hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞の増殖シグナルと接着シグナルのクロストーク制御機構とヒトがんにおける異常

生理的な細胞増殖と細胞接着のシグナル伝達機構の解明は、がんの生物学的特性である無制限な増殖能や浸潤・転移能を分子レベルで理解する上で必須であると考えられる。このような観点から、私共は細胞の増殖と接着の制御機構における蛋白質チロシンリン酸化シグナルの生理的役割とがん化や転移の病態との関連につき研究を行っており、本年度は、新しい細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系に関連する分子の生理的機能と作用機構を中心に研究を行い、以下の結果を得た。(1)糖鎖認識型ユビキチンリガーゼであるNFB42はSHPS-1の細胞外領域に結合し、SHPS-1を基質としてユビキンチン化し、SHPS-1の細胞表面への発現を制御することを明らかにした。(2)赤血球上のCD47はマクロファージ上のSHPS-1と相互作用して、赤血球貪食を負に制御する。一方、SHPS-1の類縁分子であるSIRPβはMAPキナーゼ系を介してマクロファージ貪食能を正に制御していることを明らかにした。(3)神経芽腫由来細胞において、CD47の強制発現により突起伸長が刺激された。CD47の強制発現による突起伸長にはRacが、SHPS-1-Fcによるfilopodia形成にはCdc42が関与すること、また前者の効果にはintegrinの関与が示唆された。上記の如く、当初の研究目的を充分に達成することが出来た。このような観点から、私共は細胞の増殖と接着の制御機構における蛋白質チロシンリン酸化シグナルの生理的役割とがん化や転移の病態との関連につき研究を行っており、本年度も、チロシンホスファターゼSHP-2とSAP-1およびこれらに関連する分子の生理的機能と作用機構を中心に研究を行い、以下の結果を得た。(1)新しい細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系による細胞運動の制御機構を、SHPS-1を発現するヒト悪性黒色腫細胞をモデル細胞として用い検討した。その結果、CD47あるいはSHPS-1抗体のSHPS-1への結合依存性に、SHPS-1発現細胞の細胞運動は抑制された。この抑制効果には、少なくともSHPS-1の細胞内領域に結合するSHP-2とRhoの活性化が関与していることを明らかにした。従って、CD47-SHPS-1系は接触阻害(コンタクトインヒビション)の分子機構に関与する可能性が示唆された。(2)受容体型チロシンホスファターゼSAP-1が、P13キナーゼ-Akt経路を抑制することとカスパーゼ依存性の経路を活性化することにより、アポトーシスを介して細胞増殖を抑制することを明らかにした。さらに、SAP-1はT細胞においてLckチロシンキナーゼと結合し、これを不活性化することによりT細胞受容体シグナルを負に制御することを明らかにした。今後、さらに新たな細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系の生理機能とその作用機構、さらにがんにおける異常について解析する予定である。また、私共はSAP-1遺伝子KOマウスの作成を始めており、これら培養細胞系で得られた成果をin vivoでも今後検証する予定である。このような観点から、私共は細胞の増殖と接着の制御機構における蛋白質チロシンリン酸化シグナルの生理的役割とがん化や転移の病態との関連につき研究を行っており、本年度も、チロシンホスファターゼSHP-2とCD47-SHPS-1系に関する分子の生理的機能と作用機構を中心に研究を行い、以下の結果を得た。(1)新しい細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系による細胞運動の制御機構を解析し、CD47-SHPS-1系が接触阻害(コンタクトインヒビション)の分子機構に関与する可能性を示した。一方、CD47はインテグリンβ3と作用しながら、神経突起伸長を正に制御することを見い出した。この作用には、主にRacが関与していることを明らかにした。(2)SHPS-1の細胞外領域が、切断されること(Ectodomain shedding)を見い出した。この過程には、RasあるいはProtein kinase Cの活性化とメタロプロテアーゼが関与しており、Ectodomain sheddingもSHPS-1による細胞運動の制御に関与していることが示唆された。(3)Fcγ受容体を介したマクロファージによる貧食作用をSHPS-1は負に、SIRPβは正に制御していることを見い出した。今後、さらに増殖因子によるRas括性化におけるSHP-2の作用機構、ならびに新たな細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系の生理機能とその作用機構、さらにがんにおける異常について解析する予定である。このような観点から、私共は細胞の増殖と接着の制御機構における蛋白質チロシンリン酸化

シグナルの生理的役割とがん化や転移の病態との関連につき研究を行っており、本年度は、新しい細胞間シグナル伝達系であるCD47-SHPS-1系に関連する分子の生理的機能と作用機構を中心に研究を行い、以下の結果を得た。(1)糖鎖認識型ユビキチンリガーゼであるNFB42はSHPS-1の細胞外領域に結合し、SHPS-1を基質としてユビキンチン化し、SHPS-1の細胞表面への発現を制御することを明らかにした。(2)赤血球上のCD47はマクロファージ上のSHPS-1と相互作用して、赤血球貪食を負に制御する。一方、SHPS-1の類縁分子であるSIRPβはMAPキナーゼ系を介してマクロファージ貪食能を正に制御していることを明らかにした。(3)神経芽腫由来細胞において、CD47の強制発現により突起伸長が刺激された。CD47の強制発現による突起伸長にはRacが、SHPS-1-Fcによるfilopodia形成にはCdc42が関与すること、また前者の効果にはintegrinの関与が示唆された。上記の如く、当初の研究目的を充分に達成することが出来た。
分離・培養したウズラ胚骨形成細胞の骨髄骨形成能に関する研究

鳥類の特異組織である骨髄骨に存在する骨形成細胞は性ホルモン、特にエストロジェンとアンドロジェンに反応することが示唆されている。これらの細胞の性ホルモン支配を詳細に知るために、骨髄骨からこれらの細胞を分離・培養することが試みられているが、骨髄細胞の混入が避けられず、また多量の細胞を得ることが困難である。したがって、性ホルモンに速やかに反応し、骨髄骨形成能を有する純粋な細胞を多量に分離・培養する必要がある。それ故、性ホルモン処理を施したウズラ胚のCalvariaから骨形成細胞の分離・培養を試み、これらの細胞の骨髄骨形成能を調べた。孵卵9日齢のウズラ胚に17β-エストラジオールとテストステロンを単独もしくは併用投与し、孵卵14日齢のCalvariaをコラゲナーゼ処理し、Calvaria表面の細胞を分離した。これらの分離した細胞をウエル付きスライドガラスとウエル付きデッシュに4×10^3cell/cm^2を播き、10%FCSを含むD-MEM培養液で48時間培養した。性ホルモンが骨形成細胞に及ぼす影響を知るために、骨形成細胞の指標であるアルカリ性ホスファターゼ活性を有する細胞の割合を調べたところ、17β-エストラジオール投与区78.19%、テストステロン投与区70.19%、17β-エストラジオールとテストステロン併用投与区74.99%および無投与区66.91%であった。また、ウエル付きデッシュで14日間培養して、nodule形成を調べたところ、性ホルモン投与区では無投与区に比べてnoduleの数も多く、しかもこれらのnoduleはvon kossa染色陽性で十分に石灰化していた。特に、17β-エストラジオール投与区において顕著であった。以上のことから、性ホルモン投与したウズラ胚のCalvariaから分離培養した骨形成細胞は性ホルモンに速やかに反応して増殖・分化し、骨形成能を有していることが示唆され、今後の骨髄骨の研究に応用できることが窺えた。
超臨界クロマト法による超微粒子の分離分析

数10nm数μmの微粒子の分離分析法の一つに,ハイドロダイナミック・クロマトグラフィー(HDC)法がある。この手法を超臨界流体中の微粒子の分離分析手法として確立させることを目的とし,超臨界流体溶離液に1820MPa,4060°Cの二酸化炭素を用い,分離部細管にフューズドシリカ管(公称径50μm,長さ10mおよび20m)およびPEEK管(公称径130μm,長さ20m)を用いて検討したところ,次のような結論を得た。1.溶離液を超臨界二酸化炭素のみにすると,表面処理をした疏水性シリカ粒子でも,検出器の石英セルに付着し,粒子が通過しても吸光度の低下しない現象が見られた。この現象を改善するにはメタノール等の極性溶媒を添加して,溶離液の極性を高める必要があることが判明した。2.超臨界流体を溶離液として用いるHDC法は,水溶液などの一般の流体を溶離液とした場合より広い条件(細管径,装置長さ,溶離液流速など)で操作できることが判った。しかし装置内滞留時間と粒子の拡散係数の比で表現される無次元数で比較すると,両者の溶離液の相違による粒子流出時間への影響は,ほとんど無いことが判明した。3.粒子排除効果に基づく粒子流出時間の計算予測値と実験値の一致は良くなかった。このような計算値と実験値の乖離の原因として,従来は粒子と細管壁とのコロイド相互作用力であると予測されていた。しかし本研究のような余りにも物性の異なった実験系でも同様の結果が得られたことから,従来の考え方は適切でないと推定される。4.二次流れによる見かけの拡散係数増加を利用して,HDC法による微粒子の分離分析を期待することは,余り効果がないと考えられる。
不完全変態昆虫（コオロギ）の胚形成における位置情報の形成と細胞移動のメカニズム

不完全変態昆虫のモデルシステムであるコオロギの初期胚発生メカニズムの解析を行った。細胞動態を可視化するためにGFP発現系統を用い、Wnt, BMP等の主要な細胞シグナル経路に関わる因子のRNAi解析を行った。その結果、Wntが予定胚原基細胞の移動方向の制御に、BMPが背側から腹側への細胞移動に、それぞれ必要なことが明らかとなった。また、これらのシグナルがotd等のパターン形成遺伝子の発現制御に関与していることも示された。一方、新規のゲノム改変技術の開発を進め、遺伝子ノックアウトとノックインのシステムをほぼ確立することができ、ゲノム解読の進展と合わせて今後のさらに多様な研究の展開が可能となった。23年度はコオロギの初期胚発生における位置情報に関係する因子を特定することを目指しRNAi解析による位置情報関連遺伝子のスクリーニング、および異所性発現系の構築のための実験を行った。特に、主要なシグナル経路であるNotch,Wnt,BMPシグナル経路等に関わる因子の働きをRNAiにより解析した。GFP発現トランスジェニックコオロギの系統を用いたライブイメージングにより、細胞移動を伴う胚原基形成過程でWntとBMPシグナルが重要な役割を果たしていることを示す結果を得た。初期のシグナル因子の働きで、OtdやCaudalが特定の位置に発現し、さらに下流のギャップ遺伝子の発現を誘導することで胚の領域特異化が起こると考えられる。一方、ショウジョウバエのギャップ遺伝子giantやknirpsのオーソログをトランスクリプトームのデータより見いだし、これらが胚の後部で発現することを示す結果を得た。さらに詳細な発現と機能の解析を行う予定である。異所性発現系についてはUAS/GAL4のシステムの構築には至らなかったが、人工制限酵素ZFNに加えて新たにTALENを用いた遺伝子ノックアウトの系を確立することに成功した。これによりターゲット配列の幅が格段に広がり、異所性発現実験を含めた様々な応用の可能性が広がった。レポーター遺伝子の導入による胚発生関連遺伝子のin vivo解析のために,CRISPR/Casシステムによる遺伝子ノックインを検討した。前年度までに相同組換えによるノックインで結果が得られなかったため,非相同末端結合を介したノックインを試み,これにより蛍光タンパク質遺伝子の導入に成功した。コオロギゲノム解読について、前年度に引き続き新学術領域研究・ゲノム支援の支援課題としてシーケンス解析の技術支援を受けつつ解析を進め、アセンブリの状況がさらに大きく改善された。スキャフォールドN50が5Mbを越え、高品質なドラフトゲノム配列を得る事が出来た。他の知られている昆虫ゲノムと比較して,コオロギゲノムは長大なHox遺伝子クラスターを有することなどが明らかになった。共同研究者らとアノテーションを進めており,出版とデータベース公開に向けて準備を行っている。上記ゲノム情報とゲノム改変技術を用いて複数の発生関連遺伝子についてノックアウトによる機能解析とノックインによるレポーター発現システム構築が進行中である。昨年度、Wnt、BMPシグナルが細胞移動を伴う胚原基形成過程で重要な役割を果たしていることを示唆するデータを得ていたが、引き続きGFP発現トランスジェニックコオロギの系統を用いた胚発生ライブイメージングの系による解析をさらに詳細に行った。両シグナル経路に関わる因子の遺伝子を、RNAiにより複合的にノックダウンするなどの解析を通じ、WntシグナルとBMPシグナルが協調的に胚後部のパターン形成を制御している可能性を示唆す結果を得た。BMPシグナルの胚前部パターン形成への役割についてもデータが得られており、解析を継続している。一方、コオロギのゲノム編集に関して、人工制限酵素ZFNおよびTALENによる遺伝子ノックアウトの成果について論文を発表し(Watanabe et al., Nat. Commun., 2012)、また、招待講演を行った(Mito, Janelia Workshop, 2013など)。本年度は、ZFN/TALENによる遺伝子ノックインの系を確立すべく、相同組換え用ベクターを構築し実験を行ったがノックインを示す結果は得られなかった。しかし、並行して進めていたCRISPR/Casシステムによるコオロギゲノムへの標的特異的変異導入に成功し、しかも、本方法によってZFN/TALENよりも顕著に高い効率で変異導入が可能なことを示す結果を得た。遺伝子ノックインにも有効であると期待される。さらに、コオロギゲノム解読について、新学術領域研究・ゲノム支援の支援課題としてシーケンスデータの情報解析支援を受けたことにより、難航していたアセンブリの状況が大幅に改善された。スキャフォールドN50が500kbを越え、実用的なレベルに到達した。さらなる連結性(contiguity)向上を目指しつつ、一方で共同研究者とのアノテーションの準備を進めている。GAL4/UASシステムの確立はやや難航しているが、一方で人工制限酵素を用いた遺伝子ノックアウトを効率良く行うことができるようになり、蛍光マーカー遺伝子のノックインや異所性発現実験への応用の可能性が広がったため。

25年度が最終年度であるため、記入しない。ZFN/TALENによる遺伝子ノックインにはまだ成功していないものの、CRISPR/Casシステムにより標的特異的導入がZFN/TALENよりも顕著に高い効率で起こることを発見した。これは画期的な成果であり、ゲノム編集の効率が大幅に上がり今後の研究の進展を加速する可能性がある。また、Wnt,BMPシグナルの胚発生における機能について、ライブイメージングを利用して新規の重要な知見を得ている。成果発表についても順調に行っている。これらの点から標記の評価に至った。これまでに明らかになってきた初期胚形成に関与するシグナル経路を起点にその上流と下流を重点的に解明し、位置情報の実体とその解読メカニズムに迫りたい。一方、異所性発現解析のための部位特異的転写制御領域の獲得や、人工制限酵素を用いた遺伝子ターゲッティングを効率的に進めるためにゲノム配列情報が必須である。このため現在進行中のフタホシコオロギ全ゲノム解析の早期完了を目指す。さらに、UAS/GAL4システムの導入がうまく行かない場合に備え、人工制限酵素によるゲノム編集技術を応用した解析系の構築を進める。CRISPR/Casシステムを用いて遺伝子ノックイン技術の確立を目指し、胚原基のパターニングに関与する遺伝子のリアルタイム発現解析を早期に実現する。また、ゲノム配列情報について、アノテーションを充実させたデータベースを構築し、転写制御領域の獲得や遺伝子ターゲッティングの標的領域の決定を迅速に行える環境を整備する。最終年度となるので、胚発生メカニズムの新たなモデル構築にむけて成果の統合や論文等での発表にも力を入れる。
古建築の保存を目的とした石材強化保存用合成樹脂の物性評価

石造古建築の保存、修復に用いられている石材強化保存用合成樹脂および近年開発された新しい合成樹脂の基本的な物性、即ち、石材への浸透性、石材への凝集力の付与効果(強化力)、処置効果の持続性(耐久性)等についての実験室および実験フィールドによる評価試験を行った。現在実際に現場で用いられている数種のシリコーン樹脂溶液、アクリル樹脂溶液、エポキシ樹脂溶液について試験を行った。浸透性については、石材がかなりの水分を有している場合について、石材の含有水分量と樹脂溶液の浸透性との関係を調べた。強化力については、樹脂の含浸深さと強化改善効果との関係を調べた。また、樹脂処置後の石材の気体透過性の変化を水蒸気透過性を指標として調べた。さらに、樹脂処置効果の持続性については、種々の劣化促進処理を行って比較検討した。実験フィールドにおける現場作業性試験では、特に表面からの樹脂溶液の浸透性と強化力について調査した。以上の試験の結果、得られた主な知見は以下の通りである。・含水状態にある石材への浸透性は、溶剤タイプが水溶性タイプに比べて格段に優れており、また、粘度の影響が大きい(粘度が低いほど浸透がよい傾向がより高まる)。・樹脂溶液を毛細管現象で表面から浸透含浸させた場合、一般的に外側面において石材の強度がより高まる傾向にある。これは、溶剤の揮発に伴う樹脂分の外側面への移動によるものと考えられる。従って、樹脂濃度の低い(溶剤分の多い)溶液にその傾向が大きく、本試験ではアクリル樹脂、エポキシ樹脂が該当する。・樹脂処置後の水蒸気透過性は、撥水性シリコーン樹脂の場合にかなり低下する。これは水蒸気が石材内で一旦液体化するためとも考えらる。現在石造古建築の保存、修復に用いられている石材強化保存用合成樹脂および近年開発された新しい合成樹脂の基本的な物性、即ち、石材への浸透性、石材への凝集力付与効果(強化力)、処置効果の持続性(耐久性)等について、実験室における評価実験を行った。その結果、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、数種のシリコーン樹脂が、基本的に良好な性能を有するものとして選定された。これら選定された樹脂について、更に細かい評価実験を現在実行中である。一方、現場実験を行うための石材古建築フィールドとして、いくつかの文化財古建築を選定し、石材の劣化状態と環境条件につての詳細な調査を行った。以上の結果、本年度得られた主な知見は以下の通りである。・石材を強化し保存するためには、樹脂が石材中に深く浸透することが絶対条件である。この点から低分子量のシリコーン樹脂溶液が優れていることが確認された。・石材への凝集力付与力(強化力)という点では、有機系の樹脂であるアクリル樹脂、エポキシ樹脂の方が無機系のシリコーン樹脂より優れている。従って、劣化が著しく、大幅に凝集力を失っている石材に対しては、シリコーン樹脂のみでは強化しきれず、有機系樹脂との併用が必要となろう。・各樹脂の長所、短所を性格に知り、石材の状況に応じた的確な使い分けが重要であり、この観点に基づいての評価実験を今後続けていく。現在石造古建築の保存、修復に用いられている石材強化保存用合成樹脂および近年開発された新しい合成樹脂の基本的な物性、即ち、石材への浸透性、石材への凝集力の付与効果(強化力)、処置効果の持続性(耐久性)等についての実験室および実験フィールドによる評価試験を行っている。昨年度行った基礎物性試験により、良好な効果が得られた数種のシリコーン樹脂溶液、アクリル樹脂溶液、エポキシ樹脂溶液について、さらに試験を行った。

浸透性については、石材がかなりの水分を有している場合について、石材の含有水分量と樹脂溶液の浸透性との関係を調べた。強化力については、樹脂の含浸深さと強化改善効果との関係を調べた。また、樹脂処置後の石材の気体透過性の変化を水蒸気透過性を指標として調べた。さらに、樹脂処置効果の持続性については、種々の劣化促進処理を行って比較検討した。実験フィールドにおける現場作業性試験では、特に表面からの樹脂溶液の浸透性と強化力について調査した。以上の試験の結果、得られた主な知見は以下の通りである。・含水状態にある石材への浸透性は、溶剤タイプが水溶性タイプに比べて格段に優れており、また、粘度の影響が大きい(粘度が低いほど浸透がよい傾向がより高まる)。・樹脂溶液を毛細管現象で表面から浸透含浸させた場合、一般的に外側面において石材の強度がより高まる傾向にある。これは、溶剤の揮発に伴う樹脂分の外側面への移動によるものと考えられる。従って、樹脂濃度の低い(溶剤分の多い)溶液にその傾向が大きく、本試験ではアクリル樹脂、エポキシ樹脂が該当する。・樹脂処置後の水蒸気透過性は、撥水性シリコーン樹脂の場合にかなり低下する。これは水蒸気が石材内で一旦液体化するためとも考えられ、さらに実験を継続中である。石造古建築の保存、修復に用いられている石材強化保存用合成樹脂および近年開発された新しい合成樹脂の基本的な物性、即ち、石材への浸透性、石材への凝集力の付与効果(強化力)、処置効果の持続性(耐久性)等についての実験室および実験フィールドによる評価試験を行ってきた。一昨年度、昨年度に行った基礎物性試験により、良好な結果が得られた数種のシリコーン樹脂溶液、アクリル樹脂溶液、エポキシ樹脂溶液について、最終的な確認試験を行った。浸透性については、石材が水分を有している場合の、石材の含有水分量と樹脂溶液の浸透性との関係を詳細に調べた。強化力については、樹脂の含浸深さと凝集力改善効果との関係を綿密に調べた。また、樹脂処置による石材の気体透過性の変化について、水蒸気透過性を指標として定量的に測定した。樹脂処置効果の持続性については、様々な劣化促進処理を行って比較検討した。実験フィールドにおける現場作業性試験では、表面からの樹脂溶液の浸透性について特に詳細に調査した。以上の試験の結果、以下のような知見が得られた。現在、これらの研究成果を取りまとめ中であり、近々に研究報告書として刊行する。・含水状態にある石材への合成樹脂溶液の浸透性については、溶剤タイプが水溶性タイプに比べて格段に優れている。また、粘度の影響が乾燥時より顕著となる(粘度が低いほど浸透がよいという傾向が高まる)。・樹脂溶液を毛細管現象により石材表面から含浸させると、外側面において石材の強度がより高まる傾向にある。これは、溶剤の揮発に伴って樹脂分が外側面に移動するためと考えられる。この傾向は樹脂濃度の低い(溶剤分の多い)場合により顕著であり、アクリル樹脂、エポキシ樹脂の場合がこれに相当する。・樹脂処置された石材の水蒸気透過性については、撥水性シリコーン樹脂を含浸した場合かなり低下する。水蒸気が石材内で液体化することにより、撥水層を通過できなくなるためと考えることができる。
細胞増殖を制御する新しいサイトカインLD78α、β、γの遺伝子構造と作用機構の研究

ヒト・サイトカインLD78は細胞増殖や炎症反応に関与するILー8等を含むス-パ-ファミリ-の一員である。LD78遺伝子にはα、β、γの3種類の遺伝子が存在するが、これらの内、α、β遺伝子の構造を先に報告したが、今回さらにγ遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。その結果γ遺伝子は第1エクソン及びその上流を欠く偽遺伝子である事が判明した。また3種類の遺伝子とも染色体17番に存在していることを見いだしていたので、それらの位置関係を調べるためにコスミドクロ-ンの解析を行った。その結果、β遺伝子とス-パ-ファミリ-の一員でLD78と最も相同性の高いActー2/AT744の第2の遺伝子が約14kbの所にheadーtoーheadで存在している事が分かった。次にα遺伝子のプロモ-タ-に存在する発現誘導を阻害する領域について、siteーdirected mutagenesis、ゲルシフトアッセイ、フットプリンティング、methylation interference、転写因子結合部位のオリゴマ-を用いて解析した結果、この領域にはpositive及びnegativeに働く2種類の転写因子が結合して、両者の量比によってLD78 mRNAの発現誘導量がコントロ-ルされているものと考えられた。LD78の生理活性を調べるために前年度に調製したLD78αタンパクと同様、LD78βタンパクについても量産し、種々の細胞種に対する走化活性を調べた結果、T細胞はLD78βに対してもLD78αに対すると同様な走化性を示す事が分かった。また破骨細胞の分化をビタミンD依存的に促進することや造血幹細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。さらにLD78の生理活性を調べるためにトランスジェニックマウスの作製を試みたが、生まれてきた32匹のマウスではすべて、ヒトのLD78遺伝子が検出できなかった。
手漉き和紙の技能伝承システムの開発

手漉き和紙の熟練者(職人)と未熟練者(弟子)による紙漉きの動作解析・比較を行い,定量的に第三者に伝えることが困難な職人の暗黙知的技能の継承を目的とし,その技能データを計測・解析し,後継者育成の手助けとなる指導方法および技能データベースの開発を試みるものである.本研究ではこれらのデータの定量化のため,モーションキャプチャリングや視線計測を行うことで,職人が有する技能の伝承に役立てることを目的とする.また,後継者育成を目的とし,センサを用いた紙漉き技能評価装置の開発も同時に行い,その性能評価を実施する手漉き和紙の熟練者(職人)と未熟練者(弟子)による紙漉きの動作解析・比較を行い,定量的に第三者に伝えることが困難な職人の暗黙知的技能の継承を目的とし,その技能データを計測・解析し,後継者育成の手助けとなる指導方法および技能データベースの開発を試みるものである.本研究ではこれらのデータの定量化のため,モーションキャプチャリングや視線計測を行うことで,職人が有する技能の伝承に役立てることを目的とする.また,後継者育成を目的とし,センサを用いた紙漉き技能評価装置の開発も同時に行い,その性能評価を実施する
骨芽細胞の遺伝子発現調節機構とその骨形成過程における生理的、臨床的意義

はじめに、PDGFによるヒト骨芽細胞の増殖促進機構と遺伝子発現への影響を検討した。その結果、増殖促進機構にPDGFレセプターの持つチロシンキナーゼ活性とそれによるレセプターのチロシンリン酸化、および細胞内タンパク質のリン酸化が関与している可能性が示唆された。また、c-myc mRNAが一過性に上昇する傾向が認められたが、明らかなシグナルとしてはとらえられず現在実験を追加中である。次に、より生体内に近い骨組織形成を再現できればとの考えからヒト骨芽細胞をディフュージョンチャンバーに封入し実験動物に移植する方法でinvivoでの骨形成系の確立を試みた。その結果、チャンバー内に生体内で見られる石灰化と似した過程からなる石灰化物の形成を確認することができた。さらに、骨形成細胞に分化し得る細胞の存在する骨髄間質細胞培養系を用いて、形成されたmineralized noduleの検索を行なった。mineralized nodule中には骨芽細胞および幼若な骨細胞に類似した細胞が認められ、また多数の基質小胞石灰化球が存在するとともに石灰化が周囲のコラーゲン細線維に沿って進行しているのが確かめられた。大理石骨病は、破骨細胞の分化や骨のリモデリングにおける骨芽細胞の役割を研究する上で重要である。そこで大理石骨病患者から得られた骨組織を形態学的に観察したところ、本疾患患者の骨は層板構造がきわめて不規則であり正常な骨リモデリングが行なわれていないことが推察された。また、破骨細胞はほとんど認めず骨全体としてviabilityに乏しいことが判明した。一方、骨の成長には骨芽細胞の他にも軟骨細胞が関与している。ニワトリ胚成長板由来で肥大軟骨細胞の性質をもつ細胞のレチノイン酸による増殖促進と脱分化機構におけるCキナーゼの関与について検討し、Cキナーゼによる細胞内のタンパン質リン酸化がレチノイン酸の作用の発現もしくは調節に関与している可能性が示唆された。本年度の研究業績は以下のように要約される。まず、われわれは骨芽細胞の石灰化の定量的分析を行うため、ラット骨髄間質細胞を用いて骨原性細胞の分化し得る安定した培養系の確立を試みた。骨髄組織の培養下に得られたMineralized nodule(M.N.)につきその定量を行うとともに組織学的、免疫組織化学的に検索を加え、さらにM.N.中の無機物をX線微小分析、電子線回折等により検討し、以下の結果を得た。1)10nMのデキサメサゾン存在下でβーグリセロリン酸を含まない培養条件においてもM.N.が形成された。2)培養液中に5mM以上のβーグリセロリン酸を添加するとM.N.の形成が促進された。3)M.N.の内部には強いアルカリ性ホスファタ-ゼ活性を有する骨芽細胞あるいは幼若な骨細胞に類似した細胞が存在し、その細胞外基質はおもにI型コラ-ゲンからなっていた。4)M.N.の石灰化はin vivoでの正常の石灰化過程と類似していた。次に、骨芽細胞の増殖に及ぼすサイトカインの影響を細胞数および^3Hチミジンの取り込みを指標に検索した。種々のサイトカインの中で骨折の治癒機序など骨代謝系への関与が推察されている血小板由来成長因子(PDGF)に着目し、ヒト顎骨より分離培養した骨芽細胞様細胞に及ぼす本成長因子の影響を検討し、さらにPDGFレセプタ-を含めた細胞内蛋白質のリン酸化との関連を検討した。

その結果、PDGFは細胞数からもDNA合成能からも本細胞の増殖を促進することが明らかとなった。また、この増殖機構にPDGFレセプタ-の持つチロシンキナ-ゼ活性とそれによるレセプタ-のチロシンリン酸化、および細胞内蛋白質のリン酸化が関与している可能性が示唆された。現在、骨芽細胞の石灰化に際して起こる遺伝子発現の変化をfos、mycなどをプロ-ブとしたノ-ザンハイブリダイゼ-ション法にて研究を進展させている。骨形成を考える上で骨芽細胞に対するサイトカインの影響は重要であるとの観点から、骨基質中にも存在するPDGFのヒト骨由来骨芽細胞における増殖促進機構と遺伝子発現への影響を検討した。その結果、増殖促進機構にPDGFレセプターの持つチロシンキナーゼ活性とそれによるレセプターのチロシンリン酸化、および細胞内タンパク質のリン酸化が関与している可能性が示唆された。また、PDGF添加によるc-myc mRNAが一過性に上昇する傾向が認められたが、明らかなシグナルとしてはとらえられず現在実験を追加中である。次に、より生体内に近い骨組織形成を再現できればとの考えからヒト骨芽細胞をディフュージョンチャンバーに封入し実験動物に移植する方法で、本胞細のin vivoでの骨形成系の確立を試みた。そして、チャンバー内に生体内で見られる石炭化と類似した過程からなる石灰化物の形成を確認することができた。大理石骨病は全身性びまん性の骨硬化性変化をなす骨疾患で、破骨細胞の分化や骨のリモデリングにおける骨芽細胞の役割を研究する上で重要である。そこで大理石骨病患患者から得られた骨組織を形態学的に観察した。そして、本疾患者の骨は層板構造がきわめて不規則であり正常な骨リモデリングが行なわれていないことが推察された。また、破骨細胞はほとんど認めず骨細胞も深層に向かうにつれて次第に変性、壊死に陥り骨全体としてviabilityに乏しいことが判明した。さらに、石灰化について口腔外科疾患からもアプローチすることを試み、顎骨内部に発生し嚢胞上皮にghost cellの出現および石灰化のみられる石灰化歯原性嚢胞において、その異所性石灰化を検索し、これも基質小胞様の類球形構造物から始まることが確認された。この石灰化は上皮内にみられるものであり従来の間葉系組織にみられる石灰化との異同をさらに詳細に検討することにより石灰化機構の解明に役立つものと考えられた。
枯草菌遺伝子操作株を滅菌・凍結乾燥させた粉体によるレアメタルの抽出法の開発

本研究は枯草菌あるいはその遺伝子操作株を培養後、フリーズドライにより粉末化させ、その粉体を種々の有用元素イオンと相互作用させることにより、選択的に抽出することができないか検討するものである。枯草菌の遺伝子操作株を3種新たに作成した。野生株および従来の遺伝子操作株3種を併せて、7種類の枯草菌株についてそれぞれフリーズドライした粉末を作成した。これら粉末を用いて希土類金属イオンおよび金イオンとの吸着性を検討した。結果、希土類金属イオンについては今回作成したグルコースとD-アラニンを欠損させた株が最も高い吸着性を示した。これは希土類金属が吸着する際の立体障害が低いためであると考察した。また、金イオンについては壁テイコ酸欠損株が最も高い吸着性を示した。これは壁テイコ酸が欠損することにより、表面の電荷がより正となり、アニオンである金イオン(塩化金酸イオン)を吸着しやすくなったためと考察した。さらに金イオンを吸着させた後にアスコルビン酸を作用させることによって、枯草菌表面に金ナノ粒子が析出することを発見した。この金ナノ粒子を触媒として用いることを現在、検討中である。なお、金イオンを吸着させた後にアスコルビン酸を作用させて金ナノ粒子を析出させるテクニックを用いて、濾紙上に金ナノ粒子を析出させる実験を併せて行った。この結果を枯草菌を基質として用いた金ナノ粒子のコントロールにしたいと考えた。濾紙にあらかじめ鉛筆により塗りつぶすことにより、従来、赤色である金ナノ粒子が金色になるということを発見した。この金色のナノ粒子は高い触媒活性を示した。枯草菌株の作成に成功し、希土類金属イオンとの相互作用および金イオンとの相互作用について明らかにすることができた。いずれも遺伝子操作株が野生株よりも高い吸着性を示す例をみつけることができ、有用金属の分離への応用が期待できる。また、金ナノ粒子を枯草菌粉末表面に析出することもできた。枯草菌粉末上の金ナノ粒子を環境汚染物質の分解用の触媒として応用できないか検討を進める予定である。また、この金ナノ粒子の作成技術を応用し、濾紙上に金ナノ粒子を作成する研究を進めていたところ、濾紙を鉛筆で塗ると、その上に析出した金ナノ粒子が従来赤色を示すのに対し、金色になるということを発見した。さらに、この金色の金ナノ粒子が環境汚染物質の分解に有用な触媒活性を示すことを明らかにした。このことは当初、予期していない結果であった。枯草菌野生株および壁テイコ酸欠損株の金イオン吸着能を利用して、それら表面に金ナノ粒子を析出させ、その金ナノ粒子による環境汚染物質の分解反応を検討する。具体的にはニトロ基を有する農薬のアミノ化あるいはメチルオレンジなどのアゾ染料の脱色反応に活用することを予定している。また、枯草菌株が種々の環境汚染物質の吸着にも適用できないか、検討を進めていく予定である。希土類金属は液晶、磁石などの材料として需要が高く、資源として重要である。しかしながら、その抽出および分離には酸や有害なリン化合物が一般に用いられており、環境負荷の低い抽出・分離手法の開発および確立が望まれている。本研究ではグラム陽性菌である枯草菌およびその遺伝子操作株を培養後、フリーズドライさせて得られた粉末を希土類金属の抽出・分離に利用する手法の開発を目指している。希土類金属イオンの分離にはペプチドグリカンと結合している壁テイコ酸(WTA)を欠損させた遺伝子操作株が有効であることが明らかになった。例えばSc(III)とLa(III)の混合溶液ではpH2で吸着試験を行ったところ、溶液からはLa(III)のみが検出され、一方、枯草菌粉末上にはSc(III)が94%、La(III)が4.8%の割合で存在していることが明らかになった。Sc(III)とLa(III)、Sc(III)とEu(III)、Sc(III)とTm(III)の組み合わせについての分離は良好に達成されたが、一方でLa(III)とEu(III)、La(III)とTm(III)およびEu(III)とTm(III)の組み合わせの混合溶液については枯草菌粉末上へ吸着した希土類金属について、より原子量が高いほうが多く吸着しているという傾向は見られたものの完全な分離を達成することはできなかった。次に枯草菌168株のD-アラニン修飾欠損株およびグルコース修飾欠損株を遺伝子操作により構築し、培養後、フリーズドライにより得た粉末による希土類金属イオン吸着挙動に関する研究を行った。結果、修飾の有無により、その挙動に変化が見られた。現在、得られた知見をもとに論文を執筆中である。さらに枯草菌および遺伝子操作株より作成したフリーズドライ粉末による塩化金酸イオンの吸着に関する研究を進めている。当初、予定していた遺伝子操作株の構築に成功し、そのフリーズドライ粉末による希土類金属イオンの吸着実験まで結果を得ることができた。予想していたとおりに、遺伝子操作株が野生株と異なる吸着特性を示すことも明らかになった。さらに、塩化金酸イオンの吸着性があることも確認できたため、今後はこれらデータを確立し、論文および学会発表へと結びつけたい。

野生株および従来の遺伝子操作株3種を併せて、7種類の枯草菌株についてそれぞれフリーズドライした粉末を作成した。これら粉末を用いて希土類金属イオンおよび金イオンとの吸着性を検討した。結果、希土類金属イオンについては今回作成したグルコースとD-アラニンを欠損させた株が最も高い吸着性を示した。これは希土類金属が吸着する際の立体障害が低いためであると考察した。また、金イオンについては壁テイコ酸欠損株が最も高い吸着性を示した。これは壁テイコ酸が欠損することにより、表面の電荷がより正となり、アニオンである金イオン(塩化金酸イオン)を吸着しやすくなったためと考察した。さらに金イオンを吸着させた後にアスコルビン酸を作用させることによって、枯草菌表面に金ナノ粒子が析出することを発見した。この金ナノ粒子を触媒として用いることを現在、検討中である。なお、金イオンを吸着させた後にアスコルビン酸を作用させて金ナノ粒子を析出させるテクニックを用いて、濾紙上に金ナノ粒子を析出させる実験を併せて行った。この結果を枯草菌を基質として用いた金ナノ粒子のコントロールにしたいと考えた。濾紙にあらかじめ鉛筆により塗りつぶすことにより、従来、赤色である金ナノ粒子が金色になるということを発見した。この金色のナノ粒子は高い触媒活性を示した。枯草菌株の作成に成功し、希土類金属イオンとの相互作用および金イオンとの相互作用について明らかにすることができた。いずれも遺伝子操作株が野生株よりも高い吸着性を示す例をみつけることができ、有用金属の分離への応用が期待できる。また、金ナノ粒子を枯草菌粉末表面に析出することもできた。枯草菌粉末上の金ナノ粒子を環境汚染物質の分解用の触媒として応用できないか検討を進める予定である。また、この金ナノ粒子の作成技術を応用し、濾紙上に金ナノ粒子を作成する研究を進めていたところ、濾紙を鉛筆で塗ると、その上に析出した金ナノ粒子が従来赤色を示すのに対し、金色になるということを発見した。さらに、この金色の金ナノ粒子が環境汚染物質の分解に有用な触媒活性を示すことを明らかにした。このことは当初、予期していない結果であった。枯草菌168株のD-アラニン修飾欠損株およびグルコース修飾欠損株を用いた希土類金属の吸着挙動についてのデータをまとめて論文化および学会発表する予定である。また、塩化金酸イオンおよび金ナノ粒子の遺伝子操作株の吸着特性について網羅し、廃棄物中に含まれる金の回収に枯草菌が利用できないか検討を深める予定である。枯草菌野生株および壁テイコ酸欠損株の金イオン吸着能を利用して、それら表面に金ナノ粒子を析出させ、その金ナノ粒子による環境汚染物質の分解反応を検討する。具体的にはニトロ基を有する農薬のアミノ化あるいはメチルオレンジなどのアゾ染料の脱色反応に活用することを予定している。また、枯草菌株が種々の環境汚染物質の吸着にも適用できないか、検討を進めていく予定である。
農村地域における景観評価に関する社会学的実証研究

農村地域における景観評価に関する調査研究の最終年度であったため、前年度までの調査結果の補充と、その成果の確認を主眼とした調査を行った。農村景観の整備は、わが国の場合、主として市町村自治体が、条例の制定や景観整備への助成によって行うことが多く、一義的には行政の姿勢、特に首長の施政方針や、担当者の判断の如何に左右されることが多い。事例対象地域の多くは、首長の景観に対する見識が高く、市町村の総合発展計画等、まちづくり計画の中に、景観整備が明確に位置付けられ、それに基づいて各種の整備事業や関連助成事業が展開している。しかし、こうした行政主導の景観整備は、ともすれば住民の景観認識と乖離して行われる場合があったり、外部専門家の「客観的評価」に大きく影響を受けて実施されることが少なくない。グリーン・ツーリズムに代表される、都市と農村の交流が活発になるにつれ、市町村外からの「交流人口」にたいするイメージや、アッピール性として、農村景観はますます重視されつつあるが、こうした現実的な課題に対して、住民の景観意識の現状と、「客観的」な景観評価の整合化が重要になると考えられ、外部-内部、主体-客体、素人-専門家、住民-行政、民間企業-行政、住民-民間企業といった多元的視野構造に立った景観評価と整備を実現する態勢づくりが求められている。農村地域における景観評価に関する先駆的研究について農業土木学、建築学、都市計画学の諸分野の文献を収集し、その理論的整理を行った。その結果、農村景観は、感覚的、抽象的、間接的な傾向が強く、その機能・効能を明らかにする中で抽象的、感覚的な内容を具体的、即物的、客観的な評価手法の確立が必要となっていることが明らかになった。集落景観の実態を把握するために、山形県高畠町をはじめとする市町村の事例調査を行い、市長村レベルの農村景観施策の実態を調査した。その結果、各市町村では、景観条例等の制定を試みながら、景観整備に取り組んでいるものの、町民の意識啓発、あるいは企業サイドの理解等に課題が多いことが明らかになった。近年は、グリーン・ツーリズム事業に着手している市町村が増え、その一環に景観整備に取り組んでいる市町村がみられるものの、行政・住民・企業が一体となって実践している例が少ない。その意味では、英国において1980年代に始まった「グラウンドワーク」運動は、「トラスト」と呼ばれる常設の専門家組織が、行政・住民・企業のパートナーシップを形成し、持続可能な景観整備を行っており、日本への具体的な手法の導入が急がれる。平成10年度は、以上の結果を踏まえて、1ないし2市町村を調査対象地区として選定し、住民の聴き取り調査及びアンケート調査を実施し、従来手法の課題と新たな景観評価への社会学的考察を加えたい。今年度の研究においては、景観条例を施行している各市町村におけるヒヤリング及び、担当者の聞き取り等を通して、農村地域における景観評価の現状についての調査を行った。近年各地で景観条例が施行されているが、大半の事例では行政側からの規制制度という正確が強く、各関係機関代表、住民代表、学識経験者等による景観条例策定委員会という「専門組織」による検討を経て議会に上程され、承認後施行運用される。こうした「規制型景観条例」は、(1)罰則条項がない行政指導規則であること、(2)住民の景観認識との乖離が見られるという、制度及び現実上の問題を有している。ところで、景観とは、人間と自然との相互的作用関係の表象であり、主体・人間の客体・自然に対する認知→作用行為の有り様に規定され、その有り様は、人間の生業・生活様式という文化的要因に基本的には規定される。戦後の都市化の急速な展開によって、多くの農村景観は破壊や変容を遂げたが、経済成長の鈍化・停滞や複合不況が背景となり、成長神話の崩壊とともに、日本の原風景としての農村景観が社会的に再評価されてきている。このような転換期における農村景観の中枢的課題は、社会的・行政的必要性と住民の生活様式の都市化の下での景観認識との乖離の克服にあるといえる。その意味では、住民の景観評価の実態を踏まえながらも、専門家集団の影響力が重要と考えられ、継続的な専門家集団の関わりの有り様が問われている。

特に私的所有権と公共性のせめぎ合いの中から、新たな共生空間をどのように創造するか、住民、行政、民間企業、そして専門家集団の関係性が課題として析出されている。今年度の研究においては、景観事業に取り組んでいる各市町村におけるヒヤリング及び、担当者の聞き取り等を通して、農村地域における景観評価の現状についての調査を行った。人間と自然との相互的作用関係の表象としての景観は、主体・人間の客体・自然への認知・作用行為の有り様に規定され、その実態は、人間の生業・生活様式よいう歴史的・文化的要因に規定される。調査事例においては、農村地域という地域特性もあって、自然景観、農業生産景観、農村集落景観、歴史的建造物景観、公共施設景観といった多様な構成要素を有し、各々が社会・経済的要因による開発行為によって変容を余儀なくされている。しかし、90年代後半のグリーン・ツーリズムへの関心の高まりや、美しい村づくり運動が背景となって、日本の原風景としての農村景観が、社会的な再評価を獲得しつつあることも事実である。このような転換期における農村景観の中枢的課題は、社会的・行政的必要性と住民の生活様式の都市化の下での景観認識との乖離状況の克服にあるといえる。その意味では、住民の景観評価の実態を踏まえながらも、専門家集団の影響力が重要と考えられ、継続的な専門家集団の関わりの有り様が問われている。農村地域における景観評価に関する調査研究の最終年度であったため、前年度までの調査結果の補充と、その成果の確認を主眼とした調査を行った。農村景観の整備は、わが国の場合、主として市町村自治体が、条例の制定や景観整備への助成によって行うことが多く、一義的には行政の姿勢、特に首長の施政方針や、担当者の判断の如何に左右されることが多い。事例対象地域の多くは、首長の景観に対する見識が高く、市町村の総合発展計画等、まちづくり計画の中に、景観整備が明確に位置付けられ、それに基づいて各種の整備事業や関連助成事業が展開している。しかし、こうした行政主導の景観整備は、ともすれば住民の景観認識と乖離して行われる場合があったり、外部専門家の「客観的評価」に大きく影響を受けて実施されることが少なくない。グリーン・ツーリズムに代表される、都市と農村の交流が活発になるにつれ、市町村外からの「交流人口」にたいするイメージや、アッピール性として、農村景観はますます重視されつつあるが、こうした現実的な課題に対して、住民の景観意識の現状と、「客観的」な景観評価の整合化が重要になると考えられ、外部-内部、主体-客体、素人-専門家、住民-行政、民間企業-行政、住民-民間企業といった多元的視野構造に立った景観評価と整備を実現する態勢づくりが求められている。
基底小体へと伸長するユニークな膜構造のシリア位置制御における役割の解明

カタユウレイボヤ胚の表皮細胞の最終分裂では、中心体へと伸長し、細胞分裂方向を制御する膜構造が見られる。私のこれまでの研究によりこの膜構造の伸長先の中心体は分裂期に入る前に繊毛の基底小体へと変換することが分かっている。また、他のグループの研究によりこの繊毛がホヤの左右軸決定に関わる神経胚回転に必要であるという結果が報告されている。この繊毛における膜構造の役割を調べるため、まず本年度はこの繊毛のダイナミクスについて解析した。正常胚においてこの繊毛の動きをディスク回転式共焦点顕微鏡により観察したところ、繊毛が動く様子が観察できた。胚自体も神経胚回転中であり動いているため、繊毛の動きを正確に捉えることができなかったが、1)全ての繊毛が同じように動いていない、2)個々の繊毛も常に動いていない可能性を示す観察結果を得た。また、他のグループの先行研究において、繊毛の動きを産み出すモータータンパク質であるダイニンの阻害剤により神経胚回転が阻害されることが報告されている。今回、この阻害剤処理により回転を阻害したカタユウレイボヤ胚において、左側特異的に発現するNodalの発現が阻害された。また、このNodalの発現時期を正常胚において詳細に観察したところ、回転終了直前で既に左側での発現が観察できた。このことは、カタユウレイボヤにおいて繊毛が引き起こす回転運動の結果というよりは、回転運動そのものがホヤの左右軸の確立に関わることを示唆している。本研究計画で注目している膜構造の伸長先である繊毛の位置はDishevelled(Dsh)により膜構造の極性を介して制御されており、Dshの機能阻害胚では繊毛の位置が細胞後方から中央へと変化する。また前年度までにDsh機能阻害胚では神経胚回転が異常になるとことを明らかにしていた。本年度はDsh機能阻害胚においても繊毛の動きを観察し、その機能阻害胚でのNodalの発現を観察する予定であったが、サンプリングやin situ hybridizationの条件検討に時間がかかり、計画を完遂することができなかった。今後は、まずDsh機能阻害胚でのNodalの発現について解析し、膜構造が介する繊毛位置がホヤの左右軸にどのような影響を与えるかを示す。さらに、物理的に神経胚回転を止め、ホヤの左右軸への影響を観察する。これらの結果を併せ、膜構造-繊毛位置-神経胚回転-左右軸の関係を明らかにする。本研究計画では、カタユウレイボヤ胚の最終分裂において胚前方に伸長する新奇な膜構造に注目し、この膜構造の伸長先にあるシリアとその機能を明らかにすることを目的としている。本年度は、この膜構造の極性化のメカニズムについて明らかにすることを目的として、Dishevelled(Dsh)の解析を行った。申請者の先行実験において、Dshの機能阻害により膜構造の向きがランダムになることが分かっていた。本年度においては、Dshの機能阻害の結果を定量的に解析し、さらにDshの過剰発現により機能阻害の影響の緩和にも成功した。これらの結果は、この膜構造の極性はDshにより確立していることを強く示唆する。さらに、シリアの位置に関しても正常胚では後方に偏っているものがDshの機能阻害胚においては、細胞中央に有意に変化していた。このことから、この膜構造のシリア位置の制御に関わっている可能性が高いと考えている。以上の結果は、今までのものと併せ論文として発表した。さらに、本年度は膜構造及びシリアの機能の探るためにカタユウレイボヤ胚を覆うコリオン(卵膜)を除去せずに様々な観察を行った。マボヤ胚においても、本研究で注目している時期と相同な時期にシリアが形成され、そのシリアの働きによりコリオン内で神経胚回転が起こるとされている。通常カタユウレイボヤ胚はコリオンを化学的に除去し実験が行われるが、神経胚回転の観察のために、大沼博士、日下部博士(甲南大学)のサポートのもとコリオン付きで実験を行った。この結果、膜構造の形成時期と神経胚回転の時期は一致しており、さらにDsh機能阻害胚において神経胚回転の異常が観察できたことから、カタユウレイボヤ胚において後方に偏ったシリアが神経胚回転に関わっている可能性が考えられる。本年度においては、注目している膜構造の極性化メカニズムについて明らかにする計画であり、Dishevelled(Dsh)を中心とした極性化の分子的経路を明らかにする予定であった。まず、Dshの機能阻害に用いたモルフォリノオリゴ(MO)の特異性を確認するためにDsh mRNAを強制発現し、レスキュー実験を行い、正常胚・機能阻害胚・レスキュー胚のそれぞれの膜構造の極性、細胞分裂方向、シリアの位置を定量的に測定した。その結果、機能阻害胚において全ての測定結果で他と差が見られたことから、今回用いてMOは膜構造の極性化においてDshの機能を特異的に阻害しているといえる。しかしながら、上記の解析に時間がかかったため、計画中のDshの下流因子の探索を行うことが本年度中にできなかった。一方で、平成29年度以降に解析を計画していた膜構造のシリア位置への関与については、本年度のMOを用いた解析でその関与を示唆する結果を得ることができた。また、甲南大学の日下部教授、大沼博士の協力の元、コリオン付きのカタユウレイボヤ胚において膜構造の観察に成功し、膜構造及びシリアの形成時期と神経胚回転の時期が一致することを明らかにした。

さらに、Dsh MOを用いて機能阻害を行ったところ神経胚回転に異常が見られたことから、カタユウレイボヤ胚においてシリア位置が正常な神経胚回転に関わっている可能性が高い。これらの解析も平成29年度以降に計画していたもので、ある程度前倒しで行うことができた。総合的に鑑みて、本年度の進捗は概ね順調に進展していると考えている。本研究計画では、カタユウレイボヤ胚の最終分裂において胚前方に伸長する新奇な膜構造に注目し、この膜構造の伸長先にあるシリアとその機能を明らかにすることを目的としている。本年度においては、シリアの機能がホヤ左右軸の確立にあると考え、研究を遂行した。ホヤの左右をライブイメージングにより観察するため左側特異的遺伝子であるPitxのプロモーターを利用した。西駕博士より既に左側特異的な活性が報告されているPitxプロモーターを含むコンストラクトを譲り受け、H2B-GFPの上流に組み込みライブイメージング用のコンストラクト、ePitx-H2B-GFPを作製した。このePitx-H2B-GFPを注入した場合、コリオン付き胚では全ての胚で左側において左側でのGFPの核局在が観察できた。さらに、コリオンを持たない胚では両側での発現が見られ、以前の報告(Yoshida & Saiga 2008)と一致する結果を得た。また、シリアがホヤの左右軸形成に関わっているとすると胚全体の回転運動である神経胚回転を介している可能性が高い。そこで、シリアが回転運動により水流を起こし、神経胚回転に関与しているのではないかと考えた。この仮説を検証するため、先端バイオイメージング支援プラットフォーム(ABiS)のサポートを受け、海産動物を用いた高速度撮影技術を持つ筑波大学下田臨海実験センター稲葉研究室においてシリアの回転運動と水流の観察を試みた。しかしながら、現在までのところ、はっきりとした回転運動と水流を確認できていない。当該年度から所属機関の変更があったため、実験材料であるカタユウレイボヤの飼育環境を含む実験環境のセットアップに時間がかかってしまい、当初の計画の遂行が難しかった。カタユウレイボヤ胚の表皮細胞の最終分裂では、中心体へと伸長し、細胞分裂方向を制御する膜構造が見られる。私のこれまでの研究によりこの膜構造の伸長先の中心体は分裂期に入る前に繊毛の基底小体へと変換することが分かっている。また、他のグループの研究によりこの繊毛がホヤの左右軸決定に関わる神経胚回転に必要であるという結果が報告されている。この繊毛における膜構造の役割を調べるため、まず本年度はこの繊毛のダイナミクスについて解析した。正常胚においてこの繊毛の動きをディスク回転式共焦点顕微鏡により観察したところ、繊毛が動く様子が観察できた。胚自体も神経胚回転中であり動いているため、繊毛の動きを正確に捉えることができなかったが、1)全ての繊毛が同じように動いていない、2)個々の繊毛も常に動いていない可能性を示す観察結果を得た。また、他のグループの先行研究において、繊毛の動きを産み出すモータータンパク質であるダイニンの阻害剤により神経胚回転が阻害されることが報告されている。今回、この阻害剤処理により回転を阻害したカタユウレイボヤ胚において、左側特異的に発現するNodalの発現が阻害された。また、このNodalの発現時期を正常胚において詳細に観察したところ、回転終了直前で既に左側での発現が観察できた。