hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞間情報伝達を介した発生時間制御機構

発生過程では少数の幹細胞が分裂と分化を繰り返すことで、複雑かつ再現性の高い組織をつくりあげるが、各組織幹細胞の中でも脳をつくる幹細胞は時間に対する感受性が高いことが知られている。とりわけ大脳皮質においては異なるサブタイプのニューロンが正確なタイミングで産生され、同じ時期に生み出されるニューロンは共通の層特異性や投射パターンを示すが、大脳皮質における発生時間を制御するしくみについては分子を含め、不明な点が多く残されてきた。そこで本研究は組織形成における時間コードの実体を明らかにするために、大脳皮質をモデルとしたニューロン-幹細胞間の相互作用に着目し、発生時期特異的に作動する制御ネットワークの分子実体とその作用機序を明らかにすることを目的としている。今年度は幹細胞から分化する娘細胞を生体内で標識し、分化ニューロンー神経幹細胞間の接触動態およびシグナルの伝達経路について解析を進め、細胞間シグナルの制御に関わる核輸送因子を介した局在の変化と細胞分化のタイミングへの影響を明らかにした。さらにこれら幹細胞ーニューロン間のシグナル伝達を担う経路として、新たに細胞接触型シグナルとその受容体の候補因子を同定した。また発生時計と場の相互作用による領野特異的細胞の動態について同一時間に生み出される神経前駆細胞の動態を解析するために、遺伝学的手法を用いた標識と脳スライスを用いたライブイメージングの条件について検討を行った。この結果、異なる領域間において、細胞の挙動が細胞周期離脱後、早い段階から内因性の遺伝子発現と細胞間相互作用により制御されている可能性が示された。本年度は研究代表者の転出に伴って研究機器やマウス系統のコロニーの立ち上げのために一部の実験に遅延が生じたが、その他の実験については概ね予定通りに進行した。これまで大脳皮質神経幹細胞が増殖期から分化期に移行するタイミングで一過的に発現が上昇するNeurog2遺伝子の特性を用い、Neurog2の誘導型Cre組み換え酵素のノックインマウスとタモキシフェン投与により、同じタイミングで生み出される層特異的サブタイプのニューロンの標識を行うことが可能となった。そこで今後はこれらの細胞をプラットフォームとして、同一時間に生み出される神経前駆細胞の動態について、時間(移動と分化)および空間(領野)軸において解析を進め、さらに脳スライスやin vitro培養モデルを用いたタイムラプスイメージングにより可視化し、大脳皮質の異なる神経細胞サブタイプの時空間的な分化と配置パターンを決定する内因性・外因性機構を明らかにする。脳をつくる幹細胞は、各組織幹細胞の中でも時間に対する感受性が高いことが知られるが、時間情報がどこでコードされ、どのような細胞のふるまいに変換されるのかについては不明な点が多い。これまで大脳皮質の主要構成ニューロンの経時的産生を制御する機構を明らかにするために、神経幹細胞に発現する転写因子の時期特異的操作により、大脳皮質ニューロンの産生のタイミングが、Foxg1遺伝子の発現の切り換えに伴って移行すること、深層ニューロンから上層ニューロンへの切り替えがニューロンからのフィードバックにより制御されることを見出した。これらの結果から大脳皮質形成において神経幹細胞に発現する転写因子によるドミノ式制御の実体が明らかになった。さらにこのドミノ式制御因子として働くFoxg1の下流で深層ニューロンから上層ニューロンへ分化能切り替え時期に変動する遺伝子としてPOU転写因子群を見出し、発生期大脳皮質における発現パターンを解析したところ、発生時期特異的に細胞内局在が細胞質から核内に移行することを見出した。これらの知見からニューロン-神経幹細胞間シグナルを介しPOU転写因子群の細胞内局在のダイナミクスが、神経幹細胞の上層ニューロン分化を制御していることが示唆された。さらにこの細胞間のシグナル伝達を担う分子機構を明らかにするために、皮質形成初期の大脳皮質神経幹細胞を単離・培養し、深層および上層ニューロン特異的遺伝子の下流でレポーターを発現するマウスを用いたライブイメージングの条件を確立した。大脳皮質ニューロンの分化タイミングの決定機構を明らかにするため、レポーターを導入したマウス大脳皮質神経細胞の培養とタイムラプスイメージングの解析時に、使用予定であったインキュベータ付き顕微鏡の水補給装置および電動ステージ、レーザーのパルス発生異常の問題が生じ、当初予定していたイメージング実験が4ヶ月遅れた。また研究代表者の転出に伴い研究組織のメンバーと使用設備・マウス施設・機器等に一部変更が生じた。他の研究は概ね予定通りに進行し、発生時計を制御する機構について新たな知見が得られた。脳をつくる幹細胞は、各組織幹細胞の中でも時間に対する感受性が高いことが知られるが、発生時計がどこでコードされ、どのような細胞のふるまいに変換されるのかについては不明な点が多く残されている。我々はこれまでに、大脳皮質の主要なサブタイプでの産生タイミングを決定する発生時計のドミノ式制御因子としてFoxg1を同定し、その下流の遺伝子制御ネットワークを明らかにしてきた。本研究はこれら遺伝子ネットワークにより産生されるニューロンから神経幹細胞へ伝達されるフィードバックシグナルの分子実体を解明し、経時的に変化する場の情報がニューロンの動態にもたらす影響を明らかにすることで、発生時計の制御機構を解明するものである。今年度はニューロン-幹細胞間シグナル伝達機構について、幹細胞から分化する娘細胞を生体内で標識し、分化ニューロンー神経幹細胞間のシグナルの伝達経路について解析を行った。

この中でドミノ式制御因子Foxg1の下流で深層ニューロンから上層ニューロンへ分化能切り替え時期に変動する遺伝子としてPOU転写因子群を見出し、Brn2の核輸送を制御する上流の候補因子としてKPNA因子群について発現スクリーニングを行った結果、ニューロン-神経幹細胞間シグナルを介したKPNA2の制御がBrn2の細胞質から核への移行を誘導し、神経幹細胞の上層ニューロン分化を開始することが示唆された。並行してニューロンと神経幹細胞間の接触についてドミナントネガティブ型N-カドヘリンの導入による放射状グリアとの接触解除実験により、発生時計を制御するシグナル伝達の細胞間接触依存性を見出した。これらの細胞間シグナルを伝達する候補分子についてin vitro培養による阻害実験を行なった結果、深層から上層ニューロンへの切り替えのタイミングと産生細胞数の比を規定するシグナル伝達経路が同定された。研究代表者の転出に伴い、研究組織のメンバーと使用可能な設備・マウス系統・機器等に変更が生じた。また研究室の移設、機器の故障等により一部の実験に遅延が生じたが、その他の研究は概ね予定通りに進行し、発生時計を制御する分子機構について新たな知見が得られた。発生過程では少数の幹細胞が分裂と分化を繰り返すことで、複雑かつ再現性の高い組織をつくりあげるが、各組織幹細胞の中でも脳をつくる幹細胞は時間に対する感受性が高いことが知られている。とりわけ大脳皮質においては異なるサブタイプのニューロンが正確なタイミングで産生され、同じ時期に生み出されるニューロンは共通の層特異性や投射パターンを示すが、大脳皮質における発生時間を制御するしくみについては分子を含め、不明な点が多く残されてきた。そこで本研究は組織形成における時間コードの実体を明らかにするために、大脳皮質をモデルとしたニューロン-幹細胞間の相互作用に着目し、発生時期特異的に作動する制御ネットワークの分子実体とその作用機序を明らかにすることを目的としている。今年度は幹細胞から分化する娘細胞を生体内で標識し、分化ニューロンー神経幹細胞間の接触動態およびシグナルの伝達経路について解析を進め、細胞間シグナルの制御に関わる核輸送因子を介した局在の変化と細胞分化のタイミングへの影響を明らかにした。さらにこれら幹細胞ーニューロン間のシグナル伝達を担う経路として、新たに細胞接触型シグナルとその受容体の候補因子を同定した。また発生時計と場の相互作用による領野特異的細胞の動態について同一時間に生み出される神経前駆細胞の動態を解析するために、遺伝学的手法を用いた標識と脳スライスを用いたライブイメージングの条件について検討を行った。この結果、異なる領域間において、細胞の挙動が細胞周期離脱後、早い段階から内因性の遺伝子発現と細胞間相互作用により制御されている可能性が示された。本年度は研究代表者の転出に伴って研究機器やマウス系統のコロニーの立ち上げのために一部の実験に遅延が生じたが、その他の実験については概ね予定通りに進行した。これまでの研究から、大脳皮質の発生時計において深層ニューロンから上層ニューロンへの切り替えが、ニューロンー神経幹細胞間シグナル伝達を要することが示され、さらに分化後の深層ニューロンが神経突起を介して神経幹細胞とシグナル伝達をしている可能性が見出された。
脳神経系におけるIFNシステムの解析と新規固定型IFNの応用

本研究では,現在広く臨床応用されているIFN-α/β製剤に関して問題となっている副作用の軽減を目指し,より効率の良い効果をもたらすIFN分子の改良を試み,とくに脳神経系の腫瘍であるグリオーマに対する検討を行うこと,さらにはこれを発展させて,脳神経系の領域におけるIFN biologyの解明にもせまることを目的として昨年度より実験を進めてきた.本研究においては,ヒトIL-2受容体α鎖の細胞内領域および膜貫通領域をヒトIFN-βに融合させたタンパク質をデザインすることで,IFN-βを細胞膜表面に固定し,周囲への分散を抑制することによってIFNの副作用を抑えることを目指した.しかしながら,この膜結合型IFNは,膜表面に発現されるよりも細胞外に分泌されてしまう割合が9割をしめるという問題が浮上し,本年度は,この問題点を解決すべく,効率よく細胞膜に局在する分子を設計しなおすことを進めていた.まず,ヒトIL-2受容体α鎖とヒトIFN-βとの間に(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x3という配列のリンカーを挟んで両者を結合させたタンパク質をデザインしていたが,そのリンカー部分の長さを変えることで検討したところ,当初の15個のアミノ酸残基数よりも長い50個のアミノ酸残基数に変えたところ,膜表面に発現される割合は5割までに改善されることを見出した.しかしながらまだ5割は細胞外に分泌されてしまうため,更なる改善が必要と考えられた.本年度,開始から1か月半を経た現時点で,若手(S)の研究費が支給されることに決まった.そのため,本研究費はその重複規定の剃限に従い,この時点をもって本課題に対する研究費の支給が停止されることになる.若手研究費による新たに始まる研究は感染やがんに対する自然免疫応答をとくにIFN応答を誘導するパターン認識受容体を介するシグナル伝達を解明するものであり,これまで行ってきた基盤(B)による研究結果も生かし,さらに発展させた研究を展開させていきたいと考えている.IFN-α/β製剤は一部の悪性腫瘍をはじめ,治療薬として広く臨床応用されていたが,一方でIFNsは多様な生物活性を有することから多彩な副作用が出現し,余儀なく治療中止しなくてはならない場合が認められる.このような副作用を如何に抑制させ,かつ高い効果をあげることができるかが,IFN治療において重要な課題であると考えている.本研究では,IFN分子を細胞膜上に固定化させるという方法で,周囲への分散を抑制し,IFNの副作用を抑えることを考えた.まず本年度においては,IFNの局所への固定化を目的に細胞膜結合型のIFNとして,ヒトIL-2受容体α鎖の細胞内領域および膜貫通領域に続いて細胞外領域の代わりにヒトIFN-βをリンカーを挟んでfusionさせたタンパク質をデザインした.次に,レトロベクターの系を用いてHEK293T細胞にデザインした分子を発現させた結果,予想されたサイズのタンパク質の発現を確認した.FACSや細胞免疫染色法によりこの分子の局在を調べた結果,大部分は細胞質内に分布するものの,一部は細胞表面に存在していることが確認された.そのため,この細胞を用いて実際にcell-to-cellでのリガンドー受容体結合によって細胞内シグナル伝達が起きていることをルシフェラーゼアッセイの系を用いて検討した結果,膜結合型IFNを発現したHEK293T細胞の時のみlucの活性が認められた.この結果が,新しくデザインした分子がsheddingすることによるものではないことを除外するために,Boydenチェンバーを用いて検討したところ,多くの場合sheddingされていることがわかった.この問題点を解決すべく,リンカー部分の長さを変えることにより,効率よく細胞膜に局在する分子を設計しているところである.問題が解決すれば悪性グリオーマの細胞株を用いて,膜型IFNの効果を検討する予定である.本研究では,現在広く臨床応用されているIFN-α/β製剤に関して問題となっている副作用の軽減を目指し,より効率の良い効果をもたらすIFN分子の改良を試み,とくに脳神経系の腫瘍であるグリオーマに対する検討を行うこと,さらにはこれを発展させて,脳神経系の領域におけるIFN biologyの解明にもせまることを目的として昨年度より実験を進めてきた.本研究においては,ヒトIL-2受容体α鎖の細胞内領域および膜貫通領域をヒトIFN-βに融合させたタンパク質をデザインすることで,IFN-βを細胞膜表面に固定し,周囲への分散を抑制することによってIFNの副作用を抑えることを目指した.しかしながら,この膜結合型IFNは,膜表面に発現されるよりも細胞外に分泌されてしまう割合が9割をしめるという問題が浮上し,本年度は,この問題点を解決すべく,効率よく細胞膜に局在する分子を設計しなおすことを進めていた.まず,ヒトIL-2受容体α鎖とヒトIFN-βとの間に(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x3という配列のリンカーを挟んで両者を結合させたタンパク質をデザインしていたが,そのリンカー部分の長さを変えることで検討したところ,当初の15個のアミノ酸残基数よりも長い50個のアミノ酸残基数に変えたところ,膜表面に発現される割合は5割までに改善されることを見出した.しかしながらまだ5割は細胞外に分泌されてしまうため,更なる改善が必要と考えられた.本年度,開始から1か月半を経た現時点で,若手(S)の研究費が支給されることに決まった.

そのため,本研究費はその重複規定の剃限に従い,この時点をもって本課題に対する研究費の支給が停止されることになる.若手研究費による新たに始まる研究は感染やがんに対する自然免疫応答をとくにIFN応答を誘導するパターン認識受容体を介するシグナル伝達を解明するものであり,これまで行ってきた基盤(B)による研究結果も生かし,さらに発展させた研究を展開させていきたいと考えている.
労働法のジェンダー分析-ジェンダーの視点からの労働法の再構築に向けて-

本研究は,第一に,労働法がジェンダー分析という実践的な営為によって,どのような変革を迫られているのかを,比較と実証に基づいて明らかにし,第二に,世界中の国々が共通に解決を迫られている法的な課題として,雇用平等法の研究,ならびに,仕事と家族生活の両立をめぐる理論的な諸問題の研究を行った。総括として,国際シンポジウムを開催し,アメリカ,イギリス,イスラエル,南アフリカ,スペイン,カナダ,オーストラリア日本がそれぞれ報告を行った。ここには,上記のテーマに即して行われた報告を収録し,性差別はなぜ生じるのか,差別禁止法が効果的に機能するためには何が必要か,労働と家族責任はどのようにすれば調和するのか等に関して得られた「知見」を掲載している。労働法がジェンダー分析によって市場労働以外のアンペイド・ワークを視野に入れて全体を理論化することは,典型としての労働者像に変革を迫り,労働法理論を再構築し,ひいては新たな「社会法」という枠組を提示することになるだろう。本研究は、ジェンダーの観点から従来の労働法を批判的に解析することを目的とする。そのために、本研究は、第一に、労働法がジェンダー分析という実践的営為によって、いかなる変革を迫られているのかを、比較と実証に基づいて明らかにすること、第二に、世界中の国々が共通に解決を迫られている法的課題という労働法のジェンダー分析の論点として、「間接性差別禁止法理」、「男女間の賃金差別禁止法理」、「セクシュアル・ハラスメント禁止法理」を中心に、その理論的・制度的な転換の様相を具体的に明らかにすることを目標とする。以上の目標に向けて、研究代表者と分担者計7名は、主として以下のグループごとに研究を進めている。日本班(大久保、石田)、アメリカ・カナダ班(林、中窪)、イギリス班(小宮、浅倉)、ドイツ班(毛塚)。2002年度には、浅倉と石田が、Intell第6回国際学術総会(イタリア、カターニア大学、2002年7月4日7日)に参加して「労働法のジェンダー分析」について海外共同研究者と打ち合わせを行った。国内では、各班ごとの研究会・打ち合わせに加えて、2002年12月1日に研究総会をもち、阿部浩己(神奈川大学助教授)「法のジェンダー分析について-国際法の視点から」、浅倉むつ子「労働法のジェンダー分析とは何か」の報告を受けて、討論を行った。また、以下の論文の翻訳作業を続けている。Joann Conaghan, Feminism and Labour Law contesting the Terrain, in Ann Morris & Therese O'donnell, Feminist Perspectives on Employment Law, Cavendish Publishing, 1999, pp.13-41. Alain supiot, Beyond Employment, Oxford University Press, 2001.2003年度に日本で開催する予定の「労働法のジェンダー分析に関する国際学術集会(仮称)」の開催打ち合わせのため、海外の共同研究者と随時、メールを通じて、連絡・討議を行っている。本研究は、2002年度と2003年度の2か年のプロジェクトである。本研究は、ジェンダーの視点から従来の労働法を批判的に解析することを目的とするものである。そのために、本研究は、第一に、労働法がジェンダー分析という実践的な営為により、どのような変革を迫られているかを、比較と実証にもとづいて明らかにした。第二に、世界中の国々が共通に解決を迫られている法的課題として、各国における労働法のジェンダー分析の焦点としての「間接性差別禁止法理」、「男女間の賃金差別禁止法理」、「労働生活と家族生活の両立問題」(アンペイド・ワーク論)を素材に、そこにおける理論的・制度的な転換の様相を具体的に明らかにした。本年度は、日本、アメリカ、カナダ、イギリス、オーストラリア等における労働法のジェンダー分析の歴史と現状そして課題について、それぞれの国と日本の比較研究を行なった。前半には、国内における文献研究を蓄積した。そのうえで、研究の集約として、2004年3月に、国際シンポジウム「労働法のジェンダー分析」を立命館大学において開催した。

「労働法のジェンダー分析」「差別と雇用平等」「仕事と家庭の両立と社会法」のテーマをめぐって、Linda Krieger(米・カリフォルニア大学バークレー校)、Consuelo Chacartegue(スペイン・ポンペウ・ファブラ大学)、Carole Cooper(南アフリカ・ウィットワタースラン大学)、Joanne Conaghan(英・ケント大学)、Kerry Rittich(カナダ・トロント大学)、Deborah Maranville(米・ワシントン大学)、Rosemary Owens(豪・アデレード大学)、Juria Lopez(スペイン・ポンペウ・ファブラ大学)、Anna Chapman(豪・メルボルン大学)、浅倉むつ子(東京都立大学)、林弘子(福岡大学)、相沢美智子(束京大学)が報告と討諭を行った。一般からの参加者も加えて120名規模のシンポジウムであり、盛会であった。
抽象化に基づく類推を用いた複数領域からの知識獲得

抽象化図式の有無による獲得知識の違いを心理学実験により調べた結果,抽象化図式のプラグマティックな側面が特に重要となり,抽象化図式を介した類推が推論の効率化に継ることも明らかになった.ベ-ス領域とタ-ゲット領域が抽象化図式のインスタンスとなるため,抽象化図式によりベ-ス領域の選択に強い制約をかけることができる.また,抽象化図式により学習が促進される場合もあれば,逆に阻害される場合もあることが明らかになった。次に,抽象化図化による類推を用いた学習システムの試作を行った.学習の対象を論理プログラムとして,学習アルゴリズムの検討を行った.本学習アルゴリズムでは,目標プログラムを合成するための補助的知識として,抽象化図式を仮定する.抽象化図式は,EBLで用いられるような領域知識と比較して学習システムに与え易いという特徴がある.抽象化図式は,訓練例を説明する目標プログラムを合成するための種であり,二階の論理プログラムとして与えられる.目標プログラムは,二階の変数を適切な述語記号に具体化することによって学習され,一般的過ぎるプログラムは精密化演算子を用いて特殊化される.学習の対象領域に関する知識が不足している場合でさえも,抽象図式を与えることにより,効率的に新しい知識を獲得できる.更に,推論の深さを制限した論理プログラムの部分評価の技法を用いることにより,表現系の拡張も実現できることを示し,抽象化図式に対して制約条件を付加することによって,学習時間の短縮を図ることができることも示した.複雑な知識を獲得するためには,単一領域から基本となる知識を獲得するだけでなく,獲得された基本知識を合成する機能が必要となる.すなわち,複数の領域から獲得された知識を合成し,合成した知識を体系的に取り込むような機能が必要であり,この機能の理論化および実現は今後の課題である.抽象化図式の有無による獲得知識の違いを心理学実験により調べた結果,抽象化図式のプラグマティックな側面が特に重要となり,抽象化図式を介した類推が推論の効率化に継ることも明らかになった.ベ-ス領域とタ-ゲット領域が抽象化図式のインスタンスとなるため,抽象化図式によりベ-ス領域の選択に強い制約をかけることができる.また,抽象化図式により学習が促進される場合もあれば,逆に阻害される場合もあることが明らかになった。次に,抽象化図化による類推を用いた学習システムの試作を行った.学習の対象を論理プログラムとして,学習アルゴリズムの検討を行った.本学習アルゴリズムでは,目標プログラムを合成するための補助的知識として,抽象化図式を仮定する.抽象化図式は,EBLで用いられるような領域知識と比較して学習システムに与え易いという特徴がある.抽象化図式は,訓練例を説明する目標プログラムを合成するための種であり,二階の論理プログラムとして与えられる.目標プログラムは,二階の変数を適切な述語記号に具体化することによって学習され,一般的過ぎるプログラムは精密化演算子を用いて特殊化される.学習の対象領域に関する知識が不足している場合でさえも,抽象図式を与えることにより,効率的に新しい知識を獲得できる.更に,推論の深さを制限した論理プログラムの部分評価の技法を用いることにより,表現系の拡張も実現できることを示し,抽象化図式に対して制約条件を付加することによって,学習時間の短縮を図ることができることも示した.複雑な知識を獲得するためには,単一領域から基本となる知識を獲得するだけでなく,獲得された基本知識を合成する機能が必要となる.すなわち,複数の領域から獲得された知識を合成し,合成した知識を体系的に取り込むような機能が必要であり,この機能の理論化および実現は今後の課題である.
マダニ由来培養細胞株の樹立ならびにマダニ類が保有するウイルスの網羅的探索

本研究では(1)本邦マダニ由来の細胞株樹立の試みと(2)本邦マダニが保有・媒介するウイルスの網羅的探索を行った。(1)タカサゴキララマダニ体内組織をVP-12培地(FBS15%TPB15%添加)で培養した実験区において、一部、細胞分化の誘導が認められた。現在、細胞接着能のより高い培養容器を用いて、同条件下での培養を再度試みている。(2)山口県を中心に、国内で旗振り法または野生動物に寄生しているマダニを採集し、ウイルス保有状況を調査した。その結果、これまで日本で報告の無いウイルスの遺伝子を検出することに成功した。これらの発見に関して、現在、詳細な解析を行っている。本研究では、本邦マダニ由来の細胞株樹立の試みと、マダニ由来細胞株を用いた、本邦マダニ類が保有するウイルスの網羅的探索を行う。本研究課題において、初年度はマダニ組織片を用いた初代培養の作出を中心に行った。初代培養に用いたマダニ種は、野外捕集タカサゴキララマダニ、フタトゲチマダニ、キチマダニを主とし、組織片にはマダニ卵または成マダニ諸器官(唾液腺、中腸、筋繊維等)を用いた。マダニ卵または成マダニ諸器官の表面殺菌には、塩化ベンザルコニウム液、70%エタノール、ポビドンヨード液を用い、各組織片へのダメージが少なく且つ充分な殺菌効果が得られる条件を検討した。組織片の初代培養のための基礎培地として、マダニ培養細胞に実績のあるL-15培地の他、蚊培養細胞に実績のあるVP-12培地、MM培地を用いた。また、培養液の添加物として、ウシ胎児血清、トリプトースフォスフェイトブロスの各々または混合物を様々な濃度(1015%)で試みた。培養容器には、ガラスシャーレ、ポリスチレン製シャーレ、リジンコートシャーレ、コラーゲンコートシャーレを用い、組織片はすべて30°Cインキュベーター内(暗条件)に静置した。ウイルスの網羅的探索に関しては、初年度は本邦マダニの捕集と保存に努めた。国内数地点においてマダニの捕集を行い、実験室に持ち帰り種を同定後、ウイルス分離用乳剤のため凍結保存した。蚊やマダニは吸血によりウイルスや細菌など様々な病原体を媒介する重要な衛生害虫である。これら媒介節足動物の培養細胞は、その生物と病原微生物間の相互作用の解析を行う上で重要な研究ツールである。しかし、これまで本邦マダニ由来の培養細胞株は存在しなかった。そこで本研究では、本邦マダニ由来の細胞株樹立の試みと、本邦マダニが保有するウイルスの網羅的探索を行った。(1)本邦マダニ由来細胞株の樹立;我が国に分布するマダニ47種のうち、人畜への刺咬例が多いマダニ種を用いて初代培養を試みた。組織片には、産下卵を表面殺菌したもの、新生幼虫、成虫を解剖して得た体内組織を用いた。培養液は、蚊やマダニの組織培養で実績のある数種類の基礎培地(Grace, Schneider, MM, VP-12, L-15等)に、ウシ胎児血清やTPBなどの添加物、抗生物質(ペニシリン・ストレプトマイシン)を様々な濃度で組み合わせて用いた。その結果、組織片をタカサゴキララマダニ成虫の体内組織、培地をVP-12(ウシ胎児血清15%, TPB15%,抗生物質0.1%添加)とした実験区において、一部、細胞分化の誘導が認められた。しかし、これら分裂細胞は培養容器との接着が弱かったために浮遊し、その後、分裂は停滞した。現在、より細胞接着能の高い培養容器を用いて、同条件下での初代培養を進めている。(2)本邦マダニが保有するウイルスの網羅的探索;日本国内において、旗釣り法で集めたマダニや動物に寄生していたマダニを用いて、ウイルス遺伝子の検出ならびに培養細胞を用いたウイルス分離を実施した。現在、陽性疑いの分離株が複数得られており、それらの遺伝子解析および性状解析を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。衛生動物学26年度が最終年度であるため、記入しない。各条件下でマダニ由来組織片の培養区を設けた結果、いくつかの区において、雑菌の増殖が見られないマダニ生細胞の維持が可能となり、充分な成果が得られた。しかし、これらはまだ著しい細胞増殖までには至っていない。そこで本年度はこれら生細胞の維持・継代を続けるとともに、他にマダニ培養細胞で実績のある培養液も新たに用いて、引き続きマダニ由来組織切片の作成を実施する。最終年度は引き続きマダニ由来細胞株の樹立を目指すとともに、野外捕集マダニからのウイルス分離を実施する。

野外捕集マダニを種または発育ステージに基づいてプール分けを行い、ウイルス分離用乳剤を調整する。乳剤を接種する培養細胞は、現段階でマダニ由来の細胞株が安定しないことから、当面は哺乳動物由来の培養細胞を用いる。なお、現在得られているマダニの生細胞片については、ウイルスを接種し、各ウイルスに対する感受性(感染性、増殖性)を調査する予定である。
会計情報の検証行為における事実認定に関する実証研究

本年度は,昨年度より引き続き,米国証券取引委員会(SEC)による企業・経営者・監査人に対する処分事例を検討し,その結果の一部を日本監査研究学会および日本会計研究学会において発表した。米国証券取引委員会による処分は,『会計および監査実施通牒』(AAER)において公表されている。『会計および監査実施通牒』は,米国証券取引所登録会社に対して,連邦証券法・連邦取引所法および同規則等に違反した企業・経営者・監査人に対して行った処分を公表する資料であり,2002年度末現在まで1400を超える処分事例が公表されている。本研究では,そのうち,713号から1378号までを研究対象とした。『会計および監査実施通牒』は,米国における会計不正問題のすべてを網羅するものではなく,また,SECにおける処分政策上のバイアスを含む可能性はあるが,件数が多くSECによる処分事例を網羅するという点で包括的であり,また,Wall Street Journal紙などのデータベースのように他に大事件があった場合に取り上げられないなどの資料上のバイアスを除去することができる。本研究で明らかになったことは,SECにおける処分事例では,会計上の不正が行われ隠蔽された年数が長ければ長いほど,監査人(公認会計士および監査事務所)が処分される傾向にあるが,他方,会計上の不正が行われた項目や隠ぺい工作と監査人の処分には有意な差は見られなかった。本年度は,米国証券取引委員会が公表している会計・監査連続通牒(第715号から第1000号)を分類・データベース化するとともに,これに関連する資料の収集にあたった。会計・監査連続通牒は,会計制度・会計基準に対する米国証券取引委員会の見解の他,不正な財務報告がなされた場合において監査人(公認会計士・会計事務所)にかかる不正な財務報告を発見する責任があったと考えられるケースについて,米国証券取引委員会がその監査人を告訴した旨,その経緯・理由等を公表するものである。会計・監査連続通牒は証券取引委員会が告訴したケースのみを公表しており,米国におけるすべての不正な財務報告を代表するサンプルとして適格であるかどうかについて疑義はあるが,潜在するすべての不正な財務報告を他の手段を通じて検索することは事実上不可能であるため,本研究では,会計・監査連続通牒を主要なデータのもとであると仮定し,そのデータの分類とデータベース化を行っているものである。具体的には,不正な財務報告の行われた会社の規模(資本金),当該会社の属している産業,当該会社の営業上の特性,不正な財務報告の生じている領域,荷担した主体(経営者・従業員,まれに監査人),潜伏期間(最初の不正が行われてから発覚に至るまでの期間),被害額について分類・データベース化を行った。現在,このデータベースをもとに,実証分析を行っており,その結果を次年度の日本監査研究学会東日本部会において公表する予定である。
自閉症児および健常児の自己の知識とその由来の理解について

本年度は,平均言語年齢6歳以上の自閉症児と36歳の健常児を対象に,誤信念ならびに自分の知識の由来(知識がいかにして得られたか)を理解する能力の発達を検討した。誤信念を理解しているか否かは,標準的な心の理論課題である予期せぬ場所の置き換え検査を実施して調べた。すなわち,登場人物が対象物Aを場所Xにしまって立ち去った後,本人のいない間に対象物Aを場所Yに移し,本人が戻ってきたらAを探すのはどこかを推測してもらった。また,知識の由来は,「触る」と「見る」という2つの情報源が区別できるか否かを,トンネル検査で調べた。トンネル(箱)の中に入れた対象物Bの硬さ(触覚的情報源)もしくは色(視覚的情報源)を知るためには,箱の中の対象物Bを触って確かめる必要があるのか,覗いて見て確かめる必要があるのかを判断してもらった。自閉症児と健常児の群間で両検査の遂行を比較したところ,自閉症児は言語年齢が同じか低い健常児に比べ,誤信念も知識の由来も理解が困難であることが示された。さらに健常児について,きょうだいの有無でこれらの心の理論の能力の獲得に相違があるかを検討した。その結果,上のきょうだいがいる子どもの方が,下のきょうだいがいる子どもよりも,心の理論の獲得が早く,年長のきょうだいが年少の子どもの心の理論の獲得を促進することが明らかになった。しかし本研究では,以上の予備的データは得られたものの,健常児については欧米の先行研究で指摘されているよりも課題の遂行が全体に半年から1年遅れているように見えること,また自閉症児については,課題の教示の理解に著しい困難が見られることなどの未解決の問題が残された。より安定した結果と結論を得るためには,さらに実験を重ねる必要がある。本年度は,まず,自閉症児が示す心的表象を理解する能力(これを「心の理論」と呼んでいる)の障害についての神経心理的諸研究の展望を行った。最近の自閉症をめぐる神経心理学では,同等の言語的知能水準にある健常児や知的障害児などの対照群に比べて,自閉症児は他者の誤った信念(誤信念),正しい信念(知識),驚きや当惑などの認知的感情,ふり,だまし,欲求と意図など,特に自分の心的状態とは異なる他者の心的状態を推測し理解する能力に障害を示す実証的研究が提出されてきていることを紹介した。さらに,たとえ1次的な誤信念(例えば,“太郎は`花子が北海道にいる'と信じている")の理解が可能な自閉症児でも,2次の誤信念(例えば“私(花子)は,太郎が`花子は北海道にいる'と信じている,と知っている")は理解できないことや,暗喩や皮肉に代表される高次の対人的コミュニケーションが困難であることを報告している研究を紹介した。そして神経心理学的には,こうした自閉症の障害が,心の理論の障害仮説以外にも,前頭葉機能の障害説,発達初期の対人的関係性の形成に関わる障害説,および中枢統合系の障害説などからも説明されていることを展望し,これらの諸説の理論的長所と短所および相互関係を整理して,今後の研究の方向性を示唆した。以上のような研究の展望に基づき,本年度はさらに,自閉症児の「心の理論」と能動文・受動文の理解との関係や,「心の理論」と時空間を定位する自己に関わる記憶や知識の情報源の理解との関係などについての研究計画を立案し,予備実験を行った。
近代黒海国際関係史の基礎的研究

日本における近代黒海地域史研究の確立を目的とし、本研究は18・19世紀における黒海地域の国際化の過程を、オスマン、ロシア、西欧の三つのそれぞれの一次史料に基づき検討した。特に、ワラキアとモルドヴァをめぐる国際関係を従来のバルカン史ではなく黒海地域史の枠組みの中でとらえ直し、さらに18世紀のオスマン政府によるクリム・ハーン国支配を考察した。その結果、黒海周辺のオスマン帝国の付庸国支配の変容が、黒海の国際化を考える上で重要であることが明らかとなった。二年目にあたる今年度は前年度に引き続き、近代を中心にその前後の時期にも注意しながら黒海国際関係史に関する先行研究を収集して把握し、また政治外交・通商分野に関するロシア史、西欧史、オスマン史の最新の研究動向にも目を配り、関係文献を入手した。史料に関しては、今年度は主にロシア側の黒海進出に関する史料の収集を行い、国内では、いくつかの大学図書館において、近世ロシア・オスマン関係に関するマイクロフィルムや関連する論文を、さらに18ー19世紀のロシア帝国の黒海政策や対ハプスブルク・オスマン外交政策などについての刊行史料を中心とする一次史料を収集し、これらの分析を進めた。そして秋にはウクライナのクリミアで現地調査を行った。18世紀後半のロシアの黒海進出において重要な位置を占めていたクリム・ハーン国の、特に末期に関する一次・二次史料を、シンフェローポリのクリミア・タタール図書館で調査し、またクリム・ハーン国史の専門家であるセルヴェル・エブベキーロフ氏にインタヴューを行って、様々な情報と新たな知見を得た。これらの研究の結果、18世紀後半のロシアの対黒海政策が、黒海を取り巻くバルカン(特に18世紀後半から19世紀前半においては、現在のルーマニアを構成するワラキアとモルドヴァ)・クリミア・カフカースに対する政策と密接な関係を有していた事実が、外交史料の分析などを通じて改めて実証的に裏付けられ、バルカン史、クリミア史、カフカース史と当研究課題をどのように関連させて新たな地域史像を構築して行くかが大きな課題として浮かび上がった。このような視点をも踏まえつつ、近世から近代への移行期におけるバルカンのワラキアとモルドヴァをめぐるロシア、オスマン、西欧諸国間の政治外交関係を扱った論考を発表し、この課題に本格的に取り組む足掛かりを得ることが出来た。前年度で先行研究文献の網羅的な収集は一応終えたものの、今年度も本研究課題に関連するいくつかの新たな研究成果が見られたため、それらを参照して参考とした。これらを踏まえて、今年度はグルジアのトビリシとフランスのパリにおいて一次史料の調査と収集を行った。まずグルジアでは、首都トビリシにあるグルジア国立議会図書館とG.ツェテレリ東洋学研究所において、主に近世から近代移行期におけるオスマン帝国との政治経済関係に関する一次・二次史料を入手することが出来た。また、18・19世紀のグルジア史を専門とする東洋学研究所研究員イレネ・ナチュケビア氏をはじめとして数人の研究員にインタビューを行い、当課題に関して新たな知見を得ることが出来た。これらの調査の結果、オスマン帝国とグルジア西部とのいわゆる「宗主=付庸」関係の重要性が改めて確認された。一方、パリではフランス外務省附属文書館において、18世紀末に置かれた駐ブカレストフランス領事の報告のマイクロを参照した。時間的・経済的制約から十分な量の史料を見られたとは言い難いが、その領事館開設の目的が黒海通商の問題と大いに関連していることが史料の上から確認された。現在、この史料の分析を進めているところであるが、18世紀末以降の黒海の問題を考える上でフランスは、イギリスとならんで不可欠のアクターであり、今後さらなる調査が必要であることを確信した。また今年度は、ウクライナの学会において日本のウクライナ史研究について報告する機会があり、日本におけるウクライナ史研究の歴史を紹介する中で、本研究課題についても言及し、これまでの研究成果の一端を紹介することが出来た。初年度である本年度は、まず近代黒海国際関係史に関してこれまでに行われた研究を収集し把握することに努めた。国内の大学図書館等で、欧文雑誌論文を中心に、18ー19世紀の黒海通商ならびに黒海周辺地域をめぐる西欧・ロシア・オスマン間の外交関係に関する文献を集めた。また同様の内容の研究書を購入して当研究課題の背景を広くおさえ、さらに夏にトルコで調査を行った際、オスマン帝国の黒海支配とヨーロッパ列強の黒海進出初期におけるオスマン・ヨーロッパ諸国間外交に関するトルコ語の研究文献を収集した。これらの先行研究の収集と調査を通じて、今後明らかにすべき問題点を洗い出し、研究の方向性について考察を行った。一次史料に関しては、18・19世紀に黒海周辺地域を旅したヨーロッパ人による旅行記や、同じくヨーロッパ人により同時代に書かれた黒海・地中海通商に関する文献などを購入した。本研究では、黒海研究の拠点となる研究機関とのネットワーク作りも目的の一つであるが、9月にトルコで行った調査では、トラブゾンの黒海工科大学(Karadeniz Teknik Universitesi)附属の黒海研究所(Karadeniz Arastirma Enstitusu、通称KAREN)を訪問し、関係者にインタヴューを行った。これらの研究の結果、いくつか重要な問題が明らかとなったが、ロシアとハプスブルク帝国の他、新たにイギリスとフランスが黒海通商に参入することになった1800年前後の時期が、黒海地域をめぐる国際関係において一つの重要な転換点として浮かび上がって来た。

そのためこの時期の西欧・ロシア・オスマン間の国際関係に大きな影響を与えたと考えられる、1802年にワラキア・モルドヴァ公宛てにオスマン皇帝から発布された勅令について、当時のオスマン帝国をめぐる国際関係の観点からその意義を考察する論文を執筆した。ロシアによるクリミア併合問題などによって、世界的に黒海地域への関心が高まった影響もあり、本年度はFraryの"Russian-Ottoman borderlands"をはじめ、本研究課題に関してもいくつかの研究が公にされ、それらの検討を行うことが重要な課題となった。その検討の結果、19世紀初頭の西欧諸国の黒海通商参入とそれをめぐるオスマン帝国との交渉過程等に関して新たな知見を得るとともに、これまでの見方をやや修正せざるを得なくなった。史料調査に関しては、7月に広島修道大学において、18世紀から19世紀初頭にかけてのロシア・オスマン関係に関する一次史料を集めたマイクロフィルムの調査を行い、各都市における主な取引商品の品目と特徴、取引ルートなど、同時代の黒海通商に関する比較的詳細な情報を得ることができた。しかしながら、夏に予定していたギリシアのテッサロニキ、ブルガリアのソフィアとヴァルナ、ルーマニアのブカレストとコンスタンツァなどでの史料調査と研究者へのインタビューは、インタビューを予定していた研究者の何人かが急遽不在となったことなどから、十分な成果が見込めないと判断し、やむなく中止とした。そのためこの調査は、研究期間を延長して次年度に行うこととした。成果としては、18世紀後半のロシア・西欧諸国の黒海進出に伴う、オスマン帝国とその付庸国であるワラキア・モルドヴァとの間の宗主・付庸関係の変化を論じた論考を、共著書の形で出版した。本年度は、前年度計画しつつも実施できなかったバルカンでの調査を実施した。予算の都合上ブルガリアとルーマニアに限定せざるを得なくなったが、ソフィアでは国立キリル・メトディ図書館において、未入手だったブルガリアにおける近世近代黒海地域史研究文献といくつかの一次史料を収集し、また、バルカン研究所の研究員らから、本課題に関する有益な助言を得ることが出来た。ブカレストでは、ブカレスト大学中央図書館や歴史学部図書館などで史料収集を行った。一方、本年度の成果の発表に関しては、8月に開催されたICCEES(国際中欧・東欧研究協議会)第9回世界大会において、18世紀後半の黒海の国際化にとって重要な意味を持つロシアのクリミア進出に関して研究成果の一端を報告し、また11月にブルガリアのソフィアで行われた国際バルカン年次会議においても報告を行った。本年度は事業期間の最終年度であるため、これまでの研究成果をまとめる作業にも着手し、平成28年度中に出版予定の黒海国際関係に関する論集の1章として、18世紀後半から20世紀初頭にかけての黒海地域の国際関係を概観する論考を著した。本研究が当初目指した1黒海における外国船舶航行問題と2黒海周辺地域をめぐるオスマン帝国と諸外国間の政治外交関係の二点に関して、前者については19世紀以来の海峡通行問題、後者については18世紀後半のクリム・ハーン国やドナウ二公国をめぐるロシア・オスマン関係などを中心に、これまでに明らかにした知見をその論考の中に十分盛り込むことが出来た。
マウス初期胚における多様な細胞競合機構とその役割

細胞競合のしくみやその生体における役割は、未だその多くが不明であり、特に哺乳類において、細胞競合が個体の発生に果たす役割の研究は立ち遅れている。本研究では、我々が開発したNIH3T3細胞の細胞競合系を用いたスクリーニングにおいて同定した新規細胞競合関連遺伝子の中から、マウス初期胚での細胞競合に関与する遺伝子を明らかにすることを目的とする。また、これら遺伝子も含めた様々な遺伝子による細胞競合を比較し、マウス胚における細胞競合の多様性と共通性とを明らかにすることを目的として研究を行った。まず、遺伝子ノックアウトES細胞を用いたキメラマウス胚の作製により、任意の遺伝子のマウス初期胚における細胞競合への関与を検定できる系を作成した。NIH3T3細胞を用いて同定した新規細胞競合関連遺伝子については、培養細胞では明確に細胞競合を起こしたが、キメラマウス胚の作製による方法で、いずれの遺伝子も初期胚発生では明確な競合を起こさないか、変異胚が発生異常を示すため、変異細胞の排除が細胞競合の結果かどうかわからないという結果になってしまった。一方で、ハエなど他の系で細胞競合を起こすことが分っているp53、Myc、Tead-Yapについては、その変異細胞と正常細胞とのキメラ胚が初期胚において細胞競合を起こすことを明らかにした。p53の変異細胞は強力な勝者に、Mycは弱い敗者に, Tead1-Yap1の変異細胞は強力な敗者になった。p53について詳細な解析を行ったところ、ESキメラ胚では着床前のエピブラストで細胞死による過剰細胞の排除が起きるが、その際の細胞死がp53依存的であり、p53変異細胞ではこの細胞死が抑制されることで細胞競合の勝者となっていることを明らかにした。本研究では、当初、培養細胞におけるスクリーニングで得られた新規遺伝子を中心に、マウス初期胚にみられる様々な細胞競合機構の比較をすることを目的としていたが、ES細胞を用いた独自のキメラマウス初期胚による細胞競合系を作成し、検討したところ、残念ながら新規遺伝子の中にマウス初期胚で明確な細胞競合を起こす遺伝子は存在しなかった。しかしながら、その代わりに、他の系で細胞競合に関与する事が知られている遺伝子について、新たにキメラマウス初期胚における細胞競合への関与を明らかにすることができた。さらに、p53における細胞競合について詳細な解析を進めたところ、これまでに、ESキメラマウス胚の発生においてエピブラスト細胞の過剰がp53依存的な細胞死によって解消されており、それによりp53変異細胞が細胞競合の勝者になっている、という新規の知見を得ることができている。これらの研究成果は、今後細胞競合機構の比較のための基盤となる重要な知見であり、研究はおおむね順調に進展しているといえる。当初予定していた、新規遺伝子による細胞競合は見られなかったが、代わりに既存遺伝子のキメラマウス初期胚における新たな役割を明らかにすることができた。そこで、既存の遺伝子p53, Tead-Yap, Mycについて、それぞれの変異が起こす細胞競合について比較を行うとともに、それらの間の関係性の有無を解析する。さらに、私の研究室の別の研究で確立したESキメラ胚によらない初期胚における細胞競合解析系を用いて、それら遺伝子による細胞競合が初期胚発生に果たす役割の比較解析を行う。

さらに、p53における細胞競合について詳細な解析を進めたところ、これまでに、ESキメラマウス胚の発生においてエピブラスト細胞の過剰がp53依存的な細胞死によって解消されており、それによりp53変異細胞が細胞競合の勝者になっている、という新規の知見を得ることができている。これらの研究成果は、今後細胞競合機構の比較のための基盤となる重要な知見であり、研究はおおむね順調に進展しているといえる。当初予定していた、新規遺伝子による細胞競合は見られなかったが、代わりに既存遺伝子のキメラマウス初期胚における新たな役割を明らかにすることができた。そこで、既存の遺伝子p53, Tead-Yap, Mycについて、それぞれの変異が起こす細胞競合について比較を行うとともに、それらの間の関係性の有無を解析する。さらに、私の研究室の別の研究で確立したESキメラ胚によらない初期胚における細胞競合解析系を用いて、それら遺伝子による細胞競合が初期胚発生に果たす役割の比較解析を行う。
CD40とRPl05経路によるB細胞活性化機構の比較、解析

RPl05は分子量105kDでマウスの成熟B細胞に発現されている分子である。抗体で架橋されると活性化シグナルを伝達し、非常に強い活性化増殖反応をB細胞に誘導する。この活性化されたB細胞は放射線で誘導されるアポトーシスに対して耐性を示すが、興味深いことに抗原レセプター刺激に対しては逆に増殖抑制やアポトーシスを示す。RPl05を介する刺激はB細胞の増殖ばかりでなく抗原による死滅にも関わっていると考えられる。本研究においては、RP105のシグナル伝達機構の解析を目的とする。RP105の細胞内部分はアミノ酸11個と短く、シグナル伝達分子の存在が予想される。その分子の検索として、B細胞リンホ-マを用いて抗RP105抗体で免疫沈降をおこなったところ、分子量約22,25kDのふたつのシグナルが共沈された。このタンパクのN末端アミノ酸配列を決定したところ、22,25kDのシグナルから同一の配列が得られ、これらは同じ分子と予想された。cDNAクローニングを行い塩基配列を決定したところ、チキンですでに報告されていた分子のマウスホモローグであった。アミノ酸配列から、分泌タンパクと予想された。得られたcDNAを一過性に293T細胞に発現させると培養上清中には約28kDの分子が検出され、、細胞表面には検出されなかったが、、RP105と一緒に発現させると、細胞表面に現れた。したがってこの分子はRP105に結合した状態で細胞表面上に存在し、RP105がなければ分泌されると考えられる。現在、この分子の会合がRP105のシグナル伝達にどのような影響を及ぼすか解析を進めている。また、シグナル伝達に関わる新たな会合分子の検索も進めている。
スフィンゴリン脂質代謝調節が気道リモデリングに及ぼす影響について

強力な脂質メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸が気管支喘息に及ぼす役割について、培養細胞および喘息マウスモデルの2点から研究を行った。しかし本研究期間内には予定通り終了し得ず、なお実験遂行中である。1)気管支上皮細胞・線維芽細胞へのスフィンゴリン脂質の作用の解析気管支喘息患者のBAL液中にスフィンゴリン脂質が増加しているという報告から、我々はその源として気道上皮細胞に注目している。炎症性サイトカインによりスフィンゴシン1リン酸を産生するスフィンゴシンキナーゼ活性が上昇すること、またスフィンゴシン1リン酸がIL-8産生などによる強力な炎症作用を引き起こすことを報告した(投稿中)。また、スフィンゴリン脂質は受容体およびRhoを介して肺線維芽細胞のmyofibroblast化に働くことを示した(投稿中)ことから喘息の気道リモデリングへの関与が示された。最近の報告からアレルゲン曝露により肥満細胞中のスフィンゴシンキナーゼ活性の上昇が指摘され、今後さらにスフィンゴリン脂質の役割の解明が必須と考える。現在遺伝子導入およびRNAiを用いた抑制実験を計画中である。2)気管支喘息モデルマウスでのスフィンゴリン脂質代謝酵素の発現と遺伝子導入C57/BL6マウスにOvalbumin吸入を行い、喘息急性期および慢性期モデルの2種類を作成し検討を加えている。スフィンゴシンキナーゼの発現は蛋白レベルおよび遺伝子レベルでも急性期に一時的低下することが示された(未発表データ)。現在免疫染色を行っているところでありさらに遺伝子導入による効果について今後研究をすすめていく予定である。強力な脂質メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸は、血管内皮の増生や腫瘍増殖に働くだけではなく、気管支喘息のような炎症性疾患にも関与していることが知られている。喘息患者のBAL液中にスフィンゴリン脂質が増加しているという報告がすでにいくつかあり、我々はその源として気道上皮細胞にまず注目し、スフィンゴシン1リン酸を産生するスフィンゴシンキナーゼ活性が上昇し、受容体を介してスフィンゴシン1リン酸が強力な炎症作用(IL-8やMMP産生)を引き起こすことを報告した(投稿中)。気道上皮におけるスフィンゴリン脂質の役割はまだ十分に解明できておらず、引き続き研究をおこなっている。また、スフィンゴリン脂質は受容体を介して肺線維芽細胞のmyofibroblast化に働くことを示した(投稿準備中)ことから喘息の気道リモデリング・線維化への関与が予想された。肺でのスフィンゴリン脂質の重要性はその臓器特異性からも指摘されているが現在のところ細胞レベルや、ヒト検体でのデータが主でまだ世界的にもそれほど多くなっていない。ただ昨年末にアメリカのグループがスフィンゴシン1リン酸の受容体の特異的阻害剤が喘息炎症を抑制することを報告(Sawicka E, et al. J Immunol.2003;171:6206-14)しており今後急速に研究が進む可能性がある。我々については科学研究費が充当されたために、直ちにマウスの喘息モデルでの研究を進めているところで、RNA interferenceを含めた遺伝子導入も今後行っていく予定である。喘息患者のBAL液中にスフィンゴリン脂質が増加しているという報告がすでにいくつかあり、我々はその源として気道上皮細胞にまず注目し、炎症性サイトカインによりスフィンゴシン1リン酸を産生するスフィンゴシンキナーゼ活性が上昇すること、またスフィンゴシン1リン酸が受容体を介して強力な炎症作用(IL-8やMMP産生)を引き起こすことを報告した(投稿中)。また、スフィンゴリン脂質は受容体を介して肺線維芽細胞のmyofibroblast化に働くことを示した(投稿中)

ことから喘息の気道リモデリング・線維化への関与が予想された。肺でのスフィンゴリン脂質の重要性はその臓器特異性からも以前より指摘されているが、現在もなお世界的に報告は多くない。しかしヒトへの抗原チェレンジでスフィンゴシン1リン酸分泌が増えること、スフィンゴシン1リン酸の受容体の特異的阻害剤が喘息炎症を抑制することなどから喘息疾患、とくに肥満細胞での活性を中心に注目を浴びつつある。我々はマウスの喘息モデルのうち急性炎症を起こすもの、気道リモデリングを起こすものの2種類を作成し検討を加えている。スフィンゴシンキナーゼの検出には時間を要したが、抗体を作成することにより肺での発現を調べた。意外なことにスフィンゴシンキナーゼの発現は喘息モデルで低下することがわかった(未発表データ)。
アポトーシス関連分子を利用した癌に対する分子標的療法の確立

申請者は、caspase-8の遺伝子導入、またBH3蛋白であるBADの過剰発現によるアノイキス感受性亢進を証明しこれを利用した転移抑制療法の基盤的研究を行ってきた。これの発展的研究として以下の計画を実施した。1.癌特異的発現caspase-8アデノウイルスベクターの確立Cre recombinaseによるアデノウイルスcaspase-8発現ベクター(Adv-caspase-8)をさらに実用化させるために癌細胞でのみ発現させる新しいプロモーターに着目した。Dr.W.Nicol Keith(University of Glasgow)との共同研究により、今年度の成果としてこの新規プロモーターを利用したアデノウイルス発現ベクターの構築に成功した。これをさらに発展させるためにIn vivoでの有効性について検討中である。2.BADの遺伝子治療への基盤的研究BADは、足場を喪失するとAKTが不活化され、BADの抑制系が解かれ、活性化される。したがってBADは、転移や播種を抑制する分子として適している。様々な変異型BAD蛋白をPCRを用いて作製し、その機能解析をした結果、BH3ドメイン内において類似アミノ酸への変異により強力なBADへ改変しうることを見出した。3.ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた放射線感受性亢進これらの併用療法として、低分子化合物の同定を目指してスクリーニングを行い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がBH3蛋白Bimを増加させ、放射線感受性を亢進させることを見出した。