hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
実証分析による２０世紀の交響楽団におけるレパートリー形成とその要因の国際比較研究

音楽学当該年度は、まず、本研究の第一のプロジェクト、二十世紀における日本の交響楽団のレパートリー形成の要因分析について、学会発表での成果報告とコメントに基づき、説明変数の妥当性や新規追加を検討することにより精緻化を図ることができた。現在、本分析に基づく論文は、専門誌への投稿準備中であり、おおむね順調に進展していると言える。また、第二のプロジェクトである、レパートリー形成の要因分析の国際比較については、長期間にわたる演奏会記録が体系的に整理・編纂され、且つ電子データとして公開されている団体の調査を行い、データ取得とデータベース構築を進めてきた。この調査から、体系的な演奏会記録のデータを情報公開している団体は、現状ではごく一部に留まり、当初の計画よりも大幅に考察対象を絞り込まざるを得ないことが判明したが、結果的には、こうした条件を満たす団体は国内にもグローバルにも認知され、一定の高評価を得ているオーケストラが該当し、レパートリー形成の要因分析の国際比較研究の第一段階としては、適正なサンプルが揃うことになったと考える。本研究に関し、計画では初年度に当たる平成24年度は、第1のプロジェクト、すなわち日本の職業交響楽団のデータ収集とデータベース構築、そのレパートリー形成に関する要因分析を進める予定であった。当該年度は、日本の職業交響楽団全23団体(2000年時点)を検討した結果、代表的な8団体をサンプルとして、1927年から2000年までの定期演奏会の演奏曲目データベースを構築し、レパートリー形成の要因分析を実施した。サンプルとした8団体の定期演奏会の曲目データベースは、本研究の仮説検定に必要かつ充分な量と、サンプルとしての代表性、及び一定の多様性を備えるものとなった。分析結果については、国際音楽学会で研究報告を行い、国際専門誌への投稿準備段階に進んでおり、おおむね順調に進展していると言える。また、当該年度は、平成25年度、平成26年度に実施する計画となっている第2のプロジェクト、すなわちレパートリー形成の要因分析の国際比較に向けて、海外の職業交響楽団の演奏会記録に関する資料調査を進めた。ヨーロッパ、米国、アジア・太平洋地域の複数の国と地域の職業交響楽団154団体を対象に、体系的な演奏会資料(紙媒体または電子データ)の編纂と公開状況に関する調査を行い、電子データを公開する団体に関しては、順次、データ収集とデータ整備を進め、試行的にデータベース構築に取り組んだ。今後、体系的な演奏会資料およびデータ取得のために、個別団体レベルでのより詳細な調査を進めることが必要となる。前述のように、二十世紀日本の職業交響楽団のレパートリー形成に関する要因分析の結果については、学会発表でのコメント対応を中心に追加修正を加え、国際専門誌への投稿を準備中である。
新生児および骨髄移植患者のサイトカイン産生態と感染象の特異性に関する研究

ヒト末梢血細胞のうち、種々の刺激によりILー1、ILー6を産生する主たる細胞は単球であることを免疫疫組織染色、in situ hybridization法により確認し、臍帯血、成人末梢血を全血のまま刺激する方法でこれらのサイトカイン産生能を検討した。生下時体重1,800gm以上の児ではこれらのサイトカイン産生能は既に成人のレベルに達していたが、存胎30週未満、生下時体重1,500gm以下の極小未熟児では種々の刺激によるILー6の産生が不良なことから、単球のモノカイン産生態は在胎30週前後に成熟に達するものと推察される。また、骨髄移植後のIL6産生能も、かなり早い時期に獲得されるようであるヒト末梢血T細胞におけるCD45抗原群の発現状態を見ると、臍帯血T細胞の殆どはCD45ROー,CD45RA+の形質をもつナイ-ブT細胞からなるが、年令の進むにつれCD45Ro+(メモリ-)T細胞の比率が増す。ウイルス感染症では急性期にCD45RO+T細胞の著増がみられ、回復期にいたり次第2減少する現象がみられ、ヒト末梢血のCD45RO+T細胞の比率は、その個体が生後に受けたな抗原刺激の総和を反映するものかもしれない。臍帯血のCD4+T細胞は殆どがCD45RA+,CD45RO-(ナイ-ブ)T細胞からなり、IL-4,IL-5,IFN-γ産生態を欠き、B細胞の免疫グロブリン産生をヘルプし得ないが、数日間のin vitroPHA刺激によりCD45RA+、RO-からCD45RA-,RO+への形質変換がおこり、これに伴ってIL-4,IL-5,IFN-γなどのサイトカイン産生態、ヘルパ-能が出現することが確かめられた。単離したナイ-ブT細胞を抗CD2抗体で刺激しても増殖反応はみられないが、メモリ-T細胞は旺盛な増殖をしめす。メモリ-T細胞は抗CD2抗体刺激により自らが微量のIL-6を産生し、オ-トクリン機構を介して増殖し得るが、ナイ-ブT細胞はIL-6産生能を欠くため、IL-6ソ-スとしての単球の共存なしには増殖し得ないことが明らかにされた。分離操作に伴う非特異的刺激によるモノカイン産生を避けるため、全血の状態で刺激を加える方法(全血法と略)でヒト末梢血単球のIL-1,IL-6,TNF産生能を検討した。刺激後、単核細胞を分離し、特異抗体による免疫組織染色、in situ hybridization法などでこれらのモノカインを胞体内に保有する細胞の蛋白レベル、mRNAレベルでの同定を試み、形態的に、また、膜抗原の発現状態からみて、末梢血ではこれらのモノカインの主たる産生は単球によるものであることを明らかにした。

LPS,Con A刺激、大腸菌、B群溶連菌、リステリア菌(生菌、死菌)による刺激、あるいは、ラテックス、ザイモザンなどの貧食による刺激などによるモノカイン産生能を臍帯血、成人末梢血について比較したが、いずれの刺激に際しても産生のカイネティクス、産生量などに有意な差を見いだし得ず、ヒト末梢血単球の重要なエフェクタ-機能の一つであるモノカイン産生能は、生下時既に成人のレベルに達しているものと考えられた。検索し得た限りでは1800gm以上の未熟児のモノカイン産生能には成熟児と間に差はなかった。一例の超未熟児(950gm)で著しいモノカイン産生能の不良が観察されたが、RDS予防の目的で母体にステロイド剤が投与されており、その影響を除外しえなかった。また、骨髄移植に際してはステロイド、サイクロスポリンAが使用されることが多く、これらの薬剤による影響をin vitroで検討し、少なくともIL-6産生に関しては、ステロイドはかなり抑制的に働くが、サイクロスポリンの影響は少ないことが確かめられた。種々の細菌刺激による末梢血単球のILー6産生能を臍帯血、成人末梢血について全血法で検討した。生下時体重1,800gm以上の児では単球のILー6産生能はすでに成人のレベルに達していたが、在胎30週未満、体重1,500gm以下の極小未熟児にあってはILー6産生能は不良であり、単球のモノカイン産生能は在胎30週前後に成熟に達するものと考えられた。また、少数例ではあるが、骨髄移植後のILー6産生能も早期に回復することが確かめられている。ヒト臍帯血T細胞のCD45抗原ファミリ-の発現状態をみると、その殆どがCD45RA陽性であり、メモリ-T細胞のマ-カ-とされるCD45RO抗原の発現はみられない。このようなナイ-ブ形質の臍帯血T細胞も、種々の刺激を受けることによりCD45RAーCD45ROの形質変換が起こり、それに伴ってILー4,ILー5,IFNーγなどのリンホカイン産生能を獲得するに至ることが蛋白質レベルで、また、PCR変法によりmRNAレベルで確かめられた。さらに、臍帯血CD4^+CD45RA^+T細胞にはヘルパ-活性はみられないが、<in>___ー<vitro>___ーでCD45RO形質を獲得させると弱いながらヘルパ-活性が誘導される。また、CD45RA^+(ナイ-ブ)CD4^+細胞とCD45RO^+(メモリ-)CD4^+細胞の抗CD2抗体に対する増殖能の違いを検討し、メモリ-T細胞では抗CD2抗体刺激によりILー6が産生され、オ-トクライン機構により増殖がみられるが、ナイ-ブT細胞ではILー6産生はみられず、増殖も起こらないことなどが明らかにされた。小児の成長に伴い末梢血CD45RO陽性T細胞の比率が増加するが、ウイルス感染に際して著しいCD45RO抗原の発現のみられることなどから類推すると、ヒトのCD45RO陽性T細胞は生後に受けた抗原刺激の総和を示すものとも考えられる。しかし、骨髄移植後にはアロ、オ-トを問わずCD45RO陽性T細胞の著増が見られ、この現象の解明は今後に残されている。
統合失調症におけるミトコンドリア機能異常ならびに病態関連遺伝子の探索

統合失調症患者および健常者のmtDNAにおける変異を探索し、患者のみで同定されるリスクvariantをピックアップした。患者特有と考えられるvariantについて異なる母集団でも解析した結果、複数のvariantが再現性よく検出された。mtDNAのコピー数を測定し、コピー数の多い患者8人中5人で稀な変異を有することが示された。統合失調症の発症要因として遺伝要因が強く関連することが知られており、その一つとしてミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異や多型(variant)の関与が示唆されている。本年度は、昨年度に引き続き、患者末梢血からmtDNAの変異・多型の探索を行い、統合失調症に特徴的なミトコンドリアDNAのvariantの探索を行うとともに、新たに解析規模を拡大し、検出されたvariantについて異なる母集団を用いた再現性の検討を行った。患者特異的に同定されたvariantの中から、11ヶ所のvariantに着目し、患者314名、対照76名について再現性を解析した。その結果、4ヶ所のvariantが再現性良く患者群から同定され、より統合失調症の病態に関与したと考えられるvariantを抽出することができた。またmtDNAのハプログループは地域によって統合失調症に関与する可能性が示唆されていることから、今回解析を行った日本人の統合失調症患者のmtDNAのハプログループを解析しているが、対照群と比較した結果、これまでに本症のリスクとなり得るハプログループは見出されておらず、ハプログループとしての関与に比べ、個人もしくは母系遺伝のmtDNAのvariantが病態に強く関与する可能性が示唆された。これまで統合失調症におけるmtDNAのvariantの再現性はほとんど検討されていなかったが、本研究の結果、いくつかのvariantは患者に集積している可能性が示唆された。患者から同定されたvariantには、呼吸鎖複合体機能にダメージを与え得るvaritantが含まれていたことから、一部の統合失調症ではミトコンドリア機能低下が生じているという仮説を支持する結果であり、本症の原因解明へ発展できる結果と考えられた。本研究では、患者末梢血からmtDNAの変異・多型の探索を行い、統合失調症に特徴的なミトコンドリアDNAのvariantの探索を行うとともに、検出されたvariantについて異なる母集団を用いた再現性の検討を行った。またmtDNAのコピー数の解析も行い、稀なvariantの有無と合わせて総合的に評価した。患者特異的に同定された複数のvariantについて再現性を検討した結果、より統合失調症の病態に関与したと考えられるvariantを抽出することができた。一方で、mtDNAコピー数を調べた結果、特に入院患者群でコピー数が多い結果が得られた。さらにmtDNAコピー数が多い患者群について稀なvariantの探索を行った結果、数は少ないが、コピー数が多い患者では稀なバリアントが複数見出だされた。患者から同定されたvariantには、呼吸鎖複合体機能にダメージを与え得るvariantが含まれていたことや、稀なvariantを有する患者でmtDNAのコピー数が多い一群が存在することを示す結果は、一部の統合失調症ではミトコンドリア機能低下が生じているという仮説を支持するものであり、本症の原因解明へ発展できる結果と考えられた。統合失調症の発症要因として遺伝要因が強く関連することが知られており、その一つとしてミトコンドリアの関与が示唆されているが、いまだ不明な点が多い。そこで、統合失調症患者のミトコンドリアDNA (mtDNA)の多型・変異の探索を行った。患者検体からmtDNAを抽出し、mtDNA上の遺伝子・tRNA・promoter領域について多型・変異を同定した。アミノ酸置換を伴うvariantのうち、統合失調症患者でのみ検出され、mtSNPデータベースに登録されている精神疾患以外の日本人では報告されていないvariantを選択し、これらを統合失調症に関与する可能性のあるvariantとしてリストアップした。本年度の解析では患者84例の末梢血mtDNAから、7遺伝子に8ヶ所のvariantを同定した。PlyPhenツールにより、タンパク質におけるアミノ酸置換のダメージを予測した結果、4ヶ所にダメージが予測された。この中には開始メチオニンが置換するvariantや、ミトコンドリア病の原因として報告されているvariantが含まれていたことから、これらアミノ酸置換がタンパク質や複合体の機能低下を招いていた可能性が示された。また、家系の異なる複数の症例から検出されたvariantは認められないことから、多様なvariantによってミトコンドリア呼吸鎖複合体の機能低下が生じていた可能性を示唆する結果であった。統合失調症におけるmtDNAのvariantの機能についてはほとんど解析されていない。ミトコンドリアの機能異常が本症の病態に関与することが明らかとなれば、従来と全く異なった治療薬の開発に道を開く可能性があることから、今回同定したvariantの解析は本症の原因解明ならびに治療薬開発へ発展できると考えられる。

mtDNAのvariantの探索・同定と再現性、ならびにハプログループを解析することで、ミトコンドリア機能低下を生じ得るvariantを同定できた。また、本年度で、患者および対照群の末梢血からmRNAの抽出が行えたことから、遺伝子発現を解析する準備が整った。ミトコンドリア機能を解析・推測するためのアッセイ系の準備も進んでいる。患者末梢血から統合失調症のみに見出されるvariantを複数同定し、多様なvariantが本症に関与する可能性を示した。機能低下が推測されるvariantについて、該当患者末梢血からリンパ芽球様細胞株を作製できた。健常者の株化細胞も作製しており、遺伝子発現の比較、複合体活性測定の準備が進んでいる。本年度の研究結果で得られた統合失調症関連variantには、新規に見出されたvariantや、ミトコンドリア病に関連すると報告されているvariantがいくつか同定された。来年度は、これらvariantがミトコンドリアの機能に与える影響を調べる。患者および対照群のmtDNAコピー数の測定を進め、mtDNAのvariantとの関連を調べる。また、ミトコンドリア機能に関連した遺伝子発現をRT-PCRにより解析し、患者に特有の遺伝子発現変化を同定する。本年度の研究結果で得られた統合失調症関連variantには、ミトコンドリア病の原因となるvariant、あるいは関連すると報告されているvariantがいくつか同定された。これはミトコンドリアの機能異常が統合失調症の病態に関与することを強く示唆する結果である。新規に見出されたvariantも含まれており、これらvariantの機能解析が特に重要であると考えられる。来年度は、mtDNAの統合失調症関連variantについて、株化リンパ球を用いた遺伝子およびタンパク質発現量の解析、ならびに複合体などの活性と機能解析を重点的に試みる。mtDNAの多型・変異の探索に必要なシーケンスに用いる試薬のほか、mtDNAのコピー数の解析、遺伝子の発現量ならびにタンパク質の発現量を解析するための試薬・primer・抗体・器具などを購入する。また、ミトコンドリア・呼吸鎖複合体活性測定のための活性酸素や酸化ストレス測定の試薬を購入する。また成果報告のための学会参加費用として使用する。mtDNAの多型・変異の探索に必要な試薬のほか、遺伝子ならびにタンパク質の発現量を解析するための試薬を購入する。また、mtDNAのvariant機能を解析するためのプラスミド作製、安定発現細胞株の作製、ならびにミトコンドリア・呼吸鎖複合体活性測定のための活性酸素やATP産生測定の試薬を購入する。
高校教育から労働社会への移行過程を再編成する教育実践の展開論理

本研究は、札幌市の定時制高等学校において展開されている「実社会の生産活動と連動した地域連携型キャリア教育プロジェクト」を対象としてフィールドリサーチを実施し、高校教育から労働活動への移行過程を再編成する教育実践の可能性を検討した。実践研究の結果として、既存の社会に適応していくことを準備させるだけでなく、既存の社会を維持し、創造し変容させていくという挑戦を準備させることを含めたキャリア教育が必要であり、その実現にあたっては生徒たち(若者世代)の学習活動とそれを支える教育関係者と職場関係者とが学び合う研修活動とを相互に作用させる媒介的な実践共同体が不可欠であることが明らかになった。平成27年度は、地域の定時制高校、地元企業、まちづくり活動団体の連携を通じたキャリア教育実践を対象として、生徒たち・関係者へのインタビュー調査及び実践調査をほぼ計画通り実施し、分析データを蓄積することができた。特に、ここ3年間の実践プロジェクトの到達点と課題に関わって、「ローカルで柔軟性に富んだ実践展開」と「実践の持続的展開を支えるカリキュラム・マネジメント」とが並行して展開していく中で、実践の「制度化(institutionalization)」をめぐる葛藤状況の把握と分析を進めることができた。また、そのような葛藤状況を捉え、実践的な解決の途を探る(教育現場との)協働実践研究を積み重ねていく中で、より多様なメンバーとの関係を築きながら、地域の実状に即してこれからの若者の移行支援の課題と可能性を省察する「ラウンドテーブル」事業を実現するに至った。それにより、当初の研究計画に含めていた「省察的カンファレンス」の機能を強化することができた。平成27年度の調査研究の成果や協働実践研究の報告ついては、大学紀要等で論文発表するとともに、それを活用しながら国際学会や研究会・研修会等での発信に取り組むことができた。平成27年度の進捗状況については、概ね順調である。定時制高校とのこれまでの協働実践研究の積み重ねを活かし、精力的にデータの収集と分析を進めることができた。また、それによって本研究課題の中間成果発表の機会を予定よりも多く設定し、次年度以降の実践分析の視点や課題を明確にすることができた。なお、今後、高校現場との協働実践研究の継続が予期せず困難になった場合に備え、当該高校が所在する地域の教育委員会等との連携を強化し、先述の「ラウンドテーブル」事業をコーディネートしていくことで、調査の対象と方法を柔軟に調整できる条件を整えていく。本研究は、定時制高校において展開されている「実社会の生産活動に基づく地域連携型教育実践プロジェクト」を対象としたフィールドリサーチを実施し、(1)高校教育と職場を往還する若者たちの学習経験、(2)それを支える学校教員、協力企業、地域関係者等の意識やかかわりの変容、そして、(3)具体的な実践を媒介して構築されていく組織間連携・コミュニティ形成という三層のプロセスの相互作用を分析し、高校教育から労働社会への移行過程を再編成する教育実践の展開論理を明らかにして行くことを目的としたものである。平成28年度は、前年度に着手した調査活動を継続しながら、実際の実践展開に即したフィールドリサーチを進めることができた。特に、カナダ・韓国の研究者を交えながら、研究協力対象の地域にある定時制高校・民間企業・市民活動の実践交流をコーディネートし、今後の分析課題について検討を深めることができた。それと並行して、本研究の目的である「地域に根ざした新しいキャリア教育実践モデルの開発」を見据え、現場教員の協力も得ながら調査研究の成果発表の準備を進めることができた。具体的には、研究協力対象以外の地域(3ヶ所)において、高校教員・教育委員会・大学関係者が参加する実践研究会をコーディネートし、本研究で協力を得ている定時制高校の現場教員とともに「地域に根ざした新しいキャリア教育実践モデルの開発」の構想・中間成果・課題の検討を集中的に進めた。加えて、それらの地域の関係者との間で継続的に研究交流を深めていくネットワークを立ち上げることができた。平成28年度の進捗状況については、概ね順調である。前年度に引き続き、定時制高校との協働実践研究に取り組み、データの収集と分析を進めることができた。また、最終年度の研究成果発表に向けて、関連学会の国際シンポジウムの機会を活かして、カナダや韓国の取り組みについて情報収集し、実践分析の視点や課題を明確にすることができた。本研究は、定時制高校において展開されている「実社会の生産活動・経済活動と連動した地域連携型教育実践プロジェクト」を対象としたフィールドリサーチを実施し、(1)高校教育と職場を往還する若者たちの学習経験、(2)それを支える学校教員、協力企業、地域関係者等の意識やかかわりの変容、そして、(3)具体的な実践を媒介して構築されていく組織関連携・コミュニティ形成という三層のプロセスの相互作用を分析し、高校教育から労働社会への移行過程を再編成する教育実践の展開論理を明らかにしていくことを目的とするものである。平成29年度は、前年度から引き続き定時制高校及び地域社会での調査活動を継続しながら、上述の省察的かつ重層的な学習活動の成果を「地域に根ざした新しい教育実践モデルの開発」に反映すべく、データ分析と研究協議を進めた。特に実践の持続的な展開を支えるコーディネーターの役割及び制度設計について検討を進めた。主な研究実績として、当該プロジェクトを通じて得られた実践経験を振り返り、その成果と課題を共有してさらなる実践の発展の足場としていくコミュニティ(ラウンドテーブル式実践研究会)を生徒たち、学校教員、地域関係者それぞれに組織化し、それらの間で実践記録や多様なデータ・成果物を交流させることで相互作用を活性化させることに成功した。

また、そのような重層的な学習活動において媒介的な機能を果たすラウンドテーブルを位置付けた地域連携型の教育実践モデルを報告書としてまとめることができた。本研究は、札幌市の定時制高等学校において展開されている「実社会の生産活動と連動した地域連携型キャリア教育プロジェクト」を対象としてフィールドリサーチを実施し、高校教育から労働活動への移行過程を再編成する教育実践の可能性を検討した。実践研究の結果として、既存の社会に適応していくことを準備させるだけでなく、既存の社会を維持し、創造し変容させていくという挑戦を準備させることを含めたキャリア教育が必要であり、その実現にあたっては生徒たち(若者世代)の学習活動とそれを支える教育関係者と職場関係者とが学び合う研修活動とを相互に作用させる媒介的な実践共同体が不可欠であることが明らかになった。本研究課題は、実社会の生産活動と定時制高校における教育活動とが相互に作用しながら展開する「地域連携型キャリア教育プログラム」を対象にしたフィールドリサーチを通じて、高校教育から労働社会への移行過程を再編成する教育実践の展開論理を明らかにすることを目的としている。先述の通り、実践の持続的な展開を支える要件を明らかにすべく、平成28年度は実践の「制度化(institutionalization)」に注目しながら、引き続き調査とデータ分析を進めていく。そのために、実地調査の回数を十分に確保し、最終年度の研究成果発表に向けた実践分析に重点を置いて本研究を進めていく。最終年度にかけて、実践の持続的展開を支えるコーディネーターの役割と「実践の制度化(institutionalization)」をめぐる問題についてさらに検討を深めていく。最終年度は、できる限り多くの事例研究を通じて得られた知見を参照しながら、研究成果のより広範な、実効性の高い普及を目指す。社会教育学、生涯学習論次年度以降の実践分析の視点と課題をより明確なものにしていくために、当初の研究計画よりも本研究課題に関する中間成果の発表機会を多く設定した。その結果、旅費等の支出がやや膨らみ、前倒し請求に至った。残額に相当する物品を購入するタイミングが当初の予定より遅れ、支出にかかわる手続きが年度をまたいでしまったため。実地調査の計画を早めに固めることができたため、旅費等(主として航空運賃等)の実支出が低めに抑えられる。実地調査の頻度については、当初の研究計画通りに実施する予定である。年度が明けてすぐに支出にかかわる処理が済んでいるため、平成29年度の使用計画に大きな変更は生じない。
新規MAPKKK関連キナーゼの細胞内情報伝達における役割

哺乳類のMAPキナーゼカスケードの上流のシグナル分子を検索する目的で、酵母のMAPKKKのアミノ酸配列を基にRT-PCRを行い、MUK1、MUK2、MUK3という3種の新規キナーゼを単離した。MUK1は、酵母の胞子形成に関与するMAPキナーゼ経路の構成因子であるSPS1とキナーゼドメイン間で約50%の高い相同性を示し、現在までに知られている哺乳類のMAPキナーゼ経路とは異なる新しい経路の存在が示唆された。MUK2は、低分子量G蛋白質Rac1、Cdc42の結合により活性化され、酵母の接合に関与するキナーゼSTE20の哺乳類ホモローグと考えられるPAKと同一であることが判明した。また、COS細胞に高発現させたPAK/MUK2は、MEKの活性化を通してMAPキナーゼを活性化することを示唆する結果も得た。MUK1は、STE20、PAK/MUK2ともキナーゼドメインで45%程度の相同性を示すことから、STE20、SPS1、MUK1、PAK/MUK2が新たなキナーゼファミリーを形成していることが示唆された。(MUK1とMUK2は、MAP kinase cascade Related Kinaseという意味を表すMRK1とMRK2とにそれぞれ改称した。)最近、ストレスに応答してJNK(c-Jun amino-terminal kinase)の活性化に至る経路もMAPキナーゼ経路の一つであることが明らかになったが、MUK3はこのJNKを著明に活性化することが分かった。今後MUK3の活性化機構、及び下流の因子の検索により、哺乳類の新たなストレス応答経路が解明されることが期待される。
クロマチン構造による複製開始点の活性化制御機構の解明

真核生物では染色体上の様々な領域に複製開始点が存在しており、染色体構造や機能と複製開始制御が互いにどのように影響するかは興味深い問題である。個々の複製開始点をS期の特定の時期に活性化させる時間的・空間的な複製開始制御が存在すると考えられるが、その分子機構は未だ明らかではない。私は分裂酵母染色体の複製タイミングコントロールに関わる新規の塩基配列を発見した。後期複製開始点AT2088の近傍にS期初期での複製開始を抑制する領域を同定し、この仕組みに必要な塩基配列はテロメアリピート類似配列を含み、テロメア結合因子Taz1が配列依存的に結合していた。テロメアリピート類似配列は別の後期複製開始点AT2035の近傍にも存在し、S期初期での複製開始抑制に必要であった。taz1欠失株では複数の後期複製開始点の中でAT2088とAT2035が特異的にS期初期に活性化したことから、Taz1が染色体腕部のテロメアリピート類似配列に結合することが隣接する開始点のS期初期の活性化を抑制していると考えられる。興味深いことにtaz1欠失株ではサブテロメア領域の後期複製開始点もS期初期に活性化していた。このことからテロメアに存在するTaz1も複製の制御に関わっていると考えられる。さらに他のテロメア結合因子であるRif1やShelterin complexを構成するRap1, Poz1の欠失は、AT2088含む多数の後期複製開始点のS期初期での活性化を引き起こした。以上の結果から、テロメアとその結合因子が染色体上の広範囲の複製開始点を制御している可能性が示唆された。AT2088への複製因子の集合過程を解析した結果、S期でのpre-RC活性化の最上流のステップであるDDK依存的なSld3結合が起きていないが、テロメアリピートを塩基置換したAT2088ではSld3が結合した。以上の結果から、複製開始点近傍に結合したTaz1が、DDKもしくはSld3の機能や結合を妨げる仕組みを介して複製タイミングの制御に関与するのであろうと考えられる。真核生物の染色体には多数の複製開始点が存在しており、その活性化の制御は染色体機能や維持に重要である。しかし個々の複製開始点の活性化時期・頻度を決めている仕組みは未だ明らかになっていない。我々の研究室の解析により、分裂酵母染色体上でS期初期に活性化する初期複製開始点と後期に活性化あるいは受動的に複製される後期複製開始点が網羅的に同定された。これらの結果に基づき、私は染色体上の内部あるいは外部に活性化時期を決定するエレメントが存在するのではないかと考え、そのエレメントの同定を通して複製開始点の活性化時期制御機構を明らかにしようと考えている。複製開始点を移動させて複製開始時期の変化を解析した結果、分裂酵母第二染色体上の初期複製開始点ars2004と後期複製開始点AT2088の位置を操作した場合、ars2004のS期初期の活性化がAT2088と隣接した時に抑制されることを発見した。さらにAT2088内部に部分欠失をつくり、隣接したars2004複製効率を定量的に測定した結果、AT2088内部の特定の領域(210bp)が近傍の複製開始点を抑制するために必要であることが明らかになった。この領域を除去したAT2088はS期初期に活性化したことから、この領域には後期複製開始点の決定要素が含まれている可能性が考えられる。複製開始反応のどの段階が制御されているかを明らかにするためにクロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いて複製因子の結合過程を調べた結果、後期複製開始点では複製前複合体(pre-RC)活性化の最も上流に位置するSld3結合が大きく遅れることが明らかになった。興味深いことにAT2088に隣接した初期複製開始点arS2004でもSld3結合の遅延が見られた。このことから、DDK依存的なSld3結合段階が複製開始点の制御に重要であり、我々が見出した領域はSld3結合の抑制に必要であると考えられる。現在はこの制御機構の分子メカニズムの解明を目指してさらなる解析を行っている。真核生物では染色体上の様々な領域に複製開始点が存在しており、染色体構造や機能と複製開始制御が互いにどのように連携するかは興味深い問題である。個々の複製開始点はS期の特定の時期に活性化することから、時間的・空間的な制御機構が存在すると考えられているが、その分子機構はほとんど明らかになっていない。当研究室の解析により、分裂酵母染色体上でS期初期に活性化する初期複製開始点と後期に活性化あるいは受動的に複製される後期複製開始点が網羅的に同定された。本研究では、初期/後期複製開始点の違いをもたらす要素の同定を通して複製開始点の活性化制御機構を明らかにすることを目的としている。活性化を決定している要素が各開始点に特有のものなのか、それとも周囲の領域なのかを区別するため、初期複製開始点ars2004と後期複製開始点AT2088からARS活性をもつ断片を取り出して染色体上で移動させたところ、ars2004はAT2088と隣接したときに抑制された。さらにAT2088内部に部分欠失をつくり隣接したars2004の複製効率を定量的に測定した結果、AT2088内部の特定の25bp領域が抑制に必要であることが明らかになった。

この領域を含む210bpの範囲を欠いたAT2088は本来の位置でS期初期に活性化したことから、開始点活性化の制御は塩基配列依存的な負の制御であると考えられる。興味深いことに上記の25bpにはテロメアリピート類似配列が含まれていた。当研究室のこれまでの解析でテロメア結合蛋白質Taz1やRif1の欠失時に後期複製開始点の複製早期化が見られていたことから、テロメア結合蛋白質が後期複製開始点抑制に関わっている可能性を想定した。rif1欠失株でAT2088がS期初期に活性化したことから、私はAT2088内部の抑制必須領域にテロメア結合蛋白質Taz1が直接結合し、開始反応を阻害しているのではないかと考えている。今後は開始点の制御とテロメア結合蛋白質との関係を明らかにしたい。真核生物では染色体上の様々な領域に複製開始点が存在しており、染色体構造や機能と複製開始制御が互いにどのように影響するかは興味深い問題である。個々の複製開始点をS期の特定の時期に活性化させる時間的・空間的な複製開始制御が存在すると考えられるが、その分子機構は未だ明らかではない。私は分裂酵母染色体の複製タイミングコントロールに関わる新規の塩基配列を発見した。後期複製開始点AT2088の近傍にS期初期での複製開始を抑制する領域を同定し、この仕組みに必要な塩基配列はテロメアリピート類似配列を含み、テロメア結合因子Taz1が配列依存的に結合していた。テロメアリピート類似配列は別の後期複製開始点AT2035の近傍にも存在し、S期初期での複製開始抑制に必要であった。taz1欠失株では複数の後期複製開始点の中でAT2088とAT2035が特異的にS期初期に活性化したことから、Taz1が染色体腕部のテロメアリピート類似配列に結合することが隣接する開始点のS期初期の活性化を抑制していると考えられる。興味深いことにtaz1欠失株ではサブテロメア領域の後期複製開始点もS期初期に活性化していた。このことからテロメアに存在するTaz1も複製の制御に関わっていると考えられる。さらに他のテロメア結合因子であるRif1やShelterin complexを構成するRap1, Poz1の欠失は、AT2088含む多数の後期複製開始点のS期初期での活性化を引き起こした。以上の結果から、テロメアとその結合因子が染色体上の広範囲の複製開始点を制御している可能性が示唆された。AT2088への複製因子の集合過程を解析した結果、S期でのpre-RC活性化の最上流のステップであるDDK依存的なSld3結合が起きていないが、テロメアリピートを塩基置換したAT2088ではSld3が結合した。以上の結果から、複製開始点近傍に結合したTaz1が、DDKもしくはSld3の機能や結合を妨げる仕組みを介して複製タイミングの制御に関与するのであろうと考えられる。
羊膜移植眼及び羊膜上培養角膜上皮移植眼における包括的視機能解析と評価

【研究目的】重症眼表面疾患に対して羊膜移植を施行した場合、羊膜の半透明性により一時的に視機能が低下する。本研究は羊膜移植眼における視機能を評価する。【研究方法】同意を得た正常者6人の片眼に無縫合で移植可能な羊膜コンタクトを装用した。視力、色覚、装用感、羊膜厚及び羊膜厚と視機能検討項目の相関関係についても検討した。視力は、遠見及び近見視力を装用前、装用30分後、装用6090分後、脱装用30分以内で測定した。色覚は装用6090分後にパネルD15で評価した。装用感は、差明感、異物感、乾燥感、疼痛、霧視の5項目を点数化した。【研究成果】平均裸眼遠見視力及は、装用前は-0.22±0.06logMARであったが、装用30分後及び6090分後は、それぞれ0.92±0.45logMAR、1.04±0.35logMARに低下した。平均裸眼近見視力は、装用前は-0.14±0.07logMARであったが、装用後30分及び6090分後には、10眼中5眼で1.0logMAR以上に低下した。羊膜コンタクト脱装用により平均裸眼遠見視力及び平均裸眼近見視力ともに速やかに改善した。使用した羊膜コンタクトの中で、比較的良好な視力を与えた羊膜ドナーが存在し、それらは細隙灯顕微鏡で観察すると羊膜の混濁が少ない傾向にあった。色覚は、全例で正常に保たれた。装用感は、羊膜コンタクト装用により平均1.67±3.54点から平均47.8±9.1点に悪化した。平均羊膜厚は67.6±25.2μmであり、羊膜厚と平均裸眼遠見視力及び装用感には有意な相関関係は認めなかった。以上より、本研究により羊膜移植眼は、羊膜の不透明性により視力は低下するものの色覚は保たれることが明らかになった。また、羊膜移植による視力低下の程度は、羊膜の透明度に左右され、使用する羊膜のドナーによる異なる可能性が示唆された。
維管束を介したサイトカイニン情報の長距離伝播の仕組みと役割

サイトカイニン(CK)は植物の成長・発達の様々な過程の制御に不可欠な植物ホルモンであり、局所シグナルとして作用するだけでなく、維管束を介して長距離輸送され、器官間(長距離)シグナルとしても重要な役割をもつ。本研究では、CKの長距離輸送を介した個体統御メカニズムの解明を目指し、(1)CKの維管束への積み込みの分子メカニズムと(2)CK長距離輸送の生理的役割の観点からアプローチした。特に根から地上部への道管を介した長距離輸送に注目した。(1)ABCG14はCKの道管への積み込みに必須の因子であるが、基質特異性や輸送方向などの生化学的特性や機能組織など、詳しい働き方は分かっていない。我々はT87シロイヌナズナ培養細胞に誘導発現コンストラクトを導入した実験系を構築し、ABCG14がCK前駆体の排出に関わることを強く示唆する結果を得た。またabcg14背景でABCG14を組織特異的に発現する形質転換体を用いて表現型の回復を評価した結果、ABCG14が維管束で働くことが道管へのCK積み込みに重要であることが示唆された。ABCG14は維管束でCK前駆体を細胞外に排出することにより、道管へのCK積み込みを司ると考えられる。(2)根から地上部への道管を介したtZ型CKの輸送は、地上部の正常な成長・発達に欠かせない。道管液中の主要なCK分子種は前駆体tZRと活性型tZであるが、それらの生理的役割については不明であった。我々は、CK輸送・代謝系の変異体と接ぎ木を組み合わせることにより、tZRとtZの輸送の影響を区別して評価できる実験系を構築した。それにより、根由来のtZRとtZは異なった生理作用を持つことを明らかにし、論文化した。このようなCK分子種の使い分けは、環境変化に応じた個体統御システムを構成する重要なメカニズムの1つであると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では根から地上部への道管を介したサイトカイニンの長距離輸送に注目し、(i)根における道管への積み込みの分子メカニズムとその制御と、(ii)根から地上部へのサイトカイニン長距離輸送の制御とその生理的役割の解明を目指した。(i)我々が最近同定したサイトカイニンの道管への積み込みを司る因子ABCG14の生化学的特性の解析を中心に行った。大腸菌、酵母、昆虫細胞を用いたアッセイ系では活性を検出することはできなかったが、T87シロイヌナズナ培養細胞において誘導発現系を構築し、ABCG14がサイトカイニンの前駆体の一種であるリボシド型を排出する活性をもつことを強く示唆する結果を得た。現在in vitroタンパク質合成系を用いて、ABCG14の輸送特性を詳細に解析する系を構築中である。またABCG14機能の分子生物学的解析のための、ABCG14の発現組織や発現量を変化させた形質転換体の作製を完了した。(ii)道管液中の主要なサイトカイニン分子種は前駆体tZRであり、古くからこれが根から地上部へのシグナルであると考えられてきた。道管液からは活性型であるtZも少量検出されるが、その役割については不明であった。我々は、サイトカイニン代謝系の変異体(log, ipt)と接ぎ木を組み合わせることにより、根由来のtZとtZRの生理的役割を区別できる実験系を構築し、tZも根から地上部へのシグナルとして働くこと、根由来のtZとtZRは異なった生理的役割を持つことを明らかにした。根由来のtZは葉の成長促進、tZRは茎頂分裂組織の活性化に作用する。サイトカイニン分子種の使い分けは(tZ/tZR, iP型/tZ型)、環境変化に応じた個体統御システムを構成する重要なメカニズムの1つであると考えられる。ABCG14機能の分子生物学的解析に用いるABCG14の発現組織や発現量を変化させた形質転換体の確立がやや遅れているが、それ以外は予定通りに進展している。

(2)根から地上部への道管を介したtZ型CKの輸送は、地上部の正常な成長・発達に欠かせない。道管液中の主要なCK分子種は前駆体tZRと活性型tZであるが、それらの生理的役割については不明であった。我々は、CK輸送・代謝系の変異体と接ぎ木を組み合わせることにより、tZRとtZの輸送の影響を区別して評価できる実験系を構築した。それにより、根由来のtZRとtZは異なった生理作用を持つことを明らかにし、論文化した。このようなCK分子種の使い分けは、環境変化に応じた個体統御システムを構成する重要なメカニズムの1つであると考えられる。当初の計画通り、(i)では無細胞系で作製したABCG14を含む膜小胞を用いてABCG14の輸送特性の詳細な解析を行える系を確立し、輸送基質やカイネティックスなどの詳細な解析を中心に進める。(ii)では、昨年度見いだした、長距離輸送されたtZの生理的役割について、論文化を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
反射第2高調波エリプソメトリの開発と化合物半導体の非線形光学特性の研究

1.反射第2高調波エリプソメトリの開発本研究で提案した反射第2高調波エリプソメトリと,基本波と第2高調波の波長での通常のエリプソメトリ測定を組み合わせることによって,申請者の予測した通りに,単一の試料を用いて膜厚・線形屈折率の実部と虚部・非線形光学定数の実部と虚部とを同時に決定することができること示した。バルク試料としてはGaAs単結晶基板,薄膜試料としてはAlGaAs/GaAsに対して基本波光源としてNd:YAGレーザを用いて実験をおこない,理論解析の結果とを比較することによって本手法の有効性を実証することができた。2.半導体薄膜の非線形光学定数の評価反射第2高調波エリプソメトリの手法を幾つかの新しい非線形光学半導体材料の評価に適用した。GaAs基板上に成長したAl_<0.2>Ga_<0.8>AsとGaP基板にイオン照射をおこなって作製した非晶室GaP,六方晶系のSiC,Si基板上に成長した立方晶β-SiCについて,その非線形光学定数を決定することに初めて成功した。これらのデータは,今後の化合物半導体を用いた高性能波長変換素子の研究・開発に欠くことのできない重要な基礎データとなるものと確信している。
安全性の高いファジィコントローラ・人工ニューラルネットワークの開発

本研究は,高安全性ニューラルネットワーク(以下NN)・ファジイコントローラ(以下FC)の開発を目的とし,以下に示す成果を得ることができた.(1)メンバシップ関数多重縮退故障に対するオンライン検出法を提案した.本方法は,後件部における検査用観測対象として,積分値であるファジィ出力集合面積を用いた.これにより,本方法に基づき,従来法より安定性において優れたハードウェア構築が可能となった.(2)上記(1)により検出されたもののうち,各前件部,後件部に高々一個生じている故障に対する即時的補償法を提案した.本方法は,後件部に補償用関数を一個付加するだけでよいため,従来法よりハードウェア付加量を削減できる.(1)入力層,中間層,出力層からなる階層型NNに生じた結合線縮退故障に対し,その影響を最低限に抑え込む学習アルゴリズムを提案した.中間層内故障耐性化のためには、活性化関数であるシグモイド関数の傾きを小さくする.一方,出力層内故障耐性化のためには,シグモイド関数の傾きを逆に大きくする.本方法は,耐故障性において従来法より優れている.(2)上記(1)の傾き操作に加え,ニューロン内部状態における演算改良も採用したフォールトトレランス強化法を提案した.荷重縮退故障の影響が一定量を大幅に超える場合は,演算改良としてニューロンに新たに加えられたフィルタ機能が,その値を許容値まで低減する.一方,ニューロンへの各入力値を一定量減じた後,各内部状態値を一定量増加させる演算改良策が,故障影響の比較的小さい場合に作用し,耐故障性を向上する.本方法は,耐故障性・学習収束速度の両面において,従来法よりも大幅に優れている.3.NNオンライン検査法確立NNへの教師信号符号化に際し,1ビット数を奇数にし,オンラインパリティ検査を可能にした.本研究は,高安全性ニューラルネットワーク(以下NN)・ファジイコントローラ(以下FC)の開発を目的とし,以下に示す成果を得ることができた.(1)メンバシップ関数多重縮退故障に対するオンライン検出法を提案した.本方法は,後件部における検査用観測対象として,積分値であるファジィ出力集合面積を用いた.これにより,本方法に基づき,従来法より安定性において優れたハードウェア構築が可能となった.(2)上記(1)により検出されたもののうち,各前件部,後件部に高々一個生じている故障に対する即時的補償法を提案した.本方法は,後件部に補償用関数を一個付加するだけでよいため,従来法よりハードウェア付加量を削減できる.(1)入力層,中間層,出力層からなる階層型NNに生じた結合線縮退故障に対し,その影響を最低限に抑え込む学習アルゴリズムを提案した.中間層内故障耐性化のためには、活性化関数であるシグモイド関数の傾きを小さくする.一方,出力層内故障耐性化のためには,シグモイド関数の傾きを逆に大きくする.本方法は,耐故障性において従来法より優れている.(2)上記(1)の傾き操作に加え,ニューロン内部状態における演算改良も採用したフォールトトレランス強化法を提案した.荷重縮退故障の影響が一定量を大幅に超える場合は,演算改良としてニューロンに新たに加えられたフィルタ機能が,その値を許容値まで低減する.一方,ニューロンへの各入力値を一定量減じた後,各内部状態値を一定量増加させる演算改良策が,故障影響の比較的小さい場合に作用し,耐故障性を向上する.本方法は,耐故障性・学習収束速度の両面において,従来法よりも大幅に優れている.3.NNオンライン検査法確立NNへの教師信号符号化に際し,1ビット数を奇数にし,オンラインパリティ検査を可能にした.
系外惑星直接観測のための干渉光学システムの研究

本研究では,UNI-PAC,(2段)立体サニャックナル干渉計の個別および総合的な機能・性能向上を目的とし,また,全体の光学システムを完成させ,10桁の消光比を得ることを目的とする.UNI部に面精度の高い光学素子を導入したことで面精度が向上し,また,安定な光学マウントを導入することでナル干渉後の出力波面が安定した.さらに,PAC補償光学の制御アルゴリズムの改善も加え,波面の位相誤差・振幅誤差ともに,従来より高い約λ/100rms(λ/640rms相当)の波面補償精度に速く収束するようになった.そして,振幅比を変化させることで,理論通りの波面誤差の拡大率が得られることを証明し,高精度波面補正を実行できることを証明した.また,立体サニャック干渉計型コロナグラフを結合して測定したPAC補償光学による焦点面でのスペックルの低減も約1桁向上し,UNI-PAC法の原理実証をした.この結果より,レーザ学会学術講演会での招待講演,外国学術雑誌(OPTICS EXPRESS)への掲載が決定した(次項参照).また,波面補正精度の向上,焦点面でのスペックル低減領域拡大のため,6×6素子のシャックハルトマン波面センサー,可変形鏡(精度λ/250rms,中心から03λ/Dの範囲に対応)から,12×12素子(精度λ/1000rms,中心から06λ/Dの範囲に対応)へ多素子化を行った.12×12素子の波面センサーと可変形鏡を用いた補償光学の精度がλ/3000rmsまで可能であることを確認し,PAC部への導入を進めている.コロナグラフとして高コントラスト光学システムに導入を検討している2段立体サニャックナル干渉計では,実際の光学素子のパラメータを考慮した数値シミュレーションにより考察検討を行い,波長無依存性,面光源に対しても高い消光比が得られることを確認した.これらの結果をもとに,光学配置を決定し,現在原理実証の実験推進中である.本研究では,UNI-PAC,(2段)立体サニャックナル干渉計の個別および総合的な機能・性能向上を目的とし,また,全体の光学システムを完成させ,10桁の消光比を得ることを目的とする.UNI部に面精度の高い光学素子を導入したことで面精度が向上し,また,安定な光学マウントを導入することでナル干渉後の出力波面が安定した.さらに,PAC補償光学の制御アルゴリズムの改善も加え,波面の位相誤差・振幅誤差ともに,従来より高い約λ/100rms(λ/640rms相当)の波面補償精度に速く収束するようになった.そして,振幅比を変化させることで,理論通りの波面誤差の拡大率が得られることを証明し,高精度波面補正を実行できることを証明した.また,立体サニャック干渉計型コロナグラフを結合して測定したPAC補償光学による焦点面でのスペックルの低減も約1桁向上し,UNI-PAC法の原理実証をした.この結果より,レーザ学会学術講演会での招待講演,外国学術雑誌(OPTICS EXPRESS)への掲載が決定した(次項参照).また,波面補正精度の向上,焦点面でのスペックル低減領域拡大のため,6×6素子のシャックハルトマン波面センサー,可変形鏡(精度λ/250rms,中心から03λ/Dの範囲に対応)から,12×12素子(精度λ/1000rms,中心から06λ/Dの範囲に対応)へ多素子化を行った.12×12素子の波面センサーと可変形鏡を用いた補償光学の精度がλ/3000rmsまで可能であることを確認し,PAC部への導入を進めている.コロナグラフとして高コントラスト光学システムに導入を検討している2段立体サニャックナル干渉計では,実際の光学素子のパラメータを考慮した数値シミュレーションにより考察検討を行い,波長無依存性,面光源に対しても高い消光比が得られることを確認した.これらの結果をもとに,光学配置を決定し,現在原理実証の実験推進中である.
繊毛が成体脳の神経新生と神経細胞の機能に果たす役割の解析

本年度は新規に繊毛へ局在するキナーゼを同定するために、培養細胞を用いたキナーゼの細胞内局在スクリーニングを行った。これはFlagタグを付加した目的の蛋白質をNIH3T3細胞に発現させ、Flagと繊毛のマーカーであるアセチル化チューブリンに対する抗体を用いた免疫染色により繊毛への局在の有無を判定するものである。現在までに2つの繊毛において機能未知のキナーゼが繊毛に局在することを見出した。これらはいずれもICKとキナーゼドメインにおける相同性が高く、ICKと同様の機能を持つ可能性があり興味が持たれる。今後は、培養細胞を用いた実験により繊毛形成や繊毛内輸送に対する機能を調べ、さらにノックアウトマウスの作製を行いその表現型を解析し、生体内における機能を明らかにしたい。また昨年度まで私たちが行ってきたICKの機能解析をさらに発展させる形で内耳有毛細胞におけるICKの機能を解析することにより、繊毛の形成・機能異常に起因する聴覚障害が引き起こされる分子メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。私たちはICK欠損マウスにおいて、蝸牛の長さが短縮していることを見出した。有毛細胞を走査型電子顕微鏡を用いて観察すると、ICK欠損マウスにおいて、V字型に配列した不動毛の頂点に動毛が存在しないものや、不動毛の配置の規則性が乱れているものが増加していた。次にICKの欠損による聴力への影響を調べた。ICK欠損マウスは新生児致死となり成体マウスでの解析ができないため、ICK floxマウスと内耳においてCreを発現するトランスジェニックマウスを掛け合わせて、コンディショナルノックアウト(CKO)マウスを得た。このICKを内耳において欠損させたマウスを用いて、聴性脳幹反応(ABR)や歪成分耳音響放射(DPOAE)を測定すると、ICK CKOマウスでは聴力の低下が認められた。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はまず繊毛局在キナーゼICKの中枢神経系における繊毛形成への関与を調べた。ICKコンディショナルノックアウトマウスにおいて、神経前駆細胞や網膜前駆細胞において繊毛の数の減少が見られた。一方で、分化した神経細胞や網膜視細胞においては繊毛の数や長さはコントロールマウスと比較して差が認められなかった。このことからICKは中枢神経系において神経前駆細胞の繊毛の形成には必須であるが、神経細胞の繊毛形成には必須でないということが明らかとなった。次にICKの欠損による繊毛への影響をICK欠損マウスの胎児線維芽細胞(ICK KO MEF)を用いて詳細に解析した。ICK KO MEFにおいてはShhシグナル構成因子であるSmoothenedやGliタンパク質が繊毛に異常に蓄積していた。またIFT複合体の構成因子の局在についても調べた。IFT複合体は大きくIFT-AとIFT-Bに分かれるが、ICK KO MEFの繊毛においてはIFT-A、IFT-B両者の構成因子が繊毛の先端に集積していた。一方でICKを過剰発現した細胞においてはIFT-Bのみの構成因子が繊毛の先端に蓄積していた。以上の結果は、ICKは繊毛内におけるタンパク質輸送を制御し繊毛の形成に必須の因子であることを示した。この研究はこれまで明らかとなっていなかった繊毛の先端におけるタンパク質輸送を制御する因子を同定し、その生体内における分子メカニズムを明らかにしたものである。ICK欠損による繊毛形成への影響がより詳細に明らかとなった。

繊毛の先端における蛋白質輸送の制御メカニズムの一端が解明された。ICKによる繊毛の先端における蛋白質輸送の制御メカニズムをより詳細に明らかにするために、酵母ツーハイブリッドやICKとの共沈物に対して質量分析を行うことによりICKの相互作用因子を同定し、それらの因子がICKによりどのように制御されるのかを解析していく。
分子シャペロンマシーナリーのX線結晶構造解析

細胞内でのタンパク質の一生のケアを行う分子シャペロンは、そのほとんどが複雑なオリゴマー構造を取ることで機能する。立体構造未知の分子シャペロンの構造解析に向けて、本年度は、結晶解析に適している好熱菌の分子シャペロンの大量発現系の構築および機能解析を中心に研究を進めた。扱ったシャペロンは以下の通りである。1)好熱菌ClpXPプロテアーゼ複合体(プロテアソーム・ホモログ)3)好熱菌FtsHプロテアーゼ本研究は,種々の分子シャペロンの細胞内での機能を構造的基盤の上に立って解明する第一歩として、構造未知の分子シャペロンのX線結晶構造解析を行い、作用機構を解明することを目的とする。本年度は、構造未知の分子シャペロンを生化学的に扱うための準備(大量発現系の構築、機能解析)を中心に研究を進めた。1)好熱菌ClpXPプロテアーゼ複合体(プロテアソーム・ホモログ)3)好熱菌FtsHプロテアーゼ