hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
裁判員裁判における目撃記憶の信頼性評価に関する心理学的研究

本研究の目的は、裁判員と裁判官がそれぞれどのような情報処理の過程を経て目撃証言の信頼性を評価するのか、その認知的なプロセスの一端を明らかにすることである。模擬裁判実験や判例分析などの手法を用いて、目撃証言の信頼性がどのようにして評価されるのか検討を行った。その結果、目撃証言の信頼性を推定可能と思われる情報が複数ある場合、個々の情報に対して、必ずしも排他的に重みづけが行われるわけではない可能性が示唆された。情報の重み付けは、事案に含まれる他の情報の影響を受けて相互作用的に変化すると考えられた。本研究の目的は,裁判員裁判における「目撃記憶の信頼性評価」の問題について,心理学的な観点からアプローチを行うことである。裁判員裁判では,裁判官と裁判員とがそれぞれ目撃記憶(証言)の信頼性を評価することになる。しかしながら,両者が公判から得られた情報をどのように処理し,目撃記憶の信頼性を評価するのかといった認知的なメカニズムの解明は,これまでに十分議論が行われていない。目撃記憶の信頼性評価における認知的なメカニズムを解明することは,ヒトの情報処理に関する基礎心理学的な知見に加え,より有効な裁判員裁判のあり方を議論する上での基盤的な知見を提供することにもつながる。そこで本研究では,どのような情報処理の過程を経て,裁判において目撃記憶の信頼性が評価されるのかを明らかにする。裁判員は,どのような情報処理の過程を経て,目撃記憶(目撃証言)の信頼性を評価するのだろうか。前年度までの研究によれば,目撃記憶の信頼性を推定可能と思われる情報が複数ある場合,裁判員は個々の情報に対して,必ずしも個別に情報の重みづけを行っているわけではない。情報の重み付けは,事案に含まれる他の情報の影響を受けて相互作用的に変化する可能性が示された。本年度は,次の2つの実験を行い,上記知見の精緻化を試みた。実験1では,事件の目撃者が被疑者を犯人であると同定する架空の事例を,冊子によって参加者に提示した。各事例は, (1)証人の確信度(高,低), (2)凶器注目の有無,(3)目撃から犯人識別までの遅延(1日, 1週間, 3ヶ月),(4)被疑者の特性(既知人物,異人種,記述なし)の4要因の組み合わせによって構成された。参加者は,各事例における犯人識別(目撃記憶)の信頼性について, 7件法で評価した。実験2では,証人の視力が目撃記憶の信頼性評価に及ぼす影響に焦点を当て,実験1に準じた手続きにより実験を行った。具体的には, (1)証人の確信度(高,低), (2)凶器注目の有無に, (3)証人の視力(0.33, 2.0,記述なし), (4)犯人目撃時の状況(明るい,暗い)の要因を加えた4要因の組み合わせからなる事例を参加者に提示し,各事例における犯人識別の信頼性について, 7件法による評価を求めた。実験1, 2とも,結果については現在分析中である。本年度は,子どもの目撃証言に焦点を当てた。事案に含まれる情報の相互作用によって,裁判員による目撃証言の信頼性評価のあり方がどのように変化するかを調べた。一般的に,子どもの証言は,成人の証言に比べ,信頼性が低いと判断されやすい。しかし,現実の目撃事態において,証言の信頼性評価に結びつく情報が証人の年齢だけであるという状況は想定され難い。目撃から証言までの遅延日数や証人の確信度といった複数の情報が,同時に存在することを考慮しなければならないだろう。そこで本研究では,(1)証人の年齢に加え,(2)証人の確信度,(3)凶器に関する詳細な供述の有無,(4)目撃から犯人識別までの遅延日数の要因が交絡した事例を提示し,子どもの証言の信頼性がとのように評価されるのかを検討した。その結果,(1)子どもの証言は,成人に比べて信頼性が低いと判断される傾向にあった。しかし,(2)"詳細な供述","高い確信度","目撃から犯人識別までの遅延が少ない"という情報を含む子どもの証言は,これらの情報を含まない成人の評言よりも信頼性が高いと判断された。子どもによる目撃証言の信頼性は,証言の信頼性と関連する他の要因との相互作用によって変化すると考えられる。また,(3)確信度が証言の信頼性に影響を及ぼしたのは,詳細な供述が得られた場合のみであった。詳細な供述が得られなかった場合,確信度の高さは証言の信頼性に影響しなかった。このことは,上記(2)において子どもの証言の信頼性を高めた情報が,証言の信頼性に対して必ずしも独立に(加算的に)影響していなかった可能性を示唆する。証言の信頼性に及ぼす情報の影響力は,情報間の相互作用によって変化すると考えられた。

以上,昨年度までの研究成果と同様に,裁判員による認知的な情報処理のダイナミズムが,目撃証言の信頼性評価に強く関与する可能性が示唆された。実際の裁判と同様、目撃記憶の信頼性評価の根拠となり得る情報が複数存在する状況を設定し、裁判官および裁判員がどのような情報処理の過程を経て、目撃記憶の信頼性を評価するのかについて検討を行った。まず、前年度までに行った実験結果を精査することで、目撃記憶の信頼性評価に関して市民が持つ信念(素朴理論)と,実証研究で得られた知見との相違を検討した。その結果、目撃記憶に関する実証的研究で指摘されてきた知見とは異なり、(1)証人の確信度が高いほど証言の信頼性が高いと判断される傾向や、(2)犯人が所持していた凶器について詳述できた証人ほど、犯人同定の信頼性が高いと判断される傾向が見られた。このことから、目撃記憶の信頼性に関する市民の素朴理論には少なからず誤信念が含まれていると考えられた。次に、本年度に実施を予定している下記の研究計画に向けて、研究準備を行った。第一に、裁判官がどのような情報に基づいて目撃記憶の信頼性を判断するか検討する目的で、法学者の協力を得て、目撃記憶の信頼性が争点となった判例の収集を行った。第二に、これまでに得られた知見をより臨床に近い場面に敷衍して検討する目的から、映像刺激を用いた模擬裁判実験を行うための準備を行った。具体的には、石崎・荒川・若林(2010)で作成された公判映像刺激を用いて予備実験を行い、評議の進行方法、公判の背景情報、情報間の整合性等について検討を行った。本年度は次の2点について検討を行った。第一に、次の2つの研究調査を行い、裁判官および裁判員は目撃記憶の信頼性についてどのような信念を持ち、どのような認知的過程を経て目撃記憶の信頼性を評価するのかについて検討した。(1)裁判官の信念については、判例分析によって抽出を行った。裁判員制度が施行された平成21年5月21日より以前の判例のうち、目撃証言に関する記述を含む判例を最新のものから50件を収集した。また、裁判員裁判の判例39件を収集した。テキストマイニングの手法を用いることで、これらの判例において目撃証言の信頼性の有無がどのように記述されているか分析を行った。(2)市民が目撃証言の信頼性に対して抱く信念については、模擬裁判実験を行い、評議での発話から抽出した。その結果、証人の自信の程度を信頼性評価の根拠とする傾向が見られた。多くの場合、確信度は正確性の指標とならないことが指摘されてきている。本研究の結果は、裁判官や裁判員が目撃記憶の信頼性に対して抱く信念、(素朴理論)と、心理学研究において蓄積されてきた実証的知見とのかい離が、実際の裁判にも当てはまる可能性を示唆している。第二に、前年度までの成果を踏まえ、目撃記憶(犯人識別)の信頼性を判断する際に参照される情報の重みづけが、先行研究での議論とは異なり、必ずしも個別に行われているわけではない可能性について検討を行った。本年度は、より現実の裁判に近似した状況で検討を行うため、弁護士監修のシナリオ(石崎・荒川・若林、2010)に基づき音声と静止画で公判の様子を提示し、有罪無罪の判断を求めた。その結果、証人の確信度と犯人性の判断とには必ずしも相関がみられなかった。情報の重みづけは、必ずしも情報ごとに独立に行われるわけではなく、事案に含まれる他の情報の影響を受けて、相互作用的に変化すると考えられた。
インフォームドコンセントにおける患者の決断の“ゆれ"と看護婦の対応に関する研究

インフォームド・コンセント(以下ICとする)に関して、Medlineおよび医学中央雑誌等から検索された1980年以降の文献66編を選び、つぎの4つの観点、1)概念・原則等、2)形式上の実行と現実とのずれ、3)決断のゆれ、4)看護婦の役割からレビューを行った。ついで、医師・患者・看護婦を1組とする面接事例6組18人からえた情報を分析し、ゆれに関する医療者側要因と患者側要因を同定した。前者では「情報の質」「情報提供の仕方」「提供される情報のズレ」「悩みへの対応」「プライバシーを侵す環境」が見られ、後者では、「情報提供への親や妻の関与」「病気の性質とライフイベント」、自覚症状のない「身体状況」「誰かに相談する時間がない」などが認められた。とくに患者の家族がどう関与するか、患者のライフイベントがどうなっているか、そのときの身体状況はどうだったかが大きく関与している。同意にいたる最終決断を促す要因としては、医療者側では「患者の対処への支持」が見られ、とくに「看護婦の対応:関心をよせる;親身に話を聞く;決断の妥当性を保証する;医師に働きかける」行動は有効であることが示唆された。一方、患者側には、「ジレンマへの対処能力」「納得への猶予期間の適当な長さ」などの要因が見いだされた。最後に、これらの結果にもとづいて、「ゆれ」をめぐる諸要因の関係構造をゆるやかな概念枠組みとして構築し、大まかな量的情報をうることを目的として患者対象に「ゆれ」調査を行った。調査票配布数261部に対して164人からえた回答によれば、対象の2割弱に「ゆれ」が存在した。調査の結果を、1)ICの実態、2)「ゆれ」の存在と3)プロセス、4)患者が期待する看護婦の役割の観点から分析し、看護婦の基本的役割として、1)医療チームのコーディネータ役割、2)患者の知る権利を擁護し医療への参加を促す役割、3)患者や家族を精神的情緒的に支援する役割が取りだされた。本研究の目的は、インフォームドコンセントにおける決断の"ゆれ"と患者および医療者側の条件を明らかにし、看護の介入の仕方を確立するところにある。本年度は、その目的にそって1)医師、2)看護婦、3)患者の3者からインフォームドコンセントに関連する諸体験を面接によって調査した。研究作業としてはまず、検索した文献資料にもとづいてICにおける"ゆれ"を操作的に定義した。その後、対象条件を設定し、該当する患者の探知方法および当該患者が見いだされた場合の接近方法を定めた。これは対象患者が多かれ少なかれ心理的クライシスを体験していることに対する看護上および倫理上の配慮を必要とするからである。そのような配慮を含めて、患者本人および関係する医師・看護婦3者の面接調査を実施するためのガイドラインを作成した。このガイドラインにしたがって同一研究者が3者を一組とする面接を行い、その結果を分析した。分析はいまだその途上にあり、事例による相違も示唆されているが、「インフォーミングをめぐる医師の状況」、「コンセントをめぐる患者の状況」、「プライバシー」、「関係3者の対処行動」、当該病院の診療システムと密接に関係するとみられる「状況全体の構造」、すなわちインフォーミングから治療開始へと流れていく組織としての慣習的な体制のすべて、「患者-医療者関係」

さらには「関係者相互の役割期待」などが分析の鍵概念として取り出された。これらはすべて医療社会のエ-トスを構成する要素である。このすべてにおいて"ゆれ"は顕在化しないまでも、潜在的に発生することが示唆されていた。現在引き続き事例収集と分析を行っているが、平行して平成8年度に実施する予定の質問紙調査の枠組みを検討している。インフォームド・コンセント(以下ICとする)に関して、Medlineおよび医学中央雑誌等から検索された1980年以降の文献66編を選び、つぎの4つの観点、1)概念・原則等、2)形式上の実行と現実とのずれ、3)決断のゆれ、4)看護婦の役割からレビューを行った。ついで、医師・患者・看護婦を1組とする面接事例6組18人からえた情報を分析し、ゆれに関する医療者側要因と患者側要因を同定した。前者では「情報の質」「情報帝京の仕方」「提供される情報のズレ」「悩みへの対応」「プライバシーを侵す環境」が見られ、後者では、「情報提供への親や妻の関与」「病気の性質とライフイベント」、自覚症状のない「身体状況」「誰かに相談する時間がない」などが認められた。とくに患者の家族がどう関与するか、患者のライフイベントがどうなっているか、そのときの身体状況はどうだったかが大きく関与している。同意にいたる最終決断を促す要因としては、医療者側では「患者の対処への支持」が見られ、とくに「看護婦の対応:関心をよせる;親身に話を聞く;決断の妥当性を保証する;医師に働きかける」行動は有効であることが示唆された。一方、患者側には、「ジレンマへの対処能力」「納得への猶予期間の適当な長さ」などの要因が見いだされた。最後に、これらの結果にもとづいて、「ゆれ」をめぐる諸要因の関係構造をゆるやかな概念枠組みとして構築し、大まかな量的情報をうることを目的として患者対象に「ゆれ」調査を行った。調査票配布数261部に対して164人からえた回答によれば、対象の2割弱に「ゆれ」が存在した。調査の結果を、1)ICの実態、2)「ゆれ」の存在と3)プロセス、4)患者が期待する看護婦の役割の観点から分析し、看護婦の基本的役割として、1)医療チームのコーディネータ役割、2)患者の知る権利を擁護し医療への産科を促す役割、3)患者や家族を精神的情緒的に支援する役割が取りだされた。
内部に複数の構造物を有する容器内の非線形液面揺動特性

本研究課題では内部に複数の構造物を有する容器内液面のスロッシング特性の解明するため,複数の内部構造物を二つの円筒で近似し,第1年はその二つの円筒の半径が等しい場合,第2年は異なる場合を取り上げ,以下の点に着目し研究を行った.1.複数の内部円筒を有する円筒容器内の非線形液面揺動を支配する基礎方程式系が適用できることを確認した.2.求めた非線形の基礎方程式を線形化し,液面揺動の固有振動数・振動モードを算出した.内部円筒の大きさ等による液面揺動の自由振動数・振動モード形状の変化を考察した.振動モード間の固有振動数の大きさの関係から,非線形連成により,直接励振されない振動モードが成長する可能性のある容器形状や液深を考察した.3.内部円筒の直径や位置の異なる模型円筒容器を用いて,調和励振による揺動実験を行った.4.液面揺動を支配する非線形微分方程式を導出し,時刻歴応答波形を求めた.5.理論解析結果と実験結果を比較し,解析の妥当性を確認するとともに,複数の内部構造物を有する容器内の液面揺動特性を考察した.主な特徴を以下に示す.●液面の振動モードの非線形連成特性により,直接励振される振動モード以外に,励振振動数の2倍付近に固有振動数を有する振動モードが成長する.●上記のような非線形特性は,円筒容器でも生じるが,円筒の場合には振動モードの固有振動数間の関係を決定するパラメータが液深のみであるのに対して,複数の内部構造物を有する容器の場合には,液面揺動(液体運動)の固有振動数が,液深以外には部円筒の直径や位置にも依存するため,複雑な非線形液面揺動を生じる.●円筒容器のような軸対象の容器とは異なり,複数の内部構造物を有する容器の場合には,節直径が1本の振動モード以外にも直接励振力が作用し,成長する可能性がある.本研究課題では内部に複数の構造物を有する容器内液面のスロッシング特性の解明するため,複数の内部構造物を二つの円筒で近似し,第1年はその二つの円筒の半径が等しい場合,第2年は異なる場合を取り上げ,以下の点に着目し研究を行った.1.複数の内部円筒を有する円筒容器内の非線形液面揺動を支配する基礎方程式系が適用できることを確認した.2.求めた非線形の基礎方程式を線形化し,液面揺動の固有振動数・振動モードを算出した.内部円筒の大きさ等による液面揺動の自由振動数・振動モード形状の変化を考察した.振動モード間の固有振動数の大きさの関係から,非線形連成により,直接励振されない振動モードが成長する可能性のある容器形状や液深を考察した.3.内部円筒の直径や位置の異なる模型円筒容器を用いて,調和励振による揺動実験を行った.4.液面揺動を支配する非線形微分方程式を導出し,時刻歴応答波形を求めた.5.理論解析結果と実験結果を比較し,解析の妥当性を確認するとともに,複数の内部構造物を有する容器内の液面揺動特性を考察した.主な特徴を以下に示す.●液面の振動モードの非線形連成特性により,直接励振される振動モード以外に,励振振動数の2倍付近に固有振動数を有する振動モードが成長する.●上記のような非線形特性は,円筒容器でも生じるが,円筒の場合には振動モードの固有振動数間の関係を決定するパラメータが液深のみであるのに対して,複数の内部構造物を有する容器の場合には,液面揺動(液体運動)の固有振動数が,液深以外には部円筒の直径や位置にも依存するため,複雑な非線形液面揺動を生じる.●円筒容器のような軸対象の容器とは異なり,複数の内部構造物を有する容器の場合には,節直径が1本の振動モード以外にも直接励振力が作用し,成長する可能性がある.本研究課題では内部に複数の構造物を有する容器内液面のスロッシング特性の解明するため,内部構造物を円筒で近似し,今年度は二つの同一の半径を円柱状の構造物を有する容器を取り上げ,今年度は以下の点に着目し研究を行った.1.複数の内部円筒を有する円筒容器内の非線形液面揺動を支配する基礎方程式系を導出した.2.求めた非線形の基礎方程式を線形化し,液面揺動の固有振動数・振動モードを有限要素法を用いて算出した.内部円筒の大きさや相対位置をパラメータとして,液面揺動の自由振動数・振動モード形状の変化を考察した.振動モード間の固有振動数の大きさの関係から,非線形連成により,直接励振されない振動モードが成長する可能性のある容器形状や液深を考察した.3.内部円筒の直径や位置の異なる模型円筒容器を用いて,調和励振による揺動実験を行った.4.理論解析結果と実験結果を比較し,解析の妥当性を確認するとともに,複数の内部構造物を有する容器内の液面揺動特性を考察した.主な特徴を以下に示す.●液面の振動モードの非線形連成特性により,直接励振される振動モード以外に,励振振動数の2倍付近に固有振動数を有する振動モードが成長する.

●上記のような非線形特性は,円筒容器でも生じるが,円筒の場合には振動モードの固有振動数間の関係を決定するパラメータが液深のみであるのに対して,複数の内部構造物を有する容器の場合には,液面揺動(液体運動)の固有振動数が,液深以外には部円筒の直径や位置にも依存するため,複雑な非線形液面揺動を生じる.●円筒容器のような軸対象の容器とは異なり,複数の内部構造物を有する容器の場合には,節直径が1本の振動モード以外にも直接励振力が作用し,成長する可能性がある.本研究課題では内部に複数の構造物を有する容器内液面のスロッシング特性の解明するため,内部構造物を円筒で近似し,今年度はその二つの円筒の半径が異なる場合を取り上げ,今年度は以下の点に着目し研究を行った.1.昨年度導出した複数の内部円筒を有する円筒容器内の非線形液面揺動を支配する基礎方程式系が適用できることを確認した.2.求めた非線形の基礎方程式を線形化し,液面揺動の固有振動数・振動モードを算出した.内部円筒の大きさ等をによる液面揺動の自由振動数・振動モード形状の変化を考察した.振動モード間の固有振動数の大きさの関係から,非線形連成により,直接励振されない振動モードが成長する可能性のある容器形状や液深を考察した.3.内部円筒の直径や位置の異なる模型円筒容器を用いて,調和励振による揺動実験を行った.4.液面揺動を支配する非線形微分方程式を導出し,時刻歴応答波形を求めた.5.理論解析結果と実験結果を比較し,解析の妥当性を確認するとともに,複数の内部構造物を有する容器内の液面揺動特性を考察した.主な特徴を以下に示す.●液面の振動モードの非線形連成特性により,直接励振される振動モード以外に,励振振動数の2倍付近に固有振動数を有する振動モードが成長する.●上記のような非線形特性は,円筒容器でも生じるが,円筒の場合には振動モードの固有振動数間の関係を決定するパラメータが液深のみであるのに対して,複数の内部構造物を有する容器の場合には,液面揺動(液体運動)の固有振動数が,液深以外には部円筒の直径や位置にも依存するため,複雑な非線形液面揺動を生じる.●円筒容器のような軸対象の容器とは異なり,複数の内部構造物を有する容器の場合には,節直径が1本の振動モード以外にも直接励振力が作用し,成長する可能性がある.
顎骨嚢胞壁線維芽細胞由来の液性因子による歯根嚢胞の成因増大の解析

本年度は、歯根嚢胞とIL-6や上皮細胞増殖因子(EGF)、角化細胞増殖因子(KGF)等との相互反応性について解析を行った。解析として、歯根嚢胞の内面層は口腔粘膜上皮細胞に似ているため、口腔粘膜上皮細胞を用いて、IL-6やEGFやKGFの刺激の効果について解析した。(1)口腔粘膜上皮細胞のそれぞれの因子による増殖効果を解析正常粘膜表皮から分離した口腔粘膜上皮細胞を角化細胞無血清培地で96穴プレートに1000細胞/wellで培養し、IL-6(5ng/ml)、EGF(5ng/ml)、KGF(5ng/ml)加え、細胞増殖能について72時間後MTT法を用いて解析したが、粘膜上皮細胞の増殖能促進はなかった。LPS(2ng/ml)やIL-1β(5ng/ml)でも同様の結果が得られた。(2)口腔粘膜上皮細胞のそれぞれ抗体による細胞増殖の抑制効果を解析EGFやKGFは粘膜上皮細胞から無刺激状態で産生されているため、抗EGF抗体(100ng/ml)、抗KGF抗体(100ng/ml)を加え培養したが、細胞増殖能に対して有意な抑制効果は得られなかった。(3)歯肉由来線維芽細胞に対する細胞伸展刺激メカニカルストレスの効果細胞の伸展刺激により、一酸化窒素(NO)の産生が認められ、細胞伸展装置(スカラテック社、当講座所有)を用い、伸展率7%、0.25Hzの伸展刺激が最もNOを産生させることがわかった。この条件で合成酵素はiNOSであることがRT-PCR法で明らかにされた。2年で、培養した歯根嚢胞由来線維芽細胞についてIL-6の産生が、有意に高いことが証明された。がIL-6は口腔上皮粘膜細胞の直接の増殖能を促進せず、また、他の因子も口腔粘膜上皮細胞の増殖に直接関与していなかった。現在伸展刺激を用いて線維芽細胞の解析から嚢胞周囲の骨吸収、骨硬化についてNOの産生と骨改造の関与が証明されメカニカルストレスとの関与について解析する。本年は定量RP-PCR法による解析法の確立を行った。歯根嚢胞壁線維芽細胞内で発現しているIL-6 mRNAについて解析し、解析装置はロッシュ社ライトサイクラー(当講座既設)を用いた。定量RT-PCR法は、サンプルの間のmRNAの発現差の解析を目的としており、外部標準遺伝子を用いることで、発現量の絶対値が得られ比較が可能である。しかし、この定量RT-PCR法に用いる外部標準遺伝子は未だに、世界的に確立していない。そこで、今回、申請者は、この外部標準遺伝子として目的の遺伝子を大量生産し、これを用いて定量化を行った。目的の遺伝子は内部標準のPBGD遺伝子とヒトIL-6遺伝子を用いた。ヒトPBGD遺伝子及びヒトIL-6遺伝子は、正常ヒト線維芽細胞から発現しているmRNAを逆転写酵素でcDNAにし、それぞれのプライマーで増幅したPCR産物をTAクローニング法によって、ベクターBluescriptIISK(+)にPCR産物を組み込んだ。まず、ベクターをEcoRVで消化し、ベクターの3'末端にdTを付加し、PBGDのPCR産物を組み込み、さらに、SmaIで消化した後、同様にヒトIL-6遺伝子を組み込み、1つのベクターに内部標準遺伝子とIL-6遺伝子を組み込んだ。ベクターに正確に組み込まれたかどうか確認するためABI PRISM310(当大学既設)を用いて、組み込んだ遺伝子の塩基配列の確認を行った。サイトカイン産生通り、正常歯肉、正常歯根膜に比べ、歯根嚢胞壁線維芽細胞からのIL-6 mRNAの産生は有意に高かった。さらに、転写因子であるNF-IL-6, NF-κB, NF-IL-6βの解析が必要となるが、その上流域であるMAP kinase familyの解析をWestern blotting法(本年度申請品)で解析を試みている。今年は、症例が少なかったため、正常歯肉及び正常歯根膜細胞のついての解析だが、これらの細胞は、歯根嚢胞壁線維芽細胞のoriginになると考えられるため、大変意義のあることとなる。(3)歯肉由来線維芽細胞に対する細胞伸展刺激

メカニカルストレスの効果細胞の伸展刺激により、一酸化窒素(NO)の産生が認められ、細胞伸展装置(スカラテック社、当講座所有)を用い、伸展率7%、0.25Hzの伸展刺激が最もNOを産生させることがわかった。この条件で合成酵素はiNOSであることがRT-PCR法で明らかにされた。2年で、培養した歯根嚢胞由来線維芽細胞についてIL-6の産生が、有意に高いことが証明された。がIL-6は口腔上皮粘膜細胞の直接の増殖能を促進せず、また、他の因子も口腔粘膜上皮細胞の増殖に直接関与していなかった。現在伸展刺激を用いて線維芽細胞の解析から嚢胞周囲の骨吸収、骨硬化についてNOの産生と骨改造の関与が証明されメカニカルストレスとの関与について解析する。
オリゴデンドロサイトのシグナル伝達を指標とした損傷軸索再生の試み

本研究では、まずオリゴデンドロサイトに特異的なセリンプロテアーゼと考えられているmyelencephalon-specific protease(MSP)の虚血モデルと外傷モデルでの発現をmRNAと蛋白レベルで検討した。その結果、虚血周囲白質で虚血後3-7日をピークに、MSPがオリゴデンドロサイト様細胞に特異的に発現することを明らかにした。この場合白質での発現が白質への直接的な虚血によるものか、皮質虚血からの浮腫水の波及によるものかが問題となる。そこで白質損傷は全く起こらず、浮腫水のみが白質に波及する凍結脳損傷モデルを作成し、同様の検討を行った。その結果やはり損傷後5日目をピークとして、損傷部位と繊維連絡のある白質でのMSP mRNAと蛋白の発現がみられた。またMSP蛋白とオリゴデンドロサイトのマーカーであるCNPaseとの2重染色を行ったところ、MSP陽性細胞が確かにオリゴデンドロサイトであることを明らかにした。これらの結果から、MSPは白質に波及した浮腫水によってオリゴデンドロサイトに何らかの刺激がもたらされ、発現したものと判断された。またMSPの蛋白形成と分解の過程を推察するため、ウエスタンブロットを行ったところ、MSPには19kDaの低分子だけでなく、37,40,50kDaの高分子分画が存在すること、また37kDaの高分子分画は凍結損傷後6時間と5-7日目に2つの産生のピークがあることを明らかにした。これらは損傷初期の神経連絡を介したオリゴデンドロサイトへの刺激と、損傷後しばらくしてからの浮腫水の波及によるオリゴデンドロサイトへの刺激の2つの種類があることを示唆した。これらと類似の結果はくも膜下出血モデル、脳出血モデルでも得られた。オリゴデンドロサイトに特異的なセリンプロテアーゼであるmyelencephalon-specific protease(MSP)はオリゴデンドロサイトの増殖、ミエリンの分解と再生、神経突起の伸展やシナプスの可塑性に関連する。このMSPのcDNAを用いてラット脳虚血モデルでmRNA発現を解析すると、虚血周囲白質で3-7日をピークに、オリゴデンドロサイトに特異的に発現亢進がみられた(Uchida A, et al:Mol Brain Res)。また免疫染色用の抗体はMSP部分ペプチドを家兎に免疫して作成し、これをアフィニティ・カラムにかけて精製したものを用いた。ラットの局所脳虚血モデルでこの抗体を用いて解析したところ、MSPの蛋白発現は7日をピークとして、梗塞周囲の脳梁や内包にみられることを明らかにした。またミクロオートラジオグラフィーおよび免疫二重染色の結果、発現はオリゴデンドロサイトに特異的であることを明らかにした。次に凍結損傷による外傷モデルでも軸索損傷からの回復時期に一致してMSPが発現することを明らかにした。(Oka Y, Asai K, Yamada K, J Neurotrauma)。また蛋白発現でも時間経過は異なるが、類似の空間的広がりをもって損傷周囲の白質オリゴデンドロサイトに発現することを明らかにしている。このことから、MSPは軸索損傷後の修復再生活動のシグナル伝達指標として使用できることが明らかになった。現在MSP mRNAの発現をマーカとして、神経幹細胞移植や軸索再生促進因子の投与による軸索再生活動へのオリゴデンドロサイトの関与を検討中である。このことにより、従来マーカーに乏しくその役割が不明確であったオリゴデンドロサイトの再生活動への関与が明らかになることが期待でき、より効果的な再生や移植の方法が開発できることが期待できる。

その結果、虚血周囲白質で虚血後3-7日をピークに、MSPがオリゴデンドロサイト様細胞に特異的に発現することを明らかにした。この場合白質での発現が白質への直接的な虚血によるものか、皮質虚血からの浮腫水の波及によるものかが問題となる。そこで白質損傷は全く起こらず、浮腫水のみが白質に波及する凍結脳損傷モデルを作成し、同様の検討を行った。その結果やはり損傷後5日目をピークとして、損傷部位と繊維連絡のある白質でのMSPmRNAと蛋白の発現がみられた。またMSP蛋白とオリゴデンドロサイトのマーカーであるCNPaseとの2重染色を行ったところ、MSP陽性細胞が確かにオリゴデンドロサイトであることを明らかにした。これらの結果から、MSPは白質に波及した浮腫水によってオリゴデンドロサイトに何らかの刺激がもたらされ、発現したものと判断された。またMSPの蛋白形成と分解の過程を推察するため、ウエスタンブロットを行ったところ、MSPには19kDaの低分子だけでなく、37,40,50kDaの高分子分画が存在すること、また37kDaの高分子分画は凍結損傷後6時間と5-7日目に2つの産生のピークがあることを明らかにした。これらは損傷初期の神経連絡を介したオリゴデンドロサイトへの刺激と、損傷後しばらくしてからの浮腫水の波及によるオリゴデンドロサイトへの刺激の2つの種類があることを示唆した。これらと類似の結果はくも膜下出血モデル、脳出血モデルでも得られた。
膵インスリノーマ細胞の酸化ストレス応答と新規シグナル伝達分子機構の解明

本研究はがん細胞の酸化ストレス感受性を制御する因子を探索し、その分子機構を解析することにより、発がん過程における酸化ストレス感受性変化の分子機構とその病態的意義を明らかにすることを目的として行われた。高グルコース濃度特異的な酸化ストレス応答の解析。高グルコース濃度では過酸化水素による酸化ストレスのもとで、膵由来インスリノーマbTC細胞が、容易に細胞傷害を受けることを見い出した。がん細胞傷害様式について、細胞周期解析、Anexin Vの細胞表面発現、Tunel法などを通じて、apototicあるいはnecrotic damageの両方面から生化学的あるいは形態学的解析を進めたところ、細胞傷害様式は典型的なapoptosisとは異なり、Caspase3などの活性化は認められなかった。高グルコース濃度により制御されるシグナル伝達機構の解析。新規シグナル伝達分子pp54の精製と同定。PI3Kに結合するリン酸化チロシンをもつ分子として、分子量54kDaのpp54を、酸化ストレス応答制御に関わる分子として見い出した。pp54について、抗リン酸化チロシン抗体アガロースにより分離精製し、トリプシン消化ペプチドの質量分析を行ったところ、TGFb-II型受容体ファミリーのALK6が候補分子として同定できた。現在、その機能解析を続けているが、ALK6は直接にPI3Kシグナルの上流因子として機能する分子ではなく、PI3Kに結合するリン酸化チロシンをもつ分子の複合体の一部として同定された可能性を考えている。
足場非依存的な複製開始機構の解明

S期開始因子であるCdc6は、足場の有無に応じてタンパクレベルで発現の制御を受けており、これが足場依存的なG1/S期制御の最終ターゲット因子であろうと考えられる。Cdb6は、G2/M期そして休止期においてはユビキチン分解系による制御を受けている。一方、G1期におけるCdc6発現の消失は、プロテアソームの特異的な阻害剤であるラクタシスチンでは阻害すること出来ず、システインプロテアーゼファミリーの特異的阻害剤ALLNによって抑制することが出来る。このことからG1期におけるCdc6の発現制御は、ユビキチン系とは別にシステインプロテアーゼファミリーに属する酵素が行っているものと考えられた。我々はまず同ファミリーの中でもカルパイン類に着目し、Cdc6の分解活性のカルシウム依存性の有無を検討した。その結果、in vitroで合成したCdc6を基質とし、これに浮遊培養条件に移したNRK細胞抽出液(分解酵素が活性化している)と共に濃度を変えたEGTA、EDTAを加えた場合も、また逆にカルシウム濃度を上げた場合にもCdc6の分解活性に変化はなかった。このことからNRK細胞内で見られるCdc6の分解はカルシウム依存的なカルパイン類に依るものではないと結論付けられた。次に同ファミリーに属するカテプシン類について検討を開始した。カテプシンはリソソームプロテアーゼの総称であり、基質特異性などによってアルファベットで分類されている。多くのカテプシン類の中から最も可能性の高い酵素を選ぶため、細胞抽出液に種々の阻害剤を加えてCdc6の分解状態を検討した。その結果、シスタチンCによってCdc6の分解は効果的に抑制された。シスタチンCはカテプシンB,F,H,L,Sに対して特異的に作用する。別の阻害剤の実験によってカテプシンBの可能性も削除出来たことから、残るカテプシン類が候補因子となる可能性が高いと考えられた。実際、この中の市販の精製タンパクが存在する幾つかは、in vitroでCdc6と直接反応させる実験においても、分解活性を持つことが確認された。
遺伝子導入による老化肝若返りによる移植肝の肝再生促進、肝虚血再灌流障害克服

生体肝移植でドナーが老年の場合、生着率が悪いため、本研究では肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目、虚血再灌流障害に対し、抗老化遺伝子群の発現、制御を検討した。結果:生体肝移植において、肝内マクロファージを測定、若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)では、マクロファージが少なく、感染症発症を多く認めた。高齢マウスと若年マウスに群別して、虚血再灌流モデルを用いて、肝障害、組織中の抗老化遺伝子発現、炎症性サイトカイン、抗酸化物質を比較検討した。抗酸化物質投与後、高齢群、若年群とも抗老化遺伝子増加は認めなかった。抗酸化物質投与により、肝障害の軽減、抗炎症効果に差を認めなかった。目的:生体肝移植でドナーが老年の場合、移植された肝臓が再生しにくく生着率が悪いことが知られている。しかし、未だに画期的な改善方法が確立していない。そこで本研究では、肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目し、生体肝移植の際に生じる虚血再灌流障害と肝再生不全に対し、それら抗老化遺伝子群の発現制御がどのような効果をもたらすのかを明らかにする。方法と結果:まず当科で施行した生体肝移植216例中、50歳以上ドナー(高齢ドナー)からの肝移植は49例施行した。その成績は、1/3/5年生存率73.1/59.3/50.5%であり、それ以外のドナー(49歳以下)と比較して、有意に低値であった。その原因を検索すべく、ドナー肝ゼロ生検を用いて、肝内マクロファージ(CD68陽性細胞)を測定した。若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)では、CD68陽性細胞は有意に数が少なかった。高齢ドナーを使用した肝移植では、CD68陽性細胞12未満の症例で、有意に12以上の群よりグラフト生存率が低下していた。また、有意に感染症発症を多く認めた。多変量解析では、グラフト不全に関わる因子は、ドナー肝内CD68陽性細胞12未満であった。考察:高齢ドナーからの肝グラフトでは、肝内マクロファージが低下している。その中でも、特に低下しているグラフトでは、肝移植後の感染症も多く、グラフト不全を有意に引き起こしていた。今後、高齢ラットでの虚血再灌流障害に老化遺伝子がどのように関わっているか、検討する。そこで本研究では、肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目し、虚血再灌流障害と肝再生不全に対し、それら抗老化遺伝子群の発現制御がどのような効果をもたらすのか、また抗酸化物質(レスベラトロール)が虚血再灌流障害を改善しないかを明らかにする。方法と結果:1.生体肝移植症例中、50歳以上ドナー(高齢ドナー)からの肝移植は49例施行した。ドナー肝ゼロ生検を用いて、肝内マクロファージ(CD68陽性細胞)を測定した。若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)では、CD68陽性細胞は有意に数が少なく、有意に感染症発症を多く認めた。2.高齢マウスと若年マウスに群別して、虚血再灌流モデルを用いて、A.肝切除のみ、B.虚血再灌流+肝切除、C.レスベラトロール内服+虚血再灌流+肝切除で肝障害、組織中のSirt1発現、炎症性サイトカイン(TNFα, IL-6, IL-1β)、抗酸化(HO-1)を比較検討した。レスベラトロール投与後、高齢群、若年群ともSirt1増加は認めなかった。レスベラトロール投与により、肝障害の軽減、抗炎症効果に差を認めなかった。今後、高齢ラットでの虚血再灌流障害に老化遺伝子どのように関わるのか、抗酸化薬により再還流障害が軽減出来ないか、検討を続けていく。高齢マウスの週数が50週であり、若干高齢とは言えない可能性がある。そのためか、老化遺伝子SIRT1の発現は、レスベラトロール投与前でも低下していなかった目的:生体肝移植でドナーが老年の場合、移植された肝臓が再生しにくく生着率が悪いことが知られている。しかし未だに画期的な改善方法が確立していない。本研究では、肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目、虚血再灌流障害と肝再生不全に対し、それら抗老化遺伝子群の発現制御がどのような効果をもたらすのか、また抗酸化物質(レスベラトロール)が虚血再灌流障害を改善しないかを明らかにする。若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)ではCD68陽性細胞は有意に数が少ない群では生存率が低下していた。

高齢レシドナーでのグラフト不全に寄与する因子はドナー肝内CD68陽性細胞12未満であった。2.高齢マウスと若年マウスに群別して、虚血再灌流モデルを用いて、A.肝切除のみ、B.虚血再灌流+肝切除、C.レスベラトロール内服+虚血再灌流+肝切除で肝障害、組織中のSirt1, FOXO発現、炎症性サイトカイン(TNFα, IL-6, IL-1β)、抗酸化(HO-1)を比較検討した。レスベラトロール投与後、高齢群、若年群ともSirt1増加は認めなかったが、FOXO遺伝子は若干高齢マウスで増加していた。レスベラトロール投与により、肝障害の軽減、抗炎症効果に差を認めなかった。考察:高齢ドナーの肝グラフトでは肝内マクロファージが低下、特に低下している群では有意に生存率が低下していた。抗老化薬、遺伝子導入により、高齢マウスでの虚血再灌流障害軽減が可能か、今後検討を続けていく。高齢マウスの週数が50週であり、若干高齢とは言えない可能性がある。そのため、現在高齢ラットを飼育し、今後の検討を行っていく。抗老化遺伝子(FOXO遺伝子)の導入を、今後検討していく必要がある。目的:生体肝移植でドナーが老年の場合、移植された肝臓が再生しにくく生着率が悪いことが知られている。しかし、未だに画期的な改善方法が確立していない。そこで本研究では、肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目し、虚血再灌流障害と肝再生不全に対し、それら抗老化遺伝子群の発現制御がどのような効果をもたらすのか、また抗酸化物質(レスベラトロール)が虚血再灌流障害を改善しないかを明らかにする。方法と結果:1.生体肝移植症例中、50歳以上ドナー(高齢ドナー)からの肝移植は49例施行した。ドナー肝ゼロ生検を用いて、肝内マクロファージ(CD68陽性細胞)を測定した。若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)では、CD68陽性細胞は有意に数が少なく、有意に感染症発症を多く認めた。多変量解析では、グラフト不全に関わる因子は、ドナー肝内CD68陽性細胞12未満であった。2.高齢マウスと若年マウスに群別して、虚血再灌流モデルを用いて、A.肝切除のみ、B.虚血再灌流+肝切除、C.レスベラトロール内服+虚血再灌流+肝切除で肝障害、組織中のSirt1発現、炎症性サイトカイン(TNFα, IL-6, IL-1β)、抗酸化(HO-1)を比較検討した。レスベラトロール投与後、高齢群、若年群ともSirt1増加は認めなかった。レスベラトロール投与を行い、虚血-再灌流傷害、肝切除を施行した群で、明らかな炎症性サイトカインの改善は、認めなかった。考察:高齢ドナーからの肝グラフトでは、肝内マクロファージが低下、特に低下しているグラフトでは、グラフト不全を有意に引き起こしていた。今回、抗酸化物質(レスベラトロール)による老化遺伝子の発現は上昇せず、虚血再灌流障害による肝切除後の炎症サイトカインや抗酸化を改善しなかった。生体肝移植でドナーが老年の場合、生着率が悪いため、本研究では肝臓の老化を支配する抗老化遺伝子群に着目、虚血再灌流障害に対し、抗老化遺伝子群の発現、制御を検討した。結果:生体肝移植において、肝内マクロファージを測定、若年ドナー(20歳代)と比べると、高齢ドナー(50歳以上)では、マクロファージが少なく、感染症発症を多く認めた。高齢マウスと若年マウスに群別して、虚血再灌流モデルを用いて、肝障害、組織中の抗老化遺伝子発現、炎症性サイトカイン、抗酸化物質を比較検討した。抗酸化物質投与後、高齢群、若年群とも抗老化遺伝子増加は認めなかった。
転写伸長機構に着目したマイクロサテライトリピート伸長病の治療開発

これまでの我々の研究において、脊髄小脳失調症36型(SCA36)における非翻訳領域GGCCTGリピート伸長変異、およびc9orf72連鎖性筋萎縮性側索硬化症/前頭側頭型認知症(c9-ALS/FTD)におけるGGGGCCリピート伸長変異を導入し、これらの疾患の病態を反映する培養細胞モデルの作成を行った。本研究においては、これらの培養細胞モデルに加えて、商業目的で購入・利用が可能な各種のマイクロサテライトリピート伸長病患者由来の線維芽細胞を対象とし、これらの疾患の病態解明および治療開発を目指して様々な検討を順次遂行していく。
ネコ・ウサギの副交感神経細胞に発生する膜電位・膜電流振動のメカニズムの解析

本研究の目的は哺乳動物の副交感神経細胞に賦与されている二つの極性の異なる振動子の機序とその調節を電気生理学的に解明することであった。本補助金で購入した器具等を用いて多くの成果を上げることができた。ウサギ膀胱神経節細胞に発生する過分極性膜電位振動(SH)の振動子は細胞質Ca濃度([Ca]_c)の振動で、それにより形質膜Ca依存性イオンチャネルの周期的開閉が起こることを提示した。静止電位で活性化しているCa influx、細胞内Ca貯蔵部位からのCa誘起性Ca放出及びCa取り込み機構が連関して[Ca]_cの振動が起こるモデルを構築した。ネコ結腸神経節細胞に発生する脱分極性膜電位(DMO)の主たるイオン機序はテトロドトキシン感受性、膜電位依存性Naチャネルの活性化によることを示した。振動子はこのNaチャネルが示す負性抵抗に基づくことを示唆した。SH及びDMOは各々シナプス伝達の減衰器及び増幅器として機能しており、種々の生体内活性物質がそれらの作動状態を調節している。SHはエンドセリンによりサイクリックGMPを介して増強される。またα_2及びマスカリン受容体の活性化により各々DMOの抑制及び増強が起こり、神経細胞の興奮性が機能的に変換されることを明らかにした。これらは自律神経系に於ける情報処理に“振動子とその調節による"機構があることを初めて実証したものである。また一般に神経細胞膜の等価回路に発振器及び作動・停止スイッチを組み込むことでより高度な情報処理が可能になることを示唆した。本研究で提示した二つのモデルは決して特殊なものではなく、これらに含まれる細胞装置は中枢神経系にも広く分布しており、それらの機能解明の糸口となると考えられる。また比較生理学的視点より振動子局在には種特異性、部位特異性のあることを示した。本年度の主たる研究目的は、哺乳動物神経細胞に賦与されている電気的振動子の機序解明であった。本助成金により購入した三次元水圧式マニピュレーター等を用い、より安定した記録を得ることに成功し、以下の成果を挙げることができた。1.ウサギ膀胱神経節細胞:過分極性膜電位振動モデルの構築。(1)細胞外から細胞内への緩徐な持続性カルシウム(Ca)流入が起こる。(2)細胞質Ca濃度がある閾値を越えると、細胞内Ca貯蔵部位からCa誘起性Ca放出(CICR)が起こり、細胞質Caが急激に増大する。(3)増大したCaはCaポンプを活性化又は促進し、Caは速やかに元のレベルに回復する。(1)-(3)の繰り返しにより細胞質Ca濃度の振動が発生するらしい。その振動に同期してCa依存性Kチャネル活性化及びCa依存性Clチャネルの不活化が起こり、膜電位・膜電流振動が発生している。以上を電気生理学的・薬理学的実験に基づき結論した(Soc.Neurosci.Abstr.Vol.18,1503,1992)。これらは生理的条件下の神経細胞での初めての研究成果である。2.ネコ結腸神経節:脱分極性膜電位振動(DMO)の発生機序。DMOはナトリウム(Na)チャネルの活性化により発生することが判明した。このNaチャネルはテトロドトキシン感受性があるが、不活性化がない(或いは非常に遅い)ことから、活動電位発生に関わるNaチャネルとは異なると考えられる。又、DMOは外液のCaに依存していることも判明した。しかし、CICR阻害剤(ライアノジン・プロカイン)やCaポンプ阻害剤(サイクロピアゾニン酸)が無効であり、1.のウサギ神経細胞の膜電位振動とは全く異なるCa依存機序が介在しているものと考えられる。

これらの知見も、自律神経細胞では過去に報告例はない。本年度の主たる研究目的は、昨年度までに解明したネコ・ウサギの副交感神経細胞に賦与されている振動子の生理的な調節機序について解明することであった。本補助金で購入したマニピュレーター等を駆使して以下の成果を挙げることができた。(1)昨年度示した振動モデルを基にして細胞外Mg^<2+>によるSH発生間隔の調節が、静止レベルでのCa^<2+>influx rateをかえることで説明し得た。又このCa influxがT-,N-,L-Caチャネルとは異なるが膜電位依存性であることを示した。(2)カフェインの作用が振動モデルのCICRの発生閾値を下げることで説明し得ることを示した。(3)エンドセリン・ATPがSHの調節因子たることを示した。特にエンドセリンはcyclic GMPに依存した系を活性化することによりSHを増強或いは新たに出現させ得ることを示した。2.ネコ結腸神経節細胞:脱分極性膜電位振動(DMO)の調節。(1)以前に、無Ca/高Mg溶液及びEGTA注入の作用に基づいてDMOがCa依存性であることを指摘したが、その後これらのデータはCaの作用というよりMgの作用であることを見いだした。(2)内因性のアセチルコリンが、シナプス下膜外にあるマスカリン受容体を活性化することにより休止状態にあるDMOを作動状態とし、quiescent neuroneをspontaneously discharging neuroneに機能的に変換することを見いだした。(4)エンドセリンがET_B受容体を介してDMOを増強し得ることを示した。本年度、多くの物質が振動子の作動状態を調節することを示し、振動子を作動或いは休止状態にするスイッチが実在することを証明できた。多くの神経細胞がその興奮性により分類されてきたが、それら興奮性の相違は振動子の作動状態による機能的なもので本来は単一の細胞群である可能性を指摘したい。
低酸素症における胎仔脳保護機構:in vivoイメージング法による解析

胎児脳は低酸素に対して強いことが知られている。特に分娩時において、胎児脳は長時間の間欠的低酸素状態となるが、生後、殆どの場合重篤な後遺症は見られない。私たちはその生理的メカニズムを明らかにするためにグルタミン酸受容体の関与に焦点をしぼり、以下の実験を行ったので報告する。母体ラットと臍帯でつながった胎仔(胎生22日目)を用いて、臍帯結紮による低酸素実験モデルを作製した。低酸素負荷時の胎仔上丘の細胞内Caイオン動態を光学的イメージング法により測定した。実験に際して、母体と胎仔をウレタン麻酔した(腹腔内投与)。胎仔上丘の吻側部に双極刺激電極を留置した。電気刺激は13mA(1、10Hz)で行った。[Ca2+]iの変化はCaイオン感受性蛍光色素(Fura-2)を用いて、光学的イメージング法により解析した。1)胎仔上丘の電気刺激により、[Ca2+]iは急峻に上昇し、その後緩やかに元のレベルに戻った。この反応の最大値と持続時間は刺激強度に比例した。non-NMDA受容体の阻害剤(CNQX)投与によって、反応は減弱した。さらにNMDA受容体阻害剤(AP-5)投与により反応はほとんど消失した。最初の早い反応はCNQXにより阻害された、それに続く緩やかな反応はAP-5により大きく阻害された。GABA受容体阻害剤のビククリンを前投与すると反応はわずかに増強した。2)臍帯結紮によって、胎仔上丘の[Ca2+]iは緩やかに上昇した。結紮解除後、ゆっくりと回復した。CNQXの前投与によって、[Ca2+]iの上昇は減少、さらに、AP-5投与により大きく減少した。3)臍帯結紮解除から3時間後、臍帯結紮によって[Ca2+]iの上昇反応はみられなかった。また、電気刺激によって、[Ca2+]iは一過性に増加し、これに続く緩やかな反応は殆ど消失した。この一過性の反応はCNQXにより阻害された。以上の結果から、胎仔脳は低酸素負荷の早い時期ではCaイオンはNMDA受容体を介して細胞内に流入する、しかし時間が経過するとNMDA受容体は機能しなくなることが示唆された。胎仔脳は低酸素に対して、NMDA受容体の機能を抑制することにより、過剰なCaイオンの流入による神経細胞の障害を防ぐための防御機構をもっていることが考えられる。発達期の脳は低酸素症に対して強い保護機構を持つことがよく知られている。しかし、そのメカニズムは多くの研究があるにもかかわらず明らかではない。私たちは、母体と臍帯でつながった胎仔のin vivo実験系をすでに開発している。この実験系を用いて、低酸素に対する胎仔脳の保護機構について研究を行った。本年度は低酸素負荷時の胎仔上丘の細胞内Caイオン濃度変化を調べた。

低酸素負荷は臍帯を微少クリップで結紮(510分間)することによって行った。結紮解除後は血管拡張剤(パパベリン)を結紮部に塗布することによって再還流した。細胞内Caイオンのプローブ(Fura2-AM)を胎仔上丘の表面に滴下し、90分間ロードした。細胞内Caイオン濃度変化は2波長方式(340/380nm)のCa画像測定装置(HiSCA)によって測定した。臍帯を結紮すると短い潜時(30秒)で細胞内Caイオン濃度は緩やかに増加(1020%)した。臍帯の結紮を解除すると徐々にもとのCaイオン濃度レベルに戻った。このCaイオン濃度の増加はNMDA受容体阻害剤(AP-5,100300μM)の前投与によって阻害された(5例)。しかし、non-NMDA受容体阻害剤(CNQX,100300μM)によっては殆ど影響されなかった(5例)。これらの結果は、低酸素時において上丘の細胞内Caイオン濃度の増加はNMDA受容体を介したCaイオンの流入によることを示唆している。また、in vitroの実験系と比較するために、胎仔脳スライス標本を用いて、低酸素時の細胞内Caイオン濃度の観察を試みている。今後、さらに例数を増やし詳細に検討するとともに、細胞内シグナル伝達系の関与についても検討を加えて行かなければならない。胎児脳は低酸素に対して強いことが知られている。特に分娩時において、胎児脳は長時間の間欠的低酸素状態となるが、生後、殆どの場合重篤な後遺症は見られない。私たちはその生理的メカニズムを明らかにするためにグルタミン酸受容体の関与に焦点をしぼり、以下の実験を行ったので報告する。母体ラットと臍帯でつながった胎仔(胎生22日目)を用いて、臍帯結紮による低酸素実験モデルを作製した。低酸素負荷時の胎仔上丘の細胞内Caイオン動態を光学的イメージング法により測定した。実験に際して、母体と胎仔をウレタン麻酔した(腹腔内投与)。胎仔上丘の吻側部に双極刺激電極を留置した。電気刺激は13mA(1,10Hz)で行った。[Ca2+]iの変化はCaイオン感受性蛍光色素(Fura-2)を用いて、光学的イメージング法により解析した。1)胎仔上丘の電気刺激により、[Ca2+]iは急峻に上昇し、その後緩やかに元のレベルの戻った。この反応の最大値と持続時間は刺激強度に比例した。non-NMDA受容体の阻害剤(CNQX)投与によって、反応は減弱した。さらにNMDA受容体阻害剤(AP-5)投与により反応はほとんど消失した。最初の早い反応はCNQXにより阻害された、それに続く緩やかな反応はAP-5により大きく阻害された。GABA受容体阻害剤のピククリンを前投与すると反応はわずかに増強した。2)臍帯結紮によって、胎仔上丘の[Ca2+]iは緩やかに上昇した。結紮解除後、ゆっくりと回復した。CNQXの前投与によって、[Ca2+]iの上昇は減少、さらに、AP-5投与により大きく減少した。3)臍帯結紮解除から3時間後、臍帯結紮によって[Ca2+]iの上昇反応はみられなかった。また、電気刺激によって、[Ca2+]iは一過性に増加し、これに続く緩やかな反応は殆ど消失した。この一過性の反応はCNQXにより阻害された。