hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超低体温逆行性脳灌流法・至適灌流条件の研究

研究1.雑種成犬を用い矢状静脈洞及び上大静脈送血による逆行性脳灌流実験を行った。大脳表面の微小循環観察では完全な逆行性循環が確認され、脳組織PCO2上昇も抑制された。逆行性循環時の大脳血管抵抗は順行性の1.2-1.5倍であった。レーザー組織血流量計による大脳皮質血流量は15mmHg,25mmHg,35mmHgの各灌流圧で、5.5,9.0,10.1ml/100g/minで90分間安定した血流の得られた。大脳組織pHiは各6.38-6.8,6.73-7.08,6.79-7.16で60分循環停止群6.24-6.43に対し有意に高かった。マイクロソフェア法による大脳前頭葉/皮質血流は、同じ各灌流圧において2.2/4.0,7.0/12.1,8.1/13.6ml/100g/minが得られた。25mmHgまたはそれ以上で十分な脳灌流が得られ、脳組織アシドーシスから保護可能である。本研究では実効脳組織血流は証明されたが、今後の課題としてHyperfrontalityのない均一な灌流モデルが逆行性脳灌流後の脳浮腫の実験的研究のため必要である。研究2.超低体温における必要脳組織血流量、安全限界を決定する目的で、雑種成犬43頭を用い20°C,120分超低流量灌流を行った。(2.5,5,10,20,40ml/kg/min)2.5,5,10ml/kg/minでは脳組織酸素飽和度低下が見られたが、10ml/kg/min以上で脳局所pHは保たれた。灌流圧10mmHg以上では、大脳皮質組織血流量が10.2±1.9ml/100g/min以上を保ち、かつ大脳皮質組織血流量9ml/100g/min以上では大脳皮質pHが7.1以上となり、必要脳組織血流量は大脳皮質で9.0全脳で6.7(ml/100g/min)以上となった。従って、一昨年度求めた脳動静脈血管抵抗比より計算して逆行性脳灌流の必要灌流圧は15mmHgと考えられた。大脳皮質組織血流量9ml/100g/min以下の不完全脳灌流の効果については更なる研究が必要である。雑種成犬29頭で90分超低体温逆行性脳灌流を行った。21頭では15,25,35各mmHgの灌流を各30分行いカラーマイクロソフェア法にて脳組織血流分布を測定した。両側顎静脈送血(上大静脈送血無し,n=4)では有効脳組織血流は観察されず、上大静脈送血併用矢状静脈洞送血17例中後方送血、側孔付きカニューラ使用例各4例(計8例)でも同様であった。

側孔なし前方送血・上大静脈送血併用(9例)でのみ有効脳組織血流が観察され、25,35各mmHg送血での脳組織血流は全脳、前頭葉皮質で各3.8,4.6及び12.1,13.6ml/min/100gで、15mmHgでは前頭葉皮質でも4.0に過ぎなかった。脳細胞内pHは15mmHg灌流群8例では6.58±0.14と低く、25mmHg灌流群6.93±0.11と60分循環停止群(8例controll study)6.27±0.16の中間値となった。脳細胞内pHmapでは、25mmHg灌流群でも前頭葉で他部位より高いpHであったが、15mmHg灌流群では後頭葉・小脳のpHは低く循環停止群と同等であった。脳内ヘモグロビン・酸素飽和度の検討は8例で行った。25mmHg灌流により脳内ヘモグロビンは230-250g/1、酸素飽和度68-77%を維持可能であり、逆行性脳灌流中は低下せず上昇傾向が観察されたが、前方灌流例ではやや不良であった。実験的逆行性脳灌流法による脳全域のpHの維持と脳実質内組織血流の証明はいずれも世界初の知見であるが、Hyperfrontalityを認め全脳の均等な血流分布は観察されていない。現在は均等な血流分布を実現する実験モデルの開発を種種の灌流形態を用い進めている。しかし、PSA-IIINによる脳内ヘモグロビン・酸素飽和度の測定結果は脳内酸素飽和度の上昇傾向を示しており、近い将来に実現可能と考えている。1.均一な脳組織灌流を得られる逆行性脳灌流実験モデルを得る目的で、雑種成犬17頭を用い、両側顎静脈送血逆行性脳灌流(n=12.単独6上大動脈送血併用6,)、矢状静脈洞送血逆行性脳灌流(頸部緊縛、頸動脈脱血、n=5)を各テストした。両側顎静脈送血群では有効脳組織灌流は得られず、また脳組織pHも6.04-6.57と低かった。矢状静脈洞送血頸部緊縛群では、5例中2例で均一な有効脳組織灌流が得られ1例では脳酸素消費量0.47ml/100g/minが得られたが、中心静脈圧10mmHgではBasilar sinus-椎骨静脈系の静脈間シャントを防止できなかった。本研究により、昨年度までの灌流モデルに頸部緊縛、頸動脈脱血を加えることで脳代謝測定と遷延性脳浮腫の検討が可能になることが判明した。2.超低体温における必要脳組織血流量、安全限界を決定する目的で、雑種成犬43頭を用い20°C,120分超低流量灌流を行った。(2.5,5,10,20,40ml/kg/min)2.5,5,10ml/kg/minでは脳組織酸素飽和度低下が見られたが、10ml/kg/min以上で脳局所pHは保たれた。灌流圧10mmHg以上では、大脳皮質組織血流量が10.2【.+-。】1.9ml/100g/min以上を保ち、かつ大脳皮質組織血流量ml/100g/min以上では大脳皮質pHが7.1以上となり、必要脳組織血流量は大脳皮質で10全脳で6.7(ml/100g/min)以上となった。従って、一昨年度求めた脳動静脈血管抵抗比より計算して逆行性脳灌流の必要灌流圧は15mmHgと考えられた。
設置型モニタリングシステムを用いたミナミマグロ幼魚の回遊経路の解明

当該研究期間において、主に2項目について成果を挙げることが出来た。以下に成果の概要をそれぞれ記す。1.海洋環境が分布特性に及ぼす影響ルーウィンカレントの勢力が強かった年(2004年度)は、温かい水(約19.5°C)が調査海域を満たした。この年、ミナミマグロ幼魚は海山周辺海域に集中して(全出現数の92%)分布した。一方、ルーウィンカレントの勢力が弱かった年(2005年度)は、他海域からの冷水の浸入が考えられ、陸棚上に暖水塊・冷水塊が多数存在した。また、本種幼魚は海山周辺に集中せず、水塊縁辺部に出現する傾向が見られた。以上の結果および過去の知見より、本種幼魚の分布は、海洋環境に左右されやすい餌生物(Sardinops sagaxやScomber australasicusなど)の分布に大きく影響されている可能性が示唆された。2.サイズ別分布特性全ての年において、大型個体ほど沿岸の受信機に出現する傾向が見られた。また、2歳魚と1歳魚が同海域に同時に分布しだ場合(2002、2003年度)は2歳魚が、2歳魚が分布しなかった年(2004、2005年度)では1歳魚の中でも大型の個体(尾叉長>50cm)がより沿岸域に出現した。特に2005年度では大型1歳魚が沿岸域の海山周辺海域に集中して分布した(大型1歳魚の全出現数の97%、小型50%)。以上の結果より、本種幼魚は、餌生物(Spratelloides robustusやEngraulis australisなど)が多く分布する沿岸域の海山周辺海域のニッチを巡り、サイズ依存の個体間競合を展開していると判断された。豪州南西海域に来遊するミナミマグロ幼魚(主に1歳魚)の回遊動態とその年変動要因を検討するために,個体識別型発信器(コード化ピンガー)と係留型受信器(VR2)を組み合わせた本種の行動追跡調査を実施した.コード化ピンガーを装着・放流された実験魚の追跡用の係留システム(LS : listening station)は,VR2・切り離し装置・温度データロガー・アンカーとブイによって構成されている.VR2を中心とする半径500m(海況等によって距離は100800mの間で変動)の受信範囲内にコード化ピンガー標識個体が出現すると,パルス間隔から識別される「個体番号」と「受信時刻」がVR2の内部メモリに記録される.LSは2004年12月3-4日に,Albany東部から沖側に向けて20台(西ライン:LS No.120(南緯34.935.2,東経118.4118.4)),Bremer Bayから沖側に向けて20台(中部ライン:LS No.2140(南緯34.534.7,東経119.4119.6)),さらにBremer BayとEsperanceの中間地点付近に21台(東ライン:LS No.4161(南緯34.034.5,東経120.6))に各LS間の距離が約1500mになるように,水深20-120mに合計61台を設置した.また,ミナミマグロの海山への出現・滞在状況を記録するために,南緯34.5東経119.0の沿岸近くに合計9台のVR2を係留してモニタリングを実施した.

標識放流は2004年12月5-7日,2005年1月10-17日の2回行った.放流地点は南緯34.5東経119.0の沿岸近くから,合計79個体の放流に成功した.標識放流個体(尾叉長:44-90cm)のうち,29個体には深度・温度ロガーを装着した.本課題の共同研究者であるHobday博士によって,2005年3月30日にVR2は回収される予定である.これまでの予備調査の実績から,50台前後のVR2の回収を見込んでいる.平成16年度調査は、2004年12月1日から2005年3月20日まで実施され、解析は平成17年度に実施された。その結果、係留した音響ステーションから70台のうち58台が回収された。また、音響タグ標識放流個体79個体のうち55個体から、27,729回の受診記録を得た。そのうち、ホットスポットであるLumpにおいて80%(44個体)が出現し、91.3%(25,325回)がLumpの受信であった。このことは、ミナミマグロ幼魚にとって、Lumpが好適な環境であることを示唆している。また、調査期間中の水温は、12月上旬に18°C、その後徐々に上昇し、2月上旬には20.8°C、以降3月中旬まで1920°Cで推移した。2月上旬の高水温は、ルーイン海流由来と考えられる暖水塊によるものと考えられ、この時期を境にLumpの出現が激減した。また、ライン上の出現率を月別に比較すると、季節経過とともに、西から東のラインへの出現割合が大きくなる傾向が確認された。以上より、本調査海域に来遊してきた夏期のミナミマグロ幼魚は、Lump周辺での「滞在期」と、東方への「移動期」の2フェーズを持つことが示唆され、季節的な水温変化がフェーズの変化の契機になることが推察された。なお、平成17年度も同様の調査デザインで音響ステーションを設置し実験を実施中である。これら音響ステーションは2005年5月に回収される予定であり、回収後に解析を実行予定である。平成18年度は、平成17年度の調査結果を中心に解析を実施した。平成17年度調査は、平成16年度同様の調査デザインで音響ステーション70台を設置し、2005年12月1日から2006年5月まで実施した。解析の結果、70台中60台の音響ステーションが回収され、また、放流した81個体中68個体から、5,214回の受信記録を得た。Lumpにおける総受信数は、受信が集中した平成16年度の結果(90.8%)と比べ、大幅に低い値(7.1%)を示した。本結果より、ミナミマグロ幼魚の滞在域は年によって大きく変動することが示唆された。そこで、ミナミマグロ幼魚の分布と海洋環境要因とを比較し、両者の関係について検討した。両年度の海表面水温分布図を比較した結果、平成16年度では、ルーウィンカレントの勢力が強かったことが確認でき、調査海域全体に20°C前後の温かい水が均一的に分布した。一方平成17年度では、ルーウィンカレントの勢力が弱く亜南極域や東部海域からの冷水の浸入の可能性が考えられ、調査海域に暖水・冷水塊が散在的に存在し、複雑な海洋構造を形成していた。また、両年度ともに>50cmの大型1歳魚は、小型1歳魚(≦50cm)よりも沿岸域に出現し、特に平成16年度では、Lump周辺での受信のほとんど(85.4%)は大型1歳魚によるものであった。以上より、夏季、豪州南西海域において、本種幼魚が滞在する海域は、餌となる外洋性魚類を取り巻く海洋環境によって大きく変動することが示唆され、また、体サイズの大小によって棲み分けが行われている可能性も考えられた。
分子間水素結合を利用したカルボン酸誘導体の光反応の制御

分子間水素結合を利用したカルボン酸誘導体の光反応制御に関して,次の知見が得られた。1.カルボン酸誘導体として芳香族イミド類を用いた場合に,水酸基との分子間水素結合による光反応制御が特に効果的に働くことが明らかになった。さらに,溶媒ではベンゼンなど極性の低い溶媒を用いた場合に,また温度に関しては低温ほど,光反応の制御が効果的に行えた。また,1,8-ナフタルイミドの光反応系では,水酸基との分子間水素結合によって付加の立体選択性が制御されると同時に光反応性がかなり顕著に強められることが明らかになった。2.光物性に対する分子間水素結合の影響を明らかにするため,芳香族イミド類のケイ光スペクトルに対するアルコールの添加効果を検討したところ,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が大きなイミドの場合にはアルコールの添加によって発光強度にそれほど大きな変化は認められなかったが,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が小さな1,8-ナフタルイミドの場合には発光強度が大きく増加することが明らかになった。3.さらに強い相互作用を期待してトリフルオロ酢酸の添加効果を検討したところ,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が大きなイミドの場合には添加によってケイ光強度の減少が認められ,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が小さな1,8-ナフタルイミドの場合には,低濃度の酸の添加によって強度が約5倍と顕著に増大し,より高濃度の酸の添加によってケイ光強度が減少する,二段階のスペクトル変化が観測された。4.1,8-ナフタルイミドとスチレンとのベンゼン中での[2+2]光環化付加反応に対するトリフルオロ酢酸の添加効果を検討したところ,ケイ光強度の変化にほぼ対応して反応性が変化し,分子間水素結合により励起分子の反応性自体が制御されることが明らかになった。分子間水素結合を利用した光反応制御の可能性を探るため,平成13年度は水酸基との水素結合を利用したカルボン酸誘導体の光反応制御に関して総合的に研究を行ったところ,次の知見が得られた。1.カルボン酸誘導体としては,エステル類よりも酸無水物やイミド類において水酸基との分子間水素結合による光反応制御が特に効果的に働くことが明らかになった。さらに,溶媒ではベンゼンなど極性の低い溶媒を用いた場合に,また温度に関しては低温ほど,光反応の立体選択性の制御等がより効果的に行えた。この水素結合による光付加反応の促進効果は,励起状態の反応性自体の変化という観点から興味深いと思われる。2.芳香族イミド類の吸収スペクトルでは,アルコールの添加効果はほとんど認められなかった。しかし,ケイ光スペクトルでは,S_1(ππ^*)とS_2(nπ^*)のエネルギー差が大きなイミドの場合にはアルコールの添加によって最大発光波長は若干長波長シフトするものの,発光強度にそれほど大きな変化は認められなかったが,S_1(ππ^*)とS_2(nπ^*)のエネルギー差が小さな1,8-ナフタルイミドの場合には最大発光波長の長波長シフトと同時に,発光強度が大きく増加することが明らかになった。

この結果より,S_1(ππ^*)とS_2(nπ^*)のエネルギー差が小さな芳香族イミドの系ほど,おそらく水素結合がS_2(nπ^*)のエネルギーにより大きな影響を与えるため,励起状態自体が水素結合の影響を受けやすいと考えられる。以上の知見をもとに,平成14年度は,水酸基以外の官能基との分子間水素結合を利用した光反応系への展開等をはかり,合成化学的応用への可能性を探る。平成14年度は,平成13年度の研究で不十分な点を補うとともに,水酸基以外の官能基との分子間水素結合を利用した光反応系への展開等を検討したところ,次の知見が得られた。1.カルボン酸誘導体として芳香族イミド類を用いて,ケイ光スペクトルに対するカルボン酸の添加効果を検討した。酢酸を用いた場合には,アルコールの場合と比較して少し強いが,類似した効果が認められたが,さらに強酸であるトリフルオロ酢酸を用いると,明らかに吸収スペクトルにも大きな変化が現れ,ケイ光スペクトルにもイミドの構造に強く依存して顕著な変化がみられた。すなわち,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が大きなイミドの場合にはトリフルオロ酢酸の添加によって最大発光波長が長波長シフトすると同時にケイ光強度の減少が認められたが,特に1,2-ナフタルイミドの場合の強度の減少は非常に顕著なものであった。一方,S_1(ππ*)とS_2(nπ*)のエネルギー差が小さな1,8-ナフタルイミドの場合には最大発光波長の長波長シフトと同時に,低濃度(30mM)の酸の添加によってケイ光強度が約5倍と顕著に増大し,より高濃度の添加によって,ケイ光強度が減少する,二段階のスペクトル変化が観測された.2.酸の添加が光反応に及ぼす影響を明らかにするため,1,8-ナフタルイミドとスチレンとのベンゼン中での[2+2]光環化付加反応に対するトリフルオロ酢酸の添加効果を検討したところ,ケイ光強度の変化にほぼ対応して反応性が変化することが明らかになった。以上のように,芳香族イミド類のような系では,カルボン酸との水素結合は,分子の空間配向の制御だけではなく,励起分子の反応性自体も制御可能であると考えられる。また,酸の添加によって引き起こされるケイ光強度の増減がイミド化合物の種類に強く依存し,またその変化が顕著である点も非常に興味深いと思われる。
吸入麻酔薬による心筋保護作用に対してナチュラルキラー細胞及び免疫応答が及ぼす影響

吸入麻酔薬による心筋虚血再灌流障害と免疫細胞ナチュラルキラー細胞(NK細胞)による免疫応答の関与を探索する目的で研究を行なっている。ラット生体モデルを用いた研究において継続的に、吸入麻酔薬による心筋保護作用を確認した。本作用に対するNK細胞の関与を明らかにするために、NK細胞除去薬であるAAGM1の先行投与を試みたが、現在のところ明らかな影響を認めていない。AAGM1の投与量は、先行研究を参考に0.5mcg/g body weigt)で行なっているが、本研究では不十分な血中濃度となっている可能性もあるため,今後, 0.05 mcg/g - 5 mcg/g bdy weigtのような異なる用量で本研究を行う予定である。単離ミトコンドリアによる研究では, in vitro研究では,吸入麻酔薬が電子伝達鎖の直接的に抑制し活性酸素種を生じることを明らかにしてきたが、in vivo研究でAAMG1暴露後の単離ミトコンドリアでは明らかな作用の変化を認めていない。in vivo研究でのAAGM1効果発現用量を同定したのちに、単離ミトコンドリア研究も継続して行う。また、同時にin vitro研究でもAAGM1投与を行い、単離ミトコンドリアへの直接的影響の有無についても検討する。臨床業務および教育関連業務のため十分な研究時間が確保できていない。今年度は、本研究の遂行が遅延していることを踏まえ、業務調整を行い本研究遂行に向け鋭意努力する。吸入麻酔薬の心保護作用については明確に示すことができているため, NK細胞活性を制御できる方法を早急に検討し、研究を進めなくてはならない。吸入麻酔薬による心筋虚血再灌流障害の抑制作用と、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)による免疫応答の活性度評価を目的に研究を開始した。ラットの生体モデル(in vivo)を用いた虚血再灌流障害に対する吸入麻酔薬の効果に関する研究を行い、虚血再灌流モデルを確立した。本モデルにおいて吸入麻酔薬投与群では、非投与群と比較して、虚血再灌流障害が抑制されることを確認した。吸入麻酔薬による心保護作用が活性酸素除去薬であるTempol(TEM)を先行投与することで棄却されることから、本機序には吸入麻酔薬曝露による活性酸素種の制御が関与していると考えられる。さらに、吸入麻酔薬投与は心筋ミトコンンドリア電子伝達鎖に対して複合体Iを選択的に抑制し、少量の活性酸素種(Signaling ROS)が産生されると考えられる。Signaling ROSは、心保護作用の細胞内シグナルカスケードが惹起し、本心保護作用がもたらされることをこれまで明らかにしてきた。一方、吸入麻酔薬自体がNK細胞活性へ及ぼす影響についてはWhole blood NK cytotoxicity Assayが遂行できておらず次年度以降の課題である。さらに、活性酸素種とNK細胞活性の関係については、活性酸素種がNK細胞活性へ直接影響を及ぼす可能性が考えられるため、研究の指標および方法について再検討中である。また、虚血再灌流後の血液から、白血球分離を行い、フローサイトメトリー、定量リアルタイムPCRを行い、mRNAの発現に関する研究も遂行できておらず、今後の研究課題である。臨床業務多忙により、十分な研究時間が確保できていない。研究が遅延していることを踏まえ、業務体制を見直し十分な時間を確保する。特に、研究の遅延が明らかである、吸入麻酔薬とNK細胞活性評価について焦点を当て、研究方法について多角的に再検討を行う。当初予定していた、NK細胞活性評価が遂行できていないために使用予定であった物品費に残額が生じた。平成30年度に使用予定である。活性酸素種とNK細胞活性評価などのin vitro研究が遂行できていないために使用予定であった物品費に残額が生じた。平成31年度に使用予定である。
膵癌の癌化過程解析と、早期癌および転移巣早期診断のバイオマーカーの解明

膵癌における癌化過程の解析と早期診断に有用なbiomarkerを模索するために、通常型膵癌38例、膵管内乳頭腫瘍13例、膵島細胞腫瘍7例、慢性膵炎5例の凍結標本と、膵癌15例、膵管内乳頭腫瘍28例、慢性膵炎12例において術前ERPにより採取された純粋膵液を用いて、各種遺伝子異常とテロメラーゼ活性について検討を行った。DPC4遺伝子のヘテロ接合性の検討では、通常型膵癌および膵島細胞腫ともに30-50%に異常が認められた。免疫染色によるp53の遺伝子発現異常の検索では、この遺伝子の発現異常は通常型膵癌、膵管内乳頭腺癌の悪性病変にのみ認められるものの、その発現頻度は約50%前後と低かった。また、K-ras点突然変異の膵腫瘍組織での検討では、膵癌組織でのその異常の発現の頻度は80%前後と高率ではあるが、膵管内乳頭腺腫および慢性膵炎例でもその発現の異常が検出された。これに反して、膵腫瘍組織のテロメラーゼ活性の検討では、通常型膵癌では95%、膵管内乳頭腺癌では100%のテロメラーゼ活性の陽性率を示し、また、慢性膵炎、膵管内乳頭腺腫ではテロメラーゼ活性の陽性例は存在しなかった。また、術前採取した純粋膵液のテロメラーゼ活性は、癌化例に高率な陽性率を示し、また、良性例には陽性例は認められなかった。以上の結果より、テロメラーゼ活性の測定が膵癌早期発見においては最も有用なbiomarkerであることが判明し、K-ras点突然変異は腺腫などの前癌病変において既に発現が見られ、テロメラーゼ活性は癌化とともにその活性が見られ、p53は癌化後、増殖進展後にその異常が発現するものと考えられた。消化器外科領域における最も予後不良とされる膵癌の各種遺伝子異常ならびにテロメラーゼ活性の関与を検討するために、まず、本年度は、当科において外科的に切除し、切除後、液体窒素中に凍結保存されている通常型膵管癌38症例、膵島細胞腫瘍7症例、膵管内乳頭腫瘍5症例、慢性膵炎症例3症例を用いて、以下に述べる各種遺伝子異常、テロメラーゼ活性の検討を開始した。1.蛍光プライマーによるDPC4遺伝子のへテロ接合性の消失の検索DPC4遣伝子のへテロ接合性の消失の検索においては、通常型膵管癌24症例、膵島細胞腫瘍7症例について現時点においては検索を施行した。その結果、通常型膵管癌12/24、膵島細胞腫瘍2/7にDPC4遺伝子のへテロ接合性の消失が認められた。切除検体における腫瘍内テロメラーゼ活性の検索においては、通常型膵癌34/38、膵管内乳頭腺癌5/5、膵管内乳頭腺腫0/8、慢性膵炎1/3にテロメラーゼ活性が認められ、癌化早期に腫瘍はテロメラーゼ活性を獲得することが示唆された。3.免疫染色によるp53発現の検索p53発現の検索においては、通常型膵癌16/38、膵管内乳頭腺癌3/5、膵管内乳頭腺腫0/8、慢性膵炎0/3にp53の免疫染色による発現が認められ、癌においてもその発現頻度が低率であることよりp53は腫瘍の癌化成立後、後期に発現の異常が生ずることが示唆された。4.MASA法を用いたK-ras遺伝子点突然変異の検索K-ras遺伝子点突然変異の検索においては、通常型膵癌28/38、膵管内乳頭腺癌4/5、膵管内乳頭腺腫5/8、慢性膵炎0/3にK-ras遺伝子点突然変異が認められ、腺腫などの前癌病変においてもK-ras遺伝子点突然変異は認められた。

以上のような結果より、膵腫瘍の癌化過程においては、まず、前癌病変においてまK-ras遣伝子点突然変異が生じ、癌化早期にデロメラーゼ活性を腫瘍は獲得し、癌の浸潤増大によりp53、DPC4遣伝子の異常が生ずることが推測された。今後、症例を重ねて同様の検索を施行するとともに、術前採取した純粋膵液中の膵管細胞などについても検索を施行する予定である。前年度の膵腫瘍切除検体における各種遺伝子異常の検討では、さまざまな膵腫瘍における遺伝子異常が存在することが判明した。まず、膵腫瘍におけるDPC4遺伝のヘテロ接合性の検討では、通常型膵癌および膵島細胞腫について検討を行ったが、この遺伝子の遺伝子異常は存在するものの過去に文献的に報告された頻度ほど多くないことが判明した。免疫染色によるp53の遺伝子発現異常の検索では、この遺伝子の発現異常は通常型膵癌、膵管内乳頭腺癌の悪性病変にのみ認められるものの、その発現頻度は約50%前後と低く、膵癌発生過程の癌化成立後後期に発現の異常が発生するものと考えられ、膵癌早期発見のbiomarkerとしては十分でないことが判明した。また、K-ras点突然変異の膵腫瘍組織での検討では、膵癌組織でのその異常の発現の頻度は80%前後と高率ではあるが、膵管内乳頭腺腫および慢性膵炎例でもその発現の異常が検出され、良性病変にも異常を認めることより膵癌早期発見時の偽陽性例が存在することが示唆された。これに反して、膵腫瘍組織のテロメラーゼ活性の検討では、通常型膵癌では95%、膵管内乳頭腺癌では100%のテロメラーゼ活性の陽性率を示し、また、慢性膵炎、膵管内乳頭腺腫ではテロメラーゼ活性の陽性例は存在せず、膵癌細胞の検出においてはspecificity、Sensitivityともに今回検討を行った遺伝子学的検索において膵癌早期発見においては最も有用なbiomarkerであることが判明した。以上の検討をもとにして平成13年度は消化器外科領域で最も予後不良な膵癌の早期発見に対する遺伝子学的手法の導人を目指し、テロメラーゼ活性をターゲットにして以下の検討を行った。術前逆行性膵管造影時に採取した純粋膵液中のテロメラーゼ活性の検討術前採取した純粋膵液のテロメラーゼ活性は、膵癌13/15、膵管内乳頭腺癌11/13、膵管内乳頭腺腫0/15、慢性膵炎0/12に陽性例が存在し、癌化例に高率な陽性率を示し、また良性例には陽性例は認められなかった。以上の検討により、膵癌早期発見のbiomarkerとして術前純粋膵液によるテロメラーゼ活性の検出は有用な膵癌早期発見の手段となりうることが示唆された。
どちらの性が選ぶのか?夜間のニホンジカの繁殖行動におけるメスとオスの戦略

今年度(平成18年度)は、個体ごとの繁殖期の18年11月と19年3月の2回にわたり、宮城県金華山島で、センサス、遺体回収、日中と夜間の個体の行動観察をおこなった。夜間の調査にはスポットライトを使用した。19年3月の調査では、生体捕獲をおこなって、遺伝子サンプルを採取した。さらに、研究協力者である南正人および大西信正(NPO法人ピッキオ)から、個体の生涯履歴データの提供をうけて、個体の遺伝的多様性と出生体重(適応度に関連する形質と考えられる)との関連について、一般化線形モデルによる解析を行った。個体の遺伝的多様性(individual heterozygosity)の測定には、マイクロサテライト9遺伝子座をマーカーとして用いた。サンプル個体として、1994年から2004年までに生まれた仔ジカ68個体を用いた。説明変数として、遺伝的多様性のほかに、仔ジカの性、3月の母ジカの体重、母ジカの前年出産の有無、出生時期である4月の平均気温、を用いてモデル選択をおこなったところ、最も低い赤池情報量基準値を示す回帰モデルは、個体の標準化されたヘテロ接合度、母親の体重、仔ジカの性、4月の平均気温を説明要因とするものであった。さらに、仔ジカの性別により再解析をおこなったところ、オスの出生体重に対しては個体のヘテロ接合度が影響を及ぼす可能性が示唆された。一方、メスの出生体重に対しては、ヘテロ接合度の影響は認められなかった。本研究では、当初の作業仮説であるメスの能動的な配偶者選択を実証することはできなかったが、オス、メスともに個体の遺伝的多様性自体が繁殖成功度の決定要因となることを示すことができた。以上の結果は、Clutton-Blockらが提唱する遺伝的多様性と適応度との関連を、支持するものと考えられる。本研究では、これまでの定説とは異なるシカの繁殖戦略を、実証することを目的とした。アカシカやニホンジカなど、繁殖なわばりをつくる大型有蹄類の繁殖戦略では、オスは順位の高い個体が繁殖をほぼ独占するのにたいして、メスは積極的な配偶者選択はおこなわず子に対する投資のトレードオフで適応度をあげる、と考えられている。しかし、これとは異なる戦略が存在する可能性を検証するために、本研究では金華山島のニホンジカの交尾行動を観察し、遺伝子分析によって繁殖成功度を測定することを試みた。2005年10月に15日間にわたり、共同研究者とともにニホンジカの繁殖期の行動調査を実施した。特に、西北部の黄金山神社を中心とする地域において、識別個体の行動追跡をおこなった。その結果、約40個体の識別が可能であった。夜間の行動追跡は、計画当初に予定していた暗視装置ではなくスポットライトを照明として行ったが、今回の対象個体では十分に追跡を行うことが可能であった。その結果、なわばりオスの縄張りサイズは昼と夜で変化しないものの、行動圏は夜に縮小する傾向があることが明らかになった。さらに繁殖期初頭の社会的ランクが高いなわばりオスは交尾回数が多いことが確認できたが、その反面、繁殖期終盤にはいると、ランクの交代がおこるので、スニーカーであったオスでも繁殖成功をえることが認められた。一方、メスは能動的交尾(能動的な配偶者の選り好み)と受動的交尾があることが確認された。どちらの交尾様式を選択するかは、相手のオスのランクなどによるものではなく、同じ個体で時間経過にしたがい、変化していた。したがって、当初の予想どおりメスの能動的な交尾行動はあると思われるが、なぜ、そのような行動が成立しうるのかについては明らかではない。能動的交尾が適応度をあげている可能性について、今後、追跡個体の繁殖成功を測定することによって、検証する計画である。
肝細胞周期調節因子の肝糖脂質代謝における役割

Cyclin D1は、細胞周期調節のみならず、様々な転写因子の活性を制御している。肝臓Cyclin D1の遺伝子および蛋白発現は、絶食に伴い減少し、食事摂取後に増加した。培養肝細胞を用いた糖新生酵素プロモーター解析では、Cyclin D1の遺伝子導入により肝糖新生酵素遺伝子発現プロモーター活性が、減少した。これらの結果は、肝臓Cyclin D1が糖代謝制御に何らかの役割を果たす可能性を示している。肝臓における糖新生は、肝糖新生酵素の遺伝子発現調節により調節される。代表者らは、転写因子STAT3が、肝糖新生系酵素の遺伝子発現調節に重要であることを明らかにしてきた。食事摂取に伴い、肝臓STAT3は活性化され、肝糖新生酵素の遺伝子発現を抑制する。一方で、肝臓STAT3は細胞周期調節分子Cyclin D1の遺伝子発現を誘導し、肝細胞増殖を調節する。Cyclin D1は、細胞周期調節のみならず、肝糖代謝に関連する転写因子であるPPARγやC/EBPβの転写活性を制御することが知れている。すなわち、肝臓STAT3-Cyclin D1系が、肝細胞増殖のみならず、肝糖代謝調節にも関与する可能性を示唆している。本研究計画では、Cyclin D1の肝糖代謝調節における役割を明らかにすることを目的としている。本年度は、肝Cyclin D1発現調節の解明・Cyclin D1による肝糖新生酵素発現調節作用・肝臓特異的Cyclin D1欠損マウスの作成に取り組んだ。その結果、肝臓Cyclin D1の遺伝子発現および蛋白発現が、絶食に伴い減少し、食事摂取後に増加することを見出した。H4IIE培養肝細胞を用いた肝糖新生酵素プロモーター活性解析では、cAMP存在下において肝糖新生酵素遺伝子発現プロモーター活性は増加し、Cyclin D1の遺伝子導入により減少した。これらの結果は、食事摂取後のCyclinD1増加が肝糖新生酵素遺伝子発現調節に何らかの役割を果たす可能性を示している。また、肝臓特異的Cyclin D1欠損マウス作成のために、Cyclin D1の第2-3エクソンをLoxP配列で挟んだマウスを作成した。来年度は、Cyclin D1による肝糖新生系酵素遺伝子発現制御メカニズムの解明を進めるとともに、肝臓特異的Cyclin D1欠損マウスの解析を通し、Cyclin D1の肝糖新生調節における重要性を解明する予定である。Cyclin D1は、細胞周期調節のみならず、肝糖代謝に関連する転写因子であるPPARやC/EBPの転写活性を制御することが知れている。H21年度に、肝臓Cyclin D1の遺伝子発現および蛋白発現が、絶食に伴い減少し、食事摂取後に増加することを見出し、H4IIE培養肝細胞を用いた肝糖新生酵素プロモーター活性解析では、Cyclin D1の遺伝子導入により肝糖新生酵素遺伝子発現プロモーター活性が、減少することを明らかにしている。本年度には、Cyclin D1が細胞周期調節作用と関連するCDK4活性制御とは異なるメカニズムにより、肝糖新生酵素発現を制御する可能性を見出している。また、本年度は、H21年度に作成したCyclin D1の第2-3エクソンをLoxP配列で挟んだCyclin D1 floxマウスを肝臓特異的Cre組み換え酵素発現マウスと交配し、肝臓特異的Cyclin D1欠損マウス作成し、解析をおこなった。肝臓特異的Cyclin D1欠損マウスでは、メンデルの法則どおりに出生し、また肝臓組織像も正常であった。
ループス腎炎の病態発現におけるインターフェロン制御因子5の作用の解析

インターフェロン制御因子5(IRF5)は全身性エリテマトーデスの発症への関与が示唆されていた。我々はIRF5を欠損するループスマウスを作成しその病態を解析した。自己抗体では抗核抗体や抗dsDNA抗体等は著明に低下していた。ループス腎炎の程度も軽症であり、これらの結果生命予後は著明に改善した。脾樹状細胞ではTo l l-like receptorに対するサイトカイン産生が低下していた。以上よりIRF5はループス腎炎の発症に極めて大きな作用を有し、治療ターゲットとして有望であると考えられた。IRF-5欠損MRL/lprマウスを作製し、自己抗体、免疫細胞分画、腎病変、生存率などについて、コントロール(IRF-5+/+MRL/lprマウス)と比較検討した。1.生存率.生存率はコントロールに比べて著明に改善した(1年生存率:87.5% vs 0%)。さらに+/-マウスでも予後の改善が認められた。2.自己抗体.抗dsDNA抗体は、IgGの各サブクラスでは低下し、特にIgG3抗体は検出感度以下だった。しかしIgM抗体は変化なかった。さらにIgGクラスの抗RNP抗体や抗Sm抗体も-/-マウスでは検出できなかった。抗核抗体値も同様に著しく低下していた。3.免疫グロブリンレベル.IgG3のみ軽度低下していたが、他のIgGサブクラスやIgMについては有意な差はなかった。4.ループス腎炎.HE染色、PAM染色、PAS染色では糸球体病変、間質病変、血管炎ともに著明に改善していた。糸球体へのIgGや補体の沈着も減少しており、特に補体C3で顕著だった。糸球体内部へのCD4陽性T細胞やマクロファージの浸潤は減少しており、間質ではマクロファージの浸潤が減少していた。また、腎皮質でのサイトカインの発現をみると、TNF-αやIL-6、RANTESのmRNA発現レベルが低下していた。5.脾細胞分画.脾臓の重量はコントロールに比べて低かった。細胞分画ではCD4細胞の減少と、B細胞の増加が認められた。CD4陽性T細胞の分画では、活性化T細胞、メモリーT細胞の減少が認められた。またマクロファージと形質細胞性樹状細胞は増加していた。IRF-5欠損MRL/lprマウスを作成して、ループスの病態解析を行った。野生型のlittermate control MRL/lprマウスと比較した。昨年度は生存率や自己抗体、腎炎などについて検討したが、今年度はさらに脾細胞の機能などについて検討した。1.マウス樹状細胞のサイトカイン産生能に関する検討マウス脾細胞を単離し、ビーズ法にて樹状細胞(DC)を分離した。DCを各種Toll-likere ceptor (TLR)アゴニストで刺激しサイトカイン産生を検討した。IRF-5欠損lprマウスではTLR-7,TLR-9の刺激に対するTNFα、IL-6、IL-10などの産生が低下していた。またTLR-9刺激(CpG)によるインターフェロンα産生も低下していた。2.マウス腹腔マクロファージのサイトカイン産生に関する検討腹腔マクロファージを採取し、上記と同様にTLR-4,7,9のリガンドで刺激した。IRF-5欠損lprマウスマクロファージにおいて、TLR-7,TLR-9刺激によるTNFα産生は低下していたが、IL-6やMCP-1の産生では差を認めなかった。3.IRF-5の発現抑制法に関する検討IRF-5の発現抑制について検討した結果、核酸を抗原提示細胞特異的に導入するキャリア(SPG)を用いてIRF-5に対するsiRNAを投与することにより抑制効果が得られることがわかった。siRNAをアテロコラーゲンを用いてマウス個体に投与すると、脾臓でのIRF-5の発現が低下することも確認できた。4.IRF-5の発現抑制によるマクロファージ機能に関する検討野生型MRL/lprマウス腹腔マクロファージをTLR-9リガンドで刺激し、上清のサイトカインを測定する系において、IRF-5特異的siRNAを刺激1時間前に投与するとTNFαやIL-6の産生は著しく抑制された。昨年度までの研究でIRF5欠損MRL/lprマウスではループスの病変が著しく軽快することを明らかにし、その要因として樹状細胞のTLR7およびTLR9リガンドに対するサイトカインやインターフェロンの産生低下、さらには免疫複合体に対するTNFαやIL-6の産生低下があることを示した。以上よりIRF5の機能制御がループスの治療として有望であると考えられた。そのため、本年度はIRF5の発現抑制の手法について検討を行った。IRF5の遺伝子発現を抑制するsiRNA

配列をいくつかの候補より選択した。アテロコラーゲンをキャリアとして用い、siRNAをマウスにiv後に脾臓を摘出し、IRF5の発現量を検討した。またマウス腹腔マクロファージを1日培養後、TLR9リガンドであるCpGで刺激する系で、siRNAをCpG刺激の1時間前に添加して、翌日のサイトカイン産生に対する抑制効果を検討した。これらの実験により選択したsiRNAではCpGによるTNFやIL-6の産生を90%以上抑制し、in vivo投与では3日後をピークに脾におけるIRF5発現を約50%程度に抑制できることが明らかになった。次にSchizophyllan(SPG)を用いたsiRNAのin vivo投与法を検討した。SPGはβグルカンで3重らせん構造をとり核酸をその構造中に取り込む。SPGはdectin-1と結合するので、dectin-1を発現する抗原提示細胞にのみ核酸をデリバリーできる。IRF5に対するsiRNAとSPGの複合体を作成し、MRL/lprマウスに12週例から18週齢まで、週2回腹腔内へ投与してループス腎炎の評価を行った。現在解析中であるが、これまでの検討では腎炎の程度には明らかな改善は認めていない。今後さらに解析と追試を行い、IRF5を介したループス腎炎の治療について検討を行う予定である。当初の目的であるマウスループスにおけるIRF-5の重要性は証明できた。腎炎の発症に深く関与していることも明らかにできた。さらに細胞レベルの実験により、Toll-likere ceptorを介したシグナルが重要であることも明らかにできた。以上の結果は研究目的で挙げた点のかなりの部分を網羅しており、順調に研究が進行していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はIRF-5の発現抑制によりノックアウトマウスで見られたような所見が得られるかを検討する。すでに本年度の基礎実験でsiRNAを用いた系がうまく働くことが確認できた。次年度はIRF-5に対するsiRNAとコントロールのスクランブル配列のRNAを用いて、抗原提示細胞特異的キャリアによる導入方法について検討を行う。まずは細胞レベルで行い、次にマウス個体に投与して抑制効果を検討する。これらの実験が順調にいけば、その後MRL/lprマウスに投与して、治療効果が得られるかを検討する予定である。
超高率分子変換

重点領域研究「超高率分子変換」は、分子変換の方法論的原点にたち、一般性のある超高率的な新方法を創出することを目的とし、研究組織は総括班と5つの研究実施班よりなる。本研究はその総括班に関するものであり、各研究班を総括するとともに、機器分析手段の提供、各種化学情報の提供、ならびにシンポジウムを通しての各班および各班員間の情報交換の促進等により、各班員の研究の支援を目的とするものである。また総括班には研究評価グループを置き、本重点領域研究全体の進捗状況を把握し、適宜適切な助言を与える。上記目的を達成するため、本年度に行なった活動の概要は次の通りである。1.本年度は各班員からの多岐にわたる多量の研究支援要請に応えるため、初年度に導入した200MH_Z NMRとプロトンーカーボン専用FTーNMRのグレードアップを行うとともに、キャピラリー専用GC-MSを導入した。2.通算7回の公開シンポジウムを開いたが、本年度はそのうち第6回(6月)と第7回(1月)の計2回の公開シンポジウムを開催し、それぞれ11人、13人の班員による研究成果の発表を行なった。第7回シンポジウムでは、班員外の研究者による講演を企画し、本研究の活性化を図った。また、シンポジウムでは全体会議とともに班別会議を開き、各研究課題別に研究成果の綿密な検討を行なった。3.これと平行して、班員相互間で成果と問題点に関する情報の流通の促進をニュースレター(広報誌)の形で行なった。4.オンライン検索による各班員への化学情報の提供を行なった。以上、研究支援態勢の拡充、化学情報の提供および各班員間の情報交換の促進を通じて全体計画の推進を図った。本年度は、本研究の最終年度にあたるため、本研究を通じて得られた成果の取りまとめを行ない成果の公開と社会への還元に向けて準備を整えつつある。
精子幹細胞のエピゲノム安定性と発がんとの関係の解析

2004年に我々は培養精子幹細胞であるgermline stem (GS)細胞が培養中に自発的に脱分化し、embryonic stem (ES)細胞と同等な多能性幹細胞であるmultipoitentGS (mGS)細胞へと変化することを見出した。しかしながら、その効率は極めて低く、分子メカニズムについても不明であった。本研究で我々はGS細胞においてDNAの脱メチル化が起こるとmGS細胞へ変化することを見出した。DNAの脱メチル化は発がん遺伝子Dmrt1の発現低下を引き起こし、これがES細胞の維持に必要とされるSox2の発現上昇を誘導することでGS細胞が多能性を獲得することがわかった。Germline stem (GS)細胞は試験管で精原細胞として増殖するが、精巣の精細管内に移植すると精子形成を起こす。通常、GS細胞は精子にしか分化することができないが、試験管内において自発的にES細胞様の細胞であるmultipotent GS細胞へと変化することが知られていた。我々はがん抑制遺伝子であるp53とDNAのメチル化維持酵素であるDnmt1を同時に抑制するとGS細胞からmGS細胞を誘導することができることを見いだした。Dnmt1の抑制はグローバルなDNA脱メチル化を引き起こし、遺伝子導入された細胞はほぼ全例でmGS細胞へと変化した。p53とDnmt1遺伝子の抑制は体細胞でも発がんを誘導することから、我々はこの処置が生殖細胞の発がん遺伝子の発現異常を誘導しているのではないかと考えた。この仮説を試すために、ヒト生殖細胞関連遺伝子を候補としてその発現異常を誘導し、多能性細胞への変化を引き起こす遺伝子をスクリーニングしたところ、Dmrt1遺伝子を抑制した場合にGS細胞の脱分化を誘導できることが分かった。Dmrt1は性決定と減数分裂制御に関与する遺伝子として知られるが、GS細胞においてはSox2のmRNAの発現を抑制している。Sox2はES細胞の多能性維持に重要な遺伝子であることから、Dmrt1によりSox2が抑制されていることによりGS細胞の脱分化が制限されていることが予想された。そこでGS細胞においてp53の抑制とSox2の過剰発現を行ったところ、この方法によってもGS細胞からmGS細胞を誘導することができた。これらの結果は、GS細胞におけるエピゲノムの不安定性がDmrt1の発現異常を引き起こし、その結果Sox2の発現上昇が起こることがmGS細胞の発生の原因になっていることを示唆する。今年度までに予定された実験がマウスのギョウ虫汚染事故のために遅れていたが、研究を再開することができた。これにより遅れていたp53ノックアウトマウスからのGS細胞の樹立を試みた結果、新しいGS細胞の樹立に成功した。このp53欠損GS細胞を利用して、多能性に関与しうる小分子化合物のスクリニーングを開始した。現在の段階では候補を得られていないが、予定した化合物のスクリニーングについては当初の計画通りの部分にまで追いつくことができた。また、これと並行してp53欠損GS細胞に対してsiRNAを導入して多能性発現に関わるエピゲノム制御分子についてもスクリニーングを開始している。マウスの汚染事故は収束し、予定通りの実験を再開することができるようになった。これまでに我々はGS細胞でDmrt1とp53遺伝子を同時に抑制することで多能性細胞であるmultipotent GS細胞を樹立することができることを報告した。本年度においては、この手法が胎児期の生殖細胞および生後の精巣由来の生殖細胞においての役割について検討を行った。GS細胞と同じプロトコールで精巣細胞において遺伝子抑制を行ったところ、mGS細胞の出現は認めることができなかった。一方で胎児期のprimordial germ cell(PGC)に対してDmrt1とp53の遺伝子抑制を行った場合には、mGS細胞を得ることができた。この結果は胎児期の細胞の方がより多能性細胞へと変化しやすいことを示す。さらに、Dmrt1もしくはp53遺伝子のみについてPGCを用いて遺伝子抑制を行ったところ、Dmrt1を抑制した場合には細胞死が起こりmGS細胞を得ることができなかったが、p53のみの遺伝子抑制でもmGS細胞を得ることができた。したがって、PGCにおいてはp53遺伝子の方がDmrt1遺伝子よりも多能性遺伝子の発現制御により重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本年度はp53と並びがん抑制遺伝子として知られるRb遺伝子についてもGS細胞の多能性制御における役割についての解析を行った。p53遺伝子を欠損した場合と異なり、Rb遺伝子を破壊した場合にはGS細胞の精子幹細胞活性が顕著に低下し、その増殖も停止することが明らかとなった。p53遺伝子の抑制により若干の改善は見られるものの、レスキュー効果を得るまでには至らなかった。Rb欠損GS細胞を解析したところ、E2F1がその下流として働いており、DNAダメージが生じることが明らかとなった。このことから、Rb遺伝子はGS細胞の多能性制御にはRbは関与しおらず、ゲノム安定性において重要な役割を担うことがわかった。GS細胞の多能性制御因子の機能を胎児期にまでさかのぼることで生殖細胞の異なるステージにおいては多能性遺伝子の制御方法が異なることを明らかにすることができた。本年度においては発がんと体細胞のリプログラミングに重要とされているc-MycとN-Myc遺伝子の役割の解析を行った。c-MycとN-Mycの遺伝子を欠損したノックアウトマウスの作成を行ったところ、それぞれの片方の遺伝子を欠損した場合には特に異常は見られなかった。

しかし、c-MycとN-Mycの両方を同時に欠損させたマウスにおいては精子幹細胞の自己複製分裂が著しく低下することが明らかになった。自己複製分裂の低下は試験管内のみならず生体内においても継代移植で確認された。自己複製分裂の低下の原因を調べたところ、グルーコース代謝の異常が見つかり、c-Myc/N-mycを欠損した精子幹細胞は解糖系が低下していることが明らかとなった。培養精子幹細胞であるGermline stem (GS)細胞は従来DBA/2から樹立されてきたが、C57/BL6においてはその樹立は困難であった。そこでDBA/2とB6系統のマウスの生殖細胞における解糖系の活性を調べてみたところ、DBA/2の系統においてはより強く解糖系の活性化が見られることがわかった。この結果は解糖系の活性化レベルがGS細胞の樹立と関連があることを示していたために、PS48を用いてC57BL/6の精巣細胞を培養したところ、予想通りGS細胞の培養が可能となった。これらの成果はMycが精子幹細胞のがん化に関与するのみならず、生理的な状態では解糖系の促進に働くことで精子幹細胞の自己複製を制御していることを示唆する。Myc、Mycnのノックアウトマウスの解析はマウスに表現型がなかったために困難であった。しかしながら、二重に遺伝子をノックアウトすると明快な症状をしめしため、順調に成果をまとめることができた。本年度はPS48という解糖系を刺激する小分子化合物がgermline stem (GS)細胞から多能性細胞であるmultipotent germline stem (mGS)細胞へのリプログラミングに影響を与えるかの解析を行った。昨年度までにDmrt1とp53遺伝子を同時にノックダウンするとGS細胞からmGS細胞へと変化するという実験系を確立してあるので、この実験系でPS48を添加し、mGS細胞への転換効率を調べたが、特にPS48は大きな影響を与えることができなかった。解糖系の促進は自己複製を刺激することから、この実験に加えて我々はGS細胞の解糖系を促進する分子のスクリーニングを追加しておこなった。セレック、プレストウィック、シグマ、カルビオケムなどの小分子化合物ライブラリーの薬剤を用いて大規模スクリーニングを行った結果、MHY1485という分子がGS細胞の解糖系を刺激することを明らかにした。MHY1485はPS48と同様に通常のGS細胞の培養条件では増殖しないC57BL/6の精子幹細胞からGS細胞を樹立することに成功した。MHY1485を加えた培養ではGS細胞はPS48を加えて増殖を刺激した場合よりも活発に増殖刺激された。そこでPS48とMHY1485を同時に加えて解糖系の促進を相乗効果を調べたが、とくに改善されず、GS細胞の増殖に対しても大きな改善はみられなかった。PS48がPDPK1を刺激するのに対して、MHY1485はmTORを刺激する分子として知られており、この結果はmTORからの刺激によりPDPK1が活性化されて自己複製が亢進する可能性を示唆する。