hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スパッタ膜を用いたき裂発生寿命の実測に基づく疲労強度に及ぼす表面状態の影響評価

1)イオンスパッタ金属膜を用いて,曲げ疲労試験片のき裂発生寿命,き裂進展寿命及び疲労寿命を測定した結果,疲労き裂発生寿命は破断寿命の7090%程度を占めていることが知られた.また,表面粗さRaを1.27μmから0.03μmにすることでき裂発生寿命は3倍ほど長くなることと,き裂進展寿命の変化がないことがわかった.それらの結果から,表面粗さの改善にょってき裂発生寿命が長くなったことが疲労強度向上に繋げたことを明らかにした.2)浸炭焼入れ過程で生じた表面異常層(非マルテンサイト組織)による表面硬さの低下は200HVにも達している.表面異常層による疲労強度の低下を確認するため,表面異常層を電解研磨によって除去し,表面異常層の有無による疲労寿命の変化を調べた.その結果,表面異常層の除去によって疲労寿命が大幅に長くなったことを確認した.高負荷動力伝達用浸炭焼入れ歯車には表面異常層の発生の抑制及び異常層の除去は強度向上の重要な手段であることとの指針を得られた.なお,本年度で得られた結果を平成21年度5月と7月の国際会議にて発表した.また,平成22年度の国際会議での発表も予定している.
RNAinterferenceによるヒト癌細胞の放射線感受性の増感

目的より効率のよい放射線癌治療を行うためには、放射線で誘導されるアポトーシスを積極的に増強させるか、放射線照射後も細胞を生存に導く細胞内反応系を阻害することが有効と考えられる。本研究は後者の考えに基づき、放射線によって生じたDNA損傷の修復系を阻害することにより細胞死を誘導し放射線感受性を高めることを目的とした。放射線によって生じたDNAの2本鎖切断は主に2つの修復系(Homologous recombination, HRとNonhomologous end-joining, NHEJ)によって修復される。HR/NHEJ修復系に関与するNBS1遺伝子の発現をsmall interference RNA(siRNA)によって特異的に阻害することにより、癌細胞を死に導き放射線感受性が高めることができるか、さらにNBS1標的siRNAによる放射線増感に細胞生存シグナル伝達系も関与しているかについて検討した。方法p53欠損ヒト非小細胞肺癌H1299細胞に正常型あるいは変異型p53遺伝子を導入した細胞(H1299/wtp53、H1299/mp53)を用いた。NBS1を標的としたsiRNAを発現するDNAカセット(SEC)をX線照射処理の2日前にliposomeで細胞内に導入した。ウエスタンブロッド法と免疫蛍光染色法でNBS1、リン酸化NBS1、Mre11およびRad50蛋白質の量的変化と細胞内局在、免疫沈降法で蛋白質結合様式を検討した。さらに、細胞生存シグナル伝達系ではたらくアポトーシス抑制タンパク質ファミリーの1種であるXIAPタンパク質を阻害するため、XIAP標的siRNAを設計、合成して細胞内に導入した。結果2.XIAP標的siRNA導入によりXIAの蓄積誘導が特異的に抑制された。3.NBS1あるいはXIAP標的siRNA導入によって放射線感受性が増強された。4.NBS1あるいはXIAP標的siRNA導入による放射線増感率は変異型p53細胞の方が正常型p53細胞よりも高かった。考察NBS1あるいはXIAP標的siRNAは難治性の変異型p53細胞の放射線増感に有効であること、DNA修復系および細胞生存シグナル伝達系の阻害によって放射線増感が誘導されることが示唆された。本研究は後者の考えに基づき、放射線によって生じたDNA損傷の修復系を阻害することにより細胞死を誘導し放射線感受性を高めることを目的としている。最近、これら修復系に関与する遺伝子群が同定されその機能が次々と明らかにされつつある。本研究ではHR/NHEJ修復系に関与するNBS1遺伝子の発現をsmall interference RNA(siRNA)によって特異的に阻害することにより、癌細胞を死に導き放射線感受性が高められるかを調べた。

NBS1を標的としたsiRNAを発現するDNAカセット(SEC)をX線照射処理の2日前にliposomeで細胞内に導入した。ウエスタンブロッド法と免疫蛍光染色法でNBS1、リン酸化NBS1、Mre11およびRad50蛋白質の量的変化と細胞内局在、免疫沈降法で蛋白質結合様式を検討した。結果1.SECの導入効率は約80%であった。2.SEC導入によりNBS1タンパク質の蓄積誘導が特異的に抑制された。3.SEC導入によって放射線感受性が増強された。4.SEC導入によって細胞生存シグナル伝達因子であるNF-κBとsurvivinの発現が阻害された。5.以上の結果はH1299/wtp53とH1299/mp53の両細胞で見られた。考察NBS1を標的としたsiRNAはp53非依存的な放射線増感作用を示すこと、細胞生存シグナル伝達系の阻害がsiRNAによる放射線増感効果の一因であることが示唆された。目的より効率のよい放射線癌治療を行うためには、放射線で誘導されるアポトーシスを積極的に増強させるか、放射線照射後も細胞を生存に導く細胞内反応系を阻害することが有効と考えられる。本研究は後者の考えに基づき、放射線によって生じたDNA損傷の修復系を阻害することにより細胞死を誘導し放射線感受性を高めることを目的としている。放射線によって生じたDNAの2本鎖切断は主に2つの修復系(Homologous recombination,HRとNonhomologous end-joining, NHEJ)によって修復される。昨年度はHR/NHEJ修復系に関与するNBS1遺伝子の発現をsmall interference RNA(siRNA)によって特異的に阻害することにより、癌細胞を死に導き放射線感受性が高められることを明らかにした。本年度はNBS1標的siRNAによる放射線増感に細胞生存シグナル伝達系も関与していることをさらに詳しく調べた。方法p53欠損ヒト非小細胞肺癌H1299細胞に正常型あるいは変異型p53遺伝子を導入した細胞(H1299/wtp53、H1299/mp53)を用いた。さらに、細胞生存シグナル伝達系ではたらくアポトーシス抑制タンパク質ファミリーの1種であるXIAPタンパク質を阻害するため、XIAP標的siRNAを設計、合成して細胞内に導入した。結果2.XIAP標的siRNA導入によりXIAの蓄積誘導が特異的に抑制された。3.NBS1あるいはXIAP標的siRNA導入によって放射線感受性が増強された。
卵成熟過程において卵成熟促進因子の作用を抑える因子の同定

卵成熟促進因子(maturation-promoting factoriMPF)は,単に卵母細胞にとどまらず真核細胞一般において,分裂中期促進作用をもつ蛋白質である.卵成熟過程においてMPF活性は,各分裂中期に最高値に達し極体放出時には消失して,減数分裂周期に応じて変動する.本研究の目的は, MPF活性消失の意義と機構を明らかにして, MPF活性の調節機構を解明する糸口を得ることにある.本年の研究の結果,以下のことが判明した.1.マウス末成熟卵は濾胞から培養液中に単離すると,自然成熟をおこす.この際サイトカラシンDで処理すると,第1減数分裂中期の状態で成熟分裂の進行は停止し, MPF活性は高いままに維持された.こうした時さらにシクロヘキシミドを加えると, MPF活性は減少・消失し,その後を追って染色体は両極へ分離し,やがて脱凝縮して核様の構造体が2個形成された.従って, MPF活性の消失は分裂中期から後期への移行を促すといえる.2.酵母Saccharomycescerevisiaeにも, M期にはMPF活性が存在しているが, G1期には存在しない.そこで温度感受性突然変異体cdc20株を制限温度(36°C)で培養して核分裂中期に同調させたあと,許容温度(24°C)に下げて細胞周期をG1期まで同調的に進行させ,そこから細胞質抽出物を得た.これと酵母MPF粗分画とを混合すると, MPF標品中に当初あったMPF活性が消失した.このことは, G1期の細胞内にはMPF活性を抑える因子(suppressor MPF;supMPF)が存在している可能性を示唆している.以上の結果から,卵成熟時におけるMPF活性の周期的変動のうちの減少の方は, supMPFがMPF活性を抑えることに起因し,これが分裂中期から後期への移行の引金になると考えられる.現在, supMPFに対する蛋白分解酵素, Ca等の影響を検討中であり, supMPFの大まかな化学的性質をまず明らかにしていきたい.卵成熟促進因子(maturation-promoting factoriMPF)は,単に卵母細胞にとどまらず真核細胞一般において,分裂中期促進作用をもつ蛋白質である.卵成熟過程においてMPF活性は,各分裂中期に最高値に達し極体放出時には消失して,減数分裂周期に応じて変動する.本研究の目的は, MPF活性消失の意義と機構を明らかにして, MPF活性の調節機構を解明する糸口を得ることにある.本年の研究の結果,以下のことが判明した.1.マウス末成熟卵は濾胞から培養液中に単離すると,自然成熟をおこす.この際サイトカラシンDで処理すると,第1減数分裂中期の状態で成熟分裂の進行は停止し, MPF活性は高いままに維持された.こうした時さらにシクロヘキシミドを加えると, MPF活性は減少・消失し,その後を追って染色体は両極へ分離し,やがて脱凝縮して核様の構造体が2個形成された.従って, MPF活性の消失は分裂中期から後期への移行を促すといえる.2.酵母Saccharomycescerevisiaeにも, M期にはMPF活性が存在しているが, G1期には存在しない.そこで温度感受性突然変異体cdc20株を制限温度(36°C)で培養して核分裂中期に同調させたあと,許容温度(24°C)に下げて細胞周期をG1期まで同調的に進行させ,そこから細胞質抽出物を得た.これと酵母MPF粗分画とを混合すると, MPF標品中に当初あったMPF活性が消失した.このことは, G1期の細胞内にはMPF活性を抑える因子(suppressor MPF;supMPF)が存在している可能性を示唆している.以上の結果から,卵成熟時におけるMPF活性の周期的変動のうちの減少の方は, supMPFがMPF活性を抑えることに起因し,これが分裂中期から後期への移行の引金になると考えられる.現在, supMPFに対する蛋白分解酵素, Ca等の影響を検討中であり, supMPFの大まかな化学的性質をまず明らかにしていきたい.
脳機能に関わるPLP依存性酵素のX線結晶構造解析と機能解析

NMDA受容体にアゴニストあるいは競争アンタゴニストとして作用する物質を合成することにより、脳の機能の発現に関与しているサイトゾル分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素、セリンラセマーゼ、キヌレニンアミノ基転移酵素について、X線結晶構造解析の手法を用いて立体構造を明らかにするという目的で研究を行ってきた。これら3種の酵素は、いずれもピリドキサール5'-リン酸を補酵素として用いる、いわゆる、ビタミンB6酵素である。これらの酵素の立体構造を決定するとともに、基質あるいは基質アナログとの複合体の立体構造を決定し、基質認識機構および反応メカニズムを明らかにする。初年度の去年は、ヒトサイトゾル由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素について、基質認識機構および抗鬱剤や抗てんかん薬として用いられるガバペンチンの認識機構を提案した論文を投稿、掲載された。次年度の今年は、主に分裂酵母由来セリンラセマーゼについての結晶化条件の最適化を行ない、放射光施設SPring-8およびPFを用いて、高分解能の回折データを測定し、立体構造を決定した。これまでの研究により、分裂酵母由来セリンラセマーゼは、ネイティブ型と修飾型という二つの異なる性質を持つことが明らかとなっている。修飾型はネイティブ型が基質であるセリンによって化学的な修飾を受けることにより生じる。修飾型酵素は、ラセミ化能をほとんど失い、主にレセリンデヒドラターゼの触媒能を持つ酵素となっている。また、ネイティブ型酵素は、Mg-ATPにより非加水分解的に活性化されることもわかっている。このようなセリンラセマーゼの機能の解明のために、私は、ネイティブ型の構造、ネイティブ型とMg-ATPとの複合体の構造、修飾型の構造、修飾型と基質であるL-セリンとの複合体の構造という4種類の立体構造を決定した。そしてそれらの構造をもとにして、セリンラセマーゼのネイティブ型酵素の基質認識機構、Open-Closedコンホメーション変化、活性化因子であるMg-ATP結合部位、ネイティブ型酵素のMg-ATPによる活性化方法、修飾型酵素の活性部位の修飾方法、修飾型酵素において新たに形成される活性部位の構造とその基質認識機構、さらに修飾型酵素で新たに形成される基質誘導トンネルなどを提案した。そして、これらのことをアジア結晶学会にてポスター発表した。初年度の今年は、ヒトサイトゾル由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素(hBCATc)、分裂酵母由来セリンラセマーゼ、および高度好熱菌由来キヌレニンアミノ基転移酵素の結晶化条件を幅広く検索し、最適結晶化条件を見つける。放射光施設SPring-8およびPFを用いて、高分解能の回折データを測定し、立体構造を決定するという計画を立て研究を行ってきた。その中でも、論文投稿に至ったhBCATcについて報告する。まず、大腸菌を用いて大量発現させた本酵素を、PEG4000を主な沈殿剤とする結晶化条件にて、結晶化することに成功した。結晶化条件を最適化し、得られた良質な結晶を用い大型放射光施設SPring-8にて2.0Å分解能を超える回折強度データを得ることができた。位相の決定は、既知のヒトミトコンドリア由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素(hBCATm)の構造を利用する分子置換法により行った。また、分岐鎖アミノ酸であるロイシンのアナログの4-メチル吉草酸との複合体構造、および、抗鬱剤や抗てんかん薬として用いられるガバペンチンとの複合体構造を明らかにした。そして、これらの立体構造より明らかとなったhBCATcの基質認識機構、さらに、ガバペンチンによる阻害を受けないhBCATmとの比較などから明らかにしたガバペンチンの認識機構を提案し、論文を投稿、掲載された。

修飾型酵素は、ラセミ化能をほとんど失い、主にレセリンデヒドラターゼの触媒能を持つ酵素となっている。また、ネイティブ型酵素は、Mg-ATPにより非加水分解的に活性化されることもわかっている。このようなセリンラセマーゼの機能の解明のために、私は、ネイティブ型の構造、ネイティブ型とMg-ATPとの複合体の構造、修飾型の構造、修飾型と基質であるL-セリンとの複合体の構造という4種類の立体構造を決定した。そしてそれらの構造をもとにして、セリンラセマーゼのネイティブ型酵素の基質認識機構、Open-Closedコンホメーション変化、活性化因子であるMg-ATP結合部位、ネイティブ型酵素のMg-ATPによる活性化方法、修飾型酵素の活性部位の修飾方法、修飾型酵素において新たに形成される活性部位の構造とその基質認識機構、さらに修飾型酵素で新たに形成される基質誘導トンネルなどを提案した。そして、これらのことをアジア結晶学会にてポスター発表した。
非集計行動モデルを用いた航空と高速鉄道の提携に関する研究

本研究では,3都市ネットワークにおいて航空と高速鉄道の提携による利益最大化モデルを構築し,両機関が競合している場合と比較することで,市場シェアおよび社会的厚生に対する提携の効果を定性的に分析することが目的である.本研究の結果,提携により両機関が競合する国内路線の価格の上昇に伴い,総需要は減少するが,乗り換え路線の総需要が増加することを示した.さらに,両機関が国内で大きなシェアを占めている区間または乗り換え路線の潜在需要が比較的大きい区間を提携サービスの対象にすることで,提携により企業利益と消費者余剰の総和である社会的厚生が増加することを示した.近年、航空と高速鉄道の提携が注目されている。中短距離市場において高速鉄道を既存の航空路線の代替機関として利用できれば、空港の混雑緩和だけでなく、地方都市の活性化や災害時の代替移動手段の確保などの社会的効果が期待される。両機関の提携により、国際線に接続する鉄道の区間も、航空券と一緒に購入できるサービスがドイツやフランスなどで始まっている。本研究では、このようなサービスが社会的厚生および空港の混雑緩和に対してどの程度の効果があるかを評価するための数理モデルを構築し、検証することが目的である。本年度は、先行研究を多項ロジットモデルを用いたモデルに拡張することで、各機関の特性や顧客の嗜好を需要モデルに取り入れた。ここでは、国外の都市Aから空港のある都市Bで乗り換え、国内Cへ鉄道または航空で移動するルートを考える。まず、空港Bの発着容量に制約のない場合において、航空と鉄道が競合するモデルと提携するモデルをそれぞれ定式化した。2つのモデルから得られた最適価格や市場シェア、企業利益、消費者余剰、社会的厚生を3都市間の各輸送市場AB、BC、ABCにおいて比較し、提携効果を定性的に分析した。その結果、(i)都市BとCの距離が比較的近いほど、提携サービスの利用者が増加し、空港の混雑緩和に効果がある、(ii)提携により、乗り換え市場ABCの旅客数および社会的厚生は増加し、国内市場BCの旅客数は減少することが明らかとなった。この結果は、5月に香港で開催された「7th International Forum on Shipping, Ports and Airports」と6月に名古屋で開催された「第4回中部圏研究フォーラム」にて報告した。現在は、空港Bの発着容量に制約のある場合にモデルを拡張し、容量制約が提携効果に与える影響を分析している。ここまでに得られた研究成果を学術雑誌に投稿する予定である。近年,欧州の一部の区間で時速200km以上の高速鉄道を既存の航空路線の代替機関として利用することで,空港の混雑緩和を目指す取り組みが行なわれている.競合する航空会社と鉄道会社とが提携し,国際線に接続する鉄道の区間を航空券と一緒に購入できるサービスを提供している.本研究はこのような提携が市場シェアおよび社会的厚生に与える影響を定性的に明らかにすることを目的とする.平成26年度は3都市ネットワークにおいて,需要関数に多項ロジットモデルを仮定し,提携モデルを定式化した.航空と鉄道が競合する区間においては,各機関のサービス品質の大きさに関わらず,提携サービスにより航空シェアは減少し,鉄道シェアおよび総需要が増加することを明らかにした.平成27年度は同一市場の高速バスや他社企業等の存在による消費者の非購買選択が提携効果に与える影響を分析した.この結果,国内市場において非購買の効用が大きい場合(例えば,移動距離が短い市場)には,提携は3都市ネットワーク全体の社会的厚生の増加に有効であることを示した.また,非購買の効用が小さい場合は乗り換え市場の潜在需要が大きい場合に限り,社会的厚生は増加することを示した.さらに,当年度は前年度の提携モデルを乗り換え空港に容量制約を課したモデルに拡張し,空港容量および非購買の効用の大きさと提携効果との関係を分析した.結果,提携によって限られた航空容量が鉄道のアクセス不可能な国外路線および国外からの乗り継ぎ路線に配分され,鉄道の効率的な利用により社会的厚生は増加することを示した.本研究では,3都市ネットワークにおいて航空と高速鉄道の提携による利益最大化モデルを構築し,両機関が競合している場合と比較することで,市場シェアおよび社会的厚生に対する提携の効果を定性的に分析することが目的である.本研究の結果,提携により両機関が競合する国内路線の価格の上昇に伴い,総需要は減少するが,乗り換え路線の総需要が増加することを示した.さらに,両機関が国内で大きなシェアを占めている区間または乗り換え路線の潜在需要が比較的大きい区間を提携サービスの対象にすることで,提携により企業利益と消費者余剰の総和である社会的厚生が増加することを示した.本年度の目的は先行研究の拡張である。航空と鉄道の提携モデルはSocorro and Viecens (2013)およびJiang and Zhang (2014)により提案されているが、価格と需要の関係を示す関数が線形であり、移動時間や距離、運行本数、サービスなど顧客が輸送機関を選択する要因を考慮できない。本研究のスタートとして、従来研究と同様の輸送ネットワークにおいて需要関数を非集計行動モデルにおけるロジットモデルを用いて拡張することで、より現実的なモデルを構築することが目的である。本年度はモデルの拡張および各輸送機関の最適価格や市場シェアを解析的に求めることができたため、目的は達成できたといえる。2つ目の目的は、社会的厚生やハブ空港の混雑率を競合モデルと比較し、提携効果の定性的な性質を明らかにすることである。空港の発着容量に制約のない場合には、モデルが複雑でないため、いくつかの性質を得ることができた。しかし、空港の容量制約を考慮した場合には、モデルから得られた結果が複雑であり、競合モデルと提携モデルの比較が難しい。

このため、数値計算を通して、提携効果を分析した。航空と鉄道のサービス品質の差や市場の顧客数など輸送環境に応じて、提携効果に異なる結果が得られたため、どのような条件の下で提携により空港の混雑が緩和されるか、社会的厚生が増加するかを明らかにする必要がある。平成26年度はこの点まで進められなかったため、達成度の評価として、「おおむね順調に進展している。」とした。オペレーションズ・リサーチ平成26年度におこなった研究では、3都市ネットワークにおいて乗り換え空港である混雑空港(ハブ空港)に鉄道を乗り入れるという状況の下で、空港の混雑緩和を議論した。しかし、日本国内のように高速鉄道網が整備されている場合には、非混雑空港に鉄道を乗り入れ(または、直接乗り入れるのでなく、シャトルバスを利用して空港から駅への移動サービスを提供し)、混雑空港のある地域へ鉄道輸送することも可能である。例えば、国外から羽田空港へ直接向かうのでなく、国外から中部国際空港を経由し、新幹線で首都圏に移動する旅程が考えれる。このように地方空港を利用した航空と鉄道の提携サービスが効果的であれば、混雑空港の緩和だけでなく、非混雑空港の維持や多様な航空網の整備につながると思われる。したがって、平成26年度とは異なる3都市ネットワークにおける提携効果を分析することが第1の課題である。第2の課題は、研究計画の通り、競合他社の存在を考慮することである。他社の価格決定やサービスは提携サービスの価格や利用者の選択に大きく影響するため、他社の存在が提携効果にどのような影響を与えるかを分析する。
シソ科ハーブ二次代謝産物の抗菌性及び抗酸化能解析並びに植物病害防除利用

シソ科ハーブ10種におけるin vitro抗菌検定の結果、数種ハーブが相対的に高抗菌性・抗酸化物質高含有ハーブであることが示唆された。一方、耐病性誘導に関するバイオアッセイにより、数種ハーブ抽出液添加による発病軽減効果や病原菌増殖抑制に起因する静菌作用が確認された。これらのことから、ハーブ抽出液に含まれる二次代謝成分(主にフェノール物質群)が単独・複合的にフザリウム菌への抗菌性を示すことが示唆された。シソ科属ハーブの抗菌・抗酸化活性についてはこれまでに臨床・食品微生物を対象とした利用例があるが、植物病害における検討事例は非常に乏しい。本研究では、抗菌性および抗酸化物質含量の高いハーブの選抜及びハーブを用いた耐病性検定を行った。1.シソ科ハーブ抽出液の数種病原菌へのin vitroにおける抗菌性評価及び抗酸化機能解析シソ科ハーブ10種(オレガノ、キャットニップ、セージ、ダークオパール、タイム、バジル、ヒソップ、ペパーミント、ラムズイヤー、レモンバーム)の蒸留水抽出液を添加(0.5、2%、w/v)したCzapec-Dox液体培地にアスパラガス立枯病菌、イチゴ萎黄病菌、シクラメン萎凋病菌、メロンつる割病菌、トマト萎凋病菌の分生胞子懸濁液を混合し増殖指数を算出した。その結果、オレガノ、セージ、ヒソップ、レモンバームの4種、特にセージとレモンバームにおいて、茎葉部・根部抽出液添加区ともに供試病原菌に対し最大で対照区の2割程度にまで増殖を抑制する効果がみられた。一方、シソ科ハーブ10種の抗酸化能評価の結果、DPPHラジカル捕捉能、総ポリフェノール及び総アスコルビン酸含量において、オレガノ、セージ、レモンバームは比較的高い傾向がみられた。また、抗菌性と抗酸化能に相関はみられなかった。2.ハーブを用いた耐病性検定シクラメン(Cyclamen persicum Mill.,`Mini')における萎凋病及び炭疽病に対する植物検定を、セージ及びレモンバーム抽出液の土壌添加及び茎葉部噴霧法により行った。その結果、両病害においてハーブ抽出液処理区の発病率・発病程度の低下、地上部乾物重の増大、根組織中の萎凋病菌菌量の減少が確認された。これらのことから、耐病性誘導には特に病原菌増殖抑制・病原性低下に起因する静菌作用(殺菌作用を含む)が関連することが示唆された。27年度の研究実施計画に記載の、1.シソ科ハーブ抽出液の数種病原菌へのin vitroにおける抗菌性評価及び抗酸化機能解析、2.ハーブを用いた耐病性検定について、当初の予定通り遂行できた。シソ科ハーブの抗菌・抗酸化活性については、植物病害への検討事例は未だ乏しい。本研究では、ハーブ抽出液を用いた耐病性誘導のバイオアッセイ、ハーブ2次代謝成分のメタボローム解析と抗菌物質の探索を行った。昨年度に抗菌性ハーブとして選抜したレモンバーム、オレガノ、セージ、ヒソップの茎葉部抽出液処理により、アスパラガス立枯病、イチゴ萎黄病及びシクラメン萎凋病に対する耐病性誘導のバイオアッセイを行った。検定を行ったアスパラガス、イチゴ及びシクラメンにおいて、特にレモンバーム、セージ抽出液処理により発病軽減効果が確認された。この場合、根圏土壌及び根中におけるフザリウム菌の菌量もハーブ抽出液処理区で有意に低下していた。これらのことから、セージ、レモンバームの茎葉部抽出液処理により発病抑制効果が確認され、耐病性誘導にはハーブ抽出液の病原菌増殖抑制による静菌作用が関連していることが示唆された。オレガノ、セージ、ヒソップ、レモンバームの葉部抽出液について、UPLC-MS/MS (Q Tof)により2次代謝成分のメタボローム解析を行った。MS/MSによるフラグメント解析から、カフェ酸,ロスマリン酸が共通して含まれることが示唆され、カフェ酸、ロスマリン酸にはフザリウム菌への増殖抑制効果があることをin vitro検定で確認した。よって、耐病性誘導にはカフェ酸、ロスマリン酸による静菌作用が関与していることが示唆された。一方、セージ葉抽出液においてはルテオリン、フィセチン、フラキセチン、レモンバームではアピゲニン、オレガノではフラキセチン、フィセチン、ヒソップではフラキセチンが検出された。よって、4種ハーブではそれぞれ共通した抗菌成分を含有する可能性はあるが、ハーブ種により抗菌物質群が異なることも考えられた。28年度の研究実施計画に記載の、シソ科ハーブ二次代謝成分のメタボローム解析及び抗菌物質の同定並びに根圏微生物相解析について、当初の予定通り遂行できた。これまでに選抜された抗菌性・高抗酸化能である4種シソ科ハーブ(レモンバーム、オレガノ、セージ、ヒソップ)について、植物共生菌であるアーバスキュラー菌根菌4菌株の接種検定、耐病性誘導評価を行った。菌根菌感染は全てのハーブにおいて確認され、感染率にはハーブ種・菌種の組合せにより差がみられた。また、共生個体では茎葉伸長促進、葉数増加といった植物体生長促進効果が確認された。

また、菌根菌共生によるハーブの抗酸化物質含量(総ポリフェノール、総アスコルビン酸、DPPHラジカル補捉能)については大きな変動はみられなかったが、LC/MSによるメタボローム解析では、数種2次代謝成分において菌根菌接種区での増大が確認された。続いて、レモンバーム抽出液及び菌根菌の複合処理がイチゴ炭疽病耐性に及ぼす影響を調査した。レモンバーム茎葉抽出液(20%, w/v)単独処理区、菌根菌(Gigaspora margarita)単独処理区、レモンバーム+菌根菌処理区の全てにおいて、イチゴ(`とちおとめ')における炭疽病発病・発病程度の軽減効果が確認され、複合処理区でさらに効果が高まる場合がみられた。一方、コンパニオンプランツの圃場評価として、アスパラガス忌地圃場土(病原菌汚染土:長野県より採取)及び市販育苗土(立枯病菌を接種)に、レモンバームとアスパラガス(`Welcome')のコンパニオンプランツ処理を行った。その結果、アスパラガス単独区では、フザリウム菌に起因する立枯症状(根褐変、茎葉黄化)といった症状が忌地圃場土・市販育苗土の両区で重度に発現したが、レモンバームコンパニオン区では、両区で根褐変・茎葉黄化が軽減され、植物体乾物重も単独区より増大する場合があった。これらのことから、実際の忌地圃場でのハーブのコンパニオンプランツ法が、アスパラガスの忌地症状を改善できる可能性が示唆された。シソ科ハーブ10種におけるin vitro抗菌検定の結果、数種ハーブが相対的に高抗菌性・抗酸化物質高含有ハーブであることが示唆された。一方、耐病性誘導に関するバイオアッセイにより、数種ハーブ抽出液添加による発病軽減効果や病原菌増殖抑制に起因する静菌作用が確認された。これらのことから、ハーブ抽出液に含まれる二次代謝成分(主にフェノール物質群)が単独・複合的にフザリウム菌への抗菌性を示すことが示唆された。28年度の研究では、27年度の研究成果で明らかとなった数種植物病原菌に対するハーブの抗菌作用について、ハーブ含有抗菌物質の同定を主体に行う。この場合、共通して抗菌性が特に高かったハーブ4種を基本モデルとして、二次代謝成分のメタボローム解析をLC/MSにより行い、抗菌物質を同定する。また、ハーブ抽出液処理による耐病性誘導のバイオアッセイを数種園芸作物において継続し、土壌中病原菌量変動等の調査を含めて耐病性機構を検討する。H29年度の研究では、地上部病害であるイチゴ炭疽病及びシクラメン炭疽病へのハーブ抽出液による耐病性検定を行うとともに、有用微生物であるアーバスキュラー菌根菌とハーブ抽出液の併用による耐病性増強効果の検討を行う。この場合、土壌伝染性病害に対する抑制効果がこれまで総合的に高かったハーブ4種(オレガノ,セージ,ヒソップ,レモンバーム)をモデルとし、地上部病害への効果を検証するとともに、抗菌物質の探索を継続検討項目とする。一方、抽出液法とは対照的なコンパニオンプランツ法により、アスパラガス立枯病への耐病性誘導を圃場検定を含めて選抜ハーブで行い、耐病性誘導機構についても調査する。これにより、園芸作物の栽培場面に応じたハーブによる耐病性誘導法を確立する。園芸科学物品費等支出額が予定より少なかったため。分析に関わる物品費及び成果発表旅費等に使用する予定。
糖尿病患者における食道知覚低下による逆流性食道炎重症化メカニズムの検討

平成19年度は、前年度の症例数よりもさらに対象症例を増やし、正常者、逆流性食道炎患者、糖尿病患者の食道運動機能をチェックした。その結果、正常者と比較して、糖尿病患者においては食道蠕動圧の上昇は見られないが食道蠕動速度の低下が認められた。我々は食道運動に影響を与えるとされる高血圧治療剤であるCa拮抗薬、ARB、βプロッカーの食道運動機能に対する影響について検討を行っているが、その中で食道体部蠕動圧が高くなれば食道蠕動速度は低下すること、逆に蠕動圧が低くなれば蠕動圧は速くなることを明らかとしている。糖尿病患者においては、食道蠕動圧の上昇が見られないのにもかかわらず速度が低下しているという検討結果から、糖尿病患者における逆流性食道炎の高頻度発症,重症化の機序として、何らかの原因で食道運動機能が低下し食道のクリアランス機能が悪化していることが考えられた。糖尿病で見られる抹消神経障害のうち、食道知覚の障害が運動機能低下に影響を与えているかに関しての検討はみられていない。そこで、ラット慢性逆流性食道炎モデルを作製し、ラットの食道知覚に関与すると考えられるカプサイシン感受性神経への影響について、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、サブスタンスPの蛋白発現を解析し検討した。その結果、CGRP、サブスタンスPの発現の低下がみられ、糖尿病に伴う末梢性神経症が食道感受性低下に影響を与えることが明らかとなった。また、この研究中に逆流性食道炎及び食道裂孔ヘルニアに対する動脈硬化の影響に関して検討し、食道裂孔ヘルニアをもつ患者で動脈硬化に関連する指数が有意に高いこと、逆流性食道炎患者では動脈硬化に関連する指数に影響しないことを明らかとし、英文誌に投稿し受理された。糖尿病患者における逆流性食道炎の高頻度発症,重症化の機序について詳細は未だ不明であり、今回我々は、そのメカニズムを明らかにすることを目的に平成18年度の検討を行った。糖尿病患者では神経障害を合併することがよく知られているが,食道知覚が低下しているため酸逆流を感知した際におこる食道蠕動運動が低下することで逆流性食道炎を高頻度に合併し,またその重症化がおこっている可能性がある。そこで、はじめに食道運動機能が非糖尿病患者と糖尿病患者で異なっているか否かについて再検討を行った。その結果、糖尿病患者では非糖尿病患者と比較して食道体部の蠕動圧に変化は見られないが、食道蠕動速度の低下が認められ、食道クリアランス能力の低下が見られることが明らかとなった。また、糖尿病患者において逆流性食道炎の頻度が高く重症化が見られるもう一つの機序として糖尿病による末梢神経障害に伴う食道粘膜の知覚の低下が関与していると考えられている。実際の糖尿病患者での検討の前にまずはラットにおいて食道知覚に関与すると考えられるカプサイシン感受性神経の存在・分布を再度確認するとともに、ラットの逆流性食道炎モデルを作製し逆流性食道炎モデルの食道粘膜におけるカプサイシン感受性神経の分布に変化が見られないか、またバニロイド受容体(TRPV1)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、CGRP受容体に変化が見られるか否かに関して検討を行っている。現在データの解析中であり近いうちにその結果を報告できると考えている。
ヒト抗体が認識するLPS/LOS内部コア糖鎖の合成とエピトープ解析

グラム陰性菌が産生するリポ多糖(LPS)のコア糖鎖はワクチン開発の標的である。本研究はコア糖鎖合成法の開発と糖鎖プローブの作成を行った。また合成コア糖鎖を認識するヒト抗体選抜,その免疫学的性質の解明を行った。その結果,マンノ型3,4分岐構造の効率的合成,4,5分岐Kdo構造の効率的構築を達成し,ビシナルジオール分岐が連続したコア糖鎖の完全立体選択的合成を初めて達成し10種の糖鎖合成を完了した。つづいてビオチン及び磁気粒子コンジュゲートの作成を行った。そしてこれらを使用して,市販のヒト抗体より糖鎖認識抗体の選抜を行いの抗体を得た。これらは菌体由来LPSの低低分子領域を認識することを突き止めた。本年度はKdo供与体を用いるグリコシル化における収率・立体選択性の向上、及び分岐Kdo糖鎖合成の反応経路の最適化を中心に取り組んだ。計画による分子内環化反応を利用するKdo2糖合成ではエステル結合を介した2糖の合成は予定通り行えたが、その後のグリコシル化反応では期待したグリコシド結合を有する2糖を得ることが出来なかった。そこでグリカールを有するエステル誘導体を作成し、ヨードラクトン化によるグリコシド生成反応を試みた。その結果期待したグリコシド生成物へ得られなかった。前者ではKdoの4,5位がイソプロピリデン基で保護されているため、活性化後にグリカール生成反応が優先して進行すること、後者ではグリカールの活性化が困難であることが原因であることが明らかになった。この問題を解決するために、4,5位の保護基をイソプロピリデン基からシリル系保護基に変更し、ピラノース環の立体配座をイス型とする変更を行った。まず分子間でのグリコシル化を行った所立体選択性がα/β=26/1まで向上し、当初の目的を達成することが出来た。これまでに合成を達成したKdo単糖、2種類のKdo2糖についてマウスマクロファージ細胞株を用いて免疫活性化および免疫抑制活性効果について検証を行った。その結果いずれの試料についても活性化は認められなかったことから、Kdo自体にはマウスの免疫系を刺激する効果がない可能性が考えられた。計画にあるKdo糖鎖合成における立体選択性の改善方法を見いだすことが出来た。分子内反応の利用は期待しない反応が主反応になってしまったが、保護基を変更することでこの問題を解決することが可能になった。これを利用して、糖鎖ライブラリ合成が順調に進行している。免疫糖鎖の活性評価は、当初28年度に試みる計画であったが前倒しして評価することが出来た。推定した通りKdoのみでの免疫賦活効果が期待できなかったが、より大きな糖鎖を用いた場合に活性変化が起こるか検証するためのコントロールとなることが確認できた。平成27年度に作成したLPS/LOSの酸性内部コア2糖[Kdo(a2-4)Kdo]の5位水酸基へグリコシル化反応によりオリゴ糖の導入を検討した。マンノヘプトース,マンノース,ガラクトース,ガラクトサミンの単糖誘導体による予備実験では,6089%の高収率でグリコシル化を達成し,4,5分岐3糖の合成を達成した。また直鎖の2及び3糖供与体を用いた場合においても良好な収率で4糖,5糖糖鎖を得ることが可能であった。さらにヘプトースの3,4位で分岐した4糖供与体を用いた場合においても立体選択的に糖鎖導入が可能で,連続分岐した内部コア6糖糖鎖の初めての合成を達成した。(収率58%)これらの結果より,研究計画時に懸念されていたKdo2糖の5位水酸基の反応性は,グリコシル化反応については低下しないことが明らかになった。またブロック合成とすることで,反応後の精製においてサイズ排除クロマトグラフィーを利用することで簡便かつ効率的に合成糖鎖が得られ,本方法が有用であることを実証した。続いて合成したオリゴ糖鎖をタンパクまたは磁気粒子を結合させた糖鎖コンジュゲート合成を行った。Kdoを含む単糖3糖糖鎖を,光反応を利用してリンカー導入後,ビオチン化を行いプローブ合成を達成した。また磁気粒子コンジュゲート合成の反応条件探索を行った。一連の過程において2-8結合を有するKdo2糖は2-4結合を有するKdo2糖や分岐3糖糖鎖と比較して各段階での収率が低下する傾向が見られたことより,グリコシド結合が開裂しやすいことが示唆された。糖鎖ライブラリの構築について当初計画であるオリゴ糖供与体を用いたグリコシル化反応を達成し,コア糖鎖の効率的な合成経路が確立できただけでなく,分岐オリゴ糖供与体を用いた糖鎖伸長が可能である新しい知見を得ることができた。これによりNeisseria属LOS内部コア糖鎖ライブラリ作成が当初計画より早く完了した。内部コア糖鎖プローブ合成ではビオチンコンジュゲートの合成経路と基本的な合成条件が確定できた。また磁気粒子コンジュゲートの合成条件も整いつつある。タンパクコンジュゲート合成については担当予定の大学院生が進学を辞退したため,研究を予定通り進めることが出来なかった。以上のことより,当初計画の80%以上の目的が達成できたと判断し概ね順調に進展していると評価した。本年度は合成糖鎖を磁気粒子に固定化する反応条件の検討,糖鎖固定磁気粒子ライブラリ使用して糖鎖認識ヒト抗体IgGの選抜に取り組んだ。6種類のKdoを含む

オリゴ糖を固定化した磁気粒子より,糖鎖結合IgGを得ることが出来,Re-LPSを用いたアフィニティークロマトグラフィーより選抜したIgGとほぼ同量の抗体を得ることが出来た。得られたIgGを使用して野生株および変異株のLPSに対する結合能を評価したところ,2-4結合を有するKdo2糖から選抜したIgGが属に対して最も幅広い結合能を示すことを見いだした。まとめ本研究では,複合糖脂質LPSのコア糖鎖の機能解明に向けた糖鎖プローブの化学合成に取り組み,Neisseria属LOS部分コア糖鎖合成を達成し,合成部分コア糖鎖を認識するヒト抗体の選抜を行いその性質を検討した。オリゴ糖合成ではビシナルジオールで分岐したHeptoseおよびKdoの効率的な合成法を確立することができ,幅広い属のLPS/LOSのコア糖鎖合成の基盤が確立できた。特にビシナルジオール位で分岐した構造が連続する酸性オリゴ糖鎖の立体選択的および収斂的合成は世界で初めての合成例で,汎用性が高い合成手法である。本方法により14種類のNeisseria属LOSコア糖鎖の酸性および中性部分糖鎖ライブラリ合成を達成した。合成糖鎖を使用してマウスマクロファージ細胞株の免疫賦活活性を検討したが,顕著な影響を示さなかったため,コア糖鎖のみでは免疫系に対する機能は少ないことが示唆された。また合成糖鎖を磁気粒子に固定化し糖鎖結合ヒト抗体IgGの選抜を行い,市販ヒトIgG(10 mg)より3-7 μgのIgGを得ることができた。これらの天然由来LPSに対する結合能を評価したところ,2-4結合を有するKdo2糖から選抜した抗体が最も幅広い結合活性を示した。グラム陰性菌が産生するリポ多糖(LPS)のコア糖鎖はワクチン開発の標的である。本研究はコア糖鎖合成法の開発と糖鎖プローブの作成を行った。また合成コア糖鎖を認識するヒト抗体選抜,その免疫学的性質の解明を行った。その結果,マンノ型3,4分岐構造の効率的合成,4,5分岐Kdo構造の効率的構築を達成し,ビシナルジオール分岐が連続したコア糖鎖の完全立体選択的合成を初めて達成し10種の糖鎖合成を完了した。つづいてビオチン及び磁気粒子コンジュゲートの作成を行った。そしてこれらを使用して,市販のヒト抗体より糖鎖認識抗体の選抜を行いの抗体を得た。これらは菌体由来LPSの低低分子領域を認識することを突き止めた。今後は引き続き糖鎖ライブラリの拡充をおこなう。合成の基盤となるKdo2糖の大量合成法を確立する必要があり、10g単位での合成を次年度集中的に行いライブラリ作成に備える。また連続した3連続分岐した標的コア糖鎖合成に向けた糖鎖ユニット合成に取り組む。これまでに合成した糖鎖はビオチン標識、およびヒト血清アルブミンとの縮合条件の最適化を行う。29年度は当初予定していた人的資源が確保できないため以下の内容を絞って研究をするめる。1)糖鎖合成のスケールアップを行い糖鎖標品の量を確保する。2)合成糖鎖コンジュゲートを使用した糖鎖結合抗体を選抜する基礎条件の確立。3)抗体との結合能評価実験を行う。糖鎖工学
細胞増殖制御因子としての細胞外ATPとその受容応答機構の解析

FRTL-5甲状腺細胞は甲状腺刺激ホルモン(TSH)に依存して増殖する。この作用はアデニル酸シクラーゼを活性化するフォルスコリンでも再現でき、cAMPを介した作用である。一方、ATPは単独ではDNA合成を促進するがTSHと共存させるとTSHのDNA合成能を抑制した。このATP作用の解析の結果、ATPのDNA合成促進作用はおそらくホスホリパーゼC-Ca^<2+>系を介した作用であること、一方ATPによるDNA合成抑制作用はATPの分解産物であるアデノシンでも再現できた。したがってATPが細胞膜エクトヌクレオチダーゼによってアデノシンに代謝されA_1アデノシン受容体を介している可能性が示唆された。しかしアデノシン作用は百日咳毒素で完全に遮断されるのに対しATPのDNA合成抑制は毒素処理で一部しか抑制されず百日咳毒素非感受性の経路の存在も示唆された。我々はさらにヒト肝ガン細胞であるHep G2でも同様にATPのDNA合成活性を検討したところ、細胞密度に依存して作用を発揮することが明らかにされた。すなわち低密度ではATPは合成を高め、一方、高密度では逆に抑制する。この場合も抑制はアデノシンで再現できる。このように今回新たに2種の細胞においてATPが細胞増殖を抑制する活性があることが明らかにされた。我々の用いた細胞に関する限り、ATPそれ自身はおそらくP_2受容体を介して増殖促進に、一方、その分解産物であるアデノシンは逆に増殖抑制作用を有すると結論される。
カーボネイトスキャベンジングの二面性

前年度の問題点として挙げた、『水簸による分級において、分級した粒子の量が理論的に予想される関係と一致しない』という問題を先ず最初に検討した。水簸作業において上の段を全量を採取することで改善が認められた。部分的な水の採取によって、上下層の混合が発生したものと考えられた。全量を採取する方法で研究を継続した。炭酸塩としてカルサイトとアラゴナイト、分配させる元素として希土類元素を、共存元素として鉄とマンガンを検討した。(組み合わせは6通り)そして、それぞれにおいて、分配後、二酸化炭素分圧を上げ溶解させる実験を行ったので、全組み合わせは12通りの実験を行った。希土類元素の炭酸塩への分配は再現性が良かった。分級した粒子の粒径に対して、濃度の変化が認められた。この変化は理論的に推測されていた変化と良く一致し、粒径の鉄を除き、一週間の反応で、粒径の小さい領域で一定の濃度(M/Ca)が得られた。マグネシウムの分配時と溶解時の挙動から分配平衡が得られていることが確認できた。結果として、次のことが得られた。1.カルサイトとアラゴナイトへの希土類元素の分配には小さな系統的な差異が認められたこと。2.マンガンの共存は希土類元素の分配に顕著な影響を及ぼさなかったこと。3.鉄の共存は希土類元素の分配に大きく影響したこと。4.炭酸塩への希土類元素の分配は速やかに進行する。溶解段階において、少なくとも希土類元素は速やかに再分配し、その濃度が濃縮されることはないことが分かった。見込んでいたMnやFeの酸化数の変化が認められず、予定していたX線吸収微細構造の測定を行う必要がないと判断した。現在到達したことろで、一編の論文の執筆が可能なので、論文の執筆を行う。鉄の共存が重要であることが分かったため、鉄、単独の分配挙動を調べ、自然界で進行している現象と比較したい。また、鉄とマンガンの協同的に効果の有無も調査したい。さらに、本研究で開発した方法は、炭酸塩への分配平衡を調査する極めて優れた方法であることが分かったため、ほかの金属元素のイオンの分配挙動も調べる。炭酸塩分配反応装置の製作分配反応をより平衡に近い条件で進行させる反応装置をガラスを用いて製作した。その際、形状の異なる三種類のガラス製反応容器を試作した。溶液の飽和状態の確認のためにpHを測定できるようにした。粒径の異なるカルサイト粉末は、天然のカルサイト粒子(0.1 mm)をメノウ乳鉢で粉砕し水簸によって自作し、電顕でサイズ分布を確認した。ガスフローコントローラを3つ用いて二酸化炭素分圧の調整された窒素を作った。撹拌するためのバブリングでは、窒素だけでなく空気を用いて、酸素分圧の変化の影響も考察できるようにした。カルサイトの平衡分配反応実験と溶解実験pHをモニターしながらMnと希土類元素の塩化物溶液を用いてカルサイトへの分配実験を行った。反応時間は1週間から3週間を検討した。その後、水簸により分級後、組成変化をICP質量分析計とICP発光法により測定した。Mnを用いた生成実験では漸近線により安定した分配係数が得られた。さらに酸素を含む系と含まない系で溶解実験も行い、カルサイト粒子中のMnの量の変化を観察した。希土類元素を用いた生成反応においても、再現性の良い分配実験が可能であった。分配の希土類元素パターンはMucciらの報告したものと良く一致していたが、値は一桁低かった。また、粒子サイズの効果が明確でなく、分配定数にサイズ依存性が弱かった。水簸による分級後回収したカルサイト粒子の量が理論的な傾向と一致せず、その原因を探っている。炭酸カルシウム粒子の水簸による分級が、理論的に予想される分布とは異なっており、分級中のカルサイト粒子の生成や水簸装置内の対流等の可能性が疑われた。その原因を解明するために追加実験が必要になり時間を要している。

3.鉄の共存は希土類元素の分配に大きく影響したこと。4.炭酸塩への希土類元素の分配は速やかに進行する。溶解段階において、少なくとも希土類元素は速やかに再分配し、その濃度が濃縮されることはないことが分かった。見込んでいたMnやFeの酸化数の変化が認められず、予定していたX線吸収微細構造の測定を行う必要がないと判断した。水簸処理中の粒子の生成や流動を抑えるため、水簸時間の短縮を図る。多少粒径サイズの分級は粗くなっても、分析値の漸近値が得られる見通しである。その後、漸近線が得られたならば、その他の問題はすでにクリアされているので、計画通り、希土類元素を吸着したカルサイトの溶解実験を行う。さらに粒子をアラゴナイトに変えた吸着実験と溶解実験へと進む計画である。現在到達したことろで、一編の論文の執筆が可能なので、論文の執筆を行う。鉄の共存が重要であることが分かったため、鉄、単独の分配挙動を調べ、自然界で進行している現象と比較したい。また、鉄とマンガンの協同的に効果の有無も調査したい。さらに、本研究で開発した方法は、炭酸塩への分配平衡を調査する極めて優れた方法であることが分かったため、ほかの金属元素のイオンの分配挙動も調べる。研究の進展でX線吸収微細構造の測定を必要としないと判断したため、実験経費特に旅費が少額となった。次年度は、経費を研究成果の発表に使う予定である。
BMP－2の環境選択的骨誘導/抑制メカニズムの解明・応用に基づく骨再生療法の開発

強力な骨誘導活性のある骨形成タンパク質(BMP)-2の応用は、補綴歯科治療においても、非常に有効な骨再生療法として期待されている。一方、申請者らは、骨髄腔内においては逆に、BMP-2が骨形成を著明に抑制する事を明らかにした。作用部位によって全く逆の効果を示すBMP-2の応用は、確実な骨造成を目指す上で問題がある。そこで、本申請研究の目的は、骨髄内でのBMP-2による骨誘導抑制メカニズムを解明することである。平成28-29年度は、BMP-2の骨誘導抑制メカニズムを明らかにするために、骨形成,吸収に関わっている骨芽細胞,破骨細胞がトラッキングできるマウス、造血幹細胞ニッチの形成に関わるCXCL12陽性細胞をトラッキング可能なマウスを入手し解析を行い、骨髄内に移植したBMP-2周囲の骨芽細胞数が低下していることを明らかにしてきた。平成30年度は、骨髄内に移植したBMP-2周囲のCXCL12陽性の間葉系幹細胞数に変化が生じないことを明らかにした。また、骨髄内のどの細胞が本BMP-2誘導性骨芽細胞分化の抑制に関わっているかをin vitroにて解析を行った。具体的には、磁性ビーズを用いた細胞分離用キットを用いて得た、CD11b陽性のMyeloid、CD4陽性のT細胞、CD19陽性のB細胞をそれぞれ除去した骨髄細胞、およびCD19陽性の骨髄B細胞をC2C12-BRE細胞と共培養し,BREに対するルシフェラーゼ活性を計測した。その結果、CD19陽性のB細胞を除去した骨髄細胞でのみ、BMP-2誘導性骨芽細胞分化抑制効果が有意に減弱した。また、CD19陽性の骨髄B細胞は、骨髄細胞と比較し、より強いBMP-2誘導性骨芽細胞分化抑制効果を示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。強力な骨誘導活性のある骨形成タンパク質(BMP)-2の応用は,補綴歯科治療においても,非常に有効な骨再生療法として期待されている.一方,申請者らは,骨髄腔内においては逆に,BMP-2が骨形成を著明に抑制する事を明らかにした.作用部位によって全く逆の効果を示すBMP-2の応用は,確実な骨造成を目指す上で問題がある.本申請研究では,骨髄内でのBMP-2による骨誘導抑制メカニズムを解明し,それを制御する事で骨髄内でより効率的なBMP-2誘導骨造成法の開発に繋げる.更に,造血幹細胞ニッチである骨髄腔を制御する事で,骨髄腔が狭窄する大理石骨病やその他の骨代謝疾患に対する新規治療法開発の基盤を構築する.平成28年度は,BMP-2の骨誘導抑制メカニズムを明らかにするために,骨形成,吸収に関わっている骨芽細胞,破骨細胞がトラッキングできるマウスを入手した.さらに,造血幹細胞ニッチの形成に関わるCXCL12陽性細胞をトラッキング可能なマウスも入手し,これらのマウスを用いて,骨形成,骨吸収,骨髄ニッチ形成にBMP-2がどのように関わっているか,in vivoにて解析を行っている.また,Nude mice, Scid mice, Nod-Scid miceを用いた解析も実施し,BMP-2の骨髄投与により,骨髄内の様々な細胞が欠損したマウスにおいて,どの様の表現型を示すか検討している.今年度は,BMP-2の骨髄内での骨形成抑制メカニズムを明らかにするため,骨代謝に関わっている様々な細胞がトラッキング可能なマウスを入手し,解析を開始しており概ね順調に進展していると考える.強力な骨誘導活性のある骨形成タンパク質(BMP)-2の応用は,補綴歯科治療においても,非常に有効な骨再生療法として期待されている.一方,申請者らは,骨髄腔内においては逆に,BMP-2が骨形成を著明に抑制する事を明らかにした.作用部位によって全く逆の効果を示すBMP-2の応用は,確実な骨造成を目指す上で問題がある.本申請研究では,骨髄内でのBMP-2による骨誘導抑制メカニズムを解明し,それを制御する事で骨髄内でより効率的なBMP-2誘導骨造成法の開発に繋げる.更に,造血幹細胞ニッチである骨髄腔を制御する事で,骨髄腔が狭窄する大理石骨病やその他の骨代謝疾患に対する新規治療法開発の基盤を構築する.平成28年度に骨形成,吸収に関わっている骨芽細胞,破骨細胞がトラッキングできるCol1a1-GFPマウス,Trap-Tomatoマウスを入手した.さらに,造血幹細胞ニッチの形成に関わるCXCL12陽性細胞をトラッキング可能なCXCL12-GFPマウスも入手した.平成29年度はこれらのマウスを用い,BMP-2が骨髄内の細胞に与える影響を検討した.その結果,マウスカルバリアでは,BMP-2の移植部位に骨芽細胞,破骨細胞ともに誘導されたが,骨髄内において,BMP-2の移植部位には骨芽細胞は誘導されず,破骨細胞のみが誘導されることが明らかとなった.また,in vitro実験において,骨芽細胞分化を抑制している因子として,骨髄細胞が直接関与していることを明らかとした.今年度は,BMP-2の骨髄内での骨形成抑制メカニズムを明らかにするため,骨代謝に関わっている様々な細胞がトラッキング可能なマウスを入手して解析を行い,骨髄内のどのような細胞がBMP-2誘導性骨形成を抑制しているのかを明らかにしており,概ね順調に進展していると考える.強力な骨誘導活性のある骨形成タンパク質(BMP)-2の応用は、補綴歯科治療においても、非常に有効な骨再生療法として期待されている。