hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子電流ミラー効果の研究

2.より小さな接合寸法の素子を作製するため、レジスト/Ge/レジストの3層構造の蒸着マスクを使った素子作製プロセスを開拓した。3.電流ミラー効果の機構を明らかにするために、実験で用いている斜め結合の電流ミラー素子について、伝導担体が単一電子である場合のモンテカルロ・シミュレーションによる動作特性の予測を行った。結果として、伝導担体が単一電子である場合には、微小Josephson接合からなる素子についての実験結果を十分に再現できないことがわかった。これは、微小Josephson接合からなる素子における電流ミラー効果に、超伝導の位相コヒーレンスが重要な役割を果たしていることを示すものと解釈できる。微小Josephson接合列を用いた量子電流ミラー効果に関して、次のような成果を得た。1.計画1の内容である、電流二倍器の実現、またその動作特性の解明、さらに、より大きな整数倍器を実現する上での素子作製上、回路構成上の留意点を明らかにした。2.計画2の内容の一部として、接合のJosephson結合エネルギーの大きさと最大ミラー電流の関係、同じ接合特性を持つ接合列の接合数(素子長)と最大ミラー電流の関係などについてのデータ蓄積を行った。3.計画3の内容である、接合数が異なる接合列間での電流転写の特性を明らかにした。特に、短い接合列から長い接合列への電流転写が不完全であることが明になった。4.3接合列からなる素子で、直接静電容量で結合していない接合列間でも、直接静電容量で結合した接合列間と同様に電流転写が生じることを見出した。これらのうち、成果1は、本研究全体を通じての目標の一つであり、予想した素子構造で微小電流の整数倍器が原理的に作製できることを検証できた大きな成果であった。また、成果4は、本研究全体として想定外の結果であり、量子電流ミラー効果が、予想された「静電結合による電荷ソリトン間の局所的な相関」というメカニズムではなく、何らかの非局所的な媒体を通じての相関によるものであることを示唆する。これは、この現象がより深い物理的な内容を持つことを物語っており、新たな研究展開を予期させるものである。
プロテアーゼ解析を基にしたクドア属粘液胞子虫の防除法開発

粘液胞子虫の一種であるクドアは様々な海産魚に寄生し、魚体の変形や魚肉の変質を引き起こすため、水産業上の重大な問題となっている。また近年ではクドアがヒトの食中毒原因体で有ることが判明し、公衆衛生上も大きな問題となっている。本研究では養殖魚におけるクドアの防除法開発を最終目的として、それに繋がるクドアの生物学的知見を得ると共に、陸上養殖施設で即時利用可能な防除法を確立した。当初予定してたワクチン開発に繋がるプロテアーゼ解析については、期間内の感染体特定が困難であることが分かったため、研究内容を一部変更した。クドア属粘液胞子虫の分子系統解析を実施し、パナマ産サワラの筋肉中から得た新種クドアの記載(Kudoa rayformis)含め、学術論文に纏めた。これにより、現在国内外で問題となっているクドアについて包括的に情報を整理し、今後の研究課題の方向性を決定することができた。さらに、国内で食中毒原因体として大きな問題となっているヒラメのナナホシクドアについて、同じくヒラメに寄生する複数のクドアと区別する簡便かつ正確な診断法としてマルチプレックスPCRを確立した。同時に、国内養殖ヒラメに寄生するクドア種リストを更新し、学術論文とした。当初の予定通り、ヒラマサの脳に寄生するK. yasunagaiの魚体内感染動態を調べ、感染初期には消化管で当該種の遺伝子が多く検出できることを確かめた。これにより、侵入門戸が消化管であることが示され、学術論文としてまとめた。研究の最終目的であるクドア防除法としては、飼育水を15 mJ/ cm2程度の比較的弱い紫外線殺処理することで、寄生を完全に抑えることを突き止めた。これにより、少なくとも陸上養殖施設でのクドア防除法は確立したと言える。これらの成果は計4報の学術論文としてまとめた。28年度が最終年度であるため、記入しない。クドア属寄生虫については、魚への寄生前のステージや生活環が不明なため、有効な防除法が無く、水産業界において問題となっている。本研究では、魚の脳に寄生するKudoa yasunagai(以下、本虫)をモデル種として、生活環や魚への寄生様態を明らかにすることで、防除やワクチン開発に繋がる知見を得ることを目的としている。本年度はまず、より特異的かつ高感度に本虫を検出するため、既存のPCR系を見直し、新しく設計したプライマーによるPCR系を確立した。例年本虫の寄生がみられる海域で海水を採取し、異なる目合いフィルターで濾過し、新PCRに供した結果、20と10ミクロンで陽性反応がみられた。増副産物を遺伝子解析した結果、K. yasunagaiと一致し、本虫の感染体は10ミクロン以上の大きさであることが初めて示された。また、生活環解明の一環として、これまで不明であるクドア属の中間宿主の探索を行っている。クドアの寄生が見られる養殖生簀周辺から、3回に渡り環形動物や星口動物を多数採取し、検鏡やPCRによる検査を実施したが、未だ寄生個体は見つかっていない。また、別研究で得られたパナマ産サワラの筋肉中からクドア属粘液胞子虫を発見した。この遺伝子解析を行った結果、新種である可能性が示唆されたため、その記載を行っている。この新種クドアの系統解析を行う過程で、クドア属全体の遺伝子系統解析を行い、形態や寄生様態によって系統群が異なることを突き止めた。これについても現在論文にまとめるための解析を勧めている。クドア属粘液胞子虫は海産魚に寄生し、商品価値を低下させるため養殖産業で問題となっているだけでなく、近年は食中毒の原因体として公衆衛生上の問題にもなっている。本研究ではクドアの防除法開発のため、Kudoa yasunagaiをモデルとし、魚体への侵入機構や生活環の解明を目指した。例年K. yasunagaiの寄生が見られる種苗生産施設でヒラマサ稚魚を飼育し、血液、鰓、消化管、筋肉等、魚体の部位別の寄生を経時的に調べた結果、本虫の侵入門戸は腸管である可能性が示され、魚への侵入機構を把握する端緒が得られた。前年度に引き続いて実施している海水中からの感染体検出ではPCR法を改良した結果、検出感度とPCRの特異性が向上し、海水サンプルからの検出率は上昇したものの、感染体の特定には至っていない。また、中間宿主を特定するため、汚染海域で採取した無脊椎動物(主に環形動物)の検査も継続して実施しているが、こちらも特定には至っていない。一方、これまでに研究から飼育用水を紫外線することで寄生を防げることが分かっているため、異なる照射量で処理した用水でヒラマサ稚魚を2か月間飼育し、最低有効照射量を調べたところ、5mJ/cm2で大幅な寄生軽減効果が認められ、最低有効量は5 15mJ/cm2の間であることが判明した。これにより、クドアは飼育施設で通常用いられる紫外線処理で充分防除できることが分かった。別途、パナマのサワラ類から採取したクドアを調べたところ、未記載種であることが明らかになったため、これを記載した。同時にこれまで遺伝子情報が登録されているクドア全種を対象として、寄生部位や寄生様式から系統解析を行い、投稿論文としてまとめた。クドアの魚体への侵入門戸、体内で胞子形成するまでの大凡の経路や発育時間は把握できたが、組み換えワクチン作製への糸口となるプロテアーゼ解析については進捗が遅れている。

また、ある程度予想されたことだが、未だ感染体および中間宿主の特定には至っていない。感染体については、510umフィルターでの検出率が高く、大凡の大きさが示された。また、PCRによる検出方法の改良がなされた。一方、実用的な防除法として用水の紫外線処理法を確立した。また、当初予定していなかった、クドア属の新種記載と系統解析については一定の成果を得ることができた。粘液胞子虫の一種であるクドアは様々な海産魚に寄生し、魚体の変形や魚肉の変質を引き起こすため、水産業上の重大な問題となっている。また近年ではクドアがヒトの食中毒原因体で有ることが判明し、公衆衛生上も大きな問題となっている。本研究では養殖魚におけるクドアの防除法開発を最終目的として、それに繋がるクドアの生物学的知見を得ると共に、陸上養殖施設で即時利用可能な防除法を確立した。当初予定してたワクチン開発に繋がるプロテアーゼ解析については、期間内の感染体特定が困難であることが分かったため、研究内容を一部変更した。クドア属粘液胞子虫の分子系統解析を実施し、パナマ産サワラの筋肉中から得た新種クドアの記載(Kudoa rayformis)含め、学術論文に纏めた。これにより、現在国内外で問題となっているクドアについて包括的に情報を整理し、今後の研究課題の方向性を決定することができた。さらに、国内で食中毒原因体として大きな問題となっているヒラメのナナホシクドアについて、同じくヒラメに寄生する複数のクドアと区別する簡便かつ正確な診断法としてマルチプレックスPCRを確立した。同時に、国内養殖ヒラメに寄生するクドア種リストを更新し、学術論文とした。当初の予定通り、ヒラマサの脳に寄生するK. yasunagaiの魚体内感染動態を調べ、感染初期には消化管で当該種の遺伝子が多く検出できることを確かめた。これにより、侵入門戸が消化管であることが示され、学術論文としてまとめた。研究の最終目的であるクドア防除法としては、飼育水を15 mJ/ cm2程度の比較的弱い紫外線殺処理することで、寄生を完全に抑えることを突き止めた。これにより、少なくとも陸上養殖施設でのクドア防除法は確立したと言える。これらの成果は計4報の学術論文としてまとめた。クドアが魚体に侵入するステージを見つけるための新規PCR系を確立し、それを用いて感染体特定の第一歩を踏み出しており、こちらは概ね予定通りに進んでいる。また生活環解明のためのサンプリングも複数回行い、作業工程もほぼ確立されている。さらに、予定には無かった新種クドアの発見やそれによる系統解析等も進んでおり、こちらで新しい知見が得られている。新しく発展したテーマでの仕事が発生したため、当初予定していたK. yasunagaiのプロテアーゼ解析については、サンプル採取は行ったものの、解析の方は遅れている。残された研究期間が限られていることから、組み換えプロテアーゼだけではなく、魚体内の寄生ステージである粘液胞子を直接魚に接種し、ワクチン効果を調べる試験も検討する。クドアは培養ができないため、粘液胞子は大量に採取が可能な別のクドア種を用いる。また、最終年度であるため、データの取り纏めにも注力する。現在昨年度の試験結果について論文2報の投稿準備をしている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
地域創生のために「自治力」を起点とするまちづくりの新展開：水俣病被害地域を中心に

本研究では、学会発表3件及び雑誌論文2件が掲載された。1件目の論文では、水俣地域の農山漁村の豊かな自然環境が活かされてきた重点的な施策(主要プロジェクト)による3つの取組みを、地域創生に向けて成熟させていくために必要と考えられる各自治体の政策について考察した。2件目の論文では、水俣エコタウン事業による取組みを、地域創生に向けて成熟させていくために必要と考えられる水俣市の政策について考察した。本研究における「地域創生」は、地域社会の変化やライフスタイルの多様化が急速に進展する中で、「長期的・広域的視点から地域にあるものを活かして」めざす地域社会像を実現することである。これらの点で、社会の拡大期に行われてきた「地域再生」とは異なる。本研究の目的は、みなまた地域(水俣市よりも広い地域単位)の地域創生に向けて、水俣市等における“まちづくりの基礎的な力"を「自治力」という概念で独自に捉え、これを起点として「未来思考のまちづくり」へと展開するための研究基盤を構築をすることである。研究初年度である平成27年度は、水俣市等における「自治力」を、各自治体における「1これまでの政策、2市民による自治、3水俣病に由来する地域資産」の3要素から捉えるために、2つのテーマについて文献調査等を実施し、研究基盤の構築に着手した。1つ目のテーマでは、水俣市の「自治力」を捉える3要素のうち、上記1及び2について把握するために、九州内でエコタウン(環境と調和したまちづくり)の承認を国から受けた3地域(水俣、大牟田、北九州)に着目し、文献調査等を実施して各エコタウンの成否の要因を分析し、比較検討を行った。また、2つ目のテーマでは、水俣市や津奈木町の「自治力」を捉える3要素のうち、上記3について把握するために、両市町における代表的な4つの景観資源に着目し、その成り立ち、特徴、課題について比較検討し、その一部を日本景観学会にて発表した。これらの成果は、“まちづくりの法と政策"の進展に寄与し、地域創生のための政策研究の萌芽としての意義をもつことが期待される。初年度の計画は、水俣市における「自治力」を捉えるために、水俣市における1992年以降の環境政策と市民自治の関連性を検証し、住民からみた問題点とその改善策を明らかにすることであった。そのため当初は、水俣市環境基本条例を研究素材として検討することとしていたが、市民自治との関連性が弱く、しかも著しい問題点が存在しなかったため、新たな研究素材として、九州内でエコタウン(環境と調和したまちづくり)の承認を国から受けた3地域(水俣、大牟田、北九州)に着目し、環境政策と市民自治の関連性を含めて地域間の比較検討を行い、概ね計画通りに実施できた。2年度である平成28年度は、水俣市等における「自治力」を、各自治体における「1これまでの政策、2市民による自治、3水俣病に由来する地域資産」の3要素から捉えるために、文献調査等を実施し、研究基盤の構築を進めた。具体的には、エコタウン(環境と調和したまちづくり)が環境問題に対応する地域創生の一形態と考えられることから、今後、『自治体が新たな環境問題に対応する地域創生をめざす上で、エコタウン(環境と調和したまちづくり)にどのような政策的示唆が含まれているのか』という問題を設定し、この問題を明らかにした。分析の対象は、昨年度に引き続き、九州内でエコタウンに承認された3地域(北九州、大牟田、水俣)とした。3地域は、いわゆる企業城下町で、公害を経験した後にエコタウンプランの承認を受けて、同時期に近接した地理的条件の下で事業が実施され、成果が概ね出揃っている。分析の視点は、現状や課題の分析からはじめる「課題解決型のまちづくり」に対し、本稿では、めざす未来像を先に描いてその実現方法を考える「未来思考のまちづくり」とした。分析の枠組は、3地域のエコタウンが実現された過程を、「未来思考のまちづくり」の視点から捉えて4段階に切り分け、調査項目を設定した。分析結果の一部を、日本地域政策学会九州・沖縄支部設立記念フォーラムにて研究発表を行った。こうして、自治体の政策を「未来思考のまちづくり」の視点からバックキャスト的手法で整理・分析をしたことにより、自治体への政策的示唆を若干なりとも明らかにすることができたものと考えられる。2年度目は、エコタウン(環境と調和したまちづくり)が環境問題に対応する地域創生の一形態と考えられることから、その実現過程を「未来思考のまちづくり」の視点から捉えて、バックキャスト的手法で整理・分析を行った。これにより、地域創生に向けた政策的示唆を若干なりとも明らかにすることができたものと考えられる。最終年度である平成29年度は、地域創生に貢献するために、「未来思考のまちづくり」へと展開するための研究基盤の構築をめざして、現地調査及び文献調査等を実施し、論文2報が学会誌に掲載された。具体的には、1報目の論文は、日本地域政策学会の学会誌『日本地域政策研究』に、特集(論説)として掲載された。本論文は、水俣市の「元気村づくり」、津奈木町の「緑と彫刻のある町づくり」及び「住民参画型アートプロジェクト」による取組みを、地域創生に向けて磨き上げる場合に、自治体(水俣市、津奈木町)の政策に必要な役割を明らかにした。分析の枠組は、それぞれの取組みに関する政策過程を4段階に切分け、調査項目を設定して事実を把握し、その背景や要因を考察した。

その結果、自治体政策の役割は、それぞれの課題の解消策や工夫の手法及び新たなゴールを見出してそれらの改善を図ること、並びに、地域全体の取組みの視点から拡充を図ることと結論づけた。2報目の論文は、日本計画行政学会九州支部の機関誌『JAPA九州』に、研究論文として掲載された。本論文は、みなまた地域を対象にした水俣市の「水俣エコタウン」による取組みを、地域創生に向けて磨き上げる場合に、自治体(水俣市)の政策に必要な役割を明らかにした。分析の枠組は、水俣エコタウン事業に関する政策過程を4段階に切分け、調査項目を設定して事実を把握し、その背景や要因を考察した。その結果、自治体政策の役割は、水俣エコタウン周辺の生活環境に配慮する手法を見出して改善を図ることと結論づけた。本研究では、学会発表3件及び雑誌論文2件が掲載された。1件目の論文では、水俣地域の農山漁村の豊かな自然環境が活かされてきた重点的な施策(主要プロジェクト)による3つの取組みを、地域創生に向けて成熟させていくために必要と考えられる各自治体の政策について考察した。2件目の論文では、水俣エコタウン事業による取組みを、地域創生に向けて成熟させていくために必要と考えられる水俣市の政策について考察した。当初予定していた研究計画に沿って、平成28年度以降も引き続き水俣市等における「自治力」を捉えるための研究調査を実施する。併せて、自治体間の連携協力により地域の生活機能を確保することや、水俣病に由来する地域の資産を、地区レベルの「公共的な利益」として法的に位置づけることについても、当初予定していた研究計画に沿って、研究調査を進めていく予定である。当初予定していた研究計画に沿って、平成29年度も引き続き水俣市等における「自治力」を捉えて、さらに高めるための研究調査を実施する。そのため、まず、水俣地域の農山漁村の豊かな自然環境が活かされてきた重点的な施策(主要プロジェクト)による複数の取組みを、地域創生に向けて磨き上げる場合に、自治体の政策に必要な役割を明らかにする。公共政策平成27年度は、九州内での日帰り調査が多かったため、旅費に残額が生じた。平成28年度は、県内及び隣県での日帰り調査が多かったため、旅費を中心に残額が生じた。平成28年度からは、自治体間の連携協力や地域資産の公共的利益化に関して、全国的に先進的な自治体の調査及び資料収集にも旅費を使用する予定である。平成29年度は、国会図書館にて資料の収集を複数回計画するとともに、環境都市の先進地にて調査及び資料収集を行うために旅費を使用する予定である。
心不全発症進展における新しい転写抑制因子NRSFとその標的遺伝子の意義の解明

アルドステロンはRAA系の最終産物であり、その合成はステロイドからの合成経路の中で最終段階を司るCYP11B2(アルドステロン合成酵素)によって規定されている。アルドステロンは近年心不全の病態ばかりでなく心肥大や心線維化にも深く関与することが明らかとなりその発現調節機序の解明は重要である。今回は、一副腎線腫由来細胞295R細胞株を用いてNRSF/NRSE系のアルドステロン合成に及ぼす役割を検討した。ヒト副腎腺腫由来細胞株295R細胞の核蛋白質抽出物中にNRSFの存在しることがWestern blot法で確認され、ゲルシフトアッセイでNRSFとCYP11B2のNRSE配列が結合することを確認した。dominapt negativeNRSFを含有するアテノウイルスベクター(AD/dnNRSF)を295R細胞にトランスフェクションするとCYP11B2mRNAとCACNA1HmRNAの双方が増加し、RIAで測定したアルドステロンの分泌量もmRNAと並行して増加することが示された。次に、CYP11B2遺伝子の5'上流1.5Kbpをルシフェラーゼ遺伝子の上流にさらに下流にはCYP11B2遺伝子のNRSE配列を結合させたレポーター遺伝子(CYP11B2/NRSE/Luc)を作製し検討すると、予想通りコントロールレポーター遺伝子と比べ活性は約50%に抑制された。さらに、今日意味深いことには、AD/dnNRSFを今日発現するとこれらのレポーター遺伝子の発現は亢進したが、この発現亢進には、同じくNRSFで転写抑制されているCACNA1H遺伝子の発現亢進が間接的に関与していることも併せて証明された。以上の研究成果を通して、NRSF.NRSE系はANP、BNPなどの胎児型遺伝子のみでなく、心不全の病態生理に非常に深くかかわっているアルドステロン合成にも深く関与していることが明らかとなった。特にアルドステロン合成に関してはCYP11B2遺伝子そのものをNRSF/NRSE系が調節しているのみならず、CACNA1H遺伝子の発現亢進と相乗的にNRSF/NSE系がアルドステロン分泌を制御していることが明らかとなった。心不全時に観察される胎児型遺伝子の再発現現象はよく知られた事実であるが、その分子機序はよく分かっていない。我々は、ANP・BNPがあらゆる胎児遺伝子の中で心不全や心肥大時における再発現現象が最も鋭敏でしかも再現性の高いことを考慮すると、ANP・BNPの転写調節機序は心不全の発症に関わる基礎的な分子基盤を共通しているとの仮説を立てて研究を遂行してきた。この過程で、ANP・BNP遺伝子の再発現に関わる興味深い転写調節系NRSE/NRSF系を同定した。すなわち、正常状態ではNRSEには強力なサプレッサーであるNRSF(Neuron restrictive silencer factor)が結合し、NRSEを含む遺伝子の発現を強力に転写抑制しているが、刺激下ではNRSFとNRSEの結合が解離しNRSFによる転写抑制が回避される結果、NRSEを含む遺伝子の転写が亢進することを証明した。NRSFの心臓での働きを確かめるために、NRSFのdominant negative変異体を心筋細胞特異的に強制発現するマウスを作成すると、そのマウスは拡張型心筋症に似た形態を示し、心室性不整脈で突然死を来すことが明らかになった。

cDNAアレイを用いてNRSFの標的遺伝子を検討すると、ANP, BNP、α骨格筋型アクチン等の胎児遺伝子の他、T型カルシウムチャンネルの一つであるCav3.2のαサブユニットをコードするCACNA1Hが候補となった。CACNA1H遺伝子にはその転写調節領域にNRSE配列が確認された。NRSF/NRSE系の心不全における意味をさらに検討する目的で、Dahl食塩感受性ラットをモデルに検討すると、CACNA1H遺伝子が発現亢進しており、T型Caチャンネルブロッカーであるエホニジピンの投与により、Dahl食塩感受性ラットの心機能や予後が非投与群と比べ有意に改善していた。NRSF/NRSE系が心不全全体で働いている可能性が示唆された。我々は心臓に於けるANP,BNPの心不全に伴う遺伝子再発現機序にNRSF/NRSE系という強力な転写抑制系が働いておりその抑制の回避が転写亢進に働くことを確認してきた。心不全は2次性アルドズテロン症であるが、アルドステロン合成酵素であるCYP11B2遺伝子のイントロンにもNRSE配列と相同性の高い配列が存在していることがコンピューター解析で明らかとなった。本年度は副腎でのアルドステロンに産生機序にNRSF/NRSE系が関与しているかを検討した。【結果】ヒト副賢腺腫由来細胞株295R細胞の核蛋白質抽出物中にNRSFの存在しることがWestern blot法で確認され、ゲルミフトアッセイでNRSFとCYP11B2のNRSE配列が結合することを確認した。dominant negativeNRSFを含有ずるアデノウイルスベクター(AD/dnNRSF)を295R細胞にトランスフェクションするとCYP11 2mRNAとCACN1HmRNAの双方が増加し、RIAで測定したアルドズデロンの分泌量もmRNAと並行して増加することが示された。アルドステロンの刺激薬であるアンジオテンシンIIやカリウムによるCYP11B2遺伝子発現の亢進にNRSF/NRSE系が関与しているか否かを検討すると、AD/dnNRSF存在下ではアンジオテンシンIIやカリウムによるCYP11B2の遺伝子発現亢進が有意に抑制された。【結論】アルドステロンの合成にCYP11B2遺伝子とCACNA1H遺伝子双方に存在するNRSE配列が関与していることが明らかとなった。
幼児・児童のコンピテンスの自己評価の正確さ-横断的、及び継断的検討を通して

横断的検討から以下の4点が明らかとなった。(1)コンピテンスの各領域と自己価値としてのイメージ間の相互関連は、年少では少なく、年中・年長になるにつれて相互関連が多くなり、自己の捉えの内的一貫性が高まり、幼児なりの正確さが増していくこ、(2)各児の日常保育場面における行動について、エピソードに分類し、各エピソード毎に行動面に現れているコンピテンスの様態を把握した結果、年少児では保育者との関わりはコンピテンスの自己評価が低いこと、年中男児では仲間との交渉が多い子は仲間のコンピテンスが高いのに対して、年中女児では自己イメージが低いこと、年中男児では仲間や保育者との交渉が多い子は仲間のコンピテンスの自己評価が高く、年長女児では自画自賛が多い子は仲間から受容されていないこと、(3)コンピテンスの自己評価が一貫して高い子と低い子について日常保育場面における行動特徴を比較すると、前者は仲間とも交渉しながら自分の活動に集中しじっくり取り組んでいるのに対して、後者は集団での遊びに加わっているものの、仲間の指示に従うことが多いなど自己実現できていない、といった行動特徴の違いが見られること、(4)コンピテンスの自他評価とのズレ(自己・教師評価)と自画像の大きさとの関連を見ると、学習面でのコンピテンスの高い年中・年長児はズレが大きい子ほど自画像が大きいこと、逆に人との関係のコンピテンスが低い年中・年長児ではズレが大きいほど自画像が小さい傾向が示された。縦断的検討からは以下の4点が明らかとなった。(1)幼児期から児童期までのコンピテンスの自己評価の発達的変化を見ると、就学、低学年から中学年にかけて低下し、そうした傾向は各領域の重要性評価が現実の自己評価を上回っていくことに一部起因すること、(2)自己評価と他者評価の発達的変化を比較すると、自己評価の発達的変化は保育者・教師評価の発達的変化と類似していること、(3)学校での休み時間や給食時の行動観察から、児童のコンピテンスの行動特徴を分析する枠組みを検討し、行動面からコンピテンスの様態を測定する質問紙が作成されたこと、(4)幼児期のコンピテンスの自己評価から児童期の自己評価に対する予測性を検討した結果、幼児期における人からの受容感は児童期の学校のコンピテンスや自己イメージを予測すること、などが明らかにされた。したがって、保育者評価との類似性、自画像の大きさや日常行動との関連性、自己評価からの予測性などから、幼児期から児童期にかけてのコンピテンスの自己評価に関して一定程度の正確さが確認された。
ALKキナーゼによるがん抑制因子p53のチロシンリン酸化と転写活性化の抑制機構

リンパ腫や肺がんにおいて、ある種の染色体転座が認められており、その転座はがん化を促進することが知られている。この原因遺伝子は、がん促進因子を活性化する一方で、がん抑制因子の働きを阻害すること、そして、がん化に重要ながん抑制因子を直接的にリン酸化することで、その機能を阻害していることを私達は発見した。また、その機能阻害には、がん抑制因子の細胞質への集積の増強が関与していると推察された。私達は、以前の研究からクラスリン重鎖(CHC)は核内に存在し、p53を介した転写の活性化因子として機能することを報告した。また、ある種のがんにおいてCHC遺伝子はALKキナーゼ遺伝子座で転座を起こし、その結果として生じるCHC-ALK融合タンパク質がp53の転写活性化能を抑制すること、そして、意外なことに、核内に存在するALKのチロシンキナーゼ活性がその抑制には必要であり、ALKによってp53のチロシン残基がリン酸化されることを見出していた。そのような背景のもと、本研究では、ALKによるp53転写活性化の抑制機構を解明することを目的として、まず、p53のどのチロシン残基がALKによってリン酸化修飾を受けるか質量分析法を用いて調べた。質量分析の結果、p53の327番目のチロシン残基がリン酸化されていることを同定したが、それ以外のチロシン残基がリン酸化されていないと断言はできず、今後更に詳細な解析が必要であると結論付けた。また、ヒトp53には一次構造上9ヵ所のチロシン残基があり、それぞれのチロシン残基をフェニルアラニン残基に様々な組み合わせで置換したp53変異体を作製し、ALKによるp53転写活性化の阻害効果について検討した。その結果、234番目、236番目および327番目のチロシン残基がALKによりリン酸化されるのに必要な残基であること、そして、それらのチロシン残基が、p53転写活性化の阻害に重要であることが判明した。それらの部位に対する特異的な抗リン酸化チロシン抗体を作製したところ、327番目のチロシンリン酸化を認識する良好な抗体は得られたが、234番目、236番目のチロシンリン酸化を認識する抗体はそれ程良好ではなく、再度検討する余地があると思われる。また、ある種のがんにおいてCHC遺伝子はALKキナーゼ遺伝子座で転座を起こし、その結果として生じるCHC-ALK融合タンパク質がp53の転写活性化能を抑制すること、ALKによってp53のチロシン残基がリン酸化されることを見出していた。昨年度、ヒトp53中に存在する9カ所のチロシン残基のうち3カ所がALKによってリン酸化されることがわかった。本年度は、ALK融合蛋白質を発現している細胞株を用いて、ALK融合蛋白質をsiRNAでノックダウンした際のp53活性について調べた。その結果、ALK融合蛋白質の発現を抑制すると、p53の発現量は変化しないが、その下流の標的遺伝子であるp21の発現が著しく増大し、そのp21の発現誘導は、p53が必要であった。また、ALKチロシンキナーゼに対する特異的低分子阻害剤を用いて、p53の転写活性化の回復が見られるか調べたところ、siRNAを用いた実験と同様の結果が得られ、ALK融合蛋白質がp53経路を阻害していることが裏付けられた。本来、ALKは受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するタンパク質であり、主に、脳組織で発現している。そこで、本来のALKの機能にp53経路が関与しているかどうか、p53が野生型でかつ野生型ALK受容体が発現している神経芽腫細胞を用いて調べた。そのリガンドとして知られるPleiotrophinで細胞を処理したが、p53の細胞膜近傍への集積はあまり見られず、刺激依存的なp53のチロシンリン酸化も検出されなかった。ただし、PleiotrophinによるALKの活性化が非常に弱く、他のALKリガンドや条件等再度検討する余地があると思われる。過去2年間で、私達は、ヒトp53中に存在する9カ所のチロシン残基のうち3カ所がALKによってリン酸化されること、内在性ALK融合蛋白質の発現抑制により、p53機能が回復すること等を見出した。本年度は、ALKによるp53のチロシンリン酸化によって引き起こるp53機能の阻害メカニズムを解析した。

まず、ALK発現の有無によって、p53の他の修飾部位へ影響を与えるかどうか調べたが、ALK発現によってp53の他の修飾部位へ影響はなかった。また、一つのチロシンリン酸化部位がp53の4量体形成化部位近傍に存在していたことから、架橋剤を用いて4量体化能について調べたが、ALKによるp53のチロシンリン酸化が4量体形成には影響を与えなかった。一方、p53の細胞内局在に与える影響を調べたところ、ALK発現によって野生型p53は細胞質内へ移行するが、非リン酸化型p53は、ALKの発現の有無にかかわらず、そのほとんどが核内に存在した。おそらく、ALKはp53のチロシンリン酸化を介して、Mdm2/mdmx系による核外輸送あるいは何か別のp53核外輸送系に影響を与えるものと推察された。
食塩依存性高血圧における肥満細胞キマーゼの役割解明

8%高食塩食では高血圧を発症しない野生型マウス(C57BL/6J)で、2%食塩水飲水により12週後の血圧が146/100 mmHgへ上昇し、食塩依存性高血圧モデルを確立した。このモデルで特異的キマーゼ阻害薬は用量依存性に降圧及び心拍数減少効果を示した。一方、既存の降圧薬投与では、アンジオテンシン受容体拮抗薬とアルドステロン受容体拮抗薬がわずかに、しかし、有意に降圧及び心拍数減少効果を示した。さらに、各臓器のキマーゼ依存性アンジオテンシンII産生活性は、主に、消化管そして皮膚・骨格筋で有意に増加していた。すなわち、高食塩負荷に伴なう組織キマーゼ活性化が昇圧と交感神経活性化を促す事を証明した。平成26年度の研究目的は、目的I:一般的には8%高食塩食では高血圧を発症しない野生型マウス(C57BL/6J)で、飲水中食塩濃度を0.25%から2%まで変化させ、3ヶ月間、血圧・心拍の変動を観察し、血圧上昇を惹起する適切な飲水中食塩濃度を設定する。(目的Iの研究期間は平成26年度)目的II:目的Iで設定したモデルと組織キマーゼ活性欠損マウス(WBB6F1-W/Wv)に同濃度の飲水食塩負荷を3ヶ月間施行し、1週間毎の体重・血圧・心拍測定と飲水量・尿量をメタボリックケージで測定する。さらに、血中・尿中・組織中各RAASコンポーネントを1ヶ月毎に測定して、血圧変化に伴う各RAASコンポーネントおよび炎症・酸化ストレスマーカー変化を明らかにする。病理学的にも組織肥満細胞数測定や臓器障害の程度を判定する。両群の差異から、食塩依存性血圧上昇と肥満細胞の関連を明らかにする。(目的IIの研究期間は平成26年度から27年度にかけて)であった。目的Iに関しては、0.5%25%までの食塩濃度で高血圧を生じることが明らかになった、その中で2%食塩水飲水による高血圧が146±10/100±10程度のマウスとしては中等度高血圧が投与後12週で生じたので、この濃度をその後の実験に用いることとした。現在までに目的IIに上げた項目について実験が終了しており、今後組織キマーゼ活性欠損マウスでも実験予定である。一方、目的IIIの一部であるキマーゼ阻害薬の降圧については一部のデータが得られている。すなわち、上述した食塩依存性高血圧を用量依存性に阻害した。現在はこれらの結果をまず報告する予定で学会発表や論文投稿中である。平成26年度の研究目的は、目的I:一般的には8%高食塩食では高血圧を発症しない野生型マウス(C57BL/6J)で、飲水中食塩濃度を0.25%から2%まで変化させ、3ヶ月間、血圧・心拍の変動を観察し、血圧上昇を惹起する適切な飲水中食塩濃度を設定する(目的Iの研究期間は平成26年度)。目的II:目的Iで設定したモデルと組織キマーゼ活性欠損マウス(WBB6F1-W/Wv)に同濃度の飲水食塩負荷を3ヶ月間施行し、1週間毎の体重・血圧・心拍測定と飲水量・尿量をメタボリックケージで測定する。両群の差異から、食塩依存性血圧上昇と肥満細胞の関連を明らかにする(目的IIの研究期間は平成26年度から平成27年度)。目的Iに関しては、0.5%2.0%までの食塩濃度で高血圧を生じることが明らかになった、その中で2%食塩水飲水による高血圧が146±10/100±10程度のマウスとしては中等度高血圧が投与後12週で生じたので、この濃度をその後の実験に用いることとした。現在までに目的にIIに上げた項目について実感が終了した。今後、組織キマーゼ活性欠損マウスでも実験予定である。一方、目的IIIのキマーゼ阻害薬の降圧についてもデータが得られている。すなわち、上述した食塩依存性高血圧を用量依存性に降圧した。これらの結果を報告した(Devarajan S, AJP 2015)。目的I,IIは組織キマーゼ活性欠損マウスの実験を除いて終了している。目的IIの一部であるキマーゼ阻害薬の効果についてもデータが得られている。目的IIIも終了した。本研究目的は、目的Iは8%高食塩食では高血圧を発症しない野生型マウス(C57BL/6J)で、飲水中食塩濃度を0.25%から2%まで変化させ、3ヶ月間、血圧・心拍の変動を観察し、血圧上昇を惹起する適切な飲水中食塩濃度を設定することであった。目的IIは目的Iで設定したモデルと組織キマーゼ活性欠損マウス(WBB6F1-W/Wv)に同濃度の飲水食塩負荷を3ヶ月間施行し、1週間毎の体重・血圧・心拍測定と飲水量・尿量をメタボリックケージで測定する。

目的IIの研究期間は平成26年度から平成27年度であった。目的Iに関しては、0.5%2.0%までの食塩濃度で高血圧を生じることが明らかになった、その中で2%食塩水飲水による高血圧が146±10/100±10程度のマウスとしては中等度高血圧が投与後12週で生じたので、この濃度をその後の実験に用いることとした。現在までに目的にIIに上げた項目について終了した。目的IIIは確立した食塩依存性高血圧モデルマウスに特異的キマーゼ阻害薬を含む各種降圧薬の効能を比較することであったが、特異的キマーゼ阻害薬は用量依存性に降圧及び心拍数減少効果を示した。一方、既存の降圧薬投与では、アンジオテンシン受容体拮抗薬とアルドステロン受容体拮抗薬がわずかに、しかし、有意に降圧及び心拍数減少効果を示した。すなわち、高食塩負荷に伴なう組織キマーゼ活性化が昇圧と交感神経活性化を促す事を証明した。これらの結果は既に報告した。(Devarajan S, AJP 2015)8%高食塩食では高血圧を発症しない野生型マウス(C57BL/6J)で、2%食塩水飲水により12週後の血圧が146/100 mmHgへ上昇し、食塩依存性高血圧モデルを確立した。このモデルで特異的キマーゼ阻害薬は用量依存性に降圧及び心拍数減少効果を示した。さらに、各臓器のキマーゼ依存性アンジオテンシンII産生活性は、主に、消化管そして皮膚・骨格筋で有意に増加していた。目的I,IIは組織キマーゼ活性欠損マウスの実験を除いて終了している。目的IIの一部であるキマーゼ阻害薬の効果についてもデータが得られている。したがって、今後は平成27年度以後の研究目的IIIを遂行する。実験研究で最も重要であった、食塩依存性高血圧マウスモデルについては確立したので、キマーゼ阻害薬の効能についてのデータとともに論文化した。(Devarajan S, AJP 2015)今後は、製薬会社が作成するキマーゼ阻害薬は臨床応用されていないため、ヒトでは応用出来ない。したがって、食品・海洋生物・昆虫などの成分ライブラリをヒトキマーゼ阻害作用を有するか否かについてスクリーニングし、臨床応用可能なキマーゼ阻害物質を同定し、今回確立した動物モデルでin vivoでの有用性を探索したい。医歯薬学実験研究で最も重要であった、食塩依存性高血圧マウスモデルについては確立したので、キマーゼ阻害薬の効能についてのデータとともに論文化し、その他の降圧薬との併用投与効果などを検討していく。現時点では新産業財産権の対象となる結果はないと考えている。
臍帯血プロテオーム二次元電気泳動ゲル画像データバンクの構築

ヒトの健康状態や疾病には、胎児期にその起源を有するとの報告が数多くなされている。しかし、その具体的機序は何ら解明されておらず、様々な要因が複雑に絡み合ってそれぞれの病態を形成すると考えられている。我々は平成18年、出生コホート研究を立ち上げ、妊娠から出産、子どもの発達という一連の追跡調査を開始した。生体試料としては、臍帯血を収集しており、これは胎児期の生物学的曝露環境をはかる上で重要な資料となる。臍帯血中には、疾病の環境的要因となりうる物質として、環境ホルモンなど様々な化学物質が存在する。これらの量的な変化が生体に悪影響を及ぼし、種々のタンパク質の発現量に変化をもたらすことが想定される。また、母体や児の遺伝的要因から、臍帯血中のタンパク質の発現量にも差が生じ得ると推測される。したがって、ある特定の疾病群と非疾病群とで臍帯血中のタンパク質を網羅的に解析し、発現量に差があるものを特定できれば、疾病の予知因子として発症リスク予測に使用できるだけでなく、発症のメカニズム解明に対する重要な情報をもたらす。本研究では、臍帯血のプロテオーム二次元電気泳動ゲル画像を大量に保存し、胎児期に起源をもつと考えられる疾病を対象とした、あらゆる疫学研究に対応できるデータバンクの構築を日指す。これまでに我々の出生コホート研究に登録、出産した研究協力者は、約1000名である。本年度は、昨年度確立したプロテオーム二次元電気泳動の実験系を用いて、研究協力者の臍帯血のプロテオーム二次元電気泳動画像の収集を開始した。本研究では、臍帯血のプロテオーム二次元電気泳動ゲル画像を大量に保存し、胎児期に起源をもつと考えられる疾病を対象とした、あらゆる疫学研究に対応できるデータバンクの構築を目指す。これまでに我々の出生コホート研究に登録、出産した研究協力者は、約600名である。本年度は、プロテオーム二次元電気泳動の実験系の確立のため、妊娠高血圧症候群の疾病群と非疾病群の臍帯血の二次元電気泳動画像を収集、比較解析し、特異的なタンパク質スポットを特定するという一連の実験を行い、実験系を確立した。現在、この特異的なタンパク質を質量分析法で同定中である。
ARDS後に生じる肺線維化におけるマトリックスメタロプロテアーゼの関与

ラットに高濃度酸素下(FiO2 75%)でエンドトキシン(LPS)を10日間持続静注(500 g/kg/day)し,ARDS亜急性期における肺胞構造の変化とコラーゲン代謝,MMP, TIMP-1,2,TGF-β1の関与を検討した.1)室内気下生理食塩水投与群(control群),2)高濃度酸素下生理食塩水投与群(HIO2群),3)高濃度酸素下LPS持続投与群(LPS+HIO2群),4)室内気下LPS持続投与群(LPS群)の4群(N=6)を作成した.LPS+HIO2群において気管支肺胞洗浄液(BALF)中細胞数及び肺血管透過性,肺湿乾重量比が最大で,肺組織中のhydroxyproline量は高濃度酸素により有意に低下し,LPSにより有意に増加していた(昨年報告).BALF中のcollagenase活性とgelatinase活性はHIO2群とLPS+HIO2群ではcontrol群の4倍で、zymographyで高濃度酸素によるMMP-2の、LPSによるMMP-9の活性化率の有意な増加を認めた。PCR法によるMMPsのmRNA発現の検討では肺組織中ではMMP-2とMMP-14については全例においてその発現が認められた.TIMP-1のmRNA発現の検討では,HIO2群とLPS+HIO2群で発現の低下を認めた。TIMP-2でもほぼ同様の傾向であった.肺組織中のTGF-β1はHIO2群では他3群と比較して1.5倍以上の増加を認めた.PCRでは全例においてTGF-β1の遺伝子発現を認めた.群間で明らかな発現量の差は確認できなかった.病理学的にHIO2群で肺の気腫化を,LPS群で肺胞壁の肥厚,LPS+HIO2群ではそれらの混在を認めた.ARDS亜急性期における高濃度酸素曝露ではMMP-2の発現増加とTIMPsの発現抑制が肺気腫化に強く関与している可能性があることが示唆された.臨床に近い肺傷害を生じさせるため,ラットに高濃度酸素環境下(FiO2 75%)でエンドトキシン(LPS)を10日間持続静注(500ug/kg/day)し,ARDS亜急性期における肺胞構造の変化とコラーゲン代謝,MMPの関与を検討した.以下の4群(N=6)を作成した.1)室内気下生理食塩水投与群(control群),2)高濃度酸素下生理食塩水投与群(HIO2群),3)高濃度酸素下LPS持続投与群(LPS+HIO2群),4)室内気下LPS持続投与群(LPS群).10日後に肺を摘出し,気管支肺胞洗浄液(BALF)中細胞数,肺血管透過性,肺湿乾重量比,肺組織中hydroxyproline量,BALF中collagenase及びgelatinase活性を測定し,BALFのprotease zymography,病理組織学的検討を行った.LPS+HIO2群においてBALF中細胞数及び肺血管透過性,肺湿乾重量比が最大であった.肺組織中のhydroxyproline量はcontrol群1.71±0.28(ug/mg tissue)であったのに対し,HIO2群では1.32±0.19と有意に低下し(p=0.0075),LPS群では2.01±0.34と有意に増加していた(p=0.0352).LPS+O2群では1.55±0.11であった.BALFのcollagenase活性とgelatinase活性はHIO2群とLPS+HIO2群ではcontrol群の4倍であった.ZymographyでMMP-2とMMP-9の活性を認めた.病理学的にHIO2群で肺の気腫化を,LPS群で肺胞壁の肥厚,LPS+HIO2群ではそれらの混在を認めた.ARDS亜急性期においてエンドトキシンの持続静注は肺に線維化を生じさせ,高濃度酸素は逆に気腫化を生じさせた.肺構造の破壊にはMMP-2及びMMP-9の関与が示唆された.ラットに高濃度酸素下(FiO2 75%)でエンドトキシン(LPS)を10日間持続静注(500 g/kg/day)し,ARDS亜急性期における肺胞構造の変化とコラーゲン代謝,MMP, TIMP-1,2,TGF-β1の関与を検討した.1)室内気下生理食塩水投与群(control群),2)高濃度酸素下生理食塩水投与群(HIO2群),3)高濃度酸素下LPS持続投与群(LPS+HIO2群),4)室内気下LPS持続投与群(LPS群)の4群(N=6)を作成した.LPS+HIO2群において気管支肺胞洗浄液(BALF)中細胞数及び肺血管透過性,肺湿乾重量比が最大で,肺組織中のhydroxyproline量は高濃度酸素により有意に低下し,LPSにより有意に増加していた(昨年報告).BALF中のcollagenase活性とgelatinase活性はHIO2群とLPS+HIO2群ではcontrol群の4倍で、zymographyで高濃度酸素によるMMP-2の、LPSによるMMP-9の活性化率の有意な増加を認めた。

TIMP-2でもほぼ同様の傾向であった.肺組織中のTGF-β1はHIO2群では他3群と比較して1.5倍以上の増加を認めた.PCRでは全例においてTGF-β1の遺伝子発現を認めた.群間で明らかな発現量の差は確認できなかった.病理学的にHIO2群で肺の気腫化を,LPS群で肺胞壁の肥厚,LPS+HIO2群ではそれらの混在を認めた.ARDS亜急性期における高濃度酸素曝露ではMMP-2の発現増加とTIMPsの発現抑制が肺気腫化に強く関与している可能性があることが示唆された.
神経活動の繰り返し活性化による長期的シナプス新生の観察

記憶形成の細胞基盤であると考えられているシナプス可塑性には、短期相と後期相が存在し、それぞれ短期記憶と長期記憶に対応すると想定されている。短期可塑性については、海馬の長期増強現象(LTP)を優れたモデル系として、急速に機構解明が進んだ。しかし、長期可塑性は適した解析モデル系が乏しくほとんど未解明である。近年、LTP後期相で起こるシナプス新生などの細胞形態変化が、長期可塑性であると期待されているが、この形態変化が何週間にも亘り持続し、長期的なシナプス伝達効率の増大に寄与するかについては不明であった。本研究では、海馬脳切片培養系を用いて、このLTP後期相に起こる形態変化が真に長期的な可塑性であるかを検証した。フォルスコリン(アデニル酸シクラーゼの活性化剤)の単回投与によって誘発されたLTP後期相で起こる形態変化(シナプス新生)は24時間以内に消失してしまい、フォルスコリンの繰り返し投与、すなわちLTP後期相の繰り返し誘発によってのみ、数週間持続する長期可塑性に移行することが明らかとなった。シナプス新生は電気生理学的、組織化学的、形態学的に評価し、いずれの指標も上記の結果を支持した。また、この繰り返しLTP後期相の誘発によって起こる長期シナプス新生は、刺激の回数や間隔に依存するものであった。さらに、阻害剤を用いた実験から、MAPKおよびPKAの活性化が刺激以降のシグナルカスケードに位置することも明らかとなった。以上の結果から、LTP後期相と長期可塑性は同じではないと結論づけられる。本研究で見出された繰り返しの短期可塑性(LTP)触発刺激によって起こる、真に長期的な可塑性現象こそが、長期可塑性を細胞基盤とする長期記憶の解析系になると期待される。後期相LTPが長期的シナプス新生へと移行する過程を解析するために、以下の実験モデル系を確立した。ラット海馬の切片培養標本に対し、アデニル酸シクラーゼの活性化剤であるホルスコリン(FK)50μMを1日1回30分ずつ連続3日投与すると、その10-12日経過後に、CA3-CA1シナプスにおける最大集合シナプス電位の大きさを最大集合スパイクの大きさで除した比の値(E/S比)を指標として見て、CA1錐体領域のニューロン1個あたりのシナプス数が増加する。この効果はFK刺激の繰り返し回数に依存し、1回で無効、2回でやや有効、3回以上では飽和した。また、投与回数を固定して比較すると、1-50μMの範囲で濃度に依存して増大すること、刺激の間隔は3-24時間では有効で、1時間以下または48時間以上開けると無効になることが分かった。興味深いことに、FKの1回投与では、数時間オーダーのLTPが起き、E/S比もいったんは上昇するが、24時間後には刺激前の値に戻っていた。次に、電気的指標で見たシナプス新生を、FK繰り返し投与14日後の培養標本について形態学的に確認した。まずシナプス前部構造の指標として、CA1樹状突起領域でのシナプトフィジン免疫陽性スボヅトの密度を調べると、FK繰り返し投与群で対照群(生理的に不活性なFK類似体であるジデオキシホルスコリン繰り返し投与群)に比べて増加していた。ついで、シナプス後部構造の指標として、蛍光標識剤PKH26でCA1錐体細胞を染色し、共焦点検鏡後三次元再構築して樹状突起棘数を数えたところ、遠位樹状突起上において一定長あたりの棘数が増加していた。さらに透過型電子顕微鏡観察によって微細構造を検討すると、遠位樹状突起上において一定長あたりのシナプス数が、近位樹状突起上においては有孔末端シナプス(perforated synapse)の数が増加していた。以上の結果は、形態学的にシナプス新生を裏付けると同時に、シナプス伝達効率の増大をもたらす形態変化には複数の要素があることを示唆する。

本研究で見出された繰り返しの短期可塑性(LTP)触発刺激によって起こる、真に長期的な可塑性現象こそが、長期可塑性を細胞基盤とする長期記憶の解析系になると期待される。これまで、ラット海馬の切片培養標本にアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリン(F : K)を繰り返し投与すると、投与後1週間経過してゆっくりと始まるシナプス新生が観察されることを報告した。この長期シナプス新生を起こすためには、3時間から24時間の間隔で3回以上繰り返してFKを投与することが必要であった。本年度は海馬の興奮性伝達物質であるグルタミン酸の繰り返し投与で同様の長期シナプス新生が起こるかについて検討した。培養812日後の海馬切片培養標本にグルタミン酸を1回3分間、24時間間隔で3回投与し、その後のシナプス新生を観察した。まず、FKの時と同様にCA3-CA1シナプスにおける最大集合シナプス電位の大きさを最大集合スパイクの大きさで除した比の値(E/S比)を、CA1錐体細胞1個当たりのシナプス数の指標とした。グルタミン酸3回投与群(Glu3)では対照群(Con3:グルタミン酸を含まない溶液で液交換のみ行った)と比較すると、刺激の1週間後から有意にE/S比の増大が認められ、2週間後まで持続した。この増大はグルタミン酸1回投与群(Glu1)では認められなかった。このとき、プレシナプスの指標であるシナプトフィジン免疫陽性スポット密度を調べると、Glu3ではCon3やGlu1に比べて電気生理学的指標と同様の時間経過で有意に増加していた。次に、グルタミン酸刺激時にどのような蛋白質リン酸化酵素が活性化されることが長期シナプス新生につながるのかを知る目的で、種々の蛋白質リン酸化酵素の阻害剤存在下でグルタミン酸刺激を行い、1週間後のE/S比を観察した。その結果、MEKおよびPKAの阻害剤で長期シナプス新生が阻害された。以上の結果より、グルタミン酸の繰り返し投与によっても長期シナプス新生を起こせること、またグルタミン酸による長期シナプス新生は投与時のMEKとPKAの活性化が必要であることが示唆された。さらに、MEKによりリン酸化されたMAPKの発現量が、1回刺激直後に比べて3回刺激直後でより顕著に増加すること、また3回刺激時にのみリン酸化MAPKがCA1錐体細胞の細胞質から核に移行することも分かった。今後、長期シナプス新生を起こすのに有効なグルタミン酸の刺激間隔、刺激頻度、さらにMAPKのリン酸化がこの長期シナプス新生にどのように関与しているのかについて検討を進めていく。前年度は、ラット海馬切片培養にグルタミン酸を繰り返し投与すると、CA3-CA1シナプスにおいて長期的シナプス新生が起こることを見出した。本年度はこの現象について、さらに詳細な解析を行った。シナプス新生は電気的および組織学的指標で観察した。電気的指標にはCA3-CA1シナプスにおける最大集合シナプス電位の大きさを最大集合スパイクの大きさで除した比の値(E/S比)を、CA1錐体細胞1個当たりのシナプス数として用いた。組織学的指標にはシナプトフィジン免疫陽性スポット密度を用いた。グルタミン酸繰り返し投与による長期的シナプス新生に関して明らかになったことは、以下の点である。1)グルタミン酸の濃度依存性:30μM以下は無効、100-300μMで有効であった。海馬切片培養にLTPを誘発させる濃度と一致していた。2)投与回数