hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラクタル次元を用いた形態の複雑さの定量化

緒言:これまでの形態学は、リアス式海岸のような形の骨の縫合や、曲線が樹木上に広がる血管・神経の分布なとの特徴を表すには、言葉で描写するか、正確に描画するのみであった。ところが、最近では理工学系を中心に自然界の事象や形態をフラクタル次元を用いて表現する研究が行われている。そこで、この方法を形態学の研究に応用し、フラクタル次元を用いて生体を構成する器官・組織の形態の複雑さを定量化した。方法:試料にインド人乾燥頭蓋骨を用いて。前頭縫合、矢状縫合、ラムダ縫合の複雑さを定量化した。最適な解析方法を検討した上で、ディバイダを利用して矢状縫合の形態をトレースし、「折れ線の被覆によるフラクタル次元」を求めた。すなわち、いろいろな長さdに対する個数(d)を推測して、N(d)を測定して、N(d)とd^<-k>の間に比例関係があるとき、ある定数kをフラクタル次元と定義した。実際には、線分の長さdを3mm11mmまで2mm毎に変化させ、そのときの個数N(d)を測定した後、それぞれの自然対数をとり、logN(d)とlogdの回帰直線の傾きを求めてフラクタル次元とした。結果および考察:計測結果の回帰直線から各縫合の形態はフラクタルと言えることが分かった。冠状縫合のフラクタル次元は1.30(SD-0.100)、矢状縫合のフラクタル次元は1.48(SD-0.123)、ラムダ縫合のフラクタル次元は1.54(SD=0.077)であった。これより、縫合の複雑さ歯、冠状縫合<矢状縫合<ラムダ縫合の関係にあることが分かった。肉眼で観察した際の所見を数値によって裏付けることができた。このように、フラクタル理論を応用することにより、これまで定量化が困難であった生体の構成機関・組織の形態の複雑さの測定が可能であることが分かった。これまでの形態学は、リアス式海岸のような形の骨の縫合や、曲線が樹木状に広がる血管・神経の分布、網目構造が3次元的に広がる海綿骨などの特徴を表すには、言葉で描写するか、正確に描画するのみであった。そこで、この方法を形態学の研究に応用し、フラクタル次元を用いて生体を構成する器官・組織の形態の複雑さを定量化することを考えた。今年度は、頭蓋骨の矢状縫合の形態の複雑さを定量化することを試みた。方法は、試料に当教室所蔵のモンゴロイド(日本人)およびコーカソイド(インド人)乾燥頭蓋骨を用いた。すなわち、ある長さdの線分を繋ぎ合わせた折れ線により縫合を近似するために、N(d)個の線分が必要であるとする。ここで、いろいろな長さdに対する個数N(d)を測定して、N(d)とd^<-k>の間に比例関係があるとき、ある定数kをフラクタル次元と定義した。結果より、矢状縫合の形態はフラクタルと言えることが分かった。フラクタル次元はコーカソイドが1.44(最大1.56、最小1.22)、モンゴロイドが1.23(最大1.37、最小1.13)であった。肉眼で観察すると、コーカソイドの矢状縫合の方がモンゴロイドより複雑であることが分かるが、これを数値によって裏付けることができた。このように、フラクタル理論を応用することにより、これまで定量化が困難であった生体の構成器官・組織の形態の複雑さの測定が可能であることが分かった。これらの要旨を、第260回東京歯科大学学会例会(平成9年3月1日,千葉)で発表した。

実際には、線分の長さdを3mm11mmまで2mm毎に変化させ、そのときの個数N(d)を測定した後、それぞれの自然対数をとり、logN(d)とlogdの回帰直線の傾きを求めてフラクタル次元とした。結果および考察:計測結果の回帰直線から各縫合の形態はフラクタルと言えることが分かった。冠状縫合のフラクタル次元は1.30(SD-0.100)、矢状縫合のフラクタル次元は1.48(SD-0.123)、ラムダ縫合のフラクタル次元は1.54(SD=0.077)であった。これより、縫合の複雑さ歯、冠状縫合<矢状縫合<ラムダ縫合の関係にあることが分かった。肉眼で観察した際の所見を数値によって裏付けることができた。このように、フラクタル理論を応用することにより、これまで定量化が困難であった生体の構成機関・組織の形態の複雑さの測定が可能であることが分かった。
三方キラルらせん集合体の配位空間構築と反応制御

本研究では、三方向キラルらせんの集合体を基にして、有機結晶のナノ配位空間におけるゲストのインターカレーションならびにモノマーや気体の化学反応を調べるとともに、これに伴うホスト分子集団のダイナミクスを明らかにすることを目的としている。以下に本年度の研究成果を挙げる。天然物を配位子とした不斉ナノ空間の構築:シンコナアルカロイド、コール酸1、およびその類縁体と種々の金属イオンとを用いて金属錯体を調整した。アルカロイドはそのキノリン環にCu(II)が配位し錯体を形成することが^1H NMRスペクトルより示唆された。さらに、1はZn(II)の添加によりゲルが生成することがわかった。金属の添加により1同士の水素結合に加えZn(II)の配位結合によって超分子ネットワークが形成されたためであり、メタノールやブタノールなどのアルコールを用いても生成する。得られたゲルの構造をAMFで観測したところ、繊維状の構造が見られた。Zn(II)による1のゲルの生成は本研究が初めての例である。有機色素分子をホストフレームワークとした機能性ナノ空間の構築:アゾベンゼンジスルホン酸2およびメチルオレンジ3はトリフェニルメチルアミン4とクラスターを形成し、結晶中においてゼオライトのようなチャネル状多孔質構造をとることを見出した。クラスター2・4の結晶は、ゲスト吸収・脱離により伸縮することが明らかとなった。さらに、トルエン包接結晶の溶媒分子の脱離により橙色から赤褐色への色調変化が観測された。クラスター3・4の結晶は、クラスター間の強い相互作用による非常に剛直な骨格をもつ。その空孔にはトルエン誘導体やアルキルアルコールを可逆的に吸着脱離できる。さらに、二酸化炭素などのガスを吸着させることにも成功した。有機化合物のみからなる多孔質結晶を用いた気体の吸着脱離は本研究が初めてである。
運動物体に対する認知予測特性と運動制御スキルが捕捉パフォーマンス与える影響

本研究は、仮想環境において運動物体の認知・予測課題、運動制御課題を用いて実施した。様々な条件における実験結果から、運動物体の捕捉までの一連のプロセスの中で、予測プロセスにおいてエラーが生じる可能性が示唆された。また、若年者群と高齢者群における運動物体の認知課題と予測課題の結果を比較することにより、可視条件における運動物体の認知特性に加齢の影響が顕著に表れることが判明した。平成25年度の研究計画は、本実験準備段階と位置づけ、各能力評価のための実験タスクの検討と立体視による仮想現実感システムの構築であった。この実験タスクは、認知予測特性と運動制御スキルが捕捉パフォーマンスに与える影響を検討するためには重要な要素となる。仮想環境における課題は、当初、垂直落下物体による課題を採用する予定であったが、水平移動物体による課題を採用することとし、認知能力と予測能力を評価する実験タスクを構築することができた。運動制御スキル評価の課題については、次年度に検討することとした。捕捉能力評価の実験タスクを検討するためにベースとなるタスク、すなわち飛来物体を捕捉する実技課題については、飛来物体の材質やサイズの違い、捕捉道具(カップ)の直径の違い、物体発射位置から被験者までの距離の違いによる難易度の差について検討した。これらのタスクについては、難易度に幅を持たせられるようなタスクをさらに検討しなければならない。また、実技課題の実施にあたっては、発射方法や発射位置の背景など、いくつかの問題点が見つかった。これらの問題点については、次年度に検討を進めることになる。立体視による仮想現実感システムについては、プロジェクターのリフレッシュレートの問題から、速度の速い物体を描画する際に離散的表示になるため、表示方法や物体速度の検討が必要であることから、今年度再検討する。また、色と文字の認知特性について若年者と高齢者を比較検討し、加齢による認知特性の違いについて検討した。若年者では、条件により反応が異なるのに対し、高齢者では、条件の違いにおいても反応に変化が少なかった。このことから、色や文字認知に関して、加齢により処理速度や能力が異なってくるものと推測された。平成26年度は、1認知・予測・運動制御タスク実験および捕捉タスク実験の実施、2認知・予測運動制御と捕捉能力評価の関係についての検討であったが、当該年度は認知・予測能力の評価タスクと捕捉能力の評価タスクを実施した。予測能力の評価タスクでは、コンピュータグラフィックスによって構築された仮想環境において、水平移動する物体を再現した。物体は、移動途中で遮蔽板の後方を移動することにより見えなくなる。遮蔽後、視覚刺激(遮蔽板の変色)を提示し、その時の位置を回答させた(統制条件)。また、同じタスクにおいて、遮蔽板の上部と下部にストライプフロー(短い縦線の列が動く)を提示し、タスクの際に外乱を与えながら、その状況において位置を回答させた(フロー条件)。タスクによって得られた予測位置の結果から各被験者の遮蔽後の物体運動速度を計算し予測能力を評価した。一方、認知能力の評価タスクでは、仮想環境において、推計移動する物体を見ながら視覚刺激を提示した時の位置を回答させ、認知した位置から運動速度を計算した。捕捉能力評価タスクでは、飛来ボールの捕捉タスクと垂直落下ボールの捕捉タスクを実施した。これらの成功率と認知能力評価タスクと予測能力評価タスクによって得られた結果との関係について検討したが、特筆すべき関係性は見いだせなかった。次年度において、被験者数を増やし実験データを収集するとともに実験タスクを再検討し、更に実験を進める予定である。また、運動物体の認知・予測能力における加齢の影響について検討するため、65才以上の高齢者を対象に認知予測課題を実施した。若年者では、遮蔽後の物体運動速度が実速度の38%であったのに対し、高齢者では45%と若年者よりも高い値を示した。若年者と高齢者において異なる傾向を示したことから、加齢による予測能力への影響が考えられた。次年度は、被験者数を更に増やし検討する予定である。平成27年度は、1認知・予測能力と捕捉能力評価の関係、2失敗要因、3認知・予測能力における加齢の影響について検討した。タスクでは、仮想環境において水平移動する物体を再現した。予測能力の評価タスクでは、物体が移動途中で遮蔽板の後方を移動し見えなくなる。また、同じタスクにおいて遮蔽板の上部と下部にストライプフローを提示し、外乱を与えつつ位置を回答させた(フロー条件)。認知能力の評価タスクは、物体が遮蔽板の前面を移動する際に視覚刺激を提示し、その時の位置を回答させた(可視条件)。各タスクによって得られた予測位置と認知位置の結果から各被験者の遮蔽後の物体運動速度(予測速度)と可視物体の運動速度(認知速度)を計算し、予測能力と認知能力を評価した。捕捉能力の評価タスクでは、昨年同様垂直落下ボールの捕捉タスクを実施した。これらの捕捉成功率と認知・予測速度との間に特筆すべき関係性は見いだせなかった。予測タスクの際、指またはマウスの追尾動作によりフィードバックを行い、位置予測する実験を実施した。結果は、統制条件フロー条件とほぼ同様の速度であった。運動物体の脳内イメージを具現化する指やマウスの動き自体が実速度より低下しているため、予測処理プロセスにおいてエラーが生じている可能性が示唆された。これが失敗の要因の一部である可能性が考えられる。60才以上の成人を対象に認知課題と予測課題を実施した。

予測速度は、実速度に対して若年者39.1%、高齢者44.7%であった。また認知速度は、実速度に対して若年者92.4%、高齢者82.7%であった(p<0.05)。これは加齢に伴い実際の運動物体速度を遅く認知すること示唆し、加齢の影響を実験的に証明するものである。したがって加齢は予測機能よりも視覚認知機能に大きく影響することが示唆された。本研究は、仮想環境において運動物体の認知・予測課題、運動制御課題を用いて実施した。様々な条件における実験結果から、運動物体の捕捉までの一連のプロセスの中で、予測プロセスにおいてエラーが生じる可能性が示唆された。また、若年者群と高齢者群における運動物体の認知課題と予測課題の結果を比較することにより、可視条件における運動物体の認知特性に加齢の影響が顕著に表れることが判明した。運動制御実験タスクの検討に遅延が生じている。そのため、運動制御能力と認知能力および予測能力の関係について未検討である。また、捕捉実験における実験施設(体育館)の確保が授業等とバッティングすることにより、実験施設の確保が困難である。体育学次年度に運動制御実験タスクの検討し実施する。実験日程を調整し実験施設を確保する。遅延が生じている分、次年度の研究計画に影響するため、極力実験実施を急ぎたい。実験タスクの検討に遅れが生じている。実験タスク検討には、予備実験の実施が重要であるが、その実施に遅延が生じたためタスクの検討に遅れが出ている。また実験施設の利用可能時間帯と被験者の実験参加可能時間帯が合わなかった点も、計画の遅れの原因となった。3月中にも実験を行ったため、被験者謝礼の精算が当該年度の締め切りに間に合わず、次年度に繰越となった。実験施設の利用可能時間帯における参加可能な被験者の確保につとめる。次年度は、実験、分析、学会、投稿関連費用等に使用する予定である。実験では、実験装置作成のための材料や備品の購入、分析に関わる費用、被験者およデータ処理の補助者への謝金に使用する。学会関連では、学会参加費、旅費として使用する。投稿関連では、投稿料、英文ネイティブチェック等の費用に使用する。物品購入時、可能な限り価格の安いものを選び購入したため。運動制御課題実験の装置部品の費用に充当予定である。
細胞間接着を導くジッパー状分子の創製と細胞間相互作用の時空間的解析手法の確立

同種あるいは異種の細胞間の相互作用は、発生から免疫反応あるいは癌の転移現象など、ほとんどの生命現象で重要な役割を担う基本現象の一つである。本研究では、同種あるいは異種の細胞間で起きる生物学的な細胞間相互作用を調べる材料開発と、その手法の確立が目的である。脂質二重層である細胞膜と疎水性相互作用する両親媒性高分子(例えば、ポリエチレングリコール結合脂質の誘導体)に、細胞同士の接着を誘導する単鎖DNAや相互作用するオリゴペプチドを結合したジッパー状分子を合成し、同種あるいは異種の細胞同士を接着させ、細胞間相互作用や細胞融合の検討を行ってきた。本年度では、昨年度から引き続き膜融合タンパク質を模倣したジッパー状分子の創製を目指した。引き続き、同種細胞のみならず異種細胞同士の接着を誘導するため、単鎖DNAあるいは膜融合タンパク質由来のペプチド配列を選択し、細胞同士の融合を引き起こす分子設計の検討と細胞融合条件の最適化を含む検討を行った。PEG脂質末端に単鎖DNAあるいはオリゴペプチド(異なる2種類のペプチド配列)を結合させることで、同種細胞のみならず異種細胞同士を自在に接着させることが可能であることを明らかにできた。スペーサーの分子量や細胞表面への修飾濃度を変化させることで、自在に細胞接着が制御できた。また、細胞融合を引き起こす条件検討を行ったところ、効率よく細胞融合を引き起こすジッパー状分子の分子設計と条件を明らかにすることができ、最適化に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、同種あるいは異種の細胞間で起きる生物学的な細胞間相互作用を調べる材料開発とその手法の確立が目的である。細胞膜と疎水性相互作用する両親媒性高分子であるポリエチレングリコール結合脂質と単鎖DNAが結合したssDNA-PEG脂質を合成し、ジッパー状分子として細胞の表面修飾に利用した。相補配列を有する単鎖DNAの組み合わせを利用することで、同種あるいは異種の細胞同士を接着させることに成功し、併せて、細胞膜上へのssDNAの導入率を制御することで、細胞同士の接着状態を制御できることを見出した。また、ジッパー状分子を利用して、正常細胞とがん細胞の細胞間接着を誘導した後に、細胞同士の相互作用を調べたところ、正常細胞がガン細胞内部へ取り込まれる挙動を発見した。詳細については、現在解析中だが、ジッパー状分子による細胞同士の特異的な相互作用を調べることを実証できた。本研究は、実験計画に通り、概ね順調に進展している。細胞同士の接着をジッパー状分子の表面密度により制御できることを見出せたことから、その接着挙動を容易に調べることが実現できた。同種あるいは異種細胞同士間の細胞間相互作用は、発生から免疫反応であるいは癌の転移現象など、ほとんどすべての生命現象で中心的な役割を担う基本現象の一つである。本研究では、同種あるいは異種細胞間で起きる生物学的な細胞間相互作用を調べる材料開発とその手法の確立が目的である。疎水性相互作用により細胞膜へ導入される両親媒性高分子であるポリエチレングリコール結合脂質(PEG脂質)と単鎖DNAが結合したssDNA-PEG脂質を合成し、ジッパー状分子として、様々な細胞の表面修飾に利用した。相補配列を有する単鎖DNAであるpolyA20とpolyT20の組み合わせを利用することで、同種あるいは異種細胞の接着を誘導でき、その表面修飾率によりその接着状態を制御できることを見出している。ジッパー状分子を利用して、正常細胞とガン細胞同士の細胞接着を誘導し、細胞同士の相互作用を詳細に調べたところ、正常細胞がガン細胞内部へ取り込まれる現象がわかり、この相互作用は、E-カドヘリンが大きく関与して起きる反応であることがわかった。また、ジッパー状分子を用いて細胞同士の接着を強く誘導した場合に、この現象が多く見られることから、異種細胞同士の特異的な相互作用によるものであることが分かった。また、細胞融合を引き起こすジッパー状分子の設計に着手しており、接着海面の距離を制御するため、様々なDNA配列とDNA鎖長、PEG鎖長を用いて検討した。本研究は、概ね実験計画通りに進展している。異種細胞同士の細胞間相互作用を詳細に解析でき、次に、細胞融合を研究に着手できている。脂質二重層である細胞膜と疎水性相互作用する両親媒性高分子(例えば、ポリエチレングリコール結合脂質の誘導体)に、細胞同士の接着を誘導する単鎖DNAを結合したジッパー状分子を合成し、同種あるいは異種の細胞同士を接着させ、細胞間相互作用や細胞融合を検討してきた。本年度では、平面二分子膜のモデル細胞膜を用いて、細胞同士の接着や融合過程を詳細に検討することを目的とした。ここでは、リポソームのベシクル融合法を用いて、平面脂質膜モデルを作成し、共焦点レーザー顕微鏡ならびに全反射蛍光顕微鏡により細胞との接着と融合を観察し、その過程を観察した。PEG脂質により短鎖DNAを導入した細胞は、相補配列を有するDNA'を導入した平面二分子膜に選択的に接着して、細胞の接着が見られた。この細胞の接着反応は、DNA同士のハイブリダイゼーションによる特異的な反応であることを確かめた。

また、その細胞接着では細胞がDNA同士のハイブリダイゼーションの形成に伴い、大きく進展していくことが分かった。これは、細胞同士の接着と同じ現象が起きていることが分かり、平面二分子膜モデルが実際の細胞膜を反映していることが分かった。ただ、細胞融合が起きるまで接着が進行せず、接着するにとどまっていたことが分かった。おおむね予定通りである。同種あるいは異種の細胞間の相互作用は、発生から免疫反応あるいは癌の転移現象など、ほとんどの生命現象で重要な役割を担う基本現象の一つである。本研究では、同種あるいは異種の細胞間で起きる生物学的な細胞間相互作用を調べる材料開発と、その手法の確立が目的である。脂質二重層である細胞膜と疎水性相互作用する両親媒性高分子(例えば、ポリエチレングリコール結合脂質の誘導体)に、細胞同士の接着を誘導する単鎖DNAや相互作用するオリゴペプチドを結合したジッパー状分子を合成し、同種あるいは異種の細胞同士を接着させ、細胞間相互作用や細胞融合の検討を行ってきた。本年度では、昨年度から引き続き膜融合タンパク質を模倣したジッパー状分子の創製を目指した。引き続き、同種細胞のみならず異種細胞同士の接着を誘導するため、単鎖DNAあるいは膜融合タンパク質由来のペプチド配列を選択し、細胞同士の融合を引き起こす分子設計の検討と細胞融合条件の最適化を含む検討を行った。PEG脂質末端に単鎖DNAあるいはオリゴペプチド(異なる2種類のペプチド配列)を結合させることで、同種細胞のみならず異種細胞同士を自在に接着させることが可能であることを明らかにできた。スペーサーの分子量や細胞表面への修飾濃度を変化させることで、自在に細胞接着が制御できた。また、細胞融合を引き起こす条件検討を行ったところ、効率よく細胞融合を引き起こすジッパー状分子の分子設計と条件を明らかにすることができ、最適化に成功した。本年度では、膜融合タンパク質を模倣したジッパー状分子の創製を目指した。ここでは、細胞同士の接着を誘導するため、単鎖DNAあるいは膜融合タンパク質由来のペプチド配列を選択し、細胞同士の融合を引き起こす分子設計の検討を行った。PEG脂質末端に単鎖DNAあるいはオリゴペプチド(異なる2種類のペプチド配列)を結合させて、細胞膜表面への導入挙動を詳細に調べ、定量的にその導入量を制御できることを明らかにした。
父親抗原特異的免疫寛容成立に与える精漿の役割

妊娠成立維持には母児間の免疫寛容が必須であり、父親抗原特異的制御性T細胞が一員を担っている。妊娠成立維持が破綻した不妊症や不育症の原因解明および治療探究に応用するため、マウスモデルを用いて父親抗原特異的制御性T細胞および同細胞を誘導する免疫寛容誘導性樹状細胞と精漿の関連性について検討した。マウスアロ交配では、精漿のプライミングにより、免疫寛容誘導性樹状細胞が着床直前より子宮で誘導され、父親抗原特異的制御性T細胞が着床直前より子宮所属リンパ節で誘導されていた。精漿が妊娠成立維持に免疫細胞を介して重要な役割を担っていると考えられた。免疫寛容が妊娠維持に必須であることは知られており、申請者はこれまでに制御性T細胞(Treg)が母児免疫寛容に重要な役割を果たすことを報告してきた。その誘導機序として父親由来の精漿が妊娠時の免疫寛容誘導を担っている可能性が示唆されている(Robertson SらBOR2009)。申請者はT細胞受容体から父親抗原特異的制御性T細胞をT細胞受容体レベルで正確に同定する手法を開発し、これまでに精漿プライミングにより着床1日前に父親抗原特異的Treg細胞が子宮所属リンパ節に集簇し、着床後に子宮に同細胞が集簇することを証明し、同細胞が着床前後で妊娠維持に非常に重要な役割を果たしていることを報告した(Shima Tら,JRI2015)。今回、精漿がどのような機序で免疫寛容を誘導するのかを、父親抗原特異的Treg、制御性樹状細胞、制御性NK細胞等の免疫細胞との関連性から明らかにすることを目的とし、研究を進めた。マウス妊娠における精漿存在の有無による各臓器における樹状細胞のpopulationおよびその変動をフローサイトメトリーを用いて解析した。精漿の免疫細胞への機能を検討するため、精嚢除去マウスを作成し、アロ交配させた。アロ交配では同系交配および非妊娠マウスに比較し、着床直前(day3.5)および着床直後(day5.5)で子宮局所においてMHCclassII発現低下、CD86分子発現低下、B7DC分子発現増強を認めた。一方で、精嚢除去マウスとのアロ交配では、上記分子発現は同系交配や非妊娠マウスと変化を認めなかった。精漿のプライミングが子宮における制御性樹状細胞の誘導に関連していると考えられた。現在この制御性樹状細胞の機能解析を施行しているところである。また、父親抗原特異的Treg細胞のさらなるPopulation解析および制御性NK細胞の変動についても検討中である。免疫寛容が妊娠維持に必須であり、申請者はこれまでに制御性T細胞(Treg)が母児免疫寛容に重要であるこをと報告してきた。その誘導機序として父親由来抗原を含む精漿が妊娠時の免疫寛容誘導を担っている可能性が示唆されている(Robertson SらBOR2009)。申請者は父親抗原特異的制御性T細胞をT細胞受容体レベルで正確に同定する手法を開発し、これまでに精漿のプライミングにより着床1日前に父親抗原特異的Treg細胞が子宮所属リンパ節に集簇し、着床後に子宮に集簇することを証明し、同細胞が着床前後で妊娠維持に非常に重要な役割を果たしていることを報告した(Shima Tら、JRI2015)。今回、精漿がどのような機序で免疫寛容を誘導するのかを父親抗原特異的Treg,制御性樹状細胞等の免疫細胞に注目し研究を進めた。マウス妊娠における精漿の有無による各臓器の樹状細胞のpopulationおよびその変動を明らかにするために、精嚢腺除去(SVX)マウスを作成し、アロ交配させ、正常アロ交配、正常同系交配、非妊娠マウスと比較した。着床直前(day3.5)および着床直後(day5.5)の正常アロ交配マウスの子宮局所に集簇している樹状細胞は、非妊娠マウスに比較し、MHCclassII発現が低下、CD86分子発現が低下、B7DC分子発現が増強していた。一方で、SVXマウスとのアロ交配では、上記分子発現は同系交配や非妊娠マウスと変化を認めなった。さらにその機能解析のため、脾臓または子宮から樹状細胞を回収し、非妊娠マウス由来リンパ球とMMC処理した父親由来脾細胞と混合培養しサイミジン取り込み試験を行った。正常アロ交配の子宮中の樹状細胞は、SVXマウスとのアロ交配の子宮中の樹状細胞や、脾臓中の樹状細胞に比較し、リンパ球増加を有意に抑制していた。以上より、精漿のプライミングが子宮局所(母児接点)に集簇する樹状細胞のpopulationを制御性樹状細胞に変化させ母児免疫寛容に関与していると考えられた。

精漿が妊娠成立維持に免疫細胞を介して重要な役割を担っていると考えられた。申請においては、平成26年度にはマウス精漿存在の有無における父親抗原特異的Treg細胞、制御性樹状細胞、および制御性NK細胞の変動および機能解析が本年度の研究予定としていた。どの細胞分画も微小であり、妊娠成立しサンプル採取をしても同時に上記細胞すべての解析が困難である。また、精嚢腺除去マウス(精漿のないマウス)と正常メスマウスとの交配も、通常の交配(正常オスマウス、正常メスマウス)に比較し効率が悪い状態である。このため、サンプル数確保に時間を要しているが、徐々にサンプル数を増やしその変動について確認しているところである。産科婦人科平成26年度に予定していた研究はやや遅れているものの、現時点では解析の見通しがたっている状態であり、継続していく。研究進展を改善するために、適宜マウス妊娠効率を確認しながら研究を進めていく必要がある。本年度予定の研究が終了次第、平成27年度予定の研究にすすめていく予定である。研究の進行状況にあわせて費用を使用した。次年度も研究継続予定であったため、当初より次年度使用額が生じるように使用した。物品費として、実験動物であるマウス購入費および飼料などを含めた飼育量、DNAマイクロアレイきっとの購入、フローサイトメトリーのための抗体購入費に使用する計画である。また、人件費および研究発表のための旅費や論文投稿料に使用する予定である。
表面非晶質化による金属材料の生体適合性向上に関する研究

材料の生体親和性は材料表層の物理・化学的物性に強く依存する。一般に金属の窒化物や炭化物は元の金属に比べて化学的に安定で、生体適合性も高いと考えられている。また金属は通常、結晶質であるが、一部の金属では溶融状態から超急冷することにより非晶質化することが知られており、非晶質金属では結晶質の場合と比べて種々の特性が向上することが知られている。近年、歯科用としても普及してきた高出力のレーザーを用いると、非接触で局部のみを急熱・急冷することが可能となり、通常の熱処理に比べて表面のみを限局的に処理することが可能となる。そこで本研究では、第一に各種金属試料表面にNd-YAGレーザーを雰囲気・照射条件を変化させて照射し、その表面性状や状態の変化を調査した。その結果、チタンにおいては窒素雰囲気中で照射することにより、表面にごく薄い窒化チタン層を形成することが可能であることが判明した。窒化チタンは硬度が高く、耐摩耗性に優れるため、レーザー照射により任意の部位に窒化チタンを形成することにより、耐摩耗性が要求される部位のみに処理を施すことが可能であることが判明した。さらに生体内での金属材料の耐食性や生体適合性、溶出金属元素の生体内での化学状態を調べる観点から、金属インプラント周囲の軟組織をX線分析顕微鏡を用いた元素分布測定および放射光を用いたX線吸収微細構造(XAFS)測定により評価した。チタン及びニッケル埋入部周囲の生体軟組織中には各元素の溶出が明瞭に観察され、XAFS測定からチタンは金属粉末または酸化物として分布し、ニッケルは水和イオンに近い状態で分布しており、この状態の差がチタン及びニッケルの生体親和性に関係していると推定された。この分析手法は放射光によるXAFS測定を生体内微量元素の測定に応用しており、XAFS測定が生体内の微量元素の状態分析に極めて有効であることが示された。そこで本研究では、各種金属材料表面をレーザー照射により急熱・急冷し、表面を非晶質化及び表面に窒化物や炭化物などの薄い改質層を形成させることで、各種物性や生体適合性を改善させる目的で研究を行った。対象として用いた金属は歯科材料として一般的な、チタン及び金パラジウム銀合金である。これら金属材料にレーザー溶接機を用いて表面改質を行い、その変化をX線回析測定装置で解析した。チタンの場合は不活性ガス中でレーザー照射をした場合には目立った変化はなく、大気中では表面に不定比の酸化物と思われる相が見られ、一部窒化物相が検出された。窒素中で行った場合には表面に主として窒化物が形成され、その厚みはレーザー出力の上昇と共に増加した。金属の窒化物は一般に化学的に極めて安定であり、生体適合性にも寄与することが期待される。また金パラジウム銀合金では一部の試料で非晶質に近いX線回析パターンを示した。多くの試料では通常の鋳造を終えた状態の同合金が2相(Ag rich相とCu rich相)に分離しているのに対して、レーザー照射した部位では急熱・急冷により溶体化処理と同様の効果によって単相化することが判明した。

光学顕微鏡による観察でもレーザー照射による単相化は確認された。通常、耐食性において複数相からなる合金では各相のイオン化傾向の違いにより合金内部で局部電池が形成されるため単相合金より耐食性が落ちるとされ、レーザー照射による単相化は耐食性の向上に寄与し得ると考えられた。材料の生体親和性は材料表層の物理・化学的物性に強く依存する。一般に金属の窒化物や炭化物は元の金属に比べて化学的に安定で、生体適合性も高いと考えられている。また金属は通常、結晶質であるが、一部の金属では溶融状態から超急冷することにより非晶質化することが知られており、非晶質金属では結晶質の場合と比べて種々の特性が向上することが知られている。今年度は、各種金属試料の耐食性を調べる観点から、金属インプラント周囲の軟組織中へのチタン等の移行、溶出を調査した。実験はチタンインプラント二次手術の際に患者より除去された口腔粘膜組織を凍結乾燥し、以下の分析に供した。なお本実験は北海道大学大学院歯学研究科倫理委員会の認可の元で行った。最初にX線分析顕微鏡(XSAM)により試料中のTiの分布状態を確認した。X線吸収微細構造(XAFS)測定は高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光科学研究施設(KEK-PF)BL-9Aにて行った。XSAMによりTiの局在が確認された2試料について、局在部位を中心に透過法及び蛍光法によりXAFSスペクトルを測定した。蛍光法は19素子半導体により行った。チタンを含む口腔粘膜組織のXSAMによるTi分布像から組織中のTiは点状(粒子状)に分布する場合と広範囲に広がって分布する場合があることが判明した。XAFS測定から粒子状に分布しているTiでは金属Tiの特徴を持つスペクトルが得られ、同試料中に存在しているTiが金属状態と推測される。すなわちこのTiはインプラント埋入時などに発生した摩耗粉のような金属Ti粒子と考えられた。また広範囲に分布したTiではXAFSスペクトルにおいてTiO_2(anatase)と思われるTiが検出された。これはTiが溶出し組織内で再析出した可能性を示すものであるが、Tiの溶解度を考えると組織内への溶解を結論づけるには更に検討が必要であると考えられる。以上より、XAFS測定が生体内の微量元素の状態分析に極めて有効であり、Tiインプラントの生体内での挙動について興味深い知見が得られた。実験は純チタン及びニッケルチタン合金の円柱材をラット皮下に埋入し、種々の期間飼育した後、周囲組織を摘出し、以下の分析に供した。XSAMによりTi及びNiの高濃度部位を特定し、同部位を中心に透過法及び蛍光法によりXAFSスペクトルを測定した。
風圧・風向可変制御デバイスによるアクティブ制振システムの開発

可動翼を利用して風圧・風向を変化させ、風の力により構造物の揺れを制御する制振システムであるアクティブフィンシステムの実用化ための課題、特に有効な2方向制振を行うための制御アルゴリズムの開発についての検証を行った。1.実験装置(1)振動方向1自由度型構造物模型---構造物模型の振動方向と風向との関係をパラメータとし、アクティブフィンによる制御効果の変動を検証した。(2)振動方向3自由度型構造物模型---水平2方向の振動成分とねじれ成分をもつ、より実構造物に近い形式の構造物模型に対して、風による揚力・抗力を有効に利用した2方向制振方式についての検証を行った。2.可動翼の受ける受風圧の特性(1)可動翼の種々の形状に対する翼の迎角と受風圧との関係について準静的な特性を調べた。(2)可動翼の駆動にともなう受風圧の変動の動的な特性を調べた。3.制御装置(1)単一可動翼による制御システムの検証。(2)補助可動翼を利用した制御システムの検証。4.制御アルゴリズム(1)可動翼周辺の風の流れの変化と、可動翼の受ける受風圧の変動とをマクロな物理現象としてモデル化し、この力学的モデルに基づく制御力生成メカニズムを考慮した制御アルゴリズムを構築した。(2)振動方向3自由度型構造物モデルに対して適用可能な、より実際的な2方向制振アルゴリズムを構築した。5.制御システムの検証(1)実構造物の風による振動の実地調査を行い、データを採集するとともに、実機レベルの制振装置による制御効果のバックデータを得た。(2)風洞での、縮小モデルを用いた風振動制振実験を行うことにより、アクティブフィンの2方向制御アルゴリズムを、より最適なものとして修正した。(3)可動翼による制御力の力学的モデルをもとに数値シミュレーションを行い、実験結果を検証した。
補体レクチン経路の自然免疫における役割と活性化機構

マンノース結合レクチン(MBL)やフィコリンは自然免疫において重要な働きをしていることから生体防御レクチンと呼ばれている。ヒト血清中のMBLやフィコリン(L-ficolin/P35と博多抗原)には補体成分のC1r, C1s様構造を持つセリンプロテーゼMASP(MASP-1,MASP-2,MASP-3)と低分子量蛋白sMAPが結合している。MASP-3はMASP-1遺伝子の、またsMAPはMASP-2遺伝子のスプライシングバリアントである。MBLやフィコリンが一旦細菌等の糖鎖へ結合すると、MASPによりC2,C3,C4が分解され、補体レクチン経路が活性化される。レクチン経路は生体防御や、一方で病態とも関係していると推定されるがその詳細は不明である。そこで、本研究ではMASP-1/-3や、MASP-2/sMAPのノックアウトマウスを用いてレクチン経路の生体内での意義を明らかにする。また、マウスのレクチン経路を解析することにより、未だ不明な活性化機構の全体像の解明を目指す。次の成果が得られた。(1)ジーンターゲッティーング法により作製したMASP-1,MASP-3ホモ型欠損マウス(以下、Masp-1/3(-/-))の血清から部分精製したMBL-MASP複合体にはMASP-2とsMAPが含まれているが、Masp-1/3(-/-)血清をマンナンと反応させると、MASP-2の活性化がMasp-1/3(+/+)血清に比べて低下していることがわかった。この系において、Masp-1/3(-/-)血清にヒトMASP-1/3を添加すると、Masp-1/3(+/+)血清による活性化のレベルまで回復した。また、Masp-1/3(-/-)においてMBL-A, MBL-C共にMasp-1/3(+/+)に比べて低値を示した。(2)マウス血清よりN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)-アガロース等を用いてficolin-Aを部分精製した。MonoQ上、ficolin-A画分に一致してMASP-1,MASP-2とsMAPが含まれていた。ficolin-AとMASPs/sMAPとの結合はカルシウムイオン依存性であり、複合体はGlcNAcに結合するとC4を活性化したことから、マウスのficolin-Aもヒトのficollinと同様にMASPとの複合体としてレクチン経路を活性化することが明らかになった。次の成果が得られた。
イネの品種間差を利用したヒ素の吸収と蓄積についての分子生理学的解析

本研究はヒ素の蓄積や輸送に違いを示す各種イネ品種を用いて、農業上有用なヒ素低減遺伝子を同定することを目的として開始したものである。これまでにシロイヌナズナやイネを用いた分子遺伝学的研究によって、ヒ素の輸送や蓄積、耐性に関与する遺伝子が同定されてきている。ヒ素は基本的には毒物であるため、植物はヒ素特異的な吸収(取込み)のためのトランスポーターは持っていないと考えられている。例えば、シロイヌナズナのヒ酸を輸送するトランスポーターは本来は化学的に似たリン酸を本来の基質とするし、亜ヒ酸を輸送するトランスポーターは化学的に似たケイ酸を本来の基質としている。昨年度までにイネにおけるヒ酸輸送を担う分子の同定を目指してイネのリン酸トランスポーターの中からヒ酸輸送を担う可能性のあるリン酸トランスポーター遺伝子の変異株を入手しヒ酸吸収が低下していることを確認ていたが、今年度はこの変異株にリン酸トランスポーター遺伝子を導入し直して表現型が回復することを確認した。これによってリン酸トランスポーターがヒ素吸収に重要であることが示された。また、イネに酵母由来の排出型亜ヒ酸トランスポーターを発現させる実験については、昨年度までに得られていた形質転換系統について、ヒ素の排出活性があるかどうかを調べたところ、ヒ素の排出活性が高まっていることを明らかにした。これにより、ヒ素低減の新たな手法を提示した。本年度は最終年度にあたりリン酸トランスポーターがヒ素吸収に関与していることを証明するデータを得ただけでなく、ヒ素低減手法を確立することができ、当初の計画以上の達成度であると考えている。本研究は本年度が最終年度であり、目的とする結果は得られていることから、今後は論文としての発表に至る様に努力して行きたいと考えている。本研究はヒ素の蓄積や輸送に違いを示す各種イネ品種を用いて、農業上有用なヒ素低減遺伝子を同定することを目的としている。ヒ素毒性の被害は現在も中国、バングラデシュ、インドなどに存在し100万人以上が影響を受けていると推定されている。これら地域での主食であるイネから農業上役立つヒ素濃度を低減することのできる遺伝子や遺伝子座を同定することは、ヒ素輸送の基礎的知見としてだけでなく、応用上も極めて大きな意義を持つものである。Dr.Duanのこれまでのデータを参考にしつつ、受け入れ研究者の研究グループがこれまでに蓄積してきたノウハウを用いて、ヒ素蓄積や輸送の違いの原因についての解析を生理的、分子遺伝学的実験手法を駆使して行う計画として開始した。H21年度においては、まず、これまで中国でDuan博士が関与しつつ行われてきた各種イネのヒ素濃度データを解析することから開始した。平成21年度の実験データによると、それまでの試験で違いの見られた系統でもそれほど明確な子実のヒ素濃度の違いが見いだされなかった。この原因は明らかではないが、天候や土壌の性質、水管理の問題である可能性は考えられる。しかしながら、当初の計画にあった、各種イネのヒ素濃度の系統間の差異を元にした解析を進めることが難しくなったため、ヒ素の吸収や移行に関与する可能性のある遺伝子をリストアップし、どの遺伝子に着目した研究をすべきか検討した。その結果、アクアポリンに相同性を示す遺伝子やリン酸輸送体遺伝子を候補にすることとし、各種系統の収集や解析に必要なクローンの整備などを進めた。本年度はイネのヒ素輸送機構の解析とイネにおけるヒ素集積の低減を目的に二つの研究を進めた。一つはイネにおけるヒ酸輸送を担う分子の同定である。イネにおいてはヒ酸輸送を担う分子が明らかでなく、シロイヌナズナの研究を基にイネのリン酸トランスポーターの中からヒ酸輸送を担う可能性のあるリン酸トランスポーター遺伝子の変異株を入手しヒ酸吸収が低下していることを確認した。この変異株にリン酸トランスポーター遺伝子を導入する実験を進めた。現時点では形質転換植物は未だ得られていないが形質転換は進行している。もう一つはイネに酵母由来の排出型亜ヒ酸トランスポーターを発現させる実験である。形質転換系統を複数取得し、その種子でのヒ素蓄積を測定したところヒ素蓄積が低下している傾向が認められた。

例えば、シロイヌナズナのヒ酸を輸送するトランスポーターは本来は化学的に似たリン酸を本来の基質とするし、亜ヒ酸を輸送するトランスポーターは化学的に似たケイ酸を本来の基質としている。昨年度までにイネにおけるヒ酸輸送を担う分子の同定を目指してイネのリン酸トランスポーターの中からヒ酸輸送を担う可能性のあるリン酸トランスポーター遺伝子の変異株を入手しヒ酸吸収が低下していることを確認ていたが、今年度はこの変異株にリン酸トランスポーター遺伝子を導入し直して表現型が回復することを確認した。これによってリン酸トランスポーターがヒ素吸収に重要であることが示された。また、イネに酵母由来の排出型亜ヒ酸トランスポーターを発現させる実験については、昨年度までに得られていた形質転換系統について、ヒ素の排出活性があるかどうかを調べたところ、ヒ素の排出活性が高まっていることを明らかにした。これにより、ヒ素低減の新たな手法を提示した。本年度は最終年度にあたりリン酸トランスポーターがヒ素吸収に関与していることを証明するデータを得ただけでなく、ヒ素低減手法を確立することができ、当初の計画以上の達成度であると考えている。本研究は本年度が最終年度であり、目的とする結果は得られていることから、今後は論文としての発表に至る様に努力して行きたいと考えている。
無細胞膜タンパク質合成技術を基盤とした熱帯熱マラリア原虫の赤血球レセプター探索

マラリア原虫は赤血球表面のタンパク質と相互作用することによって、赤血球に侵入し感染を成立させると考えられている。そこで本研究室にある約200種類の原虫・宿主タンパク質に対する抗体(約200種)を用いて、大規模に免疫沈降を行った。その結果ワクチン候補分子として注目される、原虫のGAMA分子と相互作用するタンパク質、GAAPタンパク質を見出すことに成功した。両タンパク質はKd = 2.5 nMという、抗原抗体反応に匹敵するほど強い相互作用を有することが明らかとなった。結合ドメインの同定を行った結果GAMA分子の100アミノ酸からなるドメインがGAAPとの結合に重要であることが明らかとなった。マラリア原虫メロゾイトの赤血球侵入に関するタンパク質相互作用は、ほとんど明らかにされていない。本研究は、原虫リガンドに対する赤血球レセプター分子の網羅的な探索技術の確立をを行うものである。赤血球表面のタンパク質は膜貫通領域を持つ膜タンパク質である。そのため赤血球レセプター分子の網羅的な探索技術の開発は、「膜タンパク質の合成」という大腸菌等の既存のタンパク質合成法では実施困難な技術的障壁に阻まれていた。最近当センターでは、リポソームを添加したコムギ無細胞系を用いてタンパク質を合成するとプロテオリポソームが形成され、様々な膜タンパク質が高確率で合成される技術を確立した。さらに、ビオチン化プロテオリポソームを利用したアルファスクリーンによる膜タンパク質相互作用のハイスループットスクリーニング系も確立した。そこで申請者は、赤血球表面の膜タンパク質をビオチン化プロテオリポソーム上に合成し、マラリア原虫赤血球レセプター分子の網羅的な探索を行う本研究を着想した。【ビオチン化リポソームを用いたヒト赤血球膜タンパク質の網羅的合成】リポソーム上に発現させるタンパク質を、血液型抗原、ヒト赤血球のプロテオーム解析による膜貫通領域を持つタンパク質、さらに既報論文にある情報によって選定した(計90種程度)。当研究センターが所有するヒト完全長cDNAライブラリからこれらのクローンを得て、発現ベクターpEUにサブクローニング後、ビオチン化リポソーム存在下でコムギ無細胞合成系によって膜タンパク質を合成した。【プロテインタグ融合マラリア原虫リガンドタンパク質の合成】赤血球表面のタンパク質は膜貫通領域を持つ膜タンパク質である。赤血球表面タンパク質ライブラリーの構築に予想よりも時間がかかってしまい、予定していたアルファスクリーニングを基盤とした、原虫リガンド-赤血球レセプター相互作用スクリーニングは未だ達成されていない。そこで、実験方法と実験計画を見直すことにした。当初から当該年度に実施予定だった免疫沈降法によるタンパク質複合体の検出を前倒しで行った結果、GAMAと相互作用するタンパク質、GAMA associated protein (GAAP)を同定することができた。続いて、組換えGAMA-GAAPタンパク質複合体をin vitro再構成を試みた。組換えGAAPタンパク質のN末端にビオチン、組換えGAMAタンパク質のN末端にGSTタグを付加したものを用意し、お互いを混合してインキュベートした後、タンパク質複合体形成をアルファスクリーンで検出した。その結果、タンパク質複合体形成特異的なシグナルを検出することができた。以上のことから、複合体形成を確認できただけでなく、当該複合体を標的にした薬剤スクリーニング系の確立に成功した。そのため、赤血球レセプター分子の網羅的な探索技術の開発は「膜タンパク質の合成」という大腸菌等の既存のタンパク質合成法では実施困難な技術的障壁に阻まれていた。最近当センターでは、リポソームを添加した小麦無細胞系を用いてタンパク質を合成するとプロテオリポソームが形成され、様々な膜タンパク質が高い確率で合成される技術を確立した。さらにビオチン化プロテオリポソームを利用したアルファスクリーンによる膜タンパク質相互作用の愛スループットスクリーニング系も確立した。そこで申請者は赤血球表面の膜タンパク質をビオチン化プロテオリポソーム上に合成し、マラリア原虫赤血球レセプター分子の網羅的な探索を行う研究を着想した。赤血球レセプター分子を網羅したタンパク質ライブラリーの構築が予想以上に時間がかかることが明らかになったため、本研究室にある、約200種類の原虫・宿主タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて、網羅的に免疫沈降を行った。その結果、ワクチン候補分子として注目されている、GAMAに対する相互作用分子、GAAPタンパク質を見出すことに成功した。続いてGAMA・GAAPタンパク質の相互作用をBiacoreによって解析した結果、Kd =2.5 nMという抗原抗体反応に匹敵するほど強い相互作用を有することが明らかになった。

研究計画どおり、両タンパク質の結合ドメインの同定を行った結果、GAMA上のN末側100アミノ酸長からなるドメインとKd = 10nM程度で相互作用することが明らかになった。マラリア原虫は赤血球表面のタンパク質と相互作用することによって、赤血球に侵入し感染を成立させると考えられている。そこで本研究室にある約200種類の原虫・宿主タンパク質に対する抗体(約200種)を用いて、大規模に免疫沈降を行った。その結果ワクチン候補分子として注目される、原虫のGAMA分子と相互作用するタンパク質、GAAPタンパク質を見出すことに成功した。両タンパク質はKd = 2.5 nMという、抗原抗体反応に匹敵するほど強い相互作用を有することが明らかとなった。結合ドメインの同定を行った結果GAMA分子の100アミノ酸からなるドメインがGAAPとの結合に重要であることが明らかとなった。研究計画を見なおした結果、交付申請書に記載した「研究目的」の前半である「スクリーニング系の確立」の研究期間内での達成は難しいと考えられる。しかしゴールである「原虫リガンドと相互作用するタンパク質の同定」は達成することができた。寄生虫学今後は、Biacoreによる表面プラズモン共鳴解析を行い、当該タンパク質複合体の解離定数など詳細な生化学的なパラメターを明らかにすることを予定している。またゲルろ過による分子量測定を行い、当該複合体がどのようなサブユニット構造を持つのかについても検討予定である。また、複合体に対する抗体や、阻害剤を見出すことによって、当該タンパク質複合体の原虫侵入に於ける機能を明らかにしたいと考えている。一回膜貫通タンパク質がビオチン化リポソーム上に配列せず、可溶性のタンパク質として発現する傾向にあることがわかった。そのため、赤血球膜タンパク質とマラリアタンパク質相互作用を検出する系が機能しない。これはコムギ無細胞系に使われるコムギ胚抽出液に含まれる脂質と相互作用することにより、膜タンパク質が可溶化されているものと考えられた。このため、組換えタンパク質のビオチン化法を再検討する必要が生じた。年度末直前で出張予定を変更したため一回膜貫通タンパク質をビオチン化させる方法を変更した。タンパク質のN末端にビオチンリガーゼ認識部位(BLS)を融合させ、コムギ無細胞系によるタンパク質合成と同時にビオチン化を行う。そのためのヒト赤血球タンパク質のサブクローニングを順次行っている。全体的な実験予定に変更の必要はないと考えている。直接経費として使用する予定
「スーパー抗体酵素」を用いた新型バイオセンサの開発と実用化

1)数十の抗体遺伝子の解析と、その抗体サブユニットの酵素的反応性を徹底的に調べた。その結果、酵素活性を示した抗体には触媒三ツ組残基様構造があるという特徴が認められたことから、この構造を有する抗体の割合を検索した。PDBに登録されているモノクローナル抗体、および我々の所有するモノクローナル抗体、計91株について可変領域の立体構造を解析したところ、約30%もの割合で触媒三ツ組残基様構造が認められた。これは、遺伝子レベルで酵素活性が用意された抗体の存在を示唆する重要な知見である。これを検証する目的で、立体構造解析の結果から触媒三ツ組残基様構造を持つと推定されたモノクローナル抗体について酵素活性の有無を検討し結果、いくつかの抗体においてペプチダーゼ活性が認められ、触媒三ツ組残基様構造と酵素活性の関係を裏付ける結果となった。2)3年間研究でいくつかの新しい天然型抗体酵素(「スーパー抗体酵素」はこの中に含まれる)を見出す事ができた。i41SL1-2抗体L鎖およびi41SL1-2抗体H鎖は、共に、短い「誘導期」とこれに続く活性期の二相性を示しながら抗原ペプチドを分解しており、中間分解産物を解析した結果、セリンプロテアーゼと同様の挙動を示した。trypsinと比較すると、親和性においてはtrypsinより高い値を示し、kcatは逆に低い値を示した。触媒効率(kcat/Km値)はほぼ同様であった。即ち、抗原認識において天然型抗体酵素は抗体の性質をそのまま残し、ゆっくりと抗原を分解しており抗体と酵素の中間に位置する分子であることが判った。i41-7抗体L鎖は各種の短鎖ペプチドをほぼ完全に分解し、しかも、抗原タンパク質をある程度特異的に分解し、また、一般的なペプチドを非特異的に分解する新たな天然型抗体酵素である事が判明した。3)Ru錯体がアミノ酸やペプチドと反応する事により発光する現象を利用した新しいセンシングシステムを構築している段階であるが、抗原や抗体の検出に応用するための適切な電極と測定の最適条件を探索した。その結果、電極にはAuが最適であり、これを使ってペプチドが10^<-6>/Mの感度で検出できる事が判った。また、N末にプロリンを付加することによりセンサとしての実用化が現実的になった。本年度の研究計画は1)現在我々が有している「スーパー抗体酵素」をバイオセンサに使用した場合を想定して、活性面からその基礎データを採取する。2)「スーパー抗体酵素」を使ってのバイオセンサ構築の最適な方法を探る。3)現在当研究室で開発した「スーパー抗体酵素」(2種類)はともにエイズウイルスタンパクに関連したものであるが、これらを用いて大量発現系の確立に取り組む。4)「スーパー抗体酵素」に点突然変異の導入したり分子進化工学的改良を目的として、遺伝子的変異を加えより高機能化する。5)「スーパー抗体酵素」は高活性を示す前に誘導期が存在するが、「スーパー抗体酵素」がどのようなコンフォーメーションを取ったときに最も酵素活性が高くなるのか究明する。6)目標となる各種のモノクローナル抗体についてその遺伝子配列を決定する。という事であった。1)については「スーパー抗体酵素」がpMのオーダーで活性を持つことを明らかにした(未発表)。2)についてはSPRおよびRuを使った電解発光電極を作製しその性能を評価した。次年度電解発光電極にさらなる改良を加える事にした。3)および4)についてはpETおよびファージを使った発理系に取組んでおり、抗体酵素である軽鎖全体とその可変領域だけを発現させた。5)については誘導期に金属イオンが酵素活性獲得に重要な関与をしていることを明らかにした。6)については4クローンの抗体遺伝子配列が決定出来た。今回は計画の初年度であるが、研究計画書に述べた主要6項目についてまずまずの進展が見られた。特に「スーパー抗体酵素」の活性獲得の全容を明らかにしつつある点は目を見張る事が出来よう(論文を投稿および準備中)。一方で、センサ構築の手法がいろいろ考えられるのでこれを如何に効率的に網羅するかが次年度の課題である。抗体酵素の製造法については特許出願中である。本年度の研究計画は1)「スーパー抗体酵素」が「なぜ」酵素活性を発現するかについて、立体構造を含め根本的な視点から解析を行う。特に、金属イオンの役割、触媒三ツ組残基の有効性について明らかにする。2)「スーパー抗体酵素」により抗原ペプチドはアミノ酸に変化する事を利用してアミノ酸検出電極を試作誌、新しいセンシングシステム作りを行う。3)H.pylori菌に対する「スーパー抗体酵素」の探索に取りかかる。それにはこれら抗体の立体構造解析から触媒三ツ組残基を持つものを検索する。4)触媒三ツ組残基をもつ抗体に何か法則性があるか究明する。という主に4項目であった。1)については「スーパー抗体酵素」と抗原ペプチド(TP-41 or YP-41)との反応開始時にEDTAを数10μM添加すると「スーパー抗体酵素」のペプチダーゼ活性が完全に消失する事。そして30μMまではEDTAの添加濃度に依存してペプチダーゼ活性が抑制される事。この系に金属イオンをさらに添加すると再度ペプチダーゼ活性が完全に回復する事。この時の金属イオンとしてはFe,Zn,Caが有効である事。