hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜臨界水とハニカム型構造体触媒による非食料セルロースの連続式加水分解反応場の創製

平成23年度は,本研究の基盤技術となる構造体触媒の調製と,その基本物性の測定調査を中心に検討した。具体的には,担体としてメタルハニカム基材(アルミニウム製の円筒形:50mm×18φ,セル密度:100cpsi)を選定し,セルロースの加水分解反応促進のための触媒成分(Ru/Al2O3系やPt/Al2O3系)を,ゾルーゲル法と無電解めっき法の組み合わせ技術を活用してそのフィン基材上に創製した。その際,亜臨界水環境下でも強固な触媒成分の付着強度の実現化に留意した。また,調製した触媒を試料とした種々のキャラクタリゼーション(X線回折測定,走査型電子顕微鏡による表面観察,エネルギー分散型元素分析など)を実施し,調製した構造体触媒の物理化学的な物性評価を行なった。得られた結果は次の通りである。(1)アルミニウムのゾル溶液のフィン基材上への塗布と,その後の焼成処理,そして貴金属成分の無電解めっき操作により,0.1mm厚のフィン基材上に均一で均質な触媒成分の創製が可能となった。(2)ゾル溶液の組成とエージング処理,無電解めっき浴の組成とめっき条件は創製する触媒層の物性に大きく影響することがわかった。(3)めっき層の成分は,γーアルミナが主であり,RuやPtなどの貴金属担持量は約15wt%であった。平成24年度は,前年度において課題として残った臨界流体の創製ならびに触媒性能評価装置の製作を年度前半の重点課題として取り組み,予定通りにその目的が達成できた。装置は縦型ラック形式とし,亜臨界状態の精緻な制御とモニタリングのために加圧系と昇温系の操作に工夫を加えた。そして,前年度に調製したRu系構造体触媒のセルロースの加水分解特性について評価を実施し,当初の計画スケジュールに沿った進行となった。構造体触媒の創製に関する検討内容も,ほぼスケジュール通りであった。すなわち,前年度に開発したRu系触媒の評価とその結果を反映した触媒チューニングの実施,他の触媒成分系の文献調査とそこから判断された候補触媒系の試作,および構造体化,そしてセルロースの加水分解特性の評価を実施した。また,それぞれの触媒系に関したXRD測定やXPS測定による触媒成分系の状態観察や,SEM観察による触媒構造の把握などの物性測定についても順調に実施することができた。以上のことから,本年度の研究推進はほぼ計画通りに進行しているものと考えられる。平成23年度の実施計画の一つである,"セルロースの加水分解反応用構造体触媒の調製とその物性測定"に関する項目は,計画以上の成果が得られた。ハニカムフィン上への触媒成分を担持するために本研究で採用するゾルーゲル法と無電解めっき法の組み合わせ技術において,亜臨界水下でも付着強度の良好な触媒層を創製しなければならないという観点から,当初はゾル溶液の組成や条件,無電解めっき液の組成やめっき条件の最適化に時間がかかることが予想された。しかし,研究代表者が保有する構造体触媒の調製に関するこれまでの知識と技術を生かすことができ,フィン基材上に均一で良質な触媒成分の創出に成功した。また,得られた構造体触媒の物性測定の実施から,フィン基材上には加水分解に必要な所定の触媒成分が正しく担持されていることが明らかとなった。一方,構造体触媒の性能評価のための亜臨界水発生装置の製作は少し予定より遅れていることが計画外であった。
培養ヒト皮膚細胞により再構成されたヒト皮膚モデルを用いた創傷治癒の研究

本研究の目的は今まで使用してきた人工皮膚材料にさらに組織工学的手法を用いて改良を加えヒト皮膚モデルとし、これに対して創傷を作製して実際の皮膚における創傷治癒過程をシミュレーションして解明することである。平成16年度はヒト皮膚モデルに各種創傷治癒因子を付加した際の創傷治癒反応の変化を明らかにするための基礎実験を行った。具体的には作製の際に組織工学的手法を用いて標本の厚みを変化させ、それに伴う創傷治癒の変化についての病理組織学的検索を行った。標本内にメラノサイトやマクロファージを組み込んでの研究はアメリカ合衆国でのBSE発生に伴い、購入する予定であった凍結細胞の培養液中にBSE危険部位であるウジ下垂体抽出液を含んでいることにより輸入が禁止されたことにより断念した。平成17年度はヒト皮膚モデルに各種創傷治癒因子を付加した際の創傷治癒反応の変化を明らかにした。培養液中にbFGFやVEGFなどのサイトカイン類を付加する研究については、基礎的な実験としてそれらのサイトカイン類を含むプラセンタ溶液を線維芽細胞、表皮角化細胞の培養液中に添加してその至適培養条件を検索した。さらに人工皮膚標本の創傷作成後の培養期間中に培養液内に各種濃度のプラセンタ溶液を付加してその創傷治癒に及ぼす影響を調べた。人工皮膚標本の表皮層についてはプラセンタを培養液中に0.1%添加した場合にもっとも創傷治癒が促進され、それ以上でも以下でも創傷治癒は遷延した。真皮層では濃度に依存して創傷治癒が促進された。以上より当研究で使用している人工皮膚標本は実際の皮膚の創傷治癒をある程度シミュレーションすることが可能であることが推察された。平成16年度はヒト皮膚モデルに各種創傷治癒因子を付加した際の創傷治癒反応の変化を明らかにする予定であった。具体的には作製の際に組織工学的手法を用いて標本の厚みを変化させるとともに、標本内にメラノサイトやマクロファージを、培養液中にbFGFやVEGFなどのサイトカイン類を付加する計画であった。現在までに人工皮膚標本の厚みを変化させて、それに伴う創傷治癒の変化についての病理組織学的検索を進めている。さらに人工皮膚標本の創傷作成後の培養期間中に培養液内にプラセンタ溶液を付加しての実験を行いその効果を調べた。標本内にメラノサイトやマクロファージを組み込んでの研究はアメリカ合衆国でのBSE発生に伴い、購入する予定であった凍結細胞の培養液中にBSE危険部位であるウシ下垂体抽出液を含んでいることにより、輸入が禁止されており現在まで行っていないが、今後BSE発生がなく安全とされているニュージーランド産ウシ下垂体抽出液を含む培養液を使用した凍結細胞の供給体制が整い次第実験を行う予定である。標本内にメラノサイトやマクロファージを組み込んでの研究はアメリカ合衆国でのBSE発生に伴い、購入する予定であった凍結細胞の培養液中にBSE危険部位であるウシ下垂体抽出液を含んでいることにより輸入が禁止されたことにより断念した。

平成17年度はヒト皮膚モデルに各種創傷治癒因子を付加した際の創傷治癒反応の変化を明らかした。培養液中にbFGFやVEGFなどのサイトカイン類を付加する研究については、基礎的な実験としてそれらのサイトカイン類を含むプラセンタ溶液を線維芽細胞、表皮角化細胞の培養液中に添加してその至適培養条件を検索した。さらに人工皮膚標本の創傷作成後の培養期間中に培養液内に各種濃度のプラセンタ溶液を付加してその創傷治癒に及ぼす影響を調べた。人工皮膚標本の表皮層についてはプラセンタを培養液中に0.1%添加した場合にもっとも創傷治癒が促進され、それ以上でも以下でも創傷治癒は遷延した。真皮層では濃度に依存して創傷治癒が促進された。以上より当研究で使用している人工皮膚標本は実際の皮膚の創傷治癒をある程度シミュレーションすることが可能であることが推察された。
リポ蛋白刺激による単球上の表面抗原Mac-1を介する凝固開始機構の検討

1.目的:in vitroにおける、リポ蛋白添加によるヒト単核球あるいは単球の凝固活性化について検討したので報告する。2.方法:種々の濃度VLDL、LDL、HDLを、単核球、単球、リンパ球にそれぞれ添加し、37°C、5%CO_2下で培養し、浮遊液のprocoagulant activity(PCA)、tissue factor(TF)-like activity、TF抗原量を測定した。3.成績:(1)単核球の検討:単核球(単球20%、リンパ球80%の混合)にVLDLを添加した浮遊液では、濃度依存的にPCA、TF-like activity、TF抗原量は増加し、100μg/ml VLDLの添加にてTF-like activityは対照の約20倍、TF抗原量は対照では感度以下であったのに対し、762±79pg/10^5cellまで著増した。LDL、HDLを添加した場合、低濃度では対照と有意差を認めなかったが、100μg/mlの濃度にて対照と有意差を認めた。(2)単球の検討:単球にVLDLを1μg/ml、50μg/mlと各濃度を加えて培養し、浮遊液中のPCA、TF-like activityを測定すると、対照と比較して有意に上昇していた。(3)リンパ球の検討:リンパ球に種々のリポ蛋白を添加した浮遊液では、PCA、TF-like activity、TF抗原量は対照と有意差を認めなかった。4.考察:今回の検討より、VLDLは単球を活性化し、TF産生を促進すると考えられ、高脂血症患者における凝固亢進状態を引き起こす要因のひとつになるかもしれない。リンパ球にリポ蛋白を添加した場合にはTF-like activityを認めず、リンパ球と単球の混在した場合に、より高いTF-like activityを認める可能性が示唆され、この点については今後さらに検討を要する。
糖尿病性心筋障害の病態に関わる分子の探索及び機能解析

目的;糖尿病自体が心筋の構造変化や心筋障害を引き起こす病態は糖尿病性心筋症として知られており、その増悪因子として高血糖や低血糖また酸化ストレスの関与が示唆されているものの未だ詳細は明らかでない。そこで我々は糖尿病性心筋障害の発症病態に関わる分子の探索や機能解析を本研究の目的とした。内容;我々は以前行ったストレプトゾトシン(STZ)投与後の糖尿病ラットの心臓におけるマイクロアレイの結果より、アラキドン酸12/15-リポキシゲナーゼ(12/15-LOX)に注目した。野生型マウスにSTZを投与し高血糖状態が維持されると、徐々に心機能低下が見られ、組織学検索では炎症系サイトカイン(TNF-α、NFkB)や酸化ストレスの増加及び心筋線維化が見られた。またSTZ投与後の心臓で投与後4週をピークに12/15-LOXの発現及び下流分子である12/15-HETEも増加した。次に12/15-LOX KOマウスにSTZを投与しその後の心機能や心臓での発現分子、組織学検索を比較検討したところ、炎症系サイトカイン及び酸化ストレスが抑制され、心機能の悪化も見られなかった。またin vitroの実験において、ラット初代心筋細胞に高血糖刺激を与えると、TNF-a、4-HNEの発現亢進が見られ、12/15-LOX阻害薬投与でその効果はキャンセルされた。これらの結果より、高血糖が引き起こす心臓における12/15-LOXの発現が心筋酸化ストレスを介し,心筋症を発症させるメカニズムが考えられた。また近年,1型および2型糖尿病および関連する心血管合併症,高血圧症,腎疾患,アルツハイマー病やパーキンソン病などの病態の発症に12/15-LOXが関与していることが示されており、12/15-LOXの抑制は心筋症のみならず,糖尿病が引き起こす動脈硬化,糖尿病性腎症,末梢神経障害にも有用な可能性があると考えられた。今回我々は糖尿病性心筋障害の発症病態に関わる分子の探索や機能解析を本研究の目的とする。Wisterラットにストレプトゾトシン(STZ)を投与した持続性高血糖ラットの心不全期の心臓でマイクロアレイを行ったところ、コントロール群と比較しアラキドン酸12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)の発現が著明に上昇していた。そこで今回、高血糖刺激に伴う心臓における12-LOXの作用を検討することした。野生型マウスにSTZを投与して持続性高血糖マウス(糖尿病心筋症モデル)を作成する。そして持続性高血糖マウスを用いて、12-LOX -炎症系サイトカイン及び酸化ストレスの関与を心臓において確認する。また、12-LOX欠損マウスを用い、野生型同様にSTZ投与して心機能の変化を心臓超音波検査を用いて検討する。またSTZ投与1216週後の心臓組織標本を各々作製し、各種免疫染色を行い、発現の程度や分布を調べる。また、心臓組織内の12-LOXの発現及び炎症系サイトカインや線維化マーカーの発現を、RT-PCR法もしくはウエスタンブロッティング法で確認する。その後結果次第では12-LO阻害薬や抗酸化ストレス剤を用いた実験も考慮する。培養新生児ラット心筋細胞・心筋線維芽細胞に高血糖刺激(450mg/dl)を行い、12-LOX及び炎症系サイトカインの発現をRT-PCR法を用いて、コントロール群(100mg/dl)と比較検討する。

高血糖刺激で12-LOXの発現の亢進が見られたら、12-LOX酵素阻害薬(CDC)を用いて12-LOX抑制する実験も検討する。また、高血糖刺激のみならず、低血糖刺激や血糖変動刺激に伴う心筋細胞における障害の評価も行っていく。12-LOX及び炎症系マーカー、酸化ストレスの発現、細胞死の有無もチェックしていく。in vivoにおいて、12-LOXノックアウトマウスを使った実験において、野生型マウスと比較し、有意に高血糖負荷による心機能低下が抑制されたこと。組織学検索においても有意に線維化がノックアウトマウスで軽減されていた。また炎症系サイトカイン、酸化ストレスの発現もノックアウトマウスにおいて有意に軽減していたため、予定通りに実験が進められた。また、STZ投与の野生型マウスの作成も順調に作成可能であり、またノックアウトマウスの産生においても順調に増えており、マウスワークでの実験進行が滞らなかったこと。現在in vitroの実験系でも高血糖刺激を心筋に与え、よいデータが出ており、高血糖刺激のみならず、低血糖、血糖変動刺激における心筋障害を評価している。in vitroにおける実験において、12-LOX阻害薬を使用し、高血糖刺激に伴う炎症系マーカーや酸化ストレスの発現と、12-LOXの関係を確認していく。またTNF-αの上昇後の下流の検索としてNFkBの存在を考えており、野生型高血糖マウスと12-LOXノックアウトマウス群の心臓におけるNFkBの発現を確認して行く。また、in vivoの追加実験として抗酸化ストレス剤(NAC)を野生型高血糖マウスに投与し、コントロール群との心機能の評価を行っていく。それに合わせて、酸化ストレスの抑制の程度や、炎症系マーカーの発現を週令を追って確認する。抗酸化ストレス剤投与後の、心臓組織学検索も行う予定である。データが出そろったところで、論文形式にまとめていく。昨年、実験の進行が予定より進んだため、前倒し申請行った。その後ELISA kitや各種抗体の購入行った。また今後阻害薬や抗酸化ストレス剤、また各種抗体を引き続き購入予定である。またマウスの系統維持及び血糖変動モデルマウスの作成にあたり、自動えさやり機能の付いたマウスケージを購入する予定。このケージの購入のため、昨年前倒し申請行ったが、現時点まだ購入できていない状況である。よって今年度残金が余っている状態である。今年、血糖変動モデルマウスの作成及び解析を行う予定である。その作成にあたり自動えさやり機能付きマウスケージを購入予定である。実験計画としては、心筋細胞における低血糖刺激や血糖変動刺激の作用を調べていく。In vitroでは心筋細胞に低血糖刺激及び血糖変動刺激を与え、それに伴う影響を評価して行く。細胞死や炎症系サイトカインの関与、またp53の発現の程度を合わせて評価して行く予定である。そして、in vivoモデルとして血糖変動マウスモデルの確立も検討したいと考えている。
第一原理分子動力学法による超臨界水中の新規な有機反応経路の解明と制御

本研究の実績は、次の2点にまとめることが出来る。一つは、溶液内の化学過程に伴う自由エネルギー変化を計算する為の新規な計算方法を開発したことであり、もう一つは、高温高圧水中で1,4ブタンジオールからテトラヒドロフランが生成する反応について、水素結合鎖に沿ったプロトン移動機構により反応が触媒されることを量子化学計算により、明らかにしたことである。以下にそれぞれについて詳述する。(1)量子化学による凝集系の自由エネルギー計算凝集系の化学過程に伴う自由エネルギー変化を計算するために、我々は、ハイブリッド型の第一原理分子動力学法と新規な溶液の理論であるエネルギー表示の理論をカップルさせた新しい方法論を開発した。エネルギー表示の理論では、溶質周りの溶媒の空間的な分布関数の代わりに、溶質-溶媒間相互作用エネルギーの分布関数を基本的な変数として、溶質の溶媒和自由エネルギーを構成する。この方法は、RISM理論において表れる相互作用点という概念を必要としないので、量子化学的な方法との融合が容易である。(2)高温高圧水中のアルコールの脱水反応の量子化学計算1,4ブタンジオールからプロトン移動機構により水分子が脱離する場合、その遷移状態は、ビラジカルな性質を持つ。しかし、水の様な極性の大きな溶媒中で反応が進行すると、その電子状態は、zwitterionを形成し、溶媒としての水と相互作用することにより大きく安定化する。前述(1)の方法により、このような反応の溶液中の活性化自由エネルギーを計算すると、およそ50kcal/molとなり、実験値と良く一致することが分かった。このことから、熱水中で、プロトン移動機構が反応を触媒する経路の妥当性が示唆された。従来、アルコールの脱水反応は酸触媒により進行すると考えられて来た。これに対してMatubayasiらは、高温高圧水における1,4-butanediolの脱水反応の速度に対する酸添加の影響を調べ、酸触媒によらない新たな反応経路の存在を指摘した。この実験事実は、超臨界水をはじめとする高温高圧水の特異な反応性の一端を示すものであり、その反応機構を明からにすることは、理学的、工学的に極めて重要である。我々は、この反応について以下のような経路を仮定した。それは、1,4-butanediolの脱水によりbiradical中間体が生成し(HO-(CH_2)_4-OH→・O-(CH_2)_3-CH_2・+H_2O)、中間体の環化によりTHFが生成する(・O-(CH_2)_3-CH_2・+H_2O→THF+H_2O)というものである。この過程では脱水が反応の律速段階であり、我々は水素結合鎖に沿ったプロトン移動により脱水が進行すると考えた。QM/MM法とエネルギー表示の理論を組み合わせた新規な手法により、超臨界水中の1,4-butanediolの脱水反応の活性化自由エネルギーを計算し、反応機構の妥当性を検証した。水2分子がプロトン移動に関与する場合について、密度汎関数法を用いて反応物及び遷移状態の構造を最適化した。反応物では1,4-butanediolと水分子が水素結合により複合体を形成する。反応は、1,4-butanediolのOH基のプロトンが隣接するH_2Oの酸素原子へ移動すると同時に、2つ目の水分子の水素が1,4-butanediolの片方のOH基を攻撃することにより進行する。この機構の気相中の活性化自由エネルギーはΔG_<gas>=62.9kcal/molであり、高温中でも反応は進行しにくい。QM/MM計算により、反応に対する高温高圧水(T=500K, p=0.6g/cm^3)の溶媒効果を考慮すると、活性化自由エネルギーは46.6kcal/molにまで減少することが分かった。

遷移状態の分子のスピン密度解析により、気相中ではビラジカルな電子構造が、極性溶媒の影響により溶液中では分子内双極子(zwitterion)を形成することが分かった。本研究の実績は、次の2点にまとめることが出来る。一つは、溶液内の化学過程に伴う自由エネルギー変化を計算する為の新規な計算方法を開発したことであり、もう一つは、高温高圧水中で1,4ブタンジオールからテトラヒドロフランが生成する反応について、水素結合鎖に沿ったプロトン移動機構により反応が触媒されることを量子化学計算により、明らかにしたことである。以下にそれぞれについて詳述する。(1)量子化学による凝集系の自由エネルギー計算凝集系の化学過程に伴う自由エネルギー変化を計算するために、我々は、ハイブリッド型の第一原理分子動力学法と新規な溶液の理論であるエネルギー表示の理論をカップルさせた新しい方法論を開発した。エネルギー表示の理論では、溶質周りの溶媒の空間的な分布関数の代わりに、溶質-溶媒間相互作用エネルギーの分布関数を基本的な変数として、溶質の溶媒和自由エネルギーを構成する。この方法は、RISM理論において表れる相互作用点という概念を必要としないので、量子化学的な方法との融合が容易である。(2)高温高圧水中のアルコールの脱水反応の量子化学計算1,4ブタンジオールからプロトン移動機構により水分子が脱離する場合、その遷移状態は、ビラジカルな性質を持つ。しかし、水の様な極性の大きな溶媒中で反応が進行すると、その電子状態は、zwitterionを形成し、溶媒としての水と相互作用することにより大きく安定化する。前述(1)の方法により、このような反応の溶液中の活性化自由エネルギーを計算すると、およそ50kcal/molとなり、実験値と良く一致することが分かった。このことから、熱水中で、プロトン移動機構が反応を触媒する経路の妥当性が示唆された。
ペダリングスピードおよび負荷が下肢の二関節筋の筋活動に及ぼす影響

本研究の目的は、ペダリングスピードおよび負荷(トルク)の変化が大腿部における単関節筋および二関節筋の筋活動に及ぼす影響を筋電図学的に検討するとともに、それがパワー発揮のタイプによってことなるかどうかを明らかにすることであった。一般成人男子11名体重1kgあたり2.5、3.5、4.5、5.5および6.5Wの自転車エルゴメータ運動(パワーマックスV)をペダルスピード60rpmにて行わせるとともに、同じパワー出力の運動をペダルスピード50、70、90、110およびl30rpmにより行わせた。このとき、右側の外側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋短頭および長頭より、表面電極法を用いて筋電図活動を導出・記録した。また彼らに対して、自転車エルゴメータを用いて、体重の5、7.5、10および12.5%の負荷によるパワーテストを行い、パワー発揮のタイプを力型とスピード型に分類した。ペダリングスピードおよびトルクの増加は、毎秒あたりの筋放電量をいずれの筋においても直線的に増加させたが、その傾向にパワー発揮型の違いによる違いは認められなかった。一方、単位パワー出力あたりの筋放電量を観察すると、ペダルトルクの増加は単関節筋の放電量を低下させたが二関節筋の放電量は変化させず、その傾向にパワー発揮のタイプによる違いは認めるられなかった。これに対し、ペダルスピードの増加は単関節筋の放電量は変化させなかったが、二関節筋の筋放電量の有意な低下を生じさせた。しかし、これらの傾向はパワー発揮のタイプによって異なり、スピード型ではスピードの増加に伴って大腿二頭筋短頭と大腿直筋の筋放電量を有意に低下させる傾向を示した。これらの結果から、ペダリングスピードの増加は、1)大腿部の二関節筋の筋活動に対して抑制的に作用する、および2)スピード型のパワー発揮タイプの被験者においては、大腿直筋および大腿二頭筋短頭の筋活動に対して抑制的に作用することが示唆された。筋収縮の速度および負荷を変化させたときの二関節筋の筋活動の特徴を研究するために、被験者に自転車エルゴメータを用いて、1)一定摩擦負荷(3kp)でペダリングスピード(50130rpm)を変えながら、および2)一定ペダリングスピード(60rpm)で摩擦負荷(27kp)を変えながら運動を行わせた。このとき、大腿部の筋(外側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋)より表面筋電図を導出し、特に脚の伸展と股関節の伸展に作用する大腿直筋と脚の伸展のみに作用する外側広筋の筋活動に焦点を当てて分析を行った。摩擦負荷を増加させると、両筋のペダル1回転あたりの放電量(積分筋電図値μV・sec/回転)は360ワットの仕事率までは直線的に上昇したが、ペダリングスピードを増加させたときの放電量に増加はほとんど観察されず、放電量の平均値は50rpm時がもっとも大きかった。一方、毎秒あたりの放電量は、外側広筋では摩擦負荷およびペダリングスピードの増加とともに360ワットの仕事率まではほぼ直線的に増加したが、大腿直筋のそれはやや異なる傾向を示した。すなわち、大腿直筋の毎秒あたりの放電量は、摩擦負荷を変化させたときは仕事率が240ワットまでほとんど変化せず、その後指数関数的な増加を示した。また、ペダリングスピードを増加させたときの放電量は110rpm(330ワット)まではほとんど変化が見られず(79μV・sec)、130rpm時にほぼ2倍近い大きな増加を示した。

これらの結果は、ペダリング運動において脚の伸展と股関節の伸展に同時に作用する大腿直筋の筋活動は、比較的軽い仕事率の場合は、種々の程度に抑制されていることを示唆しているものと考えられ。ペダリング運動における筋収縮のスピードおよび力を変化させたときの鍛練者の二関節筋の筋活動の特徴を観察するために、自転車競技選手に自転車エルゴメータを用いて、1)一定摩擦負荷(3kp)でペダリングスピードを変化(50,70,90,110,130rpm)させる運動、および2)一定ペダリングスピード(60rpm)で摩擦負荷を変化(1,3,5,6,7,8kp)させる運動を行わせ、下肢筋の筋電図活動を観察した。筋電図は表面筋電図法を用いて、右の外側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋長頭および大腿二頭筋短頭より導出し、記録した。その結果、摩擦負荷を増加させるとペダル1回転あたりの筋放電量(積分筋電図:mV・sec/回転)は、いずれの筋においても直線的に増加し、筋による違いは観察されなかった。このようないずれの筋においても認められた負荷の増加に伴う筋放電量の直線的な増加は、非鍛練者のそれとは異なっていた。一方、負荷を一定に固定してペダリングスピードを増加させたときのペダル1回転あたりの筋放電量の変化は、負荷を増加させた場合とは異なる傾向を示した。すなわち、単関節筋である外側広筋と大腿二頭筋短頭の放電量は、スピードを増加させても変化しない傾向にあったが、大腿直筋や大腿二頭筋長頭の放電量はペダリング速度の増加に伴って低下する傾向を示した。これらのことから、運動スピードの増加は、ペダリングにおける下肢の二関節筋の活動を抑制する可能性が示唆された。本研究の目的は、パワー発揮における“力型"と“スピード型"の被験者が、種々のスピードおよび負荷によるペダリング運動を行っているときの大腿部単関節筋および二関節筋の筋活動に対する神経系コントロールの違いを明らかにすることであった。被験者(一般成人男子12名)に対し、電動制御式自転車エルゴメータ(パワーマックスV)を用いて、体重の5、7.5、10および12.5%の負荷によるパワーテストを行い、力型とスピード型に分類した。これら2群の被験者に対して、体重1kgあたり2.5、3.5、4.5、5.5および6.5ワットのペダリング運動をペダル速度60rpmにて行わせるとともに、同じパワー発揮の自転車エルゴメータ運動をペダル速度50、70、90、110および130rpmにより行わせた。このとき、右側の外側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋短頭および長頭の筋電図活動を表面電極法を導出・記録し、パワー発揮のタイプ別に単関節筋および二関節筋の放電量(μVsec/ペダル1回転)を観察し、検討した。ペダリング負荷の増加は、いずれの筋の放電量も直線的に増加させ、パワー発揮のタイプによる違いは認められなかった。ペダル速度の増加は、各筋の放電量の変化に異なる影響を与えた。ペダル速度の増加は、両群の外側広筋の放電量の推移に影響を与えなかった。しかし、大腿二頭筋短頭の放電量は力型においては高いペダル回転数(110rpm)では増加したが、スピード型ではこのような傾向は認められず、ペダル速度の増加とともに漸減する傾向を示した。また、ペダル速度の増加はスピード型における大腿直筋および大腿二頭筋長頭の放電量を漸減させたが、力群においては低減傾向は大腿直筋にしか認められなかった。したがって、パワー発揮における“力型"と“スピード型"を決定する要因の1つは、筋収縮速度の増加に伴う大腿二頭筋長頭(二関節筋)および短頭(単関節筋)の活動抑制あるいは促進に依存することが示唆された。
大強度パルス中性子による局所スピン・原子構造とそのダイナミクスの研究

本年度は、本特定領域研究終了後の事後評価年次であった。関係者の協力により取りまとめ作業も滞りなく進められ、また、事後評価の準備の甲斐があり、評価結果:A(期待通りの研究が進展した)を得ることが出来た。中間評価では、A-で計画の一部見直しが必要であるとされたが、最終的に高く評価されることが出来たのも関係者一同の協力の賜物である。また、2003年度に本特定領域研究に関連し開催した2つの国際会議及び、さらに、本特定領域研究が進めてきた日英中性子散乱研究協力事業は、関係者の努力により、学術創成研究の一環として継続して進められる運びとなった。このように本特定領域研究は概ね計画したように進められ、相応の成果を得るとともに、その後の発展的継続が成されたことになり、ほぼ満足の行く事業であったと言ってよい。本研究は平成9年度より進めてきた日英科学技術協力事業を継承したものである。同事業で英国ラザフォードアプルトン研究所に建設を推進してきたMAPS分光器を完成させるとともに、MAPS分光器を主に利用し、広範なエネルギー・運動量空間に広がる非等方非弾性散乱(動的構造)を的確に観測することにより、物質の持つ機能・性質を微視的な立場から理解しようとするものである。具体的研究領域は次にあげる3つの研究分野であり、MAPS分光器のカバーし得ない観測領域の測定には、適宣ISIS施設の他の分光器も利用する。(a)磁性体・超伝導体等の高エネルギー・スピン励起とその局所構造の研究(b)非晶質等新素材の動的構造と局所構造の研究(c)誘導体や生体高分子物質等の動的構造と局所構造の研究MAPS分光器の建設は平成9年度から開始され、平成10年度に設置が完了し、平成11年4月から検出器の設置、調整、試料を使ったハードウェアの調整に入った。現在、試運転中であり、平成12年度には本格的実験が開始される見込みである。各研究班から、適宣MAPS分光器の建設、調整、試運転、予備実験、本実験のため、研究者を英国に派遣した。各計画班は、総括班と実施しようとする実験課題について討議し、更に英国側研究協力者とも討議して、研究を進めた。なお、研究者の派遣は、派遣旅費の主たる部分として、基盤研究(A)「日英科学技術協力事業による新型中性子分光器の共同開発研究」と当科学研究費とを併用して行った。本研究は、我が国の文部省高エネルギー加速器研究機構(KEK)と英国中央研究所審議会(CCLRC)間で締結されている日英科学技術協力事業を進めるものである。同事業は、日本と英国が協力して、CCLRC所属のラザフォードアップルトン研究所の大強度スポレーションパルス中性子源ISIS施設に単結晶専用高性能チョッパー型中性子分光器MAPSを建設し、中性子散乱による先端的物質科学研究を行うものである。日本側は主として、中性子検出器の開発及び設置を分担した。MAPS分光器は1997年より建設に入り、予定通り本年度(平成12年度)に建設を完了した。平成12年度11月より試験運転に入り、設計性能が達成されていること、データー解析のチェックがなされつつある。試験運転では、一次元反強磁性体であり、スピン・パイエルス転移を有するCuGeO3の実験を行い、MAPSが有する二次元位置敏感検出器の性能が予想以上であることを確認した。平成13年度以降の本実験により、MAPS分光器により優れた研究成果が出せることが大いに期待できる。MAPS分光器からのデータは0.5GBy teにも及び、そのデータの処理に大きな課題がある。従って、本年度は、高性能ワークステーションを国内に導入し、ソフトウェアー等の開発を行った。本日英協力事業で進めてきたMAPS分光器の建設は平成12年度に終了し、その後約一年間の試運転を行った。そして、平成13年度6月より本格的な研究に入った。また、MAPS分光器以外の既存の分光器を適宜使用して研究を進めた。本領域の研究は多岐にわたっているので、ここでは、行った研究の内一部についての概略を列挙するにとどめる。「酸化物超伝導体YBa2CuO3のスピン非整合磁気励起の研究」では、超伝導機構に関わる磁気相互作用を反映して、非整合磁気励起とレゾナンス・ピークの観測を行った。「酸化物超伝導体YBa2CuO3のフォノンに異常の研究」では、フォノンのB2gモードのTOモードとLOモードにエネルギーの逆転があることがわかり、オーバースクリーニングが想像以上に強いことが判明した。「MgB2のフォノン異常の研究」では、フォノン状態密度に関して詳細な情報を得ることができ、その超伝導機構との関連を研究した。「非晶質のフォノンの分散関係の研究」では、非晶質のフォノンダイナミックスに分散関係に似たダイナミックスが発見され、大きな波紋を与えることが出来た。「Ni-Zr金属ガラスにおける動的秩序構造の解明」の研究では、結晶相の原子振動モードの解析から、金属ガラスにおける構造を極めて定量的に議論できることを初めて示した。「半導体一金属転移に於ける液体テルルーセレン合金の鎖間相互作用」の研究では、金属化領域で長短2種類の共有結合の繋ぎ変わりが起きていることを観測した。「メタンハイドレートの動的構造因子の研究」では、メタンハイドレート中のメタン分子が自由に回転運動して存在していることを確認した。

「中性子反射率測定による分子構造の異なるブロック共重合体の相分離界面の研究」では、同じ成分から成るが分子構造が異なるブロック共重合体のミクロ相分離界面は分子構造の違いによらずほぼ同じ厚みを有することを明らかにした。本研究は、我が国の文科省高エネルギー加速器研究機構(KEK)と英国中央研究所審議会(CCLRC)間で締結されている日英科学技術協力事業を進めるものである。同事業は、日本と英国が協力してCCLRC所属のラザフォードアップルトン研究所にある大強度パルス中性子源ISIS施設に単結晶試料専用高性能チョッパー型中性子分光器MAPSを建設し、中性子散乱による先端的物質科学研究を行うものである。また、研究の進捗に応じてISIS施設に既存の他の実験装置の利用も行い研究を進める。本特定領域研究では以下の3つの研究がなされている。(a)磁性体・超伝導体等の高エネルギー・スピン励起とその局所構造の研究(b)非晶質等新素材の動的構造と局所構造の研究(c)物質中水素の動的構造と局所構造の研究平成2002年度には33件の実験申請がなされ、19件の実験が実施された。これらの実験のために25名の研究者の派遣が基盤研究(A)「日英科学技術協力による大強度パルス中性子実験研究」、(課題番号:13304032)によりなされた。また、同研究に利用した実験総時間数は90日間にも及ぶものであった。また、本特定領域研究の予算は主にこれら実験のための費用として利用された。本特定領域研究では以下の3つの研究がなされた。(a)磁性体・超伝導体等の高エネルギー・スピン励起とその局所構造の研究(b)非晶質等新素材の動的構造と局所構造の研究(c)物質中水素の動的構造と局所構造の研究平成2003年度には29件の実験申請がなされ、14件の実験が実施された。これらの実験のために29名の研究者の派遣が基盤研究(A)「日英科学技術協力による大強度パルス中性子実験研究」、(課題番号:13304032)によりなされた。また、同研究に利用した実験総時間数は80日間にも及ぶものであった。本特定領域研究の予算はこれら実験のための費用として利用された。また、本年度は同領域の最終年度であったため、また、出席者が重複することから、他の資金(国際会議等開催計画経費)とあわせ、「大強度陽子加速器計画・中性子科学に関する国際シンポジューム2003」(10月27,28,29日、つくば)および、「日英協力研究会2003」(10月30,31日、茨城県五浦)を開催した。延べ170名の参加を得た。報告書は国際的にも定評のあるJournal of Neutron Researchに掲載予定でいる。本年度は、本特定領域研究終了後の事後評価年次であった。
組合せ論的計算量の理論-特に下界の証明と最適アルゴリズムの-意性の問題

本研究では、いくつかの組合せ論的計算モデルについて、計算能力の解析と“自然な"計算問題を解くのに必要な計算資源の量の分析を行なった。以下では、今年度論文としてまとめるに至ったものについてより詳しく述べる。1.constant-depth polynomial-sizeの組合せ論理回路によって定義される計算量のクラスACCについて、以前よりRichard Beigel(Yale大学)と共同研究を行なっていたが、今年度この結果をJ.of Comp.Complexityに発表した。この論文では、クラスACCに属する任意のブール関数は、深さ2のある形の回路で計算可能であること等が示されている。2.整列されている2つのリストをcomparator(比較器)によって併合するmergng networkに必要なcomparatorの数について、Batcherのodd-even mergeに基づくものが、漸近的に最適であるという結果を含む論文のjournal versionを今年度まとめた。これは、以前よりの共同研究を発展させたもので、論文は現在審査中である。
鉄欠乏によるムギネ酸類合成誘導機構の解明

1ムギネ酸類合成部位の探索:鉄欠乏エヒメハダカムギ体内のムギネ酸類の存在量を,地上部,根,導管液,篩管液で測定した.根内の量が最も少なく,地上部にも存在したが,篩管液にはごく微量しか検出されず,導管液には存在するところから,合成部位は根であり,導管を経て地上部にも運ばれるものと推定した.さらに,鉄欠乏トウモロコシの根を先端から基部まで, 1cmずつに切り,それぞれのムギネ酸類存在量を測定したところ,根の先端部分の含量が最も高く,同時にトウモロコシが分泌するのはデオキシムギネ酸であることが判明した.ムギネ酸類は,主に根の先端部で合成されると考えられた.根のどの細胞で,細胞内のどこで合成されるかについては現在検討中である.2前駆本アミノ酸の決定:ムギネ酸類はその構造式から,アミノ酸3分子より合成されるものと考えられるが,前駆体アミノ酸は不明であった.鉄欠乏によりムギネ酸合成を誘導したムギ類,ならびにイネの根に各種の標識アミノ酸を投与し,ムギネ酸類への取り込みを, HPLC,ラジオアナライザーにより調べた.投与時間30分では, 1-^<14>C-メチオニンのが取り込まれ,他のアミノ酸,酢酸の取り込みはみられなかった.葉では取り込まれなかった.この結果から,ムギネ酸類生合成経路における前駆体アミノ酸がメテオニンであること,また根で合成されることが明らかになった.放射活性取り込の順序,構造式,ならびに各イネ科植物におけるムギネ酸類の存在様式から,現在,以下の生合成経路を推定している.メチオニン⇒⇒アベニン酸⇒デオキシムギネ酸⇒ムギネ酸⇒ハイドロキシムギネ酸.ムギネ酸類生合成経路における前駆体アミノ酸が特定されたことによって,合成誘導機構の解明へむけて大きな前進がもたらされた.現在生合成経路の酵素を単離すべく準備中である.1ムギネ酸類合成部位の探索:鉄欠乏エヒメハダカムギ体内のムギネ酸類の存在量を,地上部,根,導管液,篩管液で測定した.根内の量が最も少なく,地上部にも存在したが,篩管液にはごく微量しか検出されず,導管液には存在するところから,合成部位は根であり,導管を経て地上部にも運ばれるものと推定した.さらに,鉄欠乏トウモロコシの根を先端から基部まで, 1cmずつに切り,それぞれのムギネ酸類存在量を測定したところ,根の先端部分の含量が最も高く,同時にトウモロコシが分泌するのはデオキシムギネ酸であることが判明した.ムギネ酸類は,主に根の先端部で合成されると考えられた.根のどの細胞で,細胞内のどこで合成されるかについては現在検討中である.2前駆本アミノ酸の決定:ムギネ酸類はその構造式から,アミノ酸3分子より合成されるものと考えられるが,前駆体アミノ酸は不明であった.鉄欠乏によりムギネ酸合成を誘導したムギ類,ならびにイネの根に各種の標識アミノ酸を投与し,ムギネ酸類への取り込みを, HPLC,ラジオアナライザーにより調べた.投与時間30分では, 1-^<14>C-メチオニンのが取り込まれ,他のアミノ酸,酢酸の取り込みはみられなかった.葉では取り込まれなかった.この結果から,ムギネ酸類生合成経路における前駆体アミノ酸がメテオニンであること,また根で合成されることが明らかになった.放射活性取り込の順序,構造式,ならびに各イネ科植物におけるムギネ酸類の存在様式から,現在,以下の生合成経路を推定している.メチオニン⇒⇒アベニン酸⇒デオキシムギネ酸⇒ムギネ酸⇒ハイドロキシムギネ酸.ムギネ酸類生合成経路における前駆体アミノ酸が特定されたことによって,合成誘導機構の解明へむけて大きな前進がもたらされた.現在生合成経路の酵素を単離すべく準備中である.
自家培養真皮のサイトカイン産生に関する実験的研究および小児全身熱傷後瘢痕への応用

大阪医科大学倫理委員会の承認を得て本法をおこなった。10名の正常皮膚1×2cmをあらかじめ採取した。これらは平成15年度の本研究において用いたものである。文章による同意を得た1歳から10歳の6症例11部位で本法を施行した。手術日が決定したら、ヒアルロン酸とコラーゲンから成るシートに保存していた線維芽細胞を播種し、自家培養真皮を作成した。1回目の手術において、拘縮を解除して生じた皮膚欠損創に自家培養真皮を貼付した。貼付後5日から12日目で約46/1000inchの基底層を分割するような超薄分層植皮を行った。植皮片は薄く破れやすいため、両面テープに付着させたままの状態で創部に縫着し、タイオーバー固定を行った。タイオーバー固定は術後7日目で解除し、抜糸は14日目におこなった。抜糸後はレストンによる圧迫をおこなった。結果:自家培養真皮は貼付後一週間で肉眼的には、ほぼ吸収されていた。移植床は、脂肪層上に薄く形成されていた。超薄分層植皮の収縮率は50%から150%と症例、部位により異なった結果が得られた。植皮片が収縮した症例でも術後46カ月頃より再び伸びる傾向が見られた。採皮部の上皮化はいずれの症例も7日目でほぼ完了しており、瘢痕を残さなかった。患児の負担を緩和することができ、また同一部位から再び採皮する事が可能であった。考察:自家培養真皮のサイトカイン産生に関する実験的研究のデータに基づいて本法をおこなった。本法は自家線維芽細胞移植、線維芽細胞から産生されるサイトカイン、および培養真皮のマトリックス自体の創傷治癒能力の結果脂肪層上に移植床が形成される。これにより基底層を分割するような超薄分層植皮が可能となる。最大の効果は、同一部位から複数回の採皮が可能で瘢痕を生じないことにある。植皮片の収縮や肥厚、赤味は経過観察の結果改善する傾向にある。新しい治療方法になることが期待される。大阪医科大学倫理委員会での承認を得た後、治療を希望する患者の皮膚を1×2cmの大きさで採取した。対象は1歳から11歳の小児11人で、平均年齢は6.36歳であった。次のような手順で試料を採取した。(1):保存したチューブ一本から線維芽細胞を取り出し、150cm^2のフラスコ5枚に播種し1週間培養する。操作はクリーンベンチで行い、フラスコは37度のCO2インキュベータに入れておいた。(2):1週目に、フラスコの培養液を1ml採取し冷凍保存(試料A)した。また、5枚のフラスコから線維芽細胞数をカウントし、シャーレ内のヒアルロン酸およびコラーゲンでできたマトリックスに5×10^4個/cm^2となるように播種した。マトリックスに生着するまで一晩インキュベーター内に保管した後、翌日、培養液をシャーレ内に追加し、1週間インキュベータ内で保管した。(3):(2)より1週間後にシャーレ内の培養液を1ml採取し冷凍保存(試料B)した。(4):シャーレ内の培養液は1週間ごとに入れ替えた。その際、培養液を1mlずつ採取し、冷凍保存しておいた。この操作を3週間続けた(試料C、試料D)。このようにして採取した11人分のチューブを対象に、ELISA法を用いてVEGFについて定量をおこなった。結果:いずれの試料においてもVEGFの産生が確認できた。培養真皮作成後13週間と時間が経つにつれて、その産生量は低下しているものの、3週目においてもVEGFの産生は確認できた。年齢・部位によるVEGF産生量の違いは、今回の研究では確認できなかった。考察:自家培養真皮は、患者自身の細胞を用いているため、線維芽細胞が免疫学的に拒絶されることはない。今回の研究では、創部植皮下に線維芽細胞がとどまり、VEGFを産生し続けることが示唆された。これは植皮片の生着、経過に有効な結果を与えると考えられた。

植皮片が収縮した症例でも術後46カ月頃より再び伸びる傾向が見られた。採皮部の上皮化はいずれの症例も7日目でほぼ完了しており、瘢痕を残さなかった。患児の負担を緩和することができ、また同一部位から再び採皮する事が可能であった。考察:自家培養真皮のサイトカイン産生に関する実験的研究のデータに基づいて本法をおこなった。本法は自家線維芽細胞移植、線維芽細胞から産生されるサイトカイン、および培養真皮のマトリックス自体の創傷治癒能力の結果脂肪層上に移植床が形成される。これにより基底層を分割するような超薄分層植皮が可能となる。最大の効果は、同一部位から複数回の採皮が可能で瘢痕を生じないことにある。植皮片の収縮や肥厚、赤味は経過観察の結果改善する傾向にある。新しい治療方法になることが期待される。
中性子ビームを利用した酵素反応中間体の結晶構造解析

酵素(タンパク質)は、高度に進化した分子認識能とダイナミクスによって、複雑な骨格や多様な官能基を有する生理活性物質を効果的に合成する分子である。酵素の触媒機構の解明は、生命科学研究の発展と深く関わるだけでなく、複雑な化学構造をもった有用化合物を効率よく合成する産業技術の開発にも繋がる。本提案では、学術・産業の両面から有用な生合成経路を担うモデル酵素を研究対象として選択し、その反応中間体や遷移状態アナログ複合体の中性子結晶構造解析により、酵素の複雑で巧妙な反応触媒機構を解明する。また得られた知見を有用化合物の創製に資することを目的とする。1、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉を目標に研究を進めている。本年度は、昨年と同様に、X線結晶構造解析での分解能の向上を試みたが、十分な結果は得られなかった。そのため、次の試料2および試料3に注力した。2、アミノ酸ラセマーゼについて、1.0Åという高い分解能のX線結晶構造解析によって、中間体を補足していることを確認し、さらに中性子結晶構造解析のために、大型結晶の作製に取り組んだ。その結果、体積約1x1x1mm以上の大型の結晶が得られ、予備的な中性子回折実験で、2Åを超える十分な分解能の回折イメージを得た。3、創薬標的酵素においては、Ser/Thrキナーゼに注力した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶を作製し、ドイツの研究用原子炉施設を利用して、解析に十分な中性子回折データを収集した。さらに、X線の回折データを収集し、X線と中性子の両方のデータを用いた同時精密化を実施した。本研究での成果創出のためには、水素原子の直接観測がポイントであり、中性子構造解析が一つの重要なステップとなる。アミノ酸ラセマーゼについては、中間体の構造解析に必要な結晶を作製することができたため、解析の目途が付いた。論文としては、ヒスチジンラセマーゼの構造解析に世界で初めて成功したことを報告した。また、キナーゼに関しては、基礎データとなるリガンドフリー型の中性子構造解析の論文を発表するに至った。さらに、阻害剤複合体の中性子結晶構造解析に成功している。全4年間の計画の中で後半の2年間になるが、最初の2年間で構築した試料調製系を土台として、中性子結晶構造解析も着実に進んでおり、十分な達成度で進捗していると考える。1、昨年度に引き続き、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、X線結晶構造解析での分解能の向上が鍵となるため、質の高い結晶の取得に取り組む。その後、基質などのリガンドを結合させた複合体結晶の作製に取り組み、X線結晶構造解析によってPKSの反応中間体の捕捉に注力する。2、アミノ酸ラセマーゼについては、得られている中間体の大型結晶を使い、中性子結晶構造解析のためのフルデータを収集し、立体構造を決定する。さらに、中間体の構造から、補酵素であるビタミンB2と酵素によって制御される酵素反応機構を考察する。3、創薬標的酵素においては、Ser/Thrキナーゼを引き続き対象とする。阻害剤複合体の中性子結晶構造解析をすすめるとともに、量子化学計算に着手し、反応中間体と阻害剤の設計に重要な構造情報に関する知見の取得を試みる。(i)植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉に注力して研究をすすめた。既に当該酵素のX線結晶構造を決定しているが、中性子利用研究で鍵となるPKSの高効率での調製系の確立に取り組んだ。PKSは大腸菌による高発現が可能であるが多くは不溶性タンパク質として発現する。また、触媒基の一つであるCys残基が容易に酸化され失活するので、迅速な精製方法の確立が必要となる。本年度は、HisTag配列の見直しを実施し、発現コンストラクトを確定した。(ii)アミノ酸ラセマーゼやアミラーゼ両酵素について、大量調製系の確立に成功した。そのうちアミノ酸ラセマーゼに関しては、1.0Å分解能のX線結晶構造解析に成功した。(iii)創薬標的酵素においては、野生型およびE166A変異型βラクタマーゼ、Ser/Thrキナーゼに関して試料調製と大型結晶作製を実施した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶作製のための条件検討を実施した。本研究での成果創出のためには、安定な試料調製系の確立と、高分解能な解析が可能な結晶の作製が鍵となる。研究対象とするほぼすべての酵素に関して、それらが達成され、今後の取り組みの土台作りができた。

酵素の触媒機構の解明は、生命科学研究の発展と深く関わるだけでなく、複雑な化学構造をもった有用化合物を効率よく合成する産業技術の開発にも繋がる。本提案では、学術・産業の両面から有用な生合成経路を担うモデル酵素を研究対象として選択し、その反応中間体や遷移状態アナログ複合体の中性子結晶構造解析により、酵素の複雑で巧妙な反応触媒機構を解明する。また得られた知見を有用化合物の創製に資することを目的とする。1、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉に注力して研究をすすめた。昨年構築した大腸菌発現系と精製方法により、PKSの調製を実施した。その結果、結晶を得ることができたが、X線結晶構造解析で、十分な分解能が得られていない。2、アミノ酸ラセマーゼやアミラーゼ両酵素について、基質との複合体として、中間体を補足する実験を試みた。結果として、基質であるヒスチジンが補酵素であるピリドキサールリン酸と共有結合した中間体が得られ、1.0Å分解能のX線結晶構造解析に成功した。3、創薬標的酵素においては、Ser/Thrキナーゼに注力した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶作製のための条件検討を実施するとともに、阻害剤が結合する前の状態についても解析をすすめた。その結果、分子を縦断する水素結合のネットワークが、キナーゼの触媒反応に重要な役割をもつことを示す、新規で興味深い知見を得た。本研究での成果創出のためには、安定な試料調製系の確立と、高分解能な解析が可能な結晶の作製が土台となる。研究対象とするほぼすべての酵素に関して、それらが実現し、現時点では、中性子結晶構造解析のための大型結晶の作製や、分解能が高い質の良い結晶の作製に取り組んでいる。全4年間の計画の中で、必要な土台作りができていることから、十分な達成度で進捗していると考えている。酵素(タンパク質)は、高度に進化した分子認識能とダイナミクスによって、複雑な骨格や多様な官能基を有する生理活性物質を効果的に合成する分子である。1、植物二次代謝化合物合成酵素の反応機構の解明に向けて、ポリケタイド合成酵素(PKS)の反応中間体の捕捉を目標に研究を進めている。本年度は、昨年と同様に、X線結晶構造解析での分解能の向上を試みたが、十分な結果は得られなかった。そのため、次の試料2および試料3に注力した。2、アミノ酸ラセマーゼについて、1.0Åという高い分解能のX線結晶構造解析によって、中間体を補足していることを確認し、さらに中性子結晶構造解析のために、大型結晶の作製に取り組んだ。その結果、体積約1x1x1mm以上の大型の結晶が得られ、予備的な中性子回折実験で、2Åを超える十分な分解能の回折イメージを得た。