hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
整形外科領域難治性疾患に対する転写調節因子制御を目的とした新規遺伝子療法の開発

1.これまでの検討により、ラット、サルを用いたコラーゲン関節炎モデルにおいて関節炎、関節破壊の進行を抑制することができたが、今後ヒトへの臨床応用にむけて準備をすすめている。2.ヒト軟骨培養モデルでIL-1bにより変性刺激を加えた後、NFkBデコイ型核酸医薬を投与することにより、培養軟骨細胞中のアグリカン及びtype2コラーゲンの減少が抑制された。このことより、NFkBデコイの投与によりヒト軟骨の変性、破壊に対して抑制的に働くことが示唆され、関節リウマチ、変形性関節症に対する関節内投与の可能性が期待される。3.これまで関節炎モデル動物において関節内にNFkBデコイを投与することにより、関節炎の抑制効果を示され有効性を確立できてきたが、今後全身投与の可能性を検討するため関節炎モデルマウスに対してNFkBデコイを静脈内投与することにより関節炎の抑制効果を示すかどうかについて検討中である。4. S化した核酸医薬に較べて生体内での安定性を増強する目的で核酸医薬の両端をループ型に処理したリボン型デコイの特性についての検討を行っている。核酸分解酵素や関節液と同時に処理することによりS型二本鎖核酸に較べてリボン型デコイは分解されにいという実験結果が出ている。リボン型デコイは酵素耐性を保持し、生体内での安定性が増強していると考えられる。5.マウス骨肉腫高肺転移細胞株であるLM8を移植した肺転移モデルマウスにおいて経鼻的にNFkBデコイを導入することにより、肺転移巣の総数が有意に抑制され、生存曲線において生存期間が延長した。1.サルコラーゲン関節炎モデルにおいてnaked NFkBデコイ型核酸医薬の関節内連続投与により、組織学的、画像的にも有意に関節破壊の進行が抑制された。FITCラベルした核酸医薬での検討では関節滑膜細胞中の核内に少なくとも1週間は蛍光が認められたことより、1-2週間間隔の投与は適当であると考えられた。NFkBデコイ型核酸医薬2回投与後の、関節滑膜中のTNFaおよびIL-1bの発現はタンパクレベルで有意に抑制されていた。安全性試験として同関節炎モデルを用い、治療的投与量の90倍以上の濃度で繰り返し5回静脈内投与を施行したが、明らかな副作用、毒性の出現は臨床的にも組織学的にも認められなかった。2.ヒト関節リウマチ滑膜細胞中ではE2Fのアップレギュレーションが認められた。ベクターを用い滑膜細胞内へE2Fデコイ型核酸医薬を導入したところ導入効率は約75%程度であった。またE2Fデコイ型核酸医薬を導入により滑膜細胞の増殖は有意に抑制され、関節破壊抑制効果の可能性が示唆された。3.これまで使用してきたS化核酸医薬にくらべより生体内での安定性を増強させる目的で核酸医薬の両端をループ型に処理したリボン型NFkBデコイ型核酸医薬を考案した。ラット破骨細胞誘導系を用いた検討では破骨細胞の誘導および成熟破骨細胞の活性化の抑制効果を認めた。4.マウス骨肉腫高肺転移細胞株であるLM8においてはE2F、NFkBのアップレギュレーションが認められた。E2F、NFkBデコイ型核酸医薬を導入により有意に細胞増殖抑制が認められた。その作用機序においては細胞周期関連遺伝子の発現に差は認められなかったことより別の機序の関与が示唆された。1.今年度はヒトへの臨床応用をふまえ、サルコラーゲン関節炎モデルでのオーバードーズ投与試験を行い、主要臓器での副作用が認められないことが確認された。2.ヒト軟骨細胞培養モデルでIL-1bにより変性刺激を加えNFkBデコイ型核酸医薬を投与すると、培養軟骨細胞中のTNFaおよびIL-1bの遺伝子発現レベルは有意に抑制された。ヒト変形性関節症への応用が期待される。NFkB

デコイ型核酸医薬2回投与後の、関節滑膜中のTNFaおよびIL-1bの発現はタンパクレベルで有意に抑制されていた。3.ヒト関節リウマチ患者よりえられた滑膜組織にE2Fデコイ型核酸医薬を導入し、ヒト関節軟骨と接触させ、SCIDマウスの背部に移植するモデルを確立した。E2Fデコイ型核酸医薬を導入により滑膜組織中の炎症性細胞の増殖は有意に抑制され、パンヌスによる軟骨の浸食は組織学的に有意に抑制された。3.これまで使用してきたS化核酸医薬にくらべより生体内での安定性を増強させる目的で核酸医薬の両端をループ型に処理したリボン型NFkBデコイ型核酸医薬を考案した。ラットコラーゲン関節炎モデルにおいて関節炎発症後足関節にnakedでリボン型NFkBデコイ型核酸医薬を関節内投与したところ、有意に足関節破壊の進行は抑制され、破壊関節局所での多核TRAP陽性細胞の総数も有意に低下し、破骨細胞誘導抑制を介した関節破壊抑制効果がin vivoで証明された.4.マウス骨肉腫高肺転移細胞株であるLM8を移植した肺転移モデルマウスにおいて、経鼻的に核酸医薬を投与する方法を確立した。FITCラベル核酸医薬が肺内にデリバリーされていることが明らかとなった。プレリミナリーな検討では、NFkBデコイ型核酸医薬経鼻的投与においてマウスの生存が有意に延長した。1.これまでの検討により、ラット、サルを用いたコラーゲン関節炎モデルにおいて関節炎、関節破壊の進行を抑制することができたが、今後ヒトへの臨床応用にむけて準備をすすめている。2.ヒト軟骨培養モデルでIL-1bにより変性刺激を加えた後、NFkBデコイ型核酸医薬を投与することにより、培養軟骨細胞中のアグリカン及びtype2コラーゲンの減少が抑制された。このことより、NFkBデコイの投与によりヒト軟骨の変性、破壊に対して抑制的に働くことが示唆され、関節リウマチ、変形性関節症に対する関節内投与の可能性が期待される。3.これまで関節炎モデル動物において関節内にNFkBデコイを投与することにより、関節炎の抑制効果を示され有効性を確立できてきたが、今後全身投与の可能性を検討するため関節炎モデルマウスに対してNFkBデコイを静脈内投与することにより関節炎の抑制効果を示すかどうかについて検討中である。4.S化した核酸医薬に較べて生体内での安定性を増強する目的で核酸医薬の両端をループ型に処理したリボン型デコイの特性についての検討を行っている。核酸分解酵素や関節液と同時に処理することによりS型二本鎖核酸に較べてリボン型デコイは分解されにいという実験結果が出ている。リボン型デコイは酵素耐性を保持し、生体内での安定性が増強していると考えられる。5.マウス骨肉腫高肺転移細胞株であるLM8を移植した肺転移モデルマウスにおいて経鼻的にNFkBデコイを導入することにより、肺転移巣の総数が有意に抑制され、生存曲線において生存期間が延長した。
臨床応用を目指した腫瘍胎児性アミノ酸トランスポーターの基礎的研究

本研究では腫瘍胎児性アミノ酸トランスポーターの一つであるL type amino acid transpoter-1 (LAT1)が犬の腫瘍性疾患において、新たな治療ターゲット分子として有望であるか否かを基礎的観点から検討を行った。LAT1は正常組織と比較して犬血管肉腫、犬悪性黒色腫、犬乳腺腫瘍等でその発現量が高値を示した。また、これらの腫瘍由来株化細胞を用いてLAT1阻害薬による細胞増殖抑制試験を行ったところ、株化細胞の増殖性は阻害薬によって用量依存的に抑制された。以上より、LAT1は犬腫瘍の新たな治療のターゲットに成り得ることが示唆された。<研究目的>L-type amino acidtransporter 1(LAT1)はアミノ酸トランスポーターの1つで、胎生期の細胞で発現し生命活動に必要な分枝アミノ酸や芳香族アミノ酸を細胞内へ供給する重要な役割を果たしている。最近ではヒトの腫瘍においてLAT1の高発現が明らかにされ、所謂、oncofetal proteinの1つと考えられている。LAT1は、活発な細胞活性を維持するために必要となるアミノ酸を腫瘍細胞に供給し、腫瘍細胞の増殖・維持に重要な役割を果たしていることから、LAT1は腫瘍治療のターゲット分子として注目されている。本研究では、獣医学領域におけるLAT1の腫瘍治療ターゲット分子としての有用性について検討する。本年度の研究実施計画は、LAT1阻害薬の有効性の評価を1) In vitro(犬腫瘍由来細胞株)および2) In vivo (実験動物)で行うことである。<本年度の研究成果> 1)犬乳腺腫瘍由来株価細胞(5株)におけるLAT1の発現解析を行った。LAT1 mRNAおよび蛋白発現をreal-time RT-PCRとWestern blotingによって解析したところ、すべての細胞株においてmRNAと蛋白レベルの双方でLAT1発現が確認された。一方、一般正常組織で発現が確認されるLAT2は1細胞株のみで発現が確認された。2)犬乳腺腫瘍由来細胞株を用いて、LAT1阻害薬(BCHとメルファラン)の有効性を評価した。WST-8による細胞増殖性の評価に加え、トリチュウム-ロイシンを用いた細胞内アミノ酸取り込み実験によって検討したところ、阻害薬は用量に依存して細胞の増殖性、アミノ酸取り込み能を抑制した。以上の結果から、LAT1阻害薬はLAT1発現乳腺腫瘍の治療に有効である可能性が示された。<本研究の目的>L-type-amino acidtransporter 1 (LAT1)はアミノ酸トランスポーターの1つで、胎生期の細胞で発現し生命活動に必要な分枝アミノ酸や芳香族アミノ酸を細胞内へ供給する重要な役割を果たしている。最近では人の腫瘍においてLAT1の高発現が明らかにされ、所謂、oncofetal proteinの1つと考えられている。LAT1は活発な細胞活性を維持するために必要となるアミノ酸を腫瘍細胞に供給し、腫瘍細胞の増殖・維持に重要な役割を果たしていることから、LAT1は腫瘍治療のターゲット分子として注目されている。本研究では獣医学領域におけるLAT1の腫瘍治療ターゲット分子としての有用性について検討する。平成27年度の研究実施計画は平成26年度に引き続き、LAT1阻害薬の有効性を1.細胞株(in vitro)と2.実験動物(in vivo)で行うことである。<本年度の研究成果>1. <In vitroの実験系での研究成果>犬悪性黒色腫由来細胞株(5株)についてLAT1の発現解析を行ったところ、すべての細胞株で蛋白およびmRNAレベルでLAT1の高発現が確認された。これらの細胞株のうち1細胞株を用いて、LAT1阻害薬(BCHおよびメルファラン)の効果を検討したところ、阻害薬は細胞の増殖性およびアミノ酸取り込み能を有意に抑制した。これらの結果から、LAT1阻害薬はLAT1が高発現する悪性黒色腫の治療に有効である可能性が示された。2. <In vivoの実験系での研究成果>ヌードマウスに悪性黒色腫由来細胞株を定着させた後、抗がん剤とLAT1阻害薬の併用効果について、腫瘍塊の大きさと腫瘍の全身への広がりの観点から検討した。その結果、LAT1阻害薬併用は腫瘍の大きさと腫瘍の全身への広がりを相乗的に抑制した。当初の予定では、悪性黒色腫(検討済み)に加え、犬肥満細胞腫株化細胞においても同様のin vitroおよびin vivoの検討を行う予定であったが、平成27年度8月1日付で所属大学が変わり、研究環境のセットアップに時間を要した。犬肥満細胞腫株化細胞での検討は現在行っている。<平成28年度の研究成績の概要>平成26年度の乳腺腫瘍についての解析、平成27年度の悪性黒色腫についての解析に続き、今年度は血管肉腫について検討を行った。1)血管肉腫脾臓組織と血管肉腫

由来株化細胞(5株)を用いてLAT1発現を比較解析したところ、血管肉腫組織および株化細胞において正常脾臓組織よりも有意にLAT1の高発現が確認された。2)これらの血管肉腫細胞株(5株)を用いて、LAT1阻害薬(メルファラン)がドキソルビシンの細胞増殖抑制効果に与える影響を検討したところ、LAT1阻害薬はドキソルビシンの効果を有意に増強した。3)予備実験にて、血管肉腫組織においてLAT1とともにエンドセリンの高発現が確認された。そこで、LAT1とエンドセリンの細胞増殖に対する役割の比較検討を行った。株化細胞におけるエンドセリンレセプターの発現解析を行ったところ、エンドセリンAレセプターの発現がBレセプターに比べ優位であることが確認された。そこで、エンドセリンAレセプター拮抗薬を培養液に添加したところ、細胞の増殖が用量依存的に抑制された。本研究では腫瘍胎児性アミノ酸トランスポーターの一つであるL type amino acid transpoter-1 (LAT1)が犬の腫瘍性疾患において、新たな治療ターゲット分子として有望であるか否かを基礎的観点から検討を行った。LAT1は正常組織と比較して犬血管肉腫、犬悪性黒色腫、犬乳腺腫瘍等でその発現量が高値を示した。また、これらの腫瘍由来株化細胞を用いてLAT1阻害薬による細胞増殖抑制試験を行ったところ、株化細胞の増殖性は阻害薬によって用量依存的に抑制された。以上より、LAT1は犬腫瘍の新たな治療のターゲットに成り得ることが示唆された。1)本年度の目標は当初、LAT1阻害薬の有効性の評価を1)In vitro(犬腫瘍由来細胞株)および2) In vivo (実験動物)の双方で行うことを予定していた。In vitro解析の成果は犬乳腺腫瘍由来細胞株において当初の予定通り得ることができた(前述)。In vitro解析はヌードマウス腫瘍移植モデルを用いて現在行っている途中である。2)LAT1阻害作用を有する分子として現在入手可能なものはBCHとメルファランであるが、人医療での使用を目的として特異的阻害薬が開発されている。臨床例での有効性の検討はこの特異的阻害薬の入手が前提となるが、現在のところ入手に至っていない。LAT1阻害薬の前臨床研究として、種々の腫瘍に対する有効性を細胞株やヌードマウスを使った移植モデルで評価することは、有効腫瘍スペクトルを考える上でも重要である。従って、現在行っている評価法を基盤として、多くの種類の腫瘍細胞株を用いて継続実験を行う。現在検討中である犬肥満細胞腫株化細胞に加え犬血管肉腫株化細胞で検討を予定している。(2)LAT1とエンドセリンの関連性について予備実験にて、血管肉腫組織においてLAT1の高発現とエンドセリンの高発現が確認されている。エンドセリンの発現にはHif-1αの関与が明らかにされており、またLAT1発現にもHif-1αの関与が疑われている。
ヒトリポペプチド抗原提示分子の同定～新たなウイルス制御パラダイムの確立を目指して

研究代表者はサルエイズモデルを活用し、ウイルスが産生する「脂質修飾ペプチド(リポペプチド)」を標的とした免疫応答の存在を見出し、その免疫応答を担う鍵分子を発見した。本研究においては、サルにおける第二の鍵分子を発見し、この構造を明らかにした。さらにこれら2つのサル分子の解析結果をもとに、同様の働きをもつヒト分子候補を絞り込むことに成功した。さらにヒト分子の解析に適したトランスジェニックマウス作製の研究基盤を確立した。これらの研究は新たなウイルス制御の理解に道を開くものである。すでに同定を完了した2種のアカゲザルリポペプチド提示分子に共有される特質を明らかにし、ヒトリポペプチド提示分子の同定に向けた道筋を得ることができた。まず、我々が世界に先駆けて同定したアカゲザルリポペプチド提示MHC分子Mamu-B*098に加えて(Nature Communications, 2016)、新たなアカゲザルリポペプチド提示分子B*nov2の分子実態を明らかにし、そのX線結晶構造を高い解像度で解明することに成功した(投稿準備中)。さらには特異的T細胞抗原受容体を包含した共結晶構造の情報が得られつつある。これらの解析の結果、リポペプチド提示分子に特有の抗原結合構造とそれを支えるアミノ酸残基の存在が明らかとなった。他方、タンパク質輸送や分子フォールディングを促進する種々の因子を欠損した細胞において、Mamu-B*098やB*nov2を強制発現させ、安定的な細胞表面発現の有無を検証した。これらの解析をもとに、従来の抗原提示分子には見られない細胞生物学的特質が明らかとなってきた。これらのアカゲザルリポペプチド提示分子の特徴を具備したヒトリポペプチド提示分子を絞り込む目的で、ヒトMHCアリルをコードする遺伝子を網羅的に単離し、条件に合致するアリルHLA-nov1を同定した。将来的な展開を見据え、HLA-nov1をベースにしたトランスジーンを構築し、トランスジェニックマウスの作出に成功した。すでにトランスジェニックマウスの仔が多数得られつつあり、タンパク質発現と機能を検証する段階に達した。ヒトリポペプチド提示分子の同定に向けて、基盤となる2種のアカゲザルリポペプチド提示分子に関する細胞学的特質と構造学的特質を、当初の予知通りに明らかにすることができた。さらにこの情報をもとに、ヒトリポペプチド提示分子候補を絞り込み、それを発現したトランスジェニックマウスの作出をほぼ完了する段階に達した。それとともに、この候補分子のX線結晶構造が得られつつあり、次年度の発展的研究への基盤が十分に確立できたと考えられる。エイズウイルスNefタンパク質は、そのN末端グリシン残基がミリスチン酸修飾を受けることによりその機能(宿主免疫抑制)を発揮する。研究代表者はこのミリスチン酸修飾に起因して生成されるリポペプチド抗原が細胞傷害性T細胞の免疫標的となることを見出し、これを担うアカゲザルリポペプチド提示分子(MHCクラス1アリル)を同定した。そのX線結晶構造解析の結果、このアカゲザルリポペプチド提示分子は抗原結合溝において広く疎水性のBポケットを有し、リポペプチドのアシル鎖部分をアンカーとして収納することがわかった。今年度、第二のアカゲザルリポペプチド提示分子を同定しそのX線結晶構造を解明したところ、微細なアミノ酸構築は第一のアカゲザルリポペプチド提示分子と異なるものの、全体として広い疎水性のBポケットを有し、そこにリガンドのアシル鎖を収納することを見出した。またその細胞表面発現が小胞体ポプチドトランスポーターに依存する旧来のペプチド提示MHCクラス1アリルと異なり、これら2つのリポペプチド提示MHCクラス1アリルはペプチドトランスポーター欠損細胞においてもコントロール細胞と同等の細胞表面発現を認めた。以上の結果から、リポペプチド提示分子の特質として、1)広く疎水性のBポケットを有すること、2)ペプチドトランスポーター非依存的に細胞表面発現することを想定するに至った。この想定をもとにヒトMHCクラス1アリルを検証し、有望なヒトリポペプチド提示分子として8つのアリルを絞り込んだ。これらはBポケットのサイズを規定するアミノ酸ポジションにおいて小さな側鎖を有するアミノ酸が配置されており、さらにペプチドトランスポーター欠損細胞株においてもコントロール細胞と遜色のない細胞表面発現を認めた。これらのリコンビナントタンパク質を調整し、モデルリポペプチドリガンドを用いた結合能の評価に着手した。上記の通り、研究は順調に進捗しており、当初の計画通りに進めて行く。具体的進路は、以下の2点である。(項目1)ヒトリポペプチド提示分子のX線結晶構造を確定し、リポペプチド結合を支える構造学的特徴を明らかにする。(項目2)ヒトリポペプチド提示分子を発現したトランスジェニックマウスの樹立と解析を進め、リポペプチド提示という機能的観点から個体レベルでの解析を展開する。項目1については、半年以内に完了できると想定している。一方、項目2については、効率的な免疫応答誘起のトライアルが必要と考えられ、1年間を通して種々の可能性を検証する予定である。

感染免疫作出したトランスジェニックマウスについて、種々の遺伝子欠損マウスとの大規模な交配を計画していたが、異なるプロモーターを利用した複数のマウスラインが樹立できたため、まずその基本的解析を優先し、交配を次年度に先送りしたため。種々の遺伝子欠損マウスを購入あるいは樹立し、当該トランスジェニックマウスとの大規模な交配を進める。
母親に発達障害のある家族への支援プログラムの応用

本研究の目的は、自身に発達障害がある母親に対して、母親や家族を支援をするためのビデオを用いたプログラムを、子育て支援の現場において応用するものであり、平成30年度32年度の3年間で完成させるものである。その基本となるプログラムは平成24年度26年度にかけて研究者が作成したものである(科学研究費挑戦的萌芽研究:NO.24653207)。平成30年度は、研究対象となる家族とその子育て支援の現場となる施設として、2つの対象を選んだ。事例1の研究対象家族については、母親と認定こども園からの協力は得られたが、父親はビデオ撮影に拒否感があるとして、実施には至らなかった。この経過を踏まえて、認定こども園に対して本プログラムを実施する場合の課題点などの意見を聴取した。事例2の研究対象家族は、母親が自閉スペクトラム症と診断されており、子どもも自閉スペクトラム症およびADHDとの診断を受け、父親は仕事上不在が続き、実質的には母親が一人で子育てを担っていた。事例2については、家族(母子)に研究の依頼を行った上で、平成30年11月31年2月末までの間に児童発達支援事業所においてビデオ検証を4回実施した。実施に際しては、基本プログラムを参考にしながらも、子ども、母親、および児童発達支援事業所職員らが現実的に実施できるよう内容を変更する形に応用した。具体的には、家庭内に定点カメラを設置し、検証する映像は母子が選び、検証場面にも父親は参加せず、子どもが検証に参加する、という形での応用であった。プログラムの初回と最後には、TK式親子関係テストやPSII育児ストレスインデックスを実施して、親子双方の意識の変化などを確認した。児童発達支援事業所の職員は親子に負担なくプログラムが実施できるよう研究に協力した。また、プログラム終了後には研究者と施設職員は課題や成果について協議を行った。平成30年度の研究がおおむね順調に進展していると判断した理由は、当初の計画通り、研究対象家族を選び、基本プログラムを応用する実験を実際の子育て支援の現場で実施することができたためである。平成30年度は2家族に対してのプログラム実施を試みたが、結果的には1家族への実施に留まった。実施できなかった1家族については、子どもの通う認定こども園から意見聴取を行うことが可能であった。このデータは、今後プログラム実施の応用版作成の参考とする予定である。実験の実施に至った家族(事例2)については、子どもの通う児童発達支援事業所において協力を得ながら、家族のスタイルに合わせた形で基本プログラムを応用することができた。基本プログラムを応用した点は、以下の通りである。1基本プログラムでは研究所内で家族の触れ合いを撮影したが、事2の親子は、実際の生活場面における課題点を振り返ることを希望したため、家庭での映像を使用することとした点。2家庭の事情で父親はプログラムの実施に参加していない点。基本プログラムは、夫婦の相互扶助を高めることを目的としているが、近年の家庭事情は夫婦が揃っている家庭ばかりではなく、ひとり親家庭における課題も多い。このため家族の実情に合わせることを念頭において実験を行った。3ビデオ検証に小学校5年生の子どもを含めて、4者(子ども、母親、児童発達支援事業所の職員、研究者)で実施した点。なお、検証場面での子どもの参加は、自身の意志に添って実施した。これら基本プログラムを応用して実験を行った結果、親子や職員からは、応用プログラムの実施がその後の親子関係の改善に効果があったという意見がもたらされた。本事例の分析やまとめは今後行う予定であるが、年度ごとに1事例のビデオ検証を実施することを計画していたことから、予定通りおおむね順調に進展していると判断した。本年度は、平成30年度に実験を行った事例2の結果をまとめる。実施した親子関係テストの結果から何が読み取れるかという点で分析し、また、事例の経過の分析も加えて、全体を通して得られた内容を、児童発達支援事業所における応用の結果としてまとめる。その際には1基本プログラムのどの点をどのように応用したのか、2児童発達支援事業所の職員が実施する場合の配慮点について、等について具体的に述べる。さらに、本年度は昨年度と種別の異なる子育て支援施設でのプログラムの実施(ビデオ検証))を計画し実行する。具体的には児童養護施設(1施設)への実施を視野に入れて施設側に依頼する。児童養護施設では家族再統合に向けた子育て支援が行われていることから、通常は子どもとは暮らすことができない家族に対して実施することとなる。さらに母親に発達障害があることを踏まえて、本プログラム(ビデオ観察と検証)がどのように応用できるのかを検討する。方法としては、子どもとの面会時にビデオ観察法を実施することが考えられる。または、保護者の意向を尋ねた上で、家庭での一時帰宅時の様子をビデオに撮り、施設に戻った際に、保護者、施設職員とともにビデオ検証を行うことも考えられる。子どもも一緒に検証することが復帰に向けて最適と考えられるならば、その方法も視野に入れることとする。いずれにしても、児童養護施設においては児童指導員や保育士が親代わりとして子どもに接していることから、どのような応用が可能であるのか、或いはどのような点が限界として考えられるのか、施設職員に協力を依頼して、応用の可能性を検討していく予定である。そのためには、施設職員への協力依頼に具体的な説明を行う必要がある。万が一保護者への実施が難しい場合でも、児童養護施設での本プログラム応用案の意見を聴取して、可能な範囲で施設における実施を目指す。

本研究の目的は、自身に発達障害がある母親に対して、母親や家族を支援をするためのビデオを用いたプログラムを、子育て支援の現場において応用するものであり、平成30年度32年度の3年間で完成させるものである。その基本となるプログラムは平成24年度26年度にかけて研究者が作成したものである(科学研究費挑戦的萌芽研究:NO.24653207)。平成30年度は、研究対象となる家族とその子育て支援の現場となる施設として、2つの対象を選んだ。事例1の研究対象家族については、母親と認定こども園からの協力は得られたが、父親はビデオ撮影に拒否感があるとして、実施には至らなかった。この経過を踏まえて、認定こども園に対して本プログラムを実施する場合の課題点などの意見を聴取した。事例2の研究対象家族は、母親が自閉スペクトラム症と診断されており、子どもも自閉スペクトラム症およびADHDとの診断を受け、父親は仕事上不在が続き、実質的には母親が一人で子育てを担っていた。事例2については、家族(母子)に研究の依頼を行った上で、平成30年11月31年2月末までの間に児童発達支援事業所においてビデオ検証を4回実施した。実施に際しては、基本プログラムを参考にしながらも、子ども、母親、および児童発達支援事業所職員らが現実的に実施できるよう内容を変更する形に応用した。具体的には、家庭内に定点カメラを設置し、検証する映像は母子が選び、検証場面にも父親は参加せず、子どもが検証に参加する、という形での応用であった。プログラムの初回と最後には、TK式親子関係テストやPSII育児ストレスインデックスを実施して、親子双方の意識の変化などを確認した。児童発達支援事業所の職員は親子に負担なくプログラムが実施できるよう研究に協力した。また、プログラム終了後には研究者と施設職員は課題や成果について協議を行った。平成30年度の研究がおおむね順調に進展していると判断した理由は、当初の計画通り、研究対象家族を選び、基本プログラムを応用する実験を実際の子育て支援の現場で実施することができたためである。平成30年度は2家族に対してのプログラム実施を試みたが、結果的には1家族への実施に留まった。実施できなかった1家族については、子どもの通う認定こども園から意見聴取を行うことが可能であった。このデータは、今後プログラム実施の応用版作成の参考とする予定である。実験の実施に至った家族(事例2)については、子どもの通う児童発達支援事業所において協力を得ながら、家族のスタイルに合わせた形で基本プログラムを応用することができた。基本プログラムを応用した点は、以下の通りである。1基本プログラムでは研究所内で家族の触れ合いを撮影したが、事2の親子は、実際の生活場面における課題点を振り返ることを希望したため、家庭での映像を使用することとした点。2家庭の事情で父親はプログラムの実施に参加していない点。基本プログラムは、夫婦の相互扶助を高めることを目的としているが、近年の家庭事情は夫婦が揃っている家庭ばかりではなく、ひとり親家庭における課題も多い。このため家族の実情に合わせることを念頭において実験を行った。
GnRHニューロンにおける形態変動解析のための機能科学的アプローチ

GnRHニューロンの制御に関して近年注目を集めるkisspeptinに対する抗体を作製して、kisspeptin神経の視床下部における神経線維の分布から、その生理作用に関して解析を進めた。Kisspeptin神経線維のGnRH神経細胞体への近傍への投射は稀であり、代わってKisspeptin神経線維は視床下部内の背側弓状核に密な分布が認められた。この領域は下垂体からのプロラクチン分泌を制御するDopamineニューロンが分布する(TIDA neuron)。本研究による形態学的解析結果は、kisspeptin神経線維はTIDA neuronにシナプスを介した連絡があることを示している。また生理学的な応答として、TIDA neuronはkisspeptinに応答した細胞内カルシウムの上昇、神経活動マーカーFosの発現誘導を見出した。以上よりkisspeptinによるDopamine neuronを介したプロラクチン分泌の制御が明らかとなった。更にはプロラクチンの脳内への浸潤によるGnRHニューロンを含めた神経内分泌制御の可能性が期待できる。平成20年度の実験研究については、GnRHプロモータにEGFP遺伝子を組み込んで開発したトランスジェニクラットを材料として、共焦点レーザ走査顕微鏡を利用して、コンピューター画像処理によって、GnRHニューロン形態の三次元画像の構築と解析を行った。GnRHは主に視索前野に存在するGnRHニューロンによって魔生されている。思春期発動に伴ってGnRHニューロンの形態にも何らかの変化が起っている可能性があるが、その形態的変化に関して十分な検討はなされていない。本研究では、新しいアプローチで思春期前後の視索前野のGnRHニューロンの形態を詳細に検討した。GnRHニューロンは、主に単極性と双極性であり、spine様の突起を持つか否かによってさらにsmooth typeとirregular typeに分けられる。思春期前後の動物のいずれでも、双極性ニューロンにはsmooth typeが多く、単極性ニューロンにはirregular typeが多かった。思春期後の動物では双極性GnRHニューロンが多く見られ、逆に思春期前の動物では単極性のほうが多いことが確認された。GnRHニューロンには、特にirregular typeのGnRHニューロンに多くのspine様が確認された。GnRHニューロンへのシナプス入力を調べるために、Synaptophysin二重蛍光免疫染色を行った。GnRHニューロンへ入力するpresynapticterminalsは主にGnRHニューロンのspineに分布している。思春期発動に伴い、GnRHニューロンへのシナプス入力を増加することが確認された。以上の結果により、動物の成熟に伴いGnRHの機能的活性が上昇するに従って、GnRHニューロンの形態やシナプス形成も変化し、機能的成熟と相関する可能性が示唆された。現在、これらのデータを含む論文を投稿準備中。生殖神経内分泌の中核であるGnRHニューロンへの入力に関して形態学的な検討を行った。GnRHニューロンへの制御入力として、kisspeptinが近年注目を集めている。我々はkisspeptinに対する抗体を作製して、kisspeptin以外のへの交叉反応をNeuropeptide FFを前吸収させることのより除外して、kisspetin神経細胞体、神経線維を特異的に可視化することに成功した。この染色法を用いてGnRHニューロンへのkisspeptin神経線維の連絡を検討したところ、細胞体周囲にkisspeptin神経線維はほとんど検出されなかった。またGnRH神経は正中隆起に投射され、その近傍でkisspeptin神経線維と混在が認められたが、明確な接触は観察し得なかった。この傾向は思春期の前、中、後でも一貫していた。この結果は生理学的、分子遺伝学的に示されている"kisspeptinによるGnRHニューロンの制御"に関して、形態学的にはまだ支持をしえないことを示している。一方Kisspeptin神経線維は背側弓状核に密な分泌が観察された。この領域は下垂体からのプロラクチン分泌を制御するドーパミンニューロンが分布する。Kisspeptin神経線維はドーパミンニューロンとの密な接触が多く観察され、脳室へのkisspeptin注入によりドーパミン神経細胞へのcFosの発現を観察した。以上の結果はkisspeptinから、ドーパミンを介したプロラクチン分泌の制御、更にはプロラクチンの脳内への浸潤によるGnRHニューロンを含めた神経内分泌制御の可能性を示唆している。

我々はGnRHニューロンの制御に関して近年注目を集めるkisspeptinに対する抗体を作製して、kisspeptin神経の視床下部における神経線維の分布から、その生理作用に関して解析を進めた。Kisspeptin神経線維は視床下部内の背側弓状核に密な分布が認められた。この領域は下垂体からのプロラクチン分泌を制御するDopamineニューロンが分布する(TIDA neuron)。二重蛍光免疫組織化学によりKisspeptin神経線維はTIDA neuronとの密な接触が多く観察された。さらにSynaptphysin(シナプス構成タンパク)/Tyrosinhydroxylase(Dopamine産生律速酵素)/kisspeptin三重蛍光染色でも3種の輝点は一致が観察された。免疫電子顕微鏡観察では、TIDA neuronの細胞体、樹状突起にkisspeptin神経線維との間にシナプス構造をを見出した。これらの結果はkisspeptin神経からTIDA neuronにシナプスを介した連絡があることを示している。生理学的な応答として、視床下部分散培養系におけるTIDA neuronはkisspeptinに応答した細胞内カルシウムの上昇を見出した。以上の結果はkisspeptinによるDopamine neuronを介したプロラクチン分泌の制御を強く示唆している。更にはプロラクチンの脳内への浸潤によるGnRHニューロンを含めた神経内分泌制御の可能性が期待できる。
岩盤のゆるみ領域測定のための真空透気試験に関する研究

本研究は岩盤のゆるみ領域を測定するための真空透気試験について,(1)試験装置の製作,(2)試験装置の動作確認,(3)ゆるみ領域の評価プログラムの開発,に焦点を絞り基礎的研究を行った。その結果,以下に示す成果を得た。(1)試験装置の製作:岩盤に削孔されたボ-リング孔に挿入する圧力センサ付き真空室を有するパッカ-および圧力,流量等を測定する計測装置を製作した。これらは,現場において使用することを念頭におきハンディなものとした。(2)試験装置の動作確認:ドラムカンに土,または,コンクリ-トをつめた供試体を用いて,装置の動作確認を行った。当初は装置上の不都合がいくつかあったが,改良の結果,実用上問題のない精度で圧力,流量および温・湿度を計測できること,並びに真空室の気密性が確認された。さらに,試験結果を自動収録するためのパソコン用のデ-タ収録プログラムを作成した。(3)ゆるみ領域の評価プログラムの開発:試験結果からゆるみ領域の範囲を推定するプログラムを開発した。まず,亀裂密度の高い岩盤を不均質な多孔質媒体の軸対称3次元場としてモデル化し,測定孔における気圧回復が岩盤のゆるみの大きさおよび範囲によってどのように異なるかを数値解析によって検討した。また,亀裂密度の小さい場合については,2次元の亀裂系モデルを設定し,亀裂開口幅のばらつきを考慮して,気圧回復測定結果に基づくゆるみ有無の判定結果における過誤の危険率を検討した。さらに多孔質地盤における解析手法を用いて,岩盤のゆるみ領域の固有透過度を均質地盤の値として評価する逆解析手法を開発した。以上の研究によって,ゆるみ領域に新しい評価試験法の基礎的なパ-ツができあがったと考えている。今後は,実際への適用を試みながら実用化を図るつもりである。
超低体温下における循環停止法の安全性確保に関する実験的検討

実験的検討として、32°Cから20°Cの段階的低体温下に種々の時間、虚血侵襲を与え、海馬CA1領域の錐体細胞の組織学的な変化および海馬領域での反応について観察した。スナネズミ前脳虚血モデルを用い、5分から120分間両側総頸動脈を遮断した。組織学的検討は虚血あるいはシャム手術後7日目に行った。海馬CA1領域の錐体細胞の遅発性神経細胞死(以下DNDとす)を評価するためにクレシルバイオレット染色とMAP2免疫染色を用いた。またアストロサイトの反応を見るためにGFAP免疫染色を、マイクログリアの反応を観察するためにイソレクチンB4組織染色を用いた。32°C10分間あるいは28°C20分間の前脳虚血では、CA1領域にDNDは起こらなかった。しかし32°C20分間あるいは28°C30分間の虚血では、CA1領域の錐体細胞に高度の変性が起こった。超低体温下においては、24°C60分間あるいは20°C120分間という、今回の実験系においてそれぞれの温度で動物が生存しうる最長の虚血時間を負荷してもCA1領域にDNDは起こらなかった。アストロサイトの反応性の変化は虚血後DNDが起こった動物だけでなく、虚血侵襲を与えたにもかかわらずDNDが誘導されなかった動物の海馬全体において観察された。これに対し反応性マイクログリアの分布は、虚血後DNDが発生した動物のCA1領域に限局して観察された。これらの実験結果は、超低体温法の著明な神経保護効果を示している。また低体温下においても、グリア細胞の反応は虚血侵襲後の神経細胞の生死の過程に重要な役割を果たしていることを示唆している。またこの超低体温法を臨床例における循環停止中の脳保護法として使用し、胸部大動脈瘤手術などを施行し、さらに縦隔悪性腫瘍の拡大手術にも応用し、良好な結果を得た。虚血性神経細胞死には、激しい障害によって神経細胞が急激に死ぬ壊死(necrosis)と、虚血に対して特に脆弱な神経細胞のグループが、より軽度の障害によって急性の死を免れても数日数週間後に死に至る遅発性神経細胞死(delayed neuronal cell death以下DNDと略す)とが存在する。これまで我々は、一貫して超低体温循環停止法における脳保護に関する研究を続けてきており、スナネズミ前脳虚血モデルを作成し、低体温によって海馬CA1領域のDNDが抑制できることを組織学的に確認していた。今回、同モデルを用いて、虚血性神経細胞障害時における神経細胞周囲のグリア細胞の変化を観察した。GFAP免疫染色を用いて、アストログリアを観察し、この組織のGFAP陽性率(アストログリアの面積比)の画像解析装置によって解析した結果、虚血障害を加えたモデルの脳ではGFAP陽性率が高い(アストログリアが肥大化)ことを確認した。アストログリアは、一般的に神経保護作用を持つといわれている。またその陽性率は脳に加わった虚血障害の程度と正の相関を示した。虚血時低体温の導入によって、このGFAP陽性率は、ある程度の低下をみるが、完全にコントロール(非虚血手術群)レベルまでは低下しなかった。このことは、低体温環境下においてもアストログリアは、虚血障害に反応して肥大化し得る事とともに、低体温処理によってDNDは妨げるものの、アストログリアの肥大化を必要とするような脳への虚血障害を完全には防ぎ得ていない可能性を示していると考えられた。

実験的検討として、32°Cから20°Cの段階的低体温下に種々の時間、虚血侵襲を与え、海馬CA1領域の錐体細胞の組織学的な変化および海馬領域でのグリア細胞の反応について観察した。スナネズミ前脳虚血モデルを用い、5分から120分間両側総頸動脈を遮断した。組織学的検討は虚血あるいはシャム手術後7日目に行った。海馬CA1領域の錐体細胞の遅発性神経細胞死(以下DNDとす)を評価するためにクレシルバイオレット染色とMAP2免疫染色を用いた。またアストロサイトの反応を見るためにGFAP免疫染色を、マイクログリアの反応を観察するためにイソレクチンB4組織染色を用いた。32°C10分間あるいは28°C20分間の前脳虚血では、CA1領域にDNDは起こらなかった。しかし32°C20分間あるいは28°C30分間の虚血では、CA1領域の錐体細胞に高度の変性が起こった。超低体温下においては、24°C60分間あるいは20°C120分間という、今回の実験系においてそれぞれの温度で動物が生存しうる最長の虚血時間を負荷してもCA1領域にDNDは起こらなかった。アストロサイトの反応性の変化は虚血後DNDが起こった動物だけでなく、虚血侵襲を与えたにもかかわらずDNDが誘導されなかった動物の海馬全体において観察された。これに対し反応性マイクログリアの分布は、虚血後DNDが発生した動物のCA1領域に限局して観察された。これらの実験結果は、超低体温法の著明な神経保護効果を示している。また低体温下においても、グリア細胞の反応は虚血侵襲後の神経細胞の生死の過程に重要な役割を果たしていることを示唆している。またこの超低体温法を臨床例における循環停止中の脳保護法として使用し、胸部大動脈瘤手術などを施行し、さらに縦隔悪性腫瘍の拡大手術にも応用し、良好な結果を得た。
革新的なバイオ医薬創製に向けた分子連結技術の高度化

本年度は、研究代表者らが開発したタンパク質連結技術を用いて、ナチュラルキラー細胞表面抗原CD16および2種のがん関連抗原(EGFRおよびHER2)を標的とするヘテロ4量体型三重特異性抗体の調製および機能評価を進めた。まず、大腸菌を用いて組換え抗体を発現させ、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより目的タンパク質を高純度に精製した。ゲルろ過クロマトグラフィーにより組換え抗体の会合状態を調べたところ、設計通りのヘテロ4量体と考えられるピークが見られたが、2量体と考えられる分子種も同程度存在することがわかった。以前に作製した二重特異性抗体においては、主にヘテロ4量体として存在したことから、新たに2つの抗体可変領域を連結したことによって立体障害が生じ、短鎖ペプチド間の相互作用に影響を与えたと考えている。フローサイトメトリーを用いて、がん細胞への結合を評価した結果、組換え抗体は標的がん細胞に対して特異的に結合することがわかった。表面プラズモン共鳴法(SPR法)を用いて、可溶性CD16に対する結合の速度論的解析を行った結果、結合価が1価の抗体と比較して、解離速度が遅いことがわかった。また、可溶性EGFRを固定化したセンサーチップに対して、組換え抗体を添加した後、さらに可溶性CD16および可溶性HER2を順に添加したところ、すべての場合においてレスポンスの増加が見られたことから、作製した組換え抗体は三重特異性を有すると考えた。作製した組換え抗体は、期待通りの機能を示したが、設計とは異なる分子種が含まれていることがわかったため。抗体可変領域同士の立体障害を緩和するために、ペプチドリンカーの鎖長や配列を検討する。当初の計画よりやや遅れているため、進捗状況に応じて、作製する組換え抗体の絞り込みも検討する。本研究では、研究代表者らが開発した特異的タンパク質連結技術を発展させることによって、優れた機能を発揮するバイオ医薬開発技術を確立することを目的としている。本年度は、ヘテロ4量体を形成する短鎖ペプチドを利用することによって、T細胞表面抗原および2種のがん関連抗原を標的とする三重特異性抗体を新たに設計し、その調製系の構築を進めた。大腸菌を用いて組換え抗体を発現させ、培養上清から金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製したところ、高純度な目的タンパク質を得ることができた。フローサイトメトリーを用いて、標的細胞への結合を評価した結果、2種のがん細胞に対する結合は見られたが、T細胞に対する結合は見られなかった。今回設計した組換え抗体では、短鎖ペプチドのヘテロ会合を介して、合計6つの抗体可変領域が連結されるため、可変領域の増加に伴って立体障害が生じ、標的細胞への結合に影響を与えたのかもしれない。現在、原因の究明に向けて検討を進めている。また、ナチュラルキラー細胞表面抗原および2種のがん関連抗原を標的とする三重特異性抗体についても、大腸菌発現系による調製を進めた結果、前述と同様の方法を用いて、目的タンパク質を得ることができた。現在、調製した組換え抗体について、標的細胞に対する結合などの評価を進めており、ナチュラルキラー細胞をエフェクター細胞として用いたがん細胞傷害性の評価も検討している。研究代表者らが開発したタンパク質連結技術を用いて、三重特異性抗体を作製できる可能性を示すことができたと考えているが、作製した組換え抗体は、期待した機能を十分に示さなかったことから、当初計画していた評価に遅れが生じているため。当初計画よりやや遅れているため、期待した機能を示さなかった組換え抗体について、原因の究明を進めつつ、もう一方の組換え抗体について、迅速に評価を行う。進捗状況に応じて、作製する組換え抗体を絞り込む必要性も検討する。
自己組織化単分子膜を反応場とした選択的結合切断反応の機構解明

化学者の夢の一つとして、内殻電子励起によるサイト選択的化学結合切断反応の研究を行い、その選択性が自己組織化単分子膜(SAM)上において格段に向上することを見出した。本研究の主目的はこの反応の選択性が何故SAM膜上でうまく制御できるかという問いに答えることである。その選択性とSAM膜の主鎖の種類と長さとの関連性を精密に調べることにより、選択性はSAM膜上に生じた反応前駆体の寿命に大きく左右されることが判明し、主鎖の長さを短くして寿命を短くすると、反応性は減少するが、選択性は向上することが判明した。申請者らは、気相孤立分子系では観測が困難であった元素選択的内殻電子励起によるサイト選択的イオン解離反応が表面分子系で顕著に観測されることを見出してきた。さらに、反応場としてアルカン主鎖長が15(n=15)の自己組織化単分子膜を用いることによりその選択性が格段に向上することも見出してきた。本研究では、何故、自己組織化膜において選択性が向上するのかを、選択性とアルカン主鎖長との関連を精密に調べることによりサイト選択的イオン解離反応の反応機構の全貌を解明することを目的としている。今年度は、以下の研究を実施した。1.主鎖長が21(n=21)の試料を調整し、その選択的イオン解離反応を調べた結果、選択性が予想通りやや低下することを確認した。2.今年度購入した/AFM/STMヘッドによる電気伝導度の測定も行い、n=15の試料に比べてn=21の試料ではその電気伝導度が1桁以上低下していることを確認した。以上の結果は、申請者が表面分子系で選択性が顕著に観測される理由として提案してきた仮説を支持する重要な知見である。申請者らは、内殻励起による特定の結合切断反応の選択性が自己組織化単分子膜(SAM)上において向上することを見出し、その選択性とアルカン主鎖長との関連を精密に調べることによりサイト選択的イオン解離反応の反応機構の全貌を解明することを目的として平成22年度の研究計画を実施した。しかしながら研究執行途上で当初予定したアルカン主鎖長の短いSAM膜より鎖長の長いSAM膜による実験の方が本研究目的を達成するために有効であることが判明し、新試薬の入手に時間を要したため実験研究の遂行に約5カ月の遅延が生じた。以下、平成22年度の研究実績を記述する。1.新試薬を用いた主鎖長が21(n=21)のSAM膜試料の作成とその評価および予備的な実験を広島大学のHiSORにおいて実施し、内殻励起反応の反応確率は向上するが、結合切断反応の選択性は予想通りやや低下することを確認した。2.SAM膜の主鎖中に芳香環を挿入したSAM膜試料の実験も並行して行い、内殻励起による結合切断の選択性が向上することを確認した。主鎖中に芳香環を挿入したことにより、反応部位と基板間の伝導性が増し、励起状態の寿命が短くなったために、選択的な速い反応以外の2次的反応が抑制されたことにより選択性が向上したと結論した。3.理論面からの研究も並行して進めており、上記1、2の実験結果を含めて、申請者がこれまでに提案してきた仮説を支持する新しい重要な知見を見出した。申請者らは、内殻励起による特定の結合切断反応の選択性が自己組織化単分子膜(SAM)上において向上することを見出し、その選択性とアルカン主鎖長との関連を精密に調べることによりサイト選択的イオン解離反応の反応機構の全貌を解明することを目的として、本研究課題の最終年度である平成23年度の研究計画を実施した。以下、平成23年度の研究実績を記述する。1,アルカン鎖(CH2)nのnが15のMHDA-SAMを標準試料として、昨年度までに購入した鎖長の異なる試薬(n=2-21)を用いてSAM膜試料を作成し、内殻励起によるサイト選択的結合切断反応の実験を実施した。その結果、nの増加とともに内殻励起反応の反応確率は向上するが、結合切断反応の選択性はやや低下することを確認した。3.理論面からの研究も並行して進めており、上記1、2の実験結果は、申請者がこれまでに提案してきた仮説を支持する有力な知見である。
気管支肺アスペルギルス症の発症機序ならびに病原性因子の解明

ヒト気管支粘膜"Organ culture"法やマウス慢性肺アスペルギルス症モデル等を用いて気管支肺アスペルギルス症の発症機序ならびに病原性因子に関する検討を行い、以下の成績を得た。1)A.fumigatusの野生株は気管支粘膜の線毛ビ-ト数の抑制と著しい気道線毛上皮傷害を惹起した。走査電顕による観察では、A.fumigatusの菌糸増殖に伴い、線毛の著しい配列の乱れ、線毛上皮細胞のtight junctionの乖離、線毛細胞の剥離脱落、菌糸の上皮下への侵入像を認めた。2)Alkaline protease単独欠損変異株の気道線毛ビ-ト数の抑制作用および気道線毛上皮傷害作用は上記の野生株に比べて有意に軽微であり、Alkaline proteaseが気道線毛上皮傷害作用の一翼を担っていることが示唆された。以上の成績は欧州呼吸器学会(Stockholm,1996.9)及び米国胸部疾患学会(San Francisco,1997.5)で報告し、現在英文論文作成中である。II.A.fumigatus変異株(単一因子欠損株)によるマウス慢性肺アスペルギルス症の病変の検討。A.fumigatus変異株(alkaline proteaseまたはrestrictocinの単一因子欠損株)とその野生株を、当教室で開発したマウス慢性肺アスペルギルス症モデルに使用し、惹起される病変の広がり、病変の性状、生存率の差異などを検討したが、変異株と野生株の間で有意の差が認められなかった。現在さらにalkaline proteaseとrestrictocinの両者欠損株を用いた検討を継続している。III.A.fumigatus培養濾液中の高分子のヒト好中球機能抑制物質および気道線毛上皮傷害物質に関しては、想定される複数の物質(protease活性を有する物質と欠く物質)の分離同定を継続中である。
動物細胞膜カルジオリピンの機能に関する遺伝生化学的研究

平成5年度には、ポリエステル布レプリカ法を用い、カルジオリピン(CL)の生合成前駆体と考えられるホスファチジルグリセロール(PG)の生合成初発反応を触媒するホスファチジルグリセロリン酸合成酵素(PGS synthase)欠損温度感受性変異株(PGS-S)を分離し、その性状解析を行った。その結果、PGS-Sを非許容温度下で培養すると、総リン脂質に占めるPG、CLの割合は野性株の10%、30%に減少し、同時に、ミトコンドリアの形態と機能が異常となることを明らかにした。これらのことから、CLがミトコンドリア機能発現に必須であることが示唆された。平成6年度は、PGS-S細胞のミトコンドリア電子伝達系について検討した。細胞ホモジネートを用いてミトコンドリア電子伝達系の種々の活動を測定した結果、非許容温度で培養したPGS-S細胞ホモジネート中のロテノン感受性NADHオキシダーゼ活性が野性株の約50%に低下していた。さらに、電子伝達系の中でもロテノン感受性NADH-ユビキノンリダクターゼ活性(コンプレックI)が野性株に比べ約1/5に低下していた。PGS-Sの復帰株では野性株と差はなかった。以上の結果から、CLがミトコンドリア電子伝達系で重要な働きをしていることが明らかとなった。PGS-Sを用いてPGP synthase遺伝子のクローニングを試みた。HeLa細胞及びCHO-Kl細胞のゲノムDNA、CHO-Kl細胞のcDNAをCa^<2+>ホスフェート法やリポフェクション法でPGS-S細胞に導入し、非許容温度で増殖するトランスフォーマントの選択を行った。現在のところまだ目的のトランスフォーマントは得られておらず、研究を継続中である。なお、細胞分画法によりPGP synthaseはミトコンドリアに局在することを明らかにすることができた。CL生合成欠損変異株(PGS-S)は、ポリエステル布レプリカ法を用い、CLの生合成前駆体と考えられるホスファチジルグリセロール(PG)の生合成初発反応を触媒するphosphatidylglycerophosphate synthase (PGP synthase)の欠損株として分離することに成功した。平成5年度の研究成果は次の通りである。(1)PGS-S株の形態学的研究;親株とPGS-Sの細胞内構造を電子顕微鏡を用いて解析した結果、非許容温度下で培養したPGS-S細胞のミトコンドリアは野性株のものに比べサイズが著しく大きく、電子密度が低く、クリステも異常であることが判明した。これらの結果から、CLがミトコンドリアの構造・機能に必須であることが強く示唆された。(2)PGS-S株のintact細胞における機能異常;PGS-S株は非許容温度下において以下の性質を示した。:(a)グルコースをガラクトースで置換した培地では増殖しない。(b)ATPの産生が低下する。(c)解糖系の活性増加により乳酸の産生が増加する。(d)酸素消費能が低下する。以上の結果は、先の形態学的観察結果とともに、CLがミトコンドリア機能発現に必須であることが明らかにされた。

その結果、PGS-Sを非許容温度下で培養すると、総リン脂質に占めるPG、CLの割合は野性株の10%、30%に減少し、同時に、ミトコンドリアの形態と機能が異常となることを明らかにした。これらのことから、CLがミトコンドリア機能発現に必須であることが示唆された。平成6年度は、PGS-S細胞のミトコンドリア電子伝達系について検討した。細胞ホモジネートを用いてミトコンドリア電子伝達系の種々の活動を測定した結果、非許容温度で培養したPGS-S細胞ホモジネート中のロテノン感受性NADHオキシダーゼ活性が野性株の約50%に低下していた。さらに、電子伝達系の中でもロテノン感受性NADH-ユビキノンリダクターゼ活性(コンプレックI)が野性株に比べ約1/5に低下していた。PGS-Sの復帰株では野性株と差はなかった。以上の結果から、CLがミトコンドリア電子伝達系で重要な働きをしていることが明らかとなった。PGS-Sを用いてPGP synthase遺伝子のクローニングを試みた。HeLa細胞及びCHO-K1細胞のゲノムDNA、CHO-K1細胞のcDNAをCa^<2+>ホスフェート法やリポフェクション法でPGS-S細胞に導入し、非許容温度で増殖するトランフォーマントの選択を行った。現在のところまだ目的のトランスフォーマントは得られておらず、研究を継続中である。なお、細胞分画法によりPGP synthaseはミトコンドリアに局在することを明らかにすることができた。
発熱植物ザゼンソウの体温調節に関わる温度センシングモジュールの探索と同定

一般に植物の体温は外気温の変動とともに変化すると考えられている。しかしながら、寒冷環境で積極的に発熱し、その体温をほぼ一定に調節できるザゼンソウは植物界では希な恒温植物である。このような発熱植物ザゼンソウを対象とした本研究は、「植物はどうやって体温を調節しているのか?」という生物学上の大きな問題を解き明かそうとするものである。