hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医薬品用新規味覚センサの開発

本申請課題は,服薬ノンコンプライアンスの改善に必要な医薬品の苦味を評価するための新規味覚センサの開発を目的とした.味覚センサの受容部である脂質高分子膜の膜表面および膜内部の組成分布を調査し,膜電位応答との関連性を評価した.その結果,センサの感度は,苦味物質の吸着量にのみ依存するのではなく,脂質と可塑剤による膜表面電荷密度に影響し,それらのバランスが重要であることが分かった.これらの知見から,医薬品用苦味センサと人工甘味料用センサを作製し,センサ応答と官能検査のデータを用い,官能値と相関が高い統計モデル式を作成できた.従って,医薬品の苦味を設計する際に有効な新規手法として有用であると考えられる.本申請課題は,服薬ノンコンプライアンスの改善に必要な,医薬品の苦味を客観的に数値化するための新規味覚センサの開発を目的としている.味覚センサは,食品の味強度を客観的に数値化出来る世界初・日本発の革新的なケミカルセンサとして食品業界等で利用されており,これらの技術を応用・発展させることでセンサの実現を目指す.味覚センサの受容部である脂質高分子膜は,脂質,可塑剤,高分子から成り,脂質と可塑剤の種類や組成量を調整することで,味物質との静電相互作用や疎水性相互作用による膜電位変化を引き起こす.実施項目として,1.深さ方向に対する脂質,可塑剤の分布に関する分析,2.脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合と医薬品の吸着量の計測,3.脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価を行うこととし,H26年度は,項目1,2に関して研究を実施した.実施項目1では,エイジング処理によって変化する脂質高分子膜の組成分布等の膜構造(モルフォロジー)をTOF-SIMSによる脂質高分子膜表面の組成分布を調査し,膜組成に含まれる脂質が膜表面方向に優位に分布していることが明らかとなった.また,接触角測定による膜表面の疎水性度がエイジング時間に対して減少する傾向を確認した.実施項目2では,TEMを用いた表面観察,FT-IR (ATR法),XPSを用いた膜表面の組成分析を実施した.その結果,FT-IR及びXPSを用いた分析において,脂質高分子膜表面の組成分析に関する実験手法や評価方法の確立に成功した.また,脂質高分子膜の膜電位応答や吸着量の評価を実施した.医療分野において,服薬ノンコンプライアンス(服薬不尊守)が大きな問題となっている.本研究は,服薬ノンコンプライアンスを改善するために,医薬品の苦味を客観的に数値化するための新規味覚センサの開発を目指すものである.味覚センサは,ヒトが各味受容体を有することを模倣し,基本五味毎に対応する脂質高分子膜電極を用いることで,各基本味の識別・味強度の数値化を可能とした世界初・日本初の膜電位計測型のケミカルセンサである.味覚センサの脂質高分子膜電極は,脂質,可塑剤,ポリ塩化ビニルから構成されており,対象物と静電相互作用や物理吸着により膜電位が変化することで味の強度を定量化する.医薬品の苦味をヒトの官能と一致する新規医薬品用味覚センサを開発するために,1.深さ方向に対する脂質,可塑剤の分布に関する分析,2.脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合いと医薬品の吸着量の計測,3.脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価の3つの項目について研究を実施した.実施項目1,2では,昨年度に引き続いてエイジング処理による脂質高分子膜の効果について検証した.実験は,表面ゼータ電位,FTIR-RAS,XPS,接触角測定をおこない,両性イオンによるエイジング処理と脂質高分子膜の特性変化について実施した結果,表面の脂質,可塑剤の分布が変化することや,測定感度が向上する条件が明らかとなった.また,当初の予定を拡大し,人工甘味料による苦味の抑制効果を苦味センサと甘味センサを用いて評価する手法の開発に着手した.官能評価を実施し,苦味物質であるキニーネと人工甘味料の苦味強度の抑制を苦味,甘味センサを用いることでヒトの苦味強度に良く一致する統計モデルを得ることに成功した.本申請課題の実施項目は,1.深さ方向に対する脂質,可塑剤の分布に関する分析,2.脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合いと医薬品の吸着量の計測,3.脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性をおこなうことを予定していた.予定通り実施項目1.2を進め,有益な知見を得た.また,これらの実施項目に加え,人工甘味料による苦味の抑制効果を苦味センサと甘味センサを用いて評価する手法の開発に着手し,官能検査を実施して人工甘味料による苦味抑制効果をよく表現する解析モデルを得ることに成功した.従って,「当初の計画以上に進展している.」とした.高齢社会を迎えた我が国や今後迎えるであろう先進諸国において,服薬ノンコンプライアンスの改善は喫緊の課題となっている.本申請課題は,医薬品の苦味を客観的に数値化するための新規味覚センサの開発を目指すものである.味覚センサは,人が各味受容体を有することを模倣し,基本五味毎に対応する脂質高分子膜電極を用い,各基本味の味強度の数値化を客観的に評価する世界初・日本発の膜電位計測型のケミカルセンサである.本申請課題では,医薬品の苦味をヒトの官能値と一致する新規味覚センサの開発を目指し,実施項目1脂質,可塑剤の分布に関する分析,実施項目2脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合いと医薬品の吸着量の計測,実施項目

3脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価の3項目について実施する.本年度は,実施項目3に関して実施した.また,昨年度開発をおこなった人工甘味料による苦味の抑制効果を苦味センサと甘味センサを用いて評価する新規手法の開発も実施した.脂質高分子膜は,昨年度までに検討をおこなった脂質及び可塑剤の種類・量と疎水性度,脂質膜表面電荷密度に関する知見を基に最適化した結果,センサの感度,選択性のみならず耐久性を改善することができ,長期使用に耐えうる脂質高分子膜の作製に成功した.また,医薬品苦味のモデル味物質として用いられる塩酸キニーネと苦味抑制剤として用いられる人工甘味料を混合したサンプルを対象とし,苦味センサと人工甘味料用センサを用い,人の官能値と相関が高い統計モデル式の作成に成功した.本申請課題は,服薬ノンコンプライアンスの改善に必要な医薬品の苦味を評価するための新規味覚センサの開発を目的とした.味覚センサの受容部である脂質高分子膜の膜表面および膜内部の組成分布を調査し,膜電位応答との関連性を評価した.その結果,センサの感度は,苦味物質の吸着量にのみ依存するのではなく,脂質と可塑剤による膜表面電荷密度に影響し,それらのバランスが重要であることが分かった.これらの知見から,医薬品用苦味センサと人工甘味料用センサを作製し,センサ応答と官能検査のデータを用い,官能値と相関が高い統計モデル式を作成できた.従って,医薬品の苦味を設計する際に有効な新規手法として有用であると考えられる.実施項目は,1.深さ方向に対する脂質,可塑剤の分布に関する分析,2.脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合と医薬品の吸着量の計測,3.脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価を行うことを予定しており,H26,27年度に上記実施項目1,2を,H28年度に実施項目3を計画していた.本年度は予定通り,実施項目1,2を実施し,十分な知見を得ることができたため,「おおむね順調に進展している.」とした.実施項目3の脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価と,本年度から新たに実施した人工甘味料による苦味の抑制効果を苦味センサと甘味センサを用いて評価する手法の開発について進める予定である.工学当初の予定通り,H26年度に引き続きH27年度に,1.深さ方向に対する脂質,可塑剤の分布に関する分析,2.脂質高分子膜表面の脂質,可塑剤の分布度合と医薬品の吸着量の計測をおこない,H28年度に3.脂質高分子膜の膜電位応答と脂質高分子膜の構造との関連性評価をおこなう.また,医薬品は,苦味を緩和させるために,人工甘味料を使用している.従って,当初の研究を拡充し,人工甘味料による苦味の抑制効果を含めた苦味センサの開発を進める予定である.外部機関に機器分析に関する分析委託を行う予定であったが,申請者の所属先で予定していた分析装置を使用することができたため,予定より使用額が減少した.また,官能検査に関しても分析委託を行う予定であったが,関連研究グループ内で実施できたため,予定より使用額が減少することができた.当初計画の計画では,脂質や可塑剤の組成量を高速液体クロマトグラフィーを用いて評価する予定であった.しかし,カラムの選定,サンプル調整等の評価手法を吟味する必要が出たため,当初予定していたカラムの購入等を控えたため,予定より使用額が減少した.本年度の成果を鑑み,GC-MSを用いた脂質高分子膜の分析が有効であると考えられる.そのため,カラムの購入に使用する予定である.
全ゲノム解析結果に基づいた2型糖尿病候補遺伝子解析と糖尿病網膜症関連遺伝子の解析

(1)全ゲノム解析結果に基づいた2型糖尿病候補遺伝子の解析:我々の解析において日本人2型糖尿病の感受性領域である可能性が示唆された染色体21番領域の80種類以上の多数の遺伝子のSNPについて、東京大学人類遺伝学教室(徳永教授)において解析中である。症例として罹患同胞対法に用いた家系の糖尿病患者155名、対照はPSCより年齢と性別をマッチさせた100名を用いており、間もなく解析が終了する予定である。(2)糖尿病網膜症関連遺伝子の解析:2型糖尿病で網膜症を有する者500例と有しないもの350名を用いて、候補遺伝子であるVEGF遺伝子多型を検討した。その結果、検討した7種類のSNPの中で、全例を用いた解析では有意ではなかったが、増殖網膜症の有無でサブ解析した場合に1種類のSNPにおいて有意差を認めた。さらに、このSNPは硝子体液中VEGF濃度と関連している可能性が示唆された。現在投稿準備中である。(3)新規MODY遺伝子の検討:インスリン遺伝子のpromoter領域に結合する蛋白の多くがMODYの原因遺伝子であるが、未だに検討されていない新規の蛋白であるMafAについてMODYパネルを対象として変異解析を行った。その結果、MODY例でのみ認められる変異とMODYで出現頻度の明らかに高い変異力確認された。現在、これらの変異について機能解析を施行中である。(4)特許出願:平成15年5月21日に「Calpain10遺伝子による2型糖尿病のリスク診断法」の出願を完了した。
バイオ３Ｄプリンタを用いた犬軟骨組織の体外構築と移植による軟骨再生治療効果の検討

まず、我々が培養法を確立させた新規犬間葉系幹細胞(MSCs)であるbone marrow peri-adipocyte cells (BM-PACs)からスフェロイドを作製し、バイオ3Dプリンタを用いて、3D組織構造体を作製した。構造体は通常酸素および低酸素環境下で7日間軟骨分化誘導を行った。一部のスフェロイドは構造体作製に用いず、単体で分化誘導を行った。構造体およびスフェロイド単体のいずれも、低酸素環境下で硝子軟骨様の分化を示したが、スフェロイド単体と比較すると、SOX9等の軟骨関連遺伝子の発現は構造体で有意に亢進した。また、通常酸素環境下では構造体のプロテオグリカンやII型コラーゲン発現が低下した。以上から、3D軟骨組織構築においても低酸素環境は重要であり、バイオ3Dプリンタと低酸素培養を組み合わせることで、犬MSCsから硝子軟骨組織を体外構築することが可能であった。次に、作製した構造体の犬軟骨欠損モデルにおける軟骨再生治療効果を検討した。健常ビーグル犬2頭からBM-PACsを培養し、移植予定部の3D形状を再現した直径6 mmの硝子軟骨構造体を低酸素下で作製した。その後、両後肢の大腿骨内側顆荷重部に直径6 mmの軟骨欠損を作製し、片側は構造体を移植する移植肢、対側は移植を行わない対照肢とした。3か月後に膝関節を採取し、移植部の組織学的評価を行った。Dog 1では移植肢、対照肢ともに欠損部が軟骨様組織で置換されていた。組織学的評価では、移植肢の欠損部は大部分が硝子軟骨様組織で置換されていたのに対し、対照肢では線維軟骨様組織が混在している様子が確認された。一方でDog 2では移植肢、対照肢ともに欠損部に再生軟骨組織はほとんど認められなかった。以上から、バイオ3Dプリンタにより作製した硝子軟骨構造体の移植により、欠損部の線維軟骨による再生を抑制出来る可能性が示唆されたが、今後、移植方法や移植後の管理等をさらに検討する必要があると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、申請者らが新規に培養法を確立した犬間葉系幹細胞である骨髄周囲脂肪細胞周囲細胞(BM-PACs)の効率的な軟骨分化条件について検討した。まず、基礎的な培養条件として、増殖段階での塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)添加の有無および分化誘導時のFBS濃度の観点から評価を行った。増殖段階にbFGFを添加することで増殖能の亢進と、細胞の小型化が認められた。bFGF添加群のspheroidでは無添加群と比較して早期に多量のグリコサミノグリカン(GAG)発現がみられ、I型コラーゲンの発現は抑制された。一方、FBS濃度が低いほどGAGおよびII型コラーゲンの発現が亢進した。また、10%および1%FBS群ではspheroid表層がSafranin O陰性を示したが、0%FBS群ではspheroid全体がSafranin O陽性を示した。以上より、増殖段階におけるbFGF添加とFBS不含軟骨分化培地により、BM-PACsを迅速かつ効率的に軟骨分化させることができた。ここまでの検討で基礎的な軟骨分化条件を確立することが出来たため、続いて硝子軟骨分化を促進させる成長因子の組み合わせを検討し、より生体内の軟骨に近い組織の作製を目指した。これまで軟骨分化培地に添加していたTGF-β1に加えて、軟骨分化促進作用が報告されている成長因子(BMP-2, GDF-5, IGF-1)を培地中に添加し、軟骨誘導試験を行った。BMP-2添加群およびGDF-5添加群では有意にGAG発現が亢進した。qPCRによる遺伝子発現解析を行ったところ、硝子軟骨マーカーであるCOL2/COL1の発現はGDF-5添加群で高い傾向が認められた一方、肥大軟骨マーカーであるCOL10の発現はBMP-2添加群で有意に高値を示した。以上より、GDF-5は硝子軟骨の作製に理想的な成長因子であると考えられた。これまで軟骨分化が困難とされてきた犬間葉系幹細胞の軟骨分化能を飛躍的に促進させる培養法を確立し、さらに硝子軟骨への分化に促進的に機能する成長因子の同定にも成功した。次年度は予定通りバイオ3Dプリンタを用いた実験へ移るため、おおむね順調に進展している。昨年度までの研究により、新規の犬間葉系幹細胞である骨髄周囲脂肪細胞周囲細胞(BM-PACs)の効率的な軟骨分化条件の確立に成功したが、一部の細胞は線維軟骨へ分化していると考えられた。よって本年度は、Hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)を介して様々な細胞の増殖・分化制御に関与するとされる低酸素環境に着目した。まずは、BM-PACsの拡大培養および、その後の軟骨分化に対する低酸素環境(2% O2)の影響を評価した。低酸素下での拡大培養ではHIF-1αの核内移行が促進し、増殖能の亢進と骨関連遺伝子発現の有意な抑制が認められた。拡大培養時の酸素濃度に関わらず、低酸素で軟骨誘導を行ったspheroidではHIF-1αの核内移行が認められ、グリコサミノグリカンおよび硝子軟骨マーカーであるII型コラーゲンの発現が亢進し、線維軟骨マーカーであるI型コラーゲン発現は抑制された。

軟骨関連遺伝子の発現は低酸素下で軟骨誘導を行ったspheroidにおいて有意に亢進した一方で、COL1の発現は有意に抑制された。以上より、軟骨誘導時の低酸素環境はHIF-1αの核内移行を介してBM-PACsの軟骨分化を促進させるだけではなく、硝子/線維軟骨への分化運命決定にも関与することが示唆された。続いて低酸素環境によりBM-PACsを硝子軟骨へと分化運命決定付けすることが可能であるかを検討したところ、培養初期の1週間のみ低酸素培養を行うことで、グリコサミノグリカンおよび硝子軟骨マーカーであるII型コラーゲンの発現が亢進し、線維軟骨マーカーであるI型コラーゲン発現が抑制された。遺伝子発現についても軟骨関連遺伝子の発現が有意に亢進した一方で、COL1の発現は有意に抑制された。以上より、軟骨誘導の初期に低酸素環境に曝すことで、BM-PACsを硝子軟骨へと分化運命決定付けすることに成功した。これまで分化制御が困難であった間葉系幹細胞の硝子/線維軟骨の分化運命決定に関与する因子を発見し、幹細胞を硝子軟骨へと運命決定付けることにも成功した。次年度は予定通り犬軟骨欠損モデルへの移植を実施するため、おおむね順調に進展している。まず、我々が培養法を確立させた新規犬間葉系幹細胞(MSCs)であるbone marrow peri-adipocyte cells (BM-PACs)からスフェロイドを作製し、バイオ3Dプリンタを用いて、3D組織構造体を作製した。構造体は通常酸素および低酸素環境下で7日間軟骨分化誘導を行った。一部のスフェロイドは構造体作製に用いず、単体で分化誘導を行った。構造体およびスフェロイド単体のいずれも、低酸素環境下で硝子軟骨様の分化を示したが、スフェロイド単体と比較すると、SOX9等の軟骨関連遺伝子の発現は構造体で有意に亢進した。また、通常酸素環境下では構造体のプロテオグリカンやII型コラーゲン発現が低下した。以上から、3D軟骨組織構築においても低酸素環境は重要であり、バイオ3Dプリンタと低酸素培養を組み合わせることで、犬MSCsから硝子軟骨組織を体外構築することが可能であった。次に、作製した構造体の犬軟骨欠損モデルにおける軟骨再生治療効果を検討した。健常ビーグル犬2頭からBM-PACsを培養し、移植予定部の3D形状を再現した直径6 mmの硝子軟骨構造体を低酸素下で作製した。その後、両後肢の大腿骨内側顆荷重部に直径6 mmの軟骨欠損を作製し、片側は構造体を移植する移植肢、対側は移植を行わない対照肢とした。3か月後に膝関節を採取し、移植部の組織学的評価を行った。Dog 1では移植肢、対照肢ともに欠損部が軟骨様組織で置換されていた。組織学的評価では、移植肢の欠損部は大部分が硝子軟骨様組織で置換されていたのに対し、対照肢では線維軟骨様組織が混在している様子が確認された。一方でDog 2では移植肢、対照肢ともに欠損部に再生軟骨組織はほとんど認められなかった。以上から、バイオ3Dプリンタにより作製した硝子軟骨構造体の移植により、欠損部の線維軟骨による再生を抑制出来る可能性が示唆されたが、今後、移植方法や移植後の管理等をさらに検討する必要があると考えられた。現在は、上記の研究で確立した軟骨分化条件にて、バイオ3Dプリンタを用いた三次元犬軟骨組織の体外構築を進めている。組織学的評価によりspheroid同士の融合および軟骨基質発現を確認した後に、三次元犬軟骨組織の移植による有効性・安全性の評価を行う予定である。
確率的言語モデルを用いたソフトウェア解析の研究

本研究は,ソフトウェア開発者の知的作業に起因して生ずるプロダクトの曖昧性を,確率的要素を含むモデルで表現し,ソフトウェア解析・進化のプロセスを体系的に支援するための方法論とツール基盤を構築した.ソフトウェア進化研究の包括的な調査に基づいて本研究の位置づけを行うとともに,再利用可能なソースコード解析ツール基盤の開発やソフトウェアアーキテクチャ設計判断過程のモデル化を行った.本研究は,ソフトウェア開発者の知的作業に起因して生ずるプロダクトの曖昧性を,確率的要素を含むモデルで表現し,ソフトウェア解析・進化のプロセスを体系的に支援するための方法論とツール基盤を構築した.ソフトウェア進化研究の包括的な調査に基づいて本研究の位置づけを行うとともに,再利用可能なソースコード解析ツール基盤の開発やソフトウェアアーキテクチャ設計判断過程のモデル化を行った.本課題では,次の三つの項目について動向調査と研究開発を実施した.本年度は主にソフトウェアのソースコードインスペクションツールを構築することで,プログラム解析に関するノウハウを蓄積し,確率的言語モデルの適用の可能性について検討を行った.(a)ソフトウェアコーパスの構築に関する研究では,ソースコードからソフトウェアコーパスを構築すること目的に,オープンソースソフトウェアから題材を収集するとともに,既存のフォールトプローン解析手法をはじめ,ソフトウェアリファクタリングにおけるソースコードの悪臭に対応する事例の調査を行った.(b)確率的言語モデルの構築に関する研究では,ソースコードの確率的言語モデルを構築するために,ソースコードに出現する誤りや誤りを招きやすい記述について調査した.リファクタリングにおける書き換えパターンなど既存の技術を参考に言語要素の抽象化について検討を行った.(c)開発支援ツールの整備に関する研究では,ソフトウェアインスペクションにおける既存のプログラム解析技術の調査と,インスペクションツールの実装を行った.実装したツールは,確率的言語モデルに基づく解析機能を組み込む基盤環境として今後も整備を続ける.ツールの構築にあたっては,決定的な解析結果と確率的な解析結果との統合が容易になるよう,再利用可能かつ保守性の高いソフトウェアアーキテクチャを設計し,それに基づくアプリケーションインタフェースの設計を行った.本課題では,前年度までの研究成果に立脚し,次の三つの重点研究項目について要素技術を統合しツール化するための研究開発を実施した.前年度までに構築したソフトウェアのソースコードインスペクションツールを,保守性向上を目的として改良し,確率的言語モデルを採り入れたインスペクションの実装の受け皿を整備した.さらに,本研究課題と深く関係するソフトウェア進化研究に関して包括的な文献調査を行うことで,本研究の位置づけを明確にした(a)ソフトウェアコーパスの構築に関する研究では,オープンソースリポジトリ解析などを利用したソフトウェア進化研究の文脈における,ソフトウェアコーパスの位置づけを明確にするために,進化研究の包括的な文献調査を行ったこの中で,フォールトプローン解析手法やデバッグ手法,テストケース設計手法における確率モデルの利用動向やソフトウェアコーパスの構築方式などを調査した.(b)確率的言語モデルの構築に関する研究では,確率モデルを利用した検査の実現に向けて,前年度までに構築したソースコードインスペクションツールにおける,検査パターン記述方式の改良を行った」また,ソフトウェアアーキテクチャの保守において確率モデルを導入・利用する方式について検討を行った.(c)開発支援ツールの整備に関する研究では,(b)で改良した検査パターン記述を実際のソースコード検査につなげるために,インスペクションツールの改良を行った.実装したツールは,確率的言語モデルに基づく解析機能を組み込む基盤環境として今後も利用と改善を継続する.本課題では,前年度までの調査および研究開発成果に立脚し,研究計画時に策定した三つの重点研究項目について研究開発を実施した.ソフトウェア解析およびソフトウェア進化に関する包括的な動向調査を継続しながら洗練するとともに,当該研究課題の位置づけをさらに整理した.また,構築したソースコードインスペクションツールCDIのためのソフトウェアアーキテクチャについては,統合的な検査仕様記述方式の組込みを容易にするための改良を行った.(a)ソフトウェアコーパスの構築に関する研究では,ソフトウェア進化研究の包括的な文献調査を行った.さらに,プログラム書き換え支援や,サービス指向アーキテクチャにおける統合支援への確率モデルの適用について検討を行った.さらに,組込みソフトウェアを取り巻く環境の仕様を記述する手段として確率モデルをとらえ,形式手法への適用について検討を行った.特に後者は大規模な事例の入手が困難であることから具体的なコーパス作成には至らなかったが,適用可能性についての知見を得ることができた.(b)確率的言語モデルの構築に関する研究では,確率モデルを利用した検査の実現に向けて,前年度までに構築・改良したソースコードインスペクションツールにおける,検査仕様記述方式の開発を行った.この方式では,検査仕様を有限オートマトンに基づいて記述するものであるが,遷移やイベントの発生に確率的要素を導入すること,さらに具体的な検査論理をプログラミングすることで,インスペクション仕様の記述が可能な構成となっている.(c)開発支援ツールの整備に関する研究では,(b)で開発を行った有限オートマトンに基づく検査仕様記述に基づき,検査論理に対するプログラム,検査論理のテストケースを自動生成するツールなどの整備を行った.ツールや基盤環境の実装,調査研究ともに順調に進捗しており,研究成果に示す通り,雑誌等への査読付き論文が掲載されている.このことから本研究課題については順調に進捗していると判断した.24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に示す通り,引き続き次の三つの重点研究課題に対して調査,研究,開発を継続する.(a)ソフトウェアコーパスの構築に関する研究:オープンソースリポジトリの解析方式の研究・開発(b)確率的言語モデルの構築に関する研究:ソースコードおよび設計モデルに対する確率モデル構築と評価

(c)開発支援ツールの整備に関する研究:インスペクションツールの保守と改善,アーキテクチャ評価加えて,今年度において新たに着手したソフトウェア進化に対する調査研究を推進し,内外の最新研究開発動向と比較した本研究の有用性・優位性について明らかにし,本研究のとりまとめを行う.24年度が最終年度であるため、記入しない。
表面解析手段としての濡れ性測定

本研究は溶融金属による固体の濡れ性の結果から固体の表面の構造変化を追跡することを目的とする。得られた結果は以下のようにまとめられる。あらかじめ水素をその表面に吸着させたダイヤモンドの溶融純Snによる濡れ性の温度変化を測定した。濡れ性はダイヤモンドの表面方位に依存するのみならず、それ以上に水素の吸着、脱離によって影響されることがあきらかとなった。溶融純Snとダイヤモンドとの接触角は、融点から1000K近傍までは160°以上の高い値を維持し1000K1150K近傍で急激に減少し、以後回復し、1750K以上ではさらに高い値を示した。このような濡れ性(接触角)の変化はこれまで他の測定方法で得られた水素脱離温度の結果と良い対応を示した。ダイヤモンド表面の水素の脱離温度は、これまで2,3の測定者によって報告されており、いずれも脱離温度はダイヤモンドの表面方位に依存し、その温度は1073K1273Kの間であるとされている。また、ダイヤモンドは黒鉛の準安定相で、高温では黒鉛化することが知られているが、本研究で得られた1750K以上での接触角の増大は表面の黒鉛化に対応するものと考えられる。比較実験として同一条件で、溶融Snと黒鉛との接触角の測定を行ったが、結果は良い一致を示した。また、溶融純In,Gaと固体酸化物単結晶(Al_2O_3,MgO)の濡れ性の測定も行い、この場合には水分の吸着、脱離が濡れ性に大きな影響を示していることが明らかとなった。
オブジェクト指向高度並列AIマシンに関する研究

一般に並列性は、問題領域によって量的にも質的にも異なるものであり、このためアーキテクチャに対する要求も応用分野によって変わってくる。従って、真に有効な高度並列計算機を実現するには、計算機のハードウェア構成と共に、応用分野や並列処理記述言語の検討を同時に進める必要がある。このような背景から、本研究では、並列オブジェクト指向を核概念として、応用分野、並列プログラミング言語、ならびにこれを実行する高並列計算機アーキテクチャの3者を総合的な立場から考慮したトータルアーキテクチャA-NETを提案した。この提案に基づいて、(1)並列処理を前提とした並列オブジェクト指向言語A-NETLを定義し、その処理系を開発した。(2)A-NETLを人工知能分野(知識工学、言語理解)ならびに要素プロセッサのOS記述に応用し、その評価を行った。(3)A-NETLの高速実行のための専用プロセッサを設計し、そのシミュレーションによる評価を行った。などの成果を得た。これらの成果によって、我々は、高度並列計算機の実用化を目指した壮大なプロジェクトを実施する道が開かれたと確信しており、今後、プロトタイプマシンの試作を行うと共に、その結果を踏まえて、A-NET専用のVLSIチップの試作から高度並列計算機の試作へと進めて行きたいと念願している。などの成果を得た。1.AI分野における高度並列処理の検討今年度は特に知識工学に的を絞って,電力系統ネットワークに対するエキスパートシステムを実際的に記述することを行った.これによって,問題の持つ並列性をオブジェクト間の並列性として自然な形でモデル化できることを確かめた.2.並列オブジェクト指向言語の設計並列メッセージ転送(同時,非同期)を中核とするオブジェクト指向言語の設計が実質的に終り,記述経験を重ねることにより,仕様の微調整を行っている.3.言語処理系の試作並列オブジェクト指向言語に対するコンパイラ・アセンブラを試作した.今後,ローダ等の試作を進め,処理系を拡充する.4.高度並列AI計算機アーキテクチャの設計従来の計算機の設計がプロセッサの内部処理中心であるのに対し,本研究では,並列メッセージ転送命令など専用の命令を含む命令セットを設計した.ネットワークアーキテクチャが最近の高度並列計算機の中心的な概念となっているが,現在並列入出力を高速に行えるルータを中心に設計を進めている.5.プロトタイプマシンの理論設計・実装設計プロトタイプマシン2台までの試作を目標として,理論設計を進めている.マイクロプログラム制御方式を採用し,実装の要となるAMD社のビルディングブロックチップAM29300シリーズを準備した.詳細設計は, 63年度に継続して行う.以上の研究経過に沿って,設備備品・消耗品を購入した.また,言語とアーキテクチャについては62年10月の情報処理学会で発表し,言語処理の結果に基づく評価については, 63年3月の情報処理学会で発表した.一般に並列性は、問題領域によって量的にも質的にも異なるものであり、このためアーキテクチャに対する要求も応用分野によって変わってくる。この提案に基づいて、特に63年度においては、1.並列処理を前提とした並列オブジェクト指向言語A-NETLの言語処理系を開発した。2.A-NETLを人工知能分野(言語理解)ならびに要素プロセッサのOS記述に応用し、その評価を行った。3.A-NETLの高速実行のための専用プロセッサを設計し、そのシミュレーションによる評価を行った。4.専用プロセッサのVLSI化の可能性について検討し、この結果に基づいてハードウェア構成の簡単化を行った。などの成果を得た。
平安時代貴族住宅の建築規模復元に関する基礎研究

平成11年度には可能な限り平安時代の柱間寸法や平面構成に関する記述を網羅的に収集し、母屋・庇といった平面部位に着目しながら整理を行った。12年度では、研究書の考古学・文献史学といった関連分野の研究成果を活用するために、これら諸分野の情報の収集を行うとともに、整理、把握されたデータを時代・利用者・利用目的など社会的・文化的な属性と合わせて多角的に分析・検討した。13年度では、この検討をもとに、柱間寸法や平面構成の解明と、時代による変遷の把握につとめた。時代的変遷から位置づけられてきた柱間寸法の相違の多くが、むしろ社会層の反映としての住宅の位置づけの相違に起因するとの結論を得て、社会層の相違を考慮して柱間寸法を想定し、その相違を反映した平面を復元、図示し比較した。結果として柱間寸法の設定は、平安時代貴族住宅の実態把握の前提として等閑視できない重要事項である点を改めて確認した。具体例における建築規模の復元案作成への基礎データとして整理した。そこで東三条殿を事例として、既往の主要な復元案について柱間寸法の適否を逐一検討し、復元の基本前提を再確認した。そして従来の復元案は、本研究から明らかになった平面部位の相違による柱間寸法の差異の実態に対して齟齬が大きく問題があることを指摘した。なお、復元研究における課題についても問題点や学問的な限界と可能性を総括的に整理し提言した。基礎データとなる文献史料の整理・検討によるデータ収集が本年度の研究テーマである。可能な限りの悉皆的な文献の調査を行い、平安時代の柱間寸法や平面構成に関する記述を網羅的に収集し、母屋・庇といった平面部位・時代・利用者・利用目的などの属性に着目しながら整理を行った。一次資料の詳細な分析を基本とするため、各種史資料の購入、資料収集のための所蔵機関への調査旅行、データ整理謝金が、主要な研究経費の使途である。次に収集した資料を平面部位ごとに整理したデータをもとに、平面構成と柱間寸法の相関に関する一般的な傾向を把握した。研究成果については、まず、現在の関連分野の成果に則しつつ、従来の研究の問題点と課題を整理し、建築史学会の学会誌に「書評宮本長二郎著『日本原始古代の住居建築』」(建築史学,第33号,1999年9月)として発表した。続いて、具体的な事例分析をまとめて「閑院における殿舎の柱間寸法」(日本建築学会東海支部研究報告集第38号,2000年2月)として発表した。可能な限りの悉皆的な文献の調査を行い、資料を網羅的に収集し整理を行った前年度に続き、本年度では、まず、前年度に引き続き基礎データとなる文献史料の整理・検討によるデータ収集の補足を行った。続いて、研究書の考古学・文献史学といった関連分野の研究成果を活用するために、これら諸分野の情報の収集を行った。本年度の分析は、この整理、把握されたデータを母屋・庇といった平面部位・時代・利用者・利用目的など社会的・文化的な属性と合わせて多角的に分析・検討することを主眼とした。続いてこの検討をもとに、柱間寸法や平面構成の解明と、時代による変遷の把握につとめた。以上の本年度の把握をもとに、次年度では具体例における建築規模の復元案作成への応用をはかる予定である。研究成果としては、まず、古代の儀式と建築空間との関係を把握するために、古代建築の規模、構成を考える上での基本ともいえる大極殿の平面構成と規模について、考古資料と文献資料との整合を試み、従来の研究とは異なる解釈を得た。概要については、4月開催の建築史学会総会で発表すべく応募中である。また柱間寸法や平面構成の事例収集から、寝殿の平面構成が舗設と密接に関係しており、従来の研究で典型例としてとり上げられてきた東三条殿の寝殿が、特殊な条件のもとで成立した平面構成を示すものであることが明らかとなった。この点については、9月開催の建築学会大会に発表を予定している。

平成13年度では、前年度までの分析により得られた建築規模に関する知見をうけた分析を進め、時代的変遷から位置づけられてきた柱間寸法の相違の多くが、むしろ社会層の反映としての住宅の位置づけの相違に起因するとの結論を得た。そこで中心殿舎となる寝殿の平面について、里内裏や摂関家の儀式を想定した場合と、それ以外の場合といった社会層の相違を考慮して柱間寸法を想定し、その相違を反映した平面を復元、図示し比較した。結果として柱間寸法の設定は、平安時代貴族住宅の実態把握の前提として等閑視できない重要事項である点を、改めて確認した。そこで東三条殿を事例として、既往の主要な復元案について柱間寸法の適否を逐一検討し、復元の基本前提を再確認した。しかしこれら従来の復元案は、本研究から明らかになった平面部位の相違による柱間寸法の差異の実態に対して齟齬が大きく問題があることを明らかにした。そして摂関家の儀式場としての性格を持つ東三条殿や閑院の寝殿の復元案を作成し、研究成果の応用を試みた。研究成果として、まず、古代の儀式と建築空間との関係を把握する上での基本ともいえる大極殿の平面構成と規模について、考古資料と文献資料との整合を試み、従来の研究とは異なる解釈を得たため、13年4月開催の建築史学会総会で発表した。次に、藤原基通邸として紹介されてきた六条堀河殿の寝殿の平面構成を再検討し、従来の研究と異なる復元案を得たことから、14年2月開催の日本建築学会東海支部研究発表会において示した。なお、復元研究における課題についても総括的に整理、提言した(『芸術工学への誘いVI』2002年刊行予定に所収)。
リポソーム投与により誘導されるMDSC様細胞の機能発現に関わる分子基盤の解明

Myeloid-derived suppressor cell(MDSC)は、T細胞免疫応答を抑制する機能を有する。その抑制にはT細胞とMDSCとのcell-to-cell contactが必要だが、その分子は不明である。ラットにリポソーム粒子を静注すると、短期間で脾内に大量にMDSC様細胞(リポソーム捕捉細胞)が蓄積する。この細胞を用いて、当該分子の候補を探索した。MDSC様細胞では、CD276(B7-H3)の発現の増加よよび細胞表面でのB7-H3の発現量が増加を見いだした。MDSCの機能の発現にB7-H3分子の関与する可能性が示唆された。ratに尾静脈からリポソームを投与し、その翌日に脾臓を摘出し、磁気ビーズにて、CD11b/c陽性細胞rich分画を回収した。回収した細胞のほぼ50%はCD11b/c陽性細胞であった。そこからRNAを抽出後、cDNAの合成およびcRNAのラベルと増幅をおこなった後、マイクロアレイ( whole rat, 44,000 gene, Agilent Technologies)にアプライし、リポソーム貪食後に発現の増強している遺伝子を調べた。生理食塩水(コントロール)投与後とリポソーム投与後の結果を比較し、前者と比較して2.6倍以上発現量の差がみとめられた場合を有意な増強と判定した。その結果、遺伝子発現が2回の施行でともにコントロールの2.6倍以上であった遺伝子が168個確認された。その中で、免疫応答に関与すると推定されるもとして、Matrix metalloproteinase p14 (Mmp14), Chemokine(C-C motif) ligand 9 (Ccl-9), IL-18 binding protein (IL-18bp), IL-1α, CD276 (B7-H3)が挙げられた。Ccl-9, IL-18bp, IL-1αはいずれも主としてマクロファージの産生する物質であることから、リポソーム貪食後に免疫応答抑制機能を持つようになるマクロファージ(免疫抑制性マクロファージ)を特徴付ける遺伝子発現パターンと考えられた。一方、CD276はB7 familyの一つで免疫応答の制御に関わる分子である。その機能に関しては、T細胞機能を促進するあるいは抑制するという相反する2つの報告がある。我々の系においては、CD276がT細胞の増殖抑制に関与している可能性があると推定している。リポソームを投与する事によりラットの脾臓にT細胞の増殖を抑制するマクロファージが誘導される。一昨年に、このマクロファージの遺伝子発現プロファイルを解析した結果、168個の遺伝子が再現性をもって、その発現が増強していた。この中で、免疫応答に関与すると推定される遺伝子として、matrix metalloproteinase 14 (Mmp14), Chemokine (C-C motif) ligand9 (Ccl 9), IL-18 binding protein (IL-18bp), IL-1a, CD276 (B7-H3)が挙げられた。特にCD276はB7 familyの一つで免疫応答の制御に深く関わる分子であり、我々の系においても何らかの役割を果たしていると推定し、蛋白レベルでの解析を進めた。Western blotによる解析では、CD276蛋白のあきらかな増加を認めなかった。しかしながら、flow cytometerにより細胞表面への発現を検討した結果、リポソームを貪食した脾マクロファージにおいて、CD276の発現の増加を認めた。一方で、同じB7 familyに属する分子であるCD274の発現には明らかな変化はなかったので、CD276分子の発現増強は特異的であると考えられる。この事は、CD276分子の発現が、T細胞の増殖抑制に関与している事を示唆する。同時に、脾細胞の培養系における、サイトカイン・ケモカインの産生への影響について、網羅的解析を行った。その結果、リポソームの投与により、IFN-g, TNF-a, IL-10の産生が増強する事が明らかとなった。一方、いままでの実験系では、ラットの循環血液量の20%(v/v)のリポソーム溶液を投与していたが、その1/10量でもT細胞の増殖を抑制できる事が判明した。これは、リポソームが免疫抑制剤としても利用できる可能性を示唆するデータと考えられる。リポソームを投与する事により、ラット脾臓にT細胞の増殖を抑制する細胞が誘導される。この抑制にはNOが関与している事、細胞間接触が必要である事から、誘導された細胞はいわゆるmyeloid-derived suppressor cell(MDSC)に類似な細胞と判断できる。本研究を推進する過程で、リポソーム投与後の脾細胞培養上清中にはIL-10, TNF-a, IL-6の産生増強が認められることから、サイトカン産生プロファイルもMDSC細胞と類似していることがわかった。さらに。この細胞に特徴的に発現している分子の一つがB7-H3であることが判明した。H7-H3は細胞表面に発現し、免疫応答を制御する分子でもあり、この分子が、当該細胞のT細胞増殖抑制に関わっている可能性がでてきた。また、投与するリポソームをいままでの1/10近くまで減量しても、T細胞の抑制効果が得られる事も確かめる事ができた。従って、観察された実験結果は、脂質の過剰投与のみで誘発されるものではないと考えられる。

しかも、実験に使用しているリポソームは生体内で産生されるmicrovesicle(ectosome)と構造および組成が類似しているので、一連の実験結果は、microvesicleを生体内で捕捉したマクロファージの機能をよく反映していると考える事が出来るかも知れない。即ち、生体内でMDSCが如何なる機序で誘導されてくるかを解明するための実験モデルと考える事ができる。途中で、実験補助員の交代があったため、実験系の構築に時間がかかった。また、観察された結果が脂質の大量投与によるものでは無い事を示すため、容量依存性の検討を行わなければならず、その為に多くの時間を割いてしまった。免疫応答の調節を司る細胞群の一つにmyeloid-derived suppressor cell(MDSC)がある。MDSCは主としてT細胞とのcell-to-ceell contactを通してT細胞の増殖を抑制する。しかしながら、cell-to-cell contactの分子基盤は、MDSC側もT細胞側も不明である。我々は、ラットにある種のリポソームを投与すると脾臓内にMDSC様の細胞が誘導される事を見いだした。この系を用いて、cell-to-cell contactに関与する分子を探索する事を目的に実験を重ねた。遺伝子発現プロファイルの検討では、リポソームを投与したラットの脾で発現の増強を認めた蛋白の一つが免疫応答の調節に関与しているとされるB7-H3であった。この結果を元に解析を進めた結果、リポソームを捕捉した脾マクロファージ細胞表面ではB7-H3の発現が有意に増強しているという結果を得た。この事から、B7-H3がcell-to-cell contactに関与している分子の候補の一つと考えるに至った。このB7-H3分子が一部のMDSCに発現している事が近年海外の研究者から報告されている。また、T細胞の増殖抑制にはnitric oxide(NO)が関与している可能性も見いだしていたが、リポソームを投与した脾細胞ではiNOSの発現が誘導されている事も示すことができた。これらはいずれもリポソーム投与により誘導されるT細胞の増殖を抑制する細胞がMDSCと極めて類似の細胞である事を裏付けるものとなった。目的の分子基盤の解明にはいたらなかったが、リポソームの投与でMDSC様細胞がin vivoで誘導され、かつB7-H7がそのマーカーとなる可能性を示したことは、リポソームを用いたMDSCのinivo誘導法の開発やその制御法の開発につながる興味深い成果と思われる。今後は、B7-H3分子がT細胞増殖抑制機能の発現に関与しているか否かを検討する事を通して、cell-to-cell contactの分子基盤の探索を続けると同時に、リポソームが如何なる機序でMDSC様細胞を誘導するのかを明らかにして行きたいと考えているMyeloid-derived suppressor cell(MDSC)は、T細胞免疫応答を抑制する機能を有する。その抑制にはT細胞とMDSCとのcell-to-cell contactが必要だが、その分子は不明である。ラットにリポソーム粒子を静注すると、短期間で脾内に大量にMDSC様細胞(リポソーム捕捉細胞)が蓄積する。この細胞を用いて、当該分子の候補を探索した。
高級並列言語の様々な安全性を保証するプログラム進化支援つき汎用型システムの研究

ここ数年のインターネットおよびWorld Wide Web(WWW)の普及,また並列計算機の普及に伴い分散/並列環境上でのプログラミング技術が注目を集めている。本研究では,分散/並列プログラミングにおける様々な安全性(デッドロック/競合状態が起きないこと,計算資源が正しく使われること)を保証するための統一的な枠組みを構築することを目的としている.本年度の研究成果は以下の通り.1.オブジェクト指向言語の再利用性を安全に高めるための言語機構の考案.近年,Javaなどで書かれたオブジェクト指向プログラムの汎用性を高めるための言語機構として,汎用クラス(generics)という,クラス定義中の型情報をパラメータ化できる機構が実用化されつつある.これにより,リスト・木などの汎用データ構造の記述において再利用性が高められることが知られている.しかし,従来のオブジェクト指向言語に備わっていた型に基づく再利用の機構である部分型との統合についてはあまり研究されてこなかった.本年度の研究では汎用クラスのための新しい部分型の機構を提案した.具体的には,核言語とその型システム・意味論を形式化し,提案する機構が型安全であることを証明した.これにより,プログラムの汎用性・再利用性がさらに高まり,従来のプログラムを汎用クラスを使って書き換える際に生じがちであった,型の制限による困難も緩和されると考えられる.ここ数年のインターネットおよびWorld Wide Web(WWW)の普及,また並列計算機の普及に伴い分散/並列環境上でのプログラミング技術が注目を集めている。本研究では,分散/並列プログラミングにおける様々な安全性(デッドロック/競合状態が起きないこと,計算資源が正しく使われること)を保証するための統一的な枠組みを構築することを目的としている.本年度の研究成果は以下の通り.1.計算資源に対するアクセス方法の正しさの検証のための型システムの考案計算機システムにおいては,プログラムは記憶領域(メモリ),ネットワーク,CPU,ファイルなどさまざまな資源を共有して動作しており,あるプログラムが不正に資源にアクセスを行うと,計算機システム全体の動作に悪影響を与える.本研究では各プログラムが正しいプロトコルで資源にアクセスすることを検証するための型システムの確立に成功した.この型システムを用いることにより例えば,(1)新たにメモリを獲得したらいずれそのメモリを解放する.すでに解放したメモリ領域への読み書きを行わない,(2)ファイルを開いたらいずれ閉じる.閉じたあとは読み書きを行わない,(3)ある資源にアクセスする前には必ずその資源に関するロックを獲得してから行う.ロックを獲得したらいずれ解放する.2.プログラム進化支援のための型システムの形式化一般的に,すでに流通している言語へ新しい機能(ここでは先進的型システム)を組み込む場合には,新しい機能を仮定せずに書かれた既存のプログラム部品を,を最小限の書き換えで,新しい環境下での部品と組み合わせ実行できることが望ましい.この目的のために,既存のraw typesという技術を基礎にする方向であるが,これは比較的新しい技術であるため,理論的な基盤を確立する必要がある.本年度はraw typesの理論の研究を行い,raw typesを実際に使っている既存の言語処理系の不具合を発見することに成功した.ここ数年のインターネットおよびWorld Wide Web(WWW)の普及,また並列計算機の普及に伴い分散/並列環境上でのプログラミング技術が注目を集めている。本研究では,分散/並列プログラミングにおける様々な安全性(デッドロック/競合状態が起きないこと,計算資源が正しく使われること)を保証するための統一的な枠組みを構築することを目的としている.本年度の研究成果は以下の通り.1.オブジェクト指向言語の再利用性を安全に高めるための言語機構の考案.近年,Javaなどで書かれたオブジェクト指向プログラムの汎用性を高めるための言語機構として,汎用クラス(generics)という,クラス定義中の型情報をパラメータ化できる機構が実用化されつつある.これにより,リスト・木などの汎用データ構造の記述において再利用性が高められることが知られている.しかし,従来のオブジェクト指向言語に備わっていた型に基づく再利用の機構である部分型との統合についてはあまり研究されてこなかった.本年度の研究では汎用クラスのための新しい部分型の機構を提案した.具体的には,核言語とその型システム・意味論を形式化し,提案する機構が型安全であることを証明した.これにより,プログラムの汎用性・再利用性がさらに高まり,従来のプログラムを汎用クラスを使って書き換える際に生じがちであった,型の制限による困難も緩和されると考えられる.
RNAサイレンシングを介した過敏感反応の制御メカニズムの解明

筆者はこれまでに、強力なRNAサイレンシング抑制タンパク質(サプレッサー)をもつウイルスが、植物に感染した場合に全身壊死を引き起こすこと、全身壊死はHRと同様の機構で誘導されることを明らかにした。以上の知見から、これまで独立したウイルス防御機構と考えられてきたRNAサイレンシングとHRが連動して作用しているのではないかと着想し、解析を進めている。本年度は、タバコ属植物に全身壊死を引き起こすウイルス(P1AMV,TBSV)のサプレッサー形質転換植物についてRNAサイレンシングの指標であるsmall RNAと遺伝子の発現量を調べ、非形質転換体との比較を行った。データ解析の結果、複数のsmall RNA、遺伝子の発現が変動していた。発現が変動した遺伝子群の中には、HRに関与することが示唆されている転写因子、キナーゼ、オーキシン応答遺伝子などが含まれていた。今後、変異体、過剰発現体を用いてこれらの遺伝子の発現がRNAサイレンシングによって制御されていることを実験的に検証するとともに、他の全身壊死を引き起こすウイルスのサプレッサー発現下でも同様の変動が生じるかを解析したい。また、本年度は、P1AMVと近縁なCarlavirus属のウイルスの2つのサプレッサーの機能を詳細に解析した。その結果、一方は単一細胞レベルでRNAサイレンシングを抑制し、他方はRNAサイレンシングのシグナルが植物体全身に拡大する過程を抑制することが明らかになった。さらにウイルスベクターを用いた解析から、本ウイルスはこれらの作用機序の異なる2つのサプレッサーをそれぞれウイルス感染の2つの段階で使い分けていることを明らかにした。これまでにサプレッサーを複数もつウイルスはいくつか同定されていたが、その機能が異なること、実際のウイルス感染において使い分けがなされていることを明らかにしたのは本研究が初となる。筆者は、先行研究より、Plantago asiatica mosaic Virus(PlAMV)がコードするTGBp1が近縁なウイルス間で最も強力なRNAサイレンシング抑制タンパク質であり、なおかつ、タバコ属植物Nicotiana benthamianaに感染した場合に、全身壊死というHRに類似した病徴を引き起こすことを明らかにしていた。そこで、これまで独立したウイルス防御機構と考えられてきたRNAサイレンシングとHRが連動して作用しているのではないかと着想し、解析を進めている。本年度は、まず、PlAMVのTGBplのRNAサイレンシング抑制機構を詳細に解析した。これまでに報告されている植物の複数のRNAサイレンシング経路に対する影響を解析した結果、PlAMVのTGBp1は、植物に外来性遺伝子を導入することで誘導されるRNAサイレンシングと、遺伝子導入後に植物体全身に拡大する全身性RNAサイレンシングを強力に抑制した。これら2つの経路には共通してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)が必要とされることから、PlAMVのTGBp1はRdRpが作用する過程を阻害している可能性が示唆された。今後、さらにTGBp1が作用する因子を同定することによって、HRを制御するRNAサイレンシング経路の解明につながると考えられる。また、PlAMV感染時に生じる全身壊死がHRと同様の反応であるかを調べた。解析の結果、PlAMV感染部位からは、HR誘導時の指標が検出されたとともに、HR誘導に必要とされる因子が、PlAMVによる全身壊死にも必要であることを明らかにした。さらに、HRには細胞死とウイルスの増殖抑制の2つの現象が伴うが、これらの現象の誘導には関与する因子は異なることを明らかにした点は、既存のHRの概念に新たな視点を提示するものであり、非常に興味深い。筆者はこれまでに、強力なRNAサイレンシング抑制タンパク質(サプレッサー)をもつウイルスが、植物に感染した場合に全身壊死を引き起こすこと、さらにこの全身壊死にはHR誘導に必要とされる因子が関与していることを明らかにしてきた。本年度は、ウイルスのサプレッサーの発現下でのsmall RNAおよび遺伝子の発現変動を解析した。まず、強力なサプレッサーであるTGBp1,p19(タバコ属植物に全身壊死を引き起こすplantago asiatica mosaic virus,tomato bushy stunt virusのサプレッサー)形質転換植物を作製し、安定発現体を得た。次に、これらの安定発現体からRNAを抽出し、small RNAおよび遺伝子発現量を調べ、非形質転換体との比較を行った。サプレッサーによって発現が低下したsmall RNAと発現が上昇した遺伝子を照合することで、RNAサイレンシングによって発現が制御されている遺伝子が見出せると考えられ、現在データ解析を進めている。また、本年度は、サプレッサーが未同定だったCarlavirus属のウイルスについても解析を進め、本ウイルスは2つのサプレッサーを持つことを明らかにした。複数のサプレッサーを持つウイルスの報告はこれまでほとんど無く、その機能や感染段階における役割は興味深い。今後、2つのサプレッサーの作用メカニズムを詳細に解析してきたい。さらに、本年度は、Carlavirus属と近縁なTymovirus属のpoinsettia mosaic virusのゲノム配列の解読も行った。今後、両属のウイルスのサプレッサーの比較解析を進めることによって、植物ウイルスのサプレッサー獲得進化の機構に迫りたい。

本年度は、タバコ属植物に全身壊死を引き起こすウイルス(P1AMV,TBSV)のサプレッサー形質転換植物についてRNAサイレンシングの指標であるsmall RNAと遺伝子の発現量を調べ、非形質転換体との比較を行った。データ解析の結果、複数のsmall RNA、遺伝子の発現が変動していた。発現が変動した遺伝子群の中には、HRに関与することが示唆されている転写因子、キナーゼ、オーキシン応答遺伝子などが含まれていた。今後、変異体、過剰発現体を用いてこれらの遺伝子の発現がRNAサイレンシングによって制御されていることを実験的に検証するとともに、他の全身壊死を引き起こすウイルスのサプレッサー発現下でも同様の変動が生じるかを解析したい。また、本年度は、P1AMVと近縁なCarlavirus属のウイルスの2つのサプレッサーの機能を詳細に解析した。その結果、一方は単一細胞レベルでRNAサイレンシングを抑制し、他方はRNAサイレンシングのシグナルが植物体全身に拡大する過程を抑制することが明らかになった。さらにウイルスベクターを用いた解析から、本ウイルスはこれらの作用機序の異なる2つのサプレッサーをそれぞれウイルス感染の2つの段階で使い分けていることを明らかにした。これまでにサプレッサーを複数もつウイルスはいくつか同定されていたが、その機能が異なること、実際のウイルス感染において使い分けがなされていることを明らかにしたのは本研究が初となる。