hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アナロジーを用いた消費者の新製品採用行動と新製品導入のマーケティング戦略

消費者の類推プロセスを用いて、消費者が記憶の中に保持する内部情報が新製品の採用にいかなる影響を与えるのかを説明するための理論枠組みの構築を行い、新製品導入のマーケティング戦略へのインプリケーションを提示した。平成19年度は、主に文献研究に当てられた。文献研究は大きく、歴史に当たる部分と近年の研究に当たる部分の2部から構成される。まず、歴史にあたる部分は、本研究のテーマである、消費者による新製品の採用過程に関する研究が、消費者行動研究やマーケティング研究において、歴史的にどのような経緯をたどってきたのかということについてレビューしたものになった。そこから得られた知見としては、今日の消費者行動研究の中では、本研究のテーマとなる、新製品、特にデジタル家電の新製品に対する消費者の行動を十分に説明できる有用な研究枠組みがないということであった。次に、近年の研究に当たる部分については、歴史研究を踏まえた上で、消費者による新製品の採用過程に関する研究が今後どのような方向性で行われるべきかという考察を行った。具体的には、認知心理学におけるアナロジーという考え方を用いることによって、今日の消費者による新製品の採用行動をうまく説明できる可能性があり、そして企業が取るべきマーケティング戦略への有意義な示唆を行うことができる可能性ある、というものである。さらに、文献研究と平行して事例研究も行った。事例として取り上げたのは、薄型テレビ、シャープ・アクオスのマーケティング戦略である。この事例研究を通じて、新製品としての薄型テレビを消費者が購入する際に、いかに既存知識を適用しているのかということについて有意義な考察が得られた。平成20年度は、前年度の成果を論文としてまとめるとともに、同種の問題意識を共有する他の研究者のとの共同研究発表を行った。また、前年度同様、文献研究と並行して事例研究も行った。論文「新製品の普及過程における消費者行動-類推研究の再考と新製品普及のマーケティング戦略-」においては、今日のデジタル家電と呼ばれる製品群の普及過程における消費者行動を捉えるためには、認知心理学の視点から、とりわけ消費者が記憶の中に保持する内部情報の多様性に注目する必要があるとの問題意識を設定した上で、分析枠組みとして類推プロセスを用いて、新製品に対する消費者行動の理論枠組みの構築を試みた。消費者行動研究における類推研究や、認知心理学における類推研究をレビューしたのち、その問題点を指摘し、カテゴリー化という観点から新たな類推のプロセスの提案を行った。この新たな類推プロセスに基づいて新製品普及のマーケティング戦略へのインプリケーションを提示し、企業が新製品を広く市場に普及させていくためには、消費者が保持する内部情報の態様の多様性に柔軟に対応したマーケティング戦略が必要であることを示唆した。今後の課題として、本論文の理論枠組みが検証される必要性が挙げられた。研究発表においては、「既存製品の知識転移に基づくIT製品の採用-なぜ採用前に操作できそうだと確信できるのか」というタイトルで、本研究の成果を応用しながら、新製品がもつ新しいインターフェイスを消費者がいかに既存の知識から類推を行いながら理解するのか考察を行った。事例研究については、薄型テレビ、シャープ・アクオスのマーケティング戦略を取り上げ、新製品としての薄型テレビを消費者が購入する際に、いかに既存知識を適用しているのかということについての考察を行った。平成21年度は、主に、前年度の研究成果をベースにした事例研究に当てられ、文献研究とあわせたその成果を研究会において発表した。事例研究では、薄型テレビを題材として取り上げ、新製品としての薄型テレビが市場に普及していく際に、購買に直面した消費者がどのような情報処理を行い、どのような行動を取るのかを分析した。薄型テレビを始めとしたデジタル家電を市場にいかに普及させていくのかということは、今日の日本の家電メーカー、さらには日本の製造業が競争力を維持していくために非常に重要な課題であるのと同時に、デジタル家電を想定した新製品の消費者行動に関する研究はまだ不十分であることが、本研究の問題意識であり、研究の意義でもある。薄型テレビの普及過程における消費者行動を捉えるためには、認知心理学の視点から、とりわけ消費者が記憶の中に保持する内部情報の多様性に注目する必要があるとの問題意識を設定した上で、分析枠組みとして類推プロセスを用いて、新製品に対する消費者行動の理論枠組みの構築を試みた。そこから浮き上がってくる薄型テレビの消費者行動、は2000年以前のブラウン管テレビの消費者行動とは明らかに異なるものであり、企業には消費者の内部情報を生かしたマーケティングが求められることが明らかになった。また、実際の薄型テレビのマーケティング状況を鑑みた場合には、消費者行動だけではなく、家電流通の動態にも注目する必要があり、とりわけ寡占化が進む家電量販店の動向についても分析を行った。なお、この事例研究の成果は、今年9月発行予定のマーケティング関連の書籍(共著、タイトル未定)にて発表される予定である。
地域を基盤とした総合的な学習のカリキュラム開発支援・研修支援に関する研究

(1)地域を基盤とした総合的な学習のカリキュラム開発においては「タテ連携」と「ヨコ連携」がある。前者は幼小中高による連携である。後者は家庭や地域等との連携である。地域を基盤として総合的な学習の充実化を図る上でいずれも重要な要因である。先進校への訪問調査や共同研究により,多様かつ有効な手だてを見出すことができた。(2)文部科学省研究開発学校を中心に,小中連携を進めている先進校の研究紀要を分析し,小中の連の類型化を試みた。両者の「つながり」の要素を分析した結果,「子ども」「教師」「カリキュラム」の3つのカテゴリーとその組み合わせにより,7つのタイプが明らかになった。(3)岐阜県関ヶ原町の3小学校と2中学校をネットワークで繋ぎ,活字や静止画像,動画など多様な情報を時間・空間を超えて発信・受容できるグループウエアを活用することで,主に,地域素材をとり上げた総合的な学習における学校,校種を越えた子どもたちの共同学習および学校,校種を越えた教師による子どもの学びに対する協働的な学習支援のシステム化を行った。子どもや教師の書き込み情報および面接調査情報から,地域を基盤とした教員研修の可能性が見いだされた。(4)総合的な学習における小中高の連携を進めている広島県竹原市立吉名小学校・中学校および県立忠海高等学校において,授業研究を小中高の教師がワークショップ的に行うことにより,日常的・継続的な連携ができ,小中高の児童生徒が協同的に学習する単元開発が実現できた。(5)総合的な学習のカリキュラム開発の中核になる情報教育主任に対する支援システムを徳島県三好郡内において開発・実施し,評価データより支援のあり方の有効性と課題を明らかにした。(6)2年間の研究成果を報告書にまとめた(A4版,120頁)。(1)文部科学省研究開発学校を中心に,小中連携を進めている先進校の研究紀要を分析し,小中の連携の類型化を試みた。(2)岐阜県関ヶ原町の3つの小学校と2つの小学校をネットワークで繋ぎ,活字や静止画像,動画など多様な情報を時間・空間を超えて発信・受容できるグループウェア(JR四国コミニュケーションウェア社「わいわいレコーダー」)を活用することで,主に,地域素材をとり上げた総合的な学習における学校,校種を越えた子どもたちの協同学習および学校,校種を越えた教師による子どもの学びに対する協働的な学習支援の計画・実施・評価を行った。教師の書き込み情報および面接調査情報から,地域を基盤とした教員研修の可能性が見いだされた。(3)子どもたちの総合的な学習の成果を広く表現・発信するためのコミニュケーションツール(JR四国コミニュケーションウェア社「でじたるキッズミュージアム」,本ツールの開発は別の研究費で行った)を活用し,その作成途中の成果物の内容・方法に対する助言をネットワークを介して教員養成段階の学部学生に行わせた結果,子どもの学習に対する支援情報が共有化できることによる学びの有効性が明らかになり,現職教員に対する活用の有効性を見いだすことができた。(4)日本教育工学会合宿や独立行政法人中堅教員中央研修などの各種セミナーにおいて協同的・創造的な問題解決型ワークショップを企画・実施し,その有効性が見いだされてきている。(5)京都市立御所南小学校や鳴門教育大学附属小学校の訪問調査より家庭や地域をカリキュラム作りや研修に巻き込む際の成果と課題の整理に関してはこれからである。(1)地域を基盤とした総合的な学習カリキュラム開発においては「タテ連携」と「ヨコ連携」がある。

学習指導要領における記述が小中高で重複・共通する部分が多く、また教科書もなく、身近な地域社会を教材やフィールドとすることの多い総合的な学習にとっては、その充実化を図る上でいずれも重要な要因である。先進校への訪問調査や共同研究により、多様かつ有効な手だてを見出すことができた。(2)総合的な学習における小中高の連携を進めている広島県竹原市立吉名小学校・中学校および県立忠海高等学校において、授業研究を小中高の教師がワークショップ的に行うことにより、日常的・継続的な連携ができ、小中高の児童生徒が協同的に学習する単元開発が実現できた。また、新潟県上越市では中学校区単位で小中連携を図っており、学期に一度の程度の割合で授業研究会やワークショップ型の研究協議を実施している。(3)家庭や地域との連携の理想型としては、京都市立御所南小学校が挙げられる。保護者や地域の専門家が年度始めの総合的な学習のカリキュラム開発段階から参画し、授業支援を行うだけでなく、カリキュラム評価においても内からの外部評価を行っている。(4)各学校で総合的な学習のカリキュラム開発の中核にもなる情報教育主任を支援するためのシステムを徳島県三好郡内において開発・実施し、利用者に関する多様な評価データの分析により、支援の在り方の有効性と課題を明らかにした。(5)その他、各種センター研修等においても、ネットワークを活用した協同的・創造的な問題解決型ワークショップを企画・実施し、その有効性が見いだされた。
血小板放出(PPF)因子の同定と血小板産生の分子機序

TPOによって巨核球が成熟分化することが明らかになったが、多倍体化した巨核球から血小板が放出される分子機序に関しては不明のことが多い。そこで骨髄細胞から巨核球を単離しTPOを投与し成熟巨核球を得、血小板放出(PPF)のin vitroでのアッセイ方法を確立した。また胎児肝細胞やES細胞からも巨核球は産生可能でありPPF形成もできることが判明した。PPFにはTPOを始め既知の因子は全く関与していないことが判明した。そこでPPFを促進する外来因子の存在の可能性を調べた結果、PPFが促進される因子が血小板減少症患者血しょうに存在することを見い出した。また、ある特定細胞上清にも患者血しょう成分と同じ分子量分画にPPF促進活性が見い出され、種々のクロマトグラフィーを使って精製を試みた。この粗精製品はマウスに投与すると24-36時間後に血小板を顕著に増加させた。TPOは5-7日後に血小板を増加させるのに対比して即応性が高かった。現在この因子の遺伝子を単離中である。血小板産生には初期にはIL3、SCFが作用し、TPOによって巨核球の産生と成熟が促進され、最後にPPF形成に未同定の因子が作用し血小板産生が制御される可能性が考えられた。また多倍体化する巨核球を細胞生物学的に解析した結果、株化された細胞で言われているような細胞分裂(M期)をスキップしてDNA合成のみが反復されるメカニズムではなく、巨核球はM期に入りanaphase Aまでは進行するものの、姉妹染色体が極まで充分引かれないために核膜が複製した染色体を全て包括してしまう為に起きることが判明した。NFE2ノックアウトマウスよりNFE2の下流で作用する新規因子を同定し、PPF形成における役割を解析した。また特定チロシンキナーゼがPPF形成に関与していることが判明した。そこでPPFを促進する外来因子の存在の可能性を調べた。その結果、PPFが促進される因子が血小板減少症患者血しょうに存在することを見い出した。また、ある特定細胞上清にも同じ分子量分画にPPF促進活性が見い出され精製を試みた。この粗精製品はマウスに投与すると24-36時間後に血小板を顕著に増加させることが出来た。また多倍体化する巨核球を細胞生物学的に解析した結果、株化された細胞で言われているような細胞分裂(M期)をスキップしてDNA合成のみが反復されるメカニズムではなく、巨核球はM期に入りprophase、metaphase、anaphase Aまでは進行するものの、姉妹染色体が極まで充分引かれないために核膜が複製した染色体を全て包括してしまう為に起きることが判明した。血小板放出(PPF形成)にはTPOを始め既存のサイトカインは関与しておらず、PPF形成のメカニズムに関しては不明なことが多い。

そこでマウスのPPFアッセイ系を確立しPPF形成を促進する外来因子の存在の可能性を調べた。また胎児肝細胞やES細胞からも巨核球は産生可能でありPPT形成もできることが判明した。私達は既にPPT形成を促進する因子が血小板減少症(ITPやAA)患者血しょうに存在することを見い出しているが阻害因子も存在する。従って、血しょう中からPPF因子を精製するのは困難と考えた。そこで、特定細胞の上清に患者血しょう成分と同じ分子量分画にPPF形成を促進する活性を見い出したので、現在この因子の同定を種々のクロマトグラフィーを使って精製しクローニングを試みている。血小板産生には初期にはIL3、SCFが作用し、TPOによって巨核球の産生と成熟が促進され、最後にPPF形成に未同定の因子が作用して血小板産生が制御されていると考えられた。さらにNFE2ノックアウトマウスよりNFE2の下流で作用する新規因子を同定し、PPF形成における役割を解析した。また特定のチロシンキナーゼがPPF形成に関与しており、アクチンやチューブリンの重合シグナルに関与していることが判明した。
遺伝性象牙質形成不全症における象牙質石灰化異常に関する分子生物学的研究

我々は、正常ヒトのAMBの遺伝子クローニングし、ヒトAMB遺伝子の全翻訳領域の配列解析と遺伝構造を決定し、サザンブロット解析により、ハプロタイプに1コピー存在する事を報告した。(Toyosawa et al.,2000b;GenBank accession No.AF219994)。現在、正常ヒトゲノムから、翻訳領域の遺伝子多型解析を終了し、DGI type II患者の血液を採取するため、倫理委員会の返答を待っている。また、ラットの歯のcDNAライブラリーから見つかったDMP1遺伝子の相同遺伝子が歯の欠失した鳥類に見つかった事から(Toyosawa et al.,2000a)、DMP1遺伝子は骨に重要な役割を果たしている事が推測された。そこで、ニワトリとラットの骨においてDMP1 g遺伝子のin situ hybridizationを行ったところ、骨芽細胞には発現しないが、骨細胞に特異的に発現する事を発見した。さらに、この事を立証するため、DMP1に対する抗ペプチド抗体を作製し、DMP1蛋白の局在を検討した。その結果、DMP1蛋白は骨細胞周囲の骨基質に特異的に存在する事が判明し、DMP1遺伝子発現細胞と一致し、世界ではじめて骨細胞に特異的に発現する遺伝子を同定した(Toyosawa et al.,2001)。今後、DMP1蛋白の機能を遺伝子導入実験により解析し、石灰化不全症との関連を検討していく予定である。そこで、現在、正常ヒトのDSPPとAMBの遺伝子クローニングを試みた。今までに、ヒトAMB遺伝子の全翻訳領域の配列解析やサザンブロット解析は終了し、ヒトのハプロタイプに1コピー存在する事がわかり、遺伝子配列は遺伝子バンクに登録済みである(GenBank accession No.AF219994)。また、すべての硬組織に共通に発現し、石灰化に重要な遺伝子DMP1 geneに関しては、哺乳類、爬虫類や鳥類におけるDMP1 geneの分子進化を検討した。その結果、爬虫類と鳥類におけるDMP1 geneの遺伝子構造に変化のある事、それぞれのハプロタイプに1コピー存在する事、機能ドメインは保存されているものの、進化速度は非常に速い事が分かった(Toyosawa et al.,1999a,b,2000)。また、正常マウスにおけるDMP1とDSPPのin situ hybridizationのためのプローブを作製し、DMP1とDSPPの発現パターンを検討中である。そこで、ニワトリとラットの骨においてDMP1g遺伝子のin situ hybridizationを行ったところ、骨芽細胞には発現しないが、骨細胞に特異的に発現する事を発見した。
生体染色法の開発による難水溶性色素の再評価を軸とした高性能膜電位感受性色素の探索

高性能膜電位感受性色素の必要な理由:興奮性細胞の電気活動を測定する方法として、近年、膜電位の光学的測定法が注目を浴びるようになってきている。しかし、膜電位の光学的測定法は、細胞内カルシウム濃度の光学的測定法に比べると、著しく普及が遅れている。その大きな要因の一つとして、膜電位変化に伴う光学的シグナルが非常に小さく、極めてロ-ノイズの測定システムを作製する必要があり、光学測定を専門とする研究者が研究テーマに合わせて自らシステムを開発し、測定時にもノイズ対策を十二分に施して実験する必要があるのが現状である。この障壁を打破する最良の方法は、1桁大きい光学シグナルを出す膜電位感受性色素を開発することと考えられている。本研究の特徴:新しい膜電位感受性色素の開発は、色素がなぜ膜電位感受性を持つのかというメカニズムが解明されていないこともあって、膨大な時間と費用を要するものである。本研究のは、既に高価な開発費をかけて合成されたが、生理的塩溶液にほとんど溶解しないため評価ができなかった色素を、新しい染色法を開発する方向から再評価し、高性能の膜電位感受性色素を探索することを特徴とする。1)最適な界面活性剤の探索:PluronicやCremophorより強力で生体に無害なものを探索するのを目的とし、血清中からリポ蛋白に注目し、油脂に色素を溶かし、リポ蛋白でリンゲル液中に溶かすことを試みたが、現段階では、PluronicやCremophorでリンゲル液に溶解困難な疎水性の強い色素をこれらの方法でリンゲル液中に溶かすことには成功していない。2)リポゾーム法:リン脂質を色素で染色した後、超音波で均質に懸濁させてリポゾームとし、生体膜に融合させる方法がある。予想に反し、難水溶性色素はリン脂質にも溶解困難であることが判明し、引き続き実験条件を検討中である。
ファイトプラズマの動植物ホストスイッチングメカニズム

当研究室において、ファイトプラズマの昆虫伝搬能喪失変異株(OY-NIM)の作出に成功し、接木により維持している。このことはファイトプラズマが存続し続けるためには宿主植物-媒介昆虫間のホストスイッチングが必須ではないことを示唆している。本研究では、これまでの結果をもとにファイトプラズマのホストスイッチングに関わる遺伝子を同定し、発現の比較解析を行うことを目的としている。まず、野生株(OY-W)と比較してOY-NIMの染色体では130キロベースにおよぶ欠失と、染色体外DNAにおいていくつかのORFが欠失していることを明らかにした。染色体における欠失領域の解明は現在進行中であるが、染色体外DNAにおいて欠失しているORFの解析を行ったところ、欠失しているORFは2つあり、1つは1本鎖DNA結合タンパク質をコードする遺伝子で、もう1つは機能未知のタンパク質をコードしていた。後者を機能予測プログラムを用いて解析したところ、2ヶ所の膜貫通領域と、膜輸送系の1つであるSecシステムにより輸送されるためのシグナル配列を持つことが明らかとなり、このタンパク質は膜タンパク質である可能性が高いことが明らかとなった。ファイトプラズマは細胞壁を持たないために膜タンパク質が宿主細胞質に露出しており、宿主タンパク質と直接相互作用すると考えられる。また、スピロプラズマにおいては接着性の膜タンパク質が昆虫伝搬に関わることが知られており、この膜タンパク質がホストスイッチングに関わる可能性が高いと考えられた。さらに、当研究室ではOY-Wより得られた弱毒変異株(OY-M)の全ゲノムDNAの解明に成功したため、今後OY-NIMとの比較解析により、新たな知見が得られることが期待される。
マウス及びヒトｉＰＳ細胞を用いた神経分化誘導での神経栄養因子ＢＤＮＦの機能解析

本研究の意義は神経分化誘導の効率化を進めることによりシャーレ上でネットワークとして機能する神経回路を形成させ、我々のグループで開発した多点電極を用いた回路活動の計測システムを応用し脳神経細胞分化の真の評価系の確立を目指すことにある。新たな神経細胞分化誘導方法の検討や神経分化において重要な働きをする神経栄養因子の機能解析等将来的にこのような実験系を用いて特定の薬剤の効果や副作用をシャーレ上で安全に検証するための重要な成果が得られた。当該年度はマウスiPS細胞の神経分化誘導について新規な方法を試みた。HES1は発生初期に働くbHLH型の転写因子で周期的に発現量が振動することが知られている。HES1が高発現時には中胚葉への分化が促進され、HES1が低発現時には神経系に分化することが報告されている。またHES1の発現が神経幹細胞からグリア細胞への分化を促進するということも報告されている。そこで本研究ではHES1をノックダウンすることによりiPS細胞から神経細胞への分化誘導を促進する事を行った。ヒトHES1遺伝子のドミナントネガティブを全合成しプラスミドベクターによりマウスiPS細胞に安定的に導入して神経細胞への分化誘導を行ったところ、コントロールと比較して有為に神経細胞分化が促進された。このHES1ドミナントネガティブによる神経分化誘導を多点電極シャーレ上で行うことにより神経ネットワークとしての活動電位を計測し論文投稿の準備中である。この研究成果を踏まえて同様の効果が得られると期待されるヒトiPS細胞でもヒトHES1ドミナントネガティブを用いた神経分化誘導を行う。本研究の目的はヒトiPS細胞由来の神経細胞により構成された神経ネットワークの活動電位への薬剤の影響を計測することにより精神神経疾患薬を探索することであるので本年度の研究成果により目的達成に近づいた。BDNF研究については研究実施計画にあるようにBDNFの分化過程における発現量の昂進とTuJ1、Nestin等神経細胞マーカー及びNGF等神経成長因子TrkB、NGFR等の神経成長因子受容体の発現量変化を調べたところ、BDNFの昂進と同様に発現昂進が見られた。またSMAD経路の阻害剤SB431542をBDNFと組み合わせて培地に添加したところBDNFによる神経分化誘導にはSMAD経路が関連することを示唆する結果が得られた。当該年度はiPS細胞の神経分化誘導についての効率化を図った。神経栄養因子BDNFの神経分化に対する影響を見るためにBDNFの変異型及び野生型をそれぞれサブクローニングしマウスiPS細胞に導入した。成熟神経マーカーTuJ1、神経幹細胞マーカーNestinやNGF等の神経栄養因子のmRNA量、TuJ1、Nestin、成熟神経マーカーPSD95等の免疫染色による局在の観察等により神経分化効率の違いを調べたところ野生型BDNFは変異型BDNFより有為に神経分化が促進されていた。本研究の研究の目的である神経分化誘導の促進による脳のひな型となる神経ネットワークの構築の重要な足がかりとなる成果となった。iPS細胞から分化誘導した神経回路網の評価系の確立するため分化誘導培地にmBDNFやヘパリンを添加して見たところ多点電極での神経発火計測頻度が若干上昇したので引き続き培養を行いった結果、神経分化誘導を促進する働きがあることがわかった。この知見を生かしてさらに多点電極での神経発火計測を続ける。神経分化制御に非常に深い関わりのある遺伝子Hes1のドミナントネガティブの導入により神経分化促進を試みた。ゲノムに組み込まれないことが確かめられているプラスミドpCEP4にHes1たんぱく質のドミナントネガティブをコードする遺伝子を組み込んだものを作製した。pCEP4プラスミドは薬剤耐性により染色体外に多コピーで維持されるが薬剤を除くと比較的速やかに抜けていくことが報告されている。ドミナントネガティブHes1はラットHes1で報告があったへリックス-ループ-へリックス部分のアミノ酸4残基改変による機能喪失の報告を参考にヒトHes1遺伝子の当該部分に変異が入るように遺伝子全体を全合成して作製した。ヒトHes1遺伝子のドミナントネガティブは本研究が初である。すでにこのドミナントネガティブヒトHes1プラスミドをマウスiPS細胞に形質転換し、現在分化誘導をかけたところドミナントネガティブヒトHes1がマウスiPS細胞において神経分化を促進する効果があることがわかった。神経細胞の分化過程におけるBDNFの機能を解明するためVal66Met変異の入ったBDNF、及び野生型のBDNFをiPS細胞で安定的に保持されるプラスミドベクターにクローニングに成功した。今後このプラスミドを用いてマウスiPS細胞に形質導入しその影響を調べる予定である。最終年度に実施した研究により神経栄養因子BDNFの発現制御に5`側非翻訳領域に結合するアンチセンスRNAが重要な役割を果たしていることを示す結果が得られた。当該アンチセンスRNA配列はヒトBDNFの5`側非翻訳領域にも存在しており同様の機構でBDNFの発現を制御していると考えられる。

BDNFは神経細胞内で脳の発達、長期記憶、神経細胞伸長など様々な機能を持つためそれぞれの機能に合わせて、いつどの細胞でどの程度発現するかをコントロールするため多様で複雑な発現制御が行われていると考えられるがその端緒を開く成果が得られた。研究期間全体を通じてBDNF及び転写因子HES1の神経分化誘導に対する役割、影響について研究を進めた。BDNFについては多数のデータを得たが細胞内でBDNFを大量に発現させると神経分化が促進されること、またBDNFの成熟化が阻害される変異型BDNFを用いた実験では細胞内局在の変化が観察され未だ全容が解明されていないBDNFの成熟化、細胞内輸送を解明するための足掛りが得られた。また本研究ではヒト細胞での神経分化誘導促進を目指し細胞内で転写因子HES1の働きを阻害するヒトHES1のドミナントネガティブを作製しマウスの細胞で神経分化に対する影響を観察したところ、HES1ドミナントネガティブを発現させた細胞ではコントロール細胞よりも神経分化誘導が促進される成果が得られた。本研究の意義は神経分化誘導の効率化を進めることによりシャーレ上でネットワークとして機能する神経回路を形成させ我々のグループで開発した多点電極を用いた回路活動の計測システムを応用し脳神経細胞分化の真の評価系を確立することにある。将来的にこのような実験系を用いて特定の薬剤の効果や副作用をシャーレ上で安全に検証するための重要な成果が得られた。分子生物学本研究の目標はiPS細胞由来の神経細胞を用いて精神神経疾患に対する薬を探索するための神経細胞ネットワーク活動電位計測系の構築及び神経細胞分化におけるBDNFの役割を明らかにすることであるが現在までにこの2つの目的について一定の研究成果が得られている。神経分化誘導の効率化方法についてBDNF、HES1等について着目し研究を行ってきたがいずれも神経分化促進の効果が認められ研究開始当初より一定の成果が得られた。当初の計画通りおおむね順調に進展している。本年度は昨年度までの知見を踏まえてさらに研究を進めていきたい。HES1遺伝子ドミナントネガティブによる神経分化誘導について論文発表に向け準備する。HES1遺伝子ドミナントネガティブによる神経分化誘導についてはヒトiPS細胞でも実施しできるだけ早期の発表を目指す。神経分化誘導中のBDNFの働きについてはさらに解析を進めその機構を明らかにしていきたい。iPS細胞から分化誘導した神経回路網の評価系の確立のため多点電極でiPS細胞由来神経ネットワークの活動電位の計測を進める。すでに予備的な実験として多点電極上での神経ネットワーク活動電位計測に成功しているが、まだ分化誘導効率が低いため神経細胞以外の雑多な分化細胞が混じり合い電極に接する神経細胞の密度が足らず計測される神経発火の頻度が少なくなってしまっているのが課題である。そこで本研究課題の今後の推進方策として分化誘導効率の上昇に取り組む。今後もこれまでと同じく交付申請書の記載に基づいて研究を推進する。
ユビキチン化によるDNA修復制御機構の解明

本研究ではユビキチンリガーゼSHPRH遺伝子破壊細胞株及びRNF20遺伝子条件発現抑制株の作製・解析を行った。SHPRHは抗がん剤シスプラチンによるDNA鎖間架橋損傷の修復に対してユビキチンリガーゼRAD18と協調的に作用する。またRNF20の条件発現抑制によって相同組換え因子RAD51のγ線照射部位への集積が減少したことから、RNF20は相同組換えによるDNA二本鎖切断修復を促進すると考えられた。DNAは放射線や化学物質によって絶えず損傷を受ける。複製DNAポリメラーゼは損傷を受けた鋳型DMによって進行停止に陥る。細胞はこのような鋳型DNAの損傷による複製ポリメラーゼの進行停止を解除し、適切に複製を再開する仕組みを複数備えている。この複製停止解除機構は、様々なDNA代謝に関わるタンパク質因子のユビキチン化によって厳密に制御されている。我々はこれまでにヒトユビキチンリガーゼSHPRH及びHLTFが「複製後修復」と呼ばれる複製停止解除機構を制御していることを明らかにした。また近年の研究から、ヒトユビキチンリガーゼRNF8及びRNF20も複製停止解除に関与することが示唆されている。そこで本研究では、ユビキチン化による複製停止解除機構をさらに解明するために、SHPRH及びHLTFを中心としたタンパク質複合体を精製する。これまでにSHPRH及びHLTFにFLAG-HAエピトープを付加した遺伝子を安定発現するヒトHeLa細胞株を作製した。また、ニワトリB細胞株DT40を用いて、SHPRH,RNF8,RNF20遺伝子の欠損細胞株を作製した。SHPRH欠損細胞株は各種DNA損傷に対して顕著な感受性を示さなかったが、SHPRH欠損によってジーンコンバージョンと呼ばれる特殊な相同組換え修復が亢進することを示唆するデータを得た。それに対してRNF8遺伝子欠損株は、トポイソメラーゼ阻害剤カンプトテシンやPARP阻害剤オラパリブに対して強い感受性を示し、RNF8は「一本鎖DNA切断に始まる相同組換え修復」を促進することによって複製停止を解除することが示唆された。またRNF20遺伝子はホモ変異細胞株が得られず、テトラサイクリン依存的にRNF20遺伝子発現が抑制される細胞株を作製・解析した結果、RNF20遺伝子は細胞の生存に必須であることが明らかになった。損傷を受けたDNAは複製DNAポリメラーゼの進行を阻害する。DNA複製停止解除機構は様々なDNA代謝に関わるタンパク質因子のユビキチン化によって厳密に制御されていることが明らかにされてきた。我々はこれまでの研究から適切な複製停止解除ががんの引き金となる遺伝子変異を抑制することを示した。従って複製停止解除の制御機構の解明はがんの発生機序や抗がん剤の作用機序を理解する上からも重要である。本研究では、これまでにDNA損傷応答に関与することが示されたユビキチンリガーゼSHPRH,RNF8,RNF20などの遺伝子破壊細胞株の作製・解析やタンパク質複合体精製による結合因子の同定を行い、ユビキチン化による複製停止解除機構をさらに解明する。これまでにニワトリB細胞株DT40を用いて、SHPRH,RNF8,RNF20遺伝子の欠損細胞株を作製した。SHPIRH欠損細胞株は各種DNA損傷に対して顕著な感受性を示さなかったが、SHPRH欠損によってジーンコンバージョンと呼ばれる特殊な相同組換え修復が亢進することを示唆するデータを得た。RNF8遺伝子欠損株は、ポリ(ADP)リボシル化阻害剤オラパリブに対して強い感受性を示し、主要なポリ(ADP)リボシル化酵素であるPARP-1遺伝子欠損と合成致死であると考えられた。RNF20遺伝子は細胞の生存に必須であることが明らかになり、現在結合因子との結合部位を欠失した変異体の解析を行っている。また、SHPRH及びHLTFにエピトープタグを付加した遺伝子を安定発現するヒト細胞株をもちいて引き続きタンパク質複合体の精製を試みる。放射線や化学物質によるDNA損傷は複製DNAポリメラーゼの進行を阻害する。近年、DNA複製停止解除機構は様々なタンパク質因子のユビキチン化によって厳密に制御されていることが明らかにされてきた。本研究では、ニワトリB細胞株DT40を用いてDNA損傷応答に関与するユビキチンリガーゼSHPRH, RNF8, RNF20の遺伝子破壊細胞株の作製・解析を行った。SHPRH単独変異株は各種DNA損傷に対して顕著な感受性を示さなかったが、ジーンコンバージョンと呼ばれる特殊な相同組換え修復が亢進した。

また、複製停止解除に関わるユビキチンリガーゼRAD18の単独変異株はDNA鎖間架橋損傷剤であるシスプラチンに対して感受性を示すが、SHPRH/RAD18二重欠損細胞株は、RAD18単独欠損細胞株より強い感受性を示した。このことからSHPRHはDNA鎖間架橋損傷による複製停止解除においてRAD18と協調的に作用することが示唆された。一方、RNF8遺伝子欠損株は、トポイソメラーゼI阻害剤であるカンプトテシンやポリ(ADP)リボシル化阻害剤オラパリブに対して強い感受性を示した。また、RNF8変異は主要なポリ(ADP)リボシル化酵素であるPARP-1遺伝子欠損と合成致死になることが分かった。これらのことからRNF8はDNA複製に伴う相同組換え修復において作用することが示唆された。また、RNF8単独変異株及びRNF8/SHPRH二重変異株はシスプラチンには高感受性を示さなかったことから、RNF8はDNA鎖間架橋損傷による複製停止解除には関与しないことが示唆された。RNF20遺伝子は細胞の生存に必須であることが明らかになり、現在部分欠失変異体の解析を行っている。ニワトリ細胞株をもちいたユビキチンリガーゼRNF8,RNF20遺伝子破壊細胞株の解析に焦点をあてていく。現在解析結果の論文原稿を作製中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。RNF20遺伝子欠損株及びRNF8,PARP1二重欠損細胞株は致死であったので条件発現細胞株や遺伝子一部欠損株を作製して解析を試みる。また、タンパク質複合体精製はより精製効率のよい方法を採用して継続する。
肺癌における血行性転移機序の解明と新規アジュバント治療の開発

肺癌の血行性転移は機序が未解明で,抑制法も存在しない。我々は、ヒト肺腺癌高転移株PC14HMの血行性転移には細胞骨格vimentin(VIM)の発現が重要であること、その抑制により遊走能や浸潤能、上皮間葉転換化や癌幹細胞化が制御可能であり、VIM受容体としてのinsulin growth factor 1 receptor (IGF1R)の可能性があることを見出した。本研究はPC14HMを用い,VIMをノックダウン/強制発現させることでVIMを介した血行性転移の機序を解明し、さらに肺腺癌に対して抗IGF1R治療薬を用いて血行性転移を抑制する新規のアジュバント療法の開発を目的に研究を行う。
女性のパフォーマンス空間としてのアスコーナ

本研究では、20世紀の芸術家コロニー、アスコーナのモンテ・ヴェリタの文化史的意義を解明し、詩人ラスカーニシューラー、舞踊家バラ、画家ヴェレフキンら、女性芸術家にとっての芸術家コロニーの解放的意義を明らかにした。また、女性が主導した舞踊芸術と他芸術や社会状況との相互的関係を、精神医学、女子体操、身体文化運動を例に分析した。成果の一部を盛り込んだ著書『踊る身体の詩学』は、ドイツ語圏モダニズム期の舞踊を学際的な視野から包括的に論じた初の研究として二つの学会賞を受賞した。20世紀前半で最重要の芸術家コロニーの一つであるスイス・アスコーナの「モンテ・ヴェリタ」を取り上げ、女性芸術家による舞踊と他芸術との関わりを研究する。各年度の小テーマは、(1)アスコーナの文化史的意義、(2)詩人エルゼ・ラスカー=シューラー、(3)舞踊家シャルロッテ・バラ、(4)画家マリアンネ・フォン・ヴェレフキンである。本研究のうち、平成18年度の小テーマ「アスコーナの文化的意義」に関しては、2006年度末出版の『踊る身体の詩学-モデルネの舞踊表象』(名古屋大学出版会)において、概略を述べた。1)アスコーナの芸術家コロニー「モンテ・ヴェリタ(真理の山)」は、田園都市ヘレラウや芸術家共同体「新しい共同体」などとともに、政治や学問、芸術の領域で正規のキャリアを積めない市民女性の受け皿であり、自己解放の空間であった。彼女たちの業績や人間関係を辿っていくことで、モデルネの文化の裏面を考察できる。たとえば舞踊家ヴィグマンと精神科医プリンツホルン、ヴィグマンと建築家ミース・ファン・デア・ローエ夫妻との関係から、モダンダンスと精神分析や建築との関わりを考えることが可能となることを指摘した。2)思想的にも人脈的にもアスコーナとつながりの深かった田園都市ヘレラウについて考察した。田園都市協会のメンバーの多くが、「新しい共同体」のメンバーであったこと、ヘレラウで活動したジャック=ダルクローズの思想にも改革運動の影響が見られること、アスコーナで活動し、表現舞踊の舞踊家たちの思想との共通点が認められること、さらにマルティン・ブーバーや小山内薫との関わりについても言及した。3)まずアスコーナの現地調査を踏まえて、その地理的な空間がブリコラージュ的な特性を持つことを指摘した。さらに、アナーキズム、神秘主義、改革運動、芸術、の側面から、アスコーナと各分野の多様な人物との関係を辿った。とりわけ、アスコーナと縁の深い芸術がモダンダンス(表現舞踊)、特にルドルフ・フォン・ラーバンに焦点を当て、「舞踊・音・言葉」の「調和」を目指したラーバンが、その理想を、総合芸術的な作品においてばかりではなく、舞踊学校の教育科目や、理論書においても実践していることを指摘した。申請者は、平成18年度に、アスコーナの文化史的意義の検討を含む著書『踊る新身体の詩学-モデルネの舞踊表象』(単著、名古屋大学出版会、2006年)を公刊した。平成19年度に、この著書は「これまでほとんど体系的検討がなされてこなかったモデルネ期の舞踏に焦点をあて」た「広くドイツ関連分野の裨益するところが多い業績」であることが評価され、「2006年度日本ドイツ学会奨励賞」を授与された。また、『ドイツ文学』(日本独文学会)第136号(2008年3月)の書評をはじめ、『舞踊学』(舞踊学会)第30号(2007)の文献紹介記事など、各種のメディアで取り上げられた。平成19年度の本研究は、「エルゼ・ラスカー=シューラーアスコーナを中心に」を小テーマとしつつ、この芸術家の活動を幅広く研究し、その成果を「複製技術時代のユダヤ人・女性・詩人-エルゼ・ラスカー=シューラーのイメージ戦略」としてまとめた。また、平成19年12月のシンポジウム「1890年-1930年のドイツ語圏の文化・芸術の解体と融合」において、「コンセプトとしての<筆跡画>-エルゼ・ラスカー=シューラーにおける身体・画像・文字」と題して、ラスカー=シューラーにおける身体性の問題を、画像性・文字性の問題と絡めて論じた。さらに、平成20年3月に開催された、「世界の演出可能性」をテーマとした国際シンポジウム「第50回蓼科シンポジオン」(日本独文学会主催)において、,,,...meine norwegische Briefschaft [ist] ein Massenlustspiel": Sozial-und mediengeschichtliche Aspekte bei Else Lasker-Schulers,, Briefe nach Norwegen"と題してドイツ語で発表を行い、ラスカー=シューラーの書簡体小説『ノルウェーへの手紙』を、社会史的およびメディア史的観点から考察した。申請者は、研究テーマであるアスコーナの文化史的・舞踊史的意義の検討を含む著書

『踊る身体の詩学-モデルネの舞踊表象』(単著、名古屋大学出版会、2006年)によって、今年度「第5回日本独文学会賞日本語研究書部門」を受賞した。受賞理由は、「これまで部分的にしか扱われてこなかった、モデルネ期の文学と舞踊との関連を博捜した研究」であることである。今年度の小テーマは、ラスカー=シューラー、舞踊家のシャルロッテ・バラのアスコーナにおける活動である。申請者は、アスコーナにおける活動も含んだ、バラの芸術的活動を概観できるような論文の作成を目指し、論文「聖なる踊り子-シャルロッテ・バラの舞踊美学における宗教性」においてその目標を達成した。本論文では、バラの生涯と作品を、写真や図版を用いて詳細に紹介し、アスコーナやヴォルプスヴェーデとの関連や、バラの舞踊美学を検討した。本論文は、日本での初のバラに関する本格的な論文であり、日本の舞踊研究に貢献ができたと考えている。またラスカー=シューラーに関しては、Brief als Medium der Transformation.Else Lasker-Schulers"Briefe nach Norwegen"と題する招待講演を、国際シンポジウムUbersetzung und Transformation(於:早稲田大学)において行った。さらに、モダニズムの舞踊において重要で、アスコーナにおける舞踊運動とも関わりの深い「輪舞」に関してAsiatische Germanistentagung 2008(於:金沢星稜大学)および名古屋大学におけるシンポジウム「欧米の市民文化の諸相」で発表した。また女性の身体文化との関連で、女子体操の一つであるMensendieck-Gymnastikに関する発表も行った。平成18年度以来の研究「女性のパフォーマンス空間としてのアスコーナ」の最終年度の小テーマは、1)ロシア出身でドイツ語圏で活躍した表現主義の女性画家、マリアンネ・フォン・ヴェレフキンにおける絵画と舞踊の関係、および追加的テーマとして、2)アスコーナを拠点の一つとした舞踊家メアリー・ヴィグマンの活動の調査を挙げた。1)の成果は、第61回舞踊学会大会において、「マリアンネ・ヴェレフキンにおける絵画と舞踊-予備的考察」の発表である。主な内容は、ヴェレフキンにおけるロシア・リアリズムや象徴主義の影響、ミュンヘンのロシア人サークルにおける役割、舞踊家サハロフ夫妻、ヴィグマン、バラとの交流、「心的な運動のリズム」を重視するヴェレフキンの美学とカンディンスキーとの親縁性、画家ミュンターやヤウレンスキーらによるサハロフのスケッチとの比較、である。本発表は、日本ではほとんど知られていない画家ヴェレフキンについての初めての本格的紹介であり、また舞踊史・美術史・およびモダニズムの文化史の観点から見て、舞踊と絵画、あるいは視覚文化と身体文化の相互作用に関する新たな知見を提示することができたと考えている。2)またメアリー・ヴィグマンに関しては、日本病跡学会からシンポジウム「モダンの構造・モダンの病理」に招待される機会を得た。本発表では、舞踊家ヴィグマンと、彼女と恋愛関係にあった精神科医ハンス・プリンツホルンの舞踊観をはじめて比較・検討し、モダニズムにおける表現舞踊と精神医学の緊密な相互的関係を明らかにした。プリンツホルンは、精神病患者の造形芸術を蒐集して解説した『精神病者の描画』の著者でもある。
癌間質相互作用を制御する膵星細胞関連ｍｉＲＮＡの同定とその制御機構の解明

癌間質相互作用に関して、他の癌腫で報告のあるmiRNAに関して、癌関連膵星細胞(PSCs)での発現解析を行った。膵癌細胞株SUIT-2とPANC-1より樹立した高肝転移株(MS・MP)を用いて発現解析を行ったところ、親株と比較してMSでは、miR-125b-5p・miR-4324・miR-4706の発現増加を認め、miR-16-5p・miR-21-5p・miR-192・miR-194・miR-5100では発現低下を認めた。膵星細胞、膵癌高肝転移株、IPMNのmiRNAを解析することで、これらが予後規定因子としてのマーカーになり得ると考えられた。膵癌において様々な研究が行われており、miRNAについてその発現・機能解析が広く行われている。しかし、近年癌間質相互作用という概念が中心となってきていることから癌間質相互作用において重要な役割を担う膵星細胞関連のmiRNA発現・機能解析を行うことが本研究の目的となっている。これまで癌関連PSCsにおけるmiRNAの発現プロファイリングのため、膵癌組織由来PSCsの樹立を行い、その癌間質相互作用に関しての解析を行い、Arrayを行うPSCsを選択した。癌間質相互作用に他の癌腫で関与が報告されている、miR31、miR204、miR34a、miR21、miR200cなどのmicroRNAに関して、膵癌由来PSCsでの発現解析を行った。その結果、miR31の癌由来のPSCsで発現が増加していることを認めた。miR204は膵星細胞で癌細胞と同程度の発現を認めたが、癌由来と正常由来の膵星細胞の間で明らかな傾向は認められなかった。miR34aは癌細胞と比較して正常由来の膵星細胞で発現の増加を認め、さらに癌由来の膵星細胞で発現の増加を認めた。miR21は正常由来膵星細胞より癌由来膵星細胞で発現の低下を認めた。miR200cは正常由来膵星細胞と癌由来膵星細胞とで明らかな差は認められなかった。今年度は膵癌の間質のみならず前癌状態といわれているIPMNのサブタイプにおけるmiRNAの評価を行った。腸上皮化生組織や大腸癌では発現が上昇しているmiRNA196aに着目し検討を行った。腸型IPMNはそれ以外のIPMNに比してmiRNA196aが高発現していることが判明した。これまで癌関連PSCsにおけるmiRNAの発現プロファイリングのため、膵癌組織由来PSCsの樹立を行いその癌間質相互作用に関しての解析を行いArrayを行うPSCsを選択した。癌間質相互作用に他の癌腫で関与が報告されているmiR31、miR204、miR34a、miR21、miR200c等のmicroRNAに関して膵癌由来PSCsでの発現解析を行った結果miR31の癌由来のPSCsで発現が増加しmiR204は膵星細胞で癌細胞と同程度の発現を認めたが癌由来と正常由来の膵星細胞の間で明らかな傾向は認められなかった。miR34aは癌細胞と比較して正常由来の膵星細胞で発現の増加を認め、更に癌由来の膵星細胞で発現の増加、miR21は正常由来膵星細胞より癌由来膵星細胞で発現の低下を認めた。前年度は膵癌の間質のみならず前癌状態といわれているIPMNのsubtypeにおけるmiRNAの評価を行ったが、本年度は膵星細胞だけでなく膵癌細胞のmiRNA解析を追加する方針とし膵癌細胞株SUIT-2とPANC-1より樹立した高肝転移株を用いてmiRNA発現解析を親株と比較した。SUIT-2の高肝転移株は網羅的解析の結果miR-4706、4324・miR-125b-5p等で有意な上昇を認め、miR-192、194・miR-21-5p・miR-16-5p・miR-5100等で低下を認めた。PANC-1の高肝転移株は網羅的解析の結果miR-2964a-5p・miR-3135b・miR-1247-3p等で有意な上昇を、miR-377-5p・miR-5100・miR-4454等で低下を認めた。膵星細胞、膵癌高肝転移株、IPMNのmiRNAを解析することでこれらが予後規定因子としてのマーカーになり得る可能性が示唆された。

癌組織や癌細胞におけるmiRNAの発現・機能解析は広く行われてきたが、癌の進展に強く影響を及ぼす癌関連線維芽細胞におけるmiRNAの発現・機能解析については報告はなく、癌間質相互作用を制御する膵星細胞関連miRNAの発現・機能解析を行うことが本研究の目的であり、本年度は以下の研究を行った。癌関連PSCsにおけるmiRNAの発現プロファイリングのため、膵癌組織由来PSCsの樹立を行い、その癌間質相互作用に関しての解析を行いArrayを行うPSCsの選択を行った。現在それらのPSCsよりmicroRNAを抽出し、arrayへ出す準備を進めている。また、癌間質相互作用に他の癌腫で関与が報告されている、miR31、miR204、miR34a、miR21、miR200cなどのmicroRNAに関して、膵癌由来PSCsでの発現解析を行った。その結果、miR31の癌由来のPSCsで発現が増加していることを認めた。miR204はゲムシタビン治療群において高発現で予後良好であることが知られているが、膵星細胞では癌細胞と同程度の発現を認めたが、癌由来と正常由来の膵星細胞の間で明らかな傾向は認められなかった。miR34aは癌の増殖抑制で知られているが、癌細胞と比較して正常由来の膵星細胞で発現の増加を認め、さらに癌由来の膵星細胞で発現の増加を認めた。miR21は癌の増殖や浸潤能や薬剤耐性に関与することが知られているが、正常由来膵星細胞より癌由来膵星細胞で発現の低下を認めた。miR200cはE-cadherinの発現を制御し転移を抑制するが、正常由来膵星細胞と癌由来膵星細胞とで明らかな差は認められなかった。平成24年度は選択した有望なmiRNAにて関して、in vitroおよびin vivoでの実験を進めていく。microRNAの発現プロファイリングを行う膵癌由来の星細胞選択に難渋している。また、これまで発現解析を行ったmiRNAの機能解析について十分に検討の余地がある。microRNAの発現プロファイリングを行う膵癌由来膵星細胞の選択にあたって、その解析も最も適した細胞選択のための解析に難渋した。今後は、IPMNの亜型について更なる検討を行っていく。そこより前癌状態から発癌へと至る過程でmiRNAが間質にどのように関与するか検討する。また、当研究室で作成した放射線耐性膵癌細胞株について親株との比較としてmiRNAの評価を行うことを検討している。さらに癌間質との放射線耐性の評価も検討する。microRNAの発現プロファイリングの結果を受けて、膵癌の癌間質相互作用に最も関与すると思われるmiRNAを早急に選択し、その後の実験を的確かつ円滑に進めていく。本研究の遂行に必要な主要装置(フローサイトメーター、in vivo蛍光イメージャー、リアルタイムPCR,蛍光顕微鏡、遺伝子導入装置、バイオアナライザー、ナノドロップなど)は既に研究室内に設置されている。この他の機器(共焦点レーザー顕微鏡、透過型電子顕微鏡、DNAシークエンサーなど)については学内の研究支援センターにおいて利用可能であり、現在の研究遂行に支障はない。また固形癌に適した高額なセルソーターが必要となる場合もあるがすでに学内の研究支援センターにおいて2台使用できる環境にあり特に新規に購入する必要はない。このため研究経費において新たな設備備品の購入は不要である。消耗品においてはqRT-PCRを行うための試薬やプライマーの購入、ソート用モノクローナル抗体,ソート時の使用試薬、Nucleofector用導入試薬、shRNA/レトロウイルス作成キット、マウス等を実験遂行において購入を予定している。本研究の遂行に必要な主要装置(共焦点レーザー顕微鏡、フローサイトメーター、in vivo蛍光イメージャー、リアルタイムPCR,蛍光顕微鏡、遺伝子導入装置、セルソーター、バイオアナライザー、ナノドロップ、FACS機器など)は既に研究室内に設置されている。
新規蛍光プローブによるシナプス膜における膜受容体動態の解析

【研究の目的および意義】グルタミン酸によるシナプス伝達の長期増強(LTP)は記憶・学習の形成に必要な素過程と考えられている。AMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)は、その中心的役割を果たしておりLTPの分子的実態であるという考え方が確立しつつある。このためシナプス活動依存的にAMPARの分子数がどのように制御されているのか、明らかにすることが重要な課題であると考えられるが、未だに不明な点が多い。そこで本研究ではAMPA受容体の主要なシナプス輸送経路を明らかにすることを目的とし、新たな蛍光イメージング法によるシナプス刺激依存的なAMPA受容体のシナプス輸送の解析手法を樹立した。成果(1)シナプス刺激によるスパイン容積増大とGluA1サブユニット総量増大の同時相関解析法の樹立N末端細胞外領域にSNAPタグ(酵素タグの一種)を挿入したSNAP-GluA1を構築し、初代培養海馬神経細胞に発現させ、細胞膜非透過性蛍光色素によって標識を行った。また細胞外フィールド電極刺激による高頻度刺激(2sec,50Hz)を加えることで、一部のスパインで頭部容積の増大を引き起こし、さらに容積増大に伴い側方拡散によってスパイン膜上のGluA1が増加した。またこの過程はNMDA受容体の阻害剤であるAP5で阻害されることから、NMDA受容体を必要とする。成果(2)新規蛍光プローブによるAMPARサブユニットの膜挿入可視化手法の樹立新規蛍光基質(Komatsu,JACS,2011)を用いたパルスチェイス解析によって、刺激のない状態の初代培養海馬神経細胞において、240分の間に新規挿入されたGluA2サブユニットを検出することが可能になった。海馬神経細胞では神経活動依存的なAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)のシナプスにおける動態は、シナプス伝達効率の長期増強に重要であることが知られている。しかし神経活動に伴うシナプス膜へのAMARの輸送がどのように制御されるのか、いまだ不明な点が多く解明すべき課題である。そこで本研究において、細胞外領域に酵素タグを挿入したAMPARを細胞膜非透過性の低分子合成プローブにより蛍光標識し、シナプス膜における動態の解析を試みる。(1)蛍光標識の条件最適化初代培養海馬神経細胞にAMPARを発現させ、細胞膜非透過性の蛍光プローブによって5-10分でほぼ全てのAMPARを蛍光標識できる条件に最適化した。この条件の下、神経細胞をシナプス刺激する前後に蛍光標識することで、新たに細胞膜上に挿入されたAMPARを検出できる可能性が高い。(2)培養海馬神経細胞の経時観察を行うための装置・撮像条件の最適化シナプス刺激依存的なAMPARの動態を解析するために、培養海馬神経細胞を経時観察するための条件を最適化した。現在、刺激を加えた場合の動態について検討している。