hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細菌のECFδ因子-アンチδ蛋白質による環境応答機構の網羅的な解析

多くの細菌に複数存在し、多様性に富むECF(Extra Cytoplasmic Function)σ因子-アンチσ膜蛋白質制御系の機能や活性制御機構ネットワークの全体像を、枯草菌を主な材料として解析した。また、枯草菌での総合的な知見を踏まえて、同属・異属細菌の未解析ECFσ因子の機能・制御機構を生物情報学の手法を交えて、枯草菌細胞を宿主として解析した。各ECFσ因子の活性が誘導される機構を詳細に検索した。具体的には、解析の初発段階として、トランスポゾン変異法等による遺伝学的な手法を用いて、各ECFσ因子の制御機構(アンチσ蛋白質を含んだ機構)を制御する因子を同定する解析を行った。また、蛍光蛋白質やエピトープタグをアンチσ蛋白質や関連制御因子に付加し、細胞学的、生化学的にそれらの蛋白質を解析するための株を構築した。エピトープタグを利用し目的蛋白質を精製しており、その後細胞分画やin vitro実験等に用いる。また、蛍光観察や免疫蛍光法を用いて、蛍光顕微鏡下で細胞内での動態を観察する。枯草菌の全ECFシグマ因子、及び数種の非必須シグマ因子を同時に複数破壊した株を作製した。個々にシグマ因子の解析を行う予定である。同時に、シグマを欠いた枯草菌に、他細菌の機能未知シグマ因子を導入し、枯草菌内でin vivo解析する。同属・異属細菌の未解析ECFσ因子を生物情報学の手法により抽出および、アミノ酸の類似性により分類した。機能が誘導されると思われる条件を、さきの分類により予想し、その検証のために、各条件における未解析ECFσ因子の遺伝子転写誘導をリアルタイム-RT-PCRの手法により解析した。バクテリアのECFσは細胞質で機能するが、細胞表層に存在するアンチσ蛋白質を介してその活性が制御されていると一般的に考えられている。枯草菌の7つのECFσ因子は、半数は全くの未解析で残りも詳細な働きは判っていない。ゲノム配列が既知の生物では、マイクロアレイの技術を用いれば、生育条件の違いから生じる全遺伝子のmRNA量の変化を一度にモニターできる。シグマ因子は遺伝子の転写を正に制御する蛋白質なので、前述のマイクロアレイ解析を行い、枯草菌の各シグマ因子が発現を正に制御している遺伝子候補を明らかにした。その結果、各シグマ因子についてそれが制御する遺伝子群は、その数は数十個から数個まで幅広かったが、興味深い事に、それらの間には重なりがほぼなく、個々の因子の働きに個性があり、使いわけがなされていることがわかった。その他得られた膨大なデータを現在解析中である。個々の因子の詳細解析としては、シグマMが抗生物質バシトラシンの耐性に関わる遺伝子の発現を調節することにより、その耐性機構に寄与していることがわかった。シグマYのオペロンは枯草菌のもつ大きな特徴のひとつである胞子形成の時期に発現が誘導され、シグマYを不活化すると胞子形成に少なからず影響を与えた。枯草菌の7つのECFシグマ因子のうち6つに関してはアンチσ蛋白質候補を見出し、特異的な相互作用を酵母two-hybridsystemや遺伝学的手法により確認した。現在、このアンチσ蛋白質によるシグマ因子の活性調節のメカニズムの解析に取り組んでいる。アンチσ蛋白質に、部位特異的変異・欠失変異などを導入したり、キメラ蛋白質を作製し特異性の変化を観察することによって機能ドメイン構造を解析している。また、遺伝学的な手法を用いて、アンチσ蛋白質の機能に影響を与える別の因子・遺伝子の探索も行っている。1)各ECFσ因子の活性が誘導される条件を詳細に検索した。例えば熱、低温、高塩濃度、酸化剤等の外界ストレスといっても細胞にどのような形の細胞外信号として認識されるのかは不明な点が多い。従ってそれらストレスにより、実際に細胞内外でどのようなことが起こり、それが各ECFσ因子の制御機構にどう集約されていくのか解析した。各ECFσ遺伝子の転写には、栄養増殖期末期から定常期初期において顕著に発現誘導が見られるものがあった。また、この発現誘導はNa^+/H^+antiporter geneの変異により影響を受けた。また、解析の初発段階として、トランスポゾン変異法等による遺伝学的な手法を用いて、各ECFσ因子の制御機構(アンチσ蛋白質を含んだ機構)を制御する因子を同定、解析を行った。現在、その挿入変異により、ECFσ遺伝子の活性に影響を与える遺伝子を幾つか新たに見つけ、詳細なる解析を行っている。現在アンチσ蛋白質や関連制御因子に関して、部位特異的変異・欠失変異などの導入、キメラ蛋白質の作製による特異性の変化を観察し機能ドメイン構造等、分子機構を解析する準備を行っている。2)蛍光蛋白質やエピトープタグをアンチσ蛋白質や関連制御因子に付加し、細胞学的、生化学的にそれらの蛋白質を解析する。具体的には蛍光観察や免疫蛍光法を用いて、蛍光顕微鏡下で細胞内での動態を観察することや、エピトープタグを利用し蛋白質を精製し、細胞分画やin vitro実験等に用いる。また、エピトープ特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により検出可能である。その為の株構築を終了し、現在解析中である。

また、枯草菌での総合的な知見を踏まえて、同属・異属細菌の未解析ECFσ因子の機能・制御機構を生物情報学の手法を交えて、枯草菌細胞を宿主として解析した。各ECFσ因子の活性が誘導される機構を詳細に検索した。具体的には、解析の初発段階として、トランスポゾン変異法等による遺伝学的な手法を用いて、各ECFσ因子の制御機構(アンチσ蛋白質を含んだ機構)を制御する因子を同定する解析を行った。また、蛍光蛋白質やエピトープタグをアンチσ蛋白質や関連制御因子に付加し、細胞学的、生化学的にそれらの蛋白質を解析するための株を構築した。エピトープタグを利用し目的蛋白質を精製しており、その後細胞分画やin vitro実験等に用いる。また、蛍光観察や免疫蛍光法を用いて、蛍光顕微鏡下で細胞内での動態を観察する。枯草菌の全ECFシグマ因子、及び数種の非必須シグマ因子を同時に複数破壊した株を作製した。個々にシグマ因子の解析を行う予定である。同時に、シグマを欠いた枯草菌に、他細菌の機能未知シグマ因子を導入し、枯草菌内でin vivo解析する。同属・異属細菌の未解析ECFσ因子を生物情報学の手法により抽出および、アミノ酸の類似性により分類した。機能が誘導されると思われる条件を、さきの分類により予想し、その検証のために、各条件における未解析ECFσ因子の遺伝子転写誘導をリアルタイム-RT-PCRの手法により解析した。
重度傷病者の搬送を可能とする空気圧制御を用いた担架システムの開発

本研究では,地下街やプラント施設をはじめとする施設内の災害において,現場に取り残された要救助者を迅速・安全に救出しつつ,消防隊員の負担を軽減することを目的とした救助支援型担架システムの開発を行う.具体的には,救助活動の際に力を要する要救助者を担架へ乗せる作業を,上面にクローラベルトを取り付けた担架で要救助者を持ち上げることなく半自律的に担架に乗せることで負担を軽減する.その後,階段等では五星形の車輪機構を用いることで,搬送時のパワーアシストを行う.さらに,搬送時の振動の大きさ・方向周波数を測定し,その振動を低減する非線形構造の担架を開発し,RMS値と加速度PSDによりその性能を評価した.本研究では,ダブルクローラ方式を採用した担架システムを開発し,傷病者をわずかな力で担架へ乗せ,そのまま階段昇降も行うことを目的としている.最終的には,担架システムに局部圧迫防止や振動抑制の機能を付加することで,重度傷病者を安全かつ迅速に救助可能なシステムを開発する.今年度は,以下の2点の項目を実施した.1担架システムの階段昇降機構の改良:昨年度,五角形の車輪を複数個連結する階段昇降機構を試作した.その結果,従来のシステムに対して階段上昇速度が約3倍以上,階段降下速度も約1.5倍の向上が実現できたが,可搬重量の増加に伴い,滑りが発生した.そこで,車輪の素材をブルコラン(ゴム)および,アルミ材の表面にゴムを貼り付けた車輪に変更し,車輪の形状も引っかかりを良くするよう改善した.その結果,ブルコランは想定以上の変形が起き,性能低下となったが,ゴムを貼り付けたアルミ車輪は,従来システムより滑りを低減することができ,性能向上となった.2非線形構造による振動低減装置の開発:昨年度,手持ち式担架に人を乗せて搬送作業を行い,そのときの振動を計測し,発生する振動の大きさ・方向・周波数などの特性を把握した.その計測結果より振動低減の方法を検討し,振動低減装置を製作した.具体的には,手持ち式担架や,本研究で目指す担架システムの搬送速度は,消防車の搬送速度とは異なり,23.5Hz程度の低周波領域で振動が発生する.そのような低周波領域では,通常の縦バネや,エアマット等による振動低減ではなく,非線形構造による振動低減が効果的とわかった.そこで,非線形構造を有した振動低減装置を設計・製作し,その装置を用いて搬送時の振動計測を行った.その結果,各搬送速度における加速度の値が防振なしに比べ,飛躍的に小さくなり,RMS値を用いて装置により搬送時に発生する振動を約60%低減させることができることを確認した.本研究では,地下街やプラント施設をはじめとする施設内の災害において,現場に取り残された要救助者を迅速・安全に救出しつつ,消防隊員の負担を軽減することを目的とした救助支援型担架システムの開発を行う.具体的には,救助活動の際に力を要する要救助者を担架へ乗せる作業を,上面にクローラベルトを取り付けた担架で要救助者を持ち上げることなく半自律的に担架に乗せることで負担を軽減する.その後,階段等では五星形の車輪機構を用いることで,搬送時のパワーアシストを行う.さらに,搬送時の振動の大きさ・方向周波数を測定し,その振動を低減する非線形構造の担架を開発し,RMS値と加速度PSDによりその性能を評価した.本研究では,ダブルクローラ方式を採用した担架システムを開発し,傷病者をわずかな力で担架へ乗せ,そのまま階段昇降も行えることを目的としている.最終的には,担架システムに局部圧迫防止や振動抑制の機能を付加することで,重度傷病者を安全かつ迅速に救助可能なシステムを開発する.今年度は,以下の2点の項目を実施した.1担架システムの階段昇降機構の改良:傷病者の局部圧迫や振動を抑制する以前に,実際の災害現場を想定した場合,現在の階段昇降速度では非常に遅いことから,まず始めに速度の改善を重点に階段昇降機構について検討する.階段昇降機構の分類から新たな階段昇降機構を提案し,製作することで階段昇降速度の改善を行う.本研究では,五角形の車輪を複数個連結する機構とすることで,階段の角にフィットし,エッジの高さも高く取れつつ,クローラのように階段の角に複数箇所接地できるメリットを備えた階段昇降機構を試作した.その結果,従来のシステムに対して階段上昇速度が約3倍以上,階段降下速度も約1.5倍の向上が実現できた.本研究で開発した五角形の車輪により,段差の角にフィットし,階段上昇・降下ともに滑落が全く見られなくなった.重量も軽量化されたことから,隊員が背負って現場へ搬送可能となり,迅速な救助活動が期待できると考える.2手持ち担架における振動の様子の検証:地元消防隊員にヒアリングを行った結果,救助活動のうち,傷病者の搬送に特に大きな負担を感じ,その点を改善する機器があれば有効であると指摘を受けた.そのことから,手持ち担架で傷病者を搬送する際の,搬送速度や人数によって,振動がどのように変化するかという検証を行う.実験の結果,4人で搬送した場合は搬送速度が上がるにつれて鉛直方向の並進運動に加え,ロール・ピッチ方向の振動も発生していることがわかった.本研究では,ダブルクローラ方式を採用した担架システムを開発し,傷病者をわずかな力で担架へ乗せ,そのまま階段昇降も行うことを目的としている.

最終的には,担架システムに局部圧迫防止や振動抑制の機能を付加することで,重度傷病者を安全かつ迅速に救助可能なシステムの開発を目的とする.期間内に以下の2点の項目を実施し,成果を得た.1担架システムの階段昇降機構の改良:五角形の車輪を複数個連結する階段昇降機構を試作した.その結果,従来のシステムに対して階段上昇速度が約3倍以上,階段降下速度も約1.5倍に向上したが,可搬重量の増加に伴い,滑りが発生した.そこで,車輪の素材・形状を検討し,アルミ材の表面にゴムを貼り付けた車輪に変更し,車輪の形状も引っかかりを良くするよう改善した.その結果,ゴムを貼り付けたアルミ車輪は,従来システムより滑りを低減することができ,担架を3人で運ぶ際の速度9.3m/minを上回る10.9m/minの上昇速度を実現できた.2非線形構造による振動低減装置の開発:手持ち式担架に人を乗せて搬送作業を行い,そのときの振動を計測し,発生する振動の大きさ・方向・周波数などの特性を把握した.その計測結果より振動低減の方法を検討し,振動低減装置を製作した.具体的には,手持ち式担架や,本研究で目指す担架システムの搬送速度は,消防車の搬送速度とは異なり,23.5Hz程度の低周波領域で振動が発生する.そのような低周波領域では,通常の縦バネや,エアマット等による振動低減ではなく,非線形構造による振動低減が効果的とわかった.そこで,非線形構造を有した振動低減装置を設計・製作し,その装置を用いて搬送時の振動計測を行った.その結果,各搬送速度における加速度の値が防振なしに比べ,飛躍的に小さくなり,RMS値を用いて装置により搬送時に発生する振動を約60%低減させることができることを確認した.レスキュー工学昨年度階段昇降機構の見直しを行ったことが影響したことと,今年度は本研究に予定していたエフォート率を確保できなかったことから,研究の遂行が若干遅れている.しかし,新たな振動低減方法を開発するなどして効果が出ていることから,当初予定していた機能の実現は可能であると考える.担架システムの開発にあたり,地元消防隊員にヒアリングを行った結果,まず階段昇降速度が遅いため,そもそも現場での使用に至らないということが意見として挙げられたため,階段昇降機構の見直しを行い,改良を行った.そのため,当初予定していた担架上部の改良に着手することができず,研究の遂行が若干遅れている.まず,開発した階段昇降機構の完成度を高めつつ,今年度開発した非線形構造の振動低減機能を担架へ付加する.そして,搬送時の振動の度合いに応じて,エアマットを取り付けた担架システムを開発する.その際,今年度取得した加速度のデータを参考に,マットの配置等を決定する.最終的に,実際に平地や階段昇降などを行い,加速度のデータ測定を行い,システムの評価および改良を行う.今年度開発した階段昇降機構の完成度を高めつつ,当初の計画通り傷病者の搬送時の振動を抑制するために,エアマットを取り付けた担架システムを開発する.その際,今年度取得した加速度のデータを参考に,マットの配置等を決定する.その後,実際に平地や階段昇降などを行い,加速度のデータ測定を行い,システムの評価および改良を行う.今年度は本研究に予定していたエフォート率を確保できなかったことから,研究の遂行が若干遅れている.そのため,物品の購入にかかる使用が少なくなった.まず,担架上部の改良を行うため,金属材料や機構部品等の購入を行う.また,エアマットを製作するための,エアセルや空圧機器の購入を行う.
介護人材の離職ストップのための支援ツールの開発-ストレスマネジメントの観点から-

本研究の目的はストレスマネジメントの観点から、高齢者介護福祉分野で従事する相談員・介護職員・看護師などの対人援助職者の離職防止に資するための支援ツールを開発・活用し、ストレスマネジメントの観点から支援者支援を充実させ、介護人材の離職を防止することである。2018年には本研究の最終目的である「支援者支援ツール活用ガイド」を作成した。感情を使う仕事に携わっている感情労働者について、高齢者介護福祉施設における介護人材の実態、介護人材のストレス軽減のための支援ツール開発の経過、支援ツールの記入方法と判定結果の解釈の仕方、2017年に600名の調査協力者から得られた標準偏差や支援ツール活用後の感想を掲載している。「共感疲労・ストレス自己チェックリスト」及び「レジリエンス自己チェックリスト」も添付してある。この支援ツールを活用することで、自己のストレスおよびレジリエンスの状況を客観的に自己理解することができる。「精神的消耗感」「援助者としての規範意識へのとらわれ」「利用者との対応場面におけるストレス」「援助者としての感情管理」「心身のストレス反応」という5つのストレス要因別に平均値を示し、ストレス要因を低減させるための対処法について解説している。「前向きな気持ちへの切りかえ」「人的サポート」「自己肯定感」「職場のサポート」「困難への対処法」という5つのレジリエンス要因別に平均値を示し、レジリエンスを増強させるための対処法についても解説している。「支援者支援ツール活用ガイド」は冊子として印刷製本し、これまでの調査研究協力施設・事業所に届けた。さらに、より幅広い方々に活用して頂くため、「支援者支援ツール活用ガイド」は天理大学リポジト(https://opac.tenri-u.ac.jp/opac/repository/metadata/)上で公開している。本研究の目的はストレスマネジメントの観点から、高齢者介護福祉分野で従事する相談員・介護職員などの離職防止に資するための支援ツールを開発・活用し支援者支援をすることである。2015年に実施した予備的調査結果や関連する先行研究を参考に、共感疲労・レジリエンスの因子となる要因を明らかにするためのアンケート調査を2016年8月から9月に実施した。697名に調査票を配布し551部の調査票を回収(有効回収率79.1%)した。設問項目(50問)について探索的因子分析を行い、共感疲労・レジリエンスを構成する因子が5項目づつ抽出された。共感疲労の因子は、精神的消耗感・援助者としての規範意識へのとらわれ・利用者との対応場面でのストレス・援助者としての感情管理・心身のストレス反応と命名した。レジリエンスの因子は、前向きな気持ちへの切りかえ・人的サポート・自己肯定感・職場のサポート・困難への対処法と命名した。それぞれの因子を基に各項目について6つの設問(計30問)を設定し、各自で1から5点の自己評価ポイントをつけ、共感疲労・レジリエンスの状況について自己チェックできるリストを作成した。2017年度はこれまでの研究成果をふまえて、高齢者介護福祉分野で従事する相談員・介護職員など500名を対象に自己の共感疲労・レジリエンスの状況について自己覚知して頂くと共に、抽出した因子項目の精度について確認作業を進める。また、2016年調査の自由記述(離職意向の有無・どんな時に辞めたいと思ったか・仕事をしていて楽しいと感じるのはどんな時か)について、カード分類法やテキストマイニングを活用した質的分析からストレス・レジリエンス要因を抽出し、ストレスを軽減しレジリエンスを高めるための支援ツールを開発する。2016年8月から9月に実施したアンケート調査の有効回収率は79.1%と高く、探索的因子分析から有意な共感疲労因子とレジリエンス因子が各5項目抽出された。それぞれの信頼性係数もかなり高い数値を示した。(共感疲労Cronbackのα=0.85・レジリエンス因子Cronbackのα=0.91)抽出された因子を基に共感疲労・レジリエンスについての自己チェックリストが作成できた。2017年には予定通り500名の高齢者介護福祉領域で従事する相談員・介護職員を対象にこれまでの研究成果の公開と、援助者らの共感疲労・レジリエンスの状況を自己チェックし、2016年調査の因子分析結果の精度検証のための調査活動を行うための準備段階となっている。また同調査の自由記述回答の質的分析を、カード分類法やテキストマイニングを用いて進め、援助者らのストレス・レジリエンス要因を明確化し、支援ツールの開発についても取り組んでいける目途がついた。本研究の目的はストレスマネジメントの観点から、高齢者介護福祉分野で従事する相談員・介護職員・看護師などの対人援助職者の離職防止に資するための支援ツールを開発・活用し、支援者支援を充実させ、介護人材の離職を防止することである。2016年度に実施したレジリエンス・共感疲労を構成する項目を抽出するためのアンケート調査結果を探索的因子分析によって得られたそれぞれ5項目について、各6つの設問を設定し、ライカート式5段階評価による「共感疲労・レジリエンスの自己チェックリスト」を作成した。自己チェックリストを活用することで、その時点での援助者の共感疲労度やレジリエンスの状況を客観的に把握することが可能となる。自らの状況を必要に応じて確認することで、共感疲労度を低減させたりレジリエンスを高める様な対処を早めにとることが可能になる。2017年度には2016年度の調査結果の報告と、作成した自己チェックリストへの回答協力を求めた調査を実施した。600名の調査協力を得ることができた。

回答から共感疲労・レジリエンスを構成するそれぞれの因子についての標準偏差を得た。また調査協力者へは高齢者介護福祉分野で従事する対人援助職者に固有の共感疲労やレジリエンスについて解説すると共に、共感疲労を低減しレジリエンスを強化するための対策についてもアドバイスし、次年度支援ツール作成時には協力者へ冊子としてお届けすることを約束した。2018年2月には、調査協力に応じた社会福祉法人の代表者宛に各法人の調査結果と全体の傾向をグラフで示し、離職防止に資するための対策について研究会で協議した結果も付記し郵送した。訪問して職員に直接報告することを要望された法人には出向いて、職員・管理者を対象に報告した。2016年度に実施したアンケート調査の因子分析より抽出した共感疲労・レジリエンスについての自己チェックリストを活用して、2017年8月16日から2018年1月20日の期間に8法人・17事業所に所属する600名の調査協力者を対象に、自己チェックリスト作成のプロセス・研究成果の報告を行った上で、各自に共感疲労・レジリエンスの自己チェックをしてもらった。自己チェックリストでは、因子分析から得られた共感疲労・レジリエンス各5項目についてそれぞれに6つの質問項目を設定、ライカート式5段階評価にてチェックを入れて頂き、600名の回答を基に標準偏差を得た。標準偏差を活用して自己のストレスやレジリエンス状況について適宜自己評価できるシートを作成し、調査協力を得た8法人に対し法人ごとの傾向と全体との比較について結果報告し、介護人材の離職防止に向けてのアドバイスを2018年2月に回答した。2016年・2017年の調査結果を活用し、2018年度は支援ツールの開発を行う。研究活動はおおむね順調に進展していると考える。本研究の目的はストレスマネジメントの観点から、高齢者介護福祉分野で従事する相談員・介護職員・看護師などの対人援助職者の離職防止に資するための支援ツールを開発・活用し、ストレスマネジメントの観点から支援者支援を充実させ、介護人材の離職を防止することである。2018年には本研究の最終目的である「支援者支援ツール活用ガイド」を作成した。感情を使う仕事に携わっている感情労働者について、高齢者介護福祉施設における介護人材の実態、介護人材のストレス軽減のための支援ツール開発の経過、支援ツールの記入方法と判定結果の解釈の仕方、2017年に600名の調査協力者から得られた標準偏差や支援ツール活用後の感想を掲載している。「共感疲労・ストレス自己チェックリスト」及び「レジリエンス自己チェックリスト」も添付してある。この支援ツールを活用することで、自己のストレスおよびレジリエンスの状況を客観的に自己理解することができる。「精神的消耗感」「援助者としての規範意識へのとらわれ」「利用者との対応場面におけるストレス」「援助者としての感情管理」「心身のストレス反応」という5つのストレス要因別に平均値を示し、ストレス要因を低減させるための対処法について解説している。「前向きな気持ちへの切りかえ」「人的サポート」「自己肯定感」「職場のサポート」「困難への対処法」という5つのレジリエンス要因別に平均値を示し、レジリエンスを増強させるための対処法についても解説している。
女子スポーツ選手における運動性無月経と血管内皮機能の関連-前向き研究

目的我々は,先行研究において運動性無月経(EAA)の選手では正常性周期の選手に比べて反応性充血時の血管拡張反応(Flow-mediated vasodilatation : FMD)が低下しており,FMDは血中エストラジオール濃度と正の相関を持つことを見出した.血中エストラジオールの低下と血管内皮機能低下の因果関係をさらに明確にするために本研究では前向き研究を行った。すなわち、EAAの選手が競技的スポーツ活動を中止し正常性周期に回復した時点でFMDが回復するかどうかを検討した.さらに、今年度は対象群として、同年代の運動を行っていない女子について同様の測定を行った。研究の対象:全国大会レベルの某高等学校女子バレーボール選手、運動をしていない女子測定項目:2)血液検査:総コレステロール、HDLコレステロール、中性脂肪、E3、プロゲステロン3)血管内皮依存性血管拡張反応:FMD4)血管内皮非依存性血管拡張反応:ニトログリセリン(GTN)に対する血管拡張反応先行研究での運動性無月経群から7名について、競技的スポーツ活動を中止し6ヶ月後の時点でfollow up測定を行った。結果EAA群では対照群に比較し、FMDとGTNに対する血管拡張反応、血中エストラジオールが有意に低下していた。Follow up時点では全員が正常性周期に回復しており、EAA時に比べて血中エストラジオールは有意に増加し、FMDとGTNに対する血管拡張反応も有意に増加した。結語EAAでは、血中エストラジオールの低下に伴って内皮依存性および非依存性血管拡張反応が低下していることが示された.しかし、若年者においては競技的スポーツ活動の中止によって、血管機能低下は回復することが確認され、可逆的な障害であると考えられた。無月経をきたすような激しい運動は、血管機能障害をきたす可能性があり、低エストロゲン状態が長期に続いた場合には運動機能の低下や動脈硬化の早期進行が危惧され、さらに長い経過を見る研究が必要である。目的我々は,先行研究において運動性無月経の選手では正常性周期の選手に比べて反応性充血時の血管拡張反応(Flow-mediated vasodilatation:FMD)が低下しており,FMDは血中エストロゲン濃度と正の相関を持つことを見出した.これらは運動性無月経の選手ではエストロゲンの低下と関連して,血管内皮機能が低下していることを示唆している.しかし,縦断的研究のため,前向き研究が必要と考えられた.そこで,運動性無月経の選手が正常性周期に回復した時点で,血中エストロゲン濃度が正常化し,運動性無月経の治癒にともないFMDが回復するかどうかを検討する事を目的とした.研究の対象:全国大会レベルの某高等学校女子バレーボール選手測定項目:1)身体組成:身長、体重、Body Mass Index、体脂肪率(インピーダンス法)を測定する。2)血液検査:血計、総コレステロール、HDLコレステロール、中性脂肪、エストラジオール、プロゲステロン(RIA固相法)、黄体化ホルモン(LH;IRMA法)、卵胞刺激ホルモン(FSH;IRMA法)を測定する。3)血管内皮依存性血管拡張反応:反応性充血時の血管拡張反応(FMD)の測定4)血管内皮非依存性血管拡張

反応:ニトログリセリン(GTN)に対する血管拡張反応の測定結果運動性無月経の群は運動をしていない対照群に比較し、血中エストラディオールとFMDは有意に低値であった.先行研究で運動性無月経を認めた群から7名について、競技的なスポーツ活動を中止した後、6ヶ月経過した時点でfollow upの測定を行った.全員が正常性周期に回復していた.正常性周期回復後は、運動性無月経時に比べて、エストラディオールは有意に増加し(30.7±16.2→48.8±15.6pg/ml、p<0.05)、それに伴ってFMDも有意に増加した(5.6±2.3→11.7±3.9%、p<0.05).GTNに対する血管拡張反応には有意な変化は認めなかった.結語運動性無月経では、血中エストロゲンの低下に伴って血管内皮機能が低下していることが示された.しかし,トレーニングの中止によって、この内皮機能の低下は改善することが確認され、可逆的な障害であると考えられた.目的我々は,先行研究において運動性無月経(EAA)の選手では正常性周期の選手に比べて反応性充血時の血管拡張反応(Flow-mediated vasodilatation : FMD)が低下しており,FMDは血中エストラジオール濃度(E3)と正の相関を持つことを見出した.E3の低下と血管内皮機能低下の因果関係をさらに明確にするために本研究では前向き研究を行った。すなわち、EAAの選手が正常性周期に回復した時点で,血中E3が正常化し,EAAの治癒にともないFMDが回復するかどうかを検討した.さらに、今年度は、対象群として、運動を行っていない女子(同年代)について同様の測定を行った。研究の対象:全国大会レベルの某高等学校女子バレーボール選手、運動をしていない女子測定項目:2)血液検査:総コレステロール、HDLコレステロール、中性脂肪、E3、プロゲステロン3)血管内皮依存性血管拡張反応:FMD4)血管内皮非依存性血管拡張反応:ニトログリセリン(GTN)に対する血管拡張反応先行研究で運動性無月経群から7名について、競技的なスポーツ活動を中止し6ヶ月後の時点でfollow upの測定を行った。結果EAAでは対照群に比較し、FMDとGTNに対する血管拡張反応、E3が有意に低下していた。Follow up時点では全員が正常性周期に回復しており、EAA時に比べて、E3は有意に増加し、それに伴ってFMDとGTNに対する血管拡張反応も有意に増加した。結語EAAでは、E3の低下に伴って血管内皮依存性および非依存性血管拡張反応が低下していることが示された.若年齢において、しかし、トレーニング中止によって、血管機能の低下は改善することが確認され、可逆的な障害であると考えられた。無月経をきたすような激しい運動は、血管機能障害をきたす可能性があり、低エストロゲン状態が長期に続いた場合には運動機能の低下や動脈硬化の早期進行が危惧され、さらに長い経過を見る研究が必要である。
てんかん発作を誘発するカルシウムチャネル異常の薬理学的解明

自然発症てんかんラット(SER:zi/zi,tm/tm)について、てんかん発作を誘発するカルシウムチャネルの機能を明らかにするため、次の研究を行った。1.SERの発作発現遺伝子の探索:tm遺伝子は、ラット第10染色体上のD10M11Mit351とD10M11Mit7との間にあり、この間200kBの欠失が存在することが明らかとなった。この中でN-アセチル-L-アルパルテート(NAA)を代謝する酵素のアスパルトアセチラーゼ遺伝子が欠失していることが明らかとなった。事実、SERでは脳内のNAAが増大していること、NAAを正常ラットあるいは発作発現前週齢のトレモアラット(SERの親系統であり、欠神様発作を起こす)の脳室内に投与することにより、用量依存性に脳波上5-10Hz棘徐波を伴う欠神様発作及びけいれんが誘発された。NAAは海馬CA3ニューロンに脱分極シフトと頻回発射を誘発した。2.SER海馬におけるCa^<2+>流入の増大:発作を発現しているSERの海馬スライス標本において、fura2/AMを負荷し、高K^+を投与した時、CA3野ニューロンへのCa^<2+>流入が正常ラットのそれよりも増大していた。Ca^<2+>の細胞内流入はL型Ca^<2+>チャネルブロッカー(ニフェジピン)により抑制されたが、SER海馬CA3の方が正常動物のそれよりも強い抑制を受けた。自然発症てんかんラット(SER):zi/zi、tm/tmを用いて、てんかん発作を誘発するカルシウムチャネルの機能異常を明らかにするため、遺伝学的および薬理学的研究を行った。1.SERの発作遺伝子を明らかにするため、連鎖解析を続けているが、結局カルシウムチャネル遺伝子とは連関せず、tm因子は第10染色体上にあり、シナプトブレビンをコードするSyb2と1.5Mb以内に、zi因子とは第3染色体にあり、プリオンタンパクをコードするPryと30Mb以内にあることが明らかになった。tm因子については現在クローニング中である。2.SER海馬CA3錐体細胞を単離し、パッチクランプ法によるホールセル記録を行った結果、電位依存性Ca^<2+>チャネルの開放閾値は発作を発現しているSER(1116週齢)では正常動物のそれと比べ510mV低下していた。しかし発作発現以前(7週齢以下)ではこの閾値に差は認められなかった。従って、生育にしたがいCa^<2+>チャネルの立体構造あるいはその修飾因子が変化することが示唆された。3.海馬スライス標本において、SER CA3野細胞は正常動物のそれよりもグルタミン酸に対する感受性が高く、有意に大きい静止膜の脱分極と律動的な脱分極シフト(C^<a2+>チャネル性)と頻回発射を起こした。この異常興奮は抗てんかん薬(トピラメート)により抑制された。4.一方、SERCA1細胞においてはシューファー線維刺激により脱分極シフトは得られず、CA1細胞のCa^<2+>チャネルは正常と考えられた。自然発症てんかんラット(SER:zi/zi,tm/tm)は強直性けいれんと欠神様発作の両発作を起こす。本動物を用い、次の研究を行った。1. SER海馬単離細胞を用いたパッチクランプ法による研究:海馬CA3野錐体細胞を単離し、ホールセルパッチクランプ法による研究を行った。すなわち、TTXにてNa^+チャネルをブロックし、CS^+にてK^+チャネルをブロックした状態で細胞内に脱分極パルスをあたえることによりCa^<2+>電流を計測した。発作発現前(生後47週令)のSERにおいては発作を発現しないウイスターラットの場合と同様の電位ム電流曲線が得られた。その閾値(45mV)に差が認められなかった。一方、発作を発現したSER(1114週令)では電位一電流曲線からCa^<2+>チャネルの開放閾値は低下(-55mV)していることが判明した。

2. SER海馬スライス標本におけるCa^<2+>動態の研究:Fura2-AMを負荷し、高K^+にて脱分極させた時の細胞内へのCa^<2+>流入を計測した。発作を発現していないウイスターラット海馬では40nM以上のK^+負荷によりCA1CA3野に用量依存的Ca^<2+>流入が認められた。一方、発作を発現しているSERの海馬では10mMK^+負荷により、Ca^<2+>の流入が認められ、CA3細胞に対照動物よりも有意に多い流入が観察された。以上の2つの実験からSER海馬CA3野細胞のCa^<2+>チャネルの開放閾値が低下し、かつその開放頻度が恐らく増加することにより、本細胞が異常興奮を示すと考えられた。3.新規抗てんかん薬トピラメートの作用メカニズム:海馬スライス標本およびCA3単離細胞を用い検討した。この結果トピラメートは苔状線維からCA3錐体細胞へのグルタミン酸遊離を抑制し、大量ではグルタミン酸レセプターを抑制することにより、抗てんかん作用を示すことが明らかにされた。自然発症てんかんラット(SER:zi/zi,tm/tm)について、てんかん発作を誘発するカルシウムチャネルの機能を明らかにするため、、次の研究を行った。1.SERの発作発現遺伝子の探索:tm遺伝子は、ラット第10染色体上のD10M11Mit351とD10M11Mit7との間にあり、この間200kBの欠失が存在することが明らかとなった。この中でN-アセチル-L-アスパルテート(NAA)を代謝する酵素のアスパルトアセチラーゼの欠失していることが明らかとなった。事実、SERでは脳内のNAAが増大していること、NAAを正常ラットあるいは発作発現前の週齢のトレモアラット(SERの親系統であり、欠神様発作を起こす)の脳室内に投与することにより、欠神様発作及び5-10Hz棘徐波けいれんが誘発された。2.SER海馬におけるCa^<2+>流入の増大:発作を発現しているSERの海馬スライス標本において、fura2/AMを負荷し、高K^+を投与した時、CA3野ニューロンヘのCa^<2+>流入が正常ラットのそれよりも増大していた。Ca^<2+>の細胞内流入はCa^<2+>チャネルブロッカー(ニフェジピン)により抑制されたが、SER海馬CA3の方が正常動物のそれよりも強い抑制を受けた。
競泳インターバルトレーニングにおける生理学的応答とそのトレーニング処方への応用

1.泳距離100mおよび200mのインターバルトレーニングにおいても、インターバルトレーニング疲労性閾値曲線は存在することが判明した。2.インターバルトレーニング疲労性閾値曲線は、泳距離、泳速度および休息時間の3次元グラフで描写することが可能となり、トレーニング目的に応じた泳距離、泳速度(タイム)、休息時間および繰り返し回数の設定は容易となった。これにより、適切なトレーニング処方が簡便に行えるものと思われる。3.インターバルトレーニングに関するアンケート調査によっても、インターバル疲労性閾値曲線は得られることが判明し、自由形以外の種目においてもトレーニング処方に活用できるものと思われる。1)各休息時間における総泳距離とインターバルテストの持続時間の間には、高い正の相関関係がみられ、著しく直線の関係にあることが判明した。この結果は、critical swimming velocityの概念がインターバルトレーニングヘ応用可能であることを示唆したものである。2)疲労困憊に至ることなく、その運動を繰り返し行うことのできる休息時間が、1)より推定でき、その休息時間は、運動後の血中乳酸濃度および運動前後の心拍数の変動からも、その妥当性が示唆された。3)critical swimming velocityの概念をインターバルトレーニングに応用すると、簡便的かつ非観血的に負荷泳速度と休息時間の関係からみたインターバルトレーニング疲労性閾値曲線を決定することが可能であった。4)インターバルトレーニング疲労性閾値曲線は専門とする距離種目によって異なる傾向を示した。相対的に等しい負荷泳速度における休息時間は、短距離タイプの選手ほど長く、長距離タイプほど短いものとなった。
オーラルケア介入による肺炎発症率低下と要介護レベル進行抑制への貢献に関する研究

超高齢社会において要介護者の肺炎予防は重要課題である。そこで申請者らは、施設における肺炎予防を目的としたオーラルケアマネジメント法を開発して、その効果を特別養護老人ホームにて実施して評価した。その結果、最初の施設では、カンジダ数やフードテストの改善が認められたが、肺炎の有意な減少は確認できなかった。2年目は、細菌学的な指標の検討を行なうとともに、オーラルケア法を改善した。3年目には、肺炎発症率の高い施設を選定して介入した結果、3カ月後から肺炎が減少する傾向が確認された。今後、さらに長期的に検討する予定である。日本は、急速な高齢化の進展に伴い、老人医療費・介護保険料の高騰が国民的な課題となっている。申請者らは、これまでに、某病院に隣接する介護老人福祉施設(特別養護老人ホームA、50床)において歯科がオーラルケア・マネジメントを医科・介護職員と連携して行うことにより、肺炎による入院患者数・在院日数が半減して医療費を73%削減できることを確認してきた。そこで昨年より、オーラルケア・マネジメント法を標準化して新たな施設で介入することにより、その有効性を肺炎および要介護度等から実証することを目的に3年計画でスタートした。昨年(2012年)は、オーラルケア・マネジメント・マニュアルの開発を行い、その有効性を検討するために、近隣の特別養護老人ホームB(80床)において介入をスタートした。最初に入所者全員を対象に歯科健診を行い、口腔清潔度および機能に関する検査を行った。その結果に基づき、月1回のオーラルケア・マネジメントによる介入を行うことで、口腔の清潔度指標の一つと考えられるカンジダ菌が減少するとともに、肺炎による入院者数が介入前の年間17名から、介入1年後には7名に減少した。その後、引き続き半年に1回の検査と調査を行ないながら、得られた結果をフィードバックして2年後まで検討を継続してきた結果、今年度(2013年)は、カンジダ菌がさらに減少するとともに、肺炎による入院者が介入前の年間17名から、介入2年後も引き続き9名と低い水準を維持した。また、肺炎による入院日数は、介入前は一人平均29日から介入1年後では18日、2年後では11日に半減するという成果が得られた。要介護度については、2年経過後も有意な悪化は認められなかった。さらに、今回は新しい特別養護老人ホーム(寝屋川市、30床)にて、開発したオーラルケア・マネジメント・マニュアルに基づき、口腔清潔度の指標を強化して介入をスタートした。申請者らは、これまでに某病院に隣接する介護老人福祉施設(特別養護老人ホームA、50床)において歯科がオーラルケア・マネジメントを医科・介護スタッフと連携して行うことにより、肺炎による入院患者数・在院日数が半減し、医療費を73%削減できることを確認してきた。そこで今回、これまでに実施されてきたオーラルケア・マネジメント法を標準化し、新たな施設で介入することにより、その有効性を肺炎および要介護度等から実証することを目的に3年計画でスタートした。まず初年度は、以下に示す2項目に取り組んだ。1つは、『有効なオーラルケア・マネジメント・マニュアルの開発』である。オーラルケアを「口腔清掃」と「口腔機能」に分け、それぞれについてマニュアル化した。口腔清掃は、介護度(自立・部分介助・要介護)と口腔状態(多数歯・中・少数歯・無歯顎)から9つのカテゴリーに分類し、各カテゴリーに対応したオーラルケア用具と具体的な方法を提示したマニュアルを作成した。「口腔機能」は、その機能を「口腔周囲力」「咀嚼力」「嚥下力」「口腔清掃力」の4つのカテゴリーに分けて検査を行い、その結果に対応した口腔機能向上方策を摂食・嚥下機能訓練も含めてマニュアルを作成した。2つ目は、『オーラルケア・マネジメント・マニュアルの有効性の実証』である。今までに有効性を確認してきた特別養護老人ホームAの近隣の特別養護老人ホームB(80床)において作成したマニュアルに基づくオーラルケア・マネジメントの有効性を検証することとし、初回調査と月1回のオーラルケア・マネジメントを開始した。その結果、口腔の清潔度指標の一つと考えられるカンジダ菌が減少するとともに、肺炎による入院者が介入前の年間17名から、介入1年で7名に減少するという成果が得られた。目的:日本は急速に高齢化が進展しており、老人医療費や介護保険料の高騰が国家的課題となっている。そこで申請者らは、今までに肺炎による医療費を削減したオーラルケアマネジメント法を標準化するとともに、細菌学的な評価方法等の改善を図り、3年目は肺炎発症率の高い施設でその効果を検討した。方法:オーラルケアマネジメントは食支援と口腔清掃の支援に分けて実施した。

また、口腔清掃の支援においてその効果を評価する場合は、口腔が乾燥状態にある高齢者からも口腔微生物を確実に採取できるよう、綿棒を湿潤する方法で効果を確認した。さらに、細菌数とカンジダ菌数によりハイリスク者をスクリーニングして月1回の介入を行ない、半年後まで評価した。また細菌数の測定については、今回から細菌カウンタ(パナソニックヘルスケア(株))を導入し、細菌検査結果をすぐにフィードバックできるようにした。結果:オーラルケアマネジメント介入3カ月間は、肺炎による入院回数および日数が増加したが、その後、減少・安定した。口腔清掃の評価指標としては、細菌数とカンジダ数の測定を行った。その結果、細菌数の有意な変化は認められなかったが、細菌カウンタのレベル4以上の細菌数が多い入所者が減少した(p<0.05)。また、舌苔スコアー(小島らの分類、p<0.01)および初回時の唾液湿潤度が3mm/10s未満の口腔が乾燥していた入所者(17名)の改善(p<0.05)が認められた。食支援の指標であるフードテスト、体重、食事時間においては有意な変化は認められなかった。今後、今回のオーラルケアマネジメント法が肺炎予防に貢献できるか否かについて口腔環境も含めて長期的に観察をしていく予定である。口腔保健研究目的の1つである『オーラルケア・マネジメント・マニュアルの開発』は、肺炎予防効果が認められた特別養護老人ホームAにおけるオーラルケア・マネジメント法を参考に、医師・歯科医師・看護師・歯科衛生士・栄養士・介護職員等の参画する関係者各々の役割分担と具体的な方法のマニュアルを作成することができたため、達成度はほぼ100%と評価する。第2の研究目的である『オーラルケア・マネジメントの有効性の実証』は、オーラルケア・マネジメントを行っていない特別養護老人ホームBにおいて、初回検査後に今回開発したマニュアルに基づくオーラルケア・マネジメントを開始し、昨年(2012年)は口腔清掃の効果としてカンジダ菌数の減少を確認したが、口腔内の総菌数の変化を確認するには至らなかった。この理由として、含嗽ができない高齢者が多数存在したため、滅菌綿棒にて舌背部より試料を採取してPCRにて総菌数を測定したが、口腔乾燥者において試料採取法によるバラツキが大きく、得られるデータにやや客観性を欠く結果となった。そこで、2年目(2013年)には、口腔乾燥者を対象とした口腔微生物の採取法について検討した結果、一定の水分を含浸させた滅菌綿棒を、さらに定圧測定器に固定して舌背部から試料採取することで、よりバラツキが小さくなることが明らかとなった。この方法は今後他の施設にて初回検査時から導入し、その有用性を評価する予定である。また、2年後には、肺炎による入院者数および入院日数を指標とした評価で一定の成果が得られ、研究目的とした『オーラルケア・マネジメントの有効性の実証』を進めることができた。これらの理由から、2年目の目標としてのオーラルケア・マネジメントの有効性の実証については、80%程度の達成度であり、今後、さらに医療経済学的な評価を導入して行きたい。
新学習指導要領移行を踏まえた高等学校地理歴史科における地域史デジタル教材の開発

○研究目的:現在、社会構造や価値観の変化から、高等学校においても学習課題を有する生徒が増えている。筆者は、従来から「教育課題校」における世界史・日本史の授業成立の機序を探ってきたが、そのような学校においては、授業そのものが成立し難くなっているのが実状である。こうした教育課題校においては、授業構成・授業内容ともに改善が喫緊の課題として求められている。本研究は、既存の教科・科目における高校生たち自身の記憶とのあいだの架橋が困難な状況を打開する意味において地域史を通じた歴史学習のための教材を開発することを目的とする。○研究方法:筆者が提唱する「SLRWサイクル」モデルの実践は、常に、「見る(see)」「聞く(listen)」「読む(read)」「書く(write)」要素をユニット化し、一定の課題解決に取り組むという授業モデルである。「SLRWサイクル」モデルの授業では、画像等の「地理歴史的評価(画像の持つ価値性)」の読み取らせが重要な鍵を握っている。すなわち、従来から画像等を教材に用いた授業実践は数多く行われてきたものの、その効果的な使用方法についての検証は、意外にも疎かになっていたように思われる。本研究の授業構成面についての目標は、「ただ画像を授業の導入に用いる」のではなく、画像のなかに含まれる「地理歴史的評価」を読み取らせることを重視し、その学習効果について実証することにある。○研究成果:筆者は、自らの生活圏の地誌及び歴史を、ICT機器を用いた視覚教材として40項目にわたり開発し、生徒自身の立脚する知的視点を確立したうえで歴史を俯瞰したが、これが生徒の「興味・関心」の涵養に資するものになることを実証した。生徒の感想文では、「今までやってきた歴史はいつも大規模だったので、地域史を一年間勉強できてよかったです」というものがあったが、生徒の興味を喚起できたため、歴史的事項の定着率も20ポイント程度上昇した。本成果を踏まえ、今後は歴史的思考力の分析及びその涵養機序の研究にあたりたい。
トロンボポエチンの血管内皮細胞および血管平滑筋細胞に及ぼす作用

本研究はトロンボポエチン(TPO)の血管内皮細胞と血管平滑筋細胞に及ぼす作用を課題としたが、TPOの血管および血管壁細胞に対する生理学的作用についての報告は現時点でもない。TPO受容体のmRNAは血管内皮細胞に発現していることは知られているが、その存在意義については未だに不明である。本研究では、初めに血管平滑筋細胞におけるTPO受容体の発現をみることにした。ラット大動脈中膜由来の血管平滑筋細胞を培養し、RNAの抽出後、ラットTPO受容体(mpl)のcDNAプローブを用いてNorthern blot analysisを施行した。その結果、ラット培養血管平滑筋細胞はTPO受容体のmRNAを発現していることが判明した。この事実は新知見と思われる。現在、この結果の確認と解釈のためにラット血管内皮細胞の培養系を確立中である。さらに、ヒト大動脈由来の血管平滑筋細胞と血管内皮細胞を購入し、Northern blot analysisと抗TPO受容体抗体を用いたWestern blottingを施行しているが、現在のところ一定した結果は得られていない。方法論に問題があると思われる。TPOの血管壁での一酸化窒素(NO)代謝に関する実験も進行中である。ラットのnitric oxide synthase(NOS)のcDNAプローブ(eNOS,iNOS)もようやく使えるように準備が進んできた。我々が同時に進めている血管壁代謝に関する研究で、動脈硬化巣における超低比重リポ蛋白(VLDL)受容体の発現を初めて報告した。(Am.J.Pathol.149:1831-1838,1996)。また、脂質代謝におけるGM-CSFとM-CSFのリポ蛋白受容体(VLDL受容体、LDL受容体)に及ぼす作用もまとめた(J.Atheroscler.Thromb.2:76-80,1996)。
抗CD80/86抗体誘導制御性T細胞を用いた新規角膜移植免疫寛容療法の開発

角膜移植後の急性拒絶反応に対して、ステロイドやタクロリムスなどの免疫抑制剤を中心とした治療が行われているが、感染症、自己免疫疾患の合併、再移植などで血管新生を生じたハイリスク症例では未だにその4090%に高い拒絶反応を伴う。制御性T細胞(Treg)は免疫抑制的に働き、副作用なく角膜移植片に免疫寛容を成立させることができると期待されているが、ヒト生体内でのTregの増幅は難しく、有効な体外増幅法の開発が必要である。これまでに当大学では、ヒト腎・肝移植にて抗CD80/86抗体で誘導・培養したTregによる新規免疫寛容誘導療法の可能性を明らかにしてきた。しかし、局所環境である角膜移植片において炎症や血管新生が惹起されたハイリスク症例に対して、体外で培養したTregが生体内と同等の機能を発揮するかについては不明である。そこで、本研究では血管新生を誘導したマウスハイリスク角膜移植モデルを作製し、抗CD80/86抗体で誘導・培養したTregの角膜移植片に対する免疫抑制効果の機序を検証し、ヒト角膜移植における新規免疫寛容誘導療法開発に向けた一助とする。2018年度は、角膜移植のレシピエントにはBALBcマウスを用いるため、C57BL6系統のFoxp3ノックインマウス(hCD2-Foxp3)をBALBc系統にバッククロスし、繁殖に成功した。このマウスを用い、角膜血管新生モデルであるハイリスクレシピエントマウスを作成した。角膜移植後の頸部リンパ節細胞ならびに角膜移植片を採取し、フローサイトメーターにて制御性T細胞ならびにCD45陽性CD4陽性細胞の分布を確認した。角膜移植のレシピエントにはBALBcマウスを用いるため、Foxp3ノックインマウス(hCD2-Foxp3)をC57BL6からBALBcにバッククロスする必要があり、時間を要した。BALB/cFoxp3ノックインマウスの繁殖に成功したため、2019年度はドナーであるFoxp3-GFPノックインマウス(C57BL6)からCD4陽性CD25陽性Foxp3陽性Tregをフローサイトメーターにて分離し、体外から移入したTregの角膜移植片への移行性の確認、in vitroで誘導したTregの増殖および抑制能の評価など円滑に実験が行えるものと考える。C57BL6系統のFoxp3のノックインマウス(hCD2-Foxp3)からBALBc系統へのバッククロスに時間を要し、実験が遅れたため次年度使用額が生じた。現在は、BALBc系統のFoxp3のノックインマウス(hCD2-Foxp3)の繁殖に成功しているため、2019年度はドナーであるFoxp3-GFPノックインマウス(C57BL6)からCD4陽性CD25陽性Foxp3陽性Tregをフローサイトメーターにて分離し、体外から移入したTregの角膜移植片への移行性の確認、in vitroで誘導したTregの増殖および抑制能の評価など円滑に研究が行えるものと考える。
細胞周期関連遺伝子の導入による放射線抵抗性がんの感受性化機構

ヒト由来脳腫瘍細胞(T98、A1235)にp16cDNAを組み込んだ発現プラスミド(pOPMTS)をトランスフェクションし、G418にて選択し,T98から14個のクローン、A1235から20個のクローンを選んだ。これらのクローンからRNAおよびタンパクを抽出し、P16遺伝子の発現について、ノーザンおよびウエスタンプロットを用いて検索した。これらのクローンのうち、それぞれの細胞株からp16を発現している4クローンずつを実験に用いた。p16遺伝子導入により得られた計8つのクローンと親株(T98、A1235)およびベクター導入株(T-V4、A-V3)の放射線感受性を比較した場合、p16発現クローン全てにおいて、親株やベクター導入株に比べて放射線に感受性となった。対照のベクター導入株は親株と比較して放射線感受性に有意な差が見られなかった。フローサイトメトリーにより親株(A1235)、ベクター導入株(A-V3)およびp16遺伝子導入クローン(A-C29)に関してフローサイトメトリーにより指数的増殖期における細胞周期分布を調べたところ、細胞株間における有意な差は見られなかった。次に、放射線照射後の細胞周期分布について解析した。3Gy照射後20および40時間後におけるDNAヒストグラムの結果、全てのクローンにおいてG1アレストならびにG2ブロックが見られた。とくにp16発現クローン(A-C29)においてその効果は顕著であった。さらに、16発現クローンでは、放射線照射後、部分的なDNAのマイクロフラクションが観察された。このことは部分的なアポトーシスが起きていることを示唆している。ヒトI-κBα/MAD3cDNAを発現ベクターpcDNA3に組み込んでI-κBαの発現プラスミドの作製を完了した。放射線抵抗性脳腫瘍細胞(MO54ならびにA172)にI-κBα発現プラスミドをトランスフェクションし、選択培地によりI-κBα発現クローンをチェックした。得られたI-κBα過剰発現クローンの放射線感受性を検索したところ、用いた2種の脳腫瘍細胞からの複数クローンにおいて放射線感受性が高まっていた。また、放射線感受性化の程度は、I-κBα過剰発現の程度にほほ比例していた。親株ならびにI-κBα発現クローンを用いて5Gy放射線照射後のNF-κBのDNA結合活性をelectrophoretic mobility shift assayにて調べたところ、親株では核分画におけるDNA/NF-κB複合体の増加が観察され、I-κBα発現クローンではこの複合体に変化は見られなかった。従って、この結果は、I-κBα発現クローンにおいて放射線照射後、NF-κBの核移行が阻害されていることを示している。