hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケアとしての保育環境の創出

これまでの実践と考察を通して得られた成果のポイントは、1乳幼児の生活空間は変容を内在したものであるのが望ましいこと、2乳幼児の活動は終着点といえるようなものはなく、絶えず循環し成長し続けるものであること、以上の2点であった。これまでと同じように、実践のほとんどを保育現場で行い(一部、公立美術館でも実践)多くの幼児教育・保育の関係者に関わっていただいたため、実践の成果を速やかに現場に還元するための報告会や研究会を持つ必要があった。今年度はそのことに多くの時間を使ったこともあり、アートワークショップの実践、特に保育空間を創出するための活動は2歳児・3歳児が中心になってしまい、年長の幼児での材木等を使った大掛かりな実践が充分にできたとはいえなかった。その点についての反省は残ってしまったが、それぞれの現場で記録写真・映像を駆使して研究成果をリアルタイムに報告できたことは、研究者にとっても幼稚園教諭・保育士の方々にとっても有意義であったと考える。美術幼児造形1)当初の予想以上に多くのアートワークショップを実践することができた。2)専門領域の異なる識者との対話では、アジール(避域)としての保育空間の有り方、また生活空間に内包される〈死〉の問題についての知見が得られた。3)日本保育学会、愛知県美術館でのシンポジウムでは、多くの聴衆(保育、学校、美術館関係者)に、これまで保育学やケア学で触れられることのなかったアジールや保育空間と〈死〉の関わりについての問題提起ができた。4)アートワークショップの実践では、小さな問題が次々に発生し毎回細かな修正を余儀なくされた。そのためそのことに少しエネルギーを使いすぎてしまい、具体的な保育空間の創作が若干遅れ気味となってしまった。1)ドイツの子ども施設は15年前に一度視察していたが、その時訪れた幼稚園と保育園各1園を再訪することができた。保育空間は15年前とほとんど同じだったが、ドイツの経済優先政策による福祉関係の援助の停滞が感じられ、そのことは現場で働く人たちとの意見交換の中でも強く伝わってきた。スヌーズレンなどの新しい空間設営も見ることができたが、これらはドイツのオリジナルではなく、スウェーデンやオランダの模倣であった。保育も教育も“生きている"ものであることを実感させられ、貴重な体験となった。2)空間の問題を、領域の異なる専門家が意見を出し合いながら、一つの展覧会を創作することができた。美術は視覚を中心にした空間の区切りであり、農業は人の手による耕作地と自然との空間のせめぎ合いである。また、歴史学からはアジールという人間が逃げ込む場が提示され、アジールという概念そのものがケア空間であり、同時に幼き子たちの保育空間そのものであることが示された。3)乳幼児とのアートワークショップでは、彼らの空間への思いが、彼らの身体と深く関わりがあることが示された。創る〈もの〉や〈場所=空間〉は、すべて彼らの身体の尺度が大きな要因となり、また動きには必ず休息が伴い、その休息が、次のイメージの跳躍に深く関わっていることが推測された。最終年となる平成26年度の活動は、おおよそ3つに分けられる。1)アートワークショップに新たな展開を加える。子どもたちがカメラを持って自分たちの生活空間を撮影し、それを遊びの中で再構成するもの。彼らが、毎日の生活の中で何を感じ、何を見ているのかをリサーチする。
中枢におけるアディポネクチンシグナルの解明

アディポネクチンは視床下部においてAdipoR1を介してAMPKを活性化し、摂食を増加させエネルギー代謝を抑制した。さらに髄液中のアディポネクチン濃度や視床下部弓状核のAdipoR1発現は絶食時に増加し摂食後減少することから主に絶食時に作用していることが示唆された。本研究より、アディポネクチンは中枢を介して絶食時に脂肪蓄積に作用する倹約遺伝子として作用していると考えられた。AMPキナーゼ(AMP-activated protein kinase)は5' AMPによって活性化されるセリン/スレオニンキナーゼである。以前より、AMPキナーゼは細胞内のエネルギーセンサーとして作用していることが知られていたが、最近、視床下部を介して個体のエネルギー状態や摂食についてもコントロールしていることが報告され注目を集めていた。アディポネクチン受容体(AdipoR1/AdipoR2)はいずれも視床下部弓状核にその発現が認められ、免疫組織学的検討によりAdipoR1とレプチン受容体は視床下部弓状核においてcolocalizeしていること明らかとなった。また野生型マウスの髄液(CSF)中にはアディポネクチンが存在し、アディポネクチン欠損マウスに対し外来性にアディポネクチンを静注するとアディポネクチンが末梢循環からCSF中に移行することが確認された。興味深いことに、CSF中のアディポネクチンは、血清中とは異なり12量体以上の多量体はほとんど存在せず、6量体と3量体のみであった。また血中やCSF中のアディポネクチン濃度や視床下部AdipoR1の発現はいずれも絶食時に高く、摂食後に有意に低下していた。次にアディポネクチンの摂食やエネルギー調節における役割について検討したところ、アディポネクチンは主にAdipoR1を介して視床下部弓状核のAMPキナーゼを活性化し、摂食量を増加させ、個体のエネルギー消費量を抑制することが明らかとなった。またアディポネクチン欠損マウスでは、絶食時の視床下部弓状核のAMPキナーゼ活性が野生型マウスに比較して低く、高脂肪食下において摂食量の低下と酸素消費量の増加が認められた。以上の結果から、アディポネクチンは主に絶食時すなわち脂肪量が低下した状態において作用し、摂食促進とエネルギー代謝抑制を介して脂肪蓄積を増加するような生理的作用を持っており、そのため脂肪量が過剰となった肥満の状態ではアディポネクチンレベルが減少する。ところがこれが骨格筋や肝臓においてはインスリン抵抗性を引き起こす原因の1つになっていると思われる。
東南アジア自動車部品生産ネットワークの展開:域内貿易と地場産業の国際競争力調査

本件研究では、東南アジアの自動車産業・自動車部品産業の政策・発展の課題に着目し、タイ・マレーシア・インドネシアのアセアン3カ国の自動車産業の発展の歴史、部品調達ネットワーク、生産・貿易の動向並びに国際競争力について分析した。タイ自動車産業は、近年急速な成長を遂げており、2012年に自動車生産台数は248万台に到達し、世界第9位の自動車生産国となった。また、インドネシア自動車産業は、タイには劣るものの近年、順調な成長をしており、2012年に初めて100万台の生産台数を記録し、世界の17位の地位を誇るまでに至った。一方、マレーシアの自動車産業は緩やかな成長に留まり、2012年度の生産台数は57.2万台(世界22位)である。各国の部品メーカーの数を比較すると、タイは2390社、インドネシア850社、マレーシア690社である。輸出に関しては、タイの自動車産業は生産台数約半数を世界中に輸出する東南アジアの自動車輸出拠点として成長している。本研究は、自由化の波に取り巻かれた東南アジアの自動車産業の発展の課題と可能性を自動車部品産業及び部品貿易の視点から検証することを目的とした。とりわけ、アセアンの最大の自動車生産国であるタイに注目して、自動車産業の振興政策と自動車部品産業の集積の現状と産業高度化の分析を行った。90年代以降、タイ政府はインフラ整備、人材育成、中小企業支援・経営改善を促進することで、自由貿易政策のもと外資系自動車関連企業の誘致及び地場企業の育成を行い、自動車関連産業のクラスター形成を積極的に推進してきた。その結果、タイはとりわけピックアップ・トラック市場でアジアのみならずグローバルなレベルで重要な地位を確立しつつある。こうした背景において、同国の自動車産業は、規模の経済性をフルに活用することでさらなる部品産業の集積を進め、東南アジア域内の自動車産業の再編の原動力となっている。本年度の研究では、FTA及びエコカー・プロジェクトなどの新しい政府主導の政策が、タイ自動車部品産業において、どのような影響を及ぼしているか検証した。本年はマレーシアに注目して、自動車産業の振興政策と自動車部品産業の集積の現状と産業高度化の分析を行った。マレーシア政府は2004年にローカルコンテンツ規制を撤廃し、2006年には自動車産業の自由化に対応した新国家自動車政策(New Automotive Policy)を導入した。マレーシア政府は自動車産業の自由化を図っているが、国民車、とりわけ、経営不振のプロトン社を救済する為に、マレーシアには依然として様々な保護色の強い政策が存在する。2006年に産業調整基金(Industrial Adjustment Fund)、産業リンケージプログラム(Industrial Linkage Program)を導入して、政府の補助金及び物品税を、国民車メーカーが有利になるように、自動車メーカーの現地調達率に応じた水準で付与する制度を構築した。また、WTOのルールに反する、Approval Permits(AP)制度と呼ばれる、クオータ(輸入車の数量規制)制度及び製造ライセンス許可制度が存在する。これらの政策の結果、自動車分野における海外投資は少なく、タイと比較すると、マレーシアの自動車産業の発展は比較的緩やかな成長に留まっている。また、アセンブラー(自動車メーカー)数はタイとほぼ同数であるにかかわらず、自動車部品企業数はタイの2390社に対して、マレーシアは690社と、3分の1以下となっており、裾野産業の発展が急務となっていることが調査により明らかになった。本年はインドネシアに注目して、自動車産業の振興政策と自動車部品産業の集積の現状と産業高度化の分析を行った。インドネシアは、1960年代よりデリーション・プログム、1993年より現地調達率と完成率をリンクさせたインセンティブ・システムを導入し、90年代後半まで現地調達率を高める(部品産業の発展)政策を施行してきた。また、1996年からは、自国ブランドの自動車産業を育成するために、外資系・自国ブランドを差別する関税政策を導入した。しかしながら、アジア通貨危機の結果、世界銀行・IMFの構造調整プラグラムを導入し、自動車産業は自由化されることとなった。

2000年代前半は、自国ブランドの自動車育成政策の失敗を受けて、自動車産業育成政策の導入は行われなかったが、2009年より、ロー・コスト・グリーンカー(環境に優しい低価格自動車)の振興政策が提唱され、近年、インドネシアの自動車産業は急速に成長している。2000年から2012年の期間にインドネシアの自動車生産台数は約5倍に拡大し、2012年に初めて生産台数は100万台を突破し、世界の17位の地位を誇っている。インドネシア自動車産業において、アセンブラー(自動車メーカー)数はタイとほぼ同数であるにかかわらず、自動車部品企業数はタイの2390社に対して、インドネシアは850社と、3分の1程度となっている。また、各メーカーの現地調達率は70%だが、部品の素材輸入が約50%であり、実際の現地調達率は35%程度が推定されている。本調査より、インドネシアの自動車産業は裾野産業の発展が急務となっていることが明らかになった。なお、部品貿易は増えているものの、依然、輸入が輸出を上回いる現状である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、タイ・マレーシアの自動車産業の比較研究の論文を作成したいと考えている。
細胞内DNase I制御による画期的エピミュータジェンスクリーニング系の構築

界面活性剤が、細胞骨格アクチンからDeoxyribonuclease I (DNase I)をリリースし、核内に移行させ、DNAを切断することを見出し、この現象を化学物質曝露によるクロマチン構造変化の評価へ応用することを試みた。最適な側鎖長を有する界面活性剤の使用により、効果的にアクチンからDNaseIを遊離させ、弛緩したクロマチンDNAが切断された。厳密な濃度制御によりヒストンH2AXのリン酸化を指標にクロマチン構造変化の評価ができる可能性が示された。また、熱も同様のメカニズムでDNAを切断する可能性が示され、今後の検討により、界面活性剤よりも効果的な方法を構築できる可能性が示された。我々は、一定以上の長さのアルキル側鎖を有する界面活性剤が、細胞骨格アクチンからDeoxyribonuclease I (DNase I)をリリースし、核内に移行させ、DNAを切断することを見出したことから、この現象をクロマチン構造変化のスクリーニングに応用することを思いついた。本年度は、評価手法構築の基盤となる技術の確定のため、界面活性剤の最適濃度、種類などを、DNase Iの細胞内分布とDNA切断の関係を含め検証した。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤でヒストンを高アセチル化し、クロマチン構造を弛緩させた場合、界面活性剤作用によるDNA切断が亢進したことから、この系を利用してクロマチン構造変化を評価できる可能性が考えられた。また、研究を進めていくうちに、熱処理が、DNase Iをリリースし、核内に移行させ、DNAを切断する同様のメカニズムでヒストンH2AXをリン酸化することを発見した。界面活性剤よりも簡便にDNase Iを核内移行させる方法が見出されたため、今後は界面活性剤の代わりに熱を使用した評価系の構築を考えていく予定である。研究は順調に進展している。まず、非イオン界面活性剤であるNonylphenol polyethoxylate、Tween 20、Triton X、Nonidet P-40、陰イオン界面活性剤であるLinear alkylbenzenesulfonateは作用後DNA二本鎖切断(DSBs)を誘導することを明らかにした。また、いずれも細胞死を誘導しない低い濃度でも検出可能であったこと、Deoxyribonuclease I (DNase I)の阻害剤で抑制されることから、これらDSBsが細胞死によるものでなく、DNase Iの核内移行によるものであることを示した。DNase Iの核内移行は、免疫染色法、細胞分画法により確認された。一方、陽イオン界面活性剤であるSodium dodecyl sulfate (SDS)はH2AXリン酸化を誘導しなかった。これは、SDSが、DNase Iの阻害剤であり、核内移行してもDNAを切断できないためと考えられた。よって、SDSは本研究が目指す評価系においては使用不可と判断された。そこで、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Sodium butyrate(SB)でヒストンを高アセチル化し、クロマチン構造を弛緩させた時に、界面活性剤を作用させ、DNA切断の変化について検討した。界面活性剤によるH2AXリン酸化や電気泳動法によるDNA切断が、SB作用により亢進したことから、この系を利用してクロマチン構造変化を評価できる可能性を示唆する知見が得られたといえる。この発見は処理を簡便にするため、評価系をより実用性のあるものに近づける可能性がある。評価法構築の基盤となる技術の確定のため、界面活性剤の最適濃度、種類などを、Dnase Iの細胞内分布とDNA切断の関係を含め検証した。また、研究を進めていくうちに、熱作用が界面活性剤作用と同様に、DNase Iのアクチンからのリリースに関係することが考えられたため、界面活性剤と共に熱作用によるDNA切断の関係を検討した。Nonylphenol polyethoxylate(NPEO)をはじめとした複数の界面活性剤により、DNA切断が誘導されることが、ヒストンH2AXリン酸化(γ-H2AX)を指標に示された。界面活性剤作用によるDNA切断やDNase Iの核内移行について側鎖長依存性や濃度依存性について検討した。例えば、NPEOにおいては側鎖1015のNPEOが高いDNA損傷性、DNase Iの遊離を引き起こすことから、クロマチン構造の評価に適していると考えられた。しかし、DNAを切断する濃度範囲が狭く、作業者による差が出てしまい、評価系を構築するのは難しいと考えられた。一方、熱処理でも同様のDNA切断が誘導されることを明らかにした。細胞種によって最適の熱処理温度は異なるが、およそ4548°Cの熱ストレス作用後、γ-H2AXが誘導されることが示された。また、熱ストレス作用後、DNase Iが核内に移行する可能性も確認された。熱ストレスは、界面活性剤に比べ、簡便に精度高く作用できることから、以後、熱誘導によるクロマチン構造変化とDNA損傷の関係を明らかにし、実用化に向けた検討を行っていく予定である。

界面活性剤が、細胞骨格アクチンからDeoxyribonuclease I (DNase I)をリリースし、核内に移行させ、DNAを切断することを見出し、この現象を化学物質曝露によるクロマチン構造変化の評価へ応用することを試みた。最適な側鎖長を有する界面活性剤の使用により、効果的にアクチンからDNaseIを遊離させ、弛緩したクロマチンDNAが切断された。厳密な濃度制御によりヒストンH2AXのリン酸化を指標にクロマチン構造変化の評価ができる可能性が示された。また、熱も同様のメカニズムでDNAを切断する可能性が示され、今後の検討により、界面活性剤よりも効果的な方法を構築できる可能性が示された。熱処理が界面活性剤処理と同様にDNase Iをリリースし、核内に移行させることを明らかにした。熱は界面活性剤にくらべ、作用が容易に行えるため、今後は、熱を使用して、クロマチン構造変化のスクリーニングへの応用を目指す。これまでに文献上でクロマチン構造変化を誘導する、ヒストンを修飾変化させることが既に明らかになっている化学物質を作用後、ヒストン修飾変化が認められる時間帯に熱処理を行い、DNA切断量を評価する。また、ミュータジェンであることが知られている化学物質や、逆にAmes試験陰性でも発がん性陽性とされる化学物質を中心に評価を行う。さらに、多数の化学物質の評価の必要性を考慮して、本評価法をハイスループット化する方法を考案する。ヒストンH2AXリン酸化の検出をフローサイトメータで行うなどの工夫により、実用性のある評価系の構築を目指す。毒性学ヒストンH2AXなどのウエスタンブロッティングや免疫染色法を効率よく行う工夫をし、使用抗体の節約をした。また、自身の健康上の理由により、予定していた学会に不参加であったため、その分が次年度使用となった。多様な化学物質のスクリーニング系に適した評価系を構築するために、多数の化学物質の購入などに充てる。また、実験補助者の依頼時間を増やし、研究を効率よく遂行する。
慢性関節リウマチにおける坑カルパスタチン抗体の臨床的・病因的意識とその治療応用

我々はカルパイン(カルシウム依存性システインプロテアーゼ)の特異阻害蛋白カルパスタチンに対する自己抗体が慢性関節リウマチ(RA)に検出されることを報告してきた。カルパインは軟骨破壊や炎症惹起に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられるため、その阻害蛋白であるカルパスタチンに対する自己抗体の存在はRAの病態に関与する可能性がある。本研究では、1)ヒトカルパスタチンの全長cDNAの分離と、その発現産物を利用した坑カルパスタチン抗体のドメイン反応性、2)患者自己抗体のカルパスタチン活性抑制能、3)モデル動物関節炎におけるカルパイン阻害物質の効果、を検討した。1)患者血清は疾患によって、カルパスタチンの5つのドメイン(L,I,II,III,IV)に対して様々な反応性を示した。RAではドメインIとIIを高率に反応した。また、RAの81%はいずれか1つ以上のドメインと反応したが、SLEは46%、強皮症は32%、筋炎は43%にとどまっていた。2)坑カルパスタチン抗体陽性RA患者IgGはドメインIIVの精製融合蛋白のカルパイン阻害活性を用量依存的に抑制した。RA患者IgGの11例中5例(45%)はいずれか1つ以上のドメインに対してカルパイン活性を40%以上回復したが、SLE患者および健常人IgGではかかるカルパイン活性の回復は認められなかった。3)様々なカルパイン阻害薬の中で、カルペプチンにII型コラーゲン誘発ラット関節炎の抑制効果が確認された。組織像でも、カルペプチン投与ラットでは滑膜増殖や骨軟骨破壊の程度が軽度であった。以上の成績は坑カルパスタチン抗体がRAの新たなマーカーとして有用であり、同抗体がRAの病態形成に関与する可能性を示し、RAの新たな治療法の可能性が示唆された。【目的】我々は,慢性関節リウマチ(RA)を中心とするリウマチ疾患患者に,カルシウム依存性中性プロテアーゼ(カルパイン)の特異的阻害蛋白であるカルパスタチンに対する自己抗体が高頻度に見いだされることを報告してきた。カルパインはプロテオグリカンの分解や炎症の惹起に関与する中性プロテアーゼの1つと考えられており,その阻害蛋白カルパスタチンに対する自己抗体の産生はRAの病因・病態と関連する可能性がある。本年度の研究では,ヒトカルパスタチンの全長cDNAをクローニングし,その発現産物を利用して,抗カルパスタチン自己抗体の出現頻度およびエピトープ反応性の検討を目的とした。【方法】既に分離したヒトカルパスタチン部分cDNA(RA-6)をプローブに用い,HeLa細胞およびヒト甲状腺由来cDNAライブラリーよりカルパスタチン全長cDNAの分離に成功した。このcDNAより,PCR法でドメインL,I,II,III,IVをそれぞれコードするcDNAを増殖し,発現ベクター(pEX-2)に組み込んでカルパスタチンドメイン融合蛋白を発現させた。これらの融合蛋白とリウマチ疾患患者血清との反応を免疫ブロット法により検討した。【結果】患者血清により1つのみのドメインから全ドメインまで,様々なドメイン反応様式が示された。また,RAの81%がいずれか1つ以上のドメインと反応したが,SLEは46%,強皮症は29%,多発性筋炎は38%にとどまった。RAではすべてのドメインについて最も高率に反応したが,特にドメインIに対する反応が49%と高率に認められた。SLEでは全ドメインと均一に反応する傾向があり,強皮症はドメインIとIV,筋炎ではドメインIIIとIVとの反応が主であった。【結論】RAにおける抗カルパスタチン抗体の陽性率はリウマトイド因子に匹敵し,抗カルパスタチン抗体はRAの新しい診断マーカーとして有用と考えられた。【目的】慢性関節リウマチ(RA)

患者血清中に新たに見いだされたカルシウム依存性中性プロテアーゼ(カルパイン)の阻害蛋白であるカルパスタチン(CS)に対する自己抗体の病因的意義を追求するため,患者抗体のカルパスタチン活性抑制能を検討した.【方法】既に分離に成功したヒトCS全長cDNAより,5つのドメイン(L,I-IV)をコードする領域をそれぞれPCRで増幅し,発現ベクターpMal-c2に組換え,大腸菌に感染させて発現させたマルトース結合蛋白(MBP)融合蛋白を精製した.家兎骨格筋由来m-カルパインの蛋白分解活性をカゼインを基質として測定し,ここに精製CSドメイン融合蛋白を加え,リウマチ疾患患者IgG(RA 11,SLE 3例)の存在下および非存在下でのカルパイン阻害活性を検討した.【成績】精製融合蛋白はドメインIIVのいずれも用量依存的に家兎カルパインのカゼイン分解活性を抑制した.ここでCSドメイン融合蛋白をあらかじめ抗CS抗体陽性患者IgGと反応させておくと,カルパインの蛋白分解活性が用量依存的に回復した.5mg/mlのIgG濃度では,RA患者IgGの11例中5例(45%)でいずれか1つ以上のCSドメインに対して40%以上のカルパイン活性の回復が認められたが,SLE患者IgGおよび健常人IgGではかかるカルパイン活性の回復は認められなかった.【結論】抗CS抗体はRAの新しい疾患マーカーとして有用であり,同抗体が関節組織でのカルパイン活性増強を通じてRAの病態形成に関与する可能性が示唆され,RAの新しい治療法の開発の可能性が示唆された.【目的】我々はカルパイン(カルシウム依存性システインプロテアーゼ)の特異阻害蛋白カルパスタチンに対する自己抗体が慢性関節リウマチ(RA)に検出されることを報告してきた。カルパインは軟骨破壊や炎症惹起に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられるため、その阻害蛋白であるカルパスタチンに対する自己抗体の存在はRAの病態に関与する可能性がある。本年度はRAモデル動物におけるカルパイン阻害薬の効果を検討した。【方法】ラットカルパスタチンペプチド(ドメインIVのカルパイン結合部位を含む合成27アミノ酸)(2mg/kg)、ロイペプチン(3mg/kg)、カルペプチン(3mg/kg)、E-64-d(3mg/kg)、および対照薬剤としてデキサメサゾン(0.1mg/kg)を用いた。Lewis系ラット(7週齢)にウシII型コラーゲン(1.5mg/ml)とComplete Freund Adjuvandの超音波エマルジョン1mlを皮下注し、10日目に追加免疫した。経時的に後肢の足容積を測定し、関節炎の指標とした。カルパインインヒビターは0日目より21日目まで上記の用量で1日1回腹腔内投与した。【結果】II型コラーゲン免疫ラットは12日目より関節炎を発症し、14日目には全例で関節炎が認められた。カルペプチン投与ラットでは、後肢足浮腫の発現は有意に減少しており(13日目64%、17日目50%、21日目30%抑制)、関節炎発症の抑制効果が確認された。また、組織像においてもカルペプチン投与ラットでは滑膜増殖や骨軟骨破壊の程度が軽度であった。
多変数複素力学系とフラクタル上のラプラシアンのスペクトル分布の接点

木上は一般の測度-距離空間上のディリクレ形式から定義される熱核に対して、測度のvolume doubling propertyのもとでexit timeの評価とlocal Nash inequalityが熱核のある種の上からの評価と同値であることを示した。その結果を線分上のブラウン運動を自己相似測度に関して時間変更した拡散過程の熱核に応用し、測度がvolume doublingであるときに熱核の詳細な評価を得た。さらに一般のresistance formに対して、境界が有限個の点である場合のgreen関数の定義をあたえ、そのgreen関数がresistance metricに関して一様Lipschitz連続であることを示した。また、green関数を用いて測度に値を持つLaplacianの定義を与えるとともに自己相似集合上のディリクレ形式の定義域、Laplacianの定義域の関数のresistance metricに関するLipschitz連続性を考察した。熊谷は、異なった次元を持つフラクタルを張り合わせた空間上の拡散過程の研究を行った。まずベゾフ空間のトレースの理論を援用することで2次形式の正則性を示し、熱核の短時間挙動についての詳しい評価をえた。その評価を用いて短い時間スケールでみたとき粒子が最も通りやすい経路のエネルギー関数の変分問題の解としての特徴付けを得た。さらにベゾフ空間の理論の応用として、(フラクタル集合を自然に含む)d-setと呼ばれるクラスの集合の上に飛躍型対象マルコフ過程と対応するディリクレ形式を構成した。また対応する熱核の詳細な評価を得て、過程の再帰性や粒子の軌跡のハウスドルフ次元に関する結果を得た。宍倉は自己相似集合上のLaplacianに付随する高次元の複素力学系に関係して、高次元複素力学系の不変集合(ジュリア集合、ファツウ集合を含む)の構造、繰り込みおよび力学系に付随するポテンシャル(グリーン関数)に関する研究を行った。木上はresistance formに対するgreen functionを構成しgreen functionおよびharmonic functionがresistance metricに関して一様にLipschitz連続であることを示した。またその応用として、resistance formのもとで測度に値を持つラプラシアンを構成した。宍倉は多変数複素力学系の研究をおこない、2002年8月北京で開催された国際数学者会議に出席し、多変数複素力学系に関する最新の研究動向を調査を行った。熊谷はUniversity of WashingtonのChen教授と共同でd-set上でのstable-like processの研究を行い、その熱核の漸近評価およびprocessのrangeのHausdorff次元を得た。その応用として、自己相似集合集合上のjumpを持つ確立過程の熱核の漸近評価を得た。2003年1月に京都大学数理解析研究所で行われた共同研究集会「フラクタルの数学的諸相」にフラクタル上のラプラシアンのスペクトルと多変数複素力学系の関係を研究しているC. Sabot博士を招聘し、Grassmann algebra上の力学系のスペクトルへの応用など最近の研究についてレクチャーを受けた。さらに木上はSabot博士とHata-treeなどの非対称的な自己相似集合上のラプラシアンのスペクトルへの応用について共同研究を行った。
栄養素感知システムを構成するGサイクル制御の解明

本研究は、細胞が栄養素(特にアミノ酸)を感知するメカニズムにおいてGTP結合タンパク質群がどのように関わっているかを明らかにすることを目的とする。本年度の研究では、これまでに見いだした低分子量GTP結合タンパク質(Rheb、RalA、Rag)間のクロストークを中心にシグナル分子群のマッピングを行い、(1)いずれのシグナル系を阻害した場合にも細胞外アミノ酸に応答したmTORC1活性化が阻害されること、(2)いずれのシグナル系の(恒常的活性化型変異体の発現による)人為的活性化も他のシグナル経路の阻害によって部分的に抑制されることなどから、これらのGTP結合タンパク質を介する細胞内シグナルが互いに並列に機能していることを見いだした。さらにこれらの知見に加えて、(1)細胞外アミノ酸に応答して細胞内カルシウム濃度の一過的上昇が起こること、(2)膜透過性カルシウムキレーターであるBAPTA-AM処理によってmTORC1活性化が阻害されること、(3)細胞外アミノ酸に応答したカルシウム上昇およびmTORC1活性化がPLC阻害剤で抑制されることなどから、PLC上流に位置する三量体GTP結合タンパク質がアミノ酸感知シグナルに関わっている可能性を見いだした。このような三量体GTP結合タンパク質の関与はさらに形質膜上の受容体の存在を示唆しており、今後アミノ酸感知シグナルの全貌を明らかにする上で重要な知見になると考えられる。細胞は細胞外から様々なエネルギー源・栄養素を取り入れ、利用するために様々な細胞外環境の変化を感知し応答するシステムを備えている。アミノ酸は蛋白質合成の原料となる重要な栄養素であり、その細胞内外での量的変化が細胞の蛋白質合成シグナルを厳密に制御していることがよく知られている。しかしながらアミノ酸感知システムがどのようなシグナル分子群で構成されているのかは未だに不明な点が多い。そこで本研究ではスイッチ分子として様々な細胞内シグナルにおいて重要な機能を担うG蛋白質に着目し、アミノ酸感知システムに関与するG蛋白質(群)の同定およびその機能解明を目的とした。RNAi法によってアミノ酸感知システムに関与する低分子量G蛋白質のスクリーニングを行ったところ、RalAおよびRalGDSをはじめとする活性化因子群のノックダウンが、遊離アミノ酸に応答したmTORC1活性化を阻害することを見いだした。またRalAおよびRalGDSのノックダウンはグルコースに応答したmTORC1活性化も阻害したが、インスリンによるmTORC1活性化にはほとんど阻害作用を示さなかった。このことから、RalAおよびRalGDSは栄養素感知システムに特異的なシグナル分子であると考えられた。またRalAのノックダウンが活性化型Rhebの発現によるmTORC1活性化を部分的に抑制したことなどから、RalAを介するシグナルはmTORC1に対してRhebと並列に作用することが示唆された。以上の結果はmTORC1がRalA、RhebあるいはRagといったG蛋白質群によって複雑な制御を受けていることを示しており、今後その作用機作の解明が期待される。
炎症性腸疾患時における膜バリアー機能の生理学的・生化学的診断法

炎症性腸疾患時における粘膜異常を、より正確に把握する評価法を確立する目的で、粘膜のバリアー機能及び電解質輸送機能の変化に着目した。(1)ラットにトリニトロベンゼンスルホン酸(TNB)及び酢酸を注腸して作製した炎症性腸疾患モデルについて、膜電位、短絡電位(Isc)及び膜抵抗(Rm)の電気生理学的パラメータの変化と、従来からの肉眼的炎症度(ダメ-ジスコアー)との対応を検討した。その結果、スコアーの増大と上記パラメータ値の減少に、ある程度の関係が認められたが、従来法よりも本研究の評価法の方が客観的かつ鋭敏であることが示された。(2)(1)の方法を酢酸モデルの検討に応用したところ、低下したRmは4日目までに、また増大したFITC-デキストラン(FD-4)の膜透過性は7日目までに正常値に回復した。結局、酢酸モデルは、比較的短時間で自然治癒するが、その過程が本評価法で十分確認できた。(3)ラット大腸にジクロフェナックによる粘膜障害を作製したところ、Rmの減少とFD-4の透過性増大が得られた。これらの変化は吸収促進剤の作用下及び先の病態モデルと類似しており、主に細胞間隙経路拡大が示唆された。細胞内蛋白の漏出も見出されたが、減少したIscはテオフィリンの添加により上昇し、CIイオン分泌に関する一連の膜代謝機能は正常に保たれていることが示された。(4)TNBモデルに対するデキサメタゾン及び5-アミノサリチル酸の治療効果を検討したところ、14日間治療群は対照群よりも、電気生理学的パラメータが正常値へ回復する傾向が大であったが、病態モデルの症状のばらつきにより、有意な効果としては捉えられなかった。以上、本研究で確立した評価法により、粘膜炎症時には起電的電解質の輸送能の低下、水溶性高分子物質の透過性上昇が起こることが見出され、今後は各種腸粘膜障害の定量的評価への応用が期待される。1.ラット大腸にトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)あるいは酢酸の注腸,デキストラン硫酸(DSS,MW25,000)の任意摂取により,炎症性腸疾患モデルを作成した.2.本科研費により購入した実体顕微鏡下に,粘膜筋層を剥離し,また必要に応じて,外的刺激による変動原因となる神経系を切除した上皮細胞のみからなる粘膜セグメントを調製した.3.炎症度の肉眼観察から,10段階のスコアーを付け,他方では2のセグメントから,膜電位(PD)、短絡電流(Isc),膜抵抗(Rm)を求め比較した.TNBS及び酢酸モデルでは,3つのパラメータとも炎症度により減少し,これらの減少とスコアーの増大との間にそれぞれ良好な相関関係が認められた.ただし,スコアーがゼロで見かけ上は炎症が回復している場合でも,各パラメータは正常値には回復していないことから,炎症時の膜の生理学的機能の評価方法として,客観的かつ鋭便な定量的評価法として,上記の電気生理学的手法が有用であることが示された.DSSモデルの結果では,上記の相関はなく,ラットでは病態モデルが作成しにくいという従来の報告と一致していた.4.TNBSモデルでは炎症発生直後から約8週間にわたり、パラメータは正常値よりも低下した.酢酸モデルでは炎症発生7日目にはパラメータは正常に戻り,スコアーもゼロに低下し自然治癒が観察された.

一方,細胞間隙ルート透過物質であるFITC-デキストラン(FD,MW4000)の透過性も,酢酸モデルの1日目では正常値の約2倍に増大し,7日目には正常値へ回復しており,電気生理学的パラメータと透過性さらにスコアーがよく対応していた.従って,炎症時には,特に水溶性高分子物質FDの粘膜透過性,恐らく細胞間隙経路透過性が亢進していることが示された.本年の炎症性腸疾患モデルにおける結果をもとに、次年度は薬物副作用時に起こる粘膜炎症についての検討を計画している.また,細胞内経路の透過性変化についての検討も,合わせ計画中である.非ステロイド系抗炎症薬ジクロフェナックナトリウム(DC)10mMをラット大腸内潅流後の粘膜障害について検討した。その結果、前年度、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNB)や酢酸を用いて、作製した炎症性腸疾患モデルと同様に、膜抵抗の減少とFITC-デキストラン4000(FD-4)の膜透過性の上昇が、潅流終了後継続的に見出された。このときの膜抵抗の逆数である膜コンダクタンスとFD-4の膜透過クリアランス間に高い相関が認められ、吸収促進剤の作用下と同様に、細胞間隙経路拡大の可能性が考えられた。さらに細胞からの漏出蛋白量の測定を行った結果、比較のために行った1%Triton X-100処理時の漏出量の4分の1であり、ある程度の粘膜障害が見出された。このとき短絡電流も減少していたが、テオフィリンを漿膜側に添加したところ、短絡電流は増大し、CIイオンの起電的分泌活性は保持されていることが認められた。従って、DFによって、粘膜は障害を受けているが、細胞死にまでは、至っていないことが判明した。なお、このテオフィリンによる短絡電流の上昇は、TNBモデルにおいても見出された。次にTNBモデルを用いて、デキサメタゾン及び5-アミノサリチル酸をエチルセルロースコーティングした顆粒剤による治療効果を電気生理学的に検討した。その結果、短絡電流と膜抵抗は、2週間治療時に正常値への回復傾向が現れたが、病態モデルの症状のばらつきのためか、必ずしも有意な効果としては、捉えられなかった。さらに、東京医大消化器内科の医師グループとの意見交換を行い、炎症のパラ-タとして、免疫性蛋白(IAP)の血中濃度を検討した。その結果、膜抵抗の低下と符号したIAP濃度の上昇が見出され、確かに炎症が発生していることが確認された。以上から、電気生理学的パラメータと膜透過性を用いた評価法の有用性が十分証明されたといえる。
ＡＴＦ６による黒質神経細胞の救済と蛋白質凝集抑制

パーキンソン病(PD)における小胞体ストレス応答(UPR)の重要性を明らかにする為、MPTP/プロべネシド慢性投与マウスを用いて検討した。その結果、1MPTP/プロべネシド投与後、UPR3経路のうち、ATF6及びPERK経路が活性化することが明らかになった。2更に、ATF6ノックアウトマウスを用いて同モデルを作製した所、神経変性の増強、ユビキチンの集積、アストロサイトの活性化抑制が認められた。3一方、UPR活性化物質タンゲレチンをマウスに投与すると、PTP/プロべネシド投与後の神経変性は抑制された。以上より、PDモデルマウスにおいてUPRの活性化は神経保護に働くことが示唆された。1.PDモデルマウスを用いた検討。野生型、及びATF6ノックアウトマウスを用いて、MPTP/プロベネシド慢性投与モデルを作製し、神経の変性及び凝集体形成について詳細な検討を行った。その結果、1特にアストロサイトの活性化が認められる時期(MPTP/プロベネシド投与開始後1-2週間の時点)にATF6ノックアウトマウスで強い神経変性が起こっていること、2同マウスで認められるユビキチン陽性の蛋白質凝集体にはalpha-synucleinはほとんど認められないものの、変性過程のドーパミン作動性神経に特に認められる事が明らかになった。これらのは、ATF6を欠損すると活性化アストロサイト由来の神経保護機構が低下し、神経変性が促進される、という我々の仮説を支持するものである。さらに、ATF6ノックアウトマウスでアストロサイトの活性化が起こりにくい原因として、IL-6やLIFなどの液性因子の発現低下が関与する可能性が示唆された。2.UPR活性化物質タンゲレチン(IN19)によるドーパミン作動性神経の救済。我々がUPR経路を活性化する化合物として同定したタンゲレチンをマウスに経口投与すると、黒質ー線条体系に存在する神経細胞及びアストロサイトにおけるUPRは活性化し、神経保護因子BDNFの産生量は増加した。この時、アストロサイトの活性化自身も軽度ながら有意に促進したことから、UPRの活性化はアストロサイトの活性化を介して黒質線条体系のドーパミン作動性神経の生存に重要な働きをしていること、更に新たな治療標的になる可能性が示唆された。3.ATF6過剰発現用のアデノウイルス。野生型ATF6、或いはドミナントネガティブATF6を過剰発現するアデノウイルス作成に成功し、培養細胞を用いた実験を開始した。1.野生型、及びATF6ノックアウトマウスを用いた検討。野生型、及び小胞体ストレス応答(UPR)のマスター転写因子ATF6の欠損マウス(ATF6ノックアウトマウス)を用いてMPTP/プロベネシド慢性投与PDモデルを作製し、ATF6ノックアウトマウスで認められるアストロサイトの活性化低下と神経変性促進、蛋白質凝集体形成の関係についての検討を進めた。その結果、同マウスではMPTP/プロベネシド投与開始後1ー2週間という、比較的早期の段階でアストロサイトの活性化抑制が起こり、その後、1-2週間後で神経変性の促進、更にユビキチン陽性の凝集体形成が認められることが明らかになった。つまり、本モデルにおいて、ATF6はアストロサイトを介して細胞非自律的(non-cell autonomous)に神経を保護している可能性を示唆された。2.培養アストロサイトを用いた検討。上記1の結果を踏まえ、野生型、及びATF6ノックアウトマウスからアストロサイトを単離し、アストロサイト活性化の程度の違いについて分子レベルで検討した。その結果、1ATF6ノックアウトアストロサイトではSTAT3-GFAP経路の活性化が有意に低下していること、2小胞体ストレスを軽減するケミカルシャペロン4-PBAで細胞を処理によりそれら活性化が回復すること、3野生型アストロサイトを小胞体ストレス誘導剤ツニカマイシンなどで処理した場合、STAT3-GFAP経路の活性化は消失する事が明らかになった。以上より、ATF6は小胞体ストレスを制御することでアストロサイトの活性化を促進している可能性が示唆された。3.ATF6過剰発現用のアデノウイルスベクター。H25までに開発したウイルスベクターを実際に培養アストロサイトで使用し、ATF6過剰発現を確認した。野生型、及びATF6ノックアウトマウスを用いて、(1)MPTP急性投与モデル、(2)MPTP/プロベネシド慢性投与モデル((1)に比べてヒトのPDの病態に近いと考えられるモデル)を作製した。抗TH抗体、及び抗ユビキチン抗体を用いた免疫染色によりドーパミン作動性神経の変性及び凝集体形成について評価した所、いずれのモデルにおいても、野生型マウスに比べてATF6ノックアウトマウスで神経変性が促進し、また、ユビキチン陽性の蛋白質凝集体を認めることが明らかになった。

さらに、抗GFAP抗体、抗BDNF抗体、抗HO-1抗体を用いた免疫染色、ウエスタンブロットを行ったところ、野生型マウスに比べてATF6ノックアウトマウスにおいてはアストロサイトの活性化が極めて弱く、抗酸化遺伝子HO-1の発現や神経保護因子BDNFの産生も少なくなっていることが確認された。一方、ミクログリアの活性化については野生型及びATF6ノックアウトマウスの間で有意な差は認められなかった。これらの結果から、ATF6ノックアウトマウスにおいてアストロサイト由来の神経保護機構が機能しなくなり、神経変性が促進する可能性を示唆された。2.UPR活性化物質タンゲレチン(IN19)によるドーパミン作動性神経の救済。申請者らがUPR経路を活性化する化合物として同定したタンゲレチンをマウスに経口投与すると、黒質ー線条体系に存在する神経細胞及びアストロサイトにおけるUPRは活性化し、神経保護因子BDNFの産生量は増加した。PDモデル(上記(1)、(2))において認められる神経変性は軽減した。以上のことから、UPRの活性化は黒質線条体系のドーパミン作動性神経の生存に重要な働きをし、新たな治療標的になる可能性が示唆された。1.ATF6ノックアウトマウスの解析が予想以上に進行し、既に論文に掲載され高い評価を受けた(Hashida et al., PLoS One. 2012)。ATF6ノックアウトマウスにおいては、野生型マウスに比べてMPTP投与後の神経変性が促進するのみならず、神経傷害時に起こるべきアストロサイトの活性化が非常に弱いことが明らかになった。今後、ATF6がそれら液性因子の発現をどのように調節するかについて分子レベルで検討する予定である。2.UPR活性化物質タンゲレチン(IN19)によるドーパミン作動性神経の救済も、順調に進展した。我々に結果は、UPRの活性化がアストロサイトの活性化を介して黒質線条体系のドーパミン作動性神経の生存に重要な働きをしていること、UPRが更に新たな治療標的になる可能性が示唆するものである。3.ATF6過剰発現用のアデノウイルス作成についても順調に進展し、培養細胞を用いた実験を開始した。以下の2つの点で予想以上に計画が進展したと考える。現在、論文投稿準備中である。1.ATF6ノックアウトマウスの解析が予想以上に進行した。野生型マウスに比べてATF6ノックアウトマウスにおいては、MPTP投与後の神経変性が促進するのみならず、神経傷害時に起こるべきアストロサイトの活性化が非常に弱いことが明らかになった。これまで、神経変性疾患における多くの研究が神経細胞自身のストレス応答を扱ったものであったが、今回の結果は、グリア細胞のひとつアストロサイトにおけるストレス応答、特に小胞体ストレス応答(UPR)の重要性を強調するものである。今後、アストロサイトを標的とした治療薬開発が可能になると考えられる。2.UPR活性化物質タンゲレチン(IN19)がマウスPDD神経モデルにおいて神経保護作用を示した。
ショウジョウバエの細胞分裂に伴うオルガネラ動態とメンブレントラフィックによる制御

ショウジョウバエの雄減数分裂細胞は、サイズが大きく、分裂後期以降の解析にも適している。この細胞内で波長の異なる蛍光タグで細胞内の構造を標識し、それらの動態を同時観察できるようにした。また、メンブレントラフィックの関連遺伝子1030個を選び、精母細胞においてノックダウンさせ影響を調べた。その結果、小胞輸送に必要なCOPI、COPIIが細胞質分裂に必要なことがわかった。前者は細胞質分裂の開始に必須なタンパクや脂質を分裂溝に集積させるのに、後者は収縮環を細胞膜に固定するのに必要なことがわかった。一方、幼虫期神経芽細胞の分裂にはこれらは必要ではなかった。膜系構造が発達した精母細胞に特異的と考えられる。精巣内から取り出した精母細胞をex vivoで培養し、その条件下で細胞が成長期を経て減数分裂まで完了できることを確認した。次にゴルジ体等に局在するCOPI複合体のγサブユニットにRFP蛍光タグを付加した融合タンパクを精巣内の細胞で発現させ、ゴルジ体を蛍光標識した。この個体から精母細胞を取り出し、ex vivoにて減数分裂を観察した。雄減数分裂ではゴルジ体が娘細胞に均等分配されることがわかった。メンブレントラフィックの阻害剤であるプレフェルジンA、小胞輸送に関わる微小管の重合阻害剤コルヒチンを培養系に添加すると、ゴルジ体や小胞体の形成、維持あるいは減数分裂における分配が影響を受けた。これらの薬剤処理により減数分裂時の細胞質分裂も阻害されることから、雄減数分裂細胞の細胞質分裂においてメンブレントラフィックが重要な役割を演じることがわかった。また、小胞体からゴルジ体への小胞輸送を担うCOPII複合体の5種類の構成タンパク質をそれぞれノックダウンあるいはノックアウトしても減数分裂時の細胞質分裂が阻害された。タイムラプス観察の結果、細胞膜の貫入が途中で停止し、もとにもどるのが観察された。この結果は、COPIのみならずCOPIIによる小胞輸送も細胞質分裂に必要であることを示す。また、精母細胞においてRFP-TubulinとGFPーLarp1を同時発現させ、微小管とミトコンドリアをそれぞれ蛍光標識した。雄減数分裂の過程でミトコンドリアが分裂後期から終期にかけてセントラル微小管上を均等分配される様子をタイムラプス観察した。現在、微小管モータータンパク8種類をそれぞれ精母細胞特異的にノックダウンして、ミトコンドリア分配に影響を及ぼすものをさがしている。ゴルジ体についても同じように雄減数分裂において伝達される過程をタイムラプス法により観察した。ゴルジ体の分配には細胞質ダイニンが必要であった。ショウジョウバエ雄の減数分裂細胞は、サイズが大きく、分裂後期以降に微小管が果たす役割も解析できるという利点がある。各種細胞内構造の構成タンパクにGFP、RFP、YFP、Venus、CFPタグを付けたものを精母細胞で発現させ、それらの細胞内構造を同時に観察できるマルチカラーイメージング法を確立した。この方法により精母細胞をその成長期から減数第1、2分裂終了まで連続観察できる。蛍光タグを選べば複数の細胞内構造の変化を同時に観察できる。ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体の変化を明らかにした。この細胞にsiRNAを直接導入するelectroporation法も試みたが、効率が悪かった。代わりに、任意の遺伝子の2本鎖RNAとDcer2をGal4/UASシステムにより強制発現させることにより、同遺伝子を効率よくノックダウンできる系を構築した。系統センターからRNAi系統を入手すれば、ショウジョウバエのほぼ全遺伝子をノックダウンして、効果を調べることができる。本研究では、メンブレントラフィックに関わる遺伝子群1,030個の2本鎖RNAを発現させて、細胞質分裂に異常が表れる遺伝子を同定した(Kitazawa et al., 2014)。その結果、細胞内の小胞輸送を担うCOPIならびにCOPII小胞の構成因子が雄減数分裂細胞における細胞質分裂に必須なことがわかった。前者は細胞質分裂に必要な因子を分裂溝に運搬するために、後者はアクトミオシン環を細胞膜に固定するのに必要な因子を運搬するのに必要であった。一方、それらの小胞輸送因子が体細胞分裂にも関わるか検討した。幼虫期中枢神経系から神経芽細胞を調整して、その細胞分裂をタイムラプス観察した。同細胞特異的にCOPI, COPIIの構成因子の2本鎖RNAを発現させて効果を調べたが、雄減数分裂細胞でみられたような明確な細胞質分裂の欠損は観察されなかった。GFP、mRFP、CFP蛍光タグを種々の細胞内構造の構成タンパクに付与したタンパクをGal4に依存して誘導できるUAS系統を作製、入手した。

これらをbam-Gal4系統と交配して得た個体の精母細胞において、核、染色体、微小管、アクチン繊維、核膜、小胞体、ミトコンドリアがそれぞれ蛍光標識されることを確認した。これらの精巣から取り出した精母細胞を減数分裂の開始から、第1分裂、2分裂終了までタイムラプス観察できるようになった。さらに精母細胞を14時間以上ex vivo培養し、それらの細胞が成長期を経て減数分裂に移行できることを確認した。そして細胞骨格が蛍光標識された精母細胞の培養液に、微小管重合阻害剤コルヒチン、アクチン重合阻害剤サイトカラシンDを加えると、当該細胞骨格が脱重合する様子が観察できた。また、メンブレントラフィック阻害剤プレフェルジンA、Exo1を添加して観察すると、COPI小胞の減数分裂期における動態、膜系オルガネラの形成が阻害されることがわかった。COPI小胞は減数分裂における細胞質分裂に重要な働きをすることが明らかになった。次にメンブレントラフィックに関わる1,030個の候補遺伝子のdsRNAをGal4/UASにより精母細胞特異的に発現させた。このときDicer2を同時発現させ、ノックダウン効率を高めた。これらの個体から精母細胞をとりだし、減数分裂における細胞質分裂に異常がないか上記のライブ解析法にて調べた。ノックダウンすると減数分裂に異常が表れた遺伝子については報告した(J. Cell Sci. in press)。メンブレントラフィックが雄減数分裂における細胞質分裂に必須なことが証明された。さらに精母細胞にsiRNAを直接導入することも検討している。このためRFP-Tubulinを発現させるプラスミドDNAを電気穿孔法にて導入するための条件検討をおこなった。小胞輸送は細胞内のメンブレントラフィックの中で中心的な役割を演ずる。そのうち小胞体で合成されたタンパクをゴルジ体に運ぶ順行輸送には被膜小胞COPIIが必要であり、逆にゴルジ体から小胞体にタンパクをもどす逆行輸送にはCOPIが必須である。このうちすでにCOPIが雄減数分裂における細胞質分裂に必須なことを示した(Kitazawa et al., 2012)。それに加えて、COPIIの全サブユニットを精母細胞特異的にノックダウンあるいはモザイク法により突然変異ホモの精母細胞を作り、観察することに成功した。COPIIによる順行輸送も細胞質分裂に必須であることがわかった。COPIのノックダウンでは分裂面に必要なタンパクが輸送されず、細胞質分裂の開始が阻害されていた。一方、COPIIのノックダウンでは細胞質分裂は開始するものの、収縮環が安定せず、細胞膜の貫入が途中で停止し、もとにもどることがわかった。小胞輸送タンパク複合体が細胞質分裂において異なる役割を果たすことが始めて明らかとなった。これは予想以上の成果である。ショウジョウバエの雄減数分裂細胞はサイズが大きく、分裂後期以降の解析にも適しているので細胞分裂の遺伝学的研究に繁用されてきた。一方、分裂期を通して連続観察できないという欠点もあった。そこで本研究では、減数分裂にともなう種々の細胞内構造の変化を同時に観察できるマルチカラーイメージング法を確立することを第1の目的とした。
心肺同時移植に関する基礎的研究1

日本猿を用いて片肺移植実験を行い、以下の結果を得た。平成2年度は、肺移植術後の急性拒絶反応に対する免疫抑制剤FK506の効果について検討した。FK506投与は、術直後から第6病日まで0.5mg/kg、第7病日以後0.15mg/kgを筋肉内注射した。投与群では5182日の生存を得た。移植後胸部X線写真所見では、術後12週後に一過性の移植肺陰影増強を認めた後、次第に肺陰影が消失した。移植肺組織所見では、肺血管周囲へのリンパ浸潤はほとんどないか、あってもごく軽度で、、7例中6例の肺が生着したと判断された。FK506非投与群では535日の生存を得たが、術後胸部X線写真所見では第57病日で移植肺の含気が失われ、組織学的にも肺組織は壊死に陥っていた。以上の所見から、ニホンザル左片肺同種移植においては、FK506の単独投与で十分な免疫抑制効果が得られることが確かめられた。平成3年度には肺移植後の拒絶反応の診断法としての、胸腔内洗浄液内リンパ球解析の有用性について実験的検討を行った。胸腔内洗浄液中細胞のCD4陽性率/CD8陽性率は移植肺拒絶時に低下した。胸腔内洗浄液内リンパ球の解析は拒絶反応の診断に有用と考えられた。平成4年度には脾臓ならびに移植肺の免疫組織染色を行い、同種肺移植における変化を検討した。その結果、MHC抗原の発現、B細胞、CD4、CD8陽性細胞の出現が同種移植肺において認められた。MHC抗原の発現は免疫抑制剤使用下においても認められた。CD4、CD8陽性細胞、B細胞の出現は拒絶反応の進行と密接な関係があると考えられた。本研究を通じて、同種、異種移植肺の拒絶反応時における免疫学的な変化が明らかにされた。[<目的>___ー]心肺同時移植における拒絶反応の発現の解析ならびにその早期診断法の開発をめざすにあたり、本年度は左片肺移植実験を施行し、肺における拒絶反応の対象デ-タを得た。また、免疫抑制剤の新薬であるFKー506(以上FK)を投与し、その効果を分析した。[<方法>___ー]雑種オス日本猿に対し、同種同所性左肺移植を施行した。術後FK投与群(A群:n=7)には術後第0ー6病日にFK0.5mg/kg,それ以後0.15mg/kgを筋注した。非投与群(B群:n=7)には免疫抑制剤を使用しなかった。術後適宜胸部X線撮影および移植肺の開胸生検・剖検を施行し、拒絶反応を病理組織学的に診断した。[<結果>___ー]術後A群では18日ないし80日の生存を得、最長例はなおも生存中である。B群は5日ないし35日の生存を得、最長例は拒絶反応の完成による移植肺の完全壊死を確認した後犠性死せしめた。胸部X線所見では、B群ではいずれも術後第3病日頃より移植肺陰影の増強を認め、5ー7病日でほぼ完全に不透明化し、その後改善の傾向を認めなかったのに対し、A群では第714病日で肺陰影がピ-クに達した後、再び肺野は次第にclearになった。病理組織所見では、B群では第3病日より肺血管周囲に円形細胞浸潤が認められ、第5ー7病日では浸潤が高度となり、肺胞壁にも細胞浸潤を認めた。