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社会的構築物としての人種概念に関する理論的考察

最近の自然人類学においては、人類集団の変異は連続的であり、遺伝子構成が互いに不連続な「人種」に相当する分集団は存在しないことが明らかにされている。また系統樹も恣意的と批判する声もある。そもそも既存の人種概念の根幹は、18世紀半ば近代科学の父祖により確立されたもので、それは西欧における「存在の大いなる連鎖」や旧約聖書の曲解、色のイデオロギーなどに立脚した、西欧中心的な価値観に拘束されたものであった。しかしそれが明らかな序列階層的イデオロギーを持つのは、19世紀後半の植民地主義とその脇役としての擬似科学によるところが大きい。19世紀の人類学は、人種主義的な思想を煽る人種概念と共犯関係であったといえる。20世紀に入り、特にアメリカでは、それまでの人種概念を覆そうとする努力が一部見られたが、1990年代はこの問題に関する転機でもあった。アメリカ人類学会を中心として積極的に、社会的構築物、一つの世界観としての人種という理解を世にアピールする動きが活発化し、数々の公式声明も発表している。他方、1980年代後半からカルチュラル・スタディズにおける人種にまつわる研究も増え、近代、国民国家、植民地主義との関連で人種を捉え直す傾向にある。過去の負の遺産を是正していくためには、人種概念が不可欠であり、かといって現実の社会現象は、人種主義が改善の見通しのない状況であり、過去と現在・未来をどのようにつなぐかという深いジレンマが存在する。本研究の研究成果は、出版物のみならず、委員を務めた学術会議小委員会「人種・民族概念を検討する委員会」の報告書にも反映させた。また2002年の国際人類学民族学会議でのシンポジウムでも発表する予定である。
前頭前野の近赤外分光法の測定に基づくLD児の書字の学習支援システムに関する研究

学習障害(LD)児の特性としてワーキングメモリにおける障害が指摘されている。書字は読みの記憶、文字の形の認知など複数のメモリ機能に関連する。これより書字困難の原因としてメモリ不全が推測できる。我々は近赤外線分光測定法(NIRS)によりワーキングメモリ・前頭前野の機能測定を可能にした。本研究では、(1)書字困難を示すLD児のワーキングメモリ特性を、NIRS法によって評価するため、健常児の基準値を測定し基準値に基づく比較を可能にする。(2)書字困難を示すLD児のワーキングメモリの特性を、NIRS法により明らかにする。(3)LD児のワーキングメモリの特性に応じた援助を実施し、その改善経過をNIRS法により評価する。(4)それに基づき、最適な書字学習の支援システムについて提案する。平成17年度は、NIRS法により評価可能な課題として、音声数唱課題、数字記憶課題、視覚運動記憶課題を開発し、数唱課題に関して健常小児のデータを測定し、発達基準値を収集した。また、書字障害を伴うLD児40名について視覚運動記憶課題を実施し、書字障害と視覚運動記憶の特性との関連について検討した。平成18年度には、開発したワーキングメモリ課題について、その援助課題を開発し、援助課題遂行時の前頭前野の賦活特性について検討した。対象としたLD児は8名であった。援肋課題としては、色呈示条件、意味呈示条件、音声呈示条件とした。援助条件の効果について、対象児のワーキングメモリの特性との関連で評価することができた。これによって、ワーキングメモリを促進する上で有効な刺激条件について考察することができた。平成19年度には、色呈示条件、意味呈示条件を考慮した、漢字書字支援教材を開発した。この教材は、ワーキングメモリの特性に合わせて援助刺激を提示可能にし、その効果を確認することができた。LD児では,ワーキングメモリの困難が指摘されてきた。本年度は,近赤外線分光法(NIRS法)で用いるワーキングメモリの評価課題を開発した。ワーキングメモリ課題としては、言語メモリ課題をとりあげ、順唱課題を用いた。成人では、3桁、5桁、7桁の条件とした。小児では、3桁条件とした。成人では、3桁条件において、左と右の上・中前頭回ではdeoxyHb濃度変化が増加せず、下前頭回でdeoxyHb濃度変化の増加が生じた。5桁条件と7桁条件でも、上・中前頭回ではdeoxyHb濃度変化が増加せず、左と右の下前頭回でdeoxyHb濃度変化の増加が生じた。特に7桁条件では、右でdeoxyHb濃度変化の増加部位が、左と比べて中前頭回を含む広い範囲になった。これより成人においては、音声数詞の保持において、左右の下前頭回は明瞭な賦活を示し、負荷の増加に伴って、右の中前頭回を含む活動になったことが指摘できる。小児において、3桁条件の左と右の上・中前頭回ではdeoxyHb濃度変化が増加せず、下前頭回でdeoxyHb濃度変化の増加が生じる傾向をしめしたのは、小学5年生と6年生であった。小学4年生以下では、左右前頭前野でdeoxyHb濃度変化が減少または増加する傾向にあり、部位に限局した特徴は認められず、これは小学5年生と6年生の特徴と異なった。これより、3桁条件での賦活について、基本的な特徴が成人の段階に達するのは、小学5年生以降であることが推測された。

我々は近赤外線分光測定法(NIRS)によりワーキングメモリ・前頭前野の機能測定を可能にした。本研究では、(1)書字困難を示すLD児のワーキングメモリ特性を、NIRS法によって評価するため、健常児の基準値を測定し基準値に基づく比較を可能にする。(2)書字困難を示すLD児のワーキングメモリの特性を、NIRS法により明らかにする。(3)LD児のワーキングメモリの特性に応じた援助を実施し、その改善経過をNIRS法により評価する。(4)それに基づき、最適な書字学習の支援システムについて提案する。平成17年度は、NIRS法により評価可能な課題として、音声数唱課題、数字記憶課題、視覚運動記憶課題を開発し、数唱課題に関して健常小児のデータを測定し、発達基準値を収集した。また、書字障害を伴うLD児40名について視覚運動記憶課題を実施し、書字障害と視覚運動記憶の特性との関連について検討した。平成18年度には、開発したワーキングメモリ課題について、その援助課題を開発し、援助課題遂行時の前頭前野の賦活特性について検討した。対象としたLD児は8名であった。援助課題としては、色呈示条件、意味呈示条件、音声呈示条件とした。援助条件の効果について、対象児のワーキングメモリの特性との関連で評価することができた。これによって、ワーキングメモリを促進する上で有効な刺激条件について考察することができた。学習障害(LD)児の特性としてワーキングメモリにおける障害が指摘されている。書字は読みの記憶、文字の形の認知など複数のメモリ機能に関連する。これより書字困難の原因としてメモリ不全が推測できる。平成19年度には、色呈示条件、意味呈示条件を考慮した、漢字書字支援教材を開発した。
アトピー素因を有する乳幼児の健康管理システムの研究

アトピー素因を有する乳幼児の健康管理システムを策定するために、次の研究を行った。1.個々の小児について、出生時から15歳までの小児期全般にわたり、アレルギー疾患に関連する事項と継時的に記録する「小児アレルギー健康手帳(以下手帳と記す)」を新たに製作した。この手帳を約160名のアトピー素因を有する乳幼児に配付した。2.6ヶ月以上実際にこの手帳を使用した75名にアンケート調査を行い、この手帳についての意見をきき、32名から回答を得た。またこの手帳を用いた医師10名からも意見を徴した。3.これらの意見に基き、手帳の改良を検討し、さらに手帳の利用方法の改善について考察した。4.保健所による乳児健康診査の場を利用し、乳児期にアトピー素因を有する小児を選抜し、臨床検査を含む診断・治療・指導を行うシステムを考察し、東京都文京区において実施した。5.このシステムに参加した児が5-6歳になった時点の現況をアンケート調査した。対象児のうち491名の回答を得、現在のアレルギー疾患の有病率、それと4ヶ月健診時の状況との相関、行った食事や生活についての指導の実施状況、臨床検査項目とアレルギー疾患発生との関係などについて検討した。また本システムの有用性について意見を求め、本システムの評価を行った。6.以上の結果をふまえ、手帳の応用を含んだアトピー素因を有する乳幼児の健康管理システムの改良試案を作成した。今後これに基いて、さらに参考例について試行を行う予定である。1.アトピー素因を有する小児を乳児期から成人するまでの間、ことにアレルギー疾患に重点をおいて総合的に管理するのに有用な記録簿(「アトピー手帳」とよぶ)を新たに製作することとし、それに収載し記録すべき事項を研究分担者間で検討した。2.「アトピー手帳」には、次の事項を記載することにした。1)児の罹患疾患の総括2)アレルギー疾患を中心とする家族歴3)児の妊娠経過4)周生期の状況5)出生時より15歳に至るまでの歴年のアレルギー疾患および関連事項に関する記録6)主な臨床検査結果7)発育の記録8)施行された治療・指導の記録9)禁忌事項10)その他3.この方針に従って「アトピー手帳」を編集し、試作品を印刷した。4.「アトピー手帳」は、妊娠中から記載し出生後長期にわたって使用するべく企画したものであるが、その有用性を研究期間内に評価するために、まず乳児健康診査に参加した乳児のうちアトピー素因を疑うものに使用させることとし、その対象児を選ぶためのアンケート調査を東京都文京区において実施した。5.次年度以降では上記によって選択した対象児とその他の適応の児に「アトピー手帳」を実際に使用し、これを用いたアトピー素因を有する児の管理指導システムについて検討を加える。1.アトピー素因を有する小児を乳児期から成年に至るまで、ことにアレルギー疾患に重点を置いて総合的に管理するために有用な記録簿(「小児アレルギー健康手帳」と称する)を企画し、前年度においてその大綱を決定し試作品を印刷したが、本年度はさらにその内容を検討して改定し増刷した。2.この手帳を、主として東京大学医学部付属病院分院小児科受診中のアトピー素因を有する乳幼児の保護者に、趣旨を説明のうえ配布し、実際の記入と使用を依頼した。このほか本研究への協力を承諾した他施設受診中の該当児と、東京都文京区乳児アレルギー健康診断参加者中の該当児をも含めて約60例に配布を終了した。3.今後さらに約200例を選択し、手帳を配布する予定である。4.この手帳を用いて記録を行なうことによるアレルギー疾患診療上、および保護者における児の健康管理上の利便を、使用した医師と保護者に対するアンケートによって調査してその有用性を検討することとし、質問票を作成した。5.この調査は配布後一定の期間を置いてから実施する必要があるため、研究期間内には分析に十分な例数が集計できなかったので、以後も引き続き調査を続行し報告する予定である。
出土史料と文物考古資料からみた古代チベット帝国の文書行政と国家体制の研究

古代チベット帝国(吐蕃)は6世紀末から7世紀初に突如登場し、後のチベット文明の礎を作り上げた。しかし、チベット帝国がどのようにして短時間で国家体制を築き上げ、2世紀半の間も国家を維持することができたのか、不明な点が多く残る。本研究では、チベット帝国が文書による高度な行政ネットワークを持っていたことに注目し、その仕組みと広がりを、敦煌文書などの出土史料や石碑などの金石文の解読を通じて明らかにする。
衛星海面高度計と漂流ブイを用いた北太平洋海面流速場に関する研究

本研究では、衛星海面高度計と漂流ブイから推定した海面流速場を用いて、日本南岸の黒潮流軸の変動や、それに伴う海面流速の変動との関連性を明らかにすることが目的である。本年度ではまず、2004年の黒潮の大蛇行遷移について、紀伊半島沖の膠州海山による大蛇行遷移への影響の詳細を調べた。Endoh and Hibiya(2001)による力学的な数値モデル結果は、膠州海山の影響を考慮したケースが、本研究での黒潮流軸位置をと最も変動が一致しており、この海山が黒潮大蛇行の遷移の一因になっている可能性が極めて高いことが明らかになった。この黒潮大蛇行は2005年の6月に終息したが、終息期の2005年の3月には、伊豆海嶺の東方から強い低気圧性の渦が黒潮の蛇行部分に接近し、伊豆海嶺付近の流軸が不安定になった後に、非大蛇行離岸流路に遷移したことが分かった。しかし一方で、紀伊半島沖の流軸は同じ時期(3月)から接岸方向に単純的に移動しており、紀伊半島より上流側の黒潮変動の信号にも大蛇行終息の原因がある可能性が示唆された。次に、2004年における大蛇行遷移期の小蛇行の変動について、衛星軌道沿いのデータを用いてさらに詳しく調べた。その結果、小蛇行の四国沖での発達に伴って、黒潮の内側域で強い西向きの反流が発生し、その後黒潮が大蛇行に遷移する直前には、この反流がなくなり東向流となっていた事が分かった。このときの四国南岸の潮位は、東向流の発生時期に20cm程度減少しており、地衡流の関係からも矛盾しない結果となった。過去(19601992年)の大蛇行遷移期の小蛇行について、海洋速報(海上保安庁発行)の流路情報を基に潮位変動を調べた結果、全5ケース中3ケースにおいて、黒潮が大蛇行に遷移する直前に同程度の潮位の減少が見られ、大蛇行遷移との因果関係について今後の議論の対象となることが期待された。本研究では北太平洋の海面流速場の変動を、衛星海面高度計と漂流ブイのデータを用いて調べる事が目的である。今回は特に亜熱帯循環の西岸境界流である黒潮を中心に、黒潮や黒潮周辺の流速場と、黒潮の流軸位置の変動について、高精度の海面高度計の観測が始まって以来初めて捉えられた、2004年夏季における黒潮の大蛇行への遷移期間に着目し解析を行った。まず、衛星海面高度計と漂流ブイのデータを組合せることで、1992年10月から2004年12月までにおける北太平洋の海面での流速ベクトル分布の時系列を、緯度・経度1/3度毎で7日おきに推定した。推定した流速場は、現場観測データと高い相関を示し、その有用性が認められた。次に、求めた流速場から日本南岸における黒潮の流軸位置を抽出した。得られた流速場は、九州南東で発生した小蛇行が東方へ伝播し大蛇行流路へ発展していく、というこれまでの知見を明確に描写していた。また、黒潮が大蛇行流路を形成する約4か月前に、黒潮流軸が今回の解析期間で初めて、紀伊半島沖の四国海盆にそびえている膠州(こうしゅう)海山の縁に差し掛かり、大蛇行流路が形成されるまで常に隣接していることが分かった。この解析結果から、黒潮の大蛇行への遷移に海底地形が影響している可能性が非常に強く示唆された。膠州海山が大蛇行への遷移に影響している可能性は、数値モデルを用いた研究(Endo and Hibiya, 2001)でも指摘されているが、今回これを初めて観測的事実で示す結果となった。また遠州灘沖では、大蛇行流路に遷移するときに黒潮が分岐流を持っていた。他にも、全解析期間において九州南東で小蛇行が発生した際、ほとんどのケースで黒潮の沖側に高気圧性渦が発達しており、小蛇行発生と中規模擾乱の関連性が示唆された。黒潮の流軸上での流速の変動は、非大蛇行期間と大蛇行遷移期間で顕著な特徴の違いが見られなかった。

次に、2004年における大蛇行遷移期の小蛇行の変動について、衛星軌道沿いのデータを用いてさらに詳しく調べた。その結果、小蛇行の四国沖での発達に伴って、黒潮の内側域で強い西向きの反流が発生し、その後黒潮が大蛇行に遷移する直前には、この反流がなくなり東向流となっていた事が分かった。このときの四国南岸の潮位は、東向流の発生時期に20cm程度減少しており、地衡流の関係からも矛盾しない結果となった。過去(19601992年)の大蛇行遷移期の小蛇行について、海洋速報(海上保安庁発行)の流路情報を基に潮位変動を調べた結果、全5ケース中3ケースにおいて、黒潮が大蛇行に遷移する直前に同程度の潮位の減少が見られ、大蛇行遷移との因果関係について今後の議論の対象となることが期待された。
歯肉線維芽細胞による合成ハイドロキシアパタイトのコーティング培養法の確立

合成ハイドロキシアパタイトを歯肉線維芽細胞で被覆して新たな移植材料を開発するために、10歳の男子の正常歯肉線維芽細胞を24穴マルチウエルプレートで顆粒状(直径約300mum)とそれで構成されるブロック状(約3mm大)の2種類の合成ハイドロキシアパタイトと共に静置培養し、線維芽細胞の付着状態についてSEMで観察した。用いた線維芽細胞は3代継代したものであり、培養開始時の細胞濃度は5.0x10^4/ml、1.0x10^5/ml、5.0x10^5/ml、1.0x10^6/mlで、それぞれについて3日、7日、14日、21日培養した。また、FGFの影響をみるためにbasic FGF(bFGF)を10ng/ml、100ng/mlで培地に添加し、ブロック状の合成ハイドロキシアパタイトと共に培養開始時の細胞濃度が50.x10^4/mlで、3日、7日、10日、14日培養し、bFGFを添加しなかったものと付着状態を比較した。さらに、bFGFを10Nng/ml添加して6日間培養した場合の線維芽細胞の細胞数を添加しなかったものと比較した。その結果以下のことがあきらかとなった。ブロック状および顆粒状の合成ハイドロキシアパタイト共に、(1)培養開始時の細胞濃度と線維芽細胞の付着状態には差がみられず、歯開始時の細胞濃度を多角しても、線維芽細胞の付着が促進されないこと、(2)14日間培養すると合成ハイドロキシアパタイトの顆粒の1つ1つが判別できない程度に線維芽細胞が密に付着しており、移植材として用いるためには14日間程度の培養期間を必要とすることがわかった。(3)ブロック状合成ハイドロキシアパタイトのマルチウエルプレートの底面に接触している面にも他の面と同様な線維芽細胞の付着が認められ、静置培養により線維芽細胞をブロック状合成ハイドロキシアパタイトの全面に付着させることが可能であった。(4)bFGFを10ng/mlを添加した培地で6日間培養すると、添加しなかったものに比較して細胞数が約1.4倍に増加した。しかし、bFGFを10ng/ml、100ng/mlを添加した培地を用いて線維芽細胞の付着状態を調べてみると、添加しなかったものと差がみられず、bFGFで細胞の増殖速度を速めても線維芽細胞の付着が促進されないことがわかった。(5)顆粒状の合成ハイドロキシアパタイトでは1つ1つの顆粒が線維芽細胞によって結合してしまい、移植材として用いるにはブロック状のものに比べて操作性が劣ると思われた。現在は、この新しい移植材料としての歯肉線維芽細胞で被覆した合成ハイドロキシアパタイトの臨床応用に向けて準備を進めているところである。

現在は、この新しい移植材料としての歯肉線維芽細胞で被覆した合成ハイドロキシアパタイトの臨床応用に向けて準備を進めているところである。
遺伝的背景による疼痛感受性の差異

1.マウスにおける脊髄後角ニューロンにおける細胞外記録とin vivoパッチクランプ記録(1)細胞外記録タングステン電極(10-15□)をL4開窓部より脊髄に刺入し,足底部に受容野を有する脊髄後角wide-dynamic-range(WDR)ニューロンの単一活動電位を導出した.von Frey hair,ブラシ,動脈クリップを用いた非侵害・侵害性刺激に対する応答を記録後,2.5%フォルマリンを受容野中心に皮下注射し,活動電位の発生を1時間まで観察記録した.フォルマリン注入で誘起される活動電位の発射頻度はI相,II相ともに,CBA/J>C57/BL6>A/Jの順となり,CBA/JとA/JおよびC57/BL6とA/J間に有意差を認めた(P<0.05).また行動学上の疼痛行動の大きさもCBA/J>C57/BL6>A/Jの順であり,よく相関した.ガラス電極(8-12□)をL4開窓部より脊髄に刺入し,膠様質(substantia gelatinosa: SG)ニューロンから,電流固定下でホールセルパッチクランプ記録を行った.非侵害性,侵害性機械刺激の」両者に応答するMulti-recetiveニューロン活動を記録し,air-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.次いで受容野中心を5mm皮膚,皮下,筋肉に切開を入れた.切開後30分まで自発活動を記録し,受容野にair-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.A/Jマウスでは,切開後,自発性活動電位は消失したが,C57/BL6およびCBA/Jマウスでは切開後,自発性の活動電位が長時間持続した.1.マウスにおける脊髄後角ニューロンにおける細胞外記録とin vivoパッチクランプ記録(1)細胞外記録タングステン電極(10-15□)をL4開窓部より脊髄に刺入し,足底部に受容野を有する脊髄後角wide-dynamic-range(WDR)ニューロンの単一活動電位を導出した.von Frey hair,ブラシ,動脈クリップを用いた非侵害・侵害性刺激に対する応答を記録後,2.5%フォルマリンを受容野中心に皮下注射し,活動電位の発生を1時間まで観察記録した.フォルマリン注入で誘起される活動電位の発射頻度はI相,II相ともに,CBA/J>C57/BL6>A/Jの順となり,CBA/JとA/JおよびC57/BL6とA/J間に有意差を認めた(P<0.05).また行動学上の疼痛行動の大きさもCBA/J>C57/BL6>A/Jの順であり,よく相関した.ガラス電極(8-12□)をL4開窓部より脊髄に刺入し,膠様質(substantia gelatinosa: SG)ニューロンから,電流固定下でホールセルパッチクランプ記録を行った.非侵害性,侵害性機械刺激の」両者に応答するMulti-recetiveニューロン活動を記録し,air-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.次いで受容野中心を5mm皮膚,皮下,筋肉に切開を入れた.切開後30分まで自発活動を記録し,受容野にair-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.A/Jマウスでは,切開後,自発性活動電位は消失したが,C57/BL6およびCBA/Jマウスでは切開後,自発性の活動電位が長時間持続した.平成17年度1.マウスにおける脊髄後角ニューロンにおける細胞外記録とin vivoパッチクランプ記録A/J,C57/BL6,CBA/Jマウスをウレタン麻酔下に人工呼吸とした.腰部脊髄(L2-L5)を露出し,固定器に脊柱を固定した.硬膜を切除し,脊髄表面を酸素化したクレブス液を潅流し,L4後根進入部の軟膜を切除し開窓した.(1)細胞外記録タングステン電極(10-15Ω)をL4開窓部より脊髄に刺入し,足底部に受容野を有する脊髄後角wide-dynamic-range(WDR)ニューロンの単一活動電位を導出した.von Frey hair,ブラシ,動脈クリップを用いた非侵害・侵害性刺激に対する応答を記録後,2.5%フォルマリンを受容野中心に皮下注射し,活動電位の発生を1時間まで観察記録した.フォルマリン注入で誘起される活動電位の発射頻度はI相,II相ともに,CBA/J>C57/BL6>A/Jの順となり,CBA/JとA/JおよびC57/BL6とA/J間に有意差を認めた(P<0.05).また行動学上の疼痛行動の大きさもCBA/J>C57/BL6>A/Jの順であり,よく相関した.ガラス電極(8-12Ω)をL4開窓部より脊髄に刺入し,膠様質(substantia gelatinosa : SG)ニューロンから,電流固定下でホールセルパッチクランプ記録を行った.非侵害性,侵害性機械刺激の両者に応答するMulti-receptiveニューロン活動を記録し,air-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.次いで受容野中心を5mm皮膚,皮下,筋肉に切開を入れた.切開後30分まで自発活動を記録し,受容野にair-puffおよびpinch刺激に対する電圧変化を記録した.A/Jマウスでは,切開後,自発性活動電位は消失したが,C57/BL6およびCBA/Jマウスでは切開後,自発性の活動電位が長時間持続した.ウレタン麻酔下のマウスRVMニューロンからの細胞外記録に成功し,モルヒネに対する応答性を検討開始した.平成18年度

1.マウスにおける疼痛閾値とDAMGO脳室内投与の行動学的変化A/JおよびCBA/Jマウスをハロタン麻酔(2-3%)下に脳室内にポリウレタンカテーテルを留置し,注入部を頸部の背側から導出した.神経学的に麻痺や異常行動がないことを確認し,3-5日後,実験に使用した.まず熱刺激を足底に行い,逃避する潜時を記録した.von Freyフィラメントと用い,逃避閾値を測定し,尾に動脈クリップをはさみ,尾を舐める,あるいは噛むまでの時間を測定した.次いで,μレセプタアゴニストであるDAMGOをカテーテルを通して脳室内投与し,それぞれの潜時,閾値を60分まで測定した.A/J, CBA/Jマウスをウレタン麻酔下に人工呼吸とした.脳固定器に頭部を固定した.開頭しBregmaを同定後、硬膜を切除した脳表面を適宜、生理食塩水で浸し,タングステン電極(10-15Ω)を硬膜開窓部より刺入し,小脳部を越え,Rostral Ventromedial Medulla : RVM領域まで進めた.マイクロマニピュレータを2-5μmずつ進めた.自発活動が少なく,足底部や大腿部にピンセットで20gの力(pinch刺激)に応じて活動電位を生じるON cell,自発活動が多く(2-5Hz以上),足底部や大腿部への侵害刺激で自発活動が減じるOFF cell,自発活動が多く(2-5Hz以上),侵害刺激でも自発活動にまったく変化がみられないNEUTRALcellの単一ニューロン活動を分離した(S/N ratio >3-4).まずpinch刺激,brush刺激,熱(40°C),冷(4°C)を足底部に行い,それぞれに応答するニューロン活動を記録した.次いで,脳室内に留置したカテーテルを通じ,μレセプタアゴニストであるDAMGOをcummulativeに投与し,各容量の投与後60分までの応答を,10分間隔で記録した.平成19年度1.系統別マウスにおける切開モデルの行動学的差異A/JおよびCBA/Jマウスをハロタン麻酔(2-3%)下に足底に5mmの皮膚・皮下・筋肉への切開を行い,1針を7-0ナイロン糸で縫合した。覚醒後,自発痛関連行動を観察し,von Freyフィラメントと用い機械的刺激に対する逃避閾値を測定した.A/Jマウスは自発痛関連行動が術直後より少なく,術前と有意差を認めなかった.Von Freyフィラメントに対しては,軽度の痛覚過敏を示した.他方,CBA/Jマウスは術前に比べ,強い自発痛を認め,Von Freyフィラメントに対する強い痛覚過敏を認めた.A/J,CBA/Jマウスをウレタン麻酔下に人工呼吸とした.脳固定器に頭部を固定した.開頭しBregmaを同定後、硬膜を切除した脳表面を適宜、生理食塩水で浸し,タングステン電極(10-15Ω)を硬膜開窓部より刺入し,小脳部を越え,Rostral Ventromedial Medulla: RVM領域まで進めた.マイクロマニピュレータを2-5μmずつ進めた.自発活動が少なく,足底部や大腿部にピンセットで20gの力(pinch刺激)に応じて活動電位を生じるON cell,自発活動が多く(2-5 Hz以上),足底や大腿部への侵害刺激で自発活動が減じるOFF cell,自発活動が多く(2-5 Hz以上),侵害刺激でも自発活動にまったく変化がみられないNEUTRALcellの単一ニューロン活動を分離した(S/N ratio>3-4).
超高分解能携帯型マイクロチップ電気泳動システム

マイクロチップ電気泳動(MCE)装置は実用化され始めているが、POCT(Point-of-Care Testing;その場で診断という意味)用途で実用化されたコンパクト(持ち運び可能)なMCE装置は登場していない。1つの問題として、現行のMCE装置は、低い分離能を補うため分離流路長が長い(3cm程度)。そのため電気泳動に必要な電圧が高く、高電圧電源などを小型化することが困難である。本研究の目的は、MCE装置小型化のために、分離能の高分解能化を目指した、1ステップでサンプル濃縮が行える新規オンライン濃縮システム(緩衝液系)の開発を行うことである。まずDNAの分析に関して、サンプル緩衝液にタウリンを主成分とする緩衝液を選択し、分離緩衝液に酢酸を主成分とする緩衝液を選択した。各イオン種の移動度は、酢酸イオン>DNA>タウリンイオンであり、過渡的等速電気泳動(tITP)の濃縮効果が得られた。興味深い点は、従来のtITPと異なり、サンプルDNAとターミナルイオンのタウリンイオンを混ぜた状態で濃縮効果を得られた点である。この一工夫によって、1ステップでサンプル濃縮が行え、操作が簡単になり、普及性の観点からも実用的な高分解能MCE法が確立出来た。その性能は、わずか10mmの分離流路長で、1001000bpのDNAを分離度0.7210.7の高分離能で60s以内に解析出来る事を示しており、従来のMCE装置と比較して分離流路長を1/3に短縮出来ることが分かった。この異種の緩衝液を組み合わせる方法を単糖の分離にも応用し、濃縮効果によって検出感度が19.665.6倍向上することも示した。これらの成果によって、光学系の負担を減少させ、よりコンパクトなMCE装置が開発し易くなり、場所を選ばず、高速で精度の要求される感染症の診断などの応用も可能になり、大きな社会的波及効果が期待される。
脊髄損傷に対する各種神経栄養因子発現ベクター導入後の組織学的評価及び運動機能解析

脊髄圧迫損傷マウス(twy/twy)を用いて、非侵襲的な方法としてadenovirus vectorを筋肉内に注入することで、脊髄前角細胞内にBDNF遺伝子を導入することを企図した。Twyマウス、ICRマウス共に、C1-C3に分布する左脊髄副神経内側核に陽性細胞が確認され、BDNF抗体ではtwyマウス、ICRマウス共に灰白質、特に前角細胞、また介在ニューロンが染色された。特に最大圧迫部、尾側部の前角ニューロンの染色性はAdV-LacZ群に比べ、AdV-BDNF群では有意に高かった。Nissl染色、ChATによる免疫染色、AChE染色においても同様の結果であり、コントロール群に比べAdv-BDNF群では有意にその染色性は強かった。Nissl染色、ChAT免疫染色、AChE染色いずれにおいても最大圧迫部位において有意に陽性細胞数は多かった。この導入方法は、筋肉内から軸索流にのり、逆行性に前角細胞へ直接輸送する方法で、損傷脊髄に非侵襲的であり、免疫反応を最大限に抑制することができることやapoptosis助長効果がないことが報告されている。慢性圧迫に伴う軸索流の障害により、導入効率が低下することが危惧されたが、adenovirusが強力なretrograde tracerとして働き、細胞感染を生じさせたものと推察される。本研究においては、上位頚髄前角細胞に分布する胸骨乳突筋をtarge torganに設定したが、損傷部位に応じたtaget organの選択も可能であることは大きな利点のひとつと考えられる。障害脊髄周囲でのcholinergic enzymes(ChAT、AChE)の活性上昇は、細胞生存の指標として重要であり、特に運動機能と相関があるとされている。細胞死の抑制、cholinergic enzymes活性上昇、長期間の神経栄養因子補充など、頚髄前角細胞に対して非常に有益な効果をもたらしていた。新たな遺伝子導入の試みとしてアデノウイルスを用いた神経栄養因子導入法を行った。human GDNF遺伝子、β-galactosidase遺伝子(LacZ virus)を組み込んだ非増殖型アデノウイルスベクター(AxCAhGDNF,AxCALacZ)をCOS-TPC法で作製した。脊髄損傷モデルは、Wistar Rat(体重400-450g)を用い、脊髄完全損傷モデルを作製した。損傷直後、1分間1μlの速度でtotal 10μlの髄内投与を行った。作製したvectorの生物学的活性はIn Vitroでは、Western Blot解析にてCOS1細胞感染後の上清を調べた。In Vivoでの検討は、まずAxCALacZにおいてベクター発現の局在を観察後、PBS、AxCAhGDNF注入群の両群間で、免疫組織化学的検討を行った。COS1細胞感染後のGDNFの発現は2日以降で認められた。損傷後約2週、4週のGDNF免疫染色では、コントロール(PBS群)に比べニューロンに特に強いimmuno reactivityが観察された。半定量化として行ったWBではPBC群では損傷初期に強い発現を認めたのに対し、AxCAhGDNFでは2週にベクターによる蛋白発現が確認された。損傷後4週のChAT免疫染色では、コリン作動性ニューロンである前角ニューロンにも特に強いimmuno reactivityが観察された。ニッスル染色では前角部のcell countを行った。AxCAhGDNF群では特に2から4週においてPBS群に比べ有意に細胞数の減少が抑制されていた。来年度は他の栄養因子との比較実験を行う予定である。

Twyマウス、ICRマウス共に、C1-C3に分布する左脊髄副神経内側核に陽性細胞が確認され、BDNF抗体ではtwyマウス、ICRマウス共に灰白質、特に前角細胞、また介在ニューロンが染色された。特に最大圧迫部、尾側部の前角ニューロンの染色性はAdV-LacZ群に比べ、AdV-BDNF群では有意に高かった。Niss1染色、ChATによる免疫染色、AChE染色においても同様の結果であり、コントロール群に比べAdV-BDNF群では有意にその染色性は強かった。Niss1染色、ChAT免疫染色、AChE染色いずれにおいても最大圧迫部位において有意に陽性細胞数は多かった。この導入方法は、筋肉内から軸索流にのり、逆行性に前角細胞へ直接輸送する方法で、損傷脊髄に非侵襲的であり、免疫反応を最大限に抑制することができることやapoptosis助長効果がないことが報告されている。慢性圧迫に伴う軸索流の障害により、導入効率が低下することが危惧されたが、adenovirusが強力なretrograde tracerとして働き、細胞感染を生じさせたものと推察される。本研究においては、上位頚髄前角細胞に分布する胸骨乳突筋をtarget organに設定したが、損傷部位に応じたtaget organの選択も可能であることは大きな利点のひとつと考えられる。障害脊髄周囲でのcholinergic enzymes(ChAT、AChE)の活性上昇は、細胞生存の指標として重要であり、特に運動機能と相関があるとされている。細胞死の抑制、cholinergic enzymes活性上昇、長期間の神経栄養因子補充など、頚髄前角細胞に対して非常に有益な効果をもたらしていた。
砂地盤の液状化に及ぼす地震動特性と地盤構造の影響に関する研究

平成10年度は最終年度であり、研究分担者ごとに連絡を密にとりながら個別に研究を進めるとともに、研究代表者の機関でその成果をできる限り関連づけて取りまとめることとした。研究代表者は、液状化地盤について入力地震動特性と、例えば累積損失エネルギーのような地盤材料の塑性化指数あるいは液状化指数との関係を調べ、最大速度やSIおよび速度応答スペクトルの最大値などのパラメータが、地盤の液状化に最も大きく影響することを見出した。更に、兵庫県南部地震におけるポートアイランドの地震記録を用いて、地盤の液状化を伴う非線形挙動および粘土層の動的物性の変化について室内試験を利用して考察を行った。また、研究分担者は、規模の大きな強震動特性において、速度応答スペクトル特性に非線形挙動の影響がかなり明確に現れることから、地盤を増巾度特性と地震動記録の非定常性から地盤構造の影響を推定する設計的手法について検討した。また、詳細な液状化解析に必要な三次元有限要素法に用いることができるような構成則については、多軸応力下における砂の変形挙動を表現するために増分非線形モデルを考案し、主応力軸が変化する場合の変形特性を表現し得る構成則を定式化する手法を示すと共に、大型単純せん断試験機を用いて実験的な検討を行い、大地震時における地盤材料の変形特性や強度特性について検討を行い、ダイレタンシー特性など基本的な性状については定式化できるような具体的な知見を得ている。本年度は、研究計画にのっとり各研究分担者ごとに備品を購入し、資料収集と解析を行った。強震地震動特性に及ぼす地盤の非線形挙動については、液状化のような地盤の破壊現象を伴わない場合と液状化現象に伴う場合とに分けて研究を進めた。規模の大きな強震動特性においては、速度応答スペクトル特性に非線形挙動の影響がかなり明確に表れることを地盤の増巾度特性から検討した。また、液状化地盤については、入力地震動特性と液状化指数の関係を調べることにより、最大速度やS.Iおよび速度応答スペクトルの最大値などのパラメータが、地盤の液状化に最も大きく影響することを見出した。また、詳細な液状化解析に必要な三次元有限要素法に用いることができるような構成則については、多軸応力下における砂の変形挙動を表現するために、増分非線形モデルを考案し、主応力軸が変化する場合の変形特性を表現し得る構成則を定式化した。これらの成果については逐次公表している。この他、液状化地盤の動的調査法および液状化被害に及ぼす地盤条件の影響については、被害地において調査を行うとともに、液状化被害に関する資料収集を行う。平成9年度は、研究分担者ごとに連絡を密にとりながら個別に研究を進め、研究代表者の機関でその成果をまとめることとした。本年度、研究代表者は、液状化地盤について入力地震動特性と液状化指数の関係を調べ、最大速度やS.Iおよび速度応答スペクトルの最大値などのパラメータが、地盤の液状化に最も大きく影響することを見出した。また、研究分担者は、規模の大きな強震動特性において、速度応答スペクトル特性に非線形挙動の影響がかなり明確に現れることを地盤の増巾度特性から求め、それを推定する設計的手法について検討した。また、詳細な液状化解析に必要な三次元有限要素法に用いることができるような構成則については、多軸応力下における砂の変形挙動を表現するために、増分非線形モデルを考案し、主応力軸が変化する場合の変形特性を表現し得る構成則を安定化した。また、本年度に購入した備品(三軸セルおよび水系装置)を用いて実験的な検討を行い、その結果については逐次公表している。

研究代表者は、液状化地盤について入力地震動特性と、例えば累積損失エネルギーのような地盤材料の塑性化指数あるいは液状化指数との関係を調べ、最大速度やSIおよび速度応答スペクトルの最大値などのパラメータが、地盤の液状化に最も大きく影響することを見出した。更に、兵庫県南部地震におけるポートアイランドの地震記録を用いて、地盤の液状化を伴う非線形挙動および粘土層の動的物性の変化について室内試験を利用して考察を行った。また、研究分担者は、規模の大きな強震動特性において、速度応答スペクトル特性に非線形挙動の影響がかなり明確に現れることから、地盤を増巾度特性と地震動記録の非定常性から地盤構造の影響を推定する設計的手法について検討した。また、詳細な液状化解析に必要な三次元有限要素法に用いることができるような構成則については、多軸応力下における砂の変形挙動を表現するために増分非線形モデルを考案し、主応力軸が変化する場合の変形特性を表現し得る構成則を定式化する手法を示すと共に、大型単純せん断試験機を用いて実験的な検討を行い、大地震時における地盤材料の変形特性や強度特性について検討を行い、ダイレタンシー特性など基本的な性状については定式化できるような具体的な知見を得ている。
環状ペプチドPF1171類の三次元構造に着目した活性発現機構研究

カイコの麻痺活性やアポリポタンパク質Bの産生抑制活性を示す環状ペプチドPF1171類を有機合成した。X線結晶構造解析法や核磁気共鳴法により、分子内水素結合がPF1171類の三次元構造の維持において重要であることを明らかにした。類縁体を合成して三次元構造と活性の関係を綿密に調べることにより、結晶で見られた三次元構造が活性発現に深く関わっていることを示唆した。構造活性相関の知見を基に、PF1171類の標的分子探索が可能な分子プローブを設計・合成した。環状ペプチドPF1171類は、カイコに対して経口投与で麻痺を引き起こし、ヒト培養細胞ではアポリポタンパク質Bの産生を抑制することから、その活性発現機構に興味が持たれる。PF1171類は、アントラニル酸やピペコリン酸などの特殊な環状アミノ酸を含有しており、これらが活性コンホメーションの形成に関与していることが予想される。本研究は、PF1171類の三次元構造に着目し、有機化学的手法と機器分析法を駆使して、活性発現機構を解明することを目的としている。H26年度は、誘導体合成を指向して、PF1171類の固相法を用いた全合成を行った。スプリット&ミックス合成が容易なブロック状固相担体(Lantern)を用い、ペプチド鎖の伸長をFmoc法により行った。求核性が弱いアントラニル酸の芳香族アミンに対する縮合は、トリホスゲンとコリジンを用いて系中で酸クロライドを発生させる方法を用いることにより、高収率で進行させることができた。固相から切り出した後、鎖状ペプチドを液相で環化することで、PF1171A、C、F、Gの初の全合成を達成した。合成したPF1171類をカイコの4令幼虫に投与したところ、顕著な麻痺活性を示し、その活性の強さは天然物と同程度であることを確認した。PF1171Fの単結晶のX線結晶構造解析を行った結果、4つの分子内水素結合の存在が確認され、これらがコンホメーションの維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。同時に、核磁気共鳴法(NMR)による構造解析を行い、得られた核間距離情報と二面角情報を満たすコンホメーションを分子力学計算プログラムのMacroModelを用いて探索した結果、PF1171Fは重クロロホルム中において上述の単結晶構造とほぼ同じコンホメーションを形成していることが明らかとなった。環状ペプチドPF1171類は、カイコに対して経口投与で麻痺を引き起こし、ヒト培養細胞ではアポリポタンパク質Bの産生を抑制する。環状ペプチドは多様な立体配座を取ることから、作用機構の詳細な解明には活性立体配座を明らかにすることが重要である。本申請者はH26年度に、PF1171類の固相法を用いた全合成を達成した。さらに、X線結晶構造解析およびNMRによる三次元構造解析を行い、PF1171Fが4本の分子内水素結合を特徴とする立体配座を形成していることを明らかにした。しかし、本立体配座と活性との関連は不明である。本研究では、PF1171類の活性立体配座の解明を目的として、PF1171Fの類縁体を合成して活性を評価するだけでなく、その三次元構造を解析することにより、三次元構造ー活性相関研究を行った。これまでに確立した合成法により、23種類のPF1171F類縁体を合成した。これらの類縁体をカイコに血液注射して麻痺活性を評価するとともに、NMRによる三次元構造解析を行った。その結果、1H NMRスペクトルがPF1171Fと類似している類縁体(D-allo-Ile→D-Alaなど)では活性が維持されているのに対し、分子内水素結合の様式が変わってNMRスペクトルが異なる類縁体(D-Ala→L-Alaなど)では活性が失われる傾向が見られた。本結果は、結晶の立体配座が麻痺活性の発現に深く関わっていることを示唆している。一方で、合成したPF1171類縁体のヒト肝癌細胞HepG2に対するアポリポタンパク質B産生抑制活性を、ELISAを用いた比色定量により評価したところ、天然物のPF1171類は50 μMの濃度でアポリポタンパク質Bの産生を40%抑制した。しかしながら、開環体やエナンチオマーも同等の抑制活性を示したことから、本活性に係る相互作用に不斉は関与しておらず、特異性が低いものと考えられた。PF1171類の三次元構造ー活性相関研究を行い、立体配座と活性との関連を明らかにした。本成果は、第57回天然有機化合物討論会で口頭発表に選ばれるなど、高い評価を得ている。しかしながら、本研究成果の原著論文としての発表ができていない。また、当初計画していたPF1171類の標的タンパク質探索はほとんど進んでおらず、分子プローブの合成を始めたところである。環状ペプチドPF1171類は、カイコに対して経口投与で麻痺を引き起こす。環状ペプチドは多様な立体配座を取ることから、作用機構の解明ならびに高活性類縁体の設計のためには、活性立体配座を明らかにすることが不可欠である。さらに、X線結晶構造解析およびNMR解析により、PF1171Fの三次元構造を明らかにした。

H27年度には、PF1171Fの類縁体を合成して活性を評価するだけでなく、その三次元構造を解析することにより、三次元構造と活性の関係を明らかにした。H28年度は、PF1171類の標的分子を同定することを目的として、PF1171類の分子プローブ化を行った。本申請者はH27年度までに、側鎖に光反応基やアジドを有するアミノ酸数種の合成を完了していた。そこでH28年度は、これらのアミノ酸を導入したPF1171類縁体の設計・合成を行った。光反応基やアジドを導入する部位は、H27年度に行った構造活性相関の結果を基に設計した。固相法を用いて合成したプローブ11種についてカイコ麻痺活性試験を行った結果、L-MeLeuの側鎖にアジド基を、L-Pheの芳香環のパラ位に光反応基であるトフルオロジアジリンを導入した類縁体が活性を維持していた。さらに、アジド部位に対してアルキンとのクリック反応を行うことで、ビオチンを導入した類縁体を合成することができた。本分子プローブを用いることにより、標的分子の効率的な探索を行うことができると考えられる。カイコの麻痺活性やアポリポタンパク質Bの産生抑制活性を示す環状ペプチドPF1171類を有機合成した。X線結晶構造解析法や核磁気共鳴法により、分子内水素結合がPF1171類の三次元構造の維持において重要であることを明らかにした。類縁体を合成して三次元構造と活性の関係を綿密に調べることにより、結晶で見られた三次元構造が活性発現に深く関わっていることを示唆した。構造活性相関の知見を基に、PF1171類の標的分子探索が可能な分子プローブを設計・合成した。H26年度に計画していたPF1171類の全合成および三次元構造解析を完了した。さらに、本研究成果を原著論文(Masuda, Y. et al., J. Org. Chem. 2014, 79, 7844-7853)として出版し、PF1171類の初の全合成として報告した。標的分子の探索を目的としたPF1171類のプローブ化を行う。H27年度までに、側鎖に光反応基やアジドを有するアミノ酸数種の合成を完了している。H28年度は、構造ー活性相関の結果を基にして、これらのアミノ酸を導入したPF1171類縁体の設計・合成を行う。続いて、カイコに対して血液注射および経口投与での麻痺活性試験を行い、活性を維持した類縁体を選択する。農芸化学、生物有機化学、ペプチド化学、核磁気共鳴H26年度に構築した三次元構造モデルを基に、誘導体を設計・合成する。誘導体合成は、固相ペプチド合成により20 30種類を並行して行う。合成した誘導体のカイコに対する麻痺活性を評価し、活性に大きな差異が認められたものを中心に三次元構造を解析し、天然物と比較する。また、PF1171誘導体のヒト肝癌細胞HepG2に対するアポリポタンパク質B産生抑制活性を、ELISAを用いた比色定量により評価する。顕著な抑制活性を示した誘導体をもとに次世代のリード化合物を設計・合成し、新規高脂血症治療薬の開発を目指す。構造ー活性相関の結果を基にして、PF1171類に光反応基やビオチンを導入して分子プローブとし、標的タンパク質の探索を行う。合成したプローブをカイコ培養細胞BM-Nならびにヒト培養細胞HepG2の細胞破砕液中でインキュベーションした後、アビジンビーズに固定化して標的タンパク質を釣り上げる。得られたタンパク質はLC-MS/MSにより解析する。
エピジェネティクスに基づく小児自閉症の神経病態解明のための萌芽的アプローチ

【研究目的】本研究の目的は、自閉症の発症メカニズムをエピジェネティクス機構の破綻と定義し、その脳病態を明らかにすべく「MeCP2異常に起因する脳細胞の異常」と「MeCP2蛋白機能不全による異常発現遺伝子」を具体的に明らかにすることである.今年度は「MeCP2蛋白機能不全による異常発現遺伝子」を明らかにする研究を行った.【研究成果】1.がん細胞において、MeCP2蛋白が結合しかつDNAがメチル化されている領域がヒトゲノム上に22カ所存在することを、ゲノムマイクロアレイにより明らかにした.2.この22箇所のうち、ゲノムデータベース探索で、5カ所に神経関連遺伝子が存在することを明らかにした.3.5つの神経関連遺伝子のうち、上流領域にMeCP2蛋白の結合コンセンサス配列が有する遺伝子が4つ存在することを明らかにした.4.4つの遺伝子のうち、3つにおいてMeCP2が結合していることを、神経系培養細胞においてクロマチン免疫沈降法で明らかにした.5.3つの遺伝子のうち、2つで神経系細胞における強度のメチル化を明らかにした.以上の結果から、この2つの遺伝子がMeCP2蛋白に制御を受けていることが推測された.この結果とMeCP2蛋白の制御不全が遺伝性自閉症(Rett症候群)の発症に関わりうることを考えあわせると、今回得られた2つの遺伝子が自閉症に関わっている可能性が示唆された.これらの遺伝子が自閉症に関わっているかをさらに明確にする研究が必要と考えている.【研究目的】本研究の目的は、自閉症の発症メカニズムをエピジェネティクス機構の破綻と定義し、その脳病態を明らかにすべく「MeCP2異常に起因する脳細胞の異常」と「MeCP2蛋白機能不全による異常発現遺伝子」を具体的に明らかにすることである.初年度は「(1)MeCP2蛋白の局在変化メカニズム、(2)MeCP2発現低下時の神経細胞ならびに神経膠細胞(グリア細胞)の機能異常」を明らかにする.【初年度(H17年度)の研究成果】1.MeCP2蛋白の局在変化メカニズム従来核に局在していることが知られていたMeCP2蛋白が神経培養細胞においては、細胞質にも存在することを見い出し、MeCP2の核と細胞質間の移動に、MeCP2蛋白質の各種修飾が関係しうることを見い出した(論文投稿中).2.MeCP2発現低下時の神経細胞ならびに神経膠細胞の機能異常MeCP2の遺伝子発現調節異常が神経膠細胞に生ずると、細胞増殖が低下することを明らかにし報告した(Nagai et al.,Dev Brain Res 2005).このMeCP2低下に起因する神経膠細胞機能不全が本症患者の神経病態の一端を担っていると考えられた.【次年度(H18年度)の課題】1.MeCP2蛋白のグリア細胞不全による症状発現メカニズムを解明する.具体的には、グリア細胞特異的MeCP2遺伝子欠失マウスを作製し、小頭症状や自閉症状の出現の有無を明らかにする.2.MeCP2の蛋白質修飾に関する知見をさらに確固たるものにする.具体的には、MeCP2蛋白のリン酸化部位を特定する.【研究目的】本研究の目的は、自閉症の発症メカニズムをエピジェネティクス機構の破綻と定義し、その脳病態を明らかにすべく「MeCP2異常に起因する脳細胞の異常」と「MeCP2蛋白機能不全による異常発現遺伝子」を具体的に明らかにすることである.今年度は「MeCP2蛋白機能不全による異常発現遺伝子」を明らかにする研究を行った.【研究成果】1.がん細胞において、MeCP2蛋白が結合しかつDNAがメチル化されている領域がヒトゲノム上に22カ所存在することを、ゲノムマイクロアレイにより明らかにした.2.この22箇所のうち、ゲノムデータベース探索で、5カ所に神経関連遺伝子が存在することを明らかにした.3.5つの神経関連遺伝子のうち、上流領域にMeCP2蛋白の結合コンセンサス配列が有する遺伝子が4つ存在することを明らかにした.4.4つの遺伝子のうち、3つにおいてMeCP2が結合していることを、神経系培養細胞においてクロマチン免疫沈降法で明らかにした.5.3つの遺伝子のうち、2つで神経系細胞における強度のメチル化を明らかにした.以上の結果から、この2つの遺伝子がMeCP2蛋白に制御を受けていることが推測された.この結果とMeCP2蛋白の制御不全が遺伝性自閉症(Rett症候群)の発症に関わりうることを考えあわせると、今回得られた2つの遺伝子が自閉症に関わっている可能性が示唆された.これらの遺伝子が自閉症に関わっているかをさらに明確にする研究が必要と考えている.
fosB遺伝子による細胞のがん化と遺伝子発現制御

我々は平成5年度のがん特別研究(2)において、ラット線維芽細胞株Rat-1A細胞のΔFosBの発現によるトランスフォーメーションに伴い細胞増殖の制御に重要なサイクリンとサイクリン依存性キナーゼのmRNA量が増加することを見出した。しかしながら,Nuclear Run On法による転写頻度の解析からcaK2,サイクリンE遺伝子の転写頻度はΔFosBの発現に伴って増加しないことが確認された。この結果は、ΔFosBが転写後の段階でこのような細胞増殖に必須な遺伝子の発現を制御する可能性を示唆する。本年度は、ΔFosBによるCdk2,サイクリンEの転写後の発現制御機構の解明を目視した。また,FosBの発現によりトランスフォームしたRat-1a細胞でのサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼの発現を検討し,発現に変化の見られた遺伝子についてその発現制御のメカニズムを明らかにすることを目的として以下の研究を行った。(1)ΔFosB発現細胞におけるサイクリンE,Cdk2 mRNAの安定化:ΔFosBの強制発現により増殖している細胞とΔFosBを発現していない休止期の細胞をアクチノマシンで処理しdenovoのRNA合成を阻害した後,時間を追ってtotal RNAを調製しサイクリンEとCdk2のmRNA残存量を測定した。その結果,2つのmRNAともにΔFosB非発現細胞では速やかに分解され,そのレベルが低く維持されることが明らかになった。一方、ΔFosB発現細胞では2つのmRNAとも分解速度が低下し,安定化されていた。この安定化がそれぞれのmRNAレベルの増加の原因と考えられた。(2)FosB発現細胞における細胞増殖制御遺伝子群の発現:サイクリンEとCdk-2のmRNA量をFosB発現細胞においてノーザンブロッッテイングにより解析したところ,サイクリンEの発現増加のみが観察された。(3)FosBによるサイクリンEの転写制御:FosB発現細胞におけるサイクリンEの転写レベルをNvclear Run Onアッセイにより解析したところ,休止期の細胞やΔFosBの発現細胞により有意に転写レベルが増加していることが確認され,FosBは転写の活性化によりサイクリンE遺伝子の発現を誘導するようである。以上より,ΔFosBの発現によって細胞がトランスフォームする際には,mRNAの安定化によってサイクリンEとそのパートナーCdk2の発現が誘導され,細胞増殖が活性化されることが明らかにされた。一方,FosBの発現によっては,サイクリンEの転写増殖mRNAレベルの増加が観察された。このことは,fosB遺伝子が2つの遺伝子産物によりそれぞれ異なる経路で細胞の増殖,がん化に関わっている可能性を示すものである。