hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管石灰化の発症・進展における低酸素応答性転写因子HIF-1の役割に関する研究

血管石灰化の発症・進展におけるマクロファージのHIF-1の役割について検討した。アポEノックアウトマウスにおいて動脈硬化病変内の低酸素領域にマクロファージが局在するとともにoncostatin M (OSM)の発現が確認された。OSMはJAK3-STAT3シグナル伝達経路を介して血管平滑筋細胞の骨芽細胞への分化を促進した。一方、HIF-1はマクロファージにおけるLPSによるOSMの誘導反応に対して抑制的に作用した。したがって、マクロファージにおけるHIF-1はOSMの発現を低下させることにより血管石灰化の発症に抑制的に作用する可能性が示唆された。【マクロファージにおけるOSMの発現調節機構とHIF-1aの関与についての解析】ヒト単球様細胞株(THP-1細胞)をPMAで48時間処理することによりマクロファージ分化させた(THP-1マクロファージ)。LPSはOSM遺伝子およびOSMタンパクの発現を用量依存的に促進した。LPSによるOSMの発現誘導は選択的COX-2阻害剤の添加により有意に抑制された。また、THP-1マクロファージにおけるCOX-2の発現はLPSにより強力に誘導され、PGE2の添加はOSMの発現を有意に促進した。さらに、EP4阻害剤であるL161,932によりLPSによるOSMの発現誘導が有意に抑制された。したがって、THP-1マクロファージにおけるOSMの発現誘導にはCOX-2の発現誘導を介する内因性PGE2の産生が関与しており、さらに、EP4受容体を介してOSMの発現を上昇させることが示唆された。THP-1マクロファージにおいてLPSがHIF-1aの遺伝子発現を誘導するとともにOSMの遺伝子発現を上昇させることが明らかにされた。また、Dimethyloxalylglycine (DMOG)とLPSの同時添加では、HIF-1a蛋白の発現上昇と共にcyclooxygenase-2 (COX-2)の蛋白発現も増加した。Cobalt chloride (CoCl2)の前処理によりHIF-1a蛋白の発現が増加したが、その後のLPS添加ではHIF-1&#61537;の発現は影響されなかった。また、CoCl2によるHIF-1a蛋白の上昇はLPSによるOSMの分泌誘導にも影響しなかった。マウスマクロファージ様細胞株(RAW264.7細胞)においては、CoCl2の前処置によりLPSによるOSMの遺伝子およびOSMタンパクの発現誘導が有意に増強された。また、CoCl2の前処置によりLPSによるCOX-2の発現も増強された。以上のことから、少なくともマウスのマクロファージ系細胞においてHIF-1aはLPSによるOSMの誘導を促進する可能性が示唆された。【血管平滑筋細胞の骨芽細胞への分化に対するマクロファージ由来のoncostatin M (OSM)の作用とその機序の解析】種々のヒト動脈(臍帯動脈、大動脈、冠動脈)由来の血管平滑筋細胞に対するOSMの骨芽細胞への分化促進作用について検討した。いずれの動脈由来の血管平滑筋細胞においても分化メディウム存在下でOSMはalkaline phosphatase (ALP)活性を上昇させるとともにin vitroでの石灰化を促進した。また、骨芽細胞の分化マーカーであるRunx2およびALP遺伝子の発現も上昇させた。次に、OSMの骨芽細胞への分化促進作用の機序を臍帯動脈由来の血管平滑筋細胞において検討した。OSMが血管平滑筋細胞においてSTAT3のリン酸化(活性化)を引き起こすことをウエスタンブロット法により確認した。このOSMによるSTAT3のリン酸化はJAK3の阻害剤であるWHI-P154により用量依存的に抑制された。WHI-P154はOSMによるALP活性の誘導を用量依存的に抑制した。また、10 microM WHI-P154はOSMによる石灰化をほぼ完全に抑制した。WHI-P154はOSMによるALP mRNAの発現誘導を有意に抑制したが、OSMによるRunx2 mRNAの発現誘導は抑制されなかった。JAK3をsiRNAによりノックダウンしたところ、OSMによるALP活性の上昇およびin vitroでの石灰化は有意に抑制されたが、ALPおよびRunx2の遺伝子発現は抑制されなかった。一方、STAT3をsiRNAによりノックダウンしたところ、ALP活性、ALP遺伝子の発現およびin vitroでの石灰化はほぼ完全に抑制された。以上の結果から、OSMはJAK3-STAT3シグナル経路を介して血管平滑筋細胞において骨芽細胞への分化を促進することが示唆された。マウスマクロファージ様細胞株(RAW264.7細胞)において、血管平滑筋細胞の骨芽細胞への分化誘導作用を有するoncostatin M (OSM)の発現調節機構とそれに対するHIF-1aの関与についてさらに検討した。Dimethyloxallylglycine (DMOG)によりHIF-1a蛋白の発現を上昇させると、LPSによるOSMの誘導反応が有意に抑制された。さらに、RAW264.7細胞を低酸素下(1% O2)で培養すると、HIF-1aの蛋白発現が上昇するとともにLPSに対するOSMの誘導反応は有意に抑制された。一方、ChetominによりHIF-1の転写活性を阻害すると、LPSによるOSM誘導反応は有意に増強された。また、siRNAを用いてHIF-1aの発現をノックダウンするとLPSによるOSMの誘導反応は有意に増強された。

次に、ヒト単球様細胞株(THP-1細胞)をPMAでマクロファージに分化させた細胞(THP-1マクロファージ)において上記と同様の検討を行った。2-deoxyglucoseによりHIF-1a蛋白の発現を抑制すると、LPSによるOSM誘導反応は有意に増強された。また、HIF-1aの阻害剤であるLW6の処理によりLPSによるOSMの誘導反応は有意に増強された。一方、CoCl2によりHIF-1a蛋白の発現を上昇させると、LPSによるOSM誘導反応は有意に抑制された。以上の結果から、HIF-1aはLPSによるOSMの発現誘導に対して抑制的に作用しており、その結果、血管石灰化にも抑制的に作用する可能性が示唆された。最後に、マクロファージ特異的にHIF-1aを欠損した動脈硬化モデルマウスであるapoEKO/Mac-HIF-1αKOマウスを作製した。このマウスに由来する腹腔マクロファージにおいてHIF-1a蛋白発現の著明な低下を確認した。動脈硬化性プラークの石灰化に対する影響については現在検討中である。血管石灰化の発症・進展におけるマクロファージのHIF-1の役割について検討した。アポEノックアウトマウスにおいて動脈硬化病変内の低酸素領域にマクロファージが局在するとともにoncostatin M (OSM)の発現が確認された。OSMはJAK3-STAT3シグナル伝達経路を介して血管平滑筋細胞の骨芽細胞への分化を促進した。一方、HIF-1はマクロファージにおけるLPSによるOSMの誘導反応に対して抑制的に作用した。したがって、マクロファージにおけるHIF-1はOSMの発現を低下させることにより血管石灰化の発症に抑制的に作用する可能性が示唆された。当初の予想どおり、マクロファージに由来するoncostatin M (OSM)が血管平滑筋細胞の骨芽細胞への分化をJAK3ーSTAT3経路を介して促進することが明らかにできた。この成果からおおむね順調に進展していると判断する血管病態学今後は、動脈硬化モデルマウスを用いたHIF-1aの役割の検討を中心にすすめる。マクロファージに由来する血管石灰化促進因子oncostatin M (OSM)の発現調節機構について、LPSによるOSMの発現調節経路(LPS-TLR4-COX2-PGE2-EP4受容体-OSMの発現)を明らかにした。また、HIF-1aタンパク発現の増加により、LPSによるOSMの誘導反応が増強されたことから、HIF-1aがOSMの発現調節に関与していることが示唆された。以上の成果からおおむね順調に進展していると判断する。次年度に多くの物品購入が予想されるため、本年度の物品購入を抑えた。今後はマクロファージに由来するOSMの血管平滑筋細胞への作用(骨芽細胞への分化促進作用)の検討とin vivoでの動脈硬化モデルマウスを用いたHIF-1aの役割の解析を予定どおり行う。主にマウスを用いた解析のための物品費(血液検査、標本作成、免疫染色用の抗体購入など)に充てる。少額のため次年度に繰り越す実験試薬の購入にあてる
リンパ管網形成と静脈網形成を請け負う脈管芽細胞のイメージングと細胞特性の解析

血管内皮細胞特異的に蛍光蛋白EGFPを発現するトラスジェニック・ゼブラフィッシュTg(flil;EGFP)y1のタイムラプス・イメージングにより、以下のことを明らかにした。リンパ管発生に関わる細胞は後主静脈(PCV)を起源とする脈管芽細胞で、本来は節間静脈(ISV)になりうる細胞群である。後主静脈から伸び出た内皮細胞は節間静脈(二次節間血管)を形成すべく、先に背側大動脈(DA)から伸びた節間動脈(一次節間血管)に接触し連絡する。この後、二次節間血管と連絡した節間動脈は節間静脈に変貌する。ところが、一部の二次節間血管の内皮細胞の動脈との連絡を果たすことなく、体壁の水平筋間中隔に留まり、やがてこの細胞群の一部が胸管系のリンパ管を形成する(受精後2日-4日)。またこの細胞群の他の細胞は体壁の筋節の循環で主要な位置を占める傍索血管の形成、さらには肋間静脈の形成に関わる(受精後4日-7日)。そこで、静脈系内皮細胞のリンパ管系内皮細胞へのtrans-differentiationの時期とその分布領域を明確化する目的で、prox1-FRPトランスジェニック・ゼブラフィッシュの作製を試みている。現在、最新のBACライブラリーを用いた遺伝子コンストラクト作製法により、Prox-1のプロモーター領域を含む全長150Kbのprox1-FRPのコンストラクトを作製し、インジェクションを行っているが、未だラインの樹立に至っていない。申請者らは、二光子顕微鏡で血管内皮細胞特異的に蛍光蛋白EGFPを発現するトラスジェニック・ゼブラフィッシュTg(fli1;EGFP)y1のタイムラプス・イメージングによりリンパ管の発生過程を捉えることに成功し、以下のことを明らかにした。リンパ管発生に関わる細胞は後主静脈(PCV)を起源とする脈管芽細胞で、本来は節問静脈(ISV)になりうる細胞群である。後主静脈から別れ、一旦筋間中隔に留まるこれらの内皮細胞を、申請者らは、その分化能の特殊性と広い領域への伸長から能力から、「pioneer cell」と呼んでいるが、この細胞が胸管系のリンパ管網を形成する際に、prox1、VEGF-Cの遺伝子発現が関与していることを、それぞれのmorphorinoを用いたノックダウン実験により明らかにした(Nature Med 12,711-716,2006)。現在、静脈系内皮細胞のリンパ管系内皮細胞へのtrans-differentiationの時期とその分布領域を明確化する目的で、prox1-FRPトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作製中である。
ベトナム人参の有効成分の化学的研究 -抗発癌プロモーター作用の活性構造相関-

ベトナム人参(Panax vietnamensis)のメタノールエキスを、EBV-EA発現抑制試験を用いた。EBV潜在感染ヒトリンパ芽球様細胞株Raji細胞を用い、TPAによる初期抗原(EA)の誘発率を間接蛍光抗体法により抗発癌活性を測定したところ、100(g/mlあたり38%の活性が認められ、これから得られた粗サポニン分画には10(g/mlあたり74%という強い活性が濃縮されていたことを見出した。この分画から得られた7種のサポニン(majonosides-R1 and R2,ginsenosides-Rb1,Rb2,Rd,Re and Rg1)のうち、majonoside-R2に強い活性が認められた。これは本種に特有のオコチロール型主サポニンであり、活性発現に必要な構造因子としてのオコチロール骨格および、本種の活性本体を明らかにした。活性の最も強かったmajonoside-R2をフローサイトメトリー法により分析し、本化合物は細胞周期のS期を濃度依存的に有意に増強させることを見出し、この活性発現の機序の一端を明らかにした。ついで、majonoside-R2についてin vivoのマウス二段階発癌抑制実験を行った。ICR雌性マウスを用い、DMBAとTPAで発現させた皮膚乳頭腫の抑制活性を測定し、10,15,20週において、それぞれ、30,50,80%抑制し、その活性は強い活性が知られてぃるglycyrrhetic acidを凌いでいた。別の二段階発現系として、DMBAとfumonisin B1を用いて同様な実験を行ったところ、やはり、強い活性を見出した。さらに、DENとpentobarbitalで発現させた肝臓癌について、25週後に対照群には80%の腫瘍が認められたのに対して、majonoside-R2を週あたり1.26mgの投与した群では僅かに39%という著効を見出した。この成果を1998年10月にベトナムのハノイで行われた国際学会(第9回ASOMPS)で発表した。ベトナム人参(Panax vietnamensis)のメタノールエキスを、次に述べるin vitro法により、抗発癌活性を測定したところ、100μg/mlあたり38%の活性が認められた。活性の認められたメタノールエキスをダイヤイオンクロマトグラフィーにより、分画し、粗サポニン分画を得、その活性を測定したところ、10μg/mlあたり74%という強い活性が濃縮されていたことを見出した。次いで、各種クロマトグラフィーにより分画を繰り返し、得られた7種のサポニン(majonosides-R1 and R2,ginsenosides-Rb1,Rb2,Rd,Re and Rg1)について、活性を測定したところ、majonoside-R2に最も強い活性が認められた。このサポニンは他の人参属の植物にはあまり例のないオコチロール型であり、ベトナム人参の主サポニンで、その含量は他を圧して、生薬乾燥重量の4%にも上るため、本生薬の活性を代表しているものと思われる。活性の最も強かったmajonoside-R2について、フローサイトメトリー法による分析を行った。上記の培養Raji細胞を洗浄後、分散させ、Triton X-100で処理してろ過して裸核化した試料を集め、RNAaseにより処理してRNAを除いた。その後、DNA染色を行い、FAC Scanにより測定したところ、やはり有意な活性が認められた。majonoside-R2についてin vivoのマウス二段階発癌抑制実験を行った。

ICR雌性マウスを用い、皮膚癌の抑制活性を測定したところ、10,15,20週において、皮膚の乳頭腫をそれぞれ、30,50,80%抑制し、その活性は今まで強い活性が知られているglycyrrhetic acidを凌いでいた。in vitro法でEBV-EA発現抑制活性の認められたベトナム人参(Panax vietnamensis)のメタノールエキスから得られた粗サポニン分画にはさらに強い活性が濃縮されており、その分画から得られた7種のサポニンのうち、本植物に著しく高含量(4%)で含まれるmajonoside-R2に際立って強い活性が認められた。他の化合物と比較することにより、活性発現に必要な構造因子をオコチロール骨格と決定した。活性の最も強かったmajonoside-R2をフローサイトメトリー法により細胞周期を分析したところ、本化合物はTPAにより著しく短くなったS期の割合を濃度依存的に有意に増加させることを見出し、この活性発現の機序に細胞周期調節が関与していることを明らかにした。ついで、in vivo法により、昨年明らかにしたmajonoside-R2についてのDMBAとTPAによるマウス皮膚癌抑制実験に続いて、最近見出されたTPAとは別の機構によるプロモーターのfumonisin B1を用いて同様な実験を行ったところ、11週と20週において、全ての対照群に腫瘍が見られたのに対し、majonoside-R2投与群では腫瘍発現はそれぞれ、30%以下と70%以下となり、著しい腫瘍抑制活性を見出した。さらに、肝臓癌について検討し、DENとpentobarbitalで発現させた25週後に対照群には80%の腫瘍が認められたのに対して、majonoside-R2を週あたり1.26mgの投与した群では僅かに39%という著効を見出した。以上のように、このオコチロール型サポニンはかなり広い範囲の抗腫瘍活性を有し、今後の二段階発癌プロモーター抑制による抗癌剤開発のリード化合物として優れたものであることを明らかにした。この結果を10月にベトナムのハノイで行われた第9回アジア天然物シンポジウム(ASOMPS)で発表した。
アプリケーション適応型動的超多階層メモリアーキテクチャの開発

本研究の目的は、アプリケーションが求めるメモリ機能・性能からアーキテクチャ設計を見直し、多階層・アプリケーション適応型オンチップメモリアーキテクチャ、及びその利用技術を確立することを目的としている。本研究では、マイクロプロセッサの高性能化・低消費電力化に向けて、キャッシュメモリを考慮した効率的な資源管理に取り組んだ。このような資源管理は、キャッシュメモリ上で発生するスレッド間資源競合の回避や、キャッシュメモリ資源の効率的な利用を可能とし、マイクロプロセッサの性能向上・消費電力の削減を可能とする。最終年度である平成25年度は,アプリケーション適応型動的超多階層メモリアーキテクチャの確立を目指して必要な基本機能の詳細化に取り組み,その基本機能をソフトウェアシミュレータに実装し,様々な分野のアプリケーションを用いての動作検証と性能評価を通じて,その有効性を明らかにした.先ず,基本機能として,実際の利用状況である複数アプリケーションの同時実行時に,アプリケーションのメモリ要求に対して短時間で適切にメモリ資源を最適な形に再構成する機能と,マルチコアプロセッサ間での共有データと排他データの適切な管理が可能なキャッシュ配置・分割機能,データの再利用性を動的に判断し高い参照局所性を有するデータのみをキャッシュに配置することができるキャッシュバイパス機能,アプリケーションのメモリ要求に応じてバンド幅調整を行い電力あたりのメモリのデータ転送能力を最大化する機能などの詳細設計を行い,機能検証・評価ソフトウェアシミュレータに実装した.また,評価アプリケーションとして,画像生成・処理といったマルチメディアアプリケーションだけでなく,SPECベンチマークを中心に様々な分野のアプリケーションをベンチマークとして取り上げ,提案機能の有効性の評価を行った.得られた成果は,学術論文誌および国際会議発表論文として国内外で発表した.本研究の目的は、アプリケーションが求めるメモリ機能・性能からアーキテクチャ設計を見直し、多階層・アプリケーション適応型オンチップメモリアーキテクチャ、及びその利用技術を確立することを目的としている。本年度は、1001000のコアからなるメニーコアプロセッサ時代の革新的メモリシステム実現を目指して、アプリケーションが求めるメモリ機能・性能からアーキテクチャ設計を見直し、超多階層・アプリケーション適応型オンチップメモリアーキテクチャ、及びその利用技術について検討した.特にメモリ階層におけるデータの再参照性について様々なプログラムについて調査を行った.その結果,キャッシュ挿入後に全くアクセスされないブロックや,最後のアクセス後にキャッシュに残るブロックがあり,これらのブロックは性能向上に寄与していないことがわかった.さらに,このようなブロックがキャッシュ領域に占める割合は非常に大きく,メモリシステムにおける消費電力増加の大きな要因となっていることがわかった.そこで,メモリ階層においてデータの再参照性を適切に評価し,階層のなかで適切に配置すると共に,再参照性のないデータはメモリ階層をバイパスできるメモリ階層管理機構について,その実現のための要求要件をハードウェアとソフトウェアの両面から精査し,その基本アーキテクチャの概念設計を行った.そして,概念設計に基づき,性能評価モデルを構築し,ベンチマークを用いたアーキテクチャ性能の試算を行った.評価の結果,考案したメモリ階層管理機構が適切に機能し,不要なデータが長時間キャッシュを占有することを防ぎ,その結果,性能低下を抑制しつつキャッシュのエネルギを最大で55%削減できることを明らかにした.アプリケーション適用型オンチップメモリアーキテクチャの概念設計が終わり,その初期評価を通じて有効性が確認できたことから,おおむね順調に進展していると考えている.概念設計の詳細化に取り組み,より精密なシステム評価モデルを構築し,動作確認/性能評価シミュレータの設計/開発に取り組む.そして,メモリ階層でのデータ管理をプログラマが支援するためのプログラミング技術についても検討し,ハードウェア/ソフトウェア協調による,低消費電力,高スループット,そして低レイテンシなメモリサブシステムの基本アーキテクチャの実現を目指す.ソフトウェアシミュレータ開発補助に大学院学生を雇用するための謝金と,国内外での研究成果発表のための旅費を中心に考えている.
ゼブラフィッシュの後脳と血管系の位置決定

本研究は、生存に不可欠な役割を持つ後脳に着目して、その特徴的な分節構造や背腹軸の特性が後脳血管のパターン形成にどのように作用するのかを明らかにすることを目的とし、胚体内部を生きたまま観察できる脊椎動物モデルであるゼブラフィッシュを用いて解析を行った。後脳は菱脳節と呼ばれる分節構造を持ち、それぞれの中央付近はシグナルセンターと呼ばれる特定の神経細胞が集合している。後脳の血管が形成される時、このシグナルセンター付近に血管枝の出芽が起こることから、シグナルセンターからの誘導因子と菱脳節境界からの反発因子の可能性について、発現解析と機能解析を行い、関与する遺伝子の分子機構を調べた。本研究は、脳血管の発生について、細胞挙動と分子機構を解明することを大きな目標としている。脳の中でも、脊椎動物すべてにおいて生存に不可欠な役割を持つ後脳に着目して、その特徴的な分節構造が脳血管の発生にどのように作用するのかを明らかにすることをここでの目的としている。胚体内部を生きたまま観察できる脊椎動物モデルであるゼブラフィッシュを用いて、脳発生時の神経領域・非神経領域の分化と、血管発生の相互作用を調べている。平成26年度は主に2つの視点から解析を行った。1点目は誘導的ガイダンス因子についてである。後脳の分節構造である菱脳のそれぞれの中央付近は、特定の神経細胞が分化してくるためシグナルセンターと呼ばれているが、その位置と後脳に侵入する後脳中心血管の出芽位置に相関関係があるのではないかという予測を確かめるために、遺伝子発現解析とその組織切片解析を行った。2点目は反発的ガイダンス因子についてである。後脳中心血管は、各菱脳節の中央付近に出芽侵入したのち菱脳内を背側に伸長するが、菱脳節境界からは離れた節の中央部分を走行する。そのため、菱脳節境界からの反発因子があることを予測し、その候補となる遺伝子の発現解析と組織切片解析を行った。それぞれ観察をする発生段階としては、受精後30、36、48時間を用いた。それぞれの視点において、発現時期と発現パターンの血管との位置関係から、ガイダンス因子としての有力な候補遺伝子を挙げることができている。この成果をもとに、平成27年度は遺伝子ノックダウンなどを用いた機能解析を行い、後脳中心血管のパターン形成に関わる分子機構を明らかにしていく予定である。平成27年度は、平成26年度の研究成果として得られた菱脳節内の血管走行に対するガイダンス因子に対して、モルフォリノアンチセンスオリゴを作製し、遺伝子ノックダウン実験を実施した。候補遺伝子についていずれも変異体とノックダウン胚が同じ表現型を示すことがすでに報告されていたため、この方法を用いた。注入方法として、ゼブラフィッシュ受精卵の1細胞期の細胞にマイクロインジェクションをした。候補遺伝子の1つ目は、変異体では体節の形態形成に異常を生じることが知られており、本実験においてもその表現型が確認された。また、それに伴い、胴尾部の血管形成にも異常が生じることが観察された。本候補遺伝子が胴尾部の血管系の形成に関与することはこれまで報告されていないことから、この結果も新規性がある。また、後脳の血管については、期待の通り、形成異常が認められたため、ガイダンス機能があると考えられた。しかし、2つ目の候補遺伝子に関しては抑制的な機能の報告があったことに反して、ノックダウン胚において血管の低形成が観察されたことから、今後詳細な検討が必要となる。これらの結果をもとに、平成28年度は遺伝子ノックダウンの結果を評価する実験を行い、後脳中心血管のパターン形成に関わる分子機構を明らかにしていく予定である。脳血管の発生に関与する誘導的ガイダンス因子と反発的ガイダンス因子について、それぞれのノックダウン実験の結果、それぞれの脳血管の発生に対してなんらかの表現型を示すことを明らかにできたため、おおむね順調に進展していると判断する。一部予測と異なる結果が得られていることから、当初の計画以上に進展しているとは評価できない。今後、それらの結果の示す意味について考察し、分子機構を明らかにするための実験を組む予定である。平成26年度の研究成果として得られた菱脳節内の血管走行に対するガイダンス因子候補について、平成27年度はモルフォリノアンチセンスオリゴを作製して遺伝子ノックダウンによる表現型解析を行い、平成28年度は絞り込んだガイダンス因子候補についてさらに詳細な表現型解析を進めた。モルフォリノアンチセンスオリゴについては、毒性や異所作用が懸念されているため、変異体とノックダウン胚が同じ表現型を示すことがすでに報告されているものについて使用した。

使用を避けたガイダンス因子候補の遺伝子については、ノックアウト作製など他の方法による機能阻害実験の準備を始めた。候補遺伝子の1つは、変異体では体節の形態形成に異常を生じることが知られており、本実験においてもその表現型が確認されるとともに、新たに胴尾部の血管形成にも異常が生じることが観察された。また、後脳の血管については血流観察・血管内皮細胞のパターニングの観察ともに異常が認められ、ガイダンス作用が働いていることが確認され、成果をまとめている段階にある。また別の候補遺伝子の1つは、平成27年度にガイダンス因子として誘導的か反発的か、これまでの知見と異なる結果を得たためその機能を確認する実験を進めたが、明確な機能の説明には至らなかった。機能阻害により後脳血管の低形成を引き起こすことは確かであるため、他の可能性も含めて今後も研究を進める。本研究は、生存に不可欠な役割を持つ後脳に着目して、その特徴的な分節構造や背腹軸の特性が後脳血管のパターン形成にどのように作用するのかを明らかにすることを目的とし、胚体内部を生きたまま観察できる脊椎動物モデルであるゼブラフィッシュを用いて解析を行った。後脳は菱脳節と呼ばれる分節構造を持ち、それぞれの中央付近はシグナルセンターと呼ばれる特定の神経細胞が集合している。後脳の血管が形成される時、このシグナルセンター付近に血管枝の出芽が起こることから、シグナルセンターからの誘導因子と菱脳節境界からの反発因子の可能性について、発現解析と機能解析を行い、関与する遺伝子の分子機構を調べた。脳血管の発生に関与する誘導的ガイダンス因子と反発的ガイダンス因子について、詳細な遺伝子発現解析により、それぞれの候補となる遺伝子を挙げることができたため、おおむね順調に進展していると判断する。候補遺伝子の探索は、これまでの知見からの予測でいくつか列挙はしていたが、継続して追加していく必要があると考えているため、当初の計画以上に進展しているとは評価できない。今後、機能解析に取り組んでいく中で、結果的に関係がなさそうと判断される遺伝子も出てくる可能性があるため、並行してガイダンス因子の探索を行う予定である。平成26年度および平成27年度に得られた結果をもとに、今後は候補遺伝子の機能解析の詳細をさらに検討する予定である。また、継続して、他のガイダンスの候補となりうる遺伝子についても検索して、今後の研究を推進していく予定である。血管生物学平成26年度に得られた結果をもとに、今後は候補遺伝子の機能解析を行う予定である。研究計画では、モルフォリノアンチセンスオリゴのインジェクションによる遺伝子ノックダウンを用いることとしているが、近年CRISPR/Cas9の技術によるゲノム操作が進み変異体の作成が従来より容易になり、かつ、変異体の表現型とモルフォリノアンチセンスオリゴによる表現型が異なることが多数報告されている。各候補遺伝子について、いずれの方法が適切かを再検討し、より適切な方法を選択するようにして、今後の研究を推進していく予定である。
視覚誘発性行動におけるシンクロナスオシレーションの機能的意義の解明

視覚系におけるシンクロナスオシレーション(SO)は視覚対象の大きさや連続性に依存して観察される細胞集団による位相のあった周期的な同期発火である。この現象はゲシュタルト的知覚統合の神経基盤として注目されているが、機能的意義には不明な点が多い。カエル網膜には、受容野が比較的大きく、大きな黒い影に対してよく応答するディミング検出器と呼ばれる神経節細胞があり、SOが観察される。ディミング検出器は逃避行動に関係する情報を脳に送っていると考えられており、この行動を指標とすることでSOの機能的意義を検討した。カエルは暗いスポット光がある程度の大きさまで拡大する刺激に対して逃避行動を示す。マルチ電極をカエルの剥離網膜標本に適用し、ディミング検出器群のスパイク発火を同時記録したところ、暗いスポット光が拡大する刺激に対してSOが観察された。このSOはGABAA受容体の阻害剤を投与すると抑制され、GABAC受容体の阻害剤を投与すると増強された。さらにカエルの眼球にGABAA受容体の阻害剤を投与したところ、暗いスポット光に対する逃避行動が観察されなくなった。一方、GABAC受容体の阻害剤を投与したところ、逃避行動の生起確率が上昇し、より小さいスポット光に対しても逃避行動を示すようになった。薬物投与によるディミング検出器の発火頻度の変化では行動の変化は説明できなかった。また、薬物投与後もディミング検出器以外の神経節細胞のスパイク発火数に有意な変化はなく、発火パターンにも一貫した変化は観察されなかったため、他神経節細胞の活動変化によって逃避行動が影響を受けたということも考えられなかった。したがって、カエル網膜ディミング検出器群のSOは逃避行動に必要な視覚情報を脳に送るために重要な役割を果たしていることが明らかになった。視覚系において受容野外の光刺激の連続性に依存した同期的周期的発火が報告されており、ゲシュタルト的知覚統合への関与が示唆されているが、その神経機構や機能的意義に関しては不明な点が多い。そこで、既に同期的周期的発火が報告されているカエル網膜神経節細胞のサブタイプ(ディミング検出器)に関して剥離網膜標本にマルチ電極を適用することでその刺激依存性を解析した。ディミング検出器の発火活動はカエルの逃避行動に関与することが示唆されており、同期的周期的発火の機能的意義の解明が注目される。まず、ディミング検出器間の同期的周期的発火における刺激のグローバルな特性に対する依存性を詳細に解析することで情報符号化の特性を調べた。記録細胞群中から互いに離れた2細胞を選択し、それぞれの受容野の間に光強度が変調しないgap領域を挿入することで刺激の空間的連続性を阻害したところ、細胞間の同期的発火が減少した。刺激を2領域に分け、刺激の時間的位相を段階的にずらしたところ、位相のずれの大きさに依存してそれぞれ違う領域に受容野を持つ細胞間の同期的発火が減少した。一方、同じ刺激領域に受容野を持つ細胞間における同期的発火の強度には系統的な変化が観察されなかった。以上の結果より同期的周期的発火が刺激の時空間的な連続性を符号化している可能性が示唆された。次に、同期的周期的発火の機能的な意義を解明するために、カエルに逃避行動を誘発する刺激を同定した。液晶モニタを用いてカエルに対して様々な刺激を提示したところ、暗点がある程度の大きさまで拡大する刺激に対して最も逃避行動を示すことが明らかになった。同様の刺激を剥離網膜に提示したところ、同期的周期的発火が生じ、さらに逃避行動と同じような刺激サイズの依存性があることが明らかになった。以上の結果より、同期的周期的発火が逃避行動の生起に関与している可能性が示唆された。視覚系において神経細胞間に観察される相関発火現象(シンクロナスオシレーション)は視覚刺激として呈示されたオブジェクトのグローバルな特徴に依存して観察されるため、ゲシュタルト的知覚統合への関与が示唆されている。そこでカエル網膜の神経節細胞群にマルチ電極を適用することでその刺激依存性と薬物投与による変化を解析した。CRTモニターにより任意の光刺激をカエル剥離網膜片に呈示し、平面型マルチ電極から電気生理学的手法により神経節細胞の一種であるディミング検出器群のスパイク発火活勲を多数同時記録した。光刺激の呈示に対するスパイク発火応答に関して相互相関関数を算出し、細胞間の発火相関を解析したところ、個々の細胞の受容野より遥かに大きな刺激に対してシンクロナスオシレーションが生成されていたが、小さな刺激に対しては生成されていなかった。シンクロナスオシレーションは受容野の重ならないような離れた細胞間でも観察される。この結果は広範囲にわたり活動の位相のずれない神経回路網の存在を示している。神経節細胞より末梢側にはアマクリン細胞が存在しており、ギャップジャンクション(電気シナプス)で互いに電気的に結合している。アマクリン細胞がギャップジャンクションを介して形成している広範囲の神経回路網がディミング検出器間のシンクロナスオシレーションを形成している可能性を検討するため、ギャップジャンクションの阻害剤を投与してその効果を検討し。ギャップジャンクション阻害剤の一種であるカルベノキソロン投与したところ、ディミング検出器間のシンクロナスオシレーションが消失した。したがって、ディミング検出器間のシンクロナスオシレーションはアマクリン細胞がギャップジャンクションを介して形成している広範囲の神経回路網によって形成されている可能性が示唆された。

カエル網膜には、受容野が比較的大きく、大きな黒い影に対してよく応答するディミング検出器と呼ばれる神経節細胞があり、SOが観察される。ディミング検出器は逃避行動に関係する情報を脳に送っていると考えられており、この行動を指標とすることでSOの機能的意義を検討した。カエルは暗いスポット光がある程度の大きさまで拡大する刺激に対して逃避行動を示す。マルチ電極をカエルの剥離網膜標本に適用し、ディミング検出器群のスパイク発火を同時記録したところ、暗いスポット光が拡大する刺激に対してSOが観察された。このSOはGABAA受容体の阻害剤を投与すると抑制され、GABAC受容体の阻害剤を投与すると増強された。さらにカエルの眼球にGABAA受容体の阻害剤を投与したところ、暗いスポット光に対する逃避行動が観察されなくなった。一方、GABAC受容体の阻害剤を投与したところ、逃避行動の生起確率が上昇し、より小さいスポット光に対しても逃避行動を示すようになった。薬物投与によるディミング検出器の発火頻度の変化では行動の変化は説明できなかった。また、薬物投与後もディミング検出器以外の神経節細胞のスパイク発火数に有意な変化はなく、発火パターンにも一貫した変化は観察されなかったため、他神経節細胞の活動変化によって逃避行動が影響を受けたということも考えられなかった。したがって、カエル網膜ディミング検出器群のSOは逃避行動に必要な視覚情報を脳に送るために重要な役割を果たしていることが明らかになった。
複数台カメラの統合を用いた広域多車線道路環境での交通計測に関する研究

自動車保有台数の増加に伴い、渋滞等の道路交通問題が引き起こされてきた。このような社会状況を反映して、特に都市部において交通渋滞に対する不満が高まり、道路整備の促進を求める声とともに、運転者/道路利用者へより「見やすい」、「高精度」、「多くの道路で」の道路交通情報の提供を含めて快適な交通環境を求めるニーズが高まっています。次世代道路交通管理を実現するための重要な技術として,交通映像を用いた道路交通の自動計測方式は注目されている。本研究は,広域に亘って点々としたマイクロ交通情報を知的に統合し,マクロ交通情報を構築する研究である。その一環として,本年度の研究では,複数台カメラの対応関係から,従来では困難の車両同士の重なり問題と車両3次元寸法計測を解決し,確実に監視領域内における車両数・スピードの計測、車種の分類、車線変更の検出、交通渋滞・事故などのマイクロ交通情報を計測できた。具体的には、オンラインキャリブレーション手法の検討および公道実験を行った。実環境では風や路面の振動によるカメラの空間位置のズレが発生する。カメラの位置ズレによる測定誤差を最小化するために,システムを自動的にオンラインキャリブレーションする必要がある。そのため,道路区画線位置の検出と自動推定,カーブ路面の区画線位置補正などの手法を検討した。また,対象物追跡による3次元交通計測の手法を提案した。複数レイヤーPFM法による対象物の3次元寸法を計測し,時系列画像の対象物追跡結果から走行車両状況(車種,位置と速度),交通流計測(通過台数,通過平均速度)を行った。さらに、影領域の検出および道路路面(背景)の補完法を提案した。自由視点の道路監視映像を合成する際に,遮蔽による欠落される画像情報および再構築される背景の道路路面を補完することによって,よりリアルな映像を合成できる。近年,自動車の社会問題の対策として,道路を走行中の運転者に対し,道路情報,交通情報,沿線情報などを提供するシステムが実用化されつつある。そこで,広域道路交通状況をリアルタイムに収集・解析することは次世代高度道路交通システム(ITS)の構築において不可欠な要素技術である。現在の道路交通情報センサの中で,一般的に使用されているものは,超音波式,ループコイル式および光式である。これらは安定で高信頼性を持つが道路の代表的な区間に設置し,局所的な情報を取得するものであるため,空間的な広がりを持った情報を取得することができず,追跡のような高度な処理ができない。また,新設や変更も容易ではない。一方,画像を利用した道路情報の収集が実現されれば,落下物や事故,避走といった様々な空間的な道路情報も取得することができ,利便性が高い。しかし,従来の画像処理手法では,ほとんど単眼によるもので,カメラの設置位置や方向によって,車両同士の遮蔽(オクルージョン)問題が生じてしまい,計測精度が悪くなる。更に,カメラ1台ずつ独自に監視計測タスクを果していて,カメラ同士の間で計測データの共用またはハンドリングができないため,広域時間と空間で連続的な交通情報を得られず,運転者および交通/道路管理者により正確な道路交通情報を与えられない。本研究では,広域大規模道路監視カメラネットワークを知的に統合することによって,次世代道路交通計測システムの構築に関する基盤技術を研究開発する。その一環として,本稿では,複数台カメラのデータ統合を用いて広域多車線道路環境での交通計測手法を提案する。また,対象物を連続的に監視するために,広域に散布される監視カメラを「クラスター」「グループ」と「ネットワーク」という3レベルに分解し,効率良く情報をハンドリングできる知能型道路交通監視システムの構成を提案する。カメラクラスターの各カメラから計測されたデータを同一空間に統合する必要があるため,本研究では,確率フュージョンマップ(PFM : Probability Fusion Map)の概念を提案して、複数台カメラのデータ統合を用いて従来の道路交通計測方式では困難である車両同士の重なり問題と車両3次元形状計測問題を解決する。様々の路上実験より本研究の有効性が示された。

さらに、影領域の検出および道路路面(背景)の補完法を提案した。自由視点の道路監視映像を合成する際に,遮蔽による欠落される画像情報および再構築される背景の道路路面を補完することによって,よりリアルな映像を合成できる。
上部地殻における延性-脆性断層帯の特性と運動像

本研究では地殻衝上帯において,地殻深部変成岩が延性的変形と脆性的変形を重複して受けていることに着目し,シュードタキライトを伴う地震性の脆性的剪断向とマイロナイト片理面との関係を解析し,地震性の脆性剪断作用が先行する延性的剪断作用といかなる関係にあるか,応力場と運動方向や条件の関係を考察した.研究対象は領家変成帯,八幡浜大島変成岩体および下伊那和田地域の下部マイロナイト帯,日高変成帯上部変成岩層である.八幡浜大島では,4ステージのマイロナイト化とシュードタキライトの形成を伴う地震性の脆性剪断帯があり,シュードタキライトは延性変形を受けている.この断層帯の詳細な観察の結果,地震性の脆性断層と延性変形が繰り返し起こっていることが判明した.この運動は大島変成岩層が三波川帯に衝上する上盤西ずれの運動に関連し,上盤西ずれのマイロナイト化作用IIの運動と一連と見なすべきとの結論を得た.このことは内陸地震の発生場所が,地殻の衝上に伴う断層に沿っていることを予想させるものとして重要な意味をもつ.一方,下伊那におけるマイロナイト帯に,マイロナイトの片理に平行な脆性剪断面に,今回新たにシュードタキライトを発見した.このシュードタキライトは気泡を有し,母岩の条件からみても.比較的浅いところで形成されたものである.この点は,八幡浜大島の場合と異なる点であるが,マイロナイト化作用の応力場を引き継いでいる点は同じである.このことから,地殻深部層の衝上運動が,延性的剪断運動から脆性的剪断運動に連続し,この過程で地震性の剪断破壊が起こることを示すものであり,このシュードタキライトの発見は八幡浜大島の結論を支持補強するものである.本研究では地殻衝上帯において,地殻深部変成岩が延性的変形と脆性的変形を重複して受けていることに着目し,シュードタキライトを伴う地震性の脆性的剪断向とマイロナイト片理面との関係を解析し,地震性の脆性剪断作用が先行する延性的剪断作用といかなる関係にあるか,応力場と運動方向や条件の関係を考察した.研究対象は領家変成帯,八幡浜大島変成岩体および下伊那和田地域の下部マイロナイト帯,日高変成帯上部変成岩層である.八幡浜大島では,4ステージのマイロナイト化とシュードタキライトの形成を伴う地震性の脆性剪断帯があり,シュードタキライトは延性変形を受けている.この断層帯の詳細な観察の結果,地震性の脆性断層と延性変形が繰り返し起こっていることが判明した.この運動は大島変成岩層が三波川帯に衝上する上盤西ずれの運動に関連し,上盤西ずれのマイロナイト化作用IIの運動と一連と見なすべきとの結論を得た.このことは内陸地震の発生場所が,地殻の衝上に伴う断層に沿っていることを予想させるものとして重要な意味をもつ.一方,下伊那におけるマイロナイト帯に,マイロナイトの片理に平行な脆性剪断面に,今回新たにシュードタキライトを発見した.このシュードタキライトは気泡を有し,母岩の条件からみても.比較的浅いところで形成されたものである.この点は,八幡浜大島の場合と異なる点であるが,マイロナイト化作用の応力場を引き継いでいる点は同じである.このことから,地殻深部層の衝上運動が,延性的剪断運動から脆性的剪断運動に連続し,この過程で地震性の剪断破壊が起こることを示すものであり,このシュードタキライトの発見は八幡浜大島の結論を支持補強するものである.今年度は領家帯および八幡浜大島を重点的に調査し、日高変成帯上部の予察を行った.国内研究を優先させるため、とくに日高帯上部断層の調査が緊急を要すると判断し、本年度計画していたスコットランドの調査は取り止めた.1)領家帯(和田-平岡地域)の流動変形条件下(地殻深部)においては、従来からよく知られているマイロナイト化を伴う片麻面に平行な広域的剪断帯の他に、局所的に発達する共役剪断面に注目した.この剪断面は片理面に高角に形成され、片理面の引きずりとマイロナイト化がみられ、剪断面に沿って熱水流体を起源とする石英-長石主体の優白質脈が形成されていることを特徴とする.一部の脈は花崗岩質であり、流体の一部は花崗岩マグマに由来する.半流動的剪断面に伴う脈の存在は、地殻深部(1315km)において熱水流体が存在することを示す.2)日高帯上部と下部を分離する剪断帯の存在が確認された.この剪断帯は左横ずれであり、最上部堆積岩層の変形構造のセンスと一致するが、最下部剪断帯(soul thrust)のセンスとは逆になる.これは日高地殻の上昇運動像の修正を迫る重要な発見である.上部層の変形運動を詳細に解析する必要がある.3)八幡浜大島シュードタキライト断層の解析から、地震の発生は少なくとも810回くり返されていたことが判明した.断層は初期には塑性一脆性変形遷移帯で形成され、後期にはカタクレーサイトを伴う脆性領域で形成されたことが明らかになった.八幡浜大島および下伊那和田地域の領家変成帯,下部延性剪断帯において,延性剪断作用(マイロナイト化作用)と脆性剪断作用の関係について調査研究を行った.大島変成岩層は領家変成帯最下部に相当する.

ここでは,4ステージのマイロナイト化とシュードタキライトの形成を伴う地震性の脆性剪断帯がある.シュードタキライトは延性変形を受けている.この断層帯の詳細な観察の結果,地震性の脆性断層と延性変形が繰り返し起こっていることが判明した.この運動は大島変成岩層が三波川帯に衝上する上盤西ずれの運動に関連し,上盤西ずれのマイロナイト化作用IIの運動と一連と見なすべきとの結論を得た.このことは内陸地震の発生場所が,地殼の衝上に伴う断層に沿っていることを予想させるものとして重要な意味をもつ.一方,下伊那におけるマイロナイト帯に,マイロナイトの片理に平行な脆性剪断面に,今回新たにシュードタキライトが発見された.このシュードタキライトは気泡を有し,母岩の条件からみても,比較的浅いところで形成されたものである.この点は,八幡浜大島の場合と異なる点であるが,マイロナイト化作用の応力場を引き継いでいる点は同じである.マイロナイト層の片理に平行な脆性剪断面は無数に存在し,これによってマイロナイトは覆瓦構造を取る場合も稀ではない.このことから,地殻深部層の衝上運動が,延性的剪断運動から脆性的剪断運動に連続し,この過程で地震性の剪断破壊が起こることを示すものであり,このシュードタキライトの発見は八幡浜大島の結論を支持補強するものである.
刺胞動物と緑藻との共生の起源・共進化過程の解明

この、共生の初期段階にあると考えられるヒドラとクロロコッカムの共生に関わる宿主側の遺伝子発現の変化を、非共生状態のヒドラ(105系統)とクロロコッカムとの共生状態にあるもの(105G系統)との間でのトランスクリプトームの網羅的比較によって解析しその内容をまとめつつあるが、途中経過を日本動物学会第89回大会において「ヒドラにおける共生クロロコッカムの水平伝播と遺伝子発現変動解析(御代川、津田、金谷、楠見、舘田、小早川)」として発表した。また、安定的な共生であるグリーンヒドラ/クロレラの系を用いて、2系統のグリーンヒドラに共生しているクロレラを入れ換え、本来の宿主が異なるクロレラが新たな別系統の宿主にどのような影響を及ぼすのか、特にその増殖と有性生殖(卵形成)の頻度に着目して実験・観察を行い、その結果を第20回日本進化学会において「グリーンヒドラとクロレラの共生関係の特異性について(御代川、戸川、山口、楠見、小早川)」として発表した。現在は、RNASeqによる遺伝子発現の比較解析を進めている。また、viridissimaグループのヒドラとクロレラの共生に関しては、グリーンヒドラ2系統とそれぞれの共生クロレラを除去した系統、および共生クロレラを入れ替えた系統の6系統について、増殖率・有性生殖を行う固体(ポリプ)の出現頻度等の増殖・生殖に関する形質について基本的データを得た結果を動物学会・九州地区大会(2016年5月、鹿児島大学)で「グリーンヒドラ-共生緑藻の組み合わせの特異性について」戸川優弥子、山口淳也、小早川義尚として発表した。vulgarisグループのヒドラとクロロコッカムの共生に関しては、共生クロロコッカムの単離培養系の確立を当初のH28年度内の目標としていた。しかし、この点に関してはクロロコッカムの共生しているヒドラの飼育液中に宿主から離脱して自由遊泳状態のzoosporeの形態をもったクロロコッカムが確認でき、遺伝子の塩基配列からそれが、ヒドラの内胚葉細胞内に共生しているクロロコッカムと同一であることを確認したに止まっている。この点では、研究計画に若干の遅れがある。その他の点では、ほぼ順調に研究が進んでいる。とくに、Hydra magnipapillata標準野生型系統(105系統)と105系統にクロロコッカムの共生した系統105G系統のトランスクリプトームの網羅的解析は、これまでに2回の次世代シークエンサーによるデータを取得し、現在その解析を進めているところである。ただし、用いた次世代シークエンサーの解像度(リード数)が、期待よりも低く2017年度は外部委託も含めてよりリード数を多くして解像度を上げて解析を進める予定である。viridissimaグループのヒドラとクロレラの共生に関しては、2系統のグリーンヒドラ(K10, M9)とそれぞれから共生クロレラを除去した系統(K10Apo, M9Apo)、それぞれの宿主ー共生体を入れ替えた系統(K10Ch/M9Apo, M9Ch/K10Apo)の6系統を確立し、それぞれの共生クロレラ・宿主ヒドラの由来をrbcL、COI遺伝子の塩基配列で確認した。また、共生クロレラの除去・入れ替えに伴うヒドラの増殖率・形態等の変化について基礎的なデータを取得し、興味深い結果を得ている。また、この6系統のクロレラーヒドラの共生体についても次世代シークエンサーによるデータを取得し、現在その解析を進めているところである。自然状態でクロロコッカムの共生しているヒドラ(J10系統)から、他の緑藻の共生していないヒドラへのクロロコッカムの水平伝搬の確認とその新しい宿主へ及ぼす影響の詳細な解析を続けた。このクロロコッカムの新しい宿主内での消長には宿主毎に差があり、その反応は3種類に分かれた。第1のグループは、クロロコッカムをポリプが取り込むが、その後の内胚葉上皮細胞への取り込みは極めて少ないか、あってもすぐに消化されてしまう。第2のグループでは、ポリプの取り込んだクロロコッカムは内胚葉上皮細胞内にしばらくは生きた状態でとどまり、外部からの供給が続く限りはその数も増加する。しかし、外部からの供給が絶たれるとやがて消失してしまう。第3のグループはvulgaris groupに属する系統で、外部からの供給が絶たれた後も共生状態が継続する。第3グループに属する105系統のヒドラでは、共生によって形態・行動・増殖等に顕著な変化が観られた。以上の研究成果は、日本動物学会九州支部第70回大会(大分大学)において「共生緑藻(Chlorococcum sp.)のヒドラポリプ間での水平伝播:御代川・津田・金谷・楠見・舘田・小早川」として発表した。また、現在これらの追加のデータを加え、その研究成果を論文にまとめBiological Bulletin誌へ投稿した。査読の結果、修正を加えての掲載とされ、現在修正版を投稿したところである。また、非共生状態のヒドラとクロロコッカムとの共生状態にあるものとの間での遺伝子発現の差異をトランスクリプトームの網羅的比較によって解析した。その結果の一部は、日本遺伝学会第89回大会(岡山大学)において「クロロコッカムとヒドラの水平伝播での共生関係構築における遺伝子発現変動解析:御代川・津田・楠見・舘田・小早川」として発表した。

研究目的である「自然状態でクロロコッカムの共生しているヒドラ(J10系統)から、他の緑藻の共生していないヒドラへのクロロコッカムの水平伝搬の確認とその新しい宿主へ及ぼす影響の詳細な解析」については、研究実績の概要にも述べたようにほぼ研究の目的は達成でき、現在その成果を論文として投稿中である。もう一つの大きな目的である「非共生状態のヒドラとクロロコッカムとの共生状態にあるものとの間での遺伝子発現の差異の網羅的比較による解析」は、今(2017)年度において、NGSによるデータの取得を終了し、現在その解析を進めている状況にある。その比較解析の中からヒドラのパターンフォーメーション、光受容等に関連する遺伝子の発現の変化が検出されている。現在、それらの遺伝子の発現解析を進めるために、クロロコッカムを共生させているヒドラとさせていないヒドラにおいて、q-RT-PCRによる確認を行い、in situ hybridizationを行う準備を進めている。また、安定した緑藻との共生状態を維持しているviridissima-groupのヒドラにおける「非共生状態のヒドラとクロレラとの共生状態にあるものとの間での遺伝子発現の差異の網羅的比較による解析」についても、NGSによるデータの取得を終了し、現在その解析を進めている状況にある。また、共生クロロコッカムの培養についても着手し、現在、自然状態でクロロコッカムの共生しているヒドラ(J10系統)から、クロロコッカムを抽出し、in vitroでの増殖を誘導できる培養液の開発を進めている。現在、増殖が起こる条件をほぼ確立できたところである。今後は、単離培養を試み、その後、遺伝子情報による単離できたクロロコッカムとヒドラ内に共生しているものとの同一性を確認し、解析を進めるる予定である。この、共生の初期段階にあると考えられるヒドラとクロロコッカムの共生に関わる宿主側の遺伝子発現の変化を、非共生状態のヒドラ(105系統)とクロロコッカムとの共生状態にあるもの(105G系統)との間でのトランスクリプトームの網羅的比較によって解析しその内容をまとめつつあるが、途中経過を日本動物学会第89回大会において「ヒドラにおける共生クロロコッカムの水平伝播と遺伝子発現変動解析(御代川、津田、金谷、楠見、舘田、小早川)」として発表した。また、安定的な共生であるグリーンヒドラ/クロレラの系を用いて、2系統のグリーンヒドラに共生しているクロレラを入れ換え、本来の宿主が異なるクロレラが新たな別系統の宿主にどのような影響を及ぼすのか、特にその増殖と有性生殖(卵形成)の頻度に着目して実験・観察を行い、その結果を第20回日本進化学会において「グリーンヒドラとクロレラの共生関係の特異性について(御代川、戸川、山口、楠見、小早川)」として発表した。現在は、RNASeqによる遺伝子発現の比較解析を進めている。vulgarisグループのヒドラとクロロコッカムの共生に関しては、今後、緑藻クロロコッカムを共生し増殖率が増加しポリプの形態が小型化した系統(105G)と本来の緑藻を共生させていない系統(105)の遺伝子発現の比較をより解像度の高い(リード数の多い)次世代シークエンサーによるデータ取得に基づいて行うことを考えている。これまで得られたデータと総合的に解析し、ヒドラの緑藻との共生に関与する遺伝子の特定を進める。また、特定された共生に関与していると考えられる遺伝子については、その発現動態をRT-PCR、in situ hybridization等によって解析する。