hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の微量要素変異株スクリーニング法の開発と変異株よりの原因遺伝子の単離

シロイヌナズナを用いて栄養学的な変異株を単離し、それを解析し、その変異の原因となる遺伝子を単離することは、植物の栄養生理を分子レベルで理解するうえでも非常に重要である。本研究課題においては、次の2点の方法論を確立することを目指している。(1)シロイヌナズナ植物個体の養分分析を効率よく行うシステムを構築し,変異株のスクリーニングを行う。(2)変異株単離後の原因遺伝子単離の効率化を計るために、T-DNA挿入によるダギングラインの作成を目指す。変異株作成と原因遺伝子の単離が効率よく行える方法としては、T-DNAダギング法が有効であると考えられた。バキュウム法によりシロイヌナズナを効率的に形質転換できる系を確立し,2000の独立な変異株を作出し,種子を集めた。得られた独立なランダム変異株よりDNAを抽出し、T-DNAの挿入の様式を確認した。マーカーとしてT-DNA上に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子の働きにより、形質転換体はハイグロマイシン耐性になるが、それぞれの株には、ランダムにT-DNAが挿入されていることをサザン解析により確認した。T-DNAの挿入数は、それぞれの株に1ヶ所あるいは2ヶ所以上挿入されていることが確認された。これら作成されたタグラインを用いて栄養要求性変異株の単離を開始するにあたり、まず、極く低濃度の硫酸イオンを与えた培地で変異株の集団を成育させ、この条件では成育が良くないが、通常濃度の硫酸イオンを与えて成長が回復するものを変異株として選抜す系をEMS処理により得られた変異株を用いて確立した。また、ホウ素要求性の変異株単離のための方法も同様に確立した。T-DNAタグラインの有効性も確認され、スクリーニング法も確立できたので、作成したタグラインを用いての目的変異株のスクリーニングが可能になった。植物栄養学的に重要な現象を分子レベルまで解明していくためには、関連するさまざまな変異株を単離し、その原因遺伝子を解明していくことが重要である。この目的を達成するためには、T-DNAタギング法が有効であり、現在まで数多くの遺伝子がこの方法で単離されている。本年度は、エンハンサー配列をT-DNAのライトボーダー近傍に持つタギングベクター(pVICE)を利用するタギング法により大量ランダムな形質転換体を作成することを優先して行った。この過剰発現型タギング法を用いれば、植物に優性の挿入変異を導入することが可能であり、さらに、その変異の原因遺伝子を特定することが可能である。まず、簡便な形質転換法であるIn Planta法(植物個体にバキュームインフィルトレーション法によりpVICEを持つアグロバクテリウムを導入する)を用いて大量のシロイヌナズナ(WS)を形質転換した。得られた種子1000個あたり1-5株の形質転換体(ハイグロマイシン耐性)を得ることができた。それぞれの形質転換体より種子を採取しタグラインとした。現在まで、約2000株の独立なタグラインが得られた。次世代のハイグロマイシン耐性を調べたところ、ほぼすべての植物が耐性を示した。得られた変異株のうち、形態的な変異を示す株が得られており、これらの変異株を用いてタグラインの有用性を確認している段階である。最終的に、数万の独立な形質転換体を得られれば、有用なタグラインになると考えている。

本研究課題においては、次の2点の方法論を確立することを目指している。(1)シロイヌナズナ植物個体の養分分析を効率よく行うシステムを構築し、変異株のスクリーニングを行う。(2)変異株単離後の原因遺伝子単離の効率化を計るために、T-DNA挿入によるタギングラインの作成を目指す。変異株作成と原因遺伝子の単離が効率よく行える方法としては、T-DNAタギング法が有効であると考えられた。バキュウム法によりシロイヌナズナを効率的に形質転換できる系を確立し,2000の独立な変異株を作出し、種子を集めた。得られた独立なランダム変異株よりDNAを抽出し、T-DNAの挿入の様式を確認した。マーカーとしてT-DNA上に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子の働きにより、形質転換体はハイグロマイシン耐性になるが、それぞれの株には、ランダムにT-DNAが挿入されていることをサザン解析により確認した。T-DNAの挿入数は、それぞれの株に1ヵ所あるいは2ヵ所以上挿入されていることが確認された。これら作成されたタグラインを用いて栄養要求性変異株の単離を開始するにあたり、まず、極く低濃度の硫酸イオンを与えた培地で変異株の集団を成育させ、この条件では成育が良くないが、通常濃度の硫酸イオンを与えて成長が回復するものを変異株として選抜す系をEMS処理により得られた変異株を用いて確立した。また、ホウ素要求性の変異株単離のための方法も同様に確立した。T-DNAタグラインの有効性も確認され、スクリーニング法も確立できたので、作成したタグラインを用いての目的変異株のスクリーニングが可能になった。
発達期中枢神経系シナプスの選択的強化・除去過程のリアルタイムイメージング

本研究では、登上線維-プルキンエ細胞シナプスの選択的強化・除去がどのように進行するのかを直接解明することを目指し、新たなリアルタイムイメージング方法を開発する。昨年度、延髄細胞の軸索やプルキンエ細胞を蛍光タンパクの発現により可視化する方法を最適化した。また、3種類の蛍光シグナルを検出できるようにレーザーなど顕微鏡の改良を行った。本年度は、(1)3種類の蛍光タンパク質(BFP,GFP,Tomato)の組み合わせ発現により、細胞や線維を多くの別々の色で、生きたまま染色する方法を確立した。さらに、(2)それらの生きた細胞、線維を長期的に観察できる実験系の確立を目指し、標本を浸す液やその液に送る気体などに関して、条件検討を行った結果、顕微鏡下で、温度とpHを制御した状態で、細胞や線維を1日以上経時的に観察できるシステムを開発した。このように、複数の生きた細胞や線維を同時にかつ区別して、1日以上リアルタイムで観察できる実験系がほぼ確立できた。残された課題は、蛍光タンパク質を任意の細胞に発現させる方法の開発である。プルキンエ細胞へは特異的なプロモーター(L7)を使用すれば可能だが、登上線維は適したプロモーターがない。新規プロモーターの探索あるいはプルキンエ細胞からシナプスを介して逆行的に遺伝子を登上線維に輸送する方法の開発を必要とする。このことが達成されれば、登上線維、プルキンエ細胞のリアルタイムイメージングを行うことができ、登上線維-プルキンエ細胞シナプスの選択的強化・除去の実体を解明することが可能となる。さらにこれらの方法は、脳内で起こる様々な現象に応用することが可能であり、多くの研究に貢献できることが期待される。本研究では、登上線維-プルキンエ細胞シナプスの選択的強化・除去がどのように進行するのかを明らかにするために、実験操作が容易なin vitro共培養系を確立し、複数の細胞やシナプスを区別して標識することで、選択的なシナプス強化・除去に伴う構造変化をリアルタイムで観察できる実験系の開発を目指している。生後710日のマウスから小脳スライスを作製し、胎生15日のラットの延髄と共培養した。培養7日後と14日後に小脳プルキンエ細胞から記録し、延髄片を電気刺激して、共培養下で進行する登上線維シナプスの形成と除去を電気生理学的に評価した。平成21年度は以下の結果を得た。(1)培養下でおこる過剰な登上線維シナプスの除去がin vivoと同様の分子機構によるかどうかを、薬理学的操作や遺伝子操作により調べた。その結果、in vivoと同様、1型代謝型グルタミン酸受容体(mGluR1)やデルタ2型グルタミン酸受容体(GluD2)が培養下のシナプス除去にも必須であることが判明した。(2)登上線維やその標的細胞であるプルキンエ細胞を蛍光タンパクの発現により可視化する方法を試みた結果、登上線維の可視化には局所的エレクトロポレーション法あるいはレンチウィルスベクターにより蛍光タンパク質の遺伝子を導入する方法が最適であることがわかった。また、プルキンエ細胞の可視化にはプルキンエ細胞特異的であるL7プロモーターとその下流に蛍光タンパクを持つレンチウィルスベクターを用いた導入方法が最適であった。(3)3種類の蛍光シグナルを検出できるようにレーザーなど顕微鏡の改良を行った。これらの成果の一部を、2009年9月の日本神経科学学会で発表した。これらの成果は、目的達成に必要とされる技術がおおむね開発できたことを意味しており、次年度の研究の発展が期待できる。
影響と創造性-大岡昇平におけるスタンダールの場合

本プロジェクトにおいて明らかにしたのは、大岡昇平が日本の文学を、戦前の世界の一つの到達点まで、日本と西洋の近代性の交差に至るまで導いたことであった。小説とは何か、小説家とは何か。こういった美学的かつ倫理的な問いに答えることを暗に目指して大岡はスタンダール作品の読解・翻訳・研究において研鑽を重ねたのである。彼の文学的営為は未だ十分に認められてはいないが、将来的には世界文学として認められるに違いない。本研究は、大岡昇平の著作品を対象に、彼が西洋文学から受けた影響を、単なる影響に留まらず、如何にして独自の創造性へと発展させ、普遍性を持つ文学作品へと昇華させたかを明らかにする。まず大岡昇平の作品についての研究の現状を把握するため、大岡に関する国内外の既往研究を調査・整理し、大岡研究の実態の明確化、および本研究と直に関わる資料の選定を行う。次に、『わがスタンダール』の読解・分析・仏語翻訳およびそれに関する引用出典と論文自体の出版経歴のデータベースも本計画に含まれている。最後に大岡昇平に関する批評およびスタンダールの著書に限らずそれに対する評論(日仏問わず)の調査を行う。■設備設置、調査、データベース作成/必要設備を設置、MAGAZINE PLUSシステムを利用し、国内の既往研究文献調査を実施。900件余のデータを整理し、キーワード検索可能なデータベースを作成。■『わがスタンダール』の読解・分析・仏語翻訳作成/大岡昇平の論文集『わがスタンダール』を精読、大岡自身を含めた日本におけるスタンダール受容を中心に調査。仏語翻訳は全体の半分(約200項)まで完了。これに応じる大岡の引用出典、大岡の論文自体の出版経歴を調査、データベース化。■必要文献の収集と照合/上述で得られた文献のうち、研究上必要なものを選択、現物収集・複写を実施。『わがスタンダール』における出典を明確にするため、スタンダール作品の原文および、収集した文献との照合を実施。■インタビューの準備と情報収集/大岡全集(岩波書店版)の元編集者、星野紘一郎に取材、重要な資料・情報を収集。仏語翻訳者Anne Bayard-Sakai(『花影』)に代わりFrancois Compoint(『俘虜記』)への取材交渉成立。Thierry Mare(『武蔵野夫人』)への取材準備完了。尚、計画外だが次に挙げる関連分野の第一人者らに取材し、新たな取材計画も立てた。大岡と密に接触したスタンダール研究の権威、栗須公正、西川長夫に取材、貴重な情報を収集。21年度以降、大岡の友人でもあった池端雪浦、大岡研究者である関塚誠、花崎育代への取材交渉成立。■成果報告/「大岡における聖書の影響」に主眼を置き、『野火』を中心として論文を執筆(21年度発表予定)。国際高等研究所にて「受容から創造性へ-近現代日本文学におけるスタンダールの場合」と題す研究会を提案。その基礎となる本研究の「大岡昇平におけるスタンダール」を中心に「受容と創造性」を巡る研究の意義と概要について発表した。■設備設置、調査、データベース作成/必要設備を設置、マガジンプラス及び、国立国会図書館(NDL)を利用し、国内の既往研究文献調査をデータベース化し分析を行った。分析方法としては1000件余に及ぶデータを、大岡作品に関し時系列において分類し、作品別の評論の推移に焦点を当て分析した。■『わがスタンダール』の読解・分析・仏語翻訳作成/大岡昇平論文集『わがスタンダール』における日本のスタンダール受容および、フランスのスタンダール評論を調査。仏語訳は全体の4分の3(約300項)まで完了。これに応じる大岡の引用出典と論文自体の出版経歴をデータベース化した。■関連資料の調査・収集・分析『わがスタンダール』中に挙げられる全ての日仏文学作品および評論文のリストをデータベース化した(データベースは全て日仏語版を作成)。(1)『わがスタンダール』における出典を明確にするため、それぞれの原文および、収集した文献との照合を実施。(2)大岡の既往研究において、文献を作品ごとに目次を作成し、整理した。■インタビューの実施と情報収集・分析/スタンダールの専門家である西川長夫氏、フィリップ・ベルティエ氏(一部)、大岡昇平の専門家である星野紘一郎氏、桜井均氏、花崎育代氏、関塚誠氏。彼ら6名の研究発表に参加、その際の議論の総括を執筆した。■成果報告/。■成果報告/下記の4題の表題を発表した。「大岡における聖書の影響」に主眼を置き、『野火』を中心として論文を執筆(21年度発表予定)■発展として国際高等研究所において「受容から創造性へ-近現代日本文学におけるスタンダールの場合」と題す研究会を発足。

その基礎となる本研究の「大岡昇平におけるスタンダール」を中心に「受容と創造性」を巡る研究の意義と概要について引き続き発表した。本年度(平成23年3月31日)の研究実施計画■『わがスタンダール』の読解・分析・仏語翻訳作成/大岡昇平論文集『わがスタンダール』における日本のスタンダール受容および、フランスのスタンダール評論を調査。仏語訳は完了(400頁)。■関連資料の調査・収集・分析/『わがスタンダール』中に挙げられる全ての日仏文学作品および評論文のリストをデータベース化完了(データベースは全て日仏語版を作成)。■必要文献の収集と照合/上述で得られた文献のうち、研究上必要なものを選択、現物収集・複写を実施。(1)『わがスタンダール』における出典を明確にするため、引用された全ての仏文学作品および評論文のリストを作成、現物を収集し、大岡の原文との照合を実施。(2)国内外の大学、図書館、研究機関の検索システムを使用し、既往の大岡研究全般に関して資料収集をなした。作品ごとの目次作成によってこれを整理。以上の二つの作業((1)、(2))はおおむね完了。■読解・分析/上記の収集・整理の作業によって集められた資料を分析。とくに、優れた研究書でありながら、旧来の慣習に従って文献参照等を欠いた大岡の『わがスタンダール』に必要な情報を加え、これを現代的形式に見合う文学的研究書とするための準備をほぼ全て完了した。■インタビューの実施と情報収集・分析/スタンダールの専門家であるフィリップ・ベルティエ(第二部)、『武蔵野夫人』の仏訳者ティエリ・マレの研究発表に参加、議論の総括を執筆。また、前年度に行った桜井均への研究発表の仏語訳を作成。■成果報告/下記の1題の査読付諭文、4題の研究発表を公表した。■発展/財団法人京都国際高等研究所における研究プロジェクト「受容から創造性へ-近現代日本文学におけるスタンダールの場合」の活動を継続。本研究の主題となる「大岡昇平におけるスタンダール」を問題意識としつつ活動を主導した。また、フランスの日本研究学会の大会議にて研究発表、本研究成果をフランスにて公表した。日本は、その発展過程において、西洋の文化を受容してきた部分は多大である。しかしながら、そうした受容の過程は単なる西洋文明の模倣に留まるのみならず、新たな文明の創出へと結びつくことが往々にしてある。大岡昇平がスタンダールを受容し、さらにそこから自らの創作へと結びつけていく過程は、まさにそうした文明間の受容と創造性を考えるにあたり格好の題材であった。本年度の交付申請書の内容に照らし合わせると、主に以下の通り成果が得られた。1)大岡昇平の『わがスタンダール』の翻訳を終え、その校正・脚注整理・引用の典拠の調査もほぼ完了した。2)大岡の上記著作における引用の典拠に対する収集・分析もおこなった。そこでは、下記の二項目にわたってすでにその収集・データ入力が完了した:a.『わがスタンダール』中に挙げられる仏文学作品および評論文のリスト、b.既往の大岡昇平研究論文のうち、本事業に関連するもの。加えてそれらの情報の検索用のインデックスや解題などを加える作業をほぼ完了した。3)比較文学者であるフランソワ・ルセルクル(パリ第三大学教授)へ比較文学の方法論に関してインタヴューを行った。
二次Wiener汎関数とGrassmann多様体上の力学系

2次のWiener汎関数がその特性関数、すなわち、その汎関数を位相関数とする振動積分型の期待値を通して、汎関数の停留点である古典軌道と結びつき、自然な形でGrassmann多様体と対応することを示した。これによって、特性関数はこのGrassmann多様体上の力学系を定義する。この結果は下記の論文誌に投稿、掲載されている。また、ポルトガルのリスボン大学で行われた国際シンポジウム"The Mathematical Legacy of Feynman's Path Integral Approach"(2002年6月)に招待され、同内容の講演を行った。この結果より、Grassmann多様体の代数構造を通してソリトン理論との結びつきが示唆されるが、この関係は実際に、池田信行氏と谷口説男氏(九州大学)の最近の共同研究によって陽に与えられた。次の問題としては、3次以上の高次汎関数についての同様の研究が期待されるが、その手がかりとしてファインマン積分での対応物として、焦線近傍での近似によるグリーン関数の漸近展開の問題がある。これは理論物理学において与えられた結果であるが、この理論の確率解析の枠組みでの捉えなおしが必要であると考える。この背景と物理的な結果については、2002年11月に佐賀大学で開催されたシンポジウムで講演した。これはまだ研究の途上であるが、3次以上の汎関数を扱う場合には、特異点の問題やカタストロフィの理論が重要な働きをすることが、理論物理の結果から推察され、非常に興味深い現象が新たに現れると期待される。これからの課題として挑戦を続けて行きたいと考える。申請者は研究課題である二次のウィナー汎関数とグラスマン多様体上の力学系の対応について研究活動を行った。確率論、特に確率解析学の中で、二次のウィナー汎関数は最も基本的でかつ豊かな性質を持つ対象であり、広く研究されてきているが、申請者が注目しているのは、そのウィナー空間上の振動積分の漸近挙動を研究する上での基礎としての役割である。ウィナー空間上の振動積分の研究は、理論物理学のファインマン積分の枠組みで言えば量子力学の波動関数の経路積分表示に対応し、その漸近挙動はすなわち半古典近似による古典力学への移行を意味する。しかし、ファインマン積分の数学的定義は未だに不可能であり、厳密に定義できる対応物であるウィナー空間上の振動積分の研究はその意味で重要と思われる。二次の汎関数の場合は、その基礎となる対象であるが、やはり未だに困難が大きい。そこで申請者はこれを一層精密に研究すること、特にその構造を捕まえることを目指して、二次ウィナー汎関数の特性関数、すなわちその振動積分型の期待値をグラスマン多様体上の力学系として対応させることに成功した。この事実は平成12年度の11月にパリ第六大学で行われた確率論日仏シンポジウムで報告したが、13年度になって、さらに大阪大学の小谷眞一教授によって示されたソリトン理論とガウス型確率変数との対応との関係が得られ、また、ガウス型確率変数の標準表現の問題とも関連することが分かった。これらの事実は13年度の9月に京都大学で行われたシンポジウムでの連続講演として発表した。また、同じく10月には以上の結果を論文"Quadratic Wiener functionals and dynamics on Grassmannians"としてBull. Sci. math. 125,No.6-7に発表、既に掲載されている。
日米中国における女性肺癌の疫学的、病理学的、ならびに分子生物学的要因の比較研究

肺癌発生と喫煙との関係は明瞭であるが、従来から、女性肺腺癌患者の喫煙率は低いといわれている。そこで、女性肺癌に焦点を当て、その背景因子を他国間との比較の下に検討すること、ならびに、喫煙以外の肺癌発生要因を検討することを本研究の目的とした。中国雲南省富源県は肺癌の多発地帯として知られているが、同地区は90%以上が農耕漢民族で、女性に喫煙習慣が無い。そこで、同地区を中心として喫煙以外の肺発癌の環境要因の検討を行った。さらに、肺組織内に沈着した発癌物質について、日中の切除標本について比較検討を行った。1.中国雲南省富源県における肺癌の発生状況中国雲南省富源県における1986年から1988年にかけての死因調査を行った。調査対象1,511,645名中5,763名が死亡した。この内、悪性腫瘍死亡率(訂正死亡率)は、10万対61.00(男性76.00、女性44.00)であったが、その内、肺癌死亡率は、10万対51.9(男性64.9、女性36.1;男女比1.81:1)で共に他臓器癌と比較して群を抜いて多かった。なお、1973年から1975年にかけての中国全体での肺癌死亡率(粗死亡率)は、10万対5.0と報告されている。富源県は10行政区に分割されている。各行政区についての肺癌死亡率をみると同県の北部は南部と比較し死亡率が高かった。たとえば、北部の死亡率最多行政区(大河)は南部のそれ(富村)の16倍であった。2.現地環境調査と資料中の変異原活性の解析平成2年6月に富源県の中心都市(中安鎮)と北部の農村に入り現地環境調査と標本の採取を行った。農村部の伝統的な家屋は2階建てであるが、1階は台所兼居間として使用され、2階は寝室兼貯蔵庫として使用されている。1階と2階の仕切りは、中央部が梁に細竹を通しただけの構造となっている。2階の天井は一部吹抜けになっており、この部位を通じて室内の煙の大半が屋外へ排出される仕組みになっている。多くの農家では、現地で産出される石炭を粉砕し、土と水を混合して固めたものを家庭用燃料として使用していた。1階で炊事・暖房用に燃やされた石炭の煙は、2階の寝室兼貯蔵庫に立ち上り、ハムの薫煙にも利用されている。すなわち、家庭内において、高濃度の石炭燃焼物に暴露されていることが示唆された。このような生活様式と生活環境は重要な肺癌発生要因と推察されたが、一般家庭の生活様式は富源県の南部と北部で大きく異なるわけではなく、同県南北での肺癌死亡率の差異を説明することはできなかった。富源県北部一帯では有煙炭が、南部では無煙炭が産出される。そこで、当地における燃料炭の燃焼物と室内に沈着したスス中の変異源性物質を検討した。その結果、富源県北部農家の家屋に沈着したススと北部の石炭(有煙炭)燃焼物中の変異原性が高く、有煙炭由来の半コークスと南部の無煙炭中のものは低かった。3.肺癌切除患者の肺組織に沈着した発癌物質の日中比較中国富源県の肺癌患者21例、日本人の胸部疾患患者137例の切除肺組織中のベンツピレン(BaP)、1-ニトロピレン(1-NP)の濃度及び変異原活性(YG1204,-S9 YG1029,+S9)を測定し、その相関をみた。BaPについては、グラム乾燥肺重量当たり、中国例608.7±477.1pg、日本例180.3±103.7pgであった。1-NPについては中国例5.9±2.4pg、日本例21.3±12.4pgであった。BaP濃度が高い中国例は、日本例に比べてYG1204,+S9に対する変異原活性が高く、1-NP濃度が高い日本例は、中国例に比べてYG1204,-S9に対する変異原活性が高かった。4.まとめ中国雲南省富源県北部は、男女共に肺癌死亡率が高かった。その原因として、生活様式に基づく住居環境、ならびに、燃料用の石炭の成分が重要と思われた。肺発癌に石炭由来の発癌物質の関与が示唆された。日本肺では、中国肺と異なり、石油由来と思われる発癌物質の沈着が多かった。産業構造の変革に伴いこのような相違が生じたと思われた。日米でいわれている肺腺癌の増加との関連の有無等につきさらに解析する必要があると思われた。また、女性肺癌として始めた検討は、非喫煙因子の解析に帰結することになった。

さらに、肺組織内に沈着した発癌物質について、日中の切除標本について比較検討を行った。1.中国雲南省富源県における肺癌の発生状況中国雲南省富源県における1986年から1988年にかけての死因調査を行った。調査対象1,511,645名中5,763名が死亡した。この内、悪性腫瘍死亡率(訂正死亡率)は、10万対61.00(男性76.00、女性44.00)であったが、その内、肺癌死亡率は、10万対51.9(男性64.9、女性36.1;男女比1.81:1)で共に他臓器癌と比較して群を抜いて多かった。なお、1973年から1975年にかけての中国全体での肺癌死亡率(粗死亡率)は、10万対5.0と報告されている。富源県は10行政区に分割されている。各行政区についての肺癌死亡率をみると同県の北部は南部と比較し死亡率が高かった。たとえば、北部の死亡率最多行政区(大河)は南部のそれ(富村)の16倍であった。2.現地環境調査と資料中の変異原活性の解析平成2年6月に富源県の中心都市(中安鎮)と北部の農村に入り現地環境調査と標本の採取を行った。農村部の伝統的な家屋は2階建てであるが、1階は台所兼居間として使用され、2階は寝室兼貯蔵庫として使用されている。1階と2階の仕切りは、中央部が梁に細竹を通しただけの構造となっている。2階の天井は一部吹抜けになっており、この部位を通じて室内の煙の大半が屋外へ排出される仕組みになっている。多くの農家では、現地で産出される石炭を粉砕し、土と水を混合して固めたものを家庭用燃料として使用していた。1階で炊事・暖房用に燃やされた石炭の煙は、2階の寝室兼貯蔵庫に立ち上り、ハムの薫煙にも利用されている。すなわち、家庭内において、高濃度の石炭燃焼物に暴露されていることが示唆された。このような生活様式と生活環境は重要な肺癌発生要因と推察されたが、一般家庭の生活様式は富源県の南部と北部で大きく異なるわけではなく、同県南北での肺癌死亡率の差異を説明することはできなかった。富源県北部一帯では有煙炭が、南部では無煙炭が産出される。そこで、当地における燃料炭の燃焼物と室内に沈着したスス中の変異源性物質を検討した。その結果、富源県北部農家の家屋に沈着したススと北部の石炭(有煙炭)燃焼物中の変異原性が高く、有煙炭由来の半コークスと南部の無煙炭中のものは低かった。3.肺癌切除患者の肺組織に沈着した発癌物質の日中比較中国富源県の肺癌患者21例、日本人の胸部疾患患者137例の切除肺組織中のベンツピレン(BaP)、1-ニトロピレン(1-NP)の濃度及び変異原活性(YG1204,-S9 YG1029,+S9)を測定し、その相関をみた。BaPについては、グラム乾燥肺重量当たり、中国例608.7±477.1pg、日本例180.3±103.7pgであった。1-NPについては中国例5.9±2.4pg、日本例21.3±12.4pgであった。BaP濃度が高い中国例は、日本例に比べてYG1204,+S9に対する変異原活性が高く、1-NP濃度が高い日本例は、中国例に比べてYG1204,-S9に対する変異原活性が高かった。4.まとめ中国雲南省富源県北部は、男女共に肺癌死亡率が高かった。その原因として、生活様式に基づく住居環境、ならびに、燃料用の石炭の成分が重要と思われた。肺発癌に石炭由来の発癌物質の関与が示唆された。日本肺では、中国肺と異なり、石油由来と思われる発癌物質の沈着が多かった。産業構造の変革に伴いこのような相違が生じたと思われた。日米でいわれている肺腺癌の増加との関連の有無等につきさらに解析する必要があると思われた。また、女性肺癌として始めた検討は、非喫煙因子の解析に帰結することになった。女性肺癌(特に腺癌)に焦点を当て、1)その背景因子を多国間との比較の下に検討すること、2)喫煙以外の肺癌発生要因を検討することを本研究の目的とした。
シスプラチン耐性に関与するヒト細胞内因子の酵母を用いた検索

新しいシスプラチン耐性因子を同定するために,遺伝子ライブラリー中からシスプラチン耐性に関与する遺伝子の同定を試みた。まず,2μm系ハイコピープラスミドYEp13をベクターとする酵母ゲノムDNAライブラリーを酢酸リチウム法により親株(W303B)に導入し,導入遺伝子を高発現する形質転換体(約2.4×104個)を得た。次に,この形質転換体を親株が成育できない濃度のシスプラチンを含む寒天培地で培養し,本条件下で生育してきた酵母クローン中のプラスミドについて解析を行った。その結果,高発現することによって酵母にシスプラチン耐性を与える遺伝子としてCRP1およびCRP2を見いだすことに成功した。両遺伝子は,出芽酵母ゲノム中に存在するORFの中で互いに最も相同性の高い遺伝子であり,これらの遺伝子のコードする蛋白質中には塩基性領域ロイシンジッパー(bZIP)モチーフが存在する。両遺伝子は,出芽酵母の多剤耐性に関与する転写因子として同定されているYAP1に対しても比較的高い相同性を有することから,CRP1,CRP2およびYAPlを高発現する酵母のシスプラチン以外の薬毒物に対する交叉耐性を調べたところ,CRP1およびCRP2導入酵母はメタンスルホン酸メチルおよびマイトマイシンCに対しても交叉耐性を示したが,YAP1導入酵母が耐性を示す過酸化水素およびカドミウムに対しては耐性を示さなかった。また、YAP1導入酵母はCRPlおよびCRP2導入酵母が耐性を示すシスプラチンおよびマイトマイシンCに対して耐性を示さず,CRPlおよびCRP2が共にYAP1とは異なる機構で薬剤耐性に関与している可能性が示唆された。
神経成長因子の作用機構に関する分子生物学的・生化学的研究

NGF作用の分子機構をモデルニューロンであるPC12h細胞および培養中枢ニューロンを用いて分子レベルで明らかにすることを目的とする。NGF作用の第一段階は,NGFレセプターとの結合であるので,まずNGFレセプターの発現調節を解析した。NGFレセプターには,低親和性レセプター(LNGFR=p75)と高親和性レセプター(HNGFR=trkA遺伝子産物)の2種類が存在するが,まずp75を解析した。PC12h細胞は,NGFの作用を受けてニューロン様に分化するが,もともとp75を発現している。この発現量を変動させる要因を検索した。PC12h細胞では,NGF自身はp75mRNA発現に影響を与えず,むしろ細胞密度をあげると発現量が上がっていた(しかし,蛋白質レベルでは上昇していなかった)。一方,PC12h細胞の亜株でNGF応答の速いPC12h-R細胞では,NGFによってup-regulationを受けていた。さらにラット培養中枢ニューロンを用いてRT-PCR法でp75mRNA発現量を解析した所,PC12h-R細胞と同様に培養前脳基底野コリン作動性ニューロンにおいても,NGFによってup-regulationを受けていた。このLNGFRのupregulationの現象がHNGFRにあてはまるかどうか,trkA mrna量を同様にRT-PCR法で解析した。この結果,ラット前脳基底野コリン作動性ニューロンにおけるp75mRNAとtrkAmRNA量の発現は共に,NGFによるup-regulationを受けた。しかし,組織での発現パターンに違いがあり,NGFによりup-regulatioみを受ける時期に違いがあるものと考えられる。NGFはtrkA遺伝子産物であるp140trkAを活性化することによって,細胞内シグナル伝達を開始するとされている。PC12h細胞およびPC12h-R細胞をNGFで分化誘導したときのp140trkAのチロシンリン酸化パターンを抗TrkA抗体による免疫沈降物を,抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロットする事によって解析した。PC12h細胞とちがってPC12h-R細胞では,NGFによるp140trkAのチロシンリン酸化の持続が見られた。この結果は,PC12h-R細胞の速いNGF応答性を説明するものと考えられる。脳神経系を構成するニュ-ロン群はその分化・生存維持に種々の拡散性の情報蛋白質群の影響を受けることが知られている。これらの蛋白質の中で最も研究が進んでいるのが神経成長因子(NGR)である。NGFの作用は、まずNGFレセプタ-に結合することから始まる。このレセプタ-には、低親和性レセプタ-(p75)と高親和性レセプタ-の2種類が存在し、最近trkAプロトオンコジ-ン産物がその一員であることが明らかとなった。NGFの作用をより明瞭にしていくためには、そのレセプタ-の発現調節を調べることが重要と思われる。本研究では、NGFに分化促進作用がみられた生後3日齢ラットからの初代培養前脳基底野コリン作動性ニュ-ロンにおける、NGFによるp75の発現調節の可能性を調べた。

±NGF(100ng/ml)の条件で、0、1、3日後のp75 mRNAの発現をRTーRCR法で定量した。その結果、NGF添加群ではNGF無添加群より約2倍のmRNA増加が認められた。その上、この増加はNGF添加後1日目という比較的早い時期に起こり、1ng/mlの生理的濃度でも同様の増加が認められた。この結果は、NGFによるp75 mRNAの増加が、10^<ー11>Mのオ-ダ-の解離定数をもつ高親和性レセプタ-を介して起こっていることを示している。抗p75抗体を用いた免疫組織染色でもNGF無添加群に比べ添加群の方により強く染色される細胞が認められ、この細胞はその形態的特徴からNGFの作用が知られているコリン作動性ニュ-ロンと考えられる。以上の結果は、NGFが前脳基底野コリン作動性ニュ-ロンに対してp75の増加、即ちupregulationを起こす可能性と、NGFの作用がNGPレセプタ-の発現制御によってコントロ-ルされている可能性を示唆している。NGF作用の分子機構をモデルニューロンであるPC12h細胞および培養中枢ニューロンを用いて分子レベルで明らかにすることを目的とする。NGF作用の第一段階は、NGFレセプターとの結合であるので、まずNGFレセプターの発現調節を解析した。NGFレセプターには、低親和性レセプター(LNGFR=p75)と高親和性レセプター(HNGFR=trkA遺伝子産物)の2種類が存在するが、まずp75を解析した。PC12h細胞は、NGFの作用を受けてニューロン様に分化するが、もともとp75を発現している。この発現量を変動させる要因を検索した。PC12h細胞では、NGF自身はp75mRNA発現に影響を与えず、むしろ細胞密度をあげると発現量が上がっていた(しかし、蛋白質レベルでは上昇していなかった)。一方、PC12h細胞の亜株でNGF応答の速いPC12h-R細胞では、NGFによってup-regulationを受けていた。さらにラット培養中枢ニューロンを用いてRT-PCR法でp75mRNA発現量を解析した所、PC12h-R細胞と同様に培養前脳基底野コリン作動性ニューロンにおいても、NGFによってup-regulationを受けていた。このLNGFRのup-regulationの現象がHNGFRにもあてはまるかどうか、trkA mRNA量を同様にRT-PCR法で解析した。その結果、ラット前脳基底野コリン作動性ニューロンにおけるp75mRNAとtrkA mRNA量の発現は共に、NGFによってup-regulationを受けた。しかし、組織での発現パターンに違いがあり、NGFによるup-regulationを受ける時期に違いがあるものと考えられる。NGFはtrkA遺伝子産物であるp140trkAを活性化するこによって、細胞内シグナル伝達を開始するとされている。PC12h細胞およびPC12h-R細胞をNGFで分化誘導したときのp140trkAのチロシンリン酸化パターンを、抗TrkA抗体による免疫沈降物を、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロットする事によって解析した。PC12h細胞とちがってPC12h-R細胞では、NGFによるp140trkAのチロシンリン酸化の持続が見られた。
幾何的論証能力向上のためにパソコンを活用する学習指導法の研究

幾何的論証能力の向上は,幾何的図を「実体」から「記号」と捉えられようになることと関連していると考えられる。本調査で,中学生2年生では,まだ半数の生徒が「記号」と捉えられていないことが分かった。幾何的論証能力の向上に資する幾何授業でのパソコン活用方法を,「説明の教具として」「課題を発展させる教具として」「発見の文脈をつくる教具として」の3つの方向から考案し,教材を開発し授業実践を行ってその有効性を検証した。本研究の具体的目標の一つは,幾何的図の捉え方の相違(実体か,記号か)と幾何的論証能力との相関性を,中学生に対する調査で明らかにすることである。幾何的図の捉え方を問う問題の回答と証明問題の成績とを対応させることによって、この相関性を調べる。そして、図的表記を実体と見る思考から規約的記号と見る思考への変容と幾何的論証能力向上との関係性について考察することである。図的表記を、実体と規約記号のどちらと捉えているかを知るには、図的表記の類似的有契性と規約性のどちらをより信頼できるものと考えているかを調べればよい。24年度は、中学生へのアンケート調査を実施し、証明問題の成績を利用して、相関性を調べた。しかし、有効な相関性が得られなかった。これは、アンケート問題において、極端に歪んだ図を避けたため、図的表記の類似的有契性と規約性のどちらをより信頼するかの判断の明確な相違がとれなかったためと考えている。本研究の第2の具体的目標は,幾何的論証能力の育成に,「図形を分析する前に,まず作らせることから始める」という構成を先行させる指導法が有効であり,特にパソコンの幾何的シミュレーション・ソフトの活用が有効であることを,中学校の授業実践を開発して検証することである。これについては中学校の現場教師の協力を得て、パソコンを幾何学習の教具として、(1)説明の教具として活用、(2)問題を発展的に捉えさせる教具として活用、(3)新しい性質や課題を発見する文脈をつくるための教具として活用の3つの活用方法を考察・授業実践した。特に、(2)の活用では、証明の対象となっている図を動的に変化させることによって、証明とはある条件下での性質の不変性を扱っていることを生徒に意識化させ、図の場合分けと証明記述の変化との対応を考察させるという画期的な証明活動を中学校の授業で実現することができた。本研究の目標の一つは,幾何的図の捉え方の相違(実体か,記号か)と幾何的論証能力との相関性を,中学生に対する調査で明らかにすることである。そして、幾何的図を実体と見る思考から規約的記号と見る思考への変容と幾何的論証能力向上との関係性について考察することである。幾何的図の捉え方の相違を調べるため,図の類似的有契性と規約性のどちらをより信頼しているかをみるための図を改めて作り直して調査を実施した。生徒の回答からは,図の類似的有契性と規約性のどちらをより信頼できるかの判断に明確な相違が見られ,その根拠は,幾何的図の捉え方の相違を反映していることが明らかになった。また、証明問題の成績を利用してその相違と証明能力との相関性を調べた。しかし,証明問題の成績の十分なデータの数が得られなかったため,幾何的図の捉え方と証明能力との相関性については,量的に有意な結論は得られなかった。これは,今後の課題である。本研究の第2の目標は,幾何的論証能力の育成に,パソコンの幾何的シミュレーションソフトの活用が有効であることを,中学校の授業実践を開発して検証することである。これについては中学校の現場教師の協力を得て,幾何的問題を発展的に捉えさせる教具としてパソコンを活用する授業実践を開発した。パソコンの幾何的シミュレーションを活用して,証明する図を動的に変化させることによって、証明の記述対象が,ある性質に関する条件下で不変性であることを生徒に意識させることができた。また,図の場合分けと証明記述の変化との対応を考察させることも実践することができた。この実践と論証能力向上との因果関係について,上記調査アンケートが完成できなかったため量的分析を行うことはできなかったが,論証活動に対する生徒の意欲・関心・思考態度の向上など,生徒の論証能力の質的変容は,実践した数学教師の主観的判断では明らかとなった。本研究の目的の一つは,幾何的図の捉え方の相違(実体か,記号か)と幾何的論証能力との相関性を中学生に対する調査で明らかにすることである。幾何的図の捉え方を問う問題と証明問題を解かせることによって、この相関性を調べる。そして、図的表記を実体と見る思考から規約的記号とみる思考への発達と幾何的論証能力向上との関係性について考察することである。図的表記を,実体と規約的記号のどちらと捉えているかを知るには,図的表記の類似的有契性と規約性のどちらをより信頼できると考えているかを調べればよい。23年度はこれを調べる質問紙を作成した。

中学校の現場教師の協力を得て、中学生へのアンケート調査を依頼した。しかし、このアンケートの回収は、23年度中はまだ終わっていない。また、幾何的論証能力をみる問題は、証明問題に対する成績を利用できることになったが、データの回収は、23年度中はまだ終わっていない。本研究の第2の目的は,幾何的論証能力の育成に,「図形を分析する前に,まず作らせることから始める」という構成を先行させる指導法が有効であり,特にパソコンの幾何的シミュレーション・ソフトの活用が有効であることを,中学校の授業実践を開発して検証することである。これについては中学校の現場教師の協力を準備を整え、試行的検討を行ってきた。まず、実践現場に持ち込めるパソコンとプロジェクターを揃え,パソコンの幾何的シミュレーション・ソフトCbriIIの個人ライセンスを購入した。そして、その使い方を協力者の中学校教師に指導し、技術やノウハウを取得したもらった。また、中学校数学教材で、シミュレーション・ソフトを活用できる教材について検討し、試行的に幾何の授業でパソコンを活用する実践を行った。しかし、本格的な実践的研究には至っていない。本研究は、実践的研究を基本にしているので、教育現場の制約に合わせざるを得ないところに、研究の達成度が十分でないところがある。しかし、24年度は、中学校現場教師の協力を得て、アンケートの回収と生徒の幾何的論証能力に関わる成績の提供を得たので、ほぼ計画通りに研究が進められた。ただ、期待した分析結果が得られなかった。しかし、アンケートの改良点が明らかになったので、アンケートを改良し25年度に再度、調査・研究を進める。パソコンを活用する幾何の学習指導については、24年度は、中学校現場教師の積極的な協力を得て、教材開発・授業設計・授業実践を計画通りに行うことができた。ただし、その授業の幾何的論証能力向上への効果については、アンケート分析が期待通りの結果が得られなかったために、それを評価する量的分析はできていない。しかし、授業ビデオや生徒の記述したものを分析すると、質的には有効性を検証することができた。やや遅れている理由は、パソコン機器と幾何のシュミレーションソフトを教室に持ち込むためには、その操作や活用の基本的方法について、現場教師に十分習得してもらう必要があったからである。パソコンを活用することの教育的意義の理解も含めて、このための時間がかなり必要であった。また、本研究は、実践的研究を基本にしているので、教育現場の様々な制約にあわせざるを得なかったことも、研究がやや遅れている主要な原因の一つである。例えば、学習指導内容が代数や関数である時期に、本研究が対象としている幾何の授業を実践することは難しく、幾何的内容でのパソコン活用の実践的検討は、3学期(1月3月)に行わざるを得なかった。また、論証能力の調査も証明が指導された後に行わざるを得ず、このため、調査・分析を23年度中に修了することができなかったのである。ただし、今年度は、パソコン機器やソフトも一通り調え、協力者の現場教師の理解も十分得られ、また、研究会への参加で有益な情報を得たので、24年度に向けた研究の基礎的な準備は調えることはできた。幾何的図の捉え方を問う問題の図は、平成24年度に行ったアンケートの結果、改良点が明らかになったので、25年度は図を改善し、再度アンケート調査を行う。
自然な運転状況の中での人間-機械双中心型多層的追突回避マネジメント

本研究課題は,ドライバの自然な運転状況の中での追突リスクの多層的マネジメントを実現するための枠組みと,その実現に必要な要素技術を構築した.具体的には, (1)無拘束実時間ディストラクション検出手法と,香り提示に基づくディストラクション解消技術,(2)追突リスクとその認知の評価のための解析ツール,(3)視覚と聴覚の特性を生かしたリスク認知ギャップの知覚支援技術,(4)警報との接続をふまえた自動ブレーキロジック,である.本研究課題は,ドライバの自然な運転状況の中での追突リスクの多層的マネジメントを実現するための枠組みと,その実現に必要な要素技術を構築した.具体的には, (1)無拘束実時間ディストラクション検出手法と,香り提示に基づくディストラクション解消技術,(2)追突リスクとその認知の評価のための解析ツール,(3)視覚と聴覚の特性を生かしたリスク認知ギャップの知覚支援技術,(4)警報との接続をふまえた自動ブレーキロジック,である.視線位置情報,脈波などの指標を用いて,ドライバの認知的ディストラクション(いわゆる意識の脇見)の実時間検出技術の高精度化を行い,脈波の解析ではワークロードの度合を識別できることを見出したとともに,視線位置情報の解析では,認知的負荷を伴わないディストラクションの検知の可能性を見出した.段階的なリスク認知支援方法の開発に向け,注意喚起による支援の必要性および有用性を検証した.その結果,先行車が減速する可能性のある場面に対して予め注意を喚起することで,追突リスクを低減できる可能性があることを明らかにした.NIRSを用いて,ACC(Adaptive Cruise Control)による運転の負担軽減をドライビングシミュレータ実験にて,脳活動から評価した.22名の被験者を計測した結果,通常時と比較してACC利用時は,運転操作に関連した脳活動が見られないことが統計的に有意に確認できた.香り提示によるメインタスクに対するディストラクションの低減およびタスクパフォーマンスの向上のメカニズムについて,主として,心電のゆらぎ,f-NIRSによる脳血流を基に明確にした.夜間走行環境下において歩行者との追突リスクを連続的に視覚情報提示することで,ドライバが歩行者との追突リスクを把握可能となり,結果として追突に対する危険性が低減されうることをドライビングシミュレータ実験によって検証した.衝突リスクを考慮した,作動タイミングおよび目標収束状態を変更できる自動ブレーキロジックの開発を行った.また作動タイミングの設計手法確立を目指し,動作タイミング変化が運転行動に及ぼす影響を調査し,タイミング変化によって行動変化が低減できる可能性を示唆する結果を得た.認知的ディストラクション検出の高精度化をふまえ,心的状態を考慮にいれた追突リスク評価手法を検討し、場合によっては車間を空けていても安全ではないことがあることを定量的に確認した.不確実な状況の認知を支援する注意喚起により,脇見状態の時に先行車が急減速するような状況に対しても,追突リスクを低減できることを実験によって確かめた.前方障害物衝突警報によるドライバの注意力の変化を評価した.シミュレータで先行車の急減速実験を行い,ドライバの脳活動を近赤外分光装置を用いて計測した結果,警報の有無により脳活動に違いがあることを確認した.音声と香りを組み合わせた注意喚起システムの有効性をシミュレータ実験で検証し,実験で得られた運転行動データを基に,ディストラクションの低減効果を検証するためのドライバ・環境モデルを構築した.誤報や欠報が生じる歩行者衝突警報を連続的な視覚情報ならびに聴覚情報で提示することで,正報時には歩行者回避に有効であるが,欠報時や誤報時には危険な状況を招きうることをシミュレータ実験により確認した.先行車に対する衝突リスクを評価する衝突回避減速度の計算方法を改良することで,従来手法よりも適切に衝突リスクを評価できることを閉ループシミュレーションにより示した.リスク感覚に基づく衝突回避ブレーキの介入タイミングがドライバの平時運転行動と緊急時運転行動へ及ぼす影響を調査した.その結果,ドライバのブレーキタイミングよりもある一定量ブレーキ介入を遅くすることによって,危険側への行動変化が少なくなる傾向を見出した,また,周辺車両に対する衝突リスクと,視認行動の関係からドライバの注意配分傾向を定量化する手法を提案し,急ぎ運転の検出の効果を見出した.1.認知的ディストラクションの非拘束・実時間検出技術の高精度化を行うとともに,心的状態を考慮に入れた追突リスク評価手法の構築を行った.車間距離が長くとも,結果的に危険となりうる事態のメカニズムを明らかにした.追突リスクツールボックスの作成を行って,近日中に公開予定である.2.注意喚起と警報の方法の在り方について,これまでの実験的検討を踏まえて理論的整備を行った.注意喚起と警報との多層支援によって,追突リスクの低減効果が高まる可能性があることを明らかにした.3.NIRS計測装置を用いて,先行車追従時における前方車両衝突警報がドライバの脳機能に及ぼす影響についての詳細な解析を行った.その結果,注意をより必要とする前方衝突警報なしの場合において,脳活動が顕著であることが確認できた.4.運転環境での香り供給による心理的ディストラクション抑制方法を構築する.具体的には,ディストラクションの低減効果を定量的に分析することが可能な,時系列での信頼性モデルを提案した,5.車両状態としての追突リスクとドライバの行動を比較し,両者に生じうるギャップをドライバが知覚できるように支援する技術を構築した.これは,衝突回避減速度を視覚・聴覚情報として提示するシステムであり,実験によって安全性の向上が確認された.

6.追突回避ブレーキを含む多層的回避支援技術が導入された際の,平時のドライバの運転行動変化を踏まえた回避ブレーキ手法の適合手法を構築する.ドライバのブレーキタイミングよりも遅く制御介入するタイミングに設定することで,少しでも危険な運転行動変容を抑える効果があることが示唆された.
ヒト胚性幹細胞からの心筋分化機構の解明

平成20年度は、ヒト胚性幹細胞から分化した心筋が、実際マウスで報告されているように、中胚葉細胞を経て心筋に分化するかどうかを検討した。ヒト胚性幹細胞をOP-9ストローマ細胞上で分化培養すると、分化6日目から中胚葉系マーカーであるFetal Liver Kinase 1(Flk1)陽性細胞が出現する。このFlk1陽性細胞を分離回収することで有効に心筋分化する細胞が得られるか検討した。Flk1陽性細胞の割合は分化8日目から増加し、10日目でも同様の割合で確認された。このFlk1陽性細胞をCell Sorterで分離回収し、さらにOP-9ストローマ細胞上で分化培養させた。一部の細胞は血球系の細胞、内皮シート形態を持ったコロニーに分化した。PCR法ではANF、MLC2a、Cardiac Actin、ANPなどの心筋マーカーの発現上昇が見られたが,明らかな心筋収縮は同定されなかった。この原因が細胞をCell Sorterで分離回収する際に細胞を単一細胞にしなければならないために細胞のViability低下が起きる結果と考え、Flk1陽性細胞を回収後にSuspension Cultureで更にEmbryoid Bodyを作製した。この時、細胞増殖を助長するRock Inhibitorを添加した。我々は、このRock Inhibitorを添加することで、単一細胞レベルの未分化ヒト胚性幹細胞が有効にEmbryoid Bodyを形成することを確認している。Rock Inhibitorを添加した培養液中でFlk1陽性細胞は径50-100μm程度のEmbryoid Bodyを形成した。現在、このEmbryoid BodyをさらにゼラチンディッシュまたはOP-9ストローマ細胞上で分化培養し、心筋分化を確認しているところであり、研究を継続中である。ヒト胚性幹細胞をペトリまたはウルトラロウアッタチメントディッシュを用いて7日から10日間サスペンションカルチヤーを行うか、またはハンギングドロップ法で7日から10日間培養し、胚葉体を作製した後、この胚業体をゼラチンコートディッシュ上でさらに培養することで先ずは中胚葉系マーカーであるGATA4やFlklの発現がmRNAレベルで確認され、培養細胞が中胚葉分化していることが確認された。これらを更に培養することでANF、ANP、BNP、MLC2V、MLC2a、cardiac Actinなどの分化した心筋マーカーの発現がmRNAレベルで確認された。また、免疫染色においてもcardiac Troponin IやBNPなどの心筋特異的マーカーやギヤップジヤンクションフーカーであるConnexin43の発現が確認された。これらの中から心筋内皮を有効に分離するため、中胚葉マーカーであるFlk1を用いて細胞回収することを試みた。未分化ヒト胚性幹細胞はOP-9ストローマー上で8日から10日間、分化培養することで、Flk1を発現する。この発現効率はUmeda K et al.がDevelopment 2004に記載しているサル胚性幹細胞のものとほぼ同程度である。このFlk1陽性ヒト胚性幹細胞を回収し、OP-9ストローマ細胞土でさらに分化培養すること心筋と同じ側板中胚栗原基である内皮や血球への分化を確認することができた。収縮コロニーとして特徴づけられる心筋コロニーは未だ確認されていないが、ANF、ANP、BNP、MLC2V、MLC2a、cardiac Actinなどの心筋マーカーの発現はmRNAレベルで確認された。今後、Flk1陰性細胞と比較検討し、Flk1陽性細胞からの心筋分化効率が優位に高ければ、マウスで確認されている心筋前駆細胞にFlk1が発現しているという裏付けがヒト胚性幹細胞でも確認できる。