hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
わが国における地方鉄道事業の形成と再編成に関する歴史地理学的研究

基本的には、昨年度同一テーマで交付を受けた研究を継続するかたちで研究を行なった。昨年度に一応の完成をみた三重県地域に関しては、若干の補足調査にとどめ、本年度はとにかく瀬戸内海地域の資料収集および路線プランからみた地域交通体系分析の展望論文の完成に力を注いだ。瀬戸内海地域に関する調査では、昨年度から行なってきた広島県立文書館所蔵史料の調査を概ね終えることができ、ひきつづいて岡山県総務部公文書館対策班及び山口県文書館所蔵史料の調査にとりかかる一方、対象地域の現地調査を行なっている。また、当該地域に関する「鉄道者文書」の調査では、国立公文書館所蔵分が概ね終了しつつあり、ひきつづき交通博物館所蔵分の筆写にとりかかっている。本調査の成果の一部を、第62回社会経済史学会大会(平成5年10月)において「昭和初期の地方交通問題と局地鉄道事業」と題して報告を行ない、その内容を「局地鉄道事業の展開と地域交通体系の再編成」と題して『社会経済史学』に投稿、審査中である。さらに来年度以降も、当該地域の調査を進め、海運と鉄道をめぐる交通体系変容に関する論文をまとめる予定である。一方、全国的展望論文は、昨年来の調査をベースに、静岡県、佐賀県、栃木県に関するフィールド調査と文書史料収集(国立公文書館及び神戸大学)を行ない、その成果を1993年度人文地理学会大会(平成5年11月)において、「わが国における近代交通体系の形成」と題して報告を行ない、報告内容を「支線鉄道の組織化からみたわが国における近代交通体系の形成」と題して『地理学評論』に投稿、審査中である。これらは、いずれも将来、学位(博士)審査論文として提出予定の研究の骨子を構成するものであり、来年度以降も残された課題に向けて研究をつづける予定である。
新しい増殖制御型アデノウイルスベクター開発による新世代癌遺伝子治療の研究

<研究の背景と目的>現在の癌遺伝子治療における最大の問題は、いかなる非増殖型ベクターを用いてもin vivoでは100%の癌細胞に遺伝子導入することは不可能であることで、このため非遺伝子導入癌細胞から癌が再発して臨床的恩恵にはつながっていない。本研究の目的は従来の遺伝子治療法を最適化するだけでなく、増殖制御可能なアデノウイルスベクターを新たに開発してin vivoで100%の癌細胞に遺伝子を導入すること、さらにそのベクターにのせる新たな治療候補遺伝子の機能解析を行い、新世代の癌遺伝子治療を開発することである。<今年度の研究成果>今年度の具体的成果として次の3つが上げられる。(1)我々が開発したコンビネーション遺伝子治療の最適化を種々の癌でおこなった。一例として臨床病態を反映する胃癌肝転移モデルを作製し、自殺遺伝子治療の検討を行ってみると、従来いわれていたこととは異なり自殺遺伝子は発現を単に強くすれば効果が増すというものではなかった。(2)増殖制御型アデノウイルスベクターの開発:一例として肝癌をモデルとして、癌胎児性抗原AFPへの反応型アデノウイルスベクターの機能とその治療効果を解析し、増殖制御型アデノウイルスベクターの潜在能力を確認した。その他、種々の増殖制御型アデノウイルスを作製している。(3)新たな治療候補遺伝子の検討:CD9分子の生体内機能解析としてCD9ノックアウトマウスを作製し、CD9は受精に必須の膜タンパクであることが解明できた。さらにCD9の癌への分子作用もin vasion assayで検討し、一部の癌で癌抑制作用があることがわかった。<考察と展望>本年度の成果は、本研究の高いオリジナリティーとさらなる発展への有望性を示唆している。今後新世代癌遺伝子治療開発による癌の根治を目指し、さらに強力に研究を進めていく予定である。
鉄骨コンクリート基礎梁の開発

鉄骨造建築にRC基礎を用いる場合の問題点として,寸法精度の差異や,建設技能労働者の減少などが挙げられている。本研究は,その解決策として,無筋コンクリートと鉄骨を用いた基礎梁工法(以下SC基礎梁工法)を提案する。昨年度は,柱脚部に着目して,施工性,耐力を考慮した3体の試験体を提案し実験を行った。第1の試験体では,鉄骨基礎梁にスチフナを溶接して剛性を高めた。第2の試験体では,T形鋼と鉄筋で柱脚の剛性を高めた。第3の試験体では,鉄筋を貫通させることにより剛性を高めた。これらの柱脚の回転剛性を一般露出柱脚や既製品と比較し,構造性能の確認を行った。平成29年度は,鉄骨コンクリート基礎梁同士の接合についての実験を行った。通常,鉄骨梁の接合は高力ボルトなどを用いて行われるが,基礎梁では下側のボルトを締付けることができない。現場溶接も同様に困難である。さらに,上側のボルトは仕上げ材と干渉しやすい。今回は,工場で鉄骨梁にプレートを溶接し,ループ筋あるいは鉄骨プレートと斜め筋を併用する工法を考案し,高力ボルトや現場溶接を不要としたものである。これにより,施工の簡素化が期待できる。実際,試験体を制作した感触として,施工の容易さが実感できた。実験は,二段階で行った。第一段階では,接合部の純粋な曲げ強度を知るため,4点曲げ加力により,一様な曲げモーメントを加えた。第二段階では,接合部のせん断強度を知るため,地震時の荷重を想定して,逆対称の曲げモーメントとせん断力を加えた。いずれも,コンクリート,鉄骨,鉄筋は普通強度のものを用いた。これも,施工の容易さを考えてのことである。実験結果はおおむね良好であった。ただし,鉄骨プレートを用いた曲げ実験では,ひび割れが一か所に集中する傾向があり,曲げひび割れの分散という点ではループ筋が優れるという結果となった。せん断強度に関する実験は,ループ筋・鉄骨プレートの試験体とも,非常に高い強度(必要強度の2倍以上)が得られた。この理由は現在のところ不明であり,うれしい誤算ではあるが,研究論文として発表するためには,今後の解析的な検討が必要である。当初は,平成29年度に柱脚の実験を行い,梁同士の接合については平成30年度を予定していた。しかし,柱脚の実験に関する検討を始めたところ,実験装置の設計など,種々の困難が明らかになった。そこで,今回は順序を逆にし,平成29年度に梁同士の接合についての実験を実施した。しかし,全体の進捗状況という点では全く問題がない。また,平成30年度の実験についても現在までに検討が進んでおり,順調に実施できる目途が立っている。鉄筋を使用しないで,コンクリートだけで柱脚の固定度を高めることを目指した実験を行う。このようなSC基礎梁(鉄骨+無筋コンクリート)を用いれば,基礎,上部構造ともに工場で製作(プレハブ化)できるようになり,基礎も含めた建物全体の寸法精度を統一できるようになる。また,鉄筋をほとんど使用しないため工期の短縮と工費の削減が実現できる。柱脚の固定度も簡単に確保できる。つまり,SC基礎梁には設計,施工,コストいずれも大きなメリットがある。鉄骨建物では柱脚が降伏し基礎梁は降伏しないケースがほとんどと考えられるので,基礎梁は無筋コンクリートでも十分である。今回の研究は,世界の鉄骨造(特に基礎工事の割合が大きい低層建物)の基礎梁形式を一変させる可能性を秘めている。その結果,平成29年度は予定よりも少なめの経費で研究が可能になった。平成30年度は残額をすべて使用する予定である。
カイガラムシにおいて染色体システムが性比とオスの行動に与える影響

カタカイガラムシのうちロウムシ類の1種であるカメノコロウムシ(Ceroplastes japonicus)の交尾行動について調査した。この種では,オスが成虫になった段階での性比はメスに偏っていた。前年度にオス寿命が約1日以内と非常に短いことが判明したので,オスを大量に用意し,交尾の際の行動とオスのあいだの競争について室内で観察を行なった。オスは遭遇しても顕著な相互作用を示さなかった。このことから,オス間競争はあるとしても,直接物理的な接触を伴うようなものではないと考えられる。また,マンゴーカタカイガラムシMilviscutus mangiferae1齢幼虫における分散行動が血縁認識に基づく調節を受けることは昨年度に実内実験により判明していた。遭遇する他個体が血縁個体であるときに移出傾向が強くなることは,理論的には,多くの実証的研究で生息場所での密度と適応度が低下するときに期待される。しかも,生息場所での密度と適応度の負の相関があればその他の条件にはほとんど依存せずにこの予測が成り立つ。今年度は,昨年度の室内実験に対応した条件での野外実験を行い,1齢幼虫の密度が適応度に与える影響を調査した。寄主であるホルトノキの葉への移出・移入を制限して,葉裏に1頭ないし2頭のメス1齢幼虫を接種した。接種したカイガラムシがメス成虫になった段階で葉とともに回収し,成虫の体サイズ(蔵卵数を反映している)を計測した。1頭区の方が2頭区よりも体サイズが大きかった。この結果は,分散行動の調節が適応的であることを示しているだけでなく,近親交配との回避などの要因ではなく(マンゴー力夕カイガラムシの当該個体群はオスを欠くため近親交配はありえない)血縁個体との競争回避によることを示している。染色体による性判別のための予備調査を行なった結果,ワタフキカイガラムシ類では染色体の観察が可能であったが,ロウムシ類やその他のカタカイガラムシ類については,条件をさらに検討する必要があった。とくに染色体観察用の標本を作成する発育段階によって染色体像が強く影響された。ロウムシ類のうち,カメノコロウムシで配偶行動の調査を行なった。オスの寿命は実験室条件下でほぼ1日未満であることがわかり,配偶行動,オスは主要な寄生バチよりも小型であり超拡大撮影装置の使用が観察には不可欠だった。また,カメノコロウムシでは,オスが成虫になった段階(この段階ではメスはまだ若虫である)での性比は強くメスに偏っており,配偶行動を観察するためには想定されていた以上に多数の試料が必要であった。一方,イボタロウムシでは,性比はオスが成虫になった段階で極端にオスに偏っており,予備的な調査では,メス1に対してオスは100を越えていた。イボタロウムシのオスはカメノコロウムシに比して著しく大型で寿命を実験室条件下で1週間程度であった。イボタロウムシにおいては,交尾行動の観察のためには,メスを十分な数だけ確保する必要があった。また,これまでの研究で,メスのみを産出する単為生殖を行なうことが明らかにされているマンゴ-カタカイガラムシを用いて,超拡大撮影装置により1齢幼虫間の相互作用を調べた。1齢幼虫は母虫から離脱後,活発に移動した。1齢幼虫が姉妹である場合には,そうでない場合に比べて,個体間の反発が強かった。これは,生息場所が高密度であるほど適応度が低いという単純な仮定からの予測と一致した。また,この結果は,半翅目昆虫における血縁個体識別の初めての例であり,日本動物行動学会大会(題名カイガラムシ1齢幼虫における姉妹と非血縁個体の識別)で発表した。
近世英国演劇における「聖母」/「娼婦」分節の諸相

「聖母」と「娼婦」の表象は、男性中心的言説にあって、女性を徹底的に称揚または排除するその修辞構造によって、女性に対し抑圧的に機能する。すなわち一見、女性の価値についての両極に別れたかに見えるこの二つの記号は、共同体にとっての価値の観点からは、中心化しつつ同時に周縁化することで、表裏一体となって互いの意味を支えあうように機能する。ここで注目すべきは、聖母が中心で娼婦が周縁にあるのではなく、両者はそれぞれ、男性の欲望の対象として中心的に言及されておきながら最終的に共同体の外部へと排除される点で、いわば正・負の方向性ながらも絶対値において等しく周縁化されているということである。英国演劇史におけるロマンスの展開は、その解釈史ともどもこの伝統のバイアスを受けており、修辞的構造のレヴェルでのキャノンの読み直しを経ることなしにこの問題を「外側」から考察することは困難を極める。具体的には、ジェイン・ショアの挿話の演劇史的変容を軸としてみることで、ロマンスが封建制度下の主体から市民社会のそれへと委譲されるプロセスで、聖母性と娼婦性をともに纏わされた女性が帰依すべき世界を剥奪され、結果的に社会によって消費され、あるいは排除される様子を確認した。演劇史のキャノンの周辺的なテキスト群を精査する過程で、電子テキストのデータを利用する際の思いがけない方法論的落とし穴を発見することができたことは、併せて収穫であったと言えよう。1570年代から王政復古期までの演劇作品の渉猟はほぼ完了した。現在はこれらの文献を精読・分類しているところであるが、事前の予想に反して「聖母」「娼婦」ともに、テクスト内に明示的に表象されていることはきわめてまれである。見るべきは暗喩の横行であり、「聖」と「俗」両極端ともに、明確な言説化が回避されたことが窺い知れる。タブーを言説化し、規定することで制度の内へ取り込もうとするような、フーコー的な発想からは、かかる定義の空洞化は説明しにくい。明白な形で定位されざる二つの記号は、しかしながら、とりわけ都市喜劇群においてCharity vs.Chastityという経済のメタファに置き換えられるとき、同一の土壌で議論しうる比較対象たりうる手応えを得つつある。トマス・ミドルトンの芝居のいくつかでは、貞淑は欲望の対象・代価として流通し始めるや否や、その価値を暴落させる。また、トマス・ヘイウッドの『エドワードIV』では喜劇『靴屋の休日』にもみられる主題、すなわち貴族による市民の妻の誘惑のモティーフが、男性の誘惑の前にその「価値」を下落させない女性を描きうるものとして反復される。「動かない価値(貞淑)を私物化するために、一度だけ動かす」というロマンスの原理を際立たせるために、そこではあくまでも世俗のレヴェルにおいて、女性の価値は「聖母」と「娼婦」のステレオタイプのなかを横断するのである。ステレオタイプは生身の人間とは違う。だがそのステレオタイプに回収されることへの恐怖が、モラルとして人間を縛るのだ。Chastityを「立証」することはできない。にもかかわらずそれが“marketable"であるとは、いったいどういうことなのか。次年度はリサーチの範囲を当時の道徳律一般を論じた文献に拡大し、市場経済下における欲望の近代化について、踏み込んだ研究をする予定である。前年度に引き続き、近世英国演劇(王政復古まで)に頻出する、女性の表象に共存する聖母・娼婦の重層的な側面を、作品、作家、時代、劇場、劇団などをキーとして分類・整理した。演劇における聖と俗の対比は、娼婦というエロティシズムと貨幣経済に多重決定される身体を契機として、中世と近代を道徳的に峻別する手がかりとなりうるものであり、より具体的には、ロマンスの(あるいはローマ新喜劇の)もつ構造の破綻というかたちで顕在化する。聖母の価値はそれが性的誘惑の言説の外部にあることによって保証されるけれども、逆説的にその価値を下支えするのは、たとえどれほど巧みに母性の強調によって回避しようと試みても、不可避に表面化する性的対象としての女性性である。

聖母は性を媒介とする流通の枠の外にあることを装いつつ、ロマンスに潜む男性主体的言説、すなわち「動かないことによって保証される女性の価値(聖母性)を、男性が自らのものとするために、ただ一度だけ動かす」という獲得の原理を告発するが、他方、ほかならぬその聖母すら、娼婦との相対的な定位から逃れることができない。娼婦と聖母は、互いの存在に依拠することで(つまり相互決定的に)自らの意味付けを行わざるをえない。換言すれば、男性主体的言説空間においては、聖母は娼婦に、娼婦は聖母に接近・転換することをあらかじめ求められているのであり、その遅延を常に告発されることで、それぞれのアイデンティティを外部から構成されているようにみえる。こうしたステレオタイプが、現代にいたるまでどのように浸透しているかを調べることが、最終年度の目標となるだろう。「聖母」と「娼婦」の表象は、男性中心的言説にあって、女性を徹底的に称揚または排除するその修辞構造によって、女性に対し抑圧的に機能する。すなわち一見、女性の価値についての両極に別れたかに見えるこの二つの記号は、共同体にとっての価値の観点からは、中心化しつつ同時に周縁化することで、表裏一体となって互いの意味を支えあうように機能する。ここで注目すべきは、聖母が中心で娼婦が周縁にあるのではなく、両者はそれぞれ、男性の欲望の対象として中心的に言及されておきながら最終的に共同体の外部へと排除される点で、いわば正・負の方向性ながらも絶対値において等しく周縁化されているということである。英国演劇史におけるロマンスの展開は、その解釈史ともどもこの伝統のバイアスを受けており、修辞的構造のレヴェルでのキャノンの読み直しを経ることなしにこの問題を「外側」から考察することは困難を極める。具体的には、ジェイン・ショアの挿話の演劇史的変容を軸としてみることで、ロマンスが封建制度下の主体から市民社会のそれへと委譲されるプロセスで、聖母性と娼婦性をともに纏わされた女性が帰依すべき世界を剥奪され、結果的に社会によって消費され、あるいは排除される様子を確認した。演劇史のキャノンの周辺的なテキスト群を精査する過程で、電子テキストのデータを利用する際の思いがけない方法論的落とし穴を発見することができたことは、併せて収穫であったと言えよう。
腸管NK細胞の炎症性腸疾患への関与の解明及び細胞集団の移行性の検討

腸管NK細胞にはNKp44とNKp46の細胞表面分子により大きく二つの集団に分類され、正常腸管においてはこれらの細胞集団が均衡により腸管免疫の恒常性が保たれていることを示した。一方、クローン病においてはこれらの著しい不均衡が生じており、病態に関与している可能性を示した。また、腸管NK細胞の活性化には腸管マクロファージとの相互作用が重要であることを見出し、ここにかかわる因子としてIL-23とTL1Aの存在を見出した。これらの結果はNKp46+NK細胞がクローン病の病態に関与する可能性を示唆するものと考えられた。クローン病、潰瘍性大腸炎に代表される炎症性腸疾患は急増する原因不明の難治性自己免疫疾患であり、原因解明と疾患特異的な創薬は急務である。これまでに我々はクローン病の病態の中心に腸内細菌に対する腸管マクロファージの機能異常が存在することを証明し腸管NK細胞がクローン病において増加していることを報告した。これらの知見および、昨年からの検討結果を踏まえ本研究では2年間で腸管NK細胞の詳細な解析、正常腸管における腸管免疫の恒常性の維持、炎症性腸疾患病態への関与を証明し、細胞間接触に関わる因子の探索、シグナル伝達経路の解明、更に炎症惹起性及び免疫恒常性に関わる各腸管NK細胞分画の移行性の検証を行い、病態解明、治療法の開発を目指し、研究を行う。平成22年度においては腸管NK細胞の免疫恒常性の維持及び炎症性腸疾患との関与の解明、腸管NK細胞と腸管マクロファージとの相互作用にかかわる新規因子の探索を目標として研究を行っている。本年度の研究においては交付された研究資金をもとに、腸管照細胞にはNKp44とNKp46の細胞表面分子により大きく二つの集団に分類され、正常腸管においてはこれらの細胞集団が均衡により腸管免疫の恒常性が保たれていることを示す。一方、クローン病においてはこれらの著しい不均衡が生じていることを見出し、病態に関与している可能性を示す。また、腸管NK細胞の活性化には腸管マクロファージとの相互作用が重要であることを見出し、ここに関わる因子としてIL-23、TL1Aを検証する。今回の研究における発見はクローン病の病態に腸管局所におけるNK細胞の関与があることを解明するとともに、難治性疾患であるクローン病に対し腸管NK細胞やIL-23、TL1Aを標的とした新たな治療方法の開発につながる研究である。本研究内容は平成22年度の国際学会も含めた複数の学会において報告し、Gastroenterologyへ投稿する。平成22年度までに腸管NK細胞にはNKp44とNKp46の細胞表面分子により大きく二つの集団に分類され、正常腸管においてはこれらの細胞集団が均衡により腸管免疫の恒常性が保たれていることを示した。平成23年度においては平成22年度までに得られた研究の続きとしてNK細胞に対する刺激の下流シグナルの検証を行うとともにNKp44細胞とNKp46細胞間の移行性を検証するとともに腸管NK細胞の消化管がん発癌制御への関与の検討を目標として検証を行った。これまでの検討からNK細胞の下流シグナルを検証しているがいまだに有力な分子の特定には至っていない。派生する検討で胆汁酸の腸管免疫に対する関与について共著者として報告したことから腸管NK細胞への影響を検討中である。現在までのところ、vitroでの腸管NK細胞の培養は困難を極めており、条件設定を行っている。本検証により移行性の証明さらには発癌への影響を検証できた場合には疾患特異的な制御が可能となるものと考えられ、大きな意義を持つものと考えられる。
多周波数アドミタンス法による水分分布及びその変化の推定

1.人工透析による除水量の推定;人工透析中ヘマトクリット値が変動することによる血液導電率が変化する。組織アドミタンスの人工透析による変動は細胞内外液量の変動だけでなく、この血液導電率の変動にもよる。血液の導電率変動を考慮した結果除水量がかなりよい精度(誤差20%以下)で推定できた。この方法ではかなりの精度で細胞内外液量の変動が推定できるものと思われる。2.エコノミー症候群の基礎的研究;長時間座位を保つとうっ血による細胞外液量の増加による細胞内液量の変動がエコノミー症候群の何らかの要因になっていると考えられている。色々な体位での下肢アドミタンスの変動を測定した結果、座位での下肢アドミタンスの変動は下肢内血液量の変動と細胞の形状の変化によることが分かった。3.腹部脂肪量の推定;従来の電気インピーダンス法(市販されている脂肪測定装置)では腹部の脂肪量はまったく測定できないことが分かった。腹部のみのアドミタンスを測定する電極は位置が必要である。4.生体組織構造と電気アドミタンスの関係;低周波帯での組織アドミタンスではシャドウイフェクトの影響が大きい。特に、血液などのように、細胞密度の少ない組織ほど大きいことが分かった。骨格筋などではそれほど大きな影響はなさそうである。低周波でのアドミタンス値は細胞外液量に依存しているといえる。5.細胞形状と細胞アドミタンスの関係;細胞膜と細胞内液による時定数はひとつの細胞でもコール・コール分布をしていることが分かった。生体組織の時定数の分布がコール・コール・分布を取るのは細胞膜によると考えられる。したがって、全ての臓器の時定数分布がコール・コール分布を取り、アドミタンス軌跡半円とならず円弧の一部となる。1)アドミタンス装置の開発バンド幅1MkHzのアドミタンス測定装置の開発を行った。性能は以下の通りである。A)電流源は両極型定電流源(フローティングと同様の動作)で、周波数、振幅がコンピュータでコントロール。定電流源の誤差は1kΩまで100kHzで約0.01%以下。B)電圧検出部は増幅率可変型電圧増幅器で、5段階のコンピュータでゲインコントロール(40dBから60dBの間)。バンド幅は利得40dDで1MHz。C)入力部では、電極にバファーを取り付け、1MHzで入力インピーダンスIMΩ以上。D)CMRRは100kHzで約90dB。E)入力換算雑音は約1μV以下(バンド幅1Hz)。電圧検出器の検波回路で実効値を求める回路を用いた為、外乱の影響を受け測定値が非常に不安定となった。このため実験は失敗であった。来年度に改良する必要がある。検波では同期検波をするため、掛け算器を用いた検出回路にする必要がある。定電流源、検波回路以外の増幅部の特性はきわめて良好であった。2)測定セルの作成系統的に血液の物理特性を検討するため、光学特性と電気特性(2電極法)を同時測定できるガラス製セルの作成。赤血球の配向の状態、物理特性への影響を調べるため、セル内厚さ方向の赤血球数を10数個にするようにセルサイズを、チャネル厚さ150μm、幅20mm、長さ170mmとした。アドミタンス測定装置が不良のため、血液の光学特性の測定(光源はキセノンランプ)を単独で実行。前方散乱、後方散乱とも流れの影響を受け、特にshearの増加と共に散乱の角度分布はミイの散乱に近づくことが分かった。使用した光の波長は660nmで酸化ヘモグロビンでは流れによる前方散乱強度は数%以下の減少。

還元ヘモグロビンによる光吸収の影響が大きく赤血球の配向により前方散乱強度が20%程度減少した。来年度は後方散乱強度の測定精度向上が必要である。1,電気回路の設計回路設計(前年度は設計失敗)の修正を行った。新設計による試作回路は今までになく安定(周波数帯域1kHz200kHz)したものであった。試作回路を元にプリント基板の作成完了。入手困難な部品があったため現在回路組立中。今後の問題は生体との接続である。測定誤差、安全性を考慮した入力部の接続による回路全体の安定性の問題を解決する必要がある。周波数200kHzで位相測定精度を0.5°以下にするため、入力部の回路作成が非常に困難である。2,エコノミー症候群の研究立位の状態より座位または横臥になった時点からの下肢ふくらはぎ部でのアドミタンスの周波数特性変化を測定し、下肢部での血液量、体水分布の変化を推定した。推定は前年度考案した組織内血液量の変化を考慮した新アルゴリズム(報告書参照)を使用した。座位、横臥位の状態中3カ所でふくらはぎ部の周囲の時間変化を計測し、下肢体積変化を算出した。アドミタンス法による血液変化量と下肢体積変化との相関を調べた。次に測定結果の一部を示す。(1)座位での下肢推定血液量の時間変化は個人差が非常にある。(2)一般に血液量変化は、座位になってから約10分間急激な増加を示し、徐々に一定値に到達する傾向(指数関数的変化)を示した。3)特筆すべき点は、全ての被験者において座位でうっ血状態と同時に、細胞内液量の僅かな減少が見られたことである。(4)横臥位では約30分から1時間の間、下肢細胞間液量の持続的減少が存在した。血液量は横臥位になった時点(約10分間)で急激な減少が見られたが、その後ほとんど変化が見られなかった。以上の結果、エコノミー症候群の研究に役立つ貴重なデータが得られた。来年度、細胞内液量変化が実際に起こっているのか、また、この変化がエコノミー症候群の一原因であるかを詳細に検討したい。1.エコノミー症候群の研究前年度の研究結果、座位での下肢部細胞内液量の減少が見られた。この結果を検証するため、本年度は自律神経系の関与の検討も含め、座位、横臥位、横臥位(下肢を10cmおよび45°上げた状態)での細胞内外液量の変動を推定した。1分間隔でのアドミタンス測定中に上腕での血圧測定を5分間隔で測定した。被験者は20歳男子で、やせ型、標準型、肥満型(長身及び標準)を含め4名でである。測定は春夏秋冬各2回づつ行った。以下に結果を示す。a.座位では昨年同様、細胞内液量の減少と細胞外液量の増加が見られた。この傾向は肥満型と長身型で顕著であった。この傾向に季節変動は見られなかった。b.横臥での自律神経系の関与が示唆されたが、あまり顕著には現れなかった。この原因は血圧測定によるものと思われるため、次年度は心電図も併用測定する必要がある。c.下肢を10cm及び45°持ち上げた状態での細胞内液は増加の傾向が見られた。細胞外液量の変動はあまり見られなかった。以上の結果は、従来生理学的に考えられている変化と異なっている。さらなる詳細な検討が必要である。
細胞老化関連遺伝子の探索とその解析

チミジン類似体のブロモデオキシウリジンは、正常細胞および不死化細胞の両者において速やかに、かつ同調的に細胞老化を誘導する。細胞老化関連遺伝子のカタログ化、各遺伝子の細胞老化における役割および遺伝子の共通の発現調節機構の解明を目的として、ブロモデオキシウリジンで発現が上昇する遺伝子をサブトラクション-ディファレンシャルハイブリダイゼーション法により分離し、さらにその中で正常細胞の老化過程で発現が上昇するものの選択を行い、老化関連遺伝子の収集を行っている。昨年度は、HeLa細胞のブロモデオキシウリジン処理で誘導される42種類の遺伝子を分離し、約2/3は正常細胞の老化で誘導されること報告した。そこで本年度は、規模を10倍に上げてスクリーニングを行った。まず、ブロモデオキシウリジン処理で発現が上昇する遺伝子を濃縮したライブラリーより、任意の12,000クローンについてディファレンシャルハイブリダイゼーション解析を行い、約900クローンに候補を絞った。次いで、各クローンの挿入断片をPCR増幅し、ナイロン膜上にスポットしてcDNAマクロアレイを作製し、Rl標識一本鎖cDNAを用いて発現量を調べた。4日間のブロモデオキシウリジン処理により2倍以上発現が上昇した約500クローンについて塩基配列を決定し、BLAST解析を行った。その結果、316種類のブロモデオキシウリジン誘導遺伝子を新たに同定した。予備的実験の段階では、うち219種類が正常細胞の老化で誘導された。今後、収集した遺伝子よりcDNAマクロアレイを新たに作製し、不死化細胞のブロモデオキシウリジン処理、および正常細胞の老化による発現量の変化の半定量的解析を行い、論文にまとめる予定である。またこのアレイを用いて、活性酸素、その他のストレスによる細胞老化での発現変化も調べ、ストレスによる老化と複製老化との違いについて、また老化診断への応用の可能性も調べたい。細胞老化関連遺伝子のカタログ化、各遺伝子の細胞老化における役割および遺伝子の共通の発現調節機構の解明を目的として、ブロモデオキシウリジンで発現が上昇する遺伝子をサブトラクションーディファレンシャルハイブリダイゼーション法により分離し、さらにその中で正常細胞の老化過程で発現が上昇するものの選択を行い、老化関連遺伝子の収集を行っている。これまでに800クローンのスクリーニングを行い、HeLa細胞においてブロモデオキシウリジンで誘導される42種類のcDNAクローンを回収した。その内訳は、1)既に細胞老化マーカーとして見いだされている遺伝子が6種類、2)これまでに老化との関連が報告されていない既知遺伝子が20種類、3)新規を含むEST配列が16種類であった。また、これらの遺伝子の約2/3はヒト正常線維芽細胞の老化で発現が上昇していたことから、本手法が老化関連遺伝子の収集に適していることが分かった(詳細は、発表論文を参照)。現在、規模を10倍に上げてスクリーニングを行っているが、作業の効率化が課題となっており、遺伝子アレイ利用した発現の定量化を含め、種々の検討中を行っている。発現が減少する遺伝子の大規模スクリーニングについても計画したが、本年度はまだ着手にまで至っていない。また、上記2)に属する遺伝子の機能と細胞老化への役割を調べるために、いくつかの遺伝子について全長cDNAのクローニングを行い、不死化細胞および正常線維芽細胞への遺伝子導入を行っているが、まだ結果は出ていない。
クーロメトリック検出高速液体クロマトグラフィーによる生理活性物質の高感度分析

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用電気化学検出器(ECD)は、電極表面で酸化または環元をうける化合物を高感度かつ高選択的に検出することから、体液中超微量物質の分析に汎用されている。本研究はECDのなかでも、ごく最近開発されたクーロメトリック検出器に着目したもので、優れた電気化学活性基(electrophore)のラベル化などにより従来測定が困難であった体液中超微量物質の分析法を確立すると共に、臨床診断、病態解析に信頼度の高い方法論を提供することを目的とするものである。さきにHPLC/ECDの適用範囲拡大を目的として、易酸化性で酸化環元の可逆性に優れるフェロセンをelectrophoreとするアルコール、グルクロニド用プレラベル化剤の開発を行い、良好な結果を得た。そこでフェロセンをelectrophoreとし、脂肪酸には活性ハロゲン、チオールにはマレイミドを反応活性基とするプレラベル化剤を調製し諸性質に検討を加えた。その結果、前者には3ーbromoacetyl-1′+dimethylferrocene、後者にはN-(ferracenyl)maleimideが最も優れた結果を与えた。ついで、N-(ferroceny)maleimideを生体内グルタチオンの定量へ応用したところ、クーロメトリック検出器は従来のECDに比しより高感度、高選択的な応答を示し極めて有用なことが明らかとなった。さらに、HPLC/ECDによる光学異性体分離用試薬として初めて、R-(-)-1-ferrocenylethylamineを開発し、抗炎症薬であるibuprofenの分離定量へ応用した。誘導体化は緩和な条件下定量的に進行すると共に、異性化等もみられなかった。また、逆相系モードにも抱らずR、S体の分離が20分以内で完了した。(±)-Ibuprofenを健常人に経口投与し、血中濃度測定を応用したところ、良好な結果が得られ、本試薬の有用性が確認された。以上のようにHPLC/ECDは生体成分の分析に有用であるが、特にクーロメトリック検出器は感度、選択的に優れるものであった。本研究は,細菌開発されたポーラスグラファイトを電極とする検出システムの卓越した特性を活かし,優れたelectrophareのラベル化により従来測定が困難であった体液中超微量成分の高感度,高選択的分析法を確立すると共に臨床診断,病態解析に信頼度の高い方法論を提供することを目的として行なわれた.まずredox性に優れるフェロセンおよびその誘導体を電気化学活性基,マレイミドをreacting groupとして3種類のチオール化合物用プレラベル化剤を合成した.ついで,それらの反応性,電気化学的性質をN-acetyl-L-cysteineをモデル化合物として検討したところ, N-(ferrocenyl)maleimideが最も優れていることが明らかとなった.すなわち,本試薬は氷冷下10分で定量的かつ安定な付加体を与えるうえ,高い電気化学的応答性(検出限界0.06pmol)と他の電気化学活性物質の妨害を受けない高い選択性を示した.本試薬を用いて,ヒト血中グルタチオン,ラット肝中グルタチオンの定量を行いEllman法と比較したところ良い相関を示し分析法の信頼性が確認された.現在,同様の観点から,カルボン酸用プレラベル化剤を開発し,ヒト血清中脂肪酸の分析へ応用している.さらに,アミンの分析用試薬,光学活性薬物の分析用

試薬を開発中であるが,いずれも良好な結果を得つつあり,今後の発展が期待される.特に,光学分割用試薬で電気化学検出器に応答を示すものは少なく,画期的試薬になるものと思われる.本研究は、卓越した分析システムである高速液体クロマトグラフィー用電気化学検出器(HPLC/ECD)のなかでも、最近開発されより高感度、高選択性を示すクーロメトリック検出器に着目し行われたものである。すなわち、優れたelectrophareのラベル化により従来測定が困難であった体液中超微量成分の高感度、高選択的分析法を確立すると共に、臨床診断病態解析に信頼度の高い方法論を提供することを目的としている。先に易酸化性で、酸化還元の可逆性に優れるフェロセンをelectrophoreとし、チオール化合物にはマレイミド、脂肪酸には活性ハロゲンを反応活性基とするプレラベル化剤を開発し、その諸性質に検討を加えた。その結果、チオール化合物にはN-(ferrocenyl)mdleinde、脂肪酸には3-bromo-acefyl-1、1'-dimethylferroceneが反応性、電気化学的性質共優れていることが判明した。さらとにこれらを各々生体内グルタチオン、脂肪酸の分析へ応用し、いずれも良好な結果を得た。この際クーロメトリック検出器は特に優れた応答性(検出限界0.06pmol)を示し、有用であった。一方、光学異性薬物の生体内挙動を的確に把握することは、薬物の有効性、安全性を確保するうえで極めて重要であり、種々のプレラベル化剤の開発が行われている。しかし、光学異性体分離用試薬でECDに応答するものは未だ開発されておらず、HPLC/ECDの有用性が活かされていない。こそでR-(-)-1-ferrocenylethylamineを開発し、抗炎症薬であるibuprofenの分離定量へ応用した。誘導体化は緩和な条件下定量的に進行すると共に、異性化等もみられなかった。さらに、逆相系モードにも抱らずR、S体の分離が20分以内に完了した。そこで(±)-ibuprofenを健常人に経口投与し、血中濃度測定へ応用したところ、光学異性体の体内動態に差のみられることが明らかとなった。以上のように本試薬は、HPLC/ECDの有用性を活かすものとして極めて有用である。
手話調動自動生成機能をもつインタラクティブ電子化辞書システムの構築に関する研究

本研究の目的は、手話としての統語構造を満足し口形付き3次元アニメーションの自動生成が可能でネットワークアクセスも可能とするマルチメディア対応電子化辞書システムを構築することである。本研究では、対話コーパス部、言語解析部、アニメーション生成部および電子化辞書部と各機能別に検討を行った。その結果、下記の主な成果を得た。1.対話コーパス部では、自然な手話対話の収集法について検討を行い、日本語の影響の少ない資料収集方式を提案した。提案した資料収集方式により994単語、約3,800対話例文コーパスの収集を行った。更に、収集コーパスを有益な資料とするための電子的なタグ付けを支援する対話映像解析支援システムの構築を行った。2.言語解析部では、対話映像支援システムを用いた対話例文コーパスの解析から、手話の弁別特徴や形態素記述方式の検討し、文レベルのNVGS形態素記述モデルの提案を行った。3.アニメーション生成部では、語構造記述にNVGS形態素モデル、非手指信号記述にはsIGNDEXを用いた調動の生成方式を提案した。アニメーションの読み取り精度を向上させるため、15基本口形の生成も可能とした。4.電子化辞書部では、総語彙1,142単語より構成される手話単語データベースKOSIGN Ver.2とその例文の検索、口形付きアニメーション生成などの機能をもつインタラクティブな電子化辞書の構築を行った。以上のように、本研究目的および実施計画はほぼ達成された。また、これら成果のうち、口形付きアニメーション自動生成に関しては、HIS2000で発表した"読話アニメーションシステムの構築"において2001年3月2日付けでヒューマンインタフェース学会学術奨励賞を受賞した。また、研究成果は電子情報通信学会誌、ヒューマンインタフェース学会論文誌、国際会繕において発表してある。本研究の成果から、手話の詳細な言語分析や情報処理機器とのマルチモーダルインタフェースの要素技術獲得に向け、研究を継続・発展させる重要性を感じた。本研究の成果をうけ、手話の対話解析を通し認知科学的側面からの解析作業を続行している。我々の所属するグループでは手話を工学的および言語学的な側面から手話を解析することを目指した手話工学、手話認知科学の立場で研究を行っている。本年度は、インタラクティブな手話電子化辞書システムの構築のため、手話を言語学的に解析・記述するために、以下の項目について検討を行った。1.効率的な映像解析のため、手話映像解析支援システムの構築を行った。その結果、ビデオ映像を見ながら用紙に記入することなく、本科研費により購入した液晶プロジェクタを用いて計算機のビデオ出力を投影しながら、Windows環境下で実時間でAVI形式映像データを対話形式により解析することが可能となり、大幅に効率が向上した。2.購入した液晶プロジェクタを用いて等身大に拡大された手話アニメーションとネイティブスピーカとの擬似的な対話データベースの録画収集を関東地区と九州地区で行った。これらのデータは、手話の意味ある動作と遷移動作とに切り分けるためのセグメント処理を行うための基礎的データベースとなる。3.手話基本例文の作成および映像録画をネイティブスピーカの協力により200例文作成を行った。これらの例文から約1,000語彙より構成されるKosign Ver.2用の例文作成のめどを立てた。4.手話アニメーションでは、非手指動作の読み取り補助のため、モデル変形手法を導入し、読話基本16口形の生成を行った。読話口形導入により、アニメーション動作による同型異義語の読み取り補助の可能性が期待できる。

5.手話単語ラベルsIGNDEXの文レベル対応記述方式の検討を分担者と共に3回の合宿により基本案を作成し、テスト記述用の100例文の撮影を行った。その結果、記述規則のゆれなをを調べるため、1.で作成した解析支援システムを用いることにより10例文の解析を行い、次年度以降引き続き100例文の記述を試みることにした。我々の所属するグループでは手話を工学的および言語学的な側面から解析することを目指した手話情報工学、手話認知科学の立場で研究を行っている。本年度は、前年度に引き続きインタラクティブな手話電子化辞書システムの構築のため、手話を言語学的に解析・記述するために、以下の項目について検討を行った。1.前年度作成した手話映像解析支援システムを同期して複数人の対話解析を行えるように拡張した手話対話映像解析支援システムを構築した。その結果、二人の対話映像へ適用することにより手話認識に必要なセグメンテーションに有効な要素の抽出を行い良好な結果を得た。この抽出要素を基に、共同研究機関で画像からの手話認識に応用している。2.昨年度録画収集した手話アニメーションとネイティブスピーカとの擬似的な対話データベースの解析を対話映像解析支援システムにより行い、約半分ほどの解析を行った。その結果、提案するアニメーション制御による認識システムの可能性が示唆された。このデータは対話権譲渡などの解析にも使用する予定である。3.昨年度のネイティブスピーカの協力により検討したKosign Ver.2用の例文作成の方針を基に、手話コーパスの作成方法の検討を行い、約450単語の語彙に対して約1,800対話の収録を行った。収録データの基礎的な解析から対話における使用単語の頻度分析を行い形態素辞書の構築のめどを立てた。4.昨年度製作した読話用口形アニメーションにより読み取り評価実験を行い、良好な結果を得た。また、手話アニメーションの非手指信号の記述にsIGNDEX V.2を形態記述にはNVG形態モデルを用いることを提案し、読み取り向上の可能性が期待できる。5.前年度に引き続き、手話単語ラベルsIGNDEXの文レベル対応記述方法の検討を分担者と共に5回の合宿により、テスト記述用の100例文の記述をネイティブスピーカの協力のもとに行った。現在は記述データの記述ゆらぎや統計解析中である。なお、記述用ツールは分担者の作成したものを使用した。以上のように、本年度研究目的及び実施計画はほぼ達成された。本研究の目的は、手話としての統語構造を満足し口形付き3次元アニメーションの自動生成が可能でネットワークアクセスも可能とするマルチメディア対応電子化辞書システムを構築することである。
視交差上核を介する内因性神経活性物質による代謝制御機構

[研究目的]糖およびその誘導体が視床下部視交差上核(SCN)に作用して、明暗依存性に高血糖を誘発すること、摂食行動の概日リズムに対する効果から判断して、血糖変動作用を有する活性物質の作用部位が識別可能であること等の我々の実験成績を踏えて、腦内に存在する神経活性ペプチドのエネルギー代謝調節機構とその作用部位を解析することを主目的として本研究をおこなった。[実験結果]以下の実験は明暗の効果を比較するため12時間明-12時間暗の照明条件下でおこなった。1.インシュリン腦内注入の効果、インシュリンをSCNる投与すると、明期には血糖低下、暗期には増加作用を示した。また、血糖値の変動と一致して肝グリコーゲン代謝酵素の活性を速かに変動させること、これらの諸変動はSCNの破壊によって完全に消失することを見出した。2.腦内に存在する神経活性物質の注入による効果、上記のインシェリンを外続的に腦内に注入すると、明期の摂食量を増加させ、暗期の摂食量を減少させることによって摂食行動の概日リズムを破綻せしめるので、glutaryl CCK-8;pyroglutaryl CCK-8などのコレシストキニン誘導体、インシュリン成長因子【I】【II】カルシトニン、CGRP(Calcitonin-gene related peptide)を同様の方法で腦内に注入し、その効果を観察した。インシュリンとは異りこれらは暗期の摂食量のみを低下させることが判明した。3.CCK-8の作用部位の檢索。背側脚傍核、橋から視床下部腹内側核(VMH)へ投射するCCK含有ニューロンの破壊が肥満を誘発することを見出した。この実験結果はCCK-8がSCNよりVMHに作用していることを示す、他の活性ペプチドについても同様の実験結果を保つつある。但し、CCK-8誘導体カルシトニンの腦内投与は血糖に有意な変化を誘導しないことも確認している。以上の実験結果はインシュリンのみがSCNに作用していることを示しているので、その代謝調節機構の解析をす、めている。
中性子ラーモア回転による磁気結晶の動力学回折位相・回折時間

我々は、中性子固有スピンおよび固有エネルギー状態の重ね合わせ状態の原理による中性子スピン干渉計として、中性子スピンエコー干渉計および磁気共鳴を利用した時間エコー干渉計を実現た。スピンエコー干渉計を用いてし、磁気膜トンネル位相、磁気ファブリペロー膜共鳴トンネル束縛位相、磁気多層膜回折位相、ヘリカル磁気回折位相、磁気結晶回折位相の測定に世界で最初に成功した。この結果は、Phys.Rev等に報告した。しかしながら、"トンネル時間"や"回折時間"の概念は量子力学でもまだ定義すら確立していない。しかしながら、実験の立場では、実時間でこれらの時間を測定することは可能である。従来の中性子飛行時間法では、中性子波の時間分割に限界があり、当科研費は、主として時間エコー干渉計の制作に使用された。この時間干渉計では、共鳴スピンフリッパー間に磁気ポテンシャルを挿入すると、中性子固有スピン間で磁気ポテンシャルの相違による位相差を感じるが、アナライザーの下流側に磁気ポテンシャルを挿入すると、この領域では、up中性子の2エネルギー状態による時間ビートが存在し、両固有状態とも同じ磁気ポテンシャルを感じるので、時間ビートは、変化しない。しかし、中性子の飛行時間遅れが存在するときは、時間ビートの位相は、変化する。したがって、我々が従来観測してきた中性子ラーモア回転による磁気膜や磁気結晶透過動力学回折位相を時間ビートによる時間遅れと比較して、議論出来る実験手法を確立する事が出来た。この結果は、ASR2000国際会議およびその他に報告した。我々は、ラーモア中性子を磁気単層膜、磁気ファブリペロー膜、磁気多層膜などに入射させ、透過中性子のスピン回転により↑↓スピン中性子波動関数の位相差の測定に世界で最初に成功してきた。これらのスピン回転は、入射中性子波数ベクトルの磁気膜に垂直方向成分にたいする1次元井戸型ポテンシャルのSchreodinger解で与えられる↑↓スピン中性子波動関数の位相差で良くシミュレート出来ることを我々は示した。一方ヘリカル磁気単結晶ホロミウムの(000)^±磁気サテライト条件でのラーモア中性子の透過中性子前方回折波を観測し、ω結晶角回転と中性子スピン回転を測定し、スピン回転位相がブラッグ反射強度に比例する関係を得た。この時↑↓スピン中性子の片方が偶数回の磁気ブラッグ多重反射を受け前方に回折する。他のスピン中性子はそのまま透過し、観測されたスピン回転は、片方のスピン中性子の多重回折による余分の中性子位相であると考えられる。このとき、単結晶はモザイク結晶であるが、動力学回折効果が観測されていると言える。しかも、モザイク結晶透過波のうち多重回折をうけずに透過したスピン中性子と平行な他のスピン中性子成分のみが、ラーモア回転に寄与し得る。また、このスピン回転は、結晶の厚みと片方の中性子スピンが感じるヘリカル磁束ポテンシャルエネルギーのqフーリエ成分に比例する。今年度新たに、強磁性単結晶パーマロイを磁気飽和させ、結晶面に垂直に入射させたラーモア中性子の(200)反射が90度となる条件で、多重反射が結晶面内で最大になる条件で、透過中性子のスピン回転を調べた。その結果ヘリカル磁気結晶の場合と同じく、ブラッグ反射強度に比例するスピン回転を観測した。この実験は、JRR3M原子炉PONTA-G5中性子スピンエコー装置を用いて行い強磁性体結晶内部では、磁束密度による中性子ラーモア回転が生じるので、中性子スピンエコー装置内に類似の同じ軸を立てた2枚の結晶を中性子スピンπフリッパーの前後に挿入して、動力学に関係のない中性子スピン回転をうち消した。

一方ヘリカル磁気単結晶ホロミウムの(000)^±磁気サテライト条件でのラーモア中性子の透過中性子前方回折波を観測し、ω結晶角回転と中性子スピン回転を測定し、スピン回転位相がブラッグ反射強度に比例する関係を得た。単結晶はモザイク結晶であるが、動力学回折効果が観測されていると言える。しかも、モザイク結晶透過波のうち多重回折をうけずに透過したスピン中性子と平行な他のスピン中性子成分のみが、ラーモア回転に寄与し得る。また、このスピン回転は、結晶の厚みと片方の中性子スピンが感じるヘリカル磁束ポテンシャルエネルギーのqフーリエ成分に比例する。強磁性単結晶パーマロイを磁気飽和させ、結晶面に垂直に入射させたラーモア中性子の(200)反射が90度となる条件で、多重反射が結晶面内で最大になる条件で、透過中性子のスピン回転を調べた。その結果ヘリカル磁気結晶の場合と同じく、ブラッグ反射強度に比例するスピン回転を観測した。今年度は、量子ビートスピン干渉系を完成させ、中性子時間エコーを観測した。ラーモア中性子による磁気人工格子膜の方が動力学回折効果が完全結晶に近いので、多重連結磁気ファブリペロー膜について、トンネル位相の連結井戸数にたいする加算性を実証した(Phys.Rev.61(2000)013607-1-8)。位相と時間の関係は、時間位相干渉計を用いて、時間ビートによる多重散乱の時間遅れを観測できる可能性がある。我々は、中性子固有エネルギー状態の重ね合わせ状態の原理による中性子時間ビート干渉計を磁気共鳴中性子スピンフリッパーを用いて実現し、時間ビートを観測した。この時間干渉計では、共鳴スピンフリッパー間に磁気ポテンシャルを挿入すると、中性子固有スピン間で磁気ポテンシャルの相違による位相差を感じるが、アナライザーの下流側に磁気ポテンシャルを挿入すると、この領域では、up中性子の2エネルギー状態による時間ビートが存在し、両固有状態とも同じ磁気ポテンシャルを感じるので、時間ビートは、変化しない。しかし、中性子の飛行時間遅れが存在するときは、時間ビートの位相は、変化する。したがって、我々が従来観測してきた中性子ラーモア回転による磁気膜や磁気結晶透過動力学回折位相を時間ビートによる時間遅れと比較して、議論出来る実験手法を確立する事が出来た。この結果は、ASR2000国際会議に報告した。
がん細胞およびその遺伝子異常を検出するイメージング分子の開発

前年度までに、DNA分子内に存在する5-メチルシトシン(mC)塩基のナフトキノン(NQ)増感光-電子酸化を経るDNA鎖の部位選択的切断反応をモニターすることによりmC変異部位を簡便に検出できることを明らかにした。また、より高感度なDNAメチル化検出系へと展開、拡張することを目的として、p53がん抑制遺伝子の部分塩基配列をmC部位で切断調製した実存DNAを標的とするNQ増感光酸化反応を調べるとともに、インベーダー法を改変することにより、メチル化遺伝子の高感度検出システムを構築した。また、改変インベーダー法によるシグナル増幅の結果、サブフェムトモルの微量メチル化DNAを蛍光法により検出し得ることを明らかにした。今年度は、DNA内mC塩基の光電気化学的検出法の開発を目的として、DNA分子内ホール移動を誘起する光酸化機能部位としてアントラキノン(AQ)を選択し、AQ修飾ウリジンならびに3'末端にチオール基を導入した機能性核酸プローブ(AQ-Probe)を合成した。金電極上に固定化したAQ-Probeと制限酵素認識部位にシトシンまたはmCを含む標的DNAを二重鎖形成させ、メチル化感受性制限酵素処理の前後における光電流を直接計測した。その結果、非メチル化二重鎖はメチル化感受性制限酵素の作用によってDNA鎖が切断し、光電流密度が減少することを観測した。他方、メチル化二重鎖の揚合は、DNA鎖切断が起こらず、DNA分子内ホール移動反応に起因する高い光電流応答を保持した。また、p53がん抑制遺伝子の部分配列を検出対象として、酵素処理後の光電流を計測した結果、メチル化二重鎖からは高い光電流密度を観測し得たことから、金電極固定化DNA二重鎖内のホール移動反応特性とメチル化感受性制限酵素処理を併用することにより、標的となるメチル化DNAを光電気化学的手法により検出可能であることを明らかにした。本研究では、がん細胞に特異的な遺伝子配列中におけるメチル化シトシン変異塩基を簡便に検出する手法の開発を目指して、ナフトキノン誘導体を導入した人工核酸の光化学反応特性を応用し、DNA内5-メチルシトシン変異塩基の簡便かつ位置特異的な検出法の構築を行った。一般に、遺伝子中のメチル化シトシンはグアニン-シトシンペアが豊富に存在する配列に形成され易いためグアニンが多数存在する配列においても明暸に検出する必要がある。今年度、様々な遺伝子配列に対応可能な検出系の構築を目指して、DNAオリゴマーの鎖内中央部にナフトキノン誘導体を共有結合で結んだ光機能性核酸を設計・合成し、がん抑制遺伝子配列内5-メチルシトシンの光酸化反応を検討した。合成した人工核酸と5-メチルシトシン塩基を同一鎖内に2つ含むDNA二重鎖の光反応を調べたところ、ナフトキノン部に近接したメチルシトシン部位においてのみDNA切断が確認された。一方で、対応するシトシン残基ならびに近接したグアニン残基でのDNA切断は観測されなかった。これらのことは、光励起されたナフトキノン誘導体と近接した5-メチルシトシンのみが酸化体へ変換され、位置特異的なDNA切断が起こったことを示している。これらの結果からナフトキノン部の光酸化作用による5-メチルシトシン部位でのDNA切断を応用すれば、遺伝子配列内のメチル化シトシン変異部位を簡便かつ位置特異的に検出し得ることが示された。今回、メチル化シトシン部位選択的なDNA切断が進行し対応するDNA断片が生成することが明らかになった。今後、本検出系を蛍光シグナル応答による検出系ならびに高感度5-メチルシトシン変異塩基の検出系へと展開するため、既存の遺伝子増幅手法であるPCR法やInvader法、またはデオキシリボザイム等を利用して5-メチルシトシン部位におけるDNA断片の増幅反応を評価する予定である。前年度までに、ナフトキノン誘導体を導入した光機能性核酸および標的となるメチル化DNAとの二重鎖に対して光反応を調べた結果、DNA内の5-メチルシトシン(mC)が一電子酸化されたのち、mC部位においてDNA鎖切断が選択的に起こることを見いだしている。一方、シトシンの場合には酸化的切断が生じないため、DNA鎖の切断をモニターすることによりmC変異部位を簡便に検出できることを明らかにした。今年度は、さらに、より簡便かつ高感度検出系への展開、拡張を目指して、上述のmC部位特異的なDNA鎖切断を蛍光発光によるmC検出システムへと応用した。一般的に、微量の遺伝子を検出するためのPCR法による遺伝子増幅反応を5-mCに適用できないため、別法による高感度検出が求められる。そこで、PCR非依存的な遺伝子解析手法であるインベーダー法を改変し、上述の光反応を組み合わせた新しい高感度mC検出系を設計した。上述の光反応によってターゲットDNA(p53がん抑制遺伝子;exon 8部分配列)をmC部位で切断した後、インベーダー法のFRETプローブを加え、Flap endonuclease(FEN)にて処理した。その結果、FRETプローブの酵素による切断が進行し、非常に強い蛍光発光が観測された。一方、同様の反応を非メチル化DNAに対して行ったところ、発光はほとんど観測されなかった。これらの結果は、メチル化DNAの光反応によって形成されるDNA断片とFRETプローブのハイブリッドのみが、FENの基質として機能したことを示している。以上のことから、本システムを利用することによって、DNAメチル化を蛍光発光により検出しうることを実証できた。