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日本人によるショパン作品の演奏解釈の変遷と研究との関わり

それをもとに、共著で研究論文「フリデリク・ショパン国際ピアノ・コンクールにおけるエディションの選択とその変化」を発表した。平成29年度は、前年度の《ワルツ》嬰ハ短調作品64-2のエディション研究で明らかになったことが演奏とどのような関連が見られるのか、音響ソフトを用いて演奏におけるテンポの速さや揺れ、強弱の変化等を考察する予定であったが、この研究は、多大な時間を要することと、演奏と楽譜との関連性を明らかにすることが難しいため、現段階では本格的には行われていない。また、他の作品において、ショパンの作品の特徴的な記譜法(拍と同時に前打音を打鍵することなど)について、演奏方法における時代的特徴の傾向を分析し考察する研究には取掛かっているが、纏めには至っていない。そして、平成30年度の国際ショパン学会(9月26-28日、ワルシャワ)に、3名の連名で応募した発表が認められた。発表が認められたこと自体が大きな成果といえるが、さらに発表に向けて全力を尽くす。最終年度の平成30年度は、代表者岡部玲子と協力者2名(武田幸子、多田純一)による共同研究がNIFC主催のショパン学会の発表に採択され、9月に3名で共同発表`Performance Styles of Chopin's Music by Japanese Musicians during the Meijiperiod'を実現した。更に岡部玲子は、ショパン作品に独自の演奏方法について演奏と楽譜の関係を分析・考察し、「ショパンの前打音に関する一考察ー《バラード》第3番変イ長調作品47を例としてー」を発表した。一方、分担者の加藤一郎氏は、第1回ショパン国際ピリオド楽器コンクール(ワルシャワ、9月214日)を視察し、その成果を「「第1回ショパン国際ピリオド楽器コンクール」の芸術的・社会的意義に関する研究ー演奏解釈と楽器及び楽譜の関連を通してー」として発表した。平成28年度は、ショパン作曲《ワルツ》op.64 No.2についてエディション研究を主とした論文を4名の連名にて1件発表した。平成29年度は、前述の論文において、楽譜における異同の内容および分類(1.ショパンによる弟子の楽譜への書き込みが伝承により一般化する例、2.類似箇所の音などが転用され定着する例、3. 2つの資料からの選択あるいはそれらの混合/改変が行われる例、4.表現の変化が見られる例、5.長い間共通認識となっていたタイの例、6.校訂者が改善を試みた例)、そして海外で出版された楽譜が国内で出版された楽譜にどのような影響を与えたのかを明らかにした上で、美的考察を行った。平成29年度は、それらのエディション研究で明らかになったことが、演奏にはどのような関連が見られるのかを考察する。具体的には、音響ソフトを用いて演奏におけるテンポの速さや揺れ、強弱の違い等を考察する。
計算機による身体言語理解に関する基礎研究

人と計算機の対話、さらには計算機支援により人の間のコミュニケ-ションを促進する方法として、本研究では人間のコミュニケ-ションで重要な役割を果たしているノンバ-バル言語に注目し、特に身体言語を導入するための基礎研究を行った。1.2次元身体骨格からの3次元形態の推定計算機との対話によって2次元画像から抽出した身体骨格と、計算機がもつ身体寸法、関節の可動域などの知識に基づいて、3次元空間での人の形態を推定するアルゴリズムの有効性を再確認した。本法により、計算機は約52万の可能性を少数個の3次元形態の候補にまで絞り込むことができた。2.全身の形態を扱える形態コ-ドの導出昨年度に提案した手のコ-ドとは異なる観点で全身形態コ-ドを作成した。これは関節の可動域を等分割し、それにパラメ-タを割り当てる方法であり、24のコ-ドで全身形態が記述される。また音声言語の表記法と身振りとの対比を行って、2.のコ-ドと手の形態コ-ドを用いて身振りを記述する手法を導出した。この方法が計算機処理に適しており、入力文に対応する指文字刊などをグラフイック表示できることを確認した。4.人体皮膚の写実的表示法の導出人の皮膚を皮膚色要素と形態要素に分け、それぞれを皮膚らしくグラフィック表示するための基本アルゴリズムを導出した。各要素のパラメ-タを指定することで多様な皮膚を表現できる。これらを人体モデルにマッピングすることで比較的リアルな表示を得ることができる。
スポーツクライミングにおける人体の運動知能の獲得と最適化

本年度は,モーションキャプチャシステム及び力覚センサを組み合わせることによって,スポーツクライミングの運動計測システムを開発した.まず,モーションキャプチャシステムにおいては,クラミング壁によって一方向が遮蔽されているため,既存のモデルでは計測が困難である.そのため,クラミング専用全身モデルを開発し,計測を行った.次に,多種多様なホールドの取り付けが可能な力覚センサシステム開発を行った.6軸力覚センサを壁とホールドの間に設置し,カバー等を組み合わせることで,ホールドのみに適切に力がかかるよう設計した.さらに,3次元レーザスキャナFAROを用いて壁形状,ホールドの3次元位置計測を行った.これらの同期処理を行い,情報を統合することで,幾何的な運動データと力学的な運動データを同時に計測可能なシステムを構築した.また,本システムを用いて,実際のクライミングジムにおいて運動計測実験を行った.初級者と上級者それぞれの乗り込み動作を比較し,重心の軌跡や各ホールドにかかる力・モーメントを計測・解析した.これらのデータを比較することで,初級者と上級者の動作の間に有意な差が認められた.この結果は従来研究結果を裏付けるものであり,クライミングの課題設定を行うルートセッターによって結果が妥当であることを確認した.これらの運動計測実験により提案システムの有効性を確認した.また同時に,従来研究とは異なる運動特徴が力覚センサにより計測されており,詳細を解析中である.概ね当初の計画通りに研究が進んでいる.ただし,力センサの無線化については,設置スペースの関係から見送っている.本年度の実験結果を精査し,構築したシステムの改良を行う.その後,計測データから全身の内力や各部位にかかる負荷の計算を行う.また,計測データを競技者に提示するインターフェース開発を行う.これにより運動計測後,競技者に計測データを速やかに適切に提示し,コーチングやトレーニングに利用することが可能となる.また,今年度の研究成果をもとに学会発表を行う.本年度は,モーションキャプチャシステム及び力覚センサを組み合わせることによって,スポーツクライミングの運動計測システムを開発した.まず,モーションキャプチャシステムにおいては,クラミング壁によって一方向が遮蔽されているため,既存のモデルでは計測が困難である.そのため,クラミング専用全身モデルを開発し,計測を行った.次に,多種多様なホールドの取り付けが可能な力覚センサシステム開発を行った.6軸力覚センサを壁とホールドの間に設置し,カバー等を組み合わせることで,ホールドのみに適切に力がかかるよう設計した.さらに,3次元レーザスキャナFAROを用いて壁形状,ホールドの3次元位置計測を行った.これらの同期処理を行い,情報を統合することで,幾何的な運動データと力学的な運動データを同時に計測可能なシステムを構築した.また,本システムを用いて,実際のクライミングジムにおいて運動計測実験を行った.初級者と上級者それぞれの乗り込み動作を比較し,重心の軌跡や各ホールドにかかる力・モーメントを計測・解析した.これらのデータを比較することで,初級者と上級者の動作の間に有意な差が認められた.この結果は従来研究結果を裏付けるものであり,クライミングの課題設定を行うルートセッターによって結果が妥当であることを確認した.これらの運動計測実験により提案システムの有効性を確認した.また同時に,従来研究とは異なる運動特徴が力覚センサにより計測されており,詳細を解析中である.概ね当初の計画通りに研究が進んでいる.ただし,力センサの無線化については,設置スペースの関係から見送っている.本年度の実験結果を精査し,構築したシステムの改良を行う.その後,計測データから全身の内力や各部位にかかる負荷の計算を行う.また,計測データを競技者に提示するインターフェース開発を行う.これにより運動計測後,競技者に計測データを速やかに適切に提示し,コーチングやトレーニングに利用することが可能となる.また,今年度の研究成果をもとに学会発表を行う.(理由)学会発表を次年度に行う予定に変更したため,旅費の支出が少なかった.(使用計画)次年度の学会発表の旅費に使用する予定である.
立体保護されたp性の高いリンを鍵構造とするリン版ポリアニリンの合成研究

嵩高い芳香族置換基導入により結合角が大きく、高いp性を有し、更に立体保護されたリン原子を鍵構造とするリン版ポリアニリンの合成を目指した合成研究を展開した。嵩高い芳香族置換基を有するジクロロホスフィンへの求核置換及び還元反応により、2つの芳香族置換基を有するリン版ポリアニリンの部分構造に相当する2級ホスフィンを合成した。さらに遷移金属錯体を用いたクロスカップリング反応によるリン版ポリアニリン合成の単量体に相当する、2、6位にアルキル或はアリール基が置換した4-ブロモフェニルホスフィン誘導体を対応するジクロロホスフィンやホスホン酸ジエステルの還元により合成し、その反応性を検討した。立体混雑したリン版ポリアニリン合成における重要な鍵合成中間体となることが期待できる「芳香環上に容易に官能基導入が可能であるジアリールホスフィン誘導体」の合成を検討した。まず、2-ヨード-1,3,5-トリブロモベンゼンとアリールGrignard試剤との反応により進行する2回の連続したベンザインの生成及びアリールGrignard試剤の付加を経由して得られる4-ブロモ-2,6-ジアリールフェニルGrignard試剤をヨウ素で捕捉することにより2,6位にアリール基を有する4-ブロモヨードベンゼン誘導体を合成した。次に、ヨウ素を選択的にハロゲンーメタル交換し三塩化リンと反応させることによりリン原子上には2つの嵩高いm-ターフェニル型置換基が置換し、更にm-ターフェニル型置換基上にはリン原子の4位にブロモ基が置換した立体混雑したジアリールクロロホスフィンを合成することが出来た。特にアリール基として4-t-ブチルフェニル基を用いることにより遠隔からリン原子周辺を覆うことができた。更に対応するトリアリールホスフィンへと誘導し、その構造をX線結晶構造解析により明らかにした。これに関しては既に投稿、受理され2014年度中に発表予定である。一方、4位に電子吸引基を有する立体混雑したトリアリールホスフィンの光化学の研究過程において、いくつかの誘導体では近紫外から可視光の照射により効率良くリンー炭素結合が切断され低濃度では主にジアリールホスフィンが生成することを見出した。この反応は安定な前駆体からの立体混雑したリン版ポリアニリン合成における鍵反応として用いることが出来る可能性があり、立体混雑したトリアリールホスフィンがリン版ポリアニリンの前駆体と成りうることが示唆された。立体保護されたリン版ポリアニリン合成における重合反応における単量体やリン版ポリアニリンのモデル化合物合成を目的として4-ブロモアリール基を有する立体保護された1級及び2級ホスフィンの合成を検討した。特に平成25年度に引き続き検討した立体保護基としてm-ターフェニル型置換基を有するホスフィンについては、立体保護されたリン版ポリアニリン合成における遷移金属錯体触媒を用いたクロスカップリング反応による重合反応の単量体に相当する4-ブロモ-2,6-ビス(2,4,6-トリイソプロピルフェニル)フェニル基を有する1級ホスフィンを合成し安定な化合物として単離することが出来た。更に単量体ユニットに相当する4-ブロモ-2,6-ビス(2,4,6-トリイソプロピルフェニル)フェニル基及びフェニル基を有する2級ホスフィンを合成し空気中安定な化合物として単離した。また、立体保護されたリン版ポリアニリンの部分構造や末端部に相当する嵩高いアリール基と4ーブロモフェニル基や5-ブロモ-2-チエニル基を有するジアリールホスフィンを3塩化リンにアリール基を連続して導入することにより合成した。一方でこれらの2級ホスフィンのブロモ基のアルキルリチウムを用いたハロゲン-メタル交換及びクロロホスフィン類との反応についてはハロゲン-メタル交換に関してtーブチルリチウム等の比較的強い条件を要することが分かった。2015年度は立体保護されたリン版ポリアニリンへの遷移金属錯体触媒存在下でのクロスカップリング反応によるアプローチを目指し、単量体として期待される2,6位に嵩高いアリール基或いはアルキル基を有する4-ブロモフェニルホスフィンの合成を行った。前年度に合成した4-ブロモ-2,6-ビス(2,4,6-トリイソプロピフフェニル)ホスフィンは1級ホスフィンとしては空気中安定であった反面、反応性の低さやジクロロホスフィンの水素化リチウムアルミニウム還元時の脱臭素が見られたため、新規に4-ブロモ-2,6-ジイソプロピルフェニルホスフィン及び4-ブロモ-2,6-ジシクロヘキシルフェニルホスフィンを、対応する1,3-ジアルキル-5-ブロモ-2-ヨードベンゼンをヨウ素-リチウム交換とクロロリン酸ジエチルとの反応により(ブロモアリール)ホスホン酸ジエチルとし、さらに還元することにより合成した。(ブロモアリール)ホスホン酸ジエチルの1級ホスフィンへの還元では水素化ジイソブチルアルミニウムを用いることにより脱臭素は回避できたが高収率を得るためには過剰の還元剤を要した。これらの単量体を用いてパラジウム錯体触媒存在下のクロスカップリング反応による重合反応を検討した。本研究を通じて多様な大きさ、形のアルキル基、アリール基を2,6位に有する立体保護された4-ブロモフェニルホスフィンを合成することができた。また、リン版ポリアニリンの部分構造に相当する立体保護されたジアリールホスフィン等を合成することができた。一方で、一連の4-ブロモアリール基を有する1級ホスフィンの多量化反応についてはリン-炭素結合のみならずリン-リン結合や炭素-炭素結合の形成が示唆されており生成物は広義のリン版ポリアニリンに留まると考えられる。

精密に構造制御されたリン版ポリアニリンの合成には更なる反応条件の検討が必要である。嵩高い芳香族置換基導入により結合角が大きく、高いp性を有し、更に立体保護されたリン原子を鍵構造とするリン版ポリアニリンの合成を目指した合成研究を展開した。嵩高い芳香族置換基を有するジクロロホスフィンへの求核置換及び還元反応により、2つの芳香族置換基を有するリン版ポリアニリンの部分構造に相当する2級ホスフィンを合成した。さらに遷移金属錯体を用いたクロスカップリング反応によるリン版ポリアニリン合成の単量体に相当する、2、6位にアルキル或はアリール基が置換した4-ブロモフェニルホスフィン誘導体を対応するジクロロホスフィンやホスホン酸ジエステルの還元により合成し、その反応性を検討した。東日本大震災後に震災対策として建てられた免震新棟が2015年9月に完成し、10月から12月にかけて大型機器の移動を含む大規模な引っ越しがあり実験停止となったため研究が遅延した。有機典型元素化学、物理有機化学平成26年度までに合成した4-ブロモ-2,6-ビス(2,4,6-トリイソプロピルフェニル)フェニルホスフィンに代表される「4位にブロモ基を有する立体保護基」を有する1級ホスフィンのパラジウム,銅等の遷移金属錯体触媒を用いたクロスカップリングによる立体保護されたリン版ポリアニリンの合成研究を遂行する。同時に上記ホスフィン類のジハロベンゼン、チオフェン誘導体等との遷移金属錯体触媒を用いたクロスカップリング反応や、上記ブロモアリールホスフィン類合成時の合成中間体として得られるクロロホスフィン類へのアリールリチウム等の求核試剤との反応を用いることによりリン版ポリアニリンの部分構造、オリゴマーの合成を検討する。また、「4位にブロモ基を有する立体保護基」を有する2級ホスフィン誘導体はp-フェニレンジアミン等のアニリン誘導体との遷移金属錯体触媒を用いたクロスカップリングや銅触媒を用いたウルマン型カップリングによりポリホスフィンーポリアニリン共重合体へと誘導できることが期待される。そこで、上記ブロモアリール基を有する2級ホスフィン誘導体への遷移金属触媒反応によるジアリールアミン部位の構築を検討しポリホスフィンーポリアニリン共重合体合成を検討する。さらに、ブロモアリール基を有する2級ホスフィン誘導体を鍵合成中間体とする遷移金属触媒反応によるジアリールアミン部位の構築や求核的な窒素官能基導入と還元によるポリホスフィンーポリアニリン共重合体の部分構造の構築についても検討する。最終的には、これらリン版ポリアニリン、そのオリゴマー、ポリアニリンとの共重合体の構造を分光学的測定により明らかにするとともに、その酸化還元的性質の電気化学的測定や化学的酸化による探究やプロトン化による電子状態の変化を明らかにする。本研究で用いるジアリールクロロホスフィン等の合成中間体は、立体混雑したトリアリールホスフィン等の多様な興味深い化合物へと誘導することが出来、更にホスフィニルラジカル等の興味深い反応中間体の前駆体と成るものも多い。また、合成的な可能性や反応性を明らかにすることは該当する合成中間体の実践的な大きさや有用性を見積もることにつながる。このような検討を並行しながら研究を進めた結果、結果的に研究上の寄り道が多くなり研究の進行が遅れた。
甲状腺癌細胞内情報伝達機能異常の解析による癌治療への基礎的検討

1.放射線照射による甲状腺細胞の応答について甲状腺細胞において放射線照射による生理的および癌化後の細胞内応答変化を調べるために、甲状腺初代培養細胞と癌細胞継代株を用いて実験をおこなった。まず放射線2Gy照射後の生存率は初代細胞18%、癌細胞株では58%以上であった。また細胞周期解析では初代細胞ではG1期周期停止を認めたが、p53遺伝子に変異を持つ癌細胞ではG1期周期停止はおこらずG2期で周期停止を認めた。こうした現象は細胞内蛋白p53の異常の有無に由来するためと考えられた。さらに放射線照射により甲状腺細胞に特異的な反応が起こりうるかp53下流遺伝子群(p21/WAF1,GADD45,Bax,FAS)の反応について調べたところp21/WAF1では照射後に発現増加を認めたがGADD45、Bax、FASは発現に変化を認めなかった。また、初代培養細胞では正常p53が存在するにもかかわらず放射線によるアポトーシスが起こりにくいことがわかった。これより、放射線に対し甲状腺細胞では特異的な反応が認められることが確かめられた。この結果はCancer Res.に掲載された。2.セミオート尿中ヨード測定法の開発甲状腺の分化、増殖に関与する因子の一つとしてヨードがある。このヨード摂取の量を正確かつ迅速に測定するために、尿中ヨードのセミオートマチック測定法を開発した。この測定法では多数のサンプル(30/時間)を処理することが可能であり従来の測定法と比較検討し同程度以上の感受性を有していた。この結果はClinical Chemistryに掲載された。甲状腺癌ではTGF-β1およびその受容体の発現を認めることがすでに報告されている。甲状腺癌細胞株を用いTGF-β1の作用を調べたところ、細胞増殖抑制作用を認めた。TGF-β1の増殖抑制作用がどのようなメカニズムを介して起こっているかを増殖に関連する遺伝子c-mycを指標として調べたところTGF-β1の量依存症c-myc mRNAの発現低下を認めた。またc-mycの上流にTGF-βの反応領域があるかを調べたところc-myc上流-86-63領域に結合する核蛋白をTGF-β1が抑制を介して、c-mycの発現を抑制していることがわかった。この結果はEndocrinology 135:1378,1994に掲載された。さらに甲状腺C-細胞においてはRET遺伝子の正常な発現がその分化を規定していると考えられる。甲状腺髄様癌においてRET遺伝子の点突然変異を調べたところ散発性髄様癌におけるRET遺伝子の点突然変異を調べたところ散発性髄様癌10例中4例にエクソン16のコドン918においてATGがACG(メチオニンがスレオニン)に変異していることが証明された。この結果はEnndocrine Journalに掲載予定である。またチェルノブイリ原発事故後の小児甲状腺癌の発生に関して、スクリーニング調査を現地で行なった。その結果新たに事故後に甲状腺癌増加が認められ、その結果をまとめた。1,甲状腺細胞に対する放射線の生理学的な反応の解析長崎被爆者やチェルノブイリ事故後の疫学調査の結果、甲状腺組織は放射線照射により癌化しやすい組織であることが報告されているが、細胞レベルでどのような反応がおこっているかについては理解されていない。我々は甲状腺初代細胞および甲状腺癌細胞株に放射線を照射することでどのような反応がおこるか解析をおこなった。p53正常の初代細胞ではp53変異を持つ癌細胞に比べ放射線照射後の生存率の低下を認めることがわかった。さらに照射後の細胞周期を調べると初代培養細胞ではG1期で細胞周期の停止(G1アレスト)を誘導されるが癌細胞ではG1アレストを認めずG2期での細胞周期停止(G2アレスト)を認めた。

即ちG1アレストは正常p53に依存性であるがG2アレストは正常p53に非依存性であることがわかった。さらに放射線照射後のアポトーシスに関しては甲状腺細胞ではp53の状態にかかわらず起こりにくいことがあきらかになった。正常p53により転写活性が増強する遺伝子群の放射線照射後の発現増加について調べたところG1アレストに関与する遺伝子p21/WAF1の発現の増加は認めたがGADD45遺伝子の発現は不変であり、他の組織との放射線照射後の細胞内反応の違うことが明らかになった。2,甲状腺髄様癌における遺伝子異常散発性の甲状腺髄様癌においてRET癌遺伝子の変異について解析したところ、コドン918の部位に40%の頻度で変異があることが明らかになった。この変異が髄様癌の発症の一因になっていることが推測された。
カルニチン欠乏症(JVS)マウスの病態発生に及ぼす環境ストレスの影響

C3H.OHに発生したJVSマウスのjvs遺伝子をC57BL/6マウスに戻し交配して得られたB6-jvsマウスを生産し、JVSマウス、jvsヘテロ(表現型は正常)、正常ホモマウスで、以下の実験を行った。動物は34ヶ月齢で実験に供した。1)熱産生、体温の測定環境温度32°Cでの酸素消費にはJVS群と対象群に差は見られず、基礎代謝に違いの無いことが推察された。環境温度24°Cとすると、酸素消費増加量には有意な差が見られ、JVSマウスで有意に低かった。またJVSマウスへのカルニチン添加食の給餌により若干の酸素消費量増加が見られた。さらに環境温度24,28,30,32°Cにおける体温は24°Cで有意な低下が観察され、環境温度上昇と共に高くなり、3032°Cでほぼ一定となったが、正常マウスに比べるとやや低い傾向が見られた。従ってJSVマウスは熱産生能が低く、至適飼育温度は30度前後であることが示唆されたが、32°C環境においても有意差はないものの、低体温になる傾向が観察されたことから、長期飼育による観察を要するものと推察された。2)環境温度24°CでのJVSマウスの寿命通常の飼育室(約24°C)でのJVSマウスの寿命は、通常の自由給水自由摂餌下では正常マウスの23年に比べ有意に短く、平均寿命355日であった。このことより、JVSマウスでは老化が促進していることが示唆された。また、24度室温下で飼育されたJVSマウスの血清中の免疫グロブリン量は、正常個体に比べ差は見られなかったが、血清中のチロシンキナーゼを測定したところ、JVSマウスで有意に低い値となっており、寿命短縮と免疫系の異常の探索を要するものと推察された。C3H.OHに発生したJVSマウスのjvs遺伝子をC57BL/6マウスに戻し交配して得られたB6-jvsマウスを生産し、JVSマウス、jvsヘテロ、正常ホモマウスで、以下の実験を行った。1)熱産生、体温の測定環境温度32°Cでの酸素消費および体温にはJVS群と対照群に差は見られず、基礎代謝に違いの無いことが推察された。さらにJVSマウスでは、体温にも環境温度24°Cで有意な低下が観察され、JVSマウスの熱産生能が低いことが示唆された。24度室温下で飼育されたJVSマウスではNatural Killer活性が対照群に比べ有意に低かった。3)血清イムノグロブリンおよび甲状腺ホルモン(チロシンキナーゼ)測定24度室温下で飼育されたJVSマウスの血清中の免疫グロブリン量(IgMおよびIgG)は、正常個体に比べ差は見られなかったが、血清中の甲状腺ホルモン(チロシンキナーゼ)を測定したところ、JVSマウスで有意に低い値となった。今後はマイトジェン刺激による免疫グロブリン産生応答あるいは細胞性免疫応答について検討するとともに、差の見られた項目については、環境温度32度で飼育、馴化したマウスにおいて検討を行う。
大豆ペクチンメチルエステラーゼと煮豆の硬度との関係に関する遺伝学的・形態学的研究

煮豆や納豆等大豆加工食品では、加工の過程で加熱処理により調製する煮豆(蒸煮大豆)は柔らかいほうが好ましいとされている。申請者らの研究成果より、大豆のペクチンメチルエステラーゼ(PME)遺伝子であるGlyma03g03360が煮豆の子葉の硬さに大きく影響を及ぼすことが明らかとなった。しかし、その後の研究で、煮豆の種皮の硬度や種子保存中の煮豆の硬度変化には別のPMEが関与する可能性が示唆された。そこでGlyma03g03360以外のPME遺伝子変異体や、変異体と既存品種との交配後代等を用いて、煮豆種皮の硬度や、種子の保存中の煮豆硬度変化との関係を明らかにするとともに有望な育種素材を作出する。
薬物依存成立の共通発現機序の同定とその遺伝子治寮への応用

本研究では、薬物依存形成過程に共通するL型高電位開口性カルシウムチャネル(HVCC)の機能亢進の機序解析と、薬物依存の遺伝子治療への応用を試みる目的で、薬物依存形成時におけるL型HVCC subunitの発現調節機序と依存状態の関連性について検討した。諸種の薬物依存モデル動物あるいは依存性薬物を連続曝露した神経細胞を用い、脳内L型HVCCの機能変化の共通性および相違点について検討したところ、精神および身体依存を誘発する依存性薬物ではその種類に関係なく共通にL型HVCCの機能亢進を誘導するが、その発現様式には明らかな相違が認められた。この薬物依存成立過程において認められるHVCCの機能変化には、L型HVCCα1subunitのリン酸化に伴う調節は関与しないこと、細胞内リアノジン受容体(RyR)機能元進に伴う細胞内Ca^<2+>濃度の上昇(Ca^<2+>-induced Ca^<2+> release ; CICR)が重要な役割を担っていることが判明した。さらに、細胞内RyR遮断薬を前処置した動物では、依存性薬物による報酬効果が減弱・消失することを初めて明らかにしたが、身体依存の成立を抑制することはできなかった。L型HVCCの機能調節に連関する諸種の細胞内機能性蛋白の発現・動態変化について検討したところ、細胞内Ca^<2+>センサー蛋白(NCS-1)の有意な細胞内局在の変化が、細胞内RyRの機能亢進に先行して生じることが明らかとなった。本研究の結果から、依存性薬物によるL型HVCCの機能亢進を介した細胞内Ca^<2+>の動態変化が薬物依存形成に重要な役割を担っているものと考えられ、またこれら疾患に至る神経化学的な共通経路としてL型HVCCの発現変化が極めて重要であることが判明した。さらに、身体依存にみられるL型HVCCの発現変化の機序は精神依存の場合とは異なる様式であることが判明した。本研究では、薬物依存形成過程に共通するL型高電位開口性カルシウムチャネル(HVCC)の機能亢進の機序解析と、薬物依存の遺伝子治療への応用を試みる目的で、本年度は薬物依存形成時および退薬症候発現時におけるL型HVCC subunitの発現調節と依存状態の関連性について検討した。諸種の薬物依存モデル動物あるいは依存性薬物を連続曝露した神経細胞を用い、脳内L型HVCCの機能変化の共通性および相違点について検討したところ、身体依存を誘発する依存性薬物ではその種類に関係なく共通にα1およびα2/δsubunitの発現増加を誘導するが、βsubunit発現は依存性薬物の種類により固有の発現変化を示した。薬物依存成立時あるいはその退薬後に見られる症状は、依存性薬物の種類に関係なく極めて類似していることから、これら疾患に至る神経化学的な共通経路としてL型HVCC α1およびα2/δsubunitの発現変化が極めて重要であることが判明した。さらに、神経細胞におけるHVCC subunitの発現調節と依存状態の経時変化ついても検討したところ、薬物依存の成立に先行してHVCCの機能変化が生じること、またその機能変化にはHVCC機能の調節機構の1つとして考えられているL型HVCC α1 subunitのリン酸化に伴う調節によるものではないことが判明した。さらに、L型HVCC機能の調節に連関する諸種の細胞内機能性蛋白の発現・動態変化について検討したところ、細胞内calcium sensor蛋白の有意な細胞内局在の変化が観察された。本研究の結果から、依存性薬物によるL型HVCC α1 subunitの発現増加を介した細胞内Ca^<2+>の動態変化が薬物依存形成に重要な役割を担っているものと考えられる。

本研究では、薬物依存形成過程に共通するL型高電位開口性カルシウムチャネル(HVCC)の機能亢進の機序解析と、薬物依存の遺伝子治療への応用を試みる目的で、昨年度に続き薬物依存形成時におけるL型HVCC subunitの発現調節機序と依存状態の関連性について検討した。諸種の薬物依存モデル動物あるいは依存性薬物を連続曝露した神経細胞を用い、脳内L型HVCCの機能変化の共通性および相違点について検討したところ、精神および身体依存を誘発する依存性薬物ではその種類に関係なく共通にL型HVCCの機能亢進を誘導するが、その発現様式には明らかな相違が認められた。この薬物依存成立過程において認められるHVCCの機能変化には、L型HVCC α1 subunitのリン酸化に伴う調節は関与しないこと、細胞内リアノジン受容体(RyR)機能亢進に伴う細胞内Ca^<2+>濃度の上昇(Ca^<2+>-induced Ca^<2+> release)が重要な役割を担っていることが判明した。さらに、細胞内RyRを一過性に機能抑制させた動物では、依存性薬物による報酬効果が減弱・消失することが初めて観察されたが、身体依存の成立を抑制することはできなかった。L型HVCCの機能調節に連関する諸種の細胞内機能性蛋白の発現・動態変化について検討したところ、細胞内Ca^<2+>センサー蛋白(NCS-1)の有意な細胞内局在の変化が、細胞内RyRの機能亢進に先行して生じることが明らかとなった。本研究の結果から、依存性薬物によるL型HVCCの機能亢進を介した細胞内Ca^<2+>の動態変化が薬物依存形成に重要な役割を担っているものと考えられ、またこれら疾患に至る神経化学的な共通経路としてL型HVCCの発現変化が極めて重要であることが判明した。さらに、身体依存にみられるL型HVCCの発現変化の機序は精神依存の場合とは異なる様式であることが判明した。
質量分析ナノーディラトメトリによる中性子照射欠陥の回復及び生成ガスの放出挙動

核融合炉や核分裂炉においては、各種セラミックスが使用されている。セラミックスの中性子照射損傷はその結晶構造特性に著しく影響されることが分かってきたが、その本質である生成欠陥の特定、それらの回復機構は必ずしも明らかではなく、セラミックスの中性子照射損傷の統一的な解釈は得られていない。さらに、核変換で生成するヘリウムが、はじき出しによる格子欠陥と相互作用をして複雑な挙動を示すと想定される。本研究では、照射済み各種セラミックスを質量分析装置を組み合わせた高精度熱膨張計を用いて長さの回復挙動を精密に解析することにより、生成した格子欠陥の種類と熱安定性を明らかにした。本研究では、種々の条件で中性子照射した炭化ケイ素を始めとする各種セラミックスについて、質量分析装置を付加した超精密熱膨張計を用いて、徐々に昇温しながら、高温で長さ(体積)変化とその時のヘリウムなどのガス放出を同時にその場測定し、核変換ガスの挙動を含めた照射欠陥の回復挙動、すなわち安定性を明らかにすることを目的とする。本年度の研究実績を次に示す。1)非密封放射性物質取扱施設に設置されている超高精度熱膨張計に、質量分析装置を新規に購入して連結した。精度の維持のため、空調設備の有る部屋の、除振台の上に設置した。2)材料試験炉で中性子照射したSiC、SiAlONおよびSi_3N_4等について、長さ測定、格子定数測定を行った。また低温から順次高い温度に電気炉にょり等時アニールを行い、室温にもどしてその変化を観察した。3)2)に示した同一照射条件の試料を、超高精度熱膨張計を用いて、ある一定温度に昇温後、その温度に6時間以上一定に保ち、長さの時間変化を1ナノメートル感度で検出した。ついで、温度を少し昇温し、試料長が照射以前の長さに戻るまで順次温度を上昇しながら繰り返し測定した。4)測定温度範囲全体について変化の活性化エネルギーを求め、欠陥回復機構および温度によるその変化を明らかにした。5)すでに日本原子力研究所の材料試験炉で中性子照射した焼結助剤としてホウ素を添加したSiC焼結体と、ホウ素以外の助剤を添加したSiC焼結体に関して、本研究で組み立てる放出ガスの質量分析が同時に測定可能な超高精度膨張計を用いて、照射後アニールによる長さ変化とヘリウム放出速度を高温において、"その場"連続同時測定し、放出ガスの質量分析と長さ測定の同時計測が可能なことを確認した。本研究では、種々の条件で中性子照射した炭化ケイ素を始めとする各種セラミックスのついて、質量分析装置を付加した超精密熱膨張計を用いて、徐々に昇温しながら、高温で長さ(体積)変化とその時のヘリウムなどのガス放出を同時にその場測定し、核変換ガスの挙動を含めた照射欠陥の回復挙動、すなわち欠陥の安定性を明らかにすることを目的とする。1)東工大に輸送した、東北大学金属材料研究所附属量子エネルギー材料科学国際研究センターの共同利用にて中性子照射した炭化ケイ素(SiC)およびその複合材、炭化ケイ素焼結に用いる各種酸化物等各種セラミックスについて、引き続き長さ測定(スウェリング測定)、格子定数測定(X線回折装置)を行った。2)1)に示した同一照射条件の試料を、質量分析装置付き超高精度熱膨張計を用いて、ある一定温度に昇温後、その温度に3時間以上一定に保ち、長さの時間変化を1ナノメートル感度で検出した。ついで、温度を少し昇温し、同様な測定繰り返す。これを、試料長が照射以前の長さに戻るまで順次温度を上昇しながら繰り返し測定すた。3)測定温度範囲全体について、各温度での長さの時間変化から、回復の活性化エネルギーを求め、欠陥回復機構および温度によるその変化を明らかにした。4)精密熱膨張計に質量分析装置を結合して、ヘリウムの検出感度と測定条件について種々検討し、検量線を得た。JOYO高速実験炉で制御材として使用されたヘリウム生成量の多い試料である照射済みの炭化ホウ素(B4C)粉末を用いて、昇温と同時にヘリウム放出量連続測定を行ったところ、昇温過程の800°C以上において、ヘリウムが検出され、本研究で提案した手法により、熱膨張回復とヘリウム放出の同時測定が可能なことを明らかにした。

1)昨年度に東工大に輸送した、日本原子力研究開発機構で中性子照射を行った炭化ケイ素(SiC)、窒化ケイ素(Si3N4)、サイアロン(SiAlON)等各種セラミックスについて、引き続き長さ測定(スウェリング測定)、格子定数測定(X線回折装置)、及び熱拡散率測定(熱定数測定装置)を行った。2)1)に示した同一照射条件の試料を、昨年度に設置した質量分析装置付き超高精度熱膨張計を用いて、ある一定温度に昇温後、その温度に3時間以上一定に保ち、長さの時間変化を1ナノメートル感度で検出した。ついで、温度を少し昇温し、同様な測定を繰り返す。これを、試料長が照射以前の長さに戻るまで順次温度を上昇しながら繰り返し測定すた。3)測定温度範囲全体について長さの時間変化から、回復の活性化エネルギーを求め、欠陥回復機構および温度によるその変化を明らかにした。4)質量分析装置について、ヘリウムの検出感度と測定条件について種々検討し、検量線を得た。長さ測定と同時に、ヘリウム放出量連続測定を行ったが、今回測定の試料においては、単位時間当たりの放出量が極めて少なく、検出感度以下であることが分かった。今後は、試料形態や昇温速度を変化させて、実験を進める。本研究の目的とする、中性子照射後のセラミックスの回復過程において、スウェリング回復過程と核変換ガス、特にヘリウムの放出の関連を検出することを試みるため、新たに質量分析装置を購入し、既存設備に連結して組み立て、本装置が正常に動作することを確認できた。ヘリウムの検出感度の確認がやや遅れているので、24年度当初に実施する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、中性子照射後のセラミックスの回復過程において、スウェリングの回復機構と核変換生成ガス原子、特にヘリウムの放出量の関連を調べることであるが、23年度に購入した質量分析装置と精密熱膨張計の連結は確認できた。ヘリウムの検出感度と測定条件について種々検討し、検量線を得たが、試料中に生成していると想定されるヘリウム量と、その温度変化に伴う放出量は極めて少なく、今回用いた試料に関しての長さ測定とヘリウム放出の同時測定はかなり難しいことが分かってきた。今後は、ヘリウム生成量のより多い試料で測定条件も勘案して、引き続き計測を行う予定である。24年度当初において、ヘリウム生成量が分かっている試料を用いて、ヘリウムガスの検出感度の確認を行う。その後、計画通り、長さ測定とのその場連動計測を行う。今後は、炭化ホウ素などヘリウム生成量のより多い試料で測定条件も勘案して、引き続き計測を行う予定である。バルクでの測定が困難な場合には、粉末試料を用いて、温度条件だけを揃えた測定に切り替える。精密熱膨張計による長さ(体積)変化の測定は順調であり、酸化物を含めた各種セラミックスの測定を順次進める予定である。
読書紹介の活動を通して中学生の読書意欲を高める実践的研究

1.実践授業の概要「『わたしの一冊』を紹介しよう」-後輩達に図書室の本を紹介しよう-第1次作品の選定・紹介する方法や内容の検討をする。...4時間第2次読書案内冊子の作成...3時間第3次活動についての振り返り...2時間2.成果と課題これまでも読書を勧める情報発信の方法として,スビーチや紹介ポスターなど様々なスタイルを用いてきた。ぞの中で出てきた課題を次の目標に設定するという形で学習を積み上げ,今回の授業につなげていった。今回,後輩達へ贈る読書案内の冊子作りにおいて,生徒は意欲的に取り組み,活動に対する自己評価も高かった。その理由として,「日頃の読書が生かせたこと」「活動の目的が明確であったこと」「冊子を読んだ相手の反応から達成感が味わえたこと」が挙げられる。また,冊子を読んだ生徒の感想も「身近な人のすすめだったので興味がわいた。」「『この本面白そう!』と思える本がたくさんあった。」などの評価を得,図書の貸出し冊数は,読書案内冊子発行前後3ヶ月を比較すると,2.3倍(497冊)に増えていた。読書指導に「紹介活動」を取り入れることで,紹介する側,される側双方の読書意欲を高めることができた。ただ,その意欲を継続的なものにするためには,「紹介活動」が教室の中だけで行われるのではなく,日常生活の中で当たり前に行われるものへと発展させていく必要があり,さらなる取組みが必要であろう。新学習指導要領においても,読書指導の重要性は増すばかりである。読書指導を行った時期は読書量も増える実態からみると,「読書をする目的」や「読書したくなる環境」を教師が作りだすことで,中学生の読書意欲を喚起することは十分可能であると考える。
建築技術史における日本古代設計技術の復元研究

本研究は、古代社会における建築造営史の構築を全体構想に据えつつ、奈良時代を中心に建造物が設計される際に用いられた計画技術(設計技術)の復元を目的とする。研究は史料と遺構のふたつを対象として進め、史料は『正倉院文書』の造石山寺所関係文書を扱い、記録された建材の整理をた。たをつの材に目し、のをて、が計画されるを復元した。遺構もの技術に着目し、現存する古代の材の確認と測量調査を実施した。本研究課題は、古代社会における建築造営史の解明を構想に据えつつ、奈良時代の日本において建造物が設計される際に用いられた計画技術(設計技術)の復元を目的とするものである。本年度は、研究初年度として、既往研究の確認・整理を踏まえ、文献研究、遺構研究を行った。1.文献研究建材の詳細な寸法値が残る史料として、『正倉院文書』に残る天平宝字期の石山寺造営記録を考察対象とし、造形記録からの設計技術の復元を試みた。同史料についてはこれまで約千三百余りの建材について寸法値や製材・運搬過程の整理を進めてきたが、本年度は建築の具体像について部分的復元を行った。中心的建造物であった「仏堂」(本堂)を主とし、特に軒形式に着目し、棉梠(木負・茅負)、架(垂木)、角木(隅木)について、寸法・部材数・収納時期の史料の整理を行い、復元した。史料記録に混乱があり解釈に幅があるため、従来と異なる見解を導き、成果の一部を学術論文として投稿した。造営全体、具体的な建築全形の復元について、今後も継続して分析・考察を行ってゆく。2.遺構研究現存遺構と既往研究を設計技術の観点から整理し、未解明な点が多く残されている海龍王寺五重小塔を対象として設計技術の復元を試みた。未解明な点が多いのは、後世に確立した計画法が見られない以上に、整合性や統一性のある計画概念が不明瞭であるよう見受けられることによる。本年度は寸法値の整理を行い、基本となる規模計画から検討を開始し、2011年3月には現地での確認調査を実施した。本研究については、調査結果の分析を含め、継続して考察を行ってゆく。本年度は、研究2年目として、昨年度までの研究成果を踏まえ、文献研究、遺構研究を行った。同史料についてはこれまで約千三百余りの建材について数量・寸法値や、製材・運搬過程の整理を進めてきたが、本年度は改めて製材過程の整理と復元分析を実施した。その結果、技術的な知識を有し、建材作成の指導や作業に携わった職掌の人物を新たに比定することができ、技術情報の伝達の流れを示して学術論文として投稿した。造営過程の全体、具体的な建築形態の復元について、今後も継続して分析・考察を行ってゆく。未解明な点が多いのは、中世や近世における設計技術の計画方法が当てはまらない以上に、整合性や統一性のある計画概念が不明瞭であると見受けられることによる。本年度は、前年度からの継続課題として現地調査を再び実施し、非接触型調査であることを条件に、仕様や風蝕等の視認調査、記録写真の撮影、光波測量による外寸測量、三次元デジタルデータのスキャニング等を行った。視認調査では、補修や材料の交換を確認することができ、特に下層部や正面にあたる東面には新材使用が多くあることが判明した。また、計画技法については、垂木割が左右対称ではない層もある点などを確認できた。三次元デジタルデータの情報工学的なデータ処理作業には時間を要するため、今後は具体的な形状分析から検証を行う。
新規非侵襲的イメージング法による受精における卵子微絨毛とCD9分子の機能解析

本研究では、卵子微絨毛とCD9分子に注目し、(1)微絨毛欠損卵子の受精能解析、と(2)非侵襲的イメージング法による微絨毛の可視化を目指した。結果、(1)微絨毛関連遺伝子群を欠損したマウスを作りその卵子が不妊になる可能性を証明した。(2)受精ライブセルイメージング系の開発に成功し微絨毛の可視化を実現した。また、この応用から、受精必須因子を通して精子と卵子の融合過程を可視化することに初めて成功した。受精は、次世代に遺伝子を伝達するという生物にとって極めて重要な過程だが、分子生物学的な機構について未知の部分が多い。本研究では、卵子微絨毛に存在し、受精に必須なCD9分子の機能について、(1)遺伝子改変により微絨毛欠損卵子を作製し、受精能を解析する(2)非侵襲的イメージング法により受精における微絨毛やCD9分子の挙動を解析することにより、CD9の機能を解明するのが目的である。本研究は、(1)遺伝子ノックアウト(KO)マウスを用いたmicrovilli欠損卵子の解析(2)受精時におけるCD9分子の動態に関する解析、の二つの主軸からなる。このうち今年度は、(1)について、計画通りI-plastin遺伝子ホモKO個体を作出し、卵子microvilliの状態を観察した。この結果、I-Plastin KOでは、微絨毛の構造に変化が見られる一方で受精が進行することが明らかとなった。次に、ezrin遺伝子について、Cre-LoxP系を用いたコンディショナルKOマウスの生殖細胞を入手し、個体をICSI法により作出した。また、卵子特異的Cre発現マウスとの交配により、卵子特異的にezrinを欠損させたマウスを作出することができた。(2)については、野生型マウス卵子をいて受精観察ライブセルイメージングの条件を設定した。また、CD9-GFPのみを卵子上に持つマウスの繁殖と受精時の卵子の観察を行うため、CD9 KOマウスに対し、交配によりCD9-GFPを導入したマウスを作出した。また、精子の先体反応の状態を可視化できるマウスについて繁殖と精子の観察を行い、これらの組み合わせにより受精の瞬間と微絨毛を可視化する実験系を構築した。受精は、次世代に遺伝子を伝達する生物にとって極めて重要な過程だが、分子生物学的な機構について未知の部分が多い。本研究では、卵子微絨毛上に存在し、受精に必須なCD9分子の機能に注目し、(1)遺伝子改変により微絨毛欠損卵子を作製しその受精能を解析し、(2)非侵襲的イメージング法により受精における微絨毛やCD9分子の挙動を可視化することで、その機能を解明するのが目的である。今年度までの研究で、このうち、(1)のKOマウスの研究では、微絨毛に関連する複数の遺伝子を卵子特異的に欠損したダブルKOマウスの作出を経て、このマウスの卵子が不妊になる可能性を強く示唆することができた。(2)については、昨年度開発した受精ライブセルイメージングの実験系とCD9-GFP導入マウスを用いて、卵子上の微絨毛のダイナミクスを可視化することに成功した。この結果、生きた卵子上のCD9-GFPの挙動が予想よりも活発であり、受精する前の精子の状態に応じて選択的に結合する可能性を示唆することができた。また、この技術を応用して、精子側の受精必須因子であるIzumoが先体膜の崩壊時に精子頭部外面に移動する仕組みと、卵子との融合時にその融合特異部分で最初に失われていく状態を可視化することができた(論文投稿中)。
人癌増殖局所における免疫応答の解析

人癌増殖局所に浸潤するリンパ球の機能を解析し、癌患者の自家癌に対する免疫反応を証明し、その機序を明かにせんとした。1.乳癌、膵癌など数例の癌症例において、先ず癌細胞を培養株化し、一方その患者の癌組織または胸膜浸潤、腹膜浸潤のある例の胸水腹水よりリンパ球を分離し、FACSアナライザーで表面形質を検討した。分離リンパ球はT細胞が多く、Len-2陽性細胞が優越する。2.分離リンパ球の機能、その培養、クローン化:現在までに、癌細胞を培養し、同一患者リンパ球を1L-2加、癌細胞抗原刺激により長期培養し得たのは乳癌4例、膵癌2例、胸癌3例、子宮頸癌2例である。このうち乳癌の1例、HMC-1は、自家癌に対して特異的なキラー活性を示すT細胞をクローン化することができたので、これについて更に検索した。他の症例では、培養T細胞は何れもNK活性、LAK活性を示した。3.自家癌抗原認識機構の解析:HMC-1癌活性に対する自家癌特異的キラーT細胞クローンについて、モノクローナル抗体T3、T4、T8を用いてcompetitive inhibition assayを行った。T3、T8処理で明かな抑制があり、キラーT細胞による特異的癌抗原認識にはT3、T8抗原が関与していることが示唆された。4.HMC-1のブタノール抽出抗原(CBE)刺激によって、キラーT細胞クローンのキラー活性はdose dependentに上昇した。このことは癌細胞のCBE抗原が自己キラーT細胞の認識あるいは破壊の対象であることを示唆する。5.自家癌拒絶抗原と考えられるCBE抗原をSephadex Ct200で分画し、各画分についてキラー活性誘導能を検索した所、Fraction3、4の分子量20万前後に高いキラー活性誘導能を認めた。現在その生化学的純晃と、これに対応するT細胞クローンのレセプターを検索している。
ヒトNK細胞が増殖する新規ヒト化マウスによるin vivo細胞傷害性試験系の開発

ヒト造血幹細胞移植後ヒトNK細胞が優位に分化したNOG-hIL-2 TgマウスにヒトCCR4陽性腫瘍株L428を移植し、抗CCR4抗体を投与することで抗体依存性細胞傷害活性を評価し得るin vivo ADCCモデルを確立した。ヒトNK細胞の成熟度を向上させるためNOG-hIL-15 Tgマウスを樹立した。NOG-hIL-15 Tgマウスは、ヒト造血幹細胞を移植するとヒト成熟NK細胞が顕著に分化・増幅し、また、ヒト血液由来成熟NK細胞を移植すると増幅し3カ月以上維持され、ヒト腫瘍株K562に対する細胞傷害活性も認められたことから、生体内でのヒトNK細胞の解析に適した系統だと考えられた。申請者らが開発した、ヒトインターロイキン-2(IL-2)遺伝子を導入したNOG-hIL-2 Tgマウスはヒト造血幹細胞を移植してヒト化すると、ヒト腫瘍細胞を傷害する能力のある機能的なNK細胞が劇的に分化する。本研究では、ヒト化NOG-hIL-2 Tgマウスを使い、in vivoでヒトNK細胞によって引き起こされる抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を検証することが可能となる細胞傷害試験系の作製を試みる。平成25年度は、NOG-hIL-2 Tgマウスへ既存のヒト腫瘍細胞株および抗体医薬品を多様に組み合わせて移植・投与することで、in vivoでの細胞傷害試験に最適と考えられる細胞・抗体の組み合わせを決定できた。この細胞・抗体をヒト造血幹細胞を移植してヒト化したNOG-hIL-2 Tgマウスに用いた結果、ヒトNK細胞に起因すると考えられる腫瘍抑制効果(ADCC活性)を確認することができた。本研究課題の目的は、ヒト腫瘍細胞を傷害する能力を有する機能的ヒトNK細胞が劇的に分化するマウスを作製し、ヒトNK細胞の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性をin vivoで検証することが可能となる実験システムを確立することである。申請者らが開発したヒトインターロイキン-2(hIL-2)遺伝子を導入した超免疫不全NOGマウスは、ヒト造血幹細胞を移植しヒト化するとヒト腫瘍細胞を傷害する能力を有する機能的成熟NK細胞が劇的に分化する。平成26年度は、ヒト造血幹細胞を移植し機能的成熟NK細胞を増加させたヒト化NOG-hIL-2 Tgマウスに、既存のヒト腫瘍細胞および抗体医薬品を組み合わせて作製したin vivo ADCCモデルの検証を複数回実施した。NOG-hIL-2 Tgマウスの結果をまとめ、論文を投稿し、採択された。一方で、機能的NK細胞の分化・成熟に必須と言われているhIL-15の遺伝子を導入し樹立したNOG-hIL-15 Tgマウスに関して、造血幹細胞移植実験の至適条件を検証したが、細胞の移植条件とヒトNK細胞の分化率とのバランスの良い系を作製することは非常に困難であることが判明した。しかし、ヒト末梢血より単離した成熟NK細胞を移植細胞として用いた場合、ヒト成熟NK細胞が生着・一時的に増幅し、さらに、ヒト末梢血と同様の表現型を有したままマウス生体内に長期間維持されることが判明した。本研究課題の目的は、ヒト腫瘍細胞を傷害する能力の持つ機能的ヒトNK細胞が劇的に分化・増幅・維持するよう遺伝子改変を加えた免疫不全マウスを作製し、ヒトNK細胞申請者らが開発したヒトインターロイキン-2(hIL-2)遺伝子を導入した超免疫不全NOGマウス(NOG-hIL-2 Tgマウス)は、ヒト造血幹細胞を移植しヒト化すると、ヒト腫瘍細胞を傷害する能力を有する機能的成熟NK細胞が分化・増幅し、ヒト腫瘍細胞およびヒト抗体を併用することでin vivo ADCCモデルを確立することができた。一方、ヒトインターロイキン-15(hIL-15)遺伝子を導入した超免疫不全NOGマウス(NOG-hIL-15 Tgマウス)も、ヒト造血幹細胞を移植することで機能的成熟NK細胞が劇的に分化・増幅したが、in vivo ADCCモデルを作製する上でバランスの良い実験プロトコールを確立をすることは困難であると評価した。従って、移植細胞をヒト末梢血から分離した成熟NK細胞に変更し、前年度に引き続き平成27年度も、NOG-IL-15 Tgマウスへ移植した後のヒト成熟NK細胞の特性解析およびヒト腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の検証を行った。結果、NOG-hIL-15 Tgマウス内で増幅したヒト成熟NK細胞は、その分子生物学的特性は維持されているが、細胞傷害活性は減退することが明らかとなった。ヒト成熟NK細胞の細胞傷害活性が維持/向上されることを目的とし、NOG-hIL-2/IL-15 double Tgマウスを作製し、ヒト成熟NK細胞移植実験を行ったが、NK細胞に少量混入していたヒトT細胞が急激に増幅したため、NK細胞に対する正確な評価が困難となった。従って、ヒトT細胞増幅を抑制できる移植条件を確立するために、NK細胞の精製方法およびヒト抗体投与による抑制効果を組み入れた検証実験を実施した。NOG-hIL-15 Tgマウスは、ヒト造血幹細胞を移植するとヒト成熟

NK細胞が顕著に分化・増幅し、また、ヒト血液由来成熟NK細胞を移植すると増幅し3カ月以上維持され、ヒト腫瘍株K562に対する細胞傷害活性も認められたことから、生体内でのヒトNK細胞の解析に適した系統だと考えられた。1)ヒト造血幹細胞を移植してヒト化したNOG-hIL-2 Tgマウスに、ヒト腫瘍細胞株および医療用抗体を用いることで、in vivo ADCC細胞傷害試験系を複数回実施した。3) NOG-hIL-15 Tgマウスに造血幹細胞を移植し、移植時の至適条件の検討および分化したヒトNK細胞の特性解析を行った。4) NOG-hIL-15 Tgマウスにヒト末梢血由来成熟NK細胞を移植し、長期的な生着能を確認した。免疫学、実験動物学1) NOG-hIL-15 Tgマウスは、ヒト末梢血由来NK細胞移植実験を主体に研究を進める。NOG-hIL-15 Tgマウスで増幅・維持されたヒトNK細胞の特性解析を進める。さらに、ヒト腫瘍細胞株・抗体医薬品を用い、in vivo細胞傷害試験系の樹立を目指す。1) NOG-hIL-2 Tgマウスに、標的抗原を高発現するヒト腫瘍細胞株を移植した後に抗体医薬品を投与することで、in vivo ADCCの作製に適する組み合わせを選定できた。2) 1)で選定した腫瘍細胞株および医療用抗体をヒト造血幹細胞を移植したNOG-hIL-2 Tgマウスに用いることで、in vivo細胞傷害試験を実施できた。以上の結果から、申請書に記載した計画通り、おおむね順調に進展していると考えられる。また、現在1),2)の結果を含めた論文を作成しており、近日中に投稿する予定である。次年度に予定している実験で、高額な試薬の使用量が増える可能性が考えられた。2) NOG-hIL-15 Tgマウスの特性検査:ヒト造血幹細胞の移植実験、およびヒト末梢血由来NK細胞の移植実験を行い、ヒトNK細胞の分化・生着能について検証する。また、ヒト化したNOG-hIL-15 TgマウスからヒトNK細胞を分離し、細胞の性質についても検証する。さらに、ヒト化したNOG-hIL-15 Tgマウスにヒト腫瘍細胞株を移植し、細胞傷害活性を有するか検証する。次年度の物品費と併せて、高額試薬の購入に充てる。申請段階では、国内学会(2か所)の旅費を含めて計画をしていたが、1か所は参加できなくなったことに加え、もう1か所は他の研究費を使用することができたため余剰分ができた。この余剰分を試薬の購入代にしようと検討したが高額な製品であったため、次年度分の経費と併せて購入することにした。次年度以降の物品費と併せて、高額試薬の購入に充てる。