hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
片頭痛におけるASICの役割-片頭痛動物モデルを用いた検討

本研究は片頭痛の病態へのASIC(acid sensing ion channel)およびTRPV1受容体(the transient receptor potential vanilloid subfamily member 1)の関与を検討したものである.片頭痛の病態には,血管反応性の異常に加え,三叉神経と硬膜の神経原性炎症が関与していると考えられている.本研究により片頭痛の病態に関係すると考えられている脳硬膜および三叉神経節におけるTRPV1受容体の存在を明らかにした.さらに,TRPV1受容体のアゴニストであるカプサイシンによる侵害刺激を脳硬膜に加えると,三叉神経節にて痛覚伝達に関係するextracellular signal-regulated kinase(ERK)のリン酸化が生じることを明らかにした.同様の刺激を神経系株化細胞に与えた場合もERKリン酸化が起こることも明らかにした.また脳硬膜TRPV1受容体陽性神経線維は頭蓋骨内の板間静脈と交差しており板間静脈を介した熱などが,TRPV1受容体の感受性に影響を及ぼしている可能性が示唆された.(1)ASICおよびTRPV1の硬膜および三叉神経血管系の分布の検討(2)ASICおよびTRPV1の三叉神経血管系における機能の検討これらの研究により,脳硬膜の片頭痛発作への関与を検討する.本研究は片頭痛の病態へのASIC(acid sensing ion channel)およびTRPV1受容体(the transient receptor potential vanilloid subfamily member 1)の関与を検討したものである.片頭痛の病態には,血管反応性の異常に加え,三叉神経と硬膜の神経原性炎症が関与していると考えられている.本研究により片頭痛の病態に関係すると考えられている脳硬膜および三叉神経節におけるTRPV1受容体の存在を明らかにした.さらに,TRPV1受容体のアゴニストであるカプサイシンによる侵害刺激を脳硬膜に加えると,三叉神経節にて痛覚伝達に関係するextracellular signal-regulated kinase(ERK)のリン酸化が生じることを明らかにした.同様の刺激を神経系株化細胞に与えた場合もERKリン酸化が起こることも明らかにした.また脳硬膜TRPV1受容体陽性神経線維は頭蓋骨内の板間静脈と交差しており板間静脈を介した熱などが,TRPV1受容体の感受性に影響を及ぼしている可能性が示唆された.本年度は,カプサイシンに感受性をもつTRPV1 receptor(transient receptor potential vanilloid sub-family member 1)の存在について検討した.三叉神経血管説では神経原性炎症という無菌的な炎症が脳硬膜におこり片頭痛が生じていると考えられている.本研究では,これらのプロトン受容体の中でTRPV1受容体の三叉神経血管系での局在と分布および起源について抗体を利用して免疫組織化学により検討した.Sprague-Dawley種ラットを用い,深麻酔下に氷冷ピクリン酸添加パラホルムアルデヒド溶液(Zanboni液)により灌流固定後,脳硬膜,三叉神経節,翼口蓋神経節,耳神経節,内頸神経節,上部頸髄神経(C_<2-3>)および後根神経節を摘出し,螢光抗体法により受容体の局在と分布を光学顕微鏡で検討した.この結果,脳硬膜にTRPV1受容体陽性の神経線維を認めた.また,三叉神経節および後根神経節にTRPV1受容体陽性の神経細胞を認めた.さらに,脳硬膜のTRPV1受容体陽性神経線維の起源を調べるため深麻酔下に逆行性神経軸索トレーサーであるTrue Blue Chloride(Molecular Probes)を中硬膜動脈付近の硬膜へのapplicationを行った.2週間後に灌流固定し三叉神経節および後根神経節を摘出し螢光抗体法により受容体の局在と分布を光学顕微鏡で検討した.TBの集積は三叉神経節および少数の後根神経節の神経細胞に認められた.三叉神経節について行った定量的解析ではTB集積細胞の約50%がTRPV1陽性でさらにこれらの内80%の細胞がCGRPと共存しており片頭痛におけるTRPV1受容体の役割を考える上で重要な知見と考えられた.ASIC受容体およびTRPV1受容体を介する三叉神経血管系での落痛刺激の伝達機序について,抗体を利用して免疫組織化学およびWestern blottingにより検討した.実験にはSprague-Dawley種ラットを用いた.ラットをペントバルビタール麻酔下に脳固定装置に固定し,頭部皮膚正中切開にて頭蓋骨を露出し歯科用ドリルにて頭頂部に頭窓を作成した.ASIC受容体の刺激として脳硬膜を露出して外頚動脈の枝である中硬膜動脈の灌流領域を酸性のpHのbufferで灌流した.TRPV1受容体の刺激として脳硬膜をcapsaicinで刺激した.その後,深麻酔下に氷冷ピクリン酸添加パラホルムアルデヒド溶液(Zanboni液)により灌流固定後,片頭痛の病態の主座をなす三叉神経脳血管系および片頭痛に関与しているとされる三叉神経節および脳幹の三叉神経核を摘出し,これらの組織サンプルを液体窒素により凍結しクリオスタット用の組織標本とした.標本はクリオスタットにより10μm厚の切片としてスライドグラスに貼付し,MAPキナーゼp38およびERKのリン酸化抗体を用いた螢光抗体法により受容体の局在と分布を光学顕微鏡で検討した,さらに投与から灌流固定までの時間をそれぞれ与1分,3分,5分,10分,30分,60分と設定し,MAPキナーゼ(p38,ERK)のリン酸化の程度を三叉神経節,脳幹三叉神経脊髄路核において比較検討する.同様の実験を,免疫組織化学のほかにwestern blotによってもリン酸化を確認した.

この結果ERKおよびp38刺激1分後にピークとなり,その後,刺激前のリン酸化レベルまで低下した.本研究は,脳硬膜のTRPV1受容体を刺激した結果,疼痛の指標としてMAPキナーゼリン酸化を捕らえており,疼痛モデルとして有用である可能性が考えられた.昨年度より引き続きTRPV1受容体を介する三叉神経血管系での疼痛刺激の伝達機序について,抗体を利用してWestern blottingにより検討した.実験にはSprague-Dawley種ラットを用いた.ラットをペントバルビタール麻酔下に脳固定装置に固定し,頭部皮膚正中切開にて頭蓋骨を露出し歯科用ドリルにて頭頂部に頭窓を作成した.ASIC受容体の刺激として脳硬膜を露出して外頚動脈の枝である中硬膜動脈の灌流領域を酸性のpHのbufferで灌流した.TRPV1受容体の刺激として脳硬膜をcapsaicinで刺激した.刺激から三叉神経節摘出までの時間をそれぞれ与1分,3分,5分と設定し,MAPキナーゼ(p38,ERK)のリン酸化の程度を三叉神経節,脳幹三叉神経脊髄路核において比較検討した.この実験により,昨年度は,三叉神経節において,MAPキナーゼのなかのERKのリン酸化が刺激1分および3分後に認められた.今年度は,三叉神経節におけるERKリン酸化が,TRPV1受容体アンタゴニスト,およびERKリン酸化を抑制するMEK inhibitorであるPD98059およびU0126で抑制されるかを検討した.これらの薬剤を頭部皮膚正中切開にて頭蓋骨を露出し歯科用ドリルにて頭頂部に頭窓を作成した頭窓に30分前投与をしたあと,capsaicinでTRPV1受容体を刺激し3分間後に三叉神経節を摘出した.この結果,ERKリン酸化がコントロールと比べ減弱していた.以上より脳硬膜capsaicin刺激により三叉神経節でみられるERKリン酸化はTRPV1受容体からMAPキナーゼの経路を介することを明らかにした.本研究は,脳硬膜のTRPV1受容体を刺激した結果,疼痛の指標としてMAPキナーゼリン酸化を捕らえており,疼痛モデルとして有用である可能性が考えられた.昨年度より引き続きTRPV1受容体を介する三叉神経血管系での痙痛刺激の伝達機序について,抗体を利用してWestern blottingにより検討した.実験にはSprague-Dawley種ラットを用いた.昨年度は,三叉神経節において,MAPキナーゼのなかのERKのリン酸化が3分後に認めれる現象がTRPV1受容体アンタゴニスト,およびERKリン酸化を抑制するMEK inhibitorであるPD98059およびU0126で抑制されることをin vivoにて明らかにした.今年度は今回、培養細胞を用いcapsaicin刺激によるMAP kinaseおよびAkt(protein kinase B)の経時変化をin vitroで検討した。神経系株化細胞PC12において、capsaicin 30μMを投与し、1分、3分、15分、60分後におけるERK、p38およびAktリン酸化をwestern blot法により検討した。
縮合複素環を有する新規な電子供与体および受容体の開発

電子供与体の骨格へ電子受容性の複素環を縮合すると、電子供与性の面ではマイナスとなるが、分極が大きくなること、ヘテロ電子接触により分子関相互作用が強まることなどから新物性の発現が期待できる。本研究では、1,2,5ーチアジアゾ-ルが縮合した新規な電子供与体の合成を行い、Xー線構造解析によりヘテロ原子間の相互作用を明らかにするとともに、電荷移動錯体を含めた物性を検討した。ジメチルジヒドロピラジンは、8π電子系であるために不安定であり単離できないが、チアジアゾ-ルを縮合させることで安定に単離することに成功した。この化合物は、12π電子系のために電子供与性が高く,一部の電子受容体と高導電性の錯体を形成した。また、Xー線結晶解析より、S...Nの相互作用と水素結合で平面シ-トを形成していることが判明した。ビスチアジアゾロテトラチアフルバレン(TTF)は、新規に合成したチオンとトリフエニルホスフィンの反応で得られた。この化合物は、S...N,S...Sに短い原子間接触が見られ、分子間相互作用が強い分子であることが明らかとなった。強力な電子供与体であるpーキノビス(1,3ージチオ-ル)の骨格にチアジアゾ-ル環が縮合した化合物は、WittigーHormer反応を利用して合成でき、特異な物性を示した。すなわち、高触点で昇華性があり、単一成分で10^<ー3>Scm^<ー1>の電導性を示した。Xー線結晶構造解析から、この化合物は短いS...S接触(3、26A^^°)によりシ-ト状のネットワ-クを形成し、このシ-トが積層していることが分かった。単一成分での高電導性は、ヘテロ原子接触に基づく強い分子間相互作用に起因すると考えられる。上記の合成実験を行った時に、分離手段として中圧分取液体クロマトグラフを、構造解析ならびに分子軌道計算にデ-タ解析用システムを用いた。
社会福祉実践における意思決定過程に関する実証的研究-葛藤経験の現象学的分析-

社会福祉実践にかかわる熟練者が経験する葛藤の特徴は、自己決定の尊重を巡る価値葛藤として特徴づけられる。また、葛藤の解決に向けた意思決定過程においては、本人や他職種との対話によって協働関係を形成しようとする態度や、制度の谷間のニーズを充足するための支援活動を創出しようとする態度が確認された。これらは、昨今の社会福祉研究にみられる、自己決定概念の限界を巡る言説との接点を示すものであると考えられる。本研究の目的は、高齢者・障害者(児)の生活支援に携わる実践者、とりわけ、組織内外のさまざまな関係調整を担うコーディネーターの認識や思考に焦点をあて、さまざまな葛藤に直面する際の意思決定過程を倫理的観点から分析し、祉会福祉実践にみられる「実践知」の特徴について実証的に明らかにすることである。平成19年度は、フィールドワークや事例研究によって質的データを採集することに併せて、分析視角について検討を重ねた。研究実績は次のとおりである。1.障害児の地域自立生活支援にかかわるフィールドワークの実施アクションリサーチの手法を用いて、障害児の地域自立生活支援にかかわる実践に取り組み、本人の主体性や意思を理解する際に経験されるさまざまな葛藤にかかわる質的データを得た。併せて、本人・家族・教員・ピアカウンセラー・ホームヘルパー・友人らとのネットワークづくりの段階で経験される葛藤を抽出した。2.高齢者の在宅ターミナルに関する事例研究の実施高齢者の在宅ターミナルに関する事例研究に取り組み、ターミナルに特有の倫理的ジレンマの様相や、チームアプローチの際に他職種との間に経験される葛藤について質的データを得た。さらには、そのような倫理的ジレンマや役割葛藤と折り合いをつけるための意思決定過程に関する質的データを得た。3.分析視角の検討臨床哲学を基盤とする研究会活動に継続的に参加し、社会福祉実践現場にみられる相互関係性を視野に入れながら、実践者の経験や認識を分析する方法について検討を重ねた。また、在宅ケア学会などに参加し、在宅ターミナルケアのニーズやプロセスを分析する視点について知見を得た。本研究の目的は、高齢者・障害者、および、その生活支援に携わる実践者の認識や思考に焦点をあて、さまざまな価値葛藤に直面する際の意思決定過程を分析し、社会福祉実践にみられる実践知の特徴について実証的に明らかにすることである。平成20年度は、フィールドワークやインタビュー調査によって次のような質的データを採集し、解釈の内容について研究会で検討を重ねた。さらに、葛藤経験を記述するための質的研究の方法について研究会で検討を行なった。【高齢者分野】1.韓国の介護保険サービスを利用する高齢者の経験する葛藤2.終末期にある在宅高齢者へのチームケアにおける職種間の葛藤3.認知症高齢者介護における介護職員の葛藤【障害者児分野】4.進行性難病者が進行期に経験する葛藤5.障害者運動の担い手が制度化のプロセスにおいて経験する葛藤6.障害児の主体性が社会関係のなかで象られることを支援する葛藤当事者の経験および実践者の経験を、制度や理念と照らし合わせながら記述する先行研究は十分ではなく、理念・制度・実践との狭間で葛藤しながら、それらと折り合いをつけている当事者または熟練者の経験の内実が描き出された。また、学識経験者より現象学にかかわる学識の提供を受け、価値葛藤に焦点をあてた経験を記述する方法について、示唆を得ることができた。[研究協力者]橋本卓也,樽井康彦,太田啓子:大阪市立大学大学院後期博士課程森口弘美:同志社大学大学院後期博士課程本研究の目的は、高齢者・障害者・難病者である当事者および支援者の認識や思考に焦点をあて、さまざまな価値葛藤に直面する際の意思決定過程を分析し、社会福祉実践にみられる実践知の特徴について実証的に明らかにすることである。昨年度に採集した質的データについて、解釈の妥当性について検討を重ねながら研究成果を報告書にまとめた。また、在宅高齢者にかかわる実践者を対象とする研修会において、研究成果の一部を還元した。報告書の構成は次のとおりであり、理念や制度の狭間で葛藤しながら、それらと折り合いをつけている経験の内実が描き出された。これらの研究成果については出版化することが予定され、広く社会に還元することとする。第1章実践現場の<わたし>の<経験>をまなざす視角第2章社会福祉実践における<実践知>および<葛藤>への着眼第3章在宅高齢者終末期における専門職がチーム活動を行う上で経験する葛藤とその対処過程第4章特別養護老人ホームの認知症介護における介護職員の役割葛藤に関する研究第5章韓国における施設入所高齢者が経験する葛藤第6章自立生活を送る全身性障害者の介助者が抱えるジレンマと、その解決過程第7章障害者施設におけるアート活動にかかわる実践者の葛藤とその解決過程第8章障害児の自立を支援することの葛藤-個人将来計画の作成にかかわるアクションリサーチを通して-第9章障害のある子をもつ親にとっての子離れの葛藤に関わる環境要因および成人期の知的障害者への支援第10章進行性難病者の社会参加における折り合いのつけかた-
西洋古代の「心の哲学」における基礎概念の成立と変容

本年度は、前年度に引き続き、「心の哲学」におけるいくつかの基礎概念の成立と変容の過程を分析した。(i)まず、現代の心の哲学における重要概念である<志向性>について、前年度の研究を発展させた。この概念の直接の源泉となった<志向的内在>の概念について、その導入者フランツ・ブレンターノ自身はアリストテレスの魂論にその主要な源泉を求めたが、その概念が要請される彼の理論的背景からも、またブレンターノのアリストテレス解釈自体にも、デカルト的な内在主義が強く影響していることを具体的に論証して、この概念の歴史的問題を明らかにした。同時に、アリストテレス自身の哲学には、デカルト的な内在主義とは別の志向性の理解が胚胎していることを展望した。(ii)さらに、現代哲学のなかで近年再び議論の的となっている<感情>の概念について、感情に認知的、合理的要素を認める現代の議論の基本方向を俯瞰した上で、西洋古代思想、とりわけアリストテレス哲学においてそのような現代的捉え方が基本であったことを見届けた。さらに<感情>の概念が形成されるに到る思考動向をたどった。プラトン以前には、基本的に<感情>という概念は不在であったのに対して、プラトンの著作、とりわけ『国家』における魂の非理知的部分についての議論には、<感情>の概念の形成と「パトス」という言葉におけるその概念化の達成に深くかかわる重要な考察が展開されていることを確認した。そこでは、現実の生を悲喜劇が演じる生と重ねて見るという視点のもとで、悲喜劇の用いる語りの構造が使用している心理学をプラトンが批判的視点を伴いながらもそれとして読みとることを通じて、<感情>の概念の確立を準備するような概念的集約がおこなわれていることを論証し、感情という概念を再考する上での重要な手がかりを得た。本年度は、まずこの研究の最も重要な資料となるアリストテレスの『魂について』(De anima)の研究を継続した。その成果の一部は、翻訳と訳注、及び少し詳しい解説を付して『アリストテレス魂について』として京大学術出版会から刊行されている。なおこの書についての詳しい注解は現在さらに進行中である。それと平行しつつ、「心の哲学」におけるいくつかの基礎概念の成立と変容の過程を分析した。まず現代の心の哲学における重要概念である「志向性」について、現代哲学での基本的問題を見届けたうえで、この概念の問題性の源泉が、ブレンターノによるこの概念の定立の背景にあったアリストテレスの魂論とデカルト的な心の哲学との緊張関係にあることを解明した。その一部を「志向性-現在状況と歴史的背景(1)」という論文にまとめた。また「対象」「客観」(Objekt)という概念についても、その直接の源泉であるスコラ哲学でのobiectumが登場する初期文献およびその前史を構成する新プラトン主義者やキケロの著作の検討をおこない、obiectumという言葉には、ストア派と新プラトン主義者に由来する「表象」的捉え方とアリストテレスの「アンティケイメノン」という「実在する相関対象」的理解が潜在していることを確認し、そのことの意義を再考した。さらに「感情」(emotion, passion)という概念についても、現在古代ギリシアのパトスという概念を手がかりに解明を進めている。
ヒトクローン化T細胞の特異的自家癌破壊機序の研究

ヒト自家癌の免疫学的破壊のメカニズムの解明は直接、癌の治療にもつながるだけに腫瘍免疫学の最大の課題でもある。今日まで動物のモデルをはじめとして様々な報告があるが、そこから得た実験事実や理論がヒトの自家癌破壊にも適用されてきた。より直接的には実際にヒト自家癌の材料を使用して検討がなされるべきなのであるが、ヒト自家癌特異的に働くキラーT細胞クローンの長期培養が困難であり、今日までそのassay系の確立はなされていない。我々はこのようなassay系の確立に努め、自家癌特異的なTキラークローン(TcHMC-1)の長期培養と自家癌標的細胞(HMC-1)の確立に成功した。本研究の目的はそのassay系を用いてヒト自家癌破壊のメカニズムを自己キラーT細胞クローンによる癌抗原認識、および腫瘍細胞破壊の各ステップで解析することである。TcHMC-1クローンは今日まで1年以上そのキラー活性を強く保持し、一方HMC-1はクローニング後、安定した特異抗原の発現を示している。しかも、HMC-1はOKT3および8単クローン抗体によりその活性が阻止され抗原特異的なレセプター(Ti)分子を有することが推測される。またTcHMC-1により認識されるHMC-1腫特異抗原はブタノールを用いることによりnon-cytr ticに強い免疫原性を保持しつつ可溶化されている。これらの基礎実験をふまえ本年は次のような実験を行った。(1)ブタノール可溶化HMC-1腫瘍特異抗原の純化とその構造決定。(2)単クローン抗体を用いてTcHMC-1上のTi分子を解析する。(3)HMC-1 DNAトランスフェクションを自家線維芽細胞を含めた様々の細胞を用いて行い、腫瘍特異抗原の発現と細胞の悪性形質転換との関係をさぐり、TcHMC-1による癌細胞破壊の機構を解析する。現在までのところ(1)については、分子量で30K前後の3つのポリペプチドが同定されており、さらに詳しく検討中である。
膠原病の病理生理における抗hnRNPA2/B1自己抗体の意義の解析

GST結合蛋白を用いたheterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP)A2、B1およびB0自己抗体検出ELISAプレートによる検定はコントロールの希釈系列を用いた検定でも成績が安定せず、実用化に困難が生じたため、従来のイオン交換カラム、ssDNAアフィニティーカラムを用いて固相化蛋白を確保することとした。このため処理検体数は制限されたが、新たに全身性エリテマトーデス(SLE)4例、円板状エリテマトーデス(DLE)3例、強皮症(SSc)3例、皮膚筋炎(DM)2例について血清中の抗hnRNP自己抗体の測定を試みた。この結果慢性関節リウマチで37.5%(3/8例)、SLEで46%(6/13例)、強皮症で40%(4/10例)、シェーグレン症候群で0%(0/3例)、皮膚筋炎で0%(0/2例)、ベーチェット病で0%(0/5例)という結果を得た。各種膠原病において明らかな特異性はみられず、これはSmolenら(Int Arch Allergy Immunol,1996)の報告とほぼ一致した結果となった。またSLE12例、DLE6例、SSc4例について生検にて採取された皮膚組織において、A2/B1蛋白を個別に認識する抗体4G8、2B2を用いて抗原の分布を解析した。A2/B1t蛋白の分布には明らかな差は認められず、有棘細胞層下層および浸潤リンパ球の一部が染色された。凍結切片を用いた個々の細胞内での抗原蛋白分布は、核内、細胞質染色パターンであり、細胞膜が有意に染色された症例は認められなかった。これは増殖に伴いRNA合成がさかんな細胞群と一致しており、膠原病の病態との関連性は低いと考えられた。症例数が少ないため今後の検討が必要と思われるが、特定の膠原病発症とheterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP)A2、B1およびB0自己抗体産生との関連性は低いと考えられた。今年度は、解析の対象となるheterogeneous nuclear ribonucleoprotein(hnRNP)A2、B1およびB0蛋白の精製方法を改良するとともに、これらがテロメア伸長酵素に与える影響を比較検討し、報告した後、各種膠原病患者におけるhnRNPA2、B1蛋白に対する自己抗体の存否、抗体価のアッセイを行うため、多数検体の処理に適するELISA法の確立に着手した。組み換え蛋白を大量に得るため、精製が容易であるGST結合蛋白として抗原となるhnRNP蛋白を作成して、ELISAプレートの作成を試みた。カラム精製された組み換え蛋白をGST結合蛋白用のELISAプレートに固相化し、以前に作成したhnRNPA2およびB1蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて検定を行ったが、安定して抗体価を測定できないという問題が生じた。解析対象とするhnRNPA2およびB1蛋白は同一遺伝子から選択的スプライシングにより産生される。両者の差異は同蛋白のN末端付近に存在し、モノクローナル抗体はこの部分の合成ペプチドを用いて作成されているため、大型の分子であるGSTが結合することで物理的に抗体との接触が障害されるため、安定した検定結果が得られないのではないかと考えている。今後は精製後切断可能な形で抗原蛋白を作成し、これを用いて新たなELISA法による測定を試みる予定である。従来の方法によって得た蛋白を用いたELISAにて臨床検体における抗体価の測定を加療中の患者血清において数例施行したが、ステロイド投与を含む治療の影響か、高抗体価を示す症例は現在のところ認められていない。これに関しては新鮮例における検討を行う必要があると考えられ、新規患者における測定をルーチーン化する体制を構築するものとした。

これは増殖に伴いRNA合成がさかんな細胞群と一致しており、膠原病の病態との関連性は低いと考えられた。症例数が少ないため今後の検討が必要と思われるが、特定の膠原病発症とheterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP)A2、B1およびB0自己抗体産生との関連性は低いと考えられた。
質量イメージングによる関節リウマチ関節滑膜組織の疾患関連分子プロファイル解析

関節炎マウスではマクロファージやリンパ球などの免疫担当細胞の滑膜組織への浸潤と滑膜組織でのMMP-3,9、TGF-β、VEGF発現の増加を認めたが、関節炎を誘導しなかったマウスではこれらの増加は見られなかった。関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで二次元電気泳動および安定同位体を用いた定量プロテオミクスの手法を用い比較検討し、12のピークが関節炎発症群で高く、その一つがα-enolaseであった。新鮮凍結滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成を試みたがスライドの作成困難であった。骨組織を含むことや組織切片は小さいことが原因であった。本研究では確立された慢性関節炎モデルSKGマウスを用い、質量イメージング(IMS)法および免疫組織学的手法により関節炎に関連する分子を同定し、その空間的局在性及び量的変動を解析する。SKGマウスは真菌菌体を皮下投与することで関節炎を誘導し、新鮮凍結関節滑膜組織から超切片スライドを作成し、ホルマリン固定後に免疫染色をした。マクロファージやリンパ球などの免疫担当細胞の滑膜組織への浸潤と滑膜組織でのMMP-3,9、TGF-β、VEGF発現の増加を認めた。関節炎を誘導しなかったマウスでは炎症細胞の浸潤、MMP-3,9、TGF-β、VEGF発現の増加は見られなかった。シトルリン化蛋白については、滑膜組織での発現を確認できなかった。現時点では新鮮凍結滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成は、骨組織を含むために困難であった。滑膜組織のみを関節から剥離し超切片スライドを作成する手法を試みているが、挫滅が著しく課題を残している。関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで定量プロテオミクスの手法を用い比較検討した。両群の滑膜組織より抽出した等量の細胞内蛋白を安定同位体で標識された試薬で標識しトリプシン消化した後、質量分析計でピーク強度の差をタンパク質量の差として定量した。その結果、蛋白発現量が2倍以上あるピークを12個見出した。関節炎発症群と非発症群それぞれに発現量が多いピークがあった。これらのピークについて、蛋白の同定を試み、α-enolaseを同定した。本年度、SKGマウスは真菌菌体を皮下投与することで関節炎を誘導し、新鮮凍結関節滑膜組織から超切片スライドを作成し、ホルマリン固定後に免疫染色をした。マクロファージやリンパ球などの免疫担当細胞の滑膜組織への浸潤と滑膜組織でのMMP-3発現の増加を認めた。関節炎を誘導しなかったマウスでは炎症細胞の浸潤、MMP-3発現の増加は見られなかった。また、同一の新鮮凍結滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成を試みたが、骨組織を含むために超切片スライドの作成が困難であった。そこで滑膜組織のみを関節から剥離し超切片スライドを作成する手法を試みている。さらに関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで定量プロテオミクスの手法を用い比較検討した。これらのピークについて、蛋白の同定を試みている。

現時点では新鮮凍結滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成は、骨組織を含むために困難であった。そのため滑膜組織のみを関節から剥離し超切片スライドを作成する手法を試みた。組織切片の剥離は可能であったが、IMSによる解析は困難であった。また、関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで定量プロテオミクスの手法を用い比較検討した。両群の滑膜組織より抽出した等量の細胞内蛋白を安定同位体で標識された試薬で標識しトリプシン消化した後、質量分析計でピーク強度の差をタンパク質量の差として定量した。その結果、蛋白発現量が2倍以上あるピークを12個見出した。関節炎発症群と非発症群それぞれに発現量が多いピークがあった。これらのピークについて、蛋白の同定を試み、2つのピークはα-enolaseであったが、他のピークに関しては現時点で同定ができなかった。膠原病滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成が計画以上に難しく、さらなる工夫が必要であったことと、実験に用いていたマウスの形質が継代とともに変化し、関節炎が誘導しにくくなったことが研究の進行を遅らせている。滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成が計画以上に難しく、さらなる工夫が必要であったことと、滑膜組織、特に関節炎非発症群の滑膜組織から抽出できる細胞内蛋白量が少ないことが研究の進行を遅らせている。関節滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成を行う。骨などの硬い組織から超切片スライドを作成する方法および滑膜組織のみを関節から剥離し超切片スライドを作成する方法を試み、滑膜組織のIMSを確立する。関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで定量プロテオミクスの手法を用い前年度と同様に比較検討する。抽出できる細胞内蛋白量を増やすために実験に用いるマウスを増やし、蛋白の同定を引き続き行う。α-enolaseについては、ウエスタンブロットにより確認を行う。また、関節滑膜組織より抽出した細胞内蛋白の発現を関節炎発症群と非発症群とで定量プロテオミクスの手法を用い前年度と同様に比較検討する。抽出できる細胞内蛋白量を増やすために実験に用いるマウスを増やし、蛋白の同定を行う。同時に血清を採取し、CRP、MMP-3、IL-6、TNF-αなどの血清マーカーを測定し、発現量に変化がある蛋白との相関をみる。実験に用いていたマウスの形質が継代とともに変化し、関節炎が誘導しにくくなったため進行が遅れが生じ未使用額が生じた。実験に用いていたマウスの形質が継代とともに変化し、関節炎が誘導しにくくなったため改めて購入し、費用は前年度未使用額で充てる。関節滑膜組織の定量プロテオミクスの試薬、血清マーカー測定の試薬を購入する。実験に用いるマウスを増やすために飼育費用・関節炎発症のための試薬を購入する。関節滑膜組織からIMS用の超切片スライドの作成、滑膜組織のIMS法に用いる試薬を購入する費用は、当年度未使用額で充てる。
敗血症における呼吸筋筋力の低下に対する人工呼吸の影響

患者の自発呼吸努力により同調したモードであるプレッシャーサポート換気が現在、人工呼吸法として主流である。プレッシャーサポート換気では患者の呼吸努力と人工換気を一致させるため、逆に呼吸筋に対する人工呼吸の影響が大きくなる可能性が高い。われわれは患者の自発呼吸努力に同調した陽圧換気法である持続陽圧換気(CPAP)+プレッシャーサポート換気(PSV)モードにおいて従圧式換気のプレシャーサポート値を上下させ、エンドトキシンによる横隔膜筋力低下へのどのように影響するかについて検討した。鎮静薬投与、局所麻酔施行下にラットに気管切開を施した後、エンドトキシン10mg/kgを投与し、30分後に以下の4つの条件で人工呼吸を開始して300分後に横隔膜筋力を測定した。(3)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧10cmH_2O(気道内圧上昇速度小)(4)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧10cmH_2O(気道内圧上昇速度大)(5)Control群ではエンドトキシンの代わりに同量の生理食塩水を投与し、300分後に同様に横隔膜筋力を測定した。横隔膜の筋力の評価についてはin vitroのチャンバー法を用いた。補助換気の程度を評価するため、食道内圧を測定し、食道内圧の低下の程度で換気補助の程度を評価した。結果は横隔膜筋力の低下はプレッシャーサポート5cmH_2Oが最も小さく、プレッシャーサポート0と10cmH_2Oでは横隔膜筋力の低下はより大きかった。食道内圧の低下の程度はプレッシャーサポート圧0よりも5で小さく、10では食道内圧はむしろ陽圧であった。エンドトキシンによる横隔膜筋力の低下に対して適切なレベルのプレッシャーサポート換気を行えばその進行を遅らせられる可能性がある。本年度は以下のように補助換気法、間歇的強制換気(IMV)の敗血症モデルにおける呼吸筋障害への影響を調べる実験を行った。370-420gオスSprague-Dawley系ラット(n=60)対象を対象として、ケタミン、キシラジンを腹腔内投与し麻酔導入、局所麻酔下に気管切開、右内径動脈をカットダウン。麻酔維持はケタミン、キシラジンを持続投与した。敗血症モデルはLPS10mg/kgを5分間かけて投与して作成し、LPS投与後30分間、ルームエアー下自発呼吸で放置した後、以下の呼吸条件で4時間人工呼吸管理を行った。(1)CPAP群;CPAP 5 cmH_2O,陽圧補助はなし。(2)IMV15群;IMVモード15/min,PEEP 5 cmH_2O。(3)IMV30群;IMV30/min,PEEP 5 cmH_2O。(4)IMV45群;IMV 45/min,PEEP 5 cmH_2O。(5)IMV45+MR群;筋弛緩薬投与下、IMV 45/min,PEEP 5 cmH_2O。(6)Control群;LPSの代わりに生食を投与、4hrの人工呼吸もせず。IMV換気条件はpressure control圧10cm_2O、吸気時間0.3秒とし、人工呼吸器:Servo300(ジーメンスエレマ社)を使用した。横隔膜筋力の評価にはin vitroチャンバー法を用いた。実験終了後、横隔膜を摘出し左横隔膜から筋strip(2×13mm)を作成。5%CO_2+95%O_2をバブリング下のKrebs-Ringer液を還流したチャンバー内で電気刺激し筋張力を測定した。

測定項目はtwitch刺激、10,20,50,100,120Hzのテタヌス刺激、50Hzのテタヌス刺激(duty cycle 1:1、2min)後の筋力の減衰度とした。結果は換気条件によって血液ガス、循環動態に各群間に大きな差はなかった。換気条件はLPS投与後の横隔膜筋力の低下の程度に影響し、120Hzテタヌス刺激時に得られる最大筋力で比較するとIMV30が最も筋力低下が小さく、IMV45が筋力低下が最大であった。twitch張力はIMV30とIMV45とに差があった。筋疲労のしやすさにはグループ間に大きな差はなかった。このように換気条件はLPS投与後の横隔膜筋力の低下に影響した。補助換気条件を調整することによってLPSによる筋力低下を防止できる可能性がある。しかし、高い換気補助条件ではLPSによる筋力低下の程度は大きくなった。筋弛緩薬投与下の調節呼吸の筋力低下防止効果は補助換気よりは小さかった。より患者の自発呼吸努力に同調したモードであるプレッシャサポート換気が現在、人工呼吸法として主流である。プレッシャサポート換気では患者の呼吸努力と人工換気を一致させるため、逆に呼吸筋に対する人工呼吸の影響が大きくなる可能性が高い。われわれは患者の自発呼吸努力に同調した陽圧換気法である持続陽圧換気(CPAP)+プレッシャーサポート換気(PSV)モードにおいて従圧式換気のプレシャーサポート値を上下させ、エンドトキシンによる横隔膜筋力低下へのどのように影響するかについて検討した。にラットに気管切開を施した後、エンドトキシン10mg/kgを投与し、30分後に以下の4つの条件で人工呼吸を開始して300分後に横隔膜筋力を測定した。(1)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧0 cmH_2O(2)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧5 cmH_2O(3)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧10 cmH_2O (気道内圧上昇速度小)(4)CPAP+PSVモードプレッシャーサポート圧10 cmH_2O (気道内圧上昇速度大)(5)Control群ではエンドトキシンの代わりに同量の生理食塩水を投与し、300分後に同様に横隔膜筋力を測定した。横隔膜の筋力の評価についてはin vitroのチャンバー法を用いた。補助換気の程度を評価するため、食道内圧を測定し、食道内圧の低下の程度で換気補助の程度を評価した。結果は横隔膜筋力の低下はプレッシャーサポート5cmH2Oが最も小さく、プレッシャーサポート0と10cmH2Oでは横隔膜筋力の低下はより大きかった。食道内圧の低下の程度はプレッシャーサポート圧0よりも5で小さく、10では食道内圧はむしろ陽圧であった。エンドトキシンによる横隔膜筋力の低下に対して適切なレベルのプレッシャーサポート換気を行えばその進行を遅らせられる可能性がある。
ＭＥＤＩＣＡＬ　ＨＵＭＡＮＩＴＩＥＳ　ＤＡＴＡＢＡＳＥ　ＪＡＰＡＮ

本研究の目的は、医療に関する文学作品や映画を日本語と英語の二ヶ国語で紹介するウェブサイト上のデータベース、医療人文学データベース日本版(Medical Humanities Database Japan;以下MHDJ)を構築することであった。本研究によって、英語で書かれた文学作品25本、日本語で書かれた文学作品20本、映画作品21本を収録した英語と日本語の二ヶ国語のウェブサイト上のデータベースを構築した。本研究で製作したMHDJはhttp://www.medicalhumanitiesjapan.com.で公開している。本研究の目的は、日本では初めてとなる医療人文学のデータベース(MHDJ)を構築することである。これは医療人文学に関連のある文学作品や映画を基に構築し、コミュニケーションや共感の重要性、患者の病気体験に対する配慮などの医療人文学的洞察を日本人医療関係者に与えることを目的とする。この概念はニューヨーク大学医学部で構築された医療人文学データベースをベースとしている。しかし、このデータベースが英語を母語とする人を対象にしたものであるのに対し、本研究で構築する医療人文学データベースは、外国語として英語を学習している日本人を対象としている。そのため、本研究における医療人文学データベースの内容は、英語と日本語の二言語で記載している。データベース上の作品は英語版も日本語版も出版されているが、利用者の利便性を考慮し、言語を選択できるよう配慮している。文学作品の概要については、本来英語で書かれたものを日本語に翻訳したものもあれば、逆に日本語で書かれたものを英語に翻訳したものもある。日本語版の英訳を付したのは、日本人の利用者に日本の作品を英語で読む機会を提供するためだけでなく、日本文学や文化を外国人に紹介し、医療に関連した日本文学を世界中の医療関係者に紹介するためでもある。データベースに掲載されている映画の使用言語は全て英語であるが、日本語字幕付きである。また、MHDJ上の全ての文学作品及び映画には、利用者にその作品の医療人文学的価値を説明する英語と日本語の注釈を付している。MHDJの目的は国際的な医療マインドの向上させ、映画や文学作品を通して日本語と英語を話す2つの医療界を近づけることにある。本研究によるMHDJに適切な作品の検証を通して、日本には医療人文学に適した文学作品が多いことが明らかになった。本研究は医療人文学に関する研究である。本研究の目的は,医師の英語コミュニケーション能力の育成を目指し,文学作品や映画を利用した日本初の医療人文学データベース(MHDJ)を構築することである。本研究の概念は,ニューヨーク大学医学部で構築された世界初の医療人文学のデータベースをもとにしている。そのデータベースには,現在2,500以上の文学と250以上の映画が収録されている。本研究は,日本人に特化しているという点で独創的であり,外国語として英語を学んでいる学習者を対象にした医療人文学データベースという点でも世界初の試みである。本研究で構築するMHDJは英語と日本語で表記し,日本の学生や医療人が英語力向上のために使用することを想定している。本研究では,まずデータベースに収録する文学作品や映画を検証するために,20の文学作品と28のグラフィック小説,40の映画を選定した。選定の際は,日本で容易に利用することができ,手頃な価格であることを基準とした。そのため,MHDJに適切な文学作品や映画もあったが,その基準を満たさず選定できないものもあった。最終的に,英米の20の映画を選定し,それぞれに英語で注釈を付記した。さらに,それらを6つの分野に分類し,医学的キーワードを付した。文学作品に関しては,文と絵の両方で物語を伝えているグラフィック小説が英語学習者にとっては理想的でMHDJに最適なジャンルだという結論に達した。そこで医学部4年生を対象にグラフィック小説を用いて研究を行った結果,グラフィック小説は学生の読むことに対する関心とモティベーションを高めることが明らかになった。グラフィック小説は日本においてもインターネット経由で容易に購入でき,価格も1,0001,500円と安価である。そこで,データベースに収録する作品として,17のグラフィック小説を選定し,それぞれに英語で注釈を付記した。このデータベースは医療規範、医学史、医療文化などの医療人文学的洞察を日本人医療関係者に教示することを目的としている。さらに、医療人文学分野の授業用教材を模索している日本人教育者にとって、有用なデータベースとして活用されることを期待し、研究を行った。本研究によって、英語で書かれた文学作品25本、日本語で書かれた文学作品20本、映画作品21本を収録したウェブサイト上のデータベースを構築した。作成にあたっては、デザイン性、機能性、利便性を考慮すると同時に、日本人学習者の積極的な活用を期待し、それぞれの作品に関して、英語と日本語の二ヶ国語で注釈を付した。

この注釈では、国際的な医療コミュニティの理解促進を目的に、作家や俳優、監督たちの雑誌やテレビでのインタビュー等のコメントも紹介した。また、学習者がこのデータベースに収録されている作品をすでに読んだり、見たりしていなくても、教材として活用できるよう配慮した。さらに、容易にかつ安価に今後も継続してデータベースの充実を図ることができるように、ウェブサイト設計を行った。このMHDJが日本における医療人文学の発展と、日本の優れた医療人文学の海外への発信に貢献することを期待している。本研究で製作したMHDJはhttp://www.medicalhumanitiesjapan.com.で公開している。医療人文学2013年度は、MHDJのウェブサイトの構築を行った。そのため、ウェブサイトの契約およびドメインの購入のために科研費を利用した。本研究によって構築されたデータベースは現在インターネット上のウェブサイト( URL: http://www.medicalhumanitiesjapan.com. )で閲覧可能である。現在の閲覧可能なデータベースの内容は、65作品のデータである。2013年度は、研究計画に従って、データベースに掲載する文学作品の選定を行った。その際に、日本人利用者の英語レベルに適した作品を選定するよう配慮した。その結果、MHDJ上の全ての作品が英語版も日本語版も出版されているものとなり、利便性の向上につながった。まず第一に、英文学の日本語翻訳版を利用することができるため、データベース上の作品に関しては言葉の壁を取り払うことが可能となった。そのため、英語で文学作品を読むことができない日本人であっても、日本語翻訳版から英文学作品内の多くの情報を吸収することができるのである。第二に、データベース上には英訳されている日本文学作品も掲載されているため、日本人の英語学習者が既知のストーリーを通して効率的に英語を学習することも可能である。さらに、英訳版が出版されていることにより、医療に関連した日本文学を世界中の医療関係者に紹介することも可能となる。MHDJ上の全ての文学作品と映画には、注釈を付している。この注釈に関しては、単に作品の概要を示すだけではなく、利用者により多くの情報を提供することができるように、今年度改良を図った。改良版の注釈には、医療人文学に対する示唆に富む作家や俳優もしくは監督のコメントなども含まれている。この注釈は、英語と日本語の二言語で掲載する予定である。当初の計画では、2013年度中に二言語での注釈を完成させる予定であったが、翻訳作業がまだ途中段階である。本研究の1年目の目標は,MHDJに収録する40の文学作品と20の映画を選定することであった。映画に関しては,この目標を達成し,データベースに収録するべき20の作品を選定することができた。
幕末維新期における薩摩藩の対外関係史の研究

本研究の目的は,幕末維新期にベルギー商社設立やパリ万博出展の斡旋など薩摩藩と極めて深い関わりを持ったフランス貴族モンブラン伯爵に関する史料の調査である。従来,幕末薩摩藩の外交史の研究は,薩英戦争,留学生派遣,グラバーからの武器調達など,対イギリスとの関係を中心に進められてきた。モンブラン伯爵との関係については,日本側の史料がほとんど残されていないという状況から本格的な研究は行われてこなかった。モンブラン伯爵のご子孫が史料を所蔵していることは一部では知られていたが,研究者が同史料を活用することは不可能であった。そうした中,このたびモンブラン伯爵のご子孫で史料所蔵者のボードワン・モンブラン氏から史料調査の許可が下り,今回の調査が実現した。史料は数点ずつ封筒に入れられ,3箱の段ボールに入れられていたが,目録なども存在せずほとんど未整理の状態であった。合計数百点に上る史料のうち,幕末薩摩藩に関するものを選び出しデジカメで撮影した。さらに,ボードワン・モンブラン氏に聞き取りを行い,史料伝存の経緯などについて調査した。モンブラン家の旧居城であるインゲルムンステル城の調査についても,現在の城館の所蔵者である地元のビール会社の協力を得て行った。当日は,地元の郷土史家のアルバート氏も調査に立ち会ってくださり,これまで調べたモンブラン家の歴史についてもご教授いただいた。帰国後,鹿児島県歴史資料センター黎明館所蔵(寄託)の玉里島津家資料や大阪商工会議所所蔵の五代友厚関係史料などと照らし合わせる作業を続けているが,両史料群には含まれない史料が数点モンブラン家史料に含まれることが判明した。今後,さらに詳細に比較・分析を続けたい。
吻側延髄腹外側部の血管運動ニューロンの化学感受性

吻側延髄腹外側部(rostral ventrolateral medulla;RVLM)に存在し交換神経性血管運動神経をコントロールしている血管運動ニューロン(vasomotor neuron;VMN)は、脳脊髄液中の化学情報の検出器ないしは中継点でもあると考えられているが、VMN自身が脳脊髄液中の化学情報を直接感知するのか、間接的機構が存在するのか、不明であった。そこで本研究の目的はVMNの化学感受性を直接検証することであった。従来のように最終出力、すなわち血圧反応からの推測するのではなく、VMNの活動を記録しながら、生理活性物質の1つであるendothelin-1(ET)をRVLMの表面または直接VMNに投与してVMNの活動変化を比較検討した。実験には麻酔・非動化したラットを用いた。VMNの同定は、自発活動、心拍との同期性、交感神経節前細胞の存在する脊髄中間外側角の刺激による逆行性興奮などの生理学的指標の確認と、実験終了後に組織学的検索を行い、記録したニューロンがRVLMに存在することを確認することにより行った。RVLMの表面にETを投与した場合には、調べた全てのVMN(n=18)が反応した。一方、直接VMNに投与した場合には、大多数のVMN(19/21;90%)が興奮反応または興奮に引き続く抑制反応を示した。すなわち、VMNは脳脊髄液中または細胞外液中に含まれるETに直接反応し得ると結論された。この結果から、VMNは動脈圧受容器反射などの神経情報の中継点としての既に確立された役割だけでなく、それ自身が脳脊髄液中の化学情報の受容器として液性情報と神経性情報の統合的役割も果たしている可能性があると考えられた。
ヘテロクロマチン構造の確立と維持を制御する分子機構

本研究では分裂酵母のヒストンメチル化酵素複合体CLRCに着目し、ヘテロクロマチンの形成とユビキチン化との関連を検討した。分裂酵母からアフィニティー精製したCLRCを用いたin vitroのユビキチン化アッセイによって、CLRCがヒストンH3に対するユビキチン化活性を有することが明らかになった。さらに、ユビキチン化されたヒストンH3が実際に分裂酵母のクロマチン上に存在していること、またユビキチン化修飾の存在がメチル化酵素の活性を促進することを明らかにした。真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、本年度は以下の2つの研究を遂行した。【研究項目1:CLRC複合体の動態解析】分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明である。本年度はまずCLRCの構成因子であるRik1にTAPタグを付加した分裂酵母株を作成し、アフィニティー精製によってCLRC複合体の精製を進めた。最終産物を質量分析で解析したところ、以前の報告通り各構成因子の存在が確認されたことから、きちんとCLRC複合体が精製できたと考えられる。次にRik1を除く他の因子を欠損させた酵母株で同様にCLRC複合体を精製したところ、Raf1、Raf2の欠損株ではRik1以外の因子がほとんど解離してしまったのに対して、Clr4の欠損株ではClr4以外の構成要素が確認された。以上の結果より、Raf1とRaf2がCLRC複合体の形成に重要な役割を果たし、Clr4はCLRCコア複合体に弱く相互作用している構成要素であることが示唆された。【研究項目2:CLRC複合体のユビキチン化基質の同定】上記研究項目1でアフィニティー精製したCLRC複合体を使って、in vitroユビキチン化反応系の構築を試みた。過去の報告に従ってE1、E2、ユビキチンを用意し、CLRC複合体の有無でユビキチン化活性が認められるか調べたところ、実際にポリユビキチン化のシグナルが確認されたことから、精製したCLRCがユビキチン化活性を持つことが分かった。次に候補となる基質を使ってCLRCの基質になり得るか検討したところ、ヒストンH3が効率の良い基質になることを見出した。真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズムの解明を目指して、本年度は以下の2つの項目の研究を遂行した。【研究項目1:CLRC複合体の機能解析】分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明である。昨年度までに精製したCLRC複合体を用いたin vitroユビキチン化アッセイによって、ヒストンH3がユビキチン化の標的になることを見出した。本年度はこの知見をもとに標的となる残基の特定を目指した。まず、質量分析によってユビキチン化されたヒストンH3を調べることで、H3のN末端の複数の標的リジン残基を同定した。次に、候補となるリジン残基に変異を入れた基質を用いてユビキチン化アッセイを行ったところ、14番目のリジンに変異を導入した場合に、CLRCのユビキチン化活性が顕著に減少することを見出した。【研究項目2:ヒストンH3のユビキチン化動態の解析】これまで分裂酵母の細胞内でヒストンH3がユビキチン化修飾を受けているという報告はなかったが、上記の解析結果から、ヒストンH3のユビキチン化がヘテロクロマチン形成において重要な役割を果たしている可能性が考えられた。そこで分裂酵母の細胞内のユビキチン化状態を解析するため、ユークロマチンのマーク(H3K4me2)とヘテロクロマチンのマーク(H3K9me2)を認識する抗体を用いてクロマチンを免疫沈降し、そのサンプルを質量分析を用いてユビキチン化の解析した。その結果、H3K9me2に対する抗体で沈降したクロマチンに、H3K14のユビキチン化が特異的に検出されることを見出した。これまでCLRC複合体の役割や基質については全く明らかにされておらず、その活性を検出するとともに、実際に標的となる基質と残基を特定したのは大きな成果であり、ヘテロクロマチン形成とユビキチン化との関係解明につながる画期的な成果であると評価できる。真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズム解明を目指して、本年度は以下の2つの項目の研究を遂行した。【研究項目1:CLRC複合体の機能解析】分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明であった。平成27年度までにヒストンH3の14番目のリジンがCLRCによって優先的にユビキチン化されることを見出した。本年度はこの知見に基づき、H3のユビキチン化がどのようにClr4のメチル化活性に影響を与えるのか検証した。CLRC