hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細菌のＡＴＰ分泌機構の解析

細菌のATP分泌機構を解析した。使用した腸球菌属23菌種中、最も大量にATPを分泌するEnterococcus mundtiiを用い、グルコースがATP分泌に必須の成分であること、解糖系がATPの分泌に重要な役割を果たしていることを示した。菌体内ATPを枯渇させた静止菌体にグルコースを添加すると、対数増殖期の菌体は定常期の菌体よりも多くのATPを分泌した。定常期では、ATPを分泌しないとされていた大腸菌や黄色ブドウ球菌などを含む6菌種全てが対数増殖期にATPを分泌していた。以上より、種々の細菌が増殖期依存的にATPを分泌し、細菌間または細菌-宿主間の相互作用を担っていることが示唆された。腸内に存在するATPが、腸管粘膜固有層におけるTヘルパー17(Th17)細胞を誘導することが報告された。無菌マウスはSpecific pathogen free(SPF)マウスと比べ、糞便中のATP量が著しく少なく、腸管粘膜固有層のTh17細胞数も著しく少ない、SPFマウスに抗菌薬を投与し、腸内細菌を排除すると、糞便中のATP量と腸管粘膜固有層のTh17細胞数がともに著減する、無菌マウスに経直腸的にATPを投与すると腸管粘膜固有層のTh17細胞数が著増し、大腸炎が悪化することが判明した。これらの結果から、腸内細菌由来のATPが腸管粘膜固有層におけるTh17細胞の分化を誘導した結果、マウスの大腸炎を悪化させる可能性が示唆された。しかしながら、腸管内のどの細菌がATPを分泌しているかは不明であった。我々は、マウスの腸内細菌叢を解析し、世界に先駆けてATPを分泌する細菌を単離し、腸球菌の一種Enterococcus gallinarumと同定した。これまで細菌のATP分泌に関する報告はほとんどなされていない。そこで、細菌によるATPの分泌機構について解析を行った。E. gallinarum以外の腸球菌属についてATP分泌能にについて検討したところ、新たに7株のATP分泌細菌を発見した。新たに発見された7株のうちEnterococcus mundtiiが大量にATPを分泌していたため、本菌を細菌のATP分泌機構の解析に使用した。合成培地を使用し、ATPの分泌に必要な成分を検討した結果、ATPの分泌にはグルコースが必須成分であることが判明した。また、E. mundtiiを好気的および嫌気的条件で培養した結果、ATPの分泌に差がないことが判明した。このことより、ATPの分泌には解糖系が重要な役割を果たしていることを示した。近年、腸内細菌の分泌するATPが腸管粘膜固有層におけるTh17細胞の分化を誘導し、炎症性腸疾患を悪化させることを示唆する報告がなされた。どの菌種がATPを分泌するかについては不明であったが、最近、我々は、マウス、ヒトの腸内細菌であるEnterococcus gallinarumがATPを分泌することを見出した。本研究は、細菌のATP分泌メカニズムの解析を目指した。まず腸球菌属22菌種についてATP分泌の有無を検討したところ、E. gallinarum以外に7菌種がATPを分泌することを新たに見出した。最も大量にATPを分泌するEnterococcus mundtiiを用い、ATP分泌に影響を与える培地成分を検討した結果、グルコースがATP分泌に必須の成分であることを発見した。嫌気的培養でも好気的培養とほぼ同量のATPを分泌することから、解糖系がATPの分泌に重要な役割を果たしていることが示唆された。ジニトロフェノールで処理し、菌体内ATPが枯渇した静止菌体にグルコースを添加すると、対数増殖期の菌体は定常期の菌体よりも多くのATPを分泌することが判明した。そこで、現在までATPを分泌しないとされていた大腸菌や黄色ブドウ球菌などを含む6菌種の各増殖相におけるATP分泌について検討したところ、6菌種全てが対数増殖期にATPを分泌していることを見出した。以上より、様々な常在菌や黄色ブドウ球菌などの病原菌がグルコース存在下で増殖期依存的にATPを分泌し、それが細菌間または細菌-宿主間の相互作用を担っていることが示唆された。ATP分泌腸球菌のATPの分泌に関わる遺伝子の同定を行うために、腸球菌の遺伝子操作系(トランスポゾンやプラスミドの導入)の確立を試みた。腸球菌は、腸内常在細菌であり、この菌を用いたトランスポゾン導入による変異体の作製などの遺伝学的解析は、全くなされていない。そこで、他のグラム陽性菌(腸球菌、乳酸菌、ブドウ球菌など)で使用されているトランスポゾンやプラスミドを収集し、腸球菌に導入できるか検討し、トランスポゾンTn916の腸球菌導入に成功した。

導入可能なトランスポゾンが得られたので、ATP分泌菌にトランスポゾンを導入し、3800株のトランスポゾン挿入株を得た。トランスポゾン導入株のATP分泌能を検索した結果、1株のATPを分泌しない株を分離した。この株についてゲノム解析を行ったところ、4箇所にトランスポゾンが挿入されている事が分かった。そのうち、1つのORFの中にトランスポゾンが挿入されていた。このORFについてホモロジー検索を行なったところ、未知遺伝子であった。今後、この遺伝子を破壊した株を作成することで、本遺伝子がATP分泌に関与するかどうかを明らかにできるものと考えられる。また、生化学的な解析により、遺伝子の機能を推定できるものと期待される。現在まで、細菌のATP分泌に関わる報告はほとんどなされておらず、細菌によるATPの分泌メカニズムの解析も全くなされていないのが現状であった。我々はマウスの腸内細菌叢の解析により、腸球菌の一種E. gallinarumがATPを分泌することを発見した。また、ヒト由来のE. gallinarumも同様にATPを分泌することを見出した。さらに、E. gallinarum以外の腸球菌属についてATPの分泌能について検討したところ新たに7株のATP分泌細菌を発見した。その中で大量にATPを分泌するE. mundtiiを用い、細菌のATP分泌機構を解析した。合成培地を用い、ビタミン欠損培地、アミノ酸欠損培地、グルコース欠損培地を作成し、ATPの分泌に必要な因子を検討した結果、グルコースがATP分泌に必須の因子であることを見出した。さらに、通常の細菌培養に用いられる培地では、E. mundtiiはATPの分泌をしないが、通常の細菌培養培地にATPを添加すると、E. mundtiiはATPを分泌することを見出した。このことより、グルコースが細菌のATPには必須の因子であることを明らかにした。一般的に、ATPはグルコースなどの糖を基質として解糖系、TCA回路、電子伝達系で合成される。これらのATP合成経路のうちTCA回路と電子伝達系は酸素の影響を受けやすい、そこで、ATP分泌への酸素の影響を確かめるため、E. mundtiiを好気培養ならびに嫌気培養し、ATP分泌量を比較した。好気培養と嫌気培養でATP分泌量に差は認められなかった。この結果から、本菌によるATP分泌には酸素は不要であり、酸素の有無によって活性が影響を受けない解糖系が重要な役割を果たしていることを示した。腸球菌は腸内常在細菌であり、この菌を用いた変異体の作製など遺伝的解析は全くなされていなかった。我々は、腸球菌に導入可能なトランスポゾンを見いだし、導入効率を上げるための工夫を行い、数千株のトランスポゾン挿入株を得ることができた。また、トランスポゾン挿入株をスクリーニングした結果1株のATP非分泌株を得た。この変異体の解析を進めることによりATPの分泌機構の解明が可能になると思われる。平成24年度に得られた結果を基にして、ATP分泌機構の解明および細菌の分泌するATPの生態系における役割を検討する。1、ATP分泌機構のさらなる解明のために、ジニトロフェノールを添加し菌体内ATPを枯渇させた状態(静止菌体)のE. mundtiiを作成し、グルコースを添加し細胞内外のATPの産生量の経時的変化を検討する。
カエル類の移動能に着目した農村集落の生物相保全機能に関する研究

両生類の世界的な減少が警告される中、日本では農村環境の変容が両生類の減少に強く関係する。豊かな生物相を持つ農村環境の維持・創造を計画論的に進めるには、それぞれの地域特性に応じたカエル類等小動物の保全研究が重要である。まず都市内の孤立的な緑地でアカガエル2種が生息する7箇所の丘陵地-谷戸型の公園・保全緑地を対象に解析を行った。19992001年の3繁殖期の卵塊数平均を目的変数に、植生面積等を説明変数として相関をみた。その結果両種とも緑地全体の規模ではなく、湿田等繁殖空間の規模と状態がその生息量に最も重要な規定要素となっていることが明らかにされた。一方、既に孤立個体群と見なせる状態になってから1525年以上経っている地点も存在し、都市域の孤立的な緑地における水田の重要性が示された。農村の散居集落水田域におけるトウキョウダルマガエルの生息では土水路畦畔の重要性と丘陵地麓からの距離に生息が強く関係することが明らかになった。次に農地が面として広がる農村域を対象とし、両生類の分布動態と生息制限要素や環境傾度について、神奈川県、茨城県中部の水戸地区を事例に調査した。種組成と立地状態との関係からその生息適地予測を行った。24区域でのサンプリング調査を基に、各種の出現率割合を求めTWINSPANにより8タイプの両生類種組成類型を得た。GISから読みとった地形・植生の面積割合を説明変数とし各類型を区分する判別関数式を得た。地形条件を用いてトウキョウサンショウウオ、ヤマアカガエル、ツチガエルの3種が出現する丘陵地エリアと出現しない台地/低地エリアに区分された。また、他の種の多寡により植生条件を用いて区分した。これらの正判別率6586%であった。さらに判別関数式を用い未調査域(840km^2)で予測生息適地図を作成し、13区域を加え検証調査を行いその妥当性が示された。このようにサンプリング調査、種組成の類型化、判別関数式の算出、予測生息適地図の出力、検証調査による妥当性の検討まで、一連の研究フローを確立することにより、広域緑地計画への応用を可能とした。水田域におけるカエル類の餌生き物として昆虫類を、またカエル類を餌とする生き物としてサギ類に注目し調査を行った。その結果水田に隣接する畦畔草地の重要性が明らかになり、また低地水田域でのサギの行動圏として12km圏が示された。営巣繁殖の点では河川に沿った樹林地の重要性が示唆された。カエル類を指標とした緑地保全に関する研究は、これまで各種地域レベル(都市の地区レベル、農村地域レベル)で進めてきている。都市の地区レベルからは都市公園計画予定地谷戸湿田におけるカエルの生息状況を中心に行動圏域の関係を調べ、残存樹林を持つ谷戸水田ではニホンアカガエルが500m圏域を中心に活動していることを明らかにした。また、同様の都市内および都市周辺部に残存する谷戸田におけるカエルの生息状況を調査し、種、個体数、地区特性について検討し地域的視点から分布の偏り、生息状況の問題点などを明らかにし緑地空間の連続性、規模・形態の特性を明らかにしている。カエルは人の生活とも深い関係を持ち、特に幼生のオタマジャクシ捕獲は子供のレクリエーション的活動と関係が有る。従って、その行動と種の生息域拡大との関係を捉えるため調査し、捕獲行動との一定度の関係を明らかにした。さらに、都市内にある緑の多い神社仏閣の水辺空間はカエルの繁殖にとってどのように機能しているか、少なくなったビオトープ的機能の存在を明確にするため、鎌倉市の寺院池を中心として調査した。その結果、池は少なくなってきている水辺空間としても重要でありカエルの生息、繁殖の点からも重要であることが明らかになった。農村地域のレベルにおける研究は下総地域を事例として進めた。沖積低地地域と丘陵台地地域で複雑に展開する谷戸地形の農地を中心としてカエルの生息状況を捉え、両者の間に違いのあることがわかった。その違いは主として水田の乾湿の違いと大きく関連していることが明らかになった。つまり乾田化はカエルにとって生息しにくくなっているといえる。この間、環境指標としてカエル類を対象とすることの検討と鳴き声による生息状況調査の妥当性についても検討を行った。具体的な農村の対象を砺波と胆沢に取り散居集落における緑(屋敷林、畔、水路)とカエルの生息について検討を進めてきている。また、相模平野水田地域を中心としてサギの行動を調査し塒と採餌空間の関係を調査してきている。これらについては現在まで、資料の収集、整理の段階である。

一方、既に孤立個体群と見なせる状態になってから1525年以上経っている地点も存在し、都市域の孤立的な緑地における水田の重要性が示された。農村の散居集落水田域におけるトウキョウダルマガエルの生息では土水路畦畔の重要性と丘陵地麓からの距離に生息が強く関係することが明らかになった。次に農地が面として広がる農村域を対象とし、両生類の分布動態と生息制限要素や環境傾度について、神奈川県、茨城県中部の水戸地区を事例に調査した。種組成と立地状態との関係からその生息適地予測を行った。24区域でのサンプリング調査を基に、各種の出現率割合を求めTWINSPANにより8タイプの両生類種組成類型を得た。GISから読みとった地形・植生の面積割合を説明変数とし各類型を区分する判別関数式を得た。地形条件を用いてトウキョウサンショウウオ、ヤマアカガエル、ツチガエルの3種が出現する丘陵地エリアと出現しない台地/低地エリアに区分された。また、他の種の多寡により植生条件を用いて区分した。これらの正判別率6586%であった。さらに判別関数式を用い未調査域(840km^2)で予測生息適地図を作成し、13区域を加え検証調査を行いその妥当性が示された。このようにサンプリング調査、種組成の類型化、判別関数式の算出、予測生息適地図の出力、検証調査による妥当性の検討まで、一連の研究フローを確立することにより、広域緑地計画への応用を可能とした。水田域におけるカエル類の餌生き物として昆虫類を、またカエル類を餌とする生き物としてサギ類に注目し調査を行った。その結果水田に隣接する畦畔草地の重要性が明らかになり、また低地水田域でのサギの行動圏として12km圏が示された。営巣繁殖の点では河川に沿った樹林地の重要性が示唆された。農(耕)地が面として連続的に広がる農村域を対象とし、水平的関係におけるカエル類の分布動態から生息を制限する要因を抽出した。散居集落を持つ岩手県胆沢地区で事例調査を行い、扇状地水田の端から中心方向への軸に沿うよう1/25,000スケールでのベルト・トランセクトを想定し、カエル類の扇状地中心方向への分布限界を把握した。調査の結果、ニホンアカガエル、ヤマアカガエルの2種は丘陵地際に生息が限られており、扇状地中央部への侵出が抑えられていることが示された。一方、両種は丘陵地際から1.52kmの範囲に隔離的に生息域が残存していた。胆沢川流域の段丘面区分図に今回設定したベルトを当てはめると、この1.52kmの範囲は横道段丘面に位置している。より上位の上野原段丘面からの浸透水によりシルト層上に溜まり水が形成されやすいと考えられ、これが飛び地的に横道段丘面においてアカガエル2種の生息を可能にしてきた理由であると推察された。ツチガエルの生息分布を段丘面区分図にあてはめると、扇状地の南半分を占める上野原・横道・堀切の各段丘面では広く生息しているが、福原段丘面に入ると急激にその生息確認が低くなり、水沢高位段丘面では生息が見られなくなる。これはシュレーゲルアオガエルについても類似した関係が認められるが、本種の場合、水沢高位段丘面に入っても小数の生息が確認されている。各段丘面における樹林地の存在様態の差異が、散居屋敷林のような小規模な樹林地ではなく、まとまった樹林帯の存在がシュレーゲルアオガエルのような非繁殖期に主に樹林地等で生活するカエル類にとって生息条件となる可能性が示唆された。
さまざまな管理段階にある熱帯フタバガキ林の構造と更新動態

1.西カリマンタンの植生(1)概要:西カリマンタンのニウット山自然保護区とその周辺で、昨年までに設定した19個の調査区に5調査区を加え、合計9.1haの植生を調べた。その結果、1haの調査区で幹周囲15cm以上の樹木が300370種、全体では1300種以上の樹木が分布し、きわめて多様性が高い地域であることがわかってきた。熱帯アジアの優占種であるフタバガキ科だけでも約60種が見られ、場所によってさまざまな植生があった。それは、沢ぞいと尾根ぞいに多い種というように環境条件の違いで説明できるものと、類似した立地に設定した調査区でもかなり異なった種組成が出現しまだ説明のできない例もあり、今後の研究が必要である。(2)土壌と植生の関係:フタバガキ科天然林、焼畑などで土壌の分析を行った。川付近の砂質土壌に多い植生、丘陵に多い植生など、植生の全体的な変化は土壌の変化とおよそ対応してた。しかし土壌の多様性は植生の多様性よりもはるかに低いので、その複雑な変化を土壌だけで説明することはできない。(3)山地林:今年度重点的に調べたのはニウット山西部の山地林である。そこには数百年以前から存在する集落があるが、最短の集落までは1日、自動車道路がある町までは23日間歩かなければならない。伝統的な土地利用をしている地域と考えられるが、最近になって月に一度来る医療チームのおかげか人口が増加し、焼畑の面積が増えつつあった。その集落周辺で天然林に1haの調査区と焼畑跡地で小さい区を3つ設定し植生の変化を調べた。(4)熱帯の他地域との比較:赤道付近の低地帯で以前調査した西スマトラ、東ボルネオのフローラと本調査地域のものを比較すると、共通種は互いに数%しかなく、類似の気候条件にある熱帯多雨林でも、植生は大きく異なることがわかった。これは熱帯地域の多様性が高いことの反映であり、少数の箇所の調査だけでは全体を理解することが難しいことを示している。2.個体群動態(1)結実と実生の定着:フタバガキ科天然林内に設定した2つの1haの調査区周辺で、1993年には多くの樹木が結実した。その結実量とその後の実生の定着過程を、代表的な数樹種について調べた。たとえばこの地域の優占種になることが多いフタバガキ科のDryobalanops beccariiでは、74個/m^2の果実が落下し、そのうちの42%が健全で、1.8本/m^2の実生が定着した。これらの実生にはラベルをつけたので、来年度以降も追跡調査を行う。後述する森林動態の研究も継続測定が必要があり、調査基地となる小屋を天然林のそばに作った。(2)Scaphium macropodumの生態:アオギリ科の高木である本種は、フタバガキ科のように風散布果実をつくり数十mまで散布していた。散布後数日でほとんどの種子が発芽するが、母樹の直下の死亡率は高かった。発芽後樹高約14mに達するまでは、主幹だけで枝を出さない。その代わりに大きい個体の葉ほど大きく、また掌状に深く切れ込むようになる。暗い林内では幹の上部だけにそのような長い葉柄をもった葉を傘型につけて、林冠のギャップができるのを待っている。ギャップができると樹高成長が盛んになり、また枝を出す。分岐した成熟個体では、切れ込まない小さな葉をつけるようになる。3.森林の動態以前に設定した7調査区について、樹木の成長量測定を行った。伐採会社が大径木を抜き伐りしただけの林分では、多数残存するフタバガキ科幼木の成長が旺盛であった。従って、放置しておけば以前と似たような森林が回復すると思われる。ただし、多くの択伐跡地は焼畑に変えられていた。焼畑跡地では代表的な先駆種であるMacarangaが多かったが、成長の速い個体と、競争に負けてほとんど成長していない個体にわかれていた。フタバガキ科は種子の寿命が短く埋土種子として残らないので、幼木が焼かれた場所からは消滅した。フタバガキ科の中で果実が有用なので植林されたテンカワンの約百年生の林分では、多くの個体がまだ活発に成長していた。

しかし土壌の多様性は植生の多様性よりもはるかに低いので、その複雑な変化を土壌だけで説明することはできない。(3)山地林:今年度重点的に調べたのはニウット山西部の山地林である。そこには数百年以前から存在する集落があるが、最短の集落までは1日、自動車道路がある町までは23日間歩かなければならない。伝統的な土地利用をしている地域と考えられるが、最近になって月に一度来る医療チームのおかげか人口が増加し、焼畑の面積が増えつつあった。その集落周辺で天然林に1haの調査区と焼畑跡地で小さい区を3つ設定し植生の変化を調べた。(4)熱帯の他地域との比較:赤道付近の低地帯で以前調査した西スマトラ、東ボルネオのフローラと本調査地域のものを比較すると、共通種は互いに数%しかなく、類似の気候条件にある熱帯多雨林でも、植生は大きく異なることがわかった。これは熱帯地域の多様性が高いことの反映であり、少数の箇所の調査だけでは全体を理解することが難しいことを示している。2.個体群動態(1)結実と実生の定着:フタバガキ科天然林内に設定した2つの1haの調査区周辺で、1993年には多くの樹木が結実した。その結実量とその後の実生の定着過程を、代表的な数樹種について調べた。たとえばこの地域の優占種になることが多いフタバガキ科のDryobalanops beccariiでは、74個/m^2の果実が落下し、そのうちの42%が健全で、1.8本/m^2の実生が定着した。これらの実生にはラベルをつけたので、来年度以降も追跡調査を行う。後述する森林動態の研究も継続測定が必要があり、調査基地となる小屋を天然林のそばに作った。(2)Scaphium macropodumの生態:アオギリ科の高木である本種は、フタバガキ科のように風散布果実をつくり数十mまで散布していた。散布後数日でほとんどの種子が発芽するが、母樹の直下の死亡率は高かった。発芽後樹高約14mに達するまでは、主幹だけで枝を出さない。その代わりに大きい個体の葉ほど大きく、また掌状に深く切れ込むようになる。暗い林内では幹の上部だけにそのような長い葉柄をもった葉を傘型につけて、林冠のギャップができるのを待っている。ギャップができると樹高成長が盛んになり、また枝を出す。分岐した成熟個体では、切れ込まない小さな葉をつけるようになる。3.森林の動態以前に設定した7調査区について、樹木の成長量測定を行った。伐採会社が大径木を抜き伐りしただけの林分では、多数残存するフタバガキ科幼木の成長が旺盛であった。従って、放置しておけば以前と似たような森林が回復すると思われる。ただし、多くの択伐跡地は焼畑に変えられていた。焼畑跡地では代表的な先駆種であるMacarangaが多かったが、成長の速い個体と、競争に負けてほとんど成長していない個体にわかれていた。フタバガキ科は種子の寿命が短く埋土種子として残らないので、幼木が焼かれた場所からは消滅した。フタバガキ科の中で果実が有用なので植林されたテンカワンの約百年生の林分では、多くの個体がまだ活発に成長していた。西カリマンタン中部のランダック川周辺には、戦前まで愛知県ほどの広さのウガバン王国があった。この地域の森林が人間によってどのように管理され変えられたかを知るため、地域の歴史に関する王家の子孫や住民への聞込調査と森林の植生調査を行った。ランダック川上流にテンガワン(Shorea macrophylla)というフタバガキ科の樹木の天然林がある。フタバガキ科はアジア熱帯林を代表する樹種で、ラワン材として盛んに伐採されているが、テンガワン類は果実から食用油が採れるので森林を破壊せずに利用できる。
生細胞核の複数種蛍光１分子イメージング定量解析による転写サイクルの機構解明

本研究は、生細胞1分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的とした。独自に開発した薄層斜光照明法を基に、1分子蛍光顕微鏡システムの最適化を行い、転写サイクルの複雑な時空間制御の解明を進めた。薄層斜光照明法を用いた超解像イメージングにより、転写関連タンパク質について高精細な空間分布解析を行った。1分子軌跡追跡による時空間動態と結合解離の定量解析法を開発し、転写因子の結合解離や、リモデリング複合体構成タンパク質の核内構造との相互作用ダイナミクスの解析を進めた。本研究は、生細胞1分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的としている。独自に開発した蛍光照明法である薄層斜光照明法による1分子イメージング観察と定量解析を、転写サイクルの動態観察により複雑な時空間制御の解明に向け、最適化を進めた。具体的には、以下のような成果を得た。(1)細胞の活性化に伴う転写因子の細胞質から核への移行を解析する目的で、核膜孔複合体の3色同時1分子イメージングの観察系を確立した。核膜孔複合体構成タンパク質を位置マーカーとして、核膜通過時のタンパク質の定量解析が可能になった。また、分裂酵母の核膜孔複合体構成タンパク質の蛍光1分子定量解析により、発芽酵母やヒトと異なる特徴的な組成を示すことが分かった(Nucleus 5, 1-14, 2004)。(2)複数種タンパク質同時発現細胞系の構築法最適化において、1分子レベルでの発現細胞構築方法を改良した。ヒストンや転写伸長因子NELFなどのタンパク質では、(i)1コピーの遺伝子導入、(ii)弱いプロモータ支配下でも発現レベルが低下しない。SNAPタグ融合タンパク質に至適濃度の蛍光色素リガンドを添加することにより、NELFの1分子イメージング解析を可能にし、RNAポリメラーゼとの相互作用解析を進めることができるようになった。独自に開発した薄層斜光照明法を基に、4色同時観察・3次元スキャン対応の1分子蛍光顕微鏡システムの最適化を行い、転写サイクルの複雑な時空間制御の解明を進めた。(1)転写開始におけるヌクレオソームリモデンリングの役割解明のために、複合体構成タンパク質について、1分子イメージング解析とFRAP(光褪色後蛍光回復法)を組み合わせた解析を進めた。領域内の原田昌彦らとの共同研究により、構成タンパク質である核内アクチンの可視化を進め、OCT4などの転写因子の発現を活性化することを明らかにした(Biosci.Biotechnol.Biochem. 79, 242-246)。(2) RNAポリメラーゼのリン酸化セリンに対する蛍光抗体フラグメントを用いて、転写開始型と転写伸長型に対する結合タンパク質の推移を解析した。連携研究者木村宏らとの共同研究により、ヒストンH3のアセチルが転写開始から伸長過程へ促進することを明らかにした(Nature 516, 272-275)。(3)核内転写関連タンパク質の動態は、細胞外からの刺激に応答し変化しているために、細胞表面での刺激受容体分子の動態解析も重要な情報である。特に免疫細胞などの浮遊精細胞では、細胞表面分子の本来の動きを維持しながら細胞を観察用のディッシュに保持することが求められる。このために、ガラス支持脂質二重膜を簡便に構築する方法を確立した(Anal.Sci.30, 1103-1106)。この方法により、細胞表面から核内へのシグナル伝達を含めて、核内転写関連タンパク質の刺激応答の詳細な解析が可能になった。さらに薄層斜光照明法を用いた超解像イメージングにより、転写関連タンパク質について高精細な空間分布解析を行っている。リモデリング複合体構成サブユニットのノックダウン解析により、各サブユニットの機能解明を進めた。領域内の原田昌彦らとの共同研究により、構成タンパク質である核内アクチンが転写制御に関わることを明らかにした(山崎、染色体ワークショップ)。(2)転写伸長因子NELFとDSIFは、転写の開始から伸長を経て終結にいたるまで、RNAポリメラーゼのCTDリン酸化に関連して、相互作用のタイミングが異なると考えられている。領域内の山口雄輝らとの共同研究により、リン酸化阻害剤およびDSIFの各種ドメイン欠失変異体を用いた1分子イメージングおよびFRAP解析により、転写伸長因子のダイナミクス解明を進めた(伊藤、池田、生物物理学会)。

本年度の研究計画であった、1分子定量解析とFRAPによる分子群としての動態解析を統合した解析方法を用いて、変異体の比較、阻害剤による変化などを中心に、転写関連タンパク質のダイナミクス解析を進めた。さらに、超解像イメージングにより、転写関連タンパク質の空間分布を高精細に解析できるようになった。複数の領域内共同研究により、転写サイクルの様々な局面で機能する調節因子について、イメージング解析を進めており、解析対象が広がっている。本研究は、生細胞1分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的としている。独自に開発した薄層斜光照明法による蛍光1分子イメージングの他に、FRAP(光褪色後蛍光回復法)や、超解像イメージングも用い、転写関連タンパク質について高精細な空間分布解析を行っている。具体的には、以下のような成果を得た。1.転写開始におけるヌクレオソームリモデンリング複合体の役割解明。領域内の原田昌彦および連携研究者の木村宏との共同研究により、リモデリング複合体構成サブユニットのノックダウン解析を行い、各サブユニットの機能解析を進めた。(伊藤、生物物理学会)2.核小体の構造と機能に関するRNA結合タンパク質の役割解明。連携研究者の斉藤典子との共同研究により、RNA結合タンパク質ノックダウン条件下での核小体構成タンパク質の動態を解析し、核小体構造維持への関与を明らかにした。(松本、生物物理学会)3.転写抑制因子IPASの構造変化と機能の相関。東北大の十川和博との共同研究により、IPASの細胞内局在を詳細に解析した。FLIM-FRETの結果と合わせて、結合タンパク質によるIPASの構造変化を明らかにした。(J.Biochem. 161:291-296, 2017)5.転写伸長因子DSIFの細胞内動態解明。領域内の山口雄輝らとの共同研究により、リン酸化阻害剤存在下でのFRAP解析を行い、RNAポリメラーゼのリン酸化部位による相互作用安定性の違いを明らかにした。(國見、生物物理学会)本研究は、1分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的としている。独自に開発した蛍光照明法である薄層斜光照明法による1分子イメージング観察と定量解析を、転写サイクルの動態観察により複雑な時空間制御の解明に向け、最適化を進めた。(1)転写サイクル解析のための1分子イメージング顕微鏡システムの構築を進めた。1分子蛍光顕微鏡システム(3色同時観察可能)を発展させるため、4色同時観察系の構築に取り組んだ。さらに高速画像取得カメラを導入したことで、これまで以上にダイナミックな相互作用解析が可能になった。(2)複数種タンパク質同時発現細胞系の構築法最適化および蛍光抗体による標識を行い、多色1分子解析に向けて実験系を構築した。
トリチウムの生物影響に関する細胞・組織学的研究

1)母親の胎内で原爆破爆した子供の多くに極度の知能発育遅滞がみられ,大きな社会問題となっている.そこで知能発育に対するトリチウムのリスクを推定するためマウスによる基礎実験を行なった.その結果,ガンマ線の急照射では脳細胞死は容易に検出されたが,緩照射では死亡率が大幅に低下した.一般にトリチウムは緩照射のため脳細胞死の検出方法を今後検討しなくてはならぬ(佐藤).2)マウスの卵母細胞に対するトリチウムの致死効果が妊性にどの程度影響するか調べたところ,トリチウムを16ラド以上照射すると対照群に比べて明らかに妊性が低下するが,ガンマ線ではもっと多量の線量を照射しないと低下しない(李).3)マウス皮膚創傷部からのトリチウム水の吸収速度は傷の種類によって異なるが,傷の組織学的な観察を行なったところ,傷害度と吸収速度がよい一致を示すことがわかった.また,すり傷からのトリチウム水の吸収は脂溶性塗布剤では完全に抑制できなかった(澤田).4)ヒト骨髄細胞のうち赤芽球幹細胞BFUーEに対するトリチウムの致死効果を調べ,ガンマ線に対するRBEとして1.3を得た(重田・大北).5)ヒトのリンパ球の染色体異常と小核出現率を指標としたトリチウム水のRBEはそれぞれ2.8と2.6が得られた(田中).また,リンパ球の致死を指標とするとRBEは2.8となった(中村).6)トヒ精子染色体に対するトリチウム水の影響を調べ, X線に対するRBEとして2.3が植られた(美甘ら).7)マウス3T3細胞に対するトリチウム水の影響を生存率,癌化率及び突然変異率を指標としてRBEを求めたが,生存率では1.0,癌化率では1.7が得られ,突然変異に関しては十分な結果が得られなかった(榎本).8)マウス受精卵の胚盤胞形成を指標として有機結合型トリチウムの影響を試験管内で定量的に調べ,トリチウム水に比べ10010000倍も強い影響を与えることがわかった(山田).1)母親の胎内で原爆破爆した子供の多くに極度の知能発育遅滞がみられ,大きな社会問題となっている.そこで知能発育に対するトリチウムのリスクを推定するためマウスによる基礎実験を行なった.その結果,ガンマ線の急照射では脳細胞死は容易に検出されたが,緩照射では死亡率が大幅に低下した.一般にトリチウムは緩照射のため脳細胞死の検出方法を今後検討しなくてはならぬ(佐藤).2)マウスの卵母細胞に対するトリチウムの致死効果が妊性にどの程度影響するか調べたところ,トリチウムを16ラド以上照射すると対照群に比べて明らかに妊性が低下するが,ガンマ線ではもっと多量の線量を照射しないと低下しない(李).3)マウス皮膚創傷部からのトリチウム水の吸収速度は傷の種類によって異なるが,傷の組織学的な観察を行なったところ,傷害度と吸収速度がよい一致を示すことがわかった.また,すり傷からのトリチウム水の吸収は脂溶性塗布剤では完全に抑制できなかった(澤田).4)ヒト骨髄細胞のうち赤芽球幹細胞BFUーEに対するトリチウムの致死効果を調べ,ガンマ線に対するRBEとして1.3を得た(重田・大北).5)ヒトのリンパ球の染色体異常と小核出現率を指標としたトリチウム水のRBEはそれぞれ2.8と2.6が得られた(田中).また,リンパ球の致死を指標とするとRBEは2.8となった(中村).6)トヒ精子染色体に対するトリチウム水の影響を調べ, X線に対するRBEとして2.3が植られた(美甘ら).7)マウス3T3細胞に対するトリチウム水の影響を生存率,癌化率及び突然変異率を指標としてRBEを求めたが,生存率では1.0,癌化率では1.7が得られ,突然変異に関しては十分な結果が得られなかった(榎本).8)マウス受精卵の胚盤胞形成を指標として有機結合型トリチウムの影響を試験管内で定量的に調べ,トリチウム水に比べ10010000倍も強い影響を与えることがわかった(山田).
マルチスライスCTによる肺野小型腫瘤の質的診断技術とその臨床応用に関する研究

本研究は,マルチスライス,CT像による早期肺がん候補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術を研究開発するものである.この診断技術は従来の画像診断を用いた診断能より優れた鑑別精度を目指すものであり,十分な医学的評価の後に早期肺がん候補の信頼度の高い非侵襲・非観血的な質的診断技術として臨床現場で活用できることを目標とする.そこで,以下の4つの課題を挙げて2年間で実施するものである.これらは,1.肺野小型腫瘤の時空間的な特徴解析アルゴリズムの研究,2.客観的な良悪性鑑別に有効な定量的特徴量の研究,3.時空間的な特徴量を用いた鑑別法の確立と質的診断技術の研究,4.臨床データを用いた質的診断技術の正当性の評価である.平成14年度は,重点的に3.及び4.の課題について実施し,マルチスライスCT像を入力して肺がん候補の良悪性鑑別結果を出力するまでの腫瘤のサイズ,内部濃度,発生部位別による分類処理,時空間的な特徴量抽出処理,良悪性鑑別処理からなる質的診断技術を研究開発し,これらの処理手順を統合した質的診断支援システムのプロトタイプの開発を行った.これらの研究成果をIEEE国際会議,MICCAI国際会議,SPIE国際会議で発表して非常に高い関心と評価を得ている.これらの成果から,マルチスライスCT像による早期肺がん侯補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術の実用化に向けてさらに研究を進めている.本研究は,マルチスライスCT像による早期肺がん候補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術を研究開発するものである.この診断技術は従来の画像診断を用いた診断能より優れた鑑別精度を目指すものであり、十分な医学的評価の後に早期肺がん候補の信頼度の高い非侵襲・非観血的な質的診断技術として臨床現場で活用できることを目標とする.そこで、以下の4つの課題を挙げて2年間で実施するものである。これらは、1.肺野小型腫瘤の時空間的な特徴解析アルゴリズムの研究,2.客観的な良悪性鑑別に有効な定量的特徴量の研究,3.時空間的な特徴量を用いた鑑別法の確立と質的診断技術の研究,4.臨床データを用いた質的診断技術の正当性の評価である.平成13年度は,重点的に1.及び2.の課題について実施し,(1)病変部辺縁性状、内部構造及び、既存構造の関与形態,(2)病変の時間経過に伴う形態変化,(3)造影剤投与後の病変部における時間経過に伴う造影効果をマルチスライスCT像を用いて定量的に解析する手法を検討し,これらの時空間的な特徴量の変化を用いて鑑別精度の高い良悪性の鑑別法の研究開発を行った.これらの研究成果をIEEE国際会議、、MICCAI国際会議,SPIE国際会議,RSNA国際会議などで発表して非常に高い関心と評価を得ている。これらの成果から、マルチスライスCT像による早期肺がん候補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術の実用化への研究開発に強い自信を得て取り組んでいるものである。本研究は,マルチスライス,CT像による早期肺がん候補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術を研究開発するものである.この診断技術は従来の画像診断を用いた診断能より優れた鑑別精度を目指すものであり,十分な医学的評価の後に早期肺がん候補の信頼度の高い非侵襲・非観血的な質的診断技術として臨床現場で活用できることを目標とする.そこで,以下の4つの課題を挙げて2年間で実施するものである.これらは,1.肺野小型腫瘤の時空間的な特徴解析アルゴリズムの研究,2.客観的な良悪性鑑別に有効な定量的特徴量の研究,3.時空間的な特徴量を用いた鑑別法の確立と質的診断技術の研究,4.臨床データを用いた質的診断技術の正当性の評価である.平成14年度は,重点的に3.及び4.の課題について実施し,マルチスライスCT像を入力して肺がん候補の良悪性鑑別結果を出力するまでの腫瘤のサイズ,内部濃度,発生部位別による分類処理,時空間的な特徴量抽出処理,良悪性鑑別処理からなる質的診断技術を研究開発し,これらの処理手順を統合した質的診断支援システムのプロトタイプの開発を行った.これらの研究成果をIEEE国際会議,MICCAI国際会議,SPIE国際会議で発表して非常に高い関心と評価を得ている.これらの成果から,マルチスライスCT像による早期肺がん侯補の時空間的な特徴解析に基づいた質的診断技術の実用化に向けてさらに研究を進めている.
有機―無機ハイブリッドゲルの創出と光・磁気機能材料への応用

ハイブリッドナノゲルを利用したセンサー材料の創出を目的に、分子レベルで有機成分と無機成分がハイブリッドした構造のPOSSを利用した。POSSは、ビチオフェンもしくはトリフェニルアミンで結合され、ナノゲルを形成した。ビチオフェン架橋のナノゲルは、シリカ粒子の大きさにより発光波長が変化した。また、トリフェニルアミンで架橋したナノゲルは、トランス脂肪酸とシス脂肪酸を認識し、発光波長が変化した。一方、フッ素誘導体を導入したフッ素化ナノゲルは、常磁性化合物との共存により、生理活性アミノ化合物を認識し、フッ素NMR信号が変化した。開発したハイブリッドナノゲルは、光・磁気を利用した検知材料として期待される。本年度は、申請書に記載した研究課題のうち、以下の研究を実施した。1.共役系分子の導入法の確立と機能性ハイブリッドナノゲルの創出と微粒子状物質のサイズ認識...分子レベルで有機成分と無機成分がハイブリッドした構造を有しているPOSSを利用した、ハイブリッドナノゲルを合成した。本年度は、POSSを連結する色素としてビチオフェンを選択し、POSSとの縮合反応により合成した。得られたハイブリッドナノゲルは、水溶液中で青色発光を呈した。蛍光発光スペクトルを測定した結果、450 nm付近にブロードなピークが観測された。またピーク波長は、ビチオフェンのみの場合より長波長側に移動していることが確認された。得られたハイブリッドナノゲルへシリカ微粒子を添加した。その結果、シリカ微粒子のサイズに応じ、ハイブリッドナノゲルの発光ピークトップは、変化した。その変化はビチオフェンユニットの導入量により制御可能である。これは、POSSの疎水性効果を利用した、ハイブリッドナノゲルの応用例の1つになると期待される。2.フッ素NMR信号を示す常磁性フッ素化ナノゲルの合成と標的物質によるフッ素NMR信号の変化...POSSの放射状に広がった置換基へフッ素置換基を導入し、常磁性のニッケルを配位させたポルフィリンを吸着させることで、合成を行った。その結果、POSSの高水中分散性からニッケルの磁性を損なわずフッ素NMR信号を示す常磁性フッ素化ナノゲルが得られた。これは、市販のアミン化合物を蛍光法と同程度の濃度で添加することで、フッ素NMRの信号が減少する挙動を示した。信号の減少時、凝集体が形成すること、NMRの緩和時間が変化しないことから、アミン化合物により形成した凝集体は常磁性効果の増強によりフッ素NMR信号を示さなくなり、残留した常時性フッ素化ナノゲルのフッ素NMR信号が観測されたと考えられる。本年度の課題(1)の研究に関して、共役系分子の導入法の確立と機能性ハイブリッドナノゲルの創出を目的とし、共役系分子をリンカーとしたナノゲルの合成を予定していた。実際にビチオフェンの二置換カルボン酸体と八置換アミノPOSSとのゲル化反応により、有機ー無機ナノゲルの合成に成功した。共役系分子をリンカーとして利用したナノゲルの合成には、基盤技術の構築が必要であったが、前半期間において、多種分子への適用やそれらの導入量のコントロール法の開拓に成功した。更に、得られた発光性有機ー無機ハイブリッドナノゲルを利用し、シリカ微粒子のサイズを光学測定により判別できる機能発現に成功した。その結果、本研究で目的とする機能の発現に成功し、化合物の合成から物性の評価まで効率的に進行したため、おおむね順調に進行している。課題(2)の研究に関して、フッ素基を組み込んだハイブリッドゲルは次年度に合成する予定であったが、フッ素修飾POSSの合成とポルフィリンニッケル錯体の混合物によるフッ素NMRプローブの合成に成功した。更に、アミン化合物をターゲットとして蛍光濃度で判断できる機能発現に成功し、POSSが磁性へと影響を与えず、水中での高分散性の特性を十分に発現した機能が得られた。得られた実験結果より、当初目的としていた磁性へ与えるPOSSの影響が判断できかつ、磁性を利用したNMRプローブの開発に成功しており、学術誌へと投稿していることから、おおむね順調に進行している。そのほか、学会発表も行っており、全体としてはおおむね順調に進展したと考えられる。ハイブリッドナノゲルを利用したセンサー材料の創出を目的に、分子レベルで有機成分と無機成分がハイブリッドした構造を有しているPOSSとを利用した。POSSは、ビチオフェンもしくはトリフェニルアミンで、縮合反応により結合し、ゲルを形成した。得られたハイブリッドナノゲルは、水溶液中で450 nm付近(ビチオフェン)と460 nm付近(トリフェニルアミン)にブロードピークが観測された。またピーク波長は、色素のみの場合より長波長側に移動した。ハイブリッドナノゲルの検出対象として、粒子サイズと脂肪酸の異性体認識を選択した。また、trans脂肪酸とcis脂肪酸を認識して、発光ピークトップが短波長シフトした。生体活性化合物アミノ化合物は毒性が高く、高感度での検出が求められる。検出には、生体内で非侵襲の測定である、MRIが注目されている。MRIの感度向上を目指し、フッ素NMR信号を示す常磁性フッ素化ナノゲルの合成を行った。POSSの放射状に広がった置換基へフッ素置換基を導入し、常磁性ニッケルが配位したポルフィリンを吸着させた。その結果、POSSの高水中分散性からニッケルの磁性を損なわずフッ素NMR信号を示す、常磁性フッ素化ナノゲルが得られた。

これは、市販のアミン化合物を蛍光法と同程度の濃度で添加することで、フッ素NMRの信号が減少する挙動を示した。信号の減少時、凝集体が形成すること、NMRの緩和時間が変化しないことから、アミン化合物により形成した凝集体は常磁性効果の増強によりフッ素NMR信号を示さなくなり、残留した常時性フッ素化ナノゲルのフッ素NMR信号が観測されたと考えられる。ハイブリッドナノゲルを利用したセンサー材料の創出を目的に、分子レベルで有機成分と無機成分がハイブリッドした構造のPOSSを利用した。POSSは、ビチオフェンもしくはトリフェニルアミンで結合され、ナノゲルを形成した。ビチオフェン架橋のナノゲルは、シリカ粒子の大きさにより発光波長が変化した。また、トリフェニルアミンで架橋したナノゲルは、トランス脂肪酸とシス脂肪酸を認識し、発光波長が変化した。一方、フッ素誘導体を導入したフッ素化ナノゲルは、常磁性化合物との共存により、生理活性アミノ化合物を認識し、フッ素NMR信号が変化した。開発したハイブリッドナノゲルは、光・磁気を利用した検知材料として期待される。課題(1)に関して今後は、化合物ライブラリー形成のため、他のリンカーを利用した有機ー無機ハイブリッドナノゲルの合成を行う。またそれらを解析することで、更なる有機ー無機ハイブリッドナノゲルの構造と機能との相関を詳細に突き詰めていく。具体的には、電荷移動錯体を形成しやすいトリフェニルアミンの二置換カルボン酸体を合成し、それを共役系リンカーとした縮合反応により新たな機能性有機ー無機ハイブリッドナノゲルの合成を行う。さらに、赤色発光を示すジチエノベンゾチアジアゾールの二置換カルボン酸体を利用してナノゲルの合成を試みる。これら作成したナノゲルは、架橋率をコントロールした水溶性の向上を図り、水中での疎水性物質(ピレンなど)の吸着挙動と内包量の評価を試みる。疎水性物質の吸着を行う際に、発光領域がオーバーラップしてしまう可能性が考えられる。その際には、発光領域の異なる色素の利用を視野に入れて行う。これらにより、一般性の拡張を検討してゆく。課題(2)に関して今後は、導入する錯体種変更による更なる高感度化や選択性向上の検討を行う予定である。具体的には、鉄やコバルトが配位したポルフィリン錯体を利用する。また感度向上のために、フッ素基導入量の増加や常磁性金属を配意させたポルフィリンの添加量の増加を図る。更に、アミン化合物以外のターゲット物質を利用したフッ素NMRセンサーの開発を行う。標的認識後やフッ素基導入量の増加、ポルフィリンの添加量の増加により沈殿が生じる可能性が考えられる。その場合は、錯体種の変更や水溶性置換基の導入により解決を図る。高分子化学
α2-マクログロブリンによるプロテアーゼ捕獲機構の解明

原子間力顕微鏡(AFM)を用いた1分子速度論の測定の開発のために重要な技術となる孤立1分子の観測・測定に関して,タッピングモードを有効に使うことによって成果を得ることができた.本研究の主目標物質であるα2-マクログロブリン(α2-M)の劈開マイカ上での観察では,大気中観察において3種類の構造すなわちインタクトなド-ナツ状の構造・プロテアーゼ(トリプシン)をトラップした後の「H」型の構造・メチルアミン処理により構造変化させた後の構造を観察することができた.さらにリン酸緩衝液中でもマイカ上にくっついているα2-Mを観察することができた.溶液中で蛋白質分子を見ることができたことは意義深く,溶液中でのタッピングモードでのAFMという新しい手法の大きな可能性を示している.今後この手法を応用することで1分子速度論の研究が,蛋白質分子を対象としてできるようにしていきたい.乾燥させたときと溶液中とでその像を比べると,まず第一にその厚みが大きく違うことがわかった.大気中で観察した場合にはかなり分子がつぶれてしまうようだ.第二に像の見え方,安定性が大きく異なった.大気中では像は安定しておりある程度形がわかるが,溶液中ではα2-Mの存在とその位置は特定できるが、変形した球形に見え,スキャンする度に形が変わる.これはα2-M分子が溶液中でかなり柔らかい事を示しているようだ.また緩衝液中においても蛋白質分子の約1/3はそのままマイカ表面上に留まっていることがわかった.原子間力顕微鏡(AFM)を用いた1分子速度論の測定の開発のために重要な技術となる孤立1分子の観測・測定に関して,タッピングモードを有効に使うことによって成果を得ることができた.本研究の主目標物質であるα2-マクログロブリン(α2-M)の劈開マイカ上での観察では,大気中観察において3種類の構造すなわちインタクトなド-ナツ状の構造・プロテアーゼ(トリプシン)をトラップした後の「H」型の構造・メチルアミン処理により構造変化させた後の構造を観察することができた.さらにリン酸緩衝液中でもマイカ上にくっついているα2-Mを観察することができた.溶液中で蛋白質分子を見ることができたことは意義深く,溶液中でのタッピングモードでのAFMという新しい手法の大きな可能性を示している.今後この手法を応用することで1分子速度論の研究が,蛋白質分子を対象としてできるようにしていきたい.乾燥させたときと溶液中とでその像を比べると,まず第一にその厚みが大きく違うことがわかった.大気中で観察した場合にはかなり分子がつぶれてしまうようだ.第二に像の見え方,安定性が大きく異なった.大気中では像は安定しておりある程度形がわかるが,溶液中ではα2-Mの存在とその位置は特定できるが、変形した球形に見え,スキャンする度に形が変わる.これはα2-M分子が溶液中でかなり柔らかい事を示しているようだ.また緩衝液中においても蛋白質分子の約1/3はそのままマイカ表面上に留まっていることがわかった.
循環器疾患における圧反射異常の神経性メカニズムの解明とその医工学的治療応用

本研究は自律神経系に介入して心不全や高血圧等の循環器疾患を治療する医工学的治療に関して、動脈圧受容器から自律神経中枢への求心路を構成する有髄A線維と無髄C線維が交感神経性の血圧調節に果たす役割や、種々の病態における各線維の変化について、システム工学的な方法論を用いて解明することを目的とする。本年度は麻酔下ラットにおいて実験を行い、低電圧高頻度の電気刺激では主にA線維、高電圧低頻度の電気刺激では主にC線維を介して交感神経が調節されることを、選択的なC線維の薬理的遮断実験と組み合わせて証明した。次に、低電圧高頻度刺激(A線維主体の刺激)では交感神経活動の抑制と体血圧の低下が30秒間持続しないのに対して、高電圧低頻度刺激(C線維主体の刺激)では交感神経活動の抑制と体血圧の低下がより長く持続することを明らかにした。また、この刺激方法を二値白色雑音と組み合わせることにより、A線維の中枢経路の動的特性と、C線維の中枢経路の動的特性を個別に定量化した。その結果、A線維の中枢特性は、0.11Hzにかけて入力の変調周波数が高くなるほど調節ゲインが大きくなる微分特性を示し、0.01Hzの変調周波数では小さな調節ゲインしか示さなかった。これに対して、C線維の中枢特性は周波数依存的な調節ゲインの変化が小さく、全体として弱い微分特性しか示さなかった。これまでに、A線維とC線維の圧受容器における発火特性の違いに関する報告はあったが、中枢経路の違いについてはほとんど知られていなかった。本研究結果より、動脈圧反射による長期の交感神経活動抑制と血圧低下には、A線維よりもC線維を介する中枢経路が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。圧受容器反射を利用した降圧治療においてはA線維よりもC線維を標的として刺激条件を調節することが重要と考えられる。本研究は自律神経系に介入して心不全や高血圧等の循環器疾患を治療する医工学的治療に関して、動脈圧受容器から自律神経中枢への求心路を構成する有髄A線維(太くて速い線維)と無髄C線維(細くて遅い線維)が血圧調節に果たす役割や、種々の病態における各線維の変化について、システム工学的な方法論を用いて解明することを目的とする。本年度は麻酔下ウサギの右腕頭動脈に存在する圧受容器領域を体循環系から分離して、圧反射性の血圧調節におけるA線維とC線維の役割を検討した。まず、C線維の細胞膜上に存在するTRPV1受容体を刺激し、神経線維を完全脱分極状態にして伝導を遮断するレシニフィラトキシンを神経線維周囲に投与したが、ウサギにおいてはこの受容体の発現が少なくC線維を充分に遮断できなかった。そこで、このTRPV1受容体の発現が確認されているラットを用いて同様の実験を行うために、ラットにおいて右腕頭動脈の圧受容器領域を体循環系から分離する手技を確立した。そして、圧受容器に階段状圧入力および動的な圧入力を加えて、遠心性の交感神経活動および体血圧の応答をレシニフィラトキシン投与前後で比較した。その結果、レシニフィラトシキン投与によって、高い圧入力レベルに対する交感神経活動の抑制が鈍化し、圧反射性の降圧が起こりにくくなった。それに対して、動的な圧入力に対する交感神経活動と体血圧の応答には明らかな変化は認められなかった。以上のことから、C線維は高い圧入力レベルにおける求心性情報を中枢に伝えていること、C線維は動的な圧入力情報の伝達にはあまり関与していないことが判明した。これまでの研究から、心不全においては高い圧入力レベルに対する交感神経活動の抑制が鈍化していることが知られている。このことから、心不全においてはA線維に比べてC線維が障害され、交感神経活動の抑制が悪くなっている可能性が示唆された。

圧受容器反射を利用した降圧治療においてはA線維よりもC線維を標的として刺激条件を調節することが重要と考えられる。当初はウサギを用いて実験を計画し実施していたが、ウサギではC線維上のTRPV1受容体の発現が少なく、カプサイシンやレシニフィラトキシン投与によって、C線維の伝導を充分に遮断することができなかった。そのため、TRPV1受容体の発現が確認されているラットを用いて実験を行うために、ラットにおいて腕頭動脈の圧受容器領域を分離する手技を確立し、実験を遂行した。このように途中で実験動物の変更が必要であり、新たな手技を確立するのに時間を要したために、当初の計画以上に進展させることができなかった。それでも当初の計画通り、C線維の選択的遮断で圧反射性の血圧調節がどのような影響を受けるかを明らかにすることはできた。今後は、心不全や高血圧等のモデル動物を用いて同様の実験を行い、各種病態において動脈圧反射求心路のA線維とC線維を介する応答がどのように変化しているかを明らかにし、病態の解明と自律神経に介入する医工学的治療の開発に役立てる計画である。