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子宮内癌の発癌・進展におけるエストロゲン受容体変異株の生物学的意義の解析

我々は、ヒト子宮内膜ならびに内膜癌において、exon5ならびにexon7が欠失したエストロゲン受容体(ER)αmRNA variantsが存在することを初めて明らかにし発表したが、本研究の目的は、これらのヒト子宮内膜癌の発癌・進展におけるこれらER変異株の生物学的意義を解析することであった。この目的達成のために、ERの遺伝子発現の調節機構を解明することが必要不可欠と考えられた。そこで、ERαならびにβの遺伝子発現機構の解析を行った。この結果、ERαの遺伝子発現の多重非翻訳第一エキソンならびに多重プロモーター機構による調節機構の詳細を解明した。また、ERβの遺伝子発現も多重プロモーター機構により調節されていることをはじめて明らかにした。この遺伝子発現の調節機構をより詳細に検討するため、非翻訳第一exonならびにプロモーター機構により遺伝子発現が調節されている代表的な遺伝子であるアロマターゼ(エストロゲン合成酵素)遺伝子について解析を行った。さらに、子宮内膜癌におけるERαならびにβ遺伝子のプロモーター活性の変化を検討した。以上の成績から、子宮内膜ならびに内膜癌におけるERαおよびβの遺伝子発現機構の詳細がかなり明らかにすることができた。また、ヒト子宮内膜ならびに内膜癌のプロゲステロン受容体(PR)にも、ERαと同様の複数のsplicing variantsが存在することをはじめて明らかにした。これらの成績から、ヒト子宮においてこれらの性ステロイドホルモン受容体の変異株が何らかの生理的・病的な役割を果たしていることが強く示唆された。しかしながら、これまでの研究期間においてこれらの変異株mRNAの発現機構、ことにalternative splicingの調節機構を解明するには至っていない。今後、子宮内膜癌の発癌・進展におけるこれらの受容体変異株の生物学的意義を究明するために、さらにこの発現機構・調節機構に焦点を絞って研究を展開する予定である。本研究の目的は、子宮内膜癌の発癌・進展過程におけるER variantsの生物学的ならびに臨床的意義を明らかにすることである。本研究は3年計画であり、研究の初年度である本年度は、正常子宮内膜ならびに内膜癌におけるER variantsの存在とそのレベルの解析をおこなった。その結果、内膜癌の脱分化に伴うwild type ER mRNAレベルが低下するが、とくに分化度の低いG3癌の中にはER mRNA variantsのレベルの低下が見られないものがあることが判明した。このER mRNAvariantsの遺伝子発現の調節機構を検討する目的で、とくに本年はER遺伝子の上流構造につきラットをモデルに研究を開始した。その結果、ER遺伝子に多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構が存在していることを明らかにし報告した(文献1、2参照)。また、ヒトのER遺伝子の上流構造についても研究に着手し、ラットと同様に多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構が存在していることを明らかにした。現在、子宮内膜癌における多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構の詳細について解析を開始したところである。すでに、正常子宮内膜ならびに内膜癌におけるER variantsの存在とそのレベルの解析を行った。その結果、内膜癌の脱分化に伴いwild type ER mRNAレベルが低下するが、とくに分化度の低いG3癌の中にはER mRNA variantsのレベルの低下がみられないものがあることが判明した。このER mRNAvariantsの遺伝子発現の調節機構を検討する目的で、ER遺伝子の上流構造についてラットおよびサルをモデルに研究を開始している。その結果、ER遺伝子に多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構が存在していることを明らかにした(文献1、2)。また、ヒトのER遺伝子の上流構造についても研究に着手し、ラットやサルと同様に多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構が存在していることを明らかにした。

現在、子宮内膜癌における多重非翻訳第一エキソンならびにプロモーター機構についての詳細な解析を開始したところである。我々は、ヒト子宮内膜ならびに内膜癌において、exon5ならびにexon7が欠失したエストロゲン受容体(ER)αmRNA variantsが存在することを初めて明らかにし発表したが、本研究の目的は、これらのヒト子宮内膜癌の発癌・進展におけるこれらのvariantsの生物学的意義の解析を行うことであった。このために、ERの遺伝子発現の調節機構を解明することが必要不可欠と考えられた。そこで、ERαならびにβの遺伝子発現機構の解析を行った。この結果、ヒトERαならびにβの遺伝子発現が多重非翻訳第一エキソンならびに多重プロモーター機構によって調節されていることがはじめて明らかになった。この遺伝子発現の調節機構をより詳細に検討するため、非翻訳第一exonならびにプロモーター機構により遺伝子発現が調節されている代表的な遺伝子であるアロマターゼ(エストロゲン合成酵素)遺伝子について詳細な解析を行った。さらに、子宮内膜癌におけるERαならびにβ遺伝子のプロモーター活性の変化を検討した。以上の成績から、子宮内膜ならびに内膜癌におけるERαおよびβの遺伝子発現機構の詳細がかなり明らかにすることができた。しかしながら、ERの変異株mRNAの発現機構、ことにalternative splicingの調節機構を解明するには至っていない。今後、さらにこの点に焦点を絞って研究を展開する予定である。
胸部悪性腫瘍における腫瘍免疫抑制機構の解明とその臨床応用

免疫チェックポイント経路の一つであるPD-1(Programmed cell death-1)/PD-L1(Programmed cell death-1-Ligand1)は、腫瘍免疫で重要な役割を担っているとされているが胸腺癌ではほとんど報告例がなく、またその発現制御についても不明である。以前より我々は肺癌細胞株を用いて上皮間葉移行(Epithelial mesenchymal transition; EMT)とPD-L1発現制御について検討し、その結果EMT誘導因子の一つであるTGF-βによってPD-L1発現制御を受けていることを明らかにした(Oncol Rep. 2017)。今回我々は外科切除検体から初代培養した胸腺癌細胞株を用いPD-L1発現制御の一端を明らかにするとともに、PD-L1発現とEMTとの関連性について分析した。当科で外科的切除した胸腺癌35例(観察中央値4.1年、平均年齢59歳、男;女26;9、正岡分類I/III/IVa/IVb期;2/20/4/9例)を対象とし、うち一例から初代培養を確立した。【方法】確立した胸腺癌初代培養株を用い分子生物学的に検討した(RT-PCR/Western blot)。また病理組織学的にはPD-L1、EMTマーカーを免疫染色にて評価し、それらの相関関係と臨床背景について比較分析した。なおEMT陽性はN-cadherin/Vimentin免疫染色陽性と定義した。【結果】TGF-β投与にてPD-L1のmRNA,タンパクでほぼ上昇を認めたが、有意差を認めるほどではなかった。また免疫染色の結果、PD-L1は35例中20例(57%)で陽性で、腫瘍径、正岡分類に有意な相関関係は認めなかった。予後解析したところ、無再発生存率ならびに全生存率はPD-L1陽性例が陰性例に比べ有意に不良であり(P=0.036/ P=0.01)予後因子であった。そしてPD-L1発現とEMTとに相関関係を認めた(P=0.003)。【結論】TGF-βによるPD-L1発現制御が示唆されたが、さらに検討が必要と考えられた、病理組織学的解析ではPD-L1は胸腺癌の有意な予後因子であるとともに、EMTとの関連性も示唆された。免疫チェックポイント経路のPD-1/PD-L1は癌免疫において非常に重要な役割を担っていると考えられている。免疫細胞に発現しているPD-1と癌細胞に発現しているPD-L1が結合することにより免疫抑制状態となり、癌細胞が免疫細胞からの攻撃を回避しえるものと考えられているが、特に癌細胞におけるPD-L1の発現制御のメカ二ズムについては不明である。今回我々は癌の悪性化に関係していると考えられている上皮間葉移行(EMT;Epithelial Mesenchymal transition)と、PD-L1の発現制御について検討した。肺腺癌細胞株(A549)にEMT誘導物質であるTGF-βにて処理し、その発現をRT-PCR、Western blotにて分析してみた。その結果、TGF-β投与にてEMTマーカーである、N-cadherinとPD-L1のmRNAの上昇が確認できた。同様にタンパクレベルでも上昇を認めた。また、TGF-β阻害剤(SB431542)を投与して、それらの発現変化をみた。N-cadherinもPD-L1の上昇も抑制されていることが分かった。また、一旦TGF-β導入によるEMTにて上昇したN-cadherin、PD-L1をTGF-βを含まない培地に変更することによる反応を調べてみた。TGF-βを含まない培地で培養するとEMTとは逆の間葉上皮移行(MET)によるN-cadherinの変化と、PD-L1の発現の変化を検討してみた。その結果、一旦EMTにて上昇したN-cadherinはMET過程にて低下しPD-L1もそれに呼応するように減少し元のレベルまで減少した。一方抗がん剤投与にてもEMTが誘導される報告がある。これは抗がん剤耐性の過程でもTGF-β誘導型EMTが関与していると考えられている。次はPD-L1の発現変化も調べる予定である。抗がん剤カルボプラチンをA549細胞に投与し、上記遺伝子の発現レベルを調べるよう計画している。現在のところ概ね予定通りに研究は進行している。免疫チェックポイント経路の一つであるPD-1(Programmed cell death-1)/PD-L1(Programmed cell death-1-Ligand 1)は、腫瘍免疫で重要な役割を担っているとされており、近年、この阻害剤が様々な癌種で治験され、その結果、素晴らしい効果を示していることが報告されている。しかし、がん細胞に認めるPD-L1の発現制御については不明な点も多く、その解明が喫緊の課題である。今まで、肺癌細胞株を用いて上皮間葉移行(Epithelial mesenchymal transition; EMT)とPD-L1発現制御について検討し、その結果EMT誘導因子の一つであるTGF-βによってPD-L1発現制御を受けていることを明らかにした。つまり肺癌細胞株にTGF-βを添加しEMTを誘導した結果、mRNA並びにタンパクレベルでEMTマーカーの上昇に呼応してPD-L1の上昇も認めた。またこの上昇はTGF-β阻害剤にて抑制された。一方、EMTは抗がん剤投与にてもTGF-β経路で誘導されることが知られている。これを基に肺がん細胞株に抗癌剤処理を行った。

その結果、PD-L1の上昇も認め、またこの上昇はTGF-β阻害剤にて抑制された。次に肺癌切除検体や胸腺癌切除の臨床検体をPD-L1、EMTマーカーの発現を免疫染色で確認した。その結果、EMT陽性とPD-L1陽性に相関関係を認めた。また、EMT陽性例、並びにPD-L1陽性例では有意に再発率が高く、予後因子であることも示唆された。一方、特に化学療法後手術症例では術前に比べPD-L1の発現は上昇を示しており、化学療法後によりEMTが誘導され、それに呼応してPD-L1の発現が上昇したことが示唆された。現在、胸腺癌にても肺がん同様の結果が得られるか初代培養株を用いて解析中である。肺癌細胞株においてはTGF-βによるPD-L1誘導は再現性ありで確認できたが、胸腺癌については細胞株の樹立が難しく、また樹立株を用いたPD-L1発現実験の再現性も難しかった。免疫チェックポイント経路の一つであるPD-1(Programmed cell death-1)/PD-L1(Programmed cell death-1-Ligand1)は、腫瘍免疫で重要な役割を担っているとされているが胸腺癌ではほとんど報告例がなく、またその発現制御についても不明である。以前より我々は肺癌細胞株を用いて上皮間葉移行(Epithelial mesenchymal transition; EMT)とPD-L1発現制御について検討し、その結果EMT誘導因子の一つであるTGF-βによってPD-L1発現制御を受けていることを明らかにした(Oncol Rep. 2017)。今回我々は外科切除検体から初代培養した胸腺癌細胞株を用いPD-L1発現制御の一端を明らかにするとともに、PD-L1発現とEMTとの関連性について分析した。当科で外科的切除した胸腺癌35例(観察中央値4.1年、平均年齢59歳、男;女26;9、正岡分類I/III/IVa/IVb期;2/20/4/9例)を対象とし、うち一例から初代培養を確立した。【方法】確立した胸腺癌初代培養株を用い分子生物学的に検討した(RT-PCR/Western blot)。また病理組織学的にはPD-L1、EMTマーカーを免疫染色にて評価し、それらの相関関係と臨床背景について比較分析した。なおEMT陽性はN-cadherin/Vimentin免疫染色陽性と定義した。【結果】TGF-β投与にてPD-L1のmRNA,タンパクでほぼ上昇を認めたが、有意差を認めるほどではなかった。また免疫染色の結果、PD-L1は35例中20例(57%)で陽性で、腫瘍径、正岡分類に有意な相関関係は認めなかった。予後解析したところ、無再発生存率ならびに全生存率はPD-L1陽性例が陰性例に比べ有意に不良であり(P=0.036/ P=0.01)予後因子であった。そしてPD-L1発現とEMTとに相関関係を認めた(P=0.003)。【結論】TGF-βによるPD-L1発現制御が示唆されたが、さらに検討が必要と考えられた、病理組織学的解析ではPD-L1は胸腺癌の有意な予後因子であるとともに、EMTとの関連性も示唆された。癌細胞の抗がん剤耐性にもEMTが関与していると考えられていることからPD-L1の発現制御について調べる予定である。
共振器中のRydberg原子を用いた量子光源の開発

平成30年度には、原子冷却用の真空装置の準備、光共振器の設計および共振器用マウントとミラーの作製、Rydberg励起用光源の開発を行った。真空装置については、超高真空チャンバーの組み立ておよびRb原子源の導入を行った上でベーキングを行ったが、ビューポートにおいて漏れが生じたため、部品を交換して再度のベーキングを行っているところである。ベーキングが終了すれば、原子冷却を行うための真空装置の準備が整ったことになる。光共振器に関しては、フィネスが高いほど原子が共振器モード中に光子を放出する確率が高くなる一方で、ミラーの反射率が高いことによりミラー表面での損失が有意になり、共振器中に放出された光子を外部へ取り出すことが困難になる。本研究ではさらに、原子集団の協働現象を利用して共振器モード中への光子の放出確率の増大を図る。そこで、最終的に外部に光子を取り出す確率を最大化するような共振器のフィネスと、それに対応して必要となる原子集団の密度について検討を行った。その検討結果に基づいて、ミラーの反射率および許容される散乱損失と共振器の幾何学配置を決定し、共振器マウントおよび低損失の特注ミラーを作製した。今後はミラーの特性評価を行ったのち、共振器を構築する。Rydberg励起用光源に関しては、Ti:sapphireレーザーの960 nmの光を基本波とし、Bow-tie型共振器中のPPKTP結晶を用いて480 nmの倍波を発生させ、共振器のアラインメントと温度位相整合の最適化を行うことでパワーの最大化を図った。さらに、87Rb原子の吸収線に対して安定化させた780 nmの光源を準備し、室温のガスセル中で、n=41, 50, 60, 70のRydberg状態について、電磁場誘起透明化のスペクトルの観測に成功した。このスペクトルの観測により、Rydberg励起用光源の安定化の目途が立った。平成30年度に予定していた、光子の取り出し確率を最大化させるための光共振器のフィネスの最適値およびそれに対応して必要となる原子集団の密度についての検討は完了した。さらに、ミラーに関して許容される散乱損失についても検討を行い、実際に共振器マウントおよびミラーの作製も行った。原子の磁気光学トラップについては、真空装置に漏れが見つかり、十分な真空度を得ることができなかったため、トラップの作製には至っていない。一方、当初は次年度に予定していたRydberg遷移に対する光源の安定化については、当初の想定を上回る進捗が見られた。具体的には、Ti:sapphireレーザーの960 nmの光を基本波とし、Bow-tie型共振器中のPPKTP結晶を用いて480 nmの倍波を発生させ、共振器のアラインメントと温度位相整合の最適化を行うことでパワーを最大化させた。さらに、Rb87の吸収線に対して安定化させた780 nmのレーザー光源を準備した。これら2つの光源を利用することにより、n=41, 50, 60, 70までのRydberg状態の電磁場誘起透明化スペクトルを用いた分光が実現した。このスペクトルを誤差信号として利用することで、光源の安定化が実現すると見込まれる。令和元年度は、まず超高真空チャンバーの構築を完了し、四重極磁場用コイルおよび周辺光学系の構築を行った上で、原子の冷却を試みる。さらに、冷却した原子を用いたRydberg状態の分光を行う。一方、光共振器用のミラーの特性評価を行った上で、光共振器の構築を行う。続いて、光共振器にRb原子の共鳴光が共振するように共振器長の安定化を行う。さらに、光共振器モードに一次元光格子を作製し、その中に原子を補足して密度の評価を行う。この際に、目標の密度に達していない場合には共振器に垂直な方向の光双極子トラップの導入を検討する。さらに、これまでに得られたRydberg遷移のスペクトルを利用して、Rydberg励起用光源の安定化を試みる。令和2年度には、単一光子発生に向けた、冷却Rb原子の2光子励起を試みる。さらに、480 nmのレーザー光による脱励起を行い、放出される780 nmの光子の自己相関関数を測定することにより、単一のRydberg励起の実現を確認する。さらに、光子の検出確率から、共振器中で原子集団の協働現象による超放射が起きていることを確認する。この際に、脱励起光のアラインメントを調整することにより、光共振器モードへの超放射の最適化を試みる。ここまでで、単一光子の任意時刻における特定の空間モードへの発生のための準備が整うこととなる。続いて、実際に、任意時刻における特定の空間モードへの単一光子発生を試みる。

光共振器に関しては、フィネスが高いほど原子が共振器モード中に光子を放出する確率が高くなる一方で、ミラーの反射率が高いことによりミラー表面での損失が有意になり、共振器中に放出された光子を外部へ取り出すことが困難になる。本研究ではさらに、原子集団の協働現象を利用して共振器モード中への光子の放出確率の増大を図る。そこで、最終的に外部に光子を取り出す確率を最大化するような共振器のフィネスと、それに対応して必要となる原子集団の密度について検討を行った。その検討結果に基づいて、ミラーの反射率および許容される散乱損失と共振器の幾何学配置を決定し、共振器マウントおよび低損失の特注ミラーを作製した。今後はミラーの特性評価を行ったのち、共振器を構築する。Rydberg励起用光源に関しては、Ti:sapphireレーザーの960 nmの光を基本波とし、Bow-tie型共振器中のPPKTP結晶を用いて480 nmの倍波を発生させ、共振器のアラインメントと温度位相整合の最適化を行うことでパワーの最大化を図った。さらに、87Rb原子の吸収線に対して安定化させた780 nmの光源を準備し、室温のガスセル中で、n=41, 50, 60, 70のRydberg状態について、電磁場誘起透明化のスペクトルの観測に成功した。このスペクトルの観測により、Rydberg励起用光源の安定化の目途が立った。平成30年度に予定していた、光子の取り出し確率を最大化させるための光共振器のフィネスの最適値およびそれに対応して必要となる原子集団の密度についての検討は完了した。さらに、ミラーに関して許容される散乱損失についても検討を行い、実際に共振器マウントおよびミラーの作製も行った。原子の磁気光学トラップについては、真空装置に漏れが見つかり、十分な真空度を得ることができなかったため、トラップの作製には至っていない。一方、当初は次年度に予定していたRydberg遷移に対する光源の安定化については、当初の想定を上回る進捗が見られた。具体的には、Ti:sapphireレーザーの960 nmの光を基本波とし、Bow-tie型共振器中のPPKTP結晶を用いて480 nmの倍波を発生させ、共振器のアラインメントと温度位相整合の最適化を行うことでパワーを最大化させた。さらに、Rb87の吸収線に対して安定化させた780 nmのレーザー光源を準備した。これら2つの光源を利用することにより、n=41, 50, 60, 70までのRydberg状態の電磁場誘起透明化スペクトルを用いた分光が実現した。このスペクトルを誤差信号として利用することで、光源の安定化が実現すると見込まれる。令和元年度は、まず超高真空チャンバーの構築を完了し、四重極磁場用コイルおよび周辺光学系の構築を行った上で、原子の冷却を試みる。さらに、冷却した原子を用いたRydberg状態の分光を行う。一方、光共振器用のミラーの特性評価を行った上で、光共振器の構築を行う。続いて、光共振器にRb原子の共鳴光が共振するように共振器長の安定化を行う。さらに、光共振器モードに一次元光格子を作製し、その中に原子を補足して密度の評価を行う。この際に、目標の密度に達していない場合には共振器に垂直な方向の光双極子トラップの導入を検討する。さらに、これまでに得られたRydberg遷移のスペクトルを利用して、Rydberg励起用光源の安定化を試みる。令和2年度には、単一光子発生に向けた、冷却Rb原子の2光子励起を試みる。さらに、480 nmのレーザー光による脱励起を行い、放出される780 nmの光子の自己相関関数を測定することにより、単一のRydberg励起の実現を確認する。
乱流構造のアクティブ制御を用いた伝熱促進に関する基礎的研究

本研究では、伝熱面からの吹き出し及び吸い込みを利用した乱流構造のアクティブ制御により、熱および運動量輸送の非相似性の強化を行うことによって、熱伝達の促進と壁面摩擦抵抗の低減を図る方法の有効性に関する基礎的な検討を行った。(1)まず、伝熱面上に間欠吹き出しがある場合の基本的な流動および熱伝達特性を知るために、開水路内で実験を行った。その結果、連続吹き出しの場合には、壁面摩擦抵抗は下がるものの、熱伝達も減少すること、間欠吹き出しの場合には、吹き出し孔周辺で、熱伝達が増大し、一方で壁面摩擦抵抗が減少することが明らかとなった。(2)パーソナルコンピュータによって乱流の直接シミュレーションを行い、乱流構造のアクティブ制御を行った場合の結果の予測を行った。その結果、非相似性を強化すると考えられているインターラクション運動を強化することが、アクティブ制御によって可能であることがわかった。しかしながら、強化されたインターラクション運動が、必ずしも熱伝達の促進に寄与せず、十分な伝熱促進がなされなかった。今後、アクティブ制御のより有効な手段を開発することが課題として残った。(3)乱流構造のうちスウィープ構造を制御し、非相似性を強化すると考えられているインターラクション構造に変換することを考え、熱膜式のセンサー部を作成し、本手法の有効性について検討を試みた。しかしながら、センサーに混入するノイズにより、十分な制御を行うことができず、今後の課題として検討する。
量子カオス系における応答関数の統計的性質

不規則さを内在する量子力学系(量子カオス系)に摂動を加えた際の応答の統計的性質を調べることを目的とし,以下の2項目について研究を行った:(1)量子カオスとBerryの幾何学的位相の関係Berryの位相とは量子系のハミルトニアンに含まれるパラメーターの断熱変化に伴い波動関数に現れる位相であり,パラメーター空間内のエネルギー準位の偶然縮退点より生じる仮想的“磁場"による磁束と見なせる。準位の偶然縮退は古典力学では系の非可積分性を意味し,量子力学的量であるBerryの位相と非可積分性から起きる古典軌道のカオス的振る舞いとの相関が期待される。この予想を確かめる為,2自由度系を用い古典軌道と断熱的“磁場"を計算した。“磁場"は古典カオス領域では大きく変動するが規則領域ではほぼ0になり,両者の相関関係を示した。今後は,カオス領域でエネルギー準位統計などに見られる普遍性をBerryの位相も持つかどうかを明らかにする必要がある。(2)量子カオス散乱の記述におけるランダム行列模型の妥当性応答関数の一つである電気伝導係数はメゾスコピック系では散乱行列で表される。散乱行列の統計的性質の理解の為,散乱領域のハミルトニアン等を適当なランダム行列に単純化する模型が使われている。しかし散乱過程には散乱領域内の滞在時間が短い軌道も寄与する為,ランダム行列模型の適用範囲が明らかでない。この適用範囲を調べる為に準1次元格子模型による数値計算との比較を行った。散乱領域と外界との結合が弱くなればランダム行列模型との一致がよくなるという定性的結果を得た。今後は,散乱の実験データからランダム行列模型によって記述できるだろう普遍的部分と個々の系に特徴的な部分を分離する処方を定めていく必要がある。本研究では不規則さを内在する量子力学系(量子カオス系)の応答関数の統計的性質を調べる事を目的とした。本年度の研究では特に,応答関数としてBerryの位相に関して調べた。Berryの位相とは量子系のハミルトニアンに含まれるパラメーターの断熱的変化に伴い断熱エネルギー固有関数に現われる幾何学的位相であり,外界からの摂動に対する波動関数の応に答関係する量である。また,Berryの位相は断熱パラメーター空間内でのエネルギー準位の偶然縮退点から湧きだした仮想的な“磁場"による磁束とみなす事ができる。一方,エネルギー準位の偶然縮退は系の非可積分性と結び付いている為,Berryの位相とカオス的振舞いとの相関が期待される。本研究では,この予想を数値的に確かめるためにパラメーターを含んだ2自由度のモデルハミルトニアンを用い,古典軌道および上述の仮想的“磁場"をいろいろなパラメーター値について計算した。古典軌道の振舞いはPoincareの横断面に現われるトーラス構造により判断している。その結果,この“磁場"の値は,古典軌道が規則的に振る舞うエネルギー領域にあるエネルギー準位に対してはほぼ0であるのに対し、古典軌道がカオス的に振る舞う領域の準位に対しては変動しながらもかなりの値を持つ事がわかり,Berryの位相とカオス的振舞いの相関を裏付けた。以上の結果については1996年度日本物理学会・応用物理学会中国四国支部例会で発表した。上述の結果は未だ定性的である。今後は数値計算としてはエネルギー軸やパラメター軸についてこの仮想的“地場"の平均や分散などの統計的量が必要である。また系のハミルトニアンが乱雑行列で表されるとした場合に対応する量を計算し比較する事により,Berryの位相の統計的性質がエネルギー準位統計と同じ様にカオス系において普遍的であるかどうかを調べる必要がある。本研究では不規則さを内在する量子力学系(量子カオス系)に摂動を加えた際の応答の統計的性質を調べることを目的としている。

例えば外部からの摂動が電場であり応答が電流である場合の応答関数は電気伝導係数(コンダクタンス)となる。特に,電子間の相互作用が無視できる場合にはコンダクタンスは1電子の散乱行列によってあらわされ,従ってこの場合,コンダクタンスの統計的性質は散乱行列の統計的性質と等価である。本年度の研究ではこのような不規則な多重散乱(いわゆる量子カオス散乱)の統計的性質の理解を目指した。量子カオス散乱の理論的取扱いには散乱領域を表すハミルトニアンや散乱行列を適当な統計性を持つランダム行列に置き換えて単純化する模型が使われている。しかし特に散乱領域の大きさが平均自由行程と同程度であるバリスティック領域に対しては,散乱領域内の滞在時間が短い軌道も散乱行列に寄与する為に,ランダム行列模型の適用範囲が明らかでない。本年度の研究では特に,ランダム行列模型が量子カオス散乱の記述においてどの程度,妥当であるかを調べる為に準1次元格子模型を用いた数値シミュレーションとの比較を行った。乱数から作られたランダムポテンシャルを散乱領域に配置することにより系に不規則さを導入している。散乱領域と外界との有効的結合が弱くなればランダム行列模型との一致がよくなるという定性的結果を得たがこれは閉じた系に対してはランダム行列模型が良く適用されるということから自然に予測されることである。今後は,散乱過程の実験データからランダム行列模型によって記述できる普遍的な部分と個々の系に特徴的な(規則的な)部分を分離する処方を見つける必要がある。以上の結果は日本物理学会1997年秋の分科会で発表した。
高齢社会にシフトしたアメリカ型生前契約がもたらす葬送の変化に関する国際比較研究

本研究は、平成15年度から3か年に亘る研究である。平成15年度は、アジアの生前契約と葬送の実態を捉え生前契約4類型化の妥当性を生前契約の社会的な影響力との関連で捉えた。4類型化の妥当性はかなりあるということが分かった。生前契約の社会的な影響はそれぞれの国・地域の葬送習慣によるという成果をえた。これらをもとに平成16年度は、4類型化の3要素をアジア諸国の葬送に適用できるかを見た。生前契約がどのようにアジア型として普及するかの形式についても捉えることとした。3要素である「葬送儀礼」、「生前契約」、「葬送産業」は、現代社会の人の死には欠かせず、それぞれの関係も社会によって異なるということが見出された。これら2年間の研究成果を基に、平成17年度は、アジアの中でもとりわけ、経済成長と社会構造が変化し、それによって葬送が変化してきた韓国を中心に3要素について具体的な質的調査を実施した。併せて、日本国内の葬送事業者に対する全国調査を実施し、平成16年度調査およびアメリカにおける葬送事業者の調査と比較研究を行った。研究成果は、アジア諸国の葬送の動きを捉えることによって、葬送儀礼が、経済の発展と社会構造、社会文化によって変化し、それが生前契約を推進させるという画期的な動きを捉えることができた。例えば、韓国における葬送の変化と生前契約の動きには顕著な動きが見られた。社会政策・政治改革等(住宅政策・経済政策)により人々の生活様式が変化すると、葬送儀礼が変化し、生前契約の進展と葬送事業者の連接分野との連携により巨大化する一方で中小の事業者の消長が危惧されるという側面が象徴的である。日本国内においては、死亡率の増加傾向としに行く過程への注目で静かに死後の葬送のあり方を考えるという着実な備えの段階に入った。アジア諸国では、日本の1990年代のような葬送への熱い関心が事業者、関連分野に見られる。今後さらに人間開発が振興すれば、人々はタブーから放たれ、葬送の変化と生前契約への関心は向上するであろうことが、本研究の調査により明らかになった。平成15年度は、主として、(1)アジア各国における葬送の生前契約の実態を捉え、生前契約4類型化の妥当性の検証、(2)生前契約の社会的影響力と経済効果を捉える、(3)わが国における生前契約の実態調査をすることにあった。(1)生前契約4類型の検証アジア各国、特にシンガポール、マレーシア、タイ、韓国および台湾において、寺院、葬儀社等の訪間調査を行った。その結果、わが国がアジアで最も早くアメリカ型の葬送の生前契約を導入した国であるにもかかわらず、法整備も十分ではなく、提供者の共通理解、手法が十分に浸透していないのに対し、シンガポール、韓国、台湾においては、アメリカ型葬送の生前契約が短期間に周知、展開されている。アジア諸地域においては、宗教的な背景がさまざま異なるにもかかわらず、キリスト教、仏教においては、同様の進展度が見られる。しかしマレーシアにおいては、宗教による祭祀の差異が大きく、十分な訪問調査ができなかったことは次年度への課題である。韓国においては、ヨーロッパ型といえる「散骨公園」が普及しつつあるところは、他の地域と異なる点である。

台湾においては、徹底したアメリカ型による生前契約が主流であり、現在、わが国にも起こった1990年代後半と同様の「生前契約ブーム」とでもいえる状況で生前契約市場は活況を呈している。タイ、シンガポールにおいては、キリスト教、仏教に関わらず、同様の生前契約の傾向であるが、積極的に生前に備える環境は整っていない。(2)生前契約の経済効果は、台湾においては、アメリカ・モデルによる生前契約によって中小の葬儀社よりも大手の葬儀社が生前契約の成約率を伸ばしており、大手のチェーン化も目立つ。これは、さらにアメリカ型が促進してきていることを物語るものである。また、韓国においては、散骨公園が住宅販売と同様の方法(チラシ、見学会)によって実施されており、ヨーロッパ型を巧みに取り入れたアジア型(または韓国独自型)が特徴として見られる。また生前契約は必ずしも急速な経済効果をもたらすものではない傾向が見られるのがタイ、シンガポールであり、まだ草創期といえよう。祭祀の伝統型は、アジアでは共通に多い。(3)生前契約に関する意識調査・実態調査を国内の葬儀社、葬儀専門職に対して平成16年1月より実施しているが、アメリカの調査と同様、回答・回収率が低い。生前契約は殆どの葬儀社が取り扱っているが、わが国に導入されて10年余を閲しているにもかかわらず、取扱者に熟知されていないところが感じられる。以上のことから、次年度においては、ヨーロッパ型の調査、わが国における調査を引き続き実施することの必要性および、葬儀社の経営と生前契約を経済効果からのアプローチの必要性が見出された。本研究は、平成15年度から3か年に亘る研究である。平成15年度は、アジアの生前契約と葬送の実態を捉え生前契約4類型化の妥当性を検証することと、生前契約の社会的な影響力を捉えた。4類型化には、資料を基に妥当性はかなりあるということが分かった。また、生前契約の社会的な影響はそれぞれの国・地域の葬送習慣によるという成果をえた。これらをもとに平成16年度の研究計画は、4類型化の要素を3区分しアジア諸国に妥当性があるかどうかを捉えることを目的とし、また、アメリカ型の生前契約がどのようにアジア型として普及するかの形式についても捉えることとした。アジア諸国・地域で生前契約が急成長したものの、アメリカ型のトラブルが多発し、葬送事業者による量と質両面でのリモデル化が開始されつつある。(1)3要素である「葬送儀礼」、「生前契約」、「葬送産業」は、現代社会における人の死には欠かせず、それぞれの関係も社会によって変化あるということが見出された。(2)それを具体的にみるために、平成15年度に引き続き葬送事業者への生前契約調査を実施したが、葬送事業者の組織によって取り組む方向性が異なり、それが自己完結型の生前契約に大きな影響を与えるとともに、葬送様式も変化させることを捉えることができた。(3)アジア諸国においては、社会政策・政治改革等(住宅政策・経済政策)により人々の居住様式が変化すると、葬送儀礼が変化し、生前契約と葬送事業者の消長が危惧されるという社会もあるということが、アジア諸国における訪問調査によって明らかにされた。調査による実態と生前契約、葬送意識、葬送儀礼の習慣がそれぞれの国・地域の特色を如実に現し、葬送事業者とさらに墓苑業者の境界が希薄化してきているために、社会政策、葬送文化・習慣の視点をどのように位置づけていくかが次年度の課題の一つとなった。
DNA上で一次構造を制御した導電性高分子の合成および単一分子の電気特性測定

剛直なひも状構造・高い分子認識機能を有するDNAを鋳型分子として、ナノスケールの電子デバイスの構築を目指した機能性ナノ細線の作製が盛んに研究されている。これまでに塩基配列がデザインされたブロックコポリマー型の長鎖DNAを生体高分子の一種であるDNAポリメラーゼを用いて合成し、塩基配列に選択的なプラチナの析出に成功した。今年度はDNAを鋳型にした導電性高分子の合成を目指し、核酸塩基に導電性高分子のモノマーを修飾したデオキシヌクレオチド三リン酸の合成、およびその酸化重合を行い各化合物の物性評価を行った。導電性高分子のモノマーであるピロールまたはチオフェンをアルキルリンカーを介してデオキシウリジンのC5位に修飾することに成功した。その後、酵素反応の基質とするために三リン酸化することに成功した。合成したデオキシヌクレオチド三リン酸の水溶液に塩化鉄水溶液を加えて酸化重合を行い、それぞれの導伝性をサイクリック・ボルンタメトリーによって測定した。その結果、ピロールとチオフェンが交互に配列したポリマー構造の導伝度が最も優れていることを明らかにした。この結果は、2種類の核酸塩基にピロールとチオールをそれぞれ修飾し、酵素反応によってDNA上に交互に配列させることによって優れた導電性を示す導電性ナノワイヤーの重合が可能になることを示している。合成したデオキシヌクレオチド三リン酸を基質としたDNAポリメラーゼによる酵素重合を検討し、DNA上での導電性高分子の重合および基板上での物性評価を行うことによって、これまで困難だった重合度および配列の制御された単一導電性高分子の物性評価が可能になると期待される。
経年強化特性を備えた加熱改質フライアッシュの補修材としての適用性

火力発電所から排出される石炭灰を加熱改質処理した未燃カーボンの少ない改質フライアッシュ(Modified Fly Ash、MFA)と,それを風力粉砕分級処理した平均粒径が35μmのJIS I種相当の超微粒子MFA-Iを混和したポリマーセメント系補修材料(断面修復材とひび割れ注入材)の開発において、補修後の構造物の耐久性を考慮した補修材料としての最適配(調)合を提案するために必要な材料設計システムを確立する。既存構造物の長寿命化による社会資本の保全やCO2排出量の削減等が期待できるという観点から、今回の補修材の開発は社会的要請の強い研究テーマと言える。
神経軸索の成長と誘導を制御する機能分子群のプロテオーム解析

本研究課題では、質量分析イメージング手法を用いて脂質やその複合体の解析を行うことで、パーキンソン病が発病するメカニズムを明らかにすることを目的とした。イオン化を補助剤するマトリクスとしてDHBを用いることで各種生体分子のイオン化を促し、陽イオンに注目してこれを検出することによって試料上の各位置で質量分析を行った。多くの生体分子を同時に検出することが可能であるが、その中でも特に脂質に注目し、その空間分布や継時変化などを解析した。6-Hydroxydopamine(6-OHDA)という神経毒を投与することによってパーキンソン病の病変を再現することが可能であり、このようにしてパーキンソン病の病変を誘導したモデル動物の脳を測定試料として用いた。モデルマウスの脳切片を解析したところ脂質組成に顕著な変化が見られた。モデルマーモセットの脳切片を解析したところ、脂質組成において同様の変化が確認できたため、これによってパーキンソン病の病変を特徴づけることができたと考えている。従来の測定手法では脂質のイメージングや分布の解析は困難であったため、このような脂質の異常に着目した研究として意義のあるものであると考えている。本研究で得られた成果は、パーキンソン病において脂質変化の重要性を明らかにするものであり、将来的には他の手法と組み合わせることで異常をきたした脂質の同定、定量化を行うことが可能となり、パーキンソン病発症の詳細なメカニズムを明らかにすることができると期待している。重要な結果を得ることができたという点において満足のいくものであったが、その重要性に見合うだけの多くの検証、解析の必要性が次々と生じる結果となってしまい、その作業を期間内に完遂することができなかったという点で不満が残っている。また、装置のトラブルなどによって研究が遅延してしまったこともあり、このような評価とした。細胞外環境に存在する様々なガイダンス分子は、軸索先端部(成長円錐)での非対称的なカルシウムイオン(Ca^<2+>)シグナルを介して、軸索の伸長方向を制御する(軸索ガイダンス)。成長円錐の片側の細胞質でCa^<2+>濃度が上昇すると、成長円錐は高Ca^<2+>濃度側もしくは低Ca^<2+>濃度側へ旋回して新たな方向へ移動する。環状アデノシンーリン酸(cAMP)依存性キナーゼが活性化された状況では成長円錐は高Ca^<2+>濃度側で回り込み、環状グアノシンーリン酸(cGMP)依存性キナーゼが活性化された状況では成長円錐は低Ca^<2+>濃度側へ回り込む。このように軸索誘導の方向性は少なくとも2種類の細胞内シグナル分子(cAMPとcGMA)により拮抗的に制御されており、cAMPとcGMAの下流シグナル(特にタンパク質リン酸化)が軸索誘導の極性を決定する鍵である。平成21年度11月末に着任した外国人特別研究員は、ニワトリ胚由来の脊髄後根神経節神経細胞の分散培養法を習得し、cAMPあるいはcGMA漁経路を選択的に活性化/不活性化するための薬剤の選択とその至適濃度を決定した。今年度中に、これら培養神経細胞でリン酸化状態が変化するタンパク質を網羅的に同定するための実験を開始する。研究代表者らが開発した方法(Nabetani et al.,Proteomics 2009)を用いて、リン酸化ペプチドを濃縮して定量的リン酸化プロテオーム解析を行い、cAMP依存性キナーゼとcGMA依存性キナーゼでリン酸化制御を受けるタンパク質群を同定していく。細胞外環境に存在するさまざまな軸索ガイダンス分子は、伸長過程にある軸索突起の先端部(成長円錐)の移動方向を制御することで、複雑な神経回路の構築に貢献する。軸索ガイダンスの方向性は少なくとも2種類の細胞内シグナル分子(cAMPとcGMA)により拮抗的に制御されており、cAMPとcGMAの下流シグナル(特にタンパク質リン酸化)が軸索ガイダンスの極性を決定する鍵である。

重要な結果を得ることができたという点において満足のいくものであったが、その重要性に見合うだけの多くの検証、解析の必要性が次々と生じる結果となってしまい、その作業を期間内に完遂することができなかったという点で不満が残っている。また、装置のトラブルなどによって研究が遅延してしまったこともあり、このような評価とした。
悪性症候群発症におけるリアノジン受容体3型アイソフォームの関与

悪性症候群は抗精神病薬使用に伴う最も重篤な副作用であり、その発症機序は不明であるが、ドーパミン受容体との関連が広く考えられている。しかしその治療薬としてダントロレンが有効であることから、線条体神経細胞に特異的に局在するCa遊離チャネル蛋白であるリアノジン受容体RyRの3型アイソフォームRyR3の関与も考えられる。この可能性を検討するため、昨年度はRyR3が多く存在すると云われている脳、横隔膜を用いて、特異的抗体を用いた免疫沈降法を用いて、RyR3の特性を間接的に検討してきた。本年度は横隔膜よりRyR3を単離精製し、その特性を直接検討することを目指した。RyRの活性は反応溶液の組成により大きく影響されるので、塩の種類、その濃度および種々のpolyolの効果を検討した。単純なイオン強度や浸透圧により規定されるのではなく、タンパク質分子表面と水分子との相互作用が重要であることが分かった。またskinned fiberを用いた実験から小胞体内腔のCa^<2+>が負の制御をすることが示唆された。その機序の一つとして小胞体内腔から放出されたCa^<2+>がRyRの抑制性部位に作用することも考えられる。RyR3の精製は横隔膜より筋小胞体画分を調製、CHAPSとりん脂質存在下に可溶化、蔗糖密度勾配遠心によりRyR四量体を多く含む画分を分取し、抗RyR3抗体結合アガロースビーズと反応させ、RyR3を免疫沈降する。よく洗浄後大量の抗原ペプチドを加え、RyR3を溶出させる。Centri-Sepカラムを用いて、RyR3を精製した。[^3H]リアノジン結合活性で調べると既報の結果を多く再確認できた。しかしMg^<2+>による抑制は高濃度のCa^<2+>による抑制と同程度であり、これは前回の結果と異なるものであった。りん脂質二重膜に組み込んで測定したチャネル活性のCa^<2+>依存性は[^3H]リアノジン結合のそれと異なり、その原因を検討中である。リアノジン受容体はCa^<2+>放出チャネル蛋白であり、遺伝子が異なる3つのアイソフォームが知られている。1型は主に骨格筋に、2型は主に心筋、中枢神経系に存在する。3型は始め脳の特定の部位に局在するアイソフォームであると考えられたが、その後僅かであるが広く遍在することが分かった。骨格筋では成体では横隔膜に存在することが知られている。一方、悪性症候群はクロールプロマジン等の抗精神病薬を服用中にみられる筋硬直と急激な発熱を伴う重篤な副作用であり、1型リアノジンの特異的拮抗薬として知られているダントロレンがその治療に有効であることから脳の3型リアノジン受容体の関与が考えられている。哺乳類の3型リアノジン受容体はそのcDNAまたはmRNAによりその存在が確立されているが蛋白としては捉えられていなかった。我々は部分アミノ酸ペプチドを用いて特異的な抗体を作製し、この抗体を用いて免疫沈降法により脳の3型アイソフォームの性質を検討した(J.Biol.Chem.271,5079-5084,1996)。3型には多くの変異体が存在することが考えられるので、横隔膜の3型受容体についてその性質を[^3H]リアノジン結合活性をもとに検討した。3型受容体の存在比は1型の1%以下であること、四量体1分子につき1分子のリアノジンが結合し、そのCa^<2+>依存性リアノジン結合のリアノジンに対する親和性は約2nMである。アデニンヌクレオチドで促進され、Mg^<2+>、プロカイン、ルテニウムレッドなどの阻害薬で抑制されるなど他のリアノジン受容体とよく似た性質を示す。Ca^<2+>親和性については3型は1型に比し約1/10であるが、これは3型そのものの特徴ではなく、1型は動物種差が大きく、むしろ動物種差による差と見做した方が適切であることをカエル骨格筋のものとの比較で明らかにした。またMg^<2+>により抑制されはするが、その抑制の程度は1型に比し、極めて弱いことを明らかにした。これらの成果を既に報告している。

またskinned fiberを用いた実験から小胞体内腔のCa^<2+>が負の制御をすることが示唆された。その機序の一つとして小胞体内腔から放出されたCa^<2+>がRyRの抑制性部位に作用することも考えられる。RyR3の精製は横隔膜より筋小胞体画分を調製、CHAPSとりん脂質存在下に可溶化、蔗糖密度勾配遠心によりRyR四量体を多く含む画分を分取し、抗RyR3抗体結合アガロースビーズと反応させ、RyR3を免疫沈降する。よく洗浄後大量の抗原ペプチドを加え、RyR3を溶出させる。Centri-Sepカラムを用いて、RyR3を精製した。[^3H]リアノジン結合活性で調べると既報の結果を多く再確認できた。しかしMg^<2+>による抑制は高濃度のCa^<2+>による抑制と同程度であり、これは前回の結果と異なるものであった。りん脂質二重膜に組み込んで測定したチャネル活性のCa^<2+>依存性は[^3H]リアノジン結合のそれと異なり、その原因を検討中である。
中性子・誘導ガンマ線透過ベンチマ-ク実験と解析法の開発

ポリエチレン供試体中の屈曲ダクト,屈曲スリット,オフセットスリット,マルチホ-ルの各体系について、ストリ-ミングを、CR-39反跳陽子飛跡検出器,熱けい光線量計,小型NF213シンチレ-タ,球形水素ガス比例計数管で測定した。実験は、阪大オクタビアンで行った。合計9種類の体系についてシステマテイックなデ-タが得られた。解析は三次元Sn中性子輸送計算コ-ドTRISTANで行ない、その適用性を検討した。本コ-ドは、DDXの使用,多群断面積の使用,角度分点の階層化,随伴計算との結合計算の利用などにその特徴がある。又、散乱線と非散乱線の分離計算が可能である。今回の実験体系は、極端な前方の分点を必要とするSn計算コ-ドにとっては困難な問題であるにもかかわらず、よい一致が得られた。ストリ-ミングの簡易評価のためのアルベド法に基づく経験式を実験デ-タとの比較により作製した。この式は簡易評価手法として極めて高い実用性を有していると思われる。炭素,ニッケル,鉄,クロムの平板状供試体に、DD中性子が入射した場合の透過散乱スペクトルを東北大ダイナミトロンでTOF法により測定した。DD中性子の物質透過に関する基本的デ-タが得られた。核融合炉中のMeV領域の中性子透過計算に関係する核デ-タの精度評価に役立つと思われる。JENDL3PR1デ-タを用いたMCNPによる解析を行った。シリコン,クロム,ニオブの球形供試体の中央にDT中性子源を置き、TOF法により透過中性子スペクトルを測定した。実験は阪大オクタビアンで行なった。又、2次γ線生成に関する実験デ-タもあわせて測定された。Al(n,Xγ)反応断面積を、オクタビアン重照射室で照射したサンプルを用いてHe原子測定装置により測定を行った。
腰部脊柱管狭窄症における黄色靭帯肥厚メカニズムの解明

黄色靭帯が加齢とともに弾性を失い微小損傷を受けやすい環境となっていることを報告した。基盤となる病因として加齢に伴う小胞体ストレスの変化に着目した。若年者の正常靭帯と高齢者の肥厚靭帯から得られたRNAを使用して網羅的に遺伝子発現の差異を検討した。結果、高齢者の靭帯には、PERK、IRE1、ATF6、GRP78といった分子が強発現し、小胞体ストレスが生じていることが明らかとなった。また、肥厚靭帯の背側には強い線維化がみられ、その周囲には、alpha-SMA、I & III型コラーゲンが強く生成されていることが確認された。肥厚のメカニズムが線維増殖性疾患と同様である可能性が示唆された。我々は、腰部脊柱管狭窄症患者から得られた肥厚黄色靭帯と若年者腰椎椎間板ヘルニアの手術より得られた肥厚の無い黄色靭帯を組織学的に比較検討した(Sairyo et al. SPINE 2005)。結果、肥厚靭帯では、正常弾性線維が減少し、コラーゲンに置き換わり線維化・瘢痕化が進行していることが分かった。その変化は、靭帯内の脊髄神経に近い腹側部分では顕著ではなく、背側に著しいことが明らかとなった。背側の瘢痕化は肥厚が強くなるほど顕著であり、肥厚の原因として靭帯内の背側部分への瘢痕の蓄積であることが示された。胎児の黄色靭帯にはほぼ正常の弾性線維で占められ瘢痕形成がみられないことも確認した(Kosaka et al. SPINE 2007)。背側に瘢痕化が著しい原因を、脊椎有限要素3次元モデルを使用して解析したところ、脊椎運動時、腹側に比べ背側では約5倍の応力が生じていることが示された(Sairyo et al. SPINE 2005)。また、肥厚靭帯のマイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的解析により(Sairyo et al. SPINE 2007)、靭帯内炎症性サイトカインの発現を見出し、特にCOX-2に関しては免疫染色でも確認した。これらの検討から次の如き仮説が得られた。靭帯肥厚は若年者には見られず、加齢とともにみられることより、靭帯の加齢に伴う変化が考えられる。瘢痕化に関与するする因子として、1弾性力の低下に伴う易損傷性があげられる。2伸張性の乏しい靭帯に伸張負荷が加わり損傷が生じる。3炎症性サイトカインによる線維化・瘢痕形成がもたらされる。4背側に繰り返される瘢痕形成の蓄積により肥厚がもたらされる。従って、本病態は、皮膚の創傷治癒過程に生じる、肥厚性瘢痕やケロイドに代表される線維増殖性疾患(fibroproliferative disorder: FPD)の類似疾患と仮説を立てている。若年者と高齢者の靭帯比較:各5検体よりtotal cellular RNAを抽出し、マイクロアレイにより比較検討した。現在注目しているのは、高齢者靭帯における小胞体ストレスの上昇である。今回の結果より、高齢者において小胞体ストレスがかかっていることが遺伝子レベルから示された。高齢者肥厚靭帯における背側と腹側との違い:5検体よりtotal cellular RNAを抽出し、マイクロアレイにより比較検討した。背側にて瘢痕繊維化形成が強く、同部位での瘢痕形成の蓄積により肥厚が生じているという仮説を提唱している。マイクロアレイにより繊維化に重要である、I, III, XII, XIV型コラーゲンの高発現が確認された。また、繊維化を助長させる低酸素の強いシグナルも観察された。免疫染色:I, III, XII型コラーゲンについては繊維化との関連性を調査し、背側での強い染色性を確認した。整形外科学平成25年11月1日に帝京大学から徳島大学に異動しました。それに伴い、研究環境が変化し、徳島大学での研究室の微調整を行っております。担当の大学院生も決まりましたので、本年度、ペースが戻るものと確信いたしております。免疫染色による解析: I型およびIII型コラーゲン、α-SMAを染色し、黄色靭帯内における瘢痕蓄積分布を解析する。さらに瘢痕蓄積のメカニズムとして、各種Matrix metalloproteinaseおよびTissue inhibitor of metalloproteinaseの産生分布を解析し肥厚靭帯内の瘢痕蓄積における役割を解析する。また、若年層から得られた靭帯をコントロールとし、高齢者におけるこれらの特徴を検討する。背側瘢痕層における機械受容シグナル伝達経路の解析:手術時に得られた肥厚黄色靭帯をサンプルとして使用する。背側30%の瘢痕成分靭帯サンプルと、腹側30%の正常靭帯サンプルを比較検討する。肥厚の著しい5人の腰部脊柱管狭窄症の靭帯を調査する。

得られた靭帯は液体窒素で急速凍結する。トライゾールにて組織を保存し、全RNAを抽出する。そのRNAを元にcDNAマイクロアレイ法を用いて、背側と腹側の発現遺伝子を網羅的に解析し、強発現・弱発現の遺伝子をスクリーニングする。その候補遺伝子を元に、バイオインフォマティクスの手法を用い、シグナル伝達経路解析を行う。活性化している、あるいは非活性化しているシグナル伝達系路を解析し、どのシグナル伝達に異常が生じているかを検討する。帝京大学から徳島大学への異動により、一時的に研究が止まった為。平成26年度から引き続き研究を行う予定。背側瘢痕における機械受容シグナル伝達経路(Mechanosignaling Pathway)の解析:分担研究者小川がケロイドと正常皮膚に対して行った方法を黄色靭帯に応用する。尚、次年度使用額については上記研究計画にかかる消耗品に使用する予定である。