hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天然生態情報に基づく新しいウナギ種苗生産技術の開発

資源が激減したウナギの養殖用種苗を補うために,天然生態情報を活用して人工種苗の生産技術の開発研究を行った。その結果,ホルモンを使わず,水温の操作のみにより自然にウナギを成熟させる技術の確立に道が開けた。雌雄の親魚を水槽内で自然産卵させることにより,奇形率が減り,良質の卵を得ることができた。天然仔魚の栄養段階の解析から,マリンスノーを餌としていることがわかった。天然の生息環境を調べて,これを模した飼育装置を開発し,生産コストを大幅に削減することができた。本研究によりウナギの大量種苗生産の実現に向けて大きく前進した。ウナギの種苗生産技術の確立を図るため,野外調査と室内実験を併用して以下のことを明らかにした。(1)成熟過程(1)浜名湖と三河湾で採集した下りウナギについて降海行動に伴うステロイドホルモン(E_2,T,11-KT),T_4,GTH, GnRHの動態を明らかにした。(2)ホルモンを投与しないで親ウナギを催熟するため,毎日5-15°Cの変動水温を下りウナギに与えたところ,3ヶ月目にGSIが8.3%の個体が出現し,世界初の非ホルモン催熟の事例を得た。(2)産卵過程(1)2006年7月および8月の航海ではウナギ卵・親魚は採集されなかった。(2)φ3mの大型水槽で30尾の♂♀親ウナギの産卵行動を観察したところ,顕著な追尾行動が見られないまま,放精,放卵が行われることを確認した。ウナギの産卵は少なくともサケのようなペア産卵ではないと考えられた。(3)発育過程(1)天然プレレプトセファルスと人工魚の発達過程を比較するため,人工魚を水温1928°Cで飼育したところ,人工魚の発達は2528°Cで飼育した時,天然のそれと等しくなった。一方通常行われている1922°Cにおいては,特に1920°Cで奇形率が高く,また孵化率・生残率は19°Cで有意に低く,1922°Cは飼育温度としては低すぎるものと考えられた。(2)走光性の個体発生過程を調べたところ,レプトセファルスと変態期仔魚は強い負の走光性を示したのに対し,シラスウナギはいかなる走性も示さなかった。平成19年度に予定した計画はほぼ順調に進み,最終目的であるウナギの人工種苗生産技術の開発に向けて,研究は大きく進展した。本研究の三つの小課題について得られた具体的成果は以下の通りである。(1)成熟過程(1)前年度同様,浜名湖と三河湾で採集した下りウナギについて,降海行動に伴うステロイドホルモン(E2,T,11-KT)および,T4,GTH,GnRHなど各種ホルモンの動態を明らかにした。(2)ホルモンを投与しないで親ウナギの催熟を行う技術を開発するため,ステロイドホルモン(E2)処理によってメス化した養成ウナギに毎日5-15°Cの変動水温を与えたところ,3ケ月後にはGSIが4%前後にまで進み,本技術の開発研究が大きく進んだ。(2)産卵過程(1)2007年8月および9月のウナギ産卵場踏査航海でウナギ卵,親魚は採集されなかったが,ニホンウナギのプレレプトセファルス37尾が採集された。これにより2005年航海で得られたスルガ海山産卵説の再現性が確認できた。(2)人工産卵法についても進展があり,卵,精液の搾出による人工受精法より,雌雄のペアリングによる自発産卵法の方が受精率が高く,奇形率が低いことがわかり,自発産卵法が大量種苗生産に適しているものと考えられた。(3)発育過程(1)レプトセファルスの飼育に適した回転水流をもつ縦型円形水槽"レプトタング"を作成した。タンクの洗浄およびタンク内での給餌を自動化して,省力化を図った。これにより従来の生産コストを約1/10にすることができた。(2)低照度下で摂餌するか否かを検討したところ,暗黒下でもウナギ仔魚の摂食行動が起きることが確認された。本研究計画の最終年度に当たる本年度は,前2年の成果のまとめと再現性確認の実験・調査を実施し,以下の成果を得た。(1)成熟過程i)下りウナギの内分泌状態の観察:浜名湖と三河湾で採集した下りウナギのホルモン動態を3ヶ年に亘り調べた。秋初冬の降海行動に伴って, E2, T, 11-KT, LHが上昇し, GHが下降することがわかった。FSH, TSHは変化しなかった。ホルモン動態をほぼ把握できた。

ii)非ホルモン催熟実験:大型回遊水槽に親ウナギを収容し, 5-15°Cの日周変動水温を与え3ケ月後に成熟度を調べた。有意差は無かったものの,卵径, GSI,組織像に催熟効果が認められた。水温刺激で自然催熟できる可能性が示された。今後光や運動の影響を検討する。(2)産卵過程i)卵・親魚の採集:2008年57月の白鳳丸航海で孵化後3-7日のプレレプトセファルス約150尾を得た。開洋丸で二ホンウナギの産卵後雌親魚2尾,産卵前雄親魚2尾,オオウナギ雄親魚1尾を得た。天然仔魚の発育過程がわかった。生殖腺,脳下垂体,耳石は解析中。ii)産卵行動実験:人工受精法と雌雄のペアリングによる自発産卵法の比較を行ったところ,自発産卵法で得た卵の方が受精率が高く,孵化仔魚の奇形率は低かった。水温22°Cで最も産卵前の活動が活発になることがわかった。この結果は,直接採卵技術の向上につながる。(3)発育過程i)初期餌料の探索:天然海域で採集されたレプトセファルスのアミノ酸の安定同位体解析を行い,栄養段階を推定したところ, 2.2-2.4の低値を示し,動物プランクトンが少量混じった植物プランクトン主体のマリンスノー状の餌を食べているものと推定された。ii)飼育技術の開発:レプトセファルス飼育専用に"レプトタンク"開発し,その自動給餌システムを考案した。これによって種苗生産コストの大幅削減が見込める。
肋骨の胸部特異的な形成に必須の体節.表皮間相互作用における分子基盤

脊椎動物の進化の過程で肋骨形成部位が限局した結果,ほ乳類と鳥類の胴部は胸部と腹部とに分化した.肋骨は長軸に沿って3区画に分けられる.発生初期に体節と側板中胚葉の接触を阻止すると,最も遠位部にあたる肋骨胸骨部が形成されない.これは,胸骨部の原基である側軸部体節細胞が形成されなかったためである.体節を標識し,その発生を追跡すると腹壁筋の大部分は,最下位の肋骨を形成する体節1個に由来していた.腰部体節は肋骨のみならず筋も形成しないといえる.表皮外胚葉-体節間相互作用に関わる候補遺伝子Wnt6, Fzd7をクローニングした.脊椎動物の進化の過程で肋骨形成部位が限局した結果,ほ乳類と鳥類の胴部は胸部と腹部とに分化した.肋骨は長軸に沿って3区画に分けられる.発生初期に体節と側板中胚葉の接触を阻止すると,最も遠位部にあたる肋骨胸骨部が形成されない.これは,胸骨部の原基である側軸部体節細胞が形成されなかったためである.体節を標識し,その発生を追跡すると腹壁筋の大部分は,最下位の肋骨を形成する体節1個に由来していた.腰部体節は肋骨のみならず筋も形成しないといえる.表皮外胚葉-体節間相互作用に関わる候補遺伝子Wnt6, Fzd7をクローニングした.多くの動物は,例えば昆虫で明らかなように,分節を単位として構成され,その分節ひとつひとつが異なることによって多様な形態が生み出されている.脊椎動物もその例にもれない.本研究が対象としている中軸骨格は椎骨と肋骨からなっており,ほ乳類や鳥類においては,肋骨が胸部に限局して形成される.椎骨も肋骨も胚発生の最も初期に現れる分節構造である体節中胚葉に由来し,形態上全く異なるところのない体節が,発生の進行とともに,部域ごとに異なった形態をうみだすのである.肋骨は,発生的に3つの区画に分けられ(Aoyamaら, 2005, lnt. J. Dev. Biol),正中に近い方から,近位部,遠位部椎骨部,遠位部胸骨部となる.遠位部は肋骨の大部分を占めるものであるがこれは表皮外胚葉に依存して形成される.本研究の目的は,肋骨形成の部域による違いについて体節と表皮外胚葉の相互作用に焦点を当て,その実体を明らかにしようとするものである.LiemとAoyama (2009, Mech. Dev.)は,遠位部椎骨部,遠位部胸骨部が,最近Ann Burkにより提唱された,体壁の発生的区画でいえば,それぞれ主軸部,側軸部に属することを明らかにした.これは,異所的な四肢形成によって肋骨の遠位部胸骨部の形成のみが抑制されしかもその細胞は四肢の形成に加わっていたことから示された.この結果は,個体発生における肋骨形成機構のみならず,系統発生における胸部と腹部の分化の機構についても示唆を与えるものである.肋骨遠位部形成に表皮外胚葉が必要であることは,表皮と体節との相互作用を遮断すると,肋骨は,椎骨の近くの部分のみ形成されることから示された.表皮外胚葉由来の分泌因子としてWntファミリーの遺伝子産物,その受容体としてFrizzled群が,また,その阻害因子としてFrzbが想定される.現在,各遺伝子をクローニングしているところであり,今後,それぞれの発現パターンを明らかにし,さらに強制発現/阻害実験によりその機能を検証する予定である.本研究は,脊椎動物のボディプラン形成機構を考察するための格好の題材として,体節から中軸骨格が形成される機構,とくにその胸部を特徴づける肋骨の部域特異的形態形成機構を取り上げている.体節は,中軸組織(神経管,脊索),表皮,表皮+側板中胚葉にそれぞれ依存して発生する.例えば,表皮と体節との相互作用を遮断すると,肋骨は,椎骨の近くの部分のみ形成され,胸椎があたかも頸椎のような形態となる.本年度は,肋骨の相同部位が,実際に,頚椎や腰仙椎にあるのかを検討するため,頚椎や腰椎の肋骨突起の発生と,胸椎及び肋骨の発生を,その骨化点,関節形成,軟骨分化において比較した.骨化点は椎体と椎弓に加え,胸部では肋骨に,頚椎では肋骨突起に見られた.胸部では関節形成に先立って細胞の凝集が見られたが,頚椎でも椎体と肋骨突起の間に同様の細胞凝集が一過性に見られた.頚部でも椎体と肋骨突起の間に関節が途中まで形成されると推測される.骨化に先立つ軟骨形成をSox9の発現で検討した.肋骨突起や肋骨では,いずれも椎体や椎弓から離れた位置から軟骨分化が始まった.すなわち,肋骨突起も肋骨と同様,椎体や椎弓とは独立に軟骨分化していた.以上の結果から,頚椎の肋骨突起が肋骨と相同であることが確認された.頚椎は肋骨の近位部のみが残っていると考えられるのである.本研究の最終目的は,肋骨形成における表皮外胚葉-体節中胚葉間相互作用の実体を明らかにすることにある.

今後,表皮外胚葉では分泌因子の候補となる因子を,体節側ではその受容体について,その時間的空間的発現パターンの変化を調べ,表皮と体節との間でどのような時空間配置における相互作用が存在するのか検討する予定である.本研究では,脊椎動物の軸骨格の部域特異的形成,とくに肋骨が胸部特異的に形成される機構についてニワトリ胚を用いて行う.我々は2005年に肋骨がその原基である体節から発生するためには表皮外胚葉の存在が必須であることを示した.2008年度には,肋骨胸骨部の形成が四肢形成と競争的関係にあることを示し,進化における肋骨の部域化が四肢形成の影響によるものではないかという仮説を提唱した.2009年度には,各部域の椎骨において肋骨との相同部位を同定することにより,部域間で比較すべき対象を明らかにした.本年度は,(1)表皮外胚葉と体節との相互作用を阻害した場合に見られる組織形成,(2)表皮外胚葉から分泌されるWnt分子群,体節側で発現されるfrizzled分子群の分布と機能解析を計画した.(1)については阻害実験系を確立し継時的に観察を始めたところである.(2)については,表皮からの分泌物としてWnt6を,体節側の受容体としてFzd1,2,7を候補とした.現在,Wnt6,Fzd7をクローニングし,それぞれの空間的時間的発現パターンの変化について記載を開始した.一方,骨格の部域特異的形態形成能が,骨原基自身に内在するものかは明らかではない.体節についてはそれが将来形成するべき形態が決定されているが,体節からは四肢や体壁の筋も発生する.我々は先にウズラ-ニワトリキメラ胚作成により腹壁筋の大部分が,胸部/腰仙部境界にある1体節に由来することを示した.今年度,ニワトリ胚の1体節を蛍光色素標識することにより,この体節が筋や骨格を形成するまで継時的に追跡した.その結果,腹壁を構成する筋は胸部/腰仙部境界の1体節が移動して形成されること,腰仙部体節細胞は椎骨とその周囲の筋を形成する他は後肢に移動して行くことが明らかになった.腰仙部体節細胞は肋骨のみならず腹壁筋も形成しない.すなわち,胸部体節と腰仙部体節との違いは体壁への移動能の有無であることを示唆している.
低酸素換気抑制における脳内アデノシンの役割

低酸素血症は末梢化学受容体に対する作用とは逆に中枢では呼吸抑制作用を持つ。その機序については中枢にアデノシン、GABAなどの神経抑制性物質が蓄積するためとの仮説が有力であるがその詳細は現在も明らかではない。昨年我々はマイクロダイアリシスを用い、中等度の低酸素負荷でも脳内アデノシン濃度が有意に増加するが、その変化は可逆的であり比較的短時間に回復すること、その際の換気量の変化が脳幹アデノシン濃度の推移と平行し、しかも換気抑制現象との間に一定の相関が認められることを示した。本年度は同様の方法により低酸素負荷中の脳内GABA濃度の変化を測定した。すなわち麻酔ネコの前頭葉及び延髄孤束核周辺にプローブを穿刺し、自発呼吸をモニターしながら呼気終末O_2分圧45Torrで40分間維持し、10分ごとに採取した灌流液のGABA濃度をHPLCを用いて測定した。負荷前のGABAの平均値は皮質で1.29±0.37(1SD)mM、脳幹で1.50±0.32であり、低酸素負荷により皮質で1.94±1.07(0-10分)、1.76±0.87(10-20分)、1.76±1.00(20-30分)、2.01±1.33(30-40分)、脳幹で1.73±0.42(0-10分)、1.93±0.45(10-20分)、2.09±0.55(20-30分)、2.02±0.52(30-40分)と有意に増加し、室内気に戻すと前値に戻った。ただし皮質および脳幹いずれのGABA濃度ともその増加の程度と分時換気量の減少の程度との間に一定の相関は認めなかった。従って中等度低酸素負荷によりネコ大脳皮質、脳幹で内因性GABA濃度が可逆的に有意に増加したが、換気抑制現象との間に一定の相関はなかった。以上の結果は低酸素換気抑制現象を媒介する物質としてはGABAよりもアデノシンの方が有力である可能性を示すのかもしれない。本年はマイクロダイアリシス法を用い低酸素負荷時の内因性アデノシンの脳組織内動態を経時的に調べ、低酸素換気抑制現象への関与について検討した。対象は麻酔ネコを用い、前頭葉及び延髄孤束核よりサンプリングし、同時に自発呼吸下で分時換気量および呼吸パターンを記録した。低酸素負荷は45Torr前後とした。室内気下でのアデノシン濃度の平均は、前頭葉で0.78μM、延髄孤束核周辺で0.58で、両部位間に有意差はなかった。室内気下での分時換気量の平均は0.52L/分で、低酸素負荷開始後まもなくピークとなったが、56分頃より次第に低下し、その後はほぼ一定で、室内気に戻すことよりほぼ前値に復した。この低下部分は一回換気量の減少に由来し、低酸素換気抑制現象が再現された。

アデノシン濃度の平均は、皮質において(020分)で1.14μM、(2040分)で1.06、脳幹において(020分)で0.99、(2040分)で0.97へといずれも有意に増加し、室内気に戻すと2040分でほぼ前値に復した。負荷の各相とも両部位間に有意な濃度差を認めなかった。低酸素負荷時のアデノシン濃度の変化と換気抑制現象との関係について、脳幹におけるアデノシン濃度の前値に対する2040分での増加率と、分時換気量のピーク値に対する負荷40分目での減少率との間に正相関があった(p<0.05)。この研究は低酸素負荷時の脳内因性アデノシン濃度を経時的に測定し、呼吸調節との関連について論じた初めての報告であり、PaO_245Torr前後の低酸素負荷でも大脳皮質及び脳幹でアデノシン濃度が有意に上昇し、しかもその変化は可逆的であり比較的短時間に回復することが示された。さらに分時換気量の変化が脳内アデノシン濃度の推移と平行し、同時に観察された換気抑制現象と脳幹アデノシン濃度の増加との間に相関が認められたことよりいわゆる低酸素換気抑制における脳幹アデノシンの関与の可能性が示された。低酸素血症は末梢化学受容体に対する作用とは逆に中枢では呼吸抑制作用を持つ。その機序については中枢にアデノシン、GABAなどの神経抑制性物質が蓄積するためとの仮説が有力であるがその詳細は現在も明らかではない。昨年我々はマイクロダイアリシス法を用い、中等度の低酸素負荷でも脳内アデノシン濃度が有意に増加するが、その変化は可逆的であり比較的短時間に回復すること、その際の換気量の変化が脳幹アデノシン濃度の推移と平行し、しかも換気抑制現象との間に一定の相関が認められることを示した。本年度は同様の方法により低酸素負荷中の脳内GABA濃度の変化を測定した。すなわち麻酔ネコの前頭葉及び延髄孤束核周辺にプローブを穿刺し、自発呼吸をモニターしながら呼気終末O_2分圧45Torrで40分間維持し、10分ごとに採取した灌流液のGABA濃度をHPLCを用いて測定した。負荷前のGABAの平均値は皮質で1.29±0.37(1SD)mM、脳幹で1.50±0.32であり、低酸素負荷により皮質で1.94±1.07(0-10分)、1.76±0.87(10-20分)、1.76±1.00(20-30分)、2.01±1.33(30-40分)、脳幹で1.73±0.42(0-10分)、1.93±0.45(10-20分)、2.09±0.55(20-30分)、2.02±0.52(30-40分)と有意に増加し、室内気に戻すと前値に戻った。ただし皮質および脳幹いずれのGABA濃度ともその増加の程度と分時換気量の減少の程度との間に一定の相関は認めなかった。従って中等度低酸素負荷によりネコ大脳皮質、脳幹で内因性GABA濃度が可逆的に有意に増加したが、換気抑制現象との間に一定の相関はなかった。以上の結果は低酸素換気抑制現象を媒介する物質としてはGABAよりもアデノシンの方が有力である可能性を示すのかもしれない。
小児てんかんにおけるＱＯＬ評価尺度ＱＯＬＣＥ－Ｊの臨床活用に向けた簡略版の開発

前年度に続き、小児てんかんにおけるQOL評価尺度日本語版QOLCE-Jの簡略版開発を行った。前年度までに、QOLCE-Jを因子分析した結果、4つのサブスケールおよび54項目からなる簡略版が完成した(QOLCE-Js)。今年度はこのQOLCE-Js54を用いて調査を行った。全国の小児神経専門医が所属する施設をはじめとした57施設において協力を得て、415歳のてんかんをもつ子どもの保護者に調査を行い、226部の回答が得られ、うち年齢が対象外であった3部を除いて223部を有効回答とした。調査内容はQOLCE-Jsのほか、てんかんに関するプロフィールや抗てんかん薬の副作用、また基準関連妥当性を検証するための外的基準として「こどもの強さと困難さアンケート(SDQ)」を用いた。また、再テスト信頼性を確認するために、QOLCE-Js54は初回回答から23週間後にも再度回答を得た。各サブスケールにおいて主成分分析を行ったところ2項目が除外対象となり、<認知>24項目、<日常の活動>10項目、<抑うつ・不安>10項目、<コンピテンシー>8項目の計52項目が採用された(QOLCE-Js52)。各サブスケールおよび尺度全体においてCronbach's αは0.77ー0.97であり、内的整合性が確認された。Test-retestにおける級内相関係数は各サブスケールおよび尺度全体で0.85ー0.95であり、尺度の再現性が確認された。基準関連妥当性については「子どもの強さと困難さアンケート(SDQ)」を外的基準として用いて検証したところ、認知や感情、適応性を示す領域で中程度の相関がみられた。本検証により、QOLCE-Js52の信頼性・妥当性が確認され、実用可能であることが示された。てんかんをもつ子どもには日常生活や社会生活を送るうえでさまざまな対応すべき課題がある。そのような課題に対してサポートを行ったり治療を行う上で、その効果を図るための客観的な指標が不可欠である。しかし、日本には小児てんかんに特化したQOL測定尺度が存在せず、我々はその開発に取り組んできた。その結果、先行研究においてオーストラリアで開発されたQUALITY OF LIFE IN CHILDHOOD EPILEPSY QUESTIONNAIRE(QOLCE)の日本語版QOLCE-Jに着目し、QOLCE-Jの信頼性・妥当性を検証を経て実用化してきた。しかしQOLCE-Jは質問項目数の多さが最大の懸念であり、回答者の負担や多忙な臨床における医療者の評価に要する時間等を考慮すると、QOLCE-Jがさらに積極的に活用されるためには簡略版の開発が望まれた。尺度開発のガイドラインに沿って、平成27年度は簡略版のパイロット版を作成した。初期計画ではパイロット版を用いてパイロットテストを行うところまでを計画していたが、パイロットテストには至っていないため。前年度に続き、小児てんかんにおけるQOL評価尺度日本語版QOLCEーJの簡略版開発を行っている。前年度作成した簡略版のパイロット版を用い、10例を対象にパイロットテストを実施した。その際、対象者に数分のインタビューを行い、パイロット版への回答の労力や困難さ、言葉の解釈等について質問し、得られたコメントをふまえて尺度の修正を行った。これにより、本調査を行うための準備が整った状況である。簡略版は初期版QOLCEーJよりも質問項目も少なく、回答への負担が軽減したとの意見が得られた。また、小児てんかんや子どものQOL、てんかんの併存障害に関連する学会や研究会に参加し、知見を得た。初期計画では本調査を行うところまでを計画していたが、パイロットテストまでしか行えていないため。前年度に続き、小児てんかんにおけるQOL評価尺度日本語版QOLCE-Jの簡略版開発を行っている。前年度のパイロットテストをふまえ、尺度の簡略版を作成した(完成版)。計画では、完成版を用いて本調査を行い、尺度の信頼性と妥当性を検証する予定であったが、そこまでには至っていない。また、小児てんかんや子どものQOL、てんかんの併存障害に関連する学会や研究会に参加し、知見の収集を継続している。尺度を完成させ、それを用いて本調査を行い、尺度の信頼性と妥当性を検証する予定であったが、尺度を完成するところまでしか進んでいない。

各サブスケールにおいて主成分分析を行ったところ2項目が除外対象となり、<認知>24項目、<日常の活動>10項目、<抑うつ・不安>10項目、<コンピテンシー>8項目の計52項目が採用された(QOLCE-Js52)。各サブスケールおよび尺度全体においてCronbach's αは0.77ー0.97であり、内的整合性が確認された。Test-retestにおける級内相関係数は各サブスケールおよび尺度全体で0.85ー0.95であり、尺度の再現性が確認された。基準関連妥当性については「子どもの強さと困難さアンケート(SDQ)」を外的基準として用いて検証したところ、認知や感情、適応性を示す領域で中程度の相関がみられた。本検証により、QOLCE-Js52の信頼性・妥当性が確認され、実用可能であることが示された。パイロットテストについてはすでに協力施設が確保できており、直ちに実施できる状況であるため、研究の進捗の遅れは解消できる見込みがある。29年度は本調査を行う。研究協力施設は確保できているので、質問紙の配布、回収、データ入力をすすめていく。30年度はデータの分析結果をふまえて学会や誌上における発表を予定している。研究協力施設にて本調査を行い、質問紙の配布、回収を行う。得られたデータの統計学的分析により尺度の信頼性と妥当性を検証する。また、31年度6月の日本小児神経学会でこの結果を発表すべく準備を行う(30年12月に演題登録予定)。ノートパソコン一式を購入予定であったが、初年度は必要とするタイミングがないために購入を見送ったため。研究進捗の遅れに伴い、質問紙の印刷代や郵送費などにかかる経費を使用していないため。(理由)研究進捗の遅れに伴い、質問紙の印刷代や郵送費などにかかる経費を使用していないため(使用計画)30年度は本調査を行うため、質問紙の準備や配布に伴う費用を使用予定である。28年度は調査により得られたデータの集計や分析にノートパソコンが必要であるため、購入予定である。29年度は本調査を行うため、質問紙の準備や配布に伴う費用を使用予定である。
古インド・アーリヤ語歴史文法動詞篇

古インド・アーリヤ語(広義の「サンスクリット語」)の動詞組織について,具体的語形と用例を収集し,活用組織を確定し,語形成とシステムそれぞれの機能と原理を厳密に分析し,歴史的展開を跡づけて記述する。ヴェーダ語から古典サンスクリットに至る記述文法と歴史文法とを兼ね備え,文献研究の参考書としても役立つ動詞形態論の記述を完成させる。歴史的に,インド・ヨーロッパ祖語,インド・イラン祖語に遡って各形態の起源と改変とを分析して跡づけ,他方,必要に応じて,パーリ語を始めとする中期インドアーリヤ語への展開にも留意する。さらに,副詞等の不変化詞をも合わせて扱い,先行の研究計画で完成した名詞,数詞,代名詞に関する部分と合わせ,古インド・アーリヤ語形態論の出版を目指す。類書が無い現状から,インド・ヨーロッパ語比較言語学の一到達点を紹介する入門書ともなろう。本年度は,インド・ヨーロッパ語比較言語学における最近の諸研究を吟味し,動詞組織を形成する各カテゴリーの分析確定に時間を割いた。具体的な内容としては以下の5項目の検討記述を行った:(1)能動態と中受動の両態(Diathese)の形態,言語事実と原理,その多重多層なあり方とシステムの分析,歴史的起源と展開次第,(2)動詞語根の語彙的内容が持つ時間軸的性質(Aktionsart:瞬間的←→持続的など),動作様態(Verhaltensart:行為,状態変化,状態;作成,作為,加工;使役,受動など),支配様態(Rektionsart:自動詞,他動詞,絶対用法,など),(3)アスペクト(観)とそれの基づくアスペクト語幹(現在組織とアオリスト組織)の形成法,補完現象(Suppletion);完了組織,(4)現在語幹形成法とその分類法の確定(パーニニの10分類を合理的に再編),(5)動詞語尾一覧とその起源と原理。最近のインド・ヨーロッパ語比較言語学における成果ないし提言を改めて検討し,諸カテゴリーを分析吟味して確実なものとして設定する理論的作業に,当初の予定よりも時間が懸かった。2019年度は次の2章を完成させる,(1)「法」(言及法,直説法,接続法,願望法,命令法)の概念と機能,形成原理の分析,アスペクト語幹(現在語幹とアオリスト語幹),完了語幹における「法」の具体的発現事情と改変の確認,(2)現在語幹形成法の分類と各類に属する動詞語形の収集確認,各類の基本的機能(形成法の動機)と原理。-- 8月にはドブロヴニク(クロアチア)で開催される国際ヴェーダ学ワークショップに久しぶりに参加して最新の知見を得る。2020年度にはアオリスト組織と完了組織,二次的現在語幹(未来語幹,意欲活用語幹,反復活用語幹,使役語幹,受身語幹,名詞起源語幹類)の分析と記述を終える。最終2021年度前半に,動詞起源の名詞等派生諸語形(不定詞,絶対詞,等々)を扱い,後半に,副詞,間投詞等を簡潔に扱ってこれまでの諸成果を再点検し,出版用原稿の完成を目指す。2019年度は次の2章を完成させる,

(1)「法」(言及法,直説法,接続法,願望法,命令法)の概念と機能,形成原理の分析,アスペクト語幹(現在語幹とアオリスト語幹),完了語幹における「法」の具体的発現事情と改変の確認,(2)現在語幹形成法の分類と各類に属する動詞語形の収集確認,各類の基本的機能(形成法の動機)と原理。-- 8月にはドブロヴニク(クロアチア)で開催される国際ヴェーダ学ワークショップに久しぶりに参加して最新の知見を得る。2020年度にはアオリスト組織と完了組織,二次的現在語幹(未来語幹,意欲活用語幹,反復活用語幹,使役語幹,受身語幹,名詞起源語幹類)の分析と記述を終える。最終2021年度前半に,動詞起源の名詞等派生諸語形(不定詞,絶対詞,等々)を扱い,後半に,副詞,間投詞等を簡潔に扱ってこれまでの諸成果を再点検し,出版用原稿の完成を目指す。当初出席を考えていた国際学会のテーマに相応しいものが無く,発表の準備ができなかった。勤務校の最終年度に当たり,すべきことが多く,また研究計画自体を先に進めておきたかった。ノートパソコン,電子辞書等,設備の更新,増補が必要でありながら詰め切れず,窓口となる大学の移行措置を待った。2019年度は,クロアチアで開かれる国際ヴェーダ学ワークショップに開催者側の一員として出席を予定している。しかるべき学会で発表を再開したい。書籍の注文やコピーにも予定しているものが多く,早めに揃える。
農地工学へのエンジニアリング・ペドロジーの適用

1.物理的手法による分類赤黄色土:沖縄土壌の耐食性を硬度・浸透能・団粒分布を指標にして分類し、畑地造成に寄与した(翁長)。全国に分布する赤黄色土に粘土鉱物の土層分布特性による分類を試み、気温・雨量との関係を明らかにした(岩佐)。火山灰土:pFによる国際分類基準に加えて、新しく乾燥密度による分類を内外の資料を基礎に提案した(前田)。砂丘土:粒度曲線と保水曲線の特性式の係数を用いて新しい分類を試み、物理性との高い相関を得た(小谷)。2.農地工学とペドロジー農用地造成:草地を耕種複合・林畜複合・大規模傾斜地に分類し、後二者を林地土壌・改良山成工・環境保全の視点から新山地畜産としてその役割を明らかにした(小林・堤)。黒ボクとマサ土の造成土壌の経時変化を追い、その物理性が相反する変移をたどることを見出した(駒村)。水田基盤整備:現場調査に基づき、ペドロジカル・エンジニアリングの確立のため、土壌知見適用の定式化を試みた(多田)。八郎潟干拓地で、土壌統レベルの経時変化と収縮・含水比の関係を明らかにした(住田)。地下水土壌型の生成過程と通年地下水位変動特性との関係を実測をもとに定式化した(浜崎)。3.土の物理像全体像:地表付近の熱エネルギの流れを地球的視野から把え、土地生産性の成立基礎を明かにした(粕渕・岩佐)。物理常数の相互関係を基礎・中間・機能の三階級に分け、農地工学への適用手順を検討した(中野)。構造:土の構成分として非晶質を新しく取上げ、その凝集作用(軽部)とコンシステンシーの影響(岩田)を調べ、有機物の土の構造への役割(長田)に新知見を得た。工学的性質:各種の土を対象に、乾燥履歴(荒川)、凍結・乾燥の効果(宮内)、スレーク特性(月館)および、膠結特性(須藤)に新知見を得た。
異所性脂肪蓄積の遺伝素因と環境因子の検索と前向き追跡調査での検証

ゲノムワイド関連解析にて非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)と強い相関を示すPNPLA3遺伝子領域を同定した。この領域のターゲット・リシークエンスを行い、PNPLA3遺伝子領域がNAFLDの発症と進行に、PARVB遺伝子領域が進行に関連していることを明らかにした。ターゲット・バイサルファイトシークエンスを行い、進行したNAFLDではPNPLA3遺伝子上のCpG99のメチル化が増加し、PNPLA3の発現が低下していることを示した。rs738409のMM型でその傾向が強く表れ、遺伝子多型がエピゲノムに影響を与えることが示唆された。ゲノムワイド関連解析(GWAS)で同定した非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)感受性領域(PNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子領域)を含む108kbのゲノム領域を16個のlong-range PCR (3.8-13.6 kb)にて増幅した。PCRは28人のNAFLD患者の血液由来ゲノムを用いた。PCR産物を混合してイルミナTruSeq DNA Sample Preparation kitで調節後、次世代シークエンサー(MiSeq)にて配列を決定した。この領域に関しては大きな構造変化やCNVなどは見出せなかった。シークエンスで同定した5%以上の頻度の201遺伝子多型について540人のNAFLDと1012人のコントロールでタイピングを行った。180個の遺伝子多型でタイピングに成功し、7個の欠失を含む頻度10%以上の169遺伝子多型を用いて連鎖不平衡マップ(LD)を作成した。NAFLDと強い相関を認めた領域は4個のLDブロックに分かれた。PNPLA3遺伝子は2個のブロックにSAMM50は1個、PARVB遺伝子の5'側は1個のブロックに含まれていた。全てのブロックでNAFLDと強い相関が認められた。非アルコール性脂肪肝炎(NASH)と脂肪肝との相関解析、及び肝臓の繊維化にはブロック1と4が強い相関を示した。NAFLD activity score (NAS)はブロック2と4で強い相関を認めた。NAFLD発症にはPNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子が、進展にはPNPLA3、PARVB遺伝子が重要であることが示唆された。候補遺伝子解析でGCKRとTRIB1がNAFLDと相関を示し、GCKRの多型は中性脂肪や内臓脂肪量とも関連していた。GCKRとTRIB1の多型は繊維化やNASとの関連がなく、進展には関連していないことが示唆された。以上を論文に報告した。本年度は非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)関連遺伝子領域に存在するPNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子の発現調節領域に存在する4ヶ所のCpG island(CpG99、CpG71、CpG26、CpG101)のメチル化解析と上記3遺伝子の発現解析を行った。NAFLD患者65名から採取した肝生検の組織からゲノムとRNAを抽出した。ゲノムをバイサルファイト処理し、PCRでCpG islandを含む領域を増幅し次世代シークエンサーでメチル化レベルを測定した。CpG26でNAFLDの繊維化に伴いメチル化が低下していることを明らかにした。CpG99では繊維化に伴いメチル化が増加し、PNPLA3の発現の低下が認められた。CpG99の変化はPNPLA3上のI148M多型のリスク型(MM)で顕著であり、IM型及びII型では繊維化によるメチル化やPNPLA3の発現の有意な変化は認められなかった。CpG26のメチル化低下はどちらの遺伝子多型でも認められた。CpG26のメチル化低下とCpG99のメチル化増加はC型肝炎での繊維化にも関連していることを明らかにし、肝臓疾患における繊維化においてこの2ヶ所のCpG islandのメチル化が重要であること、またNAFLDにおけるメチル化の変化の関与は遺伝子多型により影響を受けることを示し、論文報告を行った。DNAメチル化チップを用いて48名のNAFLD患者の肝臓ゲノムのメチル化解析をゲノムワイドに行い、解析を行った。また、メチル化チップ解析を行った48名を含む53名の同じ肝臓組織より抽出したRNAを用いて次世代シークエンスを行った。NAFLD発症に重要な因子であるアディポネクチン値とインスリン抵抗性に関して、ADIPOQ遺伝子上のSNPが女性においてアディポネクチン値とインスリン抵抗性に関連していることを示し、論文報告を行った。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の肝臓生検検体から抽出したRNAを次世代シークエンサーにて解析した。繊維化の進行度で軽症NAFLDと重症NAFLDの2群に分けて解析した。具体的にはRNAシークエンスのFastqファイルをFastXによりアダプター配列除去後、TopHatにてマッピングを行い、Cufflinksにて発現変動遺伝子の同定を行った。その結果をCummeRbundにて全体的な解析を行った。発現変動遺伝子は約2400存在していた。これらの遺伝子について、KEGG、Go Ontology、DAVIDによるpathway解析を行った。さらにWGCNAによる分子ネットワーク解析を行った。昨年度に行った48人に加えて12人の全ゲノムのメチル化解析をイルミナ社HumanMethylation450 BeadChipを用いて行った。56症例はRNAシークエンス解析に用いたのと同じ肝生検組織から抽出した肝臓ゲノムDNAを用いた。約3000ヵ所のCpGサイトで軽症、重症NAFLD群間で有意差を認めた。NAFLD進行に重要な因子である血中アディポネクチン値がCDH13遺伝子の多型と相関することを報告した。内臓脂肪量と独立にCDH13

遺伝子多型は血中アディポネクチンと関連していた。CDH13遺伝子多型は内臓脂肪量、血中アディポネクチン値と共にメタボリックシンドローム発症に重要な因子であることを明らかにした。ゲノムワイド関連解析にて非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)と強い相関を示すPNPLA3遺伝子領域を同定した。この領域のターゲット・リシークエンスを行い、PNPLA3遺伝子領域がNAFLDの発症と進行に、PARVB遺伝子領域が進行に関連していることを明らかにした。ターゲット・バイサルファイトシークエンスを行い、進行したNAFLDではPNPLA3遺伝子上のCpG99のメチル化が増加し、PNPLA3の発現が低下していることを示した。rs738409のMM型でその傾向が強く表れ、遺伝子多型がエピゲノムに影響を与えることが示唆された。本年度までにターゲットのゲノム解析とエピゲノム解析(DNAメチル化、RNA発現解析)を終了し、論文報告まですることが出来た。ゲノムワイドなメチル化解析とRNA発現解析の実験をほぼ終了したので、目標を予想より早く達成している。残すは解析のみである。追跡調査も連携研究者と進めており、論文投稿中である。遺伝学RNAシークエンスが終了したので、その解析を行う。解析の結果、有意差のついた遺伝子に関してはqPCRにて別サンプルで確認を行う。メチル化チップ解析結果の統計解析を行う。27年度は最終年度であるので、これらの研究について、論文にまとめいくことを中心に行う。平成25年度の研究計画であるlong PCRによるターゲットゲノム領域の増幅と次世代シークエンサーMiSeqによる解析のうち、NAFLDにおけるPNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子を含む領域については終了した。内臓脂肪蓄積についてはSH2B1を含む領域についてlong PCRまで終了している。シークエンス解析結果の大規模解析についてはNAFLDにおけるPNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子を含む領域については終了した。Long PCR法によるエピゲノム解析の開発については、1.5kbまではPCRを行えたが、それ以上についてはバイサルファイト処理により塩基の種類が3個にまで減少し特異的なプライマー設計が困難であること、バイサルファイト処理によりゲノムが不安定になり分解しやすくなることから困難であることが判明した。しかし、NAFLD症例の肝組織より抽出したゲノムとRNAを32人分収集することができた。32人全てで肝臓ゲノムとRNAをそろえることができた。このうち、19症例についてはPNPLA3、SAMM50、PARVB遺伝子のCpG islandについてメチル化解析を次世代シークエンサーMiSeqにて解析できた。シークエンサーから出た結果をマッピングする方法やメチル化レベルの解析も確立した。
ファージ提示法による抗原抗体相互作用における特異性・親和性創出機構の解明

本研究では,申請者がこれまで行ってきた熱力学的測定と結晶構造情報に基づく抗原抗体相互作用解析を基盤とし、さらに当研究室において構築されているファージ提示法による抗体クローンの人工選択系を取り入れ、選択された抗体変異体の分子認識能に関する議論を行うことで、蛋白質-リガンド間の特異的分子認識機構の解明を目指した.1.抗体HyHEL-10各CDRの変異ライブラリーの構築と、抗原HELを用いた抗体の選択:ニワトリ卵白リゾチームHELに対するモノクローナル抗体HyHEL-10抗体可変領域Fv断片の相補性決定領域CDRの残基に無作為変異を導入した遺伝子ライブラリーを構築し、それらをファージ表面に提示させ、抗原HELに対して親和性と特異性を有するクローンの選択を行った.その後、選択した抗体ファージの抗原HELに対する結合活性の評価をオープンサンドイッチファージELISAにて行った.2.選択した抗体変異体と抗原HELとの抗原抗体相互作用の解析:ファージ提示法により選択したクローンの発現ベクターを作製し、変異型HyHEL-10Fvの大腸菌システムによる大量培養・精製を行い、抗原HELとの相互作用を、酵素活性阻害度測定および等温滴定型熱量測定にて評価した.3.選択した抗体変異体と抗原HELとの複合体の構造解析:同様に調製した変異型抗体を用いて、抗原HELとの複合体の結晶化およびX線結晶構造解析を行い、上述の熱力学的解析の結果と組み合わせて、機能と構造の両面から抗原抗体相互作用についての原子・残基レベルでの詳細かつ多角的な考察を行った.本研究では,申請者がこれまで行ってきた熱力学的測定と結晶構造情報に基づく抗原抗体相互作用解析を基盤とし、さらに当研究室において構築されているファージ提示法による抗体クローンの人工選択系を取り入れ、選択された抗体変異体の分子認識能に関する議論を行うことで、蛋白質-リガンド間の特異的分子認識機構の解明を目指した.1.抗体HyHEL-10各CDRの変異ライブラリーの構築と、抗原HELを用いた抗体の選択:ニワトリ卵白リゾチームHELに対するモノクローナル抗体HyHEL-10抗体可変領域Fv断片の相補性決定領域CDRの残基に無作為変異を導入した遺伝子ライブラリーを構築し、それらをファージ表面に提示させ、抗原HELに対して親和性と特異性を有するクローンの選択を行った.その後、選択した抗体ファージの抗原HELに対する結合活性の評価をオープンサンドイッチファージELISAにて行った.2.選択した抗体変異体と抗原HELとの抗原抗体相互作用の解析:ファージ提示法により選択したクローンの発現ベクターを作製し、変異型HyHEL-10Fvの大腸菌システムによる大量培養・精製を行い、抗原HELとの相互作用を、酵素活性阻害度測定および等温滴定型熱量測定にて評価した.3.選択した抗体変異体と抗原HELとの複合体の構造解析:同様に調製した変異型抗体を用いて、抗原HELとの複合体の結晶化およびX線結晶構造解析を行い、上述の熱力学的解析の結果と組み合わせて、機能と構造の両面から抗原抗体相互作用についての原子・残基レベルでの詳細かつ多角的な考察を行った.
脳血管攣縮におけるカルパインの役割

自家動脈血を成犬大槽内に2回注入して脳血管攣縮モデルを作製し、脳血管攣縮におけるカルパインの関与を検討すると同時に、KCIまたはセロトニンを成犬脳血管局所に投与して脳血管収縮モデルを作製し、両モデルにおけるカルパインの関与の相違から脳血管攣縮の特徴を検討して次の結果を得た。1.μーカルパインのpre-およびpost-autolysisformsに対する杭体を用いたimmunoblotの結果、脳血管攣縮群ではμカルパインが常に活性化されるに反し、脳血管攣縮群では収縮初期でμーカルパインは恬性化されるが、持続収縮期には活性化されない。またカルパインの内因性阻害物質であるカルパスタチンの恬性を測定すると、脳血管攣縮群ではカルパスタチンの活性が低下するのに反し、脳血管収縮群では時期の如何を問わず恬性に変化が観察されない。従って脳血管攣縮群におけるカルパスタチン活性の低下は、カルパインの活性化につながると考えられる。2.カルパインの選択的阻害剤があるカルペプチンを脳血管局所に投与すると、脳血管攣縮は用量依存的に緩解されるに反し、脳血管収縮には無効である。1,2の実験より脳血管攣縮におけるカルパインの関与が示唆される。3.平滑筋収縮に関与するα-平滑筋アクチン、ミオシン、デスミン、フィラミン、タリン、ビンクリン、α-アクチニンの夫々の杭体を用いたimmunoblotでは、何れの蛋白質も脳血管攣縮群では強い分解が観察されるが、脳血管収縮群ではミオシン、フィラミン、タリン、α-アクチニンの軽度の分解が見られるにすぎない。以上の結果より、平滑筋収縮に関与する蛋白質の分解は脳血管収縮と比較して脳血管攣縮では極めて強く、活性化カルパインによって惹起されるものと考えられる。このことが脳血管攣縮の治療抵抗性を示す主原因であると考えられる。成犬で自家動脈血を大槽内に2回注入して実験的脳血管攣縮モデルを作製した。初回自家血注入後7日目に脳血管写を施行して脳血管攣縮を確認後、経斜台的に攣縮脳底動脈を露出した。3種の酵素抑制剤、すなわち、Cキナ-ゼの触媒領域にあるATP結合部位に作用するHー7,Cキナ-ゼの調節領域に作用するカフフォスチンC、カルパインに作用するカルペプチンを、用量依存的に攣縮脳底動脈に局所的に投与して、その寛解度を観察した。Hー7とカルペプチンは用量依存的に攣縮脳底動脈を寛解させ、4mMEGTAによる寛解度を100%とした時のHー7およびカルペプチンの最大寛解度は夫々95.7±2.5%と86.8±7.2%であった。カルフォスチンCは用量依存的に攣縮脳底動脈を寛解させるものの、その最大寛解度は31.9±3.5%であった。しかし、攣縮脳底動脈を50%寛解させる17nMのカルペプチン投与後では、カルフォスチンCは単独投与時よりも有意に用量依存的に攣縮脳底動脈を寛解させ、その最大寛解度は65.2±2.0%であった。一般にプロティンキナ-ゼのATP結合部位は構造上の類似性があり、この部に作用するHー7の選択性には問題がある。また本実験で用量依存的に用いたHー7の高濃度領域ではミオシン軽鎮キナ-ゼも抑制される。他方、カルフォスチンCとカルペプチンの効果を併せ考えると、静止状態ではCキナ-ゼの調節領域を不活化しているので、カルパインによりCキナ-ゼが限定分解される結果、カルフォスチンCの効果が減少し、カルペプチンによりCキナ-ゼの限定分解が抑制されて、Cキナ-ゼの調節領域が触媒領域を不活化して攣縮脳底動脈が寛解されるものと考えられる。このことは、カルペプチン投与後のカルフォスチンCの寛解効果が有意に上昇する事実よりも裏付けられるものと考えられる。

3.平滑筋収縮に関与するα-平滑筋アクチン、ミオシン、デスミン、フィラミン、タリン、ビンクリン、α-アクチニンの夫々の杭体を用いたimmunoblotでは、何れの蛋白質も脳血管攣縮群では強い分解が観察されるが、脳血管収縮群ではミオシン、フィラミン、タリン、α-アクチニンの軽度の分解が見られるにすぎない。以上の結果より、平滑筋収縮に関与する蛋白質の分解は脳血管収縮と比較して脳血管攣縮では極めて強く、活性化カルパインによって惹起されるものと考えられる。このことが脳血管攣縮の治療抵抗性を示す主原因であると考えられる。脳血管攣縮は成犬で自家動脈血を大槽内に注入して作製した。なお脳血管攣縮の進展を観察する目的で、1回注入2日後の成犬(Day2)と、最初の注入7日後で2日間の間隔で計2回注入した成犬(Day7)で観察した。脳血管攣縮度は血管写上の脳底動脈の口径を計測して判定し、脳底動脈の口径はコントロ-ルに比較してDay2で平均70.4±3.2%、Day7で52.8±5.0%であった。イムノブロット法で検索した対象は、脳底動脈のαー平滑筋アクチン、ミオシン、デスミン、フィラミン、タリン、ビンクリク、αーアクチニンで、攣縮犬で多少の相違はあるが、多くの場合イムノブロット上複数の断片を示し、脳血管攣縮では上記蛋白質が分解されることを示唆した。代表例では、Day2でアクチン、ミオシン、デスミン、フィラミンは軽度分解し、タリン、αーアクチニンは中等度分解し、ビンクリンは分解されなかった。Day7ではアクチン、デスミンは軽度分解し、ミオシン、フィラミンは中等度分解し、ビンクリンは高度分解し、メタビンクリン、タリン、αーアクチニンは殆ど完全に分解した。すなわち、Day7の方がDay2より一般に分解が高度であり、収縮蛋白質系と細胞骨格蛋白質系とのuncouplingの程度が、Day2よりもDay7の方が強く一種の異常状態にあることを示唆する。このことは平成2年度の成績、すなわちカルパインの選択的阻害剤であるカルペプチンの実験で、カルパインが脳血管攣縮の発生に関与しているという所見と合わせ考えると、上記蛋白質の分解はカルパインによると考えられるが、他の蛋白質分解酵素の関与も否定出来ない。Day7における脳血管攣縮の血管弛緩剤に対する抵抗性とcomplianeの減少は、筋収縮蛋白質、細胞骨格蛋白質、それらに関連する蛋白質の高度の分解によるものと考えられる。なお、上記蛋白質の免疫組織化学では量的変化の検討が困難であるので、途中で断念した。自家動脈血を成犬大槽内に2回注入して脳血管攣縮モデルを、KClまたはセロトニンを成犬脳血管局所に投与して脳血管収縮モデルを作製し、脳血管内のμ-カルパインとカルパスタチン(カルパインの内因性阻害物質)の動向を両モデルで比較検討した。1.μ-カルパインの動向は、μ-カルパインのpre-およびpost-autolysis formsに対する抗体を用いたimmunoblot法で検討した。脳血管攣縮群ではμ-カルパインは動脈血注入日より7日まで連続的に常に活性化された。脳血管収縮群では血管収縮の初期でμ-カルパインは活性化されたが、持続収縮期には活性化されなかった。2.カルパスタチンの活性はカゼインを基質としたm-カルパインの活性を分光光度計により測定した。脳血管攣縮群では、動脈血注入日より7日までカルパスタチンの活性は有意に低下したのに反し、脳血管収縮群では時期の如何を問わず活性に変化が観察されなかった。従って、脳血管攣縮群におけるカルパスタチン活性の低下は、カルパインの活性化につながるものと考えられる。以上の結果より、脳血管攣縮にカルパインの関与が考えられる。この実験結果は平成2,3年度の実験結果と符合するものである。すなわち、カルパインの選択的阻害剤であるカルペプチンの脳血管局所投与により、脳血管攣縮は用量依存的に緩解されるのに反し、脳血管収縮には無効であった(平成2年度)。平滑筋収縮に関与する
ＩＬ－１Ｒａ欠損マウスを用いた歯周組織破壊におけるＩＬ－１Ｒａの影響

IL-1RaKOマウスは野生型マウスに比べ,炎症性サイトカインの有意に高いmRNA発現が認められたことから、IL-1RaKOマウスは野生型マウスに比べ,容易に歯周病を発症させることができるのではないかと考え,両マウスに実験的歯周炎を惹起し、比較検討を行った。A. actinomycetemcomitans感染IL-1Ra KOマウスでは歯槽骨表面が粗造となり,下顎第二臼歯歯間部と歯根分岐部に歯槽骨吸収が観察された。また、IL-1RaKOマウスの骨芽細胞を歯周病細菌刺激したところ,骨吸収に働く遺伝子の発現は増加しており,骨形成に働く遺伝子の発現は低下していた。平成25年度は研究実施計画の中心であるIL-1RaKOマウスでの実験的歯周炎を野生型マウスと比較したところ、良好な結果が得られた。その結果を学術雑誌(Infection and Immunity)に投稿・受理され平成26年5月に公表(volume:82, issue5)されることとなった。以下に簡単にその結果を示す。A.actinomycetemcomitans(A.a.)感染IL-1Ra KOマウスの感染50日後のA.a.血清抗体価は野生型(WT)マウスと比較して有意に高い値を示した。A.a.感染IL-1Ra KOマウスの骨吸収はWTマウスと比較して明らかに進行していた。組織学的に調べたところ、A.a.感染IL-1Ra KOマウスはWTマウスと比較して接合上皮と歯肉固有層に炎症性細胞浸潤、付着の喪失および多数の破骨細胞を骨表面に認めた。IL-1Ra KOマウス由来骨芽細胞はWTマウス由来骨芽細胞と比較して骨吸収に働くRANKL、M-CSF、TNFα、およびIL-6のmRNAの有意な発現増加を認めた。骨形成に関与するRunx2、BSP、OCNおよびALP mRNAの発現低下を認めた。以上の結果から、IL-1RaKOマウスでは炎症性サイトカイン産生の上昇に伴い、破骨細胞分化関連遺伝子発現増加と骨形成関連遺伝子発現抑制が生じ、実験的歯周炎の病態悪化を起こしたと考えられた。今回の結果からIL-1Raは歯周炎診断マーカーや歯周病治療薬として利用できる可能性があることが強く示唆された平成26年度はこれまで調べてきた、骨代謝に関する検討から、IL-1Raの歯肉と歯との付着に与える影響について、研究を継続して行っていく予定であるIL-1RaKOマウスは野生型マウスに比べ,炎症性サイトカインの有意に高いmRNA発現が認められたことから、IL-1RaKOマウスは野生型マウスに比べ,容易に歯周病を発症させることができるのではないかと考え,両マウスに実験的歯周炎を惹起し、比較検討を行った。歯周組織破壊におけるIL-1Raの影響を調べるために、24年度実施計画していた4つの研究計画を実施したところ、IL-1RaはマクロファージからのIL-1だけでなく他の炎症性サイトカイン産生も制御していることを明らかとし、歯周病原菌菌体成分刺激マクロファージ培養上清による骨髄細胞の破骨細胞分化・活性化にプロスタグランデインE2とその受容体であるEP4が関与している事を明らかとし、論文投稿し、アクセプトされた。またIL-1Ra欠損により実験的歯周炎は重症化し、エックス線画像上での形態計測したところ、IL-1Ra欠損マウスの方が野生型マウスに比べ有意に骨吸収していることが明らかとなり、組織学的に、炎症性細胞浸潤と多数の破骨細胞形成が認められた。また骨芽細胞からの骨関連分子の遺伝子発現は骨吸収を抑制し、骨形成を促進するようにIL-1Raが作用していることが明らかとなった。現在上記の作用がIL-1Raの直接的または間接的作用であるかについて炎症性サイトカイン転写因子の活性化を指標に検討中である。25年度計画の上皮細胞の接着性分子の発現に関わるIL-1Raの影響については、予備実験として株化ヒト上皮細胞をRNA干渉によりIL-1Raをノックダウンし、接着分子発現をPCRアレイにより解析したところ、IL-1Ra遺伝子発現はRNA干渉により、約1/5に低下し、ほとんどの接着分子発現は低下していることを確認することができた。次年度はその中でも特に発現低下している遺伝子のスクリーニングを行い、候補接着分子のタンパクレベルでの産生と歯周組織での局在についてIL-1Ra欠損マウスを用いて解析する予定である。IL-1Raのリンパ球の表面抗原の発現についても実験系を検討している所である。IL-1の活性抑制に働く、IL-1レセプターアンタゴニストは歯周病の発症や進行を制御する歯周治療薬の一つになりうる可能性を探るべく、IL-1レセプターアンタゴニスト遺伝子欠損(IL-1RaKO)マウスに歯周病原細菌感染による実験的歯周炎を惹起し、歯周組織破壊の程度を野生型マウスとの間で比較検討した。