伝送装置の使用方法や34回の交信記録について検討し、問題点の解消に画像の収録、伝送用・受信用のコンピュータープログラムを改良試作し、その使用方法と交信内容の記録についての画像伝送マニュアルを改訂した。一方、研究協力者による2回の「画像伝送による救急医療システム」検討会では、画像伝送システムの運用方法と改善点について討論し、更に、既に画像伝送システムの稼働している札幌医科大学での運用状況を調査し、整形外科的な疾患の骨折のX線写真、脳外科的な疾患の頭部CT写真の画像伝送は治療方針や手術適応の判断に有益であることが一般に言われているような結論であった。また、新しい試みとして、在宅患者の部屋や救急車内に設置し、在宅患者の病状監視や救命士活動の支援策としても有用であることが推察された。
核内外輸送の異常が関わる細胞がん化機構の分子基盤

本研究では、核ー細胞質間物質輸送異常と細胞がん化の相関を明らかにすることを目指し、核ー細胞質間物質輸送の介助をする核膜孔タンパク質NUP214の白血病で観察される変異型タンパク質SET-NUP214,DEK-NUP214の機能解析を行った。SET-NUP214,DEK-NUP214発現細胞では核外輸送運搬体CRM1/XPO1およびNXF1/TAPの局在が変化し、生体高分子の核外輸送に変調を来すことが明らかとなった。加えて、SET-NUP214,DEK-NUP214発現細胞ではNF-κB構成タンパク質の局在が変化し、NF-κB活性が抑制されることを明らかとした。平成25年度は、以下の解析を行った。【Nup214融合遺伝子産物がNF-kB経路に与える影響の解明】NF-kBの構成因子p65およびその調節因子IkBaはそれぞれに存在するNLS及びNES配列に依存して核ー細胞質間を移動し、そのことはNF-kB経路の制御に重要な役割を果たしている。SET/DEK-Nup214は人工的に作成したNESタンパク質の核外輸送を阻害する。そこで、両タンパク質が内在性のNESタンパク質局在にも影響を与え、影響をうけたNESタンパク質が関わる経路へ作用を及ぼすのではないかと考え、SET/DEK-Nup214がNF-kB経路に与える影響の解析を行った。正常細胞では刺激非存在下において、p65およびIkBは細胞質に存在する。一方、SET/DEK-Nup214発現細胞では両タンパク質の発現量に依存してp65およびIkBの核への蓄積が起きていた。次に、NF-kB活性をレポーターアッセイとRT-PCRにより検討したところ、SET/DEK-Nup214発現の有無による転写活性の違いは見られなかった。理由として、転写因子p65と共にp65の活性阻害因子であるIkBaも核へ移動したため、両者の複合体が核内で形成され、p65が活性型として機能していないことが推測される。免疫沈降法およびChIPアッセイの結果、SET/DEK-Nup214発現細胞でp65はIkBaと結合していること、p65はプロモーター上へほとんどリクルートされていないことが明らかとなった。一方、TNF-a存在下では、SET/DEK-Nup214発現細胞においてNF-kBの活性抑制が見られた。正常細胞では、TNF-a刺激後にIkBaは分解され、p65との相互作用は消滅する。免疫染色の結果、SET/DEK-Nup214発現細胞ではTNF-a刺激後でもIkBaが核内に存在しており、このことがNF-kB活性を抑制している可能性が示唆された。本研究では、生体高分子の核ー細胞質間輸送異常による発がん機構の解明を目指し、核内外物質輸送の補助を行っている核膜孔構成因子Nup214の転座型融合遺伝子産物であるSET-Nup214、DEK-Nup214の機能解析を行っている。今年度は、以下の2点を行った。1.【Nup214融合遺伝子産物の結合する核ー細胞質間物質輸送因子の決定】SET-Nup214あるいはDEK-Nup214と結合する因子を質量分析装置により同定し、タンパク質やRNAの核移行あるいは核外移行を担う因子が複数両タンパク質と結合することを明らかにした。また同定された輸送因子間でNup214融合遺伝子産物との相互作用には違いがあり、特に核外輸送因子であるNXF1/TAP及びXpo1/CRM1とNup214融合遺伝子産物が結合すること、それらの積み荷であるmRNAやタンパク質が融合遺伝子産物発現細胞では核内に滞留していることを見出した。2.【細胞内輸送異常がおきるタンパク質の実体の同定】上記の結果から、Nup214融合遺伝子産物発現によって生じたタンパク質の核-細胞質間移行の異常が発がん機構に関与している可能性が考えられたことから、細胞内局在に変化が生じたタンパク質の同定を試みた。融合遺伝子発現細胞及び非発現細胞から核抽出液を調製し、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動を行い、因子の同定を行う。現在、実験系の構築がほぼ終了したため、今後は変化が見られたタンパク質を質量分析装置により同定する予定である。平成27年度は、以下の解析を行った。【核外輸送が抑制されているタンパク質の同定】血球分化の抑制が起きているset-nup214トランスジェニックマウスの脾臓細胞を用い、核への蓄積が見られるタンパク質の同定を試みた。その結果、IκBαに加え、リボソームの核外輸送を担うNMD3の核への蓄積が観察された。【核外輸送が抑制されているタンパク質が細胞に及ぼす影響の解析】

SET-NUP214に加え、DEK-NUP214発現細胞でもNMD3の核への蓄積が観察された。また、両融合遺伝子産物発現細胞では、60Sサブユニットに含まれるRNAの細胞内局在が変化していることが明らかとなり、NMD3機能が阻害を受けている可能性が示唆された。研究期間全体を通じ、1白血病でみられる融合遺伝子産物SET-NUP214およびDEK-NUP214が細胞内において複数の核ー細胞質間輸送因子と結合し、その機能に影響を及ぼすこと、2両融合遺伝子産物が内在性の生体高分子の核外輸送を阻害すること、3そのことにより、細胞での遺伝子発現の変調を引き起こすことを明らかにした。細胞内の輸送異常が細胞のがん化を引き起こす可能性を提案する分子基盤を明らかにした点が本研究の意義である。細胞内の輸送異常がどのように細胞のがん化を引き起こすかその詳細な機構を明らかにすることが今後の課題である。本研究で得られた成果については、現在論文作成中である。細胞生物学抽出液の最適化及び2次元電気泳動のセットアップに時間がかかったため、研究計画・方法の(1)に記述したプロテオーム解析について遅れが生じている。遂行する順番に変更は生じたが、研究計画に記述した実験については1年間で遂行する予定の実験は進んだので、おおむね順調である。研究に遅れが生じている1細胞内局在に変化が生じたタンパク質の質量分析による同定、および2細胞内局在に変化が生じたmRNAのアレイによる同定、を行う。また3年間で遂行した研究結果を国際学会で発表、論文投稿を行いたいと考えている。今年度に引き続き、細胞内局在に変化が生じたタンパク質の同定を試みる。加えて融合遺伝子発現によりmRNAの核内への蓄積も見られていたことから、細胞内局在に変化が生じたmRNAをマイクロアレイにより同定する。同定された因子については、局在変動が細胞増殖や分化能に及ぼす影響を同定因子の強制発現やノックダウンにより評価する。該当なし
タイ近現代政治史における日本政治モデルをめぐる諸論争

本研究が明らかにしたことを以下に要約する。タイにおいては自国の政治変革のモデルとして日本が議論されるようになるのは1885年以降のことであるが、それ以降第2次大戦期に至る間を3期に分けて見ることができる。第1期は1885年以降日露戦争までの期間で、日本は東洋においても清国とも比較できぬ程の小国と考えられていたが、革新的若手王族や官僚らは日本は東洋において西洋の道を歩む唯一の国であるとしてチュラーロンコーン王に日本の立憲制への努力を見習いタイも絶対王政を廃止する事を提言した。これに対し同王はタイ王政の独自性を強調した。日露戦争で日本が勝利すると、日本がどうして大国になったのかという議論が生じた。これから1932年の立憲革命までが第2期である。この議論もタイの政治変革と結びついていた。その1例として1912年のラッタナコーシン暦130年の乱時の議論を見ることが出来る。反乱を企図した若手将校達は日本の成功は立憲制を導入して天皇の恣意的国家歳入の浪費を抑えその分を軍事強化に回したからであると主張した。一方、ワチラーウット王は日本の成功は天皇に対する忠誠心に起因しており、それは武士道精神が基本になっているとしてタイが日本から見習うものは同精神であるとして反駁した。立憲革命後のタイ恒久憲法制定では明治憲法も参考にされた。この革命は推進した人民党の指導者、ピブーンは日本は英仏独と並ぶ民主主義大国でありタイのモデルであると讃えた。一方反政府のロイヤリストたちは日本における複数政党制などに見られる民主主義の現実とともに天皇に対する忠誠心とを評価し一党独裁の人民党政権の非民主性と反王族的態度を糾弾した。以上のようにタイにおいては重要な政治転換時において日本はモデルとして常に引照されたことを明らかにした。
染色体ストレス応答におけるクロマチンリモデリング制御の分子メカニズム

我々が研究してきた遺伝病「ファンコニ貧血(FA)」の原因遺伝子群の構成するFA経路は、DNAクロスリンク(ICL)修復と染色体ストレス応答に必須の役割を果たし、発がんや幹細胞不全などの重篤な疾患状態の原因となるため、医学・生物学的に重要な研究課題である。FA経路の中心分子FANCD2のDNA損傷応答、DNA修復機能はクロマチン上で発揮されることが判名しているが、我々の報告したFANCD2のヒストンシャペロン活性は、クロマチン上に存在するFANCD2の新規機能である。我々は、FANCD2のヒストンシャペロン活性がICL修復能に重要であることを明らかにしたが、その分子メカニズムは不明である。クロマチン上のFANCD2にリクルートされるFA下流分子として、SLX4, FAN1, CtIPなどのヌクレアーゼが知られている。Fancd2欠損DT40細胞に野生型FANCD2、あるいはFANCD2ヒストンシャペロン変異体を再発現させた細胞を構築し、続いて、GFPタグ付きの下流分子を導入した細胞を構築した。GFP-SLX4, GFP-FAN1, GFP-CtIPのフォーカス形成は、野生型およびFANCD2ヒストンシャペロン変異体発現細胞で、大きな違いは観察できなかった。一方、野生型DT40細胞とFANCD2ヒストンシャペロン変異細胞で、OVA遺伝子座におけるターゲットインテグレーション頻度を測定したところ、FANCD2ヒストンシャペロン変異細胞は野生型細胞に比べ、効率が1/7に減少していた。以上の結果より、FANCD2ヒストンシャペロン活性の作用点は、FANCD2への下流ヌクレアーゼのリクルートよりも下流で、ターゲットインテグレーションに関与する反応の上流であることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。ファンコニ貧血(FA)原因遺伝子群の構成するFA経路は、DNAクロスリンク(ICL)修復と染色体ストレス応答に必須の役割を果たす。従来の研究からFA経路の中心分FANCD2の機能はクロマチン上で発揮されることが判明している。まず、クロマチン上に存在するFANCD2の相互作用分子を同定する目的で、FLAG-HA-FANCD2発現ヒトHeLa細胞を構築した。ヒドロキシウレア処理でFA経路を活性化させた細胞から、クロマチン画分を調整し、その画分からFANCD2を精製し、結合分子をプロテオーム解析し、CtIPを同定した。In vivo, in vitroの解析から、CtIPの166-273アミノ酸残基領域とFANCD2のモノユビキチン化が、FANCD2とCtIPの直接結合と、CtIPのフォーカス形成に必須である。ICL修復において、FANCD2とCtIPは相同組換えの初期反応である2本鎖DNA末端からの削り込み(エンド・リセクション)に必要であり、クロマチン上のFANCD2がCtIPをクロマチンにつなぎ止める役割を担うことを明らかにし、論文発表した(Unno等、印刷中)。また、一般にクロマチンリモデリングとヒストン修飾との密接な関連が知られている。昨年度までの本領域公募研究で我々が明らかにしたFANCD2のヒストンシャペロン活性により引き起こされるDNA損傷部位でのクロマチン動態の変化を、チミジン類似体であるEduを用いたiPOND法により検出することを試みている。DNA損傷に伴うFANCD2の集積を検出することに成功しているが、検出効率が低い(数%)ため、現在、FANCD2を指標に実験条件の検討・改善を行っている。クロマチン上に存在するFANCD2の機能解析については、まず、プロテオーム解析により、FANCD2の新規結合分子としてCtIPを同定、解析し、クロマチン上のFANCD2がCtIPをクロマチンにつなぎ止める役割を担うことを明らかにした。これらの成果は論文として発表した(Unno等、印刷中)。

また、我々の明らかにしたFANCD2のヒストンシャペロン活性は、クロマチン上に存在するFANCD2の示す新規機能であり、この活性の生理学的意義を明らかにすることが重要である。従来の研究から、クロマチン上のFANCD2には、FA経路の下流分子であるヌクレアーゼFAN1、Slx4/FANCPとその結合分子ヌクレアーゼXPF/FANCQがリクルートされることが知られている。FANCD2のヒストンシャペロン活性がこれらの下流分子を制御する可能性を検討するため、FANCD2のヒストンシャペロン活性変異体を発現させた細胞を構築し、GFPタグ付きの下流分子を導入する手順で細胞株の構築を進めており、順調に推移している。最後に、FANCD2のヒストンシャペロン活性により引き起こされるDNA損傷部位でのクロマチン動態の変化を、チミジン類似体であるEduを用いたiPOND法により検出することを試みている。DT40細胞を用い、DNA損傷に伴うFANCD2の集積を検出することに成功しており、現在、FANCD2を指標に条件検討を行っている。以上の状況から、研究はおおむね順調に進行していると判断した。1.FANCD2シャペロン活性がFA経路の下流分子に与える影響の検討クロマチン上のFANCD2に直接リクルートされるFA経路下流分子としてFAN1, Slx4, CtIPなどに注目し、現在アッセイのための細胞株構築を進めている。細胞が完成次第、フォーカス形成、クロマチン局在などの下流分子の動態を解析し、FANCD2シャペロン活性の影響を明らかにする。2.FANCD2ヒストンシャペロン活性にカップリングするクロマチン動態の解析DNA損傷に伴うDNA修復反応により新成DNA鎖領域に結合するタンパク質を解析するiPOND法を使用し、現在行っている検出条件の最適化を完了する。完了次第、ヒストン修飾タンパク質を含むDNA損傷応答・DNA修復タンパク質の集積・離脱やヒストン修飾変化の有無などの経時的変化などを解析し、DNA損傷領域やその周辺部位のクロマチン動態を明らかにする。
ヒト腎臓由来iPS細胞の細胞記憶を利用した腎臓構成細胞への特異的分化誘導法の確立

本研究にて、起源元細胞が異なる線維芽由来iPS細胞と腎臓由来iPS細胞を2つの腎系統特異的分化誘導法で比較した。いずれも腎臓由来iPS細胞は腎臓系統へ分化し易い事が明らかとなった。また各iPS細胞の包括的メチル化解析にて、新たな腎系統分化誘導関連遺伝子として、高メチル化が56個、低メチル化が17個の遺伝子を同定した。更に網羅的マイクロアレイ解析にて、それらを8個に絞り込めた。これらの遺伝子は新たな腎臓発生・再生因子として期待され、今後の様々な研究に役立つ事を願う。申請者らは独自に樹立した3種類のヒト腎上皮細胞由来、近位尿細管細胞由来、メサンギウム細胞由来のiPS細胞が正しくiPS化(初期化)されているかを検討した。ALP染色において、いずれの3種類の腎臓由来iPS細胞は線維芽由来iPS細胞と比較して大きな相違はなく染色されていた。しかし、未分化マーカー(Oct3/4、Nanog)の発現では最も腎上皮細胞由来iPS細胞が線維芽由来iPS細胞と近似した未分化能を有していた。その腎上皮細胞由来iPS細胞をSCIDマウス腹膜下へ細胞移植したところ、線維芽由来iPS細胞同様にテラトーマの形成を認め、初期化を検証できた。未分化状態における腎上皮細胞由来iPS細胞および線維芽細胞由来iPS細胞において、その包括的DNAメチル化解析で比較検討を行った結果、相違を認めた。腎臓特異的なメチル化プロファイルの解析を施行中である。各iPS細胞の分化誘導研究において、誘導剤としてエピジェネティックス制御薬、特異的腎臓誘導刺激剤を使用した。エピジェネティックス制御薬は分化誘導を促進するHDAC阻害剤(Trichostatin A)を用い、また特異的腎臓誘導刺激剤としてActivin A、CHIR99021、BMP7などを用いて、線維芽由来iPS細胞と腎上皮細胞由来iPS細胞の誘導を試みた。両分化系iPS細胞はいずれも腎臓発生マーカー(WT-1、Pax-2、Sall-1)や腎臓分化マーカー(AQP-1、Nephrin)の発現増加を認め、誘導期間によっては腎上皮細胞由来iPS細胞が優位に腎臓マーカーを高発現しているものがあった。申請者らは前年度までの研究成果より、独自に樹立した腎臓由来iPS細胞の中でも腎上皮細胞由来iPS細胞(K-iPS)が最も線維芽細胞由来iPS細胞(F-iPS)と類似した未分化能を有し、腎系統特異的分化誘導に適していると考えた。当該年度の研究では、K-iPSがF-iPSと比べDNA Methylationに相違があることを以前に見出した事より、腎臓構成細胞への分化誘導に最適であると考えた。K-iPSに既報のNature Communicationの報告に従ったアクチビン、レチノイン酸、BMP-7などでの分化誘導法と、Cell Stem Cellsの報告に従った分化誘導法とを比較しながら腎系統特異的分化誘導を目指した。更にK-iPSにEpigenetic ModificationとしてHDAC阻害剤(Trichostatin A)を処置して、Epigeneticsが分化誘導に及ぼす影響を検討した。iPS細胞への2つの腎系統特異的分化誘導法の検討に関して、既報の方法はその有効性を確認できた。更にF-iPSと比べてK-iPSを用いた方が分化誘導に優れており、腎臓発生・分化因子の発現の相違は時間経過と共にK-iPSの方が増強された。これらの事よりEpigenetic memoryを有するK-iPSの方が腎臓再生には有利に働く可能性が示唆され、DNAメチル化の相違が関係しているものと考えられた。加えてEpigenetics修飾のためHDAC阻害剤(TSA)を添加すると、いずれの腎臓発生因子の発現は増強したが、F-iPSとK-iPSを比較してその発現に相違はなかった。これらの事よりDNAコアヒストンのアセチル化による遺伝子制御が分化誘導に大きく働いるものと考えら、iPS細胞の分化誘導機構においてEpigeneticsの重要性を見出した。申請者らは前年度までの研究成果より、独自に樹立した腎上皮細胞由来iPS細胞(K-iPS)と線維芽細胞由来iPS細胞(F-iPS)を利用して、腎系統特異的分化誘導法において、既報のNature Communicationの報告に従いアクチビン、レチノイン酸、BMP-7などでの分化誘導法と、Cell Stem Cellsの報告に従った分化誘導法を検討した。結果、2つの既報の方法は、その誘導法の有効性を確認でき、またF-iPSと比べてK-iPSを用いた方が腎臓への分化誘導に優れていた。しかし、いずれも確実で、一定な腎臓分化度を示しておらず、この事象はiPS化する前の元細胞に残されたEpigenetic memoryが関与しているものと考えられた。本年度の研究は、各iPS細胞の樹立前後の細胞において、45万以上の遺伝子のDNAメチル化解析を行った。解析結果から腎上皮細胞のiPS化でメチル化変化を示さなかった腎臓細胞記憶遺伝子を同定し、更にその遺伝子の中から線維芽細胞のiPS化でメチル化変化を示した56の高メチル化遺伝子、17の低メチル化遺伝子を同定した。得られた遺伝子が、既報の発生関連遺伝子とは全く異なる腎系統への分化誘導候補遺伝子ではないかと考えた。今後、得られた候補遺伝子の発現を、包括的マイクロアレイを使ってiPS化前後、腎臓分化誘導過程で確認する。

更にマウスES細胞における候補遺伝子をCRISPR/Cas9法で欠失させ、既往の腎臓系統への分化誘導に対する影響を検討する。これまでの発生過程に順じた分化誘導法と全く異なるヒトiPS細胞における高効率な腎系統分化誘導法の確立をめざす。本研究にて、起源元細胞が異なる線維芽由来iPS細胞と腎臓由来iPS細胞を2つの腎系統特異的分化誘導法で比較した。いずれも腎臓由来iPS細胞は腎臓系統へ分化し易い事が明らかとなった。また各iPS細胞の包括的メチル化解析にて、新たな腎系統分化誘導関連遺伝子として、高メチル化が56個、低メチル化が17個の遺伝子を同定した。更に網羅的マイクロアレイ解析にて、それらを8個に絞り込めた。これらの遺伝子は新たな腎臓発生・再生因子として期待され、今後の様々な研究に役立つ事を願う。腎上皮細胞由来iPS細胞への腎系統特異的分化誘導法にて、2つの誘導法を試みており、かつ両方法とも線維芽細胞由来iPS細胞と比較、誘導期間のTime courseの検討もしている。また、2つの誘導法も時々、分化発育の遅延があり、一部変法要した誘導法となった。以上より予定していた研究に遅延を生じた。再生医学ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞(K-iPS)を使った腎系統特異的分化誘導法が、線維芽由来iPS細胞(F-iPS)と比較して腎臓分化に適していた。その理由の検索にてDNAメチレーション、メチル化プロファイルを未分化、分化K-iPS、F-iPSなどで比較検討して、腎系統への分化を規定する遺伝子群を同定する。同定した遺伝子群をsiRNAでKnockoutすることにより、ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞の腎系統へ分化誘導法の機序を解明する。次にin vivoへの応用として、処理した分化系iPS細胞を腹膜皮下、腎被膜下へ移植し、組織学的に腎系統への分化が促進されるかを評価する。in vitro内での分化誘導と違い、in vivo応用での誘導剤の量や誘導期間などの最適条件を検討する必要がある。各分化系iPS細胞移植により得られた腫瘤について、組織学的な評価(病理組織、免疫染色)および腫瘤から抽出した蛋白、RNAサンプルを用いて、腎臓発生・分化マーカーの発現をwestern blot、real time PCRなどで検出する。更により腎臓再生に向けて、細胞移植した組織に対して誘導剤の追加投与なども検討する。樹立した3種類のヒト腎上皮細胞由来、近位尿細管細胞由来、メサンギウム細胞由来のiPS細胞において未分化マーカーの検証をしたところ、正しくiPS化(初期化)されてないものもあり、iPS細胞の樹立を再度行い、時間を要した。現状において最も適した腎上皮細胞由来iPS細胞を用いて特異的腎臓誘導を試みたが、誘導剤の量や誘導時期、誘導期間などにより分化に差異を認めた。未だ腎系統特異的分化に最適な誘導法を検討中であり時間を要している。腎上皮細胞由来iPS細胞への2つの腎系統特異的分化誘導法を試したが、分化発育速度が一定しないため誘導法を一部変法した。その為、最適化な誘導法を得るために研究を繰り返し、予定していた研究が遅れた。同系統の研究が続いたため研究費が予定していた額より少なく済んだ。
間質細胞telocyteの小腸内細胞間ネットワークに関する形態学的研究

腸管粘膜内に存在する様々な間質細胞(telocyteや、より広範な細胞集団である線維芽細胞様細胞(FBLC)など)に関する組織学的解析を行い、以下の通り学会・学術雑誌等で公表した。2回腸パイエル板において、円蓋域の間質系の細胞がRANKLを発現し、M細胞の分化に必要であると考えられる「上皮細胞のアポトーシスの抑制」に貢献している可能性を見出した(Yuasa et al., 2017, J. Vet. Med. Sci.).4間質系の細胞は免疫担当細胞の局在の制御にも重要であることが想定されるため、リンパ球の動態に関する研究も実施した。その結果、小腸内における常在細菌の腸絨毛間隙への侵入に伴い、様々なリンパ球の局在が変動することを見出した(Yuasa et al., 2019, J. Vet. Med. Sci.)。5小腸粘膜内の様々な上皮下FBLCに神経線維が投射することを明らかにするとともに(Mantani et al., 2019, J. Vet. Med. Sci.)、その神経線維に含まれる神経伝達物質の詳細を免疫組織化学的に明らかにした(第161回日本獣医学会学術集会などにて公表)。本年度はラットを実験モデルとして用い,小腸telocyteによって構成される細胞間ネットワークの解明を目標とし,小腸telocyteの同定方法の検証やこれに関連してtelocyte以外の間質細胞の局在や上皮との関連などに関する研究を行った.その結果,得られた成果の概要は次のとおりである.1回腸一般粘膜のtelocyteがCD34+CD31-を示す間質細胞として同定可能である可能性を明らかにするとともに,代表的な上皮下間質細胞であるα-smooth muscle actin(α-SMA)陽性の筋線維芽細胞が腸陰窩側面の上皮下に,c-kit+を示すCajal介在細胞(ICC)が神経叢や筋層に局在する一方で,CD34+CD31-間質細胞が腸陰窩底部の上皮下や粘膜下組織,筋層を含めて広範囲に局在することを明らかにし,学会公表を行った(第159回日本獣医学会学術集会).2小腸の一般粘膜の腸陰窩と,パイエル板リンパ小節近傍の腸陰窩を比較すると,リンパ小節近傍の腸陰窩周囲ではCD34+CD31-を示す間質細胞およびICCはみとめられない一方で,同腸陰窩の底部から側面にわたってα-SMA陽性の筋線維芽細胞が局在することから,小腸の一般粘膜とリンパ小節では腸陰窩周囲の間質細胞の種類が異なることを明らかにし,学会公表を行った(第92回日本解剖学会近畿支部学術集会).3回腸パイエル板では一般粘膜とは異なり濾胞被蓋上皮(FAE)に特有のM細胞の分化が起こることが知られている.そこでM細胞の分化に必要であるとされるRANK-RANKLの局在を調べたところ,FAE直下の間質細胞がRANKLを発現していたが,RANKLの局在とFAEで陽性を示すRANKの局在が対応する部位が常在細菌増殖に伴うM細胞の分化促進の位置とは対応しないことから,RANK-RANKLシグナルが常在細菌によるM細胞の分化促進の誘導には直接関与しない可能性を明らかにし,学会公表を行った(第159回日本獣医学会学術集会).本年度はラットの回腸を実験モデルとしてtelocyteで検出される細胞マーカーの同定方法の検証を中心に実績を上げることができ,従来着目されてきた間質細胞との関係やそれぞれの間質細胞の組織学的局在の差異を明らかにできた.また未だ公表には至っていないものの,telocyteを含めた種々の粘膜固有層中の細胞の細胞間ネットワークについて三次元的な超微形態学解析を行うために,Serial Block face-SEM(SBF-SEM)による回腸粘膜の断層撮影像の取得を行うことができた.得られたデータは現在解析中で,今後三次元構築を行ったうえで順次公表する予定である.本年度は以下の通り前年度学術集会で公表した内容の一部を投稿論文にて公表するとともに,学会公表を行なった。1小腸のPaneth細胞による常在細菌に対する生体防御応答の誘導機構に関して,粘膜固有層内の細胞群の関与を超微形態学的に精査した。その結果,一部のPaneth細胞が基底側に細胞突起を伸長すること,telocyteに相当する間質細胞がこの細胞突起と接触することでPaneth細胞の活動に影響を及ぼす可能性を明らかにした。またこの細胞がCD34+CD31-PDGFRα-αSMA-のphenotypeを示す細胞群である可能性を明らかにした(Mantani et al., 2018)。2回腸パイエル板の濾胞被蓋上皮に存在する特殊な上皮細胞-M細胞の分化機構について調べた結果,従来M細胞の分化に必須であるとされてきたRANK-RANKLシグナルがM細胞の分化に必要な上皮細胞のアポトーシスの抑制に貢献している可能性を明らかにした(Yuasa et al., 2018).3ラットの回腸腸陰窩周囲に存在する間質細胞群をSerial Block face-SEM(SBF-SEM)を用いて三次元超微形態学的に分類するとともに,このSBF-SEMによる解析は結合組織内における複雑な細胞集団の中で形成される細胞間ネットワークの解析に非常に有用であることも明らかにした。(第160回日本獣医学会学術集会,第93回日本解剖学会近畿支部学術集会にて学会公表)

4これまで小腸を実験モデルとして実施してきた研究を大腸にも展開し,大腸各部位(盲腸,上行結腸,下行結腸,直腸)における上皮下間質細胞を免疫組織化学的に解析した。その結果,小腸,大腸各部位でLP内に存在する間質細胞の種類や局在には部位差が存在することを明らかにした(第93回日本解剖学会近畿支部学術集会にて学会公表)。本年度はラットの回腸におけるSBF-SEMによる三次元超微形態学的解析を実施した。その結果,このSBF-SEMによる解析は間質細胞のような形態の複雑な細胞種の分類に非常に有用であること,加えて1つ1つの細胞が形成する細胞間ネットワークの全容の解析に有用であることを見出した。このため,研究開始当初はtelocyteに焦点を絞った研究を展開することを予定していたが,telocyteを含めた間質細胞群全てを研究対象にすることに変更した。これに伴い,三次元解析の対象箇所も腸陰窩周囲を当初予定していたが,解析範囲を拡張し,本年度は回腸粘膜全体の断層撮影を実施することができた。三次元再構成による解析は現在進行中であるが,得られた成果は研究計画当初想定していた以上であり,来年度の論文公表を予定している。加えて,昨年度より実施してきた細胞マーカーによる間質細胞の分類については,ラットの回腸の上皮下間質細胞を実験モデルに3種類のphenotypeに分類されることを明らかにでき,学術誌に投稿済みである(Mantani et al., 2018, Anat. Rec.)。これに加えて,SBF-SEMによる解析の情報を元にtelocyteを含む上皮下間質細胞に限らず他の間質細胞群の細胞マーカーによる同定方法についても解析を進めている。これらの成果をもとに,研究計画当初解析を予定していた小腸粘膜だけでなく,解析対象を腸管全長に変更し,腸管各部位に局在する「間質細胞の部位差」という観点からも間質細胞の細胞集団の実態解明を行なうことができた。この成果についても現在投稿論文を執筆中である。なお,細胞単離などを用いた新たな細胞マーカーの開発については次年度に実施する予定である。腸管粘膜内に存在する様々な間質細胞(telocyteや、より広範な細胞集団である線維芽細胞様細胞(FBLC)など)に関する組織学的解析を行い、以下の通り学会・学術雑誌等で公表した。2回腸パイエル板において、円蓋域の間質系の細胞がRANKLを発現し、M細胞の分化に必要であると考えられる「上皮細胞のアポトーシスの抑制」に貢献している可能性を見出した(Yuasa et al., 2017, J. Vet. Med. Sci.).4間質系の細胞は免疫担当細胞の局在の制御にも重要であることが想定されるため、リンパ球の動態に関する研究も実施した。その結果、小腸内における常在細菌の腸絨毛間隙への侵入に伴い、様々なリンパ球の局在が変動することを見出した(Yuasa et al., 2019, J. Vet. Med. Sci.)。5小腸粘膜内の様々な上皮下FBLCに神経線維が投射することを明らかにするとともに(Mantani et al., 2019, J. Vet. Med. Sci.)、その神経線維に含まれる神経伝達物質の詳細を免疫組織化学的に明らかにした(第161回日本獣医学会学術集会などにて公表)。
利用者の意思に基づいた救助支援型担架システムの研究開発

我々は地下街や駅で迅速安全に救助が行える救助支援型担架システムの研究開発を行う.担架システムは,消防隊員の救助活動時の負担を軽減させるものである.階段昇降の機構を考察し,最後に実験によって担架システムの有効性を検証する.我々は地下街や駅で迅速安全に救助が行える救助支援型担架システムの研究開発を行う.担架システムは,消防隊員の救助活動時の負担を軽減させるものである.階段昇降の機構を考察し,最後に実験によって担架システムの有効性を検証する.過去に製作した担架機構をベースに,下部に移動用のクローラ機構を取り付け,それを2台連結させることで,担架システムのベースを製作した.当初3台のクローラ機構を連結させる予定であったが,階段での昇降と駆動の出力を検討した結果,クローラ機構は2台が適切であると判断し,2台と担架機構のみの結合とすることとした.そして,担架システムを用いて「要救助者を持ち上げることなく担架へ乗せる」という機能の確認,および担架システムの移動機構に対する性能評価を行った.担架の操縦系は,昨年度に比べ高出力の電子部品を採用し,移動用にスイッチを2つ,担架ベルトの回転にスイッチを1つ(計3つ)というシンプルさを保ちつつ高出力なものに改良した.また,担架システムは,複数台のクローラを連結したものとなるため,操作が非常に複雑となる.その複雑となる操作系を直感的に操作できるよう,担架に接続したレバー操作に応じた動作が行えるような操作システムのシミュレータを構築し実機に実装した.レバー操作に見立てた,乗用車のハンドル・アクセル・ブレーキからの入力に応じて多連結のクローラが操作できることを実機(ハードの製作が遅れたため別の多連結クローラ)において確認レた.製作した担架システムを用いて,実際に要救助者を担架に乗せることができるか(担架ロボットを体の下に潜り込ませることができるか)について確認した.その結果,要救助者の体の下に潜り込むことができるということが確認できた.また定性的ではあるが,要救助者を乗せた状態で駆動用のクローラを回転させることで搬送時の負担が軽減されることが確認できた.今回の実験では,要救助者の体の下に潜り込むまでに平均で20[sec]程度要した.過去に製作した担架機構を参考に,階段昇降機能を付加した担架システムを製作した.そして,担架システムを用いて「要救助者を持ち上げることなく担架へ乗せる」という機能の再確認,および「階段の昇降」に対する性能評価を行った.また,「利用者の意志に基づいた直感的な操作が行えるシステム」の準備として操作システムの簡易版を製作した.これは,担架システムが複数台のクローラを連結したものとなるため,操作が非常に複雑となる.その複雑となる操作系を直感的に操作できるよう,担架に接続したレバー操作に応じた動作が行えるシステムである.今年度は,実験的に,多連結のクローラではなく,車輪移動ロボットを用いて操作性に対する確認を行う.製作した担架システムを用いて,実際に要救助者を担架に乗せることができるか(担架ロボットを体の下に潜り込ませることができるか)について確認した.過去の実績からも,問題なく要救助者の体の下に潜り込むことができるということが確認できた.また,階段の昇降実験を行った結果,安全性の面で実際の人を乗せずに実験を行ったが, 40kgf程度の重量物を乗せた状態で階段の昇降が行える事が確認できた.その際,従来だと発生していた階段の昇降時における操作者にかかる負担もクローラのパワーアシスト効果により軽減されていることがわかった.また,レバー操作(人の意志に見立てた)に応じて移動ロボットを直感的に操縦できるかという実験においても,複数人の被験者のコメントより概ね操縦しやすいとの回答を得ることができた.昨年度製作した階段昇降機能を付加した担架システムを参考に,より小型・軽量化を実現した担架システムを製作した.そして,担架システムを用いて「要救助者を持ち上げることなく担架へ乗せる」という機能の再確認,および「階段の昇降」に対する性能評価を行った.また,「利用者の意思に基づいた直感的な操作が行えるシステム」として操作システムの簡易版を製作した.これは,担架システムが複数台のクローラを連結しだものとなるため,操作が非常に複雑となる.その複雑となる操作系を直感的に操作できるよう,担架に接続したレバー操作に応じた動作が行えるシステムである.しかし,最終的にはクローラの操作は,階段昇降の際の直進動作のみであったため,操作システムは不要となった.しかし,システムとしては構築できたため,今後違った現場で利用できると考える.製作した担架システムを用いて,実際に要救助者を担架に乗せることができるか(担架ロボットを体の下に潜り込ませることができるか)について確認した.過去の実績からも,問題なく要救助者の体の下に潜り込むことができるということが確認できた.また,階段の昇降実験を行った結果,安全性の面で実際の人を乗せずに実験を行ったが,40kgf程度の重量物を乗せた状態で階段の昇降が行える事が確認できた.その際,従来だと発生していた階段の昇降時における操作者にかかる負担もクローラのパワーアシスト効果により軽減されていることがわかった.これらの性能を実現しつつ,昨年度の35[kgf]から21[kgf]へと大幅に軽量化を行うことができ,隊員が現場へ担いで搬送することが可能なレベルとなった.
超高感度磁気センサを用いた細胞膜電位計測システムの構築

自発的な収縮が有り比較的に計測が行いやすい心筋細胞(ラット)を用いて磁気信号の計測技術確立を中心に研究を進めた。これまでのパイロット実験では、数十ミクロンサイズの心筋培養細胞から、活動電位変化に起因する200pT(10^<-12>テスラ)程度の信号が得られていたが、大抵の場合は信号強度がその1/101/100であり、信号が小さすぎて検出できないこともあった。これを高感度で検出するためには細胞の電流の向きと磁気センサの相対位置の検討をおこなった。電磁解析シミュレーションによって最も感度が高くなるような細胞形状とセンサの位置関係を検討した結果、細胞を培養ディッシュ内で縦方向に置いて培養することが必要となった。縦方向の培養を試みたが、細胞が定着せず、この方法はうまくいかなかった。昨年、センサの形状の検討を行い、マルチチャンネルタイプのSQUID(3ch)を新規に開発、設計試作し、これを用いて10dayラットの心臓片からの磁気計測を行うことができた。H18年度は3chで位置分解能が優れた1mm×1mmのSQUIDを試作し、特性評価を行った。その結果、0.01mm2の有効捕獲面積を得られ、従来の0.1×0.1mm2の約2倍の大きさを得ることができた。また、試作したSQUIDのホワイトノイズレベルは約5pT/Hz1/2であった。これはこれまで作製してきたSQUIDの約半分であり、感度が約2倍向上したことを示している。しかし、残念ながら、細胞からの信号を計測するには至らなかった。さらに磁場分解能と、位置分解能の最適化が必要と思われる。また、センサの形状の検討を行い、マルチチャンネルタイプのSQUID(3ch)を新規に開発、設計試作した。これを用いて10dayラットの心臓片からの磁気計測を行うことができた。
光ファイバを用いた位相感応無雑音光増幅器の研究

複素振幅の実部に利得を有し,他方,虚部を減衰させる増幅器では,無雑音(雑音指数0dB)の増幅が可能となる。このような光増幅器は,位相感応光増幅器としてその存在が知られている。本研究は,光ファイバ型2ポンプ縮退パラメトリック光増幅を用いた位相感応光増幅器の原理検証を行うことを目的とする。石英ガラス分散シフト高非線形ファイバ(HNL-DSF)を用いた光ファイバ型2ポンプ縮退パラメトリック光増幅器の動作解析を行った。数値解析により,信号光周波数での分散を抑えるが逆に分散スロープ値は大きくし,さらにポンプ光周波数I間隔を広げることにより,パラメトリック利得を増大させることが可能との知見を得た。この設計に基づき,パラメトリック増幅用光回路を試作した。搬送波に位相変調(PM)を加え,変調サイドバンドにより位相同期したポンプ光を発生させている。搬送波を信号光として,2つのポンプ光によりパラメトリック利得の発生を試みた。変調周波数の制限により,十分なパラメトリック利得を得ることには成功していないが,今後光コム発生器を用いてポンプ光周波数間隔を拡大することにより,パラメトリック利得特性の改善を試みる。現在実用化されている光ファイバ通信システムでは,エルビウム添加光ファイバ増幅器(EDFA)が実用化されている。EDFAは所謂レーザ増幅器であり,光複素振幅の実部と虚部に対して等しい利得を有する。しかし,これらに対応する量子力学的演算子は非可換であるため,不確定性原理による制約から3dBの雑音指数が不可避となる。これに対して,複素振幅の実部に利得を有し,他方,虚部を減衰させる増幅器では,無雑音(雑音指数0dB)の増幅が可能となる。本研究は,光ファイバ通信システムに導入可能な新しい構成の位相感応光増幅器の原理検証を行うことを目的とする。今年度は,提案する光ファイバ型2ポンプ縮退パラメトリック光増幅器の動作解析を行った。光ファイバには,石英ガラス分散シフト高非線形ファイバ(HNL-DSF)を仮定している。設計パラメータは,ファイバ長I,周波数ωpでの分散値D,分散スロープdD/dλ,ポンプ光1,2の間の周波数間隔ωp、-ωp2,ポンプ光パワーPsである。数値解析により,パラメトリック利得を最大化する条件を探索し,分散スロープおよび周波数間隔ωp1-ω2を大きくとることが有効であることがわかった。さらに,2つのポンプ光と信号光を位相同期させる手法に関して,設計を行った。
古典期マヤ文明の盛衰や崩壊に周縁部の2次センターがはたした役割に関する研究

古代マヤ文明のこれまでの研究動向は、都市国家の中心部にあたる大遺跡(1次センター)の調査・研究に著しく偏っており、その文明史観も中心部の1次センターからのものであった。その一方で、都市国家を形成していた周縁部の2次センターにおける調査研究は、大幅な遅れを取っているのが実情である。本研究は、このような研究動向の中で、古典期マヤ文明の代表的な1次センターである南東部のコパンの周縁に位置する2次センターの調査によって得られた1次資料を分析・比較検究することを通して、コパン地方国家の盛衰やこの地域における古典期マヤ文明崩壊の問題にこれら2次センターが果たした役割を解明しようとするものである。本年度の調査研究は、主に周縁の地方国家形成時の資料に焦点をあて、コパン地方国家の代表的な周縁2次センターの一つであるエル・プエンテ遺跡の建造物10番、11番出土の土器資料を中心に分析・検討を行なった。その結果、従来の放射性炭素年代測定値と建造物1番出土土器による地方国家形成年代が裏づけられるとともに、その時期の中心である王都と周縁である2次センターの間の相互関係に関する重要な示唆が土器の上から得られている。このような示唆をより確たるものとするために、土器胎土の理化学分析を行なう必要性があることも確認されており、来年度以降の重要な課題となっている。
Aggresomeの構成成分であるリン酸化αBクリスタリンの生理的・病理的意義

平成13年度の研究成果。(1)ヒトグリオーマ細胞U373MGは恒常的にαBクリスタリンとHsp27が高いレベルで発現している。この細胞にプロテアゾーム阻害剤であるMG-132あるいはラクタチスチンを曝露すると、両分子シャペロンの合成の誘導と、分子内セリン残基のリン酸化ご促進され、それらはとくに不溶性分画に蓄積し、形態学的には核周辺部にアグリゾームと思われる封入体が形成され、その構成成分として、両シャペロンおよびそのリン酸化型とともに、ビメンチン、ユビキチン、プロテアゾーム、βチュブリンが検出された。微小管脱重合促進剤であるノコダゾールを共存させるとアグリゾームの形成は阻止されたが、両シャペロンの合成の誘導、不溶性分画への蓄積、リン酸化の促進は影響を受けなかった。また、リン酸化の促進は、p44/42MAPKおよびp38MAPKカスケードの高進に起因し、その阻害剤であるSB203580またはPD169316によって両シャペロンのリン酸化は阻止された。しかし、合成の誘導と不溶性分画への蓄積とアグリゾーム形成は影響を受けなかった。すなわち、アグリゾーム形成にはリン酸化は無関係であることが明らかになった。HeLa細胞でも、MG-132処理により、Hsp27を含んだアグリゾームの形成が認められた。また、NG108-15細胞に、cystic fibrosisの病因遺伝子を発現させると、αBクリスタリンを含んだアグリゾームの形成が観察された。以上の結果より、αBクリスタリンとHsp27が細胞内蛋白質の品質の管理に関与していることが示唆されるが、それらのリン酸化の意義は不明である(2)後肢懸垂によって誘導した廃用萎縮ラットヒラメ筋でのαBクリスタリンとHsp27の応答は、上記の培養細胞系でのプロテアゾーム阻害剤曝露時の応答と極似していた。しかも、懸垂中に坐活神経を片側切断すると、切断側の応答が直ちに消滅することから、これらの応答が神経支配を受けていることが明らかになった。
オレキシンによる脳幹呼吸調節機構の修飾作用ー幼若動物と成熟動物との比較検討ー

覚醒・睡眠状態によって変化する呼吸の調節機構を理解するために、オレキシンが呼吸および気道の開通性を調節する神経路にいかに作用しているかを形態学的に解析した。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)成獣ラットでは、オレキシンは、腹側呼吸ニューロン群吻側部(rVRG)、横隔神経核および舌下神経核へ投射する結合腕傍核ニューロンにオレキシンレセプター2を介して作用し、呼吸の促進およびそれに伴う気道の確保を引き起こす。(2)新生児ラットにおいて、オレキシン含有線維とrVRG投射ニューロンの分布が結合腕傍核で一致し、オレキシンBの結合腕傍核への注入によって呼吸頻度の増大が引き起こされる。本研究では、覚醒・睡眠状態によって変化する呼吸の調節機構を理解するために、覚醒・睡眠の制御ペプチドであるオレキシンが呼吸および気道の開通性を調節する神経路に如何に作用しているかを、機能形態学的立場から追求することを目的とした。平成25年度は、横隔神経核や腹側呼吸性ニューロン群吻側部あるいは舌下神経核に投射する結合腕傍核ニューロンとオレキシン神経終末の間に形成されるシナプスを電子顕微鏡下で解析した。成獣ラットのKolliker-Fuse (KF)核に観察されたオレキシン陽性神経終末には、多くの大型の芯有シナプス小胞を含むものや、それと同時に小型の球形のシナプス小胞を含むものが認められた。それらの神経終末と結合腕傍核ニューロンの細胞体や樹状突起の間に形成されるシナプスのほとんどは非対称性であることが観察された。また、いくつかのオレキシン陽性神経終末は、フルオロゴールドで標識された横隔神経核や腹側呼吸性ニューロン群吻側部あるいは舌下神経核へ投射するKFニューロンとシナプスを形成することが観察された。また、結合腕傍核に多くのオレキシンレセプター2の発現が免疫組織化学的に認められた。次に新生児期の結合腕傍核におけるオレキシン陽性神経線維の分布を解析した。新生児期は上小脳脚の発達が弱いため、成獣と同様な細胞構築が困難である。そこで、まず新生児期の結合腕傍核の同定を結合腕傍核のマーカー蛋白となるFoxP2に対する免疫組織化学およびrVRG投射ニューロンの分布を解析することにより行った。この結果を用いることにより、新生児期においてもオレキシン陽性線維が結合腕傍核に分布することを確認した。これらの結果から、睡眠・覚醒状態を制御するオレキシンの呼吸調節における作働経路の一端が解明できたと考えられる。本研究では、覚醒・睡眠状態によって変化する呼吸の調節機構を理解するために、覚醒・睡眠の制御ペプチドであるオレキシンが呼吸および気道の開通性を調節する神経路に如何に作用しているのかを、機能形態学的立場から追求することを目的とした。平成24年度は、橋の呼吸調節中枢である結合腕傍核において、横隔神経核(PhN)や腹側呼吸性ニューロン群吻側部(rVRG)、あるいは舌下神経核(HGN)に投射する各ニューロンと、オレキシン神経終末との接合様態を光顕レベルで詳細に解析した。実験では、成獣ラットのPhNやrVRGあるいはHGNに逆行性標識物質であるフルオロゴールド(FG)を注入し、免疫組織化学的にオレキシン含有神経終末を検出後、同一標本でFG標識ニューロンを免疫組織化学によって検出した。その結果、結合腕傍核においてオレキシン含有神経終末の密な分布が認められ、その分布領域はPhNやrVRGあるいはHGNへ投射するニューロンの分布と一致することが認められた。この領域内では、オレキシン含有神経終末が、PhNやrVRGあるいはHGNへ投射するニューロンに近接する像を観察した。また、生後5日令の幼若動物においても結合腕傍核相当領域にオレキシン含有神経終末が認められた。平成25年度はこれらオレキシン含有神経終末とPhNやrVRGおよびHGN投射結合腕傍核ニューロンとの間に形成されるシナプスを電顕下で解析するとともに、幼若動物においても同様の解析を行う予定である。本研究では、覚醒・睡眠の制御ペプチドであるオレキシンが呼吸および気道の開通性を調節する神経路に如何に作用しているかについて機能形態学的立場から追求することを目的とした。平成26年度は、成獣ラットの呼吸関連領域へ投射するKolliker-Fuse核(KF)ニューロンと接合するオレキシン陽性終末を電子顕微鏡下で詳細に解析した。その結果、オレキシン陽性終末は、腹側呼吸ニューロン群吻側部(rVRG)へ投射するKFニューロンの細胞体および樹状突起の間に、また、横隔神経核(PhN)および舌下神経核(HGN)へ投射するKFニューロンの樹状突起の間にシナプスを形成していた。