hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T-box遺伝子ファミリー機能解析による先天性心血管疾患発症機構の解明

葉酸の作用機序および未知のepigenetic因子の特定を試みるため、正常餌および葉酸餌Tbx1発現低下マウス胎仔の遺伝子発現プロファイルを比較検討し、遺伝子pathwayに関わる上流CpG islandのDNAメチル化の変化を網羅的に解析した結果、Fibronectinをはじめとする胎生期の心臓発生に重要な役割を果たす複数の因子に有意な発現変化が認められた。Tbx1が機能する二次心臓領域細胞に対する上記因子の作用を検討するために、二次心臓領域由来の心臓前駆細胞を特異的に単離できるiPS細胞株をゲノム編集技術により樹立した。また、Tbx4の肺血管発生における機能解析について、Tbx4をノックダウン(KD)するRNAiを用いた実験、分子マーカーを用いた実験、血管新生・管腔形成能解析実験、ルシフェラーゼアッセイ、ChiPアッセイにより、Tbx4が下流の分泌性増殖因子であるFgf10の発現を直接調節することを証明し、Tbx4に制御される肺血管発生および肺動脈性肺高血圧に関与する新たな分子機序を解明した。Tbx20とTbx1による心疾患表現型の検討として、Tbx20のノックアウトマウスの作製に着手した。Tbx20の機能を喪失させるために変異を導入する部位を決定し、guide RNAをデザインして、CRISPR/Cas9システムを用いて変異を導入した。4系統の独立したマウスを得ることができ、いずれにも目的としたゲノム塩基配列に変異が導入されていることが確認された。上記研究実績概要に記載した結果より、研究目的の1つであるTbx1とepigenetic因子による心疾患表現型の検討については、Tbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子の作用による心血管疾患の表現型の変化を詳細に解析・解明するシステムを確立することができ、葉酸の作用および心疾患表現型を変化させる複数の環境・epigenetic因子が特定された。その分子機構を解明するための実験の進捗状況は良好である。Tbx4とTbx1による肺血管発生および異常の検討については、培養細胞系を用いたTbx4の機能解析は良好に進捗し、1つの分子経路が解明された。Tbx4遺伝子改変マウスの利用について、進捗が遅れている。Tbx20とTbx1による心疾患表現型の検討については、Tbx1の心疾患表現型の詳細な解析は良好に進捗した。一方、Tbx20遺伝子改変マウスについては、当初既存の公表されたものを入手する計画だったが、困難だったため樹立に着手した。まだ解析には至っておらず進捗が遅れているが、4系統の変異マウスラインが樹立し、次年度には解析を完了できる見通しである。以上、一部計画の遅れがあるものの、全体的には概ね計画書に沿った進捗状況と考える。交付申請書に記載した研究の目的に基づき、T-box遺伝子ファミリーのTbx1、Tbx4およびTbx20に着目して研究計画を実施した。先天性心臓流出路異常モデル動物であるTbx1発現低下マウスにおいて、葉酸により心血管疾患の表現型が変化することを明らかにし、遺伝子発現プロファイルおよびDNAメチル化の網羅的解析により、神経堤細胞の遊走・分化に関与するヘッジホッグシグナルの調節因子であるEfcab7の発現変化を明らかにした。葉酸による神経堤細胞の遊走・分化およびアポトーシスの救済により、Tbx1発現低下マウスの心疾患表現型が軽症化することが示唆された。
母体脳は胎仔脳の発達を制御しているか?

本研究の目的は、母体脳が胎仔脳の発達・分化に重要な役割をはたしているかどうかを検討することである。そのために,母体脳の視床下部内側部を電気刺激が、胎仔脳での神経栄養因子の発現に影響を与えるかどうかを検討した。まず、この実験を行う前にラット胎仔期での脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現の発達についてBDNFの抗体を用いた免疫組織化学法で実験を行った。その結果、胎生後期において、BDNFは胎仔脳で広範に明瞭に発現していることを確認した。さらに、BDNFの発現は同じ脳部位であっても胎仔ごとにかなりのばらつきがあった。次に、母体脳刺激によって影響を受ける胎仔脳部位を特定するために、Fos蛋白の抗体による免疫組織化学法を用いて母体脳刺激によって賦活される胎仔脳部位の同定を試みた。母体をネンブタール麻酔し、母体視床下部内側部を1mA,10発のパルストレインを2秒ごとにあたえて10分間刺激をした。その後、30分と2時間後に胎仔を取り出して後の実験に用いた。対照群は実験群と同様の手術を行い母体脳を刺激しなかった。その結果、Fosの発現は、胎仔脳の視床下部室傍核、視索上核、中隔において対照群と実験群の両方で観察された。両群で、Fos発現の強さに明らかな差を認めなかった。Fosの実験から、通常の手術等の動物に対する操作がストレスに関連した胎仔脳部位を賦活していることを示唆している。母体脳刺激による胎仔脳Fos発現実験と同様の方法で、BDNFの発現をBDNFの抗体を用いて検討した。その結果、母体脳の刺激によって胎仔脳のBDNFの発現に対照群と比較して明らかな差を認めなかった。一方、別の実験において、BDNFの発現は母体に加えたストレスによって変化する可能性を示唆する結果を得ている。従って、今回の実験では、母体脳の刺激によって胎仔脳にBDNFの発現が起こるかどうかについての結論は得られなかった。本研究の目的は、母体脳の活動が胎仔脳の発達・分化に重要な役割をはたしているかどうかを検討することである。そのために母体脳(視床下部)を電気刺激した時に胎仔脳での神経栄養因子の発現に影響を生じるかを検討する必要がある。今年度は、この実験を行う前にまずラット胎仔期での脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現の発達について検討した。その結果、胎生後期において、BDNFは胎仔脳で広範に明瞭に発現していることをBDNFの抗体を用いた免疫組織化学法で確認した。そのために、母体脳刺激によってBDNFの発現変化を検討するのはかなり困難であると考えた。そこで、母体脳刺激によって影響を受ける胎仔脳部位を特定できるかどうかを検討するために、c-fosの抗体を用いて母体脳刺激によって賦活される胎仔脳部位の同定を試みた。その結果、c-fosの発現は、胎仔脳の視床下部室傍核、視索上核、中隔核において対照群と実験群の両方で観察された。両群で、c-fosの発現の強さに差があるかどうかの詳細は現在検討中である。C-fosの実験から、通常の手術等の動物に対する操作がストレスに関連した胎仔脳部位を賦活していることを示唆している。一方、別の実験において、BDNFの発現も母体に加えたストレスによって変化する可能性を示唆する結果を得ている。これからの実験は、以上のこれまで得られた結果を参考にして進めていきたい。

母体脳刺激による胎仔脳Fos発現実験と同様の方法で、BDNFの発現をBDNFの抗体を用いて検討した。その結果、母体脳の刺激によって胎仔脳のBDNFの発現に対照群と比較して明らかな差を認めなかった。一方、別の実験において、BDNFの発現は母体に加えたストレスによって変化する可能性を示唆する結果を得ている。従って、今回の実験では、母体脳の刺激によって胎仔脳にBDNFの発現が起こるかどうかについての結論は得られなかった。
地域の再生可能エネルギー利用最適化の為の共創システム設計支援プラットフォーム開発

本研究では、再生可能エネルギーの組み合わせと地域でのエネルギーの利用と管理に関わる施策の選択を同時に最適化できる共創システム設計の支援プラットフォームの構築を目的として計画された。本研究遂行のためには、博士課程前期までに開発していた単目的の再生可能エネルギー地域別最適化ツールREROUTESを基に、研究課題1:制度と新技術の実装シミュレーションによる共創システム設計機能の拡張、研究課題2:再生可能エネルギー需給の動態シナリオの可視化による順応的システム設計機能の付加、研究課題3:エネルギーシステムの共創的意思決定支援機能のための多基準最適化モデルの構築の3課題に取り組むことを計画していた。平成29年度には主に研究課題2の遂行に注力し、両研究課題の達成を示すケーススタディを実施した。研究課題2は、人口動態やライフスタイル、国政の変化などによる将来的な地域の再生可能エネルギー需要量の変動等を反映して最適化を行う機能をREROUTESに付加するものである。平成29年度には、「社会経済状況および温室効果ガス排出量の定量推計ツール」を本研究で開発するプラットフォームに統合し、算出された将来のエネルギー需要を入力としてエネルギーシステムの多目的最適化を行えるよう数理モデルの改良を行った。上述の改良が完了した本プラットフォームの有用性検証のため、滋賀県高島市においてケーススタディを行った。その結果、市民が描いた将来像を基に五味らのツールで推計された将来のエネルギー需要に対して、市民を対象に行った選好調査の結果に基づいて最適な再生可能エネルギーの組み合わせ解を導出できた。市の行政担当者から有用性評価を受けた結果、本プラットフォームは地域での再生可能エネルギー利用計画の共創的設計に資するとの評価を受けた。ここまでの結果を博士課程の学位論文としてまとめ、国内外への論文発表を準備中である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究では、再生可能エネルギーの組み合わせと、地域でのエネルギーの利用と管理に関わる施策の選択を同時に最適化できる共創システム設計の支援プラットフォームの構築を目的として計画された。研究開始第1年目である平成28年度には、研究課題1と2に関しては、平成29年度以降に本格的に取り組むための研究スキームの設計を行った。平成28年度に主に取り組んだ課題は課題3であり、目指していた多目的最適化機能の構築を行い、対象地域における多目的最適化結果を導出できる段階に達した。再生可能エネルギーミックスの単目的最適化ツールであったREROUTESを改良して多目的遺伝アルゴリズムを実装することで、経済性や環境性能等を複合的に考慮した多目的最適化機能を有したモデルを構築した。開発したモデルを新潟県佐渡市や東京都千代田区等に適用した結果、地域のエネルギー需給特性を反映したパレート最適解集合を導出でき、実行可能解の存在領域やトレードオフ関係にある目的関数を可視化できた。それにより、トレードオフを有する再生可能エネルギーミックスのオプションを定量的に示すことが可能となり、エネルギーシステムの策定にあたり地域のステークホルダーが協議する際に活用できる結果を導出することができた。ここまでの結果について国内外の学会で発表すると共に、人工知能学会論文誌に論文投稿を行い、現在査読を受けている。本研究を遂行するために掲げていた3研究課題のうち、そのうちの一つの「エネルギーシステムの共創的意思決定支援機能のための多基準最適化モデルの構築」を行い結果を公表するに至ったため、『(2)おおむね順調に進展している。』を選択した。平成28年度の研究成果について査読付きの論文投稿が実績に挙げられていないが、平成28年度11月に日本人工知能学会論文誌に論文を投稿済みであり、現在その査読結果を待つ状態である。

その結果、市民が描いた将来像を基に五味らのツールで推計された将来のエネルギー需要に対して、市民を対象に行った選好調査の結果に基づいて最適な再生可能エネルギーの組み合わせ解を導出できた。市の行政担当者から有用性評価を受けた結果、本プラットフォームは地域での再生可能エネルギー利用計画の共創的設計に資するとの評価を受けた。ここまでの結果を博士課程の学位論文としてまとめ、国内外への論文発表を準備中である。今後は、研究課題1:制度と新技術の実装シミュレーションによる共創システム設計機能の拡張,研究課題2:再生可能エネルギー需給の動態シナリオの可視化による順応的システム設計機能の付加に取り組む。研究課題1については、各再生可能エネルギーの導入シミュレーションを個別に行い後に統合することを目指し、住宅用の太陽光発電の導入シミュレーションから着手する。ある地域の世帯や行政、金融機関等をエージェントとしてマルチエージェントモデルを構築し、最も迅速に太陽光発電の導入が進むルールすなわち政策を分析するというスキームで研究を遂行する。今後は詳細な各エージェントの行動ルールと選択メニューを、実在する地域の実情を反映しながら設計し、シミュレーションを行う予定である。研究課題2については、将来的な地域の需要の変化に対応した再生可能エネルギー利用システムを構築するために、滋賀県の基礎自治体にて適用されている「社会経済状況および温室効果ガス排出量の定量推計ツール」を本研究で開発するプラットフォームと統合させる予定である。この定量推計ツールは、将来のライフスタイルの変化予測から対象地域のエネルギー需要と温室効果ガスを動的かつ定量的に推計するツールであるため、ここで算出された将来のエネルギー需要を入力としてエネルギーシステムの多目的最適化を行えるよう本プラットフォームの数理モデルの改良を進める。なお、特定の地域に密着しながら対話的にエネルギーシステムの最適化を行うプロセスを実践するため、滋賀県高島市を対象地域としてその応用を行うことも計画している。その実践の中で、対象地域の様々なステークホルダーの意見を収集及び反映しながら、開発した数理モデルを用いてエネルギーシステムの最適化を行い、それを可視化して地域に還元するまでの一連のプロセスを試行し、モデルおよび最適化プロセスの検証を行う。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
HLAクラスIIおよびクラスIII領域遺伝子の分子進化学的研究

1.DQB遺伝子第4ならびに第5イントロン内の塩基配列をプライマ-として、PCR法を用いて第5エクソンを含む領域を増幅し、スプライス部位塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドプロ-ブを用いたドットブロットハイブリダイゼ-ションを行った。HLA領域ホモ接合体由来のDNAを用いた解析から、DQB第5エクソンの使用はDQB1・0503および・0601に限られていることが明らかとなった。旧世界猿由来のDNAを用いた解析から、アフリカミドリザルにおいて第5エクソンを使用しないDQB遺伝子の存在が明らかとなったことより、この不活化の時期は少なくとも旧世界猿の分岐以前にさかのぼる。2.HLA-Dw12ハプロタイプ由来のDQB遺伝子と、Dw15ハプロタイプのDQB遺伝子を第4イントロン内で組み換えることにより第5エクソンを使用しないDQB1・0601遺伝子を作製した。この遺伝子をDw12あるいはDw15ハプロタイプ由来のDQA遺伝子とともにL細胞にトランスフェクトし、DQ分子の発現レベルが異なるトランスフェクタントを複数個単離した。DQw1拘束性抗原特異的T細胞株、アロ反応性T細胞株を用いて、トランスフェクタントの抗原提示能を現在検討中である。3.DQA遺伝子のプロモ-タ-領域(約300塩基対)をPCR法を用いて増幅しその塩基配列を決定した。HLA領域ホモ接合体由来のDNAを用いた解析から、少くとも9種の対立遺伝子の存在が明らかとなったが、いずれにおいてもYbox内の単塩基置換が検出された。4.健常人集団を対照とした21水酸化酵素遺伝子群の解析から、B44-DRw13、Bw46-DRw8ハプロタイプでは偽遺伝子の第8エクソンに遺伝子変換様事象により機能的遺伝子の一部の配列が導入されていることを明らかにした。
T4ファージ各部位のトンネル物性

今年度は、方法として、1)タッピングモードAFMを使用したことによって再現性のよい画像が得られるようになり、また、2)電顕用のカーボン蒸着したコロジオン膜に吸着させた試料を観察することが可能であることが分かったので、同じ条件で調製した試料を、電子顕微鏡とAFMで比較観察することが可能になった。電子顕微鏡での観察はルーチン化していて簡便であるため、このことは同一試料について独立な情報が得られるというメリットがあるだけでなく、電顕グリッドに固定した試料が、AFM観察に適しているかどうか事前に判定できるという点でも重要である。試料は、主として尾管基盤複合体を用い、感染時に起こるのと同じ構造変化を観察することを目標とした。AFM観察では試料の純度が重要であり、庶糖密度勾配遠心法によって精製したサンプルについて良好なAFM画像が得られた。観察の結果、以下のことが明らかになった:1)尾管・基盤複合体は電顕グリッドに吸着された後、3M塩酸グアニジン処理して構造変化させた基盤を観察することによって、感染時に起こる"六角型"から"星型"への基盤の構造変化を明瞭に観察できた。2)タッピングモードで応力一定の条件で走査を行った場合、応力の強度に依存して尾管の像が変化することが観察された。これはAFMによって蛋白質集合体の柔軟性を測定する可能性を示唆していると考えられる。今後の計画は以下の通りである:1)基盤の調製(尾管のない基盤を調製し、非対称な裏表を区別して観察する。2)基盤へのPCMBの導入(導電性の低い蛋白質をSTMで観察する可能性を探るため、システイン残基に水銀を導入した後、STMで観察し、水銀を導入していないものと比較する。)3)試料を固定する基板として活性化ガラス(S.Karrasch et al., 1993)を用い、試料を基板上に化学的に固定することにより、水中でのAFM、STM観察を行う。
高速かつ可逆的に窒素酸化物を吸収除去する金属酸化物材料の開発

本研究では、排ガス中のNOxを分離濃縮し共存ガスの影響のない状態で触媒反応を行うための固体吸収剤に着目し、複合酸化物系および金属担持酸化物系について高速かつ可逆的に窒素酸化物を吸収できる材料を探索するとともに、NOxの吸収-放出拳動について動的解析を含めて詳細に検討し、吸収剤の構成成分の要素解析を行うとともにNOx吸収機構を明らかにした。複合酸化物系で最も優れたNOx吸収能を示したのはMn-Zr系複合酸化物で、O_2非共存下でもNO吸収除去反応はある程度進行したが、反応はO_2存在下で著しく促進された。高濃度の共存O_2を含む排ガスからのNOx除去に極めて有利である。共存するCO_2やH_2Oにはほとんど影響を受けないため、75ppmという非常に希薄な濃度でもNOの効果的な吸収除去が可能である。Mn-Zr系複合酸化物のNO吸収機構は、NO酸化能の高いMnサイトにおいてNOからNO_2が形成され、これをZrO_2が硝酸塩として固体中に取り込むと結論した。NOを吸収した後の複合酸化物は昇温または還元脱離により吸収脱離を再現性よく反復でき、脱離時にC_3H_8やC_2H_5OHなどの還元剤を共存させると脱離NOxの数十%がN_2にまで還元された。次に、優れた酸化触媒能を持つPtと、NOx種の吸収能を持つZrO_2の両成分を組み合わせて高表面積担体に担持したPt-ZrO_2-Al_2O_3を検討した。この吸収剤もNOxの吸収-放出サイクルに反復使用でき、還元性雰囲気で放出を行うと放出ガスのうちN_2が7割以上を占め、吸収したNOxの相当部分を還元して放出できることが分かった。また、この系ではSO_2はNO吸収に影響を与えないことが分かった。以上、本研究で検討した金属酸化物系吸収剤は、希薄なNOxを高濃度のO_2、CO_2、H_2Oの共存下でも300°C程度の低温で高速かつ選択的に100%除去することができ、昇温または雰囲気変化により固体内に濃縮されたNOxを可逆的に放出できることを明らかにした。リーンバーンやディーゼルエンジンからの排気ガスには酸素が過剰に含まれているため既存の触媒によるNOxの除去は困難である。固体酸化物への吸収によるNOx除去法は希薄なNOxを比較的低温で除去できるという利点がある。本研究では金属-酸化物系のPt-ZrO_2-Al_2O_3の吸収除去及び放出の性能を評価するとともに複合酸化物系であるMn-Zr系複合酸化物の性能と比較した。1wt% Pt-5wt% ZrO_2-Al_2O_3にNO800ppmを含むガスを供給し5°C/minで昇温した。反応ガスがNOのみの場合200°CからNOを吸収し始め、300°C以上では逆に放出した。NOとO_2を供給した場合350°C以下ではNOの吸収が、それ以上でNOxの放出が進行した。この吸収はNOが固体表面で酸化されNO_3-として固体内に蓄積されるためである。NO+O_2にCO_2やH_2Oが共存した場合も300°Cまでの吸収の挙動に変化はない。

NOとC_3H_8にO_2を共存させた場合、低温ではNOを除去したが270°C付近から放出が始まり、極大を示した後再び減少するという複雑な挙動を示した。これは270°C付近から放出が開始するものの、300-450°Cでは放出されたNOxの選択還元がPt上で進行するためNOx濃度は減少したと考えられる。このPt-ZrO_2-Al_2O_3を用いて吸収と放出を繰り返し行っても吸収量は変わらずMn-Zr系酸化物と同様に連続的に使用できることを確認した。あらかじめNOを吸収させたPt-ZrO_2-Al_2O_3とMn-Zr系酸化物をC_3H_8による還元性、及び酸化性雰囲気下でNOxの放出を行いこの放出された窒素成分ガスの選択率を調べた。Pt-ZrO_2-Al_2O_3は還元性雰囲気下で7割以上をN_2として放出した。酸化性雰囲気下ではN_2,N_2Oよりも吸収ガスのNO,NO_2の方が多く放出された。一方Mn-Zr系酸化物では還元性、酸化性どちらの場合でも放出ガスのほとんどはNO,NO_2であった。Pt-ZrO_2-Al_2O_3系、Mn-Zr系酸化物のいずれの場合も反応開始直後は気相中の全てのNOを吸収除去する。これはNOが固体表面で酸化されNO_<3->として個体内(ZrO_2)に吸収されるためである。本年度はMn-Zr系酸化物及びPt-ZrO_2-Al_2O_3系酸化物のNOの吸収放出機構について、C_3H_8やO_2等の雰囲気による反応の制御などについて測定した。あらかじめNOを吸収させたPt-ZrO_2-Al_2O_3とMn-Zr系酸化物をC_3H_8(還元性)及びC_3H_8+O_2(酸化性)の各ガス雰囲気下、NO_xの放出を行ったときの挙動について検討した結果、放出された窒素成分ガスの選択率はPt-ZrO_2-Al_2O_3では還元性雰囲気下において7割以上をN_2として放出したが、酸化性雰囲気下ではN_2,N_2OよりもNO,NO_2の方が多く放出されることが分った。一方、Mn-Zr系酸化物では還元性、酸化性どちらの場合でも放出ガスのほとんどはNO,NO_2が大部分を占めその割合はガス雰囲気によって異なった。Mn-Zr系複合酸化物ではNOの選択還元活性が低く、Mn酸化物の格子酸素がNO-NO_2系の平衡に関与するもの考えられる。またNOの酸化触媒としてのMnとPtが放出ガス組成に影響を与えることが分った。15EA02:Mn-Zr系複合酸化物のNO_x吸収-放出特性を、還元ガスであるC_3H_8の濃度を連続的に変化させることによって検討した。その結果、この吸収剤は可逆的に使用でき、NO吸収はC_3H_8燃焼の量論点から開始し酸化雰囲気で進行した。NO_xの放出が開始するC_3H_8濃度は吸収量に依存し吸収量が多いほど酸化雰囲気でも放出が始まるなど気相中の酸素分圧が大きな効果を有することが明かとなった。本研究で開発している固体酸化物中へのNOx吸収除去法は、排ガス中の希薄なNOxを効果的に除去でき、共存ガスの影響のない状態で触媒反応を行うための分離濃縮プロセスとして注目されている。また、NOx吸収剤の評価法として雰囲気の動的変化を用いた例は報告されていない。本年度は、還元剤であるC_3H_8の濃度を経時的に変化させることによってMn-Zr系複合酸化物及びPt-ZrO_2/Al_2O_3系NOx吸収剤のNOx吸収-放出特性を比較検討した。ここで用いた吸収剤であるMnOy-ZrO_2およびPt-ZrO_2/Al_2O_3上では、酸化雰囲気下ではNOの酸化で生成するNO_3^-の固体内への吸収が、加熱条件下あるいは還元雰囲気ではNO_3^-吸着種の還元によるNOの脱離が進行する。
大規模水田農業経営の形成と集落土地管理機能の展開方向に関する研究

稲作大規模経営の単位面積当たり労働時間と収益性をみると、北海道の農家では大規模ほど省力化がすすむが、都府県の農家では稲作作付け規模7-10haが労働時間最小で最も効率的な経営的指標を示し、協業経営では15ha前後が同じく効率的な指標を示して、それを超えると非効率になる(平成2,3年産・米生産費調査)。都府県のこうした狭い規模限界での収益性の壁は、稲作投下労働時間の分析によれば、稲作大規模経営が分散耕地の借地拡大によって形成されてきた構造を反映していることが判る。それは、機械利用効率が分散地移動の非効率により打ち消され、さらには非効率が勝るようになること、分散錯圃の管理作業が多数の集落慣行・協定の規制を受けてかえって増大することもあるからである。この理由により、しばしば大規模経営の収量が、周囲の零細規模農家の収量を下回る。圃場の団地化と集落との協力関係を築くことにより、その非効率を克服する必要があるが、そうした事例もまた存在する。その一つの形態は、集落農家のほぼ全戸を構成員にしてその労働力を管理・補助作業に当て、専業的従事者を中心にオペレーター作業を遂行するものである。例えば、富山県のM農事組合法人では、補助的作業の条件に応じた出役体制を敷いているほかに畦畔草刈り・水管理は構成員農家個々にまかせその労賃相当を組合が構成員に支払っている。大規模機械化作業と零細規模適応作業との結合により収量は周囲の普通農家を上回る。これは、稲作になお意欲のある農家が多い場合の組織対応事例だが、その条件がもはやなくなった地域事例として愛知県安城市の「集落農業構築」事業がある。そこでは、大規模経営体の集落単位での圃場団地化を実現するためのエリア制や集落利用権一括設定などの先進事例がみられるが、大区画圃場化やパイプライン用水などの基盤整備も進んでいる。90年農業センサス及びその先行農業センサンスの分析の結果、以下の点が明らかになった。(1)農家では、5ha以上アリが増加、特に10ha以上アリの増加が急であり、特に大都市近郊圏の零細兼業農家滞積地域において10ha以上アリの増加率が高い。(2)しかし、大規模農家の形成基盤は弱体化し、今後その増加、余り期待しえなくなっている。(3)一方、田のある農家以外の農業事業体は、なお点的存在とはいえ、順調に増加していて、地域によってはすでに重要な位置を占めている。また、米生産量調査の分析には、稲作大規模農家の稲作コストは7-10haで最も低く、10ha以上層は相対的に高くなること、稲作協業体では15-20ha別が最も低くそのコストは個別農家の7-10ha別を下回ること、協業体の形態では集落ぐるみ的な「集落営農型」よりも少数精鋭の「専業農家型」がコストが低いこと、などが明らかになった。精鋭農業業者の経営体が集団団地団場の上で展開する重要性を確認するとともに、個別大規模農家、協業経営、集落営農が展開しつつあるなかで、その相互の利点を抽出し補光する形態を構想する必要性を堤起した。実態分析面では、集落で土地利用調整を実施しているところの小作料(Y)は、粗収益(X)との間で、Y=0.95×-11万19(新潟県小作料データ85年、γ^2=0.64という差額地s-V表貫撤式を得た。

小作料その他の貸借条件の統一は、土地利用調整の要だが、それが経済合理性をもって実現されうることが証明された。それを実現する一形態が集落の土地利用調整であり、日本の実態からは農地が不即不補の形態で関与するのが望しい。農協による農地保有合理化事業の実施成功例がそれを教えているが、系統農協の末端組織単位の集落の構成員の変化と日本の水田農業のかかわりの面から理論的整理で加えた。農業センサス及び実態調査によれば、特に平坦水田地帯では世代交代を契機とする農業離脱が農地所有権を保持して貸し付けの形態で多発、他方それらの農地を借地して規模を急速に拡大する経営体がみられる。その際、借地経営体は集団地を形成して効率的な経営を営むことを志向しはじめているが、同時に貸し付け希望農地に借入者がなく耕作放棄地になっているものもある。また米生産費調査によれば、大規模稲作農家の収益性は稲作作付け規模7-10haが最も高く、10haを超えると収益性は低下する。稲作協業経営体では15-20haが最高の収益性を示し、20ha以上はやはり低下し、「専業農家型」「集落営農型」「中間型」区分では、「集落営農型」がやや低い収益性をしめすが、「専業農家型」と「中間型」の差はあまりない。稲作受託組織では、受託農家の生産性が高く、委託農家は受託農家と比して収益性はやや低いものの一般の稲作農家よりも収益性は高い。大規模経営体を育成するとともに農業に必ずしも関心を持たない土地貸し付け層との関係を調整して、個別経営体のみならず零細兼業農家を含めた地域全体の生産性を高めていくという観点が需要になっている。そのためには、(1)機械化技術の開発とそれに適応した大型圃場の形成(2)水管理の装置化・自動化、といったハード面もさることながら(3)零細兼業農家や土地貸し付け非農家との協力関係に関する合意の形成が特に重視される。それは広い意味での(4)分散錯圃の是正に至らねばならないが、集落を合意の基礎単位としつつそれを超える地域を視野に入れることも必要であり、さらには農地の権利関係として明確に確定しない作業受委託や交換耕作なども包含した対応を不可欠とするので、農協などが組織的に関与することも重要である。こうした対応を実現しているところでは、上述の収益性の下げ止まり現象は見られないことが実態調査結果の分析で判明した。
オートファジー関連筋疾患の病態解明と治療法開発

オートファジー関連筋疾患の病態解明と治療法開発のため、ダノン病のモデルマウスであるLamp-2遺伝子欠損マウスを用いて、骨格筋・心筋の表現型を生理学的または病理学的に特徴付け、ホモログ分子であるLamp-1を外来性に発現させることでの表現型の回復を解析した。Lamp-2遺伝子欠損マウスにLamp-1を過剰に発現するマウスを掛け合わせることで、心症状が改善した。Lamp-2遺伝子欠損細胞ではマクロオートファジーによる分解が顕著に低下しており、この低下はLamp-1過剰発現により改善された。Lamp-1の過剰発現はオートファゴソームとリソソームの融合を改善することにより、Lamp-2欠損による細胞機能障害を改善しうると考えられた。以上から、Lamp-1の発現誘導は、ダノン病の治療候補として有用であることが示唆された。本研究の目的は、オートファジー関連筋疾患の病態解明と治療法開発のため、Lamp2遺伝子欠損(KO)マウスを用いて、骨格筋・心筋の表現型を生理学的または病理学的に特徴付けること、ホモログ分子であるLamp1を外来性に発現させることでの表現型の回復を解析することである。今年度は、LAMP2KOマウスの骨格筋の生理学的性質を調べた。LAMP-2KOマウスは50週齢以降に、運動能力の著明な低下を示し、骨格筋は収縮力の低下と筋萎縮(特に筋線維萎縮)を示した。また、心臓はサイズが増大し、筋線維自体の肥大化と大規模な線維化も起こっていた。また、抗体マーカーによる病理学的解析では骨格筋・心筋はともに自己貪食空胞の蓄積を示した。電子顕微鏡下での骨格筋での自己貪食空胞の観察では、筋線維内に大きな領域を占める、多数の自己貪食空胞の集積構造が観察されたが、その周りに分布する個々の空胞には、むしろインタクトな粗面小胞体や輸送小胞様の構造の他、電子密度の高い顆粒状の物質が蓄積していた。LAMP-2KOマウスは遺伝学的にはDanon病のモデルであるが、今回、実際にモデルマウスにおいて骨格筋と心筋の症状をはっきりと特徴づけたことは、治療実験に向けて、測定すべき視点が準備できたといえる。また、電子顕微鏡で観察された空胞内の未消化オルガネラ構造の蓄積は、Lamp2KO細胞でのリソソーム内pHの上昇やリソソーム酵素の輸送異常と考え合わせ、Lamp2欠損におけるリソソーム機能(分解反応)の異常を示唆するものと考えられる、しかしながら、加齢に伴う変化であることをも考え合わせると、単にLamp2欠損から生じることだけでなく、他の因子を関係していると考えられる。これらのことは、Danon病の病態を考える上で意義深いと思われる。今後は、今年度の情報を基礎として、治療法開発を進めたいと考えている。本研究の目的は、オートファジー関連筋疾患の病態解明と治療法開発のため、ダノン病のモデルマウスであるLAMP-2遺伝子欠損(KO)マウスを用いて、骨格筋・心筋の表現型を生理学的または病理学的に特徴付けること、ホモログ分子であるLAMP-1を外来性に発現させることでの表現型の回復を解析することである。昨年度は、LAMP-2KOマウスにおける骨格筋と心筋の症状を報告した。今年度は、LAMP-2KOマウスにLAMP-1を過剰に発現するマウス(LAMP-1 Tg)を掛け合わせることで、LAMP-2欠損において観察された表現型を外来性のLAMP-1の発現によって改善しうるかを解析すると共に、LAMP-2 KO、LAMP-2KO/LAMP-1Tgマウスから初代培養細胞を単離し、リソソームの機能解析を行った。初代培養細胞を用いた解析では、LAMP-2 KO細胞でマクロオートファジーの誘導に伴い酸性小胞が著明に蓄積していくこと、誘導停止後の酸性小胞のクリアランスが低下していること、また、長寿命蛋白質の分解(活性)が低下していることが観察されたが、LAMP-2KO/LAMP-1Tgマウス細胞では、これらはすべて改善された。この結果は、LAMP-1を外来性に発現させる治療法が有効である可能性を示すとともに、いまだその機能が十分に解明されていないLAMP-1のマクロオートファジーへの関与を示唆するものと考えられた。さらに、マウスを用いた解析では、50週齢以降のLAMP-2KOマウスでみられた骨格筋収縮力の低下及び、心筋線維の肥大化と大規模なfibrosisが、LAMP-2KO/LAMP-1Tgマウスでは改善されていることを明らかにした。

しかしながら、マウスの運動能力と骨格筋線維の萎縮、及び病理変化に改善は認められなかった。ダノン病は心臓の機能障害により死に至るため、心筋に改善が見られたことは、治療法開発に向けてこの方法の有効性を示唆している。今後は、何故、心筋と骨格筋における表現型の改善度に違いがあるのかを明らかにすることで、組織特異的なLAMP-1の機能を明らかにすると共に、LAMP-2KOマウス骨格筋機能の改善方法の探索、および他のオートファジー関連筋疾患の治療への応用を考えている。オートファジー関連筋疾患の病態解明と治療法開発のため、1)ダノン病のモデルマウスであるLamp2遺伝子欠損(KO)マウスを用いて、骨格筋・心筋の表現型を生理学的または病理学的に特徴付けること、2)ホモログ分子であるLamp1を外来性に発現させることでの表現型の回復を解析すること,を目的とした。昨年度までに、Lamp2 KOマウスにLamp1を過剰に発現するマウスを掛け合わせることで、心症状が改善すること、及び初代培養細胞を用いた解析から、Lamp1の過剰発現によりLamp2 KO細胞において観察された酸性小胞のクリアランスの低下と、タンパク質分解率の低下が改善することを報告した。今年度は、阻害剤を用いたタンパク質分解活性の解析、骨格筋における免疫組織染色及び電子顕微鏡による解析を行った。初代培養細胞を用いたタンパク質分解活性をマクロオートファジー及びプロテアソームの阻害剤を用いて解析したところ、Lamp2 KO細胞ではマクロオートファジーによる分解が顕著に低下していることが確認され、その低下はLamp1過剰発現により改善されることを明らかにした。また、免疫組織染色の結果から、Lamp2 KOマウスでは、リソソームと共局在しているオートファゴソームの割合が少ないのに対し、Lamp1の過剰発現によりその割合が増加し、オートファゴソームマーカー陽性の筋線維数も減少していることが観察された。電子顕微鏡による観察においても、Lamp2 KOマウスでは、多くのオートファゴソーム様の小胞が観察されたが、Lamp1過剰発現によりその数は減少していた。これらの結果から、Lamp1の過剰発現はオートファゴソームとリソソームの融合を改善することにより、Lamp2欠損による細胞機能障害を改善しうると考えられた。以上から、Lamp1の発現誘導は、ダノン病の治療候補として有用であることが示唆された。
遺伝子改変マウスを用いた遺伝子難聴の治療開発の挑戦

本研究では独自の遺伝子改変難聴モデル動物を用い効果的な細胞導入法およびウイルスベクターを用いた遺伝子治療法を開発するため、以下の実験により良好な結果が得られている。移植用幹細胞の作製:移植用骨髄間葉系幹細胞(MSC)作製のため、C57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞株にEGFP遺伝子(緑色蛍光)をレトロウイルスにて発現させ、安定的に強度な蛍光を発する細胞を選抜クローニングした。新規Connexin26(Cx26)欠損マウスの作製:P0プロモーターを用いたCre-loxPシステムにより内耳特異的にCx26遺伝子を欠損するマウスを新規開発した。Brn-4欠損マウスの作製:癌研究所(東京、有明)にて凍結保存したBrn-4欠損マウスの受精卵を順天堂大学動物施設にて融解し、C57BL/6J系統のレシピエントマウスに移植してBrn-4欠損マウスの個体を得た。これらの交配、遺伝子タイピングによる選抜により大量の同欠損マウスを作製中である。幹細胞の経半規管移植:後半規管および外側半規管に小孔をあけ、後半規管より2x105cellsを還流した。移植細胞の検出:経半規管移植後の組織をGFP蛍光検出により移植細胞の組織進入を解析し、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。更に蝸牛線維細胞に選択的障害を与えることにより細胞導入効率が大幅に上昇した。更にこの誘導機構の解析により、ケモカインMCP1とその受容体CCR2による誘導機序が示唆されたため、CCR2遺伝子を内耳より単離し発現用プラスミドを構築した。これを移植細胞に導入したところ、細胞生着効率が飛躍的に向上した。更に我々はCx26遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルスを作製し、Cx26欠損マウスへの遺伝子導入を行った。その結果外側壁線維細胞においてCx26を発現させることに発現に成功した。これらの条件検討を推進することにより新規細胞治療法がCx26変異等による遺伝性難聴に対する更に効果の高い治療法として聴力改善につながると考えられる。先天聾は1000出生に1人の頻度に発生し、その半数が遺伝性の原因であり、日本人においてGJB2遺伝子変異が重要であることが知られている。根本的な治療法として遺伝子導入をマウス動物で検討した。内耳への遺伝子導入の方法として蝸牛壁に小孔を開けての投与、正円窓からの投与、半規管からの投与があるが、半規管からの投与は導入効率が低いため今回は検討しなかった。ウイルスベクターはアデノウイルスベクター(AdV)とアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いた。AdVを蝸牛壁を経由して内リンパ腔に投与すると支持細胞への発現は認めたが、投与時の侵襲により聴力は低下した。また、正円窓から鼓室階に投与すると聴力は保たれるが、支持細胞を含むコルチ器には発現を認めなかった。一方、AAVを内リンパ腔に投与するとAdVの投与時と同様に支持細胞への発現は認めたが、聴力は低下した。鼓室階にAAVを投与すると聴力の低下を認めずに主にDeiters細胞などの支持細胞に発現を認めた。鼓室階にAAVを出生直後のマウスに投与することにより聴力の損失なく蝸牛支持細胞に遺伝子を導入することに成功した。

これは6JB2遺伝子変異の先天性難聴患者の根本治療に結びっく可能性がある。蝸牛側壁に作製した小孔からの内リンパへの投与法と正円窓からの外リンパへの投与でARBによる侵襲性を検討した。内耳への遺伝子導入の方法として蝸牛壁に小孔を開けて内リンパ腔への投与、正円窓から外リンパ腔への投与、半規管から外リンパ腔への投与があるが、半規管からの投与は導入効率が低いため今回は検討しなかった。ウイルスベクターはアデノウイルスベクター(AdV)とアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いた。アデノウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の2種類でGFPの免疫染色による内耳の構成細胞への高効率な発現を検討する。E1とE3遺伝子領域を欠損したAAVベクターに正常Gjb2遺伝子を組み込んだ。また、投与前後に聴性脳幹反応を行い、聴力を比較した。AdVを蝸牛壁から内リンパ腔へ投与すると支持細胞への発現は認めたが、投与時の侵襲により聴力は全音域で80dB以上と悪化した。また、正円窓から投与すると聴力は10dB以内の変化しか認めないが外リンパ腔の辺縁の中皮細胞にしか発現を認めず、支持細胞を含むコルチ器には発現を認めなかった。一方、AAVを蝸牛壁から投与するとAdVの投与時と同様に支持細胞への発現は認めたが、聴力も同様に低下した。正円窓からAAVを投与すると聴力の低下は10dB以内で成熟マウスでは内有毛細胞に発現をみとめた。一方で、出生直後のマウスを用いた検討ではDeiters細胞などの支持細胞に発現を認めた。本研究では独自の遺伝子改変難聴モデル動物を用い効果的な細胞導入法を開発するため、以下の実験により良好な結果が得られている。移植用幹細胞の作製:移植用骨髄間葉系幹細胞(MSC)作製のため、C57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞株にEGFP遺伝子(緑色蛍光)をレトロウイルスにて発現させ、安定的に強度な蛍光を発する細胞を選抜クローニングした。新規Connexin26(Cx26)欠損マウスの作製:P0プロモーターを用いたCre-loxPシステムにより内耳特異的にCx26遺伝子を欠損するマウスを新規開発した。Brn-4欠損マウスの作製:癌研究所(東京、有明)にて凍結保存したBrn-4欠損マウスの受精卵を順天堂大学動物施設にて融解し、C57BL/6J系統のレシピエントマウスに移植してBrn-4欠損マウスの個体を得た。これらの交配、遺伝子タイピングによる選抜により大量の同欠損マウスを作製中である。幹細胞の経半規管移植:後半規管および外側半規管に小孔をあけ、後半規管より2x10^5cellsを還流した。移植細胞の検出:経半規管移植後の組織をGFP蛍光検出により移植細胞の組織進入を解析し、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。更に蝸牛線維細胞に選択的障害を与えることにより細胞導入効率が大幅に上昇した。更にこの誘導機構の解析により、ケモカインMCP1とその受容体CCR2による誘導機序が示唆されたため、CCR2遺伝子を内耳より単離し発現用プラスミドを構築した。これを移植細胞に導入したところ、細胞生着効率が飛躍的に向上した。この方法によりこれらの条件検討を推進することにより新規細胞治療法がCx26変異等による遺伝性難聴に対する更に効果の高い治療法として聴力改善につながると考えられる。
IDDMにおけるFas依存的膵β細胞障害機構の解明とその制御による治療法の開発

ヒト1型糖尿病の発症におけるFas、Fas-ligand系の関与を検討するために、発症早期の1型糖尿病患者より同意のもとで腹腔鏡下に膵X組織を採取し免疫組織化学的に検討した。検討を行った患者13人中、6人で膵X島へのリンパ球浸潤など膵X島炎の所見を認めた。膵X島炎の認められた標本では膵Xβ細胞および膵X島浸潤細胞にFasの発現を認めた。膵X島細胞でのFasの発現はβ細胞で高頻度に認められた。一方、Fas-Lの発現は浸潤細胞でのみ認められた。また、浸潤細胞で最も頻度の高かったものはCD8陽性T細胞であった。膵X島炎の認められなかった症例では、Fas、Fas-Lの発現は認められなかった。以上より、1型糖尿病の発症に対して、Fas、Fas-L系の発現が膵X島炎の発症とその後のβ細胞破壊に関与している可能性が示唆された。2.ヒト膵X組織および膵X島細胞腫におけるBetacellulin発現の検討ヒト膵X組織および膵X島細胞腫におけるBetacellulin発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、Betacellulinは成人ではα細胞、膵X管細胞とβ細胞に発現しているのに対して、胎児では未分化な膵X管細胞で強い発現が見られることが明らかとなった。またインスリノーマ細胞、グリカゴノーマ細胞ともにBetacellulinの発現が認められた。これらはBetacellulinが膵X島の増殖、分化に重要であることを示唆するものである。3.1型糖尿病の新たな病型に関する検討1型糖尿病患者について、その発症様式、検査所見、免疫学的異常などを比較検討したところ、急激な発症、血清膵X酵素の上昇を認め糖尿病関連自己抗体が検出されない一群の患者の存在を認めたので、新たな病型として提案した。交付申請書に記した実験実施計画に基づき以下の実験を行った。1.当大学動物実験施設.においてSPF環境下に飼育された、インスリン依存性糖尿病(IDDM)を自然発症するNODマウスについて、その単離膵島及び浸潤細胞を用いてFas、Fas-L、perforinの発場をRT-PCR法により検討した。現在得ている予備的な知見では比較的早期よりFas、perforinの発現を検出している。NODマウスでは、浸潤リンパ球を含まない膵島の単離は困難であり、現状ではこれらの発現がいずれの細胞に由来するものかは明確ではない。今後さらなる検討を行う予定である。2. Fas-FasL系に対する中和抗体によるIDDM発症阻止効果についての実験を行った。現在までの成績では、中和抗体によって糖尿病の発症は阻止されていない。今後は抗体投与下の膵の組織学的分析を行う予定である。さらに抗体投与を受けたマウスについて各種サイトカインの発現の検討を行い、Fas-FasL系が免疫寛容の破綻、膵B細胞障害の現場およびTh1/Th2バランスの調整といかに関わるか免疫学的検討を行う予定である。3. Fas抗原欠損NOD 1pr/1prマウスより単離した膵島を糖尿病未発症および発症後のNODマウスに.移植する実験については現在これを行っており、今後得られた知見をもとに糖尿病の進展性と可逆性について検討解析する予定である。ヒト1型糖尿病の発症におけるFas、Fas-ligand系の関与を検討するために、発症早期の1型糖尿病患者より同意のもとで腹腔鏡下に膵組織を採取し免疫組織化学的に検討した。

検討を行った患者13人中、6人で膵島へのリンパ球浸潤など膵島炎の所見を認めた。膵島炎の認められた標本では膵β細胞および膵島浸潤細胞にFasの発現を認めた。膵島細胞でのFasの発現はβ細胞で高頻度に認められた。一方、Fas-Lの発現は浸潤細胞でのみ認められた。また、浸潤細胞で最も頻度の高かったものはCD8陽性T細胞であった。膵島炎の認められなかった症例では、Fas、Fas-Lの発現は認められなかった。以上より、1型糖尿病の発症に対して、Fas、Fas-L系の発現が膵島炎の発症とその後のβ細胞破壊に関与している可能性が示唆された。2.ヒト膵組織および膵島細胞腫におけるBetacellulin発現の検討ヒト膵組織および膵島細胞腫におけるBetacellulin発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、Betacellulinは成人ではα細胞、膵管細胞とβ細胞に発現しているのに対して、胎児では未分化な膵管細胞で強い発現が見られることが明らかとなった。またインスリノーマ細胞、グルカゴノーマ細胞ともにBetacellulinの発現が認められた。これらはBetacellulinが膵島の増殖、分化に重要であることを示唆するものである。3.1型糖尿病の新たな病型に関する検討1型糖尿病患者について、その発症様式、検査所見、免疫学的異常などを比較検討したところ、急激な発症、血清膵酵素の上昇を認め糖尿病関連自己抗体が検出されない一群の患者の存在を認めたので、新たな病型として提案した。
くも膜下出血後遅発性脳虚血のマーカー及び治療標的としてのmiRNAスクリーニング

くも膜下出血患者の血清中でコントロールと比較して発現が1/4以下に低下している49種の(hsa-miR-223等)、2倍以上に上昇している27種のマイクロRNA(hsa-miR-451a等)を同定した。モデルマウスでは、頭蓋内圧上昇を5秒とすると、海馬でモデル作成後1日で微小血管基底膜が脱落し、アストロサイトの足突起が基底膜から剥がれた。3日後には基底膜周辺のアストロサイトのGFAP染色性が低下し、神経細胞自体の形態学的、数的変化は認めずに神経機能が障害された。くも膜下出血後のNVU統合性の崩壊は微小血管周囲に始まり、周辺アストロサイトの機能障害を介して、神経機能障害に至る可能性が考えられた。当該研究機関(慶應義塾大学医学部)において課題を遂行するために必要な倫理申請を行い、研究目的で患者血液の提供を受けるための許可を倫理委員会より受けた(承認番号20140326)。現在まで、7名のくも膜下出血患者及び4名の未破裂脳動脈瘤患者から血液の提供を受けた。遠心により血液から血清を分離、-80°Cにストックした。今後RNAを抽出、くも膜下出血群とコントロール群にてmiRNAアレイ解析予定である。上記患者検体の解析と並行してmiRNA同定後の機能解析に用いる目的でくも膜下出血モデルマウスの作成を行った。既に報告があるマウス自家血注入モデルを改変し(尾動脈からの採血は困難で顔面静脈から自家血を採血することとし、針刺入の角度はCTや肉眼所見で検討を重ねて修正し、安定したモデルマウスが得られるようになった。モデルマウス作成直後に肉眼的、及び、動物用CTスキャンを用いてくも膜下出血が生じていることを確認した。更にモデルマウスを還流固定した後に断頭、脳の凍結切片を作成した。miRNA同定後の機能解析には本モデルがくも膜下出血後の遅発性脳虚血を起こすことを確認する必要があるため、蛍光免疫染色を行い神経細胞をNeuNで、アストロサイトをGFAPとアクアポリン4で、微小血管を基底膜のコラーゲン4で染色し、各々の構造物の形態を確認した。同モデルにおいて、モデル作成6時間後の段階で、基底膜崩壊を示すコラーゲン4の染色性が低下しているという既に報告されている事象と同様の事象が観察され、くも膜下出血モデルマウスとしての妥当性が確認された。提供を受ける血清は患者の多寡、同意の可否に依存するが、ある程度の検体が集まったためmiRNAの解析を開始した。並行して、機能解析に用いるモデルマウス作成を開始し、モデルが安定するに至っている。おおむね順調な進捗状況と考えている。当該施設において治療したくも膜下出血(SAH)患者7名とコントロール群としての未破裂脳動脈瘤患者4名から血液の提供を受け、RNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行い49種類のSAH群でコントロール群と比較して発現が1/4以下に低下しているマイクロRNAと27種類のSAH群においてコントロール群と比較して発現が2倍以上に上昇しているマイクロRNAを同定した。また症例数を増やし、SAH群11例、コントロール群7例として、RNAを抽出、マイクロアレイ解析から選んだ数種類のマイクロRNAに関して症例ごとの発現の解析を進めている(特にSAH群において発現が上昇していると考えられるマイクロRNAであるhsa-miR-451aは症例ごとの解析でもコントロール群と比較してSAH群で高い発現を認める症例が散見された)。一方、同定したマイクロRNAのin vivoにおける機能解析のために準備していたくも膜下出血モデルマウスに関しては解析の結果、モデルマウスのNeurovascular Unit(NVU)中で毛細血管基底膜とアストロサイトは形態学的にダメージを受けており、かつアストロサイトの足突起が毛細血管基底膜から剥奪している一方で、神経細胞自体のviabilityが保たれているにも関わらず神経機能障害を呈するSAHモデルマウスであることが明らかになった。本モデルにおいては神経細胞自体の障害を伴わない、NVU統合性の破綻が神経機能障害を呈しており、本モデルを検討することでNVUを標的とした神経保護治療の可能性を検討できると考えている。次年度は症例数を増やし症例ごとのマイクロRNA発現解析を繰り返しつつ、そこで選別されたマイクロRNAの機能実験を準備したくも膜下出血モデルマウスを用いて行う予定である。提供を受ける血液の数は順調に伸びており、他施設共同研究として更に症例数を増やせる可能性が現実味を帯びてきた。昨年度「今後の研究の推進方策」として記載した、くも膜下出血モデルマウスがどの程度ヒトのくも膜下出血後の虚血性変化を再現し得るかに関する検討も概ね終了し、順調な進捗状況と判断している。くも膜下出血後の遅発性虚血性脳障害に関与するマイクロRNAを患者血清中で同定すべく、まず、一次スクリーニングとしてくも膜下出血患者7例及び未破裂脳動脈瘤患者4例から提供を受けた血液からRNA分画を単離し、マイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイ解析の結果49種のくも膜下出血患者群において未破裂脳動脈瘤群と比較して1/4以下に発現が落ちているマイクロRNAが同定された。一方くも膜下出血患者において、未破裂脳動脈瘤群と比較して発現が2倍以上に更新している27種のマイクロRNAが同定された。

くも膜下出血群において発現が亢進しているマイクロRNAのうちhsa-miR-451aは比較的その絶対的な発現量が高く、またin silicoにおける機能解析の結果からも神経の栄養因子であるMIF(macrophage inhibiting facor)や細胞外マトリックスの分解に関与していることが知られているMMP2やMMP9を標的としており、機能的にもくも膜下出血後の遅発性虚血性脳障害への関与が疑われたため、2次スクリーニングにて更に症例ごとの解析を進めることとした。2次スクリーニングは症例数を増やし、くも膜下出血10例、未破裂脳動脈瘤群7例の検体を用いてSYBR greenを用いたqPCRの手法を用いて解析した。qPCRのコントロールには先行研究で有用性が示され、かつ今回のマイクロアレイ解析においても両群で比較的均一な発現を認めたhsa-miR-4655を用いた。マイクロアレイ解析の結果hsa-miR-451aのくも膜下出血患者血清における発現量は未破裂脳動脈瘤患者のそれと比較して統計学的有意に(p=0.0402)高いことが明らかになった。くも膜下出血患者の血清中でコントロールと比較して発現が1/4以下に低下している49種の(hsa-miR-223等)、2倍以上に上昇している27種のマイクロRNA(hsa-miR-451a等)を同定した。モデルマウスでは、頭蓋内圧上昇を5秒とすると、海馬でモデル作成後1日で微小血管基底膜が脱落し、アストロサイトの足突起が基底膜から剥がれた。3日後には基底膜周辺のアストロサイトのGFAP染色性が低下し、神経細胞自体の形態学的、数的変化は認めずに神経機能が障害された。くも膜下出血後のNVU統合性の崩壊は微小血管周囲に始まり、周辺アストロサイトの機能障害を介して、神経機能障害に至る可能性が考えられた。患者検体は、これまで同様、可及的くも膜下出血全例において検体提供の依頼を行い、同意が得られた場合には検体を採取し、血清サンプル数を増やしていく。モデルマウスは安定して作成することが可能になってきたため、今後早期に本モデルがどの程度ヒトのくも膜下出血後の虚血性変化を忠実に再現し得るかを確認する。具体的にはearly brain injury, delayed cerebral ischemia、形態学的な脳血管攣縮が再現されるか否かを確認して行く。血液検体の提供を頂いた症例数が更に増えてきたので、これまでくも膜下出血群とコントロール群で発現に差を認める可能性があっても統計学的な有意差が出ていなかったマイクロRNAに関して再度の定量PCRを用いた検討を行うことを検討している。また昨年度安定して作成が可能となったモデルマウスにおいて当初の予定通りマイクロRNAの解析及び機能実験を行っていく方針である。脳血管障害miRNAアレイが患者検体の集まり状況で次年度にずれ込んだため。追加で行う予定であった定量PCRを最近患者検体の集まりが良いため、まとめて行うことでコストカットとなることから次年度にずらしたため。患者検体が解析に必要な数集まったため、予定通りmiRNAアレイ解析に用いる。予定通り定量PCRを行い検体毎のマイクロRNAの発現を解析する。