hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体性幹細胞を用いた変性軟骨の再生

本研究では、OA自然発症モデルであるハートレー系guinea pigを用いて骨髄幹細胞(MSCs)を有効に局所に定着させることと、軟骨再生に寄与していることを評価した。Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)にてラベリングしたヒトBMScを培養し、PBSとHAに混濁した。その混濁液を7ヵ月齢のハートレー系guineapigの膝関節に注入し、注入後1,3,5週で膝関節を摘出し蛍光顕微鏡にて評価、5週においては組織学的評価、免疫組織学的評価も合わせて行った。コントロール群では同週齢のハートレー系guinea pigにPBSとHAを単独で注入した。その結果5週齢にHAとMSCsを注入した群において軟骨再生が見られ、またMSCsが関節軟骨表面だけでなく軟骨深部へと移動しており、軟骨細胞へと分化、typeII collagenをその細胞周囲で産生していることがわかった。今回我々はBMScを用いて、これまで適応ではない変性疾患で損傷した軟骨病変に対して、さらに簡便で効率のよい手法での軟骨再生の基礎的研究を計画し、平成23年度より開始した。まずウサギを用いて軟骨欠損モデルの作成に取りかかった。6ヵ月齢の白色家兎の膝関節においてリューターを用いて、表層欠損と、軟骨下骨まで欠損したモデルの作成を計画し行ったが、6ヵ月齢ではすでに変形性関節症を発症している個体も存在していたため若年齢のものを使用するように変更し、モデル作成を継続する予定である。またハートレー系の変形性関節症自然発症モルモットを用いて、同個体にヒアルロン酸とBMScを関節内直接注入することで変性軟骨の再生増強作用が得られることが確認された。現在GFPラット、GFPマウスのBMScを抽出し、安定した細胞となるように継代培養も含めて細胞培養技術の確立を行っており、今後実験に用いる予定である。今後の実験予定としてはBMScを採取、軟骨組織に特異的に分化する条件について検討を行う。またBMScが軟骨へと分化した際の細胞外基質産生量など細胞代謝活性について検討を行う。また実際に関節内へ投与する際に細胞とともに投与するscafoldを選定する(より効率よく移植細胞が損傷軟骨部に長時間とどまれるような特性のもの)。次にOAの自然発症モデルであるハートレー系モルモットを用いて実際にscafoldと表面マーカーもしくは細胞内に抗体でマーキングした細胞懸濁液を混合したものを関節内へ投与し、それら細胞が関節軟骨へどの程度取り込まれるものかを評価する。さらに大型のウサギ、ブタなどの細胞でも靱帯切断モデルを使用して同様の評価を行う予定であり、将来的にはES細胞、iPS細胞など分化能の高い細胞を用いての実験や、ヒトへの臨床応用を目指して実験を行う予定である。ウサギの軟骨欠損モデルの作成が当初考えていたものより困難であり、均一な軟骨損傷状態にすることがなかなか難しくウサギ変形性軟骨症モデルの作成、実験導入が遅れている。変形性膝関節症自然発症モデルであるハートレー系モルモットを用いて実験を行うことも並行して行っていく予定である。主に、動物購入に研究費を振り分けていく予定である。また場合によっては細胞の購入、実験結果の解析などにも研究費を使用する予定である。
適応障害患者における個体側の要因と心理社会的要因との関連について

適応障害における個体側の要因と環境因との関係を明らかにするために、I.今日までに蓄積していた適応障害症例に対する疫学調査、II.新たに発生した適応障害症例に対する症状の経過や予後に関する調査を立案し、遂行している。平成11年度は主にIの調査が主体で、IIについては症例を蓄積中である。蓄積していた病棟リエゾンにおける適応障害411例中詳細な調査が可能であった363例について疫学的な検討を行った結果、(1)年齢分布は男女共2峰性であるが、ピーク年齢などには男女間で異なり、男女共20歳台に最初のピークがあるが、男性では50歳台に、女性では40歳台に次のピークがあること。(2)身体状況としては「自殺企図・自傷行為」が最多で、次いで「癌」が多く、両者で67%を占めていたこと。(3)「自殺企図・自傷行為」、「癌」のそれぞれで年齢分布に男女間の差があり、「自殺企図・自傷行為」では男女共20歳台にピークがあるが、男性では50歳台が多いのに対し、女性では10および40歳台が多いこと。また、「癌」では男性が50、60歳台に多いが女性は40、70歳台に多いこと。(4)同居家族の構成は男女間で差があり、男性は3、4人が多いが女性は2、3、4人が多く同症例数であること、男女共「本人・配偶者・子」という構成が多いが、次いで多いのは男性では「本人一人暮し」、女性では「本人・配偶者」であること。(5)職業は男性では給与所得者が最も多く、女性では専業主婦、給与取得者の順であること、などが明らかとなった。適応障害症例は、「自殺企図・自傷行為」のように適応障害を起こして入院する症例と「癌」のように入院中に適応障害が生じる症例が存在し、実際に両者だけで全体の2/3を占めていることがわかった。個体側の要因として年齢・性別を中心に他の要因を比較したが、それぞれで違いがあることもわかり、今後さらにそれらと環境因を明らかにする研究を続けていく予定である。
コンタクトフィットネスの測定評価法の検討

コンタクトスポーツにおけるボディコンタクトの継続性やその耐性など、コンタクトフィットネスの捉え方に着目し、現場で有用な複合的体力測定法を研究することを目的とした。ラグビー競技とハンドボール競技について、間欠的な筋力発揮(タックルやサンドバッグの持ち運びなど)が間欠的な無気的パワー発揮ならびに有気的パワーに及ぼす影響を検討した。ラグビー競技における専門的・複合的体力測定法では、その測定値が高い選手ほど有気的パワーに優れ、また間欠的な無気的走パワー低下率が少ない選手ほど総合的筋力に優れていた。一方、汎用性のある20mシャトルスプリントテストやyo-yotestを用いた測定法では、間欠的な筋力発揮の影響は見られたものの筋力レベルの影響についてはみられず、検討の余地を残した。コンタクトスポーツにおけるボディコンタクトの継続性やその耐性など、コンタクトフィットネスのとらえ方に着目し、現場で有用な複合的体力測定法を研究する目的で、初年度の平成21年度は、ラグビー競技のゲーム分析から得られた代表的な動きを抽出し、それらの運動様式をランダムに配置した速度漸増式多段階運動負荷試験(以下RSTT : Rugby Specific Technical Testing)を作成、その能力と個人の体力特性との関連性を検討した。大学男子ラグビー部フォワード選手42名を対象に体力測定を行い、スタミナと最大筋力に特徴のある選手たちをA群(スタミナ、筋力ともに優位)、B群(スタミナ優位、筋力劣位)、C群(筋力優位、スタミナ劣位)、D群(スタミナ、筋力ともに劣位)の4群に分けた。各群3名ずつ計12名を対象にRSTTを行い、RSTT内で定期的に発揮する無気的走パワー(10m方向変換走)の低下率や12分間走、50m走、各種最大筋力との関連性を比較検討した。RSTTにおける平均心拍数は169.1±7.75拍/分となり、推定最高心拍数の約85%となった。RSTT試技回数と12分間走との間に有意な正の相関関係(r=0.914,P<0.01)がみられたことから、本測定法はラグビーフォワード選手の有気的作業能力測定法として有用であると示唆された。一方、RSTTに定期的に組み込んだ10m方向変換走の終末低下率は平均11.37±3.38%となり、A群とC群がB群とD群に比べその低下率が少ない結果となった。すなわち、総合筋力と10m方向変換走の終末低下率との間に有意な負の相関関係(r=-0.792,P<0.01)がみられたことから、高い総合筋力を備えた選手ほどRSTTでの無気的走パワー発揮能力の低下を抑制することも示唆された。以上の結果から、本測定法(RSTT)はラグビーフォワード選手に必要な専門的かつ複合的体力を測定評価する方法として有用と考えられる。コンタクトスポーツにおけるボディコンタクトの継続性やその耐性など、コンタクトフィットネスのとらえ方に着目し、現場で有用な複合的体力測定法を研究する目的で、2年目の平成22年度は、フィールドテストとして有用な20mシャトル走(往復40mスプリント)を無酸素性走パワーの指標とし、短いインターバル中に筋力発揮を行わせた間欠的発揮能力について検討した。大学男子ハンドボール選手13名を対象に、有酸素性作業能として12分間走、無酸素性作業能として20mシャトル走、筋力としてベンチプレス、ハイクリーン、ハーフスクワットの各最大筋力を測定した。走、投パワーの間欠的発揮能力として、20mシャトル走を30秒ごとに8セット繰り返しその走行タイムを各セット計測するとともに、インターバル中に5kgのメディシンボール投げを2投行わせその飛距離を各セット計測した(測定I)。日を替えて、測定Iと同様の方法に加え、インターバル中に5kgのサンドバッグを持ち上げ5m移動させることを入れた測定も実施した(測定II)。インターバル中に筋力発揮を伴わない場合、間欠走の走パワー低下は約14%であったのに対し、筋力発揮を伴った場合は約25%となった。いずれの測定においても低下の少ない選手は、有酸素性作業能と筋力のいずれも高い選手であった。筋力発揮を伴わない場合の間欠走の走パワー低下は、有酸素性作業能に優れるほど少ないと言われており、今回のインターバル中のメディシンボール投げ2投が筋パワー発揮として影響した可能性が考えられた。なお、投パワーの低下は筋力発揮なしで約13%、筋力発揮ありで約18%となったが、体力的特徴はみられなかった。今後、生理的負担度の検討の必要性も示唆された。コンタクトスポーツにおけるボディコンタクトの継続性やその耐性など、コンタクトフィットネスのとらえ方に着目し、現場で有用な複合的体力測定法を研究する目的で、3年目の平成23年度は、平成22年度の結果を踏まえて、同様の測定方法に生理的負担度として運動中の心拍数と血中乳酸濃度の測定を加えた。

なお、測定方法はフィールドテストとして有用な20mシャトル走(往復40mスプリント)を無酸素性走パワーの指標とし、短いインターバル中に筋力発揮を行わせた間欠的発揮方法である。大学男子ハンドボール選手19名を対象に、有酸素性作業能として12分間走、無酸素性作業能として20mシャトル走、筋力としてベンチプレス、ハイクリーン、ハーフスクワットの各最大筋力を測定した。走、投パワーの間欠的発揮能力として、20mシャトル走を30秒ごとに8セット繰り返しその走行タイムを光電管にて各セット計測するとともに、インターバル中に5kgのメディシンボール投げを2投行わせその飛距離を各セット計測した(測定I)。日を替えて、測定Iと同様の方法に加え、インターバル中に30kgのサンドバッグを持ち上げ5m移動させることを入れた測定も実施した(測定II)。なお、測定中に心拍数を継続的に測定、血中乳酸を走行直前と走行後2分ごとに5回測定した。インターバル中に筋力発揮を伴わない場合、間欠走の走パワー低下は約12%であったのに対し、筋力発揮を伴った場合は約19%となり、有酸素性作業能と筋力のいずれも優れる選手にはその差がみられなかった。なお、運動中の心拍数と運動後の最大血中乳酸濃度については、筋力発揮の有無による差は見られなかった。一方、投パワーの低下は筋力発揮なしで約12%、筋力発揮ありで約17%となり、有酸素性作業能と筋力のいずれも劣る選手にその差がみられた。コンタクトスポーツにおけるボディコンタクトの継続性やその耐性など、コンタクトフィットネスの捉え方に着目し、現場で有用な複合的体力測定法を研究する目的で、最終年度の平成24年度は、複合的体力測定として以下の測定を行い、基礎的体力測定結果との関連性を検討した。測定Iに比べ、漸増負荷レベルを下げた測定IIではインターバル中の筋力発揮により総走行距離が低下した。測定IIに比べ、測定I+方向変換走の方が総走行距離は少なかった。測定III、測定IV、測定Vと総走行距離は有意に減少した。いずれの測定にも、12分間走との間に有意な正の相関関係が見られ、サンドバッグの持ち運びによる筋力発揮と筋力水準との間には何ら関係が見られなかった。本結果は、筋力発揮が走能力に影響するほど高くない負荷水準であったことを示唆しており、再検討の必要がある。本テーマの最終年度であったが、コンタクトフィットネス評価について継続的な検討が必要である。当初の計画では、さまざまな筋力発揮方法の影響も考えていたが、測定方法の規定が困難であることから、比較的シンプルな筋力発揮にすることにより現場で有用な測定評価法が固まりつつある。昨年度末にも、最終の測定評価法を作成するための予備実験を行っており、最終年度の平成24年度で概ね終了の見通しである。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の「コンタクトフィットネスの測定評価法」は、従来のシャトルランテストを一部改良したyo-yo intermittent recoverytest(Bangsbo,J.,1996)をベースに、さらに筋力発揮や方向変換走を加えた改良法として多くの球技スポーツで活用できると考えられる。
VWF/ADAMTS-13/FⅧ制御軸による極低出生体重児の脳室内出血の病態解明

【方法】成熟新生児の残存臍帯を用いて、臍静脈内をPBSで洗浄後、1000PU/mlのDispase注入し、37°Cで10分間インキュベーションした。剥離したHUVECをPBSで遠心・洗浄しHUVEC浮遊液を作成し培養した。この細胞を用いて、H2O2による酸化ストレスの血液凝固・線溶因子のRNA発現に及ぼす影響についてリアルタイムPCR法を用いて検討した。併せて炎症性サイトカインの発現についても検討した。【考察】酸化ストレスに対して、VWF以外の凝固線溶因子の発現増加を認めた。今後は、低出生体重児の臍帯について同様の検討を行い、極低出生体重児のIVH発症機序を検討する。当初は、3年間の研究計画期間であったが、4年間に延長申請が必要であった。理由として、1研究時間の確保が難しい、2極低出生体重児の血液検体の確保が困難であることが主たる原因であった。2については、臍帯血管を用いる研究内容の変更により、進捗可能と考える。極低出生体重児由来のHUVECを用いた検討を行う。酸化ストレスに加えて、Lipopolysaccharideなどを用いた細菌感染実験モデルにおける血液凝固・線溶因子の動態を検索することにより、極低出生体重児のIVH発症機序の解明に繋げる。出生体重1,500g未満の極低出生体重(VLBW)児の脳室内出血(IVH)は、児の生命予後や神経学的予後を左右する重篤な合併症である。しかし、VLBW児のIVH発症に関与する血栓止血制御機構は不明な点が多い。本研究は、一次止血として重要な、血小板の損傷血管壁との結合に必須の血漿糖蛋白(von Willebrand因子:VWF)、VWFを特異的に切断する酵素(ADAMTS-13)と臍帯静脈に着目し研究を行っている。本年度の研究目標の第1は、臍帯静脈の免疫組織学的検討である。すなわち極低出生体重児の児と成熟新生児の臍帯から凍結切片を作成し、FITC標識抗von Willebrand因子(VWF)モノクローナル抗体、VWFを特異的に切断する酵素(ADAMTS-13)をFITC標識した抗モノクローナル抗体、FITC標識抗FVIIIモノクローナル抗体を用いて、臍帯静脈内皮細胞上の各種抗原を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による多重リアルスペクトル解析で解析している。また、VLBW児と成熟新生児の、血漿VWF抗原量、ADAMTS-13活性、VWFマルチマー解析および還元VWFサブユニット解析と、純化ADAMTS-13添加後のVWFマルチマー解析、還元サブユニット解析を行うことである。血漿VWF抗原量は、抗ヒトVWFポリクローナルを用いたELISA法で、ADAMTS-13活性は連携研究者の松本らが開発した抗ADAMTS-13モノクローナル抗体を用いたELISA法で測定する。VWFマルチマー解析と還元VWFサブユニット解析は研究代表者が既報のSDS-アガロースゲル電気泳動法で解析している。1.極低出生体重児の血漿の採取が予想以上に困難である。2.重症新生児症例の入院が多く、研究に十分な時間を費やせていない。3.臍帯検索方法の予備実験に、予想以上に時間がかかっていること。児の脳内血管の疑似血管として、臍帯静脈血管内皮細胞を用いて血管由来のVWFの構造と機能評価の検討を行った。臍帯の断面を利用した組織学的検討では、臍帯血管内皮細胞のVWFと、VWFに結合している血液凝固第VIII因子(FVIII)は、特異抗体を用いて蛍光免疫染色法でそれぞれ同定が可能であった。この組織学的結果は、極低出生体重児における臍帯静脈血管を用いても同様に、VWFとFVIIIの同定が可能であった。続いて、この血管内皮細胞に認められたVWFのFVIII結合能を評価するために、一旦、VWFに結合しているFVIIIをカルシウム塩で分離し、純化VWFを新たに添加する事により成熟児の血管内皮細胞内のVWFと極低出生体重児のVWFとの比較検討を試みた。しかしながら、in vitroでは、容易にVWFから分離するFVIIIが、臍帯血管内皮細胞を用いた組織学的実験系では、モル濃度を高くしても分離できなかった。そこで、塩化カルシウム未添加の極低出生体重児の臍帯血管内皮細胞と成熟児血管内皮細胞を用いて、VWFの発現量とFVIII結合量を共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光濃度から定量比較する検討を行った。その結果、蛍光強度は、成熟児の臍帯静脈血管内皮細胞と極低出生体重児の血管内皮細胞間で有意差を認めなかった。そのため、臍帯静脈から血管内皮細胞をdispaseを用いて分離し、その分離した内皮細胞を用いて、VWFとFVIIIについて検討する事とした。分離した細胞にDDAVPを添加した所、VWFの放出を確認した。分離した血管内皮細胞にDDAVPを添加し、放出されるVWFの定量とマルチマー解析、および還元バンドの解析を行い、還元バンドで270kDaのサブユニットの存在を確認した。さらにDDAVPの濃度や反応時間によるVWFの放出を検討した所、反応後1時間で最も高い濃度を示した。また。この反応は、V2レセプター阻害剤で、容量依存性に阻害されたことから、DDAVPによるV2

レセプターを介した細胞内VWFの放出であることが確認された。しかし、臍帯静脈から血管内皮細胞を分離するのに用いるdispaseは、組織障害性は低いものの、低濃度でも純化VWFを消化・切断することが判明した。【方法】成熟新生児の残存臍帯を用いて、臍静脈内をPBSで洗浄後、1000PU/mlのDispase注入し、37°Cで10分間インキュベーションした。剥離したHUVECをPBSで遠心・洗浄しHUVEC浮遊液を作成し培養した。この細胞を用いて、H2O2による酸化ストレスの血液凝固・線溶因子のRNA発現に及ぼす影響についてリアルタイムPCR法を用いて検討した。併せて炎症性サイトカインの発現についても検討した。【考察】酸化ストレスに対して、VWF以外の凝固線溶因子の発現増加を認めた。今後は、低出生体重児の臍帯について同様の検討を行い、極低出生体重児のIVH発症機序を検討する。当初は、3年間の研究計画期間であったが、4年間に延長申請が必要であった。理由として、1研究時間の確保が難しい、2極低出生体重児の血液検体の確保が困難であることが主たる原因であった。2については、臍帯血管を用いる研究内容の変更により、進捗可能と考える。研究の必要な検体、特に血漿を確保するため、採取システムの変更が必要と考える。具体的には、チトラートを入れた容器を事前に多数準備して、採血時にルーチン化する事が上げられる。また、採血量は微量で検査が可能であることを改めて周知して、研究への理解を周知することも重要と考える。また、対象とする児の出生体重を1,000g以上2,000g未満に変更することも検討する。臍帯の採取は、比較的順調に進んでいるので、検討方法の確立により、遅れを取り戻すこそは可能と考える。そのため、事前に、低酸素血症や感染症で出生した児の臍帯をあらかじめ、凍結保存しておくことが、重要と考える。dispaseにVWF切断機能があることから、低濃度のdispaseを用いて血管内皮細胞を剥離検討する方法に加えて、臍帯静脈血管内にDDAVP溶液を注入し、血管内皮から放出されたVWFを検索する方法も検討する必要がある。また、臍帯静脈血管内のVWF遺伝子のreal-time PCRによるmRNAの定量による、極低出生体重児の特性の評価も検討する予定である。極低出生体重児由来のHUVECを用いた検討を行う。酸化ストレスに加えて、Lipopolysaccharideなどを用いた細菌感染実験モデルにおける血液凝固・線溶因子の動態を検索することにより、極低出生体重児のIVH発症機序の解明に繋げる。臍帯検索の方法論の確立に、時間を要しているため、保管されている多数の検体の検索が行えなかったため、次年度使用額が生じた。本年度に行う予定であった研究に修正を必要としたため、その修正研究の基礎研究に要した費用が、本研究ほどには費用がかからなかったため。今年度は修正研究を多数症例を対象に行うため、予定通りの費用を必要とする。研究計画の見直しと予備実験に時間を要したため、次年度への繰越金が生じた。方法論はほぼ確立されつつあるので、次年度は多数例の検索が可能と考えられる。
口腔内生体防御成分の分析による口腔疾患の予防法と看護に関する研究

生体感染防御機構の低下,痴呆,運動障害,嚥下障害などがあるために自分自身で歯磨き,うがいなどの口腔内ケアを十分に実施できない患者に,歯科的疾患(う歯,歯周疾患)や口腔内感染症とともに嚥下性肺炎を予防するための効果的な看護ケアの方法を基礎的に検討することが本研究の目的であった。1.含嗽の細菌数に対する影響:2.嚥下障害患者に対する口腔ケアの検討:嚥下障害がある患者に起こりやすい嚥下性肺炎の発症を予防する方法として給吸ブラシ910(ライオン社製)による口腔ケアを検討した。脳梗塞のために嚥下障害があり,経鼻経管栄養を受けている1症例と、食餌を経口的に摂取中の1症例を対称とし,3ヶ月間就寝前に実施し,歯肉の発赤や腫脹,出血が軽減し,総細菌数,ブドウ球菌数,カンジダ数は減少したが,緑膿菌は減少を示さなかった。3.脳血管障害患者のADL、特に経口摂取の有無と口腔内細菌数の関係:療養型病床群に入院中の脳血管障害患者40名を、ADLと口腔ケアの内容によって4群に分け、早朝起床時の口腔内細菌数を調べた。緑膿菌は経鼻経管栄養中の患者からのみ検出された。ADLが低く経口摂取しない患者は口腔内細菌数が増殖しやすいことが明らかになった。特にこれらの患者に対する口腔ケアの必要性が示唆された。4.重症心身障害者の口腔の状態と口腔ケア:重心病棟に入院中の患者159名を対象に口腔の状態と口腔ケアの実態を調査した。口腔の状態はADL別による差は見られず,腫脹や出血が著明であった。これは,看護婦や介護者の適切な口腔ケアに関しての理解不足のためであり,効果的な口腔ケアが実施できるシステムを構築するために,歯科医,医師,看護婦,介護職等の連携が必要であることが明らかになった。本研究期間では,細菌学的検索から口腔ケア法についての知見を得た。今後はさらに生体防御成分の分析から口腔ケア法を検討していきたい。口腔微生物,殊に細菌は,歯科的疾患(う歯,歯周疾患),口腔内感染症とともに嚥下性肺炎の原因になるとされている。生体感染防御機構の低下,痴呆,運動障害,嚥下障害などがあるために自分自身で歯磨き,うがいなどの口腔内ケアを十分に実施できない患者に,上記疾患を予防するための効果的な看護ケアの方法を基礎的に検討することが本研究の目的である。(1)嚥下障害のような神経障害があり,ガラガラのような後洗口含嗽ができない患者に,主にブクブクによる前洗口により含嗽を行った場合に咽頭細菌数が減少するか否かを解明するために,健常者志願者16例を対象に前洗口による含嗽1回の咽頭ぬぐい液細菌叢に対する影響を検索した。なお,対象をポビドンヨード(イソジンガーグル),緑茶,水道水で含嗽した3群に分類した。1)いずれの含嗽液で含嗽しても咽頭ぬぐい液の総細胞数,レンサ菌数ともに含嗽後2時間,4時間,6時間のいずれの時間においても明かな減少を示さなかった。

2)いずれの含嗽液で含嗽しても総細胞数は含嗽前に比し翌朝で増加していた。3)各含嗽液の咽頭ぬぐい液細菌数に対する影響に明かな差はみられなかった。以上の成績から,ブクブクによる前洗口による含嗽法によっては咽頭に付着している細菌を減少さすことは比較的困難と考えられる。従って一般に嚥下障害のような神経障害をもつ患者に対する嚥下性肺炎予防法としては含嗽以外の方法を開発する必要があると考えられる。(2)前洗口による含嗽では咽頭に付着している細菌を減少さすことは比較的困難であることが立証された。嚥下障害のような神経障害をもつ患者に対する嚥下性肺炎予防法として口腔清拭がおこなわれるがその効果は期待できないことが予測されるため,含嗽の方法や他の穂方法を開発するためにも,後洗口による含嗽で咽頭に付着している細菌を減少さすことができるか否かを解明することが必要であると考えている。口腔微生物,殊に細菌は.歯科的疾患(う歯,歯周疾患),口腔内感染症とともに嚥下性肺炎の原因になるとされている。生体感染防御機構の低下,痴呆,運動障害,嚥下障害などがあるために自分自身で歯磨き、うがいなどの口腔内ケアを十分に実施できない患者に,上記疾患を予防するための効果的な看護ケアの方法を基礎的に検討することが本研究の目的である。本年度は以下の研究を行なった。1.脳血管障害患者のADL、特に経口摂取の有無と口腔内細菌数の関係:リハビリテーションを目的とした療養型病床群に入院中の患者40名を、ADLと口腔ケアの内容によって4群に分け、早朝起床時の口腔内細菌数を経時的に調べた。I群は自立し食餌の経口摂取、歯磨きともに自分でしていた。II群は寝たきりであるが、食餌は介助者の助けで経口摂取し、介助者による口腔清拭を受けていた。III群は寝たきりで経鼻経管栄養を受けており、介助者による口腔清拭を受けていた。IV群は自立しているが総義歯であった。調査の結果,III群は他群に比べブドウ球菌数,カンジダ数が有意に多く検出された。また緑膿菌はIII群からのみ検出された。ADLが低く経口摂取しない患者は口腔内細菌数が増殖しやすいことが明らかになった。特にこれらの患者に対する口腔ケアの必要性が示唆された。2.嚥下障害患者に対する口腔ケアの検討:嚥下障害がある患者に起こりやすい嚥下性肺炎の発症を予防する方法として給吸ブラシによる口腔ケアを検討した。給吸ブラシ910(ライオン社製)は電動ブラシに給水吸引機能が装備されている口腔ケア器具である。この給吸ブラシによる口腔ケアを,脳梗塞のために嚥下障害があり,経鼻経管栄養を受けている1症例と、食餌を経口的に摂取中の1症例を対象とし,3ヶ月間就寝前に実施し,その効果を口腔内所見の変化,呼吸器感染症の発生状況,細菌学的検査およびADLへの影響から検索した。給吸ブラシにより歯牙の清掃と咽頭部および舌背のケアを介助者が一人で同時に行うことが可能であった。給水しながら吸引するために,誤嚥の心配がなく,患者自身がむせないためブラッシングに対する不安や苦痛が軽減されブラッシングに協力的になり,患者が自分でブラッシングすることができ,ADLの向上になった。さらに歯肉の発赤や腫脹,出血が軽減し,総細菌数,ブドウ球菌,カンジダ数も減少したが,緑膿菌は減少を示さなかった。今後は症例数を増し、洗浄剤の影響等についても検討していく必要があると考えられた。生体感染防御機構の低下,痴呆,運動障害,嚥下障害などかあるために自分自身で歯磨き,うがいなどの口腔内ケアを十分に実施できない患者に,歯科的疾患(う歯,歯周疾患)や口腔内感染症とともに嚥下性肺炎を予防するための効果的な看護ケアの方法を基礎的に検討することが本研究の目的である。昨年度,脳血管障害による嚥下障害がある患者や対象に,嚥下性肺炎の発症を予防する方法として給吸ブラシによる口腔ケアについて検討した。
イオンビ-ム分析法を用いた炉壁材料からの水素同位体の再放出挙動の研究

本研究の目的は、第1壁における粒子束と同じ条件で水素イオン照射を受ける試料中の保持水素濃度分布および照射後の加熱あるいはヘリウムイオン照射による試料中の保持水素濃度分布の変化をイオンビ-ム分析法を用いて直接測定し、そのデ-タ解析から水素同位体の挙動を記述する質量平衡方程式中の素過程の物理パラメ-タを決定することである。本年度はまず、昨年度設置した差動排気型イオン銃を用いて6×10^<15>/cm^2・sのH^+イオン照射下における黒鉛中の保持水素濃度分布を測定し、照射後の保持水素濃度分布との比較から黒鉛ではダイナミックリテンションが極めて小さいことを明らかにした。次に3keVH^+_2あるいはD^+_2イオンを室温で飽和するまで注入した黒鉛からの等温加熱再放出を450°Cから600°Cまでの温度で測定した。その実験デ-タから、黒鉛からのHの再放出はDの再放出より早いという明瞭な同位体効果を見つけた。これらのデ-タ解析から水素同位体の加熱再放出が主として動き得る水素同志の局所的再結合により生じることを示した。またHおよびDの再放出における同位体差は熱的脱捕獲係数および拡散律速過程に基づく捕獲係数および局所的再結合係数の同位体差、すなわち反応係数の質量効果で説明されることを示した。更にHe^+イオン衝撃再放出の測定から、この場合のHおよびDの再放出に加熱再放出よりも大きな同位体差が存在することを示した。この同位体差はイオン衝撃脱捕獲断面積の同位体差および動き得る水素と捕獲水素との局所的再結合係数および捕獲係数の同位体差で説明されることを示した。最後に等加熱再放出における水素濃度の減衰曲線の理論式を用いて昇温脱離スペクトルを計算できること示すと共に、その計算結果が実験デ-タを良く再現すること、本研究で提案した水素同位体の挙動を記述するモデルが極めて一般的であることを示した。本研究の目的は、第1壁における高粒子束負荷と同じ条件でイオン照射を受けている試料中の保持水素濃度分布(ダイナミック・リテンシヨン量)および照射後の加熱あるいはヘリウムイオン照射による試料中の保持水素濃度分布の変化を,イオンビ-ム分析法を用いて直接測定し,そのデ-タ解析から水素同位体の挙動を記述する質量平衡方程式中の物理パラメ-タを決定することである。本年度は、まず主要申請設備である高輝度の差動排気型イオン銃を購入・設置した。4keVH^+_2イオンを散乱槽内の真空度1×10^<-7>トルで発生させた場合,約6×10^<15>/cm^2・sのHイオン束が得られ,本研究の遂行に有用であることを確認した。目下本装置を用いてダイナミック・リテンションの測定を行っている。これと平行して、黒鉛からの水素の再放出挙動および金属炭化物における水素の捕捉挙動を調べた。3keVH^+_2あるいは2keVD^+_2イオンを1×10^<19>/cm^2注入した黒鉛からの1.5MeVHe^+イオン衝撃によるHあるいはDの再放出量の測定と解析からイオン衝撃により脱捕獲された水素は,動き得る水素と捕獲水素との再結合により再放出されるモデルを新しく提案した。更に,これに基づき、脱捕獲断面積,捕獲係数およびこの場合の再結合係数を決定した。3keVH^+_2

イオンを1×10^<19>/cm^2注入した黒鉛からのHの等温加熱再放出量を測定・解析し,熱的に脱捕獲された水素は、動き得る水素間の再結合により再放出されることを示した。又熱的脱捕獲係数およびこの場合の再結合係数を決定した。更に2つの再放出過程における再結合機構の相異は、イオン衝撃により脱捕獲された水素は励起状態にあることによるとの結論に達した。炭化クロム(Cr_7C_3)や炭化タンタル(Tal)について照射下では、水素が飽和値より10%多く捕捉される,動的捕捉が確認された。本研究の目的は,第1壁における粒子束と同じ条件で水素イオン照射を受ける試料中の保持水素濃度分布および照射後の加熱あるいはヘリウムイオン照射による試料中の保持水素濃度分布の変化をイオンビ-ム分析法を用いて直接測定し,そのデ-タ解析から水素同位体の挙動を記述する質量平衡法程式中の素過程の物理パラメ-タを決定することである。本年度はまず,昨年度設置した差動排気型イオン銃を用いて6×10^<15>/cm^2・sのH^+イオン照射下における黒鉛中の保持水素濃度分布を測定し,照射後の保持水素濃度分布との比較から黒鉛ではダイナミックリテンションが極めて小さいことを明らかにした。次に3keVH^+_2あるいはD^+_2イオンを室温で飽和するまで注入した黒鉛からの等温加熱再放出を450°Cから600°Cまでの温度で測定した。その実験デ-タから,黒鉛からのHの再放出はDの再放出より早いという明瞭な同位体効果を見つけた。これらのデ-タ解析から水素同位体の加熱再放出が主として動き得る水素同志の局所的再結合により生じることを示した。またHおよびDの再放出における同位体差は熱的脱捕獲係数および拡散律速過程に基づく捕獲係数および局所的再結合係数の同位体差,すなわち反応係数の質量効果で説明されることを示した。更にH^+_eイオン衝撃再放出の測定から,この場合のHおよびDの再放出に加熱再放出よりも大きな同位体差が存在することを示した。この同位体差はイオン衝撃脱捕獲断面積の同位体差および動き得る水素と捕獲水素との局所的再結合係数および捕獲係数の同位体差で説明されることを示した。最後に等温加熱再放出における水素濃度の減衰曲線の理論式を用いて昇温脱離スペクトルを計算できること示すと共に,その計算結果が実験デ-タを良く再現すること,本研究で提案した水素同位体の挙動を記述するモデルが極めて一般的であることを示した。
ヒト肝癌に対するモノクロナール抗体の診断と治療への応用

〈研究目的〉ヒト肺癌に対するモノクローナル抗体の診断と治療への応用を目的とする。〈研究計画〉種々の肺癌のモノクローナル抗体と細胞診断学的研究、肺小細胞癌の特異抗原の分離、及びその微量測定法の開発。放射性同位原素にて標識した抗体による肺癌の画像診断、及び自家骨髄移植へのモノクローナル抗体の応用を行う。〈研究成果〉肺小細胞癌に特異的なモノクローナル抗体TFS-4は、他の組織型の癌とは反応せず、肺小細胞癌の組織診断、胸水や喀痰などの細胞診に有用であることが判明した。又、TFS-4と【^(131)I】を結合し、これを用いて肺小細胞癌の部位を画像診断できることが判明した。又本抗体が認識する抗原の純化に成功し、現在これを用いて、血中の抗原量の測定法の確立を急いでいる。又【^(131)I】標識TFS-4は肺小細胞癌の治療にも有効であった。次に各種肺癌と反応するが、正常組織とは反応しないTFS-2を用いて自家骨髄移植による肺小細胞癌の根治療法を試みた。骨髄中に浸潤した肺癌細胞はTFS-2と補体で処理することにより除去することが可能であった。又その際造血幹細胞に対しては毒性を示さず、安全であることが判明した。〈研究の考察〉肺小細胞癌は放射線や抗癌剤に極めて感受性が高いので、【^(131)I】や抗癌剤とTFS-4を結合させることにより、いわゆるミサイル療法が奏効する可能性が大きい。〈将来の展望〉肺小細胞癌の新しい治療法として、モノクローナル抗体によるミサイル療法の確立が急がれる。又自家骨髄移植の併用により、肺小細胞癌の根治療法の開発は最も現実的な目標である。
メタノール選択増感酸化電極の開発

直接メタノール形燃料電池(DMFC)の電極触媒として、Ptが用いられるが、メタノールと酸素が共存すると、酸化反応と還元反応が同時に生じ、DMFCの起電力と出力の低下を引き起こす。本研究では反応選択性のある電極の作製を意図して、前年度のPt-C二元系電極に引き続き,Pt-Ru-C三元系スパッタ電極を作製し、酸素共存下のメタノール酸化活性について研究を展開した。Au基板上に,三元同時スパッタ装置を用いてPt-Ru-C層を形成した。作製したPt-Ru-C電極の組成は、エネルギー分散X線分光法(SEM-EDS)で計測し、またX線光電子分光法(XPS)、X線回折(XRD)を用いたキャラクタリゼーションを行った。電気化学測定は,硫酸水溶液中,N2およびO2雰囲気下で電流-電位(i-E)曲線の測定を行った。作製したPt-Ru-Cにおいて,PtとRuは固溶体化しているが,Cはいずれとも固溶していない。酸素雰囲気下でメタノール酸化を行うと,Pt-Ru-Cスパッタ電極の多くの組成において、Pt-Ruスパッタ電極では見られない酸化電流の増加が起こった。これは酸素添加によるメタノール酸化増感作用であると考えられる。Pt-Ru-Cスパッタ電極を前年度に研究したPt-Cスパッタ電極と比較すると、電流の立ち上がりが卑電位方向にシフトし,酸素添加によるメタノール酸化電流が増大して起こる。このような特異な特性と,Pt-Ru-Cスパッタ電極の組成について詳細に調べた結果,C含有量が約525 at.%である時、酸素添加による増感作用が起こり易く、特にPt56Ru38C6スパッタ電極は、酸素添加により最も高いメタノール酸化電流の増幅を示すことがわかった。以上より,本研究で見出されたPt-Ru-C電極を燃料極に使用することで、高出力の直接メタノール形燃料電池を作製できると期待される。本研究では反応選択性のある電極の作製を意図して、Pt-C二元系スパッタ電極を作製し、メタノール酸化と酸素還元活性を各々測定した。Au基板上に同時スパッタ法を用いて,Pt-C層を形成した。作製したPt-C電極は、エネルギー分散X線分光法(SEM-EDS)、X線光電子分光法(XPS)、X線回折(XRD)で評価した。また、電気化学測定は,硫酸水溶液中,N_2およびO_2雰囲気下で電位走査法により電流-電位(i-E)曲線の測定を行った。作製したPt-C電極をEDSで組成分析した結果、Pt:C=100:056:44(原子比)であった。XPSスペクトルが、Cの添加によりPt 4fの結合エネルギーが高い側にシフトしたことから、Pt-C間に電子的相互作用があると考えられた。XRDより,Cの添加がPt粒径を減少させることも分かった。i-E曲線測定の結果,Ptスパッタ電極(Pt:C=100:0)では、メタノールとO_2が共存すると、メタノール酸化と酸素還元の活性がいずれも低下した。これはPt上でメタノール酸化と酸素還元が同時に生ずるためと考えられる。一方、Pt:C=56:44電極では,メタノールとO_2が共存すると酸素還元活性は低下するが,メタノール酸化活性は向上した。すなわち,Pt-C電極におけるO_2存在下のメタノール酸化は、一種の増感反応と捉えられる。また、Pt-C電極における酸素還元活性は、Pt電極と比べて低下した。これは,Pt-C電極におけるPt粒子サイズの減少と関係していると思われる。以上より,本研究で見出された電極を燃料極に使用することで、高出力の直接メタノール形燃料電池を作製できると期待される。このような特異な特性と,Pt-Ru-Cスパッタ

電極の組成について詳細に調べた結果,C含有量が約525 at.%である時、酸素添加による増感作用が起こり易く、特にPt56Ru38C6スパッタ電極は、酸素添加により最も高いメタノール酸化電流の増幅を示すことがわかった。以上より,本研究で見出されたPt-Ru-C電極を燃料極に使用することで、高出力の直接メタノール形燃料電池を作製できると期待される。
観察・実験活動におけるメタ認知活性化が高校生の理科実験観の変容に及ぼす効果

本研究の目的は,高等学校理科の観察・実験活動において,メタ認知を活性化させる学習指導が,高校生の観察・実験活動に対する認知や態度(以下,「理科実験観」とする)のポジティブな変容に効果があるかどうかついて実践的に検討することであった。まず,メタ認知の活性化を量的に測定するためにメタ認知尺度を準備した。そして,高校生の理科実験観の下位概念を抽出するために質問紙を作成した。公立高等学校3校389名(1学年169名,2学年165名,3学年55名)を対象として,因子分析によって理科実験観の下位概念を抽出した。第1因子には「メタ認知的方略志向」,第2因子には「仮説検証方略志向」,第3因子には「意味理解方略志向」,第4因子には「可視化方略志向」,第5因子には「新しい発見や気づき」,第6因子には「実験プロセスの重視」の6つの因子(計20項目)が抽出された(以下,本質問紙を「理科実験観尺度」とする)。次に,メタ認知を活性化させる学習指導として次のように考え,理科総合A「化学反応式と量的関係」において実践事例を開発した(2月下旬に実施)。"生徒が科学的概念を学習した後に,科学的知識を活用して解決する現実的な課題を提示する。生徒は,グループで課題解決のための仮説と目的を設定し,実験方法を計画・実行する"。メタ認知尺度と理科実験観尺度の観察・実験活動前の測定結果を統制変量,授業(処遇授業と対照授業)を独立変数,観察・実験活動直後の測定結果を従属変数とする共分散分析を行った。その結果,処遇群(38名)の「他者との関わりによるメタ認知」の平均値は,対照群(39名)のそれより有意に高かった。また,処遇群の「仮説検証方略志向」,「新しい発見や気づき」,「実験プロセスの重視」,の平均値は,対照群のそれよりも有意に高かった。
サーカディアン・カルシウムリズムを支配する体内時計分子基盤の解明

本研究の主な目的は、体内時計中枢である視床下部視交叉上核(SCN)ニューロン内に見られる細胞内カルシウム濃度の約24時間リズム(サーカディアン・カルシウムリズム)の形成過程において、時計遺伝子の制御機序を明らかにすることである。そこで、視床下部スライス培養にカルシウム感受性蛍光タンパク質遺伝子を発現させ、以下に示す様々な解析を行った。時計遺伝子mPer1およびmPer2のアンチセンスmRNAを長期間培養液中に投与したが、サーカディアン・カルシウム濃度リズムや活動電位の自発発火頻度リズムに有意な効果は及ぼさなかった。行動リズムを恒暗条件下で無周期にすることが知られる時計遺伝子Cry1/Cry2ダブルノックアウトマウスでは、サーカディアン・カルシウム濃度リズムの振動(100-500nM程度の振幅)は持続するものの、無周期になっていることが明らかになった。一方で、その他のクラスの時計遺伝子であるBmal1の強制発現やBmal1ドミナントネガティブ体の強制発現を行なったところ、サーカディアン・カルシウム濃度リズムが劇的に抑制されることが明らかとなった。さらに、Bmal1の転写制因子として働くRORαの欠損マウスにおいてもサーカディアン・カルシウム濃度リズムが劇的に抑制されることが明らかとなった。これらの結果は、ある特定のクラスの時計遺伝子が細胞生理活動リズムの形成に重要な役割を担っていることを示唆している。本研究ではさらに、体内時計光同調機構や、睡眠発現調節機構に関する研究も展開した。特に、摂食調節ぺプチド受容体の一つであるCCK-A受容体の欠損マウスでは、光による時計遺伝子mPer1/mPer2の発現が有意に抑制されることが明らかとなったが、この効果は、網膜アマクリン細胞におけるCCK-A受容体の発現に起因することが明らかとなった。H14-15年度基盤研究B「カルシウム感受性蛍光タンパクを用いた体内時計ニューロンの超長期局所カルシウムダイナミックスの解明」(研究代表者池田真行)において明らかにされた視床下部視交叉上核(SCN)ニューロン内の約1日の細胞質Ca^<2+>濃度のリズムの発生機構を、(i)遺伝子レベルおよび(ii)関与する細胞内小器官についてさらに詳細に解析を進めた。その結果、既知の時計遺伝子であるmPer1/mPer2のアンチセンスmRNAは、培養SCNニューロンの活動電位発火頻度リズムや、サーカディアンCa^<2+>濃度リズムに有意な効果を及ぼさないことが明らかとなった(Sugiyama T, Toshioka T & Ikeda M,Biochem.Biophys.Res.Commun.2004)。一方で、Bmallの強制発現実験ではCa^<2+>濃度リズムが一時的抑制されること(未発表)や、Cry1/Cry2ダブルノックアウトマウスでは、アリズミックなCa^<2+>濃度リズムを観察されること(未発表)が明らかとなりつつある。これらのことは、現時点で報告されている「時計遺伝子群」がサーカディアンCa^<2+>濃度リズムの形成にとって一様に働いていないことを示唆するものである。さらに、細胞内小器官内のCa^<2+>濃度リズムを観察する第一歩として、視床下部視索前野核ニューロンのミトコンドリアにPericamセンサーを導入し、Ca^<2+>イメージングを行なった結果は、2005年2月号(Vol.130)のNeuroscience誌のカバーページを飾っている(Ikeda M.et al.,Neuroscience 2005)。ミトコンドリアターゲティングPericamセンサーをSCNニューロンに導入する実験もすでに開始している。本研究の目的は、(i)サーカディアン細胞質Ca^<2+>リズムを制御する遺伝子・細胞内小器官は何か?

および(ii)サーカディアンCa^<2+>リズムは既知の時計遺伝子候補群の発現リズムと相互作用しているのか?を解析し、単一ニューロンレベルのサーカディアンリズム形成過程の全容を明らかにすることである。一年目の実験により、SCNニューロン内の約1日の細胞質Ca^<2+>濃度のリズムの発生にはPer1あるいはPer2アンチセンスmRNAは有意な効果を持たないことが明らかとなった。そこで本年はBmal1およびその転写に係わる分子の関与を解析した。(1)SCNニューロンに見られるサーカディアンCa^<2+>濃度リズムに対するネイティブマウスBmal1及びドミナントネガティブBmal1遺伝子強制発現効の検討マウスのネイティブBmal1を強制発現させると、四-五日間にわたりサーカディアンCa^<2+>濃度リズムが抑制された。この期間は、強制発現したBmal1が細胞核に局在する期間と一致していた。ネイティブBmal1のC末側182アミノ酸を欠損させたドミナントネガティブ体を同様に強制発現させると、さらに長きにわたり(約10日間)サーカディアンCa^<2+>濃度リズムが抑制された。これらの結果の一部は2005年Gordon Conferenceや2006年日本生理学会において発表された。(2)核内オーファン受容体RORαの遺伝子欠損マウスにおける細胞内Ca^<2+>濃度リズム解析Bmal1遺伝子発現に関与することが報告されているRORαの遺伝子欠損マウスのSCNスライス培養においてサーカディアンCa^<2+>濃度リズムを解析したところ、ホモ欠損では細胞致死率が高く、またヘテロ欠損では有意にサーカディアン振動の抑制が見られた。この結果の一部は2005年阪大蛋白研セミナーにて発表された。体内時計細胞にみられるサーカディアン細胞質Ca^<2+>濃度リズムの発生に関与する時計遺伝子の機能を明らかにするために、Bmal1およびそのドミナントネガティブ体をコードする遺伝子を、CMVプロモーターとXpressタグを含む発現ベクターに組み込み、NIH3T3細胞や培養SCNニューロンに強制発現させた。なお、NIH3T3細胞への遺伝子導入は、通常のリポフェクション法を用い、SCNニューロンへの遺伝子導入には遺伝子銃を用いた。それぞれのタンパク質の細胞内局在や発現の様子は、抗Xpress免疫染色を行なうことにより解析した。その結果、ネイティブBmal1の強制発現は、24時間以内にBmal1タンパク質の細胞核凝集を引き起こし、遺伝子導入後約3日の間、細胞核で高いレベルに維持されることが明らかとなった。また、この間は、SCNニューロンのサーカディアン細胞質Ca^<2+>濃度リズムが抑制された。一方で、ドミナントネガティブ体の強制発現は、細胞質での一時的な局在に引き続き、細胞核への移行が起きるが、その期間は1週間以上におよび、より長期の細胞質Ca^<2+>濃度リズム抑制作用があることが明らかとなった。
効率的バイオエタノール生産を目指した代謝能および糖輸送能の複合的改変技術の開発

キシロース代謝経路としてキシロースイソメラーゼ経路をキシロースイソメラーゼ遺伝子の染色体組み込みにより酵母へ導入する手法を確立した。キシロースイソメラーゼ経路を導入した酵母ならびに同時に副産物であるキシリトール生産経路を遮断した酵母によるグルコースならびにキシロースからのエタノール発酵能の評価を行った。加えて酵母内への糖取り込み能を司るトランスポーターをこれら酵母に過剰発現させることでグルコースならびにキシロース消費速度の向上を実現した。キシロース代謝経路としてキシリトールを代謝中間体として生産しないキシロースイソメラーゼ経路の酵母への導入手法の確立および、これを用いたキシロースからのエタノール発酵能の評価を実施した。Orpinomycessp.由来キシロースイソメラーゼ発現遺伝子カセットをδインテグレーション法により酵母Saccharomyces cerevisiaeゲノム上に多コピー導入することで、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵母株の作成に成功した。また、この酵母株を用いキシロースを単一炭素源としたエタノール発酵が可能であった。現在までにキシロースイソメラーゼ発現遺伝子カセットを酵母ゲノム上へ組込み、酵母にキシロースイソメラーゼ経路によるキシロース代謝能を付与した例は報告されていない。ゲノム上への目的遺伝子組み込みは遺伝子組換えの安定性が高く産業利用に適した手法であり、本研究成果は競争が激化している当該分野において非常に重要性の高いものである。また、副生産物であるキシリトール生産を抑制するため、キシリトール生産反応に関与していると考えられる非特異的アルドースレダクターゼをコードするGRE3を欠損させた酵母株を作成し、キシロースイソメラーゼ経路によるキシロース代謝経路を導入した。その結果、キシロースからのエタノール発酵において副産物であるキシリトールの生産量が減少し、エタノール生産量の向上が見られた。さらにキシロース消費速度並びにエタノール生産性の2倍以上の向上が確認された。発酵培地中にキシリトールを添加した発酵実験結果から、キシロースイソメラーゼ経路によるキシロースからのエタノール発酵ではキシリトールが阻害剤として働き、キシリトールの複製産を抑制することが発酵効率の向上において非常に重要であることを明らかとした。酵母内への糖の取り込みを司るトランスポーターの過剰発現によるエタノール発酵性能の向上の実証ならびに評価を実施した。トテンスポーターとしてSaccharomyces cerevisiae由来Hexose transporter 2種(HXT1ならびにHXT7)、Candida intermedia由来glucose/xylose facilitator 1(GXF1)、glucose/xylose-H+ symporter (GXS1)の計4種のトランスポーターをそれぞれ、前年度に創製したキシロースイソメラーゼ経路によるキシロースからのエタノール発酵能を有する酵母ヘシングルコピーゲノム組み込みにより導入した。それぞれのトランスポーターを導入した酵母全てにおいてグルコース消費速度の向上が確認され、GXF1を導入した酵母ではグルコース消費速度は2倍以上の向上が確認された。キシロース消費速度についてもGXS1を除く全てのトランスポーターでキシロース消費速度、特に低濃度域での消費速度が向上しグルコースの場合と同様にGXF1の導入が最も効果が大きく、キシロースの完全消費に必要な時間が1/3に短縮された。またそれぞれの場合においてエタノールの対糖収率の大きな変化は確認されず、安定性が高く簡便であり産業利用に適したゲノム上へのシングルコピー組み込みによる過剰発現によりトランスポーター機能を強化し、エタノール生産性の向上できることが実証された。エタノール発酵生産に必要となる時間が短縮されることで、実プロセスにおいては発酵一回あたりの発酵プラントの運転時間の短縮によるプラントあたりのエタノール生産性の向上、ならびに単位エタノールの生産に必要なエネルギー消費の抑制が可能となるとが見込まれる。