hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天然林の資源把握・環境モニタリングに関する研究

1.天然林の資源・環境管理と地理情報システム(GIS)森林資源情報,森林管理情報,地沢情報のような数値情報と,森林基本図,林相図,土壌図などの図形情報から成る地理情報システムを作成し,このGIS情報と現地情報,リモ-トセンシング情報との照合を行った。2.資源・環境モニタリングの設計とその天然林への応用秩父演習林の森林については,1984,1987,1988年の3時期のランドサット・TMデ-タを用いてCVA(Change Vector Analysis)解析を行った結果,国道開設に伴う森林伐採箇所や河川の埋め立て地を検出することができた。また,北海道演習林の天然林を対象に,テクスチャ-解析により林型区分を行ったところ,この手法が樹冠疎密度区分に有効であることが確認された。さらに,1990年に撮影されたSPOTのパンクロマチックデ-タ(解像度10m)とマルチスペクトルデ-タ(解像度20m)をRGBーHRV変換を使って合成し,5万分の1のカラ-衛星画像マップを作成した。この図では,広大な演習林の森林状態が詳細に表現されており,誰にでも森林環境を把握することが可能である。3.残された問題点と今後の課題技術的には,雲や影による衛星情報の損失の問題,各センサの特質の解析などがある。また,資源調査、環境モニタリングシステムを森林管理の中核に位置づけるための,体制づくりとものの見方の転換が必要である。1.現地調査昭和63年7月に、東京大学北海道演習林において天然林の林分構造に関する現地調査を実施し、リモートセンシング情報との照合に必要なプロットと情報を準備した。2.GIS(地理情報システム)作成のためのデータベースの検討。森林調査簿や固定標準地の情報を基に、GIS作成のためのデータベースの検討を行った。また、リモートセンシング情報とのつぎ合わせを行うためには、林班、小班のポリゴンデータや他の地形図、地質図、土壌図などが必要である。現在、本研究室では人工林のGISを作成中であるが、これをさらに天然林を含めたより包括的なシステムに拡張する必要がある。3.画像処理システムの作成Nexus・6510カラーイメージプロセッサを主体とするリモートセンシングデータ処理システム(FREDAM、Forest Remote Sensing Data Analysis System)を購入し、資源、環境モニタリングシステムとしての応用可能性を検討した。本システムの長所は、(1)画像処理が効率的、高速であること(2)入出力媒体として、ドラムスキャナ、MT装置、デジタイザーを有し、汎用性が高い(3)他機種との互換性が高い等であるが、森林情報をうまく取り込むためにはさらに改良する必要がある。今回は、林班界、小班界などのポリゴンデータをラスター情報に変換するための「ベクトル・ラスター変換機能」を追加し、同時に変換された情報をTM画像に重ね合わせて表示するプログラムを作成した。さらに、地上データ、写真情報、森林調査簿データとTMデータを有機的に結び付けるために、その媒体となるGISデータベースとDTM(Digital Torrein Model)を作成中である。1.GIS(地理情報システム)の作成東京大学北海道演習林(面積2万3千ha)で使用されている各種デ-タは、従来の森林調査(主として地上調査)、経営実験を基にしたポリゴン情報である。そこで、これらの地上情報とTMデ-タ等のリモ-トセンシング情報を有機的に結びつけるために、メッシュを軸としたGISを作成した。現在、このGIS情報と、現地情報(土壌、植生・林分構造等)、リモ-トセンシング情報との間の照合を進めている。2.各種生体モデルの検討天然林の資源・環境を把握し、管理するためには、上記の基礎情報に加えて、より高次の知識べ-スが必要である。各種森林生長・生態モデルやシミュレ-ションモデルがこれに属する。今回は、育種、樹木社学、森林生長論、施業論の立場から、天然林の動態を記述する二、三のモデルを開発した。

今後の課題は、これらのモデルとリモ-トセンシング情報との融合を図ることである。3.環境モニタリングシステムの基本設計(1)大型のAO判デジタイザの購入により、地形図、森林基本図などの大判の地図からの直接入力が可能となった。(2)25mメッシュの地理変換を行うことにより、3時期(1985年5月31日、1988年7月26日、1984年9月14日)のLANDSAT・TMデ-タの重ね合わせ・比較が可能となった。(3)昨年購入した画像処理システムFREDAMのソフトウェアに、主成分分析、クラスタ-分類などのプログラムを追加し、森林内の比較的小さい環境(植生、林相など)の変化を把握できるようにした。このプログラムは、GIS情報とリモセン情報を統合することにより森林環境のモニタリングを可能にするもので、上記の3時期のデ-タを基に、風害跡地のモニタリングを行った結果、有効性が確認された。1.資源環境モニタリングの天然林への応用東京大学秩父演習林と北海道演習林の森林に対して,本システムの有効性を検討した。秩父演習林の森林については,1984,1987,1988年の3年期のランドサット・TMデ-タを用いてCVA(Change Vector Analysis)解析を行った結果,国道開設に伴う森林の伐採箇所や河川の埋め立て地を検出することができた。また,北海道演習林の天然林を対象にテクスチャ-解析により林型区分を行ったところ,この手法が樹冠疎密度区分に有効であることが確認された。さらに,1990年に撮影されたSpotのパンクロマチックデ-タ(解像度10m)とマルチスペクトルデ-タ(解像度20m)をRGBーHRV変換を行って合成し,5万分の1のカラ-衛星画像マップを作成した。この図では,広大な演習林の森林状態が詳細に表現されており,誰にでも森林環境を把握することが可能である。2.報告書の作成及び残された問題の検討報告書を作成する共に,雲や影による情報損失の問題,各センサ-の特質の解明,地理情報システムとの連結の問題を検討した。
飛来塩分評価技術の高度化に向けた海岸構造物での 海塩粒子生成モデルの開発

本研究の目的は,塩風害の原因である飛来塩分の評価技術の向上に資するべく,大量の飛来塩分の発生源となり得る直立護岸を対象に,発生量の推定式を得ることである.波と風を同時に作用させる水理模型実験を行い,波の打ち上げの特性を把握した.並行して,建設中の人工島において冬季の高波浪時に現地観測を行い,飛来塩分量と越波流量の空間分布などを得た.これらの結果から,直立護岸で生じる飛来塩分量の推定式を得た.本研究の目的は,塩風害の原因である飛来塩分の評価技術の向上に資するべく,大量の飛来塩分の発生源となり得る直立護岸を対象に,発生量の推定式を得ることである.波と風を同時に作用させる水理模型実験を行い,波の打ち上げの特性を把握した.並行して,建設中の人工島において冬季の高波浪時に現地観測を行い,飛来塩分量と越波流量の空間分布などを得た.これらの結果から,直立護岸で生じる飛来塩分量の推定式を得た.暴風暴浪時には,波が防波堤等の海岸構造物に衝突し大量の海水飛沫が発生する.発生した飛沫のうち,微小な飛沫(海塩粒子)は風に運ばれ陸域に拡散し広範囲に塩害をもたらす.本研究では,沿岸部における飛来塩分量の高精度な評価技術の開発に資するため,海岸構造物に波が作用して発生する飛来塩分量のモデル化を目指している.これを実現するため平成22年度は,小型の断面2次元造波風洞水路(長さ28m,高さ0.5m,幅0.3m)を使用し,波と風の条件に応じた飛沫の打上げ規模(打上げ高さ,打上げ水量など)の発生頻度を解明するための水理模型実験を行った.構造物は過去に現地観測を実施した直立防波堤を対象とし,縮尺1/70で模型を作成した.実験では,防波堤模型の前面に蛍光トレーサーを混入し,グリーンレーザーシートを照射して,流体の動きをデジタル高速度カメラで撮影する可視化実験を行った.防波堤の壁面に沿って打ち上がる波の速度は速いため,撮影は秒間400コマで行った.撮影した画像をもとに,画像解析により防波堤の高さを越えて打ち上がる水の速度や量,また,打ち上がりの高さなどを計測した.この画像解析による計測手法は,風洞水路内に計測機器を設置しないため,風や波に影響を与えずに計測できる利点がある.ただし,解析精度が撮影画像の質に大きく影響を受けるため,波高と周期が一定の規則波を対象に,計測精度の検証と可視化や撮影方法等の改善を繰り返し行った.計測手法の検証の後,種々の不規則波と風を同時に作用させる本実験を実施し,一波毎の波高と周期が異なる不規則波について,撮影画像から一波毎の打上げ規模を計測した.この実験の結果,飛沫の打上げ高さ等について,波と風の条件に応じた出現頻度分布を把握でき,本研究の目的である海岸構造物で生じる飛来塩分のモデル化に繋がる成果が得られた.本研究では,海岸構造物からの飛来塩分は,暴風暴浪時に構造物で激しく打ち上がった飛沫が強風によって細粒化し,海塩粒子となって陸域に輸送されるというプロセスで生じるものと仮定し,飛沫の打上げ規模(打上げ高,水量など)と風速を変数とした海岸構造物における海塩粒子生成モデルを構築することを目的としている.これを実現するため,平成23年度は,前年度に引き続き断面2次元造波風洞水路を用いた飛沫の打上げ規模に関する可視化実験,および,現地での暴風暴浪時における海岸構造物からの飛来塩分量等の観測を実施した.可視化実験では,前年度の知見をもとに,護岸で生じる打上げ等の激しい現象を詳細に把握するため,トレーサーについて検討し,本実験では一般的に利用されている蛍光トレーサーに比べて,人工海水で作成したマイクロバブルが有効であることが分かった.マイクロバブルは形状がほぼ球で浮上速度が遅く,また,合一しないなどの特徴があり本実験において非常に都合が良い.実験においては,まず,人工海水のマイクロバブルが打上げや越波にほとんど影響しないことを確認し,次いで,波と風の条件を組み合わせた実験を行って,打上げ規模(打上げ高,打上げ水量,越波量など)の発生頻度を調べた.現地観測では,波浪(波高・周期・波向),潮位,風向風速,海岸構造物(護岸)での飛沫の打上げ高,飛来塩分量,飛沫粒径(陸域に飛来するもの)について観測を行った.場所は建設中の人工島で,建物等の遮蔽物がほとんど無いことから,基礎的な検討に適した貴重なデータが得られた.得られたデータをもとに,現地での風等の条件に応じた飛来塩会の拡散状況を把握した.また,これらのデータは室内実験で調べている打上げ規模の発生頻度等との対応や,最終的に構築する海岸構造物における海塩粒子生成モデルの検証のために利用される.本研究では,飛沫の打上げ規模(打上げ高,水量など)と風速を変数とした海岸構造物における海塩粒子生成モデルを構築することを目的としており,平成24年度は,前年度に引き続き断面2次元造波風洞水路を用いた飛沫の打上げ規模に関する可視化実験,および,現地での暴風暴浪時における海岸構造物からの飛来塩分量等の観測を実施した.

可視化実験では,前年度までに構築したマイクロバブルを利用した可視化実験手法に更なる改良を加え,さらに,可視化実験で撮影した映像から画像解析により打上げ水量を求める算定手法についても改良を加えた.この手法を用い,種々の条件における打上げ規模について検討した.その結果,海岸構造物(直立壁)で打ち上がる水量は風速の増加に伴い大きな打上げ水量の発生頻度が増加すること,その増加率は風速と入射波高の関数として表せること,打上げ水量の出現頻度分布は指数分布で表されること,などの知見が得られ,それらを元に海塩粒子生成モデルを構築した.現地観測では,昨年度と同様に,建設中の人工島において,波浪(波高・周期・波向),潮位,風向風速,海岸構造物(護岸)での飛沫の打上げ高,飛来塩分量,飛沫粒径(陸域に飛来するもの)について観測を行い,データを蓄積した.得られたデータをもとに,現地での風等の条件に応じた飛来塩分の拡散状況を調べ,飛来塩分の発生箇所(護岸)の近傍では,発生位置から離れるにつれ塩分量指数関数的に減少することなどがわかった.これらの知見を元に,水理模型実験の結果から構築した海塩粒子生成モデルの現地条件への適用性について検証した.今年度は計画に沿って水理模型実験と現地観測を実施した.実験と観測のそれぞれで適切なデータを取得するための工夫や検討を加え,当初から想定していた貴重な知見が得られている.ただし,気象条件等の原因で観測を行った時期が年度末となってしまったため,縮尺模型実験によるデータと現地観測データの比較に基づく縮尺効果に関する検討が若干遅れており,その点を踏まえ自己評価を「(3)やや遅れている」とした.24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,室内での水理模型実験と現地での観測によって様々な検討に必要な数多くのデータを得ることが極めて重要と考えており,これまでの研究の過程において,本研究で必要な可視化等の模型実験手法や観測技術を確立することができ,データの蓄積が順調に進んでいる.最終年度は,更なるデータの蓄積に加え,得られたデータをもとに研究計画に沿った検討を行なって,当初の目的を達成するべく研究を進める.また,最終年度には,これまでに得られた知見を整理しつつ,逐次,学会発表等により成果を発表する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
反応性プラズマによるシリコン膜表面の化学反応性制御

反応性プラズマを利用したシリコンの低温成膜技術に必要な非平衡プロセス制御技術開発の一環として、基板上でのシリコン網目構造(Si-NW)形成過程とその制御方法に関する検討を行った。プラズマ中で、シラン、及びテトラフロロシランを分解して得たエリコン系ラジカルを前駆体として、基板上にSi薄膜を堆積し、その化学組成、及び構造とプラズマ、及び基板反応制御因子との関係を求めた。その結果、テトラフロロシランを原料とする場合は、水素による部分還元反応によって形成される前駆体(SiHnFm,n+m=3)が膜堆積に有効であり、シランからの堆積では、SiHn(n≦3)が前駆体となることが分かった。これらの中性ラジカルは基板上での付着反応の後、Si-NWw形成のための架橋反応を起こす。その際、原子状水素の供給がこの反応を著しく促進する事実を見い出し、Si-NWをアモルファスから結晶まで連続的に制御することができることを見い出した。また、F元素の存在はその水素との強い相互作用(クーロン引力)によって、Si-NW形成反応速度を著しく増加し、高速堆積時(20A/S)においても結晶シリコンを300°C程度の低温基板上で形成できることを見い出した。さらに、基板上でのSi-NW形成反応の動力学解析を試み、この反応に関わる水素の特異性、及びハロゲン(F,Cl)の役割などを明らかにし、基板上での架橋反応が、これら前駆体中に含まれるシリコン以外の元素の化学反応性に強い影響を受け進行していることが分かった。その結果、300°Cの低温基板上でSi単結晶のエピタキシャル成長を実現し、高品質アモルファス・シリコン薄膜と同時に将来性の高い堆積技術の道を開拓した。
電子とフォトンの同時制御構造とそれに基づく機能素子の研究開発

まず3次元フォトニック結晶の作成を行った。InP基板上に化学気相成長法により製作したSiO_2薄膜に、電子線リソグラフィ法を用いて周期0.5ミクロンあるいは0.3ミクロンの円座標パタンと三角格子を製作した。このパタン上へバイアス・スパッタ装置を用い,オートクローニング法でTa_2O_5とSiO_2の多層構造を作成した。得られた3次元フォトニック結晶のバンドギャップの評価を、顕微分光法を基礎とした可視赤外域反射スペクトルの測定によって行った。三角格子3次元フォトニック結晶において0.5ミクロンと0.3ミクロン周期の試料の端面からの反射スペクトルを格子の対称性の高いΓ-K方向およびΓ-M方向で測定した。得られた結果を計算結果と比較したところ、反射のピーク位置の周期依存性は計算で求められたバンド端のギャップ位置の周期依存性と良い一致を示した。この解析より、第一バンドおよび第二バンドの周期依存性が求められた。この結果を基に、円座標フォトニック結晶のバンドの測定を試みた。測定は、円座標3次元フォトニック結晶の断面(試料1.)、およびスパッタエッチ法により円座標試料側面を円形に切り出して(試料2)行った。円座標の周期は0.4ミクロンおよび0.3ミクロンである。試料1.では第一バンドと第二バンドに対応すると思われる反射が見られた。また試料2.でも第一バンドに対応する反射構造が見られた。またこれらの構造は測定誤差の範囲内で等方的であった。この結果より、可視領域でも円座標を用いて等方的なバンドギャップの形成に成功したと考えられる。また半導体ナノ構造をフォトニック結晶内に導入するため,フォトニック結晶を作成するための積層プロセスを一時中断し,その上に半導体ナノ構造を形成した後,再び多層構造を積層した。得られた試料はギャップの位置の発光強度が減少し、フォトニックバンドの効果が現れた。1.2次元円座標フォトニック結晶の制作とその光学特性の評価通常のフォトニック結晶では光の伝播方向によってバンド端のエネルギーが異なる。しかし、全てのバンドギャップの形成、導波路等への応用を考えた場合、フォトニック結晶の光学特性は等方的であることが望まれる。最近、回転対称性の構造を用いると、等方的なフォトニックバンドギャップが形成されることが宮嵜達により示された。本年度は先ず結晶内の電場スペクトルを測定し、2次元円座標フォトニック結晶の光学特性を評価した。測定には半径3nmのアクリル円柱を同心円状に配置したフォトニック結晶を用いた。同心円は5回回転対称性を示し、半径の間隔は12mmである。5角形のある頂点から中心方向にミリ波を照射し、結晶内の電場強度をプローブアンテナで測定した。10GHz付近で強度の減少が観測された。計算によって得られたスペクトルと比較すると、減少している周波数帯はよく一致している。またミリ波の入射角とフォトニックバンドギャップ(PBG)の関係を測定したところ、強度の減少が±90°の範囲で入射角に依存することなくほぼ同じ周波数帯で観測され、等方的なギャップが形成されている事が示された。2.3次元円座標フォトニック結晶の制作とその光学特性評価円座標3次元フォトニック結晶の作成は自己クローニング法によって行われた。InP基板上のSiO_2膜に円座標(rN,2nπ/6N)(r=500nm:同心円の半径周期,n【less than or equal】N:自然数)で表される位置に直径250nmの穴を開けてパターンを作成した。

パターン基板上にはSiO_2とTa_2O_5を交互に250nmずつ20回積層した。作成したフォトニック結晶の表面AFM像から表面の凹凸は基板パターンと同じ周期構造を保持していることが確認された。また劈開面のSEM像から面内周期構造が鋸波状になっており、3次元フォトニック結晶が制作されている事が確認できた。本年度は,3次元フォトニック結晶の作成,ナノ構造の導入技術の確立に重点を置いた。3次元フォトニック結晶の作成は、まずInP基板上に化学気相成長(CVD)法により製作したSiO_2薄膜に、電子線リソグラフィ法を用いて周期0.5ミクロンあるいは0.3ミクロンの円座標パタンを製作した。この円座標パタン上ヘバイアス・スパッタ装置を用い,オートクローニング法でTa_2O_5とSiO_2の多層構造を作成した。多層膜の周期は円座標周期と合わせている。得られた円座標3次元フォトニック結晶のバンドギャップの評価を顕微分光法をベースにした反射スペクトルの測定によって行った。測定は、円座標3次元フォトニック結晶の断面、およびスパッタエッチ法により円座標試料側面を円形に切り出して行っている。また半導体ナノ構造をフォトニック結晶内に導入するため,フォトニック結晶を作成するための積層プロセスを一時中断し,その上に半導体ナノ構造を形成した後,再び多層構造を積層する事を検討した。ナノ構造の形成を行うため、フォトニック結晶をスパッタ装置から有機金属化学気相成長(MOCVD)装置(現有)に移動させ,MOCVD法でZnOなどの紫外あるいは可視領で域発光するII-VI族半導体ナノ構造を形成する方法を試みた。予備実験として、Ta_2O_5とSiO_2酸化物多層膜上にZnMgOにはさまれたZnO量子構造を作製し、反射スペクトルおよび室温での発光スペクトルを測定した。またこれらのスペクトルの入射角度依存性を測定した。現在解析を行っている。さらに、フォトニック結晶内に導入する新たな量子構造として、ZnO量子ドットをZnMgO上に成長する成長条件を探索している。まず3次元フォトニック結晶の作成を行った。InP基板上に化学気相成長法により製作したSiO_2薄膜に、電子線リソグラフィ法を用いて周期0.5ミクロンあるいは0.3ミクロンの円座標パタンと三角格子を製作した。このパタン上へバイアス・スパッタ装置を用い,オートクローニング法でTa_2O_5とSiO_2の多層構造を作成した。得られた3次元フォトニック結晶のバンドギャップの評価を、顕微分光法を基礎とした可視赤外域反射スペクトルの測定によって行った。三角格子3次元フォトニック結晶において0.5ミクロンと0.3ミクロン周期の試料の端面からの反射スペクトルを格子の対称性の高いΓ-K方向およびΓ-M方向で測定した。得られた結果を計算結果と比較したところ、反射のピーク位置の周期依存性は計算で求められたバンド端のギャップ位置の周期依存性と良い一致を示した。この解析より、第一バンドおよび第二バンドの周期依存性が求められた。この結果を基に、円座標フォトニック結晶のバンドの測定を試みた。
細胞創傷治癒機構におけるユビキチンの役割

細胞は増殖の過程で細胞表層に様々な環境ストレスを受け、傷つく。傷の周りにアクチンや微小管、Rho型GTPaseなどが集まり、細胞質分裂とよく似た仕組みで速やかに行われる修復を「細胞創傷治癒(Cellular wound-healing)」と呼ぶ。これに欠損があるとデュシェンヌ型筋ジストロフィー症を発症するが、詳細な分子機構は解明されていない。今回、出芽酵母の強力な遺伝学を背景に、ポストゲノム時代のツールを駆使して細胞創傷治癒に関与する遺伝子の網羅的同定を行った。その結果22のユビキチン・プロテアソーム関連遺伝子を含むヒットを同定した。更なる解析により、傷ついた細胞が細胞周期を停止する「細胞創傷治癒チェックポイント」を初めて見出した。スクリーニングヒットのうち極性輸送を制御するESCRTタンパク質はモノユビキチン化によって活性制御を受けることが知られている。今回、ESCRTタンパク質は膜損傷直後の応急処置的な緊急応答に必要であることが明らかになった。また、細胞創傷治癒チェックポイントにおいては、Cdkを阻害するWee1ホモログSwe1のポリユビキチン化とその後のタンパク質分解が抑制されていることが明らかになった。膜修復を完了して通常の増殖に復帰する際に、膜修復に必要な細胞骨格制御タンパク質がポリユビキチン化されプロテアソームにより分解されることも示唆された。以上より、細胞創傷治癒の過程では多様なユビキチンコードが重要な役割を果たしていることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。外界との境界である細胞膜が保たれることは細胞の生存に必須であり、細胞膜の損傷を修復する細胞創傷治癒機構は進化的に保存されている。細胞膜が損傷を受けると、傷の周りにアクチン繊維、V型ミオシン、Rho型GTPase等が集まり、細胞質分裂期の分裂リング収縮によく似たメカニズムで膜修復が行われる。この機構に欠損があるとデュシェンヌ型筋ジストロフィー症を発症することが知られているが、詳細な分子メカニズムは明らかにされていない。細胞創傷治癒機構を包括的に理解する目的で、出芽酵母の非必須遺伝子を網羅的に破壊した破壊株ライブラリー、そして必須遺伝子のmRNA量を減少させたDAmPライブラリーを用いて、細胞創傷治癒機構に欠損のある変異株を網羅的に単離した。その結果、ポジティブコントロールであるユビキチン・プロテアソーム系の因子を始め、高等真核生物において細胞創傷治癒に関与することが分かっているERやゴルジの制御因子などを含む108の遺伝子が細胞創傷治癒に関与するものとして同定された。これらの遺伝子の中には数多くのユビキチン関連因子が含まれ、K48ポリユビキチン鎖が重要な役割を果たすタンパク質分解経路、K63ポリユビキチン鎖が関与する膜輸送の経路、さらにはK63モノユビキチンが利用されるDNA損傷修復関連因子など、一つの種類のユビキチン鎖にとどまらず、多様なユビキチン修飾が細胞創傷治癒に必要であることが明らかになった。細胞創傷治癒に関与するユビキチン鎖の種類を明らかにするために、出芽酵母の強力な遺伝学を利用して網羅的なスクリーニングを行った結果、当初の計画立案時には予想しなかった、多様なユビキチン鎖の関与が示唆された。来年度はさらに詳細な生化学的・細胞生物学的解析を進め、細胞創傷治癒における各々のユビキチン鎖の役割や制御について明らかにすることを目指す。これまでに、細胞創傷治癒機構は少なくとも(1)成長点への細胞極性の消失(2)損傷部位への新たな極性の確立(3)修復

(4)成長の再開、という4つの段階からなることが明らかになっていたが、今年度の解析結果により、さらに「細胞周期の一時停止」「DNA合成の一時停止」「細胞周期及びDNA合成の再開」という段階が存在することが見出されている。そこで来年度は、多様なユビキチン鎖が細胞創傷治癒機構のどの段階に重要かを明らかにしていく。
脊髄の背腹軸に沿ったパターン形成におけるカドヘリン-7の役割

神経管の背腹軸に沿った細胞分化パターンの形成には背側からのBMPとWntシグナル、さらに腹側からのsonic hedgehogシグナルのバランスにより背側から腹側に渡って規則正しく細胞分化が調節されている。ニワトリ胚神経管の背腹軸に沿ってちょうど中間の位置に、発生過程の比較的早い段階に一過性に帯状にカドヘリン-7が発現される。カドヘリン-7の存在意義は全く不明であるため、HH stage11-15ニワトリ胚神経管に電気穿孔法によりその遺伝子を導入し強制発現を試みた。異所性カドヘリン-7を発現する細胞集団は大きな凝集塊を作り、その異所発現部位に依存して、脊髄の背腹軸の分化パターンが変化した。背側マーカーとしてPax7の発現パターンを調べると、Pax7発現領域の腹側下限とカドヘリン-7発現領域上限とは境界を形成している。正常コントロール側に比較して、異所性のカドヘリン-7が背側に発現されるとこの境界は背側に移動し、腹側に発現されると腹側に移動した。さらにPax7とカドヘリン-7の境界だけではなく、本来カドヘリン-7が発現する部位よりも遠く離れた脊髄背側に分化する抗Islet-1/2抗体陽性のdI3介在神経細胞数にも変化が見られた。Pax7やカドヘリン-7の発現が腹側にずれた場合は数が増加し、背側にずれた場合は減少した。ただしカドヘリン-7の異所発現が、本来の発現とは無関係な領域に生じた場合には何の変化も見られないことから、カドヘリン-7が正常に発現する領域において本来持っている活性が修飾されたのではないかと考えられた。これらの結果は、あたかも帯状に発現するカドヘリン-7(+)細胞が形態形成のオーガナイザー様の機能を果たしているように見え、単なる接着分子としての機能によるものではないと考えられた。神経管は背側からのBMPやWntシグナルと腹側からのShhシクナルによって背腹軸に沿ったパターン形成が行われる。脊髄前駆細胞は、背側から腹側にかけてそれぞれ異なった領域を形成し、各々の前駆細胞から異なったタイプの細胞が分化する。カドヘリン-7は非典型的カドヘリンに属し、ニワトリ初期胚では移動中の神経提細胞、背側と腹側神経根のboundary cap、運動神経、床細胞、後根神経節、筋節などに発現する。以前、我々は選択的スプライシングによって生じる可溶性カドヘリン-7が存在し、カドヘリン-7の接着を阻害することを見出した。カドヘリン-7は脊髄横断面の背腹軸の中央に帯状に発現している。その内在性カドヘリン-7の発現領域の背側境界は、背側神経前駆細胞に発現する転写因子Pax7と境をなしている。我々は、カドヘリン-7の機能解析のためニワトリ初期胚神経管にエレクトロポレーションによって異所性にカドヘリン-7を発現させた。異所性カドヘリン-7の発現によって巨大なカドヘリン-7(+)細胞の凝集塊が形成された。また、異所性カドヘリン-7の発現が内在性カドヘリン-7発現領域と接する場合、内在性カドヘリン-7の発現領域が移動すると共に、Pax7領域の背腹軸に沿った下限も移動した。同時に、背側介在ニューロンの各領域の長さやPax7発現領域の細胞増殖に変化が認められた。しかし、カドヘリン-7の異所性発現による直接の細胞運命や増殖の変化は認められず、異所性カドヘリン-7の発現による内在性カドヘリン-7発現細胞の移動が重要であると考えられた。以上により、内在性カドヘリン-7発現領域の細胞が腹側あるいは背側シグナルセンターからのシグナルの修飾を行っており、内在性カドヘリン-7発現細胞が移動することにより分化誘導シグナルの強度が変化するのではないかと考えられた。

ただしカドヘリン-7の異所発現が、本来の発現とは無関係な領域に生じた場合には何の変化も見られないことから、カドヘリン-7が正常に発現する領域において本来持っている活性が修飾されたのではないかと考えられた。これらの結果は、あたかも帯状に発現するカドヘリン-7(+)細胞が形態形成のオーガナイザー様の機能を果たしているように見え、単なる接着分子としての機能によるものではないと考えられた。
アルツハイマー病患者の町歩きの特徴とオプティック・フロー認知障害の関係

本研究の目的は、AD患者のオプティッ・フロー(以下OF)認知障害を評価し、町を歩く際の環境整備などの基礎的情報を得ることである。対象はAD患者9名と健常者9名であった。方法は、対象者の前方のスクリーンに正面から左上,左下,右上,右下の位置にOFの中心のある刺激を提示し、中心を棒で指示させた。この間の固視点を眼球運動計測装置で計測し、各固視点とOFの中心の距離θを求めた。結果は、AD患者9名中5名において,4方向のいずれかで健常者より明らかな異常がみられた。4方向のどこに異常があるかを確かめることで、生活上の困難が異なる可能性が考えられ、リハビリの基礎的情報として有用な可能性がある。本研究の目的は、アルツハイマー病患者が町を歩く際の行動の特徴と、その際の視点の特徴や風景の流れ(オプティック・フロー)を認知する障害との関係を明らかにし、アルツハイマー病患者が地域で暮らす上での危険回避の手がかりを見出し、地域支援の一助とすることを目的とする。28年度は、本研究の趣旨に同意の得られた、健康な65歳以上の高齢者9名、アルツハイマー病患者9名を対象に、オプティック・フロー認知の評価を実施した。方法は、アイマークレコーダを装着した対象者の前方にスクリーンを設置し、プロジェクターにてオプティック・フロー刺激を投射した。オプティック・フローの中心の位置は、開始時の固視点(中央)から、右上・右下・左上・左下に一定距離だけ離れた4つのうちの1つとし、それをランダムに提示した。この時に起こるオプティック・フロー中心への固視を記録し、その正確さを固視点とフローの中心との距離で測定した。実験機器の不具合が発生したことと、町歩きの評価について、解析上の問題で道具に改良を加える必要ができたため、試行を繰り返す必要があり時間を要した。本研究の目的は、アルツハイマー病(以下AD)患者が町を歩く際の行動の特徴と、その際の視点の特徴や風景の流れ(オプティック・フロー)を認知する障害との関係を明らかにし、AD患者が地域で暮らす上での危険回避の手がかりを見出し、地域支援の一助とすることを目的とする。平成29年度は、平成28年度に行った健康な65歳以上の高齢者9名、AD患者9名の、オプティック・フロー(以下OF)認知評価の結果を解析、比較検討を行った。方法は、アイマークレコーダを装着した対象者の前方にスクリーンを設置し、プロジェクターにてOF刺激を投射した。OFの中心の位置は、開始時の固視位置(中央)から、右上・右下・左上・左下に一定距離だけ離れた4つのうちの1つとし、それをランダムに提示した。この時に起こるOFの中心への固視を記録し、固視位置とOFの中心との距離で測定した。解析は、専用の解析ソフトを使用し、固視位置、固視時間、固視位置の変化を測定した。結果は、全方向としてAD患者の固視は健康高齢者群の固視よりOFの中心から離れていた。4方向ごとの解析では、いずれかの方向に中心のあるOF刺激に対して明らかな固視の異常を示す者と、健康高齢者に近い反応を示す者とがいた。また、4方向すべてに異常を示した者は無く、いずれかの方向のみで著しい異常を示した。OF中心への固視が健常者に比べて、明らかに離れていた症例は、AD患者の半数を超えていた(9名中5名)。異常のあった方向は、症例により様々であった。本研究では、AD患者にとって容易で注意障害や遂行機能障害の影響の少ない方法で、OF認知の異常を検出することができた。これは、対象となる患者の範囲を拡大できる可能性がある。4方向のどこに異常があるかを確かめることで、異常のある方向によって、生活上の困難が異なる可能性が考えられ、リハビリテーションの基礎的情報として有用な可能性がある。28年度の実験より、健康な高齢者とアルツハイマー病患者のオプティック・フローの認知評価の結果を解析、比較する。また、健康な20歳代成人のオプティック・フロー認知の評価、各対象者における町歩きの評価、解析を進める予定である。これら三者の関係から、町を歩く際の特徴的行動の背景にある、脳機能障害のひとつを明らかにし、地域で暮らすアルツハイマー病患者の支援に役立つ、危機予測・回避の手がかりを見出す。リハビリテーション科学28年度に実施した実験は、以前より当該研究者の使用している実験機器、道具、環境で行えたため、新たな支出の必要がなかった。29年度は、実験旅費、実験道具改良に必要な物品、データ保存に使用する記録媒体、参考書籍、論文投稿にかかる費用などに使用する予定である。
ピロリ菌感染に起因する胃粘膜細胞間接着障害の影響

ピロリ菌の胃粘膜への持続感染は、胃・十二指腸潰瘍、胃癌などの胃関連疾病との疫学的関連性が指摘されている。日本は世界でも有数の胃癌大国であるが、その原因としてピロリ菌の感染率の高いことが挙げられている。ピロリ菌感染による疾病発症の危険因子として、ピロリ菌が分泌するCagA蛋白が最も重要であると考えられている。CagAは胃上皮細胞内でチロシンリン酸化を受け、そのリン酸化されたCagAは細胞増殖や細胞運動、細胞死抑制など多様な細胞応答を引き起こすことが報告されている。しかしながら、非リン酸化状態のCagAが持つ生物活性および菌感染における役割についてはこれまで不明であった。本研究では、CagAはリン酸化とは関係なく肝細胞増殖因子受容体Metと結合し、PI3K/Akt経路を活性化することにより、β-カテニンおよびNF-κBの活性化など胃癌発症に関わる細胞増殖と炎症促進のシグナルを引き起こすことを明らかにした。このCagAのリン酸化非依存的な活性に関わるCRPIA配列(conserved repeat responsible for phosphorylation-independentactivity)に変異を導入したピロリ菌は、スナネズミの胃粘膜に対する定着能と炎症誘導能が低下した。また、CagAの同活性部位に由来する合成ペプチドを細胞内に導入すると、CagAによる発癌シグナルが著しく抑制された。このことから、非リン酸化状態のCagAは宿主のシグナル伝達系を撹乱することで、胃粘膜でのピロリ菌の持続感染を促進し、胃癌発症に関わる細胞増殖と炎症反応を異常促進することが判明した。本成果はピロリ菌感染症に対する新たな治療薬やワクチン開発につながるものと期待される。ピロリ菌の分泌蛋白CagAは細胞内でSrc/Ablファミリーキナーゼによってチロシンリン酸化を受け、様々なシグナル分子と結合し、細胞増殖、細胞運動、細胞死など多様な細胞応答に関与する。CagA陽性のピロリ菌が感染した上皮細胞では、本来、細胞-細胞間の接着部位にアンカーされているβ-カテニンが高頻度に核内に蓄積する。通常、細胞質内のβ-カテニンはユビキチン・プロテアソーム系によって速やかに分解される。種々の分子生物学的解析によって、CagAによるPI3K/Akt経路の活性化はβ-カテニンを安定化させることが示唆された。CagAは自身のチロシンリン酸化に依存してPI3Kの触媒サブユニットp85と結合した。しかしながら、宿主内でリン酸化されるチロシンをフェニルアラニンに置換したリン酸化耐性CagA変異体も依然としてPI3K/Akt経路の活性化、その下流のβ-カテニン/TCF経路およびNF-κB経路の活性化を誘導可能であった。そのため、CagA内にリン酸化チロシンとは別に何らかの生物学的活性を示す構造があり、それがPI3K/Akt経路の活性化に寄与する可能性が考えられた。β-カテニン/TCF経路への影響などを指標に種々のCagA変異体を精査した結果、CagAのリン酸化非依存活性を担うCRPIA配列(CRPIA: conserved repeat responsible for phosphorylation-independent activity)を同定し、アラニンスキャニング法によって必須アミノ酸を同定した。このアミノ酸に変異を持つCagAを発現するピロリ菌は、PI3K/Akt経路の活性化能が低下しており、菌感染で誘導される炎症性サイトカインの産生が劇的に減少した。以上の結果より、ピロリ菌の病原因子が宿主シグナル伝達系を攪乱し、胃粘膜に増殖、炎症反応を惹起する新たな分子機構の一端が明らかとなった。ピロリ菌の胃粘膜への持続感染は、胃・十二指腸潰瘍、胃がんなどの胃関連疾病との疫学的関連性が指摘されている。

日本は世界でも有数の胃がん大国であるが、その原因としてピロリ菌の感染率の高いことが挙げられている。ピロリ菌感染による疾病発症の危険因子として、ピロリ菌が分泌するCagAたんぱく質が最も重要であると考えられている。CagAは胃上皮細胞内でチロシンリン酸化を受け、そのリン酸化されたCagAは細胞増殖や細胞運動、細胞死抑制など多様な細胞応答を引き起こすことが報告されている。しかしながら、非リン酸化状態のCagAが持つ生物活性および菌感染における役割についてはこれまで不明であった。本研究では、CagAはリン酸化とは関係なく肝細胞増殖因子受容体Metと結合し、Pl3K/Akt経路を活性化することにより、β-カテニンおよびNF-κBの活性化など胃がん発症に関わる細胞増殖と炎症促進のシグナルを引き起こすことを明らかにした。このCagAのリン酸化非依存的な活性に関わるCRPIA配列(conserved repeat responsible for phosphorylation-independent activity)に変異を導入したピロリ菌は、スナネズミの胃粘膜に対する定着能と炎症誘導能が低下した。また、CagAの同活性部位に由来する合成ペプチドを細胞内に導入すると、CagAによる発がんシグナルが著しく抑制された。このことから、非リン酸化状態のCagAは宿主のシグナル伝達系を撹乱することで、胃粘膜でのピロリ菌の持続感染を促進し、胃がん発症に関わる細胞増殖と炎症反応を異常促進することが判明した。本成果はピロリ菌感染症に対する新たな治療薬やワクチン開発につながるものと期待される。
大脳皮質味覚野に存在する神経ペプチドの機能的役割

1.ラット大脳皮質における神経ペプチドニュ-ロテンシン,コレチストキニン,エンケファリン,ニュ-ロキニン,カルチリニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)などのうち大脳皮質味覚野に存在するのはCGRPのみであった。CGRPは無顆粒性島皮質からさらにその背側の不全顆粒性島皮質の腹側半分にわたり,神経線維中に存在し,CGRPを含む細胞体は認められなかった。逆行性トレ-サ-とのニ重標識法とイボテン酸による脳局所破壊実験から,皮質味覚野にCGRP線維を送るのは視床味覚野のもっとも内側部の細胞であることが分った。2.味刺激によるCGRPの変動大脳皮質味覚野のCGRPは,動物がもっとも嫌悪するキニ-ネ溶液や,嫌悪条件づけにより強い拒否行動を示す溶液の刺激に対して有意に増加することが分った。3.味覚嫌悪学習における大脳皮質味覚野の役割大脳皮質味覚野を前もって破壊しておいても味覚嫌悪学習は可能であったが,学習獲得後の皮質破壊により条件づけ効果はすみやかに消失した。皮質味覚野は,過去に経験した味か初めての味かの判定に,また,嫌悪学習獲得時には条件刺激の味の記憶に重要な働きを演じる。4.大脳皮質味覚野におけるCーfos蛋白質以上のように,大脳皮質味覚野は味覚嫌悪学習に重要であることが分ったので,このとき,プロトオンコジ-ンであるCーfosによる蛋白質産生を免疫組織化学的に検索したところ,嫌悪条件獲得後,大脳皮質味覚野ニュ-ロンで顕著に認められた。この詳細な働きは今後解明すべき研究課題である。本年度は、ラット大脳皮質味覚野にいかなる神経ペプチドが局在化するのかを免疫組織化学的に調べ、次いで、味刺激により神経ペプチド量がどの様に変化するかをラジオイムノアッセイ法により検討した。1.大脳皮質味覚野における神経ペプチドニュ-ロテンシン、コレチストキニン、ロイシンーエンケファリン、メチオニンーエンケファリン、ニュ-ロキニンA、ニュ-ロキニンB、カルチトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の各神経ペプチドにつき大脳皮質を検索した結果、味覚野に限局的に存在していたのはCGRPのみであった。CGRPは嗅裂のすぐ背側部、すなわち、無顆粒性島皮質から、さらにその背側の不全顆粒性島皮質の腹側半分にわたり、神経線維中に存在した。いずれの島皮質部においても、CGRPを含む細胞体は認められなかった。なお、皮質味覚のの吻尾的な広がりは、中大脳動脈を中心にして、ほぼ3mmであり、CGRPの分布は、むしろ、味覚野をすぎて尾側方向に、いわゆる嗅裂周囲皮質により豊富であった。2.CGRPの定量的分析味覚野背側の体性感覚野、頭頂野、味覚野、嗅裂周囲皮質のCGRP量は、10例の平均値(fmole/g)で、それぞれ、50、51、251、1060であった。味刺激によって味覚野のみのCGRPが増大することがわかった。水、食塩、グルタミン酸ナトリウム、塩酸、キニ-ネの中では、動物がもっとも強く嫌悪するキニ-ネ溶液での刺激に対応して、有意にCGRP量は増加したことから、きわめて嫌な味に対してCGRP活性が増すと考えられる。一方、CGRP量を有意には増加させなかった味刺激を条件づけ味覚嫌悪学習のための条件刺激として用いた場合は、これら味刺激(0.1M食塩水と0.5M蒸糖溶液)に対しても、CGRP量は顕著に増大した。1.大脳皮質味覚野にCGRP含有線維を送る細胞体の存在部位。カルチトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有線維は,ラット大脳皮質

味覚野に密に存在する.細胞構築学的に皮質味覚野は,背側から腹側に向って,顆粒性島皮質,不全顆粒性島皮質,無顆粒性島皮質に分けられるが,CGRP含有神経は,無顆粒性島古質と不全顆粒性島皮質の腹側半分に局在化していた。従って逆行性トレ-サ-としてFITCーHRP腹側味覚野に微量注入し,脳切片作製後,免疫組織化学的にCGRP含有ニュ-ロンを同定し,トレ-サ-との二重標識細胞を検索したところ,視床後腹側内側核(視床味覚野)内の最内側部から,同核のさらに内側部の視床中心内側核に二重標識細胞を認めた.また,視腹味覚野のイボテン酸注入による微小破壊により大脳皮質味覚野のCGRP線維が消失することからも,皮質味覚野にCGRP線維を送るのは、視床味覚野とくにその内側部の細胞であることが分った.2.味覚嫌悪学習における大脳皮質味覚野の役割り。サッカリンを経験させたラットでも,皮質味覚野の破壊により,新奇性恐怖は再現し,嫌悪学習獲得も可能であった.皮質味覚野を前もって破壊しておいても嫌悪学習獲得は可能であったが,学習獲得後の皮質破壊により条件づけ効果はすみやかに消失した.以上のことから,皮質味覚野は.過去に経験した味か初めての味かの判定に,また,嫌悪学習獲得時には条件制激の味の記憶に重要な働きを演じる。3.味覚嫌悪学習によるCーfos蛋白質の出現以上のように,大脳皮質味覚野は味覚嫌悪学習に重要であることが分ったので,このとき,プロトオンコジ-ンであるCーfosにより蛋白質産生を免疫組織化学的に検索したところ,嫌悪条件獲得後,皮質味覚野ニュ-ロンで著明に認められた。この詳細な働きは今後の課題である。
神経幹細胞の発生段階依存的な外部刺激応答性を規定するエピジェネティクス機構の解明

申請者は液性因子である骨形成因子(BMP)が胎生中期神経幹細胞をニューロンへ誘導する一方で、胎生後期神経幹細胞をアストロサイトへの分化を促進するという性質に着目し、本研究を開始した。採用開始時点では、BMPシグナル下流の転写因子であるリン酸化Smad(P-Smad)の結合領域の変化に伴い、P-Smadは胎生中期ではニューロン、後期ではアストロサイト分化に重要な遺伝子を標的とすることが明らかとなっていた。そこで平成30年度は、発生段階依存的なP-Smadの結合領域変化にエピジェネティクス機構が関与しているかを調べるため、以下の様に研究を展開した。全ゲノムDNAメチル化データ(PBAT)を用いた解析では、胎生中期に特異的なP-Smad結合領域は胎生中期及び後期を通じて低メチル化状態が維持されていたが、一方で胎生後期に特異的な結合領域では胎生中期から後期にかけて脱メチル化が進行していた。また、転写因子等の結合が可能なオープンクロマチン領域をATAC-seqにより調べたところ、胎生中期及び後期に特異的なP-Smad結合領域は、それぞれの結合時期でより開いた状態であった。さらに、胎生中期及び後期に特異的なP-Smad結合領域に含まれるモチーフを解析したところ、胎生中期ではSox11やBrn2といったニューロン分化に関与する転写因子が、胎生後期ではグリア分化に関係するNfiaやSoxEファミリー転写因子の結合配列が頻出した。これらの因子が結合領域の変化に関与する可能性を考え、相互作用を免疫沈降法により調べたところ、Smadとの結合が確認された。以上より、平成30年度はP-SmadはDNAメチル化の認識やパートナー転写因子の変換により標的遺伝子を変化させ、胎生中期及び後期の神経幹細胞の分化能変化(BMP応答性変化)を引き起こしているということを示唆する重要なデータを得ることができた。これまでの研究進捗状況の概略は以下の通りである。胎生期神経幹細胞のBMPへの応答性が発生段階により異なる原因として、発生段階によりP-Smadの結合領域が変化すること、またそれに伴って標的遺伝子も変化することを明らかにした。次に、P-Smad結合領域の変化にエピジェネティクス機構の関与を想定し、以下の解析を行った。DNAメチル化データ(PBAT)の解析では、胎生中期に特異的なP-Smad結合領域は胎生中期から後期まで低メチル化状態が維持されていたが、一方で胎生後期に特異的なP-Smad結合領域は脱メチル化が進行していた。また、オープンクロマチンを同定できるATAC-seqによる解析では、時期特異的なP-Smad結合領域は、それぞれの結合時期でより開いた状態であった。さらに、P-Smad結合領域のモチーフ解析を行ったところ、胎生中期ではニューロン分化に関与する転写因子が、また胎生後期ではグリア分化に関係する転写因子の結合配列が頻出した。そこで、P-Smadと相互作用するパートナー転写因子が自身の結合配列近傍にP-Smadをリクルートする可能性を考え、免疫沈降法を行ったところ、Smadとの相互作用が確認された。以上のことから、P-SmadはDNAメチル化の認識やパートナー転写因子の変換により標的遺伝子を変化させることにより、胎生中期及び後期の神経幹細胞の分化能変化(BMP応答性変化)に寄与していると考えられる。一方で、候補因子が得られない場合を想定して検討していたenChIP法は、標的領域を免疫沈降することが困難であった。上述の候補因子が目的の因子でなかった場合は、enChIP法の代替法(今後の方策に記載)を予定している。しかしながら、平成30年度はP-Smad結合領域の解析と候補因子を選出できたことから、概ね期待通り研究が進展したと考える。これまでの成果から、P-SmadはDNAメチル化の認識やパートナー転写因子の変換により標的遺伝子を変化させることにより、胎生中期及び後期の神経幹細胞の分化能変化(BMP応答性変化)に寄与していると考えられる。そこで、平成31年度は以下のように研究を進めていく予定である。まず、胎生中期及び後期の神経幹細胞において候補因子の過剰発現やノックダウン実験を行い、BMP刺激による分化誘導に変化が生じるかを調べる。変化が認められた場合には、候補因子の過剰発現及びノックダウン時のP-Smad結合領域や結合量の変化、エピジェネティクス修飾等を調べることにより、候補因子がP-Smadのリクルーターとして機能またはP-Smad結合領域のエピジェネティクス変換因子として機能する可能性を検討する。また、実際に候補因子の結合が標的遺伝子座で認められるかをChIP-qPCRで確認する。上記の実験により、現時点での候補因子の中からP-Smadの結合に発生時期及び領域特異性を与える因子を見出せない可能性も想定し、採用時よりenChIP法の検討を行ってきたが、標的領域を免疫沈降することは困難であった。そこで、目的の因子が得られない場合は、胎生中期及び後期の神経幹細胞を用いて、P-Smadを免疫沈降後に質量分析を行い、P-Smadに結合するタンパク質の中から候補因子を選出し、上記の実験を行う。これらにより、P-Smad結合領域に真に発生時期及び領域特異性を与える因子を同定し、胎生期神経幹細胞の分化変換機構の解明を目指す。

採用開始時点では、BMPシグナル下流の転写因子であるリン酸化Smad(P-Smad)の結合領域の変化に伴い、P-Smadは胎生中期ではニューロン、後期ではアストロサイト分化に重要な遺伝子を標的とすることが明らかとなっていた。そこで平成30年度は、発生段階依存的なP-Smadの結合領域変化にエピジェネティクス機構が関与しているかを調べるため、以下の様に研究を展開した。全ゲノムDNAメチル化データ(PBAT)を用いた解析では、胎生中期に特異的なP-Smad結合領域は胎生中期及び後期を通じて低メチル化状態が維持されていたが、一方で胎生後期に特異的な結合領域では胎生中期から後期にかけて脱メチル化が進行していた。また、転写因子等の結合が可能なオープンクロマチン領域をATAC-seqにより調べたところ、胎生中期及び後期に特異的なP-Smad結合領域は、それぞれの結合時期でより開いた状態であった。さらに、胎生中期及び後期に特異的なP-Smad結合領域に含まれるモチーフを解析したところ、胎生中期ではSox11やBrn2といったニューロン分化に関与する転写因子が、胎生後期ではグリア分化に関係するNfiaやSoxEファミリー転写因子の結合配列が頻出した。これらの因子が結合領域の変化に関与する可能性を考え、相互作用を免疫沈降法により調べたところ、Smadとの結合が確認された。以上より、平成30年度はP-SmadはDNAメチル化の認識やパートナー転写因子の変換により標的遺伝子を変化させ、胎生中期及び後期の神経幹細胞の分化能変化(BMP応答性変化)を引き起こしているということを示唆する重要なデータを得ることができた。これまでの研究進捗状況の概略は以下の通りである。胎生期神経幹細胞のBMPへの応答性が発生段階により異なる原因として、発生段階によりP-Smadの結合領域が変化すること、またそれに伴って標的遺伝子も変化することを明らかにした。次に、P-Smad結合領域の変化にエピジェネティクス機構の関与を想定し、以下の解析を行った。DNAメチル化データ(PBAT)の解析では、胎生中期に特異的なP-Smad結合領域は胎生中期から後期まで低メチル化状態が維持されていたが、一方で胎生後期に特異的なP-Smad結合領域は脱メチル化が進行していた。また、オープンクロマチンを同定できるATAC-seqによる解析では、時期特異的なP-Smad結合領域は、それぞれの結合時期でより開いた状態であった。さらに、P-Smad結合領域のモチーフ解析を行ったところ、胎生中期ではニューロン分化に関与する転写因子が、また胎生後期ではグリア分化に関係する転写因子の結合配列が頻出した。そこで、P-Smadと相互作用するパートナー転写因子が自身の結合配列近傍にP-Smadをリクルートする可能性を考え、免疫沈降法を行ったところ、Smadとの相互作用が確認された。以上のことから、P-SmadはDNAメチル化の認識やパートナー転写因子の変換により標的遺伝子を変化させることにより、胎生中期及び後期の神経幹細胞の分化能変化(BMP応答性変化)に寄与していると考えられる。一方で、候補因子が得られない場合を想定して検討していたenChIP法は、標的領域を免疫沈降することが困難であった。
マウス骨髄性白血病原因遺伝子Evi-9の同定とその解析

Evi-9は、新規のマウス骨髄性白血病原因遺伝子である。この遺伝子は、最近我々が開発したCpG islandを利用してレトロウィルスの挿入部位を同定する方法によって発見されたが、本年度の研究ではEvi-9がコードする蛋白の機能解析を進め、以下の点を明らかにした。(2)3種類のisoformをコードするcDNAをHeLa細胞に導入すると、double zinc finger domainを有するAとBのisoformは核内に、有さないisofom Cは細胞質に存在した。核内においてこれら2つのisoformは、nuclear body様のpanctuate patternの局在を示した。(4)Evi-9蛋白の核内における特徴的な局在様式から、co-localizeする蛋白質の候補を検討すると、Evi-9はBCL-6とco-localizationを示していた。BXH-2白血病細胞では、Evi-9とBCL-6の共発現がしばしば認められたが、このような細胞やRaji細胞では、これら2種類の蛋白質のinteractionが免疫沈降-Western blotting法により確認された。(5)ヒトEvi-9遺伝子cDNA全長を単離したが、ヒトとマウスではアミノ酸レベルで99%以上のsequence identityがあり、高度に保存されている遺伝子であることが示唆された。