hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬物乱用防止教育の指導者研修のあり方に関する研究

近年の青少年の喫煙・飲酒・薬物乱用問題の深刻化にともない,学校教育における有効な防止教育への期待が高まってきている。従来の学校健康教育は,知識の獲得に専ら焦点を当てたものであり,行動変容という観点からは有効ではなかった。しかしながら,我が国でも最近になって,妥当な行動科学の理論に基づいた喫煙・飲酒・薬物乱用防止プログラムや教材が開発され,広く利用できるようになってきている。ただし,多くの教師は,そうしたプログラムや教材を適切に活用するのに必要な能力が不十分なために,期待される効果をあげえないのが現状である。そのため,行動変容に有効な喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を普及するためには,現職教師に対する指導者研修が極めて重要な役割を果たすものと考えられる。そこで本研究では,行動変容に有効な喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を教師が適切に実施するために必要な能力を形成できるように,ワークショップ(参加型の研修会)を企画・実施し,その形成的評価を行うこととした。本年度も昨年度に引き続いて,福岡県教育庁が主催した薬物乱用防止教育の研修会を企画・実施し,その形成的評価を試みた。研修会の前後に実施した質問紙調査の結果によれば,ほとんどの参加者はワークショップ(参加型の研修会)を肯定的に評価していた。また喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を実施する自信がある者の割合も,研修前の25%から研修後は69%に増加していた。そして,研修会がわかりやすいと感じたり,有益だと感じたり,楽しいと感じているほど,研修会終了後の時点で喫煙・飲酒・薬物乱用防止に関する指導を実施する自信を持っていた。以上のことから,ワークショップ(参加型の研修会)を開催することは都道府県教育委員会レベルでも可能であり,参加者の喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を実施する自信を高め,取り組みへの意欲を促進するのに有効であると考えられた。近年の育少年の喫煙・飲酒・薬物乱用問題の深刻化にともない,学校教育に対して有効な防止教育への期待が高まってきている。本研究の目的は,従来の講義を中心とした一方的伝達型の研修会の限界を考慮して,参加型研修会(ワークショップ)を企画・実施し,その有効性について形成的評価を行うことである。本年度は,まず全国都道府県教育委員会が主催する薬物乱用防止教育の指導者研修会の内容と方法について分析し,そのほとんどが予想されたように講義形式の伝達型の研修会であることを明らかにした。そこで諸外国の薬物乱用防止教育の指導者研修のあり方に関する研究成果に基づいて,福岡県教育委員会が主催する薬物乱用防止教育の研修会を企画・実施し,参加者に対する質問紙調査を研修会の前後で実施した。その結果,参加者のほとんどが参加型研修会(ワークショップ)を肯定的に評価していた。また,喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を実施する自信がある者の割合も,研修前の30%から研修後は72%に増加していた。

以上のことから,参加型研修会(ワークショップ)は都道府県教育委員会レぺルでも実施可能であり,その効果は極めて大きいことが示唆された。近年の青少年の喫煙・飲酒・薬物乱用問題の深刻化にともない,学校教育における有効な防止教育への期待が高まってきている。従来の学校健康教育は,知識の獲得に専ら焦点を当てたものであり,行動変容という観点からは有効ではなかった。しかしながら,我が国でも最近になって,妥当な行動科学の理論に基づいた喫煙・飲酒・薬物乱用防止プログラムや教材が開発され,広く利用できるようになってきている。ただし,多くの教師は,そうしたプログラムや教材を適切に活用するのに必要な能力が不十分なために,期待される効果をあげえないのが現状である。そのため,行動変容に有効な喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を普及するためには,現職教師に対する指導者研修が極めて重要な役割を果たすものと考えられる。そこで本研究では,行動変容に有効な喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を教師が適切に実施するために必要な能力を形成できるように,ワークショップ(参加型の研修会)を企画・実施し,その形成的評価を行うこととした。本年度も昨年度に引き続いて,福岡県教育庁が主催した薬物乱用防止教育の研修会を企画・実施し,その形成的評価を試みた。研修会の前後に実施した質問紙調査の結果によれば,ほとんどの参加者はワークショップ(参加型の研修会)を肯定的に評価していた。また喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を実施する自信がある者の割合も,研修前の25%から研修後は69%に増加していた。そして,研修会がわかりやすいと感じたり,有益だと感じたり,楽しいと感じているほど,研修会終了後の時点で喫煙・飲酒・薬物乱用防止に関する指導を実施する自信を持っていた。以上のことから,ワークショップ(参加型の研修会)を開催することは都道府県教育委員会レベルでも可能であり,参加者の喫煙・飲酒・薬物乱用防止教育を実施する自信を高め,取り組みへの意欲を促進するのに有効であると考えられた。
肝病理組織抽出検体を用いたピロシーケンシングによる胆汁うっ滞性肝疾患の病態解析

当該年度は主に前年度に樹立したパラフィン包埋切片からの次世代シーケンサーによるライブラリー作成用の核酸抽出を行い、血清中とのデータ比較を多数例で行なった。その結果ほぼ45%程度の原発性胆汁性胆管炎患者の検体では血清と肝病理標本に共通する、これまでに報告のない細菌門に属する外来性微生物の16sRNAが同定した。これらについては、同一個体の経時的な追跡により、発症前には検出されず、発症後の検体のみで検出されることを確認した。複数の症例で再現性を持って検出されたため、胆汁性肝疾患の病態形成との関連について、さらに経時的な検討を進めた。その結果、臨床データの改善と共に同外来遺伝子が消退する例も認め、病状の進展とも関連する可能性が示唆された。さらに同遺伝子は分類学上、「門」レベルでの同定にとどまるため、より個体を特定できる「属」「種」レベルでの同定のため、検出のためのプライマー設定を行なった。ただし、「種レベル」まで特異性を高めると検出力が低下することも経験したため、より適切なプライマーの設計が必要であると考えられた。今回認めた細菌門のうち、代表的な菌種を入手し、その核酸をポジティブコントロールとして、デジタルPCRで肝病理組織標本もしくは血液から特異的に検出できる系の設計を行なった。その結果、肝病理検体と同様に血液からも同等の結果を得ることができた。今後今回確立した検出方法の妥当性を他の疾患コントロールなども置いた上で検証し、新しい病態形成メカニズムを提唱することとした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度は主に前年度に引き続きパラフィン包埋切片からの次世代シーケンサーによるライブラリー作成用の核酸抽出を行なった。一部の症例ではレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法による切り出しも可能であり、それらの検体では血清からの抽出核酸検体との整合性も比較検討した。その結果、細胞浸潤が多い検体では主にリンパ球由来の核酸検体が良好な品質で抽出されたのに比し、胆管上皮細胞由来の核酸検体は良及びその品質が不十分なためにそのままでは次世代シーケンサでのライブラリー作成が困難であることが判明した。核酸抽出が良好な検体からはピロシーケンスも可能となり、その結果これまでに報告のない細菌門に属する外来性微生物の16sRNAが同定された。これらについては、同一個体の経時的な追跡により、再現性を持って検出されたため、胆汁性肝疾患の病態形成との関連について、さらに検討を進めることとなった。さらに同遺伝子は血液中からも分離されたために、肝病理組織標本と血液という入手方法が全く異なるものでどちらが今後研究を展開する上で優位性があるかという検討を進めるために、主に血液由来の外来性遺伝子を同様の方法で検出する系の確立することも進めた。その結果、肝病理検体と同様なライブラリーを作成することが可能であり、大腸菌などの適切な内部コントロールを置いて、疾患特異性を肝病理標本と血液双方で進めて、検出方法の妥当性を検証し、われわれが確立した方法で十分に特異性があることを確認した。この技術を用いて、次年度ではさらに当教室で蓄積した症例で検証試験を実施することとした。途中で、肝病理標本からの抽出に必要なレーザーキャプチャーマイクロダイセクション装置が故障して修理不能となり、代替え機が用意されるまでパラフィン包埋切片からの核酸抽出が不可能となったために、代用器が使用できるまでの約4ヶ月間その工程が遅れたため、全体の研究も遅れた。その後新機器が設置されたため核酸抽出も順調に実施されるようになった。胆汁うっ滞性肝疾患の肝病理標本からの16S RNAの測定のための基礎的店頭として、血清よりサンプルを抽出して次世代シーケンサーを用いて腸内細菌由来の外来遺伝した探索を行った。

遺伝子調整の手法として超遠心法よりもスピンカラム法がRNAの純度が高いなどの知見を見出し、実際胆汁うっ滞性肝疾患患者の血清から外来最近由来の新規16S RNAを見出した。具体的には、16S rRNAなどの外来性遺伝子を含めた抽出のための試料調製には、既に市販のプロトコールが数種確立しており、本研究では申請者らが既に使用経験のあるQIAGEN社のキットを使用し、主にピロシーケンスのための核酸試料抽出を行った。さらに、調整された核酸資料を基に次世代シーケンサーを用いたピロシーケンスを行った。この方法を応用すれば、肝病理組織より切り出した同一患者の異所性の胆管上皮細胞サンプルにおいても同時に多数検体を解析することが可能であると考えている。今回のピロシーケンス法を用いた解析ではリード長の長さを利点として外来遺伝子の探索、とりわけ相同性探索で有利な点は明らかであると思われる。本年度の技術基盤を形成する研究では、少数例の患者の血清サンプルより比較的珍しい腸内細菌叢由来の遺伝子断片を検出することができた。今後はこの結論が妥当かという点について、肝組織抽出検体を用いて確認するとともに、多数例の患者検体を用いて、適切な疾患コントロールをおきつつ検討を重ねていくことが重要であると思われた。未だ肝病理検体からの外来遺伝子抽出には至っていないが、血清を用いた基礎検討は順調に推移しており、早番この手法で肝病理検体を用いたアッセイが開始できると見込めるため。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今後は今回開発した肝病理標本からの核酸抽出法と血液からの抽出法から、より多数の検体からの核酸標本を抽出して今回見出した外来性微生物由来の16sRNAの再現性を検証する。さらに、同様の手法で別の新規の外来性微生物由来の16sRNAを見出した場合には、その肝疾患への病態形成に意義についても経時的な変化及び臨床的な変化との相関などを含めて検討する。また一部の核酸がマッチングした微生物に関しては、その微生物特異的な検出法を確立するためにデジタルPCR装置などを用いて定量する系を導入するための基礎検討を行なう。概ね計画通りに進行しており、格段の研究手法の変更を必要としていないが、患者の病理検体などの使用についての同意取得の手法が変更される可能性も有り、その手続きなどに留意して進めていく。
フランス19世紀文学における聖職者像-制度と精神史のダイナミズム-

本研究は複雑に交錯する19世紀の政治・社会さらに文学の様相に対して、聖職者像というテーマによって補助線を引くことで、個々の作家の特異性を浮かび上がらせるとともに、ひいては19世紀文学の多様性を新たな角度から検証することを企図した。19世紀のカトリック教会の状況を制度の面から考察するとともに、実在の司祭像をとおして当時の精神性を考究した。司祭像研究については、個々の作家に特化したもの、あるいはマイナーな作者までも含めての概説書は存在するが、本研究のようなかたちでの先行研究は未だない。本研究の構成は、以下のとおりである。第一部「政教条約下の教会と聖職者」では収集した宗教・社会関連資料を駆使してカトリシスムの組織・動向・精神性研究を行い、文学が描いた司祭像のより深い理解を意図した。第二部「反自然としての聖職者縁」では、ミシュレとゾラを結びつけて検討することで、19世紀反教権主義の一系譜を示し、二人の作家の共通性と差異を明確にした。第三部「『絶対』の人、過去の人」は、ユゴーとルナンの「司祭なるもの」をめぐる思索に関する考究である。第四部「信仰あるいは信仰の誘惑と聖職者像」では、サント=ブーヴとユイスマンスを取り上げ、肉欲の懊悩と信仰と関連して司祭像がどのように把握されているのかを調べた。複数の作家の司祭像をまとめて検討したことで、19世紀フランス文学のダイナミズムの一端を明らかにできた。なお、ルナンに関する論文は、『ルナン学会誌』(Bulletin de laSociete des etudesrenaniennes)に掲載することができた。またその論文が認められ、2009年7月のフランス学国際協会(AIEF)のルナン分科会での発表を依頼された。1資料購入の必要上、まず、研究の計画を具体的に定め、第1章政教条約下の教会と聖職者(スタンダール、バルザック、フロベール)、第2章反自然としての司祭像(ミシュレ、ゾラ)、第3章過去の人-作家の感性がとちえた司祭像(サント・ブーヴ、ルナン、フロベール)、第4章表象としての司祭像-キリスト教をめぐる思索(ユゴー、サント・ブーヴ、サンド)、第5章聖性と司祭-世紀への反発と郷愁-(バルベイ・ドールヴィイ、ブロワ)、結論司祭像の地平(ラムネとベルナノス『田舎司祭の日記』)、とした。2実施計画にしたがって、図書、資料を購入した。実在の聖職者の動向把握を一つのポイントと考え、フェリックス・デュパンルー、アルスの司祭等に関する資料を追加した。さらに下に記した草稿研究の結果、新たに知り得たキリスト教関係資料も追加した。3資料収集と草稿研究に役立てる目的で、ノート型パーソナルコンピュータを購入した。4授業休業期間を利用して渡仏し、フランス国立図書館において資料収集を行った。さらに、パリ市歴史図書館においてミシュレ「宗教史ノート」、ロマン主義資料館においてエルネスト・プシカリの草稿を二週間にわたって調査・研究した。5反教権主義に関係する文献を中心に資料を熟読した。反教権主義の背景にはさまざまな思想が交錯しているが、そうした思想状況を読み解くため、ともに反自然という見地から司祭のあり方を糾弾したミシュレ、ゾラの類縁性と相違を考究した。その結果をふまえ、17年度中に「ゾラにおける司祭像-反自然の糾弾-」(仮題)、「反教権主義の一系譜-ミシュレとゾラ-」(仮題)を発表する予定である。

6上記の草稿研究の内容をさらに充実させて、18年度以降に、「ミシュレにおける聖フランソワ・ド・サル論」(仮題)、「ルナンからプシカリへ-イデアリスムと聖職者像-」(仮題)を発表する予定である。2資料調査:(1)16年度に調査したミシュレ「宗教史ノート」の内容を上記の論文に反映した。(2)フランス国立図書館においてエルネスト・プシカリの草稿および雑誌Art sacreのバックナンバーを調査した。5発表計画:「ルナンにおける司祭像」、「アルスの司祭と世紀末精神性」と題して口頭発表さらに論文発表を計画し、関連学会に申し込みをした。1研究成果公表:16年度に取り上げたゾラにおける司祭像研究を完結させるために(1)ゾラにおける司祭像(2)-反自然的あるいは悪魔的人間-、社会史的視点から19世紀の実在の司祭とその文学への影響を検討するために(2)ラムネとヴィアンネ-二人の司祭、二つのキリスト教-を発表した。さらにルナンにおける司祭像を考究した成果を(3)エルネスト・ルナンにおける司祭像-「神」への道としての《abstraction》-と題して『日本キリスト教文学研究』(第24号)に、さらに広く海外にも成果を公表する目的で同テーマの論文La figure du pretre chez Renan, metaphore des《natures abstraites》をBulletindes etudesrenaniennes(第110号)に掲載するため、すでに原稿を提出済みである。2資料調査:(1)17年度には修復作業中で閲覧できないナンバーが多かった雑誌Art sacreのすべてのバックナンバーに目を通して今後の研究に重要を思われる箇所を把握した。4研究者との交流:日本フロベール研究会、日本ユゴー研究会の定期研究会に出席した。ユゴー研究会に関しては、19年度に研究発表を予定している。5発表計画:Hugo, Sainte-Beuveにおける司祭像、さらに王政復古期における司祭像に関する論文の発表を準備したので、19年度に順次公表するつもりである。1研究成果公表:(1)論文交付申請書には1)ユゴーにおける司祭像-トルクマダとシムールダン」、2)「サント=ブーヴVolupteにおける司祭像」3)「王政復古期の司祭像」と題して発表を計画していたが、1)およぼ3)はすでに公表した。2)に関しては、本年度5月原稿提出締め切りの大学紀要に掲載を予定している。計画にはなかったが、社会・制度史の視点を充実させるため、デュパンルー枢機卿関連論文を公表した。(2)口頭発表実施計画にしたがって日本ニゴー学会において、「死刑による救い-ユゴーにおける司祭像:トルクマダとシムールダン」と題して発表を行った。この際にユゴー学会のその他のメンバーとこのテーマに関して意見交換を行い、貴重な示唆をえた。(2)渡仏した際、フランス国立図書館において主としてデュパンルー枢機卿関連の資料で手元になかったものを検索し、精読して論文作成に役立てた。(3)昨年度にフランス国立図書館で調査した雑誌Art sacreの内容を吟味し、必要箇所をコピーのかたちで入手した。3海外研究者との交流:渡仏した際、Renanの研究者であるLaudyce Retat氏と意見交換した。またBulletin renanienに掲載された論文が評価され、ソルボンヌ大学のClaire Evesque氏より、Association internationale des Etudes
縮小モデルを用いた簡便なキャリブレーションによる3次元空間再構築方法の確立

本研究は,種々の球技種目の競技エリアに実空間での座標が既知である特徴点が含まれることに着目し,それらの特徴点をコントロールポイント(CP)に用いた簡便なキャリブレーションによって,競技中の偶発的な動作を競技エリア全体で精度良く3次元的に分析可能とすることを目指している.今年度はまず,自作したバレーボールコートの縮小モデル,従来のカメラおよび動作分析システムを用いた物理シミュレーションにより得られた結果から,本研究で提案する方法は,分析空間内の3次元座標を十分な再現精度で算出可能であるが,分析空間内で再現精度が一様でない,カメラの設置位置によって再現精度が変化するなどの特徴を有することを明らかにした.また,これらを考慮して利用すれば,競技スポーツ場面で簡便に競技エリア全体を計測可能とする方法となり得ること,コンピュータビジョン(CV)の適用により3次元座標の再現精度の改善が期待できる可能性を示唆した.次に,同方法において,CPの2次元座標をCVを用いて取得した場合について検討し,撮影映像に対するレンズ歪みの補正よりも,一般化Hough変換によるCPの2次元座標の計測精度の向上が3次元座標の再現精度の改善に貢献することを確認した.加えて,コート内の各計測点を高精度で規定した縮小モデルおよびモーションキャプチャカメラを用いた各計測点の2次元座標の光学的計測によって,系統誤差および偶然誤差をできるかぎり取り除いた物理シミュレーションを行い,本研究の方法では,計測点の2次元座標が精度良く計測されれば,非常に精度よく3次元座標が算出されることが明らかとなった.そして,計測点の2次元座標の僅かな計測誤差や真値を知り得ない実空間座標に対して最確値が用いられたことによる影響,3次元座標の算出時に生じた丸め誤差などの累積が僅少な誤差の要因であることが分かった.昨年度遅延していたバレーボールコート内の縮小モデルの補修が完了した.このことにより,モーションキャプチャカメラを用いた計測システムによる各計測点の2次元座標の光学的計測が可能となり,当初計画していた物理シミュレーションが実施できた.そして,得られた結果を自作した縮小モデルと従来の計測システムによって昨年度に得た結果と比較することで,本研究で提案する簡便なキャリブレーションによる3次元座標空間の再構築方法における3次元座標の再現精度やその特徴を明確にすることができた.当初はゴール型球技の縮小モデルを使用した物理シミュレーションを予定していたが,現有のバレーボールコートの縮小モデルの作製費用の超過によって新規の縮小モデルの製作が叶わず,今年度は現在取り組んでいるバレーボールに資源を集中して分析を行うとともに,これまでの研究を総括する予定である.特に,現在までの物理シミュレーションにおいてキャリブレーションに使用したCPは同数および同一の組み合わせであったため,CPの数や組み合わせが変わることで各計測点の3次元座標の再現精度がどのように変化するのかについて検討する.本研究は,種々の球技種目の競技エリアに実空間での座標が既知である特徴点が含まれることに着目し,それら特徴点をコントロールポイント(CP)として用いた簡便なキャリブレーションによるDLT法によって,競技中の偶発的な動作を競技エリア全体で精度よく3次元的に分析可能とすることを目的としている.今年度は,ネット型の球技種目であるバレーボールを取り上げ,カメラの設置位置を多様に設定するため,競技エリアを模した縮小モデルを自作した.カメラの縮小モデルの中心に対する俯角あるいは光軸の交差角を変化させて2台のカメラを設置し,縮小モデルを撮影した.そして,先述した方法により競技エリア全体に配した基準点の3次元座標を算出し,カメラの設置条件間での比較を行った.その結果,全ての条件において,競技エリア全体にわたって,撮影映像を3次元的に解析する際の許容範囲内の誤差で3次元座標が算出されることが分かった.しかし,算出された3次元座標は,競技エリア内で一様の誤差ではなく,概して外側に位置する基準点ほど誤差が大きくなる傾向,鉛直位置が上方ほど中央部で誤差が小さく,外側で誤差が大きくなる傾向が見られたことから,CPと分析点との距離が3次元座標の再現精度に影響を及ぼすことが示唆された.加えて,カメラの設置位置の変化によって,算出される3次元座標の誤差は基準点全体で一様に変化するのではなく,基準点ごとあるいは座標ごとに異なった変化を示した.この変化は,カメラの俯角あるいは光軸の交差角の変化に伴う各座標軸方向の空間分解能の変動の影響によるものであると考えられた.これらのことから,本研究の方法は,計測空間内における3次元座標の再現精度の特徴を考慮して用いることで,競技スポーツ場面において簡便に競技エリア全体を分析可能な方法となり得ることが明らかとなった.当初の予定では,今年度内にバレーボールコート内の特徴点や基準点を高精度で規定した縮小モデルを作製し,モーションキャプチャカメラによって光学的に各点の2次元計測座標を取得するシステムを購入し,計測を開始する予定であった.しかし,縮小モデルの設計や材料の選定,作製精度の担保等の問題により製作が遅れ,納入が年度末となったことに加え,納入後に縮小モデルの不具合が見つかり,補修が必要となったことや,縮小モデルの製作コストが当初の想定を上回り,今年度中に測定システムに用いる全ての物品を購入することができなかった.これらの理由により,計画していた計測は次年度に行うこととした.

本研究は,種々の球技種目の競技エリアに実空間での座標が既知である特徴点が含まれることに着目し,それらの特徴点をコントロールポイント(CP)に用いた簡便なキャリブレーションによって,競技中の偶発的な動作を競技エリア全体で精度良く3次元的に分析可能とすることを目指している.今年度はまず,自作したバレーボールコートの縮小モデル,従来のカメラおよび動作分析システムを用いた物理シミュレーションにより得られた結果から,本研究で提案する方法は,分析空間内の3次元座標を十分な再現精度で算出可能であるが,分析空間内で再現精度が一様でない,カメラの設置位置によって再現精度が変化するなどの特徴を有することを明らかにした.また,これらを考慮して利用すれば,競技スポーツ場面で簡便に競技エリア全体を計測可能とする方法となり得ること,コンピュータビジョン(CV)の適用により3次元座標の再現精度の改善が期待できる可能性を示唆した.次に,同方法において,CPの2次元座標をCVを用いて取得した場合について検討し,撮影映像に対するレンズ歪みの補正よりも,一般化Hough変換によるCPの2次元座標の計測精度の向上が3次元座標の再現精度の改善に貢献することを確認した.加えて,コート内の各計測点を高精度で規定した縮小モデルおよびモーションキャプチャカメラを用いた各計測点の2次元座標の光学的計測によって,系統誤差および偶然誤差をできるかぎり取り除いた物理シミュレーションを行い,本研究の方法では,計測点の2次元座標が精度良く計測されれば,非常に精度よく3次元座標が算出されることが明らかとなった.そして,計測点の2次元座標の僅かな計測誤差や真値を知り得ない実空間座標に対して最確値が用いられたことによる影響,3次元座標の算出時に生じた丸め誤差などの累積が僅少な誤差の要因であることが分かった.昨年度遅延していたバレーボールコート内の縮小モデルの補修が完了した.このことにより,モーションキャプチャカメラを用いた計測システムによる各計測点の2次元座標の光学的計測が可能となり,当初計画していた物理シミュレーションが実施できた.そして,得られた結果を自作した縮小モデルと従来の計測システムによって昨年度に得た結果と比較することで,本研究で提案する簡便なキャリブレーションによる3次元座標空間の再構築方法における3次元座標の再現精度やその特徴を明確にすることができた.上記の理由により,研究全体の進捗状況がやや遅れているが,その間にバレーボールコートの縮小モデルを自作し,従来のカメラと動作分析システムによって前述の結果を得た.これらの結果は,縮小モデルの作製やカメラの設置に関する誤差,2次元計測座標の手動による取得誤差を含むが,実際の競技スポーツ場面における撮影およびその後の動作分析に極めて近似した条件で計測された結果である.今年度と同様の撮影条件を設定し,次年度補修完了した縮小モデルとモーションキャプチャカメラによる測定システムによって計測した結果と今年度の計測結果とを比較することで,先述した種々の誤差が3次元座標の算出にどのような影響を与えるのか検討することが可能である.また,バレーボールの縮小モデルの製作費用の超過により,次年度予定しているゴール型球技の縮小モデルの作製が叶わない可能性もあり,一旦今年度取り上げたバレーボールに資源を集中して取り組む予定である.
虚血早期における脳血流量と脳組織の経時的変化

当初予定の通り,電気凝固器の購入によりラットにおいて中大脳動脈閉塞モデルの作成が可能になった.しかし,田村らの原法では,中大脳動脈閉塞のみでは一定した梗塞巣は作成できないことが判明した.そのため,中大脳動脈閉塞に加えて,同側の内頚動脈閉塞単独あるいは両側の内頚動脈を閉塞させて梗塞巣の範囲を検討した.両側の内頚動脈閉塞を加えると3時間後には高率に虚血巣を中大脳動脈領域に作成できることがわかった.虚血巣の判定には, TTC(triphenyl tetrazolium chrolide)のimmersion法を用いた.水素クリアランス法による脳血流量測定を予定していたが,脳深部の脳血流量も重要と考えられたので現在はC14-iodoantphyrineを用いたオートラジオグラフィー法を用いて検討している.現在のところ,オートラジオグラフィー法により脳血流量イメージは作成可能となり,定量性を検討している段階である.虚血組織において,免疫組織化学的手法を用いて種々の細胞骨格蛋白,神経伝達物質などの染色を行っている.従来行っていた,免疫組織化学的方法は灌流した脳を用い,凍結切片を溶液中に浮遊させるいわゆるfree-float法を用いていた.この方法では染色性は上昇するが,虚血巣では灌流固定の程度が正常部位と異なるために染色性が低下する可能性がある.したがって,凍結切片をスライドグラス上に貼付して染色する必要がある.この方法では,チュブリン,ニューロフィラメントの染色に際し,従来の固定法では染色性が弱く,また切片自身も脆くなってしまった.種々の固定法を試行し,現在はチュブリン,ニューロフィラメントにおいては染色性が向上したが, 5HTなどではまだ不十分である.現段階では小数例の検討であるが,ニューロフィラメントに関しては虚血早期においては,染色性の低下はみられていない.当初の予定より遅れているが,今後与えられた機会を生かし,検討を続けていく所存である.当初予定の通り,電気凝固器の購入によりラットにおいて中大脳動脈閉塞モデルの作成が可能になった.しかし,田村らの原法では,中大脳動脈閉塞のみでは一定した梗塞巣は作成できないことが判明した.そのため,中大脳動脈閉塞に加えて,同側の内頚動脈閉塞単独あるいは両側の内頚動脈を閉塞させて梗塞巣の範囲を検討した.両側の内頚動脈閉塞を加えると3時間後には高率に虚血巣を中大脳動脈領域に作成できることがわかった.虚血巣の判定には, TTC(triphenyl tetrazolium chrolide)のimmersion法を用いた.水素クリアランス法による脳血流量測定を予定していたが,脳深部の脳血流量も重要と考えられたので現在はC14-iodoantphyrineを用いたオートラジオグラフィー法を用いて検討している.現在のところ,オートラジオグラフィー法により脳血流量イメージは作成可能となり,定量性を検討している段階である.虚血組織において,免疫組織化学的手法を用いて種々の細胞骨格蛋白,神経伝達物質などの染色を行っている.従来行っていた,免疫組織化学的方法は灌流した脳を用い,凍結切片を溶液中に浮遊させるいわゆるfree-float法を用いていた.この方法では染色性は上昇するが,虚血巣では灌流固定の程度が正常部位と異なるために染色性が低下する可能性がある.したがって,凍結切片をスライドグラス上に貼付して染色する必要がある.この方法では,チュブリン,ニューロフィラメントの染色に際し,従来の固定法では染色性が弱く,また切片自身も脆くなってしまった.種々の固定法を試行し,現在はチュブリン,ニューロフィラメントにおいては染色性が向上したが, 5HTなどではまだ不十分である.現段階では小数例の検討であるが,ニューロフィラメントに関しては虚血早期においては,染色性の低下はみられていない.当初の予定より遅れているが,今後与えられた機会を生かし,検討を続けていく所存である.
心血管疾患のリスクファクター、ADMAの代謝機構の解明と病態生理的役割

心血管疾患のリスクファクターである非対称性ジメチルアルギニン(ADMA)の血中レベルを調節する機構を解明するために,血球細胞における本アミノ酸の代謝系について精査した.赤血球において,ADMAの代謝系が活発に働いていること,ならびに産生と分解に関わる酵素としてPRMT1およびDDAH1の存在を立証し,それらの部分精製品の酵素学的性質を明らかにした.また,ADMAを含むタンパク質としてカタラーゼを同定し,PRMT1のターゲットタンパク質であることを立証した.このように,赤血球におけるADMAの全体像を明らかにしたのは本研究が初めてである.心血管疾患のリスクファクターである非対称性ジメチルアルギニン(ADMA)の血中レベルを調節する機構を解明するために,血球細胞における本アミノ酸の代謝系について精査した.赤血球において,ADMAの代謝系が活発に働いていること,ならびに産生と分解に関わる酵素としてPRMT1およびDDAH1の存在を立証し,それらの部分精製品の酵素学的性質を明らかにした.また,ADMAを含むタンパク質としてカタラーゼを同定し,PRMT1のターゲットタンパク質であることを立証した.このように,赤血球におけるADMAの全体像を明らかにしたのは本研究が初めてである.【目的】心血管疾患の有効な予防ならびに治療法の確立は緊急を要する課題である。最近、本疾患の新しいリスクファクターとして、NOS拮抗阻害剤である内因性N^G,N^G-dimethylarginine(asymmetric dimethylarginine: ADMA)が同定され、注目されている。本研究においては、ADMAの代謝機構(産生系ならびに分解系を含む)を明らかにして、血漿ADMAがどのように調節されているかを解明することである。初年度に計画したADMA代謝の担当細胞の特定および血液細胞におけるADMA含有タンパク質の精製と同定に関する研究成果を得たので報告する。【方法および結果】ラット血液から赤血球,白血球,血小板の各画分を得て,RT-PCRおよびWestern blottingにてADMA代謝酵素群[加水分解酵素,DDAH1/DDAH2;タンパク質のADMA化,PRMT1]の発現について検討した.すべての細胞画分においてPRMT1およびDDAH1のmRNA,ならびにタンパク質発現が認められたが,DDAH2については確認されなかった,DDAH活性の結果から血中におけるADMA代謝の中心となる組織は赤血球であることが示唆された.そこで,タンパク質結合型ADMAに特異的な抗体(ASYM24)を用いたWestern blottingによって赤血球中に存在するADMAを含むタンパク質(遊離型ADMAの給源となる)の検索を行ない,最終的にLC/MS/MS分析によって,catalaseが同定された.以上の結果から,赤血球においてはADMAの産生・分解系を含む代謝系が活発に働いていることが明らかとなり,本細胞が血中のADMAレベルを調節しうることが示唆された.また,翻訳後修飾によるADMA化のターゲットタンパク質がcatalaseであるとの興味ある新知見が得られた。本研究の目的は、血漿中の非対称ジメチルアルギニン(ADMA)濃度がどのように調節されているかを解明し、心血管疾患の予防・治療法のターゲットを見つけ出すことである。初年度の研究結果から、赤血球においてはADMAの産生・分解系を含む代謝系が活発に働いていること、ならびに翻訳後修飾によるADMA化されたタンパク質がカタラーゼであるとの興味ある新知見が得られた。本年度は、この成果を発展させて、課題1.ヒト赤血球カタラーゼ分子中、ADMA化されたアルギニン残基をタンパク質化学的ならびに遺伝子工学的手法を用いて特定するとともに、課題2.ADMA化タンパク質の消長を解析するための基質を合成した。以下にその結果を報告する。課題1.リジルエンドペプチダーゼを用いてヒト赤血球カタラーゼを消化し、ペプチド断片をトリシン-SDS-PAGEによって分離し、結合型非対称ジメチルアルギニン残基と特異的に反応するASYM24抗体を用いたイムノブロットを行った。唯一反応の見られた16kDaペプチド断片をN末端アミノ酸配列分析に供した結果、MLQGRLFAYPDTHRHの配列データが得られた。本ペプチドはカタラーゼ分子の350番目のメチオニンから始まるペプチドであったことから、非対称ジメチル化されたアルギニン残基は365番目のアルギニン残基であることが示唆された。現在、組換え型ペプチドを作製し、PRMT1によるメチル化を確認しているところである。課題2. PRMT1の良好な基質となるGAR(グリシンアルギニンリッチ)モチーフを含む17残基のペプチドをGST融合タンパク質として合成し、組換え型PRMT1およびS-アデノシル-L-[^3H-メチル]メチオニンによりGST-GARペプチドのメチル化を行った。ここで得られた合成基質を赤血球抽出液とインキュベーションすると、低分子領域に放射活性が確認され、その反応はATP依存的であり、またプロテアソームの阻害剤によって阻害された。以上の結果より、赤血球はADMA結合型タンパク質の産生・分解機構を解析するのに適した細胞であり、得られた成果は、心血管疾患の予防・治療法のターゲット発見に繋がるものと期待される。

最初の2年間の研究結果から、赤血球においてはADMAの産生・分解系を含む代謝系が活発に働いていること、赤血球に存在する主要なタンパク質であるカタラーゼ(CAT)とカーボニックアンヒドラーゼ(CA)が血中ADMAの給源となるADMA化タンパク質であることを初めて同定した。本年度は、CATのADMA化の機序を明らかにすることを目的に行った。すなわち、課題1. CATのADMA化に関わる酵素の同定と精製を行うとともに、課題2. CATの精製PRMT1によるADMA化の実証を行った。以下にその結果を報告する。課題1.これまで、タンパク質アルギニンメチル化反応を触媒する酵素として、11種類のPRMTアイソフォームの存在が報告されているが、天然型酵素としては未だ単離・精製されていない。そこで、まず赤血球抽出液のウエスタンブロット分析によりアイソフォームの同定を行った結果、赤血球には、PRMT1が発現していることが明らかとなった。次いで、本酵素の単離・精製を試みた。酵素活性はPRMT1の良好な基質となるグリシン-アルギニンリッチペプチド(GAR)をGSTとの融合タンパク質(GST-GAR)として発現させ、S-アデノシル[^3H-CH 3]メチオニンを補基質としたときの[^3H-CH 3]の取り込みにより測定した。各種カラムクロマトグラフィーにより、赤血球PRMT1の部分精製標品(収率;46%,精製倍率;866倍)を得た。本酵素の分子質量は、ゲル濾過法により約420kDaと推定され、サブユニット(42kDa)の10量体を形成していることが明らかとなった。また、大腸菌や無細胞発現系にて発現させた組換え型PRMT1に比べると高活性を示した。課題2.大腸菌にて発現させた組換え型CAT,赤血球由来精製PRMT1,S-アデノシル[^3H-CH 3]メチオニンを用いて酵素反応を行った結果、CATとPRMT1の結合ならびにCATへの[^3H-CH 3]の取り込みが確認された。以上の諸結果から、心血管疾患の予防・治療法の新規ターゲット細胞として、赤血球の重要性を示すことができた。
早期関節リウマチ患者の心理過程と自己管理行動に関する研究

本研究は、発症から1年以内の早期関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis:以下RAと略す)患者が辿る心理過程と自己管理行動に影響を与える要因及び早期RA患者に関わる医療従事者の患者指導の現状や認識について分析することにより、早期RA患者への効果的な患者指導・教育の方法を見出すことを目的に研究を行った。本研究において、早期RA患者は、生活や予後に対する不安が強く、自己管理の方法がわからず医療従事者に療養方法に関する情報提供を求めていることが明らかになった。さらに、外来看護師を対象とした調査では、早期RA患者への指導・教育の必要性を理解していても時間的余裕や指導基準がないこと、他職種との連携が少ないこと等が明らかとなった。今回の調査から、早期RA患者への心理支援及び自己管理行動を支援できるような指導・教育方法の確立、研修会の開催の必要性が示唆された。近年、医学・薬学の分野では抗リウマチ薬や生物学的製剤などの治療薬が開発され、関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis :以下RAと略す)患者の治療には期待が持てるようになった。しかしながら、早期RA患者に対するリハビリテーションや看護については未だ効果的なアプローチ方法が解明されていないため、薬物療法と同じように早急な対応が必要であると考える。本研究は、発症から約1年以内の早期RA患者が辿る心理過程と自己管理行動に影響を与える要因を分析することにより、早期RA患者への効果的な患者指導・教育の方法を見出すことが目的である。今年度は、早期RA患者の心理過程と自己管理行動に関する予備調査を実施した。内容は、1文献検討(RA・リハビリテーション・質的研究方法に関する書籍の購入を含む)、2.調査依頼先の選択・協力依頼、3.インタビュー内容及び方法の検討、4.分析方法の検討、5.情報収集(1)RA・看護・リハビリテーション・質的研究方法に関する学会及び研修会への参加(2)RA患者の看護の経験がある看護師、質的研究の経験のある学識経験者、M-GTAの専門家との情報交換(研究計画、分析方法等について)などである。今年度、文献検討や情報収集など予備調査を行ったことにより、具体的な研究の方法について検討することができ、今後のデータ収集、分析につながったと考える。本研究の対象者である発症1年未満の早期RA患者という対象の希少性ゆえ、対象者の確保が十分に行えていないため、今後も引き続き、調査依頼先の医療施設と調整し、データ収集を行っていく。また、今後は得られたデータの分析を行い、研究成果については学会等で発表していく予定である。近年、医学・薬学の分野では抗リウマチ薬や生物学的製剤などの治療薬が開発され、関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis:以下RAと略す)患者の治療には期待が持てるようになった。しかしながら、早期RA患者に対するリハビリテーションや看護については未だ効果的なアプローチ方法が解明されていないため早急な対応が必要である。平成21度は、早期RA患者の自己管理行動を決定づける要因と阻害する要因の分析に関する予備調査、早期関節リウマチ患者に関わる医療従事者(主に看護師を対象に)の患者指導及び教育に対する認識についての予備調査を実施した。内容は、1.文献検討(RAやリハビリテーション、質的・量的研究方法に関する書籍の購入)、2.調査依頼先の選択・協力依頼、3.研究方法の再検討、4.情報収集1)RA・看護・リハビリテーション・質的・量的研究方法に関する学会及び研修会への参加、2)早期RA患者の看護の経験がある看護師、質的・量的研究の経験のある学識経験者、M-GTAの専門家との情報交換(研究計画、分析方法等について)などである。文献検討や情報収集など予備調査を行ったことにより、早期関節リウマチ患者の自己管理に関する具体的な研究の方法について検討することができた。次年度は、データ収集、分析を継続して行い、成果発表につなげたいと考える。対象者が発症1年未満の早期RA患であるため、その対象の希少性ゆえ、対象者の確保が十分に行えていないことが課題である。次年度も引き続き、調査依頼先の医療施設と調整し、データ収集を行っていきたいと考える。本研究は、発症から約1年以内の早期RA患者が辿る心理過程と自己管理行動に影響を与える要因を分析することにより、早期RA患者への効果的な患者指導・教育の方法を見出すことを目的としている。平成22年度は、発症1年未満の早期RA患者を対象に半構成的面接を実施した。

面接内容は録音し、逐語録を作成した。逐語録の内容を質的帰納的に分析し、早期RA患者の心理状態及び自己管理行動を決定づける要因と阻害する要因、医療従事者(特に看護師)に求める内容について抽出した。その結果、早期RA患者は、発症後は不安感が強く、複雑な心理状態を辿っており、自己管理の方法がわからないことや医療従事者に対して療養方法に関する情報提供など多くの支援を求めていることが明らかになった。これらの分析結果をもとに、外来でRA患者の看護に携わっている看護師を対象に、患者指導・教育の実態及び認識に関する質問紙調査を実施した。全国のリウマチ科標榜のある医療機関(病院・診療所)から無作為に500施設を抽出し、そのうち承諾の得られた55施設の外来看護師計248名を対象に質問紙を配布した。回収数186(回収率75.0%)。結果、外来看護師は、早期RA患者への指導・教育の必要性は理解していても時間的余裕がないことや人・場所不足の問題があること、患者指導・教育について他職種(医師・理学療法士・作業療法士・薬剤師・栄養士など)とは情報交換や連携が少ないことが明らかとなった。また、指導項目では、リハビリテーション、安静、自助具、医療費、就労、妊娠などについてはほとんど指導していない実態が明らかとなった。今回の調査から、早期RA患者の不安の軽減及び自己管理行動の遂行を支援できるよう効果的な指導・教育方法の確立、外来看護師への研修会などの開催の必要性が示唆された。今後さらにこれらの実施に向けて検討を重ねていきたい。
新規CD34抗原陰性白血病幹細胞の同定とニッチ機能を阻害する抗体療法の開発

白血病の再発の原因となる白血病幹細胞を標的とした抗体療法の開発を目的として研究を行った。まず、従来の報告よりも、さらに未分化な(母細胞となる)CD34抗原陰性白血病幹細胞(CD34-LSC)の存在を明らかにした。そのうえで、CD34-LSCを標的とする抗体の作製を行った。作製した抗体の標的抗原を解析することにより、白血病の治療標的として有望と考えられる抗原の同定に成功した。白血病細胞の培養実験により、この抗原を標的とした抗体が抗白血病細胞効果を持つことが確認された。CD34抗原陰性細胞分画に存在する新規白血病幹細胞の同定:急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病の計18症例について、フローサイトメーターを用いて幹細胞特性をもつ白血病細胞分画の解析を行った。その結果、病型により特徴的なパターンを示すことを明らかにした(未発表)。また、そのうちの9症例の白血病細胞をフローサイトメーターにより分取してNOGマウスへ骨髄内移植法により移植を行った。その結果、従来白血病幹細胞が限局して存在すると報告されている分画以外にも生着能力のある細胞分画を認めると同時に、CD34抗原陰性分画も生着能力を示すことがあることが確認された。ニッチシグナルを阻害する抗体の作製、及び抗体のスクリーニング:最初に、特定の細胞分画に純化しない白血病細胞を免疫し、特異的な抗体が産生されることを確認することから着手した。現在までに急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病の各1例の白血病細胞をBALB/cマウスに免疫し、リンパ節細胞を回収してハイブリドーマを作製した。これらより多数のクローンの抗体を産生した。抗体のスクリーニングを行ったところ、2例とも白血病細胞に特異性を示すクローンが得られた。それらのクローンをフローサイトメーターで単細胞分取を行い、モノクローナル抗体であることを厳格に確認している。現在、免疫沈降により抗原タンパクを分離し、質量分析を行う為の実験をすすめているところである。抗体のスクリーニングを行ったところ、急性リンパ性白血病に対する3クローンの抗体、及び慢性骨髄性白血病に対する3クローンの抗体が白血病細胞に対して特異的に反応し、有望な候補抗体であると考えている。6クローン全て改めてフローサイトメーターで単細胞分取を行い、モノクローナル抗体であることを厳格に確認している。CD3抗原陰性細胞分画に存在する新規白血病幹細胞の同定:急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病の計18症例について、フローサイトメーターを用いて幹細胞特性をもつ白血病細胞分画の解析を行った。また、そのうちの9症例の白血病細胞をフローサイトメーターにより分取してNOGマウスへ骨髄内直接移植法により移植を行った。その結果、従来白血病幹細胞が存在すると報告されている分画以外にも生着能力のある細胞分画を認めれ、またCD34抗原陰性分画も生着能力を持つことがあることが確認された。これらより急性リンパ性白血病に対する3クローン、及び慢性骨髄性白血病に対する3クローンの白血病細胞に特異的抗体を得た。作製抗体の標的抗原の同定と特性の解析:作製抗体の標的抗原を同定するために、免疫沈降により抗原タンパクを分離し、質量分析を行っている。これまでに1つの抗体クローンの標的抗原が判明した(未発表)。さらに、ヒト骨髄由来CD271+SSEA-4+ Mesenchymal Stem Cellを用いた白血病細胞との共培養実験により、この抗体が抗白血病細胞効果を持つことが観察されている。

白血病細胞の培養実験により、この抗原を標的とした抗体が抗白血病細胞効果を持つことが確認された。CD34抗原陰性細胞分画に存在する新規白血病幹細胞の同定については、予定通りの例数の実験を行うことができた。また、仮説どおりCD34抗原陰性細胞分画にも白血病幹細胞が存在する可能性が示唆される結果が得られているため順調に進行していると考える。ニッチシグナルを阻害する抗体の作製、及び抗体のスクリーニングに関しては、免疫に必要な細胞数の問題から、現在までのところ特定の細胞分画に純化しない白血病細胞を用いて抗体産生を行っている。この実験により抗体産生システムを確立し、今後、より少ない細胞数で免疫することによって抗体産生を行ってゆく必要がある。既に作製した抗体の標的抗原を同定するため、免疫沈降により抗原を分離し質量分析により同定を行う予定である。現在免疫沈降を行っているが、通常行われる標準的な手技では分離が不可能であることが分かった。そのため、方法の改善策を検討しているところである。血液内科CD34抗原陰性細胞分画に存在する新規白血病幹細胞の同定については、可能な限り移植実験の例数を増やし、これまで得られた結果の普遍性を確認する必要がある。既に作製した抗体の標的抗原を同定するための実験において、複数のクローンにおいて標準的な方法によっては免疫沈降が行えないことが判明した。理由は確定されていないが、蛋白を溶解する際に標的抗原の高次構造が崩壊していることにより抗原性が消失していること、あるいは複合体蛋白に対する抗体が得られているが蛋白溶解時に複合体が解離することにより抗原性が消失していることなどが考えられる。蛋白溶解方法などについての代替案を検討してゆく予定である。前年度は研究の進捗が予想よりも遅くなったため、使用額が当初予定されていた額より小さくとどまった。そのため前年のの未使用額がやや高額となった。当該年度は研究の進行速度が上がり、結果として前年度より使用額が上昇し、そのため通算しての当該年度の未使用額が前年度の未使用額を下回る結果となった。CD34抗原陰性細胞分画に存在する新規白血病幹細胞の同定については、可能な限り移植実験の例数を増やし、これまで得られた結果の普遍性を確認する必要がある。
多糖修飾によるアレルゲン蛋白質の抗原構造低減化と経口免疫抑制剤の開発

食餌性アレルギーやスギ花粉症などのアレルギー疾患が増加しつつあるが根本的な治療法はなく、アレルゲン除去療法、抗炎症剤などによる対症療法が行われている。本研究では「根本的なアレルギー治療」を可能にするアレルゲンに対する免疫応答そのものを低減化する方法として免疫寛容を誘導する手法を検討した。アレルゲンとしてはリゾチーム、大豆アレルゲンGly m BD 30K、スギアレルゲンCJ1をターゲットとして、これらのアレルゲン性を低減化する方法として、自然下で生じるメイラード反応を利用した多糖修飾が有効であることを確認した。また、予め多糖修飾アレルゲンを腹腔内投与したマウスはIgE抗体産生が抑制されることが示された。したがって、多糖修飾アレルゲンは投与してもアレルギー症状をおこさず、これを予め経口投与するとIgE産生を抑制できる可能性が示された。今後、ボランティアによるヒトでの実験を行う予定である。さら分子レベルでの多糖修飾によるアレルゲン構造の低減化機構を解明するために大豆アレルゲン、スギアレルゲンのcDNAを作成し、抗原構造の同定を試みた。また、モデル蛋白質としてリゾチームの遺伝子工学的多糖修飾を酵母発現系で行い、エピトープ部位の多糖修飾がアレルゲン低減化に有効であることを明らかにできた。本研究では我々が開発してきた蛋白質ー多糖複合化の茂術を用いて、食餌性アレルギーおよび花粉アレルギーの低減化にこの多糖修飾が有効であることを明らかにし、実用化の可能性を検討すること目的とした。このために、食餌性アレルゲンとして大豆アレルゲンP34およびスギアレルゲンCryj1の多糖修飾により、抗原構造をマスクし、これを経口投与することにより、IgG, IgEの産生を調べた。その結果、(1)ガラクトマンナンをアレルゲンに結合させることにより、エピトープがマスクできること、(2)マウスを用いたin vivoでの多糖修飾P34の投与がアレルゲン抑制に効果があるかどうかを検討したところ、多糖修飾したP34の投与はIgGの産生の増加をもたらすが,IgEの産生は抑制することが明らかになり、アレルゲンの多糖修飾がその低減化に極めて有効な手段であることがin vivo実験で示された。本研究は食餌性アレルギーだけでなく、スギアレルゲンの抑制にも、この手法が効果のあることを検討中である。また、遺伝子工学的なアプローチとしてP34の大腸菌発現系を確立しており、エピトープ部位を明らかにし、より効果的なアレルゲン低減化を検討している。さらに、スギアレルゲンCryj1を大腸菌や酵母で発現・分泌させるための研究も行っている。昨年度は大豆アレルゲンP34のアレルゲン構造をガラクトマンナンとメイラード型の多糖修飾により、低減化できることを明らかにした。今年度はこの手法により、スギ花粉症アレルゲンCryj1の抗原構造を多糖化によりマスクできる事を明らかにした。これと並行して、エピトープ解析に用いるために、アレルゲンCryj1のcDNAを作成し、酵母及び大腸菌での発現系を作成したが、分泌量が少量であるため、充分なデータが得られていない。現在は、多糖化Cryj1が経口免疫寛容剤として有効であるかどうかをマウスを用いて検討中である。経口免疫寛容剤として有効であるための分子基盤は(1)B細胞エピトープをマスクする(アナフィラシーを抑制)(2)T細胞エピトープを腸管免疫系で吸収しやすい構造にする(3)消化管でのプロテアーゼに対する抵抗性を有することであり、多糖修飾はこの分子基盤を満足できる。今年度後半から、人に対する効果を検討する。本研究では、多糖修飾を用いて、スギ(Cry j I)、ダイズ(Gly m Bd 30K)のアレルゲンタンパク質の抗原性・アレルゲン性を低減化し、安全な新規の寛容原の作製を目的とした。修飾多糖には天然物由来の高分子量のガラクトマンナンまたはキトサンを用い、天然に生じるメイラード反応によりタンパク質-多糖複合体を作製した。これらのタンパク質-多糖複合体とそれぞれの患者血清中のIgE・IgG抗体との結合性をELISAおよびイムノブロットにより解析した。

その結果、両アレルゲンタンパク質ともIgE抗体との結合性が大幅に減少し、IgG抗体との結合性は顕著な変化はなかった。このことは、多糖により、アレルゲンタンパク質のIgEエピトープがマスクされ、抗体との結合が阻害されたためと考えられる。またIgG抗体との結合性は残存していることから、タンパク質分子の表面は完全にはマスクされておらず、寛容原としての有効性が期待できる。さらに、マウスへの腹腔投与においては、未修飾の物に比べ、IgE抗体の産生量が低下しており、アレルゲン性の低下も示唆された。一方、分子レベルでの抗原構造低減化の機構を調査するために、遺伝子工学的に作製したニワトリリゾチームの糖鎖付加変異体を作製し、モノクローナル抗体との結合性を調査し、糖鎖付加部位および糖鎖の種類による抗原性低下率の違いについて解析した。その結果、抗体結合表面領域近傍に選択的に多糖を付加した場合において、最も効率良く結合性が低下し、多糖が抗原-抗体反応の立体障害になることにより、抗原性が低下していることが明らかになった。このように、スギ・ダイズアレルゲン蛋白質、鶏卵白リゾチームのいずれも、その抗原性が多糖修飾により効率良く低減化した。これらの結果は、多糖修飾が多くのタンパク質の抗原性低下に有効であることと、安全な寛容原を簡易に作るための新規な製法であることを示している。