hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
静止期遺伝子による骨格筋幹細胞維持の分子基盤の解明

その結果、両モデルマウスにおいて、筋幹細胞数の減少が観察され、Hey1-HeyLンディショナル欠損マウスにおいては、ectiopicな筋分化マーカーの発現が観察された。また、Nrf2を筋系譜細胞における、Notch、Hey1-HeyLの下流分子として着目し、Nrf2欠損マウスの解析も行い、実際に筋幹細胞においてもNrf2が抗酸化遺伝子群を制御している事を明らかにした。Hesr1/Hesr3に関しては、コンディショナル欠損マウスの作成及び、解析はおおむね順調にかつ期待していた研究成果が得られている。Hesr1/3の標的として期待した分子、Nrf2のin vitroの解析は期待していた結果であったが、Nrf2欠損マウスの結果は正常マウスと全く違いがなかったため、Hes1/3によるMyoDやmyogeninの直接制御を中心に行う事にし、それを示唆する結果が得られている。カルシトニン受容体に関しても、おおむね順調にすすんでおり、カルシトニンシグナルとニッチとの関係など、予想外の研究成果を得る事ができている。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨格筋生物学Hesr1/Hesr3に関しては、コンディショナル欠損マウスの解析を中心に、Hesr1, Hesr3, Hes1の関連性を明らかにすることで、骨格筋幹細胞の未分化性維持機構の本質に迫る。また、カルシトニン受容体シグナルに関しては、cAMP-PKAを介した静止期維持メカニズムとヒストンメチル化パターンの解析を中心に行う。一方、カルシトニン受容体-cAMP-PKA/Epacを介した骨格筋幹細胞のニッチへ局在と老化に伴う骨格筋館細胞のニッチ外への局在との関連性を明らかにする。申請書において平成25年度ないにおいては、3つの実験を計画していた。一つ目が【研究計画1 Hesr3コンディショナル欠損マウスの作製】である。これに関しては、当初自身で作成を予定していたが、参加した研究会の情報からドイツのGessler博士がHesr1コンディショナル欠損マウスを所有されていることを知り、Gessler博士にコンタクトしたところ、快諾頂けた。ドイツからクリーンナップ等をへて当該施設に搬入することができ、順調にPax7-CreERT2、Hesr3欠損マウスとの交配を始めている。二つ目が【研究計画2筋衛星細胞におけるカルシトニン受容体の役割】である。こちらも予定していた通り、レポーターマウス(Rosa-EYFP: Enhanced Yellow Fluorescent Protein)とPax7CreERT2::Calcr(f/f)を交配し,解析を行うことができた。その結果、カルシトニン受容体コンディショナル欠損マウスでみられる骨格筋館細胞の減少は、Hesr1/3欠損マウスでみられるような、幹細胞の早期分化ではなく、細胞死によるものと考えられた。さらに、EYFPでラベルされた細胞の中には、通常では考えられない基底膜の外の細胞を観察した。この結果は、カルシトニン受容体欠損により、骨格筋館細胞が自身のNicheから逸脱したことを示した。研究計画3【Hesr1/3の標的遺伝子の同定二つ目が】である。こちらも、網羅的な遺伝子発現解析から、Hesr1/3を同時に欠損した場合においてのみ、抗酸化遺伝子群の発現が低下している事を見いだし、さらに、それらの遺伝子群のマスターレギュレーターであるNrf2の発現の減少している事を見いだした。
肺血栓塞栓症による院内突然死の予防に対する法医病理学的アプローチ

肺血栓塞栓症の院内発症予防のため,肺血栓塞栓症の法医解剖62例の塞栓源につき検討した.62例中60例に下肢の深部静脈血栓を確認した.1例は上肢の深部静脈血栓,1例は帝王切開後の骨盤静脈血栓であった.下肢深部静脈血栓の左右差は新鮮血栓では両肢性:片肢性が43:17例,器質化血栓を含めると55例が両肢発症であった.下肢静脈の各部位における血栓の検出率は腸骨静脈4%,大腿静脈20%,膝窩静脈55%,後脛骨静脈62%,腓骨静脈73%,ヒラメ筋静脈93%前脛骨静脈28器,腓腹静脈39%であり,ヒラメ筋静脈の血栓検出率が最も高かった.またヒラメ筋静脈の還流路に沿って血栓検出率が徐々に低下する関係がみられた.症例の血栓分布をヒラメ筋静脈の還流路(ヒラメ筋静脈,後脛骨静脈,腓骨静脈,膝窩静脈)非還流路の下腿静脈(前脛骨静脈,腓腹静脈),中枢部静脈(腸骨静脈,大腿静脈)に分け血栓の連続性を検討したところ,ヒラメ筋の静脈還流路から血栓が発生して中枢部静脈を閉塞したのち,非還流路の下腿静脈に二次性に血栓が発生し,中枢部静脈の血栓が塞栓化する経過が推察された,以上の結果から,肺血栓塞栓症の院内発症予防として,血栓の好発部位であるヒラメ筋静脈の検索および血栓形成予防が重要であるとともに,同部から還流路への血栓の成長を予防し,最終的に致死性塞栓子の供給源となる大腿部の二次血栓の形成を押さえることが重要と結論した.1肺血栓塞栓症(PTE)による突然死の疫学的調査として東京都監察医務院の事例検討を行った.過去10年間の行政解剖における年次別PTE件数を10年前と比較すると,行政解剖数は1995年から2004年で約1.1倍であったが,PTE件数は25件から53件と2.8倍になっており,PTEの増加率が顕著であった.2 19992001年までの東京都監察医務院におけるPTEによる死亡86例につき背景因子を検討した.院外発症83例(93%),精神疾患28例(32%),肥満(BMI25以上)23例(26%),高齢(75以上)9例(9%),悪性腫瘍8例(9%),高脂血症5例(6%),下肢外傷4例(5%),妊娠2例(2%)であった.3慶應義塾大学医学部法医学教室および東京都監察医務院の院内発症PTE15剖検例につき検討した.入院期間は平均15日.(1)背景因子:表在静脈瘤1例,高齢3例,肥満5例,精神疾患8例.(2)増強因子:外傷8例,手術8例,血管造影1例,身体拘束3例,麻酔による鎮静1例.(3)入院後の経過:予防策施行1例.前駆症状あり4例.生前診断4例.(4)剖検所見:PTE:一回型8例,acute on chronic型7例であった.4結果から次の3点が確認された.(1)PTEは法医解剖においても増加している.(2)PTEの行政解剖例の背景因子として院外発症・精神疾患の既往が特徴的である.(3)院内発症例では多くが何らかの背景因子または増強因子を有していた.以上の結果をふまえ,次年度は詳細な病理形態学的検討をすすめ,患者背景と病理組織像を対比させ,PTEによる突然死の更なる病態把握を行う予定である.肺血栓塞栓症の院内発症予防のため,肺血栓塞栓症の法医解剖62例の塞栓源につき検討した.62例中60例に下肢の深部静脈血栓を確認した.1例は上肢の深部静脈血栓,1例は帝王切開後の骨盤静脈血栓であった.下肢深部静脈血栓の左右差は新鮮血栓では両肢性:片肢性が43:17例,器質化血栓を含めると55例が両肢発症であった.下肢静脈の各部位における血栓の検出率は腸骨静脈4%,大腿静脈20%,膝窩静脈55%,後脛骨静脈62%,腓骨静脈73%,ヒラメ筋静脈93%前脛骨静脈28器,腓腹静脈39%であり,ヒラメ筋静脈の血栓検出率が最も高かった.

またヒラメ筋静脈の還流路に沿って血栓検出率が徐々に低下する関係がみられた.症例の血栓分布をヒラメ筋静脈の還流路(ヒラメ筋静脈,後脛骨静脈,腓骨静脈,膝窩静脈)非還流路の下腿静脈(前脛骨静脈,腓腹静脈),中枢部静脈(腸骨静脈,大腿静脈)に分け血栓の連続性を検討したところ,ヒラメ筋の静脈還流路から血栓が発生して中枢部静脈を閉塞したのち,非還流路の下腿静脈に二次性に血栓が発生し,中枢部静脈の血栓が塞栓化する経過が推察された,以上の結果から,肺血栓塞栓症の院内発症予防として,血栓の好発部位であるヒラメ筋静脈の検索および血栓形成予防が重要であるとともに,同部から還流路への血栓の成長を予防し,最終的に致死性塞栓子の供給源となる大腿部の二次血栓の形成を押さえることが重要と結論した.
実験腫瘍における温熱化学療法時の腫瘍内血流制御ならびに抗腫瘍効果に関する研究

平成4年度の本研究では前年度の実験結果から加温処置による腫瘍内血流低下が認められたことから、加温処置と抗癌剤投与の併用に際して、血流低下の影響を可及的に少なくする治療順位を検索した。実験腫瘍はマウスMeth-A腫瘍を用い、CDDPは5mg/kgとし(腹腔内投与)、加温処置は43°C、30分間の一回加温とした。治療順位は加温6時間前および6時間後CDDP投与群、加温3時間前および3時間後CDDP投与群、加温直前および直後CDDP投与群とした。これらの各群における抗腫瘍効果ならびに腫瘍組織内CDDP濃度を検索し、加温処置と化学療法の治療順位が抗腫瘍効果および抗癌剤の腫瘍内到達性にどの様に影響しているかを検索した。その結果、抗腫瘍効果では加温単独処置群に比べ、加温直前および直後群に強い抗腫瘍効果が認められ、特に加温直前投与群において著しい腫瘍増殖抑制が観察された。一方、加温6時間前および6時間後、加温3時間前および3時間後では加温単独処置と同程度の抗腫瘍効果が認められたが、CDDPの併用効果は認められなかった。また、腫瘍組織内CDDP濃度の検索でも加温直前投与群において高い腫瘍組織内濃度が認められた。加温6時間前後および加温3時間前後投与では比較的低いレベルで濃度推移が生じるものの、CDDPの腫瘍組織内濃度は長時間持続することが明らかとなった。以上の検索結果からCDDPを用いた温熱化学療法においては加温処置とCDDP投与時期は近接している時に最も効果的であり、加温直後よりも加温直前投与に高い治療効果が期待できるものと考えられた。これらの結果は第30回日本癌治療学会(1992年9月18日東京)および第1回日中友好医学大会(1992年11月2日北京中華人民共和国)にて発表した。平成3年度の本研究では温熱化学療法における抗癌剤の腫瘍組識内到達性がどのように変化するのか、またこれらの変化に腫瘍内血流がどのように関与しているのかを検索した。実験腫瘍はマウスMeth-Aを用い、抗癌剤シスプラチン(CDDP)5mg/kgを局所加熱(43°C、30分)の直前に腹腔内投与して経時的に腫瘍組識内濃度を原子吸光度法にて測定し、CDDP単独群(非加温群)と比較した。その結果、CDDP+加温群でCDDP単独群よりも腫瘍組識内CDDP濃度が長時間、高濃度で維持されることが明らかとなった。腫瘍発育曲線でもCDDP+加温群で腫瘍増殖抑制が最も強く、病理組識学的観察および抗Brduモノクロ-ナル抗体を用いた免疫組識学的検索でもCDDP+加温群に抗腫瘍効果が最も強く認められた。CDDP+加温群における腫瘍細胞の病理組識学的変化は核濃縮、核崩壊、好酸性変性および空胞変性で、腫瘍内血管の変化は出血、拡張および充血であった。CDDP単独群では特に空胞変性が特徴的であった。また、これらの変化はCDDP+加温群では処置直後から認められるのに対してCDDP単独群では処置36時間後より認められることから、加温処置の併用によりCDDPの抗腫瘍効果が早期に生じると考えられた。抗Brduモノクロ-ナル抗体によるS期標識細胞陽性率でみるとCDDP+加温群において処置直後より72時間後も陽性細胞は低下しており、前述のCDDP腫瘍組識内濃度の高濃度維持を裏付ける結果と考えられた。さらに加温処置後の経時的な腫瘍組識内血流をレ-ザ-ドップラ-組識内血流計に2計測したところ少なくとも加温処置24時間後でも血流の低下が認められ、CDDP+加温群における腫瘍組識内の障害による結果と考えられた。これらの検索結果は第8回日本ハイパ-サ-ミア学会(平成3年10月30日東京)において発表した。また、第6回温熱療法国際シンポジウム(平成4年4月26日5月1日Tucson Arizona USA)にて発表予定である。

以上の検索結果からCDDPを用いた温熱化学療法においては加温処置とCDDP投与時期は近接している時に最も効果的であり、加温直後よりも加温直前投与に高い治療効果が期待できるものと考えられた。これらの結果は第30回日本癌治療学会(1992年9月18日東京)および第1回日中友好医学大会(1992年11月2日北京中華人民共和国)にて発表した。
核移植技術を用いた生殖サイクルのエピジェネティクス変化の解析

体細胞などをドナーとして核移植クローンを行ない、生殖サイクルにおけるエピゲノム変化を解析した。体細胞由来の抑制性メチル化ヒストンH3K9me2およびme3は、体細胞クローンの障害になっていた。また胎盤特異的刷込み遺伝子を制御するH3K27me3は、クローン胎盤で消去されており、それが胎盤の過形成の原因の一つであった。また、アルギニンメチル化であるH3R17me2は、受精時の再プログラムの際に、卵子のヒストンH3.3を精子ゲノムに取り込ませる必須のマーカーであることを明らかにした。以上の通り、生殖サイクルにおけるエピゲノムの重要性、特に新たなヒストンメチル化の役割を明らかにした。本研究では、核移植クローン技術や顕微授精技術など特殊胚を作出する技術を利用して、哺乳類の生殖サイクルにおける重要なエピジェネティクス転換期(受精、着床、生殖細胞分化)の制御機構を明らかにする。25年度は、以下の2つの解析を進めた。1.円形精子細胞を用いた受精における能動的DNA脱メチル化機構:受精直後から精子由来の雄性前核は能動的DNA脱メチル化を受けることが明らかにされている。そこで、円形精子細胞を用いた顕微授精を行い、果たして正常に脱メチル化されるかどうか解析した。対照は同じタイミングで実施した精子を用いた顕微授精胚とした。その結果、受精後早期においてはいずれの顕微授精胚も、メチル化(5mC)とヒドロキシメチル化(5hmC)の比率が雌雄前核で差が見られなかった。しかし6時間以降、精子由来受精卵ではほぼすべての例において雄性前核における5mCの低下と5hmCの上昇が見られたのに対し、円形精子細胞由来では、ほぼ半数の例にとどまった。円形精子細胞を用いた顕微授精の低出産率との関連で興味深い。2.着床後の胎盤形成における正常な層構造の形成機構:マウス体細胞クローン胚では、胎盤の層構造が乱れ、過形成を呈することが知られている。そこで、層構造が乱れる直前の11.5日胎盤におけるmRNAおよびマイクロRNAのマイクロアレイ解析を行った。その結果、正常対照との差次的マイクロRNA発現は、ほとんどが2カ所の刷込み遺伝子領域に絞られることが明らかになった。その下流の遺伝子群と差次的mRNAとの共通遺伝子も絞り込むことができた。昨年度までに、円形精子細胞を用いた顕微授精では、ほぼ半数の例のみで雄性前核ゲノムの脱メチル化が進行することを明らかにした。そこで、DNAメチル化状態を蛍光タンパク質で可視化し、ライブイメージング技術を用いることにより、DNA脱メチル化が正常に進行した胚と異常な胚を区別し、胚移植を行ったところ、異常な胚で効率に発生遅延が生じることを明らかにした。この現象は、精子細胞のヒストンの卵子ヒストンへの置換が遅れていることに原因があった。昨年度までに、2カ所の刷込み遺伝子領域に差次的な遺伝子発現が生じていることを明らかにした。これらの刷込み遺伝子は、体細胞クローンにおいて両アレル発現をしていることが知られているので、その発現を正常化するためにCRISPR/Cas9システムを用いて、片側アレルを欠損させたマウスの体細胞を用いて核移植クローンを実施した。その結果、胎盤重量および組織像の異常の軽減が見られた。今後、複数の遺伝子の関与の可能性も検討し、原因を詰めていく予定である。27年度は、以下の2つの解析を進めた。1.哺乳類の着床前胚のゲノムは、桑実期から胚盤胞期、すなわち着床直前において、きわめて特徴的な低DNAメチル化状態となる。そこで、マウスをモデルに用いて、低メチル化状態にある桑実期胚ー胚盤胞においてレトロトランスポゾンが抑制される機構を解析した。マウス着床前胚においてヒストンシャペロンCAF-1をノックダウンすると、胚が発生停止する。この原因として、LINE-1、SINE-B2、そしてIAPが異所性に発現し、胚にダメージを与えていることを明らかにした。さらに、ヒストンバリアントあるいはヒストン修飾に対する特異抗体を用いたChIP解析により、CAF-1がヒストンバリアントH3.1-H4とともに抑制性ヒストン(H3K9me3およびH4K20me3)を付加し、それがレトロトランスポゾンの発現を抑えていることがわかった。2.胎仔側組織に寄与しうる胚性幹細胞(ES細胞)に対して、胎盤組織に寄与する栄養膜幹細胞(trophoblast stem cell、TS細胞)が胚体外細胞系列から樹立できることが知られている。しかし、ES細胞に比べ、その幹細胞としての均質性が低いことが欠点である。

そこで、TS細胞株を構成するコロニーあるいは細胞タイプを分類し、その特性を明らかにした。その結果、type 1と名付けたドーム型のコロニーが最も未分化であり、そこに含まれる小型の不定形、偽足を有する細胞が幹細胞としての特性を維持していることを明らかにした。また、胚体外組織のマーカーのうち、Cdx2よりもElf5がより未分化性のマーカーとして優れていることがわかった。本研究は、受精、着床、生殖細胞分化という哺乳類のライフサイクルにおける大きなエピジェネティクス転換期における機構を解明しようとするものである。核移植胚や顕微授精胚という特殊な胚を材料として、これまでに、円形精子細胞を用いた顕微授精における能動的脱メチル化の異常に有意なデータを得ることに成功するとともに、正常胚を用いて、能動的脱メチル化に関わるTet3タンパク質を標的部位にリクルートする機構も解明、そして着床前胚におけるヒストンシャペロンの胚発生への役割も明らかにした。また、長年の謎であるクローン胎盤の異常については、1つの遺伝子の発現正常化で、クローン胎盤の層構造の形成が正常に近くなった。さらに、初めてTS細胞の非均質性の特性解析も行った。以上から、おおむね順調に進展していると考えられる。本研究では、核移植クローン技術や顕微授精技術など特殊胚を作出する技術を利用して、哺乳類の生殖サイクルにおける重要なエピジェネティクス転換期(受精、着床、生殖細胞分化)の制御機構を明らかにする。28年度は、以下の解析を進めた。エピジェネティクス異常表現型として過形成を生じるマウス体細胞クローンの胎盤を解析した。これらの胎盤では、胎盤特異的刷込み遺伝子(父方発現)であるSlc39a4、Gab1、Sfmbt2の3遺伝子の刷込みが消去(loss of imprinting; LOI)されていることを明らかにした。これらのLOIは、クローン由来trophoblast stem cellでも確認された。また、Sfmbt2のイントロン内には、マイクロRNA(miRNA)クラスターが存在しており、これらのmiRNAもクローン胎盤で過剰発現していることを確認した。このクラスターを父方欠失した胎盤の解析により、これらのmiRNAも父方発現であること、抗腫瘍あるいはアポトーシス遺伝子を抑制して胎盤の成長を促進していることを明らかにした。そこで、miRNAクラスターの母方のノックアウト体細胞を用いて核移植クローンを行ったところ、重量が正常化胎盤が得られた。さらに、Gab1との母方ダブルノックアウトとすることで、さらに正常化が進んだ。よって、少なくとも本miRNAクラスターとGab1の過剰発現(biallelic expression)が、クローン胎盤過形成の原因の1つであることを明らかにした。一方、28年度中に、Slc38a4ノックアウトマウスの作成にも成功しており、やはり胎盤の発生に影響が出ることを明らかにしている。この遺伝子も胎盤の過形成に関係している可能性が示された。
海洋有機物プールからオリゴ糖鎖を分離・検出する試み

海洋有機物プールの維持機構解明へ向けて、海水中に存在する懸濁および溶存有機物からオリゴ糖鎖を分離・検出することを目的とする。具体的には,タンパク質・ペプチド・脂質、等の分子と共有結合した糖鎖、更に有機物-有機物相互作用による複合体形成に寄与する糖鎖を海洋有機物プールを構成する懸濁および溶存有機物から切り出し、検出する.平成20年7月に東京大学海洋研究所所属淡青丸たよる相模湾・黒潮域を対象海域とした研究航海および平成20年9月に三重大学生物資源学部所属勢水丸による伊勢湾三河湾黒潮流軸四国海盆航海に参加し、これらの航海において、試料を採取した。採取した試料に対し、有機炭素量、同定可能成分(脂質、糖、アミノ酸)の濃度を有機炭素計、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、試料の基礎パラメータを得た。さらに得られた試料について、限外濾過法および電気透析法を用いて、海水中の無機塩類の除去方法について条件検討し、濃縮有機物試料を得たのち、蛍光標識糖鎖電気泳動法を用いて、海水中の溶存有機物に221単糖の糖鎖が含まれることを発見した。これらの糖鎖は、従来海水に酸処理を行うことで検出可能となる単糖類の存在することから、海水には多糖類が存在することが指摘されてはいたが、具体的に糖鎖を構成する単糖の個数までは知られていなかった。海洋の溶存有機物中の多糖類そのものを世界で初めて検出したことは、大きな成果である。海洋有機物の動態について、海洋性腐植様物質の海盆スケールの分布及び^<14>C測定に関して新たな知見が得られた。いずれも世界で初めて研究成果であり、この知見を中心に平成18年度の結果を要約する。海洋溶存有機物の大部分を占める化学的に同定できない化合物群の代表として海洋腐植様物質を選び、その蛍光強度の海盆スケールの分布を明らかにした。分布は表層で低く深度に伴い増加し、所謂栄養塩型を示し、特に見かけの酸素消費量とは最も強い正の相関関係であった。観測の解析結果から、海洋性腐植様物質は有機物の分解に伴い生成すること。表層では光分解すること。海洋内部での生成量は、河川を通して陸域から海洋へ負荷される溶存有機物量や堆積物への有機物の埋没量に匹敵すること。海洋中深層においては、一旦生成すれば、900年の時間スケールで安定的に存在すること。等が明らかになった。沿岸海水中の全脂質について、プロトン核磁気共鳴法及びガスクロマトグラフィー質量分析計等により化学組成を決定し、同一試料の^<14>C年代を決定した。水深5mで得られた全脂質及び溶存有機炭素の^<14>C濃度(^<14>C年代)は、伊勢湾湾奥ではそれぞれ72.32±2.01pMC(2600yr BP)及び93.48±2.03pMC(540yr BP)、相模湾湾口ではそれぞれ41.31±1.64pMC(7100yr BP)及び95.25±2.09pMC(390yr BP)であった。いずれの試料についても全脂質の^<14>C濃度は全有機炭素のそれに比べて低い。この結果は、同一海水中の溶存有機物であっても成分により動態の時間スケールが異なっていることを示唆している。具体的には,タンパク質・ペプチド・脂質、等の分子と共有結合した糖鎖、更に有機物-有機物相互作用による複合体形成に寄与する糖鎖を海洋有機物プールを構成する懸濁および溶存有機物から切り出し、検出する。今年度は,懸濁有機物中の糖鎖の検出を重点的に行った.懸濁態有機物に対して,タンパク質の生成分離法としてもっとも一般的なドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を応用して,糖鎖-タンパク聞の結合の検出を試みた.懸濁態有機物中において糖鎖の多くは,短いペプチド鎖に結合し,分子種としては「プロテオグリカン」として存在する可能性が高いことが示唆される結果を得た.海洋生物に限らず,生物の多くは,タンパク質を中心に多様な糖鎖を保つ糖タンパク質を生産する.このことから,従来,懸濁態有機物を加水分解して糖およびアミノ酸が検出された場合,糖タンパク質が存在すると推察されてきた.しかし,本研究で得られた結果により,懸濁態有機物において,分子内に糖鎖とタンパク(ペプチド)を保つ分子種の多くは,プロテオグリカンである可能性が高いことから,海洋の有機物を中心とした物質循環過程を考える際には,糖鎖の多様性を新たに考慮する必要があることが明らかとなった.海洋有機物プールの維持機構解明へ向けて、海水中に存在する懸濁および溶存有機物からオリゴ糖鎖を分離・検出することを目的とする。

採取した試料に対し、有機炭素量、同定可能成分(脂質、糖、アミノ酸)の濃度を有機炭素計、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、試料の基礎パラメータを得た。さらに得られた試料について、限外濾過法および電気透析法を用いて、海水中の無機塩類の除去方法について条件検討し、濃縮有機物試料を得たのち、蛍光標識糖鎖電気泳動法を用いて、海水中の溶存有機物に221単糖の糖鎖が含まれることを発見した。これらの糖鎖は、従来海水に酸処理を行うことで検出可能となる単糖類の存在することから、海水には多糖類が存在することが指摘されてはいたが、具体的に糖鎖を構成する単糖の個数までは知られていなかった。海洋の溶存有機物中の多糖類そのものを世界で初めて検出したことは、大きな成果である。
造血幹細胞移植時に生じる口腔粘膜障害と口腔細菌叢の関係についての検討

造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation:HSCT)時における口腔粘膜炎(oral mucositis:OM)7の発生率は7585%と報告され、易感染状態にある患者にとって口腔粘膜の破綻に起因する感染症は死に至る危険性がありOMへの対策が重要である。【目的】口腔細菌叢の網羅的解析を行いHSCT時のOMの程度と細菌叢の関係について検討を行う。【対象及び方法】検討対象は東海大学医学部付属病院血液腫瘍内科でHSCTを行った36例(軽度OM18例重度OM18例)1初診時及びHSCT14日前より退院するまで一週間に2回、検体採取およびOMの評価を行った。検体はうがい液とした。OMの評価はOral Assecment Guideスコアを用い、9-11点を「軽度のOM」、12-14点以上を「中等度のOM」、15点以上を「重度のOM」に分類した。2メタゲノム解析を行い軽度OM群と重度OM群の移植直前の口腔細菌叢の比較検討を行った。【結果】男性20例、女性16例、年齢21-69(中央値53)歳、前処置は骨髄破壊的処置17例、非破壊的処置は19例であった。移植ソースとOMの程度には有意差は認めなかったが、前処置においては軽度OM群が非破壊的/破壊的:13例/5例、重度OMでは6例/12例であり重度OM群の方が破壊的処置を施した症例が有意に多かった(P=0.02)。メタゲノム解析では472-747種(中央値620)の細菌が同定された。Veillonella属は重度OM群の移植前の口腔内占める割合が高かった(p<0.05)。【考察】Veillonella属は口腔内では,和見感染などに深く関わっているとの報告がある。移植前に軽度OM群にとどまった口腔細菌菌叢に整えることによりOMの重篤化を予防することが出来る可能性が示唆された。検討症例は予定した症例数に近く、また口腔細菌のメタゲノム解析においても過去の口腔細菌の菌種数の報告と相違なく検出できている。口腔ケア介入による口腔細菌叢の変化についての検討を行う。方法:口腔ケア介入を「口腔清掃群」20症例と「プロバイオティクス投与群」20症例の2群に分け、口腔環境の変化、および口腔細菌叢の変化についてメタゲノム解析を行い検討する。主要評価項目:介入により口腔細菌叢菌叢がどのように変化するかを検討する。副次評価項目:介入による菌叢の変化とOMの程度の関係について検討する。メタゲノム解析を当初は研究支援センターを利用し行う予定であったが、その一部を研究代表者自身で行った。そのため,センター利用費を計上しなかった。次年度は予定通り、研究支援センターを利用する予定である。
マイクロRNAによる上皮間葉転換の制御と放射線感受性の修飾

CRISPR-Cas9システムを利用することにより、HCT116細胞にEMTマーカー遺伝子であるE-カドヘリン(Ecad)およびビメンチン(Vim)の下流にウイルス由来の2A配列を介して、ウミシイタケルシフェラーゼ(hRLuc)遺伝子およびホタルルシフェラーゼ(FLuc)遺伝子の導入に成功した。得られた組換え細胞のゲノム構造は予想通りのものであること、リアルタイムPCR法やイムノブロット法によりそれぞれのルシフェラーゼ遺伝子の発現は、EcadおよびVimの発現に連動していることが示された。現在までに複数の癌細胞株にこのシステムを導入しているが、これらの細胞を使用して、放射線によるEMT誘導の細胞株間の違いについて検討を進めている。これまでのところ、TGF-βに応答してEMTを誘導する癌細胞株は放射線でも応答することが示された。それらの誘導は抗酸化剤であるNACの添加で抑制された。その際、TGFβレセプター1(TGFbR1)阻害剤を添加するとその誘導が抑制された。そこで放射線によるTGF-β1、TGF-β2、TGFbR1、TGFbR2の発現誘導についてリアルタイムPCR法で調べてみたところ、TGF-β1、TGFbR1の発現についての変化はみられなかったが、TGF-β2、TGFbR2については発現が増加する細胞も認められた。また、ヒトのケラチノサイト由来の細胞株HaCaT細胞に同様のSMTモニターシステムを導入し、大気圧プラズマの照射によりEMTが誘導されるかどうかを調べている。現状では、EMTが誘導される傾向は認められるものの、その変化はクリアーなものではなく、今後も検討を続けていく。EMTをモニターする細胞の構築は完成したが、その過程で細胞の種類によりその応答が大きく異なることに気がついた。そこで、複数の癌細胞にこのシステムを導入することで、種々の癌細胞でEMTの誘導を簡便にモニターできるシステムを立ち上げ、当初予定にはなかったが、放射線などの治療刺激によるEMT誘導メカニズムの解析を試みているため予定よりも時間を費やしている。EMTの誘導メカニズムの解析については、すでにいくつもの報告がなされてはいるが、今回立ち上げた新たなシステムを利用することにより、これまでに知られていない新たなメカニズムの発見を期待している。これらの研究は今後の展開に有益だと考えている。今後はEMTとCSCを同時にモニターできる細胞を構築して、EMTの促進によりCSCに変化する細胞と、CSCに変化しない細胞との違いについての解析を行いたいと考えている。それぞれの細胞について、遺伝子発現やタンパクをコードしていないRNA(ncRNA)の発現について網羅的に解析を行い、違いを作り出している遺伝子やncRNAを同定し、そのメカニズムの解析を行いたい。さらに、同定した遺伝子やncRNAを利用した新たな癌治療の戦略を構築していければと考えている。培地にTGF-βを添加することにより多くの癌細胞で上皮間葉転換(EMT)が促進されることを確認することから研究を開始した。さらに、TGF-β添加による長期の培養により癌幹細胞(CSC)関連遺伝子の発現が増強することが示された。また、上皮成長因子(EGF)や線維芽細胞成長因子(FGF)などの成長因子を含むCSC形成培地で癌細胞を培養することでも、CSC関連遺伝子の発現が増強することを確認した。後者の場合、CSC関連遺伝子の発現と並行して、スフェロイド様の細胞塊の形成が観察された。これらの培養法や培養過程の解析データをもとに、現在、EMTの可視化およびCSCの可視化を進めている。EMTに関しては、EMTマーカー遺伝子であるビメンチン遺伝子およびE-カドヘリン遺伝子それぞれの下流に2A配列を介してレポーター遺伝子をCRISPR-Cas9法により導入し、それぞれの変化を追跡することにより簡便で効果的なアッセイシステムの確立を目指している。CSCの可視化は使用細胞であるHCT116をCSC誘導培地で培養した時に発現増強割合が特に大きかったOct4、Lgr5、NANOGの各遺伝子について同様の手法で下流にマーカー遺伝子の導入を目指している。これらのアッセイ系の確立を進める一方で、EMTが活性酸素種に影響を受けることが知られているが、放射線刺激や大気圧プラズマの刺激など細胞内酸化ストレスを引き起こす処理でどのようにEMTの誘導や促進が起こるのかについての解析を始めた。また、治療抵抗性が高いと言われるCSCについて、CSC培地で培養した癌細胞がどの程度の放射線抵抗性や大気圧プラズマ抵抗性を示すかについての解析にも着手した。当初、TGF-βを加えた培養液での培養によるEMTの促進がうまくいかず、かなり長い時間を取られた。結局は、培養細胞数を抑え、培地交換頻度を上げ、さらに培養日数を長く取り(最大で1ヶ月間くらいまで検討)培養を行うことにより検討を続け、現在は比較的安定した結果を得られるようになった。また、CRISPR-Cas9によるゲノム編集でのアッセイ細胞の構築は相同組換え用のベクターの構築でもマーカー遺伝子下流に2A配列を介してインフレームでレポーター遺伝子を導入するため、その設計や構築に予定よりも多くの時間を要したため。

得られた組換え細胞のゲノム構造は予想通りのものであること、リアルタイムPCR法やイムノブロット法によりそれぞれのルシフェラーゼ遺伝子の発現は、EcadおよびVimの発現に連動していることが示された。現在までに複数の癌細胞株にこのシステムを導入しているが、これらの細胞を使用して、放射線によるEMT誘導の細胞株間の違いについて検討を進めている。これまでのところ、TGF-βに応答してEMTを誘導する癌細胞株は放射線でも応答することが示された。それらの誘導は抗酸化剤であるNACの添加で抑制された。その際、TGFβレセプター1(TGFbR1)阻害剤を添加するとその誘導が抑制された。そこで放射線によるTGF-β1、TGF-β2、TGFbR1、TGFbR2の発現誘導についてリアルタイムPCR法で調べてみたところ、TGF-β1、TGFbR1の発現についての変化はみられなかったが、TGF-β2、TGFbR2については発現が増加する細胞も認められた。また、ヒトのケラチノサイト由来の細胞株HaCaT細胞に同様のSMTモニターシステムを導入し、大気圧プラズマの照射によりEMTが誘導されるかどうかを調べている。現状では、EMTが誘導される傾向は認められるものの、その変化はクリアーなものではなく、今後も検討を続けていく。EMTをモニターする細胞の構築は完成したが、その過程で細胞の種類によりその応答が大きく異なることに気がついた。そこで、複数の癌細胞にこのシステムを導入することで、種々の癌細胞でEMTの誘導を簡便にモニターできるシステムを立ち上げ、当初予定にはなかったが、放射線などの治療刺激によるEMT誘導メカニズムの解析を試みているため予定よりも時間を費やしている。EMTの誘導メカニズムの解析については、すでにいくつもの報告がなされてはいるが、今回立ち上げた新たなシステムを利用することにより、これまでに知られていない新たなメカニズムの発見を期待している。これらの研究は今後の展開に有益だと考えている。とりあえずは、アッセイ系の立ち上げに注力したい。現在、EMTとCSCのユニークな可視化を目指しているが、これを確立させることを最重点課題として進めていく。その後、確立したアッセイ系を利用して、EMTからCSCの形成に大きな影響を与えうる遺伝子について、可能であればsiRNAライブラリを利用してその同定を試みる。これらと並行して、放射線や大気圧プラズマなどによる酸化ストレスの刺激が細胞に与える影響についてEMTおよびCSCの形成という観点からどのような影響があるかについて解析を行なう。また、同様に、CSCの放射線に対する感受性の解析についても進めていきたい。最終的には癌細胞の形質転換に重要な働きをするEMTを制御することでCSCの形成、さらには腫瘍全体が示す治療抵抗性を制御したい。さらに、EMTだけではなく、CSCを直接的に標的としてこれまでに知られているCD44v以外の治療抵抗的に機能する遺伝子の同定も試みたい。今後はEMTとCSCを同時にモニターできる細胞を構築して、EMTの促進によりCSCに変化する細胞と、CSCに変化しない細胞との違いについての解析を行いたいと考えている。
イオントフォレシス法による重症虚血肢治療法の開発

プロスタグランディンE_1(以下PGE_1)は閉塞性動脈硬化症、バージャー病などの慢性閉塞性動脈疾患の薬物療法に使用されてきた。しかし、動脈注射は侵襲的であり、経口投与や静脈注射では局所的な薬物濃度が低い一方、全身的副作用の発現頻度が高いといった欠点があった。イオントフォレシス法は、電気泳動の原理を応用し、イオン性薬物を能動的に吸収させる経皮的投与法である。イオントフォレシス法を慢性閉塞性動脈疾患に対するPGE_1の投与に応用した。まず、hairless mouseの皮膚を用いたin vitro実験を施行し、イオントフォレシスによるPGE_1の皮膚透過を確認した。続いて、成人ボランティアの協力を得て、イオントフォレシスによる皮膚障害がないことを確認した。その後、閉塞性動脈硬化症の男性患者19名を対象とした臨床的検討を行った。レーザードプラで皮膚血流を測定し、指標とした。その結果、イオントフォレシス法によるPGE_1投与で対照の生理食塩水と比較し、有意に皮膚血流量が増加した。対象を重症度で分類すると、間欠性跛行肢と重症虚血肢で皮膚血流の増加率は同等であった。イオントフォレシス法を点滴静注法と比較すると、PGE_1による皮膚血流増加率はイオントフォレシス法で有意に高率であった。続いて、虚血性潰瘍患者9例(バージャー病6例、閉塞性動脈硬化症3例)に対し、潰瘍の治療目的でイオントフォレシス法によるPGE_1投与を行った。その結果、4例で潰瘍の改善がみられた。イオントフォレシス法が有効であった症例の皮膚血流増加率は無効例に比べ有意に高率であった。以上より、この方法によって、PGE_1が無侵襲的に虚血肢の患部に直接投与され、患部の皮膚血流が有意に増加していることが証明された。また、下肢の虚血性潰瘍の治療に応用され、効果をみることができた。慢性閉塞性動脈疾患の治療に、プロスタグランディンE_1(以下PGE_1)製剤は広く使われてきた。PGE_1を副作用なく高濃度に局所投与する方法としてイオントフォレシス法を応用することが本研究の目的である。本年度は基礎的検討を行った。(1)PGE_1がイオントフォレシスによって膜を透過することを確認するためin vitro透過実験を行った。拡散セルの2個のチャンバーの間に拡散膜としてヘアレスマウス(7ー8w、28-35g)の皮膚を装着し、Ag電極(+)側チャンバーに生理食塩水をAgCl電極(-)側チャンバーにPGE_1水溶液(100μg/ml)を充填した。電圧6v、通電時間3時間の条件下で、生理食塩水中に透過されたPGE_1濃度を経時的にHPLCで測定した。電圧を負荷しないコントロールではリザーバー側への膜透過は見られなかったが、イオントフォレシスでは能動的なPGE_1の膜透過が確認された。(2)生体への応用としてヘアレスマウスを用い、脱分極型イオントフォレシス(イオントフォレシスADIS-4030:久光製薬)を使用した動物実験を行った。薬物投与のためのリザーバーには、それぞれにAg電極(+)とAgC1電極(-)を装着したパットを作製した。

Ag電極(+)の不織布に生理食塩水0.4mlを、AgC1電極(-)の不織布にPGE_1(20μg/ml)水溶液0.4mlを浸漬しヘアレスマウス(n=5)の腹部に装着した後、1時間通電した。その結果、いずれのマウスにも発赤、熱傷などの皮膚障害が観察されなかった。(3)健康成人5人に対して同様の条件のイオントフォレシスでPGE_1(20μg/ml)水溶液を1時間投与した。いずれも副作用は見られなかった。以上の結果より慢性閉塞性動脈疾患患者に対するPGE_1のイオントフォレシス法による投与の臨床応用が可能と考えられた。慢性閉塞性動脈疾患の治療に、プロスタグランディンE_1(以下PGE_1)製剤は広く使われてきた。PGE_1を副作用なく高濃度に局所投与する方法としてイオントフォレシス法を応用することが本研究の目的である。本年度は昨年度の基礎的検討に引き続いて本法を慢性閉塞性動脈疾患患者に施行する臨床応用の検討を行った。男性閉塞性動脈硬化症患者19名(年齢40-80、平均70歳)に対し、治療の主旨を説明し同意を得た後投与を行った。レーザードプラ血流計による皮膚血流量(laser Doppler flux:LDF)を患部の治療効果の指標とした。患者を15分間臥位にて安静にした後、蒸留水に溶解したPGE_1溶液(20μg/ml)1mlおよび生理食塩水1mlをそれぞれ(-)側と(+)側の不織布に浸漬して足部に装着し、電位差10Vで1時間電流を流した。投与5分前より投与終了時までの足部の皮膚血流量を連続測定した。投与前5分間の流速を平均し投与前値とし、投与最終5分間の平均値を投与後値とした。PGE_1の効果を確認するため、コントロールどして生理食塩水を同様の方法で投与した。19例全例で1時間のイオントフォレーシスによるPGE_1投与が可能であり、不快な刺激や痛みを訴える例はなかった。イオントフォレーシスによるPGE_1投与の結果患者の皮膚血流量は平均32.7±20.2%増加した。この増加はコントロールの生理食塩水投与による増加(平均10.3±15.5%)に比べ有意に高率であった(p<0.001)。以上の結果から、イオントフォレーシスによる投与でPGE_1は虚血肢に有効に供給されることが示された。PGE_1を副作用なく高濃度に局所投与する方法としてイオンフォレシス法を応用することが本研究の目的である。本年度は重症虚血肢の患者の症状に対する効果の検討を行った。Buerger病患者9名と閉塞性動脈硬化症患者8名を対象とした。全例に安静時痛があり、8名には虚血性漬瘍を合併した。従ってFonteine分類ではIII度9名、IV度8名である。治療の主旨を説明し同意を得た後投与を行った。投与前5分間の流速を平均し投与前値とし、投与最終5分前の平均値を投与後値とした。PGE_1の効果を確認するため、コントロールとして生理食塩水を同様の方法で投与した。皮膚血流はcontrolと比較してBuerger病患者で2.1倍、閉塞性動脈硬化症患者で1.7倍にそれぞれ有意に増加した。
ジヒドロフラン－クリップ反応を用いたスーパーファン類の合成に関する研究

ベンゼン環側鎖として鎖状末端1,3-ジケトエステルが16個置換した化合物と末端アルケニルアルキル基が16個置換した化合物を合成し、我々が開発したジヒドロフランークリップ反応を用いて6個の側鎖がそれぞれジヒドロフラン環で繋がれたカゴ型のスーパーファン分子の一段階合成を目指す。平成30年度の研究として、ベンゼン環置換基側鎖に3個の鎖状末端1,3-ジケトエステルを置換した化合物を合成し、モノアルケンとのMn(III)触媒空気酸化反応を調べた。その結果、相当するトリポダンド型末端トリス(ジオキサン)化合物が得られた。続いて、このトリス(ジオキサン)化合物を用いて我々が開発した酸触媒ジオキサン環縮小反応にかけ、相当するトリポダンド型末端トリス(フラン)化合物へと誘導することに成功した。得られたトリス(フラン)化合物は各種分光学的方法および元素分析により構造決定することができた。これらの化合物はUFOキャッチャー型分子としての機能性が期待される。次に、1,3,5位に4-ヒドロキシ-2-オキソブチル基を置換したベンゼン誘導体とアセト酢酸エチルの縮合反応から合成した末端に3-オキソブタノイル基を持つテザー化合物と、1,3,5-トリス(ヒドロキシメチル)ベンゼンと臭化アリル類から合成した末端アルケンが3個置換したテザー化合物を合成した。続いて、合成したこの2種類のトリス(ブタンジオン)とトリス(アルケン)をジヒドロフランークリップ反応にかけた。その結果、ジヒドロフラン環を介した相当するシクロファン型クリプタンドを一段階で合成することに成功した。生成物の構造はNMR、IRおよびMSスペクトルにより決定された。さらに生成物の収率向上を目指して、反応の最適化を行なった。特に、我々が開発した酢酸ーギ酸溶媒系を用いた反応を詳しく調べた。その結果、生成物の収率を向上することができた。我々が開発したジヒドロフランークリップ反応を行うにあたっての原料であるベンゼン環側鎖に鎖状末端1,3-ジケトエステルが置換したテザー化合物および末端アルケニルアルキル基が置換したテザー化合物の合成には多段階を要し、各段階の反応効率を上げるのに苦労している。まずはモノ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、ジヒドロフランークリップ反応を色々な条件で検討し、その有用性を確認した。続いて、ジ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、同様の反応にかけてジヒドロフラン環を介したシクロファン型マクロジオリド類の合成に成功した。さらに、トリ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、ついに1,3,5-トリ置換の[11,11,11]シクロファン型クリプタンドを一段階で合成することに成功した。Mn(III)酸化反応ではギ酸を添加することでジヒドロフラン化反応の効率が向上することを報告しており、その条件を適用することで、平成30年度に[11,11,11]シクロファン型クリプタンドの合成収率を向上するところまで成功した。これは半分のテザー置換基でつながれたカゴ型スーパーファン分子と考えることができ、研究計画に沿って概ね研究は進行していると言える。また、ベンゼンを窒素に変え、鎖状末端1,3-ジケトエステルが3つ置換したテザーアミン化合物および末端アルケニルアルキル基が3つ置換したテザーアミン化合物も合成し、ジヒドロフランークリップ反応を調べた。この反応でも、Mn(III)酸化反応を行なうにあたり酢酸ーギ酸系が有効に働き、ジヒドロフラン環を介した同様のクリプタンド類を一段階で合成することに成功した。現在、テザーの長さをもっと長くしたアミン化合物の合成に取り組んでいる。この原料合成の反応条件を詳しく調べ、最終的には複数のベンゼン環側鎖を持つテザー化合物原料の合成に応用していく予定である。ジヒドロフランークリップ反応は70°C以上で行なうため、基質のベンジル位やアリル位も酸化されやすい。そのため、基質の酸化分解が起こり、生成物収率の低下を招くことがこの反応の欠点である。我々はβ-ケトエステルとアルケンの酸化反応にギ酸を添加すると、反応速度が極端に加速され、ジヒドロフランの収率が向上することを発見した。また、この反応は室温で効率よく進行することもわかった。そこで、70°C以上で起こりやすい基質側鎖の酸化的開裂を防ぎ、生成物の収率改善を図るために、モノ置換やジ置換テザー化合物を用いてギ酸を添加する室温条件におけるジヒドロフランークリップ反応をさらに詳しく調べ、大環状化合物の生成を最適化する。次に、1,3,5-三置換テザー化合物を用いてカゴ状クリプタンド型大環状化合物の合成をさらに詳しく調べ、反応の最適化を行なう。続いて、テザーの長さをさらに長くした化合物をそれぞれ合成し、同様のジヒドロフランークリップ反応を調べる。最終的に1,2,3,4,5,6-六置換化合物を用いてスーパーファン分子の合成に挑戦する。カゴ型大環状化合物の合成はアミン系配位子による金属錯体を利用したイオン反応が主流であるので、この酸化的ラジカル反応によるカゴ型大環状化合物の合成が効率よく行えれば、新たなカゴ型化合物の合成法として利用できる。また、このジヒドロフランークリップ反応で得られるカゴ型大環状化合物にはラジカル反応を制御するためにジヒドロフラン環にフェニル基を置換している。そのため、フェニル基同士の立体反発が予想されるので、どこまでアルキル側鎖を短くできるかにも興味がある。

さらに、この反応で得られるカゴ型化合物は比較的剛直な骨格と予想されるので、有機化合物をゲスト分子として包接させてその包接構造も観察したい。ベンゼン環側鎖として鎖状末端1,3-ジケトエステルが16個置換した化合物と末端アルケニルアルキル基が16個置換した化合物を合成し、我々が開発したジヒドロフランークリップ反応を用いて6個の側鎖がそれぞれジヒドロフラン環で繋がれたカゴ型のスーパーファン分子の一段階合成を目指す。平成30年度の研究として、ベンゼン環置換基側鎖に3個の鎖状末端1,3-ジケトエステルを置換した化合物を合成し、モノアルケンとのMn(III)触媒空気酸化反応を調べた。その結果、相当するトリポダンド型末端トリス(ジオキサン)化合物が得られた。続いて、このトリス(ジオキサン)化合物を用いて我々が開発した酸触媒ジオキサン環縮小反応にかけ、相当するトリポダンド型末端トリス(フラン)化合物へと誘導することに成功した。得られたトリス(フラン)化合物は各種分光学的方法および元素分析により構造決定することができた。これらの化合物はUFOキャッチャー型分子としての機能性が期待される。次に、1,3,5位に4-ヒドロキシ-2-オキソブチル基を置換したベンゼン誘導体とアセト酢酸エチルの縮合反応から合成した末端に3-オキソブタノイル基を持つテザー化合物と、1,3,5-トリス(ヒドロキシメチル)ベンゼンと臭化アリル類から合成した末端アルケンが3個置換したテザー化合物を合成した。続いて、合成したこの2種類のトリス(ブタンジオン)とトリス(アルケン)をジヒドロフランークリップ反応にかけた。その結果、ジヒドロフラン環を介した相当するシクロファン型クリプタンドを一段階で合成することに成功した。生成物の構造はNMR、IRおよびMSスペクトルにより決定された。さらに生成物の収率向上を目指して、反応の最適化を行なった。特に、我々が開発した酢酸ーギ酸溶媒系を用いた反応を詳しく調べた。その結果、生成物の収率を向上することができた。我々が開発したジヒドロフランークリップ反応を行うにあたっての原料であるベンゼン環側鎖に鎖状末端1,3-ジケトエステルが置換したテザー化合物および末端アルケニルアルキル基が置換したテザー化合物の合成には多段階を要し、各段階の反応効率を上げるのに苦労している。まずはモノ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、ジヒドロフランークリップ反応を色々な条件で検討し、その有用性を確認した。続いて、ジ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、同様の反応にかけてジヒドロフラン環を介したシクロファン型マクロジオリド類の合成に成功した。さらに、トリ置換のテザーベンゼン誘導体をそれぞれ合成し、ついに1,3,5-トリ置換の[11,11,11]シクロファン型クリプタンドを一段階で合成することに成功した。Mn(III)酸化反応ではギ酸を添加することでジヒドロフラン化反応の効率が向上することを報告しており、その条件を適用することで、平成30年度に[11,11,11]シクロファン型クリプタンドの合成収率を向上するところまで成功した。これは半分のテザー置換基でつながれたカゴ型スーパーファン分子と考えることができ、研究計画に沿って概ね研究は進行していると言える。
リソースパーソンとしての障害者観の内実とその普遍化可能性に関する研究

障害者を「リソース」としてとらえることを達成していると考えられる(1)職場での共生の障害者観、および(2)地域活動における共生の障害者観を取り上げ、その中でどのような価値観が共有されているのか、また、それを生みだすための要件を明らかにすることを目的とした。研究結果より、職場においては、「その人の能力を見いだす」「見いだした能力を活かすことに喜びを見いだせる環境をつくり、結果として生産性を上げる」「障害のある就労者と支援者が共に働く同僚として日常のコミュニケーションをはかる」ことが重要な要素として共通して語られた。また、これら価値観は組織風土として健常の就労者の働きやすさを生み出すことも共通して指摘された。地域活動においては、防災という住民の共通課題に積極的に参加する中で、分担した役割を担う地域の構成員として認識されうることが明らかになった。そのためには、「障害者自身が参加する話し合う場の設定」「助かる方法の習得」「災害時をシミュレーションし、体験し、さらに想像すること」が重要であり、保健福祉職にはこうしたプログラムを行政等と協力して設定するための役割が期待されることが明らかになった。【研究方法】初年度には、探索的な質的調査として、精神障害者の個々人の能力にあわせた職場づくりをしていることで知られる浦河べてるの家をフィールドとして、下記の面接調査およびグループディスカッションによるデータを収集し、分析した。なお本研究では、研究の協力を得た浦河べてるの家の方針に基づき、施設名を明らかにした。1)浦河べてるの家のメンバー(利用者)14名、スタッフ2名と、自閉症の当事者であり自閉症児・者支援の研究者でもあるスティーブン・ショア氏によるパネルディスカッション2)浦河べてるの家のメンバーの能力を活かした仕事づくりを行っている「MCメディアン」の経営者への面接調査それぞれにおいて、障害を持ちながら就労するための難しさ、工夫やこつについて自由に語ってもらい、会話の内容を質的に分析した。【研究結果】精神障害の当事者により就労の難しさとして語られたのは、仕事の内容そのものに対する苦痛ではなく、「仕事に行く前に体調が悪くなるなどして職場に行くことができない」、「周囲のサポートの有無に関わらずとにかく辛く感じる」といった"自分自身の状態のコントロールの難しさ"についてであった。こうした状態に対する専門家・支援者から出された就労環境の作り方の工夫は、「本人が好きなこと、快適なことを仕事内容に活かす方法を考える」「自分を快適に保つための方策を蓄積する」「一緒に働く人たちとの関係構築を最優先する」という"本人の自己コントロールを可能にする環境づくり"が最も重視されていた。すなわち、労務内容に直結する作業能力の強化ではなく、作業能力を発揮するための本人の状態を含む職場環境づくりが支援を必要とする対象であり、またそれが支援されることで就労が可能となっていることが示された。本研究は先進的な取組を進める障害者支援の専門職がもつ障害者観の特徴、その障害者観の広がりとその背景要因を明らかにすることで、障害者の能力に価値を認めた上で支援する障害者観の普及を可能にする要件を明らかにすることを目的としている。初年度の調査により、障害者本人にとっては「自分自身の状態をコントロールすること」が最大の困難であり、支援者は「本人の自己コントロールを可能にするための環境づくり」を重視して支援していることが探索的に明らかになった。本年度は昨年度の結果を基に、理論的サンプリングを進め、就労継続支援A型作業所(1施設)、公的機関(1機関)、知的障害者を多数雇用している企業(3社)、障害者の就職コンサルティングを行っている企業(1社)の計6事業所の担当者に対して、それぞれの業態によって就労において生じる困難とその対処に関する配慮について面接調査を行った。結果より、要求する能力に水準を設けるかどうかは、A型作業所では全ての障害を受け入れるのに対して、その他の事業所では、一定の能力判断をして受入の可否を検討していたが、一度受け入れた障害者に対する接し方の方針には共通した価値観が語られた。すなわち、表現の形は異なるものの、事業の形態を問わず「障害の有無ではなく、その人の能力を見いだす」「見いだした能力を活かすことに喜びを見いだせる環境をつくり、結果として生産性を上げる」「障害のある就労者と支援者が共に働く同僚として日常のコミュニケーションをはかる」ことが重要な要素として共通して語られた。