hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨形成不全症の分子生物学的病態解明とWntシグナル経路を介する新しい分子標的治療

本研究の目的は、骨形成不全症(OI)の分子学的背景の全容解明と新しい分子標的治療法の確立である。日本人OI患者の80%にCOL1A1遺伝子、COL1A2遺伝子変異を同定し、遺伝学的背景と表現型の検討を行った(Junko Kanno :Journal of Bone and Mineral Metabolism, 2017印刷中)。引き続いて、COL1A1遺伝子、COL1A2遺伝子に変異を見いだされなかった患者を対象としてエクソーム解析を行った。エクソーム解析で1名の患者に本邦初のPPIB変異を同定した。患者の臨床像は過去の報告と同様であった。現在、機能解析の準備中である。今回の研究では、日本人骨形成不全症の患者において、既知の原因遺伝子(COL1A1、COL1A2、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、IFITM5、BMP1、TMEM38B、WNT1)の変異解析を次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析、MLPA法、アレイCGH等を用いて包括的に行い、早期診断法を確立すること、既知の遺伝子で変異が同定されなかった場合、エクソーム解析で候補遺伝子を同定し、新規の原因遺伝子を同定すること、WNT1で変異を同定された場合は、WNT経路にシグナル増強するSema3Aや、骨髄移植などによる新たな分子標的治療を確立することを目的とした。過去の研究で遺伝子変異が見いだされなかった骨形成不全症の患者及び新たに骨形成不全症と診断された患者9名を対象として、既知の原因遺伝子(COL1A1、COL1A2、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、IFITM5、BMP1、TMEM38B、WNT1)を中心とした変異解析を行った。エクソーム解析で新規の患者5名において遺伝子変異が同定された。同定された変異の内訳は、既知の遺伝子であるCOL1A1のヘテロ接合性変異3名、PPIBのホモ接合性変異を1名、新規遺伝子変異を1名に認めた。これらの同定された変異について、サンガー法で確認した。また、ホモ接合性の変異については両親の解析も行った。現在、新規遺伝子について、病因であるかどうかを解析中である。今回の研究では、日本人骨形成不全症の患者において、既知の原因遺伝子(COL1A1、COL1A2、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、IFTM5、BMP1、TMEM38B、WNT1)の変異解析を次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析、MLPA法、アレイCGH等を用いて包括的に行い、早期診断法を確立すること、既知の遺伝子で変異が同定されなかったった場合、エクソーム解析で候補遺伝子を同定し、新規の原因遺伝子を同定すること、WNT1で変異を同定された場合は、WNT経路にシグナル増強するSema3Aや、骨髄移植などによる新たな分子標的治療を確立することを目的とした。過去の研究で変異が見いだされなかった骨形成不全症の患者及び新たに骨形成不全症と診断された患者9名を対象として、既知の原因遺伝子(COL1A1、COL1A2、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、IFTM5、BMP1、TMEM38B、WNT1)を中心とした変異解析を行った。同定された変異の内訳は、既知の遺伝子であるCOL1A1のヘテロ接合性変異3名、PPIBのホモ接合性変異を1名、新規遺伝子変異を1名に認めた、これらの同定された変異について、サンガー法で確認した。COL1A2変異が同定された患者は重症で遺伝子型表現型相関が認められた。PPIBのホモ接合性変異が認められた患者の両親はヘテロ接合体であった。この変異は機能予測ソフトでprobably damagingであった。表現型は過去の報告と一致していた。日本人で初めてのPPIBによる骨形成不全症の患者であった。エクソーム解析は、ある程度の対象患者を集めた時点で行おうとしたため、以前の研究で変異が同定されなかった患者の他、新規診断の患者をある程度の対象患者を確保する必要があり、検体の採取に時間を要した。WNT1で変異を同定された患者がいなかったため、WNT経路にシグナル増強するSema3Aなどの新たな分子標的治療についての研究が進んでいない。エクソーム解析は、ある程度の対象患者を集めた時点で行おうとしたため、以前の研究で変異が同定されなかった患者の他、新規診断の患者をある程度の対象患者を確保する必要があり、検体の収取に時間を要した。

新規遺伝子については病因かどうかの機能解析を行う。今回のエクソーム解析で変異が同定されなかった患者においてMLPA法、アレイCGHを用いた包括的な変異解析を行う。小児内分泌学今回のエクソーム解析で変異が同定されなかった患者においてMLPA法、アレイCGHを用いた包括的な変異解析を行う。エクソーム解析の対象患者の検体の収集に時間を要したため、前年度、本年度はエクソーム解析を中心に解析を行った。エクソーム解析の対象患者の検体の取集に時間を要したため、本年度は、エクソーム解析しか行わなかった。今後、エクソーム解析で変異が同定されなかった患者においてMLPA法、アレイCGHを用いた解析を行う。
炭素材料を反応場および触媒として活用した高効率ホルモース反応系の構築

分子間反応の速度は、活性化エネルギーだけでなく、分子同士の出会いやすさ(頻度因子)にも影響を受ける。本研究では、分子間反応として五炭糖とホルムアルデヒドによるホルモース反応に着目し、塩基点を直接導入、あるいは表面に担持した炭素材料を触媒に用いて、六炭糖の高収率合成を目指す。本触媒は、単なる固体塩基触媒として用いるのではなく、糖化合物に対する炭素材料の高い親和性に着目し、基質分子同士が出会い、反応する場として利活用することで、分子間反応であるホルモース反応の高効率化実現を目指す。
海産未利用資源由来の生物活性物質の探索

本研究では海綿動物や海藻類など,未利用の海洋生物を対象として生物活性物質の探索研究を行ってきた.本年度は,愛媛県佐田岬の三崎漁協の協力により,水深200m付近より採集した7種の海綿動物ついて探索研究を展開した.これまでに分析を行った物質について以下に報告する.本年度は,マウスリンパ性白血病細胞P388に対する活性および抗菌・抗カビ活性を指標として機能分子の探索研究を行った.その結果,一種類の抽出液に非常に強力な活性が認められた.活性を指標として精製を進めた結果,分子量1009,IC_<50>>0.1ng/mlを示す分子を見出した.本物質は,高速液体クロマトグラフを用いて分離した3画分が互いに異性化する分子であった.各種NMRスペクトルの解析を進めたところ,本物質はカリキュリンA^<1)>であった.この他の画分からも分子量1000を越える物質が確認しているが,これまでのところカリキュリンアミドAを始めとするカリキュリン類であると考えている.現在,微量同族体の分離と詳細な構造の解析を進めている.さらに別の海綿動物の抽出液について質量分析を試みたところ,一臭化物および二臭化物の分子イオンピークを観測した.質量分析を指標として分析を進め,マンザシジン類およびジブロモファケリンを単離した.さらに分析を進め,新規化合物であるジブロモジヒドロファケリンとジブロモジヒドロイソファケリンを単離し,その平面構造を明らかとした.現在のところ,さらなる微量同族体の分離と共に立体化学の解析を進めている.また,本物質については共に約70mgを得ており,他の活性試験に供することを検討している.本研究では海綿動物や海藻類など,未利用の海洋生物を対象として生物活性物質の探索研究を行ってきた.本年度は,愛媛県佐田岬の三崎漁協の協力により,水深200m付近より採集した7種の海綿動物ついて探索研究を展開した.これまでに分析を行った物質について以下に報告する.本年度は,マウスリンパ性白血病細胞P388に対する活性および抗菌・抗カビ活性を指標として機能分子の探索研究を行った.その結果,一種類の抽出液に非常に強力な活性が認められた.活性を指標として精製を進めた結果,分子量1009,IC_<50>>0.1ng/mlを示す分子を見出した.本物質は,高速液体クロマトグラフを用いて分離した3画分が互いに異性化する分子であった.各種NMRスペクトルの解析を進めたところ,本物質はカリキュリンA^<1)>であった.この他の画分からも分子量1000を越える物質が確認しているが,これまでのところカリキュリンアミドAを始めとするカリキュリン類であると考えている.現在,微量同族体の分離と詳細な構造の解析を進めている.さらに別の海綿動物の抽出液について質量分析を試みたところ,一臭化物および二臭化物の分子イオンピークを観測した.質量分析を指標として分析を進め,マンザシジン類およびジブロモファケリンを単離した.さらに分析を進め,新規化合物であるジブロモジヒドロファケリンとジブロモジヒドロイソファケリンを単離し,その平面構造を明らかとした.現在のところ,さらなる微量同族体の分離と共に立体化学の解析を進めている.また,本物質については共に約70mgを得ており,他の活性試験に供することを検討している.
疾患単位確定を目指した境界領域的リンパ増殖病変の臨床病理学的分子生物学的研究

悪性リンパ腫およびその周辺に位置する種々のリンパ増殖病変は臨床病態のみならず生物学的さらには疫学的に極めて多様生に富む疾患スペクトラムを形成している。特に境界領域的リンパ増殖病変は従来ある程度疾患単位として記載されたT細胞領域異形成や胚中心進展性異形成から、疫学的に極東アジア地域に多い特殊なEpsten-Barr virus(EBV)関連病変、臓器委嘱後等の免疫不全合併病変、さらに今後本邦での増加が予測される高齢化に付随した免疫機能の低下や自己免疫異常などを背景とするものまで多岐に亘る。しかし、それら病変の認識自体極めて稚拙な段階にあり、真に学際的な研究による整理および本態の解明は急務である。本研究では、悪性リンパ腫から境界領域的病変に亘る疾患スペクトラムの把握と類型化に意を用いた。平成8-9年度の当該期間中にEBVが関与するリンパ増殖病変については新たな病型を見出し、現在学術誌に投稿中である。これらは病勢が比較的急速に進行し、EBVの分子生物学的検索によってのみ腫瘍への移行が示唆されるものであった。しかしながら、増殖細胞に証明されたEBVのclonal intgrationが腫瘍性か特異な反応状態のいづれと見るかは厳密な意味での定義が困難であり、今後の病理総論的な観点からの整理が期待される。一方、高齢者等にしばしば認められ、且つ現時点での分子生物学的手法では腫瘍性格が証明されず境界領域的リンパ増殖病変と判断された症例の経過は一般に緩徐であり、その帰趨は不明であった。当然、その本態の如何は不分明のままであったと云わずるを得ないが、その本質的な意義を解明し得るのは当該研究期間を超えた長期的な臨床病理学的研究の継続のみとも思われた。本研究から得た所感はこれら境界領域病変は各種病因と個体の反応性との相互作用、あるいは異なる遺伝情報間の相互作用における"変容"の過程であるということであり、次年度以降も諸々の悪性リンパ腫亜型と関連を含め研究を続行する予定である。悪性リンパ腫およびその周辺に位置する種々のリンパ増殖病変は臨床病態のみならず生物学的、疫学的に極めて多様性に富む疾患スペクトラムを形成している。しかしながら、リンパ腫に比べ境界領域的リンパ増殖病変は疾患としての理解が極めて稚拙な段階に留り、真に学際的な研究による本態の解明は急務である。平成8年度から研究対象を昨年度までの各種悪性リンパ腫亜型群のみならず境界領域的リンパ増殖病変まで拡大し、症例の収集とその臨床病理学的および分子生物学的解析を開始した。胚中心進展性異形成(B細胞領域)(30症例収集済み)については同病変からの進展の可能性が示唆されるホジキン病(80症例収集済み)あるいは鑑別が問題となる濾胞性B細胞リンパ腫(100例収集済み)との対比で、またT領域異形成についてはT領域リンパ腫群(血管免疫芽球型、類上皮細胞[レンネルト]型、T領域型)との関連の検討を進めた。これらの症例について免疫グロブリン遺伝子およびT細胞抗原受容体遺伝子の再構成の有無に加え、特に染色体転座関連遺伝子/癌関連遺伝子(cyclin D1、bcl-

2、bcl-6、nm23、p53、p80等)の発現を分子生物学的あるいは免疫組織化学的に検索、またEBVの有無をin situ hybridization (ISH)法、polymerase chain reaction (PCR)法およびSouthern法によるモノクロナリティ検索と併せて解析中である。これらの解析は次年度以降にも継続して行う予定であり、得られた結果と相互の関連について系統的に検討することにより、リンパ増殖疾患全体における境界領域病変の位置付けと診断基準の確立を目指す。当初企図したbcl-2の再構成の検出の為のlong distance PCR法については幾つかの課題を残し、より再現性と信頼性を高めた方法の確立を目指す予定である。悪性リンパ腫およびその周辺に位置する種々のリンパ増殖病変は臨床病態のみならず生物学的さらには疫学的に極めて多様性に富む疾患スペクトラムを形成している。特に境界領域的リンパ増殖病変は従来ある程度疾患単位として記載されたT細胞領域異形成や胚中心進展性異形成から、疫学的に極東アジア地域に多い特殊なEpsten-Barr virus(EBV)関連病変、臓器移植後等の免疫不全合併病変、さらに今後本邦での増加が予測される高齢化に付随した免疫機能の低下や自己免疫異常などを背景とするものまで多岐に亘る。しかし、それら病変の認識自体極めて稚拙な段階にあり、真に学際的な研究による整理および本態の解明は急務である。本研究では、悪性リンパ腫から境界領域的病変に亘る疾患スペクトラムの把握と類型化に意を用いた。平成8-9年度の当該期間中にEBVが関与するリンパ増殖病変については新たな病型を見出し、現在学術誌に投稿中である。これらは病勢が比較的急速に進行し、EBVの分子生物学的検索によってのみ腫瘍への移行が示唆されるものであった。しかしながら、増殖細胞に証明されたEBVのclonal integrationが腫瘍性か特異な反応状態かのいづれと見るかは厳密な意味での定義が困難であり、今後の病理総論的な観点からの整理が期待される。一方、高齢者等にしばしば認められ、且つ現時点での分子生物学的手法では腫瘍性格が証明されず境界領域的リンパ増殖病変と判断された症例の経過は一般に緩徐であり、その帰趨は不明であった。当然、その本態の如何は不分明のままであったと云わずるを得ないが、その本質的な意義を解明し得るのは当該研究期間を超えた長期的な臨床病理学的研究の継続のみとも思われた。本研究から得た所感はこれら境界領域病変は各種病因と個体の反応性との相互作用、あるいは異なる遺伝情報間の相互作用における“変容"の過程であるということであり、次年度以降も諸々の悪性リンパ腫亜型と関連を含め研究を続行する予定である。
Bcr-AblTKIの効果と非再発予後に関連するCML患者要因の分子薬理学的探索

慢性期慢性骨髄性白血病(Ch-CML)に対し、1stラインで使用が認められている第二世代のBcr-Ablチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)のうち、ダサチニブおよびニロチニブで分子遺伝学的完全寛解(CMR)を達成し、その状態を一定期間維持できた患者ではBcr-Abl TKIを中止できるか否かの臨床試験が開始されている。本研究ではTKIを中止後、長期間再発しない患者や逆に短期で再発してしまう患者が如何なる背景を有するのかを明らかにすることを主目的とし、患者要因とTKI応答性との関連性を検討した。2年度目である平成28年度は、平成27年度実施状況報告書の12.今後の研究の推進方策等に記載した内容に沿って、第三世代Bcr-Abl TKIポナチニブの血中濃度測定法の確立から開始した。標準試料を用いた検討は終了したが、本薬剤が未承認のままであるため、投与された患者検体を用いたバリデーションはできなかった。2年目開始後3ヶ月経過した時点で岡山大学へ転出することが決まり、岡山大学病院で新たに協力してくれる医師が見つかる保証がないこと、倫理審査委員会の申請を最初から行う必要があること、研究機器の確保が不透明であったことなどから研究継続を断念し本課題の廃止を決断した。本研究では、研究期間全体を通じてTKI投与を中止した後に、長期間再発しない患者と逆に早期に再発した患者の遺伝的要因や非遺伝的要因を探求することが目的であった。しかし、3年計画の2年目開始直後に研究中止となったため、それら患者を集めることができず、主目的の解析を行うことができなかった。しかしダサチニブ応答性が低く、CMRに到達するのに時間がかかるため投与を中止できない患者の一部は、白血球中のABCG2の発現量が高いことを見出すことができた。将来ABCG2阻害剤との併用がダサチニブ応答性を改善することで早期にCMRを達成し、ABCG2の活性を抑え続けることで寛解を維持できる可能性を示唆する結果と考えられた。慢性期の慢性骨髄性白血病(CML)に対し現在1stラインで使用が認められている第二世代のBcr-Ablチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)のうち、ダサチニブおよびニロチニブで分子遺伝学的完全寛解(CMR)を達成し、その状態を一定期間維持できた患者ではBcr-Abl TKIを中止できるか否かの臨床試験が開始されている。本研究ではTKIを中止後、長期間再発しない患者や逆に短期で再発してしまう患者が如何なる背景を有するのかを知るために患者要因とTKI応答性との関連性を明らかにすることを主目的としている。初年度の平成27年度は、研究用検体の収集、Vaults多型と発現量および第二世代TKIの効果との関連性、ならびにBIMやトランスポーターの多型や発現量と第二世代TKIに対する応答性との関連性を検討することを目標とした。研究用検体の収集ではTKI血中濃度測定受託の暫定的中断で計画より遅れている。Vaultsの主成分MVP(Major Vault Protein)の多型探索については予定のSSCP解析ではなくシークエンス解析で検討した。トランスポーター発現量や多型と応答性との関連解析に関しては、患者血液検体からのmRNAの抽出条件を確立しmRNA量と応答性との関連性を検討した。TKI有効性の指標を分子遺伝学的効果(MMR)達成の有無とした時、ダサチニブ投与でMMR非達成の患者では白血球中のABCG2の発現量が中央値で5倍高かった。それに対しABCB1では多型や発現量とダサチニブの有効性には関連性が認められなかった。ニロチニブの有効性に関してはこれらの多型や発現量との関連性を認めなかった。ダサチニブでは維持投与量が有効性と関連する傾向を認めたため、副作用による減量や投与中断は問題となるがABCB1多型がダサチニブによる血小板減少の発現および発現時期と有意に関連していることを見出した。7月に所属部署の全面移転があり、分析機器移設に伴う質量分析器の再調整のため、患者のTKI血中濃度測定の受付(検体収集)を一時中断した。さらに病院の方針で病棟薬剤業務実施加算算定の準備を最優先で行うこととなり、業務の一環として行っていた研究の中で、第二世代のBcr-Abl TKIの血中濃度測定など診療報酬が付かない測定は部内において保留となり、診療報酬が算定できる業務へのシフトが必要となった。また、本研究の遂行に必須だが、いずれも耐容年数を超えている機器(サーマルサイクラー1台、SSCP解析装置、DNAシークエンサー、リアルタイムPCR装置)が相次いで故障したため、故障中はそれらを用いる研究の進行が滞った。これら機器の故障に伴い、当初予算では質量分析器のターボ分子ポンプの交換費用を計上していたが、DNAシークエンサーおよびリアルタイムPCR装置の修理(キャリブレーションとして支出)に充当させていただいた。一方、それらを除けば概ね順調に進捗していると考えている。初年度の実績概要に記載したように、修理した機器での既存の検体を用いた解析によって、一部のトランスポーターは第二世代TKI、特にダサチニブの有効性や忍容性と関連性がある可能性が考えられる。

Bcr-Abl TKIの場合、治療の中断は効果に著しい影響を及ぼすことから、治療を中断することなく早期にMMR、さらにはより深いCMRに到達することによってTKIを中止できる患者か否かに関しては、これらトランスポーターの多型や血球細胞における発現量によって一部規定されている可能性が考えられる。他方、TKI中止後、早期に再発する患者か否かに関しては、もはやTKIの投与が継続されていないことから、おそらく全く別の因子が規定要因として関与していることが推測される。慢性期慢性骨髄性白血病(Ch-CML)に対し、1stラインで使用が認められている第二世代のBcr-Ablチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)のうち、ダサチニブおよびニロチニブで分子遺伝学的完全寛解(CMR)を達成し、その状態を一定期間維持できた患者ではBcr-Abl TKIを中止できるか否かの臨床試験が開始されている。本研究ではTKIを中止後、長期間再発しない患者や逆に短期で再発してしまう患者が如何なる背景を有するのかを明らかにすることを主目的とし、患者要因とTKI応答性との関連性を検討した。2年度目である平成28年度は、平成27年度実施状況報告書の12.今後の研究の推進方策等に記載した内容に沿って、第三世代Bcr-Abl TKIポナチニブの血中濃度測定法の確立から開始した。標準試料を用いた検討は終了したが、本薬剤が未承認のままであるため、投与された患者検体を用いたバリデーションはできなかった。2年目開始後3ヶ月経過した時点で岡山大学へ転出することが決まり、岡山大学病院で新たに協力してくれる医師が見つかる保証がないこと、倫理審査委員会の申請を最初から行う必要があること、研究機器の確保が不透明であったことなどから研究継続を断念し本課題の廃止を決断した。本研究では、研究期間全体を通じてTKI投与を中止した後に、長期間再発しない患者と逆に早期に再発した患者の遺伝的要因や非遺伝的要因を探求することが目的であった。しかし、3年計画の2年目開始直後に研究中止となったため、それら患者を集めることができず、主目的の解析を行うことができなかった。しかしダサチニブ応答性が低く、CMRに到達するのに時間がかかるため投与を中止できない患者の一部は、白血球中のABCG2の発現量が高いことを見出すことができた。将来ABCG2阻害剤との併用がダサチニブ応答性を改善することで早期にCMRを達成し、ABCG2の活性を抑え続けることで寛解を維持できる可能性を示唆する結果と考えられた。本研究課題の今後の推進方策としては、まず平成28年度の研究実施内容として当初より計画していた第三世代のBcr-Abl TKIであるポナチニブの血中濃度測定法を優先的に確立する。ポナチニブは、昨年初頭にすでに国内製造承認申請がなされている。米国で問題となり一時流通停止にまでなった血栓塞栓症リスクのためか、審査にやや時間がかかっているようであるがT315I変異に基づく第一、第二世代TKIの治療不成功例に対する切り札の薬剤であるため、本年度前半にも国内承認される可能性がある。承認後は、第一、第二世代でfailureとなった患者の一部に使用されるほか、第一、第二世代のTKIでCMRに到達し、投与中止後に再発した患者、すなわち本研究の主要な対象集団の一部にも使用される可能性が考えられるため、本研究の副目的である再発した患者における適切な治療の検討にはポナチニブの血中濃度測定法は必要不可欠となる。また初年度に引き続いて既存検体の解析を推し進め、患者要因とTKI応答性との関連性をさらに明らかにする。研究遂行上の課題については、現状新たな患者検体の収集再開の目処が立っていない点であり、状況が好転しない場合は、既存検体での解析のみで結果を出すことになる可能性がある。
補綴物の材料および合着用セメントの違いが水平歯根破折に及ぼす影響

歯髄を失った歯は時に歯根破折を生じ、場合によっては抜歯に至ることがある。歯根破折には、縦破折と水平破折の2種類がありいずれの場合も憂慮すべきことである。本研究では主に水平破折に主眼をおき、破折部位の応力集中状態を有限要素法および抜去歯を用いた模型実験で調べた。その結果,歯の土台(支台築造)の材料、クラウンの材料およびセメントの物性が応力集中状態に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。近年、材料の発展によりハィブリッド強化型硬質レジンが用いられるようになった。このようなクラウンが長期にわたって良好に機能するには、歯頚部に過度の応力が集中しないものが望まれる。本実験では、2種の材質のクラウンをコンポジットレジンコアにコンポジット系レジンセメントにて合着し材料が歯頚部に及ぼす影響を比較・検討した。披験歯はヒト下顎単根小臼歯14本とし通法に従いグラスファイバーポストおよびコンポジットレジンにて支台築造を施した。マージン形態はラウンデッドショルダー、フェルールの高さ1.5mm、テーパー片側4°、支台歯の高さ6mmとなるように支台歯形成し、全部鋳造冠(MC)、ハイブリッド強化型硬質レジンクラウン(HC)を各8個ずつ作製し、2グループとした。歯頚部のクラウンと歯根にひずみゲージ(KFR-02N-120-C1-16N10C2、KYOWA)を接着し、万能試験機(AUTOGRAPH AGS-H,島津製作所)を用い、クロスヘッドスピード1mm/minとし、頬側咬頭に歯軸に対して45°に150Nまで静的荷重を付与した。このときのクラウンおよび歯根の頬舌側のひずみ量、頬舌側の歯根およびクラウンのひずみ量の差を算出し、それぞれT検定を用いてMC・HC間で比較した(有意水準5%)。クラウンおよび歯根の頬舌側のひずみ様相は、頬側は引張ひずみ、舌側は圧縮ひずみを示したが、MCの100N、125N、150N荷重時のみクラウン頬側は圧縮ひずみを示した。MC・HC間において、125N、150N荷重時のみ、クラウン舌側に有意差が認められた。また、クラウンおよび歯根のひずみ量は全てHCの方が大きかったら頬舌側の歯根およびクラウンのひずみ量の差において、MC・HC間に有意差は認められなかった。このことからHCは歯根、クラウンともにMCと同程度の応力状態を示すことが示唆された。近年、カリエス、歯周病に加え歯根破折が抜歯の要因にあけられるようになってきた。歯根破折には垂直性破折と水平性破折に分類される。このうち本研究では垂直性歯根破折について行う予定である。研究は有限要素法を用いた研究と抜去歯を用いた模型実験に分かれて行う予定である。本年度は有限要素法を用いた研究を行ってきた。具体的には根管充填を施した小臼歯モデルにファイバーポスト併用のレジンコアを築盛し、そののち3種類のクラウン、すなわち、全部鋳造冠、ハイブリッドセラミッククラウン、オールセラミッククラウンを弾性率の異なる2種類のセメントで合着したモデル、計6種類を作製し、咀嚼時の咬合力を咬合面中央部に付与、歯根象牙質の歯頚部、ポスト先端部、根尖部の応力分布状態を比較検討した。6種類のモデルの中では、ポスト先端部および根尖相当部の歯根象牙質の応力分布状態には大きな差が認められなかった。これに対し、歯頚部歯根象牙質には大きな差が認められた。3種類のクラウンのうち、ハイブリッドセラミックスを用いたモデルが最も応力集中度が低く、2種類のセメントでは、弾性率が大きいモデルが応力を緩和させる傾向にあった。すなわち、計6種類のモデルのなかで、ハイブリッドセラミックスを高い弾性率のセメントを用いて合着したモデルが最も歯頚部の応力を緩和されることがあきらかとなった。失活歯に対して支台を補強するために従来は金銀パラジウム合金をはじめとする鋳造ポストが主に使用されていた。しかしながら近年では時に重篤な歯根の縦破折を生じることがあるとされ、この一因として歯根象牙質と金属築造体との間の弾性係数が大きく異なることが指摘されている。そこで縦破折の危険性を減ずるために弾性係数が歯根象牙質に近いファイバーポストとコンポジットレジンを併用した支台築造法が新たに開発された。これにより縦破折の可能性は減ってきたが逆に機械的強度が金属より劣るため金属築造体よりも小さい破壊強度にて水平破折が生じることが明らかとなっている。

現在は支台築造法にのみ焦点が置かれ研究が進行しているが、水平歯根破折の原因は当然ながら歯頚部に応力が集中することから生じ、この部位において歯冠補綴物は歯質、築造体、セメント、クラウンの4者が密接に関連していることから、セメント、クラウンに関しても研究が行われる必要があると考えられる。そこで、本研究において、セメントはコンポジット系、MMA系のレジンセメント2種類、最終補綴物はハイブリッド強化型硬質レジン、オールセラミックス、金属冠の3種類に変化させ、抜去歯を用いだ実験と有限要素法を用いた研究の両面から検討を加えた。結果はセメントに関しては、築造体、最終補綴物に比較してかなり低い弾性係数を有するMMA系レジンより、コンポジット系レジンセメントの方がより歯根歯頚部に低い応力分布状態となり、模型実験に関しても同等な結果が得られた。一方最終補綴物の材質は象牙質により近い弾性係数を有するハイブリッド強化型硬質レジンが最も水平破折を生じにくいことが示唆された。
東・東南アジア地域におけるツバメの巣取引の多現場民族誌的研究

本研究は近年の東・東南アジア地域における、中華料理の高級食材であるツバメの巣の生産・流通・販売・消費の特徴を、明らかにした。その際に本研究が取った研究手法が、東・東南アジアの複数の地域における同商品の取引および複数の行為体の活動を対象とした他現場民族誌的調査である。特に本研究では東南アジアにおける、人工的な建築物の中に人為的にアナツバメに巣を作らせる手法である。2014年度の活動は本科研研究プロジェクトの予備調査としての性格が強かった。そのため日本国内での文献研究と東南アジアでの現地調査を行った。国内での文献研究は、関連する文献資料の収集及び先行研究の整理と批判的検討を行った。特に本科研プロジェクトがテーマとする東・東南アジア各地におけるツバメの巣取引に関しては、歴史学や地域研究、文化人類学等の諸研究で従来から言及されることが多く、またこのテーマが取り扱われる時代や地域も広範囲にわたっている。そのため本年度は東・東南アジア地域におけるツバメの巣取引を、他の海産物や森林産物の取引に関する諸研究を参照することにより、その特徴を明らかにする作業を行った。このような国内での文献資料研究に加え、シンガポール、マレーシア、タイでのフィールドワークも実施した。シンガポールは東南アジア地域におけるツバメの巣に代表される森林産物やその他の海産物や漢方薬の原料等の集積地であるため、それらを専門に扱う店舗が集中しているサウス・ブリッジ・ロード周辺での調査を行った。またマレーシアとタイでは燕屋と呼ばれる人工的な建築物にアナツバメを呼び寄せ人為的に営巣させるというメソッドや、天然の洞窟でアナツバメの巣を採集する方法の現状に関する調査を行った。また当初予定していた国外でのフィールドワークに加え、日本国内(神戸市、大阪市、横浜市)でのツバメの巣の販売・消費に関わる予備的なフィールドワークも実行した。2015年度は7月にオーストラリア、アデレードを、夏季休業中にマレーシアのクアラルンプールとペナンを、堂夏季休業中にベトナム社会主義共和国のハノイを、春季休業中にマレーシア、クアラルンプールとタイ、バンコクを訪問した。それぞれの研究成果の報告と大学や博物館、研究所での資料収集、チャイナタウンでの具体的なツバメの巣の流通と販売、消費に関わる現地調査を行った。さらに通常の授業期間中には日本国内にて、大学や研究機関にて関連する資料収集および国内の中国系コミュニティでの特産物の流通と販売に関する現地調査を行った。本年度は本研究代表者の所属大学が変更したことと、新たな所属大学での海外学術調査、特にフィールドワーク調査に関する支援が十分ではなかったため、計画通りの調査をすることが出来なかった。そのため所属大学の制度の範囲内での現地調査および文献研究を行い、研究成果を上げることに努めた。最終年度は2014年度、2015年度と同様、国内での文献研究と東南アジアでの現地調査を行った。それを踏まえ、本年度は最終的な成果報告の公表に向けた活動も行った。本年度は年間を通して日本国内でのツバメの巣取引や他の中華料理の高級食材や薬材に関する取引、多現場民族誌に関する先行研究の収集を行った。また夏季休業中と春季休業中にマレーシアおよびベトナムにて現フィールドワークを行い、東南アジア地域における特産品の生産や流通、消費といったテーマに関する調査を行った。特に華人系と先住民との相互交流およびそこでなされるツバメの巣を含めた特産品や観光土産の取引に関する調査を行った。それにより、ツバメの巣に限らず現在の東南アジア地域における特産品の取引に関しては、域内における多民族状況が多大な影響を与えるとともに、域外、特に中国語文化圏の消費動向やアウトバウンド観光といった多様な要因も影響を与えることが明らかになった。以上の調査研究活動を踏まえ、本年度は日本語及び英語での論文の執筆を行った。2014年度の活動は当科研研究プロジェクトの予備調査としての性格が強いため、東南アジアの三カ国での予備的・広域的なフィールドワークを行い、二年目以降の本調査を行うための準備段階に充てた。そのため日本国内での関連文献・先行研究の収集を行った。これらの活動はおおむね計画していた調査成果を上げることが出来た。ただし今年度の予算配分が当初計画していた研究費の額よりも少なかったため、本研究立案時に行うことを想定していたツバメの巣の代表的な集積地である香港での現地調査を行うことはできなかった。そのため多現場民族誌的調査としての地理的な範囲は当初の予定よりも縮小させた。ただ本年度は日本国内でInternational Union of Anthropological and Ethnological Studiesの大会が開催されたため、二年目以降に行うことを予定していた英語を用いた国際学会での研究成果発表をすることが出来た。2016年度は本研究プロジェクトの最終年度であるため、現行制度の下で可能な限り現地帳を行い、当初の研究計画を遂行することを予定している。またこれまでの二年間の調査研究の成果を、学術論文の執筆および国際会議での研究発表という形で公表することを計画している。地域研究2015年度も引き続き、日本国内での関連文献資料・関連先行研究の収集と整理、および東南アジア、香港およびオセアニアのチャイナタウンでの多現場民族誌的現地調査を行うことを計画している。現地調査に関しては2014年度から行ってきたシンガポール、マレーシア、タイでの多現場

民族誌的調査に加え、日程的な余裕があれば香港およびベトナムでの短期調査を行う計画を立てている。また同時に日程的・資金的な余裕があればオセアニアのチャイナタウン(現時点ではオーストラリア、シドニーを予定)でのツバメの巣の販売と流通、消費に関する短期調査を行うことを計画している。またその成果を中間報告のかたちで文章化し、学術論文か研究ノートとしてしかるべき媒体に発表することを考えている。加えて2015年度はツバメの巣の取引により特化した先行研究の整理を行う計画を立てている。
象牙質歯髄複合体培養系を用いた温度痛覚受容体の発現とそのメカニズム解析

今回われわれはヒト歯髄細胞およびマウスの象牙芽細胞において、温度感受性イオンチャネルTRPM8が発現していることを遺伝子レベル、タンパクレベルで確認した。また、象牙質歯髄複合体モデルとしてラットの切歯の薄切切片を用いて、象牙芽細胞にTRPM8が発現していることを明らかにした。このことから象牙芽細胞が感覚受容体として機能し近接する末梢神経に痛覚を伝えることにより、象牙質知覚過敏症に関わっている可能性を示すことが出来た。象牙質知覚過敏症において、動水力学説(歯の根面の露出等により、象牙細管の入り口が開口し、外部刺激により象牙細管内溶液が動くことにより、歯髄や内層象牙質に存在する自由神経終末を機械的に刺激し、痛みを誘導する説)が現在最も広く受け入れられているが、この説だけでは十分に説明できない部分もまだ残っている。最近では、象牙芽細胞自身が感覚受容細胞としての機能を持ち、外部からの刺激を痛覚神経線維に伝えるという象牙芽細胞受容器説が徐々に研究されつつある。求心性の感覚神経には6つの温度感受性イオンチャンネルがあり、それらは異なる温度帯を閾値としている。熱刺激を感受するものではVR-1(>43°C)、冷刺激を感受するものではTRPM8(<25°C)があげられる。われわれは、これまでにVR-1がヒト歯髄細胞において発現すること、また温熱刺激によりVR-1が活性化し歯髄炎を増悪する可能性があることを明らかにした。今年度、われわれは、温度感受性イオンチャンネルが、歯における冷刺激の引き起こす痛みや、知覚過敏症に関わっている可能性について検討するために、冷刺激感受性受容体であるTRPM8の発現を、歯髄細胞、象牙芽細胞およびラット歯髄の横断薄切標本を用いて検討した。その結果、1.ヒト歯髄細胞およびラット象牙芽細胞(OLC)においてTRPM8 mRNAの発現が認められた(RT-PCR法)。2.ヒト歯髄細胞およびOLCにおいてTRPM8の発現がタンパクレベルにて認められた(ウェスタンブロット法)。3.歯髄組織外層の象牙芽細胞において、DMP-1、DSPおよびTRPM8の発現が確認された(免疫染色法)。以上の結果より、冷刺激感受性受容体であるTRPM8はヒト歯髄細胞および象牙芽細胞において発現しており、歯における冷刺激の引き起こす痛み、知覚過敏症において何らかの役割を担っている可能性があると考えられる。今後は、TRPM8の機能についても解析を行っていく予定である。われわれは、これまでにVR-1がヒト歯髄細胞において発現すること、また温熱刺激によりVR-1が活性化し歯髄炎を増悪する可能性があること、冷刺激感受性受容体であるTRPM8 mRNAが、ヒト歯髄細胞およびラット象牙芽細胞(OLC)において発現すること(RT-PCR法)、また、ヒト歯髄細胞およびOLCにおいてTRPM8の発現をタンパクレベルにて確認した。さらに、ラット歯髄の横断薄切標本を用いた実験により、歯髄組織外層の象牙芽細胞において、DMP-1、DSPおよびTRPM8の発現を確認した(免疫染色法)。今年度は、ラットの歯牙の縦断薄切切片を免疫染色し、象牙芽細胞層において、TRPM8、VR-1の発現をタンパクレベルにて確認した。以上の結果より、温度感受性受容体は象牙芽細胞において発現しており、歯における温度刺激の引き起こす痛み、知覚過敏症において何らかの役割を担っている可能性があると考えられる。

熱刺激を感受するものではVR-1(>43°C)、冷刺激を感受するものではTRPM8(<25°C)があげられる。われわれは、これまでに1)VR-1がヒト歯髄細胞において発現すること、2)温熱刺激によりVR-1が活性化し歯髄炎を増悪する可能性があること、3)TRPM8が歯髄細胞、象牙芽細胞に発現すること、4)ラット歯髄の横断薄切標本におけるTRPM8の発現を確認してきた。今年度においては、TRPM8の機能について更なる検討を加えるために、擬似的な冷刺激メントールで歯髄細胞、象牙芽細胞を刺激し細胞の反応を解析した。結果、熱等による刺激で発現し細胞を保護するとされるタンパク、ヒートショック蛋白(HSP70、HSP27)の発現の増加は特に認められなかった。温度感受性イオンチャンネル(VR-1およびTRPM8)はヒト歯髄細胞および象牙芽細胞において発現しており、歯における温度刺激の引き起こす痛み、知覚過敏症において何らかの役割を担っている可能性があるが、そのメカニズムはまだ分かっていない。今後さらにこれらの機能について検討していきたい。
人体による無線機からの電力吸収量の測定法に関する研究

携帯電話やPHSなどの携帯無線機の普及に伴って,アンテナから放射された電波電力の人体への吸収が問題となっており,アンテナを設計する際に吸収電力を定量的に測定しておくことが重要となっている.本研究では,人体モデル及びその近傍に置かれた無線機を方位角方向に回転し,受信アンテナを仰角方向に回転させて無線機からの電波を受信し,その電力を積分することにより高速・高精度で人体による吸収電力を測定する方法を確立すること,並びに現実に近い人体モデル(ファントム)や実際の無線機匡体上に設けられたアンテナを用いて,電力吸収の少ないアンテナ構造を明らかにすることを目指して研究を行った.その結果,以下の知見が得られた.1.ダイポールアンテナからの放射効率を求めてランダムフィールド法による測定結果と比較し,ランダムフィールド法に比べて測定精度が高いことを明らかにした.2.回転装置を計算機で制御することにより,放射効率測定の自動化と高速化を図った.3.ヨーロッパの標準(COST244)で定められた人体頭部のファントムを用いて近傍のダイポールアンテナの放射効率を測定し,FDTD(Finite Difference Time Domain)法による計算結果と比較することにより測定精度の高さを示す共に,立方体ファントムと球ファントムでは人体に吸収される電力が異なることを明らかにした.4.人体への吸収電力が少ないアンテナを得るために,八木・宇田構造のモノポールアレーアンテナ,並びに無線機内蔵型のループアレーアンテナをFDTD法により設計し,放射効率の測定を通じて効率向上を確認した.携帯電話やPHSなどの携帯無線機の普及に伴って,アンテナから放射された電波電力の人体への吸収が問題となっており,アンテナを設計する際に吸収電力を定量的に測定しておくことが重要となっている.本研究では,人体モデル及びその近傍に置かれた無線機を方位角方向に回転し,受信アンテナを仰角方向に回転させて無線機からの電波を受信し,その電力を積分することにより高速・高精度で人体による吸収電力を測定する方法を確立すること,並びに現実に近い人体モデル(ファントム)や実際の無線機匡体上に設けられたアンテナを用いて,電力吸収の少ないアンテナ構造を明らかにすることを目指して研究を行った.その結果,以下の知見が得られた.1.ダイポールアンテナからの放射効率を求めてランダムフィールド法による測定結果と比較し,ランダムフィールド法に比べて測定精度が高いことを明らかにした.2.回転装置を計算機で制御することにより,放射効率測定の自動化と高速化を図った.3.ヨーロッパの標準(COST244)で定められた人体頭部のファントムを用いて近傍のダイポールアンテナの放射効率を測定し,FDTD(Finite Difference Time Domain)法による計算結果と比較することにより測定精度の高さを示す共に,立方体ファントムと球ファントムでは人体に吸収される電力が異なることを明らかにした.4.人体への吸収電力が少ないアンテナを得るために,八木・宇田構造のモノポールアレーアンテナ,並びに無線機内蔵型のループアレーアンテナをFDTD法により設計し,放射効率の測定を通じて効率向上を確認した.携帯電話やPHSなどの携帯無線機の普及に伴って,アンテナから放射された電波電力の人体への吸収が問題となっており,無線機を設計する際に吸収電力を定量的に測定しておくことが重要となっている.本研究では,人体モデル及びその近傍に置かれた無線機を固定し,受信アンテナを比較的近い距離で方位角及び仰角方向に回転させて無線機からの電波を受信し,その電力を積分することにより高速・高精度で人体による吸収電力を測定する方法を確立することを第1の目的とした.また,これを利用してより現実に近い人体モデル(ファントム)や実際の無線機匡体上に設けられたアンテナを用いて,電力吸収の少ないアンテナ構造を明らかにすることを目指した.平成10年度は,まず受信アンテナを方位角及び仰角方向に回転させて基準ダイポールアンテナからの放射電力を測定することにより放射効率を求めると共に,ランダムフィールド法による測定結果と比較した.その結果,例えば1.5GHzでは4%程度の誤差で放射効率を測定できること,ランダムフィールド法に比べて精度が高いことが明らかになった.次に,回転装置を計算機で制御することにより,放射効率測定の自動化を図った.また,COST244(European Cooperation in the field of Scientific and Technical Research)で定められた人体頭部のファントムを用いて近傍のダイポールアンテナの放射効率を測定し,FDTD(Finite Difference Time Domain)法による計算結果と比較することにより測定精度の高さを示す共に,立方体ファントムと球ファントムでは人体に吸収される電力が異なることを明らかにした.さらに,携帯電話機匡体に取り付けられたアンテナの種類やその位置を変化させて測定と数値計算を行い,半波長モノポールアンテナが効率の点で優れていることなどを明らかにした.携帯電話やPHSなどの携帯無線機の普及に伴って,アンテナから放射された電波電力の人体への吸収が問題となっており,アンテナを設計する際に吸収電力を定量的に測定しておくことが重要となっている.本研究では,人体モデル及びその近傍に置かれた無線機を固定し,受信アンテナを方位角及び仰角方向に回転させて無線機からの電波を受信し,その電力を積分することにより高速・高精度で人体による吸収電力を測定する方法を確立すること,並びに現実に近い人体モデル(ファントム)や実際の無線機匡体上に設けられたアンテナを用いて,電力吸収の少ないアンテナ構造を明らかにすることを目指して研究を行った.その結果,以下の知見が得られた.1.ダイポールアンテナからの放射効率を求めてランダムフィールド法による測定結果と比較し,ランダムフィールド法に比べて測定精度が高いことを明らかにした.

2.回転装置を計算機で制御することにより,放射効率測定の自動化と高速化を図った.3.ヨーロッパの標準(COST244)で定められた人体頭部のファントムを用いて近傍のダイポールアンテナの放射効率を測定し,FDTD(Finite Difference Time Domain)法による計算結果と比較することにより測定精度の高さを示す共に,立方体ファントムと球ファントムでは人体に吸収される電力が異なることを明らかにした.4.人体への吸収電力が少ないアンテナを得るために,八木・宇田構造のモノポールアレーアンテナ,並びに無線機内蔵型のループアレーアンテナをFDTD法により設計し,放射効率の測定を通じて効率向上を確認した.
Neurogenic Progenitorを用いた脳変性疾患の治療法の開発

Neural Progenitor(NP)によるNiemann-Pick病type C(NPC)モデルマウスの中枢神経障害に対する治療法開発の試み:生後3ヶ月の12匹のNPDtypeCマウスの左側脳室内及び脳実質内にLacZ遺伝子導入NPを31G針にて注入し、beta-galactosidase活性を組織学的に検討した。注入側及び対側脳室周囲を中心として酵素活性を認めNPの組織への浸潤を10例で確認したが、全脳homogenizeでの有意な酵素活性の上昇を認めなかった。その為NPCの脳内コレステロール代謝異常を改善する為には、疎水性と考えられるコレステロール転送蛋白の活性を十分上げる必要があり、種々のpromoterをNPC geneに導入し活性の高いベクターを開発中であり、同時にNPの胎児期モデルマウス脳内注入も検討中である。サイトカイン処理による脳内LacZ標職アデノウイルス導入の試み:マウスの内頸動脈より20%マンニトール注入しBlood Brain Barrierを一時的に破壊し種々の濃度でIL-1,TNF-alfaを負荷し、アデノウイルスの脳内移行を組織学的に検討した。高濃度のサイトカイン負荷によりアデノウイルスが若干脳内に移行したが、サイトカインの副作用によると思われる痙撃発作が生じた。サイトカインの投与方法の改善とより高率良いウイルスベクター開発が必要と考えられた。胎児NPCマウスのアデノウイルスベクターによる中枢神経障害にに対する治療法の検討:在胎12-15日令マウス胎児の羊膜静脈よりLacZ標識アデノウイルスを注入し、胎児各組織へのウイルス移行を検討した。在胎12-15日令マウス胎児のすべての肝臓に組織学的にLacZ活性を認めたが、脳へのウイルス取込みは認められなかった。なお共同実験者の"胎児羊水内アデノウイルスの注入実験"では在胎数日令マウス胎児の脳内にウイルスの侵入によると思われる組織学的活性を脳組織内に認めた。現在ウイルスの投与時期、投与方法等を検討中である。1)Neurogenic progenitor(Npro)を用いたNiemann-Pick病typeCマウスモデル(NPCm)の脳障害に対する治療法の開発の試み:β-galactosidase標識Nproを2匹のNPCm左側脳室内に注入後延命効果を検討したが、コントロールに比べ有意な延命効果を得られなかった。しかしながら脳内へのNpro侵入を確認し得たことより、現在NPC活性をあげるべくレトロウイルスを用いたNPCgeneの遺伝子導入をNproに試み、脳内での酵素学的補充効果を生化学的及び組織学的に検討中である。2)サイトカインによるBlood Brain Barrier破壊法の検討と同法を用いたアデノウイルスベクターによるNPCマウスの脳障害の治療法開発の検討:マニトールによる脳高浸透圧ショック後IL-1,TNF-αを経内経動脈に注入し、エバンスブルー及びアデノウイルスベクターの脳内取り込みを検討した。コントロールに比べ若干の取り込み増加を認めたが、LacZ標識アデノウイルスベクターの取り込みは認められなかった。現在IL-1,TNFの投与条件を再検討すると共に、他の炎症性サイトカインを用いた検討を行っている。3)胎児NPCマウスの脳障害に対する治療法の検討:在胎15週令マウス胎児の羊膜動脈よりLacZ標識アデノベクターを注入し、胎児各組織でのLacZ活性を測定。肝臓での有意な活性の上昇を認めたが、脳内での活性は認められず、今後ベクター投与時期を早め投与方法の検討を加えていきたい。

Neurogenic progenitor(Npro)を用いたNiemann-Pick病type Cマウスモデル(NPCm)の脳障害に対する治療法の開発の試み:β-galactosidase標識Nproを2匹のNPCm左側脳室内に注入後延命効果を検討したが、コントロールに比べ有意な延命効果を得られなかった。しかしながら脳内へのNpro侵入を確認し得たことより、現在NPC活性をあげるべくレトロウイルスを用いたNPCgeneの遺伝子導入をNproに試み、脳内での酵素学的補充効果を生化学的及び組織学的に検討中である。2)サイトカインによるBlood Brain Barrier破壊法の検討と同法を用いたアデノウイルスベクターによるNPCマウスの脳障害の治療法開発の検討:マニトールによる脳高浸透圧ショック後IL-1,TNF-αを経内経動脈に注入し、エバンスブルー及びアデノウイルスベクターの脳内取り込みを検討した。コントロールに比べ若干の取り込み増加を認めたが、LacZ標識アデノウイルスベクターの取り込みは認められなかった。現在IL-1,TNFの投与条件を再検討すると共に、他の炎症性サイトカインを用いた検討を行っている。3)胎児NPCマウスの脳障害に対する治療法の検討:在胎15週令マウス胎児の羊膜動脈よりLacZ標識アデノベクターを注入し、胎児各組織でのLacZ活性を測定。肝臓での有意な活性の上昇を認めたが、脳内での活性は認められず、今後ベクター投与時期を早め投与方法の検討を加えていきたい。
新規膜結合リゾホスホリパーゼＤによるリゾホスファチジン酸産生と口腔粘膜保護

リゾホスファチジン酸〔LPA〕は、最近、脚光を浴びているリゾリン脂質メディエーターであり、6種の特異的受容体を介して多彩な生理作用を発揮する。本研究で、健常者の歯肉溝浸出液(GCF)に混合唾液の濃度より一桁も高い濃度でLPAが存在していること、及び、歯周病患者のGCFでLPA量が激減していることが、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で明らかとなった。健常者と比べて歯周病患者のGCFではLPAを分解する酵素が高値であることが、その主因であった。LPAは骨リモデリングに関与しており、GCFを含む歯槽骨近辺でのLPA枯渇が骨吸収に寄与し歯周病を悪化させている可能性が強く示唆された。歯周病患者と健常者の歯肉溝浸出液を採取し、脂質を抽出し液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法でリゾホスファチジルエタノールアミンの分子種分析を行った。歯周病患者の方が、総濃度は低値であった。マウス骨芽前駆細胞MC3T3-E1細胞を分化誘導後、無血清培地下でリゾリン脂質を添加しインキュベート後、培養液と細胞回収液のリゾリン脂質の変動を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で定量した。また、その代謝物を酵素共役蛍光法で定量した。その結果、MC3T3-ECは,分化1週間にはリゾホスホリパーゼCを、2週間後には、リゾホスホリパーゼDを発現することが明らかとなり、分化が進むと、リゾホスファチジン酸を含むリゾリン脂質メディエーターの産生が順次、誘導されることが推定された。以上の結果から、歯肉溝浸出液に高濃度に含まれるリゾリン脂質が歯肉粘膜のみならず歯槽骨にも作用し、骨リモデリングに関与すること、並びに歯周病患者では、リゾリン脂質メディエーターの産生・代謝系が異常が歯槽骨吸収に一部、寄与していることが示唆された。ヒトの歯肉上皮腫瘍由来の株細胞Sa3を培養皿上で培養し、ウシ胎児血清を除去後、飽和アルキルエーテル亜種(C16)あるいは飽和アシル亜種(C16)のリゾホスファチジルコリン(0.25%ウシ血清アルブミン含有生理食塩水)溶液を添加後、一定時間(0.5, 1 3, 6時間)インキュベートを行い採取した培養上清中のコリンを定量するリゾホスホリパーゼD活性の簡便な測定法を構築した。この方法を用い、既知のエキソリゾホスホリパーゼD(オートタキシン)阻害剤(S32826, HA130, BrP-LPA)の効果を調べたところ、予想とは異なり、BrP-LPAとS32826が高濃度でのみlysoPLD活性を弱く抑制し、HA130は無効であった。しかし、ヒトやBALB/cマウスのヘパリン血漿やBALB/cマウスのヘパリン血液中のオートタキシンのリゾホスホリパーゼD活性は、これら阻害剤により,すべて顕著に阻害された。これらの結果は、本検定系がエクトリゾホスホリパーゼDの検定として妥当であること、及び、口腔粘膜上皮に存在するオートタキシンと異なるタイプのリゾホスホリパーゼDが唾液等の口腔内体液に含まれるLPCを絶えず捕捉し、創傷治癒や粘膜保護作用を持つLPAを恒常的に産生していることを示唆している。ヒト健常者と歯周病患者の歯肉溝浸出液を採取後、Bligh & Dyer法で脂質抽出を行い、液体クロマトグラフィー・質量分析法で数種のリゾリン脂質メディエーターの総量と分子種組成を解析した。その結果、患者群では、飽和あるいはモノエン型の脂肪酸を有するリゾホスファチジン酸(LPA)濃度が低下するが、多価不飽和脂肪酸を持つLPA濃度が高いことが明らかとなった。LPAの前駆体であるリゾホスファチジルコリン(LPA)の総量は患者群で増加していた。ほとんどのLPC分子種の濃度が増加していたが、多価不飽和脂肪酸を持つ分子種の増加幅の方が高かった。この浸出液にLPCを添加してインキュベートし、LPCからLPAとコリンを直接的に産生するリゾホスホリパーゼD活性を測定した。アルキルエーテル型のLPCを添加した場合にはコリン産生が低く、アシル型LPCを基質とするとコリン産生が高くなることから、本浸出液にはリゾホスホリパーゼD活性はほとんど存在せずLPCを脂肪酸に分解するリゾホスホリパーゼA活性とグりセロホスホコリン:コリンホスホジエステラーゼ活性が高いことが推定された。この活性は健常者と比べて患者群で著しく高値であった。