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低融点アルカリ金属溶融塩のリチウム二次電池用電解液特性の解明

アルカリ金属溶融塩は難燃性、難揮発性と電解液に適した性質を持つが、一般に融点が200°C以上であり室温域では使用できない。しかしながら非対称アミドアニオンのアルカリ金属塩は融点が100°C以下と特異的に低く、新規な室温域の溶融塩となる可能性を持つ。本研究ではこの溶融塩を用いた溶融塩リチウム二次電池の構築を目的として、この低融点塩をベースにした溶融塩のリチウム二次電池用電解液特性を検討した。溶融塩のレート特性の特異性について検討した結果、充放電においては電解質や電極固相内ではなくリチウム金属の界面でリチウムイオン移動が律速になっており、それが溶融塩のレート特性の要因である可能性が高いことが分かった。申請者が100°Cで溶融することを見出した[(FSO2)(CF3SO2)N]ー(以後C0C1と略する)のリチウム塩をベースに室温近傍(33°C)に融点を持つカチオン混合溶融塩Li[C0C1]-Cs[C0C1]を調製した。これは公知のアルカリ金属溶融塩の中では最も融点が低い。これはその融点の低さからゼロソルベントのリチウム二次電池用電解液として用いることができ、一般の室温用電解液と同様に合材電極とも組み合わせて45°Cから100°C以上の広い温度域で充放電が可能であることが分かった。有機溶媒、イオン液体などの一般にリチウム塩を溶解させる室温液体を用いていないことから、この溶融塩は非常に粘度が高く、また一方でイオン伝導率は低い(一般のリチウム二次電池用電解液と比べて粘性は10000倍でイオン伝導率は100分の1)。しかしながら、リチウム金属負極、リチウム二次電池用合材正極であるLiCoO2やLiFePO4と組み合わせてリチウム二次電池を構築して電池試験を行った結果、同条件の有機電解液の電池よりも高いレート特性を示した。この原因を調べるため電気化学交流インピーダンス測定を行ったところ、溶融塩は電極との界面の抵抗が有機電解液よりも小さいことが分かった。また、溶融塩のリチウムイオン濃度が高いことも原因であると考えられる。さらに溶融塩はゼロソルベントであることから蒸気圧が低く、充放電サイクル試験においても有機電解液よりも高い容量を長サイクル維持した。このように、低融点リチウム塩を起点とした室温域アルカリ金属溶融塩は難燃性で優れた電池特性を示し、高安全、高エネルギー密度の電解液として期待できる。平成25年度はこれらの内容について1報の論文発表を行った。電解液は低粘度、高伝導率なものほど実際の電池において優れた性能を示すとされるが、前年度で室温域まで低融点化したアルカリ金属溶融塩が有機電解液の100010000倍の粘性にもかかわらず、有機電解液と同等以上のレート特性を示すことを報告した。この特異性を明らかにするため、アルカリ金属溶融塩と有機電解液、およびイオン液体電解液(有機イオンから構成される室温液体にリチウム塩を添加したものについてリチウム金属と合剤正極それぞれの電極-電解液界面の抵抗を電気化学交流インピーダンス法で測定したところ、リチウム金属に対してはそれぞれの電解液はほぼ同等、正極においては若干ながらアルカリ金属溶融塩が最も小さいという結果が得られた。界面抵抗も電解液の粘度が高いほど大きくなる傾向があるため、この溶融塩の結果は電池のレート特性と同様に特異である。この内容について1件の学会発表を行った。また、リチウムイオン電池の負極として実用化されている炭素負極もこの溶融塩中で安定に作動することを確認した。これまで炭素負極は電解液に固体電解質被膜を形成する添加剤(実用化されている有機電解液には含まれている)がなければ機能しないことが知られており、イオン液体電解液でも機能しないことが報告されている。前述の粘度に反して界面抵抗が低いことも併せて考えると、アルカリ金属溶融塩は有機溶媒や有機カチオンを含まないことから既存の電解液とは異なる固体電解質被膜を形成している可能性がある。この内容について1件の国際学会の発表と1報の論文発表を行った。また、基礎研究として低融点アルカリ金属溶融塩中におけるアルカリ金属の析出試験を行い、1件の国際学会の発表と1報の論文発表を行った。また、本研究を含めた低融点アルカリ金属溶融塩塩の合成から物性、リチウム二次電池用電解質への応用について1件の依頼講演と1報の総説発表を行った。リチウムイオン電池の電解液は粘度が低いほど、またイオン伝導率が高いほど優れた電池性能を示すとされている。しかしながら本申請者が前年度までに報告したように、低融点リチウム塩を用いたアルカリ金属溶融塩は粘度が1000倍以上、有機電解液の100分の1以下のイオン伝導率であるにもかかわらず有機電解液とほぼ同等のレート特性を示す。本申請者はこの溶融塩を電解液に用いたリチウム二次電池について研究を行っている。昨年度よりこの溶融塩のレート特性の特異性の要因について、電極-電解液界面に着目し、界面抵抗をインピーダンス測定し、一般的な有機電解液やイオン液体電解液と比較した。本年度は合剤電極粒子固相内のリチウムイオン拡散に着目し、サイクリックボルタメトリーにより拡散係数の測定を行った。結果、有機電解液と比べて拡散係数は若干小さく、レート特性が高い要因でないことが分かった。

従って、現状ではレート特性が高い要因としては、昨年度に測定したリチウム金属に対する界面抵抗が他の電解液より小さいことが最も可能性が高いと考えられる。この内容について1件の国内学会発表を行った。また、基礎研究としてアルカリ金属溶融塩中におけるアルカリ金属の析出試験について、前年度の二極式セルでの電位が不明瞭である問題を解決するため三極式で参照極にリチウム金属およびナトリウム金属を使用して測定した。アルカリ金属溶融塩は難燃性、難揮発性と電解液に適した性質を持つが、一般に融点が200°C以上であり室温域では使用できない。しかしながら非対称アミドアニオンのアルカリ金属塩は融点が100°C以下と特異的に低く、新規な室温域の溶融塩となる可能性を持つ。本研究ではこの溶融塩を用いた溶融塩リチウム二次電池の構築を目的として、この低融点塩をベースにした溶融塩のリチウム二次電池用電解液特性を検討した。溶融塩のレート特性の特異性について検討した結果、充放電においては電解質や電極固相内ではなくリチウム金属の界面でリチウムイオン移動が律速になっており、それが溶融塩のレート特性の要因である可能性が高いことが分かった。前年度に報告した室温域アルカリ金属溶融塩の優れたレート特性の解明のために電極-電解液界面の抵抗の測定と既存の有機電解液、イオン液体電解液と比較を行い、溶融塩の特異性を明らかにした。また、炭素負極もこの溶融塩中で問題なく作動することを確認した。このように、低融点アルカリ金属溶融塩は既存の電極をそのまま組み合わせることができ、有機電解液よりも安定かつ高いレート特性を示すリチウムイオン電池用電解液として期待できることが分かった。溶融塩化学上述したアルカリ金属溶融塩とリチウム金属および電池用合剤電極の界面の特異性を明らかにするためには、電池試験後の電極を解体・回収して表面を分析する必要がある。電解液の粘性が非常に高く、また吸湿性も高いため、電極を破壊せずに解体するのが困難であるが、不活性雰囲気を維持しつつX線回折分析などの表面分析を行う予定である。一方で、前年度で予定していたリチウム塩のみのアニオン混合による室温域溶融塩の調製と電池試験は、融点や導電率について電解液の最適化の検討を続ける予定である。過去の溶融塩を用いたリチウム二次電池は溶融塩の融点の高さから100°C以上で作動させる必要があったが、我々は低融点アルカリ金属溶融塩を調製し、それを用いて室温近傍で作動させることができた。室温域溶融塩は従来の溶融塩の難燃性、低揮発性に加えて室温域でしようできることから有機電解液と同様の取り扱い性を獲得しており、リチウム金属や室温用合剤電極とも組み合わせることが可能である。また、イオン液体電解液と比べてアルカリ金属溶融塩は有機カチオンを含まないためそれの熱・電気化学的安定性を考慮する必要がなく、非常にシンプルかつ安定性の高い構成である。H25年度はこのような低融点溶融塩の調製、その物理化学・電気化学的性質の測定、リチウム二次電池を構築しての電池試験を行い、2件の学会発表と1報の論文発表を行った。平成26年6月、アルカリ金属溶融塩の電気化学安定性を調べるために白金と銀を不活性ガス雰囲気で密閉した二極式セルでサイクリックボルタメトリーを行ったが、当初の予想に反し、銀を対極と参照極の兼用では安定に電位が取れないことが分かった。三極式セルで再度試験を行う必要が生じた。その後(およそ12月まで)三極式セルで試験を行ったが密閉性が悪く、密閉セルを用いずに不活性雰囲気で直接試験を行う必要が生じた。
九州を中心とする仏涅槃図の基礎的研究

一昨年度、昨年度と産前産後休暇および育児休暇のため研究を中断していた。一昨年度、昨年度と産前産後休暇および育児休暇を取得し育児に専念していたため。一昨年度および昨年度遂行予定であった研究を進める。また最終年度となるため、論文執筆や発表に向けての準備を行う。本研究は涅槃図の総合的研究という長期的な視野に立ち、九州所在の涅槃図を調査し、他地域の涅槃図と比較検討することにより地域的特徴の解明にも挑むものである。昨年度は当該研究の初年度として、1)鹿児島県の涅槃図の実地調査、2)典拠となるテキストの考察、3)九州にある涅槃図の情報収集などを行った。鹿児島では大乗院(鹿児島市)伝来の釈迦八相図を調査した。これは釈迦の生涯を描いた仏伝図で明時代の制作とされるが、明時代のどこに位置付けるかは研究者間で意見が分かれているが明代絵画との詳細な比較の必要性を感じた。全13幅のうち、第9幅については島津義久が国分・龍昌寺に寄進したものを大乗院に移したことが付属資料より判明しているが、この伝承についても改めての考察が必要で。また黎明館の研究員より鹿児島県内の作品についての情報が得られた。また、京都国立博物館所蔵『釈迦金棺出現図』の典拠となるテキストについての考察を行った。この作品は平安時代の制作とみられ、釈迦が涅槃に入ってまもなく、実母である摩耶夫人のため棺から起き上がり説法するという劇的な母子再会の場面とともに、鍛冶工純陀が釈迦に最後の供養をおこなう場面が描かれた涅槃図の変化形とも言える作品である。しかし、従来典拠とされてきた『摩訶摩耶経』や『仏母経』に純陀の供養に関する記述はなかった。そこで金棺出現と純陀の供養をつなぐテキストの探索を行い、敦煌周辺において発見されている『仏母経』、また元時代に成立した『勅修百丈清規』に両者をつなぐ痕跡が見られることを明らかにした。この成果については当該年度に学会発表を終えた。九州国立博物館の『大涅槃展』に伴い行われた「中世絵画史研究会」において九州の若手研究者と交流し新たな情報や協力を得られた。また展覧会に於いては調査予定であった涅槃図数点をまとめて観る機会を得た。平成27年2月1日平成28年4月21日。理由:産前産後の休暇又は育児休業平成27年2月1日平成28年4月21日の間、産前産後の休暇および育児休業を取得したため。涅槃図の総合的研究という長期的視野に立ち、九州所在の仏涅槃図の調査を行い地域性の解明に挑む2年目にあたる。今年度は特に福岡県内を中心に仏涅槃図の調査を行った。研究実績の概要は主に下記の通り。1)福岡・開善寺に室町時代(15世紀)の仏涅槃図を発見した。畳秀山開善寺は14世紀に信濃の守護小笠原氏が開創した妙心寺派の寺院である。藩主の小笠原氏が江戸時代初期に小倉に転封されたことにより小倉・馬借町に同名の寺院が開創された(現在は小倉南区湯川に移転)。当該作品はこの小倉・開善寺に伝来したもので、これまで未調査であった。本図は平成28年秋に小倉城庭園の企画展「小笠原家と開善寺」で急遽初公開されたが、この時、本格調査などが未完であり、展示後に再調査を行った。本研究終了時までに調査の成果を論文等で公表する予定である。2)福岡県内の調査を進める中で、地域に残る中世の仏涅槃図を江戸時代に写した事例、具体的には、福岡・東長寺本、福岡・善導寺の仏涅槃図の江戸時代の写本が発見された。大分でも宇佐・大楽寺本について同じような事例が報告されており、江戸時代の地方絵師の絵画学習などにも示唆を与えるもので、仏涅槃図の図様の伝播と地域性の問題を表すトピックになると考える。次年度以降の新たな研究課題としたい。3)鹿児島・興善寺旧蔵の清時代の仏涅槃図(福岡市博物館所蔵)の調査を行った。本図は福州を中心に活躍した中国人画家で、琉球画壇に多大な影響を与えた孫億(1638-1712)の作品。長崎・崇福寺所蔵で万暦38年(1610)の作である同じく福州の出身呉彬の仏涅槃図に通じる点があり、当時福建では孫億の描いたような仏涅槃図がプロトタイプとして確立していた可能性があると考えられた。ま中国の仏涅槃図の作例は多くはないが、次年度以降、具体的に検証していきたい。育児、妊娠など思うように遠方への出張が出来なかったために、九州島内の仏涅槃図のうち今年度は主に福岡県内の調査を主として行った。当初計画していたのは中世に遡る仏涅槃図の調査および研究であったが、中世に制作された仏涅槃図の写本についても手を広げることによって必然的に近世の涅槃図についての調査を行うこととなった。これによって当初予定にはなかった地方の仏涅槃図の図様の広がりなどについて具体的に明らかになるような可能性も見えてきた。当初の予定とは異なるが、一定の成果が上がったと考える。平成29年度は福岡・豊前国分寺の仏涅槃図の調査を行った。豊前

国分寺の江戸時代の記録に拠れば、大友の兵火を免れた仏涅槃図が存在したとされ、近代の記録にも古い仏画として仏涅槃図が挙げられていた。実際に調査に赴いたところ、これに該当するような作例はなく、近代に描かれたとみられる仏涅槃図1点が確認された。ただ、当該仏涅槃図とともに存在したという三千仏図と胎蔵界曼荼羅は中世に遡る作品であり、これらが納められた江戸時代の木箱の箱表の墨書には三千仏図と胎蔵界曼荼羅が納められていたことが明記され、加えて「仏涅槃図」とあり、豊前国分寺にこの2幅とともに古い仏涅槃図が伝わっていたことについては確認できた。なお、豊前国分寺の胎蔵界曼荼羅については既出論文もあり町指定文化財となっているが、三千仏図については未紹介であり、九州に所在する仏教絵画の遺品として、今後広く紹介する必要があるだろう。他、これまで調査を行った作品の調書や画像などの整理などを行った。平成29年8月12日から現在に至るまで、産前産後の休暇および育児休業を取得したため。一昨年度、昨年度と産前産後休暇および育児休暇のため研究を中断していた。一昨年度、昨年度と産前産後休暇および育児休暇を取得し育児に専念していたため。九州島内の涅槃図の調査については年度途中より産前産後休暇に入ったために鹿児島の調査のみに留まっているが、当初調査予定であった九州国立博物館本、東長寺本、福岡市博物館本については九州国立博物館で開催された「大涅槃展」において実見することができ当該展示の担当者より多くの情報を得ることが出来たことから、結果おおむね順調と言える。また、画像の解析やデータベース化は遅れているが、中国絵画また中国由来のテキストとの関係性の解明は進んでいる。27年度に計画していた、調査やデータベース化をはかる。26年度に行けなかった熊本方面の調査は今年度行う予定であったが、熊本地震の復興状況を見ながら考える。今年度は近隣の福岡方面また大分方面の調査を重点的に行う予定である。次年度は最終年度となるが、引き続いて九州島内の涅槃図の実地調査を行うとともに、地方での図様に関する伝播状況などを仏涅槃図を用いて考察していきたい。また新出の福岡・開善寺の仏涅槃図に関しては調査結果をまとめ公表したいと思う。平成29年度に行う予定だった調査・研究を引き続き行う。また、仏涅槃図の調査に付随して発見・調査した資料類についても九州に所在する仏画の基礎資料として公開できるよう研究を進めたい。また、古文書などの記録に照らして失われた作品についてのデータも収集していきたい。一昨年度および昨年度遂行予定であった研究を進める。また最終年度となるため、論文執筆や発表に向けての準備を行う。次年度以降は引き続いて九州内の涅槃図の実地調査を行う。また当該年度の研究成果より日本で流通した涅槃図については中国絵画はもとより、制作にあたって流行していた涅槃に関するテキストとの関係が見えてきたため、引き続き涅槃とテキストとの関係、また請来版本などとの比較検討も進めていく予定である。また調査済の作品についてはデータベース構築を逐次してゆく予定である。26年度に使用予定であったが、物品の購入について相見積もりをとったことにより、価格が下がり、余剰分が出た。育児・妊娠などの影響で、遠方への出張がままならなかったため、近場の福岡県内の調査が主とした。そのため旅費が多くかからなかった。平成29年8月12日より妊娠・出産などにより研究を中断し当初予定していた調査等を行えず、支出がなかった。残額は研究を再開した際に予定の調査を行うために利用する予定である。一昨年、および昨年度と産前産後休暇および育児休暇を取得していたため。この間予定していた研究を順次進めていく予定である。物品費について、相見積もりを取った結果、価格が下がったため。
ウシ乳腺組織におけるマイコプラズマの高度免疫回避機能に関する細胞生物学的研究

本研究ではM. bovisが末梢血好中球および単核球の細胞死に及ぼす影響について検討した。研究概要は以下の通りである。1本研究において好中球にM. bovisを添加した際に、MOIの増加に従って細胞生存率の低下が認められた。これらのことから、M. bovisは菌数が増えるに従って好中球に細胞死を誘導することが示された。またM. bovisを好中球に添加することにより、対照群ではMOIの増加に伴ってアポトーシスが誘導された。2M. bovis刺激により誘導される好中球のcaspaseの活性は増加することが示された。さらにM. bovis刺激により、好中球のcaspase-3および9のmRNA発現量の増加が認められた。このことから、好中球においてM. bovisはcaspase-9および-3のmRNA発現量を増加することにより、細胞内のcaspase-9および-3の蛋白発現量を増加させることが示唆された。これらcaspase-9および-3の蛋白が活性化することにより、アポトーシスを誘導することが考えられた。3PBMCでも同様の試験を行ったところアポトーシスの抑制が認められた。PBMCにM. bovisを添加した際のcaspase活性は対照群では低下したのに対し、STS添加群では増加することが示された。PBMCにおいてM. bovisはcaspase-9および-3のmRNA発現量を減少させることで、細胞内のcaspase-9および-3の蛋白発現量を低下させ、アポトーシスを抑制することが考えられた。以上本研究ではM. bovisが好中球およびPBMCの細胞死を調整することを示し、このことがM. bovisによって引き起こされる乳房炎を難治性へと招来することが考えられた。■M. bovis株の分離・同定と系統解析:本年度は研究に供するM. bovis(野外株)を40株の分離を試みた。その結果、マイコプラズマ性乳房炎に罹患した個体から得た乳汁を出発材料として40株の分離を完了した。これらの菌はいずれもクローニングを行い、またPCRによる最終確認を実施した。■M. bovis株の系統解析:RAPD法により遺伝的系統解析を行い、その概要を明らかにした。■乳腺細胞の初代細胞株:試験に供する細胞株について、基本的な代謝系を確認し、試験実施に用い得るこを確認した。2015年度はM. bovis株の分離・同定と系統解析をおこない、研究に供するM. bovis(野外株)を40株の分離した。また、RAPD法により遺伝的系統解析を行い、その概要を明らかにした。また、乳腺細胞の初代細胞株を選別し試験実施に用い得るこを確認した。当初の予定通りの進度で研究計画が進んでいる。マイコプラズマは多くの動物種において慢性・持続性の感染症を惹起し、それらは難治性疾患へと移行することが獣医学領域において広く注目されている。マイコプラズマは長い進化の過程で自身のゲノムサイズと生物学的機能を極限まで退化(退行性進化)させ、宿主動物への機能的依存性を高めた。これらは生体におけるマイコプラズマの長期生存戦略の一端を担うとされるが、宿主免疫応答に関する研究知見は乏しく、その本質を解明するには至っていない。本研究では、人類にとって重要な生物資源であるウシに対し極めて重篤な感染症を引き起こすマイコプラズマ種(Mycoplasma bovis: M. bovis)に着目し、長期生存戦略に関わる機能的特性、すなわちM. bovisの免疫回避機構を解明する。以下の内容について研究を実施した。本年度の実験として1)乳腺上皮細胞の分離および培養およびウシ乳腺感染培養モデルの構築と応答性の評価i)ホルスタイン種乳牛由来正常乳腺組織を無菌的に生体より分離、ii)トリプシンおよびコラゲナーゼ処理により乳腺上皮細胞を分離、iii)M. bovis(MOI1-1000)に対する細胞応答性の評価、を行った。結果として、乳腺細胞の分離培養を実施し、M. bovisがCaseinタンパクを始めとする乳腺機能におよぼす影響を評価するとともに、免疫関連遺伝子の網羅的発現解析を実施した。乳腺上皮細胞の構築と、M.bovisがその機能およぼす影響を評価した。また、乳腺上皮細胞における免疫関連遺伝子の発現についても網羅的評価を試みた。近年のM. bovisに関する最新の研究知見は、本菌種が高度に発達した免疫回避機構を有することである。M. bovisによる白血球の免疫調節は、その主要なメカニズムであると推察されている。免疫細胞に対する機能抑制作用も強く、これらはM. bovisの高病原性および高度感染性の主因として注目されている。本課題において、ウシ白血球に対するM. bovisの免疫制御機構に関する分析を行った。その結果、本課題において行った以下の評価系において、好中球およびリンパ球においてM. bovisによる特異的な応答性が確認された。1好中球のルミノール依存性化学発光反応はMOI依存性に有意な上昇が確認された。2PMAによって誘導される好中球のNET形成能はM. bovisの添加によって著しく阻害されることが明らかになった。3リンパ球幼若化反応はM. bovisの添加による有意な変化は認められなかった。

4好中球のアポプトーシスはM. bovisの添加によって有意に上昇した。5リンパ球のアポプトーシスはM. bovisの添加によって有意に低下した。以上のことより、好中球はM. bovisに対して一定の免疫応答性を示すものの、重要な殺菌系でありNETsの形成能は阻害され、さらにアポプトーシスも誘導されることが確認された。また、リンパ球では免疫応答能に対する影響は少なく、また、アポプトーシスを阻害する可能性も示唆された。以上の結果より、M. bovisはウシ好中球およびリンパ球の免疫応答性を調整し、これらはM. bovisの生存戦略に関連している可能性が示唆された。ウシ白血球に対するM. bovisの免疫制御機構に関する分析を行った結果、好中球およびリンパ球においてM. bovisに対する特異的な免疫応答性が機能的側面から確認された。本結果よりM. bovisはウシ好中球およびリンパ球の免疫応答性を調整し、これらはM. bovisの生存戦略に関連している可能性が示唆された。研究については、順調に実施されており、上記の通り当初計画に則り進められている。本研究ではM. bovisが末梢血好中球および単核球の細胞死に及ぼす影響について検討した。研究概要は以下の通りである。1本研究において好中球にM. bovisを添加した際に、MOIの増加に従って細胞生存率の低下が認められた。これらのことから、M. bovisは菌数が増えるに従って好中球に細胞死を誘導することが示された。またM. bovisを好中球に添加することにより、対照群ではMOIの増加に伴ってアポトーシスが誘導された。2M. bovis刺激により誘導される好中球のcaspaseの活性は増加することが示された。さらにM. bovis刺激により、好中球のcaspase-3および9のmRNA発現量の増加が認められた。このことから、好中球においてM. bovisはcaspase-9および-3のmRNA発現量を増加することにより、細胞内のcaspase-9および-3の蛋白発現量を増加させることが示唆された。これらcaspase-9および-3の蛋白が活性化することにより、アポトーシスを誘導することが考えられた。3PBMCでも同様の試験を行ったところアポトーシスの抑制が認められた。PBMCにM. bovisを添加した際のcaspase活性は対照群では低下したのに対し、STS添加群では増加することが示された。PBMCにおいてM. bovisはcaspase-9および-3のmRNA発現量を減少させることで、細胞内のcaspase-9および-3の蛋白発現量を低下させ、アポトーシスを抑制することが考えられた。以上本研究ではM. bovisが好中球およびPBMCの細胞死を調整することを示し、このことがM. bovisによって引き起こされる乳房炎を難治性へと招来することが考えられた。今年度はウシ乳腺上皮細胞を用いた、乳腺感染培養モデルの構築を行う。すなわち、ホルスタイン乳房より乳腺組織を分離し、Nalkajimaらの方法に従い、培養系を構築する。これに先に分離したM.bovis株を感作させ、細胞の免疫応答性を確認する。昨年度までの研究は予定通り遂行されており、本年度もこれらを遅滞なく実施する。
抑制と活性シグナルを導入する多型性リンパ球受容体群の認識分子の同定

免疫・炎症性細胞の中で,B細胞,骨髄球系細胞,マスト細胞に発現する新規膜表面受容体分子PIRのリガンド分子の同定を目的とした研究を,12年度研究計画に則り行った.その成果を以下2項にまとめる.1.PIRのポリマータンパクの発現細胞の選定とタンパク精製11年度の結果から,当初計画された293T細胞やCOS細胞を用いた一過性発現系では,PIRポリマーが細胞内に貯留し,分泌タンパクとしては回収・精製不能と判断された.12年度の研究では,ミエローマ細胞での安定発現系によるPIRポリマーの発現を実施し,分泌タンパクとして回収・精製されるかを検討した.その結果,一過性発現系の場合と同様に,PIRポリマーは細胞内に発現するものの分泌はされなかった.次に我々は,293T細胞を用いた一過性発現系に戻り,細胞分画よりPIRポリマーの精製を試みた,PIRポリマーcDNA構築を293Tに導入し,該タンパクの発現を確認後,細胞溶解液より抗FLAG抗体アガロースビーズで精製した.SDS-PAGE後の銀染色で,ほぼ単一バンドまでに精製されたPIRポリマーが得られたが,せいぜい10^8あたり1μg以下の回収率に止まった.2.PIRポリマーを用いた細胞染色1.で精製したPIRポリマーを用いて,マウス脾細胞の染色を行った.さらに,サイトカイン刺激後の脾細胞も同様の解析に供した.NK細胞マーカー,T細胞マーカーとPIRポリマーの組み合わせで,二重染色を施し,FACS解析装置によってPIRポリマーの結合を示す細胞種の同定を試みた.その結果,我々の精製したPIRポリマーに認識される細胞種は認められなかった.免疫・炎症性細胞の中で、B細胞、骨髄球系細胞、マスト細胞に発現する新規膜表面受容体分子PIRのリガンド分子の同姓を柱として、PIRが免疫・炎症反応において果たす役割を明確にすることを目的とした研究を、11年度研究計画に則り遂行した。その成果を以下2項にまとめる。1.PIRの細胞外領域を含むプローブタンパクおよびPIRを発現する細胞の準備リガンド結合領域が多価(ポリマー)かつ可溶性タンパクとして発現する合成キメラタンパクのデザインとその為のDNA構築を行った。合成キメラタンパクの基本骨格は、ペプチドN末端側から、PIR-Bの細胞外領域、ヒトC4bp(complement 4-binding protein)のα-ヘリックス領域および標識配列となるFLAG領域とした。C4bp領域は、システイン結合特性により7量体を形成するため、C4bp領域に連結したPIRの細胞外領域(部分領域を含む)は、ホモポリマーの可溶性タンパクで回収されることが期待された。293T細胞に上記キメラDNA構築を一過性に発現させ、培養上清や細胞分画を抗FLAG抗体を用いた免疫沈降やウエスタンブロット法で解析した。その結果、期待される合成キメラタンパクは、ポリマーとして(約57量体)細胞内には蓄積するものの、培養上清より回収可能な可溶性タンパクとして発現しないことが判明した。nativeなリガンド結合活性を維持しながら、大量の合成キメラタンパクの精製には、培養上清より回収する手順が必須であると考えた為、現在、キメラDNA構築をミエローマ細胞に安定に発現させて、培養上清からの回収を試みている最中である。2.PIRのリガンドを発現する細胞種の同定今後、1.のプローブタンパクが調整されしだいに実施する予定でいる。リガンドとしては、細胞表面タンパクに限らず、可溶性タンパクや糖脂質なども考慮しながら解析を進めていく計画である。免疫・炎症性細胞の中で,B細胞,骨髄球系細胞,マスト細胞に発現する新規膜表面受容体分子PIRのリガンド分子の同定を目的とした研究を,12年度研究計画に則り行った.その成果を以下2項にまとめる.1.PIRのポリマータンパクの発現細胞の選定とタンパク精製11年度の結果から,当初計画された293T細胞やCOS細胞を用いた一過性発現系では,PIRポリマーが細胞内に貯留し,分泌タンパクとしては回収・精製不能と判断された.12年度の研究では,ミエローマ細胞での安定発現系によるPIRポリマーの発現を実施し,分泌タンパクとして回収・精製されるかを検討した.その結果,一過性発現系の場合と同様に,PIRポリマーは細胞内に発現するものの分泌はされなかった.次に我々は,293T細胞を用いた一過性発現系に戻り,細胞分画よりPIRポリマーの精製を試みた,PIRポリマーcDNA構築を293Tに導入し,該タンパクの発現を確認後,細胞溶解液より抗FLAG抗体アガロースビーズで精製した.SDS-PAGE後の銀染色で,ほぼ単一バンドまでに精製されたPIRポリマーが得られたが,せいぜい10^8あたり1μg以下の回収率に止まった.2.PIRポリマーを用いた細胞染色1.で精製したPIRポリマーを用いて,マウス脾細胞の染色を行った.さらに,サイトカイン刺激後の脾細胞も同様の解析に供した.NK細胞マーカー,T細胞マーカーとPIRポリマーの組み合わせで,二重染色を施し,FACS解析装置によってPIRポリマーの結合を示す細胞種の同定を試みた.その結果,我々の精製したPIRポリマーに認識される細胞種は認められなかった.
小胞体関連分解を担う小胞体膜上のユビキチンリガーゼ複合体の研究

細胞内小器官の1つ小胞体では、多くのタンパク質の生合成が行われる。ところが生合成の過程で、タンパク質はしばしば高次構造形成に失敗してしまう。細胞にはこのような異常タンパク質をサイトゾルに引き出し、ユビキチン化して分解するシステムがあり、小胞体膜にユビキチンリガーゼ複合体が存在している。本研究では、このユビキチンリガーゼ複合体の安定性を調べるとともに、細胞は複合体形成状態を変化させることでタンパク質の分解機能を制御していることを明らかにした。小胞体では、多くの分泌タンパク質や膜タンパク質の生合成が行われている。多細胞生物では、細胞接着や細胞間コミュニケーションのために多くの膜タンパク質や分泌タンパク質が必要となる。ところが生合成の過程で、タンパク質はしばしば高次構造形成に失敗することが明らかになってきた。小胞体関連分解機構(ERAD)は、小胞体内でミスフォールドしたタンパク質をサイトゾルに引き出し、ユビキチン・プロテアソーム系で分解するシステムである。哺乳類小胞体膜に存在するユビキチンリガーゼHRD1はSEL1Lと複合体を形成し、さらに種々のERAD関連分子とともに大きな品質管理複合体を形成している。本研究において、HRD1-SEL1L複合体の安定性およびその制御機構およびHRD1-SEL1Lを含む品質管理複合体の形成状態と基質分解機能との相関関係を調べた。その結果、1.SEL1Lは半減期の短い不安定なタンパク質であるが、HRD1と複合体を形成することによって細胞内で安定に存在する、2.HRD1-SEL1L複合体の細胞内存在状態は複数存在し、ダイナミックに複合体形成状態を変化させることで分解機能を制御している可能性がある、3.SEL1Lは単独で発現すると、HRD1とは異なるユビキチンリガーゼによって速やかに分解される、4.HRD1-SEL1L複合体はERAD基質の分解速度を調節している、ということが明らかになった。小胞体では多くの分泌タンパク質や膜タンパク質の生合成が行われる。特に多細胞生物では、細胞接着や細胞間コミュニケーションをおこなうために多様な膜タンパク質や分泌タンパク質を生合成する必要がある。哺乳類小胞体膜に存在するユビキチンリガーゼHRD1はSELILと複合体を形成し、さらに種々のERAD関連分子とともに大きな品質管理複合体を小胞体膜上に形成している。本研究において、哺乳類HRD1-SEL1L複合体の安定性およびその制御機構ならびにHRD1-SEL1Lを含む品質管理複合体の形成状態と基質分解機能との相関関係を調べた。その結果、出芽酵母の場合とは異なり、SEL1Lは半減期の短い不安定なタンパク質であるがHRD1と複合体を形成することによって細胞内で安定に存在すること、HRD1-SEL1L複合体の細胞内存在状態は複数存在しダイナミックに複合体形成状態を変化させることでミスフォールドしたタンパク質の分解を制御している可能性があることを明らかにし、論文として発表した。引き続いてHRD1-SEL1L複合体に存在するレクチンXTP3-Bの機能および安定性、SEL1L自身の安定性がどのように制御されているかについての研究を進めている。小胞体関連分解機構(ERAD)は、小胞体内でミスフォールドしたタンパク質をサイトゾルに引き出してユビキチン化し、プロテアソームで分解するシステムである。哺乳類小胞体膜に存在するユビキチンリガーゼHRD1はSEL1Lタンパク質と複合体を形成し、さらに種々のERAD関連分子とともに大きな品質管理複合体を小胞体膜上に形成している。小胞体で生合成されるタンパク質の多くは、N結合型糖鎖をもった糖タンパク質で、レクチンと呼ばれる一群のタンパク質は特定の糖鎖構造を認識してこれに結合する。本年度は、小胞体レクチンXTP3-BとHRD1-SEL1L複合体の機能について研究を行い、XTP3-Bタンパク質はSEL1Lと結合してはじめて安定に存在できること、XTP3-Bは成熟途上にある糖タンパク質の分解を抑制する機能があることを明らかにした。我々はすでに、XTP3-BのホモログであるレクチンOS-9が、HRD1-SEL1L複合体と結合すること、特定の糖鎖構造を認識してミスフォールドした糖タンパク質に結合しERADを促進することを報告している。これらの結果を総合すると、HRD1-SEL1Lを含む品質管理複合体は、パートナーとなるレクチンを使い分けることによって、基質の分解を促進するのみならず、フォールドすべき基質の分解を防ぐ働きもしていることが示唆された。さらにHRD1およびSEL1Lそれぞれのタンパク質が、どのようにして基質を認識し、小胞体からの基質の運び出し、ユビキチン化に関与しているかについても検討を進めた。哺乳類HRD1-SEL1Lユビキチンリガーゼ複合体の安定性および基質分解に対する機能を解明し、論文として発表することができた。

24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、HRD1-SEL1L、ユビキチンリガーゼ複合体に存在するレクチンXTP3-Bの機能および安定性、およびSEL1L、自身の安定性がどのように制御されているかについての研究を進めている。現在のところおおむね順調に進展しており、当初の研究計画に従って研究を進めていく予定である。
セリンプロテアーゼ・ヘプシンの腎臓における生理的機能の分子解明

セリンプロテアーゼ・ヘプシンは腎臓に発現しているが、腎の局在やその生理的機能は不明である。本研究において腎近位尿細管から皮質集合尿細管においてヘプシンmRNAおよび蛋白の発現を同定した。急性リン負荷および慢性リン負荷モデルマウスの検討では尿中リン排泄増加を認めたが、腎でのヘプシンmRNAや蛋白発現に変化は認めなかった。Xenopus oocyteでの検討ではヘプシンはナトリウム依存性リン酸トランスポーターのリン輸送活性には影響を与えず、上皮型ナトリウムチャネル活性を増加することが確認された。以上のことから、ヘプシンは尿細管リン再吸収には関与せず、Na再吸収に関与することが示唆された。1)腎臓におけるヘプシン発現の局在検討4週齢雄ラット腎ネフロンをマイクロダイセクションした後、RT-PCR(タカラバイオPrimeScript; One Step RT-PCR Kit Ver.2)を施行したところ、腎臓においてラットヘプシンmRNAの発現を確認した。また、ラット腎近位尿細管細胞(NRK52E)においてRT-PCRを施行したところ、ヘプシンmRNAの発現は観察されなかった。8週齢雄マウスの腎臓においてヘプシン抗体(Abcam ab27765)を用いたimmunohistochemistryを施行したが、ヘプシンを同定できず、現在、抗原賦活化処理を変更して再度、施行中である。2)アフリカツメガエル卵母細胞系でのヘプシンによるNaPi-IIaリン輸送活性の測定Ambion MEGAscriptを使用して作製したラットヘプシンおよびNaPi-IIa cRNAをXenopus oocyteに共発現させ、32Pのoocyteへの取り込みを測定する系を現在作製中である。NaPi-IIaのウエスタンブロット解析に関してもNaPi-IIa抗体を検討中である。実験系の立ち上げに時間を要しており、また、抗体がワークしない等の問題点があり、遅れている。1)腎臓におけるヘプシン発現の局在検討4週齢雄ラット腎ネフロンをマイクロダイセクションした後、PT-PCR(タカラバイオPrimeScript;One Step RT-PCR Kit Ver.2)を施行したところ、腎近位尿細管から皮質集合尿細管においてラットヘプシンmRNAの発現を確認した。また、シスプラチン腎症モデルマウスの腎臓においてヘプシンmRNA発現の減少を認めたが、UUOモデルマウスの腎臓においてはヘプシンmRNA発現に変化は認めなかった。8週齢雄マウスの腎臓においてヘプシン抗体(Abcam ab27765)を用いたimmunohistochemistryを施行したが、ヘプシンを同定できず、現在、抗体をBioss社、とCayman Chemical社に変更して検討中である。2)アフリカツメガエル卵母細胞系でのヘプシンによるNaPi-IIaリン輸送活性の測定Ambion MEGAscriptを使用して作製したラットヘプシンおよびNaPi-IIa cRNAをXenopus oocyteに共発現させ、還流液のNA96に3mMPiとなるようPiを添加し、Na依存性の電流を測定した後、NaClをコリンクロライドに置換することによりIpを測定した。コントロールと比較し、ヘプシンとNaPi-IIaを共発現させてもIpに変化はなかった。3)ヘプシン(TMPRSS1) floxマウス(loxP-flanked alleleを持つ)の作製と全尿細管ヘプシンノックアウトマウスの作製の前に慢性Pi負荷時および急性Pi負荷時の腎臓および尿細管におけるヘプシンおよびNaPi-IIaの発現について、現在、モデルマウスを作製し、検討中である。地震による機器の故障、廃棄のため、実験・測定系の確立ができず、遅れている。1)腎臓におけるヘプシン発現の局在検討:8週齢雄マウスの腎臓においてヘプシン抗体(Cayman Chemical 100022)を用いてimmunohistochemistryを施行し、近位尿細管および遠位尿細管管腔側にヘプシンの発現を確認した。2)急性リン負荷モデルである無リン食+急性Pi腹腔内投与マウスおよび慢性リン負荷モデルである高リン食(1.2% Pi)負荷マウスにおいて腎臓におけるヘプシンmRNA発現を検討したが、急性リン負荷、慢性リン負荷マウスいずれにおいてもヘプシンmRNAの発現増加は認めなかった。Immunohistochemistryによるヘプシン蛋白発現の検討でも、急性リン負荷、慢性リン負荷マウスいずれにおいてもヘプシンの蛋白発現の増加を認めなかった。NaPi-IIaの発現については、腎臓でのNaPi-IIa抗体を用いたimmunohistochemistryを施行したが、NaPi-IIaを同定できず、抗原賦活化法を変更して再検討中である。3)Xenopus oocyte系におけるヘプシンによる上皮型ナトリウムチャネル(ENaC)活性化の測定:リン負荷モデルにおけるヘプシンの発現増加を認めなかったため、ヘプシンと腎尿細管、特に皮質集合尿細管におけるNa再吸収の関与を調べるために現在、MEGAscript T7 Transcription Kitを使用して作製したラットENaCα、β、γサブユニットおよびラットヘプシンcRNA 1ngずつをXenopus oocyteに共発現させ、アミロライド感受性ナトリウム電流(Ina)を測定中である。

Xenopus oocyteでの検討ではヘプシンはナトリウム依存性リン酸トランスポーターのリン輸送活性には影響を与えず、上皮型ナトリウムチャネル活性を増加することが確認された。以上のことから、ヘプシンは尿細管リン再吸収には関与せず、Na再吸収に関与することが示唆された。現在の問題点は明らかであるため、一つ一つの問題点に対して解決法を見出し、実験を遂行していく。当初の実験計画で予定していた機器を使用せず、別の機器での実験を検討中である。腎臓内科学熊本地震による実験室と実験機器の損壊等の影響で実験を長期間遂行することができず、予定通りの実験が進まなかったため。昨年度、遂行することができなかった実験を本年度に実施予定である。
切削油蛍光プローブによる工具刃先形状のオンマシン計測

本研究では切削油が波長400 nm程度の紫外光に対して、可視域の蛍光を放出する特性に着目し、切削油が発する蛍光を信号として、工具刃先形状の機上計測技術の開発を目指し、研究を行った。実験的に数μm程度の磨耗痕も測定可能であり、つまり、本手法は切削油の蛍光を取得することで、切削油が付着した状態でもマイクロスケールの工具磨耗を測定することが可能であった。このように、本手法を用いたオンマシンでの計測の工具形状計測可能性を示すことができた。本研究は、切削油の蛍光特性に着目し、その切削油からの蛍光を信号として取得することで、切削油で覆われた工具の形状をオンマシンで計測することを目的としたものである。励起光によって放出される蛍光を共焦点光学システムを用いて取得することで工具の表面の位置を得ることができるが、切削油の屈折率があることによって測定誤差が発生するため、この切削油膜の厚みを測定する必要がある。測定で得られる信号は、光学システムの共焦点特性(OTF)と切削油膜のコンボリューションであることが考えられるので、それを利用した手法について検討した。まず、蛍光共焦点のシステムを構築し基礎実験を行った。次に、水平面における液膜表面と測定表面で得られる励起光の反射光と取得される蛍光の信号を比較した結果、光学系の対物レンズの焦点が蛍光オイルの領域に到達し始めた際、検出される蛍光の信号が急激に増加し焦点が蛍光オイルの内部を透過している際にはおおよそ一定強度の蛍光信号が取得される事が明らかとなり、共焦点信号と切削油膜の明らかな関係性が得られ、この信号のデコンボリューションによる油膜厚さ計測の可能性を得ることができた。切削油の蛍光特性評価の基礎実験の過程で、切削油に含まれる添加物の吸光効果によって理論とは異なる蛍光光学特性を示していることが判明した。この原因追求と解明に時間を要した。本研究は、通常は光計測することが困難である切削油で覆われた工具の形状をオンマシンで計測することを目的としたものである。その手法として、切削油の蛍光特性に着目し、その切削油からの蛍光を信号として取得する。励起光の照射によって放出される蛍光を共焦点光学システムを用いて取得することで工具の表面の位置を得ることができる。機械加工で用いられる切削油にUV光を照射すると、波長500nm近傍に蛍光発光があることを確認した。この蛍光信号を共焦点顕微鏡で検出することに成功し、工具表面に対して共焦点顕微鏡の焦点を走査することで工具の表面情報の取得に成功した。厚みを持つ切削油の屈折によりシフトする検出位置を補正する必要がある。顕微鏡の光学伝達関数と膜厚のコンボリューションが走査信号として現れるため、あらかじめ計測した光学伝達関数をでコンボリューションすることで膜厚を推定する手法を提案した。この手法を用いることで、工具表面の正確な位置を推定できる。実験的に取得した信号に対して、これらのポストプロセス手法を用いて測定対象の形状を得る。最終的に、切削油で覆われた加工刃先(SEKN42MT)のすくい面摩耗を測定した結果、約4.6μm深さの摩耗を計測可能であり、本計測原理の有用性を示すことができた。これまでは油に蛍光を混入した蛍光オイルを使用した基礎実験を行っていたが、今後は、切削油を実際に用い、工具刃先の計測行う。光応用加工計測本研究は、切削油の蛍光特性を利用する原理であるため、その特性を把握することは今後の計測原理に大きく影響を及ぼす。本年度の初めに計画していた、切削油の蛍光特性が当初の予想に反した結果を示した。これの原因について調査をし、理解するために時間を要したため、その後構築する予定であった蛍光共焦点顕微鏡システムの構築への着手に遅れが生じた。昨年度の結果から、蛍光の特性を精密に測定する必要があることがわかったため、本年はそれらの光学特性を精密に測定評価可能な体制を整える。具体的には、切削油の材料、酸素濃度、屈折率などを評価する必要がある。そのための測定器を共用設備の利用を考えている。また、蛍光を取得するための、光学システムの構築と改良に予算を当てる予定である。
緑濃菌の病原因子エラスターゼとアルカリプロテアーゼの構造と発現制御に関する研究

本年はエラスターゼとアルカリプロテアーゼについてその遺伝子発現制御を詳しく研究した。まずエラスターゼについてその転写因子のひとつであるlasR遺伝子をクローン化し大腸菌での発現実験を行なった。またlasR遺伝子自身の発現についてNorthern blottingで調べたところ鉄のイオンではその発現にほとんど影響を与えなかった。現在大腸菌で発現させたlasRタンパク質を抽出し、In vitroでDNA結合実験を行ない、エラスターゼプロモーターのどの部分に結合して転写を活性化しているか、また培地中に分泌される低分子量物質により活性化されるかを検討している。一方、アルカリプロテアーゼについては、まずprimer-extension実験により転写開始点を同定した。その上流には大腸菌のRNApolymeraseシグマ70の結合部位に相同性のある部分が存在した。さらに、アルカリプロテアーゼの鉄のイオンによる発現制御を調べたところ、鉄イオン10muMの濃度でその発現は非常に強く阻害されることがELISAにより分かった。またNorthern blottingとprimer-extensionで調べるとこの抑制は転写の段階で起こり、fur(ferric uptake regulation)による発現制御の可能性が強く示唆された。一方、このアルカリプロテアーゼはLasR遺伝子内に変異が見つかっているPA103株でその発現が非常に低く、その転写にLasRの関与が考えられている。今回の実験で転写開始点上流にエラスターゼ遺伝子上流と高い相同領域が固定され、その結合部位である可能性が示唆された。この点についてもDNA-LasR結合実験により今後確認する。これらの研究によりエラスターゼとアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現制御について理解されると考えられる。
γδT細胞の末梢でのホメオスタシスにおけるTCRシグナル要求性

ナイーブαβT細胞の末梢でのホメオスタシスには、TCRとIL-7レセプターからの2つのシグナルが必要である。一方、γδT細胞のホメオスタシスにはIL-15とIL-7のシグナルが必要であることは分かっているが、TCRシグナルの要求性は分かっていない。マウスγδTCRのリガンドはほとんど分かっていないため、今回はγδTCRの発現を低下させることでTCRシグナルを弱めることを試みた。その結果、末梢のCD27+CD45RBhighのIFNγ産生型γδT細胞のみ特異的に減少した。この結果は、少なくとも一部のγδT細胞サブセットはそのホメオスタシスにTCRシグナルを必要としていることを示唆する。TCRgamma遺伝子座に存在するエンハンサーEg4の欠損マウスを作製し、その表現型(分化のFACS解析、V-J組換えとTCRgamma鎖転写量の定量)を解析した。このマウスのガンマデルタT細胞の一部のサブセットは、成体マウスでも胎児マウスでも、胸腺内での分化に異常はみとめられなかったが、末梢リンパ組織での細胞数が減少していることがわかった。また、ex vivoでPMA+Ionomycinで刺激を行うと、サイトカインの産生パターンが野性型と異なっていることが明らかになった。様々な臓器を調べた結果、Eg4欠損マウスの末梢リンパ組織での特定のガンマデルタT細胞サブセットの細胞数減少は、少なくとも、胸腺からリンパ組織への移行障害が原因ではないことが判明した。また、TCRgamma遺伝子座の別のエンハンサーであるEg1とJg1遺伝子のプロモーターが転写因子Stat5依存性に結合することをchromosomeconformation capture assay (3C assay)にて示すことができた。この1年の間に海外のグループから、ガンマデルタT細胞を、エフェクター機能やホメオスタシスに要求するサイトカインの違いにより分類することができる新たなマーカーが複数報告された(doi:10.4049/jimmunol.1500375, doi:10.4049/jimmunol.1502082)。そこで、TCRg遺伝子のエンハンサーEgの欠損(EgKO)マウスで、これらのマーカーの発現がどのように変化しているか調べた。EgKOマウスではCD27陽性のガンマデルタT細胞が減少していることが前年度までに分かっていたが、CD27陽性サブセットをさらに詳細に解析したところ、CD27+/CD45RBhigh/Ly6C+の集団が著しく減少していることが分かった。また、homeostatic proliferationに伴い、ガンマデルタT細胞はCD45RBlowからCD45RBhighへ変化することが報告された。そこで、野生型マウスとEgKOマウスの末梢リンパ組織からCD45RBlowのガンマデルタT細胞を単離し、Rag2欠損マウスへ移植後のガンマデルタT細胞を解析した。EgKOマウス由来ガンマデルタT細胞も野生型マウスと同様に、CD45RBlowからCD45RBhighへ変化した。この結果から、EgKOマウスのCD27+/CD45RBhigh/Ly6C+ガンマデルタT細胞の減少は、CD45RBlowからCD45RBhighへの移行が障害されているためではないことが明らかになった。TCRgエンハンサー欠損(EgKO)マウスでは、CD27+ガンマデルタT細胞の中でも特にCD45RBhighの集団が顕著に減少していることが分かった。また、野生型マウスとEgKOマウスのCD27+CD45RBlowガンマデルタT細胞をRag2欠損マウスへ移植したところ、EgKOマウスのガンマデルタT細胞も野生型マウスと同様にCD27+CD45RBhighへ変化できることが分かり、少なくともこの実験系においては、CD45RBlowからCD45RBhighへの移行は障害されていないことが確認できた。ナイーブαβT細胞のホメオスタシスには、T細胞抗原受容体(TCR)からのシグナルと、サイトカインIL-7の2つのシグナルが必要である。一方、γδT細胞のホメオスタシスにはIL-15やIL-7が必要であることは知られているが、TCRシグナルが必要かどうかは分かっていない。そこで、TCRγ遺伝子座にあるエンハンサーの一つであるEγ4の欠損(KO)マウスを作製し、TCRγ遺伝子の転写を低下させることによりγδT細胞のTCRシグナルを弱められるかを試みた。Eγ4KOマウスではVγ1.1-Jγ4遺伝子のV-J組換えの障害により、胸腺でVγ1.1陽性γδT細胞がほぼ完全に欠損していたが、その他のTCRγ遺伝子のV-J組換えは正常であった。Eγ4KOマウスでは野生型(WT)マウスに比べて胸腺内TCRγ遺伝子の転写がすべて低下していたものの、γδT細胞の分化は正常であった。しかし、脾臓とリンパ節ではVγ2陽性γδT細胞の数が減少しており、減少しているVγ2陽性γδT細胞はCD27+CD45RBhigh(以下27+RBhi)の集団に限られることが判明した。また、27+RBhiの受け取るTCRシグナルは、WTマウスに比べてEγ4KOマウスで減弱していることも確認された。そこで、27+RBhi Vγ2陽性γδT細胞の分化ではなく、「維持」にTCRシグナルが必要かどうかを調べるために、WTマウスとEγ4KOマウスから単離した27+RBhi Vγ2陽性γδT

細胞を同数混合して、Rag2KOマウスへ移植し、1か月後に解析したところ、回収されたVγ2陽性γδT細胞数はWTマウスよりEγ4KOマウスの方が明らかに少なかった。これらの結果から、27+RBhi Vγ2陽性γδT細胞の末梢リンパ組織での維持にはTCRシグナルが重要であることを示すことができた。ナイーブαβT細胞の末梢でのホメオスタシスには、TCRとIL-7レセプターからの2つのシグナルが必要である。一方、γδT細胞のホメオスタシスにはIL-15とIL-7のシグナルが必要であることは分かっているが、TCRシグナルの要求性は分かっていない。マウスγδTCRのリガンドはほとんど分かっていないため、今回はγδTCRの発現を低下させることでTCRシグナルを弱めることを試みた。その結果、末梢のCD27+CD45RBhighのIFNγ産生型γδT細胞のみ特異的に減少した。この結果は、少なくとも一部のγδT細胞サブセットはそのホメオスタシスにTCRシグナルを必要としていることを示唆する。投稿中だった別の論文の追加実験に3C assayを追加する必要が生じ、条件検討などにかなり時間を取られたため、平成26年度に予定していたEg4欠損マウスの解析の一部が実施できなかったため。CD27+/CD45RBhighガンマデルタT細胞をRag欠損マウスへ移植した時の生存維持に、野生型とEgKOマウスで差があるかどうかについて、さらに複数回の追加実験を行う。また、ガンマデルタT細胞の生存維持のみならず、サイトカイン産生能への影響も調べる。免疫学3C assayの実験条件がおおよそ定まったので、平成27年度以降に予定していたEg4エンハンサーと他のTCRgammaエンハンサーの結合を検出するための実験に応用できると考えられる。平成26年度に実施できなかった一部の実験は、平成27年度に合わせて行う。抗体や磁気ビーズが、同じ製品を使う他の実験ですでに購入してあったため、今年度に限っては予定していた量より実際の購入量が少なかった。投稿中だった別の論文の追加実験として、平成27年度以降に予定していた3C assayを前倒しして実施したので、当初平成26年度に計画していた実験の一部が実施できなかったため。再現性の確認のために、さらに複数回実験を繰り返すためには、追加での磁気ビーズと抗体の購入が必要である。平成26年度実施予定だった実験は、平成27年度に追加して行う。フローサイトメトリー用の抗体や、ソーティング用の磁気ビーズの購入に使用する。