hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
旧石器時代人の狩猟活動の季節性を探る－新手法による狩猟対象獣の歯の成長線解析－

方法論の開発に関して、昨年度検討したもののほかに歯のエナメル質に食物との接触によって生じるマイクロウェアを死亡季節推定の指標として用いる手法も新たに検討した。主要観察対象となる更新世のノウサギの下顎切歯化石の切縁部の多くは、堆積物中の酸によるダメージが認められたため、まず試料として国立科学博物館に収蔵されている保存状態の良好な更新世のヤベオオツノジカやニホンザルの歯化石を選び、歯科用シリコーンによって歯の表面のマイクロウェアの印象を採取し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。観察を進めるなかで、印象材によってマイクロウェアの印象採取精度が大きく異なることが判明し、研究を進めていく上で、どの材料を選択すべきなのか、また、その材料はどんな物性を持つものなのか、を明らかにする必要が生じた。この課題の解決に向け、国内外の歯科用シリコーン9つについて、上述の試料を使って、実物とシリコーン印象型でのマイクロウェアにどれほどの違いが生じるのか定量的に検討した。それと並行して、シリコーン自体の物性を定量的に評価し、マイクロウェアの印象精度との関係を解明するために、動的粘弾性と硬化収縮率の測定も実施した。検討の結果、主剤と硬化剤を混和してから急速に収縮が進んでしまうシリコーンはマイクロウェアの印象を正確に採取できない傾向が確認された。また、硬化が遅いシリコーンも同様に印象を正確に採取できない傾向にあった。こうした検討から、先行研究によって多用されてきた国外産のシリコーンに代替可能な国内産の製品として今回検討した中からは2つの製品があげられることを示した。これに加え、これらの製品以外についても代替品を選択するための重要な指標となる歯科用シリコーンの収縮率と粘弾性という物性の経時変化を初めて定量的に示すことができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。狩猟季節推定のための方法論の開発に関して、まず、現生ノウサギならびに旧石器時代遺跡から出土したノウサギの下顎切歯の樹脂包埋横断切片を作成し、透過型顕微鏡観察による組織形態学的検討を行った。さらに同一サンプルを、SEM-EDSにより線分析を行った。その結果、象牙質の石灰化の強弱を反映する歯質由来のP、Caの構成比変動では、旧石器時代標本の髄腔近心縁の中間部で石灰化が顕著に弱い箇所が認められた。これらの結果は、形態特徴においても元素組成の面でも旧石器時代標本と現生標本の両者が近似したパターンを持つことを示すものである。切歯象牙質から死亡時期を推定する方法論の確立には冬季以外に死亡した個体のサンプルの追加調査も踏まえなければならないものの、この近似性を積極的に評価するのであれば、旧石器時代のウサギ狩猟の季節のひとつが冬季であったと解釈し得る。この研究に関して、2016年7月に日本動物考古学会大会においてポスター発表を行った。上記の手法とは異なる新しい方法論を開発するために、東京大学総合研究博物館放射性炭素年代測定室の協力を得て、宮城県で冬季に捕獲された現生ノウサギを対象に、下顎切歯象牙質中のリン酸塩の酸素同位体比の変化から死亡季節を推定する手法について検討を開始した。季節性を検出するためには歯の成長線の形成方向に沿って連続的にサンプリングする必要があるが、本年の予備実験によって、連続サンプルによる測定への課題を明らかにすることができた。現生標本よりも断片的な遺跡出土標本にも適用可能なサンプリング法を十分検討した上で今後の実験を進める。放射光施設の高分解能マイクロCTによって歯の試験的な撮影は実現したものの、当初想定された視野と分解能の画像を取得することはできず、非破壊的な歯の成長線観察法の開発と実施に問題が生じ、別の手法へシフトする必要に迫られたため。それに加え、ノウサギの現生標本の収集に関して、冬季に死亡した個体以外を集めることが困難であったため。ただし、ノウサギの切歯について現生標本と旧石器時代遺跡から出土した標本の切片を作成しSEM-EDSで元素分析を実施する、あるいは、ノウサギの現生標本の切歯について安定同位体比測定を試験的に実施する、などの当初予定はしていなかったものの、有力な分析手法の開発に取り組むことができたため、次年度以降の研究の新しい展開にはある程度の見通しをつけることができた。

検討の結果、主剤と硬化剤を混和してから急速に収縮が進んでしまうシリコーンはマイクロウェアの印象を正確に採取できない傾向が確認された。また、硬化が遅いシリコーンも同様に印象を正確に採取できない傾向にあった。こうした検討から、先行研究によって多用されてきた国外産のシリコーンに代替可能な国内産の製品として今回検討した中からは2つの製品があげられることを示した。これに加え、これらの製品以外についても代替品を選択するための重要な指標となる歯科用シリコーンの収縮率と粘弾性という物性の経時変化を初めて定量的に示すことができた。ノウサギの切歯象牙質の成長線の形成方向に沿った連続サンプリングによる酸素同位体比測定によって死亡時期を推定する手法の開発を進める。また、ノウサギの現生標本の収集に努め、季節ごとに歯の組織形態がどのように異なるのかを調査する。これらの手法や知見を旧石器時代遺跡から出土した標本の分析に適用することで、旧石器時代人の狩猟季節を復元することを目標とする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
アポトーシスにおける核凝縮の分子形態学的解析

アポトーシスの実行過程のうち、最も未解明な点の多い核の凝縮に焦点を当てた。単離核を用いた方法によって、リング凝縮の機構について解析した。分子量30K50Kの分画に強いリング凝縮活性があること、それはカスパーゼ、DNase、JNKキナーゼとは異なる可能性が高いことを明らかにした。またリング凝縮の過程を詳細に解析する方法を見出した。アポトーシスにおける核の凝縮は、形態学的にも研究者によって統一的な見解が得られていなかった。それはこれまで核の凝縮の同調性が悪く、また同一の核を追跡してその形態学的変化を捉えた研究が皆無であったからである。我々は、これまでに、cell-freeアポトーシスの手法と微速度映画を用いて、アポトーシスにおける核の凝縮過程がリング形成、ネックレス、最終の3ステップをたどることを確定し、そのうち23分で生じるリング構造を引き起こす因子(リング形成因子)が、アポトーシス細胞の抽出物からヘパリンアガロースによるアフィニティーカラムによって高濃度に精製できることを見出している。今年度はヒト白血病細胞Jurkat並びにニワトリヘパトーマ細胞CHEPからヘパリンアガロースおよび限外濾過法によってリング形成因子を部分精製し、各分画を単離した核にかけたところ、分子量30K50Kの分画に強い活性があることを見出した。このことは、リング形成がある種のイオンや低分子によるアーティファクトであることを完全に否定する結果でもある。しかし、1次元SDS電気泳動によって多数のバンドを認めたので、質量分析計による蛋白の同定には至っていない。更なる大量培養による試料の大量取得と精製が必要である。我々は、これまでにcell-freeアポトーシスの手法と微速度映画を用いて、アポトーシスにおける核の凝縮過程がリング形成、ネックレス、最終の3ステップをたどることを発見し、そのうち23分で生じるリング構造を引き起こす因子(リング形成因子)が、アポトーシス細胞の抽出物からヘパリンアガロースによるアフィニティーカラムによって高濃度に精製できることを見出している。この因子をヒト白血病細胞Jurkatからヘパリンアガロースおよび限外濾過法によって部分精製し、分子量30K50Kの分画に強い活性があることを明らかにした。21年度は硫安分画法などで部分精製したが、同定には至っていない。また、この活性によって核蛋白のリン酸化が起きることは確かめたが、p38並びにJNKキナーゼに対する阻害剤では、cell-freeの核凝縮はまったく阻害できなかった。両酵素以外のキナーゼが働いていると考えられる。この因子をヒト白血病細胞Jurkatから部分精製し、分子量30K50Kの分画に強い活性があることを明らかにした。また、この活性によって核蛋白のリン酸化が起きることは確かめたが、p38並びにJNKキナーゼに対する阻害剤で、cell-freeの核凝縮はまったく阻害できなかった。22年度は硫安3050%分画にリング誘導活性があることを見出したが、同定には至っていない。また今年度は、リングが誘導される過程を微速度映画で撮影することに成功した。これまでリング形成過程は極めて迅速でその途中状態を捉えることに成功していなかったが、温度を25°Cまたは30°Cに下げることで進行速度を落とし、初めて撮影に成功することができた。その解析結果からリングの空洞部分は徐々に拡大していくのではなく、核全体が同調的に薄くなっていくことが分かった。
外場応答型分子性強誘電体

強誘電物質の開発を目指して[H2dabco] (H2dabco2+ = diprotonated 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane)に着目して研究を行った。その結果、[H2dabco]と[2CB](2CB=2-Chlorobenzoate)からなる新物質[H2dabco]・[2CB]2の単結晶を得た。この物質は室温でPca21の空間群に属する構造をしていた。非対称ユニットは二つの2CBアニオンと一つの[H2dabco]2+カチオンからなり、二つの2CBアニオンが[H2dabco]2+カチオンで架橋された構造をしていた。分子間水素結合のN-O間の距離は2.555(2)と2.593(2) Aであった。この物質のDSCを測定したところ325 K付近で相転移することがわかった。高温相の構造は非極性のPbcaの空間群に属していた。対称要素は室温で(E, C2, σv, σd)、高温相では(E, 3C2, i, σv, σd, σh)である。これは常誘電から強誘電への相転移が起きたことを示唆している。高温相では[H2dabco]2+の配向は無秩序化しており、二つの2CBアニオンの中間に位置していた。分子間水素結合のN-O間の距離は2.572(4)Aであった。さらに、この物質の誘電率を測定したところ325 K付近で誘電率がピークを示した。これは常誘電から強誘電への転移が起きたことに一致している。さらに、極性構造に変化することを確かめるためにSHG顕微鏡を用いて温度変化によるSHGの強度変化をモニターした。その結果325 K以下でSHGが強まることが分かった。これは、非極性構造から極性構造へと変化したことを支持している。昨年、強誘電物質の開発を目指して[H2dabco] (H2dabco2+ = diprotonated 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane)に着目して研究を行い、[H2dabco]と[2CB] (2CB=2-Chlorobenzoate)からなる新物質[H2dabco][2CB]2の開発に成功した。結晶構造の解析から、温度変化により極性構造と非極性構造間をスイッチすることが示唆されている。本年度は、この物質の極性構造を確かめるために、岡山理科大の研究者と共同で焦電流の測定を試みた。極性構造を持つ物質は焦電性を有することが分かっている。単結晶を劈開し実験を行ったところ初期的な結果ではあるが、焦電流が観測され極性を持つことが明らかになった。また、強誘電挙動を確かめるために、ヒステリシス曲線の測定を試みた。さらに、[H2dabco][2CB]2に加えて様々な新物質の開発を試みた。特に、レドックス挙動を示す配位子を有する複核コバルト錯体において、温度変化による電子移動現象を見出した。物質化学分子性強誘電材料の開発が注目されるようになり様々な有機強誘電体、金属錯体強誘電体が開発されている。また、電荷秩序に伴う強誘電材料(電子強誘電体)が酸化物や低次元有機導体で相次いで見出されている。今後、これらの物質を応用していくためには、光、温度等の外部刺激により誘電特性をスイッチングできる新物質を開発する必要がある。この目標を達成するために一年目はまず新規有機強誘電体の開発を目指して研究を行った。その結果室温以上で強誘電への相転移を示す新物質を開発することに成功した。二年目は外場により強誘電特性を自在に制御できる新物質の開発を行う予定であるが、そのための基盤となる物質を得ることができたといえる。従って、一年目としてはおおむね順調である。一年目に開発した物質の電場応答、光応答を検討する。また、光応答部位を導入した新規有機強誘電体の開発を行う。これらにより、強誘電特性と光応答性が相互作用する新物質の開発を目指す。液体ヘリウムの供給不足で一部予定通りに測定が進まず次年度使用額が生じた。測定装置を低温センターに移すことにより問題は解決したので今年度中に研究・研究費の使用が当初の計画通りに戻る予定である。
アディポカイン結合蛋白を標的にした動脈硬化診断法の開発

本研究は、新規アディポカイン結合蛋白(AKBP)を同定し、アディポネクチンやオメンチンとAKBPとの複合体による動脈硬化発症機序を明らかにすると共に、複合体測定による動脈硬化疾患の診断法と、AKBPをターゲットとした治療法の開発につなげることを目的とする。2015年度は、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体による免疫沈降と質量分析法により、ヒト培養細胞からE-selectin ligand (ESL)-1をアディポネクチン結合蛋白として同定した。ESL-1は血管内皮細胞のE-selectinと結合し、動脈硬化初期段階における単球のローリング現象に重要な分子であり、アディポネクチンが単球表面のESL-1に結合することによって単球と血管内皮との接着を阻害するという新たな抗動脈硬化機序を明らかにした。動脈硬化性疾患で血中濃度が増加することを見出したアディポネクチン-AKBP1複合体(未発表)が、血清を抗アディポネクチン抗体で免疫沈降し抗AKBP1抗体でウエスタンブロットする系において、動脈硬化性疾患の症例数を増やして高値であることを明らかにした。しかし、多量体アディポネクチンを結合する抗体を固相化して複合体を結合し抗AKBP1抗体で検出するサンドイッチELISAでの測定値は、免疫沈降とウエスタンブロットで得られた複合体量を定量化できておらず、複合体の立体構造がELISAに用いている抗体の反応性に影響したためと考えられた。E-selectin ligand-1を新規アディポネクチン結合蛋白として同定し、新たな抗動脈硬化機序を明らかにした。また、新たなAKBPの同定や、測定系の開発が進んでいる。本研究は、新規アディポカイン結合蛋白(AKBP)を同定し、アディポネクチンやオメンチンとAKBPとの複合体による動脈硬化発症機序を明らかにすると共に、複合体測定による動脈硬化の診断法と、AKBPをターゲットとした治療法の開発につなげることを目的とする。2016年度は、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体による免疫沈降と質量分析法により、ヒト血清からMac2 Binding Protein (M2BP)をアディポネクチン結合蛋白として同定した。M2BPは、炎症性疾患や非アルコール性脂肪肝炎などで血中濃度が上昇することが知られている分子であるが、動脈硬化疾患における報告はない。冠動脈疾患症例において、血清を抗アディポネクチン抗体で免疫沈降し抗M2BP抗体でウエスタンブロットする系を用いてアディポネクチン- M2BP複合体を半定量したところ、年令を合わせた対照の健診受診者に比して著明に高値であり、アディポネクチンやM2BPそれぞれの血中濃度より明らかに大きな差を認めた。従って、複合体の測定系を確立すれば冠動脈疾患の診断に有用となると考えられた。また、アディポネクチンは炎症で血管内皮細胞に発現する単球接着分子を抑制するという抗動脈硬化作用を有するが、M2BPはこの抑制を阻害することが明らかとなった。従って、血中アディポネクチン-M2BP複合体の増加は動脈硬化惹起性であると考えられた。以上より、アディポネクチン- M2BP複合体の測定は、新たな動脈硬化診断法につながることが期待される。Mac2 Binding Proteinを新規AKBPとして同定し、新たな動脈硬化診断法につながるメカニズムを明らかにした。2017年度は、ヒト血清からAKBPとして同定したシスタチンCの動脈硬化における意義を、血管内超音波法(IVUS)を施行した男性安定狭心症患者を対象に検討した。冠動脈プラークの形態や組織性状は、iMap-IVUSを用いて冠動脈プラークを維性成分、壊死性成分、脂肪成分に分類することで評価した。次に、冠動脈疾患症例において、血清を抗APN抗体で免疫沈降し抗CysC抗体でウエスタンブロットする系を用いてAPN-CysC複合体を半定量したところ、血清APN-CysC複合体量は、プラークの線維性成分と有意な負の相関、壊死性成分および脂肪成分と壊死性成分の和と有意な正の相関を認めた。重回帰分析において、APN-CysC複合体濃度はプラークの線維性成分、壊死性成分、脂肪成分と壊死性成分の和と最も強く関連する因子であることが明らかとなった。今年度も引き続き、ヒト血清や培養細胞から免疫沈降と質量分析法を用いたAKBPの同定を行う。並行してヒトゲノムデータベースを用いて既に同定したAKBPに共通するアミノ酸配列を含むcDNAの検索も行う。動脈硬化との関連が推定される分泌蛋白や受容体や機能が未知の分子を候補とし、候補分子のcDNAを用いて蛋白を発現させ、in vitroの系でアディポネクチンやオメンチンとの特異的な結合が確認されたものをAKBPとし、複合体測定系の開発と臨床意義の解明、動脈硬化モデルにおける機能解析を行う。冠動脈疾患で血中濃度が増加することを見出したアディポネクチン-AKBP1複合体(未発表)が、血清を抗アディポネクチン抗体で免疫沈降し抗AKBP1抗体でウエスタンブロットする系において、症例数を増やしても冠動脈疾患で高値であることを確認し、定量系の開発を進める。

並行してヒトゲノムデータベースを用いて既に同定したAKBPに共通するアミノ酸配列を含むcDNAの検索も行う。動脈硬化との関連が推定される分泌蛋白や受容体や機能が未知の分子を候補とし、候補分子のcDNAを用いて蛋白を発現させ、in vitroの系でアディポネクチンやオメンチンとの特異的な結合が確認されたものをAKBPとし、複合体測定系の開発と臨床意義の解明、動脈硬化モデルにおける機能解析を行う。アディポネクチン-M2BP複合体測定のELISA系の構築に関して、新たに作製したモノクローナル抗体を用いた検討を行う。まず、高分子アディポネクチン測定ELISAキットで固層化抗体として用いられているANOC9121を用いて、96ウエルプレートに複合体を結合させる。次いで、新たに作製したM2BPに対する十数種類のモノクローナル抗体を反応させ、免疫沈降とウエスタンブロットでの半定量結果との相関性を検討する。ELISA系が構築できれば、大血管症と細小血管症が既に評価されている糖尿病100症例の血清を用いて、アディポネクチン-M2BP複合体を測定し、動脈硬化性疾患のスクリーニングにおける意義を検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。臨床検査医学29年度が最終年度であるため、記入しない。
320列CTによる各種がんのよる各種がんの4次元運動の解析と同期照射研究

食道癌・乳房・胃癌・肺癌の放射線治療時と同様の体位での20秒間の4次元の動きを解析した。食道癌・胃癌・肺癌ではやはり横隔膜に近い病巣ほど呼吸性の動きが大きかった。乳癌では予想よりも呼吸性移動ははるかに小さく2mm程度であった。放射線治療計画におけるinternalmargin決定の際の有用なデータを示せた。今後の放射線治療の主流になっていくIMRT(強度変調放射線治療)の治療計画においては特に重要なデータである。横隔膜周辺の体幹部(胸部・腹部・骨盤部)に発生した癌に対し、放射線治療(根治目的・緩和目的は問わない)を行う症例を対象にしている。実際の放射線治療と全く同様の呼吸状態(自由呼吸下)・体位・ベッド・固定具を用いた状態で診断用の320列Multi-slice computedtomography (MS-CT)(東芝製のAquillion ONE)で、20秒間連続のシネ・モード撮影を行っている。それにより照射中の臓器の3次元的な位置座標の移動距離の大きさとその動きと呼吸周期との関連性を調査している。具体的には、食道癌の放射線治療中の4次元の動きに関する英語論文は英文雑誌にpublish済みである(Int J Radiat Oncol Biol Phys 2011 ; 79:588-595.)。肺癌(12症例)と乳癌術後(20症例)の放射線治療中の4次元の動きに関してはそれぞれ予定の症例全て終了しており、データ解析も終了、英語論文化まで終了しており、現在査読のある海外雑誌に投稿中である。胃癌の4次元の動きに関しては予定の12症例全てにおいて320MSCT検査は終了しており、データ解析中である。今後論文化し、投稿予定である。肝細胞癌の照射中の4次元の動きに関しては登録予定12症例中8症例まで320MSCT検査は終了している。症例登録を継続中である。横隔膜周辺の体幹部(胸部・腹部・骨盤部)に発生した癌に対し、放射線治療(根治目的・緩和目的は問わない)を行う症例を対象にした。実際の放射線治療と全く同様の呼吸状態(自由呼吸下)・体位・ベッド・固定具を用いた状態で診断用の320列Multi-slice computedtomography(MS-CT)(東芝製のAquillion ONE)で、20秒間連続のシネ・モード撮影を行った。それにより照射中の臓器の3次元的な位置座標の移動距離の大きさとその動きと呼吸周期との関連性を調査した。具体的には、食道癌と乳房の放射線治療中の4次元の動きに関する英語論文は英文雑誌にpublish済みである。肺癌(12症例)・胃癌の放射線治療中の4次元の動きに関してはそれぞれ予定の症例全て終了しており、データ解析も終了、英語論文化まで終了しており、現在査読のある海外雑誌に投稿中である。肝細胞癌の4次元の動きに関しては予定の10症例全てにおいて320MSCT検査は終了しており、データ解析中である。放射線治療施行時と同等のベッドならびに体位で撮影した20秒間の動きのデータが得られ、様々な臓器における放射線治療中のintra-fraction motionに関する詳細で正確な情報がまとめられた。このデータは今後の強度変調放射線治療(IMRT)などでCTV-PTVマージン(internal margin)を決定する際に非常に有用なデータとなる。
酵母ミニ染色体の安定保持に関与する遺伝子の解析

酵母動原体(CEN)と自律複製能を有する配列(ARS)を持つプラスミドは、ミニ染色体として酵母内で比較的安定に存在しうる。本研究では、温度感受性変異株のうち、中間温度でミニ染色体が不安定になるものを選択し、その表現形を調べると共に、遺伝子産物が複製や分配にどのような役割りを果しているかを明らかにすることを目的としている。アデニン要求性株が赤色コロニ-を形成することを利用して、ミニ染色体の安定性を形質転換体コロニ-の色で識別する方法を、すでに単離されているいくつかのts変異株に応用した。中間温度にして、白いセクタ-が出る変異株を2種、白の他の赤いセクタ-を生ずるもの1種を新たにスクリ-ニングし、前者は複製の、後者は分配のメカニズムに欠損を生じていると思われる。今後は遺伝子をクロ-ニングして解析する予定である。細胞周期G1期よりS期への移行に欠損のあるgst1変異株もミニ染色体を不安定にすることが判っている。遺伝子産物は、分子量77Kで、EFIαとのホモロジ-が高いタンパクである。さらにオムニポテントなどのサプレッサ-と同一遺伝子であることが判った。このタンパクの機能を、特に細胞周期との関連で研究することが今後の課題である。この酵母GST1DNAを用いてヒト培養細胞のcDNAライブラリ-より相同遺伝子を単離した。酵母に比べ、分子量は56Kと小さいが、酵母gst1^<ts>を部分的に相補できたので、機能的にも似た働きをしていると考えられる。血清で刺激して細胞周期を同調化させ、mRNAの量を経時的に追うと、S期に入る直前に発現量が最大になることが判った。酵母GST1が、G1期よりS期への移行に欠損のある細胞周期変異株であることを考えあわせると興味深い。酵母アデニン要求性変異株が、赤色コロニーを形成することを利用してミニ染色体の安定性をコロニーの色で検出する方法が開発されている。ミニ染色体の安定保持に関与する遺伝子について解析を進める為、動原体と多コピープラスミドである2μプラスミドのSTB部位を含むキメラプラスミドのコピー数調節機構を利用して単離した温度感受性変異株について応用した。今年度までに、2種のTS変異株について調べた。1.gst1変異株について。gstlade2ade3leu2を作成し、ADE3を含むプラスミドPDK243を形質転換法により導入した。26°C、選択培地中でピンク色になり、非許容温度との中間温度、34°Cでは、中央がピンク、まわりが白いコロニーを形成した。従って、ミニ染色体の安定性に温度依存性が観察された。さらに、ミニ染色体ばかりでなく、多コピー系の2μ型プラスミドも不安定であった。非選択培地上で、34°C、20h培養後、26°Cで2日間培養したコロニーは、ピンクと白のセクターを形成した。セクターの色が、赤色を呈しなかったことから、分配機構の異常ではなく、simple lossであると推論された。gstl変異株を高温にすると、蛋白合成に比べ、DNA合成が著しく阻害されることが判っている。extra chromosomalなDNAの方が、染色体よりも、温度の影響を受けやすいと思われる。同様にして、2.ts46変異株について調べた。34°Cで白色コロニーを形成したが、その後の実験により、tsが2つの遺伝子に分離した。ts46を相補するDNA断片として単離されたts46-1遺伝子は、CHEF法により分離した染色体のサザン法により、染色体7番にマップした。

新しく分離したts46-1とアデニン要求性との二重変異株は、34°Cでも、ピンク色のコロニーを形成することから、オリジナルなts46に含まれるもう一つのts遺伝子に、ミニ染色体を不安定にする性質があると考えられる。真核生物のモデルケ-スとしての酵母サッカロミセス・セレビシェでは、動原体DNA(CEN)が単離されて居り、自律複製能を有るす配列(ARS)と共に作製されたプラスミドは、ミニ染色体として酵母内で比較的安定に存在しうる。本研究では、湿度感受性変異株のうち、中間温度でミニ染色体が不安定になるものを選択し、その表現形を調べると共に、遺伝子産物が複製や分配にどのような役割りを果しているかを明らかにすることを目的としている。アデニン要求性株が赤白コロニ-を形成することを利用して、ミニ染色体の安定性をコロニ-の色で識別する方法が開発されているので、いくつかの温度感受性変異株とかけあわせ、ミニ染色体の安定性に温度依存性があるものをスクリ-ニングした。今年度は、新たに、3種、ts12、ts22、ts47が見つかった。ts12はピンクや白のセクタ-に、赤いセクタ-も観察され、染色体の分配に関与している可能性がある。tsは、温度を制限温度にすると、大きな芽を出したところで形態が止まり、いわゆるcdc変異株の一つと考えられる。今後は、遺伝子をクロ-ニングして解析する予定である。すでに詳細な研究が進んでいるgst1変異株については、ヒトのhomologueが単離された。ヒトGST1タンパクは、酵母タンパクに比べ分子量が小さいが、酵母gst1X^<ts>を部分的に相補した。機能的にも似た働きをしていると考えられる。血清で刺激して細胞周期を同調化させ、mRNAの量を経時的に調べると、S期に入る直前に最も発現量が上がることが判った。酵母GSTIが、GI期よりS期への移行に欠損のある細胞周期変異株であることを考えあわせると、興味深い。
高密度プラズマスパッタリングによるナノコンポジット超硬質薄膜合成の研究

誘導結合型プラズマ(ICP)を重畳した新形式のプラズマスパッタリング法を用いて、低エネルギーイオン照射効果を生かしたナノコンポジット薄膜合成の研究を行い以下のような成果を得た。1.Ti-Cu-Nナノコンポジット薄膜合成においては、2at%Cuの添加時に42Gpaの超高硬度膜を得た。その時の膜の構造としてはナノ結晶TiN・ナノ結晶Cuコンポジットとなっていることがわかった。またICPの重畳による低エネルギーイオン照射効果により、膜応力は1.5Gpa以下に抑制された。2.i-Si-Nナノコンポジット薄膜合成においては、5.8at%Siの添加時に48Gpa以上の超高硬度が得られた。その構造はナノ結晶TiN/非晶質Si_3N_4コンポジットとなっていることが確認された。また超高硬度発現の原因は圧縮応力によるものではなく、非晶質Si_3N_4のナノ結晶粒界への分離による粒界強化にあると推測された。以上のように、スパッタリング法においてICP重畳という新しい方法を採用することにより、ナノコンポジット薄膜の超高硬質発現の機構を明快にすることができると共に、その成果を多くの学術誌や国際会議に発表した。最近c-BNより硬くダイヤモンドと同様の硬さで100GPaにも達する可能性を持ち、基板との密着性も優れていて膜厚もより大きくすることが容易な、新しい超硬質薄膜として、TiN/Si_3N_4やCrN/Niなどのいわゆるナノコンポジット薄膜が大きな話題となっている。本研究においてはセラミックス/金属系の薄膜に着目して、その超高硬度発現機構の解明のみならず、その他の新しい機能を持つナノコンポジットの実現を目指すことを目的とする。平成13年度は研究の初年度に当たるため、主としてナノコンポジット薄膜作成装置の開発に主体が置かれると共に、それを用いたTiN/CuあるいはTiN/Si合成の予備実験を行うこととした。まず装置の試作開発についてはDCあるいはRF電力を用いた多重スパッタリングシステムの構築を行い、2元あるいは3元材料を1枚の基板に同時にスパッタさせて成膜を行えるようになった。またこのスパッタリング法に対して誘導結合型プラズマを重畳できるようなシステムの構築が行われた。ただしこれに関しては今のところ得られるプラズマのパラメータが十分満足できる物ではないので、次年度も引き続き改良を行う予定である。一方ナノコンボジット薄膜合成の予備実験としては、TiN/Cu系での成膜に成功している。そして膜硬度のCu含有量依存性は、我々のイオンビームスパッタリング法により得られた結果と同じ傾向を示しているが、硬度の絶対値に顕著な差が現れている。現在膜の組成などを調べてその原因を調べている段階である。以上のような成果は今年の秋にドイツで開催される国際会議で発表の予定である。又上述のイオンビーム法による研究も成果の1つとして雑誌に発表された。平成13年度はナノコンポジット薄膜合成装置の開発に重点をおき、予定通りの成果をあげた。平成14年度はこの成果をもとに、精力的にナノコンポジット薄膜合成の研究を遂行した。その結果以下のような成果が得られている。1)TiN/Cu薄膜合成においては、膜に対してイオンや電子照射を行ったときの膜硬度やモルフォロジーにおよぼす影響を調べた。そして少量のイオン照射は、微細なTiNとCu結晶の複合した膜構造となって、それが硬度を増大させていることが明らかになった。一方十分な量の電子照射は表面での原子のマイグレーションを促進し、高密度の膜を形成して硬くなることが推論された。2)TiN/Si薄膜合成においても同様の実験を行い、高硬度をもたらすのは基本的に小さなTiN結晶がSi_3N_4非晶体の中に存在することによるものと推論できた。現在これについてさらに詳細に研究中である。3)さらに上述のスパッタリング法に対して、基板近傍に高密度のICPプラズマを重畳させる実験を行い、膜特性への影響を調べている。このICPプラズマにより、膜の組成や構造の制御がさらに向上することが期待される。今年度はこれをさらに詳細に明らかにしていく予定である。4)このようにナノコンポジット薄膜の硬度を高める機構には、種々の原因があげられることが明らかになりつつあるので、今年度で総合的な結論を得る予定である。

成果の一環としては学術論文を1編発表した。昨年度はICPを重畳しない状態での、マルチマグネトロンによる膜特性とプロセスパラメータとの相関を明らかにした。これらの成果をふまえて、今年度は以下のような研究を実施した。1 ICP重畳時のプラズマパラメータとイオンエネルギー分布を明らかにする。2 ICP重畳時の膜特性の変化を明らかにする。特にイオンエネルギーとイオン束を独立に制御して、膜の微細構造と硬度に及ぼす影響を明らかにする。3膜の密着性をその内部応力との相関から明らかにして、低応力、高密着性及び高硬度を兼備した高品質ナノコンポジット薄膜を完成させる。1に関しては基板表面に生成されるICPはプラズマ密度が高く10^<11>cm^<-3>台に達すると共に、電子温度は低くて3eV程度になり、膜に対して低ダメージのプラズマであることがわかった。また、接地された基板に対して20eVという低いエネルギーのイオンを高密度で照射出来ることが分かった。2については、上記イオンの照射により(200)優先配向の高硬度で緻密なTiN膜が作製可能となった。さらにTi-Cu-NならびにTi-Si-Nナノコンポジット薄膜作製においても、緻密な柱状晶を持つ硬度40GPa以上の超硬質薄膜を得ることが出来た。3については、高密度低エネルギーイオンの照射により、超硬質性を維持しながら1.5GPa以下の小さな応力しか持たない高品質ナノコンポジット薄膜の作製を実現できた。以上のような一連の結果に基づいて学術論文を4編発表し、さらに2編を投稿中である。又国際会議や国内会議にも数編づつ発表済みであり、これまでの研究の集大成として多くの成果を得た。
発癌物質その他による実験的卵巣腫瘍に関する研究

1.DMBA直接作用により発生する卵巣腫瘍DMBAを直接卵巣に作用させると卵巣腫瘍の発生をみる。大部分はseroustypeと、時に扁平上皮化生を伴うendometrioid typeから成るconcomitant adeno-carcinomaである。これらは生物学的発育態度はヒト卵巣癌と類似しており、発生の面からも卵巣の表層上皮由来が考えられる。次に本法で発生する腫瘍はfibrasarcomaである。しかし発生過程の究明は未だ将来に残されている。最後のtypeは同様にadenocarcinomaであるが全て小腺管状構造を示すacinar struc-tureを呈する。初期には門部にのみ認められ、また表層上皮の増殖を欠くことから、本腫瘍は表層上皮由来とは考えにくい。後二者の頻度は低く、発生腫瘍のうち約2%である。2.性腺の脾内移植による腫瘍既に報告されているように卵巣の脾内移植では顆粒膜細胞腫の発生がみられた。これらは全例、生物学的には悪性の態度は示さなかった。DMBAで前処理した卵巣を脾内に移植すると腺癌の他、腹腔内進展や著明な細胞異型を示す悪性顆粒膜細胞腫の発生をみた。睾丸組織を脾内自家移植することにより高率に脾内に腫瘍形成をみるが、興味あることにこの腫瘍はSertoli cell成分が混在し、PAPテストステロンでは陽性であった。3.Teratomaの発生今までの報告のうちマウスを用いてfetectomy法を行い発生した腫瘍とLT/Svマウスでみられる自然発生卵巣腫瘍との比較を試みた。両者共に成熟した組織成分から成るcystic tumorを形成するが、LTマウスのものにみられるextra-emoryonicなelementはfetectomy法ではみられなかった。
２次元物体の柔らかな画像マッチングの研究

1.KLダイバージェンスをマッチング尺度としてアフィン変換耐性のある新たな画像マッチング手法を考案した。まず濃淡画像を2次元確率分布として表現し、次に2つの2次元確率分布間のKLダイバージェンスを最小化する最適アフィン変換の非線形最適化問題として定式化し、最後に最適アフィン変換成分の効率的な反復解法を示した。2.処理時間の短縮が課題となっていたGAT相関法において、変数分離およびテーブル参照を用いて計算量を大幅に削減する高速化GAT相関法を考案した。これにより、k-最近傍法との組合せによる強力な画像マッチングの実装が可能となった。手書き数字認識に適用し、世界最高水準の認識精度を達成した。1.本研究の基礎となるGAT相関法は、2枚の濃淡画像間で正規化相互相関値を最大化する最適なアフィン変換成分を決定する際、(1) 1枚の画像の総画素数をNと記すと、準最適解を求めるための計算量がNの2乗オーダーとなる、(2)準最適解を最適解に収束させるために反復解法を用いている、ために多くの処理時間がかかった。今回、GAT相関法の計算モデルの構造を詳細に分析することにより、上記(1)に対して、(a)変数分離の手法により計算量がNの1乗オーダーとなる、(b)定型計算をテーブル参照で置き換える、という高速化手段を考案した。この高速化GAT相関法は、従来のGAT相関法と比較すると、マッチング精度は維持したままで、処理時間を約20分の1に短縮できた。2.画像マッチングで、学習サンプル数が少なく統計的パターン認識手法が利用できない場合、学習サンプルを全数登録するk-最近傍法が有力である。その際、画像マッチングに変形耐性を持たせると認識能力が大きく向上すると期待される。変形耐性のない単純な相関マッチング、代表的な変形耐性マッチング手法である接距離法、および高速化GAT相関法によるk-最近傍法を手書き数字認識に適用した結果、登録サンプル数の大小に関わらず、高速化GAT相関法は明らかに認識率が高く、かつ処理時間は接距離法の約2分の1に抑制できることが確認できた。3.非線形変形を吸収する新たな画像マッチング手法として、2次元射影変換成分を吸収できる汎用的な画像マッチング手法の定式化を行い、計算モデルの骨子を定めた。これをGPT(Global Projection Transformation)相関法と呼ぶことにする。基本アイデアは、2次元射影変換をアフィン変換と部分射影変換の積に等価的に分解した点にある。この分解により、GAT相関法の自然な拡張として計算モデルが構築できる。研究期間全体を通じて実施した研究の成果は次の通りである。1.KLダイバージェンスをマッチング尺度としてアフィン変換耐性のある新たな画像マッチング手法を提案した。まず濃淡画像を2次元確率分布として表現し、次に2つの2次元確率分布間のKLダイバージェンスを最小化する最適アフィン変換の決定問題として定式化し、最後に最適アフィン変換成分の効率的な反復解法を提案した。国際会議発表で高い評価を得た。2.非線形変形吸収のための2次元ワープ法とGAT/LAT法の結合については、2次元ワープ法の変形対応能力と処理量に問題があることが明らかとなった。一方、PAT相関法については「非線形変形=局所領域での線形変形」として捉える強力な画像マッチング法であることを確認したが、局所領域の指定法に任意性が残った。これらについては今後の継続課題とした。3.処理時間の短縮が課題となっていたGAT相関法において、変数分離およびテーブル参照を用いて計算量を大幅に削減する高速化GAT相関法を考案した。これにより、学習サンプルを全数登録するk-最近傍法との組合せによる強力な画像マッチングの実装が可能となった。手書き数字認識に適用した結果、処理速度を抑制して世界最高水準の認識精度が達成できることを示した。最終年度に実施した研究の成果は次の通りである。1.画期的な研究成果である高速化GAT相関法を権威ある海外ジャーナルに投稿して採録・掲載となった。海外からの閲覧回数も多い。2.非線形変形の吸収について、新たに2次元射影変換を取り上げた。2次元射影変換がアフィン変換と部分射影変換の積に分解できることを活用し、GAT相関法の自然な拡張としてのGPT相関法の基本アイデアを定式化して、最適な2次元射影変換成分の効率的な反復解法を考案した。今後さらなる展開が期待できる極めて有用な成果であり、国内研究会発表で大きな関心を集めた。1.アフィン変換で記述できる広範囲の線形変形を吸収する画像マッチング手法として、新たにKLダイバージェンス最小化基準を取り上げた。

まず、濃淡画像を2次元確率分布として表現して2枚の濃淡画像間のKLダイバージェンスを新たに定義し、次いで上記KLダイバージェンスを最小化するアフィン変換成分を求める非線形最適化問題を定式化し、最後にレーベンバーグ・マーカート法と新規提案の線形近似による反復解法を適用した。人工的にアフィン変換を加えた変形画像間のマッチング実験を行った結果、提案手法の線形近似による反復解法は、レーベンバーグ・マーカート法と比較して、アフィン変換変形耐性、過剰マッチングの抑制、処理時間のいずれにおいてもはるかに優れた性能を示した。これは汎用的かつ有力なアフィン不変画像マッチング手法の新規提案であり、極めて意義が大きい。2.アフィン変換で記述できない非線形変形を吸収する画像マッチング手法として、2次元ワープ法とGAT/LAT法の結合により変形ベクトル場を漸近展開する手法の検討を進めた。この手法では2次元ワープ法により変形ベクトル場が高精度に抽出できることを前提としているが、具体的実装とその最適化を行ったものの、非線形変形への対応能力が不十分であること、およびワープ範囲を拡げると処理時間が膨大となること、が明らかとなった。3.非線形変形を吸収する画像マッチング手法として、「非線形変形=部分と全体の線形マッチング」と規定する新しい観点から、部分と全体の正規化相互相関マッチングで非線形変形を吸収するPAT相関法を提案した。具体的に実装して手書き数字認識に適用した結果、従来のGAT相関法との直列適用により認識精度が大きく向上した。極めて有力かつ有望な手法であり、PAT相関法の定式化をさらに工夫してより高精度化すること、処理時間の短縮を図ること、などの課題が明らかとなった。1.処理時間の短縮が課題となっていたGAT相関法において、変数分離およびテーブル参照を用いて計算量を大幅に削減する高速化GAT相関法を考案した。これは画期的な成果であり、国際会議ICFHRおよびICPRでの発表でも高い関心と評価を得た。2.部分と全体の線形マッチングにより非線形変形耐性を実現するPAT相関法について、部分を指定する窓領域の最適化を核とする定式化の改良を目指したが、具体的なアイデアには結実しなかった。3.非線形変形の吸収について、新たに2次元射影変換を取り上げ、2次元射影変換をアフィン変換と部分射影変換の積に等価的に分解できることに着目し、GAT相関法の自然な拡張としてGPT相関法の基本アイデアを定式化できた。これは、今後の大きな展開が期待できる極めて有用な成果である。1.広範囲の線形変形の吸収については、研究の目的の第一の課題に記した通り、マッチング尺度として正規化相互相関に加えてKLダイバージェンスなどの情報量基準、最適化手法としてGAT相関法や共役勾配法、非線形最小二乗法などの比較検討を進めることができた。これにより、柔らかな画像マッチングにおけるマッチング尺度および非線形最適化問題の解法の選択について各手法の得失が明らかとなった。2.非線形変形の吸収については、研究の目的の第二の課題に記した通り、2次元ワープ法とGAT/LAT法の結合による変形ベクトル場の漸近展開を実装して実験を進めた。ただ、2次元ワープ法による変形ベクトル場の生成能力に限界があることが判明した。
多変量解析における統計的数値計算法の研究

平成5年度、6年度の2年間の研究期間の中で、現象分析のための統計的モデルの構築とその評価規準の構成、高次元データから有効に情報を抽出するための手法開発,コンピュータの利用を前提とした数理の展開と統計的数値計算法と最適計画法を組み合せた新しい手法開発と理論・方法論の研究を推進し、以下のような研究実績を上げた。1.適用範囲の広い柔軟な線形、非線形判別関数の構築とそれを将来の予測に用いた際の誤差を有効に推定するための方法を研究し、計算機の利用を前提とした統計的数値計算法の枠組みの中で、新たな予測誤差推定法と有効なモデル構築法を提案した。2.高次元データの次元縮小問題に関連して、主成分分析、因子分析における種々の推定量の非正規モデルの基での変動を有効に捉えるために、統計的数値計算法の一つであるブートストラップ法の適用研究を行った。その結果、バイアス、分散推定、信頼区間および信頼領域の構成に対して、その理論構造と共に、どのような状況で手法が有効に働き、適用上どのような点に注意を要するかを明らかにすることが出来た。3.確率分布の特徴付けと極限定理について研究をおこない、極限分布がある種の関数方程式を満たすものとして特徴付けを行うことで、収束の速さ等に関して新しい結果を導いた。4.システムの信頼性について統計学的視点から研究をおこなった。特に、Consecutive-k-out-of n:Fシステムの信頼性について総合的に考察し、オーダーkの離散分布論との関係を明らかにし、システム母数の推定問題について新たな知見を得た。5.臨床試験における新処理法の有効性を検定する問題に対して、Mantel-Haenszelタイプの検定統計量を提唱しその良さを確かめた。6.順序制約条件をもつ二項データに対する変化点問題を多重逐次比較法の観点から研究し種々の結果を得た。7.カテゴリカルデータに対する無作用量を決定する問題に対して、情報量規準AICに基づく方法を提唱し,従前の方法との比較においてその有効性を実証した。8.動節点をもつスプライン関数によるチェビシェフ近似問題の2次の特殊な構造を解明した。9.片側相条件をもつ変分問題に対して2次の最適性条件を与え、相条件から生成される包絡線についての考察をおこなった。10.位置母数、尺度母数などに対する二標本ノンパラメトリック検定問題を研究し、ある種の順位検定法を提唱しその良さを確かめた。多変量解析における統計的数値計算法に関して理論的・数値的両側面から、以下のような研究を行った。(1)計算機の発展・普及にともない、あらゆる分野でより複雑かつ高次の情報処理の必要性が生じ、最尤法の枠をはずしたモデル、ベイズアプローチによるモデル等、多様な統計モデルの構築が試みられている。このような状況に対応して、ここでは、様々なモデルを評価するための規準構成を目的として、基礎理論研究を行なった。その結果、ロバスト推定量、Penalized likelihood、ベイズアプローチに基づいて構成されたある種の予測分布等に対する評価規準の構成法を、情報量規準の枠組みの中で提唱することができた。

(2)因子分析における因子負荷量、独自因子の分散の推定量の変動を有効に捉えるために、ブートストラップ法の適用を検討した。その結果、バイアス推定、分散推定、信頼区間の構成に関して、実際上どのような状況で手法が有効に働くかを明らかにし、また適用上注意を要するいくつかの点を指摘することができた。(3)n個の成分から成るシステムにおいて,連続した少なくともk個の成分が故障したとき,システムが機能しなくなるシステムをConsecutive-k-out-of-n:Fシステム(Con/k/n/Fと略す)という.Con/k/n/Fの例,拡張やその例を紹介した.成分間の仮定を分類することで,扱われている問題を整理し,どのようなことが研究されているのかを調べた.平成6年度は、前年度の研究実績をふまえこれに新たな視点からの研究を加えて、以下のような成果を上げた。1.適用範囲の広い柔軟な線形、非線形判別関数の構築とそれを将来の予測に用いた際の誤差を有効に推定するための方法を研究し、計算機の利用を前提とした統計的数値計算法の枠組みの中で、新たな予測誤差推定法と有効なモデル構築法を提案した。さらに、開発した手法を実際問題へ適用し手法の安定性、信頼性等について研究中である。2.高次元データの次元縮小問題に関連して、主成分分析、因子分析における種々の推定量の非正規モデルの基での変動を有効に捉えるために、統計的数値計算法の一つであるブートストラップ法の適用研究を行った。その結果、バイアス、分散推定、信頼区間および信頼領域の構成に対して、その理論構造と共に、どのような状況で手法が有効に働き、適用上どのような点に注意を要するかを明らかにすることが出来た。この研究をさらに発展させ構造分析に於けるブートストラップ法の理論研究を推進中である。3.臨床試験に於ける新処理法の有効性を検定する問題に対して、Mantel-Haenszelタイプの検定統計量を提唱しその良さを確かめた。4.順序制約条件をもつ二項データに対する変化点問題を多重逐次比較法の観点から研究し種々の結果を得た。5.カテゴリカルデータに対する無作用量を決定する問題に対して、情報量基準AICに基づく方法を提供し,従前の方法との比較においてその有効性を実証した。6.動節点をもつスプライン関数によるチェビシェフ近似問題の2次の特殊な構造を解明した。7.片側相条件をもつ変分問題に対して2次の最適性条件を考え、相条件から生成される包絡線についての考察をおこなった。8.位置母数、尺度母数などに対する二標本ノンパラメトリック検定問題を研究し、ある種の順位検定法を提唱しその良さを確かめた。
レトロトランスポゾン転写制御機構の解析

レトロトランスポゾンの転写制御機構を明らかにするため、シロイヌナズナを用いトランスポゾンサイレンシングに異常がみられる変異体を単離解析し、トランスポゾン抑制に関わる新規因子KUMONOSU(KUN)を明らかにした。KUNは植物に特有のトランスポゾン関連ドメインであるPlant mobiledomainを有し、DNAメチル化や主要なクロマチン修飾とは異なる新規の機構でペリセントロメア領域の凝集に関わることでサイレンシングを制御することを明らかにした。トランスポゾン制御機構を明らかにするため、トランスポゾンのサイレンシングが解除された変異体及びストレス感受後のトランスポゾン活性化に対する変異体を単離した。今年度は、トランスポゾン抑制に関わる2つの変異体の解析を進めた。(1)トランスポゾンの転写抑制が解除されるkumonosu(kun)の解析維管束及び茎頂組織特異的なサイレンシングの解除が見られるkun変異体について、ゲノムワイドRNAシーケンスを行い、ターゲット遺伝子及びトランスポゾン等を同定した。一方、ゲノムワイドバイサルファイトシーケンスを行い、DNAメチル化状態についてのデータ解析を進めている。ヒストンメチル化抗体による免疫組織染色及びクロマチンIPにより、kun変異体におけるヒストン修飾についても解析を行っている。(2)トランスポゾン抑制に関わるE5変異体トランスポゾンサイレンシングが解除された変異体E5について、詳細なマッピングと変異の探索を進めた所、既知の遺伝子上に変異が見つかった。該当遺伝子のT-DNA変異体とのアレルテストを行い、変異の原因が確かに今回同定した遺伝子であることを確かめた。平成27年度に計画した内容については、おおむね計画通り進んでいる。トランスポゾンの制御機構を明らかにするため、シロイヌナズナを用い、トランスポゾンのサイレンシングが解除された変異体及び熱ストレス感受後のトランスポゾン活性化に異常が見られる変異体を単離し、解析を進めた。今年度は、主に、トランスポゾンの転写抑制が解除されるkumonosu(kun)変異体の解析を進めた。kun変異体では、前年度までに、ペリセントロメア付近の多くのトランスポゾンだけでなく、特定の遺伝子の発現が変化していること、DNAメチル化レベルが野生型と変わらないことを明らかにしており、それに加え、今年度は、kun変異体において抑制的ヒストン修飾H3K9me2は変化していないが、核内のクロマチンの凝集が変化していることを明らかにした。kun変異体ではヘテロクロマチン領域の凝集が緩んでおり、ペリセントロメアに存在する反復配列の核内での局在パターンが変化していた。既知のサイレンシングに関わる変異体との遺伝学的解析を行ったところ、kunは既知のサイレンシング経路とは別の経路で働いていることが明らかになった。kunの原因遺伝子をゲノムワイドシーケンスにより同定したところ、植物に特有のPlant mobiledomainタンパク質をコードしていた。シロイヌナズナでkunと最も相同性の高い遺伝子の変異体を解析したところ、kun同様にトランスポゾンのサイレンシングが解除されることが明らかになった。トランスポゾンの制御に関わる変異体を複数単離した中で、新規の変異体kunに焦点を絞って解析を進め、概ね計画通りに進行している。レトロトランスポゾンは、生物のゲノム中に多数存在し、その転移は生物の進化において多様性を生み出すと共に生存に必要な遺伝子を破壊する可能性もあるため、通常、転移が抑制されている。転移の第1段階として、レトロトランスポゾンの転写活性化が必要であると考えられるが、その機構については不明な点が多い。本研究では、シロイヌナズナを用いトランスポゾンサイレンシングに異常がみられる変異体を単離解析し、レトロトランスポゾン抑制に関わる新規因子を明らかにした。最終年度では、トランスポゾンの転写抑制が解除されるkumonosu(kun)変異体について、どのような機構でトランスポゾンサイレンシングを制御しているかを詳しく解析し、KUNと既知のサイレンシング制御因子との遺伝学的相互作用や、細胞死の経路との関連性を詳細に解析した。また、KUNは植物に特有のトランスポゾン関連ドメインであるPlant mobiledomainを有するが、このPlant mobiledomainタンパク質の系統樹解析などにより、植物進化の過程におけるPlant mobiledomainとトランスポゾンの挿入の関係について考察した。これまでの結果を論文に発表し、Plant mobiledomainを持つKUN(MAIL1)及びその相同遺伝子MAINがDNAメチル化や主要なクロマチン修飾とは異なる新規の機構でペリセントロメア領域の凝集に関わることでサイレンシングを制御することを報告した。(1)トランスポゾンの転写抑制が解除されるkumonosu(kun)の解析上記の研究実績の概要には局在解析の内容が含まれないが、これについては既にマーカー植物の準備を進めており、今後解析を行う予定である。また、現在進めているバイサルファイト解析のデータ処理及びヒストン修飾の解析についても引き続き進める。(2)トランスポゾン抑制に関わるE5変異体既知の原因遺伝子が同定されたので、解析をストップする予定である。(3)その他の変異体についても解析を順次進める。kunの同定について論文にまとめるとともに、kunがどのような機構でサイレンシングを制御しているかを明らかにするために、kun変異体の抑圧変異体のスクリーニングを行う。

また、RNA-seq, ChIP-seqなどによりkunにおけるトランスポゾン抑制解除の組織特異性を詳細に調べる予定である。植物分子遺伝学共同研究により実施しているRNAシーケンスの消耗品等は次年度に請求される予定であるため。予定していた次世代シーケンス解析の一部について、当該年度中に解析を終了させるのが困難だったため、次年度に行うことを予定している。RNAシーケンス消耗品やシーケンスのデータ処理のソフト等の購入、人件費等に計画的に使用予定である。次世代シーケンス解析に必要な消耗品、シーケンス外注、およびデータ解析外注費用などに使用する予定である。