hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリオーマの予後を規定するマイクロRNAの同定と新たな治療戦略の構築

ルシフェラーゼアッセイでは、miR-183を導入した細胞ではIDH2 3'UT Rを組み込んだものはルシフェラーゼ活性が低下し、さらに変異型I D H2 3'UTRでは変わりなかったことから、mi R -1 8 3が直接的にI D H2 3 'U T Rに作用していることが示された。また、m iR - 18 3 m i mic導入によりH IF-1αのmRNAおよび蛋白発現は、コントロールR N Aを導入した場合と比べ共に上昇した。さらに、m i R- 1 83を導入した細胞ではHIF-1aの下流のGLUT1, VEGFの発現が亢進していた。(結語)悪性グリオーマではmiR-183の発現が著明に亢進しており、miR -1 8 3によりID H 2発現が抑制している可能性が示唆された。また、miR-183によるIDH2の低下よりHIF1aの発現が亢進している可能性が示唆され、miR-183がグリオーマの予後規定因子となりうる可能性が示唆された。マイクロRNAは腫瘍形成、悪性化に関与していることが報告されており、グリオーマにおいてもマイクロRNAのさまざまな異常が報告されている。申請者はグリオーマの予後に関連するマイクロRNAを同定し、治療応用できるマイクロRNAの有無を検討することを目的としている。悪性グリオーマにおけるマイクロRNAの発現異常を、マイクロアレイ解析、リアルタイムRT-PCRにて解析したところ、microRNA-10b,microRNA-21, microRNA-183, microRNA-92b, microRNA-106bで発現が亢進し、microRNA-302C, microRNA-379, microRNA-329,microRNA-134, microRNA-369-3pでは発現が低下していた。microRNA-10b, microRNA-183とも、low grade gliomaよりもhigh grade gliomaにおいて発現が亢進しており、グリオーマの悪性度と比較的よく相関していた。microRNA-183の標的となるmRNAを検討し、他の癌で報告されているPDCD4 (Programmed cell death 4)のグリオーマにおける発現を検討すると、A172,U87細胞ではPDCD4の発現が認められ、microRNA-183をグリオーマ細胞に導入して強制発現させると、PDCD4のmRNAの発現は低下した。このことから、グリオーマにおいてもmicroRNA-183の高発現によって、PDCD4の発現が低下して、アポトーシスに対する耐性が獲得される可能性が示唆された。現在、さらに解析を進めているところである。本研究はグリオーマに関連するマイクロRNAを同定し、治療応用できるマイクロRNAの有無を検討することを目的としている。悪性グリオーマにおけるマイクロRNAの発現異常を、マイクロアレイ解析にて解析したところ、microRNA-183(miR-183)の発現上昇を認めたため、88例のグリオーマで腫瘍周囲脳との発現量を比較したところ、多くのグリオーマでmiR-183の発現が亢進していた。そのターゲットとして、相補性を検討したところ、IDH2(isocitrate dehydrogenase 2)を制御している可能性が分かったため、U251,A172,T98,U87グリオーマ細胞にmiR-183を導入してIDH2の発現量を検討すると、全ての細胞でIDH2の発現低下を認めた。これはルシフェラーゼアッセイでも確認でき、miR-183がIDH2を直接制御していることが分かった。miR-183 inhibitorを細胞内に導入すると逆にIDH2の発現は上昇した。
適応放散過程にあるトラフグ属魚類の集団・種多様性進化過程の解明

本研究は適応放散過程にあるトラフグ属魚類の多様性進化における種内変異と種間交雑の役割について,主に遺伝マーカーを用いて検証することを目的に実施した。トラフグ属魚類2種(A種とB種)において,自然下で大規模な交雑現象が起きていることが明らかになり,また交雑がB種雌とA種雄間の方向で偏って起きていることが明らかになった。雑種第一世代(F1)の多くはA種方向に戻し交雑していることが明らかになり,これら戻し交雑個体は両親種やF1よりも形態学的多様性に富むことが示された。これらの結果から,種間交雑を介したB種からA種への一方向的な遺伝子流動と,A種のもつ遺伝的・形態学的種内変異との関連性が示唆された。食品として流通しているトラフグ属魚類10種(各8個体以上)および外部形態より種が判別できない不明フグ36個体について,AFLP法による集団遺伝学的分析を行い,ベイズ法に基づくクラスター分析並びに雑種分析を行った。その結果,トラフグ属魚類10種のうち,トラフグとカラス間に遺伝的差異はなく,これらとその他の8種間には明瞭な差異が検出された。36個体の不明フグのうち,9個体がトラフグ(カラス含む)とマフグの種間交雑個体であり,そのうち7個体はF1雑種,2個体はBC1(戻し交配第1世代)だった。また,9個体がヒガンフグとコモンフグの種間交雑個体であり,そのうちすべてがF1雑種だった。従って,これらの組み合わせにおいて自然種間交雑が多く発生していることが示された。また,不明フグのうち9個体は遺伝的に純粋なフグであり,そのような個体を含む種における形態的多様性を示していると考えられた。AFLP法によって明らかになった自然種間交雑の多く見られる種間(A種とB種)に形成された雑種について,より定量的な試料採集を行い,合計279個体について雑種クラス判別を行った。その結果,131個体のF1雑種,18個体の戻し交配第1世代(BC1)雑種が見つかり,両種間に自然下で大規模な交雑現象が起きていることが確認された。また,F1雑種の母系をmtDNAの塩基配列に基づき調べたところ,A種を母系とするものが32個体,B種を母系とするものが99個体と,大きな差があった。またBC1雑種のうち17個体はA種に,残りの1個体はB種に戻し交配しており,種間交雑による遺伝子流動はB種からA種方向に偏って起きていることが示唆された。AFLP法およびmtDNA塩基配列に基づく種全体としての遺伝的多様性は,A種の方がB種よりもはるかに大きかったことから,B種が最近になってA種より生殖的に隔離され,創始者効果と一方向的な遺伝子流動により遺伝的多様性が低くなっている可能性が示唆された。AFLP法によって明らかになった自然種間交雑の多く見られる種間(A種とB種)に形成された雑種について,定量的な試料採集を行い,合計279個体についてSTRUCTURE,NewHybrids,DAPCに基づき雑種クラス判別を行った。その結果,131個体のF1雑種,18個体の戻し交配第一世代(BC1)雑種が見つかり,両種間で自然下で大規模な交雑現象が起きていることが明らかになった。また,BC1個体のうち17個体はA種に,残りの1個体はB種に戻し交配しており,種間交雑による遺伝子流動はB種からA種方向へ偏って起きていることが示唆された。遺伝的にA種と判別された119個体のうち2個体でB種由来のmtDNAの異種間浸透が起きていた。遺伝的に区別された純粋なA種とF1間で,外部形態を比較したところ,8測定項目において有意差が認められた。これらの測定項目に基づく主成分分析,正準判別分析,DAPCを行ったところ,99%以上の確率で外部形態からF1雑種を判別できることが示された。また,戻し交配個体の外部形態データを同様に解析したところ,純粋なA種やF1に比べて,主成分プロットの分散が大きくなっていることが示された。このことから,両種間の交雑とそれに伴う種間の遺伝子流動が,戻し交配世代において超越分離をもたらし,A種の遺伝的,形態的多様性に貢献している可能性が示唆された。

年度当初の計画通り,種間交雑の多く見られる種間について定量的な試料採集を行い,多数の自然種間交雑個体をAFLP法およびmtDNA塩基配列に基づき解析することができた。集団遺伝学AFLP法によって雑種クラス判別された個体のうち,F1と戻し交配第1世代個体について,RADライブラリを作成し,次世代シーケンサーを用いたシーケンス分析を行う。それらを基に,雑種の遺伝子型を推定し,純粋個体を比較することにより,種間交雑を起こしている個体に特徴的な遺伝子型が存在するのかどうかを調べる。研究の目的のうち,AFLP法による種・雑種判別がほぼ終わり,自然種間交雑の多く見られる種の組み合わせや,各種の種内変異についての把握ができた。また,成果の一部を学会で発表した。物品費のうち試薬・消耗品にかかる金額の一部が年度末まで確定せず,計画に比べて少額になったため,次年度使用額が生じた。AFLP法により明らかになった純粋な個体および自然種間交雑の多く見られる種間に形成された雑種について,より定量的な試料採取を行い,トラフグ属魚類の適応放散過程における種間交雑の進化的意義について検討する。また,これらの種においてRADライブラリを作成する。昨年度末に不足した試薬・消耗品の購入に充てる。
柿本人麻呂の「うた」の文字と七世紀代を中心とする木簡文字資料との比較研究

最終年度である今年度は、文字資料の調査を木簡だけでなく、墨書土器・正倉院文書に広げ、考察を行った。墨書土器に書かれる和歌は、現在、多く知られていないが、今年度(2012年11月)、平安前期の出土とされる土器が京都市で発見された(藤原良相の邸宅跡)。速報の現地資料(京都市考古資料館速報展)によれば、「ひらかな」の連綿や、檜扇2点「難波津の歌」の事例が新たな墨書資料として提示されている。速報資料および、新聞報道では、「ひらかな」の成立をさらに遡って考えるべき資料であると指摘があったが(通説では10世紀前半)、管見の墨書土器・木簡資料では、9世紀半ばから後半のものが知られ、その点につき、中心的に考察を深めた(来年度に発行予定の自著『柿本人麻呂の文字表現(仮)』に、「難波津の落書一仮名書きの文字資料のなかで一」と題し、書き下ろし原稿を掲載予定)。さらに、今年度の調査において、平城宮出土の墨書土器のなかに「□流□良武/□□」(『墨書土器集成』II一一二号、奈良時代後期)とある例、平安朝以降のものと推測されるが、「タツ波毛(立つ波も)」(『墨書土器集成』II二三五号)の例を、独自に新たな「和歌資料」として指摘した。この2点は、先行研究において、いまだ指摘のない事例であるが、「和歌」ないしは「歌ことば」の可能性を残すものと考えてよいであろう。なお、本年度は、科研研究の別に依頼原稿「『万葉集』の鰻」(三弥井書房『鳥獣虫魚の文学史』2012・7)があり、観音寺遺跡木簡の「鰻」の文字について考察を深めた。萬葉集に「鰻」は一例用いられているが、「武奈伎」と「仮名書き」されている。・「仮名書き」と「正訓文字」が『萬葉集』の中で混在していることに注目し、ことに人麻呂の文字のそれについて、考えを深めた(「柿本人麻呂の音訓仮名の交用表記-「うた」の文字としての「仮名」一」と題して、上記自著の一部とし、本年度入稿した)。最終年度の研究目標であった「木簡の文字」と「柿本人麻呂の文字」との比較研究は、連続面と相違面の両様を探っていく姿勢が今後とも必要であろう。3年計画の初年度の研究目標に掲げていた、近時、発見報告がなされた和歌木簡についての調査・研究を中心的に行った。なかでも、研究対象の一つに挙げていた飛鳥石神遺跡から発掘の「朝凪に来寄る白波」の歌句を有する木簡について、「墨書」ではなく「刻書」の例であることに着目し、刀で刻書される木簡の事例についての調査を詳細に行った。その結果として、刻書の例は、七世紀半ば後半の木簡に例が多く(難波京遺跡・飛鳥池遺跡・飛鳥京跡苑地遺跡)、ことに飛鳥石神遺跡では、文字の練習(習書・すさび書き)としての例を多くみることが確認された。すなわち、様式としては「歌」であるものの、それが歌を誦詠する、または歌を作成・推敲する、といった目的で書かれたものではないことを立証した。そのほか、「難波津の歌」木簡について、公的な場で誦詠される際に用いられたものと、考える説があったことに対し、それが落書(すさび書き)によるもの、との新たな見解を学界に提示した(拙稿「『難波津』の落書再考-『習書』と『落書(すさび書き)』のあいだ-」谷中信一編『出土資料と漢字文化圏』2011年3月31日発行、所収)。この自説を提唱するにあたって、法隆寺五重塔に書かれる「難波津歌」に並行して書かれる習書や、文字瓦の「難波津歌」にやはり並行して書かれる習書の例など、多くの事例について、調査・研究を行った。その結果、「道」「大」など、「はらい」や「しんにょう」などの運筆のための「筆馴らし」と推測される例や、「仮名書き(一字一音書き)」を続けて何文字も書いた例など、「難波津歌」の仮名書きと、「習書」との関連性が浮き彫りになってきた。さらに多くの木簡や土器・瓦に書かれた「難波津歌」の調査から、習書だけでなく戯画を伴う例があることが発見され、それが書かれた状況が、一回的であり、より私的な例があることを追認した。3年計画の2年目の研究目標に掲げていた「宮外(在地)」で発見された和歌木簡について、調査・研究を行った。具体的には、地方官衙遺跡である姫路の辻井遺跡木簡(A)、観音寺遺跡木簡(B)の調査を行った。(A)の「難波津」木簡の例「・□□□□尓佐久□□乃[ ]夫□己母利□・□知知知知屋屋屋屋□や屋屋□□」では、裏面に「知」や「屋」の万葉仮名が、繰り返し習書されている。「習書」は、第一用途を終えた廃材に書かれることが多いが、この辻井遺跡木簡は表面・裏面ともに同筆の可能性が高い。すなわち、「難波津の歌」と「万葉仮名」の習書は、同時的になされていることが知られる例である。

これは、既に論じられている「難波津歌の木簡は公的な典礼の場で用いるもの」と考える説の反証として、提示できる事柄である。さらに(B)にも「奈尓波ツ尓作久矢己乃波奈×」の本文の右に習書があり、同遺跡から報告された新釈文の木簡(2011年報告)にも「那尓波都」や「奈尓波」が同じ面に何回か習書されていた。同面や裏面に何度も書かれる難波津木簡は、それを公の場で挿頭して持ったと考えるには不自然であるし、とりわけ「繰り返し(書かれること)」を重視するならば、それは「習書」の残痕であると考えるしかないであろう。今年度の調査ではさらに、「倭語」を仮名書きした習書木簡「阿多加多毛(あたかたも)」(C)や、「歌ことば」である「比□可タ乃(ひさかたの)」と書かれた檜扇墨書について考証した。その結果、前者には習書や戯画が見られ、後者には「仮名書き」の習書(落書)が見られた。結論として、難波津歌や和歌、倭語を書いた木簡は、習書性・落書性が強く、とりわけ「万葉仮名」を練習したり、すさび書いたりする(和歌の一部など)目的のもとに書かれたものと考えられる。最終年度である今年度は、文字資料の調査を木簡だけでなく、墨書土器・正倉院文書に広げ、考察を行った。墨書土器に書かれる和歌は、現在、多く知られていないが、今年度(2012年11月)、平安前期の出土とされる土器が京都市で発見された(藤原良相の邸宅跡)。速報の現地資料(京都市考古資料館速報展)によれば、「ひらかな」の連綿や、檜扇2点「難波津の歌」の事例が新たな墨書資料として提示されている。速報資料および、新聞報道では、「ひらかな」の成立をさらに遡って考えるべき資料であると指摘があったが(通説では10世紀前半)、管見の墨書土器・木簡資料では、9世紀半ばから後半のものが知られ、その点につき、中心的に考察を深めた(来年度に発行予定の自著『柿本人麻呂の文字表現(仮)』に、「難波津の落書一仮名書きの文字資料のなかで一」と題し、書き下ろし原稿を掲載予定)。さらに、今年度の調査において、平城宮出土の墨書土器のなかに「□流□良武/□□」(『墨書土器集成』II一一二号、奈良時代後期)とある例、平安朝以降のものと推測されるが、「タツ波毛(立つ波も)」(『墨書土器集成』II二三五号)の例を、独自に新たな「和歌資料」として指摘した。この2点は、先行研究において、いまだ指摘のない事例であるが、「和歌」ないしは「歌ことば」の可能性を残すものと考えてよいであろう。なお、本年度は、科研研究の別に依頼原稿「『万葉集』の鰻」(三弥井書房『鳥獣虫魚の文学史』2012・7)があり、観音寺遺跡木簡の「鰻」の文字について考察を深めた。萬葉集に「鰻」は一例用いられているが、「武奈伎」と「仮名書き」されている。・「仮名書き」と「正訓文字」が『萬葉集』の中で混在していることに注目し、ことに人麻呂の文字のそれについて、考えを深めた(「柿本人麻呂の音訓仮名の交用表記-「うた」の文字としての「仮名」一」と題して、上記自著の一部とし、本年度入稿した)。最終年度の研究目標であった「木簡の文字」と「柿本人麻呂の文字」との比較研究は、連続面と相違面の両様を探っていく姿勢が今後とも必要であろう。本申請者は、RPD特別研究員であるが、3年採用の初年に第二子を出産しているため、当初の計画以上に研究が進展しているとは言い難い。しかし、可能な限り、研究に必要となる論文・調査報告書の整備や、現地調査の準備を進めており、研究の進捗には、まったく問題はない。研究計画のひとつに掲げていた自著の出版も3年計画の最終年度に刊行予定であり、計画通りであることを報告しておく。2年間の研究において、研究課題に関する基礎的考察(木簡の釈文確認、文字調査など)は、ほぼ完了した。そのため、最終年度である年年度は、それを活字化し、学会に提示する予定である。自著『柿本人麻呂の文字表現』(笠間書院刊行予定)の中には、上記の調査に基づく書き下ろし原稿を多くする。また、木簡の文字との比較ということにおいて、万葉集に残る柿本人麻呂の文字について、その文学的性質を掘り下げて論じる予定である(現在、執筆中であり、最終年度の中心的な研究課題となろう)。
社会階層と差別：信念・価値観および地位選好に関する定量分析

本研究を通じて、二度のインド現地調査を行った。一つ目は2013年23月にタミルナードゥ州の二つの農村にて約500家計を対象に行った家計調査である。この事前調査の研究成果は、開発経済学の国内主要学会にて発表されている。二つ目は2014年3月にデリーにて400名を対象に行った地位選好に関する個人調査である。諸般の事情により、調査時期が遅れてしまったために現在も分析中である。本年度は、本研究の一つ目のテーマである「社会階層間の教育格差に関する研究」を更に進展させ、また二つ目のテーマである「社会的地位に対する選好に関する研究」について調査の準備を進めた。一つ目のテーマに関して、具体的には、インド・ビハール州農村調査データを用いた分析を論文としてまとめ、開発経済学の国内主要学会の一つである、アジア政経学会(2012年10月14日、関西学院大学)にて報告を行った。この研究は、その後更に改訂を重ね、2013年夏に出版予定である『南アジアの教育発展と社会変容(仮)』に収録される章の一つとして発表されることになっている(章の題名は「初等教育の就学における社会階層間格差:ビハール州農村の事例から」である)。このテーマに関しては、社会階層間における教育格差の要因を更に詳しく分析するために、23月にインド・タミルナードゥ州農村において追加調査も行った。調査項目の一つに、人々の主観的な教育の収益率を尋ねた質問があり、教育投資の収益率に社会階層ごとで大きな違いがあるのかどうか、そして主観的な教育収益率が人々の実際の教育投資行動に影響を及ぼしているのかどうかを明らかにすることを目的としている。現在、鋭意、調査データのクリーニング作業を行っている段階である。二つの目のテーマについては、社会的地位に関する選好についての先行研究を精読し、またこの分野における代表的な分析手法について学習し、本研究の分析の方向性を定めた。より具体的には、地位選好についての選択実験をデザインし、現地における調査に向けて、現在、質問票(実際には、ネットを用いた調査サイト)を作成中である。最終年度である本年度は、本研究の一つ目のテーマである「社会階層間の教育格差に関する研究」分析を行い、二つ目のテーマである「社会的地位に対する選好に関する研究」の調査を行った。より具体的に、一つ目のテーマについては、昨年2月にインド・タミルナード州で行った家計調査で得られた約500家計分のデータ整理を終了させ、分析を行った。残念ながら、仮説通りの結果が得られず、現時点では論文執筆の段階まで進んでいないが、継続して分析を行っている。二つ目のテーマについては、地位選好に関する調査を本年3月にデリーにて行った。調査対象者は400名で、現在データ整理の最中であり、作業が終了し次第分析に取り掛かる予定である。本年度は、本研究の目的の一つである「社会階層間の教育格差に関する分析」について研究を進めた。具体的には、昨年度実施したインド・ビハール州農村データを用いて、子どもの教育投資に関する研究を行った。子どもの教育水準は現在の家計の所得とその教育投資を通じて将来得られる所得の予測を通じて決定されることになる。仮に、将来において教育から得られる収益の予想が低ければ、当然現在の子どもへの教育投資は低くなる。インドの文脈においては、労働市場における賃金あるいは就業の社会階層間格差が現在でもなお存在し、この労働市場における階層間格差が将来の教育格差を生んでいる可能性がある。分析結果は、6歳から14歳の義務教育年齢下にある子どもの就学状況は社会階層間で大きく異なっており、年齢と性別をコントロールした後で、一般カーストと指定カースト(被差別階層)との間には平均1.25年程度の差が存在する。当然ここには、途中で学校を辞めてしまった子どもも含まれる。この1.25年の差が何によってもたらされているかを更に分析した結果、26.6%程度が現在の経済的格差によって説明される部分であり、13.6%が将来の職業期待、5.3%程度が親の教育に対する考え方の違いによって説明されることが示された。残りの説明不可能な部分が約55%と非常に大きいが、将来の職業期待や親の教育に対する考え方などの影響も決して小さくないことが示されたことは特筆すべきである。すなわち、初等教育の普及のためには無償教育などの供給面における改善のみならず、需要面すなわち教育を受ける側の誘因となる労働市場の改善あるいは雇用や教育についての情報の格差の改善も同時に必要であることを意味している。現在は推計上の幾つかの問題点を解決すべく、秋に小規模な再調査を行うことを予定しており、分析の修正が終わり次第、学術論文としてまとめる予定である。昨年度実施した「社会階層間の教育格差に関する研究」に再調査の必要性が生じており、今年度はインド・タミルナードゥ州農村にて追加の調査を行った。このため、時間的な制約から今年度実施予定であった「社会的地位に関する研究」の調査を実施することが出来きず、全体的な研究計画からはやや遅れていると判断される。

今年度は社会階層間の教育格差に関する研究を終わらせる予定であったが、親の教育に対する考え方を数値化する質問と将来の職業期待に関する質問項目に不十分な点があり、正確にそれらの影響を推計できているかという点について疑問が残った。国際的な学術水準を保つためにも再調査が必要であるとの考えにいたり、次年度の秋に再調査を予定している。このため、教育格差に関する研究については、進度がやや遅れていると判断される。本研究の二つ目の目的である「社会階層と地位選好の関係に関する分析」についても、次年度中にデリーにて調査を予定しており、こちらについても、当初の予定からは若干の遅れがあるものの、調査の方法・設計などの準備に関しては、着実に進んでいる。本研究の一つ目のテーマである「社会階層間と教育格差に関する研究」については、データのクリーニングを早期に終了させ、年度の前半までには最終的な分析を終了させ、論文としてまとめる予定である。二つ目のテーマである「社会階層と地位選好の関係に関する研究」については、遅くとも秋までには調査を終了させ、データのクリーニング、分析を完了させ、出来うる限り早い時期に論文としてまとめる予定である。本研究の一つ目の目的である「社会階層間と教育格差に関する分析」については、次年度1112月ごろに、インド・ビハール州農村にて、教育に関する調査項目について重点的に再調査を行い、データのクリーニングが終了し次第、最終的な分析に取り掛かる予定である。二つ目の目的である「社会階層と地位選好の関係に関する分析」については、次年度の9月あるいは2月ごろに、インド・デリーの都市部にて、選択実験による調査を予定している。9月あるいは2月としているのは、調査手法・設計などの準備の進展具合次第であるためである。こちらも、データのクリーニングが終わり次第、分析に取り掛かる予定である。次年度は、地位選好に関する選択実験の支出に予算の多くを充てることになる。現時点での予定としては、調査のための旅費に40万程度、調査謝金(調査補助、翻訳、調査用プログラムの作成、データクリーニングなど)に50万程度を考えている。次年度は、研究費のほとんどを調査関連の支出に充てることになる。現段階の予定としては、繰越金と合わせて、調査のための旅費に40万程度、調査謝金(調査補助、翻訳、調査用プログラムの作成など)に90万程度を考えている。
ナノプローブ走査型顕微鏡システムによる細胞内分子ネットワークの解析

申請者らは、走査型プローブ顕微鏡と近接場顕微鏡を連携したシステムにより、細胞内で発現するGFP(Green Fluorescent Protein)分子や細胞表面に局在するレセプター分子などを10ナノメートルレベルの空間分解能でイメージングすることに成功しており、ゲノム情報にもとずいた細胞内で発現する生化学ネットワークを細胞内外のナノ空間情報と連携させて解析することを確立する。そこで、今回は、グルコースの存在下でGFPを発現するGFP形質転換酵母の時間経過にともなうGFP融合タンパク質の挙動をSNOAM(走査型近接場光/原子間力顕微鏡)システムを用いて解析することを検討した。まず、SD-W培地20°CでGFP形質転換酵母を培養した。対数増殖期の酵母細胞を分取し、レーザー共焦点顕微鏡にて励起光488nmを照射し、グルコース添加後の酵母細胞の蛍光像の経時的変化を観察した。同様に対数増殖期の酵母細胞を分取し、SNOAMにて観察した。GFP形質転換酵母の共焦点顕微鏡による観察によって、グルコース添加後の時間経過ごとの蛍光変化より細胞内部から細胞表層へGFP融合表層タンパク質の発現の様子が観察された。この発現の観察では細胞表面の蛍光に強弱がみられた。このことからGFP目的タンパク質である細胞表層タンパク質が、細胞表層で局在していることが認められた。また、細胞の分裂周期によってこの表層タンパク質の局在が異なることが観察された。この局在の詳細は、既存の共焦点顕微鏡では観察できなかった。そこでSNOAMを用いて観察したところ、酵母細胞の形状および蛍光像が得られた。
二重課題を用いた児童の課題習熟過程にみられる注意処理機能の解明

平成30年度では,先行研究においても採用されている二重課題を認知課題であるオドボール課題と運動課題としてマッチング課題を用いておこなった.先行研究では,成人を対象として左手の握力発揮をモニタリングしたマッチング課題を用いていたが,本研究では特に児童を対象とした際に課題の繰り返しによる疲労が課題の習熟過程へ影響を与える可能性があることから手関節の屈曲伸展動作時に生じる手関節の角度変化をゴニオメータでモニタリングしたマッチング課題を考案した.これにより,対象は疲労感なく運動課題の反復が可能となった.一方,オドボール課題については先行研究と同様に聴覚刺激を用いて標的刺激へのボタン押し反応課題を採用したが,各セットの実施時間を当初計画していた3分間よりも短縮させ,当初計画していた10セットの反復を実施しても課題に集中して取り組めるように配慮した.これにより,成人を対象とした実験課題では,認知課題,運動課題それぞれを単独でおこなった単一課題遂行時に比べて二重課題遂行時には,認知課題における反応時間(RT)の遅延,エラー率の低下,運動課題におけるマッチングの正確性低下が認められた.この二重課題遂行によるパフォーマンスの低下は二重課題干渉と呼ばれるが,二重課題を繰り返しおこなうことによりパフォーマンスは向上することが明らかとなった.しかしながら,当初の計画よりも課題の考案,選定に時間を要したため,児童を対象とするためのスケジュール調整などがスムーズにいかず,児童を対象とした二重課題の反復についてはまだ検討できていない.平成30年度では,本研究課題を達成するために重要な課題の習熟過程を検討することが可能となる実験条件について試行し,児童が参加しても実験の継続が可能であり,かつ課題の繰り返しによる疲労度合いも考慮した実験条件を計画していた.しかしながら,計画していた実験デザインでは成人においても各セットの実験時間が長くなったため,繰り返しおこなう二重課題に対する参加者のパフォーマンス維持が難しくなった.そこで,二重課題として用いる運動課題(マッチング課題),認知課題(オドボール課題)それぞれにおいて十分なデータ数が確保できるとともに,参加者が集中して取り組めるセット数と各セットの実施時間を検証するために多くの時間を費やすこととなってしまった.このため,特にオドボール課題において呈示する二種類の音刺激の刺激間間隔を短くして必要な刺激呈示回数を確保できるように実験条件を修正したが,これらの実験条件の再検討に時間がかかった.これにより,児童参加者の実験参加スケジュール調整が間に合わず,本年度は成人のみのデータ測定となったため,本研究課題の進捗状況は遅れている.本年度では,昨年度対象として検討することができなかった児童を対象とした二重課題をおこない,成人においてみられていると同じような課題の習熟過程が生じるかについて検討していくこととなる.合わせて,成人においても前年度と同様に二重課題の反復による課題習熟過程について検討していく.このため,児童,成人を対象として得られた二重課題の繰り返しにより,課題それぞれにみられる行動指標(運動課題:マッチングの正確性,認知課題:オドボール課題における反応時間,エラー率)について詳細な検討を進めていくとともに,二重課題遂行中に同時記録しているオドボール課題中の脳波データから標的刺激,標準刺激にみられる同時に測定している脳波データから事象関連電位成分の振幅変化について解析を進め,二重課題を繰り返し実施することによる課題習熟過程において注意処理資源の配分がいかに変化していくか,またこれらの変化が児童と成人で異なるかについて検証していく.平成30年度では,先行研究においても採用されている二重課題を認知課題であるオドボール課題と運動課題としてマッチング課題を用いておこなった.先行研究では,成人を対象として左手の握力発揮をモニタリングしたマッチング課題を用いていたが,本研究では特に児童を対象とした際に課題の繰り返しによる疲労が課題の習熟過程へ影響を与える可能性があることから手関節の屈曲伸展動作時に生じる手関節の角度変化をゴニオメータでモニタリングしたマッチング課題を考案した.これにより,対象は疲労感なく運動課題の反復が可能となった.一方,オドボール課題については先行研究と同様に聴覚刺激を用いて標的刺激へのボタン押し反応課題を採用したが,各セットの実施時間を当初計画していた3分間よりも短縮させ,当初計画していた10セットの反復を実施しても課題に集中して取り組めるように配慮した.これにより,成人を対象とした実験課題では,認知課題,運動課題それぞれを単独でおこなった単一課題遂行時に比べて二重課題遂行時には,認知課題における反応時間(RT)の遅延,エラー率の低下,運動課題におけるマッチングの正確性低下が認められた.この二重課題遂行によるパフォーマンスの低下は二重課題干渉と呼ばれるが,二重課題を繰り返しおこなうことによりパフォーマンスは向上することが明らかとなった.しかしながら,当初の計画よりも課題の考案,選定に時間を要したため,児童を対象とするためのスケジュール調整などがスムーズにいかず,児童を対象とした二重課題の反復についてはまだ検討できていない.平成30年度では,本研究課題を達成するために重要な課題の習熟過程を検討することが可能となる実験条件について試行し,児童が参加しても実験の継続が可能であり,かつ課題の繰り返しによる疲労度合いも考慮した実験条件を計画していた.しかしながら,計画していた実験デザインでは成人においても各セットの実験時間が長くなったため,繰り返しおこなう二重課題に対する参加者のパフォーマンス維持が難しくなった.そこで,二重課題として用いる運動課題(マッチング課題),認知課題(オドボール課題)それぞれにおいて十分なデータ数が確保できるとともに,参加者が集中して取り組めるセット数と各セットの実施時間を検証するために多くの時間を費やすこととなってしまった.

このため,特にオドボール課題において呈示する二種類の音刺激の刺激間間隔を短くして必要な刺激呈示回数を確保できるように実験条件を修正したが,これらの実験条件の再検討に時間がかかった.これにより,児童参加者の実験参加スケジュール調整が間に合わず,本年度は成人のみのデータ測定となったため,本研究課題の進捗状況は遅れている.本年度では,昨年度対象として検討することができなかった児童を対象とした二重課題をおこない,成人においてみられていると同じような課題の習熟過程が生じるかについて検討していくこととなる.合わせて,成人においても前年度と同様に二重課題の反復による課題習熟過程について検討していく.このため,児童,成人を対象として得られた二重課題の繰り返しにより,課題それぞれにみられる行動指標(運動課題:マッチングの正確性,認知課題:オドボール課題における反応時間,エラー率)について詳細な検討を進めていくとともに,二重課題遂行中に同時記録しているオドボール課題中の脳波データから標的刺激,標準刺激にみられる同時に測定している脳波データから事象関連電位成分の振幅変化について解析を進め,二重課題を繰り返し実施することによる課題習熟過程において注意処理資源の配分がいかに変化していくか,またこれらの変化が児童と成人で異なるかについて検証していく.前年度は国内外への旅費としての支出が予定より少なかったこと,また当初予定していた実験スケジュールが遅れたため,実験参加者への謝金請求が年度内に間に合わなかったことが理由として挙げられる.本年度は前年度と同様に二重課題を用いた研究課題を進展させていくために,データ測定に必要となる備品,消耗品の追加購入および,研究成果を発表予定であるため実験参加者等への謝金,論文校閲,学会への旅費としての使用を計画している.
いわゆるびまん性間質性肺炎,肺線維症の病理:タイプ別コラ-ゲンの動態と局在

1.剖検により得られた正常肺8例とびまん性間質性肺炎、肺線維症組織3例の新鮮材料を未固定のままクリオスタットで10μに薄切し、スライドグラスにはりつけ、ペプシン処理、コラ-ゲンを可溶化し抽出後、その抽出液をDEAEセルロ-スクロマトグラフィ-でタイプ別コラ-ゲンを分離した。この操作の前後で、肺組織のEvG,Ag,Masson染色、また抗タイプ別コラ-ゲン抗体、抗タイプI、抗タイプIIIと抗タイプIV抗体を用いてABC法による酵素抗体法を行い、コラ-ゲン成分の消失と残存を観察した。2.生材料そのままを30ー50グラム、ホモゲナイズ後上記と同様に可溶化してタイプ別コラ-ゲンを定量した。おおよそのαI(III)/αI(I)は正常例で0.1線維化肺例で0.8ほどであった。3.抗コラ-ゲン抗体を用いてPAP法により、上記の結果を確認したが、線維化肺ではタイプIIIの抗体のものの方がより強く染色された。4.出現する細胞成分の種類と増減について線維化肺組織では、リンパ球、マクロファ-ジ、線維芽細胞、平滑筋細胞等が増加しているが、場所によるバラツキが大きいこと、光学顕微鏡のみでは同定の困難な細胞が結構あることがわかった。5.ヒト線維化肺のタイプ別コラ-ゲンの増減の研究の(1)の剖検により得られた正常肺、進行した線維化肺の新鮮材料をホモジネ-トし、除脂質、ペプシン処理によりコラ-ゲンの可溶化では、IV、V型コラ-ゲンがペプシン処理により殆ど抽出された。タイプI、III型コラ-ゲンはペプシン処理後の残渣をさらに尿素処理、CNBr消化を行ってもまだその中にI、III型が存在した。タイプI、III型コラ-ゲンの可溶化にはペプシン消化の条件を改善しなければならない。6.ヒト線維化肺では、正常に比べてI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンの相対比の変化、III型コラ-ゲンの増加、IV型コラ-ゲンの減少、V型コラ-ゲンの増加の傾向が認められた。肺線維化の実態であるコラ-ゲン分子種の動態を掴み肺における線維化の基礎的な機序を解明したいと考える。剖検により得られた正常肺8例と線維化肺組織3例の新鮮材料を未固定のままクリオスタットで10μに薄切し、スライドグラスにはりつけ、ペプシン処理、コラ-ゲンを可溶化し抽出後、その抽出液をDEAEセルロ-スクロマトグラフィ-でタイプ別コラ-ゲンを分離した。また、生材料そのままを30ー50グラム、ホモゲナイズ後上記と同様に可溶化してタイプ別コラ-ゲンを定量した。おおよそのα1(111)/α1(1)は正常例で0.1線維化肺例で0.8ほどであった。ヒト線維化

肺では、正常に比べてI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンの相対比の変化、III型コラ-ゲンの増加、IV型コラ-ゲンの減少、V型コラ-ゲンの増加が認められた。抗コラ-ゲン抗体を用いてPAP法により、上記の結果を確認したが、線維化肺ではタイプ111の抗体のものの方がより強く染色された。出現する細胞成分の種類と増減について線維化肺組織では、リンパ球、マクロファ-ジ、線維芽細胞、平滑筋細胞等が増加しているが、場所によるバラツキが大きいこと、光学顕微鏡のみでは同定の困難な細胞が結構あることがわかった。ヒト線維化肺のタイプ別コラ-ゲンの組織学的局在の研究ではスライドグラスにはりつけた肺組織が、酵素処理ではがれることが多くあり、この点の対策を講じないと能率が悪い。また、症例を増やしつつ、タイプ別コラ-ゲンの定量をしっかりしたデ-タとし、これに関与する細胞の役割を明らかにして、肺における線維化の基本的機序を解明したいと考えている。1.剖検により得られた正常肺8例とびまん性間質性肺炎、肺線維症肺組織3例の新鮮材料を未固定のままクリオスタットで10μに薄切し、スライドグラスにはりつけ、ペプシン処理、コラ-ゲンを可溶化し抽出後、その抽出液をDEAEセルロ-スクロマトグラフィ-でタイプ別コラ-ゲンを分離した。この操作の前後で、肺組織のEvG,Ag,Masson染色、また抗タイプ別コラ-ゲン抗体、抗タイプI、抗タイプIIIと抗タイプIV抗体を用いてABC法による酵素抗体法を行い、コラ-ゲン成分の消失と残存を観察した。2.生材料そのままを30ー50グラム、ホモゲナイズ後上記と同様に可溶化してタイプ別コラ-ゲンを定量した。おおよそのαI(III)/αI(I)は正常例で0.1線維化肺例で0.8ほどであった。3.抗コラ-ゲン抗体を用いてPAP法により、上記の結果を確認したが、線維化肺ではタイプIIIの抗体のものの方がより強く染色された。4.出現する細胞成分の種類と増減について線維化肺組織では、リンパ球、マクロファ-ジ、線維芽細胞、平滑筋細胞等が増加しているが、場所によるバラツキが大きいこと、光学顕微鏡のみでは同定の困難な細胞が結構あることがわかった。5.ヒト線維化肺のタイプ別コラ-ゲンの増減の研究の(1)の剖検により得られた正常肺、進行した線維化肺の新鮮材料をホモジネ-トし、除脂質、ペプシン処理によりコラ-ゲンの可溶化では、IV、V型コラ-ゲンがペプシン処理により殆ど抽出された。タイプI、III型コラ-ゲンはペプシン処理後の残渣をさらに尿素処理、CNBr消化を行ってもまだその中にI、III型が存在した。タイプI、III型コラ-ゲンの可溶化にはペプシン消化の条件を改善しなければならない。6.ヒト線維化肺では、正常に比べてI型コラ-ゲンとIII型コラ-ゲンの相対比の変化、III型コラ-ゲンの増加、IV型コラ-ゲンの減少、V型コラ-ゲンの増加の傾向が認められた。
低温ヘリウム気体中でのアルカリ原子のスピン関連基礎物理研究への応用

今年度は主に、低温ヘリウム気体中において、軽いアルカリ金属原子(Li,Na,K)とヘリウム原子が構成する励起分子(exciplex)の分光研究を行った。このアルカリ金属-ヘリウム原子系は原子物理学研究において典型的に用いられる系でありながら、その引力相互作用の弱さのためにその分子の分光研究はあまり進められていなかった。本研究では低温ヘリウム気体を用いる方法により、用いた検出器の有感度領域(波数>6300cm^<-1>)において発光するすべてのexciplexを観測することができた。アルカリ金属原子の特徴として、重いアルカリ金属原子ほど励起状態におけるスピン-軌道相互作用が大きいという点が挙げられる。また、アルカリ金属-ヘリウムexciplexは引力相互作用とスピン-軌道相互作用が同程度の大きさであるという興味深い性質がある。昨年度では重いアルカリ金属原子(Cs,Rb)のexciplexについて研究を行い、スピン-軌道相互作用に起因するポテンシャル障壁がexciplex形成・成長プロセスのいくつかを阻害していると考えられることを示した。今年度の研究では軽いアルカリ金属原子について調べることで、その説明が正しいことを確かめた。その他に、偏極アルカリ金属原子を用いた研究を行うための非磁性クライオスタット系を作成したが、装置の製作・修繕に予定以上の時間がかかり、目立った研究成果は得られなかった。研究成果は1回の国内学会のシンポジウム公演、2本の論文投稿(ともにPhys.Rev.Aに掲載)を通じて公表した。今年度は主に、低温ヘリウム気体中においてアルカリ金属原子とヘリウム原子が構成する励起分子(exciplex)の分光研究を行った。このexciplexの分光研究はアルカリ-ヘリウム原子間相互作用ポテンシャルの評価や原子衝突過程の解明に直接的につながり、偏極アルカリ金属原子のスピン緩和の定量的研究や、我々が最終的な目標としている偏極Cs原子を用いた電子の永久電気双極子モーメントの精密測定を行う実験環境の最適化のためにも重要な研究である。アルカリ金属原子とヘリウム原子がつくるexciplexは、結合エネルギーが弱いため数十K程度の低温でしか安定に存在しえない。しかしこれまでの実験手法では室温以上の温度でしか原子蒸気の生成が行えず、アルカリ-ヘリウム原子間相互作用ポテンシャルに関しても詳細な研究を行うための十分な実験データが得られていなかった。これに対し我々は、レーザーアブレーション法を用いて低温ヘリウム気体中にアルカリ金属蒸気を生成することで、数Kという低温環境でexciplexの生成とそれらからの発光スペクトルを観測することに成功した。またLiからCsまでのアルカリ金属原子について広い温度範囲で発光スペクトルを調べ、exciplexの形状や生成ダイナミクスを論じた。例えば、Csのexciplexではヘリウム原子が2個までしか付着せず、Rbでは6個付着するということを明らかにし、この相違がアルカリ金属原子のスピン-軌道相互作用の強さの違いに起因することを示した。これらの研究成果は、2回の国内学会発表、1回の海外学会発表、2本の論文投稿(1本はPhys.Rev.Aに掲載、1本は投稿中)を通じて公表した。
非可換微分幾何学の構築

1997年から1998年にかけては,次の研究テーマを主題に行なった.(2)変形量子化問題と非可環幾何学(3)無限次元空間における無限次元リー群の作用によるオービットの幾何学的性質(1)については,4次元コンパクト多様体のYang-Mills qradient flowについて,チャーン数に近い初期データを与えることでその滑らかな解が大域的に存在することを示した.また,3次元空間のYang-Mills-Higgs qradient flowについては,その弱大域解の存在を与えられることがわかった.(2)については,特に接触多様体の変形量子化問題とそのレダクションの方法について研究を行なった.(3)についてはコンパクト多様体のリーマン計量の空間に作用する微分同型群(無限次元リー群)のオービットに対する平均曲率の定式化とその応用について研究を行なった.これらの研究は萌芽研究として申請した,非可換微分幾何学の構築において基礎となる成果をあげることができた.そして,その成果はこの2年間の間に行なわれた,国内の研究集会,国際研究集会で発表や討議を行ない,これから先に非可換微分幾何学の展開に向けて,大きな成果をあげた.さらなる成果は,近い将来に出版される予定である.今年度は、非可換幾何学の構築に向けて、準備段階としての基礎研究から始めた。まず、非可換多様体の構成とその性質を調べた。非可換多様体は現在まで、それほど多く知られているわけではない。そこで、その例を多く構成することが当面の課題とされている。今年度は、3次元非可換多様体の概念を3次元球面を量子化することから与えた。これは、正則元の存在を用いて、形式ベキ級数として、実現される代数であるが、古典的な部分として、標準的な3次元球面が実現され、その変形量子化として与えられている。しかも、3次元球面がもつホップファイバーリングの構造が明確に表され、その結果として、2次元非可換球面が自然に現れて来ることが、解明された。この過程は、ちょうど幾何学的量子化に対応することである。次に、その表現論の構成を考察した。非可換環からはじめて、その表現を構成するのは、それほどやさしいことではないが、生成消滅演算の一般化をおこなうことで、その表現を精密に構成することが出来た。しかも、これはBerezin表現とよばれる表現と一致した。このことは、我々の設定がある意味で自然な非可換代数を与えていると評価できる。次年度は、さらに一般の非可換代数の構成とそれに基ずいた非可換多様体の例と幾何学の展開を試みたい。さらに、今年度はコンパクト多様体のうえのリーマン計量全体のなす空間の幾何学的性質を微分同相写像の群の作用を使い調べることが出来た。これも、来年度、無限次元非可換幾何学の構成のための重要な布石となる。また、共同研究者(藤原、伊藤)による幾何学的群とエルゴード理論の研究が精力的に行われ、その研究は来年度以降の非可換幾何学の立場から見直す予定である。1997年から1998年にかけては,次の研究テーマを主題に行なった.(2)変形量子化問題と非可環幾何学(3)無限次元空間における無限次元リー群の作用によるオービットの幾何学的性質(1)については,4次元コンパクト多様体のYang-Mills qradient flowについて,チャーン数に近い初期データを与えることでその滑らかな解が大域的に存在することを示した.また,3次元空間のYang-Mills-Higgs qradient flowについては,その弱大域解の存在を与えられることがわかった.(2)については,特に接触多様体の変形量子化問題とそのレダクションの方法について研究を行なった.(3)についてはコンパクト多様体のリーマン計量の空間に作用する微分同型群(無限次元リー群)のオービットに対する平均曲率の定式化とその応用について研究を行なった.これらの研究は萌芽研究として申請した,非可換微分幾何学の構築において基礎となる成果をあげることができた.そして,その成果はこの2年間の間に行なわれた,国内の研究集会,国際研究集会で発表や討議を行ない,これから先に非可換微分幾何学の展開に向けて,大きな成果をあげた.さらなる成果は,近い将来に出版される予定である.
エンベロープタンパク質の改変による細胞持異的レトロウイルスベクターの開発

遺伝子治療において遺伝子の運び屋として用いられているものの一つにレトロウイルスベクターがある。レトロウイルスベクターを用いる利点は、長期的に安定して目的遺伝子を発現する、宿主域が広い、遺伝子導入に伴う細胞毒性・紳胞障害性が少ない事などがある。逆に欠点としては、非分裂細胞への導入が困難であり、ウイルスの力価(タイター)が低く、挿入変異の問題や、標的細胞特異性が無いことなどがあげられる。これれまでに、レトロウイルスバクターに標的細胞特異性を持たせることに成功した例はあるが、そのタイターの低さなどから実用化には到っていない。本研究では、基礎研究が進んでいるマウス白血病ウイルスを用いて、このエンベロープタンパク質(Env)の改変により、標的細胞に特異的に高いタイターで遺伝子導入することのできるウイルスベクターの作成を目的とした。HIV-1は、CXCR4レセプターを発現しているT細胞に感染する。そこで、マウス白血病ウイルスのEnvのレセプター結合ドメインのPro-79部位にCXCR4レセプターのリガンドであるSDF-1を挿入した、キメラEnvを持つウイルスを作成した。このウイルスはCXCR4を過剰発現させたヒトの細胞に10∧4のタイターで遺伝子導入することができた。CXCR4は、各種マウスレトロウイルスの本来の染色受容体と同様、複数回膜貫通型であると同時に、HIVの感染共受容体でもある。そこで、次に、複数回膜貫通型の膜蛋白質であるが、HIVの共受容体ではないケモカイン受容体CCR7が、マウスレトロウイルスの感染受容体として機能しうるか杏かを調べた。この研究には、CCR7に結合するケモカインであるCCL19およびCCL21をPro-79部位に挿入したキメラEnvを作製し、これらのキメラEnvを持つレトロウイルスペクターのCCR7経由での遺伝子導入能を調べた。遺伝子治療において遺伝子の運び屋(ベクター)として用いられているものの一つにレトロウイルスベクターがある。レトロウイルスベクターを用いる利点は、長期的に安定して目的遺伝子を発現することができる、宿主域が広い、遺伝子導入に伴う細胞毒性・細胞障害性が少ない事などがある。これまでに、レトロウイルスベクターに標的細胞特異性を持たせることに成功した例はあるが、そのタイターの低さなどから実用化には到っていない。本研究では、基礎研究が進んでいるマウス白血病ウイルスを用いて、このエンベロープタンパク質(Env)の改変により、標的細胞に特異的に高い力価で遺伝子導入することのできるウイルスベクターの作成を目的としている。AIDSを発症させるHIV-1は、CXCR4レセプターを発現しているT細胞に感染する。そこで、マウス白血病ウイルスのEnvタンパク質のレセプター結合ドメインの80番目のアミノ酸部位にCXCR4レセプターのリガンドであるSDF-1をリンカーを介して挿入した、キメラEnvを持つウイルスを作成した。このウイルスは、CXCR4を過剰発現させたヒトの細胞に10Λ4のタイターで感染することができた。また、CXCR4を発現していると言われているヒトの乳癌細胞や、ヒトのT細胞にも同様のタイターで感染が確認できた。実用化するに当たってはさらにタイターを上げる必要があるため、自己複製可能なキメラEnvウイルスを作成し、このウイルスに変異を促し、タイターの高い変異体を単離する作業を現在進行中である。
GluK3含有カイニン酸受容体による不安行動制御の解明

申請者はGluK3による不安制御がどこの領域でどのように行われているのか明らかにするため、予定していた解析のうち、GluK3を介した不安制御神経回路の解析を主に行った。GluK3の発現量が抗不安行動に影響するのか、GluK3の発現量が減少しているGluK3ヘテロマウスを用いて調べた。その結果、オープンフィールドでは抗不安行動を示し、高架式十字迷路テストでは野生型とGluK3KOマウスの中間の表現型を示した。このことからGluK3による不安行動調節はGluK3の発現量に従うことが明らかとなった。またGluK3による不安行動調節にドーパミンが関係しているのか調べるために、ドーパミン受容体選択的な拮抗薬であるハロペリドールを投与したときの不安行動を解析しているところである。研究室の異動に伴い、これまで検討してこなかった培養神経細胞の解析を始めた。まずはラット18日胚の脳から、GluK3の発現量が最も高い大脳皮質の神経細胞の培養を立ち上げた。この培養細胞をウェスタンブロットで解析したところ、GluK3の発現が確認できた。そこで神経細胞の膜表面におけるGluK3の発現量がドーパミンにより制御されるのかを検証した。しかしながらセロトニン受容体とドーパミン受容体の拮抗薬のリスペリドンで神経細胞を刺激しても膜表面のGluK3量に顕著な変化は見られなかった。さらにこの培養神経細胞でのGluK3の局在を免疫染色で調べた。GluK3とプレシナプスマーカーのシナプトフィジン、そして興奮性のポストシナプスマーカーであるPSD95、または抑制性のポストシナプスマーカーのgephyrin、これらの三重染色でGluK3局在シナプスの特徴を調べたところ、GluK3は両方のシナプスで高密度に発現していることがわかった。その染色像は他のサブタイプのGluK2などとはかなり異なることが明らかとなった。行動解析では生理食塩水の投与により不安行動が増加してしまい、不安行動の変化に対する評価が遅れている。また、新たに解析に組み込んだ培養神経細胞の解析から、GluK3が発現する神経細胞には多数の性質を示すものがあることが分かり、GluK3の関与する神経回路は広範に渡って制御されているために、この回路の特徴を見出すことに当初の予定より時間がかかっている。行動解析では生理食塩水やハロペリドールを用いた薬剤投与後の解析条件の検討がより必要であることがわかったため、薬剤投与後の行動解析をする時間を検討する。行動解析で異常が明らかとなった薬剤投与後のマウスの脳を採取し生化学解析を行いGluK3発現量の増減を確認する。また培養神経細胞で内在性のGluK3の刺激による局在変化を免疫染色で見るには、神経細胞の種類によってGluK3の発現パターンが異なるため評価が難しいことが分かった。そこで蛍光標識したGluK3発現ベクターを作製し培養神経細胞に発現させ、薬剤刺激時のGluK3の局在変化を解析する。これまでの解析ではどこの領域がGluK3による不安制御を中心的に行っているのかは明らかにできていない。野生型とGluK3KOマウスの脳切片を免疫染色し、主要な興奮及び抑制性の神経伝達に重要な分子の発現の差を脳全体で検討する。また、野生型とGluK3KOマウスの脳領域を切り分けて、それぞれ質量分析にかけ、発現に差がある分子群を網羅的に解析する。さらにGluK3を介した不安制御神経回路の解析は、回路に関係する候補分子を絞る。そのために、GluK3が大脳皮質のシナプスに高発現していることが免疫染色で明らかとなったのでGluK3結合タンパク質を免疫沈降実験と質量分析法で調べる実験を追加し、シナプスにおける受容体や足場タンパクとの相互作用を改めて解析に組み込む。平成29年度は育児休暇したため、進展はない。中断期間:平成29年4月1日平成30年3月31日育児休暇で、研究開始を中断していたため。