hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素の立体構造に基づくスフィンゴ脂質生合成と分解の制御機構の解明

パルミトイルCoAのチオエステル部分への求核反応に続くCoASHの脱離と脱炭酸により,生成物の3-ケトジヒドロスフィンゴシンが生じる.生成物が酵素から解離すると,活性中心で酵素のLys残基とPLP間の分子内シッフ塩基が再生する.セリンパルミトイル転移酵素(SPT)はL-セリンとパルミトイルCoAを基質としてスフィンゴ脂質の基本骨格である長鎖塩基,3-ケトジヒドロスフィンゴシン(KDS)を合成する.SPTの反応機構に関しては,2つの対立する機構が提唱されてきた.1つは基質L-セリンの脱炭酸反応によってキノノイド中間体が生じ,次にアシル化が起こるという機構(A)であり,もう1つはL-セリンのα位の脱プロトン反応によってキノノイド中間体が生じ,アシル化と脱炭酸反応がその後に続くという機構(B)である.KDS生成がいずれの機構を経由するのかは長らく未定のままであった.非反応性のアシルCoA誘導体を有機合成し、大腸菌で発現させた組み換えSPTの精製標品を用いて、SPT・L-セリン・アシルCoA誘導体の三者の反応について時間分解スペクトルを測定した。想定した反応機構に基づいてグローバルフィッティング解析を行なったところ、キノノイド中間体を含む各中間体の吸収スペクトルを算出することができた。また、^1H-NMRを用いたSPTに結合した状態のL-セリンおよびD-セリンの重水中でのα位プロトンの交換反応の測定によって、アシルCoA誘導体の結合によってL-セリンα位脱プロトン反応(キノノイド中間体形成)が著しく促進される一方,D-セリンについてはアシルCoA誘導体の有無にかかわらずα位脱プロトン反応がほとんど起こらないことが明らかになった.以上の結果は、SPTの反応機構として機構(B)が妥当であるこどを示しており,また,L-セリンとの比較によってD-セリンは酵素の活性中心内でα位脱プロトン反応に適した立体配座をとれないためにSPTの基質になり得ないことが明らかになった.
4次以上のメタプレクティックゼータ関数

4次以上のメタプレクテイツクゼータ関数は、その係数がガウスの和を通じてメビウス関数に結び付くことから、リーマン予想解決のための有力な手がかりになるものと期待されるが,新たな進展を見るためには,数論的関数をなるべく簡単に直接的表示によって統制する手段が不可決である。その方向において,さしあたり手近な例を用いて,具体的な結果を出してみたいというのが本研究の主目的であったが,その目的は一応十分に達成されたといってよい。特に,上半平面上の尖点形式でない保形関数を取るとき,それに対応するゼータ関数の関数等式,特異点等が,元の関数がラプラシアンの固有関数でなくても、わかりやすい表示で得られたため、リーマンのゼータ関数の零点に対応する非尖点形式が,同じ形で統制されることが示された。これはきわめて意味深い結果である。なぜなら,ラプラシアンのような楕円作用素の固有関数は離散的であるのに反し、作用素や固有値によって束縛を受けない保形関数は連続的にとれるため、いわゆる「deformation」のような考え方が可能になるからである。ゼータ関数の零点と,ラプラシアンのような楕円作用素の固有関数とは、古来密接な関係があるのではないかと考えられ,中でもヒルベルトおよびポリアによって1915年頃述べられた意見は有名であるが,実際にそれらの間の具体的関係は,現在まで全く見いだされていない。従って本研究は,リーマン予想に関して,少なくとも新しい研究の道を開いたということができる。研究計画調書の研究目的の欄にも記入しておいたとおり、リーマン予想という問題ははなはだ困難なものであって、早急な解決は期待できないものであるが、本研究の目的は、多少の手がかりをもととして、可能な範囲で考察を試みることであったから、決定的な進展と言えるほどの成果を挙げるまでに至らなかったことはやむを得ないと考える。
遺伝子操作マウスの歯周組織におけるフリーラジカル関連酵素mRNAの発現

生体に取り込まれた酸素の数パーセントは平時でも反応性の高いフリーラジカルに変換され、蛋白、脂質、遺伝子と反応して代謝や輸送に影響を与える。さらにこれらラジカル(活性酸素、NO)は連鎖反応により、危険反応産物を産生増加し、多彩な疾患の増悪因子として働くことが知られている。近年、歯周組織、骨組織の細胞において、フリーラジカル関連酵素である活性酸素消去酵素及び一酸化窒素合成酵素などの存在有無が議論されているが、正常像における動態及び局在についても大部分不明である。そこで本研究は、In situ hybridization法及び免疫組織化学的方法による歯周組織及び骨におけるフリーラジカル関連酵素の存在部位を検索し、各種ラジカルの相互関係を明確にするため、ノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスを用いたある特定のラジカルの増加及び減少時の他種ラジカルの変動動態を、関連酵素を目安にして主に形態学的に検索した。(方法及び材料)Control mice, SOD1 transgenic mice, NOS2 KO, NOS3 KO miceを用い、頭蓋骨、上顎歯槽骨、上顎歯肉、歯根膜についてi-NOS mRNA, e-NOS mRNA, Mn-SOD mRNAの発現についてin situ hybridization法を用い検索した。(結果)、歯肉のcontrolでは、Mn-SOD mRNA及びe-NOS mRNAの発現は弱陽性、i-NOS mRNAの発現は陰性であった。さらに遺伝子操作マウスにおけるmRNAの発現については、(1)Mn-SOD mRNAの発現は、SOD1 transgenic miceにおいては、弱陽性、NOS2 KO miceの歯肉においては強陽性、NOS3 KO miceの歯肉においては弱陽性であった。(2)i-NOS mRNAの発現についてはSOD1 transgenic miceにおいては陽性、NOS2 KO miceの歯肉においては陰性、NOS3 KO miceの歯肉においては弱陽性であった。(3)e-NOS mRNAの発現については、SOD1 transgenic miceにおいては弱陽性、NOS2 KO miceの歯肉においては強陽性、NOS3 KO miceの歯肉においては陰性であった。さらに、蛋白レベルの変動を調べるために、Western blottingを行い検索した。その結果、mRNA変動とパラレルに蛋白レベルでも変動していた。また活性酸素と一酸化窒素が同時に発生する時に生じる危険産生物パーオキシナイトライトの発生有無を調べるために、ニトロチロシン抗体を用いた免疫組織学的検索を行った。その結果各種ラジカルの変動と関係があることが示された。(考察).Control miceにおけるMn-SODmRNA, e-NOS mRNAは、歯肉上皮の角化層直下にシグナルが認められたが、これはこれらの部位においてsuperoxideとnitric oxideを調節する必要性があり、さらに細胞の角化を制御している可能性が考えられる。NOS2KO miceにおけるMn-SODmRNA及びe-NOS mRNAが増加していた。これらのことからi-NOS遺伝子をノックアウトしても,superoxideとnitric oxideは増加するものと考えられ、さらには、nitrotyrosineの変化からperoxynitriteの発生が考えられる。NOS3KO miceにおけるi-NOS mRNAがcontrolより増加していたが、これは代償性変化だと考えられる。さらにMn-SODmRNAが増加し、nitrotyrosineの増加が観察されたことにより、peroxynitrite発生が考えられる。

また活性酸素と一酸化窒素が同時に発生する時に生じる危険産生物パーオキシナイトライトの発生有無を調べるために、ニトロチロシン抗体を用いた免疫組織学的検索を行った。その結果各種ラジカルの変動と関係があることが示された。(考察).Control miceにおけるMn-SODmRNA, e-NOS mRNAは、歯肉上皮の角化層直下にシグナルが認められたが、これはこれらの部位においてsuperoxideとnitric oxideを調節する必要性があり、さらに細胞の角化を制御している可能性が考えられる。NOS2KO miceにおけるMn-SODmRNA及びe-NOS mRNAが増加していた。これらのことからi-NOS遺伝子をノックアウトしても,superoxideとnitric oxideは増加するものと考えられ、さらには、nitrotyrosineの変化からperoxynitriteの発生が考えられる。NOS3KO miceにおけるi-NOS mRNAがcontrolより増加していたが、これは代償性変化だと考えられる。さらにMn-SODmRNAが増加し、nitrotyrosineの増加が観察されたことにより、peroxynitrite発生が考えられる。ヒトは生命活動維持の為に多量のATPを合成・消費し続けているが、これには多量の酸素を必要としている。生体に取り込まれた酸素の数パーセントは平時でも反応性の高いフリーラジカルに変換され、蛋白、脂質、遺伝子と反応して代謝や輸送に影響を与える。さらにこれらラジカル(活性酸素、NO)は連鎖反応により、危険反応産物を加速的に産生増加し、多彩な疾患の増悪因子として働くことが知られている。近年、歯周組織、骨組織の細胞において、フリーラジカル関連酵素である活性酸素消去酵素及び一酸化窒素合成酵素などの存在有無が議論されているが、正常像における動態及び局在についても大部分不明である。そこで本研究は、In situ hybridization法及び免疫組織化学的方法による歯周組織及び骨におけるフリーラジカル関連酵素の存在部位を検索し、各種ラジカルの相互関係を明確にするため、ノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスを用いたある特定のラジカルの増加及び減少時の他種ラジカルの変動動態を、関連酵素(合成酵素及び消去酵素)を目安にして主に形態学的に検索した。
すだれ状配置線対線電極系オゾナイザの開発とガス処理への応用

高濃度のオゾンを生成するために,一般には滞留時間を長くするため放電領域を長くする方法がとられている。この場合,無声放電により生成されたオゾンが次の放電により破壊されるためエネルギー効率が悪くなることが指摘されている。またガスの通過長が長くなるため圧力損失が増し大量のガスを流すのに不利こなっている。そこで,本研究では大量の原料ガスを導入でき,また電極最短距離部で高密度の無声放電が集中して発生するようにガラス被覆棒電極対棒電極をすだれ状に配列した大口径の無声放電型オゾナイザを試作し,オゾン生成の諸特性について調べ、検討した。主な結果を以下に示す。(1)棒対棒電極系の最適ギャップ長は0.71.0mmであり,ギャップ間でフィラメント状の一様な放電が発生していた。(2)本オゾナイザの最大オゾン収率は空気原料で123g/kWh(放電電力0.7W,オゾン濃度340ppm),料で375g/kWh(放電電力0.5W,オゾン濃度745ppm)であった。(3)電極列数3列のオゾナイザでは空気原料の場合オゾン濃度2500ppmでオゾン収率100g/kWh,酸素原料の場合オゾン濃度5500ppmで200g/kWhのオゾン収率が得られた。(4)本オゾナイザの最大オゾン濃度は空気原料で3400ppm(オゾン発生量860mg/h,オゾン収率829/kWh),酸素原料で6800ppm(オゾン発生量1.749/h,オゾン収率173g/kWh)であった。(5)今回提案したオゾナイザは簡単に電極列を増やすことができ,大容量化が可能である。本研究では高濃度のオゾンをより高いオゾン収率で得ることを目的とし、大量の原料ガスの導入が可能なガラス被覆線電極対線電極をすだれ状に配列した無声放電型オゾナイザを試作し,オゾン生成の諸特性について調べ、検討した。1.ガラス被覆線電極対線電極による電極構成について実験を行った結果、印加側電極1本に対して放電ギャップを1.0mm設け、接地側電極を2本とした場合が最適であることがわかった。2.スクリーン状の放電領域を形成するためにガラス被覆線電極対線電極により電極列を構成し実験を行った結果、高濃度のオゾンをより高いオゾン収率で得ることができることがわかった。今回提案したオゾナイザは簡単に電極列を増やすことができ,大容量化が可能であると思われる。3.周波数を40Hzから480Hzまで変えて実験を行った結果、本オゾナイザのオゾン収率を向上させる周波数の最適値が存在すると考えられる。しかしながらこの場合の収率においては数%程度しか向上しなかった。今回試作したガラス被覆線電極が10W以上の放電電力に耐えられるなら,空気原料で4000ppmを超えるオゾンを生成できると考えられる。4.本オゾナイザの最大オゾン収率は空気原料で123g/kWh(放電電力0.7W,オゾン濃度340ppm),酸素原料で375g/kWh(放電電力0.5W,オゾン濃度745ppm)であった。5.本オゾナイザの最大オゾン濃度は空気原料で3352ppm(オゾン発生量862mg/h,オゾン収率82g/kWh),酸素原料で6773ppm(オゾン発生量1.74g/h,オゾン収率173g/kWh)であった。

またガスの通過長が長くなるため圧力損失が増し大量のガスを流すのに不利こなっている。そこで,本研究では大量の原料ガスを導入でき,また電極最短距離部で高密度の無声放電が集中して発生するようにガラス被覆棒電極対棒電極をすだれ状に配列した大口径の無声放電型オゾナイザを試作し,オゾン生成の諸特性について調べ、検討した。主な結果を以下に示す。1.スクリーン状の放電領域を形成するためにガラス被覆棒電極対俸電極により電極列を構成し実験を行った結果、高濃度のオゾンを高いオゾン収率で得ることができることがわかった。今回提案したオゾナイザは簡単に電極列を増やすことができ,大容量化が可能である。2.放電電力を増すとオゾン収率は低下するが,電極列数を増すことにより低下の割合を緩和できる。3.ガス流量を2L/minから10L/minまで変えた場合,印加電圧が一定であれば,ガス流量の増加と共に発生オゾン濃度は低下するが時間当たりのオゾン発生量は変化しないことが分かった。4.本オゾナイザの最大オゾン収率は空気原料で123g/kWh(放電電力0.7,Wオゾン濃度340ppm),酸素原料で375g/kWh(放電電力0.5W,オゾン濃度745ppm)であった。電極列数3列のオゾナイザでは空気原料の場合オゾン濃度2500ppmでオゾン収率100g/kWh,酸素原料の場合オゾン濃度5500ppmで200g/kWhのオゾン収率が得られた。5.本オゾナイザの最大オゾン濃度は空気原料で3400ppm(オゾン発生量860mg/h,オゾン収率82g/kWh),酸素原料で6800ppm(オゾン発生量1.74g/h,オゾン収率173g/kwh)であった。
学習教材用「星座判別・観察アプリケーション」の開発

全体的な「実験」の時間の減少から理科に興味・関心・学習意欲を持たない「理科離れ」の学生の増加が指摘され,大きな問題となっている。そこで,観察・実験などの体験的な学習を重視し,学生にわかりやすく理科を教えることができるようなデジタル教材を作る必要があると考えられる。そこで,本研究では星座観察に注目し,実際の夜空で観察した星の群れから星座を自動判別・観察・記録するアプリケーションを作成することを目的とする。アプリケーションの仕組みとしては,モバイル型小型ノートPCにCMOSカメラ,「実際に観察する星座」と「その星座の解説」を同時に見ることができる半透明のヘッドマウントディスプレイ,GPSレシーバ等を接続し,実際に観察した星座の上に星座線や解説を重ねて見ることができるようになっている。まず,星座の自動判別の方法としてOpenCVという画像処理ライブラリを用い,CMOSカメラで読み取った動画と星座の画像とのテンプレートマッチングを行った。はじめは全ピクセルを単純に捜査する方法でマッチングを行ったが,星座の画像は黒がほとんどを占めるため思ったような結果が得られなかった。そこで,SURFにより特徴量を比較するマッチング方法を採用した。その結果,マッチングの精度は格段に向上した。しかし,今回使用したWebカメラでは十分な量の光を感知することができず,星座を自動判別するには天候や周囲の暗さの面でかなりの好条件が必要となった。次に,GPSレシーバの情報をもとに観測場所の緯度・経度を求め,観測者がボタンーつでその情報と共に観察画像をキャプチャーし,その画像がPCに保存できるようにした。観察後,その記録を見ることで学習効果を上げる手助けとなる。このアプリケーションを使用して星座観察を行うことで天文分野の学習に興味・関心を持つことができ,少しでも理科離れを食い止めることができると考える。
再生ヒドラの揺らぎの全モード解析

多細胞生物の発生の初期過程において極めて重要である体軸の決定機構を解明するため、発生過程のモデル実験系として頻繁に用いられているヒドラに着目し研究している。当該年度以前までには(A)ヒドラ切片と(B)単離細胞を再凝集した塊の再生過程における形状揺らぎを、全モード解析によって定量的に解析した。ここではモードの時間発展は類似しているものの運動(並進・回転)が全く異なることを明らかにし、その理由に迫るため、組織の変形や運動を可能とする細胞骨格構造の時間発展の定量に取り組んだ。その結果、ヒドラ切片では常にヒドラの成体に特有な格子状のアクチン構造が見られる一方、再凝集系ではランダムなアクチン配列から始まり、再生する過程で格子構造を形成する、という異なる時間発展プロセスを明らかにした。この結果は、再凝集系に特徴的な、形状の対称性の破れがヒドラ切片に比べて遅くかつ運動が見られないという結果を説明する上で大変興味深い。また変形・運動だけでなく、体軸形成に影響を及ぼすWntシグナル経路はヒドラの再生過程において大変重要な要素である。再生過程における組織の変形とこのシグナル経路の関係を探るため、Wntシグナル経路の活動を促進・抑制した遺伝子的摂動下での形状揺らぎの全モードの解析も行った。その結果、(1)促進した際はヒドラの再生過程に特徴的なpump-burst cycle(大きさが徐々に増加し、破裂するサイクル)の回数が減る一方、(2)抑制した場合には再生することなく、pump-burst cycleも見られなかった。また、変形する組織の理論構築に着手し、モードの時間変化と張力・弾性といった物理的制約の関係式から全モード解析で得られたモード0と2が逆位相になるという現象を準定量的に再現することに成功した。当初研究計画において当該年度には、(1)環境因子がヒドラの再生過程に与える影響の定量的な解析と(2)理論構築を計画した。(1)においては、体軸形成に影響を及ぼすWntシグナル経路のような内部因子の活動を促進・抑制した場合の形状揺らぎの全モードの定量解析を行った。これまでは定性的な振舞いの理解に留まっていたが、pump-burst cycleの周期や軸方向への変形(モード2)の時間変化を今まで得られた結果と定量的に比較した。また、成体への再生スピードだけでなく、初期の口の生成(体軸決定に伴い、細胞が分化し起こる現象)時期がWntシグナル経路の活動を促進した場合、著しく早まったことを突き止めた。また(2)においては、変形する自己駆動型粒子のモデルをもとに、周期的な粒子サイズ変化とモード2の変形度の関係式を作り、それに張力や弾性といった物理的制約を加えた。これらの関係式に、実験で得られた組織のサイズ変化(モード0)のデータを代入したところ、実際に全モード解析で得られたモード0と2が逆位相になるという現象の再現に成功し、対称性の破れ(体軸決定)の統合的理解に一歩近づき、計画通りに進んでいると考えられる。体軸形成に影響を及ぼすWntシグナル経路分子を使った実験で非常に興味深い結果がでたため、他の分子で経路の様々な場所に摂動を与える実験を行い、これまでに得られた結果を更に裏付けることで、当初の研究目的をより精緻に達成することを目指す。また、得られた結果について研究成果を学会で発表するだけでなく論文にまとめ国際誌に発表するなどの成果報告を順次進める予定である。多細胞生物の個体の発生において形態形成は最も重要な過程の一つである。ここでは細胞同士の相互作用に加えて、それらを取り巻く環境との相互作用によって多数の細胞が秩序的な高次構造を自発的に生み出し、個別細胞の単なる総和とは異なる機能を生み出す。なかでも、等方的な胚が体軸を決定する過程は発生の初期過程において極めて重要である。この体軸の決定という「対称性の破れ」を、発生過程を理解するためにモデル実験系として頻繁に用いられているヒドラを用いて、非平衡形状揺らぎの全モード解析という物理的リードアウトによって定量的に解析した。また、形状揺らぎと再生ヒドラ切片の運動(並進・回転)の相関も得られた。ヒドラ切片の再生過程で得られた結果をより深く理解するために、単離した細胞を再凝集した塊から再生する系を用いて実験を行った。モードの時間発展は切片から再生する系に類似していたが、運動が全く異なるという興味深い結果が得られた。さらに、この現象において組織の変形を可能とする細胞骨格の重要性を調べるため、細胞骨格を駆動している分子モーターを阻害した系でのモード解析も行った。また研究準備段階では計画していなかった再生ヒドラ切片の体積弾性率を非侵襲的かつ高精度で評価するという研究テーマを見つけ、その成果をまとめ論文として発表した(Veschgini,...Suzuki, et al., APL 108, 103702 (2016))。ほぼ無限で強力な再生能力をもつヒドラの組織切片は1週間ほどで完全なヒドラとして再生する。なかでも最初の2、3日は体軸形成において非常に重要であり、変形しながら駆動する。長時間にわたり自発的形状揺らぎ及び運動を追跡するため、ヒドラの自動追跡システムの構築にとりかかり、ほぼ完成している。形状揺らぎの全モード解析に関しては、再生ヒドラ切片を用いて異なるサイズで行ったのに加えて、比較として単離した細胞を再凝集したReaggregate系でもモード解析を行った。

さらに、形状を司る細胞骨格の駆動しているミオシンの働きを阻害する実験も実施したことから、計画通りに進んでいると考えられる。また研究準備段階では計画していなかった再生ヒドラ切片の体積弾性率を非侵襲的かつ高精度で評価するという研究テーマを見つけ、その成果をまとめ論文として発表した(Veschgini,...Suzuki, et al., APL 108, 103702 (2016))。等方的な胚が体軸を決定する過程は、多細胞生物の発生の初期過程において極めて重要である。この体軸の決定機構を解明するため、発生過程のモデル実験系として頻繁に用いられているヒドラに着目し研究している。当該年度以前までには(A)ヒドラ切片と(B)単離細胞を再凝集した塊の再生過程における形状揺らぎを、全モード解析によって定量的に解析した結果、モードの時間発展は類似しているものの運動(並進・回転)が全く異なることを明らかにした。その理由に迫るため、組織の変形や運動を可能とする細胞骨格構造の時間発展の定量に取り組んだ。再生過程における様々な時点でサンプルを固定しアクチンを蛍光染色した結果、(1)ヒドラ切片では成体へと再生する間、常にヒドラの成体に特有な格子状のアクチン構造が見られる一方、(2)再凝集系ではランダムなアクチン配列から始まり、再生する過程で局所的に格子構造が生じ、やがて一様な格子構造を形成する、という異なる時間発展プロセスを明らかにした。この結果は、再凝集系に特徴的な、形状の対称性の破れがヒドラ切片に比べて遅くかつ運動が見られないという結果を説明する上で大変興味深い。また、ヒドラの再生過程において重要な要素としては変形・運動だけでなく、体軸形成に影響を及ぼすWntシグナル経路がある。このシグナル経路の活動を促進・抑制した遺伝子的摂動下での形状揺らぎの全モードの解析も行った。その結果、(a)促進した際は再生が早まり、ヒドラの再生過程に特徴的なpump-burst cycle(大きさが徐々に増加し、破裂するサイクル)の回数が減る一方、(b)抑制した場合には再生することなく、pump-burst cycleも見られなかった。(b)においては、変形を可能とする細胞骨格・分子モーターは正常に働いている状態にも関わらず再生能を失うことを明らかにした。当初研究計画において当該年度には、これまで得られた全モード解析の結果を理解するために環境因子(外的摂動)がヒドラの再生過程に与える影響の定量的な解析を計画した。ここでは外部摂動として、(1)物理的摂動、(2)化学的摂動、(3)遺伝子的摂動、という環境因子を変えたときの影響を見るのが目標である。(1)と(2)においては、溶液の浸透圧や粘性、ヒドラの成長速度を変える実験の一部に着手した。またこれに並行して、組織の変形や運動を可能とする細胞骨格の再生過程における時間的変化に着目し、これまでに再生過程の異なる(A)ヒドラ切片および(B)単離細胞の再凝集塊における細胞骨格(アクチン)構造の時間発展の追跡に成功した。これらの結果は、形状揺らぎの全モード解析から得られた結果を理解するにあたって大変重要である。今回得られた成果を踏まえた上で、来年度本格的に(1)と(2)の実験を行うことで、環境因子が形態形成および対称性の破れに与える影響の本質をより深く理解できると期待している。
包括的健康指標を用いた生活習慣変容の予防医学的評価システムの開発

ライフスタイルを喫煙、飲酒、睡眠、運動・睡眠様態、ストレス、労働時間、並びに栄養バランスなどの生活習慣を包括的に評価することにより定量化する方法を考案した。このように評価したライフスタイルと様々な健康度指標(末梢リンパ球染色体変異、NK細胞活性、精神心理的な健康状態、光トポグラフィーによる脳活性化状態、生活労働満足度など)との関連を職域コホート集団を対象に定量的に解析した。末消リンパ球染色体変異量はこれらの健康習慣指数と有意に関連性を持って変化したが、特に喫煙、飲酒、及びストレスが大きな決定要因であった。また、免疫力の代表的な指標であるNK細胞活性もこれら健康習慣指数と有意に関連して変化することが明らかになったが、特にストレス、喫煙、並びに睡眠様態が重要な決定要因として働いていた。また、加齢によるこれら健康度の低下と実年齢との関連から健康年齢を評価する方法を考案し、ライフスタイルによりこれら諸健康指標の改善と共に包括的な健康年齢が大きく変化する重実を明らかにした。これら健康年齢を評価する手法を用いるとライフスタイルの悪い集団は良い集団に比し加齢の速度が約2倍早い事実も明らかとなった。これらの健康度評価体系を健康人集団に適応することによりライフスタイル変容が実際に健康年齢の若返りを期待できることが科学的に保証される。これまでの観察的疫学研究により、高脂肪食や運動不足は大腸癌のリスクをあげることが示唆されている。そこで、我々は、大腸癌の高危険度群患者である多発性大腸腫瘍(腫瘍・癌)患者に対し、食事指導と適正な運動負荷による無作為割付をおこない、大腸腫瘍の発生の有無および、大腸癌に関連した生物学的指標の変化について検討する臨床試験を企画した。エントリー期間は2年間、介入期間は2年間である。先ず、食事指導の参加を呼びかけ、参加希望者に食事指導をおこなった3ヵ月後、運動負荷への参加を呼びかける。割付は参加者自身がくじを引き、A群;食事指導およびフィットネスクラブでの運動負荷療法、B群;食事指導のみの2群に無作為に割り付ける。食事指導内容は、脂肪摂取量の適正化と多価不飽和脂肪酸組成の適正化とする。運動負荷は、1週間に1回以上、フィットネスクラブに通い、所定の運動負荷を受けるように指導する。主なエンドポイントは2年目に全大腸内視鏡検査における大腸腫瘍の発生の有無である。募集予定数は、A群100名、B群100名、計200名である。登録は平成9年10月に開始した。平成12年2月現在、適応基準に合致した207人に参加を呼びかけ、163人(79%)が食事指導についての参加を承諾した。参加を承諾した者のうち食事指導をうけて3ヶ月経過した者のうち、運動負荷に関する除外項目に合致した者を除外し、残りの者に、再度参加を呼びかけ、85人が参加を承諾し、運動療法および食事療法をおこなう43人と食事療法のみをおこなう42人に無作為に割り付けされた。発癌予防のための生活習慣への介入を企画、実施し、高い参加率を得ることができた。この良好な参加率の理由は、2段階に分けたインフォームドコンセントと、自らがくじを引く方法、無償による生活習慣変容指導が効果的だあったと考えられた。多発性大腸腫瘍患者に対し、食事指導と運動負荷による無作為割付をおこない、大腸腫瘍の発生の有無および、生物学的指標の変化について検討する臨床試験を企画した。エントリー期間と介入期間はそれぞれ2年間である。先ず、食事指導への参加を呼びかけ、参加希望者に食事指導を行った3ヶ月後、運動負荷への参加を呼びかける。食事指導および運動負荷の内容は昨年の報告に述べた。主エンドポイントは2年目に全大腸内視鏡検査における大腸腫瘍の発生の有無である。平成9年10月から平成12年3月まで参加呼びかけを実施した。適応基準に合致した211人全員に参加を呼びかけ、165人(78%)が食事指導についての参加を承諾した。

参加を拒否した46人の理由は、仕事の多忙28人、当施設が遠い3人、家族が病気や多忙5人、自分で食事には気をつけているので指導は不要と考える2人、面倒3人、などであった。食事指導をうけた165人のうち、運動負荷に関する除外項目等により除外された者は41人である。その理由は、心疾患3人、重度の疾患により運動不可11人、すでにスポーツクラブに通っている19人、フィットネスクラブが遠い8人である。残りの124人について、再び運動負荷療法についての無作為割付試験への参加を呼びかけた。81%が参加を承諾し、運動、食事療法ともにおこなう53人(平均年齢52.6歳、女性7人)と食事療法のみを行う50人(平均年齢52.1歳、女性13人)に無作為に割り付けされた。21人が参加を拒否したが、その理由は、現在の生活の運動で十分8人、多忙9人、などであった。2回の参加呼びかけ同意率を掛け合わせた値は63.4%であった。試験参加後、参加継続を中止した者は、肺癌で死亡した1人のみである。多発性大腸腫瘍患者に対し、食事指導と運動負荷による無作為割付をおこない、大腸腫瘍の発生の有無および、生物学的指標の変化について検討する臨床試験を企画した。エントリー期間と介入期間はそれぞれ2年間である。先ず、食事指導への参加を呼びかけ、参加希望者に食事指導を行った3ヶ月後、運動負荷への参加を呼びかける。割付は参加者自身がくじを引き、A群;食事指導およびフィットネスクラブでの運動負荷療法、B群;食事指導のみの2群に無作為に割り付ける。食事指導および運動負荷の内容は一昨年の報告に述べた。主エンドポイントは2年目の全大腸内視鏡検査における大腸腫瘍の発生の有無である。平成9年10月から平成12年3月まで参加呼びかけを実施した。適応基準に合致した211人全員に参加を呼びかけ、165人(78%)が食事指導についての参加を承諾した。21人が参加を拒否した。試験参加に同意した参加者のうち、フィットネスクラブで運動負荷を行う群では、フィットネスクラブに通うことにより特に問題は発生していない。エンドポイントのための2年目の大腸内視鏡検査は順次、実施され、2002年3月末に本試験は完遂できる予定である。
神経調節因子の自然免疫系における役割の解明

本研究では、神経調節因子である中脳アストロサイト由来神経栄養因子(MANF)とジアゼパム結合阻害因子(DBI)について、マクロファージ系細胞における産生・分泌機構及び生理作用を解析し、自然免疫系における役割を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、ブレビバチルス菌によるタンパク質の分泌生産法(BIC法)を用いて、MANFとDBIの組換えマウスタンパク質を菌体外に生産するシステムを構築した。本年度、菌から抽出したプラスミドDNAの配列解析を行ったところ、両タンパク質をコードする遺伝子が全長で挿入されていることを確認した。培養液中からはHisタグを利用した精製の後、透析及びセントリコンによる濃縮を行うことでmg/mlという比較的高濃度で両タンパク質溶液を調製できることを示した。3060mlの培養液から1mg程度の両タンパク質を生産できることがわかった。この方法で作製した組換えMANFタンパク質の生理活性について、マウス腎臓マクロファージ株KM-1細胞に対する作用を検討した。LPS及びATPでKM-1細胞を刺激すると炎症性サイトカインIL-1βの放出が誘導されるが、組換えMANFで前処理した細胞では、そのIL-1β放出が抑制される傾向が見られた。また、組換えMANFを投与したマウスから調製した腹腔内マクロファージでは、LPS及びATP刺激によるIL-1β放出能が減弱していた。これらの結果から、MANFが抗炎症性の作用を持つことが示唆された。さらに、組換えMANFのT細胞への影響についても、マウスT細胞への直接的作用、組換えMANFを投与したマウスのT細胞活性の変化、さらに遅延型過敏症への組換えMANFの効果について現在検討を進めている。今後も、組換えMANFあるいはDBIをマウスに投与し、免疫系への影響についてマウスを用いて研究を進める。本研究では、神経調節因子として知られる中脳アストロサイト由来神経栄養因子(MANF)とジアゼパム結合阻害因子(DBI)について、マクロファージ系細胞における産生・分泌制御機構及び生理作用を解析し、脳や末梢組織の自然免疫系における役割を明らかにする。本年度は、マウス組織マクロファージの不死化細胞株である脳ミクログリア由来MG6細胞、腎臓糸球体マクロファージ由来KM1細胞からのMANFとDBIの分泌機構について解析した。またブレビバチルス菌を用いた組換えタンパク質作製法(BIC法)について検討した。MANFに関しては、細胞溶解液をウエスタンブロット法で解析したところ複数のバンドが検出されたことから、タンパク質修飾を受けたと考えられる複数のMANF分子種が存在する可能性が示唆された。それぞれのMANF分子種の存在割合は、MG6細胞とKM1細胞の間でも異なることがわかった。また、ATP刺激による両不死化マクロファージ細胞株からのMANFの細胞外への分泌には、P2X7受容体活性化を介した分泌機構が関与することが示唆された。特に、リポ多糖で前処理した場合には、MANF分泌量も多くなることが確認された。さらに、BIC法を用いて組換えマウスMANFタンパク質を菌体外に直接分泌・生産するシステムを作製した。一方、DBIに関しても、ATP刺激で濃度依存的な不死化マクロファージ細胞株からの細胞外への分泌を確認した。ところが、DBIの発現量は比較的少ないため、特にウエスタンブロット法で検出するためには、サンプル中のタンパク質を濃縮するなどの前処理が必要であることがわかった。本年度は、ATP刺激によるマウス不死化マクロファージ細胞株からのMANFとDBIの細胞外への分泌機構について解析を進めた。MANFについては、修飾を受けたと考えられる複数のタンパク質分子種が存在すること、BIC法を用いた組換えタンパク質の分泌生産系が利用可能であることなど、いくつかの新しい知見を得ることができた。また、DBIの分泌に関してもウエスタンブロット法による検出系の検討を進めた。よって、当初の研究計画に従っておおむね順調に進展していると考えられる。ATP刺激によってマクロファージ系細胞から分泌されるMANFに関して、複数の分子種が存在する可能性が示唆されたため、内因性MANFのタンパク質修飾(糖鎖付加及びユビキチン化)について検討した。N結合型及びO結合型糖鎖を切断する酵素あるいはユビキチン抗体を用いた解析を行ったが、MANF分子にこれらのタンパク質修飾を確認することはできなかった。また、MANF抗体を用いたウエスタンブロット(WB)法で検出される複数のバンドパターンの再現性も低いことが明らかとなった。つまり、WB法では非特異的なバンドの検出を含む可能性が示唆されたため、既に得られている実験データについても見直す必要があることがわかった。さらに、ブレビバチルス菌によるタンパク質の分泌生産法(BIC法)を用いたMANFとDBIの組換えタンパク質の作製についても検討を進めた。MANFに関しては、精製後の組換えタンパク質に不純物(着色)が残るという問題があったため、精製法と産生菌の培養条件を再検討した。その結果、菌の培養液をTMNm培地から2SYNm培地に変更することによって、精製後のサンプルに着色も少なく、純度良く比較的大量にMANFの組換えタンパク質を回収できる条件を見出した。DBIに関しても、組換えタンパク質を分泌生産するブレビバチルス菌の発現クローンの作製に成功した。

本年度は、BIC法による組換えタンパク質の分泌生産に関して、組換えMANFタンパク質の生産法をほぼ確立するとともに、組換えDBIタンパク質の生産菌を得ることができた。一方で、WB法による内因性MANFの検出法について問題点を見出した。既に得られているWB法の実験データの見直しが必要ではあるが、全体としてはおおむね計画通りに研究が進展していると考えられる。本研究では、神経調節因子である中脳アストロサイト由来神経栄養因子(MANF)とジアゼパム結合阻害因子(DBI)について、マクロファージ系細胞における産生・分泌機構及び生理作用を解析し、自然免疫系における役割を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、ブレビバチルス菌によるタンパク質の分泌生産法(BIC法)を用いて、MANFとDBIの組換えマウスタンパク質を菌体外に生産するシステムを構築した。本年度、菌から抽出したプラスミドDNAの配列解析を行ったところ、両タンパク質をコードする遺伝子が全長で挿入されていることを確認した。培養液中からはHisタグを利用した精製の後、透析及びセントリコンによる濃縮を行うことでmg/mlという比較的高濃度で両タンパク質溶液を調製できることを示した。3060mlの培養液から1mg程度の両タンパク質を生産できることがわかった。この方法で作製した組換えMANFタンパク質の生理活性について、マウス腎臓マクロファージ株KM-1細胞に対する作用を検討した。LPS及びATPでKM-1細胞を刺激すると炎症性サイトカインIL-1βの放出が誘導されるが、組換えMANFで前処理した細胞では、そのIL-1β放出が抑制される傾向が見られた。また、組換えMANFを投与したマウスから調製した腹腔内マクロファージでは、LPS及びATP刺激によるIL-1β放出能が減弱していた。これらの結果から、MANFが抗炎症性の作用を持つことが示唆された。さらに、組換えMANFのT細胞への影響についても、マウスT細胞への直接的作用、組換えMANFを投与したマウスのT細胞活性の変化、さらに遅延型過敏症への組換えMANFの効果について現在検討を進めている。今後も、組換えMANFあるいはDBIをマウスに投与し、免疫系への影響についてマウスを用いて研究を進める。今後は、MANFに関しては不死化マクロファージ細胞株に加えて初代培養マクロファージも用いて、分泌制御機構について再現性を確認していく。本年度、複数のMANF分子種が存在する可能性が示唆されたことから、糖鎖付加などタンパク質修飾についての検討も進める必要があると考えている。また、分泌性の膜小胞であるエキソソームとの関連についても検討する。BIC法で分泌生産した組換えMANFタンパク質の精製法を検討し、その生理活性を確認する。DBIについてもMANFと同様な解析を順次進める予定である。今後は、WB法による内因性MANFの検出については、基本的にMANFの分子量(約18kDa)に相当するバンドのみを解析対象とする。
18世紀後半における清朝とカザフ遊牧勢力の対外交渉に関する研究

本研究では、18世紀後半における清朝とカザフ遊牧勢力との対外交渉を、一次史料である文書史料の分析に基づいて研究した。特筆される成果として、清朝-カザフ関係に関する英文資料集の刊行がある。本資料集の主な目的は、カザフ首長層から清朝に送付された書簡を紹介し、その特徴と歴史史料としての価値を検討することにあり、加えて清朝に派遣されたカザフ使節に関する基礎データも提示した。本研究の目的は,18世紀後半における満洲人王朝の清朝(1616-1912)と中央アジアのカザフ遊牧勢力との対外交渉を,清朝の公文書である満洲語文書,カザフ首長層が清朝に宛てたオイラト語(トド文字モンゴル語)・チャガタイ語(アラビア文字テュルク語)文書等の分析にもとづいて検討し,中央アジア北部草原地帯における清朝の政治権力の拡大・浸透過程と,それがカザフ遊牧社会に与えた影響を具体的に明らかにすることにある。本年度は,日本語論文1本,中国語論文1本,英文報告書1冊(単著)を刊行した。日本語論文ではジューンガル遊牧国家の発展・衰退の過程におけるカザフ遊牧民との関係,中国語論文ではカザフ内におけるオスマン朝認識およびその清朝への伝播について論及することができた。また,12月には台北市の故宮博物院図書館と中央研究院歴史語言研究所を訪問し,清代公文書の調査を行った。特にカザフ首長層が派遣した使臣の迎接体制に関する文書を重点的に調査した。また,その資料の内容と対照しつつ,すでに筆写してある中国第一歴史档案館所蔵「満文カザフ档」の翻訳とデータ化を進めた。さらに,現在までに収集し得たカザフ首長層が清朝に送付した書簡(来文)の原本であるチャガタイ語文書6件について,翻訳とデータ化を完了することができた。以上の作業はいずれも,2009年度に予定している,清朝-カザフ関係の研究において根本となる資料を集成した英文史料集刊行のための準備作業である。本年度は、研究計画に沿い、18-19世紀における清-カザフ関係に関連する文書史料の収集と分析をおこなった。そして、本研究課題の申請時に目標として設定していた、清-カザフ関係に関する英文資料集(野田仁氏との共著)を刊行することができた。本書の第一章には、本研究課題によって収集したものを含む、カザフ首長層が清朝に宛てたオイラト語・チャガタイ語文書16件を収録した。各文書のアラビア文字テキスト(チャガタイ語文書のみ)、ラテン文字転写テキスト、訳文、註釈を提示し、また関連する満文・漢文文書のテキスト・訳文も加えた。第二章は小沼の英文論文、第三章は野田氏の英文論文を収録した。第四章では、中国北京市の中国第一歴史梢案館所蔵のカザフ関連史料「満文哈薩克档」を利用して、カザフ首長層が清朝宮廷(北京・承徳)に派遣した使節団の回数・年次・人的構成を解明した。また、本書には収録できなかったが、平成22年1月に中国第一歴史梢案館で調査を実施した際に発見したチャガタイ語文書についても分析を進め、1770年代におけるカザフ草原南辺における政治情勢が清朝の対中央アジア政策、新彊統治政策に与えた影響を検討した学術論文を執筆した(投稿中)。さらに、5月にはソウル大学中央ユーラシア学研究所の国際シンポジウムに招聘され、本研究課題に隣接する分野である、ジューンガル遊牧国家における中央アジア商人の活動と役割について報告を行い、同研究所刊行の英文雑誌への寄稿を準備している。
超新星爆発と宇宙線由来原子核の起源

今年度の研究は′(1)非球対称超新星爆発による元素合成′および(2)′中性子星の上限質量および白色矮星から中性子星への進化とフィズラ-過程′である.(1)非球対称超新星爆発による元素合成系統的に大質量の超新星爆発に伴う非球対称爆発的元素合成を調べた.まだpreliminaryではあるが,10-50M【of sun】の星について計算を行った.超新星1987Aのprogenitorである20M【of sun】の場合すでに同様の計算を行っており質量数A=45,65付近の元素が球対弥の場合より過剰生産されていたが大質量星全般についてもこのことは確かめられた.放射性元素との関係では^<44>Ti(半減期47yr),^<59>Ni(半減期10^5yr)が球対称の場合より大幅に生成された.もし宇宙線が超新星起源であれば^<59>Niの電子捕獲は大幅に遅れると予想され、宇宙線中のNi/Co比が球対弥の場合と異なっている可能性がある.このことを今後定量的に調べることにより宇宙線起源と超新星の関係に新たな視点を与えられると結論した.(2)中性子星の上限質量および白色矮星から中性子星への進化とフィズラ-過程中性子星の強磁場は宇宙線加速に役割を果たすが,中性子星の起源が最近見直されている.我々は超新星爆発なしで白色矮星から直接中性子星へ進化するシナリオの強い可能性を示すことに成功した.磁場と回転と中性子星の活動期は宇宙線の起源とも密接に関連しているはずなので,今後は磁場とフィズラ-との関係を調べていくことも必要である.今年度の研究は′(1)非球対称超新星爆発による元素合成′および(2)′中性子星の上限質量および白色矮星から中性子星への進化とフィズラ-過程′である.(1)非球対称超新星爆発による元素合成系統的に大質量の超新星爆発に伴う非球対称爆発的元素合成を調べた.まだpreliminaryではあるが,10-50M【of sun】の星について計算を行った.超新星1987Aのprogenitorである20M【of sun】の場合すでに同様の計算を行っており質量数A=45,65付近の元素が球対弥の場合より過剰生産されていたが大質量星全般についてもこのことは確かめられた.放射性元素との関係では^<44>Ti(半減期47yr),^<59>Ni(半減期10^5yr)が球対称の場合より大幅に生成された.もし宇宙線が超新星起源であれば^<59>Niの電子捕獲は大幅に遅れると予想され、宇宙線中のNi/Co比が球対弥の場合と異なっている可能性がある.このことを今後定量的に調べることにより宇宙線起源と超新星の関係に新たな視点を与えられると結論した.(2)中性子星の上限質量および白色矮星から中性子星への進化とフィズラ-過程中性子星の強磁場は宇宙線加速に役割を果たすが,中性子星の起源が最近見直されている.我々は超新星爆発なしで白色矮星から直接中性子星へ進化するシナリオの強い可能性を示すことに成功した.磁場と回転と中性子星の活動期は宇宙線の起源とも密接に関連しているはずなので,今後は磁場とフィズラ-との関係を調べていくことも必要である.
円柱形状レーザー生成プラズマ標的を用いた低エネルギー重イオンの飛程測定

平成14年度は、レーザー生成プラズマ標的の高密度化を目指して改良を行った。また、改良後のプラズマ標的に数100keV/核子の入射エネルギーを持つ酸素イオンビームを入射し、標的通過後の酸素イオンの荷電状態分布を測定した。プラズマ標的の改良においては、ドライブレーザーをCO_2レーザーからより短波長のNdガラスレーザーに変更した。Ndガラスレーザーを固体水素表面にラインフォーカスさせ、照射強度6×10^9W/cm^2のもと高密度水素プラズマを生成した。プラズマ標的の診断には、分光法及び干渉法を用いた。分光法では、電子密度をシュタルク幅拡がりから、電子温度を輝線及び連続スペクトルの強度比から求めた。一方、干渉法では測定用レーザーとしてヘリウムネオンレーザー及びアルゴンレーザーを用い、それぞれの干渉縞のシフト量から電子密度および中性原子密度を求めた。電子密度に関しては、どちらの診断法においてもレーザー照射の約50ns後に最大で約1×10^<18>cm^<-3>という結果が得られた。しかし、電離度に関しては、分光法ではほぼ1に等しいという結果が得られたのに対し、干渉法では、0.1以下と非常に小さい結果となった。これはプラズマ標的において局所熱平衡が成立しておらず、分光法における電子密度及び電離度の見積もりに問題があることを示している。以上の結果から、我々のプラズマ標的中での重イオンのエネルギー損失を見積もる際には中性原子の寄与が無視できないことが分かった。Ndガラスレーザーにより生成された水素プラズマ標的に、核子当たりのエネルギーがそれぞれ150keV、200keV、250keVの酸素イオンを入射し、下流に設置した分析電磁石により価数分解し、各価数の強度を測定した。入射エネルギーを上げるに従って、平均価数が上昇する様子が観測された。また、理論計算により予測された平均価数ともよく一致することが分かった。これらの結果から、我々の用いた理論計算モデルを用いて、プラズマ標的中における重イオンの飛程を十分に予測できることを確認できた。平成13年度は、円柱型プラズマ標的およびビームエネルギー損失測定系の設計、製作を行った。プラズマ標的は、固体水素に炭酸ガスレーザーを照射して生成するので、円筒形の空洞内壁にあらかじめ固体水素の結晶を形成しておく必要がある。そこで、円筒空洞を持つ銅製のブロックを製作し、それをGM冷凍機により10K程度まで冷やした後に、円筒内に水素ガスを封入して固体水素の形成試験を行った。その結果、円筒内壁に厚さ0.5mm程度の固体水素の結晶を作ることに成功した。ただし、現時点では結晶の一様性に問題があるため、水素ガス封入圧、冷却温度等の最適化を今後行う必要がある。ビームのエネルギー損失量は、分析電磁石を通過して価数毎に分解されたビームの位置のわずかな変化を読み取ることで測定する。ビームの位置検出にはMCPアセンブリを用いた。また、ビーム移動量を時間分解して記録するために、MCP背面の蛍光面の発光を高速ストリークカメラで撮影した。酸素ビームを水素プラズマ標的に入射し、標的内でのビームのエネルギー損失量を実際に測定することで、検出器の時間・空間分解能を評価した。その結果、どちらの分解能もエネルギー損失の定量的な評価には不十分であることが分かった。空間分解能の悪化の原因は、MCP直前に配置した金薄膜内でのイオンの散乱によるビームスポットの増大であると考えられる。薄膜の材質を変えることで、薄膜中でのビームの拡がりを抑えることを現在検討している。時間分解能に関しては、ストリークカメラの掃引時間を短くすると同時に、蛍光面を発光減衰時間の短いプラスティックシンチレータに変更することで改善が可能であると考えている。

また、理論計算により予測された平均価数ともよく一致することが分かった。これらの結果から、我々の用いた理論計算モデルを用いて、プラズマ標的中における重イオンの飛程を十分に予測できることを確認できた。
ヘム結合型酸素センサーキナーゼの酸素センシングとリン酸化シグナリングの分子機構

根粒菌のFixL・FixJタンパク質はそれぞれ二成分情報伝達系の酸素センサーヒスチジンキナーゼとレスポンスレギュレーターである。とりわけ、FixLはセンサードメインにヘムを含むユニークなセンサータンパク質であり、リガンドである酸素の結合/解離を分光学的に精密に扱えるという研究上の利点を持つ。我々はFixL・FixJ混合液中でATPを用いたリン酸化反応の前後でFixLの酸素親和性が低下することを発見し、さらに、ADPがFixLの酸素親和性を低下させるアロステリックエフェクターであることを突き止めた。ADPはATPと競合的にリン酸化触媒部位に結合すること、ATPの方がADPより強く結合することがわかった。これらの結果から、FixLホモダイマー中でATPを用いたリン酸化反応の際に生成したADPが交互にFixLサブユニットのリン酸化反応を促進する2気筒エンジンモデルを提案した。ADPによってリガンド親和性が変化するという発見は二成分情報伝達系研究において初めてである。ヒスチジンキナーゼは例外なくホモダイマーで機能していることから本モデルの普遍性が予想され、あらたなパラダイムを構築した。また、細胞におけるヘムの重要性を考え、動物細胞におけるヘムの輸送を研究した。本研究では細胞への取込みを検出するために蛍光性類似体である亜鉛ポルフィリンを用い、蛍光顕微鏡で観察した。亜鉛ポルフィリンの取り込みには細胞種特異性、ヘムによる阻害、pH依然性、タンパク質修飾剤感受性などが認められ、特異的なヘム輸送体、もしくは受容体の存在が示唆された。【酸素センサータンパク質FixLの初発情報変換機構】二成分情報伝達系の作動はまず、リガンドの結合/解離によって始まる。FixLのリガンドである酸素分子はセンサードメインのヘムに結合する。酸素分子の認識機構を調べるために、センサードメインのX線結晶構造解析を行った(論文1)。FixLがキナーゼ活性の制御を行うためには酸素の結合/解離がセンサードメインのタンパク質構造変化を引き起こさなければならない。これまでのXAFS測定などの結果からヘム近位測(第5配位子側)アミノ酸の構造変化は検出されていないことから、酸素の結合/解離は遠位側アミノ酸の構造変化を引き起こすということが予想された。そこで、遠位側アミノ酸Ile209とIle210をアラニンなどに置換した変異体を作成して分光学的、生化学的解析を行った(論文2)。これら変異体は酸素結合能を持つが、酸素存在下でも酸素解離型と同様に自己リン酸化活性を持つことが判明した。この結果はヘム遠位側のアミノ酸がキナーゼ活性の調節機構の初発段階に関与していることを強く示唆する。【哺乳動物の酸素適応機構】哺乳動物では低酸素障害や虚血に対して主に循環器系、造血系での適応応答がみられる(VEGFやエリスロポエチンの合成など)。古くから培養細胞系では低酸素処理の代わりにコバルト添加によっても同様の応答があることが知られている。我々はコバルトを経口摂取させたラットの低酸素灌流、再酸素化での心臓の発生圧、心拍数、仕事量などを測定したところ、著しい心機能の増強を認めた。コバルト処理ラットの心筋組織ではVFGFの発現量が上昇しており、血管新生による筋組織の酸素摂取量の増加などが心機能増強を支えていると考えた(論文3)。バクテリア、カビ、高等植物に広く存在する2成分情報伝達系はタンパク質のリン酸化反応によって外部からの刺激に対して細胞内でシグナル伝達を行う。本年度はまず、タンパク質間のリン酸化リレー反応によって生じた個々のタンパク質のリン酸化レベルをラジオアイソトープ標識したATPを用いて、ウエットSDS-PAGEゲルで定量する方法を考案した。この方法は従来法より簡便かつ正確に定量できる上、酸・アルカリで不安定なタンパク質のリン酸基の定量にも十分適用できることを示した。次に、2成分情報伝達系のパラダイムとしてヘム結合型酸素センサーキナーゼであるFixLのリン酸化反応制御における一酸化炭素、一酸化窒素の効果を調べた。FixLはリガンドである酸素がFixLのヘムに結合していない時には自己リン酸化反応が起こるが、酸素結合によりリン酸化を抑制することで環境の酸素濃度を感知する。しかし、分子構造が類似している2原子分子である一酸化炭素、一酸化窒素を結合させた場合はリン酸化反応の抑制が見られないことを明らかにした。この結果はFixLが一酸化炭素、一酸化窒素のセンサーとはなり得ず、酸素のみをセンシングするガスセンサーであることを意味する。ついで、2原子分子のうち、酸素のみを認識するメカニズムを明らかにする目的でトリプトファンを蛍光プローブにして、UV共鳴ラマン分光法を用いて、結合した酸素分子近傍のアミノ酸が分子認識に関与していることを示した。これらの結果から従来提唱されていたヘム鉄の電子スピン状態とキナーゼ活性の相関を否定する新しいモデルを提唱した。バクテリア、カビ、高等植物に広く存在する2成分情報伝達系はタンバク質のリン酸化反応によって外部からの刺激に対して細胞内でシグナル伝達を行う。本研究では2成分情報伝達系のパラダイムとしてヘム結合型酸素センサーキナーゼFixLとレスポンスレギュレーターFixJのシグナル伝達の制御機構を明らかにする。本年度はin vivoレポーター系を用いて分離したFixJ変異体に関して、生化学的解析を詳細に行った。FixJはリン酸基を受容するレシーバードメインと転写促進活性を持つエフェクタードメインからなる。得られた変異体はすべてレシーバードメインの点突然変異体であったことからレシーバードメインがエフェクタードメインのDNA結合活性を制御していることがわかった。