hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性疼痛の痛覚ー情動系の分子機構解析と栄養因子治療応用

慢性疼痛はしばしば不安や鬱を併発し、極めて難治性である。そこで、痛覚ー情動系における分子メカニズムを解明し、また神経栄養因子(BDNF)治療応用について検討した。その結果、前帯状回や脳幹部(網様体)におけるモノアミン変調に随伴したBDNFの機能低下が慢性疼痛や気分障害に関連すること、またカテーコール化合物や磁気治療の有用性が判明した。慢性疼痛の治療法に新たな指針を提唱するものと考えられる。慢性疼痛や精神的抑うつ状態は極めて難治性で、ヒトの生活など社会的にも大きな影響を及ぼすことから、治療法確立は急務である。最近、共通して神経栄養因子(BDNF)不足の関与が示唆されている。申請者らが開発した携帯型慢性疼痛・うつ病治療器(AT)は、微弱なエネルギーでありながら、培養グリアの活性化とBDNF誘導作用があり、ラット慢性痛に有効性を見出した。またカテコール基を有する4-methylcatechol(4-MC)も同様な作用が期待され、BDNF誘導作用により根治治療の根拠を解明することを目指している。そこで、1ラット慢性痛(気分障害併発病モデルにおいて、症状を緩和するか、2その効果は神経栄養因子(BDNF)誘導作用を介するか解析する。今までに、慢性疼痛に併発する気分障害の解析及び神経栄養因子型治療法について以下の解析が進んだ。1)前帯状回神経細胞群のBDNFおよび関連するシグナルの変調によりもたらされること。2)“うつ病"とは異なり,慢性疼痛に併発するうつ症状では,5-HTとBDNFの相互作用,特に共通したシグナル変調により起こること。3)BDNFの機能低下は,さまざまな神経変性疾患の情動系分子メカニズムとしての可能性を示した。また、神経栄養因子型治療法では、Atおよび4-MCともに、これらの神経系の機能変調に対し、BDNFの作用は神経系障害において,細胞障害の修復のみならず,シナプスの正常化に向けて改善することが判明した。特に、4-MCについては、論文発表(Cell Molecular Neurobiolog)や米国神経科学学会および国内疼痛学会で発表し、高い評価を受けた。このように、難治性神経疾患患者におけるうつ症状は近年、大きく注目されており、その中で本研究成果は先駆的である。口腔顔面の難治性疼痛は、長期化し気分障害を併発しQOLを低下させる。我々は、痛覚-情動系のシグナル変調と神経栄養因子(BDNF)不足が関与すると考えている。特にBDNFは、シナプスの修飾作用の他、細胞傷害過程の抑制、軸索進展および再生能を高める神経変性疾患を軽減する可能性がある。本研究では、ラット慢性疼痛における痛覚-情動系の時空的分子機構解析を行うことを目的とした。今年度は以下のことが判明した。1)磁気刺激によりラット培養大脳ニューロンのBDNF(ELISA)およびmRNA発現が増加した。2)細胞内シグナルではBDNFの主要経路MAPキナーゼの活性化(リン酸化)を認めた。3)神経障害性疼痛モデルで、磁気刺激は神経幹細胞の増殖と分化をもたらし、この作用は神経細胞のマーカーで確認した。4)磁気刺激を培養細胞へ照射すると、BDNF mRNA発現がRT-PCRで確認された。本研究において神経栄養因子が神経細胞傷害の予防及び障害後の修復に極めて有用であることが、培養細胞および脊髄・脳神経回路の細胞実験から判明した。磁気刺激以外にも、ポリフェノール化合物が細胞活性を高める可能性があり、鬱状態、神経過敏を軽減する可能性を見いだした。したがって、慢性痛の分子機構解明、つまり培養系実験と生体実験から、神経栄養因子の生理活性がより詳細となり、また磁気刺激による治療応用に基礎的知見を得た。よって近い将来に、神経栄養因子様活性をもつ化合物や磁気刺激によって慢性疼痛の治療が可能になれば、本研究の臨床への貢献度はきわめて高いと考える。背景・目的:口腔・顔面におけるさまざまな痛み、特に処置による急性痛の管理や末梢神経損傷後の神経障害性疼痛は科学的治療法がなく、またしばしば不安や鬱を併発し痛みの悪循環を引き起こすことがある。したがって、慢性疼痛の発症機構と合わせ、気分障害のメカニズムを解明することは、臨床的に極めて重要である。本研究では、慢性疼痛を感覚系および情動系(帯状回、島、扁桃体など)神経回路の変調と捉え、これらの分子機構を解析する。特に、高次神経疾患に共通するとされている神経栄養因子(BDNF)とその関連シグナルの挙動に注目し調べた。方法:H26年度では、末梢神経障害(坐骨神経を当初の歯髄神経に代わり検討した)後7、14日目に痛覚過敏とうつ様行動を評価した。また実験後に脳を摘出し、感情調節を担う前帯状回(ACC)とモノアミン含有で気分を調節する神経回路の起始である延髄網様体(RVM)におけるpERK, CREB,およびBDNFb含量やmRNAを調べた。

また、これらの病態に対し、向精神薬のイミプラミン(IMI)と慢性痛の治療薬ノイロトロピン(NTP)、および、pregabalin(PG)を参照として、神経栄養因子誘導剤(4-MC)および磁気治療のこれらに対する修飾作用を調べた。結果・結論:IMIおよびNTPは有意な鎮痛効果や抗うつ作用を示したが、PGの抗鬱効果は不明であった。今回の主目的である磁気治療や栄養因子治療は、これら鎮痛効果や抗うつ作用を示すと共に、ACCおよびRVMでのpCREBの活性化を介したBDNF mRNA増加作用をエビデンスとすることが判明した。この成果は、慢性疼痛の治療法に新たな指針を提示するものと考えられる。痛みの分子機構以下のことがほぼ達成できたと考えている。1)慢性疼痛の患者で遭遇する気分障害をラットで再現性の良いモデル作成ができた。2)慢性疼痛に併発する気分障害は、前帯状回神経細胞群のBDNFおよび関連するシグナルの変調、5-HTとBDNFの相互作用,特に共通したシグナル変調により起こること。3)このようなBDNFの作用は神経系障害において,細胞障害の修復のみならず,シナプスの正常化に向けて有意な基礎的知見と考えられ、臨床における治療法の理解に大きく貢献する成果と考えられる。神経障害性疼痛は気分障害を伴うが最近、脳内帯状回神経系の過剰興奮、および連鎖した下降性抑制系の機能低下の関与が示唆されている。このことはまた、脳イメージ画像法からも確認ができているとともに、臨床的にも有用な解析や病態診断となっている。こうした中、本研究では、培養系で生理活性を解明したのち、続けて脳の不快情動に関与する部位、前帯状回、島、扁桃体の脳活性亢進や下降性抑制系の賦活作用などの解析が順調に進んでいる。主な成果は、1)慢性痛モデルで前帯状回におけるpERK-pCREBの活性化が判明した。今後、こうした意義深い所見をもとに、BDNF合成誘導薬がそれらの機序を適正に緩和させる分子細胞学的裏付けを行う予定である。また電磁刺激治療器の痛覚ー情動系の時系列的・局所的細胞応答の変化を解明し、本治療が臨床応用できるか否か、培養系実験から生体実験まで、詳細な基礎的知見を得る予定である。今までの成果は、細胞障害の修復のみならず,シナプスの正常化に向けて有意な基礎的知見と考えられ、臨床における治療法の理解に大きく貢献する成果と考えられる。今後は、さらにシグナルや遺伝子レベルを強化したい。うつ症状は近年、大きく注目されており、その中で本研究成果は先駆的であり、発展が期待されている。また、すでに別途業績に示すように、海外雑誌や国際学会での発表をこなしてきた。さらにこれらの活動も促進したい。我々は、多くの神経変性疾患では、「脳内の親和性の高い部位で共通してBDNF不足が起こる」と仮説を立て作業を進めている。その検証の一つとして、BDNF誘導剤が、細胞内pERKシグナルの過剰興奮が併発する病態を修飾するか否かを解明したい。その結果により、BDNF合成誘導薬がそれらの機序を適正に緩和させる可能性が判明すると考えられ、したがって、このような分子細胞学的裏付けが必要とされる。今後、分子細胞学的裏付けを行う予定である。また電磁刺激治療器の痛覚ー
ウエルシュ菌エンテロトキシンのクローディンへの結合様式の解析

本研究は、食中毒の原因となるウエルシュ菌エンテロトキシン(CPE)と、その受容体であるクローディン(Cldn)の認識結合機構を解析し、本毒素の細胞膜傷害機構を明らかにすることを目的とした。その結果、CPE感受性Cldnの第二細胞外ループのC末端側12アミノ酸領域が、CPEと結合するために必要な最小領域であることと、この領域とCPEとの間の静電的引力が両者の相互作用に重要であることを明らかにした。さらに、CPE全分子の結晶構造解析に成功し、β型孔形成毒素の構造学的特徴を見出すことができた。本研究は、食中毒の原因となるウエルシュ菌エンテロトキシン(Clostridium perfringens enterotoxin、CPE)と、その受容体であるクローディン(Cldn)の認識結合機構を解析し、本毒素の細胞膜傷害機構を明らかにすることを目的としている。Cldnはタイトジャンクションを構成する4回膜貫通型タンパク質であり、少なくとも24の異なる分子種が存在する。CPEはこのうち特定のCldnのみを認識して毒作用を発揮する。本研究では、これらのうちCPEに感受性のあるCldn4あるいはCldn7、CPEに感受性のないCldn5を用いて種々のキメラCldnを作製し、CPE受容体のないL929細胞に発現させてCPE感受性を検討した。その結果、CPE感受性の第二細胞外ループのC末端側12アミノ酸領城(CPE sensitivity-related region、CPE-SRとした)が、CPEとの結合に必要であることを明らかにした。さらに、CPEに対する感受性の高いCldnは感受性の低いCldnに比べて、CPE-SRの等電点が高い傾向にあることがわかった。実際に、アミノ酸置換によりCPE-SRの等電点を変えることによって、CPE感受性を任意に変えることができた。一方、CPEの立体構造から、Cldnと結合するクレフト部分は負に帯電していることが予測された。このことから、感受性CldnのCPE-SRの正電荷が、負電荷を持つCPEとの相互作用に重要であることが示唆された。以上の結果から、CPEの受容体認識には受容体であるCldnのCPE-SRが必須であり、しかもCPE-SRとCPEとの間の静電的引力が両者の相互作用に大きな影響を与えていることがわかった。本研究の目的は、食中毒の原因となるウエルシュ菌エンテロトキシン(CPE)とその特異的受容体でありタイトジャンクションを構成する4回膜貫通型タンパク質のクローディン(Cldn)の認識結合機構を解析し、本毒素の細胞膜傷害機構を明らかにすることを目標としている。本年度は、CPEとCldnとの複合体について立体構造を明らかにすることを目的に、CPE単独の構造と機能について解析を行った。全長のCPEをC末端及びN末端にHisタグを付加した組換えタンパクとして大腸菌で大量培養し、ニッケルアフィニティーカラムを用いて精製した。この精製標品について結晶化スクリーニングキットを用いて最適な結晶化条件の決定を行い、全長CPEの結晶を得た。最終的に2.0Åの分解能でX線結晶構造解析に成功した。解析の結果、CPEの全体構造は3つのドメイン(DI,DII,DIII)からなり、DIはこれまでの報告通り受容体であるクローディンとの結合ドメインと考えられた。またDII,DIIIドメインはaerolysin、C.perfringensのε-toxin、Laetiporus sulphureus hemolytic pore-forming lectinなどのβ膜孔形成毒素と類似の構造をしていることがわかった。全長CPEの立体構造について既知の報告はなく、本研究は初めてその構造を明らかにした。本研究の成果は、細胞膜傷害毒素に関する新たな知見を提供するものである。結晶構造はPDBに登録済である(論文公表後開示予定)。
中空コアを有する星型高分子錯体の三次元的集積化による物質分離/変換メンブレン

本課題では生体の細胞膜にヒントを得て物質を選択的に透過させるチャネルを模倣した中空コアを有する高分子(高分子MOP)を合成し、それらを集積化させることで高機能メンブレンの開発することを目的とした。内部にナノ空間を有する籠状化合物である有機金属多面体(MOP)をチャネルとして起用し、MOPから高分子を重合させる手法を開発することで高分子MOPの合成に成功した。高分子MOPは溶液キャスト法により均質なメンブレンを与え、そのメンブレンは良好な二酸化炭素分離性能を発現することがわかった。また、チャネル内での触媒反応の可能性についても検討し、物質分離変換メンブレン創製へ繋がる糸口をつかむ事ができた。本研究では、中空コアを有する新規星型高分子錯体「高分子グラフトMOP」を生み出し、その大面積かつ三次元的配列により、物質透過・分離・変換を実現する高機能メンブレンの開発を目指す。平成28年度には、ケージ状化合物:MOPをコアとする新規星型高分子の合成、およびそのメンブレン作成手法の検討に注力した。重合開始部位を有する配位子をデザイン・合成し、金属イオンとの錯形成反応を介してMOPコアを合成した、その後、MOP表面よりリビング重合を開始することで、MOPを中心として合計24本の高分子が分岐した高分子グラフトMOPの合成に成功した(Divergent法)。しかし、この手法は大量合成には向かないことがわかり、別手法の開拓も続けて行った。結果、片末端に配位子部位を有する高分子を合成し、後に金属イオンとの錯形成反応を行うという別アプローチにより、全く同様の高分子グラフトMOPを合成する手法を開発した(Convergent法)。後者の方法は、高分子と金属イオンを溶液中で混ぜるだけで、任意の構造の高分子グラフトMOPを構築できる点で、大量合成に非常に有用な手法である。これらの結果は、アメリカ化学会誌へ掲載され、新聞等のメディアにも掲載された。このようにして得られた高分子グラフトMOPは、その溶液を基板上にキャストすることにより容易に薄膜を与え、メンブレン形成に適した性質を有することが明らかとなった。Convergent法はグラフトさせる高分子を選ばないため、あらゆる高分子をMOP表面より分岐させることが可能となる。本年度は、目標としていた高分子グラフトMOPの合成手法の確立を終え、次年度に予定していたメンブレンの作成まで検討することができた点で、当初の計画以上に進展していると考えている。本研究で開発した高分子グラフトMOPは、新しい分岐型高分子とも捉えることができる。開発した手法は非常に簡便に様々な分岐高分子の合成を可能にする全く新しい方法であり、論文発表と共に国際特許(PCT)の出願も行った。本研究では、中空コアを有する新規星型高分子錯体「高分子グラフトMOP」を生み出し、その大面積かつ三次元的配列により、物質透過・分離・変換を実現する高機能メンブレンの開発を目指すものである。平成28年度の成果:MOP表面よりリビング重合を開始する新手法を開発し、MOPを中心として合計24本の高分子が分岐した高分子グラフトMOPの合成に成功した(Divergent法と名付けた)。さらに別手法の開拓も進めた結果、MOPの自己組織化的形成反応を利用するという逆転のアプローチにより、全く同様の高分子グラフトMOPを非常に簡単に合成する手法を開発した(Convergent法と名付けた。Convergent法はグラフトさせる高分子を選ばないため、あらゆる高分子をMOP表面より分岐させることが可能となった。平成29年度の成果:まずは二酸化炭素/窒素の分離性能をベンチマークとして評価するため、メンブレン作成に適した高分子を選出し、その高分子をグラフトさせた高分子グラフトMOPを上記手法により合成した。その物質からメンブレンを作成し、二酸化炭素/窒素の分離試験を行ったところ、高分子だけからなる参照用メンブレンと比較して、高分子グラフトMOPのメンブレンは10倍の二酸化炭素選択性を示した。さらに、本高分子グラフトMOPを他の既存ガス分離膜と混合することで、その分離性能を向上させることにも成功した。続けて変換機能についても検討するため、MOPコア内部への触媒担持を試みた。本研究では、中空コアを有する星型高分子錯体「高分子グラフトMOP」を利用して、高機能のガス分離膜が合成可能であることを示し、物質変換機能についても触媒担持手法の可能性を探った。平成29年度は、メンブレン合成を目的として、材料の大量合成において有利であるConvergent法について詳細に検討を行い、グラフト高分子の長さ・種類・本数などにおいて最適化を図る。異種高分子から成る高分子グラフトMOPの合成にも着手する。また、将来的なメンブレン触媒反応に向けて、まずは高分子グラフトMOP単体の触媒性能について溶液反応を調査する。

ガス分離性能をテストするためのガス透過度測定装置については、平成28年度中に既に準備が整っており、必要なサイズおよび厚さのメンブレンを調製後、迅速に分離性能の検討に着手する予定である。高分子材料化学
光刺激によるヒドラの形態形成の誘導

これまでの2年間の研究によって,光条件下でヒドラを培養することによって,光が触手や精巣の形成,間細胞の増殖に作用していることを明らかにしてきた。3年目の今年度は,これまでの研究成果を発展させ,次の2点を中心に研究を行なった。1)光の作用する波長域の詳細な検討。2)神経伝達物質の投与による光形態形成の検討。1)において,20,000lxのハロゲンランプを光源として,様々なタイプの色フィルターとカットフィルターを組み合わせて特定の波長下でヒドラを21日間培養し,触手形成と精巣形成を調べた。これまで,触手と精巣形成に有効な波長域は両者で一致していると考えられてきた。しかし,本研究によって,触手形成に有効な波長域は455-470nmと800nm以上の2領域にあるが,精巣形成に有効な波長域は800nm以上の一領域だけで,触手を形成する455-470nmの領域は無効であることが判明した。このことは,触手形成と精巣形成には異なった種類の光受容体が関与している可能性を示唆している。2)において,HPLCの測定によって,神経伝達物質のモノアミン(ドーパミン,セロトニン等)が触手形成や精巣形成に関与している物質であることを示唆されている。そこで昨年はドーパミンを投与する実験を行ない,ドーパミンが触手形成に働くが精巣形成には作用しないことを明らかにした。本年は,セロトニンの効果を調べた。すると,セロトニンは新しい触手を形成するばかりでなく,精巣も誘導した。そこで,ドーパミンの追試実験を行ったところ,ドーパミンでも精巣が形成されることが明らかとなった。ヒドラの光形態形成における実験は,触手形成と精巣形成については21日間行い,細胞解離による間細胞の増殖に関する実験は7日間実施した。まず,光形態形成を誘導する光の強度をNDフィルターを使って0,312,1,250,5,000,20,000lxの5段階で検討した。1,250lx以下では新しい触手や精巣はほとんど形成されなかった。一方,5,000lxでは80%の個体に新しい触手が,20,000lxでは100%の個体に新しい触手が出現した。また,精巣の出現は5,000lxで47%,20,000lxで100%であった。以上のように触手と精巣は5,000lx以上で形成された。間細胞の増殖は,1,250lx以上で光量依存的に増殖していた。このように,ヒドラの光形態形成はいずれも光量依存的な反応であることが明らかとなった。次に,光の作用する波長域を,カットオフフィルターを用いて調べた。その結果,触手形成,精巣形成・間細胞増殖のいずれにおいても,390460の範囲であった。ヒドラを常明下と常明下で1年間長期飼育し,精巣形成を観察した。すると,常明下では,活発に精巣を形成しつづけたが,常明下では,ほとんど精巣は形成されなかった。このことからも光が精巣の形成に関与していることは明らかである。研究に着手した昨年度は,異なった光条件下でヒドラを培養することによって,光が触手形成,精巣形成,間細胞の増殖に作用していることを明らかにした。2年日の今年度は,次の3点を中心に研究を行なった。2)恒暗と恒明条件で培養した際の神経伝達物質量のHPLCを使っての比較検討。3)神経伝達物質の投与による光形態形成の検討。1)において,20,000lxのハロゲンランプを光源として,カットオフフィルターを用いて,特定の波長下でヒドラを21日間培養し,触手形成と精巣形成を調べた。その結果,触手と精巣形成に有効な波長域は両者で共通し,それは390-460nmと660nm以上の2領域にあることが明らかとなった。このことは,触手と精巣形成に関与する光受容体が同じものである可能性を示唆している。2)において,ヒドラを恒明条件で培養すると,神経伝達物質のモノアミン(ドーパミン,セロトニン等)の量が恒暗条件で培養したものより多量に存在することが,HPLCの測定によって明らかとなった。このことはモノアミンが触手形成や精巣形成に関与している物質であることを示唆している。3)の実験では,2)の結果を受けて,神経伝達物質のドーパミンを投与する実験を行なった。21日間毎日様々な濃度でドーパミンをヒドラに投与すると,新しい触手が形成された。一方,精巣はまったく形成されなかった。この結果は,光刺激によって増加したドーパミンは触手を形成するが,精巣形成には関与しない物質であることを示唆した。精巣形成には別の物質が関わっている可能性がある。

1)において,20,000lxのハロゲンランプを光源として,様々なタイプの色フィルターとカットフィルターを組み合わせて特定の波長下でヒドラを21日間培養し,触手形成と精巣形成を調べた。これまで,触手と精巣形成に有効な波長域は両者で一致していると考えられてきた。しかし,本研究によって,触手形成に有効な波長域は455-470nmと800nm以上の2領域にあるが,精巣形成に有効な波長域は800nm以上の一領域だけで,触手を形成する455-470nmの領域は無効であることが判明した。このことは,触手形成と精巣形成には異なった種類の光受容体が関与している可能性を示唆している。2)において,HPLCの測定によって,神経伝達物質のモノアミン(ドーパミン,セロトニン等)が触手形成や精巣形成に関与している物質であることを示唆されている。そこで昨年はドーパミンを投与する実験を行ない,ドーパミンが触手形成に働くが精巣形成には作用しないことを明らかにした。本年は,セロトニンの効果を調べた。すると,セロトニンは新しい触手を形成するばかりでなく,精巣も誘導した。そこで,ドーパミンの追試実験を行ったところ,ドーパミンでも精巣が形成されることが明らかとなった。
ArgosによるRasシグナルを介した細胞分化制御とアポートーシス誘導

Argosはショウジョウバエの発生におけるRasシグナル伝達経路を制御する分泌性蛋白質であり、遺伝学的及び生化学的研究によってEGF受容体の活性化を負に制御することが明らかになっている。ArgosによるEGF受容体活性化の阻害機構の解明を目的として、ArgosがEGF受容体へ結合するかどうか、そしてArgosの結合がEGF受容体にどのような影響を及ぼすのかを生化学的に解析した。得られた結果から、Argosという抑制性のリガンドが結合してEGF受容体の二量体形成を阻害するという新しいメカニズムの存在が明らかになった。ArgosによるRaS/MAPKシグナルの抑制および細胞死誘導の分子機構は完全に解明されたわけではなく、未知の分子が関与している可能性がある。これら未知の分子の同定を目的として、複眼特異的にArgosを過剰発現するトランスジェニックフライ(GMR-argos)の表現型を変化させる変異体をスクリーニングした。約140,000の個体をスクリーニングし、有意な効果を示す変異体を複数分離した。これらの変異体を解析したところ、分離した系統の中にはArgosと共通のシグナル経路を介して細胞死あるいは細胞分化の制御に関与する遺伝子の変異体が含まれているものと考えられた。これらの変異をさらにマッピングし、未知のものについては原因遺伝子をクローニングする予定である。これらの遺伝子の機能を解析することによって、Ras/MAPK経路の制御機構および機能について重要な知見が得られるものと期待している。ショウジョウバエのEGF受容体の活性化を負に制御する分泌性蛋白質Argosについて解析を行い、以下のような成果を得た。(1)複眼特異的にArgosを過剰発現するトランスジェニック系統GMR-argosを作製した。本系統の複眼を解析した結果、発生後期において過剰な細胞死が起こっていることが判明した。この細胞死は、p35及びDIAP1・DIAP2の共発現によって有意に抑制されたことから、カスパーゼが関与するプログラム細胞死であると考えられた。このArgosによる細胞死は、熱ショックプロモーターを用いて細胞分化が完了した後で活性変異型Rasを発現させることによって抑制されたことから、細胞分化異常の結果として二次的に誘導されたものではなく、むしろRasシグナルの細胞死抑制機能の低下によるものであると考えられた。すなわち、Ras/MAPKカスケードのシグナル伝達はプログラム細胞死を負に制御し生存を維持する機能を有することが明らかになった。(2)EGF受容体を発現する培養細胞株をつくり生化学的な解析を行った。ArgosがSpitz (TGF-α相同分子)によるEGF受容体及びMAPKの活性化を阻害することを確認した。リガンド非依存的に二量体を形成し活性化する変異型EGF受容体によるERKの活性化をもArgosが阻害できることを見出し、ArgosがEGF受容体を介さずに機能している可能性を示した。(3)ArgosによるRas/MAPKシグナルの抑制および細胞死誘導の分子機構は完全に解明されたわけではなく、未知の分子が関与している可能性がある。これら未知の分子の同定を目的として、GMR-argosの表現型を変化させる新しい変異体の遺伝学的スクリーニングを行った。現在までに約50,000の個体をスクリーニングし有意な効果を示す系統を複数同定し、マッピングの作業を進めている。
化学物質により誘発される脂肪変性の毒性パスウェイ解析

肝臓は化学物質暴露により最も影響を受ける臓器で、医薬品開発で肝毒性は開発中止の主な要因の一つである。早期に生じる肝毒性において、脂肪変性は肝がんにつながる可能性が高い重要な病変である。本研究では、化学物質で生じる肝脂肪変性についてタンパク質の機能的変化に注目し、遺伝子発現から組織変化までを統合的に解析してシーケンシャルな毒性パスウェイを解明する。まず脂肪変性に関連した標的分子を絞り込み、次に細胞内イベントをタンパク質レベルで検出し、最後に多層的データからの毒性パスウェイを構築する。これらを通して、化学物質暴露による肝脂肪変性の機序を明らかにし、毒性メカニズム研究の新たなアプローチを示す。
前庭神経核細胞の自動能におけるプロテインキナ-ゼCの役割に関する電気生理学的研究

延髄スライス標本において、前庭神経内側核ニュ-ロンは規則正しい自発発火を示すことから、自動能があるように考えられる。本研究ではこの自発発火において、細胞内のプロティンキナ-ゼCがどのような役割を演じているかについて電気生理学的研究を行った。ラット延髄スライス標本において、細胞外に記録した前庭神経内側核ニュ-ロンの自発発火数およびリズムは、水槽内に投与したプロティンキナ-ゼCを活性化するホルボルエステルによって影響を受けなかった。一方、酵素処理により単離した前庭神経内核ニュ-ロンについて、ホ-ルセル記録を行ったところ、静止膜電位が-6075mVにおいて、やはり規則的な自発発火がえられた。このような状態下で、外液にGABAを作用させると膜電位依存性の外向き電流がえられ、かつGABAの作用はビククリンより遮断された。従って、このようにして単離されたニュ-ロンは膜興奮性とGABA受容体機能が保持されていると考えられた。外液にホルボルエステルを投与すると自発発火リズムが乱れ群発発火がおこり、この発火につづいて過分極がおこった。次に、テトロドトキシンおよびTEAを外液に投与してナトリウムおよびカリウムチャネルをブロックしておき、さらに記録電極内にEDTAを入れ、この単離ニュ-ロンからホ-ルセル記録を行った。このような条件下で、細胞内へ脱分極パルスを与えた時にえられるカルシウム電流について検討した。この電流は外液に加えたホルボルエステルにより増大した。洗滌後はもとのレベルまでに回復した。これらのことから、プロティンキナ-ゼCの活性化により、カルシウムチャンネルが開口され、カルシウムの流入と共に自発発火が亢進し、次いでCa^<++>活性性カリウムチャンネルが開口して過分極による興奮抑制がおこると考えられる。
イギリス初期近代における宗教と演劇文化の歴史的研究

16世紀末に政治・宗教抗争が激化する下で劇場・印刷文化が発展したが、文芸への政治・宗教の影響の態様は以前想定されたよりも複雑で曖昧なものであることが明らかになってきた。文芸が孕む問題は、単に新旧両信仰の二項対立的図式では割り切れず、複雑・微妙な様相を呈した。カトリック詩人の苦悩にプロテスタント詩人が共感して影響を受ける例もあり、政治・宗教的利害より商業主義との関係が緊急である場合もあった。プロテスタント神学書を多く出版したスイスの印刷業者が、同時に異教的古典詞華集の出版も行い、結果として英国の官能的詩文学の発展に寄与した可能性も見えてきた。ヘンリー8世の時代から17世紀初頭に至る間のプロテスタント国家形成期におけるイギリス文化が抱えた問題を、主として宗教と演劇との関係という側面から解明することを目指すものである。初期近代の英国社会において、政治と宗教が緊密かつ複雑な緊張関係にあったことは良く知られる。しかしまたその一方で、宗教改革後の新たな精神状況において、演劇が教会とも政治権力とも微妙に距離を置きつつ民衆の心の拠り所となっていったことも、見逃すことのできない演劇史的事実である。本研究計画では、テューダー朝後期に急速に成長した商業演劇とそれをとりまく文化が、同時代の広義の宗教的諸問題とどのように関係したかを調査・考究するとともに、そのような劇場文化に一つの足場を置いた個々の詩人たちが、政治や宗教の力に一方で大きく依存し、それを利用しつつも、他方で両者の支配的影響力を巧妙にすり抜ける形で独自の地歩を築き上げていった過程を具体的に明らかにしていくことになる。本研究計画実施初年度の平成18年度は、研究代表者・分担者それぞれの分担テーマごとに研究を開始した。また市川真理子東北大学教授、三盃隆一金沢大学教授、玉泉八州男東京工業大学名誉教授、野崎睦美東京工業大学名誉教授、青木信義山梨大学名誉教授の5氏を研究協力者とし、専門的知識の提供、講演等を依頼し協力を得た。本研究計画による会合を計4回開催し、研究分担者・研究協力者による以下の研究発表・講演・ディスカッション・文献の輪読等を行った。「勧告論争を読む」(小野、6月)、「ロマンス的聖人表象とトマス・ディローニー」(竹村、6月)、「『ダイドー』説話群、殉死、エリザベス朝カルトー女王カルトと演劇」(山田、9月)、「シェイクスピア劇における舞台上と舞台裏」(市川、11月)、「エリザベス朝悲劇の創造について-C・L・バーバーの悲劇論を中心に」(三盃、11月)、「シェイクスピアの`Catechism'」(村井、1月)。文献討論会で扱った主たるテキスト:George Chapman, Bussy d' Ambois(1607)。調査研究は研究代表者および各研究分担者がそれぞれ独自に進めたが、海外への調査としては、竹村はるみと由井哲哉の2名を8月に英国(オックスフォード、ケンブリッジ、他)に派遣し、16・17世紀の希覯文献を中心に資料調査を行った。主たる学会発表としては、第46回シェイクスピア学会(東北学院大学、10月)で研究分担者の篠崎実がコーディネーターとなってセミナー「エリザベス1世の表象」を開催し、竹村はるみと研究代表者の清水がメンバーとして参加して研究報告と討論を行った。篠崎は『シンシアの饗宴』と『ヴィーナスとアドーニス』について、竹村はスペンサー、リチャード・ジョンソンらにおける「妖精女王」の表象について、清水は女王表象の恣意化と純粋詩的ポエティックスの発展についての研究報告を行った。以上の他にも、殉教史、宗教論争、出版、検閲、文学の世俗化、エリザベス政権末期の政治的・社会的混乱、宗教的イメージの演劇的応用、などの観点から分担して、本研究計画のテーマに沿った研究を進めている。エリザベス1世治世後期を中心に、政治的・宗教的状況と詩・演劇・出版との関係について研究協力者・研究分担者(10人)・研究協力者(3人)で分担調査を進めるとともに、年間5回の研究会会合を開き研究成果の中間報告と文献輪読・討論を行って分担者間の情報交換と研究指針の統一に努めた。研究代表者は8月に渡英し、Musaeus関係の写本と印刷本を調査した。その成果として、1580年代の祝婚歌の疑似儀式性について、平成20年7月に国際マーロウ学会(カンタベリー)で発表する予定である。分担者山田雄三はダイドー伝説の儀式性・政治性について調査した。分担者勝山貴之は、政権末期の宗教対立の中でカトリック・ロイヤリストが果たした役割について、8月に渡英調査を行い、1月の研究会で成果を報告した。分担者井出新は、8月に渡英して軍人殉教者の例などを調査し、ピューリタニズムと国家意識形成との関係を考察した。

研究分担者竹村はるみは、1570年代後半から80年代前半にかけての、レスター泊を中心とする一派のパトロネージ活動を調査した。研究分担者篠崎実は、8月に渡英し反劇場パンフレット等の調査を行った。研究分担者村井和彦は、教理問答(catechism)のエリザベス朝演劇への影響について調査した。研究分担者佐藤達郎は、Arundel Harington手稿について調査し、研究会で口頭発表した。研究分担者英知明は、John Danter印刷所関係の資料を調査し、初期近代に文学・演劇が「書物」化する過程を考察した。研究分担者由井哲哉は、Henry Chettleを中心に1590年代の散文文学の状況を調査した。以上の分担調査を通して、エリザベス政権後期の政治・宗教状況と演劇・出版文化との複雑な絡み合いを多面的に眺め、その時代の特色を歴史的に明らかにする作業を進めている。平成20年度は5月、7月、9月、11月、1月の計5回研究会を開催し、意見交換、文献討論、研究方向の確認をしつつ本共同研究を進めた。研究代表者は、宗教改革期イタリアおよびスイスの印刷業者による古典対訳本の英国への流入状況とそれが英国演劇と詩に及ぼした影響などを中心に調査した。特にスイスのカルヴァン派印刷業者による出版物が英詩・英国演劇に与えた影響が大きいことが次第に明らかになってきた。この研究成果の一部を、平成20年5月の日本英文学会第81回大会シンポジアムで発表予定である。研究分担者・連携研究者による分担としては、1580年代以降におけるロマンスと散文の変質(由井)、宗教的急進主義の言説と国民国家形成の関係について道徳劇他のテキストによって考察(井出)、エセックス伯をめぐる政治・宗教状況と大衆演劇の関係(佐藤)、ダイドー劇の改作状況をめぐる歴史的考察(山田)、16世紀末王権下の劇場における宗教的・経済的自由の発展(前沢)、カトリック穏健派詩人における想像力の問題(勝山)、レスター伯を中心とする急進派プロテスタントの詩人たちの出版戦術(竹村)、演劇における「男装」の宗教的・社会的意味について(篠崎)、演劇におけるレトリックと宗教的レトリックとの関係(村井)を、それぞれ調査・検証し、現在は、21年度末にそれぞれの成果を纏めるべく準備を進めている。平成21年度は、5月、7月、9月、11月、1月の計5回、研究会会合を開催し、研究代表者、同分担者、連携研究者、研究協力者による研究成果の報告と討論を行った。そこで報告された主なテーマは、「栄光」の概念の推移、ロマンス文学翻訳をめぐる政治的・宗教的コンテクスト、劇場空間における詩的手法の応用、シェイクスピア悲劇の改作の変遷における治的・宗教的コンテクスト、大学出身劇作家の評伝研究における方法的問題、大陸のプロテスタント系印刷業者による古典文学出版の宗教的・政治的・商業的コンテクストなどである。本研究はエリザベス政権後半における政治的・宗教的抗争というコンテクストを踏まえた上で、その状況の中からいかに新しいドラマツルギーとポエテックスが成長を遂げたかを追跡した。研究代表者は研究組織全体の成果を取りまとめる作業を行うとともに、以下の研究成果を得た。
性寄生細菌ボルバキアが誘起する生殖異常の逆遺伝的解析

ボルバキア属の細菌は,多くの昆虫に感染する細胞内リケッチア様細菌で,宿主に雄殺し,性転換,産雌単為生殖,細胞質不和合など,多様な生殖異常を引き起こす.これらの現象は,基礎生物学的に興味深いだけでなく,昆虫の生殖操作による有益昆虫の増産や害虫の肪除に応用でる可能性をもつが,その分子機構は分かっていない.本研究はボルバキアの形質転換技術を開発し,逆遺伝学的手法により生殖異常の分子機構を解明することを目的として遂行した.本研究では,申請者らが発見したボルバキアに感染するファージを利用して,ボルバキアへの遺伝子導入ベクターを構築するために,このファージのゲノム構造を解析した.ボルバキア感染昆虫(スジコナマダラメイガ)からファージ粒子を精製し,そこから抽出したDNAを解析し,ファージは約20kbpの直鎖状2本鎖DNAをもつことを示した.さらにその全塩基配列を決定した.塩基配列からは,ファージの複製開始点を同定できなかったが,ファージ・ゲノム上にはボルバキア細胞内で複製されるために必要な構造が揃っているはずである.ファージ・ゲノムの任意の領域をPCR法で増幅し,大腸菌プラスミド等に組み込むことにより,ボルバキア細胞内でも複製されるシャトル・プラスミドを作製する準備が整った.ファージ・ゲノムは24のORFを含むと推定され,その中の一つ(Gp15)は,羊腐蹄症の原因細菌がもつファージ由来の病原遺伝子と相同性を示した.細菌の病原性を規定する遺伝子はファージ感染に由来することが多く,ボルバキアによる宿主の生殖撹乱の原因遺伝子がファージ上に存在する可能性を指摘した.また,定量PCR法を応用してボルバキア感染密度を測定し,感染密度と細胞質不和合の強度に正の相関があること,ボルバキアの増殖は主に宿主側の因子によって制御されることを示唆した.多くの節足動物の細胞内に寄生するボルバキア属の細菌は,宿主の生殖に干渉し,性転換,単為生殖,雄殺し,雄の不妊化などの生殖異常を誘起する。これらの生殖異常は細胞内に存在する寄生生物が宿主の有性生殖に歪みを生じさせるというきわめて興味深い現象であり,また生殖操作を利用した新技術の開発にも応用できる可能性をもつが,その分子機構はまったく分かっていない。本研究はボルバキアの形質転換技術を開発し,逆遺伝学的手法により生殖異常の分子機構を解明することを目的とする。本研究に先立ち,ボルバキアに感染するファージが存在することを発見した。このファージを遺伝子導入ベクターとして利用すれば,ボルバキアの形質転換法が開発できると期待される。本研究では,さまざまなボルバキア感染昆虫から超遠心法によるファージ粒子の精製を試み,スジコナマダラメイガから多量の粒子を得ることに成功した。粒子から抽出したDNAを解析し,このファージは約20Kbの直鎖状2本鎖DNAをゲノムとしてもち,ラムダファージに比較的近縁であることを明らかにした。また,異なる系統のボルバキアに2重感染した昆虫を材料にファージ感染状況を解析し,ファージがボルバキア間で水平感染することを確認した。これによりファージを利用した形質転換が可能であることが裏付けられた。形質転換法を開発するためには,ボルバキアを培養することが不可欠である。そこで培養法の検討を行い,スジコナマダラメイガ由来のボルバキアを蚊の培養細胞に感染させ,in vitroで培養することに成功した。ボルバキア属の細菌は,多くの昆虫に感染する細胞内リケッチア様細菌で,宿主に雄殺し,性転換,産雌単為生殖,細胞質不和合など,多様な生殖異常を引き起こす.これらの現象は,基礎生物学的に興味深いだけでなく,昆虫の生殖操作による有益昆虫の増産や害虫の肪除に応用でる可能性をもつが,その分子機構は分かっていない.本研究はボルバキアの形質転換技術を開発し,逆遺伝学的手法により生殖異常の分子機構を解明することを目的として遂行した.本研究では,申請者らが発見したボルバキアに感染するファージを利用して,ボルバキアへの遺伝子導入ベクターを構築するために,このファージのゲノム構造を解析した.ボルバキア感染昆虫(スジコナマダラメイガ)からファージ粒子を精製し,そこから抽出したDNAを解析し,ファージは約20kbpの直鎖状2本鎖DNAをもつことを示した.さらにその全塩基配列を決定した.塩基配列からは,ファージの複製開始点を同定できなかったが,ファージ・ゲノム上にはボルバキア細胞内で複製されるために必要な構造が揃っているはずである.ファージ・ゲノムの任意の領域をPCR法で増幅し,大腸菌プラスミド等に組み込むことにより,ボルバキア細胞内でも複製されるシャトル・プラスミドを作製する準備が整った.ファージ・ゲノムは24のORFを含むと推定され,その中の一つ(Gp15)は,羊腐蹄症の原因細菌がもつファージ由来の病原遺伝子と相同性を示した.細菌の病原性を規定する遺伝子はファージ感染に由来することが多く,ボルバキアによる宿主の生殖撹乱の原因遺伝子がファージ上に存在する可能性を指摘した.また,定量PCR法を応用してボルバキア感染密度を測定し,感染密度と細胞質不和合の強度に正の相関があること,ボルバキアの増殖は主に宿主側の因子によって制御されることを示唆した.
弱パネル型角形鋼管柱・はり接合部の復元力特性に関する研究

弱パネル型角形鋼管柱・H形鋼はり接合部の復元力特性を評価する目的で次のような実験を行った。1.パネル耐力比の違いによる柱はり接合部の弾塑性挙動の相違を明確にすることを目的に,種々のパネル耐力比を有する柱はり接合部をもつ十字形試験体の単調載荷実験を行った。2.パネル周辺枠組のみの復元力特性を明らかにするために,接合部パネルを除去した試験体の単調載荷実験を行った。3.単調載荷時で求められた復元力特性を繰返し載荷時において適用できることを検証するために繰返し載荷実験を行った。4.柱軸力が柱はり接合部の復元力特性に及ぼす影響を調べるために定軸力下における繰返し載荷実験を行った。5.合成ばりが柱はり接合部の復元力特性に及ぼす影響について評価するために,コンクリートスラブ付き試験体の繰返し実験を行った。以上のような載荷実験から以下のような結論が得られた。1.単調載荷時における柱はり接合部の復元力特性は,接合部パネルとパネル周辺枠組のそれぞれの復元力特性を求めて加え合せることにより大略予測できる。2.繰返し載荷時における柱はり接合部の復元力特性は,単調載荷時のものに移動硬化則を適用して拡張することにより大略予測できる。3.弱パネル型柱はり接合部を有する試験体において,試験体全体の荷重変形関係は,柱はり接合部の弾塑性挙動さえ考慮すれば柱及びはりを弾性体とみなしてもほぼ予測できる。4.降伏軸力比0.2程度の柱軸力は,柱はり接合部の復元力特性にはほとんど影響を及ぼさない。5.鉄筋コンクリートスラブの影響により,柱はり接合部の耐力は数10%上昇する。今後の研究計画としては,パネル周辺枠組の復元力特性を解析的に予測すること,また,本研究においては,載荷繰置の制約のために大ひずみ領域までの繰返し載荷実験ができなかったので,試験体寸法を縮小して大ひずみ繰返し載荷実験を行うこと等を予定している。パネル耐力比の違いによる角形鋼管柱・H形鋼はり接合部の弾塑性変形性状の相違を明確にすることを目的に,パネル耐力比が0.6,0.8,1.0,2.0となる接合部をもつ4体の十字形試験体の単調加力実験を実施した。また接合部をパネルとパネル周辺枠組に分離して別々に評価する手法の適用性を検討するために,パネル周辺枠組の抵抗のみを求める目的で,接合部パネルを除去した同種の4体の試験体についても併せて実験を行った。以上の実験の結果,次のことが明らかになった。1.接合部パネルに貼付したロゼット・ゲ-ジの測定値から求められたせん断ひずみ度と,接合部パネルの上下端の相対変位から計算されたものとがほぼ等しくなるので,接合部パネルは純せん断変形すると考えられる。2.接合部におけるパネルモ-メントとせん断ひずみ度の関係は,素材試験結果より求められる接合部パネルの荷重・変形関係に,パネルを除去した試験体の実験結果より求められる周辺枠組の関係を加えることによりほぼ推定できる。3.弱パネル型接合部を有する十字形試験体の荷重・変形関係は,接合部の荷重・変形関係として実験により得られた弾塑性のものを適用すれば、柱及びはりを弾性体として取り扱ってもほぼ良好な推定値が得られる。

4.弱パネル型の試験体では,実験終了時まではりはほぼ弾性状態であると考えられる。5.スカラップ近傍のはりフランジにおいて,内側のひずみの方が外側のものより大きくなる。6.接合部近傍のはりウェブのひずみ分布は,はり理論とは逆方向になる場合がある。今後は,繰返し加力実験を行うことにより,スカラップの存在に起因するはりフランジの破断について検討する予定である。また,平成4年度に計画しているコンクリ-トスラブ付き十字形試験体の加力実験についても,パネル耐力比としては,0.6,0.8,1.0,2.0の4種類を採用する予定である。昨年度において弱パネル型角形鋼管柱・H形鋼はり接合部の復元力特性を評価するために、十字形部分架構試験体の単調載荷実験を行った。接合部パネル周辺枠組の復元力特性のみを評価する目的で、角形鋼管柱の接合部パネルを除去した十字形試験体についても併せて載荷実験を行い弱パネル型柱はり接合部の復元力特性が接合部パネルとパネル周辺枠組の復元力特性の和で求められることを示した。本年度においては繰返し載荷を受ける柱はり接合部の復元刀特性を評価するために、昨年度と同じ寸法を有する試験体の繰返し載荷実験を行った。また、柱軸力が柱はり接合部に及ぼす影響を調べるために、降伏軸力の20%の定軸力下における繰返し載荷実験を行った。更に、合成ばりを有する試験体についても繰返し実験を行った。以上の実験結果より次のようなことが明らかになった。1)繰返し載荷を受ける弱パネル型柱はり接合部の復元力特性は単調載荷時のものに移動硬化則を適用して求めた履歴曲線で大略抗定できる。2)弱パネル型柱はり接合部を有する試験体においては、骨組の全エネルギー吸収量のうち大部分を柱はり接合部が分担するので、骨組の荷重変形関係は柱はり接合部のみに弾塑性復元力特性を適用すればほぼ予測できる。3)軸力比0.2の柱軸力を受ける柱はり接合部の復元力特性は柱軸力のないものとほぼ同一の傾向を示した。4)合成ばり試験体の柱はり接合部の耐力は、純鉄骨ばりのものに比べて1030%程度上昇する。5)合成ばり試験体の柱はり接合部の吸収エネルギー分担率は、パネル耐力比0.6の場合には、純鉄骨ばりのものとほぼ同等の値となったが、パネル耐力比1.0の場合には、純鉄骨ばりのものより高い値となった。6)はりウェブのスカラップの存在に起因するはりフランジの破断はいずれの試験体にも起こらなかった。今後、パネル周辺枠組の復元力特性についての解析的研究を行う予定である。
食環境感受性バイオモジュレーターとして機能するトランスグルタミナーゼの解析

本研究の目的は、細胞の多様な機能に深く関係すると考えられている、カルシウム依存性のタンパク質修飾酵素トランスグルタミナーゼ(TGase)の、生理機能や制御機構を分子レベルで理解し、食環境に起因するシグナル因子が本酵素の関与する生体制御とどのように関連しているかを解明することである。1.動物肝抽出液中のTGaseアミン受容体基質タンパク質の検索と同定一肝抽出液の内因性TGaseによるタンパク質へのビオチンカダベリン導入反応を行った。反応生成物をアビジンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーにかけ、TGaseの基質候補タンパク質を得た。N-末端部アミノ酸配列の解析と配列ホモロジー解析から、モルモット肝抽出液ではθ型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-θ)が、ラット肝油出液ではグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)がそれぞれ同定された。マウス、ラットおよびモルモットの肝抽出液からは、ベタイン-ホモシステインメチルトランスフェラーゼが基質として同定された。精製したヒト胎盤GSTやウサギ骨格筋GAPDHについても、TGaseによるアミン基質の導入が確認できた。GSTやGAPDHはTGaseによる分子間架橋反応の基質にはならなかった。これらの酵素タンパク質の機能が、TGaseによるアミン導入修飾で、どのように制御されるかを解析することが次の課題である。2.肝細胞TGaseのシグナル因子応答性-インスリンは、食環境への適応をもたらす代表的なシグナル因子である。まずヒト肝癌細胞株HepG2を用いて、TGaseのインスリン応答性を解析した。HepG2細胞のインスリン受容体をA型優位あるいはB型優位にしても、インスリン作用により細胞のTGase活性は有意な変化をみせなかった。HepG2細胞のTGase活性はグルカゴン、インスリン様成長因子IおよびIIにも応答しなかった。動物組織を構成する各種細胞の多様な機能に深く関係すると考えられている、カルシウム依存性のタンパク質修飾酵素であるトランスグルタミナーゼ(TGase)の、生理機能や制御機構を分子レベルで理解し、食環境に起因する多様なシグナル因子が本酵素の関与する生体制御とどのように連係しているかを解明する。1,動物肝抽出液中のTGase基質タンパク質の検索と同定-各種動物肝の抽出液にビオチンカダベリンを加え、内因性TGaseによるタンパク質へのビオチンカダベリン導入反応を行った。N-末端部アミノ酸配列の解析と配列ホモロジー解析から、モルモット肝抽出液ではθ型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-θ)が、ラット肝抽出液ではグリセルアルデヒド3ーリン酸脱水素酵素(GAPDH)がそれぞれ同定された。2,肝細胞TGaseのインスリン応答性-インスリンは、食環境への適応をもたらす代表的なシグナル因子である。ヒト肝癌細胞株HepG2を用いて、TGaseのインスリン応答性を解析している。HepG2細胞のインスリン受容体をA型からB型優位に変換すると、インスリンにより細胞のTGase活性が増加する現象が、予備実験でみられた。インスリンの誘起する多彩な細胞内作用にTGaseが関与する可能性について解析して行きたい。TGaseの生理的活性抑制機構の解明-微生物の代謝産物中にTGase阻害活性をもつ物質を見出している。本研究の目的は、細胞の多様な機能に深く関係すると考えられている、カルシウム依存性のタンパク質修飾

酵素トランスグルタミナーゼ(TGase)の、生理機能や制御機構を分子レベルで理解し、食環境に起因するシグナル因子が本酵素の関与する生体制御とどのように関連しているかを解明することである。1.動物肝抽出液中のTGaseアミン受容体基質タンパク質の検索と同定-肝抽出液の内因性TGaseによるタンパク質へのビオチンカダベリン導入反応を行った。反応生成物をアビジンゲルによるアフィニテイークロマトグラフィーにかけ、TGaseの基質候補タンパク質を得た。N-末端部アミノ酸配列の解析と配列ホモロジー解析から、モノレモット肝抽出液ではθ型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-θ)が、ラット肝抽出液ではグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)がそれぞれ同定された。マウス、ラットおよびモルモットの肝抽出液からは、ベタイン-ホモシステインメチルトランスフェラーゼが基質として同定された。精製したヒト胎盤GSTやウサギ骨格筋GAPDHについても、TGaseによるアミン基質の導入が確認できた。GSTやGAPDHはTGaseによる分子間架橋反応の基質にはならなかった。これらの酵素タンパク質の機能が、TGaseによるアミン導入修飾で、どのように制御されるかを解析することが次の課題である。2.肝細胞TGaseのシグナル因子応答性-インスリンは、食環境への適応をもたらす代表的なシグナル因子である。まずヒト肝癌細胞株HepG2を用いて、TGaseのインスリン応答性を解析した。HepG2細胞のインスリン受容体をA型優位あるいはB型優位にしても、インスリン作用により細胞のTGase活姓は有意な変化をみせなかった。HepG2細胞のTGase活性はグルカゴン、インスリン様成長因子IおよびIIにも応答しなかった。
アルツハイマー病における失書の特徴とその発現機序

軽症アルツハイマー病(以下、AD)患者において漢字の書き取りに障害があることが見出され、書き誤りの特徴として無反応が多くみられた。書き誤りと局所脳血流との関連から、書き誤り総数は、左下頭頂小葉の血流低下と相関があり、無反応は、左下頭頂小葉、左中・下側頭回後部、中前頭回の血流低下と相関が見られた。本研究において無反応と相関が見られた部位における血流低下は漢字の字形想起、保持さらに書字につながる運動過程に負の効果を持つ可能性があり、書字に必要となる神経ネットワークの機能不全と関連していることが示唆される。本研究では、アルツハイマー病(以下AD)の失書症状にみられる質的特徴を把握するために、書字と他の言語機能との関連、さらに記憶や構成といった認知障害間の関連性を見出し、どのような認知機能障害に伴って書字の障害が出現するのかを横断的、縦断的に検討していく。さらに、ADの書字障害の特徴から、脳損傷患者で得られてきている失書症状との異同について考察し、失書の発現機序について検討していく。欧米語圏で得られている知見とともに日本語に特有な失書の特徴についても検討することで書字のメカニズムを心理学的に解明し、脳機能画像検査データとの相関も用いることにより神経基盤との関連についても考察する。老年・初老期発症AD群に関して、横断的検討に参加した被験者に書字課題の再評価、その他の認知課題を行ない、縦断的変化についての検討を行なった。今後も継続していく予定である。視覚、構成、記憶、注意といったいくつかの認知機能的側面と失書症状の関わりについて考察し、症例群としての特徴を調べる。症例検討として、非典型的な老年発症・初老期発症AD例の2症例について失書症状についてさまざまな検査を施行し今後も続けていく。これらの症例は漢字が思い出せず、字形想起困難が強い症例と漢字の形態はかなり想起可能ではあるものの構成障害が強い症例である。これら2例には他の症例とは異なり、軽症であるにもかかわらず形態的な錯書が多くみられた。この錯書と漢字の形態的処理障害、記憶障害、構成障害、書字運動覚の障害などとの関連から症例間の違い、他の症例との違いについて検討をおこなっているところである。どのような認知機能障害が書字に影響をもたらしているのかについて考察を進め、書字障害の特徴、経時的な変化についてもまとめる。研究の遂行に当たっては十分に配慮するとともに被験者の同意書を徴し、プライバシーを厳重に保護して研究を進めていく。さらに、ADの書字障害の特徴から、脳損傷患者で得られてきている失書症状との異同について考察し、失書の発現機序について検討した。視覚、構成、記憶、注意といったいくつかの認知機能的側面と失書症状の関わりについて考察し、症例群としての特徴を調べた。症例検討として、非典型的な老年発症・初老期発症AD例の2症例について失書症状についてさまざまな検査を施行した。この錯書と漢字の形態的処理障害、記憶障害、構成障害、書字運動覚の障害などとの関連から症例間の違い、他の症例との違いについて検討をおこなった。研究の遂行に当たっては十分に配慮するとともに被験者の同意書を徴し、プライバシーを厳重に保護して研究を行なった。