hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブロック共重合体のレオロジー

本年度は、ブロック共重合体や界面活性剤を含む溶液の動的な性質を、主に計算機シミュレーションの手法を用いて、様々な方法・状況で調べることを行なった。具体的な成果としては、以下の3つが挙げられる。(1)ブロック共重合体の転移点近傍の一様相(高温相)に着目し、その構造関数が転移温度からの温度差とずり流れの強さにどのような影響を受けるかをOonoらによって考案されたセルダイナミクスの方法を用いて系統的に調べた。その結果、ずり流れが加わったときの構造関数の減衰率が温度差とずり流れの強さのある組み合わせを変数とする関数としてスケールされることが見い出された。(2)ブロック共重合体の一様相とラメラ相の間の相転移において揺らぎの影響を考慮すると転移の次数が平均場理論から予想される2次から弱い1次に変わるとされている(Brazovskii効果)。我々は一様相とラメラ相の間の界面の進行速度が転移点からのずれにどのように依存するかという点に着目して、Brazovskii効果の計算機シミュレーションによる検証を行なった。その結果、2次転移の場合、界面の進行速度は転移点からの温度差の1/2乗に比例するのに対して、1次転移の場合は1乗に比例することがわかった。(3)ミドル相やスポンジ相のように膜面が複雑に入りくんだ系のレオロジーを現象論的なモデルに基づいて調べることを行った。我々は2秩序変数Ginzburg-Landauモデルのいくつかの特別な場合について、系に様々なずり流れを加えた時のストレスを計算し、そのレオロジー特性や構造変化との関連を明らかにしつつある。一般に弾性的な膜面の存在する系のマクロな力学的性質は、表面張力で支配される界面の系とは異なった振舞いが期待される。
リチウムイオン二次電池のリサイクル・再生利用に関する研究

リチウムイオン二次電池のリサイクル・再生利用に関する研究を行った。電池の解体に関しては、その手間暇からコスト高に繋がり、事業性が低いという結果になったが、性能劣化は活物質の劣化よりも、むしろ電極構造の劣化が主因であることがわかり、電池の解体を伴わないリユース、すなわち用途開発によるマッチングに主眼をおいたリユースが現実的な解である。また、本研究の過程で発見した液晶場をプローブとした炭素材の評価法は、分離という用途だけでなく、新規電池の開発・製造における材料選択の基準を与えるものに成長しうるものである。リチウムイオン二次電池のリサイクル・リユーズに関して、以下を目的として研究を行った。1.劣化電池の活物質コンポジットを剥離・分離し、再度混練し直すことによる電極反応の復活を迅速に評価する微小電極評価系を構築する2社の18650型電池、1社の直方体アルミ缶型電池、3社のアルミラミネートパック型電池の解体評価を行った。いずれの電池においても、負極側は銅集電体に結着しておらず、脆くボロボロと崩れ落ちるものであった。正極に関しては比較的に構造は維持されており、アルミ集電体への結着も良好なものがあったので、これからサンプルを切り出し、そのままで充放電試験を行ったところ、良好な充放電特性を示した。一部の正極サンプルは、充放電試験中に電解液がピンク色になるものがあり、解体前の安全性確保のためにOVまで放電したことにより、LiCoO_2のCo^<3+>が一部Co^<2+>まで還元したためであると考えられる。各社によって正極活物質の組成が異なっているようであり、元素分析およびXRDにより組成と結晶構造の解析を実施中である。2.脆化・剥離した劣化電池コンポジットから活物質、炭素導電助剤、バインダを迅速に分離するプロセスを確立する→平成21年度に実施3.わが国、並びに米国、台湾、中国、フランスにおけるリチウムイオン二次電池のリサイクル実施、リサイクル技術の現状と将来計画に関する調査研究を実施する→平成21年度に実施4.上記結果を元に、各素材まで分離・精製している従来のリサイクル手法ではなく、廃棄電池の部材をできるだけそのままで再利用することによるコストの低減と低環境負荷性に優れたリユーズ志向の新プロセス技術を確立する→平成22年度に実施リチウムイオン二次電池のリサイクル・リユーズに関して、以下を目的として研究を行った。1.劣化電池の安全な分解法の検討アルミニウムラミネートフィルム・パック型電池の分解はカッターナイフで簡単に行えるが、金属ケース型の分解は容易ではない。本年は18650型電池の安全な分解法についてある程度の結論を得た。そのプロセスは、(1)完全放電する(2)負極底部角をグラインダーで切削・解放し、負極タブリード溶接部をカットする(3)上部正極部のかしめ部をグラインダーで切削後、ペンチで開き、正極タブリードを引き出し、溶接部をカット(4)上記でジェリーロール型電池部が引き由せるようになるので引き出し、正極・セパレータ・負極を分離2.脆化・剥離した劣化電池コンポジットから活物質、炭素導電助剤、バインダを迅速に分離するプロセスを確立する炭素材は負極活物質であるグラファイト系やアセチレンブラック系の導電助剤など複数存在する。これを合理的に判断・分離する手法を検討した。炭素表面の官能基の性質によって水に対する分散性が異なることを利用し、容易に分離することが可能であることが分かった。これは表面電荷の違いを利用するもので、分散媒の双極子モーメントがカギとなり、特にグラファイト系では4Debyeを境として分散・非分散が分かれることを見出した。3.わが国、並びに米国、台湾、中国、フランスにおけるリチウムイオン二次電池のリサイクル実施、リサイクル技術の現状と将来計画に関する調査研究を実施する→国内での協力企業を見出した。今後、交渉に入る。4.上記結果を元に、各素材まで分離・精製している従来のリサイクル手法ではなく、廃棄電池の部材をできるだけそのままで再利用することによるコストの低減と低環境負荷性に優れたリユーズ志向の新プロセス技術を確立する→平成22年度に実施リチウムイオン二次電池のリサイクル・リユーズに関して、以下を目的として研究を行った。1.携帯電話用使用済み廃棄電池の収集とデータベース化アンケート調査程度では有意な情報とはならず、使用履歴情報の収集は非常に困難であり、これをデータベース化するまでには至らなった。これを実施するためには、通信履歴をキャリア会社から得る必要があるが、個人情報保護法の点で一般研究のレベルでは無理があった。2.劣化電池の安全な分解法の検討昨年度に確立した電池分解プロセスに対する引き合いがあり、数社に技術指導を行った。また、この分解技術により、電池内部の劣化状況を正しく把握できるため、逆に電池の長寿命化に向けた技術開発に資するものとなり、セミナーでの講演依頼が殺到し、実際に企業との共同研究も立ち上がりつつある。

2.脆化・剥離した劣化電池コンポジットから活物質、炭素導電助剤、バインダを迅速に分離するプロセスを確立する炭素材は負極活物質であるグラファイト系やアセチレンブラック系の導電助剤など複数存在する。これを合理的に判断・分離する手法を検討した。炭素表面の官能基の性質によって水に対する分散性が異なることを利用し、容易に分離することが可能であることが分かった。これは表面電荷の違いを利用するもので、分散媒の双極子モーメントがカギとなり、特にグラファイト系では4Debyeを境として分散・非分散が分かれることを見出した。3.わが国、並びに米国、台湾、中国、フランスにおけるリチウムイオン二次電池のリサイクル実施、リサイクル技術の現状と将来計画に関する調査研究を実施する→国内での協力企業と共同研究を展開するまでに至った。電解液関係ではLi_2CO_3としてのリサイクルが有望ではないかとの分析結果を得ている。4.上記結果を元に、各素材まで分離・精製している従来のリサイクル手法ではなく、廃棄電池の部材をできるだけそのままで再利用することによるコストの低減と低環境負荷性に優れたリユーズ志向の新プロセス技術を確立する→まだ途上であるが、需要とコストとの関係からターゲット物質の形の絞りこみができつつある。
スピン三重項超伝導体と強磁性体の新奇超伝導接合素子

〇本研究の目的は、強磁性体とスピン三重項型超伝導体の接合(F/T接合)素子を開発し、そこで現れるスピン三重項近接効果の研究から、従来の超伝導接合素子では得られなかった新奇な現象の確立を目指すことである。〇これまでの研究で、超伝導体Sr2RuO4をT、強磁性体金属SrRuO3をFとして選択し、ソウル国立大学および理化学研究所・日本女子大との共同研究で接合素子の開発に成功し、京都大学でその特性を詳しく調べて論文発表した。そして引き続き、京都大学において、このSr2RuO4/SrRuO3/Auマイクロデバイスの電子輸送特性から近接効果を調べてきた。〇その結果、超伝導体から常伝導金属に超伝導電子対が浸透する際に起こる、アンドレーエフ反射に伴う、コンダクタンスの上昇を明確にとらえた。つまり、超伝導電子対は強磁性体金属に長距離近接効果として浸透している。また、磁場中での特性から、接合界面に磁気的な不均一性が無い場合でも長距離近接効果が現れることを明らかにした。これらの結果から、初めて単純な構造の接合素子で、スピン三重項電子対の長距離近接効果を実現することに成功した。〇この成果は、中国で開催された強相関電子系国際会議(SCES2016)を含めて、いくつかの会議やセミナーで発表した。さらに、Anwar博士を筆頭著者として、2016年10月にNature Communications誌に発表した。また、これまでの共同研究実績のあるオランダのライデン大学でも、この成果と今後の共同研究について相談した。〇このような超伝導素子において、強磁性体の磁化の方向制御によって、長距離近接効果が制御できるようになれば、「スーパースピントロニクス(Superspintronics)」と呼ぶべき新しい分野開拓に貢献できる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究「スピン三重項超伝導体と強磁性体の新奇超伝導接合素子」の目的は、スピン三重項超伝導体と強磁性金属の接合系を開発して、その近接効果を研究し、従来の超伝導接合素子では得られなかった新奇な現象の確立を目指すことである。従来の超伝導体と特殊な複合磁性層構造を組み合わせた素子ではなく、超伝導体としてスピン三重項超伝導体Sr2RuO4を用いることで、単一の強磁性体SrRuO3中に直接的にスピン三重項対を浸み込ませるという、全く新しい発想に基づく単純な構造の接合素子での強磁性・超伝導近接効果を明らかにする研究を進めている。H26年11月に開始して以来、12月には投稿中の論文を出版した。この論文では、スピン三重項超伝導体Sr2RuO4単結晶表面に、強磁性金属SrRuO3の薄膜がエピタキシャル成長することを初めて報告し、二層系界面の電気導電性が高いことと、強磁性モーメントがバルクのSrRuO3より大きくなる可能性などを明らかにした。この二層系の製膜技術は確立でき、様々な厚みのSrRuO3薄膜について信頼できるデータが出始めている。この系で面内圧縮されたSrRuO3の薄膜の磁性や電子状態の変化について、京都大学での磁化測定に加え、共同研究でのソウル国立大での光学伝導度実験、マックスプランク固体研究所(シュトゥットガルト)によるスピン偏極中性子線を用いた強磁性モーメントの空間分布検出などの研究を進めている。それと同時に、理研との共同研究による二層系に対する微細加工接合素子で、超伝導近接効果の研究を着々と進めることができた。本研究「スピン三重項超伝導体と強磁性体の新奇超伝導接合素子」の目的は、スピン三重項超伝導体単結晶と強磁性金属薄膜の二層系で、スピン三重項超伝導近接効果の新奇現象を確立することである。従来型超伝導体と特殊な複合磁性層構造の組み合わせではなく、スピン三重項超伝導体Sr2RuO4を用いて、単一の強磁性体SrRuO3中にスピン三重項電子対を浸み込ませる新発想に基づいている。超伝導電流に加えて超伝導スピン流も制御する「超伝導スピントロニクス」とも呼べる新分野・概念を創る先駆けにもなると期待できる。本年度は、Sr2RuO4単結晶/SrRuO3薄膜の二層系では、強磁性磁化が異常ともいえる値まで増大していることを実験的に確立した。基板の常磁性体としてSr2RuO4だけでなく、SrTiO3など多くの酸化物の単結晶基板上にSrRuO3薄膜を育成し、それらの強磁性転移温度や磁気モーメントを測定して定量的に相互比較した。そしてSr2RuO4/SrRuO3の組み合わせで磁化が異常に大きくなるという実験事実を確証できた。磁化増大の起源解明を目指して、マックスプランク固体研究所との共同研究によるスピン偏極中性子線を用いた磁化・磁化分布測定、ソウル国立大学でのXMCD磁化分布測定、スイスのポール・シェラー研究所(PSI)での超低エネルギーミュオンを用いた超伝導近接効果測定などを駆使した研究を進めた。次に上の二層系を用いた超伝導接合素子の作製に成功し、電流・電圧特性に現れるアンドレーエフ反射から、スピン三重項超伝導電子対がSr2RuO4単結晶からSrRuO3強磁性薄膜に近接効果で侵入していることを明らかにし、その特性侵入長も求めて、成果を論文投稿した。現在査読審査中である。

超伝導接合素子の作製に成功し、スピン三重項超伝導電子対のSrRuO3強磁性薄膜への侵入を明らかにし、その特性侵入長も求めて、成果を論文投稿したことは当初計画以上の進捗といえる。しかしその一方で、強磁性磁化の増大のメカニズムについては、いくつかもの有力な手法で研究を進めてはいるものの、まだ解釈につながる有力な実験事実は得られていない。〇本研究の目的は、強磁性体とスピン三重項型超伝導体の接合(F/T接合)素子を開発し、そこで現れるスピン三重項近接効果の研究から、従来の超伝導接合素子では得られなかった新奇な現象の確立を目指すことである。〇これまでの研究で、超伝導体Sr2RuO4をT、強磁性体金属SrRuO3をFとして選択し、ソウル国立大学および理化学研究所・日本女子大との共同研究で接合素子の開発に成功し、京都大学でその特性を詳しく調べて論文発表した。そして引き続き、京都大学において、このSr2RuO4/SrRuO3/Auマイクロデバイスの電子輸送特性から近接効果を調べてきた。〇その結果、超伝導体から常伝導金属に超伝導電子対が浸透する際に起こる、アンドレーエフ反射に伴う、コンダクタンスの上昇を明確にとらえた。つまり、超伝導電子対は強磁性体金属に長距離近接効果として浸透している。また、磁場中での特性から、接合界面に磁気的な不均一性が無い場合でも長距離近接効果が現れることを明らかにした。これらの結果から、初めて単純な構造の接合素子で、スピン三重項電子対の長距離近接効果を実現することに成功した。〇この成果は、中国で開催された強相関電子系国際会議(SCES2016)を含めて、いくつかの会議やセミナーで発表した。さらに、Anwar博士を筆頭著者として、2016年10月にNature Communications誌に発表した。また、これまでの共同研究実績のあるオランダのライデン大学でも、この成果と今後の共同研究について相談した。〇このような超伝導素子において、強磁性体の磁化の方向制御によって、長距離近接効果が制御できるようになれば、「スーパースピントロニクス(Superspintronics)」と呼ぶべき新しい分野開拓に貢献できる。計画していた製膜技術の確立・接合素子化などが、計画通り順調に進捗したことに加え、超伝導近接効果のデータ収集が予想以上に進んだ。特に、SrRuO3薄膜の磁気モーメントが異常に大きいことを確認し、また、強磁性体中に強い超伝導近接効果が起こっていることを強く示唆するデータが得られたことは既に大きな成果といえる。これらの成果については、ドイツ及び韓国での国際会議、また日本物理学会で発表した。国際共同研究についても、Anwarがスイス(ミュオン実験)、ドイツ(スピン偏極中性子回折)、オランダ(超伝導近接効果)などの共同研究者の研究現場を訪問し、前野がソウル国立大(製膜、界面原子像観察、光電子分光等)を訪問して、実験及び理論について議論を進め、理解を深めるための素地作りができた。H28年度には、最終年度に当たり、二層系の異常な磁化に関する成果をまとめた論文を投稿・発表する。超伝導素子では、Sr2RuO4/SrRuO3/SiO2/Au/の配列で、スピン三重項超伝導侵入に伴う状態密度の変化を測定する。以上の成果をとりまとめて論文投稿・発表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。H27年度は以下の項目について更なる研究推進を図る。(1)ルテニウム酸化物の強磁性金属/超伝導体二層系素子について、高純度の超伝導Sr2RuO4の単結晶育成を継続し、様々な膜厚の強磁性薄膜SrRuO3との二層系試料を数多く成長させる。
地球内核境界の不均質構造の解明

日本およびフランスの短周期地震計綱の記録を用いてコアフェ-ズPKP波のアレイ解析を行なった。北海道ー東北大学の26観測点で記録されたアルゼンチン深発地震とフランスLDGの28観測点で記録されたフィジ-深発地震を解析した。さらにGDSN(グロ-バルディジタル観測綱)とNARS(ヨ-ロッパに配置された線状地震計アレイ)の記録も観測された現象がグロ-バルなものかどうか確かめる目的で調査した。解析結果をまとめると以下のようになる。1.PKPーC点(震央距離155度)以遠で回折波(低周波)に続いて高周波数の波が日本およびフランスの観測綱のデ-タから検出された。この波は1)卓越周波数が2ー3Hz,2)PKPーABの近くまで振動が続く,3)スロ-ネスがPKPーABのそれに近いといった特徴がある。2.1.で観測された波の初動到着時刻はPKPーBCの観測点側上部マントル底部からの散乱波の初動走時(最短時間)で説明できることが明らかになった。従って内核境界付近に複雑な不均質構造を仮定してこの波を説明する(森田(1987),梅津・浜口(1989)の説)必要はなくなった。3.日本・フランスの高密度アレイを用いて,PKPーC点の位置を正確に決定することができた。C点の位置は155.5度に決まった。この値から外核最下部のP波速度の値は10.27±0.01km/sと決定された。従来の値(例えばPREM)より約0.1km/s低く,外核のP波速度は内核境界近傍で圧力による単純な勾配より少し緩やかになる。
エボラウイルスのレセプター分子探索

1、エボラウイルスの膜糖タンパク質を発現するVero細胞の樹立エボラウイルスはその病原性の高さからBSL-4に分類されており、実際のウイルスを用いた基礎研究に困難がつきまとう。本ウイルスの侵入過程の研究に用いるため、またワクチン開発への応用を目的にGPを発現するVero細胞の樹立を試みた。GPは細胞毒性を持つため、発現量を抑えて細胞へ導入する必要がある。レトロウイルスベクターはその条件を満たすと考え、本実験に用いた。その結果エボラウイルスのGPを発現するVero細胞の作製に成功した。またこの細胞はウイルスの増殖に必須であるG遺伝子を欠くウイルスの増殖を補完したことから、エボラウイルスにおいても同様の結果が期待された。エボラウイルスのGPを発現するVero細胞を樹立したのは本研究が初めてであり、本ウイルスの侵入過程に関する基礎研究やワクチン開発への応用が可能である。2、マールブルグウイルスのマトリックスタンパク質によるウイルス様粒子形成に重要なアミノ酸配列の同定。マトリックスタンパク質(VP40)を細胞へ発現させると、ひも状のウイルス様粒子(VLP)が培養上清中に放出される。VP40のN末端側にはVLP形成に重要であると考えられているLドメインが存在するが、Lドメインを欠損したVP40変異体はVLPを形成することができる。そこでLドメイン以外にVLP形成に重要なアミノ酸配列の同定を本研究の目的とした。欠損変異体、アラニン置換変異体を用いた解析により、VP40によるVLPの形成には39位のイソロイシン、40位のスレオニン、297位のアスパラギンが重要であることが示唆された。これらのアミノ酸はウイルスの出芽に働く宿主因子との相互作用に関与する可能性が考えられた。本研究においては、未解明であるエボラウイルスのレセプター分子をヒトの臓器由来cDNAライブラリから同定することを目的とした。1,エボラウイルスの細胞への侵入時にレセプターを認識すると考えられているウイルス膜表面糖タンパク質GPを、レトロウイルス粒子の表面に持つシュードタイプウイルスを作製した。ウイルスの感染の指標(レポーター遺伝子)として、ネコのCD2分子または緑色蛍光タンパク質を導入した。2,エボラウイルス低感受性であるJurkat細胞(T細胞)へ、レトロウイルスベクターを用いてヒト臓器由来cDNAライブラリを導入した。平成18年度に用いたライブラリは脾臓、胎盤脳由来である。3,ライブラリを導入したJurkat細胞へ上述したシュードタイプウイルスを接種し、エボラウイルスのGPを介した感染に対する感受性のあがった細胞を、パニング法によりクローニングした。多くのクローンが得られたので、別のレポーター遺伝子を持つシュードタイプウイルスを接種し、感染が起こったクローンを分離した。4,得られたクローンからcDNAを抽出し配列を決定後、相同性検索をおこなった。脾臓由来cDNAライブラリからはヒトCD151分子、脳からはRhomboid domain-containing protein 2がクローニングされた。胎盤からはクローンは得られなかった。5,CD151分子、Rhomboid domain-containing protein 2を各々レトロウイルスベクターに組込み、Jurkat細胞へ導入した。導入した細胞ヘシュードタイプウイルスを接種し、エボラウイルスのGPを介した感染が増強されるかどうかを確認した。しかし、どちらの分子も感染を増強しなかった。【エボラウイルスの膜糖タンパク質によるウイルス様粒子の出芽促進作用】エボラウイルスの侵入に関わる膜糖タンパク質GPは、マトリックスタンパタ質であるVP40によるウイルス様粒子の出芽を促進する作用があることがわかっている。そこでGPの欠損変異体を作製し、出芽促進作用に重要なGPの領域を絞り込んだ。現在は絞り込まれた領域においてアミノ酸置換によるスキャニングをおこなっている。【マールブルグウイルスのマトリックスタンパク質による粒子形成に重要な領域】エボラウイルスと同じフィロウイルス科に属するマールブルグウイルスは、マトリックスタンパク質であるVP40を細胞に導入するだけで、ウイルス様粒子の形成が見られる。粒子の形成にはVP40のN末端に存在するLドメインと呼ばれるアミノ酸配列が重要であることがわかっているが、Lドメインを欠損したVP40は低い効率ではあるが粒子を形成することが知られている。そこでVP40において、Lドメイン以外にウイルス様粒子の形成に重要な領域を同定することを目的として実験をおこなった。欠損変異体、アミノ酸置換によるスキャニングにより、VP40による粒子形成に重要な領域が決定された。【ボルナ病ウイルスのレセプター結合領域】エボラウイルスの同じモノネガウイルス目に属するボルナ病ウイルスは、膜糖タンパク質であるGPを介して細胞へ侵入することが知られている。GPは細胞内プロテアーゼであるブリンなどによって開裂するが、N末端側のGP1が特に細胞内への侵入に重要であると考えられている。そこでFLAGタグをGP1に融合し細胞への結合をフローサイトメトリーにより解析した。GP1はボルナ病ウイルス感受性であるVero細胞には結合し、非感受性であるCH0細胞へは結合しなかった。さらにGP1の欠損変異体を作製しVero細胞への結合に重要な領域を決定した。GPを外皮に持つレトロウイルスをベースとしたシュードタイプウイルスを用いて、決定した領域の変異がウイルスの侵入にもたらす影響を現在実験しているところである。

GPは細胞毒性を持つため、発現量を抑えて細胞へ導入する必要がある。レトロウイルスベクターはその条件を満たすと考え、本実験に用いた。その結果エボラウイルスのGPを発現するVero細胞の作製に成功した。またこの細胞はウイルスの増殖に必須であるG遺伝子を欠くウイルスの増殖を補完したことから、エボラウイルスにおいても同様の結果が期待された。エボラウイルスのGPを発現するVero細胞を樹立したのは本研究が初めてであり、本ウイルスの侵入過程に関する基礎研究やワクチン開発への応用が可能である。2、マールブルグウイルスのマトリックスタンパク質によるウイルス様粒子形成に重要なアミノ酸配列の同定。マトリックスタンパク質(VP40)を細胞へ発現させると、ひも状のウイルス様粒子(VLP)が培養上清中に放出される。VP40のN末端側にはVLP形成に重要であると考えられているLドメインが存在するが、Lドメインを欠損したVP40変異体はVLPを形成することができる。そこでLドメイン以外にVLP形成に重要なアミノ酸配列の同定を本研究の目的とした。欠損変異体、アラニン置換変異体を用いた解析により、VP40によるVLPの形成には39位のイソロイシン、40位のスレオニン、297位のアスパラギンが重要であることが示唆された。これらのアミノ酸はウイルスの出芽に働く宿主因子との相互作用に関与する可能性が考えられた。
自律的な分子分離に向けた微小管運動の電気的制御による分子設計論の確立

平成28年度は,当初の目的通り,高精度な微小管分離システムを実証した.まず,これまで提案してきた微小管の特性制御技術を応用し,キネシン上を運動する微小管を複数方向に輸送する技術を確立した.微小管の重合条件の調整,および微小管へのDNAの修飾により,曲げ剛性と電気泳動移動度を改変した複数の微小管を作製した.それぞれの一様電界中における運動方向を定量的に評価した後,その結果を基に分離に最適なマイクロ流体デバイスを設計した.微細加工技術を用いて作製したマイクロ流体デバイス内で,特性の異なる2種類の微小管を運動させた結果,一様なアッセイ環境下においても微小管を約80%の精度で分離できることを初めて実証した.以上の成果は,キネシンと微小管の系を用いた高次機能を有する分子システムの構築につながるものであり,マイクロナノシステムに関する国際会議MicroTASにおいて口頭発表で採択された.さらに,CBMSによる旅費助成を受けるなど,世界的に認められつつある.また,平成28年度においては,生物物理学的な方面にも研究を発展させ,微小管の曲げ剛性に関する新たな知見を得た.従来の曲げ剛性の測定値には2桁程度のばらつきがあるなど,曲げ剛性に関する統一された見解はなかった.画像解析における微小管の位置決定精度,および微小管の伸長速度を変えて曲げ剛性を測定し,これまで考慮されてこなかったこれらの条件が曲げ剛性を決定する重要な要因であることを明らかにした.さらに,曲げ剛性の正確な測定手法を確立することで,微小管の伸長速度がある閾値を超えると,曲げ剛性が急速に低下するという新たな知見を得た.以上の成果は,曲げ剛性の関わる細胞内輸送の制御機構の解明につながるものであり,生物物理学に関する国際会議Biophysical Societyに採択され,分野を跨いで注目されている.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内物質輸送の役割を担っているキネシンと微小管の系を生体外で再現し,微小管を分子シャトルとして用いる分子分離・濃縮手法の基礎を確立した.微小管は負に帯電しており,キネシン上を動く微小管に対して電界を印加すると,元々ランダムだった微小管の運動方向が電界に沿うようになる.本研究では微小管の電荷と固さを設計し,これらの特性に応じて微小管の運動軌跡を制御した.まず,長さの異なる二種類のDNAを使って,微小管の電荷を改変した.これは,DNAは長くなるにつれ大きい負電荷を持つためである.長いDNAのついた微小管,短いDNAのついた微小管,DNAのついていない微小管の三種類について電荷を計測したところ,DNAがついている方が,またDNAが長い方が,微小管の負電荷が有意に大きかった.これら三種類の微小管を一様電界中で運動させたところ,負電荷が大きくなるにつれ軌跡の曲率半径が有意に小さくなることがわかった.次に,重合条件を変えることで固さの異なる二種類の微小管を作製した.これらの微小管を一様電界中で運動させたところ,軟らかい微小管の方が固い微小管に比べて軌跡の曲率半径が有意に小さかった.得られた曲率半径から予測される軌跡を基に,微小管分離部を持ったマイクロ流路を作製し,この中で二種類の微小管を運動させたところ,微小管はその固さに応じて分離された.また,その分離効率は約75%以上と,高い値を示した.以上の技術を組み合わせることで,微小管につけたターゲット分子を精度良くかつ効率よく,自律的に分離させることが可能になる.さらに,マイクロ流路に微小管捕捉部を設ければ,チップ上で分子の分離と濃縮を同時におこなうことができると考えられる.これは,分子の検出精度の向上に直結するものであるため,本研究はキネシンと微小管の系を用いた実用的な診断アプリケーションの実現に向けて非常に重要なものであると言える.平成27年度は,課題として挙げた微小管の曲げ剛性制御技術を確立した.まず,バッファ溶液中での微小管の熱揺らぎから曲げ剛性を測定する手法を,マサチューセッツ大学のJ. L. Ross准教授のもとで三ヶ月学んで習得し,自らの系に合うよう調整した.次に,重合中のタウタンパク質の有無,ヌクレオチドの種類,そしてチューブリン濃度を変えた六種類の微小管を準備し,それぞれの曲げ剛性を測定した.結果として,タウタンパク質は曲げ剛性に影響を与えないこと,ヌクレオチドとチューブリン濃度は有意に影響を与えることを明らかとした.これにより,曲げ剛性の異なる四種類の微小管を作製することに成功した.平成26年度におこなった実験で,曲げ剛性の差に応じて二種類の微小管が一様電界中で異なる軌跡を取り,マイクロ流路内で約75%の精度で分離できることを既に示した.

したがって,今回の微小管曲げ剛性制御技術は,曲げ剛性に応じた四種類の微小管の同時分離を可能にするものであると言える.あるいは二種類の分離に限定する場合,最も固い微小管と軟らかい微小管の組み合わせを選ぶことで,さらなる分離精度の向上が期待できる.これらは,既に確立されている微小管への分子修飾技術と組み合わせることで,本研究の目的である複数分子の自律的な分離につながるものである.また同時に,微小管の曲げ剛性変化は生物物理学の分野においても強い関心が持たれており,今回の結果は生物物理学者約7000人が集まる最大規模の学会,Biophysical Society 60th Annual Meetingに採択された.以上のことから,平成27年度はナノテクノロジー及び生物物理学双方の分野にとって重要な知見を得たと言える.マサチューセッツ大学への三ヶ月の留学や,計測系を一から構築した影響もあり,当初目的としていたマイクロ流路内での微小管分離まで実証することはできなかった.しかし,平成26年度の結果と合わせれば,平成27年度に得られた微小管の曲げ剛性に関する緻密なデータの積み重ねは,提案する系を用いた高効率な微小管分離の実現可能性を充分に示すものである.現状,課題の進捗状況はやや遅れてはいるが,要素技術の確立はできているため,平成28年度に充分取り戻せると考えている.平成28年度は,当初の目的通り,高精度な微小管分離システムを実証した.まず,これまで提案してきた微小管の特性制御技術を応用し,キネシン上を運動する微小管を複数方向に輸送する技術を確立した.微小管の重合条件の調整,および微小管へのDNAの修飾により,曲げ剛性と電気泳動移動度を改変した複数の微小管を作製した.それぞれの一様電界中における運動方向を定量的に評価した後,その結果を基に分離に最適なマイクロ流体デバイスを設計した.微細加工技術を用いて作製したマイクロ流体デバイス内で,特性の異なる2種類の微小管を運動させた結果,一様なアッセイ環境下においても微小管を約80%の精度で分離できることを初めて実証した.以上の成果は,キネシンと微小管の系を用いた高次機能を有する分子システムの構築につながるものであり,マイクロナノシステムに関する国際会議MicroTASにおいて口頭発表で採択された.さらに,CBMSによる旅費助成を受けるなど,世界的に認められつつある.また,平成28年度においては,生物物理学的な方面にも研究を発展させ,微小管の曲げ剛性に関する新たな知見を得た.従来の曲げ剛性の測定値には2桁程度のばらつきがあるなど,曲げ剛性に関する統一された見解はなかった.画像解析における微小管の位置決定精度,および微小管の伸長速度を変えて曲げ剛性を測定し,これまで考慮されてこなかったこれらの条件が曲げ剛性を決定する重要な要因であることを明らかにした.さらに,曲げ剛性の正確な測定手法を確立することで,微小管の伸長速度がある閾値を超えると,曲げ剛性が急速に低下するという新たな知見を得た.以上の成果は,曲げ剛性の関わる細胞内輸送の制御機構の解明につながるものであり,生物物理学に関する国際会議Biophysical Societyに採択され,分野を跨いで注目されている.当初から計画していた微小管の電荷改変による運動方向制御は予定通り遂行でき,実験結果も概ね当初期待していた通りであった.また,測定した微小管の電荷から軌跡を予測することも可能となり,これは後述のマイクロ流路構造の最適化に向けて重要な成果となった.さらに,当初の予定に加えて微小管の曲げ剛性を改変する実験にも着手し,こちらも期待していた通り,曲げ剛性に応じて微小管の軌跡が変化した.予測される微小管の軌跡を基に,構造を最適化したマイクロ流路内での分離実験もおこない,ある程度高い分離効率が示された.これらの成果は英文ジャーナルや国際学会で発表済みであり,ある程度の評価を得ている.以上のことから,当初の計画以上に進展していると言える.マイクロ流路内での微小管および分子の分離システムを実証する.微小管の曲げ剛性のみならず電荷も同時に改変することで,さらに微小管の運動軌跡制御能を向上させ,高精度な複数分子同時分離システムを構築する.また次の展開として,平成27年度に構築した曲げ剛性測定系を用い,外部からの衝撃に対する微小管の曲げ剛性変化を評価することを考えている.
心不全と心房細動におけるミトコンドリアATP感受性K^+チャネルのリモデリング

心不全や心房細動ではイオンチャネルのリモデリングが起こる。このリモデリングがミトコンドリアATP感受性K^+(mitoK_<ATP>)チャネルにも起こるか否かをBio 14.6心不全ハムスターを用いて検討した。コラゲナーゼ処理により単離したBio 14.6ハムスター心室筋細胞のフラボプロテイン自家蛍光を蛍光顕微鏡にて測定し(励起波長480nm,測光波長520nm),mitoK_<ATP>チャネル活性化の指標とした。Bio 14.6ハムスター心室筋細胞にmitoK_<ATP>チャネル開口薬であるジアゾキシド(100μM)を添加すると,フラボプロテイン自家蛍光は,約15分間の無反応期間(latency)のあと酸化反応による増強が認められた。一方,対照群として用いたF1βハムスターの心室筋細胞では,ジアゾキシドを添加すると,数分間のlatencyのあとフラボプロテイン酸化反応が生じた。Latencyは,Bio 14.6では15.1±0.7分,F1βでは8.0±1.2分であり,心不全心筋細胞で有意に延長していた。しかしながら,フラボプロテイン酸化反応はBio 14.6では最大蛍光の48.1±5.7%,F1βでは45.1±5.6%までそれぞれ増加し,両者に差はなかった。この結果から,mitoK_<ATP>チャネルの密度は心不全心筋細胞では減少していないと推察される。つぎに,フラボプロテイン酸化反応におけるlatencyの延長が,protein kinase C (PKC)の活性化が低下しているために起こったのではないかと考え,Bio 14.6ハムスター心室筋細胞にブラジキニン(1μM)を作用させてPKCを活性化した状態でジアゾキシドを添加した。するとlatencyが8.4±0.7分へと有意に短縮し,フラボプロテイン酸化反応も63.7±3.6%へと有意に増加した。したがって,Bio 14.6ハムスター心室筋細胞では,PKCによる細胞内情報伝達系に異常があり,PKCを介するmitoK_<ATP>チャネルの調節機構に変調を来たしていることが示唆された。心不全にともなうミトコンドリアATP感受性K^+(mitoK_<ATP>)チャネルのリモデリングをBio14.6心不全ハムスターを用いて検討した。Bio14.6ハムスターの心室筋細胞をコラゲナーゼ処理により単離し実験に供した。MitoK_<ATP>チャネル活性化の指標として,フラボプロテイン自家蛍光を蛍光顕微鏡にて測定した(励起波長480nm,測光波長520nm)。Bio14.6ハムスター心室筋細胞にmitoK_<ATP>チャネル開口薬であるジアゾキシド(100μM)を添加すると,フラボプロテイン自家蛍光は,約15分間の無反応期間(latency)があり,その後酸化反応による増強が認められた。一方,対照群として用いたF1βハムスターの心室筋細胞では,ジアゾキシドを添加すると,数分間のlatencyの後フラボプロテイン酸化反応が生じた。Latencyは,Bio14.6では15.1±0.7分,F1βでは8.0±1.2分であり,心不全心筋で有意に延長していた。しかしながら,フラボプロテイン酸化反応はBio14.6では最大蛍光の45.1±5.6%,F1βでは48.1±5.7%までそれぞれ増加し,両者に差はなかった。フラボプロテイン酸化反応におけるlatencyは,protein kinase C(PKC)の活性化により短縮することが知られている。

そこで,ブラジキニン(1μM)によりPKCを活性化した状態でBio14.6ハムスター心室筋細胞にジアゾキシドを添加すると,latencyが8.4±0.7分著明に短縮し,フラボプロテイン酸化反応も63.7±3.6%へと有意に増加した。以上の結果より,Bio14.6心不全ハムスターの心室筋細胞では,mitoK_<ATP>チャネル密度の変化はないが,PKCを介するmitoK_<ATP>チャネルの調節機構に変調を来たしていることが示唆された。心不全や心房細動ではイオンチャネルのリモデリングが起こる。このリモデリングがミトコンドリアATP感受性K^+(mitoK_<ATP>)チャネルにも起こるか否かをBio14.6心不全ハムスターを用いて検討した。コラゲナーゼ処理により単離したBio14.6ハムスター心室筋細胞のフラボプロテイン自家蛍光を蛍光顕微鏡にて測定し(励起波長480nm,測光波長520nm),mitoK_<ATP>チャネル活性化の指標とした。Bio14.6ハムスター心室筋細胞にmitoK_<ATP>チャネル開口薬であるジアゾキシド(100μM)を添加すると,フラボプロテイン自家蛍光は,約15分間の無反応期間(latency)のあと酸化反応による増強が認められた。一方,対照群として用いたF1βハムスターの心室筋細胞では,ジアゾキシドを添加すると,数分間のlatencyのあとフラボプロテイン酸化反応が生じた。Latencyは,Bio14.6では15.1±0.7分,F1βでは8.0±1.2分であり,心不全心筋細胞で有意に延長していた。しかしながら,フラボプロテイン酸化反応はBio14.6では最大蛍光の48.1±5.7%,F1βでは45.1±5.6%までそれぞれ増加し,両者に差はなかった。この結果から,mitoK_<ATP>チャネルの密度は心不全心筋細胞では減少していないと推察される。つぎに,フラボプロテイン酸化反応におけるlatencyの延長が,protein kinase C(PKC)の活性化が低下しているために起こったのではないかと考え,Bio14.6ハムスター心室筋細胞にブラジキニン(1μM)を作用させてPKCを活性化した状態でジアゾキシドを添加した。するとlatencyが8.4±0.7分へと有意に短縮し,フラボプロテイン酸化反応も63.7±3.6%へと有意に増加した。したがって,Bio14.6ハムスター心室筋細胞では,PKCによる細胞内情報伝達系に異常があり,PKCを介するmitoK_<ATP>チャネルの調節機構に変調を来たしていることが示唆された。
サリドマイド併用によるヒト前立腺癌ＰＣ３細胞のドセタキセル感受性の増強

【研究目的】去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の標準治療としてドセタキセル(DTX)が使用されるが、徐々に耐性を示し予後不良となる。当院では、DTX耐性CRPCに対し、DTXにサリドマイド(Tha)を併用することで再び前立腺特異抗原の低下を認めた症例を経験している。既に我々はヒト前立腺癌PC3細胞(PC3)を用いた曝露実験において、Tha単剤では抗腫瘍効果がほとんど認められないにも関らず、Tha/DTX併用においてはDTX単剤と比較して抗腫瘍効果が増強することを報告している。また、併用による抗腫瘍効果の増強と抗癌剤の細胞外排出機構ならびに耐性化に関与するとされている多剤耐性遺伝子1(MDR1)との関連性は低いことを報告している。本研究では、抗癌剤による癌細胞の細胞死に関連している内因性アポトーシスに及ぼすサリドマイドの影響を検討する目的にて、PC3ならびにDTX耐性PC3(DR-PC3)を用いた研究を行った。【研究方法】DR-PC3はPC3をDTX50nMで4ヶ月以上培養することで確立した。Cell viabilityの測定はWST-8を用いて行った。アポトーシスの解析はAnnexin V-FITC/PI染色後、FACS Calibur flowcytometerにより行った。目的とするタンパク質の発現はイムノブロットで確認した。アポトーシス抑制タンパク質であるBcl-2、Bcl-xLとの関連性は、これらに対するsiRNAのトランスフェクションによりタンパク質の発現を選択的に抑制した状態で確認した。【研究成果】DR-PC3に対するDTXのIC_<50>(Half maximal inhibitory concentration)は800nMでありPC3におけるIC_<50>6.25nMと比較して約100倍の抵抗性を示した。PC3においてsiRNAのトランスフェクションによりBcl-xLの発現を抑制した結果、DTXによるcell viabilityの有意な低下ならびにアポトーシスの著明な増加を認めた。これらの結果、Bcl-xLがPC3のDTX感受性の増強に関与していることが示唆された。現在、ThaがBcl-xLの阻害に影響を及ぼしている可能性について、PC3ならびにDR-PC3を用いて検討を行っている。これらの検討により、DTX耐性CRPCのDTX感受性を回復するための薬剤としてのThaの有用性が明らかとなる。
光学活性配位子を有する遷移金属錯体による生体関連物質の認識

実用性の高い、アミンおよびアミノ酸の鏡像体選択的呈色試薬の開発を目的に、遷移金属イオンと発色団を含む光学活性遷移金属錯体を設計し、大環状光学活性配位子の合成に取りかかった。2,9-ジメチル-1,10-フェナントロリン(1)を出発物質とし、塩素化、エステル化、還元、塩素化、シアノ化を経て、2,9-ビスシアノメチル-1,10-フェナントロリン(2)を得た。今後、2を加水分解し塩素化して得られる酸塩化物を光学活性ジアミンと縮合させ、得られたアミドを還元することにより、光学活性大環状配位子を合成しようと考えている。
ハイテク汚染物質による薬物代謝酵素系の変動に関する研究

テトラクロロエチレンは,各種産業用に使用され,その廃棄や漏出のため非常に微量ではあるが,かなり広範囲の地下水や大気から検出されている.また,PCEは肝臓のシトクロムP450(P450)によって代謝されることがすでに明らかにされており,その毒性発現にはP450を含む薬物代謝酵素が何らかの形で関わっていることが考えられる.本研究では,テトラクロロエチレンの毒性機構を解明するための一環として,ラット肝薬物代謝酵素に及ぼすテトラクロロエチレンの影響についてin vivoおよびin vitro系で検討した.7-ペントキシレゾルフィンおよび7-ベンジルオキシレゾルフィンの脱アルキル化酵素活性はテトラクロロエチレン投与により用量依存的に増加し,最も増加した2000mg/kg投与群におけるそれらは対照群のそれぞれ4.6および6.1倍であった.また,抗CYP2B1/2抗体を用いてイムノブロッティングを行ったところ,対照群では認められなかった2本の強いバンドが1000および2000mg/kgのテトラクロロエチレン投与群で認識された.一方,薬物代謝第二相反応酵素であるUDP-グルクロン酸転移酵素,グルタチオンS-転移酵素およびDT-ジアホラーゼ活性も高用量のテトラクロロエチレンで有意に増加し,それらの誘導率は1.43.9倍であった.このようにラットにおいてテトラクロロエチレンは薬物代謝の第一相および第二相反応酵素の両方を誘導し,特にCYP2BサブファミリーのP450を強く誘導する化合物であることが示唆された.フェノバルビタール処理ラット肝ミクロゾームの7-ペントキシレゾルフィンおよび7-ベンジルオキシレゾルフィンの脱アルキル化酵素活性は2.0mMのテトラクロロエチレン添加によりそれぞれ80および81%阻害された.また,Eadie-Hofsteeプロットからこれらの阻害はいずれも非競合的阻害であることが示され,阻害定数はそれぞれ0.16および0.29mMであった.さらに,テトラクロロエチレンはフェノバルビタール処理ミクロゾームの7-エトキシクマリン0-デエチラーゼ活性もわずかに阻害し,その阻害パターンは競合的阻害であった.しかし,フェノバルビタール処理ラット肝ミクロゾームの他のP450依存性酵素については,テトラクロロエチレンによる著しい変化は認められなかった.一方,7-エトキシレゾルフィン0-デエチラーゼ,アニリン4-ヒドロキシラーゼおよびテストステロン6β-ヒドロキシラーゼ活性は,β-ナフトフラボン,イソニアジドおよびプレグネノロン16α-カルボニトリル処理によりそれぞれ誘導されたが,テトラクロロエチレンによる活性阻害は認められなかった.以上の結果より,テトラクロロエチレンはフェノバルビタール誘導性のP450依存性酵素を非競合的あるいは競合的に阻害し,CYP2B1/2がテトラクロロエチレンの代謝および毒性に関与していることが推察された.テトラクロロエチレンは,各種産業用に使用され,その廃棄や漏出のため非常に微量ではあるが,かなり広範囲の地下水や大気から検出されている.また,PCEは肝臓のシトクロムP450(P450)によって代謝されることがすでに明らかにされており,その毒性発現にはP450を含む薬物代謝酵素が何らかの形で関わっていることが考えられる.本研究では,テトラクロロエチレンの毒性機構を解明するための一環として,ラット肝薬物代謝酵素に及ぼすテトラクロロエチレンの影響についてin vivoおよびin vitro系で検討した.7-ペントキシレゾルフィンおよび7-ベンジルオキシレゾルフィンの脱アルキル化酵素活性はテトラクロロエチレン投与により用量依存的に増加し,最も増加した2000mg/kg投与群におけるそれらは対照群のそれぞれ4.6および6.1倍であった.また,抗CYP2B1/2抗体を用いてイムノブロッティングを行ったところ,対照群では認められなかった2本の強いバンドが1000および2000mg/kgのテトラクロロエチレン投与群で認識された.一方,薬物代謝第二相反応酵素であるUDP-グルクロン酸転移酵素,グルタチオンS-転移酵素およびDT-ジアホラーゼ活性も高用量のテトラクロロエチレンで有意に増加し,それらの誘導率は1.43.9倍であった.このようにラットにおいてテトラクロロエチレンは薬物代謝の第一相および第二相反応酵素の両方を誘導し,特にCYP2BサブファミリーのP450を強く誘導する化合物であることが示唆された.フェノバルビタール処理ラット肝ミクロゾームの7-ペントキシレゾルフィンおよび7-ベンジルオキシレゾルフィンの脱アルキル化酵素活性は2.0mMのテトラクロロエチレン添加によりそれぞれ80および81%阻害された.また,Eadie-Hofsteeプロットからこれらの阻害はいずれも非競合的阻害であることが示され,阻害定数はそれぞれ0.16および0.29mMであった.さらに,テトラクロロエチレンはフェノバルビタール処理ミクロゾームの7-エトキシクマリン0-デエチラーゼ活性もわずかに阻害し,その阻害パターンは競合的阻害であった.しかし,フェノバルビタール処理ラット肝ミクロゾームの他のP450依存性酵素については,テトラクロロエチレンによる著しい変化は認められなかった.一方,7-エトキシレゾルフィン0-デエチラーゼ,アニリン4-ヒドロキシラーゼおよびテストステロン6β-ヒドロキシラーゼ活性は,β-ナフトフラボン,イソニアジドおよびプレグネノロン16α-カルボニトリル処理によりそれぞれ誘導されたが,テトラクロロエチレンによる活性阻害は認められなかった.以上の結果より,テトラクロロエチレンはフェノバルビタール誘導性のP450依存性酵素を非競合的あるいは競合的に阻害し,CYP2B1/2がテトラクロロエチレンの代謝および毒性に関与していることが推察された.
生きる力を育む「幼児のための生き物を介在した保育システム（ＡＡＥＦＣ）」の構築

わが国の幼稚園では明治期から生き物飼育が伝統的に行われてきたが、現在では保育者の知識不足と意識の低下による不適切な飼育や不衛生な管理、幼児への誤った指導などが増加している。また近年は子どもが自然の中で生き物に触れる機会が少ない。本研究は、「幼児のための生き物を介在した教育システム(AAEFC)」を確立し、幼稚園や保育園における生き物飼育を通した保育を再構築することで、子どもの生きる力の育成を目指した。研究の成果として、伴侶動物、昆虫、飼育動物、動物園動物、産業動物(家畜)を介在した幼児のための教育システムを確立することができた。さらに、その成果を現場の保育に生かすための指南書として出版した。わが国の幼稚園では明治期から保育の一環として生き物飼育が伝統的に行われてきた。しかし現在では、保育者の知識不足と意識の低下による不適切な飼育や不衛生な管理、幼児への誤つた指導など、生き物飼育による本来の保育の意義が見失われ、飼育の形骸化が幼児の心身に悪影響を及ぼしているという報告もある。その一方で、近年は子どもをとりまく環境が大きく変貌しており、物質的な豊かさは享受していても、自然の中で生き物に触れるなどの屋外遊びの場が奪われたことにより、子どもの「生きる力」が低下したとする指摘がある。そこで本研究は、保育学、教育学、精神生理学、獣医学、動物行動学、動物介在教育学の専門家が有機的に関わり、「幼児のための生き物を介在した保育システム(AAEFC)」を確立し、幼稚園や保育園における生き物飼育を通した保育を再構築することで、子どもの「生きる力」の育成を目指した。1)幼稚園の生き物飼育に関する比較調査調査幼稚園の選定を行った上で,園児、保育者、生き物に対する参与観察を行った。現地調査の結果、両園の保育者のウサギに対する意識と関わり方の間に大きな差のあることが認められた。また、保育者のウサギに対する意識や姿勢が、園児のウサギに対する扱い方や言動にも影響していることが示唆された。また、調査園に飼育に関するニュースレターを配布した結果、動物介在教育のための補助教材として効果めあることが認められた。2)生き物飼育が困難な幼稚園や保育園を想定した代替AAEFC立案のために予備調査様々な事情で生き物飼育が困難な幼稚園や保育園も存在するので、これらの教育機関のために代替AAEFCの提供が必要となる。代替AAEFCとして、馬の訪問を介した教育と犬の訪問を介した教育に焦点を搾った。その結果、馬介在教育については、短期的効果が認められた。犬介在教育については、愛護センタ鱒への譲渡犬の活用を試みた。両教育において介在動物に対する配慮についても科学的に評価した。しかし現在では、保育者の知識不足と意識の低下による不適切な飼育や不衛生な管理、幼児への誤った指導など、生き物飼育による本来の保育の意義が見失われ、飼育の形骸化が幼児の心身に悪影響を及ぼしているという報告もある。その一方で、近年は子どもとを取り巻く環境が大きく変貌しており、物質的な豊かさは享受していていも、自然の中で生き物に触れるなどの屋外遊びの場が奪われたことにより、子どもの「生きる力」が低下したとする指摘がある。そこで本研究は、保育学、教育学、精神生理学、獣医学、動物行動学、動物介在教育学の専門家が有機的に関わり、「幼児のための生き物を介在した保育システム(AAEFC)を確立し、幼稚園や保育園における生き物飼育を通した保育を再構築することで、子どもの「生きる力」の育成を目指した。平成25年度は以下の研究を実施した。1)犬の訪問活動を通した幼稚園飼育動物の福祉の改善に関する研究犬を幼稚園に連れて行き、幼児と関わらせることを通して、幼児と保育者の動物に対する知識と意識を高めることで、幼稚園で飼育されているウサギやサカナの飼育環境の改善につなげることを目指した。研究の結果、犬の訪問活動によって、幼児と保育者の動物に対する関心が高まり、そのことが幼稚園の飼育動物の飼育環境の改善にもつながることが明らかとなった。2)高齢化した幼稚園のウサギとのふれあいを通した幼児の心の育みに関する研究幼稚園の飼育動物は終世飼育が必須条件であるが、高齢化した動物の飼育管理にはかなりの知識が必要で、また高齢化動物をいたわる心が必要となる。一般的な幼稚園の認識としては、高齢化動物の飼育は手間がかかるということで敬遠されがちであるが、本研究では高齢化したウサギの世話を幼児にさせることで教育効果のあることが明らかとなった。平成26年度も、研究計画に従って各研究担当者が幼児のための生き物を介在した保育システム(AAEFC)の構築に向けて研究を実施した。本研究者らは平成24年度から、命の教育を目指して幼稚園への介在犬訪問活動を行うことで犬に対する園児の認識と理解を深めることができたが、幼稚園の動物の飼育環境を大きく改善するには至らなかった。そこで平成25年度には、介在犬の訪問と飼育動物の教育を一体化した動物介在教育プログラムを実施した。その結果、幼稚園のウサギと魚の環境エンリッチメントを実現することができたが、その後の追跡調査から飼育環境が適切に維持されていないことが明らかとなった。そこで平成26年度は、園の飼育動物であるウサギと魚の飼育環境の維持を目指した教育プログラムについて検討した。