hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
劣性致死変異体を用いた包括的な初期胚発生分子機序の解析

また、野生型胚においては、ヘパリンを添加すると、より広範囲に下流遺伝子の活性化が見られた。以上から、ヘパラン硫酸鎖は、FGFが細胞内にシグナル情報を伝える上で必須であることが明らかになった。1、現在までにトランスジーン挿入によって胚性致死を示すExt2遺伝子のナル変異を同定している。Ext2は、プロテオグリカンコアタンパク質にヘパラン硫酸鎖を付加重合する活性を持つが、ホモ変異胚では、ヘパラン硫酸鎖が特異的に失われていた。更に、Ext2欠損胚では、FGFシグナルの伝達が見られないことが分かった。そこで、どのようなヘパラン硫酸鎖の機能がFGFシグナルの伝達に関与しているのか明らかにするため、FGF4リガンド、FGF受容体、コアタンパク質であるsyndecan-1、ヘパラン硫酸鎖の発現を胚体外外胚葉の形成過程で解析した。その結果、Syndecan-1はユビキタスに発現する一方で、ヘパラン硫酸鎖が標的細胞表面に特異的に発現していた。つまり、ヘパラン硫酸鎖は、FGF4リガンドの分布に必須であることが示唆された。2、ヘパラン硫酸鎖の機能をより詳細に解析するため、キメラ胚を作成して、モザイク解析を行った。その結果、ヘパラン硫酸鎖は遠く離れた細胞には働くことはできず、細胞自律的又は、直接隣接する細胞においてのみ機能することが分かった。この結果は、ヘパラン硫酸鎖が、主にFGFリガンドの遠距離の輸送ではなく、分布に働いていることを強く支持する。3、更に、ヘパラン硫酸の発現を発生過程で解析すると、FGFシグナルが強く活性を持つ領域に、より強く濃度勾配を持って発現していた。この結果は、FGFリガンドのようなモルフォーゲン分子の濃度勾配をもった分布形成にヘパラン硫酸が関与していることを強く示唆する。働いている以上から、ヘパラン硫酸鎖は、哺乳類の発生過程において時間的、空間的に特異的に発現することで、FGFリガンドの分布を制御していることが分かった。その結果、FGFシグナルがどの標的細胞に特異的なが細胞内にシグナル情報を伝える上で必須であることが明らかになった。1、昨年度までにトランスジーン挿入劣性致死変異体としてExt2変異を同定した。Ext2は、プロテオグリカンコアタンパク質にヘパラン硫酸鎖を付加重合する活性を持つため、ホモ変異胚は、ヘパラン硫酸鎖を欠損していた。Ext2欠損胚では、FGFシグナルの伝達が見られないため、FGF4リガンド、FGF受容体、コアタンパク質、ヘパラン硫酸鎖の発現を胚体外外胚葉形成過程で、タンパク質レベルで解析した。結果、コアタンパク質はユビキタスに発現する一方、ヘパラン硫酸鎖は、胚体外外胚葉特異的に発現していた。更に、FGF標的分子の発現は、Fgf4mRNAが発現するエピブラストでは観察されず、ヘパラン硫酸鎖、FGF4、FGF受容体が共局在する胚体外外胚葉でのみ観察された。従って、ヘパラン硫酸鎖は、リガンドの局所的な分布に必須であることが示唆された。2、細胞膜上のヘパラン硫酸鎖と分泌された細胞外基質のヘパラン硫酸鎖のどちらが働いているか検討するため、Ext2ホモ胚に野生型細胞を導入したモザイク胚を作成し、FGF下流分子の発現を単一細胞レベルで解析した。胚体外外胚葉の発生過程でErr-bの発現を、野生型細胞をb-galで、変異型細胞をヘパラン硫酸鎖の発現でマーキングした。
温度応答性表面の低温処理による培養細胞の接着・脱着メカニズムの解析

イソプロピルアクリルアミド(IPAAm)モノマーをポリスチレンフイルム上に電子線照射によりポリIPAAmを表面グラフトした。電子線照射強度、時間、モノマー濃度を変化させ、表面グラフト層の厚さと表面の親水性・疎水性の温度応答性をESCA、動的接触角測定により解析した。その結果、45%モノマー濃度で2回照射した表面が最も本実験に適していた(YBプレート)。このYBプレートとガラス板との間に厚さ0.03cmのテフロンスペーサーをはさんだ温度応答型作用場流動分画装置(FFF)を設計し作製した。チャンネルは体積0.135cm^3、表面積4.5cm^2、最大流速(4cm/s)におけるレイノルズ数は約15であり層流範囲にあった。このFFFチャンネルの表面で細胞を培養し一定の層流を流すと表面にかかるせん断応力は流速に比例したことから、FFFによって表面と細胞との接着力および脱着力を定量的に評価できることを示した。市販の培養用ポリスチレン板を対照とし、またガラス面へHEMA-sTブロック共重合体を被覆し細胞の粘着を制御した。培養したウシ大動脈の血管内皮細胞をチャンネル内に満たし、それぞれ37°C、25°C、10°Cに静置し、細胞の接着率を経時的に調べた。接着率は37°CではYB、対照ともにほぼ100%であったが、25°CではYBが約40%、対照が約80%、10°CでYBが約10%、対照が約80%であった。低温では温度応答表面が親水性になり細胞の接着が妨げられることを示した。また、チャンネル内で血管内皮細胞を37°Cで4時間または16時間培養した後、10°Cの培地を流速1cm/sで流し脱着細胞数を経時的に測定した。YBの細胞脱着率は4時間培養で約80%、16時間培養で約20%であり、培養時間の増加とともに細胞-材料間、細胞-細胞間の接着力が増大することを示した。16時間培養した細胞を10°Cで10分間静置後、25°Cの培地を流すととほぼ100%の細胞が脱着回収できた。これらの結果は細胞の脱着には表面の親水性だけでなく細胞自体の代謝が関与することを示した。
血流と血管病変の成因に関する計算流体力学的研究

「目的」本研究は、粥状動脈硬化症に代表される血管病の発症、進展、局在化因子を探求することを最終目標として、大血管のスケールから、ミクロのスケールにわたる血管壁の作用による大変形、および、このような変形の機構と、これが流れに与える影響を検討するため、次の2主題について実施した。(1)大変形する大型血管の内部流れの計算流体力学的検討(2)細胞スケールでの流れと細胞の創発的反応の計算流体力学モデルによる解析「研究結果」1.従来我々が計算を実行してきた有限体積法による流体計算のために開発したモデルについて、形状データを移植し有限要素法の形式に適合した流体内部の格子形成を行い、壁要素を追加し予備計算を行って格子の最適化した。2.上述のモデルにおいて、定常および非定常の条件で、血管壁運動と血流の連成計算を行った。第1段階として、平均のレイノルズ数、ウォマスリ-パラメタなどを変更しながら比較的単純な三角関数をもちいた計算を実行した。3.計算結果は3次元のカラーコンピュータグラフィックス表示を動画化して解析した。これにより、空間的パターンとして表示される病理標本、細胞生物学的実験の画像データなどの観察結果と比較することが可能になった。
圧縮センシングを用いた新しいSPECT画像再構成法の開発

圧縮センシングは,不十分なサンプル数のデータから原信号を復元する技術であり,MRIやCTではその有用性について研究が進んでいるが,SPECT画像再構成に応用した報告はない.本研究では,圧縮センシングを用いたSPECT画像と従来の画像再構成法による画像を比較し,圧縮センシングの適応性を検証した.また,投影データ数を減少させたデータを用いてSPECT画像を作成して画質を評価した.1トータルバリエーション(TV)を用いたSPECT用圧縮センシング画像再構成プログラム(TV-recon法)の構築を行い,パーキンソン症候群の診断に用いられるドパミントランスポータSPECTに応用した.その結果,TV-recon法は従来の1/3まで投影データ数を減少させることが可能であり,検査時間の短縮が可能であることが示された.この結果を論文として投稿し,学会誌に掲載された.2圧縮センシングは,ランダムにサンプリングされたデータに対して効果を発揮するため,投影データをランダムに減少させたデータを対象とした新しい画像再構成プログラム(random-recon法)を構築した.対象はコンピュータシミュレーションで作成した幾何学的配置を持つデータで,ランダムに投影データ数を低下させてrandom-recon法による画像再構成を行い,空間分解能,均一性,コントラスト,濃度直線性を比較した.その結果,一定の効果は得られたものの,画像再構成プログラムの改善が必要であることが示された.本年度は,SPECT画像再構成に対する圧縮センシングの応用と投影データ数を減少させたSPECT画像の評価について学会発表を行い,論文も掲載された.現在は新しい画像再構成プログラムの構築・修正を進めている.ランダム投影データ数に対する新しい画像再構成プログラムの検証と再構築を進める予定である.また,心筋シンチグラフィや骨シンチグラフィに拡大する予定である.圧縮センシングは,不十分なサンプル数のデータから原信号を復元する技術であり,MRIやCTではその有用性について研究が進んでいるが,SPECT画像再構成に応用した報告はない.本研究では,圧縮センシングを用いたSPECT画像と従来の画像再構成法による画像を比較し,圧縮センシングの適応性を検証した.また,投影データ数を減少させたデータを用いてSPECT画像を作成して画質を評価した.1トータルバリエーション(TV)を用いたSPECT用圧縮センシング画像再構成プログラム(TV-recon法)の構築を行い,従来から臨床で用いられている画像再構成であるFBP法と逐次近似画像再構成(MLEM法)から得られるSPECT画像を比較した.対象とした画像は,十分なスパース性を持つと考えられるドパミントランスポータSPECTとした.比較の結果,TV-recon法により得られるSPECT画像は,従来の画像再構成法から得らえる画像を大差ないことが確認できたため,圧縮センシングはSPECT画像再構成に使用できると判断した.2圧縮センシングの最大の利点は,不十分なサンプル数(投影データ数)から原画像を復元できることにある.そこで投影データ数を少なくして圧縮センシングによる画像再構成を行い,画質を保つことができる最小投影データ数を求めた.対象はドパミントランスポータSPECTで,ガイドラインで推奨されている120方向から90,60,45,30方向と減少させて投影データを作成した.作成した投影データに対してTV-recon法で画像再構成を行い,空間分解能,均一性,コントラスト,濃度直線性を比較した.その結果,TV-recon法は従来の1/3まで投影データ数を減少させることが可能であり,検査時間の短縮が可能であることが示された.本年度は,1SPECT画像再構成に対する圧縮センシングの応用,2投影データ数を減少させたSPECT画像の評価が終了した.また,1については研究会(国内)で発表を行った.2については国際学会(2018年6月)に発表予定である.また,12をまとめた論文を作成し,投稿準備中である.圧縮センシングは,不十分なサンプル数のデータから原信号を復元する技術であり,MRIやCTではその有用性について研究が進んでいるが,SPECT画像再構成に応用した報告はない.本研究では,圧縮センシングを用いたSPECT画像と従来の画像再構成法による画像を比較し,圧縮センシングの適応性を検証した.また,投影データ数を減少させたデータを用いてSPECT画像を作成して画質を評価した.1トータルバリエーション(TV)を用いたSPECT用圧縮センシング画像再構成プログラム(TV-recon法)の構築を行い,パーキンソン症候群の診断に用いられるドパミントランスポータSPECTに応用した.その結果,TV-recon法は従来の1/3まで投影データ数を減少させることが可能であり,検査時間の短縮が可能であることが示された.この結果を論文として投稿し,学会誌に掲載された.2圧縮センシングは,ランダムにサンプリングされたデータに対して効果を発揮するため,投影データをランダムに減少させたデータを対象とした新しい画像再構成プログラム(random-recon法)を構築した.対象はコンピュータシミュレーションで作成した幾何学的配置を持つデータで,ランダムに投影データ数を低下させてrandom-recon法による画像再構成を行い,空間分解能,均一性,コントラスト,濃度直線性を比較した.その結果,一定の効果は得られたものの,画像再構成プログラムの改善が必要であることが示された.本年度は,SPECT画像再構成に対する圧縮センシングの応用と投影データ数を減少させたSPECT画像の評価について学会発表を行い,論文も掲載された.現在は新しい画像再構成プログラムの構築・修正を進めている.圧縮センシングは,ランダムにサンプリングされたデータに対して効果を発揮する.

今回検証したデータは均等にサンプリングされたデータに対して検証を行ったため,十分に圧縮センシングの効果を発揮できていない可能性がある.今後の方針として,投影データを「ランダムに減少させて」検証を行い,さらに少ない投影データ数での画像再構成をめざす.ランダム投影データ数に対する新しい画像再構成プログラムの検証と再構築を進める予定である.また,心筋シンチグラフィや骨シンチグラフィに拡大する予定である.コンピュータシミュレーションデータを使用したため,放射性同位元素の購入は計画よりすくなく,また,ドパミントランスポータシンチグラフィのみを対象としたため.次年度は対象を心筋シンチグラフィや骨シンチグラフィに拡大する予定.コンピュータシミュレーションデータを使用したため,放射性同位元素の購入が計画よりすくなかったため.また予定より論文掲載が早かったため.新たに作成した画像再構成プログラムを心臓や骨シンチグラフィに応用する際の実験消耗品に使用する予定.
脳虚血におけるVEGF遺伝子発現のPETによる生体画像化の開発

脳虚血性疾患において血管新生因子のシグナル伝達は極めて重要であり,それらに関する分子レベルの画像化は脳梗塞の新しい治療法に結びつくものと考えられる.VEGF mRNAおよびHGF mRNAの発現を画像化するため,ポジトロン標識アンチセンスプローブの作成を行い,新たな生体画像化法の方法論の確立を目指した.我々は前年度に11C-ethylketene法を用いてVEGF mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを作成し,in situ hybridizationの結果から最適なVEGFmRNAおよびHGFmRNAに対するアンチセンスプローブのsequenceを選択した.本年度はこのプローブの親和性を調べるために,antisense-BioMagおよびsense-BioMagを用いてin vitro hybridizationの効率を比較した.その結果,sense-BioMag fractionの方に35%の親和性の増加を認めた.これによりポジトロン標識アンチセンスプローブでも塩基特異的結合が起こっていることが示された.上述の方法で作成したアンチセンスプローブのsequenceにもとづき,VEGF mRNAおよびHGFmRNAに対するBrigati標識アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いて,モヤモヤ病の硬膜切片におけるVEGF mRNA発現を組織学的に検討した.モヤモヤ病患者の血行再建術時に切除した硬膜切片を標本としてin situ hybridizationを行った結果,VEGF mRNAおよびHGF mRNAともに陰性であった.以上より,VEGFmRNA、HGFmRNAに対するポジトロン標識アンチセンスプローブのsequenceを決定し,合成法,及びそれを用いたPETでの非侵襲的画像化法の基礎的方法論を確立した.脳虚血性疾患の回復期には血管新生が起こり再潅流に至ると考えられるが、血管新生の促進や抑制には血管新生因子のシグナル伝達が極めて重要であり、それらに関する分子レベルの画像化は脳梗塞の新しい治療法に結びつくものと考えられる。そこでVEGF mRNAやHGF mRNAの発現を画像化するためにin vivo hybridization、すなわちポジトロンエミッショントモグラフィー(PET)を用いポジトロン標識antisenseによる新たな生体画像化法の方法論の開発を目的とした。本年度はVEGF mRNAに対するポジトロン標識antisenseの合成および品質管理、それを用いたPETでの非侵襲的画像化法の前駆的開発を行った。ethylketene反応は1級アミンに選択的に反応するためにDNAのbaseに保護基をつけておく必要がないというメリットがあるため、本方法によりone step反応が可能になった。また本方法で標識したVEGF mRNAアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて、血管新生の多い髄膜腫の摘出切片におけるVEGF mRNA発現の画像化を行ったところBrigati標識プローブによる染色法と相関した。すなわちポジトロン標識アンチセンスをもちいたin situ hybridizationにおいて塩基配列に特異的な結合をすることを示した。効果的なVEGF mRNA antisenseとして5'-TGG TGA GGT TTG ATC CGC AT-3'を確認した。今後の課題としてはPETトレーサとして実用的効果を高めるためにコレステロール修飾などにより細胞透過性を高めin vivoでの条件に適合するように改良を加えることである。脳虚血性疾患において血管新生因子のシグナル伝達は極めて重要であり,それらに関する分子レベルの画像化は脳梗塞の新しい治療法に結びつくものと考えられる.VEGF mRNAおよびHGF mRNAの発現を画像化するため,ポジトロン標識アンチセンスプローブの作成を行い,新たな生体画像化法の方法論の確立を目指した.我々は前年度に11C-ethylketene法を用いてVEGF mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを作成し,in situ hybridizationの結果から最適なVEGFmRNAおよびHGFmRNAに対するアンチセンスプローブのsequenceを選択した.本年度はこのプローブの親和性を調べるために,antisense-BioMagおよびsense-BioMagを用いてin vitro hybridizationの効率を比較した.その結果,sense-BioMag fractionの方に35%の親和性の増加を認めた.これによりポジトロン標識アンチセンスプローブでも塩基特異的結合が起こっていることが示された.上述の方法で作成したアンチセンスプローブのsequenceにもとづき,VEGF mRNAおよびHGFmRNAに対するBrigati標識アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いて,モヤモヤ病の硬膜切片におけるVEGF mRNA発現を組織学的に検討した.モヤモヤ病患者の血行再建術時に切除した硬膜切片を標本としてin situ hybridizationを行った結果,VEGF mRNAおよびHGF mRNAともに陰性であった.以上より,VEGFmRNA、HGFmRNAに対するポジトロン標識アンチセンスプローブのsequenceを決定し,合成法,及びそれを用いたPETでの非侵襲的画像化法の基礎的方法論を確立した.
学校の自律性と自己責任の法的構造に関する日本・ドイツ・オランダの比較法制的研究

(1)文部省の権限に関する日本・ドイツ・オランダの比較法制的考察わが国、ドイツ、オランダの「国家の学校監督」法制史を概観したうえで、現行法制下において、文部省がどのような教育事項について、いかなる形態の権限(許認可権・指揮監督権・基準設定権・指導助言権など)を有しているかを、これら3ヶ国の実定法制・判例・学説を分析・検討することによって明らかにし、比較法制的な観点から考察した。(2)ドイツの「学校共同体的・参加型」学校法制とオランダの「教育の自由・選択型」学校法制の構造分析上記のように特徴づけられるドイツとオランダの学校法制について、いうところの「学校の自律性と自己責任」とかかわって、以下のようなメルクマールを摘出し、その法的構造を明らかにした。(1)地方教育行政当局の学校管理・監督権、(2)ナショナル・レベルの教育課程基準と各学校の教育課程編成権との関係、(3)教科書検定制度と教科書・補助教材の採択制度、(4)校長の法的地位と権限、(5)学校の人事上の権限(校長・教員の選任権)、(6)学校財政システムと学校の財政自律権、(7)教員・親・生徒・地域住民の教育行政や学校経営への参加制度、(8)学校のアカウンタビリティーと学校評価、(9)学校教育における選択の自由。(1)ドイツの「学校共同体的・参加型」学校法制とオランダの「教育の自由・選択型」学校法制の構造分析前年度に引き続いて標記の法制研究を行なった。すなわち、ドイツとオランダの学校法制について、いうところの「学校の自律性と自己責任」とかかわって、以下のようなメルクマールを摘出し、その法的構造を明らかにした。(2)ドイツの教育関係者に対するヒアリングの実施上記(1)の法制研究や実証研究を実施するための知見や資料を得るために、平成13年11月10日から同24日までドイツに出張した。今回の出張では、ドイツ連邦共和国防衛大学、ハンブルク州文部省、公行政専門大学、ザクセン州文部省、ドレスデン工科大学、ドイツ国際教育研究所、ケルシェンシュタイナー基礎・基幹学校、ヘッセン州文部省、ラインラント・プファルツ州文部省を訪問し、教育行政の衝に直接あたっている責任者やこの面で既に優れた業績を公刊している研究者から、特に90年代以降における学校の自律性をめぐる法制と理論、直面している問題と今後の課題等についてレビューをうけた。

(1)ドイツの「学校共同体的・参加型」学校法制とオランダの「教育の自由・選択型」学校法制の構造分析前々年度、前年度に引き続いて標記の法制研究を行った。すなわち、ドイツとオランダの学校法制について、いうところの「学校の自律性と自己責任」とかかわって、以下のようなメルクマールを摘出し、その法的構造を明らかにした。(1)地方教育行政当局の学校管理・監督権、(2)ナショナル・レベルの教育課程基準と各学校の教育課程編成権との関係、(3)教科書検定制度と教科書・補助教材の採択制度、(4)校長の法的地位と権限、(5)学校の人事上の権限(校長・教員の選任権)、(6)学校財政システムと学校の財政自律権、(7)教員・親・生徒・地域住民の教育行政や学校経営への参加制度、(8)学校のアカウンタビリティーと学校評価、(9)学校教育における選択の自由。(2)学校管理規則の収集と分析「地方分権一括法」(平成12年4月1日施行)の制定をうけて、全国の地方自治体において「学校管理規則」の見直し作業が進められたが、これまでに改正された学校管理規則を収集し(対象・すべての都道府県教育委員会と50市教育委員会)、教育委員会の学校管理権について、「学校の自律性と自己責任」の観点から法制分析した。(3)報告書の作成過去2年間における研究および上記本年度の研究について、その成果をまとめるべく、現在、報告書を作成中である。
海洋内部混合の空間不均一性を考慮した全球規模熱塩循環の高解像度モデリング

海洋の熱塩循環において深層水が浮力を獲得する過程は鉛直方向の乱流混合であるが、その混合の維持のためには海洋外部からの力学的エネルギーの供給が必要となる。そのエネルギー源は海面での風応力と潮汐の二種類であるが、そのいずれに関してもどのような大きさと分布を持っているのかは観測的に明らかではなく、さらにそのエネルギーの乱流混合への変換効率に関しても不確定な部分が大きい。本研究ではそのうちの潮汐について着目する。潮汐に起因する乱流混合は空間的に大きく変動していることが観測によって最近になって知られ、その空間変動が熱塩循環の形態や強度に対してどのような意味を持つのかに特に注目する。本研究においては海洋大循環モデルを用い、観測的に知られている海洋の密度分布と熱塩循環の強度をシミュレートするためにはどれだけのエネルギーが乱流混合に消費されていなければならないのかを見積もる。海洋大循環モデルにおいては鉛直(乱流混合)拡散係数をパラメータとして外部から与えなければならず、これは観測的には必ずしもよく知られていない不確定量であるため、その大きさや空間分布を考えられる不確定性の幅で様々に変更した実験を行い、必要な乱流混合エネルギーの量がどの程度異なり得るかを調べることにした。その結果、東西積分流量としての熱塩循環強度は鉛直拡散係数の水平方向の分布にはあまり依存しないことがわかった。また、現実的な熱塩循環強度を得るために必要な乱流混合のエネルギーは0.4TW程度と求められ、観測的に見積もられている潮汐エネルギー量のうち20%程度が乱流混合に消費されている必要があるという結果を得た。この変換効率は理論的に提唱されている値と整合的である。近年の観測で明らかになってきた深層海洋における混合の強さの大きな空間不均一性が全球規模熱塩循環の3次元構造の決定に対してどのような影響を及ぼしているかを調べるため、必要となる高解像度海洋大循環モデルの整備を行い、予備的な数値実験を行って混合の強さのパラメタリゼーションの検討・改良を行った。海洋大循環モデルの整備に関しては、計算効率および必要とされる物理的プロセスのより現実的な表現という観点から、海面の昇降を陽に取り扱う自由海面、海底地形をより実際に即した形で表現するための数値差分法、および海洋深層水の形成・流出過程を表現するための海底境界層を新たに取り入れた。観測されている深層海洋における混合の強さの空間不均一性は海底地形の粗度と相関しており、内部潮汐の砕波というプロセスによっていることを示している。海洋大循環モデルにおいては内部潮汐を陽に表現することができないため、海底地形の粗度と深度に基づくパラメタリゼーションが必要となる。海洋の熱塩循環の実態に関しては観測データに乏しく、とくに太平洋における循環はよくわかっていないが、観測された温度躍層や部分的に観測されている流量を指標として、整備された海洋大循環上でいくつかのパラメタリゼーションの方法を試した。パラメタリゼーションにおいて特に問題となるのは、起伏の激しい海底上で励起された内部潮汐が鉛直方向にどこまで伝播して砕波するかであり、混合の強さの鉛直方向の減衰率を変えたケーススタディーを通して、観測とできるだけ整合するようにパラメタリゼーションを改良した。
SMS201-995による膵外分泌抑制が膵内分泌機能及び膵組織に及ぼす影響の検討-膵照射による外分泌抑制との比較検討-

1目的:膵切除後の膵液瘻は、臨床上重要な問題である。この病態に対する治療法の一つとして、Somatostatinの誘導体薬、SMS201-995は、その強力な膵外分泌抑制作用の点で注目されている。SMS201-995の膵外分泌抑制作用の臨床病態を明らかにする意味で膵炎犬における本剤の治療効果を検索した。2.方法:雑種成犬に対し、十二指腸切開の上、総胆管と主膵管を5Frのチュ-ブで連結し膵炎犬を作成し、血糖、膵酵素を測定した。(計画では60%膵切除の予定だったが、予備実験での死亡率が高く、本実験では付加していない。)本モデルにSMS201-995を投与し(SMS投与群)、投与しない群(対照群)と比較検討した。SMS直後(IV)10μg/Kg、6、18、30hs後(IM)各々10μg/Kgを投与した。3.結果1)予備実験:膵炎モデル犬を作成し、1週間までの経過観測では、術後血清ビリルビン・血清アミラ-ゼ値が、2日目をピ-クに上昇し、以後漸減し、7日まで生存した。SMS201-995の投与を術直後よりほぼ6時間毎に投与し、48時間で膵臓組織を採取することとした。2)本実験:血清アミラ-ゼ値は術前2010±413IU/lであったものが、対照群(n=6)で48時間後に31032±3820、SMS投与群(n=6)48時間後12300±946と6時間後よりSMS投与群が有意(x^2-test,p<0.01)に低下した。血清エラスタ-ゼ値では、術前117±9ng/dlであったが、対照群で18時間224±13.5SMS投与群で18時間154±614とSMS投与群が有意(x^2-test,p<0.01)に低かった。3)組織像:HE染色光顕像では、対照群にみられた小葉構造の破壊が、SMS投与群にはみられず膵炎像は軽度であると思われた。4.まとめ:膵炎モデル犬に対するSMS201-995の投与は、膵炎抑制に対する有効性が、膵酵素および組織所見から推察された。本剤は膵酵素逸脱による膵炎・膵液瘻に有用であると考えられる。
歯周病細菌に対する血中抗体価検査のインプラント周囲炎発症予知の有用性に関する検討

近年,口腔インプラント治療の増加に伴い,歯周病原細菌をはじめとする口腔細菌の感染症であるインプラント周囲炎が急増している。インプラント周囲炎は,口腔インプラントの予後を左右する主な因子の一つであり,細菌学的評価に基づいたインプラントを含む口腔内の感染管理の充実が求められる。そこでこの度,歯周病原細菌関連検査におけるインプラント周囲炎の予測因子の有用性について検討した。その結果、血液と唾液を用いた歯周病原細菌関連検査がインプラント周囲炎の予測因子として有用である可能性が示唆された。近年,口腔インプラント治療が著しく増加している。一方で,インプラント治療によるトラブルとして,歯周病原細菌をはじめとする口腔細菌の感染症が急増している。このインプラント周囲炎は,口腔インプラントの予後を左右する主な因子の一つである。これは,歯周病原細菌をはじめとする細菌がインプラントへ感染することにより,歯肉の発赤・腫脹・出血・排膿を認め,さらに進行すると骨吸収にいたる疾患である。骨吸収が重度に進行すると,インプラントを除去せざるを得ない状況にもなり得る。このインプラント周囲炎を予防するためには,細菌学的検査値に基づいたインプラントを含む口腔内の感染管理が重要である。それを充実させるために,歯周病原細菌感染度の指標である歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価検査に着目した。これまでに私が参加した研究から,主な歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalis(Pg)に対する血中IgG抗体価検査が歯周病重症度と有意に正の相関があり,その基準値(標準値)は1.68であることがわかった。そこで,インプラント治療の評価においても,このPgに対する血中IgG抗体価による細菌学的評価が有効ではないかと考えている。以上のことから,インプラント周囲炎予防のために,インプラント施術前後における歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価検査導入によるインプラント検査システムを確立し,エビデンスに基づいたインプラント治療のガイドラインを作成したいと考えている。そのために,インプラント施術前後における,歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価を指標にした大規模な長期間追跡調査を予定している。本研究は,そのパイロットスタディとしてインプラント周囲炎の現状を調査し,また,歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価検査がインプラント周囲炎の発症予知に有用であるかを検討することを目的としている。一方で,インプラント治療によるトラブルも急増しており,最も多いのが歯周病原細菌をはじめとする口腔細菌の感染症である。歯周病原細菌の感染によるインプラント周囲炎は,口腔インプラントの予後を左右する主な因子の一つである。これは,歯周病原細菌などの細菌がインプラントへ感染することにより,歯肉の発赤・腫脹・出血・排膿を認め,さらに進行すると骨吸収にいたる疾患である。このインプラント周囲炎を予防するには,細菌学的検査値に基づいたインプラントを含む口腔内の感染管理が重要である。以上のことから,インプラント周囲炎予防に,インプラント施術前後における歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価検査導入によるインプラント検査システムを確立し,エビデンスに基づいたインプラント治療のガイドラインを作成したいと考えている。本研究は,そのパイロットスタディとしてインプラント周囲炎の現状を調査し,歯周病原細菌に対する血中IgG抗体価検査がインプラント周囲炎の発症予知に有用であるかを検討することを目的としている。目的:インプラント周囲炎は,口腔インプラントの予後を左右する主な因子の一つであり,細菌学的評価に基づいたインプラントを含む口腔内の感染管理の充実が求められる.そこで,歯周病原細菌関連検査におけるインプラント周囲炎の予測因子の有用性について検討した.方法:SPT期治療あるいはインプラントリコール中である,20歳以上の口腔インプラント治療歴があるメインテナンス患者5名(メインテナンス群)とSPT患者10名(SPT群)を対象とした.対象に対して,歯周ポケットとインプラント周囲ポケットの深さを測定し,パノラマX線写真からスクリューに骨吸収が及ぶインプラント(Bone resoption in implant screw:BRIS)の有無を調査した.さらに,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査と歯周病原細菌量の唾液検査(定量PCR法)を行った.結果:BRIS保有患者数が,メインテナンス群よりもSPT群に有意に多かった.P. gingivalisに対する血漿IgG抗体価のcut-off値1.68を用いて陽性者と陰性者間で比較すると,抗体価の陽性者数がメインテナンス群よりSPT群に有意に多かった.また,唾液中の歯周病原細菌検出者数をメインテナンス群とSPT群間で比較したところ,唾液中のT. forsythiaの保菌者がメインテナンス群よりSPT群に有意に多かった.

さらに,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価と唾液中の歯周病原細菌検出者数をBRIS非保有群とBRIS保有群間で比較した.その結果,P. gingivalisに対する血漿IgG抗体価の陽性者数と唾液中のT. forsythiaの保菌者がBRIS非保有群よりBRIS保有群に有意に多かった.結論:血液と唾液を用いた歯周病原細菌関連検査がインプラント周囲炎の予測因子として有用である可能性が示唆された.近年,口腔インプラント治療の増加に伴い,歯周病原細菌をはじめとする口腔細菌の感染症であるインプラント周囲炎が急増している。インプラント周囲炎は,口腔インプラントの予後を左右する主な因子の一つであり,細菌学的評価に基づいたインプラントを含む口腔内の感染管理の充実が求められる。そこでこの度,歯周病原細菌関連検査におけるインプラント周囲炎の予測因子の有用性について検討した。その結果、血液と唾液を用いた歯周病原細菌関連検査がインプラント周囲炎の予測因子として有用である可能性が示唆された。平成26年9月に岡山大学を退職し,10月から神奈川歯科大学へ着任した。従って、岡山大学では17サンプルの検体採取に留まった。また異動に伴い,岡山大学臨床研究倫理委員会へ変更届を申請した。また,赴任先の神奈川歯科大学にて,臨床研究倫理委員会への申請に加えて,検体採取のための外来での準備をする必要があり,研究進行がやや遅れている。歯周病研究計画の具体的内容に関する変更はない。研究費申請者の異動に伴い,岡山大学臨床研究倫理委員会への変更届と神奈川歯科大学臨床研究倫理委員会への申請は承認された。その後,神奈川歯科大学附属病院にて検体採取に向けての準備が整いつつあり,2015年5月から引き続き,同意を得られた対象患者に対して,1インプラント治療歴のある対象患者の患者情報および生活習慣に関する情報収集2インプラント治療歴のある対象患者の口腔内検査3歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査および歯周病原細菌量の唾液検査(定量PCR法)を実施して,対象患者数を増やす。さらに,収集した対象患者のデータを統計学的に解析し,その成果を学会および論文で報告する予定である。岡山大学病院臨床研究倫理審査委員会に,本研究に関わる倫理審査を申請し承認を得た。現在,予定通り対象者の集積を開始できている。平成26年9月に岡山大学を退職し、10月から神奈川歯科大学へ着任した。また、赴任先の神奈川歯科大学での検体採取のための外来での準備をする必要があり、予定していた検体採取が延期となったことから当該助成金が発生した。研究計画の変更はない。よって,引き続き,同意を得られた対象患者に対して,1インプラント治療歴のある対象患者の患者情報および生活習慣に関する情報収集2インプラント治療歴のある対象
末梢感覚神経レベルでの疼痛緩和システムの解明

感覚神経の細胞体を用いた電気生理学的実験から、侵害受容感覚神経に発現しているα2受容体の活性化がTRPV1の活性化をプロテインキナーゼA依存性に抑制することが明らかとなった。そこでラットを用いた行動学的実験により末梢感覚性レベルでα2アドレナリン受容体とTRPV1との間に相互作用があるかを検討した。後肢の足底部にTRPV1アゴニストであるカプサイシンを注射して痛み関連行動を経時的、定量的に測定した。カプサイシン注射に先立って、同じ箇所にα2アドレナリン受容体作働薬であるクロニジンを注射したラットと反対側に注射したラットの痛み関連行動を測定したところ、反対側にクロニジンを注射した場合には痛み関連行動は対象と同程度であったが、同側に注射した場合には有意に減弱した。すなわち、クロニジンは注射した局所でTRPV1の活性を抑制することで鎮痛作用を発揮することが示唆された。より強力なα2受容体活性化作用を持つデクスメデトミジンでは、強力な鎮静作用が現れて痛み関連行動を評価することが出来なかった。一方、ノルアドレナリンは同側、反対側への注射にかかわらず、痛み関連行動を増大させた。ノルアドレナリンはα2以外のサブタイプのアドレナリン受容体にも強い作用を示すため、皮下から吸収されたノルアドレナリンが血流により運ばれて、注射した以外の箇所で作用を発揮し、疼痛を増大させていると考えられた。これらの結果から、少なくとも皮下の末梢神経レベルでα2アドレナリン受容体の活性化がTRPV1の活性を抑制することが明らかとなった。行動学的実験による評価を終え、分子生物学、免疫組織化学による検討に進む段階にまで進展しているため。【侵害受容神経線維に発現しているα2受容体サブタイプの同定】背根神経節より分離したcDNAをテンプレートにしてリアルタイムPCR法により、α2A、α2B、α2Cのいずれのサブタイプの受容体が優勢に発現しているかを検討する。それにより、以下の免疫組織化学に用いる抗体を選抜する。【侵害受容神経線維におけるTRPV1とα2受容体の共存】生体内で、感覚神経線維上のTRPV1をノルアドレナリンが抑制して、鎮痛効果を示せる可能性について検討する。まず、背根神経節にある感覚神経の細胞体、坐骨神経線維において、α2アドレナリン受容体とTRPV1分子が共発現しているのか検討する。さらに、皮下に伸展している末梢神経繊維上でもα2受容体とTRPV1分子が共発現しているかを確認する。その上で、アドレナリン作動性神経線維をチロシンヒドロキシラーゼをマーカータンパクとして免疫染色して、アドレナリン作動性神経線維とTRPV1陽性の侵害受容感覚神経線維との空間的位置関係を検討する。また、アドレナリン作動神経線維上にノルアドレナリンなどの伝達物質を分泌する数珠状膨大部がないか、線維上に伝達物質を含んだ小胞が存在していないか電子顕微鏡検索により検討し、アドレナリン作動性神経から分泌されたノルアドレナリンが感覚神経線維上のTRPV1に働きかける可能性について検討する。【細胞膜上でのα2受容体とTRPV1の蛋白質間相互作用】ノルアドレナリンがα2受容体を介してどのような細胞内シグナル伝達機構を介してTRPV1の活性を抑制しているのかをさらに詳細に検討する必要がある。HEK293細胞を用いて、TRPV1分子を安定発現する細胞株を作製する。その細胞にα2受容体分子を一過性に発現させて、パッチクランプ法によりα2受容体がTRPV1活性を抑制するかを確認する。体性感覚神経の細胞体が集まっているラット背根神経節(DRG)より神経細胞(ニューロン)を単離して培養し、ホールセルパッチクランプ法による細胞膜電流の記録に供した。DRGニューロンに発現している侵害刺激受容分子である陽イオンチャネル、TRPV1をcapsaicinで刺激すると、チャネルが活性化し内向き電流が生じる。このcapsaicin電流をnoradrenaline (NA)は0.1 pMという非常に低濃度で抑制した。この反応はα2アドレナリン受容体の拮抗薬(Yohimbine)とβ受容体の拮抗薬(Propranolol)では抑制されたが、α1受容体の拮抗薬(Prazosin)では抑制されなかった。また、capsaicin電流はα2受容体作用薬であるclonidine (1 pM)とdexmedetomidine (1 pM)によっても抑制された。プロテインキナーゼAの触媒サブユニットや脱リン酸化酵素抑制薬であるokadaic acidを細胞内に適用したところ、capsaicin電流に対するNAの抑制作用が減弱した。また、三量体Gタンパクの活性を抑制するGDPβSを細胞内に適用したり、Gi/o型Gタンパクの活性を阻害する百日咳毒素でニューロンを処理したところ、NAのcapsaicin電流抑制作用が減弱した。以上の成績より、NAはα2受容体、Gタンパクの活性化を介してプロテインキナーゼAの活性を抑制することでTRPV1の活性を抑制していることが示唆された。NAは、交感神経節後線維の神経終末から分泌されるのに加えて、副腎髄質細胞からadrenalineと共に血液中に分泌される。上記の成績から、神経あるいは副腎髄質由来のNAが皮下の組織中においてTRPV1を発現している侵害受容神経線維に働きかけて、痛みの感知を抑制している可能性が考えられた。当初の計画通りに、培養感覚神経細胞での電気生理学的検討を完了できたため。

感覚神経の細胞体を用いた電気生理学的実験から、侵害受容感覚神経に発現しているα2受容体の活性化がTRPV1の活性化をプロテインキナーゼA依存性に抑制することが明らかとなった。そこでラットを用いた行動学的実験により末梢感覚性レベルでα2アドレナリン受容体とTRPV1との間に相互作用があるかを検討した。後肢の足底部にTRPV1アゴニストであるカプサイシンを注射して痛み関連行動を経時的、定量的に測定した。カプサイシン注射に先立って、同じ箇所にα2アドレナリン受容体作働薬であるクロニジンを注射したラットと反対側に注射したラットの痛み関連行動を測定したところ、反対側にクロニジンを注射した場合には痛み関連行動は対象と同程度であったが、同側に注射した場合には有意に減弱した。すなわち、クロニジンは注射した局所でTRPV1の活性を抑制することで鎮痛作用を発揮することが示唆された。より強力なα2受容体活性化作用を持つデクスメデトミジンでは、強力な鎮静作用が現れて痛み関連行動を評価することが出来なかった。一方、ノルアドレナリンは同側、反対側への注射にかかわらず、痛み関連行動を増大させた。ノルアドレナリンはα2以外のサブタイプのアドレナリン受容体にも強い作用を示すため、皮下から吸収されたノルアドレナリンが血流により運ばれて、注射した以外の箇所で作用を発揮し、疼痛を増大させていると考えられた。これらの結果から、少なくとも皮下の末梢神経レベルでα2アドレナリン受容体の活性化がTRPV1の活性を抑制することが明らかとなった。行動学的実験による評価を終え、分子生物学、免疫組織化学による検討に進む段階にまで進展しているため。【皮下でのアドレナリン作動性神経線維と侵害受容神経線維の相互作用】生体内で、感覚神経線維上のTRPV1をNAが抑制して、鎮痛効果を示す可能性について検討する。まず、皮下の感覚神経線維において、α2アドレナリン受容体とTRPV1分子が共発現しているのか検討する。その上で、アドレナリン作動性神経線維をチロシンヒドロキシラーゼをマーカータンパクとして免疫染色して、アドレナリン作動性神経線維とTRPV1陽性の侵害受容感覚神経線維との空間的位置関係を検討する。また、アドレナリン作動神経線維上にNAなどの伝達物質を分泌する数珠状膨大部がないか、線維上に伝達物質を含んだ小胞が存在していないか電子顕微鏡検索により検討し、アドレナリン作動性神経から分泌されたNAが感覚神経線維上のTRPV1に働きかける可能性について検討する。【細胞膜上でのα2受容体とTRPV1の蛋白質間相互作用】NAがα2受容体を介してどのような細胞内シグナル伝達機構を介してTRPV1の活性を抑制しているのかをさらに詳細に検討する必要がある。NAが非常に低濃度で作用を示すことから、DRGニューロンの細胞膜上でα2受容体とTRPV1分子が密接にリンクした状態にあり、ごく一部のα2受容体が活性化されただけでTRPV1の活性が抑制されることが考えられる。そこでまず、これら二つ分子が相互にリンクしている状態にあるのかを検討する。HEK293細胞を用いて、TRPV1分子を安定発現する細胞株を作製する。
高温超伝導体のSTM分光

酸化物高温超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_8において、低温用走査型トンネル顕微鏡(STM)を用い4.2Kにおいてトンネル分光測定を行った。単結晶側面において測定を行い超伝導ギャップの面内異方性を直接的に調べ、ギャップの対称性を明らかにすることを目的とした。異なる2つの方向からトンネル探針をアプローチし、ノイズの少ないトンネル微分コンダクタンスが得られた。1.[110]方向(Cu-O-Cu結合方向から45°)でのトンネルゼロバイアス付近のコンダクタンスは十分に減少し、明確な超伝導ギャップ構造が観測された。そのコンダクタンスカーブは50nm程度の範囲内では場所によらず同一である。コンダクタンスの関数形は以前の測定とほぼ一致する。ギャップの大きさはΔ_<p-p>=21meVと求まり、以前の結果(Δ_<p-p>=25meV)より若干小さいが、これは試料依存性と考えられる。2.[100]方向(Cu-O-Cu結合方向)でのトンネル[110方向でのトンネルとは対照的に、ゼロバイアス付近のコンダクタンスは十分に減少せず、明確なギャップ構造は観測されなかった。方向によりトンネルスペクトルが変化することは、STM測定においてトンネル遷移確率の波数依存性が強いことと、超伝導ギャップが異方的であることを意味する。また、ゼロバイアス付近でコンダクタンスが増加するスペクトルもしばしば観測された。これはいわゆるzero bias conductance peak (ZBCP)に対応するものと思われる。我々の結果ではZBCPは[100]方向でのみ観測されている。ZBCPの存在はギャップにノードがあることを強く示唆する。超伝導ギャップの対称性は、純粋なd-波、もしくはs-波とd-波の混合の対称性である。後者の場合d-波成分がかなり大きいことが結論される。
甲状腺癌幹細胞の高精度新規マーカー群の同定とその機能解析

癌幹細胞は、癌細胞の中でも癌の根本的な原因であり、癌の再発や転移にも深く関わっているとされている。今回、多数の培養甲状腺癌細胞株と腫瘍形成能力を検討できる実験系を用い、これまでに他の種類の固形癌で報告のある癌幹細胞マーカーを候補とし、甲状腺癌における幹細胞マーカーの同定を試みた。その結果、細胞におけるアセトアルデヒド脱水素酵素の活性が最も有力な候補であることが明らかになったが、同時に、細胞の種類によってはCD326やCD44もマーカーとなることが示唆された。このことは、甲状腺癌においては、普遍的なマーカーはなく、癌のタイプや症例によってマーカーが異なっている可能性を示唆している。昨年度に引き続き、セルソーターから直接細胞を低接着培養プレートにソートし、特殊な無血清培地で培養する方法を組み合わせ、甲状腺癌細胞株を用いて癌幹細胞マーカーの検索を行った。その結果、マーカー候補としてALDH1活性、CD326を同定したが、ALDH1活性はいくつかの細胞腫でマーカー候補であることが確認されたものの、全ての細胞腫における共通のマーカーとはならなかった。また、CD326はFRO細胞でのみマーカーとして利用できた。このことは、ALDH1活性は、甲状腺癌幹細胞の重要なマーカー候補であるものの、他にもマーカーが存在すること、また各症例ごとにマーカーが異なっている可能性を示唆している。甲状腺癌においては、癌幹細胞をターゲットとした治療を考える場合、腫瘍ごとに対応を変える必要があるのかもしれない。今後も、マーカー同士の関連など、詳細な研究の継続が必要であると考えられた。また、ヌードマウスに細胞株で作らせた腫瘍、さらにスフェロイド培養にて作らせたスフィアから細胞を調製し、マーカー発現の変化をフローサイトメトリーで確認したところ、通常の接着培養系と比較し、両者には高い類似性が見られた。このことは、スフェロイド培養法は、より生体内での腫瘍の状態を反映していることが示唆された。ただし同時に、スフェロイド培養法では、癌幹細胞をそのままの状態で分裂増殖されているとは考えにくく、その状態でヘテロな細胞集団を生み出している可能性も考えられた。これまで固形癌で同定されている癌幹細胞マーカーによって細胞を染色し、セルソーターで細胞を分取後、細胞の機能解析を行った。まずFRO細胞においては、ALDH活性、CD326発現の両方がマーカー候補として挙がったため、両マーカーに対する同時染色を行い、より細かい細胞分画のスフィア形成能を検討した。その結果、FRO細胞においては、CD326の方が非癌幹細胞をより厳密に除外できる精度の高いマーカーであることが示唆された。しかし濃縮するという目的では、両マーカーを併用しても残念ながらあまり効果の上昇は見られなかった。次に、癌幹細胞の特性の一つとされている細胞分取後のそれぞれの分画における細胞自己複製能、分化能を検証した。こちらは、分取後は通常の接着培養にてしばらく細胞を培養後、再びフォローサイトメトリーによるマーカーの発現を検討した。予想通り、癌幹細胞が濃縮された分画からは自己複製能、分化能を示す細胞が確認されたが、逆に癌幹細胞をあまり含んでいない分画からも癌幹細胞マーカーを発現する細胞が出現し、非常に複雑な結果となった。これは、未だ癌幹細胞マーカーが不確実である、さらには非癌幹細胞から癌幹細胞への転換が起こるといった可能性が考えられた。二つ目の可能性は臨床的にも重要で、癌幹細胞のみをターゲットとする治療では不十分である可能性を示唆する。さらに細胞分取後、両分画細胞の抗癌剤感受性、放射線感受性も検討したが、明らかな差は認められなかった。甲状腺癌研究で頻用されている癌細胞株FRO、WRO、TPC1、KTC1、KTC2、KTC3、ACT1、8505Cを入手し、ヌードマウスでの腫瘍形成能を確認したところ、FRO、KTC3、ACT1、8505Cで腫瘍の形成が確認された。マトリゲルを追加してさらに検討したところ、必要な細胞数は少なくなるものの、細胞種に変化はなく、マトリゲルが新たに腫瘍形成能を付与する訳ではないことが示唆された。次に、現時点で固形癌の癌幹細胞マーカーと言われている表面抗原:CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、CD166、c-kit、SSEA-1の発現とALDH1活性を、すべての細胞株で検討した。マウスでの腫瘍形成能と相関した表面抗原の発現パターンは確認できなかった。また、すべての細胞株で、特殊な表面処理をした細胞培養プレートと無血清培地を組み合わせたスフィア形成アッセイを、ヌードマウスでの腫瘍形成能と比較検討したところ、非常に高い相関を示すことが分かった。

そこで、腫瘍を形成する細胞株FRO、KTC3、ACT1、8505Cを用い、表面抗原の発現量によって細胞をソートし、それら細胞をそのまま直接上記スフィアアッセイに利用するという実験系を確立した。現時点で、FRO細胞において、ALDH活性の高い細胞は、ALDH活性陰性の細胞に比べ、非常に高いスフィア形成能を持つことが分かった。これは、甲状腺癌において、ALDH活性が癌幹細胞のマーカーの一つである可能性を示唆している。in vitroで作らせたスフィア状態の癌細胞は、in vivo(生体内)での癌細胞の状態をよりよく反映しているとの結果であり、またこれを支持する論文が出版されていることから、一度in vitroでスフィアを形成させ、そこから細胞を回収し、フローサイトメトリー、セルソーターによる解析を行った。ただし、径が小さいスフィアからの細胞は、ソーティング後にほとんど生着しなかったため、これら径の小さなスフィアを除外し、ある程度の大きさのスフィアを回収後、それを分解して得られる細胞を対象として解析を行った。FRO細胞において、スフィア状態の細胞ではCD44の発現が出現し、このマーカーに従って細胞を分取したところ、CD44高発現分画でスフィア形成能が上昇していることが確認された。つまりこのことは、生体内ではCD44も癌幹細胞のマーカー候補となる可能性を示唆している。しかしALDH活性での細胞分取と比較したところ、ALDH活性がよりスフィア形成能を反映しており、スフィア状態の細胞でもALDH活性が有力なマーカー候補であることがわかった。H26年度にはさらに追加で12種類の新たな甲状腺未分化癌細胞株を取得し、ALDH活性、スフィア形成能を中心にこれまでと同様の解析を行った。これらすべての細胞株でALDH活性やスフィア形成能が見られた訳ではなく、解析に使用できたのは数種類であったが、その結果はこれまでの結果を支持するものであった。以上より、甲状腺癌の癌幹細胞のマーカーとしては、ALDH活性が有力ではあるが、それ以外にも細胞の種類によってはCD326、CD44もマーカーとなり得ることが示唆され、マーカーの生物学的な意義を含めたより詳細な解析が必要であると考えられた。内分泌腫瘍学ほぼ、当初の計画通りである。さらに新しい細胞種を追加したいが、手続きと検証が遅れている。ほぼ、当初の計画通り進行している。このまま、当初の計画通りに推進する。今後、これらの実験結果が普遍的なものか、細胞の種類を増やし、実際の生体内での状態により近いスフィアから細胞を分取し、解析を継続する予定である。当初の予定通り推進する。物品費120万、旅費40万、その他40万で計画している。次年度は、物品費104万円、旅費20万円、その他20万円で計画している。