hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属化学種の付加による有機金属種の触媒的生成を鍵とする交差カップリング反応の開発

クロスカップリング反応は今日の有機合成化学に革新をもたらした炭素ー炭素結合形成手法であるが,通常,事前調製した化学量論量の有機金属反応剤を必要とするため,多段階操作を必要としたり,有機金属反応剤由来の金属塩が副生する問題がある。本研究では,銅化学種のアルケンまたはアルキンへの付加により触媒的に生じるアルキル銅またはアルケニル銅を利用するクロスカップリング反応の開発を行った。その結果,アルケンまたはアルキンのヒドロアリール化,カルボホウ素化,およびカルボアリル化反応の開発に成功した。これら反応は,入手容易な出発原料から単工程で,高度に官能基化されたアルカンやアルケンを合成できるため有用である。本研究課題では,金属化学種の不飽和化合物への付加による有機金属種の触媒的生成を鍵とする交差カップリング反応の開発を目的としている。本年度は,付加化学種として銅ヒドリドおよびボリル銅を用いた反応の開発を行った。その結果,パラジウム/銅協働触媒によるアルケンおよびアルキンのヒドロアリール化反応,アルケンのアリールホウ素化反応の開発に成功した。詳細は以下の通りである。アルキルおよびアルケニル有機金属反応剤を用いる交差カップリング反応は,ハロゲン化アリールのアルキル化およびアルケニル化反応として重要である。一般的に,アルケンおよびアルキンのヒドロメタル化によって事前調製した有機金属反応剤を用いて反応を行うため,ステップエコノミーの点で問題があった。一方,本年度開発したパラジウム/銅協働触媒によるヒドロアリール化反応は,系中で銅ヒドリドのアルケンおよびアルキンへの付加により触媒的に生成する有機金属種を用いるため,ステップエコノミーの点で優れた反応である。また,本手法を用いることにより,生理活性物質の合成も達成した。アルケンのカルボホウ素化反応は入手容易なアルケンから複雑なアルキルホウ素化合物を得る強力な手法である。しかしながら,既存の反応は大部分が分子内反応であり,分子間反応は高反応性の基質を用いた例に限られていた。本年度開発したパラジウム/銅協働触媒によるアルケンのアリールホウ素化反応は,安定で入手容易なビスピナコラートジボロンおよびハロゲン化アリールを用いたアルケンの分子間アリールホウ素化反応であり,その重要性は高い。さらに,本反応を用いた生理活性物質の短工程合成にも成功した。本研究課題は,金属化学種の炭素ー炭素不飽和結合への付加による有機金属反応剤の触媒的生成を鍵とする交差カップリング反応の開発を目的としている。本年度は,ヒドロシランを還元剤として用いたパラジウム/銅協働触媒によるアルケンのヒドロアリール化反応に関する反応機構解析を行った。また,水素を還元剤とするパラジウム/銅協働触媒によるアルキンのヒドロアリール化反応および,パラジウム/銅協働触媒によるアルキンのアリールホウ素化反応の開発に成功した。前年度に開発したヒドロシランを還元剤とするパラジウム/銅協働触媒によるアルケンのヒドロアリール化反応における反応機構解析を実験および計算化学を用いて行った。その結果,本反応の鍵となるアリールパラジウム種とアルキル銅のトランスメタル化が,3配位のアリールパラジウム種を経て進行することを明らかにした。さらに,アルキル銅上のアルキル基が立体反転を伴いながらアリールパラジウム種にトランスメタル化することも明らかにした。上述のヒドロシランを用いるヒドロアリール化は,ステップ効率には優れているがヒドロシランを還元剤に用いる点で,原子効率には改善の余地があった。本年度開発した水素を還元剤とするパラジウム/銅協働触媒によるアルキンのヒドロアリール化反応は,典型金属反応剤を全く用いないため,ステップ効率および原子効率に優れた有用な反応である。アルキンのアリールホウ素化反応は,多置換アルケンを入手容易なアルキンから合成する有用な反応である。しかしながら,既存の系では反応性の高いヨウ化アリールやクロロボランが必要であった。本年度開発したアリールホウ素化反応は,入手および取扱いの容易な塩化アリールおよびビスピナコラートジボロンを出発原料として用いるため有用である。本年度は,水素を還元剤とするアルキンのヒドロアリール化反応およびアルキンのアリールホウ素化反応の開発を目標としていた。いずれの反応の開発も順調に進行しており,現在論文執筆中である。以上の点から,本年度の計画はおおむね順調に進展していると判断した。本年度は,ヒドロアリール化およびアリールホウ素化反応を環境調和型の反応へと発展させることを目的として検討を行なった。その結果,パラジウム/銅協働触媒による水素を還元剤とするヨウ化アリールとアルキンの還元的クロスカップリング反応とニッケル/銅協働触媒によるアルケンのアリールホウ素化反応の開発に成功した。前年度に予備的に見出していたパラジウム/銅協働触媒による水素を還元剤とするヨウ化アリールとアルキンの還元的クロスカップリング反応における反応条件の最適化を行い,得られた最適条件のもとヨウ化アリールおよびアルキンの基質適用範囲を調査した。その結果,本触媒系は種々のジアリールアセチレン誘導体に適用可能であり,様々なトリアリールエテンが中程度から良好な収率で得られた。アルケンのアリールホウ素化反応に関しては,これまで用いていたレアメタルのパラジウム触媒をベースメタルのニッケル触媒へと置き換えることに成功した。

さらに,これまでは5.0 mol%必要であった銅の触媒量を1.0 mol%まで低減することにも成功した。本ニッケル/銅協働触媒系を用いることで,これまでに開発したパラジウム/銅協働触媒では適用できなかった,フェノール誘導体のp-トルエンスルホン酸アリールを求電子剤として用いることが可能となった。フェノール誘導体は豊富に存在し,ハロゲン含有の副生成物を排出しないより低環境負荷な求電子剤である。本年度は,これまでに開発したヒドロアリール化およびカルボホウ素化反応を環境調和型の反応へと発展させることを目的としていた。ヒドロアリール化に関しては,これまで必要であったヒドロシランを水素に置き換えることができたため,原子効率の面で大きな改善に成功した。カルボホウ素化反応に関してはレアメタルであるパラジウム触媒をベースメタルであるニッケル触媒に置き換え,また求電子剤の臭化アリールをフェノール誘導体であるp-トルエンスルホン酸アリールへと置き換えることで,低環境負荷な反応へと発展させることに成功した。以上の理由により,本年度の研究は概ね順調に進展したと判断した。本研究では,金属化学種の付加による有機金属種の触媒的生成を鍵とする交差カップリング反応の開発を目的として研究を行った。本反応は,典型的な交差カップリング反応で必要であった事前調製された化学量論量の有機金属反応剤を必要としないため,ステップ効率に優れる有用な手法である。これまでの研究において,銅ヒドリドおよびボリル銅のアルケンおよびアルキンへの付加による有機銅種の触媒的生成に基づく,アルケンおよびアルキンのヒドロアリール化反応およびアリールホウ素化反応の開発に成功した。これらはいずれもステップ効率に優れた反応である。また,本アリールホウ素化反応は本手法を用いて初めて実現された変換反応であり,関連分野に大きな影響を与えた。本年度は,前年度までに見出した水素を還元剤とするパラジウム/銅協働触媒によるヨウ化アリールとアルキンの還元的クロスカップリング反応の開発を行った。基質適用範囲の調査を行ったところ,本系は内部アルキンにのみ適用可能であり,末端アルキンや他の不飽和化合物には適用できなかった。反応機構に関する研究を行ったところ,従来予想していた機構ではなく,アリールパラジウムのアルキンへの付加を経る機構を示唆する結果が得られた。これら研究の成果は,国際学術論文誌に速報として発表した。前年度に新たに見出した,パラジウム/銅協働触媒による電子不足アルケンのカルボアリル化反応については,基質適用範囲の調査を完了した。クロスカップリング反応は今日の有機合成化学に革新をもたらした炭素ー炭素結合形成手法であるが,通常,事前調製した化学量論量の有機金属反応剤を必要とするため,多段階操作を必要としたり,有機金属反応剤由来の金属塩が副生する問題がある。本研究では,銅化学種のアルケンまたはアルキンへの付加により触媒的に生じるアルキル銅またはアルケニル銅を利用するクロスカップリング反応の開発を行った。その結果,アルケンまたはアルキンのヒドロアリール化,カルボホウ素化,およびカルボアリル化反応の開発に成功した。
複雑流体における個別運動と臨界現象・相分離現象

これまで、高分子溶液等の流体系における相分離様式は、流体モデルにより例外なく記述されると信じられてきた。しかし我々は、系を構成する2種類の分子の動的性質が著しく異なる場合において、粗大化を伴わない安定な粒子状相分離や、ネットワーク構造の形成などといった流体モデルでは記述できない現象を発見し、それを粘弾性相分離現象と名付けた。また、高分子溶液のみならず、ガラス転移温度が大きく異なる高分子混合系においても、同様の相分離現象を見出し、この現象が普遍的なものであることを指摘した。本研究では高分子溶液系の臨界点近傍における臨界挙動、粘性異常に注目し、臨界揺らぎに対する粘弾性効果について明らかにしたい。また、粘弾性効果を取り入れた相分離現象の数値シミュレーションを行い粘弾性相分離を支配する物理的因子についての理解を深めることを目的とする。本研究では、当初の予定どおり、以下の様に研究を進めた。(1)高分子溶液系の臨界減速・粘性異常の実験的研究:高分子溶液(主にPS/DEM)系における、臨界点近傍での臨界減速や粘性異常の測定を、特に分子量依存性に着目して行なった。臨界減速は、準弾性光散乱を中心に測定した。この動的光散乱による濃度揺らぎの周波数依存性・波数依存性の測定に加え、レオメータによる粘性異常を測定することで、高分子溶液系における、物質固有の緩和モードと臨界緩和モードの関係を定量的に明らかにした。(2)粘弾性相分離現象の数値シミュレーション:粘弾性相分離を記述する基本方程式は、土井・小貫等によって既に得られている。我々はこれらの式を、数値的に解くことで、粘弾性相分離の発現に必要な要因を明らかにした。これまで粘弾性相分離を実験的に研究してきた我々が、独自の視点で数値シミュレーションを行い、観測された様々な現象を理論的に再現することにより、粘弾性相分離のメカニズムに対する新しい視点を構築することができたと考えている。
昆虫の脳の高次中枢における記憶形成の神経機構

本研究ではゴキブリのキノコ体ニューロンの活動と場所記憶の形成との関係を解析し、昆虫の脳における場所記憶形成の神経機構を解明することを目標とした。1)私は以前、脳の微小破壊と場所学習行動実験によりゴキブリの脳のキノコ体が場所の記憶に関与していることを示唆したが、その結果の一部については実験が不十分ではないかとの批判があった。そこで、今回、行動実験の手順に更なる改良を加えて、その結果の再検討を行った。その結果、キノコ体が場所の記憶に関与することをより明確に示す証拠が得られた。2)ワモンゴキブリのキノコ体に極めて細い(直径14mum)銅線電極を埋め込み、自由行動中のゴキブリのキノコ体のニューロンの活動を慢性記録した。記録終了後、電極から組織中に銅イオンを注入して電極近傍のニューロンを染め出し、どのタイプのニューロンからの記録であるのかを推定した。キノコ体の入力部であるCalyxのニューロンのほとんどは感覚性であり、視覚、嗅覚、または機械覚刺激に反応した。一方、キノコ体の出力部であるLobeのニューロンの活動はゴキブリの運動と密接な関係があった。Lobe-pedunculus接合部と呼ばれる領域には、歩行の開始や、方向転換の開始に先行して発火するニューロン群が多数あった。これらのニューロンは目標地への定位運動の組み立てに関与する可能性がある。これらのニューロンの活動が場所学習訓練の前後で変化するのかを調べたが、現在までのところは明確な変化は見い出せなかった。場所記憶に直接かかわるのはキノコ体の他の種類のニューロンかもしれない。今後さらに検討を深めたい。3)キノコ体ニューロンの出力ニューロンからの細胞内記録・染色にわずか数例ではあるが成功し、現在、繰り返し感覚刺激を与えた時の応答特性の変化を解析中である。
中性子透過分光法を用いた磁性材料評価法革新のための基盤研究

中性子を用いた磁気構造解析法に支えられ既知のスピン協力現象の理解は進み,未踏の極限環境下や新物質に未知の現象を探索し,あるいは既に確立した知見を磁性材料に利用する動きが進んでいる.そこで,本研究では,この新たな潮流における磁気構造解析法のニーズに上手く応えられる手法としての,従来の回折法にはない,回折波の発生を透過波の減少で検出する中性子透過スペクトル分光法の可能性を明らかとする.中性子を用いた磁気構造解析法に支えられ既知のスピン協力現象の理解は進み,未踏の極限環境下や新物質に未知の現象を探索し,あるいは既に確立した知見を磁性材料に利用する動きが進んでいる.そこで,本研究では,この新たな潮流における磁気構造解析法のニーズに上手く応えられる手法としての,従来の回折法にはない,回折波の発生を透過波の減少で検出する中性子透過スペクトル分光法の可能性を明らかとする.
筋と骨のネットワーク機構におけるWnt-βカテニン経路阻害因子の役割の解明

加齢と共に重要度が増す骨粗鬆症とサルコペニアには共通した病態機序の存在が示唆されている。近年、筋と骨の相互作用(筋骨連関)が注目されており、骨粗鬆症とサルコペニア両者の病態への寄与が示唆されているが、その詳細は不明である。本研究課題では、骨粗鬆症とサルコペニアに共通した要因として重要なメカニカルストレスの変化により骨格筋で変動する体液性因子として、古典的Wnt-βカテニン経路の阻害因子に着目し、筋骨連関の観点から、古典的Wnt-βカテニン経路を介した骨代謝および筋量調節機構や骨粗鬆症とサルコペニアに共通した病態機序を明らかにしたい。
トランスポーターの発現・活性の制御と機能性SNPを基盤としたがん化学療法の戦略

1.当研究室は、estrogenがヒト乳がん細胞のP-gp発現が低下させることを見いだした。この機構の解明のために、cDNAマイクロアレイ解析により抽出した402遺伝子をもとに、siRNA導入によりP-gpの発現を低下させる遺伝子を検索した。その結果、CTDSP2(carboxy-terminal domain small phosphatase2)、DUSP1(dual specificity phosphatase1)、IMPA2(inositol(myo)-1(or4)-monophosphatase2)のsiRNA導入により、MCF-7/MDR細胞のP-gpの発現が大きく低下することを見いだした.これらの3遺伝子はいずれも脱リン酸化酵素をコードする遺伝子であった。2.当研究室は、MEK-ERK-RSK系の阻害により、ヒト大腸がん細胞のP-gpの発現が低下することを見いだした。新規MEK阻害薬は、数nMでSW620細胞のMEKを選択的に阻害し、またP-gpの発現を大きぐ低下させた。MEK阻害薬は、SW620細胞のMDR1 mRNA発現量を変化させなかった。このことから、MEK阻害薬は転写後の過程においてP-gpの発現を抑制していると推察された。3.マルチキナーゼ阻害薬であるsunitinibはK562/BCRP、K562/MDRのvesicleへのATP依存的なestrone sulfate、vincristineの取り込みを競合的に阻害した。sunitinibは、BCRPをより低濃度で阻害した。4.新規acrylonitrile化合物は、当研究室が同定したBCRPの5種のSNPについて、一様な阻害作用を示した。一方、sunitinibは、BCRPの膜貫通ドメインに変異を持つF431L-BCRPに対して阻害効果を示さなかった。sunitinibは、野生型BCRPへのiodoarylazidoprazosin(IAAP)の結合を顕著に減少させた。一方、BCRP-F431LへのIAAPの結合には影響しなかった。1 estrogenにより、MCF-7などのヒト乳がん細胞のP-gp発現が低下することを見いたした。この発現抑制機構の解明のために、cDNAマイクロアレイ解析により抽出した4756遺伝子をもとに、機能分類、siRNA導入、shRNA発現ベクターの導入により絞り込みを行い、最終的にshRNA発現ベクターの導入によってP-gpの発現が著明に低下する安定細胞株を得られる2遺伝子を同定した。この2遺伝子は、ubiquitin-conjugating enzymeおよび脱リン酸化酵素であった。2マルチキナーゼ阻害薬であるsunitinibは、野生型BCRP発現細胞のmitoxantrone取り込み量を増大させ、mitoxantrone耐性を低下させた.これにより、sunitinibはBCRPによる薬剤排出を阻害すると考えられた。次に、BCRPの種々の変異体を導入した細胞のSN-38耐性に対するsunitinibの効果を調べたところ、100nMのsunitinib添加により、PA/BCRPWT、PA/Q141K、PA/R482S、PA/R482G、PA/H630EのSN-38に対する耐性度は半分以下に低下したが、PA/F431LのSN-38に対する耐性度は変化しなかった。これにより、SNP型BCRPであるBCRP(F431L)はsunitinibによって阻害されないことが示された。3BCRPの二量体形成機構を解明するため、BCRPの膜外領域に存在するCvs-592、Cvs-603、Cvs-608のうち1つ、2つ、又は3つ全てをSerに置換したmutant BCRPの発現細胞を作成し、mutantBCRPの二量体形成と機能について解析した。その結果、Cys-603、Cys-608の2つがBCRPのdimer形成に関与していることが示された。CvstriDlemutant発現細胞がSN-38およびmitoxantroneに耐性を示したことから、BCRPのcovalentなdimer形成は、トランスポーターの機能に必須ではないと結論された。また、このtriple mutant発現細胞は、BCRP阻害薬のFumitremorgin Cに抵抗性を示した。

sunitinibは、BCRPをより低濃度で阻害した。4.新規acrylonitrile化合物は、当研究室が同定したBCRPの5種のSNPについて、一様な阻害作用を示した。一方、sunitinibは、BCRPの膜貫通ドメインに変異を持つF431L-BCRPに対して阻害効果を示さなかった。sunitinibは、野生型BCRPへのiodoarylazidoprazosin(IAAP)の結合を顕著に減少させた。一方、BCRP-F431LへのIAAPの結合には影響しなかった。
IgG4関連疾患の炎症の発生と収束にかかわる脂質メディエーターとそのバランス制御

多施設共同の前方視試験に登録された症例を、IgG4関連疾患診断のアルゴリズムに当てはめ、確定群、擬診群、準確診群、否定群に分けるとともに、疾患、臓器別にカテゴライズを行った。本研究の対照については、性差、年齢差の影響を考慮し、IgG4関連疾患で多くを占める5060歳代男性とし、治療前、治療後、健常人コントロールの血清それぞれ10例準備し、3群間、n=10例で、治療前・後、患者・健常人間での解析を行った。解析については、メタボロン社のライブラリーに登録された代謝物(分子量約501000の糖・アミノ酸・核酸・脂質等)を解析対象とした。解析の結果、IgG4関連疾患群では、起炎性の脂質メディエーターであるアラキドン酸(arachidonate(20:4n6)), 12-HETEが健常人群に比べ、治療前・治療後とも高い値を示した。また、その値は、ステロイド治療後でも、低下しなかった。IgG4関連疾患は、ステロイド治療により症状は著明に改善するが、ステロイド治療を中止すると高率に再発することが知られている。ステロイド治療で症状は改善しても、その根本的な原因は潜在していると考えられる。起炎性の脂質メディエーターが、IgG4関連疾患群で高値を示し、またその値は、ステロイド治療によって変動しないことから、これらの起炎性メディエーターが、IgG4関連疾患の炎症の遷延化に関連することが考えられた。この結果を踏まえ、脂肪酸代謝系の内、炎症に寄与するn-6系のアラキドン酸由来起炎性メディエーターを網羅的に解析した。IgG4関連疾患患者の治療前後、また、健常人血清を用い、IgG4関連疾患の疾患特異的に変動する代謝物群のパターン解析を行い、疾病により増減するバイオマーカー探索を行った。多価不飽和脂肪酸は、シクロオキシゲナーゼや、リポキシゲナーゼなどの酸化酵素によって活性代謝物に変換され、これらは脂質メディエーターとして様々な生体調節機能を担っている。今回の解析で、IgG4関連疾患では、アラキドン酸や12-HETEといった、いくつかの起炎性メディエーターが、健常人群に比べ高い値を示し、また、ステロイド治療後でも、その値が変動しないことを見いだした。起炎性の脂質メディエーターが、IgG4関連疾患群では高値を示し、ステロイド治療によって変動しない点は、IgG4関連疾患の持続する免疫異常により炎症が遷延するという慢性炎症性疾患の一因とも考えられる。炎症の遷延化には、炎症を促進する「起炎性脂質メディエーター」と、炎症の制御に関与する「抗炎症性脂質代謝物」のバランスとその制御が重要な役割を果たしていると考えられている。IgG4関連疾患の炎症の「発生と収束」に関わる脂質メディエーターとそのバランス制御を明らかにするため、IgG4関連疾患群で高値を示したアラキドン酸由来の起炎性および抗炎症活性を有するn-6系のアラキドン酸由来起炎性メディエーターを網羅的に解析した。現在、得られた結果をパスウエイデータベースIngenuity Pathways Analysis (IPA)に落とし込み、転写・代謝プロファイルを作成し、代謝機能による分類を行っている。本研究の対象については、性差、年齢差の影響を考慮し、IgG4関連疾患で多くを占める5060歳代男性とし、治療前、治療後、健常人コントロールの血清それぞれ10例準備し、3群間、n=10例で、治療前・後、患者・健常人間での解析を行った。

解析については、メタボロン社のライブラリーに登録された代謝物(分子量約501000の糖・アミノ酸・核酸・脂質等)を解析対象とした。解析の結果、IgG4関連疾患群では、起炎性の脂質メディエーターであるアラキドン酸(arachidonate(20:4n6)), 12-HETEが健常人群に比べ、治療前・治療後とも高い値を示した。また、その値は、ステロイド治療後でも、低下しなかった。IgG4関連疾患は、ステロイド治療により症状は著明に改善するが、ステロイド治療を中止すると高率に再発することが知られている。ステロイド治療で症状は改善しても、その根本的な原因は潜在していると考えられる。起炎性の脂質メディエーターが、IgG4関連疾患群で高値を示し、またその値は、ステロイド治療によって変動しないことから、これらの起炎性メディエーターが、IgG4関連疾患の炎症の遷延化に関連することが考えられた。この結果を踏まえ、脂肪酸代謝系の内、炎症に寄与するn-6系のアラキドン酸由来起炎性メディエーターを網羅的に解析した。IgG4関連疾患患者の治療前後、また、健常人血清を用い、IgG4関連疾患の疾患特異的に変動する代謝物群のパターン解析を行い、疾病により増減するバイオマーカー探索を行った。IgG4関連疾患で、治療後に変動した代謝物群は93、また、健常人、IgG4関連疾患群で変動を示した代謝物群は118であった。ステロイド治療による代謝プロファイルの変化について解析を行ったところ、ステロイドは、肝臓での糖代謝、筋肉での蛋白質代謝、脂肪組織での脂質代謝に影響を与え、結果的に、グルコースの血液中への供給を増加させた。また、ステロイド治療による脂肪酸のβ酸化の亢進が認められた。さらに今回の解析で、IgG4関連疾患では、アラキドン酸や12-HETEといった、いくつかの起炎性メディエーターが、健常人群に比べ高い値を示し、また、ステロイド治療後でも、その値が変動しないことが見いだされた。起炎性の脂質メディエーターが、IgG4関連疾患群では高値を示し、ステロイド治療によって変動しない点は、IgG4関連疾患の持続する免疫異常により炎症が遷延するという慢性炎症性疾患の一因とも考えられる。炎症の遷延化には、炎症を促進する「起炎性脂質メディエーター」と、炎症の制御に関与する「抗炎症性脂質代謝物」のバランスとその制御が重要な役割を果たしていると考えられている。IgG4関連疾患の炎症の「発生と収束」に関わる脂質メディエーターとそのバランス制御を明らかにするため、IgG4関連疾患群で高値を示したアラキドン酸由来の起炎性および抗炎症活性を有するn-6系のアラキドン酸由来起炎性メディエーターを網羅的に解析した。多施設共同の前方視試験に登録された症例を、IgG4関連疾患診断のアルゴリズムに当てはめ、確定群、擬診群、準確診群、否定群に分けるとともに、疾患、臓器別にカテゴライズを行った。本研究の対照については、性差、年齢差の影響を考慮し、IgG4関連疾患で多くを占める5060歳代男性とし、治療前、治療後、健常人コントロールの血清それぞれ10例準備し、3群間、n=10例で、治療前・後、患者・健常人間での解析を行った。
アロ骨髄移植でのストローマ細胞補充の必要性とその役割の細胞及び分子生物学的解析

アロ骨髄移植(BMT)では、骨髄ストローマ細胞(BMSC)の補充により、移植成績が向上する。その機序を詳しく解析し、以下の知見を得た。1.ドナー骨を同時移植すると、ドナーBMSCの生着がレシピエントの骨髄及び胸腺に認められ、また、レシピエントのT細胞はドナータイプへの拘束性を獲得し、免疫応答の完全な回復が見られた。ドナーBMSCが胸腺へ移住し、positive selectionに関与すると考えられる(Exp.Hematol.28:950,2000)。2.ドナー骨髄細胞(BMSCも含有)を門脈経路(PV)で移入するとトレランスが誘導されやすい(Proc.Natl.Acad.Sci.95:6947,1998)。骨髄細胞を造血幹細胞(HSC)とBMSCとに分けた場合、両者を混合しPVで移入した時のみ肝内に造血コロニーが認められ、脾での造血コロニー形成も向上した。BMSCが宿主の肝内にまず生着し、そこでHSCが増殖分化し脾へも移住したと考えられる(Stem Cells19:144,2001)。3.BMTの成立しにくい(chimerism resistance)系でも、レシピエントを分割照射(5.56Gy)し、PVで骨髄細胞を移入、さらに静脈内へ骨髄細胞を追加投与すると生存率が著しく上昇した。PVでの移入により、まずBMSCが肝にtrapされて造血コロニーが形成され、次に骨髄、脾に造血の場が移行したと考えられる(Stem Cells2001,in press)。アロ骨髄移植(BMT)では、骨髄ストローマ細胞(BMSC)同時移植により、移植成績が向上する。1.[T,G]-A--LあるいはPCC(T cell-dependent antigen)を用いて、その高反応性マウス→低反応性マウスのBMT(骨同時移植)を行った。移植骨由来のBMSCの生着が、宿主マウスの骨髄及び胸腺に認められた(FACSおよび共焦点レーザー顕微鏡を使用して解析)。また、宿主のT cellは、ドナータイプへの拘束性(T cell proliferation assayとPFC assayにて測定)を獲得していた。胸腺ストローマ細胞のドナータイプへの置換率と、T cellのドナータイプへの拘束性との間に正の相関関係が認められたことから、ドナーBMSCは胸腺へ移住し、positive selectionに関与していると推察できる。2.ドナー骨髄細胞(BMSCも含有)を門脈経路で移入するとトレランスが誘導されやすいが、この系でのBMSC同時移植の重要性を検討した。骨髄細胞を造血幹細胞(HSC)とBMSCとに分けると、両者を混合し門脈経路で移入した場合のみ肝内に造血コロニーが認められ、脾での造血コロニー形成も向上した。BMSCが宿主の肝内にまず生着し、そこでHSCが増殖分化し脾へも移住したと考えられる。3.HSCと造血支持細胞との間にMHC拘束性が存在することを当研究室で見出し報告してきたが、この拘束性を規定している細胞表面分子を同定するため、造血支持細胞特異的モノクローナル抗体を作成し、その中から、MHCの一致したHSCと造血支持細胞との接着を阻害する抗体(すなわちMHC class I結合性分子と反応する抗体)を選別した。さらにその抗体が認識する分子を造血支持細胞株の可溶性画分より単離し、分子量1415万のタンパクであることを見出した。骨髄ストローマ細胞の骨髄移植(BMT)における重要性をさらに詳しく解析した。1.アロのBMTの組み合わせの中でも特に[DBA/2(D2)→C57BL/6(B6)]や[B6→MRL/lpr(SLEのモデルマウス)]では、ドナーの骨髄細胞が生着しにくい事(chimerism resistance)が知られている。

レシピエントを分割照射(5.56Gy)し、門脈経路でドナー骨髄細胞を移入、さらに5日後に静脈内へ骨髄細胞を追加投与すると、生存率が著しく上昇した。骨髄、脾臓、胸腺等の各臓器でドナー細胞の生着を認めた。門脈経路でのドナー骨髄細胞移入により、まず骨髄ストローマ細胞が肝臓(特に血管周囲)にtrapされて造血コロニーが形成され、次に骨髄、脾臓に造血の場が移行したと考えられる。2.骨髄ストローマ構成細胞の内のどれが重要か調べるため、ドナーの骨髄ストローマ細胞の代わりに造血支持能を持つ前脂肪細胞株(PA6やMS-5)を造血幹細胞と共に門脈経路でレシピエントに移入した。脾臓での造血コロニー形成は、造血幹細胞単独と比べ増加したが、有意の差はなかった。従って、これら前脂肪細胞株には、成体内での造血支持能がないのかあるいは、他種の細胞の存在も造血支持層の形成に不可欠であると推察された。
海洋循環の将来変化が温暖化による海洋溶存酸素濃度の低下に与える影響

熱帯域の湧昇流は,表層への栄養塩供給を介して海洋内部の溶存酸素に重要な影響を与える.湧昇流の将来変化として,CMIP3モデルの解析により太平洋および大西洋での減少が示された.この変化の要因には貿易風の変化に関係するエクマン湧昇および赤道潜流の変化が示唆されているが,これら要因が各深さでそれぞれどのように赤道湧昇変化に寄与するかについて,体系的な調査はされていなかった.よって当該年度では,赤道湧昇将来変化のより詳細なメカニズム解明を目的として,熱帯太平洋および熱帯大西洋における2100年までの湧昇流変化に関して,24のCMIP5モデルのRCP8.5シナリオの出力を解析した.熱帯太平洋では,湧昇流は表層付近の水深50-75mの海盆中央部と,75-200mの亜表層海盆東部で有意に大きく減少する.海盆中央部の表層付近では湧昇流の減少が7割のモデルで生じる一方,東部熱帯太平洋亜表層では全モデルで湧昇流が減少する.熱帯大西洋では,中央から西部の水深50-150m付近で8割のモデルが湧昇流の減少を示すが,その振幅は熱帯太平洋の3割程度である.湧昇流変化のメカニズムを詳しく調査するために,海洋内部の三次元的な循環場および密度構造に基づいて,湧昇流変化を等密度面に並行する成分と,等密度面に直交する成分とに分けて解析を行った.特に,大きな湧昇流の減少を示す熱帯太平洋に注目した.その結果,熱帯太平洋の表層約50m深における湧昇流の減少は,エクマン発散の弱まりで生じる等密度面直交な湧昇流変化成分の減少により生じることを明らかにした.また東太平洋亜表層における湧昇流の減少は,熱帯太平洋亜表層を東西に流れる赤道潜流が平坦化し,密度面平行な湧昇流成分が減少することで説明できることを明らかにした.さらに,密度面直交および平行などちらの湧昇流変化も,貿易風の弱まりによって生じていることが明らかになった.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。熱帯域の湧昇流の変化は酸素の移流および,海洋表層の生物生産に使われる栄養塩を供給することにより海洋内部の溶存酸素に重要な影響を与える.その将来変化としては,CMIP3モデルの解析により太平洋および大西洋での減少が示された.この変化の要因としては貿易風の変化に関係するエクマン湧昇および赤道潜流の変化が示唆されている.しかしながらこれらの要因がどれだけの湧昇流減少をもたらすのか,という定量的な説明はなされていない.よって当該年度では,熱帯太平洋・大西洋における湧昇流変化のより詳細なメカニズム解明を目的として,24の最新気候モデルの出力を,最大CO2排出シナリオについて2100年まで解析した.具体的には,全湧昇流変化を等密度面に沿う流速成分由来の湧昇流変化と,等密度面を横切る湧昇流変化にわけることで,熱帯域の湧昇流に対する赤道潜流の寄与を求めた.全湧昇流は東部熱帯太平洋で2100年までに現在気候の値のおよそ30%最大で減少し,そのうちの3/4が等密度面に沿う流速由来の湧昇流変化によってもたらされることが示された.また,この等密度面に沿う流速由来の湧昇流変化は,71%は赤道潜流の東西方向の傾きが減少すること,41%は赤道潜流の流速が減少することによって説明されることが明らかになった.以上のことから,東部熱帯太平洋では,全湧昇流の減少の約半分が赤道潜流の傾き変化によって生じていると言える.さらに,この赤道潜流の東西方向の傾き減少には貿易風の弱まりが強く関係していることが示された.今年度は,海洋溶存酸素濃度の将来変化に重要な熱帯域の湧昇流変化を中心に研究し,その成果の一部を国内学会で発表した.この発表に基づいた論文を現在執筆準備中である.地球温暖化に伴う湧昇流将来変化のメカニズム解明において,全湧昇流を等密度面に沿う流速成分由来の湧昇流変化と,等密度面を横切る湧昇流変化にわけたことは有効であった.このことは,世界で初めて最新の複数気候モデルにおける海洋三次元循環場を算出したことによって達成された.熱帯域の湧昇流は,表層への栄養塩供給を介して海洋内部の溶存酸素に重要な影響を与える.湧昇流の将来変化として,CMIP3モデルの解析により太平洋および大西洋での減少が示された.この変化の要因には貿易風の変化に関係するエクマン湧昇および赤道潜流の変化が示唆されているが,これら要因が各深さでそれぞれどのように赤道湧昇変化に寄与するかについて,体系的な調査はされていなかった.よって当該年度では,赤道湧昇将来変化のより詳細なメカニズム解明を目的として,熱帯太平洋および熱帯大西洋における2100年までの湧昇流変化に関して,24のCMIP5モデルのRCP8.5シナリオの出力を解析した.熱帯太平洋では,湧昇流は表層付近の水深50-75mの海盆中央部と,75-200mの亜表層海盆東部で有意に大きく減少する.海盆中央部の表層付近では湧昇流の減少が7割のモデルで生じる一方,東部熱帯太平洋亜表層では全モデルで湧昇流が減少する.熱帯大西洋では,中央から西部の水深50-150m付近で8割のモデルが湧昇流の減少を示すが,その振幅は熱帯太平洋の3割程度である.

湧昇流変化のメカニズムを詳しく調査するために,海洋内部の三次元的な循環場および密度構造に基づいて,湧昇流変化を等密度面に並行する成分と,等密度面に直交する成分とに分けて解析を行った.特に,大きな湧昇流の減少を示す熱帯太平洋に注目した.その結果,熱帯太平洋の表層約50m深における湧昇流の減少は,エクマン発散の弱まりで生じる等密度面直交な湧昇流変化成分の減少により生じることを明らかにした.また東太平洋亜表層における湧昇流の減少は,熱帯太平洋亜表層を東西に流れる赤道潜流が平坦化し,密度面平行な湧昇流成分が減少することで説明できることを明らかにした.さらに,密度面直交および平行などちらの湧昇流変化も,貿易風の弱まりによって生じていることが明らかになった.熱帯大西洋は太平洋とは異なり,各気候モデルの湧昇流の応答間に大きなばらつきがある.大西洋では太平洋と異なるメカニズムで湧昇流変化が生じている可能性があるため,大西洋の湧昇流変化は今後調査が必要となるテーマである.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規光学活性相間移動触媒の分子デザインと不斉合成への展開

私はこれまで、N-スピロ環という特徴的な部分構造を有するC_2対称な光学活性相間移動触媒を合理的に分子デザインし、これを用いた各種アミノ酸の実用的不斉合成法を開発してきた。今回、既に開発していたグリシン誘導体の触媒的不斉アルキル化反応において、触媒の構造、置換基効果、及びアルキルハライドの適用範囲についてさらに詳細に評価し、高収率、及びほぼ完全なエナンチオ選択性で生成物を得ることに成功した。さらに、本反応を機軸とすることで各種有用α-アミノ酸の効率的不斉合成法を確立した。また、不斉触媒を用いたグリシン等価体とアルデヒドとの直截的アルドール反応によるβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸の合成は、原子効率の観点からも極めて有用な有機合成プロセスであるが、その報告例は非常に限られていた。今回私は、触媒を適切に分子デザインすることで、相間移動条件下でのグリシン誘導体とアルデヒドとの直截的アルドール反応を高立体選択的に進行させることに成功した。しかし本法には、適用可能なアルデヒドに説明し難い制限があった。そこで本反応における反応機構を詳細に検討した結果、キラルな触媒が介在する逆アルドール反応の関与を見出し、これが生成するアルドール付加体の立体選択性に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。この知見を基に反応条件を改良することで本法の適用範囲を大きく広げ、極めて高いジアステレオ及びエナンチオ選択性で各種anti-β-ヒドロキシ-α-アミノ酸エステルを合成することに成功した。光学活性β-ヒドロキシ-α-アミノ酸は医薬品等の重要な合成中間体であり、またβ-ラクタム、β-ハロ-α-アミノ酸、アジリジン等に短段階で変換できる点からも、その効率的合成法の開発は有機合成化学上極めて重要な課題の一つであると言える。しかし活発な研究にも関わらず、光学的に純粋なβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸の合成にはこれまで多段階の反応や当量のキラル補助基等を必要とした。また直接的な合成法として、L-トレオニンアルドラーゼに代表される酵素法が挙げられるが、操作が非常に煩雑であり、さらに酵素特有の基質特異性により適用範囲が極端に限られていた。そこで今回、私がこれまでに開発したN-スピロ環という特徴的な構造を有するC_<2->対称な光学活性四級アンモニウム塩をさらに修飾し、これを相間移動触媒として用いることで、グリシンt-ブチルエステルベンゾフェノンシッフ塩基と各種アルデヒドとの直接的不斉アルドール反応の開発に初めて成功した。本法により、種々の光学活性β-ヒドロキシ-α-アミノ酸を良好な収率、及び非常に高いジアステレオ、エナンチオ選択性で直接的に合成することが可能となった。このことから本触媒がいわば人工酵素としての役割を担っていると言える。さらに本法は実験操作が非常に簡便であり、重金属を必要としない環境調和型の反応システムであることから大量合成に適しており、真に実用的な有機合成プロセスを提供しうるものであると言える。
Si金属触媒焼結体を疑似廃Siモデルとしたブロモ化反応による廃Si再生法の開発

摩耗金属あるいはアルカリ金属を添加したシリコンのブロモ化反応を様々な条件で検討した。すべてのサンプルが,摩耗金属あるいはアルカリ金属の有無に関わらず,臭化水素と反応した。全サンプルのブロモ化反応に対する反応性は向上することがわかった。また,ブロモ化反応によりシリコン中の金属成分は大幅に減少することがわかった。不純物の添加は,活性化エネルギーや反応性の改善をおこなえ,これは不純物の熱伝導性や表面の反応場の改善によるものと考えられる。これらの結果から,液成分を除いて,不純物がある城代でも,ブロモ化反応により廃シリコンからシリコンあるいはブロモシランを高純度で抽出できることがわかった。シリコンインゴットからウエハーを製造する過程で,廃棄物シリコン(以後,廃シリコン)が排出される。廃シリコンには,切削工程時に混入する砥粒・摩耗金属・クーラントが含まれており,リサイクル方法の主流である逐次的に不純物を除去する方法では,砥粒や金属不純物が完全に除去できずに再生プロセスの確立が困難な状況である。本研究では,廃シリコンに臭化水素を反応させることで,廃棄物からシリコン成分をブロモシランとして抽出回収することを目指している。そのため,廃シリコンに含まれる不純物許容濃度は低く,あえて金属不純物を添加することで,反応性の向上が期待される。さらに,ブロモシランは,常温常圧下で液体のため,ハンドリング性に優れ,輸送・運搬に利点があると考えられる。本年では,シリコン(廃シリコンを含む)と臭化水素ガスを反応させる流通反応系装置を完成させ,ガスクログラフィーにより随時ブロモ化反応(ブロモ化反応による全ガス成分を検出できるようにガスクロカラムを選定した)を追跡できる設定とした。また,ブロモ化反応に供する廃シリコン(2種類)の各種分析(ICP-AES,SEM-EDS,FT-IR,XRD分析)を行った。現在,環境負荷低減のため,油性クーラントから水性クーラントへ変更が検討されている。提供された水性クーラント由来の廃シリコンには,これまでの油性クーラントのものに比べ,金属不純物の組成が異なっていることがわかった。低純度シリコンから高純度シリコンを得る反応において,ハロゲン化シランからシリコンへ還元する反応(アップヒル反応)において,ブロモシランの有用性を明らかにしてきた。一方,シリコンからハロゲン化シランを生成する反応(ダウンヒル反応)においては,ブロモ系はクロロ系に比べて熱力学的に不利である。仮に,ダウンヒル反応においてクロロ系と同等の条件でブロモシランを得ることが出来れば,廃シリコンから生成できるブロモシランによるリサイクル方法を確立できる可能性が高まると考えている。ブロモシランは常温常圧で液体のため,その操作性・運搬性はクロロシランに比べ有利である。本研究では,ダウンヒル反応であるブロモ化反応(Si+nHBr→SiH4-nBrn+(n-2)H2)において,触媒能をもつ金属成分を廃シリコンに含まれる金属不純物から選定することである。廃シリコンに含まれる金属不純物の許容不純物量を明らかにすることで,リサイクルにおける除去プロセスの簡略化が可能であり,コスト削減につながる。平成27年度では,金属不純物として代表的な鉄について,その触媒能を検討した。結果,鉄を添加することで,反応性が向上(90%以上)すること,目的物であるトリブロモシランの選択率(80%以上)が維持できることを明らかにした。また,反応速度解析を実施し,活性化エネルギー(120kJ/moL)を算出した。現在,鉄の不純物許容量を検討し,ある量以上の鉄が含まれると反応性が低下することが分かっている。また,アルミニウムは目的物であるブロモシランの純度低下につながることがわかった。鉄を添加したものでは,純度に影響を与えないことがわかった。平成26年度末に完成した流通式反応装置は,平成27年度でいくつかの改善を行い,ブロモ化反応の実施と反応前後での反応ガスの変移をオンラインガスクロマトグラフィーで追跡できることが分かった。廃シリコンには,砥粒・クーラント・金属不純物が含まれる。自身の先行研究から,リサイクルをするうえで,砥粒の除去は不要であること・クーラントの除去の必要性及び除去方法を明らかにしてきた。今回,金属不純物が触媒能を持つ予備実験を参考に,詳細な実験を行った。金属不純物として代表的な鉄に関して,鉄の有無によるブロモ化反応の反応性及び速度論解析による活性化エネルギーの算出を行った。さらに,鉄は最終的に得られるシリコン生成物の純度に影響を与えないことも分かった。一方で,反応温度は,410°Cと高いため,更なる条件精査を行い反応温度の低下を行う。膨大なエネルギーを供給し作製した太陽電池セル(半導体)から発生するシリコン切り屑のリサイクルについて,化学的手法によりシリコン切り屑から得られるブロモシランの有用性を明らかにしてきた。しかし,シリコン切り屑からハロゲン化シランを生成する反応において,ブロモ系はクロロ系に比べて熱力学的に不利である。

本研究では,ダウンヒル反応であるブロモ化反応(Si+nHBr→SiH4-nBrn+(n-2)H2)において,シリコン切り屑中に主成分として含まれる金属不純物である鉄が触媒能を持つことを明らかにした。反応速度解析を実施し,活性化エネルギー(120kJ/moL)を算出し,金属不純物は前処理として除去不要であることを明らかにした。平成28年度では,混入しているアルカリ金属成分のブロモ化反応への影響を,臭化アルカリ金属を系統的に変更(Li,Na,Cs)することで,検討した。結果として,アルカリ金属を変更することでブロモ化反応の反応性とトリブロモシラン選択率を向上できることがわかった。反応後のシリコンを分析することで表面および内部に欠陥が生じていることがわかった。この欠陥の要因は,シリコンの原子半径とアルカリ金属のイオン半径が関与していることが示唆され,特定のアルカリ金属はシリコンへ固溶することで,シリコンと臭化水素の反応を促進していることが考えられる。本結果より,化学的手法によるシリコン切り屑のリサイクルに関しては,水成分のみを除去するだけで高純度のブロモシラン溶液を得られることを明らかにした。摩耗金属あるいはアルカリ金属を添加したシリコンのブロモ化反応を様々な条件で検討した。すべてのサンプルが,摩耗金属あるいはアルカリ金属の有無に関わらず,臭化水素と反応した。全サンプルのブロモ化反応に対する反応性は向上することがわかった。また,ブロモ化反応によりシリコン中の金属成分は大幅に減少することがわかった。不純物の添加は,活性化エネルギーや反応性の改善をおこなえ,これは不純物の熱伝導性や表面の反応場の改善によるものと考えられる。これらの結果から,液成分を除いて,不純物がある城代でも,ブロモ化反応により廃シリコンからシリコンあるいはブロモシランを高純度で抽出できることがわかった。入札の関係から,ガスクロマトグラフの納品および反応装置の完成が大幅に遅れた。ブロモ化反応は試運転しか行えず,系統的な研究データを得られなかった。一方で,情報収集に集中でき,これまでに山口県内の企業から主要な廃シリコンサンプルを得ることができた。近年,環境負荷低減から,シリコンインゴット切削時に使用されるクーラント成分が油性から水性に変化している。今回,提供された廃シリコンも水性クーラントを使用している。これまでに,主として不純物分析を実施した。先の研究報告にある油性クーラントと本研究の水死クーラントの廃シリコンでは,金属不純物の組成に大きな違いがあった。特に,シリコンインゴットをアルミニウム製台座に固定して切削するために,これまではアルミニウムが多く含まれているが,本研究の結果,アルミニウムはほとんど含まれず,切削方法に変化があることが分かった。また,同時進行で得られるブロモシラン溶液を蒸留する装置を作製した。現在,反応装置に設置する方法を検討している。金属不純物の代表例である鉄がブロモ化反応に対して触媒能を持つことを明らかにした。一方で,ニッケル(・アルミニウム)についてもブロモ化反応への影響を詳細に検討することで,廃棄物シリコンのリサイクルにおいて,金属除去を行う必要がなくなり,コストを抑えられると考えている。さらに,クーラントを分散する際に,アルカリ金属成分を添加していることがわかった。アルカリ金属成分についてもブロモ化反応への影響を検討していく。
骨格筋細胞骨格と裏打ち構造に関する形態学的、分子細胞生物学的研究

骨格筋の筋原線維を細胞膜につなぎ止める細胞骨格の電子顕微鏡による解析を、細胞内の可溶性蛋白を洗い流す等の処置により線維構造を見やすくしておこなった。アクチン線維および中間径線維が筋原線維と細胞膜をつないで走り、細胞膜では膜直下の暗調斑と連結する像が認められた。これらの繊維構造は筋ジストロフィーのモデルマウスでは減少していた。また骨格筋の中間径線維の構成要素であるシネミンについて、生体内での機能を調べた。マウスでは筋持久力、速筋・遅筋比率に関係すること、ジストロフィンとの二重欠損では生殖能力の落ちることが明らかになった。発生期の魚では受精後5672時間の心臓に発現していることが明らかになった。1骨格筋細胞膜裏打ち構造と細胞骨格連関の解析:正常マウスとジストロフィン欠損マウス(mdxマウス)について、電子顕微鏡観察すると、mdxマウスでは筋原線維のM線と細胞膜裏打ちをつなぐM-cableが欠損していた。一方イムノブロティング法、蛍光抗体法ではmdxマウスでケラチン含量・染色の増強が認められ、代償が考えられた。2β-シネミン(β-Syn)及びジストロフィン(Dys)二重欠損マウスの解析:二重欠損マウスを効率よく得るため、前年に得られた遺伝子欠損マウスを用い交配を続けた。β-Syn及びDysがヘテロザイゴートのオスと二重欠損マウスのメスを交配させたが妊娠は確認できなかった。さらにβ-Syn及びDysがヘテロのオスとβ-Syn欠損・Dysのヘテロのメス及びβ-Syn及びDysがヘテロのメスと交配させたが妊娠は確認できなかった。これによりβ-Syn-Dysの不全が生殖機能に影響する可能性が示唆された。またトレッドミルを用いた解析では、β-Syn欠損マウスの持久力の有意な低下が観察された。持久力テスト後に蛍光染色し筋原線維の状態を検討したが、野生型との違いは認められず、また基底状態でEvans blueを尾静注し筋細胞膜損傷の有無を蛍光観察したが、損傷によるEvans blueの筋線維内部への侵入も認められなかった。β-Syn欠損マウスの持久力の低下の原因は現在のところ不明である。3ゼブラフィッシュにおける解析:ゼブラフィッシュSyneminをクローニングした。これは後に公表されたSynemin BC171396と相同だった。また、マウスで知られているH,M,Sの3つのsplicing variantsのうちMに相同だった。ゼブラフィッシュ胚でin situ hybridizationを行ったところ、受精後4872時間の心臓にSyneminが発現していた。1シネミンノックアウトマウスの解析:シネミンノックアウトマウスのトレッドミルによる運動持久力に関し、統計処理ができるまで例数を増やし、野生型のマウスに比較して統計的にも有意に低下していることを明らかにした。次にこの持久力の低下は筋線維の相違による可能性が考えられたので、速筋及び遅筋に特異的に反応する抗ミオシン抗体を用いて速筋・遅筋の構成比の違いをヒラメ筋で調べた。その結果シネミンノックアウトマウスでは野生型に比し速筋の減少が観察された。速筋割合減少の理由としては、下り坂効果による速筋への負担増加が考えられる。2ジストロフィンーシネミン二重欠損マウスの解析:前年度までの研究でジストロフィン欠損マウスとシネミンのヘテロ或いは二重欠損マウスを雌雄様々に組み合わせ1年間交配させたが、1度だけしか妊娠は確認できなかった。これによりβ-シネミン及びジストロフィンの不全が生殖機能に影響する可能性が確認された。6週齢のシネミン二重欠損マウス及びジストロフィンのノックアウトーシネミンヘテロマウスを用い、生殖器および骨格筋において組織学的検索をおこなった。しかし生殖器には明瞭な異常は観察されなかった。骨格筋では二重欠損マウス及びジストロフィンのノックアウトーシネミンヘテロマウスにおいては野生型に比し中心核が多いものの、二重欠損マウス及びジストロフィンのノックアウトーシネミンヘテロマウス間に差が見られない事からシネミンの欠損による影響では無いと考えられた。3骨格筋細胞膜裏打ち構造と細胞骨格連関の解析:前年度までの成果をもとにさらに観察数を増やし、筋原線維のM線・Z盤から筋線維の横断方向に延びるアクチン線維、中間径線維が筋形質膜下暗調斑との間を繋ぎ、mdxマウスではそれらが減少していることを論文にまとめて、専門学術誌に投稿、掲載することができた。

(1)骨格筋細胞膜裏打ち構造と細胞骨格連関の解析:正常マウスおよびジストロフィン欠損マウス(mdxマウス)について、急速凍結ディープエッチ法(QF-DE法)あるいは超薄切片法により電子顕微鏡観察をおこない、骨格筋の細胞膜裏打ちと細胞内細胞骨格との関連を調べた。正常マウスの細胞膜裏打ちをQF-DE法による金属レプリカで観察するとカベオラの間に走る直径約6,10,14,19nmにピークをもつ4種の線維状構造物が観察された。このうち14nmのものは4.25.4nmの横縞が見られ、アクチンフィラメントと考えられた。切片法による直径とは差があるが、これは金属蒸着によるためと思われる。Triton処理し超薄切片法で観察した標本では、正常マウスに比べmdxマウスで細胞膜と細胞内構造の間が離解する傾向がみられ、両者間の機械的連結が弱くなっていることが推測された。(2)β-シネミン欠損マウスと他の筋ジストロフィーモデルマウスの二重欠損マウスの作成:細胞骨格と膜裏打ち構造の関係を調べるため、β-シネミン欠損マウスとジストロフィン欠損マウスの交配を行ない、二重欠損マウスの作成を試みた。生まれたマウスの遺伝子型を解析したところ、二重欠損マウスが出生していることを確認できた。現在は二重欠損マウスのラインを安定させ、各組織の解析の準備を行っている。細胞骨格同士の相互連関を調べるためβ-シネミンとデスミンの二重欠損マウスの作成を検討し、ギリシャの研究室よりデスミン欠損マウスを分与してもらうことに話がついたが、ギリシャ国内の情勢不安により連絡がつかなくなり延期となっている。またβ-シネミン欠損マウスの解析を進めたところ、トレッドミルを用いた持久力テストにおいて、野生型に比べβ-シネミン欠損マウスの持久力が劣っている傾向が見られた。これによりβ-シネミンが筋原線維の安定性に寄与していることが予想された。1の骨格筋の裏打ち構造と細胞骨格連関の解析ではジストロフィン欠損のmdxマウスでの検討で、野生型マウス骨格筋と比較してM-cableが欠損している事が明らかになり、比較的順調に進行している。しかし2β-シネミンと筋疾患責任タンパクの二重欠損マウスの解析ではデスミン欠損マウスが平成23年度の段階で予定していたギリシャの研究者との共同研究がギリシャの政治的・社会的混乱から進めることができず、また商業ベースでのノックアウトマウスの利用も生きたデスミン欠損マウスは市販されておらず、ES細胞の段階での販売でノックアウトマウスの作成に多額の費用と時間がかかる事が明らかになり、時間的・資金的理由から断念せざるを得なかった。ジストロフィン欠損のmdxマウスとの二重欠損マウスについては、交配を重ね作出を試みているが、概要欄にも記したように妊娠・出産が成立せず、生殖あるいは初期発生の解析を進める必要が出てきている。またβ-シネミン欠損マウスでは筋持久力の低下が確認されたが、それとβ-シネミン欠損との関係の解析は今のところ有意なものが見つからず、やや遅れ気味である。3ゼブラフィッシュの解析では、β-シネミンは心臓での発現は確認されたが、骨格筋については今のところ発現は認められず、ゼブラフィッシュは所期の目的には使えない可能性が高い。以上のように当初の予想と異なる結果が多く出ているため、現在の達成度はやや遅れ気味と判断した。(1)の骨格筋細胞膜裏打ち構造と細胞骨格連関の解析では正常マウスの解析はほぼ終了したが、そのデータを出すのに時間がかかり、ジストロフィン欠損のmdxマウスでの解析は超薄切片法ではおこなったものの、急速凍結ディープエッチ法による検討はまだ進んでいない。