hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非モデル生物で迫る、歯の発生位置決定機構

本研究計画では、セダカヘビの胚発生過程と成体標本を調査し、非対称な歯列の形成過程を詳らかにすることを目的とした。野生動物であるセダカヘビについては卵が得難く、胚発生に関して得られた成果は限られた。しかしながらコントロールとして用いた、歯列の左右対称なコーンスネークにおいては、どのマーカー遺伝子がどの時期に下顎のどの場所で発現するのかがあきらかになった。これは、これまで確かな記載のなかった知見であり、今後の本実験において、確認するべき発生段階とマーカー遺伝子を限定する助けとなる成果である。また、成体標本のCTデータの種間比較により、歯列非対称性の程度と食性の特殊化に関連のあることが示唆された。本研究は、左右非対称な歯列をもつセダカヘビ類の歯列の形成メカニズムを明らかにすることを目的とする。実験で必要な卵を得るために成熟したタイワンセダカヘビを台湾北部において採集した。採集個体のうち4個体から合計29個の卵を得ることができた。しかし、未受精卵や発生が止まってしまった胚も多く、実際に実験に使用できる胚は7割程度だった。今回得られたセダカヘビの卵を用いて歯芽形成に関わる遺伝子の発現解析(in situハイブリダイゼーション)を行なうため、標的遺伝子のサブクローニングを試みた。実験室内で産卵されたタイワンセダカヘビとイワサキセダカヘビの卵から胚を取り出し、RNAの抽出を行なった後、cDNAの合成を行なった。得られたcDNAをもとに、目的の遺伝子のサブクローニングを行なった。その結果、歯芽形成関連遺伝子であるShh、Bmp2、Bmp4、Fgf4、Fgf8、Wnt3、Wnt4、Wnt7、Osr2, Lef1、Axin2の遺伝子の単離に成功した。また、左右軸決定のマーカー遺伝子であるNodalとPitx2についても同様に単離することができた。さらに、Shhについてはコーンスネーク胚を用いてin situハイブリダイゼーション(ISH)による発現解析を行なった。その結果、歯芽形成領域での発現を観察することができた。本年度は発現解析を円滑に行なうための下準備として重要なデータを得ることができており、次年度に繋がる研究成果といえる。本研究は、左右の下顎で異なる本数の歯をもつセダカヘビ科のヘビ類を対象に、その歯の発生過程を分子マーカーのin situ hybridizationによって記載することを目的とする。当該年度は胚の確保が十分にできなかったため、コントロールとして必要としていた他種のヘビの胚を対象に実験を実施した。その結果、前年度には成功しなかったヘビ胚下顎でのin situ hybridizationに成功し、安定した結果の出せるプロトコルを開発することができた。これにより、次年度以降の研究計画実施がより確実なものになった。また、より潤沢に胚を用いられるよう、セダカヘビおよびコーンスネーク(コントロール)の親個体を多数入手し、採卵の準備を進めている。胚の採取が野外採集個体に依存しているため、実験に用いることのできる材料の数が限られていることが進捗の遅れの主な要因になっている。また孵卵設備に不備があり、得られた卵を必要なステージまで育てることができなかったことも問題であった。本研究計画では、非対称な歯列をもつセダカヘビの胚発生を観察し、非対称な歯列の形成過程を詳らかにすることにより、脊椎動物一般における歯芽形成の位置決定を理解するための基盤整備を目指した。当該年度は、まず、冬季にクーリングを経験させることにより、飼育下のセダカヘビを春に交配させ、産ませた卵から胚を得るという手法の確立に成功した。これにより、実験に用いる胚を多数確保することが可能になった。しかしながら、剖検対象とする発生段階まで卵を生かしておくことに予想外の困難が伴い、セダカヘビの胚発生に関して得ることのできた成果は非常に限られた。いっぽう、コントロールとして用いた、歯列の左右対称なコーンスネークでは多数の胚を得ることができ、歯牙形成に関与する複数のマーカー遺伝子について、どの時期に下顎のどの位置で発現が見られるのかがin situ hybridizationによってほとんど完全に解明できた。これは、未だに確かな記載のない知見であるばかりでなく、セダカヘビを用いる本実験において、確認するべき時期とマーカー遺伝子を限定するために大きな助けとなる成果である。また、台湾の一地点で集中的に実施してきたサンプリングによって得られた、共存する2種のセダカヘビの頭部CTを調査し、両者の歯列非対称性に大きな違いがあることをあきらかにした。さらに、この2種にはエサの選好性に違いがあり、非対称性の低い種はナメクジの専食者であることが行動実験により判明した。この結果は歯列非対称性とエサの特殊化に相関関係があることを示しており、セダカヘビ類に見られる歯列非対称性の種間・地域間変異を理解するうえで基礎となる仮説を実証するものと言える。調査に用いた標本のコレクションとそのCTデータは質が高く、今後さまざまな形態学的調査を実施していく予定である。

これは、これまで確かな記載のなかった知見であり、今後の本実験において、確認するべき発生段階とマーカー遺伝子を限定する助けとなる成果である。また、成体標本のCTデータの種間比較により、歯列非対称性の程度と食性の特殊化に関連のあることが示唆された。本年度は研究課題を達成するための準備に多くの時間を費やすこととなった。繁殖シーズンに得られたセダカヘビの卵の数は全体として少なく、更にそこから正常な発生を進めることができたのは7割程度であったため、当初予定していた実験用のサンプルを十分に入手できなかったことが、研究をやや遅らせてしまっている主な原因である。しかし、その一方で、新鮮なサンプルから得たRNAサンプルを有効に利用し、当初予定していたShh以外の複数の関連遺伝子を単離することができた。そのため、次年度以降の発現解析(in situハイブリダイゼーション)に必要なプローブの準備を整えることができている。最終年度にあたる今年度は、昨年度から維持している複数の親個体(セダカヘビおよび)を飼育下で交配させ、計画的な採卵をおこなう予定である。また孵卵設備を改善し、卵の生存率を高める算段をつけている。分子マーカーおよび実験手法の開発は完了しているため、進化生物学本年度の大きな問題であった発現解析に使用するセダカヘビの卵を数多く集めることが今後の研究課題である。野外から成熟したセダカヘビを採集するだけではなく、実験室内での繁殖を進めることで、より多くの卵を得るような工夫が必要である。また、産卵後すぐの卵の扱いがその後の発生を正常に進める上で重要であることが本年度の実験から明らかとなったため、次年度以降は孵卵器を用いた空中湿度の管理などを徹底することで、得られた卵をより高い割合で正常に発生させることが期待できる。本研究の課題であるセダカヘビの左右非対称な歯の発生過程を理解するためにセダカヘビの卵を上述した方法で確保することが非常に大事である一方で、左右対称な歯の形成過程との比較もする必要がある。そこで、ヘビの発生研究でメジャーな実験材料であるコーンスネークを用いて歯の発生過程の記載を行なう。コーンスネークの胚はセダカヘビに比べ、非常に扱いやすいため、どの発生段階の卵を重点的にサンプリングするかを決める上でも本研究を遂行する際に重要な研究成果が期待できる。遺伝子の発現解析に必要な遺伝子は既に単離が終了しているため、次年度以降は解析用のサンプルが揃い次第、すぐに実験を進められることができる。特に、計画当初から予定していたShhの発現パターンを胚の発生過程にそって観察することが次年度における最優先の実験である。実験に使用する予定の試料が十分な数で得られず、結果として試薬や解析ソフトウェアの購入が先送りされたため。計画の進行とともに順次使用していく。
核酸構成塩基のチオ誘導体が自己集合した金属錯体の合成と新規な光反応の開発

1. 4-アミノピリミジン-2-チオン配位子が,Co (III)錯体上でホモ集合して二量化した新規な錯体の合成とそのx線構造解析結果,およびホモ集合の二量化機構を本論文にまとめ,詳細な内容をJ. Chem. Soc., Dalton Trans., 2627 (1995)に発表した.2.チオバルビツール酸(tbba)と4, 6-ジアミノピリミジン-2-チオン(dapynt)の混合系で,2種類の配位子の組み合わせから生じるヘテロ集合した二量化配位子tbba-dapymtとdapymt-tbbaを含む新規なCo (III)錯体を合成し,構造解析結果を含めた諸性質について明らかにした.これらの結果は,Chem. Lett., 673 (1995)で速報した.3.数種類のプリンチオン系配位子を含むCo (III)ビス(エチレンジアミン)型錯体を合成した.プリンチオン系配位子ではピリミジン-2-チオン系とは異なり,4員環と5員環のN, S-キレート配位による連結異性体が可能となる.単結晶の構造解析および1H・13C-NMRスペクトルに基づき,これらの錯体の配位様式について解明しJ. Chem. Soc., Dalton Trans., (2), 305 (1996)に発表した.4.ピリミジン-2-チオン系を含むビス(ピピリジン)Ru (II)錯体を系統的に合成し,その立体化学を同じd^6電子配置のCo (III)ビス(エチレンジアミン)型錯体と比較した.その結果,Ru (II)錯体ではほとんどの系で複数の連結異性体が存在し,その存在比はCH/π相互作用に大きく依存するという興味深い結果が得られ,Chem. Lett., (1), 35 (1996)に速報した.またこの本論分は,CH/π相互作用をもつ異性体のx線構造解析結果と共に,J. Chem. Soc., Dalton Trans., (13), 2851 (1996)に詳細に報告した.1. 4-アミノピリミジン-2-チオン配位子が,Co (III)錯体上でホモ集合して二量化した新規な錯体の合成とそのx線構造解析結果,およびホモ集合の二量化機構を本論文にまとめ,詳細な内容をJ. Chem. Soc., Dalton Trans., 2627 (1995)に発表した.2.チオバルビツール酸(tbba)と4, 6-ジアミノピリミジン-2-チオン(dapynt)の混合系で,2種類の配位子の組み合わせから生じるヘテロ集合した二量化配位子tbba-dapymtとdapymt-tbbaを含む新規なCo (III)錯体を合成し,構造解析結果を含めた諸性質について明らかにした.これらの結果は,Chem. Lett., 673 (1995)で速報した.3.数種類のプリンチオン系配位子を含むCo (III)ビス(エチレンジアミン)型錯体を合成した.プリンチオン系配位子ではピリミジン-2-チオン系とは異なり,4員環と5員環のN, S-キレート配位による連結異性体が可能となる.単結晶の構造解析および1H・13C-NMRスペクトルに基づき,これらの錯体の配位様式について解明しJ. Chem. Soc., Dalton Trans., (2), 305 (1996)に発表した.4.ピリミジン-2-チオン系を含むビス(ピピリジン)Ru (II)錯体を系統的に合成し,その立体化学を同じd^6電子配置のCo (III)ビス(エチレンジアミン)型錯体と比較した.その結果,Ru (II)錯体ではほとんどの系で複数の連結異性体が存在し,その存在比はCH/π相互作用に大きく依存するという興味深い結果が得られ,Chem. Lett., (1), 35 (1996)に速報した.またこの本論分は,CH/π相互作用をもつ異性体のx線構造解析結果と共に,J. Chem. Soc., Dalton Trans., (13), 2851 (1996)に詳細に報告した.1.4-アミノピリミジン-2-チオン配位子が,Co(III)錯体上でホモ集合して二量化した新規な錯体の合成とそのx線構造解析結果,およびホモ集合の二量化機構を本論文にまとめ,詳細な内容をJ.Chem.Soc.,Dalton Trans.,2627(1995)に発表した.2.チオバルビツール酸(tbba)と4,6-ジアミノピリミジン-2-チオン(dapynt)の混合系で,2種類の配位子の組み合わせから生じるヘテロ集合した二量化配位子tbba-dapymtとdapymt-tbbaを含む新規なCo(III)錯体を合成し,構造解析結果を含めた諸性質について明らかにした.これらの結果は,Chem.Lett.,673(1995)で速報した.3.数種類のプリンチオン系配位子を含むCo(III)ビス(エチレンジアミン)型錯体を合成した.プリンチオン系配位子ではピリミジン-2-チオン系とは異なり,4員環と5員環のN,Sキレート配位による連結異性体が可能となる.単結晶の構造解析および^1H・^<13>

C-NMRスペクトルに基づき,これらの錯体の配位様式について解明しJ.Cehm.Soc.,Dalton Trans.,in press(1966)に発表した.1.数種類のプリンチオン系配位子を含むCo(III)ビス(エチレンジアミン)型錯体を合成した.プリンチオン系配位子ではピリミジン-2-チオン系とは異なり,4員環と5員環のN,Sキレート配位による連結異性体が可能となる.単結晶の構造解析および^1H・^<13>C-NMRスペクトルに基づき,これらの錯体の配位様式について解明しJ.Chem.Soc.,Dalton Trans.,(2),305(1996)に発表した.2.ピリミジン-2-チオン系を含むビス(ビピリジン)Ru(II)錯体を系統的に合成し,その立体化学を同じd^6電子配置のCo(III)ビス(エチレンジアミン)型錯体と比較した.その結果,Ru(II)錯体ではほとんどの系で複数の連結異性体が存在し,その存在比はCH/π相互作用に大きく依存するという興味深い結果が得られ,Chem.Lett.,(1),35(1996)に速報した.またこの本論文は,CH/π相互作用をもつ異性体のx線構造解析結果と共に,J.Chem.Soc.,Dalton Trans.,(13),2851(1996)に詳細に報告した.3.新しい試みとして,4-アミノ-6-ヒドロキシピリミジン-2-チオン配位子(H_2atuc)が配位したCo(III)錯体を原料にしてH_2atucとの反応を試みたところ,組成的には同じでありながら従来の合成法では生成しない別種の二量化錯体が生成していることを,NMRスペクトルで確認した.また,二量化錯体自身を原料錯体とすることにより,三量化錯体が生成することも確認した.
新規分泌型発光デュアルプローブを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ　での癌細胞上皮間葉移行解析

マウスをもちいて皮下腫瘍細胞移植モデルを作製した。腫瘍細胞移植後、マウスの皮下腫瘍のサイズの変動を記録するとともに、生体イメージング法により腫瘍サイズを評価、さらに腫瘍細胞から分泌されたルシフェラーゼ活性を同時に評価した。光プローブを導入した腫瘍細胞にて、移植実験を行ない、シグナルのバランス、血液中に分泌された分泌型ルシフェラーゼ(C-Luc)活性の測定、イメージングのためのルシフェラーゼ活性(F-Luc)および腫瘍サイズおよび転移との相互関係を解析し、その有用性を確認した。In vivoによる実験として、マウス皮下腫瘍移植モデルを作成した。乳癌の細胞株MDA-MB231、胃癌細胞株(MKN-45/NUGC-4)、大腸癌細胞株(SW480)の細胞株をそれぞれ用いて、皮下に移植し、様々な移植条件(細胞数、マトリゲル濃度、移植ボリューム)を試み、腫瘍成長への最適条件を検討した。その結果、200ulのhalf matrigel内に10の5乗レベルの細胞を背部に移植することで、生体イメージング測定、血液中ルシフェラーゼ活性測定、サイズ測定に最適であることを見出した。移植細胞としては、乳癌細胞株および胃癌細胞株にてまず検討を開始することとした。その結果、腫瘍からは、2種類のシグナルが得られたものの、両者のシグナルバランスが悪く(同程度にシグナルが得られない)、プローブのデザインの変更を行なった。再び、in vitroの実験に戻り種々の方法を試したが、最終的にIRESシステムを利用して、同時に二つの遺伝子を同じプラスミドに挿入し、それによりシグナル強度のバランスを得た。現在、このプローブを導入した腫瘍細胞にて、移植実験を行なっており、シグナルのバランス、血液中に分泌された分泌型ルシフェラーゼ(C-Luc)活性の測定、イメージングのためのルシフェラーゼ活性(F-Luc)および腫瘍サイズおよび転移との関連を検討している。小動物によるin vivo実験として、マウス皮下腫瘍細胞移植モデルを作製した。腫瘍からは、2種類のシグナルが得られたものの、両者のシグナルバランスが悪く(同程度にシグナルが得られない)、プローブのデザインの変更を行なった。このプローブを導入した腫瘍細胞にて、移植実験を行ない、シグナルのバランス、血液中に分泌された分泌型ルシフェラーゼ(C-Luc)活性の測定、イメージングのためのルシフェラーゼ活性(F-Luc)および腫瘍サイズおよび転移との相互関係を解析し、その有用性を確認した。同時に、採取した腫瘍片の組織染色(H&E)および免疫染色にて、腫瘍の存在と腫瘍細胞内のプローブ発現の確認を行った。In vitro実験によるプローブデザインおよび作製とin vivo実験ではマウス皮下腫瘍移植モデルにて2種類のルシフェラーゼ活性を評価、検討した。分泌型ルシフェラーゼプローブの作成:E-Box配列をプロモータ領域に持つ分泌型ルシフェラーゼ(Cluc遺伝子あるいはGluc遺伝子)と通常の非分泌型ホタルルシフェラーゼ(Fluc遺伝子)のベクタープラスミドを作成した。胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌の細胞株をもちいて、細胞内に2種類の分泌型ルシフェラーゼと非分泌型ルシフェラーゼを同時に導入し、その発現バランスを検討した。In vitroによるアッセイでは十分なシグナル強度を示す良い結果が得られたため、in vivoによる検証実験に移った。In vivo実験では、2種のルシフェラーゼを導入した腫瘍細胞株をもちいて、皮下移植をおこない、腫瘍増殖と2種類のルシフェラーゼからのシグナルを、まず生体イメージング装置にて確認した。その結果、腫瘍からは、2種類のシグナルが得られたものの、両者のシグナルバランスが悪く(同程度にシグナルが得られない)、プローブのデザインの変更を行なうこととした。

再び、in vitroの実験に戻り種々の方法を試したが、最終的にIRESシステムを利用して、同時に二つの遺伝子を同じプラスミドに挿入し、それによりシグナル強度のバランスを得た。現在、このプローブを導入した腫瘍細胞にて、移植実験を行なっており、シグナルのバランス、血液中に分泌されたルシフェラーゼ活性の測定、腫瘍サイズおよび転移との関連を検討している。本研究計画の目標は,新規分泌型デュアルルシフェラーゼプローブ導入膵癌細胞を作成し,マウスをもちいたin vivoモデルにて、癌の進展に伴う種々の遺伝子活性を定量的かつ経時的に少量の採血のみで計測し,かつその分布をin vivoイメージングで可視化する。実現すれば,癌の進行における実際の生体内での遺伝子発現および腫瘍伸展における分子生物学的な解析を並行して行う画期的な研究となる。本技術は,生体内での標的分子の動態を低侵襲かつ安価な方法で経時的・持続的に評価でき,通常の光イメージング技術と異なり大動物でも理論的には応用可能で,プローブ導入技術の問題がクリアされればヒトでの応用の可能性も有するなど応用範囲の広い研究である。現時点では、基本的な技術開発(デュアルルシフェラーゼプローブの細胞への最適なバランスでの導入法の確立)の開発に成功しており、マウスへの癌細胞移植条件の検討も終了し、マウスをもちいた生体イメージング実験、血液中ルシフェラーゼ活性測定、腫瘍サイズ測定等の基盤となる実験は順調に進んでいる。概ね良好なペースで研究は進んでいるが、分泌型と非分泌型のルシフェラーゼを細胞内にバランスよく発現させることに関しては、若干の時間と工夫を要した。今後、様々な条件検討を進めながら、「遺伝子発現に対するレポーターとしてのルシフェラーゼの遺伝子導入」と「腫瘍細胞の存在を示すルシフェラーゼ遺伝子の導入」をバランスよく行ない、最終的に、その細胞株の移植モデルにて、遺伝子発現、腫瘍サイズの関連、浸潤・転移との関連に関する解析をする必要がある。本研究計画において,新規分泌型デュアルルシフェラーゼプローブ導入膵癌細胞を作成し,マウスをもちいたin vivoモデルにて、癌の進展に伴う種々の遺伝子活性を定量的かつ経時的に少量の採血のみで計測し,かつその分布をin vivoイメージングで可視化する。現時点では、基本的な技術開発(デュアルルシフェラーゼプローブの細胞への最適な導入法の確立)を細胞とマウスを用いて行なっており、概ね良好なペースで研究は進んでいる。ヌードマウスに対する腫瘍細胞株の移植モデルをもちいて、遺伝子発現、腫瘍サイズの関連、浸潤・転移との関連に関する解析をする。分泌型(あるいは非分泌型)のルシフェラーゼを組み込んだベクタープラスミドに対して、増殖、生存・抗アポトーシス、酸化ストレス、小胞体ストレスあるいはEMT(上皮間葉移行)に関連する遺伝子のプロモータを挿入し、レポータープラスミドとする。
大山土壌分離糸状菌からのイネいもち病菌メラニン生産阻害物質に関する研究

稲作の最重要病害であるいもち病菌(Magnaporth grisea:不完全世代Pyricularia oryzae)のイネへの感染にはいもち病菌内でのメラニン生産が必須である。そのメラニンの合成を顕著に阻害する天然物質である大山土壌分離糸状菌Penicillium decumbensのdecumbenone類の類縁体の検索を行った。P. decumbensの培養液から得られた酢酸エチル可溶中性区(NE区)および酸性区(AE区)より類縁体と考えられる物質を検出したが,微量で反応性の高い物質の可能性が考えられることから,さまざまな精製および保存方法を試みたが,単離や構造決定には至ってはいない。Decumbenone類の生合成解明のため,^<13>Cをラベルした酢酸ナトリウムを用いてのP. decumbensへの取り込み実験を行なった。P. decumbensを麦芽培地2Lに植菌し,24°Cで培養を行なった。培養4日目から6日目に^<13>Cでラベルした酢酸ナトリウムを培地に添加し,14日間培養した。培養後,培養ろ液からNE区を得た。NE区からdecumbenone Bを単離し,^<13>CNMRスペクトルの測定を行なった。その結果、1位が^<13>Cの酢酸ナトリウムを用いた場合,decumbenone Bの1,3,5,7,9,11,13位の炭素に^<13>Cが検出され,2位が^<13>Cの酢酸ナトリウムを用いた場合、decumbenone Bの2,4,6,8,10,12,14位の炭素に^<13>Cが検出された。これらの結果からdecumbenone Bはヘプタケタイドを出発物質とするポリケチド由来の化合物であるが考えられる。稲作の最重要病害であるいもち病菌(Magnaporth grisea:不完全世代Pyricularia oryzea)のイネへの感染にはいもち病菌内でのメラニン生産が必須である。そのメラニンの合成を顕著に阻害する天然物質として大山土壌分離糸状菌であるPenicillium decumbensから単離したdecumbenone Aおよび市販のメラニン合成阻害剤であるトリシクラゾールによるいもち菌の代謝産物への影響を調査した。その結果,pyriculol以外の物質をTLC上で確認できたが,少量であったため,その物質の単離には至っていない。また,decumbenone類の類縁体の検索を行った結果,P.decumbensの培養液の酢酸エチル可溶性中性区(NE区)および酸性区(AE区)より類縁体と考えられ物質を単離した。一つはNE区からナフタレン骨格に1つのメチル基と2つのメチレンアルコール基をもつ構造であると考えられる物質であったが,構造決定までには至ってはいない。もう一つはAE区からジカルボン酸である(2E,4E,6E)-8-hydroxy-3,7,9-trimethyldeca-2,4,6-trienedioic acidであると考えられる物質を単離した。ただし,この物質は構造から酸化を受けやすいと考えられ,詳細な構造や活性を調べるには至っていない。しかしながら,これら二つの物質はdecumbenone類と部分的に構造の類似性をもち,なおかつ,ポリケチドまたはテルペン類のどちらの起源とも言える物質であった。Decumbenone類も現在ポリケチドであると考えているが,テルペンである可能性もあり,今回単離した二つの化合物はdecumbenone類との生合成上の関連も含め非常に興味深い物質であった。そのメラニンの合成を顕著に阻害する天然物質として大山土壌分離糸状菌であるPenicillium decumbensから単離したdecumbenone Aの類縁体の検索を行った。P.decumbensの培養液から得られた酢酸エチル可溶中性区(NE区)および酸性区(AE区)より類縁体と考えられ二種の物質を発見したが,微量で反応性の高い物質の可能性があることから,さまざまな精製および保存を試みているが,構造決定には至ってはいない。さらに,検索を行なっているが,微量な成分でまた単離が非常に困難な状態である。しかし,P.decumbensの菌体成分より結晶性の物質を発見し,精製を行なった。得られた微量成分について^1H NMRを行なったが不純物が多く含まれていることから,さらに精製を進めている。さらに^<13>Cを1位にラベルした酢酸ナトリウムを用いてP.decumbensへの取り込み実験をおこなった。P.decumbensを麦芽培地2Lに植菌し,24°Cで培養を行なった。培養4日目から6日目に[1-^<13>C]酢酸ナトリウムを培地に添加し,14日間培養した。NE区にdecumbenone類の存在は確認し,現在単離を試みている。P. decumbensの培養液から得られた酢酸

エチル可溶中性区(NE区)および酸性区(AE区)より類縁体と考えられる物質を検出したが,微量で反応性の高い物質の可能性が考えられることから,さまざまな精製および保存方法を試みたが,単離や構造決定には至ってはいない。Decumbenone類の生合成解明のため,^<13>Cをラベルした酢酸ナトリウムを用いてのP. decumbensへの取り込み実験を行なった。P. decumbensを麦芽培地2Lに植菌し,24°Cで培養を行なった。培養4日目から6日目に^<13>Cでラベルした酢酸ナトリウムを培地に添加し,14日間培養した。培養後,培養ろ液からNE区を得た。NE区からdecumbenone Bを単離し,^<13>CNMRスペクトルの測定を行なった。その結果、1位が^<13>Cの酢酸ナトリウムを用いた場合,decumbenone Bの1,3,5,7,9,11,13位の炭素に^<13>Cが検出され,2位が^<13>Cの酢酸ナトリウムを用いた場合、decumbenone Bの2,4,6,8,10,12,14位の炭素に^<13>Cが検出された。これらの結果からdecumbenone Bはヘプタケタイドを出発物質とするポリケチド由来の化合物であるが考えられる。
超大規模電気生理学を用いた睡眠中のオフライン学習アルゴリズムの解析

睡眠中には記憶の定着などの「オフライン学習」が行われていると考えられている。このオフライン学習は動物にとって重要な意味をもつ経験を効率よく記憶するために重要な役割を果たしている可能性があるが詳細は不明である。記憶には海馬が重要な役割を果たしているが、その学習則は未だ定説を見ない。この背景には海馬の出力は他の脳領域での情報処理を経て行動や記憶に反映されるため、海馬単体の学習則を構築することが難しいことがある。そこで、本研究ではラットの複数の脳領域から多数の神経細胞の活動を一斉に記録し、海馬を含む大域的なネットワークにおける睡眠中のオフライン学習アルゴリズムを推定する。
子宮内膜症の病因、病態における各種免疫担当細胞の役割の解明

ライフスタイルの変化にともない、子宮内膜症が生殖年齢女性の妊孕性を減弱させる大きな原因の一つとなっている。しかしながら、本疾患は発症・進展機序が不明で予防・治療に苦慮している。今回の研究では、4つの課題について検討した。(1)子宮内膜症の局所環境として知られている炎症が各種サイトカインを介して子宮内膜症間質細胞からのCCL20産生を増やしてTh17を局所に集積させることが示唆され、これにはIL-17Aを介するフィードフォーワード作用も関与していると考えられた。(2) TGFβはESCのPAR2発現を促進し、proteinaseによるIL-6産生を増強することにより子宮内膜症を進展させることが示唆された。(3) IL-17FはIL-8, COX2の発現を促進し、TNFαとの同時添加により相乗的にIL-8産生を促進した。(4) IL-1β, TNFαはアクチビンの産生を促進し、かつ、アクチビンはIL-6, PAR2の発現を促進した。よって、アクチビンが炎症の増幅因子として子宮内膜症の進展に関与していることが示唆された。以上をまとめると、子宮内膜症における免疫と炎症の新たなメカニズムを明らかにすることができた。これらのメカニズムは今後の治療選択において新たなターゲットとなる可能性が期待でき、将来的には女性の妊孕性の改善、QOLの改善などに寄与すると考えられる。子宮内膜症は発症・進展機序が不明で予防・治療に苦慮している。今回の研究では、本疾患の発症・進展メカニズムとして重要である免疫学的側面について検討した。近年、新たなT細胞であるTh17細胞が発見され、我々は本細胞が子宮内膜症の進展に関与しており、病巣局所に集積していることを示してきた。しかしながら、Th17細胞の子宮内膜症病巣への集積機序は不明であった。そこで、我々はTh17細胞が発現するケモカイン受容体CCR6がそのリガンドであるCCL20の影響を受けて集積すると考えた。本研究では、まず、子宮内膜症病巣でTh17細胞がCCR6を発現しており、CCL20が周囲の間質細胞に発現していることを示した。ついで、CCL20が末梢血よりTh17細胞を遊走させることを示した。また、培養系にて炎症性サイトカインであるIL-1β, TNFα, IL-17Aが子宮内膜症間質細胞からのCCL20産生を促進し、特に、TNFαとIL-17Aが相乗作用を持つことを示した。また、これらの作用が各種MAPキナーゼ阻害剤で抑制されることも示した。以上の所見より、子宮内膜症の局所環境として知られている炎症が各種サイトカインを介して子宮内膜症間質細胞からのCCL20産生を増やしてTh17を局所に集積させることが示唆され、これにはIL-17Aを介するフィードフォーワード作用も関与していると考えられた。子宮内膜症におけるTh17細胞の役割を考えると、本研究の成果は子宮内膜症治療に多くの示唆を与えるものと考えられる。従来の炎症抑制、MAPキナーゼ阻害といった治療概念が子宮内膜症におけるTh17細胞の作用の抑制に適応される他に、CCL20/CCR6をターゲットとする治療戦略の可能性が提示された。【目的】子宮内膜症(EM)では、病巣で特定のproteinase産生が亢進することにより、その受容体であるproteinaseactivated receptor(PAR)2が活性化され、IL-6産生などEMの進展を促進する反応が惹起される。一方、EMではtransfoming growth factor beta(TGFβ)が病巣で増加することが報告されている。我々はこれまで不明であったPAR2発現制御におけるTGFβの作月1について検討した。【方法】倫理委員会の承認を得、文書同意の下、卵巣子宮内膜症性嚢胞からEM間質細胞(ESC)を分離培養し実験した。

まずESCをTGFβ,IL-1β,TNFαにて刺激しPAR2mRNA発現をRT-PCRで測定した。次にTGFβ(0,1,5,10ng/ml)で24H刺激後、PAR2活性化のためPAR2 agonist peptide(PAR2AP)30「Mを24H添加し、上清中のIL-6をELISAで測定した。またSB431542(TGFβtypel受容体阻害剤)10「M前投与後に同様にIGFβ、PAR2AP刺激後のIL-6を測定した。最後にPAR2siRNA導入によりPAR2発現を抑制し、同様にTGFβ、PAR2AP刺激後のIL-6を測定した。【成績】TGFβのみPAR2発現を増加させ、6時間においで最大3.2倍にPAR2mRM発現を増加させた。TGFβ前投与なしではPAR2AP添加は無添加に比しIL-6産生を2.8倍としたが、TGFβはこの比を濃度依存的に増幅し、10ng/mlでは5.1倍とした。SB431542はTGFβ投与によるPAR2mRM増加、PAR2AP添加によるIL-6産生の増強効果を抑制した。PAR2smRNA導入によりPAR2APによるIL-6産生の増加、TGFβ前投与によるIL-6産生の増強作用はともに消失した。【結諭】EMにおいてTGFβはESCのPAR2発現を促進し、proteinaseによるIL-6産生を増強することによりEMを進展させることが示唆された。子宮内膜症は慢性炎症性疾患として理解されるが、我々は炎症が本疾患を促進する機序について免疫が関係していると考えて研究を進めている。免疫と子宮内膜症といえば、古くから子宮内膜症細胞に対する免疫監視の減弱により子宮内膜症が発症・進展するとされており、これを支持するデータは種々の方面から蓄積されている。また、ナチュラルキラー細胞やマクロファージといった自然免疫を担当する細胞の機能異常が病因・病態と関連することも知られている。本講演では、新たな概念として獲得免疫系の細胞が本疾患の発症・進展に重要であり、これが炎症と深く関係していることを示す。現在、Th細胞としてTh1細胞,Th2細胞,Th17細胞の3種類が知られており、Th17細胞は感染制御や炎症性疾患で重要である。特に、IL-17AはTh17細胞が分泌する特異的サイトカインとして種々の役割を担う。我々は、Th17細胞が子宮内膜症組織に豊富に存在し、IL-17を分泌して子宮内膜症細胞の増殖を促進することを示してきた。最近、我々はTh17細胞の子宮内膜症組織への集積において子宮内膜症細胞に発現するケモカインCCL20がTh17に発現しているCCR6(CCL20の受容体)に作用することが大切であり、さらに、炎症性サイトカインであるTNFαなどがCCL20の発現を促進することを明らかにした。
管内超音先流れの境界層におけるバ-スト波が擬似衝撃波の振動に及ぼす影響について

凝似衝撃波が境界層と干渉して振動するとき、擬似衝撃波領域内で観測される圧力変動は、擬似衝撃波の先頭衝撃波上流の境界層内で生じる大きな圧力変動をもつ波に影響される。この波は境界層の壁面に極めて近い所から発生するバ-ストに相当すると思われ、バ-ストが下流に伝播して先頭衝撃波の前枝衝撃波と干渉するため、先頭衝撃波下流では大きな圧力変動が生じる。流路中心軸上の各位置における圧力変動の最大振幅の流れ方向の分布において、先頭衝撃波直後の位置における振幅の最大値の勾配は、最小値の勾配よりもかなり大きいが、これは大きな圧力勾配をもつバ-ストの影響が衝撃波の振動に影響を与えているためと思われる。また最大振幅の流れ方向の分布におけるピ-ク値の位置は、擬似衝撃波を構成する各衝撃波の位置に一致せず、その位置よりも下流にある。さらに最大振幅の圧力変動は、先頭衝撃波と第2衝撃波の中間位置よりわずか下流の位置で生じるが、この位置は先頭衝撃波下流の流れの加速が終る位置、すなわち第2衝撃波上流で流れの減速が始まる位置にほぼ等しい。このような流れの加速と減速領域は擬似衝撃波の各衝撃波が形成される機構に関係していることから、擬似衝撃波の振動現象は、擬似衝撃波の構造と密接な関係がある。また先頭衝撃波の前枝衝撃波と後枝衝撃波で囲まれる境界層がはく離している領域の壁面における圧力変動と、流路中心軸上の各位置における圧力変動の相互相関は、その位置が衝撃波間の流れの加先領域にある場合は正の値となり、偏速領域では負の値となる。以上のことから擬似衝撃波の振動現象は、擬似衝撃波の先頭衝撃波直前の境界層の状態と擬似衝撃波の構造に大きく影響される。管内に発生する擬似衝撃波が乱流境界層と干渉して平均位置の前後に振動するとき、擬似衝撃波の発生領域及び擬似衝撃波の先頭衝撃波上流の乱流境界層の数個所で壁面圧力変動を測定した結果、擬似衝撃波の領域では全体的に大きな圧力変動を示し、乱流境界層においては振幅は小さいが、時々大きな変動が観測される。これらの変動を周波数解析した結果、いずれの変動もその周波数帯域はかなり広い範囲にわたっており、特定の周波数に大きなピークを示すことはない、しかるにこれらのランダムな変動を詳細に分析すると、擬似衝撃波上流の境界層で時々大きな変動が発生するとき、擬似衝撃波、とくにその先頭衝撃波の位置においてある時間遅れて大きな変動が観測される。このような変動の伝ぱ速度と、各圧力変換器の位置関係を考慮するとき、擬似衝撃波領域において観測される大きな圧力変動は、その上流の乱流境界層から伝ぱする大きな圧力変動(バースト波)と密接な関係があることがわかった。またこの大きな圧力変動と擬似衝撃波が干渉するときの流れ場を光学観察した結果、先頭衝撃波の位置がかなり大きく変動し、衝撃波の形状も顕著な影響を受けることがわかった。さらにこのような擬似衝撃波の振動を抑制する目的で、管路の一部に設けた多孔壁面上に擬似衝撃波を位置させると、多孔壁がない場合に比べて壁面圧力変動がかなり小さくなり、擬似衝撃波の構造も大きく変化することがわかった。今後、バースト波と思われる大きな圧力変動と擬似衝撃波の干渉の機構、及び多孔壁面上に擬似衝撃波が位置するとき圧力変動が減少する理由について考察を進める予定である。また先頭衝撃波とバースト波が干渉するとき、擬似衝撃波の壁面近傍における境界層のはく離域が受ける影響を明らかにするとともに、第2衝撃波以降の衝撃波の振動とバースト波との関係についても研究を進める予定である。

疑似衝撃波領域内の圧力変動は、疑似衝撃波を構成する各衝撃波の相対位置や境界層と衝撃波との干渉による境界層のはく離と密接な関係があることから、疑似衝撃波が平均位置の前後に振動しているときの流れ場を、高速度写真観察した。その結果、先頭衝撃波の壁面近傍ではく離した境界層が激しく変化しており、同時に衝撃波の位置も大きく変わることが観察された。この衝撃波の振動をスペクトル解析した結果、400Hz以下に大きなピ-クをもつ周波数成分があり、先頭衝撃波のすぐ上流の境界層内の壁面で測定した圧力変動と相関関係があることがわかった。また疑似衝撃波が振動することにより生じる流路中心軸上の圧力変動の解析より、疑似衝撃波領域内における圧力変動の伝播方向は、流路中心軸から壁面方向に伝わることが確認された。今後は、流路中心軸上で圧力変動が上下流のいずれの方向から伝わるかを明らかにするため、流路中心軸上の圧力を測定するための通しピト-管内に、2個のKulite社製圧力変換器を取り付けて、二つの変換器の相対位置を変化させ、圧力変動の伝播方向に関する詳細なデ-タを得ることを試みる予定である。この圧力変動の伝播についての結果を得た後、疑似衝撃波とバ-ストとの干渉場をモデル化し、モデル計算により疑似衝撃波の発生により生じる圧力変動が小さくなるような管路系の設計法を試みる予定である。さらに疑似衝撃波による大きな圧力変動は境界層との干渉により生じるため、壁面に多孔壁を設けて境界層をパッシブコントロ-ルすることは、疑似衝撃波による圧力変動を軽減するために有効な方法であることを確認しているが、今後、その詳細なデ-タを得ることを計画している。
沿岸地の防災と観光の両立に向けた住民・一時来訪者の津波避難のリスク評価と改善方策

茨城県大洗町大洗サンビーチ海水浴場及び周辺を対象地域として,津波襲来時の地元住民と観光客の避難シミュレーションを実施し,当地の津波避難のリスク評価を行うとともに,的確な避難先割り当てや津波避難ビルの運用方法などについて津波避難計画の改善策の検討を行った。また,関東一都六県の居住者を対象にアンケート調査を実施し,大洗サンビーチにおける津波リスクと避難対策に関する情報を提示した場合の回答者の観光意欲を計測し,観光地における防災対策充実の観光誘客面での有用性について検証した。本研究では,茨城県大洗町大洗サンビーチ海水浴場及び周辺を対象地域として,地元住民と観光客を対象とした津波避難シミュレーションによる解析を実施し,当地における津波避難計画の改善策を提示することを目的とし,また,効果的な避難誘導方法や,津波避難リスク情報と避難対策に対する一般市民の受容度・評価についても検討を行うものである。平成26年度には,まず「当地海水浴客の避難行動特性の詳細分析」として,当地において海水浴客を対象として先行的に実施したヒアリング調査結果に基づき,津波襲来時避難開始タイミング,避難方向,避難手段などについて各種属性別に要因分析を行い,海水浴客の避難行動特性を把握した。一方,マルチエージェントモデルにより,大洗サンビーチ及び周辺における5万人規模の津波避難行動を模擬計算する「津波避難シミュレーションプログラムの作成」を行った。そして,前述の海水浴客の避難行動特性を入力として与え,現状での大洗サンビーチ・周辺における津波襲来時の海水浴客の避難シミュレーションを行い,避難者の混雑・渋滞の発生状況や避難者の避難完了分布等を出力し「現状での当地における津波避難のリスク評価」を行った。この結果を受けて,現状でのサンビーチ及び周辺における津波避難時の混雑発生箇所等の課題を特定した上で,避難を効率化・円滑化するため具体的改善策として,避難開始の促進,避難先割り当ての修正,避難誘導員の配置変更,自動車避難の抑制,津波避難マップの閲覧促進,及び,津波避難ビル設置の効果とそれら施策の規範的な方法論について検討を行った。これらの検討結果から,的確な避難先割り当てや,逃げ遅れ者を収容可能とするための津波避難ビルの運用ルールなどについて「当地における規範的な津波方策の検討」を行い,津波避難対策の実務上有用となる知見を得た。平成26年度には,まず「当地海水浴客の避難行動特性の詳細分析」として,当地において海水浴客を対象として先行的に実施したヒアリング調査結果に基づき,海水浴客の避難行動特性を把握した。一方,当地における5万人規模の津波避難行動を模擬計算する「津波避難シミュレーションプログラムの作成」を行った。そして,現状での大洗サンビーチ・周辺における津波襲来時の海水浴客の避難シミュレーションを行い,「現状での当地における津波避難のリスク評価」を行った。この結果を受けて,現状での当地における津波避難の課題を特定した上で,避難を効率化・円滑化するため具体的改善策について検討し,的確な避難先割り当てや,逃げ遅れ者を収容可能とするための津波避難ビルの運用ルールなどについて「当地における規範的な津波方策の検討」を行い,津波避難対策の実務上有用となる知見を得た。平成27年度には,「現状での当地における津波避難のリスク評価」を継続して実施するとともに,また,「津波避難計画の改善効果の評価」として,シミュレーションプログラムの改良を行った上で,前年度の検討結果を受け,各種改善策を実施した場合の津波避難シミュレーションを行い,その効果を評価した。一方,「当地の津波避難計画の改善策の検討」として,以上でのシミュレーション結果を踏まえ,海水浴客及び地元住民の効率的かつ円滑な避難を実現するための具体的改善策について検討を行った。「平成27年9月関東・東北豪雨」災害の発生に伴い,その緊急調査や被災地の常総市復興計画策定委員会,及び,同市水害対策検証委員会などに携わることになり,これらの対応に時間と労力が削がれたことによって,当初は同年度中に実施予定だった「ビーチ・周辺道路の改修効果の評価」が十分に実施できなかった。具体的には,当地において計画されている緩傾斜護岸や築山,避難誘導路の設置などの構造的な改修や,周辺道の拡幅等を施した場合を仮定した津波避難シミュレーションとその効果評価に遅れが生じている。本研究では,茨城県大洗町大洗サンビーチ海水浴場及び周辺を対象地域として,地元住民と観光客を対象とした津波避難シミュレーションによる解析を実施し,当地における津波避難計画の改善策を提示することを目的とし,また,効果的な避難誘導方法や,津波避難リスク情報と避難対策に対する一般市民の受容度・評価についても検討を行ったものである。まず,当地において海水浴客を対象に実施したヒアリング調査結果に基づき,海水浴客の避難行動特性を把握した。一方,当地における5万人規模の津波避難行動を模擬計算する「津波避難シミュレーションプログラム」を開発した。そして,現状での大洗サンビーチ・周辺における津波襲来時の海水浴客の避難シミュレーションを行い,現状での当地における津波避難のリスク評価を行った。この結果を受けて,避難を効率化・円滑化するため具体的改善策について検討し,的確な避難先割り当てや,逃げ遅れ者を収容可能とするための津波避難ビルの運用ルールなど,当地における規範的な津波避難方策の検討を行い,津波避難対策の実務上有用となる知見を得た。

また,各種改善策を実施した場合のシミュレーションを実施し,当地の海水浴客及び地元住民の効率的かつ円滑な避難を実現するための避難計画の具体的改善策について検討した。さらに,津波リスク情報と避難対策に対する一般市民の受容度・評価を計測すべく,当地への潜在的観光需要者として関東一都六県の居住者を対象にアンケート調査を実施し,大洗サンビーチにおける津波リスクと避難対策に関する情報を提示した場合の回答者の観光意向を計測し,観光地における防災対策充実の観光誘客面での有用性について検証した。茨城県大洗町大洗サンビーチ海水浴場及び周辺を対象地域として,津波襲来時の地元住民と観光客の避難シミュレーションを実施し,当地の津波避難のリスク評価を行うとともに,的確な避難先割り当てや津波避難ビルの運用方法などについて津波避難計画の改善策の検討を行った。また,関東一都六県の居住者を対象にアンケート調査を実施し,大洗サンビーチにおける津波リスクと避難対策に関する情報を提示した場合の回答者の観光意欲を計測し,観光地における防災対策充実の観光誘客面での有用性について検証した。本研究は,海水浴場及び周辺を対象地域として海水浴客と地元住民の津波避難シミュレーションによる解析を実施し,津波避難計画の改善策を提示しようとするものであるが,初年度にマルチエージェントモデルにより5万人規模の津波避難行動を模擬計算に対応するシミュレーションプログラムを開発でき,それに基づく解析を実施できたため,3年計画の1年目終了時点としては,おおむね順調に進展していると言える。平成28年度には,前年度に遅れが生じた「ビーチ・周辺道路の改修効果の評価」として当地において計画されている緩傾斜護岸や築山,避難誘導路の設置などの構造的な改修や,周辺道の拡幅等を施した場合を仮定した津波避難シミュレーションを実施し,その効果の評価を行う。また,これまでの検討結果を踏まえ,「効果的な避難誘導方法の検討」として,効率的な避難を実現するための的確な避難誘導方法について検討を行う。ここでの「避難誘導方法」とは,具体的な誘導内容を避難者に周知するための情報提供の内容,媒体及びタイミングを指し,この検討に当たっては,実地において海水浴客や地元住民に評価を求める。次に,「津波リスク情報と避難対策に対する一般市民の受容度・評価の計測」として,これまでの検討結果を踏まえ,大洗サンビーチにおける津波リスクと避難対策に関する情報を提示した場合の一般市民の受容度や評価を計測し,観光地における防災対策充実の観光誘客面での有用性について検証する。この計測に当たっては,潜在的な観光需要によって検討すべく,来訪した海水浴客だけでなく,当地への誘客圏内の一般市民を対象として調査を実施する。都市・地域防災平成27年度には,「現状での当地における津波避難のリスク評価」を継続して実施するとともに,「ビーチ・周辺道路の改修効果の評価」として,当地において計画されている緩傾斜護岸や築山,避難誘導路の設置などの構造的な改修や,周辺道の拡幅等を施した場合を仮定して津波避難シミュレーションを行い,その効果を評価する。
ルーブリック評価のIR分析を通した介護実習の改善手法の開発

介護人材育成の教育課程において効果的な介護実習評価を実施するため、介護実習で到達すべき能力指標と基準を養成校、実習施設、学生が共有できるルーブリックを開発する。そして、評価結果をIR分析し学生にフィードバックすることで自己省察を促し、さらに実習指導者による実習FDにつなげて実習後の授業に活かすPDCAサイクルの仕組みを検討して、質の高い介護人材に向けて学生の成長を促す実習評価システムを構築する。
実験的脳梗塞の神経発生と血管新生に与える運動負荷の効果

実験的脳梗塞において新生ニューロンが、脳室上衣下層(SVZ)から梗塞巣に向かって移動し、傷害された神経ネットワークを修復する可能性が示唆されている。本研究では、SVZから梗塞巣に移動するSOX2陽性細胞数が、梗塞後1日30分間6日トレッドミル運動によって増加したことから、SVZで生まれた新生ニューロンの梗塞巣への移動が促進される可能性が示された。さらに、海馬歯状回顆粒細胞層(SGZ)のSOX2陽性細胞数が梗塞側において減少し、トレッドミル運動することによって回復する傾向を示した。従って、運動負荷が梗塞巣側の新生ニューロンの産生と移動を促進する可能性を示した。如何なる機構でこの促進が起こり、神経機能の回復につながるかは今後の課題である。本研究の目的は、脳梗塞の動物実験モデルを用いて、運動負荷が梗塞病巣の回復に如何に作用するかを梗塞病巣の神経発生および血管新生の誘導に着目して、神経細胞学的な解析によって明らかにすることである。また、梗塞病巣の変化の特性と対応する運動機能との関係を明らかにする。梗塞病巣の神経細胞学的な構成および動態と運動負荷による変化の関係が明らかになれば、より有効なリハビリテーションのプログラムを形成していく基礎になると考える。平成22年度は、ラットを用いて中大脳動脈血栓法による脳梗塞モデルを作製し、脳梗塞後の神経細胞学的評価を行うための予備実験を行った。ラットに対して、右中大脳動脈血栓法を行い、脳梗塞モデルラットを作製した。梗塞後の運動麻痺が定量的かつ実験に適したものであるのかどうかを確認する為に、経時的な運動機能評価を行った。運動機能評価には、Motor Deficit Scoreを使用した。また、神経神経を確認する為に、BrdUを投与した。実験期間終了後、ラットの脳を取り出し、凍結横断切片を作製し、抗BrdU抗体と神経幹・前駆細胞のマーカーnestin、未分化ニューロンのマーカーDCX、あるいは成熟ニューロンのマーカーNeuNと二重染色し、新生ニューロンの動態を観察した。血管新生については、抗BrdU抗体と血管内皮に対する抗vWFあるいはRECA-1に対する抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、運動機能評価と組織学的評価によって、定量的な脳梗塞モデルラットが我々の研究室で作製できたことが確認できた。本研究の目的は、脳梗塞の動物実験モデルを用いて、運動負荷が梗塞病巣の回復にいかに作用するかを梗塞病巣の神経発生および血管新生の誘導に着目して、神経細胞学的な解析によって明らかにすることである。梗塞病巣の神経細胞学的な構成および動態と運動負荷による変化の関係が明らかになれば、より有効なリハビリテーションのプログラムを形成していく基礎となると考える。平成23年度は、中大脳動脈血栓法による脳梗塞モデルを作製し、脳梗塞後の神経細胞学的評価と運動機能評価を行った。ラットの右中大脳動脈血栓法を行い、脳梗塞モデルを作製した。術の前後にBrdUを腹腔内投与した。また、トレッドミル運動と運動機能評価を術後7日目まで毎日行った。実験期間終了後、ラットの脳を取り出し、パラフィン包埋し、薄切した。薄切した切片に対して、抗BrdU抗体と、神経幹・前駆細胞マーカーであるnestin、SOX-2抗体、成熟ニューロンマーカーであるMAP2、NeuN抗体、血管内皮に対するvWF抗体を用いた免疫組織染色を行った。その結果、脳梗塞後に何かしらの新生細胞が梗塞巣周辺などに観察されることが分かった。しかし、運動負荷を行った群と行わなかった群に有意な違いは見られなかった。今後は、BrdUの投与時期・量や、実験期間、運動強度などについて検証し、梗塞病巣の変化の特性と運動機能との関係を明らかにできる条件を探求していく。本研究の目的は、脳梗塞の動物実験モデルを用いて、運動負荷が脳梗塞の回復に如何に作用するか、梗塞脳における神経発生および血管新生の誘導に着目して、神経細胞学的な解析によって明らかにすることである。また梗塞巣の病変の特徴と対応する運動機能との関係を明らかにする。梗塞脳における神経細胞学的な病態が運動負荷によって如何に変化するかが明らかになれば、より有効なリハビリテーションプログラムの基礎になると考える。平成24年度は、中大脳動脈血栓法による脳梗塞モデルを作成し、梗塞後トレッドミルによって運動負荷を与えた群と対照群との脳について免疫組織学的に比較した。昨年度に引き続いて、梗塞後7日目の脳のパラフィン包埋切片による比較を行った。

パラフィン切片で免疫染色可能な種々の神経系マーカーについて免疫染色を行ったが、胎生期細胞で発現するSox2分子の発現している細胞が新生神経系細胞の動態をよく反映していることが分かった。梗塞巣の脳室壁上衣下層から新生神経系細胞が梗塞巣へ移動し、梗塞周囲層へ集積した。この現象は運動負荷群において促進する傾向を認めた。統計学的有意差については例数を増やして検討する必要がある。BrdU標識神経系細胞においても同様の傾向を示した。移動する神経系細胞の同定と運動負荷との関連、さらに長時間を経た時の神経系細胞の動態と運動との関連については今後の課題である。本研究によって、運動負荷が実験的脳梗塞の回復に如何に影響を与えるかを解析するか神経細胞的動態を解析するモデルを作成することができた。技術的な問題により、BrdU染色と他の抗体との2重染色により、新生ニューロンの同定ができなかった。また、運動負荷による梗塞病巣の変化が予想していたよりも大きくなかったために、両群の比較に統計的な差がでなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。まず、梗塞病巣の変化を促すことができる運動負荷の条件を検証し、適した実験系を作り上げる。同時に、新生ニューロンの同定をするために、新しい実験方法を試す。その後、当初予定していた、梗塞病巣の神経細胞学的な構成および動態と運動負荷による変化の関係が明らかにする。