hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有限型擬凸領域における複素解析の研究

多変数複素解析学において非常に重要な正則関数の境界挙動に関して、詳細な研究を行った。特に、私が興味を持ったのは、有限型という重要なクラスの領域に関するもので、このクラスの研究には、特異点論などで重要なニュートン多面体の幾何学的な性質を研究することに帰着される場合が多く、非常に面白い現象を見た。また、これらの研究と深く関連した、調和解析学で重要な振動積分と局所ゼータ関数に関する漸近解析も行った。本年度の研究の成果として重要なものは、以下のふたつが挙げられる。ひとつは、正則ベクトル東上のベルグマン関数に関してのものである。現在までの研究としては,正値の場合に関するものが中心であり、非常に詳しく調べられているが、退化した場合については詳しいものは皆無であったが、私は趙康治氏と野瀬敏洋氏と共同で、特別な場合について、漸近展開という非常に詳しい形でベルグマン関数の挙動を表すことに成功した。もうひとつは、実解析の問題である振動積分の挙動に関するものである。バルチェンコの有名な漸近展開の結果は、相関数のニュートン図形を用いてその挙動を表すものであるが、私は趙康治氏と野瀬敏洋氏と共同で、振幅関数が消えている場合に、そのニュートン図形もさらに考慮すると挙動がより正確に表示することができるというような結果を得た。これは、有限型擬凸領域上の複素解析学への応用が期待される成果である。ジェネリックな場合の解析を含む退化した場合の解析を行う際、ニュートン多面体の幾何学的な情報が非常に有用となってきていることは、国内外の研究をみて明らかであるが、この研究においても以下のような多くの成果を得た。一つは、複素解析、複素幾何において非常に重要なベルグマン核の挙動について、漸近展開の意味で、ニュートン多面体の情報を使って計算を行い、精密な成果を得た。その際、今までに得られてきた多くの複素解析学における研究の成果を用いた。もう一つは、調和解析学で重要な振動積分の挙動について、同様にニュートン多面体の情報を用いて解析を行った。これは、1970年代に得られたヴァルチェンコの結果の一般化、精密化になっているものである。具体的には、相関数のニュートン多面体のみならず、振幅関数のニュートン多面体を用いることで、漸近挙動が非常に正確に記述されることが解った。さらに、過去の研究では相関数は実解析的であることが必要であったが、その条件は自然に一般化され、無限回微分可能な関数のなすあるクラスにまで拡張されることが示された。その際に、特異点解消を構成する必要性が生ずるが、このクラスのトーリック特異点解消をしたという点で、非常に興味深い結果と言えよう。同様な、結果は局所ゼータ関数の極の分布に関しても得られている。この成果も、過去に得られているものと比較して非常に精密なものになっている。今年度は、引き続き、多変数複素解析学において非常に重要な積分核であるベルグマン核とセゲー核の境界挙動を有限型擬凸領域に関して、詳細に調べることに取り組んだ。そのために、実解析や調和解析で重要な振動積分や局所ゼータ関数に関する漸近解析を、特異点論的なアプローチにより行った。その際、重要となるのは、ニュートン多面体という概念であり、そのトポロジカルな情報が、漸近挙動に非常に大きく関わっていることが、理解された。さらに、これに関連して、特異点解消という代数幾何学で重要な問題に取り組む必要にせまられ、実際にそれを、いくつかの場合に関して行った。特に、興味深いのは、ある種の無限界微分可能な関数のクラスについて、ある条件の下で、定量的な特異点解消を行った点である。このクラスは、Denjoy-Carlemanクラスという実解析的なクラスに近いものの、真にテーラー展開が収束しない関数を含んでおり、このクラスに相関数が含まれている時に、振動積分の漸近展開が得られることを示した。この結果は、上に述べた複素解析の問題にも応用されるものと期待される.本年度の研究の成果として重要なものは、以下のふたつが挙げられる。ひとつは、様々な数学の分野において重要となる振動積分の無限遠での挙動に関するものである.この研究は現在では主に、調和解析、実解析の分野で盛んに行われているものである.特に、近年重要となっているのが、特異点解消との関連で、これは特異点論、代数幾何などの分野にまたがる面白いテーマであることを示してもいる.さて、申請者の研究の成果を述べる。現在までに主になされてきたものは、相関数が実解析的である場合であり、これは特異点解消の研究との関連である意味で必要とされるものであり、無限界微分可能関数(以下なめらかな関数とよぶ)に結果を拡張することは、困難と思われてきた.そこで、私は、なめらかな関数のクラスにある特別なクラスを定義し、このクラスに関する関数に関して、トーリック特異点解消に関する結果を得た。その成果から、相関数がそのクラスに属している時に、非常に詳しい振動積分の挙動に関する成果を得ることができた。

この解析で重要なのは、ニュートン多面体と呼ばれる、なめらかな関数に付随して得られる幾何学的な対象である。このニュートン多面体の幾何学的な情報から、定量的な意味で特異点解消を行うというプロセスを経て、なめらかな関数の場合にも振動積分に関して、非常に強い結果を得ることができた。もう一つの成果は、有限型擬凸領域に関する不変量の決定に関するものである.具体的な領域を与えたときに、型(タイプ)よ呼ばれる不変量を決定するという問題は、非常に難しく、現在までのところ、ある特別なクラスの領域の場合しかわかっていなかった。しかし、領域の定義関数のニュートン多面体を用いることで、具体的な型を求めるアルゴリズムが得られることがわかった。これは、振動積分の研究に類似するものである。今年度は、多変数複素解析学で重要な有限型領域上の正則関数の境界挙動について、様々な角度から研究を行った。具体的な対象としては、バンプ関数、ピーク関数、サポート関数などの構成の研究に関して、いくつかの考察を行った。特に、サポート関数の構成に関しては、コーン・ニレンバーグの有名な例について、さらに一般的な状況で、その存在に関する様子を詳しく調べ、必要かつ十分な条件について成果を得た。その他の関数については、ニュートン多面体という特異点論的な概念が重要となるが、その準備段階における研究を行っているところである。また、ベルグマン核とセゲー核についても、同様な姿勢で研究を行った。また、実解析や調和解析で重要な研究対象である振動積分について、非常に深い研究を行い、多くの成果を得た。特に、相関数が単に滑らかな場合についての研究は、現在までのところあまり行われていないが、かなり詳しい様子を知ることができた。特に、実解析的という仮定を付けない場合にしか、現れないような様々な現象についての考察が、非常に興味深い。その研究と関連して、局所ゼータ関数の解析接続に関する研究も行った。この場合も実解析的な場合には、非常に詳しい成果が得られているが、単に滑らかという条件では、まだ十分に研究がすすんでおらず、面白い現象もたくさん見られる。このことについて、詳しい考察を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。多変数複素解析、調和解析26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、ニュートン多面体を用いた解析への理解が非常に深まり、多くの成果を得ることができた。しかしながら、時間的な制約があり、具体的な応用は不十分であった。実解析的な解析を中心に行うことにより、目標の研究に関する理解は深まってきているが,複素解析的な問題に取り組む時間的な余裕がなかった。当初、有限型擬凸領域上の正則関数の挙動に関する研究として、特異点論的なアプローチが有用であることはわかっていたのであるが、これらが振動積分の研究に関して新しい結果をえるまで、発展できるとは考えていなかった。振動積分に関して研究をすすめるうちに、調和解析学における非常に盛んに行われている研究を凌駕する結果をえることができたことに、非常に満足している。さらに、もとの複素解析学の研究に戻って、成果を出す段階にきている。振動積分の研究とベルグマン核の境界挙動の研究は、密接に関連しており、これらの研究を同時に進行させている段階であり、研究の進展には、満足している。
検察審査員の判断を規定する要因および判断に至る心的プロセスについての実証的研究

25年度は、下記の研究1と研究2を実施し、審査申立人の供述等が検察審査員の判断に及ぼす影響について検討した。研究1:殺人事件の事案で、申立人(被害者遺族)の目撃供述が、検察審査員の判断に及ぼす影響について検討した。協力者の大学生73人は、無作為に2つの条件(目撃供述有条件、目撃供述無条件)のうちのいずれかに割当てられ、審理の前後で質問紙に回答した。その結果、申立人の目撃供述は判断に影響を及ぼさず、審理前に「有罪になる確信」が弱いほど、検察の判断(不起訴相当)を支持する傾向がみられた。研究2予備実験:申立人の意見陳述が判断に及ぼす影響について検討するために、複数の事案を取り上げ、大学生192人を対象に、質問紙調査を行った。その結果、いずれの事案においても、申立人の意見陳述が判断に影響を及ぼさなかった。本実験:予備実験の結果をふまえ、本実験では、被疑者が申立人の求める示談に応じていることが、判断に及ぼす影響を検討した。取り上げた事案は、業務上過失致死罪の適用が申し立てられた事案1(柔道事故死)と事案2(交通事故死)であった。協力者の大学生38人は、無作為に2条件(事案1のみ示談が成立している条件、事案2のみ示談が成立している条件)のいずれかに割当てられ、同じ条件のグループ(8人11人)別に実験に参加した。各グループには、法的助言を行う審査補助員役が審理に加わった。その結果、事案1については、示談が成立している場合には、審理の前後ともに、検察の判断(不起訴相当)を支持する割合が有意に多く、示談が成立していない場合には、検察の判断を支持しない割合が有意に多かった。事案2については、審理前の判断に、示談成立の有無によるちがいはみられなかったが、示談が成立していない場合、審理前よりも審理後に、検察の判断(不起訴相当)を支持する割合が有意に多かった。25年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は、検察審査員の判断に影響を及ぼす要因について明らかにする目的で、各地の検察審査協会の協力のもと、検察審査員経験者31人を対象にした質問紙調査(研究1)を実施した。また、市民(大学生)93人を対象にした模擬検察審査会実験(研究2)を実施した。研究1では、(1)検察審査会についての知識、(2)審査内容、(3)検察審査会制度の意義および改善点、について回答を求めた。その結果、71%が審査員候補に選ばれるまで検察審査会制度について「知らなかった」と回答し、そのうち、「事務局の説明を受けた後に理解できた」と回答した者は60%であった。審査内容は、交通事故、横領、遺産相続など多岐にわたり、45%が審査の際に「法律の知識」が必要であったと回答した。また、「被害の大きさ」、「審査申立て人の処罰感情」、「社会に与える影響」、「被疑者が裁判で有罪となる可能性」のいずれも、「判断に影響した」と回答した者、「影響しなかった」と回答した者の割合にちがいはみられなかった。さらに、42%が検察審査会制度の意義について「市民の常識的判断の司法への反映」を挙げ、検察審査会制度の趣旨である司法への「民意の反映」に重きが置かれる傾向が示された。改善すべき点としては、「目を通す文書の量が多いこと」、「任期期間が短いこと」等が挙げられた。

研究2では、過去に検察審査会で審理された複数の事案の概要を提示し、検察審査員としての判断(起訴相当、不起訴不当、不起訴相当)を求めた。その結果、検察審査員としての判断には、「申立人の処罰感情」が強く影響することが示された。また、判断に影響を及ぼす要因として、「処罰感情や世論の考慮」に関連する因子、「法律の考慮」に関連する因子の存在が示され、どちらの影響を強く受けるかによって、異なる判断が導きだされる傾向が示された。24年度の研究では、検察審査員経験者31人に対する調査を実施し(研究1)、検察審査員の判断を規定する要因を抽出した。また、検察審査会事務局長2人、検察審査員経験者4人を対象にした対面調査を実施し、模擬検察審査会実験の実施について助言を得ることができた。さらに、市民(大学生)93人を対象にした模擬検察審査会実験を実施し(研究2)、複数の事案に対する判断から、検察審査員の判断に影響する2つの要因ー「処罰感情や世論の考慮」に関連する因子と、「法律の考慮」に関連する因子の存在を示すことができた。以上、検察審査員の判断を規定する要因について明らかにするという24年度の研究目的は、概ね達成できたと考える。25年度は、模擬検察審査会実験を実施し、評議過程における検察審査員の判断に至る心的プロセスを質的分析と量的分析を行うことで明らかにする。24年度の検察審査員経験者に対する調査から、70%以上は検察審査会に対する知識がなかったこと、45%が審査にあたって法律の知識が必要だったと回答し、その中には説明を受けても十分理解できなかったと回答する者がいたことから、25年度に実施する模擬検察審査会実験では、法の実務家の協力を得て、法律の説明を十分に行うことに留意する。また、検察審査員としての経験を積むことが、判断にどのような影響を及ぼすかについても検討を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
顆粒球造血の細胞内情報伝達機構の解明

好中球の血液幹細胞からの増殖、分化を司るG-CSFの細胞内シグナル伝達機構に閔しては、Tyk2の欠損は血球数に影響を与えておらず、tyk2欠損マウスにG-CSFを投与したところ、野生型マウスと同様に好中球数の増加を認めており、好中球造血は複数のJakキナーゼが互いに補完して行っていることが判明した。また、in vivoでのTPOを投与後の血小板数、in vitroでの血小板凝集能は、野生型マウスとtyk2欠損マウス間に差は認めず、tyk2は血小板のシグナル伝達には関与していなかった。tyk2はIL-12刺激時にも活性化されるが、Tyk2欠損マウスではIL-12刺激によるIFNγ産生、Th1細胞への分化が仰制されていた。IL-12とならび生体内での主要なIFNγ誘導サイトカインてあるIL-8は、Jak-Statシグナル伝達系ではなく、MAPキナーゼを介してそのシグナルを伝達する。Tyk2欠損T細胞は、IL-18刺激によるIFNγ産生が野生型細胞と較べ低下していた。IL-12と18にはIFNγ産生に関し相乗作用があり、これもtyk2の欠損により阻害されていた。野生型マウス由来T細胞ては、IL-12刺激によりIL-18レセプターの発現が亢進する。Tyk2欠損細胞ではこの発現レベルの上昇が見られないが、弱いながらもIL-12と18の相乗作用が見られ、これはレセプターの発現レベル以外に、Jak-Statシグナル伝達系とMAPキナーゼのシグナル伝達系の間にクロストークが存在することを示している。G-CSFの増殖シグナルはJakキナーゼにより伝達される。G-CSFのレセプターへの結合後、Jak1,Jak2,Tyk2が活性化される。報告されたJak1,Jak2欠損マウスの表現型によるとJak1,Jak2の欠損は顆粒球の増殖に影響を与えていない。この事よりG-CSFによる好中球の増殖には、G-CSFにより活性化される残りのJakキナーゼであるTyk2が必須であるか、または1種類のJakキナーゼの欠損を他のJakキナーゼが補完している可能性が想定され、この点を生体内で明確にするため、Tyk2欠損マウスを作成をおこなった。開始コドンを含むTyk2DNAの第1Exsonをneomycin registance geneで置換し、targeting constractを作製しES細胞に遺伝子導入した。相同組み換えが生じたES細胞をmouse blast cystに導入し、chimera miceを得た後、交配後、2個の独立したクローン由来のTyk2欠損マウスが得られた。Tyk2の欠損は生体の発育、生存に必須ではなく、現在その表現系を解析中である。また、G-CSFの文化シグナルは、そのレセプターのC末50塩基を介して伝達される。これに関与するシグナル伝達物質のクローニングを行っている。IL-3依存性細胞株に野生型G-CSFレセプターとC末をわずかに欠失したレセプターを導入した細胞をG-CSFで刺激後、両者より得られたcDNAをsubtractionし、複数個の遺伝子をクローニングした。現在これらの遺伝子の発現をNorthern blottingで検討中である。顆粒球造血を司るG-CSFの増殖シグナルはJakキナーゼにより伝達される。G-CSFのレセプターへの結合後、Jak1,Jak2,Tyk2が活性化されるが、Jak1,Jak2の欠損は顆粒球の増殖に影響を与えていない。

よってG-CSFによる好中球の増殖には、Tyk2が必須であるか、または1種類のJakキナーゼの欠損を他のJakキナーゼが補完している可能性が想定され、この点を生体内で明確にするためTyk2欠損マウスを作成した。Tyk2の欠損は血球数に影響を与えず、In vitroコロニー形成法では、G-CSF,TPOがTyk2を活性化するのにもかかわらず、CFU-G,CFU-GM,CFU-Megコロニーの形成に差を認めなかった。また、マウスにG-CSFを投与したところ、野生型マウスと同様に好中球数の増加を認め、Tyk2の欠損は好中球造血に影響を与えなかった。つまりJak2単独により制御される赤血球や血小板造血と異なり、好中球造血は複数のJakキナーぜが補完して行っていることが判明した。また、Tyk2は遺伝子クローニングに際しIFNαのシグナルに必須のシグナル伝達分子として獲得されたが、Tyk2欠損マウスではIFNαによるNOの産生は障害されていたが、抗ウイルス作用やHLA classI分子の発現は保持されていた。しかし、Tyk2欠損マウスではIL-12刺激によるStat4のリン酸化、IFN γ産生、Th1細胞への分化が抑制されており、Tyk2はIL-12シグナル伝達に必須であり、免疫応答を司る重要なキナーぜであることを明らかにした。好中球の血液幹細胞からの増殖、分化を司るG-CSFの細胞内シグナル伝達機構に関しては、Tyk2の欠損は血球数に影響を与えておらず、tyk2欠損マウスにG-CSFを投与したところ、野生型マウスと同様に好中球数の増加を認めており、好中球造血は複数のJakキナーぜが互いに補完して行っていることが判明した。また、in vivoでのTPOを投与後の血小板数、in vitroでの血小板凝集能は、野生型マウスとtyk2欠損マウス間に差は認めず、tyk2は血小板のシグナル伝達には関与していなかった。tyk2は1L-12刺激時にも活性化されるが、Tyk2欠損マウスではIL-12刺激によるIFNγ産生、Th1細胞への分化が抑制されていた。IL-12とならび生体内での主要なIFNγ誘導サイトカインである1IL-18はJak-Statシグナル伝達系ではなく、MAPキナーゼを介してそのシグナルを伝達する。Tyk2欠損T細胞は、IL-18刺激によるIFNγ産生が野生型細胞と較べ低下していた。1L-12と18にはIFNγ産生に関し相乗作用があり、これもtyk2の欠損により阻害されていた。野生型マウス由来T細胞では、IL-12刺激によりIL-18レセプターの発現が亢進する。Tyk2欠損細胞ではこの発現レベルの上昇が見られないが、弱いながらIL-12と18の相乗作用が見られ、これはレセプターの発現レベル以外に、Jak-Statシグナル伝達系とMAPキナーゼのシグナル伝達系の間にクロストークが存在することを示している。
腎細胞癌増殖における塩基性線維芽細胞増殖因子の役割

腎細胞癌はX線画像上多くがhypervascularな形態を示す。我々は腎細胞癌における血管新生及び腫瘍の増殖に塩基性線維芽細胞成長因子(b-FGF)の関与があるかどうか検討した。腎癌細胞のCell line(ACHN,VMRC-RCW,NT)を使った実験では、b-FGFが有意にDNA合成を促進することが判明すた。さらに実際に腎細胞癌患者より摘出した腎臓の正常部及び癌部のそれぞれについて遺伝子レベルで検討した。その結果67%に癌部が正常部と比し24倍のb-FGFの発現をみとめた。また免疫組織染色上、核ならびに細胞辺縁部に染色陽性をみとめた。一方腎癌細胞におけるb-FGFの働きを解析するうえで正常腎あるいは、腎の非腫瘍性の増殖性変化である腎再生現象におけるb-FGFの役割を検討することは重要である。ddyマウスを用いた一側腎摘後の代償性腎成長においてperitubular endothelial cellの増殖は、腎摘後6時間から48時間をピークにおこってくるが、この増殖は、抗b-FGF抗体の経静脈的投与によりブロックされた。このことからb-FGFは代償性腎成長でみられるperitubular endothelial cellの増殖を制御する重要な増殖因子であると考えられる。さらにHgCl_2投与によるラット急性腎不全モデルにおいて、障害後48時間から72時間を中心にみられる腎間質細胞の増殖経過に対し、障害腎組織中でのb-FGF mRNAは24時間から48時間後にその発現が増加していることから、急性腎不全においてもb-FGFが主として腎間質細胞の増殖に作用することが推測される。以上よりb-FGFは腎細胞癌や腎再生現象においてその細胞増殖制御を担う増殖因子の1つであるといえる。
雲南地域の植物性抗がん剤に関する研究

1.平成8年度は、雲南-四川地域の植物約400種類を採集し、抗がん活性、細胞周期の阻害およびBRM活性について評価した。その結果、A-15,W-15とA-104に強い抗がん活性があり有効成分を単離精製が進行中である。2.トロ根の1種Physalis alkekengi sp.より単離したマウス白血病P388/ADMに有効の物質は、4,7-didehydroneophysalin Bと同定した。この物質のin vivoの抗がん活性について評価を進めている。3.民間薬として、がんの治療に使われている"神農"から、bicalein,bicalinおよび2',5,5',7-tetrahydroxy-6',8-dimethoxyflavoneを単離同定した。これらのフラボン化合物は何れもin vitroで35μg/mlの濃度で強い細胞毒性を示した。4.グアバPsidium guajava L.の乾燥葉より単離したcastalagin、casuarininはP388/ADMに対し細胞毒性を示した。グアバ葉には他にも細胞毒性を示す化合物が多数含まれており、それらの成分の分離を進めている。これらポリフェノール化合物は、溶解性に問題があるものが多く、その解決のためにそれらの科学変換を必要と考えている。特にchebulagic acidについては可溶性誘導体を追求しており、それらの細胞レベルでの増殖阻害活性を評価中である。これらポリフェノール化合物は、溶解性に問題があるものが多く、その解決のためにそれらの化学変換を必要と考えている。特にchebulagic acidについて可溶性誘導体を追求しており、それらの細胞レベルでの増殖阻害活性を評価中である。
レジオネラ属細菌の環境中および宿主内での生存適応戦略とその多様性の研究

1.バイオフィルム形成の分子遺伝学的・形態学的解析レジオネラ38菌種50菌株のうちバイオフィルムを形成したのはL.pneumophilaのみで、その他の菌種は形成しなかった。バイオフィルムは、25°Cではガラスへの付着能も強く多糖体マトリックスの中に短い本菌が生息していた。一方、37°Cでは多糖体マトリックスは少なく、菌体が線維状に伸長して菌体自身で織物のようなバイオフィルムを形成し、線維状の菌は多核であった。2.レポーター遺伝子を使ったレジオネラ遺伝子発現の動態の研究不安定GFPがL.pneumophilaのin vitro、細胞内での遺伝子発現の研究に応用できることを明らかにした。現在、細胞内増殖に必要な遺伝子であるicmS, icmT, icmQの発現をin vitroと細胞内で観察している。また、温度依存性プロモーター領域の探索を行った。その結果、1株はicmNのプロモーターであり、icmNノックアウト変異株では25°Cでの上皮細胞接着能が低下していた。トランスポゾン誘導変異によって、マウスのマクロファージ系株化細胞J774の中で増殖できないLegionella dumoffii変異株を作成・選択した。変異株のうちの一株は、トランスポゾンがDj1A遺伝子中に挿入されており、ファゴソームとリソソームの融合を阻害できないことがわかった。Dj1Aは熱ショックタンパクDnaJファミリーの一員であり、Dj1Aが、細胞内寄生菌の細胞内増殖に重要であるとの最初の報告となった。別の1株(KL15)は細胞内侵入能が低下していた。4.2-deoxy-D-glucose(2dG)がマクロファージ内でのL.pneumophilaの増殖を抑制する機序のマウスDNAマイクロアレイを使った解析2dG単独ではマウスマクロファージのいくつかのGタンパクの発現を抑制した。L.pneumophilaの感染単独ではToll-like receptor2、TNF-αなどの遺伝子の発現が亢進し、それに2dGを添加すると、これらの遺伝子の発現は抑制された。1.バイオフィルム形成の条件L.pneumophilaがバイオフィルムを形成する条件について検討した。本菌をBYE液体培地中で培養した場合、37°Cでは液面に管壁から剥がれやすいバイオフィルムを形成し、電子顕微鏡で観察すると菌体は長く伸長して線維状になっていた。一方、25°Cで培養した場合、剥がれにくいバイオフィルムを形成し、菌体は短い桿菌状であった。(第55回日本細菌学会九州支部総会、平成14年9月、別府、にて発表)2.バイオフィルム中、アメーバ中のレジオネラの高温暴露に対する抵抗性の検討25°Cで形成されたバイオフィルムに生息するL.pneumophila、アメーバAcanthamoebaに貪食されたL.pneumophila、液中に単独浮遊するプランクトニック状態のL.pneumophilaを各々高温(6075°C)に暴露させ抵抗性を調べたところ、バイオフィルム中では有意に抵抗性が高くなっていた。3.細胞内増殖機序の多様性の研究Legionella dumoffii細胞内で増殖するのに必要な遺伝子を解析した。まずtransposon mutagenesisによって、マウスのマクロファージ系株化細胞J774の中で増殖できない変異株を選択した。

検索の結果トランスポゾンは変異株のDjl遺伝子中に挿入されていた。共焦点レーザー顕微鏡での解析により、本変異株はファゴソームとリソソームの融合(P-L融合)を阻害できないことがわかった。今後、Djl産物がP-L融合を阻害する機序について研究を進める予定である。(第55回日本細菌学会九州支部総会、平成14年9月、別府、にて発表)1.バイオフイルム形成の分子遺伝学的解析レジオネラ属細菌自身にバイオフィルム形成能があるかどうか、形成する能力はどの菌種が一番高いか、形成されるバイオフィルムの性質と、形成される条件について研究を行った。培養にはレジオネラ培養用液体培地であるBYE培地を用い、ガラス試験管にて本属菌を静置培養した。培養温度は25、30,37°Cとし、液面及びガラス面に形成されるバイオフィルムを経時的に形態を観察した。レジオネラ38菌種50菌株のうちバイオフィルムを形成したのはL.pneumophila(血清群111を調べた)のみで、その他の菌種は形成しなかった。形成されたバイオフィルムの性質は培養温度で異なっていた。25°Cでは多糖体マトリックスの中に短い本菌が生息し、ガラスへの付着能も強かった。一方、30、37°Cでは多糖体マトリックスは少なく、菌体が線維状に伸長して菌体自身で織物のようなバイオフィルムを形成し、繊維状の菌は多核であった。これらの新知見と成果は、"Temperature-regulated formation of mycelial mat-likebiofilm by Legionella pneumophila"という論文としてまとめ、米国微生物学会誌Appl.Environ.Microbiol.に投稿中である。2.細胞内増殖機序の多様性の研究Legionella dumoffiiが細胞内で増殖するのに必要な遺伝子を解析した。トランスポゾン誘導変異によって、マウスのマクロファージ系株化細胞J774の中で増殖できない変異株を作成・選択した。変異株のうちの一株は、検索の結果、トランスポゾンがDjlA遺伝子中に挿入されていた。共焦点レーザ顕微鏡での解析により、本変異株はファゴソームとリソソームの融合を阻害できないことがわかった。DjlAは熱ショックタンパクDnaJファミリーの一員であり、DjlAが、レジオネラのみならず、細胞内寄生菌の細胞内増殖に重要であるとの最初の報告であり、DjlAの機能の解析が期待される。2-deoxy-D-glucoseはマクロファージ培養液中に添加すると濃度依存的に、マクロファージ内でのL.pneumophilaの増殖を抑制する事を見いだした。その機序を解明するためにマウスのDNAマイクロアレイを使って解析中である。固形平板培地上で温度3745°Cにて培養されたL.pneumophilaの菌体は高率(95%以上)に100μm以上の長さをもつ線維状菌体に変化することを見いだした。この機序を形態学的に、また分子遺伝学的にはrelA、ftsZ遺伝子などに焦点を当て解析している。2.不安定GFPのレジオネラ属菌の遺伝子発現解析への応用
家畜伝染病発生時の防疫理論に関する研究

国内外の口蹄疫、豚コレラなど家畜伝染病流行時の防疫事例と軍事学領域で用いられる戦略理論を分析し、家畜伝染病発生時の防疫を検討する理論的枠組みとして、防疫実施主体である国や都道府県の階層機能構造と防疫に影響を与える要因(外的、中間的、内的)の2面を考慮することが有効であることを明らかにした。また、鳥インフルエンザの発生時の防疫作業を例として、鶏の処分に必要な人員を過去の発生事例から推定し、都道府県毎の動員可能数から発生時に人員が不足する確率とその人数をシミュレーションによって推定した。昨年度は軍事上の戦略・戦術の階層構造に着目し、家畜防疫の実施主体である国や都道府県の役割を明確にした。本年度は、さらに家畜伝染病の防疫活動の報告書などを分析し、疾病の流行状況、防疫組織の整備状況、緊急防疫体制、関係者の意見など防疫における意思決定に影響を与える要因を抽出・分類することにより、防疫理論構築のための影響要因を類型化した。影響要因は、外的要因、中間的要因、内的要因の3つに区分することが可能であり、外的要因は病原体の特性や家畜の地理的分布などが含まれ、防疫担当者が制御できないものとして分類した。中間的要因には、業界団体や政治家の意向などがあり、防疫担当者では制御が難しいものの、より高いレベルの権限を持った意思決定者には制御できる要因とした。また、防疫体制の整備構築などは防疫担当者が制御可能な内的要因に区分できた。これらの要因と戦略上の階層構造を組み合わせることにより、防疫理論体系化の土台構築が可能と考えられた。なお、軍事分野において危機管理上のリーダーシップ理論が発展しているが、通常時の活動規範も含まれる点においては、家畜防疫では経営で論じられているリーダシップ理論の方が参考になると考えられた。防疫戦略の理論化を検討するため、限られた人的資源を用いて最も効果的に口蹄疫のまん延防止が可能となるような資源配分方法について簡単なモデルを用いて検討した。具体的には、牛を飼養する非感染農場周辺に5戸の感染農場(様々な規模の牛及び豚農場)があったと仮定し、これらの感染農場での殺処分の実施状況が、非感染農場への口蹄疫伝播確率に及ぼす影響を評価した。その結果、殺処分を実施する順番の選択によって非感染農場への伝播確率が変わらことが明らかとなった。これにより、口蹄疫のように動物種間で伝播確率が異なる疾病の場合、防疫戦略がまん延防止の効果に影響することが示唆された。本年度は、家畜疾病発生時の危機管理対応に有用な軍事学の学問領域を特定するため、関連資料の網羅的な調査・分析を行った。また、防疫理論検討の視座を明確にするため、口蹄疫等の防疫の実施主体となる各機関の役割を定義した上で、それぞれの役割毎に対応する軍事学上の理論を分析した。軍事学の学問体系では、軍事学が扱う社会科学領域を軍事力の建設・維持・育成、軍事力の運用、リーダーシップの3つに分類している。このうち、防疫の実行に相当する分野は、戦術・戦略など軍事力の運用に関わる分野であり、古典的な用兵学から近年の意思決定理論など様々な研究が蓄積されている。また、特殊環境下の集団行動を扱うリーダーシップも軍事学では特に重要視され、多くの指針や方法論が示されている。これらの分野を本研究の対象範囲として今後詳細な検討を行うこととした。軍事学上の戦略や戦術が対象とする戦域規模や内容を考慮して、防疫における国や地方自治体の各機関の役割を軍事学上の戦略・戦術の分類に当てはめた。これにより、それぞれを対比しながら分析することが可能となった。国は防疫方針として疾病対策の大枠の決定を行う。これは軍事学における軍事戦略に当たり、陸海空それぞれの分野で理論が発達している。これらの理論の直接的応用は困難であるが、方針決定過程を検証する際の参考になるものと考えられた。地方自治体が行う疾病対策の立案・実行は野外の変化する状況の中で適切に決定されなければならない。これは軍事学の作戦と戦術に相当し、いくつかの意思決定理論が考案されており、これらの理論は疾病対策に応用できる可能性があると考えられた。実際の危機管理対応事例として、2001年に英国で発生した口蹄疫の検証報告書を分析した。国と地方自治体がそれぞれの立場から多くがとりまとめられており、情報管理、マニュアルの整備、訓練不足など多くの危機管理上の問題が指摘されていた。これまでに考案した防疫戦略に影響を与える三要因(外的、中間的、内的)と防疫実施主体の戦略機能分類に基づいて、豚コレラ流行時の防疫について事例研究を実施した。その結果、この理論的枠組みによって防疫対策の評価や課題を明確にすることが可能であり、家畜防疫理論の基礎を提供できることが明らかとなった。

疾病発生時の防疫作業における人員配備について検討するため、過去の鳥インフルエンザ(AI)発生事例に関する資料を用いて、発生農場での防疫作業に必要な人員について分析した。さらに、都道府県毎の養鶏農家の飼養規模を考慮して、AI発生時に政府が目標とする72時間以内の鶏の処分を終了することが各都道府県職員のみできる確率について、モンテカルロシミュレーションを用いて推定した。過去のAI発生事例57戸の分析の結果、肉用鶏農場では規模が大きくなるほど一人当たりの殺処分数が増加し、15万羽規模の農場では一人当たりの処理羽数が200羽を超えていた。一方、採卵鶏農場では飼養規模が大きくなっても一人当たりの処理羽数は100羽前後で頭打ちになる傾向が見られた。農場規模と処理羽数の関係をあらわす最適曲線を求め、各都道府県の動員可能数を一般職員の10%としてシミュレーションを実施した結果、20の都道府県でAI発生時に72時間以内に処分を終了できない確率が5%を超えた。同時に2戸発生した場合には、この確率は30の都道府県で5%を超えた。対応できない場合の平均不足人数は358人となり、このような場合は多くの人的支援が必要となることが明らかとなった。北海道を除く地域を東北、関東、中部、近畿、中四国、九州6つのブロックに分けて対応した場合、5%の職員動員でも4戸の同時発生までどのブロックも95%の確率で対応可能と推定された。したがって、家畜伝染病発生時の対応をブロック単位で検討することも有用であると考えられた。獣医疫学口蹄疫、豚コレラなどの発生時の対策等に関する資料の分析を進め、防疫対策の決定に与える要因を類型化することができた。これにより、防疫対策を決定する上で考慮すべき事項の整理が可能となり、軍事学上の意思決定範囲の階層構造と併せることにより、家畜防疫上の意思決定理論構築の足がかりができたと考えている。また、モデルを用いて試行的に理論の妥当性を検証することができたことも、今後いくつかの理論仮説の検証作業を進める上で重要なステップとなった。過去の発生事例の分析において、口蹄疫については多くの検証報告があり、資料収集は容易であったが、鳥インフルエンザについては清浄国において発生・封じ込めを実施した危機管理事例の報告が少なく、十分な分析ができていない。このため、理論の一般化の過程において鳥インフルエンザの扱いをどのようにするかを今後検討する必要がある。なお、本研究で得られた防疫理論に関する情報や成果は都道府県の防疫担当者を集めた研修会や講習会で発表し、防疫活動の一助となるよう還元している。軍事学の対象領域は、自然科学や社会科学の広い範囲を含むため、まず最初に本研究で扱う分野を明確にすることが重要と考えられた。軍事関係の専門書や資料を広範囲に分析することにより、家畜疾病発生時の危機管理対応に応用可能な領域を特定することができた。また、家畜防疫の実施主体である国や都道府県の機関の役割分担を明確にし、それぞれに対応する戦略・戦術概念を特定し、区分して検討することにより、軍事学上の理論の応用の可能性を明らかにすることができた。実際の研究活動においては、防衛大学総合情報図書館を訪問して各種資料を調査するとともに、高病原性鳥インフルエンザが発生した島根県を訪問し、家畜疾病防疫を担当する家畜保健衛生所の職員から防疫に関する話を聞くことができた。英国の口蹄疫に関しては、4つの地方自治体からの検証報告書を入手するとともに、英国政府や独立機関が発表した多くの報告書を入手し、口蹄疫発生時の対応の問題点や改善点について、理解することができた。
ヘパトゾーンに対する免疫応答に関与する抗原蛋白の同定とワクチンへの応用

本年度の研究計画としては、ヘパトゾーンのSPF猫への実験感染および各発育ステージのヘパトゾーンの収集および抗原蛋白となり得る候補蛋白の探索と同定を行う予定であった。ヘパトゾーンはそのオーシストを含むマダニを動物が経口的に摂取することで感染が成立することが知られている。そこで、まずはヘパトゾーン陽性のマダニの採取および採取されたマダニ体内でヘパトゾーンの発育サイクルが宿主に感染可能なオーシストまで進んでいるかの確認を行った。本年度は日本産ヤマネコに寄生しているマダニを計32匹採取した。過去の報告を参照し、マダニ採取後の保存条件の検討を行い、保存中のマダニの生存率を向上させることを試みた。しかしながら、採取したマダニのそのほとんどが保存中に死亡し、ヘパトゾーンのSPF猫への実験感染を行うことはできなかった。また、死亡したマダニの押捺標本ではオーシストは確認されなかった。一方で、ヘパトゾーンと同じアピコンプレクサ原虫に属する原虫においてワクチンの候補蛋白としての有用性が示唆されているプロフィリンに着目し、ヘパトゾーンでも同様の蛋白の発現があるかの検討を行った。まず、ヘパトゾーン由来のプロフィリン遺伝子の増幅および遺伝子配列の決定を試みた。ヘパトゾーン陽性のヤマネコの血液からRNAを抽出し、それらをサンプルとしてRT-PCRを行った。ヘパトゾーンのゲノム遺伝子の全塩基配列はいずれの種においても不明であるため、他の原虫のプロフィリン遺伝子の配列を参考にプライマーを作成した。しかし、他の原虫で報告のあるプライマーを用いたPCRではヘパトゾーン由来のプロフィリン遺伝子は増幅されず、その後も複数種類のプライマーを作成したが、いずれにおいても遺伝子の増幅は確認されず、ヘパトゾーンにおけるプロフィリン蛋白の発現を検討するに至らなかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画としては、ヘパトゾーンのSPF猫への実験感染および各発育ステージのヘパトゾーンの収集ならびに抗原蛋白となり得る候補蛋白の探索と同定を行う予定であった。ヘパトゾーンはそのオーシストを含むマダニを動物が経口的に摂取することで感染が成立するため、実験感染にはヘパトゾーン陽性のマダニが必要である。そこで、ヘパトゾーンのSPF猫への実験感染を行う前に、まずは実験感染に必要なヘパトゾーン陽性のマダニの採取を行った。日本産ヤマネコに寄生しているマダニからはヘパトゾーン由来遺伝子が頻繁に検出されており、日本産ヤマネコに寄生しているマダニをヘパトゾーン陽性のマダニとして採取した。イリオモテヤマネコおよびツシマヤマネコからそれぞれマダニを7匹と25匹採取した。次にヤマネコ由来のマダニが保有しているヘパトゾーンが実際に猫に感染可能なオーシストまでマダニ体内で成熟しているかの確認を行った。マダニを採取後、マダニ体内でヘパトゾーンがオーシストまで成熟するために要する時間を考慮し、全てのマダニ検体を14°Cで採取後35日以上保存した。マダニを採取してから35日以上保存した後、マダニから血体腔液を採取し、マダニ体内でのヘパトゾーンのオーシストの確認を行うことを試みた。しかし、採取したマダニの多くは保存途中で死亡し、35日以上生存したマダニ検体はわずか7匹となった。死亡したマダニからは血体腔液を採取することが困難だったため、マダニをスライドガラスで押捺することで塗抹標本を作成し、顕微鏡的に観察したが、ヘパトゾーンのオーシストは観察されなかった。残りの生存しているマダニからは血体腔液を採取し、顕微鏡的に観察した。しかしながら、血体腔液中にはマダニ由来のプラズマトサイトは観察されたものの、ヘパトゾーンのオーシストは観察されなかった。本年度の研究計画としては、まずヘパトゾーンのSPF猫への実験感染および各発育ステージのヘパトゾーンの収集を行う予定であり、ヤマネコに寄生しているマダニをSPF猫に経口的に投与することでヘパトゾーンの実験感染を行う予定であった。しかし、前述の研究実績の概要の項目に記載した通り、実験感染を行う前にマダニの血体腔液内のヘパトゾーンのオーシストの確認を行うことができなかった。そのため、採取したマダニ体内で実際にヘパトゾーンが猫に感染可能なオーシストの状態まで成熟しているかの検証が不十分であり、SPF猫へのヘパトゾーンの実験感染およびそれに続く研究計画を実施することができなかった。また、犬へのヘパトゾーンの実験感染に関する過去の報告では、実験的にヘパトゾーンを感染させたマダニ30匹を犬に経口摂取させることで実験感染を行っているが、今回採取したマダニの大部分は死亡したため、マダニの検体数に関しても実験感染を行うには十分ではない状況である。そのため、動物実験計画書は作成したものの、実験感染に必要な材料が準備できていない状況にあり、計画書を作成した当初の予定よりも進歩状況としては遅れている。

本年度は日本産ヤマネコに寄生しているマダニを計32匹採取した。過去の報告を参照し、マダニ採取後の保存条件の検討を行い、保存中のマダニの生存率を向上させることを試みた。しかしながら、採取したマダニのそのほとんどが保存中に死亡し、ヘパトゾーンのSPF猫への実験感染を行うことはできなかった。また、死亡したマダニの押捺標本ではオーシストは確認されなかった。一方で、ヘパトゾーンと同じアピコンプレクサ原虫に属する原虫においてワクチンの候補蛋白としての有用性が示唆されているプロフィリンに着目し、ヘパトゾーンでも同様の蛋白の発現があるかの検討を行った。まず、ヘパトゾーン由来のプロフィリン遺伝子の増幅および遺伝子配列の決定を試みた。ヘパトゾーン陽性のヤマネコの血液からRNAを抽出し、それらをサンプルとしてRT-PCRを行った。ヘパトゾーンのゲノム遺伝子の全塩基配列はいずれの種においても不明であるため、他の原虫のプロフィリン遺伝子の配列を参考にプライマーを作成した。しかし、他の原虫で報告のあるプライマーを用いたPCRではヘパトゾーン由来のプロフィリン遺伝子は増幅されず、その後も複数種類のプライマーを作成したが、いずれにおいても遺伝子の増幅は確認されず、ヘパトゾーンにおけるプロフィリン蛋白の発現を検討するに至らなかった。現段階の問題としては、マダニの血体腔内でのヘパトゾーンのオーシストの確認が行えていないこと、マダニの検体数が少ないことおよび保存中のマダニが死亡してしまうことが挙げられる。そのため、今後は日本産ヤマネコに寄生しているマダニの収集を継続的に行うとともにマダニ採取後の保存条件の検討を行い、保存中のマダニの生存率を向上させることを考えている。また、今回血体腔液の観察が行うことができたマダニ検体数が少ないため、今後はマダニの生存率を向上させることで検体数を増やし、血体腔液中のヘパトゾーンのオーシストの確認を行い、確認ができた場合には実験感染に進む予定である。一方で、十分な数のマダニ検体が採取できない可能性やマダニの血体腔液からヘパトゾーンのオーシストが確認できない可能性を考慮し、他の原虫でワクチンの候補蛋白としての可能性が報告されている抗原蛋白に関して、ヘパトゾーンでも同様の蛋白の発現があるかを検討し、ヘパトゾーンワクチンの候補蛋白となり得るかの検討を並行して行う予定である。具体的には、まずヤマネコの血液材料およびヤマネコから採取したマダニからRNAを抽出し、ヘパトゾーン由来のRNAを得る。その後、他の原虫で報告されている抗原蛋白をコードする遺伝子の配列を参考にして、プライマーを設計後、ヘパトゾーンでも同様の遺伝子の発現があるかを検証する。遺伝子の発現が確認できた蛋白に関してをヘパトゾーンにおける抗原蛋白の候補とする。候補蛋白の組換え蛋白を作成後、電気泳動を行い、日本産ヤマネコを含めたヘパトゾーンPCR陽性ネコの血清を一次抗体として、ウエスタンブロッティング法を行い、顕微鏡的に寄生虫血症が認められない個体に特異的に検出されるバンドを抗原蛋白の候補とする。得られたバンドのアミノ酸配列をペプチドシークエンス法により決定し、解析を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
カルシトニン遺伝子関連ペプチドの炎症制御機構の解明と、眼内炎症疾患への応用展開

LPS硝子体内注射が過剰な炎症を惹起するため、足底注射による評価を試みた。足底注射では逆に軽微な炎症にとどまり、前房内炎症性細胞を認める個体は少なく、網膜血管の滲出性変化を認める個体は極めて稀であったため、LPS誘導ぶどう膜炎モデル以外での解析を検討した。糖尿病網膜症モデルマウスであるKimbaマウスにアドレノメデュリン(以下AM)を投与することで網膜血管の透過性亢進が抑制された。全身投与では網膜毛細血管脱落と異常血管形成も抑制された。網膜血管内皮細胞を用いた解析では、血管内皮増殖因子で誘導される炎症と透過性亢進がいずれもAMにより抑制された。AMの糖尿病網膜症における治療的効果が示された。リポポリサッカライド(以下LPS)の硝子体内注射を野生型マウスおよびヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド(以下CGRP)ノックアウトマウスに投与し、眼内の炎症の状況を観察した。LPSの硝子体内注射では、両群ともに顕著なぶどう膜炎所見を呈し、細隙灯顕微鏡による観察では結膜毛様充血と前房内炎症細胞を認めた。眼底観察では網膜血管の拡張と強い滲出性変化を認め、重症例では硝子体混濁を認め眼底観察が不能であった。蛍光眼底造影検査でも早期から顕著な蛍光漏出所見を認め、個体によっては早期から著名な蛍光漏出を認め評価が困難な状態だった。前眼部および後眼部所見や蛍光眼底造影所見に野生型マウスとノックアウトマウスでは明らかな差異はみられなかった。病理組織では、脈絡膜を中心に網膜内にも血管からの著名な白血球浸潤を認めた。LPS投与濃度を漸減し再実験を行ったが、やはり投与後数時間後から強い炎症所見を呈し、眼底が観察困難になり評価困難になる個体が低濃度でもみられた。LPSの硝子体内への投与では、眼内の炎症を過剰に誘導してしまい、眼内炎症の評価が不能になる固定がでてしまうこと、および野生型マウスとノックアウトマウスの表現型の差異もマスクされてしまうと考え、足底へのLPS投与による炎症誘導へ変更した。LPS皮下注射による炎症誘導では、結膜毛様充血と前房内炎症細胞、および網膜血管からの滲出性変化は軽度であったが、炎症の誘導には成功した。当初行った硝子体内注射による炎症誘導モデルでは野生型マウスとノックアウトマウスの群間に明らかな差異は認められず、また炎症が強く誘導されすぎたため、別途準備していた手法に変更した。また遺伝子ノックアウトマウスの実験対象週齢マウスの確保が途中困難となった期間があり、ノックアウトマウス群での実験が停滞した。リポポリサッカライド(以下LPS)の硝子体内注射による炎症誘導が過剰な炎症を惹起し評価が困難であったため、足底注射による炎症誘導による評価を試みた。足底注射では硝子体内注射とは逆に炎症の所見はごく軽微にとどまり、いずれの個体にも結膜毛様充血を軽度認めるものの、前房内の炎症性細胞を認める個体は少なく、眼底観察による網膜血管の滲出性変化を認める個体は極めて稀であった。LPS投与量を増量して再検を行っても全個体の網膜血管病変の誘導は得られなかったため、LPS誘導ぶどう膜炎モデル以外での解析を検討した。カルシトニン遺伝子関連ペプチド(以下CGRP)ノックアウトマウス(以下CGRP-/-)を用いた解析として、塞栓糸による中大脳動脈塞栓術を用いた急性脳虚血モデルによる解析では、レーザードップラーによる血流評価においてCGRP-/-は脳虚血後の再灌流遅延を認めた。病理所見では脳虚血後の神経細胞の減少とアポトーシスの亢進がCGRP-/-ではWTと比較し顕著であった。またCGRP-/-では脳虚血後の大脳皮質と海馬でのサイトカイン発現もWTに比べ亢進していた。これらの結果から、CGRPの虚血時における神経保護作用が示された。またCGRPのファミリーペプチドであるアドレノメデュリン(以下AM)とその受容体蛋白における解析では、網膜内で血管内皮増殖因子(以下VEGF)を発現することで網膜虚血と透過性亢進が誘導される、糖尿病網膜症モデルマウスであるKimbaマウスにAMを投与することで、全身投与と硝子体内投与いずれにおいても網膜血管の透過性亢進が抑制された。さらに全身投与では網膜毛細血管の脱落と異常血管形成も抑制された。網膜血管内皮細胞を用いた解析では、VEGF投与により誘導される炎症と透過性亢進がいずれもAM投与により抑制された。これらの結果からAMの糖尿病網膜症における治療的効果が示された。

LPS皮下投与による炎症誘導は硝子体内投与に比しかなり軽微であったため、投与するLPSの濃度による炎症の度合いを確認し、安定した眼内炎症が得られた後に野生型マウスとノックアウトマウスの差異の検討を開始する。ノックアウトマウスの個体数確保が難しい状況となった場合、実験計画に基づいて体外受精を大学動物実験施設に依頼し安定した個体確保を試みる。またカルシトニン遺伝子関連ペプチドでは特異的な眼内炎症に明らかな差異が確認されない場合、そのファミリーペプチドであるアドレノメデュリンとその受容体調節蛋白の遺伝子改変マウスを用いた検討を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
X染色体上のRFLPマーカーを用いた内分泌臓器結節性病変のclonality解析

1.パラフィンブロック組織からDNAを抽出し、HUMARA法を施行した。(1)固定時間が2448時間を超える組織から得られたDNAは断片化を来し、PCRによる増殖は不良であったが、固定条件が良好な組織を選択したところ、安定した増幅結果が得られた。約半数の症例がandrogen receptor遺伝子に関してヘテロであり、解析可能であった。(2)バセドウ病と腺種様甲状腺組織ではHpaII後も2本のバンドは消失せず、polyclonalな増殖と推定された。(3)予想に反して、典型的な甲状腺濾胞腺種ならびに濾胞腺癌もpolyclonal patternを示した。さらに甲状腺乳頭癌もpolyclonalと判定された。2.上記(3)の結果は、腫瘍組織の間質細胞DNAの干渉に起因すると推定し、Dynal社製Magnet-beads(BerEP4抗体結合)を用いて腫瘍組織からの癌細胞選択的採取を試みた。(1)組織消化条件を調節した結果、乳頭癌細胞は13個の、リンパ球やfibroblastなどの間質細胞は単個に分離でき、BerEP4-coated magnetbeadsにより、ほぼ上皮細胞のみからなる細胞集団を分取できた。しかし、組織消化時に使用する酵素(trypsin)によって正常甲状腺濾胞細胞のBerEP4抗原性が賦活化され、病変周囲の正常細胞も同時に回収されている可能性が指摘された。(2)腫瘍細胞以外に上皮細胞が存在しなし甲状腺濾胞癌の軟部組織への転移巣に対し、同手法を用いたところ、monoclonal patternが得られた。3.Magnet-beadsを用いた細胞分取法は標的細胞以外に上皮細胞が存在しない検体に有効であり、甲状腺内病変に対しては、古典的なmicrodissectionを用いるべきと思われた。1.パラフィンブロック組織からDNAを抽出し、X染色体androgen receptor(AR)遺伝子をPCRにて検出した。その知見は以下の通り。(1)固定時間が2448時間を越える組織から得られたDNAは断片化を来し、PCRによる増幅不良であった。(2)固定条件が良好な組織を選択し、さらに新たに入手した組織を24時間以内で固定したところ、安定した増幅結果が得られた。約半数の症例がAR遺伝子に関してヘテロであり、解析対象となった。(3)バセドウ病甲状腺組織ならびに腺腫様甲状腺組織ではHpaIIによる切断でも2本のバンドは消失せず、polyclonalな増殖と推定された。なお、ヒト子宮内膜癌培養細胞から抽出したDNAをHpaII処理の陽性対照としている。結果の判定には申請備品のフィルムスキャナーとコンピューターを用いた。(4)予想に反して、典型的な甲状腺濾胞腺腫ならびに濾胞腺癌もpolyclonalな増殖を示した。さらに、甲状腺乳頭腺癌もpolyclonalと判定された。2.上記(4)の結果は、腫瘍組織内の間質細胞DNAによる干渉に起因すると推定し、Dynal社製Magnet-beads(BerEP4抗体結合)を用いて、腫瘍組織からの癌細胞選択的採取を試みた。(1)組織消化条件(酵素の種類、時間、破砕方法など)を調節した結果、乳頭癌細胞は13個の、リンパ球やfibroblastなどの間質細胞は単個に分離でき、BerEP4-coated magnet-beadsにより、ほぼ癌細胞のみからなる細胞集団を分取できた。(2)この(癌)細胞集団のDNAを解析した結果、一方のバンドの減弱が認められ、monoclonalな細胞集団と判定できた。現在、この手法の安定性、再現性を確認中である。