hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラット皮質脊髄路の軸索側枝の形成を誘導する因子の同定

本研究では軸索側枝形成因子の同定を目的としており、GeneChipを用いたスクリーニングにおいて得られた複数の候補遺伝子の解析を進めている。本年度は、昨年度に引き続き、子宮内マウス胎仔脳に対する電気穿孔法を用いた過剰発現により、in vivoにおける候補遺伝子の機能解析を試みた。実験としては、(1)大脳皮質第5層の起始細胞へ候補因子に対する受容体あるいは受容体のドミナントネガティブフォームを強制発現させる実験、(2)大脳基底核と間脳に候補遺伝子を異所発現させる実験、(3)橋核に候補遺伝子の過剰発現させる実験を行った。その結果、コントロールと比べて、候補遺伝子の1つであるガストリン放出ペプチド(Gastrin-Releasing Peptide : GRP)を橋核に過剰発現させた場合に、橋核の最も吻側と尾側へ伸長する側枝が少数ではあるが増加する表現型が認められた。この微小な側枝数の増加が、各サンプル間のDiIによる標識の微妙な差を反映している可能性も否定できないが、この結果よりGRPが軸索側枝形成に関与している事が示唆された。そこで、GRPノックアウトマウスを用いた解析を試みた。まず候補遺伝子であるGRPがラットと同様にマウスでも側枝が形成される領域で発現しているかどうかを調べたが、予想に反してGRPは橋核ではその発現がほとんど認められなかった。GRP受容体はラットと同様にマウスでも大脳皮質に発現が認められたので、GRP受容体ノックアウトマウスを入手し、皮質脊髄路の軸索側枝形成に異常があるかどうかを調べた。その結果、皮質脊髄路の全ての側枝形成領域において、ホモマウスでもコントロールマウスと同程度に軸索側枝が形成されていた。以上の結果から、GRPが軸索側枝形成を誘導する因子として機能する可能性が否定される訳ではないが、種を超えて軸索側枝形成に必須なものではない事が示唆された。今後はラットを用いて、GRPを過剰発現させる実験やGRP、GRP受容体をノックダウンする実験を検討する必要がある。私は昨年度までにGeneChip等を用いたスクリーニングにおいて複数の候補遺伝子を得ている。今年度はこれら候補遺伝子のin vivoにおける機能を解析するため、マウス子宮内胎仔脳に対する電気穿孔法を確立した。条件検討の結果、胎生12.5日目のマウス胎仔にこの方法を用いる事によって、候補遺伝子を皮質脊髄路付近で異所的に強制発現させる事が可能となった。実際にこの条件下でEGFP遺伝子を強制発現させた細胞の近傍を、,蛍光色素DiIで標識した皮質脊髄路が走行する事が確認できた。また胎生12.5日目、あるいは胎生13.5日目のマウス胎仔に用いる事によって、候補因子に対する受容体遺伝子、あるいはその受容体のドミナントネガティブフォームを大脳皮質第5層の皮質脊髄路起始細胞で強制発現させる事が可能となった。実際にこの条件下でEGFP遺伝子を起始細胞に強制発現させて、皮質脊髄路の走行・側枝形成を可視化する事ができた。この実験系を用いて候補遺伝子の側枝形成に対する影響をin vivoで調べる事ができる。また、候補遺伝子・それらに対する受容体遺伝子をそれぞれ単離し、それら発現コンストラクト・受容体ドミナントネガティブフォームの発現コンストラクトを作製した。培養細胞を用いて、これら発現コンストラクトから目的のタンパク質が合成されるかどうかを調べた。その結果、正しい分子量のタンパク質が合成されていることが確認できた。また、候補因子は細胞上清中に分泌される事、受容体・受容体ドミナントネガティブフォームは細胞膜に局在している事がそれぞれ確認できた。現在はマウス子宮内胎仔脳に対する電気穿孔法を用いてこれら発現コンストラクトを強制発現させ、その表現型を解析している。本研究では軸索側枝形成因子の同定を目的としており、これまでのGeneChipを用いたスクリーニングにおいて複数の候補遺伝子を得る事ができている。本年度は主に、子宮内胎仔脳に対する電気穿孔法を用いた、(1)大脳皮質第5層の起始細胞への、候補因子に対する受容体、あるいは受容体のドミナントネガティブフォームの強制発現実験、(2)大脳基底核、間脳における候補遺伝子の異所発現実験、(3)橋核における候補遺伝子の過剰発現実験を行い、in vivoにおける候補遺伝子の機能解析を試みた。その結果、(1)では大脳皮質神経細胞の細胞移動、あるいは細胞接着に影響を及ぼす受容体、あるいは受容体のドミナントネガティブフォームが数種類見つかった。また、(2)ではある候補遺伝子Aの異所発現の結果、間脳レベルで皮質脊髄路軸索が本来の経路よりも背側を走向する異常が観察された。(3)では別の候補遺伝子Bを導入した橋核神経細胞と、他の小脳前核神経細胞の細胞移動に異常が観察された。しかしながら、(1)から(3)を通して、これまでのところ軸索側枝の形成に異常は見られていない。現在は残りの候補遺伝子や、それらに対する受容体、受容体のドミナントネガティブフォームの機能解析を引き続き行っているところである。また、in vitroにおける機能解析を行うために、ラット大脳皮質組織片培養の確立を試みた。本来橋核への側枝が形成される生後0日目のラット大脳皮質組織片をある条件下で培養すると、組織片からのさかんな軸索伸長が観察された。現在は培養液中に候補因子を投与する事によって側枝形成が誘導されるかどうかを調べている。また、大脳皮質組織片と候補因子を発現する細胞塊との共培養実験を行い、側枝形成が誘導されるかどうかについても調べている。

本研究では軸索側枝形成因子の同定を目的としており、GeneChipを用いたスクリーニングにおいて得られた複数の候補遺伝子の解析を進めている。本年度は、昨年度に引き続き、子宮内マウス胎仔脳に対する電気穿孔法を用いた過剰発現により、in vivoにおける候補遺伝子の機能解析を試みた。実験としては、(1)大脳皮質第5層の起始細胞へ候補因子に対する受容体あるいは受容体のドミナントネガティブフォームを強制発現させる実験、(2)大脳基底核と間脳に候補遺伝子を異所発現させる実験、(3)橋核に候補遺伝子の過剰発現させる実験を行った。その結果、コントロールと比べて、候補遺伝子の1つであるガストリン放出ペプチド(Gastrin-Releasing Peptide : GRP)を橋核に過剰発現させた場合に、橋核の最も吻側と尾側へ伸長する側枝が少数ではあるが増加する表現型が認められた。この微小な側枝数の増加が、各サンプル間のDiIによる標識の微妙な差を反映している可能性も否定できないが、この結果よりGRPが軸索側枝形成に関与している事が示唆された。そこで、GRPノックアウトマウスを用いた解析を試みた。まず候補遺伝子であるGRPがラットと同様にマウスでも側枝が形成される領域で発現しているかどうかを調べたが、予想に反してGRPは橋核ではその発現がほとんど認められなかった。GRP受容体はラットと同様にマウスでも大脳皮質に発現が認められたので、GRP受容体ノックアウトマウスを入手し、皮質脊髄路の軸索側枝形成に異常があるかどうかを調べた。その結果、皮質脊髄路の全ての側枝形成領域において、ホモマウスでもコントロールマウスと同程度に軸索側枝が形成されていた。以上の結果から、GRPが軸索側枝形成を誘導する因子として機能する可能性が否定される訳ではないが、種を超えて軸索側枝形成に必須なものではない事が示唆された。今後はラットを用いて、GRPを過剰発現させる実験やGRP、GRP受容体をノックダウンする実験を検討する必要がある。
薬用食品からの経口投与可能なインスリン代替物質の探索及び新規糖消費亢進機構の解明

伝承・伝統医薬学において薬用に供される生薬,ならびに主に食用に供される植物を素材として,本課題のインスリン様作用を有する物質を探索した.糖尿病の薬物治療においては,「糖尿病治療ガイド」に記載されているように,生活習慣の改善が指導されるとともに,種々の医薬品が血糖値の制御を目的に使用されている.しかしながら,血糖値の制御が既存の医薬品により十分に出来ない場合には,インスリン製剤が使用されることになる.即ち,現状において使用可能な薬剤の中で,最も強力な血糖値の低減が期待出来る方法は,インスリンと同じくインスリン受容体へのアゴニスト作用であることがわかる.しかしながら,インスリンはペプチドからなる分子構造を有することから経口投与ではバイオアベイラビリティが低く,患者による自己注射が必要な製剤として提供されている.本研究課題では,前記した生薬や食用に供される植物由来の成分,特に中,低分子量の含有成分を中心にインスリンと同様の薬理活性を示す成分をひろく探索した.その結果,生薬センキュウおよびニクズクイ抽出エキスが,インスリンと同様,筋芽細胞であるL6細胞の糖消費を有意に亢進させることを見いだした.さらにこれらの含有成分についても評価を進めた結果,それぞれの含有成分から活性寄与成分を明らかにした.L6細胞を使用して,植物抽出エキスによるL6細胞の培養液中糖消費促進活性を検討した.スクリーニング試験を実施した結果,生薬センキュウおよびニクズクイなどの抽出エキスにインスリン様の糖消費促進活性を認めた.これらの抽出エキスは,インスリンの細胞内シグナルトランスダクションの阻害剤であるウォルトマンニン共存下でも,その活性が消失することはなく,インスリンと全く同じ経路を介して,細胞に糖消費の亢進を惹起するわけではないことが,現状の結果からは示唆されている.さらに,活性成分として得られた化合物は抽出エキスの薬理活性の特徴を再現することが確認出来ており,本課題の当初目的とした,「薬物により制御可能な新規糖消費促進機構」の解明に繋がる実験結果であると判断出来ることから,当初の計画よりもスムーズに研究が進行しているものと判断出来る.2年目以後の本研究課題の推進方策としては,さらに種々の素材についてスクリーニング試験を拡充し,より活性の強い素材,さらにはその活性寄与成分の解明研究を推進する.一方,1年目の研究の成果として得たセンキュウやニクズクイの抽出エキスのin vivoでの評価をすすめるとともに,その作用機序解析に着手する.作用機序解析について具体的には,インスリンにより惹起される細胞内シグナルトランスダクションを対照として,インスリンと同一の機序による部分とインスリンとは異なる部分をウエスタンブロット等により,解析を進めていく.伝承・伝統医薬学において薬用に供される生薬,ならびに主に食用に供される植物を素材として,本課題のインスリン様作用を有する物質を探索した.糖尿病の薬物治療においては,「糖尿病治療ガイド」に記載されているように,生活習慣の改善が指導されるとともに,種々の医薬品が血糖値の制御を目的に使用されている.しかしながら,血糖値の制御が既存の医薬品により十分に出来ない場合には,インスリン製剤が使用されることになる.即ち,現状において使用可能な薬剤の中で,最も強力な血糖値の低減が期待出来る方法は,インスリンと同じくインスリン受容体へのアゴニスト作用であることがわかる.しかしながら,インスリンはペプチドからなる分子構造を有することから経口投与ではバイオアベイラビリティが低く,患者による自己注射が必要な製剤として提供されている.本研究課題では,前記した生薬や食用に供される植物由来の成分,特に中,低分子量の含有成分を中心にインスリンと同様の薬理活性を示す成分をひろく探索した.その結果,生薬センキュウおよびニクズクイ抽出エキスが,インスリンと同様,筋芽細胞であるL6細胞の糖消費を有意に亢進させることを見いだした.さらにこれらの含有成分についても評価を進めた結果,それぞれの含有成分から活性寄与成分を明らかにした.L6細胞を使用して,植物抽出エキスによるL6細胞の培養液中糖消費促進活性を検討した.スクリーニング試験を実施した結果,生薬センキュウおよびニクズクイなどの抽出エキスにインスリン様の糖消費促進活性を認めた.これらの抽出エキスは,インスリンの細胞内シグナルトランスダクションの阻害剤であるウォルトマンニン共存下でも,その活性が消失することはなく,インスリンと全く同じ経路を介して,細胞に糖消費の亢進を惹起するわけではないことが,現状の結果からは示唆されている.さらに,活性成分として得られた化合物は抽出エキスの薬理活性の特徴を再現することが確認出来ており,本課題の当初目的とした,「薬物により制御可能な新規糖消費促進機構」の解明に繋がる実験結果であると判断出来ることから,当初の計画よりもスムーズに研究が進行しているものと判断出来る.2年目以後の本研究課題の推進方策としては,さらに種々の素材についてスクリーニング試験を拡充し,より活性の強い素材,さらにはその活性寄与成分の解明研究を推進する.一方,1年目の研究の成果として得たセンキュウやニクズクイの抽出エキスのin vivoでの評価をすすめるとともに,その作用機序解析に着手する.作用機序解析について具体的には,インスリンにより惹起される細胞内シグナルトランスダクションを対照として,インスリンと同一の機序による部分とインスリンとは異なる部分をウエスタンブロット等により,解析を進めていく.
E3ユビキチンリガーゼRNF125の新たな生理機能の解析

免疫機構の解明には、そのシグナルに関わる因子の機能を正確に把握することが必要不可欠である。RNF125に関してはこれまで、T細胞活性化(JI, Zhao H et al, 2005)とRIG-I分解(PNAS, Arimoto K et al, 2007)という機能しか知られていない。RNF125がウイルス感染後のインターフェロンシグナルを抑制する一方で、T細胞活性化に働くことは、RNF125が自然免疫のみならず獲得免疫にも別の働きをすることを意味し、その生理的機能を解明することは大変意義がある。したがって、本研究では、RNF125の新たな分子機能を探索し、RNF125の生体内での役割をRNF125ノックアウトマウス構築により明らかにすることを目的とした。本年度の研究は、1)個体を使用したウイルス感染実験を行うために、C57/BL6系マウスとのバッククロスを完了しつつある。細胞レベルの実験としては、RNF125ノックアウトマウス胎児繊維芽細胞(RNF125-/-MEFs)を用いてウイルス感染実験の詳細な解析を始めている。2)RNF125によるT細胞活性化についてのメカニズムを探る実験もRNF125ノックアウトマウスを用いて現在解析を遂行中である。3)RNF125の変異体が野生型とは全く異なる性質をもつことについて詳細に解析している。4)RNF125の機能解析の過程において、ウイルス感染後に活性化されるインターフェロンシグナルに必須である新規E3ユビキチンリガーゼを見いだしたものを論文投稿中である。1)理化学研究所から得られたヘテロマウスを交配し、RNF125ノックアウトマウスを作製した。現在はC57/BL6系マウスとのバッククロスを行っているとともに、ノックアウトマウス胎児繊維芽細胞を用いてウイルス感染実験を始めている。2)RNF125強制発現によりNF-κBレポーターアッセイで変化の見られたRIG-I下流の分子に対して、RNF125がどのような修飾(ユビキチン化など)を与えているかを明らかにすることを試みた。その結果としてRNF125のある欠失変異体が野生型のRNF125とは異なる性質を持っていることを明らかにした。この変異体の強制発現によりRIG-I下流分子が活性型のユビキチン化修飾を受け、NF-κBのレポーター活性が上昇した。この変異体は生理的条件下においても存在することから意義深いものであり、さらに詳細な解析を行っている。3)RIG-Iと同様にCARDドメインを持つNODファミリーがRNF125の制御を受けるかどうかを調べたところ、強制発現の系ではNODファミリーとRNF125の結合が見られNF-κBレポーター活性が低下したが、ユビキチン化や分解は見られず、RIG-Iに対するRNF125の役割とは異なることが明らかとなった。4)論文実績としては、RIG-IのISG化とユビキチン化のバランスにRNF125とUbcH8が重要であることを報告したものが2008年度に受諾された。また、ウイルス感染免疫シグナルにおけるユビキチン化の役割を総説として発表した。さらに、本研究の過程で、ウイルス感染後に活性化されるインターフェロンシグナルに必須である、新規E3ユビキチンリガーゼを見いだし、現在論文投稿中である。
がん患者家族における複雑性悲嘆のリスクアセスメント：死別前後の比較検討

本研究は、がん患者の家族に対して死別前後の心理的問題を包括的にアセスメントし、それを支援に役立てていくことを目的としている。具体的には、東北大学病院緩和ケア外来を受診したがん患者の家族を対象とした心理教育(家族教室)を実施し、そこで研究同意の得られた参加者に対して複雑性悲嘆のリスク、および精神的健康度のアセスメントを実施する。その後、対象者にはあわせて郵送法による死別後のフォローアップ調査を実施し、がん患者家族の複雑性悲嘆の発現の有無、および精神的健康度のアセスメントを実施し、患者との死別前後における家族の心理的状態の比較検討を行うものである。上記の内容で、2019年7月23日付で東北大学医学系研究科の倫理審査で承認された。家族教室実施に向け、外来担当医師向けの説明会等の準備を行った。また、家族教室の運用、複雑性悲嘆や精神的健康度の評価等、本研究に必要な情報収集を目的に国内の学会や国際学会に参加し、最新の知見を得たり研究者と情報交換等を行った。以上、研究の1年目としての基盤作りが可能であった。外来家族教室への参加希望者がなく、2019年3月末の時点で実施ができていない。したがって本研究のアンケート調査が行えていない状況である。2019年4月以降は家族面談の外来枠が拡大される見込みで、より多くの家族に研究への協力を求めることが可能となる。今後の2年間で目標の50症例を目指す予定である。予定していた学会への参加費、旅費が少なく済んだ。データ処理・解析用のPC本体とソフトウエア購入等に使用することを計画している。
ミクロゾーム型アルデヒド脱水素酵素の小胞体膜挿入及び残留機構

ミクロゾーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)は、C-末端側の疎水性領域で小胞体膜に挿入され、N-末端を含む分子のほとんどを細胞質側に露出する典型的なC-末端アンカー型膜蛋白質である。今年度は、ウシ・オプシンとmsALDHのキメラを作製しC-末端の膜トポロジーと小胞体残留機構を解析した。1.msALDHのC-末端にウシ・オプシンのN-末端部分を融合しmsALDHの疎水性領域から8および21番目に糖鎖付加可能なアスパラギンを有するキメラ(ALDH/OP)を作製した。2.このキメラをCOS細胞に発現させ、間接蛍光抗体法で細胞内局在を調べた結果野性型と同じく小胞体に局在していることがわかった。3.イムノブロット法によりこのキメラが膜画分に存在することおよび分子量が蛋白部分から予想される56kDaより3kDa増加していることが判明した。このことから、キメラのC-末端が小胞体内腔に出て糖鎖が付加されることが示唆される。4.疎水性領域から21番目のアスパラギンに糖鎖が付加しないように改変された変異体の分子量は56kDaであった。このことから、ALDH/OPで糖鎖が付加されるのは疎水性領域から21番目のアスパラギンであることが示唆される。8番目のアスパラギンは膜に近いため糖付加酵素が反応できないと推定される。5.[^<35>S]メチオニンを用いてパルス・ラベル実験を行い、ALDH/OPに付加される糖鎖はEndoH感受性・EndoD抵抗性を示すことがわかった。また、ブレフェルジンA(BFA)処理を行うと糖鎖はEndoH抵抗性・N-glycosidaseF感受性に変化した。6.以上の結果より、msALDHのC-末端疎水性領域は膜を貫通していることおよびmsALDHは小胞体-中間領域をリサイクルする機構ではなく小胞体から出ない機構で残留していると結論した。
C型肝炎ウイルス感染トランスジェニックマウスの作成

C型肝炎ウイルスのレセプターとして、CD81が有力候補にあがっている。我々は、CD81を強力に各種マウス細胞株で発現させるとともにCD81を強力に発現させたトランスジェニックマウスを作成した。細胞株での検討ではCD81を強く発現させた肝癌細胞株でのみ、RT-PCR法によるHCV-RNAのマイナス鎖が検出され、HCVの増殖が確認された。7-10日目の培養細胞でもっとも強く増殖をみとめ、通常のB-6マウスの肝細胞株よりも別の系統のマウス肝細胞株で、HCV-RNAのマイナス鎖を、つよくみとめた。一方、トランスジェニックマウスは内因性のマウスCD81をノックアウトし、ヒトCD81のみを強力に発現させたトランスジェニックマウスを作成した。C型肝炎患者の新鮮な血清をマウスに静注した。定期的に肝機能(GPT)をチェックし、肝臓をとりだしで肝炎の有無、HCVの存在などを病理学的にチェックした。現在のところ、B-6マウスでは肝炎を発症していないが、他の系統のマウスで検討中である。又、CD81以外に別のファクターの存在がHCVの感染に必要なことも考えられ、あわせて検討中である。C型肝炎ウイルスのレセプターは、まだ発見されていないが、CD81が有力候補の一つとして考えられている。とDCD81をアクチンプロモーターで強力に発現させた細胞株を作製した。マウスの肝癌細胞株(2種類)、マウスの乳癌細胞株、マウスの大腸癌細胞株を用いた。これらの細胞にヒトCD81をトランスフェクションして、強力に発弦させ、FACSRてもそれを発現しているが確認をした。これらの細胞株に。様々のタイプのC型肝炎ウイルス患者の血清をかけ、実際にウイルスが増殖するかどうかを、PCR法を用いて検討した。又、C型肝炎ウイルスが結合するかどうかの、アッセイも行なった。その結果。ヒトCD81を強力に発現させた細胞では肝細胞以外の細胞にも、C型肝炎ウイルスは決合久した。コントロールのCD81を発現していない細胞にはC型肝炎ウイルスは結合しなかった。又、C型肝炎ウイルスのマイナス鎖が検出されると、C型肝炎ウイルスが増殖していると考えられるが、肝細胞にCD81を発現した細胞に、C型肝炎ウイルス患者の血清をかけると、C型肝炎ウイルスのマイナス鎖が、PCE法にて検出されたが、他の細胞では検出されなかった。次に、ヒトCD81を強力に発現したトランスジェニックマウスを作製し、マウスのCD81をノックアウトしたマウスも作製してそれらをかけあわせ、純粋にヒトCD81のみを強力に発現させたマウスも作製した。さまざまのC型肝炎ウイルス患者のフレッシュな血清をマウスの尾から静注して、定期的に肝機能をチェックした。しばらくたったところで、肝臓をとりだして、病理検査,ヒトCD81の発現,C型肝炎ウイルスが増殖をしているかの検討を現在おこなっているところである。C型肝炎ウイルスのレセプターとしてCD81が注目をあつめている。我々はまずはじめに、ヒトCD81を過剰発現させたマウス肝痰癌細胞株にC型肝炎患者血清をかけ、C型肝炎ウイルスの一過性感染を確認することができた。他のマウス細胞株では発現せず、肝細胞株におえても、種類によっては感染するものと、しないものとがあることが判明した。我々はすでにマウスCD81をノックアウトしたマウスを作成し、保育していたが、あらたに、ヒトCD81を過剰発現させたBALB-Cマウスを作成し、ノックアウトマウスとかけあわせたマウスを作成した。このマウスに、C型肝炎患者の血清を注射し、定期的に採血を行なって肝機能をチェックし、3ヶ月後位に、このマウスの肝臓を取り出して、肝組織を検討した。現在までの検討ではC型肝炎の感染はマウスの〓では認めなかった。細胞株で一過性の感染をみとめた、別のマウスの〓でトランスジェニックマウスを作成し、感染が成立しないか現在検討中である。又、CD81にC型肝炎ウイルスはたしかに結合するが、CD81だけでは感染しない可能性があり、別の因子の検索を行なっている。
レアアースフリーな電動自動車に向けた新制御理論に基づくＳＲモータ駆動法の開発

本研究の目的は,環境にやさしい移動システムとして普及している電動自動車に対し,レアアースを用いなくとも高出力が得られるSRモータを用いた実用的な駆動システムを提供することにある.この目的ため,研究期間を通じてインバータ電源電流を一定にする定電源電流とモータ出力を一定にする定トルク出力の両方を実現できる新しいSRモータ駆動方法を開発している.29年度までの研究によって,この両方の特性を実現できる新しいSRモータの駆動方法を考案し,さらにこの駆動方法に特化して最適化したSRモータの新しいロータ構造を開発することができた.最終年度では,実際のモータベンチにおいてこのロータ構造の性能評価に取り組み,以下の成果を得ることができた.1.ロータ評価のため,モータベンチの高回転・高出力化に向けた改造を実現した.なお,この改造では,モータ負荷としてこれまで用いていたヒステリシスブレーキに代えて,誘導モータを使用するよう変更している2.モータベンチによって開発したロータ構造によるSRモータを駆動する実験を行い,新しく開発したモータ構造によって,想定通り定電源電流および定トルクでの駆動が実現できることを確認できた.3.モータベンチを用いた評価結果から,想定通り,提案するロータ構造を用いることで従来のSRモータに比べて提案駆動方法下での銅損低減効果を確認できた.銅損低減効果量は動作条件にもよるが,約2.54割程度を実現できており,提案ロータ構造の有用性を実験的に確認することができた.本研究では,研究代表者が考案したSRモータの新しい理論,および,それに基づいたトルクリップルと電源電流リップルを除去する新しい駆動方法の妥当性を検証する.さらに,その駆動方法に関する最適モータ設計手法を確立する.当該年度では,本研究の基とするスイッチドリラクタンスモータ(以降,SRモータ)の理論の妥当性を実機にて確認する.この目的のため,研究代表者は,以下の2項目に取り組み,下記の成果を得た.1.SRモータ評価ベンチの構築理論の妥当性を実機において評価できるようにするため,市販のSRモータを用いてSRモータ評価ベンチを構築した.ベンチで使用するSRモータの最大出力は2kWである.EVやPHV等の出力が数十kW程度であることを考慮すると,本評価ベンチは1/10程度のダウンサイズモデルであり,実験室内で運用できる小型ベンチながらEVやPHVと大きく出力が食い違わないことから,本研究を進めるのに適したベンチを構築できた.なお,本ベンチには,本助成によって購入した瞬時トルク計を備えており,提案する新理論の妥当性を検証するために用いることができるようにした.2.提案する解析力学に基づいたSRモータ理論の妥当性検証モータの特性を電気角・電流に対するインダクタンスの特性として表現する通常のモータ理論とは異なり,提案する解析力学によるモータ理論は電気角および磁束に対する磁気抵抗特性を用いる.提案理論の妥当性を確認すため,まず本研究で構築した評価ベンチを用いて提案理論によるモータの解析モデルを構築した.さらに,評価ベンチで動作させたSRモータの瞬時トルク波形と通電電流波形を計測し,構築した解析モデルを用いて予測した波形と整合することを確認した.以上により,提案するモータ理論の妥当性を確認できた.平成27年度の計画では,提案駆動法が基づく理論として研究代表者が構築した解析力学によるSRモータ理論の妥当性を実機にて実証することが目標である.当該年度において,実機評価を可能とするSRモータ評価ベンチを構築でき,さらにこのベンチを用いることで提案するSRモータ理論の妥当性も確認することができた.本成果については,当初の計画通り学会発表が確定している.本研究成果に関する学術論文化は,学会発表の後を計画しており,今後の実施項目となるが,学術的内容については当初の計画を満足しており,おおむね順調に進展していると結論付けた.本研究では,研究実施者が考案したSRモータの新しい理論,および,それに基づいたトルクリプルと電源電流リプルを除去する新しい駆動方法の妥当性を検証する.さらに,その駆動方法に関する最適モータ設計手法を確立する.当該年度では,トルクリプルと電源電流の両方を除去可能な新しいSRモータ駆動方法の基礎理論を導出し,その妥当性を市販のSRモータを用いたモータ評価ベンチ上で確認することが目的である.この目的のため,申請者は以下の項目に取り組み,下記の成果を得ることができた.1.SRモータ評価テストベンチの改良:前年度試作したテストベンチでは,機械振動が大きく,実動作に近い回転速度を出せなかった.そこで,ベンチの機械的強度を増すよう改良し,1500rpmの回転速度で評価できるようになった.2.トルクリプルと電源電流リプルの両方を除去する駆動法の理論導出:前年度開発したモータの解析力学モデルを用いて理論的にトルクリプルと電源電流リプルを分析し,この両方のリプルを同時に除去できるモータ駆動方法を定式化できた.理論的に定式化することに成功したため,どのようなSRモータでもモータ特性から提案する駆動方法が実現できるようになった.3.提案駆動法によるトルクリプルと電源電流リプルの除去の実証:上記の駆動方法の妥当性を実証すべく,モータ評価ベンチを用いて,SRモータの実動作において提案駆動方法のトルクリプルと電源電流リップルを評価した.その結果,従来のSRモータ駆動方法に比べて,トルクリプルと電源電流リプルの両方とも,提案駆動方法により低減できることを実証できた.平成28年度の計画では,提案駆動法を実際に構築し,実際にトルクリプルと電源電流リプルが除去できることをSRモータの実機において実証することが目的である.

当該年度では,実際に平成27年度の解析力学モデルを用いてトルクリプルと電源電流リプルの両方を同時に除去できることを実機において確認することができている.さらに,当該年度ではこれらの成果を国際学会にて発表しており,この点でも順調に研究を進めている.学術論文については,現在,遅ればせながら執筆を進めており,おおむね順調に進展していると結論付けた.平成28年度では,当初の期待通り提案するSRM駆動方法によってトルクリプルと電源電流リプルの両方とも従来駆動方法より低減できることがあきらかとなった.しかしながら,その一方で,提案駆動方法は当初より懸念していた通り,駆動に必要な電流が大きく,モータの銅損が顕著に増大する懸念があることが明らかとなった.その問題の解決策として,当該年度では,提案駆動法のよる駆動電流を小さくするようなSRモータ構造を明らかにすることが目的である.この目的のため,申請者は以下の項目に取り組み,下記の成果を得ることができた.1.駆動電流を最小にするSRモータのインダクタ特性の算出:申請者が依然に開発した解析力学によるモータ解析手法を用いて理論解析を行った結果,駆動電流を最小にするインダクタ要件を定式的に導出することに成功した.本成果は当該年度にて学会で報告した.2.算出したインダクタンス特性を有するSRモータ構造の解明:算出したインダクタンス特性を実現するため,SRモータのロータ構造とインダクタンス特性との関係を,電磁界シミュレーションを用いて調べた.その結果,求めるインダクタンス特性をほぼ実現できるロータ構造を求めることに成功した.3.新しいSRモータ構造の試作品作成:平成30年度の性能評価に向け,解明されたロータ構造を実際に試作し,現有のSRモータに搭載させたうえでモータベンチに組み込むことができた.平成30年度は,本モータの性能評価を通じて提案駆動方法が実用的にSRモータに適用できることを実証する予定である.平成27年度は,解析力学モデルを用いてトルクリプルと電源電流リプルの両方を同時に除去できることを原理的に確認することができている.平成28年度では,実機のSRモータを用いて, SRモータの実動作においてトルクリプルと電源電流リプルの両方とも,提案駆動方法により低減できることを実証できている.両年とも当初計画の通りの進捗である.さらに,平成29年についても,当初計画で示した通り,提案駆動法をより有効に用いるために適切なモータ構造を開発することができ,順調に研究を進めることができた.たしかに学術論文は当初想定より遅れているが,論文に必要な技術的成果は既にある程度そろっていることから,おおむね順調に進展していると結論付けた.本研究の目的は,環境にやさしい移動システムとして普及している電動自動車に対し,レアアースを用いなくとも高出力が得られるSRモータを用いた実用的な駆動システムを提供することにある.
大学での英語による専門授業(EMI)における国際英語(ELF)の学びの方法論

大学での英語による専門授業(EMI)における国際英語(ELF/EIL)の学びの方法論の開発を目的として、研究代表者及び連携研究者のEMIクラスにおけるアクション・リサーチ、そして他の教員のEMIクラスの観察に基づく分析等を実施した。その成果のひとつは、さまざまな国籍の留学生が受講する研究代表者(日野信行)の大阪大学大学院授業における実践を通じて創出した、OSGD(Observed Small Group Discussion)と呼ぶ授業活動である。このOSGDは、ELFのためのCLIL、つまり専門科目の内容と国際英語を同時に学ぶアプローチ(本研究ではCELFILと名づけている)における手法として考案したものである。1組のスモール・グループ・ディスカッションを他の受講生全員と教員が観察し、続いて全体ディスカッションを行う中で、スモール・グループ・ディスカッションの内容及びそこで用いられているコミュニケーション方略について検討するという形をとる。専門科目の内容に関する理解を深めるとともに、accommodation(適応)やnegotiation of meaning(意味交渉)など国際英語でのコミュニケーションにおいて重要となる技能を学ぶ方法として考案・実践し、検証を行っている。その他の成果としてはたとえば、他教員のEMIクラスの分析を通じ、通常想定される留学生が多数参加するタイプのEMIクラスだけでなく、教員及び受講生の全員が日本人であるようなタイプのEMIクラスにおいても、教員の英語が学生にとっての国際英語の産出モデルとして機能しうるという点で、EMI授業は国際英語の学びにおける意義を有することを示した。この考察において、中国でのELF学会及びトルコでのIAWE学会における他国のEMI研究者との議論は非常に貴重であった。これらの成果の研究発表の実績は別記の通りである。研究代表者及び連携研究者のEMI授業におけるアクション・リサーチは当初の目標通り進展しており、データの収集も予定通り進んでいる。大学でのEMI授業における国際英語(ELF/EIL)の学びの方法のひとつとして、たとえばOSGD (Observed Small Group Discussion)という授業活動を考案・実施し、その具体的な検証に入っている。他の教員のEMI授業の分析も予定通り実施しており、それを通じて、たとえばオーセンティックなELF環境の意義や、スモール・グループ・ディスカッションの構成方法等に関する知見を得ている。ただし、分析することができた他教員のEMI授業事例はまだ比較的少ないので、この面を今後強化していきたい。研究成果の中間発表は、予定通り、全国英語教育学会全国大会(招待講演)、International Conference on English Education(台湾、招待講演)、ELF大会(中国)、IAWE大会(トルコ)で行い、各国のEMI研究者から貴重なフィードバックを得ている。特に、国際英語におけるいわゆるExpanding Circle、すなわち日本と同様に英語の国内使用が限られている国々の研究者との意見交換からは特に有益な視座を獲得するに至っている。また、現時点での成果の出版としては、研究代表者による論文1本を出版したほか、国際学術出版であるSpringer社発行予定の学術書の章及びMultilingual Matters社発行予定の学術書の章として、本研究のここまでの成果を含む、研究代表者による2編の原稿を執筆し、それぞれに提出済みである。全体としては、おおむね順調に進展していると言える。高等教育で専門科目を英語で教えるEMI授業において、専門科目の内容と同時に、母語話者の言語文化の枠を超えた国際英語(ELF)を習得するための方法論の構築に引き続き努め、当該の教授法の具体像を描いた。この中で、CLILの理念の援用により本研究で提唱するCELFIL (Content and English as a Lingua Franca Integrated Learning)の教授法について、Anthonyの枠組みであるApproach・Method・Techniqueの形で描出した。たとえば、CELFILの手法の一環として提案したOSGD (Observed Small Group Discussion)の詳細な手順とその意義について明らかにした。ダイナミックかつ流動的なELFのインタラクションにおけるコミュニケーション能力を、EMI授業において効果的に習得するための方法である。多様な大学における多様な学問分野のEMI授業の観察と分析のフィールドワークを行い、CELFILに関し、いくつかの重要な原理を抽出した。当該年度は、前年度の課題として残った「言語学・文学・教育学以外の学問分野のEMI授業の観察と分析」をも実現することができ、貴重なデータを収集した。大学において工学・数学・経営学・美術史などを英語で教えるクラスである。これにより、分野ごとの学問的性質や教育的伝統に応じた教育法、及び個々の分野に依存しない普遍的な側面について考察することができた。EMI授業において国際英語(ELF)の能力を養うメソッドとしてのCELFILについて、具体的に記述する作業を進展させることができた。全体として、おおむね順調に進展していると言える。本年度も、昨年度に引き続き、経営学等のEMI授業の分析に加え、英語非母語話者の外国人留学生と日本人学生が共に学ぶ研究代表者の大阪大学大学院でのEMI授業等において、受講生アンケート・受講生インタビュー・授業撮影等によるアクション・リサーチを行い、CELFILの具体的な方法について考察した。ELFにおける相互行為能力の養成を目的としたOSGD (Observed Small Group Discussion)という活動を含む方法論である。そして、Richards & Rodgers (1982, 2014)のApproach・Design・Procedureの枠組みをCELFILに適用し、体系的に描出した。今回の科研の成果の一部は、本年度(最終年度)末の3月に、それ以前の科研の成果等とも合わせ、世界的に高い権威を有する国際学術出版社Routledge(英国)からの単著EIL Education for the ExpandingCircleの出版という理想的な形で結実した。研究代表者及び連携研究者の授業におけるアクションリサーチを継続する。

この取り組みにおいては、国際学会で各国のEMI研究者から得たフィードバックを参考に、研究代表者のIPTEIL授業(リアルタイムの英語ニュースの内容について比較検討する授業)も広義のEMI授業として考察の対象に本格的に加えることとする。また、これまでのアクションリサーチで得たデータの分析を深める。さらに、他のEMI教員の授業の分析を進める。ここまでの作業では、言語・文化・文学に属する分野のEMI授業が中心であったが、今後は他の学問分野のEMI授業の分析の機会の確保にいっそうつとめ、各分野のEMI授業の特徴に合った学びの方法論の提示に向けての作業を続ける。研究成果の口頭発表については、現在すでに確定しているものとして、第9回ELF学会(スペイン)における研究代表者と連携研究者の共同発表、及びEILシンポジウム(米国)での研究代表者による発表が決定している。また研究成果の出版としては、今後、「現在までの進捗状況」で触れたものに加え、やはり国際出版としてのRoutledge社の学術書の章として研究代表者が1編を執筆することが内定している。ELF・EMI・CLILに関する欧州及びアジアでの先行研究の精査、さまざまな学問分野におけるEMI授業の観察と分析、研究代表者のEMIクラスにおけるCELFILのアクションリサーチ等を継続する。CELFILの具体的内容については、ここまでの本プロジェクトではAnthonyによる古典的枠組であるApproach・Method・Techniqueを用いており、これは狭義における教授法を理論的に記述するのに適しているが、実際の授業での実践に供するためにはシラバスや教材その他の側面も含めて教育方法を総体的に記述するApproach・Design・Procedure (Richards and Rodgersによる枠組)が適しており、今後は発展的にこの後者の枠組に移行し、CELFILの全体像を明らかにしていく。「国際英語」教育パソコン1台の購入を当初予定していたが、OSの動向やソフトウェアとの適合性等の要因を最新情勢に基づいて分析した結果、本研究に最適の機種を入手するために、パソコンの購入は延期した。EMI授業の観察及び資料収集のために10万円をやや超える旅費の不足が見込まれたため、前倒し請求を行ったが、前倒し請求は10万円単位のため、20万円を前倒し請求することとなり、結果として次年度使用額が生じた。
輪状甲状関節の回転、滑走、上下運動の高分解能MRI観測

歌声や発話に関わる声の高さの調節には声帯の長さと張力が深く関わっており、声を高くする際には甲状軟骨の声帯付着部と輪状軟骨の声帯付着部が互いに離れる方向へ運動が生じている。この変化は輪状甲状関節の運動によることが知られているが、この関節運動が回転運動のみなのか、滑走運動も行っているのかについては一致した見解が得られていなかった。また上下方向の滑走運動により声の高さに影響を与えるという理論モデルもあるが、実際の計測結果の報告はない。これまでに輪状甲状関節の運動を詳細に調べるために、MRIを用いて十分な解像度を得られるように撮像装置の改良や撮像方法の開発を行ってきた。本年度は特に3次元パターンマッチングプログラムを作成し、得られたMRIデータから半自動的に正確な位置を推定した。その結果、甲状軟骨はhighでは上方への移動に加え、前方への移動が見られ、また左右方向への移動回転も確認された。輪状軟骨はhighで上昇し、後方への回転に加え、後方への移動も見られた。輪状甲状関節の上下の滑走は0.5mm以下と小さく、前後方向の滑走に比べると影響は小さいと考えられる。前後方向の滑走には左右差が見られ、最大約1.2mmの運動が確認された。以上の結果から、関節の滑走が起こらないとする従来の報告と異なり、中音域における輪状甲状関節の運動は、輪状軟骨の回転と滑走からなると考えられた。これらの結果をMaveba2005において発表した。今後は被験者の数および発声の範囲を増やして関節運動を計測し、、雑誌論文に投稿する予定である。声の高さの調節には声帯の長さと張力が深く関わっており、声を高くする際には甲状軟骨の声帯付着部と輪状軟骨の声帯付着部が互いに離れる方向へ運動が生じる。この変化は輪状甲状関節の運動によることが知られているが、この関節運動が回転運動のみなのか、滑走運動も行っているのかについては一致した見解が得られていない。そこで輪状甲状関節の運動を詳細に調べるために、MRIを用いて十分な解像度を得られるように撮像装置の改良や撮像方法の開発を行っている。MRIは体内の器官を可視化するために利用されてきたが、喉頭を対象とする場合、撮像に時間がかかるために呼吸運動によるアーチファクトを生じたり、撮像対象が小さいために十分な解像度とS/N比が得られないという問題があった。これらを解決する方法として、小型アンテナを用いた喉頭用高感度コイルを試作し、発声時のみの撮像を行う発声同期撮像法を開発してきた。今年度は高分解能三次元撮像法を応用することによって、従来の2mm厚の撮像から1mm厚の撮像に成功した。これらの手法を用い、2段階(lowとhigh)の声の高さで持続発声したときの甲状軟骨および輪状軟骨の運動を記録した結果より3次元CGアニメーションを作成し、日本喉頭科学会において発表した。Lowとhighの画像を比較すると、甲状軟骨はhighで上昇していたが回転はともなわなかった。輪状軟骨はhighで上昇し、後方への回転が見られた。輪状甲状関節の相対運動はhighで約5度の回転、および約1.25mmの滑走であった。今後はより詳細な関節運動を計測し、滑走運動をもたらす筋機能について検討を行う予定である。
精子形成におけるBCL6の機能解析

転写抑制因子Bcl6を欠損させた、ノックアウトマウス(Bcl6-/-)の雄が不妊であったことから、Bcl6が造精過程において重要な機能を果たしている可能性があると考え、Bcl6-/-の造精機能異常について解析を行った。まず、正常マウスの精巣を解析し、精母細胞から精子細胞の核Bcl6を同定した。Bcl6-/-の精巣は、ほぼ正常に発育し成熟精子も形成されるが、精細管に多数の変性精細胞が認められ、TUNNEL法にてBcl6-/-の減数分裂中期の細胞に多くのアポトーシス細胞が存在することが明らかになった。また、アポトーシス細胞の数は週令に比例して増加することがわかった。以上から、Bcl6が欠損することにより、何らかのストレスに対して精細胞がアポトーシスに陥り易くなっている可能性が示唆された。一般に、熱などのストレスを与えるとヒトにおいても精細胞がアポトーシスを起こすことが知られている。そこで、熱ストレスをマウスの精巣に投与したところ、正常マウスでは減数分裂中期の精母細胞のTUNEL陽性細胞(アポトーシス細胞)の数が著明に増加したが、Bcl6-/-ではストレス投与前に比較し、その数に変化はなかった。また、正常マウスでは熱ストレスの投与後に精細胞においてストレス反応性に活性化されるp38-MAPKのリン酸化を認めたが、Bcl6-/-では非ストレス下において、すでにp38-MAPKがリン酸化していることが判明した。Bcl6は減数分裂前後の精細胞に発現し、熱などのストレスに対して弱いサブセットである減数分裂中期の細胞が正常な状態で細胞死に陥るのを防御している役割を果たしていると思われる。また、ヒトの精巣においても精子細胞の核にBcl6の発現を認めたことから、ヒトにおいても造精機能に重要な役割を果たしている可能性があると考えた。ヒトB細胞リンフォーマにみられる染色体転座部位から単離されたBcl6のノックアウトマウス(Bcl6-/-)の雄が不妊傾向にあったことから、Bcl6が造精過程において重要な機能を果たしている可能性があると考え、Bcl6-/-の造精機能異常について解析を行った。正常マウス精巣におけるBcl6の発現部位を免疫染色で同定したところ、Bcl6蛋白は正常マウスの精母細胞から精子細胞の核に発現を認めた。12週令のBcl6-/-の精巣は正常マウスと同様に分化し精子の発育も認められたが、変性した精母細胞を多数の認めた。TUNEL法でアポトーシスを観察したところ、正常マウスではTUNEL陽性細胞は殆ど認められないが、Bcl6-/-では減数分裂中期の精母細胞に多数のアポトーシス細胞を認めた。さらに、免疫染色にて、それらの精母細胞はBax蛋白を強発現していることがわかった。以上の結果より、Bcl6-/-の精細胞は正常に分化するも減数分裂中期の脆弱な細胞が主にアポトーシスを起こすことから、ストレスによる精細胞死が起きている可能性が示唆された。そこで、正常マウスの精巣に42度の熱ストレスを与え、アポトーシス細胞の出現頻度をTUNEL法にて、また、ストレス反応性蛋白であるp38の活性化をwestern blot法と免役染色法にて検討したところ、減数分裂中期の精母細胞に多数のアポトーシス細胞が熱処理後6時間で認められ、また、熱処理後30分から1時間後にp38の活性化が認められた。これらの所見は生理的状態下におけるBcl6-/-の所見とほぼ同様であることから、Bcl6は減数分裂前後の精細胞に発現し、熱などのストレスに対して弱いサブセットである減数分裂中期の精母細胞が生理的な状態でアポトーシスに陥るのを防御している役割を果たしていると考えた。
炎症応答を調節する新規miRNAおよび分子の機能解析

我々は、炎症応答に関与する新規のmiRNAおよび分子を見つけている。新規分子TRIM39Rが実際に免疫応答に関与するかを調べるために、培養細胞を用いた2つの過剰発現系を樹立し、マイクロアレイ解析を行った。結果として、有意にI型インターフェロン経路およびその抗ウィルス効果に関与する遺伝子群を制御していることが明らかとなった。さらに、ルシフェラーゼを用いたリポーターアッセイにより、実際にNFkBおよびIRFの転写活性を惹起させることが確認できた。miRNAに関しては、新規mir-125bおよびその標的が典型的な作用機序で機能することをルシフェラーゼアッセイと変異体を用いて証明できた。本年度は、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析より、炎症応答を制御する新規分子としてTRIM39を同定することに成功した。加えて、この遺伝子の複数存在する転写産物の内、培養細胞を用いた過剰発現系を樹立し、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行なったところ、TRIM39RがI型インターフェロン応答とそれに付随する抗ウィルス応答を惹起することを明らかとした。この成果は、国際誌Biochemical and Biophysical Research Communicationsにて公表することができた。また、国際的な学術会議、15th International Congress of Immunologyおよび第36回日本分子生物学会年会にても研究成果を発表することができた。miRNAに関しても同様に、研究成果を国際的な学術会議、15th International Congress of Immunologyでは、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたハイスループットスクリーニングによる標的mRNAの同定につてい、また、第36回日本分子生物学会年会にてもmiRNAの網羅的発現解析について、研究成果を発表することができた。本年度は、さらに、T細胞の応答にこれらの分子がどのように関与するかを検討する。初代培養T細胞へは、レトロウィルスを用いて遺伝子導入および抑制する予定であり、実験を遂行するのに必要なコンストラクトは既に完成済みである。本年度は、新規分子TRIM39Rの機能解析を行った。この遺伝子の発現がT細胞およびB細胞で高いことを見出したので、前年度に構築したレトロウィルスベクターを用いてTRIM39Rの過剰発現系の樹立を行った。初代培養B細胞への導入を行った。しかしながら、IgM抗体で刺激しても導入効率はあがらなかったので、in vitro germinal centre (iGB)細胞を用いて、導入効率を上げることに成功した。レトロウィルスベクターにはIRES-EGFPが組み込まれているので、ウィルス感染細胞をソーティングにより濃縮し、回収し、RNAを抽出して、現在、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行っている。B細胞におけるTRIM39Rの制御する生物学的パスウェイおよび標的分子を同定することが期待できる。この成果は、最終年度に、学術雑誌に投稿する予定である。一方、T細胞においてもレトロウィルスベクターを用いて過剰発現系を樹立を試みたが、TCR刺激によって導入効率を上げようと試みたが、十分に上げれずソーティングで得られる細胞数も少なかった。最終年度には、T細胞においても過剰発現系を樹立し、マイクロアレイ解析を行い、学術論文に成果を報告する。miRNAおよびTRIM39遺伝子欠損マウス作成のためにCRISPR/hCas9の系を樹立し、gRNA発現ベクターを作製した。昨年度、マウスin vitro germinal center (GB)細胞の系を用いて、B細胞へレトロウィルスを介してTRIM39Rを導入し過剰発現系を樹立することに成功した。構築したベクターは、pMX-hTRIM39R-V5-IRES-EGFPであり、EGFPを指標にして、遺伝子導入された細胞だけを濃縮して、マイクロアレイ解析を行った。hTRIM39Rを導入したマウスB細胞は細胞死を起こしていると予測され、コントロールに比べ明らかに細胞数が減少していた。マイクロアレイにおいて、2倍以上発現変化している遺伝子群に細胞死に関与する遺伝子も多数含まれていた。また、炎症を負に制御する遺伝子の発現減少も見られた。しかしながら、統計的に優位な生物学的パスウェイの抽出には至らなかった。現在、抽出できた遺伝子の変化をqPCRで確認し、論文を作成しているところである。また、TRIM39Rの炎症を惹起する分子機序を検討するために、ドメイン欠損体を作製した。欠損させたドメインはB-Box, RING, Coiled-coilおよびPRYSPYであり、各ドメインをTRIM39BおよびTRIM39Rにてベクターを構築した。NFκBおよびIRF応答領域にルシフェラーゼを連結したレポーターコンストラクトを新たに樹立した。細胞へ導入し、LPSまたはIFNβを添加することにより転写活性上昇が確認できた。今後、各ドメイン欠損体を用いて、炎症惹起に必須のドメインおよび分子機序を同定していく。前年度に樹立したレトロウィルスベクターを用いて、初代培養B細胞を用いた過剰発現系の樹立に成功し、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルの取得が完了しており、解析結果を、最終年度に学術雑誌に報告できる。

また、遺伝子欠損マウスの作製もCRISPR/hCas9の系の樹立に成功したので、迅速に作製することが可能である。分子生物学初代培養T細胞においても、B細胞同様にTRIM39Rの過剰発現系の樹立を試みる。T細胞においてもマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、T細胞でのTRIM39Rの機能を検証する。解析結果は、学術雑誌にて報告する。また、Crispr/hCas9を用いて、miRNAまたはTRIM39遺伝子欠損マウスの作製を試みる。マウスの表現型解析も進め、成果を報告するように進める。マイクロアレイにより単離した炎症を制御する新規分子の検証を行なった。T細胞にて遺伝子過剰発現系を樹立する予定であったが、Neonによる遺伝子導入がT細胞では、効率が悪く、樹立することができなかった。しかしながら、上皮細胞で過剰発現系が樹立できたので、網羅的遺伝子発現解析を行い、生物学的パスウェイを抽出することに成功した。結果として、I型インターフェロンおよび抗ウィルス応答を有意に惹起することが明らかとなった。今後、T細胞における過剰発現系と発現抑制系は、レトロウィルスを用いて、行なう予定である。次年度のmiRNAの標的分子の同定についてもルシフェラーゼを用いたハイスループットスクリーニングを予定しており、研究成果について、国際会議で発表することができた。今後は、レトロウィルスを用いて、新規分子であるTRIM39Rを初代培養T細胞へ導入することを試みる。過剰発現および発現抑制系を樹立し、その際のT細胞のエフェクター機能等を検討する。サイトカインについてはELISAによって検討する。また、膜抗原に関しては、FACSによって検討する。過剰発現系を樹立後、免疫沈降法と質量分析装置を用いて、相互作用するタンパク質を同定する。TRIM39Rはユビキチンリガーゼであるので、ユビキチン化等も検討する。miRNAに関しては、ルシフェラーゼを用いたハイスループットスクリーニングによって標的mRNAの同定を試みる。次年度に予定している遺伝子改変マウス作成のためのコンストラクトを作成する。TRIM39Rに関しても遺伝子導入マウスやTRIM39遺伝子欠損マウスの作製を予定している。樹立した遺伝子改変マウスを用いて、T細胞依存的な病態モデルを検討し、自己免疫病態への関与を検討する。病態形成に差が出た場合は、T細胞サブセットへの分化や抗原提示時に及ぼす効果を検討する。研究成果を纏めて、国際的な学術雑誌に成果を発表することを目指す。