hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神遅滞児のバランス障害の要因と障害克服のための指導に関する研究

本研究は、精神遅滞児・者のバランス障害の実態及び障害の要因を明らかにし、要因に応じたバランスの改善指導法を開発することを目的として行われた。1.精神遅滞児・者のバランス障害の様相には、3タイプあることが重度から軽度にわたる精神遅滞学童及び成人192名を対象として,平均台歩き(動的バランス),片足立ち(静的バランス)の測定を行った結果わかった。すなわち,動的バランスの成績も静的バランスの成績も著しく低いX群、動的バランスの成績に比較して静的バランスの成績が著しく低いS群、静的バランスの成績に比較して動的バランスの成績が著しく低いD群の3つである。2.行動調整能力とバランスとの関連を、motor impersistence testにより検討したところ、S群のバランス障害の要因として行動調整能力の障害があることが確かめられた。そして、これらの者では、直観的に行動を方向づけ、調整する物が存在する状況の中でバランスの改善指導を行うことが有効であることが、台上片足立ちの測定から示された。3.反射(反応)系の障害とバランスの関連を、筋緊張、跳び直り反応、傾斜反応などの平衡反応をとり上げて調べたところ、動的バランス、静的バランスのいずれもきわめて低いX群は反射(反応)系に軽微な障害を有する者であることが示された。そして、この群に属する者たちのバランス改善のためには,特別にその運動量を増やす働きかけが必要であることが、万歩計を用いた日常活動量の測定から示唆された。4.眼球運動、立位姿勢の調整に視覚情報をどう利用しているかを身体重心動揺測定により調べたところ、X群、D群はこうした視覚機能に問題を有するものであることがわかった。これらの者には視覚の定位機能を高めることが必要であると考えられた。本研究は、精神遅滞者の視覚機能とバランスとの関連を解明することを目的として行われた。まず、精神遅滞児小、中学生および高校生56名を対象として平均台歩き、片足立ちの測定を行い、バランスの成績の高い者と低い者とを区別した。そして、Garfieldのmotor impersistence testにより、言語による行動調整能力を調べ、行動調整能力には大きな障害が存しないと考えられた者をバランスの成績の高い者、低い者のそれぞれから抽出した(5名ずつ)。こうして抽出された者を対象として、ト-クアイ(竹井機器製)を用い、平均台歩き、片足立ちを行っている最中の眼球の動きを調べ、そのビデオ記録から眼球運動の軌跡に関してバランスの成績の高い者と低い者とで違いが見られるかどうかを検討した。結果の細かな解析は今後さらに行う予定であるが、大まかに言ってバランスの高い者にはバランスの成績の低い者と比較した時、(1)視界の揺らぎが小さい、(2)平均台歩きの場合には視線を平均台に沿って動かしていくこと、(3)片足立ちの場合には視線を固定していることなどの特徴がみられた。また、視覚に関わる脳幹の機能を見るために回転後眼振検査を合わせて行なったところ、バランスの成績の低い者には眼振の誘発が極端に多い者と眼振の誘発が極端に少ない者とが見られた。以上から、精神遅滞者で運動中の視覚の用い方が不適切で、それとバランスの低成績とが結びついていると考えられる者では、脳幹水準にすでに障害が存する可能性が示唆された。中軽度精神遅滞児・者(1021歳、中・高生が主)51名及び健常成人11名を対象に、(1)バランス(平均台歩き、片足立ち)、(2)視運動性眼振、(3)前庭動眼反射の測定を行ない、精神遅滞児・者のバランスと眼球運動機能との関連を検討した。その結果、以下のことが明らかになった。

1.4種のスピ-ド(20度/秒、40度/秒、60度/秒、80度/秒)で測定した視運動性眼振の測定から、精神遅滞児・者では一般に視覚刺激に対する眼振の生起率がきわめて低いことが明らかになった。2.3種の頻度(0.25Hz、0.35Hz、0.5Hz)で行なった前庭動眼反射の測定から、精神遅滞児・者では一般に滑らかな眼球運動が生じていないことがわかった。3.平均台歩き及び片足立ちのバランスの成績と視運動性眼振の生起率、前庭動眼反射の出現様相との関連を調べたところ、一般にいずれの眼球運動とも合目的的に生じている者ほどバランスの成績が高いという傾向が見られた。4.しかし、より詳細な検討を加えると、視覚性の眼球運動である視運動性眼振が高率に生じている者の場合、前庭動眼反射が円滑に生じていなくともバランスの成績が高かった。一方、前庭動眼反射が円滑に生じていても、視運動性眼振の生起率が低い者の場合にはバランスの成績は低かった。前年度までに被験者となった者の平均台歩き及び片足立ちの成績の追跡調査と研究の取りまとめとを行ない、研究成果報告書を作成した。本研究の成果は、以下の4点に集約される。1.精神遅滞児・者のバランス障害の様相には3タイプあることが、重度から軽度にわたる精神遅滞学童及び成人192名を対象とした平均台歩き(動的バランス)及び片足立ち(静的バランス)の測定の結果、明らかとなった。すなわち、動的バランス、静的バランスの成績が共に著しく低いX群、動的バランスの成績に比して静的バランスの成績が著しく低いS群、静的バランスの成績に比して動的バランスの成績が著しく低いD群である。2.行動調整能力とバランスとの関連を検討したところ、S群のバランス障害の要因として行動調整能力の障害があることが確かめられた。これらの者では、直観的に行動を方向づけ調整する物が存在する状況の中でバランスの改善指導を行なうことが有効であることが、台上片足立ちの測定から示された。3.反射(反応)系の障害とバランスとの関連を、筋緊張、跳び直り反応、傾斜反応などの平衝反応を取りあげて調べたところ、X群の者は反射(反応)系に軽微な障害を有することが示された。そして、この群に属する者たちのバランス改善のためには、特別にその運動量を増やす働きかけが必要であることが、万歩計を用いた日常活動量の測定から示唆された。4.立位姿勢の調整に視覚情報をどう利用しているかを身体重心動揺測定により調べたところ、X群及びD群はこうした視覚機能に問題を有していることがわかった。これらの者には視覚の定位機能を高めることが必要であると考えられた。
脳神経系発生を中心とした脂質栄養改善に関する基礎的研究

n-3系多価不飽和脂肪酸は、脳で重要な役割を果たしている。本研究では、n-3系多価不飽和脂肪酸を欠乏した状態の母胎内の胎児から離乳時期まで個体の脳発達について、神経細胞新生や分化の観点から研究を行った。その結果、大脳皮質において、胎生期産生細胞の移動速度や、離乳期においていくつかの介在ニューロンの配置が対照群と異なることを見出した。これらの所見は、脳発達ににおける脂質栄養の重要性を示している。母体が摂取する脂質栄養の質の違い(n-3/n-6比)が,胎児および乳児の脳発達にどのような影響を与えるかについて検討した。本年度は,n-3系多価不飽和脂肪酸欠乏食摂取母体の胎児および乳児を適当なステージおいて採取し,胎生期から離乳期までの脳重量および脂肪酸組成の変化について経時的な観察を行った。その結果,胎生期においてn-3欠乏脳が正常脳に比べて重量が軽い傾向にあるがあることがわかった。このことは,適切な脂肪酸を供給されない場合に,胎児の脳発生が低形成もしくは遅延することを示唆していると考えられる。このような発達異常が'その後の脳神経発生に与える影響について検討するために,神経回路標識法を用いて生後21日目(離乳期)のラットの大脳皮質層構築(第II、III層および第V層)を調べた。その結果,皮質層構築には異常は見られなかった。また,これらに加えて大脳皮質層特異的マーカー分子による免疫組織化学を行ったが,これにおいても大きな異常は観察されなかった。この結果は,胎生期に置ける時期特異的な皮質構成ニューロンの発生にn-3系PUFAsは関与していないことを示唆している。現在は,妊娠後11日目,13日目,15日目にBrdUを投与することにより,神経細胞の誕生時期を標識する方法を用いて,脳内脂肪酸組成が神経細胞発生時期特異的に影響を与えていないか,また,各時期に誕生する細胞の種類(神経細胞なのかグリア細胞なのか)について詳細な検討を行っている。本申請課題は、母体が摂取する脂質栄養が胎児脳の形態形成に与える影響について観察し、母体が摂取すべき適切なn-6/n-3比のあり方について見いだすことを目的として遂行した。欠乏食または正常食を摂取した妊娠期(胎生13.5日または17.5日)の母体腹腔にBrdUを投与し、胎生19.5日の胎児脳を抗BrdU抗体にて免疫組織化学法を行ったところ、胎生期大脳皮質における細胞産生パターンに違いがあることが見いだされた。また、Ki-67を用いた増殖細胞の免疫組織化学法においても、同様の結果が得られた。これらの所見は胎生期脳発達過程に脂肪酸が深く関わっていることを示唆しており、妊娠時の適切な脂質栄養摂取の重要性を示している。また、同様の食餌の母胎よって育てられた乳児の大脳皮質層構築について調べるために、HRPを用いた大脳皮質第V層ニューロンの逆行性神経回路標識を行ったところ、両食餌群の間に大きな差が見られなかった。これらの所見は、層形成をしているニューロンの発生には脂質栄養が大きく関与していないことを示唆するものであり、胎生期脳に見られる細胞増殖がグリア系に分化している可能性を示唆している。現在は、胎生期に増殖したニューロンがどのような発生運命をたどるかについて詳細な検討を行っている。また、本研究期間中に遂行できなかった食事性脂質栄養によって変動する分子群の検索については、引き続き遺伝子およびタンパク質レベルの検討を続けていく。
超高速ネットワークで支援した分散共有メモリシステム研究

近年のワークステーションのCPUとネットワークの性能向上は著しく,市販のワークステーションやパーソナルコンピュータを市販のネットワーク装置に接続して構成したLAN環境を並列計算機システムとして使用することが有意義と認識されるようになった.本研究の目的は,ワークステーションクラスタにおけるプログラミング環境として共有メモリシステムを構築することである.ワークステーションクラスタで一般に使われるメッセージパッシングのインタフェースはプログラマの側に負担を強いるものである.そこで共有メモリシステムをクラスタシステムの上に構築すれば,クラスタシステムをシングルシステムイメージとして理解でき,プログラミングの負担が大幅に軽減される.本研究ではシステムの移植性を重視して,共有メモリシステムをソフトウェアにより構築した.具体的にPVMをインーターフェースとして設定し,Split-Cをプログラミングモデルとして,共有メモリシステムを構築した(I).ハードウェアで共有メモリを構築する場合と異なり,ソフトウェアによる共有システムの場合性能的な問題が発生するので,ソフトウェアで制御するキャッシュシステムをさらにランタイムシステムとして構築し,性能をあげることに成功した(II).キャッシュシステムはRead-Only Cacheを基本とした簡単なものであるが,実験の結果満足な性能の得られることを確認した(III).さらに,INSPECデータベースを用いて研究動向調査を行い,また言語処理系の理論的な検討も行った(IV).近年のワークステーションのCPUとネットワークの性能向上は著しく,市販のワークステーションやパーソナルコンピュータを市販のネットワーク装置に接続して構成したLAN環境を並列計算機システムとして使用することが有意義と認識されるようになった.本研究の目的は,ワークステーションクラスタにおけるプログラミング環境として共有メモリシステムを構築することである.ワークステーションクラスタで一般に使われるメッセージパッシングのインタフェースはプログラマの側に負担を強いるものである.そこで共有メモリシステムをクラスタシステムの上に構築すれば,クラスタシステムをシングルシステムイメージとして理解でき,プログラミングの負担が大幅に軽減される.本研究ではシステムの移植性を重視して,共有メモリシステムをソフトウェアにより構築した.具体的にPVMをインーターフェースとして設定し,Split-Cをプログラミングモデルとして,共有メモリシステムを構築した(I).ハードウェアで共有メモリを構築する場合と異なり,ソフトウェアによる共有システムの場合性能的な問題が発生するので,ソフトウェアで制御するキャッシュシステムをさらにランタイムシステムとして構築し,性能をあげることに成功した(II).キャッシュシステムはRead-Only Cacheを基本とした簡単なものであるが,実験の結果満足な性能の得られることを確認した(III).さらに,INSPECデータベースを用いて研究動向調査を行い,また言語処理系の理論的な検討も行った(IV).スケーラビリティーの観点からハードウエア的には分散記憶方式が必要であり、プログラミングの容易さの観点からは共有メモリ方式が必要なため、(物理的)分散(論理的)共有メモリの並列計算機が求められている。高速パーソナルコンピュータ(Pentium 166MHz、72MB)8台を購入し、ネットワークとして10BaseTスイッチングハブを用いて、ワークステーション(パーソナルコンピュータ)クラスタを構築した。OSとしてBSD UNIXを用い、この上で佐藤等の提案したSplit-C/PVMを稼働させた。これにより、分散環境上に、仮想共有メモリシステムが実現された。Split-Cが開発された並列計算機CM-5の場合と異なり、分散環境PVM上では、「ハードウエアによりサポートされたActive Message」がないので、PVMのsignalを用いて、Split-C/PVMを実現している。通信最適化の方式について研究を始め、メッセージ通信の送信PE、受信PEのコンパイル時解析が可能な場合、send,receive命令による最適化の方式を検討した。分散共有メモリシステムでは、グローバルメモリアクセスの高速化が重要であり、我々は分散メモリシステム上のソフトウエア的に構成したキャッシュメモリの方式を実験的にCM-5上に実現し、その有効性を確認した。ベンチマークのための並列応用プログラムの研究も行なった。具体的な問題として、2固有値問題に対する並列性の高いホモトピー法のアルゴリズムを開発した。超高速ネットワークでワークステーションを結合したワークステーションクラスタを分散メモリ並列計算機とみなすとき、一般にメッセージ通信ライブラリを用いたプログラムが作成されるが、プログラミングの負担は大きい。このプログラミングの負担を軽減するため共有メモリプログラミングモデルの実現が望まれている。我々はワークステーションクラスタ上に、移植性の高い分散共有メモリシステムをソフトウエアで実現した。すなわち、PVMを用い、ワークステーションクラスタ上に共有メモリプログラミングの可能なプログラム言語Split-cの処理系を実現した。移植性の高いソフトウェアによる分散共有メモリについては性能を高くすることが一般に困難であるので、我々は、分散共有メモリにソフトウェアによるキャッシュシステムを構築し、応用プログラムの中に、キャッシュシステムの制御のためのコードを挿入するプロプロセッサを実現して、性能の改善が行えることを示した。我々の作成したキャッシュシステムの特徴は1)READ-ONLY Cacheを基本とし、2)weak consistency modelを採用し、3)write invalidateプロトコルを用いていることがあげられる。ソフトウェアによるキャッシュシステムは分散メモリ並列計算機CM-5でも作成し、行列積、コレスキー分解、ガウス消去法のプログラムについて、ソフトウェアによるキャッシュの効果、プリプロセッサによる効果、キャッシュメモリを考慮したプログラミング技術による効果について詳細な計測評価を行い、提案している技術が有効であることを示した。近年のワークステーションのCPUとネットワークの性能向上は著しく,市販のワークステーションやパーソナルコンピュータを市販のネットワーク装置に接続して構成したLAN環境を並列計算機システムとして使用することが有意義と認識されるようになった.本研究の目的は,ワークステーションクラスタにおけるプログラミング環境として共有メモリシステムを構築することである.ワークステーションクラスタで一般に使われるメッセージパッシングのインタフェースはプログラマの側に負担を強いるものである.

そこで共有メモリシステムをクラスタシステムの上に構築すれば,クラスタシステムをシングルシステムイメージとして理解でき,プログラミングの負担が大幅に軽減される.本研究ではシステムの移植性を重視して共有メモリシステムをソフトウェアにより構築した.具体的にPVMをインーターフェースとして設定し,その上に共有メモリシステムを構築した(I).ハードウェアで共有メモリを構築する場合と異なりソフトウェアによる共有システムの場合性能的な問題が発生するので,ソフトウェアで制御するキャッシュシステムをさらに構築し性能をあげることに成功した(II).キャッシュシステムはRead-Only Cacheを基本とした簡単なものであるが,実験の結果満足な性能の得られることを確認した(III).さらに,IN-SPECデータベースを用いて研究動向調査を行い,また言語処理系の理論的な検討も,行った(IV).
低重力空間での液体と宇宙構造物の動的非線形挙動

本研究では、低重力空間における弾性構造物と液体の動的非線形連成挙動問題について、弾性宇宙構造物と内部に液体を含むタンクという基本システムの連成振動問題、及び液滴体単体又は弾性板上に付着した液滴の非線形動的挙動に注目し、その振動特性を地上でできる範囲内で実験的並びに理論的に解明した。本研究では、次の4つの問題に分けて研究を進めた。I柔軟宇宙構造物モデルとタンク内液体との動的連成挙動に関する実験平成17年度は、直径60mmのプラスチック製のカプセルの両側に、長さ500mmの2つの梁を接続した宇宙構造物モデルを製作し、磁気力で浮遊させ、電磁力によって加振するシステムを構築し、実験を行った。平成18年度は、直径100mmのプラスチック製のカプセルの両側に、長さ500mmの2つの梁を接続した宇宙構造物モデルを製作し、長さ約2.4mの紐で天井から吊るし、電磁力によって加振するシステムを構築し、実験を行った。II液滴の非線形動的挙動に関する実験振動する平面上での液滴(水)の,大振幅振動に起因する非線形挙動を調べた。具体的には、共振振動数の液滴の振幅への依存性等を明らかにした。液滴が付着する面の材質を変えて、接触角を変化させ、液滴と構造物の接触状態を種々変え、それによる振動特性の変化を調べた。III弾性矩形板と付着液滴の非線形連成振動実験液滴として水を用い、薄肉弾性矩形板に付着した連成システムで実験を行った。IV弾性矩形板上に付着した液滴の連成固有振動解析液滴を非粘性半球流体としてモデル化し、薄肉弾性矩形板に付着した連成システムを考え、解析的に解き、線形固有振動解析を行った。本研究では、低重力空間における宇宙構造物と付着液体の動的非線形挙動問題を、実験と理論解析により解明する。本年度は、構造物と液体の連成する非線形挙動を解明する為の前ステップとして、次に示す3つの項目に対して、それぞれの非線形(又は線形)挙動を解明した。A振動する平面上での液滴の非線形挙動(実験)振動する平面上での液滴(水)の、大振幅振動に起因する非線形挙動を調べた。液滴を(株)帝健から提供していただいた、超撥水性材「レクタス」の上に置き、球状に近い液滴を作り、共振振動数の液滴の振幅への依存性について調べると共に、回転現象を観測した。B薄肉弾性板と付着液滴の連成固有振動解析(理論解析)片持ち支持された薄肉弾性板上に、非粘性液体から成る半球形液滴が付着した連成システムを考え、固有振動解析を行い、J.Sound & Vibrationに投稿した。C宇宙構造物モデルの非線形挙動(実験)a.擬似的な宇宙空間の創設:宇宙構造物モデルを磁気力によって空間内に浮かせ、擬似的な宇宙空間を作った。b.試験モデルの加振:人工衛星本体を球状カプセルに、太陽電池パドルを柔軟梁としてモデル化し、電磁コイルを用いて磁気力による非接触加振を行った。加振方向による構造と液体の連成挙動の違いを明らかにした。本年度は、構造物と液体の連成する非線形挙動を解明する為に、次に示す2つの項目に対して、それぞれの非線形(又は線形)挙動を解明した。A宇宙構造物モデルの非線形挙動実験

宇宙構造物モデルを長さ約2.4mの紐で天井から吊るし、擬似的な宇宙空間の創設し、電磁力によって加振するシステムを構築して実験を行った。試験モデルは、人工衛星本体を球状カプセルに、太陽電池パドルを柔軟梁としてモデル化し、その応答を小型加速度計で測定した。B薄肉弾性板と付着液滴の非線形連成振動実験液滴として水を用い、薄肉弾性矩形板に付着した連成システムで予備的実験を行った。一般に液滴が付着すると板の振動数は低下するが、付着する位置により、増大する場合があることが分かった。また、非線形振動系に特有な、分数調波共振応答も観測された。
コアシェル型多機能集積触媒の作製と高効率one－pot反応への応用

一つの容器内で複数の反応を同時進行させる"ワンポット反応"は省エネルギーな反応方法として近年注目されている.本年度はワンポット反応の高効率化を目的とし、コアシェル触媒の作製、およびコアシェル触媒のワンポット反応特性について検討を行った。具体的にはPd触媒による過酸化水素合成と生成した過酸化水素を利用したTi含有メソポーラスシリカ触媒によるスルフィドの酸化反応からなるワンポット酸化反応について、Pd/SiO_2@Ti含有メソポーラスシリカコアシェル触媒を作製し、コアシェル構造によるワンポット酸化反応の高効率化について検討した。Pd/SiO_2@Ti含有メソポーラスシリカは球状シリカ粒子にPd粒子を無電解析出法により担持し、これにTi含有メソポーラスシリカシェルを形成することで作製した。TEM観察や窒素吸脱着測定等により、意図したコアシェル構造となっていることを確認した。ワンポット酸化反応評価の結果、コアシェル触媒は従来触媒(Ti含有多孔質シリカにPd触媒を担持した触媒)に対し3倍以上の反応活性を示し、コアシェル構造がワンポット反応に有効な構造であることを明らかにした。また、シェル部分について、細孔径やシェルの厚みを制御することで反応活性のさらなる向上に成功した他、フェノールのワンポット酸化反応においても同様にコアシェル構造が有効であるなど、汎用性の確認も行った.当初計画していた,コアシェル構造の精密制御によるワンポット反応の高効率化や,汎用性の確認を達成できた.また,フェノールのワンポット酸化おいては,反応条件によってはフェノールから2-シクロヘキセン1-オンが生成することを発見するなど,新規な知見を見出すことにも成功した.研究者の博士課程修了と就職により,本研究は一旦終了となる.シェル構造の制御だけでなくコア材の変更や,ワンポット反応の多段化,ワンポットエポキシ化への応用など,研究課題は多く残っており,いずれ再開の予定である.一つの容器内で複数の反応を同時進行させる"ワンポット反応"は省エネルギーな反応方法として近年注目されている.本年度はワンポット反応の高効率化を目的とし、コアシェル触媒の作製、およびコアシェル触媒のワンポット反応特性について検討を行った。また、シェル部分について、細孔径やシェルの厚みを制御することで反応活性のさらなる向上に成功した他、フェノールのワンポット酸化反応においても同様にコアシェル構造が有効であるなど、汎用性の確認も行った.当初計画していた,コアシェル構造の精密制御によるワンポット反応の高効率化や,汎用性の確認を達成できた.また,フェノールのワンポット酸化おいては,反応条件によってはフェノールから2-シクロヘキセン1-オンが生成することを発見するなど,新規な知見を見出すことにも成功した.研究者の博士課程修了と就職により,本研究は一旦終了となる.シェル構造の制御だけでなくコア材の変更や,ワンポット反応の多段化,ワンポットエポキシ化への応用など,研究課題は多く残っており,いずれ再開の予定である.
針葉樹における壁孔閉鎖による通水阻害の発生と回復機構の解明

本研究では、通水阻害の原因が弱い水ストレスの条件では壁孔の閉鎖であり、強い水ストレスの条件ではエンボリズムも同時に起きることでることが明らかになった。今年度は、壁孔膜の閉鎖の原因を明らかにするために、壁孔膜を閉鎖させる条件を検討した。枝の木部液の凍結する時には、凍結時の水の膨張と氷核ができた場所から凍結が進行するときに生じる水の流れが壁孔膜を動かして閉鎖させると考え、1年生の枝片に圧力を変えて水を流した時に通水コンダクタンスが低下する流速を測定した。その結果、0.4 0.5 m/h以上で水の流れやすさが低下し、1.5 m/hでは最大値の20%程度まで低下した。Picea abiesの野外の枝では1 2 m/hの速さで凍結が進むことを分かっている。このことからシラビソでも冬季の枝の凍結によって壁孔膜が閉鎖する可能性が示唆された。さらに、昨年度の研究から、シラビソの一年生枝でエンボリズムを起こした仮道管に水が再充填される可能性が示唆された。この再充填現象を実験室内で再現し、現象の時空間的スケールを明らかにするためにMRIを用いて再充填過程の可視化に挑んだ。Picea abiesで同様に実験を行っているInnsbruck大学のStefan Mayr教授にアドバイスをいただき、3月末に風衝環境に生えている枝を採集して枝の切り口が水に浸からないように葉を水に浸けた。この枝に関して1日、3日、10日後で木部の水分布を撮像した。この年は春の訪れが早く早々に水ストレスが解消されたこともあり、採集時には木部の大部分に水が満たされていた。このため、明確な傾向を見出すのは困難であったが、一部の枝で水の再充填が確認された。来年度、これがアーティファクトでないことを確認するとともに、再現性を確認したい。今年度の研究から、壁孔膜の閉鎖の原因や、MRIを用いた再充填現象の観察の解明の取り掛かりとなる重要なデータが得られた。風衝環境における常緑針葉樹の通水阻害とその回復のメカニズムを明らかにするため、来年度は以下の実験を予定している。(1)凍結時に生じる水の流れが壁孔の閉鎖を促す、という仮説を検証するために、凍結時の凍結速度を赤外線サーモグラフィーで測定する。この際に壁孔が閉鎖するかをcryo-SEMを使って確認する。(2)ひきつづきMRIを用いた木部内の水分布の経時変化の非破壊的な測定によって通水阻害からの回復過程の可視化を引き続き行う。これは、研究分担者である福田健二教授と協力して行う。(3)風衝環境での通水阻害の原因のひとつである大きな木部張力は、針葉の障害によるクチクラ蒸散の増加によって起きることが示唆されている。どのくらいの増加で木部張力の増大や通水阻害が起きるのかを定量的に評価する。本研究では、これまでに壁孔の閉鎖が通水阻害の原因となることを明らかにした。一方で、これまでの多くの研究では木部に気泡が入ることで仮道管を詰めて通水阻害を起こすことが報告されている。

今年度はこの2つの要因がどのように関わっているのかを、通水阻害の程度を定量すると同時に木部の水分布や壁孔の様子をcryo-SEMを用いて観察し、これらの季節変化を見ることで明らかにした。その結果、冬季で強い水ストレスがかかっていない時にも、木部の仮道管は水で満たされており、観察できた壁孔のうち90%で壁孔膜が閉鎖していた。このとき、最大の通水量に対して70%以上の通水阻害(PLC、percent loss of conductivity)が検出された一方で、3月末になると乾燥が進行し、PLCはほぼ100%に近い値が観察された。そして、木部では平均して65%程度の仮道管が空気で満たれていたのと同時に、観察された壁孔のうち30%で壁孔膜が閉鎖していた。これらの結果から、軽度の水ストレス条件下では通水阻害の原因が壁孔膜の閉鎖にあり、さらにストレスが深刻化するとエンボリズムによって起きることが示唆された。4月の後半になるとPLCは70%まで減少した。木部にはエンボリズムの状態にある仮道管が多数、観察されたが、観察された75%以上の壁孔で壁孔膜が通常の位置へ戻っており、PLCの回復がこれによって起きたことを示唆している。その後、7月の展葉にまでの期間で測定を続けたところ、PLCは10%付近まで低下した。この低下は、木部の仮道管は徐々に水で再充填されることと同時に6月後半から新しく肥大成長を行うためにであると考えられる。今年度の測定によって通水阻害、木部水分布、そして壁孔膜の位置の季節変化を明らかにできた。この結果は、本研究が対象とする現象の全体像を明らかにするものである。風衝環境における常緑針葉樹の通水阻害とその回復のメカニズムを明らかにするため、来年度は以下の実験を予定している。(1)凍結時に生じる水の流れが壁孔の閉鎖を促す、という仮説を検証するために、凍結時の凍結速度を赤外線サーモグラフィーで測定する。この際に壁孔が閉鎖するかをcryo-SEMを使って確認する。(2)ひきつづきMRIを用いた木部内の水分布の経時変化の非破壊的な測定によって通水阻害からの回復過程の可視化を引き続き行う。これは、研究分担者である福田健二教授と協力して行う。(3)風衝環境での通水阻害の原因のひとつである大きな木部張力は、針葉の障害によるクチクラ蒸散の増加によって起きることが示唆されている。どのくらいの増加で木部張力の増大や通水阻害が起きるのかを定量的に評価する。(1)凍結時に生じる水の流れが壁孔の閉鎖を促す、という仮説を検証するために、壁孔が閉鎖する蒸散流の速度をシラビソで測定する。(2)MRIを用いた木部内の水分布の経時変化の非破壊的な測定によって通水阻害からの回復過程の可視化を引き続き行う。(3)シラビソにおける通水阻害や水分布の季節変化での測定の際に撮像したSEMの画像を解析して、エンボリズムの割合や壁孔膜の閉鎖の度合いを定量化する。
メラノコルチン１型受容体機能低下の膵臓発がんへの関与

メラノコルチン受容体(MCR)のうち、MC4Rは摂食抑制やエネルギー代謝、MC1Rは色素合成や抗炎症・免疫に関与しており、全体として肥満や生体防御異常に関わっている。本研究では、MC1Rの機能低下と膵発がんとの関わりを明らかにすることを目的としている。H30年度は、以下について検討を行った。日本人膵がん患者の摘出腫瘍の病理標本の残余組織よりDNAを抽出し、PCR法によりMC1R遺伝子を増幅して、ダイレクトシークエンス解析によりSNPs/点突然変異の有無を調べた。ホルマリン固定標本から抽出したDNAでは長いPCR産物を得ることが難しく、一部のSNPsの解析は可能だが、MC1R遺伝子全長のSNPs/点突然変異を調べることは困難であった。そこで、数例の膵がん症例の凍結手術検体を用いてMC1RのSNPs/点突然変異の有無を解析した結果、欧米人由来の膵がん細胞株とは異なるタイプのSNPsが検出された。しかしながら、検出されたSNPsは元々日本人に多いタイプであったので、膵がんで多いかどうかはさらに多くの症例を解析して健常人との比較を行う必要がある。また、その機能解析が重要である。そのために、日本人膵がん症例の手術検体やゼノグラフト組織から培養細胞株を数株樹立した。マウス膵臓発がんモデルにおいて発生した腫瘍から研究代表者が樹立済みの野生型Mc1rの膵臓がん細胞株を、Mc1r変異を有するMc1r<e/e>マウスとその野生型マウスの皮下に移植し、宿主側のMc1r機能低下が腫瘍の増殖や炎症細胞の浸潤等に及ぼす影響を予備的に調べた。その結果、どの宿主でも移植腫瘍は順調に増殖し、野生型Mc1rの膵臓がん細胞株の増殖に対する、宿主のMc1r変異の有無の明らかな影響は認められなかった。膵臓への同所移植モデルにおいて浸潤への影響を調べるなどさらなる検討が必要である。膵がん症例のホルマリン固定標本からのDNA解析があまりうまくいかず、多くの症例の解析ができなかった。また、膵がん組織は間質が多く、がん細胞の割合が少ないため、遺伝子変異の検出も難しい。そこで、解析対象を膵がん培養細胞株とし、日本人の膵がん患者の腫瘍組織、もしくは手術検体を免疫不全マウスに移植して得られるゼノグラフトから初代培養を行っているが、その樹立に時間がかかっており、機能解析が遅れている。膵がん患者の腫瘍組織、もしくは手術検体を免疫不全マウスに移植して得られるゼノグラフトから初代培養を行い、さらに多くの細胞株を樹立してMC1RのSNPs/点突然変異の有無と発現レベルのパネルを作成し、欧米人由来の既存膵がん細胞株との遺伝子発現パターンや細胞形態・増殖性・浸潤能等の性状比較を行う。また、野生型MC1Rを有するヒト正常膵管由来細胞株や膵がん細胞株に変異型MC1R遺伝子を導入して高発現させ、その機能解析を行う。さらに、免疫不全マウスに移植して増殖への影響を調べる。マウス膵臓がん細胞の同種移植モデルにおいては、膵臓への同所移植をした場合の腫瘍の増殖・浸潤・転移についてさらに検討を行う。また、MC1R機能低下型変異を有するマウスを膵発がんモデルマウスと交配し、MC1R機能低下が発がんや浸潤・転移に及ぼす影響を明らかにする。Mc1r変異を有するマウス膵臓腫瘍からがん細胞株を樹立し、野生型マウスに移植して、野生型Mc1rの膵がん細胞株の増殖形態との比較を行う。

また、膵がん組織は間質が多く、がん細胞の割合が少ないため、遺伝子変異の検出も難しい。そこで、解析対象を膵がん培養細胞株とし、日本人の膵がん患者の腫瘍組織、もしくは手術検体を免疫不全マウスに移植して得られるゼノグラフトから初代培養を行っているが、その樹立に時間がかかっており、機能解析が遅れている。膵がん患者の腫瘍組織、もしくは手術検体を免疫不全マウスに移植して得られるゼノグラフトから初代培養を行い、さらに多くの細胞株を樹立してMC1RのSNPs/点突然変異の有無と発現レベルのパネルを作成し、欧米人由来の既存膵がん細胞株との遺伝子発現パターンや細胞形態・増殖性・浸潤能等の性状比較を行う。また、野生型MC1Rを有するヒト正常膵管由来細胞株や膵がん細胞株に変異型MC1R遺伝子を導入して高発現させ、その機能解析を行う。さらに、免疫不全マウスに移植して増殖への影響を調べる。マウス膵臓がん細胞の同種移植モデルにおいては、膵臓への同所移植をした場合の腫瘍の増殖・浸潤・転移についてさらに検討を行う。また、MC1R機能低下型変異を有するマウスを膵発がんモデルマウスと交配し、MC1R機能低下が発がんや浸潤・転移に及ぼす影響を明らかにする。Mc1r変異を有するマウス膵臓腫瘍からがん細胞株を樹立し、野生型マウスに移植して、野生型Mc1rの膵がん細胞株の増殖形態との比較を行う。(理由)膵がん症例のホルマリン固定標本からのDNA解析があまりうまくいかず、多くの症例の解析ができなかった。また、日本人膵がん症例由来の培養細胞株の樹立に時間がかかり、機能解析が遅れているため、予定より支出が少なかった。(使用計画)日本人の膵がん症例由来の培養細胞株を多数自家樹立もしくは連携研究者より入手して当該受容体遺伝子配列を解析するため、費用がかかる。また、当該受容体のSNPsを有するヒトがん細胞の移植モデルや当該受容体変異マウスを用いて腫瘍増殖や発がんへの影響を検討する動物実験にかなりの費用が必要となることから、これらの研究計画の完遂のために繰り越し分を充てる計画である。
岩礁潮間帯生物群集におけるトップダウン/ボトムアップコントロールの実験的検証

栄養塩レベルの違いが群集内の種の共存や種間関係に及ぼす影響は、古くから生態学者の興味を引いてきたが、これまでの研究の多くは平衡群集における栄養塩レベルの影響に注目したものである。植物が固着性である生息場所では、植物群落は非同調的に生じる撹乱とその後の住み着きと絶滅(パッチダイナミクス)によってその多様性が維持される非平衡な系であることが多い。このような系で、栄養塩レベルが植物同士の共存機構や食物網関係にどのように影響を及ぼすかは良く判ってはいない。北海道南部の岩礁潮間帯中部では、二枚貝のムラサキインコガイが高密度に生息している。ここで競争的優占種であるムラサキインコガイが波により剥がされてできた撹乱パッチ(空き地)には様々な海藻と、これを餌とするグレーザー(マクログレーザーのカサガイとメソグレーザー)が生息している。本研究ではパッチ内に成立するこの群集における栄養塩レベルの影響を明らかにするため、栄養塩供給量とカサガイの密度を実験的に操作し、群集構造の変化を一年間追跡し、得られた結果から、栄養塩レベルが、種間相互作用(グレージングと競争)と、種の住み着きと絶滅率を通して群集構造の時空間変異に及ぼす影響を解析した。その結果、栄養塩添加により、海藻の増殖速度は早くなり海藻間の競争が強くなった。またカサガイが増加し海藻へのトップダウン効果とメソグレーザーに対する排除が強くなった。また栄養塩添加区でだけカサガイの消費は海藻の多様性を上昇させた(keystone捕食)。これは栄養塩添加によって促進された優占種の競争的排除をカサガイが効果的に抑制することにより生じていた。この多様性維持機構はパッチへの海藻の住み着き率と絶滅率に栄養塩添加とカサガイの消費が複合的に影響することを通じて生じていた。これらのことは、北海道南部の岩礁潮間帯中部では、海藻間の競争、カサガイの量、及びカサガイの摂餌が海藻とメソグレーザーへ及ぼす影響が、栄養塩に制限されていることを意味する。さらにkeystone捕食の成立が栄養塩制限されていることを示唆する。本研究は河口域の海岸と、陸水からの栄養塩供給の無い河口から離れた海岸で、海藻-カサガイ群集を対象に、海藻とカサガイのバイオマスへの消費と資源による支配を、野外で栄養塩量とグレーザー密度を実験的に操作することで解明することを目的とした。検証するおもな仮説群は、1)栄養塩添加は海藻とカサガイのバイオマス増加に影響するか?2)グレーザー除去は海藻のバイオマス増加に影響するか?3)栄養塩添加によって海藻のバイオマス変化に対するカサガイの消費の効果は違うか?4)1-3)の結果は河口域とそれ以外の海岸で違うか?とした。1999年6月に北海道日浦海岸の岩礁潮間帯の河口と、河口から離れた場所に位置するムラサキインコガイベッド上に裸地を作成し、焼成エアーストーン盤を4つ隣接させて設置した。それらのうち2つに栄養塩(硝酸Na+リン酸K)を注入し(栄養塩添加区: +N)、残りに海水を注入した(栄養塩無添加区: -N)。それらの各1つは銅塗料により、カサガイ侵入を止め(カサガイ除去区: -G)、残りは未操作とした(カサガイ未除去区: +G)。つまり、1箇所に+G+N、+G-N、-G+N、-G-Nの4実験区が一組になるようにし、これを、河口域と海岸域にそれぞれ10組セットした。焼成エアーストーン上の海藻被度、カサガイ個体数、カサガイサイズ、海水栄養塩濃度、エアーストーン内栄養塩濃度、エアーストーン表面温度、海水塩分濃度を毎月一回測定している。実験開始から半年間の結果から、栄養塩制限は海藻群集を通してカサガイのトップダウン効果を抑えていることが明らかになったが、陸水の栄養塩供給の当群集への有為な影響は統計的に検出されてはいない。

これは栄養塩添加によって促進された優占種の競争的排除をカサガイが効果的に抑制することにより生じていた。この多様性維持機構はパッチへの海藻の住み着き率と絶滅率に栄養塩添加とカサガイの消費が複合的に影響することを通じて生じていた。これらのことは、北海道南部の岩礁潮間帯中部では、海藻間の競争、カサガイの量、及びカサガイの摂餌が海藻とメソグレーザーへ及ぼす影響が、栄養塩に制限されていることを意味する。さらにkeystone捕食の成立が栄養塩制限されていることを示唆する。
新しい進化論的計算手法「遺伝的ネットワークプログラミング」による知的制御の研究

前年度までの研究で、進化論的計算手法である遺伝的ネットワークプログラミング(GNP)と強化学習を組み合わせ、解の探索精度、探索速度およびメモリの使用量の軽減の点で優れたアルゴリズムを提案してきた。これらのGNPのアルゴリズムは離散値(例えばロボットの行動制御において、障害物があるかないか、右に曲がる、など)を入力または出力することが特徴の一つであったが、実世界の問題では入力や出力は連続値(障害物までの距離がおよそ500、速度10で前進、など)であることのほうが多いため、GNPで連続値を効率よく扱えるアルゴリズムの構築を行った。具体的には、前年度より検討を行ってきたアクタークリティックを用いたGNPとSarsaと呼ばれる強化学習のアルゴリズムを用いたGNPを拡張し、連続値の取り扱いを可能にした。さらに、各手法の性能を評価するためにKheperaロボットの壁伝い行動(センサの値を利用しながら壁に沿ってできるだけ速く真っ直ぐに移動することを目的とする行動)のルールを自動生成させる問題に適用した。その結果、ロボットは壁に沿った適切な経路を移動することが明らかになり、また、従来の進化のみに基づくGNP、およびニューラルネットワークの結合重みと閾値を遺伝的アルゴリズムを用いて探索する方式との比較を行った結果、提案手法が良い性能を示すことが明らかになった。研究成果はSICE Annual Conference 2005、電気学会C部門大会、第15回インテリジェントシステムシンポジウムで発表を行い、また、現在電気学会論文誌Cにて査読中である。今年度は、遺伝的ネットワークプログラミング(GNP)の性能向上を目的として、アルゴリズムの改良を行い、その性能をベンチマーク問題において検証した。従来、進化と学習という2つの概念は工学的には分けて考えられることが多かった。これは進化の概念は複数の個体(プログラム)が存在し、タスク終了後にその中から優れた個体が生き残り、交叉や突然変異といった遺伝的操作が行われることでよい個体が生成されていくという考え方であるのに対し、学習の概念は1つの個体がタスク実行中にプログラムの変更を行うという違いがあったためである。しかし、本研究ではこれらの2つの概念をうまくGNPのプログラムの生成に用い、解の探索精度、および探索速度の向上を実現した。具体的には、タスク実行中に学習を行うことで、実行中に得られる情報を効率的にプログラムの生成に用いることができ、タスク終了後に進化を行うことで大域探索に優れているといわれる進化の機能を十分に活用できるようになった。さらに、学習のアルゴリズムには、強化学習を用いているが、強化学習を用いる際にしばしば問題となるのが状態数の多さである。しかし、本研究ではGNPのグラフ構造を利用して適切な状態の定義を行うことで状態数を非常に少なく設定することが可能となった。これにより、計算時間を矩縮できることに加え、実行に必要なメモリも大幅に削減することができた。以上の学習・進化型GNPを代表的なベンチマーク問題である、タイルワールド問題と迷路問題に適用しその性能評価を行ったところ、これまでに提案してきた進化のみに基づいたGNPよりよい結果を示すことが明らかになった。新しい進化論的計算手法として提案してきた「遺伝的ネットワークプログラミング(GNP)」を、実世界の問題へ適用できるようにするため、適合度、計算時間、メモリ使用量などの点から実用的なシステムを開発し、エージェントのベンチマーク問題を用いたシミュレーションによりその性能を検証した。GNP、および昨年度より研究を行っている強化学習と進化を組み合わせたGNPを従来手法(遺伝的プログラミング(GP)、進化論的プログラミング(EP))と比較することにより、GNPが効率よりよいプログラムを生成できることを確認した。研究成果は、進化論的計算手法に関する国際会議GECCO2004、SICE Annual Conference 2004で発表を行い、国内学会では第14回インテリジェントシステムシンポジウム、第23回計測自動制御学会九州支部学術講演会で発表を行った。さらに計測自動制御学会論文誌に掲載し、現在はIEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics Part B、および情報処理学会論文誌に研究成果を投稿し、査読中である。また、従来のGNPは粗く分割された離散情報(目標物が「右」にある、等)のみを扱っていたが、本年度の後半より、連続情報(目標物が正面から右に23度ずれたところにある、等)を扱うため、アクタークリティックと呼ばれる強化学習の手法をGNPに適用している。性能の検証には、kheperaロボットのシミュレータを用い、提案手法がkheperaロボットを制御できることを確認し、ニューラルネットワークとの比較を進めている。

その結果、ロボットは壁に沿った適切な経路を移動することが明らかになり、また、従来の進化のみに基づくGNP、およびニューラルネットワークの結合重みと閾値を遺伝的アルゴリズムを用いて探索する方式との比較を行った結果、提案手法が良い性能を示すことが明らかになった。研究成果はSICE Annual Conference 2005、電気学会C部門大会、第15回インテリジェントシステムシンポジウムで発表を行い、また、現在電気学会論文誌Cにて査読中である。
無尾両生類の色彩およびその突然変異に関する研究

1)わが国で最も普通のトノサマガエルとダルマガエル、著しい体色変化をするアマガエル、特殊な色素細胞をもつアオガエルを主材料として、正常の体色と色彩突然変異について、形態学的、遺伝学的研究を行なった。2)トノサマガエル群では、褐色または緑色の正常色彩、配偶子の放射線照射によって得た9系統の色彩突然変異、野外で発見されたアルビノの10系統、その他黒色眼と灰色眼突然変異について、遺伝と色素細胞の微細構造について調べた。特にアルビノについては、次の重要な新知見を得た。(i)アルビノには遺伝子座の異なる5群があり、第1群は4種類の対立遺伝子によって支配される。(ii)各アルビノは、外観および黒色素胞内に含まれるプレメラノソームに明らかな違いがある。(iii)2遺伝子座でアルビノ遺伝子が同型接合になった12種類のアルビノを作り、各アルビノ遺伝子の表現の優劣を明らかにした。(iv)アルビノのトノサマガエルと正常のダルマガエルとの間の戻し雑種について、遺伝子型とランプブラシ染色体の組成との対比,および連鎖と転座の利用によって、各遺伝子の染色体上の位置を推定した。そのほか、オリーブ色と青色の各突然変異遺伝子座のある染色体を推定した。3)アオガエルでは、変態後黄色素胞の一部が下方に移動して、紫色素胞となり、退化した黒色素胞の代りをすることを確かめた。4)トノサマガエル、アマガエル、アオガエル、ツチガエルの黒色眼または灰色眼突然変異が、単一劣性遺伝子によって支配されることを確かめ、それぞれの色素細胞の異常を電顕観察によって明らかにした。5)トノサマガエル、ニホンアカガエル、ツチガエルを用い、色彩突然変異体と正常個体との間の前後キメラを作ったところ、前部が正常のものでは、それの色素細胞が癒着面を越えて後方に移動するが、特に虹色素胞が著しい移動をすることが確かめられた。1.トノサマガエル類のアルビノについて、遺伝子座の異なる5群(a,b,c,d,e)のうち、aおよびeに所属する対立遺伝子系統について、それぞれの遺伝的特徴を明らかにした。また、背面の真皮性色素細胞の微細構造を電顕によって観察し、5群8系統の違いを明確にするとともに、ドーパ反応によってチロシナーゼ活性の有無を調べた。黒色素胞の培養については、正常およびアルビノの系統の若干について成功した。2.シュレーゲルアオガエルを用い、背面皮膚における黒色素胞がカエルの成長にともなって次第に退化し、それに代わる紫色素胞が、黒色素胞の位置まで移動してきた黄色素胞から発達してくる経過を電顕によって詳しく観察した。また、このカエルのアルビノについて、これが単一劣性遺伝子によって支配されることを確かめ、黒色素胞が発生の最初から全く形成されないことを明らかにした。3.アマガエル、シュレーゲルアオガエル、ツチガエルで発見された黒色眼について、それらが各単一劣性遺伝子によって支配されることを確かめ、またそれぞれの皮膚および眼球にある色素細胞の微細構造を明らかにした。4.鳥取県と茨城県で発見された2匹の青色アマガエルおよび新潟県で発見された暗色および白色のトノサマガエルの色彩変異について、それぞれの皮膚構造を電顕によって調べた。その結果、青色変異は黄色素胞の発達不良によって起こること、暗色および白色変異については、色素細胞の退化によることを明らかにして、特に後者についてはウイルスの関与を推定することができた。

5.トノサマガエル、ニホンアカガエル、ツチガエルで正常個体と色彩突然変異体との間で前後キメラを作成した結果、色素細胞が前方から後方に向って突起を出し、次第に移動することを確かめた。1.トノサマガエルの正常個体の真皮性色素細胞をガラス器内で培養すると黒色素胞のみが増殖することを確かめた。また、3種類のアルビノ、【a^r】【a^r】,【a^h】【a^h】,ddの真皮性色素細胞を培養したところ、いずれも黒色素胞のみが増殖することを確かめた。3.トノサマガエルのアルビノ系統について、メラノソームの欠失または不完全の原因を、発生の早期から電顕によって追跡した。4.トノサマガエルのオリーブ突然変異遺伝子i(紅色素細胞の異常)は第【III】染色体上にあって最も動原体に近い短腕部にあり、アルビノ遺伝子e,MDH-B遺伝子およびME-B遺伝子と連鎖していることを明らかにした。また青色突然変異遺伝子x(黄色素細胞の異常)は、第【VIII】染色体上にあることも明らかにした。5.トノサマガエルのアルビノで、遺伝子座を異にする5つの遺伝子a,b,c,d,eのおのおのが乗っている染色体を明らかにすることができた。b遺伝子は第【I】染色体の短腕部で、ADH-Aとアルブミンの遺伝子と連鎖し、aは第【II】染色体の短腕部でα-GDHとME-Aの遺伝子と連鎖し、Cは第【II】染色体の長腕部でPep-CとSOD-Bの遺伝子と連鎖し、eは第【III】染色体の長腕部でME-B遺伝子と連鎖し、この染色体の短腕部にはMDH-Bの遺伝子が連鎖し、dは第【IX】染色体の長腕部で、Prot-CおよびALDの遺伝子と連鎖していることが推定された。また第【II】染色体上のa遺伝子座には、【a^r】,【a^h】,【a^t】および【a^f】の4つの対立遺伝子が存在することも明らかとなった。1.トノサマガエルで,アルビノ遺伝子が2遺伝子座でホモになった個体12種類を成熟させ,それらの黒色素胞を電顕で観察したところ,a^ra^rbb,a^ra^rcc,a^ra^rddのプレメラノソームは,いずれもa^ra^rによって支配されていた.また,a^ra^rdd,a^fa^fdd,bbddでは,プレメラノソームの発達段階がそれぞれa^ra^r,dd,bbで,いずれもddの支配によってプレメラノソームが塊を作ることがわかった.2.トノサマガエルの正常個体および各種アルビノ系統の個体の色素細胞を培養し,電顕で観察したところ,いずれも黒色素胞だけが増殖した.またプレメラノソームの構造を調べたところ,K_M系統のアルビノでは,in vivroでもin vitoでも大差がないことが確かめられた.3.トノサマガエルの黒色眼,灰色眼およびオリーブ色の各色彩突然変異について,色素細胞の構造を電顕によって観察した結果,いずれも虹色素胞に含まれる反射小板に異常があることが明らかとなった.4.ツチガエルで,灰色眼突然変異体と正常個体とのキメラを作り,各色素胞が結合面からどのように移動するかを調べた.その結果,各色素細胞が前方から後方へのみ移動すること,および黄色素胞と虹色素胞とが常に上下に重なって移動し,黒色素胞はそれらよりもおくれて移動することを確かめた.
ネフリンレポーターマウスを用いた新規ポドサイト保護薬の探索

ネフリンは糸球体濾過バリアの主要構成要素であり、ネフリン発現の減少は糸球体疾患の初期に共通して観察されるため、ポドサイトにおけるネフリン発現を増加させる方法は治療的意義を有する。本研究ではネフリンプロモーター配列を用いてenhanced greenfluorescent protein (EGFP)の発現を調節するノックインマウスを作製した。このマウスから糸球体を単離し培養すると、ポドサイトにおけるEGFPシグナルは培養5日後に半減したが、ビタミンDを添加するとシグナルは4倍に増加した。ネフリン遺伝子発現を増加させる化合物のスクリーニングに用いることができるマウスの開発に成功した。PITT法および古典的な顕微注入法により、nephrin-EGFP knockin miceとnephrin-mCherry transgenic miceの2系統のレポーターマウスを樹立した。nephrin-EGFPconstructを遺伝子導入した段階でポドサイト特異的にEGFPが発現するはずであったが、原因不明の理由のために発現が見られなかった。そこでCAG-FLPe transgenic mouseと交配して、Neo耐性遺伝子を含むFRT間領域の除去を行い期待通りの発現を得ることができた。従来はマウスの糸球体をsieving法で単離する場合には直径45μmのメッシュを最終段階で用いていたので、ArrayScanではその大きさに相当する2000μm2より大きい細胞塊を糸球体と認識させて自動定量を行った。ネフリンレポーターマウスの樹立および、糸球体由来のレポーターシグナルの定量法の開発に計画通り成功した。前年度、ROSA遺伝子座を用いてnephrinプロモーター配列下にEGFPを発現するNephrin-EGFPknock-inマウスの作出に成功した。またマウス由来糸球体の培養系を用いてArrayscanによるEGFPレポーターの発現強度を定量する実験系を確立した。今回、ビタミンDが単離糸球体においてnephrin mRNA、nephrin protein、EGFP reporterの発現を大きく増大させることを確認し、本実験系によりnephrinの発現を増大させる因子をスクリーニングできることを確認した。そこで京都大学大学院医学研究科・医学研究支援センターより化合物ライブラリーの供与を受け、96 well plateを用いてnephrin reporter活性を増強する化合物のスクリーニングを行った。まずPrestwick Chemical、Calbiochem、Selleck Chemicalsの3社が保有する市販化合物のスクリーニングを行うと、強陽性、弱陽性を呈する多くのシグナルを得た。ビタミンDを陽性コントロールとしてヒット化合物の濃度を1/10、1/100に減らして再現性を検討するとビタミンDの効果は濃度依存性が小さいものの、強陽性ヒット化合物ではシグナルが1/10に減弱しており、元化合物を肉眼で見ると黄色やオレンジ色を呈しており、レポーター蛍光ではなく化合物自体のシグナルを検出している偽陽性であることが判明した。次に765化合物のスクリーニングを行ったところ、40個の陽性化合物を得た。二次スクリーニングを行うと4個の化合物によりnephrin mRNA発現が2倍以上に増加した。スクリーニングの規模を拡大すると共に、化合物の全身投与により、個体レベルで(病的)糸球体におけるnephrin発現を増加させるものがあるか今後も検討を進める。ネフリンレポーター糸球体を用いた化合物ライブラリーのスクリーニングを進める。podocyteのviabilityに影響を及ぼすと考えられている1,25(OH)2 VtD3 (1-1250nM)およびall-trans retinoic acid (0.04-25μM)について、レポーターへの効果を検討する。スクリーニング化合物は10mM in DMSOの状態で供給を受ける。ビタミンDの効果を最大化する条件検討を行い、最初3日間はDMEM培地+10% Fetal Calf Serum (FCS)、次の2日間に化合物を添加しFCSを0.5%に減らすものが良いと判断しているが、更なる至適化を行う。ビタミンDの有無に関わらず、2%DMSOの存在はレポーター活性を20%低下させたが、ビタミンDの効果を見ることには影響しなかった。一次スクリーニングでは化合物10μM+1%DMSOで48時間処理し、4% paraformaldehyde固定、300ng/ml DAPIで核染色し、ArrayScanにて糸球体の同定、EGFP蛍光強度の定量を行う。腎臓内科学