hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血による崩壊心筋構成蛋白質の心臓リンパ液中での捕捉および抗狭心症薬開発への応用

リンパ液の流出速度は動物によって種々であったが,閉胸直後では約0.5ml/hrから2ml/hrであった.時間が経つに従ってリンパ液(あるいは多少混在する血液)も凝固反応を起こし,流出速度が低下したり,チュービングがつまったりした.細いチュービングなのでヘパリン液を逆流させることも困難であり,この改善策については次年度にもちこされた.オクルーダーの先端のバルーンに生理的食塩水を送り込むと不整脈が発生し,冠血流量が減少して冠動脈が狭窄されていることを示唆するデータが得られた.短時間の虚血(30分以内)ではリンパ液の流出速度に変化を認めなかった.採取したリンパ液を二次元電気泳動にかけると全体のパターンは血清のそれと類似していた.麻酔開胸犬の心筋組織を走行する心臓リンパ液を採取するため、肺動脈、大動脈の裏側に位置するリンパ節に内径約0.4mmのポリエチレンチューブ(イントラメディック)を挿入した。リンパ管に挿管したチューブは犬の喉のところで体表面に出し、光端を固定した。手術終了後閉胸し、約4時間安定に保ったのち、リンパ液を採取した。採取したリンパ液と尿素とLysis bufferを1:1:1の割合で混合したサンプル液15μlをアクリルアミドゲル等電点電気泳動にかけ、次に等電点電気泳動ゲルをSDS電気泳動にかけた。これがいわゆる二次元電気泳動法であるが、心臓リンパ液の二次元電気泳動パターンを図1と図2に示す。図1にはSDSゲルをクマジー・ブリリアント・ブルー染色したゲルを、図2には銀染色したゲルのパターンを示してある。泳動パターンに大きな差は認められないが、銀染色の方がより鋭敏であるため、微量の蛋白質のスポットがたくさん認められる。現在、冠動脈閉塞30分後に再灌流し、その5分後に得られるリンパ液の二次元電気泳動パターンを調べているが、再灌流後に得られるリンパ液の泳動パターンには閉塞前に得られるリンパ液よりも銀染色される小さな蛋白質のスポットが多い傾向が認められる。虚血になると心筋は酸素不足に陥って、心筋収縮に必要なエネルギ-はもちろん、心筋細胞の構造維持や基礎代謝に必要なエネルギ-も不足してくる。イヌ心臓の冠動脈を結紮して作製した虚血心筋モデルにおいても、冠動脈結紮初期から組織ATP、クレアチン燐酸含量が低下し、心筋のエネルギ-状態を示すエネルギ-・チャ-ジ・ポテンシャルも減少した。虚血が30分間続くと心筋のエネルギ-状態は非常に悪くなっていた。このような時期に、心臓リンパ液を採取して、その二次元電気泳動パタ-ンを調べると、冠動脈結紮前には認められなかった小さな蛋白質のスポットがたくさん検出された。また、二次元電気泳動パタ-ン上でクレアチンキナ-ゼと思われるスポットがSDSゲル電気泳動上で上下に広がりを見せ、虚血によってクレアチンキナ-ゼが崩壊し、分子量の異なるいくつかの断片に分かれたことが示唆された。以上の結果は、虚血になると心筋細胞内のエネルギ-不足によって、心筋構造を維持できなくなり、細胞構成蛋白質や、機能蛋白質(例えばクレアチンキナ-ゼ)が崩壊して心臓リンパ液中へ排出されることを示している。鼠径部のリンパ管からもリンパ液を採取し、心臓リンパ液の二次元電気泳動パタ-ンと比較した。冠動脈を結紮する前の正常状態では、鼠径部リンパ液の二次元電気泳動パタ-ン上のクレアチンキナ-ゼのスポットはいくつかのアイソマ-に分かれたが分子量的にはほとんど同一の蛋白質であったのに対し、心臓リンパ節では分子量の異なるクレアチンキナ-ゼの断片が既に認められた。興味あることに、冠動脈結紮によって鼠径部リンパ液でも小さな蛋白質断片のスポットが多数認められた。心臓リンパ液にでてくる崩壊蛋白質におよぼす抗狭心症薬の作用については今後の問題として残された。
第一原理フェーズフィールド計算

材料において諸々の物性や機能・現象が発現し観察されるスケールをミクロ、メソ、マクロと分類すると、離散格子モデルはミクロなレベルでの原子配列の詳細な知見を与え、連続体モデルはメソスケールでの組織を予測する。前者に属するものとして第一原理クラスター変分法が、後者ではフェーズフィールド法が代表的な手法として知られている。しかし、フェーズフィールド法は基本的に現象論的な手法であり、方程式中の係数項には経験値やパラメターを導入する為に任意性が伴なうこと、第一原理計算は基本的に均一な媒体を対象にしており、組織のような不均一系の計算に応用することは極めて困難であること、両手法の扱い得る時空スケールが異なること、等の問題点がある。本研究は、これらの困難を解決し、両手法の特長を活かして、組織形成過程に対する任意性のない計算を行うことを目的として遂行した。通常のフェーズフィールド法では、濃度のような保存量に対する拡散方程式と、規則度のような非保存量に対するTDGL方程式を、共通の自由エネルギー密度を用いて書き下し、両方程式を連立して解く。本研究のように規則-不規則変態を正確に取り扱う場合には、自由エネルギーを、濃度のみならず、長範囲や短範囲の規則度の関数として表現する必要がある。この為に、自由エネルギーにはクラスター変分法の自由エネルギー汎関数を用い、TDGL方程式との空間スケールの整合性をとる為に、空間粗視化の定式化を行った。そして、Fe-Pd系に対して全エネルギー計算を行い、クラスター展開法を介してクラスター有効相互作用エネルギーを算出し、これを、第一原理TDGL方程式に導入して、L10-disorderの相変態過程の第一原理計算を行った。特に、規則化に伴なう逆位相界面の生成過程に着目し、電子顕微鏡の観察結果と比較検討、その詳細を明らかにした。又、結晶方位や空間スケーリングを第一原理から一義的に決定することに成功し、時間スケーリングにも言及した。昨今のフェーズフィールド法の進展は目覚しく、合金を始めとする広範な物質群の、液相から固相を含む幅広い変態現象と組織の形成過程に対して、多くの重要な知見を与える.しかし、フェーズフィールド法は基本的に現象論的な手法であり、特に方程式の中の界面エネルギーや緩和定数などの係数項には経験値やパラメターを導入する為に任意性が伴なう.これに対して、第一原理計算は任意のパラメターを含まず、確立された原理のみに基づいて熱力学量や物性値を求める手法である.しかし、第一原理計算は基本的に均一な媒体を対象にしており、組織のような不均一系の計算に応用することは極めて困難である.両手法の特長を活かし、欠陥を補完しあうことで、組織形成過程に対する任意性のない計算を行うことを本研究の目的として一年目の計算を行った.通常のフェーズフィールド法では、濃度のような保存量に対する拡散方程式と、規則度のような非保存量に対するTDGL(Time Dependent Ginzuburg Landau)方程式を、共通の自由エネルギー密度を用いて書き下し、両方程式を連立して解いている.本研究のように規則-不規則変態を正確に取り扱う場合には、自由エネルギーを濃度のみならず、長範囲や短範囲の規則度の関数として表現する必要がある.この為に、自由エネルギーにはクラスター変分法の自由エネルギー汎関数を用いた.さらに、界面を取り扱うために、クラスター変分法の範疇で均一系の自由エネルギー式を導出した.この結果、長さのスケールと、結晶方位に対して任意性の無い定式化が可能となった.次に、Fe-Pd系を対象にして、電子論計算で導出した原子間相互作用エネルギーを導入して第一原理から内部組織を算出した.材料において諸々の物性や機能・現象が発現し観察されるスケールをミクロ、メソ、マクロと分類すると、離散格子モデルはミクロなレベルでの原子配列の詳細な知見を与え、連続体モデルはメソスケールでの組織を予測する。
幼稚園文化と保育所文化の融合に関する乳幼児教育保育の課題と展望

研究目的:平成27年4月スタートの「子ども・子育て支援新制度」は,近年の幼保一体化を強力に押し進め,認定こども園などの形で施設・内容的にこの両者を統合していこうとする制度である。本研究は,これまでの幼稚園・保育所から認定こども園に移行することが推奨されている現状を鑑み,幼稚園と保育所の保育者(教員・保育士)とカリキュラム(教育課程・保育課程)の文化的な差異を分析・検討し,幼稚園と保育所が認定こども園のような形で融合するための課題と展望を明らかにすることを目的とする。研究方法:第1の仮説(保育者文化に関する仮説),及び第2の仮説(カリキュラム文化に関する仮説)を立て,仮説検証のため,アンケート調査を実施した。調査対象者は,保育が充実していると想定されるA県B地区の公立幼稚園178園,及び公立保育所814園の管理職である。調査は平成26年10月から平成27年1月にかけて実施した。有効回答数(回収率)は,公立幼稚園が58通(32.5%),公立保育所が60通(7.4%)であった。研究成果:調査した結果を基に,保育者文化とカリキュラム文化に視点をあて,自律性,革新性,協働性の3つの価値基準から,幼稚園及び保育所の文化の差異を示した。その結果,保育者文化,カリキュラム文化共,自律性・革新性は幼稚園の方が優位であり,協働性は幼稚園,保育所とも高かった。しかし,保守性や永続性,安定性といった革新性に相対する概念は,「養護」の面から見ると極めて優れた価値概念であると言える。今後,認定こども園が,制度的に優れたシステムになるためには,教育・保育の質の保持が最優先である。そのため,認定こども園におけるカリキュラムは,自律的に組織された教育・保育計画であるという発想に立ち,改善と更新を前提として,新しいカリキュラム文化を創造していくべきである。そのカリキュラムを創造していく担い手は,保育者である。
本態性血小板血症の遺伝子情報に基づく個別化治療の実現

アナグレリドは、血中の血小板数が異常に増加する本態性血小板血症(ET)の患者に対して、血小板数減少薬として2014年から本邦で使用が開始された。これまでの血小板減少薬と異なり、二次発がんのリスクがないことから、その使用の拡大が見込まれる。一方で、研究分担者の小松らの経験やカルテ調査から、3割超の患者では効果が認められないことが明らかになってきた。本研究はnon-responderの原因を薬物動態とその応答性に注目して検討し、個別化治療の実現を目的とする。H29・30年度はアナグレリドのnon-responderに寄与する影響因子を抽出する目的で、カルテ調査によりアナグレリドを投薬開始後の血小板数、肝機能、腎機能などの推移を長期間観察し、投薬開始3ヶ月後に血小板数が40万個/μL未満になった患者を奏効群、血小板数の減少の見られない患者を不応答群に分類した。血小板減少効果に関与すると考えられる薬物動態関連遺伝子と疾病関連遺伝子を絞り込み、解析対象遺伝子として、CYP1A1、CYP1A2、CYP3A5、P-GP、BCRPと病態関連遺伝子JAK2、CALR、MPLについて、遺伝的多型(SNP)を解析条件を検討・確立し、SNP解析を行った。次にSNP解析による効果判定マーカーを絞り込むことを目的に、各解析対象遺伝子の塩基配列を調査した。最終的に、アナグレリドの血小板減少と強い相関を示すSNPsの有無をロジスティック解析法により検討した。その結果、アナグレリドのnon-responderに関して投与前の血小板数に影響するヒドロキシウレアの治療歴とJAK2遺伝子変異を寄与因子として抽出することに成功した。更にH30年度はカルテ調査から抽出されたアナグレリドの反応性の影響因子の妥当性を立証するために、アナグレリド投与患者を対象に前向き臨床試験を開始できた。1倫理承認の取得:本研究では、研究目的で患者からの採血や、遺伝情報の解析を行うことから、研究計画に倫理的な問題が無いことや、医学的かつ科学的な意義があることについて、全研究参加者の所属機関の倫理委員会に諮り、承認を取得した。2検体・臨床情報の収集と薬物動態解析:研究分担者の小松の所属する順天堂医院血液内科を受診し、アナグレリドを処方されたET(疑いを含む)患者のうち、研究参加に同意をした患者を選抜する。当該患者の末梢血から、確定診断に必要な遺伝子検査とSNP解析に用いるゲノムDNAを調製した。遺伝子検査を施行し、その結果と、収集した臨床情報を元に、WHO2008あるいはWHO2016診断基準に基づき、患者の確定診断を行った。3効果判定・関与因子の推定:カルテ調査により投薬開始後の血小板数、肝機能、腎機能などの推移を長期間観察し、投薬開始後3ヶ月で血小板数が40万個/μL未満になった患者を奏効群、血小板数の減少の見られない患者を不応答群に分類した。血小板減少効果に関与すると考えられる薬物動態関連遺伝子と疾病関連遺伝子を絞り込んだ。解析対象遺伝子としては、CYP1A1、CYP1A2、CYP3A5、P-GP、BCRP、JAK2、CALR、MPLなどの遺伝子変異(SNP)を解析対象とし、その解析条件を検討しSNP解析を行った。4SNP解析による効果判定マーカーの絞り込み:各解析対象遺伝子の対象領域の塩基配列を決定し、アナグレリドの血小板減少と強い相関を示すSNPsの有無をロジスティック解析法により検討した。5アナグレリド投与後の血小板数の時間推移の予測:母集団薬物動態解析を利用して、血小板数の時間推移とその変動要因について、間接反応モデルによるモデル構築に成功した。1検体やその臨床情報の収集、血中薬物濃度測定と薬物動態解析研究分担者の小松の所属する順天堂医院血液内科を受診し、アナグレリドを処方されたET(疑いを含む)患者のうち、研究参加に同意をした患者を選抜する。当該患者の末梢血から、確定診断に必要な遺伝子検査とSNP解析に用いるゲノムDNAを調製する。遺伝子検査を施行し、その結果と、収集した臨床情報を元に、WHO2008あるいはWHO2016診断基準に基づき、患者の確定診断を行う。続いて、患者の投薬初日と投薬開始後1週間程度経過した時点において、投薬前、投薬後1、2、4、6、8時間後に抹消血から血清を取得し、凍結保存する。その後、血清検体を外部の測定機関に送付し、アナグレリドやその代謝産物であるBCH24426およびRL603の濃度を測定する。測定された血中濃度データと患者の臨床情報を基に母集団薬物動態解析を実施し、経口クリアランスを算出する。すでに前向き試験の一部をH30年度に開始できた。2患者ごとに個別化したアナグレリド投薬量アルゴリズムの構築経口クリアランスと血小板減少に寄与するSNPsを含む効果判定マーカーの影響の程度に関する定量的解析を行い、患者ごとに最適な投与量を算出して個別化医療を実現する。3成果発表:結果を取りまとめ、国際学会や学術誌において発表を行うと共に、社会に情報を発信していく。

これまでの血小板減少薬と異なり、二次発がんのリスクがないことから、その使用の拡大が見込まれる。一方で、研究分担者の小松らの経験やカルテ調査から、3割超の患者に効果が認められないことが明らかになってきた。本研究はnon-responderの寄与因子について検討し、個別化治療の実現を目的とする。H29年度はアナグレリドのnon-responderに対する薬物動態関連因子の関与を立証するために、カルテ調査により投薬開始後の血小板数、肝機能、腎機能などの推移を長期間観察し、投薬開始後3ヶ月で血小板数が40万個/μL未満になった患者を奏効群、血小板数の減少の見られない患者を不応答群に分類した。血小板減少効果に関与すると考えられる薬物動態関連遺伝子と疾病関連遺伝子を絞り込み、解析対象遺伝子として、アナグレリドの肝代謝と消化管排出に関与する可能性のあるCYP1A1、CYP1A2、CYP3A5、P-GP、BCRPと病態関連遺伝子JAK2、CALR、MPLについて、患者ゲノムDNAにおける遺伝的多型(SNP)を解析対象とし、その解析条件を検討・確率し、SNP解析を行った。次にSNP解析による効果判定マーカーの絞り込むことを目的に、患者ゲノムDNAから、解析対象遺伝子の対象領域をPCR増幅し、シークエンスにより配列決定した。最終的に、アナグレリドの血小板減少と強い相関を示すSNPsの有無をロジスティック解析法により検討した。その結果、アナグレリドのnon-responderには、投与前の血小板数と病態関連遺伝子JAK2遺伝子変異が関与することを立証することに成功した。1倫理承認の取得:本研究では、研究目的で患者からの採血や、遺伝情報の解析を行うことから、全研究参加者の所属機関の倫理委員会に諮り、承認を取得した。2検体・臨床情報の収集と薬物動態解析:研究分担者の小松の所属する順天堂医院血液内科を受診し、アナグレリドを処方されたET(疑いを含む)患者のうち、研究参加に同意をした患者を選抜する。当該患者の末梢血から、確定診断に必要な遺伝子検査とSNP解析に用いるゲノムDNAを調製した。遺伝子検査を施行し、その結果と、収集した臨床情報を元に、WHO2008あるいはWHO2016診断基準に基づき、患者の確定診断を行った。3効果判定・関与因子の推定:カルテ調査により投薬開始後の血小板数、肝機能、腎機能などの推移を長期間観察し、投薬開始後3ヶ月で血小板数が40万個/μL未満になった患者を奏効群、血小板数の減少の見られない患者を不応答群に分類した。血小板減少効果に関与すると考えられる薬物動態関連遺伝子と疾病関連遺伝子を絞り込んだ。解析対象遺伝子としては、アナグレリドの肝代謝と消化管排出に関与する可能性のあるCYP1A1、CYP1A2、CYP3A5、P-GP、BCRP、JAK2、CALR、MPLなどについて、患者ゲノムDNAにおける遺伝的多型(SNP)を解析対象とし、その解析条件を検討しSNP解析を行った。4SNP解析による効果判定マーカーの絞り込み:患者ゲノムDNAから、解析対象遺伝子の対象領域をPCR増幅し、シークエンスにより配列決定した。最終的に、アナグレリドの血小板減少と強い相関を示すSNPsの有無をロジスティック解析法により検討でき、当初計画していた内容を概ね遂行することができた。
皮膚炎を標的とした免疫応答ダイナミクスのマルチスケールモデリング

マルチスケール数理モデルの構築を目標として掲げ、疾患動態を記述した数理モデルの作成に取り組んできた。本研究では、常微分方程式を用いて、変数間の相互作用を記述した数理モデルを構築し、数値計算によってシミュレーションを実施する手法を中心に進めた。表皮の大多数を占める細胞であるケラチノサイトを標的として、炎症反応が表皮組織レベルでどう拡大し、維持されるかに関する数理モデルを構築して解析した。プロテアーゼ活性と免疫応答の相互作用によって、また、持続的な炎症反応が表皮組織レベルで維持される仕組みをまとめ、ただいま論文として投稿中である。どのような数値計算スキームが適しているか検証した。1.皮膚炎発症と進行のダイナミクスを記述したマルチスケール数理モデルの構築を大目標として掲げ、三年間にわたってミクロ・メゾ・マクロスケール各階層における動態を記述した数理モデルの作成に取り組んでいる。今年度は、メゾスケールを記述した数理モデル構築と確率シミュレーション研究に専念して研究を進めた。具体的には、表皮の大多数を占める細胞であるケラチノサイトを標的として、オートクライン型のサイトカイン分泌による細胞間相互作用を記述した数理モデルを構築した。細胞内でのサイトカインmRNA転写と翻訳によるサイトカインの生成・分泌を常微分方程式により記述し、分泌されたサイトカインが細胞間を拡散して別の細胞に取り込まれる状況を計算機で実装可能なルールによって記述した。単位時間あたりに生じる抗原刺激の回数をPoisson計数過程によって記述し、上記のサイトカイン生成・分泌過程と併せて確率シミュレーションを実施した。本研究により、メゾスコピックなスケールで想定される炎症反応の基本機構の1つの可能性を提示した。次年度で取り組む予定であるミクロ、マクロスケールの数理モデルを統合するための数理モデルを開発したという点で、一定の成果が認められる。本研究は成果として論文投稿の準備中である。2.マルチスケール性を表現した数理モデル構築には、いくつか注意すべき点が存在する。マルチスケール性を考慮する際に生じる特有の問題に留意しながら数理モデルを構築する上での注意点、加えて後半では、イメージングを始め近年取られるようになった定量計測データを活用した皮膚組織に対する数理・実験融合研究に関する研究のレビューをまとめて総説として論文発表した(印刷中)。初年度はメゾスコピック系(表皮細胞間のオートクライン型サイトカイン分泌による細胞間相互作用を記述した確率モデル:論文投稿準備中)の研究を進め、まとめる方向性ができはじめたので、2年目にあたる今年度は、マクロスケールを記述した数理モデル構築と数値計算に専念して研究を進めた。具体的には、表皮の大多数を占める細胞であるケラチノサイトを標的として、炎症反応が表皮組織レベルでどう拡大し、維持されるかに関する数理モデルを構築して解析している。具体的には、黄色ブドウ球菌など、アトピー性皮膚炎発症時には個体数増大が観察される皮膚常在菌による抗原刺激を想定し、表皮におけるプロテアーゼ活性と細菌に対する免疫応答も組み込んだ数理モデルを構築済みである。プロテアーゼ活性と免疫応答の相互作用によって、持続的な炎症反応が表皮組織レベルで維持される仕組みをただいま解析中である。2.最終年度(3年目)に集中して取り組むべき、ミクロレベルでの皮膚炎関連シグナル伝達ネットワーク数理モデル構築に向けて、ただいま取得可能な遺伝子発現データと、注目すべきシグナル伝達系の選定を行っている。ミクロレベルのシグナル伝達ネットワーク数理モデルでは、ネットワーク上の常微分方程式を考えることになるが、変数が多くなると数値計算上の工夫が必要である。先立って、どのような数値計算スキームが適しているかを別の方程式系で検証が終わった段階(システム制御情報学会の特集号へ和文として投稿予定)である。皮膚炎発症と進行のダイナミクスを記述したマルチスケール数理モデルの構築を大目標として掲げ、三年間にわたってミクロ・メゾ・マクロスケール各階層における動態を記述した数理モデルの作成に取り組んでいる。初年度はメゾスコピック系(表皮細胞間のオートクライン型サイトカイン分泌による細胞間相互作用を記述した確率モデル)の研究を進めた。2年目は、マクロスケールを記述した数理モデル構築と確率シミュレーション研究に専念して研究を進めた。具体的には、表皮の大多数を占める細胞であるケラチノサイトを標的として、炎症反応が表皮組織レベルでどう拡大し、維持されるかに関する数理モデルを構築して解析した。黄色ブドウ球菌など、アトピー性皮膚炎発症時には個体数増大が観察される皮膚常在菌による抗原刺激を想定し、表皮におけるプロテアーゼ活性と細菌に対する免疫応答も組み込んだ数理モデルを構築・解析した。プロテアーゼ活性と免疫応答の相互作用によって、持続的な炎症反応が表皮組織レベルで維持される仕組みをまとめ、ただいま論文として投稿準備中である。最終年度(3年目)では、ミクロレベルでの皮膚炎関連シグナル伝達ネットワーク数理モデル構築に向けて取得可能な遺伝子発現データと、注目すべきシグナル伝達系の選定を行った。先立って、どのような数値計算スキームが適しているかを別の方程式系で検証が終わった段階(システム制御情報学会の特集号へ和文として受理済み)である。とりわけ、セリンプロテアーゼの相互作用ネットワークに着目した数理モデルを今現在解析中であり、まとまり次第論文として投稿する。

表皮の大多数を占める細胞であるケラチノサイトを標的として、炎症反応が表皮組織レベルでどう拡大し、維持されるかに関する数理モデルを構築して解析した。プロテアーゼ活性と免疫応答の相互作用によって、また、持続的な炎症反応が表皮組織レベルで維持される仕組みをまとめ、ただいま論文として投稿中である。どのような数値計算スキームが適しているか検証した。当初、初年度に予定していた細胞内のシグナル伝達系を記述したミクロモデル(プロテアーゼと酸化ストレス)は、参考とする実験データに基いて作成する必要がある。当初の予定とズレが生じたため、結果としてメゾスコピックスケールの数理モデル構築(初年度)、マクロスケールの数理モデル構築(二年目)に取り組むことになった。進行順序に変更はあるものの、進捗状況は概ね予定通りである。最終年度は、初年度に予定していたミクロモデルの構築に取り組み始めている。構想通り、プロテアーゼに起因すると考えられる表皮のバリアー機能減弱を表現するためのシグナル伝達系の数理モデルの構築に取り組む。並行して、酸化ストレスがトリガーとなって生じる免疫応答とその破綻に関与が想定されるシグナル伝達系についても、同様に数理モデルの構築に取り組む予定である。当初の予定とズレが生じたため、初年度は上記の通りメゾスコピックスケールの数理モデル構築に専念した。進行プランに変更はあるものの、進捗状況は予定通りである。今年度、初年度に予定していたミクロモデルの構築に取り組み始めている。まずはプロテアーゼに起因すると考えられる表皮のバリアー機能減弱を表現するためのシグナル伝達系の数理モデル構築に取り組む。
「いのちの学び」を柱とする「総合的な学習」のカリキュラム開発

本研究の目的は、「いのちの学び」につながるこれまでの教育実践をレビューし、総合的な学習の時間をうまく構成するための授業開発、カリキュラム開発を行うことにある。H.17年度には、金森俊朗の授業実践をフィールドワークし、日生連の研究資料を中心に文献研究を行った。H.18年度は、鳥山敏子の実践をフィールドワークし、「東京賢治の学校」の文献研究を行った。その他様々な「いのちの学び」のフィールドワークを行った。H.20年度は、それらの基本的考え方を整理し、それをもとに大学で「生活科研究」の実践授業を行った。そこから、「総合的な学習の時間」を取り巻く問題を以下のように整理した。(1)生活の中の気づきから生まれる学びの世界を子どもたちに実感させること。そのために、教師がそれを実感していること。(2)自然との一体感を呼び戻すには、日常の生活空間とは異界であるような現場での農作業など身体活動の深い体験が必要であること。(3)人間の過剰さへの気づきを「自分を問い直す」方向へ導くことは難しいこと。(4)教師自身が、日常的に外部から生じる問題に対処しながら「自分を問い直すこと」、そこから溢れる「からだの中からつくり出した言葉」をもって世界の区切りを動かそうと努める姿勢が大切であること。「いのちの学び」のカリキュラムのコアとなる内容として、(1)自然は人間のいのちの源であること。(2)弱い人間がいのちを維持しあうネットワークが社会であること。(3)社会特に近代社会は、人間と自然の誤った関係の捉え方(世界観)を構築していること。(4)近代社会、特に資本主義は、人間の欲望や身体性を奇形化していること。(5)社会は諸生命を搾取するばかりでなく、人間間、社会階層間、国家間にまで搾取の関係を広げていること。こうしたコアは、農業体験から、地球環境問題、差別や戦争までを一貫した視座で捉える枠組みとなっている。本研究の目的は、「いのちの学び」にっながるこれまでの教育実践をレビューし、総合的な学習の時間をうまく構成するための授業開発、カリキュラム開発を行うことにある。本年度の中核課題は、特に金森俊朗の教育実践に関するフィールドワークであった。まず研究分担者と理解を深めるために、金森実践に関する基本図書(中野光『教師としていまを生きる』ぎょうせい、金森俊朗『いのちの教科書』『希望の教室』角川書店)を輪読し、意見交換会を行った。さらに『生活教育』『子どもと教育』などの教育雑誌から、金森俊朗20代からの教育実践資料を収集・整理した。フィールドワークとしては、10月に金森氏を香川大学に呼び(学部経費による講演会)、本研究チームと懇談を行った。また研究代表者は、2月と3月に金森学級を訪問し、いくつかの授業を参観(授業記録化)し、金森氏と面談した。その他、各研究者が、「いのちの学び」をコアとした専門分野の授業実践レビュー考察を行った。研究成果の大きなところは、以下に要約できる。生活綴り方教育や生活教育の影響を受けてきた金森氏は、特に若い頃、独自教材をもって先進的な実践を展開していた。その当時から、一つ一つの実践の意味をスケッチし、トータルに教えたいこと/学ぶべきことは何か、思い悩んでいたそうである。それが「いのちの学び」として集大成されるのは、最近のことであるという。金森氏の学校の総合的な学習は、学年団で展開されている。

その同僚性の重要さから、各教科も独自教材ではなく、教科書の単元を用いて、それを深め、同僚に提案する形で、総合的に行われていた。教科書の各単元を、人・社会・いのちなどの人間存在の底流にある深い問題とつなぎ、子どもたちが主体的に学べるような形で再構成(社会科の「水道と生活」は「いのちと水」)されていた。3年理科の「蝶の一生」(いのちを生み出す大きな仕組み、自分もその中でいのちを与えられていることへの気づき)は、4年の保健「最近の私の心とからだの変化」(いのちを与えられた私は、少しずついのちを与えるものへと、知らない間に変化しつつあることへの気づき)と見事に呼応する構成になっていた。こうした一連の教科学習の中で総合的な学習(4年の田植えの学習、国際理解)が展開されていた。金森氏の教育実践の特徴的な点は,教材づくり・単元づくり・カリキュラムづくりにある。身体性の解放(怒るべきところで怒れ!)、子どものリアリティに迫る(私が生きてるって不思議!)、観を育てる(いのちって、、、だと思いました)、共感の重視(分かり合う努力!)、自己肯定感への誘い(生きてるってすごい!)等、その特徴の形式化を試みている。しかし人間存在の深さに迫ろうとする教師の強靭な知性こそが要であると痛感させられた。本研究の目的は、「いのちの学び」につながるこれまでの教育実践をレビューし、総合的な学習の時間をうまく構成するための授業開発、カリキュラム開発を行うことにある。本年度の中核課題は、鳥山敏子らの教育図書や雑誌の文献研究を行なうと伴に、「賢治の学校」の教育実践活動をフィールドワークすることであった。特に川口由一の「いのちのめぐり」の先行実践をレビューしながら、総合的な学習のカリキュラム開発のための構造的な課題を明らかにすることに努めた。「賢治の学校」では本年度、川口由一自然農ワークショップや宮崎の綾農場での実習等の行事を設けていたが、研究代表者は都合がつかず、12月末に「賢治の学校」を直接訪問し、自然農を中核にそこでの教育内容をインタビューしてきた。現在「賢治の学校」には、幼児部から10年生(高校一年)まで131人の子どもたちが在学。最初の1年生が8年生となっている。「エポック授業」等の概要を学んだ。自然農は、土、草、虫などいろんなものを壊さず作物を作ろうという営みであり、そこには、人間とはいのちの世界においてどういう性質をもっていて、どうある存在なのかを問う哲学があるという。そこでは身体を使ってじかに世界とつながる感覚があり、時に無性に嬉しさがこみ上げてくるという。普通の農業では、野菜しか見ない。それを太らせるために肥料やら何やらに手を加える。それは商業の発想。自然農では、いろんなものがあって、その中に自分がいて、自分が働いていて、全体のつながりの中に作物が育っているという感覚であるらしい。そうした体験が、9年生の宮崎での2週間の農業実習(職場体験)などへと発展するカリキュラム(みんなで何かを成し遂げる楽しさから、働くことの楽しさへ)の考え方も学んだ。それは「民族の学び」など大きく社会認識を発展させるものとなっていた。
動物のストレス耐性向上のための包括的研究：酸化ストレス・代謝・免疫系の統合的制御

本研究は暑熱・内毒素ストレスが肉用鶏の生体におよぼす影響を調べた。慢性的な暑熱環境下では、骨格筋・肝臓ともに酸化ストレスが亢進したが、前者では抗酸化システムが活性化していたのに対し、後者ではこれが認められなかった。LPS投与時では、両組織において酸化ストレスは亢進しなかったものの、炎症性サイトカインの遺伝子発現量が増加した。抗酸化力に優れる電解還元水および有機セレン給与により、暑熱時の酸化ストレスは抑制されたものの増体量は回復しなかった。以上の結果より、暑熱ストレス時の増体量の回復は酸化ストレス制御のみでは十分ではなく、他の要因例えば腸内細菌叢の最適化なども重要であることが示された。家禽生産現場において「暑熱と内毒素によるストレス」は代表的重要課題でいずれの場合も生産性が低下する。研究計画初年度にあたる本年度では、これらストレス環境下における酸化ストレス、タンパク質分解ならびに免疫の各応答メカニズムを包括的に調べた。1)慢性的な暑熱ストレス環境(33°C、6d)下において、肉用鶏の浅胸筋・肝臓では脂質過酸化・タンパク質カルボニル化の増加が確認されたが、体タンパク質分解の指標であるメチルヒスチジンの血漿中含量は変化しなかった。浅胸筋では、抗酸化酵素であるCAT活性が低下したが、SOD活性の増加、ROS産生因子NOX4のmRNA発現低下ならびにミトコンドリアROS産生制御因子UCPのmRNA発現上昇が認められ、浅胸筋では酸化ストレス抑制機構が作用している可能性が示唆された。また、浅胸筋ではタンパク質分解関連因子FoxO・μ-calpainのmRNA発現は変化しておらず、これは血漿中メチルヒスチジン含量の結果と一致する。一方、肝臓では、抗酸化関連因子HO-1のmRNA発現こそ上昇したものの、SOD活性の低下・NOX4凪NA発現上昇が認められ、肝臓では浅胸筋とは異なり酸化ストレス誘導機構が作用している可能性が示唆された。また、脾臓では炎症性サイトカインであるTLlA、IL-1およびIL-6のmRNA発現量が増加しており、暑熱感作にともない炎症応答が誘導していることが示された。2)内毒素ストレス時においては、LPS投与後24h以内における浅胸筋・肝臓中の脂質過酸化度に大きな経時的変化は認められなかったが、24h後の肝臓・脾臓の重量は増加し、血漿中セルロプラズミン含量も増加した。脾臓において炎症性サイトカインIFN-γ、IL-6、TLIA、IL-10およびiNOSの各mRNA発現は上昇し、LPS投与後1-2hで最大に達し、4h後には対照レベルまで戻ることが確認された。家禽生産現場において「暑熱と内毒素によるストレス」は代表的重要課題でいずれの場合も生産性は低下する。研究計画2年目にあたる本年度では、1)FeCl3/チオシアン酸塩を用いて潜在的還元力を評価するBAP(biological anti-oxidative potential)テストにより上記ストレスを抑制する生理活性物質候補の選別を行い、さらにこのうち一部の活性物質のストレス緩和効果を2)in vitro細胞試験ならびに3)in vivo実験で検証した。1)BAPテストの結果、典型的抗酸化物質であるCoQ10、アスコルビン酸、Nアセチルシステイン、Cysは極めて高い還元力を示し、オリーブ特有成分オレウロペインはこれら3物質よりもさらに高い抗酸化力を示すことが示された。また、カシューナッツ殻油(CNSL)主成分アナカルド酸も中程度の還元力を示した。Cys以外の主なるアミノ酸ではMet、Lys、Glyの順に還元力が高かったがこれらの値は上記5物質に比べはるかに低く、二糖類トレハロースはほとんど還元力を示さなかった。2)鶏単離肝細胞を用いてアナカルド酸の内毒素ストレス緩和効果を検証した結果、炎症性サイトカイン誘導性の活性酸素過剰産生ならびに脂質過酸化が抑制されることが示され、炎症応答関連遺伝子のmRNA発現量の上昇も抑制されることが示された。3)1)において還元力は認められなかったが、抗酸化成分を保護する作用があることが知られているトレハロースを肉用鶏に給与した結果、慢性暑熱感作時の脂質過酸化は抑制される傾向を示した。以上の結果から、一部の生理活性物質においては、その化学的評価と実際のストレス緩和効果は必ずしも一致しない可能性が示唆され、最終段階において慢性暑熱in vivo試験の重要性が再確認された。研究計画最終年度にあたる本年度では、電解還元水(ERW)およびセレン(無機および有機Se)の同時給与による暑熱ストレス低減効果を評価した(試験1)。

また、暑熱ストレス誘導要因の一つである腸管免疫能を改善した際における同ストレス緩和作用を検証した(試験2)。試験1)まず、暑熱時の酸化ストレスに対するERWおよび無機・有機Seの抑制作用について鶏骨格筋細胞高温培養モデルで検証した結果、いずれの資材も有意に細胞内ROS産生量を低減させることが示された。続いて、これら資材を暑熱感作鶏に組み合わせて給与した結果、有機Se(Se酵母、0.17 ppm)およびERWの同時給与時において過酸化脂質含量が最も低下することが示されたが、同給与条件における増体量の回復は一部に留まった。(試験2)枯草菌製剤を暑熱感作鶏に給与した結果、増体量ならびに飼料効率が濃度依存的回復傾向にあった。同製剤給与区では、腸管における炎症性サイトカインmRNA発現量の低下ならびに乳酸菌占有率の増加が認められたことから、腸内細菌叢・腸管免疫能の改善は暑熱ストレスの改善に有効であると考えられた。なお、精製LPS投与にともなう内毒素ストレスに対するERWの作用も調査したが、有効な効果は得られなかった。以上の結果より、暑熱にともなう酸化ストレスの緩和には吸収性の高い抗酸化資材の給与が有効である一方で、増体量の回復には腸内細菌叢改善の腸管免疫能の最適化が有効である可能性が示された。したがって、暑熱ストレスを100%改善するためには、上記のような異なった作用点を有する資材の併用が有効であると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。動物生産科学、家禽科学、栄養生化学、代謝・生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、各ストレス時における酸化ストレス発症、過剰炎症、体タンパク質の分解といった生体応答のみならず、抗酸化関連酵素活性・遺伝子発現など分子レベルの変化も実証できている。今後は、ストレス時における成長低下メカニズムを統合的に解明に向けて、三つの生体応答の連関メカニズムならびに制御因子を的確に検証する必要がある。当初の計画通り、in vitro実験による生理活性物質の探索が実施され、有力な候補物質が見出された。今後は、この候補物質のin vivoにおける作用を高度に検証する予定である。研究計画2年目にあたるH25年度においては、当初の計画通り、暑熱および内毒素ストレスの抑止に活用できる数種類の飼料資材を提案するため、in vitro培養細胞実験系を用いてその候補物質を合理的にスクリーニングして選別する。'メカニズム解析に基づき実践的飼料資材の組み合わせを設計し、in vivo動物実験により高温と内毒素の各ストレスならびに同時ストレスに対する効果を検討した上で、ストレスの実用的軽減を可能とする新たな家禽飼育法を確立する。34°C、5日間暑熱曝露(高温モデル)、あるいはステロイド系ホルモン投与(ストレス誘導モデル)した、3-4週齢の各ストレス負荷ニワトリに、25年度の実験結果に基づき合理的に設計した実践的飼料資材を給与し、実践的ストレス軽減および生産性向上を検証する。なお、各仮説の検討責任者は、「酸化ストレス」、「タンパク質分解」、「免疫」の各応答を統合的に解析して不測の事態への対応案を策定し、最適な実用飼料を考案する。
シグナルを統合して植物細胞の伸長を総合的に制御するbHLH拮抗阻害システムの解明

本研究においては研究代表者が発見した植物の細胞伸長制御システム、tri-antagonistic bHLHsystem研究の発展研究であり、内的な要因(植物ホルモンや発生プログラムなど)と生育環境(光、温度など)のシグナル下で細胞伸長に関連する因子を網羅的に解析するために、酵母two hybrid法を用いて、既知因子の相互作用因子を網羅的に単離し、個々の因子間の関連性と機能を解析した。本研究の成果として、既知の因子であるPIF4, ACE, PREを含む新規相互作用因子候補116因子を単離し、複数の因子について細胞伸長への関与や、各種シグナル下での発現変動が確認できた。平成26年度は酵母ツーバイブリッドスクリーニングを用いて、新たな関連因子の探索を行った。また、IBH1SRDX体、および、IBH1過剰発現体におけるマイクロアレイ解析の結果から、IBH1遺伝子を過剰に発現した際にIBH1グループの遺伝子の発現が低下する傾向を見いだし、新たなIBH1グループ候補因子を複数同定、ACEグループ・PREグループとの結合性をイーストツーハイブリッド法で確認した。これらにより、現在までに、ACEグループ因子5種類、IBH1グループ因子9種類、PREグループ因子6種類を単離・同定した。公開アレイデータを用いて各々の遺伝子の発現パターンを解析した結果、光誘導性、遠赤色光誘導性、ホルモン誘導性などを示す因子が含まれていることがわかった。これらの因子の中には、各種の光受容体と相互作用する因子が複数含まれる一方で、未だ報告の無い未知の因子も含まれていた。単離した因子については、CRES-T体の観察などを開始した。新たに単離した因子の中で特に興味深かったのは、IBH1グループの因子として単離したPAR1である。過去の報告ではPAR1はHFR1と類似しており、PIF4に結合することでそのDNA結合を妨げるとされていた。そこで、ACE-IBH1-PREからなる3重拮抗システムと、光受容体結合タンパク質であるPIF4が関与する光シグナリングシステムに関連性があるかどうかを明らかにするために、まずPAR1とHFR1について過剰発現体の形態観察、イーストツーハイブリッド法を用いてのACEグループ因子、PREグループ因子との結合性の確認などを行った。これらに加えて、H26年度はACE多重変異体の作成なども行った。平成27年度はH26年度までに同定した13種類の因子について、シロイヌナズナ全転写因子1700個を対象とした酵母ツーハイブリッドスクリーニング(Y2H)を行なった。現在までにIBH1グループ8種類、PREグループ5種類について1stスクリーニングを終了、IBH1グループ因子3種類について相互作用因子同定を終了、ACEグループの新奇候補因子を10因子以上単離した。これらの中には細胞伸長制御に関連する植物ホルモンであるブラシノステロイドやジベレリン、オーキシンのシグナル伝達や生合成に関連するものが含まれていた。この結果はtri-antagonistic bHLHシステムが各植物ホルモンの上下で細胞伸長を制御することを示している。また、単離した相互作用因子の中には、新しいグループのnon-DNA binding bHLHなど、既知のtri-antagonistic bHLHシステムの枠に収まらない因子や、転写リプレッサーなども含まれており、システムの全体像が従来の理解よりも複雑である可能性が示された。これらの新奇因子のキメラリプレッサー発現体について、形態解析を順次行って、矮性や短い鞘といった細胞の伸長阻害に由来する形質、あるいは、葉や茎の伸長など細胞の伸長促進に由来する形質を多数のラインで確認した。H26年度に新奇因子として単離したPAR1については、70個近い転写因子を相互作用因子として同定した。これらの中には既知の相互作用因子であるPIF4, ACE, PREも含まれており、スクリーニングそのものは成功していると思われる。PAR1相互作用因子の中にはPRE、ACE両グループの因子だけではなく、IBH1も含まれていたことから、PAR1は、PRE、ACE、IBH1の各グループの枠に収まらない新奇グループを形成する因子であることを示唆した。本プロジェクトにおいては細胞伸長制御の全容解明の足がかりとして、細胞伸長制御シグナルを統合するシステム(tri-antagonistic bHLHシステム)に着目し、植物細胞の伸長制御システムのアウトラインの解明をめざしている。H27年度の研究においては、新たなtri-antagonistic bHLHシステム構成因子に加えて、tri-antagonistic bHLHシステムと関連する未知のシステムの存在を暗示する多くの因子を単離できた。これらの因子の中には、各植物ホルモン関連の因子や、鞘、花器官、根毛などの時期・組織特異的細胞伸長に関与するものなどが含まれていた。これらの結果は、tri-antagonistic bHLHシステムが多様な植物ホルモンによる細胞伸長制御に関与することや、植物ホルモンの生合成制御にも関わること、さらには、個別の植物組織・器官の伸長制御にも関与することが示唆され、tri-antagonistic bHLH関与する植物現象について、より深い理解と、多様な可能性が示唆されたといえる。当初の研究計画からすると、進行はやや遅れているように見えるが、当初の計画に無かった多数の、また、多様な因子が単離され、tri-antagonistic bHLHシステムと多様な現象との関連性が示唆されたことは想定外の大きな成果であり、これによって、tri-antagonistic bHLHシステム解明の重要性が増しつつあると言える。

さらに、PAR1に代表されるような既知のtri-antagonistic bHLHシステムの枠にはまらない因子が同定されつつあることは、tri-antagonistic bHLHシステム全体像の広がりを予感させる。よって、本プロジェクトはおおむね順調に進展していると私は考えている。平成28年度はH27年度までに行った、IBH1、PREグループ因子をbaitとし、シロイヌナズナ全転写因子1700個を対象とした酵母ツーハイブリッドスクリーニング(Y2H)から単離した70種類を超える転写因子について個別に総当たりの相互作用解析を行った。これらの中には、MADS, NACなど、既知のbHLHシステムの枠に収まらない因子や、転写リプレッサーなどが多数含まれており、システムの全体像が従来の理解よりも複雑であることがわかった。40個近い因子と相互作用するnon-DNA binding bHLHもあり、既知のtri-antagonistic bHLHシステムの枠に収まらない新奇グループの存在が強く示唆されている。新規に単離した因子は、順次、キメラリプレッサー植物体の形態観察を行い、矮性や短い鞘といった細胞の伸長阻害に由来する形質、あるいは、葉や茎の伸長など細胞の伸長促進に由来する形質を多数のラインで確認している。当初の予定よりも多くの相互作用因子が単離されたために、全ての因子の総当たりY2H解析を終了するに至らなかったが、一方で、non-DNA binding bHLHを中心としたタンパク質ータンパク質相互作用による転写因子の機能制御という巨大な未知のメカニズムの存在を明らかにすることができたことは大きな成果と言える。現在、これらのY2H相互作用解析結果、表現型観察結果、遺伝子構造などの知見を総合し、インフォマティクス的な手法を用いて、立体的な相互作用メカニズムモデルを構築し、細胞伸長を制御するメカニズムの全容解明につなげる準備を行っている。また、H27年度までに着目していた光シグナリングに加えて、浸透圧ストレスによる細胞伸長制御についても解析を行い、興味深い結果を得た。今後は、細胞伸長制御における各種環境ストレス間のクロストークにも着目して研究を計画している。本研究においては研究代表者が発見した植物の細胞伸長制御システム、tri-antagonistic bHLHsystem研究の発展研究であり、内的な要因(植物ホルモンや発生プログラムなど)と生育環境(光、温度など)のシグナル下で細胞伸長に関連する因子を網羅的に解析するために、酵母two hybrid法を用いて、既知因子の相互作用因子を網羅的に単離し、個々の因子間の関連性と機能を解析した。本研究の成果として、既知の因子であるPIF4, ACE, PREを含む新規相互作用因子候補116因子を単離し、複数の因子について細胞伸長への関与や、各種シグナル下での発現変動が確認できた。
ダイズ貯蔵タンパク質コングリシニンの液胞輸送シグナルと認識機構の解析

本研究では、ダイズ貯蔵タンパク質コングリシニンの液胞へのターゲティングシグナルの特定とシグナル認識機構の究明を目的とする。昨年度は、コングリシニンのα′サブユニットの変異型をモデル植物(アラビドプシス)で発現させ、それらの種子細胞中での局在性を免疫化学的に調べることにより、α′サブユニットのシグナルの存在領域の同定を行った。今年度は、α′サブユニットの変異型の未解析のコンストラクトとともにβサブユニットの変異型の解析を行った。1.形質転換体の作成と発現タンパク質の分子集合能プロ領域、エクステンション領域、糖鎖全てを欠失させたα′サブユニットと野生型及び糖鎖、C末端6残基をそれぞれ欠失させたα′サブユニットの遺伝子をアラビドプシスに導入し、薬剤選抜によりすべてのコンストラクトにおいて形質転換体を得ることに成功した。それらの完熟種子からの抽出液を用いてショ糖密度勾配遠心分離とそれに引き続くウエスタンブロッティングを行うことにより、全ての発現タンパク質がアラビドプシス種子中で正しく分子集合していることを示した。2.ターゲティングシグナルの存在領域の同定発現タンパク質が種子中でタンパク質貯蔵液胞へ輸送されているかを調べるために、抗α′及びβ抗体を用いたアラビドプシス完熟種子の免疫電子顕微鏡観察を行った。その結果、全ての変異型α′及びβサブユニットが野生型と同様にタンパク質貯蔵液胞由来のプロテインボディーに局在していることを確認した。本研究により、コングリシニンの液胞輸送シグナルはC末端6残基を除くコア領域に存在しているということが明らかとなった。今年度は、コングリシニンのα'サブユニットの変異型をモデル植物(アラビドプシス)で発現させ、それらの種子細胞中での局在性を免疫化学的に調べることにより、シグナルの存在領域の同定を試みた。1.形質転換体の作成と発現タンパク質の分子集合能野生型及びプロ領域、エクステンション領域、プロ領域及びエクステンション領域、C末端6残基をそれぞれ欠失させたα'サブユニットと糖鎖欠損させたα'サブユニットの遺伝子をアラビドプシスに導入し、薬剤選抜によりすべてのコンストラクトにおいて形質転換体を得ることに成功した。それらの完熟種子から抽出液を用いてショ糖密度勾配遠心分離とそれに引き続くウエスタンブロッティングを行うことにより、全ての発現タンパク質がアラビドプシス種子中で正しく分子集合していることを示した。2.ターゲティングシグナルの存在領域の同定発現タンパク質が種子中でタンパク質貯蔵液胞で輸送されているかを調べるために、抗α'抗体を用いたアラビドプシス完熟種子の免疫電子顕微鏡観察を行った。その結果、全ての変異型α'サブユニットが野生型と同様にタンパク質貯蔵液胞由来のプロテインボディーに局在していることを確認した。このことから、α'サブユニットの液胞輸送シグナルは、コア領域に存在しているということが明らかとなった。
高等植物におけるタンパク質チロシン硫酸化機構の解明

PSK前駆体ペプチドの鎖長を短くしたデリーションペプチドについて硫酸化効率を検討した結果,硫酸化されるチロシンを基準として-10から-20の範囲内に硫酸化効率を決定する主要なモチーフが存在することが明らかとなった.この領域には複数の酸性アミノ酸が存在する.しかし,-1から-10の範囲内に硫酸化効率を著しく低下させるアミノ酸群(塩基性アミノ酸群)が存在することも明らかとなった.これらはPSKのプロセシングに関与している可能性がある.したがって,硫酸化酵素を精製するためのアフィニティープローブとして,PSKドメインを含む短鎖ペプチドを設計するのは配列上困難であるという結論に達した.その他様々な市販のカラムを用いて硫酸化酵素の精製を試みたが,高い精製効率を示すものは見いだせなかった.他に新規の硫酸化ペプチドを同定できれば,その硫酸化モチーフをアフィニティープローブとして酵素精製に用いることができる可能性がある.そこで,新たに確立した硫酸化ペプチド濃縮系を用いて,シロイヌナズナ細胞培養液を解析した結果,PSKについで高等植物から2例目となる23アミノ酸分泌型硫酸化ペプチド(PSY1)を同定することに成功した.この試みは当初の研究計画にはなかったが,本来の目的以上に意義のある成果であり,硫酸化ペプチドが植物にもかなりの数存在していることを示唆する重要な結果である.PSY1もPSK同様に100アミノ酸前後の前駆体ペプチドに由来するが,23アミノ酸PSY1ドメイン単独でも高い効率で硫酸化されることから,アフィニティープローブとして利用できる可能性があり,現在種々の検討を行なっている.PSY1は他を中心に地上部で発現レベルが高いことが判明しており,その機能についても過剰発現・遺伝子破壊などの手法で解析している.(1)タンパク質Tyr硫酸化酵素(TPST)はすでに動物ではクローニングされているが,そのオルソログは植物には見出されない.したがって植物独自のTPSTがPSKの硫酸化に関与していると考えられる.PSK前駆体ポリペプチド中のTyr硫酸化モチーフを同定するため,リコンビナントPSK前駆体を基質としたin vitro硫酸化アッセイ系を確立し,PSK前駆体中において保存性の高いアミノ酸群についてアラニンスキャンを行なった.その結果,Tyr残基直前のAspに加えて、10アミノ酸以上上流に存在する2個のCysと酸性アミノ酸群がTyr硫酸化に重要であることが明らかとなった.この結果は動物TPSTに比較して,植物TPSTはより広範囲のアミノ酸残基を認識していることを示唆する(投稿準備中).植物TPSTの同定を目指して,TPST認識配列周辺を固定化したアフィニティーカラムを作製し,可溶化ミクロソーム画分からの精製を行なったが,特異的な吸着は見られなかった.架橋方法などにさらなる検討が必要である.(2)リン酸化タンパク質の研究では,IMACに代表されるリン酸化ペプチド特異的濃縮法の開発が,研究の発展の基礎となった.しかし,硫酸化ペプチドの特異的濃縮法は確立されていない.硫酸基はイオン半径が大きく水和されにくい性質を持つため,陰イオン交換担体に極めて強い親和性を示す.この性質を用いて,タンパク質をトリプシン分解し,さらにcarboxypeptidase B処理により塩基性アミノ酸を除去したペプチド断片から,硫酸化ペプチドのみを選択的に精製する手法を新たに確立した(投稿中).この手法により未知の硫酸化タンパク質の同定を試みている.(3)硫酸化反応における硫酸基のドナーであるPAPSの合成酵素adenosine-phosphosulfate Kinase(APK)の機能解析を目指して,4種類存在するパラログすべての遺伝子破壊株を取得し,掛け合わせを行なっている.PSK前駆体ペプチドの鎖長を短くしたデリーションペプチドについて硫酸化効率を検討した結果,硫酸化されるチロシンを基準として-10から-20の範囲内に硫酸化効率を決定する主要なモチーフが存在することが明らかとなった.この領域には複数の酸性アミノ酸が存在する.しかし,-1から-10の範囲内に硫酸化効率を著しく低下させるアミノ酸群(塩基性アミノ酸群)が存在することも明らかとなった.これらはPSKのプロセシングに関与している可能性がある.したがって,硫酸化酵素を精製するためのアフィニティープローブとして,PSKドメインを含む短鎖ペプチドを設計するのは配列上困難であるという結論に達した.その他様々な市販のカラムを用いて硫酸化酵素の精製を試みたが,高い精製効率を示すものは見いだせなかった.他に新規の硫酸化ペプチドを同定できれば,その硫酸化モチーフをアフィニティープローブとして酵素精製に用いることができる可能性がある.そこで,新たに確立した硫酸化ペプチド濃縮系を用いて,シロイヌナズナ細胞培養液を解析した結果,PSKについで高等植物から2例目となる23アミノ酸分泌型硫酸化ペプチド(PSY1)を同定することに成功した.この試みは当初の研究計画にはなかったが,本来の目的以上に意義のある成果であり,硫酸化ペプチドが植物にもかなりの数存在していることを示唆する重要な結果である.PSY1もPSK同様に100アミノ酸前後の前駆体ペプチドに由来するが,23アミノ酸PSY1ドメイン単独でも高い効率で硫酸化されることから,アフィニティープローブとして利用できる可能性があり,現在種々の検討を行なっている.PSY1は他を中心に地上部で発現レベルが高いことが判明しており,その機能についても過剰発現・遺伝子破壊などの手法で解析している.