hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
変更挿入により生じた新たな嚢胞腎トランスジェニックマウスの分子生物学的検討

挿入変異により生じた左右内蔵逆位、嚢胞形成腎を有するトランスジェニックマウスの組織学的、分子生物学的検討をおこなってきたが、本年度で所定の研究年度を終了し、以下の研究成果をまとめた。1.候補遺伝子の決定マウスの転写領域の全長のcDNAをクローニングすることに成功し、Nature誌に報告した。遺伝子構造上ankyrin配列が認められたため、細胞骨格蛋白である可能性が示唆された。また、ヒトのhomologueの検索を行い、ヒト遺伝子のほぼ全長が獲得された。臓器別のmRNAの発現についてNorthern解析を行ったが、心臓、肝臓、腎臓でのシグナルが強陽性であった。2.嚢胞腎の組織学的検討胎生20日のhomozygoteの個体の腎の組織標本を作製した。嚢胞は主として遠位部尿細管を中心に形成されていた。電子顕微鏡的にも上皮細胞の扁平化、核の位置異常、microvilliの減少が観察された。膜蛋白であるNa/K ATPaseの免疫組織学的検討では、嚢胞の形成、進展とともに弱まっていくことが確認された。アミノ酸配列によりoligoおよびfusion proteinをもとにして、polyclonal抗体を作製しているが、主として腎尿細管の細胞質に染色性を認めており、現在はラットリンパ節法によりmonoclonal抗体の作製を行っている。今後は、抗体の完成により発現、局在の検討を進めること、およびgreen fluorescence proteinなどの手法を用いて細胞内での局在を可視化する計画である。また、ヒトにおいては内臓逆位家系でのmutationの同定により、本遺伝子の体幹形成での役割を明らかにすることが可能と考えられるが、さらに腎の低形成、胆道閉鎖などの上皮細胞の異常に起因するとか考えられる疾患群での本遺伝子の関わりを検討する予定である。挿入変異により生じた左右内蔵逆位、嚢胞形成腎を有するトランスジェニックマウスの組織学的、分子生物学的検討をおこなった。1)候補遺伝子の決定マウス胎児ライブラリーを挿入geneをマーカーとしてスクリーニングすることにより、転写領域の全長のcDNAをクローニングすることに成功した(投稿中)。細胞質内に局在する蛋白をcodingする可能性が考えられた。発達学的には、胎生3日以降の発現が確認された。全長cDNAの塩基配列およびアミノ酸配列が決定されたため、そのhomology検索を行うとともに、アミノ酸配列を基に抗体の作製を開始した。また、得られたマウスのクローンをprobeとして、ヒト腎ライブラリーをスクリーニングし、homologueを得た。今後、ヒト遺伝子cDNAの全長を決定する予定である(分担者望月)。全長cDNAをexpression vectorにサブクローニングし、今後、gene rescueを行い、形質の発現と本geneの直接的な関係を証明する予定である(分担者横山)。2)嚢胞腎の組織学的検討胎生20日のhomozygoteの個体の腎の組織標本を作製した。電子顕微鏡的にも上皮細胞の偏平化、核の位置異常、microvilliの減少が観察された。膜蛋白であるNa/K ATPaseの免疫組織学的検討では、alpha,beta両subunitの染色性が、嚢胞の形成、進展とともに弱まっていくことが確認された。現在、他の膜蛋白の局在、細胞外基質などの染色を行っている。今後、特異的抗体が作製されれば、その染色性も確認する予定である。研究者らは挿入変異(insertional muatgenesis)により新たに発生した左右内臓逆位、嚢胞腎を有するトランスジェニックマウスの組織学的、分子生物学的検討を行ってきた。1.候補遺伝子の決定およびヒトhomologueの確定。

転写領域の全長のcDNAをクローニングすることに成功し、Nature誌に報告した。遺伝子構造上ankyrin配列が認められたため、細胞骨格蛋白である可能性が示唆された。また、全長cDNAの塩基配列、アミノ酸配列が決定されたため、ヒトのhomologueの検索を行い、ヒト遺伝子のほぼ全長が獲得され、現在は、内臓逆位の家系でのmutation検索を行っている。2.アミノ酸配列によりoligoおよびfusion proteinをもとにして、polyclonal抗体を作製しているが、主として腎尿細管の細胞質に染色性を認めており、確認を行っている状況である。今後はラットリンパ節法によりinonocIonal抗体の作製を行う予定である。3.嚢胞腎の組織学的検討。嚢胞は腎遠位集合尿細管を中心に認められるが、膜蛋白の局在は正常なpolarityを維持していることを学会等で報告した。Cytokeratinなどの細胞質蛋白は、その染色性が低下しておりやはり細胞骨格の異常を示唆する所見と考えられた。今後は、抗体の完成により発現、局在の検討を進めること、およびgreen fluorescence protein(GFP)などの手法を用いて細胞内での局在を可視化する計画である。また、ヒトにおいては内臓逆位家系でのmutationの同定により、本遺伝子の体幹形成での役割を明らかにすることが可能と考えられるが、さらに腎の低形成、胆道閉鎖などの上皮細胞の異常に起因するとかんがえられる疾患群での本遺伝子の関わりを検討する予定である。研究者らは挿入変異により新たに発生した内蔵逆位、嚢胞形成腎を有するトランスジェニックマウスの組織学的、分子生物学的検討を行ってきた。内蔵逆位、嚢胞形成腎がほぼ100%生じ、かつ膵臓嚢胞、胆道閉鎖などの上皮細胞の形成、機能異常が原因と推測される奇形を合併する。前年度に、ほぼ候補遺伝子の塩基配列が最終的に決定されたため、本年度は以下を研究目的とした。1,すでにマウスinv遺伝子のクローニングに成功しており、その遺伝子配列を基にヒトでのhomologue遺伝子を単離した。2,inv遺伝子の機能および解析を行った。上皮細胞の細胞質蛋白に類似する構造が認められており、尿細管形成そのものに如何なる影響を与えうるかを検討するため、発現ベクターをMDCK cellおよびLLCPK cellに遺伝子導入し、膜蛋白、主としてNa/K ATPaseなどの酵素活性、蛋白量発現を検討した。Na/K ATPaseのmRNA発現が亢進する傾向が認められた。得られたcDNAを用いて胎生期マウスでin situ hybridizationを行い、発現時期、部位を検索、胎生15日から腎、肝を中心に発現が確認された。他には胎生期の網膜での発現が高度であった。
高度に5員環の縮環した新奇不飽和炭化水素の合成研究

8員環のまわりに2つの5員環が縮合した完全不飽和炭化水素、ジシクロペンタ[a,d]シクロオクテン(1)及びジシクロペンタ[a,c]シクロオクテン(2)、と3つないし4つの5員環が縮合した炭化水素並びにイオン種化合物の合成について検討した。1については短段階の合成経路を確立し、その構造について平面性が高く反磁性的な芳香族的な性質(diatropic)を持つこと明らかにするとともに、二三の物性に関する検討を加えた。なお、本研究費で購入した熱反応装置並びにGC分析装置は合成経路の開発における迅速な研究推進に卓越した効果をもたらした。これに引き続き、異性体である2の合成を以下の二つの経路で検討した。一つはジメチルアミノフルベンをその1位で二量化した後、ジメチルアミノ基をビニル基ないしその等価体と置換し、電子環状反応によって骨格形成し、最終的にもう一つのアミン基の脱離を経て目的物に至るルートある。この合成経路の初段階についてはジメチルアミノフルベンのクロロスクシイミドによる塩素化とそれに続くニッケル錯体を用いた二量化までには成功したが、予想に反してビニルアニオンとの付加反応が進行せずこの経路での合成を断念した。もう一つの経路として、シクロペンタ[b]チアピラン(チアレン)の硫黄部酸化物とフルベンとの環状付加反応による経路を計画し、原料となるチアレンの簡便な合成法を種々検討した。6-(ジメチルアミノビニル)フルベンと硫黄との熱反応による新たなチアレンの合成法を見出したが、グラムスケールでの合成には向ず、後者の経路も半ばにてその合成を断念せざるを得ない結果となった。さらに、8員環のまわりに3つないし4つの5員環が縮合した炭化水素並びにイオン種化合物の合成についても検討した。拡張性を考慮してフルバレニルジアニオンと種々のジカルボニル化合物との縮合反応による合成計画を立案したが、予備検討を行った段階に留まった。なお、ジシクロペンタオクテン類について化学計算をもとに構造と化学反応性についても調べた。8員環のまわりに幾つかの5員環が縮合した完全不飽和炭化水素の合成研究に着手した。まず、2つの5員環が縮合した化合物、ジシクロペンタ[a,d]シクロオクテン、の合成法について検討した。14pi電子環化反応による経路で種々の条件下熱反応を試み、低収率(2%)ながら目的物を得る製法を確率した。この化合物は赤褐色の鱗片状晶で、そのスペクトルデータは化合物の高い芳香族的性質を示した。例えば、水素磁気共鳴スペクトルは化合物のC_<2V>対称性を支持し、8員環が通常平面性を取り難いにも関わらず本化合物が平面であることを示した。また、サクリックボルメトリーによって可逆な酸化および還元波が観測され多段階レドックス化合物の設計に新たな指針を与える結果となった。さらに、その結晶構造について調べるべくX線構造解析に向けた単結晶の作成を検討したが、適正な結晶を得るには至っていない(継続検討する)。一方、異性体であるジシクロペンタ[a,d]シクロオクテンについてもその合成検討を開始した。当初予定した合成法はジシクロペンタジエニルジアニオンを利用するものであり、ジアニオンの生成とそれに続くアルデヒドならびにケトン類との縮合環化について広範な範囲の条件で検討を行っている。

しかしながら、いずれの反応においても目的物は得られず、今後反応生成物の詳細を調べると同時に反応制御の新手法を模索することが必要と考えている。また、後者の合成については新たに拡張性の高い環状付加反応による経路を計画し、実施に向け準備中である。8員環のまわりに2つの5員環が縮合した完全不飽和炭化水素ジシクロペンタ[a,d]シクロオクテンの合成についてすでに報告した。そのX線構造解析に向けた単結晶の作成を鋭意検討したが、適当な結晶を得るには至ってない。一方、異性体であるジシクロペンタ[a,c]シクロオクテンについてその合成検討を開始した。当初予定した合成法はジシクロペンタジエニルジアニオンを利用するものであり、ジアニオンの生成とそれに続くアルデヒドならびにケトン類との縮合環化について広範な範囲の条件で検討を行ったが、いずれの反応においても目的物は得られなかった。そこで、後者の合成について新たに拡張性の高い方法を考案した。本方法はジメチルアミノフルベンをその1位で二量化した後、一つのジメチルアミノ基をビニルアニオンないしその等価体と置換し、電子環状反応によって骨格形成し、最終的に脱アミンを経て目的物に至るものである。現在までのところ、この合成経路の初段階にあたるジメチルアミノフルベンの二量化について検討を行った結果、クロロスクシイミドによるモノ塩素化とそれに続くニッケル錯体を用いた二量化に成功している。現在、この原料の効率的な合成と標的化合物への誘導について検討している。本法の特徴として、当初予定した5員環がさらに縮合した化合物への誘導が可能な点と、段階数が少なく大量合成に向けた検討が比較的容易なところ挙げることができる。8員環のまわりに2つの5員環が縮合した完全不飽和炭化水素、ジシクロペンタ[α,d]シクロオクテン、の合成についてはすでに報告した。これに引き続き、異性体であるジシクロペンタ[a,c]シクロオクテンの合成を以下の二つの経路で検討した。一つはジメチルアミノフルベンをその1位で二量化した後、ジメチルアミノ基をビニル基ないしその等価体と置換し、電子環状反応によって骨格形成し、最終的にもう一つのアミン基の脱離を経て目的物に至るルートある。この合成経路の初段階についてはジメチルアミノフルベンのクロロスクシイミドによる塩素化とそれに続くニッケル錯体を用いた二量化までには成功したが、予想に反してビニルアニオンの付加反応が進行せずこの経路での合成を断念した。もう一つの経路として、シクロペンタ[b]チアピラン(チアレン)の硫黄部酸化物とフルベンとの環状付加反応による経路を計画し、原料となるチアレンの簡便な合成法を種々検討した。6-(ジメチルアミノビニル)フルベンと硫黄との熱反応による新たなチアレンの合成法を見出したが、グラムスケールでの量合成には向かず、後者の経路も半ばにてその合成を断念せざるを得ない結果となった。一方、ジシクロペンタオクテン類について化学計算をもとに構造と化学反応性について調べた。非経験的分子軌道法計算による最適化構造をもとめ、いずれも平面性が高く反磁性的な性質(diatropic)を持つものと予測できた。さらに、縮環位置による性質の違いについても検討を加えた。
文章読解時の語の意味特定における評価及びモニタリングストラテジーの指導法の検討

文章を深く理解するためには、文脈に応じた語の意味を理解しながら読む必要がある。しかし、日本語学習者にとって、この文脈に応じた語の意味特定は難しい。本研究では、文章読解中の語の意味特定の成否に大きく関わる評価及びモニタリング、すなわち、自身の理解が正しいか否かを考えながら読み進める方略に着目し、日本語学習者を対象とした調査を行い、その指導方法の提案を行う。
筋骨格系の形態的制約に基づく霊長類の樹上四足歩行シミュレーション

化石から類人猿の運動を推定することは,ヒト化における運動様式の進化とその要因を解明する上で極めて重要である。従来,現生霊長類の骨形状・骨格構造と化石形態の相関から,このような運動推定は行われてきた。しかし,形態学的手法のみでは,その大まかな移動様式を推定できても,そのダイナミックな運動を再現し,視覚化することは困難であった。そのため本研究では,霊長類の形態・構造的制約から,霊長類の四足歩行運動を再現するシミュレーションモデルの構築を行った。具体的には,4足性の霊長類の例としてニホンザルの3次元筋骨格モデルを構築し,4足歩行を生成しうる新しい神経回路モデルの実装を試みた。筋骨格系は16節3次元剛体リンクモデルとしてモデル化し,運動方程式を導出した。各節の慣性パラメータは各節を楕円錐台と近似して推定して運動方程式に入力し,ニホンザルの身体運動を計算,可視化した。一方神経系については,歩行の基本的リズムを生成する神経発振回路に,姿勢を安定に保つよう四肢を協調的に動かす姿勢制御神経系を統合した,新しい神経回路モデルを提案し,それを身体力学系に実装した。これは,従来提案されている動作生成手法とは異なり,身体の構造的制約に則った運動を自律的に生成しうる。そのため,例えば体節長や関節可動域などを変化させたときの運動変化の推定が可能となる。本モデルを用いて,自律的な運動生成を試みた結果,外乱に対して適応的に姿勢を保持した歩行を生成することができた。生成された歩行は,現在のところニホンザルの実歩行計測データと一致するものではないが,本モデルは従来手法にない優れた適応性と,視覚制御との統合や様々な移動様式への対応など高い拡張性を有している。すなわち本提案のモデルは,人類学的視点からの運動復元に留まらず,霊長類の歩行メカニズムの進化過程の解明に向けた研究への応用も可能であり,今後の多様な発展性を示唆した。本年度は,4足性の霊長類の例としてニホンザルの3次元筋骨格モデルを構築し,4足歩行を生成しうる新しい神経回路モデルの実装を試みた。具体的には,まず申請のビデオカメラによってニホンザルの4足歩行の運動計測を行い,運動の特徴やモデリングのポイントを抽出した。そしてその結果に基づき,サルの身体力学系を16節3次元剛体リンクモデルとしてモデル化し,運動方程式を導出した。各節の慣性パラメータは各節を楕円錐台と近似して推定して運動方程式に入力し,申請のコンピュータ上でニホンザルの身体運動を計算,可視化した。このようなリンクモデルを地面に置いたとき崩れないようにし,歩行を生成するのが感覚運動神経系の役割であるが,樹上での歩行を再現するには,身体のバランスをとりつつ四肢を動かすことが求められる。そのため本研究では歩行の基本的リズムを生成する神経発振回路に,姿勢を安定に保つよう四肢を協調的に動かす姿勢制御神経系を統合した,新しい神経回路モデルを考案した。これは体幹の傾きに応じて各肢の反力を調整するように自律的に関節トルクを発揮するものである。ニホンザルの身体力学モデルにこの神経回路モデルを実装して自律的な運動生成を試みた結果,外乱に対しても適応的に姿勢を維持して擬似足踏み動作を生成することができ,霊長類4足歩行の神経回路モデルとして有効であることが示唆された。また、ニホンザルの肩関節の可動特性(関節受動抵抗)を,荷重計と3次元座標計測器を用いて測定し,その3次元特性を表す数式モデルを構築した。現在,このような関節や筋の形態学的情報のモデルヘの組み込みを行っており,これら身体構造的制約に基づいた自然な歩行運動を生成することを目指している。

すなわち本提案のモデルは,人類学的視点からの運動復元に留まらず,霊長類の歩行メカニズムの進化過程の解明に向けた研究への応用も可能であり,今後の多様な発展性を示唆した。
胎児アデノシンのtumor necrosis factor-α産生抑制機構の研究

成人においてアデノシンのtumor necrosis factor-α(TNF-α)産生抑制作用が注目されている。今回この調節機構に着目し、胎児アデノシンとTNF-α産生機構を検討した。さらに胎児・胎盤系および妊娠中毒症におけるアデノシンとTNF-αの関係についてもさらに以下の研究実績を得た。(1)子宮内感染モデルにおける胎仔アデノシンおよびTNF-α産生の検討子宮内慢性実験モデルを作成し、術後7日目に母獣大腿静脈、羊水中に大腸菌由来のlipopolysaccharide(O111:B4)を投与し、子宮内感染モデルを作成し、胎仔血中、羊水中のアデノシンおよびTNF-α濃度の変化を検討した。その結果胎仔血中、羊水中のアデノシン濃度は増加するが、TNF-α濃度は一定であることが判明した。(2)胎仔アデノシンのTNF-α産生調節機構の検討1.アデノシンagonist投与によるTNF-α産生の変化の検討子宮内感染モデルにおいてアデノシンのagonistを投与し、TNF-α産生の変化を測定した。その結果アデノシンのagonistを投与するとTNF-α産生は抑制された。2.アデノシンantagonist投与によるTNF-α産生の変化の検討子宮内感染モデルにおいてアデノシンのantagonistを投与し、TNF-α産生の変化を測定した。その結果、antagonistを投与後するとTNF-α産生は増加した。(3)妊娠中毒症におけるアデノシンとTNF-αの関係の検討妊娠中毒症におけるアデノシンはTNF-α抑制機構を介して、血小板凝集を抑制することを解明した。以上よりアデノシンはTNF-α産生調節機構において中心的役割を担い、胎内ストレス対する適応機序に深く関与することが明らかになった。アデノシンのtumor necrosis factor-α(TNF-α)産生抑制作用が注目されている。今回この調節機構に着目し、子宮内感染における胎児アデノシンとTNF-α産生機構を検討した。本年は以下の研究実績を得た。(1)子宮内感染モデルにおける胎仔アデノシンおよびTNF-α産生の検討1.ヒツジ胎仔慢性実験モデルの作成妊娠125日前後の妊娠ヒツジ母獣の大腿動静脈、羊水腔および胎仔の頚動静脈および大腿静脈にカテーテル類を装着しヒツジ胎仔慢性実験モデルを作成した。2.胎仔子宮内感染モデルの作成およびアデノシン、TNF-α濃度の測定術後7日目に母獣大腿静脈、羊水中に大腸菌由来lipopolysaccharide(O111:B4)を投与し、子宮内感染モデルを作成し、胎仔血中、羊水中のアデノシンおよびTNF-α濃度の変化を検討した。以上よりアデノシンはTNF-α産生調節機構において中心的役割を担うことが判明した。

(1)子宮内感染モデルにおける胎仔アデノシンおよびTNF-α産生の検討妊娠125日前後の妊娠ヒツジ母獣の大腿動静脈、羊水腔および胎仔の頚動静脈および大腿静脈にカテーテル類を装着しヒツジ胎仔慢性実験モデルを作成した。術後7日目に母獣大腿静脈、羊水中に大腸菌由来エンドトキシン(O111:B4)を投与し子宮内感染モデルを作成し、胎仔血中、羊水中のアデノシンおよびTNF-α濃度の変化を検討した。その結果胎仔血中、羊水中のアデノシン濃度は増加するが、TNF-α濃度は一定であることが判明した。(2)胎仔アデノシンのTNF-α産生調節機構の検討子宮内感染モデルにおいてアデノシンのagonistを投与し、TNF-α産生の変化を測定した。その結果アデノシンのagonistを投与するとTNF-α産生は抑制された。さらに子宮内感染モデルにおいてアデノシンのantagonistを投与し、TNF-α産生の変化を測定した。その結果、antagonistを投与後するとTNF-α産生は増加した。また、Th1/Th2バランスもTNF-α抑制機構を介して、アデノシンが中心的役割を担うことが判明した。
遷移域を含めた乱流制御による翼の摩擦抵抗・騒音低減に関する研究

リブレットを用いた表面操作による遷移領域を含む摩擦抵抗低減および層流域での狭帯域音発生に対するラフネスの影響の解明と抑制制御の2つの主課題に取り組む.リブレットを乱流楔や乱流斑点の発達領域を含む遷移域にも適用し,乱流楔内の摩擦抵抗低減のみならず,乱流楔の成長抑制すなわち層流域の拡大によって更なる摩擦抵抗低減を目指す.また,層流域が拡大した場合,壁面のわずかな段差や孤立粗度があれば,それが起点として音響フィードバックループが形成され強い狭帯域音が発生する.このフィードバック音発生に対するラフネスの許容範囲を明らかにし,その抑制指針を確立する.リブレットを用いた表面操作による遷移領域を含む摩擦抵抗低減および層流域での狭帯域音発生に対するラフネスの影響の解明と抑制制御の2つの主課題に取り組む.リブレットを乱流楔や乱流斑点の発達領域を含む遷移域にも適用し,乱流楔内の摩擦抵抗低減のみならず,乱流楔の成長抑制すなわち層流域の拡大によって更なる摩擦抵抗低減を目指す.また,層流域が拡大した場合,壁面のわずかな段差や孤立粗度があれば,それが起点として音響フィードバックループが形成され強い狭帯域音が発生する.このフィードバック音発生に対するラフネスの許容範囲を明らかにし,その抑制指針を確立する.
定住外国人への日本語教育の組織度とその言語使用におけるクレオール化の研究

前年度に引き続き、日本語教室への参加およびその調査を行った(豊橋市めだかの学校、川崎市高津区民館等)。また、今年度の課題としていた、日本語の授業の録音・録画資料の分析を進めた。また、国内のいくつかの地域における日本語教室の布置に関する資料を得た。本研究は、組織度研究とクレオール研究の2つを行うものだが、前者に関しては、フォーマルな日本語教育の整備状況とノンフォーマルな日本語教育の取り組みがどのように現在の日本語教育の風景を構成しているかをある程度明快に把握することができた。そして、ノンフォーマルな日本語教室は、制度的にあいまいなために、日本語を教える/学ぶという事件が制度化されていく過程が露骨にあらわれるかと思えば、原初的なコミュニケーションの場として制度化に絶えず失敗していることもある、という考察に重要と思える視点を得ることができた。クレオール化研究は、上述のノンフォーマルな日本語教室における日本語を教える/学ぶことが持つ事件性の立証に不可欠のものとなった。これは、本研究開始時に予感されていた両研究テーマ(組織度研究、クレオール化研究)のリンクが明確になったということであり、喜ばしく感じている。現在、参与観察資料と録音・録画資料をプロセスすることを通してクレオール化研究を進めている。まだ途次にあるものの、教師のティーチャートーク等の現象が、論じるのに十分なデータを提供してくれると考えている。本年度中に報告書を出すという当初の計画は先のばしになったが、日本語の授業の録音・録画資料の分析を完遂させて、できるだけ早く成果を公表していと考えている。都内の中国帰国者の日本語教室、日系人の多い豊橋市の日本語教室、国際結婚の女性の多い秋田県の日本語教室等の見学・調査を行った。授業に参加し、メンバーの声をきくことで、日本語教室の現状の機能と可能性について、ある程度見通しを得た。ノンフォーマルな日本語教室は、現状の機能としては、「ボランティア教室」と言われるような広い援助の場として存在し、その下位機能として日本語の修得のための教育の場、国際交流の場、居場所としての空間等々、様々な要素が引き受けられている。組織としての性格は、時間的にも参加者的にも限定されているという制約が大きく、そのため「地域的」ではなく局所的で濃密な空間となっている。その濃密さは、一方では教師側の仕事量の多さと、教師側・学習者側双方の達成に関する不全感となっているが、一方ではこたえられないコミュニケーションの場となっている。今後、日本語教室の可能性を論じるに際し、以上のような把握から、ノンフォーマルな教育実践の内部的改革(実践面での「どうすれば」「こうすれば」に応えるかたちの論。現在の主流)についてではなく、フォーマルな教育及び社会の空気としてのインフォーマルな教育を含めた組織の整備について追求する。原則論ではなく、「こたえられないコミュニケーション」の内実を、録画・録音し現在分析中の資料から解明し、アピールしたい。また、購入した文献資料等で、ヨーロッパ諸国の状況も参考にできる段階にあるので、比較しつつ論じたい。
中学校図形領域における協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導に関する研究

1.研究の目的(1)協同学習を取り入れた数学的活動を促す教材開発を中学校2年図形領域の内容を中心として行うこと。(2)中学校2年図形領域における,協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導の効果や問題点を事例的に明らかにすること。(3)昨年度の研究で指摘された問題点について,改善の方向性を実践授業を通して見いだすこと。(4)上記(2)(3)を踏まえ,協同学習を取り入れた数学的活動を促す授業づくりの示唆を得ること。2.研究の方法ジグソー法による指導を念頭に,中学校2年図形領域の内容を中心に教材開発を行う。その際,特別な課題を用意するのではなく,教科書にある問題から新たな教材を開発する。また,各学校の公開研究会などへ参加し,情報収集を行い,協同学習を取り入れた数学的活動を促す指導の意義について検討する。先行研究をふり返り,そこで扱った題材を改善したものを実践することで新たな教材づくりにつなげる。実践授業における生徒の活動をワークシートやアンケートなどでとらえ分析することを通して,ジグソー法を取り入れた指導が数学的活動を促すことにどのように関わるかを事例的に明らかにし,知見を得る。3.主な知見(1)多角形の内角の和を求める指導において,ジグソー法を取り入れた指導は有効に働き,多くの生徒はn角形の内角の和を求めることができた。(2)平行四辺形になるための条件について考察する際,協同学習を取り入れることは意味のある活動となる。その際に,数学が苦手な生徒が含まれているグループを中心にグループで思考するための手立てを与えることはある程度有効であり,先行研究に見られたような間違った理解を少なくすることができた。(3)平行四辺形になるための条件を考察する授業において,難度の高いものついては,協同学習による解決が終わった段階で,全体の中で解決方法を共有することにより,生徒たちの理解が深まることが多い。
ヌクレオチド除去修復を介したRNAiマシナリーによるゲノムDNA品質管理機構

ヌクレオチド除去修復(NER)は紫外線によって生じたDNA損傷を修復し、特に発ガンの抑制に寄与する重要な生体防御機構である。本研究課題では、効率の良いNERの開始にRNA干渉(RNAi)関連因子が必要であるとの予備的知見に基づき、特にRNAiのエフェクタータンパク質であるARGONAUTEに対してノックダウン実験や紫外線照射前後の細胞核内における局在・相互作用因子の検討を行うことで、核内RNAiによって制御されるDNA損傷認識の分子機構を明らかにする。
糸粒体膜電位の低下、核ヌクレオボディ形成と細胞老化及び細胞死の誘導に関する研究

直接蛍光標識した抗S1-1-Z及び抗S1-1-p130抗体、並びに抗PMLアイソフォーム抗体を使用し、培養ヒト正常細胞(TIG3S)、腫瘍細胞、ラット及びヒト正常組織におけるS1-1及びPMLヌクレオボディの動態を観察した。若いTIG3S細胞では、S1-1ヌクレオボディが稀に観察され、PML2,4,5,6のヌクレオボディも顕著に観察された。さらにS1-1及びPML6ヌクレオボディの共局在が確認された。HeLa細胞では、S1-1ヌクレオボディは殆ど観察されず、S1-1及びPMLの顕著な細胞質局在、主にPML2及びPML6のヌクレオボディ、稀にPML4及びPML5のヌクレオボディが観察された。分裂の盛んな若いTIG3SやHeLa細胞では、S1-1ヌクレオボディが稀に存在した。またHeLa及び若いTIG3S細胞のS1-1p110蛋白質レベルは非常に低く、逆にS1-1p130蛋白質は高レベルであった。さらにHeLa細胞のS1-1p130レベルは、TIG3S細胞の3倍程も高レベルであった。PML及びS1-1(RBM10)の各アイソフォームのアミノ酸配列中には、多数のプロテインキナーゼC(PKC)及びカゼインキナーゼ2(CK2)のリン酸化部位が存在する。そのため、カゼインキナーゼ(CK2)の活性が強いHeLa細胞では、CK2-リン酸化修飾(PMLの517番目のセリンS^<517>)を受けたPML蛋白がプロテアソームで分解される。しかしながら、S1-1p130(RBM10 variant-1)は非常に安定であった。PKC及びCK2阻害剤を投与したHeLa及びTIG3S細胞では、S1-1ヌクレオボディの発達が認められ、リン酸化修飾によりS1-1ヌクレオボディの構築が抑制されることが示唆された。PKCとCK2阻害剤により、HeLa及びTIG3S細胞の細胞死が誘導され、それらの増殖も強く阻害された。研究代表者は、老化細胞においてリン酸化修飾が亢進されるp53の376番目セリンに対する抗体を作成した。現在、抗リン酸化セリン376-p53抗体を用いて、リン酸化p53の細胞質局在を解析中である。さらにS1-1分子のZドメイン及びS1-1p130のXドメインに対する抗体も作成した。上述の抗S1-1抗体及び抗PMLアイソフォーム抗体を用いて、ヒト正常細胞及び腫瘍細胞における局在、並びに発現レベルを解析した。両細胞において、S1-1p110分子の細胞核局在が明らかであったが、S1-1ヌクレオボディを認めなかった。またP130X抗体は顕著な細胞質局在を示した。正常細胞においては、PMLアイソフォーム2,4,5,6は核ヌクレオボディを形成していたが、HeLa細胞において顕著な細胞質局在が観察された。PML3に関して、両細胞とも中心体への局在を示した。正常細胞及びHeLaのPML2,3,5,6の蛋白レベルは同様であった。しかし、正常細胞に比べて、HeLa細胞のPML4蛋白レベルは極めて低かった。

正常細胞と比較して、HeLa細胞におけるS1-1p130の発現は極めて高く、HeLa細胞の高い増殖能との関連が示唆される。HeLa細胞では、腫瘍抑制蛋白PMLの核ヌクレオボディ形成が阻害されることが明らかになった。S1-1ヌクレオボディはスプライシング因子SC35がつくるヌクレオボディに隣接・接続して存在していた。またRNAスプライシング阻害剤:FR901464の処理により、S1-1ヌクレオボディはダイナミックに変化し、大きくなって数を減らした。さらに転写阻害剤Act Dにより同様な変化が認められ、splicingを抑制されたpre-mRNAはS1-1 bodyに局在することが示唆された。今後、S1-1p130蛋白質の細胞増殖制御並びにスプライシングにおける機能を明らかにすることが重要と考えている。直接蛍光標識した抗S1-1-Z及び抗S1-1-p130抗体、並びに抗PMLアイソフォーム抗体を使用し、培養ヒト正常細胞(TIG3S)、腫瘍細胞、ラット及びヒト正常組織におけるS1-1及びFMLヌクレオボディの動態を観察した。若いTIG3S細胞では、S1-1ヌクレオボディが稀に観察され、PML2,4,5,6のヌクレオボディは顕著に観察された。さらにS1-1及びPML6ヌクレオボディの共局在が確認された。PKC及びCK2阻害剤を投与したHeLa及びARL細胞では、S1-1ヌクレオボディの発達が認められ、リン酸化修飾によりS1-1ヌクレオボディの構築が抑制されることが示唆された。PKCとCK2阻害剤により、HeLa及びTIG3S細胞の細胞死が誘導され、それらの増殖も強く阻害された。ラット組織では、S1-1抗体の局在が細胞質に顕著に観察され、核内の発現は認められなかった。このため、ラット組織アレイ解析を中止した。そこで、ヒト正常組織、癌組織アレイ(脳、皮膚、食道、喉頭、喉頭咽頭、扁桃腺、甲状腺、肺、腎臓、尿管、乳腺、子宮頚部、子宮、卵巣、精巣、前立腺、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、結腸、リンパ節を使用)、でのS1-1蛋白質・S1-1ヌクレオボディを観察した。正常組織において、S1-1ヌクレオボディが観察されたのは、乳腺の乳管細胞、胆嚢の粘膜ヒダ組織、喉頭蓋層扁平上皮、膵臓(稀に大きいS1-1ドットが)であった。これら以外の器官では、S1-1の細胞質局在が顕著であるか、核質全体にその分布が認められた。腎臓の腺癌は稀に、扁桃腺の扁平上皮癌は、際立って発達したS1-1ヌクレオボディを持つ細胞が認められた。その他の癌組織では、S1-1は顕著な細胞質局在を示すものが多かった。扁桃腺の癌を例外として、多くの癌組織ではS1-1ヌクレオボディは発現していないと考えられた。.
糖尿病患者のパターンマネジメント援助指針と支援ツールの開発

血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実施状況では「SMBGの結果をもとに血糖値の高低や変化の原因を患者と一緒に考える」では85%が実施しているなど、多くの糖尿病看護認定看護師が看護実践の中でパターンマネジメントを活用している実態が明らかとなった。さらに、自由記載の「着目している血糖値の変化」「支援のコツ・秘訣」などを質的帰納的に分析し、血糖値記録用紙の使用方法、血糖に影響する要因についてまとめ、血糖値記録用紙、生活を把握するためのワークシートなどの支援ツールを作成した。加えて、糖尿病看護認定看護師11名に面接を行い、血糖パターンマネジメントの援助指針を明らかにしている。現在行われている血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実態を把握することを目的に血糖パターンマネジメントに関する看護実践に関する自記質問紙を糖尿病看護認定看護師303名に郵送し、返送のあった148名を対象に分析した。回収率は48.8%、無回答であった1部を除き147部を有効回答とした。回答者の年齢は42±6.7歳で、糖尿病看護認定看護師としての経験年数は平均3.4±2.7年であった。糖尿病看護認定看護師が実践の中で着目している血糖値の変化、その変化の要因、その変化に影響する地域特性についての自由記載を質的帰納的に分析を行った。その結果、着目する血糖の変化は【一時点の低血糖・血糖の低値・高値】【連続した血糖の変化】【身体状況に伴う血糖の変化】【血糖の年・月・週サイクルパターン】【治療に伴う血糖の変化】【記録だけに頼らない推測】のカテゴリーに分類できた。これらの変化の要因は、【インスリン注射や内服の方法に関する要因】【SMBGに関する要因】【食事に関する要因】【活動・運動に関する要因】【身体状態や糖尿病以外の治療に関する要因】【生活状況に関する要因】【精神面の要因】のカテゴリーに分類できた。さらに地域特性の視点として【年齢・家族構成の特性】【立地環境】【気候】【食文化】【コミュニティーの特性】【産業特性】のカテゴリーに分類できた。これらの結果は、複雑な要因が絡み合って変化する血糖値を患者とともに分析し、その患者にあった自己管理方法を見つけていくうえで、重要な視点を示していると言える。今後は、これらの結果を踏まえて、パターンマネジメントの援助指針明確化と支援ツールの開発を専門家会議を開催して行い、実証研究に繋げる予定である。現在行われている血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実態を把握することを目的に糖尿病看護認定看護師に自記式質問紙調査を実施した。148名より回答があり、糖尿病看護認定看護師が実践経験の中でつかんだ血糖パタンマネジメントの支援のコツ・秘訣、パターンマネジメントの除外基準についての意見、困難・悩みについての自由記載を質的帰納的に分析を行った。1.支援のコツ・秘訣は、≪信頼関係・なんでも話せる関係・雰囲気作り≫≪患者および主体性を尊重した関わりの工夫≫≪患者の生活状況・思いや考えについて具体的に聞く≫≪患者と一緒に考える≫≪パターンマネジメントに関する必要な教育内容≫≪パターンマネジメントを行う上での支援の工夫≫≪血糖値と記録ノートの活用の工夫≫≪パターンマネジメントを行う上での医師との連携≫の8つのカテゴリーに分類できた。2.パターンマネジメントの除外基準についての意見は、《パターンマネジメントを行うことが難しい身体状況をもつ》《医療者と協力関係が築けていない》《パターンマネージメントを行うだけの準備状態が整っていない》《パターンマネジメントでコントロールの悪化や不安感を増す可能性がある》《パターンマネージメントで負担感が増す恐れがある》《経済的に負担になる》《パターンマネジメント困難、不適応な人はいない》の7つのカテゴリーに分類できた。3.困難・悩みについては、《PMの関わりが難しいと感じる患者の状況がある》《医師・他職種との連携が難しい》《パターンマネジメントに関するスタッフ教育での困難がある》《パターンマネジメントに対する看護師自身の知識や経験不足がある》《患者に提供する教育内容に不足がある》《看護実践に関するシステム・環境が整備されていない》の6つのカテゴリーに分類できた。これらの結果をもとに現在、援助指針と支援ツールを作成中である。まず、第1段階として、現在行われている血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実態を把握するために、質問紙調査を行った。血糖パターンマネジメントに関する看護実践に関する自記質問紙を糖尿病看護認定看護師303名に郵送し、返送のあった148名を対象に分析した。その結果、回収率は48.8%、無回答であった1部を除き147部を有効回答とした。糖尿病患者に対する個別指導・相談は1週間でのべ13.5±15.9人程度、1人当たり平均30.7±10.9分行われており、その内容については、「血糖値の変化(パターン)を患者と一緒に探す」114名(78%)「SMBGの結果をもとに血糖値の高低や変化の原因を患者と一緒に考える」125名(85%)がたいてい行うか毎回行うと回答している。血糖パターンマネジメントの実施に関しては「血糖パターンマネジメントは何らかの形で活用している」147名(100%)、あるいは「血糖パターンマネジメントの導入で血糖コントロール状態は改善しなかったが、その人のQOLの向上にはつながったと考えられる場合があった」

101名(69%)が該当すると回答している。血糖パターンマネジメントを実施している対象については、「1型糖尿病患者でSMBGを実施中の患者」と「インスリン治療中の2型糖尿病患者でSMBGを実施中の患者」に対しては147名全員が実施しており、またSMBGを実施中の患者に比べ割合は少ないが、SMBGを実施していない患者についても血糖パターンマネジメントが実施されているという結果であった。この結果を踏まえ、先進的な取り組みを行っている看護師へのインタビューを行い、糖尿病患者のパターンマネジメント援助指針の作成を行う予定である。これまでに行った血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実態調査の結果をまとめ、報告書を作成した。これをもとに、糖尿病看護認定看護師および慢性疾患看護専門看護師、糖尿病看護研究者5名による専門家会議を実施し、パターンマネジメント援助指針および支援ツールについての検討を行った。専門家会議では、今回の調査を踏まえて、血糖パターンマネジメント支援の基本的な教育自体が十分浸透している状況ではなく、その部分についての支援と、アドバンスな部分でのパターンマネジメント支援方法の検討が必要であるとの結論に至った。基本的な教育内容として、1目的・目標・治療方針の確認の必要性、2準備状況の確認、3血糖値記録用紙の使用方法、4血糖に影響する要因などについてが挙げられた。また血糖値記録用紙、生活を把握するためのワークシートなど支援ツール案が検討された。調査結果の報告および紀要的な教育内容と支援ツール案についての検討のため、糖尿病看護認定看護師を対象としたワークショップを名古屋、岡山で3回開催し、37名が参加した。ワークショップでは、血糖パターンマネジメントの教育ツールの意見、要望が出された一方で、多様な実践状況における血糖パターンマネジメント教育の難しさについても発現があった。これらの結果を踏まえて、さらに実践経験豊富な糖尿病看護認定看護師にインタビューを行い、パターンマネジメントの援助指針、支援ツールを検討・洗練していく予定である。現在行われている血糖パターンマネジメントに関する看護実践の実態を把握することを目的に糖尿病看護認定看護師に自記式質問紙調査を実施した。148名から回答があり、回答者の年齢は42±6.7歳で、糖尿病看護認定看護師としての経験年数は平均3.4±2.7年であった。血糖パターンマネジメントの実施状況では「血糖の変化(パターン)を患者と一緒に探す」では78%、「SMBGの結果をもとに血糖値の高低や変化の原因を患者と一緒に考える」では85%がたいてい行うか毎日行うと回答していた。糖尿病看護認定看護師が実践経験の中でつかんだ、「着目している血糖値の変化」「その変化の要因」「その変化に影響する地域特性」「血糖パタンマネジメントンも支援のコツ・秘訣」、「パターンマネジメントの除外基準」、「支援場の困難・悩み」について自由記載を質的帰納的に分析を行った。
大規模生体バイオイメージングのための要素技術開発

生体組織深部は、その屈折率の不均一性のために、励起光が一点に収束せず、球面収差を生じる。つまり生体深部に存在する蛍光像を解像度良く捉えることが困難になる。球面収差の補正用に対物レンズには補正環が取り付けてられているものがあるが、この補正環を手動で回転させる必要がある。この補正は、深さに応じて行う必要があり、大規模な三次元像を得る際に大きなボトルネックとなっている。更に補正環による球面収差の補正は、焦点の移動を引き起こすため、最適な蛍光像の取得は、経験が頼りの煩雑な操作であった。今回、補正環の自動回転機構(Zlin-C)、および球面収差と焦点を最適に補正するアルゴリズム(Peak-C)を開発することにより、生体深部から解像度の高い三次元像を取得する自動球面収差補正系(Deep-C)を開発することに成功した。Deep-Cを用いて、麻酔下のマウス(神経細胞にYFPを発現する系統)の体性感覚野の神経細胞の観察を行うと、V/VI層の錐体細胞の微小構造スパインも明瞭に観察された。無調整の補正環の条件下では、その画質は大幅に低減したことから、Deep-Cの有用性が示された。最後に、マウス脳におけるDeep-Cの動作を、屈折率を指標に定量的に評価した。Deep-C補正データ(焦点の深さと補正環回転角)から屈折率を算出することが可能である。組織透明化試薬、ScaleA2により一様にした屈折率(1.38)とDeep-C補正係数により得られた屈折率(1.384-1.380)は完全に一致した。この結果は、Deep-Cによる補正が期待通りに機能していることを定量的に示している。今回開発したDeep-Cは対物レンズの補正環の自動調整機構であるため、顕微鏡システムへの組み込みが比較的容易であり、生体深部イメージングの標準的技術になることが期待される。<RETプローブ>(1) FRET型カルシウムプローブYC2.60を小脳プルキンエ細胞に発現するtransgenicmouse lineを用いて、小脳皮質(プルキンエ細胞)の発火の時空間パターンを大規模(4 x 8 mm @30 Hz)に計測することに成功した。(2)高輝度BRET(発光)型カルシウムプローブの開発に成功した。本プローブは励起光を必要としないため、光感受性の生命現象の基礎となるカルシウム動態解明のための基盤技術である。<細胞の個性>新規蛍光タンパク質Azalea (赤)およびh2-3(緑)を用いた改良型細胞周期プローブFucciの開発に成功した。<個体イメージング>(1)自動球面収差補正系(Deep-C)等、大規模イメージングに資する要素技術の開発を着実に進めている。(2)個体レベルの非侵襲イメージングにおいては、新規発光基質SeMpaiの開発を行った。SeMpaiは水溶性が高く、Flucと反応して近赤外発光を示し、従来のD-luciferin/Flucと比べ、深部組織においてがん細胞の高感度検出が可能であることを実証した。<RETプローブ>(1) FRET型カルシウムプローブを用いた大規模観察の小脳皮質プルキンエ細胞の発火パターンから時空間的相関を抽出する画像処理法を開発する。また、BRET(発光)とFRET(蛍光)を組み合わせたカルシウムプローブを、マウス網膜のメラノプシン発現神経節細胞に発現させ、青色光照射によるカルシウム動態を解析する。さらにFRETを介したオプトジェネティクス技術を用いて、脳深部の神経細胞の発火を誘導する新規技術を開発する。<細胞の個性>蛍光タンパク質Azalea (赤)およびh2-3(緑)を組み込んだ心気細胞周期プローブFucciの性能解析を行う。<個体イメージング>(1)レチノイン酸プローブのtransgenic mouse lineを用いて、RAome技術を完成させる。マウス個体およびマウスの発生時期の各種臓器(脳下垂体、生殖腺など)におけるレチノイン酸濃度勾配を解析し、濃度勾配の発生機序および生理的意義を探る。(2)人工生物発光システムAkaBLIを利用したカルシウムプローブを開発する。(3)固定脳組織透明化技術において、白質(髄鞘)を描出して3次元再構築する技術を開発する。我々は、レチノイン酸の蛍光プローブ哺乳類動物バージョンmGEPRA、ビリルビンの蛍光プローブUnaG、マイトファジーの蛍光プローブmSRAIを開発し、これらのプローブを発現するトランスジェニックマウスの作製を行っている。すなわち、ビタミンA代謝、ヘム代謝、自食現象の個体イメージングを目指している。個体イメージングに最適な、年齢、観察部位、手術(麻酔)の方法などの検討は、かなりの数のマウス個体を必要とし、3ヶ月から6ヶ月に渡る期間はそれぞれの結果にもとづいて次の策を練り上げることが重要である。実際の個体イメージングのための手技検討を行う予定であったが、平成27年度内にトランスジェニック個体の作製が間に合わなかった。年度繰越を行ったうえで、手技検討に取り組んだ。こうした取り組みと平行して、平成27年度には、レチノイン酸プローブmGEPRA-B(高親和性)、mGEPRA-G(中親和性)、mGEPRA-AAA(低親和性)については、培養細胞に振りかけたレチノイン酸に対する反応性を確認した。

ビリルビンプローブUnaG (Kd = 0.1 nM)については、2種類の親和性変異体UnaG2 (Kd = 2 nM), UnaG20 (Kd = 20 nM)を作製し、培養細胞で親和性の違いを確認した。また、細胞質膜を介するビリルビン移行のキネティックスを調べた。マイトファジープローブmSRAIについては、細胞に発現させ固定した状態でミトコンドリアのリソゾーム移行を可視化できることを確認した。mSRAIの発現細胞が創薬のためのドラッグスクリーニング系に利用できることを証明した。平成28年度には、mGEPRAのマウス個体のFRETを観察するための3次元顕微鏡システムの光学系のセットアップを行い、UnaGとmSRAIについては、AAVベクターによる遺伝子導入の準備を行った。さらに、マウス脳内mSRAIのシグナルを大規模に3次元観察することを目指して、透明化技術ScaleSを最適化した。レチノイン酸イメージングについて:GEPRA-BとGEPRA-AAAについては高発現のトランスジェニックマウスラインが得られた。GEPRA-Gについては理由は不明であるが低発現ラインしか得られていない。GEPRA-BおよびGEPRA-AAAのマウス胎仔からex vivoの系でFRETシグナルを定量的に計測する手技を確立した。脳下垂体、嗅覚器、胸腺、心臓、副腎について、非常に明確なレチノイン酸濃度の勾配を可視化することに成功している。全身丸ごとのイメージングについては、計画班の横田グループの3次元顕微鏡システムを使用する予定で、そのための顕微鏡システム(干渉フィルタ、ダイクロイックミラー、レーザー光源)などを準備した。ビリルビンイメージングについて:培養細胞系では、細胞が直接的に血清(ビリルビンを弱く結合するアルブミンに富む)に触れるため、in vivo状況を再現できない。とりあえずは、UnaG変異体(弱い親和性を示すUnaG2, UnaG20)を発現する培養細胞で、ビリルビン添加による細胞内ビリルビン濃度の変化を計測することで、膜を介するビリルビン動態を解析した。またゼブラフィッシュの卵にUnaG, UnaG2, UnaG20のRNA (試験管内転写産物)を導入することで、魚の胚発生に伴うビリルビン動態を観察した。マイトファジーイメージングについて:プローブ遺伝子の発現の時空間制御を行うためloxPシステムを採用してトランスジェニックマウス個体の作製を行っている。平成28年度終了においても、ラインの確認は未完了である。Fluoppiの実証実験を行い、p53とMDM2、FKBPとFRB、SmacとXIAP、HRasとcRaf、CalmodulinとM13などの相互作用の制御を秒単位の時間分解能でモニターできることを示した。こうした高い時間分解能はliquid phase dropletの動的内部構造によることを、蛍光の褪色や色変換に続く時間分解解析によって、証明することができた。さらに、4量体蛍光タンパク質AGの代わりに単量体蛍光タンパク質mAGを使用することで、観察対象(X)のホモ2量体化をモニターする手法、homoFluoppiを開発した。EGF刺激によっておこるERK2の2量体化を初めて生きた細胞内で観察することに成功し、ERK2の2量体形成はパルス状に起こること、細胞ごとにそのタイミングや回数が異なることを示した。
フジツボの接着機構の解明による界面認識型歯科用接着剤の研究

歯科診療における修復物の接着には,人工物である有機化合物が使用されているが,これらの材料は,口腔内の水分により接着剤の効果を阻害され,また溶出により生体に対する為害性や環境ホルモン等の問題をかかえている。そこで,本研究は,逆に,水分の溢れている口腔内の自然の状態を利用して,修復物と歯牙との接着を海洋に生息する自然の生命体(フジツボ)の接着機構に学び,新たな接着剤を開発しようと試みた。フジツボは,岩だけでなく船の底,漁網,発電所の排水管等海水中に存在する様々な素材,材質に付着できる優秀な接着剤としての機能を持っている。フジツボ幼生のセメント化に基づく永久固着は、alpha細胞から分泌されたセメント様物質が海水と接することにより粘着性を増し,beta細胞から分泌された顆粒状物質は徐々にセメント様物質に浸透してゆきpolyphenol-phenoloxidase系が有機の共有結合を造って力学的強度および接着強度を強固なものにしている。そこで,本研究では,alpha細胞から分泌されたセメント様物質およびbeta細胞から分泌された顆粒状物質の化学構造を明らかにし,界面における接着機構を検討した。その結果,alpha細胞からのセメント様物質は,主に接着性タンパク質のマトリックスであり,海水に接触することによりゲル化し,不溶化することにより接着する。このゲルが形成された後にbeta細胞からのpolyphenol-phenoloxidase系の分泌により接着が強化されることが判明した。このシステムは,接着性タンパク質を水分を用いてゲル化することにより,接着界面に応じた接着機構を作りだし,その後に接着を強化するものである。このシステムを応用して,現在,接着性タンパクを用いて,口腔内の水分を利用した2液混合型の歯科用接着剤の開発を行っており,さらに本研究は,生体に対する為害性のより少ない生体用接着剤の開発にも道を開くものと考えられる。伏谷接着機構プロジェクトでは、フジツボ幼生の永久固着(セメント化)のしくみについてalpha顆粒内容物が海水と接触すると粘着性が増し、固定の際にのりの役割を果たす。そして、beta細胞の分泌が始まり、beta顆粒内容物は徐々にalphaのり中に浸透してゆき、最終的にpolyphenol-phenoloxidase系が共有結合を造っていくことで力学的強度が得られるとの仮説を提唱している。本研究では、熊本県天草郡苓北町富岡の九州大学大学院理学府附属臨海実験所で採取したフジツボ幼生の着生行動の観察並びに標本作製を高橋、古賀が行った。標本作製はフジツボ飼育水槽中にスライドガラスを浸け着生させた。その後フジツボを機械的に除去し、接着面硬組織の構造解析はX線回折装置(XD-D1)にて、有機物の分析は、脱灰後、電子顕微鏡で、さらにガスマスおよびFTIRで定性分析を行った。バイオミネラルの分析は、原子吸光で行った。その結果、全ての標本から非晶質および結晶性の混在した炭酸カルシウムのピークが発現したことから、フジツボの固着様式に炭酸カルシウムが関与していると考えられた。タンパク質およびキチンからなる有機物は、網の目状構造をしており、剥離したスライドガラス上にも付着しており、接着性があるものと考えられる。今後、alpha顆粒内容物並びにbeta顆粒内容物の定性分析により新たな接着剤の分子設計の理論を確立することが重要となってくるものと考える。