hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
負イオンビームによる蒸着膜・結晶性制御技術の開発

しかも【C^-】よりも【C(^-_2)】を用いた方がより良質の膜が形成されることが分かった。(J.A.P.に発表される予定)3.負イオンビームと気体との相互作用に関する研究負イオンビーム装置の設計上極めて大切な情報である負イオンビーム崩壊断面積を測定した。負イオンビームエネルギー5-40kV,イオン種【C^-】,【C(^-_2)】,【O^-】,【B^-】,気体の種類アルゴン,窯素である。(Vacuumに発表)
室内土槽・水槽試験による不飽和土の蒸発効率の水分依存性に関する考察と数値モデル化

本研究では,降雨後の通行・運行規制の解除のため,降雨後の斜面表層からの蒸発量に着目した。蒸発量の現地モニタリング手法としてバルク法を用い,室内土槽試験結果を基に不飽和砂質土の蒸発効率βの特徴について考察を行った。交換速度および蒸発効率の算定方法について,東北大学の近藤らの交換速度の算定方法を参考にしつつ,従来とは異なる地表面の熱容量を考慮した交換速度を提案した。また,提案する交換速度を用いた蒸発効率の算定を行い,従来の方法との違いについて考察した。また,蓄積したデータから,研究代表者らが提案する不飽和土の浸透挙動に関する概念モデルから,蒸発効率算定に必要なパラメータのモデル化を行った。本研究では,一般的な気象観測データから蒸発量を推定できるバルク法を用い,そのパラメータの一つである蒸発効率βについて着目する。土質材料(豊浦砂,しらす,まさ土,シルト)や締固め具合(間隙比)の違いにおける蒸発効率の水分依存性(体積含水率蒸発効率の関係)について,土槽・水槽試験で明らかにする。また,確率・統計を援用した数値力学モデルによる,体積含水率蒸発効率の関係のモデル化を行う。今年度は,豊浦砂およびまさ土の体積含水率蒸発効率の関係を得るための室内土槽・水槽試験を行った。各試料の土質試験(粒度試験,締固め試験,土粒子密度試験)を実施し,初期体積含水率と間隙率を管理した試験を実施した。試験結果により,蒸発効率βは,地表面温度などの影響を受けて,ばらつきが大きく表れ易いことが分かったため,東北大学の近藤らが提案する蒸発効率に関連する土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)により試験結果をまとめる方が良いことが分かった。また,使用した試験の土の種類,粒度や間隙比により,体積含水率F(θ)関係の傾向が異なることが確認された。また,体積含水率F(θ)関係に関する確率・統計を援用した数値力学モデルの提案を行うため,入力データの蓄積と,数値力学モデルの基礎部分の妥当性の検討を行い,モデル提案に必要な間隙径分布および水分特性曲線を精度良く表現できることが確認された。今年度の成果により,地表面からの蒸発量予測をするために重要な蒸発効率の特性について把握することが出来たとともに,数値力学モデルの提案の可能性を確認することが出来た。来年度以降,数値力学モデルの具体的な提案と妥当性の評価を行っていきたい。また,数値力学モデル提案の基礎部分の確認を行った。試験結果の分析により,数値力学モデルでモデル化すべきパラメータについて検証を行い,蒸発効率に関連する土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)をモデル化することが効果的である結果が得られた。また,土の種類や粒度,間隙比により,そのパラメータの水分依存性が影響されることも把握出来た。以上より,概ね順調に研究が進展していると判断できる。本研究では,一般的な気象データから蒸発量を推定できるバルク法を用い,そのパラメータの一つである蒸発効率について着目し,不飽和土の蒸発特性について明らかにすることを目的としている。昨年度は,豊浦砂およびまさ土の体積含水率蒸発効率の関係を得るための室内土槽・水槽試験を行い,その試験データを分析することで,蒸発効率よりも東北大学の近藤らが提案する土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)でまとめた方が分析しやすいことが分かったことから,本年度では,そのパラメータについてこれまでに得られた試験データの分析を行うと共に,使用した試験の土の種類,粒度や間隙比に対する不飽和土の蒸発特性について検討を行った。一方,土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)と土中の体積含水率との関係を確率・統計を援用した概念モデルを用いて,一般的な土質データから推定するため,今年度は,概念モデルの骨格をなす粒度分布および間隙径分布に関する計算方法について改良を加えた。また,F(θ)を求めるための計算方法について,モデルの考え方や計算方法の流れについて検討を行った。また,蒸発特性の把握や概念モデルの開発において,不飽和土の水分保持特性を検討する必要となったため,保水性試験機の作製を行った。来年度は,検討した計算方法について,試験データとの比較などから計算方法のアルゴリズムの確立と妥当性の検討を行いたい。今年度は,昨年得られた試験データおよび知見から,土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)を用いた試験データの分析を行うと共に,使用した試験の土の種類,粒度や間隙比に対する不飽和土の蒸発特性についてまとめた。また,土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)と土中の体積含水率との関係を確率・統計を援用した概念モデルについて提案するために,概念モデルの骨格をなす粒度分布および間隙径分布に関する計算方法について改良を加えることができた。一般的な土質データから推定するため,F(θ)を求めるための計算方法について,モデルの考え方や計算方法の流れについて検討を行うことができた。蒸発特性の把握や概念モデルの開発において,不飽和土の水分保持特性を検討する必要となったため,保水性試験機の作製を行った。

本研究では,一般的な気象データから蒸発量を推定できるバルク法を用い,そのパラメータの一つである蒸発効率について着目し,不飽和土の蒸発特性について明らかにすることを目的としている。これまでに,豊浦砂およびマサ土の体積含水率蒸発効率の関係を得るための室内土槽・水槽実験を実施した。また,実験結果を分析することで東北大学の近藤らが提案する土中の間隙の奥から地表面までの水蒸気の流れに対する距離F(θ)を用いた方が分析し易いことがわかったため,体積含水率F(θ)関係の特徴について実験データの分析を行った。さらに,それらのパラメータが土の種類や粒度,間隙比の違いによる特徴を把握するための実験を実施し,実験結果の分析を行ってきた。今年度は,実験から得られた体積含水率F(θ)の関係を推定できる概念モデルの構築を行い,実験結果との比較により妥当性の検討を行った。提案する概念モデルでは,粒度分布と間隙比から土中の間隙径分布を推定し,水分特性曲線,不飽和透水係数などを算定することができる。F(θ)を表現するためのモデルを作製するため,土中の含水量が少ないほど,土中の水蒸気が外部へ流出するための距離が長くなるとの考え方からモデルの構築を行った。また,提案するモデルの妥当性評価を行うため土層実験のデータを用いて検討を行った。さらに,モデルの妥当性評価に必要な保水性試験の結果をを実施した。以上の検討の結果,粒度分布と間隙比を入力パラメータとし,体積含水率F(θ)の関係を推定するための概念モデルのアルゴリズムを構築できた。妥当性検討の結果,概ね実験結果の特徴を表現することができたが,低含水量領域での傾向などにモデル修正の必要性がある事などがわかった。本研究では,降雨後の通行・運行規制の解除のため,降雨後の斜面表層からの蒸発量に着目した。蒸発量の現地モニタリング手法としてバルク法を用い,室内土槽試験結果を基に不飽和砂質土の蒸発効率βの特徴について考察を行った。交換速度および蒸発効率の算定方法について,東北大学の近藤らの交換速度の算定方法を参考にしつつ,従来とは異なる地表面の熱容量を考慮した交換速度を提案した。また,提案する交換速度を用いた蒸発効率の算定を行い,従来の方法との違いについて考察した。また,蓄積したデータから,研究代表者らが提案する不飽和土の浸透挙動に関する概念モデルから,蒸発効率算定に必要なパラメータのモデル化を行った。今年度は,数値力学モデルの具体的な提案を行うと共に,今年度の室内土槽試験結果を基に,その妥当性の検討および今後の課題についてとりまとめることを主な研究内容とする予定である。また,今年度の土槽試験で確立された試験方法および評価方法を元に,追加試験を行う予定である。今後は,検討した概念モデル計算方法について,試験データとの比較などから計算方法のアルゴリズムの確立と妥当性の検討を行う予定である。また,モデルの入力パラメータのデータ蓄積を行う予定である。また,研究成果の公表を積極的に行う。地盤工学今年度は,室内土槽試験において,特に豊浦砂,まさ土の体積含水率蒸発効率の関係の特徴を把握することに重点を置いた。これは,より具体的な数値力学モデルの提案を行うためである。
悪性唾液腺腫瘍の治療法に関する研究

当教室で樹立したヌードマウス可移植性ヒト唾液腺癌株(TS-1)を免疫原としてモノクローナル抗体(NTS4C3)を作製した。NTS4C3の^<125>I標識,およびダウノマイシン(DNR)との結合体を作製し,唾液腺腫瘍に対するターゲティング療法の可能性を検討した。(2)DNR-NTS結合体は,DNR単独よりTS-2腫瘍に対して高い抗腫瘍効果を示した。当教室で樹立したヒト腺様嚢胞癌細胞株(KSAc3)を標的細胞として用いた。(1)蛍光抗体法による検索の結果,NTS4C3は標的細胞の細胞膜と結合することが判明した。(3)DNR-NTS結合体は,DNR単独より標的細胞に多く取り込まれる事が判明した。(4)DNR-NTS結合体は,DNR単独より標的細胞に対し高い抗腫瘍効果を示した。以上より,NTS4C3を用いたターゲティング療法は,唾液腺腫瘍に対する治療に有用となる可能性が示唆された。当教室で樹立したヌ-ドマウス可移植性ヒト唾液腺癌株(TSー1)のモノクロナ-ル抗体(NTS4C3)を作製し, ^<125>Iを標識,またダウノマイシン(DNR)との結合体を作製し,以下の実験を行った。1.in vivoにおける本抗体の臓器分布パタ-ン^<125>I標識NTS4C3をTSー1担癌ヌ-ドマウスの尾静脈より投与し,各臓器の放射活性を求めた。その結果腫瘍(TSー1)の^<125>I放射活性は,4日目に最高値を示し,いずれの計測でも他臓器より高値を示した。また,TSー1,TSー2,KGK(扁平上皮癌由来培養細胞株)の移植腫瘍の放射活性を比較した結果,KGKに比べTSー1,TSー2は,高値を示した。抗体量による各臓器の放射活性量の違いを検討した(抗体量10μg,50μg,150μg)。腫瘍(TSー1)の放射活性は,抗体量10μg/匹投与群が最高値を示した。2.DNRーNTS4C3結合体を用いた抗腫瘍効果担癌ヌ-ドマウス(腫瘍重量的200mg)にDNRーNTS4C3結合体投与(A)群,DNR単独投与(B)群,NTS4C3単独投与(C)群,コントロ-ル(生食投与)(D)群にわけ,DNR量に換算して1μg/gBWを腹腔内に隔日投与で,3回投与した。投与終了より,3日毎に推定腫瘍重量を求め,初回投与30日後の相対腫瘍重量比を検討したところA群:1.6に対しB群:3.9,C群D群はともに6.0となった。このことにより同量の投与に比し,DNRーNTS4C3結合体投与には,抗腫瘍効果の見られることが判明した。なお,本研究は第33回,第34回,第35回日本口腔外科学会総会および第49回日本癌学会総会において発表した。1.ヒト腺様嚢胞癌細胞株(KSA)のクロ-ン株,介在部導管上皮様細胞株(KSAc3)と筋上皮様細胞株(KSAc4)を用い,NTS4C3との反応性を検討した。(1)酵素抗体間接法により検討した結果,KSAc3とのみ反応が認められた。(2)未固定のKSAc3細胞を用いた蛍光抗体法では,細胞膜に局在した点状の反応が認められた。2.KSAc3細胞内へのダウノマイシン(DNR)の取り込みをDNRーNTS4C3結合体投与群とDNR単独投与群で比較検討した。(1)15時間後にDNRーNTS結合体群はDNR単独投与群より約2倍高い取り込み値を示した。(2)4°Cの条件下における細胞内への取り込み量は,DNR単独投与群では検出されないのに対して,結合体群では取り込みが認められた。このことは,DNR単独群での細胞内への取り込みは,非特異的な能動あるいは受動輸送に過ぎないが,DNRーNTS結合体群では特異的な抗原抗体反応が加わり細胞膜に結合していると考えられた。

3.DNRーNTS結合体の細胞障害効果DNRーNTS結合体とDNR単独投与の細胞障害効果をin vitroで比較検討した結果,DNR量各10,20,40μg/mlの投与時,結合体群はDNR単独投与と比較して強い細胞障害効果を示した。以上より,本抗体を用いた唾液腺腫瘍に対するタ-ゲティング療法の有用性が示唆された。
遊離脂肪酸受容体FFAR1は慢性疼痛に伴ううつ症状発症に関与するのか？

本研究では1野生型および欠損マウスに遷延性炎症性疼痛あるいは末梢神経障害性疼痛を誘発させ、経時的にうつ状態を評価し、さらに抗うつ薬の効果を検討する、21の過程で、経時的に黒質、線条体、扁桃体、前頭前野等の組織を採取し、遺伝子・タンパク質(モノアミン類のトランスポーター・受容体など)発現解析、遊離脂肪酸測定を行う、32で解析を行う領野からin vivoマイクロダイアリシスを行い、各種モノアミン遊離量を測定し、FFAR1作動薬・拮抗薬投与の効果を検討する、ことを提案する。本検討から、未だ不明点の多いFFAR1の中枢神経機能が新たに明らかになるとともに、新規抗うつ薬開発への応用が期待される。
ヒト色素産生細胞異常症におけるagouti signal proteinの役割

自験例から精製したASPとヒト悪性黒色腫培養細胞のin vitroの実験については、昨年度に続いて行っていた白斑部組織からのASP精製が成功せず実施できなかった。しかし、現在2-dimensional gelを用いて腫瘍部と白斑部の蛋白を比較し、ASPと関連する因子を検討中である。本年度はヒト悪性黒色腫とagouti signal protein(ASP)との関連について、組織学的およびin vitro実験系で検討を行った。悪性黒色腫患者(進行期)の腫瘍部とその周囲に生じた白斑部から得た組織の凍結切片に対して,酵素抗体法を用いたところ、腫瘍部では腫瘍細胞がtyrosinase強陽性、ASP陰性を示した。一方、白斑部組織においては残存melanocyteはtyrosinase陰性、一部弱陽性であり、その周囲の細胞の一部にASPが弱陽性を示した。これは白斑部の電顕像でmelanocyte中にpheomelanosome様構造物を認めた現象が、ASPがeumelanogenesisからpheomelanogenesisへのswitchingを起こしたことによる可能性を強く示唆した。マウスのmelanocyteの培養液中にASPを加えると樹枝状突起が短くなり、細胞増殖が遅くなることから、自験例においても腫瘍部周囲の白斑部の細胞はASPを産生することによって腫瘍を抑制しようと働いている可能性が考えられた。ただし、westen blottingでは血清中のASPの存在は確認できなかった。自験例では、原発病変部周囲のみでなく、頭部・上肢にも広く白斑がみられ、それぞれの部位でASPが産生されていると考える。現段階で腫瘍塊、白斑部組織からのASPの精製は成功していないが、悪性黒色腫によるASP産生の促進因子の存在についても非常に興味深い課題と考え、検討を行っていきたい。
形態形成における非コードＲＮＡの機能とその作用機序の解明

エンドセリン-1/エンドセリン-A受容体(Ednra)シグナルが第1鰓弓では下顎のアイデンティティーを決定する。下顎の上顎化が見られるEdnraホモ接合体マウスにlong noncoding RNAのEvf2を発現させると、下顎骨遠位の低形成が増強した。In vivo, in vitroの検討から、Evf2がエンドセリン-1/エンドセリン-A受容体シグナルの主要な遺伝子の発現を直接または間接的に調節していると考えられた。その機序として、DNAメチル化及びメチレーションを介したlong noncoding RNAの働きが考えられた。申請者はこれまで、エンドセリン-1(ET-1)がET-A受容体(ETAR)を介して、頭頚部の形態形成において神経堤細胞の運命決定を制御する因子として働き、特に第1鰓弓では下顎のアイデンティティーを決定することを、マウス発生工学的研究によって示してきた。本研究課題では、noncoding RNAのEvf2が、ET-1/ETARシグナルに関わる分子基盤の解明を目的とした。核転写因子Dlx5、Dlx6は、顎顔面形成においてET-1/ETARシグナル下に存在するが、Evf2はこのDlx5、Dlx6のエンハンサーであるmI56i領域に作用して発現を亢進させることをEvf2ノックインマウスの鰓弓とP19細胞を用いて示すことができた。同様の系で、Evf2は核転写因子HAND2に対して抑制的に働くことを示したが、これはEvf2KIマウスで、ETARKOマウスに比べさらに下顎の切歯が低形成になった原因と考えられた。また、野生型(WT)、ETARKO、Evf2KIの鰓弓のマイクロアレイを用いてEvf2に関わる新たな因子をスクリーニングし、パラスペックル蛋白のPSPC1に着目した。過剰発現の細胞系で、PSPC1蛋白とEvf2mRNAは核内で一部重なる、または接する状態を呈していたため、Evf2と複合体を形成していることが既に知られているDlx蛋白群とPSPC1との関係を免疫沈降法にて検討したところ、3者が複合体を形成している可能性が示唆された。一方、Evf2とDlx5,6の関係をin vivoで検討している中で、Evf2KIヘテロかつDlx5/6KOヘテロのマウスが生後1ー2日で肺の異常(または腸管の異常)で死亡することを見いだした。我々は、エンドセリン-1(ET-1)/ET-A受容体(ETAR/Ednra)シグナルが第1鰓弓では下顎のアイデンティティーを決定することを示してきたが、下顎の上顎化が見られるEdnra-/-にEvf2を発現させると、下顎歯槽骨遠位部と切歯の低形成が増強した。これは、whole mount in situ hybridizationでEdnra-/-胚の鰓弓遠位に僅かに残存していたHAND2の発現消失に起因していると考えられた。また、鰓弓におけるET-1/ETARシグナルの主要な核転写因子Dlx5/6はHAND2のエンハンサーに作用するが、そのDlx5/6とDlx5/6のエンハンサー、Evf2は相互にポジティブフィードバックループを形成していることを培養細胞とEvf2ノックインマウスの鰓弓の両方で示した。その作用メカニズムの一つとして、mI56iエンハンサーの一部のCpGのメチル化が関与している可能性が示唆された。さらに鰓弓のマイクロアレイの結果からパラスペックル蛋白のPSPC1に注目した。PSPC1はEvf2と複合体を形成することができ、in vitroではDlx5/6のエンハンサーを介して転写活性に作用し、強制発現系においてEvf2がパラスペックルの局在を変化させることを見いだした。これらによりEvf2が生体内でも、核内でパラスペックル蛋白に直接または間接的に結合して、転写調節などの機能に関与する可能性が示唆された。我々はエンドセリン-1(ET-1)が神経堤細胞に作用して、下顎のアイデンティティーを決定することを示してきたが、そのET-1シグナルにlong non-coding RNA(lncRNA)Evf2が関わっていることを見出した。そこで、Evf2の作用をin vivo, in vitroで解析したところ、下顎形成の主要な核転写因子群やエンハンサー領域に対し、Evf2がcis, transに作用していることを見いだした。このことが、Evf2ノックインマウス(エンドセリンA受容体プロモーター下にEvf2をノックインしたマウスのホモ接合体)での表現型の変化を説明しうると考えられた。その作用メカニズムを明らかにするために、エピジェネティクス修飾、miRNAの産生、他のRNAのmiRNAの産生、パラスペックルへの関与に注目した。エピジェネティクス修飾に関しては、少量の胚組織からのChIP-シークエンスの系を確立することがほぼできたので、データを蓄積中である。

また、lncRNAが機能を発揮するにはそれと結合する蛋白が重要であるが、まずlncRNAと結合することが知られているパラスペックル蛋白であるPSPC1をクローニングした。PSPC1は胎児胚においては頭部、心臓、鰓弓、四肢で発現し、培養細胞では胎児胚の発現よりかなり弱いもののP19,NIH3T3細胞株で発現が見られた。P19細胞株において、PSPC1はエンハンサーに対して核転写因子と強調して活性を上昇させる可能性を示唆するデータが得られた。下顎の形態形成に必要な因子に対するEvf2の調節に関しては、Evf2とDlx5、Dlx6、HAND2の関係をin vivo、in vitroでの検討し、最終的なデータをまとめることができ、現在投稿準備中である。また、Evf2による遺伝子発現調節の分子メカニズムにおいては、Dlx2のみならずDlx5,Dlx6とEvf2が協調してエンハンサーに作用している傍証が得られているのでRNAと蛋白の直接結合の有無をはっきりさせる必要があるが、一方でPSPC1蛋白とEvf2とのエンハンサーに対する協調作用が見られることから、パラスペックルの転写やRNAプロセッシングへの関与を加味して、Evf2の分子メカニズム研究の一つの方向性を示すことができた。さらにEvf2KIヘテロかつDlx5/6KOヘテロマウスの表現型から新生児疾患のモデルマウスとなる可能性が出てきた。Evf2が作用する蛋白のいくつかを同定することができた。しかしEvf2の機能メカニズムの解析の一つとして、蛋白との結合を証明する必要がある。このために、一般の免疫沈降法(Immunoprecipitation:IP)を応用したRNA-IPが必要であるが、一般のIPより効率のよい免疫沈降が必須なことが判明し、発現ベクターのタグに工夫を加えていたため、現在RNA-IPの結果が出ていない。しかし非常に効率のよいIPの系を構築できたので、順次実験中である。Evf2がDlx5やDlx6とエンハンサーを介して遺伝子発現調節に関わっていることを示せたので、PSPC1を含めさらなる分子メカニズムを明らかにしていく。また、プロモーター領域に対する作用についても、詳細にLuciferase assayを重ねた上で、転写開始複合体の一部に組み込まれているか検討したい。一方、Evf2とDlx5,6の関係をin vivoで検討している中で、偶然にEvf2KIヘテロかつDlx5/6KOヘテロのマウスが生後1ー2日で肺の異常(または腸管の異常)で死亡することを見いだした。この要因として、Dlx5/6 +/-, ETAR+/-, Evf2異所生発現の3要因があるのでEvf2の貢献度を慎重に見極めつつ、Evf2の生体内での作用を検討していく。RNAと蛋白の結合をRNA側からと蛋白側からの両方向で確認し、できうる限り生体での現象に関連させつつ、その結果から分子メカニズムに踏み込んでいく。分子生物学的試薬、細胞培養関連経費はもとより、ChIP-seq等、大量のデータが得られてくるので、その管理解析をする研究補助者の謝金を計上する。
ヘリウム準安定原子衝突による吸着分子の最外結合・反結合電子軌道占有状態の検出

本研究は,半導体表面上の単純分子吸着系に準安定原子脱励起分光(MDS)を適用して,吸着分子の電子軌道の立体的描像を得ることを目的にしている。本年度は,昨年からの積み残しである速度制御可能な新しいタイプの準安定原子ビ-ム源の製作と既設のMDS装置を用いた測定,の両面から研究を進めた。1.速度可変ヘリウム準安定原子源の開発:12keVの一次He^+ビ-ムを約100eVまで減速してアルカリ金属原子と衝突させることにより,アルカルs準位からの電子移行でHe^*準安定原子を作る。ここで減速電圧を変化させることにより,生成He^*のエネルギ-を制御した。高効率の三重項He^*生成が期待できるHe -Na衝突系を選んだ結果,He^+→He^*変換効率が約10^<-4>でHe^*フラックス約10 ^8s_<-1>cm^<-2>を得た。これをSi(100)上のK吸着層に照射した結果,MDS-K4sピ-ク位置が熱速度He^*の場合よりも約0.5eV高エネルギ-側へシフトした。He^*-K間反発ポテンシャルの壁に当たったところでオ-ジェ脱励起が起きているものと思われる。2.Cs/Si(100)表面上の酸素吸着状態のMDSーUPS同時測定による研究:MDSにより02pピ-ク位置がUPSによるものより約-1.0eVシフトすること,両者のモニタ-領域の違いを反映したスペクトル形状などから,下地Si原子間のブリッジサイトに侵入した酸素Csと結合した酸素が共存することを見いだした。本研究は,従来検出困難であった吸着分子の最外結合・反結合軌道の占有状態に関する知見を得るため,ヘリウム準安定原子脱励起分光装置(既設)に速度制御可能な新しいタイプの準安定原子ビ-ム源の開発,高性能電子エネルギ-分析器と制御回路の製作など,実験条件の整備を本年度の目標にした.このうち,自作予定であった球面反射型エネルギ-分析器は次年度送りとなった.以下,製作した新ビ-ム源の要点を述べる.まず1keVオ-ダ-のエネルギ-を持つヘリウムイオンビ-ムを引出し,それを200ー10eVオ-ダ-まで減速する.更にこのイオンをアルカリ蒸気中を走らせ,衝突時にアルカリ原子s準位から電子を移行させることによってHe^*1s2s準安定原子を作る.ここで減速電圧を変化させることにより,生成He^*のエネルギ-を変化させることが可能となる.計算機を用いたイオン軌道解析によって減速イオンレンズ系を設計・製作した.アルカリ蒸気密度はるつぼ温度で制御する.三重項He^*を最も効率よく生成させる衝突系としてHe^+ーNaを選んだ.現在予備実験段階であるが,He^+→He^*の変換効率が約10^<ー4>でHe^*フラックス約10^8s^<ー1>cm^<ー2>のビ-ムを得た.問題点として,変換されずに残されたHe^+のかなりの部分が,散乱を繰り返しながらも試料に到達して,表面からの電子放出に寄与していることが確認された.これを除去することが次年度の重要な課題の一つである.本研究は,半導体表面上の単純分子吸着系に準安定原子脱励起分光(MDS)を適用して,吸着分子の電子軌道の立体的描像を得ることを目的にしている。
振動刺激を用いた睡眠時ブラキシズム抑制装置の効果の検証：ランダム化比較試験

振動刺激スプリントの振動刺激強度を弱/中/強/振動なしの4段階を設定し,ランダム割付を行なって,測定夜ごとに切り替える.睡眠中の咬筋EMGを測定し,覚醒時の10%MVCを指標としてスコアリングしたSB episodeの回数と持続時間を比較検討する.各測定夜において100mm VAS(Visual Analogue Scale)を用いた起床時アンケートにより,顎口腔領域の疼痛および睡眠衛生への影響について調査し,刺激強度との関連を検討する.振動刺激スプリント装着下で,各睡眠段階の割合や覚醒反応の回数等の睡眠構造を簡易型睡眠ポリグラフ検査により測定し,その変化を比較検討する.振動刺激スプリントの振動刺激強度を弱/中/強/振動なしの4段階を設定し,ランダム割付を行なって,測定夜ごとに切り替える.睡眠中の咬筋EMGを測定し,覚醒時の10%MVCを指標としてスコアリングしたSB episodeの回数と持続時間を比較検討する.各測定夜において100mm VAS(Visual Analogue Scale)を用いた起床時アンケートにより,顎口腔領域の疼痛および睡眠衛生への影響について調査し,刺激強度との関連を検討する.振動刺激スプリント装着下で,各睡眠段階の割合や覚醒反応の回数等の睡眠構造を簡易型睡眠ポリグラフ検査により測定し,その変化を比較検討する.
心筋症および心肥大を伴った心臓性突然死の原因遺伝子解析

拡張型心筋症(DCM)の原因遺伝子として報告されているサイファー遺伝子(LDB3)及びRNA結合モチーフ蛋白遺伝子(RBM20)の解析においてそれぞれ肥大型心筋症(HCM)の原因遺伝子変異がすでに検出されたHCM例にDCMの原因として報告されている変異が検出された.また,心肥大例1例にもRBM20に新規の変異が検出され,HCMで検出報告のある変異の近傍に位置していた.以上より重複した各CMの原因遺伝子異常によるCM病態の重篤化及びRBM20のHCM原因遺伝子としての可能性が明らかとなった.心臓性突然死のうち心筋症は遺伝子異常が起因となり,心肥大や心拡張を主体とする病態を呈すといわれている.我々はこれまでに剖検時心筋症と診断された症例について11種類の心サルコメア構成蛋白質をコードする遺伝子およびmtDNA全領域の解析を行い,多くの症例に遺伝子異常を見出してきた.本研究では未だ遺伝子変異が確認されていない症例の原因遺伝子探索および複数遺伝子変異と疾患との関連の検討を目的に拡張型心筋症(DCM)で多くの変異が検出されているラミンA/C遺伝子(LMNA)について遺伝子変異解析を行った.対象は肥大型心筋症(HCM)14例, DCM18例,心筋症の既往がなく剖検時,心重量500g以上で求心性肥大が認められた31例および拡張性肥大が認められた17例である.各症例について血液および心筋からDNAを抽出し,サンガー法にて解析を行ったところ,一塩基置換および非同義置換が各5ヶ所ずつ検出された.今回検出された一塩基置換のうちg.37209T>Cおよびg.61613G>CはExon領域内におけるデータベースにない新たな変異であったが,蛋白質をコードする領域外であった.さらに,他の3ヶ所についてはIntron内での変異であった.また,非同義置換のうちExon10で検出されたp.H566=は一塩基多型であったが,対照群との間に有意差は認められず,疾患との関連性は低いと考えられた.今回,蛋白質異常をもたらすLMNA変異は確認されなかったが,引き続き他の遺伝子変異解析を行い,疾患との関連を明らかにしていく予定である.本年度はラミンA/C遺伝子であるLMNAについて遺伝子変異解析を行った.収集された全症例についてLMNAのExon領域全ての遺伝子解析を終了した.今回,未だ遺伝子異常を認めていない症例について蛋白質に影響をもたらすLMNA変異を確認することが出来なかったが,平成28年度も引き続き他の遺伝子変異解析を行い,疾患との関連について検討していく.心筋症は心筋収縮に関与する心筋サルコメア・サルコレンマ構成要素の遺伝子異常が発症原因の一つとされているが,未だ詳細な病因解明には至っていない.本研究では生前心筋症と診断された法医剖検例及び心筋症の既往がなく剖検時,心重量500g以上で心肥大または心拡張を認めた症例について原因遺伝子探索を行うことで詳細な病態解明を目指すとともに遺伝子解析による確定診断へと展開する研究基盤の確立を目的としている.本年度は拡張型心筋症(DCM)で多くの変異が検出されているサイファー遺伝子(LDB3)及びFHL2遺伝子(FHL2)の遺伝子変異解析を行った.LDB3変異解析では5ヶ所のミスセンス変異と1ヶ所のサイレント変異が検出された.そのうち肥大型心筋症(HCM)1例で検出されたp.D673Nは蛋白質機能予測プログラムであるPolyPhen-2及びSIFTにより蛋白質機能異常をきたす変異と判定された.同変異はすでにDCMの原因遺伝子変異として報告されており,さらに心サルコメア構成蛋白質である心室型ミオシン必須軽鎖をコードするMYL3の変異解析でもHCMの原因遺伝子変異として報告されているp.A57Gが検出されている.本例のようにHCM例でDCMとHCMの原因遺伝子変異を重複して有している例の報告は殆どないが,どちらか一方の原因遺伝子を複数有する場合,心筋症病態が重篤化することが報告されている.よって本例はMYL3及びLDB3異常によりHCMの重篤化が促進した可能性が考えられた.FHL2変異解析では3ヶ所の変異が検出され, p.G48Sについては対照群でも検出されたが, DCM群との間に有意差を認めたため疾患との関連が示唆された.今後さらに症例数を増やし詳細に検討するとともに引き続き他の遺伝子変異解析を行い,疾患との関連を明らかにしていく予定である.収集された全症例について本年度解析予定であったサイファー遺伝子(LDB3)及びFHL2遺伝子(FHL2)のExon領域すべての解析を完了した.未だ遺伝子異常を認めていない症例もまだあることから他の遺伝子変異解析を行い,疾患との関連について詳細に検討していく.心筋症(CM)の病態解明及び心肥大と遺伝子異常との関連について検討するため,生前CMと診断された法医剖検例及びCMの既往がなく剖検時,心重量500g以上で心肥大または心拡張を認めた症例についてその原因遺伝子探索を行った.本年度は近年新たに拡張型心筋症(DCM)の原因遺伝子として発見された心臓特異的骨形成蛋白質10遺伝子(BMP10)及びRNA binding motif protein 20遺伝子(RBM20)の遺伝子変異解析を行った.BMP10についてはDCM例も含めて全例で蛋白質機能に異常をきたす変異は検出されなかった.

一方,RBM20については,肥大型心筋症(HCM)1例で蛋白質機能予測プログラムによって機能異常をきたすと判定されたものの,疾患との関連が不明な変異として報告されているp.R1182Hが検出された.この例では,これまでの検討でミオシン結合蛋白C遺伝子にHCMの原因遺伝子変異として報告されているSer593fs:1も検出されている.よって本例はHCM及びDCMの原因遺伝子変異をそれぞれ有したことでCM病態を重篤化させた可能性が示唆された.また,心肥大1例でこれまで報告例のない変異であるp.G1217Rが検出された.RBM20の変異は,心筋の収縮・弛緩においてサルコメア全体のバランスを維持する蛋白質であるタイチンの選択的スプライシング異常を引き起こすことでDCMを発症すると言われているが,心肥大にも関与している可能性が示唆された.本研究期間で解析したDCMの原因遺伝子のうち蛋白質機能に異常をきたす変異が検出された症例はサイファー遺伝子(LDB3)でHCM1例とRBM20でHCM及び心肥大各1例であった.本結果から重複した各CMの原因遺伝子異常によるCM病態の重篤化及びRBM20のHCM原因遺伝子としての可能性が明らかとなった.拡張型心筋症(DCM)の原因遺伝子として報告されているサイファー遺伝子(LDB3)及びRNA結合モチーフ蛋白遺伝子(RBM20)の解析においてそれぞれ肥大型心筋症(HCM)の原因遺伝子変異がすでに検出されたHCM例にDCMの原因として報告されている変異が検出された.また,心肥大例1例にもRBM20に新規の変異が検出され,HCMで検出報告のある変異の近傍に位置していた.以上より重複した各CMの原因遺伝子異常によるCM病態の重篤化及びRBM20のHCM原因遺伝子としての可能性が明らかとなった.今後の研究計画では拡張型心筋症で多くの変異が検出され,心サルコメアにおけるZ帯構成蛋白質をコードするサイファー遺伝子(LDB3)およびFHL2遺伝子(FHL2)の遺伝子変異解析を行う.同義置換が検出された際にはin silicoスクリーニングおよびリアルタイムPCRを用いて変異alleleの発現量解析を行い,蛋白質への影響を分析する.さらに臨床データが得られている症例についてはその情報も合わせ遺伝子変異と疾患との関連を検討していく予定である.今後の研究計画では拡張型心筋症で多くの変異が検出され,心サルコメア構成蛋白質であるタイチンの遺伝子発現を制御しているRNA Binding Motif Protein20遺伝子(RBM20)及びZ帯に分布し, DCMの新たな原因遺伝子として着目されている心臓特異的骨形成蛋白遺伝子(BMP10)の遺伝子変異解析を行う.ミスセンス変異が検出された際にはin silicoスクリーニングおよび変異alleleの発現量解析を行い,蛋白質への影響を分析する.さらに臨床データが得られている症例についてはその情報も合わせ遺伝子変異と疾患との関連を検討していく予定である.法医学
食物摂取に対する交感神経反応の情報受容・応答の機作とエネルギ-代謝における役割

褐色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)は、エネルギ-消費の自律的調節を行う特異的産熱部位である。前年度の研究で、BAT熱産生が食物摂取に伴い亢進し、それが視床下部腹内側核ー交感神経系によって制御されていることを見出した。更に、食物中の窒素源の組成や含量によって、エネルギ-効率の変化と対応してBAT熱産生能が変動することも明らかとなった。本年度は、後者の知見を更に発展させるために、食餌窒素源の異なる飼料で飼育したラットについて、BATの交感神経活性を測定し、更に、肥満モデルラットについても研索した。(1).ラットを、理想蛋白貭組成に似せたアミノ酸混合を含む飼料、あるいは大豆蛋白貭の加水分解ペプチドを含む飼料で、2週間飼育すると、BAT熱産生能は後者の方が亢進していた。この時交感神経活性をノルエピネフリンの代謝回転速度から求めると、やはり後者の方が約50%増加することがわかった。(2).視床下部腹内側核(VMH)を電気破壊すると、ラットは肥満となるが、この時交感神経ーBAT系の活性も低下することが、我々によって確立している。そこでこのVMH肥満ラットを用いて、大豆ペプチド食の効果を調べた所、正常ラットの場合よりも、より効果的にBATの熱産生能が亢進することが見出された。これらの結果を総合すると、大豆蛋白貭の摂取は交感神経ーBAT系を賦活してエネルギ-消費を増加させる効果を持つと思われ、肥満の予防に一定の効果を期待することが可能である。
シアノバクテリアにおける光合成電子伝達鎖のレドックス検知機構の解明

LuxR型低分子量転写因子PedRは光合成電子伝達活性の低い弱光下でいくつかの遺伝子の発現を制御している。しかし光合成電子伝達活性の高まる強光下では一過的に不活化され転写調節能を失う。この活性変換の際に、PedRが構造変化を起こすことが、抗PedR抗体を用いたウェスタン解析により明らかになった。すなわち、不活型タンパク質の泳動度が活性化型より遅れることを見出した。そこで、光合成電子伝達活性の検知ならびに活性変換メカニズムを解明するために、PedRヘアミノ酸変異を導入し、弱光下、強光下におけるPedR標的遺伝子の発現レベルをノーザン法により調べた。シアノバクテリアのPedRオルソログ間で高度に保存されているK40、T54、T56、W65、K71をそれぞれアラニンに置換した結果、PedRの転写因子としての機能に、以下のような影響が見られた。K40A、T54A:リプレッサー、アクチベーターの両機能が弱まる。T56A:特に影響なし。W65A:アクチベーター機能が失われる。K71A:リプレッサー、アクチベーターの両機能が失われる。今後はこれらの変異株について、光強度変化時のPedR活性変換がどのように行われているかどうかを、ウェスタン解析により調べていきたい。さらに、TOF-MS解析により、PedR活性型・不活型がそれぞれどのような修飾を受けているか調べることを予定しており、その準備としてPedRを過剰に発現するSynechocystis sp. PCC 6803株を作製した。シアノバクテリアSynechocystissp. PCC6803のSsl0564推定転写因子が、シアノバクテリアの相同遺伝子のみに高度に保存された三つのシステイン残基をC末端領域に持つことから、光合成生物特有の転写調節機能を持つのではないかと考え、その機能解析を開始した。DNAマイクロアレイ解析の結果からSsl0564が弱光条件下でいくつかの遺伝子の正あるいは負の調節に関わっていることが示唆された。これら推定標的遺伝子の転写産物をノーザン解析により調べたところ、強光照射によりSsl0564による制御が失われるという結果が得られた。また、強光下で光合成電子伝達阻害剤を添加した条件では、あたかも弱光下であるかのように、Ssl0564による転写制御が行なわれていた。以上の結果から、光合成電子伝達鎖からの還元力が少ない条件下で、Ssl0564が活性型であることが示唆された。ウェスタン解析によりSynechocystis sp. PCC6803の細胞内Ssl0564を検出したところ、光強度変化によらず、常に二量体として一定量存在しており、活性型と不活性型を区別することは出来なかった。そこで、二量体内システイン残基のレドックス変化をより詳細に調べるため、in vivoチオールトラッピングを行った。すると、光合成電子伝達鎖からの還元力供給が少ない弱光下、および強光照射時に光合成電子伝達阻害剤を添加した条件下で、二量体内のシステイン残基が酸化型となっており、そのとき標的遺伝子の転写制御が起きていることが分かった。一方強光下では、Ssl0564は還元されたシステイン残基をもつ不活性型となり、標的遺伝子の転写制御能も失っていた。以上の結果から、Ssl0564転写因子は、光合成電子伝達鎖のレドックス変化を検知しSsl0564二量体内のシステイン残基が酸化されたときに活性型となり標的遺伝子の転写制御を行っている、と考えられた。本実験ではPedRにアミノ酸置換を導入し、標的遺伝子の発現レベルがどのように影響を受けるか調べることによりPedRの光合成電子伝達活性の検知に関わるアミノ酸残基を同定することを目的とする。そのために(1)PedRへのアミノ酸変異導入と(2)標的遺伝子の発現レベルを調べるためのレポーター系使用の、2つの実験方法検討をおこなった。(1)のアミノ酸変異導入については、error prone PCR法の適用を試みたが、効率的にアミノ酸置換を得る実験条件を見いだすことができなかったため、部位特異的変異導入キットを用いて、標的アミノ酸残基のアラニン残基への置換を行った。現在、このアミノ酸置換コンストラクトをpedR破壊株に形質転換し、変異導入株を作製中である。(2)のレポーター系使用に関しては、バクテリア、ホタル両方のルシフェラーゼ遺伝子の使用を試みたが、レポーターが、実際の遺伝子発現レベルを反映しない、発光レベルが低すぎる、等の問題点が明らかになり、引き続き実験条件の検討を行う必要がある。今後は、PedRへのアミノ酸変異導入株を用いて、弱光下、強光下におけるPedR標的遺伝子の発現レベルをノーザン法により解析することで光合成電子伝達活性の検知に関与しているアミノ酸残基を同定していくことを考えている。

そこで、光合成電子伝達活性の検知ならびに活性変換メカニズムを解明するために、PedRヘアミノ酸変異を導入し、弱光下、強光下におけるPedR標的遺伝子の発現レベルをノーザン法により調べた。シアノバクテリアのPedRオルソログ間で高度に保存されているK40、T54、T56、W65、K71をそれぞれアラニンに置換した結果、PedRの転写因子としての機能に、以下のような影響が見られた。K40A、T54A:リプレッサー、アクチベーターの両機能が弱まる。T56A:特に影響なし。W65A:アクチベーター機能が失われる。K71A:リプレッサー、アクチベーターの両機能が失われる。今後はこれらの変異株について、光強度変化時のPedR活性変換がどのように行われているかどうかを、ウェスタン解析により調べていきたい。さらに、TOF-MS解析により、PedR活性型・不活型がそれぞれどのような修飾を受けているか調べることを予定しており、その準備としてPedRを過剰に発現するSynechocystis sp. PCC 6803株を作製した。
金属アレルギ-の疫学的調査ならびにその口腔内使用金属との関連性について

従来,生活環境中の金属による感作とアレルギ-性疾患はしばしば報告されているが,口腔内の補綴物の金属による感作や皮膚粘膜疾患については,これまで歯科医はほとんど注意を払うことがなかった.これは,その種の患者が,皮膚科医や内科医の治療を受けていたためである.今回我々は,14研究機関の総合研究班を組織し,歯科用金属18種についてパッチテスト陽性者の疫学的調査を行った。研究は,先ず皮膚科学的知識を導入し,パッチテストの方法と皮膚反応の判定を規準化してスタ-トした.研究期間中3回の研究班会議を開き,研究の反省と問題の処理,研究計画の検討,結果の整理などを行った.最終的には,ボランティア,皮膚粘膜疾患を有する患者の合計1732名にパッチテストを行った.さらにパッチテスト陽性者に対しては,研究代表者井上らが科学研究費補助金(一般研究(A)No.61440081と試験研究(B)No.63870074)により開発した方法(口腔内補綴物から採取した約0.1mgの試料を,X線マイクロアナライザあるいは蛍光X線分析装置で分析)にて口腔内補綴物の金属組成をあきらかにし,パッチテストの結果との関連を追究した.その結果(1)全被験者におけるパッチテスト陽性者率,陰性者率,男女差,年齢差,(2)金属の種類と陽性率,(3)地域差,(4)パッチテスト陽性者と口腔内金属との関連,(5)疾患の種類と発症部位,(6)患者群のパッチテスト陽性率,(7)患者群の金属別パッチテスト陽性率,(8)ボランティア群と患者群のパッチテスト陽性率の比較,(9)試薬の濃度差による陽性率の比較,(10)試薬Mー9とMー11またはMー13シリ-ズの陽性率の比較,(11)絆創膏皮膏炎の発生率,(12)2種類の絆創膏による皮膏炎の発生率の比較,(13)パッチテストと確認テストの結果の比較,(14)パッチテスト期間中の皮膚反応の変化等,を検討するための多くのデ-タが得られた.従来,生活環境中の金属による感作とアレルギ-性疾患はしばしば報告されているが,口腔内の補綴物の金属による感作や皮膚粘膜疾患については,これまで歯科医はほとんど注意を払うことがなかった.これは,その種の患者が,皮膚科医や内科医の治療を受けていたためである.今回我々は,14研究機関の総合研究班を組織し,歯科用金属18種についてパッチテスト陽性者の疫学的調査を行った。研究は,先ず皮膚科学的知識を導入し,パッチテストの方法と皮膚反応の判定を規準化してスタ-トした.研究期間中3回の研究班会議を開き,研究の反省と問題の処理,研究計画の検討,結果の整理などを行った.最終的には,ボランティア,皮膚粘膜疾患を有する患者の合計1732名にパッチテストを行った.さらにパッチテスト陽性者に対しては,研究代表者井上らが科学研究費補助金(一般研究(A)No.61440081と試験研究(B)No.63870074)により開発した方法(口腔内補綴物から採取した約0.1mgの試料を,X線マイクロアナライザあるいは蛍光X線分析装置で分析)にて口腔内補綴物の金属組成をあきらかにし,パッチテストの結果との関連を追究した.その結果(1)全被験者におけるパッチテスト陽性者率,陰性者率,男女差,年齢差,(2)金属の種類と陽性率,(3)地域差,(4)パッチテスト陽性者と口腔内金属との関連,(5)疾患の種類と発症部位,(6)患者群のパッチテスト陽性率,(7)患者群の金属別パッチテスト陽性率,(8)ボランティア群と患者群のパッチテスト陽性率の比較,(9)試薬の濃度差による陽性率の比較,(10)試薬Mー9とMー11またはMー13シリ-ズの陽性率の比較,(11)絆創膏皮膏炎の発生率,(12)2種類の絆創膏による皮膏炎の発生率の比較,(13)パッチテストと確認テストの結果の比較,(14)パッチテスト期間中の皮膚反応の変化等,を検討するための多くのデ-タが得られた.金属による感作とそれに伴うアレルギ-性疾患については昨今ではマスコミにも取り上げられ、今や大きな社会問題になりつつあり、歯科領域における研究者、医療従事者としては、これに関する詳細な知識と正しい見解を持つべき、と考えられる。しかしながら、金属、特に口腔内で使用されている歯科用金属による感作についてはその発生率も、機序にも未だ不明確な点が多い。今回我々は先ず、歯科に多用される18種の金属元素についてパッチテストによる疫学的調査を全国的規模で行い、陽性反応の発生率と金属の種類、地域的な特異性の有無、さらにそれによると思われるアレルギ-性疾患の発生率を明らかにしたいと考えている。次いで、パッチテスト陽性者に対しては、研究代表者の井上らが先に科学研究費補助金一般研究(A)No.61440081及び試験研究

(2)No.63870074により開発研究した方法、すなわち口腔内修復物から極微量(約0.1mg)の試料を採取し、EPMAにより組成分析する方法によって、全国の各研究機関から集められた多数の試料を分析し、パッチテストの結果と口腔内金属との関連性を見出したいと考え、本研究を企画した。初年度の本年は当初の研究計画に基づき、先ず平成元年10月6日に14研究機関の研究分担者、協力者ら42名による研究班会議を東京医科歯科大学で開催し、パッチテストの方法、判定基準などの統一及び口腔内よりの微量金属試料の採取法を検討した。次いで各機関が若干名について行ったパッチテストの撮影スライド、判定結果などを研究代表者との間で調製した後、現在は各機関30名程度に対してパッチテストの施行及び陽性者の口腔内から試料を採取している。年度末に再度研究者班会議を開催し、これらの結果を持ち寄って、結果の検討及び今後の方針について討議する予定である。金属による感作とそれに伴うアレルギ-性疾患については昨今ではマスコミにも取り上げられ,医療従事者としては,これに関する詳細な知識と正しい見解を持つべきと考えられる.しかしながら,金属,特に口腔内で使用されている歯科用金属による感作については,その発生率も機序にも未だ不明確な点が多い.今回われわれはまず,歯科に多用される18種の金属元素についてパッチテストによる疫学的調査を全国的規模で行い,陽性反応の発生率と金属の種類,地域的な特異性の有無,さらにそれによると思われるアレルギ-性疾患の発生率を明らかにしたいと考えている.次いで,パッチテスト陽性者に対しては,研究代表者の井上らが先に科学研究費補助金一般研究(A)No.61440081及び試験研究(B)No.63870074により開発研究した方法,すなわち口腔内修復物から極微量(約0.1mg)の試料を採取し,EPMAにより組成分析する方法によって全国の各研究機関から集められた多数の試料を分析し,パッチテストの結果と口腔内金属との関連性を見出したいと考え本研究を企画した.本年度は,平成元年度末に14研究機関の研究分担者,協力者らによる第2回の研究班会議を東京医科歯科大学で開催して統一規格した方法により,引き続きパッチテスト及び陽性者の口腔内金属の採取,分析を実施し,例数を増やした.また,一般歯科医,皮膚科など他の医療機関より,金属アレルギ-が疑われる患者の検査依頼も漸増し,症例数も増えつつある.そこで平成3年1月25日に,各研究機関からの研究分担者,同協力者ら約50名による研究班会議を開催し,現在までの各研究機関における陽性反応の発生率や口腔内金属との関連性,ならびに症例について報告,討議をした.また,調査結果のまとめ方やそれらの発表方法など,今後の方針についても検討を加えた.金属による感作とそれに伴うアレルギ-性疾患については昨今ではマスコミにも取り上げられ,医療従事者としては,これに関する詳細な知識と正しい見解を持つべきと考えられる。しかしながら,金属,特に口腔内で使用されている歯科用金属による感作については,その発生率も機序にも未だ不明確な点が多い。今回われわれはまず,歯科に多用される18種の金属元素についてパッチテストによる疫学的調査を全国的規模で行い,陽性反応の発生率と金属の種類,地域的な特異性の有無,さらにそれによると思われるアレルギ-性疾患の発生率を明らかにしたいと考えている。次いで,パッチテスト陽性者に対しては,研究代表者の井上らが先に科学研究費補助金一般研究(A)No.61440081及び試験研究(B)No.63870074により開発研究した方法,すなわち口腔内修復物から極微量(役0.1mg)の試料を採取し,EPMAにより組成分析する方法によって全国の各研究機関から集められた多数の試料を分析し,パッチテストの結果と口腔内金属との関連性を見出したいと考え本研究を企画した。
乳幼児および成人心疾患における肥大心筋の変容とそのメカニズムに関する研究

本研究では、乳幼児および成人の種々の心疾患ならびに実験動物心における肥大心筋の形態学的変化、デスミンなどの細胞骨格の変化について光顕、電顕、免疫組織化学および分子生物学的手法を用いて検討を行なった。さらに心筋間質の細胞の形質転換の有無すなわち細胞変容がおこるか否かについても検討を行なった。その結果、乳幼児、小児の拡張型心筋症では、残存心筋の肥大、配列の乱れとともに、電顕的には筋原線維の粗しょう化、ミトコンドリアの増加、大小不同、変形、などの所見のほか、粗面小胞体の増加、ゴルジ装置の増生など蛋白合成能増加を示唆する所見を認めた。一方、右室圧負荷のかかるファロ-四徴症の右室心筋では、筋原線維の粗しょう化は余り目立たず、むしろ充実性増生をみるが、ミトコンドリアの増加、粗面小胞体の増加、ゴルジ装置の増生などやはり蛋白合成能増加を示唆する所見を認めた。さらに拡張型心筋症の心筋細胞内のデスミンの分布を免疫組織化学およびin situ hybridization法により検討した結果、デスミンは正常心筋では介在板およびZ帯に規則正しく染色されたが、心筋症の心筋細胞では、不規則に強い染色性を示した。免疫電顕による検討では、心筋症でのデスミンは増殖したミトコンドリアの間隙に強い陽性反応を示した。さらに心筋症の心筋におけるナトリウム利尿ホルモンの発現とデスミンの変化を比較したところ、デスミンが正常の配列を呈している心筋細胞ではナトリウム利尿ホルモンの発現がまったくみられなかったが、ナトリウム利尿ホルモンの発現がみられる心筋細胞では、デスミンの著しい配列異常がみられた。in situ hybridizationによる検討では、デスミンのmRNAレベルは比較的均一で、細胞間で明らかな差は認められなかった。また、肺動脈拘扼を行なって右室負荷を与えたラット心室心筋では、ナトリウム利尿ホルモンおよび骨格筋アクチンのmRNAの発現とともに、これと同期してデスミンmRNAの右室自由壁心筋細胞における特異的発現亢進をみた。さらに心筋間質細胞の形質転換について検討すると、拡張型心筋症、拡張相肥大型心筋症、急性および陳旧性心筋梗塞、心室拡張を示す先天性心疾患の心筋間質に平滑筋アクチン陽性の紡錘形細胞を認め、この細胞は非筋型ミオシン重鎖アイソザイム胎児型が陽性であった。電顕像からこの間質細胞は筋線維芽細胞であることが推測され、形質転換を呈していることが示唆された。以上の結果から、乳幼児および成人心疾患における肥大心筋は、種々の程度の形態学的変化ならびに形質転換を示し、さらに間質細胞も変容を示すことが示唆された。