hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
着床前診断におけるヒト割球除去が次世代に与える影響の検討

世界的な傾向として着床前診断はその適応の幅を広げつつあり、本邦においても臨床への導入に関して種々の議論が展開されていることは周知の事実である。しかし、着床前診断において割球を摘出すること自体が発生に与える影響に関しての基礎的な検証、すなわち本質的な安全性の検証は行われていない。本研究では割球を除去した後のマウス初期胚の発育をタイムラプスビデオを用い観察し、非処理の胚発育との比較を行った。マウス4細胞期胚の割球を1個吸引除去し、インキュベーター内蔵型タイムラプスビデオシステムにて胚盤胞まで継続的に観察した。割球除去を施行していない同一個体よりの胚をコントロールとして、同一のドロップ内におき比較検討した。観察した発育速度のパラメーターとしては、コンパクション開始時間、胚盤胞腔出現時間、ハッチング開始から終了時間、である。発育状況のパラメーターとしては、コンパクション開始時の割球数、胚盤胞拡張後に認められた虚脱と拡張運動の回数、胚盤胞最大拡張時の径、ハッチングの様式(透明帯からの脱出の様子)、である。結果として、マウス胚発育のコンパクション、発育速度、拡張胚盤胞の虚脱と拡張運動、ハッチングなどの挙動はコントロールに比較して明らかな相違が出現していることが観察された。すなわち、割球除去という配偶子操作が初期の胚発育に大きな影響を与えていることが明らかになった。本研究でえられた知見は、現在諸学会で注目され始めている。特に、2009年4月予定の第61回日本産婦人科学会では高得点演題に選出されている。すなわち、新しいコンセプトの萌芽として着実な歩みをはじめている。本研究に関連した本年度の活動を報告する。(1)ウシ卵子を使用したヒト精子中心体の解析:ウシ卵巣よりウシ未成熟卵子を採取し体外培養系にて成熟卵に誘導した。複数のヒト精子を時間間隔をおきウシ卵子に注入した。注入6時間後に卵子を固定して精子中心体機能の発現を観察した。(Kakoi-Yoshimoto et al. Syst Biol Reprod Med in press)結果として同一卵子内に存在するヒト精子中心体は他の精子中心体の機能発現にまったく影響を与えないことが明らかになった。受精の成立に重要な精子中心体の機能発現に関して新しい知見がえられ、平成19年10月に秋田市でおこなわれた日本生殖医学会シンポジウムで発表した。(シンポジウムテーマ胚発生における精子の関与:発表演題名寺田幸弘精子中心体の機能発現調節)(2)ヒトおよびサル精子形成過程における、微小管の形成および微小管関連タンパクの発現を解析し、精子成熟(spremiation:円形精子細胞から成熟精子になるまでの過程)に微小管を中心とした細胞骨格形成が重要であることを明らかにした(Hayasaka S et al. Asian J Andorol. In press)(3)割球除去に関しては専任の担当をおき、マウス胚をもちいた割球除去の基礎的トレーニングを行っている。(4)現在、割球除去後のヒト卵子の分割過程を連続観察すべく、タイムラプス顕微鏡の設置とマウス受精卵をもちいた観察をおこなっている。
線虫抗原によるガンマ-インターフェロン産生抑制機序の解析

これまでの研究からNippostrongylus barisiliensis成虫由来分泌排泄(Nb-ES)抗原中には多くの生理活性分子が存在することが示されている。我々の見出したNb-ES抗原中に存在するラットT細胞に対するIFN-γ産生抑制活性もそのひとつであり、本研究ではその活性機構を解析することを目的として実施された。本研究では、まずこのNb-ES抗原が他種動物のT細胞に対してもIFN-γ産生の抑制活性を持つかどうかを検討し、ES抗原およびその部分精製分画はマウスT細胞に対してもIFN-γ産生抑制活性を示すことが確認された。。次にブタ回虫(As)抗原を用いて他種線虫由来抗原中にも同様の抑制活性が認められるかどうかを検討した。その結果、As体腔液中には明らかなIFN-γ産生抑制活性は認められなかったが、As-ES抗原のNb-ES抗原と同じ精製分画にラットおよびマウスT細胞に対するIFN-γ産生抑制活性が認められた。これら結果は、宿主T細胞に対する線虫由来抗原によるIFN-γ産生抑制が幅広く線虫と宿主間に存在する現象である可能性を示している。そこで、ES抗原中に含まれる活性分子の特定を進め、段階的イオン強度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィーおよび自作の抗ES抗原ポリクローナルウサギIgG抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの組み合わせにより、ES抗原に比してほぼ20倍の比活性を持つ分画の精製に至った。その結果、活性分子は推定分子量が50kD100kDであること、活性は56°C30分の熱処理に対して抵抗性であるが、95°C30分の熱処理により部分的に失活すること、過ヨウ素酸処理により完全に失活することを明らかとした。。Nb由来ES抗原中に含まれる活性分子を特定する目的で抗原物質の生成を行い、以下の結果を得た。1)限外濾過法によりES抗原を分画し活性を比較したところ、ES抗原の>50kD分画に最も強いIFN-γ産生抑制活性が認められ、>100kDの分画にも活性が見られた。しかし、>10kDの分画には全く活性が認められなかった。2)Mono-Qカラムを用いて段階的イオン強度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィーを行ったところ、0.15-0.2M NaClで溶出される分画に強いIFN-γ産生抑制活性が見出された。3)この分画によるIFN-γ産生抑制活性はウサギ抗ES抗原ポリクローナルIgGでは阻止されなかった。次いでNb由来ES抗原中に存在するIFN-γ産生抑制活性がラット以外のリンパ球に対しても認められるかを知るために、C57B/6雄マウスの腸間膜リンパ節細胞を用いて培養を行い、以下の結果を得た。4)Nb由来ES抗原および上記のMono-Q分画はマウスリンパ球に対してもIFN-γ産生抑制活性を示すことが確認された。また、他種線虫抗原でも同様の活性が見られるか知る目的で、ブタ回虫(As)体腔液およびをAs由来ES抗原を用いて同様の解析を行い、以下の結果を得た。6)しかし、ES抗原の陰イオン交換クロマトグラフィーによる分画では0.15-0.25M NaClで溶出される分画にIFN-γ産生抑制活性が認められた。これまでの研究からNb-ES抗原中にはシステインプロテアーゼなど特異的IgE抗体の標的分子が多く存在することが分かっているが,同時にその他の未知の活性分子が数多く存在することが示されている。本研究で着目しているNb-ES抗原中に存在するラットTリンパ球に対するIFN-γ産生抑制活性もそのひとつである。

昨年度の結果からNb-ES抗原およびその部分精製分画はマウスTリンパ球に対してもIFN-γ産生抑制活性を示すことが確認され、さらなる活性機序の詳細な解析が可能となった。そこで本年度の研究においては、ES抗原中に含まれる活性分子を特定することが研究を効率よく進める上で必須であった。その結果、限外濾過法による活性分子の分子量推定が50kD100kDであることを明らかとした。さらに、段階的イオン強度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィーおよび自作の抗ES抗原ポリクローナルウサギIgG抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの組み合わせにより、ES抗原に比してほぼ20倍以上の比活性を持つ分画の精製に至った。この精製分画中の活性は56°C30分の熱処理に対して抵抗性であったが、95°C30分の熱処理により部分的に失活すること、過ヨウ素酸処理により完全に失活することを明らかとした。また、レクチンアガロースによる精製を実施し、活性分子はCon Aなど数種のレクチンに対して結合性を有していることも確認した。本年度得られた結果は、IFN-γ産生抑制活性物質が糖タンパクであり、その糖鎖部分に活性中心があることなどを示すもので、今後の研究を進めるにあたり重要な情報を得ることができたと考えている。
消化器官幹細胞の分子的同定と機能分化

本研究によって得られた主要な成果は以下のように要約できる。(1)幹細胞に共通する分子的特徴を明らかにするために、胚期の小腸および胃(前胃、腺胃)について、PPARの発現を解析した。その結果、PPARα、β、γは、それぞれ固有の発現パターンを示し、とくにγは、胃の腺上皮では発現が極端に低下することが示された。(2)胃上皮細胞を培養する系を確立し、幹細胞としての性格(自己増殖能と分化能)を保有する細胞株を樹立する基礎的知見を得た。前胃上皮細胞を、種々の成長因子を含む培養液(基礎的培養液)中で細胞培養し、その系に間充織因子を添加することで、前胃上皮細胞の分化が大きく変化することを観察した。この方法により、前胃上皮細胞を培養して、幹細胞を同定し、あるいは幹細胞に遺伝子導入する方法が確立した。(3)上述の方法で前胃上皮細胞を培養し、間充織因子や間充織細胞の条件付け培養液を添加し、上皮細胞の特異的遺伝子発現を検討した。その結果、前胃上皮細胞は、基礎的培養液でもFoxa2を発現し、間充織性の因子の添加によってcSPを発現するが、どのような因子を添加してもECPgを発現しない。このことは、ECPgを発現する幹細胞(腺細胞の幹細胞)の分化には、前胃間充織特異的因子(BMPなど)が必須であることを示唆している。(4)ニワトリ胚始原生殖細胞を数種類の成長因子を含む培養液で培養し、SSEAIを発現する多分化能細胞を分化させた。これを磁気ビーズをもちいた細胞分別法で高い効率で収集し、消化器官細胞との共培養によって消化器官細胞に分化させる系の構築を試みた。最終的にECPgのような機能タンパク質の遺伝子を発現するには至らなかったが、これにより幹細胞を間充織細胞の影響下に、特定の細胞へと分化させる実験系が確立された。本研究の目的は、消化器官に内在する幹細胞を分子的特徴に基づいて同定し、かつその機能を、主として発生過程に注目して解析することである。平成18年度においては、ニワトリ胚消化器官幹細胞を同定するための消化器官上皮細胞の培養方法の検討と、従来から幹細胞のマーカーとして注自されているいくつかの遺伝子について発現と機能を解析することに力を注いだ。(1)ニワトリ胚消化器官上皮細胞の培養と遺伝子発現。まだ未分化な6日胚前胃(腺胃)から上皮細胞を単離し、増殖を促すことの知られているいくつかの成長因子を添加した基本培地で培養する。この条件では、細胞は数日間の培養後に前胃腺細胞のマーカーであるニワトリ胚期ペプシノゲン(ECPg)を発現しないことをわれわれはすでに明らかにしている。そこで、この培養に間充織細胞のフィーダー層(FL)や、前胃間充織細胞の条件付け培養液(CM)を導入することを試みた。FLやCMを含まない培地では、上皮細胞は発生初期から発現するFoxa2やsonic hedghogは発現するが、それ以外の遺伝子の発現は観察されない。FLやCMはいくつかのマーカー遺伝子の発現に影響を与え、培養開始時に発現の始まるcSP遺伝子の発現を許容した。しかしこれらの培養条件でもなお、ECPgの発現は誘導できなかった。

この研究は、前胃上皮細胞の培養条件に関して多くの知見をもたらし、今後条件を一層改善することによって、幹細胞を検出する可能性を示唆した。(2)PPARの機能解析。PPARは核内受容体であり、種々のリガンドや因子と結合して、細胞の代謝、増殖などに関与する。消化器官のがんの発生においても重要な役割を果たしていることから、細胞の分化にも関わると考えられる。われわれはニワトリ胚前胃の形成におけるこの因子の機能解析を行った。6日胚前胃を培養し、PPARgを上皮に強制発現し、同時にそのアゴニストを添加すると、腺形成が著しく抑制され、一方アンタゴニストの添加はその効果を抑制した。また腺形成に重要であるsonichedgehogの発現を観察すると、PPARとsonic hedgehogは独立に、並行的に作用していることが明らかになった。今度はこのようなPPARの作用が幹細胞の分化とどのように関係するかを、幹細胞のマーカーであるMsi-1との二重検出法などによって明らかにしたい。本研究は、消化器官の発生において、将来幹細胞として細胞の新生に関わるようになる細胞が、どのように発生し、どのような機能をもつかを解析するものである。幹細胞は現今の医学、生物学、とりわけ再生医療において中心的役割が期待されているが、発生過程におけるその挙動は必ずしも明らかではない。本研究では、その形態形成と細胞分化の過程が詳細に明らかにされているニワトリ胚胃(前胃)をモデルとして、幹細胞を同定することを第一の目標とした。これについては、musashi-1やPPARといった細胞の分化に重要な役割を果たす遺伝子(産物)に注目してその発現を調べ、後者については機能解析を行った。また、幹細胞を純粋に単離してその分化をin vitroで解析する準備段階として、前胃上皮細胞の細胞培養系の樹立に多くのエネルギーを費やした。これまで、鳥類にしても哺乳類にしても、胚期の消化器官上皮細胞を長期間にわたって培養した例は少なく、まして細胞の分化に着目した実験はほとんどない。本研究では、ニワトリ6日胚の上皮細胞を、いくつかの基本的増殖因子を添加した培養液で培養し、消化器官上皮細胞としての性格を与える遺伝子(sonic hedgehog、foxa2)、胃の上皮細胞のマーカー遺伝子(cSP)、そして胃の腺上皮細胞のマーカー遺伝子(ECPg)の検出を試みた。またそれら遺伝子の発現に対する間充織因子の影響を調べた。その結果、消化器官上皮細胞のマーカー遺伝子は間充織因子を添加しなくても発現し、間充織因子の存在下でcSPが発現するが、ECPgはいずれの条件でも発現しなかった。このことは、間充織因子の今後の解析によって、前胃上皮細胞を希望する条件で培養することが可能になったことを示し、これによって上皮細胞中に存在する幹細胞を同定し、純粋に培養する可能性が生じた。
角度分解正逆光電子分光法によるアルカリ金属GIC表面の電子構造の研究

1.逆光電子分光用高電流高分解能電子銃の製作改良を行なった.活性試料表面の劣化に対抗するための測定時間の短縮化および精密測定のための高分解能化を計るため,新たにBaOカソードおよび4段レンズ系を持つ電子銃を製作した.2.逆光電子分光用高効率高光子検出器の設計製作を行なった.従来のGM管型光検出器の代りに, SrF_2窓とCuBeダイノードを持つ光電子増倍管型光子検出器を製作した.3.C_8M(M=K, Rb, Cs)単結晶表面に対するArI共鳴線(11.7eV)を用いた角度分解光電子スペクトルの測定とその解析を行なった.HeI共鳴線を用いた実験で見出された「点近傍における分散を示さないバンドの起源を検討した.その結果,単結晶表面には,表面電荷密度波は発生しておらず,「点近傍の非分散バンドは, K点からの間接遷移によるものと結論をみた.4.角度分解逆光電子分光および角度分解二次電子分光によるグラファイト非占有電子帯構造の決定を行なった.黒鉛層間化合物の研究の第一段階として,グラファイトについての測定を行なった.得られたバンド分散を,報告されているいくつかのバンド計算と比較し,グラファイトおよび黒鉛属間化合物における"層間準位置"のエネルギー位置について検討した.グラファイトにおいては層間準位は, Г点フェルミ準位より約4eVに位置しており,黒鉛層間化合物においてはそれがフェルミ準位の下に入り込んでいるものと結論される.1.逆光電子分光用高電流高分解能電子銃の製作改良を行なった.活性試料表面の劣化に対抗するための測定時間の短縮化および精密測定のための高分解能化を計るため,新たにBaOカソードおよび4段レンズ系を持つ電子銃を製作した.2.逆光電子分光用高効率高光子検出器の設計製作を行なった.従来のGM管型光検出器の代りに, SrF_2窓とCuBeダイノードを持つ光電子増倍管型光子検出器を製作した.3.C_8M(M=K, Rb, Cs)単結晶表面に対するArI共鳴線(11.7eV)を用いた角度分解光電子スペクトルの測定とその解析を行なった.HeI共鳴線を用いた実験で見出された「点近傍における分散を示さないバンドの起源を検討した.その結果,単結晶表面には,表面電荷密度波は発生しておらず,「点近傍の非分散バンドは, K点からの間接遷移によるものと結論をみた.4.角度分解逆光電子分光および角度分解二次電子分光によるグラファイト非占有電子帯構造の決定を行なった.黒鉛層間化合物の研究の第一段階として,グラファイトについての測定を行なった.得られたバンド分散を,報告されているいくつかのバンド計算と比較し,グラファイトおよび黒鉛属間化合物における"層間準位置"のエネルギー位置について検討した.グラファイトにおいては層間準位は, Г点フェルミ準位より約4eVに位置しており,黒鉛層間化合物においてはそれがフェルミ準位の下に入り込んでいるものと結論される.
目標志向の感性的意思決定分析

目標志向の意思決定分析における我々のこれまでの研究を発展させて、まず、多様な情報の統合化手法の応用と検証、特に適切な統合化オペレータに関する研究を実施した。次に、物理情報や感性情報に加えて文脈情報を考慮した意思決定分析の理論化を行った。以上の理論に基づいて、物理情報と感性情報、さらに文脈情報を考慮した推薦システムを開発し、伝統工芸品販売へ応用した。最後に、理論研究の成果を統合し、またシステム開発の経験を活かして、さらに研究代表者が研究してきた知識構成システム論の考え方を取り入れて、目標志向の感性的意思決定分析の方法論を提案した。本年度の主な目的は目標志向の感性的意思決定分析における情報統合化手法の応用と検証であった。消費者が商品を選択するとき、商品に関する様々な属性に関する要望を持っている。本研究ではそれらを物理、感性及び文脈属性に分類し、消費者の要望を情報として取り扱う。本年度は、サイズや価格といった物理情報、かわいらしい等の感性情報、そして製品の用途等の文脈情報を統一的に扱う方法を検討し、さらに情報の優先度を考慮した新しい手法を開発し、これまでに収集していた伝統工芸品に対する評価データを用いて手法の有効性を確認した。これらを国際会議で発表するとともに、国際ジャーナルに投稿した。次年度以降にかけての目的である情報統合化オペレータの感度分析、文脈情報を考慮した感性評価モデリング、及び推薦システムの設計に関しては、それぞれ国際ジャーナルに投稿したが、まだ研究課題は残っており引き続き研究を実施する。また、これらの方法を検証するための新しいデータを収集するために感性評価実験を実施し、専門家と一般消費者の間で感性評価に有意な差があるかどうか等のデータ分析に基づいて、推薦システムにおいて利用すべき属性を検討した。さらに、最終目的である目標志向の感性的意思決定分析の方法論の確立に関しては、本年度は初期段階のものを構築し精緻化を続けている。この方法論の基礎となるものとして研究代表者を中心に開発した知識構成システム論については国際ジャーナルに投稿するとともに、国際学会の招待公演等において公表した。本年度は、感性評価実験データの注意深い分析を重点的に実施した。これは、伝統工芸に係わる評価者あるいは詳しい評価者と一般消費者との間で、感性評価に食い違いがみられることが明らかになったからである。実際、感性評価値とデザイン要素の関係を考察すると、伝統工芸の熟知者と一般者では評価する際に着目するデザイン要素が異なる可能性が発見された。また、伝統的か現代的かというような評価では一般者の意見は割れる傾向にあるなど、知識量の差が感性評価に影響を与える。これらのことを論文として整理し投稿中であるが、商品推薦システム設計の際には、物理、感性及び文脈属性を適切に注意深く選択・決定する必要がある。本研究の当初計画であった「多様な情報の統合化手法の応用と検証」「統合化オペレータの振る舞いの分析」「文脈情報を考慮した意思決定分析の理論化(階層的モデリング)」に関して本年度までに実用レベルに達したと判断し、今後は、これらに基づいた推薦システムの開発に重点を移していく。ここで、「大きい」「高価な」などの物理属性によって絞り込んだ商品を、「可愛い」「重厚な」などの感性属性、あるいは「若者向き」「贈答用」などの文脈属性によって、さらに商品を絞っていくという階層的モデリングも検討したが、結論として、物理、感性及び文脈情報が混在する意思決定分析の統一的アプローチを提案することとなった。上記に関連して、様々な希望属性という情報を統合化する手法がいくつか提案されているが、本研究においてはそれらを比較検討するシミュレータを開発し、上記提案手法を含めて、次年度においてシミュレーションを繰り返して有効性を検証していく。その結果を受けて、感性情報と文脈情報を考慮した推薦システムの開発、知識構成システム論の考え方を取り入れた目標志向の感性的意思決定分析の方法論の確立を目指す。本研究の当初計画であった「多様な情報の統合化手法の応用と検証」「統合化オペレータの振る舞いの分析」「文脈情報を考慮した意思決定分析の理論化」に関して平成24年度までに実用レベルに達し、これらに基づいた「推薦システム」を開発してきた。また、本研究で開発した手法以外にも、様々な希望属性という情報を統合化する手法がいくつか提案されており、本研究においてはそれらを比較検討するシミュレータを開発し、シミュレーションを繰り返して提案手法の有効性を検証した。平成25年度は、推薦システムの検証と、最終目標である「目標志向の感性的意思決定分析の方法論」の確立を目指した。方法論は、研究代表者が研究を続けている「知識構成システム論」を理論的支柱として、平成24年度までに実施した研究成果を含んだフレームワークとした。平成24年度までの研究は「数理モデルに基づく意思決定分析」に対応するが、平成25年度はモデル化できない部分に対して知識ベースあるいは直接専門家に問い合わせをする「知識マネジメント」の方法論を付け加えた。数理モデルに基づく商品推薦においては、専門家が行うような柔軟な推薦を完璧に行うことは困難である。

従って、客観的・理性的なアプローチを補完するように、主観的・感性的なアプローチを用いて、推薦システム利用の有効性を高めなければならない。そのために最終年度では、上述のようにナレッジマネジメントを取り入れた「目標志向の感性的意思決定分析の方法論」を提案した。方法論はいくつかの国際会議において発表するとともに、本研究を中核として、感性による知識の総合化に関する英文図書Knowledge and SystemsScience: Enabling Systemic Knowledge Synthesisを出版した。本研究の当初計画であった多様な情報の統合化手法の応用と検証、統合化オペレータの振る舞いの分析、そして文脈情報を考慮した意思決定分析の理論化に関しては、これまでに実用レベルに達したと判断し、本年度は、感性的な要求を含んだ複数の要求に対応する商品の推薦システムの開発に着手した。そのためにまず、ある商店の特定のデータに基づいたモデリングと推薦システムのプロトタイプを開発した。また、モデルや手法の評価も主観的にならざるを得ないことから評価手法についても検討した。評価結果を受けて、本研究で提案するモデリングと情報統合化手法を確定し、評価実験データに基づいた推薦システムを開発した。その後、ある商店の多くの商品データを搭載したシステムとして発展させてユーザの反応を確かめつつシステムの改良を継続している。本年度は、推薦システムの開発と並行していくつかの新しい課題についても検討を加えた。それらは「デザイン要素自体の評価と、デザイン要素を製品に埋め込んだ際の評価の違いに関する検討」、「デザイン要素の組み合わせと、商品全体の感性評価との関係の検討」などである。これらの検討は推薦システムによる推薦結果のデータが集積された場合、それをデザイン支援に利用するためのものである。すなわち、システムによる推薦と消費者の反応という情報のフィードックにより、新たなデザインを検討するというシステムの拡張利用法を検討した。ところで、数学モデルに基づく商品推薦においては、専門家が行うような柔軟な推薦を完璧に行うことは困難である。そのために最終年度では、ナレッジマネジメントを考慮した「目標志向の感性的意思決定分析の方法論」を確立する。本研究では、感性的希望を含む様々な希望を統合して商品を推薦する手法の開発がメインテーマであるが、この理論的な部分はこれまでの2年間でほぼ完成できた。今後はシミュレーションを繰り返して有効性を実証する必要がある。これに基づいて、当初の計画であった「感性情報と文脈情報を考慮した推薦システムの開発」「目標志向の感性的意思決定分析の方法論の確立」は時間的な余裕をもって研究推進ができると確信する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
免疫系ヒト化マウスを用いた癌免疫回避機構解明と次世代遺伝子ワクチンによる克服戦略

近年、免疫チェックポイント抗体の遺伝子変異の多い癌に対する治験で治療効果が認められ、癌に対する有効性が示された。我々は同種担癌マウスにおいて抗原特異的な拒絶免疫を誘導する高分子ミセル内包遺伝子ワクチンを報告してきた。本研究においては免疫系ヒト化担癌マウスを樹立して、ヒト癌の免疫抑制・逃避機構の解明と遺伝子変異が少ない膵・胆道癌にも有効な次世代遺伝子ワクチン療法の開発を試みる。初めに免疫系ヒト化胆道癌マウスの作成条件の最適化を終え、膵癌モデルの作成が可能なことも確認した。膵・胆道癌患者検体における免疫チェックポイント分子および主要関連抗原の組織免疫染色条件を確立した。ヒト腫瘍抗原SART3遺伝子+アジュバント遺伝子(ヒトGMCSF+CD40L)から成る遺伝子ワクチンが、抗原特異的拒絶免疫と活性化免疫細胞の腫瘍内浸潤を誘導できることを、CTLアッセイ、テトラマーアッセイ、免疫組織染色にて確認した。また、腫瘍抗原や免疫チェックポイント分子に対する二重特異性抗体scFv遺伝子の構築に成功し、遺伝子発現によりin vitroの系で標的に対する活性を確認した。更に、両者の併用効果を検討し、PD-1単一抑制群に比較して、二重活性抗体分子発現で他の免疫チェックポイント分子も抑制した群がより高い治療効果を示す傾向を認めた。並行して、高分子ミセル内包遺伝子治療薬を簡便性に優れる経気道吸入薬とする為にドライパウダー化を検討し、ルシフェラーゼ遺伝子内包高分子ミセルのドライパウダー化に成功した。今後、遺伝子ワクチン+二重特異性抗体製剤のドライパウダー化と薬効・安全性の検討が求められる。以上の結果より、免疫チェックポイント抗体だけでは腫瘍組織への免疫細胞浸潤と特異的拒絶免疫の誘導が難しい癌に対しても、本研究で開発された次世代遺伝子ワクチン抗体分子療法は有望な治療戦略となる可能性が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。腫瘍抗原特異的な拒絶免疫を誘導する高分子ミセル内包遺伝子ワクチンのプラットフォーム構築に成功し、免疫系ヒト化担癌マウスを用いてヒト免疫細胞とヒト腫瘍の免疫応答を検討できる腫瘍免疫解析モデルを樹立しつつあります。近年、免疫チェックポイント分子PD1/PD-L1に対する抗体の肺癌や悪性黒色腫に対する抗腫瘍効果が報告されましたが、我々は類似の免疫チェックポイント分子の機能を制御するための抗体や核酸分子の基礎検討を終えています。本研究では、難治とされる膵・胆道癌患者検体における免疫チェックポイント分子の臨床・病理学的な検討を行い、免疫系ヒト化担癌マウスにおいて抗体や遺伝子・核酸導入により膵・胆道癌の免疫チェックポイント分子の機能を修飾してヒト免疫エフェクター細胞の免疫応答への影響を検討し、癌の免疫抑制・逃避機構の解明を進め、克服できる新しい遺伝子ワクチン免疫療法の開発に繋げます。加えて、高分子ミセル内包遺伝子治療薬を簡便性に優れる経気道吸入薬とするためにドライパウダー製剤化する方法を検討し、臨床応用に向けての基盤の確立を目指します。昨年度は、免疫系ヒト化担癌マウスの作成条件に関して、胆道癌TFK-1の移植条件の最適化を終えた。免疫チェックポイント分子の組織免疫染色条件も確立した。遺伝子ワクチンの構築に関しては、腫瘍抗原SART3遺伝子+アジュバント遺伝子(GM-CSF+CD40L)から成る遺伝子ワクチンの構築、及び免疫チェックポイント分子に対する二重特異性抗体scFV遺伝子の構築を終えている。臨床応用を見据えて吸入ワクチン製剤を作成する為に、ドライパウダー化に関しては、ルシフェラーゼ遺伝子内包高分子ミセルのドライパウダーの作成に成功しており、次年度に動物モデルにおける発現効率を検討する。研究目標の達成に必要な実験条件・モデルの確立に下記の如く成功し、おおむね順調に進展していると評価した。1.免疫系ヒト化担癌動物モデルの作成条件を確立した。2.免疫チェックポイント分子に関する免疫染色条件を確立した。3.免疫チェックポイント分子に対する二重特異性抗体scFv遺伝子の構築に成功した。4.高分子ミセル搭載遺伝子のドライパウダー化の条件を確立した。

並行して、高分子ミセル内包遺伝子治療薬を簡便性に優れる経気道吸入薬とする為にドライパウダー化を検討し、ルシフェラーゼ遺伝子内包高分子ミセルのドライパウダー化に成功した。今後、遺伝子ワクチン+二重特異性抗体製剤のドライパウダー化と薬効・安全性の検討が求められる。以上の結果より、免疫チェックポイント抗体だけでは腫瘍組織への免疫細胞浸潤と特異的拒絶免疫の誘導が難しい癌に対しても、本研究で開発された次世代遺伝子ワクチン抗体分子療法は有望な治療戦略となる可能性が示唆された。1.昨年度は免疫系ヒト化担癌マウスの作成条件を確立した。胆道癌TFK-1の移植条件の最適化を終えたが、今年度は種々の癌種での検討を進める。2.昨年度は免疫チェックポイント分子の免疫染色条件を確立した。今年度は患者膵癌組織から切片を作成し、ABC法にてPD-L1/ LAG3/ TIM3/腫瘍抗原の免疫染色を実施する。3.昨年度は腫瘍抗原遺伝子+GMCSF+CD40Lアジュバント遺伝子から成る遺伝子ワクチン、および免疫チェックポイント分子に対する抗体分子から成る二重特異性抗体scFv遺伝子のConstructの作成を終えた。今年度は、上記免疫系ヒト化担癌マウスにおいて高分子ミセルに遺伝子ワクチンと二重特異性抗体scFv遺伝子を一緒に内包して投与し、免疫チェックポイント抗体遺伝子療法の併用効果を検討する。評価項目としては、1腫瘍サイズ、2テトラマーアッセイ、CTLアッセイによる抗原特異的な拒絶免疫の誘導の有無、3腫瘍組織における免疫エフェクター細胞の集積の有無とケモカイン発現、4脾臓・リンパ節におけるサイトカイン・ケモカイン発現解析4.昨年度は高分子ミセル内包遺伝子の吸入による導入効率を評価する為に、ルシフェラーゼ遺伝子内包高分子ミセルのドライパウダーを作成した。今年度は動物モデルにおいて局所投与・吸入投与による遺伝子導入効率を検討する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ヒトサイトメガロウイルスによるヒトホメオボックス2E遺伝子活性化機構の解析

本年度の研究実績は次のようにまとめられる。1.培養細胞への感染実験に用いたHCMVウイルス高力価液は、感染細胞の培養上清より調整したものであり、ウイルス高力価液によるHOX 2E遺伝子の活性化は、ウイルス粒子の作用でなくHCMV-conditioned mediumとしての効果である可能性も否定できない。セントリコン(簡易微量濃縮器、アミコン社)を用いた分画法や高速遠心法によって活性分画を同定した。その結果、活性分画はHCMV-conditionedmediumではなくてウイルス粒子分画であることが確かめられた。2.これまでの実験結果からHOX 2E遺伝子の活性化には、新たな蛋白合成を伴わない蛋白キナーゼ(PK)の経路が介在する可能性が考えられた。PK-C系の賦活化が想定されるホルボールエステルTPAの単独負荷は奏功しなかったが、TPAには、HCMVによるHOX 2E遺伝子の活性化を強く抑制する作用が認められた。このTPAの抑制作用にPK-C阻害剤はcounteractしなかった。PK-A系の賦活化が想定されるdbcAMP単独負荷では、弱いながらHOX 2E遺伝子の活性化された。HCMVによるHOX 2E遺伝子の活性化経路にPK-A系が介在する可能性が示唆されたが、PK-C系の関与については解析不足のため今のところはっきりしない。3.HOX 2E遺伝子の発現調節機構そのものを理解しつつ、HCMV構造因子の作用機作を検討したい。例えば、HSV-1ウイルスの構造蛋白Vmw65がOct-1とDNA-蛋白複合体を形成する際の標的DNAシークエンスが報告されている。HOX 2E遺伝子上流域の構造や機能の特性を知るために、まず、上流域の分離を試みた。ゲノムファージライブラリーのスクリーニングにより、HOX 2E遺伝子上流域を含む約20kbのゲノムDNAクローン(HE-♯177)を得た。制限酵素マッピングを行い、HE-♯177から調整した断片をサブクローニングした。今後さらに構造と機能について調べる予定である。
プロービングアイテムマイニング：行動履歴データと紐付けないユーザプロファイリング

ユーザの反応を引き出すために使われる提示アイテムをプロービングアイテムと定義し,行動履歴に関する匿名化された大規模データセットから発見する手法,これを利用してユーザプロファイルを構築する手法について研究する.本研究により,匿名化された行動履歴データを推薦対象ユーザと紐付けずに活用可能とすること,省エネルギーなどの社会問題解決に有効な行動変容支援への貢献が期待できる.ユーザの反応を引き出すために使われる提示アイテムをプロービングアイテムと定義し,行動履歴に関する匿名化された大規模データセットから発見する手法,これを利用してユーザプロファイルを構築する手法について研究する.本研究により,匿名化された行動履歴データを推薦対象ユーザと紐付けずに活用可能とすること,省エネルギーなどの社会問題解決に有効な行動変容支援への貢献が期待できる.
非構造部材・設備等取り付け部の耐震安全限界の解明と補強法の開発

非構造部材・設備等取り付け部の耐震安全限界の解明と補強方法の開発を行うため、被害や構法の分析から、繰り返し複合荷重を受ける埋め込みが浅いアンカーボルトおよび破壊形式に懸念の残るケミカルアンカーについて、実施例が多いが耐力的に問題がある要素として選び、本研究の実験対象とした。実験対象の終局挙動について、設定した実験条件のもとで、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行い、既存の取り付け部に関する安全限界を明らかにした。この成果をもとに、補強法を開発する基礎的な情報がまとめられた。本研究では、非構造部材・設備等の取り付け部の耐震安全限界を解明し、補強法を開発するために、3つの調査研究を並行して進める。まずこれまでの地震被害にもとづきつつ、現在一般的に行われている取り付け方法の構法的な調査と整理を行う。次にこれら非構造部材等の取り付け方法の実態に基づいた耐震安全限界に関する解析方法について検討する。さらに、解析につなげるために、一般的な取り付け部を中心とした基礎的な実験を実施する。これらを組み合わせて耐震安全限界を解明し、補強法を開発するものであるが、平成27年度は、本格的な実験開始のための準備段階として研究を進めた。まず、建物の使用期間に更新が行われることが多い空調機器など重量のある設備機器や天井を耐震化する際の吊り元など被害が大きな事故に繋がりうる非構造材の取り付け部については、耐震補強工事でも多用されるあと施工アンカーを中心に実用に供される取り付け部に関する調査を行い、現状を分析した。(清家、江口)解析については、取り付けられる非構造部材や設備機器、取り付ける先の建物をモデル化した非構造部材・設備機器ー建物連成系の数値解析に着手した。また、取り付け部の耐震安全性を検証するための実験を行う上で再現すべき取り付け部における地震時の外力条件など実験条件を検討した。(元結)数値解析結果に基づき検討した実験条件の下で、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行う予定だが、平成27年度は、実験条件がまだ整っていないため、試験体製作などの実験準備を行った。(山田)平成27年度は、本格的な実験開始のための準備段階として研究を進めた。まず、建物の使用期間に更新が行われることが多い空調機器など重量のある設備機器や天井を耐震化する際の吊り元など被害が大きな事故に繋がりうる非構造材の取り付け部について、耐震補強工事でも多用されるあと施工アンカーを中心に実用に供される取り付け部に関する調査を行い、現状を分析した。(清家、江口)データはある程度集まったが、まだ十分とはいえず、代表的な取り付け部を抽出するために継続してデータ収集を行う。解析については、取り付けられる非構造部材や設備機器、取り付ける先の建物をモデル化した非構造部材・設備機器ー建物連成系の数値解析に着手した。(元結)また、取り付け部の耐震安全性を検証するための実験を行う上で再現すべき取り付け部における地震時の外力条件など実験条件を検討した。なお、調査・分析結果を待って数値解析を開始すると研究成果が出るまで時間を要することから、非構造部材・設備機器に関する過去の地震被害を踏まえて予備解析に着手予定であるが、これは引き続き継続して検討する。数値解析結果に基づき検討した実験条件の下で、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行う。(山田)実験については、解析から取り付け部に関する安全性検証実験の実験条件を整理しなければならないが、そこまで解析の検討が進んでいないため、ある程度代表的な対象を選定して実験の準備を進めている。また、試験体製作などの実験準備を実用に供される取り付け部の現状に関する調査・分析と並行して進めなければならないことから、重点的に検討すべき取り付け部は非構造部材・設備機器に関する過去の地震被害を踏まえて選定し、数値解析結果に基づくパイロットテスト用の実験条件を踏まえて予備的な実験の準備を整えた。平成27年度に行った、取り付け部の現状の調査・分析結果から抽出した重点的に検討すべき取り付け部について、取り付けられる非構造部材や設備機器、取り付ける先の建物をモデル化した非構造部材・設備機器ー建物連成系の数値解析をある程度実施し、取り付け部の耐震安全性を検証するための実験を行う上で再現すべき取り付け部における地震時の外力条件など実験条件を整理した。そのなかで繰り返し複合荷重を受ける埋め込みが浅いアンカーボルトについて、実施例が多いが耐力的に問題がある要素として選び、終局挙動について、設定した実験条件のもとで、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行い、既存の取り付け部に関する安全限界を明らかにした。実験による検証に加えて、数値解析についても試行的に取り組んだ。実験が途中段階ではあるが、最終年度に向けての解析を行い、実験の進捗とともに、解析についてもとりまとめていく。平成27年度に引き続き数値解析ならびに実験を同じ分担者が担当した。(元結、山田)一方、地震時における非構造部材の状況を再現する実験を行うことで、既存の取り付け部における耐震上の問題点が工法毎に明らかとなることから、平成28年度は既存の取り付け部の補強方法および新しい取り付け方法の検討に着手した。補強方法および新しい取り付け方法の検討は、代表者(清家)を中心に、施工性など構法面の切り口から非構造の専門家である清家、江口が、力学的性能面の切り口から構造の専門家である元結、山田が協力して取り組み、実効性の高い成果に結びつける予定である。平成27年度、28年度の2カ年で、当初予定していた重点的に検討すべき取り付け部については、繰り返し複合荷重を受ける埋め込みが浅いアンカーボルトに対象を絞り、その中で終局挙動を求める実験を行うことができた。

つまり、重点的な対象を絞り、その実験を実施できたことで、本研究の中心となる部分の成果はある程度確保できたといえる。一方で実験およびこれらの解析については、最終年度まで検討が必要であり、当初の計画通りの進捗である。また、補強方法の提案については、実験も途中段階だったこともあり、進捗は若干遅れている。しかし、全体の成果に向けての進捗としては、おおむね順調に進展しているといえる。これまでの研究実績として、近年地震被害が多く見られるようになった非構造部材について、その取り付け部の耐震安全限界の解明と補強方法の開発を行うため、基礎的な実験を実施してきた。平成27年度は非構造部材の取り付け部分に関する数値解析結果に基づき検討した実験条件の下で、取り付け部の要素の繰り返し載荷実験を行うための実験条件を検討し、試験体製作などの実験準備を行った。平成28年度は非構造部材の取り付け部の構法分析の結果とあわせて、繰り返し複合荷重を受ける埋め込みが浅いアンカーボルトについて、実施例が多いが耐力的に問題がある要素として選び、終局挙動について、設定した実験条件のもとで、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行い、既存の取り付け部に関する安全限界を明らかにしようとした。しかし、この実験では、安全限界の最低限の評価まではできたが、予算に応じた試験体数の制約から、評価式の信頼性という点で提案にまでは至らなかった。平成29年度については、平成28年度に実施した結果をうけて、繰り返し複合応力下における破壊形式に懸念が残るケミカルアンカーを対象とした追加実験を実施し、平成28年度の実験と整合する結果を得た。その結果、非構造部材の取り付け部の評価として信頼性の点で必要とされる実験数が整ったことから、論文として取りまとめ公表する。今後はこの成果をもとに、非構造部材の耐震性に関連する各種指針類への反映を目指していく。非構造部材・設備等取り付け部の耐震安全限界の解明と補強方法の開発を行うため、被害や構法の分析から、繰り返し複合荷重を受ける埋め込みが浅いアンカーボルトおよび破壊形式に懸念の残るケミカルアンカーについて、実施例が多いが耐力的に問題がある要素として選び、本研究の実験対象とした。実験対象の終局挙動について、設定した実験条件のもとで、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行い、既存の取り付け部に関する安全限界を明らかにした。この成果をもとに、補強法を開発する基礎的な情報がまとめられた。平成28年度は、平成27年度に行った、取り付け部の現状の調査・分析結果から抽出した重点的に検討すべき取り付け部について、取り付けられる非構造部材や設備機器、取り付ける先の建物をモデル化した非構造部材・設備機器ー建物連成系の数値解析を本格的に実施し、取り付け部の耐震安全性を検証するための実験を行う上で再現すべき取り付け部における地震時の外力条件など実験条件を整理する。設定した実験条件のもとで、重点的に検討すべき取り付け部を対象に、取り付け部要素の繰り返し載荷実験を行い、既存の取り付け部に関する安全限界を明らかにする。
花における二次代謝化合物の修飾メカニズムの解析

カーネーション(Dianthus caryophyllus)においてアントシアニンの5位に糖を転移する酵素について、またデルフィニウム(Delphinium grandiflorum)などにみられるアントシアニン7位の糖修飾を触媒する酵素活性はこれまでに報告がなかった。本年度の研究では、カーネーション花弁において糖ヌクレオチドではなく、バニリル-β-D-グルコース(VG)を用いたアントシアニン5位配糖化酵素反応を触媒する酵素が存在していることを突き止めた。VGは植物体から精製し、各種分光学的手法によって同定した。また、デルフィニウム花弁粗酵素液を用いて、VGを糖供与体として、アントシアニン3-グルコシドを糖受容体として反応させたところ、アントシアニン3,7-ジグルコシドの生成が確認された。そこでカーネーション花弁からアシルグルコース依存型アントシアニン配糖化酵素(AAGT)の精製を行い、得られたアミノ酸配列情報をもとにAAGTcDNAを獲得した。AAGTcDNA組換え大腸菌はAAGT活性を有した。カーネーションにおけるAAGT遺伝子の発現は、花弁の早い時期で極大になることが確認された。また、アントシアニンの5位の糖が欠損した欠損体の花弁の表皮細胞にAAGTcDNAを一過的に導入したところ、アントシアニン5位配糖体に由来する特徴的な蛍光が観測された。AAGTアミノ酸配列は、βグリコシダーゼとして知られるglycoside hydrolase family1(GH1)と高い同一性を有した。またAAGTの酵素学的解析を行った結果、AAGTは,非常に安定で反応速度がゆるやかであり、3位配糖化アントシアニンを特異的に認識する一方で、幅広いアシルグルコースを基質としうることが明らかとなった。アシル・グルコース依存型アシル基転移酵素に関して、この酵素をコードするcDNAの配列がserine carboxypeptldase like protein(SCPL)に分類されることが既に明らかとなっている。先の研究で、ニンジン及びハマボウフウ培養細胞の粗酵素における、アシル・グルコース依存型アシル基転移酵素活性を見出しいた為、この酵素をコードするcDNAの単離を試みた。まず、SCPLの保存された配列を基にディジェネレートプライマーを作成し、ニンジン及びハマボウフウ培養細胞より作成したcDNAライブラリーをテンプレートとして、ディジェネレートPCR法で両種のSCPLホモログ部分長を単離した。得られた配列の内部に新たにプライマーを作成し、N末端、C末端のクローニングを行い全長cDNAを得た。ニンジン培養細胞において、4種のSCPLホモログ(DcSCPL1A,DcSCPL1B,DcSCPL3A,DcSCPL3B)を、ハマボウフウ培養細胞においては、4種類のSCPLホモログの部分長を単離した(図1)。その後、ニンジン培養細胞の4種類のSCPL酵素の組換え酵素における、アシル基転移酵素活性の測定を試みた。組換え大腸菌作出用にpDEST14、酵母用にpYES DEST52、植物用にpBI-ox-GWベクターに導入し、大腸菌株KRX、酵母、タバコ培養細胞を用いて形質転換を行った。いずれの組換え体においてもタンパク質の誘導が行われず、アシル・グルコース依存型アシル基転移酵素活性は検出できなかった。また粗酵素における両種のアントシアニンAT活性の反応至適条件の検討を行った。両種の反応至適pHは6.5付近であり、反応至適温度はニンジンにおいて40°C、ハマボウフウにおいて50°C付近であった。更に、ニンジンアントシアニン合成培養細胞より単離した4種のSCPLホモログのアントシアニンを合成する培養細胞、合成しない培養細胞で発現量を解析したところ、いずれのホモログもアントシアニンを合成しないニンジン培養細胞での発現量は検出限界以下だったため、これらがアントシアニンの合成に関わっていることに矛盾しない結果を得た。
コーヒー豆粉砕時における熱発生および熱伝達挙動の解析

コーヒーは,我々に「癒し」や「ひらめき」を与えてくれるとされる日本人にとってもはや一般的になった嗜好品である.さらに,生理的星医学的にも見直され,近年ますますその効果の研究が盛んになっている.毎日の生活の中で取り入れられている嗜好品として,コーヒーはその香味や新鮮な風味を維持しているかがしばしば問われることになるが,コーヒーが飲料の形になるまでは,生産国から輸入した生豆の状態から,選別・焙煎を経て,さらに粉砕という過程を経る.とくに,この時に発生する摩擦熱により,香味や風味が損なわれるとされていることから,本研究では,家庭用の手挽きコーヒーミルでどれほどの熱が発生し,美味しさや成分にどのような影響があるのかを解明することを目的とした.本研究では,新鮮な焙煎豆をグラインドし,その時に発生する粉砕熱を熱電対により測定したコーヒーミルにはカリタKH-3を使用し,粒度のサンプルをとった.次に,実験装置の構築のために3D-CADでミルをトレースした.なお,コーヒーメーカーにより抽出したコーヒー飲料に含まれるクロロゲン酸成分を,高速液体クロマトグラフィーを用いて測定することを予定していたが,装置の都合により,粉砕熱を測定するところまでを実施した.測定の結果,2人分のコーヒー豆26gを,特に意識しないスピードで粉砕する際に,ミルの粉砕物が堆積する底部において5°C程度の温度上昇が確認できた.なお,本研究は国内の企業から研究協力をいただき,コーヒー起源伝説に関しての研究へと繋げることができた.その研究においては,コーヒー果実にもカフェインが含まれていることが明らかになり,コーヒー果実を煮出した液体と果実を搾った液体に含まれているカフェイン量をそれぞれ調べた結果,含有量はコーヒー飲料には及ばないものの,人体に覚醒効果をもたらすことができる十分な量と推測できた.(782字)コーヒーは,我々に「癒し」や「ひらめき」を与えてくれるとされる日本人にとってもはや一般的になった嗜好品である.さらに,生理的星医学的にも見直され,近年ますますその効果の研究が盛んになっている.毎日の生活の中で取り入れられている嗜好品として,コーヒーはその香味や新鮮な風味を維持しているかがしばしば問われることになるが,コーヒーが飲料の形になるまでは,生産国から輸入した生豆の状態から,選別・焙煎を経て,さらに粉砕という過程を経る.とくに,この時に発生する摩擦熱により,香味や風味が損なわれるとされていることから,本研究では,家庭用の手挽きコーヒーミルでどれほどの熱が発生し,美味しさや成分にどのような影響があるのかを解明することを目的とした.本研究では,新鮮な焙煎豆をグラインドし,その時に発生する粉砕熱を熱電対により測定したコーヒーミルにはカリタKH-3を使用し,粒度のサンプルをとった.次に,実験装置の構築のために3D-CADでミルをトレースした.なお,コーヒーメーカーにより抽出したコーヒー飲料に含まれるクロロゲン酸成分を,高速液体クロマトグラフィーを用いて測定することを予定していたが,装置の都合により,粉砕熱を測定するところまでを実施した.測定の結果,2人分のコーヒー豆26gを,特に意識しないスピードで粉砕する際に,ミルの粉砕物が堆積する底部において5°C程度の温度上昇が確認できた.なお,本研究は国内の企業から研究協力をいただき,コーヒー起源伝説に関しての研究へと繋げることができた.その研究においては,コーヒー果実にもカフェインが含まれていることが明らかになり,コーヒー果実を煮出した液体と果実を搾った液体に含まれているカフェイン量をそれぞれ調べた結果,含有量はコーヒー飲料には及ばないものの,人体に覚醒効果をもたらすことができる十分な量と推測できた.(782字)
材料劣化・高サイクル疲労の相互連成作用を受けるコンクリート構造物の性能照査手法の開発

多くの補修・補強対策では、劣化損傷要因を取り除き、原状復帰を目指す事が基本方針であるといえる。しかし、定着部損傷を有する場合、損傷が顕在化している端部を直接補強しても、その効果に乏しい恐れが多分にある。その上、定着部への直接的な補強行為は施工に多大な困難を伴う。そこで定着領域の損傷部に直接的な補強を行うのではなく、ひび割れが進展してくると予想される領域に対し、先行して限定補強を施すことで得られる補強の効果を検討した。事前に行った解析からはこの種の補強が有効であることを示す解析結果が得られており、実験ではこの効果を検証することを目的としたものである。補強箇所が少なく、かつ高い効果を得るため、通常せん断補強に用いるものよりも太径の鉄筋を集中せん断補強筋としてRC梁に組み込んだ。しかし、実験結果は事前解析の結果と異なり補強効果が現れない結果となった。原因は模擬損傷面上から発生したひび割れが補強筋と交差せず、それに沿うように鉛直に立ち上がったため、期待した補強効果が発揮されなかったことであった。実験結果と事前解析結果の比較検討を行ったところ、剛性の急変を伴わないような補強材を配置し、応力が補強箇所と交差するように流れるようにすることで予見された補強効果が得られる可能性があること、損傷面での摩擦によって進展してくるひび割れの方向が変わること、が明らかになった。そこでせん断伝達モデルを元に人工損傷ではなく、通常のひび割れ面でのせん断伝達を摩擦力学的に表現したところ、摩擦係数が4.0程度のものとなることがわかった。この場合ひび割れは載荷点に向かって直線的に延びることから、本研究で考案する補強効果が見込めるものと考えられる。以上の成果を元に、剛性の急変を避けるため、せん断スパン内のみをシートで一様に巻きたてるとして再度検討を行い、解析上大きな補強効果が見込めることが明らかになった。
関節リウマチ・強皮症におけるβ1インテグリン関連分子の病態生理的意義の研究

β1インテグリンは、メモリーT細胞に多く発現する共刺激分子である。本研究は、関節リウマチでの炎症や、強皮症での膠原繊維増生におけるβ1インテグリンとその関連分子Cas-L及びテトラスパニンについて解析を行った。1)Cas-LのTCR/β1インテグリン共刺激依存的細胞遊走能・細胞活性化能とraft移行性との構造活性相関の解析:シグナル伝達、接茄、物質の細胞内輸送等の細胞機能に重要な役割を果たしているlipid raftにCas-Lが局在すること、RNAiによるCas-Lの抑制が共刺激による細胞遊走能・IL-2産生の低下を招くことを明らかにした。2)関節リウマチにおけるRANKL/IKK/NF-κBシグナル系とCas-Lの相互作用及びその病態生理的意義の解析:Cas-LがIL-1,TNF-α等の炎症性サイトカインのシグナル伝達に重要なNF-κB系の中心に位置するIKK-α,β及びTRAF6と結合することを明らかにした。また、定量PCR法により、骨の破壊やリモデリングに関与する破骨細胞への分化誘導性サイトカインであるRANKLにより、p130Casの発現上昇とCas-Lの発現低下を見出した。3)強皮症におけるTGF-β/Smadシグナル系とCas-Lの相互作用とその病態生理的意義の解析:293T細胞を用いた過剰発現系とヒト肝癌細胞株Huh-7における、Smad6,7とCas-Lの結合と共局在を明らかにした。siRNAを用いた解析により、Cas-LとSmad6,7との相互作用は、TGF-βの細胞増殖抑制作用及び転写活性化作用を亢進することを明らかにした。TCR/β1インテグリン共刺激によるT細胞活性化・遊走能の上昇には、細胞内ドッキング蛋白質Cas-Lが必須である。また、インテグリンと会合する4回膜貫通分子テトラスパニンも、細胞増殖・遊走に対して重要な役割を担っている。本研究は、関節リウマチ・強皮症におけるインテグリンとその関連分子の重要性について、以下の点を明らかにした。1)Cas-Lとアダプター蛋白Nckがチロシンリン酸化依存性に結合する事、これらの蛋白がシグナル伝達等種々の細胞機能に重要なlipid raftへ移行する事を見出した。また、Cas-Lのraft移行ドメインがC末にある事を欠損変異体の解析により明らかにした。2)Cas-LがIL-1,TNF-α等の炎症性サイトカインによるシグナル伝達に重要なNF-κB系の鍵となる分子であるIκB kinaseと結合する事を見いだした。さらに、骨破壊に関与する破骨細胞への分化誘導サイトカインであるRANKLによるCas-L homologueであるp130Casの発現上昇を見いだした。これらの成果は、インテグリン由来シグナル伝達機構及び、炎症部位でのメモリーT細胞の活性化と遊走機構の解明、関節リウマチにおける炎症と骨破壊、強皮症における線維化の機序の解明とその治療法開発につながるものである。本研究は、関節リウマチでの炎症や、強皮症での膠原繊維増生におけるβ1インテグリンとその関連分子Cas-Lについて解析を行った。1)Cas-LのTCR/β1インテグリン共刺激依存的細胞遊走能・細胞活性化能とraft移行性との構造活性相関の解析:シグナル伝達、接着、物質の細胞内輸送等の細胞機能に重要な役割を果たしているlipid raftにCas-Lが局在すること、RNAiによるCas-Lの抑制が共刺激による細胞遊走能・IL-2産生の低下を招くことを明らかにした。これらの事から、Cas-Lのraftへの局在は、細胞遊走・活性化において重要な役割を果たしている事が示唆された。2)関節リウマチにおけるRANKL/IKK/NF-κ