hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FGF23と血管内皮機能をマーカーとする糖尿病末期腎症のリン管理プログラムの開発

持続する高リン血症は血管石灰化を誘発する。しかし、一過性の高リン血症も血管内皮機能を障害し、動脈硬化を惹起する。我々は高リン食摂取によって生じる一過性の高リン血症(リンスパーク)の影響を解析した。早期のCKD患者のモデルである腎機能低下ラットを用いてリンスパークの血管に対する影響を検討した。普通食(リン0.6%)摂取群、高リン食(リン1.2%)摂取群、高リン食と低リン食(リン0.02%)を2日ごとに交互摂取群(スパーク群)にわけ、36日間飼育して解析した。スパーク群の総リン摂取量は普通食群と同等であったが、スパーク群では高リン食摂取群と同程度の腎繊維化と血管石灰化を示した。このことから、腎機能低下患者においてもリンを多く含む食事によるリンスパークが、血管機能に悪影響を与えることが示唆された。次に機能性食品による血管内皮機能低下の予防について検討を行った。機能性食品として水溶性食物繊維を用い、健常者において高リン食とともに摂取させ、リンスパークによる血管内皮機能障害を抑制することを明らかにした。また、ヒト研究の予備検討として透析患者と健常者の食習慣と血管内皮機能との関連、排便状況、腸内環境の調査を行った。今後、透析患者における血管内皮機能改善を目指した水溶性食物繊維による介入試験を実施する予定である。外来通院する血液透析患者において食品のリン・たんぱく質比と栄養摂取量などの調査を行った。リン・たんぱく質比が14mg/g未満の低群と14mg/g以上の高群に分け比較すると両群のエネルギーとたんぱく質の摂取量に差はなかったが、低群でカルシウム摂取量が有意に低く、リンも低い傾向にあった。また、低群では無機リンを多く含む食品添加物の多い菓子などの摂取も少ないことが明らかになった。MNAを用いて栄養状況を調査すると、低群の栄養状態良好群は54%で高群(28%)より有意に多かった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。健常者へ高リン食負荷試験を行った。健常男子に高無機リン食とリン制限食をクロスオーバーで摂取させ、高無機リン食は血流依存性血管拡張反応:FMD)が低下させることを確認した。また、食物繊維の摂取はFMDの低下を抑制した。アデニン食を摂取させた腎不全ラットにおいてリンスパークが血管内皮機能に及ぼす影響を解明した。リンスパーク試験にはコントロール食(CP:リン0.6%)と低リン食(LP:リン0.2%)、高リン食(HP:リン1.0%)を用い、16日間摂食させた。LPとHPを2日毎に交互に摂食させるLH群を設定した。リン摂取量に伴い血中リン濃度は変動し、腎不全モデルにおいてもリンスパークが生じることが示された。CP群で20%、LH群で63%に血管石灰化が観察された。リンスパークは腎機能低下状態における心血管疾患に影響を及ぼすことが明らかとなった。リンによる血管石灰化のメカニズムの解明のため、ヒト血管平滑筋細胞(AoSMc)を用い、リンスパークによる直接的な石灰化の影響を検討した。2日ごとにHPとLP培地に交換し、16日間培養した後、Von kossa染色を行い石灰化評価し、リン酸トランスポーター、骨芽細胞関連因子、血管収縮性マーカーの遺伝子発現量も解析した。その結果は動物とは異なり、リンスパークによる石灰化ならびに遺伝子発現に差は認められなかった。これらの結果から、リンスパークによる血管への影響はリンの直接的な作用以外にホルモンなどの全身的な作用が関与している可能性があると考えられた。医療現場の調査として、血液透析患者のQOLに影響する食意識とリン摂取量を解析した。血液透析患者60名(男性34名、女性26名)を対象とし、KDQOL-SF、半定量食物摂取頻度調査(SQFFQ)、食意識調査を行った。QOLの総得点の中央値5953点で高群(30人)と低群(30人)に群分け解析した。重回帰分析を行ったところ透析に至った原疾患以外に、「肉類についてどのように心がけていますか」が抽出された。ヒトを用いた研究が計画通り進んでいない。2週間程度継続した高無機リン負荷を計画していたが、対象者が喫食しやすい高無機リン食の開発が順調に進まなかった。そのため準備段階としての単回の高無機リン負荷試験しか実施できなかった。動物や培養細胞を用いた研究は計画通りに進んでいる。これまでの研究で無機リンの負荷が血管内皮機能を低下させることを明らかにしている。腎不全患者のQOLを高める目的で血管内皮機能の悪化を予防する食品について検討した。ラットにおいて食物繊維と高無機リン食の同時摂取が血管内皮機能の低下を抑制するかを検討した。リン水溶液投与群(HP)において食物繊維投与が血清リン値の上昇を抑制することを示した。そこでヒトに食物繊維を長期摂取させて血管内皮機能の変化を検討した。健常若年男性17名を対象とし、2週間にわたり食物繊維摂取させた。食物繊維の摂取の前後に食物摂取頻度調査、便調査、血管機能検査としてCAVI(心臓足首血管指数)とABI(足関節上腕血圧比)、血管内皮機能検査として血流依存性血管拡張反応(Flow Mediated Dilation;FMD)を測定した。2週間の食物繊維の摂取後にFMD値は有意に改善した。

また、食物繊維の投与開始前の血清リン濃度(IP)の高い群と低い群でFMD変化を解析した。IP正常低値群では有意な変化を示さなかったのに対し、正常高値群ではFMDが有意に改善した。さらに、食物繊維の投与開始前のFMD値を3分位に分け、FMDの変化量を解析した。FMD下位群において食物繊維投与後のFMDが有意に改善することを示した。このことからIPが高い群とFMD値が低い群において食物繊維投与が有効であることが明らかになった。血液透析患者ではProtein-energy wasting(PEW)が高頻度でみられる。そこで血液透析患者におけるリン摂取量、食意識・食態度を評価し、PEWとの関連を明らかにした。血液透析患者男女59名(男性40名、女性19名)を対象とし、PEWはアルブミン、BMI、上腕筋面積などで評価した。PEWがある分とない群に分け重回帰分析を行った。「ごはんからのリン摂取量」「食事を楽しんでいますか」の2項目がPEWに影響を与える因子として抽出された。健常者と動物における検討は順調に進んでおり、今後血液透析患者も対象として研究を進める。持続する高リン血症は血管石灰化を誘発する。しかし、一過性の高リン血症も血管内皮機能を障害し、動脈硬化を惹起する。我々は高リン食摂取によって生じる一過性の高リン血症(リンスパーク)の影響を解析した。早期のCKD患者のモデルである腎機能低下ラットを用いてリンスパークの血管に対する影響を検討した。普通食(リン0.6%)摂取群、高リン食(リン1.2%)摂取群、高リン食と低リン食(リン0.02%)を2日ごとに交互摂取群(スパーク群)にわけ、36日間飼育して解析した。スパーク群の総リン摂取量は普通食群と同等であったが、スパーク群では高リン食摂取群と同程度の腎繊維化と血管石灰化を示した。このことから、腎機能低下患者においてもリンを多く含む食事によるリンスパークが、血管機能に悪影響を与えることが示唆された。次に機能性食品による血管内皮機能低下の予防について検討を行った。機能性食品として水溶性食物繊維を用い、健常者において高リン食とともに摂取させ、リンスパークによる血管内皮機能障害を抑制することを明らかにした。また、ヒト研究の予備検討として透析患者と健常者の食習慣と血管内皮機能との関連、排便状況、腸内環境の調査を行った。今後、透析患者における血管内皮機能改善を目指した水溶性食物繊維による介入試験を実施する予定である。外来通院する血液透析患者において食品のリン・たんぱく質比と栄養摂取量などの調査を行った。リン・たんぱく質比が14mg/g未満の低群と14mg/g以上の高群に分け比較すると両群のエネルギーとたんぱく質の摂取量に差はなかったが、低群でカルシウム摂取量が有意に低く、リンも低い傾向にあった。また、低群では無機リンを多く含む食品添加物の多い菓子などの摂取も少ないことが明らかになった。MNAを用いて栄養状況を調査すると、低群の栄養状態良好群は54%で高群(28%)より有意に多かった。ヒトを用いた研究が計画通り進んでいないので、平成28年度の経費の一部を平成29年度に繰り越した。時間がかかったものの、対象者が喫食しやすい高無機リン食が開発できたので、健常大学生を対象とし、2週間程度の高無機リン食負荷試験を実施し、FMDなどを測定する。
ホウ素添加したGaN系紫外微小共振器の製作

ホウ素添加したGaNおよびその混晶系材料は6H-SiC基板上に格子整合をとることが可能であると予測されており,微小共振器製作上,発光層中の残留歪み低減に効果があると報告した.本年度は,BAlGaN系微小共振器の検討を行った.従来の半導体反射鏡構造を利用した微小共振器の研究開発は有機金属気相成長法によるホウ素を含む窒化物材料の結晶成長技術の研究と平行し,ガラス基板上に微小共振器形成する技術検討も行った.この点について大きな進展があったので報告する.共振器反射鏡形成には大きな屈折率差があり,かつ紫外光に対して透明である材料系が要求される.これまでに酸化物であるSiO_2,TiO_2もしくはZrO_2が用いられてきた.これらの多層膜反射鏡は少ない層数で高い反射率の実現が可能である.しかしながらこれら,誘電体薄膜上にエピタキシャル成長は困難である.そこで,ガラス基板上にGaN薄膜材料を結晶構造にこだわらず形成し,発光素子の形成を通して微小共振器形成の可能性を検討した.Cr金属電極を形成したSiO_2上に非晶質GaNを堆積させ,エレクトロルミネッセンス素子(ELDs)を製作し,300μm程度の上部電極を形成している.交流駆動により青紫の発光が目視された.また,スペクトルは紫外発光成分を有しガラス基板上にGaN系材料を堆積する手法も有効であることが確認された.この方法をBAlN高抵抗層を6H-SiCに格子整合して形成し,上部に誘電体薄膜を利用すれば,より高効率の発光デバイス形成が可能であるとの感触を得た.本研究結果より,交流駆動型新規微小共振器構造のアイデアとともにその基礎検討結果を示すことができた.この結果は,将来大面積微小共振器アレイ構造へ発展する可能性を示している.ホウ素(B)を添加したAlN,GaN,InNおよびその混晶系は導電性基板である6H-SiC上に格子整合を取ることが可能となる.この材料を活性層に用いた紫外発光半導体レーザは,六方晶構造を有するこれらの材料中に生じうるピエゾ電界を制御する事が可能である.しかしながら,ホウ素を含むIII-V窒化物半導体BAlGaInNの薄膜成長は,混晶の製作しにくさを示す相互作用パラメータが非常に大きいので,製作が困難である.本研究では,混晶の製作が行いやすいと理論的に推測される低温にてIII-V窒化物の結晶成長が可能と考える分子線エピタキシャル成長法(MBE)により,BAlGaNの結晶成長を行うことを目的とし,最終的に紫外発光微小共振器の製作を目指す.まず,第1段階としてGaNの低温成長に着目した.GaNはその合成に1000°C程度の温度が必要とされているが,MBE法においては,基板上に堆積したGa金属の触媒作用により原料として供給されるアンモニアが分解,GaNの形成が低温(700°C)で行うことができることがすでに報告されている.本研究では,更なる成長温度低温化の可能性を検討した.その結果,原料にGaNを使用し,これを昇華させることでGaN生成に必要なエネルギー分(合成エネルギー)を必要としなくなる分だけ低温が可能ではないかとの結論に達した.その結果,450°Cで紫外発光するGaN薄膜を形成することに成功した.また,本薄膜を利用してエレクトロルミネッセンス素子を製作し,交流電界駆動による紫外発光を確認した.しかし,その薄膜は非晶質に近いものであり,さらにN原料の同時供給等の検討を行い,ホウ素を添加してゆきたい.ホウ素添加したGaNおよびその混晶系材料は6H-SiC基板上に格子整合をとることが可能であると予測されており,微小共振器製作上,発光層中の残留歪み低減に効果があると報告した.本年度は,BAlGaN系微小共振器の検討を行った.従来の半導体反射鏡構造を利用した微小共振器の研究開発は有機金属気相成長法によるホウ素を含む窒化物材料の結晶成長技術の研究と平行し,ガラス基板上に微小共振器形成する技術検討も行った.この点について大きな進展があったので報告する.共振器反射鏡形成には大きな屈折率差があり,かつ紫外光に対して透明である材料系が要求される.これまでに酸化物であるSiO_2,TiO_2もしくはZrO_2が用いられてきた.これらの多層膜反射鏡は少ない層数で高い反射率の実現が可能である.しかしながらこれら,誘電体薄膜上にエピタキシャル成長は困難である.そこで,ガラス基板上にGaN薄膜材料を結晶構造にこだわらず形成し,発光素子の形成を通して微小共振器形成の可能性を検討した.Cr金属電極を形成したSiO_2上に非晶質GaNを堆積させ,エレクトロルミネッセンス素子(ELDs)を製作し,300μm程度の上部電極を形成している.交流駆動により青紫の発光が目視された.また,スペクトルは紫外発光成分を有しガラス基板上にGaN系材料を堆積する手法も有効であることが確認された.この方法をBAlN高抵抗層を6H-SiCに格子整合して形成し,上部に誘電体薄膜を利用すれば,より高効率の発光デバイス形成が可能であるとの感触を得た.本研究結果より,交流駆動型新規微小共振器構造のアイデアとともにその基礎検討結果を示すことができた.
造血幹細胞増殖因子(SCGF)の遺伝子組換え発現と血液学診断、治療医薬品への応用

造血幹細胞増殖因子(stem cell growth factor ; SCGF)の血液学診断、治療医薬品への応用を前提として、SCGF遺伝子の同定、解析、組換え発現などを検討した。骨髄細胞、MC3T3-G2/PA6前脂肪細胞、ROS-17/2.8-5骨肉腫細胞から各々全長型ヒト、マウス、ラットSCGF遺伝子を同定した。SCGFはC型レクチンに分類され、tetranectinと最も近縁である。N末21aaのシグナルペプチドを有し、N型糖鎖はないが、シアル酸によるO型糖鎖を認める。Leucine繰り返し配列部でα-helical coiled-coil高次構造が予想される。SCGF遺伝子はNorthernで骨髄、脾、胎児肝などに、in situ hybridizationで骨、骨髄に特異的な発現を認める。増殖軟骨細胞に発現し休止あるいは肥大軟骨細胞に発現しないため、SCGFの骨形成への関与が窺われる。ヒトSCGF染色体遺伝子座は19q13.3、マウスは7B3-B5で、flt3リガンド、IL-11遺伝子座に近い。発現ベクターpAGE-SCGFで安定的に形質転換したCHO細胞を大量無血清培養し、低内毒素遺伝子組換え型ヒト(rh)SCGFを精製した。合成SCGF部分ペプチドでラットを免疫し抗SCGFモノクロナル抗体を得た。rhSCGFはヒト骨髄CD34^+Lin-細胞に対して、用量依存性にEpo存在下で赤芽球バースト増強活性を、GM-CSFあるいはG-CSF存在下で単独あるいはIL-3やflt3リガンドと相乗的に顆粒球マクロファージコロニー増強活性を示した。SCGFは骨および骨髄細胞から選択的に産生され、造血微小環境と造血幹細胞相互作用を仲介する。今後、他細胞への活性、受容体、ノックアウトマウスおよび臨床事例などの解析を通して、SCGFは新たな幹細胞生物学パラダイムの構築に大きく寄与するものと思われる。ヒト遺伝子組換え型SCGFの調製に先立って処理すべきいくつかの問題点を検討し解決した。1.ヒト全長型SCGF遺伝子:ヒト骨髄polyA^+RNAに対し、SCGFのN/C末端部合成DNAプライマーを用いてRT-PCRを行った。クローン化した増輻cDNAは従来のSCGFに78アミノ酸が付加した969塩基;323アミノ酸からなり、前者をSCGF-α、後者をSCGF-βと命名した。2.他哺乳動物のSCGF遺伝子:マウス頭蓋冠ストローマ細胞株MC3T3-G2/PA6およびラット骨肉腫細胞株ROS-17/2.8-5から調製したcDNAライブラリーに対しRT-PCRにより増幅したcDNAをクローン化した。各々のSCGF遺伝子は1,399塩基/984塩基;328アミノ酸からなり、ヒトSCGF-αと90.4%の相同性を示した。3. SCGF分子の特徴:SCGFアミノ酸配列に対し遺伝子データベースからモチーフ検索を行ったところ、Ca^<2+>依存性糖認識領域を認めSCGFはC型レクチンの一員である事が判明した。この他、酸性領域、糖鎖O結合PST領域、ロイシンジッパー領域を認めた。4. SCGFmRNAの組織発現:Northem解析の結果、SCGF遺伝子発現は骨髄を筆頭に、牌、虫垂、胸腺、胎児肝には高いが末梢血白血球には低く、SCGFの造血関連遺伝子としての意義が示唆された。5. SCGFの染色体遺伝子座:FISH解析によりヒトおよびマウスSCGF遺伝子は各々19q13.3、7B3-B5に同定された。

同部位はflt3リガンド、IL-11などの早期作用造血因子遺伝子の集積部位であり興味深い。以上の他、抗SCGF抗体の作製やヒト、マウスSCGF遺伝子の動物細胞/大腸苗における安定発現の下準備も実施しているが、その経過ならびに成果については次年度以降に報告する。遺伝子組換え型ヒト(rh)SCGFを調製しその造血活性について検討した。1.SCGF遺伝子の組換え発現:SCGF cDNAを入れた発現ベクターpAGE210由来プラスミドpAGE-SCGF-αを電気穿孔法によりdhfr欠損CHO細胞に導入した。hygromycin Bおよび50200nM MTX添加α-MEM中でSCGF遺伝子発現CHO細胞を選択した。2.抗SCGF抗体の作製:合成SCGF(27-46)ポリペプチドで免疫されたラットから抗体産生ハイブリドーマを作製しモノクロナル抗体を得た。ビオチン化抗体を精製各段階のWestern BlottingによるSCGF確認に供した。3.rhSCGFの精製:SCGF遺伝子発現CHO細胞をEX-CELL301培地で培養し、上清からSCGFを亜鉛キレーティング、硫安沈澱、MonoQクロマト、Superose6ゲル慮過により精製した。SCGF(45kDa)はシアル酸を含むO結合糖タンパクで、N末はAla22であった。N末28aa欠失体の発生はプロテアーゼ阻害剤の添加などにより回避できた。4.rhSCGFの造血活性:ヒト骨髄CD34^+Lin^-細胞に対してSCGFはEpo存在下で赤芽球バースト増強活性(BPA)、GM-CSF、G-CSF存在下でGMコロニー増強活性(GPA)を示した。SCGFはCSAを欠くがクラスター形成能を有し、BPAに対してSCFと競合阻害を、GPAに対してIL-3、flt3-Lと相乗作用を示した。5.Insitu hybridization:マウス全胎児および脛骨における解析で、SCGFmRNAは骨髄、骨、軟骨に、とりわけ生長板では増殖軟骨にのみ限局発現されていた。SCGFは造血の他骨形成にも関与する可能性がある。この他、SCGFのヒト骨髄細胞CD発現への影響や遺伝子組換え型マウスSCGFの調製、生物活性の検討も実施中である。遺伝子組換え型ヒト/マウスSCGFの調製、その造血活性の解析、SCGF受容体解析の基礎的検討を主課題として取り組んだ。1.遺伝子組換え型ヒト/マウスSCGFの調製:昨年度報告の方法によりヒト/マウスSCGFを調製精製した。純度≧90%、内毒素含有レベル≦10ng/mgの精製SCGFはO結合糖鎖を持つ分子量45kDa単量体がαヘリックスcoiled-coil構造ホモ三量体を形成している事が判明した。2.精製遺伝子組換え型SCGFの造血活性:低比重ヒト骨髄細胞からStemSep^<TM>キットを用いて磁気ビーズによりCD34^+Lin^-細胞あるいはCD34^+CD38^-Lin^-細胞を選別回収した。分離細胞にSCGFと各種造血因子を組合わせて作用させ、Two Colorフローサイトメトリーにより各細胞集団に与える影響を検討した。
トポロジカルブロック共重合体の精密合成とその凝集構造

溶媒にTHF、開始剤としてナフタレンカリウム、重合温度-78°Cの条件でスチレン(S)、次いで2-イソプロペニルナフタレン(N)の順にモノマーを逐次添加し、リビングポリマーを合成後,1,1-ジフェニルエチレン(DPE)でエンドキャップし、さらにジフェニルエチレン型ビニル基を有する停止剤を用いてテレケリックNSNトリブロック共重合体を合成した。分子量約2万程度の試料を合成した。また、同様の手法でポリイソプレンのテレクリックポリマーも合成した。(分子量約2万)テレケリックNSNトリブロック共重合体を高真空下、希薄THF溶液(0.1%以下)とし、これにナフタレンカリウムを添加し、末端官能基2量化反応を行い、環化を行った後、GPC分取操作により、環状NSジブロック共重合体を単離した。さらに高真空下、この環状NSジブロック共重合体に金属ナトリウムをTHF溶液中で反応させ、ラジカルアニオン化した。このラジカルアニオン化共重合体、およびテレケリックポリイソプレンの希薄THF溶液(0.2%以下)をそれぞれ調製し、両者を混合することにより環状NSジブロック共重合体の近傍でテレケリックポリイソプレンの末端官能基2量化反応を行い、ポリイソプレンの環化、すなわち、カテナン化を行った。得られた試料はまず、まずn-ヘキサンを用いて遊離ポリイソプレンの抽出を行い、ポリイソプレンホモポリマーを除去した後、さらにGPC分取操作により、高分子量成分のみ分離じ、2成分カテナン型複合高分子を単離・精製した。最終生成物(2成分カテナン型複合高分子)はUV検出器を接続したGPC分析を行い、ナフタレン環のみを波長320nmで選択検出したところ、環状NSジブロック共重合体の約2倍程度の分子量を有し、かつ比較的分子量分布の狭い成分の生成が確認された。さらに、この試料のキャスト膜の透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、交互ラメラ構造を呈することが確認された。本研究成果は、論文準備中である(J. Am. Chem. Soc.)溶媒にTHF、開始剤としてナフタレンカリウム、重合温度-78°Cの条件でそれぞれのモノマーを添加し、リビングポリマーを合成後,1,1-ジフェニルエチレン(DPE)でエンドキャップし、さらにジフェニルエチレン型停止剤を用いて2-ビニルナフタレンならびにスチレンからなるテレケリックマクロモノマーを合成した。いずれも分子量約1万、分子量分布Mw/Mn≦1.1の試料を合成した。テレケリックポリ(2-ビニルナフタレン)(PVN)を高真空下、希薄THF溶液(0.1%以下)とし、これにナフタレンカリウムを添加し、環化反応を行った後、GPC分取操作により、環状物を単離した。さらに得られた環状PVNに金属ナトリウムをTHF溶液中で反応させ、ラジカルアニオン化した。高真空下、ラジカルアニオン化環状PVNとテレケリックポリスチレン(PS)を共に超希薄条件(0.2%以下)となるTHF溶液をそれぞれ調製し、両者を混合することにより環状PVNの近傍でテレケリックPSの末端カップリング反応を行い、PSの環化、すなわちカテナン化反応を行った。反応生成物をUV検出器を接続したGPC分析を行い、PVNのみを波長λ=320nmで選択検出したところ、環状PVNの2.5倍付近の分子量を有し、かつ分子量分布Mw/Mn≦1.1の成分の生成が収率約1%で確認された。すなわち、初めて分子量分布の狭い2成分カテナン型複合高分子の生成が確認された。現在、逆相液体クロマトグラフィーを用いた目的物の単離・精製を検討中である。なお、本研究成果は、第42回高分子学会年次大会にて発表する。溶媒にTHF、開始剤としてナフタレンカリウム、重合温度-78°Cの条件で2-ビニルナフタレンならびにイソプレンモノマーを添加し、リビングポリマーを合成後,1,1-ジフェニルエチレン(DPE)でエンドキャップし、さらにジフェニルエチレン型ビニル基を有する停止剤を用いで2-ビニルナフタレンならびにイソプレンからなるテレケリックマクロモノマーを合成した。いずれも分子量1.5万程度の試料を合成した。次いで、テレケリックポリ(2-ビニルナフタレン)を高真空下、希薄THF溶液(0.1%以下)とし、これにナフタレンカリウムを添加し、末端官能基2量化反応を行い、環化を行った後、GPC分取操作により、環状物を単離した。さらに高真空下、環状ポリ(2-ビニルナフタレン)に金属ナトリウムをTHF溶液中で反応させ、ラジカルアニオン化ポリマーとした。高真空下、ラジカルアニオン化環状ポリ(2-ビニルナフタレン)、およびテレケリックポリイソプレンの希薄THF溶液(0.2%以下)をそれぞれ調製し、両者を混合することにより環状ポリ(2-ビニルナフタレン)の近傍でテレケリックポリイソプレンの末端官能基2量化反応を行い、ポリイソプレンの環化、すなわち、カテナン化を行った。得られた試料はまず、まずn-ヘキサンを用いて抽出を行い、ポリイソプレンホモポリマーを除去した後、さらにGPC分取操作により、高分子量成分のみ分離し、2成分カテナン型複合高分子を単離・精製した。

最終生成物(2成分カテナン型複合高分子)はUV検出器を接続したGPC分析を行い、ポリ(2-ビニルナフタレン)のみを波長320nmで選択検出したところ、環状ポリ(2-ビニルナフタレン)の約2倍程度の分子量を有し、かつ比較的分子量分布の狭い成分の生成が確認された。さらに現在、この試料のキャスト膜の透過型電子顕微鏡観察を行うことにより、どのような凝集構造を有するのか解析中である。なお、本研究成果は第55回高分子学会年次大会にて発表する予定である。溶媒にTHF、開始剤としてナフタレンカリウム、重合温度-78°Cの条件でスチレン(S)、次いで2-イソプロペニルナフタレン(N)の順にモノマーを逐次添加し、リビングポリマーを合成後,1,1-ジフェニルエチレン(DPE)でエンドキャップし、さらにジフェニルエチレン型ビニル基を有する停止剤を用いてテレケリックNSNトリブロック共重合体を合成した。分子量約2万程度の試料を合成した。また、同様の手法でポリイソプレンのテレクリックポリマーも合成した。(分子量約2万)テレケリックNSNトリブロック共重合体を高真空下、希薄THF溶液(0.1%以下)とし、これにナフタレンカリウムを添加し、末端官能基2量化反応を行い、環化を行った後、GPC分取操作により、環状NSジブロック共重合体を単離した。さらに高真空下、この環状NSジブロック共重合体に金属ナトリウムをTHF溶液中で反応させ、ラジカルアニオン化した。このラジカルアニオン化共重合体、およびテレケリックポリイソプレンの希薄THF溶液(0.2%以下)をそれぞれ調製し、両者を混合することにより環状NSジブロック共重合体の近傍でテレケリックポリイソプレンの末端官能基2量化反応を行い、ポリイソプレンの環化、すなわち、カテナン化を行った。得られた試料はまず、まずn-ヘキサンを用いて遊離ポリイソプレンの抽出を行い、ポリイソプレンホモポリマーを除去した後、さらにGPC分取操作により、高分子量成分のみ分離じ、2成分カテナン型複合高分子を単離・精製した。最終生成物(2成分カテナン型複合高分子)はUV検出器を接続したGPC分析を行い、ナフタレン環のみを波長320nmで選択検出したところ、環状NSジブロック共重合体の約2倍程度の分子量を有し、かつ比較的分子量分布の狭い成分の生成が確認された。さらに、この試料のキャスト膜の透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、交互ラメラ構造を呈することが確認された。本研究成果は、論文準備中である(J. Am. Chem. Soc.)
高速リアルタイム画像処理のための1チップ2眼スマートイメージセンサ

本年度は、先に行ったテスト用回路の評価を踏まえて、処理方式や回路の見直しを行なった後、1チップ2眼イメージセンサLSIの設計・試作を行ない、その評価を行った。●1チップ2眼スマートセンサLSIの設計と試作1チップ上に2つのセンサアレイを配置したLSIを設計し、試作した。各眼では、高開口率や高並列・高速処理を実現できるアーキテクチャを検討した。その中央には、両眼の処理結果を用いてシングル回路で効率的に処理するアーキテクチャを検討した。適宜評価用部分回路を集積した。●1チップ2眼スマートセンサ用光学系の検討チップ上では2つのセンサアレイは約9mm程度離れて配置されている。視差情報で数メートル遠方を距離計測するため、なるべく離れた2つの入光部から9mm離れたセンサアレイに投影する光学系を実現する方法を検討した。ただし、方式の検討にとどめ、製作は行わなかった。●試作イメージセンサの評価と複数動物体追跡方式の検討試作したセンサLSIと簡単な光学系を用いて、撮像性能や処理性能の評価を行った。一部の同期信号発生回路等の周辺回路は、FPGAへの実装を試みた。十分な撮像性能を有していたが、一部の処理回路に設計誤りがあったため、センサ上での視差の検出は出来なかった。しかし、動きの有無を示すフラグ信号は正しく検出できることがわかった。また、2眼の撮像システムを用いたリアルタイムでの複数動物体追跡の方式について検討した。●研究の総括本研究の問題点をまとめ、その改善方法について検討した。本年度は、1つのLSIチップ上に2つのフォトダイオードアレイを有するイメージセンサについて、主に集積する機能や回路の基本構成について検討した。以下に示すように、各眼で取得した画像に対する処理と、その結果を用いた両眼での処理についてアルゴリズムを検討し、それを実現する基本回路の設計と、その評価を行った。1.各眼・両眼での処理アルゴリズムの検討毎秒1500フレーム程度での動作を目標とし、並列処理が可能な画像処理方式を検討した。まず、左右の各センサアレイで高速アナログ処理を行い、動物体を抽出し1ビットのフラグ信号で表現する方法を検討した。動物体抽出では、条件付画素補充差分、フレーム間差分、背景差分の3つを用いた。次に、フラグ信号を雑音除去処理した後、単数動物体の位置や大きさを認識する方法を検討した。また、2つの眼から抽出した動物体の情報を用いて、センサから物体までの距離の検出や物体の動きを追跡する方式を検討した。2.センサ上処理回路のテスト用LSIの設計と評価動物体を抽出し1ビットのフラグ信号を作成するアナログ処理回路の検討を行った。3つの方式は共通の小規模な回路で実現でき、2つの制御信号で切り替えることができる。また、ディジタル処理回路にて雑音除去回路や、動物体の位置の最大値・最小値を検出する回路の設計を行なった。テスト用回路を用いてその基本性能を評価し、充分高速に処理が可能であることを確認した。
ヒト肝臓より新たに見出したCYP2C9 splicing variantの解析

本研究は、申請者らがヒト肝臓より新規に見出したCYP2C9のsplicing variant(SV)の機能を探るとともに、これをモデルとして脂肪肝などの生体要因がスプライシングの変動を介して薬物代謝酵素活性の個体差、あるいは個体内変動に関与しているか否かを検討することを目的とした。単離したSVmRNAはexon1の後にintron1の前半部分が挿入されておりexon2の最初が欠損していたが、それに伴うフレームシフトは認められず、野生型より8アミノ酸残基短い蛋白質に翻訳されるものと推定された。そこで翻訳産物が薬物代謝酵素として機能しうるか否かを種々検討した。その結果、SVmRNAは確かにCYP2C9の抗体で認識される蛋白質として翻訳されるばかりでなく、還元型にCOが結合した際のSoret帯が、一般のヘム蛋白質より顕著に長波長側にシフトしたCYPの分光学的特長であるスペクトルを示し、SVmRNAの翻訳産物(SVP)がCYPとして機能し得る可能性が考えられた。そこで、触媒活性を検討したところCYP2C9の代表的基質であるジクロフェナクとトルブタミドに対する代謝酵素活性は完全に欠失していた。また同じサブファミリーに属するCYP2C8およびCYP2C19の典型的基質ならびに、別のサブファミリーに属するCYP2D6およびCYP3A4の典型的基質に対する触媒活性を有しているか調べたが、いずれの薬物についても既知の代謝物を含め、代謝物と考えられるものは全く検出されなかった。以上の検討から、SVPは異物代謝酵素活性を有しないか、有しても薬物代謝にかかわる主要なCYP分子種の基質となるような薬物は代謝し得ないと考えられた。すなわち、蛋白質の分子量および分光学的な性質で、SVPは野生型CYP2C9とほとんど区別がつかないにもかかわらず、酵素活性は欠失しているといえる。HAB研究機構より入手したヒト正常肝、脂肪肝の計8検体を用いてリアルタイムPCRを行い、正常肝と脂肪肝で、野生型CYP2C9mRNAと、SVmRNAの量比に差が認められるか否かについて検討した。その結果、SVmRNAは全検体に検出され、興味深いことに正常肝では、常に野生型mRNAの方が多かったのに対し、脂肪肝3例中2例では野生型よりもSVmRNAの方が多く検出された。本年度は、交付申請書の計画に従い、申請者らがクローニングしたCYP2C9 splicing variantの発現系構築を中心に行った。当初計画では、発現に成功した際に、splicing variantの翻訳産物における分光学的性質、および薬物代謝酵素活性を、野生型CYP2C9とのみ比較する予定であった。しかし、仮に薬物代謝酵素活性が低いながらも保持されている場合、どの程度低下しているかを定量的に評価する必要があると考えられた。そこで、当初計画に一部追加する形で、日本人において最も多い多型として知られており、臨床的にも知見が多いCYP2C9*3に対応する多型蛋白質の発現系も同時に構築することとした。そのため、野生型CYP2C9 cDNAのクローニングに加えて、CYP2C9*3に対応するcDNAの部位特異的変異導入法による作出と発現系構築を行うこととした。

それに伴い、発現以降に行なう予定であった種々のassay(免疫化学的な蛋白質検出、分光学的測定、薬物代謝酵素活性の測定など)は、当初計画より若干遅延している。現在、野生型CYP2C9、臨床的に重要な既知の多型CYP2C9*3、および本研究で中心的に検討するCYP2C9splicing variantの各cDNAが準備でき、昆虫細胞発現系に、ヒトNADPH-CYP還元酵素と同時発現させるためのベクター構築までを完成させた。したがって早くて今月末、遅くとも4月には、蛋白質検出が可能である。また、本研究では、可能であれば病的状態にある肝臓(ウイルス性肝炎を除く、薬剤性やアルコール性肝炎、肝硬変、肝臓がん)を摘出あるいは、バイオプシーによる検査を行う患者の中で、文書で同意を得られる患者においてのみ、摘出した肝臓、あるいはその一部を提供いただきたいと考えている。当初、生命倫理委員会への研究申請は初年度に行なう予定であったが、蛋白質の機能に関する情報が得られない時点では、ヒト試料で調べる意義に関して、申請書に記載することが困難なため、申請時期を次年度に遅らさざるを得ない状況について別途報告した。最終年度は、申請者らが昨年度までに発現に成功したsplicing variantの翻訳産物(SVP)を、野生型CYP2C9、日本人で代表的な多型CYP2C9.3と比較することで種々の機能解析を行った。発現系ミクロゾームを調製し、ウェスタンプロット解析を行ったところ、SVPは野生型およびCYP2C9.3にくらべみかけの分子量がわずかに小さい蛋白質として泳動され、8アミノ酸残基分短いとの推定と一致した。次に分光学的検討を行ったところ、SVPにもCYPに特徴的なCO差スペクトルが検出され、第五配位子にチオレートアニオンを有するヘム蛋白質として発現していると考えられた。そこで、触媒活性を有しているか検討する目的でCYP2C9の代表的基質薬物であるジクロフェナクとトルブタミドを用いて活性測定を行なった結果、野生型および多型酵素の活性の違いは従来報告されてきたものと一致したが、SVPは全く触媒活性を示さなかった。イントロンの一部挿入、エクソンの一部欠失により基質特異性が変化している可能性を検討するために、同じサブファミリーのCYP2C8およびCYP2C19の典型的基質ならびに、別のサブファミリーに属するCYP2D6およびCYP3A4の典型的基質に対する触媒活性を有しているか調べたが、いずれの薬物についても既知の代謝物を含め、代謝物と考えられるものは全く検出されず、以上の検討から、SVPは異物代謝酵素活性を有しないか、有しても薬物代謝にかかわる主要なCYP分子種の基質となるような薬物は代謝し得ないと考えられた。HAB研究機構より入手したヒト正常肝、脂肪肝8検体を用いてリアルタイムPCRを用いて、正常肝と脂肪肝で、野生型CYP2C9mRNAと、SVmRNAの量比に差が認められるか否かについて検討した。その結果、SVmRNAは全検体に検出され、興味深いことに正常肝では、常に野生型mRNAの方が多かったのに対し、脂肪肝3例中2例では、野生型よりもSVmRNAの方が多く検出された。
超高速スピン変換型ＴＡＤＦ分子の開発

基底状態にある有機分子が一電子励起された場合、励起一重項状態及び励起三重項状態と呼ばれる電子スピン状態の異なる二つの励起状態を取りうる。内部緩和を経て最低一重項励起状態に緩和した電子は、基底状態へ放射または非放射失活する過程や、エネルギー的に低い最低三重項励起状態へと遷移する過程が考えられる。一重項励起状態と三重項励起状態間の電子遷移過程(項間交差過程)はスピン変換が必要な遷移であり、一重項励起状態から三重項励起状態への項間交差過程は広く観測され、三重項励起子を利用する有機デバイスで重要な役割を担っている。しかし、スピン変換過程の始状態及び終状態は自明であるものの、依然として項間交差過程の励起状態ダイナミクスは謎に包まれている。本研究では、項間交差過程だけでなく、三重項励起状態から一重項励起状態への逆項間交差過程を示す熱活性型遅延蛍光(TADF)分子のスピン変換過程の詳細な光学特性評価、量子化学計算による理論的な手法を用いることによって、スピン変換を仲介する高次三重項励起状態が中間遷移状態として存在することを明らかにした。また、高次三重項励起状態の電子状態は、部分構造分子の三重項励起状態の電子構造に由来することを実験的・理論的な両側面から明らかにした。この研究成果は、電荷移動状態を示すTADF分子の設計指針として、部分構造由来の高次励起状態を考慮した設計が必要であることを明確に提示するものである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。熱活性型遅延蛍光(TADF)分子は、励起三重項から励起一重項状態への逆項間交差過程を示し、内部EL量子効率100%に達する高効率な有機発光デバイスを実現することができる。しかし、依然として高電流密度域での励起子消滅過程の抑制および素子耐久性の向上は解決すべき問題として残されている。これは、励起三重項状態の寿命が長いためである。本研究では、逆項間交差過程の高速化を志向した分子設計指針の開発および有機EL素子特性の向上を試みた。逆項間交差過程では、始状態と終状態における波動関数の変化が大きい場合、両状態間の遷移確率は、全角運動量の保存則に従いスピン軌道相互作用が強められる結果、加速される。従来の分子設計指針は、電荷移動状態を形成し最低一重項状態励起状態と最低三重項状態励起状態のエネルギー差を小さくする設計指針に留まっており、結果として励起一重項状態と励起三重項状態は類似した分子軌道分布、すなわち分子軌道分布の変化が小さい分子となる結果、逆項間交差の向上は期待できない。そこで、電荷移動状態と異なる軌道分布を有する局在励起状態の導入を試み、ドナー・アクセプター母骨格に対し、エネルギー準位の異なる置換基を導入した“ヘテロドナー"型TADF分子を設計した。この設計によって電荷移動状態および局在励起状態を容易に制御することが可能となり、3倍以上大きな逆項間交差速度を実現した。また、ヘテロドナー型TADF分子を発光材料とした有機EL素子において、高電流密度領域における輝度の低下の抑制、30倍以上の素子耐久性の向上を実現した。これらの結果は、ヘテロドナー型の分子設計によってTADF分子の逆項間交差過程を制御に成功し、Science Advancesに受理された。TADF分子の実アプリケーションへの展開を志向した場合、高電流密度領域における励起子消滅過程の存在は、大きな技術障壁となり、“超高速スピン変換型TADF分子の開発"というテーマを掲げ研究してきた。研究方針として、スピン変換過程の物理過程の解明、分子設計への落とし込み、有機EL素子評価、フィードバックの順に行った。スピン変換過程の物理過程を解明するために、これまで数多く報告されてきたTADF分子の光学特性を再評価することで、高効率な逆項間交差過程を示すTADF分子が有する因子(局在励起状態の関与)を発見した。続いて、局在励起状態をTADF分子に組み込む分子設計指針を量子化学計算、合成・評価することで模索しし、“ヘテロドナー"型TADF分子設計を打ち建てる事に成功した。ヘテロドナー型TADF分子設計は、これまでに報告されておらず、局在励起状態を制御した初の分子設計指針となった。また、新規材料を発光材料とした有機EL素子では、高電流密度領域における発光効率の低下を著しく抑制し、これまでに報告されたTADF分子を用いた有機EL素子の中でもトップクラスの素子耐久性を実現し、高効率・高耐久性を両立することに成功した。これらの結果は、有機EL討論会第25回例会にて報告し、公演奨励賞を受賞するとともに、Science Advancesに受理され、順調に進んでいる。

しかし、スピン変換過程の始状態及び終状態は自明であるものの、依然として項間交差過程の励起状態ダイナミクスは謎に包まれている。本研究では、項間交差過程だけでなく、三重項励起状態から一重項励起状態への逆項間交差過程を示す熱活性型遅延蛍光(TADF)分子のスピン変換過程の詳細な光学特性評価、量子化学計算による理論的な手法を用いることによって、スピン変換を仲介する高次三重項励起状態が中間遷移状態として存在することを明らかにした。また、高次三重項励起状態の電子状態は、部分構造分子の三重項励起状態の電子構造に由来することを実験的・理論的な両側面から明らかにした。この研究成果は、電荷移動状態を示すTADF分子の設計指針として、部分構造由来の高次励起状態を考慮した設計が必要であることを明確に提示するものである。これまでの研究を進めていく中で、従来の分子設計指針(電荷移動状態を形成し最低一重項状態励起状態と最低三重項状態励起状態のエネルギー差を小さくする)および“ヘテロドナー"型TADF分子設計を用いて説明できないTADF分子群を発見した。このTADF分子群に隠された物理過程を解明し、これまでの分子設計指針と組み合わせることによって、本研究の目標である“超高速スピン変換型TADF分子"の開発に近づくと考えられる。未だ明らかにされていない物理過程を解明することで、TADF分子におけるスピン変換過程を統一的に理解することを今後目標とする。TADF分子におけるスピン変換過程を統一的に理解することは、三重項励起子を用いるアプリケーション(有機EL素子、三重項-三重項消滅過程を用いたフォトンアップコンバージョン、バイオイメージング、有機蓄光)の発展に大きく寄与することも可能となる。研究方策はこれまでの流れをくみ、先ず謎に包まれたTADF分子群の励起状態ダイナミクスの解明に重点的に取り組む。過渡吸収および発光測定を組み合わせることによって、二つの視点から励起子の道筋(どのような経路で発光・失活するか)を詳細に検討する。研究を進めていく中で生じた仮説を検証するために、新規分子を設計し評価、量子化学計算による裏付けを行う。仮説の実証後、新しい物理過程を取り込んだ新規分子設計指針を構築し、有機EL素子としてデバイスの評価も行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒルシュスプルング病におけるアセチルコリン受容体の局在

ヒルシュスプルング病の無神経節腸管がなぜ収縮状能を保つかは、未だ十分解明されていない。我々はヒルシュスプルング病腸管のacetylcholinesterase活性の局在を電顕的に検討し、外来性のコリン作動性神経線維が平滑筋の近傍で神経終末を形成している所見を得た。そこで、実際、平滑筋側にアセチルコリン受容体が存在するか否かを検討する目的で、本研究を行った。昭和62年度は、正常ラットを用いて〔^3H〕quinuclidinyl benzilate(以下〔^3H〕QNB)によるオ-トラジオグラフィ-の基礎的研究を行った。その結果、アセチルコリン受容体の局在を示す銀粒子は、粘膜、粘膜下層、筋層に集蔟的、あるいは線状配列として観察された。これらの銀粒子は硫酸アトロピンの前投与によって抑制されることから、ムスカリン様アセチルコリン受容体に特異性があると思われる。昭和63年度は、正常ラットの実験を重ね、液体シンチレ-ションも併せ行って、消化管部位別のアセチルコリン受容体の分布を検討した。その結果、アセチルコリン受容体は、消化管の口側に豊富で、肛門側へ向かうほど減少する傾向がみられ、消化管運動のgradient theoryが裏づけられた。平成元年度は、ヒルシュスプルング病ラットを実験モデルとして、無神経節腸管のアセチルコリン受容体の分布を検討した。その結果、無神経節腸管にも正常腸管と同様にアセチルコリン受容体の分布が認められ、量的にも正常腸管に比較して有意差を認めなかった。以上の結果より、無神経節腸管に増加した外来性のコリン作動性神経線維は、直接に平滑筋に接合し、神経支配をしていると考えられる。消化管におけるムスカリン様アセチルコリン受容体を生化学的に定量した報告はみられるが,その形態学的分布は不明のままである.そこで我々は〔^3H〕quinuclidingl benzilate(〔^3H〕QNB)を用いたオートラジオグラフィーによりムスカリン性アセチルコリン受容体の局在を検出するための基礎的研究を行った.方法はWistar系雄性ラットの尾静脈より〔^3H〕QNB250μCiを30分かけて注入し,腸管を摘出した.摘出標本はドライアイスアセトンで凍結し, 5μmの凍結切片を作製した.さらにディップ法により乳剤をかぶせ, 45週間露出後に現像し,光顕的に観察した.その結果,ムスカリン様アセチルコリン受容体の局在を示す銀粒子は粘膜,粘膜下層,筋層の各層にび慢性にみられたが,ところどころに銀粒子の線状配列がみられた.この配列は神経線維の走行に一致するものと思われた.またアウエルバッハ神経叢の周囲にも銀粒子の偏在を認めた.本年度はムスカリン性アセチルコリン受容体の局在を検出するオートラジオグラフィー法を確立した.来年度は消化管部位による受容体の分布の差違や神経終末との関係など,さらに詳細に検討する一方,新生児ラットや胎児ラットを実験材料に用いて受容体の発生についても検討する.また手術的に摘出した腸管についてアセチルコリン受容体の局在を検出する方法を確立し,研究目標であるヒルシュスプリング病腸管におけるアセチルコリン受容体の局在についても検討する予定である.今年度は、主としてラット消化管におけるムスカリン様アセチルコリン受容体の部位による分布の差について検討した。方法は、昭和62年度の研究で確立した方法である。つまりWistar系雄性ラットの尾静脈より〔^3H〕quinuclidinyl benzilate(以下〔^3H〕QNB)250μCiを30分かけて注入し、腸管を摘出した。摘出腸管をドライアイスアセトンで凍結し、5μmの凍結切片を作製し、ディップ法により乳剤をかけた。

4週間、暗所で露出の後、現像し、光顕的に観察した。また摘出腸管0.1gをソルエン350に溶解し、液体シンチレーションカウンターにて、消化管部位別の放射活性を測定した。対照群には硫酸アトロピン1mg/kgを腹腔内に前投与した。その結果、消化管部位別の放射活性の平均値(n=10)は、組織10mg当り胃9000cpm、十二指腸13000cpm、小腸上部22,000cpm、小腸下部9700cpm、大腸上部9800cpm、大腸下部7600cpmと、腸管の口側に豊富で、肛門側へ向かうほど減少傾向がみられた。ムスカリン様アセチルコリン受容体の局在を示す銀粒子は、粘膜層、粘膜下層、筋層にみられたが、特に粘膜層に多数分布していた。筋層では、アウエルバッハ神経叢や平滑筋線維の表面に銀粒子の集蔟や線状配列がみられた。これらの銀粒子は硫酸アトロピンの前投与により抑制されることより、ムスカリン様アセチルコリン受容体に特異性があると思われた。来年度は、手術的に摘出した腸管について、アセチルコリン受容体の検出を可能にし、本研究の目標であるヒルシュスプルング病腸管におけるアセチルコリン受容体の局在について検討したい。また今年度は、胎児ラット腸管についてもアセチルコリン受容体の検出を試みたが、不成功に終った。今後〔^3H〕QNBの投与方法に工夫が必要と思われた。研究の最終年度にあたる今年度は、ヒルシュスプルング病ラットを実験モデルとして、無神経節腸管のアセチルコリン受容体の局在を検討した。方法は、ヒルシュスプルング病ラット(動物繁殖研究所、体重20g)を用い、尾静脈より〔^3H〕quinuclidinyl benzilate(以下〔^3H〕QNB)25μCiを30分かけて注入した後、開腹により胃、拡張した小腸、狭小な結腸を摘出した。摘出標本はドライアイスアセトン(-80°C)で急速凍結し、5μmの凍結切片を作製した。さらにディップ法により乳剤をかけ、4週間露出後、現像し、光顕的に観察した。また摘出標本はソルエン350に溶解し、液体シンチレ-ションにて放射活性を測定した。その結果、消化管部位別の放射活性は、組織10mg当り、胃10,000cpm、小腸上部15,000cpm、小腸下部8,000cpm、結腸6,000cpmであった。またオ-トラジオグラフィ-では、胃、小腸上部および下部のムスカリン様アセチルコリン受容体の局在を示す銀粒子は、正常ラットと同様に粘膜層、平滑筋表面、アウエルバッハ神経叢周囲に認められた。また神経叢を欠如した結腸では、粘膜層と平滑筋表面に銀粒子の配列を認め、正常腸管との差異はみられなかった。本研究の最終目標は、ヒルシュスプルング病患者の手術時摘出腸管について検討することである。しかし、摘出標本についてはアセチルコリン受容体の検出法を未だ確立しておらず、今後の課題となった。
ヨーロッパ学校の言語文化教育における「複言語・複文化主義」に関する理論的研究

欧州評議会の言語教育政策に関する活動を、「複言語・複文化主義」概念、およびその概念を具現化する「欧州言語ポートフォリオ」に焦点をあて考察する。日本への効果的適用に向け、その可能性と課題を明らかにする。研究遂行にあたり、「複言語・複文化主義」概念の思想史的意義を考察した上で、「欧州言語ポートフォリオ」の活用実態を調査する。調査場所は、主としてEU諸機関に勤務する職員の子どもたちが学ぶ「ヨーロッパ学校(Schola Europaea)」である。中でも特に、歴史や地理といった社会科学系科目の授業を第2言語で行うことで、複眼的思考力育成を目指そうとする教育に焦点をあて、「複言語・複文化主義」の本質的理解を目指す。
ショウジョウバエの位置情報遺伝子ネットワーク

本年度はDppモルフォゲンの受容体の発現を制御する新規遺伝子の機能解析を通して、コンパートメント形成とモルフォゲン勾配形成の共役機構を明らかにした。Dppモルフォゲン・シグナルは受容体Thickveins(Tkv)を介して核に伝えられる。Tkvの発現レベルは後部コンパートメントで高く、前部コンパートメントで低い。またDppを発現している細胞では最も低い発現レベルを示す。細胞が受容するDppシグナルは、Dppを発現している細胞において非常に低く、後部コンパートメントにおける勾配は前部における勾配よりも急である。これはTKvの発現量で説明される。エンハンサートラップ系統のスクリーニングにより、Tkvと相補的な発現パターンを示す新たな系統を同定し、master of thickveins(mtv)と名付けた。Mtvは1つのZincfinger構造を持つほかはきわだったモチーフを持たない。抗体染色により主に核に局在することが示され、核内因子として働くと予想される。クローン解析の結果、mtvはTkvの発現を負に調節していることが解った。ヘッジホッグはDpp発現領域においてtkvの発現レベルを抑制している。また、後部コンパートメントで発現するenがtkvのレベルを調節している。2重変異クローンの解析から、これらの作用がmtvにより担われていることを明らかにした。Enはヘッジホッグを介してDPPモルフォゲンの発現を誘導するばかりではなく、その受容体であるtkvの発現をも調節し、Dppシグナルの強度分布パターンを制御する。mtvはこの共役を維持するためにenおよびヘッジホッグからのシグナルを統合する因子として働く。
発達障害児に対する会話発達アセスメント方法と支援プログラムの開発に関する研究

第I部では会話・ナラティブ発達研究の意義と課題について検討した。第II部・会話の発達では、健常幼児の2、3歳児は、母親の明確化要求に応答することで会話を継続し、かつ子どもが自発的に明確化要求を使用することで会話に参加する様相が認められ、広汎性発達障害児では、自ら明確化要求を使用することで会話を継続していくことはみられなかった。ナラティブの発達では、直前の「ケーキ作り」経験についての母子会話場面を分析した結果、3歳では複数の出来事に言及したり,それらを関連付けることが少なく、4歳になると複数の節を「時間」関係で関連付け、5、6歳になると「因果」「比較」「逆」等の多様な関係において節を関連付けるという発達過程が示された。フィクショナル・ストーリーの語りにおける視覚的手がかりの有効性を検討した結果、6歳児において周辺要素手がかりが物語理解と物語産出を促進し、物語理解においては5・6歳の年齢段階で中心要素がすでに獲得されていた。第III部では、自閉症児を対象に工作とおやつ場面の共同行為ルーティンを用いて、話者の不明確な発話に対する明確化要求の使用を目的とした指導を行った結果、指導者の曖昧な指示に対して、事物を差し出して「これですか?」と自発的に聞き返すことが可能になっていった。広汎性発達障害児を対象とし、物語文法の各要素を示す連続絵を提示し、「吹き出し」への書き込みを指導手続きに導入した結果、絵に描かれていない情報を含むCUが産出され、「欲求」「感覚」などが「吹き出し」に書き込まれるようになった。第IV部においては、以上の研究を基盤にした第I段階(通常23歳代)から第III段階(通常56歳代)までの「会話を通したナラティブ発達支援・基礎プログラム試案(NAP)」を提案した。[研究I]談話発達のアセスメントのための基礎研究小学校1年生から5年生までの健常学齢児各10名と、同程度の知的水準にある3年生から5年生の3名の高機能自閉症児を対象に、自分の経験を実験者に語る「パーソナル・ナラティブ」と連続した絵を見て語る「フィクショナル・ストーリー」について、マクロ構造、ミクロ構造、およびナラティブ内容の分析を行った。その結果、健常児のマクロ構造では、パーソナル・ナラティブ構造において加齢に伴い低次から高次へ加齢に伴う変化が認められた。ミクロ構造では、文の結束率はパーソナル・ナラティブに比ベフィクショナル・ストーリーで高く、フィクショナル・ストーリーにおいて加齢に伴い文の結束率が増加する傾向があった。高機能自閉症児のマクロ構造では、パーソナル・ナラティブの構造については、低次から高次へと加齢に伴う変化が認められたが、健常児と比べ、その構造は低次にとどまっていた。フィクショナル・ストーリーの構造は、3児ともに、健常児群と比べて年齢相応であると判断された。ミクロ構造では、結束性分析において、高機能自閉症児の文の結束率は健常児群と比較べ、1標準偏差低かった。[研究II]談話発達の実験的支援研究コミュニケーションの始発が少なく、言語を用いての自発的な要求伝達が少ない広汎性発達障害男児(CA6歳4ヶ月、指導開始時)に対し、「相撲ゲーム」ルーティン課題を用いて、対戦相手への自発的な言語による誘いかけ行動を指導した。その結果、援助無しで、自発的に「○先生、おすもうしよう」といった誘いかけが可能になり、併せて、勝った際に、ポーズをとるなどの情動表出もみられるようになった。また、日常生活でも自発的働きかけが頻繁に見られるようになった。[研究I]