hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両アリルへの挿入変異導入を利用した疾患原因遺伝子の単離と機能解析

がんの発症や悪性化の分子メカニズムを解明するためには、原因となる遺伝子の同定とその機能解析が重要となる。我々は、ウイルス感染発がんモデルマウスを用いて、発がんに関係する遺伝子を網羅的に同定し、その機能や相互作用を解析している。同定された標的遺伝子のなかでも、タンパク質のメチル化・脱メチル化に関与する酵素群は、がんの新しい分子標的の候補として、特に注目して解析を進めている。がんの発症、悪性化の分子メカニズムを解明し,がんを克服するには,がんの原因遺伝子の効率的な同定と機能解析が重要となる。申請者は,レトロゥイルス挿入変異を用いて,マウスに発症した血液腫瘍から,発がんに重要な共通挿入部位の遺伝子を網羅的に同定してきた。しかし従来法では,ウイルス挿入で発現が活性化されるがん遺伝子が主に単離され,がん抑制遺伝子の候補はほぼ発見できなかった。そこで,分裂組み換えを頻発する変異マウス(ブルーム(Blm)遺伝子変異マウス)を用いて挿入変異を行ない,両アリルへの変異導入効率を高めて,がん抑制遺伝子を優先的に単離する方法の構築を試みた。まず,Blm変異マウスは,挿入変異によって,野生型マウスより早期に血液腫瘍を発症することがわかった。腫瘍細胞ゲノムのウイルス挿入部位の解析から,新たにがん関連遺伝子を多数同定し,特にウイルスが翻訳領域の内部に挿入している遺伝子(がん抑制遺伝子の候補)を十数個単離することに成功した。この中には,RB関連遺伝子,CDK阻害因子,ファンコニ貧血原因遺伝子など既知の有力な候補が含まれており,目的の実験系の樹立が確認された。特に新しく同定された候補の機能解析を中心に実験を進行しており,これまでにJumonji(JmjC)ドメインという共通構造をもつBCIS1(Fbxl10),BCIS2(Jmjd5)遺伝子産物がDNA修復に関与する可能性を明らかにした。Jmjcドメインは,ヒストン脱メチル化酵素の重要なモチーフであることが最近報告されており,ヒストンのメチル化制御とがんとの関連性に注目して解析を進めている。現在,結合するタンパク質群を同定することにより,それぞれの遺伝子産物の作用メカニズムが明らかになりつつある。また,Jmjd5遺伝子については,遺伝子改変マウスを作製しており,個体レベルでの機能も解析している。がんの発症・悪性化の分子メカニズムを解明し、がんを克服するには、その原因となる遺伝子の効率的な同定と機能解析が重要となる。申請者は、レトロウイルス挿入変異を用いて、マウスに発症した血液腫瘍から、発がんに重要な共通挿入部位の遺伝子を網羅的に同定してきた。しかし従来法では、ウイルス挿入で発現が活性化されるがん遺伝子が主に単離され、がん抑制遺伝子の候補はほぼ発見できなかった。そこで、分裂組み換えを頻発する変異マウス(ブルーム(Blm)遺伝子変異マウス)を用いて挿入変異を行い、両アリルへの変異導入効率を高めて、がん抑制遺伝子を優先的に単離する方法を構築した。現在までに、既知の有力な候補を含めてがん抑制遺伝子の候補を十数個単離することができた。新しい候補の中には、ヒストンの脱メチル化酵素のモチーフであるJmjCドメインをもつタンパク質が複数含まれており、発がんにおけるヒストンのメチル化制御の重要性が明らかになった。これまでにヒストンのメチル化を制御する酵素の多く(メチル化酵素17種と脱メチル化酵素11種)が、ウイルス挿入の標的となることを見いだした。ヒストンの翻訳後修飾は、転写制御、DNA複製、X染色体不活性化など様々な生物学的現象に関与しており、特にヒストンのアセチル化と発がんの関係は重要で、脱アセチル化酵素の阻害剤が抗がん剤として開発されている。メチル化を制御する酵素群もまた、がんの新しい分子標的の有力な候補と考えられるため、同定した酵素について、ヒト肺がんにおける発現解析や、遺伝子発現に与える影響の網羅的な解析を進行している。最近、これらの酵素のなかに、ヒストンばかりでなく、p53などの転写制御因子や、NFkBやWntシグナル経路の因子に影響を与える酵素が複数存在することがわかった。現在、結合するタンパク質を同定することにより、その作用メカニズムを解析している。
鳥インフルエンザウイルスが患者体内で獲得するヒト適応化分子機構の解明

H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスが感染患者体内で獲得した遺伝子変異をデータベース解析のアプローチから網羅的に探索すると共に、当該変異群がH5N1ウイルスのヒト適応化に与える影響を解析した。マスデータ解析によって同定した59種類のHA領域における変異を導入した組換えウイルスを用いて、レセプター糖鎖結合特異性、膜融合活性、熱安定性およびヒト呼吸器細胞またはマウスでの増殖性を評価した。その結果、変異ウイルス群がレセプター糖鎖結合特異性、膜融合活性および熱安定性を変化させることで、ヒト呼吸器細胞においてより効率的に増殖するように変化することが明らかとなった。H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1ウイルス)が予想より遥かに少ない遺伝子変異の蓄積によって飛沫伝播能を獲得すると報告され、H5N1ウイルスのパンデミック化機序の解明は急務となっている。しかしながら、先行研究の多くが人工的な変異選択実験であるため、より詳細なH5N1パンデミック化機構の解明には、感染患者体内における実際のウイルス感染動態に基づく新しいアプローチが求められている。本申請課題では、エジプト研究機関との連携により集積化させた同国のH5N1感染患者由来ウイルス遺伝子情報に基づき、ヒト生体内で選択されたアミノ酸変異を網羅的に検索し、当該変異がウイルスのヒト感染性に与える影響を包括的に評価することで、H5N1ウイルスの新規パンデミック化機構の分子基盤を明らかにすることを目的としている。本年度は、事業初年度であり、エジプト研究機関と連携することで、H5N1ウイルス感染患者由来ウイルス遺伝子情報を集約化した。また、得られたウイルス遺伝子情報を加えて包括的に遺伝子配列をアラインメント解析することで、ウイルス遺伝子集団におけるアミノ酸変異を推定した。新たに感染患者由来ウイルス遺伝子配列を集約化させて包括的な遺伝子解析を実施することで、次年度以降に解析対象とするウイルス遺伝子変異を決定した。本年度は、マスデータ解析によって探索した感染患者体内で選択されたと推定されるHA領域における適応変異を導入した組換えウイルスを作出し、レセプター結合特異性、膜融合活性および熱安定性試験を実施した。その結果、変異ウイルスがレセプター特異性、膜融合活性および熱安定性のバランスを変化させることで、ヒト細胞への高い感染性を獲得することが明らかとなった。また、ポリメラーゼ領域における変異については、初代ヒト呼吸器細胞におけるウイルス複製に与える影響を評価した。その結果、選択された変異の幾つかについて、ヒト細胞で特異的にウイルス増殖性を高める効果を示すことが明らかとなった。マスデータ解析によって探索した感染患者体内で選択されたと推定されるHA領域における適応変異を導入した組換えウイルスを作出し、レセプター結合特異性、膜融合活性および熱安定性試験を実施した。また、ポリメラーゼ領域における変異については、in vitroでの効果試験が終了した。本年度は、マスデータ解析によって探索した感染患者体内で選択されたと推定されるHA領域における適応変異を導入した組換えウイルスを用いて、熱安定性試験および初代ヒト呼吸器細胞における増殖性をウイルス感染性力価にて測定する試験を追加的に実施した。さらに、マウス感染モデルを用いてin vivo病原性を解析した。その結果、変異ウイルスがヒト呼吸器上皮細胞およびマウスでの増殖性とマウス致死性を有意に高めることが明らかとなった。一方で、増殖性を高く変化させた変異ウイルス群は、HA構造安定性を低下させる傾向にあった。これらの知見は論文として取りまとめて、学術雑誌に投稿した。

その結果、変異ウイルス群がレセプター糖鎖結合特異性、膜融合活性および熱安定性を変化させることで、ヒト呼吸器細胞においてより効率的に増殖するように変化することが明らかとなった。今後は、今年度に決定したHA変異によるHA機能変化がヒト細胞におけるウイルス複製に与える影響を評価すると共に、ポリメラーゼ領域の変異については、in vivoでのウイルス増殖性をマウス感染実験により評価する。感染症内科遺伝子解析が予想よりも円滑に進展した結果、当初見込んでいたよりも当該解析への支出額がやや減少して次年度使用額が生じた。今年度に決定できた変異候補の数が予想よりも多いため、当該変異がウイルス性状に与える影響を次年度に解析する際に、次年度使用額を合わせて使用する計画である。
カルポニン3を介する新規の細胞融合機構の解明

これまでに我々はカルポニン3(CNN3)がトロホブラストの細胞融合による分化を制御することを見いだしてきた。またCNN3はリン酸化レベルに応じてアクチン細胞骨格との解離・会合を制御していることを明らかにした。CNN3のリン酸化部位の同定を試みたところC末の酸性アミノ酸に富む領域に二カ所(Ser293およびSer296)存在し、この領域を欠失させた非リン酸化変異体や二カ所のアラニン置導体を発現させた細胞では細胞融合効率が有意に減少していることが明らかとなった。またこれらの変異体ではアクチンとの解離が抑制されていた。さらに二カ所のリン酸化部位特異的な抗リン酸化抗体を作成し細胞融合にともなうリン酸化レベルのプロファイルを行ったところBeWo細胞ではFusion特異的に脱リン酸化が誘導しておりアクチンとの解離が促進していることが明らかとなった。マイオブラストであるC2C12細胞の細胞融合に伴う筋管形成に対してもC末欠失変異体あるいはアラニン置導体の発現により細胞融合が有意に抑制されていることを明らかにした。またC2C12細胞ではROCK1/2がCNN3キナーゼとして働き細胞融合を制御していることも明らかにした。これらのことからCNN3はトロホブラストとマイオブラストという発生の異なる細胞で共通する細胞融合による分化に深く関与していることが明らかとなった。細胞融合は骨、筋肉、胎盤の発生過程において重要な役割を果たすだけでなくウイルス感染や癌化メカニズム、組織の再生などにも関与することが知られている。しかしながらそのメカニズムに関しては不明瞭な部分が多い。これまでに我々は細胞融合のモデル細胞である絨毛癌由来細胞BeWoを用いてリン酸化特異的なプロテオーム解析を行いカルポニン3(CNN3)が細胞融合を制御しうる分子であることを見いだしてきた。カルポニンファミリーはアクチン結合性のリン酸化タンパクであり細胞骨格系を制御することが知られている。そこで我々はCNN3のリン酸化部位の同定を試み、少なくとも3カ所存在するリン酸化部位のうちの二カ所に対して抗リン酸化抗体(phospho-S293, phospho-S296)の作成と解析を行った。BeWo細胞ではトータルのCNN3リン酸化レベルはそれほど大きな変化が無かったにもかかわらず局所的な二カ所のリン酸化レベルはフォルスコリン処理時間に伴って低下していくことが明らかとなった。このことは細胞融合に伴いCNN3の等電点がアルカリ側にシフトしていた事と一致している。またCNN3はトロホブラストと同様にマイオブラストの細胞融合も制御していた為、マウス筋芽細胞C2C12を用いて分化に伴うCNN3のリン酸化レベルの変化を解析したところ、トロホブラストとは反対に分化誘導3-5日目でCNN3のリン酸化レベルが最大値に上昇し、その後減少していくことを見いだした。これらのことからBeWo細胞とC2C12細胞においてCNN3のリン酸化を介して異なる制御機構が存在することが考えられる。これまでに我々はトロホブラストとマイオブラストの分化過程における細胞融合をCNN3が負に制御することを見いだしてきた。本年度はCNN3キナーゼの同定と細胞融合特異的に駆動されるシグナルカスケードの探索を目的とし解析を進めたところ、BeWo(トロホブラスト)およびC2C12細胞(マイオブラスト)においてERK1/2およびROCK1/2がin vitroでCNN3の293番目のセリンをリン酸化することを見いだした。さらにC2C12細胞においてROCKをノックダウンした細胞ではCNN3の293および296番目のセリンのリン酸化が抑制されており、それに伴い筋管形成も抑制されていることを明らかにした。このことは細胞内においてROCKがCNN3のキナーゼであり細胞融合による筋管形成を制御するシグナルカスケードとして存在していることを示している。またCNN3の二カ所のリン酸化部位(Ser293及びSer296)をアラニンに置換あるいはC末のリン酸化領域を欠失した変異体を発現させたところBeWo・C2C12細胞共に細胞融合を抑制し、反対にアスパラギン酸置換体を発現させた場合は細胞融合が促進する傾向を見いだした。

さらにCNN3とアクチンの会合・解離に関して解析を進めたところ、CNN3のリン酸化レベルに応じてアクチンとの会合を制御していることも見いだした。これらのことからCNN3の細胞融合抑制メカニズムとしてCNN3の酸性アミノ酸に富むC末領域のリン酸化によるアクチン細胞骨格の再編成を調節することが示唆された。
食道がん術後サルコペニア予防の為の栄養・運動療法による介入臨床試験

食道癌根治手術患者の術前から術後外来通院時の長期間に渡る日常活動量を詳細に測定することで,術後サルコペニアが与える影響を探索的に明らかにすることを目的とした前向き観察研究を現在、実施中である。予定登録症例40例のうち、14症例に到達した。対象は食道癌に対して食道切除・再建を伴う手術症例(術式,術前化学療法の有無,再建臓器・経路は問わず)とし、治療前,化学療法施行後(術前化学療法を行う場合のみ),手術後(退院直後),術後4-6ヶ月に,それぞれ活動量計(HJA-750C Active style Pro OMRON社,ライフコーダGS/Me SUZUKEN社)を2週間装着して日常活動量を測定する.併せてCTによる筋肉量計測を行う。また、食道癌術後サルコペニアが与える以下の副次的項目(癌再発,合併症,骨格筋量,身長,体重,体組成,栄養指標(総タンパク,アルブミン,コリンエステラーゼ,総コレステロール,プレアルブミン),炎症指標(白血球,CRP),血清サイトカイン, QOL調査など)について探索的に評価を行っている。現状では、活動量と短期的な術後成績である肺炎をはじめとした術後合併症に特に注目して症例を集積している。すなわち、活動量低値が食道癌術後合併症の中でも重要な「肺炎」や「surgical site infection」の発症に関連するか否かを検討している。また、術後のみならず、術前の化学療法における有害事象との関連性についても検討している。当初は患者適格基準に術前化学療法実施前の測定を必須としていたが、患者の組み入れが予定よりも少なかったため、少なくとも手術前に活動量を計測することができる症例全てを対象として、ほぼ予定通りの症例登録となった。予定登録の40例に達した時点で活動量ならびに癌再発,合併症,栄養指標,血清サイトカインの解析を行い、術後サルコペニアの抑制によるQOL向上,生命予後の改善を検証する介入研究を立案することを次なる目的とする。症例集積が当初の予定よりも少なかったため、サイトカイン計測用の試薬などの費用が少なくなった。本年度中には予定の症例数に達すると考えられるため、当初の物品費などの支出を計画している。
死亡動物の性細胞の保存と利用に関する研究

ICR系あるいはBDF1マウスおよびWistar-Imamichi系ラットを、頚椎脱臼あるいは頭部殴打によって死亡させたのち、4°Cあるいは20°Cに110日間保存し、性細胞が生存可能な期間をしらべた。雌動物は、屠殺48時間前にPMSG処理を施しておき、保存後の卵胞内未成熟卵子の形態と対外培養後の成熟率をしらべた。雄動物からは精巣上体尾部精子を採取し、修正KRB液中に懸濁させて生存性と運動性を観察した。さらに、一部の卵子と精子は、体外受精によって前核期2細胞用までの発生能をしらべた。雄マウスは、20°Cに保存すると3日後には精子は死滅していたが、4°Cに保存すると5日後も高率に生存しており、10日後にも生存精子が確認された。保存動物の精子は、屠殺直後に採取した精子に比べて培養後の生存性の低下が顕著であったが、5日間保存した精子を新鮮な卵子と体外受精すると、前核期2細胞期まで発育した。ラット精子もマウスとほぼ同様の傾向を示したが、保存精子を用いた体外受精によって受精卵は得られなかった。屠殺後20°Cに1日間保存した雌マウスからは形態的に正常な卵子は回収されなかったが、保存温度が4°Cの場合は50%以上の卵子が正常な形態を有しており、培養後に乱核胞崩壊第2成熟分裂中期への成熟が観察された。しかし、4°Cにおいても2日間保存後には、正常な形態を維持した卵子の割合は大きく低下し、正常な成熟は確認されなかった。ラット卵子も同様の傾向がみられたが、4°Cに1日間保存した雌から採取した卵子を体外受精後に体外受精して、低率ながら受精が確認された。一部の未受精卵子は、EFS液を用いてガラス化保存したが、耐凍剤の除去過程に損害を受けやすいことが観察された。本研究の結果、死亡動物の生殖細胞を利用する場合はできるだけ早く冷蔵することが重要であり、卵子は死亡後1日以内に採取する必要があるが、精子は5日間以上保存しうると考えられる。
次世代大量ミトゲノム解析による魚類多様性研究の新展開：サンガー法から超並列法へ

本研究では、魚類の大規模系統研究に有用なミトコンドリア全ゲノム(ミトゲノム)分析を、超並列次世代シーケンス技術を活用して、質の良くないDNA試料も含めた多数の試料で効率的に進める方法の確立を目指した。質の良いDNA試料については、ロングPCR産物にParallel tagged sequencing法によるタグ付加を行い、多数の試料を同時分析できた。質の良くないDNA試料には、Capture-on-beads法で、ミトゲノム全領域を万遍なくキャプチャーすることに成功した。以上により、超並列シーケンシング法による本格的な大量ミトゲノム分析を実施する基盤が完成した。我々はミトコンドリア全ゲノム(ミトゲノム)分析によって大規模系統研究を開拓・推進し、魚類の包括的系統枠の概要を明らかにすることに成功した。次のステップとして、分析種数を飛躍的に多くして系統樹の密度を高めることにより、多様化の理解を格段に高める必要性が出てきた。幸い、著しく高速の超並列次世代シーケンス技術が近年実用化されるに至っている。しかし、多数の試料について、ミトゲノムのシーケンシングに次世代シーケンサーを効率的に活用するには、まだ大きな困難がある。とくに、希少種も含む多数の種のDNAを扱うため、必然的に質の良くないDNA試料も頻繁に対象にしなくてはならず、新たな次世代シーケンサーが有効に活用できない状況にある。そこで本研究では、この困難を、ミトゲノム断片を濃縮する技術の適用を突破口にして解決し、魚類の大規模系統研究の飛躍的高密度化への道を切り拓くことを目的とする。前述した目的を達成するための鍵は、断片化の進んだ質の良くない種々のDNA試料からでも、ミトコンドリアゲノム断片を効率的に濃縮する技術を開発することである。それに成功して汎用性の広い濃縮法が開発できれば、魚類の大規模高密度系統研究に次世代シーケンス技術を本格的に活用することが可能となるからである。したがって初年度には、化石霊長類由来のDNA試料などからミトコンドリアゲノム断片が成功裏に濃縮されたという報告のあるCapture-on-beads法について、これを我々が対象とする魚類試料へ適用するための実験条件の検討を行ない、本格的分析を実施するための基礎的条件をかなり明らかにすることができた。サンガー法による、ミトコンドリア全ゲノム(ミトゲノム)分析によって、魚類の包括的系統枠の概要が明らかとなってきた。しかし、魚類多様化の理解を深めるには、分析種数をさらに多くし、系統樹の密度を高める必要性が明確になってきた。超並列次世代シーケンス技術により、多数試料のミトゲノム決定が可能となったが、多数種のDNAを扱うため、質の良くないDNA試料も頻繁に対象にすることになり、これを効率的に活用できない状況にある。本研究では、この困難をミトゲノム断片の濃縮法の適用により解決し、魚類の大規模系統研究の飛躍的高密度化を拓くことを目的とした。質の良いDNA試料については、ロングPCRによるミトゲノム濃縮を行い、サンプルのタグ付加にParalleltagged sequencing法(Meyer et al., 2008)を適用した。課題とした「アユの高精度集団構造」の解析のために、パーソナル次世代1ランで90個体のミトゲノム決定に成功した。この方法により、他にアゴハゼの82個体、ウキゴリ類の53個体、モロコ類の48個体、スゴモロコ類の48個体など、合計458個体のミトゲノムを決定できた。質の良くないDNA試料のミトゲノム断片の濃縮には、Capture-on-beads法(Maricic et al., 2010)を適用し、サンプルのタグ付加には、Double indexing法(Kicher et al., 2011)を導入した。実際に、質の良くないアユのDNA試料数サンプルについて、ミトゲノム濃縮ライブラリーを作成し、次世代シーケンシングを行ったところ、アユのミトゲノム全領域を万遍なくキャプチャーすることに成功した。以上のように、2つの実験系の検討から、実験条件が明確となり、超並列シーケンシング法によって本格的な大量ミトゲノム分析を実施する基盤が完成した。我々はミトコンドリア全ゲノム(ミトゲノム)分析によって、大規模系統研究を開拓・推進し、魚類の包括的系統枠の概要を明らかにすることに成功した。しかし、魚類多様化の理解を高めるには、分析種数をさらに多くして系統樹の密度を高める必要性が明確になってきた。幸い、高速超並列次世代シーケンス技術により、多数試料についてミトゲノムのシーケンシングが可能となったが、まだ大きな困難がある。とくに、多数種のDNAを扱うため、必然的に質の良くないDNA試料も頻繁に対象にしなくてはならず、次世代シーケンサーを効率的に活用できない状況にある。

質の良くないDNA試料からミトゲノム断片の濃縮を達成するために、初年度は、化石霊長類由来のDNA試料などからミトコンドリアゲノム断片が濃縮されたという報告のあるCapture-on-beads法(Maricic et al., 2010)の条件検討を進めた。本年度は、大量のサンプルに対するインデクス化(タグ付加)の効率化を図るために、新たに報告されたDouble indexing法(Kicher et al., 2011)を導入し、実験条件の検討を行い、本格的な大量分析を実施するための実験条件をほぼ明らかにすることができた。また、ロングPCRによりミトコンドリアゲノムを濃縮する方法についても、適用条件の検討を進め、サンプルのタグ付加にParallel tagged sequencing法(Meyer et al., 2008)を導入し、タモロコの48サンプルについて、試験的に次世代シーケンスを行った。その結果、各サンプル平均冗長度約30倍のミトコンドリアゲノムシーケンスに成功した。当初より計画していた通り、Capture-on-beads法を魚類試料へ適用するための実験条件をかなり明らかにすることができたため、「おおむね順調に進展している」と言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初より計画していた通り、Capture-on-beads法(Maricic et al., 2010)をアユ・サンプルに適用し、試薬の濃度や反応時間などの基本的実験条件について検討を進めるとともに、Double indexing法(Kicher et al., 2011)を導入し、サンプルのインデクス化(タグ付加)の実験条件がかなり明らかになった。特に、Capture-on-beads法では、ミトコンドリアゲノムの濃縮に必要な、ベイトの作成条件、ベイトによるミトコンドリアゲノムの濃縮に最適な反応時間などの詳細が明らかとなり、Double indexing法では、タグ付加後のサンプルや、それらをプールしたシーケンスライブラリーの分子数の計測に、新たにリアルタイムPCRを導入し、最適な調整が可能となってきた。また、ロングPCRによりミトコンドリアゲノムの長断片が濃縮可能なサンプルについては、サンプルのタグ付加にParallel tagged sequencing法(Meyer et al., 2008)を導入することにより、魚類試料への適用のための実験条件が明確になった。この方法においては、蛍光試薬によるタグ付加サンプルの分子数計測を導入し、リアルタイムPCRによるシーケンスライブラリーの分子数計測と合わせて、最適なシーケンスライブラリーの調整が可能となった。以上の様に、「おおむね順調に進展している」と言える。本年度はさらにCapture-on-beads法の改良を進め、この段階での完成を図る。この手法のさらなる改良の一つのポイントは、ミトコンドリアゲノム断片のインデクス化(タグ付加)をいかに効率化するかであるが、新たに報告されたDouble indexing法はその有力な候補であり、これの導入を含めた改善に努める。
光受容細胞に特異的なMEKA蛋白貭の精製とその生理機能の解明

ウシ網膜cDNAライブラリ-より単離したMEKAcDNAは、分子量約3万の酸性可溶性MEKA蛋白貭をコ-ドしている。本cDNAからMEKA蛋白貭を大腸菌内で合成し、抗MEKA血清を調整した。1.ヒトMEKA遺伝子のクロ-ニングとその解析から、本遺伝子は1コピ-存在し、2つのイントロンと3つのエクソンよりなる。ヒトMEKA蛋白貭のアミノ酸配列は、ウシのそれと約90%のホモロジ-を示す。2.組識化学から視細胞内におけるMEKA蛋白貭の局在は、光刺激により変化すること、また本蛋白貭は桿体細胞のみならず錐体細胞にも存在する、抗MEKAを用いたウシMEKA蛋白貭の精製から、本蛋白貭がG蛋白貭であるトランスデュ-シンβαと複合体を形成することを見い出した。3.MEKA蛋白貭がトランスデュ-シンβαと結合することから、網膜以外の組識にも(G蛋白貭のβαサブユニットと結合する)MEKA様蛋白貭が存在する可能性がある。肝蔵や脳とのNorthernやPCRの解析から両組識にはMEKA様mRNAが存在することを確認している。事実、肝蔵cDNAライブラリ-からMEKAcDNAとハイブリダイズするクロ-ンの単離とその塩基配列の決定から、肝蔵MEKAcDNAは網膜MEKAcDNAと高いホモロジ-を示すことが明らかとなった。本クロ-ンの解析を行っている。我々が単離した網膜に特異的なMEKA cDNA(蛋白質)の解析を行い以下の成果を得ている。1.MEKA抗体の作製; MEKA cDNAを発現ベクタ-に組み込み大腸菌内でMEKA融合蛋白質を合成することができた。本蛋白質を抗原とし、抗MEKA血清を得た。2.抗MEKA血清を用いた研究(1)抗MEKA血清を用いた組織化学実験から、MEKA蛋白質或いは抗MEKA類似蛋白質がヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリの視細胞にのみ発現していることが明きらかとなった。さらに、明或いは暗順応させた動物の網膜において、MEKA蛋白質の視細胞内での局在変化を認めた。(2)抗MEKAを用い、ウシ、網膜よりMEKA蛋白質の精製を行った。MEKA蛋白質(32Kda)がトランスデュ-シンβ(36Kda)およびγ(10Kda)サブユニットと複合体(74Kda)を形成し、SDS-PAGEにより解離することが明きらかとなった。3.ヒトMEKAゲノムの単離;ウシMEKAcDNAをプロ-ブとし、ヒトゲノムのライブラリ-よりMEKAゲノムを単離した。MEKAゲノムは1コピ-で、2つのイントロンを持つ。現在、その塩基配列の決定を行っているが、ヒトとウシとのアミノ酸ホモロジ-は約90%である。ウシ網膜cDNAライブラリ-より単離したMEKAcDNAは、分子量約3万の酸性可溶性MEKA蛋白質をコ-ドしている。本cDNAからMEKA蛋白質を大腸菌内で合成し、抗MEKA血清を調整した。ヒトMEKA蛋白質のアミノ酸配列は、ウシのそれと約90%のホモロジ-を示す。2.組織化学から視細胞内におけるMEKA蛋白質の局在は、光刺激により変化すること、また本蛋白質は桿体細胞のみならず錐体細胞にも存在する、抗MEKAを用いたウシMEKA蛋白質の精製から、本蛋白質がG蛋白質であるトランスデュ-シンβαと複合体を形成することを見い出した。3.MEKA蛋白質がトランスデュ-シンβαと結合することから、網膜以外の組織にも(G蛋白質のβαサブユニットと結合する)MEKA様蛋白質が存在する可能性がある。

肝臓や脳とのNorthernやPCRの解析から両組織にはMEKA様mRNAが存在することを確認している。事実、肝臓cDNAライブラリ-からMEKAcDNAとハイブリダイズするクロ-ンの単離とその塩基配列の決定から、肝臓MEKAcDNAは網膜MEKAcDNAと高いホモロジ-を示すことが明らかとなった。本クロ-ンの解析を行っている。
ゲノム情報に基づいたP.gingivalisの宿主内での病原性因子調節機構の解析

マウス体内に埋め込んだチャンバー内にP. gingivalisを接種するとタンパク発現が増加する3タンパクについて研究を進めている。そのうちの1つPG1385はTPR domainを有するタンパクであり、このタンパクの欠損株はマウス皮下接取膿瘍形成モデルで病原性の低下を示したことを昨年の報告に記載した。また、野生株およびPG1385欠損株をマウス体内に埋め込んだチャンバー内に接種し、一定時間後回収して発現アレイによる解析を行ったところ、野生株に対してPG1385欠損株で発現が2/3以下に減少している遺伝子が12あった。そのなかにPG2100PG2103が含まれていた。PG2102はPG1385と同様にマウスチャンバー内でタンパク発現が増加していた。また、yeast two hybrid法を用いてPG1385と親和性のあるタンパクをコードする遺伝子を20検出した。そのなかにPG2101が含まれていた。PG2100,PG2101,PG2102はオペロンを形成している可能性があり、さらにPG2100とPG2102は外膜タンパク、PG2101は内膜タンパクのモチーフをもっており、PG1385がペリプラズムタンパクであることから相互に関係するタンパクである可能性が出てきた。今後これらのタンパク間での相互作用を検討するとともにPG2100,PG2101の変異株およびPG2100PG2102領域の完全欠損株を作製してマウス皮下接取膿瘍形成モデルで病原性の程度を調べる。マウス体内で発現量の増加する蛋白質については、昨年度、上昇した蛋白質の中で3種、immunoreactive 61 kDa antigen PG91(PG2102)、DNA-binding response regulator RprY(PG1089)、TPR domain protein(PG1385)に着目し、W83株を用いてそれぞれの遺伝子変異株を作製した。マウスを用いて検討したところ、PG2102欠損株の病原性は親株との間に差が見いだせなかったが、PG1089、PG1385それぞれの欠損株では病原性が顕著に減弱していた。RprYは2成分制御系の調節タンパク質であり、またTPR domainは真核細胞においてシャペロン分子の足場のような役割をしていることから、両者が複数の病原性因子の調節に関わっていることが示唆される。次にRprY(PG1089)とTPR domain protein(PG1385)が制御あるいは相互作用している病原性因子を明らかにするため、W83株、RprY(PG1089)欠損株、TPR domain protein(PG1385)欠損株がマウス体内で発現している遺伝子についてDNAチップを用いて解析をおこなった。具体的にはプロテオミクスの実験と同様にBalb/cマウス背部に埋入したコイル内腔にW83株、RprY(PG1089)欠損株、TPR domain protein(PG1385)欠損株を接種し、2時間後に回収した菌体から全RNAを回収し、W83発現アレイ(NimbleGen)を用いて解析した。実験はそれぞれ2回行った。その結果、W83株に対してRprY(PG1089)欠損株で発現の上昇しているものが64プローブ、減少しているものが2プローブ、W83株に対してTPR domain protein(PG1385)欠損株で発現の上昇しているものが5プローブ、減少しているものが5プローブであった。いずれの欠損株に於いても発現の減少しているものが病原性に関わる確率が高いと考えられるが、immunoreactive 63 kDa antigen PG102が両株に共通して野生株に比して減少していたことは興味深く、この病原性の関与を今後調べる必要がある。またW83株を培地で増殖させた場合とマウス体内に置いた場合を比較した場合、マウス体内で発現の上昇しているものが16プローブ、減少しているものが145プローブであった。発現の減少している中で126プローブはintergenic regionであり、その意義については今後の検討が必要である。酵母two-hybrid sysytemの確立は難航したが、ようやくシステムとして動き始め、成果が得られつつある状況にある。

今後これらのタンパク間での相互作用を検討するとともにPG2100,PG2101の変異株およびPG2100PG2102領域の完全欠損株を作製してマウス皮下接取膿瘍形成モデルで病原性の程度を調べる。
抗ガングリオシドD2モノクローナル抗体の神経芽細胞腫治療応用のための基礎的研究

抗ガングリオシドD2(GD2)マウスモノクローナル抗体の神経芽細胞腫治療応用のため、3種類の抗GD2抗体について組織特異性、in vitroおよびin vivoにおける抗腫瘍効果、さらにサイトカイン併用の効果について研究し、以下の結果を得た。1.抗体220-51、A1.410、3F8はいずれもヒト神経芽腫細胞株、ヒト神経芽腫腫瘍組織と特異的に反応した。ヒト正常組織との間では脳の神経細胞と反応がみられた。2.ラジオアイソトープ標識抗体220-51を用いて、腫瘍移植ヌードマウスのイメージングを行ったところ、腫瘍に特異的な集積が認められた。3.抗体220-51、A1.410、3F8はいずれも神経芽腫細胞株に対して、補体依存性細胞障害活性(CDC)およびヒトエフェクター細胞(単核球,顆粒球)による抗体依存性細胞媒介性細胞障害活性(ADCC)活性を示した。4.顆粒球によるADCCは、rhGM-CSFにより増強された。5.抗体220-51は、神経芽腫移植ヌードマウスへの投与により、単独で腫瘍増殖抑制効果を示した。rmGM-CSFまたはrhG-CSFを併用することでその効果は増強されたが、rmGM-CSFとrhG-CSFの両者を用いた場合に最も高い増殖抑制効果が得られた。今回の基礎的研究から抗GD2抗体の臨床における有用性が示唆された。1.抗ガングリオシドD2(GD2)に対するマウスモノクローナル抗体3F8、126、220、A-410の補体依存性細胞傷害性を検討した。神経芽腫細胞株TGW-I-nuをターゲットとして至適条件において3F8:98%、126:78%、220:69%、A-410:99%の細胞傷害性が得られた。2.3F8、220、A-410についてTGW-I-nuをターゲットとして抗体依存性細胞性傷害試験を行った。エフェクター細胞としては、健常者末梢血単核球を用いた。E/T比200で至適抗体濃度において3F8:43%、220:55%、A-410:42%の細胞傷害性が得られた。3.各抗体の造血幹細胞に対する補体依存性細胞傷害性を調べた。CFU-GMコロニー形成法による検討では3F8、126、220、A-410いずれも造血幹細胞に対する傷害性を示さなかった。4.抗体220、A1-410を人体に投与した場合の正常組織への影響を予測するため、免疫組織化学による検討を行った。肺、肝、腎、膵、脾、副腎、腸管、心、唾液腺、下垂体については本法では陰性であった。中枢神経系では白質は陰性であったが、大脳皮質および小脳顆粒層の神経細胞が両抗体で陽性に染まった。したがって、中枢神経系以外の臓器に対する影響は少ないと考えられた。5.4種の抗体間に明らかな抗腫瘍活性の差は認めなかった。6.本邦の抗GD2抗体である220、A-410を用いて、ヒト型モノクローナル抗体を作成することで、治療応用の可能性が示された。抗ガングリオシドD2マウスモノクローナル抗体のマウスin vivoにおける抗腫瘍効果を検討した。6週齢のBALB/cヌードマウスの背部皮下に神経芽腫細胞株TGW-I-nuを移植し、モノクローナル抗体のin vivo投与の効果を調べた。15EA03:まず皮下に明らかな腫瘤の形成された時点(腫瘍体積1194μ1)から、モノクローナル抗体100μgを4回静注した。使用した抗体は220-51、A1-410、3F8の3種である。どの抗体を用いた場合でも、腫瘍の明らかな縮小は認められなかった。

しかし、静注開始から1週間の腫瘍の増大倍率をコントロールと比較した場合、コントロール群が8.1±1.3倍(n=3)であったのに対し、220-51投与群では5.3±3.0倍(n=3)であり、有意ではないが増殖率の低下を認めた。A1-410投与群のそれは6.1±1.8倍(n=3)であり、増殖率の低下は認められなかった。次に腫瘍サイズが5,5007,400μ1に達した時点から220-51の投与(100μg、4回静注)を開始した。この場合、コントロール群が2.0±0.3倍(n=3)であったのに対し、220-51投与群では1.5±0.2倍(n=3)であり、有意な増殖率の低下を認めた(p<0.05)。腫瘍を移植したマウスは抗体の投与の有無にかかわらず生存期間に差はなく、最終的には腫瘍死し、抗体投与による延命効果は認められなかった。今回用いた抗体の種類、投与量では腫瘍の縮小効果、延命効果は得られなかったが、220-51とA1-410では増殖率の低下が認められたことから、臨床応用した場合、ある程度の効果は期待できると考えられた。1.放射性ヨード[Na^<125>I]で標識した抗体220-51を,ヒト神経芽腫細胞を左大腿部皮下に移植したヌードマウスに注射し,イメージングを行って腫瘍集積性を検討した。その結果,左大腿の腫瘍部に標識抗体の特異的な集積が認められた。2.抗体220-51の腫瘍生着阻止硬化について検討した。TGW-I-nuを皮下注射した日から,抗体220-51を7日間毎日静注し,60日までの間に皮下に腫瘤を形成するかどうかを観察した。なお,PBSのみを静注したマウスを対照群とした。その結果,対照群では69匹中,45匹で皮下移植した腫瘍の生着がみられたが,抗体を静注した10匹において腫瘍の生着はみられず,有意な生着阻止効果が得られた(p<0.005)。3.抗体220-51についてrhGM-CSFおよびrhG-CSFによる顆粒球抗体依存性細胞性障害性試験(ADCC)の増強効果を検討した。その結果,抗体濃度10μg/mlにおいてrhGM-CSFを添加した場合,有意に高い細胞障害活性が認められた。rhG-CSFの添加では活性に変化は認められなかった。またrhGM-CSFとrhG-CSFを両方添加した場合もrhGM-CSF単独の場合以上の活性は得られなかった。4.GM-CSFまたはG-CSFがin vivoにおいて抗体による抗腫瘍効果に影響するかどうかを検討した。rmGM-CSFまたはrhG-CSFを抗体の静注開始日から連日10日間皮下注射した。rmGM-CSFまたはrhG-CSFを併用した場合,1週目,2週目で抗体単独よりも強い腫瘍増殖抑制効果が認められた。さらに,rmGM-CSFとrhG-CSFの両者を抗体と併用した場合に最も強い増殖抑制効果が得られ,3週目まで対照群に比べて有意な増殖抑制効果が得られた。以上より、サイトカインの併用でより有効な抗腫瘍効果が期待できると考えられた。
光電子移動反応を利用する複素環化合物オレフィン類の高選択的アミノ化反応の開発

我々は光電子移動反応を利用する芳香族炭化水素の直接的アミノ化反応について研究を行っている.この光アミノ化反応はアミノ化試剤にアンモニアや第一アミンを用いて温和な条件下で行える簡便な直接的アミノ化反応である.そのため新しい合成反応としての展開が期待される.そこで本研究では光アミノ化反応の(1)合成化学的研究と(2)機構的研究の二つについて検討を行った.(1)スチルベン類の光アミノ化反応を利用したイソキノリンアルカロイドの合成研究-メトキシ置換スチルベンの光アミノ化反応はメトキシ置換スチルベン, mジシアノベンゼンおよびアンモニア・第一アミンを含むアセトニトリルー水(9:1)溶液を高圧水銀灯で光照射する事によって行い,対応する1-アミノまたは1-アルキルアミノー1, 2-ジアリールエタンを与えた.アミノ基はメトキシ基をより多く置換したアリール基のべンジル位へ選択的に導入された.しかしながら, 1つの芳香核に2つ以上のメトキシ基またはメチレンジオキシ基を有するスチルベンでは収率が低下した.合成化学的に重要な事としてグリシンエチルエステル,エタノールアミン,およびジエチルアミノアセタールの様な二官能性アミンを用いる光アミノ化反応が効率よく起こる事が挙げられる.それらの官能基を利用した分子内環化反応によりベアジルイソキノリンへ導く事が可能である.(2)芳香族炭化水素の光アミノ化反応の機構的研究-光アミノ化反応の機構は光電子移動反応で生成した芳香族炭化水素カチオンラジカルへのアミンの求核攻撃によって進行し,その求核攻撃の速度はフェナントレンカチオンラジカルに対するn-PrNH_2の場合8.0×10^8M^<-1>S^<-1>と求められた.また効率の良い光アミノ化反応のためにはアミンの酸化電位が芳香族炭化水素の酸化電位より0.3-0.4V高いことが必要であることなどが明らかになった.我々は光電子移動反応を利用する芳香族炭化水素の直接的アミノ化反応について研究を行っている.この光アミノ化反応はアミノ化試剤にアンモニアや第一アミンを用いて温和な条件下で行える簡便な直接的アミノ化反応である.そのため新しい合成反応としての展開が期待される.そこで本研究では光アミノ化反応の(1)合成化学的研究と(2)機構的研究の二つについて検討を行った.(1)スチルベン類の光アミノ化反応を利用したイソキノリンアルカロイドの合成研究-メトキシ置換スチルベンの光アミノ化反応はメトキシ置換スチルベン, mジシアノベンゼンおよびアンモニア・第一アミンを含むアセトニトリルー水(9:1)溶液を高圧水銀灯で光照射する事によって行い,対応する1-アミノまたは1-アルキルアミノー1, 2-ジアリールエタンを与えた.アミノ基はメトキシ基をより多く置換したアリール基のべンジル位へ選択的に導入された.しかしながら, 1つの芳香核に2つ以上のメトキシ基またはメチレンジオキシ基を有するスチルベンでは収率が低下した.合成化学的に重要な事としてグリシンエチルエステル,エタノールアミン,およびジエチルアミノアセタールの様な二官能性アミンを用いる光アミノ化反応が効率よく起こる事が挙げられる.それらの官能基を利用した分子内環化反応によりベアジルイソキノリンへ導く事が可能である.(2)芳香族炭化水素の光アミノ化反応の機構的研究-光アミノ化反応の機構は光電子移動反応で生成した芳香族炭化水素カチオンラジカルへのアミンの求核攻撃によって進行し,その求核攻撃の速度はフェナントレンカチオンラジカルに対するn-PrNH_2の場合8.0×10^8M^<-1>S^<-1>と求められた.また効率の良い光アミノ化反応のためにはアミンの酸化電位が芳香族炭化水素の酸化電位より0.3-0.4V高いことが必要であることなどが明らかになった.
カチオンのレーザー選別と低振動モードに関する光電子分光研究

本研究では,極めて高い分解能(1cm^<-1>)で,励起状態分子のレーザー光イオン化を行い,しきい光電子(運動エネルギーがほぼゼロ)の捕集を行い,カチオンラジカルの低振動モードを明らかにすることであった。低振動モードは分子間相互作用や置換基相互作用に敏感だから,その情報を引きだすことができる。そこで,二台の波長可変レーザーを組合わせ2光子イオン化を起し,分子から放出する「しきい光電子」の強度を第二レーザーの波長の関数として測定するという方法を用いた.このとき第一レーザーの波長は測定分子の最低励起一重項状態の種々の振動準位のエネルギーに一致するようにとった.測定対象としては,パラジメトキンベンゼン分子およびアルゴンとのファンデルワールス分子(Arが1個または2個付着)を取り上げた.用いた真空装置および「しきい光電子」の測定技術は以前本代表者らが分子科学研究所で開発したものである.その結果,次の成果が得られた.1:1錯体1:2錯体のシス型とトランス型回転異性体のS_1励起状態を経由して,イオン化状態の低振動モード9プログレッションを多数測定することができた.得られた断熱イオン化ポテンシャルの値は次のようである.まずArの付着しないフリーな分子では,シス型60774±7cm^<-1>,トランス型60563±7cm^<-1>,1:1錯体では,シス型60687±7cm^<-1>、トランス型60479±7cm^<-1>,さらに,1:2錯体では,シス型60509±7cm^<-1>,トランス型60295±7cm^<-1>であった.これらは,国際的にもきわめて高い精度のイオン化ポテンシャルであり,しかもアルゴンのファンデアワールス錯体の分子内回転異性体のシス型・トランス型のイオン化ポテンシャルが明確になったことの意義は大きいと考えている.本実験は超音速ジェットの条件で光イオン化を行ったものであるが,カチオンラジカルの低振動モードを実験的に決定するすぐれた手法であることがわかった.本研究では,極めて高い分解能(1cm^<-1>)で,励起状態分子のレーザー光イオン化を行い,しきい光電子(運動エネルギーがほぼゼロ)の捕集を行い,カチオンラジカルの低振動モードを明らかにすることであった。そこで,二台の波長可変レーザーを組合わせ2光子イオン化を起し,分子から放出する「しきい光電子」の強度を第二レーザーの波長の関数として測定するという方法を用いた.このとき第一レーザーの波長は測定分子の最低励起一重項状態の種々の振動準位のエネルギーに一致するようにとった.測定対象としては,パラジメトキンベンゼン分子およびアルゴンとのファンデルワールス分子(Arが1個または2個付着)を取り上げた.用いた真空装置および「しきい光電子」の測定技術は以前本代表者らが分子科学研究所で開発したものである.その結果,次の成果が得られた.1:1錯体1:2錯体のシス型とトランス型回転異性体のS_1励起状態を経由して,イオン化状態の低振動モード9プログレッションを多数測定することができた.得られた断熱イオン化ポテンシャルの値は次のようである.まずArの付着しないフリーな分子では,シス型60774±7cm^<-1>,トランス型60563±7cm^<-1>,1:1錯体では,シス型60687±7cm^<-1>、トランス型60479±7cm^<-1>,さらに,1:2錯体では,シス型60509±7cm^<-1>,トランス型60295±7cm^<-1>であった.これらは,国際的にもきわめて高い精度のイオン化ポテンシャルであり,しかもアルゴンのファンデアワールス錯体の分子内回転異性体のシス型・トランス型のイオン化ポテンシャルが明確になったことの意義は大きいと考えている.本実験は超音速ジェットの条件で光イオン化を行ったものであるが,カチオンラジカルの低振動モードを実験的に決定するすぐれた手法であることがわかった.
凍結保存骨膜からの骨新生に関する実験的研究

骨膜凍結条件を決定した。凍結保護剤にはヒト胚の培養に用いられるIVF AH25培養液に0.2Mトレハロース、抗生物質(ホスミシン、10μg/ml)、12%ジメチルスルフォキシド(DMSO)および50%(V/V)鶏卵黄を添加したものを用いた。受精18日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を直接凍結保護材1.0ml含む凍結バックに入れ、シールした後エタノールを冷媒としたプログラムフリーザーを用い、室温/+-7°C(2.0°C/分)、-2.0°C/40°C(1.0°C/分)で凍結し、その後直ちに液体窒素に浸漬して-196°Cとし、凍結保存した。融解は微温湯中で行い、培養液で洗浄した。融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撮影を行い、骨形成の有無を確認した。凍結保護剤の添加、除去方法の検討した結果、凍結保護剤に骨膜を直接添加し、融解後は培養液で直接洗浄することにした。3.DMSO不含凍結保護剤を用いた場合は新生骨形成を認めず、凍結保存に際してDMSOが必須であることを認めた。DMSO濃度は6-18%の範囲で同程度の骨新生を認め、本研究では12%を採用した。一方、卵黄不含凍結保護剤では新生骨形成は著しく低く、骨膜の凍結に際してはDMSOとともに卵黄が重要な意義を有することを見いだした。卵黄濃度は10-88%の範囲で保護効果を認めた。さらに精製卵黄レシチンを卵黄の代わりに添加しても、卵黄の場合と同様な保護効果を認めた。長期保存(1週間、1ヶ月、3ヶ月)を行った結果、いずれも同程度の骨新生率を認め、長期保存が可能であることが示唆された。透過型電子顕微鏡を用いて細胞像を観察した結果、組織表層の細胞は小器官の膨化等の変性像を認めたが、深層部では細胞膜、小器官の形態が保持されていた。上述した細胞酸化還元能の結果とともに、組織の一部が機能を保持したまま凍結保存できたと考えられる。平成10年度は、新生骨形成率を指標として骨膜凍結の至適条件の検索を拭みた.受精18日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を凍結保存し,融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撞影を行い、骨形成の有無を確認した.凍結保護剤にはヒト胚の培養に用いられるIVF AH25培養液に1.0Mトレハロース、抗生物質(ホスミシン、10μgh/ml)および種々の濃度の鶏卵黄を添加したものを基本液としてを用い、凍結保護物質として12%ジメチルスルフォキシド(DMSO)を用いた.凍結には、エタノールを冷媒としたプログラムフリーザーを用い,室温/-7°C(2.0°C/分)、-2.0°C/-40°C(1.0°C/7分)で凍結し、その後直ちに液体窒素に浸消して-196°Cとし、凍結保存した.融解は微温湯中で行った.

l.凍結保護剤の添加、除去方法の検討:凍結,融解に際して、胚凍結で一般的に行われる凍結保護剤の段階的な添加、除去を検討した.すなわち、基本液に0、6、12%DMSOを添加した凍結保護剤剤(卵黄濃度20%)を作成し、1)約5分間隔でDMSO濃度を上昇、下降、2)DMSO濃度の股階的上昇、融解後は直ちに培養液で洗浄、3)直接添加、融解後段階的下降、4)直接添加、融解後は直ちに洗浄した4群を作成し、凍結保護剤の添加、除去法を検討した.凍結容器にはガラス製試験管を用いた.4群とも新生骨形成率に有意な差を認めず,第4群、すなわち12%DMSOを含む凍結保護剤の直接添加、融解後は培養液で直接洗浄することとした.DMSO不含凍結保護剤を用いた場合は新生骨形成を認めず、凍結保存に際してDMSOが必須であることを認めた.一方、卵黄不含凍粘保護剤では新生骨形成は著しく低く、骨膜の凍結に際してはDMSOとともに卵黄が重要な意義を有することを見いだした.2.卵黄濃度の検討:上述した凍結保護剤の卵黄濃度を088%として比較を行った.その結果、卵黄濃度050%の範囲では濃度上昇に伴い新生骨形成率が向上することを認めたが、それ以上ではほぼ同程度の値が得られた.高濃度の卵黄液は粘度が高く、操作が煩雑であるため、以後の検討では卵黄濃度を50%とした.3.ミトコンドリア酸化還元能を指標とした結融解に伴う細胞障害の解析:10%アラマプルーを含む10%鶏血清加PRMl1640培養液を用いて骨膜細胞のミトコンドリア酸化還元能を測定が可能であることを見いだした.骨膜凍結条件を決定した。凍結保護剤にはヒト胚の培養に用いられるIVFAH25培養液に0.2Mトレハロース、抗生物質(ホスミシン、10μg/ml)、12%ジメチルフォキシド(DMSO)および50%(V/V)鶏卵黄を添加したものを用いた。受精18日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を直接凍結保護剤1.0mlを含む凍結バックに入れ、シールした後エタノールを冷媒としたプログラムフリーザーを用い、室温/-7°C(2.0°C/分)、-2.0°C/-40°C(1.0°C/分)で凍結し、その後直ちに液体窒素に浸漬して-196°Cとし、凍結保存した。融解は微温湯中で行い、培養液で洗浄した。融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撮影を行い、骨形成の有無を確認した。凍結保護剤の添加、除去方法の検討した結果、凍結保護剤に骨膜を直接添加し、融解後は培養液で直接洗浄することとした。3. DMSO不含凍結保護剤を用いた場合は新生骨形成を認めず、凍結保存に際してDMSOが必須であることを認めた。一方、卵黄不含凍結保護剤では新生骨形成は著しく低く、骨膜の凍結に際してはDMSOとともに卵黄が重要な意義を有することを見いだした。さらに精製卵黄レシチンを卵黄の代わりに添加しても、卵黄の場合と同様な保護効果を認めた。ミトコンドリア酸化還元能を指標として凍結融解に伴う細胞障害を解析した結果、10%アラマブルーを含むウシ血清アルブミン加PRMI1640培養液を用いて骨膜細胞のミトコンドリア酸化還元能を測定した結果、融解後においても酸化還元能を保持していることを認めた。透過型電子顕微鏡を用いて細胞像を観察した結果、組織表層の細胞は小器官の膨化等の変性像を認めたが、深層部では細胞膜、小器官の形態が保持されていた。上述した細胞酸化還元能の結果とともに、組織の一部が機能を保持したまま凍結保存できたと考えられる。