hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
麻酔薬作用部位の分子環境

近年,麻酔のあるものについてGABAA受容体蛋白に対する特異的作用やアセチルコリン受容体蛋白に特異的であるといった多くの研究が発表されている.これらの研究はこれらの受容体蛋白が意識や痛みなどに関わる麻酔薬の作用対象であるということを証明する根拠にはなるが,直ちに麻酔薬が作用する分子環境が特異的であるという根拠にはならない.作用が特異であるということと結合様式が特異であるということとは別の問題である.1960年代に報告されたXeのマッコウクジラのミオグロビンの一酸化炭素結合に対する特異作用がファンデルワールス力による一般的な結合様式で結合していることが報じられている.このことは,麻酔薬(Xeは笑気より強力な麻酔作用がある)は特異的作用を示してもその結合様式は非特異的である典型的な証左である.このことをよりどころに本研究では麻酔薬が作用する部位の分子環境は共通した性質を持つという作業仮説をたてた.研究成果としては以下のようなことが明らかになった.1)局所麻酔薬は神経軸索膜を通過する際に環境のpHに依存して解離型が膜に分配されるのに比べて非解離型は膜表面に濃縮されて分配する事か証明され,そのこと自体が活動電位の消失に関わり,またその際の軸索内部のpH変化から,通説となっている膜を通過した局所麻酔薬が膜の内部からNaチャンネルに結合するという機序だけではないという結論を得た.また,ジブカインのような局所麻酔薬では種々のアルカノールの存在下では結合性が増すことなども明らかになった.2)環境温度が低下するとMACが低下する現象を物性論的に解析し,麻酔強度は受容体の麻酔薬作用部位での結合濃度を示すものではないことを示した.3)βadrenergic-あるいはmuscarinic-受容体にαヘリックスの構造で膜を通過する構造を持つ点で非常に類似性の高いバクテリオロドプシンを用いた研究ではアルカノールの濃度依存性に蛋白の高次構造を変化させることから物性論的な影響を明らかにした.これらの知見は現在特異的作用があるとしている蛋白における麻酔薬の存在する分子環境を直接的に説明するものではないが生体膜における存在様式を考察する上で大きな進歩であったと考えている.麻酔の作用ー濃度曲線から推定される麻酔薬の作用部位の数は約30位あると報告されている.このことから推論出来る麻酔薬の作用対象に対する結合の仕方は非特異的であろうということである.しかし,近年,麻酔薬がナトリウムチャネル蛋白,GABAAレセプター蛋白等々に対して特異な作用を示すという多数の報告がなされている.それらの報告は麻酔薬が30もの意識や痛みなどに関わる因子に作用しているということを証明する根拠にはなるが,麻酔薬がそれらの種々な作用を発揮している分子環境が特異であるかどうかを証明することにはなっていない.作用が特異であることと結合様式が特異である事とは全く別の問題である.本研究では麻酔薬が作用する分子環境は共通した性質あるいは現象によるものであろうという作業仮設に基づいている.それを示唆するもっとも適切な例は希有気体であるXeのマッコウクジラのミオグロビンに対する特異作用がファンデルワールス力による一般的な結合様式で起こっているということである.上記の作業仮設のもとに各研究分担者は以下の研究を行い,1998年11月21日に佐賀医科大学で分担研究者とその共同研究者の会を開いた.麻酔作用の定量的
広域・高解像度三次元計測に基づく気泡流メゾスケールモデリング

本年度は界面活性剤水溶液中を上昇する単一気泡の3次元運動について基礎的な知見を得ることを目的とし,活性剤の濃度・種類と気泡の大きさをパラメータとした実験を行い,気泡の軌跡・形状・周囲流動場の3次元計測に基づいた議論を行った.気泡の運動軌跡と形状をとらえるための独自の測定装置による3次元計測結果を得た.界面活性剤TritonX-100の低濃度溶液中において,らせん運動からジグザグ運動へ遷移する運動を観測した.この遷移運動はこれまで報告されてこなかった新しい現象であり,大きな成果である.さらに,気泡周囲流動場のデジタルホログラフィ計測を行った.以上の測定結果を踏まえて3次元運動メカニズムについて議論し,以下の知見を得た.本研究で初めて詳細に報告したらせんからジグザグへ遷移する気泡運動は,表面の瞬時すべり条件が運動モードを決定付けている.3次元運動しながら上昇する気泡の終端速度は1-Pentanol濃度に応じて,高濃度になるほど低下する.そして上昇速度の低下の影響により形状は球形化する.さらに気泡はスリップ条件が決定されるとある運動に落ち着き,後流構造が決まることを示した.またフリースリップ条件の気泡がノンスリップ条件に近づくにつれ,まず軌跡の振幅は大きくなり最大値をとり,その後小さくなっていく.気泡の水平方向速度と上昇速度の関係から,振幅が最大値をとる現象は,後流構造の非軸対称性による気泡の運動方向変化の影響が気泡にかかる抗力の増加を上回ることによって生じることを示した.本年度の研究成果によって,気泡流の能動制御の大きな可能性が示された工学的意義は大きい.ここで得られた知見は,気泡の3次元運動モデルを構築する際に,瞬時濃度分布を用いて気泡の運動を記述できる可能性を示唆しており,数値計算モデル構築の観点からもその意義は大きい.本年度は界面活性剤水溶液中を上昇する単一気泡の3次元運動について基礎的な知見を得ることを目的とし,活性剤の濃度・種類と気泡の大きさをパラメータとした実験を行い,気泡の軌跡・形状・周囲流動場の3次元計測に基づいた議論を行った.気泡の運動軌跡と形状をとらえるための独自の測定装置による3次元計測結果を得た.界面活性剤TritonX-100の低濃度溶液中において,らせん運動からジグザグ運動へ遷移する運動を観測した.この遷移運動はこれまで報告されてこなかった新しい現象であり,大きな成果である.さらに,気泡周囲流動場のデジタルホログラフィ計測を行った.以上の測定結果を踏まえて3次元運動メカニズムについて議論し,以下の知見を得た.本研究で初めて詳細に報告したらせんからジグザグへ遷移する気泡運動は,表面の瞬時すべり条件が運動モードを決定付けている.また,すべり条件の非定常変化がもたらす影響について考察し,本実験で影響は少ないことを明らかにした.さらに,ノンスリップ条件,フリースリップ条件では従来の結果と一致する臨界Re数を確認し,新しい知見であるハーフスリップ条件では全てのRe数範囲でらせん運動する結果を示し,ハーフスリップ条件では運動のRe数依存性が低いことを明らかにした.また,らせん運動する気泡の後流の3次元計測結果から,気泡後流でおきる遷移現象は,軸対象構造が崩れ,定常な非軸対象構造が現れ,さらに周期的構造へ遷移する剛体球の後流で起きる遷移現象と同じメカニズムであることを示した.本年度の研究成果によって,気泡流の能動制御の大きな可能性が示された工学的意義は大きい.ここで得られた知見は,気泡の3次元運動モデルを構築する際に,瞬時濃度分布を用いて気泡の運動を記述できる可能性を示唆しており,数値計算モデル構築の観点からもその意義は大きい.本年度は界面活性剤水溶液中を上昇する単一気泡の3次元運動について基礎的な知見を得ることを目的とし,活性剤の濃度・種類と気泡の大きさをパラメータとした実験を行い,気泡の軌跡・形状・周囲流動場の3次元計測に基づいた議論を行った.気泡の運動軌跡と形状をとらえるための独自の測定装置による3次元計測結果を得た.界面活性剤TritonX-100の低濃度溶液中において,らせん運動からジグザグ運動へ遷移する運動を観測した.この遷移運動はこれまで報告されてこなかった新しい現象であり,大きな成果である.さらに,気泡周囲流動場のデジタルホログラフィ計測を行った.以上の測定結果を踏まえて3次元運動メカニズムについて議論し,以下の知見を得た.本研究で初めて詳細に報告したらせんからジグザグへ遷移する気泡運動は,表面の瞬時すべり条件が運動モードを決定付けている.3次元運動しながら上昇する気泡の終端速度は1-Pentanol濃度に応じて,高濃度になるほど低下する.そして上昇速度の低下の影響により形状は球形化する.さらに気泡はスリップ条件が決定されるとある運動に落ち着き,後流構造が決まることを示した.またフリースリップ条件の気泡がノンスリップ条件に近づくにつれ,まず軌跡の振幅は大きくなり最大値をとり,その後小さくなっていく.気泡の水平方向速度と上昇速度の関係から,振幅が最大値をとる現象は,後流構造の非軸対称性による気泡の運動方向変化の影響が気泡にかかる抗力の増加を上回ることによって生じることを示した.本年度の研究成果によって,気泡流の能動制御の大きな可能性が示された工学的意義は大きい.ここで得られた知見は,気泡の3次元運動モデルを構築する際に,瞬時濃度分布を用いて気泡の運動を記述できる可能性を示唆しており,数値計算モデル構築の観点からもその意義は大きい.
МＲＩと末梢バイオマーカーによるアルツハイマー病発症前簡易スクリーニング法の探索

日常診療でアルツハイマー病(以下AD)及び経度認知障害(以下MCI)の予防、早期介入のため、ADの早期スクリーニングに有用な診断法の確立を検討してきた。MRIを用いたVSRADによる脳萎縮の評価及び磁気共鳴スペクトル(MRS)がADの早期診断に有用である事を示した。またAD/MCI患者では過酸化脂質代謝産物であるアクロレイン、その代謝産物である3-HMPAがAD/MCI患者の末梢体液で高値であった。さらにAD/MCI患者ではアルカデインの脳内γ-セクレターゼによる分解産物であるp3-Alcα35がの血液中で有意に高値で、血液バイオマーカーとしてADスクリーニングに有用である可能性を示した。平成25年度は、MRIと末梢バイオマーカーによる早期診断、スクリーニング法として、北海道大学大学院薬学研究院・神経科学研究室の鈴木利治教授らのご協力を得て、多施設(3施設)で、末梢バイオマーカーとして、APP同様にγ-セクレターゼによりプロゼッシングされる脳神経細胞膜タンパクであるアルカデインのγ-セクレターゼ分解産物で、脳内から血漿中に移行し、ADでは血漿中濃度が上昇していることが判明しているp3-Alc35および従来の髄液バイオマーカーであるAB42、リン酸化タウタンパクと画像所見(MRI)との関連を検討した。MRIでは、VSRADによる側頭葉内側部の萎縮評価と後部帯状回のMRS所見(NAA低下、MI上昇)を組み合わせて検討することで早期AD診断に有用であり、さらにMCIからADへのconversionにも有用であることが示された。したがって、血漿中p3-Alc35の解析とMRI-VSRAD,MRS所見による早期診断、スクリーニングが可能である可能性が示唆された。本研究の目的:これまでのアミロイドPET等を用いた大規模臨床研究(ADNIなど)から、アルツハイマー病(AD)は発症時には既に不可逆的神経変性の病態が確立している頃が判明し、各種根本的治療の試みも遅きに失していることが推測されている。したがって、日常診療レベルでの各種バイオマーカーによる超早期、発症前AD予備軍のスクリーニング,抽出方法を探索、確立し、いわゆるADドック検診の実現を目指す。さらに非侵襲的、安価で簡便な血漿などを用いた末梢バイオマーカー候補であるAlcadein分解産物であるp3Alcの測定を行う。(Aβオリゴマーの測定は共同研究者である京都府立医科大学神経内科徳田隆彦准教授に依頼する。p3Alcαの測定は北海道大学薬学部教授の鈴木利治教授に依頼する。)VSRADを用いたVBM-MRI及びMRSの画像所見と、血漿、脳脊髄液由来のアルツハイマー病バイオマーカー候補因子との関連を解析し、ADの正確な超早期診断と発症前診断及び早期介入によるAD発症予防と進行抑制を目指す。最終年度である平成26年度は、「MRIと末梢バイオマーカーによるアルツハイマー病発症前簡易スクリーニング法の探索」の研究課題の最終年度として、平成24年度、25年度に得た、アルツハイマー病(AD)、軽度認知障害(MCI)の患者体液(血液、尿)でAD/MCIで特異的に変化する液性因子を解析した結果として、血漿中の過酸化脂質代謝産物であるアクロレイン(以下PC-Acro)が上昇しており、一方でPC-Acroの最終代謝産物である尿中3-hydroxypropyl mercapturicacid (3-HPMA)がMCI/ADにおいて低下していることを報告した。診断精度としては、既存のADバイオマーカーである脳脊髄液(以下CSF)中amyloid β42、タウやリン酸化タウには及ばないものの、今後さらに測定方法等を改良して検討しうるバイオマーカー候補と結論した。さらに、北海道大学の鈴木利治教授らが既に見出している、AD脳では脳内の異常なγセクレターゼによりアミロイド前駆体蛋白と同様に切断基質であるアルカデイン切断産物であるp3-alcα35がAD/MCI患者の血漿中で高値であることを報告し、アルカデイン切断産物がAD/MCIの血液バイオマーカーとして有力であることを示した。老年期神経変性疾患血漿中p3-Alc35および脳MRI、MRSの総合的解析により、当初の目的であった非侵襲的方法によるAD、MCI患者の早期診断と予後予測が可能であることを示し、これらが通常の物忘れ外来における認知症の客観的診断、スクリーニングに有用である可能性が示されたこと。平成24年度では160名の対象(健常高齢者、MCI、AD及び瀰漫性Lewy小体病DLB)に対して、全例にMMSE、VSRADを用いたVBM-MRIと後部帯状回のMRSを施行した。98名に対し、脳脊髄液中Aβ40,42、タウ、Aβオリゴマー及びp3Alcαを測定した。

これまでの報告の通り、AD、MCI及びMCI移行例では脳脊髄駅中AB42の低下傾向とタウの上昇を認めた。また、後部帯状回のMRSによるchemical shift解析では、AD、MCI、MCI以降例及びDLBでは有意なNAA/Cr値の低下を認め、これらの値は認知機能(MMSE)に有意に相関した。VSRADも1年の追跡で、側頭葉内側部の萎縮が早期から萎縮することが判明した。MRSとVSRADさらには脳脊髄液中バイオマーカーの総合的検討によりADの正確な超早期診断、発症予測及び早期介入が可能と思われる。倫理的同意を得て、さらに対象数を増やして、実際に脳ドック受診患者(正常者、認知症患者を含む)等にもこれらの非侵襲的バイオマーカーが有用であるかどうかを検討する余地がある。さらに、根本的治療がない現在、対症療法として広く認知症治療に使用しているドネペジル等の抗AchIをより早期から使用したケースと、中等度から使用したケースで臨床的に認知症の経過に差が出るかを、上記バイオマーカー等を駆使して検討する。対象患者数を増加する予定である。また各々の対象者について、MRI所見と各種バイオマーカーの経時的変化を追跡し解析する予定である。これにより、どの補助診断方法あるいはバイオマーカーの組み合わせがアルツハイマー病の超早期診断あるいは発症前診断に最適であるかをROC等の統計学的手法で検討する。交付決定額を計画的に使用したが残額が生じた。平成26年度に被験者から採取した脳脊髄液の保管に必要なエッペンドルフチューブを購入するために使用予定である。引き続き、健常高齢者、MCI、AD、その他の認知症疾患から採血及び腰椎穿刺を同時に施行し、ポリプロピレンチューブに-80°Cで保管する。検体数が60名以上に達した時点で、血漿及び脳脊髄液中のAβ40,42、タウ、Aβオリゴマー及びp3AlcをELISAにより測定する。脳脊髄液中Aβ40,42、総タウのEKISA Kit購入に60万円を計画している。
低次元の結び目とブレイドの構造の研究

結び目理論においてAlexanderの定理とMarkovの定理は重要な役割を果たしている。2次元結び目についてもこれらの定理の一般化が成立する。特異2次元絡み目は特異2次元ブレイドとしての表示を持ち、ブレイドを利用して特異2次元絡み目を自明に変形するようなジェネリック正則ホモトピーを構成するアルゴリズムが存在するが、適当にブレイド表示を選ぶことで、最小のジェネリック正則ホモトピーをブレイドレベルで実現できることが分かる。これより、2次元結び目の(正則ホモトピー)結び目解消数の評価を2次元ブレイドの平面上のダイアグラム(チャート表示)から求めることが可能となる。同様のことが、1ハンドル接読操作についても成立することが分かり、2次元結び目の(コボルディズム)結び目解消数の評価を2次元ブレイドのチャート表示から求めることが可能となった。2次元結び目の正則ホモトピー結び目解消補題を利用して、2次元結び目について有限型不変量(Vassiliev不変量)の擬念を定式化した。またVassiliev不変量の構成するベクトル空間の次元は1次元であること、一般の特異2次元結び目についてはある3つの基本不変量によりVassiliev不変量が決定されることが分かった。同様に、コボルディズムに対応する1ハンドル接続操作についても有限型不変量の概念が意味を持ち、この不変量の空間が1次元であることを示した。ベータシステムを用いて2次元ブレイドを分類する上で問題となっている基本変形同値問題において、ラックの概念を利用すればこの問題が見通しよくなることが分かった。実際に、2次元ブレイドのベータシステムの各要素はコードのラックの要素に対応している。そしてコードのラックの共役公式を得ることに成功した。結び目理論においてAlexanderの定理とMarkovの定理はとくに重要な役割を果たしている。2次元の結び目についてもこれらの定理の一般化が成立する。特異2次元絡み目は特異2次元ブレイドとしての表示を持つ。当研究において、任意のコード付き特異2次元絡み目はブレイド表示可能であることを示した。ブレイドを利用して特異2次元絡み目を自明な特異2次元絡み目に変形するようなジュネリック正則ホモトピーを構成するアルゴリズムが存在するが、うまくブレイド表示を選べば、最小のジュネリック正則ホモトピーを実現できることがわかった。これにより、2次元結び目の(正則ホモトピー)結び目解消数の評価を2次元ブレイドの平面上のダイアグラム(チャート表示)から求めることが可能となる。同様のことが、1ハンドル接続操作についても成立する。ブレイド表示を利用して特異2次元絡み目を自明化するアルゴリズムが存在するが、うまくブレイド表示を選べば、最小回数の1ハンドル接続操作であるような変形プロセスを実現できることがわかった。これにより、2次元結び目の(コボルディズム)結び目解消数の評価を2次元ブレイドのチャート表示から求めることが可能となる。2次元結び目の正則ホモトピー結び目解消補題を利用して、2次元結び目について有限型不変量(Vassiliev不変量)の概念を定式化した。またVassiliev不変量の構成するベクトル空間の次元は1次元であることがわかった。一般の特異2次元結び目についてはある3つの基本不変量により、Vassiliev不変量が決定されることも証明した。特異2次元絡み目についての有限型不変量(Vassiliev不変量)の定式化は現在のところ未解決である。
内殻電離によるアミノ酸の分子変化生成機構

特定元素のK殻吸収端付近のエネルギーを持つ単色軟X線を生物に照射すると、エネルギーに依存して生物効果が大きく変わることが報告されている。本研究はこの機構を解明するために、硫黄を含むアミノ酸をモデル分子として硫黄のK殻に軟X線が吸収された時にどの様な特異的な分子変化(分解)が起きるかを調べることを目的としている。昨年度は、いくつかの含硫アミノ酸について硫黄K殻吸収による分子分解パターンの変化を調べ、励起元素から離れた結合は切断され難い、硫黄一炭素間結合は他の原子の吸収によっても切れやすい、という現象がアミノ酸の分子種によらないことが明かになった。平成5年度は生体中と同様な環境である水溶液中で照射した場合に着目した。水溶液中に生成したOHラジカルとの反応によると思われる9個のピークがみられ、そのうちの一つは硫黄一炭素結合が切断されたところに水酸基が結合したホモセリンであることが確認された。OHラジカルの補捉剤を加えるとこれらのピークは減少したが、硫黄一炭素結合が切断されたときに生成するα-アミノ酪酸とアラニンの生成量は減少しなかったので、水溶液中でもこれらはOHラジカルが関与しない反応機構によって生成していることがわかった。水溶液中でのみ見られたピークも併せて、未同定ピークの分子種の同定を試みたが、収量が非常に少ないこと、および特徴的な吸収が見られなかったことから、同定することは出来なかった。アイソトープラベルされた試料を用いる等、生成物の分析に関する別の方法を検討している。今年度は以下のような成果を得た。1.すでに特異的な分子変化を示すことが知られているシスタチオニンと同様に、分子骨格のなかに一つの硫黄原子を含み、それに結合している炭素鎖の長さのことなる分子、メチオニン、ランチオニン、システインについて、硫黄K殻吸収端前後の単色軟X線を照射して分子分解パターンの変化を調べた。その結果、どのアミノ酸の場合も硫黄がX線を吸収したときの硫黄-炭素間結合の解離の量子収率が2以上であるのに対して炭素-炭素間の結合の収率は0.2以下であった。このことから励起元素から離れた結合は切断され難いこと、硫黄-炭素間結合は他の原子の吸収によっても切れやすいこと、このような現像はアミノ酸分子の個性によらないこと、が明かになった。2.生体中と同様に、照射中に水があった場合にどうなるかと言う点に着目して、シスタチオニンの水溶液試料についての実験を始めた。水溶液で照射したサンプルのクロマトグラムには固体照射で見られなかったピークが9個も発見された。これらは水溶液中に生成したOHラジカルとの反応によって生成したもの、あるいは分解後水分子と反応して水酸基が付加したもの、が含まれると考えられた。実際に、硫黄-炭素結合が切断されたところに水酸基が結合したホモセリンが生成していた。他の分解生成物の同定を早急に進めたい。昨年度は、いくつかの含硫アミノ酸について硫黄K殻吸収による分子分解パターンの変化を調べ、励起元素から離れた結合は切断され難い、硫黄一炭素間結合は他の原子の吸収によっても切れやすい、という現象がアミノ酸の分子種によらないことが明らかになった。

平成5年度は生体中と同様な環境である水溶液中で照射した場合に着目した。水溶液中に生成したOHラジカルとの反応によると思われる9個のピークがみられ、そのうちの一つは硫黄一炭素結合が切断されたところに水酸基が結合したホモセリンであることが確認された。OHラジカルの補足剤を加えるとこれらのピークは減少したが、硫黄一炭素結合が切断されたときに生成するalpha-アミノ酸とアラニンの生成量は減少しなかったので、水溶液中でもこれらはOHラジカルが関与しない反応機構によって生成していることがわかった。水溶液中でのみ見られたピークも併せて、未同定ピークの分子種を同定を試みたが、収量が非常に少ないこと、および特徴的な吸収が見られなかったことから、同定することは出来なかった。アイソトープラベルされた試料を用いる等、生成物の分析に関する別の方法を検討している。
変分問題、最適化問題、線形および非線形偏微分方程式の解の構造の研究

非線形現象の数理(特に,パターン形成における環境効果の果たす役割,対称性の崩れ現象など)を非線形偏微分方程式の解析を通して理解・解明したいという動機のもと,数理生態学に現れるアレン・カーン方程式,ギーラー・マインハルト系などの反応拡散方程式系の定常解,非線形光学現象に現れる非線形シュレディンガー方程式など種々の非線型楕円型変分問題の解の構造の研究や関連して無限次元の最適化問題を中心テーマとして研究を行った.非線形現象の数理(特に,パターン形成における環境効果の果たす役割,対称性の崩れ現象など)を非線形偏微分方程式の解析を通して理解・解明したいという動機のもと,数理生態学に現れるアレン・カーン方程式,ギーラー・マインハルト系などの反応拡散方程式系の定常解,非線形光学現象に現れる非線形シュレディンガー方程式など種々の非線型楕円型変分問題の解の構造の研究や関連して無限次元の最適化問題を中心テーマとして研究を行った.1.倉田は,空間多次元も込めて数理生態学に現れるアリ効果をもつ非線型数理モデルの定常解の構造で,環境効果による安定な多重空間パターンが出現の現象の証明を与えた.また、vortexをもつような非線形シュレティンガー方程式の最小エネルギー解の詳しい漸近挙動の研究を行った.2.岡田は,離散変分導関数の考え方を変数係数非線形に一般化した場合に適用し,対応する差分スキームを導いた.また,それを不均質な生態モデル方程式の数値解法に応用した.3.村田は,リーマン多様体内の領域と区間との直積上の2階放物型偏微分方程式の非負値解全体の構造を研究し、熱核に対する仮定-intrinsic ultracontrac4.田中は,非線形シュレディンガー方程式における空間1次元での高振動解の構成,および特異摂動問題の研究で空間1,2次元の場合に非常に一般的な非線形項を許容する条件下での局在解の存在を証明した.5.神保は,薄い3次元領域上のギンツブルグ・ランダウ汎関数の変分問題を極限の1次元あるいは2次元領域集合上の問題に還元して停留点の対応を構成した.また,極度の括れ(Constriction)のある領域あるいは瓢箪型(Gourd-shaped)領域における楕円型作用素の固有値の漸近挙動を解析を進めた.6.柴田は,単振り子型の非線形楕円型方程式のパラメーター無限大での解の境界層の挙動を調べた.また,強い摂動項をもつ単振り子型の常微分方程式に変分法を適用して得られた解の漸近的性質を調べた.7.吉冨は,周期的なδ7型点相互作用に従う1次元シュレディンガー作用素の閉じたスペクトラルギャップの同定問題,スペクトラルギャップの幅の漸近的性質と,作用素に含まれるパラメータの数論的性質の関係を得た.1.倉田は,ソボレフ空間W^{1,2}_O(\Omega)の指数が変動するL^{p(x)}空間へのコンパクト埋め込みの研究および数理生態学のパターン形成モデルのギーラー・マインハルト系で弱い飽和効果を取り入れたモデルにおいて,空間多次元軸対称領域上で多重ピークをもつ定常解の構成を行った.2.岡田は,サンプリング補間による優れた関数近似を与える2種類の基底関数をsinc関数やスプライン関数を用いて構成し,それによる関数の補間近似について,上からの誤差評価を予想し証明した.3.村田は,筒状領域での2階放物型偏微分方程式の非負値解に対する積分表示を研究し,対応する熱核の内在的超縮小性という一般的で最適な仮定の下で任意の非負値解を表示する公式を確立した.4.田中は,非線型シュレディンガー方程式に対しては一般的な非線型項をもった方程式を扱いポテンシャルV(x)の極小値に集中する凝集解の存在を示し,ギーラー・マインハルト系に関しては空間次元が1の場合に方程式にx依存性がなくとも,局所的に高振動をもつことを示すことに成功した.5.柴田は,常微分方程式を中心とした非線形楕円型方程式の固有値問題の固有値や固有関数の漸近挙動に関する詳細な解析を行った.6.吉冨は,\delta^{\prime}型の2個の周期的な点相互作用に従う1次元シュレディンガー作用素のスペクトラルギャップの幅の漸近挙動と,格子間隔の比の数論的性質の関係を得た.1.近年,指数が変数係数となるルベーグ空間やソボレフ空間の実解析的研究が盛んに行われているが,塩路直樹氏(横浜国大)との本研究で,ソボレフ空間の変数係数をもつルベーグ空間への埋め込み定理がコンパクトであるシャープな条件を見つけることに成功した.その応用として,ソボレフ臨界的変数指数をもつ非線形項を含むような非線形楕円型境界値問題の非自明解の存在を示した.2.2000年に行ったDirichlet第1固有値最適化問題の研究(S.Chanillo,D.Grieserらとの共同研究),2004年に行った非線形熱伝導問題における非線形最適化問題の研究(M.Shibata,S.Sakamotoとの共同研究)に続き,Dirichlet境界条件下で,拡散効果を持ったロジスチックモデルにおける漁獲最適戦略問題(ある非線形楕円型境界値問題に対する最適化問題)を提唱し,J.Shiとの共同研究で,対応する数理モデルにおける最適戦略解の存在,定性的および定量的性質の研究を行った.特に最適解の対称性の崩れ現象の証明を行った.

3.数理生態学におけるパターン形成モデルとして有名なギーラー・マインハルト系で,特に弱い飽和効果をもつ反応拡散系において,森本光太郎氏(首都大学東京)との共同研究で,軸対称領域上で,いくつも指定した有限個の点に凝縮した形状をもつ定常解の構成に成功した.一般の領域上でも,シャドウ系と呼ばれる場合には,1点に凝縮する定常解の存在はそのWeiとWinterによって2004年に与えられていた.我々の結果はWei-Winterの結果と飽和効果のないモデルに対するNi-Takagiの結果(1995年)を補完するものといえる.
人工肺と組織細胞を用いた呼吸器・代謝系非動物実験による火災ガス毒性評価方法の確立

ラットやマウスなどの動物実験の代替方法としてヒト肺胞基底上皮細胞A549による火災ガスの毒性評価方法を確立した.火災ガスの毒性評価システムは,火災ガス収集装置,暴露実験装置,毒性評価装置から構成される.ABS樹脂実験では,初期細胞数3×10^5cells/mlから5%CO_2環境下では3日後に3×10^6cells/mlに増加し,生存率は95%であった.空気環境下では3日後に1×10^6cells/mlに増加し,生存率は90%であった.火災ガス環境下では3日後に5×10^4cells/mlに減少し,生存率は20%になった.ラットやマウスなどの動物実験の代替方法としてヒト肺胞基底上皮細胞A549による火災ガスの毒性評価方法を確立した.火災ガスの毒性評価システムは,火災ガス収集装置,暴露実験装置,毒性評価装置から構成される.ABS樹脂実験では,初期細胞数3×10^5cells/mlから5%CO_2環境下では3日後に3×10^6cells/mlに増加し,生存率は95%であった.空気環境下では3日後に1×10^6cells/mlに増加し,生存率は90%であった.火災ガス環境下では3日後に5×10^4cells/mlに減少し,生存率は20%になった.「研究の目的」気密性建築物火災等で起こる低酸素濃度環境で生成される火災ガスが,居住者や消防職員に与える生理的影響を人工心肺システムと組織細胞を用いて構築した呼吸器・代謝系の非動物実験において明確にし,気密性建築物火災における火災ガスの毒性評価を行い,消火活動,避難および建築物等の火災安全対策を提言することを目的とする.本年度は,(1)人工呼吸系ガス回路の構築,(2)火災ガス発生システムの構築,および(3)肺上皮細胞の培養,増殖試験を行った.「当該年度に実施した研究の成果」(1)人工呼吸系ガス回路の構築マウス用レスビレータ,水平拡散チャンバーから構成される人工呼吸系ガス回路を構築した.水平拡散チャンバーに設置された肺上皮細胞にマウスの呼吸数に合わせた火災ガスを暴露するシステムを構築した.(2)火災ガス発生システムの構築温度制御装置により設定された温度に保持された石英管にサンプルを設置して,下部或いは側部より空気を流入させ,マウス用レスビレータに導入するシステムを構築した.(3)ヒトII型肺胞上皮細胞株A549の培養,増殖試験(1)A549の培地を検討した結果,EagleにFCS10%,ペニシリン5mL(0.51%),L-グルタミン1%培地で5%CO2,37°C条件における増殖曲線を作成した.(2)火災ガスによるA549の細胞毒性評価方法を検討した結果,トリパンブルー4%溶液およびCell Counting Kit-8(高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩WST-8を発色基質)で可能なことが分かった.近年,住宅の高気密高断熱化が普及しており,一端,火災が起きると低酸素濃度環境が形成される.その結果,居住者は,OA機器に使用されるアクリル樹脂,ABS樹脂,寝具や座布団に使用されるポリウレタンや新建材から発生した一酸化炭素,シアン化水素,塩化水素,ホルムアルデヒド,アンモニアなどの有毒ガスに暴露される.火災ガスの毒性評価は,従来までラットやマウスなどの動物実験をモデル火災建物あるいは燃焼装置を用いて行われてきた.昨今,欧州を中心に動物実験を廃止もしくは最小限に抑制する世界的な動きがある.本研究は,気密性建築物火災等で起こる低酸素濃度環境で生成する火災ガスが,居住者や消防職員に与える生理的影響をセルライン細胞により構築した呼吸器・代謝系の非動物実験において明確にし,火災ガスの基礎的毒物性の評価を行った.試験材料として,シアン化水素発生源であるポリウレタン,ポリアミド,ポリアクリロニトリル,ABS樹脂の4種,生分解性プラスチックのポリ乳酸を選定した.卓上焼却炉に試験材料を入れて一定温度で加熱する.燃焼ガスは,冷却管を通り,CO2インキュベーターに設置した角形ジャーに導く.角形ジャー内部には培養ディシュに播種したA549を設置する.比較対照としてCO2インキュベーターに火災ガスに暴露されない培養ディシュのA549を設置する.シアン化水素は,ガスクロマトグラフFTD検出器で測定する.コントロールとして火災ガスに暴露されていないA549の増殖曲線を得た.A549は,誘導期03日,対数増幅期315日であった.この結果から,今後の火災ガス実験において暴露期間は14日とする.卓上焼却炉でポリウレタンを燃焼させた結果,シアン化水素の発生が30ppm以上であることをシアン化水素濃度計で確認した.今後,本実験装置でA549に対する火災ガス暴露実験を行い,コントロールとの比較を行う.本研究は,気密性建築物火災等で起こる低酸素濃度環境で生成する火災ガスが,居住者や消防職員に与える生理的影響をヒト細胞により構築した呼吸器・代謝系の非動物実験(in vitro cytotoxicity)において明確にし,火災ガスの基礎的毒物性(Basal cytotoxicity)の評価を行った.

火災ガス,5%CO_2,空気の3つの環境に暴露されたA549は,3日間培養し,1日毎に細胞数,生死数,細胞状態を比較した.アクリル樹脂,ポリウレタン,ABS樹脂のうち予備実験でシアン化水素を発生量が多いABS樹脂をサンプルとした.火災ガスの吐出量は100stork/min.である.ABS樹脂の燃焼により発生した火災ガスの毒性評価を目的に,ヒト細胞A549への暴露実験を行い,空気および5%CO_2環境下の培養細胞と比較した.結論として以下のことがわかった.(1)火災ガス収集装置および暴露実験装置を製作した.(3)初期細胞数3×10^5cells/mlから5%CO_2環境下では3日後に3×10^6cells/mlに増加し,生存率は95%であった.空気環境下では3日後に1×10^6cells/mlに増加し,生存率は90%であった.火災ガス環境下では3日後に5×10^4cells/mlに減少し,生存率は20%になった.
地磁気エクスカーションと気候変動・海水準変動の相関性についての研究

本研究に先立って,我々は九州西方海域から1万4千年前の急激な地球磁場変動の記録を得た。1万4千年前の氷河期から温暖期への移行期に起こったとされる急激な海水準上昇で地球の慣性モーメントが変化し,地球の回転速度が変化したことで地球磁場変動が起こったと仮説を立て,証拠固めを目指して研究を行った。九州西方海域で採取した4本の柱状堆積物試料のうち1本で1万2千年前の地球磁場の方位と強度の異常が確認されたが,他の3本では確認されなかった。さらに,異常を示した層準から別試料を採取して再測定したが,異常は確認されなかった。異常の原因は堆積後に生成された不安定な磁性鉱物によると思われる。九州西方の男女海盆で採取された堆積物コア試料(MD982195)の結果から約1万4千年前および6千年前に地磁気エクスカーション(大規模な地磁気変動)の存在の可能性が示唆された。1万4千年前にはメルトウォーターパルス1Aとして知られている急激な海水準上昇が確認されている(Fainbanks,1989)。急激な海水準上昇は地球の慣性モーメントの増加をもたらし,角運動量の保存則から地球(地殻・マントル)の回転速度が急激に減少することが期待される。急激な海水準上昇は、コアーマントル境界に強い差分回転を導入し、地球磁場に大きな変動(地磁気エクスカーション)をもたらすことが予想される。本研究では、このような予想の下に男女海盆におけるKYO7-04航海の4本の堆積物コア試料を用いて現象の確認および海水準変動との関連性について明らかにすることを目的とした。本年度は堆積物コア試料PC1およびPC4の自然残留磁化の測定が完了したが,過去2万年間に相当する部分で地磁気エクスカーションに相当するような大きな地球磁場変動を示す結果は得られなかった。MD982195コアで確認された地磁気エクスカーションと思われる記録は堆積物の乱れ等による見かけの現象であった可能性が高くなったが,引き続き平成20年度にはPC2およびPC3の測定を行いさらなる確認を行う予定である。また,PC1については相対古地磁気強度を求めることができたが,その結果は琵琶湖や台湾北東方海域から得られている過去2万年の記録と調和的である。平成20年度には残るPC2,PC3,PC4についても相対古地磁気強度を求めることにより男女海盆周辺の地磁気強度変動曲線の確立を目指す。1万4千年前にはメルトウォーターパルス1Aとして知られている急激な海水準上昇が確認されている(Fairbanks,1989)。急激な海水準上昇は地球の慣性モーメントの増加をもたらし,角運動量の保存則から地球(地殻・マントル)の回転速度が急激に減少し、コア-マントル境界に強い差分回転を導入して地球磁場に大きな変動(地磁気エクスカーション)をもたらすことが予想される。本研究では、このような予想の下に男女海盆におけるKY07-04航海の4本の堆積物コア試料のうち未測定のPC2とPC3の2本のコアについて古地磁気測定を行った.特に,昨年度のPC1試料の測定で12,300年間(深さ852cm)に確認されたスパイク状の異常な残留磁化方位と強度の確認を行ったが,同一地点の試料PC2を含めていずれのコアの同層準試料からは異常な方位は見つからなかった.さらに,確認のためにPC1コアの古地磁気試料の横から採取した3cmと5cm幅のスラブ試料の古地磁気測定を行ったが異常方位は確認されなかった.未だ異常方位の原因は同定できないが,試料採取時の試料の乱れ,あるいは古地磁気試料のみに含まれていた続成作用で生成した磁性鉱物による化学残留磁化の影響が考えられる.古地磁気結果は本研究の目的を達成できなかったが,PC1コアの14層準から石灰質の浮遊性有孔虫をピックアップし14C年代測定を行った結果,コア最下部は約2万年前とわかった.また,コアの912-924cmで確認された火山灰が桜島薩摩(13ka)と同定された.さらに,PC1コアについて浮遊性有孔虫を用いて過去の水温の復元を試みた.その結果,東シナ海における最終氷期の水温が現在に比べ34°Cほど低く,また,完新世においては4千年前頃に水温が低下していることがわかった.
小児四肢疼痛症の患者を国内各地の医療機関を通じて収集した。53家系について、SCN11A遺伝子のコード領域の変異の検索を行った。また臨床情報を取得した。既に我々が見出したNav1.9 p.R222変異の遺伝子解析を行ったところ、17家系がSCN11A遺伝子に変異を有することが分かった。SCN11A変異スクリーニングは、小児四肢疼痛発作症の症例では有効であると考えられた。SCN11Aに変異を有さない症例について遺伝子変異を検索した結果、SCN9A遺伝子に変異を見出すことができた。これらの症例について、既報の変異と表現型との関係を評価し、電気生理学的評価も実施してる。以上の過程で発見された変異について、ゲノム編集によるSCN11A遺伝子改変マウスを作出し、脊髄後根神経節細胞を解析し、R222Sと同じく小児四肢疼痛発作症において、Nav1.9変異が活動電位の頻度の増加を証明した。また遺伝子解析の結果、変異が認められない症例について、全ネクソン配列解析を行い、他の候補遺伝子を解析している。培養細胞Nav1.9発現系の作成のため、β1、β2サブユニットの安定発現株作成を試みた。細胞への遺伝子導入を行い、薬剤選択した細胞株を得たが、発現抑制が生じ、十分な発現が見られなかった。現在、導入されるゲノム上の部位を選択できる系で作成している。当初の計画に沿って進行している。作成した遺伝子改変マウスを用いて、低温環境曝露による遺伝子発現の変化、疼痛行動の変化、電気生理学的反応解析により、それぞれの変異箇所の痛覚閾値への影響を評価する。また、細胞発現系、細胞単離系で、変異Nav1.9チャネルの特性を明らかにし、DRGの活動性との関係を検討し、また低温環境と遺伝子発現、細胞膜輸送への影響を調べる。これらにより気象環境の変化への応答性の観点から疼痛メカニズムを明らかにすることができると考えている。30家系について、SCN11A遺伝子のコード領域の変異の検索を行った。既に我々が見出したNav1.9 p.R222変異の遺伝子解析を行ったところ、10家系がR222H変異陽性であることが分かった。p.R222H/S変異スクリーニングは、小児四肢疼痛発作症の症例では有効であると考えられた。R222S/H変異を有さない症例について遺伝子変異を検索した結果、1家系で既報変異(V1184A)を、3家系で新規変異(F814C, F1146S)を見出すことができた。一方で、小児四肢疼痛発作症とみられる症状を示す場合でもSCN11A変異陰性家系が存在し、これらの症例について、他の遺伝子を含めた検討を行うことにしている。以上の過程で発見された変異について、ゲノム編集による遺伝子改変マウスに取りかかった。これらの遺伝子改変マウスを用いて、脊髄後根神経節細胞を解析し、小児四肢疼痛発作症において、Nav1.9変異が与える影響について解析を検討する予定である。またNav1.9を培養細胞系で発現させて、その電気生理学的特性を評価することを目標とするが、このαサブユニットであるNav1.9の発現、機能にはβサブユニットの共発現が重要な働きを担うことが多く報告されている。よって本年度は今回見つかったNav1.9変異型の機能解析を行う目的のため、β1、β2サブユニットの安定発現株作成を開始した。発現ベクターの作成を行い、細胞への遺伝子導入を行い、薬剤選択した細胞株を得た。今後、遺伝子発現の程度、電気生理学的評価が可能な状態であるかを調べる。現在作成中の遺伝子改変マウスを用いた、遺伝子変異の電気生理学的解析により、それぞれの変異箇所の痛覚閾値への影響を評価する。
また、細胞発現系で、変異Nav1.9チャネルの特性を明らかにし、DRGの活動性との関係を検討し、また培養環境と遺伝子発現、細胞膜輸送への影響を調べる。これらにより気象環境の変化への応答性の観点から疼痛メカニズムを明らかにすることができると考えている。作成した遺伝子改変マウスを用いて、低温環境曝露による遺伝子発現の変化、疼痛行動の変化、電気生理学的反応解析により、それぞれの変異箇所の痛覚閾値への影響を評価する。また、細胞発現系、細胞単離系で、変異Nav1.9チャネルの特性を明らかにし、DRGの活動性との関係を検討し、また低温環境と遺伝子発現、細胞膜輸送への影響を調べる。
視覚中枢における動的な生化学的指標の探究

視覚における動的な生化学的マーカーを捉えることを目的とした研究である。本来的には生理的に近い状件下でのマーカー捉えることを目標としたがかなり難しく、病的な状件下でのマーカーを数種類捉えた。その一つは網膜や視神経組織の中の尿酸で、いまゝで難しかった組織中の尿酸をHPLC法で測定可能となった。まずラッとを20分脳虚血し、血行を再開通すると、尿酸値の増加が虚血直後と再開通一時間後に認められた。二峰性の増加となるのは血行再開による酸素による害作用のためで、網膜より視神経の方が変化大きく、虚血に対してより脆弱であることを示した。もう一つはカエルの視神経切断実験でアクチンとチューブリンの遺伝子発現が一過性に増加することを見い出した。カエルの視神経は再生するので、再生への初期反応と思われた。しかし再生のないラットの視神経切断ではアクチンmRNAの増加はなられなかった。光遮断による視覚中枢での生化学的マーカーの検索実験では、特製の暗箱飼育装置の中で妊娠ラットに仔を生ませ、そのラット仔に対して種々の光状件を与えた。12時間サイクルの明暗刺戟群をコントロールに、完全光遮断群、光遮断後一定時間の光刺戟群などである。そのぞれの状件下、取り出した脳は凍結切片としホルムアルデヒド固定後in situ hybridization法にてマーカーとなる物質のmRNaの発現を検出した。切片は大脳皮質第一次視覚野と外膝状件と含む部用を用いた。まずガン遺伝子c-fosを用いた。プローブDNAはPCR法により作製、精製した。しかしc-fosmRNAの発現は弱く、各群に有意の差を見い出せなかった。Junガン遺伝子でも同様であった。他に生物活性因子のBDNF,FGF,NT_3NGFのプロープは作製ずみなので今後研究を進めていく。視覚路で生化学的動的指標となる物貭としてcーfos蛋白とmRNA,チュ-ブリンとアクチンのmRNA,Cytochrome Coxidase,GABAなどについて検索した。さらに各種蛋白やペプチドの遺伝子レベルでの発現を網膜や脳の局所的な微小部位より検出する方法として、各種のmRNAの発現をPCR法にて増中して検出できる方法を新たに開発した。種々の光刺戟状件下での動物実験が主となるため、完全な暗室となる動物飼育箱を特別にデザインし作製した。赤外線ビテオモニタ-にて動物を観察、世話ができるようになり、X線フィルムで光の漏れがないことを確めた。サルなどの視覚皮貭にはblobという点状構造がcytochrome C oxidaseでの染め出されるが、実験しやすいラットやヒヨコにはこの構造は認められなかった。cーfosの免疫組織化学的検索で成熟したラットやネコなどで、普通の光刺戟ではcーfos蛋白の量的な変化は視皮貭では認められなかった。カエルの視神経切断時に網膜でチュ-ブリンが数時間で、またアクチンが一週間でその発現増加をmRNAをノ-ザンブロット法で認められた。このときカエルを5匹で検出したが、新らたに開発したPCR法によるmRNAの増中してサザ-ンブロット法により検出する方法でラット網膜一枚、脳組織10mgからチュ-ブリンのmRNAの発現を検出できるようになった。プライマ-を選らべば核酸の塩基配列の明かな蛋白ペプチドのmRNAの発現を検出できる。

ラットの視神経切断時、チュ-ブリンmRNAの発現には有意の変化は見い出せなかったが、生理的な状件下でも変化すると考えられるmRNA(たとえばcーfos,bーFAGF,グルタミンレセプタ-GABAレセプタ-など)についても、局所的な微小部位での変化を検索できるようになった。実験動物を用いて、いろいろな視覚刺戟状件下に対応する網膜を含めた中枢神経系組織の生化学的マ-カ-について検索を試みた。さらに、病的状熊での生化学的マ-カ-の変化についても検索を行った。たとえば、ラットを用いて網膜と視神経の虚血変化に対して、それら組織中の尿酸値をHPLC法による測定したところ、虚血状熊では尿酸値が有意に上昇し、良き生化学的マ-カ-になることを示した。さらに、基磯的なものとして、脳組織の各部位をFTラマン分光スペクトル法で分子レベルで区別する方法を確立し、組織化学の脳切片へ応用できるようにした。ラット視神経切断実験では、カエルの視神経切断時に認められたチュ-ブリンmRNAの発現上昇は認められなかった。しかしNGFのmRNAの網膜での増加傾向は認められた。暗室飼育のラットでは後頭葉でのNGFのmRNAの発現の変化は認められなかった。これらmRNAの発現は、新らたに開発した微小組織からpolyAーmRNAを抽出、逆転写酵素にてcDNAとし、それを元に特定のプライア-を用いてPCR法で増幅する方法を用いたのでかなりの誤差が出る。そして特定の細胞のmRNAの発現をみている訳でないという欠点がある。そこでmRNAのin situ hybridization法を導入することにした。実験動物は妊娠ラットを完全暗箱にて、赤外モニタ-下飼育し、視覚の臨界期前後で、光刺戟の有無,強さや時間により各種のグル-プに別ける。それら動物の後頭葉,外膝状体や網膜でのmRNAの発現を検索する。暗室飼育はラットではうまくいくが、ネコではむずかしく今のところうまく出来ていない。in situ hybridizationのプロ-フとしては成長因子NGF,NT3,BDNFやそれらのレセブタ-のeDNAを用いるが、特定のプライマ-を用いてPCR法で増幅し、精製したcDNAを用いる。NGF,BDNF,NT3,CNTF,Trk,Erkなど用意でき、幼若ラットで検索を行っている。本年度は光遮断による影響を視覚中枢でみるため、生理活性のある物質の遺伝子発現をin situ hybridization法で検討した。光遮断実験は特別に作った暗箱飼育装置2台に妊娠ラットを完全な暗室状態で飼育し、生れた仔を種々の状件下で飼育した。状件別に一つのグループとし(1)生後より12時間サイクルで明暗の光刺戟を加えたグループを正常コントロール群とし、(2)完全な暗室のまゝで飼育し、3週間後に暗室の中で頚椎脱臼により屠殺し脳を取り出した群、(3)完全暗室で飼育3週間後に1時間の光刺戟を加えた群、(4)(3)の場合を10分とした群、(5)暗室で10日飼育し、片眼縫合してから生後3週間まで12時間の明暗サイクルの光刺戟を加えた群に分け、組合せて実験を行った。取り出した脳より凍結切片を作成し、パラホルムアルデヒド固定した。プローブとしてPCR法で作成、精製したラットに特異的なDNA片を用いて^<35>Sまたは^<32>Pでラベルしてから、ハイブリダイゼイションを行い、オートラジオグラフィー法で遺伝子発現を検出した。
細胞運動における細胞形質膜backward bulk flow発生機序の解析

これまでに、我々の同定したArfGAPであるAMAP2/PAG3/Papα/KIAA0400がArf6に対するGAPとして作用すること、そのことにより、形質膜の進展に関わり、AMAP2の強制発現は膜進展を阻害し、細胞運動を阻害することをモデル実験系で示し報告してきた。一方、同ArfGAP分子はin vitroにおいてはArf6以外のArf isoformsに対して効率的なGAP活性を示すことが示されている。今年度は、AMAP2の細胞内でのArf機能に関与するメカニズムを明らかにすると共に、このin vivoとin vitroのGAP活性の見かけ上の不一致の生物学的意義を明らかにする為、解析を行った。まず、RasやRho等の他の低分子量G蛋白質に対するGAP蛋白質とは異なり、AMAP2はそのGAP領域を介してGTP-Arf6に特異的に結合することを見い出した。GDP-Arf6や他のArf isoformには有意な結合性は認められなかった。さらに、AMAP2はamphiphysi-IIやintersectin-Iといったendocytic machineryと強く結合しうることを見い出した。我々の一連の結果は、AMAP2はArf6が介在するendocytosisのmachineryの一つであり、そのprimingcomplex形成に関与することを明らかにした。今回の結果は我々の以前の報告の正しさをさらに確証すると共に、Arf6が介在するendocytosis/exosytosisによるEndosomal Recycling活性が細胞運動制御に深く関わっていることをさらに証拠付けた。(平成14年度)平成15年度においては今一つのpaxillin結合性ArfGAP蛋白質であるAMAP1に関しても解析を進め、このものが乳癌細胞の浸潤に必要である形質膜の基底膜への進展と浸潤において重要な役割を果たしていることを明らかにし、病理学的解析とも合わせ、上皮がん細胞の浸潤転移における役割と、どのようにすれば上皮がん細胞の浸潤転移を阻止することができるのかに関して幾つかの知見を得た。さらに、AMAP1がその機能発揮の対象とする低分子量G蛋白質Arf6の乳癌細胞における役割も解析し,Arf6がその浸潤活性発揮に必須であることを明らかにした。また、Arf6の蛋白質レベルの調節の何らかの破綻が浸潤性獲得に寄与していることを示した。(平成15年度)これまでに、我々の同定したArfGAPであるAMAP2/PAG3/Papα/KIAA0400がArf6に対するGAPとして作用すること、そのことにより、形質膜の進展に関わり、AMAP2の強制発現は膜進展を阻害し、細胞運動を阻害することをモデル実験系で示し報告してきた。(平成15年度)これまでに、我々の同定したArfGAPであるAMAP2/PAG3/Papa/KIAA0400がArf6に対するGAPとして作用すること、そのことにより、形質膜の進展に関わり、AMAP2の強制発現は膜進展を阻害し、細胞運動を阻害することをモデル実験系で示し報告してきた。

GDP-Arf6や他のArf isoformには有意な結合性は認められなかった。さらに、AMAP2はamphiphysi-IIやintersectin-Iといったendocytic machineryと強く結合しうることを見い出した。我々の一連の結果は、AMAP2はArf6が介在するendocytosisのmachineryの一つであり、そのphmingcomplex形成に関与することを明らかにした。今回の結果は我々の以前の報告の正しさをさらに確証すると共に、Arf6が介在するendocytosis/exosytosisによるEndosomal Recycling活性が細胞運動制御に深く関わっていることをさらに証拠付けた。当該年度においては従来研究を進めていたpaxillin結合性ArfGAPの機能解析とその生物学的、医学的意義に関する研究を進め、その内の一つであるAMAP2がamphiphisinIIと結合しそのことにより細胞形質膜の外部への進展過程とその後の内部化(internalization)に関与すること、その際、AMAP2がそのGAP活性の対象としている低分子性G蛋白質Arf6の活性制御がどうようになされるのかに関して幾つかの新しい知見を得た。我々はAMAP2が細胞運動制御に深く関わる分子であることを既に報告しているが、今回の結果は細胞運動における、細胞先導端での形質膜の進展過程がどのように制御されているのか、この制御と細胞表面蛋白質受容体の動態制御とはどのような関係になっているのかの諸端を明らかにしていると考えられる。一方、AMAP2はチロシンリン酸化されるが、上記の観点をさらに明らかにする為、このチロシンリン酸化をもたらす外部からのシグナルの実態の解明とチロシンリン酸化されたAMAP2の運命に関しても重点的に解析を行ってきているが、これに関しては未だ不明な点が多く残されており、解析を続けている。今一つのpaxillin結合性ArfGAP蛋白質であるAMAP1に関しても解析を進め、このものが上皮がん細胞の浸潤に必要である形質膜の基底膜への進展と浸潤において重要な役割を果たしていることを明らかにし、病理学的解析とも合わせ、上皮がん細胞の浸潤転移における役割と、どのようにすれば上皮がん細胞の浸潤転移を阻止することができるのかに関して幾つかの知見を得た。