hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規簡易貼付型ブラキシズム検出装置による大規模疫学ならびに臨床介入研究

その結果,感度とブラキシズムイベントの相関係数は0.75,0.82および-0.29(cut-off level:40%,30%および20%最大噛み締め)であった.一方特異度は0.55から1.00の範囲であった.これらの中で,最も優れたcut-offレベルは最大噛み締め時の40%であり,この場合,感度:0.63,特異度:0.73であった.これらのことから,本筋電計は,最大噛み締め時の40%のcut-offレベルで,中等度から重度のブラキシズム患者の検出に有効な機器であることが確認できた.2.ブラキシズム検出装置の改良ならびに感度,特異度の解析上記結果より,本検出装置のブラキシズム検出のCut-off levelを40%と設定し,かつ検出基準にCut-off levelを超過した咀嚼筋過緊張イベントのうち,最小間隔ならびに最小持続時間クライテリア(それぞれ3秒,1秒)を適用するよう仕様を変更した.その結果,新仕様の検出装置は,感度:0.92,特異度:0.91と非常に高い検出精度が得られた.3.ブラキシズム検出装置を用いた測定精度の検討大規模疫学研究に先立ち,被験者自身による貼付を行った場合の測定精度を検討した.すなわち複数連続夜にわたり本検出装置を被験者自身が貼付し,ブラキシズム頻度のばらつきを測定し,安定したデータが得られるのに最低限必要な測定日数を検討した.その結果,測定開始3日後には被験者のブラキシズムデータに安定が認められた.本研究では,我々が開発した簡便かつ客観的に睡眠時ブラキシズム(Brux)を評価することの出来る小型貼付型Brux測定装置(BiteStrip-)を用いて,(1)青年層のBrux頻度と頭頚背部の筋痛との関連を検討する,(2)高頻度で生じたエラーの原因と思われる東洋人特有の皮膚抵抗に対応した改良型装置の開発を行った.対象は,高校生ならびに専門学校生のうち,本研究の参加に同意が得られた195名ならびに96名である.これら被験者にBiteStrip-を配布し,咬筋相当部皮膚に貼付して就寝させた.また,信頼性(κ=0.59)があらかじめ確認されている2名の検者が頭頸背部筋の圧痛検査を行った.この際,片側15部位の圧痛の有無を評価し,圧痛ありの部位の合計を圧痛点数とした.BiteStrip-によるBrux評価は,Bruxイベントの回数が40,75,125回をCut-offとした4段階にてそれぞれスコア0から3として評価し,Spearmanの順位相関係数にて関連性を検討した.装置未返却者29名と,エラー表示もしくは表示なし52名を除いた高校生127名と専門学校生83名を最終被検者とした結果,両被検群ともに,総圧痛点数とBrux頻度の間に有意な相関は認められなかった(高校生/専門学校生:p=0.61/0.11,ρ=-0.05/0.18).これより,青年層においてはBrux頻度と頭頸背部の筋痛には関連が認められないことがわかった.一方,この疫学研究より得られた結果,すなわち高頻度にエラー表示が発生する問題点を解決すべく,起動プログラムならびに皮膚通電感知センサーの仕様変更を行い,改良型Brux測定装置を開発した.そこで,新旧BiteStrip-の測定結果を比較して本改良点の効果について検討した.Brux陽性と診断された6名に5日間,新旧両方のBiteStrip-を貼付させ,その結果を比較した.6名が連続使用した5日間のうち,旧BiteStrip-では,エラー表示は14個(46.7%)であったのに対し,新BiteStrip-では1個(3.3%)と明らかにエラー発生率は低下した(p<0.01,Chi-Square test).これより新BiteStrip-は,旧型に比べ,東洋人に用いてもエラー表示が格段に少なく,優れた性能を示した.
マルチモーダル内視鏡による大脳基底核の細胞活動と電気的振動現象との関係解明

脳・神経系は神経細胞、局所神経回路、大規模神経回路のように階層構造を成しているため、それぞれの階層のデータを集約し統合的に解析を行うことで初めてその機能発現メカニズムを知ることができる。そのために我々は、マルチスケールイメージングを展開しているが、メゾスコピックな視点でマクロな情報とミクロな情報をつなぎ、統合的に解析する必要がある。そこで本研究では、in vivo多細胞イメージングと同時に細胞外電位を計測することが可能なマルチモーダル内視鏡システムを開発し、大脳基底核の機能解明を目指し、以下の研究を行った。1. in vivo多細胞神経活動イメージングを行うことができる極微細蛍光内視鏡イメージングシステムを開発した。このイメージングシステムを用いて、固定下の動物ではあるが、G-CaMP発現マウスでin vivoカルシウムイメージングを行い、単一細胞を識別できる空間分解能での多細胞神経活動計測に成功した。2.神経活動イメージングと電気生理学的計測を同時に行うことができる、マルチモーダル内視鏡の電極部分のプロトタイプを作成した。このプロトタイプは中に極微細蛍光内視鏡を挿入できるジルコニア製のチューブの外側に、非球面フォトファブリケーションプロセスを利用して複数の計測電極を構築したものである。このプロトタイプの電気的特性を評価し、神経活動計測に供することができる電極が作成できたことを確認した。(1)極微細蛍光内視鏡イメージングシステムの開発in vivoで神経活動のダイナミクスを捉えることができる低侵襲極微細蛍光内視鏡イメージングシステムを開発した。この内視鏡部は、直径450 um,画素数1万のイメージファイバと直径500 umのGRINレンズを組み合わせたものであり、従来の内視鏡と比較し侵襲度は低いにも関わらずその空間分解能は約2 umであり、単一細胞を十分視認できる。このイメージングシステムを利用し、固定下ではあるが、G-CaMP発現マウスの海馬での多細胞神経活動イメージングに成功している。また、この内視鏡によるイメージングを自由行動下の動物に適用するために、これまで困難であった内視鏡の動物への固定法の開発を進めている。平成30年度は、ジルコニア製の専用固定具を開発し、自由行動下の動物へ適用のための手術手技も含めた基礎技術の開発及び実用性の検討を行った。(2)マルチモーダル内視鏡の開発2-1内視鏡用マイクロ多点電極の開発極微細蛍光内視鏡での多細胞神経活動イメージングと同時に電気生理計測を行うために、内視鏡を動物に固定するガイドカニューレのように用いるジルコニア製のチューブの外側にマイクロ微小多点電極を構築した。独自に開発した非平面フォトファブリケーションプロセスを利用して複数の計測電極を有した外径0.8 mm、内径0.62 mm、電極数6のチューブ型電極のプロトタイプを作製した。この電極の電気的特性の計測を行い、一般に電気生理学計測に用いられる電極と特性を比較し、結果をもとに改良を加えることにより、電気生理学計測に供することができる電極を開発した。以上の進捗状況から、研究は順調に進展しているといえる。平成30年度に行った研究を引き続き継続し、マルチモーダル内視鏡の要素技術の更なる開発を行う。加えて、極微細蛍光内視鏡による自由行動動物に対するカルシウムイメージングを行うための技術開発を行うと共に、マイクロ多点電極を用いたin vivo神経活動計測実験を行い、その結果を基に、マルチモーダル内視鏡の更なる改良を進める。この開発を進めながら、in vivoイメージング、in vivo電気生理を同時に行うことができるような頭部固定装置の開発も進め、実際の動物に適用することで、光学計測と電気計測を同時に行うことができるマルチモーダル内視鏡の完成を目指す。

このイメージングシステムを利用し、固定下ではあるが、G-CaMP発現マウスの海馬での多細胞神経活動イメージングに成功している。また、この内視鏡によるイメージングを自由行動下の動物に適用するために、これまで困難であった内視鏡の動物への固定法の開発を進めている。平成30年度は、ジルコニア製の専用固定具を開発し、自由行動下の動物へ適用のための手術手技も含めた基礎技術の開発及び実用性の検討を行った。(2)マルチモーダル内視鏡の開発2-1内視鏡用マイクロ多点電極の開発極微細蛍光内視鏡での多細胞神経活動イメージングと同時に電気生理計測を行うために、内視鏡を動物に固定するガイドカニューレのように用いるジルコニア製のチューブの外側にマイクロ微小多点電極を構築した。独自に開発した非平面フォトファブリケーションプロセスを利用して複数の計測電極を有した外径0.8 mm、内径0.62 mm、電極数6のチューブ型電極のプロトタイプを作製した。この電極の電気的特性の計測を行い、一般に電気生理学計測に用いられる電極と特性を比較し、結果をもとに改良を加えることにより、電気生理学計測に供することができる電極を開発した。以上の進捗状況から、研究は順調に進展しているといえる。平成30年度に行った研究を引き続き継続し、マルチモーダル内視鏡の要素技術の更なる開発を行う。加えて、極微細蛍光内視鏡による自由行動動物に対するカルシウムイメージングを行うための技術開発を行うと共に、マイクロ多点電極を用いたin vivo神経活動計測実験を行い、その結果を基に、マルチモーダル内視鏡の更なる改良を進める。この開発を進めながら、in vivoイメージング、in vivo電気生理を同時に行うことができるような頭部固定装置の開発も進め、実際の動物に適用することで、光学計測と電気計測を同時に行うことができるマルチモーダル内視鏡の完成を目指す。
水晶振動子マイクロバランス法による食用油脂の品質評価

本年度は、水晶振動子センサーを用いて、油脂の冷却試験を数値的に評価可能か検討した。水晶振動子センサーとCDカメラを組み込んだ測定装置を作製した。この測定装置を用い、サンプルとして、精製および未精製の綿実油およびコーン油を用いて、冷却試験に供した。0°Cにて、精製および未精製の綿実油およびコーン油を貯蔵した際の結晶化の様子をCDカメラで撮影しながら、水晶振動子センサーの共振周波数と共振抵抗を測定した。その結果、精製油では、0°Cに3時間以上放置しても結晶は観察されなかった。一方、未精製油では、一部分で結晶の生成が確認された。また、未精製油脂と精製油脂とも、水晶振動子の共振周波数と共振抵抗の値が冷蔵中に変化した。とくに未精製油では、共振周波数の減少が観察された。一方、精製油では共振周波数の減少は観察されなかった。このことは、未精製油では、油脂中に存在する微量成分(主にワックスと思われる)が核となって、冷蔵中に結晶が生成し、それが水晶振動子に付着したため、共振周波数が減少したと考えられた。また、食用油の共振周波数と共振抵抗の関係を調べたところ、精製油と未精製油で異なるパターンを示すことを認めた。とくに未精製油脂では、共振周波数に対する共振抵抗の値が大きく変化した。以上より、水晶振動子センサーを用いて食用油の共振周波数と共振抵抗を測定することで、油脂の冷却試験を客観的に評価して、食用油の精製度を判別することが可能と思われた。本年度は、油脂の冷却試験用水晶振動子センサーの装置を作製し、実際に食用油の冷却試験を行い、水晶振動子センサーの測定結果と比較することになっていたが、当初の予定通りに実験を遂行すると共に、水晶振動子センサーの有効性を確認することができた。食用油脂の化学的品質評価法の一つに、油脂を構成する脂肪酸のうち、二重結合を有する不飽和脂肪酸の含量を評価する方法としてヨウ素価があるが、今後は、ヨウ素価の異なる多くの食用油について、水晶振動子センサーを用いて異なる温度で共振周波数と共振抵抗を測定してデーターを収集し、食用油のヨウ素価との相関性を調べると共に、水晶振動子を用いた分析法の精度や有効性について検討する予定である。今年度に購入した試薬が安価だったため、余剰金を次年度の溶媒・試薬、部品の購入に充てる。使用計画:溶媒・試薬(脂肪酸およびその誘導体)100万円、水晶振動子15万円
アルカリ骨材反応による鉄筋破断原因の究明

ASR構造物の鉄筋破断現象を以下の実験的検討により明らかにした。まず多数の鉄筋破断が確認された北陸地方の橋脚梁を対象として鉄筋の損傷分布の傾向について分析した。その結果,本橋脚では梁軸方向および断面方向の双方において,損傷鉄筋の発生分布に明確な規則性を有していなかった。このため,初期曲げによる鉄筋損傷度の差異により,不規則な鉄筋破断分布になったと考えられる。ついで,供試体実験を実施し,外観および内部ひび割れ進展度を比較すると劣化が進んでも,内部ひび割れは骨材周辺に留まることを明らかにした。本研究ではスターラップ曲げ加工部において40%にも及ぶ多くの鉄筋が損傷するなど極めて顕著なASR劣化が確認された橋脚を検討の対象とすることにより,同一構造物内で多数の鉄筋が損傷した要因に関して検討した.その結果以下のとことが明らかになった.まず,本橋脚では隅角部の広い範囲で多くの鉄筋損傷を生じていたが,梁側面のひび割れ分布では,曲げ加工部を含む隅角部と中央部分のひび割れ密度に明確な差異はなく,側面が全体的に膨張しているような挙動を示していた.ついで,多数の鉄筋損傷が生じた要因を検討するために,損傷鉄筋の梁軸方向における配列とスターラップごとの断面方向の損傷状況に着目して分析を行った.その結果,本橋脚では,梁軸方向および断面方向の双方において,損傷鉄筋の発生分布に明確な規則性を有していなかった.特に,健全鉄筋と健全鉄筋の間で破断鉄筋が存在したことなどを勘案すると,損傷鉄筋の分布は隣接する鉄筋や周辺の応力状態に依存したというより,むしろ,橋脚全体で不規則に発生した結果と考えるれた.最後に初期亀裂の発生しやすいについて検討した結果,本橋脚で使用された鉄筋は,曲げ加工に伴う初期亀裂が現行鉄筋に比べて相対的に大きく発生する鉄筋であったことが,多数の鉄筋を損傷させた要因と考えられた.また,同一条件で曲げ加工を行った際にも,初期亀裂深さが大きくばらついたことで,最終的な鉄筋進展度に大きな差異が生じたと考えられる.昨年度に引き続き今年度は以下の項目について検討を加え,鉄筋破断のメカニズムを明らかにした。1)多数の鉄筋破断が生じたASR劣化構造物の特性分析:多数の鉄筋破断が確認された北陸地方の橋脚梁を対象として,まず,橋脚梁に発生した鉄筋損傷と梁側面のひび割れ状況から,部材位置ごとのASR損傷分布を確認し,続いて亀裂鉄筋および破断鉄筋の発生状況を配列や断面方向における分布に基づき分析することで,鉄筋の損傷分布が部材内で進展した傾向について考察を加えた。特に,健全鉄筋と健全鉄筋の間で破断鉄筋が存在したことを勘案すると,損傷鉄筋の分布は隣接する鉄筋や周辺の応力状態に依存したというより,むしろ橋脚全体で不規則に発生した結果と考えられる。2)曲げ加工方法の相違による鉄筋の初期損傷評価:鉄筋破断が生じたASR劣化構造物の竣工年を考慮し,当時実施された可能性がある曲げ加工手法を再現することで,加工に伴う節形状の変化と初期亀裂の発生状況について調査した。その結果,以前主流であったハンドル型加工方法では,節のめり込み量,初期亀裂ともに小さいことが確認された。3)反応性骨材を用いた暴露供試体の長期劣化:反応性骨材を用いた複数の鉄筋コンクリート供試体を5年間に亘り長期暴露しコンクリート外観と内部劣化の特徴と連続性について検討を加えた。その結果,外観ひび割れは鉄筋拘束の方向に依存しながら長さを増し,内部ひび割れは劣化が大きく進んだ場合でも骨材粒子界面に発生するものが主要であった。コンクリート構造大学院生4名とともに現地調査を行い,またデータ分析に有用なダータが得られ査読付き論文4編など想定以上の成果が得られた.富山県の当該橋梁より,取り出した橋脚梁断面および破断鉄筋の詳細分析により,鉄筋損傷度とコンクリート内部損傷度の関係を明らかにする.
メタボリックシンドロームにおける脂肪細胞肥大化分子AP2βの役割

生検皮下脂肪組織および内臓脂肪組織を用いて、アディポネクチン、レプチン、IL-6発現量と、2型糖尿病とその遺伝子座が関連する転写因子TFAP2B発現量との相関を検討した。その結果、TFAP2Bの発現量とアディポネクチン発現量とは負に相関し、レプチンおよびIL-6発現量とは正相関した。これらの結果はこれまでの我々のin vitroでの結果と一致しており、AP-2βが脂肪組織におけるアディポカイン発現を制御している可能性が示唆された。我々は,肥満2型糖尿病とその遺伝子座が相関する転写因子AP-2βを同定し,それが脂肪組織に特異的に発現すること,脂肪細胞への分化に伴いその発現が増加することを報告した。さらに本転写因子がアディポサイトカインの一つであるアディポネクチンの遺伝子発現をそのプロモーターを介して直接抑制すること,また炎症性サイトカインであるIL-6mRNA発現を増加させることを見出した。MCP-1は,肥満のごく初期からマクロファージの誘導、活性化作用があり,インスリン抵抗性との関連が報告されているが脂肪細胞におけるMCP-1発現調節機構については不明な部分が多い。そこで,AP-2βのMCP-1発現に対する影響を3T3-L1脂肪細胞を用いて検討した。アデノウイルスを用いてAP-2βを過剰発現させると,MCP-1のmRNAは18倍に,また,プロモーター活性は6倍に増加した。また,細胞内および培養メディウム中のMCP-1蛋白量の増加を認めた。MCP-1プロモーター領域に存在するAP-2βの結合推定領域(3箇所)のうち,中央部の結合部位を変異させるとそのプロモーター活性が低下した。さらに,その部位の塩基配列に本転写因子が結合することをEMSA法およびChlP Assayにて確認した。これまでの研究成果と併せて,AP-2βは脂肪細胞の機能異常をきたし,2型糖尿病やメタボリックシンドロームを引き起こす転写因子であることが示唆された。我々は、肥満2型糖尿病とその遺伝子座が相関する転写因子AP-2βを同定し、それが脂肪組織に特異的に発現すること、疾患感受性アリルを有する人では脂肪組織でのAP-2β発現量が増加していること、AP-2βの過剰発現により脂肪細胞が大型化することを報告した。MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)は、肥満のごく初期からマクロファージの誘導・活性化作用があり、インスリン抵抗性との関連が報告されているが、その脂肪細胞における発現調節機構については不明な部分が多い。そこで、AP-2βのMCP-1発現に対する影響を3T3-L1脂肪細胞を用いて検討した。アデノウイルスを用いてAP-2βを過剰発現させると、MCP-1のプロモーター活性、mRNA、細胞内および培養メディウム中のMCP-1蛋白量の増加を認めた。DNA結合能を欠失させた変異型AP-2βの過剰発現ではこれらの変化を認めなかった。一方、siRNAを用いて内因性のAP-2βを減少させると、MCP-1発現は低下した。また、MCP-1プロモーター領域に存在するAP-2βの結合推定領域(-137-129)を変異させるとそのプロモーター活性が低下した。さらに、その部位の塩基配列に本転写因子が結合することをEMSA法およびChlP Assayにて確認した。以上より、AP-2βはMCP-1発現を正に調節し、炎症を惹起することで脂肪細胞の機能異常をきたし、2型糖尿病やメタボリックシンドロームを引き起こす転写因子であることが示唆された。我々は、肥満2型糖尿病とその遺伝子座が相関する転写因子AP-2βを同定し、それが脂肪組織に特異的に発現すること、疾患感受性アリルを有する人では脂肪組織でのAP-2β発現量が増加していること、AP-2βの過剰発現により脂肪細胞が大型化すること、さらに、in vitroにおいて、AP-2βは、アディポネクチン発現を負に、レプチン発現およびIL-6発現を正に制御することを報告した。本研究では、生検皮下脂肪組織および内臓脂肪組織を用いて、アディポネクチン、レプチン、IL-6発現量と、その血中濃度、BMIとの関係、およびAP-2β発現量との相関を検討した。その結果、BMIは血中アディポネクチン濃度と負に相関、レプチン濃度とは正相関した。皮下脂肪組織におけるアディポネクチン発現はBMIと負に相関した。一方、内臓脂肪におけるレプチン発現は、血中濃度およびBMIと正相関した。一方、IL-6発現は皮下脂肪、内臓脂肪ともBMIとは相関しなかったが、内臓脂肪におけるIL-6発現は血中濃度と相関した。以上より、アディポサイトカインにより、その発現や血中濃度における寄与が、皮下脂肪組織と内臓脂肪組織において異なることが示唆された。さらに、AP-2βの発現量とアディポネクチン発現量とは負に相関し、レプチンおよびIL-6発現量とは正相関した。
包括的遺伝子発現解析および変動蛋白解析による関節リウマチ骨破壊機序の解明

関節リウマチ(RA)滑膜炎による関節破壊の分子メカニズムを明らかにする目的で、RA及び変形性関節症(OA)患者より手術時に採取した滑膜組織を培養し,破骨細胞形成過程に変動するバイオマーカーを包括的遺伝子発現解析および多項目同時解析手法を用いた変動蛋白解析により検討した。RA滑膜組織培養では培養2日目よりACP5遺伝子の発現が上昇し、OAに比べて多数の破骨細胞が形成された.Genechip解析では,炎症性サイトカイン(IL-1, TNFα, IL-6)遺伝子の発現は培養初期に高く,漸減し、RANKL遺伝子は培養全期をとして発現がみられ,RAとOAで差はなかった.Pathway解析ではNFκ-B, p38 Mark signaling等炎症、免疫系のシグナル伝達経路に変動遺伝子の集積がみられた。培養上清中のバイオマーカーの多項目同時解析では、RA滑膜組織培養においてTNFβ、IL-17Fの増加がみられ、その他の炎症性サイトカイン、破骨細胞分化誘導因子などの変化はRA,OAで差はなかった。RA滑膜組織由来破骨細胞による骨破壊には炎症性サイトカインやT細胞サイトカインが関与している可能性が示唆された。関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)症例数例より手術時に得られた滑膜組織を用いて以下の検討を行った。1)包括的変動蛋白解析:滑膜細胞を培養し経時的に培養上清の炎症性サイトカイン(IL-1α、β,TNFα,β,IL-6),T cellサイトカイン(IL-4,IFNγ,IL-17,IL-17F)、ケモカイン(MIP-1α、β、MCP-1),成長因子(VEGF, MCSF),プロテアーゼ(MMP-9)を多項目同時解析手法(Multiple Analyte Profiling: MAP)により解析した。RA患者3名由来滑膜組織の予備的検討では、破骨細胞形成期に、TNFα,β,VEGF, M-CSFとT細胞由来サイトカイン(IL-17)の増加がみられる症例が多かった。今後、RANKL, OPGなどの破骨細胞調節因子も加えたmaicroplateを作成し,症例を増やして検討する。2)包括的遺伝子発現解析(ジーンチップ解析)は約47,000の転写産物/54,000のプローブセットが搭載されているAffymetrix社製Human Genome U133Plus2.OArrayを用いてGeneChipExpression Analysisにより行った。RA滑膜細胞培養012日目の変動遺伝子を2名の患者で予備的に解析した。培養後、1日目以降より,破骨細胞マーカーであるTRAP5b(ACP5)遺伝子の著明な発現増加がみられた。Pathway analysisではNFkBsignaling, p38MARKsignaling, Toll-like receptoe signaling, chemokine signalingに変動遣伝子の集積がみられた。破骨細胞関連、骨代謝関連、血管新生関連遺伝子の解析を行っている。遺伝子発現と変動蛋白と一致しない部分もあり,症例を増やして検討する予定である。関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)症例より手術時に得られた滑膜組織を用いて以下の検討を行った。前年度、Affymetrix社製Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayを用いて、RA滑膜組織培養中に破骨細胞が形成される過程において、発現に変動がみられた遺伝子を包括的に解析した。その結果、培養後、1日目以降より,破骨細胞マーカーであるTRAP 5b(ACP5)遺伝子の著明な発現増加がみられ、本培養モデルで滑膜組織より破骨細胞が分化・形成されることが確認された。遺伝子発現と変動蛋白と一致しない部分もあり,症例を増やして検討中である。
ランタニド混合窒化物(Ce_xLn_<1-x>N)の磁気的性質に関する研究

本研究ではこれまで合成の報告すら殆どないランタニド-ランタニド-窒素系化合物の合成とその磁気的性質を調査した。炭素熱還元法とアンモニア窒化法により、任意の組成x(x=Ce/Ce+Gd)のセリウム-ガドリニウム-窒素系化合物(Ce_xGd_<1-x>N)を合成し、SQUID磁束計を用いて温度範囲5200K、印可磁場05Tの条件でそれぞれの組成の窒化物の磁化測定を行った。CeNを除く全ての組成の窒化物は極低温で強磁性的挙動が観測された。また、高温領域では全ての組成で磁化が磁場に比例し、Curie-Weiss則に従うことが判った。このCurie-Weiss則から常磁性キュリー点と希土類一原子当たりの有効磁気モーメントを求めた。常磁性キュリー点は組成xと共に低下し、x=0.7で最小値を示した。有効磁気モーメントは、組成x【less than or equal】0.7では4f軌道にGdは7個、Ceには1個電子がある状態を仮定した理論値とよく一致したが、x=1(CeN)ではCeの4f軌道に電子が存在しない状態に、また、x=0.9ではそれらの中間的値になった。これらの窒化物のCe,GdそれぞれのL_<III>吸収端のXAFS測定し、混合窒化物中でのCe,GdそれぞれのXANES解析とEXAFS解析も行った。EXAFS解析からはCe,Gdそれぞれの原子から最近接に位置するN原子までの距離を求め、X線回折と結晶構造から得られた希土類-窒素の最近接距離とよく一致することを確かめた。XANESスペクトルの形状を比較すると、Gdがいずれの組成でもGdNのものと一致し、Gdが4f^7状態であることを示した。Ceはx【less thanor equal】0.7ではCeNに近い形状に、x【less than or equal】0.5ではCeF_3に近い状態になり、磁化測定の考察から得られた結果とよく一致した。これらのことから、Ce_xGd_<1-x>N中のGdはいずれの混合比でも4f^7の状態で存在し、CeはCe濃度の低い領域では4f^1の状態を、高濃度領域では4f^0の状態になることが判った。本研究はこれまで合成例の報告がほとんどないランタニドーランタニドー窒素系化合物の作製とその磁気的性質を探求することを目的としている。初年度はセリウムーガドリニウム一窒素化合物(Ce_xGd_<1-x>N)を合成し,squidを用いて磁化測定を行った。出発物質のCeO_2とGd_2O_3を任意の比で混合し、真空中1400°Cで炭素熱還元することで一旦炭化物に転換後,その炭化物を1200°CでNH_3気流と反応させ混合窒化物を合成した。X線回折の結果からCeN(NaCl型)とGdN(NaCl型)は1200°Cで全率固溶することが分かった。また、その格子定数は組成に対してCeNとGdNの格子定数を直線で結んだVegard則より若干正にずれることが分かった。更に温度4200K、磁場05Tの条件下で組成x=0.1,0.3,0.5,0.7及び0.9の混合窒化物について磁化測定を行った。いずれの窒化物も5Tの磁場中でも磁化が飽和せず,ヒステリシスも観測されなかった。ランタニ原子1個当たりの磁化率及び有効磁気モーメントははセリウムの減少とともに増加した。とくに有効磁気モーメントについては,x=0.9を除けば,セリウム,ガドリニウムが共に三価と仮定した理論値とほぼ一致した。また、これらの窒化物の常磁性キュリー点はXの増加と共に減少し,x=0.7で最小値を示した。これらの結果からセリウムの混合比が0.9以上になるとセリウムの価数揺動が起こっているのではないかと思われるが,今後更に詳しく調査する必要がある。

これらの窒化物のCe,GdそれぞれのL_<III>吸収端のXAFS測定し、混合窒化物中でのCe,GdそれぞれのXANES解析とEXAFS解析も行った。EXAFS解析からはCe,Gdそれぞれの原子から最近接に位置するN原子までの距離を求め、X線回折と結晶構造から得られた希土類-窒素の最近接距離とよく一致することを確かめた。XANESスペクトルの形状を比較すると、Gdがいずれの組成でもGdNのものと一致し、Gdが4f^7状態であることを示した。Ceはx【less thanor equal】0.7ではCeNに近い形状に、x【less than or equal】0.5ではCeF_3に近い状態になり、磁化測定の考察から得られた結果とよく一致した。これらのことから、Ce_xGd_<1-x>N中のGdはいずれの混合比でも4f^7の状態で存在し、CeはCe濃度の低い領域では4f^1の状態を、高濃度領域では4f^0の状態になることが判った。
戦前期日本における独仏地理学思想の受容に関する基礎研究

日本やアメリカ合衆国、イギリスなど、高等教育機関への地理学の進出が遅れた国々では、どの国も初期段階で、先進国たるドイツとフランスの地理学思想の大きな影響力をこうむってきた。本研究は、日本における独仏地理学思想受容の実態を、公刊された印刷物や主要地理学教室における蔵書内容をはじめ、種々の資料に基づいて具体的に明らかにすることを目的として出発した。研究テーマを掘り下げて考察するために、役割分担としては研究代表者の手塚がドイツ地理学思想、とくにラッツェルと日本地理学との関係を考察し、研究分担者の西村がフランス地理学思想、とくにヴィダル=ドゥ=ラ=ブラ-シュおよびドゥマンジョンの日本地理学界への影響を考察することとした。わが国におけるラッツェルの影響については、その非常に複雑な様相が明らかになった。ラッツェルの著作に対する引用ないし参照は多数にのぼり、部分的な翻訳の試みもさまざまな人々が試みた。しかし、その内容を検討すると、部分的であり、また不正確な理解が多く、かつ多分に間接的であったことが明らかになった。戦前期、ラッツェリアンとして著名だった石橋五郎の講義ノートを発掘することができたのは、本研究の大きな成果であった。フランス地理学思想の影響については、主として担当された西村氏が平成6年冬に急逝されたため、残念ながら研究成果の取りまとめが不可能になった。独仏地理学文献の翻訳状況については、研究分担者の奥野が完全なリストを作成した。英語文献をはるかに上まわる独語文献が翻訳の対象になっていたこと、しかも、その内容が人文地理学および政治地理学にかたよっていることが明らかになった。アメリカ合衆国やイギリスをはじめ、高等教育機関への地理学の進出が遅れた国々では、どの国においても、初期段階で、先進国たるドイツとフランスの地理学思想が大きな影響力をおよぼしてきた。日本においても、大学で地理学教室が相次いで開設された1920年代と1930年代には、独仏地理学思想が熱心に研究され、その成果が翻訳・抄訳・紹介・翻案などのかたちで、単行本として、あるいは学術雑誌・教育雑誌上の論文として多数発表されている。しかし、これらの蓄積は、戦後期における英米地理学思想の圧倒的な影響力のもとで、現在では、その大半が地理学界共通の記憶から消え去ってしまったように思われる。本研究は、このような状況のなかで、日本における独仏地理学思想受容の実態を、公刊された印刷物や主要地理学教室における蔵書内容をはじめ、種々の資料に基づいて具体的に明らかにし、現在ようやく活性化しつつある戦前期日本の地理学思想研究に対して、新たな観点からの基礎資料提供を目指すものである。本年度の調査進行状況は以下の通りである。1.対象として取り上げる独仏の地理学者について検討した。その際、特に重点的に検討する地理学者として、ドイツではラッツェル、フランスではビダル・ドゥ・ラ・ブラーシュを選定した。他に10名程度の地理学者を選定し、どのような形式で資料整理を実施するかを決定した。2.まず試験的に、ラッツェルとビダル・ドゥ・ラ・ブラーシュについて調査結果をまとめつつある。そこでの問題点の検討を通じて他の地理学者に適用する資料整理の枠組を検討した。3.原典の所蔵状況に関する調査は、まだ手をつけ始めた段階であるが、京都大学・東京大学・筑波大学など地理学教室の歴史が古い大学を中心に作業を進めつつある。

しかし、これらの蓄積は、戦後期における英米地理学思想の圧倒的な影響力のもとで、現在では、その大半が地理学界共通の記憶から消え去ってしまったように思われる。本研究は、このような状況のなかで、日本における独仏地理学思想受容の実態を、公刊された印刷物や主要地理学教室における蔵書内容をはじめ、種々の資料に基づいて具体的に明らかにし、現在ようやく活発化しつつある戦前期日本の地理学思想研究に対して、新たな観点からの基礎資料提供を目指すものである。本年度の研究内容は以下の通りである。1.対象として取り上げる独仏の地理学者について検討した。その際、特に重点的に検討する地理学者として、ドイツではラッツェル、フランスではビダル・ドゥ・ラ・ブラ-シュを選定した。2.まず試験的に、ラッツェルとビダル・ドゥ・ラ・ブラ-シュについて調査結果をまとめることを試みた。しかし、共同研究者の急逝のため、後者については残念ながら未完に終わった。3.ラッツェリアンとして有名な石橋五郎氏の講義ノートなど、興味深い資料が入手できた。これまで漠然と指摘されてきただけの独仏地理学思想の影響を、原典との対比に基づいて検討することができた。
生体異物代謝促進機能をもつ糖鎖高分子-機能制御とクラスター効果

生体異物(毒物)は肝臓でグルクロン酸に抱合され、小腸を経て排出(解毒)されるが、小腸にはこれを分解するβ-グルクロニダーゼがあり、遊離した異物は腸管から再吸収され肝臓に戻る。本研究では、β-グルクロニダーゼの活性を阻害するD-グルカル酸およびその誘導体を経口投与により独占的に腸内に送り込むことができるように、これらを側鎖に導入した高分子を新たに設計・合成し、β-グルクロニダーゼ活性の阻害に及ぼす効果を調べた。まず、D-グルカル酸を置換基にもつ新規スチレン(4)を合成し、アクリルアミドとのラジカル共重合により共重合体(5)を得た。基質としてD-グルクロン酸のp-ニトロフェニルグリコシド(6)を選び、5存在下でβ-グルクロニダーゼの加水分解活性を調べたところ、pH4.7の酢酸溶液中、37°Cで阻害率が80-90%に達した。特に低濃度で、グルカル酸部位をもつスチレンモノマー(4)自身よりもはるかに阻害効果を示したのは、同じ高分子鎖中にグルカル酸部位が多数結合していることに由来する、一種のクラスター効果と言える。β-グルクロニダーゼが4つのサブユニットからなる分子量約30万の高分子であることを考慮すれば、共重合体中に高密度に存在するグルカル酸単位が、酵素分子に複数個存在するであろう認識部位と相互作用しているものと推測する。4と類似しているがカルボキシル基をもたないモノマー(7)とアクリルアミドとのラジカル共重合体(8)も合成し同様に調べたが、阻害効果はほとんどなかった。すなわち、共重合体中のカルボキシル基が阻害に重要な役割を果たしていることがわかった。一方7とアクリル酸との共重合体(9)は共重合体5に匹敵する阻害効果を示した。静電的相互作用も関与している可能性がある。共重合体5及び9存在下での阻害に対する基質濃度の影響を速度論的に詳しく検討し、共重合体5は拮抗阻害剤として作用するのに対し、共重合体9の場合は不拮抗的に阻害することを明らかにした。
低酸素応答分子Tetを介する癌微小環境構築機構の解明とその制御

本研究は癌進展に寄与する微小環境の発生機構の解明を目的として実施され、以下の成果を得た。(1)鉄欠乏環境下において神経膠腫(グリオーマ)細胞中の一部の亜集団が鉄リサイクル能を有するマクロファージ(Mφ)を誘導することが明らかとなり、微小環境の形成にグリオーマ細胞自身のストレス応答が密接に関与している可能性が示唆された。(2)このMφ誘導にはグリオーマ細胞における単球動員因子CCL2、およびMφ分化誘導因子GMCSFのエピジェネティックな遺伝子発現制御が関与していることが示唆された。これらは微小環境構築を標的とした新たな癌治療戦略の確立へと展開の期待できる有益な成果と考える。癌細胞はマクロファージの誘導を介し自らに有利な微小環境を形成することが明らかとなっている。このような癌細胞の微小環境構築機構を解明するため、癌細胞のストレス応答とその適応機構に着目し、以下のような成果を上げた。(1)単球・マクロファージ誘導を惹起する環境ストレス因子を同定するため、低酸素・低血清・低グルコース・低pH・酸化ストレス・除鉄などのストレス条件下で癌細胞を培養したところ、除鉄時においてCCL2およびCSF2遺伝子の発現が著しく上昇することが明らかとなった。(2)癌細胞移植マウスモデルに鉄キレート剤を投与したところ有意な腫瘍抑制効果が得られなかったことから、癌細胞が鉄枯渇ストレスに対する適応機構を有することが考えられた。(3)癌細胞移植マウスモデルの腫瘍組織中に鉄貯蔵マクロファージの存在が確認された。(4)次に癌細胞の除鉄応答機構を解明するため、鉄応答蛋白質IRPによるCCL2およびCSF2 mRNAの制御に着目したが、mRNAのUTR上にIRP結合配列の存在を確認することはできなかった。(5)また、鉄を補因子とするDNA脱メチル化酵素Tetの関与に着目したが、CCL2およびCSF2遺伝子のプロモーター領域にCpG islandの存在を確認することはできなかった。(6)ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の投与によりCCL2およびCSF2遺伝子の発現が著しく上昇したことから、鉄を補因子とするヒストン脱メチル化酵素Jmjcドメイン含有タンパク質の関与が示唆された。以上の結果は、癌細胞がマクロファージ誘導を介する鉄補給システムを有していることを示唆しており、その分子機構の解明が癌微小環境構築を標的とした新たな治療標的の提案に繋がるものと考えられた。腫瘍内マクロファージの誘導を惹起するストレス因子として鉄を特定できたこと、除鉄に対する癌細胞の適応機構の存在を示唆できたこと、除鉄反応性に発現変化の起こる標的遺伝子を特定できたこと、その発現制御にヒストン脱メチル化酵素が関与している可能性を示唆できたことは初年度の達成目標を満たす成果であるが、詳細なストレス応答機構の解明には至っておらず、次年度の課題となる。前年度までの研究で癌細胞は鉄欠乏ストレス応答性にマクロファージ(Mφ)を誘導する可能性が示唆された。そこで今年度は癌細胞の鉄欠乏応答とMφによる鉄供給の実態を把握するため、以下の解析を行った。(1)ラット神経膠腫(グリオーマ)細胞株C6において鉄キレート時に見られる単球動員因子CCL2の発現上昇をintracellular FACS法により解析したところ、1細胞あたりの発現量に大きな変化はなかったもののCCL2陽性細胞の割合が有意に増加しており、C6細胞中にはMφ誘導を担う亜集団が存在することが明らかとなった。(2)この鉄欠乏ストレスに応答する細胞画分を単離するため、グリオーマ患者の遺伝子発現データベースGlioVisを用いて2遺伝子間発現相関を解析したところ、CCL2あるいは腫瘍随伴MφマーカーCD204遺伝子の発現と高い相関を示す既報のグリオーマ関連細胞表面分子としてCD44およびCXCR4が同定された。(3)一方、癌細胞の培養上清を用いて骨髄単球より誘導したMφにおいて鉄放出関連遺伝子FPNの発現を解析したところ、その発現量は単球よりも高く赤血球の添加によってさらに上昇することが明らかとなった。さらにグリオーマ患者におけるFPNの発現はCD204の発現、および予後との間に有意な相関を示すことも明らかとなった。以上の結果は、鉄欠乏環境下において宿主Mφの鉄リサイクリング能を利用して適応を図る癌細胞の利己的生存戦略の存在を示唆しており、癌微小環境が形成される仕組みの一端を解明できたものと考える。当初予定していた低酸素ストレスに対してマクロファージ関連遺伝子の変化が観察されなかったことから、微小環境構築に関わるストレス応答の解析を鉄枯渇に焦点を当てて行う。また除鉄標的遺伝子の発現制御に、当初予定していたDNA脱メチル化酵素Tetファミリーが関与する可能性が低いことから、詳細な分子機構の解析をヒストン脱メチル化酵素Jmjcドメインファミリーに着目して遂行する。

今後、メチル化ヒストンのマッピングをもとに鉄センサーとしてのJmjcドメインタンパク質を特定し、当初の予定通り細胞内ストレス応答経路を明らかにする。さらに、その活性評価系あるいは発現評価系を構築して、応答経路を制御する低分子化合物のスクリーニング・ヒット化合物の同定を目指す。腫瘍生物学
BMPによる骨芽細胞の分化誘導におけるエピジェネティック制御機構の解明

骨誘導因子(bone morphogenetic protein, BMP)は、筋組織中で異所性骨形成を誘導する生理活性物質として骨基質から発見された成長因子であるが、今日では、生理的な骨形成にきわめて重要な役割を果たしていることが明らかとなり、医学、歯学の幅広い分野で、BMPを用いた骨組織再建の可能性が検討されている。しかし、ヒトはBMPに対する感受性が低く、実際の臨床応用には至っていない。従って、今後BMPによる骨組織再建を実現するためには、BMPに対する感受性がヒトで低下している原因を明らかすると共に、BMP活性を促進する方法を開発しなくてはならない。一方、細胞世代を越えて継承されうる、塩基配列の変化を伴わない遺伝子機能調節機構、すなわちエピジェネティック制御が様々な細胞の分化との関連から注目を集めている。本研究では、BMPの生理活性発現機構を、エピジェネティック制御の中心であるDNAのメチル化とヒストンの翻訳後修飾に焦点を当てて解明し、その成果をもとにエピジェネティックスを応用したBMP活性促進法を新たに確立する事を目的として研究を遂行することとし、本年度は以下の研究を行った。(1)破骨細胞の分化に重要な役割を果たしている転写因子NFAT2、TNF-α、calcitonin receptorのプロモーター領域のヒストンH3、H4のアセチル化、脱アセチル化を解析した。その結果、NFAT2プロモーターのヒストンH3のアセチル化が促進していることが明らかとされた。(2)ヒトあるいはマウス由来の骨髄間葉系細胞株にっいてBMP-2感受性を検討し、それぞれのBMP-2感受性に隔たりがあることを確認した。これら感受性の異なる細胞株について、Chip assayを併用したmicroarrayを行い、BMP-2感受性とエピジェネティック制御の関わりを検討する予定である。申請者は骨誘導因子BMP-2により骨芽細胞へ分化が誘導される際、エピジェネティック制御に関わる遺伝子を網羅的に解析し、その中でBMPシグナルを制御する遺伝子を探索することにより新規の骨芽細胞分化誘導機構を解明するため、以下の実験を行なった。未分化なマウス筋芽細胞株(C2C12細胞)にBMP-2(400ng/ml)を4日間処理し、骨芽細胞へ分化させた際、発現様式に変化のある遺伝子をマイクロアレイ解析により検討した。その結果、ヒストンタンパク質のメチル化に関与する酵素Dnmt(de novo methylation transferase)ファミリータンパク質、Dnmt3A、3BはBMP-2処理により発現の上昇が認められ、Dnmtlは発現の低下が認められた。また、HDAC(hi stonedeacetylaselファミリータンパク質、HDAC5はBMP-2処理により発現の上昇が認められ、HDACl、2、3、6、7Aは発現の低下が認められた。以上の結果は、BMP-2が骨芽細胞の分化過程において、エピジェネティック制御に関与する遺伝子の発現を制御していることを示唆している。また、ヒト遺伝子においてプロモーター内のDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御が行なわれているといわれているgremlinはBMP-2処理により骨芽細胞への分化とともに発現の低下が認められた。gremlin(別名、downregulated by v-mos:drm)はdan(differential-screeningselected gene aberrative in neuroblastomalファミリータンパク質に属するBMPアンタゴニストで、生体内におけるBMPシグナルを介した様々な細胞の分化・増殖に関与していることがいわれている。BMP-2によるgremlinの発現制御機構がDNAメチル化によるものかどうか、今後の検討課題である。
抵抗性品種に加害性を示すツマグロヨコバイ”バイオタイプ”の適応機構の解明

イネの重要害虫であるツマグロヨコバイは抵抗性イネ品種から吸汁できずに餓死するが、野外虫を多数さらすと抵抗性品種を吸汁可能な加害性バイオタイプが選抜される。本加害性は虫が吸汁時に吐出する唾液成分の遺伝的変異に起因すると考え、唾液タンパク質成分を同定したのち、cDNA配列をバイオタイプ間で比較した。その結果、加害性バイオタイプの唾液タンパク質の1つに1塩基の欠損が存在することがわかった。そこで加害、非加害バイオタイプを交配して得たF2分離世代を作出して、加害性とゲノムDNA変異との連鎖の有無を個体別に調べた。しかし、変異部分を含むゲノム領域に重複が存在し、正確な判別までには至らなかった。目的:ツマグロヨコバイ抵抗性イネ品種に対して加害性を示すバイオタイプで生じている遺伝的変異を明らかにするため、イネからの吸汁達成の鍵を握る唾液タンパク質に焦点を絞って遺伝子配列を比較解析する。研究方法:(1)バイオタイプ間で遺伝的変異をもつ唾液タンパク質を探索するため、つくば個体群に由来する愛知80号(抵抗性遺伝子Grh3保有イネ)加害性および非加害性バイオタイプの唾液腺抽出物(♀5頭分)を2次元電気泳動で分離して、銀染色後にパターンを比較した。(2)ツマグロヨコバイが唾液として吐出していることを確認しているタンパク質のcDNA配列を、つくば個体群由来のGrh3加害、Grh7加害および無選抜系統間で比較した。(3)今後の解析に有用な材料を得るため、鹿児島個体群についてもGrh7加害性のバイオタイプを作出し、遺伝様式を確認した。すなわち、Grh7保有イネ加害性を非加害バイオタイプと交配して得たF1、F2およびB1F1(戻し交配)世代の孵化幼虫5-7頭をGrh7保有芽出しイネが入った試験管内に放飼し、6日後に生死を判定した。研究成果の概要:(1)Grh3加害性バイオタイプにおいて、シフトが見られた唾液腺タンパク質スポットが1つ見つかった。(2)6種類の唾液タンパク質で遺伝子変異を比較したところ、Grh3加害系統だけで2箇所、Grh7加害系統だけで1箇所で塩基が変異していることがわかった。(3)Grh7保有イネを用いて生存率を調べた結果、Grh7加害および非加害系統を交配して得たF1ではほぼ100%、F2では約75%、2組のB1F1でそれぞれ約100%、50%を示したことから、鹿児島個体群においてもつくば個体群同様、Grh7加害性は常染色体上の優性単一遺伝子に支配されていると結論した。目的:ツマグロヨコバイ抵抗性イネ品種は師管からの吸汁を阻害するが、抵抗性品種に適応した加害性バイオタイプでは師管吸汁が可能となっている。本課題の目的は、ツマグロヨコバイが吸汁に伴ってイネ組織に注入している唾液タンパク質に着目し、その遺伝子変異をバイオタイプ間での比較解析することにより抵抗性打破に関わる因子を特定することにある。研究方法:(1)各バイオタイプの唾液腺抽出物を二次元電気泳動で展開し、ゲル上でシフトが見られるタンパク質を探索・同定したのち、遺伝子配列変異を調べた。(2)これまで同定した9種の唾液タンパク質の遺伝子配列を比較することにより、各バイオタイプで特異的変異を探索した。さらに、バイオタイプ特異的と見られる変異について、加害性および非加害性バイオタイプを交配して得たF2分離集団を作出して、変異と加害性を連鎖解析した(進行途中)(3)変異を比較する対象タンパク質の数を拡大するため、新たに採取したツマグロヨコバイ漿液性唾液をゲルフリーで直接HPLC-MS/MSにより解析・同定した。研究成果の概要:(1) Grh3加害性バイオタイプでシフトが見られたタンパク質1つを同定し、遺伝子配列の変異を検出したが、加害性バイオタイプに特異的ではなかった。(2) Grh1,2,3,7加害性の各バイオタイプについて、既知の9種の唾液タンパク質を対象に遺伝子配列を比較したところ10箇所以上の変異が見つかり、そのうち下記が特異的変異の候補として得られた。1) Grh1加害性バイオタイプ:アミノ酸変異を伴う3塩基置換(AACがGGT)または1塩基(C)欠失、2) Grh2加害性バイオタイプ:3塩基(反復配列)の挿入(6反復が7反復)、3) Grh7加害性バイオタイプ:1塩基(A)欠失。(3)ツマグロヨコバイ唾液をHPLC-MS/MSで解析することにより、新たに63個のタンパク質を同定した。イネの重要害虫であるツマグロヨコバイは吸汁あるいは萎縮病等を媒介することにより被害を与える。野外に生息するツマグロヨコバイは抵抗性品種において師管から吸汁できずに死亡するが、多数の野外虫を抵抗性品種に放飼すると抵抗性品種で生存できる加害性バイオタイプが選抜される。抵抗性品種に対する加害性は単一遺伝子により支配されている。この加害性を決定づけているのは、虫が師管吸汁に先立って吐出している唾液タンパク質における遺伝子変異であるとの仮説のもとに本研究を実施した。すなわち、ツマグロヨコバイの唾液タンパク質を同定し(60種類以上)、それらタンパク質のcDNA配列をバイオタイプ間で比較することによって変異の探索を試みた。約20種類の唾液タンパク質を調べた結果、4つの異なるバイオタイプにおいて、それぞれフレームシフトを伴う

1塩基欠損(同一タンパク質の異なる2か所)、アミノ酸置換を伴う1塩基変異、1アミノ酸に相当する3塩基挿入、が見つかった。このうち、1塩基欠損についはバイオタイプ選抜の元となった野生虫の採集地域の違いに関わらず、共通していたことから有力な変異候補と考えられた。そこで、加害および非加害バイオタイプを交配して得たF2分離世代を用いて、抵抗性品種上での吸汁の有無とゲノムDNAの遺伝子型を個体別に連鎖解析した。しかし、変異部分を含むゲノム領域に重複が存在していたことから、正確な判別までには至らなかった。イネの重要害虫であるツマグロヨコバイは抵抗性イネ品種から吸汁できずに餓死するが、野外虫を多数さらすと抵抗性品種を吸汁可能な加害性バイオタイプが選抜される。本加害性は虫が吸汁時に吐出する唾液成分の遺伝的変異に起因すると考え、唾液タンパク質成分を同定したのち、cDNA配列をバイオタイプ間で比較した。その結果、加害性バイオタイプの唾液タンパク質の1つに1塩基の欠損が存在することがわかった。そこで加害、非加害バイオタイプを交配して得たF2分離世代を作出して、加害性とゲノムDNA変異との連鎖の有無を個体別に調べた。しかし、変異部分を含むゲノム領域に重複が存在し、正確な判別までには至らなかった。3系統の加害性バイオタイプに関する変異を検出することができ、候補の絞り込みのための連鎖解析を進めるところまでに至った。また、変異と加害性とが連鎖してない場合に備え、新たに63種の唾液タンパク質を同定したことから、さらなる遺伝子配列の変異の探索が可能となった。応用昆虫学前年度、HPLC-MS/MSで新たに同定した63種の唾液タンパク質に対象を拡げ、バイオタイプ間変異のさらなる探索を進めるとともに、これまで検出した候補となる変異については、交配F2分離個体を用いて連鎖解析する(進行継続中)。さらに、連鎖が確認された遺伝子については、RNAi法でノックダウンして師管吸汁行動をモニターし、抵抗性品種に対する加害性の変化を調べることにより特異性を決定する。唾液腺タンパク質の2次元電気泳動により、Grh3加害性バイオタイプ(つくば個体群由来)でシフトが見られるタンパク質スポットを1つ見出した。虫が吐出した唾液タンパク質も同様に比較しようとしたが、解析に必要な量のタンパク質を得るのが難しかったことから、計画を1年前倒しして、同定済みの唾液タンパク質の遺伝子配列を比較解析した。その結果、唾液タンパク質のcDNA配列で、Grh3およびGrh7加害性バイオタイプ(つくば個体群由来)で特異的な変異が検出された。また、変異の普遍性をチェックするために有用な材料を得るため、鹿児島個体群からGrh7加害性バイオタイプを作出し、加害性が単一優性遺伝することを確認した。当初の計画では、実験助手を週1日雇用する予定であったが、本雇用条件での応募者が半年間見つからなかったために、その間の賃金および試薬費に相当する使用額が予定より減少した。来年度は、Grh3加害性バイオタイプでシフトが見られたタンパク質を同定し、その遺伝子配列をバイオタイプ間で比較する。
アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた薬物輸送機構の分子論的解析

本研究はアフリカツメガエル卵母細胞を発現系として用い、小腸上皮細胞における輸送担体の実体を明らかにすることを目的とした。特に、核酸輸送系に焦点を絞った。mRNA注入卵母細胞はヘキソース及アミノ酸(Aシステム)輸送系が発現していることが確認された。mRNA注入卵母細胞においてNa^十依存的なウリジンの取り込みが見られた。GTC-CsCl法、Phenol/Chloroform法、GTC-Phenol/Chloroform法を用いてmRNAを抽出したところ、いずれの方法においてもNa^十依存的ウリジン輸送系の発現に差は見られなかった。mRNA注入卵母細胞におけるウリジンのNa^十依存的取り込みに飽和性が見られ、ミカエリス定数Ktは6.7μM、最大輸送速度Jmaxは3.40μ1/0.5hr/oocyteとなった。このKt値は、家兎小腸刷子縁膜小胞系(BBMV)で報告されている値(6.4μM)と極めてよく一致していた。さらに、ウリジンの取り込みは構造類似体であるアデノシン及びチミジンで顕著に阻害された。イノシンによって阻害傾向が見えたが、アデニン及びウラシルで阻害されなかった。以上の結果より、アフリカツメガエル卵母細胞に家兎小腸上皮細胞のmRNAを注入することでウリジン輸送担体が発現することが明らかになった。発現した輸送担体の特性はBBMVを用いて解明された輸送特性と一致していたことから、家兎小腸上皮細胞刷子縁膜に存在する輸送担体と同一であることが示唆された。薬物の細胞膜透過性に関する機構論的研究において、輸送担体の存在あるいは共通性についてしばしば問題となる。本実験系は透過現象の実体が膜蛋白であることを輸送機能の発現によって証明出来る点で優れている。この実験法を小腸のみなず種々の臓器における薬物輸送機構の解析に応用することで、標的組織に選択的に移行する薬物の合理的な分子設計が可能になると考えられる。