hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病性腎症における系球体プロテオグリカン

糖尿病性腎症は組織学的には細胞外基質の増加による腎系球硬化をきたし、臨床的には次第に蛋白尿が増加しネフロ-ゼ症候群を呈し、腎不全へと進行する予後不良の疾患である。ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSーPG)は、細胞外基質の主要構成成分の一つであり、硫酸基の有する陰性荷電のために荷電の面より系球体の透過性を規制している。近年系球体基底膜(GBM)のHSーpGの減少が蛋白尿の原因とも考えられている。糖尿病性腎症の発症機序は不明であるが、近年HSーpGが腎症発症の鍵を握っているとも考えられ注目を浴びている。そこで本研究は、我々がすでに作成している抗HSーpG抗体等を用いて糖尿病性腎症における変化を検討した。蛍光抗体間接法では系球体係蹄におけるHSーpGの減少とメサンギウムにおけるIV型コラ-ゲンの増加が観察された。蛋白尿の多い症例や系球体硬化の進んだ症例ほどHSーpGの減少が著しかった。金コロイドによる免疫電顕ではGBM内・外透明層におけるHSーpGの密度は粗になり減少していた。IV型コラ-ゲンの密度は低下していたが、GBMの肥厚が強いために、総和としてはIV型コラ-ゲンは増加していた。系球体においてはGBMの内・外透明層に分布するHSーpGがcharge barrierとして、また全層に分布するIV型コラ-ゲンが網目を形成してsize barrierとして透過性を制御している。今回の我々の研究により、糖尿病性腎症においては,プロテオグリカンの減少によるcharge barrierの障害とIV型コラ-ゲンの密度低下によるsize barrierの障害をきたし蛋白尿を生じることが明らかにされた。プロテオグリカンの減少とIV型コラ-ゲンの増加は系球体硬化に密接に関連していると考えられた。糖尿病性腎症の発症機序並びに腎系球体硬化症の進展機序を解明する為に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HS-PG)をはじめとする腎系球体細胞外基質構成成分の変化を検討した。ヒト糖尿病性腎症患者の腎生検組織を用い、蛍光抗体間接法にてHS-PG、ラミニンIV型コラ-ゲン、フィブロネクチンに対する抗体を用い染色した。HS-PGに対する抗体は、既報の如くラット腎糸球体基底膜よりHS-PGを分離して、ウサギに免疫して作成した。他の抗体は市販のものを用いた。HS-PGとラミニンの非コラ-ゲン成分の減少が腎糸球基底膜で観察された、IV型コラ-ゲンとフイブロネクチンの増加がメサンギウムで観察された。HS-PGの減少は糖尿病性腎症における糸球体の透過性の亢進関与していると考えられ、IV型コラ-ゲンの増加は糸球体硬化症の進展に関与していると考えられた。HS-PGの腎糸球体における局在と合成細胞の検討に関しては、蛍光抗体法において腎糸球体基底膜に存在することを説明したが、さらにロイクリルK4M包埋と金コロイドによる免疫電顕にてHS-PGは主に基底膜の内外透明層に規則的に存在し、上皮細胞にも一部存在することを観察でき、HS-PGの局在と合成細胞を明らかにできた。糖尿病性腎症は組織学的には、腎糸球体基底膜の肥厚とメサンギウム基質の増多を呈する。これらの変化を立体的に捉える為にまず手初めに正常ラット腎組織を界面活性剤と酵素により細胞成分を除去し、走査電子顕微鏡で観察した。この手法によりメサンギウム基質は連続的な有窓性の隔壁より成り立っているのが明らかにされた。今後糖尿病性腎症において細胞外基質の変化を立体的に明らかにしたい。

糖尿病性腎症の発症,並びに糖尿病性腎糸球体硬化症の進展機序を解明する為に、ラソトにストレプトゾトシンを投与し、糖尿病性腎症を作成し、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HsーPG)をはじめとする腎糸球体細胞外基質構成成分の変化と、腎糸球体細胞外基質の立体構築の変化を経時的に検討した。糖尿病性腎糸球体硬化症においてはメサンギウム基質の増多と腎糸球体基底膜の肥厚が観察された。界面活性剤と酵素により細胞成分が除去され、メサンギウム基質が末梢係へ延び糸球体基底膜の二重化として観察され、基底膜肥厚の原因となっていると思われた。走査電子顕微鏡により観察すると、メサンギウム基質はネット状の有窓壁として観察され、糖尿病性腎症においては、メサンギウム基質は拡大し、増多のために窓孔は縮少しており、糸球体硬化の過程が立体的に明らかにされた。蛍光抗体間接法にてHsーPGは変化を認めず、6カ月以降でIV型コラ-ゲンとフィブロネフリンの軽度の増加、11カ月後にはラミニンの低下が観察された。ラット腎組織をLowcryl K4Mに包埋し低温にて重合させ、post embeding法により、抗体,全コロイドにて染色し免疫電顕を行った。3カ月のラットではHSーPGは基底膜の内外透明層に観察されたが、量的には著変を認めなかった。IV型コラ-ゲンは主に緻密層に観察されたが、増加を認めた。6カ月、11カ月ラットに関しては現在検討中である。ラット糖尿病腎糸球体硬化症においても細胞外基質の増多により糸球体硬化が進展し構成成分の不均衡化が重要な役割を果していると考えられた。糖尿病性腎症は病理学的には糸球体硬化をきたし、臨床的には蛋白尿を生じネフロ-ゼ症候群を呈し腎不全へと進行する。糖尿病性腎症における蛋白尿と糸球体硬化の機序を明らかにする為に、ヒト糖尿病性腎症患者の腎生検材料を用いて金コロイドによる免疫電顕を行いヘパラン硫酸プロテオグリカンとIV型コラ-ゲンの局在の変化を検討した。また腎組織にdetergent処理を行い、細胞外基質を分離し、高分解能走査電顕で腎糸球体基底膜(GBM)の超微構造の変化を観察した。正常コントロ-ルではプロテオグリカンはGBMの内・外透明層に規則正しく分布していた。糖尿病性腎症例ではGBMは肥厚しており、GBMの内・外透明層におけるプロテオグリカンは減少しておりその密度は粗になっていた。IV型コラ-ゲンはコントロ-ルではGBMの全層に分布していた。糖尿病腎症ではIV型コラ-ゲンの密度はコントロ-ルより低下していたがGBMの肥厚が強いために、全体としてはIV型コラ-ゲンは増加していた。走査電子顕微鏡により観察すると、メサンギウム基質はネット状の有密壁として観察される。糖尿病性腎症においては、メサンギウム基質は拡大しGBMの内皮側へ延び、一部GBMの二重化として観察された。高分解能走査電顕では、コントロ-ルではGBMの網目構造は不明瞭であったが、糖尿病においてはGBMが粗になっており、網目構造が立体的に観察された。糸球体ではGBMの内・外透明層に分布するプロテオグリカンが陰性荷電を有しておりChargebarrierとして、また全層に分布するIV型コラ-ゲンが網目を形成してsize barrierとして透過性を制御している。
細胞増殖制御系におけるシグナル伝達機構

細胞増殖因子カスケードの上流から下流にいたる各段階の解析が,各段階において鍵となる蛋白質因子の同定,その遺伝子構造,発現制御機構の解明を中心として進展した.具体的には以下に述べるような研究成果を得た.1,ヒトインスリン受容体遺伝子のプロモーター領域の構造と決定した.2, Cキナーゼ(PKC)の遺伝子構造の解析から, PKCには3種類の遺伝子に由来する4種類の分子種が存在することを明らかにした.3,ウシ血小板上清画分にチロシンキナーゼ(M.W.71K)を見い出し精製した. 4,中間径フィラメントのAキナーゼによるリン酸化はその脱重合をひきおこすが, PKCによるリン酸化ではこのような変化が認められなかった. 5,細胞増殖制御は複数のG蛋白質によって媒介されていて, PDGFによる初期の応答およびボンベシンによる遅い応答が百日咳毒素(IAP)によって抑制されることが示された. 6,ヒトG蛋白質のサブユニットの染色体遺伝子の構造解析から,哺乳動物には少くとも3種類のGiの遺伝子が存在することを明らかにした.さらにGsαの遺伝子の全構造も決定された.一方酵母菌においてもG蛋白質相同遺伝子(GPA1およびGPA2)が単離された. 7, rasに対するモノクローナル抗体Yー259はP21の結合又クレオチドの解離反応を特異的に阻害することを明らかにした. 8,エールリッヒ腹水ガン細胞をインターフェロン処理すると細胞融合をおこし多核細胞を生ずることを見いだした. 9,固型腫瘍の形成に必要な血管形成における内皮細胞の増殖にはbasicFGFが自己促進的に働く可能性が示唆された. 10,酵母におけるアデニル酸シクラーゼの構造遺伝子(CyR1)産物のC末端側に触媒反応を行なう機能領域があり,そのすぐN末端側にRAS遺伝子産物と相互作用する機能領域が存在することが明らかとなった.11,分裂酵母よりras類似遺伝子であるYPT遺伝子ファミリーに属するyho遺伝子を単離した.細胞増殖因子カスケードの上流から下流にいたる各段階の解析が,各段階において鍵となる蛋白質因子の同定,その遺伝子構造,発現制御機構の解明を中心として進展した.具体的には以下に述べるような研究成果を得た.1,ヒトインスリン受容体遺伝子のプロモーター領域の構造と決定した.2, Cキナーゼ(PKC)の遺伝子構造の解析から, PKCには3種類の遺伝子に由来する4種類の分子種が存在することを明らかにした.3,ウシ血小板上清画分にチロシンキナーゼ(M.W.71K)を見い出し精製した. 4,中間径フィラメントのAキナーゼによるリン酸化はその脱重合をひきおこすが, PKCによるリン酸化ではこのような変化が認められなかった. 5,細胞増殖制御は複数のG蛋白質によって媒介されていて, PDGFによる初期の応答およびボンベシンによる遅い応答が百日咳毒素(IAP)によって抑制されることが示された. 6,ヒトG蛋白質のサブユニットの染色体遺伝子の構造解析から,哺乳動物には少くとも3種類のGiの遺伝子が存在することを明らかにした.さらにGsαの遺伝子の全構造も決定された.一方酵母菌においてもG蛋白質相同遺伝子(GPA1およびGPA2)が単離された. 7, rasに対するモノクローナル抗体Yー259はP21の結合又クレオチドの解離反応を特異的に阻害することを明らかにした. 8,エールリッヒ腹水ガン細胞をインターフェロン処理すると細胞融合をおこし多核細胞を生ずることを見いだした. 9,固型腫瘍の形成に必要な血管形成における内皮細胞の増殖にはbasicFGFが自己促進的に働く可能性が示唆された. 10,酵母におけるアデニル酸シクラーゼの構造遺伝子(CyR1)産物のC末端側に触媒反応を行なう機能領域があり,そのすぐN末端側にRAS遺伝子産物と相互作用する機能領域が存在することが明らかとなった.11,分裂酵母よりras類似遺伝子であるYPT遺伝子ファミリーに属するyho遺伝子を単離した.
mTORシグナルによる胎盤栄養輸送とエピジェネティック制御機構の解明

抗てんかん薬であるバルプロ酸曝露後のmTOR活性化変動について、mTOR活性化マーカーであるS6タンパク質のリン酸化レベルにて検討した。また、栄養素トランスポーターの発現変動を同時に解析し、バルプロ酸とmTORの活性化およびmTORの活性化と栄養素トランスポーターの発現変動との関連性について評価した。ロイシンなどの必須アミノ酸の取り込みに寄与しているLAT1(SLC7A5)の正常組織での発現は、胎盤、脳、骨髄ならびに精巣などに限られている。これまでの検討結果から、妊娠初期の胎盤にはSNAT3の発現のみが認められているが、LAT1およびLAT1と協調的に作用するは、グルタミンを細胞内に維持するNa+依存性トランスポーターであるASCT2(SLC1A5)は妊娠中期から後期に発現しているので、妊娠期全般を通じて、栄養感知システムとして機能するmTORーAMPKとの関連を評価した。カルバペネム系抗生物質およびセフェム系抗生物質を曝露することで、mTORシグナルおよび栄養素トランスポーターへの影響を確認した。一方、栄養素トランスポーターの発現は性ホルモン分泌に対しても大きな影響を与えることから、forskolin, PKCなどによって胎盤の細胞を分化・誘導させた際のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)産生とアロマターゼ活性についても検討した。さらに、BeWo, JEG-3細胞などの胎盤モデルの他、妊娠ラットおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット胎盤を用いて、DNAメチル化、ヒストン脱アセチル化解析をバイサルファイト反応キットおよびBisul Taq DNA Polymeraseを用いて検討した。当初、本学のアイソトープセンターにて、3Hーグルタミンを用いた取り込み実験を予定していた。しかしながら、アイソトープセンターでの研究が不可能となってしまったため、研究計画を変更することになったため。本補助事業期間を延長することとし、mTOR活性化と各種栄養素トランスポーター発現との直接な関連を評価するために、リン酸化S6タンパク質と各種栄養素トランスポーターを同時に蛍光標識し、両者の局在について比較・検討することを目標とする。胎盤の栄養素を輸送するトランスポーターの発現は、妊娠の進行に伴って制御されており、栄養感知システムの存在およびエピジェネティック制御機構に着目して本研究を遂行した。mTORシグナルの下流に位置するp70 S6 kinase(Thr389)のリン酸化は、Western blottingによって評価した。また、mTOR阻害剤(ラパマイシン、エベロリムス等)処理時におけるリン酸化を確認した。ヒト胎盤絨毛癌由来BeWo細胞を用いて、コントロールとしてDMSO 0.1%添加、mTOR阻害剤処理群として、ラパマイシン(100 nM)、エベロリムス(100 nM)を含むメディウム(FBS15%含有)で1時間処理し、RIPA buffer(PMSF添加)によりcell lysateを作成した。Total p70 S6kinaseおよびphospho-p70 S6 kinaseは、分子量60kDa前後に2本のバンドが検出された。今回実験に用いた抗体は、p70 S6Kinaseとともにp85 S6 kinaseを認識することから、60kDaマーカーの上に検出されるバンドがp85、下のバンドがp70であると考えられた。しかしながら、用いた抗体のデーターシートでは、p70が70kDa、p85が85kDaとなっており、検出位置に若干のずれが認められた。そこで、電気泳動の条件設定を再確認し、詳細に検討を加えた。ラパマイシン(100 nM)およびエベロリムス(100 nM)を1時間処理することによって、phospho-p70 S6 kinaseと考えられるバンドは、ほとんど消失した。このことから、各薬液の処理濃度としては、100 nMで十分であると考えられたが、さらに最適化を目指して、薬液処理の濃度および時間等の条件を検討した。また、Total S6 kinaseの発現量は、両薬物によって違いが認められたことから、詳細な密度解析を行った。近年、教育のエフォートは研究のエフォートよりも大きくなってきており、連携および共同研究者の人的な不足は否めない。しかしながら、これまでの研究経験を十分に活用し、時間を効率良く使用することで、本研究全体は緩除であるが、想定内の進捗状況と自己評価している。胎盤を通じて栄養素を胎児へ輸送するシステムとして、胎盤トランスポーターが知られている。これらのトランスポーターは、アミノ酸、グルコース、葉酸などの栄養素の妊娠期による需要の変化に応じて高度に発現制御を受けている。これらの機構により、胎児の栄養環境が決定されているが、環境に応じたトランスポーターの発現制御には、栄養感知システムが関与していることを明らかにした。特に妊娠初期に特異的な発現を確認したグルタミントランスポーターSNAT3(Slc38a3)等との関連を妊娠期毎に網羅的に解析・評価した。妊娠初期のモデル細胞であるヒト胎盤絨毛癌由来BeWo細胞に、ほ乳類発現プラスミドベクターを用いてmTORを高発現させ、各栄養素トランスポーターの発現変動を確認した。また、SNAT3の基質であるグルタミンなどの細胞内取り込みを評価した結果、SNAT3の発現量とグルタミンの取り込み量が顕著に増加し、妊娠初期の胎盤においてmTORによるトランスポーターの発現調節機構が存在する可能性が示唆された。mTORシグナルの下流に位置するp70 S6 kinase(Thr389)のリン酸化の評価は、ラパマイシンおよびエベロリムスを含むメディウムで処理したが、さらに最適化を目指して、薬液処理の濃度および時間等の条件を検討した。

今後、速度論的解析(Km, Vmax)にて輸送能を算出することで、グルタミントランスポーターSNAT3などの栄養素トランスポーターを機能面からも解析することとする。また、各種化合物処置後のmTOR活性化変動の結果とトランスポーターを介した輸送能の関連性を評価し、mTORの活性化と輸送能の変動が一致した栄養素トランスポーターを特定する。私立大学では、薬学教育6年制の改訂コア・カリキュラムの進行に伴い、教育に関するエフォートが大幅に増加している。これまでの豊富な研究経験を十分に活用し、時間および研究費を効率的に使用している。本研究全体は緩除であるが、想定内の進捗状況と自己評価している。抗てんかん薬であるバルプロ酸曝露後のmTOR活性化変動について、mTOR活性化マーカーであるS6タンパク質のリン酸化レベルにて検討した。また、栄養素トランスポーターの発現変動を同時に解析し、バルプロ酸とmTORの活性化およびmTORの活性化と栄養素トランスポーターの発現変動との関連性について評価した。ロイシンなどの必須アミノ酸の取り込みに寄与しているLAT1(SLC7A5)の正常組織での発現は、胎盤、脳、骨髄ならびに精巣などに限られている。これまでの検討結果から、妊娠初期の胎盤にはSNAT3の発現のみが認められているが、LAT1およびLAT1と協調的に作用するは、グルタミンを細胞内に維持するNa+依存性トランスポーターであるASCT2(SLC1A5)は妊娠中期から後期に発現しているので、妊娠期全般を通じて、栄養感知システムとして機能するmTORーAMPKとの関連を評価した。カルバペネム系抗生物質およびセフェム系抗生物質を曝露することで、mTORシグナルおよび栄養素トランスポーターへの影響を確認した。一方、栄養素トランスポーターの発現は性ホルモン分泌に対しても大きな影響を与えることから、forskolin, PKCなどによって胎盤の細胞を分化・誘導させた際のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)産生とアロマターゼ活性についても検討した。さらに、BeWo, JEG-3細胞などの胎盤モデルの他、妊娠ラットおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット胎盤を用いて、DNAメチル化、ヒストン脱アセチル化解析をバイサルファイト反応キットおよびBisul Taq DNA Polymeraseを用いて検討した。当初、本学のアイソトープセンターにて、3Hーグルタミンを用いた取り込み実験を予定していた。しかしながら、アイソトープセンターでの研究が不可能となってしまったため、研究計画を変更することになったため。ヒト胎盤絨毛癌由来BeWo細胞を用いて、各濃度のmTOR阻害剤を曝露処理する。p70 S6 kinaseのリン酸化を確認した上で、グルタミンの細胞内取り込みに関する速度論的な解析を行い、SNAT3を中心としたアミノ酸トランスポータの発現に及ぼす影響を検討する。最終年度であるので、母体と胎児間の栄養輸送におけるmTORシグナルを中心にエピジェネティック制御機構について明らかにすることを目標とする。
細菌鉄結合蛋白X線結晶構造解析から新規抗菌薬の創製に向けて

本研究は、歯周病細菌の増殖と病原性発現に不可欠な細菌鉄結合蛋白の分子生物学的研究を発展させ、エジンバラ大学Campopiano博士とシェフィールド大学Artymiuk博士にX線結晶解析の協力を得て、その立体構造解析を行なった。さらに新規抗菌薬を探求し、創薬の基礎とすることを目的に行ない、以下の研究成果を得た。細菌鉄結合蛋白の結晶化とX線結晶解析については歯周病細菌Actinobacillusactinomycetemcomitans(Aa)のDNA binding protein starved cells(Dps)蛋白(ABO80734)とフェリチン(ferritin : Ftn)蛋白(DDBJ AB004902)について実施した。AaはFtn1とFtn2という2つの鉄結合蛋白を菌体内で発現していた。Ftn1は結晶蛋白が得られたが、Ftn2はアモルファス状にしかならなかった。Dps蛋白(1027mg/ml)は、結晶スクリーニング溶液中で温度17度でハンギングドロップ蒸気拡散法によって良質の六角柱結晶(数mm)を生成できた。得られたAaDps結晶についてX線解析を行い、分子置換はListeria innocuaの十二量体フェリチン様蛋白を参照に鉄結合活性中心部位およびC末端の特徴的なジスルフィド部位を決定できた。新規抗菌薬として生体抗菌物質として注目されるデフェンシンを取り上げ、ヒト細胞からの発現制御様態および抗菌活性について検討した。また、天然植物では尿路感染症の民間療法として用いられているクランベリーを取り上げ、飲用後の尿中代謝物から大腸菌性バイオフィルムの形成を阻害する活性化合物として、ferulic acid、homovanillic acid、4-coumaric acid、isoferulic acid、vanillic acidを特定した。これらの低分子化合物は、複合的に作用して細菌バイオフィルム形成を抑制している可能性があった。2)S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureusについては、Yamamoto YらがStreptococcus mutansの鉄結合蛋白として報告したDpr分子(J Bacteriol.2002;184(11):2931-9)のアミノ酸配列と相同性のある遺伝子をゲノムデータベースより検索した。それぞれの遺伝子断片をPCRで増幅し、クローニングベクターに組み込み陽性クローンを選択した。さらに現在発現ベクターへの組換えを行なっている。3)それぞれの病原細菌のリコンビナント細菌鉄結合蛋白が大腸菌で十分に発現できたものから、結晶化に向けての精製を進めている。設備備品として蛋白質精製装置アマシャムファルマシアバイオテク・AKTAprimePCを購入し、リコンビナント蛋白の迅速で効率の良い精製系を構築中である。病原細菌の増殖と病原性発現に不可欠な鉄獲得系に関わる鉄結合蛋白の分子生物学的研究を基にその立体構造と機能解析を行ない、それに基づいて新規抗菌薬の創薬を目指す。各種細菌鉄結合蛋白のリコンビナント蛋白発現系を構築し、そこからリコンビナント蛋白を精製し、その結晶化を試みた。まず、グラム陰性歯周病細菌Actinobacillusactinomycetemcomitansのフェリチン遺伝子(DDBJ AB004902)およびDps遺伝子(AB080734)を基にリコンビナント蛋白大量発現系を確立し、結晶化に充分なリコンビナント蛋白を精製した。また、他のグラム陽性病原細菌である黄色ブドウ球菌や肺炎双球菌のゲノム情報から鉄獲得や鉄結合に関わる蛋白の遺伝子データを検索し、併せてそれらのリコンビナント蛋白発現系を確立した。溶血レンサ球菌およびライム病スピロヘータの鉄結合蛋白は大腸菌での発現が認められなかった。毒性蛋白の可能性もあるが、大腸菌で発現しやすいようにリーダーペプチドやアミノ酸コードを改変して発現系を再構築している。

さらにそれぞれの精製鉄結合蛋白標品について結晶化の条件を変えてスクリーニングを進めている。X線結晶解析に十分な蛋白結晶が得られたフェリチンとDps標品については現在、共同研究を行っているエジンバラ大学Campopiano博士、シェフィールド大学Artymiuk博士の協力も仰ぎその蛋白質立体構造解析を進めている。本研究は、これまで申請者らが行ってきた歯周病細菌の増殖と病原性発現に不可欠な鉄獲得系に関わる鉄結合蛋白の分子生物学的研究を基にその立体構造と機能解析を行ない、それに基づいて新規抗菌薬の創薬や探求することを目的に行なっている。今年度は以下の研究実績であった。1.グラム陰性歯周病細菌Actinobacillusactinomycetemcomitansのフェリチン遺伝子(DDBJAB004902)はフェリチン1とフェリチン2という2つの鉄結合蛋白を菌体内で発現していた。それぞれのフェリンチン1およびフェリチン2さらにはフェリチン1+2のリコンビナント蛋白をそれぞれ精製し、蛋白結晶化を試みた。フェリチン1はX線結晶解析に十分な結晶が得られたが、現在フェリチン2はアモルファス状にしかならなかった。フェリチン1と2の混合物でもフェリチン1のみしか結晶化せず、フェリチン2の構造と役割に興味が持たれた。近縁の病原細菌Haemophilus influenzaeにも同様の構造のフェリチン遺伝子を有することを見出した。2.黄色ブドウ球菌や肺炎双球菌のゲノム情報から鉄結合や菌体内酸化防止に関わるDps蛋白の遺伝子データを検索し、それぞれのHis-Tagリコンビナント蛋白を精製し、結晶化を試みた。3.ライム病スピロヘータの鉄結合蛋白Dps様蛋白は大腸菌での大量発現が困難であり、生体内抗菌物質ディフェンシンに似てC末端にシステイン残基に富んでいた。この部分の合成ペプチドを各種作成し、抗菌活性を検討している。4.X線結晶解析に十分なリコンビナント蛋白さらには蛋白結晶が得られた標品についてはX線結晶解析を進めている。現在、共同研究を行っているエジンバラ大学Campopiano博士、シェフィールド大学Artymiuk博士の協力を仰ぎその蛋白質立体構造解析を引き続き継続している。本研究は、歯周病細菌の増殖と病原性発現に不可欠な鉄獲得系に関わる鉄結合蛋白の分子生物学的研究を基にその立体構造と機能解析を行ない、さらに新規抗菌薬の創薬や探求することを目的に行なった。細菌鉄結合蛋白の結晶化とX線結晶解析についてはグラム陰性歯周病細菌、Actinobacillus actinomycetemcomitans(Dps)のDbs蛋白(ABO80734)について基礎データを得ることができた。
多剤耐性グラム陰性菌に対する最適抗菌薬併用療法の探索に関する基盤研究

B・C・Plateの作製は、基本的に日本化学療法学会標準法に準じて行った。液体培地としてはミューラーヒントン培地を基本に、2価イオンを添加したものを使用した。それぞれの抗菌薬を溶解剤で溶かした後、設定した濃度となるように上記液体培地で希釈した。B・C・Plateの有用性に関して、第一段階として保存株を用いた検討を実施した。保存株としては、全国サーベイランスで得られた株および当教室に保存されている株を用いた。現在、MDRPとして100株を超える株が保存されており、これらを用いた検討・解析を実施した。(1)(2)で得られた結果と、それぞれの耐性菌の薬剤耐性機序との関連を総合的に解析した。なお、本プレートは2007年9月に栄研化学より"BC・プレート(多剤耐性緑膿菌)"として販売されるようになった。B・C-Plateの作製は、基本的に日本化学療法学会標準法に準じて行った。それぞれの抗菌薬を溶解剤で溶かした後、設定した濃度となるように上記液体培地で希釈したのち、それぞれ50μ1(Total 100μl)を96穴マイクロプレートに添加し、抗菌薬の組み合わせを調整した。B・C-Plateの有用性に関して、第一段階として保存株を用いた検討を実施した。現在、MDRPとして100株を超える株が保存を保存しており、本年度はこれらを用いた検討を実施した。その結果、ある種の抗菌薬の組み合わせ(AZT+AMK, colistin+RFPなど)がMDRPに対して相乗効果が強いことが明らかになった。共同研究を実施している施設において、これら抗菌薬療法の臨床的有効性についても検討されており、現在その結果を解析中である。本年9月に栄研化学よりB・C-Plate (MDRP用)が発売される予定である。今後は、広く医療機関で使用していただき、その有用性が明らかになると思われる。また、選択抗菌薬、およびその設定濃度の問題についても広くご意見をいただきながら改善していく予定である。
初期インド密教文献を通じた最初期のアビシェーカ(灌頂)儀礼に関する研究

本研究は、インド密教の入門儀礼として知られるアビシェーカ(灌頂)儀礼の最初期の形態と機能について、文献学的手法により明らかにすることを課題とする。その研究計画の概要は、以下の二点にまとめられる。1インド密教最初期のアビシェーカを説く初期密教文献を扱い、当該箇所の校訂テキスト、訳註、グロッサリーを作成して、その内容を精査する。21の成果にもとづいて、インド密教最初期のアビシェーカの形態と機能を明らかにし、アビシェーカがインド密教の入門儀礼として確立されていく過程を描き出す。
新規アイソザイムP450MUT-2(MALDO)の役割とその反応機構解明

新規アイソザイムP450MUT-2(MALDO)の役割とその反応機構解明に関する研究について、以下の点を明らかにした。1) P450MUT-2(CYP2C29)の発現調節:ddN系雄マウスの11-Oxo-Δ^8-tetrahydrocannabinolを基質とした時のMALDO活性は、用いた各種誘導剤中フェノバルビタール処理で対照群の約2倍と有意に誘導されたが、3-メチルコラントレン、デキサメタゾンあるいはアセトン処理では有意な活性の上昇は認められなかった。P450MUT-2(CYP2C29)のタンパク質及びそのmRNA含量は、フェノバルビタール処理においてのみ対照群の約2培増加し、MALDO活性と良い相関が認められた。また、雄雌マウス肝のMALDO活性は、4週齢まで加齢とともに上昇、ミクロソーム中のP450MUT-2(CYP2C29)含量と良い相関を示した。現在、mRNAを分離、その変動について検討中である。2) MALDOの種差:雌ニホンザル肝ミクロソームより、9-アントラアルデヒドのMALDO活性の主要な分子種として、N末端アミノ酸配列から2Bサブファミリーに属することが推定されるP450JM-Cを精製した。3) CYP2C29と高い相同性を有するcDNAのクローニング:CYP2C29をプローブとして、129/J系雄マウス肝のcDNAライブラリーから、全長1718bpのcDNAをクローニングした。その推定されるアミノ酸配列から、N末端側から2残基に相当する6bpを欠いたものであった。このcDNAのCYP2C29との比較では、7塩基の置換が認められ(相同性99.5%)そのうちアミノ酸の置換は1残基(106Ile→104Met)のみであった。CYP2C29は、C57BL/6Jマウス肝のcDNAライブラリーよりクローニングされたことから、今回得られたクローンは系統の違いによるP450MUT-2のalleic variant(CYP2C29v)と推定された。4) cDNAの発現:P450MUT-2(CYP2C29)cDNAの発現ベクター(pCMV4)組換え体を作製、その方向を制限酵素処理により確認した。現在も本研究は進行中であり、今後COS細胞に導入、その培養細胞を用いてMALDOの性質並びにその反応機構について検討する。
現生および化石単体方射サンゴ類骨格の形成機構に関する基礎的研究

大射サンゴ骨格の種内変異を鹿児島県喜界島の第四系湾層産のムシバサンゴ(Caryophytlia(Premocyathus)compressa Yabe and Egwchi)について, 1090個体を採集して検討した.その結果種属の分類形質の識別基準に関して,旧来の考えと大きく異なる以下の知見を得た.1.ムシバサンゴのサンゴ体の大きさは個体ごとに異なっている.その莢のサイズは隔壁数に比例して大きくなる.これに対してサンゴ体の高さは,莢のサイズよりも大きい変異を示している.このことはサンゴ体の莢のサイズは遺伝的に制御され,高さは遺伝的要因と共に環境的要因によっても支配されていることを表わしている.2.隔壁の配列は,本種において従来考えられていた10の倍数を基本とする個体のみならず6から14までの数を基本とする個体も含まれる. 2の2とは,隔壁配列様式を単純に種や属の区別に使えないことを示している.3.個体群の隔壁配列パターンには99の理論的変異が予想され,このうち57の変異分野外で観察された.もし採集個体数をもっと増やせば99の変異すべてを満たす値に近づくことが予想される.4.第三次隔壁の数は個体ごとに多くの変異を示している.これまでは第三次隔壁が完全にそろったもののみが成体と考えられてきたが,連続薄片で検討の結果,第三次隔壁の挿入は遺伝的に決定されていることが明らかとなった.5.第三次隔壁の挿入位置もランダムではなく遺伝的な要因に支配されている.つまり10の倍数を基本とする個体群では, IからVまでの部位で隔壁発達頻度に一定の傾向があり,中心部のIの部位で最も欠けやすい.6.パクの発達は第三次隔壁の挿入位置と密接に関連しており,パリが全く欠如する個体も存在する.したがってパリの有無は必ずしも単純に属種の識別に用いることはできない.7.放射サンゴ類は一般に放射相称,左右相称性をもつことが特徴とされているが,本種の個体群中には相称性をもたない多くの個体が存在する.大射サンゴ骨格の種内変異を鹿児島県喜界島の第四系湾層産のムシバサンゴ(Caryophytlia(Premocyathus)compressa Yabe and Egwchi)について, 1090個体を採集して検討した.その結果種属の分類形質の識別基準に関して,旧来の考えと大きく異なる以下の知見を得た.1.ムシバサンゴのサンゴ体の大きさは個体ごとに異なっている.その莢のサイズは隔壁数に比例して大きくなる.これに対してサンゴ体の高さは,莢のサイズよりも大きい変異を示している.このことはサンゴ体の莢のサイズは遺伝的に制御され,高さは遺伝的要因と共に環境的要因によっても支配されていることを表わしている.2.隔壁の配列は,本種において従来考えられていた10の倍数を基本とする個体のみならず6から14までの数を基本とする個体も含まれる. 2の2とは,隔壁配列様式を単純に種や属の区別に使えないことを示している.3.個体群の隔壁配列パターンには99の理論的変異が予想され,このうち57の変異分野外で観察された.もし採集個体数をもっと増やせば99の変異すべてを満たす値に近づくことが予想される.4.第三次隔壁の数は個体ごとに多くの変異を示している.これまでは第三次隔壁が完全にそろったもののみが成体と考えられてきたが,連続薄片で検討の結果,第三次隔壁の挿入は遺伝的に決定されていることが明らかとなった.5.第三次隔壁の挿入位置もランダムではなく遺伝的な要因に支配されている.つまり10の倍数を基本とする個体群では, IからVまでの部位で隔壁発達頻度に一定の傾向があり,中心部のIの部位で最も欠けやすい.6.パクの発達は第三次隔壁の挿入位置と密接に関連しており,パリが全く欠如する個体も存在する.したがってパリの有無は必ずしも単純に属種の識別に用いることはできない.7.放射サンゴ類は一般に放射相称,左右相称性をもつことが特徴とされているが,本種の個体群中には相称性をもたない多くの個体が存在する.本研究課題においては、1.サンゴの成長論、特に日輪についての研究、と2.サンゴの骨格の種内変異について、の二点に焦点をあてて研究を行っている。1については、単体サンゴと群体サンゴの成長輪の比較のために、まず鹿児島県喜界島の第四系湾層産の群体サンゴ化石,Trachyphyllia geoffroyiについて研究し、次の結果を得た。(1)細かい成長輪を電子顕微鏡写真で測定の結果、一つ一つの成長輪の幅に周期性が認められ、一つの周期内に330340の成長輪が数えられた。(2)この一つの周期は一年とみなされ、細かい成長輪は日輪と考えられる。(3)従来、地球の自転速度の変化にともなう、地質時代の一年の日数の変化が注目されてきたが、日輪幅の周期性は不明であった。この周期は一年の夏と冬の水温差を反映しているものと考えられ、今後の化石および現生単体サンゴの成長輪の研究の基礎的データとなっている。

つまり、共性藻類をもたない深海の単体サンゴの成長輪の形成パターンもあわせて研究することにより、地質時代における化石単体サンゴの成長輪の形成要因を明らかにできると考えられる。2の研究では、特にサンゴの分類形質として重要視されている外形の変異,隔壁とパリの形成様式の種内変異を調べた。これまでに判明した知見は以下の通りである。(1)同一種において、莢の大きさは隔壁数に比例して大きくなる。(2)莢の高さは遺伝学的要因の他に環境によっても変化するが、基本的には隔壁数の多いものほど高くなる。(3)隔壁が6の倍数を基体としても、基本数の異なる個体が同一種内にも存在することがある。(4)隔壁のサイクルが"不完全"であっても成体とみなされるものが多い。(5)隔壁数およびパリ数は遺伝的要因によって支配されている。サンゴ個体が一定の大きさになると、その数は一定となり、個体成長の過程での隔壁の位置は変化しない。(6)パリの有無は必らずしも属種の区別には使えない。
虚血再灌流障害に対するGLP-1受容体の役割と心筋保護戦略

麻酔したブタ生体を用いて、気管切開を行い人工呼吸器を装着し、胸骨を切開し心臓を露出し、頚動脈ー左前下行枝バイパスを作成した。このバイパス回路を12分間遮断し90分間解除し左前下行枝灌流領域を虚血及び再灌流させることで、心筋虚血再灌流モデル(スタン心筋モデル)を作成した。虚血再灌流部位に一対の超音波クリスタルを植え込み局所心筋短縮率(%SS)測定し、心筋収縮力の指標とした。このモデルを用いて、GLP-1 agonistリラグルチドが心筋虚血再灌流障害からの回復に与える影響について検討した。1.スタン心筋モデル作成後、GLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与し30分後に虚血再灌流を行った群とリラグルチドの代わりに生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。2.スタン心筋モデル作成後、バイパス回路を12分間遮断し、遮断解除直後にGLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与した群と生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。3.実験前日朝に1回のリラグルチド15μg/kgの皮下注射を行った群とコントロール群との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。また、リラグルチドによる心収縮力改善効果は、グリベンクラミドの投与により減弱することを認めた。現在、引き続き、機序の解明をおこなっている。尚、1.2.の成果は2018年5月に開催された日本麻酔科学会学術集会で優秀演題として口演・ポスター発表を行った。実験の測定機器の動作不良のため、実験にやや遅れが生じ、検討が必要な実験群があと一群残っている。残りの実験グループの検討を行い、論文作成をする。当面は計画通りに実験を行う。機序の解明を行うために、KATPチャネルの阻害薬を使用した群の実験を行い、結果を検討する。実験結果の検討後、成果報告を行う。更に並行して論文を作成し、追加実験が必要になれば実験を行う。ブタ生体に麻酔を行った後、気管切開を行い人工呼吸器を装着し、中心静脈ルート確保と動脈圧ライン確保を行った後に、胸骨を正中切開し心膜を切開しつり上げて心臓を露出し、頚動脈ー左前下行枝バイパスを作成した。このモデルを用いて、GLP-1 agonistリラグルチドの虚血前投与が心筋虚血再灌流障害からの回復に与える影響すなわち薬剤性プレコンディショニングについて検討した。1.スタン心筋モデル作成後、GLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与し30分後にバイパス回路を12分間遮断し虚血としその後90分間の再灌流を行った群とリラグルチドの代わりに生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが示唆された。2.スタン心筋モデル作成後、バイパス回路を12分間遮断し虚血とし、遮断解除直後にGLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与した群と生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、その後90分間の再灌流時にリラグルチドを投与した群ではコントロール群と比較して心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが示唆された。当初のほぼ予定通り、リラグルチドの虚血前投与群と虚血後投与群の2群のデータが揃いつつあり、内容も予想通りの結果が出ている。

2.スタン心筋モデル作成後、バイパス回路を12分間遮断し、遮断解除直後にGLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与した群と生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。3.実験前日朝に1回のリラグルチド15μg/kgの皮下注射を行った群とコントロール群との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。実験前日朝に1回のリラグルチド15μg/kgの皮下注射を行い、スタン心筋モデル作成後にグリベンクラミドを投与し、30分後に虚血再灌流を行った群では心筋スタニングからの心筋収縮力の回復の改善を認めなくなることが証明された。1.2.の成果は2018年5月に開催される日本麻酔科学会学術集会で優秀演題に採択されており、発表予定である。当初のほぼ予定通りに実験を行うことが出来ており、成果発表もできるだけの結果が出ている。麻酔したブタ生体を用いて、気管切開を行い人工呼吸器を装着し、胸骨を切開し心臓を露出し、頚動脈ー左前下行枝バイパスを作成した。このバイパス回路を12分間遮断し90分間解除し左前下行枝灌流領域を虚血及び再灌流させることで、心筋虚血再灌流モデル(スタン心筋モデル)を作成した。虚血再灌流部位に一対の超音波クリスタルを植え込み局所心筋短縮率(%SS)測定し、心筋収縮力の指標とした。このモデルを用いて、GLP-1 agonistリラグルチドが心筋虚血再灌流障害からの回復に与える影響について検討した。1.スタン心筋モデル作成後、GLP-1 agonistリラグルチド7.5μg/kgを静脈内投与し30分後に虚血再灌流を行った群とリラグルチドの代わりに生理食塩水を投与した群(コントロール群)との比較では、リラグルチドを投与した群で心筋スタニングからの心筋収縮力の回復を改善することが証明された。また、リラグルチドによる心収縮力改善効果は、グリベンクラミドの投与により減弱することを認めた。現在、引き続き、機序の解明をおこなっている。尚、1.2.の成果は2018年5月に開催された日本麻酔科学会学術集会で優秀演題として口演・ポスター発表を行った。実験の測定機器の動作不良のため、実験にやや遅れが生じ、検討が必要な実験群があと一群残っている。残りの実験グループの検討を行い、論文作成をする。当面は計画通りにリラグルチドの虚血前投与群と虚血後投与群の2群の実験を行い、症例数を増やす。並行して阻害薬を投与する群の実験を開始する。ある程度結果がそろったら成果報告を行う。更に並行して論文を作成し、追加実験が必要になれば実験を行う。当面は計画通りに実験を行う。阻害薬を使用した群の実験を行い、症例を増やす。機序の解明を行うために、KATPチャネルの阻害薬を使用した群の実験を行い、結果を検討する。実験結果の検討後、成果報告を行う。実験動物や薬剤の購入費が予定していたよりかからなかった。(理由)実験
科学的分析データを持つドイツ語教科書編集支援システムの開発に関する研究

研究実施計画に基ずく研究実績は概要は以下の通りである。1.システムのインプリメンティションの完成本システムの開発に必要なMacintosh1セットを購入し,平成3年度に購入したMacintosh2セットと合わせてシステムのインプリメンティションに用いた。教科書編集支援システムは実用になる段階までインプリメンティションは完成した。2.完成したシステムの試行による評価教科書編集に必要とする機能としては,基本的には満足する評価が得られた。3.問題点・改良点をチェックして,システムの手直し・改善更に優れたシステムとするためには機能の一部追加の必要があり,その手直し中である。4.開発システムを用いて実際にドイツ語教科書編集の実施並びに評価教科書編集の実施中である。5.最終的なシステム完成一部の機能追加を除いて完成した。6.多くのドイツ語教育者並びに研究者に本システムを提供して,多方面の利用によってその有用性を評価する。一部のドイツ語教育者に依頼して評価中である。7.研究成果を関連する学会で発表する。本校の平成4年度の研究紀要並びに関連学会で発表した。研究実施計画に基づく研究実績の概要は以下通りである。1.教科書編集支援システムの仕様明細の決定パソコン上で稼働し,ドイツ語語彙に関する科学的分析デ-タベ-スを基にドイツ語教師なら誰でも使えるシステムとなるように仕様決定を行った。2.ドイツ語語彙に関する科学的分析デ-タベ-スの作成3つの基本単語リストを作成し,目下その再検討並びに拡張を行っている。3.教科書編集支援システムのソフトウェアシステム開発本システム開発に必要なパソコンとしてMacintosh2セット,プリンタ3台,スキャナでドイツ語の各種文献の単語をコンピュ-タに入力するためのソフトウェアAccuTextを調達した。使用言語としてTHINK Cを選び,基本設計として使いやすいGUI,簡単な操作性等を重視している。基本的な機能を持つ教科書編集システムの開発は完了した。平静4年度においてそれを拡張し,実用的なものとして仕上げる予定である。4.国内の関連する研究機関の視察・調査徳島大学で行っているコンピュ-タを利用したドイツ語教材の開発を視察した。5.学会等での研究成果の発表日本独文学会平成3年度秋期研究発表会での発表,ドイツ語教授法ゼミナ-ルの参加,高専情報処理教育研究発表会での発表等がある。
直接数値シミュレ-ションによる反応性乱流の解明

本研究では,初期条件として周期的じょう乱を加えた場合を対象として,スペクトル法を用いた化学反応を伴う混合層のダイレクトシミュレ-ションを行い,二成分流体が混合・反応する場合について化学反応と組織的構造との関連を明らかにすることを目的としている。また,A+B→Pのような反応を対象としており,反応による発熱が無視できるものとして濃度をpassive scalarとして取り扱う。したがって,基礎方程式は非圧縮・非定常三次元ナビエ・スト-クス方程式および連続の式と化学種保存式となる。さらに,速度場・濃度場をフ-リエ級数を用いて展開し,スペクトル法を適用して数値計算を行った。空間微分はフ-リエ空間で行い,非線形項の計算はpadding法を用いてaliasing誤差を除去し,物理空間において行った。初期条件としてはtanhで表わされる平均速度分布を与え,それにRayleigh方程式から得られる周期的な微小じょう乱とz方向に周期的なじょう乱を重ね合せたものを初期条件とした。また初期濃度分布としてもtanh型の分布を用いた。計算は64^3の格子点を用いて行い,境界条件としてはx方向とz方向には周期的境界条件を,y方向にはfree slip境界条件を用いた。以上,2成分流体が混合。反応する場合について,化学反応と乱流の組織的構造との関連を明らかにするために,スペクトル法を用いた化学反応を伴う混合層の三次元直接数値計算を行い,以下の結論を得た。(1)リブの存在する領域において活発に反応が行われ,生成項のピ-クはリブに存在している。(2)コア領域においてはそれほど活発な反応は行われないが,全生成量に対する寄与は大きい.本研究では,初期条件として周期的じょう乱を加えた場合を対象として,スペクトル法を用いた化学反応を伴う混合層のダイレクトシミュレ-ションを行い,二成分流体が混合・反応する場合について化学反応と組織的構造との関連を明らかにすることを目的としている。(2)コア領域においてはそれほど活発な反応は行われないが,全生成量に対する寄与は大きい.
FETおよびメゾスコピック構造による超薄膜グラファイトの電子物性の研究

理想的な多層Dirac電子系における負の層間磁気抵抗現象の発現を理論的に導き、有機導体α-(BEDT-TTF)2I3におけるDirac電子系実現を裏付けた。多層グラファイトについて負の層間磁気抵抗現象を実験的に見出し、H点付近の正孔が持つ3次元Dirac粒子的な性格により実験結果を説明した。単層少数層グラファイト薄膜FET構造の作製には成功したが、系統的な物性実験は今後の課題となった。(1)超薄膜/単層グラファイト素子作製技術の確立グラファイト超薄膜の層数評価のために走査プローブ顕微鏡を導入し,劈開法と電子線リソグラフィーによる少数層/単層グラファイトFET素子の作製を試みた。フェルミ準位制御の可能な超薄膜バルクグラファイト素子の作製には成功したが,単層や2層グラフェン素子の作製には至っておらず次年度の課題となっている。(2)小型パルス磁場システムの整備とグラファイトの磁場誘起電子相転移既存の8kJ小型パルス電源の容量を20kJに増強し,適合するCuAg線小型パルス磁石を製作して50Tパルロ強磁場システムを整備した。グラファイトの磁場誘起電子相転移のフェルミ準位依存性を調べる目的で超薄膜FET素子の強磁場磁気抵抗の測定を試みているが,系統的実験には至っておらず次年度の課題となっている。(3)多層ディラック電子系としてのグラファイトの層間磁気抵抗適切な端面処理を施したグラファイトのバルク単結晶について層間磁気抵抗の測定を行ったところ,顕著な負性磁気抵抗を発見した。グラファイトは近似的に単層グラフェン(2次元ディラック電子系)が積層した層間結合の強い多層系と考えることができる。層間結合の弱いもう一つの多層ディラック電子系である有機導体α-(BEDT-TTF)2I3も負性磁気抵抗を示すが,この系の磁場中層間伝導をディラック電子系特有のゼロモードラダウ準位間のトンネル伝導として考えるモデルを構築し,この物質の負性磁気抵抗を説明した。さらにこのモデルを層間結合が強い系に拡張することにより,グラファイトの負性層間磁気抵抗を定性的に説明することに成功した。この結果はバルク結晶の物性にディラック電子系の特徴が反映された顕著な例であると言える。申請段階で計画した研究内容は以下の4課題である。(1)多層グラファイトの磁場誘起電子相転移のFermi凖位依存性(2)単層グラフェンの異常量子Hall効果状態における端状態(3)グラフェン微細構造におけるメゾスコピックDirac電子系の伝導現象(4)多層グラファイトの負性層間磁気抵抗本研究の過程で発見した(4)について、観測されたShubnikov-de Haas振動と共存する負性層間磁気抵抗の起源を調べるために、現実的なグラファイトのLandauサブバンド分散から層間伝導度を評価した。その結果、H点付近に正孔ポケットを与える正孔バンドは、K点付近に電子ポケットを与える電子バンドとは別の電子バンドとH点付近の一点で準位交差するため、3次元Diracフェルミオン的な性格を持つことを指摘した。この事実から、電子系のShubnikov-de Haas振動と共存して負性磁気抵抗が現れることを説明した。本研究はバルクグラブァイトのDirac系としての新たな側面に光を当てた意義を持つ。課題(2)と(3)に関しては、単層グラファイト(グラフェン)FET素子作製の確立が研究の成否を決める。光学顕微鏡システムの改善によりSiO2/Si基板上のグラフェン結晶片の識別を可能にすると共に、顕微ラマン分光による膜厚確認を行い、グラフェン特有のDirac電子的なShubnikov-de Haas振動を示す素子の作製に成功した。こうして課題(2)と(3)の基礎は確立したが、微細加工を必要とする本格的な実験については今後の課題となった。
ムコ多糖症の脳病態に有効な新規シャペロン化合物の探索

ムコ多糖症II型、ハンター症候群は、ライソゾーム酵素イズロネート-2-スルファターゼIDSの遺伝的欠損によりおこるライソゾーム病の一つで、全身の臓器に未分解のムコ多糖などが蓄積し、脳を含む様々な病態を引き起こす。この疾患には、酵素補充療法が治療法として応用されている一方、脳障害に対する有効性は見られず、現時点で有用な治療法は存在しない。シャペロン療法とは、低分子シャペロン化合物を用い細胞内で標的変異酵素に結合することで、変異酵素蛋白質を構造的に安定化し、残存酵素活性を上昇させることで治療効果を得る方法である。また、低分子物質であるシャペロン化合物は、血液脳関門を通過し、脳病態に有効性を示すことが期待できる。本課題では、ライソゾーム病脳病態に有効な画期的治療法であるシャペロン療法の原理にもとづき、ムコ多糖症II型に有効な低分子シャペロン化合物の探索を行い、in vitroおよび培養細胞を用い細胞病態に対する効果の検証をすることで、有望はシャペロン薬候補化合物を同定することを目的とする。これまで、in vitroおよび培養細胞系を用いた解析により、複数のムコ多糖症II型に対する候補シャペロン化合物を得てきた。これらの中には、IDS酵素に対し阻害活性を示すものとともに、阻害活性を示さない新しいタイプの化合物も含まれている。本年度は、シャペロン候補化合物について、ヒトIDS cDNA発現細胞系を用いたシャペロン効果の判定を行い、効果の高い化合物について変異型特異的な効果について検討を行った。これまで、in vitroおよび患者由来細胞で選別してきたシャペロン候補化合物について、30種類のヒト変異IDS cDNA発現細胞系を用い、それぞれの変異型特異的なシャペロン効果について明らかにすることができ、候補化合物に関する有用な知見をえることができたことで、当初の予定通りの成果を得たため。これまで選別された候補化合物について、1)さらに多くの変異型IDS発現細胞系を用いた効果判定試験を行う。また、2)患者細胞を用い、ムコ多糖蓄積に対する化合物の効果を検討する。さらに、変異IDS酵素蛋白質の発現に対する効果についても、免疫学的手法により検討を行う予定である。ムコ多糖症II型は、ライソゾーム酵素IDSの遺伝的欠損によりおこるライソゾーム病の一つで、患者細胞ライソゾーム内にムコ多糖などが蓄積し、様々な病態を引き起こす。この疾患には、酵素補充療法が治療法として応用されている一方、脳障害に対する有効な治療法は存在しない。シャペロン療法とは、低分子シャペロン化合物を用い、細胞内で変異酵素に作用させることで、変異酵素蛋白質を構造的に安定化し、残存酵素活性を上昇させることで効果を得る方法である。また、低分子シャペロン化合物は、これまでの検討で、血液脳関門を通過し、脳病態に有効性を示す、また、酵素補充療法などで問題の中和抗体の出現などの問題も起こらないなどの利点がある。本課題では、ライソゾーム病脳病態に有効な画期的治療法であるシャペロン療法の原理を元に、ムコ多糖症II型に有効な低分子シャペロン化合物の探索を行い、効果の検証を行うことを目的とする。私は、これまで、独自に確立したアッセイ系を用い、酵素基質競合阻害活性および酵素安定化活性を指標とし、複数のムコ多糖症II型に対する候補シャペロン化合物を得てきた。本年度は、シャペロン候補化合物について、培養ヒト線維芽細胞を用い、各化合物の細胞毒性を示す濃度の決定を行い、シャペロン効果判定に用いる濃度域の設定を行った。また、ヒトIDS cDNA発現細胞系の構築を行い、変異IDS cDNA発現細胞を用いたシャペロン効果判定試験のための予備的な検討を行った。患者由来培養線維芽細胞およびIDS cDNA発現細胞系を用い、シャペロン候補化合物の変異酵素活性に対する効果を調べるため、各候補化合物の培養細胞に用いる濃度の設定ができ、効果判定のための準備が整った。また、変異IDS cDNA発現細胞系の構築を行い、広範な変異酵素に対する化合物効果を調べる準備が整い、当初の予定通りの研究の進捗を得ることが出来たため。