hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インビボ特定神経における可逆的遺伝子発現制御を用いた睡眠覚醒制御機構の解明

本研究では、睡眠障害のひとつである「ナルコレプシー」に着目した。ヒトのナルコレプシー発正原因は、オレキシン神経の特異的な脱落である。前年度報告した新たなナルコレプシーモデルマウスであるorexin-tTA ; TetODTAマウスをもちいて、MCH受容体拮抗薬の睡眠覚醒に与える影響を調べた。Orexin-tTA ; TetODTAマウスでは、DOXの有無でオレキシン神経細胞死を制御可能である。DOX存在下ではオレキシン神経は正常に保たれ、DOX非存在下ではTetO配列下流にあるジフテリア毒素A断片(DTA)の発現が誘導されるため、オレキシン神経が細胞死を起こす。胎児期からDOX存在下で飼育し、その後10週齢に達した段階でDOXを除去し、ナルコレプシー症状である睡眠覚醒の分断化および脱力発作を呈するマウスを作製した。再度DOX存在下で飼育し、症状進行を抑制した。脳波筋電図を記録しながら、マウスの活動期である暗期直前に薬物を腹腔内投与し、それによる睡眠覚醒パターンへの影響を観察した。マウスに触れることなく薬物を投与するため、脳波筋電図記録用電極の留置と同時に腹腔内にチューブを留置し、脳波筋電図記録用電極と共に固定した新たな腹腔内投与システムを開発した。溶媒投与投与時とMCH受容体拮抗薬投与時の睡眠覚醒パターンを解析し比較した。その結果、溶媒投与時とMCH受容体拮抗薬投与時において著しい変化は認められなかった。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では、ドキシサイクリン(DOX)の有無により特定の神経細胞において特定の遺伝子発現を可逆的に制御可能なTet-offシステムを用いてオレキシン神経細胞に対するセロトニン神経からの抑制性入力が持つ生理的役割について個体行動実験で明らかにしてした。オレキシン神経特異的にtTAを発現する遺伝子改変マウスとtTA依存的にセロトニン受容体1A(Htrla)の発現させるマウスを交配しorexin/tTA;Tet0 Htrlaマウス)を作成した。In situ hybridizationの結果から、オレキシン神経特異的にHtrla mRNAが過剰発現誘導されていることを確認した。DOX含有餌を与えると、オレキシン神経におけるHtrlaの過剰発現がcontrolと同程度に戻ることを確認した。再びDOXを餌から除去すると、再度Htrlaの過剰発現が認められた。このことから、DOXによるオレキシン神経特異的なHtrlaの可逆的発現制御が可能であることを確認した。次に、電気生理学的解析によって、オレキシン神経に対するセロトニン抑制効果を検討した。その結果、Htrlaの過剰発現状態ではセロトニンの投与により神経活動の抑制が約2倍長く持続することがわかった。次にOrexin/tTA;Tet0 Htrlaマウスから脳波および筋電図を記録し、睡眠覚醒パターン解析を行った。その結果、Htrlaの過剰発現状態では、暗期初期において睡眠覚醒の著しい分断化が観察された。DOXによりHtrla発現量を元に戻すと、暗期初期にみられた睡眠覚醒の分断化が消失し、野生型マウスの睡眠覚醒に近いパターンを示し、長時間起き続けられるようになった。これらの結果から、オレキシン神経とセロトニン神経が形成する負のフィードバック回路は、暗期初期に機能し、オレキシン神経活動を適切な範囲に留めるのに重要であることが示唆された。ヒトのナルコレプシー発症原因は、オレキシン神経の特異的な脱落である。これまでのナルコレプシー研究では、生後直後からオレキシン神経が脱落する遺伝子改変マウスやオレキシン遺伝子欠損マウスなどが用いられてきた。しかし、ヒトでは思春期または成人期初期に好発することが知られているため、これまでのモデルマウスでは不十分であり、発達段階で別の神経回路による機能補償などが生じている可能性が高い。そこで、Tet-offシステムを用いて任意のタイミングでオレキシン神経特異的にジフテリア毒素A断片(DTA)を発現させ細胞死を誘発できる、新規ナルコレプシーモデルマウス(orexip-tTA ; Te tO DTAマウス)を作製した。このマウスでは、DOX存在下ではオレキシン神経は正常に保たれ、DOX非存在下ではDTAの発現が誘導されるため、オレキシン神経が細胞死を起こす。胎児期からDOX存在下で飼育し、その後10週齢に達した段階でDOXを除去し、免疫染色によってDOX除去とオレキシン神経細胞数との関係を検討した。その結果、DOX存在下ではオレキシン神経細胞数が野生型と同程度に保たれているが、DOX非存在下1週間後では86%、2週間後では95%のオレキシン神経が脱落していた。次に、同一個体から脳波筋電図を記録し、オレキシン神経細胞数とナルコレプシー症状発現との関係を検討した。その結果、86%のオレキシン神経が脱落すると睡眠覚醒の分断化が生じ、95%のオレキシン神経が脱落すると睡眠覚醒の分断化に加え脱力発作が観察された。これらの結果から、正常な睡眠覚醒を保つには15%以上のオレキシン神経細胞数が必要であり、それ以下になると睡眠覚醒の分断化や脱力発作などのナルコレプシー症状が発現することが明らかとなった。

本研究では、睡眠障害のひとつである「ナルコレプシー」に着目した。ヒトのナルコレプシー発正原因は、オレキシン神経の特異的な脱落である。前年度報告した新たなナルコレプシーモデルマウスであるorexin-tTA ; TetODTAマウスをもちいて、MCH受容体拮抗薬の睡眠覚醒に与える影響を調べた。Orexin-tTA ; TetODTAマウスでは、DOXの有無でオレキシン神経細胞死を制御可能である。DOX存在下ではオレキシン神経は正常に保たれ、DOX非存在下ではTetO配列下流にあるジフテリア毒素A断片(DTA)の発現が誘導されるため、オレキシン神経が細胞死を起こす。胎児期からDOX存在下で飼育し、その後10週齢に達した段階でDOXを除去し、ナルコレプシー症状である睡眠覚醒の分断化および脱力発作を呈するマウスを作製した。再度DOX存在下で飼育し、症状進行を抑制した。脳波筋電図を記録しながら、マウスの活動期である暗期直前に薬物を腹腔内投与し、それによる睡眠覚醒パターンへの影響を観察した。マウスに触れることなく薬物を投与するため、脳波筋電図記録用電極の留置と同時に腹腔内にチューブを留置し、脳波筋電図記録用電極と共に固定した新たな腹腔内投与システムを開発した。溶媒投与投与時とMCH受容体拮抗薬投与時の睡眠覚醒パターンを解析し比較した。その結果、溶媒投与時とMCH受容体拮抗薬投与時において著しい変化は認められなかった。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。オレキシン神経特異的なHtrlaの可逆的発現制御が可能であることをIn situ hybridization法を用いて確認した。電気生理学的解析を行った結果、Htrla過剰発現状態ではオレキシン神経はセロトニンの投与により約2倍長く抑制されることを確認した。さらに、脳波および筋電図記録による睡眠覚醒パターン解析の結果から、オレキシン神経とセロトニン神経間の負のフィードバック回路の生理的役割を明らかにすることができた。オレキシン神経を時期特異的に脱落させられる、新たなナルコレプシーモデルマウスの作製に成功した。組織学的解析、行動学的解析を組み合わせ、オレキシン神経細胞数とナルコレプシー症状発症との関係を明らかにした。今後は、強制水泳試験や高架十字迷路などの行動テストバッテリーを行い、睡眠覚醒以外におけるオレキシン神経とセロトニン神経間神経回路の重要性を検討する。さらに、睡眠障害の一つであるナルコレプシーのモデルマウス作成および解析に取り組む。時期特異的にジフテリアトキシンA断片をオレキシン神経で時期特異的に発現させ、オレキシン神経を任意の時期に脱落可能なマウスを作成する。このマウスを用いて、オレキシン神経細胞数とナルコレプシー発症との関係を詳細に検討する。ヒトのナルコレプシーでは、症状に個人差がある。そこで、今回作製した新規ナルコレプシーモデルマウスを用いて、さまざまな症状を呈すマウスを作製する。このマウスを用いて、新たな治療薬となりうる様々な受容体の拮抗薬などを投与し、症状に与える影響を検討する。
金属クロリン二量体を用いた高効率触媒システムの構築

金属クロリン錯体を用いた酸素還元反応の触媒反応機構解明および高効率化に関する研究が大きく進展した。酸素還元電極触媒を光触媒を用いた水の酸化系と組み合わせることで、水と酸素のみを原料とする光触媒的過酸化水素生成へと研究を展開した。酸素の2電子還元で得られる過酸化水素は常温常圧で液体であるため体積当たりのエネルギー密度が高く、水素と比べて貯蔵・運搬が容易である。また生成した過酸化水素は過酸化水素を用いた燃料電池の場合、理論上では水素燃料電池とほぼ同等の開放電圧(1.09 V)を得ることができ、必要なときに効率よく電気エネルギーへと変換することが出来る。本研究では、2室型光電気化学セルを用いたシステムで世界最高活性の太陽光エネルギー変換効率を達成するなど世界トップレベルの研究成果をあげた。この成果を取りまとめてNature Communicationsに投稿し、採択された。本論文を作成するにあたり、国内、国際学会に積極的に参加して国内外の関連研究者の意見を聞いて参考にした。その後、2室型光電気化学セルで用いるカソード電極触媒のさらなる活性向上を目指して、その基礎知識と電極触媒作製のノウハウを得るために米国留学し、金属有機構造体(MOF)を用いた電極触媒の合成に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。酸素の2電子還元で得られる過酸化水素は工業的には漂白剤や有機合成におけるクリーンな酸化剤として用いられるだけでなく、常温常圧において液体であることから燃料電池の燃料としても期待されており、その効率的な生成法の確立が求められている。これまでにコバルトクロリン錯体は選択的に酸素を2電子還元すると共に、酸性溶液中で非常に安定であり、過電圧も小さいことを報告している。平成25年度は当初の目的であった金属クロリン二量体を合成する過程で種々のコバルトクロリン誘導体の合成に成功し、マクロサイクル上の置換基の違いが触媒活性や反応機構に及ぼす影響について検討した。その結果、配位子上にβ-ケトエステル構造を有するコバルトクロリン配位子はこれまでのコバルトクロリン錯体と比べ、触媒反応速度が36倍にもなることが分かった。これはβケトエステル構造を有することでケト・エノール互変異性のため酸性溶液中でプロトン化されにくく、酸素還元活性種であるコバルト2価錯体の酸化電位が低くなり、律速過程である酸素のプロトン共役電子移動還元が加速されるためであることを明らかにした(論文投稿予定)。また金属錯体を用いた酸素還元触媒系は数多く報告されているが、メタルフリー触媒系による報告例は少なく、反応メカニズムは明らかにされていない。本研究では酸素分子に対して多点水素結合を形成し得るトリフィリン誘導体を触媒とする酸素還元反応の機構解明に挑み、酸素を選択的に2電子還元し過酸化水素を得ることが分かった。このときの反応活性種はトリフィリン誘導体の2電子・2プロトン還元体であり、酸素への水素原子移動が律速過程であることを初めて明らかにした(論文投稿予定)。さらにCrを中心金属とするクロム5価コロール錯体を用いても酸素の選択的な2電子還元により過酸化水素が得られることを明らかにした(論文投稿予定)。最終的には酸素還元システムと水の酸化システムを複合化し、水を電子源とする光駆動過酸化水素生成システムを構築する予定である。この複合システムにおいては可視光応答性の光触媒を用いることが、より高い太陽エネルギー変換効率を得る上で重要となる。この際、1ステップで水の酸化反応と酸素還元反応を同時に達成するためには、より小さな過電圧で効率よく酸素を還元する触媒が必要となる。今回得られた高効率かつ高い耐久性を有するコバルトクロリン錯体はこれらの目標を達成する上で非常に重要である。持続可能な社会を構築するためには、自然エネルギーの有効利用が急務である。太陽光エネルギーは無尽蔵ではあるが地域や時間帯によって変動するため、安定にエネルギーを得るためには、貯蔵可能な化学エネルギーへの変換が重要である。本研究では酸素の2電子還元で得られ、常温常圧で液体である過酸化水素を新しいエネルギー媒体として注目した。酸素を効率よく2電子還元する電極触媒の開発を行い、これに光触媒を用いた水の酸化を組み合わせることで、酸素と水のみを原料とする光触媒的過酸化水素生成を行った。まず、反応選択性の制御が重要な酸素還元反応は、反応性の制御が容易な金属錯体を用いた均一系触媒の開発を行った。触媒サイクル中で生成する低原子価金属イオンを安定化できるクロリンを配位子とする単核コバルト錯体を用いることで高い酸素還元選択性を有し、酸性溶液中において非常に安定でかつ過電圧の小さな酸素還元触媒の開発に成功した。この際、均一系条件で分光光学測定と電気化学測定を行うことで触媒反応機構についても明らかにした。一方、水の酸化を行う光触媒は高い耐久性が要求されるため、金属酸化物などの不均一系半導体光触媒を用いた。水の酸化と酸素還元を同時に達成する適切な価電子帯と伝導帯を有する半導体光り触媒として酸化タングステンとバナジン酸ビスマスを用いた。これらの酸素還元触媒と光触媒を正極・負極にそれぞれ担持し、ナフィオン膜で分離した2室型の光電気化学セルで光駆動過酸化水素生成を行った。負極に疑似太陽光を照射したところ、水中に加えて海水中においても過酸化水素が効率よく生成し(61 mM)、太陽光エネルギー変換効率は世界最高値の6.6%を示した。

酸素還元電極触媒を光触媒を用いた水の酸化系と組み合わせることで、水と酸素のみを原料とする光触媒的過酸化水素生成へと研究を展開した。酸素の2電子還元で得られる過酸化水素は常温常圧で液体であるため体積当たりのエネルギー密度が高く、水素と比べて貯蔵・運搬が容易である。また生成した過酸化水素は過酸化水素を用いた燃料電池の場合、理論上では水素燃料電池とほぼ同等の開放電圧(1.09 V)を得ることができ、必要なときに効率よく電気エネルギーへと変換することが出来る。本研究では、2室型光電気化学セルを用いたシステムで世界最高活性の太陽光エネルギー変換効率を達成するなど世界トップレベルの研究成果をあげた。この成果を取りまとめてNature Communicationsに投稿し、採択された。本論文を作成するにあたり、国内、国際学会に積極的に参加して国内外の関連研究者の意見を聞いて参考にした。その後、2室型光電気化学セルで用いるカソード電極触媒のさらなる活性向上を目指して、その基礎知識と電極触媒作製のノウハウを得るために米国留学し、金属有機構造体(MOF)を用いた電極触媒の合成に成功した。平成26年度は金属クロリン錯体を用いた酸素還元反応の触媒反応機構解明および高効率化に関する研究が大きく進展し、これらの成果として、Inorganic Chemistryに掲載され、学会発表にも積極的に参加し、国内外で高く評価されている。その後、効率的な酸素還元電極触媒の開発に成功したので、現在は酸素還元電極触媒と光触媒を用いた水の酸化と組み合わせることで水と酸素のみを原料とする光触媒的過酸化水素生成へと研究を展開し、2室型光電気化学セルを用いたシステムで世界最高活性の太陽光エネルギー変換効率を達成するなど世界トップレベルの研究成果をあげ、二報の論文を現在投稿済みもしくは準備中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。2室型光電気化学セルを用いた光り触媒的過酸化水素生成システムの問題点として、正極で生成した過酸化水素が濃度勾配によりナフィオン膜を透過し、負極の光触媒で分解することが挙げられる。この対策として、尿素やポリペプチド、スカンジウムイオンなどの過酸化水素と強い水素結合を形成すると考えられる試薬を添加することでナフィオン膜の透過を防ぐ予定である。また光捕集能力と伝導性に優れた半導体光触媒を組み合わせたタンデム型の光触媒を用いる事で太陽光エネルギー変換効率の向上を目指す予定である。当初の目標であった金属クロリン二量体は得られていないが、この研究過程で様々なコバルトクロリン錯体の誘導体の合成に成功した。これらの誘導体を用いて置換基の違いが触媒活性に及ぼす影響について明らかにすることができた。また金属を用いない有機触媒のよる酸素還元反応機構の解明やコバルトよりもより安価なクロムを中心金属とする錯体による触媒的酸素還元についても検討を行い大変興味深い結果を得ることができた。これらの触媒的酸素還元システムの機構解明・高効率化は水の酸化システムとの組み合わせ、水を電子源とする過酸化水素生成システムを構築する上で非常に重要である。
地域低炭素化事業の経済評価と地域ブランド化戦略に関する基礎的研究

中山間地域で展開されている低炭素型・循環型地域社会の形成を指向した木質バイオマス活用事業と有機性廃棄物資源化利用事業に関する経済評価を試み、経済的効率性を含む事業成果と事業展開上の課題について検討した。併せて地域環境資源を基盤とし地域の自立的発展をめざす地域ブランディングに関する基礎的な考察を行い、地域と都市との人的交流に資する地域ブランディングを背景とした森林セラピー基地事業のあり方も検討した。本研究の目的は、北海道における代表的地域低炭素化事業の経済評価と事業に期待される地域ブランド形成や都市と地域との交流促進可能性の検討を通して、地域の環境・空間特性と地域産業特性に立脚した地域低炭素化事業の展開可能性やあり方を考察することである。研究初年目である本年度の研究内容及び研究成果の概要は、次のとおりである。1.バイオマスタウンとして認定された北海道津別町における有機性資源リサイクル事業の現状と課題を整理し、併せて自治体の低炭素化事業であるペレットボイラー設備導入に関わる便益評価も実施した。また同町が提供している生ゴミ処理サービスに関して、便益受益世帯に対し税払戻し型CV調査を実施し、世帯単位の便益評価額、地域単位の便益評価額を算出し、有機性廃棄物処理施設導入に関する費用便益評価を行った。さらに自治体の低炭素化事業に対する地域住民の認識度、意見や太陽光発電の導入状況等に加え、地域低炭素化推進に不可欠な暖房機器(ペレットストーブ等)の選好要因に関してコンジョイント分析により検討した。2.北海道における観光地の環境負荷について、コモンプール資源(CPR)の視点から環境負荷の定量化に向け、北海道東部エリアを対象にヒアリング調査及びデータ収集を実施した。3.わが国の森林セラピー事業と諸外国の健康増進のための仕組みを比較検討し、健康保養や疾病予防機能について考察を行った。また、国内の森林セラピー基地の調査並びに資料収集を行い、様々な観点から問題点を整理した。4.本研究に関連する基礎的研究として、中国・北京市において研究資料収集,関係研究者との研究交流(中国社会科学院),関連事例調査等(中新天津生態都市などの視察)を実施した。研究2年目である本年度の研究内容及び研究成果の概要は、次のとおりである。1.バイオマスタウン津別町における農村型バイオマスタウン事業として展開されている生ゴミ処理事業に関して、税払戻し型CVMを適用し世帯単位・地域単位で費用便益評価を行った結果、堆肥センターを活用した現行の処理事業は経済的にみて効率的であると評価された。一方、山村型バイオマスタウン事業、地域低炭素化事業として展開されている木質ペレットストーブの導入政策に関して実施したコンジョイント分析の結果からは、現状ではストーブの普及は不十分ではあるものの、津別町が展開しているペレットストーブ普及政策は住民のストーブに対する潜在的な選好と整合的であり、住民は政策の妥当性を一定程度支持していると評価された。2.自然豊かな北海道観光を事例に持続可能な観光を展開する上で、資源の適切な管理・運営が不可欠となるコモンプール資源の理論的枠組と観光消費による自然環境への負荷に関する定量分析を試みた。3.地方自治体の森林セラピー事業と仕組みを検討し、健康保養地としての適格性について考察を行った。また、国内外の森林セラピー基地の調査並びに資料収集を行い、健康の維持・増進システムのあり方を整理した。4.中国内蒙古自治区オルドス市を事例に地域経済発展と資源化戦略のあり方について考察を進めるとともに、関係調査として中国研究者との研究交流・文献資料収集(北京:中国社会科学院ほか)及び関連事例調査(山東省東栄市)を実施した。前年度研究調査と本年度研究調査との統合により研究論文の概略及びアウトラインを完成させた。本研究の目的は、北海道における代表的な地域低炭素化事業の経済評価と事業に期待される地域ブランド形成や都市と地域との交流促進可能性の検討を通して、地域の環境・空間特性と地域産業特性に立脚した地域低炭素化事業の展開可能性やあり方を考察することである。研究最終年度である本年度の研究内容及び研究成果の概要は、次のとおりである。1地域低炭素化事業をはじめとする農耕畜林連携したバイオマスエコタウン化によるまちづくりを展開している津別町をとりあげ、農林業、製材業などのコア産業と豊かな森林環境資源を生かした地域ブランディングについて、観光まちづくりの関係性モデルの視点から基礎的な考察を試みた。具体的には、地域ブランドに関する先行研究に踏まえて本研究での定義を行い、津別町で展開中のバイオマス関連事業、森林セラピー事業を中心とした地域再生プロジェクトの諸事業に関して、その事業構造と抱える課題、今後の展開に向けた要諦を指摘した。2本研究でとりあげた津別町でも展開されている森林セラピー事業に関して、わが国とドイツの自然療法を活用した健康増進のための仕組みを比較し、健康保養地の意義や展望等について考察した。

具体的には、わが国の森林セラピー基地とドイツの健康保養地との特徴等を整理し両者を比較検討し、そのうえで各地における森林セラピー基地の実態から、問題点や将来性について整理し今後の進むべき方向性を論じた。3自然豊かな北海道観光を事例に、持続可能な観光を展開するうえで資源の適切な管理・運営が不可欠となるコモンプール資源の理論的枠組と観光消費による自然環境への負荷に関する定量分析を試みた。具体的には、政策主体である北海道における観光消費の経済効果を産業連関分析により導出し、資源の適切な管理・運営の視点から観光消費によるコモンプール資源への環境負荷を土地資源内包量(DOM)として定量的に明らかにした。各研究分担者の調査・研究成果の一部が、複数の書籍にて今年度中に随時出版される予定であることから、・全体的にみて各自の研究スケジュールは順調に推移していると判断している。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記したように、研究は現在まで全体的に当初のスケジュール通りの進捗状況と判断しているが、引き続き各研究分担者との連絡を密にして、研究会の開催等の実施により調整をとりながら遺漏なきよう進展を図りたいと考えている。
被災者救済にかんする法的分析-被害の補填方法にかかる実証的研究-

本研究では、雲仙普賢岳噴火災害・北海道南西沖地震災害における被災者救済措置の一部を実態調査し、分析を行った。今年度は、前記災害の際の義援金配分をめぐる法的関係および被災者にたいする救援・生活再建対策について分析した。その結果、義援金をめぐる法律関係は公私にわたる多数の団体がかかわるためその法関係が複雑であるとともに、紛争を解決するための手続が非常に未整備であること、また、被災者の救援・生活再建については、ごく一部の分析にととめざるをえなかったが、被災者の権利保障の観点から今後の検討が必要であり、それに伴う法整備が不可欠になっていることが明確となった。カリフォルニア州の被災者救援・支援法制について資料の収集を実施したが、同州および米国においても法的観点からの分析・検討がきわめて少なく、議会資料や裁判例および各種報告書等を収集せざるをえず、いまだ中途の段階であり、さらに今後も収集・分析を要する。
人間の立位および歩行における姿勢動揺の関連性

1.歩行時および立位時の身体重心揺らぎ:時間特性における関連性本研究では、1)身体重心加速度振幅の一歩毎の変動にみられる時間特性を明らかにすること、2)静止立位時にも同様の計測を行い、歩行および静止立位時の時間特性の関連の有無を明らかにすることを目的とした。実験には17名の健常若年被検者が参加し、床反力計内蔵型トレッドミル上で10分間の静止立位試技および歩行試技を行った。解析の結果、床反力から算出された歩行時の身体重心加速度振幅の変動は反持続性と呼ばれる時間特性を有していた。また、この反持続性のレベルは、同様に算出された静止立位時の反持続性のレベルと類似しており、二者の間には有意な正の相関が認められた。これらの結果から、歩行中の重心加速度の大きさが一種の恒常性が保たれるような制御を受けていること、この動的な状況での恒常性が静止立位時における静的な身体重心位置の制御と関連していることが示唆された。2.歩行時および立位時の身体重心揺らぎ:動揺量における関連性と加齢の影響本研究では、1)床反力計付きトレッドミルを用いて歩行時の身体重心加速度を算出し、身体重心動揺における加齢の影響を明らかにすること、2)歩行時および静止立位時における身体重心加速度動揺の関連性を明らかにすることを目的とした。21名の健常高齢被検者および22名の健常若年被検者が、静止立位試技(90秒×5回)と歩行試技(至適速度、至適歩調での10分間歩行)を行った。その結果、歩行時の身体重心加速度動揺量は高齢被検者群において有意に大きく、この動揺量と静止立位時の身体重心加速度動揺量の間には有意な正の相関が認められた。これらの結果は、歩行時の身体重心加速度動揺量が加齢とともに増大すること、またこの増大が静止立位時の身体重心加速度動揺量の増大と関連していることを示唆した。安定なヒト二足歩行の実現において、周期的下肢活動の生成と共に重要となるのは直立姿勢を保つための適切な身体重心位置の制御である。これまで、歩行動作の安定性に関する研究の多くは下肢動作の変動に着目してきた。しかしながら、全身の安定性の指標となる身体重心位置の変動に関する検討は少なく、歩行時に身体重心がどのような調節を受け、その安定性が確保されているのかについて十分な理解は得られていない。また、同様に直立姿勢の維持を必要とする静止立位時の重心制御との関連性も明らかにされていない。そこで本研究では歩行時の身体重心加速度を計測し、身体重心加速度の大きさが一歩毎にどのように変調されているか、その時間特性に着目して検討することを第一の目的とした。また、静止立位時にも同様の計測を行い、歩行および静止立位時それぞれの条件で得られた重心加速度の時間特性の関連の有無を明らかにすることを第二の目的とした。これらの試技中に水平面方向の床反力が記録され、身体重心位置加速度に変換された。

解析の結果、歩行時の身体重心加速度の大きさは一定速度でのトレッドミル上の試技においても一歩毎に変化しており、過去に増大(減少)していれば未来には減少(増大)するという傾向があらゆる時間スケールにおいて成立するという時間特性(反持続性)を有していた。また、この反持続性のレベルは、同様に算出された静止立位時の身体重心加速度時系列における反持続性のレベルと類似しており、二者の間には有意な正の相関が認められた。これらの結果から、歩行中の重心加速度の大きさが一種の恒常性が保たれるような制御を受けていること、この動的な状況での恒常性が静止立位時における静的な身体重心位置の制御と関連していることが示唆された。高齢社会を迎えた日本において、歩行安定性の適切な評価、特に加齢に伴う変化の抽出は、転倒予防に関連する重要な研究課題の一つである。これまで、歩行安定性の評価においては、歩行周期など下肢動作の安定性に関する指標が多く用いられてきた。しかしながら、全身の安定性指標となる身体重心動揺に関する検討は十分なされておらず、この動揺特性が加齢によりどのように変化するのかはほとんど明らかにされていない。また、この歩行時の重心動揺特性が、一般にバランス維持能の指標として用いられている静止立位時の動揺特性とどの程度関連しているのかも明らかにされていない。本研究では、床反力計付きトレッドミルを用いて歩行時の身体重心加速度を算出し、身体重心動揺における加齢の影響を明らかにすることを一つめの目的とした。また、歩行時および静止立位時における身体重心加速度動揺の関連性を明らかにすることを2つめの目的とした。21名の健常高齢被検者(60-80才)および22名の健常若年被検者(20-34才)が実験に参加した。静止立位試技において、被検者は床反力計の上で90秒間の開眼静止立位を5回行った。歩行試技においては、床反力計付きトレッドミル上で、各自の至適速度、至適歩調による歩行を10分間行った。各試技中に記録された床反力は水平面上の身体重心加速度に変換され、その動揺特性に関して両被検者群間での比較分析が行われた。その結果、歩行速度の差異を考慮して規格化された歩行時の身体重心加速度動揺量は、高齢被検者群において有意に大きかった。また、この動揺量と静止立位時の身体重心加速度動揺量の間には、有意な正の相関が認められた。これらの結果は、歩行時の身体重心加速度動揺量が加齢とともに増大すること、またこの増大が静止立位時の身体重心加速度動揺量の増大と関連していることを示唆した。
分子イメージングセンターにおける植物研究の展開

分子イメージングセンターにおける代表的なイメージング装置である高分解能三次元PETを用いて、作物などの高等植物における光合成産物の動態解明研究を実施した。その結果、ダイズ植物の光合成における炭素固定直後の地下部への炭素栄養の移行、さらには炭素栄養が土壌へと湧出する詳細な様子を、はじめて経時的かつ三次元的に捉えることに成功した。高分解能三次元PETを用いた高等植物における光合成産物の動態解明研究を実施した。その結果、光合成における炭素固定直後の地下部への炭素栄養の移行と積み卸しの詳細を、はじめて経時的かつ三次元的に捉えることに成功した。植物分子イメージングを可能にするRIガス投与システムや実験器具の製作と、実験プロトコルの最適化の後、ダイズの葉に噴霧した11C標識二酸化炭素を高分解能PETで撮像する実験を行った。PETデータの再構成画像からは、葉で固定された11Cが光合成産物となり、1時間後にはすでに約20cm先の地下部の根の先端部に到達していることが明らかになった。さらに経時的に計測を続けたところ、根端での強い集積が顕著となり、植物体から土壌への炭素分泌を示唆する動画像を得る事が出来た。一方PET-MRIの利用においては、生体からのMRI信号を捉え、地下部構造可視化することはできたが、同時撮像による生理的な特徴を示す画像データの取得は、現状困難であることが解った。これは、医療分野の特に分子イメージングセンターで進む、世界最先端イメージング技術の発展が、農学・植物生理学分野へも十分に貢献できることを示す成果であり、ここで提起した医学、工学、農学、植物生理学といった幅広い学際的協力の試みの結実を示すものである。なお、本研究は分子イメージング技術の一つであるピンホール型ガンマカメラを用いて、福島原発事故への対応研究の一環となっている、農作物中放射性セシウムの動態解明技術を開発するという新たな発展を見せている。今後もイメージング装置を駆使した環境中汚染物質の動態解明というテーマにおいても、本課題で培われた技術が主導的な役割を果たしていくことが期待されている。植物研究を目的とした「分子イメージング機器による炭素栄養動態の撮像実験」に向け、分子イメージングセンター内に簡易な植物育成環境およびC-11標識二酸化炭素ガスコントロールシステムを構築した。その結果、植物体周辺の二酸化炭素が葉身に吸収・固定され、さらには光合成の後、シンク器官である果実や根へと転流する様子を3次元的に撮像することができた。また、PET-MRIを用いた生態構造と機能画像の同時イメージングに向けた準備として、イネを用いた撮像試験を行った。水耕液中のイネ地下部の構造を示すMRI画像は得られたが、シグナルが弱く、期待した分解能が得られなかった。現状の低磁場強度でも十分なシグナルが得られるよう供試植物容器サイズや形状に工夫が必要であることが分かった。さらに、Cs-137の水溶液を用いて、植物のCs-137の取り込みを調べ、植物中に、確実に、Cs-137が取り込まれていることを画像化できた。概ね、当初の予定通りに研究は進んでいる。MRIを用いた植物の画像化に関しては、撮像条件の最適化が必要であることがわかり、今後の課題となった。取得したPET画像データをもとに、光合成後の炭素栄養シンク-ソース間相互作用を中心とした生理機能解析を試みる。また、Cs-137の植物吸収の画像化をさらにすすめ、ダイナミックな吸収の様子を動画として取得することを目標とする。そのために、平成24年度は、モンテカルロシミュレーション等を行い、最適なコリメータ条件を求め、より感度の高い、放射線検出器の設計を行う。MRI撮像のため、現状の低磁場強度でも十分なシグナルが得られるよう供試植物容器サイズや形状に工夫した撮像環境を構築する。共同研究者と打ち合わせを行い、Cs-137の水溶液を購入し、これにより、Cs-137の吸収実験を行う。また、分子イメージング学会等で研究発表を行う。PETのガントリ内に対象を収め、温度、光条件をコントロールしつつガス投与とイメージングが実施できるマイクロトムセルの製作のために研究費を利用する。
エイズワクチンの活性強化分子の分子設計法の基礎研究

私どもはレセプター/リガンド結合部分の3次構造を認識するモノクローナル抗体を用いてファージライブラリーを探査し、この抗体に結合するファージクローンを単離すれば、抗体が鋳型として働き、リセプターとリガンドの結合部位の3次構造を直接コピーする可能性を検討してきた。この観点から、M-tropic HIVー1の感染でcoreceptorとして機能するCCR5のmimeticsを試み、抗CCR5抗体(2D7)用い、BiopanningによりM23クローン単離した。このクローンはM-Tropic HIVー1感染を特異的に60%阻害し、T-tropic HIV-1感染には影響せず、また、ELISAにより、M23はMIP-1a,MIP-1bおよびRANTESと結合すること、しかしCCR2のリガンドであるMCP1には結合しないことを明らかにした。MCP-1はCCR1,CCR2,CCR4に結合し単球遊走活性を有し、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、腎炎などの慢性炎症性疾患、粥状動脈硬化症等の重要な因子である。CCR2を介したHIVー1感染ではMCP-1の感染阻害活性が報告されている。ケモカインレセプターの結合部位を塞ぐようなケモカイン様モチーフとしてMCP-1mimicのファージクローンを2種(C27およびG25)を単離した。その結果、1)モチーフ配列のみを化学合成した19merのC27およびG25ペプチドは、MCP-1によるヒト末梢血細胞のChemotaxisを阻害することを明らかにした。
リボサイムを用いた腫瘍細胞上補体制御膜因子の不活化による免疫原性の増強

1。ラットの種特異的補体制御膜因子である5I2抗原を発見し、そのcDNAもクローニングすることができたので、腫瘍細胞膜上への5I2抗原の発現を抑制し、自己(同種)補体の反応を許すようにさせる方法して、5I2抗原の遺伝子を特異的に攻撃するリボザイムの開発を試みた。5I2抗原のcDNAの塩基配列を解析し、ハンマーヘッド型のリボザイムの標的とするのに適当と考えられる塩基配列を探索した。それに基づきリボザイムの合成を行った。5I2抗原cDNAのin vitrotranscriptを作り、このリボザイムを作用させたところtranscriptのmRNAを特異的に切断することが確かめられた。2。マウスのDAF (decay accelerating factor)のcDNAもクローニングすることができたので、発現組織についての検討を行ったが、精巣に強い発現が認められた。モルモットのMCP (membrane cofactor protein)のcDNAもクローニングし、その発現組織を検討したが、この場合には、より強い精巣への限局が認められた。一方、マウスの腫瘍細胞を用いて解析するため、マウスの強力な補体制御膜因子であるCnyに対するモノクローナル抗体を用いて腫瘍細胞膜上のCrryの機能をブロックしたときの補体反応性の解析を行った。その結果、Crryをブロックするだけでは不十分で、腫瘍細胞に対するIgM抗体などの反応を起こさせると強い補体反応を起こし、C3の沈着等を起こせることが分かった。3。5I2抗原リボザイムは、in vitroのtranscriptを特異的に切断するので腫瘍細胞の細胞内で作用させて、5I2抗原蛋白の細胞膜への発現をどの程度まで抑制するかを検討中である。1。2。3。
シナプス前クロライド濃度勾配の発生機構の解明

海馬苔状線維シナプスのシナプス前都にはGABA_A受容体が発現することが近年の研究で明らかになった。クロライドチャンネルであるGABA_A受容体の活性化により苔状線維終末の脱分極を生じることから、シナプス前部では細胞内クロライド濃度が細胞体より高く保たれていると推定されている。今年度は、細胞内クロライド濃度の神経細胞内の空間的な分布や濃度勾配を直接的に証明するために、蛍光クロライド指示薬を用いたシナプス前部でのクロライドイメージングを試みた。マウス海馬スライス標本において苔状線維の起始細胞である歯状回顆粒細胞に単一細胞レベルで蛍光クロライド指示薬MEQを負荷するために、単一細胞エレクトロボレーションの条件検討を行い、小型の細胞である歯状回顆粒細胞の細胞体に直視下に蛍光色素を効率的に導入することが可能になった。しかしながら、顆粒細胞の軸索である苔状線維軸索は極めて微細で、また、スライス内を立体的に走行し、共焦点顕微鏡を用いても苔状線維の神経終末部まで連続して蛍光をモニターすることが困難な場合がしばしばであった。そこで、もうひとつのアプローチとして、細胞膜透過型蛍光クロライド指示薬であるdihydro-MEQ(6-methoxy-N-ethyl-1,2-dihydroquinoline)を軸索標識法により多くの苔状線維に同時に導入することを試みている。苔状線維軸索の走行するCA3野透明層にdihydro-MEQを微量注入し、軸索内に取り込まれた後に軸索輸送の機構を介して輸送されることを利用して、多くのスライス表面の苔状線維シナプス前部(終末部および軸索部)に蛍光クロライド指示薬を負荷するための条件検討を行った。神経細胞の興奮性や情報伝達を制御する細胞内クロライドイオン濃度は、細胞外へのくみ出しに関わるKCC2と細胞内への取り込みを促すNKCC1の主に二種類のクロライドトランスポーターにより制御される。最近の研究から、海馬苔状線維の神経終末部や軸索起始部などにはGABA_A受容体が存在し、その活性化により脱分極を生じて伝達物質放出や活動電位の発生に影響を与えることが明らかとなった。GABA_A受容体アゴニストであるmuscimolを投与すると神経終末部や軸索起始部の脱分極をひきおこすことから、神経終末や軸索は細胞体に比べて細胞内クロライドイオン濃度が高いと考えられる。この原因として、神経終末部や軸索起始部では細胞体に比べてKCC2の発現量が低いか、あるいはNKCC1の発現量が高いか、という可能性が想定される。そこでこの点を薬理学的に検討するために、選択的NKCC1阻害剤であるbumetanideの効果について検討した。マウス海馬スライス標本において、苔状線維の走行するCA3野透明層を電気刺激して、苔状線維の起始細胞である歯状回顆粒細胞層から逆行性集合活動電位を記録し、苔状線維遠位部(神経終末部を含む)の興奮性の指標とした。Muscimolの投与は逆行性集合活動電位を増大させたが、この効果はbumetanide投与により抑制されなかった。苔状線維終末部の細胞内クロライド濃度が高い原因は細胞内への取り込みを行うNKCC1が終末部に多く発現するからではなく、それ以外のメカニズム、おそらく細胞外へのくみ出しを担うKCC2の発現量が少ないことによると考えられた。
チャおよびイネにおける自然共生型の植物防除生産技術の開発

イネとチャを対象に有機・無農薬栽培の効果はなぜ不安定なのかという問題解決のために、肥培管理、植物生理、害虫防除、農業経済の観点か解析を行った。九州および関東地方における現地調査に基づき、東京農工大学および埼玉県農林総合研究センターにおいて、圃場実験を行った。茶の生産過程の技術標準化は部分的で,生産者の熟練の影響が強いことが明らかになった。化学肥料区は有機質肥料区よりカンザワハダニ、チャトゲコナジラミ、チャノキイロアザミウマの発生数が有意に増加したが、両区の葉の窒素含有率に有意な違いは認められたかった。環境および人的要因を考慮した有機肥料の使用が環境保全型農業に必要であることが示された。本研究では、日本の主要作物であるイネとチャをモデルケースとし、有機・無農薬栽培の効果はなぜ不安定なのか、という問題解決のために、植物の健康を主眼とした自然共生型の栽培技術の体系化を行う。23年度では、現状調査のため、埼玉県、静岡県、京都府、熊本県において、聞き取り調査を行い、茶園に土壌断面を作成し、土壌の調査およびチャの品質について調べた。各地の茶園では、肥培管理方法が大きく異なり、茶園の地理的条件、土壌条件、加工体制、市場への販売等、多様な要因によることが示唆された。茶園内では、畝間と樹冠下におけるpHは表層において0.1O.3程度畝間のほうが小さい傾向を示した。また、pH(H_2O)よりpH(KC1)が高くなる現象が見られ、肥培管理方法の土壌pHへの影響をより精査する必要が明らかになった。農工大の圃場で作成した、圃場レベルの試験区では、(1)無施肥区、(2)慣行肥料区(堆肥36 N kg/ha/年、硫安600 kgN/ha/年)、(3)化学肥料区(硫安960 kgN/ha/年)(4)半減区(慣行の半量)を設定し、害虫の発生状況およびチャ葉の品質の影響を調べた。1番茶(5月)、2番茶(8月)、3番茶(10月)の計三回のサプリングを通じて茶葉の全窒素量の高くなる地点は変動した。ハマキは、全三回のサンプリングを通して圃場の中央において密度が高くなる傾向が見られた。圃場の中央には有機肥料が用いられている慣行肥料区および半減区があり、有機肥料が密度に影響した可能性があると考えられた。チャノナガサビダニは、第一回及び第三回では、全窒素が多く含まれる地点において密度が高かった。5月、10月はチャノナガサビダニの発生のピークであり、風によって全窒素が多く含まれる場所へ移動した個体の摂食活動が促進され、密度が増加したと考えられた。以上の結果より、全窒素量とダニに関連があると考えられた。本研究では、日本の主要作物であるイネとチャをモデルケースとし、有機・無農薬栽培の効果はなぜ不安定なのかという問題解決のために、植物の健康を主眼とした自然共生型の栽培技術の体系化を行っている。25年度では、埼玉県・狭山市周辺を中心として、経営状況ならびに管理状況等に関する聞き取り調査および、茶葉の成分と土壌の現地調査を行った。茶業協会会員10件、製茶加工団体1件、ならびに、生葉売り2件を調査した。経営面製は100400a、一番茶の生産量は10701400kgであった。280aの農家が最も効率が良く50kg/aであり、最も低い農家は経営面積100aの11kg/aであった。窒素施肥量は全国平均より少なく10aあたり40kg代の値も多く、主に硫安が芽出し施肥として使われていた。有機質肥料としては、豚ぷんおよび油かすが推奨されており、有機栽培圃場も存在した。土壌調査では、土壌への施肥量および施肥の種類が土壌生態系に及ぼす影響を明らかにするため、1無施肥区、2慣行肥料区(堆肥360 N kg/ha/年、硫安600 kgN/ha/年)、3化学肥料区(硫安960 kgN/ha/年)4半減区(慣行の半量)を設定し、土壌からの温室効果ガスの放出量の連続測定を行った。その結果、全施肥量の半分が施用された1回目(3月)の施肥時ではなく、2回目(6月)の施肥時に最大の放出が見られた。最も高い放出は、化学施肥区で見られた。放出は、施肥を行った畝間だけではなく、樹木下からも見られ、樹木下からの放出量は全体の55%を占めた。

施肥の横への移動も大きく貢献していることが明らかになった。本研究では、日本の主要作物であるイネとチャをモデルケースとし、有機・無農薬栽培の効果はなぜ不安定なのかという問題解決のために、植物の健康を主眼とした自然共生型の栽培技術の体系化を行っている。24年度では、カンザワハダニに着目し、ポット苗および圃場苗を用いてモデル実験を行った。チャ幼木の化学肥料ポット栽培においては、窒素施肥量の増加に伴って新葉の全窒素量は増加し、さらに葉の全窒素量の増加にともなって新葉に接種したカンザワハダニの発育は早まり、産卵数も増加した。一方、チャ幼木の窒素施肥量を等しくした堆肥あるいは化学肥料圃場栽培においては、堆肥区および化学肥料区ともに土壌の酸性化(pH低下)、および養分量の増加(EC増加)が認められたが、その変化量は化学肥料区の方が堆肥区よりも大きかった。新葉の全窒素量は全炭素量と同様に無施肥区<化学肥料区<堆肥区の順に増加、新葉に接種したカンザワハダニの発育日数も無施肥区<化学肥料区<堆肥区の順に長期化する傾向が認められた。これらの結果から、化学肥料では窒素施肥量の増加にともなう葉の全窒素量の増加によってカンザワハダニの発育期間は短くなり、産卵数も増加するが、堆肥では化学肥料に比べて新葉の窒素含量を増加させるものの、カンザワハダニの発育を抑制する作用が推察された。虫害については肥培管理法に加え、地形、圃場の位置等が重要であることが考えられた。よって、埼玉県狭山の茶産地を中心にして面的な調査を開始した。本研究では、日本の主要作物であるイネとチャを対象に、有機・無農薬栽培の効果はなぜ不安定なのかという問題解決のために、自然共生型の栽培技術の体系化を行っている。26年度では、1実験室レベルでの茶葉の品質・害虫発生状況を圃場で検証、2茶園土壌における亜酸化窒素(N2O)放出量の推移、3水田における肥培管理方法と害虫発生の調査、4過去に行われた現地調査のまとめ、ならびに5統計モデルを用いた各要因の関係解析を行った。1.有機区、化成区、無施肥区の3処理区で5種の害虫の発生状況を調査したところ、チャトゲコナジラミとチャノキイロアザミウマが化成区で有機区より有意に多かった。肥料形態の違いによって生じたチャ葉中の個々のアミノ酸やカテキン量の変化が、害虫発生に影響を与えていると考えられた。2.N2O放出量は有機区が化成区よりも常に高い値を示した。積算した値は、化成区は無施肥区の1.1倍、有機区は2.8倍となった。一方、有機区は化成区よりpH、陽・陰イオンの残留率が高く、堆肥が過剰な土壌酸性化、肥料分損失の抑制に効果的であることが示唆された。3.イネミズゾウムシ接種により,茎数,茎葉部乾物重,根部乾物重および出液量は低下したが,ポット苗区は慣行苗区に比べていずれの値も高い傾向がみられた.ポット苗の利用はイネミズゾウムシによる初中期の生育に対する影響を軽減する可能性が示唆された.4.茶生産技術体系全体では,生産過程の技術標準化は部分的にとどまり,生産者の熟練によって対応する局面がいまだ残存していた.一方、生葉生産では生葉農家より製茶農家の方針が遵守される傾向があった.5.ベイジアンネットワークとヒートマップ解析によりN2Oの発生量が、カンザワハダニの幼虫数、成虫などの総数に関連があることが示唆された。一般化線形モデルでも、N2O発生量の増加と害虫の増加が連動する傾向が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。環境農学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度では、日本のいくつかの産地において調査を開始し、肥培管理方法の特徴を調べることを主な目的としていた。昨年、埼玉、静岡、京都、熊本へ調査に行くことができ聞き取り調査を行い、土壌、お茶のサンプルを採取することができた。また2年目に開始する予定であった圃場レベルの実験系の準備も整った。
コンクリート工学分野における学生実験テーマの開発

1.目的コンクリート工学分野の学生実験では、鉄筋コンクリートはりを使用するのが一般的である。学生らもコンクリート補強材として鉄筋以外の素材はあまり認識していない状況である。しかし鉄筋は、近年の価格高騰や生産時の環境問題への配慮から今後の生産が制限されていくことも考えられる。こうした環境問題や循環型社会への対応が注目されるなか、天然素材を利用したモノづくりが活発になっている。本研究ではこうした点に着目し、また学生らが既成概念にとらわれないよう、鉄筋に代わる新たな補強材を使用した実験テーマを開発することを目的として実施した。2.実施方法鉄筋の代わりの補強材には竹を採り上げた。選定理由は安価で生育分布も広く、成長が早いという利点のためである。実施方法は、コンクリートはりを作製するには試験体が大きくなり様々な面で負担が生じるため、スケールダウンさせたモルタル供試体を竹筋、鉄筋、無筋の3種類作製して比較検討した。使用材料は、セメントには強度試験結果が早期に得られる早強セメントを使用した。骨材には標準砂を使用し、補強材には鉄丸棒と竹ヒゴを使用した。練り混ぜにはモルタルミキサーを使用し、補強筋をセットした型枠にモルタルを打ち込んで各供試体を作製し、所定の期間養生を行った。その後、曲げ強度試験を圧縮曲げ兼用加圧板を用いて行い、複合材料としての強度特性を調べた。なお荷重の載荷には圧縮試験機を利用した。これらの実験を複数回行い、その結果から最適な実験方法およびその手順を検討した。3.まとめコンクリート補強材において、鉄筋に代わる材料として竹筋の曲げ強度試験を行うことにより、天然素材の竹がコンクリート補強材になり得るか検討した。その結果、鉄筋には劣るものの一応の成果が見出され、学生実験のテーマになり得ることが確認できた。今後は、他の天然素材についても検討してみたい。
分子イメージングによるリアルタイム分子間相互作用解析法の開発

生体分子を結合させたマイクロビーズをガラス基板上にアレイ化する技術と全反射蛍光顕微鏡を組み合わせ、生体分子間相互作用を高感度に解析できる顕微鏡システムの開発を行った。このシステムは、微量な試料で複数の生体分子間の結合・解離過程を同時に実時間解析することができる。このシステムを使って、抗原-抗体反応、タンパク質-DNA間相互作用、低分子化合物-タンパク質間の相互作用解析だけでなく、抗体を利用し、生物試料抽出液中の特定タンパク質の濃度を結合速度から定量できることを示した。本研究では、光学顕微鏡によるイメージング技術を利用し、「生体分子個々の結合・解離の速度などの動的な情報」を網羅的に解析できる新しい分子間相互作用解析システムの開発を行ってきた。生体分子を結合させたマイクロビーズをガラス基板上にアレイ化する技術と全反射蛍光顕微鏡を組み合わせ、生体分子間相互作用を高感度に解析できる顕微鏡システムを構築し、微量な試料で複数の生体分子間の結合・解離過程を同時に実時間で解析することを示した。光ピンセットと光反応性架橋剤を使って作製するマイクロビーズアレイは、一般的な動物細胞と同等のサイズ内に複数の抗体や核酸をアレイ化することができ、分子を検出する領域を1細胞サイズ程度に狭めることが可能である。本年度は、PDMSマイクロチャンバー内で細胞を培養し、1細胞から分泌されるタンパク質の検出を行った。まず、多数の凹(40×40×20μm^3)のあるPDMSマイクロチャンバーチップ上に細胞をまき、凹部に細胞を収めた後(図1A)、カバーガラスを載せ、約30pLの微小空間に細胞を培養液と共に閉じこめた。分泌シグナルを付加した緑色蛍光タンパク質(分泌EGFP)を発現している細胞をこの方法で培養すると、分泌EGFPが細胞外に分泌されチャンバー内にEGFPの蛍光シグナルが時間と共に増加していく様子が観察された。次に同様の方法で分泌シグナルを付加したFLAGタグ融合Glutathione S-transferase(分泌FLAG-GST)を発現する細胞1個を、抗GST抗体結合マイクロビーズアレイとともに培養した。培養後、Cy3標識抗FLAG抗体でサンドイッチ検出を行うと、ビーズに蛍光シグナルが得られ、1個の細胞から分泌されるタンパク質を検出することができることが示された。昨年度までに、マイクロビーズアレイと全反射照明蛍光顕微鏡を組み合わせた高感度生体分子間相互作用観察システムとPDMS製マイクロチャンバーを用いた1細胞の捕捉・溶解技術を使って、1個の細胞中に存在するタンパク質の検出や1細胞中の酵素活性を計測する技術を完成させた。本年度は、PDMSマイクロチャンバー内で細胞を培養し、1細胞から分泌されるタンパク質の検出・計測技術について開発をおこなった。モデル系として1個のマウスハイブリドーマが産生する抗体の検出を試みた。多数の凹(40×40×20μm^3)の空いたPDMSマイクロチャンバーチップ上にマウスハイブリドーマを播き、凹部に細胞を収めた後、プローブ抗体を固定化したカバーガラスと合わせ、約30pLの微小空間に細胞を閉じこめた。検出用抗原を含む培養液を流し込み、そのままの状態で培養を行い、1020分後に蛍光像を観察した。マイクロビーズによる産生抗体の検出法、量子ドットカウント法による産生抗体の検出法のいずれも産生された抗体を検出することができた。個々の細胞の産生能を計測してみると、異なる産生能を持つ細胞が存在していることが明らかとなった。また、培地添加と同時に蛍光像を観察すると、時間とともに抗体濃度が上昇していく様子をとらえることができた。以上のようにPDMSマイクロウェルアレイ、マイクロビーズアレイ技術、量子ドットカウント法および全反射照明を組み込んだ高感蛍光検出顕微鏡を組み合わせることで、1細胞から分泌されるタンパク質の検出・定量化への応用が可能になった。今後は、1細胞レベルでの分泌サイトカイン等の検出方法や多色蛍光色素を用いての多重解析技術について検討していく予定である。ゲノムプロジェクトが進展し、明らかにされた遺伝子の発現解析やその産物であるタンパク質の機能解析に焦点が当てられてきている。多くの場合、タンパク質は、他の生体分子との相互作用を通して機能を発揮する。したがって、それらの相互作用の解析はタンパク質機能に直結する重要な課題である。そこで我々は、高感度蛍光イメージング技術を利用し、少量の試料で「生体分子個々の結合・解離の速度などの動的な情報」を解析できる新しい分子間相互作用解析システムの開発を行っている。解析する生体分子を結合させたマイクロビーズをガラス基板上にアレイ化し、蛍光標識した試料との相互作用を、全反射照明を組み込んだ蛍光顕微鏡で観察することで、微量な試料で複数の生体分子間の結合・解離過程を同時に実時間解析できる系を開発した。この系を使って、抗原-抗体反応、タンパク質-DNA間や低分子化合物-タンパク質間の相互作用解析だけでなく、生物試料抽出液中の特定タンパク質の濃度を結合速度から定量化できることなどを確認した。

さらにこの系にPDMS製のマイクロウェルを組み合わせ、1個の細胞中に存在するタンパク質の定量、1細胞内の酵素活性測定、さらに1個の細胞が分泌するタンパク質の検出なども行うことができるようになってきた。このような新技術は、FACS法では、できなかった分泌分子を指標にした1細胞解析・スクリーニング技術の開発だけではなく、1細胞レベルでの阻害剤研究やドラッグスクリーニング技術への応用が可能である。今後は、1細胞レベルでの分泌サイトカイン等の検出方法や多色蛍光色素を用いての多重解析技術について検討していく予定である。