hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聞こえることと聞こえないことの文化論的研究

--日韓テレビドラマ比較」を日本語に翻訳し、毛利義孝編『日式韓流』(せりか書房、2004年)の一章とした。本年度には、昨年度投稿した二つの論文が掲載された。一つは、『障害学研究』第1巻に掲載された「聞こえる人々の意識変容一手話学習者の語りから」で、聞こえる手話学習者が「ろう文化」を認識していくプロセスを取り上げている。もう一つは、聴者が内面化している身体規範に目を向けた「声の規範-「ろうの声」に対する聴者の反応から」で、『社会学評論』第56巻第2号に掲載された。本年度に展開した調査は二つある。まず、聞こえない親を持つ聞ごえる人々(コーダ=CODA : Children Of Deaf Adults)の二文化体験に注目した調査では、2005年10月から2006年2月にかけて11人のコータに聞き取り調査を実施したほか、12月と1月に開かれたコーダの会において参与観察を行った。また、コーダに関するシンポジウムやコーダによる講演も記録した。現在はこうした調査から得た知見を基にコーダを被験者としたアンケートを作成しており、4月中にコーダの会やろう者組織を通して配布することになっている。こうして集めたデータの一部は、既に、現在執筆中の博士論文の第一章、第二章で論じている。一方、聴覚障害者の雇用と企業の社会的責任(CSR=Corporate Social Responsibility)をテーマとした調査では、聴覚障害者を多く雇用しているJTBデータサービスや、手話活動支援グループを持つリコー・ヒューマン・クリエイツなどの企業、さらに、筑波技術短期大学聴覚障害関係学科の就職支援担当部署などを訪れて、担当の方々にインタビューを行なった。また、キャノンで行なわれた「聞こえない人とのコミュニケーション研修」の見学、JTB手話サークルでの継続的な参与観察も実施している。これらから得た知見は、今後の調査結果と合わせて、来年度に投稿論文として発表する予定である。
微生物感染に対するDNA接種免疫法に関する研究

HIV-1等の微生物感染症に対するDNAワクチンの開発が可能か否かを、マウス、霊長類、その他の実験動物に用い、その免疫反応、及び感染防御能を検討した。DNAワクチンについては、マウスに3度経鼻的、あるいは経皮的の免疫方法により、極めて強い抗HIV-1抗体や細胞障害性T細胞が出現することがわかった。LI-12発現プラスミド又はGM-CSF発現プラスミドを注入すつことによって、Th1、Th2、いづれの免疫応答も強くなることが認められた。我々が作製したHIV clade CのDNAワクチンをカロリンスカ研究所へ送り、サルでの免疫原性効果をみたところ、一部防御作用があることが判明し、現在、I相に向けての検討を行っている。また、タイのPhanuphak教授とは、clade EのDNAワクチンの前臨床試験を行っており、今のところ動物で免疫原性が強いことが認められ、そのDNAワクチンを大量に増やし、I相に向けて研究を行っている。次にインフルエンザのDNAワクチンをM蛋白をコードしているDNAにCMVを結合させたワクチンを作製し、その後、インフルエンザウイルスをchallengして防御能があうかどうか検討したところ、強い防御能があることが見られた。現在、このインフルエンザウイルスのDNAワクチンが変異に抵抗して予防効果が認められることが判明したので、ferret(イタチ)をしようしたその研究を行っている。我々は20個程度CpGモチーフを含んだDNA plasmidをDNAワクチンと同時に免疫したところ、強い免疫反応が見られた。そこで、今後DNAワクチンの他にDpGモチーフのプラスミドを免疫すれば更に良いワクチンとなることが判明した。また、緑膿菌の鞭毛や線毛を用いたワクチンもマウスに免疫し、感染防御能効果があることが判明した。以上のように国際共同研究は極めて有効であった。本研究はHIV-1等の微生物感染症に対するDNAワクチンの開発が可能かどうかを国内では実験が困難である、霊長類や、その他の実験動物を使い、それらに投与した際の免疫応答を調べ、さらにモデル感染系による感染防御能を調べることにより詳細に検討する・ことを目的としている。今年度は、マウスを使った各種アジュバントの研究で、IL-12、GM-CSFの効果が確認された。また、リポゾーム、およびMono phosphoryl lipidAを併用すると、細胞性免疫、体液性免疫の両者とも上昇することがわかった。一方、HIVのワクチンとして、C型ウイルスに対するものが、アフリカ、南米、東南アジアで非常に重要であることがわかった。そこで今回我々は、このC型に対するenv、gag、pol、のワクチンを作製し、それらをマウスに免疫したさいの抗原性を確認した。また、envのDNAワクチンについては、A型、B型、E型も作製し、それらの交差反応性についても検討を行った。その結果、C型および、B型のマクロファージ感染性株のものが、交差反応性が高く、C型ワクチンの有効性が示唆された。Karolinska研究所ではSCID/huマウスによる免疫と臨床分離株を含む種々のHIV-1を用いた感染防御実験を行い、B型のenvDNAワクチン免疫群である程度の感染防御が見られた。また、タイのウイルスに対するワクチンの有効性もマウスで確認した。HIVを主とするDNAワクチンが有効か否かを、今回国内の研究だけでなく、海外の実験施設とも共同で開発している。更にDNAワクチンの臨床試験を行なっているスウェーデン・カロリンスカ研究所やアメリカのFDA等と、我々の開発したDNAワクチンを使用して共同研究を行いつつ、その有効の検討を行なった。我々が作製したHIV clade CのDNAワクチンをスウェーデンへ送り、その有効性がカニクイザルで判明した。また、調節性タンパクを投与することにより、ヒトにHIV-1抗原特異的な免疫反応が生じることが判ってきた。

共同開発実験をしているタイのPhanuphak教授とは、clade EのDNAワクチンの前臨床試験を行なっており、今のところ動物でその免疫原性が強いことが確かめられた。次にそのDNAワクチンを大量作製し、ヒトに臨床試験を行なう方向で検討をしつつある。一方、我々は今までのHIVやインフルエンザのDNAを更にヒトのコドンを使用したDNAワクチンに作り代えることによって、免疫原性が一段と強まることを見出し、新たにHIV-1やインフルエンザのDNAワクチンを作製し、臨床試験を行なう為の研究を行なっている。その他、サイトカイン発現プラスミドを使用した実験では、IL-12がTh1タイプの免疫応答を高め、GM-CSFはTh1とTh2の両方とも高めることを確認した。更に、インフルエンザM抗原のDNAワクチンを免疫したところ、インフルエンザのチャレンジを有効に防御したことが判明し、このDNAワクチンは、インフルエンザの変異原性という困難な部分を解決した良いワクチン候補になる可能性が高いと思っている。緑膿菌のDNAワクチンについては、鞭毛、繊毛の遺伝子を使用してDNAワクチンを作製し、これらを免疫とすることにより、マウスでは緑膿菌感染の防御効果があることが判明した。
中枢神経系に作用する新規プリン及びプリンヌクレオシド類の分子設計

今年度の研究目的は,ジアミノプリン誘導体が有効な学習記憶改善作用を示したので、向知能薬(抗痴呆薬)の開発に向けて研究を行った。また,新規な三環性のプリン誘導体(トリアゾロプリン)にキサンチンオキシダーゼ阻害作用が見出された。現在、痛風治療薬で尿酸生成阻害剤として知られているのはアロプリノールだけであり、これよりも強い活性を持つ化合物を見出す目的で研究を進めた。1.8-置換1-アミノ-3-メチルグアニン誘導体の合成を行い薬理活性を検討したところ、健忘を惹起することが知られているスコポラミンに対して、1-amino-3-methylguanine誘導体の中に拮抗作用を示す化合物が見つかり、脳機能改善薬としての新薬開発に向けて一般合成法を確立した。2.新規な三環性のプリン誘導体として9H-[1,2,4]triazolo[3,4-1]purine骨格を有し、その3位にアルキル又はアリール基を、また5位にクロル、アミノ、カルボニル、チオカルボニル基等の置換基が導入できる新規合成法、及びそれらのヌクレオシド類の合成法を確立させた。3.新しいタイプの痛風治療薬を開発する目的で、対照としてアロプリノールを用い、合成した化合物に対し尿酸生成酵素(キサンチンオキシダーゼ)阻害作用についてスクリーニングを行ったところ、in vivo試験において、多くのプリン及びトリアゾロプリン誘導体がアロプリノールよりも数百倍もの強い活性を示した。特に、3-p-chlorophenyl-9H-[1,2,4]triazolo[3,4-1]purin-5(6H)-oneはアロプリノールの1000倍以上の強い活性を示した。また、in vitro試験においてもアロプリノールに近い活性を持つ化合物がみつかり、今後の更なる研究により新しい痛風治療薬としての開発に期待が持てる。
化学修飾ネットワークの構造的基盤としての天然変性領域の生理的意義の解明

昨年度までの研究目的・研究計画・方法に示した実験のうち、ヒストンテイル領域の欠失変異体の作成・解析を終了し、ヒストンH4に関して今迄に確立された知見と異なる結果を得た。今年度は、H2A、H2B、H3についても詳細な解析を行ったが、それらの知見は今迄の結果と同様であった。そこで、H4のテイル領域の欠損株には、生存に影響を与えないものの、増殖には影響を与える株があるので、我々が提唱した“Modification web theory"や“Signal router theory"の仕組みを解明するための基盤となる知見を得ることができると考え、1) H3の修飾に影響を与えるか否か、2)ヌクレオソーム構造に変動があるのか否か、3)マイクロアレイ解析を行い、出芽酵母全遺伝子の発現にどのような変動がみられるかなどの検討を行った。その結果、1)、2)共に野生株、欠失変異株では殆ど差が見られなかった。この結果は、我々の提唱した2つの理論とは矛盾していないものの、一般の研究者には驚くべき知見となった。その一方で、3)の結果はテイルの欠損度の増加に伴い、遺伝子発現が変動する遺伝子数の増加に繋がっていることが示された。1)、2)及び3)の結果を総合して考えると、H4の化学修飾の欠損が起こってもH3の化学修飾の変動は起こらず、修飾ネットワーク構造の頑強性が示されていることが明らかになったことを意味している。H4の化学修飾とリンクしているであろうH2A、H2Bの化学修飾の変動が起こっているかは検討していないものの、修飾ネットワーク構造を形成するH4の化学修飾の状態が非常に悪くなれば、H4の化学修飾の役割をH3の化学修飾が補いきれなくなったことで、遺伝子発現の破綻が大きくなり、増殖能に影響を与えていることが考えられる。現在、これらの結果を論文としてまとめている。26年度が最終年度であるため、記入しない。天然変性領域の生理的意義を示す理論として世界に先駆けて提唱した“Modification web theory"、“Signal router theory"の要となる天然変性領域と化学修飾系との関係性に関する実験的検証を行った。本理論の要点は、「天然変性領域であるヒストンテイル領域は、化学修飾間ネットワーク構造の基盤になっており、天然変性領域が示す可動性・柔軟性が化学修飾の集積、及びネットワーク構造の形成・成長・進化に必要である」という点である。そこで、ヒストンテイル領域を欠損させる、或いは繋ぎ替える(変換)といった方法を用いて、可動性・柔軟性に関する変換を行い、ヒストン化学修飾、ヌクレオソーム構造状態、mRNA合成量や表現型の変化を解析した。I)ヒストンテイル領域の欠損・変換による解析ヒストンテイル領域の機能的役割を解析するため、テイル領域を欠損させた出芽酵母株を作製した。これらの株を用いて、欠損したテイル領域以外のアミノ酸残基の化学修飾の増減、ヌクレオソーム構造状態、及びmRNA合成量を検証し、テイル領域の欠損が与える影響の解析を進め、両理論を支持する結果を得た。この解析を進めていく上で、4種類のコアヒストンのテイル領域が生存に必須ではないといった従来の知見が研究の進展を阻んでいたが、ある1種類のヒストンが生存に必須であるという思いがけない知見を得た。この知見を基に、ヒストンテイル領域の欠損株を用いて化学修飾、ヌクレオソーム構造状態、mRNA合成量、表現型への影響に関しての新しい結果を得た(論文準備中)。II)ヒストンテイル領域の性質変化による解析天然変性領域の可動性・柔軟性を、各アミノ酸の構造変換許容範囲から予測し、可動性・柔軟性を変化させうるヒストン多重点変異導入株を作製した。それらの株を用いて、上述した解析を行っている。

H4の化学修飾とリンクしているであろうH2A、H2Bの化学修飾の変動が起こっているかは検討していないものの、修飾ネットワーク構造を形成するH4の化学修飾の状態が非常に悪くなれば、H4の化学修飾の役割をH3の化学修飾が補いきれなくなったことで、遺伝子発現の破綻が大きくなり、増殖能に影響を与えていることが考えられる。現在、これらの結果を論文としてまとめている。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在までの研究目的・研究計画・方法に示した実験のうち、ヒストンテイル領域の欠失変異体の作成・解析を終了し、ヒストンH4に関して今までに確立されていた知見と異なる新しい知見を得た(論文準備中)。具体的には、以下に示す通りである。30年前から20年前迄の解析では、4種類のヒストンのテイル領域の欠損があっても、生存には必須ではないという知見が得られていた。しかし、それらの知見が得られた論文を丁寧に調べると、1997年に明らかとなったヌクレオソーム構造の情報に立脚したヌクレオソーム構造からテイルが突出している部位周辺については解析がなされておらず(ヌクレオソーム構造の解明以前の機能解析であったことが、そのような結論が得られたままになっていたため、それ以上考慮されないでいたのが理由であろう)、もう一度解析し直す必要があると考えた。その解析は、我々が提唱した“Modification web theory"や“Signal router theory"の仕組みを解明するための基盤を得るために必要となるものであった。結果的に、ヒストンH4のテイル領域は生存に必須であることが分かり、従来の解析結果とは違う状況が生まれた。この結果は、今後の解析を進める上で、有利に展開しやすいものとなった(論文準備中)。更に研究を進めるにあたっては、欠失変異体だけでなく、多重点変異体の解析が必要となるため、異なるヒストン間の繋ぎ変え実験が多少遅れたものの、その分、多重点変異体の解析が進行したので、2の評価とした。長年信じられてきたヒストンコード仮説の問題点の指摘、否定、そして新しい結論を報告した。論文(Genes Cells, 14, 789-806, 2009)で論じたスケールフリーネットワーク性を有するヒストン修飾間の複雑ネットワーク構造を具体的に示す内容(ノード間の繋がり、頑強性を示す修飾の補填度など)に関する実験を開始した。上記11.で示したように、複雑ネットワーク構造の内容の基盤となる過去の知見(ヒストンH4のテイル領域の欠失変異に対しての頑強性)に重大な欠陥があったため、その点を明確にした。その知見に立脚した戦略を立てて、引き続きヒストン修飾間関係に関する解析を今後も押し進める。更に、「N:N」反応の内容の解析を進めていくにあたっても、従来の生物学研究で行われていた「1:1」「1:N」「N:1」反応で解析を進めなければならず、あるひとつの性質を解析するだけで、数十種類の多重点変異体や様々な欠失変異体を作製し、解析を進めなければならないことになる。その一方で、今迄世界に先駆けた研究を発表すると追随者がすぐ現れてきたので、本研究も論文発表後には、追随研究が現れるだろうと考えていたが、発表後5年を経過した現在でも追随研究は現れなかった。その状況は、本研究が今迄以上に非常に独創的研究として捉えることができると思われ、我々の「N:N」研究が数学的思考に弱い生物学者の理解を超えていると考えれば、説明できる。以上に示したように、解析の難しさから遅々となりやすい研究であるが、新しい学問を創造し得るヒストン化学修飾関係の複雑ネットワーク構造内の仕組みの解明に全力を挙げる。
ミリ秒電波トランジェントの発見と起源解明に向けた観測システムの開発

本研究では、電波トランジェントと呼ばれる電波帯域での突発現象を観測し、その起源解明を目的とした研究を行った。その方法として、まず那須電波観測所において観測システムを開発し、そのシステムを利用することで従来報告された電波トラジェントの性質を解き明かすことに成功し、起源について一定の制限と知見を得ることができた。本研究で得られた結果は、次世代電波観測施設Square Kilometre Arrayなどで行われるであろう電波トランジェント探査に有用な情報であり、将来の探査観測を効率的に行えると期待できる。本研究の目的は,電波帯域において急激な光度変動を起こす突発天体を探査し,その起源を解明することであった.その手段として次の二つの研究開発を行った:(1)ディジタル分光器の開発,(2)突発天体の発見速報システムの開発.まず(1)の分光器は,突発天体の検出に必要な信号処理と天体のスペクトル情報を取得する装置であり,(2)の速報システムは他の観測所による追観測を図るものである.初年度は研究対象である突発天体と同様の性質をもつCrabパルサーを観測したが,その電波パルスを検出することができなかった.本年度でその原因を究明した結果,電波受信機の不具合が見出され,修理を行うとともに感度向上を図る受信素子を導入した.それを踏まえて(1)の分光器とスペクトルアナライザを用い,装置を確実に実証できるよう銀河系内の中性水素を観測した.その結果,期待通りに中性水素スペクトルを検出し,改良した受信機と分光器によって正常にスペクトル観測が行えることを実証し,同時に銀河系の回転速度を見積もることができた.これによりCrabパルサーの観測と突発天体の探査を行うことが可能となった.また(2)の突発天体の発見速報システムによって,光度変動の緩やかな天体を発見した.突発天体のように急激な変動を示す天体はまだ発見されていないが,その原因を過去の観測結果から追究した.その結果,突発現象はその生起確率が極めて低く,発見には多くの観測時間と掃天面積が必要であることがわかった.同時に過去に発見された突発天体WJNJ1443+3439は,その起源が未知の活動銀河核によるバーストか,あるいは褐色矮星等からのフレアであることが示唆され,突発天体の起源解明に一歩近づくことができた.この研究によって今後の突発天体探査が促進され,宇宙における未知の現象が明らかになっていくだろう.本研究では、電波トランジェントと呼ばれる電波帯域での突発現象を観測し、その起源解明を目的とした研究を行った。本研究の目的は,電波トランジェントと呼ばれる短寿命の電波バースト現象について新たな知見を得ることであり,その手段として(1)ディジタル分光器の開発と(2)電波トランジェント発見速報システムの開発を行う.(1)の分光器は電波トランジェントのスペクトル情報取得のための装置であり,(2)の速報システムは他の観測所によるフォローアップ観測を促すためのものである.当該年度に置いてはまず(1)の分光器開発に先立ち,手作業に基づくスペクトル観測の試験を行った.実際には試験観測の簡略化のため,特定の天体のスペクトルを取得するという試験ではなく,Crabパルサーのジャイアントパルスを検出するという観測を行った.というのも,スペクトル観測とパルサー観測は解析方法が本質的には同じであり,またジャイアントパルスであれば短時間の観測で即座に検出できるであろうと推察されたからである.しかし実際に観測したところ,ジャイアントパルスを検出することはできなかった.観測装置の感度不足などを疑ったものの,根本的な課題はいまだ断定できていない.(1)の分光器開発については,当該年度のほとんどをこの試験観測の試行錯誤に費やし,分光ソフトウェア開発は行ってきたものの,それを実際の観測装置として実装するには至っていない.今後はシステム開発と並行して試験観測を続け,観測の試行錯誤を行っていく.また(2)の電波トランジェント発見速報システムに関しては,開発工程の7割程度を終えた.本システムは,観測データの自動解析による天体検出,既存カタログとの照合による天体同定,その解析結果の電子メール送信,という3段階に分けることができる.このうち,既存カタログとの照合プログラムが未実装であるが,それを除くプロセスを完成させることができ,その開発進捗について学会発表を行った(日本天文学会,2012年9月).GPU分光器の使用用途となる一つであるパルサー観測の試験として,観測からデータ解析まですべて手作業によるCrabパルサーのジャイアントパルス観測を行った.しかし実際にはジャイアントパルスを検出することはできず,その試行錯誤に多くの研究時間を費やすこととなってしまった.Crabジャイアントパルスの試験観測を行ったものの,ジャイアントパルスは検出することができなかった.

スペクトルデータの積分回数を増やすことでスペクトル取得やパルス観測は可能であるので,引き続きGPU分光器を開発し天体のスペクトル取得を図る.しかし同時にジャイアントパルスを検出できなかった原因を探っていく必要がある.というのも,本研究における大きな観測対象の一つであるミリ秒電波トランジェントは,本質的にはジャイアントパルスと同様のものであり,その観測能力が必要であるためである.検出できなかった原因は感度不足としか考えられないが,推測の上では感度は達成できているため,その推測の再検討と併せて他の要因も探っていく予定である.GPU分光器開発に必要となるコンピュータ等周辺機器の購入を予定している.同時に,ジャイアントパルスが検出できなかった原因を検証し,その結果次第では,ジャイアントパルスおよびミリ秒電波トランジェントの観測能力を得るための,観測機器整備費用が必要になると思われる.
口腔内細菌をターゲットとした急性冠症候群の新しい治療法開発

急性冠症候群(ACS)患者174例から採取した冠動脈内サンプル(冠動脈血およびプラーク)の58%に歯周病の代表的起炎菌P.GingivalisのDNAが検出され、同菌から分泌される蛋白分解酵素Gingipainの活性価もプラーク内で高値を示していた。歯周病治療介入によって同酵素によるプラーク破裂によるACS発症を防ぎ、将来の主要心血管イベント発生を抑制させる新たな治療概念の誕生が示唆されたが、平均観察期間14.8ヶ月の患者予後調査において、治療6カ月後の主要心血管イベント発生率と採取サンプル内P. Gingivalis陽性検出歴に統計学的相関性は認められなかった。本研究では、急性冠症候群発症における歯周病起炎菌の役割を明らかにすることで、急性冠症候群初発・再発予防における歯周病疾患治療の重要性を明らかにする。本研究では、具体的には急性冠症候群の患者の冠動脈から直接に冠動脈血、プラーク、末梢血の検体を採取する。歯周病の代表的起炎菌であるP.Gingivalis等が冠動脈プラーク内に存在するか否かを培養法およびPCR法を用いて検討する。さらに炎症性サイトカイン、血管増殖因子、MMP等の各因子を測定解析し、冠動脈プラークへの歯周病起炎菌感染およびそれに引き続く炎症が急性冠症候群の発症に関与するメカニズムについて検討する。さらに、上記を検討した患者において歯科医師との協力のもとに歯周病のスコアリングの算定および、対照群を設定した歯周疾患の治療介入を行い急性冠症候群の発症に及ぼす効果について、前向きに追跡調査を行う。急性冠症候群の患者で経皮的冠動脈形成術を行なった、連続174例で、冠動脈から採取した吸引物においてPCR法で38%の症例でP.GingivalisのDNAが陽性であった。本研究は、歯周疾患起炎菌が急性冠症候群発症に関与するか否かを直接検討する初めての研究で、同等の報告はこれまでになく、極めて独創的である。本研究により、冠動脈プラークへの歯周病起炎菌の直接感染が急性冠症候群発症の一因になっていること、および治療介入により心血管イベントの発症が抑制されることが推測される。これらが明らかになり、本研究で歯周病起炎菌感染が急性冠症候群の発症に寄与するという概念を支持する重要な証拠が得られれば、心血管イベント予防のための全く新しい臨床的アプローチが得られる可能性がある。いくつかの検体は電顕にて観察したが、P.Gingivalisの菌は確認できなかった。しかしながら、P.Gingivalisが分泌する蛋白分解酵素であるGingipainが吸引物から検出され、数件の検体からは正常値の数十倍の数値で検出された。本研究は急性冠症候群(以下ACS)発症患者における歯周病罹患の有無とその起炎菌の役割を明らかにし、歯周病への治療介入がACSの初期発症および再発予防に重要であるか否かを検証するものである。

ACS患者へ緊急的心臓カテーテル検査・血管形成術を行う際にインフォームドコンセントが得られた対象者から冠動脈血、冠動脈内プラーク、末梢動脈血を同時採取し、代表的な歯周病起炎菌Porphyromonas Gingivalis(以下P. Gingivalis)の陽性率をPCR法で調べた。連続174対象例の全サンプルにおけるP. Gingivalis DNA陽性率は38%であったが、冠動脈内サンプル(冠動脈血+冠動脈内プラーク)においては58%であった。電子顕微鏡では同菌を確認できなかったが、Z-Phe-Arg-MCA分解活性測定法で分泌蛋白分解酵素Gingipainの活性価を測定したところ、冠動脈内サンプル内で高値を示していた。P. Gingivalis検出陽性患者においては、血中の高感度CRPおよびinterleukin-6濃度が有意に上昇していた。以上より、冠動脈プラークへの歯周病起炎菌P. Gingivalisの直接感染はACS発症の一因となるだけでなく、歯周病への治療介入が心血管イベント発症を抑制する可能性が示唆された。今回、P. Gingivalis検出陽性および陰性2群間の予後調査をACSの初期治療後平均14.8ヶ月間において行ったが、治療半年後における心血管イベント発生率に統計学的有意差は認められなかった。テレフォンインタビューによるACS治療後の歯科治療歴や除菌状態調査では不明な点も多く見受けられ、詳細な情報を基にした多数の対象者群間における統計学的評価が難しかったことも要因の一つと考えられた。今後も引き続き調査を継続し、長期予後についてさらに検証を加えてゆく。
超大気圧イオン化法を用いた新たな高速質量分析手法の開発

市販液体クロマトグラフィーultra-HPLCシステム(Shimadzu Nexera)を高圧高温エレクトロスプレーイオン源に接続して、高速の液クロ・質量分析の実験を行った。検証実験のため、キャピラリーカラム温度を常温から150度まで加熱できる制御システムを作製した。イオン源圧力は最大30気圧、最高温度が350度までに安全に作動できるように設計・作製した。予備実験によって市販の耐熱のカーボンカラム(Thermo社製graphitic carbon)が高温液体クロマトグラフィーに適することが分かった。カラム内径1mmと0.1mm,カラム充填材として直計3ミクロンと5ミクロンのカーボン粒子を検討した。低い移動祖流量分析には内径0.1 mmのカラムが適することが分かった。分子量500 Da以下の医薬物の試料を用いて、高温液体クロマトグラフィー・高圧エレクトロスプレー質量分析法の検証を行った。動作温度を150度に上げたことで、低い流速でも分析速度の向上が確認された。医薬物の試料を用いた検証成果は学術論文誌Analyst (vol 143, pp. 5552-5558, 2018)に発表した。構築した高温液クロマトグラフィーと高圧エレクトロスプレーイオン源を用いて質量500Da以下の薬物の測定を行った。高温による薬物分子の分離速度が向上することが実証されたため、実験が順調に進められるようになった。分子量1000Da以上のペチド、タンパク質などを用いて検証を行う予定である。アミノ配列の長い試料に対し、液体クロマトグラフィー移動相の組成、分析条件の最適化を行う。タンパク質の配列を高速で分析するために液体クロマトグラフィーの自動注入システムと分析カラムの間にオンラインの高温消化部を導入する。タンパク質の実験結果は日本質量分析討論会、分析化学学会に報告する予定。平成29度に導入した市販ultra-HPLCシステム(Shimadzu Nexera)に結合できる、かつ200度まで加熱できるLCカラム加熱部の設計と作製が完了した。LCカラム加熱部には予備加熱キャピラリーが含まれている。ヒーターブロックの材質は熱伝導率の良いアルミを採用した。LCカラムの温度制御には白金温度センサーと工業用温度コントロラーが含まれている。LCカラム加熱部を高圧エレクトロスプレーイオン源に接続するためのインターフェースの構築を行った。インターフェースは絶縁用のキャピラリーが含まれている。キャピラリーの材質は内径0.05mmのフューズシリカを採用した。市販の耐熱の分析カラム(Thermo社製graphitic carbon)を用いてシステムの最適化のための予備実験が開始した。高温液クロマトグラフィーシステムの構築が完了し、既存の高圧エレクトロスプレーイオン源及び質量分析計への搭載が成功したため、第一段階の評価実験が順調に進められるようになった。より高速かつ高感度の測定ができるために、分析カラムの内径、長さ、固定相の特性の最適化が予定されている。ultra-HPLCシステム、LCカラム加熱部、高温イオン源を用いて、動作温度、移動相の流量、イオン源の温度などの評価実験を行う。評価実験では一般の標準評価試薬を用いる。分析速度とイオン源感度に最適な溶液流量と背圧なども検討する。評価実験の結果に基づいて最適な形状、寸法を持つイオン源を新たに設計する。
分子進化工学の手法を応用した低分子抗原特異的一本鎖抗体の開発

タンパク質の糖化反応生成物であるAGE (Advanced GlycationEndproduct)は、多種多様な構造を持つ低分子量の翻訳後修飾体である。糖尿病関連疾患の研究を進める上で有用なAGE認識抗体を調製するため、化学的にAGE修飾したデンドリマー型合成ペプチドとファージディスプレイ法を用いて、GA-pyridineと呼ばれるAGEに対して、特異性ならびに結合性が高い一本鎖抗体の開発研究を行ったタンパク質の糖化反応生成物であるAGE(Advanced Glycation Endproducts)は,多種多様な構造を持つ低分子量の翻訳後修飾体である.糖尿病関連疾患の研究を進める上で抗AGEモノクローナル抗体は有用であるが,エピトープであるAGEが低分子化合物であり,様々なタンパク質分子上に生成するため,従来の方法では特異性ならびに結合性が高い抗AGEモノクローナル抗体を作製するのは困難である.そこで本研究では,化学的にAGE修飾した合成ペプチド(デンドリマー型ペプチド)と分子進化工学の手法を用いて,特にGA-pyridineと呼ばれるAGEに対して,特異性ならびに結合性が高い遺伝子組換え型抗体(一本鎖抗体;scFv)の開発研究を行った.1.デンドリマー型ペプチドを免疫したマウスから抗体可変領域(Fv)遺伝子ライブラリーの作製して,ファージディスプレイ法によるスクリーニングを行い,GA-pyridine高親和性scFvの獲得を進めているが,現時点では目標としている特性を持つクローンは得られていない.現在,条件を変えながら引き続きスクリーニングを続けている.2.既にファージディスプレイ法により獲得しているGA-pyridineを認識するAGE73scFvをもとに,error-prone PCRによるランダム変異導入した遺伝子ライブラリーを作製した後,ファージディスプレイ法によりGA-pyridineに高親和性を示すAGE73scFv変異体のスクリーニングを行った.その結果,GA-pyridineを含むペプチドに対する結合活性が約2倍上昇し,結合活性の熱安定性が大きく向上したクローンを獲得することができた.さらに熱力学的解析を行い,本質的な抗原結合活性を解明した.本研究の方法により,今後進める生体内でのAGE探索系の開発に有用な抗体分子の獲得に成功した.タンパク質の糖化反応生成物であるAGE (Advanced GlycationEndproduct)は、多種多様な構造を持つ低分子量の翻訳後修飾体である。糖尿病関連疾患の研究を進める上で有用なAGE認識抗体を調製するため、化学的にAGE修飾したデンドリマー型合成ペプチドとファージディスプレイ法を用いて、GA-pyridineと呼ばれるAGEに対して、特異性ならびに結合性が高い一本鎖抗体の開発研究を行ったタンパク質の糖化反応生成物であるAGE(Advanced Glycation Endproducts)は,多種多様な構造を持つ低分子量の翻訳後修飾体である.糖尿病関連疾患の研究を進める上で,抗AGEモノクローナル抗体は有用であるが,エピトープであるAGEが低分子化合物であり,様々なタンパク質分子上に生成するため,従来の方法で,特異性,ならびに,結合性が高い抗AGEモノクローナル抗体を作製するのは困難である.本研究では,化学的にAGE修飾した合成ペプチド(デンドリマー型ペプチド)と分子進化工学の手法を用いて,各種AGEに対して,特異性,ならびに,結合性が高い遺伝子組換え型抗体(一本鎖抗体;scFv)の開発研究を行う.(1) AGEで修飾されたデンドリマー型ペプチドの作製ー(-Gly-Ala-Gly-(Lys/Arg)-Gly-Ala-Gly-)をコア配列とするデンドリマー型ペプチドを合成し,反応性の高いα,β-ジカルボニル化合物を反応させ,多種多様のAGE修飾体を得た.(2) AGEで修飾されたペプチド,および,タンパク質のマウスへの免疫ーAGE修飾されたデンドリマー型ペプチドをマウスに免疫し,血清中の抗体価が上がったマウスより脾臓を摘出した.(3)抗体可変領域(Fv)遺伝子ライブラリーの作製,および,ファージディスプレイ法による組換え抗体分子のスクリーニングーマウス脾臓より,RT-PCR法によって,IgG抗体の重鎖および軽鎖Fv遺伝子ライブラリーを作製し,ファージディスプレイ法によるスクリーニングにより, AGEを識別する組換え型モノクローナル抗体(一本鎖抗体;scFv)の獲得を進めている.AGEで修飾されたデンドリマー型ペプチド〔(-Gly-Ala-Gly-(Lys/Arg)-Gly-Ala-Gly-)をコア配列〕を合成し,グリコールアルデヒドを反応させ,多種多様のAGE修飾体を得ることに成功した.さらに,このAGE修飾ペプチドをマウスへの免疫し,血清中の抗体価が上がったマウス得ることができた.マウスの脾臓より,RT-PCR法によって,IgG抗体の重鎖および軽鎖Fv遺伝子ライブラリーを作製し,scFv遺伝子ライブラリーの調製にも成功した.現在,ファージディスプレイ法によるスクリーニング進めており,今年度中には,目的のAGEを識別する組換え型scFv抗体を獲得できるものと考えている.以上,ほぼ計画通りに研究は進展している.申請書での計画通り,研究を推進する.研究費に関して,平成23年度に未使用額があるが,少ない(952円)ので,計画変更は行わない.申請書での計画通りに使用する.
成城小学校におけるドルトン・プラン受容の史的再検討

大正新教育の中心的存在の一つであった成城小学校においては、1924年4月以降、ドルトン・プランに備わっていた学校組織全体で「協同」を保障するための仕組みが、成城小で開発されていた自学法の弊害を克服するために積極的に摂取されていった。すなわち、「学校の社会化」を目的とするドルトン・プランと、「学習の個別化」を強く志向する成城小学校の自学法との間には、依然として教育目的上のズレや差異が存在していた。当該年度においては、提出した「研究の目的」と「研究実施計画」の内容に即して、1924年4月から1928年3月までの私立成城小学校におけるドルトン・プランの本格的実践の史的再検討の作業を進めた。そこで得られた具体的な成果は以下の諸点である。第一に、成城学園初等学校、および成城学園教育研究所における所蔵史料の調査を実施し、新らしい史料を発見することができた。これらは、管見の限り、先行研究において用いられてこなかったと見られることから、今後の研究の進展にとって大きな意義を有するものと考えられる。また、上記の調査を通じて入手した史料群の詳細な分析の結果、以下の(1)、(2)が明らかとなった。すなわち、(1)ドルトン・プランに備わっていた、学校組織全体で「協同」を保障するための仕組が、成城小における教育実践の抱えていた弊害を克服するために積極的に摂取されていったことが解明された。他方で、(2)「学校の社会化」を目的とするドルトン・プランと、「学習の個別化」を強く志向する成城小学校の自学法との間には、依然として教育目的上のズレや差異が存在していたことも判明した。上述の諸成果は、本研究の「研究実施計画」において期待された成果を実現したものといってよい。さらに、当該年度において得られた知見は、日本カリキュラム学会第24回大会において「成城小学校におけるドルトン・プランの本格的実践」と題して発表した。その後、同学会の紀要に同題の論文として投稿し、査読の結果、採録されることも決定した。当初の研究計画に基づき、1927年12月の沢柳政太郎の急死以後の成城小学校における教育方法改革の方向性に関する分析を進めた。やや具体的に述べるならば、同校の機関誌『教育問題研究』の記事の分析、成城学園が所蔵している資史料の調査に加え、1920年代末から1930年代前半に成城小における教育を受けた卒業生の方々4名に聞取調査を実施した。これらの検討の結果、研究計画において採用した作業仮説を修正する必要があることが明らかになった。やや具体的には、上記の卒業生の証言をもとに1930年代以降の教育実践の中心的な担い手となったと見られる小林茂、内田庄次、田中末広らといった教師たちの動向と言説を分析する過程で、ドルトン・プランのみに限らず、同時代の教育界において注目されたウィネトカ・プランや郷土教育の影響を考慮に入れなければ、同校の教育改革の方向性と到達点を適切に評価することができないことが判明してきた。そして、以上に述べた知見と、ドルトン・プランが成城小の教師をして自らの「自学主義」の抱える課題や欠点を自覚させ、一定の軌道修正を図らせる契機となったという前年度の研究成果とを総合しながら、1930年代に入ってからの成城小の教育改革の課題が、個別学習と協同学習との総合や調和の実現にあったことが解明されつつある。今後、これらの成果を踏まえ、成城小における教育研究の到達点と限界の史的再評価に向けて実証的な解明を試みる予定である。すでに、そのための基礎作業となる論文を発表済みである。さらに、その続編にあたる論文も、現在、発表に向けて準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。教育史26年度が最終年度であるため、記入しない。「研究実績の概要」においても述べた通り、所期の史料調査を実施することができたこと、さらに、投稿した論文が学会誌に採録されたことから、提出した「研究の目的」と「研究実施計画」において期待された成果を実現することができたと考えられる。また、それのみに留まらず、史料調査によって得られた史料群からは、これまでの仮説の再考を迫る史実の存在が読み取れるものまでもが発見された。今後は、上記の成果を踏まえて、さらに慎重な分析を進めていく必要がある。さしあたっては、当初に提出した「研究実施計画」に示した仮説と課題に即して分析作業を進めていく予定である。ただし、今後の史料調査の成果によっては、これまでの研究枠組では合理的に説明し切れない史実が明らかになる可能性が十分に考えられる。その際には、新史実をも含み込んだ整合的な研究枠組の再構築に取り組む必要があるだろう。
ヒト腫瘍浸潤リンパ球の自己腫瘍に対する抗腫瘍活性の誘導とその癌治療への応用の研究

1)担癌患者末梢血リンパ球をインターロイキン-2(IL-2)と共に3日間培養して誘導したlymphokine-activated killer(LAK)細胞による養子免疫療法を行った。静脈内全身投与に比べ動脈内あるいは体腔内局所投与の治療効果が良好であった。2)固形癌における腫瘍浸潤細胞の半数をTリンパ球が占め、末梢血に比べCD8陽性細胞優位であった。腫瘍内浸潤リンパ球(tumor-infiltrationg lymphocyte;TIL)はγδT細胞を含み、大腸癌ではその大部分が末梢血とは由来の異なるCD8陽性γδT細胞であった。肝細胞癌においてγδT細胞の比率が高かった。3)TILをin vitroで増殖させるためにはIL-2のみの添加培養では不十分であり、LAK細胞を誘導したあとのconditioned mediumを20%加えることにより極めて有効に増殖させうることを明らかにした。4)TILの腫瘍細胞に対する細胞障害活性は分離直後には検出されず、培養2週間から3週間で最高に達し、4週間から7週間で認められなくなった。細胞障害活性の消失後にphytohemagglutinine(PHA)を添加することによってその活性が部分的に回復することを明らかにした。5)治癒切除可能進行胃癌症例の術前にbiological response modifier(BRM)であるOK-432を内視鏡的に腫瘍内局所注射してTILを活性化し、術後の生存率を対照群と比較した。TIL数の僅少な症例では予後の改善は全く認められなかったが、TILが中等度以上存在する症例ではその活性化によって有意な3年生存率の向上が認められた。岡山大学医学部第1外科において手術された消化器癌組織を使用して研究を行った。切除腫瘍組織を細切し、コラゲナーゼ,ヒアルロニダーゼ処理により腫瘍浸潤リンパ球を生細胞として分離採取し得た。その細胞表面マーカーを単クローン抗体を使用したフローサイトメリーで検索したところ、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)には、CD3、CD8、CD4、Leu7、CD16、Leu19、CD25陽性細胞が認められた。その比率は末梢血と比較すると、CD16、Leu19、CD25陽性細胞の比率が高かった。一方、Leu7陽性細胞の比率は低値であった。TILの腫瘍細胞障害活性を、4時間^<51>Cr遊離試験で測定すると、新鮮TILには全くこれを認めなかった。末梢血リンパ球をリコンビナント、インターロイキン2(rIL-2)と3日間培養すると自己腫瘍を障害するリンホカイン活性化キラー細胞(LAK)が誘導されたが、TILの3日間培養では誘導されなかった。TILからのLAK活性の誘導は可能であり、TILをrIL-2とともに10日から14日間培養することによりLAK活性が誘導された。誘導されたLAK細胞は自己腫瘍障害活性が認められた。現在、rIL-2以外のサイトカイン、即ちガンマ-インターフェロン、腫瘍壊死因子等を添加することにより、その誘導されるキラー活性の増強が起こり得るかどうかを検討中である。末梢血より誘導されるキラー細胞は、TILから誘導されるそれと、その誘導条件が異ることから異る細胞集団に属している可能性が高い。この違いを明らかにするためにはクローン化キラー細胞が必要であり、TIL、末梢血リンパ球に加え、リンパ節リンパ球からのキラー細胞のクローニングを計画している。又、細胞障害活性、細胞表面マーカーの違いを明らかにするだけでなく、リンホカイン産生能の違いをも明らかにし、より有効なリンパ球移入療法による癌治療に資することを計画している。1.岡山大学第1外科で手術された各種臓器癌組織から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を分離採取して研究に用いた。

その分離において、組織片をコラゲナ-ゼ、ヒアルロニタ-ゼ、DNaseで18時間処理した時、最も純度の高いTILが得られた。2.TILの培養は、ヒト血清加RPMI培地にヒトリコンビナントIL-2を加えて行ったが、この時ヒト末梢血からのLAK細胞誘導に使用したspent mediumを加えるとTILの増殖は著しく増強した。3.TILの細胞障害活性の誘導には、末梢血からのLAK細胞誘導と異り7日から10日間を要した。ひきつづき培養を続けると、bulk cultureの場合にもクロ-ン化した場合にも、細胞障害活性は1ヵ月を過ぎると漸次低下した。臨床的に治療に用いるためには、低下した細胞障害活性を回復される手段が必要であると考えられた。4.細胞障害活性の低下はたTILをPWM結合ビ-ズと短時間接触させることにより細胞障害活性を回復され得ることを見出した。この方法によって摘出された腫瘍組織から抗腫瘍活性をもつリンパ球を無限に得ることができ、永続的な培養TILを用いた養子免疫療法が可能となった。5.TIL中には、末梢血に比べてγδ型T細胞レセプタ-(TCR)をもつTリンパ球が多く含まれることが明らかとなった。6.腫瘍組織の組織免疫染色法によって、γδ型TCR陽性T細胞は間質の毛細血管にそってびまん性に浸潤していることが明らかになった。7.今後、培養TILを抗腫瘍活性を上昇させた状態で癌患者に移入する養子免疫療法を計画している。8.今後、ヒトにおいてγδ型TCRをもつリンパ球が自己腫瘍と反応していることを証明する研究を計画している。
統計的依存時間の方法による臨界緩和スペクトラム

統計的依存性の方法を用いることにより、二次元イジングモデルの動的臨界指数を精度よく求めた。また、統計的な依存性のために種々の感受率に偏差が生じる問題を詳細に検討し、計算機シミュレーションによる有限時間の計算では必ず感受率や高次のキュムラントに偏差が伴うこと及びその偏差を定量的に求められることを確かめた。
質的量的変動を指標とする細胞分化制御転写因子・クロマチン因子の網羅的同定法の開発

細胞分化の制御の根幹は転写因子やクロマチン因子が担うことが明らかになっているが、これらタンパク質は存在量が微量であることから解析が困難であり、例えば1,000種以上あるとされる転写因子の中で、機能解析の対象となっているのはそのごく一部である。本研究では、質量分析法により、分化前後の核内に存在するタンパク質量や翻訳後修飾の相対定量比較を行い、制御因子候補を同定する技術を開発した。Bリンパ球と形質細胞をモデルとして、核質やクロマチン結合因子の相対定量を試みた。その結果、既知制御因子の変化を確認でき、さらに新規制御因子候補を多数特定できた。細胞分化の本質は、遺伝子発現を変え、その変動をクロマチンレベルで安定化することにある。細胞分化を制御する転写因子は、主に細胞特異的遺伝子の制御機構の解析や、細胞間の遺伝子発現パターンの違いをRNAレベルで比較することにより発見されてきた。しかし、マウスが有する2,348ヶの転写因子の多くは未だに機能が不明である。そこで本研究では、高感度質量分析器を用いて核の中に存在するタンパク質や、クロマチンに強く結合しているタンパク質のプロファイリングを行い、細胞間で定量比較することにより、細胞分化状態の誘導や維持に関わる転写因子とクロマチン構造制御因子を特定する。また、翻訳後修飾(リン酸化、アセチル化)も定量的比較できる測定法を開発する。これにより、機能未知の転写因子等の研究を進めるための基盤とする。今年度は、Bリンパ球株と形質細胞株を用いて、Bリンパ球から形質細胞へと分化する過程のタンパク質の量および翻訳後修飾を例として解析系を確立することを試みた。これら細胞を安定同位体標識アミノ酸存在下で長期間培養することで、タンパク質をそれぞれ特異的同位体で標識した細胞を用意した。ここから核を単離し、低塩濃度で抽出される核可溶性分画とクロマチン分画を調整した。二つの細胞から調整したものをそれぞれ等量混合した後にSDS-PAGEで分離し、移動度に従って12分画にさらに分けた。定法にしたがって処理し、LC-MS/MS解析を実施した。核抽出液でもクロマチン抽出液でも3000種を越えるタンパク質の相対定量に成功した。また量比についての再現性も高いことを確認した。さらに、転写因子のような存在量が低いものも多数定量できたことから、感度も十分に高いと考えられた。様々な工夫を組み合わせることで、定量性、感度、いずれの面でも再現性の高い相対比較法を確立することができたと結論した。本研究では、高感度質量分析器を用いて核の中に存在するタンパク質や、クロマチンに強く結合しているタンパク質のプロファイリングを行い、細胞間で定量比較することにより、細胞分化状態の誘導や維持に関わる転写因子とクロマチン構造制御因子を特定することを試みた。まず、Bリンパ球株と形質細胞株を用いて、Bリンパ球から形質細胞へと分化する過程のタンパク質の量および翻訳後修飾を例として取りあげた。核抽出液でもクロマチン抽出液でも3000種を越えるタンパク質の相対定量に成功し、再現性も高いことを確認した。転写因子を多数定量できたことから、感度も十分に高い。この実験結果から、形質細胞分化に関わることが予想されるクロマチン因子をいくつか特定し、そのなかの1つについては機能解析を目指し、コンディショナルノックアウトマウスの作製を進めているところである。また、転写因子Bach2について、リン酸化部位の特定を進めた。上記実験で確立した相対定量の系を用いることで、B細胞ではBach2の72カ所のセリン、スレオニン残基がリン酸化されることを見いだした。さらにこの中の一カ所が機能制御に必須であることも証明した。医歯薬学上に述べた解析手法では、転写因子のように存在量がごく低いものも多数相対定量することができた。例えばBリンパ球系転写因子であるPax5やBach2のmRNAは、Bリンパ球で発現し、形質細胞では発現が失われることが報告されてきた。今回の相対定量法では、Pax5とBach2はいずれもBリンパ球細胞株では形質細胞株と比較して10倍以上の蛋白質量であることが確認された。

逆に形質細胞特異的転写因子であるBlimp-1のタンパク質はBリンパ球では形質細胞の1/10以下であった。このように、存在量が少なく分析が難しいとされてきた転写因子についても、分化段階の過程で存在量を相対定量していくことが可能となった。また、この相対定量ではタンパク質量のみならず、翻訳後修飾量の相対比較も可能であることを確認している。特にリン酸化やアセチル化の変動はある程度の感度で測定できる目処がたった。さらに、サンプル前処理に自動化二次元電気泳動装置を組み合わせることでさらに感度を上げることが可能になりつつある。これは企業との共同研究であり本萌芽研究自体というものではないのだが、本研究の目的を達成する上で重要な技術改良になりつつある。すなわち、自動化電気泳動装置であることからサンプル泳動パターンの再現性が高く、これを用いることでサンプル組成を単純化し、それにより感度をあげるという戦略である。このような発展性も現実的なものになっており、そして上に述べたように再現性と感度の高い相対定量質量分析法を確立できたという観点から、おおむね順調に進展していると評価するものである。質量分析計を用いた相対定量法の信頼性を最大限高めるためには、それ以前の段階において実験操作上あるいは測定機器の性質上の原因で生じうる誤差を補正することが望ましい。まず、クロマチンタンパク質の収量の違いをサンプル間で補正することが必要であろう。これには、ヒストン由来のペプチドのうち修飾を受けないようなものを選んで、その量比で全体の解析結果に補正をかけることが考えられる。その後MS測定のためのサンプル処理およびMS測定時に生じうる誤差については、マウスのデータベースにはない配列のペプチドを予め一定量混入してサンプルを処理、測定、解析し、得られたそのペプチドの量比の値をもとに全体の結果に補正をかけることが考えられる。これらの手法を組み合わせて信頼性の高い定量比較を行う方法を確立する。分化の過程で転写因子やクロマチンタンパク質が受ける翻訳後修飾、特にリン酸化とアセチル化の変動を網羅的に解析する。調製したクロマチンタンパク質をトリプシンなどで断片化した後、二酸化チタンビーズあるいは抗アセチル化リジン抗体を用いたアフィニティ精製によってそれぞれリン酸化ペプチド、アセチル化ペプチドを濃縮したうえでLC-MS/MS分析を行い、修飾を受けているタンパク質を同定する。さらに、この解析を前述のように定量的に行って、修飾を受けるタンパク質とその部位、修飾の種類や量などを異なる細胞間で比較できるようなデータを得る。以上の測定データベースから、タンパク質モチーフに基づいて転写因子やクロマチン制御因子を抽出したリストを作成する。その中から、形質細胞分化に伴って量、あるいは翻訳後修飾が大きく変動するものをさらに絞りこむ。これらについて、ドメイン構造やその組み合わせ、タンパク質間相互作用、発現分布などに関する情報を公的データベースから取り込み、統合したデータベースを構築する。