hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫学・分子生物学・医用工学の統合による癌性腹膜炎治療

本研究は、予後不良の消化器癌による癌性腹膜炎に対して、免疫学、医用工学および分子生物学の統合により新たな発想に基づく治療法を開発することを第一の目的とした。本研究期間中に得られた研究実績は次のようにまとめられる。(1)治療法開発および癌性腹膜炎の病態解析を目的として、手術時摘出標本より採取したヒト細胞を用いて、人工腹膜、人工結合織、および人工免疫臓器を作成した。(2)上記人工結合組織を用いて、ヒトスキルス胃癌類似の人工癌組織を作成し、治療実験と機序解析を行い、スキルス胃癌に対するIFN-γ療法開発の手がかりを得た。(3)上記人工腹膜を用いて新たな癌細胞の腹膜播種モデルを開発し、これを用いて癌性腹膜炎腹膜炎に対する新たな免疫療法として「免疫監視機構構築療法」を開発した。(4)(3)によって開発された「癌性胸・腹膜炎に対する末梢血幹細胞移植及び樹状細胞(DC)ワクチン療法を基本とする免疫監視機構構築療法」(2001年5月九州大学医学部倫理委員会承認)のPhase I study(19症例)を開始し、ほぼ終了した。以上、開発した人工組織を用いて当初計画した全ての治療実験が完了したわけではないが、最終目的とした癌性腹膜炎に対する新たな治療法を開発し、臨床の場に登場させることができた点からみると、ほぼ計画通りの成果を得ることができた。さらに作成した人工組織を応用した次世代癌性腹膜炎治療法開発の研究に着手した。本研究は、平成12年度および13年度の二年間において、腫瘍免疫と分子生物学および医用工学の最先端の知識と技術を統合して新たな癌性腹膜炎治療法を開発することを目標とする。本年度(平成12年度)の計画案に沿って研究結果を概説する。(1)人工腹膜の改良:一層の腹膜中皮細胞を有する線維芽細胞を含むタイプIコラーゲン層(人工腹膜)をラットおよびヒトの系で作成する方法を確立した。さらに、この人工腹膜に臍帯静脈由来の血管内皮細胞を組み込み、血管網が形成されることを確認した。現在、形成される血管網の性格を解析中である。(2)人工腹膜固定材料の開発:(1)で作った人工腹膜は、特別の処置なしに、ラットに人工的に作成した腹膜欠損部の被服材料として使用可能であることが、ラットに人工腹膜を逢着する実験により判明した。この人工腹膜移植系を用いて、移植人工腹膜の病理学的検討を開始している。(3)人工サイトカイン産生装置の改良:細胞の移動はできないが、高分子物質の移動の可能な多孔性のポリウレタンに、人工結合織(タイプIコラーゲンと線維芽細胞からなる)にリンパ球を添加注入し、第一世代の人口リンパ節を作成した。(4)腹膜中皮細胞およびリンパ球へのIFN-γ遺伝子導入:リポフェクション法での導入は安定したが、長期間のIFN-γ産生系を工夫中。(5)癌性腹膜炎モデルの作成:(1)において血管内皮細胞の共存する人工腹膜を作成したが、この系を用いて癌細胞、腹膜中皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞を顕微鏡下に個々の細胞レベルで解析可能な系を開発中である。本研究は、平成12年度および13年度の二年間において、腫瘍免疫と分子生物学および医用工学の最先端の知識と技術を統合して新たな癌性腹膜炎腹膜炎治療法を開発することを目標とする。本年度(平成13年度)の計画案に沿って研究の結果を概説する。(1)癌性腹膜炎治療実験:前年度に作成した人工腹膜を用いて、癌細胞腹膜播種の病態解析を行った。人工腹膜は癌細胞との共存により腹膜中皮細胞の傷害・脱落が生じ、この中皮細胞欠損部に癌細胞が選択的に生着するという動物実験類似の結果を得、本モデルが動物実験類似モデルとして利用可能であることが示唆された。

現在、径時的に観察可能な人工腹膜播種病態解析モデルを開発中である。(2)さらに、上記の人工腹膜播種病態解析モデルに、種々の処理を施したヒトリンパ球を共存させる系での治療実験を通じ、新たな免疫学的癌性腹膜炎治療法を考案し、研究開発型医療として「癌性胸・腹膜炎に対する末梢血幹細胞移植及び樹状細胞(DC)ワクチン療法を基本とする免疫監視機構構築療法」(九州大学医学部倫理委員会にて審査・承認)を実地中である。(3)現在、「癌性胸・腹膜炎に対する末梢血幹細胞移植及び樹状細胞(DC)ワクチン療法を基本とする免疫監視機構構築療法」のPhase I studyがほぼ終了し、本研究において作成した人工腹膜播種病態解析モデルを利用して、より治療効果の高い工夫を加え、Phase I/II studyの準備を整えている。以上、本研究を通じ、新たな癌性腹膜炎治療法が実際に開発実施されたことに加え、本研究中に作成された人工腹膜および人工免疫装置を実際に応用した次世代の癌性腹膜炎治療法開発の可能性に近づいた。
フッ素で機能化された光学活性有機金属反応剤の開発

本研究では、ベンゼン環部の水素をすべてフッ素で置換した光学活性化合物1および2を合成することに成功し、それらをあたらしい不斉認識剤、不斉反応剤などに用いることができるかどうかについて検討した。化合物1はペンタフルオロベンズアルデヒドから、3工程でまずラセミ体2a(X=O)を合成し、次に、カンファースルホン酸で光学分割した。絶対配置をX-線構造解析で決定した。また、この反応経路を応用すれば、1、2-ジオール体も収率よく合成できる事が分かった。それを、さらに、1、2-ジアミン体2bに変換することも検討している。化合物1は電子欠損ベンゼン環を持つため、電子豊富な官能基と、ルイス酸-ルイス塩基の関係で相互作用し、それを鍵とした不斉認識が可能と考えられる。実際、化合物1をα-ハロカルボン酸存在下にFNMRを測定すると、ペンタフルオロフェニルのフッ素部分に著しい変化が見られた。化合物2a(M=BH)は,1(X=O)にBH_3-THFを作用させると、結晶として生成した。これは、新しいキラルルイス酸として興味が持たれる。ケトンを対象にその還元能力について検討した所、不斉還元ができることが分かった。以上のように本研究では、新しいキラルフッ素化化合物の合成に成功しており、その物理的、化学的特性を今後ひき続き明らかにしていきたい。
高機能化マイクロチップを用いるバイオ医薬品の超高速分析システムの開発

高機能化マイクロチップを用いるバイオ医薬品の超高速分析システムの開発ではバイオ医薬品の研究や品質管理に使用するため濃縮、特異的抽出および粗分画、蛍光検出などの一連の過程をチップ上で30分以内に完了することが可能な高速分析法の開発を目指している。平成30年度は細胞培養や輸送に適したフォトリソグラフィーフリー多分岐流路を有するマイクロチップの作製およびタンパク質の特異的オンライン濃縮への応用と、このタンパク質オンライン濃縮型マイクロチップと,捻じれ型流路を用いた糖鎖の蛍光標識化に関する研究を行った。作製したフォトリソグラフィーフリーのマイクロチップを用いて、8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate(APTS)標識化イソマルトオリゴ糖の電気泳動分離を試みた。その結果15本以上のピークを検出することができ、作製したマイクロチップでも十分に分離・検出が行えることが分かった。続いて6-8 kDの半透膜を用いた3次元マイクロチップを用い、分子量が80 kDのヒト血清トランスフェリンのオンライン濃縮を試みたところ、時間経過とともに流路交差部の蛍光強度の増大が確認できた。また、導入時間240秒における濃縮効率を算出した結果、透析膜を配置しなかった場合と比べ、感度が約70倍向上した。本法により作製したサイズ排除型3次元マイクロチップにおいて、濃縮を達成しつつ過剰試薬の除去が達成されたことが分かった。また、このチップを作製する上で使用した流路をねじった状態でPDMS内に設置することで糖鎖のAPTS標識化反応に適したマイクロチップを作製した。フォトリソグラフィーフリー多分岐流路の作製は様々な最適化を行い、2つの独立した流路の間に透析膜を設置したマイクロチップを再現良く作製することが可能となった。また、封入している透析膜の分子量排除の大きさに応じたタンパク質の特異的濃縮が可能となっている。現在は透析膜の代わりに市販のナノフィルターを配置し、この上で細胞が留まるか検討を行っている。捻じれ型マイクロ流路の作製に関しては圧力による送液のみでAPTS標識化糖鎖を得ることが可能となった。現在標識化反応の反応条件の最適化と上記タンパク質捕捉型マイクロチップとの統合に向けて研究を進めている。平成31年度は昨年度の研究結果をまとめつつ以下に示す実験を行う予定である。多分岐流路を有するマイクロチップを用い,異なる機能をもつ複数のゲル層を流路上に配し,濃縮,反応,粗分画,特異的抽出の一連の過程を実現する。:申請者らは,マイクロチップに光重合性アクリルアミドゲル層をピンポイントで合成する化学的な技術を導入し,その可能性を検討してきた.また、抗体医薬品中の糖鎖含量を詳細に調査するなどの実績もある.そこで培養細胞や抗体医薬品の糖鎖の抽出・濃縮・分離・検出といった一連の分析操作を1枚のチップの上で30分以内に完結することが可能な糖鎖分析用マイクロチップ電気泳動法の開発を行う.これまでの研究において、ゲルを用いた抽出、オンライン濃縮を達成し、本実験計画中で達成した酵素消化サイズ分画などの個別の前処理を流路内で達成してきたため、これら前処理技術を一度に達成するために三次元構造のマイクロチップを作製し、電圧印加のみで糖鎖解析を実施する方法を検討する。平成29年度は短時間酵素消化法のオンラインマイクロチップ酵素消化法の開発とオンライン試料濃縮・標識マイクロチップ電気泳動法の開発に関する研究を遂行した。短時間酵素消化法のオンラインマイクロチップ酵素消化法ではマイクロチップの流路に酵素を含有したアクリルアミド系ポリマーをピンポイントで作製し、バイオ医薬品の品質管理において重要な糖鎖の解析に応用した。糖タンパク質から糖鎖を切断するPNGase Fを封入したゲルを用いたところ酵素量を1/40にしても従来法で少なくとも1日必要であった工程を電圧の切り替えのみで10分以内に短縮出来る可能性が示唆された。現在酵素消化の最適化条件について検討を行っている。オンライン試料濃縮・標識マイクロチップ電気泳動法の開発では弱イオン性の光重合アクリルアミドゲルをマイクロチップ流路交差部にピンポイントで作製し,このゲル近傍で,試料の濃縮と蛍光標識化を同時に行うことが可能な分析法の開発を行った。まず、本法における蛍光試薬の検討を行った。試料にアミノ酸を用いfluoresceinisothiocyanate,5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinなどのアミノ基の標識試薬を用い反応時間に関する検討を行ったところ5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceinを用いることでアミノ酸を5分以内に標識できることが分かった。また、この時、マイナスに電荷を帯びているアミノ酸ではオンライン濃縮が起こり感度が向上した。

糖タンパク質から糖鎖を切断するPNGase Fを封入したゲルを用いたところ酵素量を1/40にしても従来法で少なくとも1日必要であった工程を電圧の切り替えのみで10分以内に短縮出来る可能性が示唆された。この方法では糖タンパク質のままの状態では反応効率が落ちる結果が示されており、タンパク質を変性させるか、ペプチドにまで切断する必要がありこの前処理もチップ上で行うために多分岐流路で実験を行っている。オンライン試料濃縮・標識マイクロチップ電気泳動法の開発では弱イオン性の光重合アクリルアミドゲルをマイクロチップ流路交差部にピンポイントで作製し,このゲル近傍で,試料の濃縮と蛍光標識化を同時に行うことが可能な分析法の開発を行った。まず、本法における蛍光試薬の検討を行った。試料にアミノ酸を用いfluoresceinisothiocyanate,5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinなどのアミノ基の標識試薬を用い反応時間に関する検討を行ったところ5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceinを用いることでアミノ酸を5分以内に標識できることが分かった。また、この時、マイナスに電荷を帯びているアミノ酸ではオンライン濃縮が起こった。この方法の汎用性を高めるため、試料の電荷に関わらず一定のオンライン濃縮を実現できる条件に付いて検討を行っている。高機能化マイクロチップを用いるバイオ医薬品の超高速分析システムの開発ではバイオ医薬品の研究や品質管理に使用するため濃縮、特異的抽出および粗分画、蛍光検出などの一連の過程をチップ上で30分以内に完了することが可能な高速分析法の開発を目指している。平成30年度は細胞培養や輸送に適したフォトリソグラフィーフリー多分岐流路を有するマイクロチップの作製およびタンパク質の特異的オンライン濃縮への応用と、このタンパク質オンライン濃縮型マイクロチップと,捻じれ型流路を用いた糖鎖の蛍光標識化に関する研究を行った。作製したフォトリソグラフィーフリーのマイクロチップを用いて、8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate(APTS)標識化イソマルトオリゴ糖の電気泳動分離を試みた。その結果15本以上のピークを検出することができ、作製したマイクロチップでも十分に分離・検出が行えることが分かった。続いて6-8 kDの半透膜を用いた3次元マイクロチップを用い、分子量が80 kDのヒト血清トランスフェリンのオンライン濃縮を試みたところ、時間経過とともに流路交差部の蛍光強度の増大が確認できた。また、導入時間240秒における濃縮効率を算出した結果、透析膜を配置しなかった場合と比べ、感度が約70倍向上した。本法により作製したサイズ排除型3次元マイクロチップにおいて、濃縮を達成しつつ過剰試薬の除去が達成されたことが分かった。
人工内耳装用児の聴覚情報処理能力の発達に及ぼすコミュニケーション様式の長期的影響

1,親の意識は、音反応出現後に安堵感を示し、その後、就学前までは聴覚とことばを意識していた。就学後は、聾学校の場合には手話を、通常小学校の場合には子どもの得意とするコミュニケーションを心がけているが、聴覚への意識が十分には持続できないことが多かった。教師側は、聾学校では聴覚活用の意識が十分でなく、通常小学校では聴覚的な配慮が十分ではなかった。2,対象児の変容:(1)コミュニケーション様式の変容:通常学校に通う児の場合、聴覚口話が多いが、十分には通じないと思われる児では、手話を併用している。この場合、親も子も手話が十分でなく、簡単な日常生活程度の簡単な手話しか使用されず、コミュニケーションが不十分となるだけでなく、意味概念上の深まりが極めて浅いことがわかった。(2)聴覚情報処理上の変容:コミュニケーションモードの種類に係わらず、術後の年数と共に向上していった。音声情報処理能力は、電極の挿入具合ばかりでなく、術前の聴覚的な活用能力が大きく影響していると思われる。(3)言語能力の変容:小学校の低学年では、読字力、語彙力、文法力、読解・鑑賞力の各領域において学年相応の力を持っているが、聴覚的情報受容力が十分でない群では、読字力以外の領域の力は、学年があがるにつれて伸びが鈍くなった。(4)話しことばの変容:構音は、年数と共に改善が認められたが、聴取能力に依存するところが大きく、個人差が大きかった。また、聴取能力の向上だけでは、一部の音は歪んだり、鼻音化することも多く、発音指導が必要であった。手指コミュニケーションモードの児ほどその傾向は強かった。(5)聾学校では、体系的なリハビリプログラムがなく(93%)、病院・リハビリ施設・学校との連携したプログラムが必要と思われた。いずれの項目も、個人差が大きく、リハビリ後の親や教師などの意識が、術後の成績に大きく関連すると思われた。手指コミュニケーションを中心とする聾学校に在籍しているA,C児と聴覚コミュニケーションを中心とする通常小学校に在籍しているB,D児(いずれも現在小12年)を対象に聴取能・発語明瞭度・語彙の関連を検討した。対象児は、両群間で条件が等しくなるようにバランスをとり、4名とした。うち、A,B児は内耳形成不全であった。検査は、聴取能(CI-2004)、発音の評価、語彙検査を行った。聴取能を比較したところ、通常小学校の聴覚環境下にあるB児(内耳形成不全、使用電極数16本、装用後3年10月)は、単語80%、2語文64%、3語文72%であった。D児は、いずれも100%に近く天井効果を示していた。一方、聾学校の手指環境下にあるC児(内耳形成正常、使用電極数20本、装用後5年4ヶ月)は、単語60%、2語文66%、3語文検査不能であった。内耳形成不全のA児はさらに成績が悪かった。このように、日常的なコミュニケーションへの聴覚の関与が成績の著しい差をもたらしたものと考えられた。聴覚を意識しない場合、相手がわかる場合にはより容易な手指コミュニケーションへと移行してしまったものと考えられた。一方、手指は併用するものの、聴覚口話が主体の児童の場合、聴取能、発音、語彙のいずれも高い評価得点であった。

日常的なコミュニケーションモードやコミュニケーション環境の影響が著しいことが明らかとなった。この他、人工内耳装用後1年半の幼児も観察してきた。コミュニケーション時に意図的に聴覚を利用し、音声表出を誘導しない場面(幼稚園の保育場合)などでは、音声表出が見られない手指コミュニケーションに終始していた。しかし、大学の指導場面では、音声も同時的に使用していたが、明瞭度が十分でなく状況がわからないと内容がほとんどつかめない状態であった。以上のように、意図的なコミュニケーションモードの使用が、人工内耳の使用を促進する上でも大切なことが明らかとなった。1,教師・親の意識の変化:[教師]担当幼稚園担任教師,加配教員の人工内耳装用児に対する意識の変容では、文字情報,手話での情報保障に関する助言に対して,加配教員は変容が見られたが、担任教師の変容は見られなかった。また、コミュニケーションの拡大・音声言語の発達を促すための意識の変容は見られなかった。[親]親の変容は、補聴器、人工内耳いずれでも、子どもの声が出始めた時に大きな安堵感が生じた。しかし、その後の子どもとの係わりは、術前の指導機関の方針によって大きく異なっていた。指示的な親から受け身的な親までその係わり方は多様であり、いずれの場合も親の変容は極めて緩慢であった。2,対象児の状況の変化:(1)コミュニケーション様式の変容:常用しているコミュニケーション様式に変化はなかった。しかし、小学生になると相手のコミュニケーション様式にあわせて、話しことばも併用することは多くなかった。(2)聴覚情報処理能力の変容:単語の場合、手指併用群では音入れ後5年時点で60%90%であった。口話群では3年以上で80%以上であった。(3)言語能力の変容:いずれの群でも、学年評価点で、1から5まで広範囲に分布していた。学年以上の成績の子ども達は、いずれも口話群であった。一方、言語力が向上せず、9歳レベル相当に留まる子ども達も認められた。特に、読字力は学年以上だが、語彙や文法力、読解・鑑賞力での生成が十分ではなく、聴覚障害の典型の型を示した。(4)話しことばの変容:構音は、年数と共に改善が認められたが、聴取能力に依存するところが大きく、個人差が大きかった。3,全国調査より、在籍児のいる学校は、難聴学級では、78校中37%程度であり、聾学校では、80%以上であった。指導病院との連携と学校独自のリハビリプログラムの開発が課題であった。以上のことから、周囲の関係者の日常的な係わりが成績の著しい差に影響したものと考えられた。1、親の意識は、小学校就学前ないしは聾学校に措置される前までは、聴覚を主体に考えているが、聾学校に入学した子ども達は手話を、通常小学校に入学した子ども達は自分の得意とするコミュニケーションモードを使用することが多かった。2、2、対象児の変容:(1)コミュニケーション様式の変容:通常学校に通う児の場合、聴覚口話が多いが、十分には通じないと思われる児では、手話を併用している。この場合、親も子も手話が十分でなく、簡単な日常生活程度の簡単な手話しか使用されず、コミュニケーションが不十分となるだけでなく、意味概念上の深まりが極めて浅いことがわかった。(2)聴覚情報処理上の変容:コミュニケーションモードの使用の種類に係わらず、術後の年数と共に向上していった。
n次元空間における拡散律速凝集体のフラクタル次元の数値解析と統計力学的意味づけ

拡散律速凝集体が成長する空間次元とフラクタル次元の関係を調べるため、2次元空間における拡散律速凝集体においてランダム・ウォークが拡散律速凝集体に付着する確率分布を詳細に調べた。また、ランダムウォークが拡散律速凝集体に付着した場合の凝集体を1次元数列で表現する新たな手法を考案しその意味づけを探った。主な成果は以下の通りである。1.付着確率分布は以前報告されていたようなガウス分布ではない。拡散律速凝集体のサイズ(粒子数)が小さい場合はガウス分布的であるが、サイズが大きくなるにつれて中心側にテイルを引く非対称な分布になる。2.1.の結果を踏まえ拡散律速凝集体の内側と外側を分けて調べた結果、内側のfrozen zoneはポアソン分布的であり、外側のactive zoneではガウス分布的である。しかし、frozen zoneとactive zoneの境界は通常考えられている境界よりも中心側にある。3.froze zoneとactive zoneの全体にわたって、凝集体の粒子数1個当たりの付着確率分布はベキ則分布でフィッティングすることも可能であるが、その指数が7ぐらいという大きな値になり物理法則としては疑問がある。4.一般に、ランダム・ウォークの存在確率はガウス分布となるが、ランダム・ウォークが構造物に付着する場合はガウス分布を拡張したTsallis分布になることが知られている。そのズレを表す量がqであり、q=1がガウス分布を意味する。そこで、付着確率分布についてTsallis分布でフィッティングすると、qは1.02ぐらいで、通常、Tsallis分布で議論されている問題より非常に小さいことが判った。5.拡散律速凝集体に限らず、凝集体が成長する場合の時間変化を1次元数列で表現する方法を考案した。その表現方法は付着する粒子に付着時刻(順番)の離散時間を与え、付着される凝集体の右隣にその付着粒子を置く、という方法である。その数列から、種粒子からどのように粒子が付着したか、その全てを知ることが出来る。6.2次元の拡散律速凝集体にこの1次元数列表現を適用して、フラクタル次元がどのように表現されるかを調べた。拡散律速凝集体は明確な縮小写像関数が無くランダムさが導入されているため統計的な解析が必要になってくるが、現在、解析中である。

3.frozen zoneとactive zoneの全体にわたって、凝集体の粒子数1個当たりの付着確率分布はベキ則分布でフィッティングすることも可能であるが、その指数が7ぐらいという大きな値になり物理法則としては疑問がある。4.一般に、ランダム・ウォークの存在確率はガウス分布となるが、ランダム・ウォークが構造物に付着する場合はガウス分布を拡張したTsallis分布になることが知られている。そのズレを表す量がqであり、q=1がガウス分布を意味する。そこで、付着確率分布についてTsallis分布でフィッティングすると、qは1.02ぐらいで、通常、Tsallis分布で議論されている問題より非常に小さいことが判った。以上を踏まえて、今後は付着確率分布の物理的意味を明かにして本研究課題の解明を目指したい。拡散律速凝集体のフラクタル次元と空間次元との関係を物理的に明らかにするためには、ランダムウォークが擬集体に付着するダイナミックスを明らかにする必要がある。そのため、昨年度は付着確率分布の統計力学的意味づけを数値解析から調べた。拡散律速凝集体のダイナミックスを研究する場合、ランダムウォークの付着の振る舞いを空間的に調べるのが定石である。一方、フラクタルの研究は写像関数を定義することによって数学的に研究する方法もある。そのような着眼から我々はすでに2次元の拡散律速凝集体の縮小率を得ているが、その立場をさらに発展させるため、今年度は、ランダムウォークが拡散律速凝集体に付着した場合の凝集体を1次元数列で表現する新たな手法を考案しその意味づけを探った。得られた主な成果は次の通りである。1.拡散律速凝集体に限らず、凝集体が成長する倍の時間変化を1次元数列で表現する方法を考案した。その表現方法は付着する粒子に付着時刻(順番)の離散時間を与え、付着される凝集体の右隣にその付着粒子を置く、という方法である。このことによって、凝集体が成長するたびに右に伸びる1次元数列を得ることが出来る。2.例として、Vicsekのフラクタル図形にこの方法を適用し、フラクタル次元がこの1次元数列からどのように得られるかを明らかにした。3.2次元の拡散律速凝集体にこの1次元数列表現を適用して、フラクタル次元がどのように表現されるかを調べた。拡散律速凝集体は明確な縮小写像関数が無くランダムさが導入されているため統計的な解析が必要になってくる。
ハンドボール競技における個人戦術能力の運動学的構造分析

戦術的能力の客観的指標作りとして、対人関係を含む運動経過の定量化をはかった。その結果、再現性の重要性や、戦術的指導の有効性についても示された。また、認知的能力とパフォーマンス、戦術的能力との関連も見出すことが出来た。これらより、戦術的能力の運動学的な構造を多角度で検討した結果、戦術学習におけるパフォーマンスへの貢献が期待され、今後のさらなる検討の可能性が合目的的コーチングにつながることが示唆されたことは意義深い。1、動機、目的競技力を客観的に評価することは、トレーニング手段を設定していく上で不可欠である。その競技力の決定因子としては、体力的要素やメンタル的要素、そして技術的要素のほかに、戦術的な要素もあげられ、競技種目特化の評価指標を持つことは、合目的的なコーチングのためには急務であるといえる。そこで、本研究では、ハンドボール競技における個人戦術能力を科学的な見地で評価するために、個人レベルの戦術的運動経過を主体としてみた、運動学的な構造を明らかにすることを目的とした。具体的には、攻撃における個人の防御突破場面での構造分析と、防御における突破に対する個人行動の構造分析を行うものとした。特に今年度は、その基礎的位置づけとして考察した。攻撃および防御局面における個人戦術的能力を検討するために、実験を行い、バイオメカニカルな手法を用い、データを得た。なお、解析には、Frame-DIAS(株式会社DKH製)を用いた。2、主な結果及び考察(1)攻撃における再現性データの検討により、攻撃局面におけるの個人戦術的能力に関して、再現性の重要性が示唆された。(2)防御局面における対応の多様性防御局面の戦術的能力おいては、対応の多様性が、重要であることが示唆された。3、まとめ戦術的能力の客観的指標作りとして、対人関係を含む運動経過の定量化を試みたが、攻撃、防御の局面における決定要因の違いが見られた。実戦的な場面においても、同様の傾向が見られ、実験的状況に限った傾向でないことが示された。今回の客観的評価の試みと、パフォーマンス能力の関係が見られたことにより、今後の更なる検討の価値が見出せた。特に今年度は、戦術的指導の有効性や、よりゲーム的状況に近い設定おける戦術的能力の検討をはかった。2、主な結果及び考察(1)戦術的指導の有効性データの検討により、戦術的指導の重要性が示唆された。戦術的指導を伴わない場合と比較して、有意にパフォーマンスの向上が見られた。(2)個人戦術的能力の検討個人戦術的能力について、エリア解析法を用いて検討した。熟練したプレーヤーにおいて再現性の高さが示唆されるとともに、エリア解析法の評価法としての妥当性が見られた。3、まとめ戦術的能力の客観的指標作りとして、対人関係を含む運動経過の定量化を昨年度と異なる観点にて試みたが、同様に再現性の重要性などが見られた。また、戦術的指導の有効性についても示されたことは意義深い。特に今年度は、総括の意味もあり、競技者のニーズに目を向けた調査も行った。また、戦術的能力の構造を検討する上で重要と思われる認知能力の実験的調査も実施した。2、主な結果及び考察(1)戦術的指導の有用性データの検討により、戦術的指導の有用性が示唆された。イメージの提供のビジュアル化による、パフォーマンスへの貢献の期待度の高さがうかがえた。(2)認知能力の重要性状況を認知する能力がパフォーマンスと関連があることが示唆された。また、パフォーマンスの決定要因である戦術的能力と認知能力、さらに観察能力との相互の関連性が示唆された。3、まとめ

平成20年度までに、戦術的能力の客観的指標作りとして、対人関係を含む運動経過の定量化をはかり、再現性の重要性などが見られたほか、戦術的指導の有効性についても示された。21年度では認知的能力とパフォーマンス、戦術的能力との関連も見出すことが出来た。これらより、戦術的能力の運動学的な構造を多角度で検討した結果、戦術学習におけるパフォーマンスへの貢献が期待され、今後のさらなる検討の可能性が合目的的コーチングにつながることが示唆されたことは意義深い。
社会的合意形成のための科学技術コミュニケーションと参加型ゲーミングの融合

本研究は,このサイエンスカフェの役割に注目し,高度な科学技術と社会の間で発生した問題における「パブリックアクセプタンス」の手法開発に焦点を置いてすすめられたものである.本研究では,ゲーミングシミュレーションによる「複合的な現実の総体」に対する伝達手法を,科学技術を取り巻く社会的問題に適用しゲームとしてデザインすることで,科学が社会に与えるインパクトや科学技術が果たす役割を,多様なステークホルダーの視点で理解する環境を容易に提供する基盤を構築し評価した.本研究は,このサイエンスカフェの役割に注目し,高度な科学技術と社会の間で発生した問題における「パブリックアクセプタンス」の手法開発に焦点を置いてすすめられたものである.本研究では,ゲーミングシミュレーションによる「複合的な現実の総体」に対する伝達手法を,科学技術を取り巻く社会的問題に適用しゲームとしてデザインすることで,科学が社会に与えるインパクトや科学技術が果たす役割を,多様なステークホルダーの視点で理解する環境を容易に提供する基盤を構築し評価した.高度な科学技術と社会の間に発生した問題に対するパブリックアクセプタンス(Public Acceptance)の手法開発は,科学コミュニケーション研究の中心的課題のひとつである.本研究を通じて,これらの問題をどのように社会に受容するか(或いは受容しないか)を考えるための公共空間を,インターネット上の広域参加型ゲーミングシミュレーションによって創出したい.参加者の体験を媒介として,ローカルナレッジをインターネット上で結集すべく,科学コミュニケーション空間を拡張すること,その社会的・技術的評価を行うことが,本研究の目的である.21年度は,(1)基本的なゲーミングシミュレーションの実装及び実行環境の構築整備(2)ゲーミングのためのインタラクション記述言語のデザイン,の2つの研究項目を実施した.前者の研究項目では,本年度に整備した実行基盤上で地球温暖化問題,国際食糧問題に関するゲーミングツールの整備構築を行ない,実践の場からの課題のフィードバックを得ることを目的として,21年12月,被験者統制として大学生に参加者を絞ったサイエンスカフェを試行した.これにより,研究基盤の技術的性能と利用性能を確認することができた.後者の研究項目は,(1)の実験環境整備に併せて実施した課題であり,本研究が対象とする科学コミュニケーションのためのゲーミングのインタラクションの特質を分析する目的を果たした.本研究の特徴は,ゲーミングに統制のためのモデルを埋め込むことで参加者間のダイナミックな協調や競争を促し,参加者の集合知の抽出を導く点にある.従って,この統制に必要な関数を多く準備することで,ゲーミングで発揮されるべき機能を効果的かつ効率的に記述できるゲーミング記述言語を設計することができると考えられる,この記述言語の体系化は更に22年度に継続して研究を行い,基盤環境の改良に関連付ける計画である.高度な科学技術と社会の間に発生した問題に対するパブリックアクセプタンス(Public Acceptance)の手法開発は,科学コミュニケーション研究の中心的課題のひとつである.本研究を通じて,これらの問題をどのように社会に受容するか(或いは受容しないか)を考えるための公共空間を,インターネット上の広域参加型ゲーミングシミュレーションによって創出したい.参加者の体験を媒介として,ローカルナレッジをインターネット上で結集すべく,科学コミュニケーション空間を拡張すること,その社会的・技術的評価を行うことが本研究の目的である.22年度は,(1)ゲーミングシミュレーション実行環境の整備改良(2)ゲーミングのためのインタラクション記述言語の実装,(3)サイエンスカフェを利用した多言語ゲーミングの展開による実践的評価,の3つの研究項目を実施した.昨年度整備した実行基盤上で地球温暖化問題,国際食糧問題,資源エネルギー問題に関するゲーミングツールの整備を図り,より多様なユーザの参加を実現するため,多言語によりゲーミングを行う基盤を整えると共に,実践の場からの課題のフィードバックを得ることを目的として,留学生を含む大学生対象の多言語サイエンスカフェを実施した.これにより,研究基盤の技術的性能と利用性能を確認すると共に,このログデータ分析からユーザ間のインタラクションモデルを抽出し,ゲーミングのためのコミュニケーション記述言語の実装を実施した.本研究の特徴は,ゲーミングに統制のためのモデルを埋め込むことで参加者間のダイナミックな協調や競争を促し,参加者の集合知の抽出を導く点にある,23年度は,このコミュニケーション記述言語の体系化と整備を進め,多様なユーザによるコミュニケーション空間実現のための参加者エージェント導入実験を行い,参加型ゲーミング基盤環境の充実を図る計画である.本研究は,高度な科学技術と社会の間で発生した問題における「パブリックアクセプタンス(Public Acceptance)」の手法開発に焦点を置いてすすめられたものである.ゲーミングの世界で開発されてきた「複合的な現実の総体」に対する効果的な伝達手法を,科学技術を取り巻く社会的問題に適用し,ゲームとしてデザインすることができれば,科学が社会に与えるインパクトや科学技術が果たす役割を,多様なステークホルダーの視点で理解する環境を容易に提供できる.この実現に向けて,本研究では,(1)遺伝子組換え作物問題(2)地球温暖化問題(3)国際食糧問題の3問題を対象に,インターネット環境で利用できる広域型ゲーミングシミュレーションを構築した.実装は,ゲームの開発言語としてPHP 5,データベース機能としてMySQLを採用し,クライアント側へのソフトウェアインストールを一切不要とする環境下で稼働する.軽量なサーバサイドテクノロジによるものとした.インターネット上のゲーミングは,地球温暖化問題のようなグローバルな課題に対する問題解決に特に有効であり,多様なステークホルダーが空間的に偏在する社会において,これらの人々を有機的に結び付けることを可能とする.本研究では,こうした次世代のゲーミング環境への試みとして,多言語ゲーミング機能を組み込んだゲームを構築した.

これにより,グローバルな問題に接近するために最大の障害となる言語の壁を取り払い,母語でコミュニケーション活動を行う環境を提供することに寄与した.本研究では,この多言語ゲーミンク環境を特に,「Langrid Gaming」と名付けた.「Langrid Gaming」は,早稲田大学国際コミュニケーションセンターでのイベントをはじめとして各所に提供され,国際食料食糧問題をテーマとしたゲームを通して,母語の異なるユーザにより利用された.
近畿に野生化するアオモジの種子散布、発芽、実生の成長特性からみた個体群動態の解明

アオモジ(クスノキ科ハマビワ属)の分布拡大過程の解明のために、平成15年度に撮影された奈良県平群町付近のヘリコプター画像の解析、京都市の上賀茂試験地での種子散布測定、大阪府吹田市の人工ギャップ内外で種子の出芽実験を行った。奈良県平群町を対象としたヘリコブター画像から黄葉したアオモジ樹冠を切り出し、東西に約5km、南北に約4kmにかけて分布することが判明した。約15年前には生育していないと考えられる東部の矢田丘陵でも分布が確認され、40年程度前に植栽された東部の生駒丘陵から東部にも分布が拡大していていることが明らかとなった。アオモジは、住宅地などの市街地には分布せず、森林を中心に分布していた。GISを用いた解析から、分布パターンはランダムではなく、集中分布であることが明らかとなった。また道路から短い距離の位置にアオモジ樹冠が多く存在し、道路の建設に伴う攪乱環境が、アオモジの分布拡大に寄与していることが示唆された。上賀茂試験地における種子散布測定では、春季の例年よりも低い温度のためか結実量が前年に比べて著しく少なく、シードトラップで採取できた散布種子は、ほとんど樹冠直下のプロットであった。前年のデータとあわせで、樹冠からの距離が大きくなるにつれて、散布密度は著しく低下することが明らかとなった。アオモジ種子の出芽率は、ギャップ内で大きく、林内で小さかった。光環境の指標である天空率の増加に伴って出芽率が増加し、天空率が0.136以下の暗い林床では、ほとんど出芽しないことが確認された。これらより、アオモジは、攪乱環境に依存して分布を拡大する移入種であることが明らかとなった。アオモジ(クスノキ科ハマビワ属)の分布拡大傾向を明らかにするため、文献および標本、インターネットでの情報収集、GPSでの現地調査から自生地外の分布域を抽出した。その結果、徳島、兵庫、大阪、奈良、京都、滋賀、静岡県から野生化が確認され、東海から西の日本各地で野生化しており、国内移入種として生態系を攪乱する潜在的な可能性が明らかとなった大阪府泉佐野市、奈良県平群町で、ヘリコプターからの地表面のデジタルビデオ撮影、画像解析を行い、過去の報告よりもアオモジの分布域が拡大していることを確認した。植栽履歴の明らかな京都市の京都大学上賀茂演習林では、48年間に3本の植栽個体から開花59個体に個体数が増加し、アオモジはパッチ状に分布、9.2km/年以上の速度で分布拡大していることが明らかとなった。京都市上賀茂試験地での、母樹付近の種子散布、埋土種子調査から、種子散布密度は小さい、または検出不可能であったものの、埋土種子は確認された。大阪府泉佐野市の伐採跡地、林内での実生密度、埋土種子密度の調査から、天空率の大きな場所に有意に多くの実生が出現したが、埋土種子密度はいずれの場所でも同程度に存在した。大阪府泉佐野市の伐採跡地における実生の成長速度は、先駆種で成長の速いアカメガシワよりも樹高と根元直径で大きかった。またアオモジ伐採後には、1年で平均2.7mの萌芽枝が形成され、萌芽再生能力が大きなことも明らかとなった。以上の結果から、アオモジは、鳥によって種子が散布され、暗い林内で埋土種子を形成し、ギャップ形成などによる光環境の改善で発芽し、成長が速いためギャップ内で優占種となり、攪乱環境が頻繁に形成される場所では、今後もアオモジの分布が拡大する可能性が示唆された。
人工干潟に欠落している生態系機能の定量的評価

徳島市にあるマリンピア沖洲人工干潟は,高速道路建設に際し埋め立てられる自然干潟の代償措置として2007年に造成された.徳島県の調査によると,代償目的の一つである絶滅危惧種ルイスハンミョウ(環境省RDB絶滅危惧IB類)は一応定着したとされているが,潮間帯に生息しているベントス群はほとんど再現されていない.特に自然干潟で1m^2あたり400個体以上と高密度に分布している藻食性巻貝のホソウミニナが人工干潟では確認されていない.そこで本研究ではホソウミニナに着目し,代償創出された人工干潟に欠落した生態系機能を明らかにした.まず,何故ホソウミニナが定着しないのかを調査した.1つめの要因として,ホソウミニナは直達発生の生活様式を持ち,分散性に欠けることが挙げられた.調査においても幼生は表面張力により浮かんではいるものの,風により押し戻されたり,少し触れるとすぐ沈んだりしていた.2つ目として,餌の問題が挙げられた,ホソウミニナは底生珪藻を主要な餌としているが,人工干潟の底生珪藻量は自然干潟と比較して有意に少なかった(t-test,p<0.01).この理由として,人工干潟に流入してくる栄養塩が自然干潟と比較して少ない(t-test,p<0.01)ことが挙げられる.これは,いわゆる都市河川からの流入がある自然干潟と比較して,人工干潟は比較的清廉な吉野川からの流入がメインである為である.この結果は,人工干潟の場所選定に対しての重要性を強く認識させるものである.自然干潟のホソウミニナは摂餌により有意に底生珪藻量を減じており,その摂餌圧はホソウミニナの密度が増えるほど上昇した(Tukey's honestly significant differencetest, ρ<0.05).ホソウミニナ生息域全体では,9月から11月の3か月間で54.2kgCの生産を行い,呼吸により190kgCを干潟系外に排出していると推察された.このように,ホソウミニナは自然干潟の物質循環を担っており,ホソウミニナが存在しない人工干潟に欠落している生態系機能は,非常に大きいことが明らかとなった.徳島市にあるマリンピア沖洲人工干潟は,高速道路建設に際し埋め立てられる自然干潟の代償措置として2007年に造成された.徳島県の調査によると,代償目的の一つである絶滅危惧種ルイスハンミョウ(環境省RDB絶滅危惧IB類)は一応定着したとされているが,潮間帯に生息しているベントス群はほとんど再現されていない.特に自然干潟で1m^2あたり400個体以上と高密度に分布している藻食性巻貝のホソウミニナが人工干潟では確認されていない.そこで本研究ではホソウミニナに着目し,代償創出された人工干潟に欠落した生態系機能を明らかにした.まず,何故ホソウミニナが定着しないのかを調査した.1つめの要因として,ホソウミニナは直達発生の生活様式を持ち,分散性に欠けることが挙げられた.調査においても幼生は表面張力により浮かんではいるものの,風により押し戻されたり,少し触れるとすぐ沈んだりしていた.2つ目として,餌の問題が挙げられた,ホソウミニナは底生珪藻を主要な餌としているが,人工干潟の底生珪藻量は自然干潟と比較して有意に少なかった(t-test,p<0.01).この理由として,人工干潟に流入してくる栄養塩が自然干潟と比較して少ない(t-test,p<0.01)ことが挙げられる.これは,いわゆる都市河川からの流入がある自然干潟と比較して,人工干潟は比較的清廉な吉野川からの流入がメインである為である.この結果は,人工干潟の場所選定に対しての重要性を強く認識させるものである.自然干潟のホソウミニナは摂餌により有意に底生珪藻量を減じており,その摂餌圧はホソウミニナの密度が増えるほど上昇した(Tukey's honestly significant differencetest, ρ<0.05).ホソウミニナ生息域全体では,9月から11月の3か月間で54.2kgCの生産を行い,呼吸により190kgCを干潟系外に排出していると推察された.このように,ホソウミニナは自然干潟の物質循環を担っており,ホソウミニナが存在しない人工干潟に欠落している生態系機能は,非常に大きいことが明らかとなった.
異種生物間情報伝達機構の制御技術開発

宿主寄生体間情報伝達物質の検出のため、ヒト脳神経系及び寄生原虫クルーズ・トリパノソーマを等しく認識する単クローン抗体(Wood,J.N.et al.,Nature,1982)を用い、ヒト臓器別およびトリパノソーマのcDNAライブラリーを精査し、多数の新規遺伝子を得た。ノザンブロット解析により、元来この抗体が認識する神経や心筋細胞、クルーズ・トリパノソーマのみに発現が認められるBradeion遺伝子が選別され、その後の生体機能解析へと進んだ。現在までにこの新規生理活性物質の生体機能解明・情報整備をほぼ完備することが出来た。即ち、1.成人脳の神経細胞での発現が認められ、2種のタイプが存在する(α及びβと呼称)。アミノ酸配列の特徴として、成長ホルモンやサイトカイン受容体特異的配列が認められ、膜貫通部分やATP/GTP結合部位も含めてオーファン受容体としての特徴的配列を有する。2.ノザンブロット解析でヒト成人脳、心臓(脳の10%以下)でのみ検知可能であり、他臓器・胎児期では検出感度以下の発現しか示さない。3.マウス脳でβ型相同遺伝子配列が存在する(94%の相同性)。マウス第11番染色体に位置し、3エクソン、2イントロンの構成で約17kb領域にコードされる。4.細胞内局在部位は、αはミトコンドリア、βは核周囲細胞質である。5.培養ヒト癌細胞に過剰発現させると、アポトーシスを誘導する。6.ヒト培養大腸癌・メラノーマ細胞株で強度遺伝子発現を示す。大腸癌の患者検体でもこの強度発現は確認された。7.アンチセンス・リボザイムで大腸癌細胞で発現を抑制すると、細胞増殖速度に顕著な影響が現れ、増殖抑制及び癌細胞の形質転換が起こる。脳神経系細胞の寿命制御・脱落防止に関しては、遺伝子病としての脳神経退行性疾患やアルツハイマー病、ハンチントン病で疾病の分子基盤解明とそれを応用した医薬品・医療機器開発が世界規模で推進されている。また、C.elegansやマウス等モデル生物系を含めた物質解明及びヒトへの応用が試みられているが、これは脳神経系という臓器・細胞の持つ種特異性や個体差というものが研究の限界となり、ヒト細胞を用いた方法論の整備が叫ばれている。Bradeionは、このような従来型のアプローチでは決して抽出されることのできないヒトの生物共進化や「寄生」という環境適合から焦点を当ててのみ得られるヒト脳神経生存(脱落)に関わる新規物質である。従って、本研究は、このような細胞寿命制御因子Bradeionの発見と機能解明を行った。この知見から現在、老化・癌化等の細胞変異制御のために、1.有用生理活性物質としてのヒト脳オーファン受容体の生体機能解明、2.脳内高次機能構築・細胞脱落の機構解析、3.脳神経細胞死、癌早期診断及び遺伝子治療に向けての技術開発、医療機器開発、を行っており、広範な新規産業創造シーズへ活用することを目指してさらなる研究が展開されている。

この知見から現在、老化・癌化等の細胞変異制御のために、1.有用生理活性物質としてのヒト脳オーファン受容体の生体機能解明、2.脳内高次機能構築・細胞脱落の機構解析、3.脳神経細胞死、癌早期診断及び遺伝子治療に向けての技術開発、医療機器開発、を行っており、広範な新規産業創造シーズへ活用することを目指してさらなる研究が展開されている。シャガス病は、中南米に広く分布する寄生原虫クルーズ・トリパノソーマの感染によって、心筋炎、血管炎、巨大結腸症を引き起こす慢性疾患で、現在2千万人以上の患者が認められている。しかし、分布する神経節細胞等への選択的障害の原因や発症機序が不明で、従って治療法も未開発であり、その解決は、緊急、かつ重要な課題となっている。本研究は、この様な腸管神経節細胞の異常と腸管収縮の喪失(巨大結腸症)が、血圧上昇ホルモン・心筋細胞拍動誘起物質であるエンドセリン(ET)の神経節細胞内での発現異常またはその受容体の機能喪失に起因すると着想、これを具体的な実験から実証することを目的とする。研究実績は以下の通り。1)トリパノソーマよりのエンドセリン(ET)遺伝子検出;トリパノソーマゲノムライブラリー、cDNAライブラリーより、ETリセプターBの遺伝子配列を用いて、関連遺伝子の検出を行い、いくつかの陽性クローンを得た。遺伝子バンクに登録の上、構造上の特徴及び機能解析を開始した。2)神経細胞との共培養系の確立;神経細胞株P12を用いてトリパノソーマとの共培養系は成功した。しかし、長期培養にて、P12細胞内で寄生体の感染形への形態変換率を観察したが30%内外と低く、求める遺伝子の生体機能解析の実験室内モデルに用いるには、さらなる工夫が必要であり、現在試験中である。3)invivoにおける遺伝子機能検定;1)で解析中のトリパノソーマET関連遺伝子について、遺伝子改変寄生体を作成、マウスに感染させてその生体機能を観察中である。4)モノクローナル抗体を用いた異種生物間情報伝達物質の検索;筑波大学山本三幸博士より供与された、マウス脳(ニューロン)モノクローナル抗体CESは、大脳錐体層、心筋細胞、及びトリパノソーマを認識する。本研究の趣旨に従い、この抗体を用いて、それぞれの遺伝子ライブラリー構造上の特徴及び機能解析を開始した。しかも、この抗体は免疫染色法による検索の結果、小脳プルキンエ細胞、視床下部の特定領域を認識しており、その脳神経系(中枢系及び末梢神経系-自律神経節)発生に関わる機能に注目している。脳神経系(中枢系及び末梢神経系-自律神経節)発生異常ミュータントマウスを用いて機能解析を進めている。1)異種生物間情報伝達物質をコードする遺伝子の検索マウス脳(ニューロン)モノクローナル抗体CE5(筑波大学山本三幸博士より供与)は、大脳錐体層や心筋細胞、トリパノソーマを認識する。このモノクローナル抗体でヒトの脳および心臓のcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性コロニーを得た。この陽性クローンのヒトの各臓器別発現の相違をNorthernブロットで調べたところ、クローンCE5B3は脳および心臓のみに発現が認められ、他の臓器にはシグナルは認められなかった。
幹細胞新生のタイミングを制御する分子機構の解明

イネのplastochron1 (pla1)変異体やシロイヌナズナのkluh(klu)変異体は、一定期間に着ける葉の数が多い突然変異体であり、腋芽幹細胞を生成するタイミングが野生型と比較して速くなっている。これまでの研究から、PLA1/KLU遺伝子はシトクロムP450酸化酵素(CYP78A)をコードすることが明らかにされている。CYP78Aの組換えタンパク質は、脂肪酸の一種であるラウリン酸を試験管内で酸化するが、その生成物である12-ヒドロキシラウリン酸を投与してもklu変異体の表現型は相補されない。また、cyp78a変異体において12-ヒドロキシラウリン酸の内生量は低下していなかった。以上のことから、ラウリン酸は植物体内におけるCYP78Aの真の基質ではないと考えられる。本研究では、CYP78Aの植物体内での基質および生成物の同定を目指している。本年度は以下の実験を行った。(1) PLA1遺伝子が発現しているイネの茎頂部をレーザーマイクロダイセクション法により単離し、トランスクリプトーム解析を行った。pla1変異体と野生型との比較を行うことにより、PLA1応答遺伝子群を同定した。現在、これらのデータを詳細に解析し、CYP78Aシグナルに対する応答を検出するためのマーカー遺伝子の選抜を試みる。マーカー遺伝子が得られた場合は、CYP78A遺伝子を発現する植物組織の抽出画分から、マーカー遺伝子の発現を誘導(または抑制)できる化合物を探索する。(2)前年度までにシロイヌナズナのKLU遺伝子をステロイド誘導性プロモーターの制御下で発現する形質転換シロイヌナズナを作出した。本年度は、液体クロマトグラフー質量分析装置を用いて、KLU遺伝子の発現誘導後に変化する代謝産物の網羅的な解析を行った。候補となるピークが得られたため、今後再現性の確認を行う。pla1変異体と野生型の比較トランスクリプトーム解析を行った。PLA1遺伝子は茎頂部の葉原基の基部で発現が強いことから、葉原基を含む茎頂部をレーザーマイクロダイセクション法により単離し、RNA抽出の材料に用いた。RNAシーケンスを行うことにより、トランスクリプトーム解析を実施した。その結果、pla1変異体で発現量が有意に上昇あるいは低下している遺伝子群の同定に成功した。詳細については、現在、データを解析中であるが、いくつかの興味深い知見が得られた。pla1変異体においては、PLA1遺伝子自身、および他のCYP78A遺伝子の発現量が高まっていたことから、PLA1経路には負のフィードバック制御機構が働いている可能性が示唆された。また、ジベレリンやサイトカイニンの代謝に関わる遺伝子の発現量が変化していたことから、pla1変異体の茎頂部においては、これらのホルモン内生量が変化している可能性が示唆された。今後は、シロイヌナズナにおいてもCYP78Aによって制御されるオルソログを見出し、それらをマーカー遺伝子としてCYP78Aシグナルの探索に用いる予定である。もう一つのアプローチとして、液体クロマトグラフー質量分析装置を用いて、KLU遺伝子の発現誘導後に変化する代謝産物の網羅的な解析を行った。シロイヌナズナの根を材料に用いた。KLU遺伝子の発現誘導後に増加あるいは減少するピークの候補が得られたことから、今後異なる実験条件におけるKLU遺伝子応答性の検討等を行う予定である。これまでにイネの茎頂部におけるPLA1応答性遺伝子群を得ることができた。まず、データを詳しく解析し、イネ茎頂部におけるPLA1応答性遺伝子群の特徴を理解する。次に、茎頂部への化合物の投与が容易なシロイヌナズナにおけるKLU応答性遺伝子(イネのPLA1応答性遺伝子のオルソログ)を見出す。シロイヌナズナのKLU応答性遺伝子をマーカー遺伝子として、植物組織の抽出画分から、マーカー遺伝子の発現量を変化させる化合物の精製を進めて行く。液体クロマトグラフー質量分析装置による網羅的代謝産物解析により得られたピークに関しては、まず、KLU遺伝子発現に対する応答性の再現性を確認する。さらに、これらのピークが他の組織や栽培条件においてもKLU遺伝子発現に応答して変化するかどうかを検討する。これまでの研究から、PLA1/KLU遺伝子は機能未知のシトクロムP450酸化酵素(CYP78A)をコードすることが明らかにされているが、この酵素の植物体内での基質や生成物は解明されていない。CYP78Aの組換え酵素を用いた以前の研究から、同酵素が試験管内で脂肪酸の一種であるラウリン酸の水酸化を触媒することが報告されている。一方で、水酸化ラウリン酸を投与してもklu変異体の表現型は相補されないことから、水酸化ラウリン酸は植物体内における真のCYP78A生成物ではないとも考えられている。本年度はこの点を追究するため、ヒメツリガネゴケのcyp78a変異体における水酸化ラウリン酸の内生量を野生型と比較した。まず、重水素標識した水酸化ラウリン酸を調製し、これを内部標準物質として液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析装置により定量分析を行った。その結果、水酸化ラウリン酸の内生量はcyp78a変異体において減少していなかった。