hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先天性コレステロール代謝異常症の遺伝子解析および高コレステロール療法

1.臨床的にSLO症候群が疑われる患者42名について7-dehydrocholesterol測定を行い,生後4か月女児1例で生化学的にSLO症候群と診断した.2.新たに診断した生後.4か月女児例には,合成コレステロールを用いたコレステロール補充療法を開始し,現在臨床症状を観察しながら経口コレステロール製剤投与による治療効果の有無をみたところ,血清コレステロールのコントロールはある程度可能だったが,現時点では顕著な臨床症状の改善をみるに至っていない.今後さらに継続して経過観察する必要があると思われる.3.SLO症候群の特徴的臨床症状をもち,生化学的に7-DHC高値を示した2例(96-003,97-021)について遺伝子解析を行った.96-003は1249番目のGがAに-塩基置換(CGG->CAG)しており,そのために352番目のArgがGlnに置換していた(R352Q).すなわち,96-003はR352Qのホモ接合体だった.97-021も96-003と同一の1249番目の塩基置換をヘテロにもっていた(R352Q).また,919番目のGがAに置換しており(CGC->CAC),そのために242番目のArgがHisに-アミノ酸置換していた(R242H).すなわち,97-021はR352QとR242Hのコンパウンドヘテロ接合体だった.本研究で解析した日本人SLO症侯群2症例ではこれまで報告のない2種類の新しいミスセンス変異だった.4.3例(19歳男子,5歳男児,4ヵ月女児)について,その臨床的特徴について欧米例との比較検討を行った.3例ともに認めた所見は知的障害,小頭,哺乳障害,顔貌異常,停留睾丸,2-3趾皮膚性合趾症,低コレステロール血症だった.5.臨床的にCDPX2が疑われる患者8名の血清8-dehydocholesterol測定を行い,3名で8-dehydrocholesterol高値を認めCDPX2と診断した.6.これらの患者について,責任遺伝子Emopamil-binding protein(EBP).遺伝子の解析を行い,塩基置換によるノンセンスおよびミスセンス変異が明らかになった.臨床的にSLO症候群が疑われる患者42名について7-dehydrocholesterol測定を行い,生後4か月女児1例で生化学的にSLO症候群と診断した.本例には合成コレステロールを用いたコレステロール補充療法を開始し,現在臨床症状を観察しながら,治療効果の有無を経過観察中である.本例と過去に確定診断した2例については,現在遺伝子解析を行っている.さらに,3例(19歳男子,5歳男児,4カ月女児)について,その臨床的特徴について欧米例との比較検討を行った.3例の臨床所見として,知的障害,小頭,発育障害,哺乳障害,筋緊張低下,自傷行為,睡眠障害,顔貌異常,口蓋裂,筋性斜頚,翼状頚,示指変形,2-3趾皮膚性合趾症,内反尖足,胆汁うっ滞性肝疾患,胃食道逆流現象,肥厚性幽門狭窄症,尿道下裂,停留睾丸,副睾丸炎,半陰陽を認めた.検査所見として脳波異常,低コレステロール血症(48,107,41 mg/dl)を認めた.これらの所見のうち,3例ともに認めた所見は知的障害,小頭,哺乳障害,顔貌異常,停留睾丸,2-3趾皮膚性合趾症,低コレステロール血症だった.臨床的にCDPX2が疑われる患者8名の血清8-dehydrocholesterol測定を行い,3名で8-dehydrocholesterol高値を認めCDPX2と診断した.さらに,これらの患者について,責任遺伝子Emopamil-binding protein(EBP)遺伝子の解析を行い,一塩基置換によるノンセンスおよびミスセンス変異を明らかにした.1.臨床的にSLO症候群が疑われる患者42名について7-dehydrocholesterol測定を行い,生後4か月女児1例で生化学的にSLO症候群と診断した.2.新たに診断した生後.4か月女児例には,合成コレステロールを用いたコレステロール補充療法を開始し,現在臨床症状を観察しながら経口コレステロール製剤投与による治療効果の有無をみたところ,血清コレステロールのコントロールはある程度可能だったが,現時点では顕著な臨床症状の改善をみるに至っていない.今後さらに継続して経過観察する必要があると思われる.3.SLO症候群の特徴的臨床症状をもち,生化学的に7-DHC高値を示した2例(96-003,97-021)について遺伝子解析を行った.96-003は1249番目のGがAに-塩基置換(CGG->CAG)しており,そのために352番目のArgがGlnに置換していた(R352Q).すなわち,96-003はR352Qのホモ接合体だった.97-021も96-003と同一の1249番目の塩基置換をヘテロにもっていた(R352Q).また,919番目のGがAに置換しており(CGC->CAC),そのために242番目のArgがHisに-アミノ酸置換していた(R242H).すなわち,97-021はR352QとR242Hのコンパウンドヘテロ接合体だった.本研究で解析した日本人SLO症侯群2症例ではこれまで報告のない2種類の新しいミスセンス変異だった.4.3例(19歳男子,5歳男児,4ヵ月女児)について,その臨床的特徴について欧米例との比較検討を行った.

3例ともに認めた所見は知的障害,小頭,哺乳障害,顔貌異常,停留睾丸,2-3趾皮膚性合趾症,低コレステロール血症だった.5.臨床的にCDPX2が疑われる患者8名の血清8-dehydocholesterol測定を行い,3名で8-dehydrocholesterol高値を認めCDPX2と診断した.6.これらの患者について,責任遺伝子Emopamil-binding protein(EBP).遺伝子の解析を行い,塩基置換によるノンセンスおよびミスセンス変異が明らかになった.1.新たに診断した生後4か月女児例には,合成コレステロールを用いたコレステロール補充療法を開始し,現在臨床症状を観察しながら経口コレステロール製剤投与による治療効果の有無をみたところ,血清コレステロールのコントロールはある程度可能だったが,現時点では顕著な臨床症状の改善をみるに至っていない.今後さらに継続して経過観察する必要があると思われる.2.SLO症候群の特徴的臨床症状をもち,生化学的に7-DHC高値を示した2例(96-003,97-021)について遺伝子解析を行った.1)96-003は1249番目のGがAに-塩基置換(CGG->CAG)しておりそのために352番目のArgがGlnに置換していた(R352Q).すなわち,96-003はR352Qのホモ接合体だった.2)97-021も96-003と同一の1249番目の-塩基置換をヘテロにもっていた(R352Q).また,919番目のGがAに置換しており(CGC->CAC),そのために242番目のArgがHisに-アミノ酸置換していた(R242H).すなわち,97-021はR352QとR242Hのコンパウンドヘテロ接合体だった.3.本研究で解析した日本人SLO症候群2症例ではこれまで報告のない2種類の新しいミスセンス変異だった.このことから,242番目ならびに352番目の、ArgはDHCR7蛋白の酵素活性に重要な役割を果たしていることが示唆されるとともに,DHCR7遺伝子が日本人SLO症候群においても原因遺伝子であることを確認することができた.
親子相互作用査定尺度ＪＮＣＡＴＳに基づく次世代センシティブ支援ネットワークの構築

本課題は早期の親子の関係性のアセスメント尺度であるJNCATSとその主要概念について,専門領域の枠や専門性の有無を超えて広く普及させ,健全な親子の関係性の育成を社会で広く支える体制の基盤づくりに資することを目的とした。本課題はJNCATSに関する教材開発と教育・啓蒙サービスの提供手段の整備から構成された。後者は子育ての現役世代の前後の世代(親準備世代,子育て終了世代)へのアプローチであった。親準備世代(大学生)を対象に心理教育を実践し,その次世代育成意識と関連要因についても検討した。また,子育て終了世代(地域の中高年者)を対象に心理教育を実践し,その次世代育成意識についての調査・検討も試みた。本課題は,早期の親子の関係性のアセスメント尺度であるJNCATS(Japanese Nursing Child Assessment Teaching Scale)とその主要概念について,専門領域の枠や専門性の有無を超えて広く普及させ,健全な親子の関係性の育成を社会で広く支える体制の基盤づくりに資することを目的とする。本課題は,JNCATSに関する教材開発(研究1)と教育・啓蒙サービスの提供手段の整備(研究2)から成る。後者は,子育ての現役世代に直接働きかけるものではなく,その前後の世代(これから親になる世代,および,子育てが終了した世代等)へ積極的に働きかける試みである。本年度は主に研究2に取り組んだ。その研究成果は以下のとおりである。2親準備世代である大学生を対象に,次世代育成意識,親との関係性,時間的展望等に関する質問紙調査を実施した。3子育てが終了し,地域子育て支援に関与する地域在住の中高年者を対象に,次世代育成に関する意識等に関する面接調査を実施した。本課題は、早期の親子の関係性のアセスメント尺度であるJNCATS(Japanese Nursing Child Assessment Teaching Scale)とその主要概念について、専門領域の枠や専門性の有無を超えて広く普及させ、健全な親子の関係性の育成を社会で広く支える体制の基盤づくりに資することを目的とする。本課題は、JNCATSに関する教材開発(研究1)と、教育・啓蒙サービスの提供手段の整備(研究2)から成る。後者は、子育ての現役世代に直接働きかけるものではなく、その前後の世代(これから親になる世代、および、子育てが終了した世代等)へ積極的に働きかける試みである。本年度の研究成果は以下のとおりである。研究1に関して、JNCATSの主要部分のひとつである乳幼児の身体的サイン(Cue)についての画像教材(予備版)を作成した。原版を参考に、より親和性の高い日本人親子について、38種類の画像を作成した。また、研究2に関連して、親準備世代である大学生を対象に、次世代育成意識と時間的展望等に関する質問紙調査、および、子育て終了世代である地域在住の高齢者を対象に、次世代育成に関する意識等に関する面接調査も実施した。昨年度に引き続き,本年度は研究2を中心に取り組んだ。2親準備世代である大学生を対象に収集した調査データ(属性,次世代育成意識,親との関係性,時間的展望)を整備し,発表した(学会発表,論文発表)。3地域子育て支援に参加する中高年者を対象に実施した面接調査の結果を整備し,論文化した。本課題は早期の親子の関係性のアセスメント尺度であるJNCATS(Japanese Nursing Child Assessment Teaching Scale)とその主要概念について,専門領域の枠や専門性の有無を超えて広く普及させ,健全な親子の関係性の育成を社会で広く支える体制の基盤づくりに資することを目的とした。本課題はJNCATSに関する教材開発(研究1)と,教育・啓蒙サービスの提供手段の整備(研究2)から構成された。後者は子育ての現役世代に直接働きかけるのではなく,その前後の世代(これから親になる世代や子育てが終了した世代等)へ積極的に働きかける試みであった。最終年度は研究2を中心に取り組み,次の4点の研究成果が得られた。1JNCATSの主要概念(Barnard Model,Teaching Loop,BabyCues),及び関連教材(Promoting First Relationships)を活用した次世代育成に関する心理教育(親準備世代である大学生を対象)の継続実施と学会発表,2大学生を対象にした次世代育成意識に関する質問紙調査結果の国際学会発表の準備(年内に発表予定),3地域在住の中高年者を対象とした次世代育成に関する心理教育についての論文発表,4地域子育て支援に参加する中高年者を対象にした面接調査・質問紙調査に関する学会発表。期間全体の研究成果は次の通りであり,当初の目的は概ね達成され,発展的な調査の実現に至った。研究1に関して,JNCATS教材である乳幼児のサイン(Cue)の画像教材(予備版)が作成できた。研究2に関しては,大学生を対象とした次世代育成に関する心理教育の実施と評価,及び次世代育成意識に関する質問紙調査が実現した。更に,中高年者が対象の次世代育成に関する心理教育の実施,及び次世代育成意識に関する面接調査・質問紙調査が実現できた。

本課題は早期の親子の関係性のアセスメント尺度であるJNCATSとその主要概念について,専門領域の枠や専門性の有無を超えて広く普及させ,健全な親子の関係性の育成を社会で広く支える体制の基盤づくりに資することを目的とした。本課題はJNCATSに関する教材開発と教育・啓蒙サービスの提供手段の整備から構成された。後者は子育ての現役世代の前後の世代(親準備世代,子育て終了世代)へのアプローチであった。親準備世代(大学生)を対象に心理教育を実践し,その次世代育成意識と関連要因についても検討した。また,子育て終了世代(地域の中高年者)を対象に心理教育を実践し,その次世代育成意識についての調査・検討も試みた。本課題は,JNCATSに関する教材開発(研究1)と,教育・啓蒙サービスの提供手段の整備(研究2)から構成される。当初の計画に幾らかの軌道修正が生じたが,本年度は昨年度に引き続き,研究2に取り組んだ。まず,親準備世代である大学生を対象とした親準備性促進のための心理教育プログラムの実施と評価に関する論文を発表した。また,昨年度と異なる対象者に実施し,データを追加収集した(整備・分析は来年度取り組む予定である)。更に,教育・啓蒙の対象者である親準備世代や子育て終了世代(地域在住の中高年者)の心理的特性を明らかにするために実施した調査データの整備・分析,及び成果発表に至った。具体的には,親準備世代である大学生を対象とした次世代育成意識とその関連要因(性別,家族要因,時間的展望)に関する質問紙調査(量的研究)についての学会発表や論文発表,ならびに,子育て終了世代(地域在住の中高年者)を対象とした次世代育成意識等に関する面接調査(質的研究)についての論文発表である。この面接調査に関しては,追加実施も実現した(データの整備・分析は来年度の課題とする)。医歯薬学(社会医学)本研究の実施期間(補助事業期間)は平成26年度までであったが,収集したデータの一部の整備・分析が終了しておらず,次年度も引き続き取り組む必要性が生じた(補助事業期間延長の承認済み)。最終年度となる平成27年度の推進方策は以下のとおりである。1親準備性促進のための心理教育プログラムの実施と効果測定:これまでのプログラムについて対象者を変えて実施し(データ収集を継続し),成果発表(学会発表,及び論文発表)を試みる。2親準備世代(大学生)を対象とした次世代育成意識と時間的展望等に関する質問紙調査:これまで収集したデータの分析を更に進め,学会や学術雑誌等で発表する。3子育て終了世代(地域在住の中高年者)を対象とした次世代育成に関する意識等に関する面接調査:これまで収集した面接データの整備・分析を進め,学会や学術雑誌等で発表する。本年度の計画として,次の3点が設定されていた。
社会的規範の生成原理：ヒュームからルイスへ

本年度は、ヒュームの知性論と情念論における鍵概念である<一般規則>と<共感>との関連を、過年度までに得られた研究成果を踏まえて詳しく検討した。まず知性論における懐疑論の帰結からヒュームがどのように「恢復」し、その後に続く学問的探求へと進むのかという問題を受け、その答えが情念論の「名声への愛」についての議論にあることを指摘した。この議論はヒュームが人々の道徳心の発達にとって重要であるとする<一般規則>と<共感>の交錯が見られる箇所でもある。それゆえ「共通する利益の一般的な感覚」であるコンヴェンションの生成原理にとっても本質的な点である。検討の結果、われわれの認識には懐疑論の後にも「知的徳」というかたちで「規範性」を問うことができ、それは共感を介した他者との社会的な交流に起源をもつとヒュームは考えていた、と結論した。またこのヒュームにおける知的徳の問題について、「好奇心」に焦点を絞ってさらに考察をおこなった。好奇心は学問的探求を動機づけるが、それもそのままでは再び懐疑論へと舞い戻ってしまう危険性を孕む。本研究では、好奇心には知的徳という側面だけでなくこうした悪徳の側面があるという点に着目した。この論点の重要性は、現代の徳認識論の観点からも少なからず議論されるところである。そこでこうした現代的議論を援用しつつ、ヒュームの哲学に即して好奇心の二面性を検討した。さらに、他者との社会的交流に根ざすヒュームのこうした「規範性」概念を東西比較思想の観点から検討する研究をおこなった。すなわち仏教倫理との関連からヒュームの道徳的行為者性について考察し、また理性と情念(感情)の相克と懐疑論(強迫性神経症)からの治癒という文脈において、大正期日本の精神科医である森田正馬の思想とヒュームの哲学の間に極めて興味深い類似性があることを指摘した。27年度が最終年度であるため、記入しない。第一年目となる平成25年度は、この分野の古典とされるデイヴィッド・ヒュームのコンヴェンション概念の解明を試みた。具体的には、当初の計画に即し、次のように進められた。(1)これまでおこなってきたヒュームの懐疑論に関する研究をベースとして、とくに主著『人間本性論』の構成で言うところの第一巻(知性論)と第二および三巻(情念論および道徳論)との間にある、ヒュームによる論究の「ギャップ」をどう解釈するかという問題に取り組んだ。具体的には、全面的懐疑論が導出される過程を「一般規則(general rules)」というヒュームの信念論の道具立てを用いて再構成し、知性論末尾で示された帰結を、「信念の形成にあたって、想像力の影響を知性の働きによって規制すべし」という方法論的規準の破綻と特徴づけた。この成果は論文「ヒューム知性論における「一般規則」と二つの「全面的懐疑論」」として、日本イギリス哲学会の『イギリス哲学研究』に査読を経て採録された。(2)全面的懐疑論の帰結をそのようなものとして特徴づけることが出来るならば、知性論と情念論および道徳論との間にはいかなるつながりもないのだろうか。また、情念論や道徳論でヒュームが語ることにいったいどんな意義があるといえるのだろうか。このような問いに答えるため、「徳(virtue)」概念を基軸にして『人間本性論』全体を捉える解釈の可能性を探った。(3)さらにヒュームの抽象観念論における、共同体内の言語実践の役割を検討することで、個人の知的判断と行為が集団におけるコンヴェンションの発生にどう関わっていくかを「抽象観念」「一般規則」「知的・道徳的徳」というヒュームのアイデアを使って分析した。本研究の目的は、社会的・共同体的な慣習ないし規約としてのコンヴェンションの概念を、哲学的な見地から分析することである。二年目となる平成26年度は、第一に、前年度に行なったデイヴィッド・ヒュームの知性論とくに信念論に関する基礎的研究成果を踏まえつつ、さらに情念論と道徳論にも検討の範囲を広げて、ヒュームのコンヴェンション概念のより包括的な研究をおこなった。また第二に、デイヴィッド・ルイスによるコンヴェンション概念の分析を中心に、それ以降現代にいたるまでの、社会的慣習をめぐる哲学的検討の議論状況を整理した。以下にそれぞれの具体的な研究内容について述べる。まずヒュームについては以下の通りである。ヒュームにおいて「(人々の間での)共通する利益の一般的な感覚」と定義されるコンヴェンションは、各人の自己利益にもとづく行動からどのようにして正義の諸規則が立てられるかを説明する際に導入されるものであった。この点に、道徳心の発達に重要なのは一般規則と共感であるという彼の見解を考えあわせれば、コンヴェンションの理解には、少なくとも、(事実についての判断も道徳的な判断も含めた)判断全般にかかわる<一般規則>と、感情のレベルでの他者に対する<共感>、そして(正義という人為的な徳を含む)<徳>についてのヒュームの見解を踏まえる必要がある。本研究ではこれら三つ組の概念を、ヒュームの主著『人間本性論』全三巻(知性論・情念論・道徳論)を統一的に解釈する鍵として捉え、その理論的な相互関係を検討した。第二に、ルイスについては、Lewis(1969)で展開された分析をヒュームによるものと適宜比較しながら検討する作業を行なった。

またルイス以降の展開を確認するため、現代の規範倫理学や社会科学の哲学において「コンヴェンション」といわゆる「規範」との関係がどのように論じられているかを整理し、検討した。本年度は、ヒュームの知性論と情念論における鍵概念である<一般規則>と<共感>との関連を、過年度までに得られた研究成果を踏まえて詳しく検討した。まず知性論における懐疑論の帰結からヒュームがどのように「恢復」し、その後に続く学問的探求へと進むのかという問題を受け、その答えが情念論の「名声への愛」についての議論にあることを指摘した。この議論はヒュームが人々の道徳心の発達にとって重要であるとする<一般規則>と<共感>の交錯が見られる箇所でもある。それゆえ「共通する利益の一般的な感覚」であるコンヴェンションの生成原理にとっても本質的な点である。検討の結果、われわれの認識には懐疑論の後にも「知的徳」というかたちで「規範性」を問うことができ、それは共感を介した他者との社会的な交流に起源をもつとヒュームは考えていた、と結論した。またこのヒュームにおける知的徳の問題について、「好奇心」に焦点を絞ってさらに考察をおこなった。好奇心は学問的探求を動機づけるが、それもそのままでは再び懐疑論へと舞い戻ってしまう危険性を孕む。本研究では、好奇心には知的徳という側面だけでなくこうした悪徳の側面があるという点に着目した。この論点の重要性は、現代の徳認識論の観点からも少なからず議論されるところである。そこでこうした現代的議論を援用しつつ、ヒュームの哲学に即して好奇心の二面性を検討した。さらに、他者との社会的交流に根ざすヒュームのこうした「規範性」概念を東西比較思想の観点から検討する研究をおこなった。すなわち仏教倫理との関連からヒュームの道徳的行為者性について考察し、また理性と情念(感情)の相克と懐疑論(強迫性神経症)からの治癒という文脈において、大正期日本の精神科医である森田正馬の思想とヒュームの哲学の間に極めて興味深い類似性があることを指摘した。当初の予定では、本年度はルイスの議論にほぼ集中して研究を進めることにしており、もし実際にそうしていればルイスのコンヴェンション概念に関しても論文などの具体的な成果にまでつながっていたと思われる。しかしこれを次年度に見送らざるをえなかった理由は、本年度より新たに科学研究費の支援を受けて開始したもうひとつの研究課題「徳認識論と徳倫理学:「徳(virtue)概念のヒューム的再構成」から得られたヒューム哲学に関する多くの知見を本研究にも反映させ、両研究課題の相乗効果を最大にするためであった。実際、そうすることによってヒュームのコンヴェンション概念についても当初の期待を超えて詳細な分析が可能になり、来年度に行なう予定のヒュームとルイスの理論の比較検討についても良い見通しが得られた。それゆえ全体として本研究は順調に進行しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。来年度はまず前半で引き続きルイスのコンヴェンションについて研究を行い、後半では現代の社会科学の哲学におけるコンヴェンション研究の議論状況も踏まえつつ、ヒュームとルイスの理論を比較検討していく。
定序配列ポリペプチド合成を指向する抗体触媒の作製

平成4年度までの研究でアゾベンゼン基を持つペプチドH-azoAla-Gly-Glyあるいはピレニル基を持つペプチドH-pyrAla-Gly-Glyを認識するモノクローナル抗体の作製に成功していた。これらの抗体はアゾベンゼン基やピレニル基を高特異的に認識、結合する。平成5年度はこれらの抗体を用い、いくつかの応用展開を行った。1.抗ピレニル抗体によるピレニルアラニンの光学分割上のテトラペプチドを抗原として作製した抗体はピレニル基だけを認識するのではなく、ピレニル基を側鎖にもつアミノ酸(ピレニルアラニン)のDL識別をも行うことが明らかになった。この結果は、非天然アミノ酸の光学分割が抗体によって可能になる事を示している。2.抗アゾベンゼン抗体によるNAD^+/NADHのメディエーション機能の光制御アゾベンゼン基に対する抗体はトランス体だけを結合し、シス体は排除することが明らかになっていた。そこでアゾベンゼン基を結合したNAD^+/NADHを合成し、その電子メディエーション作用を抗体存在下で測定した。暗下ではNAD^+/NADHに抗体が結合しメディエーション反応が阻害されたが、紫外光照射によりアゾベンゼン基をシスにすると抗体が脱離して阻害は起こらなかった。この原理によりNAD^+/NADHによる電子メディエーションを光制御する道を開くことができた。3.抗アゾベンゼン抗体の基板上の抗原への結合の光制御マイカなどの基板表面にアゾベンゼン基を単分子膜として結合させ、基板表面への抗体の結合を光で制御した。この手法はたんぱく質の基板上への光パターニングにつながるものである。抗原性の高い非天然アミノ酸として、光異性化能をもつフェニルアゾフェニルアラニン(azoAla)、および蛍光性のピレニルアラニン(pyrAla)を合成し、光学分割してL体を得た。これらを含むテトラペプチド、Glu-Xyz-Gly_2(Xyz=azoAla or pyrAla)を合成し、それらをウシ血清アルブミンと結合させた。これを抗原としてマウスに注射し、通常の方法でモノクローナル抗体を作製した。pyrAlaに対する抗体はピレニル基をK=5×10^<-6>(M^<-1>)で特異的に結合することが判った。ピレニル基を蛍光プローブとして、抗体の抗原結合状態について調べた結果、つぎの事が明らかになった。(1)結合部位は水溶液中と比べてはるかに疎水的であること、(2)補えられた抗原にO_2分子は自由に近づけるが、より大きな消光剤(例えばアクリルアミド)は近付き難いこと、(3)抗体はL体のアミノ酸は良く結合するが、D体は結合しないこと、(4)取り込むアミノ酸は各結合部位に1個のみであること。これらの結果は、今回作製した抗体は各種アミノ酸の混合物中からピレニル基をもつL体のアミノ酸のみを取り込む能力をもつことを示している。しかし取り込みは1個のアミノ酸に限られるため、そのままの形ではペプチド結合の生成には使えない。今後、2個以上を同時に取り込む抗体の作製が必要である。一方、種々の抗体混合物から特定の機能を持つものを簡便にスクリーニングする新手法として、LB膜上に抗原を固定化し、その上での抗原ー抗体反応を追跡することを試みた。その結果、LB膜上でも特異的な抗原ー抗体反応が起ることを確認した。すでに昨年度までの研究でアゾベンゼン基を持つペプチドH-azoAla-Gly-Glyあるいはピレニル基を持つペプチドH-pyrAla-Gly-Glyを認識するモノクローナル抗体の作製に成功していた。本年度はこれらの抗体を用い、いくつかの応用展開を行った。

1.抗ピレニル抗体によるピレニルアラニンの光学分割上のテトラペプチドを抗原として作製した抗体はピレニル基だけを認識するのではなく、ピレニル基を側鎖にもつアミノ酸(ピレニルアラニン)のDL識別をも行うことが明らかになった。この結果は、非天然アミノ酸の光学分割が抗体によって可能になる事を示している。2.抗アゾベンゼン抗体によるNAD^+/NADHのメディエーション機能の光制御アゾベンゼン基に対する抗体はトランス体だけを結合し、シス体は排除することが明らかになっていた。そこでアゾベンゼン基を結合したNAD^+/NADHを合成し、その電子メディエーション作用を抗体存在下で測定した。暗下ではNAD^+/NADHに抗体が結合しメディエーション反応が阻害されたが、紫外光照射によりアゾベンゼン基をシスにすると抗体が脱離して阻害は起こらなかった。この原理によりNAD^+/NADHによる電子メディエーションを光制御する道を開くことができた。3.抗アゾベンゼン抗体の基板上の抗原への結合の光制御マイカなどの基板表面にアゾベンゼン基を単分子膜として結合させ、基板表面への抗体の結合を光で制御した。この手法はたんぱく質の基板上への光パターニングにつながるものである。
熱CVDによる多孔質体上への超薄型酸素イオン伝導膜の作製

本研究で得られた主要な成果、未解決の問題点および今後の研究方針を列挙する。1.有機金属錯体を原料とする減圧MOCVD法によるジルコニア、イットリアの単成分の熱CVD、両者の固溶体であるイットリア安定化ジルコニアの詳細モデル化を、実験とセミミクロ・マクロシミュレーションにより検討し速度パラメーターを決定した。2.3次元の簡易モンテカルロ法のプログラムを開発した。ホール形状を微小なキューブで表わすことで3次元任意形状のホールを製作できその上への成膜形状をシミュレーションできるようになった。本コードで多孔質基板上のジルコニア、イットリアの成膜形状をシミュレーションできる。3.他の酸化物系(Li20,Nb203,Zn0)のステップカバレッジを上述のプログラムで解析し、反応性付着確率が得られた。一般にこれらの酸化物系の付着確率は高温で大きく温度が下がるのと共に小さくなることを明らかにした。4.以上の結果をもとに数知シミュレーションの結果、最も薄い膜で完全閉塞を得る方法として次のような操作法を提案した。・高温成膜過程(付着確率が大きい)でホール開孔径を小さくし、そこで反応温度を下げ、低温成膜過程(付着確率が小さい)にして閉塞させる本操作方法で薄い膜でホール内部での成膜量が少なくかつ、完全閉塞が達成されることが実験的にも確かめられた。5.4.で示された操作法による最適条件については現在まだ探索中である。今後、現在製作中である気密試験装置により上述の閉塞プロセスを使用して製作した膜の気密試験を行い、また実際に製作したイットリア安定化ジルコニア(YSZ)膜のイオン伝導率試験を行う予定である。成膜実験を行うための水平型ホットウォール型CVD装置を製作した。原料としてbeta-ジケトン錯体の一種であるジピバロイルメタナト金属錯体(Zr(DPM)_4、Y(DPM)_3)を用いて成膜実験を行った。基板上に合成した膜の断面を得るために、本件研究費で購入したドクターカッターを使用した。実験より以下の結果が得られた。2次元トレンチと微細孔(ポア)の上への成膜状況を比較したところ、【.encircled1.】トレンチの方がポアより内部まで成膜し易い。【.encircled2.】完全に閉塞するには、ポアの方がトレンチより厚い膜厚を必要とする。【.encircled3.】高温で成膜させた場合、トレンチやポアの内部壁面上への成膜量は少なく。しかし開口部での閉塞は困難である。3次元モンテカルロシミュレーションコードを開発し、任意形状のポアやトレンチの上の成膜のシミュレーションが可能となった。本シミュレーションの結果から、上記の実験事実は以下のように説明できた。【.encircled1.】ポアよりトレンチの方が内部表面積に比較する開孔面積が広いために成膜前駆体がより侵入しやす。【.encircled2.】ポアは、トレンチと違い浅い角度で入射してくる分子が少なくなるために、上方には成長するけれども閉塞する方向には成長し難い。【.encircled3.】高温の場合、表面反応速度が速いために基板表面で成膜しトレンチやポアの内部に侵入し難い、また開口部分で半径方向の成長が困難である。現在、多孔質基板上の成膜実験を計画中であり、成膜実験並びに気密試験を行う予定である。また、燃料電池用固体電解質に必要な極少内部成膜・極薄・完全閉塞のためには、成膜途中で反応温度を変更する方法が有効であることが、本年度の実験やシミュレーションからも、確認されたので、本方法を適用した成膜実験を行う。本年度行った事柄とその結果は下記の通りである。1.3次元成膜プログラムの改良:昨年度製作した簡易モンテカルロ法のプログラムを改良した。

ホール形状を微小なキューブで表わすことで3次元任意形状のホールを製作できその上への成膜形状をシミュレーションできるようになった。本コードで多孔質基板上のジルコニア、イットリアの成膜形成をシミュレーションできる。2.流れのある場合のシミュレーション法の開発:ホールの上下に圧力差をつけることで完全閉塞膜を作る実験方法が報告さえている(九大・諸岡教授ら、大阪市立大・矢野教授ら等)。そこで前駆体分子を多数飛ばすことで非等圧系のシミュレーションできるフルスペックのモンテカルロ法のプログラムを開発した。本コードを使用することで圧力差がある場合、ホール内部の前駆体分子の濃度が増え閉塞し易くなるという結果がえられ、上述の実験結果が裏付けられた。3.他の酸化物系への応用:他の酸化物系(Li20,Nb203,ZnO)のステップカバレッジを上述のプログラムで解析し、付着確率が得られた。一般にこれらの酸化物系の付着確率は高温で大きく温度と共に減少することを明らかにした。4.最も薄い膜で完全閉塞を得る方法の開発の:昨年度及び今年度の結果より本研究の目的である燃料電池電解質に適した基板の細孔を完全に閉塞する極薄膜の作成のためのCVD操作法として、・高温成膜過程(付着確率が大きい)でホール開孔径を小さくし、そこで反応温度を下げ、定温成膜過程(付着確率が小さい)にして閉塞させる方法が適当であることを明らかにした。この方法で最も薄い膜で細孔の完全閉塞が可能である。今後は、現在作製中である機密試験装置により上述の閉塞プロセスを使用して製作した膜の機密試験を行い、また実際に製作したイットリア安定化ジルコニア(YSZ)膜のイオン伝導率試験を行う予定である。
弾性ネットを用いた調節可能な低侵襲静的心筋形成術の開発

1)生体適合性のあるネットの作成ネットの素材をポリウレタンとした。これは、a)生体親和性に富み、b)繊維そのものにも弾性があるからであり、またそのネットの当て方を繊維の方向に対してc)斜めにすることで繊維そのものとは異なった弾性を出すことができることに着目した。すなわち、低い張力では力の方向と繊維走行の方向が異なるため、非常に柔軟な伸縮性に富むストレス-ストレイン(SS)関係を示す。張力が次第に高くなり、張力の方向と繊維の走行方向が近づいてくると繊維そのものの比較的伸縮性に乏しい急峻なSS関係となる。この結果ネットとして二相性の弾性を示すこととなる。これは心室壁の心筋繊維の走行にも当てはまり、心室壁も短軸方向の張力に対して同様に二相性のSS関係をもつ。以上より、この人工ネットによる静的心筋形成術は骨格筋を用いた動的心筋形成術に近似すると考え、実験的に検討した。2)小動物での検討このようにしてポリウレタンからなる弾性ネットを試作し、調節可能な静的心筋形成術の効果を小動物(ラット)で実験した結果、心筋梗塞急性期(40分)にも慢性期(4週-6週)にも拘束性障害を顕著に招来せずに心室の拡大を抑制する効果を実証した。3)生体適合性のあるネットの作成と特許出願以上の結果を踏まえて、東洋紡績株式会社と共同で、ポリウレタン製の心不全治療用ネットの特許を出願した(2004年5月21日)。さらに、大動物に鏡視下で装着できるネットの作成を行っており、近々前臨床試験としての研究に着手する予定である。目的本年度は、生体親和性高分子化合物からなる規則正しい網目をもつ弾性ネットを試作し、その網目の間隔・形状から発生している張力を推測できるようにする。この弾性ネットを試作し、これを用いて着脱・調節可能な静的心筋形成術の効果を小動物で実験してきた。現在までの成果と状況岸田(分担研究者)および山岡哲二(京都工芸繊維大学:研究協力者)と協議のうえ、ポリウレタンのメッシュからなる弾性ネットを作成し、これを用いてラット心筋梗塞モデルでの急性実験を行った。超急性期の外からの緊迫(=静的心筋形成術)による拘束性障害が懸念されたが、緊迫の程度を緩めたため心機能抑制効果(=静的心筋形成術の副作用)は観察できない程度であり、許容範囲内にあった。さらに、心筋梗塞を起こした後に心臓の短軸を包んで拡大を抑制する慢性実験として、同等の心筋梗塞を起こした直後のラットを2群に分け、心臓の短軸を腹巻のように包んだ群(実験群)を6週間後に再開胸して心機能とサイズを無処置の対照群と比較した。心筋梗塞後の慢性期の効果は、左室の拡張末期容積、収縮末期容積とも有意に拡大程度が抑制され、一回拍出量はほぼ同等にに保たれた結果、心機能の指標は全て有意に良好であった。心室の拡張機能が制限される結果の拘束性心機能障害を回避できる可能性と、長期的には心不全から来るリモデリングを抑制して心不全の悪化を抑制することが示唆された。この結果を元に、来年度は大動物(犬)を用いた慢性心不全モデルにおいて、同様の弾性ネットを用いた本実験を計画している。
多数配置された円形噴流の混合・拡散・伝熱制御

多数の円形噴流を配置した多数噴流では個々の噴流間に強い干渉が生じるため、自由噴流の場合には巻き込み(エントレインメント)の減少に伴う混合・拡散性能の低下、衝突噴流の場合には多数化に起因する横断流れや噴流間に生じる大規模な循環流れによる伝熱性能の低下、衝突面上の非一様な伝熱特性などが生じ混合・拡散・伝熱特性の改善が求められている。これらの問題を抜本的に解決するため、単独噴流の場合に有効性が確認された能動制御手法を多数配置された個々の噴流に適用し、さらに多数化した噴流全体を制御するための方法を開発する。また、開発した制御方法の適用範囲を広げるため、混相噴流の制御についても検討を行う。
過活動膀胱におけるKit受容体を標的とした新規分子標的治療薬の開発

消化管平滑筋の自動運動の発生には、カハール間質細胞が重要な役割を担っている。我々は同じ平滑筋細胞からなる膀胱にもこの細胞に似た間質細胞が存在し、膀胱の自動運動に係わっていると考えた。カハールの間質細胞の特徴は、c-kit遺伝子によりコードされるレセプター型チロシンキナーゼ活性をもつことである。膀胱においてもKit陽性の細胞が存在し、その役割について、免疫染色、電気生理学的手法を用いて検討した。次いで、Kit陽性間質細胞を活性化するとして、Kitのリガンドである幹細胞因子(SCF)に着目し、SCFが尿路上皮から分泌されること、過活動膀胱患者の尿中でSCF濃度が高いことを見出した。モルモットの膀胱において、KitおよびKitを活性化するリガンドであるSCFの局在と量的変化につき検討したところ、Kit陽性間質細胞は、膀胱粘膜下層を中心に膀胱全層に発現していた。またSCFは尿路上皮を中心に発現していた。2.過活動膀胱モデル動物に対するKit抑制因子(メシル酸イマチニブ)およびSCFの作用機序KITに対する抑制因子であるメシル酸イマチニブ(グリベック)およびKITのリガンドであるSCFの作用を検討した。メシル酸イマチニブは、Kitを抑制することにより元来慢性骨髄性白血病に対する治療薬として開発されたが、カハールの間質細胞由来の消化管間葉系腫瘍に対しても効果が確認されている。私たちはこの点に注目し、モルモットを用いた下部尿路閉塞モデル(過活動膀胱モデル)にグリベックを投与したところ、排尿圧を変化させることなく、non-voiding contractionを抑制し、排尿間隔を延長させることが判った。この結果からKitが間質細胞を介して過活動膀胱の発症機序に関与している可能性が示唆された。また、Kit陽性間質細胞を活性化する物質として、Kitのリガンドである幹細胞因子(Stem Cell Factor:SCF)に着目し、SCFをモルモットに投与したところ、濃度依存的に排尿間隔を短縮させた。1.モルモットおよびヒト膀胱におけるKit陽性細胞、Stem Cell Factor(SCF)陽性細胞の検討:間質細胞は、c-kit遺伝子によりコードされるレセプター型チロシンキナーゼであるKitを発現しているが、Kitを活性化するリガンドとして幹細胞因子(Stem Cell Factor, SCF)が知られている。KitおよびSCF陽性細胞の局在部位を免疫組織化学染色を用いて検討したところ、SCFは膀胱粘膜上皮に、Kitは粘膜下に存在する間質細胞や筋層間に存在する間質細胞に局在していた。2.過活動膀胱モデル動物に対するKit抑制因子(メシル酸イマチニブ)およびSCFの作用機序:Kitに対する抑制因子であるメシル酸イマチニブおよびKitのリガンドであるSCFの作用を検討したところ、過活動膀胱モデル動物に生じていた頻尿はKit抑制因子の投与により改善し、排尿間隔の延長がみられた。また正常モルモットにSCFを投与することにより頻尿が誘発された。3.ヒト過活動膀胱におけるKit遺伝子多型解析:過活動膀胱を有する患者および排尿に障害のない正常人を対象として、末梢血リンパ球よりDNAを採取する。ゲノムDNAを用いてreal time PCRシステムにより、遺伝子多型(SNP)タイピングとmutation解析を行い、過活動膀胱の発症率とc-kit遺伝子多型の関係を調べ、過活動膀胱の責任遺伝子の可能性を検討した。健常者のvariationが多い二つのSNPに着目して検討したところrs1947763のAからGへの変異を有する患者において過活動膀胱の発症率が高い傾向がみられた。4.尿中SCFを用いた過活動膀胱診断・治療効果判定マーカーの確立:過活動膀胱患者および正常人の尿を採取し、尿中クレアチニン濃度の他、尿中SCF濃度をELISA法により測定し、新しい診断マーカーとしての可能性を検討したところ、過活動膀胱患者において尿中SCF濃度の上昇が優位であった。排尿障害計画した研究に関しては、ほぼ予定通り結果を確認できているため。臨床応用にむけ、さらに対象患者からの尿を分析する必要があるが、その際に患者背景も詳細に確認する予定である。患者の尿を用い、尿中SCFをELISA法により測定することにより、過活動膀胱の症状とSCF値の関連を検討する。このため、試薬の購入・検体の測定・解析などに諸費用が必要となる。また、場合によっては実験動物を用いた追加研究も考慮しているため、動物の飼育費・購入費用なども必要となる。尿中SCFを用いた過活動膀胱診断・治療効果判定マーカーの確立過活動膀胱患者および正常人の尿中SCFをELISA法により測定し、新しい診断マーカーとしての可能性を検討する。また過活動膀胱患者の尿中SCF濃度を過活動膀胱治療薬の投薬前後で比較し、治療効果判定の指標としての有用性についても検討する。
動物細胞培養系のオンラインモニタリングシステム構築のための基礎研究

本研究では、動物細胞培養系の培養液中のグルコースやグルタミンなどの基質、乳酸、アンモニアなどの代謝産物、抗体やサイトカインなどの生産目的蛋白質など、各種成分濃度をFT-IRを用いて総合的にオンラインモニタリングする技術を開発することを目的とした。グルコース、グルタミン、乳酸のような低分子の基質、代謝産物については、培養濾液を逆浸透膜で数10倍に濃縮するという前処理を行った後にFT-IRで濃度を測定した。また、抗体やサイトカインの濃度を培地中の血清アルブミンなどと区別して測定するために、免疫診断などに用いられているELISA法を応用して、反応生成物濃度から目的蛋白質の濃度を間接的にFT-IRで測定する方式を試みた。ポリアミド/ポリビニールアルコール系の逆浸透膜を用いた場合には、操作圧2MPaの条件でグルタミン溶液およびグルコース溶液を約50倍に濃縮することが可能であった。しかし、乳酸の濃縮には逆浸透膜法は適さないことが明らかとなった。ELISA法に用いる標識酵素、基質を種々に検討した結果、酵素としてアルカリホスファターゼ、基質としてフェノールリン酸を用い、生成物であるフェノールをFT-IRで測定する系が感度の点で優れていることが明らかとなった。また、FT-IR測定に適した高感度のELISA法を確立するために、酵素標識抗体として一本鎖抗体とアルカリホスファターゼのサブユニットを遺伝子レベルで1対1となるように融合させた組み換えキメラタンパク質を大腸菌で発現させるシステムの構築を行った。このキメラタンパク質は抗原認識能、酵素活性ともに元の能力を保持し、また、検量線の再現性も極めて高く、ELISA用の酵素標識抗体として十分な性能を持つことを確認した。比較的低分子のペプチドのような単価抗原にもサンドイッチELISA法が利用できるように、抗体のH鎖とL鎖の可変領域によって抗原を挟み込んで抗原濃度を測定するという新規なELISA法、すなわちオープンサンドイッチELISA法を開発した。本研究では、動物細胞培養系の培養液中のグルコースやグルタミンなどの基質、乳酸、アンモニアなどの代謝産物、抗体やサイトカインなどの生産目的蛋白質など、各種成分濃度を赤外吸収スペクトルを用いて総合的にオンラインモニタリングする技術を開発することを目的としている。本年度は、動物細胞培養用培地成分および生産物のATR-FT-IRスペクトルデータベースの構築と検出感度の検討、ならびにこの結果に基づくサンプルの前処理方法、測定方法の検討、サンプルの濃縮や各成分の液クロによる分画条件などの検討を行なった。目的成分の濃度をATR-FT-IRスペクトルから求める際、水の吸収(15001800,20002300,27003700cm^<-1>)やZnSe結晶の吸収(1000cm^<-1>以下)に妨害されない波数領域に存在し、かつできるだけ高い吸収強度を示すIR吸収に着目する必要がある。このようなIR吸収波数として、グルコースは1020cm^<-1>、グルタミンは1330cm^<-1>、乳酸は1220cm^<-1>の吸収バンドが適していることが明かとなった。また、蛋白質濃度の評価には水のHOH変角振動吸収(1640cm^<-1>)端近傍に吸収を持つ蛋白質のアミドII(15201590cm^<-1>)が適していることが明かとなった。さらに、本年度購入したFT-IR分光光度計によるATR-FT-IRスペクトル測定では、各成分濃度の検出限界がグルコース、グルタミン、乳酸などでは約1g/l、蛋白質では5g/l程度であった。

したがって、各成分の実用的な濃度レベルを測定するためには、グルコース、グルタミン、乳酸では10100倍、また、蛋白質では約1000倍に濃縮する必要があること明かとなった。また、動物細胞培養用の培地に含まれているアルブミンなどの蛋白質成分と、抗体などの目的生産蛋白質とを区別して測定することはかなり困難であり、目的蛋白質を選択的に測定するための手法の開発が必要であった。このような手法として、免疫診断などに用いられている抗原抗体反応を用いるELISA法を応用して、目的蛋白質の濃度を間接的にATR-FT-IRスペクトルから測定する方法を検討しその実用性を確認した。本研究では、動物細胞培養系の培養液中のグルコースやグルタミンなどの基質、乳酸などの代謝産物、抗体やサイトカインなどの生産目的蛋白質など、各種成分濃度を赤外吸収スペクトルを用いて総合的にオンラインモニタリングする技術を開発することを目的としている。本年度は、第一に、動物培養系におけるグルコース、グルタミン、乳酸の実用的濃度範囲をATR-FT-IRスペクトルから求めるためには、サンプル液を10100倍に濃縮する必要があるという前年度の検討結果を踏まえ、逆浸透膜を利用したサンプル濃縮装置を試作し、その性能評価を言った。ポリアミド/ポリビニールアルコール系の逆浸透膜を用いた場合には、装操作圧2MPaの条件で2g/lのグルタミン溶液およびグルコース溶液を阻止率がそれぞれ99%、95%で約50倍に濃縮することが可能であった。また、2g/lの乳酸溶液を同様な条件で濃縮したが、阻止率は約60%と低く、逆浸透膜法は乳酸の濃縮に適さないことが明らかとなった。さらに、アルブミン1g/l、グロブリン1g/lおよび上記の各成分2g/lを溶解した模擬動物細胞培養液を同様に濃縮した場合には、阻止率は各成分単独の溶液の場合と比較して向上したが、濃縮倍率は約20倍が限界であった。酢酸セルロース系の逆浸透膜を用いた場合には、ポリアミド/ポリビニールアルコール系を用いた場合し比較して、全般的に阻止率が低かった。第2に、抗体一抗原反応を利用したELISA法により生成した反応物質の量をFT-IRで測定することにより、間接的に抗体濃度を測定できるという前年度の成果を踏まえ、基板上への抗原の安定な固定化方法について検討を行った。すなわち、抗原の基板上への固定化方法として、親水性部位にDNP抗原を導入した脂質の単分子膜をLB膜技術で疎水性処理したガラス基板に形成する方法と、分子の両端にチオール基とDNP基を持つ分子を金蒸着したガラス表面に化学的吸着法により自己組織的に固定化する方法について検討した。その結果、金とチオール基の化学的吸着法による固定化が安定性、均一性の点で優れていることを明らかにした。さらに、ELISA法に用いる標識酵素、基質を種々に検討した結果、グルコースオキシダーゼ、グルコースの組み合わせが、FT-IR測定に適していることがわかった。
受容体蛋白質との結合と、外部環境変化の同時検出能を有する蛍光プローブの開発と応用

測定対象と選択的に結合し、その蛍光が変化する蛍光プローブは、細胞生物学等の基礎研究のみならず、診療等の医学分野においても有用である。本研究ではこうしたプローブ開発を行い、プロゲステロン受容体等の受容体蛋白質、溶媒極性、溶媒の粘性等の外部環境変化を検出するプローブなど、複数のプローブの開発に成功した。これらの改良をさらに進めることにより、ガンなどの特定の疾患組織の検出が可能になると考えている。生体内の特定の細胞、分子、機能の時空間的な変化を可視化し、画像化する実験手法は1分子イメージング」と呼ばれ、ライフサイエンスの基礎研究のみならず、病態、病因の解明等の医学研究、薬の候補物質の体内動態の解析を通じた創薬研究に大きく貢献している。測定対象と選択的に結合または反応することにより蛍光特性が変化する蛍光プローブは分子イメージングに用いられる有用な化合物である。本研究は、こうした蛍光プローブを開発するにあたり、その蛍光特性を変化する原理として利用できる蛍光物質の会合現象の制御と、受容体蛋白質を測定対象とした際に必須なリガンド分子の開発を基にした研究である。平成22年度では、蛍光物質の一つであるBodipyの種々の誘導体に対して、水溶液中で疎水性相互作用によって会合し、その蛍光を消光する分子団の探索と、蛍光プローブ開発への応用を行った。Bodipyの誘導体と、ベンゼン、ナフタレンの誘導体を柔軟なリンカーを介して結合させた化合物を種々合成し、その蛍光特性の検討を行った。その結果、ジメチルアミノベンゼン、ナフタレンが、会合の有無により、特定のBodipy誘導体の蛍光を大きく褒化させる分子団であることを見出した。こうした知見を受容体蛋白質の局在の検出するための蛍光プローブへと応用するため、リガンド分子としてビオチンを結合させ、蛍光性リガンド分子とした化合物を合成した。合成した本化合物は、受容体蛋白質であるアビジンと結合した際の蛍光強度の増大を示し、受容体蛋白質の局在の高感度な検出が可能な蛍光プローブとなりえることを示した。また、同様の性質を示す蛍光性リガンド分子を、蛍光物質クマリンを母核としたライブラリーから開発する研究も行った。その結果、核内受容体の一つであるプロゲステロン受容体と結合することにより蛍光強度が増大する分子をライブラリーから見出すことに成功した。生体内の特定の細胞、分子、機能の時空間的な変化を可視化し、画像化する実験手法は「分子イメージング」と呼ばれ、ライフサイエンスの基礎研究のみならず、病態、病因の解明等の医学研究、薬の候補物質の体内動態の解析を通じた創薬研究に大きく貢献している。平成23年度は蛍光物質の会合現象の一つである、蛍光物質パイレン二分子が近接した際に引き起こされるエキサイマー蛍光を制御することによる蛍光プローブの開発を行った。具体的には、溶媒の極性により構造が変化する芳香族ヒドロキサム酸にパイレン二分子を導入することにより、その構造変化をエキサイマー蛍光の有無により可視化する分子の開発に成功した。本分子は、溶媒の極性に応じて蛍光が変化する蛍光プローブとして利用が可能である。さらに、前年度報告した蛍光物質クマリンを母核としたプロゲステロン受容体に対する蛍光性リガンド分子に、pH変化や特定のイオン濃度の増大に応じて蛍光特性が変化する機能を付与するため、クマリンを母核とする種々の蛍光プロープの開発を行った。その結果、プロトン、ナトリウムイオンにより蛍光強度、蛍光波長が変化するプローブが得ることに成功した。こうした知見を、先に報告した蛍光性リガンド分子の構造と組み合わせることにより、本研究の目的である「受容体蛋白質との結合前後で蛍光特性が変化する機能」と「外部環境変化で蛍光特性が変化する機能」を併せ持つ蛍光プローブの開発は可能になると考えている。
ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解反応の全貌を明らかにする

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は生体内で不要になったヘムを3段階の酸化反応で分解する酵素であり、その特異な反応のメカニズムに興味が持たれている。平成15年度は、HO反応の第1段階(αメソ位の水酸化)の詳細な機構を明らかにするとともに、第3段階(ベルドヘム開環)についても、その概要を初めて実験的に解明した。第1段階の活性種はヒドロパーオキシ種(Fe-OOH)と考えられているが、メソ位水酸化におけるFe-OOHの活性化機構は不明であった。低温還元法によりHO複合体中においてFe-OOHを調製し、メソ位水酸化の素過程を検討したところ、顕著な溶媒同位体効果が見られた。また、メソ位水素にも有意な2次同位体効果が見られた。これらの結果から、Fe-OOHはプロトン化により活性化され、メソ位水素の脱離と協奏的に水酸化を行うことが明らかになった。さらに、変異型HOの反応解析および結晶構造解析などから、活性化に必要なプロトンはFe-OOH近傍の水分子によっで供給され、活性部位のアスパラギン酸がこの水分子の固定に重要であることが示された。HO反応の第3段階については直接観測が困難であり、反応の概要すら明らかでなかった。そこで、化学合成したベルドヘム(酸素に不安定)を用い、HOとの再構成や全ての反応を嫌気グローブボックス中で行うことにより、詳細な検討に耐えうる反応系の確立に成功した。現在までに、酸素濃度依存性などの基礎的なデータの蓄積を終えている。特に、変異型HOを用いた研究から、第一段階と同様に活性部位のアスパラギン酸がベルドヘムによる酸素活性化に深く関与していることを明らかにした。これらの結果は、ベルドヘム代謝機構の解明の糸口になると期待され、HO反応の全貌を近い将来に明らかに出来ると期待される。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は生体内で不要になったヘムの分解を行う酵素であり、その特異な反応のメカニズムに興味が持たれている。平成14年度は、HO反応の第1段階(αメソ位の水酸化)の機構について集中的に研究を行った。メソ位水酸化の活性種はヒドロパーオキシ種(Fe-OOH)と考えられているが、compound I (オキソ鉄四価ポルフィリンラジカル)が活性種となる可能性も否定しきれていない。そこで、HOによるヘム、分解反応へのcompound Iの関与を検討した。鉄三価ヘム-HO複合体とm-クロロ過安息香酸との反応を行ったところ、HOのcompound Iを観測することに初めて成功し、compound Iからはメソ位の水酸化が起きないことを直接確認した。この結果、compound Iがヘム分解の活性種となる可能性は「完全に」否定され、メソ位の水酸化はFe-OOHのO-O結合開裂と協奏的に進行すると結論づけられた。次に、メソ位の協奏的水酸化機構を解明するために、ヘム2,4位の側鎖をビニル基からエチル、アセチル基に置換したヘムを合成し、HOによるメソ位水酸化反応への置換基効果を検討した。過酸化水素によるヘム分解反応を詳細に検討した結果、メソ位水酸化は電子吸引性置換基により促進されることが示唆された。この結果は、Fe-OOHがメソ位炭素を求核的に攻撃することを示しており、従来提案されていた求電子反応とは逆の機構である。今後、低温下でFe-OOHを調製して水酸化速度を直接測定しFe-OOHの反応様式を決定する実験を行う予定である。