hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体機能と設計分子

以上のような活動を通じて、班員の中での有意義な意見の交換と有機的な連絡がとれ、一部の新規合成探索分子は、すでに1から3班の実験に用いられている(抗腫瘍性プロスタグランジンの新規類縁体の創製、特異的探索分子の創製とその活用による脳内プロスタグランジン受容体イメージング、スルホニルウレア剤の結合蛋白質の同定)。以上のように本研究では、生命科学者と化学者の有機的連携がポイントとなっている。来年度も関連諸分野の専門家を結集し、総合的に研究を遂行するために、総括班は異分野の研究者によって構成される各班の有機的、機能的な連絡と運営ならびにそれに付随する機能探索分子の開発実験を行っていく。さらに研究期間中に生ずる新たな発見や進展に迅速に対応するために公募班員の組替えを行う。本特定領域研究では、4つの班(第1班:受容体の機能解析と個体レベルでの役割の解明。第2班:細胞内情報伝達の生理機能解析と情報分子の可視化。第3班:プロテインキナーゼを中心とする情報ネットワークの解析。第4班:標的分子の構造情報に基づく分子設計及び有機合成)が置かれ、生体情報分子を標的とする機能探索分子を用いて生体機能の解明と制御を目指した研究が遂行された。本研究の特色は、1から3班の生物分野の研究に関係する生体情報分子を標的に4班の精密分子設計および有機合成によって創製された機能探索分子が、1から3班の研究者にフィードバックされ実験に使用されていることである。本研究によりこれまで協力の機会が限られていた有機化学・構造化学と生化学・生理学・分子・細胞生物学などの学問領域が融合し、ライフサイエンスの重要課題に取り組む学際研究の基盤が構築できた。本研究を重点的、効率的に発展させ、機動的かつ弾力的な研究班の運営のために置かれた総括班では、各班で得られた成果を合同班会議(平成10年12月9日から11日まで開催)、公開シンポジウム(平成11年3月24日、第2回日本薬理学会年会)、刊行物(重点ニュースDEPCOM、2回発刊)などを通じて公表し、コンピューターネットワークを導入し情報交換を行った。以上のような活動を通じて班員同志および関連研究者との間で有意義な意見の交換、相互評価が行われ、大きな研究成果へと結実した。さらに、本研究で達成された多くの成果が新聞報道などでも取り上げられ、研究成果の社会的還元にもつながった。また、創製された探索分子の一部は試薬として市販されるに至った(一酸化窒素蛍光検出用試薬DAF)。以上のように、本研究では生物系科学者と化学者の有機的連携がポイントとなっている。本特定研究領域の成功は、今後の創薬基礎科学の推進に向けた研究体制整備の指針となるであろう。本特定領域研究は、平成9年度および平成10年度の2年間に渡って生体情報分子を標的とする機能探索分子を用いた生体機能の解明と制御を目指した研究が展開された。設定された課題(研究項目I:受容体の機能解析と個体レベルでの役割の解明。研究項目II:細胞内情報伝達の生理機能解析と情報分子の可視化。研究項目III:プロテインキナーゼを中心とする情報ネットワークの解析。研究項目IV:標的分子の構造情報に基づく分子設計及び有機合成)について、4つの研究班を設置し、関連諸分野の専門家を結集して機動的かつ弾力的に研究が遂行され、多くの成果をあげることができた。
転写因子異常による白血病発症の分子機構の解析

成人骨髄性白血病に観察されるt(11;19)(q23;p13.1)の結果MLL遺伝子とキメラを形成するMEN/ELL遺伝子をクローニングした。MENはRNAポリメラーゼII転写伸長因子であり、MLLプロモーターの制御下に異常発現することが骨髄性白血病の発症に関与している可能性がある。MENの個体レベルでの生理的な機能を解析する為に、ノックアウト・マウスを作製した。ヘテロマウスには大きさ、妊娠能力、及び全般的な発育に異常を認めなかった。ヘテロマウスを交配してホモマウスを得たが、サザン解析の結果、出世後も胎生9.5日でもホモマウスの生存は確認できなかった。着床部位の約1/4が吸収されていることから、MENノックアウト・マウスは着床後胎生9.5日までに死亡していると推測された。さらに、組織学的検討により、胎生6.5日には約1/4の胎児がすでに変性しており、胎生8.5日までに徐々に吸収されることが明らかになった。あまりに早期に死亡していた為、変性あるいは吸収胎児が本当にホモマウスであるのかどうかは決定出来なかった。しかしながら、メンデルの法則に従って約1/4の胎児が胎生6.5日で変性しており、MENノックアウト・マウスは胎生6.5日ですでに死亡していると考えられた。死因を特定することは不可能であった。以上の結果により、MENは着床後の胎児発生に必須な役割を担っており、他の転写伸長因子との機能的重複は存在しないと結論された。
三次元右室分割モデルを用いた三次元的右室部位別心機能評価のための新手法の開発

本研究では、複雑な三次元的構造を有するために従来から詳細な心機能の評価が困難であった右室に関して、三次元的右室分割モデルを用いた従来にはない右室部位別心機能評価法を確立することを目的とする。さらに、この評価法を用いて肺高血圧症例における右室機能を詳細に解析することにより、これまで充分に解明されていない肺高血圧による右室病態生理への影響を明らかにすることを目的とする。本研究の最終的な展望としては、詳細な右室部位別心機能評価法の臨床現場での実用化を目指しており、種々の原因に起因する肺高血圧症例において右室の詳細な病態把握を通して的確な治療効果判定に加え、治療効果および予後の予測が可能となるよう肺高血圧症の実臨床に貢献したいと考えている。前年度までに三次元心エコー図を基にした三次元的右室分割モデルの作成、さらにこのモデルを用いた右室部位別心機能評価手法の確立は達成できている。今年度では、この右室部位別心機能評価手法を用いて健常例および肺高血圧症例を対象とし、安静時、運動負荷時、および食餌負荷時の右室部位別心機能について検討した。また、肺高血圧症の原疾患(特発性肺動脈性肺高血圧症、膠原病、左心不全、慢性血栓塞栓性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺炎)による右室部位別心機能の差異について検討した。また、肺高血圧症の重症度と右室局所心機能との関連について検討するとともに同一症例における肺高血圧の改善あるいは増悪と右室局所心機能との関連についても検討した。さらに、薬物治療が右室部位別心機能に与える影響について検討するとともに薬物治療開始前の右室部位別心機能から薬物治療に対する反応性あるいは抵抗性が予測可能か否かについても検討した。また、観察期間中の心不全増悪に対して観察開始時の右室部位別心機能からの予測の可能性、さらに右室局所心機能による心不全増悪のリスク層別化についても検討した。本研究では、複雑な三次元的形態を有するために従来から詳細な心機能の評価が困難であった右室に関して以下の2つを研究目的とする。1)三次元右室心エコー画像をもとに三次元右室分割モデルを構築し、右室各部位における心機能を収縮能および拡張能の両面から三次元的に詳細に評価し得る三次元的右室部位別心機能評価法を開発する。2)さらに、この新手法を用いて肺高血圧症および心不全における右室各部位の心機能と予後との関連を検討し、それぞれの病態において予後不良に最も関与する右室部位を特定するとともに予後不良の予測における右室各部位のリスク層別化を確立する。当該年度は、当初の予定通り、まずは、健常者の三次元右室モデルの作成を以下の行程で行った。1)幅広い年齢層および体格の異なる健常者(男性82例、女性71例)を対象にPhilips社製iE33を用いて三次元右室心エコー画像を収集した。2)次に、各症例毎に得られた三次元右室心エコー画像から各時相毎の右室各部位の三次元位置データをX、Y、Z座標軸上の座標データとして抽出した。3)各症例毎に抽出された座標データをもとに各時相毎の三次元右室モデルを構築した。4)各症例毎に構築された三次元右室モデルを以下の手順に従って6分割し、三次元右室6分割モデルを作成した。1まず、三尖弁輪外側から右室心尖部までの右室外縁の1/2の点をA点とした。2次に、右室心尖部から肺動脈弁外側までの右室外縁の1/2の点をB点とした。3A点とB点を結ぶ線の1/2の点をC点とした。4三尖弁輪内側と肺動脈弁輪内側を結ぶ線の1/2の点をD点とした。5A点とB点を結ぶ線およびC点とD点を結ぶ線により右室を3分割した。6次に、C点において厚み方向に自由壁側と心室中隔側に2等分することにより、5で作成された3分割をそれぞれさらに2つずつに分割し、最終的に合計6分画からなる三次元右室6分割モデルを完成させた。おおむね当初の計画通り進展しているが、当初の予定より対象症例数が少なくなった。当初の予定では、健常症例男女それぞれ100例ずつを対象にする予定であったが、実際、当該年度には男性82例、女性71例しか検討できなかった。三次元右室心エコー画像からの各時相毎の右室各部位の三次元位置データの抽出に予想以上に時間を要したのが理由である。本研究では、複雑な三次元構造を有するために従来から詳細な心機能の評価が困難であった右室に関して従来にはない新たな右室心機能評価法を確立することを目的とする。本研究の最終的な展望としては、詳細な右室部位別心機能評価法の確立により肺高血圧患者での詳細な病態把握、的確な治療効果判定、および高精度の予後予測が可能となるよう肺高血圧症の実地臨床に貢献したいと考えている。本研究の工程は、以下の8つに大別される。1)まずは、健常者を対象とし、右室の三次元心エコー画像を収集する。2)得られた右室の三次元心エコー画像から各時相における右室の三次元位置データを抽出し、三次元右室分割モデルを作成する。3)作成された三次元右室モデルを用いて健常者の右室各部位における心機能を収縮機能および拡張機能の両面から詳細に評価する。4)次に、肺高血圧患者を対象とし、右室の三次元心エコー画像を収集する。

5)2)と同様の手順で三次元右室分割モデルを作成する。6)5)で作成された三次元右室モデルを用いて肺高血圧患者の右室各部位における収縮機能および拡張機能を評価する。7)肺高血圧患者における右室各部位の心機能と予後との関連を検証し、予後不良に最も関与する右室部位を特定するとともに右室各部位の心機能からみた予後不良予測のリスク層別化を確立する。8)肺高血圧症の原疾患(特発性肺動脈性肺高血圧症、膠原病、左心不全、慢性血栓塞栓性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患)による差異についても検討する。前年度において当初の予定通り上記工程の1)3)を終えることができた。当該年度においても当初の予定通り、上記の工程4)6)を実施し、肺高血圧患者での詳細な右室部位別心機能評価を行った。当該年度の最終段階では、前年度に得られた結果と合わせ、健常群と肺高血圧患者群との右室部位別心機能の比較検討を行った。おおむね当初の計画通り進展しているが、当初の予定より対象症例数が少なくなった。三次元右室心エコー画像からの各時相毎の右室各部位の三次元位置データの抽出に予想以上の時間を要したのが原因である。本研究では、複雑な三次元的構造を有するために従来から詳細な心機能の評価が困難であった右室に関して、三次元的右室分割モデルを用いた従来にはない右室部位別心機能評価法を確立することを目的とする。さらに、この評価法を用いて肺高血圧症例における右室機能を詳細に解析することにより、これまで充分に解明されていない肺高血圧による右室病態生理への影響を明らかにすることを目的とする。本研究の最終的な展望としては、詳細な右室部位別心機能評価法の臨床現場での実用化を目指しており、種々の原因に起因する肺高血圧症例において右室の詳細な病態把握を通して的確な治療効果判定に加え、治療効果および予後の予測が可能となるよう肺高血圧症の実臨床に貢献したいと考えている。前年度までに三次元心エコー図を基にした三次元的右室分割モデルの作成、さらにこのモデルを用いた右室部位別心機能評価手法の確立は達成できている。今年度では、この右室部位別心機能評価手法を用いて健常例および肺高血圧症例を対象とし、安静時、運動負荷時、および食餌負荷時の右室部位別心機能について検討した。また、肺高血圧症の原疾患(特発性肺動脈性肺高血圧症、膠原病、左心不全、慢性血栓塞栓性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺炎)による右室部位別心機能の差異について検討した。また、肺高血圧症の重症度と右室局所心機能との関連について検討するとともに同一症例における肺高血圧の改善あるいは増悪と右室局所心機能との関連についても検討した。さらに、薬物治療が右室部位別心機能に与える影響について検討するとともに薬物治療開始前の右室部位別心機能から薬物治療に対する反応性あるいは抵抗性が予測可能か否かについても検討した。また、観察期間中の心不全増悪に対して観察開始時の右室部位別心機能からの予測の可能性、さらに右室局所心機能による心不全増悪のリスク層別化についても検討した。当該年度においては三次元右室心エコー画像からの右室各部位の三次元位置データの抽出に時間を要したが、症例を重ねるごとに作業時間が徐々に短縮できているため、今後はスピードアップを図ることが可能である。また、研究補助員にはこの行程に重点的に従事してもらうようにし、多数例の三次元位置データの抽出をなるべく迅速にできるように研究体制を整備する。三次元右室心エコー画像からの右室各部位の三次元位置データの抽出に予想以上の時間を要したが、症例を重ねるごとに作業時間が短縮傾向にあり、今後はより短時間での三次元右室分割モデルの作成が可能になると思われる。
水溶性ブロック共重合体の自己組織化と機能

片末端がメトキシ基された数平均分子量5000(n=110,Mw/Mn=1.05)のポリエチレングリコールにレドックス開始剤として4価のセリウム錯体を作用させ,水酸基が結合する炭素上にラジカルを発せさせた後,NIPAモノマーを添加することで,NIPA-PEGジブロック共重合体を合成した.合成されたジブロック共重合体は,約3.5%(w/v)以上の濃度では温度の上昇に従い,ゾル状態,ゲル状態・相分離状態の3つの状態を示すことが確認された.NIPA-PEGジブロック共重合体の7.0%(w/v)水溶液のピンホール型中性子小角散乱,2結晶型中性子超小角散乱により,17°C以下の低温では,PNIPA, PEG共に重水で膨潤され,Ornstein-Zernicke型に従う溶液散乱が観察された。さらに17°Cから25°C付近において急激な散乱強度の上昇が観測され,これはNIPA鎖とPEG鎖のミクロ相分離によるものと考えられ,この温度領域でI(0)^<-1> vs 1/Tのプロットを行い,膨潤した鎖からの溶液散乱成分と相分離によるミクロドメインからの散乱成分の2成分に分離して解析を行った結果,17°Cから25°C付近において急激な散乱強度の上昇は,ゲル化の前駆現象であると考えられる.一方,30°C以上の温度領域では,NIPA鎖の脱水和により凝集したNIPAリッチドメインの微細構造を反映する散乱(q-4)が観測され,その凝集界面構造をPorodプロットから評価した.また,Mass Fractal, Surface Fractalに特徴的なベキ乗則が広い波数領域で観察された.この観測結果は,Fractal極限を考慮した散乱式(1)を用いて,定量的に解析できることが明らかになった.片末端がメトキシ基された数平均分子量5000(n=110,Mw/Mn=1.05)のポリエチレングリコールにレドックス開始剤として4価のセリウム錯体を作用させ,水酸基が結合する炭素上にラジカルを発せさせた後,NIPAモノマーを添加することで,NIPA-PEGジブロック共重合体を合成した.合成されたジブロック共重合体は,約3.5%(w/v)以上の濃度では温度の上昇に従い,ゾル状態,ゲル状態・相分離状態の3つの状態を示すことが確認された.NIPA-PEGジブロック共重合体の7.0%(w/v)水溶液のピンホール型中性子小角散乱,2結晶型中性子超小角散乱により,17°C以下の低温では,PNIPA, PEG共に重水で膨潤され,Ornstein-Zernicke型に従う溶液散乱が観察された。さらに17°Cから25°C付近において急激な散乱強度の上昇が観測され,これはNIPA鎖とPEG鎖のミクロ相分離によるものと考えられ,この温度領域でI(0)^<-1> vs 1/Tのプロットを行い,膨潤した鎖からの溶液散乱成分と相分離によるミクロドメインからの散乱成分の2成分に分離して解析を行った結果,17°Cから25°C付近において急激な散乱強度の上昇は,ゲル化の前駆現象であると考えられる.一方,30°C以上の温度領域では,NIPA鎖の脱水和により凝集したNIPAリッチドメインの微細構造を反映する散乱(q-4)が観測され,その凝集界面構造をPorodプロットから評価した.また,Mass Fractal, Surface Fractalに特徴的なベキ乗則が広い波数領域で観察された.この観測結果は,Fractal極限を考慮した散乱式(1)を用いて,定量的に解析できることが明らかになった.
骨格筋の成長に及ぼす重力負荷の効果

動物に対する重力負荷の影響を調べるため直径1.645mの生物用大型遠心機を導入した。実際には発注から納入までに予想外の時間がかかってしまい、実験を開始できたのは12月になってからであった。それまで直径80cmの遠心機を用いて予備実験を行なってきた。その結果は以下の通りである。1)孵化後3日のヒヨコを1ヶ月にわたり2xgで飼育を行なうと,前広背筋の肥大がおこった。2)肥大した筋肉ではミオシン重鎖の胎児型から成体型へのアイソフォームの転換が促進された。3)筋ジストロフィーのモデル動物であるmdxマウスを2xgで飼育すると1xgのものに比べ筋変性が促進することがわかった。4)mdxマウスの筋変性にはアポトーシスが関与していることがわかった。
先天性無痛無汗症の分子病態解析に基づく内感覚と自律神経の研究

先天性無痛無汗症(CIPA)の原因は、チロシンキナーゼ型神経成長因子受容体遺伝子NTRK1(TRKA)の機能喪失変異である。患者では、神経成長因子(NGF)依存性ニューロンであるポリモーダル受容器と交感神経節後ニューロンが欠損する。ポリモーダル受容器は、身体の内部に関するあらゆる情報をモニターする機能である「内感覚(interoception)」に重要なはたらきをする。脳は内感覚をもとに身体の恒常性を維持するが、これには交感神経による生体の調節機能が必要不可欠である。CIPAの分子病態は、NGF依存性ニューロンが、脳と身体を結ぶ神経ネットワークを形成し、生体の恒常性を維持するために重要な役割をはたすことを示す。先天性無痛無汗症(CIPA)は、温覚・痛覚を欠如し、発汗障害を伴う常染色体劣性遺伝性疾患である。私たちは、1996年にCIPAの原因をはじめて明らかにした。内感覚(interoception)は、比較的新しい生理学的感覚受容の概念で、生体の恒常性維持に重要なはたらきをする。私たちのこれまでの研究により、稀な疾患であるCIPAの分子病態を解析することで、健常者における内感覚のメカニズムを明らかにすることができる可能性が示唆された。CIPA患者では外傷・感染に対する生体防御反応が通常とは異なる経過を取る。例えば、健常者では、ヒスタミンを皮下投与した際に周囲での発赤反応(軸索反射)がみられるが、患者ではこの反応が欠如する。このことは、CIPAの分子病態を調べることで、生体の恒常性維持に重要なはたらきをしている炎症反応や神経・免疫・内分泌系の相互作用を理解する上で有用な情報が得られることを示唆する。本研究では、CIPA患者での表現型の解析を行うことで、皮膚、筋肉、関節、歯、血管、内部臓器などに関するさまざまな機械的負荷、温度変化、化学変化、代謝過程、ホルモンやサイトカインのレベルなどに対する反応や行動様式を観察する。これらの負荷や組織変化を誘起する刺激の一部は、患者にとって侵襲が大きいため許されないものもある。このため、実際にはそれぞれのCIPA患者が日常生活で経験したエピソードや病歴について、患者家族や担当医師からの情報をもとに解析を進めている。CIPAの分子病態は、この疾患のメカニズムや合併症の予防や治療に役立つだけでなく、まだ不明なことが多い健常者での内感覚のメカニズムを考察する上で、有用な情報を提供する可能性がある。先天性無痛無汗症(CIPA)の原因は、チロシンキナーゼ型神経成長因子受容体TrkAタンパク質をコードする遺伝子NTRK1の機能喪失性変異である。胎児期に神経栄養因子のひとつである神経成長因子(NGF)の受容体の機能が障害される。このため、NGF依存性ニューロンの生存・維持が障害される結果、温覚・痛覚を伝える感覚神経(ポリモーダル受容器)と交感神経ニューロンが欠損し、また中枢神経ニューロンの一部も欠損すると考えられている。ソマティック・マーカー仮説(SMH)は、アントニオ・R・ダマシオにより提唱された脳科学理論で、ヒトの推論と意思決定は身体に支えられ、適切な判断を下すためには知性だけでなく情動が必要不可欠であるとする。ソマティック・マーカー(SM)は、判断をある方向に向ける一種のバイアス装置のようなもので、その基盤は情動のプロセスにありこれから生みだされた特別な感情である。痛みは不快な感覚・情動体験と定義されるが、SMの形成過程にも大きく影響する。SMHでは、心的活動は間断なく状態が変化する身体と脳との相互作用に依存していること、また身体を考慮せずに情動や感情も合理的意志決定も説明できないとされる。これまで、SMHの基盤となる神経とNGF-TrkAシステムとの関連については言及されていない。本研究では、新しい生理学的感覚受容の概念で生体の恒常性維持に重要なはたらきをする内感覚(interoception)とSMHの関連について解析を行っている。CIPAへの分子病態をもとに、NGFが内感覚神経と交感神経の生存・維持に必須であることが判明した。また、NGF依存性ニューロンが、SMHにおいて身体と脳との相互作用に必須なはたらきをする神経ネットワークを構成することが示唆された。このことは、将来的には、痛みと恒常性維持との関連、さらに情動と慢性疼痛の関連についても新たな視点を提供する可能性がある。神経成長因子(NGF)は、感覚神経と交感神経の生存・維持に必要不可欠なはたらきをする神経栄養因子である。NGFは、痛みと痒みに関連する炎症性メディエイターとしても機能する。先天性無痛

無汗症(CIPA)は、温覚・痛覚と発汗機能を欠如し精神遅滞を伴う常染色体劣性遺伝性疾患である。その原因はチロシンキナーゼ型神経成長因子受容体TrkAをコードする遺伝子NGF、K1の機能喪失性変異である。患者ではNGF依存性ニューロンである侵害受容ニューロンと交感神経節後ニューロンが欠損する。また、中枢神経ニューロンの一部も欠損すると考えられている。侵害受容ニューロンは、AδとC線維を有し、種々の生体反応をモニターしてその情報を脳に伝えるポリモーダル受容器でもあり、内感覚(interoception)に関与することで、交感神経ニューロンとともに生体の恒常性維持や防御反応に重要な役割を果たす。水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)は、水痘に罹患した後に、宿主の感覚神経後根神経節に潜伏すると考えられている。その後、宿主の免疫状態に依存して、帯状疱疹を発症することがある。さらに、帯状疱疹後神経痛と呼ばれる神経障害性疼痛を発症することもある。VZVがどのような感覚神経に潜伏するかについては必ずしも明確ではない。興味深いことに、CIPA患者の中には、NGF依存性ニューロンが欠損しているにも拘わらず、帯状疱疹に罹患する例がある。しかし、患者は痛みや痒みの感覚を欠如している。また、帯状疱疹後神経痛もみられない。以上から、ヒトではVZVが、NGF依存性ニューロン以外の感覚神経へ潜伏して、帯状疱疹や帯状疱疹後神経痛を発症する可能性が示唆される。このことは、VZVが感覚神経に潜伏するメカニズムや帯状疱疹の発症機構を解明する上で、さらに帯状疱疹後神経痛の治療法を考える上で有用な情報を与えてくれる。
α-Synuclein代謝異常と酸化的ストレス-特にヘム異化系との関連

今年度は以下の4点を検討した。1)アルツハイマー病脳でのHO-1分布とtau蛋白の関連。2)tau蛋白が病的epitope(Alz50)を獲得する条件。3)HO-1過剰発現の細胞に対する影響。結果は以下の通りである。1)HO-1の発現分布はリン酸化tau発現細胞の一部(10%程度)であり、Alz50陽性細胞と一致していた。以上から、以下の諸点を考察した。アルツハイマー病脳内において、Alz50-epitopeの分布とHO-1分布が一致、かつAlz50-epitopeが過酸化脂質(HNE)の曝露によりリン酸化されたtauから生じる事実から、HO-1発現はtau蛋白の病的修飾過程と密接に関連していることが示唆された。HNEはLysineを介して蛋白を化学修飾するが、一方BilirubinもLysine残基を介して蛋白と結合することが知られている。HO-1過剰発現実験の結果と併せて、ヘム異化系はtauの病的変化を抑制し、神経保護的に働いている可能性がある。パーキンソン病中脳黒質細胞でもHO-1は発現増大しており、現在α-synucleinとの関連を検討している。
心筋細胞における癌抑制遺伝子の機能解明に関する研究-細胞周期と分化のネットワーク機構の解析-

ヒト大動脈由来血管平滑筋細胞におけるがん抑制遺伝子Rb及びp53の機能解析の結果、p53及びRbが細胞周期を負に調節していることが明らかになった。また、Rbの機能喪失による細胞周期進展時にはp53の存在によりアポトーシスが引き起こされるため、細胞数の増加を認めなかった。このp53によるアポトーシス誘導は、bc1-2ではなく、baxによるものであることも明らかにした。更に、ラット頸動脈へのp53アンチセンス導入により新生内膜形成を認め、生体内でもp53の異常が動脈硬化形成に関係していることも明らかになった。興味深いことに、血管新生因子VEGFの発現誘導もp53アンチセンス導入時に認め、p53が細胞周期進展による細胞増殖と血管新生を繋ぐ重要な因子であることも明らかになった。更に、心筋細胞では癌抑制遺伝子であるp53及びRb遺伝子の存在や機能が不明であるので、まず培養心筋細胞を用いてこれら癌抑制遺伝子群が存在しうるかを検討した。その結果、p53はラット成熟個体において非常に高いレベルで発現していること、Rbの発現量は平滑筋細胞に比べ少ないことなどを見いだした。更に、ラット心臓へp53に対するアンチセンスオリゴを投与した結果、1)心筋細胞のDNA合成の増加が見られること、しかし、2)心筋細胞の分裂は見られず、p53の減少だけでは心筋細胞の再生には不十分であること、が明らかになった。これらの結果は血管平滑筋とは異なっており、心筋細胞独自の細胞周期調節機構が存在する可能性が考えられた。現在更に心筋細胞の細胞周期抑制を検討している。まずヒト大動脈由来血管平滑筋細胞を用いてがん抑制遺伝子Rb及びp53の機能解析を行った。平滑筋細胞のp53及びRbに対するアンチセンスオリゴ投与により、p53及びRbの蛋白発現が特異的に減少し、p53アンチセンス単独及びRbアンチセンス単独投与によりDNA合成の増加が認められた。一方、細胞数に関しては、p53アンチセンス単独及びp53とRbアンチセンスの共導入においては細胞数の増加が認められたが、Rbアンチセンス単独では細胞数の変化は認められなかった。この結果は、Rbの機能喪失による細胞周期進展時は、p53の存在によりアポトーシスが引き起こされるためであることが明らかになった。また、p53存在によるアポトーシス誘導は、bc1-2ではなく、baxによるものであることも明らかにした。このことにより、血管平滑筋細胞増殖制御には、癌抑制遺伝子p53及びRbが密接に関与しており、p53の異常が動脈硬化形成に関係していることも明らかになった。その結果、p53はラット成熟個体において非常に高レベルで発現していること、Rbの発現量は平滑筋細胞に此べ少ないことなどを見いだした。現在更に心筋細胞の細胞周期制御を検討している。
有機EL燐光材料の単一分子レベルでの発光研究

本研究では、単一分子分光法を用いて燐光発光材料であるイリジウム錯体の光物性を1分子レベルで研究した。代表的なイリジウム錯体Ir(ppy)_3の単一分子レベルでの燐光の発光強度、発光継続時間を測定した結果、一般の蛍光色素に比べて幅広い発光強度分布及び非線形的フォトブリーチング特性を持つことが分かった。これらの原因としては錯体の構造の歪みや配位子の化学的劣化による吸収断面積の違いが生じると考えられる。この点を明確するために一個の配位子の異なる錯体Irfppy(ppy)_2を合成し、単一分子の発光観察を行った。結果として、アルデヒド基の付いた配位子のみから発光するIrfppy(ppy)_2も幅広い強度分布を示したからIr(ppy)_3もPMMA中で構造が歪む、その結果3つの配位子のエネルギー準位に違いが生まれ、安定な配位子から発光している可能性が考えられる.一方、ピコ秒レーザと時間相関単一フォトン計数の方法を用いてイリジウム錯体Ir(ppy)_3の励起状態緩和をアンサンブル及び単一分子レベルで調べた。アンサンブルレベルでは通常の1.1μs寿命が得られた。しかし、試料の濃度を薄くするとともに、1.1μs寿命の他に3nsの短い寿命成分が表れた。励起光の周波数依存性測定の結果で、レーザパルスの間隔が長くなると短い成分の割合が増える。即ち、短い成分の原因が基底状態からの吸収過程であることが分かった。励起光の強度依存性で短い成分が二次関数的、長い成分が一次関数的に増えたから、短い成分の原因が二光子吸収であると考えられる。一光子励起と二光子励起の単一分子イメージングを行ったところ、488nmの励起光を用いて発光を370と450nmの間で検出したときの1分子イメージが、一光子励起メージとほぼ同じであった。二光子励起が配位子中心のπ-π^*遷移である。二光子励起後、エネルギーがπ^*から内部転換で^1MLCT状態に落ち、そこから寿命の短い蛍光が発光することが明らかになった。本研究の目的は、単一分子分光法を用いて燐光発光材料であるイリジウム錯体の光物性を研究する。研究は2つの段階に分けられる:1.フォトルミネセンスによるイリジウム錯体の光学特性を単一分子レベルで調べる。2.イリジウム錯体を用いてEL素子を作成し、イリジウム錯体の単一分子を電荷の再結合により励起し、その発光の特性が目的1で得られた特性とどのような関係があるかを調べる。本年度は第1の段階から初めた。最初は励起状態の寿命を測定するため走査型共焦点顕微鏡を作成した。以前使った単一分子分光用走査型共焦点顕微鏡を基にして励起光の光源をピコ秒レーザに変え、試料の発光信号に検出器としてアバランシェフォトダイオード(APD)を用い、検出器の信号をデータ処理用パソコンカードに入力し時間相関単一フォトン計数の方法による励起状態寿命を測れるようになった。現在、イリジウム錯体のバルク試料の用いて、装置のテストを行っているところである。

一方、これまでの実験でCCDによるIr(ppy)_3の単一分子レベルでの燐光の発光強度、発光継続時間を測定した結果、一般の蛍光色素に比べて幅広い発光強度分布を持つことが分かった。これらの原因としては錯体の構造の歪みや配位子の化学的劣化による吸収断面積の違いが生じると考えられる。この点を明確するために一個の配位子の異なる錯体Irfppy(ppy)_2を合成し、Irfppy(ppy)_2や構造の似た蛍光発光錯体Alq_3を用いて単一分子の発光観察を行った。結果として、アルデヒド基の付いた配位子のみから発光するIrfppy(ppy)_2も幅広い強度分布を示したからIr(ppy)_3もPMMA中で構造が歪む、その結果3つの配位子のエネルギー準位に違いが生まれ、安定な配位子から発光している可能性が考えられる。本研究の目的は、単一分子分光法を用いて燐光発光材料であるイリジウム錯体の光物性を1分子レベルで研究する。最初は励起状態寿命を測定するため走査型共焦点顕微鏡を作成した。光源にピコ秒レーザ、検出器にアバランシェフォトダイオードを用い、時間相関単一フォトン計数の方法による励起状態寿命を1分子レベルで測れるようになった。イリジウム錯体Ir(ppy)_3の励起状態緩和をアンサンブルレベルと単一分子レベルで調べた。アンサンブルレベルでは通常の1.1μs寿命が得られた。しかし、試料の濃度を薄くするとともに、1.1μs寿命の他3nsの短い寿命成分が表れ、1分子レベルではこの短い成分が非常に強かった。寿命の短い成分の原因を調べるため励起光の周波数依存性を測った。レーザパルスの間隔が大きくなると短い成分の割合が増えることが分かった。そのため、短い成分の原因が励起状態の吸収や誘導放出ではなく、基底状態からの吸収過程である。励起光の強度依存性から、短い成分が二次関数的に増え、長い成分が一次関数的に増えることが分かった。従って、短い成分の原因が二光子吸収の可能性が高い。それを確認するために、一光子励起と二光子励起の単一分子イメージングを行った。488nmの励起光を用い、発光を370と450nmの間で検出したときの1分子イメージが一光子励起の1分子イメージとほぼ同じであったため、二光子励起が確実に行っていることが分かった。二光子励起が配位子中心のπ-π^*遷移である。二光子励起後、エネルギーがπ^*から内部転換で^1MLCT状態に落ち、そこから寿命の短い蛍光が発光することが明らかになった。
間質液排泄機構にかかわる血管内皮グリコカリックスの機能解析

正常時に血管内に存在するグリコカリックスは炎症により障害され、血管透過性亢進が生じる。この中で浮腫により開大した血管外腔の周辺組織表面を覆うように薄いグリコカリックス層が出現することを確認した。この現象は、グリコカリックスが血管外に漏出し、血管外腔周辺組織にグリコカリックスが付着した状態と考えられ、間質に漏れ出した水分がグリコカリックスと血管外組織により構成される水路を通ってリンパ管へ排出される代償機構であると仮定した。本研究では、この血管外に生じたグリコカリックスの由来と役割を明らかにし、浮腫改善による臓器障害抑制を目的とした治療を開発する。
ダイコンの種子生産性向上：一莢粒数を制御する遺伝子領域の同定

本申請ではインドやタイなどで栽培されるサヤダイコンの一莢粒数(多粒性)に着目し、その遺伝性の解明とそれを支配する染色体領域の同定を行う。具体的には、高密度連鎖地図に基づいた遺伝解析を実施することで候補領域の絞り込みを行うとともに、種子数に対する母性効果の確認、来歴の異なるサヤダイコン系統を用いた遺伝解析を並行して行うことにより、多粒性に関与する遺伝子座数の推定ならびにそれらの集積効果について検証する。
周産期脳障害に対する骨髄幹細胞を用いた新規治療開発

周産期低酸素性虚血性脳症に対する新規治療法の開発は急務である。本研究では、周産期脳障害に対して最も理想的な幹細胞源と考えられる骨髄単核球を用いた治療法開発への基礎研究を行った。まず、骨髄単核球の採取、調製、また、外頸静脈からの静脈内投与方法を確立させた。投与後の動態評価では、骨髄間葉系細胞に比べ肺への集積は少なく、肺塞栓のリスクは低いと考えられた。また、骨髄単核球を投与すると急性期のアポトーシスを抑制し、能動回避学習試験において、回避率が改善する傾向を認めた。本研究課題の最終目標は、周産期低酸素性虚血性脳症(HIE)に対し、理想的な幹細胞源である骨髄単核球および骨髄間葉系幹細胞による治療法を開発することである。今年度は、昨年度治療効果を確認できた臍帯血幹細胞を用いた治療に関してのさらなる行動評価、および、骨髄単核球(BM-MC)/骨髄間葉系幹細胞(BM-MSC)投与後の動態に関して検討した。周産期HIEモデルは、国際的に汎用されているRice-Vannucciモデルを用い、ラットの新生仔で作製した。凍結保存した臍帯血を解凍し、低酸素虚血負荷6時間後に、1×107個の細胞を腹腔内投与した。低酸素虚血負荷後2週間後に行ったCatwalk XTによる歩行解析では、患側の麻痺が臍帯血幹細胞投与により改善することがわかった。BM-MCに関しては、生後3週齢のラット大腿骨および脛骨から採取した細胞を、Ficoll法を用い単核球分画に分離した。BM-MSCは、BM-MCからの培養により得た。BM-MSC、あるいは、BM-MCを細胞膜のみに染色される蛍光色素(DiR)でラベルし、低酸素虚血負荷した生後7日齢のラットの外頸静脈から1×105個投与した。その後の体内動態を4週間後まで経時的にIVIS Imaging Systemにて評価したところ、両細胞とも投与後2日をピークに、肝臓を中心に多臓器において検出され、その後徐々に減少した。BM-MSCでは、肺への集積も多く認められた。両細胞とも脳内では検出できなかった。また、観察期間において死亡したラットはいなかった。今年度は、骨髄単核球(BM-MNC)の静脈内投与による治療効果を検討した。生後7日目の新生仔ラットの片側頸動脈を2重結紮切離し、その後8%低酸素負荷を60分行い、片側の梗塞モデルを作製した。BM-MNCに関しては、生後3週齢のラット大腿骨および腓骨から採取した細胞を、Ficoll Paque法を用い単核球分画に分離した。低酸素虚血負荷6時間、あるいは24時間後に外頸静脈から1×10^5個投与した。その24時間後、active caspase 3陽性細胞数を免疫組織学的に、また、3週間後より行動学的検討を行った。今後、他の急性期傷害マーカーの検討と詳細な行動評価が必要である。今年度は、臍帯血幹細胞による周産期HIEに対しての効果の確認、および骨髄幹細胞の細胞採取法の確立を行った。臍帯血採取は、帝王切開にて出生したヒト新生児の臍帯クランプ切離後、胎盤側より採血バックを用いて行った。Ficoll Paque法を用い単核球分画にし、使用まで液体窒素下に保存した。凍結保存した臍帯血を解凍し、低酸素虚血負荷6時間後に、5×106個の細胞を腹腔内投与した。低酸素負荷後24時間後に、抗active-caspase-3抗体により、アポトーシス細胞数をコントロール群と比較したところ、海馬においてアポトーシスが抑制されていた。また、抗4-Hydroxy-2-Nonenal抗体を使用し、酸化ストレスに及ぼす影響を調べたところ、細胞投与群では、海馬における酸化ストレスを抑制することがわかった。さらに、負荷後3週間後に行ったshuttle avoidance testによる学習障害の評価でも、臍帯血幹細胞投与により障害を軽減することが明らかとなってきている。

骨髄幹細胞採取に関しては、生後3週齢のラット大腿骨および腓骨から採取した細胞を、Ficoll Paque法を用い単核球分画に分離した。採取した細胞において顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞(GFU-GM)数を評価し、細胞の質が問題無いことを確認した。昨年度、ラット骨髄幹細胞採取の安定した系を確立するのに予定よりも時間がかかり計画が遅れてしまったが、その遅れを未だ取り戻せていない。また、本研究での細胞投与方法は、より臨床応用しやすい静脈内投与を選択しているが、その確立に予定より時間がかかってしまった。骨髄幹細胞採取のより安定した系の確立に時間がかかり、実験計画が遅れたが、比較的若年齢のラットを用いることにより確立することができた。今年度は、確立されたモデル、細胞採取/調製/培養、投与方法を用い、骨髄単核球による周産期HIEに投与する治療効果を検討する。細胞死を含む各種マーカーの動きを免疫組織学的に確認し、さらに、行動評価にて学習障害、運動障害の改善を確認する。また、骨髄間葉系幹細胞に関しても同様な検討を行う。臍帯血幹細胞を用いた治療に関して、さらなる行動評価を行う予定である。骨髄細胞に関しては、確立された方法で採取した骨髄単核球を周産期HIEモデルラットに投与し、細胞死を含む各種マーカーの動きを免疫組織学的に確認する。さらに行動評価にて学習障害、運動障害の改善を確認する。当初の予定の通り、実験動物、抗体などの免疫関連試薬、細胞培養に使用する薬品などに用いる。また、血管新生を評価するために、他の研究課題との共用設備として、2次元画像レーザー血流計の購入を検討している。その際は、本年度の予算の一部を充てる予定である。より詳細な免疫組織学的検討のため、現在使っている顕微鏡システムに電動ステージが必要なことがわかった。本年度の予算の一部をこの購入に充てる予定である。
チラコイド膜を構成する主要糖脂質の生合成機構とその葉緑体形成における役割

葉緑体のチラコイド膜に含まれる脂質のうちの50%近くはmonogalactosyldiacylglycerol(MGDG)と呼ばれる葉緑体に特徴的な糖脂質である。MGDGは、葉緑体の包膜でMGDG合成酵素と呼ばれる糖転移酵素によりdiacylglycerolとUDP-galactoseを基質として生合成される。本研究では、チラコイド膜の構築のメカニズムを、これまで研究が全くなされていなかった膜脂質構築の観点から新たに解析し、1.チラコイド膜構築時におけるMGDG合成酵素の制御メカニズムの解明、2.チラコイド膜糖脂質が果たす生理的役割の解明、の2点を主な目的として研究を行った。結果1.シロイヌナズナおよびタバコから単離したMGDG合成酵素遺伝子をセンスおよびアンチセンスの向きでアグロバクテリウムのバイナリーベクター中のT-DNA(転移DNA)領域に組み込み、形質転換に用いるためのベクターを作製した。MGDG合成酵素遺伝子を組み込んだアグロバクテリウム調製し、減圧浸潤法あるいはリーフディスク法により、成熟個体に導入した。この操作を行った個体を、22°Cで23週間栽培し、収穫した種を抗生物質を含む培地中で選抜した。得られた抗生物質耐性の形質転換体の中から目的遺伝子の導入の起こったものをPCRを用いて確認した。以上の実験から、チラコイド膜糖脂質が果たす生理的役割の解明に向けての、形質転換体の作製に成功したと考えている。2.シロイヌナズナに、2種の異なるMGDG合成酵素が存在することを明らかにし(MGDA、MGDB)、それぞれのcDNA、ゲノム遺伝子を単離した。また、2つの遺伝子の発現が大きく異なることをCompetitive RT-PCRの手法を用いて明らかにした。この結果から、MGDAはプラスチド、特に葉緑体の形成過程にMGDGの合成を主要に担う遺伝子であることが明らかになったが、MGDBは、花芽特異的に発現していることが分かった。葉緑体のチラコイド膜に含まれる脂質のうちの50%近くはmonogalactosyl-diacylglycerol(MGDG)と呼ばれる葉緑体に特徴的な糖脂質である。結果1.キュウリ子葉の葉緑体形成時におけるMGDG合成酵素mRNAの発現をRNAase protection assay法で解析し、MGDG合成酵素のmRNAの発現レベルが光に呼応して一過的に増大することを見いだした。またキュウリゲノム遺伝子ライブラリから、MGDG合成酵素のゲノム遺伝子を単離し、転写開始点の5`上流域の遺伝子構造の解析を行った。2.MGDG合成酵素はその活性発現においてホスファチジン酸等の酸性膜脂質の存在が不可欠である。そこで、MGDG合成酵素を大腸菌で発現させ、酸性膜脂質による活性化機構の生化学的解析を行うため、大腸菌で発現させたMGDG合成酵素の精製法を確立した。

3.植物における糖脂質の機能を、糖脂質の含量を人為的に転換した形質転換植物を用いて明らかにするため、形質転換が容易なモデル植物であるシロイヌナズナ、タバコよりMGDG合成酵素を新たにクローニングした。葉緑体のチラコイド膜に含まれる脂質のうちの50%近くはmonogalactosyl-diacylglycerol(MGDG)と呼ばれる葉緑体に特徴的な糖脂質である。MGDGは、葉緑体の包膜でMGDG合成酵素と呼ばれる糖転移酵素によりdiacylglycerolとUDP-galactoseを基質としで生合成される。本研究では、チラコイド膜の構築のメカニズムを、これまで研究が全くなされていなかった膜脂質構築の観点から新たに解析し、1.チラコイド膜構築時におけるMGDG合成酵素の制御メカニズムの解明、2.チラコイド膜糖脂質が果たす生理的役割の解明、の2点を主な目的として研究を行った。結果1.シロイヌナズナおよびタバコから単離したMGDG合成酵素遺伝子をセンスおよびアンチセンスの向きでアグロバクテリウムのバイナリーベクター中のT-DNA(転移DNA)領域に組み込み、形質転換に用いるためのベクターを作製した。MGDG合成酵素遺伝子を組み込んだアグロバクテリウム調製し、減圧浸潤法あるいはリーフディスク法により、成熟個体に導入した。この操作を行った個体を、22゚Cで23週間栽培し、収穫した種を抗生物質を含む培地中で選抜した。得られた抗生物質耐性の形質転換体の中から目的遺伝子の導入の起こったものをPCRを用いて確認した。以上の実験から、チラコイド膜糖脂質が果たす生理的役割の解明に向けての、形質転換体の作製に成功したと考えている。2.シロイヌナズナに、2種の異なるMGDG合成酵素が存在することを明らかにし(MGDA、MGDB)、それぞれのcDNA、ゲノム遺伝子を単離した。また、2つの遺伝子の発現が大きく異なることをCompetitive RT-PCRの手法を用いて明らかにした。この結果から、MGDAはプラスチド、特に葉緑体の形成過程にMGDGの合成を主要に担う遺伝子であることが明らかになったが、MGDBは、花芽特異的に発現していることが分かった。これは、MGDGの主要な存在部位が葉緑体チラコイド膜であることと相反しており遺伝子の機能を考える上で興味深い。
溶融塩電解法によるCVD用無機フッ化物の合成に関する研究

今年度に行った研究によって得られた新たな知見、成果は次のとおりである。(1)溶融KF-HF-NH_4F系浴に(NH_4)_2WO_4を0.3mol%溶解させて調製した電解浴を120°Cで、炭素電極を用いて100時間以上電解したところ、NF_3が生成し、同時にO_2も同程度の量生成した。したがって添加物質が電解フッ素化されていることは明らかであったが、WF_6は遊離した形では得られなかった。(2)陽極生成ガスのみならず、陰極生成ガスの電流効率の経時変化を測定すると、いずれも約80%であり、電解初期には陽極生成ガスの電流効率が、電解後半では、陰極電流効率が上回った。(3)再度、陽極生成ガスおよび陰極生成ガスの電流効率の経時変化を求めたところ、70万クローン(200時間)通電後に両者は一致し、その値は約60%であった。(4)200時間電解を続けても、添加物質に含まれている酸素のわずか27.6%がフッ素に変換されたにすぎず、したがって、添加物質またはそれから生じた錯イオンはオキシフルオロ錯塩または錯イオンの形態で電解浴中に留まっているのであろう。(5)比較的短時間の電解で添加物中の酸素を除去し、完全フッ化物を生成するためには、陽極室と陰極室を隔膜で仕切る必要がある。(6)フッ素系樹脂でできたイオン交換膜(ナフィオン315、ナフィオン117など)は、膜抵抗が大きすぎるため、隔膜としては不適当である。(7)テフロン繊維製フィルター(ポリフロンフィルター)は、本系溶融塩電解浴中でも隔膜として十分使用できることがわかった。1.今年度に行なった研究によって得られた新たな知見、成果は次のとおりである。(1)溶融N【H_4】F・2HF浴あるいは浴融N【H_4】F・HF浴を用いると、ガス導出管や氷冷トラップにN【H_4】Fが凝縮したり、炭素電極が崩壊したりするため、本研究用の電解浴としては不適当であることがわかった。(2)溶触KF・2HF浴に【(NH_4)_2】Ta【F_7】を添加した場合の炭素電極上では、フッ化物イオンの放電反応に加えて、【(NH_4)_2】Ta【F_7】のアンモニウムイオンの電解フッ素化反応と、陰極において化学反応により生成したタンタルの低原子価塩の酸化反応が起こっている。(3)溶融KF・2HF浴に【(NH_4)_2】NbO【F_5】を添加した場合の炭素電極上では、フッ化物イオンの放電反応、【(NH_4)_2】NbO【F_5】のアンモニウムイオンの電解フッ素化反応のほかに、【(NH_4)_2】NbO【F_5】自身も陽極酸化に関与する反応が起こっている。(4)120°Cにおける溶融KF・2HFへの【(NH_4)_2】Ta【F_7】または【(NH_4)_2】NbO【F_5】の溶解度は、それぞれ、約0.2mol%または約1mol%であった。2.今後の研究に関する計画は次のとおりである。(1)溶融KF・2HF浴に【(NH_4)_2】W【O_4】や【(NH_4)_2】Mo【O_4】を添加し、炭素電極を用いて電流密度(i)-電位(E)曲線を求める。(2)溶融KF・2HF+N【H_4】F浴に【(NH_4)_2】W【O_4】や【(NH_4)_2】Mo【O_4】を添加し、炭素電極を用いて電流密度-電位曲線を求める。(3)溶融KF・HF浴に【(NH_4)_2】W【O_4】や【(NH_4)_2】Mo【O_4】を添加し、炭素電極を用いて電流密度-電位曲線を用める。(4)それぞれの場合について定電流電解し、陽極生成ガスなどの分析を行ない、電流密度-電位曲線測定結果と合わせてW【F_6】やMo【F_6】の生成反応機構を解析する。1.今年度に行った研究によって得られた新たな知見,成果は次のとおりである.(1)120゚Cにおける溶融KF・2HFへの(NH_4)_2WO_4または(NH_4)_2MoO_4の溶解度は,いずれも約1.2mol%であった.(2)炭素電極上でのサイクリックボルタンモグラムにおいて, (NH_4)_2WO_4は2.8VvsPT, (NH_4)_2MoO_4は3.0Vvs.PTに電流ピークがあり,その値は,いずれも,添加物質濃度に依存した.(3)表面にフッ化物被膜が生成した炭素電極上での臨界電流密度は, (NH_4)_2・WO_4または(NH_4)_2MoO_4の添加濃度につれて増大した.(4)(NH_4)_2WO_4または(NH_4)_2MoC_4の添加濃度につれて,陰極反応である水素発生反応の電流効率が低下した.

(5)定電位電解によって得られた陽極ガスの成分は,いずれの場合にも同じで,それは, N_2, O_2, NF_3,CF_4,CO_2,N_2Oであった.(6)以上の結果から, (NH_4)_2WO_4または(NH_4)_2MoO_4のいずれの場合にも, NH_4^+の電解ふッ素化反応の他に,それぞれ, WF^<2x>O_<4-x>^<2->またはMoF_<2x>O_<4-x>^<2->(1≦X≦4)などの高分子価イオンが対流・拡散によって陰極に輸送されて陰極で還元され,また,生成した低原子価イオンは陽極で再酸化される反応も起こっていることがわかった.2.今後の研究に関する計画はD2次のとおりである.(1)陽極ガス中に酸素が認められなくなるまで定電位電解を続け、WF_6またはMoF_6が気体として生成するか否かを確認する。(2)WF_<6_およびMoF_6>の生成反応機構を解析する。今年度に行った研究によって得られた新たな知見、成果は次のとおりである。(1)溶融KF-HF-NH_4F系浴に(NH_4)_2WO_4を0.3mol%溶解させて調製した電解浴を120°Cで、炭素電極を用いて100時間以上電解したところ、NF_3が生成し、同時にO_2も同程度の量生成した。したがって添加物質が電解フッ素化されていることは明らかであったが、WF_6は遊離した形では得られなかった。(2)陽極生成ガスのみならず、陰極生成ガスの電流効率の経時変化を測定すると、いずれも約80%であり、電解初期には陽極生成ガスの電流効率が、電解後半では、陰極電流効率が上回った。(3)再度、陽極生成ガスおよび陰極生成ガスの電流効率の経時変化を求めたところ、70万クローン(200時間)通電後に両者は一致し、その値は約60%であった。(4)200時間電解を続けても、添加物質に含まれている酸素のわずか27.6%がフッ素に変換されたにすぎず、したがって、添加物質またはそれから生じた錯イオンはオキシフルオロ錯塩または錯イオンの形態で電解浴中に留まっているのであろう。(5)比較的短時間の電解で添加物中の酸素を除去し、完全フッ化物を生成するためには、陽極室と陰極室を隔膜で仕切る必要がある。(6)フッ素系樹脂でできたイオン交換膜(ナフィオン315、ナフィオン117など)は、膜抵抗が大きすぎるため、隔膜としては不適当である。(7)テフロン繊維製フィルター(ポリフロンフィルター)は、本系溶融塩電解浴中でも隔膜として十分使用できることがわかった。
脳静脈血行障害の発展過程解明と治療法開発に関する基礎的・臨床的研究

今回、ラット慢性脳静脈圧亢進モデルを作成し慢性脳静脈圧亢進状態の微小循環動態について検討した。雄ラット(n=16)を用いて、全身麻酔下に右総頚動脈と右外頚静脈を端々吻合し、Iaser Doppler"scanning"法で、吻合前・後および二週間後の吻合部結紮前・後に脳表25カ所の局所脳血流(ICBF)と局所脳血液量(ICBV)を測定した。rCBFとrCBVは、それぞれ25データの中央値を用いた。ラットは、以下の2群に分類した;1)A群(n=6):単純右総頚動脈結紮群、2)B群(n=10):右総頚動脈-外頚静脈端々吻合群。その結果、A群の両側半球およびB群の左側半球のrCBF、rCBVの有意な変化はみられなかった。一方、B群の右側半球(頚動脈-外径静脈吻合側)では、吻合前後でrCBF、rCBVに変化はみられなかったが、二週間後のrCBFは有意に低下し(P<0.05)、rCBVは有意に上昇した(P<0.05)。その後、吻合部を結紮すると、即座にrCBFは上昇し(P<0.05)、rCBVは低下した(P<0.05)。一側総頚動脈-外頚静脈吻合モデルは、慢性脳静脈圧亢進状態による虚血(venous ischemia)のモデルとして有用であり、慢性脳静脈圧亢進状態においては、動静脈短絡を閉鎖することによりすみやかに脳潅流圧が上昇し、CBFが改善されることが実験的に証明された。本研究の目的は、脳静脈血行障害の発展過程解明と治療法開発である。今回は、脳静脈潅流障害時の脳血流を高張食塩水を用いたSmall Volume Resuscitation(SVR)法を用いて、脳静脈潅流障害の治療法を検討した。Wistar ratを用いて、自発呼吸下に開頭を行った後、蛍光血管撮影・血液ガス測定・scanning法を用いて36(6x6)箇所の脳血流の測定を行った。光過敏性色素による脳静脈2本閉塞モデルを用いて、蛍光血管撮影にて閉塞確認後、以下の各群の処方を行った。(1)SVR群;7.5%Nacl+10%hydroxyethyl starch(HES),4ml/kg i.v.(2)HES群;10%HES,4ml/kg i.v.(3)Nacl群;0.9%Nacl,4ml/kg i.v.。scanning法を用いて36(6x6)箇所の脳血流測定を120分間行い、48時間後にratをsacrificeし、その脳障害を組織学的に検討し、各群の梗塞範囲を定量的に比較した。その結果、SVR群は、HES群およびNacl群と比較し体血圧および脳血流は有意に改善し、梗塞範囲もSVR群1.5±0.1mm^2、HES群3.2±0.5mm^2、Nacl群4.8±0.6mm^2と有意な改善をみた(P<0.05)。以上より、SVRは脳血流を上昇させることにより、脳静脈潅流障害に対して抗脳梗塞作用を持つことが実験的に証明された。今回は、脳静脈潅流障害におけるC1-esterase inhibitor(C1-INH)の有用性に関して検討した。