hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前立腺癌に対するユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法の開発

予定していたSAHAとbortezomibの併用療法につき併用効果、そのメカニズムにつき解明することが出来た。Ritonavirとbortezomibによるユビキチン化蛋白蓄積が示されたため、in vivoにおける効果、副作用の検討を推進する。また小胞体ストレス誘導、ヒストンアセチル化、SUMO化といった関連する現象についても解析をすすめ、より詳細なメカニズムの究明に努める。更に、前年度までに示されたSAHAとbortezomibの併用効果を発展させるべく、SAHAより低濃度で作用するpanobinostat, romidepsinといったヒストン脱アセチル化酵素阻害薬とbortezomibの併用についても効果を検討して行きたい。SAHAとbortezomibの併用はユビキチン化蛋白を蓄積し、前立腺癌増殖抑制に有効であったが、これまでの検討ではHDAC6の抑制、小胞体ストレスの誘導が更に詳細なメカニズムとして重要であることが見出されている。即ち、HDAC6特異的阻害薬tubastatinや小胞体ストレスを誘導するritonavirとbortezomibの併用も効果的にユビキチン化蛋白を蓄積することが予想される。そこで、今後はtubastatin或いはritonavirとbortezomibの併用療法の研究を行い、より効果的なユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法開発を目指す。更にはSAHAに比べ、より低濃度で作用するpanobinostatなど他のHDAC阻害薬とbortezomibの併用についても検討する。順調に計画が進んだこともあり、抗体や消耗品の使用量、またヌードマウスの使用量が少なく済んだ可能性があり、次年度使用の研究費が生じた。次年度に請求する研究費と合わせ、更に詳細な小胞体ストレス経路の探索のための抗体購入、他の薬剤の組み合わせによる併用療法のヌードマウスを用いた検討に使用する予定である。
巨大環拡張ポルフィリンの新規物性開拓

本研究では、環構造を拡張したポルフィリン類縁体である環拡張ポルフィリンについて、環構造のさらなる拡大に着目することで芳香族性を中心とした新規物性の開拓に取り組み、前年度までに環状π共役系のトポロジーの観点から特徴的なアヌレノアヌレン分子の創出や4回ねじれヒュッケル芳香族化合物の初の合成を達成した。これらの成果については論文として発表するとともに、国際学会においても発表し、ポスター賞を受賞するなど高い評価を得た。以上のように当初の研究計画を概ね達成したことから、最終年度となる本年度は、巨大環拡張ポルフィリンの化学のさらなる展開の足がかりとして、巨大環拡張ポルフィリンの新規環サイズ選択的合成法の開発に取り組んだ。具体的にはメゾ位に反応性の置換基を有するペンタフィリンを合成し、オリゴピロール類との酸縮合に続く酸化を経る逐次的な環構造の形成によって、これまでに比較的合成が困難であったノナフィリン(ピロール9個)の選択的な合成に成功した。得られた化合物は分子内架橋型構造を有しており、その構造、各種物性、並びに酸化還元挙動について精査した。加えて開発した本手法を応用することで、未だかつて単離されたことのなかったウンデカフィリン(ピロール11個)を高い収率で得ることにも成功した。この他に、前年度までに開発したピロール窒素上の位置選択的な修飾を用いて、巨大環拡張ポルフィリンの構造制御についての検討を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は電子的、構造的に柔軟な巨大環状π共役化合物である環拡張ポルフィリンを基軸として、従来のものと比べてより巨大な環状π共役系や高度にねじれた環状π共役系、加えて複数の環状電子共役系を有する分子を設計・合成し、芳香族性や反芳香族性についての新たな知見を得ることを目的とするものである。本年度は1)複数の共役系の寄与を有する分子内架橋型環拡張ポルフィリンの合成と物性評価、2)4重ねじれヒュッケル芳香族ドデカフィリンの合成と物性評価、の2つのテーマについて研究を展開した。以下、各項目についての概要を示す。1)各種芳香環によって連結されたビスジピロメタンを前駆体として分子内架橋型デカフィリンの合成、各種スペクトル測定による物性評価を行ったところ、期待通り架橋部位を通るような共役系の寄与が確認され、1つの分子内に複数の共役系を実現することに成功した。加えて、架橋部位を通るような環状共役系は位相が反転したメビウス型の構造を有していることが明らかとなり、メビウス芳香族性を示すアヌレノアヌレンとしての性質を見出した。2)1)のテーマを発展させる際に得られた分子内架橋型ドデカフィリンに対して金属錯化を施すことで4重ねじれ環状π共役系を固定化することに成功した。さらに、各種スペクトル測定から、この化合物がヒュッケル芳香族性を示すことが明らかとなり、初の4重ねじれヒュッケル芳香族化合物の実現に成功した。1)のテーマに関しては、当初の計画から大幅に進展し、前駆体の合成にとどまらず、目的化合物の合成から物性測定まで遂行することに成功した。また、初のメビウス芳香族アヌレノアヌレンの実現に成功するなど、当初期待していた以上の物性を見出すことに成功した。2)のテーマに関しては、適切な基質の探索に苦労したが、1)のテーマで得られた化合物を応用することにより目的とする化合物の単離に成功した。以上の点から、本年度の研究は当初の計画以上に進展したと言える。本研究では、ポルフィリンの環構造を拡張した類縁体である環拡張ポルフィリンの電子的かつ構造的に柔軟な特徴を活かして、従来にはないような芳香族化合物を創出することで、主に実験的な側面から芳香族性についての知見を得ることを目的にしている。本年度の実績の概要を以下に示す。(1)分子内架橋型デカフィリンに基づく8の字型構造を有するアヌレノアヌレンの創出分子内架橋型環拡張ポルフィリンについて架橋部位をさらに伸長させることで、よりねじれが加わった8の字型の構造を有するアヌレノアヌレン分子を初めて実現した。具体的には、ピロール環10個から構成されるデカフィリンに対して種々の伸長した芳香族架橋部位を導入した化合物を合成した。加えて、8の字型にねじれた環状π共役系においても架橋部位を通るような共役系の寄与が存在することを実験的に証明した。(2)ピロール環の窒素部位の修飾による環拡張ポルフィリンの新規構造制御の開発環拡張ポルフィリンの新たな構造制御の手法としてピロール窒素上の選択的修飾法を開発した。具体的には、ピロール誘導体を鍵前駆体とした合成経路を経ることで、ピロール環の窒素上が選択的にアルキル化された一連の環拡張ポルフィリンを得た。これらの一部は、従来の窒素上がアルキル化されていない環拡張ポルフィリンとは異なる構造をとったことから、環拡張ポルフィリンの構造制御という観点からの本手法の有用性が示唆された。分子内架橋型環拡張ポルフィリンの研究テーマに関しては(1)の成果にも示すように8の字型構造を有するアヌレノアヌレン分子を実現しており、当初の予想を大きく上回る成果が得られている。一方で超巨大芳香族化合物の実現に関するテーマは、その構造についての知見がまだ十分に得られてはいない。

これは塩基添加後の脱プロトン化体の結晶性の問題に由来するものであるが、(2)の成果にも示すように環拡張ポルフィリンの新規な構造制御の手法を開発しており、この手法を適用することによって解決出来る可能性があると考えている。以上のような理由から、本年度の研究は概ね順調に進行したと考えている。本研究では、環構造を拡張したポルフィリン類縁体である環拡張ポルフィリンについて、環構造のさらなる拡大に着目することで芳香族性を中心とした新規物性の開拓に取り組み、前年度までに環状π共役系のトポロジーの観点から特徴的なアヌレノアヌレン分子の創出や4回ねじれヒュッケル芳香族化合物の初の合成を達成した。これらの成果については論文として発表するとともに、国際学会においても発表し、ポスター賞を受賞するなど高い評価を得た。以上のように当初の研究計画を概ね達成したことから、最終年度となる本年度は、巨大環拡張ポルフィリンの化学のさらなる展開の足がかりとして、巨大環拡張ポルフィリンの新規環サイズ選択的合成法の開発に取り組んだ。具体的にはメゾ位に反応性の置換基を有するペンタフィリンを合成し、オリゴピロール類との酸縮合に続く酸化を経る逐次的な環構造の形成によって、これまでに比較的合成が困難であったノナフィリン(ピロール9個)の選択的な合成に成功した。得られた化合物は分子内架橋型構造を有しており、その構造、各種物性、並びに酸化還元挙動について精査した。加えて開発した本手法を応用することで、未だかつて単離されたことのなかったウンデカフィリン(ピロール11個)を高い収率で得ることにも成功した。この他に、前年度までに開発したピロール窒素上の位置選択的な修飾を用いて、巨大環拡張ポルフィリンの構造制御についての検討を行った。分子内架橋型環拡張ポルフィリンが新規なπ共役化合物を実現する上で有用な基質であることが見出されたため、さらなる検討を行っていく。具体的には架橋部位の探索、種々の金属錯体の合成が挙げられる。また、これまでに報告されている大環状非芳香族環拡張ポルフィリンについても酸の添加や適切な金属錯化などによって芳香族性/反芳香族性の発現を目指す。分子内架橋型環拡張ポルフィリンに関してさらなる検討を行う。具体的には、さらなる架橋部位の探索によってアヌレノアヌレンとしての性質をさらに探究するとともに、構造的に柔軟な環拡張ポルフィリンの構造制御の手法としての応用も模索していく。加えて、今年度開発したピロール環の窒素上の修飾による構造制御の手法をより大きな環構造を有する類縁体に対して適用することを目指す。既知の構造制御の手法(金属錯化、酸、塩基の添加、分子骨格の置換)とも適宜組み合わせることで従来にない新規な環状π共役系を実現し、芳香族性に関する更なる知見を得ることを目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
判断の柔軟性の分子メカニズムの解明

環境に応じて柔軟に判断を切り替えるタスクスイッチングは、霊長類特有の重要な認知機能である。NMDA受容体拮抗薬であるケタミンの低用量全身投与は、このような柔軟性を障害するが、その神経回路メカニズムは不明である。本研究では、2つの判断課題を柔軟に切り替えるタスクスイッチ課題を遂行中のサルの大脳皮質LIP野ニューロン活動を計測した。ケタミン投与は、不必要な情報の排除を障害し、判断関連活動の開始を遅らせた。これらの結果は、ケタミンが「いつ」、「どの」情報を処理すればよいのかに影響を与えたことを示唆する。本研究では、タスクスイッチングというヒトも含めた霊長類特有の認知機能の分子メカニズムを解明するため、我々が独自に開発した「判断切り替え」の系をサルに適用し、NMDA受容体が判断の形成と切り替えのどの部分に作用しているのかを解明することを目標とする。まず、認知機能障害モデルとしてよく用いられているケタミン低用量全身投与時の、タスクスイッチングの行動学的指標を定量化した。動きの方向、あるいは奥行きのどちらかを答えるタスクスイッチ課題を訓練したサルに、低用量(0.250.5mg/kg)のケタミンを全身投与し、投与前後の行動学的な変化を検証した。本研究では、スイッチ機能として、不要な情報による干渉の度合いを定量化したswitch ratio(SR)を用いた。不要な情報による干渉がなければSRが1に、不要な情報による干渉が大きく、必要な情報を正しく取り出せていない場合にはSRは0になる。運動方向判断においては、ケタミン投与前はSRは0.902、つまり、不要な情報による干渉はほとんど見受けられなかった。しかし、ケタミン投与後にSRは0.759と低下し、不要な情報による干渉が増加していたことが検出できた。この際、必要な情報を用いた判断の精度には変化が見られなかった。これらの結果は、ケタミンを低用量全身投与すると、不要な情報の排除が困難になることを示しており、NMDA受容体が、多様な情報の中から必要な情報のみを取り出すという認知機能に貢献することを示唆する。本研究では、タスクスイッチングというヒトも含めた霊長類特融の認知機能の分子メカニズムを解明するため、我々が独自に開発した「判断切り替え」の系をサルに適用し、NMDA受容体が判断の形成と切り替えのどの部分に作用しているのかを解明することを目標とする。まず昨年度に引き続き、認知機能障害モデルとしてよく用いられているケタミン低用量全身投与時の、タスクスイッチングの行動学的指標を定量化した。動きの方向、あるいは奥行きのどちらかを答えるタスクスイッチ課題を訓練したサルに、低用量(0.250.5mg/kg)のケタミンを全身投与し、投与前後の行動学的な変化を検証した結果、運動方向判断においては、ケタミン投与前のSRは0.89から0.79に低下した。つまり、不要な情報による干渉が増加していたことがわかった。さらに、反応時間は刺激強度によらず、一定時間が延長することを解明した。これは、判断に関わらないプロセスの時間が延長している可能性を示唆する。次に、LIP野から神経活動を記録したところ、必要な情報に対するLIP野ニューロンの感度は変化しなかったものの、不要な情報に対する感度が上昇した。本年度はタスクスイッチ課題を遂行中のサルにケタミンを低用量全身投与し、不要な情報の排除が困難になる際のLIP野の神経活動記録を行った。その結果、不要な情報に対するLIP野ニューロンの感度が上昇することが、その神経基盤になっていることを解明した。本研究の成果を持って、次のステップである神経活動を記録しながら、各種NMDA受容体拮抗薬の局所作用を検証する実験に進むことができる。よって、本研究はおおむね順調に進展していると評価することができる。昨年度に引き続き、認知機能障害モデルとしてよく用いられているケタミン(NMDA受容体拮抗薬)低用量全身投与前後のLIP野ニューロン活動を計測した。LIP野は眼をどちらに向けるかの判断に関連した情報収集を担当し、知覚判断課題時には刺激強度依存的な漸増(build up)活動を示すことが知られている。ケタミン投与前は、刺激呈示から刺激強度依存的build up活動が始まるまでの時間が約200ミリ秒であったが、ケタミン投与後はその時間が約60ミリ秒延長することを解明した。これは、反応時間が刺激強度によらず、一定時間(約60ミリ秒)延長するという行動学的なデータと合致する。コントロールとして、生理食塩水の投与も行ったが、生理食塩水投与では反応時間の延長、LIP野ニューロンの刺激強度依存的build up活動開始の延長のいずれも見られなかった。また、感覚情報表現を司る大脳皮質MTからニューロン活動を記録をし、同様にケタミン低用量全身投与実験を行ったが、反応潜時の延長は見られなかった。これら結果は、ケタミンが判断に関わる情報収集の開始の調節に影響を与えていることを示している。情報収集開始の制御は柔軟な判断を行うのに重要であると考えられるが、本研究では神経活動としてその制御を捉えるのに成功した。

環境に応じて柔軟に判断を切り替えるタスクスイッチングは、霊長類特有の重要な認知機能である。NMDA受容体拮抗薬であるケタミンの低用量全身投与は、このような柔軟性を障害するが、その神経回路メカニズムは不明である。本研究では、2つの判断課題を柔軟に切り替えるタスクスイッチ課題を遂行中のサルの大脳皮質LIP野ニューロン活動を計測した。ケタミン投与は、不必要な情報の排除を障害し、判断関連活動の開始を遅らせた。これらの結果は、ケタミンが「いつ」、「どの」情報を処理すればよいのかに影響を与えたことを示唆する。年度初めに提案した「ケタミン低濃度全身投与による判断切り替え能力低下の行動学的評価」は順調に進捗した。具体的には、タスクスイッチ課題を遂行中のサルにケタミンを低用量全身投与すると、不要な情報の排除が困難になることを定量的に解明できた。その結果、NMDA受容体が判断の形成と切り替えのどの部分に作用するのかの大まかな予測がついた。本研究の成果を持って、次のステップである「神経活動を記録しながら各種NMDA受容体拮抗薬の作用を検証する」実験に進むことができる。よって、本研究はおおむね順調に進展していると評価することができる。引き続き、ケタミン低用量全身投与時の神経活動記録を継続する。続いて、各種NMDA受容体拮抗薬の局所投与時の作用を検証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経生理学第一に「ケタミン低濃度全身投与による判断切り替え能力低下の行動学的評価」を継続する。特に、反応時間のデータを定量的に解析できるよう、データ数を増やすことを目標とする。第二に、次のステップとして、神経活動を記録しながら各種NMDA受容体拮抗薬の作用を検証する。行動学的な研究だけでは、脳のどこで、どのプロセスがケタミンによる影響を受けているのかがわからない。したがって、本タスクスイッチ課題の感覚情報を表現する大脳皮質MT野、判断を形成する仮定が表現されている大脳皮質LIP野から神経活動計測を行い、各種NMDA受容体拮抗薬の投与により、神経活動にどのような影響を与えるのかを検証する。全身投与と局所投与の両手法を相補的に活用する。物品費(薬品などの消耗品)が予想を下回った。本年度は各種NMDA受容体拮抗薬の局所注入を行わなかったため、注入器などの備品を整備は次年度に行うこととした。研究遂行のための物品を年度当初に揃える予定である。薬品の脳内局所注入に必要な備品を次年度にそろえる。
分岐状ポリ乳酸の精密合成と応用

核にヒマシ油、枝にポリ乳酸鎖を有する多分岐ポリ乳酸(分岐状ポリエステル)の精密合成技術の開発とその応用について検討した。乳酸やラクチドをモノマーとする重合系において、分岐状ポリエステルの精密重合技術を確立した。分岐状ポリエステルの分子量や熱的特性はヒマシ油とラクチドの仕込みにより制御し、分岐状ポリエステルの用途開発に向けた末端修飾技術を開発した。得られた分岐状ポリエステルをポリ乳酸や微生物産生ポリエステルなどのバイオマスプラスチックに添加したところ、可塑化あるいは結晶化が促進され、分岐状ポリエステルがバイオマスプラスチックの物性を向上させることが見出された。今年度は主にバイオポリオールである油脂成分をコアとする分岐状ポリ乳酸の合成を行い、ポリ乳酸用添加剤としての性能を評価した。分岐状ポリ乳酸は開始剤にヒマシ油を用い、スズ系触媒存在下にラクチドの開環重合により合成した。分岐状ポリ乳酸はラクチドと開始剤の仕込み比により容易に分子量制御が可能であった。分岐状ポリ乳酸をポリ乳酸に少量添加して作製したシートはポリ乳酸単独と同等の優れた透明性を保持していた。分岐状ポリ乳酸が分子内に乳酸鎖を有しており、ポリ乳酸との相溶性が高いためと考えられる。分岐鎖にL体の乳酸鎖を導入した分岐状ポリ乳酸を添加したシートでは、ポリ乳酸単独と比較して破断ひずみが著しく向上した。5wt%といった少量添加で優れた可塑化効果を示し、最大応力の低下も抑制された。DL体の分岐状ポリ乳酸を添加した場合にも同様の効果が見られた。これらより、L体、DL体の分岐状ポリ乳酸のポリ乳酸に対する高い可塑効果が明らかとなった。一方、D体の分岐状ポリ乳酸を用いたシートの引っ張り試験においては、応力が上昇し、破断ひずみはポリ乳酸単独と同程度となった。シートのDSC測定を行ったところ、冷却過程においてポリ乳酸単独シートでは結晶化ピークが見られないのに対し、D体の分岐状ポリ乳酸を添加したシートでは結晶化に由来するピークが観測され、冷却時に結晶化したことがわかった。また、昇温過程において210°C付近にピークが見られたことから、D体の分岐状ポリ乳酸の添加によりL体であるポリ乳酸とステレオコンプレックスが形成したことがわかった。分岐状ポリ乳酸とポリ乳酸との界面に存在するステレオコンプレックス結晶がポリ乳酸の結晶化を促進し、結晶核剤として作用したと考えられる。今年度はヒマシ油をコアとする分岐状バイオポリマーの合成と末端修飾を行った。また、末端構造の異なる分岐状ポリマーを添加したポリ(L-乳酸)(PLLA)の結晶化挙動や力学物性を調べ、分岐状ポリマーを基盤とする高性能PLLA用添加剤の開発を行った。まず、ヒマシ油の水酸基を開始点に利用してラクチドの重合を行い、分岐状ポリマーを合成した。つづいて分岐状ポリマーと酸無水物との反応により、末端基の導入を行った。その後、ホットプレスにより分岐状ポリマーとPLLAを任意の割合で混合したブレンドフィルムを作製した。報告者のこれまでの検討から、末端フタロイル型分岐状ポリマー(BP-Ph)をPLLAに15wt%添加した場合に結晶化が促進することがわかっている。本研究では低添加量でPLLAの結晶化を促進する添加剤の開発を目指し、分岐状ポリマーを5wt%添加したPLLAフィルムの等温結晶化挙動を調べた。分岐状ポリマーを添加した多くのフィルムにおいて、τ1/2の値はPLLA単独と同等、もしくは大きくなった。BP-Ph5wt%添加フィルムではτ1/2は8分以上となり、PLLAの結晶化が抑制された。一方、トリメリット酸を末端に導入した分岐状ポリマー(BP-Tr)を添加した場合には、結晶化時間が著しく短縮された。これは5wt%の添加量でBP-TrがPLLAの結晶化を促進したことを示している。異なる等温結晶化温度においても同様の結果が得られ、広い温度領域で結晶化促進作用が発現した。これらの結果より低添加量においてBP-TrがPLLAの結晶核剤として作用することが明らかとなった。今年度は分岐状バイオポリマーの添加による微生物産生ポリエステルに対する結晶化効果を調べた。PHBに対し、末端水酸基、重合度50の分岐状バイオポリマーを5%添加したところ、5090°Cにおいて90秒以内に最大結晶化率の70%以上のPHBが結晶化した。いずれの温度においても未添加よりτ1/2値が小さくなり、結晶化促進効果が見られた。続いてPHBより結晶化しづらいPHBV(3-hydroxyvalerate含量:5%)について分岐状バイオポリマーの添加効果を調べた。分岐構造の影響に関し、片末端及び両末端水酸基のポリ乳酸をPHBVに添加したフィルムを作製し、結晶化挙動を検討した。いずれの場合の冷却過程において小さな結晶化ピークしか観察されず、結晶核剤としての作用は弱いことがわかった。

一方、分岐状サンプルの添加系では優れた結晶化促進効果が見られた。次に分岐状バイオポリマーの重合度の影響を調べた。DSC分析における1st coolingにおける結晶化温度は重合度に依存し、重合度50の場合に最大となった。等温結晶化挙動から分岐状バイオポリマーの優れた増核作用が明らかとなり、5090°Cにおいて90秒以内に最大結晶化率の70%以上のPHBVが結晶化を達成した。重合度50のサンプルを用いてAvrami式を用いて結晶化挙動を詳細に検討した。95°Cでの結晶化においてPHBV単独ではAvrami指数が1.64、分岐状バイオポリマーの添加系では1.75となり、Avrami指数が変化した。偏光顕微鏡による経時観察では、分岐状バイオポリマーを添加した場合に結晶化が迅速に進み、結晶が微小化することがわかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。
分子夾雑環境におけるタンパク質の金属イオン獲得メカニズム

銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ(SOD1)は、銅イオンと亜鉛イオンを結合し、活性酸素の一種であるスーパーオキシドを除去する活性を有した酵素である。酸素呼吸が可能なほぼ全ての生物はSOD1を有しており、ヒトにおいても、SOD1活性の低下は様々な加齢性疾患を発症させることが提案されている。酸素呼吸を行うバクテリア(グラム陰性菌)は、ペリプラズム空間にSOD1(バクテリアではSodCと呼ばれる)を局在させることで、好中球によって貪食・殺菌を受ける際に発せられるスーパーオキサイドからバクテリアを保護していると考えられている。実際、病原性サルモネラ菌のペリプラズム空間には二種類のSodCが存在し(SodC-I, SodC-II)、SodC-Iを欠損したサルモネラ菌は好中球によって殺菌されやすくなり、病原性は低下することが知られている。一方で、SodC-IIを欠損させても、サルモネラ菌の病原性には変化が見られず、その役割は未だ明らかとなっていない。嫌気条件ではSodC-IIの発現は見られなくなることから、SodC-IIの役割は酸素分子に関連しているとも考えられるものの、SodC-IIを欠損させても、好気条件におけるバクテリアの増殖や生存率は影響を受けないことが報告されている。そこで、酸素呼吸を行うグラム陰性菌のモデルとして大腸菌を用い、SodC-IIが活性化するためには銅イオンが必要である点に着目することで、SodC-IIの生理的役割を検討した。その結果、活性型のSodC-IIは、酸素呼吸の過程において、電子伝達系から漏れ出た電子によって酸素分子が還元されて生じるスーパーオキシドを除去することで、大腸菌をその毒性から保護しているものと推察された。細胞内に存在する全タンパク質のうち、およそ3割は金属イオン(Fe, Cu, Znなど)を活性中心として結合することで、電子伝達や様々な酵素機能を発揮している。実際、金属イオンを結合できなければ、金属タンパク質は適切な生理機能を発揮できず、様々な疾患を発症させることも知られている。タンパク質への金属イオン結合は生命現象を維持する上で非常に重要な反応であるにもかかわらず、その細胞内制御に関する詳細なメカニズムについては未だ多くの点が明らかとなっていない。平成30年度には、大腸菌をモデルにすることで、分子夾雑な細胞内環境における銅イオンの運搬・供給メカニズムに関する検討を進めた。特に、ペリプラズム空間において主要な銅タンパク質であるSodCへの銅イオン供給・酵素活性化を制御する因子について研究を行い、夾雑環境におけるSodCの銅イオン獲得メカニズムに関して知見を得ることができた。よって、本研究課題に関する現在までの進捗状況は概ね順調であると考えられる。前年度までに引き続き、ペリプラズム空間において最も主要な金属結合タンパク質である銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ(SodC)に着目し、細胞夾雑環境であってもSodCに銅イオンを供給することができるペリプラズム内因子の同定を進める。特に、ペリプラズム空間において主要な銅タンパク質であるSodCへの銅イオン供給

・酵素活性化を制御する因子について研究を行い、夾雑環境におけるSodCの銅イオン獲得メカニズムに関して知見を得ることができた。よって、本研究課題に関する現在までの進捗状況は概ね順調であると考えられる。前年度までに引き続き、ペリプラズム空間において最も主要な金属結合タンパク質である銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ(SodC)に着目し、細胞夾雑環境であってもSodCに銅イオンを供給することができるペリプラズム内因子の同定を進める。
培養骨膜によるインプラント適応拡大に向けた臨床骨再生

培養骨膜を用いた歯槽骨再生法の臨床試験を実施した。培養骨膜と骨移植との併用は質量ともに良好な再生骨質をもたらすことが示唆された。【自家培養骨膜の適応と施用法の検討】・骨膜採取:患者下顎臼歯部頬側からのアプローチで骨膜を摘出し培養を開始した。Medium199倍地+10%FBSでシャーレ中心に静置し6週間37°Cで培養した。培養機は症例ごとに個別使用し、採取した骨膜組織より細胞の遊走と積層化が進み始めたことを確認した後、週2回の培地交換を6週間行った。培養6週から7週になった時点で細胞シートはシャーレ上で直径おおよそ34cmに成長した。感染検査を定期的に行ったところ、マイコプラズマの菌種に培養開始直後と培養終了時点において約半数の陽性が確認された。これについて駆除の方法を検討し、院内において新たにニューキノロン系薬剤による治験を計画した。・低歯槽堤症に対して、自家骨細片+自家培養骨膜+PRPを混和したものを骨膜下あるいは上顎洞底粘膜下に移植した。培養骨膜施用によって歯槽骨の厚さと高さの両面の造成が十分に行われた。CT所見では密度の比較的高い緻密な硬組織の形成が移植した範囲に確認された。移植した自家骨細片は培養骨膜移植を併用しない場合に比べて細小化し、接する既存骨との間には軟組織の介在のない骨形成な確認された。今後再生骨組織の長期的経過観察を行う。インプラント体埋入時に採取した再生骨の組織所見は骨形成に伴い活発な歯骨細胞による骨改造の所見が確認された。培養骨膜細胞の作用は、骨芽細胞の供給のみならず、血管新生と破骨細胞の誘導による骨改造現象の速やかな誘導を介して、骨組織の有機的機能を速やかに誘導することによって、効果的な骨組織の再生と維持を助けることが示唆された。・口腔癌患者および健常者の血液より白血球genomic DNAを抽出した。それに加えて、患者および健常者のり患歴、飲酒と喫煙の生活習慣、年齢、性別などの基礎データを聴取した。これまでにおおよそ患者と健常者のそれぞれ150人について検体とデータを収集した。引き続き収集を続ける予定。・引き続いて骨膜採取:患者下顎臼歯部頬側からのアプローチで骨膜を摘出し培養を行った。Mediuml99倍地+10%FBSでシャーレ中心に静置し37°Cで培養した。採取した骨膜組織より細胞の遊走と細胞シートの重層化が進み始めたことを確認した後、培養6週の時点で細胞シートは直径おおよそ34cmに成長した。・低歯槽堤症例に対して、自家骨細片+自家培養骨膜+PRPを混和したものを骨膜下あるいは上顎洞底粘膜下に移植した。培養骨膜併用骨移植によって歯槽骨の厚さと高さの両面の造成が得られた。CT所見では移植自家骨細片間のCT値上昇を伴う緻密な硬組織の形成が確認され、隣接する皮質骨との間には軟組織の介在のない骨形成が確認された。また、移植自家骨細片は培養骨膜移植を併用しない場合に比べて細小化が見られた。・培養骨膜を併用した再生骨の組織所見は移植骨細片周囲での活発な新生骨形成に加えて活発な破骨細胞動員および血管新生が確認された。培養骨膜細胞の作用は、骨芽細胞の供給のみならず、血管新生と破骨細胞の誘導による骨改造現象の速やかな誘導を介して、効果的な骨組織の再生と維持を助けることが示唆された。・低歯槽堤症例に対して、自家骨細片およびbTCP顆粒+自家培養骨膜+PRPを混和したものを骨膜下あるいは上顎洞底粘膜下に移植した。bTCP顆粒の割合を順次10%から30%に上昇した。自家骨細片およびbTCP顆粒におけるbTCPの割合が30%以上のときに再生骨に軟化傾向が観察された。細胞による骨組織再生に対する悪影響を予想しbTCPの併用を中止し、組織所見を含む慎重な効果判定を進めている。Medium199倍地+10%FBSでシャーレ中心に静置し37°Cで6週間培養した。低歯槽堤症例に対して、自家骨細片+自家培養骨膜+PRPを混和したものを移植し、歯槽骨造成における効果を検討した。研究期間中に施用症例数は40症例に達した。そのうち1年以上の経過観察が完了した症例について、その骨形成状態を組織学的および画像診断的に検討した。・培養骨膜施用による有害事象は確認されなかった。1例で原因不明の骨形成不全があった。上顎洞挙上の2例において移植材中心部の壊死による一部移植材の排出があった(一部でありインプラント植立は問題なく施行)。これらはいずれも移植材が4gを超える多量の移植であり、血管新生の限界を超えた可能性があり、移植法については今後も検討を要する。・自家骨細片およびbTCP顆粒(10-50%)+自家培養骨膜+PRPを混和したものを移植した。

bTCPの併用において、自家骨細片およびbTC顆粒におけるbTCPの割合が30%以上のとき、おおよそその1/3で形成骨が柔らかい傾向が見られた。しかし、最終的に骨形成は得られ、インプラント埋入が可能だった。・CT所見では移植後3か月で移植自家骨細片間に摺りガラス様の不透過域が形成され、その一方で、移植後1年以上経過のCTではCT値に基づく精密画像解析の結果、移植した下顎骨由来の皮質骨の吸収が細胞を施用しない骨移植単独の場合く比べて、迅速に進むことが確認された。【結論】培養骨膜の併用は自家骨を併用するという点では不完全ともいえるものの、移植材内での骨新生と骨リモデリングを活性化し、効果的に生活骨を再生する効果があることが示された。今後は細胞の均質化と高分化化をはかる培養条件の開発を進め、効率化を図る。
表面配位に基づく非対称ナノ粒子システムの構築と光・電子機能開拓

ナノ粒子やナノクラスター(NC)の配位子は配位結合により無機コアに配位し、その成長、構造並びに電子状態を制御する。特に、不斉構造を有する配位子を用いることで、コアの原子配列や電子状態に非対称性を導入し、光学活性を付与することが可能である。本年度は、安定なキラル結晶系を与える硫化水銀(HgS)ナノ粒子において、キラル表面配位子(ペニシルアミン)の二座配位構造の変化とナノ粒子のキラル結晶系反転現象が協調的に起こるということをまとめて論文発表した。また、キラル二座配位子(DHLA)とAg原子により構成されるAg29(DHLA)12について、NCの安定性における表面配位子キラリティーの影響について評価した。特定原子数のAg(原子、イオン)からなるNCは錯体やナノ粒子とも異なる特異的な電子遷移を示し、しばしば強い発光を与える。ジヒドロリポ酸(DHLA)の両エナンチオマーを用いてAg29 NCを合成し、表面におけるキラル構造と発光特性の相関を評価した。種々のエナンチオ過剰率(ee)に調整したナノクラスターにおいて、配位子の光学純度が向上すると共に、発光量子収率の増大が観察された。同様に、光学純度の向上が発光寿命の増加と無輻射失活速度定数の低下を導くことを見出した。すなわちナノクラスター上における配位子の配向と配位子間相互作用がナノクラスター全体の安定性と基礎物性に影響を与えていることを明らかにした。2019年度は個々のクラスター物性の制御を超えた、クラスター間相互作用に基づく不斉電子系の発現について検討を進める予定である。これまで、表面配位子の配位構造のキラリティーとナノ粒子、ナノクラスターの構造、電子物性の相関が評価できており、領域目標に沿った研究が進めてられている。また複数の領域内共同研究も進められており、順調に進展しているといえる。引き続き、表面キラル配位構造とキラリティ誘起の相関について研究を進める。特に、構造単位としてのクラスターを架橋し、不斉配列できるような構造制御系を開発する。これにより、個々のクラスターにおける不斉構造制御から階層を超えた、クラスター間のキラル相互作用による新しい不斉電子系の発現について検討を進める。ナノ粒子表面は、無機結晶最表面の金属元素と表面配位子からなる金属錯体が界面に沿って異方集積した配位空間を与える。本研究では、ナノ粒子表面配位子秩序性溶媒和構造を含めた拡張配位圏のアシンメトリー設計を通じて、ナノ結晶コア表面局在の配位空間ナノ粒子自己集合体のマルチスケールにおける階層的な構造非対称化法を確立し、非対称集積電子系特有の電子・光学機能を開拓することを目的とする。特に、今年度は、キラル配位子を有する金属ナノクラスターならびに半導体ナノ結晶の作製を通じ、ナノクラスターコア、半導体コアへの光学活性の誘起に取り組んだ。まず、キラルな二座配位性のリポ酸を有する発光性の銀クラスターの合成を行った。リポ酸のエナンチオマーを用いることで、ミラー対称の形状を有するCDスペクトルを得る事ができた。更に、作製した銀クラスターは発光性であり、キラルな金属クラスターからの円偏光発光の観察に世界で初めて成功した。また、コアに硫化水銀を有する半導体ナノ結晶の合成に取り組んだ。種々のキラル配位子を用いることで、コアに不斉結晶構造を有する硫化水銀ナノ粒子の合成に成功した。さらに、配位子をキラルな配位子からアキラルな配位子へ交換後も光学活性が保持されるキラルメモリー効果を見出した。これは、ナノ粒子合成時にキラル配位子により誘起された半導体コアにおける不斉結晶構造が、アキラルな配位子への配位子交換後も保持される、コアのキラル構造保持に基づく。当初、本年度は、キラル配位子設計を通じた、ナノ粒子コアの非対称合成、およびナノ粒子表面配位空間における配位子間キラル相互作用の誘起とキラル光学特性の発現を目的としていた。実際、金属(銀)クラスター系と半導体ナノ粒子系においてナノ粒子コアの非対称合成に成功している。また、表面配位子間の相互作用においても圧力効果など、キラル構造特有の現象を班間共同研究において見出しており、当初の計画通りに順調に進行している。特定原子数のAg(原子、イオン)からなるナノクラスター(NC)は錯体やナノ粒子とも異なる特異的な電子遷移を示し、しばしば強い発光を与える。ジヒドロリポ酸(DHLA)の両エナンチオマーを用いてAg29 NCを合成し、ミラー対称形のCDとCPLスペクトルを初めて見出している。今年度は、Ag29表面におけるキラル構造と発光特性の相関を評価するため、Ag29(DHLA)12をモデル構造として、DHLAの2つのチオール基とカルボキシ基による三座配位構造の構造安定性の観点から錯体の安定性を考察した。即ち、Ag NCの表面キラル構造はDHLAの表面三座配位構造を通じたクラスターの安定化と強く相関していることを明らかにした。この考察に従って、来年度の研究を推進する。一方、硫化水銀(HgS)の最安定結晶構造は三方晶系のキラル結晶(シナバー)である。HgSナノ粒子は、一旦、アキラルなメタシナバー晶を経由してキラル晶へと変換されることが見出されており、これがキラル誘起過程と言える。しかし、配位子の表面配位構造の役割、ならびにキラル誘起過程の動力学は未解明である。

本年度は、キラル配位子の化学構造とHgSキラル晶誘起の相関を評価し、特に、単一キラル配位子(N-メチル-L-システイン:Ac-L-Cys)を用いたキラル反転現象を見出した。調製直後Ac-L-Cys被覆HgSナノ粒子は正の第一コットン効果を示した。これを80度で加熱したところ、CDスペクトルが連続的に変化し、最終的に正負逆転したCDスペクトルを与えた。Ac-L-Csyはチオールとカルボキシ基またはチオールとアミド基の二座配位パターンを形成し、これらはほぼ鏡像関係にある。即ち、この表面における二座配位パターンの変化がHgSナノ粒子のキラル原子配列の反転を誘起していると考察した。さらに、FTIR測定、ならびに量子化学計算の結果から、キラル配位子の表面二座配位パターンがHgSナノ粒子コアのキラル誘起に重要な役割を果たしていることを明らかにした。漠然とした表面キラル構造ではなく、キラル配位子の化学構造に基づいた表面金属原子・イオンへのキラル配位構造とナノ粒子・クラスターの物性との相関まで踏み込んで評価することが出来ている。これは当初の計画通りの進展であり、順調に進展しているといえる。ナノ粒子やナノクラスター(NC)の配位子は配位結合により無機コアに配位し、その成長、構造並びに電子状態を制御する。特に、不斉構造を有する配位子を用いることで、コアの原子配列や電子状態に非対称性を導入し、光学活性を付与することが可能である。本年度は、安定なキラル結晶系を与える硫化水銀(HgS)ナノ粒子において、キラル表面配位子(ペニシルアミン)の二座配位構造の変化とナノ粒子のキラル結晶系反転現象が協調的に起こるということをまとめて論文発表した。また、キラル二座配位子(DHLA)とAg原子により構成されるAg29(DHLA)12について、NCの安定性における表面配位子キラリティーの影響について評価した。特定原子数のAg(原子、イオン)からなるNCは錯体やナノ粒子とも異なる特異的な電子遷移を示し、しばしば強い発光を与える。ジヒドロリポ酸(DHLA)の両エナンチオマーを用いてAg29 NCを合成し、表面におけるキラル構造と発光特性の相関を評価した。種々のエナンチオ過剰率(ee)に調整したナノクラスターにおいて、配位子の光学純度が向上すると共に、発光量子収率の増大が観察された。同様に、光学純度の向上が発光寿命の増加と無輻射失活速度定数の低下を導くことを見出した。すなわちナノクラスター上における配位子の配向と配位子間相互作用がナノクラスター全体の安定性と基礎物性に影響を与えていることを明らかにした。2019年度は個々のクラスター物性の制御を超えた、クラスター間相互作用に基づく不斉電子系の発現について検討を進める予定である。これまで、表面配位子の配位構造のキラリティーとナノ粒子、ナノクラスターの構造、電子物性の相関が評価できており、領域目標に沿った研究が進めてられている。また複数の領域内共同研究も進められており、順調に進展しているといえる。キラルな金属クラスター系に於いては、共同研究により、ナノ粒子表面におけるキラル配位空間(集合構造)特有の圧力効果について共同研究をベースに研究を推進させる。また、キラル半導体ナノ粒子については、キラル配位子からの半導体コアへのキラル構造誘起のメカニズムを明らかにするとともに、不斉誘起における配位子のと半導体コアのキラルシナジー効果について解明を行う。
超小型、永久完全埋め込み式補助および全置換型人工心臓システムの実用化に関する研究

この研究開発において、体内完全埋め込み式全置換型人工心臓(TAH)、拍動流補助人工心臓(VAD),連続流補助人工心臓、と周辺要素技術の開発、InVitro、InVivo評価を行った。夫々のプロジェクト成果の概要を纏める。TAH, VAD共に設計思想は、体重5060Kgの成人に埋め込み可能な小型、電気機械駆動人工心臓の開発を目指した。電気エネルギーを経皮伝送装置を用い、体内に伝送し、体内に埋め込まれた人工心臓を駆動する仕組みである。エネルギー変換装置としては、小型DCモーターの回転運動をローラネジの直線運動に変換し、人工心臓を駆動する仕組みである。血液ポンプとしては、制御性に優れたプッシャープレートポンプ(一回拍出量55cc)を開発した。血液ポンプのダイアフラムは、真空成形方によりポリウレタンを用い作製した。血液ポンプの設計は、CADにより3次元コンピューターモデル化し、CAMデータを作成したのち、NCを用い切削した。ポンプハウジングの材料は、歯科材料であるチタン合金(Ti-6Al-7Nb)を応用した。TAHは、左右血液ポンプの間に電気機械駆動装置をサンドイッチ状に固定し、左右ポンプを交互に拍出方式とし、VADは、TAHの右ポンプをバックプレートでカバーする方式とし、駆動装置、ポンプダイアフラムはTAH、VADで同じ物を適用し、開発時間、コストの節減を図った。ポンプの性能を模擬循環回路で評価した結果、最高流量8L/minが得られた。一回拍出量は平均55ccであった。駆動効率は、TAHが最高で13.5%、VADが24%であった。VADは、後負荷平均100mmHgに対して48L/minの流量を拍出するために、平均58ワットの電力を必要とした。TAHの必要電力は、1015ワット前後であった。TAH、VAD共に仔牛(体重80100Kg)を用い、埋め込み実験を開始した。TAHに関して、8頭の仔牛で解剖学的適合性の評価、埋め込み手術手技、麻酔管理、術後管理等について検討した結果、術後仔牛は自力で起立し30時間の生存が可能な状態に達した。VADに関しては、1頭の仔牛にて埋め込みを行い、24時間の生存を得た。今後、TAH、VAD共に耐久性、生体適合性の改良を行い、実用化に向けて慢性動物実験を継続していく予定である。拍動流血液ポンプと並行して、無拍動流血液ポンプとして、1点支持遠心ポンプの試作、性能評価、溶血試験を行った。また、約2ヶ月に渡る耐久試験も行った結果、デバイスとして安定した性能が確認できた。今後、詳細なデザイン変更等を行い、臨床用ポンプとしての開発研究を継続する予定である。人工心臓周辺要素技術として、反射型光センサの開発、評価を行い、人工心臓内血液中のヘモグロビン量及び酸素飽和度の測定に応用可能であることが示唆された。長期応用に関して、動物実験での確認を行う必要がある。

拍動流血液ポンプと並行して、無拍動流血液ポンプとして、1点支持遠心ポンプの試作、性能評価、溶血試験を行った。また、約2ヶ月に渡る耐久試験も行った結果、デバイスとして安定した性能が確認できた。今後、詳細なデザイン変更等を行い、臨床用ポンプとしての開発研究を継続する予定である。人工心臓周辺要素技術として、反射型光センサの開発、評価を行い、人工心臓内血液中のヘモグロビン量及び酸素飽和度の測定に応用可能であることが示唆された。長期応用に関して、動物実験での確認を行う必要がある。平均体重50-60Kgの成人を対象に小型、高性能体内埋め込み式全置換型(TAH)及び補助人工心臓(VAD)を開発した。TAHは直径90mm、高さ73mm、体積400cc、重量440gで、VADは直径90mm、高さ56mm、体積280cc、重量380gと小型化されており、本邦での臨床応用への期待も高い。本年度は、慢性動物実験に向けた人工心臓システムの性能向上、改良を目標に、駆動装置のエネルギー変換効率向上を、モータの駆動制御方法の改良、流入・流出弁の選択によるポンプ性能評価を模擬循環回路を用いて行った。駆動制御方法に関しては、モータ消費電力を軽減するために、(1)収縮期・拡張期方形波、(2)収縮期方形波・拡張期ランプ、(3)収縮期ランプ・拡張期方形波の3種類の駆動制御電圧波形による消費電力、効率の変化を測定した。結果として、(2)の収縮期方形波・拡張期ランプ駆動がポンプ効率を向上するために最適であることが示唆された。流入・流出弁によるポンプ性能の変化に関して、B・S弁、St.Jude弁、ポリウレタン三尖弁の3種類の弁を使用した時のポンプ拍出量の変化を求め、ポンプ効率を算出した。結果、ポリウレタン三尖弁が逆流を最小限に押さえ、ポンプ効率を改良できることが示唆された。ポンプ効率は最高で24%が可能で、使用電力も4-5L/min拍出時に5ワット前後に軽減された。最高流量8L/min時において、必要とする電力は約9ワットであった。この条件で、体内電池として、NiMH(ニッケル水素電池14個)を使用した場合、平均流量4-5L/min駆動で、約3時間の駆動が可能であることが確認された。現在、慢性動物実験に向け、ポンプハウジングのチタン合金による作製、マイクロプロセッサによる駆動制御装置の小型・高性能化、コンラインスチェンバーの影響等に着目し、研究開発を継続しいる。平均体重5060Kgの成人を対象に、体内完全埋め込み式補助(VAD)及び全置換型(TAH)人工心臓の研究開発を進めてきた。開発したTAHのサイズは、直径90mm、厚さ73mm、体積400cc、重量440gで、一回拍出量は55cc、最高流量8L/mnが可能である。必要電力は1015ワットである。血液接触面及びダイアフラムは抗血栓性に優れたポリウレタンで作製した。ポンプの駆動制御回路は、16ビットマイクロプロセッサを搭載した体内埋め込み可能なシステムを作製した。流入・流出弁は29mm、25mmのB-S弁を使用した。体重100Kgの仔牛2頭を用い、ポンプの解剖学的適合性の評価及びポンプ埋め込みに関する手術方法について検討し、良好な所見を得た。VADは、TAHと同様の部品、駆動制御回路を使用して作製した。ポンプハウジングは、生体内での長期安定性を目標にTi-6Al-7Nb合金で作成した。
細胞核構成物質の染色体輸送ー細胞周期における微細構造的同定ー

1.細胞質及び核内にみられる仁様小体の起源に関する研究ユリの減数分裂細胞で,仁蛋白質を特異的に検出するRNP選択的染色法を施こし,電子顕微鏡で詳しく調べたところ,前期から中期に至る過程で分散した仁物質が中期以降に小塊を形成し,さらに,それらが融合をくり返して終期の始めに仁様小体が形成されることが分かった。又後期に,染色体表面に蓄積した仁由来物質も時を同じくして,全く同様にして核内に仁様小体を形成することが分かった。2.仁由来物質におけるRNA検出の試み(1)RNaseーgoldラベル法による結果ソラマメ根端の体細胞では,細胞質仁様小体及び染色体表面上の仁由来物質のいずれも有意にラベルされるという結果は得られなかった。ユリの減数分裂細胞では,核内仁様小体は比較的強くラベルされたが,細胞質仁様小体のラベルは細胞質のラベルの2倍程度であった。(2)rDNAプロ-ブによるin situハイブリダイゼ-ションユリの減数分裂細胞で,細胞質仁様小体が強くラベルされることが分かった。RNaseーgoldラベルによる結果と合わせるとこの小体はRNAを含む。3.仁由来物質におけるDNAの検出の試みソラマメの根端細胞では,細胞質仁様小体及び染色体表面上の仁由来物質のいずれも抗DNAモノクロ-ラル抗体でラベルされなかった。4.細胞骨格形成阻害剤による仁由来物質の挙動に及ぼす影響コルヒチン処理すると,中期において,細胞質仁様小体の形成及び染色体表面への蓄積が起こる。又,アクチンフィラメント阻害剤であるサイトカラシンβで処理すると,細胞質仁様小体が異常に増加した。5.連続超薄切片に銀染色を施こすと,嬢核内に取り込まれた仁由来物質は,ヌクレオロネマに入ってゆくことが示唆された。先づ、染色体表面に蓄積する物質や同時に細胞質中に形成される仁様小体にRNAが含まれるかどうか検討した。(1)RNase-gold complexで超薄切片を処理し、電子顕微鏡下で金粒子の分布を分析した。ユリの減数分裂過程を通じて調べたところ、第一及び第二減数分裂の後期の終わりに、好銀性物質が細胞質中に集合し、仁様小体を形成した。RNase-gold complexで処理すると、仁には細胞質より7倍も高い密度で金粒子がみられたのに対し、細胞質仁様小体は細胞質よりわずか2倍程の金粒子しかみられなかった。ソラマメの体細胞分裂においても同様にして調べてみた。後期の終り頃染色体表面に好銀性物質が蓄積してくる。RNase-gold complexで処理したところ、仁や細胞質に高密度の金粒子が分布するのに対し,好銀性物質上にはそれよりずっと低密度の金粒子しか観察されなかった。以上の結果から仁様小体や染色体表面に蓄積する物質には、含んでいるとしても、低密度のRNAしか存在しないことが示唆された。なお,この研究で、(イ)親水性の樹脂であるLowicrylK4Mを用いるが、又は(ロ)エポンのような疎水性の樹脂を用いる場合は、超薄切片をあらかじめイオンコ-タ-で放電処理すると,RNase-goldの非特異的吸着を著しく減じることがわかった。(2)rRNAプロ-ブの作成は、電気泳動で分離し,特定のRNA種をゲルから溶出精製し,invitroでイオディネ-ションする方法を考えている。今のところ、ソラマメの若芽より全RNAを抽出し、貯えているところである。

(3)ポリ(u)RNAをプロ-ブとして用いた電顕レベルのin situハイブリダイゼ-ション法によるmRNAの検索については、(1)及び(2)の課題の進行に合わせて継続してゆく予定である。今年度の研究業績は以下の通りである。(1)疎水性樹脂で包埋した切片をあらかじめ放電処理することによりRNaseーgoldラベル法の反応特異性を増加させる方法をすでに開発したが今回試料を親水性樹脂であるLowicryl K4Mに包埋することにより,さらに反応特異性を増加させることができた。この方法をソラマメの体細胞に応用することにより,染色体上に蓄積するいわゆる前仁物質には,RNAがほとんど含まれないことがさらに裏付けられた。同様に,細胞質中に出現する仁様小体にもRNAはほとんど含まれていなかった。(2)rRNAプロ-ブの作成及びIn situハイブリダイゼ-ションソラマメの芽や根端からRNAを抽出し,アクリルアミドゲルで電気泳動し,分離した。必要なバンドを切り出して,エクストラフォアで電気的に溶出し,RNAを精製した。この精製したRNAを再泳動させコントロ-ルと比較したところ,クロスコンタミネ-ションや崩壊もなく取り出せていることが分かった。このrRNAを^<125>Iでイオディネ-ションし,ソラマメ根端細胞から調製した染色体標本にin situハイブリダイゼ-ションしてみた。その結果,仁形成部に相当すると思われる部分にラベルが現われた。しかし,ラベルの強さはさほど強くなく,今後よりspecific activityの高いプロ-ブを作成する必要がある。(3)AntiーDNAによるラベルDNAに対する抗体を用いて間接免疫抗体法を電子顕微鏡レベルで行なった。染色体上の前仁物質には全くDNAは含まれないことが分かった。又,細胞質中の仁様小体にもDNAは検出されなかった。今年度は,特に2つの点について重点的に調べた。まず,核小体構成物質の細胞周期における挙動に関与する要因についての情報を得る目的をたてた。細胞内での小器管や物質の輸送に関与しているものとして,アクチンフィラメントや微小管等の細胞骨格系がよく知られている。そこで,これら2つの細胞骨格に対する阻害剤でソラマメ根端分裂組織細胞を処理し,核小体構成物質等の挙動に及ぼす影響を光学顕微鏡で調べた。コルヒチンで2時間処理すると,興味深いことに核小体構成物質の一部が染色体表面上に蓄積しており,又一部は細胞質中に,いわゆるnucleoloidを形成することが分かった。コントロ-ルではこのような現象は決してみられない。つまり,核小体構成物質の染色体表面への蓄積は,後期の過程で生じる現象であり,又nucleobidの形成は終期の始めに起きる現象である。一方,アクチンフィラメントの形成阻害剤であるサイトカラシンB(CB)で処理してみたところ,終期に現われるnucleoloidの数が著るしく増加することが分かった。このように細胞骨格は核小体物質の輸送に何らかの関与をしていることが示唆された。現在,さらに詳しく調査を進めている。次に,染色体表面上に蓄積した核小体物質はやがて嬢細胞中に運び込まれてゆくことになる。この物質が核小体のどの構造に取り込まれてゆくかについての情報はほとんど得られていない。