hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん予防をめざした幹細胞がん化の分子機構の解明とバイオマーカーの開発

ビルハルツ住血吸虫感染患者の膀胱癌では幹細胞/前駆細胞マーカーOct-4/3が発現し、変異誘発性DNA損傷塩基8-ニトログアニンの局在と一致した。食道がんの前がん病変バレット食道炎では、8-ニトログアニンと幹細胞マーカーGlypican-3が確認された。変異誘発生DNA損傷塩基と幹細胞マーカーの局在が一致する細胞が、前がん病変およびがん病変で確認できたことは、炎症関連発がんにおけるがん幹細胞の重要性を示している。感染・炎症は極めて重要な発がん要因であるが、共通の包括的な分子機構は未だ明らかではない。がんの発生および進展に至る過程を解明する上で、幹細胞/前駆細胞に蓄積したDNA損傷の解明は極めて重要である。8-ニトログアニンは、一酸化窒素(NO)などの活性酸素・窒素種により生じる変異誘発性DNA損傷塩基で、炎症関連の発がんや予後を評価する有効なDNA損傷マーカーのひとつになりうることを提唱してきた。本課題では、幹細胞/前駆細胞に蓄積したDNA損傷およびがん関連タンパク質の誘導や損傷を解析し、幹細胞がん化の機構を解明する。インフォームドコンセントの得られた患者の生検組織標本および手術標本を作製し、免疫染色法により損傷DNA塩基の局在を解析した。さらに、各種細胞マーカーなどを用いて幹細胞/前駆細胞の局在を解析し、損傷DNA塩基の局在と比較することにより、がん幹細胞の局在を解析した。その結果、ビルハルツ住血吸虫感染による膀胱炎患者およびがん患者では、炎症性標本の上皮とがん標本のがん細胞に8-ニトログアニンおよび8-オキソグアニンの生成・蓄積、誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現を確認し、このうち一部の細胞では幹細胞マーカーOct-4/3陽性であった。逆流性食道炎などによる食道がんの前がん病変と考えられている「バレット食道」の腸上皮化生には、8-ニトログアニンと幹細胞マーカーGlypican-3の染色陽性が確認された。紫外線による皮膚がんでは、8-ニトログアニンとCD68の発現が確認された。以上のように、変異誘発生のDNA損傷塩基と幹細胞マーカーの局在が一致する細胞が、前がん病変およびがん病変で確認できたことは、炎症関連発がんにおいてがん幹細胞説が重要であることを示しており、非常に興味深い成果である。ビルハルツ住血吸虫は膀胱癌を起こす原因となることが知られている。昨年度までの成果として、ビルハルツ住血吸虫感染による膀胱炎患者と膀胱癌患者の組織標本では、変異誘発生のDNA損傷塩基と幹細胞マーカーの局在が一致する細胞が、前がん病変およびがん病変で確認できている。今年度はその成果をふまえて、さらに検体を増やして詳細に解析した。その結果、変異誘発性DNA損傷塩基の8-ニトログアニンと8-oxodGの生成は、正常組織に比べて膀胱癌組織で有意に高いことが明らかとなった。さらに、ビルハルツ住血吸虫感染による膀胱癌と非感染者の膀胱癌を比較したところ、感染患者の膀胱癌組織ではOct-4/3が発現し、非感染患者の膀胱癌組織ではCD44v6が発現していた。Oct-4/3およびCD44v6は幹細胞/前駆細胞マーカーであり、それぞれの発現は8-ニトログアニンの局在と一致していた。これは、幹細胞がん化の機構を解明するうえで、非常に興味深い。また感染以外の要因による発がんとして、アスベスト暴露マウスを用いて解析を行った。アスベスト暴露は、肺癌・中皮腫を起こすことが知られているが、発がん機構の解明は不十分である。アスベストは種類によって発がん性の強さが異なり、本研究では免疫組織染色の結果から、発がん性の強い種類であるほど、暴露マウスの肺組織で8-ニトログアニンの生成・蓄積量が多いことを確認しており、各種幹細胞マーカーを用いた解析を進めているところである。ビルハルツ住血吸虫感染患者の膀胱癌組織では、変異誘発性DNA損傷塩基の8-ニトログアニンと8-oxodGの生成は、正常組織に比べて有意に高いことが明らかとなった。さらに、ビルハルツ住血吸虫感染による膀胱癌と非感染者の膀胱癌を比較したところ、感染患者の膀胱癌組織では幹細胞/前駆細胞マーカーOct-4/3が発現し、8-ニトログアニンの局在と一致していた。感染以外では、紫外線は皮膚癌のリスク要因となる。

光エネルギーによる直接的DNA損傷や光増感物質による間接的な酸化的DNA損傷の関与が考えられているが、紫外線による皮膚炎症の関与も考えられる。紫外線誘発皮膚癌のモデルマウスを用いて検討した結果、UVB照射マウスの皮膚組織、特に表皮基底の核で、8-ニトログアニンが観察された。これは、幹細胞がん化の機構を解明するうえで、非常に興味深い。近年利用が増えているナノ素材の吸入は、肺に慢性炎症を起こして発がんに関与する恐れがある。ナノ素材の一つ多層カーボンナノチューブ(MWCNT)は、実験動物に中皮腫を引き起こす。ヒト肺上皮由来の培養細胞にMWCTNを曝露して解析した結果、MWCNTはカベオラおよびクラスリンのエンドサイトーシスの機構により細胞内へ取り込まれ、iNOSを発現させ、一酸化窒素(NO)生成によりニトロ化DNA損傷を引き起こして発がんに関与する可能性が示された。以上から炎症に伴うNO生成が、幹細胞にニトロ化DNA損傷をもたらし、その8-ニトログアニンががん予防のバイオマーカーになりうることが判明した。
凹面鏡と小規模アレイを用いたリアルタイム3次元医用超音波イメージング

凹面鏡と小規模アレイを用いた3次元医用超音波イメージング法では探触子と体表面の接触面積が広く、皮下脂肪層での脂肪含有率のばらつきが大きくなるため、収差による画像劣化を収差補正により抑圧する必要がある。皮下脂肪層の厚さが1cmである場合収差補正を行う際の送信周波数は1.5MHzが適しており、収差の影響が大きい場合には画像化を行う送信周波数の半分以下で収差補正を行うことにより収差による画像劣化を効果的に抑圧できることが分かった。今日先進国では心疾患が主な死因の1つとなっており、心疾患の診断技術向上のためリアルタイム3次元高分解能超音波イメージング技術の実現が強く望まれている。そのため、我々は凹面反射鏡と小規模2次元素子アレイを用いたリアルタイム3次元超音波イメージングシステムを提案している。本提案法はデジタルビームフォーミング技術を用いることにより、1回の送受信で全方向の測定を行うことができるため、極めて高い時間分解能を実現できる。先行研究では均一媒質中における提案法の空間分解能が考察されていた。人体の超音波検査を行う際、生体組織の不均一性により超音波画像が劣化する。特に、皮下脂肪層における収差が主原因となっている。そのため本研究では皮下脂肪層による収差の影響と、収差補正による超音波画像の改善に関する検討を計算機シミュレーションにより行った。計算機シミュレーションにはシュードスペクトラル法に基づく計算ツールであるスペクトラルフレックスを使用した。その結果、皮下脂肪層が1cmの場合送信周波数を2MHz以下にすることにより収差の影響を抑圧できることがわかった。またぐ低送信周波数により収差補正値を高精度に導出し、その補正値を用いて高い送信周波数で超音波画像を構成することにより、送信周波数を固定して収差補正、画像化を行う場合と比較し超音波画像の画質が改善されることがわかった。以上の結果から、凹面鏡と小規模アレイを用いた超音波イメージング法に適した送信周波数は収差補正を行わない場合2MHz以下であり、4MHz以上の送信周波数で画像化を行う場合は収差補正が必要であることが示唆された。現在先進国において心疾患が主要な死因の一つであり、心疾患の診断技術改善のためリアルタイム3次元超音波イメージング技術の確立が強く望まれている。そのため我々は凹面鏡と小規模2次元素子アレイを用いたリアルタイム3次元超音波イメージング法を提案している。本手法は原理的に1回の送受信により全測定空間の画像化が可能であり、極めて高い時間分解能が実現できる。また、開口合成技術を利用することにより時間分解能はいくらか悪化するが高空間分解能を持つイメージングを行うことも可能である。先行研究では均一媒質中における理論の有効性検討が行われていた。そのため本研究では皮下脂肪による収差の影響と収差補正による空間分解能の改善に関する計算機シミュレーションを行った。その結果脂肪層が1cm、0.5cmの場合それぞれ2MHz、1.5MHzの送信周波数で収差補正をするべきであり、求められた補正値を高周波数送信の際に適用することにより鋭い送信ビームが安定して形成できることが分かった。そのため、1回の送受信で補正値を求める場合だけでなく、複数回送受信を行い繰り返し補正値を計算して最適化する場合においても補正値の初期値を求める際には低周波数を送信することが望ましいといえる。以上のことから、ビームパターンが崩れており収差補正が必要な際には送信周波数を半分以下に下げた後に収差補正値を計算し、その値を用いて再度送信ビームを形成する必要性があることが示唆された。
カルタ競技者の脳内情報処理過程から考える認知症予防と脳血管障害後遺症の機能回復

本年度は、研究の最終年度に当たり、昨年度行った、事象関連電P300によるカルタ選手の脳機能評価を、より複雑でかるた競技に近い課題を用いたわれわれ独自の事象関連電位による評価で行った。対象は、大学生かるた選手35人(22.5±2,0歳)、対照一般大学生15人(21.5±1.5歳)。4音単語を聴覚、視覚の形で続けて与え、両者が一致した場合ボタンを押す課題で、Fz、Cz、Pzより事象関連電位を記録した。対照では、(1)視覚・聴覚順刺激でも、(2)聴覚・視覚順刺激でも、刺激提示後約400msec(430±120msec)に、Cz有意に深い陽性波を認めた。しかし、かるた選手では、(2)では対照同様の事象関連電位が記録されたが、(1)で事象関連電位を誘発する事が困難であった。今回記録された陽性波は聴覚・視覚情報処理に伴うものと考えた。(1)の刺激はかるた競技に類似し、選手にとって難易度が低く、特別な集中を要さず、誘発脳波が誘発されなかったと考えた。初年度の結果と合わせ、カルタ選手はその訓練を通して、運動と関連した簡単な記憶を、前運動野に保持できることが分かった。これより海馬など記憶関連部位に障害をきたした認知症患者において、安全確認行為など限られた内容なら本来の記憶部位以外に保持し、日常生活で応用可能ではないかと考えた。また、訓練で前運動野の機能をより有効に活用することが可能と考え、脳血管障害のために失われた運動機能回復のために、何らかの方法で前運動野を刺激できれば、リハビリテーションによる機能回復に有用な補助となるのではないかと考えた。初年度は、簡易刺激によるカルタ選手の脳内情報処理に関する研究を行った。対象は、大学生カルタ部員30名と、カルタ部以外の大学生12人(対照群)、および最近カルタを始めたばかりの中学生カルタ部員25人である。聴覚odd ball課題による事象関連電位を記録しながら、同時に近赤外線トポグラフィー法で脳血流の変化を測定した。P300潜時は、大学カルタ群と対照群の間に有意差を認めなかった。音声刺激後、ボタン押しまでの潜時は、対照群の500±150msecに比して、大学カルタ群で200±120msecと、大学カルタ群で有意に短かった。大学カルタ群は海馬の記憶をたどることなく、課題を遂行している事が示唆された。大学カルタ群の67%で、非標的刺激に対しても、P300様の深い陽性波が300msec付近に出現した。大学カルタ群が、「お手つき」に注意しながら課題を遂行している事がわかった。対照では、課題遂行中、優位半球聴覚野の血流が有意に増加したが、大学カルタ群では優位半球、前運動野において、音刺激後の血流増加の潜時が有意に短縮した。大学カルタ群は、聴覚odd ball課題を、海馬の記憶をたどることなく、優位半球前運動野の血流増加潜時を早めることで、対照に比して早いボタン押しを実現していると考えられた。同様の所見は、カルタをはじめて問もない中学カルタ群でも認められ、カルタ選手特有の情報処理過程は、訓練を通して得られたものであるか、このような運動特性を持つ個体がカルタと言う競技にのめりこんでいくのか、結論できなかった。次年度は、負荷法の難易度を上げ、今回結論できなかった疑問を解決したいと考えている。
類似画像検索のための検索意図を反映したクエリの自動生成

本研究では,インタラクティブな画像検索を実現するために,ブロック分割と置換えを利用する方法を提案する.この方法により,検索意図を反映した類似検索をユーザが特徴量について熟知することなく直感的に実現できると期待できる.二種類のデータセットを用いた実験により,関連フィードバックと比べて提案手法の方が高い検索精度を達成できることを示す.本研究では,インタラクティブな画像検索を実現するために,ブロック分割と置換えを利用する方法を提案する.この方法により,検索意図を反映した類似検索をユーザが特徴量について熟知することなく直感的に実現できると期待できる.二種類のデータセットを用いた実験により,関連フィードバックと比べて提案手法の方が高い検索精度を達成できることを示す.平成22年度では主にユーザの検索意図の推定に関する研究を行った.具体的には,インタラクティブな画像検索を実現するために,ブロック分割と置換えを利用する方法を提案した.提案手法では,はじめにユーザに提示された検索質問(クエリ)画像に類似した検索候補をデータベース画像(以降DB画像と表記する)から出力する.次に,所望するものに似ていると判断した画像をユーザによって検索候補から選択した後,初期クエリ画像と選択された検索候補を小領域(ブロック)に分割し,クエリの各ブロックに対して最も類似した検索候補のブロックを検索し置換えることで人工的なクエリ画像を作成する.最後に,人工的なクエリ画像から求めた特徴量に基づいて再び類似検索を行い,以上の手順をユーザの所望する画像が得られるまで繰り返す.この方法により,検索意図を反映した類似検索をユーザが特徴量について熟知することなく直感的に実現できるようになり,その効果をWANG datasetとCaltech101 datasetの二種類のデータセットを用いた実験により示した.結果として関連フィードバックと比べて提案手法の方が高い検索精度を達成できることを示した.今後は,使用できる特徴量の種類を増やしたり,提案手法を携帯端末上に実装したりして,実用化に向けた取り組みに注力する予定である.キーワードによる画像や動画像の検索では,システムの索引付けの特性に合わせてユーザが適切なキーワードを試行錯誤的に探索する必要がある.一方,内容に基づく類似検索の場合,色や形などの数値で表された特徴量に基づいて類似検索が行われるため,それらの特徴量をユーザが理解していなければ満足できる結果は得られない.そこで,ユーザがクエリ(検索質問)として利用できる画像や動画像を適合性フィードバックと我々が開発したブロック分割に基づく一般物体認識の技術を応用して人工的に作成し,それらを新たなクエリとして類似検索を行う方法を提案し,キーワードや特徴量を気にすることなく直感的に画像や動画像の類似検索を実現できる方法を開発する.平成23年度では,クエリの自動生成法の開発と,類似検索の評価について研究を行った.クエリの自動生成では,我々の開発したブロック置換えに基づく一般物体認識の手法を拡張した.すなわち,まず関心領域を検索候補から切出し,切出した画像を小領域(例えば同じ大きさのブロック画像)に分割する.次に,これらの小領域から検索意図の推定で決定した特徴量を抽出し,関心領域との類似度を計算する.その後,類似度が最大となるブロックとの置き換えを行うことでクエリの自動生成を行い,これを新たな検索キーとして再建策を行う.これを国際ベンチマークデータであるCaltec-101に適用したところ,従来法よりも高精度な類似画像検索を実現することができた.
脂肪酸の質的特性とその代謝制御機構の解明

食習慣は肥満、生活習慣病と深く関わるが、食行動の是正は困難なことが多く、未だ課題が多い。肥満状態においては、多彩な内因性生理活性因子の制御機能不全が起こるが、従来身体の構成やエネルギー源として利用されると考えられていた栄養成分、特に脂質は、栄養シグナルとして直接あるいは間接的に細胞機能の制御を繊細に行っている可能性があることがわかってきた。Elov16は脂肪酸伸長酵素ファミリーの一つであり、生体内で炭素数16から18への鎖長反応を担っている。全身Elov16欠損マウスでは肝臓の脂肪酸組成の変化が起こり、高脂肪食の負荷により、野生型マウスと同様に肥満・脂肪肝を呈するが、それらの解消に依存しないインスリン抵抗性改善が示されている。また、近年では脳において脂肪酸が摂食制御に重要な役割を担うことが明らかになってきており、本研究で、Elov16欠損マウスを用いて摂食調節機構におけるElov16の役割について検討したところ、恒常性維持のための摂食には影響せず、ショ糖のような嗜好性に基づいた摂食に影響をおよぼす可能性が示唆された。摂食パターンを詳細に検討したところ、Elov16欠損マウスの高ショ糖食嗜好性は、本来の食餌摂取時間ではない明期の給餌直後より明確にみられることが特徴的であった。また、高脂肪食に関しては野生型と同様に摂取し、脂質に対する嫌悪はみられなかった。また、高ショ糖嗜好性が甘味に対する嗜好性かどうかを検討するため、甘味料入りの飲水にて検討したが、飲水量は野生型と比較して変化が見られなかった。一方で、ショ糖単独食では野生型と比較してElov16欠損マウスで摂取量が増加した。これより、Elov16欠損マウスは、甘味に対する嗜好性は野生型と変わらないが、砂糖自体を好んでいる可能性が示唆された。(抄録なし)食習慣は肥満、生活習慣病と深く関わるが、食行動の是正には未だ課題が多い。組織中の脂肪酸組成は食事中の脂質を反映するため、新たなエビデンスに立脚した食事の提案につながると期待される。Elovl-6は脂肪酸伸長酵素ファミリーの一つであり、生体内で炭素数16から18への鎖長反応を担っている。全身Elovl-6欠損マウスでは肝臓の脂肪酸組成の変化が起こり、高脂肪食の負荷により野生型マウスと同様に肥満・脂肪肝を呈するが、それらの解消に依存しないインスリン抵抗性改善が示されている。また、脳においても脂肪酸組成の変化が起こり、野生型マウスと比較して糖質食を好むなど食行動の変化が認められつつある。代謝制御は液性因子、神経系の複雑な臓器相互作用を示す。よって、肝臓、脳など組織ごとでの新たな脂質代謝制御機構を詳細に解明する必要があるため、本年度は解析対象の作製として組織特異的Elovl-6マウスの作製を行った。既に樹立済みのElovl-6floxedマウスと、Albumin Cre Tgマウスを交配させ、肝臓特異的Elovl-6欠損マウスを得た。また、Nestin-Cre Tgマウスを掛け合わせ、脳(神経)特異的Elovl-6欠損マウスを作製し、全身各臓器でのElovl-6遺伝子発現がそれぞれ肝臓および脳で特異的に欠損していることを確認した。脳特異的Elovl-6KOマウスでの食行動の変化を現在検討中である。食習慣は肥満、生活習慣病と深く関わるが、食行動の是正には未だ課題が多い。また、脳においても脂肪酸組成の変化が起こることが確認されている。Elovl6欠損マウスを用いて摂食調節機構におけるElovl6の役割について食行動解析を行った。普通食、高ショ糖食(ショ糖70%、脂質0%、蛋白質20%)、高脂肪食(炭水化物28%、脂質35%、蛋白質26%)を単独または選択条件で与え、その摂食量を経時的に観察した。野生型と比較して、Elovl6欠損マウスでは、普通食および高脂肪食の摂食量は変わらなかったが、高ショ糖食の摂食量が有意に増加した。普通食と高ショ糖食を選択条件で与えた場合、総摂食量は野生型とElov16欠損マウスに差はないが、Elovl6欠損マウスは高ショ糖食をより多く摂食し、普通食の摂食量が減少した。

したがって、Elovl6欠損による脂肪酸組成の変化は、恒常性維持のための摂食には影響せず、ショ糖の嗜好性に基づいた摂食に影響をおよぼす可能性が示唆された。食習慣は肥満、生活習慣病と深く関わるが、食行動の是正は困難なことが多く、未だ課題が多い。肥満状態においては、多彩な内因性生理活性因子の制御機能不全が起こるが、従来身体の構成やエネルギー源として利用されると考えられていた栄養成分、特に脂質は、栄養シグナルとして直接あるいは間接的に細胞機能の制御を繊細に行っている可能性があることがわかってきた。Elov16は脂肪酸伸長酵素ファミリーの一つであり、生体内で炭素数16から18への鎖長反応を担っている。全身Elov16欠損マウスでは肝臓の脂肪酸組成の変化が起こり、高脂肪食の負荷により、野生型マウスと同様に肥満・脂肪肝を呈するが、それらの解消に依存しないインスリン抵抗性改善が示されている。また、近年では脳において脂肪酸が摂食制御に重要な役割を担うことが明らかになってきており、本研究で、Elov16欠損マウスを用いて摂食調節機構におけるElov16の役割について検討したところ、恒常性維持のための摂食には影響せず、ショ糖のような嗜好性に基づいた摂食に影響をおよぼす可能性が示唆された。摂食パターンを詳細に検討したところ、Elov16欠損マウスの高ショ糖食嗜好性は、本来の食餌摂取時間ではない明期の給餌直後より明確にみられることが特徴的であった。また、高脂肪食に関しては野生型と同様に摂取し、脂質に対する嫌悪はみられなかった。また、高ショ糖嗜好性が甘味に対する嗜好性かどうかを検討するため、甘味料入りの飲水にて検討したが、飲水量は野生型と比較して変化が見られなかった。一方で、ショ糖単独食では野生型と比較してElov16欠損マウスで摂取量が増加した。これより、Elov16欠損マウスは、甘味に対する嗜好性は野生型と変わらないが、砂糖自体を好んでいる可能性が示唆された。初年度ではElovl-6の組織ごとの役割を検討するため、解析対象の作製に取りかかった。計画通り、Elovl-6肝臓および脳(神経)特異的マウスを作製し、全身各臓器でのElovl-6遺伝子発現がそれぞれ肝臓および脳で特異的に欠損していることを確認した。摂食行動量同時測定システムを用いて、高糖質食、高脂肪食を同時に与えて嗜好性を検討し、食行動を詳細に検討したところ、高ショ糖食を選択的に好んで摂取していた。これらの結果より、Elov16欠損による脂肪酸組成の変化は、恒常性維持のための摂食には影響せず、ショ糖の嗜好性に基づいた摂食に影響をおよぼす可能性が示唆された。Elovl-6欠損マウスの食行動変容メカニズム、代謝制御の解明を行う。作製した脳特異的Elovl-6欠損マウスにおける糖質、脂肪への嗜好性を詳細に検討する。組織学的検討にて神経活性化部位の検討を行い、経路の検討として脳室内薬剤投与による嗜好性の変動を確認する。摂食行動に関わるとされる視床下部諸核のさまざまなモノアミン系、ペプチド系アミノ酸の代謝変化に関する検討を行うため、肝臓などで従来検討している遺伝子発現、脂肪酸代謝、シグナル経路の検討について、脳サンプルについても系を確立して、神経シグナルと合わせて検討する。Elov1-6欠損マウスの食行動変容メカニズム、代謝制御の解明を行う。Elov1-6欠損マウスにおける糖質、脂肪への嗜好性を詳細に検討する。
Nelsonの量子力学に基づくトンネリング時間及びその周辺の研究

本課題研究における平成9年度の各項目に対する研究成果は以下の通りであり,雑誌論文として出版された.(1)熱浴との結合系に関しては,一般的にいえば,Feynman-VernonやCaldeira-Leggettによる方法が知られている.ここではf(t)を任意の既知正関数として(例えばe^<2γt>)、作用をS=∫dt[m/2x^2+V(x)]f(t)とおけば,この系は正準形式を満たす.しかも,得られるEuler方程式は散逸型mx+2mγx+(∂v)/(∂x)=0となる.この枠組みを用いて,散逸系における量子化を正準形式と経路積分法において実行することに成功し,その実効的schrodinger方程式に対応するNelson量子力学を定式化,基礎方程式であるLangevin方程式を書き下すことができた.現在,種々のモデルについてシミュレーションを実行,その物理的内容の分析が進行中である.(2)Nelsonの量子力学を多チャンネルに拡張し,トンネル時間に現れる非弾性効果を評価することに成功した.従来までのNelsonの量子力学では一つのチャンネルのみを扱い,その中での確率過程であった.ここでは別のチャンネルに量子飛躍する.それを表すために,対応するLangevin方程式に新たな項を導入してNelson量子力学の枠組みを拡張し,この効果を取り入れることに成功した.(3)引力フェルミ系の集団励起スペクトルを計算し,phonon-roton的分散関係を,またBE凝縮体から結晶への量子転移について示唆的な結果を得た.そしてリング状超流体の永久流減衰をroton励起を伴う位相場のトンネル現象としての記述を試みている.さらに,引力フェルミ系の新しい基底状態-supersolid-の可能性を変分波動関数を用いて示した.また,SIS接合に新しい赤外発散効果が存在することを予言した.本課題研究における平成9年度の各項目に対する研究成果は以下の通りであり,雑誌論文として出版された.(1)熱浴との結合系に関しては,一般的にいえば,Feynman-VernonやCaldeira-Leggettによる方法が知られている.ここではf(t)を任意の既知正関数として(例えばe^<2γt>)、作用をS=∫dt[m/2x^2+V(x)]f(t)とおけば,この系は正準形式を満たす.しかも,得られるEuler方程式は散逸型mx+2mγx+(∂v)/(∂x)=0となる.この枠組みを用いて,散逸系における量子化を正準形式と経路積分法において実行することに成功し,その実効的schrodinger方程式に対応するNelson量子力学を定式化,基礎方程式であるLangevin方程式を書き下すことができた.現在,種々のモデルについてシミュレーションを実行,その物理的内容の分析が進行中である.(2)Nelsonの量子力学を多チャンネルに拡張し,トンネル時間に現れる非弾性効果を評価することに成功した.従来までのNelsonの量子力学では一つのチャンネルのみを扱い,その中での確率過程であった.ここでは別のチャンネルに量子飛躍する.それを表すために,対応するLangevin方程式に新たな項を導入してNelson量子力学の枠組みを拡張し,この効果を取り入れることに成功した.(3)引力フェルミ系の集団励起スペクトルを計算し,phonon-roton的分散関係を,またBE凝縮体から結晶への量子転移について示唆的な結果を得た.そしてリング状超流体の永久流減衰をroton励起を伴う位相場のトンネル現象としての記述を試みている.さらに,引力フェルミ系の新しい基底状態-supersolid-の可能性を変分波動関数を用いて示した.また,SIS接合に新しい赤外発散効果が存在することを予言した.
アレルギー性腸疾患の制圧に向けた免疫寛容機構の解明:制御分子とその産生細胞の同定

腸管粘膜には、食物抗原や腸内常在細菌などの抗原に対しては、過剰な免疫反応を抑える方向に働き、病原菌をはじめとする有害物質に対しては、活発な免疫反応でこれを排除する方向に働くように免疫系が構築されている。しかし、このような免疫系のバランスが崩れると、炎症性腸疾患や食物アレルギーなどの疾患が誘導される。我々は、腸管の免疫学的恒常性を維持するメカニズムを解明するため、卵白アルブミンに対して免疫寛容を誘導するマウスモデルを作製した。このモデルマウスを用いた研究から、腸管の免疫系の制御に重要な役割を演じる細胞群が、脾臓に存在する可能性を示唆する結果を得た。アレルギー性腸疾患における制御性T細胞の特性を解明するため、我々が作製した免疫寛容モデル、アレルギーモデルの腸間膜リンパ節より単離したヘルパーT細胞のサイトカイン産生能を比較した。その結果、アレルギーモデルでは従来どおり著明なTh2タイプサイトカイン(IL-4)の産生が確認できた。これに対し免疫寛容モデルではTh1タイプ(IFN-γ)、Th2タイプ(IL-4)のサイトカイン産生はなく、制御性サイトカインのひとつであるIL-10の産生のみが認められた。このことは、免疫寛容モデルの腸間膜リンパ節細胞中に、サイトカイン産生パターンから判断して制御性T細胞に相当すると考えられるヘルパーT細胞が誘導されていることを示唆し、アレルギー性腸疾患の制御に関わるT細胞の誘導にLPSが重要な役割を演じるものとして意義深い結果のである。また、アレルギー性腸疾患の制御に関わる樹状細胞の研究では免疫寛容モデル、アレルギーモデル、無処理コントロール群の脾臓より単離した樹状細胞のサイトカイン産生能とフローサイトメーターによる表面抗原の発現様式を調べた。免疫寛容モデルは他の2群に比べ感作後24時間以内にIL-10産生が増強すること、制御性樹状細胞の表現形質とされるCD11c^<low>・CD45RB^<high>を示す細胞群の割合が増加することの2つの結果が得られた。これらの結果は、免疫寛容モデルの脾細胞中には感作後早期にIL-10を産生する樹状細胞が誘導されること、表現形質から判断して制御性樹状細胞に相当する細胞群であることを示唆し、制御性T細胞の誘導を上位で司ると想定される制御性樹状細胞の誘導にLPSが重要な役割を演じるものとして意義深い結果である。また制御性樹状細胞の同定は今後アレルギー性腸疾患の発症と制御の過程を解明する上で重要な発見と考えられる。アレルギー性腸疾患の制圧に向けモデルマウスの作製を試みた。抗原(卵白アルブミン)に低濃度のリポ多糖類(LPS)を併用することによりアレルギーモデルを、高濃度のLPSを併用することにより寛容モデルを作製することが出来た。これらのモデルマウスの脾臓よりヘルパーT細胞を単離し、サイトカイン産生能を比較したところ、アレルギーモデルではTh2タイプサイトカイン(IL-4)の産生が確認できた。これに対し免疫寛容モデルでは、Th1タイプ(IFN-γ)、Th2タイプ(IL-4)のサイトカイン産生は認められず、制御性サイトカインのひとつであるIL-10の産生のみが認められた。このことから、免疫寛容モデルでは制御性T細胞に相当するヘルパーT細胞が誘導されている可能性が示唆された。また、卵白アルブミンに対するT細胞受容体を導入した遺伝子改変マウスを用い、免疫寛容モデル、アレルギーモデルの脾臓由来ヘルパーT細胞の機能を調べたところ、免疫寛容モデル由来T細胞は遺伝子改変マウス由来T細胞の抗原特異的増殖反応を著明に抑制するが、アレルギーモデル由来T細胞では抑制機能が認められなかった。以上の結果から、免疫寛容モデル由来T細胞は、卵白アルブミン特異的免疫反応を制御・抑制する機能を有することが示唆された。同時に食物アレルギー反応に代表されるアレルギー性腸疾患の制御にLPSが重要な役割を演じることが示唆され、アレルギー性腸疾患の発症と制御の過程を解明する上で我々の作成したモデルが意義深いものであることが明らかとなった。アレルギー性腸疾患の免疫寛容機構を解明するため、我々が作製した免疫寛容モデル並びにアレルギーモデルの脾臓よりCD4^+ T細胞を単離しその機能を解析した。その結果、免疫寛容モデルの脾臓由来CD4^+ T細胞は、卵白アルブミン(OVA)特異的増殖反応を示すトランスジェニック(Tg)マウス(DO11.10)の増殖反応を抑制した。これに対し、アレルギーモデル由来CD4^+ T細胞は増殖抑制を示さなかった。このことは、免疫寛容モデルのCD4^+ T細胞は制御性T細胞として機能する可能性を示唆する。また、寛容モデル由来CD4^+ T細胞の増殖抑制は、IL-10受容体抗体の添加により阻止されないことから、液性因子以外の要因を介するものと考えられる。

さらに、アレルギー性腸疾患の制御に関わる樹状細胞の研究では、免疫寛容モデル・アレルギーモデル・無処理コントロール群の脾臓より単離した樹状細胞のサイトカイン産生とフローサイトメーターによる形質発現の違いを調べた。免疫寛容モデルの脾臓由来樹状細胞は他の2群に比べ感作後24時間以内にIL-10産生が増強すること、制御性樹状細胞の表現形質とされるCD11c^<low>・CD45RB^<high>を示す細胞群の割合が増加することが分かった。これらの結果は、免疫寛容モデルの脾細胞中には感作後早期にIL-10を産生する樹状細胞が誘導されること、表現形質から判断して制御性樹状細胞に相当する細胞群であることを示唆する。制御性T細胞の誘導を上位で司る制御性樹状細胞の同定は、アレルギー性腸疾患の発症と制御の過程を解明し治療法を確立する上で重要な発見と考えられる。
ヒト唾液による歯科用銀合金腐食生成物のｉＰＳ／ＥＳ細胞による発生毒性の検討

口腔内環境での歯科用銀合金や金銀パラジウム合金の腐食生成物がヒトの発生に及ぼす影響は知られていない.組成イオンの銀、銅、スズなどはやや発生毒性が存在する可能性があり、腐食生成物では発生毒性レベルの変動を調べる必要がある.EST法はマウスES細胞と3T3細胞を用いて未知の化学物質によるヒト胎児の催奇形性を予測できる方法で、今回、ES細胞の他にマウス由来のiPS細胞も用いた.結果から、ヒト唾液や人工唾液で浸漬した合金表面で無処理の場合と細胞分化レベルで有意差が認められなかった.しかし合金表面に機械的な傷を付け、さらに塩酸と硫酸に浸漬した場合は組成元素の溶出量も多く、発生毒性の存在も懸念された.歯科用合金は口腔内での摩耗や腐食で組成元素イオンが唾液へ溶解することが知られている。我々は発生毒性スクリーニング法で知られるEST法で使用されるES-D3細胞の細胞分化レベルなどをしらべた.合金を唾液に浸漬して得られたデータと比較する目的で,銀合金の組成元素イオンであるAg,Au,Cu,Pd,Snについて,ES-D3細胞のID50値とIC50値を検討した.ブタ由来のコラーゲンとテラピア鱗由来のコラーゲンを用いた.その結果,AgはID50値,IC50値ともに最も低い値を示し,以下,Cu,Sn,Au,Pdの順に値は大きくなった.いずれもID50値がIC50値よりもやや大きな値を示し,細胞分化に対する影響は細胞毒性の影響より少ないことが判明した.他方,市販銀合金を石膏系埋没材で鋳造し,直径8mmの円盤状金属片を作製した.片面を耐水ペーパーで研磨・洗浄し,オートクレーブ滅菌した.濾過したヒト唾液に37°Cで浸漬した.また,人工唾液として市販のサリベートを用いた.ヒト唾液ならびに人工唾液とも浸漬後に合金表面にほとんど腐食が確認できなかったため,合金表面に歯科用ダイヤモンドポイントで多数の傷を付け再度浸漬した.浸漬面にES-D3細胞ならびにマウス由来のiPS細胞のEBsを2日間直接置いた場合、両細胞とも全く心筋への分化が認められなかった.そのため,インターセル内に合金を置き,コラーゲンを厚さ約1mmに分注し,EBsを2日間置いた後に5日間細胞分化させた結果,心筋の鼓動発生率は36%30%と低い値であった.しかし,ALP染色など他のエンドポイントでは細胞分化への大きな影響が認められなかった.両細胞間で有意差が無かった.今年度で得られた両試験結果は次年度で腐食生成物の影響についてさらに解明する予定である.前年度に引き続き、合金表面の腐食物による発生毒性レベルをしらべた。当初、2種の人工唾液(グリーンウッド氏処方、サリベート)では市販金銀パラジウム合金表面に腐食膜の形成が認められなかった。そのため、合金表面に細かな傷を付けるとともに酸に浸漬することとした。以前にダイヤモンドポイントで表面に傷を付けたが、合金表面全体に均一な傷を付けることが難しいため耐水ペーパーを用いた。歯科臨床で現在最も多く使用されているパラジウムを12%含む2種類の市販金銀パラジウム合金を鋳造し、直径8mmの円盤状金属片を作った。片面を220番から2000番の耐水ペーパーで表面研磨し細かい傷を付けた。それぞれ希硫酸ならびに希塩酸に1週間浸漬後に流水で洗浄した。さらに表面に細胞培養するためにオートクレーブ滅菌した。その結果、いずれの研磨群でも表面にわずかな曇りが認められ、腐食生成物が形成されていた。試料合金をディシュにパラフィンワックスで固定し、浸漬面を上にしてin vitro発生毒性スクリーニング法のEST法で使用されるマウス由来のES細胞であるES-D3細胞ならびにマウス由来のiPS細胞を播種し、最大10日間培養した。対照群は表面に酸処理と研磨処理をしていない合金とした。なお、前年度はEmbryo Body(EB)を作って2日間のみ培養したが、結果に差が無かったので、今回はEBを作製せず細胞を合金表面に直接播種して長期間培養する工夫を行った。しかし、合金表面での心筋鼓動が確認しにくいためALPの低下で細胞分化を評価した。その結果、対照群と比べて220番、400番,600番処理群では心筋への分化率が約25%低下し、他の耐水ペーパー処理群でもやや低下した。また、硫酸処理群では塩酸処理群より心筋分化率は10%程度低下する傾向が認められた。研究の最終年度として、合金表面に腐食物がある場合とない場合とのES-D3細胞ならびにiPS細胞を用いて比較を行った。前年度までの成果で加速度試験として合金表面に効率的に腐食物を堆積させるために合金表面に均一に傷を付けるとともに希塩酸ならびに希硫酸に1週間浸漬した.溶液はICPで元素を測定した.合金表面を洗浄しオートクレーブ滅菌した。希塩酸浸漬群ではやや表面に黒化が認められた。なお、希硫酸浸漬群では表面に若干の曇りが認められたが黒化は認められなかった。合金表面にES-D3細胞を播種したところやや細胞毒性が認められた。そこで、塩酸ならびに希硫酸に1ヶ月間浸漬した。溶液は同様にICPで元素を測定した。合金表面を十分に洗浄・滅菌した後、希塩酸浸漬群ではかなり表面に黒化が認められた。しかし、希硫酸の浸漬群では表面に曇りが認められたものの一週間浸漬群と同様に黒化は認められなかった。

表面研磨のみの合金を対照群として、表面にES-D3細胞から懸滴培養で得たEBsを置いて分化培養を試みた。希塩酸群で対照群の約20%、希硫酸群で対照群の約10%の値であった。また、ES-D3細胞のMTT法での細胞毒性は希塩酸群で対照群の69%、希硫酸群で対照群の54%の値であった。さらに、マウス由来のiPS細胞の細胞分化について調べるためES-D3細胞同様にEBsを作製した。なお、フィーダーにMEF細胞を使用するため、MEF細胞を合金上に播種し、24時間後にiPS細胞で作製したEBsを置いて分化させた。その結果、iPS細胞でも希塩酸群、希硫酸群ともにやや細胞分化率は低下した。なお、iPS細胞の場合にはフィーダー細胞が最初にダメージを受けた可能性もあることが考えられた。結果から合金表面を加速度的に腐食させた場合には、希塩酸群、希硫酸群ともに発生毒性が存在する可能性が高いことが示唆された。口腔内環境での歯科用銀合金や金銀パラジウム合金の腐食生成物がヒトの発生に及ぼす影響は知られていない.組成イオンの銀、銅、スズなどはやや発生毒性が存在する可能性があり、腐食生成物では発生毒性レベルの変動を調べる必要がある.EST法はマウスES細胞と3T3細胞を用いて未知の化学物質によるヒト胎児の催奇形性を予測できる方法で、今回、ES細胞の他にマウス由来のiPS細胞も用いた.結果から、ヒト唾液や人工唾液で浸漬した合金表面で無処理の場合と細胞分化レベルで有意差が認められなかった.しかし合金表面に機械的な傷を付け、さらに塩酸と硫酸に浸漬した場合は組成元素の溶出量も多く、発生毒性の存在も懸念された.歯科用銀合金の腐食生成物がヒトの発生に及ぼす影響をしらべるために、人工唾液による腐食生成物を使用することを企画した。しかし、歯科臨床で数多く使用されている銀合金である金銀パラジウム合金はin vitroで簡単に腐食生成物が得られなかったことから、表面に細かな傷を付けると共に合金表面を酸処理して積極的に腐食生成物を得ることができた。今後、ES-D3細胞ならびにマウス由来iPS細胞を腐食生成物上で培養して正常に分化するかどうかを調べた。その結果、腐食生成物上ではやや細胞分化率が低下し、さらに塩酸処理群より硫酸処理群がさらに細胞分化率が低下することが判明したことは、腐食生成物の種類によって細胞分化率に影響されることが判明した。当初の目標どおり、腐食生成物の発生毒性の影響が懸念された。今後、さらに詳細なデータを得る必要がある。歯科理工学合金表面に細かな傷を付けて酸処理して得られた腐食生成物が、実際の口腔内での腐食生成物とは異なる可能性も考えられる。そのため加速度試験として電気処理なども考えられるが、まず、現在得られた腐食生成物表面を人工唾液あるいはヒト唾液に浸漬して、それらの腐食生成物を積極的に積層する工夫が考えられる。最終的な表面積層物は口腔内で形成された腐食生成物と類似である可能性が高いと考えられる。さらに、表面アラサの差によっても結果に影響する可能性もあり、これらをさらに最終段階で確認する必要性が考えられる。口腔内環境における歯科用銀合金の腐食生成物がヒトの発生に及ぼす影響をしらべるために,ヒト唾液に銀合金を浸漬し,合金表面の腐食生成物をES/iPS細胞に接触させて細胞分化させることを目標としてきた.腐食生成物による発生毒性をしらべる場合に基準となる唾液による腐食がない場合の基準データがないことが判明した.
海外事業所への参与観察による英会話分析

海外に進出している企業で、日常業務の英語使用の音声データを収集した。そのデータから、いろいろな傾向が見受けられた。加えて、数名の学生を対象に、海外インターンシップを実施し、彼らの音声データも収集し、その傾向、場面ごとの対処仕方、インターンシップの初めて最後での変化を分析した。これらのデータは、大学における英語教育の今後に活用使える英語の教育日本の若者のSelf-efficacyが低い現状を考慮し、それを高めて自律した英語学習者を養成することが課題であると考えた。そして、短期海外インターンシップがSelf-efficacyを高める上でどのような効果があるかを調査した。調査は、大学生4名を2週間シンガポールにある企業に送り、学生が希望する業種において市場調査、営業などの業務を体験させた。学生が自分自身のコミュニケーション能力についてどのように感じているかは、3つの方法で確かめた。1)研修前と研修後にCommon European Framework of Reference for Languagesの日本版(CEFR-J)を使用し、理解、話す、書くの言語運用能力に関する自己評価がどのように変化するかを調べた。2)研修中に何を学び、何に失敗し、どのような英語表現を覚えたかを記録させ、会社の人とどの程度コミュニケーションが図られているかを観察した。3)研修後に、自分自身のコミュニケーション能力の変化について記述させた。以上のデータを検証したところ、研修中は英語が聞き取れず、また語彙不足から言いたいことがうまく伝わらない様子が描かれていた。しかし、CEFR-Jに基づく自己評価では、理解、話す、書くのすべての項目において、全員が自己評価を高めた。特に話すや書くのアウトプット技能の評価は顕著に高まった。また、研修後のレポートでは、自分の何ができないかを内省しており、改善点、今後の課題などを具体的に記述することができるようになっていた。母集団が少ないものの、短期インターンシップは英語使用環境が乏しい日本の教育現場と比して、Self-efficacyが高まる上で効果的であることが判明した。これらのデータは、大学における英語教育の今後に活用使える英語の教育シンガポールに進出を果たしている北海道企業(飲食業)の協力の下、日本人従業員の店舗における朝礼や日常業務の音声データを収集した。加えて、以前、海外進出を果たした北海道の企業の方々に話を伺った際、早い時期に海外で過ごした経験が役立っているという意見が多く、それを受けて、研究代表者の所属大学と共同研究者所属大学から合計3名の学生を対象に、シンガポールにおいて海外インターンシップを実施した。すでに海外でビジネスを手がけている道内企業に協力いただき、学生の受け入れ先を紹介していただいた。(建築関係の会社と不動産関係の会社)受け入れ企業に承諾を得て、学生たちには業務中ICレコーダーを装着してもらい、どのようにコミュニケーションをとっているか音声データを収集した。当初の予定よりも多くの北海道そして海外企業の方々が、本研究に理解をしていただき協力していただいているため、本研究の目的達成に向けて順調に進んでいる。将来的には海外インターンシッププログラムの確立を目指しているが、道内そして海外の多くの企業の方々に興味を持っていただき、たくさんのコネクションができている。今後、なるべく多くの学生たちに海外経験をしてもらい、将来に役立ててもらいたい。シンガポールにおいて海外インターンシップを実施する。期間を昨年度より延長させる。この取り組みを通して、学生たちの英語を使用してのコミュニケーション能力そして彼らの物事に取り組む態度、人と接する態度、気持ちの変化、将来に対する考えなどの変化にも注目する。シンガポール滞在中は学生たちにICレコーダーを装着させ、日々の音声データを収集する。今回の滞在ではホームステイをしてもらい、一日の多くを英語での生活にする。帰国後は、学生たちの報告会を開催し、意見交換の場を持つ。そして昨年度と今年度に収集した音声データの分析を開始する。現在海外で活躍している日本人の方を招いて、学生に対して講演を開催する。そこで、彼らに新しいことを発見してもらう場を作る。シンガポール行きを希望する学生の旅費、引率者の旅費・滞在費、講演会開催にあたっての旅費・謝金、映像データ収集のためのデジタルビデオカメラ、データ保管および連絡手段としてノートPC。
細胞ベースの人工関節の開発

我々は細胞だけで立体構造体を作成し、損傷した組織に直接移植を可能とするセルデリバリーシステムを開発した。あわせて、任意の形状・曲面をもった生体材料の表面に厚みをもった細胞層をコーティングする技術も開発しており、今回、骨に穏やかに吸収・置換されるトリ燐酸系の素材と組み合わせることにより、すべて自分自身の組織に置き換わる細胞ベースの人工関節の開発を行うことを目的として、本研究をおこなった。3次元スキャナを用いて、家兎大腿骨遠位関節面の形状をスキャンし、3Dデータを得た。このデータをPC上のCADソフトウェア上で解析を行い、いくつかのデザインパターンを作成し、これをネガティブ化した形状のモールドを作成した。家兎から採取した未分化間葉系幹細胞を増殖させ、作成した3Dテンプレートであるα-TCPにコーティングを行い、そのままCO2インキュベーターで、培養を行った。おおよそ1カ月程度で想定した形状の厚みをもった細胞層がコーティングされた細胞+α-TCPの細胞構造体が得られた。しかし、未分化な幹細胞のみから形成されているため、この細胞+α-TCPの細胞構造体は、扱いが難しく、脆弱であるため、細胞層の脱落や、TCPのひび割れなど、動物実験に持ち込むにはいくつかの改善が必要であると思われた。おそらく、幹細胞が未分化なため、細胞外マトリクスがほとんどないため、細胞層の強度が全くないことと、細胞と培養液の交通性を高めるために設けたTCP内の微細孔の形状に問題があると予想した。そのため、最終年度はバイオリアクターを自作し、細胞単独層に培養液が循環できるシステムで培養したところ、従来に比べて大幅に強度が増した。今後早期の臨床応用が期待される。初年度は、トリ燐酸カルシウム(α-TCP)を土台とする3Dテンプレートのデザインと試作を主に検討した。しかし、未分化な幹細胞のみから形成されているため、この細胞+α-TCPの細胞構造体は、扱いが難しく、脆弱であるため、細胞層の脱落や、TCPのひび割れなど、動物実験に持ち込むにはいくつかの改善がひつようであると思われた。おそらく、幹細胞が未分化なため、細胞外マトリクスがほとんどないため、細胞層の強度が全くないことと、細胞と培養液の交通性をたかめるために設けたTCP内の微細孔の形状に問題があると予想した。今後はこれらの問題点を踏まえ、ある程度の強度=操作性をそなえた細胞+TCP構造体の作成を行う予定である。

あわせて、任意の形状・曲面をもった生体材料の表面に厚みをもった細胞層をコーティングする技術も開発しており、今回、骨に穏やかに吸収・置換されるトリ燐酸系の素材と組み合わせることにより、すべて自分自身の組織に置き換わる細胞ベースの人工関節の開発を行うことを目的として、本研究をおこなった。本年度は、トリ燐酸カルシウム(α-TCP)の微細構造を変えることによる細胞接着性の影響と、移植時におけるハンドリングの容易さを検討した。α-TCP焼結時に、消失するマイクロパウダー(粒径200マイクロ、および500マイクロ)を混合することにより、内部にそれぞれのパウダーの粒径に応じた微細孔が形成された。この得られたTCPを円柱状に加工、整形し、細胞層をコーティングした。約一週間培養し、樹脂包埋をおこない、研磨標本を作製した。トルイジンブルー染色をおこない顕微鏡で観察した。双方とも厚さ約5ミリの細胞層が形成されており、内部に壊死などを示唆する空洞などは認められず、トルイジンブルーには染色されない、細胞外マトリックスの乏しい細胞構造体であることが判明した。200マイクロと500マイクロのTCPそれぞれと、細胞層のインターフェースを詳細に観察すると、双方ともしっかりしたIntegrationが得られているのがわかった、特に500マイクロ孔を有するTCPはインターフェース面に露出した微細孔に細胞がしっかり進入しており、細胞層とTCPがしっかり結合していることが判明した。今後TCPを曲面をもつよう加工し細胞層をコートすることを試みる。医歯薬
神経回路の可塑性を制御するクロマチン動態の解析

幼年期のほ乳類の脳には、環境から受けた刺激や経験に応じて神経回路が活発に再構築される(可塑性が高まる)時期がある。これは「臨界期」と呼ばれ、生涯の中で生後の一時期にしか現れない。自閉症のモデルマウスでは臨界期の異常が示唆されているように、臨界期に神経回路網が可塑性を持つことは脳の機能発達に重要である。本研究では臨界期の制御機構を理解することを目的として、マウス大脳皮質において初めて臨界期に必須な転写因子として発見されたホメオタンパク質Otx2の下流のターゲットを探索した。Otx2が局在する抑制性ニューロンを臨界期マウス大脳皮質より分取し、トランスクリプトーム解析(RNA-seq)を行った結果、Otx2依存的に発現量が変化する遺伝子として、転写制御に関わる因子が複数同定された。従ってOtx2は転写カスケードの最上流で働き、神経細胞機能の変化を介して神経回路の可塑性を上げると考えられる。また、酸化ストレスへの対応に必須な遺伝子の発現がOtx2に強く依存することから、Otx2はPV細胞の成熟に伴う高頻度発火による酸化ストレスから細胞を保護する役割も担うことが示唆された。更に、Otx2依存的に発現が変化する遺伝子のうち、ChIP-seqによりOtx2結合部位を持つことが示されたものの中に、IEG(Immediate early-genes;最初期遺伝子)に属する一群の遺伝子が含まれることが明らかになった。暗所飼育後の光刺激による視覚野でのIEGの発現上昇を、in situ hybridization法、および免疫染色法を用いて検討したところ、Otx2 KOマウスではc-fosの発現が減弱している傾向が見られた。これらの結果より、これまでに殆ど知られていなかった抑制性ニューロンにおけるIEGの発現調節機構の一端をOtx2が担い、この制御が臨界期に重要であることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、マウス大脳皮質視覚野の発達をモデルに臨界期の制御機構を理解することを目的として、初めて臨界期に必須な転写因子として発見されたホメオタンパク質Otx2の下流のターゲットを探索した。本年度はまず、Otx2が結合するゲノム領域をChIP-seq法を用いて網羅的に同定することを試みた。Otx2タンパク質は大脳皮質の中でもPV細胞と呼ばれる特定の抑制性介在ニューロンに限局するため、存在量が非常に少なく、ChIP-seqで特異的なシグナルを得るのが困難であった。そこで2種類の抗体で共通して見られるピークのみに着目することで偽陽性を排除し、Otx2結合部位を持つ遺伝子を明らかにした。これらの中には転写制御に関わる因子、神経細胞の機能に関わる因子(イオンチャネル、シナプス伝達因子)、構造変化に関わる因子(アクチン制御因子、細胞接着因子)等が多く見られた。これらの結果より、Otx2は転写カスケード、神経細胞機能、構造に関わる複数の因子の転写を直接制御することにより、臨界期を引き起こすことが示唆された。更に、Otx2のターゲットの中にはPV細胞の成熟に必要であることが示唆されている複数の因子も含まれていた。これらの結果はOtx2がPV細胞の成熟を促進することで臨界期の開始に導くというこれまでの知見を強く支持するだけでなく、本解析により同定されたOtx2のターゲットの中には、PV細胞成熟の機能を持つ新たな因子が含まれる可能性をも示唆する。まずOtx2が結合するゲノム領域をChIP-seq法を用いて網羅的に同定し、Otx2結合部位を持つ遺伝子を明らかにした。これらの中には転写制御、神経細胞の発達・機能(イオンチャネル、シナプス伝達因子)・構造(アクチン制御因子、細胞接着因子)に関わる因子が多く見られた。またトランスクリプトーム解析(RNA-seq)の結果、Otx2依存的に発現量が変化する遺伝子として、転写制御に関わる因子が複数同定された。これらの結果より、Otx2は転写カスケードの最上流で働き、神経細胞機能の変化を介して神経回路の可塑性を上げると考えられる。面白いことに、Otx2が直接制御する遺伝子として、神経活動依存的に発現する一群のIEG(Immediate early-genes;最初期遺伝子)が含まれていた。この結果は、Otx2が視覚野に限らず神経回路の可塑性の様々な局面で機能することを示唆している。