hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幼児教育の質が実行機能ならびに認知能力に及ぼす影響―遊びの充実を視点として－

本研究の大きな柱の一つが、幼児教育の質が、ワーキングメモリを含む認知機能にいかなる影響を及ぼすのかといった点について検証を行うことであり、もう一つが、遊びを中心とした包括的トレーニングを短期縦断的に実施し、その効果を検証することである。現時点までに、幼児教育の質に関して、文献を整理するとともに、イギリスのOfstedの取り組みを参考に、幼児教育の質をいかにアセスメントすることができるかといった点について参考資料を得、論文としてまとめることができた。同研究を補足するために、イギリス教育省でミーティングを行い、イギリスで採用されている幼児教育の質を測定する尺度について情報交換を行った。また、British Dyslexia Associationに参加し、ワーキングメモリの実践場面での応用に関して情報収集を行った。また、包括的トレーニングの内容を検討するため、特に、自然の中での子どもの遊びに着目し、新たなフィールドにて観察研究を開始した。その結果、幼児教育の質の影響を認知機能だけではとらえきれないことが示唆された。また、昨年度に引き続きわらべうたに関する調査・文献研究を重なってきたところ、特に幼児期においては、わらべうたを介した関わりが、親子関係の質にも影響しうることが示唆された。そのため、包括的トレーニングの影響として、子どもの認知機能だけではなく、情動面にも着目すること、加えて、親のマインドセットの変化についても、明らかにしていくことを決定した。それらの結果を踏まえ、次年度に向けた包括的トレーニングの内容を精査し、プログラムの立案を行った。現在、研究実施に向け、協力園側と調整している段階である。アセスメントについては、他の研究で進行中であったテストバッテリーの開発を待つこととなったが、年度の後半になったため、包括的トレーニングの実施とその効果についての検証は、次年度に行うこととなった。ワーキングメモリテストバッテリーについて,アップル社製のソフト開発は,別研究で進行中である。その開発終了を受け,本研究では,アップル社製ipadを購入し,子どもたちのワーキングメモリについて,簡便に測定していくことができるよう準備を進めていく予定である。今年度の課題を受け,次年度,新たに遊びの構造分析を行うとともに,作業中心型の園の選出,あるいは,分類方法の変更等について検討を行う。その上で,幼稚園・保育園の協力を得て,具体的にアセスメントに着手していきたい。療育場面で予備的に実施し,各局面での活動が,子どもの興味・関心を高め,より効果的なものになるよう専門家と相談し,プログラムを改良する。また,ワーキングメモリの小さい年長幼児10名程度の子どもたちを対象とした遊びを中心とした活動を行い,その効果を量的・質的に分析することとする。現時点で収集している遊び場面でのエピソードなど,幼児教育の質と関連させて,論文化していく。アセスメントについては、開発が終了したため、次年度の早期に実験を実施する計画を進めている。
連続鋳造における鋳型内潤滑挙動に関する研究

本研究では、鋼の製造プロセスである連続鋳造において、連鋳鋳片の品質を大きく左右する鋳型内の潤滑現象を明らかにすることを目的としている。その中でも特に、鋳型/鋳片間に流れ込むモールドパウダーの潤滑挙動をデジタルビデオカメラを用いてメニスカス近傍を直接観察することによって、諸現象を明らかにすることを目的とした。昨年度は、連続鋳造を模擬した実験装置を製作し、鋳型内のモールドパウダーの潤滑挙動に着目し、ビデオカメラによる直接観察からポジティブストリップ期にモールドパウダーが流入していることが判明した。また、鋳型/鋳片間の摩擦力を鋳型に設置したロードセルの荷重より摩擦力を算出した結果、鋳型振動がサイン振動の場合、鋳造速度の増加、振動数の増加、振幅の減少により鋳型/鋳片間の摩擦力が増大し、潤滑が悪化することが判明した。昨年度の結果を元に、鋳型振動方式を非サイン振動に変化させて同様の実験を行った。また、鋳型/鋳片間の流れに関して、溶融モールドパウダーの流れを非圧縮性粘性流体と仮定し1次元のNavier-Stokesの方程式を適用し、計算モデルを構築してシミュレーション計算を行った。シミュレーションにおいては、溶融モールドパウダーに加わる剪断応力を鋳型/鋳片間の摩擦力と等しいと仮定した。その結果、非サイン振動は、サイン振動と同様に鋳造速度の増加、振動数の増加、振幅の減少によって摩擦力が増加すること、また、非サイン振動はサイン振動と比較して摩擦力が減少し、潤滑が向上するという実験結果が得られた。一方、計算シミュレーションによる鋳型/鋳片間の摩擦力の評価を行った結果、鋳造速度の増加、振動数の増加、ひずみ率の減少に伴い、流体の剪断応力は増加し、鋳型/鋳片間の摩擦力が増加する結果が得られた。これは、鋳造実験による結果と一致した。その中でも特に、鋳型/鋳片間に流れ込むモ-ルドパウダーの潤滑挙動および連鋳鋳片に生成するオシレーションマークの生成をデジタルビデオカメラを用いてメニスカス近傍を直接観察することによって、諸現象を明らかにすることを目的とした。研究開始の本年度は、連続鋳造を模擬した実験装置を製作し、鋳型内のモ-ルドパウダーの潤滑挙動を中心に実験を行った。メタルにはSn-Pb低融点合金、擬似モ-ルドパウダーにはステアリン酸を用いて鋳造実験を行った。モ-ルドパウダーの潤滑挙動は、ステアリン酸に混ぜたAl_2O_3粉末のトレーサーの動きを追いかけることによって定量化を行った。また鋳型/鋳片間において生じる摩擦力の測定のために、鋳型の重量をロードセルによって測定することによって、摩擦力を算出した。また鋳片の品質の指標であるオシレーションマーク深さを測定した。その結果、デジタルビデオカメラによる直接観察からは、メニスカスより67mm上の部分におけるパウダーは、鋳型と同周期・同位相・同方向の速度ベクトルで動いていること、また鋳型/鋳片の隙間においては、tp期、特に鋳型上昇速度が最大になる時を中心に流入していることが観察された。また、鋳型/鋳片間の潤滑挙動の指標として用いた鋳型/鋳片間の摩擦力を測定した結果、同じ振幅で比較すると、オシレーションの振動数が減少する、つまりtp時間が増加するにつれて、摩擦力が減少する傾向が見られた。また、同じ振動数で振幅を変化させた実験においては、振幅を大きくすると摩擦力が減少するのが見られた。また、オシレーションマーク深さについては、従来の知見通り、tn時間の増加に伴い、オシレーションマーク深さが増加する結果が得られた。また、摩擦力の結果と同じ通り、振幅が大きくなるにつれて、オシレーションマーク深さが減少する傾向がみられた。

一方、計算シミュレーションによる鋳型/鋳片間の摩擦力の評価を行った結果、鋳造速度の増加、振動数の増加、ひずみ率の減少に伴い、流体の剪断応力は増加し、鋳型/鋳片間の摩擦力が増加する結果が得られた。これは、鋳造実験による結果と一致した。
肝細胞癌に対する新規肝動脈化学塞栓物質の開発：視認性の高い薬剤徐放性ビーズ

前年度までに作製工程を構築したポリカプロラクトン-リピオドール-ミリプラチン含浸ビーズに関して,今年度は更に作成回路の流量や融解溶液の注入量などの細かなパラメータ調整を行った.100μm前後からの微細粒子径のビーズの供給システムの作製精度と安定性向上を得ることができた.CTを用いたX線視認性評価も繰り返し行い,X線吸収値の安定性も高めることができた.ii)in vitrostudy:ウサギ腎動脈を用いたリピオドール溶解液状塞栓物質の末梢到達性の試験リピオドールの生体血管内注入後の挙動と毒性を詳細評価するための動物実験を行った.ウサギの腎動脈を対象に,リピオドールと永久塞栓物質(NBCA: n-Butyl-cyanoacrylate)の混合液を,温度や配合比などの調剤条件を変えることで,粘稠度や血液との反応速度を調整して注入した.その後の血管内の挙動を,高精細CTを用いた画像評価と病理学的評価を行った.温度条件では60度以上の高温では粘稠度低減のために連続性の末梢到達性が高くなり,4度の冷却下では血液との重合反応が障害されることで,微細な血管内への断続性の分布が確認された.また,いずれの条件においてもリピオドールのみによる血管毒性は認められなかった.今回の結果を更にin vitro studyにフィードバックして,肝動脈化学塞栓術への導入を目指す計画を立てた.iii)成果の発信:学会発表及び論文作成結果の一部の新知見に関して,欧州インターベンショナルラジオロジー学会(CIRSE2018)などの国際学会で発表した.現在,英語論文を校正中である.i)in vitrostudy:ポリカプロラクトン-リピオドール-ミリプラチン含浸ビーズ(新規DEB)の作製リピオドールにミリプラチンを混合したものとポリカプロラクトンを混合して撹拌することにより,両社が混じり合い分散した溶融流体を作製した.高温環境下におけるリピオドールの酸化は特別に作成した装置を使用した.更に流体装置を作成し,溶融状態の混合溶液を,高温環境の流水によって球体に引きちぎり,徐々に流水を低温環境へシフトさせることにより,球体を固化させてビーズを作製することが出来た.流水の速度,溶融流体の押出速度を制御することにより,作製ビーズの径を変化させることも可能となった.固化の際,ビーズが球状のまま維持させるため,ミキサーを導入し,撹拌するよう行程を改善した.溶融流体にミリプラチンを混合させ,ミリプラチン含浸ビーズ(新規DEB)を作製した.今後は,チューブを流れる水の流量,単位時間あたりの溶融溶液のインジェクション量,溶融溶液の温度パラメータ調節による粘度をそれぞれ最適化し,さらなる平均粒子径の最適化をおこない,得られる粒子径分布図がより鋭いピークを有することを目指す.大腿筋内VX2担がんウサギより腫瘍を摘出して肝臓へ移植し,VX2肝腫瘍担癌ウサギを作成する.そして,VX2ウサギ肝腫瘍に対して新規DEBを用いたTACEを行うことで,1新規DEBの生体内でのX線視認性の評価,2血中および腫瘍内白金濃度測定によるTACE後薬剤徐放効果の評価,3病理学的評価による抗腫瘍効果の評価を行う予定である.安定した新規DEBの供給は実現可能な段階にあり,今後は動物実験を推し進めてゆく予定である.i)in vitrostudy:ポリカプロラクトン-リピオドール-ミリプラチン含浸ビーズ(新規DEB)の作製前年度に作成した,リピオドールにミリプラチンとポリカプロラクトンを混合して作成した溶融流体を作製した.溶融流体にミリプラチンを混合させ,ミリプラチン含浸ビーズ(新規DEB)を作製した.今年度は,チューブを流れる水の流量,単位時間あたりの溶融溶液のインジェクション量,溶融溶液の温度パラメータ調節による粘度をそれぞれ最適化することで,安定した粒子径の新規DEBを作成することができた.新規DEBのX線透過性は,CT検査を用いて行った.大腿筋内VX2担がんウサギより腫瘍を摘出して肝臓へ移植し,VX2肝腫瘍担癌ウサギを作成した.癌腫瘍の摘出量,撹拌方法の調整を経て,一定のサイズの肝腫瘍を作成することができた.また,正常ウサギ肝動脈内にin vitro studyで作成した新規DEBを用いたTACEを行うことで,新規DEBの生体内でのX線視認性の評価を行った.新規DEBが,ウサギ体内でのX線視認性がTACE導入のために十分許容できる程度であることが確認された.引き続き,VX2肝腫瘍担癌ウサギに対するTACEを行い,血中および腫瘍内白金濃度測定によるTACE後薬剤徐放効果の評価と,病理学的評価による抗腫瘍効果の評価を行う予定である.本年度は,安定したビーズの作製および評価,およびVX2肝腫瘍担癌ウサギを作成に想定以上の時間を要したため,進行予定であったin vivo studyの評価が遅れている.前年度までに作製工程を構築したポリカプロラクトン-リピオドール-ミリプラチン含浸ビーズに関して,今年度は更に作成回路の流量や融解溶液の注入量などの細かなパラメータ調整を行った.100μm前後からの微細粒子径のビーズの供給システムの作製精度と安定性向上を得ることができた.CTを用いたX線視認性評価も繰り返し行い,X線吸収値の安定性も高めることができた.ii)in vitrostudy:ウサギ腎動脈を用いたリピオドール溶解液状塞栓物質の末梢到達性の試験リピオドールの生体血管内注入後の挙動と毒性を詳細評価するための動物実験を行った.

ウサギの腎動脈を対象に,リピオドールと永久塞栓物質(NBCA: n-Butyl-cyanoacrylate)の混合液を,温度や配合比などの調剤条件を変えることで,粘稠度や血液との反応速度を調整して注入した.その後の血管内の挙動を,高精細CTを用いた画像評価と病理学的評価を行った.温度条件では60度以上の高温では粘稠度低減のために連続性の末梢到達性が高くなり,4度の冷却下では血液との重合反応が障害されることで,微細な血管内への断続性の分布が確認された.また,いずれの条件においてもリピオドールのみによる血管毒性は認められなかった.今回の結果を更にin vitro studyにフィードバックして,肝動脈化学塞栓術への導入を目指す計画を立てた.iii)成果の発信:学会発表及び論文作成結果の一部の新知見に関して,欧州インターベンショナルラジオロジー学会(CIRSE2018)などの国際学会で発表した.現在,英語論文を校正中である.本年度はin vitro studyを中心に研究を進めた.安定したビーズの作製は可能となり,この点は順調に進んでいる.しかし,同時に進行開始しようと計画していたin vivostudyにはまだ着手できておらず,次年度は動物実験を中心に臨床応用の可否の検討を深めてゆく.研究計画の大筋に変更はない.引き続き,VX2肝腫瘍担癌ウサギに対するTACEを行い,血中および腫瘍内白金濃度測定によるTACE後薬剤徐放効果の評価と,病理学的評価による抗腫瘍効果の評価を行う予定である.in vivo studyに着手出来ず,動物実験に使用予定であった予算が繰り越された.動物実験を行い,必要備品,施設使用料として使用する.
腎癌におけるFGFR4の働きと新規治療戦略の開発

淡明型腎細胞癌遺伝子網羅解析の結果、FGFR4遺伝子コピー数の増加が特徴的であることから、FGFR4の淡明型腎細胞癌増殖における役割を調査し、新規治療標的としての可能性について検討を行った。腎癌患者臨床検体と細胞株を用いて、免疫組織化学染色、ウエスタンブロットとqRT-PCR法で、FGFR4蛋白発現量と遺伝子数の関連を認めた。siRNA法によるFGFR4ノックダウンを行い、細胞生存を評価したところ、FGFR4ノックダウンによって細胞死が誘導され、細胞内増殖因子のリン酸化阻害も認めた。選択的FGFR4阻害剤のBLU9931を用いても同様の結果が得られ、細胞死解析でもアポトーシス誘導が示唆された。腎癌細胞株におけるFGFR4の発現を確認したところ確認したすべての細胞株、ACHN、A498、A704、769Pで発現が確認された。その後、A498株を用いてsiRNA法を用いて、FGFR4の発現を抑制したところ、細胞増殖抑制が確認された。また、ERK1/2のリン酸化抑制が観察された。今後、細胞株におけるFGFR4のコピー数異常の有無をPCR法にて確認する。また、FGFR4阻害剤であるBLU9931による効果がsiRNA法による阻害と同様の効果を示すか確認する。これらの効果と増殖因子下流のカスケード(Ras/Raf/MAPK回路、PIP3/Akt/mTOR回路、ERK5回路)との関連について検討する。さらにBLU9931の臨床応用の可能性を検討するため、ヒト腎癌細胞株移植モデルに対するBLU9931の効果をin vivoで検討する。BLU9931については、既存の腎癌治療薬であるスニチニブ、アキシチニブ、ソラフェニブ、FGFR1、2、3阻害剤であるドビチニブとの併用効果をin vitro、in vivoで確認する。さらにマウスでスニチニブ、アキシチニブ耐性株を作成し、腫瘍でのFGFの血漿濃度を測定、FGFRの発現をウェスタンブロット法で確認する。また、これらのマウスにBLU9931を投与し、効果を検討する。また、臨床検体について、PCR法でFGFR4の遺伝子増幅とFGFR4発現の関連を調査、FGFR4発現と予後の調査、FGFR4発現と腎癌治療薬剤の効果との関連を解析する。siRNAのdsRNAの配列の決定に時間がかかり、当初の予定より遅れている。日本人の淡明型腎癌患者を対象に統合的遺伝子網羅解析によると約60%の癌でFGFR4の遺伝子増幅が報告されている。欧米での検討では10%程度であり、この異常は日本人で多いと考えられる。近年、肝癌領域でFGFR4阻害剤の有効性が報告され、臨床試験が開始されている。淡明型腎癌では高率にFGFR4遺伝子増幅を認めており、FGFR4が腎癌治療おいて標的になることを仮説とし、検討を行った。まず手術摘出標本でFGFR4の遺伝子増幅及び発現亢進している症例を多数認めることを確認した。ヒト腎癌細胞株においてFGFR4のコピー数を計測したところ、淡明型腎癌細胞株では3倍体以上であった一方、正常細胞と乳頭状型腎癌細胞株ACHNでは2倍体であった。淡明型腎癌細胞株では概ねFGFR4のコピー数とFGFR4のタンパク発現に相関がみられたが、786Oについては3倍体であったにもかかわらずFGFR4の発現は軽度でACHNと同程度であった。FGFR4特異的阻害剤BLU9931を細胞株に添加したところ、FGFR4のタンパク発現が低かった786O、ACHN、正常尿細管細胞株では細胞増殖抑制効果を見せなかった一方、その他の淡明型腎細胞がん株769P、A498、A704では細胞増殖抑制効果を示した。これらの細胞株についてはBLU9931添加によってAkt、STAT3、ERK1/2のリン酸化レベルの低下が観察された。769P、A498、A704についてsiRNA技術を用いてFGFR4の発現を抑制したところ、BLU9931添加と同様、細胞増殖抑制効果、およびAkt、STAT3、ERK1/2のリン酸化レベルの低下が観察された。siRNAの検討も結果がでており、以降は順調に進んでおり、今のところ、計画通りに進める予定である。泌尿器科悪性腫瘍実際の研究計画より遅れが若干あり、次年度使用額が生じた。抗体購入などに使用
摘出胎児脳神経標本を用いた神経伝達物質欠損マウスの自律神経中枢の電気生理学的研究

多くの神経伝達(候補)物質は個体の生存にとって極めて重要である場合が多く、従ってその完全欠損体の多くは致死性であることが予想される。そこで、本研究の目的は、神経伝達物質欠損マウスの胎児から摘出した延髄-脊髄標本を用いて自律神経中枢の神経伝達機構の電気生理学的解析を行うことであった。本研究で用いる摘出ブロック標本は、上述の隘路を避けられるだけでなく、解剖学的構築が良く保たれているために、特定の生理機能を担った神経細胞についての研究が可能であるという長所がある。さらに、胎児あるいは新生時の脳神経は、その未熟さ故に可塑性も高く、本研究領域に適した実験材料である。本研究では、具体的に、エンドセリン(ET)-1遺伝子ノックアウトマウスを交配・維持し、完全欠損体の胎児を随時作成し、以下の実験に供した。対照として遺伝背景が同一の野性型の胎児を用いた。1.出産予定日に帝王切開により胎児を摘出し、完全欠損体から延髄-脊髄標本を素早く作成し酸素で飽和させた栄養液中で維持した。2.調べる神経伝達機構として、呼吸調節に注目し、第4頚髄前根に装着した吸引電極から、呼吸関連自発群放電頻度を記録し、グルタミン酸、エンドセリン、炭酸ガスなどの化学刺激に対する応答性を検討した。3.野性型胎児標本の場合には、いずれの刺激によっても再現性のある興奮反応が得られたが、ET-1遺伝子ノックアウトマウスから得られた標本の場合には、炭酸ガス刺激による興奮反応のみが有意に減弱していた。4.実験終了後、組織学的検討を加えたが、ET-1遺伝子ノックアウトマウスにおいても、延髄及び脊髄に明らかな異常を認めなかった。以上の結果から、中枢神経、とくに延髄に存在する内因性のET-1は、中枢化学感受性に重要な役割を果たしていると結論された。
歪多項式環の理論とその応用

1.自己同型型の歪多項式環B[X;P]が素数次のHー分離多項式をもつための必要十分条件は、Bの中でZがZのPによる固定環上のガロア拡大となることを証明した。これは、係数理が可換の場合筆者自身によって得られた結果の拡張となっている。3.体B上の自己同型型歪多項式環B[X:P]=Rのモニックな多項式fが与えられたとき、fで生成されるイデアルI=RfRの生成元、つまりI=Rg=gRとなるモニックな多項式gが存在することは、知られていたが、上のgをfから具体的にアルゴリズムを与えた。全く同様の結果が、体B上の微分型歪多項式環B[X:D]に対しても得られた。4.A⊃Bを可換環のガロア拡大とし、Gをそのガロア群とするとき、トレ-ス1の元が存在する。Gがpー群で、pがAのジャコブソン根基に含まれるときは、トレ-スの1の元の存在のみで、A⊃Bがガロア拡大であるとが証明できた。5.係数環が非可換であるとき微分型歪多項式環B[X:D]のHー分離多項式を中心のガロア拡大で特徴づけることは一般にはできないが、特別な場合は、できることを証明した。B[X:D]が少くとも1つHー分離多項式を含むときは、B[X:D]のすベての分離多項式が決定できることを証明した。
企業金融理論のフロンティア： 動学ゲーム・契約理論に基づく証券選択の基礎づけ

2018年度は当初に提出した研究計画に基づき、企業の資金調達に関する動学的な経済モデルを構築し、そのモデルに基づくシミュレーション作業を行った。この動学的な経済モデルにおいて、節税と倒産の回避を主なインセンティブとするトレードオフ理論に基づいて構築されている。企業は取引コストを考慮に入れつつ、収益性の変動に対して株式と負債の比率を調整していく。シミューレションにおいては、実際のデータから推定されたパラメータを用い、現実に観察される企業の資金調達の頻度を再現することに概ね成功した。更にこのモデルに税制の変化を組み込むことで、過去の税制変動に対して観察された、企業の株式・負債比率の変化を説明することに成功した。この研究成果を国際ジャーナル(The Journal of Financial Economics)に投稿したところ、レフリーからの要望修正を加えた上で、出版することが決定した。更に日本経済学会や日本ファイナンス学会など、各種の関連学会でこの研究成果を報告した。今後の研究を進めていく上で、資金の出し手である投資家の期待リターンを現実のデータに照らし合わせて深く理解することが必要だとの結論に至ったため、それに必要な各種の経済データや、関連文献のサーベイ及び実証分析の手法に関して準備を行った。当初の研究計画に記した通り、研究成果を国際ジャーナルに投稿しており、また各種学会で報告しているため。今後の研究方針としては、研究計画をやや修正し、企業にとって資金の出し手である投資家サイドの期待リターンを現実のデータを用いて、より精緻に求めていく。これは、企業にとって最適な資金調達を議論するに当たって、投資家の期待リターンが時間変動する要因を理解することが必要不可欠であるからである。予定していた学会発表に関して、他の研究予算より支出することが可能となったため次年度使用額が生じることになった。この分は主としてリサーチアシスタントの雇用に用いる予定である。
顎骨骨膜細胞と骨伝導能を有する新規生体吸収性足場を用いた顎骨再生療法の開発

顎骨切除後欠損への低侵襲で効率的な顎骨再建治療の確立を目的に,新規開発された生体活性力を有する生体吸収性足場材料の多孔質u-HA/PDLLA複合体と骨形成細胞として骨膜由来細胞に着目し,治療法開発に向け研究を行った.In vitroにおいて,本足場材料の評価として,骨形成細胞の内部での増殖と分化能について検索をおこなったところ,有意な細胞増殖と骨芽細胞分化亢進が明らかとなった.また,In vivoにてラットを用いた顎骨欠損モデルに移植したところ,従来からの骨補填材料と比較し,有意な骨再生能が形態組織学的検索により明らかとなった.さらに骨膜由来細胞移植は,骨再生を高める可能性が明らかとなった.顎骨切除後欠損への低侵襲で効率的な顎骨再建治療の確立を目的に,新規開発された生体活性力を有する生体吸収性足場材料の多孔質u-HA/PDLLA複合体と骨形成細胞として骨膜由来細胞に着目し,治療法開発に向け研究を行った.In vitroにおいて,本足場材料の評価として,骨形成細胞の内部での増殖と分化能について検索をおこなったところ,有意な細胞増殖と骨芽細胞分化亢進が明らかとなった.また,In vivoにてラットを用いた顎骨欠損モデルに移植したところ,従来からの骨補填材料と比較し,有意な骨再生能が形態組織学的検索により明らかとなった.さらに骨膜由来細胞移植は,骨再生を高める可能性が明らかとなった.本研究は、新規に開発された未焼成ハイドロキシアパタイト(u-HA)とポリ-DL-乳酸(PDLLA)の複合体(3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体)と、安全かつ高効率な誘導が可能な骨形成細胞前駆細胞である顎骨骨膜由来細胞を用い、骨再生治療法確立を目的としている。まず、3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体の物性および生理活性能、細胞培養評価として、in vitroの系にて評価を行った。安定した評価を目的に、骨形成細胞のcell lineより、マウス頭蓋冠由来前骨芽細胞様細胞であるMC-3T3E1細胞を用いて、3次元培養を行った。3次元複合体内での細胞増殖が確認でき、細胞増殖活性および骨形成マーカーの発現検索が可能であった。3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体との比較検討材料として、同一組成で3次元多孔質を有さない緻密構造体を比較研究対象として検索した。3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体上では、比較研究対象間で、細胞増殖活性については有意差を認めなかった。一方で、骨形成メーカーとして、各種骨芽細胞転写因子および分化マーカーについては、mRNAレベルの発現において著明な増強を示した。一方、in vitro研究と並行し、in vivo研究を行った。当初、ウサギ顎骨において検討したが、モデル動物作製の複数予備実験から、組織検索、タンパクレベルでの発現検索を考慮し、ラットを用いて顎骨に顎骨欠損モデルを作製し、評価検討を行った。ラット下顎骨に、Critical bone defectを作製し、同部へ3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体を移植填塞し、1週、2週、4週、8週にて検体採取を行い、骨再生について検索を行った。結果は、1週目より骨再生足場内への骨誘導再生が認められ、2週目以降では著明な新生顎骨形成が見られた。4週では、ほぼ完全な骨形成がみられ、8週では成熟骨形成が明らかとなった。したがって3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体は顎骨再生の足場材料として非常に有用性が高いと考えられた.前年度に引き続き, 26年度前半にIn vitroでのu-HAとポリ-DL-乳酸(PDLLA)の複合体(以下3D-H/PLA)について,前骨芽細胞様細胞株(MC3T3-E1細胞)を用いて,研究を発展展開させた.細胞増殖能および骨芽細胞分化に関してqRT-PCRを用いて転写因子のRunx2,Osterixと,分化マーカーのOsteocalcinの発現を定量評価した.比較対象に,同一組成で3次元多孔質構造を有さない緻密体HA/PDLLAを用いた.一方, In vivoにて前年度に行ったSDラット(オス,10週齢)を用いたCritical bone defectモデルを発展させ, 3D-H/PLAを移植し,比較対象に,緻密体HA/PDLLAと一般的に臨床上用いられるβ-TCPブロックを用いた.1,2,4,8週にて検体を採取し形態組織学的に評価した.細胞増殖活性では,3D-H/PLAと緻密体とで有意差は認めなかった.一方,骨芽細胞分化において,前者は有意に著しい転写因子活性および分化マーカーの発現増強を示した.またIn vivoモデルでは,1週目より3D-H/PLA内への骨誘導再生が認められ, 2週以降では著明な新生顎骨再生が見られ, 4週で顎骨欠損部の骨架橋形成による顎骨再生が確認された.比較対象とした緻密体HA/PDLLAでは有用な顎骨再生は確認できず, β-TCPブロックでは実験群同様に4週で顎骨欠損部の骨架橋形成による顎骨再生が確認された.さらに26年度後半に,研究申請のごとく,ラット顎骨骨膜の器官培養から顎骨骨膜由来細胞を培養誘導し,骨再生の足場として3D-H/PLAを用いた3次元培養を行い,骨形成細胞-足場複合体を作製し,さらに効果的な3D-H/PLAによる顎骨再生が確認された.

今後顎骨再生治療として画期的な治療法確立になりうる可能性が示唆された.口腔顎顔面外科学現在までに、本研究の骨再生の足場材料である3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体をもちいての物性および生理活性能、細胞培養評価としてin vitro系での評価と、in vivo系としてのラットを用いての顎骨欠損モデルを作製し、骨再生および骨形成に関する形態組織学的評価を行えていることから、初年度の研究予定はおおむね予定通りに進行しているものと考えれられる。3次元多孔質u-HA/PDLLA複合体には、顎骨再生に求められる具備条件を有用性たかく有していることが本年度の研究で明らかとなった。あらたな検索内容としては、ラット顎骨骨膜由来の骨形成細胞を培養誘導し、これまでのcell line cellと同様に骨再生に関する評価を行う。また骨膜由来の骨形成細胞をさらに本骨形成足場材料へ応用し、骨再生への有用性を検索する。また本研究により得られた知見について考察を加えた上で、国内および国際的な学術大会での研究成果の報告と学術論文を作成し、国際学術雑誌へ投稿を行う。In vitroでの、骨形成細胞を用いた実験計画は、ほぼ予定通りに進行した。一方、In vivo研究では、当初、ウサギ顎骨にCritical bone defectを作製し、顎骨再生実験を予定していたが、複数予備実験より、ウサギよりもラット下顎骨での顎骨欠損モデルが最適と考えられたため、ラットを使用することとした。したがって、実験動物にかかる費用、管理及び手術にかかる費用が予定していた額よりやや安価であった。今後、In vitro研究もさらに発展させ、またラットを用いたIn vivo研究では、研究成果発展のため、更なる使用動物数も増加が予定されており、概ね本研究にかかる予算請求額と、2年間での使用予定額は、ほぼ予定通りの使用となるものと思われる。
超音波精密測定の研究

超音波精密測定班は、広い周波数域にわたる物質中の音速・吸収の測定法の確立をその主たる目的とする。超音波特定研究の最後の年度にあたり、各分担研究者は3年間の研究をまとめ、多くの成果を挙げた。1.西は液体の超低周波域の断熱圧縮率の新しい測定法を開発したが、その測定の高速かつ高精度化のため、正弦波を重畳した多周波同時測定を行った。中島は微差圧セルを用い、溶媒と溶液とのわずかな圧縮率の差を検出する方法を開発した。2.共振法は100kHz-10MHzの周波数域で有効であるが、高木は平面トランスデューサと凹面反射板の組合せセルを用い、卵白の音速・吸収の測定を、野村は各種水溶液の音波緩和の研究を行った。美宅は2枚の凹面トランスデューサの組合せセルで0.9mlの微量での音波測定とその自動化を試み、また同じセルでパルス測定も行えることを示した。3.パルス法は音波測定のもっとも一般的なものであるが、藤村、坂西はその高精度化と、それによる固体及び生体膜の音波測定を行った。4.ブラッグ反射法は50MHz-2GHzの高周波,超高周波域の技術で、高木はその高精度化を進めてきたが、それをサファイアなど固体に適用した。5.岡野は主として液晶を対象として数Hzから1kHzの低周波の微小なずり弾性測定装置を開発した。6.和田はフッ化ビニリデン-トリフルオロエチレン共重合体を用いて、広帯域トランスデューサ,小型ハイドロホン,トランスデューサアレイ等を製作、その性能評価を行った。柴山は超音波トランスデューサシステムのその支持物も含めての特性評価の方法を研究した。7.高橋は超音波フラクトグラフィーの技術開発のため、横波超音波の振幅測定法を開発した。
韻律・声質の動的特徴および形態素・品詞を考慮した発話意図認識システムの構築

音声,EGG,言語情報,発話スタイル,発話意図を含む自然対話音声データベースを構築した.気息音発声において新たな音響特徴量を提案した.構築したデータベースを利用し,多くの発話意図を伝達する単音節の感動詞(うん,あー,おー,やー,はー,等)を取り上げ,形態素と発話スタイル(音調と声質)との関連構造を解明した.感動詞の音例集を構築し,Web上で公開した.発話意図の識別性を評価し,提案した音響特徴の効果を示した.感動詞の繰り返し発話(うんうん等)に対し,繰り返しの数と音調と機能的役割に関連がみられた.質問系発話において,文末音調が上昇しないものが多くみられ,対人関係における韻律の使い分けも示された.音声,EGG,言語情報,発話スタイル,発話意図を含む自然対話音声データベースを構築した.気息音発声において新たな音響特徴量を提案した.構築したデータベースを利用し,多くの発話意図を伝達する単音節の感動詞(うん,あー,おー,やー,はー,等)を取り上げ,形態素と発話スタイル(音調と声質)との関連構造を解明した.感動詞の音例集を構築し,Web上で公開した.発話意図の識別性を評価し,提案した音響特徴の効果を示した.感動詞の繰り返し発話(うんうん等)に対し,繰り返しの数と音調と機能的役割に関連がみられた.質問系発話において,文末音調が上昇しないものが多くみられ,対人関係における韻律の使い分けも示された.自然対話には,同意の「ええ」,聞き返しの「え?」や驚きの「え!?」のように同じ音素列でも,言い方(発話スタイル)によって表現される意図が変わるものが多くみられる.しかし,発話スタイルの適切な音響的表現は確立されておらず,発話意図との関連も一途ではないため,従来の対話システムは,音素列に相当する発話内容のみを認識するに留まっており,自然対話が円滑に成立しない場合が生じる.本提案では,発話スタイルとして従来の韻律特徴に加え,提案者独自の声質特徴の動的特徴を導入し,形態素や品詞の言語情報も考慮することにより,音素列のみでは正しい意図が伝達出来ない発話の意図認識システムを実現することを目的としている.平成23年度(初年度)には、音声および声帯振動のデータと言語情報,発話スタイル,発話意図の情報を含む自然対話音声データベースの構築を開始した.まず、本研究所で先行研究より収集したデータベースを用い、それぞれの発話に付与されている「発話意図」および「談話機能」のラベルの見直しと整理を行った.また,3名の被験者間の一致度を分析し,ラベルの統一を進めた.言語学の専門家も含め、議論を重ねた結果、これまでのラベルを「発話行為」、「心的態度」、「形態素的表現」、「談話機能」の種類に分けることとした。声質に関する音響特徴分析においては、パラ言語情報を多く伝達する「りきみ」と「気息音」に焦点を当て、後者に関しては国際会議Interspeechでも研究成果の発表を行った。自然対話には,同意の「ええ」,聞き返しの「え?」や驚きの「え!?」のように同じ音素列でも,言い方(発話スタイル)によって表現される意図が変わるものが多くみられる.しかし,発話スタイルの適切な音響的表現は確立されておらず,発話意図との関連も一途ではないため,従来の対話システムは,音素列に相当する発話内容のみを認識するに留まっており,自然対話が円滑に成立しない場合が生じる.本提案では,発話スタイルとして従来の韻律特徴に加え,提案者独自の声質特徴の動的特徴を導入し,形態素や品詞の言語情報も考慮することにより,音素列のみでは正しい意図が伝達出来ない発話の意図認識システムを実現することを目的としている.平成24年度までは,感動詞がもたらす発話意図の分析において,これまで単音節の感動詞(「うん」,「えー」,「おー」,「はー」,「へー」,「やー」など)に焦点を当ててきたが、平成25年度には、「うんうん」や「うんうんうん」のように繰り返し発話される感動詞の音響的および機能的役割の分析を行い,音響学会で発表し,国際会議Speech Prosodyにも論文が採択された.また,句末音響と質問系発話の意図の関連においても,昨年度に続き分析を発展させ,対人関係における韻律の使い分けを証明した.この成果も国際会議Speech Prosodyで論文が採択され,雑誌論文にもまとめて投稿した.自然対話には,同意の「ええ」,聞き返しの「え?」や驚きの「え!?」のように同じ音素列でも,言い方(発話スタイル)によって表現される意図が変わるものが多くみられる.しかし,発話スタイルの適切な音響的表現は確立されておらず,発話意図との関連も一途ではないため,従来の対話システムは,音素列に相当する発話内容のみを認識するに留まっており,自然対話が円滑に成立しない場合が生じる.本提案では,発話スタイルとして従来の韻律特徴に加え,提案者独自の声質特徴の動的特徴を導入し,形態素や品詞の言語情報も考慮することにより,音素列のみでは正しい意図が伝達出来ない発話の意図認識システムを実現することを目的としている.

平成24年度には、自然対話音声データベースを用いて、言語情報と発話スタイルと発話意図の関連を解析した.主に、質問系発話において、句末音調が上昇することが一般的とされる概念に対し、自然発話では文末音調が上昇しないものが数多く観測され、その理由を解明するため、質問の種類を「情報要求」、「真偽要求」、「確認」、「反復的質問」、「相槌的質問」などに分類し、句末音調と句末の形態素によって分析を行った。その研究成果を国内会議で報告し、会場のフィードバックを基に、国際会議Interspeechにも投稿した。また、パラ言語情報を多く伝達する感動詞において、自然発話データベースから得られたサンプルを分析して感動詞の音例集を構築し、日本語学習者の発音教育への活用を目指している。このテーマに関しても国際会議で発表し、高い評価を得ている。平成23年度の目標として、「対話音声データベースの構築」、「韻律と声質に関わる音響特徴抽出」および「言語情報の解析」の項目が掲げられているが、データベースに重要なパラ言語情報のラベルが付与され、韻律・声質に関連する音響特徴の改善を試み、パラ言語情報の伝達における言語情報の影響を分析することにより、すべての項目が順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の目標として「言語情報の解析」および「発話スタイルと発話意図との関連構造の解明」の項目が掲げられているが、データベースに形態素なの言語情報や、感動詞および質問発話に対して新たなパラ言語情報のラベルが付与され、これらの情報と句末の韻律との関連性を追及した分析が進められ、計画通りに順調に進展している。今後の研究も計画書に沿って、進める予定である。平成24年度には、平成23年度の項目を引き続け、「発話スタイルと発話意図との関連構造の解明」という新たな項目を進める。ここでは、データベースに付与されたラベル情報を基に、言い方と伝達される意図の関連性を導き出し、この関連性は1対1の関係ではないことも理解しつつ、言語情報がいかに影響しているのかを分析する。平成25年度には、これまで得られた知見と情報を基に、「発話意図認識システムの構築」および「評価実験」の項目を進める。形態素別に発話意図と発話スタイルを関連づけた辞書を構築し、発話意図認識の精度を評価する。また、形態素と発話スタイルのみでは発話意図が識別できないものに対して、文脈の影響も追及する。また、これまでの結果をまとめて学会誌に論文を投稿する。
機能性ダイヤモンド電極における新しい電解発光反応と医療用センサーへの応用

本研究課題は,ダイヤモンド表面における新たな電気化学発光反応を探索し,その反応プロセス解明により、ダイヤモンド電極を用いた次世代型電解発光センサーデバイス,特に,新規医療用センサーの実現を図ることを目的とした.[1]ダイヤモンド電極表面における新規電界発光反応の探索ダイヤモンド電極におけるルテニウムビピリジル錯体を利用した電解発光反応では,アスコルビン酸共存下,3.5Vという極めて高い電位領域において,高輝度な発光反応挙動が観測された.この発光反応のピーク電位は共反応物質濃度に比例し,発光強度は共反応物質のOHラジカルによる水素引き抜き速度と高い相関関係を示すことから,この高電位電解発光反応には,ダイヤモンド表面で生成するOHラジカルによる共反応物質のラジカル化プロセスが関与することが判明した.この高電位発光反応の電気化学分析への適用により,OHラジカルによりラジカル化可能な2-プロパノールやテトラヒドロフラン等の高感度選択検出が可能となる.[2]医療用ダイヤモンド電解発光センサーの開発尿中蓚酸・アミノ酸分析装置の開発ルテニウムビピリジル錯体を用いる電解発光反応は,尿中に存在する多数の電気化学活性化合物の中から,pH制御によりシュウ酸を選択的に検出可能な手法である.選択センシング可能な光機能性電極実現のため,多結晶ダイヤモンド表面への高耐久性かつ修飾量の高い(高発光輝度)ルテニウム錯体の修飾方法の開拓を行なった.修飾法にはビピリジル配位子に側鎖として導入したドデシル基-表面炭素間にC-C結合を形成する方法を採用した.作製した直接修飾電極を,ECL検出器に導入したHPLCシステムを用いて実尿を分析すると,実尿中のシュウ酸成分のみに対しECL発光が観測された.この発光強度はFIA分析における発光強度と一致することから,実尿中のシュウ酸を選択的に5μMの低濃度まで検出可能であることが判明した,この修飾電極は,3時間の連続分析後も輝度低下がない.導電性ダイヤモンド表面にルテニウム錯体を直接修飾することにより,尿中シュウ酸を選択検出可能かつ,高い長期作動信頼性を兼ね備える,光機能性電極の創製に成功した.本研究課題は,ダイヤモンド表面における新たな電気化学発光反応を探索し,その反応プロセス解明により、ダイヤモンド電極を用いた次世代型電解発光センサーデバイス,特に,新規医療用センサーの実現を図ることを目的とした.[1]ダイヤモンド電極表面における新規電界発光反応の探索ダイヤモンド電極におけるルテニウムビピリジル錯体を利用した電解発光反応では,アスコルビン酸共存下,3.5Vという極めて高い電位領域において,高輝度な発光反応挙動が観測された.この発光反応のピーク電位は共反応物質濃度に比例し,発光強度は共反応物質のOHラジカルによる水素引き抜き速度と高い相関関係を示すことから,この高電位電解発光反応には,ダイヤモンド表面で生成するOHラジカルによる共反応物質のラジカル化プロセスが関与することが判明した.この高電位発光反応の電気化学分析への適用により,OHラジカルによりラジカル化可能な2-プロパノールやテトラヒドロフラン等の高感度選択検出が可能となる.[2]医療用ダイヤモンド電解発光センサーの開発尿中蓚酸・アミノ酸分析装置の開発ルテニウムビピリジル錯体を用いる電解発光反応は,尿中に存在する多数の電気化学活性化合物の中から,pH制御によりシュウ酸を選択的に検出可能な手法である.選択センシング可能な光機能性電極実現のため,多結晶ダイヤモンド表面への高耐久性かつ修飾量の高い(高発光輝度)ルテニウム錯体の修飾方法の開拓を行なった.修飾法にはビピリジル配位子に側鎖として導入したドデシル基-表面炭素間にC-C結合を形成する方法を採用した.作製した直接修飾電極を,ECL検出器に導入したHPLCシステムを用いて実尿を分析すると,実尿中のシュウ酸成分のみに対しECL発光が観測された.この発光強度はFIA分析における発光強度と一致することから,実尿中のシュウ酸を選択的に5μMの低濃度まで検出可能であることが判明した,この修飾電極は,3時間の連続分析後も輝度低下がない.導電性ダイヤモンド表面にルテニウム錯体を直接修飾することにより,尿中シュウ酸を選択検出可能かつ,高い長期作動信頼性を兼ね備える,光機能性電極の創製に成功した.本研究課題は,ダイヤモンド表面における新たな電気化学発光反応を探索し,その反応プロセス解明により、ダイヤモンド電極を用いた次世代型電解発光センサーデバイスの研究開発を目的としている.[1]ダイヤモンド電極表面における新規電界発光反応の探索ダイヤモンド電極におけるルテニウムビピリジル錯体を利用した電解発光反応では,アスコルビン酸共存下で,3.5Vという極めて高い電位領域において,高輝度な発光反応挙動が観測された.この発光反応のピーク電位は共反応物質濃度に比例し,発光強度は共反応物質のOHラジカルによる水素引き抜き速度と高い相関関係を示すことから,この高電位電解発光反応には,ダイヤモンド表面で生成するOHラジカルによる共反応物質のラジカル化過程が含まれることが判明した.この高電位電解発光反応を電気化学分析に応用することにより,OHラジカルにより容易にラジカル化する物質(2-プロパノールやテトラヒドロフラン等)を高感度に選択検出することが可能となる.[2]医療用ダイヤモンド電解発光センサーの開発尿中蓚酸分析装置の開発有機化合物の吸着を示さないダイヤモンド表面は,蛋白などを多く含む試料に対して長期作動信頼性の高い電極材料である.また,ルテニウムビピリジル錯体を用いる電解発光反応は,尿中に存在する多数の電気化学活性化合物の中から,試料のpH制御によりシュウ酸のみを選択的に検出可能な手法である.シュウ酸選択検出を可能とする光機能性

電極実現のため,耐久性の高いルテニウムビピリジル錯体のダイヤ表面への直接修飾方法の開発を行なった.修飾法として,ビピリジル配位子にドデシル基導入後,ドデシル基-表面炭素間に化学結合を形成するという担持方法を用いた.ダイヤ-ドデシル基間を(1)N原子を介したC-N-C結合,(2)O原子を介したC-O-C結合の2つの担持手法に対し,シュウ酸に対する電解発光強度の安定性評価を行なった結果,(2)の担持方法が安定性の高い修飾方法であることが判明した.これらの修飾電極は,シュウ酸をアスコルビン酸,尿酸共存下で選択的に200μMの低濃度まで選択検出可能であった.シュウ酸を選択検出可能な安定性の高い光機能性ダイヤモンド電極の創製に成功した.本研究課題は,理想的な分極性電極であるダイヤモンド表面における新たな電気化学発光反応を探索し,その反応プロセス解明により,ダイヤモンド電極の特異な電気化学特性を反映した新しい機能性電解発光センシングデバイスを実現し,特に医療用センサーへ応用を図ることを目的とした.[1]医療用ダイヤモンド電解発光センサーの開発尿中蓚酸・アミノ酸分析装置の開発ルテニウムビピリジル錯体を用いる電解発光反応は,尿中に存在する多数の電気化学活性化合物の中から,pH制御によりシュウ酸を選択的に検出可能な手法である.選択検出を可能とする光機能性電極実現のため,多結晶ダイヤモンド表面への高耐久性かつ修飾量の高い(高発光輝度)ルテニウム錯体の修飾方法の開発を行なった.本年度は,修飾法にドデシル基-表面炭素間にC-C結合を形成する方法を採用した.作製した電極をFIAシステムの電解発光検出器に導入すると,実尿中のシュウ酸を選択的に50μMの低濃度まで検出可能であった.この修飾電極は,3時間の連続分析後も輝度低下がなく,高い耐久性を示すことが判明した.このC-C結合形成による修飾電極は,発光反応性の高い3・2級アミンに対しては応答を示すが,1級アミン(PrA, EtA, MeA)には応答しない.したがって,アミノ酸分析用のダイヤモンド電解発光センサー開発には,さらに高いルテニウム錯体担持量を実現する手法を見出す必要がある.[2]サイズセレクティブ高輝度ケミルミネッスセンスセンサーの開発高配列なナノポア構造を賦与したナノハニカムダイヤモンド電極のナノポア内部では,分子・イオンの拡散が,ナノポアウォールにより非常に拘束されたものとなるため,分子サイズによる選択的な反応場に利用可能である.サイズ選択的なアミンセンサーの実現に向け,ポア径400nmおよび60nmのハニカムダイヤモンドのポアウォール表面上に,ルテニウム錯体を直接修飾し,異なるアミン分子サイズに対する反応性を検証した.いずれのナノハニカム電極とも,ジメチルアミン以下の1級アミンに対する電解発光反応性を示さず,実面積あたりの反応量が多結晶表面の20%程度であった.したがって,これらのアミンは,ポアフロント部で電解発光が起こり,ポア内部は反応に寄与しないことが判明した.
核酸結合性蛋白質との結合をトリガーとした、蛋白質架橋反応性核酸誘導体の開発

核酸結合性蛋白質はDNAやRNAに結合し、多くの細胞内遺伝子発現制御機構に関わっていおり、その中でも様々な疾患との関連性をもつmiRNAは、RNA-蛋白質複合体が作用本体として機能している。しかし、その複合体の詳細な立体構造など未解明な点も多く、新たな解析ツールの開発が望まれている。本申請課題では核酸2重鎖に近接した蛋白質に対して高い選択性で架橋形成する方法論の開発を目指した。具体的に、マイケル反応受容体となるビニル基を搭載した1,3,5-トリアジンを有する核酸誘導体が、2重鎖形成時に相補塩基との水素結合形成により反応点であるビニル基がメジャーグルーブ側に位置し、そこへ近接した核酸結合蛋白質の求核的アミノ酸と反応することを期待した。本年度はデザインした核酸誘導体を有するオリゴヌクレオチド合成法の確立、および標的モデルとして結晶構造が明らかになっている酵素蛋白質である、Hhal-DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1)を設定した。その理由として、DNAと複合体を形成時に、特定のシトシン塩基の6位近傍に求核性アミノ酸であるシステインが近接するため、このシトシンを本研究で開発した架橋反応性核酸塩基に置換することで、システインへの架橋反応が進行すると考えたためである。実際に反応特性を検討したところ、大変興味深いことに、DNMT1に対して高効率に架橋反応が進行したことをSDS-PAGEにて確認した。反応の特異性を検討するために種々反応条件を検討したところ、過剰量のメルカプトエタノール存在下でも問題なく反応が進行したこと、相補鎖存在下のみ高効率に架橋反応が進行することも確認できた。これら結果から、本研究で開発した核酸誘導体は標的となる求核性アミノ酸残基が近接した時のみ反応性を示すこと、また自鎖、相補鎖、蛋白質3者複合体を形成して架橋反応が効率的に進行したことが示唆された。
Six-Eya-Dach遺伝子ネットワークによる器官形成

Six遺伝子欠損マウスの解析、Sixタンパク質の標的遺伝子のスクリーニングおよびEyaとDachの分子機能の解析をとおして、器官形成に至る分子メカニズムを明確にすることを目標に研究を展開し、下記の5点の実績を得た。(1)Six4/Six5遺伝子二重変異マウスホモ個体のうち約半数は生後数時間以内に死亡するが、明らかな形態的組織学的異常は見いだせなかった。生き延びた個体は耳介の大きさが野生型に比して若干小さかった。(2)Six1遺伝子変異マウスホモ個体は内耳、鼻、腎臓および胸腺の形成異常が観察され、出生直後にすべて死亡した。Six1がこれらの器官の形成に必須の役割を果たしていることが示唆された。(3)Six5タンパク質の標的遺伝子として、中胚葉分化に伴って発現する転写因子やシグナル分子及びそのリセプター、また神経系で発現する転写因子やシグナル分子、さらに神経伝達物質の輸送体や受容体遺伝子などが同定された。Six5遺伝子はそれらの標的遺伝子群の制御を介して中胚葉由来の組織器官の形成や、神経組織の構築の発生にかかわることが示唆された。(4)Gal4-Eyaタンパク質とDach1タンパク質を293細胞に共発現するとGal4結合部位を複数持つ人工プロモーターのレポーター遺伝子転写活性が著しく上昇した。この、転写活性化にはCBPが関与することを明らかにした。(5)BOR症候群患者で検出されるEYA1の点突然変異のうちS486PとL504RにおいてはEya1とDach1、Gタンパク質及びSixタンパク質との相互作用の欠陥と、MyogeninプロモーターのSix5と協調した転写活性化の低下、さらに構造変化が見られた。Eyaドメインの変異がタンパク質間相互作用の欠陥を介してBOR症候群をひきおこことと、SIX、DACH及びGタンパク質もBOR症候群の病態過程と耳や腎臓の発生過程にかかわることが示唆された。
子どもの最善の利益を目指した「家族中心ケア」に基づく看護管理基準の開発と評価

本研究は、小児専門看護師及び小児病棟の看護管理者へのインタビュー調査やデルファイ調査等によって専門家の知見を統合し、子どもの最善の利益を目指した「家族中心ケア」の看護実践に向けて、看護管理基準の開発及び評価を行う。
DNA修復タンパク質Rad18複合体の生化学的解析

分裂酵母では、Rad18はもう一つのSMCタンパク質Spr18と他の数個のnon-SMCタンパク質と複合体を形成している。Rad18複合体はDNA修復に働いていると報告されている。さらにDNA複製にも働いていることが示唆されているが、細胞内でのRad18の機能や細胞周期における制御はあまり多くは知られていない。真核生物では、Rad18複合体のほかに、コンデンシン、及びコヒーシンと呼ばれるSMCタンパク質複合体が存在しており、それぞれ染色体の凝縮、姉妹染色分体どうしの対合といった過程に働いている。当研究の目的は、HeLa細胞を用いてRad18複合体の細胞内での機能や生化学的な活性を調べることであるが、まず対照としてコンデンシン複合体の解析を進めた。ヒトのコンデンシンの各サブユニットに対する抗体を作製し、HeLa細胞を用いた同調実験によりコンデンシンの細胞周期における挙動を観察した。^<32>P正リン酸を用いたパルスチェイスの実験により、HeLa細胞ではコンデンシンのSMCサブユニットの一つと三つのnon-SMCサプユニットがM期特異的にリン酸化され、M期からG1期に進行する際に著しく脱リン酸化された。分裂間期には顕著なリン酸化は観察されなかった。一方、コンデンシンのタンパク量は細胞周期を通じてあまり大きな変動を示さなかった。また、ツメガエルのM期卵抽出液から精製したコンデンシンはATPとトポイソメラーゼl存在下で弛緩した環状DNAに正のスーパーコイルを導入する活性を持つが、HeLa細胞のコンデンシンもM期特異的にスーパーコイリング活性を示した。これらの結果から、HeLa細胞においてコンデンシンの機能が量ではなくリン酸化により制御されていることが示唆された。現在、Rad18複合体に対しては、ヒトのRad18、及びSpr18のペプチド抗体を作成中で、抗体価が上がりつつある。分裂酵母では、Rad18はもう一つのSMCタンパク質Spr18と他の5つのnon-SMCタンパク質と、複合体を形成していることが報告されている。Rad18複合体はDNAの修復のみならず複製にも働いているのではないかという報告がされているが、その細胞内での役割、また生化学的活性の知見は乏しい。真核生物においては、Rad18複合体のほかに、コンデンシン、及びコヒーシンとよばれるSMCタンパク質複合体が存在しており、それぞれ染色体の凝縮、姉妹染色分体同士の対合といった過程に働いている。当研究の目的は、Rad18複合体のin vivoまたin vitroでの働きを解析するというものであるが、まず対照として比較的解析の進んでいるSMC複合体であるコンデンシンに対するペプチド抗体を作製し、コシデンシンをアフィニティー精製した。コンデンシンはin vitroでDNA結合活性を持ち、ツメガエル卵抽出液中では分裂期(M期)特異的に染色体に結合する。しかしながらコンデンシン単独では卵抽出液中での染色体への結合には不十分で、M期卵抽出液中にコンデンシンを染色体に結合させる他の因子が存在していることを見いだした。現在、Rad18複合体に対しては、ヒトのRad18、及びSpr18のC末端の配列に対するペプチド抗体を作成中で、抗体価が上がりつつある。抗体ができ次第Rad18複合体のアフィニティー精製を試みる予定である。Rad18複合体の生化学的活性をコンデンシンの種々の活性を指標に検討をしたい。更に、コヒーシン複合体についても抗体の作製と精製を検討している。