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自閉スペクトラム症における感覚障害を用いた診断マーカーの開発および病態解明研究

自閉スペクトラム症(ASD)の感覚異常は、最新の診断基準(DSM-5)に含まれるが感覚異常を評価する標準的方法はない。我々は3種の刺激への客観的痛み感覚と、視覚アナログスケール(VAS)とMcGillPain Questionnaire(SF-MPQ)によって評価された主観的疼痛感度と各刺激の最大疼痛耐性強度を検討した。ASDの疼痛検出閾値および耐性は障害されておらず、疼痛の身体的感覚は群間に差異がないことが示唆された。しかし、ASDは主観的疼痛強度および疼痛感受性の感情的側面に関して、対照と比較して有意に低感受性であった。以上より、ASDにおいて疼痛の認知経路が障害されていると考えられた。自閉スペクトラム症は対人的コミュニケーションと相互作用の質的な障害、常同的な行動・興味を特徴とする神経発達障害である。人種を問わず人口の約1%を冒し、遺伝因子と環境因子による多因子疾患である。他の精神疾患と比較して遺伝率が高い(90%)ことより、遺伝因子の関与が大きいと考えられている。その病態は不明で、根本的治療方法はなく、疾患概念そのものが発展途上にある。2013年には診断基準が改定され(DSM-5)、「感覚障害」の項目が新しく設けられた。しかし、感覚障害は、診断基準に採用されたにも関わらず、評価方法として定まったものがなく、メカニズムも不明である。そこで、本研究においては、感覚障害の診断の為の、客観的評価方法を同定し、診断マーカーを確立する。また、診断マーカーと、患者の認知機能、脳構造、神経生理機能、関連遺伝子との関連を検討し、病態解明の一助とすることを目的とする。研究の方法としては、自閉スペクトラム症罹患者と健常対象者に対して、数種類の異種刺激を用いて知覚および痛みを定量化する。また、痛みの感受性の強さと痛みの質についても群間比較し、自閉スペクトラム症における痛みの特性を明らかとし、診断マーカーとして有効な、感覚障害の客観的評価方法を確立する。さらに、定量化した痛みと、臨床症状、言語性記憶、視覚性記憶、注意・集中力、遅延再生記憶、言語流暢性、ワーキングメモリー、知能などの認知機能、三次元脳構造画像などの脳MRI画像、眼球運動などの神経生理機能のデータとの関連を明らかとする。また、痛みと、自閉スペクトラム症で特徴的な症候を組み合わせることにより、診断に寄与する因子を同定するとともに、被験者から採取したゲノムを用いて、リスク遺伝子と各種の評価項目との関連についても解析を進める。関連が高いリスク遺伝子については、細胞レベル、動物レベルで分子病態を明らかにする。我々は、年齢と性別をマッチさせた、自閉スペクトラム症罹患群と健常対照群において、異種刺激に対する痛覚閾値を定量化し、群間比較を行った。刺激には、知覚・痛覚定量分析装置(Pain Vision;ニプロ)と温冷痛覚刺激装置(PTHWAY: Medoc)を用いた。また、前述の方法で、痛みを感じるだけの十分な刺激量(痛み耐性閾値)を同定し、痛み耐性閾値における痛みの主観的評価を測定した。この際、痛みの測定方法として世界的に普及している、visual analogue scale(VAS)により痛みの強さを測定した。同時に、McGill Pain Questionnaire(MPQ)を測定し、痛みの質の感覚的側面と感情的側面の両方を定量した。その結果、痛みを感知する閾値と、痛み耐性閾値において、2群間における有意な差は認めなかった(VAS; electrical: p = 0.044, cold: p = 0.011, heat: p = 0.042)。一方、電気刺激と冷刺激に対する痛みの感情的側面における感覚は、自閉スペクトラム症罹患群において、健常対象群よりも有意に低かった(SF-MPQ; electrical: p = 0.0071, cold: p = 0.042)。以上の結果より、自閉スペクトラム症罹患者では、痛みの身体的な感覚には障害がないが、痛みを認知する過程が障害されていること可能性が示唆された。また、今回我々が用いた、痛みの感覚の測定方法は、自閉スペクトラム症の感覚障害の同定方法として、有益である可能性が示唆された。これらの成果について報告し、論文が受理された(yasuda et.al, Ann GenPsychiatry.2016.15:8.)。この様に、既に成果が得られており、進捗は順調に進展していると考えられる。そこで、本研究においては、感覚障害の診断の為の客観的評価方法を同定し、診断マーカーを確立する。

また、診断マーカーと、患者の認知機能、脳構造、神経生理機能、関連遺伝子との関連を検討し、病態解明の一助とすることを目的とする。研究計画としては、自閉スペクトラム症患者と健常対象者に対して、数種類の異種刺激を用いて知覚および痛みを定量化する。また、痛みの感受性の強さと痛みの質についても群間比較し、自閉スペクトラム症における痛みの特性を明らかとし、診断マーカーとして有効な、感覚障害の客観的評価方法を確立する。さらに、定量化した痛みと、臨床症状、言語性記憶、視覚性記憶、注意・集中力、遅延再生記憶、言語流暢性、ワーキングメモリー、知能などの認知機能、三次元脳構造画像や拡散テンソル画像などの脳MRI画像、前頭葉課題時の脳賦活や眼球運動などの神経生理機能のデータとの関連を明らかとする。また、痛みと、自閉スペクトラム症で特徴的な症候を組み合わせることにより、診断に寄与する因子を同定するとともに、リスク遺伝子との関連についても解析を進める。見出したリスク遺伝子については、細胞レベル、動物レベルで分子病態を明らかにする。我々は、年齢と性別をマッチさせた、自閉スペクトラム症罹患群と健常対照群において、異種刺激に対する痛覚閾値を定量化し、群間比較を行った。刺激には、知覚・痛覚定量分析装置(Pain Vision;ニプロ)と温冷痛覚刺激装置(PTHWAY: Medoc)を用いた。また、前述の方法で、痛みを感じるだけの十分な刺激量(痛み耐性閾値)を同定し、痛み耐性閾値における痛みの主観的評価を測定した。この際、痛みの測定方法として世界的に普及している、visual analogue scale(VAS)により痛みの強さを測定した。同時に、McGill Pain Questionnaire(MPQ)を測定し、痛みの質の感覚的側面と感情的側面の両方を定量した。その結果、痛みを感知する閾値と、痛み耐性閾値において、2群間における有意な差は認めなかった(VAS; electrical: p = 0.044, cold: p = 0.011, heat: p = 0.042)。また、電気刺激と冷刺激に対する痛みの感情的側面におる感覚は、自閉スペクトラム症において、健常群よりも有意に低かった(SF-MPQ; electrical: p = 0.0071, cold: p = 0.042)。以上の結果より、自閉スペクトラム症罹患者では、痛みの身体的な感覚には障害がないが、痛みを認知する過程が障害されていることが示唆された。また、今回我々が用いた、痛みの感覚の測定方法は、自閉スペクトラム症の感覚障害の同定において、有益である可能性が示唆された。これらの成果について既に報告し(yasuda et.al, Ann Gen Psychiatry.2016.15:8.)、進捗は順調に進展していると考えられる。また、更に自閉スペクトラム症との鑑別が問題となっている統合失調症において、疼痛刺激によるデータを収集している。現在収集は順調に進行している。今後我々が報告した自閉スペクトラム症における知見と比較検討することにより、疼痛検査の疾患異性を検証し、診断マーカーとしての有益性について明らかにしていくことを予定している。年齢と性別をマッチさせた自閉スペクトラム症群(ASD)と健常群(HC)において、刺激に対する痛覚閾値を定量化し群間比較を行った。
アメリカ思春期小説にみる男性性の研究

本研究は、思春期文学(ヤングアダルト文学)を取り上げ、作品中の男性性の変化をアメリカの社会・文化的文脈で研究する文化論である。1.ヴェトナム戦争は、アメリカの物語/アメリ力神話で「兵士」型ヒーローを演じてきた伝統的男性性の崩壊を露呈した。本研究は、戦争禍による「傷」の修復を求める世相を反映して1988年に出版された思春期文学のヴェトナム戦争物語のうち、PatersonのPark's Questを、Bridges for the Youngで取り上げ、戦争による白人男性の威信の失墜と回復の問題を当時の社会・文化的文脈で読み解く。Tinker Bell 49では、ヴェトナム戦争やウォーターゲート事件などによる政府の権威失墜を暗示する、CormierのI Am the Cheeseを分析した。政府の不正により家族を奪われ抹殺の危機に瀕する少年主人公の描写の分析をとおして、男性性と国家とのかかわりを探り、思春期の少年の真摯な自己探求が、アメリカの物語のイデオロギーと葛藤する様を浮き彫りにする。3.単著『少年たちのアメリカ』では、思春期文学が制度としてデモクラシー帝国の維持・発展のためにイデオロギー的国家装置の役割を果たすことを、諸テキストの比較・検討によって検証した。反抗文化の申し子、「成長」を拒否するヒーロー像にイデオロギー教化装置への抵抗を読みとった。本研究は、1960年代から80年代にかけてのアメリカ社会の変動期に誕生した思春期文学(Adolescent Literature/Young Adult Literature)を取りあげ、そこに描かれた男性性の変化を、同時期のアメリカの社会・文化的文脈において研究するアメリカ文化論である。1.1982年にヴェトナム戦争記念碑(通称The Wall)がワシントンに建設されたのを機に、アメリカ国内でヴェトナム戦争体験による「傷」の癒しを求めるムードが高まった。Katherine PatersonのPark's Quest (1988)は、ヴェトナム戦争体験による帝国アメリカの男性性の威信に負った「傷」の癒しをめぐり展開するいわゆる「父・息子」物語である。本研究では、2003年1月1日出版の共著Bridges for the Young : The Fiction of Katherine Patersonにおいて、パターソンのこの作品の中に、少年の視点からのアメリカの「男らしさの神話」の見直しを、社会・文化的文脈において読みとった。2.ヴェトナム戦争後の1970年代に批判の対象となった「男らしさの神話」の源流を辿り、今なおアメリカ文化において一定の勢力をもつ、肉体的強靭さをもとにした男性像を表した作品、Edgar Rice BurroughsのTarzan of the Apes (1912)を、論文「Tarzan of the Apesにみる男性性の再活性化-<野性>を母とする」において検証した。なお、本論文発表に先立ち、国際学会「第10回日韓美学研究会・第2回東方美学研究会」にて、英文の口頭発表を行い、発表論文がこれら学会の報告書に掲載された。本研究は、1960年代から80年代にかけてのアメリカ社会の変動期に確立した思春期文学(YA文学)に描かれた男性性の変化を、同時期のアメリカの社会・文化的文脈において研究するアメリカ文化論である。2.単著『少年たちのアメリカ-思春期文学の帝国と<男>』を平成16年2月に出版。平成7・8年度、10・11年度、平成14・15年度の科研費助成金補助金による研究成果に加筆修正を加えて1冊にまとめたもの。本書での書き下し部分は、まえがき、序論、あとがき。まえがきで思春期小説と男性性の定義を行い、序論でアメリカ近代社会の男性性に生じていや亀裂をトウェイン作品のトムやハックを事例的に取り上げて問題提起をした。あとがきでは、帝国アメリカと思春期小説の関係性を概観した。思春期文学は、アメリカニズムのイデオロギーの教化装置として利用され、作者の立場により、作品が馴化の場や抵抗の場となっていることが明らかとなった。
三次元培養ヒト甲状腺未分化細胞による定量的放射線発がん系の樹立

ヒト甲状腺組織より得られた甲状腺濾胞細胞を長期間培養して得られた無限増殖化細胞を用いて、放射線被ばくによる定量的発がん系の確立をめざした。無限増殖化細胞は、Pax8の発現は認められるものの、幹細胞のマーカーは発現していなかった。放射線照射後、生存細胞を高密度で維持し、過増殖してくる細胞をフォーカスとして検出したところ、線量依存的なフォーカス数の増加は認められたものの、フォーカス由来細胞には悪性形質は認められず、がん細胞への転換には、さらに別のステップが必要である事が示唆された。甲状腺未分化細胞を用いて、定量的な放射線発がん実験系を確立するために、細胞生物学的な性格付けが終わったのを受け、今年度はまず放射線に対する感受性を検討した。スフェロイドの状態で培養維持した細胞に、137Csを線源とするγ線を照射し、照射後に細胞を単個細胞に分離し、コロニー形成法によって生存率を求めた。その結果、大半の正常ヒト二倍体細胞の放射線感受性と同等の感受性を示すことが明らかになった。次に、放射線による癌細胞を誘導を定量的に評価するために、フォーカスアッセイ法の確立をめざした。フォーカスアッセイは、細胞を中密度に播種して培養し、高密度になる過程で異常に増殖した細胞の集団がフォーカスを形成するのを検出する手法である。このため、細胞培養を有る程度低い濃度の血清で行う必要があり、その濃度決定をまず行った。牛胎児血清を、1%5%までの濃度で変化させ、4週間の培養の間にどの程度細胞の密度が上昇するかを検討した。その結果、3%の血清濃度ががん化していない細胞の増殖を適度に抑制し、一方で、癌細胞の増殖を適度に支持することがわかった。そこで、放射線照射後の細胞を、3%血清濃度中で4週間培養し、フォーカス形成が認められるかどうかを検討した。その結果、高線量の放射線により、微少ながらフォーカスを形成する細胞の出現を認めた。フォーカス形成細胞をクローニングし、増殖させたところ、細胞形態や細胞増殖に顕著な悪性度は認められなかったことから、これらのフォーカス形成細胞は、放射線発がんの初期の段階にあると予想された。得られた細胞が幹細胞としての性質を有しているかを、幹細胞のマーカーであるCD34、Oct4、ABCG2において検討した。また、甲状腺特異的に発現が認められるマーカーについて検討した。その結果、甲状腺未分化細胞は、幹細胞のマーカーを発現していないが、甲状腺組織に分化する再最初に発現するPax8のみを発現している事がわかり、ES細胞のような高度に未分化な細胞ではない事が明らかになった。クローン化された甲状腺未分化細胞が正常ヒト細胞の核型を有しているか確認するため、コルセミド(0.1 μg/ml)処理により分裂中期細胞を集積させて回収後、低張処理およびカルノー液による固定を施して染色体標本を調整し、ギムザ分染法により染色体核型の解析を行った。その結果、染色体数は43本を中央値に持つ分布を示す事がわかり、何らかの染色体異常が生じている事が明らかになった。甲状腺細胞は、甲状腺刺激ホルモン(TSH)に反応して分化し、甲状腺ホルモンを分泌するようになる。そこで、クローン化した甲状腺未分化細胞が、TSHに応答して分化する細胞であることを確認するため、甲状腺未分化細胞を、高密度二次元培養法、あるいは三次元培養法により数ヶ月間維持し、この間TSH(10 mU/ml)を持続投与して、分化形質の発現誘導を確認した。生体内では、甲状腺組織は三次元的な濾泡の集合体として観察されることから、三次元培養は撥水性処理を施した培養ディッシュに細胞を播種し、細胞同士の接着によりスフェロイドを形成させた。形成された三次元的な濾泡様甲状腺スフェロイドを、長期間維持する事により細胞増殖と分化形質発現を検証した。その結果、いずれの培養法においても、細胞そのものは長期間維持できたが、甲状腺細胞の分化マーカーであるTGの発現はほとんど確認されなかった。当初予定していた平成23年度の研究実施計画をほぼ達成しているため、概ね順調に進展していると評価した。まず、今後の実験に用いる、137Csを線源とするγ線発生装置を用い、三次元的に培養された甲状腺スフェロイドを照射し、照射後アキュターゼ処理によりスフェロイドを単個細胞に分離し、コロニー形成法により生存率を検討する。対象としては、放射線照射していない甲状腺スフェロイドを用い、同様の方法で分離した細胞でコロニー形成率を求める。照射線量は、0.1 Gy4 Gyの範囲で検討する。放射線照射後の発がん形質の発現には、適当な細胞分裂数と培養時間が必要である。そこで、0.1 Gy4 Gyの放射線照射後、甲状腺スフェロイドを1週間数ヶ月の間そのまま培養し、次項の検討する発がん系の確立と平行しながら発がん形質発現時間を確定する。

細胞接触による細胞増殖抑制は正常ヒト細胞の特徴であるが、がん細胞は増殖が停止した正常細胞に重層するように増殖し、いわゆるフォーカスを形成する。そこで、発現時間を経た甲状腺スフェロイドをアキュターゼ処理により単個細胞に分離した後、100mm直径の培養ディッシュに、104個程度の細胞を播種し、一週間培養した後に細胞がコンフルエントになるようにする。その後、さらに四週間まで、培地交換だけを繰り返して培養を継続し、その後3%ギムザ液で細胞を染色し、単層の正常細胞の上に形成されたフォーカス数を計測する。フォーカスの形成は、細胞がコンフルエントに達した後の培養環境に影響されることから、この時期の培養に用いる血清の濃度を1%5%の範囲で変化させ、対象細胞でのフォーカス形成頻度を考慮しながら、最適な血清濃度を決定する。平成24年度配分が予定されている研究費については、消耗品費(100万円)および旅費(10万円)として使用する予定である。消耗品については、細胞培養に必要な細胞培養試薬、細胞培養器具、および幹細胞機能の解析や発がん系の樹立に必要な生化学試薬、抗体などの購入に充当する。旅費については、研究成果の発表のための国内旅費に使用する。
顎骨骨髄炎への応用を目指した新規抗菌性ハイブリッド生体材料の創製

顎骨骨髄炎は代表的な歯性感染症であり、治療に難渋することが多い。顎骨骨髄炎を制御するために高い抗菌活性を有する銀ナノ粒子に着目し、銀ナノ粒子を簡便かつ効率的に合成する方法を開発した。生体親和性に優れたナノ多孔性表面構造を有するキトサン、β-TCP、アテロコラーゲンスポンジが銀ナノ粒子を吸着し、強い抗菌活性を有することを確認した。顎骨骨髄炎を制御するために高い抗菌活性を有する銀ナノ粒子に着目し、銀イオン含有ガラス粉末、還元剤としてグルコースの混合液をオートクレーブすることで、銀イオン含有ガラス界面からの銀イオンの拡散及び還元により均一な粒子径(約5±2 nm)を有する銀ナノ粒子を効率的に合成する方法を開発した。本研究課題では銀ナノ粒子とキトサン等の担体との複合化により生体親和性と骨伝導能に優れた安定したハイブリッド生体材料を創製し、最適な銀ナノ粒子吸着量を明らかにするとともに、in vitroで抗菌活性と細胞毒性を検討する。また顎骨骨髄炎小動物モデルを作製し、組織学的評価を行い、口腔外科領域の新たな抗菌性ハイブリッド生体材料の開発に繋げる。28年度は生体親和性に優れたナノ多孔性表面構造を有するキトサンやβ-tricalcium phosphate(β-TCP)およびアテロコラーゲンスポンジに銀ナノ粒子を吸着させ、安定的な複合体創製について検討を行い、多孔性キトサンと銀ナノ粒子複合体が強い抗菌活性(Pseudomonas Aeruginosa,Escherichia coli)を有することをin vitroで確認した。今後はin vitroで多孔性キトサンに加えβ-TCP、アテロコラーゲンスポンジを担体とした銀ナノ粒子/担体ハイブリッド生体材料の抗菌活性とラット頭蓋由来骨芽細胞の培養系を用いて細胞毒性を評価し、担体への最適な銀ナノ粒子吸着量と添加する銀ナノ粒子の濃度を明らかにするとともに、顎骨骨髄炎治療に最適な銀ナノ粒子の担体を検討し、同時にラット顎骨骨髄炎モデルの作製を行う。29年度は多孔性キトサン、β-TCP、アテロコラーゲンが銀ナノ粒子を吸着し、銀ナノ粒子/担体ハイブリッド生体材料となりうる点と銀ナノ粒子の吸着濃度別に各々の抗菌活性をin vitroで確認した。今後、顎骨骨髄炎を惹起させるための口腔内常在菌の培養手法を確立したうえで顎骨骨髄炎小動物モデルの作製に取り組み、銀ナノ粒子/担体ハイブリッド生体材料の有効性を確認する。平成29年度は引き続きin vitroにおける銀ナノ粒子複合体の抗菌活性評価および添加する銀ナノ粒子の至適濃度探索を行うとともにラット頭蓋由来骨芽細胞の培養系を用いて細胞毒性を評価し、担体への最適な銀ナノ粒子吸着量と添加する銀ナノ粒子の濃度を明らかにする。また顎骨骨髄炎治療に最適な銀ナノ粒子の担体を検討するとともに、ラット顎骨骨髄炎モデルの作製を行い、銀ナノ粒子複合体の組織学的評価を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
デジタル技術の活用により漆芸の持続可能性を高めた次世代乾漆技法の提案

木心乾漆技法の内部構造に最先端の3D切削技術を取り入れ、薄く複雑な形状の木心を成形することで、脱乾漆技法の特徴である軽さと自由な造形、丈夫さを兼ね備え、さらに制作のスピード化をはかることができるということを研究した。ヒノキ材を使用し、直径約10mmで、1mm,2mm,3mm,4mm,5mmの厚みの半球を3D切削したが、木材を薄く加工する技術の難易度が高く、1mmの半球は欠けや割れが生じてしまう。また、木材が薄いため歪みも生じやすい。そのため薄く切削した後に漆樹液を吸い込ませ、麻布を貼り強度を補った。木材と乾漆技法との違いを検証するため麻布と絹を使用して直径約10mmの乾漆技法の半球も作成し、重量や強度を検証した。使用する木材の材質によっても異なるが、ヒノキ材で切削した2mm5mmの厚みの半球の割れはほぼ無く、歪みも気にならない程度であった。漆芸の歴史は長く、縄文時代から存在しているが、決してまったく同じ技法が継続している訳ではない。時代の要求を満たすさまざまな対応をしてきたからこそ、長い期間存続し、世界に誇る伝統と成り得た。3D切削機で表裏を薄く成形した木材の芯を利用すると、作品自体は多少厚みが増すものの、木材を選び、成形方法を工夫することにより重量面では重くならず、軽量という脱乾漆技法の特徴は維持される。脱乾漆技法と木心乾漆技法の利点を研究することにより、今後のデジタル技法を使用した漆芸表現への可能性が広がる研究である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、木心乾漆技法の内部構造に最先端の3D切削技術を取り入れ、薄く複雑な形状の木心を成形することで、脱乾漆技法の特徴である軽さと自由な造形、丈夫さを兼ね備え、さらに制作のスピード化をはかることを検証する。本研究は、3D切削機を用いて表裏を薄く成形した木材の芯を利用すると、作品自体は多少厚みが増すものの、軽い木材を選び、成形方法を工夫することで重量面では重くならず、軽量という脱乾漆技法の特徴は維持されるとの考えから着想し、軽量さ、丈夫さ、そして自由な造形という乾漆技法の特徴を薄い木材を使用することによって伝統を発展させる事を目的に、漆樹液の利用をおさえつつ、作業効率、強度面、重量面で脱乾漆技法の代用となりうるかを検証する事に意義をおいている。現段階は、初年度のため、研究を始めるにあたり使用する道具や材料、備品の購入と準備、3D切削、3D造形やシステムの調査を行い木材の3D切削や3Dプリンターでの出力を行う上での情報収集と乾漆造形や漆芸の情報収集を行った。また乾漆技法で制作された彫刻や箱などに代表される工芸品の調査のために京都、奈良へ行き、漆と麻布で造形された作品が今もなお現存し、状態が保たれている強度と乾漆造形で制作された意図を改めて再認識した。制作においては、芯となる木材の3D切削技術の習得を行っている。木心に貼る布は形状に適した布の検証を行い、木心に布を貼り制作した作品と麻布や絹のみの脱乾漆との相違点を探っている。脱乾漆技法では、麻布に変わり、シルクと和紙の併用で自由な造形と強度の研究を行っている。研究を始めるにあたり使用する道具や材料、備品の購入と準備、3D切削、3D造形やシステムの調査を行い木材の3D切削や3Dプリンターでの出力を行う上での情報収集と乾漆造形や漆芸の情報収集を行ったため、必要材料、備品などは揃いつつある。また乾漆技法で制作された彫刻や箱などに代表される工芸品の調査のために京都、奈良へ行き、漆と麻布で造形された作品が今もなお現存し、状態が保たれている強度と乾漆造形で制作された意図を改めて再認識した事により、改めて薄い木心による木心乾漆技法の発展の意義を感じた。制作においては、芯となる木材の3D切削技術の習得を行っていが、予想以上に技術習得に時間を要しているため、切削には達していないが、布(麻布、絹)や和紙による研究を進めている。

3D切削機で表裏を薄く成形した木材の芯を利用すると、作品自体は多少厚みが増すものの、木材を選び、成形方法を工夫することにより重量面では重くならず、軽量という脱乾漆技法の特徴は維持される。脱乾漆技法と木心乾漆技法の利点を研究することにより、今後のデジタル技法を使用した漆芸表現への可能性が広がる研究である。(1)前年の検証・研究・・・漆芸品は経年変化があるため、平成29年度の作品を観察し、杢目や布目が出てきていないかなどを検証する。また、乾漆技法のみの作品との相違点も探る。(2)作品調査・研究・・・実際に制作した上で再度、木心乾漆像の調査のために京都・奈良に行く。また漆文化が残っているカンボジアの漆器調査もおこなう。(3)作品制作・・・図案を複雑にしたものでさらに研究を進める。形によっては布が浮いてしまうので、最適な布を選び、慎重に作業を進める。(4)技法・・・3D切削機で今年度中に、木の切削を行う。また、樹脂による3D切削した物へ漆の塗布を行い、漆の表面への影響を研究する。3D技術の習得には時間を要するため、外部発注も含め検討していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
サイトカインの生理活性発現における糖鎖認識機構の関与

サイトカインを中心とした糖鎖認識を介した機能性タンパク質の生理活性調節に関する研究を行った。サイトカインは造血系や免疫系の主要な情報交換分子で“重複性"であると同時に“多様性"である。本プロジェクトにおいて、この複雑な作用機作にサイトカインの糖鎖認識が関わっていることを明らかにした。既に報告のあったヘパリン/ヘパラン硫酸鎖を認識してシグナル伝達を引き起こす繊維芽細胞増殖因子ファミリーの他に、新たに高マンノース型糖鎖を認識するインターロイキン(IL)-2、5、6、8のグループとGPIアンカー糖鎖を認識するIL-1β, -18、TNF-αのグループが存在することを明らかにした。特に2量体のIL-2, IL-6はそれぞれの受容体サブユニットIL-2Rα, IL-6Rに結合しているMan_<5,6>GlcNAc_2の認識をトリガーとして高親和性複合体を形成し、シグナル伝達を誘導する。一方、IL-18とIL-18Rαは、CD48のGPIアンカー糖鎖の2つのマンノース6リン酸ジエステル残基をそれぞれ認識し、高親和性8量体を形成する。また、TNF-αは(TNF-α)_3(TNFR)_3(GPI)_3の高親和性9量体を形成してシグナル伝達を活性化する機構を明らかにした。本プロジェクトではサイトカインにとどまらず、いくつかの機能性タンパク質の糖鎖リガンドと新たな機能についても研究を行ってきた。中でもガレクチン-4とVIP36の新たなリガンド及び機能解析、間質性肺炎の繊維化の原因となる肺線維芽細胞への走化因子のエピトープについても成果を上げることが出来た。様々な液性免疫因子がレクチン様活性を有しており、複合糖質の糖鎖が生理活性のモジュレーターとして機能していることが明らかになりつつある。我々は多様なサイトカインの固有な糖鎖認識と生理活性発現との関連を明らかにすることを目的として研究をおこなっている。現在までのところ、サイトカインはその結合特異性からプロテオグリカンを認識するグループ、高マンノース型糖鎖を認識するグループおよびGPIアンカー糖鎖を認識するグループの3種に分類されるが、プロテオグリカンを認識するグループを除く2つのグループの存在は我々の研究から明らかになったものである。平成14年度はインターロイキン18(IL-18)がGPIアンカーグリカン部を認識するサイトカインであることを発見し、その結合特異性と生理活性への関連について以下の知見を得た。IL-18刺激によってIFN-γを産生するヒトKG-1細胞を用いてGPIアンカーグリカン部の部分糖鎖添加の影響を調べた。その結果、マンノース-6-リン酸を添加すると阻害作用がみられる一方で、マンノビオースジリン酸を加えるとIL-18効果の増強がみられ、同時にチロシンキナーゼ活性が数十倍に増強した。これらの現象に加えて[^<35>S]標識IL-18にマンノース-6-リン酸あるいはマンノビオースジリン酸を共存させるとそれぞれ単量体および二量体が主成分となった。したがって、GPIアンカー糖鎖上のマンノビオースジリン酸エステルを認識して形成された二量体IL-18がIL-18受容体との高親和性複合体形成を促進し、シグナル伝達を引き起こすものと考えられる。様々な液性免疫因子が糖鎖認識活性を有し、複合糖質の糖鎖が生理活性のモジュレーターとして機能している。我々は平成14年度に続き、IL-1β、IL-18のみならず腫瘍壊死因子(TNF-α)がGPIアンカー糖鎖タンパク質に結合し、その結合がマンノース6リン酸で阻害されることを見出した。まず、GPIアンカーの糖鎖構造をヒト胎盤アルカリホスファターゼ(hAP)を材料にして詳細に調べた。

その結果、GlcNAcβ1→リン酸がコア構造の2番目のマンノースのC-6位に結合していることが明らかとなった。hAPからGlcNAcβ1→リン酸を除去するとTNF-αはhAPに結合しなくなることから、このマンノース6リン酸ジエステルがTNF-αに結合すると考えられる。そこでTNF-α刺激によりアポトーシスが誘導されるマクロファージ系細胞株U937にマンノース6リン酸を添加するとアポトーシスが100%阻害されることが判明した。さらに、PI-PLCで処理した細胞およびマンノース6リン酸添加でチロシンのリン酸化も阻害された。したがって、TNF-αはそのタンパク質性受容体と結合すると同時にGPIアンカー糖鎖を認識し、高親和性の(TNF-α)_3(TNFR)_3(GPI)_3のオリゴマーを形成することによって、アポトーシスを誘導すると考えられる。一方、昨年度報告したIL-18ではTNF-αと異なって、GPIアンカーの2つのマンノース6リン酸ジエステルにそれぞれ1モルのIL-18が結合し、タイトな2量体を形成し、これが、IL-18Rα,βとの高親和性複合体形成のトリガーとなることを明らかにした。現在、ケモカインであるIL-8とIL-15がユニークな糖結合活性を示すことを見い出し、それぞれの生理機能活性をモジュレートしていることを追跡中である。我々は種々の生体内生理活性因子サイトカインが糖鎖認識活性を有し、複合糖質が免疫系において生理活性モジュレーターとして機能していることを明らかにしつつある。昨年度IL-18がGPIアンカー糖鎖を認識することを見出していたことから、本年度はまず、IL-18受容体α、βサブユニットは共に膜貫通蛋白質であることから細胞膜上でIL-18及びその受容体と複合体を形成するGPIアンカー蛋白質を検索した。IL-18受容体に対する抗体による免疫沈降物をGPIアンカー結合活性を持つ細胞毒素Proaerolysinで検出した結果、47kDa付近に一本のバンドが得られた。また、抗CD48抗体によっても検出されることから、CD48であると同定した。さらに、CD48リコンビナント蛋白質を合成してIL-18受容体αサブユニットとの結合活性を調べた結果、CD48のペプチド部分とGPIアンカー糖鎖をデュアルに認識していることも明らかとなった。IL-18受容体βサブユニットはIL-18に対して直接の結合活性を持たないが、IL-18、IL-18受容体αサブユニット及びGPIアンカー蛋白質CD48が複合体を形成することがβサブユニットとの結合のトリガーとなり、シグナル伝達に結びつくと考えられる。以上の結果は、GPIアンカー糖鎖のIL-18依存的生理活性発現モジュレーターとしての役割を示唆するものである。さらに、IL-6が高マンノース型糖鎖を認識するとの知見も得られており、IL-6の生理活性発現にどのような役割を果たしているかについて検討を進めている。昨年度、予備的な実験の結果からIL-6が高マンノース型糖鎖を持つ糖タンパク質に結合性を示したことから、平成17年度はIL-6の糖鎖結合特異性の決定及び生理活性発現に果たす役割について検討した。
精神遅滞のシナプシス伝達機構に関する研究

1)神経細胞移動異常におけるシナプシス形成障害.神経細胞は胎児期に増生,移動,定着そして成熟する.大脳半球の肥大と皮質の多少脳回が認められる片側巨脳症に免疫組織化学的およびゴルジ染色を行い,脳軟膜内へのグリア,神経細胞および髄鞘のヘテロトピアを認めた.皮質表層部には小神経細胞と変形した細胞があり,深部には多くの樹状突起とスパインを有する巨大細胞が多数認められた.このことは神経細胞の異常増生,移動障害と肥大を意味し,成長因子の異常を示唆している.臨床的には早期の外科的治療が有効と思われる(Pediat Neurol).神経細胞移動異常の典型例である滑脳症を免疫組織化学的に検索し,深部細胞層と表層細胞層の間の無細胞層にはシナプトフィジンが特異的であり,アストログリアは血管周囲に見られるに過ぎないために,表層細胞は早期に移動停止した深部細胞層の分子層を貫通して,その外側に形成されると推測される(Pediat Neurol).神経細胞移動異常の樹状突起,シナプシス形成の発達的観察のうち代謝異常を伴うZellweger症候群では免疫組織化学でペロキシゾ-ムの欠損が証明され,髄鞘の形成遅滞,細胞移動障害による神経細胞ヘテロトピアと多少脳回,大脳皮質ニュ-ロンの樹状突起形成,スパイン減少が認められたペロキシゾ-ム異常と脳形成・成熟異常との関連性は血管形成の面より検討中である(Brain Res,Brain Dev).2)アミノ酸代謝異常におけるシナプシス形成異常.悪性フェニルアラニン血症やmaple syrup urine diseaseでは,深部の大脳皮質ニュ-ロンが逆転,斜め,水平などの配列異常を示し,スパインの減少もみられた.この配列とシナプシス形成の異常はニュ-ロンの移動終了後の成熟過程に生じ,出生前の代謝異常が関与しているものと考えられた(Pediat Pathol).3)脳幹のカテコラミンニュ-ロンの発達と異常胎児から小児にかけて,脳幹のカテコラミンニュ-ロンの発達を免疫組織化学的に観察し,胎児早期に成熟し,機能分化していた.先天性中脳水道狭策では,ニュ-ロンの未分化やニュ-ロピルの未発達がみられた.中脳水道狭策による水頭症のほかに,Chiari奇形にも免疫組織化学的染色を行い,Chiari奇形の脳幹には異常が少ないが,アストログリアの減少が認められ,成因と関連し,興味深い。正常の胎児,新生児および乳児では,延髄呼吸中枢のニュ-ロン樹状突起のスパインは胎児期に増加し,生後に減少する。乳幼児突然死症候群ではスパインの生後の減少が遅れることを認めた.更に,延髄の腹外側にあるカテコラミンニュ-ロンのシナプシス発達も遅れていた.従って、乳児突然死の機転に呼吸,循環ならびに睡眠覚醒パタ-ンの発達の異常が示唆される(Neuropediatr).脳幹梗塞例の中脳,橋および延髄にtyrosine hydroxylaseとサブスタンスP(SP)の免疫組織化学的染色を行い,カテコラミン神経細胞の異所的変化とSPの増加を認めた.これらの症例は臨床的な突然死や無呼吸であり,組織化学的異常は神経性呼吸・循環調節異常と関連していると考えられる(Pediat Neurol).4)21番染色体,精神遅滞と早発老化.大脳皮質の神経細胞樹状突起のスパインは出生頃から急速に増加するが,ダウン症候群では、生後の増加が少なく,シナプシスの発達遅滞があった(Brain Dev).また,シナプシスの減少も対照より早く、アミロイドの早期出現と早発痴呆と関係深いと考えられた.さらに、21番染色体コ-ドの遺伝子の特異的蛋白の抗体を作製し、免疫組織化学的に検討し、ダウン症候群の側頭葉に発現しやすいことが分かった(Develop Brain Res)。染色体21番に遺伝子があるSuperoxide dismutaseを免疫組織化学的に観察し,SODの免疫組織化学的発現は胎児中期に起こり,成人の加令では減少傾向にあった(Brain Dev).神経細胞樹状突起発達の遅れの機序を見るために,21番染色体にあるSー100を発達免疫組織化学的に検索した.Sー100は新生児と老人の側頭葉に増加し,精神遅滞との関連性が疑われた(Pediat Pathol).本症のシナプシス形成遅滞にはいくつかの因子が関与していると思われる.1)神経細胞移動異常におけるシナプシス形成障害.神経細胞は胎児期に増生,移動,定着そして成熟する.大脳半球の肥大と皮質の多少脳回が認められる片側巨脳症に免疫組織化学的およびゴルジ染色を行い,脳軟膜内へのグリア,神経細胞および髄鞘のヘテロトピアを認めた.皮質表層部には小神経細胞と変形した細胞があり,深部には多くの樹状突起とスパインを有する巨大細胞が多数認められた.このことは神経細胞の異常増生,移動障害と肥大を意味し,成長因子の異常を示唆している.臨床的には早期の外科的治療が有効と思われる(Pediat Neurol).神経細胞移動異常の典型例である滑脳症を免疫組織化学的に検索し,深部細胞層と表層細胞層の間の無細胞層にはシナプトフィジンが特異的であり,アストログリアは血管周囲に見られるに過ぎないために,表層細胞は早期に移動停止した深部細胞層の分子層を貫通して,その外側に形成されると推測される(Pediat Neurol).

神経細胞移動異常の樹状突起,シナプシス形成の発達的観察のうち代謝異常を伴うZellweger症候群では免疫組織化学でペロキシゾ-ムの欠損が証明され,髄鞘の形成遅滞,細胞移動障害による神経細胞ヘテロトピアと多少脳回,大脳皮質ニュ-ロンの樹状突起形成,スパイン減少が認められたペロキシゾ-ム異常と脳形成・成熟異常との関連性は血管形成の面より検討中である(Brain Res,Brain Dev).2)アミノ酸代謝異常におけるシナプシス形成異常.悪性フェニルアラニン血症やmaple syrup urine diseaseでは,深部の大脳皮質ニュ-ロンが逆転,斜め,水平などの配列異常を示し,スパインの減少もみられた.この配列とシナプシス形成の異常はニュ-ロンの移動終了後の成熟過程に生じ,出生前の代謝異常が関与しているものと考えられた(Pediat Pathol).3)脳幹のカテコラミンニュ-ロンの発達と異常胎児から小児にかけて,脳幹のカテコラミンニュ-ロンの発達を免疫組織化学的に観察し,胎児早期に成熟し,機能分化していた.先天性中脳水道狭策では,ニュ-ロンの未分化やニュ-ロピルの未発達がみられた.中脳水道狭策による水頭症のほかに,Chiari奇形にも免疫組織化学的染色を行い,Chiari奇形の脳幹には異常が少ないが,アストログリアの減少が認められ,成因と関連し,興味深い。正常の胎児,新生児および乳児では,延髄呼吸中枢のニュ-ロン樹状突起のスパインは胎児期に増加し,生後に減少する。乳幼児突然死症候群ではスパインの生後の減少が遅れることを認めた.更に,延髄の腹外側にあるカテコラミンニュ-ロンのシナプシス発達も遅れていた.従って、乳児突然死の機転に呼吸,循環ならびに睡眠覚醒パタ-ンの発達の異常が示唆される(Neuropediatr).脳幹梗塞例の中脳,橋および延髄にtyrosine hydroxylaseとサブスタンスP(SP)の免疫組織化学的染色を行い,カテコラミン神経細胞の異所的変化とSPの増加を認めた.これらの症例は臨床的な突然死や無呼吸であり,組織化学的異常は神経性呼吸・循環調節異常と関連していると考えられる(Pediat Neurol).4)21番染色体,精神遅滞と早発老化.大脳皮質の神経細胞樹状突起のスパインは出生頃から急速に増加するが,ダウン症候群では、生後の増加が少なく,シナプシスの発達遅滞があった(Brain Dev).また,シナプシスの減少も対照より早く、アミロイドの早期出現と早発痴呆と関係深いと考えられた.さらに、21番染色体コ-ドの遺伝子の特異的蛋白の抗体を作製し、免疫組織化学的に検討し、ダウン症候群の側頭葉に発現しやすいことが分かった(Develop Brain Res)。染色体21番に遺伝子があるSuperoxide dismutaseを免疫組織化学的に観察し,SODの免疫組織化学的発現は胎児中期に起こり,成人の加令では減少傾向にあった(Brain Dev).神経細胞樹状突起発達の遅れの機序を見るために,21番染色体にあるSー100を発達免疫組織化学的に検索した.Sー100は新生児と老人の側頭葉に増加し,精神遅滞との関連性が疑われた(Pediat Pathol).本症のシナプシス形成遅滞にはいくつかの因子が関与していると思われる.1)神経細胞移動異常におけるシナプシス形成障害.神経細胞移動異常の樹状突起,シナプシス形成の発達的観察のうち,代謝異常を伴うZellweger症候群では免疫組織化学でペロキシゾ-
発達期視覚野における求心性線維単一軸索の形態学的可塑性と神経栄養因子の役割

哺乳類視覚野の片眼視覚遮断による変化は、発達脳の可塑性のモデルとして広く研究されてきたが、近年、この可塑性に神経栄養因子が重要な役割を果たすことが示唆されている。シナプス後皮質細胞より分泌される神経栄養因子を、シナプス前線維が競合的に受容し、その競合の結果コラムの拡大や縮小を引き起こすという仮説である。報告者はこれまで、発達期の一次視覚野に脳由来神経栄養因子(BDNF)を持続的に投与すると、すでに出来上がった眼優位性コラムがdesegregateし、コラム構造が見られなくなることを見いだした。また、片眼遮蔽を行った動物では、健常眼のコラム、遮蔽眼のコラム共にdesegregationを示した。このことはBDNFが発達期の視覚野において、視床からの入力線維の皮質内分布に影響を与えうることを示す。しかし、入力線維の分布や形態が神経活動の変化によっても引き起こされることは、広く知られており、投与したBDNFが視覚野ニューロンの活動の変化、例えば、活動性を上昇させることで神経結合の強化や新生を引き起こしたために、結果として眼優位コラムがdesegregateしたという可能性も考えられる。そこで本研究は、BDNFの投与や内因性BDNFの抑制により、発達期視覚野ニューロンの光反応性がどのように変化するかを明らかにすることで、BDNFの視覚野神経回路網への影響のメカニズム理解の手がかりを探る。生後4-5週の仔ネコの両側一次視覚野にステンレスカニューレを留置し、浸透圧ミニポンプを用いてBDNFあるいはリンゲル液を2週間にわたり持続投与した。その後、動物を麻酔、非動化し、BDNF投与部位周辺の皮質より多数のニューロンのスパイク活動を細胞外記録した。リンゲル液投与部位周辺でも同様の記録を行い、各ニューロンの光反応性(反応の強さ、方位選択性等)を定量的に解析した。その結果、BDNF投与部位周辺においては、視覚野ニューロンの光反応の強さが低下しており、また方位選択性も弱くなっていることが明らかとなった。この結果は、BDNF投与が直接ニューロンの活動性を高めることはないということを示し、さらに、既存のシナプスを単純に強化あるいは抑圧するのではなく、シナプスの再編成を行うことを示唆している。
エンバクのサツマイモネコブセンチュウ抵抗性遺伝子の同定と線虫対抗品種開発への利用

本研究では、strigosaエンバク品種テララがもつサツマイモネコブセンチュウ抵抗性の遺伝機構を明らかにし、飼料および緑肥として利用される線虫対抗strigosaエンバク品種を効率的に育成できるDNAマーカーを開発する。研究方法として、サツマイモネコブセンチュウに対して抵抗性を示すテララと感受性を示すヘイオーツの塩基配列情報を取得し、テララとヘイオーツの交配により作成した解析集団と両品種の塩基配列情報を用いて抵抗性遺伝子座の座乗領域を同定する。さらに解析結果から、サツマイモネコブセンチュウ抵抗性個体を選抜できるDNAマーカーを作出し、実際の育種材料を用いてDNAマーカーの有効性を検証する。
長野市地附山地すべりの特異性とその災害に関する研究

昭和60年7月26日長野市地附山に発生した地すべりは、長野県北部の第三紀層地すべりの1つとみることができる。しかし、これまで地すべりを生じたことのない裾花凝灰岩の中で発生している。多量のモンモリロナイトを含む粘土の存在、直接の引きがねとなった多量の降雨があったとはいえ、何故この場所で地すべりが発生したかを、地質学・地球化学・土質工学の立場から検討した。また、都市内の災害で情報連絡・避難体制の新たな問題を社会学の立場から調査した。地すべり地は、比高250m、南東向きの斜面であるが、この周辺の斜面にはNNE方向の3本の断層が存在する。断層にはさまれる西側部分は地疊状の構造をなし、東側の2本の断層ではさまれる部分は地溝状に落ち込んだ構造をなす。さらに、この東側部分はほぼ直交する別の3本の断層により切られている。このため地すべり地では、斜面上部と下部で受け盤、中央部で流れ盤をなし、中央部に軟弱な裾花凝灰岩中部層が存在することも相まって、地すべりを生じやすい地質構造をなしている。地下水の水質は、不動地では塩化物イオンが多いのに比し、地すべり地では硫酸イオンが増大しており、地すべりの地下水は過去に交換された可能性がある。さらに地下水のトリチウム測定から、地すべり地で地下水の多い所は1960年代の雨水により涵養されているとみられる。粘土鉱物の面では、モンモリロナイトはほぼNaで飽和された状態にあり、地下水中の塩化物の減少による土性変化はわずかである。都市型災害の問題として、避難時に60%の人が車を利用しているという車社会の現実、避難命令にもその根拠を説明して納得してもらう事の必要性が指摘できる。
網羅的遺伝子解析による頭頸部がんの放射線感受性予測

頭頸部扁平上皮癌における網羅的遺伝子解析と、放射線治療感受性の相関について、検討を行うため、まずは一連の予備実験を行った。頭頸部扁平上皮癌位おいては、とくに、HPV関連がんが放射線感受性が良いことが知られており、HPV関連がん(中咽頭がん)における遺伝子変異解析と、HPV関連遺伝子の発現の相関について検討することとした。実臨床に還元しうるデータをえるため、実際の臨床症例から腫瘍検体を採取し、解析を行う方針とした。実際の生検材料を用いることは、あらたな生検を行うことになり、侵襲性が問題となると予想されたことから、患者の唾液や血液から、腫瘍特異的遺伝子を抽出して検討を行う方針とした。まず、唾液中の腫瘍特異的遺伝子を抽出することとしたが、放射線治療中のそれらの増減を図ることで、治療感受性の多寡を検討することとした。実際の症例からの検体採取に先駆け、院内倫理審査委員会に前向きの観察研究を行う上での研究倫理審査申請を行い、許可を得た。2016年から2017年にかけて、合計11名のHPV関連中咽頭がん患者より、試料(唾液並びに血液)を採取し、唾液中の腫瘍特異的遺伝子の網羅的遺伝子解析ならびにHPV関連遺伝子の検討を行った。腫瘍特異的遺伝子であるHPV E6、E7については、治療経過中に連続して採取可能であった9例中7例において、治療開始前と比較して治療経過中40GYで著明に減少していた。血液中のHPV関連遺伝子は、唾液に比較して変化に一貫性が乏しい傾向があった。網羅的遺伝子解析については、ライブラリ作成が終了し、解析の結果、TP53やPI3Kなど、唾液中からも頭頸部扁平上皮癌の発がんに関与すると考えられている遺伝子変異の検出が可能であった。今後、変異の定義における閾値設定の調節を進めて行く予定である。頭頸部癌の臨床検体(手術あるいは生検標本)から遺伝子を抽出し、網羅的遺伝子解析を行う方針で研究を進めた。しかし、研究開始の時点で、頭頸部癌における全ゲノムあるいは全エキソン解析の解析結果の報告が欧米の各施設から報告が新規に行われ、数十例程度の遡求的解析では、臨床データの信頼性や、パラフィン包埋切片からの遺伝子抽出による資料の質の問題もあり、インパクトのある研究結果を示せない可能性が出てきた。そこで、検討の結果、前向きに患者自身より個別に同意を得た上、試料を採取の上、前向きにがんの網羅的遺伝子解析を行う方法に研究方法の変更を行った。まずは、倫理審査委員会に患者より低侵襲に試料を採取するための研究の申請を行った。平成28年度中に、当施設での研究開始許可を得たため、試料採取に必要な諸物品の購入を行った。状況に応じて、患者血清内の浮遊腫瘍DNAも解析することを前提とした。現在、前向き研究が開始され、症例の登録、試料の収集を鋭意進めている。遺伝子の解析については、一定程度試料が集まり次第、数度に分けて行う予定としている。現状では、平成29年度後半には症例の蓄積がすすみ、おおよその解析結果の集計が可能と考えている。また、照射期間を通じて試料を採取する研究も合わせて進める予定としており、その予備実験として、食道癌細胞株を用いた放射線照射の実験を行った。通常のコロニーアッセイでは、一回照射のみでその後の生残率を検討することが多いが、日常臨床と同様の分割照射を行い、試料の採取が可能かどうかを検討した。遺伝子の長さ(integrity)の検討では、日常臨床で根治照射の際に用いられる照射線量を投与しても、一定以上のDNAの長さを保ったまま、細胞が生残することが明らかとなった。当初の研究目的であった、パラフィン包埋標本から遺伝子を抽出し網羅的解析を行う研究報告が相次いでいる状況を鑑み、個別同意を前提とした前向きな試料収集を行う方針とした。当施設の倫理審査委員会に研究申請を行い、研究許可を得た。現在は、症例登録を行い、試料の収集を継続している。当初の予定は遡求的解析を主体とした研究であったが、現在は前向きにより質を高めた研究を予定している。研究方法の変更があったが、すでに研究許可を得、症例登録を開始しているため、概ね順調に推移していると考える。臨床検体を用いた、頭頸部扁平上皮癌における、網羅的遺伝子解析を行うことを目指し、施設内の研究倫理審査委員会への申請、許可を得たのち、前向きに検体収集を行った。これまでに10例の頭頸部扁平上皮癌症例から検体を採取した。組織そのものを生検で採取を行うことは侵襲が高いため、頭頸部癌患者の血液、唾液より腫瘍組織を採取する方針とし、採取された検体より、DNAを抽出した。採取された検体内に、一定の質、量のDNAが存在することが確認されている。唾液の方が血清中よりも、回収されたDNA総量は多かった。唾液中の総DNA濃度は、9例の中央値で、540 ng/μlであった。がんの網羅的遺伝子解析を行うにあたっては、市販のキャンサーパネルを用いず、独自のキャンサーパネルを発注し、構築した。これは、特に頭頸部扁平上皮癌に特異的に認められると考えられる遺伝子変異を中心に解析を行うためである。キャンサーパネルの設計にあたっては、Pubmed上にupoladされている、遺伝子変異情報や、マイクロアレイによる発現情報を独自に二次解析を行って確認をした。

中咽頭癌においては、HPV感染例はPI3K関連変異が多く認められる一方、HPV非関連癌においては、p53など、喫煙などに関連した癌と同様の変異プロファイルを示しており、これは既報と矛盾しない結果であった。そのため、網羅的遺伝子解析を行うにあたり、従来高い頻度で変異が報告されているp53やRBなどの遺伝子候補に加えて、HPVやEBVなどのウィルス関連遺伝子も同時に解析を行う方針とした。現在、抽出されたDNAから、ライブラリを作成する部分まで完了しており、今後、網羅的遺伝子解析へ進む予定である。研究結果の一部を、2018年日本放射線腫瘍学会生物部会学術大会(第56回)で報告する予定である。当初、頭頸部扁平上皮癌における網羅的遺伝子解析と、その結果が放射線治療成績に及ぼす影響として研究を開始した。TCGAデータベースの構築の進展程度からも明らかなように、現在世界中から種々の癌における網羅的遺伝子解析の報告があり、pubmedデータベースに絶えずその遺伝子変異情報がuploadされている。このような状況のもとで、市販されているキャンサーパネルを用いた遺伝子解析を行っても、学問的に新規性のある報告を行うことは困難と考えた。そのため、頭頸部扁平上皮癌の遺伝子変異解析に特化した、カスタムキャンサーパネルを独自に構築した上で解析を進めることとした。候補遺伝子の確認においては、すでにデータベース上にuploadされている変異、発現情報を二次利用することで行うこととし、独自のキャンサーパネルを構築した。これまでのところ、前向きの検体採取そのものはDNAの質、量的に問題ないことは確認できており、抽出されたDNAからライブラリ作成まで順調に進んでいる。実際の変異解析や、実際の治療成績との比較検討はこれからであるが、研究そのものは概ね順調に進んでいることから、上記の区分(概ね順調に進展している)とした。頭頸部扁平上皮癌における網羅的遺伝子解析と、放射線治療感受性の相関について、検討を行うため、まずは一連の予備実験を行った。頭頸部扁平上皮癌位おいては、とくに、HPV関連がんが放射線感受性が良いことが知られており、HPV関連がん(中咽頭がん)における遺伝子変異解析と、HPV関連遺伝子の発現の相関について検討することとした。実臨床に還元しうるデータをえるため、実際の臨床症例から腫瘍検体を採取し、解析を行う方針とした。実際の生検材料を用いることは、あらたな生検を行うことになり、侵襲性が問題となると予想されたことから、患者の唾液や血液から、腫瘍特異的遺伝子を抽出して検討を行う方針とした。まず、唾液中の腫瘍特異的遺伝子を抽出することとしたが、放射線治療中のそれらの増減を図ることで、治療感受性の多寡を検討することとした。実際の症例からの検体採取に先駆け、院内倫理審査委員会に前向きの観察研究を行う上での研究倫理審査申請を行い、許可を得た。2016年から2017年にかけて、合計11名のHPV関連中咽頭がん患者より、試料(唾液並びに血液)を採取し、唾液中の腫瘍特異的遺伝子の網羅的遺伝子解析ならびにHPV関連遺伝子の検討を行った。腫瘍特異的遺伝子であるHPV E6、E7については、治療経過中に連続して採取可能であった9例中7例において、治療開始前と比較して治療経過中40GYで著明に減少していた。血液中のHPV関連遺伝子は、唾液に比較して変化に一貫性が乏しい傾向があった。