hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低酸素環境が軸索内ミトコンドリアに与える影響

また、OGD群では輸送ミトコンドリアが全く見られない軸索も観察された。このことから、結果の考察には細胞死との関係を含める必要が示唆された。輸送ミトコンドリアの数において、低グルコース群と対照群、低酸素群の間には有意な差はみられなかったが、OGD群とも有意な差はみられなかったため、観察数を増やして輸送ミトコンドリアの各郡における変化を観察する必要がある。今後は、更に観察数を増やし、各郡の比較を行い、輸送ミトコンドリアの各郡における違いを明らかにするとともに、軸索内の停留ミトコンドリアのサイズや電子顕微鏡を用いた微細構造の観察ならびに、種々のタイムポイントで細胞死を含めた検討が必要であることが示唆された。研究開始年度に導入予定だった、機材の導入が遅れやタイムラプス顕微鏡の不具合が重なり、ほぼ一年間、研究が滞り、培養実験の開始が遅れた。そのため、解析に必要なデータ数を収集することに遅れが生じ、現在まで培養実験とタイムラプス顕微鏡による観察を行っている。虚血による神経の損傷は、中枢や末梢に関わらず、リハビリテーションの対象となり、そのメカニズムを解明することは重要である。今回、我々は低酸素環境に着目し、神経細胞の中でも軸索内のミトコンドリアに着目し、低酸素環境におけるその動態を観察した。加えて、低グルコースと低酸素・低グルコース(oxygen-glucose deprivation, OGD)による影響による、軸索内ミトコンドリアの動態も観察した。方法は胎仔ラット由来の初代末梢神経培養細胞を用いて、遺伝子工学的技法を用いて、軸索内のミトコンドリアを蛍光標識し、タイムラプス顕微鏡を用いて、軸索内のミトコンドリアの動態を観察した。微細構造の観察は透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた。その結果、24時間の0.5%濃度の低酸素環境では、対照群と比較して軸索内の輸送ミトコンドリアの数に変化はみられなかった。同様に低グルコース環境も軸索内輸送ミトコンドリアの数に違いはみられなかった。一方、OGD環境では、対照群と比較して輸送ミトコンドリアの数が有意に減少していた。TEMによる観察では軸索内ミトコンドリアの膨隆がみられたが、同時にネクローシス像も観察された。以上のことより、0.5%の低酸素環境は軸索内の輸送ミトコンドリアの数には影響を及ば差ないことが明らかとなり、OGD環境は軸索内輸送ミトコンドリアに影響することが推察されたが、ネクローシスの影響もみられたため、暴露時間を短縮するなどして、OGDと軸索内ミトコンドリアの関係をさらに、検証する必要がある。機器の導入は遅れたが、末梢神経節初代培養および、ミトコンドリアを蛍光で標識する方法は完成されている。低酸素チャンバーを用いた実験では、低酸素環境だけでは細胞内のミトコンドリアに大きな影響を与えない可能性が示唆される実験結果を得たため、無糖培地を併用し、更にストレスを加えることで、細胞内のミトコンドリアの影響を観察する予定である。まず、ミトコンドリア動態の解析を行う。また、低酸素環境では、軸索の変性を観察できなかったため、低グルコース培地などを用いて、さらなるストレスが、軸索に与える影響を検討する。低酸素環境だけでは、軸索内の輸送ミトコンドリアの数に影響しないことが明らかになりつつあるので、無糖培地を用いて、新たに低グルコース環境と低酸素・低グルコース(OGD)環境を設定する。現在のところ、24時間のOGD暴露で、輸送ミトコンドリアの数並びに軸索内ミトコンドリアの数に影響する知見を得られている。
シンクロトロン放射光を用いたエネルギー転換型不均一系触媒のオペランド測定

本研究計画は反応中動的に変化する触媒表面の状態や反応メカニズムを理解することを目的として、反応雰囲気中でのオペランド測定を可能にするシンクロトロン放射光を用いた実験に関するものである。取り扱う触媒反応は、主にエネルギー問題解決に直結する人工光合成に係る反応を選択し、その反応中触媒状態を直接測定する。日本側は触媒反応・分光学解析に精通した研究者で構成し、当該測定を海外共同研究者が所属するアメリカ合衆国の放射光施設SLACにて協力して行う。これにより本国際共同研究関係をより強固なものとし、かつ触媒化学の理解とそれに基づいた高活性・高選択性・高寿命を示す新規触媒材料の創製を目指す。
弾性梁の凝着による把持・脱離システムの最適設計と試作

本研究課題は,生物の優れた特徴からヒントを得た凝着モデルによる把持脱離メカニズムの解明とその応用を目的としている.ヤモリなどの生物は,手足の微細毛構造が物体表面に凝着することにより自身の体重を支えるのに十分な把持力を得ている.微細毛構造による凝着現象の理解は,凝着力を利用した把持脱離デバイスの設計の上で非常に有用であるとされる.ヤモリの手足先端に生えるSpatulaと呼ばれるナノサイズの毛はヘラ状であり,毛の側面が凝着していると考えられている.ヤモリのSpatulaをヒントにし,片持ち弾性梁の側面が平面基盤に凝着する梁側面凝着モデルを考案し,理論・実験による検討を行った.表面界面の自由エネルギーと弾性エネルギーの平衡条件より梁側面が凝着している状態で梁に働く力が導出され,着脱時のヒステリシスが凝着力へ及ぼす影響が議論された.更に,弾性梁着脱プロセスの工夫による凝着力制御の可能性を検討するために梁の動きに注目し,検討が行われた.ヤモリは素早い動きの中で把持脱離を繰り返すために複雑な足の動きをしていると考えられるが,動きの中で微細毛に働く摩擦の向きをうまく利用し着脱しているとされる.本研究では,梁構造物に働く摩擦の向きが凝着力へ及ぼす影響を理論的に評価した.摩擦の有無により,梁の変形が影響を受ける.その結果,弾性梁に働く摩擦が圧縮方向の場合に比べ引張方向の場合基盤垂直方向に働く凝着力が増大することが示された.(抄録なし)本研究課題は,生物の優れた特徴からヒントを得た凝着モデルによる把持脱離メカニズムの解明とその応用を目的としている.ヤモリは,手足の微細毛構造が物体表面に凝着することにより自身の体重を支えるのに十分な把持力を得ている.微細毛構造による凝着現象の理解は,凝着力を利用した把持脱離ディバイスの設計の上で非常に有用である.ヤモリの手足先端に生えるSpatulaと呼ばれるナノサイズの毛はヘラ状であり,毛の側面が凝着していると考えられている.ヤモリのSpatulaをヒントにし,片持ち弾性梁の側面が平面基盤に凝着する梁側面凝着モデルを考案した.この凝着モデルを応用した把持・脱離の実現には,着脱メカニズムの解明が必須である.弾性梁側面が凝着するときの押し込み量と力の関係を熱力学的エネルギー平衡条件より解析的に導出した.つまり弾性変形によるひずみエネルギーの変化と凝着による表面・界面自由エネルギーの変化におけるグリフィスの平衡条件から梁側面が凝着している状態で梁に働く力が導出された.このときエネルギーは保存され,エネルギーの散逸はないと仮定した.しかしながら高分子ゲルを用いた実験において,エネルギー散逸の影響とみられるヒステリシスが観測された.凝着仕事(凝着している界面を引き剥がすのに必要とされる単位面積当たりのエネルギー)はある界面において一意に決まるパラメータであるが,実験では押し込み時と引き上げ時において異なる値を示した.これは一般に凝着ヒステリシスと呼ばれる現象であると推測される.凝着ヒステリシスの影響の補正として押し込み時と引き上げ時における凝着仕事の変化を考慮することで,梁側面凝着モデルにおける解析解と実験結果の差を説明できることが明らかにされた.また,凝着ヒステリシスを考慮した場合の凝着力が最大押し込み量と梁の傾きに大きく影響されることが明らかにされた.本研究課題は,生物の優れた特徴からヒントを得た凝着モデルによる把持脱離メカニズムの解明とその応用を目的としている.ヤモリなどの生物は,手足の微細毛構造が物体表面に凝着することにより自身の体重を支えるのに十分な把持力を得ている.微細毛構造による凝着現象の理解は,凝着力を利用した把持脱離デバイスの設計の上で非常に有用であるとされる.ヤモリの手足先端に生えるSpatulaと呼ばれるナノサイズの毛はヘラ状であり,毛の側面が凝着していると考えられている.ヤモリのSpatulaをヒントにし,片持ち弾性梁の側面が平面基盤に凝着する梁側面凝着モデルを考案し,理論・実験による検討を行った.表面界面の自由エネルギーと弾性エネルギーの平衡条件より梁側面が凝着している状態で梁に働く力が導出され,着脱時のヒステリシスが凝着力へ及ぼす影響が議論された.更に,弾性梁着脱プロセスの工夫による凝着力制御の可能性を検討するために梁の動きに注目し,検討が行われた.ヤモリは素早い動きの中で把持脱離を繰り返すために複雑な足の動きをしていると考えられるが,動きの中で微細毛に働く摩擦の向きをうまく利用し着脱しているとされる.本研究では,梁構造物に働く摩擦の向きが凝着力へ及ぼす影響を理論的に評価した.摩擦の有無により,梁の変形が影響を受ける.その結果,弾性梁に働く摩擦が圧縮方向の場合に比べ引張方向の場合基盤垂直方向に働く凝着力が増大することが示された.凝着モデルの考案および凝着メカニズムの解析により凝着力制御の可能性を解析的に議論し,論文等に発表している.凝着力制御の解析的な議論がなされたので,今後実験的に制御の可能性を検討し,把持脱離システムの試作を行う.(抄録なし)
ストレス防御系の破綻としての癌発生に関する研究

内外の様々なストレス刺激はDNAを直接、間接に傷害し、それに対し生体細胞は防御システムを持っている。こうした防御システムの破綻が細胞の悪性変化を引き起こすと考えることができる。私達はストレス刺激で活性化されるGADD蛋白とそれに結合する蛋白の働きの解明をめざしてきた。GADD34のノックアウトマウスでERストレスによる細胞の変化をワイルドタイプマウスと比較検討した。ワイルドタイプマウスMEFをThapsigarginあるいはDTTで刺激するとeIF-2αのリン酸化が見られるが、GADD34の発現に従ってeIF-2αが脱リン酸化された。一方、GADD34欠損MEFではeIF-2αのリン酸化からの回復が遅延した。蛋白合成を、メチオニンのアイソトープラベル実験で検索したところ、ワイルドタイプマウスMEFをThapsigarginあるいはDTTで刺激すると一過性の強い蛋白合成阻害が見られるもののすみやかに回復した。一方、GADD34欠損MEFでは蛋白合成阻害の遷延化が観察された。GADD34と結合するZfp148の機能を遺伝子欠損マウスで調べた。胎児期13.5日の始原生殖細胞は増殖を停止するが、それと同時にZfp148の発現が上昇し、p53のリン酸化がおきることが判明した。Zfp148のheteroノックアウトマウスではp53のリン酸化が著しく低下し、始原生殖細胞は死滅した。始原生殖細胞の増殖停止とZfp148の発現上昇、p53リン酸化が一致して観察されることはzfp148が発現上昇すれば、p53のリン酸化を介して、細胞周期停止へと導かれるといった図式と呼応する。
常磁性プローブを用いた呼吸鎖における電子伝達機構の解析

生体内のエネルギー通貨として生命になくてはならないATPを合成する酸化的リン酸化においては,複数のタンパク質を介した電子伝達機構が重要な役割を担う.その電子伝達の最終段階を担うのがシトクロムc (Cyt c)-シトクロムcオキシダーゼ(CcO)複合体である.本研究ではCyt c-CcOによる電子伝達の分子メカニズムを明らかにするために,常磁性効果や緩和分散法などを活用した最先端のNMR法を主体とした戦略により取組んだ.その結果,酸化・還元状態に依存したCyt cの立体構造変化が明らかになり,酸化・還元状態に依存したCcOとの相互作用の制御のメカニズムの一端が明らかになった.本研究では酸化的リン酸化における電子伝達経路の最終段階を担うシトクロムc (Cyt c)-シトクロムcオキシダーゼ(CcO)複合体の立体構造解析・機能解析に対し,常磁性プローブ法を用いた最先端のNMR法を主体とした戦略により取組む.これまで高分子量膜タンパク質CcOを介したダイナミックで過渡的な相互作用のためにX線結晶解析法・NMR法のいずれの応用も阻まれてきた.本研究では,NMRを用いた立体構造解析,相互作用解析,ダイナミクス解析によるCyt cの解析に加え,常磁性ランタニドプローブ法によって得られる長距離間の定量的立体構造情報に基づいたCytc-CcO複合体の立体構造解析に取り組む.それによって,(i) CytcからCcOへと、2つのタンパク質間でどのように電子が受け渡されるのか?(ii)効率的な電子伝達のために不可欠な、速く正確な分子認識がどのようにして可能になっているのか?(iii)どのようにしてCyt cの酸化還元状態が見分けられ、結合が制御されているのか?などの重要な問題の解明を目指す.本年度は主にヒトCyt cに対するNMR立体構造解析・ダイナミクス解析によって,どのようにしてCyt cの酸化状態・還元状態の差異が見分けられているのか,その詳細なメカニズムの解明に取り組んだ.酸化状態・還元状態のそれぞれのCyt cについて溶液NMR法を用いて立体構造決定し,2状態間の立体構造の差異を明らかにした.さらにNMR緩和分散法によってミリ秒マイクロ秒のタイムスケールでの構造揺らぎを観測した結果,CcOとの相互作用部位の背面に位置する領域が揺らいでいることが明らかになった.本研究では,NMRを用いた立体構造解析,相互作用解析,ダイナミクス解析によるCyt cの解析に加え,常磁性ランタニドプローブ法によって得られる長距離間の定量的立体構造情報に基づいたCytc-CcO複合体の立体構造解析に取り組む.本年度は主にヒトCyt cに対するNMR立体構造解析・ダイナミクス解析を行った.酸化状態および還元状態のCyt cを調整し,NOE情報に基づいて溶液構造を決定した.立体構造を比較したところ,CcOとの結合面において2状態間での主鎖構造の差異があることが明らかになった.この立体構造の差は2状態間の化学シフト差ともよく対応しており,有意な差であると考えられる.酸化状態の化学シフトは,ヘム鉄による常磁性効果によりpseudocontact shift (PCS)などの影響を受けるが,磁化率テンソル解析によって常磁性効果の影響を差し引いたのちに還元状態の化学シフトとの比較を行った.さらにNMR緩和分散法によってミリ秒マイクロ秒のタイムスケールでの構造揺らぎを観測した結果,CcOとの相互作用面は比較的硬い一方で,相互作用面の背面に位置するHis33を中心とした領域から構造揺らぎが観測された.His33を他のアミノ酸に変異させたところ電子伝達活性に顕著な影響を与えたことから,相互作用面から離れたHis33周辺の領域が電子伝達の制御に重要な役割を果たしている可能性が示唆された.上記の研究成果を国際誌に発表した(Imai et al. BBRC 2015).また,Cyt c-CcO複合体の構造解析へ向け,CcOの発現系・精製系を整備した.これまでは生体から精製されたウシCcOを用いてCyt cとの相互作用実験,活性評価などを行っていたが,常磁性ランタニドイオンの固定化のためには変異体を作成する必要がある.これまでにコレラ菌を用いたCcO発現系を確立し,ナノディスク中にCcOを埋め込んだ状態で精製することに成功した.生体内のエネルギー通貨として生命になくてはならないATPを合成する酸化的リン酸化においては,複数のタンパク質を介した電子伝達機構が重要な役割を担う.その電子伝達の最終段階を担うのがシトクロムc (Cyt c)-シトクロムcオキシダーゼ(CcO)複合体である.Cyt c-CcOによる電子伝達は生命活動の根幹をなす重要な機構であるにも関わらず,その詳細な分子メカニズムは明らかにされていない.本研究ではCyt c-CcO複合体の相互作用解析・構造解析に対し,常磁性ランタニドプローブ法や緩和分散法,転移交差緩和法などの最先端のNMR法を主体とした戦略により取組んだ.平成27年度には酸化・還元両状態におけるCyt cに対する立体構造解析・ダイナミクス解析によって酸化還元状態に依存したCyt c-CcO相互作用の制御機構について知見を得たが(Imai et al. 2015 BBRC),平成28度はCcOとの相互作用についてより詳細な情報を得るために,転移交差緩和法や常磁性ランタニドプローブ法を用いた相互作用解析・構造解析に取り組んだ.

転移交差緩和法の適用のためには高度に重水素標識されたCyt cを大量調整する必要があるが,そのための発現条件や精製条件の検討を行った.複合体立体構造解析のためには,Cyt cのみならずCcOについても組み替えタンパク質としての発現系が必要になる.そのためにVibrio cholerae由来のCyt c4とCcOについての発現・精製系の確立を行った.Cyt c4については安定同位体標識されたサンプルを調整し,良好なNMRスペクトルを取得することに成功した.さらに,Cyt c4-CcO複合体立体構造決定のためには常磁性ランタニドイオンを用いた定量的な長距離情報を取得する必要があるが,ESRを用いた距離情報取得のための手法の確立と検証を行った.生体内のエネルギー通貨として生命になくてはならないATPを合成する酸化的リン酸化においては,複数のタンパク質を介した電子伝達機構が重要な役割を担う.その電子伝達の最終段階を担うのがシトクロムc (Cyt c)-シトクロムcオキシダーゼ(CcO)複合体である.本研究ではCyt c-CcOによる電子伝達の分子メカニズムを明らかにするために,常磁性効果や緩和分散法などを活用した最先端のNMR法を主体とした戦略により取組んだ.その結果,酸化・還元状態に依存したCyt cの立体構造変化が明らかになり,酸化・還元状態に依存したCcOとの相互作用の制御のメカニズムの一端が明らかになった.今後は常磁性ランタニドプローブ法を用いたNMR法によるCyt c-CcO複合体の構造決定へ向け研究を進める.これまでは生体から精製したウシCcOを用いてヒトCyt cとの相互作用解析を進めてきたが,今後CcOの変異体の調整を可能にするために遺伝子組み換え体による発現系を整備した.常磁性ランタニドプローブ法の応用のためにはランタニドイオンをタグを用いてCcOに固定するの必要があるが,そのためにはCcO表面にCysをアミノ酸変異により導入し,ジスルフィド結合を介してタグを導入する必要がある.これまでにコレラ菌を用いたCcO発現系を確立し,ナノディスク中にCcOを埋め込んだ状態で精製することに成功し,Cyt cとの電子伝達活性が保持されていることを確認した.さらにコレラCcOへ電子を供与するCyt c4についても発現・精製系を確立し,良好なNMRスペクトルを取得可能であることを確認した.今後はCyt c4についてNMR信号帰属,単体での立体構造決定と進める.信号帰属の後,NMR滴定実験によってCyt c4上のCcOとの相互作用面を決定する.CcOについてはランタニド結合タグを固定するためのCys変異体を設計する.ランタニドイオンを固定したCcOをCyt c4へ滴定し,PCSやRDCなどの常磁性効果をCyt c4から観測する.PCSやRDCなどの異方性常磁性効果から立体構造情報を取得するためには,通常ランタニドイオンを固定したタンパク質(ここではCcO)のNMR信号から常磁性効果を観測し磁化率テンソルを決定する必要があるが,ランタニド結合タグを用いた場合,磁化率テンソルを高精度で予測することが可能である.
パニック障害におけるコレシストキニン誘発試験(SPECTによる脳血流変化)

パニック障害においてコレシストキニン(CCK)が重要な役割を果たしていると考えられている。すなわちコレシストキニン・レセプターのアゴニストであるCCK_4を正常コントロールに投与するとパニック発作を誘発することが判明している。またこの誘発はCCKレセプターのアンタゴニストであるL-365,260およびCI-988で発作が抑制されることがわかっている。我々はリンパ球の膜表面にCCK_Bレセプターの存在を見いだした。この細胞をCCKのアゴニストであるCCK_4で刺激すると細胞内Ca^<2+>が増加した。この細胞内Ca^<2+>増加においてはパニック障害の患者は正常コントロール、精神分裂症、うつ病に比べ有意に増加していることがわかった。すなわちパニック障害においてはCCK_Bレセプターが過感受性を示していることが考えられた。そこで私は予備的な研究としてパニック障害患者のSPECTを調べることにした。しかし、パニック障害の患者は正常コントロールに比べ有意な変化はみられなかった。
PET診断用放射性薬剤の自動合成のためのオンカラム標識法の開発

我々は昨年度、珪藻土の一種であるExtrelutを用いるカラム抽出法が^<11>C-標識合成法のオンカラム標識法へ利用可能であることを示した。今年度は、本方法で合成される^<11>C-標識脂肪酸と^<11>C-標識アミノ酸に関し、PET診断薬として実際に利用可能な合成条件を最適化し、自動合成装置を開発する上での重要で詳細な知見を得た。1.^<11>C-標識脂肪酸の合成。[^<11>C]酢酸の合成に関しては、反応条件を詳しく検討した結果、90%以上の放射化学的収率で安定に合成できる条件を求めることに成功した。また最終注射液へのオンカラム的Mgイオン混入防止法を新たに採用した。一方、[^<11>C]パルミチン酸に関しては、50%の収率で合成可能となった。これらの2種類の^<11>C-標識脂肪酸は、それぞれに適した試薬を選択するだけで、同一の装置で同一のオンカラム操作により合成可能となった。また、反応カラムを洗浄することで繰り返して使用できることを示し、本オンカラム^<11>C-標識脂肪酸合成法がPET診断のルーチンに適する簡便な方法であることを明確に示した。2.^<11>C-標識アミノ酸の合成。[^<11>C]HCNを出発物質として全操作をオンカラム的に行い、癌のイメージング剤として有用とされている[^<11>C]ACPCを合成することに成功した。[^<11>C]HCNと反応基質との反応、反応生成物の反応液からの抽出、抽出物の加水分解液への逆抽出の操作は、前年度での研究で可能なことが明らかになったが、本年度では、より詳細な条件検討による標識反応の最適化とオンカラム的な加水分解法、およびこれに基づく反応生成物の精製法の開発を行った。注射薬剤として使用可能な[^<11>C]ACPCは、本オンカラム標識法により合成時間40分以内に放射化学的収率60%以上で得られた。従来法と比較して、大幅な操作の簡便化が達成され装置の自動化が可能であることを示した。2年度にわたった本研究本では、^<11>C-標識に関して初期の目的を上回る成果をあげることができ、本オンカラム標識法のPET薬剤合成における有用性と実用性を示すことができた。今後は、PET診断用のもう一方の重要な標識薬剤である^<18>F-標識薬剤のオンカラム標識法の開発が重要となっていくと期待される。2年度にわたるPET薬剤のオンライン標識法の開発を目的とする本研究の初年度である今年は、[^<11>C]CO_2と[^<11>C]

HCNを用いる標識法の開発を重点的に行い、当初の目標を達成した。一方、^<18>Fに関しては基礎的な検討を行った。1.オンカラム的抽出を目的に開発されたExtrelut(Merck社製)を用いて、^<11>C-標識酢酸とパルミチン酸のオンカラム合成法を開発した。その合成操作は、1)Extrelutカラムにグリニャール試薬を保持させ-10°C0°Cに冷却する、2)カラムに[^<11>C]CO_2を通す、3)少量の塩酸をカラムに注入して[^<11>C]遊離脂肪酸とする、4)カラムにエーテルを通して生成物だけを抽出する、5)メーロンを保持させた別のExtrelutカラムにエーテル抽出液を通し遊離脂肪酸を逆抽出する、6)生食でカラムから[^<11>C]脂肪酸を溶出させる、から成り、[^<11>C]酢酸を80%以上で、[^<11>C]パルミチン酸を3040%の収率で迅速簡便に得ることに成功した。2.オンカラム標識法のより本格的な応用法として、上記標識法を[^<11>C]HCNからの[^<11>C]アミノ酸の合成へ応用した。その例として[^<11>C]ACPCを合成した。アルデヒドから調製される前駆体をカラムに保持させ、これに[^<11>C]HCNを通して^<11>C-標識アミノニトリルを得た。引続きエーテルを通しこの放射性生成物だけをカラムから抽出し、酸性液を保持した次のExtrelutカラムでエーテル中からオンカラム的に逆抽出することができた。[^<11>C]ACPとするには、この[^<11>C]ニトリル基を加水分解して[^<11>C]カルボニル基とする必要がある。現在この2番目のカラムに保持した状態での効率的なオンカラム加水分解法を検討中である。3.市販の陰イオン交換樹脂数種と文献に基づいて合成した1種の樹脂を、[^<18>F]フッ素イオンのターゲット水からの分離保持能力と、引続くオンカラム拍子法による^<18>FDGの合成収率で比較検討した。次年度の平成6年には、方法的に確立された[^<11>C]HCNを用いる[^<11>C]APCの自動合成装置を開発して、その有用性と実用性を示し、かつ18Fに関しては新しい樹脂の開発に一層の努力を払うこととする。我々は昨年度、珪藻土の一種であるExtrelutを用いるカラム抽出法が^<11>C-標識合成法のオンカラム標識法へ利用可能であることを示した。今年度は、本方法で合成される^<11>C-標識脂肪酸と^<11>C-標識アミノ酸に関し、PET診断薬として実際に利用可能な合成条件を最適化し、自動合成装置を開発する上での重要で詳細な知見を得た。1.^<11>C-標識脂肪酸の合成。[^<11>C]酢酸の合成に関しては、反応条件を詳しく検討した結果、90%以上の放射化学的収率で安定に合成できる条件を求めることに成功した。また最終注射液へのオンカラム的Mgイオン混入防止法を新たに採用した。一方、[^<11>C]パルミチン酸に関しては、50%収率で合成可能となった。これらの2種類の^<11>C-標識脂肪酸は、それぞれに適した試薬を選択するだけで、同一の装置で同一のオンカラム操作により合成可能となった。
クローディンノックアウトマウスとH-1 MRIを用いた脳組織水透過モデルの構築

本研究は、遺伝子操作したマウスとH-1核磁気共鳴画像(MRI)法により脳組織の各部位での血液脳関門・細胞膜の水透過性を測定し、脳組織の水透過モデルを確立することを目的とした。実験動物として、タイトジャンクション蛋白質であるクローディンをノックアウトしたマウスおよび正常マウスを用いた。平成16年度は、クローディン5ノックアウトマウスについて、Gd-DTPA, Polylysine-DTPA-Gd、NMS-60を用い、7T NMR装置により脳毛細血管の水透過性と脳実質細胞の水透過性の定量化を行い、NMRマイクロスコピー国際会議など国際学会で報告を行った。その後、7T NMR装置の超伝導磁石や分光器本体の故障などに予期しないトラブルが続発し、実験が一時的に困難となったが、平成17年度は、自然科学研究機構の動物実験用MRI装置を利用することによりラット脳間質における水・電解質の拡散についてのデータを収集し、脳間質内の拡散と対流の異方性を明らかにすることができた。また、並行して、装置の修理調整、さらにマウス用プローブの作製と調整を行い、ガス麻酔下に4-6時間安定にMRIデータ収集を行えるシステムを構築した。このプローブを用い、in vivoでの拡散係数画像を150umの分解能で測定し、拡散係数画像から拡散の異方性をFractional Anisotropy Imaging、拡散係数の大きさをTrace Imagingとして画像化することができた。本研究課題の約8割の実験データを収集でき、唯一残っているクローディン11ノックアウトマウスのin vivo拡散係数の測定を準備している状況である。本研究は、遺伝子操作したマウスとH-1核磁気共鳴画像(MRI)法により脳組織の各部位での血液脳関門・細胞膜の水透過性を測定し、脳組織の水透過モデルを確立することを目的とする。平成16年4月に研究代表者が所属替えとなり、研究体制が大きく変わってしまった。本年度の最低限のデータを採取するために、7月まで京都府立医大で7T NMR装置を用い、クローディン5ノックアウトマウスについて、Gd-DTPA,Polylysine-DTPA-Gd、NMS-60を用い、脳毛細血管の水透過性と脳実質細胞の水透過性の定量化を行った。その後、7T NMR装置を獨協医科大学に移設した。麻酔機や実体顕微鏡など周辺の実験装置が皆無であった為に、これら周辺の設備を揃えつつNMR装置の調整を行ってきた。残念ながら、超伝導磁石の不調やコンピュータや分光器本体の故障など予想しないトラブルが続発し、装置の調整がなんとかできたのは1月になってからであった。特に水拡散測定用のマイクロイメージングコイルの損傷により、クローディン11ノックアウトマウスの水拡散速度の測定は全く進んでいない(平成17年5月頃修理予定)。しかし、マウス用プローブの作製と調整は順調にすすんでおり、現在、マウスの麻酔管理の詰めを行っているところである。クローディン5ノックアウトマウスについては、学会で発表を行い、学会誌への発表の準備を行っているところである。予想外の事態の連続ではあったが、目的のおよそ2/3は達成できた。

その後、7T NMR装置の超伝導磁石や分光器本体の故障などに予期しないトラブルが続発し、実験が一時的に困難となったが、平成17年度は、自然科学研究機構の動物実験用MRI装置を利用することによりラット脳間質における水・電解質の拡散についてのデータを収集し、脳間質内の拡散と対流の異方性を明らかにすることができた。また、並行して、装置の修理調整、さらにマウス用プローブの作製と調整を行い、ガス麻酔下に4-6時間安定にMRIデータ収集を行えるシステムを構築した。このプローブを用い、in vivoでの拡散係数画像を150umの分解能で測定し、拡散係数画像から拡散の異方性をFractional Anisotropy Imaging、拡散係数の大きさをTrace Imagingとして画像化することができた。本研究課題の約8割の実験データを収集でき、唯一残っているクローディン11ノックアウトマウスのin vivo拡散器数の測定を準備している状況である。
儀礼からみた住まいの空間構造に関する日中比較研究

1)漢族の住まいにおける儀礼と空間構造の分析前年度行った日中の儀礼空間の歴史的変遷と特質の考察をうけて、前半では特に漢族の住まいについて、民俗データと文献史料の分析により、住まいの空間構造を考察した。特に戦前の農村慣行調査や徽州文書などの文献史料の分析から近世中国の住まいに関する民俗学的データを整理し、特質を考察した。2)儀礼からみた日本・中国の住まいの空間構造についての比較分析以上本年度の分析から得られた結果と前年度の結果をもとに、日本における中国の影響及び両国の住まいの空間的な特質についての比較考察を行った。ただし中国の民俗データは、いまだ安定したものではなく、時代層、地域層での差異をどのように位置づけるかが問題点として残った。なお前年度から引き続いて行ったわが国の古代中世貴族住宅の分析から、中国宮殿建築と共通する空間の多重構造についての知見が得られたので、この成果を発表論文「里内裏の裏築地について」(平成10年9月、1998年度日本建築学会大会学術講演梗概集(F-1)、p5556)として発表した。平安時代末期から室町時代までの里内裏6例に確認されるみられる裏築地という施設に着目し、裏築地の造営意図は、大内裏にみられる重郭構造の再現といえるような、隣接敷地からの区画にあったと考えることができるとした。日中の礼制比較の基礎的な作業として、第一に、わが国における儀式の実態把握を行った。具体的には平安時代における内裏・貴族住宅における鎮宅儀礼、奈良・平安時代の天皇即位儀礼の2点について、儀礼の実態と時代的変遷を分析した。鎮宅儀礼の分析からは、天皇の住まいである内裏が、殿舎構成と建築実態で、他の貴族住宅とは異なる存在である点、天皇御在所となった住宅と平安宮との系譜関係が明らかとなった。この成果は発表論文「鎮宅儀礼からみた里内裏の殿舎構成」(日本建築学会計画系論文集504号)に盛り込まれている。また分析を通して中国の宮殿建築との起源的な類似を示す点を把握した。天皇即位儀礼の分析からは、即位式の舗設実態が長岡宮から平安宮に至る間に変化している点、平安時代の儀式書には平安宮より以前の儀式実態が反映されている点が明らかとなった。第二に、安徽省で以前に収集した独自のフィールドデータと文献史料の分析に基づき、漢族の住まいについて儀礼との関係から空間構造を分析し、古代礼制との比較を行った。分析の結果、今日みられる漢族の住まいは、建築的な実態としては地域的な差異が大きいが、方位制や空間秩序の観点からは古代以来の構造を色濃く反映したものである点が明らかとなった。この成果は、比較居住文化研究小フォーラム(5)(日本建築学会)での報告、共著『徽州方言研究』(1998年3月刊行予定)に盛り込まれている。
酸化ストレス防御と寿命に関係する遺伝子の同定

酸素は生命活動に必須であるが、代謝の過程で、反応性の高い活性酸素種(O_2^-、H_2O_2、・OH等)を生成する。そして、それらが生体分子を攻撃し、老化など、種々の生命機能の劣化を引き起こす。活性酸素の消去に関わる遺伝子としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等が知られているが、実際の活性酸素の発生/消去機構は複雑で、詳細は明らかになっていない。そこで、それらに関与する遺伝子を明らかにするために、線虫Caenorhabditis elgansや、酵母Saccha romyces cerevisiaeを用いて、様々な活性酸素感受性変異体を単離し、酸化ストレスと寿命の解析を行った。線虫変異体oxy-4は、高濃度酸素下(60-90%酸素)で生育出来ず、活性酸素放出剤であるパラコートに対しても高い感受性を示す。寿命は野性型よりも短い。この変異体を詳細に解析し、oxy-4遺伝子を3番染色体上の非常に狭い領域にマップした。そこで、その領域に存在するDNAを、マイクロインジェクション法により変異体に導入したところ、1種類のDNAクローンが活性酸素感受性をほぼ完全に相補することを見いだした。しかし、このDNAを断片化し作成したコンストラクトは、十分な相補活性を示さなかった。さらに複数のコンストラクトを作成し実験を行ったが、領域を狭める事は出来なかった。そこで、領域内の遺伝子内にフレームシフト変異を導入し、原因遺伝子の同定を行い、原因遺伝子を同定する事に成功した。酵母に酸化ストレス耐性を付与出来る遺伝子として3種類の酵母遺伝子を単離した。SODやカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の発現を調べたが、発現の上昇は観察されなかったので、本年は、上記抗酸化酵素の遺伝子を欠損させた株を作成し、これら遺伝子が、抗酸化酵素欠損株のバックグラウンドでも酸化ストレス耐性化能を示すか調べた。そこで、それらに関与する遺伝子を明らかにするために、線虫Caenorhabditis elegansや、酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いて、様々な活性酸素感受性変異体を単離し、酸化ストレスと寿命の解析を行う。1.線虫変異体oxy-4は、高濃度酸素下(60-90%酸素)で生育出来ず、寿命は野性型よりも短い。これらの変異体を詳細に解析し、oxy-4遺伝子を、3番染色体上の非常に狭い領域にマップした。そこで、その領域に存在するコスミドDNAを、マイクロインジェクション法により変異体に導入したところ、あるDNAクローンが活性酸素感受性をほぼ完全に相補することを見いだした。そこで、現在、コスミドを制限酵素で切断した後、種々のコンストラクトを作成し、領域を狭めている。2.酵母に酸化ストレス耐性を付与出来る遺伝子として単離した3種類の酵母遺伝子のうち、2種類は転写因子に関係する遺伝子であった。従って、これら遺伝子は、様々なストレス関連遺伝子の発現を変化させることにより、酵母に酸化ストレス耐性をもたらしている可能性が高い。そこで、既知の抗酸化酵素であるSODやカタラーゼ等の発現を調べたが、これらの抗酸化酵素の発現は影響を受けていなかった。現在、これらを欠損させた酵母株を作成し、酸化ストレス耐性に、これらの既知抗酸化酵素が関与しているかどうかを調べている。

SODやカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の発現を調べたが、発現の上昇は観察されなかったので、本年は、上記抗酸化酵素の遺伝子を欠損させた株を作成し、これら遺伝子が、抗酸化酵素欠損株のバックグラウンドでも酸化ストレス耐性化能を示すか調べた。
周期分極反転した酸化亜鉛による励起子共鳴非線形波長変換

酸素プラズマ援用分子線エピタキシ法を用いて周期分極反転(PPI)酸化亜鉛(ZnO)薄膜の作製を行い、紫外からテラヘルツ領域の疑似位相整合(QPM)波長変換素子への応用の可能性を確認した。サファイア(0001)基板上に直接成長したZn0は0極性の(000-1)面となるが、厚さ3nm以上の岩塩構造MgO(111)バッファ層を挟んで成長したZn0はZn極性の(0001)面となる。これを利用して、サファイア上にMgO(111)バッファ層を成長したあと、フォトリソグラフィーを用いて周期的にMgOバッファ層をエッチングし、MgOバッファ層の有無によるストライプ状の周期構造を持つ基板を作製した後、ZnO薄膜を成長することでZnOの1次元PPI構造を得ることが出来た。これまでに紫外からテラヘルツ領域のQPMに対応できる分極反転周期580nmから60μmにわたってPPI構造を作製することに成功している。これらの分極ドメイン構造は2インチc面サファイア基板上に均質に作製された。チタンサファイアレーザー(波長790nm)を基本波とした第二高調波発生(SHG)実験を行った。試料に対して斜めに基本波を入射させ、光の感じる実効的な極性反転周期を変化させた結果、QPM条件の計算値と良く一致する極性反転周期でSHGの増強が確認された。さらに、ZnOの極性反転を引き起こすバッファ層の物質探索を行い、サファイア(0001)基板上の岩塩構造CrN(111)バッファ層上ではZn極性ZnOが成長し、CrNバッファ層を酸化させ得られたコランダム構造Cr203(0001)層上では0極性ZnOが成長することを見いだした。これを利用して、1次元PPI構造を作製したほか、レーザー干渉リソグラフィーを利用して2次元PPI構造も作製できた。この技術により2次元非線形フォトニック結晶の作製が可能になった。酸素プラズマ援用分子線エピタキシ法を用いて周期分極反転酸化亜鉛(ZnO)薄膜の作製および評価を行った。サファイア(0001)基板上に直接成長したZnOはO極性の(000-1)面となるが、厚さ3nm以上のMgO(111)バッファ層を挟んで成長したZnOはZn極性の(0001)面となる。これを利用して、サファイア(0001)基板上にMgO(111)バッファ層を成長したあと、フォトリソグラフィーを用いて周期的にMgOバッファ層をエッチングし、MgOバッファ層の有無による面内周期構造を持つ基板を作製した後、ZnO薄膜を成長することでZnOの周期分極反転構造を得ることが出来た。この方法で非常に周期の揃った周期分極反転ZnO薄膜が得られることを顕微鏡で確認した。これまでに分極反転周期500nmから60μmにわたって作製することに成功している。走査型プローブ顕微鏡により、圧電応答を評価し、ドメイン界面でわずかなアンチフェーズドメインの形成を確認した。また、チタンサファイアレーザーを基本波とした垂直透過による第二高調波発生(SHG)測定を行った。周期分極反転構造をもつZnO薄膜では通常のZnO薄膜と比較してSHGが強く、異方的なSHG増強も観測された。Zn極性ドメインとO極性ドメインでは成膜速度が異なることからグレーティングが形成される。周期500nmの周期分極反転ZnO薄膜からレーザーの回折光が観測され、周期分極反転によりフォトニック結晶が形成されたことを示している。

さらに、ZnOの極性反転を引き起こすバッファ層の物質探索を行い、サファイア(0001)基板上の岩塩構造CrN(111)バッファ層上ではZn極性ZnOが成長し、CrNバッファ層を酸化させ得られたコランダム構造Cr203(0001)層上では0極性ZnOが成長することを見いだした。これを利用して、1次元PPI構造を作製したほか、レーザー干渉リソグラフィーを利用して2次元PPI構造も作製できた。この技術により2次元非線形フォトニック結晶の作製が可能になった。
膵β細胞の前駆細胞の単離と分化メカニズムの解明

本研究では、膵管上皮細胞からβ細胞へ分化する過程を解明しようとした。私は、分化に必要な遺伝子として転写因子Pdx-1に着目した。Pdx-1は膵臓の発生や内分泌細胞の分化に必須の転写因子であり、生後は主にβ細胞に存在するが、肥満のヒトにおいて、また、マウスにおいては生後の成長期や組織再生時には膵管上皮細胞にPdx-1蛋白質が発現することが報告されている。そこで、「このPdx-1の発現がインスリン陽性細胞への分化に必要ではないか」と仮説を立て、膵管上皮細胞特異的にPdx-1を欠損させ、その役割を検討した。結果、ノックアウトマウスでは膵管上皮細胞からインスリン陽性細胞へ分化せず、β細胞数が減少した。これにより、膵管上皮細胞に存在する幹細胞からの供給が生体のホメオスターシスに貢献していることが明らかとなった。周知の通り、糖尿病は生活習慣病とも呼ばれ「予備軍を含めて3人に1人」といわれるほど、日本では深刻な問題となっている。特に重症な糖尿病患者に対して膵島移植を行うこともあるが、膵島の生存能力は低く、移植後の長期成績が悪いことに加え、日本ではドナー不足の問題もある。現在、移植と平行して「再生医学」の研究が進められている。これは、インスリン不足を根本的に解消するために、刺激を与えてβ細胞を増殖させる、あるいは別の細胞からβ細胞に分化させるというものである。そこで、β細胞の前駆細胞を同定しようと世界各国では、β細胞の起源の研究が盛んに行われている。β細胞の起源には色々な学説があるが、これまでの申請者の研究で、膵臓内の膵管上皮からもβ細胞が供給されることを証明している。これは、β細胞の前駆細胞は膵管上皮に存在する可能性が非常に高いことを示唆したものである。そこで本研究では、β細胞産生能力を有した末端の膵管上皮細胞からβ細胞へ分化する機序の解明を試みている。遺伝子改変マウス(トランスジェニックマウス及びノックインマウス)を用いて分化するために必要な環境や遺伝子を同定している。そこで本研究では、遺伝子改変マウス(トランスジェニックマウス及びノックインマウス)を用いてβ細胞産生能力を有した末端の膵管上皮細胞からβ細胞へ分化する機序の解明を試みた。
ホスフィン配位子の塩基性制御に基づく高活性ルテニウム錯体触媒の設計

1.新規2座ホスフィンの合成ービナフチル骨格を有するジホスフィンbinapのP原子の置換としてフェニル基よりも電子吸引性の強い2ーフリル基を持つジホスフィンの合成を試みた。従来のbinapの合成法をそのまま適用しても目的物が得られなかったが、反応試剤の組合せなどを検討した結果、新規ジホスフィン(Frーbinap)の合成に成功した。同様にして、ペンタフルオロフェニル基を持つ新規ジホスフィン(Pfーbinap)も合成した。2.新規ルテニウム錯体の合成ー上で得た新規2座ホスフィンをふくむRu錯体の合成を試みた。Ru1原子当りジホスフィン1分子を含む錯体として、[RuCl(PーP)(cymene)]Cl (PーP=Frーbinap,Pfーbinap)を単離し、NMRで確認した。これら錯体の^<31>PーNMRスペクトルは対応するbinap錯体のスペクトルとはかなり差のある化学シストを示し、電子吸引性置換基の効果が示唆された。3.新規ルテニウム錯体の触媒活性評価ー[RuCl(PーP)(cymene)]Cl (PーP=Frーbinap,Pfーbinap)の触媒活性を対応するbinap錯体の活性と比較するため、イタコン酸の水素化活性を比較した。その結果、35°Cでは新規錯体はほとんど活性を示さず、また60°Cでは水素化活性を示したが、binap錯体との比較では1/2程度であった。すなわち、binapのP原子の置換基の電子吸引性を増加させても、C=C二重結合の水素化活性は期待したようには向上せず、むしろやや低下することが判明した。現在、C=O二重結合の水素化やC=C二重結合の水素移動反応などに対する新規ルテニウム錯体の触媒活性について検討している。
倍数性植物における同祖遺伝子間相互作用の分子機構

具体的内容:倍数性は植物ゲノムの特徴であり、被子植物の約50%が倍数種であるとも言われている。これまでに申請者は、パンコムギの花器官形成ABCDEモデルの構築と、そこに同祖遺伝子がどのように関わるかの解析を行ってきた。そして研究過程における1つの成果として、パンコムギ品種「Chinese Spring(CS)」ではクラスE遺伝子であるWLHS1が、多様な分化を遂げていることを明らかにした(Shitsukawa et al., 2007)。当該年度は、当初の計画通り、異常型WLHS1-Aと正常型WLHS1-AおよびCS由来のWLHS1-Aから挿入未知配列を除去した遺伝子領域をターミネーター上流に連結したコンストラクトを作成することができた。今後、これらのコンストラクトを導入した場合、同祖遺伝子の発現がどのように変化するかを詳細に解析したい。一方で、当初の計画に加え、当該年度では倍数性進化のもたらす様々な生理的な変化の解析を行った。コムギの場合は倍数化に伴って小花数や穀粒(稔実種子)数が増加することが知られ、1小穂あたりの穀粒数は一般的に2倍体コムギ(ヒトツブコムギ)で12粒、4倍性コムギ(フタツブコムギ)で23粒、6倍性コムギ(パンコムギ)では3粒以上が形成される。そこでSEMや分裂組織マーカー遺伝子Wknox1を用いて、異なる倍数性種間での比較解析を進め、倍数性の差異が収量形質に与える影響について考察した。その結果こうした2倍性、4倍性、6倍性コムギの穀粒数の違いは小穂分裂組織の有限性(determinacy)の変化というよりも、小穂分製組織から小花分裂組織が分化する"タイミング"の差異によるものであることを明らかとなり、原著論文として成果をまとめることができた(Shitsukawa et al., 2009)。種子数の増加は、植物の生存戦略機構という面だけでなく、生産性向上にも繋がる農業上重要な現象である。これらの成果は、さらなる応用研究に向けて、倍数性進化がもたらす発生生物学的な変化の一端を解明したものといえる。
スルファチド結合タンパク質、ビトロネクチンの脳および疾患部位における機能

ビトロネクチン(VN)は血液中や組織で種々の生理的プロセスを調節する糖タンパク質である。本研究では、いまだ単離されていない脳VNを、ブタ脳組織中に検索し、構造やリガンド結合性を調べることを目的とした。1脳VNの検索と精製ブタ脳抽出液のイムノブロット分析より、分子量約60と40kDaの抗ブタ血清抗体陽性バンドが検出された。脳抽出液から陰イオン交換-HPLCによって、分子量62kDaの抗体陽性物質を得た。この物質はレクチン反応性からN-結合型糖鎖が少なく、主にO-結合型糖鎖をもつことが示唆され、N-結合型糖鎖を主にもつブタ血清VNとは異なった。ウエスタンブロット後のリガンド結合試験から、HRP-ヘパリンのほかにβ-エンドルフィンにも結合性をもつことが明らかとなった。遺伝子レベルでも、アルツハイマー病患者脳のcDNA発現ライブラリーから、抗ヒト血清VN抗体を用いたプラークハイブリダイゼーション法により脳VNの検索を行ない、抗体反応性をもつペプチドをコードする4つのクローンが得られた。2 VNの酸性糖脂質結合特異性脳VN精製のための基礎として種々の酸性脂質に対する結合性をELISAならびにAFCにより調べた結果、血漿VNがコンホメーション依存的にスルファチドに結合することを見いだした。また硫酸化脂質、リン脂質にはいずれも結合したが、ガングリオシドには結合しなかった。動脈硬化病巣部位などにおけるVN,スルファチドの沈着機構との関連が示唆された。さらにこの過程で糖鎖により、コラーゲンおよびコレステロール3-硫酸に対する結合活性が影響を受けることを見いだし、VNの肝臓疾患部位での局在や組織修復との関連が考えられた。3酸性糖脂結合ドメインの特定VNを構成する各ドメインとドメイン欠失ミュータントをそれぞれGST融合タンパク質として大腸菌に発現させ、ELISA法で種々のリガンドに対する結合ドメインを同定した。その結果、スルファチド結合活性は、ヘモペキシンIIおよびヘモペキシンIに存在した。本研究で明らかになったリガンド結合活性をもとに、脳VNの精製を検討する予定である。ビトロネクチンは血液中や組織で血液凝固、線容、免疫系、細胞の接着や移動など種々の生理的プロセスを調節する糖タンパク質である。本研究はわれわれが見い出したビトロネクチンの酸性脂質結合活性をもとに、いまだ単離されていない脳ビトロネクチンをタンパク質および遺伝子のレベルで検索し精製することを目的として以下の項目を実施した。1ビトロネクチンの硫酸化脂質に対する結合ドメインおよび部位の特定ビトロネクチンを構成する各ドメイン(ソマトメジンB、連結領域、ヘモペキシンI、ヘモペキシンII)ならびに特定のドメインを欠くミュータントをそれぞれGST融合タンパク質として、われわれが確立したヒト血漿ビトロネクチンcDNAの大腸菌での発現条件を用いて発現させ、グルタチオンカラムを通して精製し、硫酸化脂質を固相に吸着したELISA法で結合活性を調べた。その結果、スルファチド(Gal(3-SO_4)β1-1Cer)結合活性は、ヘモペキシンIIおよびヘモペキシンIに存在した。一方コレステロール3-硫酸に対しては、単独ドメインではヘモペキシンIに比べてヘモペキシンIIが非常に高い結合活性を示し、さらにヘモペキシンI、IIドメインの連結による正の協同効果が観測された。しかし分子のN-末側半分(ソマトメジンB、連結領域)には硫酸化脂質結合活性は存在しないことが判明した。これらレコンビナントドメインを用いてβ-エンドルフィン、ヘパリンならびにコラーゲンに対する結合活性もヘモペキシンドメインに存在すること、またこれらのリガンドに対する結合活性のうち、コレステロール3-硫酸とコラーゲンに対する結合は、ビトロネクチン上の糖鎖の存在によって正または負の調節を受けることが明らかになった。2.血漿ビトロネクチンの酸性脂質結合特異性Gal(3-SO_4)β1-1Cer以外にも硫酸化度の高い糖脂質はいずれも結合が観測されたが、ガングリオシドには結合しなかった。またリン脂質の結合はスルファチド結合に比べて尿素処理による変性の影響をあまり受けず、コレステロール3-硫酸への結合は変性の影響を全く受けなかった。

また硫酸化脂質、リン脂質にはいずれも結合したが、ガングリオシドには結合しなかった。動脈硬化病巣部位などにおけるVN,スルファチドの沈着機構との関連が示唆された。さらにこの過程で糖鎖により、コラーゲンおよびコレステロール3-硫酸に対する結合活性が影響を受けることを見いだし、VNの肝臓疾患部位での局在や組織修復との関連が考えられた。3酸性糖脂結合ドメインの特定VNを構成する各ドメインとドメイン欠失ミュータントをそれぞれGST融合タンパク質として大腸菌に発現させ、ELISA法で種々のリガンドに対する結合ドメインを同定した。その結果、スルファチド結合活性は、ヘモペキシンIIおよびヘモペキシンIに存在した。本研究で明らかになったリガンド結合活性をもとに、脳VNの精製を検討する予定である。ビトロネクチン(VN)は血液中や組織で血液凝固、線溶、免疫系、細胞の接着や移動など種々の生理的プロセスを調節する糖タンパク質である。本研究では、いまだ単離されていない脳VNを、ブタ脳組織中に検索し、構造やリガンド結合性を調べることを目的として、以下の項目を実施した。1脳VNの検索と精製ブタ脳抽出液のイムノブロット分析より、分子量約60と40kDaの抗ブタ血清抗体陽性バンドが検出された。興味深いことに脳VNは非変性条件下でヘパリン結合性を示し、血清VNの精製法では精製できなかったので、脳抽出液から陰イオン交換-HPLCによって、分子量62kDaの抗体陽性物質を得た。この物質はレクチン反応性からN-結合型糖鎖が少なく、主にO-結合型糖鎖をもつことが示唆され、N-結合型糖鎖を主にもつブタ血清VNとは異なった。ウエスタンブロット後のリガンド結合試験から、HRP-ヘパリンのほかにβ-エンドルフィンにも結合性をもつことが明らかとなった。遺伝子レベルでも、アルツハイマー病患者脳のcDNA発現ライブラリーから、抗ヒト血清VN抗体を用いたプラークハイブリダイゼーション法により脳VNの検索を行ない、抗体反応性をもつペプチドをコードする4つのクローンが得られた。2 VNの酸性糖質脂質結合特異性種々の酸性脂質に対する結合性をELISAならびにAFCにより調べた結果血漿VNがコンホメーション依存的にスルファチドに結合することを見いだし、動脈硬化などの病巣部位における両者の沈着機構との関連が考えられた。また硫酸化脂質、リン脂質にはいずれも結合が観測されたが、ガングリオシドには結合しなかった。さらに糖鎖の変化によりコラーゲンとコレステロール3-硫酸に対する結合が影響を受けることを見出した。3酸性糖脂質結合ドメインの特定VNを構成する各ドメインならびにドメイン欠失ミュータントをそれぞれGST融合タンパク質として大腸菌に発現させ、ELISA法でリガンド結合ドメインを同定した。脳VN精製にヘモペキシンドメインを利用することが有望と考えられた。