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感染症ダイナミクスに関する数理モデルの解析

体内で病原体が増殖する様子や,社会において感染症が広がっていく様子を記述する数理モデルの解の性質を調べる研究を行なった.主な成果はリアプノフ関数と呼ばれる関数を系統的に構成する方法を考察し,それを幾つかのモデルに適用したものである.リアプノフ関数が分かれば,解はその値を減らす方向に動いていく事から,解の挙動が分かる.しかし,リアプノフ関数を構成する一般的な方法は無く,この方法は適用範囲が限られている.本研究では,既に知られているリアプノフ関数を用いて新しいリアプノフ関数を構成するという方法を用いた.体内で病原体が増殖する様子や,社会において感染症が広がっていく様子を記述する数理モデルの解の性質を調べる研究を行なった.主な成果はリアプノフ関数と呼ばれる関数を系統的に構成する方法を考察し,それを幾つかのモデルに適用したものである.リアプノフ関数が分かれば,解はその値を減らす方向に動いていく事から,解の挙動が分かる.しかし,リアプノフ関数を構成する一般的な方法は無く,この方法は適用範囲が限られている.本研究では,既に知られているリアプノフ関数を用いて新しいリアプノフ関数を構成するという方法を用いた.1.体内レベルの感染症動態の研究。(1)未感染細胞、感染細胞、ウイルス、細胞性免疫の4者の相互作用において、感染項が飽和型になっているモデルに対して、共同研究を行った。時間遅れに関しては、感染細胞が感染力を持つようになるのに必要な時間と、免疫が働くようになるまでに必要な時間の両者を対象にした。取り入れる時間遅れに対していくつかのパターンを設定し、それらの方程式に対して平衡点の安定性に関する結果を得た。これは、現在盛んに行われている、ウイルスダイナミクスの大域挙動の研究のひとつとして意義ある結果であると思われる。(2)体内のウイルスダイナミクスを記述する微分方程式系に遅れを取り入れた際に、遅れの無い方程式に対するリアプノフを利用して、遅れのある方程式に対するリアプノフ関数を構成する方法について共同研究を行った。まだ、一般的な結果とは言えないが、かなり多くのモデルに対してこの方法が適用出来ることが分かった。リアプノフ関数の構成に関しては、Korobeinikov(2004)、McCluskey(2010)の研究の影響で、研究に拍車がかかってきたが、それらは個別の方程式に関して計算を行うものであり、それがうまくいく「からくり」は、よく分かっていない。本研究はその「からくり」にせまろうとするものであり、大いに意義がある。2.社会レベルの感染症動態の研究。ウイルスの突然変異による毒性の進化に関するモデルの解析を行った。重複感染がある場合に毒性の強い方向に進化が進みうる事が知られているが、そこでは宿主が移入により増えるモデルが用いられている。本研究では、宿主のダイナミクスにロジスティック項を採用したモデルとの比較を行い、進化の方向に関しては両モデルとも同じ数学的な構造を持つという結果を得た。本研究は、病原体ダイナミクスの進化への応用を数理の立場から見るという意義がある。リアプノフ関数を利用した関数方程式系の定性理論において,前年度の共同研究の成果を踏まえ,さらに研究を進めることができた.ここでは,時間遅れのある微分方程式に対するリアプノフ関数の構成法に関して,ある程度整理された方法を得る事ができた.それは,時間遅れのある微分方程式に対するリアプノフ関数を,対応する常微分方程式に対するリアプノフ関数を利用して構成するというもので,この方法がうまく機能する場合には,複雑な計算は常微分方程式に対するリアプノフ関数に関する計算部分に集約され,遅れに関係する部分の計算は比較的簡単になる.本研究では,感染症ダイナミクスを記述するいくつかの具体的な数理モデルに対して,この方法が適用出来る事を確認し,その方法といくつかの例(体内レベルの感染症ダイナミクスモデルの例および集団レベルの感染症ダイナミクスモデルの例)をまとめて論文にすることが出来た(Nonlinear Analysis: Real World Applications,2012).この研究結果は,今後現われるであろう様々な数理モデルに対しても適用する事が出来る可能性が高いと期待している.また,時間遅れによって平衡点が不安定化する場合には,必然的にこの方法は適用できないわけであるが,その場合においても本方法が適用できないからくりを考察することにより,平衡点の不安定化に関する何らかの新しい視点が得られるかもしれない.以上に述べたように,様々な数理モデルに対して適用できる可能性を持つ事,そして今後の研究の発展の足がかりになる可能性を秘めている事などに意義を持っていると考える.基本的な常微分方程式系に対するリアプノフ関数を用いて,その常微分方程式系に新たな未知変数や新たな項を追加して得られる常微分方程式系のリアプノフ関数を構成する方法を考察し,それを体内の感染症ダイナミクスを記述するいくつかのモデルに応用した.具体的には,ターゲット細胞,感染細胞,ウイルスの三者の相互作用を記述する常微分方程式系(感染項は質量作用型ではなく,より一般な形.ただし,適当な条件を課す.また,いわゆる病原体の吸収効果は無視している)に対するリアプノフ関数を用いて,この常微分方程式系に新たな変数として細胞性免疫の強さを追加して得られる常微分方程式系のリアプノフ関数を構成した.また,ターゲット細胞,感染細胞,ウイルスの三者の相互作用を記述する常微分方程式系(感染項は質量作用型ではなく,より一般な形.ただし,適当な条件を課す)で,病原体の吸収効果を無視したものに対するリアプノフ関数を用いて,病原体の吸収効果を取り入れた常微分方程式系に対するリアプノフ関数を構成した.また,齢構造を含む微分方程式系や無限の遅れを持つ微分

方程式系に上記の方法を応用する研究の準備として,これらの方程式系を扱う上で基礎となる事項についての調査を行なった.また,空間構造を考慮した感染症伝播モデルの研究では,個体ベースモデルの基本的なプログラムを作成した.これは,各個体が2次元トーラス格子上をランダムウオークし,感受性者が感染者と接触することにより感染するというもので,SIS感染症モデルとSIR感染症モデルの両方に対してプログラムを作成した.この基本プログラムは,今後本格的なシミュレーションを行なうための準備である.遅れのない方程式系のリアプノフ関数を用いて,遅れのある方程式系のリアプノフ汎関数を構成する方法は,昨年度論文が出版された(Kajiwara and Sasaki 2012)が,そこで述べた方法の応用について研究を行なった.ここでは,感染可能者,潜伏期にある者,感染者を変数とするSEIRモデルにおいて,それぞれをn個のグループに分けるモデルを考えている.また,インシデンス関数は(増大度などに条件を付けた)一般的な関数に拡張したものを扱っている.このモデルに時間遅れを入れたモデルに対して,リアプノフ汎関数を構成することに成功した.これは,Guo et.al. (2006)やLi and Shuai (2010)が遅れのない方程式系に対して得た結果に,上述の我々の結果の方法を適用し,更にHuang and Takeuchi (2011)で述べられている手法を用いる事によって得られたものである.現在は,この結果を論文にまとめるために,先行研究を確認し,我々の結果を整理する作業をしているところである.リアプノフ関数が知られている(遅れの無い)常微分方程式系に対して,更に未知変数を増やした(遅れの無い)常微分方程式系のリアプノフ関数を構築する方法については,体内のウイルスダイナミクスを記述するモデルにおいて,インシデンス関数を一般化したモデルやウイルスの吸収効果を取り入れたモデルについて,ある程度の結果を得た.これについては,上述の論文制作が済んだら,研究を進め論文出版に向けて作業をする予定である.また,変数分離の方法によるリアプノフ関数の構成法を体系的に考察しているが,これに関しては,1捕食者・1被食者系ではあるが,かなり一般的な形の方程式に対しても変数分離の方法が適用出来る事が分かった.1.ある常微分方程式系の平衡点に対するリアプノフ関数を利用し,その微分方程式系に新たな未知変数を加える事により得られる常微分方程式系に対するリアプノフ関数を構成する方法に関する研究を進めた.具体例を挙げると, 3つの未知変数(病原体,未感染細胞,感染細胞)を持つ常微分方程式系と,それに新たな変数(免疫)を加えた常微分方程式系が挙げられる.この方程式系をひとつのプロトタイプとし,より一般的なフレームワークにおいて考察を行なった.これを応用し,より複雑なモデル(感染後に病原体が細胞内に吸収される効果を取り入れたモデル等)に対するリアプノフ関数を構成した.この方法は更に発展する可能性がありその意義は大きいと思われる.
薄膜の熱物性評価のための新規な熱波顕微鏡システムの開発

本研究では,申請者がこれまでに開発してきた光音響顕微鏡システムに表面プラズモンによって励起する熱波を組み合わせた光音響顕微鏡システムの改良型ともいえる新規な熱波顕微鏡システムを開発することを目的とする。表面プラズモンの励起には取り扱いが簡単であるKretschmann法を用い,プリズムに銀を真空蒸着し,全反射減衰法(ATR法)を用いて実験を行った。厚み50.2nmの銀薄膜の表面プラズモンが43.6度で最大に励起することを実験および理論的に明らかにした。表面プラズモン励起によって生じた熱源を光音響信号の生成に使うためにレーザ光をメカニカルチョッパーで強度変調し,プリズムに取り付けられる特殊な光音響セルを作成し,高感度マイクロホンで光音響信号を測定した。その結果,従来の方法に比べて光音響信号振幅を最大20倍程度増強にできることを明らかにした。この結果より,表面プラズモンによって銀薄膜内に強力な熱源を形成できたものと思われる。さらに,光音響セルを使わない新たなセンサーが必要であることから,マイクロホンに変わるセンサー開発の前段階としてポジションセンサーによるレーザ光の変位を測定する光熱偏向法に関する実験を行った。プラズモンを利用した偏向角の検出方法についても実験的に検討し,偏向角の測定方法が確立できた。しかし,熱物性測定にまでは至らなかった。本研究では、申請者がこれまでに開発してきた光音響顕微鏡システムに表面プラズモンによって励起する熱波を組み合わせた光音響顕微鏡システムの改良型ともいえる新規な熱波顕微鏡システムを開発することを目的とする。表面プラズモンの励起には取り扱いが簡単であるKretschmann法を用いることにした。表面プラズモン励起のための臨界角を求めるシミュレーションを行い、厚み50nmの銀薄膜の場合、レーザ光の入射角が43.7度で表面プラズモンの励起が最大になることを明らかにした。これを確かめるために実際にプリズムに銀を真空蒸着し、全反射減衰法(ATR法)を用いて実験を行った。厚み50.2nmの銀薄膜の表面プラズモンが43.6度で最大に励起することを実験的明らかにした。表面プラズモン励起によって生じた熱源を光音響信号の生成に使うためにレーザ光をメカニカルチョッパーで強度変調し、プリズムに取り付けられる特殊な光音響セルを作成し、高感度マイクロホンで光音響信号を測定した。その結果、従来の方法に比べて光音響信号振幅を最大20倍程度増強にできることを明らかにした。この結果より、表面プラズモンによって銀薄膜内に強力な熱源を形成できたものと思われる。さらに、マイクロホンに変わるセンサー開発の前段階としてPVDF膜に関する信号検出の基礎実験を行った。PVDF膜の厚み、試料への固定方法、カップリング材について検討し、黒鉛の信号を測定できることを明らかにした。プリズムに銀を真空蒸着し、全反射減衰法(ATR法)を用いて実験を行った。しかし、光音響セルは試料形状に制約が生じ、新たなセンサーが必要であることから、マイクロホン(光音響セル)に変わるセンサー開発の前段階としてポジションセンサーによるレーザ光の変位を測定する光熱偏向法に関する実験を行った。また、プラズモンを利用した偏向角の検出方法についても実験的に検討した。その結果、ポジションセンサーの方が高分解能であることが明らかとなり、偏向角の測定方法が確立できた。
アルツハイマー病の早期発見:軽度認知機能障害の臨床的病因論的多様性の検討

1.新規アルツハイマー病(AD)治療薬導入による客観的画像評価と、脳脊髄液サンプルを用いたAD発症メカニズムの解明アセチルコリン神経の賦活作用を有する漢方薬の加味温胆湯を脳血管障害を伴ったAD症例に投与すると認知機能レベルだけでなく脳血流シンチにても改善効果を有することを確認した(J Am Geriatr Soc.2006)。また高血圧症がAD発症のリスクファクターであることが諸外国から報告されるようになり、その理由として脳内のACE活性上昇が軽度認知機能障害患者で目立っており、このことがAD発症に関与する可能性があることを脳脊髄液サンプルを用いて明らかにした(Neurology.2006.)。2.AD病理のモデル動物を用いた生体診断システムの確立AD病理学的変化を形成するトランスジェニックマウスにアミロイド斑を特異的に認識するPittsburgh Compound-Bを投与しmicroPET scanすると、生体レベルで病変部を3次元的に観察できることを証明した。PETイメージング剤を開発するにあたっては、ヒトに応用する前段階にモデル動物を用いてPET scanすることがトレーサーの動態、結合特性をモニターするための重要なアプローチであることを示した(Maeda J.et al.in press.)。3.ADの病理学的変化を画像化した臨床PET診断BF研究所と東北大学で共同開発されたアミロイド斑に特異的に結合する化合物であるBF227をPETイメージング剤として、ヒト臨床応用した。AD症例では健常者に比較し有意に集積の増加を認め、AD画像診断薬としての効能を有することを確認した。これはADの病理学的変化を描出するために本邦において初めて開発された診断薬を投与しPET撮影した臨床報告である(J Nucl Med.2007.)。1.病因論に基づく軽度認知機能障害およびアルツハイマー病の診断法開発軽度認知機能障害(MCI)からアルツハイマー病(AD)に至る分子機構として、アミロイド(Aβ)を分解する酵素であるネプリライシン(NEP)が脳内で低下することが剖検検討やモデル動物実験により示されている。そこで脳脊髄液中NEP値を評価したところ、MCIの段階ですでに低下しており、NEPの低下がADの発症に寄与することを生体レベルで証明した。本研究は理化学研究所脳科学総合研究センターの樋口真人、岩田修永、西道隆臣氏らとの共同研究により行われたものである(Ann Neurol.2005.)。脳脊髄液検査は精度の高い客観的なAD早期診断アプローチではあるが、侵襲性などの問題点から必ずしも総ての患者が受けられないのが現実である。そこで新しい診断法の開発に取り組んだところ、ADに特徴的な病理学的変化である神経原線維変化に特異的に結合する化合物を開発することに成功した。この候補化合物をポジトロンCT(PET)などに応用することにより非侵襲的診断法を確立できると期待される。本研究はビーエフ研究所の澤田徹氏、福祉村病院長寿医学研究所の赤津裕康氏らとの共同研究により行われたものである(J Neurosci.2005.)。2.発症分子機構に基づく治療法の評価ADの病理変化を食い止める治療法としては、in vitro実験において、リチウム投与によりAD病理学的変化を抑制できることが他施設から報告されている。そこで患者承諾のもと、3名のAD患者に少量からリチウム投与を開始し投与前および3ケ月後で臨床症状および脳脊髄液マーカーの評価を行ったが明らかな改善を認めなかった。(Geriatr Gerontol International.2005.)。
深部脳刺激による内在性神経前駆細胞の分化制御と神経再生誘導療法の開発

本研究は、内在性神経前駆細胞を活用した神経再生誘導療法を目指す。その開発において、細胞分化に関わる生物学的メカニズムを制御する手法の確立を進めることが極めて重要であると考え、本研究において深部脳刺激による神経前駆細胞の分化制御を試みた。深部脳刺激は、海馬歯状回に内在する神経幹細胞の活性化と増殖を促進し、神経幹細胞の活性化制御が極めて重要である事を示唆した。深部脳刺激は、内在性神経前駆細胞の分化を制御し得る方法の一つであると考えられた。本応募研究では、深部脳刺激法(deep brain stimulation : DBS)を用い、刺激の部位、強度、持続時間、頻度等を調節することにより、神経前駆細胞の領域特異的活性化・分化段階の制御、さらには新生神経細胞の誘導とその量の制御を試みる。DBSによる神経前駆細胞の分化制御を試みるに際し、平成21年度は、海馬貫通路の高頻度反復刺激(HFS)をDBSの刺激条件とし、また、神経前駆細胞分化を解析するための脳領域として海馬に焦点を絞った。貫通路は海馬歯状回に直接投射するので、直接海馬歯状回の神経活動を制御し得る。HFSにより、歯状回において電場電位の上昇を認めた。また繰り返し条件を変化させる事で、電場電位上昇の期間の延長をさせた。このように海馬貫通路HFSを用いて、海馬歯状回の神経活動を制御した。続いて、Thymidine analogueであるBrdUを用いて、神経前駆細胞の同定を行ない、DBSの効果を検討した。HFS後の1、2、7日後のいずれかにBrdUを投与し翌日還流固定する事で、海馬歯状回の主に増殖性の内在性神経前駆細胞を検出し定量した。HFS側でBrdU陽性細胞は増加していた。このBrdU陽性細胞の増加は、「神経幹細胞の活性化」と「神経前駆細胞のクローナルな細胞数の拡大」のどちらかまたは両方同時が、HFSにより促進されたと考えられた。それらを区別するために、BrdU陽性細胞の局在するコロニーの数(神経幹細胞の活性化を反映する)と1コロニーあたりのBrdU陽性細胞数(クローナルな神経前駆細胞の拡大を反映する)を、HFS側と非HFS側とで定量した。HFS側ではコロニー数が増加しており、神経幹細胞の活性化が促進された事を強く示唆した。一方で、コロニーあたりの細胞数は変化せず、DBSによる神経前駆細胞の増加は、主に神経幹細胞の活性化により達成されたと考えられた。このように、DBSは神経前駆細胞の増殖を促進するが、それは神経幹細胞の活性化を介していると考えられた。1、研究実施の概要:本研究は、神経活動を電気生理学的に制御する深部脳刺激法(deep brain stimulation : DBS)を用い、刺激の部位、強度、持続時間、頻度等を調節することにより、海馬歯状回における神経前駆細胞の領域特異的活性化・分化段階の制御、さらには新生神経細胞の誘導とその量の制御につなげるための基盤となる研究である。本研究を基盤として、うつ病などの精神・神経疾患に対する、内在性神経前駆細胞を活用した神経再生誘導療法を目指す。成体に内在する神経前駆細胞を利用した神経再生誘導療法の開発において、分化に関わる生物学的メカニズムと新生神経細胞の機能を制御し活用する手法の確立を進めることが極めて重要であると考え、本研究においてはDBSによる神経前駆細胞の分化制御を試みた。2、研究構想と研究内容:本研究を通じて、海馬貫通路DBSが海馬歯状回に内在する神経幹細胞の活性化と増殖を促進している事を見出した。それは、DBSによる細胞分化制御メカニズムの一つとして、初期ステップである神経幹細胞の活性化制御が極めて重要である事を示唆している。このように、DBSは神内在性神経前駆細胞の分化を制御し得る方法の一つであると考えられた。現在、DBSの強さ・刺激により生じる影響の期間とタイミングと細胞分化との関係などを明らかにしつつあり、今後、DBSによる内在性神経前駆細胞を活用した神経再生に最適な条件を見出したいと考えている。本研究の基本的方針は、神経活動の量的変化・神経細胞分化のそれぞれのステップに関わる量の制御・具体的な再生スケジュールなどを明らかにする事を通じて、現象論にとどまらない臨床応用へのアプローチを行うことである。そのような観点から本研究を継続したいと考えている。
陸域から沿岸域への放射性セシウムの移行動態解析と生態系への影響評価

2011年3月11日に発生した福島原発事故により環境中に放出された放射性核種の陸域と沿岸域での影響評価を行うために、主に福島県浜通りを調査地域に設定し、沈着した放射性セシウムの河川流域から沿岸域への二次的な移行動態を調べた。2011年5月から2014年12月までの観測結果では、河川水中の放射性セシウムの放射能濃度は、降雨時に一時的に増加するが、平水時には時間の経過とともに指数関数的に減少した。また、2011年度には、粒子態に含まれる放射性セシウムの存在割合が、それ以降の観測試料に比べて2030ポイント低く、放射性セシウムの河川への流出挙動が事故初期時とそれ以降では異なることが明らかとなった。福島原発事故により環境中に放出された放射性核種の陸域と沿岸域での放射能の影響評価を行うために、福島県浜通りを調査地域に設定し、沈着した放射性セシウムの土壌から河川への移行動態と河川から沿岸域への移行量を把握するとともに、沿岸域での放射性セシウムの挙動を解明することを目的に研究を開始した。平成24年度は、阿武隈川、宇多川、新田川、夏井川、鮫川の5河川8測点で23ヶ月毎に河川調査を実施した。また、放射性セシウムの輸送に及ぼす降雨の影響を評価するため、台風4号通過前後の2012年6月1921日に阿武隈川の4地点(上流部:白河、中流部:本宮、下流部:伊達、岩沼)において河川水1520L採水した。定量濾紙(東洋濾紙No.5A)及びメンブレンフィルター(0.45μm)を用いて濾過後、濾液からリンモリブデン酸アンモニウム沈殿法によりCsを分離、Ge半導体検出器を用いたγ線測定により河川水中の溶存態^<134>Cs、^<137>Csの放射能濃度を測定した。フィルター及び懸濁粒子を回収し粒子態放射性セシウムの割合を見積もった。その結果、台風通過後の6月20日に採取した河川水中の^<137>Csトータル濃度は、上流部の白河、中流部の本宮、下流部の伊達で、それぞれ0.59Bq/kg、2.34Bq/kg、4.00Bq/kgであり、2011年12月に採取した平水時における河川水中の^<137>Cs濃度に比べ、950倍高い値となった。また、平水時における粒子態^<137>Csの割合は、1139%であったのに対し降雨時にはその割合は著しく増加し、約99%が粒子態として存在・移行していることが明らかとなった。このことは、平水時に比べ降雨時には、^<137>Csを吸着した表層土壌侵食量の増加、河床堆積物の再懸濁等に伴い、粒子態^<134>Cs、^<137>Csの供給量が増加したことが要因と考えられる。平成25年度は、阿武隈川の上流から下流までの4地点、宇多川、新田川、夏井川、鮫川の下流域の各1地点で平水時の河川調査を実施した。また、放射性セシウムの輸送に及ぼす降雨の影響を評価するため、台風通過後の2012年10月1日、2013年10月17日あるいは22日に阿武隈川の下流1地点(岩沼)、宇多川、新田川、夏井川において調査を行った。新田川、宇多川、阿武隈川(岩沼)の河川水中の134Csと137Csの放射能濃度の系時変化は、平水時には全体的に減少する傾向を示した。阿武隈川河川水の懸濁態放射性セシウムの存在割合は7090%の変動幅で推移しているが、太平洋側の小河川(宇多川、新田川、夏井川、鮫川)では、2011年5月から2012年5月までの間に、懸濁態放射性セシウムの存在割合が約30%から徐々に増加する傾向にあった。これは、事故後には河川流域に沈着した放射性セシウムの水への溶存性が高いが、時間とともにエイジングの効果で流域土壌から溶出しにくくなることに関連していると考えられる。

一方、台風通過に伴う降雨の影響時に観測した2012年6月、2012年10月、2013年10月では、放射性セシウムの放射能濃度は各測点で増加した。新田川では、137Cs放射能濃度はそれぞれ、1.83Bq/L、1.68Bq/L、0.50Bq/Lと降雨により異なる変動幅であった。これは、事故後の時間経過により流域からの放射性セシウムの供給量が減少したか、あるいは降雨のタイプにより流出性が異なる可能性が考えられる。福島原発事故により環境中に放出された放射性核種の陸域と沿岸域での放射能の影響評価を行うために、福島県浜通りを調査地域に設定し、沈着した放射性セシウムの土壌から河川への移行動態と河川から沿岸域への移行量を把握するとともに、沿岸域での放射性セシウムの挙動を解明することを目的に研究を開始した。調査した福島県内の阿武隈川、宇多川、新田川、夏井川、鮫川河川水中の放射性セシウム濃度は、福島原発事故後の2011年の観測データも加えて解析すると、2014年12月までに指数関数的に時間の経過とともに減少する傾向が認められた。ただし、降雨時にはパルス的に放射能濃度は急激に増加した後、流量の減少とともに減少した。台風通過後の2012年6月20日に採取した河川水中の137Cs放射能濃度は、2011年12月に採取した平水時における河川水中の137Cs濃度に比べ、950倍高い値となった。また、平水時における粒子態137Csの割合は、2012年以降は7080%であったのに対し降雨時にはその割合は著しく増加し、約99%が粒子態として存在・移行していることが明らかとなった。このことは、平水時に比べ降雨時には、137Csを吸着した表層土壌侵食量の増加、河床堆積物の再懸濁等に伴い、粒子態134Cs、137Csの供給量が増加したことが要因と考えられる。沿岸域では津波により堆積物が浸食された夏井川・鮫川河口域で調査した結果、調査地点はいずれも砂質の河床堆積物で構成され、放射性セシウムの移行媒体である細粒懸濁粒子の沈着は殆ど起こっていなかった。また、新田川沖の調査では、水深20m以浅の海域では砂質の海底が大部分を占め、沿岸流による南方向への移動、あるいは降雨時に外洋域への移行が支配的であることが考えられる。一方、阿武隈川沿岸域では泥質の海底土が堆積する地点も存在していた。なお、いわき沿岸域の魚類の放射性セシウム濃度は、平成25-26年度の調査結果として国の基準値以下であった。26年度が最終年度であるため、記入しない。地球化学26年度が最終年度であるため、記入しない。計画されていた機器の整備、河川調査や沿岸域の予備調査が実施できた。また、2012年6月に台風通過時の降雨の影響を目的とした河川調査を行い、放射性セシウムの存在形態とともにそのフラックスを見積もり、降雨時の重要性を把握することが出来たため。計画されていた河川調査や沿岸域の調査が実施できた。また、継続的な平水時の河川調査とともに、台風通過後の降雨時影響に関する調査を行い、時系列での降雨の影響を把握することが出来た。また、新田川で河口域の調査も実施、河川と沿岸域を繋ぐ予備データが取得出来たため。河川流域から沿岸域への放射性セシウムの移行動態を継続して調査するとともに、その動態を把握するために各境界間での放射性セシウム移行挙動の支配要因を室内実験等により抽出し、定量的な検討を進める。河川流域から沿岸域への放射性セシウムの移行動態を継続して調査し、特に降雨時観測に重きをおいて河川調査を実施する。また、河川流域から供給される放射性セシウムの起源推定と河口域までの移行動態を検討するため、溶存態・粒子態ともに放射性セシウムと安定セシウムとの関係を検討する。さらに、懸濁粒子の物性測定、放射性セシウムの吸脱着過程、安定性を室内実験を実施し、将来予測に寄与できる移行動態に関する基礎データを提示するように研究を進める。消耗品等で残額が生じたため、H25年度には観測等に必要な消耗品を早めに執行する予定である。
骨芽細胞ならびに破骨細胞における情報伝達機構

歯周疾患などの慢性炎症の遷延化に伴って認められる骨代謝調節の破綻に関連して、骨芽細胞および破骨細胞の細胞内情報伝達機構の解明をめざしている。これまで得られた主な所見は以下の通り要約される。1.マウス骨髄培養系において、細菌リポ多糖(LPS)の破骨細胞形成に及ぼす影響を調べ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(CM-CSF)が関与することを明らかにした。2.上記の破骨細胞形成を調べる骨髄培養系においコロニー刺激因子(GM-CFS)が関与することを明らかにした。2.上記の破骨細胞形成を調べる骨髄培養系において、歯周病関連細菌3種の異なるタイプのLPS標品と合成リピドAは何れも破骨細胞形成に促進的であり、それぞれの効果はLPSのリピドA部分によって担われていることを示した。3.グルココルチルコイドの過剰量を長期間使用した際の副作用の一つとされている骨粗鬆症の病因に関連して、同じ骨髄培養系を用いて、デキサメサゾンが破骨細胞形成に促進効果を示し、この効果にはGM-CSFの産生抑制を介する機序が関与していることを明らかにした。4.マウス骨髄細胞と骨髄間質細胞株ST2との共存培養下で形成された破骨細胞様細胞を大量の成熟した細胞集団として純化し、この実験系を用いることによって、M-CSFおよびインターロイキン1(IL-1)が破骨細胞の延命効果に有利に働くことを明らかにした。5.骨基質中の増殖因子である塩基性腺維芽細胞成長因子(bFGF)が上記のマウス骨髄培養系やST2との共存培養系において破骨細胞様細胞の形成を抑制し,さらに同細胞による骨吸収(象牙片上での吸収窩の形成)を抑制することを見いだし、その機序の解析をおし進めた。6.株化骨芽細胞をIL-1で刺激する際、転写因子NF-κBの活性化が認められた。現在、上記4と同じ方法で純化した破骨細胞様細胞を用いてIL-1刺激によるNF-κBの活性化に関して予備実験的結果を得ている。歯周疾患などの慢性炎症の遷延化に伴って認められる骨代謝調節の破綻に関連して、骨芽細胞及び破骨細胞の細胞内情報伝達機構の解明をめざしている。1.株化骨芽細胞をインターロイキン1(IL-1)で刺激する際、転写因子NF-kBの活性化が認められた(未発表)。2.マウス骨髄培養系において、細菌性リポ多糖(LPS)の破骨細胞形成に及ぼす影響を調べ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が関与することを明らかにし報告した。3.上記の破骨細胞形成を調べる骨髄培養系において、歯周病関連細菌3種の異なるタイプのLPS標品と合成リピドAは何れも破骨細胞形成に促進的であり、それぞれの効果はLPSのリピドA部分によって担われていることを示した(論文準備中)。4.グルココルチコイドの過剰量を長期間使用した際の副作用の一つとされている骨粗鬆症の病因に関連して、同じ骨髄培養系を用いて、デキサメサゾンが破骨細胞形成に促進効果を示し、この効果にGM-CSFの抑制を介する機序が関与していることを明らかにし報告した。

5.マウス骨髄細胞と骨髄間質細胞株ST2との共存培養下で形成された破骨細胞様細胞を大量の成熟した細胞集団として純化し、この実験系を用いることによって、M-CSF及びIL-1が破骨細胞の生存維持に有利に働くことを明らかにした(論文準備中)。歯周疾患などの慢性炎症の遷延化に伴って認められる骨代謝調節の破綻に関連して、骨芽細胞および破骨細胞の細胞内情報伝達機構の解明をめざしている。これまで得られた主な所見は以下の通り要約される。1.マウス骨髄培養系において、細菌性リポ多糖(LPS)の破骨細胞形成に及ぼす影響を調べ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が関与することを明らかにした。2.上記の破骨細胞形成を調べる骨髄培養系において、歯周病関連細菌3種の異なるタイプのLPS標品と合成リピドAは何れも破骨細胞形成に促進的であり、それぞれの効果はLPSのリピドA部分によって担われていることを示した。3.グルココルチコイドの過剰量を長期間使用した際の副作用の一つとされている骨粗鬆症の病因に関連して、同じ骨髄培養系を用いて、デキサメサゾンが破骨細胞形成に促進効果を示し、この効果にはGM-CSFの産生抑制を介する機序が関与していることを明らかにした。4.マウス骨髄細胞と骨髄間質細胞株ST2との共存培養下で形成された破骨細胞様細胞を大量の成熟した細胞集団として純化し、この実験系を用いることによって、M-CSFおよびインターロイキン1(IL-1)が破骨細胞の延命効果に有利に働くことを明らかにした。5.骨基質中の増殖因子である塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)が上記のマウス骨髄培養系やST2との共存培養系において破骨細胞様細胞の形成を抑制し、さらに同細胞による骨吸収(象牙片上での吸収窩の形成)を抑制することを見いだし、その機序の解析をおし進めた。6.株化骨芽細胞をIL-1で刺激する際、転写因子NF-xBの活性化が認められた。現在、上記4と同じ方法で純化した破骨細胞様細胞を用いてIL-1刺激によるNF-xBの活性化に関して予備実験的結果を得ている。
ゲノムDNAを鋳型とする試験管内遺伝子転写系を用いた新奇SOX2複合体の機能解析

SOX2はiPS細胞作成に用いる転写因子である山中4因子の一つであり、その役割を明らかにすることは生命の仕組みの解明につながるだけではなく、再生医療の発展にも貢献すると考えられる。我々はSOX2を含む新奇なタンパク質複合体を同定し、複合体に含まれるタンパク質の特性を基にその生物学的役割の解析を進めている。既にSOX2が基本転写因子TFIIDのサブユニットであるTBPと複合体を形成し、協調してクロマチンと呼ばれるゲノムDNAの高次構造を再構築することと、試験管内で遺伝子転写を活性化し得ることを明らかにしている。更に、当研究課題の成果としてSOX2-TBP複合体はゲノムDNA上のrRNAの転写調節領域に結合すること、rRNAの転写をSOX2とTBPが協調して活性化することを新たに明らかにしている。平成31年度の研究実施の結果、SOX2とTBPが協調してrRNA転写開始領域のクロマチン構造を再構築し得る事を試験管内での実験で明らかにした。rRNA転写開始領域を含むプラスミドDNAを用いて試験管内で再構築したクロマチンにSOX2-TBP複合体を加えると、その結合領域近辺のヌクレオソームの位置に変化が生じることを確認した。この現象はSOX2やTBP単独では生じず、二つの協調が必要である。これまでの研究成果も踏まえ、SOX2-TBP複合体はrRNA領域のクロマチン構造を再構築することによりrRNAの転写を活性化することが予想される。平成30年度はSOX2-TBP複合体標的遺伝子の転写制御機構の解明を目的としていた。SOX2-TBP複合体はその標的遺伝子であるrRNA領域のクロマチン構造再構築に関与することを明らかにしたが、この再構築活性は遺伝子転写制御と密接な関係があることが知られており、目的達成のために順調に進捗したといえる。今年度はクロマチン再構築によるrRNAの転写制御に着目し研究を進める。作成したSOX2とTBPの変異体利用し、ふたつの協調による再構築のメカニズムを明らかにする。ヒストン変異体を用いてヒストン修飾との関連性を解析する。これらの試験管内での成果を基に生体内での解析を進める。本年度の研究の結果、SOX2-TBP複合体はゲノムDNA上のrRNAの転写調節領域に結合すること、rRNAの転写をSOX2とTBPが協調して活性化することを新たに明らかにした。クロマチン免疫沈降法(ChIP assay)のデータを解析した結果、rRNA転写開始点上流の同じ領域にSOX2とTBPの結合のピークが存在することから、SOX2-TBP複合体がrRNAの転写に何らかの影響を与えている可能性が示唆される。そこでrRNA転写開始点前後の領域のゲノム配列を含むプラスミドDNAからのrRNA転写を試験管内で再現した所、SOX2-TBPにより転写が活性化された。SOX2がrRNA転写を活性化する事は我々が今回初めて明らかにした。rRNA量が増加する事はタンパク質合成を促進すると考えられるが、これが細胞にどのような影響を与えるのかはまだ分かっていない。しかし、そのメカニズムの解析を進めることにより細胞の初期化から未分化維持、分化まで再生医療にとって重要な分野の知見が得られると考える。本年度の目標であったSOX2-TBP複合体の標的遺伝子を同定することができた。当初は全ゲノムDNAを用いた試験管内遺伝子転写法を用いて標的遺伝子を同定する予定であったが、ChIP assayのデータを解析することによりrRNAが標的であると明らかにすることができた。

平成30年度はSOX2-TBP複合体標的遺伝子の転写制御機構の解明を目的としていた。SOX2-TBP複合体はその標的遺伝子であるrRNA領域のクロマチン構造再構築に関与することを明らかにしたが、この再構築活性は遺伝子転写制御と密接な関係があることが知られており、目的達成のために順調に進捗したといえる。今後は予定通りSOX2-TBP複合体の標的であるrRNAの転写制御機構の解析を進める。先ず第一に、SOX2-TBP複合体がrRNAをコードするゲノム領域のクロマチン構造を再構築するのか明らかにしていく。次にrRNA領域のクロマチン再構築にヒストン修飾がどの様な影響を与えるのか解析する。このデータを基にして、クロマチン再構築から遺伝子転写までの詳細な制御機構を明らかにする。また、SOX2とTBPの結合が阻害される変異体の作製を進めている。この変異体を用いて生体内でのSOX2-TBP複合体の役割を解析していく予定である。今年度はクロマチン再構築によるrRNAの転写制御に着目し研究を進める。作成したSOX2とTBPの変異体利用し、ふたつの協調による再構築のメカニズムを明らかにする。ヒストン変異体を用いてヒストン修飾との関連性を解析する。これらの試験管内での成果を基に生体内での解析を進める。676円と少額であり、有効な使用法が存在しなかった為使用を控えた。翌年度の計画には影響のない額である為当初の予定通り進め、SOX2-TBP複合体標的遺伝子の転写制御機構解析実験の消耗品購入に充てる予定である。1円と少額であり、有効な使用法が存在しなかった為使用を控えた。
モジュール動能による低木類の生育状態評価-多種共存に配慮した里山管理計画の立案

里山と呼ばれる都市近郊林の保全に向けた基礎的な研究が社会、行政から求められている。本研究は、里山を代表する花木であるツツジ類の、繁殖生態と成長様式を明らかにすることを目的とした。繁殖生態)都市近郊のコナラ二次林の林道700mに生育するコバノミツバツツジを対象に、花粉管伸長の観察と受粉実験から、自家和合性の個体間変異について調査した。林道沿いで30個体を選び、花芽を袋掛けし、自家/他家花粉を付ける受粉実験を行った。受粉後、3、7、14、21日後に柱頭をサンプルし、染色した後、蛍光顕微鏡で花粉管を観察した。その結果、前年の受粉実験から自家和合性が高いと判定された個体でも、自家和合性が低いと判定された個体でも同様に、自家花粉の花粉管が胚珠付近まで伸長していることが確認された。したがって、自家和合性の程度に見られた個体間変異は、自家花粉の花粉管伸長を阻害する何らかの生理的な自家不和合性のシステムが存在するかどうかの違いによるものでなく、受精後の近交弱勢の大きさが個体ごとに異なるためであると推察された。成長様式)里山林に生育するウスノキとシャシャンボを対象に、林冠の閉鎖状況に対するモジュールの生育状態の変化を解析した。ウスノキは複数の地上幹からなる複幹構造を持ち、シャシャンボは単数の地上幹による単幹構造を持つ。ウスノキの場合、地上幹の成長速度は林冠の閉鎖状況と無相関であったが、新しい地上幹を発生させる頻度が明るい環境ほど増加していることが統計的な解析によって示された。一方、シャシャンボでは、地上幹の成長速度が明るい環境ほど増加した。また、シャシャンボの場合、林冠木が常緑種か落葉種かという種構成の違いによっても、成長速度や葉の回転速度が変化していることが示された。これらの結果から、複幹か単幹構造かという生育型の違いによって、光環境に対するモジュールの反応様式が異なることが明らかにされた。コジイとアラカシは西日本の温帯林において主要な構成種である。二次林の下層に同所的に生育するコジイとアラカシの稚樹(樹高62-289cm)の樹冠構造と成長を定量的に比較した。両種の樹冠形を支持器官(幹+側枝)バイオマスあたりで比較すると、コジイはアラカシに比べ大きな樹冠面積を持っていたが、樹高は小さかった。また、コジイの地上部バイオマスの純生産速度(RGR,0.442g g-1 yr-1)はアラカシ(0.256 g g-1 yr-1)の二倍近くであり、これを反映し、幹の肥大成長と総側枝長の相対成長速度はすべてアラカシよりもコジイで大きかった。しかしながら、樹高成長速度に種間差は見られなかった。これより、大きな樹冠面積をもつコジイは、アラカシよりも光の獲得能力が高いため大きなRGRを実現できるが、樹冠面積を広げるコストが大きいため樹高成長が制約されていることが示唆された。本調査地のような暗い森林下層では、樹冠を大きく発達させることにより同化産物の生産性を高めているコジイのほうが、アラカシよりも有利であることが示唆された。森林下層の光量子束密度の推定における日射フィルムの適用性について調べた。天然性二次林の下層において、1年間で合計42地点の測定を行ない、フィルムの退色率(F)、フィルムに照射された光量子量の積算値(PPFDtotal)、フィルム露光期間中の日最高気温の平均値(T)を求めた。記録値の範囲は、Fが35-99%、PPFDtotalが1.4-28.3mol m-2、Tが6-32°Cであった。FとTの値から高い決定係数(r^2=0.94)でPPFDtotalを回帰する式が得られた。回帰式から求めたPPFDtotalの推定値と実測値の誤差は平均1.3mol m-2、最大5.7mol m-2であった。これらの結果より、森林下層の光量子束密度の推定における日射フィルムの高い適用性が示唆された。ツツジ科の低木種であるウスノキを材料に、開花が起こる頻度と開花が栄養成長に与える影響(コスト)について、シュート単位の解析を行った。前年枝の頂芽が花になったシュートを繁殖枝、前年枝の頂芽が当年枝になったシュートを栄養枝とした。繁殖枝は栄養枝に比べて、当年枝の数と総伸長量が小さかった。これはシュート単位の繁殖コストを示している。この繁殖コストは、サイズの大きなシュートほど大きいことが解析により示された。さらに、分枝パターンを推移行列を使って解析し、当年の繁殖が将来の潜在的な繁殖量に与える負の影響を査定したところ、約7cm以上のサイズのシュートでは、将来の潜在的な繁殖量に与える負の影響が当年の繁殖量より大きいことが示唆された。一方、頂芽が花になる確率を調べたところ、小さいサイズのシュートでも大きいサイズのシュートでも花形成の確率は低く、中程度のサイズのシュートで最大になっていた。小さいサイズのシュートは花形成に必要な同化物資源が不足しているものと推察される。大きいサイズのシュートが花形成を行う確率が低いという現象は、生活史理論の観点から、樹冠レベルでの生涯の繁殖量を増加させるために花を形成しないという適応的な形質であると解釈できる。

このように、花形成が樹冠発達に与える影響はシュート単位で局所的に起こること、そして、それ故に花形成の頻度もまた、シュートのサイズに依存して強く決まっていることが示唆された。里山と呼ばれる都市近郊林の保全に向けた基礎的な研究が社会、行政から求められている。本研究は、里山を代表する花木であるツツジ類の、繁殖生態と成長様式を明らかにすることを目的とした。繁殖生態)都市近郊のコナラ二次林の林道700mに生育するコバノミツバツツジを対象に、花粉管伸長の観察と受粉実験から、自家和合性の個体間変異について調査した。林道沿いで30個体を選び、花芽を袋掛けし、自家/他家花粉を付ける受粉実験を行った。受粉後、3、7、14、21日後に柱頭をサンプルし、染色した後、蛍光顕微鏡で花粉管を観察した。その結果、前年の受粉実験から自家和合性が高いと判定された個体でも、自家和合性が低いと判定された個体でも同様に、自家花粉の花粉管が胚珠付近まで伸長していることが確認された。したがって、自家和合性の程度に見られた個体間変異は、自家花粉の花粉管伸長を阻害する何らかの生理的な自家不和合性のシステムが存在するかどうかの違いによるものでなく、受精後の近交弱勢の大きさが個体ごとに異なるためであると推察された。成長様式)里山林に生育するウスノキとシャシャンボを対象に、林冠の閉鎖状況に対するモジュールの生育状態の変化を解析した。ウスノキは複数の地上幹からなる複幹構造を持ち、シャシャンボは単数の地上幹による単幹構造を持つ。ウスノキの場合、地上幹の成長速度は林冠の閉鎖状況と無相関であったが、新しい地上幹を発生させる頻度が明るい環境ほど増加していることが統計的な解析によって示された。一方、シャシャンボでは、地上幹の成長速度が明るい環境ほど増加した。また、シャシャンボの場合、林冠木が常緑種か落葉種かという種構成の違いによっても、成長速度や葉の回転速度が変化していることが示された。これらの結果から、複幹か単幹構造かという生育型の違いによって、光環境に対するモジュールの反応様式が異なることが明らかにされた。
酸化物高温超伝導体の磁気的電気的特性と希土類イオンの電子状態

酸化物高温超伝導体のPrイオンの超伝導破壊効果に関連して以下の2点について研究を行った。1.ペロブスカイト型酸化物中のPrイオンの価数と磁性酸化物高温超伝導体中のPrイオンの超伝導破壊効果の機構としてPr^<4+>の形成による価電子帯のホール充填が磁化の温度変化を根拠として唱えられている。そこで結晶構造の単純なペロブスカイト中のA・B両サイトに価数の異なるPrの状態をつくり出しその磁性の研究を行った。PrScO_3の磁化測定により得られたAサイトのPr^<3+>の帯磁率の温度変化は3価の自由イオンの曲線に近いが磁化はやや小さい。これは結晶場の効果であると考えられる。BaPr_<0.5>Bi_<0.5>O_3はBサイトのPr^<3+>イオンによる小さな帯磁率を示す。PrScO_3O_yの帯磁率の温度変化はPrScO_3のそれに近く磁化の値はやや小さい。このことはPrBa_2Cu_3O_y中のPrイオン3価に近い価数をもち結晶場とCuO_2面の酸素の2P軌道との混成の成果で磁化はやや小さくなっていることを示している。磁化緩和の磁場依存性と温度依存性を詳細に測定し臨界電流密度の磁場依存性をJc^*(Hc_1/h)^nと仮定して解析した。nおよび臨界電流密度はx=0.02に極大を持つことが確認された。これはPrイオン間の平均距離がコヒーレンス長ξと同程度になるxの値であると考え解析を進めている。
各種培養細胞に対する機械的外力負荷実験モデルの確立

初年度は自作機を用いて新生ラット頭蓋冠由来骨系細胞やヒト歯根膜由来細胞に適当な伸展距離や伸展周期を設定するための基礎的データを集めながら,装置に使用する部品の使用テストを行った。その結果,当初予定していたソレノイド駆動方式では,炭酸ガス培養器中で十分な耐久性が得られないことが判明し,防水モーターとカムを使用する方式に変更した。これによって,耐久性の向上だけでなく,カムの形状を変えることにより,ソレノイド方式では不可能な外力の負荷速度の調節がある程度可能になった。この防水モーター・カム駆動方式の装置は初年度中に完成し,耐久試験や細部の改良に着手した。次年度には完成した装置を使って細胞に外力負荷を加える使用実験を行いながら,細部の改良を繰り返し,ナイロンメッシュとステンレス棒の接着法の改良や,培養細胞の播種における操作性を向上させるための周辺器具の作製などを行った。一方,より複雑な外力負荷速度の調節を可能にするための,パルスモーター駆動方式の装置は,炭酸ガス培養器中での使用に耐え得るものが無く,結局ある程度の耐久性で妥協し平成5年1月に装置として一応完成させたが,十分な耐久性のある実用的な装置として完成させることはできなかった。最終年度には,新生ラット頭蓋冠由来骨系細胞やヒト歯根膜由来細胞を使って外力を負荷する使用実験を繰り返しながら,試料保持部等に若干の改良を加えた。本研究ではパルスモーター駆動方式を完成させることはできなかったが,当初予定していなかったカム駆動方式を採用することで,目標の性能をほぼ満足し,実用に耐え得る耐久性と操作性を備えた装置を開発することができた。本研究で試作中の培養細胞反復刺激装置は、炭酸ガス培養器中に設置し、歯根膜細胞・骨系細胞・軟骨細胞などを包埋した、コラ-ゲンゲルの薄層をモ-タ-により反復伸展して、培養細胞に外力を負荷するものである。初年度は、既に完成している自作機を用いて、新生ラット頭蓋冠の骨系細胞やヒト歯根膜細胞に外力を負荷する実験を繰り返し、適当な伸展周期や伸展距離を設定するための基礎的なデ-タを得た。その結果、両細胞では外力に対する感受性が異なることが判明した(第50回日本矯正学会などで発表)。すなわち、骨系細胞はコラ-ゲンの薄層を10%伸展した場合に有意な細胞増殖の促進が見られたのに対し、歯根膜細胞では15%の伸展で初めて有意差が見られた。装置本体の試作段階において、当初予定していたソレノイド駆動方式では、炭酸ガス培養器中で充分な耐久性が期待できないと考えられたため、防水モ-タ-とカムを使用する方式に変更した。これによって、耐久性の向上に加え、ソレノイド駆動方式では不可能であった、外力の負荷速度をある程度調節することが可能になった。本体の製作は研究実施計画書より1ヵ月ほど遅れたが、平成3年12月末に完成した。その後、約1ヵ月間の耐久試験を行い、炭酸ガス培養器内という環境下で、充分な耐久性のあることが確認された。現在は、ナイロンメッシュの融着法を改良し、そのための付属装置を製作中である。まもなく、本装置を実際に使用した実験を行う予定であり、使用実験の終了後、本装置の細部の改良を加え、完成させる。また、来年度に開発を予定しているパルスモ-タ-駆動方式で使用するモ-タ-の選定作業を行っている。骨の正常な発育や機能の維持には,常に適当な荷重の負荷を必要とし,骨系細胞はこの外力に応答して,その機能を変化させていると考えられる.しかし,骨系細胞がどのような機序で外力に応答しているか,その詳細は不明である.本研究で試作中の培養細胞反復刺激装置は,骨系細胞・歯根

膜細胞・軟骨細胞などをコラーゲンゲル薄層内に包埋し,これを機械的に反復伸展することにより,生体内条件に近い三次元的な外力を培養細胞に負荷するものである.初年度に完成したカム駆動方式の試作機(4号機)は耐久性に優れ,約1年間の使用で故障していない.また,コラーゲンゲルを支持するためのナイロンメッシュとステンレス棒は,反復伸展中に剥がれやすいが,ステンレス棒にかぶせたポリエチレンチューブを接着剤としてナイロンメッシュを加熱融着することにより強固な接着が可能となった.さらに,細胞の播種は低温で,無菌的かつ均等に行わなければならず,ディッシュ数が多いと長時間を要するが,ナイロンメッシュの支持台を工夫することである程度の改善が可能となった.骨系細胞に外力を負荷した結果は,本研究以前のソレノイド駆動方式の試作機での結果と同様に,約10%の伸展で有意に細胞増殖の促進がみられた.一方,パルスモーター駆動方式の試作機(5号機)はコンピュータ制御により,複雑な外力を負荷することができる.5号機本体は平成5年1月末に完成し,現在さまざまな外力の負荷パターンで骨系細胞を培養しながら実験を行っている.最終年度には,4号機を使った生化学的および組織化学的研究を継続する他,5号機を使っていくつかの基本的な外力負荷パターンを選定する予定である.将来はこれらのパターンをROMに組み込み,コンピュータ本体とは切り放して使用することも可能である.防水モーター・カム駆動方式では不可能な,より複雑な運動による外力を負荷することのできるパルスモーター駆動方式の試作機は,平成5年1月に一応完成し,何回かの使用実験を行ったが,炭酸ガス培養器内の環境(特に湿度)のため,十分な耐久性のある実用的な装置として完成させることはできなかった。一方,防水モーター・カム駆動方式の使用実験は順調に進み,試料保持部等の若干の改良と実験修了後に組織化学的検索のために試料を固定包理する際の周辺器具の作製を行った。使用実験ではこれまでと同様にDNA量やアルカリ性フォスファターゼ活性といった生化学的な定量や樹脂包埋試料の組織学的観察の他,試料をセットしたユニットを本体から取り外し,倒立型微分干渉顕微鏡のステージ上に乗せ,コラーゲンゲルを伸展した状態および弛緩した状態で同一の細胞を観察した。その結果,コラーゲンゲルの伸展により,支持体であるナイロンメッシュの網目は伸展方向に引き伸ばされるが,それと直角の方向の変形はほとんど無いことがわかった。すなわち,ゲルの伸展により網目の面積と網目内に存在する細胞の面積が増大していた。これは網目内部のコラーゲンゲルが伸展方向に引き伸ばされると同時に,網目の支持が無い方向(ナイロンメッシュ面と鉛直な方向)に圧縮されて,細胞を変形していると考えられる。今後,こうした細胞の変形量を細胞に負荷された外力の強さの指標として使うことにより,異なった装置によって得られたデーターと比較することが可能になる。本研究ではパルスモーター駆動方式を完成させることはできなかったが,当初予定していなかったカム駆動方式を採用することで,目標の性能をほぼ満足し,実用に耐え得る耐久性と操作性を備えた装置を開発することができた。
チフス菌・パラチフスA菌病原因子とマクロファージ内増殖機構の解析

腸チフスと症状が類似した疾患であるパラチフスはパラチフスA菌によって引き起こされる。通常、パラチフスは腸チフスより軽症である。チフス菌、パラチフスA菌はともにサルモネラ属の菌であるが、チフス菌はVi抗原を持ち0抗原は09を持つ。パラチフスA菌はVi抗原などのきょう膜抗原はもたず0抗原は02をもち、同じサルモネラ属ではあるが、細菌学的にはチフス菌とは異る菌である。現在まで私たちの研究によると、Vi抗原はチフス菌の病原因子でありチフス菌の細胞内増殖に必須であり、Vi抗原のないチフス菌では細胞内増殖ができないため病原性低下していることを報告した。また、Vi抗原のないチフス菌は、一般的に病原性がないと考えられている。ところが最近、疫学情報によると、いままではパラチフスの方が腸チフスより軽症であったが、最近では逆にパラチフスのほうが腸チフスより治りにくく病態の経過が長引く傾向があることがわかった。このようにVi抗原をもたないパラチフスA菌がチフス菌と同程度の敗血症をおこすことから、細胞内寄生菌であるチフス菌、パラチフスA菌には、Vi抗原以外の両者に共通した細胞内増殖機構があると考えられる。おそらくこれらのメカニズムはチフス菌・パラチフスA菌以外のチフス性サルモネラに共通のメカニズムでもあると予想されるため、このメカニズムを解明することは、チフス性サルモネラ症の病原因子の解明に大きな貢献ができると考えている。まず初めに、チフス菌・パラチフスA薗のマクロファージ内増殖を比較した。ともに、細胞内で増殖する速度や取り込まれる量に大きな差はみられなかった。さらに、細胞内寄生性細菌は食細胞、特にマクロファージに貪食されることによって免疫応答の第1段階が始まるため、貪食された後に、貪食したマクロファージから分泌されるサイトカイン(TNF-alpha, IL-12,IL-6,IL-1,)遺伝子の発現をPCRで比較したが、両者の間で大きな差はみられなかった。これらより両者にはマクロファージ内での増殖・サイトカインの誘導性には大きな差がなくこれ以外のメカニズムが関することがわかった。