hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
II型糖尿病発症病因としての膵B細胞増殖能障害の重要性

その結果以下のような結論を得た。(1) OLETF胎児ラ氏島様細胞集塊のB細胞への分化・増殖を対照ラットLETOと比較し、OLETFラット膵B細胞増殖能障害が素因に由来するか否かを明らかにしようとした。その結果、OLETFラットにおいてB細胞への分化・増殖は胎児期から障害されており、この異常が素因に由来する可能性が高いことが明らかとなった。(2) OLETFラット幼若期より認められる高脂血症の膵B細胞機能・B細胞量に及ぼす影響について検討し、インスリン分泌障害への高脂血症の二次的関与の可能性を明らかにしようとした。その結果、FFA、TGがブドウ糖によるインスリン分泌能を抑制し、また、OLETFラット膵ラ氏島に大量に脂肪滴が沈着していることが明らかになり、高脂血症がOLETFラット膵B細胞機能障害、B細胞量減少に関与する可能性が示唆された。(3)糖尿病状態が膵ラ氏島を灌流する毛細血管網を変化させ、それがB細胞機能障害、B細胞量減少を二次的に惹起する可能性を明らかにしようとした。その結果、OLETFラットラ氏島細小血管網は粗で枯枝状となり、血流障害は明らかで、この変化が本ラットのB細胞機能障害、B細胞量減少に関与していると結論した。(4) OLETFラットに認められた膵B細胞増殖能障害が他の2型糖尿病モデル動物にも認められる普遍的現象であるか否かを明らかにするため、Wistar fattyラットを用いて検討した。その結果、Wistar fattyラットも膵B細胞増殖能が障害され、B細胞量も減少していることが明らかとなり、膵B細胞増殖能障害が2型糖尿病モデル動物の普遍的現象である可能性の高いことが明らかとなった。
翻訳制御への役割が期待される新規GTP結合蛋白質GSPTの機能解析

GSPTは、翻訳伸長因子EF1αと相同なC末端側領域に加えて、ユニークなN末端領域を有する。先に我々は、GSPTがC領域を介して終止コドンを直接認識する翻訳終結因子eRF1と結合しリボソームA部位に運搬するeRF3として機能することを証明した。この翻訳終結因子としての機能にはC末端領域のみで十分であり、N末端領域の役割については全く不明であった。我々はN領域においてポリA尾部結合蛋白質であるPABPと相互作用し、その機能を制御することを見出した。本研究においては、主に酵母を用いた遺伝学および生化学的解析から、GSPTによるPABPを介した遺伝子発現制御機構について検討を加えた。その結果、GSPTはPABPとの結合を通して(1)mRNA分解の律速段階であるポリA尾部の短縮化においてmRNAの分解を制御すること、(2)翻訳を終えたリボソームを次のサイクルの翻訳開始にリクルートするShuntingを制御すること見い出した。従って、GSPTはCドメインを介して翻訳終結反応を遂行した後、NドメインでのPABPとの相互作用を介して次のサイクルの翻訳開始と、翻訳を終えたmRNAの分解過程への移行を厳密に制御していることが明らかになった。また、GSPTと最も近縁のeRFSがCドメインを介して、eRF1と類似の構造を有する新規の因子eRFLと会合し翻訳の制御において機能すること、またNドメインを介してmRNAの分解に関わるAU rich配列結合因子であるグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)と機能的に相互作用するという知見を得た。さらに別のG蛋白質Ski7は、そのN領域を介してmRNAの3'側方向からの分解に介在するSki複合体とエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソソーム複合体に結合することを見出した。このように、GSPTファミリーに属するG蛋白質は、翻訳の制御に共役した形でそのN領域を介してmRNAの動態を調節するという、共通した遺伝子発現制御機構の存在が明らかにされた。GSPTファミリーの遺伝子産物は,翻訳伸長因子eEF1Aと相同なC末端側領域に加え,ファミリー間で相同性の低いN末端領域をもつ。我々は,先にGSPTがC領域を介して翻訳終結因子eRF1と結合するeRF3として機能することを,さらにN領域を介してpoly(A)結合蛋白質PABPの機能を制御することを見出した。本研究においては,酵母を用いた解析から,GSPTがN領域を介してmRNAの分解を制御することを証明した。mRNA分解の律速段階はポリA尾部の短縮化にあるが,GSPTのN領域の欠失変異体ではmRNAのポリA鎖の短縮化が阻害され,GSPTはN領域を介したPABPとの相互作用によりmRNAの分解を制御していることが示された。従って,GSPTはmRNAの翻訳の最終段階である翻訳終結において,C領域を介してeRF1を終止コドンに運搬し翻訳終結反応を行った後,N領域を介してPABPと相互作用して,翻訳を終えたmRNAの分解を制御するという合目的的な役割を担うと考えられる。また,GSPTと近縁の遺伝子産物であるHBS1においては,N領域に結合する因子としてmRNAのAU rich配列結合蛋白質でもあるグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を見出したが,本研究においてHBS1破壊株を作製し,mRNA分解過程に及ぼす効果について検討した結果,破壊株においてはAU rich配列を有するmRNAの半減期の延長が観察された。

さらに精製蛋白質を用いた生化学的解析から,AU rich RNAへのGAPDHの結合に対してHBSは阻害的に働くことが示され,HBSはmRNA AU rich配列に結合しているGAPDHを引き剥がし,mRNAの分解促進に働くことが見出された。このようにN領域を介したmRNA動態の制御は,GSPTファミリーに属する他のGTP結合蛋白質においても確認しており,このファミリーに共通の作用機序であると考えられる。G蛋白質GSPTファミリーは、翻訳伸長因子EF1αと相同なC末端側領域に加えて、ファミリー間で相同性の低いN末端領域を有する。先に我々は、GSPTがC領域を介して終止コドンを認識する翻訳終結因子eRF1と結合し、eRF3として機能することを、さらにN領域を介してポリA尾部結合蛋白質であるPABPの機能を制御することを見出した。本研究においては、主に酵母を用いた解析から、GSPTファミリーによるmRNAの分解制御について検討を加えた。mRNA分解の律速段階はポリA尾部の短縮化にあるが、GSPTのN領域欠失変異体では、mRNAのポリA鎖の短縮化が阻害され、それに引き続くmRNA分解が遅延した。すなわち、GSPTは翻訳終結において、そのC領域を介してeRF1を終止コドンに運搬して翻訳を終結させた後、さらにN領域を介してPABPと相互作用し、翻訳を終えたmRNAの分解を促進するという、GTP蛋白質が介する新規のシグナル伝達経路が証明された。また、GSPTと近縁のG蛋白質であるSki7は、そのN領域を介してmRNAの3側方向からの分解に介在するSki複合体とエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソソーム複合体に結合することを見出した。さらに別のG蛋白質HBS1においては、その破壊株でAU rich配列を有するmRNAの半減期が遅延し、HBS1のN末端にはAU rich配列結合蛋白質であるグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)が結合する知見を得た。AU rich配列へのGAPDHの結合は、HBSによって阻害されるので、HBSはmRNA AU rich配列に結合しているGAPDHと競合して、mRNAの分解を促進する可能性が高い。このように、GSPT(eRF3)ファミリーに属するG蛋白質は、そのN領域を介してmRNAの動態を調節するという、共通した制御機構の存在が明らかにされた。
経済連携・統合によるスピルオーバー効果の実証分析ー欧州と東アジアの比較ー

政策的な自由貿易等の経済統合プロセスの深化は、各国経済の生産要素移動や産業構造に大きな影響を与える。本研究では、ヨーロッパの経済統合とアジア、特にアセアン地域で始まろうとしている経済統合プロセスの深化によって、一国の経済政策や企業の取り組みが、他国にどのような効果を及ぼすのか、理論的背景を整理し、実証的に分析を行った。特に本研究では、経済統合・自由貿易地域において、一国が資本蓄積を進め、経済発展に成功する反面、資本蓄積が進まず、経済の停滞が起こっている国の存在を確認することができた。ここでは、複数錐型HOモデルを使った実証分析により、国家間の連動性と産業構造上の格差を明示することに成功した。ヨーロッパにおける経済統合、とくに通貨統合地域におけるマクロ経済政策上のスピルオーバー効果について研究を進めている。経済学分野のこれまでの先行研究では、財政政策の重要な一側面であ財政移転について多くの分析が行われてきたが、基本的なマクロ経済政策としての財政政策、すなわち景気刺激策としての財政支出の拡大に関するノーマティブ(nomative)な議論は十分に行われてこなかった。本研究で扱うIS-LMモデルは、Branchard [2006]6やMankiw [2010]7等で扱われているものを基本としている。ただし、経済統合地域への応用を踏まえて、国際資本移動、さらには為替制度(変動相場・固定相場)の違いを組み入れたマンデル=フレミング・モデルを修正したCaves et al. [2005]に基づいてモデルを定式化する。はじめに、ベースラインとなる基本的なIS-LMモデルについて説明し、IS-LMモデルの政策的インプリケーションについて解説する。続いて経済統合を念頭に置き、固定相場制のもとにおけるマンデル=フレミング・モデル(2国モデル)を説明する。基本的なマンデル=フレミング・モデルでは、各国の中央銀行(貨幣当局)は自律的な金融政策を行えると想定している。そこでマンデル=フレミング・モデルの枠組みを応用することにより、2ヶ国間で通貨統合・金融政策統合が行われた場合、一国の財政政策が通貨同盟の多国に対してどのような効果を及ぼすのか分析を進めている。特に、他国が直面するであろう政策上の問題について考察を進めている。研究課題「経済連携・統合によるスピルオーバー効果の実証分析ー欧州と東アジアの比較ー」の初年度として、平成24年度には大きく分けて以下の二点に関して研究を進めた。一つは、ヨーロッパの経済統合に関するスピルオーバー効果を分析する基盤として、本研究の連携研究者であるドイツ・フライブルグ大学経済学部のOliver Landmann教授とヨーロッパ経済の現状分析を行った。具体的には、EUROZoneに属する国々で起こっている不均衡について、フィリップス曲線の概念を用い、域内でどのような連動性が見られるのか実証的に分析を行った。結果として、ドイツを筆頭にした先進国とギリシャやポルトガルなどの後進国との間では、フィリップス曲線の傾きに格差があることがわかった。これは、金融政策を統合したことによる経済の連動性の裏に、財政政策の差異や各国の産業構造や経済レベルの差がぞんざいしており、域内のアンバランスを生み出しているということがわかった。本研究内容は、平成24年9月17日に名古屋大学で開催されたThe 25th Freiburg-Nagoya Joint Seminarにおいて報告した。二つ目は、アジアの経済連携に関するスピルオーバー効果を分析する基盤として、研究連携者である韓国・忠南大学経済学部のJeong Seeun准教授と、東アジアの国々における産業構造比較と生産性の収斂について研究・分析を行った。本研究は、以下のように査読論文として公刊に至った。平成26年度は、経済統合地域の労働移動の特徴や経済成長への効果について研究を進め、特にEUの経験を基にアセアン地域での労働移動の促進要素と阻害要因の解明を目標とした。ASEANに加盟する10か国は、経済統合を念頭に置いたASEAN Economic Community(AEC)を2015年に開始すると公表している。AECの工程表となるBlueprint(2007)に記されている4つの柱の一つは「単一市場と生産基地」である。「単一市場と生産基地」の中でさらに細分化された項目の一つに(A5)"Free flow of skilled labour"「高い技術を持った労働者の自由移動」がある。ここでは、財・サービス、さらに投資が自由に国境を超えることを認めるため、それに従事する労働の移動を促進すべきえあることが謳われている。この項目において注目すべきは、"Free flow of labour"、つまり「全ての労働者の自由移動」ではなく、"skilled labour"高い技術を持った労働者のみの移動を明示している点である。この"skilled labour"を企業目線で考えると、これは高い技術を持ったエンジニアや経験を積んだマネジメントクラスの人材を指すと考えられる。本研究では、AECによって進められるASEANの市場統合、特に労働市場の統合とその効果に着目し分析を進めた。ここでは、経済統合理論やEUの経験を踏まえ、AECによる労働市場の統合がどのような効果・影響を及ぼすのかを予測し、企業の人事戦略がどのように変化するのか分析することを目的とした。今年度は、これまでのヨーロッパに関する研究を踏まえ、アジアの分析を行った。特に、ASEAN Economic Community(AEC)によって進められるASEANの市場統合に関して、労働市場の流動性に着目し、そのスピルオーバー効果について分析を行った。ここでは、経済統合理論やEUの経験を踏まえ、AECによる労働市場の統合がどのような効果を及ぼすのか予測した。

AECによるアセアン地域の経済統合プロセスはアセアン加盟国の市場統合を促し、企業戦略の変革をもたらすものであると考えた。つまり、AECの進展により域内の企業は対応策としてリストラを行い、効率的な生産や物流活動を行うとともに、人材育成や人事制度にも構造的な展開が必要になると考えた。この予測をもとに、企業の人事戦略がどのように変化するのか分析を行った。また、複数錐型ヘクシャーオリンモデル(HOモデル)を理論的背景とし、自由貿易地域における産業構造の発展について、国の枠組みを超えたスピルオーバー効果の分析を行った。特に今年は、Schott(2003)やKiyota(2014)を参考に、生産関数に基づく理論展開の整理を行うとともに、実証展開の可能な国や地域のデータ整理を行った。本研究における期間全体と通じた研究成果としては、ヨーロッパの経済統合が進むとともに顕在化する国ごとの格差や経済発展の連携問題がより明確に把握できる手法が把握できた。また、アセアンを中心にアジアでの経済統合も進む中、スピルオーバー効果の意義が大きくなりつつあり、今後の研究課題への基盤を形成することができた。政策的な自由貿易等の経済統合プロセスの深化は、各国経済の生産要素移動や産業構造に大きな影響を与える。本研究では、ヨーロッパの経済統合とアジア、特にアセアン地域で始まろうとしている経済統合プロセスの深化によって、一国の経済政策や企業の取り組みが、他国にどのような効果を及ぼすのか、理論的背景を整理し、実証的に分析を行った。特に本研究では、経済統合・自由貿易地域において、一国が資本蓄積を進め、経済発展に成功する反面、資本蓄積が進まず、経済の停滞が起こっている国の存在を確認することができた。ここでは、複数錐型HOモデルを使った実証分析により、国家間の連動性と産業構造上の格差を明示することに成功した。本研究課題では、政策的に進む生産要素の国際移動自由化とそのスピルオーバー効果に焦点を当て、経済の国際化がどのような効果を起こしているのかについて実証分析を進めている。特に、経済統合すでに進んでいるヨーロッパと、経済成長が著しい東南アジアを分析対象として比較研究を進めている。ヨーロッパの分析に関しては、生産要素を背景とした産業構造変化の分析を進めており、平成27年度中に学会報告や論文の発表を計画している。ここでは、新古典派のH-O-Vモデルを基本とした実証分析を展開し、生産要素の移動と産業構造や経済成長への効果について研究を進めている。また、平成26年度に力を入れた東南アジアの経済統合に関する研究も順調に進んでいる。特に、平成27年(2015年)にASEAN Economic Community(AEC)が発足し、経済統合が政治的に促進される中で、生産要素、特に労働移動がどのような影響を受けるか研究を進めている。
自動車用インテリジェントホイールの開発

本研究の目的は,制動時の自動車の運動エネルギーを蓄え,発進時にそのエネルギーを回生することによって省エネルギーを実現することである.平成12年度は,予備実験モデルを製作し,2個のフライホイールの間で運動エネルギーの転送テストした.自動車側ホイールからの回転エネルギーをDCモータによって電気エネルギーに変換して,その電気エネルギーで別のモータを駆動し回転エネルギーとして蓄える事が調査できた.予備実験結果から,供給した全エネルギーの10%程度しか回収できないことが明らかになった.これは,一旦電気エネルギーに変換し,さらに運動エネルギーに変換するというプロセスによってエネルギーロスが起こっていると考えられた.平成13年度は,制動時の運動エネルギーの多くを回収するために,ホイール回転エネルギーをDCモータによって電気エネルギーに変換させ,それをコンデンサーに蓄えることを試みた.ここで,コンデンサーにエネルギーを蓄える場合,発電機であるDCモータの発生電圧とコンデンサーの蓄電圧が平衡してしまうと,もはやエネルギーは蓄えられない.そこで,コンデンサーを多数用意し,満充電されたコンデンサーから空のコンデンサーに回路をつなぎ替えて次々にエネルギーを蓄えて行く事でより多くのエネルギーを回収することを目指した.実験の結果,コンデンサーに電気が蓄えられ,そのエネルギー回生が出来ることが分かった.コンデンサーの切り替えタイミングは回路の時定数によって決定することで効率良くエネルギーを蓄積することが出来た.課題として既存のハイブリッドカーよりもコンデンサー自体の重量増,効率の問題が明らかになった.本研究の目的は、自動車の制動エネルギをフライホイールの回転エネルギとして蓄え、発進の際にそのエネルギを利用することによって、省エネルギを実現するインテリジェントホイールを開発することである。プロトータイプの装置やエネルギの回収-移送-蓄積-移送-再利用のプロセスを事前把握するため12年度では予備実験・研究を行った。そして、次のl-3の成果を得た。1予備実験モデルを製作した。このモデルは、DC電源、電気回路、DCモータ2台、ホイールAとBとで構成されている。自動車タイヤをホイールA、インテリジェントホイールをホイールBに対応させた。ホイールAとBは、それぞれのDCモータに連結した。また、ホイールAに回転エネルギを与え、そのエネルギ回収-移送-蓄積-移送-再利用のプロセスを実現できた。2ホイールAの回転エネルギの約37%がホイールBへ移送-蓄積された。このことから、ホイールAの全回転エネルギの約10%がホイールAの回転エネルギとして再利用可能と推定できた。3自動車の運動エネルギを制動時に回収する効率を向上させることやこのエネルギを蓄積するための合理的方法を検討しなければならないことが分った。本研究の目的は,制動時の自動車の運動エネルギーを蓄え,発進時にそのエネルギーを回生することによって省エネルギーを実現することである.平成12年度は,予備実験モデルを製作し,2個のフライホイールの間で運動エネルギーの転送テストした.自動車側ホイールからの回転エネルギーをDCモータによって電気エネルギーに変換して,その電気エネルギーで別のモータを駆動し回転エネルギーとして蓄える事が調査できた.予備実験結果から,供給した全エネルギーの10%程度しか回収できないことが明らかになった.これは,一旦電気エネルギーに変換し,さらに運動エネルギーに変換するというプロセスによってエネルギーロスが起こっていると考えられた.平成13年度は,制動時の運動エネルギーの多くを回収するために,ホイール回転エネルギーをDCモータによって電気エネルギーに変換させ,それをコンデンサーに蓄えることを試みた.ここで,コンデンサーにエネルギーを蓄える場合,発電機であるDCモータの発生電圧とコンデンサーの蓄電圧が平衡してしまうと,もはやエネルギーは蓄えられない.そこで,コンデンサーを多数用意し,満充電されたコンデンサーから空のコンデンサーに回路をつなぎ替えて次々にエネルギーを蓄えて行く事でより多くのエネルギーを回収することを目指した.実験の結果,コンデンサーに電気が蓄えられ,そのエネルギー回生が出来ることが分かった.コンデンサーの切り替えタイミングは回路の時定数によって決定することで効率良くエネルギーを蓄積することが出来た.課題として既存のハイブリッドカーよりもコンデンサー自体の重量増,効率の問題が明らかになった.
単離オルガネラ核の解体と再構成による高等植物の色素体遺伝子発現機構の解析

細胞分化の柔軟性は植物細胞で特に著しく,オルガネラの分化にも高い柔軟性が要求される.なかでも色素体は著しい可塑性を有しており,細胞機能に応じて様々に発達・分化し得る.色素体の遺伝子発現制御機講を解析するためには,特微的な遺伝子発現パターンを持つ異なる型の色素体核を無傷単離し,それらを解体・再構成し、転写パターンを比較検討できることが望ましい.タバコ培養細胞BY-2はこのような研究に理思的な系であるが,培養過程でのオルガネラの発達・分化の様式は明らかにされていない.DAPI染色-抗BrdU抗体免疫蛍光顕微鏡法や定量的サザンブロット法を用いて,通常の培養過程や培養条件を変更した際のオルガネラの挙動を解析した。その結果,原色素体やミトコンドリアのDNA合成は細胞増殖が活発になる直前に,最大になり,細胞核の分裂が活発になる時期には逆に減少することを明らかにした.また,培養7日目の定常期にあるBY-2を2,4-Dを除き6-benaylaminopurine(1mg/l)を添加した改変Linsmaier and Skoog培地に植え継ぐと,原色素体は12時間目頃から澱粉を蓄積し,48時間目頃にはほとんどがアミロプラスト化することを明らかにした.このような培養系を用いて,原色素体核を無傷単離し,単離色素体核の解体・再構成実験を行った.単離原色素体核をNaCl処理し,タンパク質を段階的に外し,原色素体核の構造と転写活性を解析した.NaCl濃度を上げると,0.1Mで31,30kDaの,0.7Mで69,14kDaのタンパク質が外れ,原色素体核の構造が拡散し,転写活性は著しく減少し,転写産生の構成も著しく変化した.解体した原色素体核を含む溶液のNaCl濃度を段階的に下げると,原色素体核が再構成されるが,再構成した色素体核のin vitro転写効率は解体時を上回ることはなかった.このような再構成系では,核構造が見かけ上再成されても,転写機能に関与する要素の再構成が十分でないことがわかる.今後,核構造の構築に関与するDNA結合タンパク質とRNA合成酵素等の転写機能に直接関与する因子を分別単離し,転写機能を保持した色素体核の再構成系の開発を試みる予定である.細胞分化の柔軟性は植物細胞で特に著しく,オルガネラの分化にも高い柔軟性が要求される.なかでも色素体は著しい可塑性を有しており,細胞機能に応じて様々に発達・分化し得る.色素体の遺伝子発現制御機講を解析するためには,特微的な遺伝子発現パターンを持つ異なる型の色素体核を無傷単離し,それらを解体・再構成し、転写パターンを比較検討できることが望ましい.タバコ培養細胞BY-2はこのような研究に理思的な系であるが,培養過程でのオルガネラの発達・分化の様式は明らかにされていない.DAPI染色-抗BrdU抗体免疫蛍光顕微鏡法や定量的サザンブロット法を用いて,通常の培養過程や培養条件を変更した際のオルガネラの挙動を解析した。その結果,原色素体やミトコンドリアのDNA合成は細胞増殖が活発になる直前に,最大になり,細胞核の分裂が活発になる時期には逆に減少することを明らかにした.また,培養7日目の定常期にあるBY-2を2,4-Dを除き6-benaylaminopurine(1mg/l)を添加した改変Linsmaier and Skoog培地に植え継ぐと,原色素体は12時間目頃から澱粉を蓄積し,48時間目頃にはほとんどがアミロプラスト化することを明らかにした.このような培養系を用いて,原色素体核を無傷単離し,単離色素体核の解体・再構成実験を行った.単離原色素体核をNaCl処理し,タンパク質を段階的に外し,原色素体核の構造と転写活性を解析した.NaCl濃度を上げると,0.1Mで31,30kDaの,0.7Mで69,14kDaのタンパク質が外れ,原色素体核の構造が拡散し,転写活性は著しく減少し,転写産生の構成も著しく変化した.解体した原色素体核を含む溶液のNaCl濃度を段階的に下げると,原色素体核が再構成されるが,再構成した色素体核のin vitro転写効率は解体時を上回ることはなかった.このような再構成系では,核構造が見かけ上再成されても,転写機能に関与する要素の再構成が十分でないことがわかる.今後,核構造の構築に関与するDNA結合タンパク質とRNA合成酵素等の転写機能に直接関与する因子を分別単離し,転写機能を保持した色素体核の再構成系の開発を試みる予定である.
遺伝子操作による細胞表面糖鎖を介したマウス繊維芽細胞の増殖制御機構の解析

(1)新規β-1,4-ガラクトース転移酵素(β-1,4-GalT)の基質特異性の解析生体には複数のβ-1,4-GalTが存在し、今日まで我々を含む幾つかのグループから7つの酵素が存在することが報告されている。我々はこれらの遺伝子を昆虫細胞Sf-9に導入・発現させ、その基質特異性を解析した結果、β-1,4-GalTs I-VIはN-型糖鎖のガラクトシル化に関与していることを明らかにした。さらにこれらの酵素はただ重複して存在しているのではなく、N-型糖鎖の各分岐側鎖に対してそれぞれ特異性をもつことを明らかにした。(2)ヒトβ-1,4-GalT遺伝子の導入による癌細胞の性質の変化の解析細胞が癌化すると、β-1,4GalT IIの遺伝子発現が減少し、β-1,4-GaIT Vの遺伝子発現が増大する傾向を見つけた。細胞表面の糖鎖の発現パターンと細胞の性質には相関が見られるので、癌細胞にβ-1,4GalT IIのセンスcDNAを導入しその発現を増大させたり、あるいはβ-1,4-GalT VのアンチセンスcDNAを導入しその発現を減少させ、これらの細胞をクローニング後、マウス皮下に移植し、腫瘍形成や、尾静脈への注入による肺への転移を解析した。その結果、両遺伝子導入細胞の腫瘍形成は著しく抑制され、形成された腫瘍塊は、対照とは異なり細胞が密に配列していた。またβ-1,4-GalT IIセンスcDNA導入細胞では転移抑制が見られたが、β-1,4-GalT VアンチセンスcDNA導入細胞では見られなかった。培養系で、遺伝子導入癌細胞には部分的な細胞間接着が見られ、その増殖速度は対照に比べ25-50%程度減少していた。これらの性質の変化は、細胞表面のガラクトシル化を含む糖鎖修飾の変化によるものと考えられる。2)β-1,4-GalTs遺伝子の癌細胞への導入(古川担当):細胞が癌化するとβ-1,4-GalT IIの遺伝子発現が減少し、β-1,4-GalT Vの遺伝子発現は増大することを明らかにした[Shirane et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.265,434-438]。我々はこれが癌に共通した現象であるかどうかを確かめるため、種々のヒト癌細胞においてβ-1,4-GalTの遺伝子発現を解析し、その一般性を確立した[Sato et al.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.276,1019-1023]。そこでB16-F10マウスメラノーマ細胞にβ-1,4-GalT IIセンスcDNAあるいはβ-1,4-GalT VアンチセンスcDNAを導入し、癌細胞をマウス皮下に移植したところ、腫瘍形成が著しく抑制された。それぞれの腫瘍塊から調製した細胞膜タンパク質で糖鎖のガラクトシル化に変化が見られ、これが腫瘍形成の抑制と関係していると考えられた。細胞が癌化すると糖タンパク質のN-型糖鎖が高分岐化し、これに伴いβ-1,4-ガラクトース転移酵素(β-1,4-GalT)IIの遺伝子発現が減少し、β-1,4-GalTVの遺伝子発現が増大することを見つけた。さらにB16-F10マウスメラノーマ細胞にβ-1,4-GalT IIセンスcDNA導入したり、β-1,4GalT VアンチセンスcDNA導入し、遺伝子発現を正常方向に戻し、遺伝子導入癌細胞をC57B/L6マウス皮下に移植したところ、腫瘍形成が抑制された。この原因を解明するため、以下の解析を行なった。(1)腫瘍塊の組織化学的

解析:遺伝子導入した癌細胞がマウス皮下で造った腫瘍塊をホルマリンで固定後切片を作製し組織化学的に解析すると、両遺伝子導入癌細胞が造る腫瘍塊は細胞が密に配列しているのに対して、対照の腫瘍では細胞間に空隙が見られ細胞は散在していた。(2)各腫瘍塊からタンパク質画分を調製し糖鎖構造を解析すると、遺伝子導入細胞で分岐側鎖からガラクトースを欠いた糖鎖構造が検出された。(3)遺伝子導入細胞を培養皿で培養しsub-confluentの状態を観察すると、両遺伝子導入癌細胞で部分的な細胞間接着が見られ、特にβ-1,4-GalT VアンチセンスcDNA導入細胞では上皮細胞様の形態変化が見られた。(4)培養系で細胞の増殖速度を測定した結果、β-1,4-GalT IIセンスcDNA導入細胞は対照より25%低下し、β-1,4-GalT VアンチセンスcDNA導入細胞は対照より50%低下していた。(5)対照及び遺伝子導入細胞をフィブロネクチンをコートしたプレート上で培養すると、対照細胞の多くは接着できず丸まっているが、両遺伝子導入細胞はフィブロネクチンへ接着し、伸展している様子が、ファロイジンでアクチン繊維を染色することで観察された。
著作物の類似性に関する総合的・比較法的研究

平成30年度は、わが国における議論の検討はもちろんのこと、ドイツおよびイギリスといった外国法における議論および裁判例の分析を継続しつつ、米国における議論および裁判例の検討を開始するという計画に基づいて、文献やデータベース等を駆使して広範にわたる様々な調査を進めてきた。その過程で、本研究課題の中心的なテーマの一つである著作物の類似性判断において著作物の著名性がどのような意味を持つかということに関して、ドイツでも最近議論があり、特に、「Verwechslungsgefahr im Urheberrecht」(著作権法における混同のおそれ)というタイトルで、ヨーロッパの比較法を行っている書籍が2017年に出版され、これをもとに議論されていることを知るに至った。こうした動向は、本研究課題と同様の問題提起のもとに展開されているものであり、研究代表者(上野)にとっても、非常に有益な考察を行うことができたと考えている。また、これは本研究課題が国際的にも共通したものであることの証であるとも考えている。そのほか、本年度は、2018年9月に、国際著作権法学会であるALAIのモントリオール大会において著作権紛争に関する比較法的観点からの研究報告を行ったほか、2018年12月に、韓国政府および韓国著作権委員会の招聘によりソウルにおける日韓著作権セミナーにおいても最近のわが国における著作権問題について招待講演を行うなど、国外における研究活動を展開するほか、国内における国際シンポジウムでも研究報告を行うなど、国際的な研究活動にも力を入れ、それぞれ大きな成果があったと考えている。国内活動としても、雑誌論文や書籍、あるいは学会等において多数の研究成果を公表できたほか、隣接分野である国際経済法学会になどで研究報告を行う機会を得たことも本研究にとって大変有益であったと考えている。本年度までにおける本研究課題は、比較法の対象をドイツ、米国、イギリスに広げているところ、そこにおける議論および裁判例は膨大なものがあり、現時点では網羅的検討を終えたとは言えないものの、それらの外国法における議論を概ね把握することができたほか、ドイツにおける新しい研究に接することもできたことから、概ね順調に進展しているものと判断した。本研究課題は、2019年度に最終年度を迎えると共に、国際共同研究加速基金の本格実施と共に、その比較法的検討を加速度的に深めることが予定されているところ、研究代表者は、2019年3月よりミュンヘン大学に滞在しつつ、国際的な学会に多数参加することによって、本研究課題の検討をこれまでになく充実させていく所存である。なお、現時点で課題等は特に見当たらない。本年度は、2016年8月にミュンヘン(ドイツ)のマックスプランク研究所に滞在して、多数の資料を収集することはもちろん、現地の専門家に面会して、本研究課題に関するまとまった調査・研究を遂行することができた。特に、ドイツ著作権法の権威であるAdolf Dietz教授に再会して議論できたことは有益であった。また、EPO審判官であるChristopher Heath博士とは3回にわたり面会して、ドイツ法を含むヨーロッパの状況および日本法との比較について詳しい議論ができた。このような過程を通じて、ドイツにおける興味深い事例と最新の裁判例について調査することができたのみならず、その背景にある社会的な事情について考察することができた。こうした外国法研究は、やはり現地に滞在して、社会的な状況を肌身に感じることを通してこそ実現できるものと改めて実感した次第である。また、本年度は、ドイツ出張以外にも、シンガポール、ローマ、ソウル、ミュンヘンにおいて講演を行う機会を与えられた。その多くは先方から招待され、本科研費を使用していないことも多いが、そうした機会においても、Silke von Levinski、Reto Hilty、Ansgar Ohly、Matthias Leistner、Jane Ginsburg、Shyam Balganeshなど多数の著名な研究者と議論する機会があり、その過程で本研究課題に関する研究を進めることができた。こうした成果は、これからさらに本研究課題の研究を進めていく過程における多面的な発展を可能にするものと思料する次第である。当初予定したドイツを中心とする調査研究を行うことができ、十分な成果が上げられたものと考えているため。本年度は、前年度に引き続き、著作物の類似性に関する網羅的な研究を比較法的観点を重視しつつ進めたが、その過程で、国際的な議論に参加することが極めて多かった1年でもあった。例えば、2017年4月には、世界知的所有権機関(WIPO)において、フランスのピエール・シリネリ教授(ソルボンヌ大学)や米国のジェーン・ギンズバーグ教授(コロンビア大学)など世界各国から招待された11名の専門家の一人として、2日間にわたって議論を行った。また、同年9月には、中国北京の清華大学において、同大学、ドイツのフランクフルト大学、米国のペンシルベニア大学および早稲田大学による共同の研究会が行われ、上野自身も研究報告を行うほか、ドイツのアレクサンダー・ポイケルト教授(フランクフルト大学)、米国のクリストファー・ユー教授(ペンシルベニア大学)、崔国斌教授(清華大学)等と2日間にわたって議論を行った。その他、メルボルン(同年8月)やソウル(同年11月)においても招待講演や研究報告を行う機会を得たと共に、国内でも多数の講演(日本語または英語)を行った。さらに、2018年3月には早稲田大学で大規模な国際シンポジウムを開催し、米国のマーク・レムリー教授(スタンフォード大学)等を招聘したほか、上野自身は、ドイツのマティアス・ライストナー教授(ミュンヘン大学)やベルギーのヒャトロイ・オーバーワル教授(ルーヴァンカトリック大学)等と共に議論を行った。研究成果として、10本以上の論文を雑誌等に公表したほか、口頭の研究報告としては、英語による研究報告・講演を6回、日本語による研究報告・講演を17回行った。

総じて、今年度は特にプロダクティブな1年であったと認識している。本年度は、申請時の計画に基づいた研究を進める共に、多数の論文等を公表することができたのみならず、当初の予定になかった外国における研究報告・講演が多数行ったことからすれば、当初の計画以上に進展していると言える。平成30年度は、わが国における議論の検討はもちろんのこと、ドイツおよびイギリスといった外国法における議論および裁判例の分析を継続しつつ、米国における議論および裁判例の検討を開始するという計画に基づいて、文献やデータベース等を駆使して広範にわたる様々な調査を進めてきた。その過程で、本研究課題の中心的なテーマの一つである著作物の類似性判断において著作物の著名性がどのような意味を持つかということに関して、ドイツでも最近議論があり、特に、「Verwechslungsgefahr im Urheberrecht」(著作権法における混同のおそれ)というタイトルで、ヨーロッパの比較法を行っている書籍が2017年に出版され、これをもとに議論されていることを知るに至った。こうした動向は、本研究課題と同様の問題提起のもとに展開されているものであり、研究代表者(上野)にとっても、非常に有益な考察を行うことができたと考えている。また、これは本研究課題が国際的にも共通したものであることの証であるとも考えている。そのほか、本年度は、2018年9月に、国際著作権法学会であるALAIのモントリオール大会において著作権紛争に関する比較法的観点からの研究報告を行ったほか、2018年12月に、韓国政府および韓国著作権委員会の招聘によりソウルにおける日韓著作権セミナーにおいても最近のわが国における著作権問題について招待講演を行うなど、国外における研究活動を展開するほか、国内における国際シンポジウムでも研究報告を行うなど、国際的な研究活動にも力を入れ、それぞれ大きな成果があったと考えている。国内活動としても、雑誌論文や書籍、あるいは学会等において多数の研究成果を公表できたほか、隣接分野である国際経済法学会になどで研究報告を行う機会を得たことも本研究にとって大変有益であったと考えている。本年度までにおける本研究課題は、比較法の対象をドイツ、米国、イギリスに広げているところ、そこにおける議論および裁判例は膨大なものがあり、現時点では網羅的検討を終えたとは言えないものの、それらの外国法における議論を概ね把握することができたほか、ドイツにおける新しい研究に接することもできたことから、概ね順調に進展しているものと判断した。本研究課題である著作物の類似性をめぐっては、諸外国で実に様々な事例が登場しているところ、研究代表者は、昨今、外国で講演することが多く、外国人の専門家との研究交流が盛んになっているため、今後は、こうした国際的関係をますます生かして、本研究課題の研究を飛躍的に発展させていきたい。
古細菌2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素群の構造生物学研究

大腸菌由来NifS相同タンパク質CsdBの結晶構造を2.5Å分解能で解析した。放射光から得られる単色X線を用いて-173°Cで収集した35,679個の独立な回折反射データに対して昨年2.8Å分解能で決定した構造を初期モデルとしてプログラムXPLORを用いて構造精密化をした処、R値17.1%、Rfree値19.5%の構造を得た。本研究で決定したCsdBの構造は、NifS相同タンパク質としては世界初の構造例となったが、NifSタンパク質により類似していて後に構造決定された超高温古細菌Thermotogamartima由来NifS相同タンパク質(tmNifS)との構造比較によってNifSタンパク質の構造特性を明らかにすることができた。両者はアミノ酸配列で23%の相同性を有し、319個のCα原子に対するRMS変位値が1.5Åで立体構造上も全体的に類似している。両者の構造上の大きな違いは、CsdB上のβ-ヘアピンループ領域(残基番号255-271)と活性残基Cys364が含まれる伸張部(残基番号362-375)に観られる。これらの領域は、酵素二量体の異なるサブユニットから突出してきて活性部を構成している。tmNifSでは、CsdB上のβ-ヘアピンループ領域は13残基の欠損によって消失しており、代わりに活性残基Cys324を含む伸張部は10残基の挿入でより突出していると考えられる。CsdBではこの伸張部および活性残基は定まった構造をとっているが、tmNifSでは挿入によって伸張部がCsdBに比べてより柔軟性を持つためにそれらの位置が電子密度図上で観察されない。活性残基を含むこの伸張部における両者の柔軟性の違いによって、両酵素は基質側鎖のβ位に位置する原子がセレンであるかシスティンであるかを認識し区別してそれぞれに特有の酵素活性を発揮しているのではないかという考えを抱かせる。窒素固定菌AzotobactervinelanoiiのnifS遺伝子によってコードされるNifSタンパク質とアミノ酸配列において相同なタンパク質である大腸菌CsdBは、システイン、セレノシステイン、システインスルフィン酸に作用して原子状硫黄、原子状セレン、二酸化硫黄を遊離させる酵素で、fold-type]のaminotransferase class Vに分類されるPLP酵素である。NIFSタンパク質類の反応機構および鉄硫黄クラスター形成時の関与機構を立体構造から解明する膜非結合型生物マシーナリーの構造生物学研究を目的として、CsdBの立体構造をX線結晶解析により決定した。20mg/ml酵素溶液を1.4M酢酸ナトリウムと10μMPLPを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)に対して25°Cのハンギングドロップ蒸気平衡により結晶化し、浸漬法により得た水銀および白金誘導体結晶を用いてR-AXIS IICで収集した回析データから重原子同型置換法で初期位相を決定し、DM法により位相改良した電子密度図に基づいて分子モデルを構築した。XPLORでの精密化により分解能2.8ÅでR値18.7%、Rfree値23.9%の構造を得た。二量体分子CsdBのサブユニット(分子量44,439)の構造は、7本鎖の逆平行βシートと7本のαへリックスからなるα/βフォールドの大ドメインと、β鎖4本とα螺旋3本の小ドメインおよび2本のαヘリックスを含むN末端セグメントでできていて、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)と類似している。だが、顕著な特徴として、一つのサブユニットの小ドメインから大ドメインへの突起部にあるαヘリックスが他のサブユニットの大ドメインから突出したβ鎖2本を含むβヘアピンと特異な相互作用をしている。PLPとの相互作用はAAT等と類似しているが、ビリジン環にスタックする残基がAAT等ではTrpやPheなどであるのに、CsdBではHisとなっている。更に、AATで基質α-カルボキシル基を認識するArgに対応する位置にArg379が存在している。

tmNifSでは、CsdB上のβ-ヘアピンループ領域は13残基の欠損によって消失しており、代わりに活性残基Cys324を含む伸張部は10残基の挿入でより突出していると考えられる。CsdBではこの伸張部および活性残基は定まった構造をとっているが、tmNifSでは挿入によって伸張部がCsdBに比べてより柔軟性を持つためにそれらの位置が電子密度図上で観察されない。活性残基を含むこの伸張部における両者の柔軟性の違いによって、両酵素は基質側鎖のβ位に位置する原子がセレンであるかシスティンであるかを認識し区別してそれぞれに特有の酵素活性を発揮しているのではないかという考えを抱かせる。
高分子薄膜のガラス転移とダイナミクス--界面・拘束下における非平衡緩和--

高分子薄膜で観測されるガラス転移温度のバルクからのずれの原因を明らかにし,さらには,ガラス転移温度の制御を最終的な目的として,高分子単層膜,高分子積層膜のダイナミクスと界面構造の変化を誘電緩和測定と中性子反射率測定を用いて調べる.誘電緩和測定からは,高分子薄膜のガラス転移に関係したα過程の緩和時間の温度依存性,中性子反射率測定からは界面のラフネスと各層の膜厚が得られる。これらの物理量の温度,アニール時間依存性を評価することにより,ガラス転移の本質に迫る.高分子薄膜で観測されるガラス転移温度のバルクからのずれの原因を明らかにし,さらには,ガラス転移温度の制御を最終的な目的として,高分子単層膜,高分子積層膜のダイナミクスと界面構造の変化を誘電緩和測定と中性子反射率測定を用いて調べる.誘電緩和測定からは,高分子薄膜のガラス転移に関係したα過程の緩和時間の温度依存性,中性子反射率測定からは界面のラフネスと各層の膜厚が得られる。これらの物理量の温度,アニール時間依存性を評価することにより,ガラス転移の本質に迫る.
神経障害性疼痛における骨髄由来ミクログリアを介した治療戦略

慢性疼痛は不快情動を惹起するが,その機序は不明である.われわれはGFP陽性キメラマウスを用いて神経障害性疼痛マウスを作成し,28日後に扁桃体中心核に骨髄由来ミクログリア(BMDM)の集積と,不安行動の発現を確認した.BMDMはIL1-bおよびCCR2受容体,CCR2受容体のリガンドであるMCP-1に有意に発現していた.CCR2受容体拮抗薬により,BMDMの発現と不安行動および疼痛関連行動は改善した.IL1-b受容体拮抗薬では不安行動は改善したが,疼痛関連行動は改善しなかった.よってBMDMは扁桃体中心核でMCP-1/CCR2との相互作用を介して慢性疼痛に惹起する不快情動の発生に関与する.慢性疼痛は不安や抑うつなどの不快情動を惹起するが,その機序は解明されていない.近年,脳内には前駆細胞由来のレジデントミクログリアだけでなく,侵害刺激を契機として骨髄由来単球細胞が脳内に移行・分化した骨髄由来ミクログリア(bone marrow-derived microglia: BMDM)が存在することが報告されている.本研究の目的は慢性疼痛による不快情動の形成に脳内の骨髄由来ミクログリアが関与するという仮説を明らかにすることである.平成24年度までにわれわれはC57BL/6JマウスにGreen Fluorescent Protein(GFP)トランスジェニックマウスの骨髄細胞を移植し,GFP陽性キメラマウスを作成した.骨髄移植4週間後に坐骨神経を部分結紮し,神経障害疼痛モデルマウス(Model群)を作成した.また,侵襲を与えない群(Naïve群)と坐骨神経の剖出のみを行う群(Sham群)を作成し,比較対象とした.坐骨神経部分結紮1,2,4週後のBMDMの脳内への集積を検討したところ,坐骨神経部分結紮4週後のModel群でのみBMDMが扁桃体中心核に有意に集積した(P平成25年度は各群について坐骨神経結紮1,2,4週後に不安・抑うつに関する行動学的解析(高架式十字迷路試験)を行った.その結果,坐骨神経結紮4週後に,Model群にのみ不安・抑うつ行動が観察された.これはBMDMの扁桃体中心核への発現の傾向と一致する.扁桃体は不快情動と深く関わっており,本研究結果から,扁桃体中心核に集積したBMDMが慢性疼痛による不快情動の形成に関与する可能性が示唆された慢性疼痛は不快情動を惹起するが,その機序は不明である.われわれはGFP陽性キメラマウスを用いて神経障害性疼痛マウスを作成し,28日後に扁桃体中心核に骨髄由来ミクログリア(BMDM)の集積と,不安行動の発現を確認した.BMDMはIL1-bおよびCCR2受容体,CCR2受容体のリガンドであるMCP-1に有意に発現していた.CCR2受容体拮抗薬により,BMDMの発現と不安行動および疼痛関連行動は改善した.IL1-b受容体拮抗薬では不安行動は改善したが,疼痛関連行動は改善しなかった.よってBMDMは扁桃体中心核でMCP-1/CCR2との相互作用を介して慢性疼痛に惹起する不快情動の発生に関与する.神経障害性疼痛は神経組織の損傷は治癒したにも関わらず疼痛が持続する病態である。近年,中枢神経系の免疫細胞であるミクログリアが神経損傷後の脊髄で過度に活性化した状態となり,神経障害性疼痛の発症に関わることが報告されている。また,炎症や中枢変性疾患では骨髄由来細胞が脳実質内に移行し,骨髄由来ミクログリア(bone marrow-derived microglia: BMDM)として中枢神経に影響を与えることが報告されている。今年度は,神経障害性疼痛モデルマウスを用いて,脳内のBMDMの発現を検討した。方法としてはC57BL/6JマウスにGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を移植し,GFP陽性キメラマウスを作成した。骨髄移植4週後に,坐骨神経を部分結紮し,神経障害疼痛モデルマウス(Model群,n=6)を作成した。また,侵襲を与えない群(Naive群,n=6)と坐骨神経の剖出のみを行う群(Sham群,n=6)を作成し,モデルマウス作製4週間後のBMDMの脳内への集積を比較した。また,神経障害性疼痛モデルマウスを用いて,坐骨神経部分結紮1週間後,2週間後,4週間後のBMDMの脳内への集積を比較した(各群,n=6)。結果としてModel群では処置の翌日から疼痛関連行動が出現した。また,坐骨神経部分結紮4週間後の比較では,Model群でのみBMDMが扁桃体中心核に有意に集積した(p<0.05)。また,坐骨神経部分結紮1,2,4週間後の比較では,4週間後の神経障害性疼痛モデルマウスでのみ,BMDMが扁桃体中心核に有意に集積した(p<0.05)。扁桃体は不安や抑うつなどの情動障害と深く関わる。神経障害性疼痛は不安や抑うつなどの情動障害がしばしば認められており,BMDMはこれらの情動障害の発生に関与している可能性が示唆される。神経障害性疼痛に代表される慢性の痛みは抑うつなどの不安情動を惹起するが,その機序は解明されていない.

近年,脳内には前駆細胞由来のレジデントミクログリアだけでなく,侵害刺激を契機として骨髄由来単球細胞が脳内に移行・分化した骨髄由来ミクログリア(bone-marrow derived microglia: BMDM)が存在しており,さまざまな刺激を契機に中枢神経系に発現することが報告されている.われわれはこれまでに坐骨神経を部分結紮して作成した神経障害性疼痛モデルマウスにおいて,結紮4週後に扁桃体中心核へのBMDMの集積と高架式十字迷路試験による不安・抑うつ行動が認められることを確認した.今回,われわれは分子生物学的解析を行い,神経障害性疼痛モデルマウスの扁桃体中心核にはinterleukin(IL)-1β,C-C chemokine receptor type 2 (CCR2)およびCCR2のリガンドであるmonocytechemotactic protein-1(MOP-1)がシャムマウスに比べて多く発現していることを明らかにした.また,神経障害性疼痛モデルマウスに対してCCR2拮抗薬を内服させることで,内服させない神経障害性モデルマウスと比較して,扁桃体中心核のCCR2の発現および不安・抑うつ行動を有意に減少させた.以上より,骨髄由来ミクログリアは扁桃体中心核におけるMCP-1/CCR2の相互作用を介して,神経障害性疼痛により惹起される不安情動の発生機序に関与していることが明らかにされた.本研究は慢性の痛みにより惹起される不安情動に対する新たな治療戦略を提示した.外科系臨床医学・麻酔・蘇生学平成25年度は高架式十字迷路を用いた不安・うつ状態の行動学的解析を行う予定であったが,目標を達成し,前述のような結果が得られている.また,本研には頭部への放射線照射によりBlood Brain Barrierが直接的な障害による影響がミクログリア遊走の原因となるのではないかという問題があった.しかしながら頭部を鉛で遮蔽することで放射線の直接的なBlood Brain Barrierへの障害に対する影響を抑えることができた(ただし,脊髄レベルには照射されている)という改善点は大きく,今後の研究を進めやすくなった.平成24年度は1C57BL/6JマウスにGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を移植したGFP陽性キメラマウスの作成,2坐骨神経部分結紮による神経障害性モデルマウスの作成,3脳内の免疫染色,4疼痛関連の行動学的解析を行う予定であったがいずれも目的を達成し,前述のような結果が得られている。神経障害性モデルマウスでは坐骨神経結紮4週後にBMDMが扁桃体中心核に集積し,それが不安・うつ状態の行動を惹起する可能性が示唆された.当初,われわれは骨髄抑制剤の投与により,BMDMの形成・遊走を抑制し,不安・うつ状態の改善させることを検討していたが,それでは全身に与える影響が大きいと判断し,現在は,脳内に骨髄由来ミクログリア遊走・および活性化させる機序を分子学的レベルで解析し,その標的分子を同定すべく研究を継続している.具体的には神経結紮28日後に,扁桃体中心核より骨髄由来(GFP陽性)ミクログリアと内在性(GFP陰性)ミクログリアを分別単離し,RT-PCRを用いて分子生物学的解析を行う.最終的にはそれらの標的分子の拮抗薬を使用することで行動学的解析およびBMDMの発現がどのように変化するかを研究する予定である.神経障害性疼痛モデルマウスでは,坐骨神経部分結紮4週間後にBMDMが扁桃体中心核に集積することが確認された。扁桃体は,慢性疼痛に合併する不安や抑うつなどの情動障害と深く関わると報告されている。
バクテリオロドプシンの変性キネティクス

膜タンパク質系は機能的に大変高度なものが多い。しかし、膜タンパク質の構造形成についてはまだ情報が乏しい状態である。つまり、X線回析など構造解析が進んでいないだけではなく、構造形成機構を調べるための変性実験などもまだほとんで行われていない。そこで本研究では、バクテリオロドプシンを例として、膜タンパク質の変性挙動を詳細に調べ、膜タンパク質の立体構造形成機構を明らかにすることを目的としている。変性実験において重要なことは、次の2つのことを明らかにすることである。1つは変性状態の構造がどういう構造をとっているか、もう1つは変性するときにどういう結合が切れるかということである。前者、つまり変性状態の構造の特徴を明らかにするには円二色性(CD)、蛍光、光吸収などのスペクトル測定を用いる。バクテリオロドプシンはレチナ-ルを含んでおり、その光吸収だけでも変性点を検出することができる。そして、二次構造の有無、三次構造の有無などは主としてCD測定により評価する。後者には、親水基や疎水基などが異なる種々の有機溶媒を用い、それらの比較から相互作用を推定する。平衡状態の研究から、アルコ-ルなどの有機溶媒による変性には膜内の水素結合性基の濃度が本質的であり、変性時には三次構造が壊れることがわかった。このことから、三次構造の形成には水素結合が重要である。さらに、熱変性のキネティクスの測定を種々の温度で行った結果、活性化エネルギ-は約30kcal/molであった。それを水素結合の数に換算すると、10個くらいとなり、最近わかったバクテリオロドプシンの分子構造からの評価とほぼ同じである。このことからも膜タンパク質の立体構造の形成には膜内の水素結合が重要であるということが確認された。