hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫のペプチドホルモンの周期的放出-受容連関の生理学的研究

甲虫類ゴミムシダマシの蛹の神経分泌細胞の電気的(分泌)活動とその標的と考えられる器官の活動の関連について調べた。蛹の腹髄の食道下神経節から腹部第6神経節には、プロクトリンとFMRFアミドに対して免疫陽性の神分泌細胞と1対の運動ニューロンがあった。各腹節の運動ニューロンは大きな筋肉を支配していた。後胸神経節と腹部第一神経節の間の神経索を電気刺激してときに起こる腹部収縮に対する神経ペプチドの効果を電気生理学的に調べたところ、プロクトリンに顕著な増強効果が認められた。プロクトリンと他のペプチドを同時に投与した時には、FMRFアミドがプロクトリンの効果を抑制した。これらの結果から運動神経末端および神経分泌細胞から周期的に放出される神経ペプチドのターゲットは腹部筋でそれを調節することによって付属肢などの血液循環を調節していることを示唆した。腹部運動が実際付属肢の血液循環を調節しているか、色素注入によって調べた。腹部拍動に伴って歩脚や羽根に色素が流入し、血液路が明らかになった。これまで昆虫の歩脚は薄い隔壁によって2つの流路にわけられ、それぞれ遠心性経路および求心性経路として働くとされているが、本研究の蛹の腿節では3つの流路に分かれ、1つが遠心性経路、2つが求心性経路として働き、複雑な循環機構があること、転節と腿節の接合部に弁があり逆流を防いでいること、およびその弁構造が蛹発達に伴って大きく変わることなど、新しいしくみが分かった。さらに、蛹の食道下神経節にある神経分泌細胞の発火活動と飛翔筋の電気的活動に加えて、6本の歩脚の電気的活動も腹部運動の活動期と同期していることが分かった。以上のことから、蛹の中で飛翔筋や歩行筋など成虫特の器官およびその調節神経機構の発達は周期的で、それらがホルモン分泌や血液循環のリズムあるいは未知の代謝機構などと密接に関連して進行していることが示唆された。ゴミムシダマシの蛹の腹部屈曲運動に与える各種神経ホルモン(プロクトリン、FMRFアミド、FXPRLアミド、PDF)の効果を探るために、中枢神経系と筋肉系におけるこれらの神経ペプチドの存在を免疫細胞化学的に調べた。これらのペプチドホルモンに対して陽性の反応を示す細胞が各神経節に多数分布していたが、プロクトリンとFMRFアミド陽性の1対の運動ニューロンが食道下神経節から腹部第6神経節まであった。腹部神経節にあるこれらの運動ニューロンは軸索を腹部腹側筋に伸ばして、9対の腹部筋の中で一番太い筋肉に終末していた。腹髄と腹部腹側筋のついた生理標本を作成し、後胸神経節と腹部第一神経節の間の神経索を電気刺激してときに起こる腹部全体の収縮に対する神経ペプチドの効果を電気生理学的に調べた。神経ペプチドを単独に与えた時に効果があったペプチドはプロクトリンだけで、他の3種のペプチドは顕著な効果を示さなかった。プロクトリンを投与すると、最初に起こる収縮の大きさが増すと共に、時間的に少し遅れて第2、第3の収縮が顕著に現われ、洗浄後もその効果が長時間続いた。プロクトリンと他のペプチドを同時に投与した時には、FMRFアミドがプロクトリンの効果を抑制し、第2、第3の収縮がほほ消失した。時間的にFMRFアミドを先に投与し、その後にプロクトリンを投与しても同じ効果が現われた。プロクトリンを先に投与し、その後FMRFアミドを投与した時には、洗浄後も長く続くプロクトリンの効果が速やかに消失した。

これらの結果から腹部の屈曲運動は運動ニューロンの性質が異なる複数の筋肉が異なるタイミングで収縮する複雑な血液循環用ポンプとして働き、運動神経末端および神経分泌細胞から放出される神経ペプチドがそのポンプ運動を巧妙に調節していると考えられる。ゴミムシダマシのサナギの食道下神経節にある神経分泌細胞の発火活動と腹部運動および飛翔筋の電気的活動の同調がこれまでに見出されているが、本年度はさらに歩行筋の電気的活動との同調があるかどうか調べた。6本の肢の脛節伸展筋からそれぞれ筋電位を記録、解析したところ、歩行筋の活動には数十分周期のリズムがあり、その活動期は腹部運動の活動期と同期していた。このことはサナギの中で飛翔筋や歩行筋など成虫特有の器官およびその調節神経機構の発達は周期的で、それらがホルモン分泌や血液循環のリズムあるいは未知の代謝機構などと密接に関連して進行していることを示唆している。いろいろな細胞や組織・器官の同調において血液循環パターンが重要となるので、腹部運動が付属肢の血液循環のポンプとして働いているかどうか、体腔に墨汁やメチレンブルーなどの色素を注入して調べた。腹部運動に伴って歩脚や羽根に色素が流入し、血液路が明らかになった。昆虫学の教科書によると、細長い歩脚は薄い膜状の隔壁によって2つの流路にわけられ、それぞれ遠心性経路および求心性経路として働くとされているが、本研究で用いたゴミムシダマシのサナギの腿節では3つの流路に分かれ、1つが遠心性経路、2つが求心性経路として働き、複雑な循環機構があること、および転節と腿節の接合部の遠心性経路に膜状の弁があり逆流を防いでいること、およびその弁構造が蠕発達に伴って大きく変わることなど、新しいしくみが分かった。これまで、歩脚の血液循環はバッタなど不完全変態昆虫で調べられ、そこでの仕組みが昆虫全般に通じるものと信じられてきたが、完全変態昆虫まで一般化できないことを本研究結果は示唆した。
心疾患患者における在宅運動療法を支援するための自律神経活動指標応用に基づいた研究

日常の活動強度と予後規定因子とされる自律神経活動との関係を明らかにし、在宅運動療法への示唆を得ることを目的とした。活動強度3Mets以上の増加は、副交感神経活動指標を上昇させることが示唆された。3Mets未満の増加は、副交感神経活動指標を増加させることに加え、交感神経活動指標を低下させることが示唆された。日常生活の断続的な活動でも増加することで、予後の維持改善に効果がある可能性が示唆された。【背景】循環器リハビリテーションは循環器死亡率の低下と健康関連QOLに有益である。【目的】日常の活動強度と予後規定因子とされる自律神経活動との関係を明らかにし、在宅運動療法への示唆を得ることを目的とした。【方法】対象者は、地域のクリニックにおける高血圧症、虚血性心疾患患者(n=41)とした。2012年度は研究実施施設を増やした影響により備品が増加した。研究参加者には普段と同じ生活の中で、開始時(0か月)、6か月の各1か月間、活動量計にて活動量と3Mets未満の活動(LA)として、3Mets以上の運動(WA)として測定した。また0か月、6か月に24時間ホルター心電図検査を実施した。自律神経活動指標として副交感神経活動指標(HF)と、交感神経活動指標(LF/HF)を全体と睡眠時間帯(sleep)で算出した。これらの指標を用いて6か月で活動量が増加した群(IC)と減少した群(DC)で、さらにHFの増加、LF/HFの減少と活動強度LA、WAの関係を明らかにした。【結果】DC群のHF、LF/HF、sleep HF、sleep LF/HFの0か月と6か月の間に有意差は認めなかった。IC群のHFは0か月と6か月の間に有意に増加し(p =0.048)、sleep LF/HFは有意に減少した(p =0.038)。またLAの増加はHFの増加に影響していることが認められた(p =0.056)。WAの増加はHFの増加に、LF/HFの減少はLAの増加とWAの増加に影響していたが、統計学的有意差は得られなかった。【結論】活動強度3Mets以上の増加は、副交感神経活動指標を上昇させることが示唆された。本研究は、心疾患患者のリハビリテーションとして日常生活中の軽微な運動に着目し、在宅運動療法支援として新しい運動療法を考案するため、以下の項目を研究した。屋内外での歩行、掃除、片付けなど在宅における比較的軽微な日常的運動で、運動療法として効果があることを示すエビデンスを取得する(運動負荷試験、及び健康関連QOLにて)。その運動療法の効果を、在宅で測定できる指標で明らかにする(自律神経活動指標などにて)。平成23年度5月から研究協力施設での研究参加者登録を開始した。参加者は、高血圧、虚血性心疾患、脂質異常症等で内服治療中の患者でコミュニケーション障害のない患者とした。参加者には普段と同じ生活をしながら、開始時と6か月後に各1か月間の活動量と同じく開始時と6か月後に24時間ホルター心電図から自律神経活動を、また健康関連QOL測定した。Wilcoxon signedranktestでp<.05を有意とした。研究の登録者68名のうち、6か月の継続調査と各種の測定項目を完遂し、分析対象としたのは22名であった。本研究の対象者の年齢は71歳で、最小が59歳、最大が83歳であった。男性が15名(68.2%)を占めていた。心疾患のうち、狭心症を既往に持つ患者は10名(45.5%)であり、心不全は(18.2%)であった。高血圧の治療を行っている患者は17名(77.3%)であり、脂質異常症は9名(40.9%)であった。全対象の健康関連QOLは開始時からすでに高値を示し、6か月後も高値を維持していた。6か月に活動量が増加した対象者を抽出し、0と6か月間の副交感神経指標を比較した。活動量のうち低い活動強度の増加群において、副交感神経指標であるHigh-frequencyは、0か月の中央値が28(11ー61)、6か月後の中央値70(15ー135)でありp=0.013で有意に6か月後に増加していた。6か月の前向き観察研究であるため、今年度末の分析対象者は22名にとどまったが、今後、順次6か月を迎える患者が多くいるため、順調に進展していると判断した。今回の分析において、データのばらつきや個人差が大きいことが明らかとなった。

今後、できる限り研究参加者を増やし、解析を行っていく必要性がある。研究協力施設を増やすことも視野に入れて取り組んでいく。統計処理ソフトの購入、国内外の学会への参加、英語論文投稿準備のため使用する。
神経細胞死抑制因子の動態に基づいたアルツハイマー病克服への試み

アルツハイマー病(AD)の防御因子ヒューマニン(HN)の研究を押し進め、1)EHは脳脊髄液中に1-5nMの濃度で存在すること,さらに、2)EHはAD類似の認知症動物モデルで有効であることを示した。これらの結果は、EHが内在性の抗AD因子としてHNより中心的な役割を果たしていることを示唆する。さらに、4)ADでは脳脊髄液中のEH濃度が減少する傾向にあることを見いだし、EHの挙動がAD発症の一要因となっている可能性があると推論した。また、5)EH阻害分子EHIbetaは細胞内でEHの分泌を抑制し、EHIsigmaは細胞外に分泌されEHと結合してEH阻害因子として機能することを見いだした。アルツハイマー病(AD)、ヒューマニン(HN)/EHシグナル活性化療法の臨床応用をより有効なものにするための基礎研究と前臨床研究を遂行した。まず、HN/EHに関連する未解決な生物学的問題に対する基礎研究に関しては、作成したEHのリコンビナント蛋白を用いて、EHの活性がHNよりはるかに強力なことを示した。従って、生体内ではEHが中心的な役割を果たしている可能性が高いことから、研究の焦点をEHの生体内挙動に絞って検討することとした。EHは主に皮膚(一部筋肉内)にのみ限局して発現すること、腹腔内投与されたEHは血液を介して中枢神経内に移行することを見いだした。この結果は、皮膚から分泌されたEHは血液循環系を介してBBBを通過して脳内移行し、AD関連神経毒性を抑制していることを示している。また、EHの活性を制御する分子として14-3-3sigmaとbetaを同定し、前者は皮膚に主に発現し、細胞外に分泌されて、EH活性を抑制すること、後者は細胞内でEHに結合して、その細胞外分泌を抑制することを示した。また、EHの高血糖抑制作用は、観察されなかった。次に、HN/EHシグナル活性化療法の前臨床研究をとして、スコポラミン誘導性のマウス記憶障害に対して、腹腔内投与されたEHは改善効果を示すことを見いだした。最後に、ADの生化学的早期診断法を確立する研究を行った。EHに対する特異抗体を作成して、ウエスタン法による測定アッセイ系を確立し、ひと血中濃度を測定したとこと、AD罹患者と正常コントロールで大きな差がないことが明らかとなった。アルツハイマー病(AD)に対するヒューマニン(HN)/EHシグナル活性化療法の臨床応用をより有効なものにするための基礎研究と前臨床研究の3年目を遂行した。まず、EHの基礎研究(HN/EHに関連する未解決な生物学的問題に対する基礎研究)に関しては、1)このシグナルのeffectorのひとつであるApollonの機能解析を行った。ApollonはユニークなIAP familyに所属する分子で、高発現すると,家族性AD原因遺伝子により誘導される神経細胞死を抑制した。また,2) AD発症を抑制する変異体A598T-APPの機能解析を行い、この変異体がTGFbeta2誘導性の神経細胞死シグナルを抑制する変異体であることを見いだした。次に、3)作製したEH transgenicマウスをADマウスに掛け合わせdouble transgenic miceを作製した。まだ十分なNが得られていないが、作成後6ヶ月で,記憶行動試験を行う予定である。また、4)EHの精子前駆細胞の細胞死抑制作用に関しては、N=3ながら、gonadotropin-releasing hormone antagonistであるCetrorelix誘導性のマウス睾丸germ cells細胞死をEHが抑制することを見いだした。最後に、5)14-3-3 sigmaが細胞外に分泌され,EHと結合してEHの神経細胞死抑制活性を抑制し,14-3-3betaはEHの細胞外分泌を抑制することを見いだした。次に、ADの生化学的早期診断法を確立する研究に関して、ヒトの髄液においても1-5 nMレベルのEHが存在することを見いだし,AD罹患者の髄液で低下する傾向があることを見いだした。今後、Nを増やして,さらに検討を重ねる予定である。アルツハイマー病(AD)に対するヒューマニン(HN)/EHシグナル活性化療法の臨床応用をより有効なものにするための基礎研究と前臨床研究の2年目を遂行した。まず、EHの基礎研究(HN/EHに関連する未解決な生物学的問題に対する基礎研究)に関しては、1)このシグナルが活性化するSTAT3の下流に存在し、このシグナルのeffectorとなる細胞内分子としてSH3BP5およびapollonを発見した。特に、SH3BP5は細胞内でJNKの直接的な阻害因子として働くことにより作用を発揮することを見いだした。2)EHノックアウトマウスに関して、マウス遺伝子上にタンデムに並んで存在する2種類のEH遺伝子があり、両者を同時にノックアウトしなければならないという技術上の難点から作製が難航した。

そこで方針をEH transgenicマウスを作成することに転換し、同マウスをADマウスに掛け合わせ、認知症状を改善できるか否かを検討することとした。マウスの作製の初期段階は順調に経過し、実際transgeneを有するマウスを得ることに成功した。3)EHにはインスリン作用増強作用はないということを確認した。4)EHの精子前駆細胞の細胞死抑制作用に関しては、実験遂行のためにモデル系を確立した。次に、ADの生化学的早期診断法を確立する研究に関して、確立したEHのウエスタン法による測定アッセイ系を駆使して、ヒトの髄液においても0.1 nMレベルのEHが存在することを見いだした。この事実は中枢神経系においてEHが有効濃度存在することを意味している。また、特異的な14-3-3sigmaの濃度アッセイ系を確立し、ADとコントロールの血中濃度を比較したが、有意な変化は見いだせなかった。ほとんどの予定した研究は行った。そして、その結果はおおむね陽性方向であった。ただし、EH遺伝子ノックアウトに関するプロジェクトは、EH1とEH2遺伝子がタンデムに連続しているという特性のため、進捗していない。HN/EH様小分子の探索は外注する必要があるが、予想外の高額費用の制約があり、進捗していない。EHの抗糖尿病活性はないことが示された。25年度が最終年度であるため、記入しない。(理由)予想以上に進捗したプロジェクトはHN/EHシグナルの下流分子の同定研究であり、特にSH3BP5がJNKの阻害因子であるという予想外の新たな発見に至った。一方、EH遺伝子ノックアウトに関するプロジェクトは、EH1とEH2遺伝子がタンデムに連続しているという特性のため、実験遂行に支障を来した為、断念せざるを得なかった。代替のプロジェクトとして、transgenicマウス作製することに方針転換した。臨床サンプルに関しては髄液サンプルの調達が困難であり、当初予想したよりも時間がかかっている。その他の研究は作業仮説が正しくないことが最終的に明らかになったプロジェクトを含め、おおむね順調に進捗している。HN/EH活性をもつ小分子の探査プロジェクトに関しては興味をもつ企業が現れず断念した。研究のコアの部分は順調に進捗している。次年度以降も同様に行う。EHのノックアウトプロジェクトに関しては、経験の豊かな申請者の属する大学所属の研究者との共同研究を考慮する。HN/EH様小分子の探索に関しては多数のmedicinal chemistを有する製薬企業との共同研究を考える。EHのノックアウトプロジェクトに関しては、既に、計画を変更してtransgenicマウス作製に変え、順調に経過している。
遷移金属酸化物を含む機能性ガラスの電気的性質と内部摩擦との関連性

遷移金属酸化物を含むリン酸塩ガラス中で鉄,バナジウムリン酸塩ガラスは,非常に高い導電率を持っておりサーミスタ,センサー,スイッチング素子等えの応用が期待される興味あるガラスである.本研究では,バナジウムを含むV_2O_5-P_2O_5系とV_2O_5-B_2O_3-P_2O_5系のガラスについて,電気的なキャリヤである電子の挙動を直流導電率,誘電率,誘電損失,内部摩擦を測定し解析を行なった.その結果,導電率の温度依存性は,いずれのガラスも直線性を示し, 30100°Cの間でlogσ=-6-3(S/cm)の非常に高い値を示した.また, B_2O_3を導入した3成分系ガラスは, B_2O_3を含まない2成分系ガラスよりも約100倍高い導電率を示した.この原因を超低周波まで測定可能な内部摩擦によって詳細に検討した結果, B_2O_3を導入したガラス中にBVO_4が形成し,この量に依存してマトリックス中のV_2O_5濃度が上昇し, V^<+4>【double half arrows】^<5+>のホッピング伝導が上昇するためであることを見い出した.又,電気的性質と内部摩擦の測定結果から1.内部摩擦と誘電吸収のピークから計算した活性化エネルギーが,一致し内部摩擦で観察されたピークは,誘電緩和現象と同様にV^<+4>【double half arrows】^<5+>間の電子のホッピングにもとずく事が明らかとなった.2.内部摩擦により観察されるピークを,ガラス中に含まれる遷移金属のモル数で割った値を,価数比(R=V^<+4+>/V^<4+>+V^<5+>)に対してプロットすると半円の規格化曲線が得られた.この事は, 2種の遷移金属を含むガラスの様に,お互いのイオンの相互作用のため化学分析が出来ない組成のガラスでも,内部摩擦のピークが観察されれば,逆にガラス中に含まれる遷移金属イオンの価数比を求めることが出来るという画期的な成果が得られた.今後の研究の展開は,ホッピング伝導においてキャリヤとして電子の挙動について解析して来たが, MnO-P_2O_5系の様に正孔が関与するガラスについても,電気的性質と内部摩擦の関連性を検討して行く積りで準備している.遷移金属酸化物を含むリン酸塩ガラス中で鉄,バナジウムリン酸塩ガラスは,非常に高い導電率を持っておりサーミスタ,センサー,スイッチング素子等えの応用が期待される興味あるガラスである.本研究では,バナジウムを含むV_2O_5-P_2O_5系とV_2O_5-B_2O_3-P_2O_5系のガラスについて,電気的なキャリヤである電子の挙動を直流導電率,誘電率,誘電損失,内部摩擦を測定し解析を行なった.その結果,導電率の温度依存性は,いずれのガラスも直線性を示し, 30100°Cの間でlogσ=-6-3(S/cm)の非常に高い値を示した.また, B_2O_3を導入した3成分系ガラスは, B_2O_3を含まない2成分系ガラスよりも約100倍高い導電率を示した.この原因を超低周波まで測定可能な内部摩擦によって詳細に検討した結果, B_2O_3を導入したガラス中にBVO_4が形成し,この量に依存してマトリックス中のV_2O_5濃度が上昇し, V^<+4>【double half arrows】^<5+>のホッピング伝導が上昇するためであることを見い出した.又,電気的性質と内部摩擦の測定結果から1.内部摩擦と誘電吸収のピークから計算した活性化エネルギーが,一致し内部摩擦で観察されたピークは,誘電緩和現象と同様にV^<+4>【double half arrows】^<5+>間の電子のホッピングにもとずく事が明らかとなった.2.内部摩擦により観察されるピークを,ガラス中に含まれる遷移金属のモル数で割った値を,価数比(R=V^<+4+>/V^<4+>+V^<5+>)に対してプロットすると半円の規格化曲線が得られた.この事は, 2種の遷移金属を含むガラスの様に,お互いのイオンの相互作用のため化学分析が出来ない組成のガラスでも,内部摩擦のピークが観察されれば,逆にガラス中に含まれる遷移金属イオンの価数比を求めることが出来るという画期的な成果が得られた.今後の研究の展開は,ホッピング伝導においてキャリヤとして電子の挙動について解析して来たが, MnO-P_2O_5系の様に正孔が関与するガラスについても,電気的性質と内部摩擦の関連性を検討して行く積りで準備している.光を用いた情報処理や通信方式の採用により、光アイソレーターとしてカルサイト単結晶は欠くことができない光学材料となってきた。しかし、天然の良質結晶は枯渇している。本研究は、申請者のこれまでの予備実験によって有効性が認められた水熱法を用いて、カルサイトの工業的育成のための最適条件を明らかにし、結晶の評価を行うことを目的としている。良質結晶を工業的に育成するためには、完全性が高い結晶を十分な成長速度で育成しうる熱水溶液の選択を行なうことが必要である。

本研究では、天然カルサイトの成長に関与していたと考えられる塩化ナトリウム,塩化カリウム熱水溶液が効果的な溶液であることを見出し、それらの熱水溶液中におけるカルサイトの溶解度を測定した。塩化ナトリウム熱水溶液中では、育成に十分な溶解度があり、その溶解熱は46kJ/molであった。成長した結晶は{10【1!】1}面で囲まれた菱面体の形をし、赤外線吸収スペクトル分析では、天然良質単結晶と同程度の良い光学的完全性を有していることが明らかになった。塩化カリウム溶液も同様に良い溶媒であることがわかった。塩化物系熱水溶液に対して、硝酸塩系熱水溶液の方が、溶解度の向上とより低温での育成の可能性の両面から考え、より優れた熱水溶媒であることに着目し、世界で初めて硝酸塩溶媒の有効性を見出した。硝酸ナトリウム熱水溶液中での溶解度は、同条件で、塩化ナトリウム熱水溶液中での溶解度の2倍と高く、硝酸カルシウム熱水溶液中での値に近かった。硝酸カルシウム溶液中での育成では、カルシウムイオンが育成結晶と同一であり、不純物イオンの混入もなく最適育成条件であることがわかった。溶解熱は43.8kJ/molで{10【1!】1}面で囲まれた、よく発達した単結晶を育成することができ、その転位密度は【10^(-3)】【cm^(-2)】程度と非常に良質であり、今後の発展が各国から期待されている。
鉄鋼スラグ水和固化体の高性能化に関する研究

製鉄副産物を主原料に製造される鉄鋼スラグ水和固化体は,環境負荷低減が大いに期待される材料である。本研究では,現在,無筋の海洋ブロック等に用いられている鉄鋼スラグ水和固化体の適用範囲を地上構造物等へ拡大することを目的に,ひび割れの原因となる乾燥収縮ひずみの予測手法および凍結融解抵抗性改善について検討を行ったものである。鉄鋼スラグ水和固化体の凍結融解抵抗性が劣る原因を解明し,改善方法を示した。また,鉄鋼スラグ水和固化体の乾燥収縮ひずみを予測する手法を提案した。鉄鋼スラグ水和固化体は,鉄鋼製造工程で発生する副産物を用いて製造される建設材料である。鉄鋼スラグは,高炉スラグと製鋼スラグの二つに大きく分類される。高炉スラグは,銑鉄を製造する高炉で発生するもので,その成分は,天然の岩石に類似したものである。一方,製鋼スラグは,銑鉄を鋼にする工程において生成されるものである。高炉スラグが,銑鉄1トン当たり約290kg生成されるのに対し,製鋼スラグは,粗鋼1トン当たり約110kg生成される。平成18年度における高炉スラグおよび製鋼スラグの発生量は,それぞれ,約2,500万トンおよび約1,400万トンである。鉄鋼スラグ水和固化体は,コンクリート用材料としての使用実績が低い製鋼スラグを用いることに特色があり,大量の産業副産物を有効利用できる環境負荷低減型材料として期待されている。鉄鋼スラグ水和固化体は,主に護岸工事用ブロック等の無筋構造物を対象に,試験施工が多く行われている。大量に発生する鉄鋼スラグの有効利用を広げるためには,鉄鋼スラグ水和固化体の有筋材への適用を検討する必要がある。本年度は,とくに細骨材の種類が鉄鋼スラグ水和固化体の耐久性に及ぼす影響を調べた。製鋼スラグを細骨材に用いた鉄鋼スラグ水和固化体は,普通コンクリートに比べて,圧縮強度,中性化,塩化物イオンの浸透性および耐硫酸性が劣ることを実験的に明らかにするとともに,細骨材に高炉スラグを用いた鉄鋼スラグ水和固化体は,圧縮強度の増加は小さいものの,中性化,塩化物イオンの浸透性および耐硫酸性は改善されることを明らかとした。鉄鋼スラグ水和固化体の強度は,水粉体比の他に,練混ぜ直後のpHにも依存する。また,鉄鋼スラグ水和固化体の耐中性化および耐鉄筋腐食性は,製鋼スラグのアルカリ性によって,長期にわたって高い性能をもつ。このように,鉄鋼スラグ水和固化体は,通常のコンクリートと同程度の性能が発現可能な,副産物を利用した建設材料であるが,使用するスラグ骨材の品質によっては耐久性,とくに凍結融解抵抗性と乾燥収縮に対するひび割れ抵抗性が劣る場合がある。鉄鋼スラグ水和固化体の性能を改善することを目的に,吸水率を下げた溶銑予備処理スラグを骨材として使用し,鉄鋼スラグ水和固化体の硬化後の性能に及ぼす影響を実験により確認を昨年行った。その結果によれば,吸水率の低い溶銑予備処理スラグを用いれば,エントレインドエアが連行されやすくなり,耐凍害性は,著しく改善されること,また,乾燥によって生じるひずみの大きさも小さくなり,乾燥によるひび割れも生じにくくなる。しかし,この方法では,溶銑予備処理スラグの吸水率を下げる工程において多大なエネルギーを要することが問題となる。これらの結果に基づき,本年度は,下記のテーマに取り組んだ。1.耐酸性鉄鋼スラグ水和固化体の開発今後510年先,下水道コンクリートの酸による劣化は加速度的に増大すると考えられており,耐酸性材料の開発は急務の課題である。鉄鋼スラグ水和固化体はセメントを全く使用していないため,酸性環境に弱い水和生成物であるエトリンガイト(3CaO・A1203・3CaS04・32H20)や二水石膏(CaS04・2H20)が少なく,耐酸性に優れることが推測できる。そこで,鉄鋼スラグ水和固化体の耐酸性についての性能を実験により把握し,耐酸性材料としての利用について検討を行った。2.鉄鋼スラグ水和固化体の耐久性の確認鉄鋼スラグ水和固化体の耐凍結融解抵抗性,塩分浸透性,耐硫酸塩抵抗性,中性化および収縮に,製鋼スラグの吸水率,密度,カルシウム含有率等が及ぼす影響を整理し,本課題で開発を行う耐凍害性に優れる鉄鋼スラグ水和固化体および有筋部材へ適用可能な鉄鋼スラグ水和固化体が,従来の鉄鋼スラグ水和固化体に比較して,各々の性能が向上するメカニズムを説明できる構成式を検討した。

鉄鋼スラグ水和固化体は,セメントおよび天然骨材を全く使用せず,製鋼スラグ(転炉スラグ,溶銑スラグ等)や高炉スラグ微粉末等の精錬過程で生じるスラグ類や,フライアッシュ等のリサイクル材料で構成される固化体であり,従来コンクリートと同等の強度を有するものである。また,pHが低く,鉄分を多く含むため,海洋における生物付着性も良好であり,港湾工事における消波ブロックや被覆ブロック等に適用されている。鉄鋼スラグ水和固化体の適用範囲をさらに拡大するためには,鉄鋼スラグ水和固化体の高強度化,高耐久性化,また,この素材の特徴を生かした用途開発が必要である。本研究では,有効利用できる可能性がありながら,利用先が明確でなく埋立て処分されてきた製鉄の過程で生じる製鋼スラグをコンクリート用骨材として有効に活用するための技術開発と,製鋼スラグを用いることによる経済的効果および環境負荷低減効果等の試算を行った。鉄鋼スラグ水和固化体の耐凍結融解抵抗性,塩分浸透性,耐硫酸塩抵抗性,中性化および収縮に,製鋼スラグの吸水率,密度,カルシウム含有率等が及ぼす影響を整理し,本研究で開発を行った耐凍害性に優れる鉄鋼スラグ水和固化体および有筋部材へ適用可能な鉄鋼スラグ水和固化体が,従来の鉄鋼スラグ水和固化体に比較して,各々の性能が向上するメカニズムを検討した。また,鉄鋼スラグ水和固化体を用いた構造物(または製品)の設計に必要とされる物性値を実験により確認し,鉄鋼スラグ水和固化体の有筋構造物への適用性について検討を行った。とくに,鉄筋コンクリート構造物として適用するために要求される性能の一つが乾燥収縮によるひび割れに対する抵抗性である。鉄鋼スラグ水和固化体の乾燥収縮ひずみ特性と,収縮によるひび割れに対する抵抗性を調べるとともに,使用荷重下でのひび割れの大きさを低減する手法を示した。
津波により塩水化した地下水の回復メカニズムの解明とその回復傾向の予測

津波被災地域では,海水の鉛直浸透により塩水化したが,降水や水田涵養等により,塩水の上に新たな淡水域が形成される形で地下水は回復(再淡水化)しつつある。今後の地下水利用再開には,回復に要する期間の見通しが必要となるが,その回復メカニズムには未解明な部分が多い。本研究では,被災地での農業用地下水の利用再開に資するために,複数の環境トレーサーを用いて地下水の回復メカニズムを明らかにするとともに,回復傾向の予測を行う手法を提示する。
陶材を応用した歯冠補綴物の強度に関する研究-ひずみゲージによる応力解析-

ポーセレンジャケットクラウン、陶材焼付前装冠などが陶材部分で破析しやすいという欠点を改善するため、当教室ではこれまで、基礎的には板状(単層、三層)にした陶材の曲げ強度試験、疲労試験を、さらに臨床的な形態にしたポーセレンジャケットクラウンや陶材焼付前装冠を金属支台に合着した場合の破析強度試験、疲労試験など、陶材の破析に関して強度の面から一連の研究を行ってきている。本研究ではまず、支台として天然歯を用いた場合のポーセレンジャケットクラウンの破析強度について調べた。さらに、微小の箔ひずみゲージを用い、荷重をかけたときのポーセレンジャケットクラウンの表面各部位に生ずるひずみを測定し、この結果と天然歯支台の強度試験の結果と比較した。支台として用いた天然歯は平均的な上顎中切歯10本で、これを形成し間接法により、2種のポーセレンジャケットクラウン(ビタデュールN、セレストアクラウン)を5個づつ製作、燐酸亜鉛セメントで支台歯に合着し破析試験を行った。その結果ビタデュールNは平均21kgf、セレストアクラウンは平均29kgfで破析した。これを詳細に検討すると、ジャケットクラウンの隣接面辺縁部の歯冠側への凸彎の程度が大きいものほど、強度が低い傾向にあることがわかった。これは凸彎が大きい程この部分への応力集中が大きいためと考えられ、破析線もすべてこの部位に発生していた。一方、ひずみゲージによる荷重時の応力分布の測定結果では、この部位のジャケットクラウンの表面には圧縮応力が生じていたが、逆に内面には引張り応力が生じていたとも考えられる。これらの結果は、隣接面部の支台形態、内面辺縁部の形態がポーセレンジャケットクラウンの強度に大きな影響があることを示唆している。今後、これらの点についてさらに研究を進める予定である。
日本人大学生の明示的・暗示的英語知識の測定：わからないのか使えないのか

本研究は大学生の英文法の知識と産出能力の測定を行った。結果、冠詞、間接疑問文、関係代名詞などの項目は正しい知識に欠けることが判明し、明示的な指導および学習の重要性が確認された。さらに複数のS、進行形、完了形などは、形式の理解度と、どういった場合に使用すべきかの理解度に差のあることが判明し、多読、多聴などを通してより多くの例に触れる事の必要性が伺えた。スピーキングにおいては、速度が非常に遅く考えてからしか話せないという結果であった。自由会話など、その場で考えて発話する事で流暢さの向上をはかりつつ、プレゼンテーションなどの場合は正確さも求める等、バランスのとれた指導と練習が望まれる。26年度はまず20の文法項目に関する時間制限有と時間制限無の文法性判断テストを作成し、260名を対象に実施した。問題プールとして各文法項目に対して非文法的な文を2種類、11項目に対して文法的な文を2種類の合計68問を準備し、共通項目を含む37問のテストを4バージョン作成した。時間制限有と無テストは異なるバージョンを受験するよう設定し、期間を2週間以上空けて実施した。対象者は時間制限有と無のそれぞれ1バージョンを受験し、共通項目を使用して4バージョンのデータを等価し、Winstepsを使用して分析を行った。結果、時間制限の有無による有意差は認められなかったが、文法的文と非文法的文の結果に有意差が確認された。さらに、対象文法項目の中に難易度の低すぎる項目と高すぎる項目があったことや、問題文やその訳が混乱を起こしたと考えられる問題が確認され、文法項目を15に絞り、いくつかの問題文を変更した。26年度の後半は、変更を加えた15の文法項目に対する時間制限無の文法性判断テストと短文英訳テストを約200名の学生を対象に実施した。短文英訳テストは文法性判断テストと同じ問題プールから選択した12問から成る4バージョンを作成し、対象者は受検した文法性判断テストと違うバージョンの短文英訳テストを受験した。結果、対象文法項目以外の間違いをどう扱うべきかという問題が生じた。これらの結果を踏まえ、27年度に実施する文法性判断テストおよび短文英訳テストを、それぞれ共通項目を含む4バージョン作成した。文法性判断テストは時間制限無バージョンのみ実施することとし、上記の15項目の問題文に変更を加えた。短文英訳テストにおいては、対象文法項目の重複する問題文はそれぞれの項目に対して採点できるような配点形式に変更した。文法性判断テストは各バージョン26問、短文英訳テストは各バージョン14問とした。本年度は約500名の大学生に対して一連のテストを実施し、データの使用に同意した449名のデータを分析した。アンケートでは、授業以外での英語の使用に関して137名が「ほとんど使わない」、260名が「全く使わない」と解答し、一般的な日本人学生にとって、英語はまだまだ教科であり、コミュニケーションの道具として使用している、又はそのような機会のある学生は稀であることがわかった。「文法ルールテスト」では、20項目の文法事項の選択問題を実施した。このテストで難易度が高かったのは「副詞の位置」「Do you like...?での複数名詞」「冠詞」「間接疑問文」などであり、難易度が低かった項目は「三単現のs」と「規則動詞の過去形-ed」などであった。「文法性判断テスト」では、17の文法項目に関する45問をテストした。このテストは英文の間違いを見つけて訂正するというものである。難易度が高かった文法項目は「間接疑問文」「Do you like...?での複数名詞」「付加疑問」などで、難易度の低かった項目は「三単現のs」「規則動詞の過去形-ed」「所有のs」などであった。「日英短文翻訳(筆記)」では同じく17の文法項目を対象に採点した。このテストでも「Do you like...?での複数名詞」「付加疑問」「間接疑問文」の難易度が高かった。興味深かった点は、その他のテストと異なり、「三単現のs」の難易度が高かったことである。「日英短文翻訳(口頭)」と「絵描写テスト(口頭)」を授業時間外での協力者22名を対象に実施したが、対象者が少ないため、28年度のテスト結果と合併して分析することとした。27年度は計画していたテストの実施は予定通り終了し、成果発表を国際学会で行うこともできた。しかし、筆記や口頭翻訳の分析段階において、対象としていなかった文法エラーが目立つなど、テスト項目を修正することでさらに信頼性の高い結果が得られるのではないかと考え、28年度にも引き続きテストを実施することとした。28年度実施する改訂版のテストでは、時間制限の影響も再度検証することとした。とういうのは、26年度のパイロットテストで時間制限の有無による有意差は無いという結果であったが、その後も海外ジャーナルなどで有意差があるとの論文も出ているからである。28年度は27年度のテストに修正を加え、文法ルールテスト、文法性判断テストおよび筆記の短文日英翻訳テストを345名の参加者を対象に実施した。更に45名の参加者に対して口頭の短文日英翻訳テスト、口頭及び筆記の絵描写テストを実施した。

知識を測定するテストでは、文法ルールテストのデータを分析した結果、最も難易度の高かったのは複数のS(総称のS)で、次にGo+動名詞(go skiing)、関係節、間接疑問文、冠詞と続き、難易度の低かったのは規則動詞の過去形、3単現のS、比較級のthanなどであった。文法性判断テストでも、関係節、間接疑問文、Go+動名詞、冠詞などが難しく、規則動詞の過去、3単現のS、Yes/No疑問文などが比較的容易であるという結果であった。産出を測定するテストでは、短文日英翻訳テスト(筆記)において、知識の測定の結果と同様に間接疑問文や冠詞、関係節が難しいとの結果になった。しかし、現在進行形が最も難易度が高いという予想外の点があり、これは口頭の短文日英翻訳でも同じ結果であった。教科書などでよく目にする進行形の例文に使われる動詞(study、readなど)以外の動詞だと進行形に出来ない可能性が考えられる。口頭及び筆記の絵描写テストでは、時制の一致、複数のS、冠詞の間違いが多かった。さらに完了形の誤った使用(完了形にすべき所ではない部分での使用)が目立ち、これは上記の進行形と同様に、形は理解できていてもどういった場面で使用するかを理解していないケースであると考えられる。絵描写テストは口頭テストの後に筆記を行ったが、口頭における1分間の発語数が顕著に少なく、口頭と筆記における産出量や文の正確さに差が見られなかった。これらの結果から、本研究の対象者が口頭テストの際もゆっくりと考えてから明示的知識に頼って発話していると考えられる。27年度のテストデータの分析段階において、対象外の文法項目のエラーが目立ち、28年度に改訂版のテストを実施した。さらに、本研究では文法性判断テストにおける時間制限は影響ないという結果が出たが、研究期間中に海外ジャーナルで有意差があるとの論文が出版された為、時間制限の影響に絞った内容の学会発表及び論文出版を先に行った。上記の理由で計画に遅延が生じた為、最終的な結果の論文執筆および学会発表を29年度に延期することとなった。最終年度は前年度までのデータを分析し、The Applied Linguistics Conference 2017で学会発表を行い、JACET東アジア英語教育研究会から論文が出版された。学会はニュージーランドのオークランドで開催され、様々な国の英語教育関係者からコメントを得ることができた。質問も多く、日本の大学での英語教育の現状を伝える事ができたのではないかと考える。他の研究者の発表内容と比較しても、日本の大学の英語教育が直面している学生の英語力の低下などの問題は英語圏におけるESL環境とは大きく異り、普段の生活で英語を必要としない日本の英語学習者に合った教育法の必要性を再認識した。本研究では、間接疑問文や付加疑問文、関係節といった文法項目は、予想通り理解、産出ともに難易度が高いという結果となった。さらに、複数形や現在進行形といった基礎的な項目の難易度が、特に産出において高いという結果も明らかになった。「複数の名詞の語尾にSを付ける。」「進行中の動作にはbe+ingを使う」といった一見シンプルなルールで、形式は理解できているにも関わらず、実際に文を書く、話す、となると、どのような場合に複数形や進行形が必要であるかという点が理解できていない学習者が多いということである。コミュニケーションの手段としての英語が求められる今日、こうした一見容易な文法項目が正しく使用できるようになる産出練習が重要であると考える。
^<15>N、^<13>C、^2H固体NMRによる繊維・高分子の非晶構造とダイナミクスの解明

本研究の目的は、繊維・高分子の非晶構造解明のための固体NMRの手法を開発し、その非晶構造ならびにグイナミクスを明らかにするとともに、その物性との関連を解明することである。研究対象は、様々な部位を^<13>C,^<15>Nおよび^2Hで同位体ラベルされた家蚕およびエリ蚕絹、^<13>Cラベル毛髪ケラチン、ポリ乳酸等である。研究手法は、角度依存固体NMR、重水素固体ダイナミクスNMR、等方的NMR化学シフトの決定と化学シフト計算、固体スピン拡散NMR、REDOR法等であり、各種測定は、CMX 400 MHz固体NMR装置を用いた。例えば、安定同位体ラベルエリ蚕絹について、角度依存固体NMR測定によって配向成分の主鎖内部回転角を決定することができた。家蚕絹同様、βシート構造をとる。その配向成分の割合の決定から、延伸初にAla連鎖部分がβシート構造を形成し、Gly残基の存在する領域は延伸によって引き延ばされると考えられた。エリ蚕絹の配向成分の割合が家蚕と比べかなり少ないこと、Gly残基の配向軸方向の乱れが大きいなどの要因が、二種類の絹の力学的物性の差に反映されるものと結論した。また、重水素ラベル家蚕及びエリ蚕絹の固体重水素NMRから、Ser側鎖には運動状態の異なる二成分が存在し、遅い成分は、Ser側鎖水酸基の関与した水素結合形成に対応した。一方、家蚕及びエリ蚕絹のTyr環の運動は、二成分で解析でき、家蚕絹では速いflip-flop成分が20%、エリ蚕絹では60%に増加した。家蚕絹ではTyr残基はβsheet中に巻き込まれ大部分動きにくい状態に存在する一方、エリ蚕絹では周囲により動ける空間が存在することを示す。これが、二種の絹間の例えば力学的損失正接tariδの値の違いに対応すると考えられた。さらに、40個のタンパク質の原子座標と化学シフトのデータベースに基づいて、^<13>C NMR化学シフトの(φ,ψ)マップをアミノ酸残基毎に作成、それを家蚕絹の繊維化前後の各々Silk I,Silk II型構造及びエリ蚕絹の繊維化前後の各々、α-helix,β構造の解明に適用した。その他、固体スピン拡散NMR、REDOR法を新たに絹構造解析に適用するとともに、ケラチン、ポリ乳酸の^<13>CNMR固体構造解析を行い、構造と物性との関連について研究した。以上のように、繊維・高分子の非晶構造解明のための固体NMRの手法を5種類程、開発でき、その非晶構造ならびにダイナミクスの検討をすすめ、その物性との関連を解明することができた。成果の詳細は、投稿中を含め、合わせて、34報にまとめることができた。

成果の詳細は、投稿中を含め、合わせて、34報にまとめることができた。繊維状蛋白質として、絹フィブロインを選らんだ。絹フィブロインの同位体ラベル化は、経口投与および絹糸腺培養法で行った。ラベル部位は、[1-13C]および[2-13C]Gly,Alaとした。得られた繊維状絹フィブロインから一軸配向ブロック試料とパウダー試料を作製し、400MHz固体NMR装置(本学に既設置)を用いて、2D固体スピン拡散NMRスペクトルを測定した。また、13Cラベル家蚕絹フィブロインモデルペプシドとして(Poly([1-13C]Ala-Gly)n,Poly(Ala[1-13C]Gly)n)を合成した。これらのペプチドを透析によってsilkI型構造に調製した。スペクトル解析は、Profs.ErnstならびにMeierらが開発したプログラムgammaを用い、Work Stationを購入して実行した。原子座標に基づき、その局所構造を仮定し、実測と理論パターンを比較して、一致するスペクトルを検討した。13Cラベル家蚕絹フィブロインモデルペプチドの透析によって得られた試料の13C CP/MAS NMRスペクトルのAla-Cβピークの化学シフトからsilkI型と同定した。この試料の2Dスピン拡散NMR測定を行ったところ、高濃度13CラベルPoly([1-13C]Ala-Gly)n試料(A)と、ノンラベルPoly(Ala-Gly)nで希釈した低濃度13CラベルPoly([1-13C]Ala-Gly)n試料(A*)では異なるスペクトルパターンとなることが観測された(Fig.1)。このパターンの変化はsilkI型の原子座標に基づくスペクトルシミュレーションから、13Cラベルサイトの分子鎖内および分子鎖間の空間配置で定量的に説明できることを明らかにできた。エリ蚕絹フィブロインの繊維化過程における13C固体2次元スピン拡散NMRスペクトルの解析からは、繊維化前後の試料から、分子鎖内の13Cスピン配置を原子座標から検討し、主鎖内部回転角の決定が可能であることが我々の研究からあきらかとなった。本研究の目的は、繊維・高分子の非晶構造解明のための個体NMRの手法を開発し、その非晶構造ならびにダイナミクスを明らかにするとともに、その物性との関連を解明することである。研究対象は、様々な部位を^<13>C,^<15>Nおよび^2Hで同位体ラベルされた家蚕およびエリ蚕絹、^<13>Cラベル毛髪ケラチン、ポリ乳酸等である。研究手法は、角度依存個体NMR、重水素個体ダイナミクスNMR、等方的NMR化学シフトの決定と化学シフト計算、個体スピン拡散NMR、REDOR法等であり、各種測定は、CMX400MHz固体NMR装置を用いた。例えば、安定同位体ラベルエリ蚕絹について、角度依存個体NMR測定によって配向成分の主鎖内部回転角を決定することができた。家蚕絹同様、βシート構造をとる。その配向成分の割合の決定から、延伸初期にAla連鎖部分がβシート構造を形成し、Gly残基の存在する領域は延伸によって引き延ばされると考えられた。エリ蚕絹の配向成分の割合が家蚕と比べかなり少ないこと、Gly残基の配向軸方向の乱れが大きいなどの要因が、二種類の絹の力学的物性の差に反映されるものと結論した。また、重水素ラベル家蚕及びエリ蚕絹の個体重水素NMRから、Ser側鎖には運動状態の異なる二成分が存在し、遅い成分は、Ser側鎖水素基の酸基の関与した水素結合形成に対応した。
ゲノムのヘテロ接合度が生産性に与える影響－カキにおける近交弱勢打破に向けて－

1)次世代シーケンサーを用いたマーカー近縁度の推定と評価3世代以上前の祖先まで家系が完全に分かっているカキ19系統について、次世代シーケンス解析(RAD-seq)によりゲノム全体わたるDNA断片の配列情報を取得した。得られたDNA断片情報をマメガキゲノムに対してマッピングすることで、ゲノム上にある12,799箇所の一塩基多型(SNP)を同定した。各SNPサイトの対立アレル頻度(対立アレル数/全アレル数)から、カキの六倍体性を想定したアレル量情報を含む量的多型、およびアレル量情報を含まない多型を判定した。量的多型データについてはPolyRelatedness(Huangら、2014)を、アレル量情報を含まない多型データについてはPLINK(Purcellら、2007)を用いて、個体間で共有するアレル情報を元にマーカー近縁度を推定した。推定したマーカー近縁度の正確性を評価するために、19系統間の家系図を元に算出した近縁係数(fped)を便宜的に真の近縁度と見なして、fpedと各マーカー近縁度との相関係数(r)を求めた。その結果、量的情報なしの多型から推定したマーカー近縁度(fplink-SNP)はr=0.61だったのに対して、量的多型から推定したマーカー近縁度(fpoly-SNP)はr=0.72であった。この結果は、次世代シーケンス解析により得られた量的多型を用いることで、より正確な類縁関係が推定できることを示唆している。2)生産性関連形質の調査次世代シーケンス解析予定の集団(約100個体)について、樹勢、雌花の着生、主幹基部の直径、および新梢数と長さ等を調査した。本年度予定していた1)次世代シーケンサーを用いたマーカー近縁度の推定と評価、および2)生産性関連形質の調査、についてはいずれも計画通り行なった。当初の研究計画通り研究を進められる見込みである。1)生産性関連形質の組合せ平均とマーカー近縁度との関連解析2019年度は、2018年度に確立した次世代シーケンサーを用いたマーカー近縁度の推定法を用いて、主要品種・系統間のマーカー近縁度を推定する。これら主要品種・系統を両親とする実生集団を用いて、マーカー近縁度と形質の平均値との関連解析を行う。2)生産性関連形質調査およびゲノムワイドヘテロ接合度との関連解析2019年度は実生集団(約100個体)について生産性関連形質を継続調査する。2020年度にはこれらの集団について次世代シーケンス解析を行い、ゲノムワイドなヘテロ接合度を推定する。最終年度の2021年度には、実生集団の生産性関連形質のデータとヘテロ接合度との関連解析を実施予定である。

最終年度の2021年度には、実生集団の生産性関連形質のデータとヘテロ接合度との関連解析を実施予定である。次世代シーケンス解析に必要な試薬を購入予定であったが、試薬費を含めて委託解析することで費用を抑えられたため次年度使用額が生じた。2019年度予定している次世代シーケンス解析について、繰越し金と研究当初の助成金を合算することで解析機種のグレードを上げて解析し、より多くのDNA断片情報が得られる見込みである。
ヒト白血病ウイルスに存在する遺伝子(X)の構造と発現

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)のX遺伝子からは、HTLV-【I】では41キロダルトン(kd)、HTLV-【II】では38kdのタンパク質(pX)が発現される。pXの構造を調べる目的で、HTLV-【I】感染細胞からpXに対するmRNAを調整し、そのcDNAの塩基配列を決定した。その結果pXのcDNAはプロウイルスゲノムの5′端から5183番目(envの5′側)でスプライスされて7302番目の塩基と結合していることがわかった。このことからHTLV-【I】のpXはX遺伝子内のフレーム【IV】の5′側アミノ酸の最初の5つが除かれ、その代りenvタンパク質のN端のメチオニン残基が結合したMet-Ala-His-....という構造をとることが予想された。HTLV-【II】の場合も同じ領域の塩基配列が保存されているので同様の構造をとると考えられる。またHTLV-【II】の領域には38kdのタンパク質をコードするフレーム(Xc)に重なる形で別のフレーム(Xb)が存在する。このフレームから推定されるペプチドを化学合成し、それに対する抗体を用いてXbフレーム由来のタンパク質をHTLV-【II】感染細胞において同定した。pXの機能としてはLTRの転写活性を増強する作用があることが示唆されている。それを確かめる目的でHTLV-【I】のX遺伝子を含む断片をマウスメタロチオネインプロモーターの下流に挿入したプラスミドを構築し、これをヒトの細胞株に導入した。この細胞へHTLV-【I】LTRの下流にCAT遺伝子をつないだプラスミドを導入したところpXを発現する細胞ではLTRの転写活性能が促進された。LTR内の転写活性、特にエンハンサー領域を同定した。TATA配列を残してU3領域を殆ど欠失させると転写活性は無くなるが、それにU3領域を戻してやると活性は90%以上回復した。挿入するDNAの方向には無関係であることからこの領域がエンハンサーとして機能し、転写活性にはこの領域の存在が必須である。
HIVタンパク分解活性を有する抗体酵素とエイズ治療への展開

本計画では1)我々の作製した「スーパー抗体酵素」がターゲット分子を破壊する能力を獲得するメカニズムを解明する事、2)抗原を分解する反応機構を解析する事、3)「スーパー抗体酵素」のHIVに対する増殖抑制効果を検討する事、さらには4)航抗HIV薬として可能性のある別なタンパク質を攻撃する新しい抗体酵素の作製する事、等を目的に研究を行っている。これまでの研究成果と新たに判明した事実として(1)「スーパー抗体酵素」はHIV-1外膜タンパクgp41の保存領域ペプチドを酵素的に分解するだけでなく、gp41分子をも特異的に破壊する。抗原分解活性はkcat/km=2.3x10^5M^<-1>min^<-1>と非常に高い。この活性はトリプシンと比べたところほとんど同程度であった。また、相当な低濃度(nM)でも高い抗原分解活性を有していた。(2)「スーパー抗体酵素」にはCDR-2の近傍に触媒三ツ組残基が存在し、それらの距離間はキモトリプシンより若干大きい。また、抗原認識あるいは取り込み関与している主な領域は超可変領域(CDR)-1であると推定され、その抗原結合能はCDR-1単独で10^7/Mという大きな値を示す。(3)「スーパー抗体酵素」は金属イオン(Fe,Zn,Ca)の影響を強く受け、EDTAを反応初期に添加すると酵素活性は完全に阻害される。適切なrefoldingを始め、酵素活性を発揮するまでにいくつかの重要なステップがある。(4)「スーパー抗体酵素」はE. coliでは、インクルージョンボディーとして発現され、可溶化が非常に難しい。(5)「スーパー抗体酵素」はin vitroでHIV-1に対する増殖抑制活性を示した。(6)HIV-1の逆転写酵素を分解する新しい抗体酵素を見出した。この抗体酵素はRTペプチドをR-G,T-Kで切断する。等が明らかとなり、今後の展開が大いに期待される。