hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人体液の遺伝標識および人特異形質の検索とその法医学的応用

3年間に亘り延べ16人が研究課題に沿った副題をテーマにそれぞれの専門的知識を生かして研究に当たった.対象とした体液は血液を含め,精液,唾液,汗にまで及び,法医学的応用が可能なところまで進展した研究が散見される.そのうち,汗の研究では,汗特異蛋白の性状を明らかにし,着衣などの斑痕から汗を同定できるまでになっている.また,唾液や血清蛋白を指標として人獣鑑別を行う試みも実務への応用が期待出来そうである.更に,血清オルソムコイド型,酵素型のGSTやALDH等の遺伝様式の判明なども親子鑑定への利用を考慮するに値する成果と考えられる.加えて, GSTやALDHなどの酵素とアルコール性肝炎との関連性を明らかにした実績は,臨床医学への貢献が極めて高いものと言える.血液型に関連した研究では, H物質の唾液と血球の差,唾液腺での分布状態の検索, Lewis a物質の定量的観察,凝集反応によらない血液型判定法の開発などがあり,これらの基礎的な研究の進展は今後への道を大きく開いたものと言え,法医学領域のみならず,腫瘍組織の血液型物質分布の研究という臨床テーマとうまく合体できる可能性がある.また,各種形質の遺伝子頻度の算出や新しい変異型の検出なども一連の研究の中でみられたことや, FGHが従来から研究対象となっているEsDと極めて類似した酵素であるという知見は非常に意義深い成績が得られたものと考えられる.以上述べてきた様に,各分担者は特意とする分野で3年間精力的に研究を進め充分満足のいく成果が得られたものと思う.しかし,中には更に発展させて行うべきテーマもあり,また,ここ数年来急速に発展しつつある遺伝子工学的手法を加味した法医実務への応用も手がける必要が感じられる.本研究班が行った内容を一層具体化する意味でも,これに類似した新たな研究班の組織は不可欠と考えられる.3年間に亘り延べ16人が研究課題に沿った副題をテーマにそれぞれの専門的知識を生かして研究に当たった.対象とした体液は血液を含め,精液,唾液,汗にまで及び,法医学的応用が可能なところまで進展した研究が散見される.そのうち,汗の研究では,汗特異蛋白の性状を明らかにし,着衣などの斑痕から汗を同定できるまでになっている.また,唾液や血清蛋白を指標として人獣鑑別を行う試みも実務への応用が期待出来そうである.更に,血清オルソムコイド型,酵素型のGSTやALDH等の遺伝様式の判明なども親子鑑定への利用を考慮するに値する成果と考えられる.加えて, GSTやALDHなどの酵素とアルコール性肝炎との関連性を明らかにした実績は,臨床医学への貢献が極めて高いものと言える.血液型に関連した研究では, H物質の唾液と血球の差,唾液腺での分布状態の検索, Lewis a物質の定量的観察,凝集反応によらない血液型判定法の開発などがあり,これらの基礎的な研究の進展は今後への道を大きく開いたものと言え,法医学領域のみならず,腫瘍組織の血液型物質分布の研究という臨床テーマとうまく合体できる可能性がある.また,各種形質の遺伝子頻度の算出や新しい変異型の検出なども一連の研究の中でみられたことや, FGHが従来から研究対象となっているEsDと極めて類似した酵素であるという知見は非常に意義深い成績が得られたものと考えられる.以上述べてきた様に,各分担者は特意とする分野で3年間精力的に研究を進め充分満足のいく成果が得られたものと思う.しかし,中には更に発展させて行うべきテーマもあり,また,ここ数年来急速に発展しつつある遺伝子工学的手法を加味した法医実務への応用も手がける必要が感じられる.本研究班が行った内容を一層具体化する意味でも,これに類似した新たな研究班の組織は不可欠と考えられる.2年目に当る61年度は、秋田市に於て班会議を開催した。この会議では、分担者がこれまでに行い得た成績を発表し、他の分担者と活発に意見を交換した。新しい遺伝形質やヒト特異蛋白の報告、新しい技法による遺伝形質の検査法の紹介などがあった。具体的には1.リンパ球中のグルタチオンS-トランスフェレース(GST)の日本人に於る遺伝的多型とその分布に関しては白人や黒人集団との間に差がないことが明らかとなり、GST1座位の遺伝子は常染色体上に存在する優劣のない対立遺伝子によって支配されていることが判明した。2.ヒト汗の特異蛋白の分子量は30kdよりも低分量領域にあり、pIは3.55.5の間であって、個体差のあることが認められた。3.血清蛋白の遺伝形質に関しては、酵素標識したallo-Aレクチンを用いオルソムコイド型やPi型を判定する新しい方法の紹介があり、実用面への応用が期待される。4.Gc型では、遺伝学的に説明のつけ難い変異型をもつ患者例が紹介され、その原因追求が待たれる。5.また、最近報告された赤血球酵素型FGHの多型は家族調査などの結果、従来から知られているEsD型と完全に対応することが判明した。6.RIによる血液型判定法では、相対的抗原量を求めることにより、ホモ型とヘテロ型の血球を区別する事が可能となり、従来の凝集反応法では行い得なかったことである。7.H抗原には血球由来と唾液由来の2種類があり、これらに対する特異抗体を用い組織学的に抗原分布を検索した。8.その他ルイス式血液型をELISA法で判定する方法、キャリヤー

アンフォライトの見直しに関する研究、赤血球酵素GPT多型の更に細い日本人集団での頻度などが明らかとなった。以上の様に、当年度は前年度の成果をふまえた一層深い検討がなされ、最終段階のつめへ向っている。最終年度には各分担者の3年分のかなりまとまった成果が期待され、遺伝形質の法医学的応用への貢献となるものと思われる。
ＣＦＲＰ積層板における負のポアソン比の発現とその検証ならびに応用に関する研究

本研究では,非弾性領域におけるCFRP積層板の負のポアソン比を高精度3次元ディジタル計測により直接的に測定し,負のポアソン比の発現・増大が起こることを実証するとともに,その解析手法を確立することで,複合材料のポアソン比に関する先駆的な成果を上げるとともに,複合材構造の高精度設計に資することを目的としている.上記目的を達成するため,本年度においてはまず,+-45°および+-60°アングルプライCFRP(炭素繊維/エポキシ)積層板の積層方向ポアソン比,ならびに積層板の変形に伴う積層方向ポアソン比の変化を3次元ディジタル画像計測装置により計測した.その結果,積層方向ポアソン比は,+-45°においては0付近の小さな値となり,+-60°においては0.4程度の正の値となること,およびそれらの値は積層板の非弾性変形が進行してもほとんど変化しないことを明らかにした.これらは,+-22.5°および+-30°アングルプライCFRP積層板が負の積層方向ポアソン比を発現し,それが積層板の非弾性変形の進行に伴い増大するという昨年度観測された結果と対照的であり,積層方向ポアソン比の顕著な積層構成依存性を実測することに成功した.さらに,研究代表者が開発した均質化法に基づくマルチスケール解析手法により,実測したアングルプライCFRP積層板のポアソン比およびその積層構成依存性を定量的に再現できることを示した.つづいて,実測したアングルプライCFRP積層板の負のポアソン比を含むマクロ挙動を表現可能な非弾性マクロ構成モデルを構築するとともに,得られた構成モデルを汎用有限要素解析ソフトウェアLS-DYNAにユーザーサブルーチンを用いて組み込むことに成功した.さらに,上記ソフトウェアを用いて,CFRP製ボルト止め継手の変形解析を実施し,その有用性を検証した.本研究では,非弾性領域におけるCFRP積層板の負のポアソン比を高精度3次元ディジタル計測により直接的に測定し,負のポアソン比の発現・増大が起こることを実証する.また,得られた実験結果を研究代表者の開発手法による解析結果と比較し,手法の妥当性を検証する.さらに,実験および解析結果に基づき,負のポアソン比を再現可能な非弾性マクロ構成モデルを作成し,それを汎用有限要素解析ソフトウェアへ組み込むとともに,その応用例を検討する.以上から,複合材料のポアソン比に関する先駆的な成果を上げ,複合材料分野および固体力学分野にインパクトを与えるとともに,複合材構造の高精度設計に資することを目的としている.上記目的を達成するため,本年度においてはまず,ポアソン比の計測精度が十分となるよう,通常より厚い板厚12mmの炭素繊維/エポキシ+-30アングルプライ積層板を用意し,厚板試験片を切り出した.この際,エッジ効果の影響を避けるため,試験片幅を40mmと幅広にし,長さも250mmと長めにした.つづいて,高精度3次元ディジタル画像計測装置を導入するとともに,上記試験片の一定ひずみ速度による引張試験を室温にて実施し,引張負荷を受ける試験片の変形を3次元的に計測した.最終的に2%まで引張試験を行い,初期形状から2%までの計測結果から試験片の板厚変化を割り出し,それを用いて積層方向ポアソン比を算出した.その結果,+-30アングルプライCFRP積層板の積層方向ポアソン比が負となること,およびその値(絶対値)が積層板の非弾性変形に伴い顕著に増大することを初めて実証した.本研究の目的を達成するため,本年度においては,+-30アングルプライCFRP積層板の引張試験を実施するとともに,その変形の様子を高精度3次元ディジタル画像計測装置により3次元的に計測し,得られた板厚変化から積層方向ポアソン比を取得する必要があった.実際本年度においては,これらを全て達成するとともに,その結果から負の積層方向ポアソン比の発現・増大を実証することに初めて成功した.この成果は,国内講演会にて公表された.以上のことから,本研究課題は研究計画通り進展していると判断できる.本研究では,非弾性領域におけるCFRP積層板の負のポアソン比を高精度3次元ディジタル計測により直接的に測定し,負のポアソン比の発現・増大が起こることを実証するとともに,その解析手法を確立することで,複合材料のポアソン比に関する先駆的な成果を上げるとともに,複合材構造の高精度設計に資することを目的としている.上記目的を達成するため,本年度においてはまず,数種類のアングルプライCFRP(炭素繊維/エポキシ)積層板の厚板試験片を用意し,一定ひずみ速度による引張試験を実施した.この試験の間,試験片の形状を昨年度導入した高精度3次元ディジタル画像計測装置により3次元的に計測することで,アングルプライCFRP積層板の板厚変化を測定し,積層板の積層方向ポアソン比,ならびに積層板の変形に伴う積層方向ポアソン比の変化を観測した.つづいて,実験により測定したCFRP積層板の積層方向ポアソン比およびその変化を,研究代表者が開発した均質化法に基づくマルチスケール解析手法に基づき解析した.これにあたっては,試験片の断面観察結果および積層構成の情報に基づき積層板のミクロ構造をモデリングするとともに,昨年度同定した炭素繊維およびエポキシの材料定数を使用した.得られた解析結果は,アングルプライCFRP積層板が負のポアソン比を発現し,それが積層板の非弾性変形の進行に伴い増大するという実験における観測結果を良く再現し,解析手法の妥当性が検証された.本年度においてはまず,昨年度開発した

3次元ディジタル画像計測装置による積層方向ポアソン比の測定手法の測定精度を検証するため,昨年度実施した+-30アングルプライCFRP積層板の積層方向ポアソン比の測定を,複数本の試験片に対して行った.その結果,いずれの実験結果においても,積層方向ポアソン比が負となること,およびその値が積層板の非弾性変形に伴い大きく減少する(絶対値としては増大する)ことははっきり捉えられているものの,定量的にはばらつきが見られ,測定精度の改善が課題となった.このため,3次元ディジタル画像計測装置およびプリポスト処理ソフトウェアの精度検証,試験片サイズの再検討,引張試験環境の変更等を実施した.このため,当初は+-15,+-45等の積層板も用意する予定であったが,+-22.5,+-30にとどまった.本研究では,非弾性領域におけるCFRP積層板の負のポアソン比を高精度3次元ディジタル計測により直接的に測定し,負のポアソン比の発現・増大が起こることを実証するとともに,その解析手法を確立することで,複合材料のポアソン比に関する先駆的な成果を上げるとともに,複合材構造の高精度設計に資することを目的としている.上記目的を達成するため,本年度においてはまず,+-45°および+-60°アングルプライCFRP(炭素繊維/エポキシ)積層板の積層方向ポアソン比,ならびに積層板の変形に伴う積層方向ポアソン比の変化を3次元ディジタル画像計測装置により計測した.その結果,積層方向ポアソン比は,+-45°においては0付近の小さな値となり,+-60°においては0.4程度の正の値となること,およびそれらの値は積層板の非弾性変形が進行してもほとんど変化しないことを明らかにした.これらは,+-22.5°および+-30°アングルプライCFRP積層板が負の積層方向ポアソン比を発現し,それが積層板の非弾性変形の進行に伴い増大するという昨年度観測された結果と対照的であり,積層方向ポアソン比の顕著な積層構成依存性を実測することに成功した.さらに,研究代表者が開発した均質化法に基づくマルチスケール解析手法により,実測したアングルプライCFRP積層板のポアソン比およびその積層構成依存性を定量的に再現できることを示した.つづいて,実測したアングルプライCFRP積層板の負のポアソン比を含むマクロ挙動を表現可能な非弾性マクロ構成モデルを構築するとともに,得られた構成モデルを汎用有限要素解析ソフトウェアLS-DYNAにユーザーサブルーチンを用いて組み込むことに成功した.さらに,上記ソフトウェアを用いて,CFRP製ボルト止め継手の変形解析を実施し,その有用性を検証した.次年度においては,炭素繊維/エポキシ+-15,+-25,+-45アングルプライ積層板を用意し,+-30だけでなく,種々の積層構成のCFRP積層板に対して3次元計測を行い,ポアソン比の積層構成依存性を調査する予定である.さらに,研究代表者の開発手法に基づき,積層方向ポアソン比をマルチスケール的に解析し,実験結果と比較することで,開発手法の妥当性を検証する予定である.この際に用いる炭素繊維とエポキシの材料定数は,すでに本年度同定済みである.まず,昨年度実験が実施できなかった積層構成に対して試験片を用意し,それらの積層方向ポアソン比を測定する.つづいて,実験および解析より得られたアングルプライ
混合音に対する複数同時発話認識のための統一的ベイズアプローチ

本研究では、音源分離を確率的に統合した同時発話音声認識を行う手法を提案した。音源分離により復元される音声信号には不確実性が存在するため、音声信号の事後分布を考慮することで音声認識との統合を行う。これにより、復元すべき音声を一意に定めることなく混合音から直接認識結果を得ることが可能となった。また、音の重畳過程と音源モデルを内包する統合モデルにより、高精度な音源分離を行う手法を考案した。具体的には、重畳過程・音源モデルに対して、混合モデル(LDA)および因子モデル(NMF)のそれぞれのモデル化を行うことで、各モデルの音源分離性能を比較評価した。平成27年度は、実環境中で録音された混合音(同時発話音声)に対する音声認識を課題として、分離音声を一意に定めず、分離音声のあらゆる可能性を考慮することにより、最終的な音声認識精度を向上させることができる技術を開発した。本研究の核心は、ベイズモデルに基づく最新の音源分離手法を用いて、分離音声のスペクトログラムを確率的にギブスサンプリングすることにある。このようにして得られた各分離音声に対して、独立に音声認識を行い、認識結果をROVER法で統合する方式を考案した。ベイズモデルの観点からは、分離音声を積分消去していることに相当するが、音声認識結果に曖昧性がなく(事後分布が非常に急峻)、認識結果の各単語が独立であるという条件のもとで、提案手法が数学的に正しいことを示した。研究成果は、音声認識や音声信号処理に関する国際会議であるInterspeech 2015に採択された。さらなる研究の進展として、本研究の基礎になっている音源分離のためのベイズモデルを改良することに取り組んだ。従来のベイズモデルは、潜在的ディリクレ配分法(LDA)を拡張したものであり、各時間・周波数ビンをある特定の音源に排他的に割り当てるものであった。このモデルに対し、音源信号のスペクトログラムの低ランク性を表現する非負値行列因子分解(NMF)を統合することにより、さらなる音源分離の性能向上が果たせることを予備的な実験により確認した。「研究実績の概要」に述べた通り、当初の目標である音声認識精度の改善を達成し、さらに音源分離手法自体の改善自体も進んでいる。本年度は、音源分離精度の本質的な向上を目的として、低ランク音源モデルとスパース重畳過程に基づくネスト型ベイズ混合・因子モデルを用いたマルチチャネル音源分離法について研究を行った。従来の音源分離では、音源モデルに対して低ランク性を仮定したうえで、因子モデルであるNMFを用いるものや、重畳過程における音源のスパース性を仮定したうえで、混合モデルであるLDAを用いるものなどがあった。提案法では、音源モデルと重畳過程を統合した音源分離を行うことで、高精度な分離が実現できる。また、因子モデルと混合モデルの関係性に着目し、音源モデルと重畳過程のそれぞれに対し、因子モデルと混合モデルによるモデル化を行うことで複数の分離法を提案した。本研究成果は、信号処理分野のトップカンファレンスであるICASSP 2017に採択され、IEEE/ACM TASLPには現在のところ条件付き採録となっている。一方、音声強調技術についても研究を行った。具体的には、マイクアレイや周囲の環境などの事前情報を用いなくても、入力音響信号である多チャネル振幅スペクトログラムを低ランク成分(雑音)とスパース成分(目的音声)とに高精度に分離することができる手法を開発した。本手法は本来、瓦礫内探査用レスキューロボットに搭載することを目的として開発されたが、一般的な場面における音声強調にも効果があることが判明し、実際に音声認識率の大幅な確認した。本研究成果は、信号処理分野の国際会議であるEUSIPCO 2017に採択され、英文ジャーナルJRMにも採録されている。これら一連の研究により、音声強調・分離・認識という一連のプロセスがすべて確率モデルに基づいて定式化さて、昨年度開発した、MCMCに基づく音響信号処理と音声認識の統合法をさらに改善することが可能となった。今後は、音源分離手法のオンライン化や残響除去・雑音除去との統合にも取り組む。さらに、音声認識との統合についても研究を進める。統計的音響信号処理研究スケジュールの関係で、当初計画していたよりも旅費が少なく済んだ。音源分離の実行には膨大な計算が伴うため、強力な計算サーバの購入を検討している。国際会議に関する旅費や論文誌投稿料も増加する見込みである。
組み換え多角体を用いた相互作用するタンパク質の検出と分離

カイコ細胞質多角体病ウイルスの多角体形成に関与するポリヘドリン遺伝子と、VP3にマウス由来のFosBを接続したキメラ遺伝子を含むバイナリーベクターを作成し、アグロバクテリウムを介してレタスやタバコBY-2細胞などを形質転換した。結果、ウエスタン法による検出ができたものの含量が少なく、生産物のサイズが小さくなっていたなど、さらに検討を要する問題が多いことが明らかになった。そこで、当初の予定を変更し、相互作用するタンパク質の分離が多角体を用いて可能かどうかをカイコ培養細胞を使って調製した多角体を使って確かめることにした。研究では、ホウレンソウ由来のチオレドキシン(Trx-m)を提示させた多角体を作成し、これを用いてTrx-mと相互作用するタンパク質群の分離を試みた。Trx-mとして、S-S結合の形成に関与するシステイン残基の一つをセリンに置換したTrx-m_<c41s>を用いた。これをVP3遺伝子に連結し、カイコ培養細胞を使用して組換え多角体を生産した。この多角体を用いて、ホウレンソウ葉緑体の粗抽出液からTrx-mと相互作用するタンパク質のいくつか(Rubisco Activaseなど)を分離することに成功した。具体的には、多角体をDTTで前処理して洗浄し、次にタンパク質と反応させ、最後にDTT処理して多角体から溶出させることで相互作用するタンパク質の分離を行うことができた。この洗浄方法や特異性の高さ、繰り返し利用性のなどについては今後も検討を続け、洗練された方法とする価値があると考えられた。カイコ細胞質多角体病ウイルスのVP3タンパク質の遺伝子に、任意のタンパク質の遺伝子を接続したキメラ遺伝子を、同ウイルスのポリヘドリン遺伝子と共にカイコあるいは植物細胞内で発現させると、VP3に接続したタンパク質の一部が表面に局在した多角体が形成され、細胞の破砕・遠心分離によって単離することができる。本研究はこの現象を利用して、相互作用する2種のタンパク質を検出・分離する方法を開発しようとするものである。本年度は、ヘテロ二量体を形成して転写調節因子として作用するJunBおよびFosBをモデルタンパク質として選び、両タンパク質の二量体形成の性質を考慮して、FosBを固定した多角体の形成を試みた。ポリヘドリン遺伝子を含むpBS(KS)-H、VP3選伝子をもつpAcVP3/GFP、FosB遺伝子をもつプラスミドベクター465.2ならびに植物用バイナリーベクターpIG121-Hmを用いて、pIG121-H-VP3/FosBを構築した。これはT-DNA領域内に、いずれもCaMV35Sプロモーターとnosターミネーターで制御されるポリヘドリンおよびVP3/Fos遺伝子をタンデムにもっバイナリーベクターで、一度のアグロバクテリウム感染でFosBをもつ多角体を生成することを目標としたものである。このベクターで形質転換したゼニゴケ培養細胞は、マーカーである抗生物質耐性を示し、顕微鏡観察によって細胞内に多角体様の構造物を形成することは確認できたが、細胞の成長が極端に悪く、DNAおよびタンパク質レベルで確認するには到らなかった。(1)昨年度に引き続き、植物に機能性の多角体を生産させることを試みた。当初の目的であるFosBに代えてGUSを連結したVP3を用意し、遺伝子導入したが、植物の生育が悪く、安定した組換え体を得ることができなかった。組換え直後には、GUS活性を示す多角体様の粒子が細胞内に観察されることがあったが、それ以降の生育がきわめて悪かった。原因として、VP3生産ないしVP3そのものが植物細胞に悪影響を及ぼしている可能性が考えられたため、VP3のC末端寄りに2箇所存在するPmaCI部位間の約700bpsを短縮化した。このベクターを利用して組み換え体の作出を試みたが、現在まで安定した組換え植物は得られていない。今後は、さらにVP3遺伝子を短縮化し、その影響を観察する予定である。(2)植物による多角体の生産は予想以上に効率が低いと考えられたので、機能性を持った多角体を試験管内で生産する可能性についても検討した。可溶化したポリヘドリンタンパク質を市販のキットを用いてPODラベルし、これをカイコ細胞由来の多角体と反応させた。結果、可溶化したポリヘドリンタンパク質が多角体の表面に結合し、PODでラベルされたタンパク質粒子が形成された。このことは、すでに存在する多角体を核として利用し、ポリヘドリンタンパク質を介することによって、多角体表面に任意のタンパク質を付着させ得ることを示している。今後このことを利用して、相互作用するモデルタンパク質として選んでいるFosBをポリヘドリンに連結し、これを核となる多角体に付着させてJunとの相互作用を検討する予定である。

Trx-mとして、S-S結合の形成に関与するシステイン残基の一つをセリンに置換したTrx-m_<c41s>を用いた。これをVP3遺伝子に連結し、カイコ培養細胞を使用して組換え多角体を生産した。この多角体を用いて、ホウレンソウ葉緑体の粗抽出液からTrx-mと相互作用するタンパク質のいくつか(Rubisco Activaseなど)を分離することに成功した。具体的には、多角体をDTTで前処理して洗浄し、次にタンパク質と反応させ、最後にDTT処理して多角体から溶出させることで相互作用するタンパク質の分離を行うことができた。この洗浄方法や特異性の高さ、繰り返し利用性のなどについては今後も検討を続け、洗練された方法とする価値があると考えられた。
知的障害者入所更生施設の脱施設化方策に関する研究

本研究は、日本における知的障害者入所施設の脱施設化方策を明らかにすることを目的とした。その当事者である知的障害者入所施設の利用者、担当職員および家族に対する脱施設化にかかわる実態・意向調査では、3-4割の利用者が地域生活への移行を希望していることが明らかにされた。担当職員もほぼ同じ意向であり、確かな願いとなっていよう。脱施設化の方策の基本課題は、この要望に応える、移行支援および受け皿づくりとなっている。しかし国の施策は、現在及びこれまでの障害者プラン分析から、脱施設化の推進ではなく、入所施設の改革も含めた入所施設政策の放棄であると明らかにした。その点では、国施策で「欧米のように脱施設化を」といわれるが、北欧とアメリカの相違を明確にする必要がある。北欧のようにノーマルな生活をあたかも保障するかのようにとられるが、実際はアメリカのような施設への社会保障予算削減を覆い隠していよう。脱施設化方策の基本課題は、この国施策の転換にある。宮城、長野県などで展開されている脱施設化計画も、移行支援や受け皿づくりのための単独施策が有効に機能しているが、しかし国の施策支援がないもとで、自治体財政の縮減との矛盾を内包している。国施策の転換にむけた当事者たちの実践課題としては、単なる居住の場の移行だけではなく、入所施設での集団生活の支援から、地域での個別生活の支援に移行する、という視点が重要であることを明らかにした。両者は相容れない独自性をもつ支援形態であり、それぞれに保障していく課題が提起される。移行方策では、集団生活の支援を受け継ぐ日中活動の場の保障、入所生活で経験していない個別生活の支援を学ぶ機会の保障、さらに移行後は、両者を総合的に永続的にコーデイネートする個別支援者制度の創設が必要であると提起した。1)主として、この間の大きく展開した障害者福祉制度改革等における脱施設化施策について検討し、成果を発表してきた。新障害者プラン(2003-2012年)は、知的障害者入所更生施設の今後の整備計画に関して、「真に必要なもののみ」と限定し、前半5年の重点施策ではその整備に関する数値目標も掲げなかった。明確な脱施設化への施策方針の変更と考える。しかし具体的な支援費制度や平成15年度施策を分析すると、現在の知的障害者入所更生施設利用者が永続的に利用継続しがたくする消極的施策でしかない。積極的な脱施設化政策、地域生活への移行を推進する特別な施策展開もなく、また現在いる待機者問題を具体的に解決する施策展開もない。本研究の意義をあらためて確認することとなった。2)欧米の脱施設化に関する文献研究では、現在のところ、アメリカにおける個の内面に関する権力の介入に対する脱施設化、北欧における標準的な生活保障としての脱施設化、という必ずしも一括りにできない傾向があるという仮説を導いている。それ故にノーマルな生活保障という施策研究である本研究においては、今後北欧を中心として、その脱施設化過程を主に検討していく。3)知的障害者入所更生施設における少人数共同生活に関しては、先駆的に活動している諸施設からの聴取、資料収集をすすめてきた。障害の軽重に係わりなく大きな変化をつくりだしており、地域生活への具体的な移行準備として十分に機能している。しかし移行にあたっては、家族問題、継続的系統的な支援担当者などの課題がある。今後はこれらの検討を進める。(1)障害者基本計画(2003-2012)における入所施設利用者の地域生活移行施策の検討

障害者基本計画の脱施設化施策は、知的障害者入所更生施設の整備抑制施策が本質であり、基本的には政府による知的障害者入所施設施策の放棄であることを、同計画の審議過程及び同計画の変遷から明らかにした。従って本研究の課題は、現場における地域生活移行実践と方策の検討が重点となった。(2)大阪府内知的障害者入所施設の利用者・家族の調査研究大阪府内25入所施設の1400人の利用者及びその家族600人の生活実態と地域生活移行への意向調査を行った。4割が在籍20年以上、3分の1が定員90人以上の大規模施設であり、ほぼ全国の実態の縮図と言える。利用者の4割、担当職員の4割が地域生活移行を表明したが、保護者は1割に満たない。この差異の解明をして移行実践の基本的課題を提起した。これだけ多くの家族に対する調査はわが国はじめてであろうと考える。所得、要介護率、寿命など深刻な実態がリアルにされた。しかし高齢になっても面会回数が増加するなど、子の保護者としての活動や意識はむしろ強まっている。家族とともに、という移行実践の重要性も確認できた。(3)地域生活移行のための方策地域資源の開発を前提にしつつも、実践上の基本的な課題としては、継続的固定的な施設支援と断続的交代的な居宅生活支援の相違を明確にしつつ、その支援形態が移行するための準備や訓練をしていくことが重要であると明らかにされた。欧米のケースマネジメントの手法や理念を日本的に蓄積された施設支援との比較で検討、教訓化した成果である。
気候変動の将来枠組に関する国際比較研究

気候変動に関する国際法の基本原則が不明確なままとどめられていることが将来枠組の合意形成を妨げているとの認識から、国際法協会において、その意味内容を明確にする報告書を纏めた。また、気候変動条約の規制対象とする温室効果ガス以外の物質も温暖化の原因となっていることが判明し、そうした物質は越境大気汚染やオゾン層破壊と密接に関連することから、筆者は、気候変動問題を、より包括的に「大気」の環境保護の枠組で捉えなければならないことを国際法委員会において提案した。平成21年度は、気候変動問題を扱う京都議定書の問題点とポスト京都の法的枠組に関する分析を行い、気候変動の将来枠組の具体的な内容について検討した。また国際法協会気候変動委員会の委員長として各国から選出された30名の委員と共に、報告書の執筆を続けた。在外調査としては、温室効果ガスの主要排出国でありながら、京都議定書の排出削減義務を負っていない中国の汚染対策、気候変動政策の実情を調査するため、北京に赴き、現地リサイクル工場などの視察を行ったほか、中国環境省の副大臣をはじめ環境問題の専門家から、中国の環境問題に対する取り組みについて多くの教示を得た。また、お気候変動問題の最大の影響を受けているとされる南太平洋諸国(パラオ、フィジー、ツバル、バヌアツ等)の実情を把握するため、現地調査を実施し、海岸浸食・海面上昇状況の視察のほか、各国国務大臣、大統領、首相と会見し、南太平洋諸国の環境問題への取り組み、気候変動締約国コペンハーゲン会議(COP15)の問題点についての意見交換を行った。さらに、オランダ・ハーグでは、国際司法裁判所判事や法務官、滞在中の国際法学者やインド外務省法律顧問との意見交換、平和宮図書館での資料収集を行い、「司法」の側面から見た国際環境法の問題について教示を得た。以上の在外調査を経て明らかとなったのは、(1)高度な経済成長を達成した途上国(中国、インドなど)には、温室効果ガス削減義務の履行能力、少なくともその意思があること、(2)問題は、これら途上国において、気候変動問題や環境問題の科学的知識が不足しており、国際環境法の国内的履行制度(国内法の整備)が十分確立されていないこと、及び、(3)先進国と途上国の政治的主張の対立の収束点を定め、一体となって気候変動問題に対処するような国際合意の内容が形成されていないこと、の3点である。このように本年度は、在外調査によって各国の実情と問題点を明らかとしたが、これを踏まえ、気候変動の将来枠組構想の提示に備えて準備を進めているところである。平成22年度は、気候変動問題に関する一般国際法原則の内容について検討した。先進国の排出削減量を固定化し、途上国に削減義務を課さない京都議定書は、気候変動を防ぐための機能を果たさないまま「第一約束期間」の終了を目前に控え、次期枠組交渉の議論は拡散、対立は深刻化している。しかし、京都議定書も国家間の合意であるかぎり一般国際法上の諸原則による制約から免れることはできないはずである。国際法協会(International Law Association, ILA)では、「気候変動に関する法原則」に関する国際委員会の委員長を務め、一般国際法たる「共通だが差異ある責任」「衡平」「予防原則」「持続可能な発展」「信義誠実の原則」といった関連「法原則」を徹底的に再吟味する作業を開始し、第一報告書を作成した。今後は、これらの法原則を条文草案として成文化し、コメンタリーを付した「気候変動京都原則」を採択する予定である。また、委員を務める国連国際法委員会(International Law Commission, ILC)においても、筆者の提案する「大気の環境保護」に関する条文草案の中で気候変動を扱い、定義、適用範囲、目的、大気の法的地位といった「一般条項」(General Provisions)を検討した。「一般条項」については、ケニアでの在外調査において、環境法専門家とワークショップを行い、意見交換や条文草案の検討を行った。このように本年度は、国際法協会と国連国際法委員会という2つの場を中心に気候変動に関する一般条項や法原則を条文草案として作成した。今後は、これを踏まえ、基本原則や義務の履行、国家責任、紛争処理に関する国際法を法典化する作業を進めたいと考えている。気候変動をもたらす科学的要因が越境大気汚染やオゾン層破壊をもたらす要因と相互に密接に連関していることから、気候変動の将来枠組構想として、気候変動問題を個別に扱うのではなく、気候変動、越境大気汚染、オゾン層破壊の問題を「大気の保護」として包括的に扱う国際法枠組を検討している。既存の条約はこれらの問題を別個に扱うにすぎない。また、気候変動関連条約は主要排出国が加入しないまま政治的対立が続き、実効的な将来枠組を示すことができていない。こうした状況において、各国の現実的状況を確認しつつ、すべての国家を拘束し、包括的に「大気の保護」を扱う一般国際法について明確化すること急務であると考えられる。「共通だが差異ある責任」

「衡平」「持続可能な発展」といった法原則については、既に国際法協会(ILA)「気候変動に関連する法原則」に関する国際委員会(委員長:村瀬信也)第一報告書にて纏めているところ、本年度は、「汚染者負担原則」「予防原則と防止原則」「信義誠実の原則」等の性質、内容、法的地位について、本年8月のブルガリア・ソフィアでの総会に提出する第二報告書を纏めた。ハーグ、中国等での在外調査では、同委員会の報告者を務めるLavanya Rajamani教授をはじめ、各国の環境法専門家や国際法専門家とワークショップを行い、意見交換、内容の検討を行った。「大気の保護」として包括的に扱う場合には、これら具体的な法原則を適用する前提として「大気の定義」「適用範囲」「大気の法的地位」を明確にする必要がある。本年度、委員を務める国連国際法委員会(ILC)において、筆者の提案する「大気の保護」に関する国際法の法典化が正式に同委員会のプロジェクトとして採用されたところ、これら内容を検討し条文化した第一報告書及び暫定コメンタリーを纏めた。本研究は、京都議定書以降の気候変動(地球温暖化防止)に関する国際枠組を、世界の各地域および各国の実情を踏まえつつ、国際法学・国際立法論の観点から実証的に検討しようとするものであった。2012年12月のドーハCOP-18では、2020年以降の新しい法的枠組を策定することが決定された。しかし各国の議論が錯綜する中、新たな国際立法に向けて、議論の「共通の基礎」として気候変動に関する法的諸原則を明らかにすることが必要とされている。2012年5月から8月にかけてジュネーヴ国連欧州本部で開催される国連国際法委員会(ILC)においては、昨年から引き続き、気候変動と密接な関連を有する越境大気汚染、オゾン層破壊を包括的に扱う「大気の保護」の提案を行い、報告書を作成し、審議に付した。2012年8月25日から31日にかけてオランダ・ハーグで開催された国際法協会(ILA)ソフィア大会では、委員長を務める「気候変動に関連する法的諸原則」の委員会にて、中国・インド・アフリカ諸国を含む世界各国から30名の専門家と意見交換、審議を行い、「共通だが差異ある責任」「持続可能な発展」「予防原則」といった法原則を明らかにする第二報告書を纏めた。「共通だが差異ある責任」原則は、すべての国が共通の責任を負うことが大前提とされており、その上で実質的な差異を考慮するものであることを明らかとした。この認識こそが、将来枠組策定において共通認識とされるべき大原則であることを明らかとした。また、ここでも気候変動と越境大気汚染、オゾン層破壊との関連性を指摘し、将来の国際立法において、これらを包括的に扱うべきことを提起した。2013年1月10日から13日にかけては、平和宮図書館・ハーグ国際法アカデミーにて、資料収集・意見交換を行い、専門家と上記の認識を共有した。国連国際法委員会(ILC)において既に提出した「大気の保護」暫定報告書、及び、本年提出する予定の「大気の保護」第一報告書において、大気の性質、法的地位、法的定義の検討を終えている。また、国際法協会(ILA)において提出した第一報告書、及び、本年提出する予定の第二報告書において、共通だが差異ある責任、衡平、持続可能な発展、予防原則、防止原則、信義則、汚染者負担原則等の原則についても一応の検討を終えている。
咀嚼サイクルにおける咬筋エネルギー代謝の解析

本研究は、咀嚼の1ストロークにおける咬筋筋細胞のリン化合物によるエネルギー代謝状態を31P-MRSで解析することによって、咀嚼の1ストロークにおける咬筋の咀嚼サイクルに果たす役割を、エネルギー代謝レベルから明らかにすることを目的として、現有する臨床用1.5Tesla MRI装置に、マルチスライスで咬筋を包含するsagittal方向でMRIを撮像後、31P-MRS測定領域として咬筋筋腹中央部を選択測定し、現在食品を介在させずに開閉口運動させて信号強度を確認するために、モーションアーチファクトの影響を考慮して許容できるS/N比でスペクトルが得られるまで加算回数、下顎運動および咀嚼サイクルを変化させての31P-MRSパラメータの設定を試みたが、モーションアーチファクトによると考えられるS/N比の低さのために測定は困難であった。そこで、これは咀嚼運動をしている間のエネルギー代謝の測定は、やはり信号強度が低いことに問題があると考え、麻酔下のラット咬筋を用いて段階的に開口させ、同じ下顎位における31P-MRS測定用の加算プログラムを開発し、そのプログラムをヒトに応用することにした。そのためにはまず、咬筋形態および咬筋重量を測定を測定し、ラット咬筋にフィットしたプロ-べを作製した。これによってラット咬筋での測定は十分可能になり、段階的にヒト自由咀嚼での同じ下顎位での31P-MRS測定へと研究を進める予定である。本研究では、咀嚼の1ストロークにおける咬筋筋細胞のリン化合物によるエネルギー代謝状態を31P-MRSで解析することによって、咀嚼の1ストロークにおける咬筋の咀嚼サイクルに果たす役割を、エネルギー代謝レベルから明らかにすることを目的として、現有する臨床用1.5TeslaMRI装置に、マルチスライスで咬筋を包含するsagittal方向でMRIを撮像後、31P-MRS測定領域として咬筋筋腹中央部を選択測定し、現在食品を介在させずに開閉口運動させて信号強度を確認している段階であり、モーションアーチファクトの影響を考慮して許容できるS/N比でスペクトルが得られるまで加算回数、下顎運動および咀嚼サイクルを変化させての31P-MRSパラメータの設定はまだ完了していない。これは咀嚼運動をしている間のエネルギー代謝の測定は、やはり信号強度が低いことに問題があると考え、今後、測定可能な信号強度が得られるように下顎運動経路を考慮し、咀嚼というモーションアーチファクトの影響がなく測定できるような下顎位を再設定して、段階的に自由咀嚼での測定へと研究を進める予定である。
肺癌の微小転移検出に関する細胞分子生物学的解析

肺癌、とくに肺非小細胞癌の細胞分子生物学的特性からみた悪性度、予後因子、遠隔転移巣形成の指標、Occult metastatic lesionの検出について研究してきた。肺癌の予後因子としては細胞外マトリックスの分解酵素であるカテプシンBの発現量の多さが有力な指標になることを示した。遠隔転移巣の形成と細胞接着分子との関連について、肺癌細胞株を用いた研究によりインテグリンα_2、α_3、α_5、α_6、α_v分子の発現率が有意に関連していた。さらに、カテプシンBの発現量との関連を抗インテグリン抗体のブロックによるカテプシンB発現の変化を検討し、肺癌細胞のインテグリンα_6β_4がカテプシンBの発現と有意な正の相関を示すことを明らかにした。ついで、臨床的に見いだし得ない微小な遠隔転移の検出を目的に、肺癌患者の骨髄液中の腫瘍細胞の検出を抗サイトケラチン18モノクローナル抗体を用いた方法で行った。遠隔転移がないとされる病期I期の肺非小細胞癌の32.3%に陽性細胞を認めた。occult metastatic lesionの存在を確認し得た。インテグリンの発現と骨髄液中のサイトケラチン18陽性細胞の検出率はα_2β_1インテグリンを発現している肺癌で有意に高率に(73.3%)検出し得た。原発巣でα_2分子を発現している肺癌のすべての転移巣でも同様に発現していた。肺癌の微小転移巣の検出にサイトケラチン18モノクローナル抗体による方法は精度が高く、臨床的に有用であることが示された。肺癌の浸潤・転移能と微小な遠隔転移病巣の検出について研究してきた。浸潤・転移能の指標として肺癌細胞の増殖能、細胞外マトリックス分解能、血管内皮細胞との接着能がそれぞれ関与していることを示したが、血管新生との関連について検討した。ヒト肺腺癌組織を用い、免疫組織化学的に検討し、腫瘍新生血管増生と所属リンパ節転移との間には有為な正の相関が見られ、腫瘍新生血管の増生率は肺癌の浸潤・転移能の有用な臨床的指標になることを示した。インテグリンα6β4はカテプシンBの発現と正の相関を示した。現在の画像診断では描出しがたい微小な転移病巣の検出として、肺癌患者の骨髄中の腫瘍細胞を抗サイトケラチン18モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色により検討すると、病理病期の進行したIIIA期では70%、IIIB期とIV期では100%と非常に高率に検出され、骨髄中のサイトケラチン陽性細胞の検討は肺癌の微小な転移病巣検出に有用となる可能性が示された。この検出率は肺癌の組織型と関係なく、同様な成績であった。遠隔転移を臨床的に見いだし得ない病理病期I期肺癌のサイトケラチン陽性細胞の検出率は腺癌で40%、扁平上皮癌で35%であり、肺癌では早期より遠隔転移の存在する可能性が示された。肺腺癌患者の骨髄中のサイトケラチン陽性細胞と腺癌細胞のインテグリン発現との関連を見ると、サントケラチン陽性の肺癌ではインテグリンα2鎖の発現の増加を認めた。α2鎖の発現の増加は肺癌の浸潤・転移に関与していることを示し得た。肺癌、とくに排非小細胞癌の細胞分子生物学的特性からみた悪性度、予後因子、遠隔転移巣形成の指標、Occult metastatic lesionの検出について研究してきた。肺癌の予後因子としては細胞外マトリックスの分解酵素であるカプシンBの発現量の多さが有力な指標となることを示した。

遠隔転移巣の形成と細胞接着分子との関連について、肺癌細胞株を用いた研究によりインテグリンα_2、α_3、α_5、α_6、α_v分子の発現率が有意に関連していた。さらに、カテプシンBの発現量との関連を抗インテグリン抗体のブロックによるカテプシンBの発現の変化を検討し、肺癌細胞のインテグリンα_6β_4がカテプシンBの発現と有意な正の相関を示すことを明らかにした。ついで、臨床的に見いだし得ない微小な遠隔転移の検出を目的に、肺癌患者の骨髄液中の腫瘍細胞の検出を抗サイトケラチン18モノクローナル抗体を用いた方法で行った。遠隔転移がないとされる病期I期の肺非小細胞癌の32.3%に陽性細胞を認めた。occult metastatic lesionの存在を確認し得た。インテグリンの発現と骨髄液中のサイトケラチン18陽性細胞の検出率はα_2β_1インテグリンを発現している肺癌で有意に高率に(73.3%)検出し得た。原発巣でα_2分子を発現している肺癌のすべての転移巣でも同様に発現していた。肺癌の微小転移巣の検出にサイトケラチン18モノクローナル抗体による方法は精度が高く、臨床的に有用であることが示された。
マングローブ林の保全林施業に関する基礎的研究

前年度と同様に面表島後良川マングローブ林に設置した気象観測搭でデータを収集した。データを集積するデータ・ローガー内での結露や塩風による器機故障で欠測した期間もあったが、各測定項目についてデータを集めることができた。現在、データを分析中であるが、例ば、風向、風速についてみると、前面のマヤプシギ林と後背地のオヒルギ林では風向が変化していること、風速は後者が弱くなっていること、また、最大風速は、林内風速は林外の約6分の1に弱くなるなど、防風機能及び微気象に関して特性が表れている。また、夏、冬季に実施したCO_2濃度、熱放射などから、気象の日変化について分析したところ、湖汐の役目など興味ある変化がみられた。次に個葉の光合成速度を測定し、上記のデータなどを使つて林分の一次生産を推定したところ、オヒルギ林では、15mume/m^2/Sという高い値を示し、マヤプレギ林では光強度の変化とともに変化したが最大値はオヒルギより大であったが、平均すると10mumol/m^2/S位であつた。以上、データの一部について大まかな傾向を示したが、収集したデータについて分析し、報告書を作成することにしている。調査地の西表島後良川における林分調査の結果,当地のマングローブ林は,海側前面にマヤプシギ,ヒルギダマシ群落,ヤエヤマヒルギ群落,河岸にはヤエヤマヒルギ群落,オヒルギ群落が帯状に分布していた。そこで,群落としては前面のマヤプシギと内陸部の河岸に分布するオヒルギに気象観測塔を設置することにした。観測塔は足場用の鉄パイプを組立てて、ヤマプシギ林では6m,オヒルギ林では12mの高さとし,温・湿度センサーを各4点,風向,風速計を各2点,熱流板を各1点設置してデータロガーにデータを集積している。機器の設置が計画より少し遅れたが,現在データを集積中である。収集したデータについては分析を進めているが、まだ短期間なので全般的な傾向については言及できないが,冬季のデータ分析は,風向・風速は前面と内部及び林外と林内での違い,地温が潮汐によって大きい影響を受けることなど,マングローブ林の特徴が得られている。今後,測定を継続し,マングローブ林域の微気象について年間を通しての傾向及び防風林としての機能等について分析してゆく予定である。また,炭酸ガスの分布についても測定して,マングローブ林の生産についても検討する予定である。
サイクリンA発現調節に基づく血管平滑筋アポトーシス誘導法の開発

1)抗酸化剤による血管平滑筋細胞におけるアポトーシス誘導において、培養細胞の細胞密度が重要であり、細胞密度が高い時はアポトーシス誘導が困難となることを発見し、その機序として、セル・サイクルの停止が関与していることを見いだした(1998年日本循環器学会)。抗酸化剤が高密度の血管平滑筋細胞の増殖を抑制する機序について引き続き検討を重ねた結果、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであるp21/waf1/cip1の発現が増大していることをmRNAレベルで確認した。現在、その発現の機序を転写レベルで検討中である(投稿中)。2)この興味ある所見にもとづき、食品中の抗酸化物質としてRed Wine Polyphenol(RW-PF)に着目し、RW-PFが血管平滑筋細胞の増殖におよぼす影響を検討した(Suntory基礎研究所との共同研究)。その結果、RW-PFは細胞密度に関わらず、血管平滑筋細胞増殖を抑制し、アポトーシスは惹起しなかった。その細胞増殖抑制作用の機序を解明するためセル・サイクル制御因子であるサイクリンAの発現を検討したところ、その遺伝子発現が、RW-PFによって転写レベルで抑制されていることが判明した(Circulation,in print)。この研究は、食品中抗酸化物質の抗動脈硬化作用のメカニズムの一部を解明するものとして重要である。1)基礎検討として、サイクリンA遺伝子の発現調節機構の解析をすすめ、サイクリンAの転写レベルでの発現調節に対して、サイクリンAのプロモーター領域にあるATF/CRE部位と、同部位への転写因子ATF-1とCREBの結合が、サイクリンAのプロモーター活性に必須であるだけではなく、それら転写因子の燐酸化の状態が重要であることを報告した(J Biol Chem 1997;272:22259-22264.に掲載)。2)すでに抗酸化剤処置によってアポトーシスを起こしている血管平滑筋において、サイクリンA遺伝子の発現が上昇していることを見出しており、その機序を解析したところ、サイクリンAのATF/CRE部位に結合する転写因子複合体の量が増加していることを見出し報告した。(1997年日本動脈硬化学会総会にて発表)他にも、ある種の核内レセプターの発現の上昇を見出しており(未発表)、そのレセプターの過剰発現によるアポトーシス誘導の可否を検討中である。3)抗酸化剤による血管平滑筋細胞におけるアポトーシス誘導において、培養細胞の細胞密度が重要であり、細胞密度が高い時はアポトーシス誘導が困難となることを発見し、その機序として、セル・サイクルの停止が関与している可能性を報告した。(1998年日本循環器学会にて発表、in press)この現象は、増殖中の血管平滑筋細胞に対し選択的にアポトーシスを誘導する方法を確立する目的には合わないが、細胞増殖抑制に働くため結果的には、平滑筋細胞を抑制することが出来ると考えられ、問題はないと思われる。抗酸化剤が高密度の血管平滑筋細胞の増殖を抑制する機序について引き続き検討を重ねた結果、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであるp21/wafciplの発現が増大していることをmRNAレベルで確認した。現在、その発現の機序を転写レベルで検討中である。その細胞増殖抑制作用の機序を解明するためセル・サイクル制御因子であるサイクリンAの発現を検討したところ、その遺伝子発現が、RW-PFによって転写レベルで抑制されていることが判明した(manuscrit in revision)。
組換え大腸菌を利用するシトクロムP450システムの機能強化

近年、生体触媒の酸化反応プロセスへの応用が注目されている。酸化反応には一般に高温・高圧が要求され、反応の制御が困難であると同時に爆発性を伴うため、これを常温・常圧で効率よく行うことが可能なバイオプロセスに変換する意義は極めて大きい。本研究では、特に脂溶性の基質の酸化反応を、常温・常圧で効率よく行うことが可能な新規生体触媒の創製を目指し、遺伝子工学的手法と有機化学的手法を組み合わせ、補酵素NADH/NADPH再生系が導入された大腸菌P450細胞触媒の機能強化について検討した。本研究では、Pseudomonas putida由来の可溶性タンパク質からなるP450システム(以下、P450camシステム)をモデルとして、大腸菌を細胞触媒として用いる超高効率なバイオ酸化プロセスの構築について検討している。本年度は、P450camシステムの触媒反応プロセスに必須の3つのタンパク質成分のうち、補酵素NADHから供給される電子を媒介するプチダレドキシン(Pdx)をタンパク質工学的手法で安定化することにより、グリセロールデヒドロゲナーゼによる補酵素(NADH)再生系と共役させたP450camシステムの触媒効率の向上ならびに安定化前に比べ約2倍の基質変換効率を達成した。この結果は、複数のタンパク質間相互作用が必要な酵素触媒プロセスにおいて、鍵となるタンパク質間相互作用の強化により、細胞触媒全体の触媒効率を向上できることを示している。また、非共有結合的相互作用に基づく機能強化について、鋳型となるタンパク質を選定し、その組換えプラスミドの調製を完了した。さらに、脂溶性且つ極性を有する基質変換のためのイオン液体-水二相系の構築に向け、水と混和しないイオン液体を合成し、上述の細胞触媒による基質酸化反応の進行を確認した。さらに、P450camシステムとの比較検討のために、触媒反応プロセスに必要な酸化還元部位を同一タンパク質中に有するBacillus megaterium由来のP450-BM3についても遺伝子クローニング、タンパク質発現ならびに触媒活性の確認まで完了した。本年度は、P450camシステムの触媒反応プロセスに必須の3つのタンパク質成分のうち、補酵素NADHから供給される電子を媒介するプチダレドキシン(Pdx)と酵素部位であるP450camを遺伝子工学的手法により融合化することによりP450camシステムの触媒効率の向上を試みた。その結果、融合タンパク質が宿主内で部分的にプロテアーゼ分解を受けながらも、グリセロールデヒドロゲナーゼの共役無しに酸化反応が進行することが明らかとなり、融合タンパク質として宿主内でタンパク質発現を行うことによる局所濃度の向上が、タンパク質間相互作用を必要とする酵素触媒プロセスの触媒効率の向上に有効なことが分かった。さらに、酵素部位の部位特異的置換により、大腸菌内で色素(インディゴ)生産が可能なことが明らかとなった。また、非共有結合的相互作用に基づく機能強化については、鋳型となるタンパク質との融合タンパク質発現ベクターを数種類構築し、大腸菌内での発現を試みたが、何れも現時点ではP450活性を確認できていない。一方、触媒反応プロセスにNADPHが必要なBacillus megaterium由来のP450-BM3については、発色基質の合成を行い、分光学的な活性の追跡が可能な系の構築を完了した。一般に高温・高圧が要求され、反応の制御が困難であると同時に爆発性を伴う酸化反応を、常温・常圧で効率よく行うことが可能なバイオプロセスに変換する意義は極めて大きい。本研究では、Pseudomonas putida由来の可溶性タンパク質からなるP450システム(以下、P450camシステム)ならびにBacillus megaterium由来のP450-BM3(以下、P450-BM3システム)をモデルとして、大腸菌を細胞触媒として用いる超高効率なバイオ酸化プロセスの構築について検討した。前者について、P450camシステムに必須の3つのタンパク質成分のうち、補酵素NADHから供給される電子を媒介するプチダレドキシン(Pdx)と酵素部位であるP450camを、酵素反応により宿主内で融合する系の構築を試みた。

具体的には、グラム陽性菌の外膜タンパク質の連結を触媒するSortase(ソルターゼ)と呼ばれる酵素の基質となるペプチド配列を、タグとしてP450camならびにPdxに導入し、P450camシステムの生体内融合化を試みたところ、融合タンパク質の存在は確認できたが、十分な連結効率を得るに至らなかった。本来、生体膜上で2次元拡散しながら反応を触媒するソルターゼを、可溶性タンパク質として細胞内で発現したことによる反応性の低下が主な原因であると考えられた。一方、後者のP450-BM3システムについては、グリセロールデヒドロゲナーゼによるNADHの再生系と、NADHの還元力をNADPHに転移する反応を触媒する可溶性トランスヒドロゲナーゼ(STH)をカップルさせる系を生体外で構築することに成功すると共に、合成した発色基質を用いた詳細な分光学的解析から、複数のタンパク質間での電子伝達の律速となる過程を明らかにすることができた。