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近・現代文学及びメディアの言説と「長崎」の相互交渉

本年度の研究は前年度から引き続き、「長崎」についての雑多な資料(公的文書を始め、パンフレット・市民読本等の雑本、文学系の単行本・同人誌、新聞記事・・・)を収集・分析することを通して、「長崎と関わる現在的な「われわれ」を問題化するものとなった。「長崎」と現在的に関わる際の一つの可能性を示している作品として、小説『長崎オランダ村』を論じる論考(1)。本研究の意義について、「長崎」のイメージ形成史を、幾つかの文学作品を解釈し評価する軸として有効なものに構築するという企図を述べた論考(2)。明治と昭和のある時期に求められた「長崎」の記念日について調査し、それを必要とする「われわれ」の欲望をあぶり出そうとした論考(3)。以上の三点が本年度の主な研究成果である。(1)の論考「内破される長崎-村上龍『長崎オランダ村』の一可能性として-」については、雑誌投稿中であった前年度の報告書に記したので省略する。(2)の論考「あたうかぎりエッセイへ-文学研究する「私」の言葉-」は、研究者自身の言説が生成される過程を巻き込む文体が必要であるとの立場から、報告者自身が「長崎」というテーマに出会い固執するに至った経緯に言及した。「長崎」のイメージがどのように作られ、その過程で誰/何が排除され、ゆえに如何に問題含みかを問うこと。と同時に、固定化したイメージとどのように格闘した作品であるかという観点を持つこと。そのために、不完全ながらも「私」という主語を立ち上げようとする、本研究の基本姿勢を確認した。一方、(3)の論考「カレンダーに書き込まれた「長崎」の記念日」は、具体的な資料と関わる側面が強い。『第一回長崎開港記念会記録』を中心に、「長崎」の記念日を創設し祝福しようとする言説を分析した。地方の活力が低下した時期に、均質な市民像を共有する公的な一日が設けられたことは、現在の様々な「われわれ」にとっても他人事でない光景として示唆深いはずである。報告者は、昭和一〇年代以降の「長崎」をめぐる言説を収集するため、また明治三〇年代の『東洋日の出新聞』にみえる言説を調査・収集するため、科学研究費補助金を使用して長崎市を訪れた。前者に関しては、市内の古書店及び長崎県立図書館で長崎案内記や地図を入手すること(県立図書館の資料はデジタルカメラでの撮影)が出来、その成果は論考にまとめた(1)。後者に関しては、県立図書館の所蔵する『東洋日の出新聞』の明治三五年四二年分の、長崎の地方色に関する記事をデジタルカメラで撮影することができ、原爆文学研究会での報告に活用する一方で(2)、二〇〇三年三月に刊行予定の『文献探求』誌に掲載予定の論考に取り上げた(3)。(1)の論考については、「村上龍『長崎オランダ村』を傍らに-長崎・故郷・内破-」という題で、長崎のように確固としたイメージをもつ土地を故郷としてアイデンティファイしようとする時の問題を、村上龍の小説『長崎オランダ村』から前景化しようとした。が、この論考は『日本文学』誌に投稿した結果不採用とされたため、現在手直しを進めているところである。(2)の報告(二〇〇二年一二月二八日、於九州大学)については、長崎の忘れられた言説に光をあてることを主眼とし、鈴木天眼らによって繰り広げられた、今の長崎観からいえば違和感の生じる主張を紹介した。この一部を、(3)の論考「近代文学における「南蛮趣味誕生」の「同時代」」に組み込んでいる。ここでは、南蛮趣味が誕生したとされる明治四〇年を一旦相対化して、北原白秋や木下杢太郎が同時代に果たした役割を評定するために、当時の『人類学雑誌』、『史学雑誌』、『風俗画報』、『東洋日の出新聞』などにみえる言説を収集・分析し、彼らが訪れる以前の長崎の日常性を浮き彫りにした。本年度の研究は、戦後の「長崎」と関わる現在的な「われわれ」をテーマとするものとなった。「長崎」を研究テーマとする報告者自身の立脚地を問う論考(1)と、「長崎」と現在的に関わる一つの可能性を示している作品として『長崎オランダ村』を論じる論考(2)がその成果である。(1)の論考「あの頃の自分たちのこと-小倉原爆、そして民話としての原爆体験」は『敍説』誌に掲載された。その主眼は、80年代に北九州市で平和教育を受けてきた報告者自身の記憶を前景化することで、ある種の典型化された表象・物語を通して原爆(ナガサキ)との間合いをとった出会いが与えられ、またその間合いからズレた出会いがリアルな体験たり得ていること。その前提として、今と昔を結びつけて想像し、自分との因果関係において原爆を受容する回路があったこと。その回路とは、あるレベルでは表象・物語の民話的枠組みであり、あるレベルではナガサキに同一化し立ち上げられた小倉というアイデンティティであったこと、を示した。その上で、小倉人として「長崎」へ通じる回路を与えられ(てしまっ)た自分自身との対話を継続・発展させるという、一研究者としての立脚地(相似的な「われわれ」にも共有され得ると考える)を論じた。また(2)の論考「内破される長崎-村上龍『長崎オランダ村』の一可能性として-」は、『日本文学』誌に投稿中である。

村上龍は小説『長崎オランダ村』の「あとがき」で、それまで「風景」だったオランダ村が「場所」になったと宣言し、そこで初めて自ら「長崎県人」を名乗ってみせる。本稿ではこれを作者の戦略として注目しつつ、「風景」としての「長崎」を内側から揺るがし破れ目を入れる「内破」の諸場面を前景化し、作品の一可能性として論じた。これによって、現代文学において「長崎」が問題化され、相互の言説が交渉する、ある場面を捉えることができたと考える。本年度の研究は前年度から引き続き、「長崎」についての雑多な資料(公的文書を始め、パンフレット・市民読本等の雑本、文学系の単行本・同人誌、新聞記事・・・)を収集・分析することを通して、「長崎と関わる現在的な「われわれ」を問題化するものとなった。「長崎」と現在的に関わる際の一つの可能性を示している作品として、小説『長崎オランダ村』を論じる論考(1)。本研究の意義について、「長崎」のイメージ形成史を、幾つかの文学作品を解釈し評価する軸として有効なものに構築するという企図を述べた論考(2)。明治と昭和のある時期に求められた「長崎」の記念日について調査し、それを必要とする「われわれ」の欲望をあぶり出そうとした論考(3)。以上の三点が本年度の主な研究成果である。(1)の論考「内破される長崎-村上龍『長崎オランダ村』の一可能性として-」については、雑誌投稿中であった前年度の報告書に記したので省略する。(2)の論考「あたうかぎりエッセイへ-文学研究する「私」の言葉-」は、研究者自身の言説が生成される過程を巻き込む文体が必要であるとの立場から、報告者自身が「長崎」というテーマに出会い固執するに至った経緯に言及した。「長崎」のイメージがどのように作られ、その過程で誰/何が排除され、ゆえに如何に問題含みかを問うこと。と同時に、固定化したイメージとどのように格闘した作品であるかという観点を持つこと。そのために、不完全ながらも「私」という主語を立ち上げようとする、本研究の基本姿勢を確認した。一方、(3)の論考「カレンダーに書き込まれた「長崎」の記念日」は、具体的な資料と関わる側面が強い。『第一回長崎開港記念会記録』を中心に、「長崎」の記念日を創設し祝福しようとする言説を分析した。地方の活力が低下した時期に、均質な市民像を共有する公的な一日が設けられたことは、現在の様々な「われわれ」にとっても他人事でない光景として示唆深いはずである。
腎尿細管のアンヒドログルシトール(AG)/マンノース/フルクトース共輸送体

今回、ペントバルビタール麻酔下のラットに各種糖・ポリオールを2時間にわたり持続静注投与し、in vivo条件下でアンヒドログルシトール(AG)と各種糖との、腎での再吸収における競合関係を中心に観察した。AG再吸収はフルクトースとマンノースにより強い競合阻害を受け、おのおの3.64mmol投与時の尿中AG排泄量は、フルクトースで1.99±0.33μmol、マンノースでは2.34±0.43μmolと、同量のグルコース投与時の3.87±0.61μmolに匹敵するレベルであった。これに対して、シュークロース、キシロース、ガラクトース、ミオイノシトールは競合関係を示さなかった。尿中AG総排泄量を尿中負荷糖総排泄量で除去したAG・負荷糖比は、グルコースの0.005に比し、ガラクトース、シュークロース、ミオイノシトールおよびキシロースでは12桁低いのに対して、フルクトースとマンノースでは0.007前後とグルコースに匹敵するレベルに達した。更に混合負荷では、AG再吸収は共存するほぼ等量のフルクトースまたはマンノースの影響を受けないのに対して、フルクトースとマンノースの再吸収は共存する等量のAGにより著明に(P<0.001)阻害されることも判明した。またAG単独多量負荷によっては、血漿ゴルコース濃度、尿中グルコース排泄量のいずれも有意な影響を受けないことも判明した。以上の結果より、腎尿細管にAG/フルクトース/マンノース選択的輸送系が存在すること、この輸送系はグルコース輸送体よりも下流に位置することが強く示唆された。またこの共輸送体は、AGに対してより強い親和性を示すことから、AG特異的輸送体の可能性も考えられる。また、近年判明しつつある、フルクトース選択的輸送体であるGLUT5との関連性を現在検討中である。なお、今回の研究より、AG再吸収には浸透圧は大きな影響を及ぼさない一方、AGを含む多くの六単糖の再吸収が、高濃度のアミノ酸の灌流により阻害されることも判明した。
学習の触媒としての教科書に関する教授学的研究：学習課題に着目した日独教科書比較

本研究の成果は、次の三点に集約できる。まず第一に、教科書における「学習課題」を教科・学年横断的に、また三つの知識観に着目して分析する分析枠組みを提起したことである。第二に、日本とドイツの教科書の比較研究を通じて、日本の教科書における「学習課題」の特徴を明らかにしたことである。すなわち、日本の教科書は、「手続きに関する知識→説明→事実に関する知識」という構成になっているパターンが圧倒的に多く、「メタ認知的知識」に関わる課題が少ないのである。第三に、教科書が「学習の触媒」として機能するためには、授業における子どもたち自身の「課題意識」を生起させる教材研究・発問研究の重要性を指摘した点である。本年度の研究成果は、大きく次の二点に集約される。まず一点目は、教科書資料の収集・比較を行ったことである。2013年9月および2014年3月に渡独し、複数の研究機関・図書館等を訪問し、また学会大会にも参加し、教科書研究関係資料の収集および教科書研究・授業研究の専門家と研究交流を行うことができた。とりわけ、PISA調査の影響を受けて進行中の「学力向上政策」のなかで、「授業とは何か」といったテーマに教授学者・教科教育学者・教育心理学者らが様々な研究方法でアプローチしている点は、子どもたちにとっての教科書および「学習課題」の意義や機能を考察する上で重要であることが明らかになった。二点目は、ドイツおよびわが国の学校のフィールドワークを行ったことである。ドイツのフィールドワークでは、中等学校の理科・ドイツ語といった教科の授業を観察し、教科書がどのように用いられているか、教科書の中の「学習課題」が学習にとってどのように機能しているか、教科書とは別に提示される「学習課題」がどのように構成されているのかを、授業の記録および授業者へのインタビューとともに明確にすることができた。わが国の学校においては、小学校および中学校の授業を複数回訪問し、教科書の「学習課題」がどのように機能しているか、授業の中で子どもたちが取り組んでいる「学習課題」と教科書中のそれとはどのような異同があるのかを、授業の観察及び授業者へのインタビューで明確にすることができた。とりわけ、実際の授業の中では、教科書に記載されている「学習課題」は、子どもたちの学習進度やそれぞれの教育的ニーズに合わせて、教師・子どもによって再構成されていることが明確になった。平成26年度の研究によって得られた成果は、1)教科書における「学習課題」の分析枠組みの開発、2)分析枠組みにもとづく日独教科書における「学習課題」の分析の実施、3)分析枠組みに基づく授業分析への応用可能性の指摘、の三点にまとめることができる。分析枠組みは、ドイツの一般教授学研究の知見をもとに、「三つの知識」観(宣言的知識・手続き的知識・メタ認知的知識)を中心的な分析項目として、診断課題・学習課題・検証課題の三つのタイプの課題を分析する枠組みを提示した。この分析枠組みに基づいて、日独の教科書26冊を対象に(57年生、国語・ドイツ語、算数・数学、理科・自然科学)、「学習課題」の分析を行った。その結果、「三つの知識」観に着目した分析として、学習課題の提示には三つのパターンがあることを指摘した。すなわち、1「手続き的知識→宣言的知識→検証課題」という配列のパターン、2「学習課題(手続き的知識)→説明」という配列のパターン、3「説明→学習課題(宣言的知識)→説明」という配列のパターンである。さらに、「メタ認知的知識」に関わる学習課題が、日本の教科書には少ない点も大きな特徴の一つであることを明らかにした。これらの研究成果は学会発表および論文執筆を通して公開している。また、この「三つの知識」観に基づく教科書における「学習課題」の分析は、授業における課題提示とまとめの提示の場面にも応用可能であることを指摘した。すなわち、授業開始時の課題提示が「手続き的知識」であるのに対して、授業終了時のまとめの提示では「宣言的知識」となってしまうことによる、授業において習得されるべき知識のズレが存在することを指摘した。平成27年度の研究成果は、教科書における「学習課題」の分析に基づいて、実際に小学校の算数の授業づくりとその参与観察、さらにはその授業分析をドイツの教授学研究者とともに実施した点にある。ここから、授業において子どもたちがどのような「課題意識」をもって学習に臨んでいるのかが重要なファクターであることを指摘した。研究全体を通じて得られた研究の成果は、次の三点に集約できる。まず第一に、教科書における「学習課題」を教科・学年横断的に分析する分析枠組みを提起したことである。学習課題や検証課題の数といった基礎情報だけではなく、「事実に関する知識」・「手続きに関する知識」・「メタ認知的知識」という三つの知識観に着目して、教科書における「学習課題」を分析することで、授業において学習者が取り組む「学習課題」がどの知識にポイントを置いているのかを明確にすることができる。日本の教科書は、「手続きに関する知識→説明→事実に関する知識」という構成になっているパターンが圧倒的に多い。さらに、「メタ認知的知識」を問う課題が少ない。こうした特徴は、授業づくりにおいてどの「知識」に着目してどのような「学習課題」を子どもたちに提供するのかの実践的な示唆を与えるものでもある。第三に、教科書が「学習の触媒」として機能するためには、授業における子どもたち自身の「課題意識」をつなげていく必要があることを実践的に検討した点である。教科書における「学習課題」はそのまま直接的に子どもたちが取り組む「課題」となるわけではない。

授業においては、子どもたちの「課題」への意識を明確化させ、さらにその「課題」に取り組む授業プランや子どもたち相互のインタラクションを構想しておく必要がある。本研究の成果は、次の三点に集約できる。まず第一に、教科書における「学習課題」を教科・学年横断的に、また三つの知識観に着目して分析する分析枠組みを提起したことである。第二に、日本とドイツの教科書の比較研究を通じて、日本の教科書における「学習課題」の特徴を明らかにしたことである。すなわち、日本の教科書は、「手続きに関する知識→説明→事実に関する知識」という構成になっているパターンが圧倒的に多く、「メタ認知的知識」に関わる課題が少ないのである。第三に、教科書が「学習の触媒」として機能するためには、授業における子どもたち自身の「課題意識」を生起させる教材研究・発問研究の重要性を指摘した点である。1)教科書における「学習課題」の分析枠組みの開発、2)分析枠組みにもとづく日独教科書における「学習課題」の分析の実施、3)分析枠組みに基づく授業分析への応用可能性の指摘という三点を明確にすることができたため。教育方法学学力テストなどで提示される課題、教科書に提示される学習課題、授業において提示される学習課題の三者を関連づけて検討することが今後の課題である。教科書関係資料の収集という点では、おおむね計画通りに進行している。その分析および理論的な考察についての基礎調査は終了していると判断した。収集した教科書関係資料および授業研究資料の分析および理論的な考察を行う。具体的には、学会発表や論文執筆を通して研究成果の公開を行う。また、フィールドワークも継続的に行いながら、必要に応じてフィールドワーク先を増やすことも視野に入れる。
インドと中国の供養者（寄進者）像に関する比較研究

(1)インドと中国で全4回の現地調査を実施し、供養者(寄進者)像の作例に関するデータを収集した。インド:マトゥラー博物館、ラクナウ州立博物館、サールナート考古学博物館、BHUバナーラスヒンドゥー大学美術館、ブッダガヤー考古学博物館、パトナー博物館、カルカッタインド美術館、アウランガーバード石窟、ピタルコーラ石窟、アジャンター石窟、ニューデリー国立博物館、チャンディガル博物館。中国:河北省博物館、西安碑林博物館、西安博物院、山東省の12の博物館。(2)インドにおける供養者像の展開について考察した。また、供養者像の配置や肖像性についてインドと中国の作例を比較した。(3)研究成果報告書を作成した。平成24年度の研究実績。24年4月11月昨年度の調査写真の整理、およびデータのパソコン入力(学生アルバイト)をすすめるいっぽう、今年度のインド調査の時期や調査地について、同行する協力者と相談しながら、現地との連絡等準備を進めた。25年2月17日25日インド調査。今年度の調査地は西インドの石窟寺院とインド北部の博物館で、計9日間の調査を実施した。訪問先は、マハーラーシュトラ州のアウランガーバード石窟、ピタルコーラ石窟、アジャンタ石窟、ニューデリー国立博物館、チャンディガル博物館である。写真撮影を中心に、石窟内のスケッチや造像内容の記録も行った。チャンデイガル博物館では特別に館蔵の画像データの提供を受け、また収蔵庫内の作品についても調査することができた。帰国後、調査で撮影した写真データを整理・保存する作業を進めている。また、上記作業に並行して参考文献の収集、購入、および関連文献の発送等をおこなった。いっぽう、24年8月に神戸大学で開催されたシンポジウム「敦煌・シルクロード国際学術研討会」に参加し、「敦煌莫高窟第275窟の造営年代についてー供養者図像による北魏造営説を中心にー」と題する発表を行った。その後、発表内容は論文として同シンポジウムの報告書(25年2月刊行済み)に掲載された。また、24年11月に京都龍谷大学で開催された「シルクロードの仏教文化;ガンダーラ・クチャ・トゥルファン」に出席、全体討議に参加した。平成25年度の研究実績。平成25年47月は前年度のインド調査の調書と写真データを整理し、参考資料用のファイルを作成した(学生アルバイト1名を雇用)。8月に中国調査(第1回)を実施した。訪問先:山東省博物館、済南石刻芸術館、済南市博物館、河北省博物館、西安博物院、西安碑林博物館(現地協力者2名)。912月は引き続きインド調査資料と中国調査資料の整理を行い、整理が終了したインドの供養者像のデータについて、所蔵館別の図版入り目録の作成を開始した(学生アルバイト1名雇用)。12月末に中国調査(第2回)を実施した。とくに、山東地区に多い坐像形式の供養者像を中心に調査をおこなった。訪問先:青島市博物館、臨くう県博物館、博興興国寺大仏、博興県博物館、山東省博物館、曲阜漢魏碑刻陳列館、武氏墓群石刻博物館、巨野県博物館、えん州市博物館、沂南漢墓、臨沂市博物館。平成26年13月は中国調査の写真整理と、インドの作例目録の作成を進めた(学生アルバイト1名雇用)。3月末にインドの作例目録と研究論文「インドの供養者像ー平成2324年度調査を中心にー」を収録した「成果報告書」(独自形式。簡易製本)を作成し、関係先へ献本した。この間、平成25年12月に京都大学人文科学研究所のワークショップで、仏像様式と供養者図像について研究報告をおこなった。また、平成26年2月に刊行された『仏教美術論集第5巻機能編』(竹林舍)に「供養者像ー図像による寄進銘ー」と題する論文を発表し、インドと中国の供養者像を比較検討した。4月11月参考文献からインドの供養者や寄進者を表す作例を抽出し、画像をスキャニングして文字データとともにパソコン内で整理保存した。また、今年度のインド調査の時期や調査地について、同行する協力者と協議し、現地との連絡等準備を進めた。12月インド調査。今年度はインド北部東部の博物館を中心に10日間の調査を実施した。訪問先は、ウッタルプラデーシュ州のマトゥラー考古学博物館(ギャラリー、収蔵庫)、ラクナウ州立博物館(ギャラリー、収蔵庫)、サールナート考古学博物館(ギャラリー)、バナーラス・ヒンドゥー大学博物館(ギャラリー)、ビハール州のブッダガヤ考古学博物館(ギャラリー)、パトナー博物館(ギャラリー、ガンダーラ彫刻室)、西ベンガル州のコルカタ・インド美術館(ギャラリー)である。すべての博物館で写真撮影が許され、参考文献も収集した。

帰国後、調査で撮影した写真データを学生アルバイトを雇って作品ごとに整理、保存している(24年度も引き続き作業中)。また、これらに並行して中国関係の文献も購入した。いっぽう、23年7月に京都龍谷大学で開催された「ガンダーラ研究会」において、研究代表者が「中国の仏教供養者像ー家族供養者の表現を中心にー」と題する発表を行い、ガンダーラ美術研究者と意見交換を行った。現在までの達成度はほぼ7割と判断している。理由は以下のとおり。本研究は、インド(古代ガンダーラを含めて)と中国の宗教美術(仏教、ヒンドゥー教、ジャイナ教、道教など)の供養者(寄進者)像を比較研究するために、現地調査を行って作例の所在確認、造像状況など、情報を集めることが大きな目的である。このために、インドの仏教およびヒンドゥー教の石窟寺院と各地博物館、中国では仏教に加えて道教関係の石窟や個体造像(とくに過去の研究で調査を実施していない四川省と江蘇省)の現地調査を計画した。このうち、インド地区に関しては、23年度にインド東部の遺蹟と博物館を効率よく回ることができた。さらに24年度は、西インドの石窟寺院(アジャンタ、アウランガーバード、ピタルコーラ)とインド北部の博物館で、石窟の一部として造られた供養者像、単体彫刻、壁画の作例を調査することができた。撮影した写真データは厖大であるが、現在整理作業をすすめている。インド地区の現地調査は23年度と24年度でほぼ終了した。のこり一年間(25年度)は中国地区の調査を実施するとともに、研究成果をまとめる作業に入る予定である。23年度は効率よく多くの作例を調査することを目指し、博物館や美術館において調査を行った。その結果、地域的にはインド東北部のガンジス川中流域、時代的には紀元前1世紀から紀元10世紀前後まで、内容的には仏教とヒンドゥー教に加えてジャイナ教関係の作品も調査することができた。とくにクシャン朝の供養者表現は造形内容が多彩で、現実の供養者を表現している可能性が高いと思われる。ジャイナ教美術については当初計画では注意していなかったが、現地に行くとジャイナ教の彫刻に供養者が表現される例が多く見られ、その表現方法には仏教彫刻と共通する要素が多かった。次年度以降の調査ではジャイナ教美術にも注意して計画を立てる必要を感じた。また、マトゥラー博物館やパトナー博物館、コルカタインド美術館にはガンダーラ彫刻が多数収蔵されており、ガンダーラ美術と中国作品との類似性をあらためて確認した。なお、申請時の計画では南インドの仏教遺蹟も調査対象としていたが、予算面で不足する可能性があり、また、中国との関係においてはさほど重要度が高くないと判断し、23年度の予定から除外した。今後も引き続き調査資料をパソコン内で整理し、画像やデータをパワーポイント形式で保存し、それらを活用しながら、インドと中国の供養者像表現の類似点と相違点を明らかにし、両地域における供養者像の意味や機能について考えていきたい。そのために、今年度は計画どおりに中国での現地調査を行う。とくに、過去において調査が不十分な場所、公表されているデータが不十分な地域を厳選して訪問する予定である。具体的には四川省成都市の博物館と研究機関、江蘇省南京市の博物館と研究機関を計画している。また、本研究では中国独自の宗教である道教の作品や遺蹟も研究対象とするため、これらのデータ収集も今年度行う計画である。
西欧中世における小経営統合に関する研究:家族経営・市場・制度

研究の最終仕上げの年にあたる本年度は、2度の研究会を開いて各分担者の成果の集約をはかり、年度末の「報告書」作成と来年度の論文集刊行にむけた準備を行った。(1)研究成果の総括にあたり注意すべきは、研究計画で当初に掲げていた「小経営統合」を越える問題の所在である。(1)中世初期の領主制の担う広域・在地的流通の組織者としての重要な機能、狭義の領主・農民関係には収まり切れない広範な保有民の存在、都市的定住における多様な地誌・社会的結合の検出(森本、丹下)、(2)中世盛期の流通の広域的展開と対応した商業組織の整備、商業的権益をめぐる社会諸層の結合と反発、市場を焦点とした領域国家(権力)と市民・農民の複合的関係、領域国家・都市の拡充と慣習法の体系化・宗教的な再編成(斎藤、山田、岡崎、岡村)、(3)中世後期の手工業・商業を起点とした都市内の階層分化と共同体の再編、都市の市場を核とした周辺諸候・都市・農村の統合、都市の行財政制度の改革や巡礼の隆盛を支える聖俗諸層の広範な結合(田北、関、藤井、奥西、花田)などを、その代表例とする。したがって、これまでの「小経営統合」にかわり「社会統合」をテーマに据え、経済・社会・法制・宗教・地誌と結合の絆こそ違え、「領主制・共同体、都市・農村、広域・在地、聖・俗」にまたがる社会諸層の結合・反発・再編の史的追究を課題とする必要をつよく感じた。(2)そこで、これまで森本芳樹氏を代表者として組織されてきた「西欧中世史料・社会経済史研究会」の構成メンバー数人にも参加いただき、『中・近世西欧における社会統合の諸相』(平成10年度の科学研究費補助・一般学術図書に申請中)として研究成果の集成し刊行することにした。本年度は,各分担者の扱う「西欧中世における小経営統合」に関する内外学界での研究動向の的確な把握のため文献・史料(未刊行を含む)の徹底した収集・整理に力を注いだ。また,それと並行して年6回(6,7,8,10,1,2月)研究会を開き,中世初期・盛期・後期「小経営統合」の特質の解明作業を進めた。その際,イスラム市場史,近代ヨーロッパ経済史,及び経済理論における市場問題など隣接領域との対話を図り,時代射程と対象地域を拡大しつつ理論・実証両面から成果の集約を試みた。そこで確認された主要な論点は次の2つに要約される。1.西欧中世社会,すなわち封建制・キリスト教社会における「小経営統合」の2元的構成の認識。領主制と共同体の枠内で「小経営」を保有・所有する農民・手工業者・商人以外に,それから排除された貧民・病人・巡礼や宗教的マイノリティも含めた諸層の経済・政治・宗教的統合の丹念な追究の必要性。(1)経済統合の場・制度として市場,商業施設,貨幣・信用,外来者法の考察,(2)様々なレベルの政治統合の形態としてギルド・兄弟団,都市,領域国家,王権に代表される領主制・共同体関係の考察,(3)宗教統合の組織として教区・施療院や境界領主の役割の解明,の3側面から実証分析を進めてきた。2.経済・政治・宗教のいずれか特定要因に還元できない、いわば「社会システム」的な接近の必要。そのための作業として「権力と市場」,社会集団相互間の合意形成の特質を映し出す鏡として「制度」の分析,領主制・共同体あるいは聖・俗両世界の対立を孕みながらも互恵的な相互依存的な「もたれあい」の解明。

なお,この間の研究成果の一部は,本年5月本学で開催される「社会経済史学会第65回大会」の共通論題「市場史の射程」(オ-ガナイザーは研究代表者)において報告される。本年度には、「市場史の射程」を共通論題とした社会経済史学会第65回大会(於、九州大学)での報告(そのための準備会)と、8月の研究会(於、久住)での全員報告と、2つの機会を利用して成果の集約を図った。(1)学会報告は、(1)市場を狭義の経済現象とではなく「社会システムの集約点」と、従って一つの制度と理解すること、同時に既存のグローバル理論に依存せずに、史料に密着した作業から市場史の奥行きと広がりを解明すること、の2点の確認から始め(問題提起;田北)、(2)中世初期の教会組織を担い手とした広域的な必需品流通を通じた緩やかな社会統合の諸相の解明(丹下)、(3)中世中期フランドル伯の領域支配拡充と並行した、流通関係の制度整備過程の追跡による「権力と市場」をめぐる複合的関係の解明(山田)、(4)中世後期都市ケルンの穀物市場を舞台とした広範な諸階層の社会統合のあり方の解明(田北)と、それぞれの時代特有な「小経営統合」論を配し、(5)前近代イスラム社会で市場を経由して達成される互酬・再分配組織化の具体相の解明(一橋大学、加藤博)と、日本史・中国史と経済理論の専門家からの3コメントの後、代表者の森本による総括で結んだ。(2)研究会では、前年度のサ-ヴェイ作業の進展を踏まえて実証研究の成果が報告されたが、そこから得られた新たな知見を時代ごとにまとめれば、次のとおりである。(1)中世初期;修道院の担う重要な再分配機能と、領主・農民間の互恵関係の考察の必要、(2)中世盛期;領域国家、教会組織、商品生産・流通の諸側面で進む領主制的・共同体的関係の変化の諸相と、その全体像確立の必要、(3)中世後期;都市内部での社会的分化のなか、周縁化した諸相も視野に入れて行われる、経済・社会・政治・宗教的な統合の試みと反発・再編の丹念な追跡の必要。なお、3月末には次年度の研究成果の集約・刊行に向けた準備作業の一環として研究会を予定している。研究の最終仕上げの年にあたる本年度は、2度の研究会を開いて各分担者の成果の集約をはかり、年度末の「報告書」作成と来年度の論文集刊行にむけた準備を行った。(1)研究成果の総括にあたり注意すべきは、研究計画で当初に掲げていた「小経営統合」を越える問題の所在である。(1)中世初期の領主制の担う広域・在地的流通の組織者としての重要な機能、狭義の領主・農民関係には収まり切れない広範な保有民の存在、都市的定住における多様な地誌・社会的結合の検出(森本、丹下)、(2)中世盛期の流通の広域的農開と対応した商業組織の整備、商業的権益をめぐる杜会諸層の結合と反発、市場を焦点とした領域国家(権力)と市民・農民の複合的関係、領域国家・都市の拡充と慣習法の体系化・宗教的な再編成(斎藤、山田、岡崎、岡村)、(3)中世後期の手工業・商業を起点とした都市内の階層分化と共同体の再編、都市の市場を核とした周辺諸侯・都市・農村の統合、都市の行財政制度の改革や巡礼の隆盛を支える聖俗諸層の広範な結合(田北、関、藤井、奥西、花田)などを、その代表例とする。したがって、これまでの「小経営統合」にかわり「社会統合」をテーマに据え、経済・社会・法制・宗教・地誌と結合の絆こそ違え、「領主制・共同体、都市・農村、広域・在地、聖・俗」にまたがる社会諸層の結合・反発・再遍の史的追究を課題とする必要をつよく感じた。(2)そこで、これまで森本芳樹氏を代表者として組識されてきた「西欧中世史料・社会経済史研究会」の構成メンバー数人にも参加いただき、『中・近世西欧における社会統合の諸相』(平成10年度の科学研究費補助・一般学術図書に申請中)として研究成果の集成し刊行することにした。
乳歯歯髄由来ヒトiPS細胞からの歯形成細胞への分化誘導制御

本研究では、遺伝子工学的手法にてLEF-1プロモーターを用い乳歯由来細胞およびiPS細胞からLEF1陽性細胞を単離し、当該細胞の幹細胞特性について検討することを目的とした。LEF1陽性単離細胞は、OCT3/4などの幹細胞マーカーの発現を示し、骨芽細胞と神経細胞への多分化能を有していた。歯科臨床において、上下顎20本もある脱落乳歯は子どもの記念に保存する以外はほとんどが廃棄されている。しかし、バイオリサイクルの観点から、乳歯は歯髄幹細胞の有効な細胞供給元として注目されている。本研究では、乳歯由来iPS細胞を用い、歯形成細胞までの分化誘導レベルの制御を目的としている。具体的には、遺伝子工学的手法を用い、分化を体細胞レベルや組織幹細胞レベルに留め、歯を形成する歯構成細胞や歯髄幹細胞・前駆細胞の効率的な取得法の検討を行う。我々の研究グループは、乳歯歯髄細胞からiPS細胞樹立を可能にしており、本研究結果を加えることにより、将来の歯のオーダーメイド治療への展望を開くことが可能となる。まずは、歯髄幹細胞を単離するために、promoterには間葉系幹細胞特異的なヒトLEF-1 promoterを採用した。その下流には、EGFP cDNA, IRES、neo及びpoly(A) sites(pA)が配置されている。IRESはEGFPとneoの2種のタンパクを同一細胞内で発現するための配列である。更に、これら配列の下流にHyg発現ユニットを置く。pLEINHがiPS細胞に導入されると、LEF-1 promoterは働かないので、EGFPやneoは発現しない。しかし、hygが発現するため、Hygromycin B耐性となる。この細胞がDPSCsに分化すると、LEF-1 promoterが働き、EGFPとneoが発現する。即ち、細胞は緑蛍光を発し、G418への耐性を示す。歯構成細胞や歯髄幹細胞に特異的に稼働するプロモーターを用い、分化誘導レベルを制御するために、まずは、間葉系幹細胞特異的なLEF-1 promoterに着目し、本promoterも可動性について、いくつかのcell lineについて検討を行った。また、PiggyBac系のプラスミドについて、乳歯歯髄由来iPS細胞への遺伝子導入効率の検討を行った結果、非PiggyBac系のプラスミドと比較し、良好な遺伝子導入効率が認められた。Lymphoidenhancer factor-1 (LEF1)はWnt/Beta-cateninシグナルの調節因子で、Beta-cateninの核内移行で活性化され、幹細胞増殖を含む多くの生物学的な事象に重要な役割を果たしている。過去の研究では、Lef1遺伝子欠損で歯の発生の停止、前象牙芽細胞・前エナメル芽細胞でのLef1発現、Lef1による象牙質シアロリンタンパク質発現の調節を通した象牙芽細胞分化に鍵となる役割を果たすことが示唆されている。本研究の現在までの成果は、1)乳歯歯髄細胞由来iPS細胞を安定的に樹立するための検討を行い、2)樹立した乳歯歯髄細胞由来iPD細胞に遺伝子導入が可能かどうかの検討を行い、piggyBac transposonシステムにより、ゲノムへの挿入による安定発現細胞株の樹立が可能であることを明らかにした。さらに、3)ヒトLEF1プロモーターを用いた遺伝子工学技術により、ヒト乳歯歯髄細胞からLEF1陽性細胞を単離した。このLEF1陽性細胞を、RT-PCR解析により、幹細胞特異的な遺伝子発現を認めた。また、LEF-1陽性細胞を分化誘導培地で培養することにより、骨芽細胞や神経細胞分化が誘導され、このLEF1陽性細胞は多分化能を有していた。LEF1プロモーターを用いた遺伝子工学技術により、ヒト乳歯歯髄細胞からLEF1陽性細胞を単離することができた。このLEF1陽性細胞は、OCT3/4、SOX2、REX1、NANOGを含む幹細胞特異的な遺伝子発現を認めた。また、LEF-1陽性細胞を分化誘導培地で培養することにより、骨芽細胞や神経細胞分化誘導が可能であり、多分化能を有していることが明らかとなった。歯科臨床において、上下顎20本ある乳歯は交換に伴い脱落し、子どもの記念に保存する以外はほとんどが廃棄されている。Lymphoidenhancer factor-1(LEF1)は、48-kDの核タンパク質であり、Wnt/β-cateninシグナルにおける転写因子として知られる。また、LEF1は、未分化な胚性幹細胞(ES細胞)における未分化の維持・増殖に関与することが報告されており、本研究では、iPS細胞から遺伝子工学的手法を用いてLEF1陽性細胞を単離することで、幹細胞レベルでの分化誘導制御を目的とした。乳歯歯髄細胞に山中4因子を導入後、乳歯由来iPS細胞を樹立し、以下の結果を得た。1)乳歯歯髄細胞

由来iPS細胞を安定的に樹立することが可能となった。2)樹立したiPS細胞への遺伝子導入が可能かどうかの検討を行い、piggyBac transposonシステムの応用により、ゲノムへの挿入による安定発現株の樹立が可能であった。3)ヒトLEF1プロモーターを用いた遺伝子工学的手法により、初代培養細胞からLEF1陽性細胞の単離が可能となった。4)このLEF1陽性細胞について、歯髄幹細胞マーカーであるSTRO-1、CD44およびSSEA-4は免疫染色陽性で、かつ、RT-PCR法にて、いずれの細胞株においてもOCT3/4、SOX2、NANOGおよびREX1が検出され、LEF1陽性細胞が幹細胞特性を有することが明らかとなった。5)乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へヒトLEF1プロモーターを配したプラスミドベクターを遺伝子導入後、分化誘導を行ったところ、LEF1陽性の歯髄幹細胞様の細胞を得ることができた。これらの細胞は、乳歯歯髄幹細胞であるSHEDと同様の遺伝子発現を有していた。本研究では、遺伝子工学的手法にてLEF-1プロモーターを用い乳歯由来細胞およびiPS細胞からLEF1陽性細胞を単離し、当該細胞の幹細胞特性について検討することを目的とした。LEF1陽性単離細胞は、OCT3/4などの幹細胞マーカーの発現を示し、骨芽細胞と神経細胞への多分化能を有していた。当該年度においては、如何に効率良くiPS細胞へ遺伝子導入するかに関して検討をおこなった。一般的な方法である電気穿孔法に基づくmicroporation(Invitrogen社製)でiPS細胞に遺伝子導入を行なったところ、70%以上の細胞が遺伝子導入されたが、その後の薬剤選別による安定株取得は不可能であった。そこで、哺乳類細胞への遺伝子導入効率が非常に高いとされるPiggyBac系をヒトiPS細胞への遺伝子導入に適用したところ良好な結果が得られた。ヒト乳歯歯髄細胞からLEF1陽性細胞を単離することができたため、現在、乳歯歯髄細胞由来iSP細胞から分化誘導を行い、LEF1陽性細胞の単離を行っている。すでにin vitroにて当該細胞の樹立が確認できている。そのため、iSP細胞由来LEF1陽性細胞とすでに樹立している乳歯歯髄由来LEF1陽性細胞の違いなどの検討を行っていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。小児歯科学今後は、乳歯歯髄由来iPS細胞へのLEF-1 promoterの遺伝子導入と分化誘導実験の検討を予定している。i)in vitro:歯構成細胞の分化には、未だ有効な分化誘導因子の報告はない。しかし、口腔組織由来の間葉系細胞(DPSCsなどが含まれる)と表皮系細胞との共培養が有効1)とされるため、今回得られる組換えiPS細胞の歯形成細胞への分化ポテンシャルを検討する手段として、共培養を選んだ。相手側の細胞には、マウス胎仔(d-14)の口腔部(歯原基の形成が盛んな時期で、表皮系細胞と間葉系細胞とが混在)の初代培養細胞を据える。この細胞と組換えiPS細胞とを通常培地で共培養し、in vitroで歯形成細胞への分化が見られるか、蛍光マーカーを指標に分化レベルを検討する。
光合成CO_2固定酵素ルビスコの高機能化による植物光合成促進

好熱性シアノバクテリアのルビスコと枯草菌ルビスコ祖先タンパク質の解析から、CO_2親和性と触媒能向上に関わる残基を同定した。また、メタン産生アーキアのルビスコの解析から、CO_2固定のための原始カルビン回路の存在を明らかにした。さらに、タバコにおいて、紅藻ルビスコ高機能残基導入を介したルビスコ高機能化により、低ルビスコ量での通常光合成CO_2固定速度の維持に成功した。ルビスコ合成遺伝子同定により、これら遺伝子の高機能化ルビスコの量的増加への利用が可能となった。現在の植物CO_2固定酵素ルビスコは、O_2とCO_2を誤認識するためCO_2固定効率が悪く、これが光合成能を大きく低下させる原因となっている。O_2反応性抑制のようなルビスコ高機能化が、植物光合成増大を可能にすると期待される。そこで、本研究では、祖先タンパク質と現存する高機能ルビスコを用いたルビスコ高機能化部位の同定(1,2)および高機能化部位の植物ルビスコへの導入(3)を行っている。1)ルビスコ祖先タンパク質は、ルビスコ触媒残基のいくつかに置換を有しCO_2固定能とO_2反応性を示さないことから、これらが両ガス基質反応性に関与すると予想された。これら残基と両反応の関連性を解析するために、全てルビスコ型アミノ酸に置換した枯草菌と紅色非硫黄細菌の変異祖先タンパク質遺伝子を作製した。今年度はルビスコ型変異祖先タンパク質のルビスコ触媒能獲得の有無を解析する。また、祖先タンパク質とルビスコの比較解析から、共通保存残基H294が酵素活性化促進残基であることを突き止めた。2)植物ルビスコと紅藻の高機能ルビスコの比較から、紅藻ルビスコのO_2反応性抑制残基をいくつか想定している。今年度は、植物ルビスコ研究モデルのラン藻ルビスコにこれら紅藻型残基を導入した変異ルビスコ遺伝子の作製を行った。大腸菌リコンビナント発現系を構築し変異ラン藻ルビスコが得られ次第、導入効果を解析する。3)ラン藻ルビスコを用いた研究から既に同定しているO_2反応性を17%抑制する紅藻ルビスコ高機能化残基をルビスコに導入した形質転換タバコの作製を行った。T0世代において、紅藻型ルビスコ遺伝子を持つ変異葉緑体ゲノムがホモプラズミックであり、変異型ルビスコが正常に蓄積していることを確認した。さらに、この形質転換体を土上げし、種子を獲得した。現在、形質転換タバコを用いて、ルビスコ酵素特性と植物体光合成能への導入効果を解析している。植物のCO_2固定酵素ルビスコは、O_2をCO_2と誤認識するため触媒効率が低く、光合成を律速している。このため、O_2反応性抑制によるルビスコ高機能化が、植物光合成能を増大させると期待される。本年度は、ルビスコ機能進化解析による高機能化部位の同定(1)と同定した部位の植物ルビスコへの導入効果解析(2)を行った。(1)ルビスコ触媒残基のいくつかを欠きCO_2固定能を持たないルビスコ祖先タンパク質にルビスコ触媒残基を導入した結果、枯草菌、紅色非硫黄細菌の導入型祖先タンパク質からはルビスコ触媒活性を検出できなかったが、気管支肺血症菌祖先タンパク質では活性が検出された。この結果から、導入した残基中にルビスコ触媒反応に関わる残基が存在すると期待された。また、枯草菌祖先タンパク質の構造活性相関解析から、この酵素の触媒能を活性化する残基を同定した。(2)O_2反応性が低い紅藻ルビスコの高機能化残基H386の導入は、ラン藻ルビスコのO_2反応性を17%抑制する。この高機能化残基をルビスコに導入した葉緑体形質転換タバコのラインを確立し、解析を行った結果、高機能化残基導入タバコはコントロール株と比較してルビスコ量が約70%に減少しているものの、葉のCO_2固定速度はほとんど変わらなかった。このことは、ルビスコの高機能化に成功していることを示唆していたが、高機能化効果を最大限引き出すにはルビスコの量的増加が望まれた。ルビスコ量増加を可能とするルビスコ生合成遺伝子を同定するため、ルビスコ量が低下したシロイヌナズナ変異株を単離し、その原因遺伝子の解析を行った。15変異株を単離し、ルビスコ生合成に関与する転写活性化因子や翻訳装置合成因子遺伝子を同定した。この研究により、ルビスコ生合成の律速段階遺伝子が同定できれば、これらを発現強化することにより、高機能化ルビスコ量を増加させることができると期待される。植物が光合成で用いているCO_2固定酵素ルビスコは、0_2をCO_2と誤認識するため触媒効率が低く、葉のCO_2固定速度を律速している。

このため、ルビスコ高機能化が達成できれば、植物光合成能を増大させることが可能である。そこで、ルビスコ高機能化部位の同定(1)と同定した部位の植物ルビスコへの導入効果解析(2)を進めた。(1)好熱性の光合成生物が持つルビスコが高いCO_2親和性を示す傾向があることを見出し、地球上で最も高温で生育可能な好熱性シアノバクテリアのルビスコが常温性シアノバクテリアのルビスコよりも約3倍のCO_2親和性を示すことを明らかにした。好熱性と常温性シアノバクテリアのルビスコが高い配列相同性を持つことから、これらの比較解析により高CO_2親和性を発揮させている残基候補を同定した。また、アーキアのルビスコ祖先タンパク質の解析から、この酵素がルビスコとしての触媒能を持ち、光合成CO_2固定回路の原型と考えられる新規のCO_2固定経路で機能している可能性を明らかにし、ルビスコの進化的な高機能化研究の好材料を得た。(2)シアノバクテリアルビスコのCO_2親和性を1.5倍に高める、地球上で最も高いCO_2親和性を示す紅藻ルビスコ高機能性残基をルビスコに導入した葉緑体形質転換タバコの解析を進めた。高機能化残基導入タバコはコントロールと比較して、葉が大きくなる傾向が観察された。このとき、導入タバコはコントロールと比較して、昨年度の結果と同様、ルビスコ量が低下していたが、CO_2固定速度、CO_2補償点にはほとんど違いが見られなかった。ルビスコ高機能化効果を最適に発揮させるためには、ルビスコ量の補完制御が必要であると考え、ルビスコ量的制御に関わる遺伝子の単離を目指した。昨年度までに単離していたルビスコ量が低下したシロイヌナズナ変異株の解析から、さらに2つの新規なルビスコ量的制御遺伝子を同定した。
霊長類モデルを用いたドルーゼン生成機序の解明と予防薬の開発

霊長類医科学研究センターで維持されている、遺伝性の若年性ドルーゼン・カニクイザルについて、遺伝学的解析による原因遺伝子変異の特定と組織・細胞生物学的な解析を行った。ドルーゼン生成機序の根本原因となる遺伝子変異を明らかにするためにカニクイザルゲノムを用いた全エクソン配列解析と全ゲノム配列解析を利用して連鎖解析および1塩基多様性の分離を行い、染色体1番の3遺伝子に原因候補が絞り込まれた。また免疫組織染色によりドルーゼン・サルでは上皮性マーカーの一部の発現が落ちていることを確認した。より詳細な解析のためにサル網膜色素上皮初代培養細胞から単層上皮の形成を行った。加齢黄斑変性症は中心視野が障害される難治性の眼疾患である。病態初期にドルーゼンが蓄積する網膜の環境や分子メカニズムは明らかにされていない。我々は生後2年でドルーゼンが黄斑部に観察される遺伝性のカニクイザルと加齢によるドルーゼン生成個体の比較を行ってきた。病理学的解析によってヒトに類似するドルーゼン組成であることが明らかとなり、網膜色素上皮細胞の形態、貪食能、タンパク分解能などが著しく低下していることも明らかになった。さらに遺伝性カニクイザルの家系について全エクソーム解析を実施したところ、2つの遺伝子変異で発症している可能性を明らかにした。本研究はドルーゼンが生成される黄斑部の環境を分子レベルで解明し、ドルーゼンの生成を遅延あるいは抑制する方法を考案することを目的とする。さらに遺伝性カニクイザルの家系について全エクソーム解析、全ゲノム解析を実施したところ、染色体1番の広い領域の複数の遺伝子変異がドルーゼンの発症に関与していることが明らかになった。次世代シークエンサーを用いた全ゲノムシークエンスを行い、全ゲノム情報を用いてドルーゼンと相関する領域を再度検証した。全エクソーム解析とは異なり、全ゲノム情報を用いた連鎖解析によって、染色体1番の広い領域にドルーゼンとの強い相関が発見された。この中に発見された複数の遺伝子変異が網膜色素上皮細胞の機能障害をもたらすと考えられる。これらの遺伝子変異は全エクソーム解析の結果と一致していた。遺伝子領域以外でのゲノム中の大きな欠損、反復配列は見つかっておらず、遺伝子領域における複数遺伝子中のアミノ酸置換とイントロン2か所における挿入(大きさ不明)が原因と考えられる。これらの変異体をそれぞれ、あるいは一度に全て網膜色素上皮細胞株(ARPE19)において強制発現させることによって、ドルーゼン個体から得られた網膜色素上皮細胞(RPE細胞)の状態と比較検討している。疾患個体から得られたRPE細胞のこれまでの培養実験から、上皮系細胞からの離脱、細胞接着能の低下、貪食能の低下、オートファジー機能の低下などを観察している。また、変異体を強制発現しているプライマリーRPE細胞とドルーゼン個体から得られたRPE細胞の遺伝子パターンの遺伝子発現とRNA発現の解析結果についても比較検討している。本研究は霊長類医科学研究センターで発見された若年性のドルーゼン・カニクイザルをモデル動物として利用し、黄斑に蓄積して視機能を低下させるドルーゼンの生成機序を明らかにする目的で行った。ドルーゼンの発症は80年代に診断された発端サルから4世代にわたって確認できることから、優性の遺伝性疾患と考えられる。まず、原因遺伝子をより詳細に絞り込む目的で、家系内の若齢個体の眼底写真を撮影してドルーゼンの有無を確認するとともに、霊長類センターに保管されている第1ー第2世代のサルの眼底画像記録を調査し、ドルーゼンの発症時期と程度について詳細な情報を得た。これをもとに家系情報を整理して全エクソン配列情報を用いた連鎖解析を行い、ドルーゼンの蓄積と強い連鎖が示された染色体領域について疾患に伴う遺伝子変異を分離した。また、全ゲノム配列情報を用いて疾患に伴うゲノム構造変化の有無を調べた。さらに変異予測ソフトウェアを用いてタンパク質機能への影響を検討した。これらの解析の結果、染色体1番の3遺伝子が持つアミノ酸置換を伴う変異が、疾患原因候補に絞り込まれ、培養細胞を用いて変異型遺伝子による影響を確認した。また、これまでの研究でカニクイザルの網膜色素上皮(RPE)初代培養細胞を用いてドルーゼン発症サルと正常サルの間ではRPE細胞の貪食能に差があることを確認した。より生体組織に近いRPE細胞のin vitro単層培養モデルを用いて細胞の形態、増殖能、貪食能、接着機能、タンパク質分解機能、基底膜への排除機能への影響を解析するために、正常カニクイザルとドルーゼン発症サルそれぞれから新たに網膜色素上皮細胞の初代培養を樹立した。これらの細胞は増殖させたのちに高密度で維持することでRPE細胞に特徴的な六角形の敷石状の形態をとること、またメラニン色素の蓄積が見られることを確認した。

霊長類医科学研究センターで維持されている、遺伝性の若年性ドルーゼン・カニクイザルについて、遺伝学的解析による原因遺伝子変異の特定と組織・細胞生物学的な解析を行った。ドルーゼン生成機序の根本原因となる遺伝子変異を明らかにするためにカニクイザルゲノムを用いた全エクソン配列解析と全ゲノム配列解析を利用して連鎖解析および1塩基多様性の分離を行い、染色体1番の3遺伝子に原因候補が絞り込まれた。また免疫組織染色によりドルーゼン・サルでは上皮性マーカーの一部の発現が落ちていることを確認した。より詳細な解析のためにサル網膜色素上皮初代培養細胞から単層上皮の形成を行った。候補となっている2つの遺伝子変異体が何らかの機能障害をもたらすと考えており、これらの変異体を網膜色素上皮細胞において強制発現させることによって、ドルーゼン個体から得られた網膜色素上皮細胞(RPE細胞)の状態と比較検討している。上皮系細胞からの離脱、細胞接着能の低下、貪食能の低下、オートファジー機能の低下などを観察している。また、変異体を強制発現しているプライマリーRPE細胞とドルーゼン個体から得られたRPE細胞の遺伝子パターンの遺伝子発現とRNA発現の解析結果についても比較検討している。変異体はタンパク質の機能阻害か新たな機能を獲得している可能性があり、RPE細胞株を用いて、ノックダウンの実験とFLAGタグを用いた免疫沈降による変異体結合タンパク質の同定を質量分析計によって行っている。本研究事業中に新たな重篤個体が発見されており、これらの個体は生後1歳で黄斑部にドルーゼンが観察される。これらの重篤個体は数が少なく、他のドルーゼン個体よりも進行が早く、ドルーゼン数が多い特徴があり、遺伝的な要因が考えられる(生活環境は全ての個体について一定であるので)。重篤個体の重点的な全ゲノム解析によって、ドルーゼン個体の中でも特に重篤に現れる個体と相関する遺伝子を探索している。ドルーゼン個体の黄斑部における電顕像からRPE細胞間に間隙が生じていることから、これらを阻害する薬の効果について、変異体を強制発現しているRPE細胞とドルーゼン個体から得られたRPE細胞を用いて評価している。28年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学変異体のタンパク質構造解析を予定している。先ずはコンピューターのシュミレーションによる構造解析を行い、十分な情報が得られない場合にはタンパク質の精製と結晶化、X線構造解析を検討したい。X線構造解析の共同研究はすでに整っている。変異体を強制発現するマウスの検討を行っている。マウスには黄斑がないので、ドルーゼンの生成には黄斑の特徴的な組織構造が必要とされるのか、重要な疑問に答えるための実験である。トランスジェニックマウスの作製はCAG(チキン・アクチン)プロモーターを用いてマウスのRosa26ローカスにZFN(Zinc Finger Nuclease)によって特異的に切断し、変異体を1コピー挿入することを計画している。今回、家系の26個体についてヒト用NimbleGen SeqCap 3.0を用いて全エクソーム・キャプチャーを行ったが、漏れているエクソンの可能性も否定できない。