hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファントムを用いた認知症早期・鑑別診断のための高精度脳体積計測システムの確立

本研究は「1.ファントム画像を用いた3次元T1強調画像の幾何歪み・信号むら同時補正手法の確立」、「2.ヒトを対象とした複数の静磁場強度(0.4ー7テスラ)のMR装置を用いた補正効果の実証」、「3.補正プログラムの開発とウェブ上での無償公開」を実施することによって、MRIを用いた高精度で再現性の高い脳体積解析のシステムを確立し、認知症を中心とした精神・神経疾患の早期・鑑別診断や縦断解析、今後の脳画像研究に大きく貢献する事を目的としている。本年度は計画通り1と3に関連したファントム解析・補正プログラムの改良や機能追加を行った。まず、解析結果のレポート出力機能を改良し、幾何歪みおよび信号むらの情報を画像化したものをtiff型式とpdf形式で出力できるようにした。この機能により、解析結果の確認が詳細かつ容易に行えるようになった。さらに、これまで画像の入出力は脳画像解析用の標準フォーマットであるNIfTI型式でのみ可能であったが、より簡便かつ実用的に画像補正が行えるように、医用画像の世界標準フォーマットであるDICOM型式での入出力部分を新たに開発し、日常的なワークフローの中で補正処理が行えるようにした。開発したプログラムを用いて0.4テスラ1台、1.5テスラ2台、3テスラ3台と7テスラ1台の計7台のMR装置を用いて幾何歪みと信号むら補正の有効性を検証する研究を行った。補正処理によって最大1.65mmあった幾何歪みを0.54mm以下に、最大2.89倍の画素値の上昇があった信号むらを1.37倍以下に低減させる事を示し、本成果を第27回日本脳ドック学会総会と第46回日本磁気共鳴医学会大会にて発表した。現在順調にファントム解析・補正プログラムの改良を進めており、今年度は解析結果のレポート出力機能の強化と画像入出力部分の機能追加を行った。レポート出力機能の強化については幾何歪みと信号むらの情報を分かりやすく3次元的に画像化したものをtiffおよびPDF型式で出力できるようにした。画像入出力部分の機能追加では、これまでは脳画像解析用標準フォーマットであるNIfTI型式でのみ入出力が可能であったが、新たに医用画像標準フォーマットであるDICOM型式での入出力部分を開発し追加した。これらの機能追加により、簡便に解析結果の確認が行え、また日常的なワークフローの中での補正処理が可能となった。開発したファントムの解析・補正プログラムを用いて、0.4テスラ1台、1.5テスラ2台、3テスラ3台と7テスラ1台の計7台のMR装置を使用してファントム画像を撮像し、幾何歪みと信号むら補正の有効性を検証した。最大1.65mmあった幾何歪みを0.54mm以下に、最大2.89倍の画素値の上昇があった信号むらを1.37倍以下に低減させる事を示し、この結果を第27回日本脳ドック学会総会と第46回日本磁気共鳴医学会大会にて発表した。2019年度は引き続きファントム解析・補正プログラムの改良・機能追加を進め、ファントム内部構造の自動検出手法の改良、サンプリング点間の補間関数、内部パラメータの最適化およびプログラム全体の高速化等を行う予定である。特に、ファントム内容液に気泡が入っている場合、磁化率アーチファクトにより画像上では磁場強度によるが気泡の数倍十数倍程度の広い範囲で強い信号値の低下が起こり、基準構造物の検出精度が下がる事が分かっているため、当該部位を自動的に認識させて補正処理にデータを使用しないなどの工夫が必要である。これらの改良、機能追加を行ったプログラムは2020年度のウェブ上での公開に向けてGUI型インターフェースを追加し、マニュアルの整備などを行う予定である。また、現在ファントム画像のみを用いて補正効果の検証を行っているが、2019年度中に倫理委員会を通してヒトを対象とした臨床研究を開始する予定である。当該研究ではボランティア15例、認知症疑い患者30例程度の組み入れを予定しており、補正前後の画像を用いてVoxel-based morphometryや自動ROI解析等の代表的な脳体積解析を行い、ファントムによるヒト画像の補正が脳体積定量値のばらつきを低減させる事を実証する予定である。

補正処理によって最大1.65mmあった幾何歪みを0.54mm以下に、最大2.89倍の画素値の上昇があった信号むらを1.37倍以下に低減させる事を示し、本成果を第27回日本脳ドック学会総会と第46回日本磁気共鳴医学会大会にて発表した。現在順調にファントム解析・補正プログラムの改良を進めており、今年度は解析結果のレポート出力機能の強化と画像入出力部分の機能追加を行った。レポート出力機能の強化については幾何歪みと信号むらの情報を分かりやすく3次元的に画像化したものをtiffおよびPDF型式で出力できるようにした。画像入出力部分の機能追加では、これまでは脳画像解析用標準フォーマットであるNIfTI型式でのみ入出力が可能であったが、新たに医用画像標準フォーマットであるDICOM型式での入出力部分を開発し追加した。これらの機能追加により、簡便に解析結果の確認が行え、また日常的なワークフローの中での補正処理が可能となった。開発したファントムの解析・補正プログラムを用いて、0.4テスラ1台、1.5テスラ2台、3テスラ3台と7テスラ1台の計7台のMR装置を使用してファントム画像を撮像し、幾何歪みと信号むら補正の有効性を検証した。最大1.65mmあった幾何歪みを0.54mm以下に、最大2.89倍の画素値の上昇があった信号むらを1.37倍以下に低減させる事を示し、この結果を第27回日本脳ドック学会総会と第46回日本磁気共鳴医学会大会にて発表した。2019年度は引き続きファントム解析・補正プログラムの改良・機能追加を進め、ファントム内部構造の自動検出手法の改良、サンプリング点間の補間関数、内部パラメータの最適化およびプログラム全体の高速化等を行う予定である。特に、ファントム内容液に気泡が入っている場合、磁化率アーチファクトにより画像上では磁場強度によるが気泡の数倍十数倍程度の広い範囲で強い信号値の低下が起こり、基準構造物の検出精度が下がる事が分かっているため、当該部位を自動的に認識させて補正処理にデータを使用しないなどの工夫が必要である。これらの改良、機能追加を行ったプログラムは2020年度のウェブ上での公開に向けてGUI型インターフェースを追加し、マニュアルの整備などを行う予定である。また、現在ファントム画像のみを用いて補正効果の検証を行っているが、2019年度中に倫理委員会を通してヒトを対象とした臨床研究を開始する予定である。当該研究ではボランティア15例、認知症疑い患者30例程度の組み入れを予定しており、補正前後の画像を用いてVoxel-based morphometryや自動ROI解析等の代表的な脳体積解析を行い、ファントムによるヒト画像の補正が脳体積定量値のばらつきを低減させる事を実証する予定である。新規購入予定だったファントムの品質改良を待ち、年度末に発注したため次年度分の精算となった。これに合わせて、ワークステーション等の購入時期も遅らせたため次年度へ持ち越しとなった。
パリティー非保存説による絶対らせん合成と機能

パリティー非保存説の妥当性を検証するため円二色分光法による測定解析を可能にする紫外・可視吸収発光性の高分子を用い、1.アキラル系→ホモキラル系、2.ラセミ系→ホモキラル系の構築を通じて、光学不活性な世界から光学活性な世界へ至るシナリオを描くことを目指した。シグマ共役ポリシランとパイ共役高分子を用い、良溶媒・貧溶媒を最適化して左右どちらかの光学活性高分子を発生した。リモネンキラリティー転写法、円偏光キラリティー転写法により発生させた光学活性π共役らせん高分子の発生に伴う円偏光吸収特性,旋光度分散、円偏光発光特性において左右の差異が認められ、パリティー非保存の可能性が示唆された。パリティー非保存性の弱い核力は中性子一電子間に働く弱中性電流(自発的なループ電流)として、すべての原子・分子・高分子の左右を区別するとされている。1980年代に、いくつかの原子蒸気から光学活性信号が検出され、原子の弱中性電流の存在が実証された。一方、不斉分子・らせん高分子も弱中性電流のため左右非対称との理論が1980年代より示されてきたが左右エネルギー差が微少であるため実験的検証が遅れていた。本研究は円偏光分光(吸収(CD)・発光(CPL)による精密測定解析を容易にするシグマ共役・パイ共役高分子を用い、(1)弱中性電流説に基づく左右の微小な偏りが普遍的に検出できることを実証し、(2)微少な偏りからホモキラルならせん高分子が希薄溶液・微粒子・薄膜として発生・増幅していくシナリオを描き、(3)それらの知見に基づき円偏光発光性を示すらせん高分子群を設計構築することにある。H22年度は、(R)/(S)-不斉側鎖基を有するらせん反転ポリシランを用い、希薄溶液、凝集体において、CD分光、NMR分光、粘度測定などを測定した。より、希薄溶液レベルで(R)/(S)で20%程度、凝集体レベルで30-40倍程度の違い、またC-NMR/Si-NMRなどで差異が認められた。パリティー非保存性の弱い核力は中性子-電子間に働く弱中性電流(自発的なループ電流)として、すべての原子・分子・高分子の左右を区別するとされている。本研究は円偏光分光による精密測定解析を容易にするシグマ共役・パイ共役高分子を用い、(1)弱中性電流説に基づく左右の微小な偏りを検出し、(2)微少な偏りからホモキラルならせん高分子が希薄溶液・微粒子・薄膜として発生・増幅していくシナリオを描き、(3)円偏光発光性を示すらせん高分子群を設計構築することにある。H23年度は、(R)/(S)-不斉側鎖基を有するポリフルオレンを用いて、希薄溶液と凝集体において、CD分光、NMR分光、粘度測定などを系統的に測定し、符号や強度などを比較した。パリティーが保存されていないという間接的なデータを得たところである。30-40種類の溶媒について振動円二色性を系統的に測定し、比較検討しているところである。さらに東京理科大学グループと共同研究で、ゾルゲル転移を起こすアキラル高分子中に微量ドープしたアキラル蛍光色素から撹拌渦による光学活性な発光現象の発生・反転・消失現象を見いだした。パリティー非保存説の妥当性を検証するため円二色分光法による測定解析を可能にする紫外・可視吸収発光性の高分子を用い、(1)弱中性電流に基づく左右のらせん構造の偏りが高分子系で検出可能であることを実証し、(2)微少な偏りからホモキラルならせん世界の発生・増幅へのシナリオを描き、(3)らせん発生の要因解明・機構解明を目指す。希薄溶液・微粒子分散溶液・薄膜を主たる研究対象とし、1.アキラル系→ホモキラル系、2.ラセミ系→ホモキラル系の構築を通じて、光学不活性な世界から光学活性な世界へ至るシナリオを描く。シグマ共役ポリシランとパイ共役高分子を用い、良溶媒・貧溶媒を最適化して左右どちらかの光学活性高分子を発生させる。リモネンキラリティー転写法、円偏光キラリティー転写法により発生させたいくつかの光学活性π共役らせん高分子の発生に伴う円偏光吸収特性,旋光度分散および円偏光発光特性において左右の差異が認められた。

その違いが、真にパリティー非保存にするのか、高分子、キラル溶媒、アキラル溶媒、あるいは何らかの不純物に起因しているのか不明である。より単純化した系を用いて検討を行った。その結果、パリティー非保存説の妥当性を示唆するいくつかの結果を得た。パリティー非保存説の妥当性を検証するため円二色分光法による測定解析を可能にする紫外・可視吸収発光性の高分子を用い、(1)弱中性電流に基づく左右のらせん構造の偏りが高分子系で検出可能であることを実証し、(2)微少な偏りからホモキラルならせん世界の発生・増幅へのシナリオを描き、(3)らせん発生の要因解明・機構解明を目指す。希薄溶液・微粒子分散溶液・薄膜を主たる研究対象とし、1.アキラル系→ホモキラル系、2.ラセミ系→ホモキラル系の構築を通じて、光学不活性な世界から光学活性な世界へ至るシナリオを描く。シグマ共役ポリシランとパイ共役高分子を用い、良溶媒・貧溶媒を最適化して左右どちらかの光学活性高分子を発生させる。リモネンキラリティー転写法、円偏光キラリティー転写法により発生させたいくつかの光学活性π共役らせん高分子の発生に伴う円偏光吸収特性,旋光度分散および円偏光発光特性において左右の差異が認められた。今後そこでより単純化した系を用いて検討を行う。当初アキラルボリシランやアキラルポリフルオレンを中心に円偏光信号の自発的発生を申請者自身および修士・博士学生数人とともに何度も確認してきた。しかしながら修論発表では公表したが学会発表などは控えて来た。その本質的な原因を探るため、アキラルポリシランやアキラルポリフルオレンに特異的であるのか否か明らかにするため、ポリマーを溶解させている(分光グレード/高純度グレードの)アキラル溶媒/キラル溶媒(約15種類)について、VCD分光器メーカーの技術者の協力を得ながらVCD測定を行っている。現在、アキラル構造にも関わらずVCD信号の出現を観測している。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後この知見をもとに、アキラル低分子(液体状態)をさらに40種類以上に増やしてVCD測定結果についての一般性を検討する。Gaussian計算結果と照らし合わせながら解析を進める。アキラル溶媒に溶かしたアキラルボリシランやアキラルポリフルオレンの振舞いについて詳細に検討する。VCD測定に関しては分光器メーカーの空き時間帯を利用し、厚意(無料)で測定して頂いている。高価だがVCD分光器(約1500万円)を導入し測定していきたい。左右の差異の違いが、真にパリティー非保存にするのか、高分子、キラル溶媒、アキラル溶媒、あるいは何らかの不純物に起因しているのか不明である。
近代日本における「世論」の歴史社会学-慰霊・顕彰施設を手がかりに-

研究課題「近代日本における『世論』の歴史社会学-慰霊・顕彰施設を手がかりに-」について、最終年度である今年度は主に成果発表をおこなった。まず、昨年度からフィールド調査していた沖縄県糸満市摩文仁の戦没者記念碑に関する知見を論文にまとめた(「慰霊・追悼の場と世論の力学-沖縄の『平和の礎』を事例として-」、『ソシオロジ』第155号、2006年2月)。この「平和の礎」は、敵味方の別を問わない無宗教の追悼施設として高く評価されており、靖国神社を論じる際には比較対照されることが多い。追悼施設と世論をめぐる問題全体を射程に入れることを意図して、沖縄の追悼施設が肯定的な評価を獲得できた背景と過程、そして記念碑が世論に果たす役割を考察した。また、昨年度に調査したオーストラリアの戦没者追悼式典と8月15日の靖国神社を比較した小文を寄稿した(「戦争の記憶と記念日の役割」(コラム:創発空間)、2005年8月22日『京都新聞』)。いずれアメリカやヨーロッパの事例もあわせて考察した文章も発表できるよう計画している。さらに、「近代日本における世論」の問題を、歴史を通じて明らかにするため、日露戦争をめぐる「輿論(よろん)」と「世論(せろん)」に関する長いものを執筆した。とりわけ世論操作の具体的事例として、日露戦争主戦論を導いた大学教授の言説と、それに呼応して行動した大衆運動との間に生じた奇妙なねじれに着目した。この論文は現在改稿中であるが、近いうちに書籍として刊行することを予定している。まずは「世論」という概念をより明確に定義するよう試みた。民主主義議会制度の正統性を基礎づける「よろん(輿論)」という概念と異なり、「国民感情」や「気分」にも似た「せろん(世論)」という概念は、学術的な研究の対象とはなってこなかった(「世論vs輿論」論文、「『世論』概念の生成」論文)。しかしながら、政治や社会の変動を理解するには、『せろん(世論)」的なものの検討こそが、重要であろう。そこで、慰霊・顕彰施設という具体的な対象をめぐる「世論」を理解するため、多様な領域からの文献収集に努めた。社会学や社会心理学からは「共通知識」や「儀式」に関する理論を、民俗学・人類学からは墓・葬制・記念をめぐる知見を、日本史や西洋史研究からは記念碑や戦没者祭祀の歴史的展開を、教育学や青少年向け社会科教育からは「戦争の記憶」に対峙する態度に関する言説を、新聞や雑誌からは一般的な政治論争における靖国神社・護国神社に対する批判的論調を、戦争体験記や回想記録や手記からは「英霊」や戦死者に対する姿勢や価値観を、研究してきた。また、広島・長崎や沖縄という、街全体で「反戦(平和祈念)碑」的な役割を果たしている現地へ実際に赴くことで、「戦争の記憶」の取り扱い方をめぐるフィールド調査を行った。どのようなものが・どこで・どのように、「記憶されるべきもの」として形を与えられているのか、戦争遺跡・モニュメント・資料館・生き証人による証言の保存運動などの実態を調査し、資料を収集すると同時に、関係する人々から聞き取り調査を行った。本研究の目的は、従来軽視されてきた「世論」の「神格性や魔力性」の解明を目的とし、抽象概念である「世論」を検討する手がかりとして、記念碑や慰霊・顕彰施設などの建造物、および記念イベントに着目する。これらは曖昧で漠然とした感情を、全体的な合意として可視化させ、人々に「共通知識」として共有されている事柄を確認させ、記憶させる装置だからである。それらが果たす機能と役割、およびその受容過程を詳細に検討することで、「世論」を創出・作動させる歴史的・文化的メカニズムを明らかにすることを目指す。そのため、前年に引き続き、民俗学・歴史学・政治学・社会心理学・社会学など、さまざまな領域の文献の収集・分析を行い、理論的枠組みの構築に努めた。同時に、本年は積極的にフィールドワークをおこなった。国内では、主に、理想的な追悼施設として扱われることの多い沖縄県の「平和の礎」を検討すべく、「慰霊の日」の追悼行事への参与観察・関係者への開き取り・公文書館や大学での資料収集などをおこなった。成果は現在、準備中である。また、比較の視点を取り入れるために、国外の戦争記念式典や慰霊施設を調査した。20世紀初頭の戦没者祭祀を保持するかのようなオーストラリアのアンザック記念日(4月25日)、およびアメリカ同時多発テロの追悼(9月11日)における式典および追悼施設を調査し、資料や文献の収集と聞き取りをおこなった。

また、昨年度に調査したオーストラリアの戦没者追悼式典と8月15日の靖国神社を比較した小文を寄稿した(「戦争の記憶と記念日の役割」(コラム:創発空間)、2005年8月22日『京都新聞』)。いずれアメリカやヨーロッパの事例もあわせて考察した文章も発表できるよう計画している。さらに、「近代日本における世論」の問題を、歴史を通じて明らかにするため、日露戦争をめぐる「輿論(よろん)」と「世論(せろん)」に関する長いものを執筆した。とりわけ世論操作の具体的事例として、日露戦争主戦論を導いた大学教授の言説と、それに呼応して行動した大衆運動との間に生じた奇妙なねじれに着目した。この論文は現在改稿中であるが、近いうちに書籍として刊行することを予定している。
胃癌予防のための中学・高校生ピロリ菌検診と除菌治療：実施方法の検討

(1)中学生ピロリ菌検診の適切な実施時期の検討。対象は篠山市で中学1年生で篠山市が実施するピロリ菌検診(尿中ピロリ菌抗体)を実施した対象について、3年生でも抗体検査を実施した986名である。尿中ピロリ菌抗体測定はウリネリザH. pylori抗体を用いた。結果:906名は中学1年、3年ともに持続陰性、40名は持続陽性であった。12名は1年生陰性であったが、3年生で陽性となった(陽転者)。一方、28名は陽性から陰性(陰転者)になった。このうち3名は除菌治療を受けていた。持続陽性のうち18名が精密検査(尿素呼気試験:UBT)を受け、10名は陽性であったが、8名は陰性で尿中抗体検査が偽陽性と判定した。陽転した12名のうち、6名はUBTを実施したが、全員陰性であり、感染は確認できなかった。尿中抗体検査はピロリ菌感染検査として簡便であるが、偽陽性が多く、陽性的中率が低いことが問題であった。今回の研究では中学生の間では新たな感染は認めず、検診時期として中学生ではどの時期でも良いことが示唆された。(2)便を用いた、クラリスロマイシン(CAM)耐性遺伝子の検出:研究途中であり、対象は少ないが、5名の便からH. pylori DNAが抽出でき、3名で変異があった。内視鏡検査を実施した2名では培養も実施しており、培養結果との相関も検討していく予定である。(3)ピロリ菌検診について、保護者はどのような感想を持っているのか、篠山市において無記名アンケート調査を行った。対象は中学3年生286名と尿中ピロリ抗体陽性結果で精検対象となった117名の保護者である。アンケート調査用紙を郵送し、それぞれ、108名、31名から回答を得た。中学3年生では93%、精検対象者では97%が『ピロリ菌検診を受けて良かった』と回答した。最終的にピロリ菌感染と診断された15名は全員が『検診を受けて良かった』と回答した。中学生986名について、2年間隔の抗体検査を実施しえた。便中のクラリスロマイシン耐性は内視鏡症例が少なく、解析が十分できていない。研究途中で、必要性があったため、中学生ピロリ菌検診を受けた対象の保護者に対して、感想調査を実施した。中学生におけるピロリ菌抗体検査の変化については、精密検査症例を増やして、論文作成予定である。クラリス耐性については、症例を集積していく。感想調査については、日本ヘリコバクター学会や日本公衆衛生学会で発表予定である。適切なピロリ菌検診時期を検討:ピロリ菌が胃癌の原因となっていることが明らかとなり、WHO/IARCは胃癌対策として感染検査と陽性者に対する除菌治療による対策を行うよう勧告した。兵庫県篠山市では市のピロリ菌・胃癌対策としてピロリ菌検診を中学1年生で実施している。しかし、この実施時期が適切であるかどうか、中学3年生までに新たに感染することはないのか。適切な検診時期を検討することを目的とした。中学1年生時(平成27年)に篠山市のピロリ菌検診を受診した361名を対象に中学3年生(平成29年)で抗体結果の変化を検討した。抗体測定は1年時と同じ、ウリネリザHピロリを用いた。361名のうち、検診に参加したのは351名(受診率97.2%)であった。ピロリ菌抗体陽性者は16名(陽性率4.6%)であった。1年生、3年生ともに陰性は317名、陽性から陰性となったのは18名であった。(除菌治療が実施されているものが含まれている)陽性持続は15名、陽転は1名であった。)では感度97.6%、特異度96.5%であったが、陰性者が多いため、PPVが61.2%で偽陽性が多くなるという結果であり、陽転者では尿素呼気試験などの他の方法を用いることが必要であると考えられた。しかし、新たな陽性は極めて少なく、検診の時期として中学生であれば大差がないと考えられた。平成30年度も同様の検討を行う予定である。1年目、予定通りの中学生ピロリ菌検診追跡調査ができた。現在、副作用調査や除菌治療後の再感染についても検討を準備中である。

尿中抗体検査はピロリ菌感染検査として簡便であるが、偽陽性が多く、陽性的中率が低いことが問題であった。今回の研究では中学生の間では新たな感染は認めず、検診時期として中学生ではどの時期でも良いことが示唆された。(2)便を用いた、クラリスロマイシン(CAM)耐性遺伝子の検出:研究途中であり、対象は少ないが、5名の便からH. pylori DNAが抽出でき、3名で変異があった。内視鏡検査を実施した2名では培養も実施しており、培養結果との相関も検討していく予定である。(3)ピロリ菌検診について、保護者はどのような感想を持っているのか、篠山市において無記名アンケート調査を行った。対象は中学3年生286名と尿中ピロリ抗体陽性結果で精検対象となった117名の保護者である。アンケート調査用紙を郵送し、それぞれ、108名、31名から回答を得た。中学3年生では93%、精検対象者では97%が『ピロリ菌検診を受けて良かった』と回答した。最終的にピロリ菌感染と診断された15名は全員が『検診を受けて良かった』と回答した。中学生986名について、2年間隔の抗体検査を実施しえた。便中のクラリスロマイシン耐性は内視鏡症例が少なく、解析が十分できていない。研究途中で、必要性があったため、中学生ピロリ菌検診を受けた対象の保護者に対して、感想調査を実施した。平成30年度も1年生で中学生ピロリ菌検診を実施している対象について3年生でも検診を実施する。また、副作用調査や便を用いたピロリ菌の薬剤耐性検査の研究計画も順調に進行中であり、平成30年度には方向性がつかめるものと考えている。中学生におけるピロリ菌抗体検査の変化については、精密検査症例を増やして、論文作成予定である。クラリス耐性については、症例を集積していく。感想調査については、日本ヘリコバクター学会や日本公衆衛生学会で発表予定である。人件費が予定より少なかった。データ入力などを委託しなかったため。データ入力のための人件費が少なかったこと、便サンプルの収集が少なかったことが主な使用学が異なる理由と考える。
発散形式解の数論的代数的研究

発散形式解の理論を構成し、数論と関係する超越的現象や,トーラス上の作用素の滑らかさに関して,数論的現象を明らかにした。さらに、KAM理論特に、ハミルトンベクトル場の標準形への帰着と数論的現象の関係を調べた。具体的には次の結果が得られた。今後の展開についてはToeplitz作用素の理論を非線型方程式にまで広げ,ベクトル場の標準形と数論的な現象の関係を調べることはイタリア、イギリスのグループとの共同研究中である。1.常微分方程式系の解析関数の族あるいは形式的Gevrey空間における指数公式をToeplitz symbolの積分を用いて与えた。証明はすでに知られている結果の証明とは本質的に異なる別証明になっている。2.Kashiwara-Kawai-Sjostrandの研究した確定型の作用素に対するすべての形式解が収束するための十分条件に対応して、これよりも収束を考える点での退化次数と微分の関係を弱めたクラスの作用素にたいし、Toeplitz symbolを用いて、Fredholm性の必要十分条件を与えた。これはすべての形式解が収束するための必要あるいは十分条件を与える。3.退化放物型作用素はanalytic hypoellipticでなく、またC^∞hypoellipticであったり、なかったりする。この時、hypoellipticとなる丁度境目のGevrey指数(=critical Gevrey index)を決定した。Newton図形と漸近解の方法およびparametrixのwave front setを評価することにより結果が得られる。4.可換なベクトル場の系にたいし、それらが同時に座標変換によって標準形になるための十分条件をhighloss derivativesの陰関数定理を証明することによってあたえた。また、可換なdiffeomorphismsの系にたいし、それらが同時に座標変換によって標準形になるための十分条件をhomology方程式をとくことによって与えた。5.トーラス上の偏微分作用素の大域的準楕円性あるいは可解性の必要十分条件をWKB解析を用いて与えた。small denominatorの問題あるいは領域の各点で楕円型、双曲型などのように方程式の型が変化する作用素の大域的準楕円性を記述できる。今年度は発散形式解の決定可能性、その収束およびその持つ意味について次の3つの観点から研究を行なった。1.Riemann-Hilbert分解との関連2.WKB解析との関連3.small denominatorとの関連。第1番目の点に関しては多変数フックス型、あるいは不確定型の作用素の形式解を決定するにあたり、それが可能になるための必要十分条件を幾何学的に与えるという点に目的をおいた。これは以前の結果を簡略化するばかりでなく非線型の問題への応用が可能になる。たとえばMonge-Ampere方程式で曲率の符号が変化する場合の可解性に応用できる。このような研究は来年度以降の課題として継続して研究する予定である。第2番目の観点は特にWKB解析にその重点をおいた。ここでの目的は発散する形式解が持つ不変量をとりだすことにある。その手続きを与え、そのような不変量を記述するのが、目的である。今までのところ、大域的準楕円性を形式解(WKB解)から、取り出すことに成功した。このような研究はまだはじまったばかりであるので、さらにいろいろな可能性について研究を進めたい。第3番目の点は天体力学などで指摘されているように発散形式解のあらわれる原因となっているsmall denominatorを評価の立場でなくその幾何学的な現象をとらえることにある。

これに関してはまだ論文を準備中であり、今後も引き続いて研究を行なう予定である。これ以外にも、関連したいくつかの研究を行なったが、これに関しては参考文献を参照願いたい。また補助金の使用状況とその成果については補助金のおよそ半分は研究の為の旅費として支出した。これは研究討論、成果の公表、情報の収集に役立った。残りのうち半額は図書の購入にあてた。これは直接入手できない広い範囲からの情報の収集に役立った。残りは研究結果の公表のための印刷費、関連した器機、消耗品の購入にあてた。1常微分方程式系の解析関数の族あるいは形式的Gevrey空間における指数公式をToeplitz sympolの積分を用いて与えた。証明はすでに知られている結果の証明とは本質的に異なる別証明になっている。2 Kashiwara-Kawai-Sjostrandの研究した確定型の作用素に対するすべての形式解が収束するための十分条件に対応して、これよりも収束を考える点での退化次数と微分の関係を弱めたクラスの作用素にたいし、Toeplitz symbolを用いて、すべての形式解が収束するための十分条件を与えた。3 Kashiwara-Kawai-Sjostrandの研究した確定型の作用素に対して、すべての形式解が収束するための必要十分条件を与えたKashiwara-Kawai-Sjostrandの研究した確定型の作用素に対し、すべての形式解が収束するための必要十分条件を与えた。この条件と方法はいずれもToeplitz作用素の方法を用いて行われる。4退化放物型作用素はanalytic hypoellipticでなく、またC^∞hypoellipticであったり、なかったりする。この時、hypoellipticとなる丁度境目のGevrey指数(=critical Gevrey index)を決定した。Newton図形と漸近解の方法およびparametrixのwave front setを評価することにより結果が得られる。5可換なベクトル場の系にたいし、それらが同時に座標変換によって標準形になるための十分条件をあたえた。これは、high loss derivativesの陰関数定理を証明することによって行われる。6可換なdiffeomorphismsの系にたいし、それらが同時に座標変換によって標準形になるための十分条件を与えた。homology方程式をとくことによってこれは証明される。トーラス上の偏微分作用素の大域的準楕円性あるいは可解性の必要十分条件をWKB解析を用いて与えた。small denominatorの問題あるいは領域の各点で楕円型、双曲型などのように方程式の型が変化する作用素の大域的準楕円性を記述できる。
核内シグナル分子によるT細胞分化の制御機構

本研究では、免疫系の司令塔であるT細胞の分化を制御する動作原理の解明を目的とし、T細胞の分化に重要な役割を担う新規分子Themisの機能解析を行った。ThemisはT細胞の核内でアダプター分子Grb2と結合し、核内Grb2量を制御すること、およびThemisの核移行とGrb2結合はT細胞分化制御に必須であることがわかった。一方で、Themisの核移行は末梢T細胞のサイトカイン産生には必要ではなく、Themisが胸腺と末梢で異なる機能を担うことが示された。また、Themis分子内に存在する2つのCABITドメインはそれぞれ異なる様式でT細胞分化制御に機能することが明らかになった。T細胞は獲得免疫システムの司令塔であり、その分化のしくみと機能の解明は免疫学における重要課題のひとつであるが、未熟T細胞(胸腺細胞)が抗原受容体(TCR)の抗原認識に従って正負の選択を受ける分子メカニズムの全容は未だ不明である。本研究では、胸腺細胞の正の選択を制御する動作原理の解明を目的とし、TCRシグナル下流で作用すると考えられる新規分子Themisの機能解析を行った。正の選択を受ける前のCD4+CD8+ (DP)胸腺細胞においてThemisは核内でアダプター分子Grb2と結合しており、Themis欠損DP胸腺細胞では核内Grb2タンパク量が著しく減少することがわかった。また、Grb2はRNA結合タンパク質であるhnRNPCと相互作用することがわかった。他のhnRNP分子や特定のRNAと結合する可能性についても現在検討中である。また、胸腺細胞の核内におけるGrb2の局在と相互作用タンパク質同定のため、FLAGエピトープタグを付加したGrb2ノックインマウスを、CRISPR/Cas9法を用いて作製中である。Themisの核内機能を明らかにするため、核移行シグナル(NLS)の欠失変異体を発現するトランスジェニックマウスを作製した。NLS欠失変異体は核局在を失うとともに、Grb2との結合能およびTCRシグナルによるチロシンリン酸化能を失い、胸腺細胞の正の選択を誘導できないことがわかった。また、Themisは末梢T細胞によるIL-2産生に必須であるが、NLS欠失変異T細胞は正常なIL-2産生を示した。以上の結果より、Themisの核局在は胸腺細胞の正の選択に重要な役割を果たすが、末梢T細胞のIL-2産生には関与しないことが示され、Themisが胸腺と末梢で全く異なる機能を担うことが示唆された。本研究では、T細胞分化を制御する動作原理の解明を目的とし、TCRシグナル下流で作用すると考えられる新規分子Themisの機能解析を行う。初年度の研究から、Themisは末梢T細胞によるIL-2産生に必須であること、Themisの核局在は胸腺細胞の正の選択に重要な役割を果たすが、末梢T細胞のIL-2産生には関与しないことが示され、Themisが胸腺と末梢で全く異なる機能を担うことが示唆された。Themis欠損マウスにおける非典型的T細胞分化について詳しく調べたところ、制御性T細胞の分化が有意に低下していた。一方、Themis過剰発現マウスでは制御性T細胞の分化と転写因子Foxp3の発現が増加していた。初年度に作成したThemis変異マウスの解析から、ThemisはAktおよびTGFbシグナル経路を介してFoxp3の発現を正に制御すること、その制御にはThemisのPRSおよびNLSが重要であることが明らかとなった。また、Themisがinositol 5'-phosphataseであるSHIP1と結合することを見出した。SHIP1 inhibitor (3AC)を用いてSHIP1の活性を阻害すると、Themisによって亢進するAktのリン酸化、Foxp3の発現、制御性T細胞の分化が抑制された。以上の結果より、ThemisはSHIP1と結合し、Aktシグナルを介して制御性T細胞の分化を促進することが示唆された。一方で、核内に存在するThemis-Grb2複合体については、hnRNP Cをはじめとするいくつかのタンパク質との結合が明らかになったものの、その意義は不明であり、機能解析は難航している。Themisと他のタンパク質との分子間相互作用の機序を理解するため、Themisの大量発現および精製系を確立し、X線構造解析に向けた結晶化を進めている。本研究では、T細胞分化を制御する分子機構の解明を目的とし、TCR下流のシグナル制御を担うと考えられる新規分子Themisの機能解析を行った。初年度の研究から、ThemisはCD4+CD8+(DP)胸腺細胞の細胞質内および核内でアダプター分子Grb2と結合しており、Themis欠損DP胸腺細胞では核内Grb2タンパク量が著しく減少することがわかった。また、Themisの核移行シグナル(NLS)を欠失させたマウスでは、Themisの核局在およびGrb2との結合が失われ、T細胞の正の選択が阻害されていた。一方で、Themisによる末梢T細胞のIL-2産生においては、NLS依存的なThemisの核移行は必要ないことがわかり、Themisが胸腺と末梢で全く異なる機能を担うことが示唆された。これらの結果を含む一連の成果を論文にまとめ発表した。二年度目には、Themis欠損マウスにおいて制御性T細胞の分化が有意に低下することを見出した。

初年度に作成したThemis変異マウスの解析から、ThemisはAktおよびTGFbシグナル経路を介してFoxp3の発現を正に制御し、その制御にはThemisのPRSおよびNLSが重要であることが明らかとなった。最終年度には、プロテオミクス解析によって相互作用タンパク質の探索を行い、TCRの構成分子であるCD3zeta、およびミトコンドリアに局在する新規タンパク質がThemisと相互作用することを新たに見出した。また、培養細胞を用いた解析から、これらの相互作用にはTCRシグナルが必要であることが示唆された。現在、これらのタンパク質の動態とT細胞分化における機能について解析を進めており、Themisの本質的な役割を解明しようと試みている。本研究では、免疫系の司令塔であるT細胞の分化を制御する動作原理の解明を目的とし、T細胞の分化に重要な役割を担う新規分子Themisの機能解析を行った。ThemisはT細胞の核内でアダプター分子Grb2と結合し、核内Grb2量を制御すること、およびThemisの核移行とGrb2結合はT細胞分化制御に必須であることがわかった。一方で、Themisの核移行は末梢T細胞のサイトカイン産生には必要ではなく、Themisが胸腺と末梢で異なる機能を担うことが示された。また、Themis分子内に存在する2つのCABITドメインはそれぞれ異なる様式でT細胞分化制御に機能することが明らかになった。Themis-Grb2複合体の機能解明を目的としたThemis-NESマウスやGrb2-FLAGマウスの作製が難航し、当初の想定通りの成果を得ることができなかった。一方で、Themisの制御性T細胞分化における役割について、新たな発見と進展があった。Themisが結合する分子としてSHIP1を新たに見出したほか、SHIP1がGrb2と構成的に結合することや、ThemisとSHIP1の結合がGrb2により阻害されることを示す予備実験結果を得ている。特に、Themis-SHIP1によるAktシグナルを介した制御性T細胞の分化促進経路が明らかになったことは大きな進展であり、現在論文発表の準備を進めている。また、SHIP1-Grb2-Dok1/2分子間相互作用が正の選択に関与するとの報告もあり、今後はThemisがどのように関与するのか研究を進める予定である。免疫学Themis-Grb2複合体と相互作用する分子の同定については、二年度目に予定していたゲノム編集法によるGrb2-FLAGマウスの作出が困難であることがわかった。本目的のためには、T細胞株へのウイルスベクターを用いた遺伝子導入によって対応するほか、Themisの分子構造を理解するためX線構造解析に向けた結晶化を進めている。しかしながら、核内Themis-Grb2複合体のT細胞選択における機能を解明するには、現在の技術と研究資源では困難であると考えられる。そのため、研究計画の一部を変更し、下記の通り、Themisによる制御性T細胞の分化制御に軸足を置いた研究を進める。二年度目の大きな進展として、Themisと相互作用する分子としてSHIP1を新たに同定し、Themis-SHIP1相互作用が制御性T細胞分化に重要であることを見出した。
葉面細菌における光応答の役割と制御機構の解明

強い太陽光を浴びる植物葉上で生息する細菌(葉面細菌)の生理生態について明らかにするため、光照射下で培養した細菌の解析を行った。自然環境中の植物葉を対象にスクリーニングを行い、光に応答して黄色色素を生産する細菌を見つけた。代表的な葉面細菌であるMethylobacterium属においては、光受容体を介してストレス防御や植物定着の能力を調節していることが分かった。本属細菌はまた、ロドプシンを使って光を生体エネルギーに変換し、生育生存のために利用できる可能性が示唆された。微生物の生息場所の中で、植物葉上は特に強い光を受ける環境である。太陽光に由来する熱や紫外線は害ともなるため微生物はそれらへの対処が必要である一方、微生物は光をシグナルとして感知して環境の変化に巧妙に適応していることも予想される。本研究では、葉面細菌の生態や生存戦略についての知見を深めるため、「光に対して葉面細菌はどのように応答をするのか」明らかにする。本年度は下記2項目を研究した。(1)自然環境中の葉面細菌が持つ光応答性の表現型の調査自然環境中の葉から細菌を分離し、それらを明所と暗所に置いた寒天培地上で培養して、目に見えて異なる表現型を示す菌を探した。その結果、試験した80株より1株の光応答性の表現型を示す菌が見つかった。本菌は、Massilia属に属し、光照射により黄色色素の生産が誘導された。(2)Methylobacterium属細菌における光応答機構の解析本菌は、種々の植物葉に生息する代表的な葉面細菌であり、遺伝子操作技術も開発されていることから、光応答機構を分子レベルで解析するための対象とした。まず、光照射下で様々な培養試験を行った結果、光照射がM. extorquensの生育、UV耐性、熱耐性、バイオフィルム形成に正または負の影響を与えることが判明した。本菌のゲノム中には、推定の光センサー遺伝子(LOV、BLUF、PYP、Phytochrome)が合計11個ある。いずれの遺伝子が、UV耐性などの形質を光依存的に制御しているか調べるため、まず4遺伝子の破壊株を作成した。現在、遺伝子破壊株の表現型を解析中であるが、いくつかの破壊株で植物上での生育(植物定着能)の低下が認められ、本菌が持つ光応答システムが植物上で正に働いていることが示唆されている。自然環境中の植物葉から回収した細菌を対象にスクリーニングを行い、光応答性の表現型を持つ細菌を取得することができた。構築したスクリーニング実験系の有効性が確認でき、引き続いて行うことで新たな菌の取得が期待できる。光応答制御機構の研究においては、M. extorquensが持つ光応答性の形質を複数明らかにすることができた。光センサー遺伝子の破壊株の作成も順調に進んでいる。今後、作製した遺伝子破壊株の表現型解析や、光センサータンパク質の特性解析を行うことで、本菌の光応答制御機構を明らかにしていくことができる。本研究では、微生物の生息環境の中でもとりわけ光を受けると考えられる「植物葉上」に生息する細菌に注目し、それら葉面細菌が持つ光応答性の表現型ならびに光応答の役割について調べた。【1.光応答の表現型を示す葉面細菌の探索と解析】平成27年度に引き続いて探索を行った。自然環境中の葉から細菌を分離し、それらを明所と暗所に置いた寒天培地上で培養して、目に見えて異なる表現型を示すものを探した。試験した300株から1株の光応答性の表現型を示す細菌(ST22株)が見つかった。本菌は、Telluria属に属し、光照射により黄色色素の生産が誘導された。次に、葉上での生育に必要なUV耐性やROS耐性が光照射下で上昇するか調べた。ST22株の過酸化水素耐性は明所と暗所で差が無かったが、UV耐性は明所で上昇することが判明した。【2.光応答機構の解析】これまでに、光照射がMethylobacterium extorquensの生育、UV耐性、熱耐性、バイオフィルム形成、色素生産に影響を与えることを明らかにしてきた。続いて、本菌のゲノムに存在する11個の推定光受容体のうち、いずれがこれら光応答性の表現型を制御しているか解析した。各光受容体の遺伝子破壊株を作製して、UV耐性を評価した結果、LOVに関連する3種の遺伝子破壊株が光照射下でも耐性を変えないことが分かった。【3.ロドプシンの機能解析】葉面細菌が持つロドプシンの機能や役割を知るため、Methylobacterium aquaticumが有するロドプシンの機能を解析した。本菌のロドプシン遺伝子は、明所培養時には暗所培養時よりも多く転写されていた。また、菌懸濁液に光を照射したところ、溶液のpH減少が認められ、本菌のロドプシンはプロトンポンプとして働くことが示唆された。主に下記の3研究を並行して進めていく。

(1)自然環境中から光応答性の表現型を持つ葉面細菌のスクリーニングを引き続き行い、新規な光応答性細菌を取得する。見つけた光応答性の表現型については、葉上での発現・役割を調べる。(2)M. extorquensの光センサー遺伝子破壊株の表現型を解析し、光応答性の表現型に関与する光センサーを同定する。光センサータンパク質の発現を行い、その光吸収特性や相互作用するタンパク質・DNAを解析する。(3)葉面での光エネルギー利用に関する知見を得るため、Methylobacterium属細菌が持つロドプシン遺伝子の発現あるいは破壊を行い、in vitro及び植物上でのロドプシンの機能を解析する。応用微生物学、環境微生物学計画通りに予算を使用できている特段の残額ではない
縮小する行政‐政策・組織廃止の質的比較分析‐

本研究では、政策廃止がどのような場合に行われるかを明らかにした。日本の都道府県におけるダム事業、自治体病院、土地開発公社を対象として、全都道府県に対するアンケート調査をもとにした質的比較分析を行った。分析の結果、政策廃止の前決定過程では政治状況や政策の性質が影響し、廃止の決定過程では科学的な政策知識に裏付けられた政策の必要性の有無を示す主張を提示することができるかが影響することが明らかとなった。こうして本研究では、先行研究で明らかとなっていなかった前決定過程を含めて政策廃止の過程を包括的に明らかにした。本研究の目的は、政策や組織の廃止がどのような場合に行われるかを明らかにすることにある。日本は、中央政府と地方政府であわせて一千兆円を超える長期債務を抱えている。膨れ上がった債務を減少させるため、歳入の増加とともに既存の政策や組織の廃止という形で政府が提供していた公共サービスを縮小させる動きがあるが、廃止がどのような場合に行われているかについては十分に明らかにされていない。本研究では、地方自治体において政策・組織廃止がどのような場合に行われているかを、ダム事業、自治体病院事業、土地開発公社を対象とした質的比較分析により包括的に明らかにする。本年度は質的比較分析を行うために、予備調査と他の資料等から入手した政治要因や社会経済要因等を組み合わせたデータセットを作成した。予備調査とは、2014年8月から2015年5月にかけて、全都道府県のダム事業・自治体病院事業・土地開発公社所管部署に対して実施したアンケート調査である。調査対象となったのは平成21年度時点で存在していた事業・組織であり、ダムは79事業、病院は184事業、公社は43公社となる。これらの事業・組織を所管するあわせて119の都道府県部署に調査票を送付し、102部署から回答を受けた。このアンケート調査では、廃止の有無、廃止案が議題にあがったかどうか、あがった場合にはどのアクターが議題にあげたのか、検討過程において廃止を主張するアクターと存続を主張するアクターが政策知識を示していたかといった自治体内部における検討過程を事業・組織ごとに質問している。これらの予備調査と他の資料等から入手した政治要因や社会経済要因等を組み合わせたデータセットを作成することにより、質的比較分析の準備を行った。当初の計画通りにデータセットの作成を終えたため。これにより、次年度以降に行う質的比較分析の準備が整った。前年度までに作成したデータセットの分析を行った。分析手法として用いた質的比較分析では、廃止という現象をもたらす原因条件の組み合わせを表し、どのような場合に廃止という現象が議題に上がり、決定するかを示す。基本的な質的比較分析のやり方としては、原因条件と廃止の有無が存在するか否かについて1か0の2値を与え、真理表にまとめる。そして、原因条件の組み合わせをブール代数式で表し、どのような場合に廃止という現象が生じるかを示す。本研究では日本の都道府県の土地開発公社、自治体病院事業、ダム事業を分析対象として設定した。これらの3つの事業・組織は、異なる首長と議会議員の政策選好の組み合わせであるため、分析対象とした。分析に際しては、先行研究の検討により、原因条件として、政策の性質、政治状況、政策の存在理由の有無の提示を想定した。これらの原因条件は基本的に2値化したが、2値化が難しいものについてはファジィ集合を用いて、0から1の間の実数とした。そして、どのような原因条件の組み合わせの場合に、廃止が議題に上がり、廃止が決定されるかをfs/QCAというソフトウェアを用いて分析した。分析の結果、廃止の前決定過程では、政治状況や政策の性質が十分条件となり影響を及ぼすが、決定過程では廃止を進める側が政策の存在理由がなくなっていることを提示したり、存続を主張する側が政策の存在理由がまだあることを提示したりすることが十分条件となり、重要となることがわかった。当初の計画通り、分析を終えることができたため。本研究の目的は、政策や組織の廃止がどのような場合に行われるかを明らかにすることにあった。日本は、中央政府と地方政府であわせて一千兆円を超える長期債務を抱えるとともに、今後は人口減少・少子高齢化により歳入が漸減していくことが予想される。厳しい財政状況を背景として、政策廃止が徐々に起き始めているが、廃止がどのような場合に行われているかについては十分に明らかにされていなかった。本研究では、地方自治体において政策廃止がどのような場合に行われているかを、質的比較分析により包括的に明らかにした。具体的には、廃止がどのようにして議題に上がり、決定されるかを明らかにするために、日本の都道府県におけるダム事業、自治体病院、土地開発公社を対象として、全都道府県に対するアンケート調査をもとにした質的比較分析を行った。ダム事業、自治体病院、土地開発公社の廃止に際しては、首長や議会が廃止に対して異なる態度をとる。様々なアクター間関係における政策廃止を分析するために、住民にとってその廃止が不利益とならない政策も含めた3つの対象を選択した。廃止がしやすい政治状況や政策の性質であるほど、廃止案が議題に上がりやすい。

例えば、自治体病院は住民が廃止に否定的であるため、土地開発公社やダム事業と比べると、廃止が議題に上がりにくい政策であった。そして、決定過程では、前決定過程における要因に加えて、政策の必要性の有無を示す主張を提示することができるかが帰結を左右していた。こうして本研究では、先行研究で明らかとなっていなかった前決定過程を含めて政策廃止の過程を包括的に明らかにした。本研究では、政策廃止がどのような場合に行われるかを明らかにした。日本の都道府県におけるダム事業、自治体病院、土地開発公社を対象として、全都道府県に対するアンケート調査をもとにした質的比較分析を行った。分析の結果、政策廃止の前決定過程では政治状況や政策の性質が影響し、廃止の決定過程では科学的な政策知識に裏付けられた政策の必要性の有無を示す主張を提示することができるかが影響することが明らかとなった。次年度以降は、本年度に作成したデータセットを用いた質的比較分析を行い、どのような場合に政策・組織廃止が起こるかを、明らかにする。具体的には、データセットを、Tosmana等の質的比較分析のためのソフトウェアを用いて分析する。分析手法である質的比較分析では、廃止という現象をもたらす原因条件の組み合わせを表し、どのような場合に廃止という現象が議題に上がり、決定するかを示す。基本的な質的比較分析のやり方としては、政策廃止という現象が生じるための原因条件を探るために、全事例について廃止の原因ではないかと予想される要因が起きているかを調べ、原因条件と廃止の有無が存在するか否かによって1か0の2値を与え、真理表にまとめる。そして、原因条件の組み合わせをブール代数式で表し、どのような場合に廃止という現象が生じるのかを示す。次年度は研究の最終年度であり、本年度に行った分析結果をまとめて公表する。分析結果をまとめる際には、当該分野における他の研究者からの批判や指摘を受けて、改善を目指す。研究成果の公表方法としては、学会誌等に投稿するとともに、書籍として出版することを予定している。公共政策予定していた資料の購入が遅れたため。予定していた資料の購入が遅れたため。翌年度に資料の購入を行う。
立体構造に基づくカルパインの活性化機構の解析

カルパインは大小二つのサブユニット(80Kと30K)からなるダイマー酵素であるが、80Kだけでも酵素活性を持つ。X線解析で高次構造を明らかにした結果、80Kを構成する4個のドメイン(IIV)のうち、プロテアーゼドメイン(II)は二つのサブドメイン(IIaとIIb)からなり、各々単独では他のシステインプロテアーゼの場合とほとんど同じであるが、両者は左右に離れ、システインプロテアーゼの場合と違って、両者間の溝に存在する活性中心が正しく形成されていない。カルシウムによる構造変化でIIaとIIbが相対的に移動して活性中心を形成することがカルパインの活性化機構である。この活性化機構を分子レベルで明らかにする研究を行った。明らかにした活性化機構を要約すると、IIaはドメインIと30Kのカルモジュリンドメイン(VI)との、IIbはドメインIIIとの相互作用で引かれているが、カルシウムがVIとIIIに結合するとIIaとIIbの位置が変わり、IIの構造は大きく変化する。さらにIIにカルシウムが結合して構造の微調整が起こると活性中心ができて活性を発現することが明らかになった。機能不明であったIIIはカルシウムとリン脂質・生体膜結合ドメインとして働き、Iはプロドメインであるがこれが自己消化で除かれることは活性化とは直接関係しないことを証明した。カルパインの活性化では、IIIが全く新しいカルシウム結合ドメイン部位として働くだけでなく、細胞内局在を決める重要な機能を持つ。また、IIにも未知のカルシウム結合部位の存在が予測された。最終的な活性化機構の解明に必要なカルシウム存在下でのカルパインの構造の解明を目指して引き続き研究を続けている。カルパインのX線解析の結果、機能が不明だったドメインIII(III)が、カルシウムイオン(Ca)、リン脂質結合部位として知られるC2ドメインと類似の構造を持つことが明らかになり、IIIがカルパインの新しいCa結合部位、生体膜結合部位として機能するカルパインの新しい活性化機構が想定された。本研究では新しい活性化機構を検証するため、IIIが予想通りCaと生体膜を結合するかを検討した。ラットのμ、m-カルパイン、およびショウジョウバエ(d)のIIIを大腸菌で発現させるとすべて封入体となって可溶化できなかったが、発現条件や可溶化条件を検討した結果、比較的低い蛋白質濃度ではμIIIおよびdIIIを可溶化する条件を見出した。精製したμとdIIIを用いてCaと生体膜の結合実験を行った。(1)SDSゲル電気泳動におけるIIIの移動度はCa存在下で特異的に変化した。これはCa結合蛋白質に一般的に見られる性質と同一である。(2)放射性Caを使い、膜に転写したμIIIとdIIIは、典型的なCa結合ドメインとして知られているカルパイン中のカルモジュリンドメイン(IV)と同程度のCa結合能を示した。(3)IIIのCa結合能はイノシトールリン脂質を含むリポソームを加えると2-10倍に増強した。(4)IIIとイノシトールリン脂質を含むリポソームとの結合をスピンカラム法で検定した結果、IIIはリポソームに結合し、その結合はCaで大幅に増強された。これらの結果はいずれもIIIがCaとリン脂質、すなわち、生体膜を同時に結合できることを示し、高次構造から推定した活性化機構の妥当性を支持している。カルパインの高次構造解析の結果に基づき、ドメインIとIIの機能を解析した。I(1-18)はヘリックス領域で、その塩基性アミノ酸Lys-5とArg-12は、ドメインVIのAsp-154およびGlu-260とそれぞれ塩様結合をしている。これらを部位特異的に変異したもの、およびN末端近辺を特異的に切断した変異体を用いて解析し、二本の塩様結合がなくなると、カルシウム感受性が上昇し、活性化状態になることを証明した。