hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATMによりリン酸化を受ける新規タンパク質の同定と解析

このp75の同定に関して、精製分離により8種類の候補タンパク質が得られたが、どれもp75抗体と強く反応するものがなく、そのものではないと判定した。今後、抗体を作製したリン酸化部位特異的配列をEGFPと結合させ、その融合タンパク質を細胞に発現させる。このリン酸化部位に変異を導入して、抗体との反応性を見ることにより、抗体が認識する抗原部位を決定する。そこからp75の同定を図る。(2)の結果、Crmp2という微小管と関連して細胞分裂に働いているタンパク質を同定した。Crmp2の過剰タンパク質発現実験系を用いて、Crmp2の過剰発現により細胞毒性が観察されること、Crmp2のスレオニン514における脱リン酸化は細胞の接触阻害による増殖休止に一致しており、これがGSK3b活性に依存して起こること、Crmp2のスレオニン555は、いくつかのがん細胞株で過剰にリン酸化されていること、線維芽細胞におけるCrmp2スレオニン555のリン酸化は、神経細胞で認められているRhoキナーゼではなく、異なる未知のキナーゼに依存することなどを解析し、論文を投稿した。また現在、これとは別にDSBsに依存して動態が変化するタンパク質を同定し、機能解析を行っている。DNA損傷のうちもっとも危機的な衝撃を与えるものとして、DNA二本鎖切断損傷(DSBs)がある。DSBsの認識・修復に関わるATMは、自己やその下流にある基質をリン酸化し、それらを活性化することでシグナル伝達を行い、細胞周期の制御やDNA修復を行っている。このATMによりリン酸化される新たなタンパク質を同定することを目的として、2つのアプローチを用いた。ATMによりリン酸化を受けるタンパク質には、リン酸化部位特異的配列が存在する。一つは、(1)この配列を帰いて、リン酸化抗体を作製鉱その抗体が認識するタンパク質を同定するという方法である。他方は、(2)タンパク質二次元電気泳動(2DE)を用いたプロテオーム解析を用いて、ATM欠損細胞と野生型組胞とを比べることによりATM依存的リン酸化反応を示すタンパク質を同定する方法である。(1)の結果、SDS-PAGEで分離すると75kDa付近に存在するタンパク質(仮称P75)を得た。このP75はDSBs特異的にリン酸化を受け,その反応は早期で、また低線量でも引き起こされる。このp75の同定を行ってきたが、同定には[至らなかった源因として、リン薩力奮精製していくと共に外れやすいことがあげられる.今後はこの原因を除去する方法を考えながら、精製、同定を行っていきたい。(2)の結果、今年度はp53の有無により変化するAnnexinファミリーの一つを同定した。このタンパク質はp53がないとスポットが2つになり、あると4つになる。このスポットの違いを検討したが、リン酸化ではなかった。今後このスポットの違いがどのような修飾によるものかを検討する。また、今年度は新たにDSBsでのATMの活性化とDSB修復で活性化するKu70/80二量体との関連性を検討した。近年、IR照射後にATM依存性でATRが活性化することが言われてきているが、このATM依存性ATRの活性化にKu70/80が必要であることを今回明らかにした。
X線CT装置におけるビーム幅に影響しない出力測定法の開発と評価

Z軸方向に広いビーム幅をもつX線CT装置の出力測定において,Z軸方向のビーム幅および回転速度に影響しない新しい出力測定方法を開発し,その精度の検証を行った.X線の出力は,X線管に印加された管電圧,管電流,照射時間,ターゲットの材質に依存し,理論的には照射野の大きさに依存しない.これを検証するするため,6-ccの電離容積を持ち,かつ時系列での線量波形の取得が可能な電離箱線量計をアイソセンターに設置した.CT装置の管電圧は80 kVp, 100 kVp, 120 kVp, 135 kVpの4種類とし,Z軸方向の照射野は40 mm, 80 mm, 120 mm, 160 mmと変化させた.各々の照射野に対する線量率のデータを取得し,照射野が0 mmとなる線量率を外挿法にて算出した(K0-w/o-A).次にX軸方向の照射野を制御するために,ガントリー下部に鉛で作成したコリメータを配置し,開口部を40 mmから80 mmまで8 mmずつ増加させて散乱線量率を変化させ,X軸方向の照射野が0 mmとなる線量率を外挿法にて算出した(K0-w-A).その結果,いずれの管電圧においてもK0-w/o-AはK0-w-Aと一致していることが判明した.得られたK0-w/o-AとK0-w-Aは測定値から散乱線が取り除かれており,Z軸方向のビーム幅および回転速度に影響しない出力測定が可能となった.この結果は散乱-直線線比の取得が可能であることを示しており,非常に有意義な結果であるといえる.しかし,これらの結果は6ccの電離箱にて得られた結果であるため,半導体線量計や,より小さな電離容積を持つ電離箱式線量計にて同じ結果が得られるかどうか,調査の必要がある.その点が今後の課題である.平成30年度に実施予定であった検討項目について,予定通り実施することができた.以上より「おおむね順調に進展している」と判断した.これまでに解明できたZ軸方向に広いビーム幅をもつX線CT装置の出力測定を確固たるものにするために,その裏づけとなるデータ取得を継続的に行う.また,これらの手法を世界標準とすべく,学会発表および欧文誌での論文投稿を通して,広く世界に普及させることを目指す.平成30年度に実施できなかった半導体検出器や,より小さな電離容積を持つ電離箱式線量計にて本手法が活用できるかどうかを継続的に検討していく.Z軸方向に広いビーム幅をもつX線CT装置の出力測定において,Z軸方向のビーム幅および回転速度に影響しない新しい出力測定方法を開発し,その精度の検証を行った.X線の出力は,X線管に印加された管電圧,管電流,照射時間,ターゲットの材質に依存し,理論的には照射野の大きさに依存しない.これを検証するするため,6-ccの電離容積を持ち,かつ時系列での線量波形の取得が可能な電離箱線量計をアイソセンターに設置した.CT装置の管電圧は80 kVp, 100 kVp, 120 kVp, 135 kVpの4種類とし,Z軸方向の照射野は40 mm, 80 mm, 120 mm, 160 mmと変化させた.各々の照射野に対する線量率のデータを取得し,照射野が0 mmとなる線量率を外挿法にて算出した(K0-w/o-A).次にX軸方向の照射野を制御するために,ガントリー下部に鉛で作成したコリメータを配置し,開口部を40 mmから80 mmまで8 mmずつ増加させて散乱線量率を変化させ,X軸方向の照射野が0 mmとなる線量率を外挿法にて算出した(K0-w-A).その結果,いずれの管電圧においてもK0-w/o-AはK0-w-Aと一致していることが判明した.得られたK0-w/o-AとK0-w-Aは測定値から散乱線が取り除かれており,Z軸方向のビーム幅および回転速度に影響しない出力測定が可能となった.この結果は散乱-直線線比の取得が可能であることを示しており,非常に有意義な結果であるといえる.しかし,これらの結果は6ccの電離箱にて得られた結果であるため,半導体線量計や,より小さな電離容積を持つ電離箱式線量計にて同じ結果が得られるかどうか,調査の必要がある.その点が今後の課題である.平成30年度に実施予定であった検討項目について,予定通り実施することができた.以上より「おおむね順調に進展している」と判断した.これまでに解明できたZ軸方向に広いビーム幅をもつX線CT装置の出力測定を確固たるものにするために,その裏づけとなるデータ取得を継続的に行う.また,これらの手法を世界標準とすべく,学会発表および欧文誌での論文投稿を通して,広く世界に普及させることを目指す.平成30年度に実施できなかった半導体検出器や,より小さな電離容積を持つ電離箱式線量計にて本手法が活用できるかどうかを継続的に検討していく.研究テーマは概ね予定通り進捗しているが、小型電離箱式線量計の所有ができていないこと,および研究成果の報告および論文執筆にかかる経費が次年度にずれこんだため、それに係る費用も次年度に持ち越しとなった.
新規クロスリンク剤を組み込んだペプチド核酸のがん治療及び診断薬への展開

本研究の目的は我々が開発したクロスリンク能をもつ2-アミノ-6-ビニルプリン誘導体を組み込んだペプチド核酸を用いて、効果的な放射性アンチセンス核酸を合成し、癌診断薬剤としての可能性を検討することである。前年度までに、ビニル体を含むオリゴマーDNAが酸性条件下、相補的配列内に含まれるシチジンと塩基選択的かつ配列特異的に反応することを見いだした。しかしその後の検討により、本化合物は酸性条件下でしか反応しないことが明らかとなった。これは生体内の適用を考えた場合問題点となると考えられたため、新たに中性条件下でも反応する誘導体の設計合成を行った。すなわち反応性部位であるビニル基に電子吸引基を導入することで反応性の向上を期待した。本誘導体を組み込んだオリゴマーDNAは設計通り中性条件下でも、シチジンに対して高い選択性及び高い反応性を示すことがわかった。本研究の成果は生体内で使用できる効率的なクロスリンク剤への展開において新たな可能性を提示するものと考えられる。また癌治療薬としてオリゴ核酸の利用を考えた場合、m-RNAは繰り返し生産されるため根本的な治療を行うには、標的を2本鎖DNAに設定したほうが望ましい。そこで2本鎖DNAに対して3本鎖を形成することで反応する、2-アミノ-6-ビニルプリン誘導体の設計、合成を行った。本誘導体を含むオリゴマーDNAは3本鎖を形成し、標的2本鎖DNAの3本鎖から遠い位置にあるピリミジン鎖にあるシチジンに対して選択的に反応することを見いだした。今後はこれらの成果をもとに今回開発した種々の誘導体を組み込んだペプチド核酸を合成し癌の診断・治療薬への展開を行いたいと考えている。本研究の目的は、私が開発した効率的なクロスリンク能を持つ2-アミノ-6-ビニルプリン誘導体を組み込んだペプチド核酸を用いて効果的な放射性アンチセンス核酸を合成し、癌診断薬剤あるいは癌治療薬としての可能性を検討することである。前年度までに、2-アミノ-6-ビニルプリンはシチジンに対して塩基選択的及び配列特異的に反応することを見いだした。これは生体内の適用を考えた場合、問題点となると考えられたため、新たに中性条件下でも反応する誘導体の設計合成を行った。その結果、合成した誘導体が、モノマーを用いたモデル実験において中性条件下でも反応することを示した。また癌治療薬としてオリゴ核酸の利用を考えた場合、m-RNAは繰り返し生産されるため根本的な治療を行うには標的を2本鎖DNAに設定したほうが望ましい。そこで2本鎖DNAに対して3本鎖を形成することで反応する、2-アミノ-6-ビニルプリン誘導体の設計、合成をおこなった。さらにこれらの化合物を含むオリゴマーDNAが2本鎖DNAに対して反応することを見いだした。現在さらにこれらの反応について詳細を検討中である。今後はこれらの基礎的検討をもとに、合成した誘導体をPNAに組み込み、さらに標識化を行い生体内の挙動を検討する予定である。
培養細胞及び個体レベルにおけるオーキシン誘導デグロン法基盤技術の開発

本助成により、植物ホルモンオーキシンが植物内で引き起こす分解システムを、異種真核生物に移植することに成功した。これにより、非植物細胞において標的タンパク質をオーキシン依存的に分解除去することが可能になり、私たちは本手法をオーキシン誘導デグロン(AID)法と命名した。私たちは本手法が出芽酵母、分裂酵母、ニワトリDT40細胞、マウスおよびヒト培養細胞で機能することを確認し、その成果を論文公表した。さらに、本手法を利用して、出芽酵母内の因子の機能解析に応用し、その成果を論文公表した。また、改良版AID法を開発することに成功し、特許申請を行った。これまでの研究により、私が開発した植物ホルモンオーキシンによるタンパク質分解系を、出芽酵母および動物培養細胞に移植することで特定のタンパク質をオーキシン添加により分解するAID (auxin inducible degron)システムの基礎は確立されていた。本年度は化このシステムの動物細胞における有効性を確認する実験を行った。そのためにニワトリ培養細胞DT40細胞において、実際の生存に必須な染色体制御因子CENP-HのAID発現コントロール株を作成し、この株の表現系と既存の転写レベルでの発現コントロール制御法と比較した。その結果、オーキシン添加によりCENP-Hは細胞内から30分以内に除去され、細胞周期は12時間以内にCENP-Hが機能するM期に停止することが分かった。これは転写制御法がCENP-H除去に36時間もかかることと比べると、AIDは極めて効果的に機能しており、実際に因子の機能を反映した表現系が非常に短時間で現れることが明らかになった。これまでの研究成果は、ArticleとしてNature Methods誌の2009年12月号に掲載された。一方、現在使用しているAIDシステムの改良も進めている。現在のAIDシステムでは標的タンパク質に25kDの分解標識(デグロン)を付加する必要があるが、これを縮小することを試みている。現在の9kDの縮小デグロンでも同等に機能することを確認した。今後はこの縮小型デグロンを用いてさらなるシステムの改良を行う予定である。昨年度までの研究により、私が開発したオーキシン誘導デグロン(AID)法が、出芽酵母だけでなく動物培養細胞にも有効に機能することが確認された。本年度は内在性遺伝子の改変が可能なDT40細胞を利用して、機能未知な因子に対するAID変異株を作成することで実際に機能解析が可能かどうか検証する実験を行った。これまで私が染色体複製に関する研究を行ってきたバックグラウンドから、出芽酵母には存在していないが高等真核生物には保存されており、染色体複製に関与することが示唆されているMCM-BPに関してDT40変異株を作成することにした。内在性MCM-BPを破壊したバックグラウンドに、デグロン融合型MCM-BPとOsTIR1を発現する株を得た。この株では、オーキシン添加後40分以内にほぼ全てのデグロン融合型MCM-BPが分解され、それに引き続いて細胞増殖の停止と細胞周期異常を伴う細胞死が観察された。今後はこの株を用いて、より深い機能解析を進めていく予定である。一方これまでの研究により、元々用いていた25kDのデグロンは9kD程度まで短縮することが可能であることが明らかになっていた。そこで、この短縮型デグロンを3つ連結させたものが、より良く機能するか出芽酵母を用いて検証した。その結果、従来型の必須因子に対するデグロン株ではオーキシン存在下でも成育が見られた株も、3つに連結した改良型では、より強い生育阻害が見られることが明らかになった。今後は、この改良型のより詳しい検証を行い、培養細胞でも機能するか確認を行う予定である。前年度より継続して行ってきた分解標識(デグロン)の小型化、さらにそれらを連結した改良型に関して、出芽酵母においておよそ30の必須因子に対して株を作成しこれらの機能を調べた。その結果、これまでのオーキシン誘導デグロンよりも改良型はより強い分解能力を持つことが明らかになり、それら内容を特許出願した。さらには、オーキシン誘導デグロン法が実際のタンパク質の機能解析に役立つことを示すために、DNA複製因子Mcm10に対するオーキシン誘導デグロン株を作成し、Mcm10の機能解析を行った。私たちは染色体複製開始反応において、複製ヘリカーゼの活性化反応にMcm10が寄与するという新たなMcm10の機能を見いだし、その結果をCurrent Biology誌に報告した。これにより、オーキシン誘導デグロン法が実際のタンパク質機能解析に役立つということを実証することができた。

培養細胞レベルにおいては、ニワトリDT40細胞において複数の複製関連因子(Mcm8,Mcm9,MCM-BP)の機能解析をオーキシン誘導デグロン法を応用して続けている。私たちはMcm8とMcm9が複合体として、DNA架橋修復に起こる二本鎖DNA切断を修復する相同組換え反応に機能していることを見いだした。この結果は現在論文として投稿中である。マウス個体レベルでの応用に関しては、EMBL Monterotondo研究所のChristophe Lancrin博士と共同研究を進行中である。_/ヒト培養細胞レベルでAID法を応用するためには、人工ヌクレアーゼを利用した遺伝子改変法TALENやCRISPRシステムの導入が不可欠である。私たちは、TALENおよびCRISPRコンストラクトを自分たちで設計、合成、活性評価する方法を確立した。さらに、作製した人工ヌクレアーゼによりU2OS細胞内で遺伝子改変にも成功した。現在、ヒト細胞でAIDにより、内在性遺伝子発現を自在にコントロールできる細胞株を作製中である。これまで本研究費によるサポートにより、出芽酵母を用いたAID法の樹立、改良、そしてヒト細胞レベルにおける実際の利用までほぼ到達することができた。また、多くの結果を論文公表することができた。今後は、ヒト細胞レベルにおいて実際に利用するため、現在継続中のAID株樹立のためのスタンダードプロトコール作製、さらにはマウス個体レベルへの応用を計っていくことが大切であろう。オーキシン誘導デグロン法の改良に成功し、その内容に関しては特許出願を行った。また、出芽酵母での実地応用に関しても論文として報告することができた。培養細胞レベルでの応用に関しては現在進行中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、オーキシン誘導デグロン法をヒト細胞レベルに応用するためには、内在性の遺伝子をどのように破壊するかもしくは、それらに分解標識を付加するかがカギになってくる。これまでこの問題に対する良い解決法が無かったが、去年報告された新たな遺伝子改変法TALENはこの状況を打破する大きなカギになると思われる。そこで、本年はオーキシン誘導デグロン法とTALENを組み合わせて、ヒト細胞レベルでコンディショナル変異株を作る技術を完成させることに挑戦したいと思っている。
メディア分析による近代日本におけるツーリズムの展開に関する研究

本研究は,新聞・旅行案内書・リーフレット・鳥瞰図・広告・写真などの多様なメディアを分析することで,近代日本におけるツーリズムの展開過程を考察することを目的とした。鳥瞰図を例にすると,近代化を象徴するイベントを伝える図像が積極的に取り入れられていたこと,表現内容には観光地としての変化が反映されていたことを明らかにした。本研究では,これまで十分に活用されていなかったメディアが有用な分析資料となることを示した。本研究は、新聞・報告書・旅行案内書・リーフレット・鳥瞰図・写真・広告などの多様なメディアを分析することで、近代日本におけるツーリズムが、どのような時期に、どのような場所で、どのような人びとを対象として成立していたのかを考察することを目的としている。ここでいうメディアとは、言語だけではなく、地図・イラスト・写真などの図像も含んでいる。本年度における研究成果は以下のとおりである。(1)「明治43年の群馬県教育品展覧会と郷土誌編纂事業」(えりあぐんま15号)では、明治期における地方博覧会が多くの人びとを動員したイベントであったことを示した。(2)「名所絵はがきを読む」(歴博158号)では、伊香保と草津の二つの温泉を事例として、絵はがき・鳥瞰図の分析による景観変遷の読解と、絵はがきの画像を利用する際の留意点や課題について論述した。(3)「戦前期における鉄道旅行の普及と草津温泉の変容」(『観光の空間』ナカニシヤ出版)では、統計・案内書・リーフレットなどを活用して、鉄道の発達とともに草津が湯治場から観光地へと変容していく過程を捉えた。上記の報告のほかに、メディア研究の方法論に関する文献の整理と内容の検討を行った。また、明治期に出版された日本全国を対象とした旅行案内書や写真帖を収集して、対象地域や挿絵等の画像をリストアップするなどのデータベース化を進めた。さらに、北海道大学附属図書館北方資料室や北海道立図書館において資料調査とその撮影を行った。これらの具体的な事例の検討は次年度以降に進める予定である。本研究は,新聞・報告書・旅行案内書・リーフレット・鳥瞰図・写真・広告などの多様なメディアを分析することで,近代日本におけるツーリズムが,どのような時期に,どのような場所で,どのような人びとを対象として成立していたのかを考察することを目的としている。ここでいうメディアとは,言語だけではなく,地図・イラスト・写真などの図像も含んでいる。本年度は,大正・昭和初期の絵はがきの収集と分析を進め,群馬地理学会大会と国立歴史民俗博物館での研究会において成果発表を行った。次年度に報告を公刊するべく準備中である。また,メディア研究の方法論に関して,文献の整理と内容の検討を行うとともに,大正期から昭和初期に出版された旅行案内書や鳥瞰図の調査・収集を行い,作成主体(著作者・出版者・販売者)などの情報をリストアップしてデータベース化を進めた。さらに,長崎県の雲仙などで現地調査を行い,長崎県立長崎図書館において雑誌・新聞などの資料を収集した。これらの資料は今後分析を進める予定である。なお,本課題に関連したものとして,草津温泉における源泉管理の仕組みの歴史的変遷について,壬申地券地引絵図や旅行案内書などを活用した考察結果をとりまとめた。また,本年度,これまで収集した研究資料を紹介するホームページを開設した。鳥瞰図や絵はがきをスキャンした画像資料を中心にして,簡便な解説を加えたものである。今後さらに閲覧できる資料の充実を図っていきたい。本研究は,新聞・報告書・旅行案内書・リーフレット・鳥瞰図・写真・広告などの多様なメディアを分析することで,近代日本におけるツーリズムの展開過程を考察することを目的とした。本年度は,おもに大正・昭和初期の絵はがきと鳥瞰図の収集とそれらの分析を進めた。研究成果としては,次のものを公刊した。(1)「絵はがきから草津温泉の景観を読む」では,大正昭和初期にかけて多様な絵はがきセットが発行されており,温泉街よりも周囲の景勝地を多く取り上げていること,交通機関の整備とともに次第に周遊観光地が含まれるようになったことなどを示した。(2)「鳥瞰図にみる近代--草津温泉を事例に」では,鳥瞰図には近代化を象徴するイベントがあれば,それを伝える図像が積極的に取り入れられていたこと,表現内容は湯治場から観光地への変化を反映していたことを明らかにし,土産物として発行された鳥瞰図が有用な分析資料となることを示した。このほか,長野県立歴史館の秋季企画展「観光地の描き方--浮世絵版画から観光パンフレットまで」に協力し,図録への寄稿(「吉田初三郎の鳥瞰図に描かれた信州の温泉」),講演会(「近代の観光と信州の温泉地」)を行った。また,国立歴史民俗博物館の企画展示「風景の記録--写真資料を考える」の展示プロジェクトにかかわった。これらによって研究成果を社会に発信した。なお,昨年度開設した研究資料を紹介するホームページについては,逐次更新を行ってきた。
ポジティブな側面からの健康指標の開発と中高年者の健康度評価

本研究では,茨城県阿見町に居住する65歳以上の高齢者全員(約5500名)を対象に悉皆調査を行い,健康に影響を及ぼす様々な要因と健康状態との関連を探った。調査は,平成8年1月2月に実施された。調査方法は質問紙による訪問留置法を用いた。まず,調査員が各家庭を訪問し,調査の目的を十分説明した上で調査票を配布し,約1週間後に再度訪問して回収するという手順で実施された。その結果,4939名から回答が得られた。調査票の回収率は90.5%であった。ライフスタイルと健康状態との関係を探るため,多重ロジスティック回帰分析を行った結果,いくつかの要因で有意な関連が認められた。睡眠時間が7時間よりも少ない者,あるいは9時間以上と多すぎる者では,Odds比が有意に高いことが示された。また,朝食をほとんど食べない者ではやはりOdds比は有意に高かった。同時に,運動頻度が週1回よりも少ない者のOdds比は有意に高かった。喫煙については,以前は吸っていたが現在はやめていると回答した者で,健康度が低い状況が認められた。食生活については,多くの者が野菜などをよく食べ,塩分のとり過ぎなどに気をつけ,栄養のバランスに気を配っているなど,比較的よい状態であったが,食事のメニューにバラエティがないこと,あるいは食べるのが速すぎることなど,いくつかの問題点も示された。精神的健康度(抑うつ度)は,健康に関連する様々な項目と関連が見られ,高齢者が元気で生き生きとした生活を過ごすための重要な要素であることが推定された。また,日常生活活動能力は,年齢が高くなるにしたがって明らかに低下するなど,有効な指標であることが示唆された。本研究では、中高年者を対象に健康調査を実施し,健康感,既往歴,自覚症状,ストレスの状況,ライフスタイルの状況,余暇生活の状況など,幅広い調査データをもとに,各要因と健康状態との関連を探り,ポジティブな側面からの健康指標を構築することをねらっている。平成7年度の研究計画では,綿密に計画された健康調査を実施することが目標であった。そこで,平成8年1月27日2月20日の期間において,茨城県阿見町に居住する65歳以上の住民全員を対象として,健康調査を実施した。調査の概要は,以下の通りである。まず,住民台帳に基づき,平成7年11月1日の時点において,年齢が65歳以上の高齢者を調査対象としてリストアップした。その作業により,男性2289名,女性3081名,合計5370名の高齢者が調査対象としてリストアップされた。調査方法としては,質問紙による訪問留置法を用いた。まず,調査員が各家庭を訪問し,調査の目的を説明した上で調査票を配布し,約1週間後に再度訪問して調査票を回収するという手順で実施された。その結果,男性2095名,女性2785名から回答が得られた。したがって,調査票の回収率は,男性91.5%,女性90.4%という状況であった。なお,調査票を回収できなかった者の内訳は,回答拒否129名,転居30名,死亡48名,入院・入所81名,長期不在50名,不明151名という状況であった。この調査データをもとに,平成8年度には,詳細なデータ解析を実施し,研究報告書を作成する計画である。
メスとオスの液性因子に制御される精子の生存機構

当初、子宮内の殺精子因子には性周期依存的なホルモンを予想していたが、解析の結果、免疫に関連する補体がその候補としてあがってきた。特に補体C3は発情期において子宮で高発現しており、子宮内液中に高濃度に存在した。卵巣摘出マウスに高濃度E2投与をすることで人為的にC3の産生を促すことにも成功した。この方法により回収した子宮内液は精子の凝集を起こし死滅させることが分かったが、その際にC3が活性化している様子は観察されなかった。しかし免疫不全マウスのメスとSVS2KOオスマウスを交配させたところ、妊孕性が野生型オスの半分程度まで回復したことから、殺精子作用にはメスの免疫とくに補体が関与すると考えられる。本研究の申請段階では、子宮内の精子に障害をもたらす因子はプロジェステロンまたはその派生物と考えていた。しかし子宮内液中にステロイド骨格を持つ因子を網羅的に調べても精子を殺す作用を持つ因子は検出されなかった。そこで視点を変えて、子宮内でSVS2非存在時の精子細胞膜の破壊のされ方に注目した。子宮内において精子は細胞膜・核膜ともに破壊されていたが、完全に膜を欠失したものは少なく、比較的小さい穴が開いているものが多かった。このような穴のあけ方をする因子の一つに補体がある。そこで一般的に補体が失活するとされる56°Cで30分間、子宮内液を処理したものを精子に作用させた。その結果、精子を殺す作用は失活することが明らかとなった。この結果から、子宮内の殺精子因子は補体関連因子ではないかと予測した。補体シグナルは複雑かつ関連する因子が多いことで有名である。そこで、多くの抗体を用いて補体を検出するよりも子宮内液に含まれるタンパク質を網羅的に同定することにした。その結果、子宮内液にもっとも多く含まれていたタンパク質は補体C3であることが判明した。その他にも補体関連因子やIgGなどシグナルに関連する因子が多く同定された。一般的に補体シグナルが活性化して抗原の細胞膜を破壊するまでに必要な因子の上流はほぼ子宮内液に含まれていることが分かったが、一方で、実際に細胞膜に穴をあける因子(C6,C7,C8,C9)は検出されなかった。補体C3が殺精子因子として機能しているかどうか確認するために、抗体を用いて免疫除去した子宮内液を精子に作用させたところ、殺精子効果は減弱することが明らかとなった。しかし一方で、精子を殺す状況下でC3は活性化していないことも判明した。これらの結果から、子宮内液に存在するC3が殺精子因子である可能性は高いが、その作用機序は通常の免疫機構とは異なる可能性があると考えられた。本年度は、子宮内におけるC3の発現条件やその活性化機構について解析を行った。先ず、野生型のメスマウスを用いて、腟スメア法で性周期を発情期および休止期に分類し、その子宮からmRNAを精製し、C3の発現量をqPCRにて確認した。その結果、発情期の子宮ではC3が高発現しており、休止期の子宮では低い値であることが分かった。一般的に、肝臓で補体は合成されると言われているが、発情期の子宮におけるC3発現量は肝臓と同レベルであることも明らかとなった。一方、卵巣内での卵子の発育・排卵を強制的に行うPMSG/hCG注射(過排卵)処理をしたマウスは一般的に発情期と同じだと考えられるが、その子宮内液には精子を殺す作用が見られないことも明らかとなった。そこで、過排卵処理した子宮からmRNAを回収し、C3の発現を調べたところ、休止期と同等の低い発現量であることも判明した。以上の結果から、子宮C3は性ホルモンの感受性があること、またそのホルモンはLH/FSHではないことも判明した。昨年度までの研究から、子宮内には補体C6-C9の因子が存在しないことが明らかとなっている。この結果は子宮内で補体パスウェイが働いていないことを示唆している。本年度はC3の働きを調べる目的で、発情期のマウスから回収した子宮内液を体外で処理し、C3の活性化状態を調べた。通常、ザイモザンを添加することによってC3はC3αがC3α'となり活性化することから、ザイモザン処理した子宮内液をポジティブコントロールとし、精子処理をした子宮内液を調べた。その結果、子宮内液に含まれるC3はC3αのままであり、精子処理をした子宮内液でも活性化される様子は見られなかった。これらの結果から、子宮内で精子が死滅する経路には、補体の古典的な活性化は関与していないと考えられた。本来であれば、子宮内の殺精子因子の候補である補体C3のKOマウスを導入し、解析を開始しているはずであったが、マウスの搬入が行えず野生型マウスでの解析に留まってしまった。このように実験ペースが遅れた原因は、平成27年度に所属が明治大学へ変わり、実験環境や授業等の仕事が増えたため、これまでと同じペースで実験を行うことが難しかったためである。しかし28年度は実験環境も整備され、授業等の仕事も慣れてきたため、以前のペースで結果を出すことが可能と考えられる。本年度は、子宮内における補体C3のタンパク質としての発現機構について解析を行った。

卵巣摘出(OVX)マウスを作製し、C3を分泌する内分泌条件を調べたところ、高濃度のエストロジェンを腹腔内投与したマウスの子宮において大量のC3が分泌されていることが明らかとなった。しかしプロゲステロンを同時に投与したところ、C3の分泌は見られなくなった。この結果から、子宮のC3分泌機能はエストロジェン依存であることが明らかとなった。またこのような人工的に誘導した子宮内液およびC3においても、精子を殺す作用が同等にあることが明らかとなった。以上の内分泌条件から考えると、子宮がC3を分泌するのは性周期のうち発情期および発情前期であると推察され、丁度交尾を行う時期に相当するタイミングで子宮からC3が発現していることが判明した。C3が多量に分泌される発情前期および発情期の子宮内を調べた結果、子宮内液には多くの細菌が存在することが明らかとなった。全ての細菌種の同定には至っていないが、補体C3が多く存在する状況である種の細菌は生存できることを意味している。昨年度までの解析によって、交尾経験のないメスマウスから回収した子宮内液でも、殺精子活性を有していることが明らかとなっている。子宮内C3がどのように精子を認識し、殺しているのかそのしくみは明らかにできていないが、今後、子宮で生存できる細菌との比較を行うことでその機構を明らかにしていきたい。当初、子宮内の殺精子因子には性周期依存的なホルモンを予想していたが、解析の結果、免疫に関連する補体がその候補としてあがってきた。特に補体C3は発情期において子宮で高発現しており、子宮内液中に高濃度に存在した。卵巣摘出マウスに高濃度E2投与をすることで人為的にC3の産生を促すことにも成功した。この方法により回収した子宮内液は精子の凝集を起こし死滅させることが分かったが、その際にC3が活性化している様子は観察されなかった。しかし免疫不全マウスのメスとSVS2KOオスマウスを交配させたところ、妊孕性が野生型オスの半分程度まで回復したことから、殺精子作用にはメスの免疫とくに補体が関与すると考えられる。当初の予想としては、子宮内のステロイド骨格を持つ因子が精子を殺す作用があると考えていたが、そのような因子は見つけることが出来なかった。しかし発想の転換により、その他の可能性のある候補因子を見つけるに至った。この候補因子は非常に有名な免疫関連因子であり、既に欠損マウスの報告がなされているが、顕著な表現型がないことでも有名である。しかし、私が解析している精嚢タンパク質SVS2を欠損した雄マウスと交尾した場合には表現型が出るのではないかと予想しており、その場合には、生殖と免疫をつなぐ新しい研究分野の創設につながるのではないかと期待している。これまでの結果から、子宮内の殺精子因子は補体C3である可能性が高くなっている。しかしその作用機序は一般的なものではないことから、作用機序を明確にするためにはC3KOマウスを導入し、野生型との違いを詳細に調べる必要があると考えている。本年度の前半にその解析を急ぎ、年度内に結果を出したい。動物生殖学次年度は、子宮内の候補因子を確実なものとして同定し、更にはどのような作用機序で子宮内精子を攻撃しているのか、詳細に解析していく予定である。また、因子が同定できた場合には、ヒトにおいてもその因子の発言があるか確認し、さらに不妊傾向のある患者においてその量がどうなっているか、調べたいと思っている。2015年度3月分の人件費・謝金を支払うために、次年度使用額が生じてしまった。2015年度3月分の人件費・謝金に使用する。
過冷却水の瞬間相転移に伴う音波発生と潜熱不安定性

過冷却水滴の凍結は一次相転移で、体積膨張と温度上昇が高速に起こると考えられる。本研究では凍結時に起こる瞬間的な体積膨張を超音波の発生(Acoustic Emission, AE)として、また潜熱の放出を急激な温度上昇として捉えることができた。撥水性容器に満たしたシリコーンオイル中に滴下した直径約1mmの脱気水滴を徐冷し、過冷却状態にした後、-5°Cから-20°Cの範囲で自然凍結させた。AE捕捉には使用周波数が10k250k、200k2MHzである水中マイクまたはAEセンサを用いた。一つの水滴から複数個のAEが得られたこともあり、凍結条件による凍結の多様性や凍結のタイミングについても考察を進めた。一様に体積膨張が起こるモデルと捕捉されたAE波形を比較検討した。さらに、温度上昇を測ることで凍結現象を確かに捉えていることを示すために温度上昇との同時測定を試みた。得られたAE波形に対し、FFTを用いてスペクトルを割り出し、単調膨張モデル等により波形発生メカニズムと凍結速度の関連付けを試みた。凍結時に発生するAEは3成分に分解され、それらは膨張とその停止に伴う球面波波形、2種の球の共振モードとそれらの消長とすると説明できることが判明しつつある。膨張球のAEについての理論的解析を行い論文を公表した。また、膨張過程の時間をAE波形から割り出し、数マイクロ秒と極めて高速の膨張過程が存在する可能性が高い。また潜熱放出に伴う温度上昇が観測され、使用した熱電対の測定限度である1ミリ秒より速い温度上昇が生じていることが判明した。本研究では、微小水滴が氷に相転移する瞬間の体積増を超音波AE信号として、また潜熱放出を温度上昇として観測し、結晶化過程の時間推移を把握することを目的とする。過冷却状態の静的物理化学的研究は海外でも盛んに行われているが、ミリ秒からナノ秒のタイムスケールで過冷却水の転移過程を動的にトレースする点が本研究の特徴である。各種サイズ(0.3mmから2mm)の水滴を低粘度シリコンオイル中に分散させ、0°Cをこえて低温状態にして徐々に温度を低下させたときの凍結によるAE信号と温度上昇を測定した。超音波AE信号は、水中マイクとAEマイクで検出し、受信信号をシーケンシャルシングルショット形のデジタルオシロに記録した。標準水中AEマイクは10Hzから200kHzの超音波を、AEマイクは200kHz2MHzの検出するのに使用した。信号の大きさは100マイクロボルトから10mVまで粒子径に対数的に比例した相関が見られたが、AE周波数については径にはよらず0.31MHzの範囲のスペクトルが観測された。温度上昇の測定には25ミクロンの熱電対を使用し、1msの昇温速度が得られたが、この値はこの径の熱電対の測定限度であり、凍結時の昇温速度は更に高速である。結論として凍結は1ms以上1マイクロ秒程度の間で進行していることが予想される結果が得られた。
文化財建造物の健常度調査に用いる超音波音速CT装置の開発

本研究では、文化財建造物の健常度調査のためその構造部材内部の異常部を非破壊で可視化する、可搬性があり容易に取扱いができる実用的な超音波音速CT装置の開発を行った。具体的には、1あらゆる音響特性の探査対象に強力かつ鋭い超音波パルスを打ち込める小型音源の設計・製造方法の確立、2超音波の波動性を考慮した画像再構成手法の開発、及び、現場での調査作業を容易にする3堅牢かつ軽量で一体化された超音波音速CT用機器の開発、4調査現場における音波伝搬時間測定の自動化を実現した。しかし、小型強力超音波音源の開発とその装置への組込みと調査現場における画像処理の自動化までは達成できなかった。交付決定が11月であったため、初年度の研究計画を当初のものから大幅に変更し、文化財建造物の現場における探査実験の結果を踏まえた小型強力音源の試作は断念して、マルチプローブ超音波音速CTシステムの中枢となるスイッチボックスの仕様の策定とその試作を先行して行なった。試作したスイッチボックスは、プローブとの接続数は18チャンネル、パワーアンプからの送波用駆動電圧入力及び受波信号出力はは1チャンネルで、受波プローブと送波プローブの選択を市販のコンピュータからUSBインターフェースを介して高速に行えるようになっている。また、制御用のプログラムモジュール(サブルーチン)も開発した。このスイッチボックスは、次年度以降、現場での探査実験に供し、その実用上の問題点を整理しながら、逐次改修を加えることで、完成させて行くことになっている。また、スイッチボックスの試作と並行して、山形大学工学部キャンパス内にある国指定重要文化財「旧米沢高等工業学校本館」の中央屋根部屋内の4本の柱の超音波探査を既存の装置を使用して行った。この建物は竣工後百年以上を経過している明治期の木造擬洋風(ルネサンス様式)建築であり、一部の外壁部材等に腐朽が見られていたことと、東日本大震災によって被害を受けたことから、現在修復工事が行われているが、その最中の平成26年1月7日と8日に探査実験を行った。結果的には、それら構造部材に大きな問題は見出せなかったが、音波の減衰が著しい節の貫入がある柱の1カ所だけに見られた。この情報は、修復工事に当たっている建設会社並びに大学の施設管理部門に伝えられた。重文「旧米沢高等工業学校本館」での探査実験では、作業空間が暗く狭い上、入り組んでいたため足場が十分に組めず、作業者同士の意思疎通も図り難かったが、こうした困難な場所での作業に対処するための、実用上の多くに知見が得られた。平成26年度は、岩手県二戸市にある天台寺の本堂の木柱及び板壁、並びに島根県出雲市にある出雲大社の会所と摂社素鵞社(そがのやしろ)の木柱及び板壁や梁の、探査実験を行い、そこで得た知見に基づいて、装置自体の改良作業を行うとともに、自動計測システムの構築を進めた。天台寺本堂の木柱に関しては報告書を作成し、現地で保存修復工事にあたっている文化財建造物保存技術協会の担当者に提出している。出雲大社に関しては、現在データの処理中である。前年度の旧米沢高等工業学校本館(国指定重文)中央屋根部屋の木柱探査実験の教訓を基に、開発した専用スイッチボックスを改良し、計測システムを構成する多くの装置群をUSBインターフェースを介してラップトップコンピュータで制御できたことが、天台寺本堂の実験における大きな成果であった。さらに従来、各超音波送受波器(プローブ)間ごとに駆動電圧や測定範囲を手動で設定していたが、出雲大社の探査実験では、それらの設定作業もラップトップコンピュータで自動的に行えるよう専用プログラムを開発し使用した。素鵞社では測定対象の木柱が円柱であったことから、測定用の超音波プローブ18本をその周囲にワイヤーで固定した後は、それら送受波器間の153の経路について、30分足らずで自動的に伝搬時間測定を終えている。一つの伝搬経路に関して256回の積算処理を行っているため、合計4万回弱の伝搬時間測定をこの時間内に自動的に行うことができるようになったことになる。超音波プローブ群の位置を中心角について10度ずらして再度同様な測定を行い、合計306の経路における伝搬時間から木柱断面(2断面)の再構成画像を得るためのデータを取得している。両現場とも、細い木柱や板壁、梁なども「差し渡し法」によって探査し、腐朽及び虫害が著しく交換などの抜本的な補修が必要な部材を現場で短時間に特定できた。平成27年度は島根県出雲市にある出雲大社参道の勢溜(せいだまり)の鳥居の木製(台湾檜)の柱を、前年度に計測の自動化を実現した超音波音速CTシステムを用いて探査した。その結果、勢溜の鳥居は腐朽の進行が著しく、正常な木柱なら確認できるはずの音波伝搬が全く確認できない部分が多数あり、探査した3断面のうち辛うじて1断面しか画像化できなかったことから、倒壊の危険があることを大社側に指摘した。その指摘を受けて出雲大社はこの鳥居を取り壊し鉄製の鳥居で再建することを決定している。また雨天での探査実験であったことから、雨滴から装置の電気的接点を確実に守るより効果的な工夫が必要であることが判明した。上記の探査結果は、協力を頂いた公益財団法人文化財建造物保存技術協会(以下「文建協」)に報告したが、さらに平成28年6月に開かれる日本文化財科学会の第33回大会でも発表する予定である。

また、山形市教育委員会の依頼を受け、山形市にある凝灰岩製の元木の鳥居の簡便な超音波探査を行い、その劣化が著しいことを見出したり、文建協の協力を得て、山形県鶴岡市にある木造の旧鶴岡警察署庁舎の探査実験も行っている。前年度に行った岩手県二戸市の天台寺本堂の超音波探査の結果は、平成27年7月に開かれた第32回日本文化財科学会で発表したが、出雲大社の素鵞の社(さがのやしろ)等の探査結果については、大社側の要望により、まだ公表できていない。一方、技術的研究成果については、11月に計測自動制御学会英文誌に画像信号処理手法に関する学術論文を掲載するとともに、同年12月にシンガポールで開かれた国際学会(WESPAC2016)でも別の信号処理手法についての基礎的研究結果を発表し、講演論文を議事録に掲載させた。それ以外にも、平成28年3月日本音響学会春季研究発表会で2件の技術的研究成果を口頭発表している。追加採択のために研究初年度の研究期間が4か月しかなかった影響が、まだ尾をひいている。特に小型強力超音波音源の開発があまり進んでいない。一方、画像信号処理の手法や計測システム全体の制御などに関しては、ほぼ当初計画していた水準の成果が上げられそうである。実際円形断面の探査対象については、音波伝搬時間測定の完全自動化を達成し、また画像・信号処理手法に関しては、有効と思われる方式を考案でき、シミュレーションによって、実用上有効たり得ることが証明されている。ただ、実用的側面においては、その画像・信号処理手法における数値パラメータの設定手法がまだ未完成である。開発された画像・信号処理手法に関する成果については、計測自動制御学会の英文誌に学術論文として掲載されている。最終的に現場で使用可能なシステムを構築することが、本研究の最も重要な目的である。そのために、当初計画の大幅な見直しと変更を行うことで、研究期間の短縮にもかかわらず、その最大の目標は確実に達成できる見通しがたったことから、研究業務遂行上の大きな誤りはなかったと考えられる。やはり、8か月間の研究期間短縮は、当初計画の目標を完全に達成することを極めて困難にしたと言わざるを得ない。むしろ、その影響を音源の開発に関わるところだけに限定することには成功し、本研究の最も重要な目的達成の目途はたったと考えている。平成28年度は、前年度までのフィールドワークから得られた知見を踏まえて、東北大学の大実験場で大型モルタル試験体を用いた実用化試験を行い、これまでに行ってきた開発や改良の検証を行った。その結果、TOFの自動計測システムにおいては、原因不明の動作不良が時々起きることが見出された。手動での計測においては問題なく動作していることから、自動計測のための制御用ソフトウェアもしくはコンピュータの問題だと考えられたが、最終的にその原因を突き止めることはできなかった。このトラブルは、作業環境の整った室内での実験では全く生じないことから、フィールワーク専用のラップトップコンピュータを新たに購入して対処することにした。また、追加採択で初年度の研究期間が4カ月間しかなく、研究計画を大幅に変更しなけらばならなかった影響で、小型強力超音波音源の開発が最後まで遅れてしまい、新しい超音波音速CTシステムにそれらを組み込むことはできなかった。しかし、最終的に回転角法レンチを用いた再現性の良い組み立て方法は確立し、振動解析結果との対応がつけやすい製造方法を確立できたので、今後はそれに基づいて新しい音源を作成し、現有のシステムに組み込む込む予定である。
ミトコンドリアtRNA異常症の発症機構に関する分子生物学的研究

【目的】未だ病態の解明されていないミトコンドリアtRNA異常症でその分子生物学的病態を明確にする。【結果および考察】1)Leigh脳症の患者で、MELASで報告されているミトコンドリアtRNALeu(UUR)のA3242Gの点変異を世界で初めて発見報告した。患者は、大脳基底核領域の対称性壊死とグリオーシスを認め、臨床病理学的にはLeigh脳症と確定できた。幼少時より精神運動発達遅滞を呈し、神経学的にLennox-Gastaut症候群を伴っていた。家系では、母系遺伝が認められた。本症は、ミトコンドリア遺伝子異常症の臨床スペクトルを確認する上で重要な症例と思われる。2)上記症例においてRNA19の異常蓄積を認めた。このことは、MELAS、Leigh脳症などの臨床病型を問わず、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のA3243Gの点変異を有する患者ではミトコンドリアRNAのプロセッシングが異常となることを示しており、普遍的な病態が存在する事を示している。同じ遺伝子異常であるにも拘わらず、異なる病型を示す機序に関しては今後の各臓器での点変異分布、臓器におけるATP依存度、臓器による特異的なプロセッシングの違いが症状発現に関与している可能性が考えられ今後検討しなければならない。3)最近NIDDM、IDDMでミトコンドリアDNAに異常を有する糖尿病(ミトコンドリア糖尿病)が報告された。報告例は、いづれも成人症例で前糖尿病病型の1%から8%と多く報告されている。一方、ミトコンドリアDNAの変異は、核DNAの10倍と変異率が高く、小児糖尿病症例での点変異の報告はない。今回15歳以下で糖尿病を発症した症例115例に関し、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のA3243Gの点変異の頻度を検索した。その結果、小児糖尿病115例中、1例で同様の変異が確認され、一般小児糖尿病患児でもミトコンドリアtRNALeu(UUR)のA3243G変異は確認された。【今後の展望】現在多くのミトコンドリアDNA異常症が報告されている。しかしその遺伝子異常と病型発現を解明する病態生理に関しては未だ不明の点が多く、今後DNA、RNA、酵素活性などの機能検索と、元来臓器別に異なると考えられる各種遺伝子発現機構の関係を重点に研究をすすめていく必要がある。【結果および考察】1)Leigh脳症の患者で、MELASで報告されているミトコンドリアtRNALeu (UUR)のA3243Gの点変異を世界で初めて発見報告した。

幼少時より精神運動発達遅滞を呈し、神経学的にLennox-Gastaut症候群を伴っていた。家系では、母系遺伝が認められた。本症は、ミトコンドリア遺伝子異常症の臨床スペクトルを確認する上で重要な症例と思われる。2)上記症例においてRNA19の異常蓄積を認めた。このことは、MELAS、Leigh脳症などの臨床病型を問わず、ミトコンドリアtRNALeu (UUR)のA3243Gの点変異を有する患者ではミトコンドリアRNAのプロセッシングが異常となることを示しており、普遍的な病態が存在する事を示している。同じ遺伝子異常であるにも拘わらず、異なる病型を示す機序に関しては今後の各臓器での点変異分布、臓器におけるATP依存度、臓器による特異的なプロセッシングの違いが症状発現に関与している可能性が考えられ今後検討しなければならない。3)最近NIDDM、IDDMでミトコンドリアDNAに異常を有する糖尿病(ミトコンドリア糖尿病)が報告された。報告例は、いづれも成人症例で全糖尿病病型の1%から8%と多く報告されている。一方、ミトコンドリアDNAの変異は、核DNAの10倍と変異率が高く、小児糖尿病症例での点変異の報告はない。今回15歳以下で糖尿病を発症した症例115例に関し、ミトコンドリアtRNALeu (UUR)のA3243Gの点変異の頻度を検索した。その結果、小児糖尿病115例中、1例で同様の変異が確認され、一般小児糖尿病患児でもミトコンドリアtRNALeu (UUR)のA3243変異は確認された。【今後の展望】現在多くのミトコンドリアDNA異常症が報告されている。しかしその遺伝子異常と病型発現を解明する病態生理に関しては未だ不明の点が多く、今後DNA、RNA、酵素活性などの機能検索と、元来臓器別に異なると考えられる各種遺伝子発現機構の関係を重点に研究をすすめていく必要がある。
種子分化に伴う特異タンパク質遺伝子の発現制御

マメ類の種子中には,塩可溶性貯蔵タンパク質および種々のプロテアーゼインヒビターなどが含まれている.これらのタンパク質は,種子の分化成熟に伴い合成貯蔵される.この遺伝的な制御機構を解析するために,本当はプロテアーゼインヒビターcDNAをクローニングし,その塩基配列を決定するとともに,このcDNAをプローブとしてマメの登熟過程におけるインヒビターmRNAの貯積を解析した.シカクマメの開花後35日目の未熟種子より全ポリ(A)^+RNAを調製し, Gubler&Hoftmanの方法を基に2本鎖cDNAを合成した.EcoRI部位をメチル化し, EcoRIリンカー付加に続いてEcoRI消化し, λgt11ベクターのEcoRI部位に挿入し, cDNAライブラリーを作製した.キモトリブシンインヒビターWCI-3に対する抗血清を用いてスクリーニングし,候補cDNAクローンを得た.このcDNAをプラスミドにサブクローニングし,サンガー法により全塩基配列を決定した.cDNAは762塩基からなり, 207アミノ酸からなるペプチドをコードしていた.25番よりC末端までの183残基からなる推定アミノ酸配列は, WCI-3の一次構造と完全に一致し, WCI-3cDNAであることが確認された. N末端に存在する24アミノ酸からなる領域は,疏水性アミノ酸に富み,シグナルペプチドと推定された.このcDNAをプローブとして,開花後30, 35, 40日目のシカクマメ種子より調製した全ポリ(A)^+RNAをノザン分析した結果, 35および40日目の種子中にはWCI-3mRNAが存在するが, 30日種子中には存在しないことが確認された. mRNAの検出とインヒビタータンパク質の出現が一致することから, WCI-3の合成制御はmRNAの蓄積によることが明らかになった.マメ類の種子中には,塩可溶性貯蔵タンパク質および種々のプロテアーゼインヒビターなどが含まれている.これらのタンパク質は,種子の分化成熟に伴い合成貯蔵される.この遺伝的な制御機構を解析するために,本当はプロテアーゼインヒビターcDNAをクローニングし,その塩基配列を決定するとともに,このcDNAをプローブとしてマメの登熟過程におけるインヒビターmRNAの貯積を解析した.シカクマメの開花後35日目の未熟種子より全ポリ(A)^+RNAを調製し, Gubler&Hoftmanの方法を基に2本鎖cDNAを合成した.EcoRI部位をメチル化し, EcoRIリンカー付加に続いてEcoRI消化し, λgt11ベクターのEcoRI部位に挿入し, cDNAライブラリーを作製した.キモトリブシンインヒビターWCI-3に対する抗血清を用いてスクリーニングし,候補cDNAクローンを得た.このcDNAをプラスミドにサブクローニングし,サンガー法により全塩基配列を決定した.cDNAは762塩基からなり, 207アミノ酸からなるペプチドをコードしていた.25番よりC末端までの183残基からなる推定アミノ酸配列は, WCI-3の一次構造と完全に一致し, WCI-3cDNAであることが確認された. N末端に存在する24アミノ酸からなる領域は,疏水性アミノ酸に富み,シグナルペプチドと推定された.このcDNAをプローブとして,開花後30, 35, 40日目のシカクマメ種子より調製した全ポリ(A)^+RNAをノザン分析した結果, 35および40日目の種子中にはWCI-3mRNAが存在するが, 30日種子中には存在しないことが確認された. mRNAの検出とインヒビタータンパク質の出現が一致することから, WCI-3の合成制御はmRNAの蓄積によることが明らかになった.