hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コア融合機能を持つ計算機システムの開発

本研究では,ハードウェア記述言語を用いて現実的なCoreSymphonyマイクロアーキテクチャの開発と動作検証をおこなった.すなわち,マイクロアーキテクチャレベルの工夫により,CoreSymphonyの回路規模の削減を達成した.また,FPGAボード間の通信としてシリアルATAケーブルを用いた高速シリアル通信の評価をおこない,高いバンド幅のデータ転送が可能であることを確認するとともに,この高速通信ポートおよびFPGA,DRAMを搭載する計算機アーキテクチャ研究に適したボードの設計をおこなった.プロセッサの性能向上を維持するため,チップに複数のプロセッサコアを集積するマルチコアプロセッサが注目されている.本研究では,コア融合の仕組みを用いる新しいメニーコアアーキテクチャによるプロセッサの高性能化を目指している.また,FPGAを用いたプロトタイプシステムを構築して,プロセッサアーキテクチャとシステムソフトウェアとを含む計算機システムのレベルで提案方式の有効性を検証することを目的としている.研究初年度の平成25年度は,研究計画をベースに次の(A), (B)の検討をおこなった.(A)HDLによるCoreSymphonyマイクロアーキテクチャの開発と動作検証,(B)タスク配置を含むシステムソフトウェアの設計と実装.この中でも特に重要となる(A)について重点的に取り組んだ.具体的な実績は次の通り.初年度の平成25年度には,CoreSymphonyプロセッサを少ないハードウェア量で実現できるように改良するとともに洗練された回路構成による高速化をおこなった.すなわち,マイクロアーキテクチャのレベルの工夫によりCoreSymphonyの回路規模の削減を達成した.また,最終的には,CoreSymphonyアーキテクチャのプロセッサをFPGAに実装して性能評価をおこなうことを考慮して,ルックアップテーブルの入力数とっったFPGAの構造を意識したハードウェア規模の削減手法を検討し,その有用性を確認した.プロセッサの性能向上を維持するため,チップに複数のプロセッサコアを集積するマルチコア/メニーコアと呼ばれるプロセッサアーキテクチャが注目されている.本研究では,コア融合の仕組みを用いる新しいメニーコアアーキテクチャによるプロセッサの高性能化を目指している.また,FPGAなどを用いたプロトタイプシステムを構築して,プロセッサアーキテクチャとシステムソフトウェアとを含むコンピュータシステムのレベルで提案方式の有効性を検証することを目的としている.研究2年目の平成26年度は,研究計画における項目(C)として挙げている「計算機アーキテクチャ研究に適したFPGAボードの設計」をおこなった.具体的には,FPGAボード間の通信としてシリアルATAケーブルを用いた高速シリアル通信の予備評価をおこない高いバンド幅のデータ転送が可能であることを確認した.また,コア融合の仕組みを持つメニーコアプロセッサにタスクを割り当てたり,複数のコアの融合や分離の制御をおこなったりするためのオペレーティングシステムが備えるべき機能の検討をおこなった.加えて,オペレーティングシステムとして採用することを検討しているLinuxが動作するx86命令セットアーキテクチャの計算機システムをFPGAボード上に実装しSPEC CPUなどのベンチマークプログラムが正しく動作することを確認した.プロセッサの性能向上を維持するため,チップに複数のプロセッサコアを集積するマルチコア/メニーコアと呼ばれるプロセッサアーキテクチャが注目されている.コア融合の仕組みを用いる新しいメニーコアアーキテクチャによるプロセッサの高速化と計算機アーキテクチャ研究に適したFPGAボードの設計と実装を目指して研究をおこなった.研究3年目の平成27年度は,ルックアップテーブルの入力数といったFPGAの構造を意識したプロセッサのハードウェア規模の削減手法に関する検討を進めた.次に,コア融合の仕組みを持つメニーコアプロセッサにタスクを割り当てたり複数のコアの融合/分離の制御をおこなったりするオペレーティングシステムとしては汎用のLinuxを利用する.このLinuxが動作させる研究と教育に適したx86命令セットアーキテクチャの計算機システムとして開発してきたFrixと呼ばれるシステムの完成度を実用的なレベルに引き上げ,ソースコードを含むこれらこの成果をウェブにて公開することができた.また,標準的で洗練されたアウトオブオーダ実行のプロセッサをVerilog HDLで記述し,そのハードウェア量との比較から,提案しているコア融合の仕組みを持つメニーコアプロセッサアーキテクチャであるCoreSymphonyの実現可能性を明らかにした.構築した標準的で洗練されたアウトオブオーダ実行のプロセッサの成果をウェブにて公開することができた.本研究では,ハードウェア記述言語を用いて現実的なCoreSymphonyマイクロアーキテクチャの開発と動作検証をおこなった.すなわち,マイクロアーキテクチャレベルの工夫により,CoreSymphonyの回路規模の削減を達成した.また,FPGAボード間の通信としてシリアルATAケーブルを用いた高速シリアル通信の評価をおこない,高いバンド幅のデータ転送が可能であることを確認するとともに,この高速通信ポートおよびFPGA,DRAMを搭載する計算機アーキテクチャ研究に適したボードの設計をおこなった.研究2年目の平成26年度は,研究計画における項目(C)として挙げている「計算機アーキテクチャ研究に適したFPGAボードの設計」をおこなった.具体的には,FPGAボード間の通信としてシリアルATAケーブルを用いた高速シリアル通信の予備評価をおこない高いバンド幅のデータ転送が可能であることを確認するとともに,この高速通信ポートおよびFPGA, DRAMを搭載するボードのレイアウト設計をおこなった.また,コア融合の仕組みを持つメニーコアプロセッサにタスクを割り当てたり,複数のコアの融合や分離の制御をおこなったりするためのオペレーティングシステムが備えるべき機能の検討をおこなった.加えて,オペレーティングシステムとして採用することを検討しているLinuxが動作する計算機システムをFPGAで実現し,OSを含むコンピュータシステムのレベルで提案方式の有効性を検証するための環境の構築を進めた.また,研究計画における項目(B)として挙げている「タスク配置を含むシステムソフトウェアの設計と実装」を進めた.一方で,FPGAの製造元であるXilinxと日本代理店の企業との提携解消という状況が生じたため,平成26年度1月以降のFPGAの入手が困難になるという事態が発生した.このため,実施を予定していたFPGAボードの実装と動作検証については平成26年度に実施することができなかった.こちらは,平成27年度の前半に優先的に進めていく.計算機アーキテクチャ

平成27年度は,これまでに開発したコア融合アーキテクチャCoreSymphonyのハードウェア記述,システムソフトウェア,FPGAボードの設計データを活用して,CoreSymphonyアーキテクチャのシステムレベルの評価を実施することを主な目的とする.まず,平成26年度にレイアウト設計したFPGAボードについては基板製造と実装,そして動作検証を早急に実施する.また,これらのボード間の通信テストをおこなうとともに,プロトタイプとして用いることができるように整備する.設計・実装するFPGAボードについては,本研究で活用するとともに,様々なコンピュータアーキテクチャ研究の例題に適用することで,その有用性を示していく.また,詳細評価に必要となる様々な分野のアプリケーションプログラムを本研究のプラットフォームに移植(並列化)し,これらを用いて,計算機システムのレベルでコア融合機能を持つメニーコアプロセッサの詳細な評価を実施する.加えて,本研究成果をまとめたホームページなどを整備して,実装したソフトウェアとハードウェアやその仕様等を公開し,それらの普及に努めていく.平成25年度には,(A)HDLによるCoreSymphonyマイクロアーキテクチャの開発と動作検証,を重点的に実施した.複雑な回路構成を必要としていた初期のCoreSymphonyアーキテクチャを見直して,現実的で効率的な構成に向けたアーキテクチャ検討を進めた.具体的には,複数分岐予測器の一つであるTree-based Multiple Branch Predictor,プロセッサバックエンドについて,コア融合のためのグローバルな情報とローカルな情報とを分離して格納する方式,の実装方式を工夫し,FPGAにで動作検証をおこなった.この成果の一部については国際会議にて発表を行った.
ホウ素の土壌環境中での動態と環境に与えるインパクト

十字科の作物はホウ素要求量が高く、土壌のホウ素供給力が低い場合、ホウ素肥料の施用が必要となる。一方、高濃度のホウ素は植物の生育を阻害し、人体にも害を及ぼす。作物のホウ素要求量を満たすために、多くの場合過剰施肥が行なわれ、それがホウ素の溶出を引き起こし、水系などの環境へ負荷を与えることが懸念されている。昨年は農耕地土壌のホウ素供給力と施肥ホウ素の潜在的溶出特性を検討し、全般的に供試した土壌のホウ素供給力が低いこと、ホウ素含量の低い土壌でも施肥を行った場合、ホウ素が流出し環境に影響を与える可能性があることを示した。本研究では昨年に続き、作物栽培条件下でのホウ素の挙動を解明するために、グリーンハウス内でポット試験を行なった。供試土壌としては川砂とハウス土壌を、栽培植物にはセロリ(Aoium fraveolens L.var.dulce DC.)を用いた。供試土壌のみの区と供試土壌対バーク堆肥1:1の区を設け、ホウ素肥料(ホウ砂)を0、1(標準)、2(二倍)及び3(三倍)レベルになるように施用した。1週間か10日間隔で流出水を採取し、全ホウ素含量などの項目を測定した。なお、栽培前後の土壌のホウ素含量、セロリのホウ素含量を測定し、土壌-植物-水系でのホウ素の挙動を検討した。35日の栽培期間中に1.417.4%のホウ素が溶出した。ホウ素の溶出量は砂区で高く、施肥量が高くなるにつれて多くなる傾向を示した。また、ホウ素の溶出量は最初の一、二回の採水で多く認められ、その後は少なくなった。このことから、施肥後最初の一、二回の雨あるいは潅水によってホウ素が溶出しやすいことが分かった。さらに、土壌だけの区よりバーク堆肥を混ぜた区の方がホウ素の溶出量が低く、バーク堆肥など有機物の施用がホウ素の溶出を抑える効果があることが明らかとなった。一方、セロリのホウ素吸収量は添加量の1%以下であった。このように、施肥したホウ素のわずか一部が植物に吸収されるが、その大部分は土壌中に残され、施肥直後には急激に、その後は徐々に溶出し、水系に負荷を与えるものと予想される。作物のホウ素欠乏症は砂質な土壌に多くみられる。そのため、肥料として施用されたホウ素が土壌から流出し、水系など環境への影響が懸念されている。必須微量元素であるホウ素の施肥は作物栽培上不可欠であるため、ホウ素の環境中での動態を明らかにすることは、環境保全型農業の実現に向けて重要な課題の一つと思われる。本研究では、ホウ素の土壌環境中でのダイナミックスを解明し、環境への影響を評価することを目的とし、高知県農耕地土壌のホウ素供給力及びホウ素の潜在的溶出特性について検討した。高知県農耕地土壌30点(水田、畑、樹園地、施設)を試料として用いた。全試料の一般的理化学性の分析を行い、全ホウ素、熱水可溶性ホウ素含量を測定した。以上の分析結果を踏まえて、3点の土壌についてホウ素を水溶性、交換態、有機物、マンガン酸化物、鉄・アルミニウム酸化物及び残留画分に分けて測定した。さらに、この3点の土壌に5mg kg^<-1>のホウ素を添加し、上記各画分への分配を定量した。なお、全ホウ素含量の測定はクルクミン比色法(550nm)で、その他はICP発光分光法で行った。供試土壌の全ホウ素含量は20.277.1mg kg^<-1>で、ホウ素の天然賦存量(2100mg kg^<-1>)の範囲にあった。一般理化学性との関係を調べたところ、粘土や細砂画分と正の相関が認められ、母材との関連が示唆された。熱水可溶性ホウ素は施設土壌の一部を含めて大部分の土壌において、一般にホウ素欠乏症が発生する恐れがあるとされている基準値の0.2mg kg^<-1>付近かそれより低い値を示した。このように、全般的に土壌のホウ素供給力が低いことが明らかになった。このことは土壌中ホウ素の98.5%以上が難溶性画分に存在するという画分別測定の結果からもうかがえた。一方、土壌に添加したホウ素の約7割が水溶性と交換態画分に抽出された。これらの結果はホウ素含量の低い土壌でも施肥を行った場合、ホウ素が流出し環境に影響を与える可能性があることを示している。

本研究では昨年に続き、作物栽培条件下でのホウ素の挙動を解明するために、グリーンハウス内でポット試験を行なった。供試土壌としては川砂とハウス土壌を、栽培植物にはセロリ(Aoium fraveolens L.var.dulce DC.)を用いた。供試土壌のみの区と供試土壌対バーク堆肥1:1の区を設け、ホウ素肥料(ホウ砂)を0、1(標準)、2(二倍)及び3(三倍)レベルになるように施用した。1週間か10日間隔で流出水を採取し、全ホウ素含量などの項目を測定した。なお、栽培前後の土壌のホウ素含量、セロリのホウ素含量を測定し、土壌-植物-水系でのホウ素の挙動を検討した。35日の栽培期間中に1.417.4%のホウ素が溶出した。ホウ素の溶出量は砂区で高く、施肥量が高くなるにつれて多くなる傾向を示した。また、ホウ素の溶出量は最初の一、二回の採水で多く認められ、その後は少なくなった。このことから、施肥後最初の一、二回の雨あるいは潅水によってホウ素が溶出しやすいことが分かった。さらに、土壌だけの区よりバーク堆肥を混ぜた区の方がホウ素の溶出量が低く、バーク堆肥など有機物の施用がホウ素の溶出を抑える効果があることが明らかとなった。一方、セロリのホウ素吸収量は添加量の1%以下であった。このように、施肥したホウ素のわずか一部が植物に吸収されるが、その大部分は土壌中に残され、施肥直後には急激に、その後は徐々に溶出し、水系に負荷を与えるものと予想される。
構音運動制御の中枢機序

本研究はヒトの脳の電気活動の空間分布を解析して、中枢神経系がいかに構音運動を制御しているかを知ることにある。そのために既設の医用電算機に2つのプログラムを導入した。第1は脳波の周波数領域での分析(即ち帯域別の振幅)を空間的に表示する脳等電位図(トポグラフマップ)プログラムである。第2は刺激、または自発運動に対する脳電気活動の時間領域での分析を平面的に表示する誘発電位図プログラムである。脳等電位図の応用では、閉目安静時をコントロ-ルとして、種々のタスク(課題)を与えて脳波所見を調べた。被検者は2230歳の健康成人で、何れも右利きであり、試みたタスクは以下である。1)読聴取(童話録音を聴取)、2)音楽聴取(平坦なオ-ケストラ音楽)、3)未知言語聴取(ロシア語の戯曲朗読)、4)暗算。脳波所見としては、精神活動に対応して速波化、電位の平低下が見られることは他の研究者の所見と一致した。部位的には言語活動に対応して側頭後部と頭頂部の所見が特徴的であった。(ブロ-カやウェルニッケの中枢と完全に対応する部位局在は見られないが、これはむしろ表皮電極による方法の限界を示すものであろう)。左右差を統計的に処理するにはC3-C4、P3-P4、03-04各電極間でのα波、β波の振幅を比較した。速波化・平低化に伴い、α波の減少とβ波の増強とが伴なって起こったが、常に有意差の見られたのはむしろα波所見であった。上記電極間では常に言語活動に伴なってα-Suppressionが起こった。誘発電位図でも言語活動の左脳優位が見られ、これは事象関連電位(いわゆるP300)に著しかった。発音運動に対応する準備電位が前頭部に見られたが、これもまたブロ-カ中枢と完全には対応しなかった。亀田らは本課題に着手する以前から,音声言語の聴取と大脳機能の左右差について研究を行なってきた.本課題による研究ではその脳電位分布への反映を確認しようとするものである.また亀田およびその共同研究者の鎌田は,動物について大脳皮質の電気的活動については諸種の研究を行ない発表してきているが,ヒトの脳波については経験が少なかった.さらに脳電位分布は電算機プログラムによって行なわれ,そのプログラムは医用電算機ATACー450に搭載して実施されるものであるが,ATACー450そのものはほとんど連日使用しているので十分使いこなせるものの,本プログラムは著作使用権保護のためユーザがこれを読みとることができないように保護されているので,経験が必ずしも役立たない.従って脳波〓鎌装置およびその分析プログラムが導入されてから,その習熟のためにかなりの時間が費やされた.安定した記録と分析が行ないうるようになったので実験が開始された.音声行動(発声および聴取)に伴なう脳電位分布が比較され,左脳の優位が認められる点で,われわれの予測および他の研究者の結果と一致した.さらに進んで言語音および擬似言語音の比較が行なわれ,どの程度類似すれば左脳慮位を示すかの実験が行なわれている.これはいかなる音響的性質が言語に特有と認知されるかについての客観的研究へ発展できる.しかし発声と発音擬似運動との差は安定した成績を得ていない.

これは指示が言語的になされ,中枢制御が内言語的になされているためと思われ,言語活動を伴なわない発音擬似運動を考え出す必要がある.昭和62年度においては脳等電位図を利用することによって、音声言語活動(特に音声聴取)に伴う脳活動について研究し、諸知見を得た。昭和63年度においてもこの研究は続行され、構音運動に伴う脳電位分布についても研究した。その結果、音声活動時と無刺激沈黙時との差は見出されたが、部位的には顕著な局所化を見出さなかった。本年度は電算機プログラムとして、「誘発反応図プログラムを導入することができたので、これによってさらに研究を進めた。音声刺激を与えた場合、古典的な短潜時の誘発電位は常に、確実に誘起されるし、これは部位的にも限局していることが誘発反応図で示される。しかし近年事象関連電位と呼ばれるものに注意が向けられている。これは別名をP300と言われるように、約300msという長い潜時ののちに、多くは陽性の電気変動として記録される。この事象関連電位についての電位分布図を作ったところ、非刺激時、音声刺激時、および非言語音刺激時の三条件で異ったパタンを示すことが分かった。さらに構音運動について同称のことを試みた。すなわち最初の発声が行われた時点をトリが信号として扱った場合、短潜時の電位変化や負潜時の電位変化(すなわちいわゆる準備電位)が記録された。これと並んで長い潜時の脳電位変化が観察された。しかしこれはP300のようには、潜時が一定ではなかった。発声する際の内的条件、中枢過程はなかなか一定にはならないので、このことが原因となっている可能性もあろう。今後発声条件の一定化に努力してゆきたい。しかし、誘発反応図によって、現在の技術でも部位局在の発見は容易になってきた。このことは本研究の見通しが明るいことを示し、研究計画を遂行する必要性を感じさせる。本研究はヒトの脳の電気活動を解析して、中枢神経系がいかに構音運動を制御しているかを知ることにある。そのために既設の医用電算機に脳等電位図および誘発電位図のためのプログラムを導入した。初(昭和62)年度で脳等電位図(トポグラフマップ)によって解析し、定性的に言語活動による特徴的な脳波所見のあること、またそれは左脳優位性を示すことが分かった。次(昭和63)年度で誘発電位図を利用することによって音声活動の分析を行なった。特に事象関連電位に焦点を置いて観察したが、種々条件での観察ののち再び以前の条件を与えるとその結果は必ずしも一致していなかった。このため本(平成元)年度では種々のタスク(課題)下での脳等電位図の実験をさらに精査することにした。被検者は2230歳の健康男女で、何れも右利きであった。閉目安静をコントロ-ルとして以下のタスク下での脳波を分析した:1)朗読聴取:童話を朗読した録音を聞かせたが破検者の注意を集中するため、予め設問を与えた。2)音楽聴取:著しい強弱のないオ-ケストラ音楽を聞かせた。3)理解できない言語の聴取:ロシア語の戯曲朗読を聞かせた。4)暗算:かなりの精神的緊張と内在的言語活動を伴うものとして行なった。結果として言語活動に対応して特徴的活動が側頭後部と頭頂部に見られた。しかし局在として例えばウェルニッケ中枢に完全に対応するものはなかった。これはむしろ脳活動局在を体表電極によって推測する場合の限界を示すものであろう。左右差を統計的に処理するにはC3ーC4、P3ーP4、03ー04各電極間でのalpha波、beta波所見を調べた。有意差が常に見られたのはalpha波であって精神活動に伴なってそのレヴェルが減少し、言語活動に伴なって特に左脳で低下した。この方法は、限界があるにしても、発展が望まれる研究手段である。
選択的リグニン分解菌の遺伝子工学的解析

本研究は、担子菌Ceriporiopsis subvermisporaのリグニン分解メカニズムの遺伝子工学的な手法を用いた解明と高効率のリグニン分解菌の創出をして、Ceriporiopsis subvermisporaにおける形質転換系の開発、およびリグニン分解酵素遺伝子の解析を行って、その生理学的な役割を明らかにするとともに、リグニン分解に関与する新しいファクターの同定を試みる。また、白色腐朽菌ヒラタケの形質転換系を用いてリグニン分解系の増強された組換え担子菌の作製を試みることを目的とした物である。これまでの研究で開発されたCeriporiopsis subvermisporaのハイグロマシン耐性への形質転換系の安定性やコピー数の解析を行ったところ、染色体内に多数、ランダムに挿入されていて形質の安定なクローンが複数確認された。一方薬剤選択圧非存在下で継代培養することにより、ハイグロマイシン耐性が脱落するクローンも単離された。今後導入DNAの挙動を調査する予定である。また、形質転換効率の上昇を目的として、ハイグロマシン耐性遺伝子のプロモーターをCeriporiopsis subvermisporaのラッカーゼ遺伝子のプロモーターに付け替えた組換え遺伝子を作り、形質転換実験を行ったが、従来のベクターに比べて著しい効率の上昇は観察されなかった。Ceriporiopsis subvermisporaのリグニン分解に関与すると考えられるマンガンペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子の単離を行い、複数のクローンを得ており部分的塩基配列を決定した。今後得られた遺伝子を用い、プロモーター等を他の遺伝子由来のものに組み換えることによって、Ceriporiopsis subvermisporaまたはヒラタケ内での酵素の一次代謝での発現を試みる。リグニン分解における選択性が高い担子菌として知られるCeriporiopsis subvermisporaの菌糸体を、等張濃度のマンニトール存在下で細胞壁溶解酵素として1%Novozyme、0.5%Zymolyase、0.2%Chitinaseを用いて消化することにより調製したプロトプラストに、ヒトヨタケのチューブリン遺伝子発現シグナルに連結した大腸菌のハイグロマイシンB耐性遺伝子を持つベクターpPHT1をPEG/CaCl_2法により導入する形質転換を行った。その結果、1次スクリーニングでは100μg/mlハイグロマイシンB含有再生培地上に生育可能な薬剤耐性株が5μg形質転換ベクター当たり814個得られたが、多くは同濃度の薬剤含有培地上での2次スクリーニングで耐性を失った。2次スクリーニングで耐性を確認した株から抽出されたゲノムDNAを鋳型としてPCRを行ったところ、いくつかの株で導入した遺伝子の増幅を検出した。さらに3回目のスクリーニングを行い薬剤耐性の安定性を調査すると共に、サザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の確認を行ったところ導入した遺伝子配列が特異的に検出される株が見つかった。このことは同菌における形質転換法が初めて開発されたことを意味する。
消滅の危機に瀕した八重山語諸方言の音声・例文付き辞書作成

当該年度は、1.既存の語彙の音声データの処理、2.新たな調査地の開拓、3.語彙データの蓄積、4.論文の執筆を行った。1.既存の語彙の音声データの処理:一昨年度、手が付けられていなかった、これまでに蓄積された音声データの処理ができた。この作業は今後も続ける必要がある。2.新たな調査地の開拓:一昨年度に予定していた調査地が調査不可となった。そのため、当該年度は新たな調査地の開拓を一つの目標としていた。結果、新たな場所でコネクションを作り、調査を始めることができた。現在100程度の語彙の調査を行っている。録音も同時に行った。ただ、例文が不足しているものがあり、完全な状態とは言えず、今後、話者との関係を構築しながら情報を追加する必要がある。一方、言語現象としては、先行研究で報告されているものとは異なるように思われる音声的現象も観察されており、今後注意深く観察する必要があるものと思われる。3.語彙データの蓄積:語彙データおよび、例文の音声データを二つの地点において蓄積した。これまでに収集されていない語彙も含まれており、危機方言の記録としては非常に価値の高い録音ができた。4.論文の執筆:南琉球八重山黒島方言の活用に関する論文の執筆を行った。同論文では、黒島方言の動詞、形容詞、コピュラの活用を記述した。黒島方言の動詞活用は、古典日本語の動詞活用分類とは一致しないものが観察されるなど、独自に注意すべき現象が多々見られる。一昨年度の遅れの原因となっていた、音声データの処理と、調査地の変更を当該年度ではカバーすることができ、おおむね順調に進展していると言える。新規フィールドが開拓できたので、今後は語彙、例文の蓄積をできる限り行う。音声データの処理も同時にすすめ、公開できるかたちにする。当該年度は、語彙データの蓄積を目的としていた。結果、1.語彙データの蓄積、2.当該方言に特徴的な表現に関する論文の執筆、を行うことができた。1.データの蓄積:本年度は、主に、沖縄県八重山郡竹富町黒島において調査を行い、黒島方言のデータの蓄積を行った。フィールドワークは計3度行った。具体的調査内容としては、これまでに収録されていなかった語彙や、その例文の収集を行った。特徴的な語彙としては、黒島方言話者にとって身近な動植物に関する語彙を収集した。ほとんどすべての項目について、録音も同時に行った。また、これまでに収集していた方言による会話の書き起こしからも語彙項目の追加を行っている。2.特徴的な表現に関する論文の執筆:語彙項目追加の過程で明らかになった黒島方言に特徴的ともいえる表現に関する論文を執筆した。具体的には、黒島方言における係助詞「du」、および、黒島方言の若者ことばともいえるいわゆる「標準語」(黒島で用いられている伝統的方言に強い影響を受けた「標準語」)の「が」の共通性に関する論文を執筆した。さらに、これらに対する観察をとおして、現代標準日本語の「が」に関する考察も加えた。研究上のデータベースとして、これまでに収集された談話資料などの録音資料を利用し、それらの中での生起の様子から、係助詞「du」の統語的特徴について観察を行った。さらに、近隣の石垣島方言において報告されている現象と対比させながら、黒島の「若者ことば」の「が」の統語的特徴について述べた。黒島方言のデータベースの蓄積(録音含む)については予定通り進んでいる。また、データベース蓄積に伴って明らかになった言語事実の公表も、論文執筆を通して行っている。一方、もうひとつ予定していたフィールドが、話者の都合で調査不可になった。そのため、他のフィールドを求める必要がある。その点において遅れていると言える。録音も同時に行った。

今後は、例文が欠けている辞書項目の例文収録を優先的に行う。同時に、現在手を付けられていない、音声の編集にも着手し、公開可能なデータベースのかたちに近づける予定である。また、新たなフィールドの開拓も必要である。新規フィールドが開拓できたので、今後は語彙、例文の蓄積をできる限り行う。音声データの処理も同時にすすめ、公開できるかたちにする。2018年3月22日から4月2日にかけて現地調査を行ったため、次年度使用額が生じた。今年度も主に現地調査のために支出する予定である。
コンクリート・地盤・水環境中の有害物質の処理・処分技術の開発

有害物質(重金属,放射性物質)の処理や処分におけるセメント系材料の利用技術に関して,コンクリート工学・地盤工学・環境化学の観点から総合的な検討を行った.セメント系材料におけるCsの挙動を分析し,特にウッドチップ混入ポーラスモルタルに関しては,セシウムのフィルターとしての機能性を評価した.重金属汚染土壌の不溶化処理について,カルシウム/マグネシウム系複合材料による効果を検証した.ベントナイトとセメントからなる人工バリアにおいて,粘土の間隙水組成とカルサイトの生成,塩化物イオンの拡散に及ぼす閉塞効果を明らかにした.(1)研究分担者によるプロジェクト会議を実施し,研究進展状況を確認するとともに,分野間の情報交換を行った.また,実務の専門家を招へいして情報収集を行った.(2)セメント硬化体および各種骨材に関するセシウム(Cs)の吸着挙動を試験するとともに,炭酸化試料の分析も行った.(3)吸着特性を把握した各種材料を用いて作製したモルタルに関して,Csの浸透挙動を評価した.特に炭酸化の影響についてEPMA分析などによって検討した.炭酸化によってセメント硬化体のCsに対する固定化能が増加し,Csを濃縮移動させる可能性が示された.また,再生利用材料である廃瓦を骨材として用いたコンクリートを作製し,強度発現や空隙構造の変化から検討を行った.さらに,ウッドチップ混入ポーラスモルタル(WPM)を利用した重金属(主にCu)及びCsの吸着挙動を調査した.(4)建設時に発生する掘削土や廃棄物埋立地盤中における重金属の移動性について,屋外曝露試験,ライシメータ試験,各種溶出試験等によって評価を行った.また,重金属不溶化処理のメカニズムを検討した.特に砒素に着目し,鉛等のカチオンと比較した不溶化メカニズムの差異,不溶化材の化学組成が及ぼす影響を明らかにした.(5)ベントナイトとセメントからなる人工バリアにおける境界面の挙動を分析するため,複合供試体を作製して浸漬試験を行い,変質状況を分析するとともに,変質抑制手法についての検討を行った.また,カラム試験によって同様の分析を行ったが,変質抑制の観点からは両者の結果は異なる傾向を示した.研究プロジェクト会議を開催し,応用化学およびコンクリート材料化学を専門とする連携研究者と議論を行い,研究の方向性についての助言を受けた.乾湿履歴や炭酸化の影響を受けたモルタル試料に関して,塩化セシウムの浸透および吸着試験を行い,炭酸化領域におけるセシウムイオン(Cs+)の吸着によって,深部への浸透が抑制されることを示した.また,塩分を含有する廃瓦を用いたコンクリートに関して,強度発現や水分逸散・収縮挙動を分析し,強度発現の促進や水分逸散および乾燥収縮の抑制効果があることを示した.ウッドチップ混入ポーラスモルタル(WPM)のセシウムイオン(Cs+)の保持挙動を調査し,Cs+に対するWPMの保持力は重金属イオン(たとえば、Cu2+)よりも弱く、イオン交換吸着の可能性が高いことを突き止めた.また,Csの保持は,水溶液のpH4-9において大きな変化が見られず,吸着速度も比較的早いことが分かった.地盤材料を中心とする鉱物系材料による放射性物質および自然由来の重金属等の吸着・不溶化特性に及ぼす主要な共存イオンの影響をバッチ試験を中心とする室内試験で検討を行った。その結果,例えばNa型ベントナイトによる放射性物質の吸着には従来指摘されていたカリウムイオンに加え,カルシウムイオンの影響も同程度大きいことを明らかにした.さらに,溶脱や炭酸化といった環境作用を受けた際の脱着・再溶出のポテンシャルを室内促進試験により明らかにした.セメントペーストとベントナイトの境界部の変質挙動について,特に,ベントナイトに事前混合する炭酸ナトリウムの量が境界部に生成する炭酸カルシウム量や拡散抑制効果に及ぼす影響を分析し,一定量以上の炭酸カルシウムが生成した場合には,拡散抑制効果が明確になることを示した.また,ベントナイトの膨潤挙動への影響を分析し,炭酸ナトリウムなどの無機物質の混合によってアルカリ変質を抑制できることを示した.(1)研究分担者によるプロジェクト会議を実施し,研究進展状況を確認するとともに,今後の展開に関する討議を行った.(2)前年度に引き続き,普通モルタルにおけるCsの浸透挙動を評価した.炭酸化によってセメント硬化体のCsに対する固定化能が増加し,再溶出過程に影響を及ぼすことを定量的に明らかにした.再生利用材料である廃瓦を骨材として用いたコンクリートに関しては,低濃度の塩分の影響を強度発現や空隙構造の変化から明らかにした.ウッドチップ混入ポーラス(WPM)に関しては,放射性セシウム(Cs)のフィルターとしての機能性を評価した.今年度は,バッチによる吸脱着試験の他にカラムに粉砕したWPMを充填し,Csイオンの吸着速度を見積もった.並行して土壌や焼却灰等からの重金属及びセシウムの流出を,逐次抽出法により評価した.その結果,CsのWPMに対する吸脱着機構はイオン交換作用によるものであり,その機構は重金属とは異なることを明らかにした.(3)地盤・鉱物系材料を用いた放射性物質,重金属等による汚染対策手法の信頼性の検討に関して,カルシウム/マグネシウム系複合材料によって不溶化した汚染土を対象に,炭酸化が及ぼす影響を評価した.ヒ素は炭酸化によって溶出しにくいFe吸着態に転換するが,砂質土においては併せて水溶性態が増加し,溶出性が高くなる.一方,鉛は土質を問わず不溶化処理により交換性態の割合が低下し,炭酸化による影響もないことを明らかにした.

(4)ベントナイトとセメントからなる人工バリアにおける境界面の挙動分析において,粘土の間隙水組成とカルサイトの生成,塩化物イオンの拡散に及ぼす閉塞効果を明らかにした.有害物質(重金属,放射性物質)の処理や処分におけるセメント系材料の利用技術に関して,コンクリート工学・地盤工学・環境化学の観点から総合的な検討を行った.セメント系材料におけるCsの挙動を分析し,特にウッドチップ混入ポーラスモルタルに関しては,セシウムのフィルターとしての機能性を評価した.重金属汚染土壌の不溶化処理について,カルシウム/マグネシウム系複合材料による効果を検証した.ベントナイトとセメントからなる人工バリアにおいて,粘土の間隙水組成とカルサイトの生成,塩化物イオンの拡散に及ぼす閉塞効果を明らかにした.セメント系材料の研究は,計画のの内容をおおむね順調に実施できている.一部,再試験による結果の精査が必要と思われる点があるが,十分な成果が期待できる.また,地盤工学分野におけるセメント系材料を含む鉱物系材料による固化・不溶化工法の検討についても概ね計画通りに実施できている.一方,遮水工法については十分な検討にいたっていないが,有害物質の吸着性に着目した新たな対策工法の検討を重ねており全体としてはおおむね順調に進展している.27年度が最終年度であるため、記入しない。コンクリート工学次年度は最終年度であることから,これまでに実施してきた実験による各種対策工法の中長期性能の評価に加えて,それらの結果に基づく長期性能の推定,配合選定へのフィードバック,対策工法の適用条件の整理といった実際の対策工事への実装に資する形で実験結果のとりまとめを行う.また,引き続き研究プロジェクト会議を開催して,コンクリート・地盤・環境化学の分野間連携を深めるとともに,研究成果の対外発表を積極的に行う.当初計画に掲げた内容の多くはおおむね順調に進展した.ただし,セメント改良地盤中における重金属の溶出および輸送特性を評価するモデル実験,ICP-MS,放射線分析(Ge半導体検出器),X線回折,元素分析などの詳細解析に準備を要し,初年度に実績できずに次年度に繰り越しとなった.そのため,やや遅れていると達成度を判定したが,次年度には実施予定であり,全体としては当初の見通しと同等の達成度が今後は見込める.27年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画においては,各種対策工法の中長期性能の評価のための室内実験に要する物品費,実験協力者への謝金支出を予定していた.しかしながら,長期性能を検証する実験が進行中であり,最終的な結果分析に要する物品と協力者の雇用が平成27年度前半にずれこんだために当初予定していた使用額が減少した.27年度が最終年度であるため、記入しない。2年目となって実質的な研究成果も蓄積されてきたことから,プロジェクト会議の開催頻度を増やし,研究成果についての考察を深め,研究を推進する.平成27年度前半に現在進行中の実験供試体の分析を実施する計画であることから,実験の実施に伴う物品の購入,実験協力者の雇用に平成27年度分として請求した研究費と併せて使用する計画である.27年度が最終年度であるため、記入しない。
脂質代謝異常によるアルツハイマー病発症機構

本研究で私は、膜脂質成分の代謝異常によるAD発症モデルを検証してきた。これまでにタウが特異的に結合する脂質成分X1を同定した。このX1は、AD患者やADモデルマウスの脳内で発現の低下している事が報告されている。そこで私はこの脂質X1に注目し、内在性X1によるタウの病変形成の検証と作用機序の解明、に取り組んできた。昨年度までに、タウの病変に関与するリン酸化部位の同定と、細胞系でのタウの凝集試験モデルを構築し、その結果、発症に酸化ストレスの関与することが示唆された。そこで、本年度はタウの病変形成への酸化ストレスの作用について、細胞系及びマウス個体モデルで検証した。タウの病変形成への酸化ストレスの作用を検証するため、脂質成分X1を欠損させたタウリン酸化モデルマウスに、メチル水銀を飲水投与し酸化ストレスを誘導し、中毒症状の発症を観察した。オスでは、野生型のオスで9週間、メスで4週間のメチル水銀投与で行動異常などの中毒症状が観察され、一方で欠損型ではオスで5週間、メスで2週間の投与で中毒症状が観察された。以上の通り、タウリン酸化モデルマウスで、メチル水銀への顕著な脆弱性が確認された。培養細胞系では、昨年度に構築した病変型タウ変異体を発現する細胞にメチル水銀やDiethyl Maleateで刺激し、酸化ストレスの作用を検証した。その結果、野生型のタウに比べて変異型のタウで顕著なリン酸化増大作用が観察された。以上の結果から、タウの病変形成における酸化ストレスの作用が明らかになった。アルツハイマー病(AD)は最も患者数の多い認知症であり、根本療法の開発が望まれる。ADの病理学的特長のひとつ神経原繊維変化の主要構成成分は凝集したタウ蛋白質である。そしてタウの凝集はADの原因の一つであると考えられており、このタウの病変の仕組みを明らかにし、防ぐ必要がある。本研究提案で私は、膜脂質成分の代謝異常によるAD発症モデルを検証する。これまでにタウが特異的に結合する脂質成分X1を同定している。このX1は複数の研究グループから、AD患者やADモデルマウスの脳内で発現の低下している事が報告されている。そこで私はこの脂質X1に注目し、研究目標I膜脂質成分の代謝異常によるタウの病変形成の検証、研究目標II膜脂質成分の代謝異常の機序の解明、に取り組む。平成26年度は、研究目標Iについて、神経細胞内の膜脂質成分の調節法の確立を目指した。その結果、X1に蛍光基NBDを付加したX1-NBDを培地に投与し細胞内への取り込みを確認した。また、生体内での脂質X1の作用を検討するため、X1の合成酵素遺伝子を欠損させたマウスを利用する。これを目的に、X1合成酵素遺伝子欠損マウスを繁殖・育成した。研究目標IIについて、脂質成分X1と前駆体脂質成分の定量法の確立を目指した。その結果、抗体ドットブロット法による脂質成分X1と前駆体脂質成分の検出法を確立した。また、X1の内在性の合成・代謝酵素の検出を目指した。その結果、2つの内1つの合成酵素と、代謝酵素について、マウス脳内の内在性分子のwestern blot方による検出を確立した。もう1つの合成酵素については引き続き平成27年度に抗体を作成し、検出を試みる。そこで私はこの脂質X1に注目し、研究目標I膜脂質成分の代謝異常によるタウの病変形成の検証、研究目標II膜脂質成分の代謝異常の機序の解明、に取り組んでいる。平成27年度は、主に研究目標Iに取り組んだ。平成26年度までに、繁殖育成したX1合成酵素欠損マウスを用いて、タウの病変に与える作用を検証した。その結果、脳内X1の枯渇は、タウの過剰リン酸化をもたらすことを明らかにした。次にX1合成酵素欠損マウスとヒト型タウを導入した遺伝子改変マウスを交配した。その結果、過剰リン酸化の増大が、内在性タウで、外来性タウより顕著な変化が観察された。外来性タウは、内在性のタウと比較して、異なる分布を示すことが知られており、これらの結果は、X1の作用が内在性タウの局在に関わるものであることを示唆している。これらの結果を踏まえ、現在、内在性X1の調節によるタウ病変の改善作用の検証を試みている。これまでに、細胞レベルの解析のために、X1の合成・代謝酵素を対象とする遺伝子抑制培養細胞株を作成した。そして、生体レベルの解析のためにX1の代謝酵素遺伝子を欠損させた遺伝子改変マウスを作成した。今後はこれらの細胞株とマウスを用いて、タウの病変に対する作用を検証する予定である。

研究目標Iについて、脂質成分X1の合成酵素遺伝子欠損マウスを用いて、X1の欠乏が脳内タウの過剰リン酸化を引き起こすことを示した。そこでさらに発展させて、X1の合成・代謝酵素を対象とする遺伝子抑制培養細胞株を作成し、X1の代謝酵素遺伝子を欠損させた遺伝子改変マウスを作成した。研究目標IIについて、平成27年度はX1合成酵素の認識する抗体の作成を、複数の抗原と方法で試みた。しかし残念ながら、内在性酵素の検出に十分な抗体価が得られなかった。以上のとおり、平成27年度は、研究目標Iに大いに進展がえられたが、研究目標IIについては進展が見られなかったため、やや遅れていると評価した。アルツハイマー病(AD)は最も患者数の多い認知症で、根本療法の開発が望まれる。ADの病理学的特長のひとつ神経原繊維変化の主要構成成分は凝集したリン酸化タウ蛋白質である。そしてタウの病変はADの原因の一つであり、この病変の仕組みを明らかにし、防ぐ必要がある。本研究で私は、膜脂質成分の代謝異常によるAD発症モデルを検証する。これまでにタウが特異的に結合する脂質成分X1を同定している。このX1は、AD患者やADモデルマウスの脳内で発現の低下している事が報告されている。そこで私はこの脂質X1に注目し、研究目標I内在性X1によるタウの病変形成の検証、研究目標II作用機序の解明、に取り組んでいる。平成28年度は、研究目標Iでは、X1代謝酵素に注目した。培養細胞系で、X1の代謝酵素と補酵素の発現をShRNAiで抑制した株を作製し、タウの病変を観察した。その結果、補酵素の発現抑制株で顕著なタウのリン酸化レベルの低下が観察された。また、個体レベルの解析ではX1の代謝酵素を欠損させた遺伝子改変マウスを作製し、タウの病変を観察した。その結果、X1の代謝酵素を欠損させたマウスではタウの一部の部位のリン酸化の低下が観察された。以上より、内在性X1によるタウの病変制御を明らかにした。研究目標IIでは、タウのリン酸化に注目した。Phos-tag法とタウリン酸化型変異体作製を網羅的に実施し、タウの主要なリン酸化部位の同定に成功した。さらに、リン酸化型変異と脱リン酸化型変異のキメラ体を網羅的に作成し、各リン酸化部位の病理的役割を検証した。その結果、X1の結合部位に存在するリン酸化修飾が特にタウの凝集に作用することが明らかになった。さらに、結合部位の変異体に対する特異的なX1の作用が観察された。以上から、X1によるタウ凝集抑制作用の仕組みとして、リン酸化を介して結合特異的な作用機序を明らかにした。平成28年度は、主に研究目標I、IIで大きな成果が得られた。研究目標Iについて、内在性X1によるタウの病変としてリン酸化レベルの制御を培養細胞系とマウスの個体レベルで明らかにした。研究目標IIについて、タウのリン酸化修飾について網羅的な解析を試み、X1結合部位のリン酸化による凝集制御の仕組みを明らかにした。一方で、上流に当たるアルツハイマー病にみられるX1の代謝異常の仕組みについては、利用できる抗体の不足から十分な取り組めていない。以上のとおり、平成28年度は、研究目標I、IIにともに大いに進展がえられたが、研究目標IIの一部で取り組みに問題があることから、おおむね順調に進展していると評価した。本研究で私は、膜脂質成分の代謝異常によるAD発症モデルを検証してきた。
力学環境操作による細胞機能応答性の均一化とその細胞生物学的・医工学的意義

本研究課題において前提となる仮説「細胞応答のばらつきの一部は、個々の細胞が置かれる力学環境(形態、基質硬さ等)が多様であることに由来する」に基づき、もし力学環境を均一にすることが可能であれば、その細胞応答における細胞ごとのばらつきを抑制することが可能となることを立証するべく、本年度は以下の研究を行った。細胞形態制御方法として、前年度においてマイクロスケールのマスクと真空放電を用いることで様々なサイズの四角形・円形状に細胞パターニングを施せることが可能となった。今年度は細胞形態を任意の形態へと制御するべく、真空放電装置内にモーター制御機構を組み込み、マスクを走査することで真空放電に暴露された基質表面のみに細胞接着領域を形成することを試みた。その結果、単一細胞レベルでは十分なパターン形成能が得られなかったものの、今後マスクと基質表面間距離を縮めることで改善できるものと考えられた。また、高分子ゴム基質に細胞形態パターニングを施し、かつその表面に任意方向へ微小ガイドを形成する方法を開発した。細胞種にも依るがガラスやポリスチレンシャーレ上では細胞長軸方向へとアクチンストレスファイバーが配向するが、長方形に細胞形態を制御し、その単軸方向に微小ガイドを形成させた基質上では、アクチンストレスファイバーは細胞短軸、つまり微小ガイドに沿った方向へと配向することが明らかとなった。この細胞応答は微小ガイドの方向とアクチンストレスファイバーの端部に形成される細胞接着構造の形成・成熟化が関与していることが示唆された。(抄録なし)本研究課題において、細胞を取り巻く微小力学環境を制御することにより、細胞の機能応答性のばらつきを抑えることを目的とする。細胞形態、細胞の生存シグナル、分化などを決定する因子として、細胞内のアクトミオシン収縮により発生する力が重要な因子であることが近年明らかにされてきている。このことから細胞が発生する力を制御することができれば、細胞の状態を均一化できることが期待される。過去の報告から、細胞形態を制御することで、細胞の発生する力とその伝達に関わるタンパク質(アクチンストレスファイバと焦点接着斑)の局在性を再現性よく制御することが可能であることが示唆されている。そこで研究初年度である当該年度においては、まず細胞形態制御法の確立を行った。従来法を参考にして、広く細胞培養に用いられる様々な基質において細胞形態を制御することが可能となった。さらに、細胞の主たる力の発生器官であるアクチンストレスファイバの生物物理的性質の計測を行った。本実験系では、細胞からアクチンストレスファイバを抽出することで、化学的・物理的に操作することが可能である。また、生化学的手法によりほぼすべてのタンパク質が維持されていることを確認した。抽出したアクチンストレスファイバに様々なATP濃度溶液を添加することで収縮力計測を行った。その結果、細胞内ATP濃度の範囲においては数10nN程度の力を発揮できるのに対し、それよりも高いATP濃度にすると、弛緩することが明らかとなった。さらに、細胞形態制御を行うことで、細胞内に発達するストレスファイバの位置依存的な構成要素の違いを再現性よく見出される可能性も示唆される。今後、研究計画にある細胞のシグナル活性状態の解析とともに、アクチンストレスファイバの生物物理的性質をより詳細に理解することが期待できる。本研究課題の大前提となる仮説「細胞応答のばらつきの一部は、個々の細胞が置かれる力学環境(形態、基質硬さ等)が多様であることに由来する」に基づき、もし力学環境を均一にすることが可能であれば、その細胞応答における細胞ごとのばらつきを抑制することが可能となることを立証すべく、本年度は以下の研究を行った。新規に開発した細胞パターニング法を用いることにより細胞形態を揃えた状態で、基質上に細胞を培養、免疫蛍光染色を行った。解析したタンパク質は、細胞焦点接着斑と呼ばれるタンパク質複合体を構成する分子であり、細胞内収縮要素であるストレスファイバーと、細胞外部にあたる基質タンパク質との物理的な橋渡し構造を成すものである。四角形パターンにおいて、焦点接着斑構成タンパク質はパターンの辺縁部、つまり細胞辺縁部に局在することが分かった。また、そのリン酸化状態についても辺縁部でリン酸化されていることが確認できた。別途数値解析により細胞内応力の分布が細胞辺縁部で大きくなることを確認していることから、分子の局在には力が関与することが示唆された。今後、細胞が基質に対して作用する力を実験的に計測することで、より詳細に力と分子の局在化ならびに活性化との関連を明らかにしていく方針である。また、細胞パターニング法によりストレスファイバーも局在化させることを確認できていることから、細胞部位を区別した形で生物物理的な性質を明らかにしていく。

その結果、単一細胞レベルでは十分なパターン形成能が得られなかったものの、今後マスクと基質表面間距離を縮めることで改善できるものと考えられた。また、高分子ゴム基質に細胞形態パターニングを施し、かつその表面に任意方向へ微小ガイドを形成する方法を開発した。細胞種にも依るがガラスやポリスチレンシャーレ上では細胞長軸方向へとアクチンストレスファイバーが配向するが、長方形に細胞形態を制御し、その単軸方向に微小ガイドを形成させた基質上では、アクチンストレスファイバーは細胞短軸、つまり微小ガイドに沿った方向へと配向することが明らかとなった。この細胞応答は微小ガイドの方向とアクチンストレスファイバーの端部に形成される細胞接着構造の形成・成熟化が関与していることが示唆された。当初予定した手法とは異なるアプローチで細胞の形態制御方法を開発し、順調に進展している。各種基板・基質への化学修飾方法の最適化の条件出しも順調に推移しつつある。細胞形態を制御した基質において、細胞焦点接着斑の局在性およびそのリン酸化状態を免疫蛍光染色により確認しており、その分布が細胞内応力の分布と相関することから力と分子の活性化との関連が示唆され、本課題の大前提となるデータが得られつつある。新たに開発した細胞形態制御方法を用いて細胞の形態制御、ならびに高分子ゲルにより基質硬さを制御した上で、細胞内小器官の局在性およびシグナル分子の活性化状態を解析する。それらのアッセイ系を通じ、上記力学環境操作時における細胞機能応答の均一化の証明について、細胞周期や生存シグナルに焦点を当てて取り組む。本年度行った、細胞焦点接着斑構成タンパク質の局在化とリン酸化状態の解析について、より多くの候補タンパク質との関連を明らかにするとともに、基質硬さを変化させることや、細胞内収縮力を阻害剤ならびに分子生物学的手法により調節することで、力と分子の活性化の詳細な機構について明らかにすべく推進していく方針である。(抄録なし)
歯周病原性菌繊毛のアミロイド線維形成とバイオフィルム形成との関連性

Aggregatibacter actinomycetemcomitansは侵襲性歯周炎の病原体である。本菌は高い付着性を有し、それが病原性において重要な役割を果たしている。本研究では、A. actinomycetemcomitansの表層タンパクからアミロイド様成分を含む線毛以外の付着因子を解明することを目的とした。アミロイド様成分はthioflavin T蛍光測定により検出でき、イオン交換およびゲル濾過によって分画できた。得られた画分の加熱およびプロテアーゼ処理、酸性のbufferに溶解によっても安定しており大腸菌などのアミロイド線維と類似していた。歯周病原性Aggregatibacter actinomycetemcomitansは慢性歯周炎や侵襲性歯周炎の原因菌であり、心内膜炎や髄膜炎からも分離され全身疾患と関連も示されている。本菌の新鮮分離株は血液平板培地上でrough型の強固な付着性のコロニーを形成し発育する。細菌産生アミロイド線維は、大腸菌やサルモネラ菌で報告されており、共凝集、バイオフィルム形成などに深く関与している。歯周病原性細菌がアミロイド様物質を産生するか否かについては不明であり、本年度は歯周病原性A.actinomycetemcomitansのアミロイド様物質産生の有無について解析した。Rough型コロニー形成株AKRをyeast extract添加Trypticase soybrothで2日間、5%CO_2下で培養した。rough型形成株は管壁に付着し発育するため、AKRは管壁より剥離した菌体をPBSに懸濁した。アミロイド様物質の有無は蛍光色素Thioflavin T(ThT)と菌体懸濁液を混合し、直後に蛍光強度を分光蛍光光度計より測定することで判定した(励起波長:450nm、蛍光波長:486nm)。AKR菌体懸濁液のThT蛍光測定により、450nmをピークとする蛍光を検出できた。AKRの菌体を加熱およびプロテアーゼ処理しても、蛍光強度に影響は認められなかったことから、本菌のアミロイド様物質も大腸菌などのアミロイドと同様の性質をもっていることが示された。以上のことからA.actinomycetemcomitans rough型集落形成株菌体には、アミロイド様物質が存在し、本菌の付着やバイオフィルム形成などの歯周病原性に関与していると考えられた。現在本成分の精製を行っている。歯周病原性細菌がアミロイド様物質を産生するか否かについては不明であり、本年度は昨年に引き続き歯周病原性A.actinomycetemcomitansのアミロイド様成分の精製を行っている。Rough型コロニー形成株AKRをyeast extract添加Trypticase soybrothで2日間、5%CO_2下で培養後、管壁に付着した菌体を2-aminomethanol bufferで剥離し、遠心で集菌した。菌体を超音波破砕、各種酵素処理を行い可溶性分を各種カラムを行い精製している。アミロイド様成分の有無は蛍光色素Thioflavin T (ThT)を用いて、蛍光強度を分光蛍光光度計より測定することで判定した。(励起波長:450nm、蛍光波長:486nm)。部分精製したアミロイド様成分はThT蛍光測定により、450nmをピークとする蛍光を検出できた。部分精製したアミロイド様成分を加熱およびプロテアーゼ処理しても、蛍光強度に影響は認められなかったことから、本菌のアミロイド様物質も大腸菌などのアミロイドと同様の性質をもっていることが示された。しかしながらTEMではアミロイド状線維は観察できなかった。歯周病原性Aggregatibacter actinomycetemcomitansは歯周病の原因菌と考えられるが、心内膜炎や髄膜炎の患者からも分離される。本菌の新鮮分離株は長い線毛を有し、血液平板培地上でrough型の強固な付着性のコロニーを形成し発育する。歯周病原性細菌がアミロイド様物質を産生するか否かについては不明であり、本年度は昨年に引き続き歯周病原性A. actinomycetemcomitansのアミロイド様成分の精製を行った。Rough型コロニー形成株AKRをyeast extract添加Trypticase soy