hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血小板情報変換酵素ホスホリパーゼCとGTP結合タンパク質の分子多様性と相互作用

PLCーγ2はサイトゾルから,PLCーβはサイトゾルと膜の両者から単一に精製し、それらの性質を明らかにした。またPLCーβをウシ脳膜から精製し、ウサギにて抗体を作製し、ヒト血小板のものと比較したところ、両者に差がみとめられなかった。同上両画分より高分子量型(ヘテロトリマ-;αサブユニットのMr40,41kDa)と低分子量型(モノマ-;サブユニットのMr21ー27kDa)を諸種のカラムクロマトグラフィを用いて分離・精製した。サイトゾルから精製された低分子量Gタンパク質_C25KGの合成オリゴペプチドを用いて、巨核球細胞のcDNAライブラリ-から新しいタイプの低分子量Gタンパク質ramをクロ-ニングし,遺伝子を大腸菌で大量発現させた。各種プロテインキナ-ゼによるリン酸化を検討したところ,膜m22KGのみがAキナ-ゼでリン酸化されたが活性には影響は見られなかった。ヒト血小板ではトロンビン刺激によりプロテインチロシンキナ-ゼの活性化が知られており、この際のPLCーγのリン酸化を検討したが顕著なリン酸化は見られなかった。ヒト血小板には数種類のイノシト-ルリン脂質特異的ホスホリパ-ゼC(PIーPLC)が存在しており、種々のカラムクロマトグラフィ-でPLC活性画分を分離し、各種アイソザイムの抗体を用いて同定を行った。サイトゾル画分にはPLCーβ,PLCーγ,PLCーδと未同定の二種類の存在が確認された。PLCーγの活性調節にはチロシンキナ-ゼによるリン酸化の関与が明らかにされており、ヒト血小板にはsrcが多量に発現していることより、srcによるPLCーγのチロシンリン酸化について検討した。トロンビン刺激によりチロンシンキナ-ゼが活性化され、ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットにより数種類の蛋白質(130,105,98,85,78kDa)のチロシンリン酸化が観察された。またトロンビン刺激後PLCーγの抗体を用いて免疫沈降を行い、チロシンリン酸化について検討したがPICーγのリン酸化は確認されなかった。また、ヒト血小板のPLCーγは細胞骨格系アクチン・ゲルゾリン複合体と結合をしていることが示され、ゲルゾリンのPLCーγの活性調節への関与が示唆された。一方、ヒト血小板には多種類のGTP結合タンパク質が存在しており、百日咳毒素非感受性GTP結合タンパク質であるGqの存在が、特異抗体を用いたウェスタンブロットにより確認された。また、PLCーβも膜画分に多く検出され、PLCーβの活性調節におけるGqの関与が示唆された。ヒト血小板には数種類の低分子量型GTP結合タンパク質が存在し、そのなかでも、サイトゾル画分から精製されたc25KGは、新規GTP結合タンパク質であることが、部分アミノ酸配列から明らかにされた。さらに、本タンパク質の合成オリゴペプチドを用いて、巨核球ライブラリ-からcDNAをクロ-ニングした(ramと命名)。このcDNAを大腸菌で発現させて多量のramP^<25>を得た。ヒト血小板を用いて、PLCの各種アイソザイムとGタンパク質を分離・精製し、機能的再構成系でそれらの相互作用を検索することを目的として研究を行った。ヒト血小板には数種類のPI-PLCアイソザイムやG蛋白質が存在しており、種々のカラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、既知の各種アイソザイムの抗体を用いて同定を行なった。サイトゾル画分にはPLC-β(150kDa)、PLC-γ1(145kDa)PLC-γ2(145KDa)とPLC-δ(85kDa)が同定された。さらに未同定の活性画分の存在を確認した。また、膜画分には主にPLC-βが同定されたが、さらにmPLC-IIを精製した。一方、ヒト血小板のサイトゾルと膜画分より高分子量型(ヘテロトリマー)と低分子量型(モノマー)のG蛋白質を分離・精製し、それぞれの同定を行った。
SWI/SNFクロマチン再構成異常を標的としたATR阻害剤によるがん治療基盤確立

がん細胞ではDNA複製ストレスが恒常的に生じており、DNA複製ストレス応答を制御するATRへの依存度が正常細胞よりも高いと予想される。そのためATR阻害剤はがん細胞特異的に作用し得ると注目されている。申請者らは種々の肺腺がんにおいてSWI/SNFクロマチン再構成複合体の構成因子SMARCA4を欠損した細胞は内在性DNA複製ストレスが高く、そのレベルがATR阻害剤感受性と相関することを見出した。本研究では、SWI/SNF複合体変異をATR阻害剤のバイオマーカーとして確立するとともに、ATR阻害剤の作用点およびSWI/SNF複合体変異によるATR阻害剤感受性促進機構の解明を目指す。
法的判断における真理概念の適用とその帰結

研究計画に基づき、引き続き前年度からの課題であるウィギンズの真理論と、認知的民主主義と呼ばれる議論の展開を検討した。特に、前年度で検討したミザクの議論に引き続き、認知的民主主義論において、真理と民主主義との結びつきを重視するエストランドの議論を比較検討を行い、またウィギンズの議論と相対する真理のミニマリズムの研究も参照することで議論のさらなる展開を図った。またこれらの研究の派生として、英米圏の徳倫理の研究も行った。研究の検討作業自体は進み、研究の派生物である英米圏の徳倫理の議論などを公刊することはできたが、肝心の認知民主主義の研究成果と真理論の研究成果を公表することができず、これらは次年度以降の課題となる。研究の研究作業自体はすでに進んでいるため、次年度は研究成果の公表に力を尽力することを試みる。本研究においては「ウィギンズの真理論」「真理と民主主義論」「真理と法理論」という3つのテーマを考察する予定であるが、2017年度では研究計画の中における「真理と民主主義論」、すなわち民主主義と真理の関係について特に集中的に研究した。真理と民主主義の関係においては、現在「認知的民主主義論」と呼ばれる議論が英米圏で盛んであり、その展開も抑えつつ、認知的民主主義論の中でもC.S.パースの真理論を参照しながら、その真理論を熟議民主主義論と接続しようとするC.ミザクの議論に注目した。ミザクの立場はしばしば「パーシアン・デモクラシー」とも呼ばれている。この研究成果は「パーシアン・デモクラシーの射程:C.Misakの議論を中心に」という論題で2017年度の日本法晢学会および東京法哲学研究会で報告した。同時に、本研究の柱となるD.ウィギンズの真理論、およびそこから派生する「弱い認知主義」という立場についても、並行して検討を行った。本研究においては「ウィギンズの真理論」「真理と民主主義論」「真理と法理論」という3つのテーマを考察する予定であるが、2017年度では「真理と民主主義論」の問題を中心に考察し、学会報告という形で暫定的な研究経過を発表することができた。また「ウィギンズの真理論」についてもある程度の研究方針の着想が得られたため、おおむね順調に進展していると考えている。ただし「真理と法理論」についてはまだ研究が未着手の部分があるため、今後はこのテーマについても研究を進めていきたい。「現在までの進捗状況」でも挙げたように、本研究は「ウィギンズの真理論」「真理と民主主義論」「真理と法理論」という3つの柱から成り立つが、2018年度では、できるだけ早く2017年度の学会報告の内容を加筆修正して論文を公刊し、「ウィギンズの真理論」の部分の研究に尽力する。2018年度は「ウィギンズの真理論」において学術論文公刊を目指し、この作業を前倒しできるようにする。余裕のある時間は「真理と法理論」の部分について、並行して作業を進めることにする。
ハフニウム同位体を用いた島弧火山マグマ発生過程の研究

スラブの沈み込みやマントル対流といったマントルの分化過程を、Hf同位体を用いてアプローチしていくのが本研究の目的である。(1)沈み込むスラブの研究大陸性島弧である東北日本弧のHf-Sr-Nd-Pb同位体分析の結果から、スラブの脱水においてHf同位体はSr-Nd-Pbとは異なる挙動を示し、これらの同位体系が沈み込み帯における火成活動を調べるための有効なトレーサーであることが示された。この成果は論文にまとめ、G-cubedに受理された。一方海洋性島弧においてはこれまでスラブ脱水が島弧火成活動の主原因であると言われてきたが、ケルマデック弧ではみスラブ脱水とスラブ融解が同時に起きている可能性が指摘されてきた。このことを明確にするためにHf同位体を応用する研究を行った結果、ほとんどの海山はスラブ脱水の影響を受けているが、前弧域に存在する海山はスラブ融解の影響を受けていることが分かった。このことは比較的冷たいスラブの沈み込みにおいても小規模ではあってもスラブ融解が起こっていることを示唆する。この成果は論文にまとめ、投稿中である。(2)マントル内物質循環に関する研究上記の研究から、スラブが沈み込む時の脱水作用で、Pb>Sr>>Nd>Hfの関係でスラブから元素が移動することが分かった。そこで過去に沈み込んだスラブを起源としていると考えられるプルーム物質について、そのモデルが真に妥当であるのかを検証するための研究を行った。ポリネシア地域のプルーム起源の火山岩についてHf同位体等を分析した結果、Nd>Hfの関係を除いて確かにPb>Sr>>Hfのように元素が枯渇していることが分かった。従ってこのプルームの起源は過去に沈み込んだスラブと考えられるが、Nd<Hfとなっていたことは過去の海洋地殻(スラブの一部)が現在のそれとは異なり、より高圧の領域で部分溶融してできたことを示唆している。島弧の火成活動におけるマグマの生成には、沈み込むスラブからの物質供給が重要な役割を果たしている。このスラブからの物質供給の様式とフラックスを調べるのに、Hf同位体分析を応用するのが本研究の目的である。本年度はこの方法を、(1)東北日本弧第三紀における火成活動の変化、及び(2)アンデスオーストラル火山帯の火成活動の解明に応用した。(1)東北日本弧第三紀に関する研究。背弧海盆(日本海)の拡大と火成活動の変化の因果関係を調べるために、22Maより現在にいたる時期の火山岩のHf-Sr-Nd-Pb同位体分析を行った。その結果、22-15Maにおいては低いHf同位体比を持ち、その後現在にむけて値が上昇していくことが分かった。このことは、前者においてはスラブ融解により低いHf同位体を持つ成分がメルトにより島弧下マントルに運搬され、後者においてはスラブ脱水により水溶性流体には溶けにくいハフニウムが運搬されなかったとして説明される。これは22-14Maに起こった背弧海盆拡大時には島弧下に高温のマントル物質の上昇・注入が起こり、それがスラブ融解を引き起こしたと解釈された。(2)アンデスオーストラル火山帯の高マグネシウム安山岩の成因に関する研究この火山帯では典型的な高マグネシウム安山岩が見られ、沈み込むスラブが融解してできたメルトが火成活動の引き金になっていると考えられてきたが、このことをHf同位体分析を行うことにより検証しようとした。分析の結果、Hf同位体とSr,Nd,Pb同位体及び微量元素組成に明瞭な相関が見られ、スラブ由来のメルトがマグマの生成に関与していることが示された。以上の結果は国際学会で一部発表しており、次年度に論文にまとめていく予定である。また、Hf同位体分析技術の改良を行っており、その一部を論文にまとめた。このスラブからの物質供給の様式とフラックスを調べるのに、ハフニウム(Hf)同位体分析を応用するのが本研究の目的である。さらに、沈み込んだスラブがマントル内物質循環にどのように寄与しているかを調べるためにもHf同位体を応用した。本年度の進行状況は以下のとおりである。(1)東北日本弧の火成活動東北日本弧の発達と火成活動の変遷を調べるため、中新世より現在にいたる時期の火山岩のHf-Sr-Nd-Pb同位体分析を行った。その結果、前期中新生の火山岩と後期中新生-第四紀の火山岩の間にはSr-Nd-Pb同位体比に対するHf同位体比に明瞭な差があった。この差は、前者においては日本海における背弧海盆拡大に伴って島弧下に高温のマントル物質の上昇が起こりそれがスラブ融解を引き起こし、後者においてはその後マントルウェッジ内の温度が低下し通常のスラブ脱水が起こるようになったと解釈された。この成果はG-cubedに投稿中である。(2)ケルマデック島弧における火成活動

海洋性島弧においてはこれまでスラブ脱水が島弧火成活動の主原因であると言われてきたが、最近の研究では同時にスラブ融解も起こっているという証拠が出されてきている。このことを明確にするために、典型的な海洋性島弧であるケルマデック弧の火山岩について、Hf同位体を応用する研究を続行している。(3)マントル内物質循環に関する研究沈み込んだスラブ物質はマントル内不均質を生み出す要因の一つである。沈み込みに伴う分化作用に鋭敏なHf同位体を用いて、マントル内不均質と物質循環を調べる研究を試みている。そのため、不均質なマントルの成分を反映していると考えられる、ハワイとオントンジャワのマントルプルームに起因する火山岩のHf同位体分析を始めた。スラブの沈み込みやマントル対流といったマントルの分化過程を、Hf同位体を用いてアプローチしていくのが本研究の目的である。(1)沈み込むスラブの研究大陸性島弧である東北日本弧のHf-Sr-Nd-Pb同位体分析の結果から、スラブの脱水においてHf同位体はSr-Nd-Pbとは異なる挙動を示し、これらの同位体系が沈み込み帯における火成活動を調べるための有効なトレーサーであることが示された。この成果は論文にまとめ、G-cubedに受理された。一方海洋性島弧においてはこれまでスラブ脱水が島弧火成活動の主原因であると言われてきたが、ケルマデック弧ではみスラブ脱水とスラブ融解が同時に起きている可能性が指摘されてきた。このことを明確にするためにHf同位体を応用する研究を行った結果、ほとんどの海山はスラブ脱水の影響を受けているが、前弧域に存在する海山はスラブ融解の影響を受けていることが分かった。このことは比較的冷たいスラブの沈み込みにおいても小規模ではあってもスラブ融解が起こっていることを示唆する。この成果は論文にまとめ、投稿中である。(2)マントル内物質循環に関する研究上記の研究から、スラブが沈み込む時の脱水作用で、Pb>Sr>>Nd>Hfの関係でスラブから元素が移動することが分かった。そこで過去に沈み込んだスラブを起源としていると考えられるプルーム物質について、そのモデルが真に妥当であるのかを検証するための研究を行った。ポリネシア地域のプルーム起源の火山岩についてHf同位体等を分析した結果、Nd>Hfの関係を除いて確かにPb>Sr>>Hfのように元素が枯渇していることが分かった。従ってこのプルームの起源は過去に沈み込んだスラブと考えられるが、Nd<Hfとなっていたことは過去の海洋地殻(スラブの一部)が現在のそれとは異なり、より高圧の領域で部分溶融してできたことを示唆している。
レ-ザ-による活性物質の局所投与法と細胞内Ca濃度・膜電位同時測光システムの開発

蛍光倒立顕微鏡を中心に、(1)ゲ-ジ分子を用いレ-ザ-光による光化学反応を利用し、Caイオンやサイクリックヌクレオチド等の生理活性物質を局所投与し、また(2)細胞膜電位、(3)細胞内Caイオン濃度を同時測光できるシステムを試作した。(1)レ-ザ-としては紫外N_2レ-ザ-を用い、光ファイバ-を使用して顕微鏡3眼鏡筒部へ導いた。3眼鏡筒には光ファイバ-中で広がった光を平行光線とするレンズ系と光束の照射位置の微調節を行う2次元微動装置を取り付けた。(2)細胞膜電位の測光は透過光光源よりフィルタ-を通し705nmの光を照射し、膜電位感受性色素としてはRH155等を使用し、標本を透過した光を顕微鏡側筒に導き、フォトダイオ-ドで測光するようにした。(3)細胞内Caイオン濃度の測光にはFluo3AMという可視光で励起されまた細胞外液に加えるだけで細胞内に負荷できる色素を用い、落射蛍光光源・ダイクロイックミラ-により490nm前後の光を標本に照射し、530nmの蛍光を顕微鏡側筒に導き、光電子増倍管で測光するようにした。また記録された電気信号はADコンバ-タ-でディジタル信号へ変換し、コンピュ-タ-に取り込ませ、デ-タ解析を行えるようにした。本システムには現在、レ-ザ-光の標本への到達率が低い、測光の空間的分解能が良くないという問題がある。上記の2つの問題点を克服すべく、レ-ザ-光の異なる顕微鏡部位からの照射、測光部の多点化といった改良を計画中である。蛍光倒立顕微鏡を中心に、(1)ケ-ジ分子を用いレ-ザ-光による光化学反応を利用し、Caイオンやサイクリックヌクレオチド等の生理活性物質を局所的に投与し、また(2)細胞膜電位(3)細胞内Caイオン濃度を同時測光できるシステムをほぼ構築した。(1)レ-ザ-には紫外N_2レ-ザ-を用い、光ファイバ-を使用して顕微鏡3眼鏡筒部へ導いた。3眼鏡筒部には光ファイバ-中で広がった光を平行光線とするレンズ系と光束の位置の微調節を行える2次元微動装置(外注)を取り付けた。(2)細胞膜電位の測光は透過光光源より705nmの光を照射し、色素としてはメロシアニン・リョ-ダミン系色素のNK2761またはNK3041を用い、標本を透過した光は顕微鏡側筒に導き、フィルタ-を通しフォトダイオ-ドで測光するようにした。(3)細胞内Caイオン濃度の測光には、Fluo3AMという可視光で励起されまた細胞外液に加えるだけで細胞内に負荷できる色素を用い、落射蛍光光源よりダイクロイックミラ-・フィルタ-を通して490nm前後の光を標本に照射し、530nmの蛍光を顕微鏡側筒に導きフィルタ-を通し光電子増倍管で測光するようにした。現時点で1.2.3.各部の作製は一応終了したが、外注した光ファイバ-取り付け部、フォトダイオ-ドおよび光電子増倍管の取り付け部に問題が生じ、全部品が揃うのが予定より大幅に遅れたため、各部を同時に制御するコンピュ-タ-のソフトフェアの開発等がまだ完了していない、このため実際に細胞を用いて本システムが計画したとおりの機能を発揮できるかどうかの試験はまだ行っていない。細胞を用いてのシステム全体の試験を平成2年度早々に行う予定である。蛍光倒立顕微鏡を中心に、(1)ケ-ジ分子を用いレ-ザ-光による光化学反応を利用し、Caイオンやサイクリックヌクレオチド等の生理活性物質を局所投与し、また(2)細胞膜電位、(3)細胞内Caイオン濃度を同時測光できるシステムを試作した。

(1)レ-ザ-としては紫外N_2レ-ザ-を用い、光ファイバ-を使用して顕微鏡3眼鏡筒部へ導いた。3眼鏡筒には光ファイバ-中で広がった光を平行光線とするレンズ系と光束の照射位置の微調節を行う2次元微動操置を取り付けた。(2)細胞膜電位の測光は透過光光源よりフィルタ-を通し705nmの光を照射し、膜電位感受性色素としてはRH155等を使用し、標本を透過した光を顕微鏡側筒に導き、フォトダイオ-ドで測光するようにした。(3)細胞内Caイオン濃度の測光にはFln03AMという可視光で励起されまた細胞外液に加えるだけで細胞内に負荷できる色素を用い、落射蛍光光源・ダイクロイックミラ-により490nm前後の光を標本に照射し、530nmの蛍光を顕微鏡側筒に導き、光電子増倍管で測光するようにした。また記録された電気信号はADコンバ-タ-でディジタル信号へ変換し、コンピュ-タ-に取り込ませ、デ-タ解析を行えるようにした。本システムには現在、レ-ザ-光の標本への到達率が低い、測光の空間的分解能が良くないという問題がある。上記の2つの問題点を克服すべく、レ-ザ-光の異なる顕微鏡部位からの照射、測光部の多点化といった改良を計画中である。
東南アジア大陸部における家畜化プロセスの総合的解明

(1)本科研でこれまでに得られた研究成果をまとめ、トルコのアンカラで2018年9月2日-7日に開催された「13th ICAZ International Conference」で発表した(発表タイトル:The huntingstrategy in the Hoabinhianperiod of northern Vietnam、発表者:Junmei Sawadaほか共同研究者9名)。(2)日本・ベトナムの共同研究者とともに、ベトナムのホアビン省に所在するハンチョー洞穴などホアビン文化期の洞窟遺跡を踏査した。また、ホアビン省石灰岩山岳地帯の景観調査を実施した。今回の踏査で、ホアビン文化期の洞窟利用を解明するために有望と思われる洞窟遺跡を確認したので、次年度以降にベトナム・日本の共同調査として発掘を実施することを検討中である。(3)ハノイのベトナム考古学院を訪問し、ベトナム北部カッドバ島カイベオ遺跡出土動物骨の動物考古学的調査を実施した(前年度の継続研究)。カイベオ遺跡は、約4000-3500年前のハロン文化期の先史遺跡で、本科研の動物資料の調査対象としているマンバック遺跡(フングエン文化並行期、約38003500年前)の比較遺跡として好適である。現在までの調査により、マンバック遺跡からは家畜のブタが多く見つかったのに対し、カイベオ遺跡の動物骨にはブタがほとんど(もしくは、全く)みられず、イルカなどの海生哺乳類や沿岸性の魚類を主体的に利用していた様相が確認されている。地理的・時代的に近い両遺跡の動物相が大きく異なることは、農耕・家畜導入期の北部ベトナムの社会の構造を探る上で興味深く、両遺跡の出土動物資料の調査を次年度も引き続き実施する予定である。当初計画で予定していたハンチョー遺跡とマンバック遺跡の資料調査をほぼ完了し、国際学会で成果の一部を発表したほか、成果をまとめた論文を執筆中である。マンバック遺跡の比較資料として分析を進めているカイバオ遺跡から出土した動物骨の検討も、共同研究者の協力のもと、順調に進行している。当初計画に盛り込んでいたベトナム考古学院の共同研究者の日本への招聘は全て完了している。以上の通り、概ね当初計画の通り順調に進展している。(1)ベトナム・日本の共同研究として、ホアビン省のホアビン文化期石灰岩岩陰遺跡の発掘調査を実施する。(2)ハノイのベトナム考古学院を訪問し、北部ベトナムのカッドバ島に所在するカイバオ遺跡(4000-3500年前)から出土した動物資料の動物考古学的調査を実施する(2018年度調査の継続研究)。(3)マンバック遺跡から出土したキジ科資料について、DNA分析、およびコラーゲンフィンガープリンティング法によるアミノ酸解析を実施し、ニワトリ(家禽)の可能性を検討する。(4)現在執筆を進めているハンチョー洞穴出土動物資料の研究論文を完成させ、国際学術雑誌に投稿する。(5)本科研の研究成果をまとめ、動物考古学の専門誌に投稿する。経済的に有用な動物の家畜化は人類史上の重要なイベントである。東南アジア大陸部はブタやニワトリなどが家畜化された地域の一つと考えられているが、家畜文化の開始時期とプロセスには不明な点が多い。近年、複数の新石器時代遺跡からこれら動物の良好な新資料が発掘され、初期家畜文化の研究環境が整いつつある。そこで本研究では、東南アジア大陸部の新石器時代遺跡から出土した初期家畜動物群を、様々な形態学的・理化学的研究手法を駆使して多角的に分析し、『東南アジア大陸部における家畜化プロセスの総合的解明』を目指す。研究の開始年度である2015年度は、研究協力者とともにハノイのベトナム考古学院を訪問し、ベトナム北部のHang Cho遺跡(後期更新世完新世初頭、ホアビン文化)とMan Bac遺跡(完新世中葉、新石器時代後期)から出土した動物遺体の資料調査を実施した。具体的には、Hang Cho遺跡から出土した哺乳類・鳥類・爬虫類の同定と計測、Man Bac遺跡から出土した魚類の同定、Hang Cho遺跡・Man Bac遺跡・現生ベトナムの野生イノシシおよび家畜ブタの歯の幾何学的形態計測・古病理学的調査・DNA試料の採取、Hang Cho遺跡・Man Bac遺跡出土動物骨の年代測定試料の選定と採取、ベトナム北部に生息する現生魚類の収集と同定用骨標本作製を行った。この調査において、ホアビン文化期のHang Cho遺跡では、周辺の環境に生息する多彩な小・中型哺乳類動物群を主対象とする狩猟活動が展開されていたことを明らかにした。Hang Cho遺跡から出土した動物骨の調査はほぼ完了したので、成果発表の論文を執筆中である。古病理学的分析および理化学的分析については、次年度以降も継続して実施する。その他、広西チワン族自治区の南寧市を訪問し、Hui Yao Tein遺跡から出土した動物資料の所見を得た。当初計画で予定していたHang Cho遺跡とMan Bac遺跡出土動物資料の形態データ収集と理化学的分析試料のサンプリング、ならびにHui Yao Tein遺跡から出土した動物資料の観察は、問題なく遂行した。研究計画の2年目にあたる2016年度は、研究協力者とともにハノイのベトナム考古学院を訪問し、前年度に引き続きベトナム北部のHang Cho遺跡(ホアビン文化)とMan Bac遺跡(新石器時代後期)から出土した動物遺体の資料調査を実施した。特に、Hang Cho遺跡出土動物遺体の調査においては、資料中に淡水性の魚骨が含まれていることを確認し、ホアビン文化期の山岳地域において内水面漁撈が展開していた可能性を明らかにした。Hang Cho遺跡から出土した脊椎動物遺体の同定は2016年度の作業でほぼ完了したので、現在成果を論文にまとめている途中である。

イノシシ/ブタ類および初期家禽の可能性が疑われるキジ科鳥骨について、詳細な形態学的検討および分子生物学的検討を進めているが、2015年度に採取したHang Cho遺跡およびMan Bac遺跡出土動物遺体試料のDNA分析および年代測定に関し、有機質の保存が不良なため今のところ良好な結果が得られておらず、2016年度に採取部位を吟味して改めてサンプリングを実施した。新資料として、カッドバ島のCai Bao遺跡(ハロン文化)から出土した動物遺体の分析に着手し、これらがイルカおよび魚類などの海産動物資源を主体としながら少量のシカ類やイノシシ/ブタ類を含む組成であることを予備的に確認した。Cai Bao遺跡出土資料については、2017年度以降の調査において詳細な内容を検討する予定である。その他、2016年6月に開催された日本動物考古学会において、これまでの研究成果の一部を発表した。また、2016年11月にベトナム考古学院のNugyen Anh Tuan研究員を日本に招聘し、更新世ベトナム動物化石の産出状況について公開講演会を開催した。当初計画で予定していたHang Cho遺跡出土ホアビン文化期動物遺体の形態分析をほぼ完了した。当初計画ではHui Yao Tien遺跡出土動物遺体の分析に着手する予定であったが、これに代わり、より本研究計画の目的に合致するCai Bao遺跡出土動物遺体の分析を行うこととし、2016年度に初回の調査を実施した。また、当初計画の通り、ベトナム考古学院の研究者を日本に招聘し、公開講演会を実施した。以上の通り、概ね当初計画の通り進展している。(1)研究計画の3年目にあたる2017年度は、共同研究者とともにハノイのベトナム考古学院を訪問し、前年度に予備的調査を実施したベトナム北部カッドバ島カイバオ遺跡出土動物骨を対象に、動物考古学的調査を実施した。カイバオ遺跡は、約40003500年前のハロン文化期の先史遺跡で、北部ベトナムのニンビン省に所在するマンバック遺跡(フングエン文化並行期、約38003500年前)と地理的・時代的に近い。マンバック遺跡からは大量のブタが出土しており、東南アジア大陸北部で明確な家畜のブタが見つかった最初期の遺跡と目されているが、北部ベトナムの同時期の遺跡で精緻な動物考古学的調査が実施された例は少なく、カイバオ遺跡のデータは、この地域の家畜導入期における生業活動の全容を解明するために重要である。今年度の調査の結果、出土動物は海生魚類とイルカを主体とし、その他にイノシシ/ブタ、マカク、少量の小中型食肉類と鳥類を含むことが判明した。マンバック遺跡で認められたようなブタを主体とした種組成はみられず、選択的に海産資源を利用する生業が営まれていたことが推察され、家畜導入期の北部ベトナムで多彩な食料獲得戦略が存在していたことが明らかになった。カイバオ資料の分析は2017年度調査では終了しなかったので、2018年度も継続して実施する予定である。
時間分解ESRによる希土類架橋多量体の性質と金属の役割の解明

時間分解ESR法・パルスESR法の高時間分解能と時間ドメイン測定の利点を生かして2つの研究を行った。1.希土類架橋二量体の励起状態におけるユニット間相互作用我々が開発した三重項のESRパラメーターを用いた二量体の分子間相互作用の解析法を用いて希土類金属(La,Y)架橋ポルフィリンダイマーの励起三重項(T_1)の性質を調べた。その結果以下の事実が明らかになった。(1)T_1における面間相互作用は面間距離4A以下で有効になり、3A以下で著しく大きい。(2)希土類架橋子は他のクラウンエーテル、芳香環架橋子などに比べて大きな相互作用を与える。(3)ポルフィリンのT_1の性質、a_<1u>-e_gかa_<2u>-e_gか、によっても相互作用の大きさが異なり、前者の方がより大きな相互作用を与える。(4)相互作用の大きさとT_1の寿命との相関があり、相互作用が大きいほど短寿命である。2.金属フラーレンの動的構造フラーレンは現在、最も活発に研究されている分子の一つであるが、我々は、Lu@C_<82>,Y@C_<82>などの希土類金属内包フラーレンのスピンダイナミクスの研究を行った。パルスESRにより、スピン格子緩和およびスピン-スピン緩和時間の温度依存性を調べた。その結果、160K-280Kでは2つの分子運動の関与が示され、緩和のシミュレーションからそれぞれ、分子全体の運動と擬ヤーンテラー状態間のポッピング又は内包金属の運動と同定された。
ウミホタル生物発光系の分子機構研究:発光酵素の活性中心の解明

1.フォトアフィニティラベルしたタンパクをマススペクトロメトリーにより構造解析する研究の一環として、MALDI-TOF/MS-PSD法によるオリゴ糖立体異性体の構造解析、MALDI-TOF/MS-ISD法の修飾ペプチドの構造解析への応用、無機固体マトリックスのMALDI-TOF/MS法への適用について検討した。その結果、MALDI-TOF/MS-PSD法によりオリゴ糖の異性体が区別できること、MALDI-TOF/MS-ISD法によりペプチドの修飾部位が容易に判別できること、無機固体マトリックスを用いれば従来困難とされていた低分子量物質でもMALDI-TOF/MS測定が可能であることなどを見出した。2.フォトアフィニティラベルによるウミホタルルシフェラーゼ活性部位を決定する研究の一貫として、まず光反応性基であるトリフルオロジアジリン基ならびにアジド基を有する2種の光反応性セレンテラジンアナログの合成を試み、それらの効率合成に成功した。ついで合成した2種のアナログの化学・生物発光挙動を精査した結果、いずれも生物発光活性のあることを見出した。さらに合成アナログの光反応性を検討したところ、いずれもタンパク質修飾に必須の活性種であるカルベンならびにニトレンがそれぞれ効率よく生成することを確認した。3.ウミボタルから電気刺激法でルシフェラーゼを放出させ、精製を行い、SDS-PAGEで68kDaのに単一バンドを有するウミボタルルシフェラーゼを得た。詳細な分子量を求めるため、MALDI-TOF/MSを用いて分子量測定を行ったところ,62kDa程度のタンパク質であることが判明した.一方,PNGaseF消化を行った後のSDS-PAGEによる分子量測定で,約2^3kDaのバンドシフトが見られたことから,ルシフェラーゼはN結合型糖鎖を有していると考えられる.現在この糖鎖構造を含めルシフェラーゼの構造確認を急いでいる.4.今後の展望光反応性ウミホタルルシフェリンの化学合成の目処がついたので、今後はそれらの合成を進め、実際にウミホタルルシフェラーゼのフォトアフィニティラベルを行い、マススペクトロメトリーにより発光活性中心の構造解析を進めていく予定である。ウミホタルの発光酵素の活性中心の解明には,発光酵素の単離抽出と修飾鎖を含むタンパクの構造解析行うことが必須である.ウミホタル発光酵素の遺伝子解析は既に行われており,アミノ酸の1次配列が決定されているが,天然の発光酵素では糖鎖修飾等がなされていることも予想され,現在のところ修飾構造についての情報は得られていない.そこで本年度は,ウミホタルから天然発行酵素の抽出を行い,修飾構造の解析を行った.生体試料として千葉県館山市沖で採集したウミホタルを使用した.○酵素の抽出酵素の抽出に際し,既知法にしたがって捕獲後直ちに冷凍保存したウミホタルを全生体ホモジナイズし,SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い精製を試みた.しかし夾雑物が非常に多く,その精製は容易ではなかった.そこで生きたウミホタルに対し海水中で1020Vの電圧で刺激をあたえてウミホタルを発光させ,海水中に放出された発光液から発光酵素の精製を行った.この結果,約200300匹のウミホタルより510μgの発光酵素を含むタンパクが比較的容易に得られることが判明した.

○酵素の断片化と構造解析電気刺激法を用いて得たタンパクに対して,トリプシンを用いたIn-gel digestionを行い,得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラフィーにより分画し,各々をMALDI-TOFマウスペクトロメトリーを用いて測定を行った.これによりいくつかの画分から,遺伝子解析により予想されるペプチド断片(データベース)に相当するペプチドが観測され,現在までおよそ30%のフィッティングを完了した.今後は残りのペプチド断片のフィッティングを急ぎ行い,修飾されたアミノ酸が存在すれば,その修飾構造の解析を行う.1.千葉県館山沖で採集したウミボタルを使用し、電気刺激法を用いて得たタンパクに対して、硫安沈殿、透析および分子量フィルターを通すことでルシフェラーゼと思われるタンパク質を良い精製度で得ることができた。これにSDS-PAGEによる分子量の確認を行ったところ、およそ68kDaのバンドが検出された。またウミボタルルシフェラーゼ抗体(多クローン抗体)を用いた検出でもこのバンドが確認されたことから、本蛋白がルシフェラーゼである事が示唆された。さらに詳細な分子量を求めるため、MALDI-TOF/MSを用いて測定を行ったところ、62kDa程度のタンパク質であることが判明した。一方、PNGaseF消化を行った後のSDS-PAGEによる分子量測定で、約23kDaのバンドシフトが見られたことから、ルシフェラーゼはN結合型糖鎖を有していると考えられる。現在この糖鎖構造を含めルシフェラーゼの構造確認を急いでいる。2.ニュージーランドの渓流に棲息する淡水産発光巻貝ラチア(Latia neritoides)はウミボタルと同様、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により黄緑色(λmax=536nm)の発光を示す。ルシフェラーゼはレクチンであるコンカナバリンAと親和性があり、PNGaseF消化後、SDS-PAGEにおけるバンドが31kDaから30kDaへシフトした。これらの結果より、ラチアルシフェラーゼはN結合型糖鎖を含むことが示唆された。そこで今だ未知であるラチアルシフェラーゼの構造解析を目的として、ルシフェラーゼを単離・精製しPNGaseF消化後マススペクトロメトリーによる構造解析を行った。単離・精製したラチアルシフェラーゼについてMALDI-TOF/MSを用いて質量分析を行ったところm/z31038にピークを示した。さらに、PNGaseF消化後に同様の測定を行ったところm/z29104にピークを示し、約1930Daの分子量の減少が観測された。この結果より、ラチアルシフェラーゼのN結合型糖鎖は11残基程度の糖鎖であることが判明した。現在、遺伝子の残基配列より求められる推定一次構造の確認や、糖鎖の構造解析を進めている。
グルタミン酸放出過程に関与する新機能分子の体系的検索

グルタミン酸放出のメカニズムとしては、神経終末からのCa^<2+>依存性の放出のほか、グルタミン酸トランスポーターの逆作動による放出があり、後者はグルタミン酸の神経毒性に重要な役割を果たしている。本年度は、グルタミン酸トランスポーターの逆作動のメカニズムを分子レベルで解明するため、グルタミン酸トランスポーターを単離し、その分子的実体を明らかにした。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現クローニングにより、ラット脳からグルタミン酸トランスポーター(GluT-1)をクローニングし、その構造・機能及び分布を明らかにした。GluT-1は543個のアミノ酸からなる分子量60kDaの膜蛋白質で、疎水性の解析から6個の膜貫通部位を持つ新しいタイプのトランスポーターである。基質であるグルタミン酸に対する親和性は62muMであり、その活性は細胞外のNa^+および細胞内のK^+に依存する。化学量論的解析の結果、1分子のグルタミン酸は3分子のNa^+と共輸送され、1分子のK^+と対向輸送される。また、ジヒドロカイニン酸、beta-グルタミン酸などの阻害剤によりその活性は抑制される。GluT-1のmRNAは脳にもっとも多く存在し、少量ではあるが腎・精巣・肺・筋肉などの末梢組織にも存在した。In situハイブリダイゼーション法により脳内での分布を詳細に調べると、GluT-1は主にグリア細胞に存在した。現在、site-directed mutagenesisによりGluT-1のグルタミン酸輸送メカニズムを詳細に検討中であり、さらに細胞外液のNa^+濃度を減少させたり、細胞外液のK^+濃度を増加させたりし、GluT-1を逆向きに作動させようと試みているところである。
ストレス顆粒による新規の活性酸素制御機構の解明

1)活性酸素の制御にアグリソームが関与することが示唆されている。USP10はアグリソームの形成を促進し、ユビキチン化蛋白質オリゴマーの細胞毒性を抑制する。HeLa細胞をMG-132(プロテアソーム阻害剤)で処理すると、蛋白質凝集体(アグリソーム)が形成された。USP10の発現を低下させた細胞では、MG-132処理によるアグリソーム形成が著しく低下した。これらの結果は、USP10がアグリソームの形成に関与することを示した。USP10とp62が強調してアグリソームの形成を促進することが示唆された。2)細胞をMG-132で処理すると、ユビキチン化蛋白質のオリゴマーが形成される。このユビキチン化蛋白質のオリゴマーは細胞毒性を示す。USP10の発現を低下させた細胞では、MG-132処理による細胞死が昂進した。これらの結果は、USP10がアグリソームの形成を介して、ユビキチン化蛋白質オリゴマーの細胞毒性を抑制することを示唆した。3)USP10はアルツハイマー病の病原蛋白Tauの凝集体形成を誘導する。HT22細胞をMG-132で処理すると, TauとTIA1が陽性のストレス顆粒の形成が誘導された。このストレス顆粒の形成は、USP10の発現を低下させると、著明に低下した。Tauはアルツハイマーの原因蛋白であり、脳病変にTau陽性の凝集体を形成する。以上の結果は、USP10がTau陽性のストレス顆粒の形成を介してアルツハイマー病の発症に関与することを示唆した。4)USP10は、パーキンソン病において、レビー小体の形成に関与する。パーキンソン病は、円滑な運動に関与する神経細胞が死滅することを特徴とする神経変性疾患である。α-シヌクレインはパーキンソン病の原因蛋白の1つである。α-シヌクレインはパーキンソン病の脳病変にレビー小体と呼ばれる、α-シヌクレイン陽性の凝集体を形成する。USP10とα-シヌクレインをHeLa細胞に共発現すると、α-シヌクレイン陽性/USP10陽性のレビー小体様の凝集体が形成された。血液系腫瘍細胞は活性酸素を多量に産生している。活性酸素の高産生は、腫瘍細胞の異常増殖、遺伝子変異の蓄積および悪性形質の獲得などに寄与する。ストレス顆粒はストレスによって一過性に誘導される細胞質内の複合体である。研究代表者は、ストレス顆粒がストレスによる活性酸素の産生と細胞死を抑制すること、この抑制にUSP10蛋白が必須であることを報告した。また、このストレス顆粒の形成に、G3BP1とG3BP2が関与することを報告している。本研究では、ストレス顆粒という、全く新しいタイプの活性酸素制御装置の生体内機能の分子機構およびこの機能不全がどのようにして白血病の病態に関与するのかを明らかにする。1)全身性のUSP10欠損マウスは造血不全を発症した。また、生後すぐに死亡するマウスが多いことが示された。2)G3BP1-KOマウスおよびG3BP2-KOマウスの作製を進めている。G3BP1マウスはヘテロマウスを樹立した。G3BP2マウスもG3BP2ターゲティングベクターを導入したG3BP2組換えマウスは樹立した。このG3BP2マウスから、Neoカセットを除去し、CREマウスと交配し、G3BP2-KOマウスを樹立する。これらのマウスを解析することにより、ストレス顆粒、G3BP1,G3BP2およびUSP10の活性酸素産生における生体内機能が明らかになることが期待できる。3)ストレス顆粒の形成能がUSP10をノックダウンすると低下し、USP10を過剰発現すると低下した。従って、USP10は、ストレス顆粒形成に対して正と負の両方の作用を持つことが示された。4)G3BP1とG3BP2とでは活性酸素の制御において違いがあることが示唆された。USP10欠損マウスの解析が進んだ。G3BP1とG3BP2の欠損マウスが順調に進んでいる。研究代表者は、ストレス顆粒がストレスによる活性酸素の産生とアポトーシスを抑制すること、この抑制にUSP10およびG3BP1蛋白が関与することを報告した。さらに、G3BP1のみならず、G3BP2がストレス顆粒の形成に関与することを報告した。本研究では、USP10, G3BP1、G3BP2およびストレス顆粒による活性酸素制御の分子機構および、USP10、G3BP1およびG3BP2欠損マウスを用いて、ストレス顆粒がどのような生体内機能に関与するのかを明らかにする。この造血不全は造血幹細胞のアポトーシスによることが明らかになった。SCL(stem cell factor)が造血幹細胞のアポトーシスを抑制するが、この抑制は、USP10欠損により低下した。USP10変異体を用いた解析から、USP10の脱ユビキチン化酵素活性がアポトーシスの抑制に必須であることが示された。2)脳特異的USP10欠損マウスを樹立した。病態解析を進めている。

3)G3BP1欠損マウスおよびG3BP2欠損マウスの作製を進めた。G3BP1マウスはヘテロマウスを樹立した。G3BP2欠損マウスもヘテロ欠損マウスの樹立の直前まで進んだ。これらのマウスを解析することにより、ストレス顆粒、G3BP1,G3BP2およびUSP10の活性酸素産生における生体内機能を明らかにする予定である。4)USP10が蛋白凝集体形成を促進することが示唆された。すなわち、USP10を過剰発現すると、ユビキチン化蛋白の凝集が亢進した。逆に、USP10をノックダウンするとユビキチン化蛋白の凝集が低下した。これらの結果はUSP10およびストレス顆粒がユビキチン化蛋白の凝集に関与することを示唆している。G3BP1欠損マウスとG3BP2欠損マウスの作製が少し遅れている。1)活性酸素の制御にアグリソームが関与することが示唆されている。USP10はアグリソームの形成を促進し、ユビキチン化蛋白質オリゴマーの細胞毒性を抑制する。HeLa細胞をMG-132(プロテアソーム阻害剤)で処理すると、蛋白質凝集体(アグリソーム)が形成された。USP10の発現を低下させた細胞では、MG-132処理によるアグリソーム形成が著しく低下した。これらの結果は、USP10がアグリソームの形成に関与することを示した。USP10とp62が強調してアグリソームの形成を促進することが示唆された。2)細胞をMG-132で処理すると、ユビキチン化蛋白質のオリゴマーが形成される。このユビキチン化蛋白質のオリゴマーは細胞毒性を示す。USP10の発現を低下させた細胞では、MG-132処理による細胞死が昂進した。これらの結果は、USP10がアグリソームの形成を介して、ユビキチン化蛋白質オリゴマーの細胞毒性を抑制することを示唆した。3)USP10はアルツハイマー病の病原蛋白Tauの凝集体形成を誘導する。HT22細胞をMG-132で処理すると, TauとTIA1が陽性のストレス顆粒の形成が誘導された。このストレス顆粒の形成は、USP10の発現を低下させると、著明に低下した。Tauはアルツハイマーの原因蛋白であり、脳病変にTau陽性の凝集体を形成する。以上の結果は、USP10がTau陽性のストレス顆粒の形成を介してアルツハイマー病の発症に関与することを示唆した。4)USP10は、パーキンソン病において、レビー小体の形成に関与する。パーキンソン病は、円滑な運動に関与する神経細胞が死滅することを特徴とする神経変性疾患である。α-シヌクレインはパーキンソン病の原因蛋白の1つである。α-シヌクレインはパーキンソン病の脳病変にレビー小体と呼ばれる、α-シヌクレイン陽性の凝集体を形成する。USP10とα-シヌクレインをHeLa細胞に共発現すると、α-シヌクレイン陽性/USP10陽性のレビー小体様の凝集体が形成された。1)G3BP1, G3BP2および組織特異的USP10欠損マウスの作成を進める。29年度の後半から欠損マウスの解析が行う予定である。2)G3BP1とUSP10の新しい結合蛋白を同定している。これらの機能解析を通して、ストレス顆粒、G3BP1, G3BP2およびUSP10の活性酸素制御における作用機構を明らかにする予定である。1)G3BP1, G3BP2欠損マウスの作成を進める。平成30年度からG3BP1とG3BP2欠損マウスの病態解析を行う予定である。2)脳特異的USP10欠損マウスの病態解析を進める。
肝性脳症における脳CCKー8の減少とアンモニア・グルタミン酸代謝との関連

1.エック瘻犬における脳CCKと血液および髄液アンモニアとの関連:エック瘻犬では正常犬に比し,大脳皮質のCCKが1/31/2に減少し,血液アンモニアは約5倍,髄液アンモニアは約3倍に増加した。エック瘻犬と正常犬において,大脳皮質のCCKと血液および髄液のアンモニアとは有意の負の相関を示した。2.エック瘻犬における脳CCKと脳グルタミン酸,グルタミンとの関連:エック瘻犬では大脳皮質のグルタミンとグルタミン酸の比(G1n1O/u比)の低値例(1.5以下)に脳CCKの減少が強い例が多く、脳CCKとGln 1Glu,比との間に正の相関傾向を認めた。このことからGluの量がGlnの量に比し相対的に多い場合に脳CCKがより減少することが考えられた。3.LECラットにおける脳CCK:脳症を伴ったLECラット(劇症肝定モデルラット)は高アンモニア血症を伴い大脳皮質CCKは著明に減少した。このことは組織化学的にも確認された。4.アンモニア負荷ラットの脳グルタミン酸,グルタミンに及ぼすMKー801の影響:MKー801(グルタミン酸受容体拮抗剤)投与(0.8mg/kg体重の経口投与)後アンモニア負荷(酢酸アンモニウム10mmol1kg体重の腹腔内投与)群はアンモニアが単独負荷(アンモニア負荷量はMKー801投与後アンモニア負荷群と同様)群に比し,疫摩発生までの時間が有意に短縮し,脳グルタミン酸が増加し,脳グルタミンは減少した。肝性脳症のモデルのエック瘻犬を作成し、次の結果をえた。1.エック瘻犬の血液、髄液のアンモニア(NH_3),グルタミン酸(glu),グルタミン(gln)の動態:エック瘻犬(N=4)を作成し、術後3週に術前時または正常犬(N=5)と比較した。血液;NH_3は117.8±34.0μg/dlで、術前値の約5倍の高値、gluは76.4±38.5μM,glnは755.1±463.8μMで、いずれも術前値と差を認めなかった。髄液;NH_3は89.3±7.8μg/dl,glnは142.6±587μM,glnは1845.2±168.9μMで,それぞれ正常犬の約3倍,2.5倍,3倍の高値を示した。2.エック瘻犬の脳CCK-8,glu,gln濃度:CCK-8;大脳皮質では正常犬の約2/31/2に著減(たとえば前頭葉;エック瘻犬183.3±34.6,正常犬354.2±128.8μmol/g wet wt)した。gln;大脳皮質では約1.3倍に増加(たとえば側頭葉;エック瘻犬97±1.4,正常犬7.7±1.1μmol/g wet ut)した。gln;大脳皮質では約3倍に増加(たとえば前頭葉;エック瘻犬14.4±7.4,正常犬5.1±0.9μmol/g wet wt)した。4.今回の分析により,脳CCK-8の減少は髄液アンモニアの増加と関連するのみならず,脳gluの増加,glnの増加とも関連する可能性をえた。Glufamate receptor aufogonist(MK801)を入手したので,これを用いてglufamateのneurofoxicityを除いた状態でのCCK-8の脳での減少,CCK-8産生neuvoriとの関連について検討する予定である。平成2年度には次の成績をえた。

1.アンモニア負荷ラットにおける脳グルタミン酸,グルタミンの変動とグルタミン酸受容拮抗剤(MKー801)の影響:SD系ラットに酢酸アンモニウム10mmol/kg i.p.またはMKー801 1ny/kg p.o.のそれぞれ単独ならびにMKー801投与60分後酢酸アンモニウム投与を行ない,神経症状および大脳皮貭のアミノ酸動態を検討した。その結果、アンモニア単独投与では対照(無処置)に比し脳のグルタミン,GABAの増加を認めた。MKー801単独投与の脳アミノ酸パタ-ンは対照と差を認めなかった。MKー801投与後アンモニア投与ではアンモニア単独投与に比しグルタミンの減少,グルタミン酸の増加傾向を認め,神経症状でも高度の痙攣が早期に認められた。すなわち,MKー801にてグルタミン酸→グルタミンの代謝が障害され,アンモニアの毒性が増強されるものと考えられた。
分泌蛋白質MFG-E8による皮膚免疫機能制御メカニズムの解明

分泌蛋白質MFG-E8は皮膚に浸潤するマクロファージやランゲルハンス細胞、血管周皮細胞などに発現し、血管新生能の他に、アポトーシス細胞の貪食促進、制御性T細胞の誘導、炎症性(M1)マクロファージの抑制などを介した抗炎症作用を持ち、皮膚免疫機能の制御に重要な役割を担っている可能性が高い。そこで本研究では、マウス皮膚炎モデル(接触皮膚炎、乾癬様皮膚炎)を用いて、皮膚免疫疾患におけるMFG-E8の役割、制御機構を明らかにし、その治療効果も明らかにすることを目的とした。接触皮膚炎モデルは、腹部にDNFBやTNCBを外用し、その5日後に耳にDNFBやTNCBを外用して、翌日から耳介の厚さを測定した。MFG-E8 WTマウスとKOマウスで比較を行ったが一定の傾向が得られず解析困難であった。また、イミキモドはランゲルハンス細胞やマクロファージのToll like receptor 7/8に作用し、サイトカイン(IFN、TNFα、IL-17, IL-23など)の発現を誘導して尋常性乾癬様の皮疹を発症させることが知られている。マウスの背部にイミキモド62.5mgを6日間連日外用すると表皮肥厚、鱗屑、紅斑といった乾癬に類似した病変を呈した。MFG-E8 WTとKOマウスで比較を行ったが、こちらも乾癬様皮疹の程度に一定の傾向が得られなかった。皮膚炎組織を用いて炎症細胞浸潤(リンパ球、好中球、マクロファージ)や炎症性サイトカインの発現(real time PCR法によるmRNA量やFACSによる発現量)などについて比較、検討を行ったところ、違いが得られたため、さらに詳しく検討を重ねている。
細胞シート工学を応用した乳歯歯髄幹細胞による唇顎口蓋裂患者の新規顎裂治療法の開発

これまでの研究により、各種の間葉系幹細胞(MSC)から骨形成細胞シートを安定的に作製することが可能となった。しかし、骨形成細胞シートだけでは、in vivoで良好な骨形成はみられなかった。そのため、当該年度は骨形成細胞シートと人工骨を組み合わせた移植法や、成長因子を用いた培養法などについて検討を行った。更に、「顎裂モデル」のみならず、他の骨欠損モデルにおいても検討を行った。その結果、抜歯後欠損モデルにて成長因子を用いた手法が骨形成細胞シートを用いる移植方法より良好な骨形成がみられた。そこで、成長因子の影響を調べるため、in vitro研究にて成長因子の至適濃度や組み合わせる担体について検討を行った。徐放製剤であるハイドロゲルとの組み合わせにおいて良好な骨形成を示すことが判明した。そこで、コントロールを設定しin vivoでの比較検討を行った。定量評価は組織学的、マイクロCTによるエックス線学的に行った。組織学的検査では実験群は旺盛な骨形成を認めたが、コントロール群では骨形成はみられず、壊死骨形成や著明な炎症細胞浸潤を伴っていた。エックス線学的検査でも実験群は旺盛な骨形成を認めたが、コントロール群でははっきりとした骨形成はみられず、腐骨と思われる不透過像がみられた。統計学的に実験群は有意に骨形成を認めた。骨形成細胞シートを用いる移植方法より成長因子を用いる手法の方が骨形成能が高い可能性が示された。現在、経時的な変化を確認するため、移植実験を継続中である。当初は動物モデルにて骨形成細胞シートによる顎裂治療の可能性を経時的に検証する予定であったが思わしい結果が得られなかった。そのため、他の再生医学的なアプローチによる顎裂治療の可能性について検証を行ったところ、成長因子を用いた手法にて一定の成果が得られた。しかし、経時的な変化を検証するところまで研究を進捗することができなかった。現在、当該研究を行っている最中であり、当初の予定よりやや遅れている状況である。当初予期していなかった方法ではあるものの、成長因子を用いた手法による顎裂治療の可能性を見出すことができた。我々の最終目標は再生医学的アプローチを用いることで自家骨移植に寄らない顎裂治療法の開発であり、今後は骨形成細胞シートを用いた方法から成長因子を用いた手法へと研究を発展的に移行し、更に推進していく予定である。本年度は、ヒト乳歯歯髄由来間葉系幹細胞(乳歯MSC)を用いた骨形成細胞シートの作製方法を確立することである。過去の研究から引き続き、播種密度、培養期間、添加因子(デキサメタゾン、アスコルビン酸)の濃度を検討することで骨形成細胞シートの作製条件の設定を行った。過去の報告をもとに播種密度と培養期間を設定し、継続的なALP活性値の計測を行った。すると、細胞の播種密度は0.25×10^4cell/cm^2、培養期間は10日の群で、最も高い骨形成能が認められた。また、添加因子に関しては、デキサメタゾンは50nM、アスコルビン酸は20.5μg/mLの濃度で最も高い骨形成が認められた。次にヌードラットを使用したin vivo実験を行った。乳歯MSCから作製した骨形成細胞シートを背側皮下へ移植を行ったが、明らかな骨形成は認めなかった。また、「顎裂モデル」に移植し、移植後8週で顎骨を摘出した。標本の評価としてマイクロCTによるX線学的評価と、組織学的評価を行った。マイクロCT像では、骨欠損部に石灰化物様の組織が少量見みられたが、組織標本像では骨様組織は認められなかった。乳歯MSCを用い、最も骨形成能の高い骨形成細胞シートの作製方法について確立することが出来た。ヌードラットの皮下では明らかな骨形成は認められなかったが、「顎裂モデル」へ移植を行うと、わずかながら骨形成を認めた。現在乳歯MSCによる「顎裂モデル」への移植実験が進行中であるため、研究はおおむね順調に進展しているといえる。昨年度で、ヒト乳歯歯髄由来間葉系幹細胞(乳歯MSC)を用いた骨形成細胞シートの作製方法を確立した。しかしヌードラットを使用したin vivo実験を行ったところ、背側皮下に移植した乳歯MSC骨形成細胞シートは明らかな骨形成は認めず、「顎裂モデル」に移植した骨形成細胞シートは、マイクロCT像上で骨欠損部に石灰化物様の組織が少量見みられたものの、組織標本像上では骨様組織は認められなかった。そこで再度in vitroの実験を行い、現状の培養条件が最も適しているか確認を行ったが、同条件での培養が最も高い骨形成を認めた。In vivoで良好な骨形成能を発揮できるような条件の開発を目指し、骨形成細胞シートだけではなく、スキャホールドと配合させた移植法や、成長因子を用いた培養法などを現在検討中である。現在in vivoで骨形成が出来るよう様々な角度で検討中である。In vitroでは最適な培養条件を確立したが、その条件に加え、人工骨の配合や成長因子の添加など、骨形成が出来るよう様々な条件で実験を行い、同時にヌードラットに移植中である。おおむね順調に進展しているといえる。