hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高次元ゲージ場のモジュライ空間とそのコンパクト化

本年度は、昨年度に得られたツイスター方程式と四元数部分多様体との関係についての結果を四元数対称空間上のベクトル束に適用することにより、ほとんどすべての四元数対称空間内の四元数部分多様体がツイスター切断の零点として実現できることを示すことに成功した。キーポイントは、等質ベクトル束の一般的なツイスター切断が零切断と横断的に交わることを統一的に導く方法を確立したこと、および昨年度の結果とBott-Borel-Weil理論を組み合わせることにより、ツイスター切断の零点集合の連結性を示せたということである。この結果はモジュライ空間についての考察に次の2点で関連してくる。1.リー群Spin(7),G_2型の四元数対称空間において、G_2,A_2型の四元数対称空間がツイスター切断の零点集合として得られることがわかる。この事実をツイスター空間上で考慮することにより、Koszul複体と呼ばれるある層の完全系列を得ることができる。するとこれら四元数部分多様体上のASD束に関するコホモロジーの情報が求めたいコホモロジーの情報を与えることがわかる。このようにして、Spin(7),G_2型の四元数対称空間上のあるASD接続の「モジュライ空間の完備性」を証明することに成功した。2.モジュライのコンパクト化においてモジュライの「境界」に現われる「特異ベクトル束」の特異点集合とベクトル束との関係を見出すことが重要課題である。さまざまな四元数対称空間上でこの特異点集合を特定することが可能となった。したがって、そのポアンカレ双対はツイスター作用素の定義されているベクトル束の次数のもっとも高いチャーン類であることがわかる。2番目の結果が示すように、モジュライ空間は底空間の幾何学を理解するうえで、ますますその重要性を増してきていると思われる。この点の解明が今後の課題である。本年度は、ツイスター方程式と四元数部分多様体との関係についての結果を得ることに成功し、その応用として二つの結果を導くことができた。主な成果は次の通りである。1.四元数多様体上では4次元リーマン多様体上で定義されるディラック作用素、ツイスター作用素の自然な拡張とみなせる微分作用素が存在する。とくにツイスター作用素に注目することにより、ツイスター方程式をみたす切断(ツイスター切断)の零点集合が四元数部分多様体となることを示すことができた。またツイスター切断はツイスター空間上では複素正則切断に対応する。そこで複素代数幾何の方法を適用することが可能となり、たとえば零点集合の連結性もコホモロジカルな情報から判定できることを示すことができた。この理論は以下のような応用をもつ。2.リー群Spin(7),G_2型の四元数対称空間において、上記ツイスター切断の理論を用いるとそれぞれ、G_2,A_2型の四元数対称空間がツイスター切断の零点集合として得られることがわかる。このようにして、Spin(7),G_2型の四元数対称空間上のあるASD接続のモジュライ空間の完備性を証明することに成功した。3.モジュライの「境界」に現われる「特異ベクトル束」の特異点集合を、上記(2)内の四元数対称空間上で決定済みであったが、どちらの場合においても特異点集合として現れるのは、ツイスター切断の零点集合であることがわかる。
大脳皮質における自発的・意志的な行動に基づく神経細胞集団動態

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
インターネットの商利用の発展をめぐる競争法上の問題

昨年度に引き続き、研究課題「次世代インターネット通信を可能とする大容量高速通信網をめぐる競争法上の問題」に関する成果を公表した。当該課題は既に昨年度中に論説を公表済みであったが、それに加えて、アメリカ合衆国で実際に顕在化したオープン・アクセス問題に関する最も重要な判例であるアメリカ合衆国第9巡回区控訴裁判所判決について、雑誌「公正取引」上に公表の機会を得た。すなわち、拙稿「アメリカ合衆国地方政府によるAT&T社のケーブル回線の非AT&T社系インターネット・サービス・プロバイダーに対する接続義務付けの合法性-ブロードバンド通信回線網へのオープン・アクセス問題を中心に-」雑誌『公正取引』620号(2002年6月号)8793頁(2002年)である。また、前記課題からの発展であるインターネット通信の発展がもたらす総メディア化が発生させる競争法上の問題について研究を行い、その成果の一部を公表した。インターネット通信は、通信・放送といった事業の枠組みを越えて、従来型の放送に類似の事業の提供を可能とするが、同時に競争法上の問題も発生させる。今年度は、特に無線通信事業と関連して実際に発生した問題に関する判例について公表を行った。すなわち、拙稿「破産した通信事業者が保有していたマイクロ波の周波数のライセンスを取消したFCCの行為は連邦破産法典に違反すると判断したアメリカ合衆国連邦控訴裁判所の判決について-無線通信事業への競争導入と周波数オークションのあり方をめぐって-」雑誌『公正取引』630号(2003年4月号掲載決定)(2003年)、及び、「アメリカ合衆国における2つの主要な直接放送衛星サービス提供者間の合併申請を拒絶したFCCの命令について」雑誌『公正取引』6xx号(2003年x月号掲載決定)(2003年)、である。その後、現在まで当該課題の研究を継続中である。
高免疫豚判別法の開発と商用集団における有効性の検証

我々は、平成2627年度に実施した科研費研究課題「ブタの免疫能選抜がもたらした遺伝的特性変化の解明」において、免疫能選抜(白血球貪食能、補体代替経路活性、豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答の育種価を指標)により造成された高免疫豚由来のマクロファージにおいて、LPS刺激後に特徴的な発現変化を示す5個の免疫関連遺伝子(RNASEL、SAMHD1、STAT3、TMEM150C、TRIM21)を発見し、その発現変化と関連する可能性のある多型を含むプロモーター型を同定している。今年度は、免疫能選抜の中間段階であり、基礎豚及び高免疫豚のそれぞれに特徴的なプロモーター型が適度にばらついて存在していることが予想される第3世代目の豚220頭のDNAに対して、上記遺伝子のプロモーター型の型判別を行い、免疫能形質との関連解析を行った。その結果、RNASELの高免疫プロモーター型には白血球貪食能及び豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答を亢進させる効果があること、また、RNASEL、STAT3及びTRIM21の高免疫プロモーター型には補体代替経路活性を低下させる効果があることが明らかとなった。免疫関連遺伝子のプロモーター型が免疫能形質に及ぼす効果を特定できたことは、今後のDNAマーカーとしての利用につながる大きな成果であると考えている。研究成果の論文公表を予定している。実際の養豚現場での利用を視野に入れて、種豚メーカーや公設試との連携を強化していく。我々は、平成2627年度に実施した科研費研究課題「ブタの免疫能選抜がもたらした遺伝的特性変化の解明」において、免疫能選抜(白血球貪食能、補体代替経路活性、豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答の育種価を指標)により造成された高免疫豚由来のマクロファージにおいて、病原体由来リガンド刺激後に特徴的な発現変化を示す5個の免疫関連遺伝子(RNASEL、SAMHD1、STAT3、TMEM150C、TRIM21)とその発現を制御する可能性のある多型を含む約5kbのプロモーター型を同定している。本研究では、これらのプロモーター型を構成する多型のうち、発現変化の原因となる多型を同定して「高免疫豚マーカー」の開発を行い、国内豚商用集団における簡便な高免疫豚選抜の可能性を検討する予定である。今年度は、上記5個の免疫関連遺伝子について、それぞれ高免疫豚型および無選抜の基礎豚型のプロモーター配列全長(約5kb)をルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入した発現ベクターを作製し、THP-1細胞に遺伝子導入してリガンド刺激後の発現への影響をレポーターアッセイにより調べたところ、STAT3およびTRIM21の2個の遺伝子において、前科研費課題で得られた結果と同様の発現パターンを示した。この2個の遺伝子について、発現変化の原因となる多型を同定するために、プロモーター領域の約600800bpの部分的断片をルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入した多数の発現ベクターを作製し、THP-1細胞を用いたレポーターアッセイの条件検討を行った。今年度は、STAT3およびTRIM21遺伝子において、リガンド刺激後の発現変化の原因であるプロモーター多型(一塩基多型もしくは挿入/欠失)を同定し、ゲノムDNAを用いて当該多型の有無の簡便な検出法(Allele Specific PCR法等)の開発まで行う予定であったが、そこまでは到達出来なかった。その理由として、2回目のレポーターアッセイ時に、THP-1細胞の培養が上手くいかなかったことが考えられる。STAT3およびTRIM21遺伝子における、リガンド刺激後の発現変化の原因であるプロモーター多型の同定に関しては、THP-1細胞以外にも当研究室で開発した、不死化ブタ腎臓由来マクロファージ等も使用して引き続き行う予定である。また、6世代に渡る免疫能選抜の過程における、実験豚のゲノムDNAや白血球貪食能、補体代替経路活性、豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答の形質値のデータも保存しており、例えば3世代目では基礎豚および高免疫豚型のプロモーターの頻度が、いずれにも固定されていないことが想定される。従って、3世代目の実験豚を用いて、5個の免疫

関連遺伝子のプロモーターの遺伝子型と免疫形質値との関連解析を行い、高免疫豚型プロモーターの免疫能への影響を明らかにすることを予定している。最終目的である、「高免疫豚マーカー」の開発を行い、国内豚商用集団における簡便な高免疫豚選抜法を確立することに変更はない。研究成果の論文公表を予定している。実際の養豚現場での利用を視野に入れて、種豚メーカーや公設試との連携を強化していく。THP-1細胞の培養を予定通りに行うことが出来ず、培地等の関連消耗品の使用額が少なかったことが、次年度使用額が生じた原因であると考えている。次年度は、当初計画にはなかった、不死化ブタ腎臓由来マクロファージの培養や、高免疫豚造成3世代目のDNAを用いた遺伝子型判別の実験を予定しており、そのためへの使用を考えている。高免疫プロモーター型の効果の原因となるSNP及び挿入/欠失等の多型を同定するために、培養細胞を用いたプロモーターアッセイを行う予定であったが、実行できなかった。次年度に、当該実験及び論文公表を行うために使用することを計画している。
BRMによる樹状細胞の機能修飾を用いた癌治療の試み

樹状細胞(DC)を用いた特異的癌免疫療法において抗腫瘍効果を得るには,充分なDCの成熟化と良好な遊走能を確保する事が必須である.今回我々はOK432とPSKを用いて成熟化したDCの各機能について検討した.OK-DCは成熟度・CTL誘導能は優れ,遊走能は劣っていた.OK-PSK-DCは,成熟度・CTL誘導能はOK-DCと同等で,遊走能が改善した.PSKをOK432に併用することにより,成熟度とCTL誘導能を損なわずに,優れた遊走能を有するDCを作成し得た.OK432, PSKはGMP gradeのBRMであるため,今後臨床におけるDC療法への応用が期待される.樹状細胞(DC)を用いた特異的癌免疫療法において抗腫瘍効果を得るには,充分なDCの成熟化と良好な遊走能を確保する事が必須である.今回我々はOK432とPSKを用いて成熟化したDCの各機能について検討した.OK-DCは成熟度・CTL誘導能は優れ,遊走能は劣っていた.OK-PSK-DCは,成熟度・CTL誘導能はOK-DCと同等で,遊走能が改善した.PSKをOK432に併用することにより,成熟度とCTL誘導能を損なわずに,優れた遊走能を有するDCを作成し得た.OK432, PSKはGMP gradeのBRMであるため,今後臨床におけるDC療法への応用が期待される.本研究の目的の一つは、OK432とPSKの併用投与よる、樹状細胞(DC)に対する作用の変化を検討し、従来の方法によるDCより成熟化能・CTL誘導能・遊走能に優れたDCを作成することである。まず、我々は健常人3例、担癌患者4例の末梢血から作成した未熟DCに、成熟化刺激としてPSK、OK432単独、および両者の併用をそれぞれ添加し、以下の検討を行った。1)DCの成熟度の指標となる表面発現抗原CD83、86をFACSで測定した。2)CTL活性の指標といわれるCD107の発現についてFACSで測定した。3)遊走能の指標分子であるCCR7をFACSにて測定した。検討の結果は、1)OK432にて成熟化刺激したDCは高い成熟度を得たが、PSK単独では成熟度は低かった。両者の併用ではOK432単独と同様に高い成熟度のDCが得られた。2)OK432にて刺激したDCおよびPSKとOK432を併用したDCではCD107発現の高いCTLが誘導された。3)OK432によって成熟化したDCではCCR7の発現低下が認められた。PSK単独と両者併用DCでは、OK432単独に比較してPSKの濃度依存性にCCR7の発現が増強し、PSK100μg/ml併用ではOK432単独に比して有意な発現増強を認めた。以上の結果より、OK432にて成熟化したDCでは高い成熟度とCTL誘導能を持つが遊走能の指標となるCCR7の発現が低下していること、またPSKを併用することにより、健常人・担癌患者の双方でCCR7の発現が高くなり、遊走能が改善することが示唆された。今後は、実際のDCの遊走を確認し、in vivoへの応用を検討していく予定である。樹状細胞(DC)を用いた特異的癌免疫療法において抗腫瘍効果を得るには、充分なDCの成熟化とCTL誘導能,サイトカイン産生能に加え,良好な遊走能を確保する事が必須である。前年度,我々はBiological Response Modifier (BRM)として知られているOK432を用いて成熟化したDCでは高い成熟度とCTL誘導能を持つが,遊走能の指標となるCCR7の発現が低下していること、また同じくBRMの一つであるPSKを併用することにより、健常人・担癌患者の双方でCCR7の発現が高くなることを見いだした。今回我々は,DCの実際の遊走細胞数をin vitroで測定した.また,サイトカイン産生能についても検討した.まず、我々は健常人3例、担癌患者4例の末梢血から作成した未熟DCに、成熟化刺激としてPSK、OK432単独、および両者の併用をそれぞれ添加し、以下の検討を行った。(1) CCR7のリガンドMIP3βに対するDCの遊走細胞数。(2) DC培養上清中のIL-12およびIFNγの濃度。検討の結果は,(1) PSKとOK432を併用して成熟化したDCは、MIP3βに対して遊走した成熟樹状細胞数が他の条件の約2倍となった。(2) DC培養上清中のIFNγ、IL12はOK432によって成熟化したDCで高値であった。PSKとOK432を併用して成熟化したDCでも同等の結果が得られた。今回の検討により,OK432によつて成熟化したDCは成熟度とCTL誘導能に優れるが、遊走能が低いこと,また,PSKをOK432に併用することにより、成熟度とCTL誘導能を損なわずに、優れた遊走能を有するDCを作成し得ることがわかった。OK432、PSKはGMP gradeのBRMであるため、今後臨床におけるDC療法への応用が期待される。
気道領域におけるヒト組織の培養および再生に関する研究

気道領域の変形・欠損に対し自己組織で再建すべく、基礎研究としてヒト皮下脂肪組織から得られたヒト脂肪組織由来幹細胞(ASCs)に対しCell analyzerを用い細胞表面マーカーの解析および分化誘導を行った。その結果、ヒトASCsは間葉系幹細胞の性格に類似することが確認され、また、ヒトASCsの分化誘導により脂肪細胞および軟骨細胞への分化の可能性が示唆された。【研究目的】耳鼻咽喉科領域のうち気道領域において,腫瘍や外傷,奇形により変形・欠損を生じると,生命に関与する重大な障害をきたす。さらに患者自身の社会生活や精神面に計り知れない影響を及ぼし,強いてはQOLの低下を招く原因となる。機能的な面では,発声,嚥下,呼吸といった日常生活における重要な機能に多大な障害を引き起こす。それゆえ,気道領域の再生は重要な課題であり,気道領域での変形・欠損部位を自己組織で再建すべく,基礎研究としてヒト組織の細胞を確実に培養し,生着・増殖可能な技術を見いだす。【用いる材料】気道領域の手術に伴って摘出された組織で,従来破棄されていた軟骨・上皮・結合織,筋肉,脂肪織を用いる。【細胞単離および培養方法】ヒト脂肪由来細胞の培養を行うべく,気道領域の手術に伴って摘出された皮下脂肪組織を用いた。直ちに抗生物質を含むPBSで洗浄した後,collagenase II溶液で酵素処理し細胞懸濁液にした。遠心分離にて脂肪細胞と脂肪滴を分離後,pore 70 μmのセルストレーナーで濾過し,通過した画分を脂肪由来細胞画分として10%FBSを含むDMEMを用いて培養を行った。【結果】これまでの当科の研究で,ラットの皮下脂肪組織を用い酵素処理することで,SVFと呼ばれる細胞群の回収およびその継代培養により脂肪組織由来幹細胞(ASCs)を得ることが可能となったが,本研究においても,同様の実験系においてヒト皮下脂肪組織を用いることで,SVFおよびASCsを得ることが可能であることがわかった。【今後の展望】ラットのASCsが気管上皮再生促進,血管内皮細胞への分化能を持っことがわかっており,今後,ヒトASCsが多分化能を有することを確認すべく,ヌードラットなどへの細胞移植を行い,組織学的に検討を行う予定である。【研究目的】耳鼻咽喉科領域のうち気道領域において、腫瘍や外傷、奇形により変形・欠損を生じると、生命に関与する重大な障害をきたす。さらに患者自身の社会生活や精神面に計り知れない影響を及ぼし、強いてはQOLの低下を招く原因となる。機能的な面では、発声、嚥下、呼吸といった日常生活における重要な機能に多大な障害を引き起こす。それゆえ、気道領域の再生は重要な課題であり、気道領域での変形・欠損部位を自己組織で再建すべく、基礎研究としてヒト組織の細胞を確実に培養し、生着・増殖可能な技術を見いだす。【用いる材料】気道領域の手術に伴って摘出された組織で、従来破棄されていた軟骨・上皮・結合織、筋肉、脂肪織を用いる。【細胞単離および培養方法】ヒト脂肪由来細胞の培養を行うべく、気道領域の手術に伴って摘出された皮下脂肪組織を用いた。直ちに抗生物質を含むPBSで洗浄した後、collagenase II溶液で酵素処理し細胞懸濁液にした。遠心分離にて脂肪細胞と脂肪滴を分離後、pore 70μmのセルストレーナーで濾過し、通過した画分を脂肪由来細胞画分として10%FBSを含むDMEMを用いて培養を行い、得られた脂肪組織由来幹細胞(ASCs)に対してCell analyzerを用い細胞表面マーカーの解析を行った。【結果】今回行った研究により、脂肪組織由来幹細胞(ASCs)の培養の可否は、原疾患に対する手術前治療により影響を受けやすいことが示唆された。また、Cell analyzerを用いて細胞表面マーカーの解析を行ったところ、造血幹細胞マーカーであるCD34、CD45に対してはほぼ陰性であった。【今後の展望】脂肪組織由来幹細胞(ASCs)の培養を安定化できる方法を見いだし、加えて、Cell analyzerを用いてさらなる細胞表面マーカーの解析を行う予定である。【用いる材料】気道領域の手術で摘出・破棄されていた軟骨・上皮・結合織、筋肉、脂肪織を用いる。【細胞単離および培養方法】

気道領域の手術で摘出された皮下脂肪組織を用い、分離・培養し得られた脂肪組織由来幹細胞(ASCs)に対してCell analyzerを用い細胞表面マーカーの解析を行った。つづいて、in vitroにおいて、コンフェルトに達したASCsを、コントロール群・脂肪細胞分化誘導群・軟骨細胞分化誘導群の3群に分け、それぞれに適した分化誘導培地を添加し、各群とも誘導前、誘導後14日の細胞について組織学的に比較検討した。【結果】手術に伴い摘出された気道領域のヒト皮下脂肪組織から分離・培養して得られたASCsを、Cell analyzerを用いASCsの細胞表面マーカーの解析を行った結果、造血幹細胞マーカーであるCD34、CD45に対してはほぼ陰性であり、間葉系幹細胞マーカーであるCD105、CD90、CD166、CD29は高率で陽性であった。また、ASCsを誘導培地にて分化させた結果、オイルレッド0染色にて脂肪組織様細胞が、アルシアンブルー染色で軟骨組織様細胞が確認された。【考察・今後の展望】本研究において、気道領域の脂肪細胞から得られたヒトASCsは問葉系幹細胞の性格に類似することが確認され、また、ヒトASCsの分化誘導により脂肪細胞および軟骨細胞への分化の可能性が示唆された。今後、ヒトASCsの安定した分化誘導を目指し、誘導細胞の動物モデルへの移植を進めていく予定である。
昆虫類のベーサル・クレードの比較発生学的再考築-カマアシムシ目の発生学的研究-

「内顎類-外顎類システム」(「内顎類[=欠尾類(=カマアシムシ目+トビムシ目)+双尾類(=コムシ目)]+外顎類[=単関節丘類(=イシノミ目)+双関節丘類(=シミ目+有翅昆虫類)]」と表記できる)は昆虫類の高次系統として広く受け入れられてきたが、近年のさまざまな分野からのチャレンジは、「内顎類」のステータスや構成群の類縁に関して、問題点を指摘する。しかしながら、これらのチャレンジ間の議論は定まることもなく、また、最近の分子系統学的アプローチも、分岐が深くしかも極めて短期間に放散したと考えられる昆虫類のべーサル・クレードには、有効な議論を発展できずにいる。本研究の目的は、昆虫類の最べーサル・クレードと目されるカマアシムシ目の発生学的知見を初めて明らかにすることにより、昆虫類のべーサル・クレードを比較発生学的立場から明確に再構築することにある。本年度は、カマアシムシ目の胚発生をさらに厳密に検討した。特筆すべきは、100μmと極小の卵ではあるが、その解剖法を確立することにより、内顎口形成が明らかになり、また、神経形成への腹器様構造の関与が示されたことである。すなわち、カマアシムシ目においては、口褶は3顎節背板に由来するものの、下唇背板は内顎口の後をも被覆するという特異な内顎口形成が起こることを明らかにし、他の内顎類の内顎口形成との間には相同性が出せない、したがって、前年度示唆した、内顎類の多起源性を強く支持する結果となった。また、昆虫類とは大きく異なり多足類のそれに類似する神経形成様式を見出した。これにより、カマアシムシ目は、現在考えられているより、さらに原始的なクレードを代表する可能性が強く示唆され、また、昆虫類の単系統性の再検討の要がさらに認識された。しかしながら、これらのチャレンジ間の議論は定まることもなく、また、最近の分子系統学的アプローチも、分岐が深くしかも極めて短期間に放散したと考えられる昆虫類のベーサル・クレードには、有効な議論を発展できずにいる。本研究の目的は、昆虫類の最ベーサル・クレードと目されるカマアシムシ目の発生学的知見を初めて明らかにすることにより、昆虫類のベーサル・クレードを比較発生学的立場から明確に再構築することにある。本年度はカマアシムシ目の胚発生の概略を明らかにすることを目指し、ほぼ目的を果たすことができた。すなわち、カマアシムシ目は、全割型の卵割、長大な初期胚帯、単純な胚運動、3顎節背板に由来する内顎口(口褶)などの発生学的特徴をもつことを明らかにした。そしてカマアシムシ目の発生においてもっとも注目すべきことは、胚膜(漿膜)が退化せずに背板形成に参加する、すなわち体形成能を保持している点である。この特徴はより原始的な節足動物、つまり多足類や甲殻類と共通するものであり、昆虫類の系統においては、胚膜はこのような体形成能をすでに失っている。

このカマアシムシ目の胚膜の特徴を、私たちが発展させてきた「胚と胚膜の機能分化の進化的変遷」のシェマに組み込むと、昆虫類の体系はテンタティブに「多足類/甲殻類+カマアシムシ目(=昆虫類の一群)+大部分の昆虫類《=トビムシ目+【コムシ目+外顎類[=単関節丘類(=イシノミ目)+双関節丘類(=シミ目+有翅昆虫類)]】》」と改編される。ここにおいては、「内顎類」だけでなく「欠尾類」、さらには「昆虫類」も多系統群である。これらの成果は、二編の国際誌(原著論文1編と総説1編)(印刷中)、また、第二回国際昆虫系統学会議において招待講演として発表された。「内顎類-外顎類システム」(「内顎類[=欠尾類(=カマアシムシ目+トビムシ目)+双尾類(=コムシ目)]+外顎類[=単関節丘類(=イシノミ目)+双関節丘類(=シミ目+有翅昆虫類)]」と表記できる)は昆虫類の高次系統として広く受け入れられてきたが、近年のさまざまな分野からのチャレンジは、「内顎類」のステータスや構成群の類縁に関して、問題点を指摘する。しかしながら、これらのチャレンジ間の議論は定まることもなく、また、最近の分子系統学的アプローチも、分岐が深くしかも極めて短期間に放散したと考えられる昆虫類のベーサル・クレードには、有効な議論を発展できずにいる。本研究の目的は、昆虫類の最ベーサル・クレードと目されるカマアシムシ目の発生学的知見を初めて明らかにすることにより、昆虫類のベーサル・クレードを比較発生学的立場から明確に再構築することにある。前年度、カマアシムシ目の胚発生の概略を記載したが、本年度はさらなる検証、詳細な把握を目指した。特筆すべきは、100μmと極小の卵ではあるが、その解剖法を確立することにより、内顎口形成を明らかにし、また、漿膜が胚分化能を保持していることに対する明らかな証左を見出したことである。すなわち、カマアシムシ目においては、口摺は3顎節背板に由来するものの、下唇背板は内顎口の後縁をも被覆するという特異な内顎口形成が起こることを明らかにし、他の内顎類の内顎口形成との間には相同性が見出せない、したがって、前年度示唆した、内顎類の多起源性を強く支持する結果となった。また、背板形成において、漿膜細胞が一列に並び背板形成を行っている像を得ることができ、カマアシムシ目の胚膜は胚分化能を有すことを決定づけた。これにより、カマアシムシ目は、現在考えられているより、さらに原始的なクレードを代表する可能性が強く示唆されるのである。これらの成果は、5編の英文論文(原著論文4編と総説1編)として公表された。「内顎類-外顎類システム」(「内顎類[=欠尾類(=カマアシムシ目+トビムシ目)+双尾類(=コムシ目)]+外顎類[=単関節丘類(=イシノミ目)+双関節丘類(=シミ目+有翅昆虫類)]」と表記できる)は昆虫類の高次系統として広く受け入れられてきたが,近年のさまざまな分野からのチャレンジは、「内顎類」のステータスや構成群の類縁に関して、問題点を指摘する。本年度は、カマアシムシ目の胚発生をさらに厳密に検討した。特筆すべきは、100μmと極小の卵ではあるが、その解剖法を確立することにより、内顎口形成が明らかになり、また、神経形成への腹器様構造の関与が示されたことである。
2型糖尿病における褐色脂肪組織の再生を促す生理活性因子の解明

メタボリックシンドロームは、重症化につれて他臓器疾患を合併する難治性の病態を呈する。エネルギー貯蔵に重要な役割を示す脂肪組織のインスリン抵抗性はこれまで精緻なアプローチがなされていない。本研究では、全身性インスリン抵抗性病態および2型糖尿病に対する治療法開発を目的として、脂肪組織の再生、特に褐色脂肪細胞前駆細胞の分化、増殖を誘導する因子の解析を進めた。褐色脂肪組織におけるインスリンシグナルが褐色脂肪組織の維持に重要であることを明らかにし、論文発表を行った。そして、褐色脂肪組織の維持におけるインスリンシグナルの標的となる因子の解析を行った。IR、IGF1Rダブルノックアウト(DKO)細胞にIR, IGF1R、IRの細胞外とIGF1Rの細胞内ドメイン入れ替えたキメラレセプターを単独発現する褐色脂肪前駆細胞株を用いて、褐色脂肪前駆細胞におけるインスリン刺激誘導性のIR/IGF1R結合タンパクをマススペクトロメトリーに基づくプロテオミクス解析を行った。その結果、707種類の両レセプターに特異的に結合するペプチドを抽出した。このうち11種類のタンパクが、インスリン及びIGF1刺激に依存して有意に結合が誘導されることを確認し、これらのシグナル伝達に重要な機能を果たす経路として焦点を当てて解析を進めた。これらの成果から「脂肪組織の維持及び再生に関わる制御因子」として新規に、レセプターとともに核内に移動する標的分子を新たに明らかにした。おおむね計画通りに進んでいる。今後も計画通りに研究を進めていく予定である。わずかで次年度の物品費に充てる。
幼児保育制度の発展と保育者養成

1、この研究の成果としては、まず、『近代幼児教育史研究』第7号(近代幼児教育史研究会発行、1993年11月)において、研究テーマ「幼児保育制度の発展と保育者養成」にかかわる年表、及び論文の公表がなされた。前者は当初の研究計画の一部であるが、イギリス、アメリカ、ドイツ、スイス、イタリア、フランス、日本等という国々における幼児保育史と保育者養成の流れとともに、比較教育史的にも展望できる資料が従来皆無に等しかっただけに、これからの研究に貢献できるものと思われる。この年表にさらに教育史や一般史等の重要の事項が加筆されたものが、下記2の(2)の『研究報告書別冊』に記載される。2、さらに進んだ研究成果として、(1)『研究報告書』、(2)『研究報告書別冊』の作成及び公表が挙げられる。(1)には、1で述べた国々における幼児保育制度及び幼児保育者養成の歴史にかかわる諸論文が収録されている。とりわけ保育者養成史として、これだけの国々を含めて展望できる研究成果は、これまでほとんど存在しないことから、保育史研究並びに養成史研究という歴史的研究においてのみならず、現在の養成の制度を検討する上で刺激を与えうる成果ではないかと思われる。(2)には、1で述べた年表とともに、この研究のテーマにかかわる文献一覧が掲載されている。これらは、この研究で購入された機器によって分類・整理されたものであるが、また検索できるようにもなっており、今後追加し、研究推進に役立てていく計画である。この文献一覧は、ほぼ皆無の状態である今日、他の研究者に対しても重要な資料を提供することになろう。3、上記の成果以外にも、学会及び研究会での発表がなされている。これらの成果をさらに補完した上で一冊の書物にしたいと考えているので、今後図書刊行助成をお願いする予定である。当初の計画に沿って本年度の研究は次の様に行われ,以下のように作業を行い,実績を挙げつつあることを報告したい。(1)研究会を開催(於:筑波大学)し,この時に「フランス19世紀保育制度史研究-保育者と初等学校教員の資格・養成・勤務条件の統合を視軸として-」(藤井穂高/筑波大学)等が発表され,それらを材料として研究の視座,方法について討議された。更に,各国部会別の討議に入り,視座,分担,資料収集等作業計画について討議がなされた。(2)日本,イギリス,ロシア,イタリア,アメリカ,フランスという各国部会毎に,「幼児保育制度の発展と保育者養成」をテーマとして先行研究リスト及び重要と思われる文献の解題を作成する作業に取り組んでいる。又,合わせて年表を作成する作業に取り組んでいるが,これらの作業は,第1段階の作業を平成5年13月に一応終え,更に第2段階の作業に入る予定である。既に第1段階作業のものは成果が集まってきている。最終的な成果を(平成6年3月に終了予定)論文集に含めて,公刊の予定である。各国の近代幼児保育史について近年の研究成果や新しく発掘された資料も含めた形で整理されたものがないことや,特に保育者養成史というテーマでまとめられたものがないことから,公刊する必要性が作業を進める中で益々感じられているように思われる。(3)上記の作業と並行して,論文作成の作業に取り組んでいる。その一部は裏面IIに書いたように公表されているが,多くは平成5年度に東京で開催される研究会(7/24に決定)及び日本保育学会,日本教育史学会,ぺスタロッチ-フレーベル学会等の学会で発表される予定である。又(2)に書いたように,平成6年度に「幼児保育制度の発展と保育者養成」をテーマとする論文集を公刊する予定である。

保育者養成及びその歴史研究に貢献できる成果を出すよう努力を傾注していきたい。1.この研究の成果としては、まず、『近代幼児教育史研究』第7号(近代幼児教育史研究会発行、1993年11月)において、研究テーマ「幼児保育制度の発展と保育者養成」にかかわる年表、及び論文の公表がなされた。前者は当初の研究計画の一部であるが、イギリス、アメリカ、ドイツ、スイス、イタリア、フランス、日本等という国々における幼児保育史と保育者養成の流れとともに、比較教育史的にも展望できる資料が従来皆無に等しかっただけに、これからの研究に貢献できるものと思われる。この年表にさらに教育史や一般史等の重要の事項が加筆されたものが、下記2の(1)の『研究報告書別冊』に掲載される。2、さらに進んだ研究成果として、(1)『研究報告書』、(2)『研究報告書別冊』の作成及び公表が挙げられる。(1)には、1で述べた国々における幼児保育制度及び幼児保育者養成の歴史にかかわる諸論文が収録されている。とりわけ保育者養成史として、これだけの国々を含めて展望できる研究成果は、これまでほとんど存在しないことから、保育史研究並びに養成史研究という歴史的研究においてのみならず、現在の養成の制度を検討する上で刺激を与えうる成果ではないかと思われる。(2)には、1で述べた年表とともに、この研究のテーマにかかわる文献一覧が掲載されている。これらは、この研究で購入された機器によって分類・整理されたものであるが、また検索できるようにもなっており、今後追加し、研究推進に役立てていく計画である。この文献一覧は、ほぼ皆無の状態である今日、他の研究者に対しても重要な資料を提供することになろう。3、上記の成果以外にも、学会及び研究会での発表がなされている。これらの成果をさらに補完した上で一冊の書物にしたいと考えているので、今後図書刊行助成をお願いする予定である。
医療検査用単核カプセル化粒子の合成法の開発

X線あるいはMR造影剤はアレルギー等の副作用が問題となっている。また、これらの造影剤は溶液状であるので、分析部位に長時間留まることができないため、安定した造影を行うことが困難である。その解決策として造影能を有する材料のカプセル化が考えられる。これにより、造影剤と生体が直接触れることを防ぎ、さらには体液中での造影剤の流速を制御できると予想されるので、良好な造影能を発現することが期待される。本研究では、無毒なX線造影剤の合成を目的として、ヨード系化合物の一つであるAglナノ粒子のシリカカプセル化法を開発を行い、粒子径が30nm程度の良好なコアーシェル粒子を合成することができた。さらに、高ヨード濃度のシリカカプセル化AgIナノ粒子を作製する方法の開発も行い、原料試薬を追添加する方法を見出した。本追添加法により、12.754.5nm程度のAgIナノ粒子を包含したシリカカプセル化複合粒子を比較的良好に作製することができた。また、MRI造影能を有するGd化合物を物理的・化学的に安定なシリカで複合化及びカプセル化し、良好なコアーシェル型複合粒子の合成条件について検討した。すなわち、シリカ粒子に均一沈殿法を利用して作製したGdカプセル化シリカ粒子をコア粒子とし、、エタノール、テトラエトキシシラン(TEOS)、塩基触媒を順に加えることで、シリカ-Gd-シリカ多層カプセル化複合粒子を合成することができた。MRI造影試験を行ったところ、市販の造影剤と同程度の造影が可能であった。MRI造影剤としての利用が期待される。最近、癌病巣のリンパ節の正確な切除を行う方法、すなわちセンチネルリンパ節生検法として蛍光ビーズやX線造影剤を利用した方法が従来法に代わる新たな検知法として期待されている。市販のX線造影剤としてヨード製剤が用いられているが、それに含まれるヨウ素化合物のサイズが小さいためリンパ節に留まることができない。また、蛍光ビーズやヨード製剤の毒性も問題となっている。その解決策として蛍光ビーズやヨウ素化合物のカプセル化が考えられる。本研究では市販の蛍光ビーズやヨウ素化合物の一つであるAgIを物理的・化学的に安定なシリカでカプセル化し、良好なコア-シェル型複合粒子の合成条件について検討した。蛍光ビーズとしてMolecular Probes社製の市販品(粒子径:100および200nm)を用いた。ヨウ素化合物として過塩素酸銀水溶液をヨウ化カルシウム水溶液に添加することにより得られるAgIナノ粒子コロイド溶液を用いた。これらのコロイド溶液に、各種表面処理をした後、エタノール、テトラエトキシシラン(TEOS)、塩基触媒を順に加えることでシリカカプセル化複合粒子を作製した。蛍光ビーズはポリビニルピロリドンによる表面修飾により良好にシリカカプセル化を行うことができた。それにより耐光性を高めることができた。また、AgIナノ粒子に関しては、塩基触媒とTEOS濃度を種々変化させて粒子を合成し、観察と考察を合成条件にフィードバックさせることにより、平均粒径約30nmの、従来よりも小粒径のシリカカプセル化AgI複合粒子を合成することができた。最近、癌病巣のリンパ節の正確な切除を行う方法、すなわちセンチネルリンパ節生検法としてX線造影剤やMRI造影剤を利用した方法が従来法に代わる新たな検知法として期待されている。市販のX線造影剤やMRI造影剤としてそれぞれヨード製剤や希土類錯体が用いられているが、それに含まれるI化合物や希土類化合物のサイズが小さいためリンパ節に留まることができない。また、ヨウ素化合物や希土類化合物の毒性も問題となっている。その解決策としてそれらの造影剤のカプセル化が考えられる。

本研究ではI化合物の一つであるAgIおよび希土類化合物の一つであるGd化合物を物理的・化学的に安定なシリカで複合化及びカプセル化し、良好なコアーシェル型複合粒子の合成条件について検討した。ヨウ素化合物に関しては、AgClO_4水溶液をKI水溶動こ添加することにより得られるAgIナノ粒子を、Gd化合物に関しては、シリカ粒子に均一沈殿法を利用して作製したGdカプセル化シリカ粒子を準備した。これらのコロイド溶液に、各種表面処理をした後、エタノール、テトラエトキシシラン(TEOS)、塩基触媒を順に加えることでシリカカプセル化複合粒子を作製した。触媒やTEOS等の種々の試料の濃度条件を変化させて複合粒子を作製し、観察と考察を合成条件にフィードバックさせることにより、良好なシリカカプセル化AgI複合粒子やシリカ-Gd-シリカ多層カプセル化複合粒子を合成することができた。現在、これらの複合粒子を用いて動物実験を遂行中である。X線あるいはMR造影剤はアレルギー等の副作用が問題となっている。また、これらの造影剤は溶液状であるので、分析部位に長時間留まることができないため、安定した造影を行うことが困難である。その解決策として造影能を有する材料のカプセル化が考えられる。これにより、造影剤と生体が直接触れることを防ぎ、さらには体液中での造影剤の流速を制御できると予想されるので、良好な造影能を発現することが期待される。これまでに、無毒なX線造影剤の合成を目的として、ヨード系化合物の一つであるAgIナノ粒子のシリカカプセル化法を開発してきた。その方法では、シリカカプセル化の際に触媒としてアミンを用いる。アミンは生体に対して有毒であることが知られている。本研究では、アミン系触媒を用いない、すなわちamine-freeシリカカプセル化法の開発に取り組み、触媒としてNaOHを用いても、粒子径が30nm程度の良好なコア-シェル粒子を合成することができた。また、これまでに開発した方法では、ヨード濃度が10^<-3>Mと低く、X線造影に用いるには濃縮工程を重ねて濃度を高める必要があった。本研究では、高ヨード濃度のシリカカプセル化AgIナノ粒子を作製する方法の開発も行い、原料試薬を追添加する方法を見出した。本追添加法により、12.754.5nm程度のAgIナノ粒子を包含したシリカカプセル化複合粒子を比較的良好に作製することができた。
多発性硬化症の寛解維持を担う多能的制御性T細胞の誘導と自己免疫ワクチンへの適応

SJL/Jマウスでは遺伝的素因によらず感作ペプチドの違いのみで異なる経過のEAEが惹起できる。EAEの寛解維持を担うのはCD69CD103共陽性CD4+CD25highFoxp3+制御性T細胞(=DP-Treg)であり、脳炎惹起性ペプチドの中で上位の優位ペプチドはEAEを惹起しやすいが、抗原特異的Tregの多くを有するDP-Tregを誘導しやすくEAEの再発・再誘導を惹起しにくい。DP-Tregは複数の病原性T細胞に対応するhybrid Tregを有し、抗原刺激によりIL6Rを低値で維持して安定するが、EAEを発症せずとも誘導でき、抑制効果はペプチド特異的な免疫寛容と異なり組織選択的である。中枢神経症状の再発・寛解を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において長期の寛解維持に関与する要因として、CD4+CD25+制御性T細胞(Treg)の中でCD69CD103共陽性群(DP-Treg)が高値で維持されること、感作する脳炎惹起性ペプチドがそれらのヒエラルキーの中で最も優位性が高いこと、そしてこれらの非遺伝的要因が相関するということをこれまでの研究で明らかにした。本研究では、このDP-Tregが炎症性T細胞の惹起以降に増加し維持されるという誘導機構と、DP-Tregが炎症性T細胞と性質を共有するhybrid Tregでありながら安定して適材適所で制御能を発揮できるという作用機構とを解明し、誘導条件の解析を通じて自己免疫ワクチンの適正化の可能性を目標とした。この脳炎惹起優位ペプチド感作によるDP-Tregの誘導・維持機構に関し(A) DP-Tregの性質を規定する要因と機構;(B) DP-Tregの誘導を規定する因子と機構;(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明するととした。本年度は、当初は予定していなかったが感作ペプチド特異的MHC classIIdextramerの入手により抗原特異性の評価が可能になったことから、(A)に関連して「優位性の高いペプチドでの感作は抗原特異性が高い細胞が惹起できること」「DP-Tregが抗原特異性の最も高い活性化細胞であること」が証明できた。さらに(C)の一部として「ペプチド寛容化条件では抗原特異的な抑制効果しか得られないが、EAEが発症しない条件でも優位性の高いペプチドを感作することによってさらに抗原非特異的な抑制効果までもが得られること」が明らかになった。中枢神経症状の再発・寛解を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において長期の寛解維持には、CD4+CD25+制御性T細胞(Treg)の中でCD69CD103共陽性群(=DP-Treg)が高値で維持されること、脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最も優位性が高いペプチド(=最優位ペプチド)で感作することが重要であるということをこれまでの研究で明らかにした。本研究では、DP-Tregが炎症性T細胞の惹起以降に増加し維持されるという誘導機構と、DP-Tregが炎症性T細胞と性質を共有するhybrid Tregでありながら安定して適材適所で制御能を発揮できるという作用機構とを解明すること、誘導条件の解析を通じて自己免疫ワクチンの適正化の可能性を探求することを目標とした。すなわち(A) DP-Tregの性質を規定する要因と機構;(B) DP-Tregの誘導を規定する因子と機構;(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明することとした。本年度は昨年度に感作ペプチド特異的MHC class II dextramerの入手により抗原特異性の評価が可能になったことから、(A)に関連して、最優位ペプチドの感作では抗原特異性の高い細胞が惹起できその多くをDP-Tregが占めること、さらにEAEの寛解維持では炎症性細胞から制御性細胞への抗原特異性のシフトが維持されることが判明した。(C)に関連して、ペプチド寛容では抗原特異的な抑制効果しか得られないが最優位ペプチド感作ではEAEが発症しない条件であってもDP-Tregの誘導により抗原非特異的な抑制効果が得られること、さらにその抑制効果は感作ペプチドのN末端とC末端の配列の長さに依存することを確認した。(B)に関連してmicroarrayの解析によりいくつかの遺伝子の関与を突き止めた。中枢神経症状の再発・寛解を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において、長期の寛解維持にはCD4+CD25+制御性T細胞(Treg)の中でCD69CD103共陽性群(=DP-Treg)が高値で維持されること、脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最も優位性が高いペプチド(=最優位ペプチド)で感作すること、そしてこれらが相関することをこれまでの研究で明らかにした。すなわち(A) DP-Tregの性質を規定する要因と機構;(B) DP-Tregの誘導を規定する因子と機構;(C)

ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明することとした。感作ペプチド特異的MHC class II dextramerの入手により抗原特異性の評価が可能になったことから、(A)に関連して、最優位ペプチドの感作では抗原特異性の高い細胞が惹起できその多くをDP-Tregが占めること、寛解維持では炎症性細胞から制御性細胞への抗原特異性のシフトが維持されることが判明した。(B)に関連してDP-Tregの数と性質の維持にはTCR刺激のみならず抗原刺激を要することが解明できた。(C)に関連して、ペプチド寛容では抗原特異的な抑制効果しか得られないが最優位ペプチド感作ではDP-Tregの誘導を介してEAEが発症しない条件であっても組織選択的に抗原非特異的な抑制効果が得られること、その抑制効果は感作ペプチドのN末端とC末端の配列の長さに依存することを確認した。SJL/Jマウスでは遺伝的素因によらず感作ペプチドの違いのみで異なる経過のEAEが惹起できる。EAEの寛解維持を担うのはCD69CD103共陽性CD4+CD25highFoxp3+制御性T細胞(=DP-Treg)であり、脳炎惹起性ペプチドの中で上位の優位ペプチドはEAEを惹起しやすいが、抗原特異的Tregの多くを有するDP-Tregを誘導しやすくEAEの再発・再誘導を惹起しにくい。DP-Tregは複数の病原性T細胞に対応するhybrid Tregを有し、抗原刺激によりIL6Rを低値で維持して安定するが、EAEを発症せずとも誘導でき、抑制効果はペプチド特異的な免疫寛容と異なり組織選択的である。当初の計画では想定していなかったペプチド特異的MHC class II dextramerの入手は可能になったことから抗原特異性の評価と検証を目的とした追加実験を経時的に行うことにしたため、時間的にも費用的にも他の実験に充てる余裕がなく予定より遅れてはいるが、今年度に施行する予定だった実験の一部は前倒しで施行しており、大幅な遅れではない。ただし抗原特異性を介することで感作ペプチドの優位性とDP-Treg誘導能との相関がより明確になり、さらにEAEの臨床経過に関連して炎症性細胞と制御性細胞の間で抗原特異性のシフトが生じることが判明しており、当初の計画に比べ一貫性のある質の高いデータになったと考えている。神経免疫学、免疫学DP-Tregが他のサブセットに比して炎症性T細胞と性質を共有するhybrid Tregを最も多く含みながら中枢神経系で安定した抑制作用を発揮できるという機構に関して、抗原特異性の高さを介した継続的な刺激が関与する可能性が考えられる。刺激条件の違いによるTregの安定性を比較する実験を追加する。解析途中ではあるが、Microarrayの結果からはTregの組織特異的な誘導に関与する可能性のある遺伝子が同定できており、この解析により組織特異的ペプチドワクチンの条件を探求したい。先送りになった実験については費用の問題と合わせて優先順位を設け、できるだけ研究の本筋に重点をおいて施行することにする。抗原特異性を評価するペプチド特異的MHC class II dextramerが予定外に入手できたことにより、注目しているDP-Tregが抗原特異性の高い性質をもっていることを証明する実験を追加し、評価と検証を行ったため、当初の予定より遅れているが、関連性の高い実験を先に行うことで一貫性の高いデータになった。現在論文にまとめているところである。残額が試薬等の物品購入額に満たないため予定外の実験を追加したことにより先送りになった実験の推進を計る。
線虫の温度及び化学走性を担うcAMP/cGMP依存型チャンネルの分子細胞生物学

野生型tax-4遺伝子のゲノムDNA及びcDNAの構造と、3つのtax-4変異の突然変異部位を決定した。野生型tax-4遺伝子は、10個のエクソンより成り、733個のアミノ酸より成るタンパクをコードしていた。p678変異体は、82番目のアミノ酸が終始コドンに置換しており、おそらくNull変異体であることがわかった。ks11変異体は、チャンネルの穴(Pore)を構成していると思われる領域に、また、ks28変異体は、2番目の膜貫通領域と思われる領域に、それぞれミスセンス変異株を持つことがわかった。これらのミスセンス変異の部位は、現在までにクローニングされているすべてのcAMP依存性チャンネルとcGMP依存性チャンネルにおいて保存されている。従って、これらの部位のアミノ酸がチャンネルの構造や機能に必須であることが示唆された。3つのtax-4変異体について、揮発性物質に対する化学走性を詳細に調べたところ、すべての変異体が、嗅覚ニューロンAWAで受容される揮発性誘因物質に対しては、正常に近い応答を示すが、嗅覚ニューロンAWCで受容される揮発性誘因物質に対しては、全く応答しなかった。従って、AWCが関与する嗅覚機構に関して、Tax-4チャンネルが必須であることもわかった。また、tax-4/GFP fusion遺伝子を導入した株を作成してGFPの発現細胞を同定したところ、AFD温度受容ニューロン、ASE味覚ニューロン、AWC嗅覚ニューロンなど、tax-4変異体で見られる感覚行動異常に関するすべての感覚ニューロンで、Tax-4チャンネルが発現していることを示唆する結果を得た。従って、環状ヌクレオチド依存性チャンネルが、哺乳類で知られている視覚や嗅覚のシグナル伝達系のみならず、温度受容や味覚のシグナル伝達系にも重要な役割を担っていることが全生物を通じて初めて示唆された。
シロアリ類の消化管内β-グルコシダーゼの精製と解析

今年度は、昨年度にコウシュンシロアリの唾液腺から部分精製したβ-グルコシダーゼを用いて、酵素学的な解析を行った。まず、セロビオースを基質としてβ-グルコシダーゼの諸性質を検討した。Lineweaver-Burkプロットにより、K_m値を求めたところ2.5mMであった。しかし、部分精製酵素であるため、V_<max>値を求める事はできなかった。PHに対する反応について検討したところ、最適pHは5.6であり、pH47の間で、最大活性の50%以上の活性を保持することがわかった。また、様々な温度条件に対して酵素活性を調べたところ、2045°Cの間で安定に活性を保つことがわかった。しかしながら、55°C以上の温度で酵素溶液をインキュベートしたところ、30分以内に完全に失活した。これらの性質について、キノコシロアリ亜科に属するMacrotermes mulleriから精製されたβ-グルコシダーゼAと比較したところ、大きな違いは認められなかった。次に、様々な基質に対して酵素活性の変化を検討したところ、シロアリ唾液腺β-グルコシダーゼはp-nitrophenyl-β-D-fucosideやラミナリビオースをよく分解したが、p-nitrophenyl-β-D-galactosideやラクトースはほとんど分解しないことがわかった。また、ゲンチビオース、ラミナリン、およびサリシンは全く分解しなかった。このことから、この酵素が、グルコピラノシドのβ-1,4結合だけでなく、β-1,3結合も潜在的に分解しうる能力を持つ事が明らかとなった。さらに、これらの基質特異性の結果から、このβ-グルコシダーゼが3つのクラスに分類されている昆虫β-グリコシダーゼのうち、クラス1β-グリコシダーゼというカテゴリーに属することが明らかとなった。まず、材料となるシロアリを選定するため、西表島および沖縄島にてサンプリングを行った。採集された7種類のシロアリについて、唾液腺と消化管内各部に含まれるβ-グルコシダーゼ活性の分布とタンパク量を検討した。その結果、コウシュンシロアリの唾液腺が最も高い比活性を示すことが明らかとなった。そこで、コウシュンシロアリの唾液腺を用いて、その後のβ-グルコシダーゼ精製条件の検討を行った。精製条件の検討は、FPLCを用いた液体クロマトグラフィーで行った。液体クロマトグラフィーのカラムとして用いるイオン交換体の選定に、簡易テストキット(HiTrap IEXテストキット:アマシャムファルマシア)を用いた。その結果、HiTrapDEAEセファロースカラムが、もっとも高い分離能を示した。そこで、このカラムを用いて最適なイオン交換条件の検討を終えた後、500対の唾液腺から抽出した粗酵素液の分離を行った。さらに、得られたβ-グルコシダーゼ画分をSuperdex-75ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製を進め、50μgの精製たんぱくを得た。このタンパク質をSDS-電気泳動にかけたところ、2本のメジャーなバンドが確認された。そこで、プロテインシーケンサーを用いて、これら2本のバンドのアミノ酸配列の解析を行った。この結果、N末端の約30アミノ酸の配列が明らかとなった。得られたアミノ酸配列をホモロジー検索にかけたところ、60kDaの位置に観察されたバンドがβ-グルコシダーゼであることが確認された。