hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NASHの発症進展に関わる免疫動態の遊離脂肪酸・アデイポカインによる修飾

NASHの病態形成への免疫学的機序の関与を動物モデルを用いて解析したところ、肝全体、CD3細胞レベルにおいてTh1サイトカインがTh2サイトカインに比し優位に存在していること、脂肪性肝炎においては肝内にCD4細胞の浸潤が認められ、それらはTh1サイトカインを有意に多く産生していることが明らかとなった。一方、Th17およびTregの病態への関与は認めなかった。またciglitazone、pioglitazone、ラパマイシン投与では肝炎や線維化の改善は認めず、肝内Treg量の変化も見られなかった。αGarCerを発症後に投与すると脂肪性肝炎の軽度の改善を認めた。脂肪性肝炎における肝内Th1免疫応答の動態解析§肝内でのTh1、Tb2サイトカイン・転写因子・シグナル伝達因子の遺伝子発現量の解析肝臓からtotal RNAを抽出し、リボヌクレアーゼアッセイキットを用いてIL-2、IFNγ、IL-12(Th1サイトカイン)、IL-4、IL-10(Th2サイトカイン)の遺伝子発現量を包括的かつ定量的に解析したところ、肝全体としてのTh1サイトカインがTh2サイトカインに比し優位に存在していることが明らかとなった。また、肝内浸潤単核球を分離しMACSにてCD3細胞を分離後total RNAを抽出し、上記のTh1・Th2サイトカイン遺伝子発現量に加え、Th1特異的転写因子T-bet、シグナル伝達因子STAT4、Th2特異的転写因子GATA-3、シグナル伝達因子STAT6の遺伝子発現量を定量的に解析したところ、CD3細胞レベルにおいてもTh1サイトカインがTh2サイトカインに比し有意に多く存在していること、Th1特異的転写因子T-bet、シグナル伝達因子STAT4がTh2特異的転写因子GATA-3、シグナル伝達因子STAT6に比し有意に多く発現していることが示された。§肝内浸潤CD4細胞の動態とサイトカイン産生プロファイルの解析CD4細胞の肝内分布動態を免疫組織化学的手法により検討したところ、CD4細胞は脂肪細胞の周辺に存在することが明らかにされた。また肝内浸潤単核球を分離しFACSを用いた細胞内サイトカイン同定法によりサイトカイン産生プロファイルを解析したところ、肝内浸潤CD4細胞はTh1サイトカインを産生していることが示された。以上より、脂肪性肝炎においては肝内にCD4細胞の浸潤が認められ、さらにそれらのCD4細胞はTh1サイトカインを有意に多く産生していることが明らかとなった。*慢性炎症期におけるTh17細胞の動態解析§肝内におけるIL-17陽性CD4細胞、Th17特異的転写因子RORγT発現動態の検討免疫組織化学的にIL-17陽性CD4細胞の肝内分布を検討したところ、肝細胞障害部位の近傍にわずかに存在を認める程度であった。また肝内浸潤CD4細胞を分離し細胞内サイトカイン同定法によりIL-17産生細胞の定量的検討を行ったところ、IL-23非刺激下ではCD4細胞はIL-17をほとんど産生せず、IL-23非刺激によりごくわずかに産生した。また、Th17特異的転写因子RORγTの肝内遺伝子発現量をリアルタイムPCR法による定量解析でも、RORγT発現は微弱だった。§肝内CD4細胞のIL-17産生動態とFFA・アデイポカインによる影響の検討肝内浸潤CD4細胞を分離、in vitroでIFNγまたはIL-23添加培養しIL-17産生能検討系にFFA・アデイポカイン添加して検討したが、添加による変化は認めなかった。*肝内T regの動態解析§肝内におけるT reg動態の検討肝内浸潤CD4細胞を分離しCD25、Foxp3モノクローナル抗体を用いたFACS解析によりT regの定量的検討を行ったところ、Th17に比し有意な差を認めなかった。§T reg機能とFFA・アデイポカインによる影響の検討肝内浸潤リンパ球からMACSを用いたnegative selectionで機能性T regを分離、CD4陽性・CD25陰性T細胞の増殖抑制能を3^H-Thymidine法で検討し、FFA・アデイポサイトカイン添加による抑制能の変化を検討したが、添加による変化は認めなかった。<NASHに対するPPARγリガンド治療の作用機序解析とTreg、NKT活性化剤の治療効果の検討>PPARγアゴニストのTreg作用増強、Th1免疫応答抑制が報告され、PPARγアゴニストによるNASH病態改善に免疫制御が関与する可能性がある。またTreg増強作用を有するラパマイシン、NKT細胞増強作用を有するαGarCerなどを用いた新たなNASH治療の可能性もある。そこで大滴性脂肪肝、リンパ球を主体とする肝小葉内細胞浸潤、線維化を認めるPTEN

ノックアウトマウスを用いて、肝炎発症前、発症後、線維化進行期に免疫調節作用があるPPARγリガンドciglitazone、免疫調節作用がないpioglitazone、ラパマイシン、αGarCerを投与し、両者の治療効果と免疫動態変化の関連を解析した。ciglitazoneを肝炎発症前に投与するとわずかに脂肪性肝炎の程度の改善を認めたが、肝内Tregの量的変化は認めなかった。また肝炎発症後および線維化進行期にciglitazoneを投与しても、肝炎や線維化の改善は認めず、肝内Treg量の変化も見られなかった。Pioglitazoneの投与では、肝炎発症前、発症後、線維化進行期のいずれの時期の投与においても、肝炎や線維化の改善は認めず、肝内Treg量の変化も見られなかった。一方、ラパマイシンを肝炎発症前に投与すると、脂肪性肝炎の軽度の改善を認めたが、肝内Tregの量的変化は認めなかった。また肝炎発症後および線維化進行期に投与しても、肝炎や線維化の改善は認めず、肝内Treg量の変化も見られなかった。αGarCerを肝炎発症前や線維化進行期に投与しても肝炎や線維化の改善は認めなかったが、発症後に投与すると脂肪性肝炎の軽度の改善を認めた。
神経変性疾患におけるストレス顆粒形成の細胞死への関与

細胞は特定のストレス刺激に応答して、細胞質内にストレス顆粒と呼ばれる一過性の構造体を形成する。細胞はストレス顆粒を形成することで蛋白質の翻訳を一時的に停止させ、またストレス顆粒内に細胞死促進因子を取り込みその機能を阻害することで、ストレス環境下での細胞の生存を促進する。申請者は神経変性疾患の病態において、細胞内で観察される複合的なストレス環境(小胞体ストレスと酸化ストレス)では、ストレス顆粒の形成が抑制されていることを見出し、その分子メカニズムの解析を行った。さらに、病態モデル細胞株を用いた実験から、このようなストレス顆粒形成の抑制が、神経変性疾患の神経細胞死を促進させることを明らかにした。細胞は特定のストレス刺激(ヒ素、小胞体ストレス、ウイルス感染など)にさらされると、細胞質内にストレス顆粒と呼ばれる構造体を形成する。ストレス顆粒はmRNAやRNA結合タンパク質を取り込むことで、タンパク質の翻訳を一時的に停止し、細胞損傷を防ぐ。申請者はこれまでに、ストレス顆粒がタンパク質の翻訳を制御するだけでなく、アポトーシス関連因子を取り込み、その機能を阻害することでも、細胞の生存に寄与することを見出した。したがって、ストレス顆粒の形成制御は細胞の運命決定に重要な役割を果たしている。生体内で細胞は、様々な種類、強度のストレス刺激に同時にさらされている。しかしながら、複合ストレス環境下でのストレス顆粒の形成制御はこれまで全く不明であった。そこで申請者は、様々なストレス刺激によるストレス顆粒形成を検証し、酸化ストレスがストレス顆粒形成を強く抑制することを見出した。細胞内に酸化ストレスと小胞体ストレスの両方が惹起された場合には、小胞体ストレスによるストレス顆粒形成が酸化ストレスによって阻害され、その結果アポトーシスが促進された。平成25年度は、酸化ストレスによるストレス顆粒形成抑制の分子機構の解析を行った。その結果、酸化ストレスは、ストレス顆粒形成の核となるmRNA結合因子TIA1を酸化的に修飾し、酸化されたTIA1は自身の標的mRNAとの結合能を失うことを見出した。TIA1は特定の刺激依存的に標的mRNAと結合し、自身が多量体化することによってストレス顆粒形成の核となる。したがって、mRNAとの結合能を失った酸化型TIA1はストレス顆粒を形成することができない。更に、申請者はTIA1内の酸化標的となるCys残基を特定し、標的CysをSerに置換したTIA1点変異体を細胞に発現させると、酸化条件下においてもストレス顆粒の形成が誘導され、細胞死が抑制されることを確認した。細胞はヒ素や低酸素、ウイルス感染などの特定のストレス刺激に応答して、細胞質内にストレス顆粒と呼ばれる一過性の構造体を形成し、タンパク質の翻訳を一時的に停止することで細胞の生存に寄与する。さらにこれまでに申請者が行った研究から、ストレス顆粒はアポトーシス関連因子を取り込み、その機能を阻害することによっても、細胞の生存に貢献することが明らかになった。しかしながら、実際に生体内で細胞が曝されるような、複合的なストレス環境下でのストレス顆粒の形成、および細胞生存との関連は、これまでまったく知られてない。そこで申請者は、様々な複合的なストレス条件下でのストレス顆粒の形成を検証し、酸化ストレスが、ヒ素や小胞体ストレスによるストレス顆粒の形成を強く抑制することを見出した。平成25年度は、酸化ストレスによるストレス顆粒形成抑制の分子メカニズムとして、酸化ストレスがストレス顆粒形成の核となる分子の一つTIA1を直接酸化修飾することを明らかにした。神経変性疾患では、神経細胞内に異常タンパク質の蓄積による小胞体ストレスと、ROSの産生による酸化ストレスの両方が生じ、結果的に神経細胞死が生じることが知られている。そこで申請者は、神経細胞内で酸化ストレスが小胞体ストレス誘導性のストレス顆粒形成を抑制することが、神経細胞死に寄与すると予想し、平成26年度はその検証実験を行った。代表的な神経変性疾患であるポリグルタミン病に着目し、はじめに、細胞内に異常に伸長したポリグルタミン鎖(polyQ70)を薬剤依存的に蓄積させることが出来るモデル細胞株を樹立した。モデル細胞において、細胞内にpolyQ70が蓄積された場合には、酸化ストレスと小胞体ストレスの両方が誘導されストレス顆粒の形成が抑制されること、さらにその結果細胞死が促進されることを確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。生体内で細胞は様々な種類、強度のストレス刺激に同時にさらされおり、個々の細胞レベルで適切なストレス応答機構を働かせることで、個体全体としての恒常性が維持されている。従って、多くの疾患は複合ストレス条件下における細胞のストレス応答機構の制御異常に起因すると考えられる。

これまでの申請者の研究により、ストレス顆粒は細胞の生存に寄与する主要なストレス応答機構であることが明らかとなったが、複合ストレス条件下におけるストレス顆粒形成の制御や、ストレス顆粒形成の疾患への関与は、これまで全く不明であった。本研究でははじめに、酸化条件下ではストレス顆粒の形成が抑制されることを見出し、平成25年度は、その分子機構の解明を目指し研究を行った。申請者のこれまでの実験結果に基づき、酸化ストレスがストレス顆粒形成を抑制する分子メカニズムとして、二つの可能性を提唱し、それぞれに対して検証を行った。その結果、当初の目的としていた通り、酸化ストレスによるストレス顆粒形成抑制の主要な分子機構を明らかにすることに成功した。従って、本研究は該当年度の研究目的を達成できたと言え、おおむね順調に進展していると判断できる。本年度は、酸化ストレスによるストレス顆粒形成阻害が、神経変性疾患で見られる神経細胞死に関与するかを検証し、結果をまとめ発表する。ハンチントン病を代表とするポリグルタミン(polyQ)病は、グルタミンをコードするCAG塩基配列の繰り返しが原因遺伝子で異常に伸長することで引き起こされる神経変性疾患である。ポリグルタミン病では、神経細胞内に異常タンパク質蓄積による小胞体ストレスと、ROSの産生による酸化ストレスとの両方が誘導され、細胞死が起こる。そこで、ポリグルタミン病に着目し、細胞レベル、個体レベルで、ストレス顆粒形成抑制の細胞死への寄与を検証する。始めに、疾患モデル細胞株として70個のpolyQを安定的に発現誘導、蓄積させることができる安定細胞株の樹立を行う。樹立したモデル細胞株では、polyQ70の発現依存的に小胞体ストレスと酸化ストレスが誘導されることを確認する。次に、polyQ70の細胞内発現に伴い、TIA1が酸化され、この時、小胞体ストレスが生じているにも関わらずストレス顆粒形成が見られないことを確認する。さらに、酸化されないTIA1変異体を細胞内に発現させると、ストレス顆粒の形成が回復し、細胞死の抑制が見られることを確認する。次に、ハンチントン病モデルマウス(R6/2マウス)を用いて個体レベルの解析を行う。疾患モデルマウスの脳、脊髄切片を作製し、免疫染色を行うことにより、個体レベルでも神経細胞において小胞体ストレスと酸化ストレスの両方が惹起されていることを確認する。さらにこの時、ストレス顆粒の形成が抑制されており、細胞に酸化抵抗性TIA1変異体を発現させると、ストレス顆粒形成が回復し、細胞死が抑制されることを確認する。
線条体GABA性インターニューロンの行動生理学的役割に関する研究

線条体は、運動制御、運動学習、報酬行動などの重要な脳機能を媒介する大脳基底核神経回路において中心的な役割を果たす脳領域である。線条体には、形態的および電気生理学的応答によって区別される複数のGABA性介在ニューロンが存在するが、それぞれの行動生理学的な作用については十分研究が進んでいない。本研究では、特に、ソマトスタチン(SST)あるいはパルブアルブミン(PVA)を含有するGABA性介在ニューロンの行動生理学的な役割と両者のニューロンが線条体神経回路を調節する機構の解明に取り組んだ。遺伝子発現の特異性に依存して特定ニューロンを破壊する手法であるイムノトキシン細胞標的法を利用して、それぞれのニューロンを線条体回路から除去し、この動物の運動制御機能および線条体回路の変化の解析を試みた。SST含有ニューロンでIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの線条体内にイムノトキシンを投与し、標的ニューロンの選択的な除去を誘導した。このニューロンの除去による運動機能への影響を解析し、SST含有ニューロンは運動行動の抑制に関与することを示唆した。また、PVAを含有する線条体GABA性介在ニューロンの役割を明らかにするために、PVA遺伝子の制御下にIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの作製を試みた。マウス胚性幹細胞の標的遺伝子座の翻訳領域にIL2R-YFPカセットが挿入された細胞株をスクリーニングし、複数の相同組換え体細胞を選別することができた。今後、これらの細胞を利用して遺伝子改変マウスを作製し、イムノトキシン細胞標的法を応用したPVA含有介在ニューロンの行動生理学的な役割の解析を行う計画である。本研究では、線条体に局在し、ソマトスタチン(SST)あるいはパルブアルブミン(PVA)を含有するGABA性介在ニューロンの行動生理学的な役割の解明に取り組む。本年度は、遺伝子発現の特異性に依存して特定ニューロンを破壊する手法であるイムノトキシン(IT)細胞標的法を利用して、それぞれのニューロンを線条体回路から除去するアプローチの構築を目指した。第一に、SST含有ニューロンの選択的除去のために、SST遺伝子の3'非翻訳領域にインターナルリボソームエントリーサイト(IRES)の制御下にインターロイキン-2受容体αサブユニット(IL-2Rα)cDNAを連結した遺伝子カセットを挿入した遺伝子ターゲティングマウスを作製した。このマウスをCMV-Creマウスと交配し、変異遺伝子内のネオマイシン耐性遺伝子カセットを除去した。さらに、変異遺伝子に関するホモ接合体マウス(SST-IL2Rαマウス)を作製した。SST-IL2Rαマウスの線条体に適当量のITを注入し、線条体SST含有ニューロンの除去を試みた。片側の線条体へのIT投与により、投与と反対側への軽度の回転運動が誘発された。第二に、PVA含有ニューロンの選択的除去のために、PVA遺伝子の制御下にIL-2Rα遺伝子を発現する遺伝子ターゲティングマウスの作製に取り組んだ。PVA遺伝子の第一エクソンにIL-2Rα遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を挿入したベクターを構築した。直鎖化したベクターをマウス胚性幹細胞へ導入し、ネオマイシンを用いて薬剤選択を行ない、多数の組換え体細胞を単離した。これらの細胞からサザンブロット法を用いて複数の相同組換え体細胞を同定した。今後、これらの相同組換え体細胞を用いて、遺伝子改変マウスを作製する計画である。

線条体には、形態的および電気生理学的応答によって区別される複数のGABA性介在ニューロンが存在するが、それぞれの行動生理学的な作用については十分研究が進んでいない。本研究では、特に、ソマトスタチン(SST)あるいはパルブアルブミン(PVA)を含有するGABA性介在ニューロンの行動生理学的な役割と両者のニューロンが線条体神経回路を調節する機構の解明に取り組む。遺伝子発現の特異性に依存して特定ニューロンを破壊する手法であるイムノトキシン細胞標的法を利用して、それぞれのニューロンを線条体回路から除去し、この動物の運動制御機能および線条体回路の変化を解析することを目的とする。本年度は、SST含有ニューロンでIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの線条体内にイムノトキシンを投与し、標的ニューロンの選択的な破壊の条件を検討した。SST含有GABA性介在ニューロンの除去による運動機能への影響を調べるために、線条体にイムノトキシンを注入し、自発運動とドーパミン誘導性の運動の変化を解析した。昨年度得られた回転運動の解析の結果とあわせて、SST含有ニューロンは運動の抑制に関与することが示唆された。また、PVAを含有する線条体GABA性介在ニューロンの役割を明らかにするために、PVA遺伝子の制御下にIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの作製を行った。昨年度得られた複数の相同組換え体ES細胞を胚盤胞へ注入し、キメラマウスを作製したが、ES細胞由来の寄与率の高いマウスの作製に至らなかった。このため、さらに、相同組換え体ES細胞のスクリーニングを繰り返し、新しい細胞クローンを胚盤胞に注入し、キメラマウスの作製を推し進める計画である。線条体は、運動制御、運動学習、報酬行動などの重要な脳機能を媒介する大脳基底核神経回路において中心的な役割を果たす脳領域である。昨年度までの研究において、SST含有ニューロンでIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの線条体内にイムノトキシンを投与し、標的ニューロンの選択的な除去を誘導した。このニューロンの除去による運動機能への影響を解析し、SST含有ニューロンは運動行動の抑制に関与することを示唆した。本年度は、PVAを含有する線条体GABA性介在ニューロンの役割を明らかにするために、PVA遺伝子の制御下にIL-2Rαを発現する遺伝子改変マウスの作製を試みた。新たにPVA-IL2Rα/YFPノックインターゲティングベクターを作製し、マウス胚性幹(ES)細胞の標的遺伝子座の翻訳領域にIL2R-YFPカセットが挿入されたES細胞株をスクリーニングした。240株のG418耐性ES細胞株を樹立し、これらの細胞株のサザンプロットによるスクリーニングの結果、標的遺伝子座にターゲティングを受けた34株のES細胞株を選別することができた。
コミュニケーションを重視したデジタル学習環境に関する実証的研究

本研究の目的は、グローバルな視点からコミュニケーションを促進させる学習環境をデザインするための要素を明らかにすることである。そこで協同的な学習に焦点を当て、海外との交流学習、コミュニケーション能力の育成、およびそれを支援するデジタル環境に関して研究を進めた。これまでの実践事例や多様な視点から分析検討を加えた研究成果から、著書『ICT教育のデザイン』および『研究成果報告書』としてまとめてきた。しかし、これらの研究は依然発展途上であり今後さらなる研究が求められている。本研究は、「『教育の情報化』に対応した双方向型デジタル学習環境に関する実証的研究(研究代表者:久保田賢一)」(以後、前科研)の知見を受け、グローバルな視点からみたコミュニケーションを促進させる学習環境をデザインするための要素を明らかにすることを目的としている。そこで、平成17年度は、具体的に、次の3分野に取り組んできた。(1)コミュニケーションを重視した学習環境の普及モデルの開発これまでパイロット校を中心に、交流学習を円滑に行うための学習環境を明らかにしてきたが、本研究ではそのモデルを一般校に広げるための普及モデルの作成のために、学校現場の学習環境調査をおこなった。また、教師コミュニティにおける運営ノウハウを収集し、内容分析をおこなった。それらの成果は、日本教育メディア学会年次大会において、「教師コミュニティにおけるwikiを用いた議論活性化の試み」、「教科『情報』における高大連携の成立の要因分析」などの中で報告した。(2)開発途上国との交流学習を推進するためのモデルの開発(3)開発途上国の大学との連携研究と研究結果の途上国の学校教育への応用今年度は、これまでの調査をもとに、ウェブサイトの開発、フィリピンで情報収集をおこなった。本研究の成果は、「大学とNGO・地方自治体が連携した国際協力の可能性」として報告した。本研究は、「『教育の情報化』に対応した双方向型デジタル学習環境に関する実証的研究(研究代表者:久保田賢一)」の知見を受け、グローバルな視点からみたコミュニケーションを促進させる学習環境をデザインするための要素を明らかにすることを目的としている。そこで、平成18年度は、具体的に、次の3分野に取り組んできた。(1)コミュニケーションを重視した学習環境の普及モデルの開発今年度は、国内における情報教育のカリキュラムモデルやデジタル学習環境の普及のための、モデル開発をおこなった。それらについては、日本教育工学会第22回全国大会において、「メディア・リテラシー教育のためのカリキュラムガイドの開発と評価」、「ワークシートを用いた学校間交流学習の授業設計モデルの評価」として報告をおこなった。(2)開発途上国との交流学習を推進するためのモデルの開発今年度は、これまでの知見をもとに、国際交流モデルに基づき、発展途上国を中心とした国際交流学習の実践をおこなった。それらの評価について、第13回日本教育メディア学会年次大会において、「ICTを利用した国際交流学習の学習効果とその要因-国際ボランティアとの国際交流学習の事例より-」、「パレスチナ難キャンプにおける絵の交流を通した国際交流学習-ICTを活用した交流学習の学習効果-」として報告をおこなった。(3)開発途上国の大学との連携研究と研究結果の途上国の学校教育への応用本研究は、グローバルな視点からみたコミュニケーションを促進させる学習環境をデザインするための要素を明らかにすることを目的としている。これまで、学習環境の普及モデルの開発、開発途上国との交流学習のモデルの開発、他国との連携研究に取り組んできた。本年度は以下の3点を具体的目標とし重点的に行うと共に、これまでの研究成果の報告を行ってきた。(1)コミュニケーションを重視した学習環境の普及モデルを開発する。(2)海外、とくに開発途上国との交流学習を推進するためのモデルを開発する。(3)開発途上国の大学と連携をした研究を行い、その知見を途上国の学校教育に当てはめる。研究の目的を達成するため、本年度も継続的に国内および海外(アメリカ・フィリピン、シリア)における情報収集などをおこなった。これまでの知見をもとに、開発途上国との交流学習を推進するためモデル開発に取り組むために先進的事例を収集し、普及モデルの質的向上を図った。また、学校現場と直接連携したアクションリサーチを通し、交流学習の普及のための調査研究を行った。さらに各研究で得られた知見を応用し、日本の学校教育の中へ、普及を視野においた学習環境モデル開発および評価をおこなった。これらの研究の成果を平成19年9月に韓国で行われた国際学会(ICoME)や国内の教育関係の学会発表、著書、論文を通して研究成果の報告をしてきた。最終年度の本年は、国内外における先進事例の情報整理を進めていくとともに、実際の学校現場でこれらの知見を普及するための「学習環境デザイン」をモデル化し提示することを目的に以下の3点の達成目標を掲げてきた。

研究の目的を達成するため、協同的な学習に焦点を当て、海外との交流学習、コミュニケーション能力の育成、およびそれを支援するデジタル環境に関して、各研究分担者のもとに研究を進めてきた。この成果などをまとめた著書『ICT教育のデザイン』のなかで、いくつかの実践事例を調査し「コミュニケーションを重視した学習環境」について、双方向性のあるコミュニケーションを多様な視点から検討・分析検討を加えてきた。また、これらの研究の成果を国内外の諸学会や国内の教育関係の学会発表、著書、論文を通して研究成果の報告をしてきた。
根粒根圏土壌微生物相の群集構造解析によるマメ科作物の連作障害発生機構の解明

根粒の存在がマメ科作物の連作障害の主因と考え、根粒着生量の異なるダイズ変異体(非着生型、超着生型、野生型)を3年間連作し、前作が連作に弱い後作のインゲンの根圏土壌の微生物多様性に及ぼす影響を検討した。その結果、前作までの連作ダイズの根粒形成量が後作のインゲン根圏土壌に対する影響は線虫を含めた真核微生物の群集構造解析では観察されなかった。しかしながら、根粒非着生ダイズ変異体の連作はインゲンの連作に似た土壌細菌相を形成することが示唆された。また、糸状菌類の解析の結果からは、根粒のバイオマスが増加するとMortierella elongataの割合が根圏で増加することが示唆された。平成22年度は連作障害の発生程度の異なるインゲン品種(感受性:大正金時・抵抗性:姫手亡)、ダイズ根粒非着生系統(En 1282)、ダイズ根粒着生野生型(エンレイ)、ダイズ根粒超着生系統(Sakukei 4)を使用し、上記の植物材料を北農研芽室研究拠点の所内圃場(淡色黒ボク土)で慣行栽培した。平成22年度のインゲン連作障害の評価は春先の6月までの低温と長雨により定植作業が遅れ、さらに7月の猛暑による異常気象で生育が著しく悪くなったことから、根褐変(根腐病)の発生が少なく、また、収穫量を指標とした評価が困難であった。群集構造解析用試料については8月上旬に行い、比較的健全に生育した収穫期のダイズ・インゲンなどの根組織を土壌から掘り出し水洗後に凍結保存した。これら根組織を液体窒素で粉砕後、組織粉末からDNAを調製し、根圏細菌と糸状菌類の多様性評価のためのDNAとして保存した。バルク土壌については、作付け前のバルク土壌(非根圏土壌)及びサンプリング時のバルク土壌も凍結保存した。さらに、これらの土壌から、DNA抽出を行った。新規技術が利用可能なコストとなったことからバルク土壌の細菌類と糸状菌類の多様性評価については経年的変化をパイロシークエンスでモニタリングする予定とした。上記で得られた環境DNAを用いて、系統的多様性の評価として16SrRNA遺伝子領域を標的としたPCR増幅を行い、シークエンス解析のためのDNA調製を行った。また、線虫類については、T-RFLP法が報告されていることから、当該手法を用いて線虫類の定性・定量による動態解析のためのPCR条件の確認と、制限酵素処理条件の検討を行った。本手法を用いて、線虫類の多様性と密度についての経年的変化を調べる予定である。平成23年度以降も同様のサンプリングを継続し、マメ連作に影響を受ける土壌微生物群の特定を試みる。平成22年度と同じ圃場を使用して、同一の作付け(ダイズ根粒非着生系統、ダイズ根粒着生野生型系統(品種Enrei)、ダイズ根粒超着生系統、連作障害の発生程度の異なるインゲン品種(金時類・手亡類))の連作を実施した。栽培はダイズ・インゲンの慣行栽培に準じて行った。8月までの栽培はほ順調であったが、十分に生育したと思われる時期(7月上旬)に電気牧柵を外したところ、ダイズ根粒超着生系統の圃場において獣害が発生し、圃場の均一性に若干問題が発生した。8月上旬に各試験圃場からバルク土壌と9個体分の根圏土壌及び植物体(根・茎・葉)についてサンプリングを行った。バルク土壌及び根圏土壌については、篩(直径2mm)にかけた後、市販キットを用いて試料あたり3反復でDNA抽出を行った。植物体については、凍結保存後、液体窒素により組織を均一に粉砕し、試料あたり3反復でDNA抽出を行った。収量調査等によるインゲン連作障害の評価を予定していたが、従来の北海道の気象記録にはない9月上旬の大型台風の被害により圃場が壊滅的打撃をうけ、収量調査が不可能となった。しかしながら、8月上旬の微生物相の分析試料の確保は順調に進めることができており、本課題の主目的である連作による根圏微生物相の分析については大きな支障はなく、課題全体への影響は小さい。2010年及び2011年の8月上旬のサンプリングにより得た土壌・植物体のDNAを用いて、現在、共生微生物群集構造解析及び根圏土壌中の線虫類の動態解析をDNA多型解析法(RISA法・T-RFLP法等)により圃場間と年次間の微生物多様性の比較解析を進めている。

野生型ダイズ、非根粒着生型ダイズ、超着生型ダイズ、インゲン姫手亡、インゲン大正金時、の各作物を3年間連作した跡区において、連作障害に特に弱いとされる5月下旬にインゲン(姫手亡)を作付した。8月上旬に各試験区から目視で健全と思われる6株(1株2個体)について抜き取り、サンプリングを行った。株毎に地上部と地下部の生重を測定したところ、地上部及び地下部組織ともに、インゲン跡作区に比べてダイズ作跡区のインゲンで生重が減少する傾向が見られた。地下部については、微生物多様性解析のために空中分画法により根圏土壌と根系をサンプリングした。根系については、根と根粒に分けて根の生重、根粒数、根粒の全重と一個重を測定した。その結果、ダイズ跡作区では根粒着生数が少ないこと、インゲン(姫手亡・大正金時)と超着生型ダイズの跡作区で無効根粒が増加すること等が明らかとなった。根圏土壌から土壌DNAを抽出し、サンプリングのバラツキの評価と予備的な多様性解析として、RISA法を用いて真核微生物類と細菌類の多様性評価をDNA多型解析により行った。その結果、細菌類については、全サンプルにおいてほぼ同一の多型パターンが得られ、細菌群集レベルでの多様性の大きな差異は、試験区間や試験区内で認められなかった。一方、真核微生物類を対象とするRISAでは、野生型ダイズと根粒超着生型ダイズの跡作区において特徴的なDNA多型が検出され、根圏土壌中の真核性微生物群に対する前作のダイズ根粒(菌)の影響が示唆された。上記の結果を受け、線虫の影響も含めた多様性評価を行うため、真核微生物向けの多様性解析のためのPCRプライマーの選定やシークエンス解析条件の検討を中である。平成23年度と同じ圃場を使用して、前年度と同一(ダイズ根粒非着生系統、ダイズ根粒着生野生型系統(品種Enrei)、ダイズ根粒超着生系統、連作障害の発生程度の異なるインゲン品種(金時類・手亡類))の5つの作付け区を設定し連作試験を実施した。栽培はダイズ・インゲンの慣行栽培に準じて行った。本年度の栽培は順調であった。8月上旬に各試験圃場からバルク土壌(各作付け区画内の4隅と中央の5点)と9個体分の根圏土壌及び根組織についてサンプリングを行った。バルク土壌及び根圏土壌については、篩(直径2mm)にかけた後、試料あたり3反復でDNA抽出を行った。根組織については、凍結保存後、液体窒素により組織を均一に粉砕し、各作付け区画あたり3個体ずつをバルクとして、3反復でDNA抽出を行った。8月上旬の微生物相の分析試料の確保は順調に進めることができた。上述の連作試験3年目にあたる5つの試験区から2012年8月に得たバルク土壌サンプルについて土壌DNAを抽出し、RISA法により真核微生物群の多様性評価を行った。具体的には、糸状菌類や線虫等の真核微生物群の検出が可能である2234Cと3126Tのプライマーセットを用いて群集構造解析を行った。その結果、ダイズ連作試験区においては、360bp付近に、ダイズ根粒菌の根粒着生量に対応するバンド濃度を示すDNA多型が得られた。バンド濃度は、超着生系統において最も高く、根粒非着生系統では検出されないか非常に低いバンド濃度であった。ダイズの根粒着生野生型系統において対応するバンドの濃度は超着生と非着生の中間であった。また、対応するDNAバンドはインゲンの2品種においても検出された。マメ科の連作において、根粒形成の有無が線虫を中心とする土壌微生物相の大きな構造変化を引き起こすという本研究課題の申請書において示した仮説と一致するデータが得られた。連作障害では、根圏における細菌類の菌数や多様性の重要性が指摘されている。そこで、根粒着生量の異なるダイズ変異体を3年間連作し、4年目のインゲンの根圏土壌の微生物多様性に及ぼす影響について検討した。
金属酵素の機能制御機構における酵素分子全体の動的構造効果：モデル蛋白質による検証

金属含有酵素の機能の発揮箇所である中心金属イオン部分の反応性は、金属配位部位の局所的な構造効果のみならず、生体高分子全体の構造柔軟性とカップルしていることを、昨年度の研究で実験的に明らかにした。しかし、構築したチオールサブチリシン内Cu(II)錯体の配位に関与するアミノ酸残基は、タンパク質構造の幾何学的配置から、Cys、Hisのみであるため、その後の研究展開に支障があると予想された。そこで、今年度は、昨年度の研究で用いたチオールサブチリシンのCys221に対して、化学修飾を行ない、補助配位子の導入を検討し、遷移金属イオンの結合能について検証した。2-ブロモメチルピリジンを化学修飾剤として作用させたところ、メチルピリジン部分に相当する質量増加が観測された。この化学修飾タンパク質に対して、遷移金属イオンの配位能を検討したところ、Cu(II), Zn(II), Ru(III)等、金属イオンの結合をICP-MS、UV-visによって確認できた。化学修飾を施さなかったチオールサブチリシンと、金属結合能について、EDTAによるキレート除去実験によって比較を行ったところ、メチルピリジンを導入した化学修飾チオールサブチリシンの方が、これらの金属イオンを強く結合する結果が得られ、ピリジン部位が補助配位子として機能していることが明らかとなり、簡便な化学修飾で、新たな金属錯形成場を構築することが可能であることが示された。簡便な方法による新たなタンパク質金属錯体の構築が可能であることが示され、人工金属酵素の反応性と、生体高分子全体の構造柔軟性との相関関係を実験的に検証するモデルタンパク質として利用できる素材が得られた。構築したタンパク質内金属錯体上での触媒反応活性の検討と、生体高分子の構造柔軟性と触媒活性との相関関係を実験的に検証する。金属含有酵素の固有機能を司る中心金属イオンの反応性は、金属配位部位の局所的構造効果のみならず、生体高分子としての性質も関与していると予想される。そのことを、実験データによって証明するために、シンプルな構造をもつチオールサブチリシンをモデル蛋白質として、この蛋白質中に唯一存在するCys残基であるCys221を配位子とするCu(II)錯体を構築した。そして、このCu(II)中心の反応性が、Cu中心から離れたところに存在するCa(II)イオンの結合状態によって影響を受けるかどうかを各種分光学的に手法によって検討した。まず、Ca(II)イオンの結合状態による蛋白質二次構造への影響は、CDスペクトルによりほとんどないことが確認された。次に、Cu(II)錯体の形成についてUV-vis、ICP-MSによって確認し、Ca(II)イオンが正常に結合している状態では、1:1の安定なCu(II)錯体として単離できることを見いだした。一方、Ca(II)イオンが脱離した状態では、蛋白質二次構造が類似しているにも関わらず、Cu(II)錯体の形成は見られなかったことから、CDスペクトルには反映されない蛋白質主鎖の柔軟性が重要なファクターであることが示唆された。そこで、Ca(II)の結合状態が異なる蛋白質を作り分けし、アミドH/D交換後の質量分析を実施したところ、Ca(II)イオンの有無により主鎖の運動性を大きく支配されることが分かった。さらに、電子スピン共鳴によって、Ca(II)イオンの結合状態はCys配位Cu(II)錯体の自動還元挙動にも影響を与えることが示された。Cu(II)錯体とCu(I)錯体では安定な錯体構造は異なる。よって、主鎖の構造柔軟性が自動還元のしやすさを制御しており、蛋白質全体のグローバルな構造柔軟性が、小さな金属イオンの反応性を制御していることが実験的に証明できた。蛋白質全体の構造効果の重要性が実験的に証明され、学術誌に報告する段階まで至った。

自動還元後の銅錯体の構造の詳細な構造的知見を得るために、蛋白質の結晶化を試みるとともに、溶液中において、構造柔軟性効果が、Ca(II)結合サイトから、Cu錯体中心へ、どのように伝搬していくのか、その伝搬経路を特定するために、溶液NMRおよびペプシン消化によるペプチドフラグメント解析を実施する。構築したタンパク質内金属錯体上での触媒反応活性の検討と、生体高分子の構造柔軟性と触媒活性との相関関係を実験的に検証する。29年度に実施予定であった実験のうち、蛋白質の結晶構造解析において、構造解析に適した品質の良い結晶を得ることが困難であったため、結晶化条件の再検討のための結晶化キットの購入および学外実験に伴う機器使用代、旅費に必要な895,211円を30年度分の助成金と合わせて請求する。29年度および30年度に実施予定であった蛋白質の結晶構造解析において、結晶化には成功したものの高分解能の構造解析のために、さらなる条件検討が必要となった。また、タンパク質内金属錯体の反応性に対するタンパク質構造柔軟性効果の伝搬様式を検討するために、変異体発現系の構築を行ったが、得られたタンパク質の安定性に問題が生じたため、別種類の変異体作成の必要性が生じた。このため、生化学実験試薬の購入および学外実験に伴う機器使用代、旅費に使用する予定である。
プラズマ計測用のバックトークレス高安定光励起型2波長遠赤外レーザーの開発

近年,大型で高密度化するプラズマ装置における核融合プラズマ計測では,波長50 μm帯の遠赤外レーザーを用いる新しい計測システムが必要とされている。しかし,光と電波の谷間に位置するこの領域では,光源を含め,計測手法が確立していない。そこで,2波長同時発振型のレーザー光源,干渉・偏光計測法,各構成要素(光学素子,検出器)の開発を進めている。高精度かつ高信頼性のプラズマ計測を実現するには,レーザー発振の安定化が必須である。光励起型遠赤外レーザーでは,励起光の戻り光の除去が長年の課題となっている。本研究では,バックトークレスの9R(8)CO2レーザー励起の48-,57-μm CH3ODレーザーの安定発振を実証し,その安定化技術を確立する。本研究ではこれまでに,(1)励起用CO2レーザーの安定化,(2)光アイソレーターの試験,(3)バックトークの影響と遠赤外レーザーの動作特性の測定,(4)低熱膨張合金製ロッドによる遠赤外レーザー共振器の固定,(5)遠赤外レーザー用光学素子の開発を行ってきた。実際の遠赤外レーザーを用いたプラズマ計測では,光ヘテロダイン干渉法による計測が行われており,本研究のレーザー装置は2本のレーザー管(A:プローブ,B:ローカル)を持つ双子型となっている。干渉計測においては,AとBの差周波(ビート信号)の安定性が重要となる。そこで最終年度は,双子型として動作させ,光アイソレーターにより戻り光を除去し,遠赤外レーザー装置の各共振器長を同時制御することで,2波長レーザー発振の出力及びビート周波数の長時間安定化を試みた。その結果,2波長共に±1.5 %/hの出力安定性,0.6 MHz±13 kHz/h(48-μmレーザー),1.7 MHz±17 kHz/h(57-μmレーザー)のビート周波数安定性を達成した。また,2波長合計で1 Wを超える出力を得ることができた。光励起型遠赤外レーザーでは,励起光の戻り(バックトーク)の除去が長年の課題となっている。本研究では,バックトークレスの9R(8) CO2レーザー励起の48-μm,57-μm CH3ODレーザーの安定発振を実証し,その安定化技術を確立する。本年度は,(1)励起用CO2レーザーの安定化,(2)光アイソレーターの試験,(3)バックトークの影響と遠赤外レーザーの動作特性の測定を行った。復光路構成のシュタルクセルを用いて励起用CO2レーザーの周波数を安定化した。その結果,±220 kHz/hの周波数安定度と±0.6 %/hの出力安定度を得ることができた。2枚のATFRミラー(S偏光に対して99 %反射,P偏光に対しては吸収し1 %以下の反射)とCdS製の波長板を組み合わせた光アイソレーターを用いることで,戻り光による出力変動を従来の1/10以下に抑えることができた。光アイソレーターを用いる場合,円偏光励起となるが,48-μm,57-μm CH3ODレーザーともに円偏光で発振し,また,2波長同時発振が可能であることを確認した。平成28年度においては,当初の計画通り,励起用CO2レーザーの安定化,光アイソレーターの選定および動作試験,戻り光の影響と遠赤外レーザーの動作特性の測定を実施した。励起用CO2レーザーについては,安定化用の外部ガスセルを従来の単光路から複光路構成にすることで,より安定なレーザー発振が実現できた。原理の異なる数種類の偏光子とπ/2位相遅延素子の中から,本研究の目的に合う光アイソレーターを選定し,透過度,偏光度,位相差を測定した。実際に光アイソレーターを配置し,戻り光が除去できることを確認した。光アイソレーターを使用すると,円偏光での励起となる。遠赤外レーザーの偏光方向は,励起レーザーの偏光方向に依存する。レーザー分子や発振線によっては,円偏光でなく,ランダム偏光になる場合もある。また,直線偏光での励起と比べ,出力が減少したり,増加したりする場合もある。目的の48-μm,57-μm CH3ODレーザーは,ともに円偏光で,問題なく2波長同時発振することが確認でき,次の研究計画につなげる結果を得ることができた。以上のことから,本研究課題は,おおむね順調に進展していると自己評価する。

光励起型遠赤外レーザーでは,励起光の戻り(バックトーク)の除去が長年の課題となっている。本研究では,バックトークレスの9R(8)CO2レーザー励起の48-m,57-μm CH3ODレーザーの安定発振を実証し,その安定化技術を確立する。本年度は,(1)高出力励起に対する光アイソレーターの試験,(2)低熱膨張合金製ロッドによる遠赤外レーザー共振器の固定,(3)遠赤外レーザー用光学素子の開発を行った。ZnSe製の波長板は,従来のCdS製のものと比較し,位相差の精度が低いが,レーザー耐力が高い(CW 100 W以上)という利点がある。今回,ZnSe波長板と2枚のATFRミラーと組み合わせた光アイソレーターを用いて,120 WのCO2レーザー励起での遠赤外レーザー発振試験を行った。その結果,戻り光による出力変動が除去でき,48-,57-μm CH3ODレーザーともに円偏光で,2波長同時発振が可能であることを確認した。遠赤外レーザー共振器長の変化は,レーザー発振の安定性に大きく影響する。そこで,室温付近で熱膨張係数0.3×10-6/°Cの低熱膨張合金ロッドを用いて遠赤外レーザー共振器を固定した。目的のプラズマ計測では,直線偏光したレーザー光をプラズマに入射する。そのために,両遠赤外レーザー用の反射防止付きのゼロオーダー波長板(結晶水晶製)を製作し,その特性を試験した。平成29年度においては,当初の計画通り,高出力の励起CO2レーザー(120 W)に対する光アイソレーターの動作試験,低熱膨張合金ロッドによる遠赤外レーザー共振器の固定,遠赤外レーザー用光学素子の開発を実施した。光励起型の遠赤外レーザーの出力は,励起光源の出力に比例する。よって,偏光子と波長板で構成する光アイソレーターには,少なくともCW 100 W以上の高出力レーザー光に対する耐久性が要求される。そこで,偏光依存性のある2枚のATFRミラーとプリズム型のZnSe波長板を用いて,その透過度,偏光度,位相差等を測定した。実際に光アイソレーターを配置し,戻り光が除去できること,48-,57-μm CH3ODレーザーが同時発振することを確認した。遠赤外レーザー共振器長の変化(例えば振動や室温変化による)は,遠赤外レーザーの出力や周波数の安定性に大きく影響する。本研究では,遠赤外レーザー共振器長を制御することで,長時間でのレーザー発振の安定化を行う計画であるが,本来は,制御することなく十分に安定であることが望ましい。そこで,熱膨張係数0.3×10-6/°Cの低熱膨張合金ロッドを用いて共振器を固定した。本遠赤外レーザー装置は,ステッピングモーターにより共振器長を制御する。現在までのところ,励起用CO2レーザーは外部シュタルクセルによる周波数安定化が可能で,光アイソレーターにより戻り光による出力変動が除去できること,目的の48-,57-μm CH3ODレーザーは,ともに円偏光で,問題なく2波長同時発振し,レーザー共振器長の制御により出力安定化できることを確認しており,次の研究計画につなげる結果を得ている。以上のことから,本研究課題は,おおむね順調に進展していると自己評価する。近年,大型で高密度化するプラズマ装置における核融合プラズマ計測では,波長50 μm帯の遠赤外レーザーを用いる新しい計測システムが必要とされている。しかし,光と電波の谷間に位置するこの領域では,光源を含め,計測手法が確立していない。
海水ウラン採取に関する研究

総量42億トンと計算される海水中の溶存ウランを工業的に採取する技術の確立は,わが国のエネルギー政策上極めて重要である.本研究では,経済的な海水ウラン採取プロセスの確立をめざして, 1.吸着性能のよい新しい吸着剤の開発, 2.球状,繊維状など各種形状吸着剤の統一的な性能評価, 3.海流,波などの自然力を利用した吸着剤と海水との接触方法,およびその装置の開発を行った.本研究によって得られた新しい知見,成果は次の点である.1.アクリロニトリルージビニルベンゼン共重合体から得られる細孔構造を制御したアミドキシム樹脂はアルカリ処理なしで海水から高いウラン吸着性能を示し, 10日間のウラン吸着量は約100mg/L-Resinであった.2.海流利用システムに適した吸着剤として,微粉末状のアミドキシム樹脂をシリカゲルとともにポリエチレンに複合した繊維状吸着剤を合成した.この吸着剤のウラン吸着速度は, 1日吸着で100mg/kg-Resinであった. 3.中空繊維状アミドキシム樹脂を合成し,それを束にして流れに並行にして充填した圧力損失の小さい吸着装置を考案した.海水を流通させて,海水の速度とウラン吸着速度との関係を得て,装置設計を行った.4.繊維状吸着剤を容易にハンドリングできるように,繊維をナイロンまたはポリエステルメッシュで球状または四方のマットにまとめ,流動化が可能なようにして,装置内の流動特性を明らかにした.5.従来の流動層より高い線流速で運転できる高性能接触装置として,ループ方式を発展させた循環流動槽を考案した.吸着剤粒子が装置内で堆積も流出も起こさずに流動する条件を調べた.6.黒潮などの海流の中に粒状吸着剤の流動層を固定設置し,流動層の海流に向かう前面のノズルより,海水を流入させ,後面のノズルより排出させる方式を考案した.この装置の大型化および多段化の検討を行った.総量42億トンと計算される海水中の溶存ウランを工業的に採取する技術の確立は,わが国のエネルギー政策上極めて重要である.本研究では,経済的な海水ウラン採取プロセスの確立をめざして, 1.吸着性能のよい新しい吸着剤の開発, 2.球状,繊維状など各種形状吸着剤の統一的な性能評価, 3.海流,波などの自然力を利用した吸着剤と海水との接触方法,およびその装置の開発を行った.本研究によって得られた新しい知見,成果は次の点である.1.アクリロニトリルージビニルベンゼン共重合体から得られる細孔構造を制御したアミドキシム樹脂はアルカリ処理なしで海水から高いウラン吸着性能を示し, 10日間のウラン吸着量は約100mg/L-Resinであった.2.海流利用システムに適した吸着剤として,微粉末状のアミドキシム樹脂をシリカゲルとともにポリエチレンに複合した繊維状吸着剤を合成した.この吸着剤のウラン吸着速度は, 1日吸着で100mg/kg-Resinであった. 3.中空繊維状アミドキシム樹脂を合成し,それを束にして流れに並行にして充填した圧力損失の小さい吸着装置を考案した.海水を流通させて,海水の速度とウラン吸着速度との関係を得て,装置設計を行った.4.繊維状吸着剤を容易にハンドリングできるように,繊維をナイロンまたはポリエステルメッシュで球状または四方のマットにまとめ,流動化が可能なようにして,装置内の流動特性を明らかにした.5.従来の流動層より高い線流速で運転できる高性能接触装置として,ループ方式を発展させた循環流動槽を考案した.吸着剤粒子が装置内で堆積も流出も起こさずに流動する条件を調べた.6.黒潮などの海流の中に粒状吸着剤の流動層を固定設置し,流動層の海流に向かう前面のノズルより,海水を流入させ,後面のノズルより排出させる方式を考案した.この装置の大型化および多段化の検討を行った.
複合汚染条件で栽培した植物の重金属耐性と金属リガンド間相互作用の解明

複合的環境汚染を想定し有用植物トマトの細胞と植物体における各種重金属イオンの集積・輸送能と各種リガンド間相互作用を検証し、以下の知見を得た:(1)トマト細胞のCd集積・耐性には液胞でのフィトケラチンリガンドによるCd-PC複合体が関係し、その複合体形成をCu等の重金属や無機アニオンが阻害する。これらはCd-PC複合体には殆ど取込まれない。(2)地上部へのCd・As輸送にはPC以外に有機酸と無機リガンド(ホウ酸)も関る。重金属混合実験ではZnとCdはCuやAsより地上部に早く輸送され、その輸送量は有機酸とPC濃度に比例する。As・Cuでは地上部にPCは検出されず、主に無機リガンドが輸送に関る。(3)他金属(Ca, Mg, Na, Cs, K)の吸収・輸送実験から、上記と異なる輸送(リガンド)と再分配の機構の存在が示唆される。以上の知見と研究成果は新たな発展課題も提示する。本研究の目的は自然界の複合汚染環境を想定した実験計画により複数の重金属による植物生体内での分子間相互作用の実態を解明することにある。具体的には、複数重金属競合下で、ペプチド性リガンドのフィトケラチン(PC)類と非ペプチド性の有機リガンド(有機酸や酸アミドなど)の双方に注目し、それらの相互作用を解明することである。これをうけて平成22年度の研究では、(1)トマト培養細胞におけるCd、Zn、Asによるペプチド性リガンドと非ペプチド性リガンドの生成と結合性を調べ、以下の成果を得た。まず、トマト懸濁細胞に各種の重金属イオンおよびヒ酸(As)を与えて細胞内の有機リガンドの濃度を調べた。その結果、主に重金属のCdと非金属のAsによってペプチド性リガンドであるPCが生成され、それぞれ結合型として蓄積することを確認した。細胞内リガンドとしては他に非ペプチド性の有機酸(特にリンゴ酸とクエン酸)が多く検出されたがこれらがCd/Asと複合体を形成する証拠は得られなかった。また、ペプチド性リガンドのグルタチオン(PCの前駆物質でもある)は、CdとAs以外の重金属によっても濃度が増加することが分かった。従って、トマト細胞内の金属結合リガンドとしてはペプチド性リガンドが重要であることを明らかにした。培地に非ペプチド性リガンドを添加してもペプチド性リガンドの濃度変化には結びつかなかった。これらから細胞内金属結合物質の合成・集積においてリガンド間相互作用を確認できなかった。ただし、リン酸やケイ酸などの無機リガンド(アニオン)の種類によっては金属吸収やPC合成能に対して特異的な作用が示すことが分かった。今後は、これらの研究に加えて、(2)液胞中への輸送とその中における複合体形成能、(3)植物体(特にシュート)中の輸送能と複合体形成能、に対するリガンドの関与および相互作用を明らかにする予定である。本研究は自然界で生じる複合的重金属汚染環境を想定し、植物体内における各種金属イオンと有機性・無機性リガンド間の分子間相互作用を明らかにすることを目的としている。平成22年度後半および23年度(本年度)前半あ研究では主にトマト懸濁培養細胞を用いた実験を行い、重金属のCdと非金属のAsに関してはペプチド性のフィトケラチン(PC)とグルタチオン(GSH)が主要な結合物質としてはたらき、その他の重金属(Znなど)に関しては、過剰の場合を除き、非ペプチド性の有機酸や細胞壁成分が主要なリガンドとしてはたらくことを明らかにした。その成果をうけ、本年度の研究では、さらに、複数金属・非金属イオンによる有機リガンド形成と液胞集積佐についてセファデックスG-50カラムなどを用いた分析実験を行った。その結果、ペプチド性リガンドによるCd/As結合と液胞輸送はきわめて元素特異的であること、また、非ペプチド性リガンドのリンゴ酸などより無機リガンドのホウ酸などの影響を受けることを明らかにした。また、トマト植物体(特にシュート)中のCd/As輸送能と複合体形成能に対する無機イオンと有機リガンド間の相互作用について調べた結果、根でのCd液胞蓄積にはPCが関与し、その他の金属やAsの蓄積には殆ど関与しないこと、また、根からシュートへのCd/As輸送には主に非ペプチド性のリガンドと無機のリガンドが関与することを明らかにした。ここで、ホウ酸はPC形成以外の過程や機構を介してCd/As輸送に骸響することも分かった。

以上の研究成果を国内外の学会で発表し、論文としても一部公開した。複数重金属競合下でペプチド性リガンドであるフィトケラチン(PC)と非ペプチド性リガンド(有機酸・その他)に注目し、(1)細胞質中のリガンド生成能、(2)液胞中の複合体形成能、(3)植物体中の複合体形成と輸送能の機構解明を目的として本研究を行い、以下の成果を得た:1重金属(Cd, Cu, Zn塩)及び砒酸塩を添加した液体培地にトマト植物体を移植し、各金属塩の組み合わせ条件で110日間栽培した。植物組織から細胞壁画分と可溶性画分に分けて各元素やリガンドを抽出定量した。その結果、Cuに較べZnとCdは地上部により多く輸送され、その地上部でのZnとCd濃度増加は有機酸とPC濃度の増加とそれぞれ相関があった。トマト植物体では砒酸(As)とホウ酸(B)処理ではPCは全く検出されなかった。また、BはAsの吸収輸送を阻害し、Cdの輸送を促進した。このように重金属輸送に有機酸、PCおよびホウ酸が関係することが示された。2組織抽出液中の各種イオンやリガンドの変化をSephadex G-50とHPLCで分析した。その結果、重金属は低分子の有機酸、GSH・PCと結合して移動することが示唆された。なお、微量のため回収木部液と篩部液の分析には至らなかったが、時間追跡実験で重金属とリガンドとの大まかな移動速度を推定できた3以上の成果を発展させ、さらに複合的重金属汚染環境を想定したモデル実験ー塩集積植物アイスプラントを用いた水耕・土耕条件での根と葉面からの金属吸収、輸送に関する複合実験ーを行った。その結果、二価の重金属と軽金属および一価のアルカリ金属類において、それぞれ異なる集積・分布および結合特性が明らかになった。トマトにおいてはセシウムの吸収と輸送蓄積に関する顕著な成果も得られた。4以上の研究成果を関連学会で発表し、論文や著書として公開することができた。複数の植物材料を用いて元素(重金属・非金属)特異的なリガンド結合と輸送に関して明らかにできた。また、結合リガンドのうち有機リガンドにはそれぞれ異なったはたらき(液胞内蓄積やシュートへの輸送)があることも明らかにした。その成果を多くの国内・国際学会で発表するとともに学術論文と専門書も執筆できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、さらに組織特異的な検出法とチェイス実験を組み合わせて最終的な詰めの実験を行い、最終成果発表へと繋げてゆきたい。複合実験の室内実験はほほ完了できる見込みだが、自然環境(人為的汚染環境)における野外実騨がさらに必要であろう。そしてそれらの成果をさらに学会等で発表し複数の学術論文として公表する。