hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発話に対するキャラクタ重畳機能の実現

キャラクタ性を持った発話文の自動生成の実現基盤となる「日本語表現文型辞書」を作成した。この辞書は、「依頼」や「勧誘」といった発話の目的(発話意図)に対して、それを伝達するために使用される日本語の表現文型を整理したもので、50種類の発話意図に対して、のべ675件の表現文型を収録しており、それぞれの表現文型には、話し方の特徴を表す情報(8次元ベクトル)が付与されている。この辞書を利用して、話者の特徴を反映した発話文生成システムを試作した。本年度は以下の研究を行なった。1.研究の準備段階として、既存の発話データベースを分析し、発話のどの部分に発話者の個性を反映させることができる自由度があるかを調査した。これまで、機能語に発話者の個性が反映されやすいことがわかっていたが、それ以外にも、内容語の選択、構造の選択等、多岐に渡っていることが判明した。2.小説から登場人物の発話は抜き出した小説発話データベースを新たに作成した。対象小説としては、森博嗣の犀川・萌絵シリーズを選び、この2名の主要人物の発話をそれぞれ1500発話ずつ抜き出し、データベース化した。3.作成した小説発話データベースに対し、それぞれの登場人物の個性と結びついていると考えられる表現をピックアップし、それらと登場人物の個性の関係を整理した。具体的には、登場人物の個性を、キャラクタ設定(大学教員、お嬢様)、性格類型(論理的、浮世離れ、上品、気が強い、甘えん坊)、発話スタイル(理路整然、丁寧語多用、辛辣、子供っぽい)という3段階で階層的に捉え、発話スタイルの下に、それに固有な表現を整理した。当初予定していた発話データベースの利用に制限があることが判明したため、方向を転換し、新たに小説の発話を対象としたデータベースを作成することとした。このため、計画の一部修正を余儀なくされた。また、このデータベースの分析を進める過程で、発話者の個性は、発話の表現の選択(how to say)だけでなく、発話内容の選択(what to say)にも寄与することが明らかになりつつある。このため、研究戦略・研究方法の再考が必要となった。本年度は、主に、次の項目で成果を得た。1.日本語表現文型辞書の作成:キャラクタ性を持った発話文の自動生成の実現基盤となる「日本語表現文型辞書」を作成した。この辞書は、「依頼」や「勧誘」といった発話の目的(発話意図)に対して、それを伝達するために使用される日本語の表現文型を整理したもので、50種類の発話意図に対して、のべ675件の表現文型を収録している。それぞれの表現文型に、話し方の特徴を表す情報(8次元ベクトル)が付与されている。これは、4軸の8特徴(男性的・女性的、子供っぽい・大人っぽい、断定的・婉曲的、丁寧・粗雑)に対する、3段階の値(0から2)である。2.話者の特徴を反映した発話文生成システムの試作:上記の「日本語表現文型辞書」を利用して、話者の特徴を反映した発話文を生成するシステムを試作した。このシステムの基本フレームワークは、「発話内容+発話意図+発話者」→「発話内容+発話意図+話し方の特徴」→「発話内容+表現文型」→「発話文」である。発話者は、「発話意図と話し方の特徴」のセットとしてモデル化し、50種類の発話意図のうち10種類に対して話し方の特徴を与える(話者プロファイル)。明示的に与えられていない発話意図に対する話し方の特徴は、類似度計算により推測する。こうして定まった話し方の特徴と発話意図の組で上記の日本語表現文型辞書を引くと、使用すべき表現文型が定まる。最終的に、それを発話内容と適切に結合することにより、発話文を生成する。小規模な実験において、このシステムが、ほぼ違和感のない発話文を生成できることを確かめた。当初の計画を変更し、新たに作成した小説発話データベースを中心に、小説発話と登場人物の個性の関係について分析を進め、ある特定の個性を持つ人物の発話を生成するモデルを作り、それをプログラムとして実装する方向で研究を進めたい。発話者の個性は、原理的には、what to sayとhow to sayのすべての過程に寄与しうる。しかしながら、実装可能な計算モデルにおいては、それらをうまく限定する必要がある。おそらく、個性というものをどのようにモデル化し、どのような粒度で分節化するかという点が、最も重要な検討事項となる。本研究の期間内では、限定された小説登場人物に的を絞り、その後の発展の出発点となる計算モデルを作るところまで進める予定である。自然言語処理研究が当初計画通りに進まなかったため、研究機材の購入、研究補助者(アルバイト)の雇用、研究発表等が計画と齟齬をきたすこととなった。新しい計画に沿って、研究機材の購入と研究補助者(アルバイト)の雇用を進める予定である。
４次元多様体上の安定写像とそれを用いた４次元多様体の図示法の研究

期間中に得られた成果は主に以下の2つである。切断を持つトーラス上のトーラス束の全空間が種数3のレフシェッツペンシルを持つことがわかっていたが、その消滅サイクルは知られていなかった。本研究では4次元トーラス上の正則なレフシェッツペンシルの消滅サイクルを決定し、さらにそれを用いてトーラス上のトーラス束と同相な多様体上のレフシェッツペンシルを構成した。近年trisectionと呼ばれる、4次元多様体の新たな図示法が提案され、さらにその特別なクラスとして単純なtrisectionが定義された。本研究では単純なtrisectionの図式と写像類群との関係を明らかにし、またその図式の例を得る方法も与えた。本研究の目的の一つは4次元多様体から3次元空間への安定写像の臨界値集合およびファイバーに着目することにより、4次元多様体および安定写像自身の図示法を確立することにより、4次元多様体の微分構造の分類手法を確立することであった。この目的を達成するために、当該年度ではまず4次元多様体から3次元空間への写像として十分一般的にとったとき、その写像自身と、その写像に3次元空間から2次元空間への射影を合成して得られる写像が持つ臨界点について調べる方法を確立した。研究計画を提出した際には、計画に記載されている通りBruce-Kirkの結果を利用する予定であったが、その方法ではホモトピーの分類の際に困難が生じることが判明したため、complete transversalと呼ばれる、写像芽の分類を簡素化する手法や、微分同相写像芽のジェットからなる群の冪等部分群を用いた、有限確定性の評価法を、我々の考えている状況に適合するように一般化することにした。これらの結果の一般化により、4次元多様体から3次元空間への写像とそのホモトピーを統一的に扱うことができるようになった。また研究計画には4次元多様体から3次元空間への写像についてのみ記載されているが、この手法自体は他の次元対にも適用可能であるので、今後は他の次元間の写像にも適用することも視野に入れていく。またこの手法により、ホモトピーにとどまらずより余次元の大きい写像芽の分類も理論上可能になるので、図示法のみではなく、Vassiliev型の不変量の構成も試みる。本研究の主な目的は4次元多様体上の安定写像を介して、4次元多様体の大域的構造を調べる手法を確立する、というものである。前年度までは安定写像のみに着目し、その目的の達成を目指してきたが、今年度はレフシェッツ束やレフシェッツペンシル等の、安定とは限らない写像にも注目し、定義域の多様体上のシンプレクティック構造や複素構造などの幾何構造との関連も調べてみた。その結果以下に述べるように、ある特殊な状況において定義域の幾何構造が写像の微分位相幾何学的な性質を決定づけるということが判明した。一般にレフシェッツペンシルが与えられると、その一般ファイバーの閉包を見ることにより、種数と可約度という非負整数値の不変量が定義できる。定義域が4次元トーラスの場合、これらはともに一般ファイバーの閉包が代表するホモロジー類から決まる不変量がある。本研究では種数が6以上あるいは可約度が2以上の2つの4次元トーラス上の正則なレフシェッツペンシルは、その種数と可約度が一致すれば同型になるということを示すことができた。一般には種数と可約度から同型類が決まるということはない、ということに注意しておく(実際Baykurとの共同研究において、種数と可約度が一致するが同型にはならないレフシェッツペンシルの例を与えている)。この結果は4次元トーラス上の複素構造が、その上の(構造に適合する)レフシェッツペンシルに多大なる制約を与える、ということを示唆するものである。なおこの結果の証明では偏極付きアーベル曲面のモジュライ空間の理論を援用しているが、その手法自体真新しいもので、当該分野が新たな方向へ発展を遂げるきっかけになるということも期待できる。本研究の目的は可微分写像を介して、定義域である4次元多様体の大域的構造を理解するということであるが、それに対し今回得られた結果は4次元多様体上の複素構造がその上の(複素構造と適合する)可微分写像に制約を与える、ということを示唆するものである。この結果は一見4次元多様体の大域的構造の理解につながらないようにも思えるが、この結果の証明方法を他の多様体にも適用し、さらに写像類群によりレフシェッツペンシルをうまく構成することができれば、今後の研究の推進方策にもあるようにエキゾチックな4次元多様体の対の新たな例の発見や、ケーラーにはなり得ないシンプレクティック構造の例の構成につながるということが期待できる。このような事情から、当初の予定にはなかったものの、可微分写像を調べることにより4次元多様体を理解する、という目標には着実に近づいているということができる。本年度は以下に述べるように、昨年度の結果やそれを得る際の手法をもとに、昨年度扱わなかったシンプレクティック多様体やレフシェッツペンシルを調べたが、残念ながら研究を大きく進展させるには至らなかった。昨年度行った4次元トーラス上の正則なレフシェッツペンシルの分類では、同じ種数と可約度を持つ2つのレフシェッツペンシルは連続変形で移りあうということを示し、その結果分類することができた。

この手法を正則とは限らないレフシェッツペンシルにも適用するため、本年度はまずDonaldsonによるレフシェッツペンシルの構成方法を調べ、直線束の切断の対がレフシェッツペンシルを与えるための、切断のノルムやシンプレクティック多様体に適合する概複素構造から定まるリーマン計量の(曲率などの)不変量に関する十分条件を得た。この条件を用いて昨年度の手法と同様、複素射影平面などのシンプレクティック構造の様子のよくわかっている多様体上の、正則とは限らない2つのレフシェッツペンシルが(種数などに関する適当な仮定のもと)連続変形で移りあう、ということを示そうとしたが、たとえシンプレクティック構造の様子がよくわかっていても、適合する概複素構造が非常に多く存在し、その結果対応するリーマン計量が複雑になり得るため、求める結果を得るには至らなかった。昨年度は代数多様体の分岐被覆を介して構成された、4次元トーラス上のレフシェッツペンシルのモノドロミーを決定した。本年度は同様の手法を用いて、3次元複素射影空間内の、2次式で定義される代数曲面上のレフシェッツペンシルのモノドロミーの決定を試みた。これができれば6次元シンプレクティック多様体の組み合わせ的表示の例を構成する手がかりとなるが、昨年度調べた代数多様体より、定義多項式が複雑になっているため、昨年度の手法をそのまま適用することはできない、ということが判明した。本年度は昨年度の結果をもとに、正則ではないレフシェッツペンシルの分類を行うとともに、昨年度扱えなかった正則なレフシェッツペンシルのモノドロミーを決定する予定であったが、研究実績の概要でも述べた通り目的の達成には至っていない。とはいえ(正則とは限らない)直線束の切断が、レフシェッツペンシルを与えるための十分条件の決定などの、目的を達成するための準備を進めることはできた。さらに当該年度に行った研究により、今後の研究の方向性を確定することができた。以上の理由から「やや遅れている」とした。本研究は4次元多様体上の安定写像を介して、4次元多様体の全体像を明らかにしようとするものであった。本年度は近年Gay-Kirbyにより導入されたtrisectionを、安定写像の観点から研究し、その結果安定写像のモノドロミーとtrisectionの図式との関係を明らかにすることができた。4次元多様体のtrisectionとは、4次元多様体の3つの4次元ハンドル体による分解で、それぞれのハンドル体の境界にHeegaard分解が現れるものである。4次元多様体のtrisectionから3つのHeegaard図式が得られるが(これをtrisectionの図式という)、この図式からtrisection(の分解を保つ微分同相類)が一意に定まるということが知られている。一方でtrisectionは元来不定値の特異点のみを持つ安定写像の研究の過程で現れた概念であり、安定写像の理論と密接に関わっている。特別なtrisectionとして、Baykur-Saekiは昨年単純なtrisectionを導入し、その具体例もいくつか構成した。単純なtrisectionは対応する安定写像の性質を以て特徴づけられていたが、図式による特徴づけはできていなかった。そこで本研究では写像類群の理論を援用し、trisectionの図式が単純なtrisectionに対応するための必要十分条件を与え、系としていくつかの既存の例が単純になることを示した。
ナノフラクトグラフィ技術の確立と破壊強度研究への応用

走査プローブ顕微鏡としてSTM,コンタクトモードAFM,タッピングモードAFMを用いた,ナノフラクトグラフィ技術の開発とその標準化をはかるためのラウンドロビン試験を実施した。試験にあたってはマイクロシ-ニングにより作成したSPM標準試料,CDサンプル試料を各研究機関に配付して,各研究機関において,SPM観察を行った。これにより,各研究機関間における深さ精度などの測定結果の差異,水平距離測定精度,SPM像に及ぼす超高真空中と大気中の観察環境の影響や探針先端の形状の影響,SPM観察を行う前後の探針の損傷,および各SPMモード間の差異とそれらの特徴について考察を加えた。また,ナノメータオーダの3次元形状測定におよぼす製造メーカーの依存性について検討を加えた。さらに,AFM・STMを破壊強度研究に用いた例として,腐食ピット,粒界腐食,応力腐食割れ損傷のその場観察について検討を加えるとともに,種々の金属材料の疲労損傷過程にSPMを用いて,き裂発生,進展過程のナノメータオーダの機構について考察を加えた。また,AFMをナノメータオーダの微小硬さ計として応用するための基礎研究を行い,本手法を用いてナノメータオーダの微小領域の機械的特性が十分な精度により測定できることを示すとともに,SPM像に大きな影響を与えるSPM探針の先端形状をナノメータオーダの精度で測定する手法を開発し,その有用性について考察を加えた。本年度は、AFM観察における探針先端形状の重要性について検討を加え,AFM探針先端形状とAFM像の関係について考察を加えるとともに,電子ビーム堆積(EBD)を利用したAFM探針を作成して,その有用性について検討した。さらに,AFM・STMを破壊強度研究に用いた例として,STMを用いたAuやCuなどの繰り返し変動荷重下における表面損傷の微視観察,水素吸蔵合金の表面の微視的変化の観察,腐食環境中の腐食生成物のナノメータオーダの成長過程観察,オーステナイト系ステンレス鋼の粒界腐食・応力腐食割れき裂進展のその場観察を行った。その結果,粒界腐食はナノメータオーダの腐食ピットが粒界に沿って発生・成長し,それらの腐食ピットがお互いに連結して綿状の粒界腐食に進展すること,また,応力腐食割れき裂は,巨視的にモードIの負荷下においても微視的に見るとモードI,II,IIIの混合モードでき裂が進展すること,応力腐食割れき裂はミクロンメータオーダでは停留することなく連続的に進展すること,環境を真空環境に変更すると,き裂先端が鈍化してき裂が停留するが,再び環境をSCCを生じる大気環境に変更することにより,鈍化してき裂先端より再び鋭いき裂が発生・進展することを明らかにした。さらに,高強度・高弾性繊維の環境劣化繊維の表面をナノメータオーダで詳細に観察することにより,セラミックス系繊維においてはSCGに起因する表面損傷を,また,有機系高強度繊維であるアラミド繊維では,吸収,真空環境放置,電子線照射,さらに紫外線照射により繊維表面にナノメータオーダの「ふくれ」状損傷傷や「溝」状損傷が生じることを明らかにし,これらの微小損傷により繊維スプリッティングが促進されて,繊維引張強度が低下することを明らかにした。さらに,AFMを用いた,超微小硬さ計を開発するとともに,その微小硬さ計の応用について考察を加えた。試験にあたってはマイクロマシ-ニングにより作成したSPM標準試料,CDサンプル試料を各研究機関に配付して,各研究機関において,SPM観察を行った。

さらに,AFM・STMを破壊強度研究に用いた例として,腐食ピット,粒界腐食,応力腐食割れ損傷のその場観察について検討を加えるとともに,種々の金属材料の疲労損傷過程にSPMを用いて,き裂発生,進展過程のナノメータオーダの機構について考察を加えた。また,AFMをナノメータオーダの微小硬さ計として応用するための基礎研究を行い,本手法を用いてナノメータオーダの微小領域の機械的特性が十分な精度により測定できることを示すとともに,SPM像に大きな影響を与えるSPM探針の先端形状をナノメータオーダの精度で測定する手法を開発し,その有用性について考察を加えた。
アミノ酸シグナル調節による運動器疾患の発症制御

私たちのこれまでの研究により、破骨細胞特異的に中性アミノ酸トランスポーターLAT1を欠損させた遺伝子改変マウス(ノックアウトマウス)の脊椎と大腿骨では、組織中の海綿骨量が減少することが明らかになっていた。この理由として、トランスポーターの欠損が細胞内へのアミノ酸の取り込み不足に繋がり、細胞内のアミノ酸によって活性化されるセリン・スレオニンキナーゼmechanistic target of rapamycin Complex 1 (mTORC1)の活性化が起きていないことが考えられた。そこで、破骨細胞特異的にmTORC1の機能を抑制する因子HamartinとLAT1を共に欠損させたマウス(レスキューマウス)を作製したところ、脊椎と大腿骨の海綿骨量は野生型マウスと同程度の値を示し、ノックアウトマウスと比較して有意に高い値を示した。以上が平成29年度までの実験により明らかとなっていた内容であり、平成30年度は海綿骨量が減少した原因を詳細に調べることにした。骨組織では破骨細胞が組織中の古くなった基質を分解し、骨芽細胞が新しい基質を作るサイクルが働いている。これらの細胞の機能に異常が生じると骨量の減少や増加が起きることになる。そこで、私たちは組織中の破骨細胞や骨芽細胞の活性を評価することを目的として、骨形態計測を行った。その結果、ノックアウトマウスの脊椎では、野生型マウスに比べて破骨細胞の活性化が認められたが、骨芽細胞の測定値に有意な変化は認められなかった。また、レスキューマウスではノックアウトマウスと比較して破骨細胞の活性が有意に低下しており、野生型マウスと同程度の値を示すことが明らかとなった。以上の結果から、破骨細胞の中性アミノ酸トランスポーターLAT1はmTORC1を介して破骨細胞の活性化を調節している可能性が示唆された。1.当初の計画通り、別のアミノ酸シグナル関連因子として破骨細胞特異的にmTOR Complex 1の構成タンパクであるRaptorを欠損させたマウスを作製したところ、3週齢付近で死亡することが明らかとなり、予定されていた週齢での解析ができなかった。2.当初のもう一つの計画である「骨代謝性疾患モデル動物の骨組織で発現・修飾変動するアミノ酸シグナル分子の同定」に取り掛かれていない。以上の理由から、遅れていると考えている。当初の予定通り進めるが、破骨細胞特異的Raptorノックアウトマウスに関してはCreERT2などのシステムを使用し、時期特異的な欠損を引き起こして解析する必要があると考えている。昨年度は骨組織におけるアミノ酸シグナルの生理学的意義をin vivoで調べることを研究計画の大きな目標とした。そこで、骨組織の代謝調節機構に重要な細胞である破骨細胞において、アミノ酸トランスポーターを欠損させたマウスを作製し、その大腿骨および脊椎の組織構造解析を行った。その結果、1213週齢の場合、野生型マウスに比べて明らかな海綿骨量の減少が観察され、定量化を行ったところ、有意な骨量の低下が認められた。細胞内のアミノ酸シグナルにはセリン・スレオニンキナーゼであるmTOR Complex 1(mTORC1)が関与していると考えられているため、我々は破骨細胞においてmTORC1の機能が低下したことが原因となって今回の表現型が得られたと考えた。そこで、mTORC1のサプレッサーの機能を抑制したマウス(レスキューマウス)を作製し、そのマウスでは骨量の減少が回復することを確かめることにした。レスキューマウスの大腿骨および脊椎を同様の方法で解析したところ、著明な海綿骨量の回復が観察され、定量化を行ったところ、有意な骨量の上昇が認められた。これまでにアミノ酸シグナルと骨代謝性疾患との関連性についてはあまり報告がない。しかし、この研究結果は破骨細胞のアミノ酸シグナル入力の異常が骨代謝性疾患を誘導する可能性を示唆している。この研究を継続することで、骨代謝性疾患に対する新規治療法開発につながる成果の獲得が期待できる。1.当初の計画では、他のアミノ酸シグナル関連因子の機能を骨組織特異的に欠損させたマウスを用いて、その骨表現型を解析する予定もあったが、現在は破骨細胞特異的にアミノ酸トランスポーターの機能を抑制したマウスの解析しか終了していない。以上の理由から、元々2年目も1年目の内容を継続する予定ではあったが、少し遅れていると考えている。

これらの細胞の機能に異常が生じると骨量の減少や増加が起きることになる。そこで、私たちは組織中の破骨細胞や骨芽細胞の活性を評価することを目的として、骨形態計測を行った。その結果、ノックアウトマウスの脊椎では、野生型マウスに比べて破骨細胞の活性化が認められたが、骨芽細胞の測定値に有意な変化は認められなかった。また、レスキューマウスではノックアウトマウスと比較して破骨細胞の活性が有意に低下しており、野生型マウスと同程度の値を示すことが明らかとなった。以上の結果から、破骨細胞の中性アミノ酸トランスポーターLAT1はmTORC1を介して破骨細胞の活性化を調節している可能性が示唆された。1.当初の計画通り、別のアミノ酸シグナル関連因子として破骨細胞特異的にmTOR Complex 1の構成タンパクであるRaptorを欠損させたマウスを作製したところ、3週齢付近で死亡することが明らかとなり、予定されていた週齢での解析ができなかった。2.当初のもう一つの計画である「骨代謝性疾患モデル動物の骨組織で発現・修飾変動するアミノ酸シグナル分子の同定」に取り掛かれていない。以上の理由から、遅れていると考えている。研究のペースを速める必要があるが、内容については交付申請書に記した通りに進める。当初の予定通り進めるが、破骨細胞特異的Raptorノックアウトマウスに関してはCreERT2などのシステムを使用し、時期特異的な欠損を引き起こして解析する必要があると考えている。
戦後日本における学校という制度の自明性の成立と変容-2定点における縦断的ライフヒストリー分析を通して

本研究では、近代日本において学校という制度が人々の生活世界の中で「制度化」されたのが高度経済成長期であり、また、ポスト高度経済成長期においてその制度の自明性は変容していくのではないかという仮説を設定し、この仮説の検証を通じて、今日の学校における制度の機能不全状況を歴史的過程のもとに捉える実証的素材を得ようと試みた。研究にあたっては、東京都荒川区日暮里地域及び長野県北佐久郡望月地域という大都市地域と中山間地域のそれぞれに調査地点を設け、高度経済成長期以前(第1期)、高度経済成長期(第2期)、高度経済成長期以降(第3期)という3つの時期区分にひとまずよりながら、それぞれの時期に学校を経過した人たちからの聞き取りを通じ、学校という制度の再構成を試みることとした。望月地域についてはここまで、当地の学校と地域に関わる歴史概要を把握するための聞き取り・資料収集に取り組んできた。日暮里地域については、教師・父母・生徒からの聞き取りを実施してきた。当面の作業課題としてきたのは、「なぜどのようにして、高度経済成長期に人々の中で学校が制度化するのか」を明らかにすることであったが、特に日暮里地域における作業から浮かび上がってきたのは以下のような点である。第一に、学校はそれが拠ってたつ地域社会と結びついたのではなくむしろそこの秩序・文化と一線を画した場であることによって、人々の中で意味をもったこと。第二に、子どもだけでなく時には親にとっても教師は「先生」であり学校は「学ぶ場」であり、学校が一個の共同体たりえたこと。第三に、学校という制度の社会的機能について無前提の信頼感があったこと。今後は、これらの諸点の関係を探ることでその全体構造を明らかにすることが課題である。本研究では、人間形成における「中間集団」の果たす機能に着目している。およそ人間形成の正否は、「中間集団」の機能如何に大きく条件付けられると考えられる。近代日本においてこれがどのように変化してきたかに私の関心があるが、本研究ではその関心へのアプローチの一環として、特に「制度としての学校」が、戦後日本社会において人間形成における「中間集団」として、どのように機能しまた機能変容してきたのかを明らかにしようとしている。その際の仮設としてもっているのは、戦後の中でも高度経済成長期の期間、学校は「中間集団」としてもっとも良好に機能しうる条件を有し、その条件が1970年代半ば以降に変化していったのではないかということである。その条件とは何であったのか、まだどのようにしてその条件が形成され、また変化していったのかを、本研究では二つの地域の二つの学校に即して明らかにしようとしている。検証に際しては、それぞれの時期に当該学校で過ごした学習者が、自らのライフヒストリーをどのように物語り、その中で学校体験がどのように意味づけられているのかを、インタビュー調査を通してたどりデータを蓄積することを考えている。対象は、一つは東京の日暮里地域の中学校、もう一つは長野佐久地域の高校である。前者は、読売教育賞を受賞するほどの学校づくり実践を70年代の後半に展開している。後者は、長期間にわたる地域づくり実践の蓄積のある地で、その地域に唯一の高校であるが、現在統廃合の危機に立たされつつある。なにゆえ70年代後半にそうした実践の結節点をみたのか、また何ゆえ現在統廃合の危機に立たされるのか、そうした点を切り口として作業を進めている途上である。
腫瘍血管の病理学的特殊性-樹脂鋳型走査型電子顕微鏡法による三次元的観察-

これまでに、ラット繊維肉腫、ラット繊維腺腫、ラット乳頭状腺腫、イヌ扁平上皮癌イヌ可移植性性器肉腫、チャイニーズハムスター肝細胞癌、イヌ肝臓癌、イヌメラノーマのそれぞれの血管系について観察してきた。それぞれの腫瘍に共通する特徴として、1)腫瘍血管には血流調節装置であるintra-arterial cushionが存在しない、2)腫瘍に分布する動脈では、血管中膜を構成する平滑筋細胞に退行性変化が見られる等を確認した。2005年度の研究では研究範囲をさらに広め、観察の目的を、ラット乳癌およびイヌメラノーマの血管構築を明らかにすることとした、観察の主眼を腫瘍組織内での血管新生過程と血管系の退行過程(中心壊死の形成過程)とした。研究方法は以下のとおりである。1)7,12dimethylbenzanthraceneをラットに投与し乳癌を得る、臨床獣医師の協力のもとで自然発生の口腔メラノーマ(イヌ)を得る。2)乳癌およびメラノーマの血管系の樹脂鋳型標本を作成し、3>得られた標本を走査型電子顕微鏡で観察する。観察結果は以下のとおりである。乳癌もメラノーマも血管新生の過程は共通で、1)既存の血管に新しい細い血管が刺状に発達(buddingの形成)する。2)隣接する同様の血管から同様のbuddingが進展する、3)buddingが次第に進展し先端付近で互いに連結し、一つのhair-pinを形成する、4)それぞれのhair-pinが互いに連結し複雑な血管網を形成する。また、血管系の退行は以下の過程を経ることが解明された。1)腫瘍動脈の平滑筋細胞に変性(形質溶解、空胞化)が起きる.2)動脈壁が薄くなり血管腔が拡張し静脈化する.3)腫瘍中心部では血管腔の狭窄、扁平化、断裂が起き、本来の血管構築が消失する,今回の研究により、腫瘍血管の新生過程および退行過程(中心壊死の形成過程)を三次元的に詳細に示して、腫瘍血管の特性を明らかにすることができた。さらに、メラノーマでは、旺盛な血管新生の状況およびメラノーマの血管構築を詳細にかつ立体的に示すことができた。周辺リンパ節に転移したメラノーマの血管系についても同様に観察し、原発巣とほぼ同様の所見を得た。これまで、申請者(二宮)はラット繊維肉腫、ラット繊維腺腫、ラット乳頭状腺腫、イヌ扁平上皮癌イヌ可移植性性器肉腫、チャイニーズハムスター肝細胞癌、イヌ肝臓癌のそれぞれの血管系について観察し報告してきた。それぞれの腫瘍の共通点として、(1)腫瘍血管には血流調節装置であるintra-arterial cushionが存在しない、(2)腫瘍に分布する動脈では、血管中膜を構成する平滑筋繊維に退行性変化がみられ、自動血流調節機能が欠如している、等を確認した。今年度はさらに観察を進め、腫瘍血管の新生と増殖過程および腫瘍中心部における腫瘍血管の崩壊過程(中心壊死)について観察することとした。材料に発癌剤投与によるラット乳癌およびシリアンハムスター頬袋への移植癌を用いた。研究方法:ラットでは7,12dimethyl-bennzanthraceneを経口投与し乳癌を得た。

シリアンハムスターでは頬袋にウシ由来顆粒膜細胞腫の培養細胞1000-1500万個を頬袋に注射し腫瘍を得た。得られた腫瘍を組織学的に観察し、さらに、血管鋳型標本を作製し、走査型電子顕微鏡で観察した。観察結果:ラット乳癌およびシリアンハムスター顆粒膜細胞腫いずれも血管新生は次の過程を経ることが解明された。(1)既存の血管に微細な棘状血管が形成(budding)され、(2)これが進展し隣接する血管から同様にbuddingがおき、(3)このbuddingが互いに連結し一つのhairpinを形成する、(4)このhairpinから引き続きbuddingが形成され次第に複雑な毛細血管網が形成され腫瘍が栄養される。腫瘍血管の退行変性は、以下の過程を経ることが解明された。(1)腫瘍を支配する腫瘍動脈壁の平滑筋細胞に変性(形質溶解、空胞化)が起きる、(2)動脈壁が薄くなり血管腔が拡張し洞様(sinusoid)化する、(3)腫瘍中心部では洞様化した血管が周囲の腫瘍組織に圧迫され狭窄、扁平化、断裂が起き、既存の血管網が消失する。こうした血管の変化により中心壊死が起こることが推察された。これまで、申請者(二宮)はラット繊維肉腫、ラット繊維腺腫、ラット乳頭状腺腫、イヌ扁平上皮癌イヌ可移植性性器肉腫、チャイニーズハムスター肝細胞癌、イヌ肝臓癌のそれぞれの血管系について観察し報告してきた。それぞれの腫瘍の共通点として、(1)腫瘍血管には血流調節装置であるintra-arterial cushionが存在しない、(2)腫瘍に分布する動脈では、血管中膜を構成する平滑筋繊維に退行性変化がみられ、自動血流調節機能が欠如している、等を確認した。今年度はさらに観察を進め、腫瘍血管の新生と増殖過程および腫瘍中心部における腫瘍血管の崩壊過程(中心壊死)について観察することとした。材料に発癌剤投与によるラット乳癌およびシリアンハムスター頬袋への移植癌を用いた。研究方法:ラットでは7,12dimethyl-bennzanthraceneを経口投与し乳癌を得た。(1)腫瘍を支配する腫瘍動脈壁の平滑筋細胞に変性(形質溶解、空胞化)が起こる、(2)動脈壁が薄くなり血管腔が拡張し、洞様(sinusoid)化する、(3)腫瘍中心部では洞様化した血管が周囲の腫瘍組織に圧迫され狭窄、扁平化、断裂が起き、既存の血管網が消失する。
学生の在宅看護実践力向上を目指したシミュレーション教育教材の開発

本研究の目的は、看護基礎教育において在宅看護実践力を育成するために、新卒訪問看護師に求められる能力を知り、在宅看護における卒業時の到達目標を再構築し、目標を達成するためのシミュレーション教育教材の開発を行うことである。平成27年29年度は、訪問看護ステーション管理者に対して、新卒看護師に求める在宅看護実践力(11領域73項目)について調査し、管理者の半数以上が全項目において到達を望んでいること、高度医療の知識や技術が実施できることよりも、「看護職としての基本姿勢と態度」や「状態の変化に気づき、適切に報告・連絡・相談ができる」ことを望んでいることが明らかになった。また、新卒看護師が「自己の課題を認識し自律的に学習ができる」ことを望んでいた。新卒訪問看護師へのインタビュー調査では、看護基礎教育で学ぶべき内容として【実体験と自律的学習活動】等が述べられた。当研究者は、平成27年より看護学部最終学年である4年次の看護統合科目の実習で在宅看護を選択した学生に対して、自律学習を支援する「訪問看護実習支援プログラム」(シミュレーション教材学習を含む)を活用した教育活動を実践している。平成30年度は、現行のプログラム評価を行い、その結果を受け、先の調査結果を含めて、プログラムの精錬と卒業時の到達目標の再構築することとした。評価は、平成30年10月に本実習の単位を取得した学生23名に対して、2回のグループインタビューを実施した。結果、学生にとっての自律性が【認知】、【判断】、【実践】の看護実践において、【準備】、【気づき】、【言語化】、【調整】等の自主的・主体的行動が明らかになった。また、【課題】も明確になり、現在、プログラムの精錬中である。今後、卒業時の到達目標を再構築し、在宅看護実践力が看護基礎教育で強化できるようシミュレーション教育教材を教科目に広げ開発していく必要がある。本研究の目的は、訪問看護師の人材育成と資質の向上を目指して、看護基礎教育において在宅看護実践力を養成するために、新卒訪問看護師に求められる能力から在宅看護における卒業時の到達目標を再構築し、目標を達成するためのシミュレーション教育教材の開発を行うものである。その開発過程は、まず新卒の訪問看護師やその支援者(訪問看護師)の在宅看護実践の現状を明らかにし、看護基礎教育における卒業時の到達目標を明らかにする。そして、学習目標を設定し、その教材開発と授業の実施、評価をする。教材とは、ストーリー型のシナリオや具体的な教育技法、人材と機器の準備等を示す。以上の結果を受けて、教育学や看護学などの先駆的研究者および実践者の意見を得て、教材・教育技法を検証し再考する。平成27年度は、在宅看護実践力の現状と卒業時の到達目標に関する分析(Analysis)を行うために以下の準備を行った。(1)看護基礎教育における看護実践力に関する文献や訪問看護師の看護実践力に関する文献、先駆的に新卒看護師を育成・教育している訪問看護ステーションに関する資料、学会発表などから在宅看護実践力に関する知識・技術を11領域、73項目を抽出し、無記名自記式調査票を作成した(一次調査)。(2)新卒訪問看護師を採用している事業所に二次調査(新卒訪問看護師6名に、卒業時に到達しておきたい知識や技術について、インタビュー調査)を行うためのインタビューガイドを作成した。(3)本研究計画について、所属研究機関での倫理審査委員会での承認(受付番号2015-1-41)を受けた。今後、質問紙調査・インタビュー調査を実施し分析していく予定である。平成27年度の研究実施計画では、平成28年3月までに「訪問看護師に求められる新卒看護師の在宅看護実践力に関する調査」を質問紙調査及びインタビュー調査を行い、分析する予定であったが、看護基礎教育における看護実践力に関する文献や訪問看護師の看護実践力に関する文献から、在宅看護実践力に関する知識・技術を抽出する過程で多くの時間を要した。しかし、時間をかけて検討した結果、11領域73項目の在宅看護実践力に関する知識・技術を抽出するに至った。本研究の目的は、新卒訪問看護師に求められる能力から看護基礎教育での卒業時の到達目標を構築し、目標達成するためのシミュレーション教育教材の開発を行うものである。平成27年度は、文献から在宅看護実践力に関する知識・技術を11領域73項目抽出し、質問紙調査票の作成(一次調査)と就業中の新卒訪問看護師(卒後3年以内)に対して、在宅看護実践の場で求められる能力についてのインタビューガイドを作成(二次調査)、研究機関の倫理審査委員会での承認を得た。平成28年度は、一次・二次調査を実施し、以下のような結果を得た。1.一次調査:平成28年5月から6月、A県内498ヶ所の訪問看護ステーションの管理者に対して、新卒看護師に求める在宅看護実践力(「とてもそう思う、まあそう思う、あまりそう思わない、全く思わない」の選択肢)や新卒看護師採用の関心等について調査した。結果、有効回答数168件(回収率33.7%)について分析した。就業中の新卒訪問看護師は、9件(5.4%)で、採用を積極的に考えている訪問看護ステーションは14件(8.3%)、状況によっては考えたい44件(26.2%)を含めると3割が関心を寄せていた。

在宅看護実践力の選択肢を点数化した平均値の比較では、コミュニケーション(3.87±0.37)や利用者を尊重した対応(3.85±0.39)など看護職としての基本姿勢に関する項目が高く、公的負担制度の理解(2.68±0.72)や地域特性の診断(2.75±0.67)、地域の社会資源(2.84±0.67)という制度や地域看護に関する項目が低かった。2.二次調査:平成28年12月から平成29年3月、現在就業中の新卒訪問看護師5名にインタビュー調査を実施し、その結果、清拭や入浴介助等の日常生活援ケア、採血や点滴等の医療的ケア、異常に気付くことができるようなアセスメント力等の内容が語られた。平成28年度の研究実施計画では、「訪問看護師に求められる新卒看護師の在宅看護実践力に関する調査」を終えて、看護基礎教育における卒業時の在宅看護実践力の到達目標を構築し、関連科目の学習目標や教育内容、教育技法を検討する予定であった。しかし、「訪問看護師に求められる新卒看護師の在宅看護実践力に関する調査」の一次調査である質問紙調査票の回収率が低くかったために、回収締切日を延長し、調査協力の再依頼葉書の送付を行うなど回収率を高めるための攻略を行った。また、「訪問看護師に求められる新卒看護師の在宅看護実践力に関する調査」での二次調査である新卒訪問看護師へのインタビュー調査において、就業中である調査協力者とのインタビュー日程調整に時間を要した。以上の結果から、データ収集に時間を要し、調査結果を分析し、基礎看護教育における卒業時の在宅看護実践力の到達目標を構築するまでには至っていない。しかし、分析を行うにあたって十分なデータを収集することができた。本研究は、新卒訪問看護師に求められる能力にもとづき看護基礎教育における卒業時の到達目標を構築し、目標達成するためのシミュレーション教育の教材開発を行うことを目的とする。平成27年28年度は、文献から在宅看護実践力に関する知識・技術(11領域73項目)を抽出し、A県内498ヶ所(有効回答数168件、回収率33.7%)の訪問看護ステーション管理者に対して、新卒看護師に求める在宅看護実践力や新卒看護師採用意向等について調査した(一次調査)。また、新卒訪問看護師5名に看護基礎教育の卒業時に到達しておきたい在宅看護実践力に関するインタビュー調査を実施した(二次調査)。平成29年度は、一次・二次調査の結果を分析し、看護基礎教育における在宅看護実践力の卒業時到達目標について検討した。1.一次調査:新卒訪問看護師を採用すると仮定し、卒業時に希望する到達度は「コミュニケーションの基本的要素を意識して利用者の話が聞ける」等の看護職としての基本姿勢と態度に関する内容と「日々の看護実践において、常に報告・連絡・相談ができる」等の組織での役割に属する内容に加えて、看護実践では「状態の変化に対処することを理解し、症状の変化について迅速に報告できる」ことであった。卒業時に管理者が新卒看護師に望む到達度と管理者の採用意向の有無との関係では、アセスメントとケアの理解に関する項目内8割において、採用意向なしの管理者が有意に高い実践力を求める傾向にあった。採用意向のある管理者が求めた項目で、唯一有意な差が見られたのは、「主体的学習ができる」であった。2.二次調査:新卒訪問看護師による看護基礎教育での在宅看護実践力の到達目標は、【在宅看護の基礎と基本姿勢】であり、在宅看護実践力を身に付けるためには【実体験と自律的学習活動】であることが抽出できた。
X線結晶構造解析による、脱アミノ化酵素の作用機構及び基質認識機能の解明

APOBEC3Gと相互作用するタンパク質との複合体の調製を中心に行った。大量調製に成功しているHIV-1 Vifと、それと相互作用するユビキチンリガーゼの構成要素であるタンパク質であるヒトElongin B、Cとの複合体は、溶解度が低いという問題点があるため、さらに別のユビキチンリガーゼ構成要素を加えて、複合体の性質を改良することを考え、ユビキチンリガーゼ構成要素の中で最大サブユニットのヒトCullin 5(Cul5)に関して、大腸菌を用いた調製法を検討した。ヒトCul5は780アミノ酸からなる。タグの異なる種々のベクターにヒトCul5全長を組み込んで、大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させた。培養温度を振った幾つかの条件全てで、SDS-PAGEの泳動結果不溶性画分にはCul5と推定される位置に、発現誘導した菌ではしていない菌と比較して明らかなバンドが見られたが、可溶性画分では優位な差は見られなかった。既に構造が決定されているヒトCul2の構造を元にCul5のモデル構造を作成し、Vifが相互作用することが知られている前半部分の断片を調製した。Cul5の前半部分のN端にGSTタグを付加し、融合タンパク質として大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させ、大量調製した。可溶性画分にサンプルが得られた。グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質を精製しプロテアーゼを用いてN端のGSTタグを切り離した。タグを切断した後も可溶性を保っていたため、他のタンパク質との複合体を形成させるための条件検討を行った。精製できた複合体に関して市販のスクリーニング試薬を用いて、ハンギングドロップ法を用いた結晶化を行ったが、これまでに結晶は得られていない。ヒトAPOBEC3G及びAPOBEC3Fタンパク質に関して発現条件の検討を行った。大腸菌を用いてGST融合タンパク質を発現させ生化学的に活性を検出した先行研究と同様に行なったところ、大量に発現したが可溶化率が非常に低く、収量が少なかった。収量を上げる試みの結果、古細菌Methanocaldococcusjannaschii由来のペプチヂルプロリル異性化酵素(PPI)をN末端に持つ融合タンパク質が良く可溶化した。プロテアーゼを用いてPPI部分を切り離し、精製を行なったが、結晶化に適した純度の精製標品は得られなかった。今年度に報告された生化学活性測定の論文によると(Journal of Virology, 80, 5992-6002, 2006)、昆虫細胞で調製したAPOBEC3Gの性質は生体内の現象を説明できるが、大腸菌で調製したAPOBEC3Gは生体内とずれた性質を示す。そのため、昆虫細胞を用いて発現させるために必要な発現系を作成した。平行してAPOBEC3Gタンパク質と相互作用するHIV-1 Vifタンパク質を、大腸菌を用いて大量調製する系の確立を行った。精製の便宜を図り、HIV-1 VifのN末端にヒスチジンタグ、あるいはGSTタグを融合させるベクターを作成し、それぞれ培地の種類、温度などを検討したが、可溶性画分HIV-1 Vifタンパク質は得られなかった。C末端が凝集を起こし沈殿している可能性を考えて数残基ずつ順番に削った発現系を8種類作成するなど、条件の改良を続けたところ、温度は20度、IPTG濃度は1mMで、発現誘導を20時間かけることで、十分な量のタンパク質を可溶性画分に得ることができた。条件検討の結果、SDS-PAGEで見て95%以上の純度に精製した。結晶化条件検討の結果、針状結晶を得ることができたが、X線回折には適していない。ヒトAPOBEC3G及びAPOBEC3Fタンパク質に関して、可溶性が高く、性質の良いコンストラクトを作成するべく条件検討を続けていた。具体的には安定構造をとらないと考えられるループ領域を予測し、アミノ酸置換を行なっていた。しかしながら脱アミノ化酵素のX線結晶構造解析は競争が激しく、米ミネソタ大のグループ(Matsuo Hiroshiら)により、APOBEC3Gの活性ドメインが解かれてしまった(Nature.2008 Mar 6;452(7183):116-9)。なお変異体探索による溶解度の高いAPOBEC3Gの作成、機能解析実験、構造解析に関して、このグループが先行していることは以前の報告からも明らかであった。(FEBS Lett.2007 0ct2;581(24):4761-6. Epub 2007Sep 7)そのため今年度の途中から、APOBEC3G単体に関する条件検討をやめて、相互作用するタンパク質との複合体の調製を中心に行った。前年度に大量調製に成功しているHlV-1 Vifと、それと相互作用するユビキチンリガーゼの構成要素であるタンパク質との複合体の結晶化条件を改善するために、リジンやグルタミン酸といった長い側鎖を持ち結晶化に良くない残基を、セリンやアラニンに置換したコンストラクトを複数作成した。しかし大腸菌内で沈殿したり、精製の途中で沈殿したり、野生型が吸着するカラムに結合せず精製できないなど、調製過程でさまざまな困難があった。精製できた一部のものに関して結晶化を試みたが、結晶は得られていない。

そのほかに修士時代に行なっていたtRNAの56位のシチジン残基をメチル化する酵素であるaTrm56のx線結晶構造の研究結果、およびイソロイシンtRNAの34位にリシジンを導入する酵素Tilsとその基質であるATP、リジンとの複合体のX線結晶構造について、それぞれ投稿論文としてまとめた。APOBEC3Gと相互作用するタンパク質との複合体の調製を中心に行った。大量調製に成功しているHIV-1 Vifと、それと相互作用するユビキチンリガーゼの構成要素であるタンパク質であるヒトElongin B、Cとの複合体は、溶解度が低いという問題点があるため、さらに別のユビキチンリガーゼ構成要素を加えて、複合体の性質を改良することを考え、ユビキチンリガーゼ構成要素の中で最大サブユニットのヒトCullin 5(Cul5)に関して、大腸菌を用いた調製法を検討した。ヒトCul5は780アミノ酸からなる。タグの異なる種々のベクターにヒトCul5全長を組み込んで、大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させた。培養温度を振った幾つかの条件全てで、SDS-PAGEの泳動結果不溶性画分にはCul5と推定される位置に、発現誘導した菌ではしていない菌と比較して明らかなバンドが見られたが、可溶性画分では優位な差は見られなかった。既に構造が決定されているヒトCul2の構造を元にCul5のモデル構造を作成し、Vifが相互作用することが知られている前半部分の断片を調製した。Cul5の前半部分のN端にGSTタグを付加し、融合タンパク質として大腸菌を用いて組み替えタンパク質として発現させ、大量調製した。可溶性画分にサンプルが得られた。グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質を精製しプロテアーゼを用いてN端のGSTタグを切り離した。タグを切断した後も可溶性を保っていたため、他のタンパク質との複合体を形成させるための条件検討を行った。精製できた複合体に関して市販のスクリーニング試薬を用いて、ハンギングドロップ法を用いた結晶化を行ったが、これまでに結晶は得られていない。
眼血液関門(BRB)構成機構としての細胞膜的特異性に関する研究

血液眼関門の一つに血液網膜関門があげられる。この関門の特徴を明らかにするために様々な分子量および荷電状態のペルキオキシダ-ゼをモルモットの血管内に投与し、その脈絡膜および網膜色素上皮における各ペルオキシダ-ゼの経時的透過性について電子顕微鏡で観察した。分子量が小さくともそのペルオキシダ-ゼが陰性荷電を帯びていると分子量が大きく陽性荷電を帯びているものに比べ網膜色素上皮を越えての透過性が悪かった。つまりペルオキシダ-ゼの透過性は脈絡膜毛細管および網膜色素上皮の荷電状態に左右されていると考えられた。この現象を詳細に観察するためクライオ超ミクロト-ムで凍結超薄切片を作成しカチオン化フェリチン(CF)を反応され細胞内外の荷電状態を観察した。CF粒子は色素上皮と脈絡膜網細管の基底膜に沿って観察された。網膜色素上皮細胞の細胞間結合細置ではギャップ結合を除く結合複合体表面にCF粒子が認められた。次にこのCF粒子が結合した陰性荷電が何によるものかを検索するため凍結超薄切片にフェリチン標識したレクチンを反応された。この結果この陰性荷電はシアル酸によるものと考えられた。Essnerらはブルッフ膜は陰性荷電を持っており一種のcharge barrierとして働くと報告している。今回の研究よりブルッフ膜だけでなく色素上皮細胞の基底膜も、主としてシアル酸によると考えられる陰性荷電を持っており、それらが一体となってcharge barrierとして働くと考えられた。同一分子量で、荷電の異なるmicroperoxidaseあるいはhorseraddish peroxidase isoenzymeの静脈内投与によるtracer研究を行い、その脈絡膜および網膜毛細血管における各tracerの経時的透過性および細胞内取込み現象について酵素組織細胞化学的電子顕微鏡観察を行った。その結果、非常に興味のあることに、同一分子径であっても、負に荷電していると明らかに毛細血管を透過する速度が遅延することが判明した。さらにその傾向は例えより小さい物質についても同様であるという結果を得た。そこで、脈絡膜および網膜毛細血管内腔および外腔の細胞膜荷電を観察するため、63年度に購入した凍結超薄切片作製用クライオキットを用いて、急速凍結超薄切片下でcationized ferritinおよびanionized ferritin等charge markerを結合させ、その分布密度の観察を行ったところ、脈絡膜毛細血管の内・外腔は明らかに負の荷電の状態であるが、網膜毛細血管は内・腔で異なることが判明した。以上から、われわれが予想していたように、第三のbarrier機構、すなわち電荷という一定の規則性によって、細胞膜が各種の物質の透過性をある程度コントロールしている可能性があり、それが組織の部位によって異なるのではないかと考えられた。また、今回の細胞膜荷電情況とtracerの持つ電荷による透過性の時間的相違を比較してみることにより、細胞膜の特異性がbarrier機能に大きな影響力を持つことが明らかにされた。1.同一分子量で、荷電の異なるmicroperoxidaseあるいはhorseraddish peroxidase isoenzymeの静脈内投与を行い、その脈絡膜および網膜毛細血管における透過性について、酵素組織細胞化学的電子顕微鏡観察を行った。その結果非常に興味あることに、同一分子径であっても、陰性に荷電していると明らかに毛細血管を透過する速度が遅延することが判明した。さらに各種分子径が異なるtracerを用いた実験から、その傾向はたとえ分子径がより小さい物質についても同様であるという結果を得た。2.そこで脈絡膜および網膜毛細血管内腔および外腔の細胞膜荷電を観察するため、昭和63年どに購入した凍結超薄切片作成用クライオキットを用いて急速超薄切片下でのcationized ferritinおよびanionized ferritins等charge markerを結合させて、その分布密度の観察を行った。網膜毛細血管内皮細胞では、管腔内は陰性に強く荷電する傾向があるが、反管腔側細胞では陽性荷電末端も多く存在することが明らかとなった。

しかし、脈絡膜毛細血管では管腔および反管腔側細胞とも陰性の荷電末端が多く配列していることを突止めた。従って、分子径以外にも細胞の膜荷電等の状況によっても物質の透過性が影響されることは明らかであり、当初われわれが予想していたように、第三のbarrier機構、つまり通しにくいものや通しやすいものが一定の規則性を持って区別され、しかもそれが組織の部位によって異なる可能性があることが明らかにされた。眼血管関門の一つとして網膜色素上皮細胞間のtight junctionがあげられる。このtight junctionを含めたjunctional complexの荷電状態を検索するために急速凍結したラット網膜を用いて凍結超薄切片を作成しカチオン化フェリチンを切片上で反応させ電子顕微鏡で観察した。カチオン化フェリチンの粒子は色素上皮細胞の形質膜表面に認められた。またjunctional complexではgap junctionを除くjunctionに反応が認められた。さらに色素上皮細胞の基底膜側のBruch膜に強い反応が認められた。以上のことは色素上皮細胞はその基底部とjunctionに陰性荷電を持っており、そのため陰性荷電を持った粒子は色素上皮細胞を越えて網膜側には入りにくいという可能性をを示している。次に同様の技法をもちいてレクチンを反応させたところこの色素上皮細胞の陰性荷電は主にシアル酸によるものと推定された。細胞骨格蛋白質であるフォドリンおよびアクチニンの局在を同様の技法を用いて電顕観察するとフォドリンは色素上皮細胞の頂突起と基底部に、アクチニンはadherens junctionに認められた。色素上皮細胞の基底部のフォドリンおよびアクチニンは色素上皮細胞による物質の取り込みに関与すると考えられ、選択的な物質の取り込みをとおして色素上皮細胞の眼血管関門の一助となっていると考えられた。