hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
接続期の子どもの発達を支えるアーティキュレーション・サポート・システム

本研究は、就学前教育から小学校へ移行する接続期に生じている、教師間にある段差(教育の目的、内容、方法の違いに生じている意識の段差)に注目し、その実態を明らかにすると共に、連携サポートシステム(A・S・S)のネットワークを構築し、連携を促進する2つのアクション・リサーチ(以下AR)を展開していった。小学校教師と幼稚園教師に対し面接調査を行い、グラウンド・ルールに基づく発話分析を行い、S.S.A.の介入によりそれぞれの教育観の違いを明らかにする中で、連携のモチベーションを高める効果や、教育実践の自己課題を促すことが出来た。本研究では、校種を超えた連携教育の推進には、現場実践を共感的に理解しサポート環境を作り上げるA・S・Sの存在が効果的であることを実証した。本研究は、就学前教育から小学校へ移行する接続期をとりあげ、「子どもの学びと発達の連続性を育む」ための人的ネットワークを構成し、接続期教育の実態を把握すると共に、良好な人的ネットワークが子どもに及ぼす効果を検証、環境改善するアクション・リサーチである。19年度は、Articulation Support System(AS)のあり方について検討した。接続期の子どもの学びと発達の連続性を支えるための人的環境の在り方として、学生ボランティアと大学教師(研究者)が、それぞれ独自の役割を担いながら、接続期の教育内容と方法のあり方をサポートする取組みを行った。学生ボランティアは、教師の授業・保育方法を参与観察しながら、教師らのビデオを撮影し双方の教育内容と方法に関する自省環境をサポートする役割である。大学教師は、教師の授業・保育を観察しながら、オン・ゴーイング記録をとり、当該教師らとリフレクション・カンファレンスを開催、こどもの発達の連続性を支える教師のあり方をテーマに、それぞれの教育方法や内容の変容を明らかにしていくこととした。これは平成21年3月末まで実施される。本年度は、研究の基礎的資料として、幼小連携の背景について歴史的考察を行った。平成元年の幼稚園教育要領改定では、幼児教育の内容や方法に大きな転換期が訪れ、幼小の連続性や繋がりの視点が全面に現れなくなるのが特徴である。このとき幼児教育の独自性を強調した結果、その後問題となる小1プロブレム現象が表出する原因となったと推察できた。本年度は、幼小連携が重視される背景を確認した結果、幼稚園の教員の保育内容と方法への戸惑いが契機となり、幼児教育自体が混乱に陥った背景を鑑みると、これからの幼稚園教諭には、幼児教育の意義や役割を適切に理解した上で、その独自性を明らかにすると共に、その意義等を小学校や保護者に伝承しうる専門性を身につけることが重要であることがわかった。次年度は、幼小連携にふさわしい保育者や教師のあり方を検討するべく、本研究独自のASシステムを構成し、アクション・リサーチを進めながら、検証していく。20年度の研究成果を報告する。アーティキュレーション・サポート・システム(=以下A・S・S)では、私立K小学校1年生組担任1名と私立K幼稚園年長児組担任1名の幼小連携を推進する試みをサポートした。両校の円滑な連携関係が構築されていない現状を踏まえ、二人の担当教員には、それぞれの教育観・保育観を明らかにしながら相互理解を図り、同時に連携を推進するモチベーションを高めることを目的とした。教育観を明らかにする手続きとして、(1)GRによる発話分析と(2)「振り返る協働者(A・S・S)」とのビデオ・リフレクション、という2つの独創的な手法を取り入れた。A・S・Sは、(1)発話記録と授業(保育)記録のサポートを行い、(2)授業リフレクションの際、GR指標の発話分析を行いリフレクションを促し、(3)授業の振り返りと共に、教育内容・方法に生じている段差の相互理解と連携モチベーションを得するためのサポートを行った。サポート期間は、小学校教諭(2007年6月-2008年3月)幼稚園教諭.(2008年4月-10月)であった。A・S・Sがサポートとして介入することより、小学校教諭Nには、(1)「クラス集団」の中の個を基本とする特徴を明らかにする効果、(2)自らの授業を問いなおす効果、(3)連携モチベーション獲得に効果があったことが検証された。幼稚園教諭Mには、(1)幼稚園教育の特性を明らかにするサポート効果、(2)自らの教育(保育)を問い直す効果、(3)連携モチベーション獲得の効果があったことが検証された。21年度は、事例研究数を拡大し、A・S・Sが果たすカタリスト効果の実態を検証し、幼保小連携を推進する具体的な教育環境の改善に向け、アクション・リサーチを継続していく。2009年度は、(1)保育者Cとのアクション・リサーチと(2)神奈川県全域の私立幼稚園対象のアンケート調査を行った。(1)保育者Cとのアクション・リサーチ(AR)の概要

保育者Cは、本研究3人目の事例となる。22年の教育実績を有し、幼児教育の実践に熟知しているベテラン教師である。Cは、「連携推進のモチベーション」は既に獲得している状況にあるが、小学校との連携方法や内容に確信が持てず不安を抱えている現状にあった。昨年度の本研究成果に賛同し、C自身が当事者になりA・S・S介入による共同生成的アクション・リサーチを行っていった。保育者Cはリフレクションをする際の「語り」の中で次の2つのGR((1)保育GRは園全体のGRとして位置き、実践上の個人的信念となっている。(2)年長独自の発達を考慮し、「遊び」「自覚」「グループ活動」の柱を持つ。)を明らかにしていった。また、Cの幼小連携を見据えた自己課題は2つ((1)保育者は・人・人のドラマを客観的に把握し視野を広げることが重要である。(2)幼児教育の特徴は、子どもの長期的発達観を持ち、見通しを持った教育であり、このことを小学校と共有していきたい。)明らかにされていった。(2)神奈川県全域の私立幼稚園対象のアンケート調査神奈川県全域295の幼稚園(回収率49.6%)を対象とした結果が得られた。結果の概要として、連携の実施状況では、79%の園で「園児が小学生と交流をしている」、74,2%の園で「園児が小学校の尾様子を体験している」という結果であった。小学校との連携を実施する園内の職員間で、意識差が確認され、幼小連携を推進する際には園内でも充分なコンセンサスをとる必要があることが示唆された。
ハイブリッドマイクロカプセルによるパラジウムの選択的分離および回収

使用済核燃料の再処理工程から排出される高レベル放射性廃液(HLLW)中には、種々の有用元素が含まれている。現在、HLLWは、ガラスと混合して溶融固化し、多重バリアを施した後、安定した地層中に埋設する計画である。HLLW中のパラジウム(Pd)は、溶融固化時に析出し、ガラス固化を困難にする可能性がある。希少元素であるPdを廃液から選択的に分離・回収できれば、廃液処理の高度化が図れ、かつ有用核種として有効利用が可能であり、元素戦略の観点からも重要である。本研究では、Pdに対して高い選択性を示す不溶性フェロシアン化物を調製し、Pd^<2+>の高度分離・回収技術を開発した。以下に研究成果を示す。(1)不溶性フェロシアン化物の吸着速度は比較的大きく、KCuFCに関しては、10分で99.9%という高い吸着率を示し、吸着速度の序列は、KCuFc >KNiFC>KCoFCであった。Pd吸着はイオン交換/酸化還元による特異的吸着である。Pd^<2+>吸着率は、0.37.0Mの広い硝酸濃度範囲において、90%を超え、Pd^<2+>を吸着後、不溶性フェロシアン化物を熱分解し、酸処理することにより、不溶解残渣としてPd0を高純度で回収できた。(2)不溶性フェロシアン化物は微粒子であり、カラム操作のための造粒法として、アルギネートゲル担体によるマイクロカプセル(MC)化を実施した。MC充填カラムのPd破過容量は、5M硝酸共存下で0.031mmol/gであり、0.1Mのチオ尿素を43mlを通液し、約92%のPd^<2+>をチオ尿素中に溶出可能である。(3)KCuFCとNa-ALGとの混練ゾルをろ紙上に塗布し、Ca^<2+>水溶液を噴きつけることで、ろ紙を支持体として厚さ数μmのKCuFC内包型アルギネートフィルムシートの製造に成功した。フィルムの厚さも調整でき、今後は、透過性の高いフィルムを調製し、交換フィルターまたは液体膜によるPd^<2+>の選択的分離・濃縮への展開・応用が期待できる。不溶性フェロシアン化物の合成、パラジウムの吸着特性評価およびキャラクタリゼーションを実施し、以下の成果を得た。1.フェロシアン化カリウム(K_4Fe(CN)_6)と二価金属(Cu,Ni,Co,Zn)の硝酸塩水溶液を混合することにより、沈殿として不溶性フェロシアン化物を調製した。粉末試料のSEM観察では、非常に細かい超微粒子(約50nm)が集合して、より大きい粉末粒子(約30μm)を形成している。XRDの結果から、KZnFC以外の4種類は、FCC構造の不溶性フェロシアン化物であることが同定できた。Pd^<2+>の吸着前後におけるEPMA分析結果から、イオン交換は主にK^+とPd^<2+>の交換が主体である。

2.不溶性フェロシアン化物の吸着速度は比較的大きく、KCuFCに関しては、10分で99.9%という高い吸着率を示した。吸着速度の序列は、KCuFC>KNiFC>KCoFCであった。Pd^<2+>吸着に及ぼす硝酸濃度の影響を調べ、0.37.0Mの広い硝酸濃度範囲において、90%を超える高い吸着率を得た。KCuFCおよびKCoFCはそれぞれ低硝酸濃度、高硝酸濃度において分配係数は低下したが、KNiFCでは、全領域で99.9%となり、高い吸着率を示した。Pd^<2+>吸着に及ぼす温度の影響は、1070°Cの温度範囲において、80%を超える高い吸着率を得た。KCuFC,KNiFCおよびKCoFCは3050°C付近でPd^<2+>吸着率が最大となった。吸着等温線を作成し、Langmuirプロットを行うことで飽和吸着量を算出し、KCuFCが最も大きい飽和吸着量Q_<max>2.07mmol/gを有することが分かった。Q_<max>の序列は、KCuFC(2.07mmol/g)>KNiFC(1.85mmol/g)>KCoFC(0.96mmol/g)であった。KCuFCにPd^<2+>を飽和吸着させ、400°Cで熱分解し、さらに11.6MHClで処理することで、PdO純度:82.3%の不溶解残渣を得た。3.KCuFCとNa-ALG水溶液の混練ゾルをCa(NO_3)_2溶液中に滴下することで、KCuFCを内包したアルギネートマイクロカプセル(KCuFC-MC)を調製した。SEM観察により、KCuFC-MCの直径は約1mmで、内部および表面に全体的にKCuFCが固定されていることが分かった。さらにEPMAによる分析では、KCuFC-MC中のKCuFC粉末に選択的にPd^<2+>が吸着されていることが分かった。不溶性フェロシアン化物のマイクロカプセル(MC)化およびパラジウムの吸着特性評価、キャラクタリゼーションおよびフィルムの製造を実施し、以下の成果を得た。(1)KCuFC-MCへのPd吸着速度は、25°Cより50°Cで大きく、2dでPd^<2+>吸着率が99%を超えた。0.25MNa^+共存下においても、吸着速度の低下は認めらず、KNiFC-MCはKCuFC-MCよりも吸着速度は小さい。(2)KCuFC-MCは、0.37Mの広い硝酸濃度で、97.5%以上の高いPd^<2+>吸着率を示した。高濃度硝酸共存下で僅かにPd^<2+>吸着率が低下したが、MC構造の崩壊およびH^+とPd^<2+>の競合反応と考えられる。KCuFC-MCは2580°Cの温度で、99%以上という高いPd^<2+>吸着率を示した。KCuFC-MCおよびKMFC-MCの温度依存性は、アルギネートゲル内のPd^<2+>の拡散速度が影響している。(3)KCuFC-MC充填カラムによるPd^<2+>の破過特性を調べ、Feed溶液の硝酸濃度がPd^<2+>破過容量に与える影響は認められない。5Mの硝酸濃度において0.031mmol/gで、破過容量は最大値を示した。流速を更に低下できれば、破過容量の増加が期待できる。(4)Pd^<2+>を吸着させたKCuFC-MCカラムに0.1Mのチオ尿素を通液し、Pd^<2+>の溶出を試みた。43mlの通液により、約92%のPd^<2+>をチオ尿素溶液中に溶出できた。Fe^<3+>も同時に検出されたが、チオ尿素の強力な錯化作用により、KCuFC結晶格子元素の:Fe^<3+>がチオ尿素錯体を形成し、KCuFC結晶格子が崩壊した可能性が示唆される。(5)KCuFCとNa-ALGとの混練ゾルをロ紙上に塗布し、Pd^<2+>の水溶液を噴霧し、ろ紙を支持体として、厚さ数μmのKCuFC内包型アルギネートフィルムシートの調製に成功した。
動的表情パタンの発現・認知によるコミュニケーションを担う頭頂葉皮質神経機構

ニホンザルの大脳皮質頭頂葉後方下部領域は、視覚や聴覚、体性感覚などの複数の感覚と運動が統合される領域であり、口腔顔面運動を制御する領域であることも知られている。ここでは口腔顔面運動に関して、異なる個体間での意味のコミュニケーションに関わる情報処理が行われている可能性が強い。自己の特定の表情発現とともに他個体の同様の表情表出に対しても同様に活動するニューロンがサルの大脳皮質頭頂葉後方下部領域に存在するという結果が得られるならば、サルのこの領域が異なる個体間における意味のコミュニケーションを可能にする上で重要な役割を果たしていると解釈することが可能である。本研究では、この点に関する手がかりを得るために、行動学的および電気生理学的実験を行った。行動学的実験においては、画像解析装置(動作解析システム)により、ニホンザルの顔面上に定めた特定の特徴点の2次元的位置を指標に、視線移動を含む顔面表情の動的変化を経時的に数値化し、それらの軌跡・速度・加速度の時間特性を解析する事によって顔面表情を大きく3つの表情(menacing faceとfrightened face、smacking face)に分類する事ができた。また電気生理学的実験においては、大脳皮質頭頂葉後方下部領域から単一ニューロン活動を慢性的に記録し、このニューロンがコードする行動特徴を動作解析システムによって定量化した。その結果、自己(サル)の特定の行為の実行時とともに、他個体(実験者)の同様な行為を観察する事によっても同様に活動するニューロンを記録した。大脳皮質頭頂葉領域におけるこれらのニューロンの存在は、この領域が行為の意味のコーディングに関わる領域である事を示唆しており、表情によるコミュニケーションにおいても同様なニューロンが存在することを示唆するものであると考える。他者の心的状態を推定する能力(「心の理論」)の萌芽は、身振りや手振りなどの行為を制御・認知する霊長類の脳神経機構に存在する事が期待される。これらの身振りや音声の表出と同様に、「顔の表情」は異なる個体間における意味のコミュニケーションを可能にする上で重要な役割を担うと推測される。自己の特定の表情発現とともに他個体の同様の表情表出に対しても同様に活動するニューロンが存在することが推測され、この様な結果が得られるならば、このことはサルが自己と他者の行為の「意味」の共通性を理解していると解釈することが可能であると考える。本研究ではこの点に関する手がかりを得るために、行動学的および電気生理学的実験を行った。行動学的実験においては、画像解析装置(動作解析システム)により、ニホンザルの顔面上に定めた特定の特徴点の2次元的位置を指標に、視線移動を含む顔面表情の動的変化を経時的に数値化し、それらの軌跡・速度・加速度の時間特性を解析する事によって顔面表情を行為の種類として定量化レて分類した。その結果、menacing faceとfrightened face、smacking faceの3つの表情を分類する事ができた。その結果、自己(サル).の行為とともに他個体の同様な行為を観察することによっても同.様に活動するニューロンを記録した。.これらのニュー口ンの発見は「表情」においても同様なニューロンが存在することを示唆するものであると考える。ここでは口腔顔面運動に関して、異なる個体間での意味のコミュニケーションに関わる惰報処理が行われている可能性が強い。

自己の特定の表情発現とともに他個体の同様の表情表出に対しても同様に活動するニューロンがサルの大脳皮質頭頂葉後方下部領域に存在するという結果が得られるならば、サルのこの領域が異なる個体間における意味のコミュニケーションを可能にする上で重要な役割を果たしていると解釈することが可能である。本研究では、この点に関する手がかりを得るために、行動学的および電気生理学的実験を行った。行動学的実験においては、画像解析装置(動作解析システム)により、ニホンザルの顔面上に定めた特定の特徴点の2次元的位置を指標に、視線移動を含む顔面表情の動的変化を経時的に数値化し、それらの軌跡・速度・加速度の時間特性を解析する事によって顔面表情を大きく3つの表情(menacing faceとfrightened face、smacking face)に分類する事ができた。また電気生理学的実験においては、大脳皮費頭頂葉後方下部領域から単一ニューロン活動を慢性的に記録し、このニューロンがコードする行動特徴を動作解析システムによって定量化した。その結果、自己(サル)の特定の行為の実行時とともに、他個体(実験者)の同様な行為を観察する事によっても同様に活動する.ニューロンを記録した。大脳皮質頭頂葉領域におけるこれらのニューロンの存在は、この領域が行為の意味のコーディングに関わる領域である事を示唆しており、表情によるコミュニケーションにおいても同様なニューロンが存在することを示唆するものであると考える。
分子生物学的根拠に基づく褥瘡ケア評価基準の開発

本研究の目的は、難治性褥瘡のサイトカインの推移と治癒過程の関係を検討することである。さらに、この関係より難治性の褥瘡に対しケアを変更した時に、このケアが有効であるかを早期に評価できる褥瘡ケア評価基準を作成し、評価するこどである。方法は、難治している褥瘡に通常のケアを導入した後にサイトカインと創の変化を調査し、創の病期別にサイトカインの推移の特徴を導いた。サイトカインは貯留した浸出液からIL-1α・1β、bFGF、IL-4、TGF-β1、VEGF、PDGF-ABをケア変更後3日後と7日後に測定し、創は1週間ごと観察した。なお、対象者からは研究協力の承諾を得た。創の変化別にサイトカインの上昇した割合をみると、ポケットの接着はケア変更7日後のVEGFが6/7、肉芽増殖はケア変更3日後のbFGFが8/8、表皮化はケア変更3日後のbFGFが8/10と高率であった。これ基にケア評価基準を作成し、その陽性反応一致率はbFGFが70.0%、VEGFは66.7%であった。以上より、今回開発した褥瘡のケア評価基準は有効と示唆された。褥瘡ケアの良否の評価は、創傷を肉眼的な観察によってのみ、いわば観察者の経験知によって判定している。さらにその判定を行なうには、2週間経過しないと創の状態が変化しない。そのため、望ましいと判断したケアが褥瘡の治癒を遅滞させるだけではなく、悪化させる危険性がある。そこで本研究は褥瘡のケア評価方法を早期にかつ客観的に評価できる分子生物学的視点からサイトカインに注目し、サイトカインによるケア評価基準を開発することを研究の目的とした。そして、今年度は治癒遅滞している褥瘡の形態的分類とサイトカイン(IL-1α・1β、bFGF、IL-4、TGF-β1、VEGF、PDGF-AB)の量の特徴を抽出し、ケア介入後のサイトカインの推移を調査した。対象者20名の調査結果からは、褥瘡の浸出液中からは毎回定量可能なレベルでIL-1α・1β、VEGFが検出されたが、創の治癒が遅滞しているときにはbFGF、IL-4、TGF-β1、VEGF、PDGF-ABは毎回検出されないこともあった。治癒過程との関係では、ずれ予防、創の排泄物による汚染予防や細菌をコントロールする薬剤を使用すると、サイトカインに変化がみられた。ケア介入後1週間後TGF-β1が上昇していると2週間後にポケットの接着を確認できた。ケア介入後3日後bFGFが上昇していると10日目移行に肉芽組織増殖と表皮形成時を認めた。以上より、創の治癒過程からどのような創の変化が次に起こるのかは予測可能であるため、治癒過程の状況より必要時どの項目のサイトカインをいつ調査すればよいのかという指標が見出されたといえる。そこで、来年度はその指標が妥当かを検証する予定である。そこで、本研究は褥瘡のケア評価方法を早期にかつ客観的に評価できる分子生物学的視点からサイトカインに注目し、サイトカインによるケア評価基準を開発することを研究の目的とした。そして、前年度は治癒遅滞している褥瘡の形態的分類とサイトカイン(IL-1α・1β、bFGF、IL-4、TGF-β1、VEGF、PDGF-AB)の量の特徴を抽出し、ケア介入後のサイトカインの推移を調査した。その結果、ケア介入後1週間後TGF-β1が上昇していると2週間後にポケットの接着を確認できた。ケア介入後3日後bFGFが上昇していると10日目移行に肉芽組織増殖と表皮形成を認めた。

そのため、創の治癒過程からどのような創の変化が次に起こるのかは予測可能であるため、治癒過程の状況より必要時どの項目のサイトカインをいつ調査すればよいのかという指標が見出されたといえる。そこで、今年度はその指標が妥当かを検証した。対象者15名にケア介入後に1週間後にTGF-β1と3日後にbFGFを調査した。その結果、TGF-β1の上昇時にはその後60.4%にポケットの接着を確認できた。bFGFの上昇時にはその後70.2%に肉芽組織増殖と表皮形成を確認できた。以上より、本指標は有効と示唆された。
ブラジル移民を対象としたがんの疫学研究

ブラジルを中心とする在外で生活する日系人を対象として、がん発生における遺伝的素因と環境要因との関わりについて疫学的手法を用いて検討している。サンパウロ州における1999年から2001年の3年間の死因統計に基づき年齢調整死亡率(SMR)求め、日本人の統計と比較した。日系人は、悪性腫瘍、自殺死亡が少なく、糖尿病、虚血性心疾患、脳血管疾患、他殺死亡が多いという特徴が観察された。また国勢調査から分母人口の入手可能な日系人1世について1980年、1991年、2000年の3点における死亡率の推移を検討するために、1980年と1991年のデータの整理を行った。乳がんの症例対照研究は、環境要因による発がんの影響を修飾する遺伝素因の役割についての検討を効率的に行えるように、日系人とブラジル人の各々を対象とした2つの症例対照セットに、別の研究費により収集している日本人の症例対照セットを加えた3セットについて、環境要因と遺伝素因についての情報を収集し、両者の相互作用について検討するプロトコールを作成した。関連施設の倫理審査承認後に開始し、これまでに日系人症例109例、ブラジル人症例421例、日本人症例428例、および、ほぼ同数の対照例の調査を終了した。対象者の収集が完了したブラジル人についてBuffy coatからDNAの抽出を開始した。また食物摂取頻度調査票から栄養素摂取量の計算を行った。また平成15年度から開始した食物摂取頻度調査の妥当性研究は、今年度に予定されていたすべての調査が終了し、食事記録のデータベース化・データクリーニング作業を行っている。さらに、大腸腺腫の症例対照研究の実施準備として、米国ハワイ大学および国立がんセンターがん予防・検診研究センターで行われている大腸腺腫の疫学研究と比較可能なプロトコールを作成し、サンパウロ州の病院において研究実施の可能性について検討した。ブラジルを中心とする在外で生活する日系人を対象として、がん発生における遺伝的素因と環境要因との関わりについて疫学的手法を用いて検討した。平成12年度は、日系人と非日系人を対象に実施した胃癌の症例対照研究について、Helicobactor pylori(H.p.)の血清抗体価や胃粘膜萎縮の指標であるペプシノーゲン1、ペプシノーゲン2の血清濃度との関連を解析した。血清ペプシノーゲン1の低値は、両グループ共に、胃癌と関連していたが、1と2の比の低値については、非日系人でのみ関連を認めた。ニトロソ化合物代謝に関連する薬物代謝酵素Cyp2ElのRsaI多型やDNA酸化的損傷の修復酵素hOGGlのSer326Cys多型などの遺伝子多型解析を行い環境要因との相互作用を検討した。非日系人においてCyp2El多型がニトロソ化学物の暴露量の少ない場合に関連してくる事が示唆された。また、発癌に関連すると予想される要因の断面的保有状況を明らかにするために、サンパウロ在住日系人約300名について、生活習慣の調査や血清カロテノイド・ビタミンの測定を行った。そして、これらのデータを米国在住者と比較出来るように、シアトルの研究者と打ち合わせを行った。死因統計の予備的分析結果として、2000年2月分と3月分の日系人の悪性新生物死亡では、胃癌が最も多く、次いで、肺癌であった。さらに、サンパウロにおいて、乳癌の症例対照研究実施のための準備を行った。平成13年度は、日系人と非日系人を対象に実施した胃癌の症例対照研究について、Helicobactor pylori(H.p.)のCagA血清抗体を測定し、症例対照間および人種間差について検討した。対照の抗体陽性率に人種間差は認められなかったが、症例対照間差については、非日系人において、胃癌とのより強い関連が認められた。また、DNA酸化的損傷の修復酵素hOGG1のSer326Cys多型解析を行い環境要因との相互作用を検討した結果、症例対照間差よりも人種間差の方が顕著であった。症例数の多い非日系人において、胃癌との関連が示唆された喫煙、野菜摂取頻度、牛肉摂取頻度と、hOGG1多型との相互作用を検討した。その結果、Ser/Ser多型において喫煙がリスク要因となる一方、Cysを含む多型では関連を認めなかった。しかしながら、相互作用に関する統計的有意性は検出されなかった。そして、乳癌の症例対照研究を関連施設の倫理審査承認後に開始し、現時点で、非日系人乳癌症例110例、日系人乳癌症例10例、および、ほぼ同数の対照例の調査を終了した。さらに、サンパウロ州における死因統計作成のため、1999年から2001年の3年間について、日系人データの抽出作業を行い、2000年死亡例について、暫定的解析を行った。日本生まれの1世の死亡票1154例、二世以上の日系人と思われるものの死亡票1468例が収集された。年齢分布が大きく異なるために単純な比較は出来ないが、がん死亡については、一世男性では胃(24%)、二世以降男性では肺(16%)、一世女性では胃(16%)、二世以降女性では乳房(21%)が最も頻度の多い部位であった。

サンパウロ州における1999年から2001年の3年間の死因統計に基づいて、がんの年齢調整死亡割合比を求め、世代別に日本の統計と比較した。二世以降の女性を除き、胃がんが最頻のがん死因であり、前立腺がんや乳がんが相対的に頻度が高く、肝臓がんが低いというのが特色であった。また、ブラジル在住の日系人と非日系人に加えて、日本在住者を対象に実施した3セットの胃がんの症例対照研究において、Helicobactor pylori(H.p.)の血清抗体価、CagA血清抗体価、ペプシノーゲンの血清濃度について、症例対照間、人種間、および、居住国間の差異を非噴門部がんに限り検討した。H.p.とCagAを組み合わせて検討すると、対照のH.p.、またはCagAのいずれかの抗体陽性率は、日系人74%、ブラジル人80%、日本人64%であったのに対して、症例の陽性率は、日系人84%、ブラジル人93%、日本人92%であった。H.p.もCagAもいずれも陰性に対するオッズ比は、各々、1.8、2.2、6.9であり、対照の抗体陽性率の最も低かった日本人において、非常に強い関連が認められた。対照における血清ペプシノーゲンに基づいて判定した萎縮性胃炎保有者の割合は、日系人19%、ブラジル人22%、日本人8%であったのに対して、症例は、日系人36%、ブラジル人48%、日本人22%であり、人種間差よりも居住国差の方が大きかった。そして、乳がんの症例対照研究を関連施設の倫理審査承認後に開始し、昨年末時点で、非日系人乳がん症例322例、日系人乳がん症例36例、および、ほぼ同数の対照例の調査を終了した。ブラジルを中心とする在外で生活する日系人を対象として、がん発生における遺伝的素因と環境要因との関わりについて疫学的手法を用いて検討している。サンパウロ州における1999年から2001年の3年間の死因統計に基づき、がんの年齢調整死亡率(SMR)求め、日本人またはサンパウロ州在住ブラジル人の統計と比較した。日系人のがん死亡は、胃がん・大腸がん死亡は日本人と変わらず、肝がん・胆のうがん・肺がん死亡が少なく、前立腺がん・乳がん・子宮がん・脳腫瘍死亡が多いという特徴が観察された。また、日系人とブラジル人に加えて、日本在住者を対象に実施した胃がんの症例対照セットに対してhOGG1のSer326Cys遺伝子多型解析を行った。その結果、すでに解析が終わっている日系人とブラジル人のセットと比べると、遺伝子多型頻度は、日本人、日系人、ブラジル人の順で変異型を持つ割合が高く、人種間に違いが見られたが、症例対照間ではいずれの人種でも差がなかった。Helicobacter pylori感染、萎縮性胃炎、喫煙とhOGG1多型との相互作用を検討したところ、ブラジル在住者では有意な違いが見られなかったが、日本人では萎縮性胃炎の胃がんに対するリスクがhOGG1多型により有意に異なることが明らかになった。乳がんの症例対照研究を関連施設の倫理審査承認後に開始し、これまでに日系人症例63例、ブラジル人症例421例、日本人症例305例、および、ほぼ同数の対照例の調査を終了した。また食物摂取頻度調査の妥当性研究を開始し、55人の日系人とブラジル人の対象者に対して食物摂取頻度調査1回と4日間の食事記録調査を2回(冬と夏)行った。
ヒトCD5^+Bリンパ球におけるapoptosis関連遺伝子の発現の検討

今回の研究ではCD+Bリンパ球におけるアポトーシス関連遺伝子の変異などの異常が自己免疫疾患やBリンパ系腫瘍の発症と関連性を有するのではないかと考え、この仮説を基に実験をすすめた。ヒト扁桃より高純度のB細胞を採取して標的細胞とし、Fas抗原の発現とCD5抗原の発現には相関性があるかどうかを検討した。無刺激Bリンパ球ではFas抗原の発現は認められなかったが、マイトゲン刺激B細胞ではFas抗原を発現しており、これらの細胞群はCD5抗原も同時に発現していた。次にマイトゲン刺激B細胞群をCD5+BとCD5-Bに分離してBcl-2抗原の発現について検討した所、Bcl-2の発現はCD5+、CD5-B細胞ともに同程度に認められ、BCl-2の発現とCD5抗原の発現には相関性はないものと考えられた。次にCD5+B細胞に抗Fas抗体を添加して培養したが、これらの細胞群にアポトーシスを誘導することが出来なかった。したがってCD5+Bリンパ球はFas抗原のみではアポトーシスに陥らないと考えられた。次の実験ではCD5抗原の発現の意義を明らかにすることを目的とした。Bリンパ球の成熟過程に重要な役割を演じるCD40を介するB細胞の増殖、分化の実験系をin vitroで作成し、ここに抗CD5抗体を添加してBリンパ球の機能に及ぼす影響を調べた。抗CD5抗体はBリンパ球の増殖能には影響を及ぼさなかったが、抗体産生能を濃度依存的に抑制した。B細胞サブセットでは抗CD5抗体添加培養群において記憶B細胞の比率が増加し、germinal centerB細胞や、処女B細胞の比率が低下していた。この結果からCD5抗原を介するシグナルが記憶B細胞への分化を誘導し、形質細胞への分化を阻止するように作用することが示唆された。今後、CD5抗原を発現した記憶B細胞とFas抗原、及びアポートシスの関連性について検討を加えてゆく予定である。自己免疫疾患の発症および悪性Bリンパ腫の発症におけるCD5^+Bリンパ球の関与の可能性が報告されてきたが、本研究ではヒトCD5^+Bリンパ球におけるapoptosis関連遺伝子の発現の異常が、これらに関連しているかどうかを検討することを目的とした。最初に正常人ヒトCD5^+Bリンパ球におけるapoptosis関連遺伝子の発現の特異性の有無について検討した。すなわちCD5^+、CD5^-Bの両リンパ球においてapoptosis関連遺伝子、Bcl-2及びFasの遺伝子産物の発現が異なっているかどうかを検討した。両リンパ球を分離してimmunoenzymatic stainingh法及びreverse transcriptasepolymerase chain reaction法にて検討した結果、Bcl-2遺伝子の産物の発現は、量的にも質的にも両者において相違が認められなかった。しかしFas抗原の発現は、CD5^+Bリンパ球集団においてより多く認められた。次にCD5^+Bリンパ球を抗Fas抗体と共存させて培養し、apoptosisが誘導されるか否かを調べた。CD5^+Bリンパ球は、抗Fas抗体の共存のみにおいてはapoptosisを生じなかった。これらの結果は、CD5^+Bリンパ球ではFas抗原を介するsignalのみではapoptosisを誘導し得ないことを示唆している。我々は前回の研究で、CD5^+Bリンパ球はCD5抗原を介し、抗体産生細胞への分化に対するnegative signalをうける可能性を示唆する結果を得ている。

このことを合わせ考えると、CD5^+Bリンパ球のapoptosis誘導にはFas抗原とCD5^+抗原の両者を介するsignalが必要である可能性が考えられ、現在この点について更に研究をすすめている。今回の実験においてはpolyclonalなstimulationによってCD5^+Bリンパ球を増加させたが、今後抗原特異的Tリンパ球依存型による刺激にてCD5^+Bリンパ球が増加するかどうかを検討しT細胞の関与の有無について検討してゆく予定である。平成6年度の実験結果をもとにして、7年度の研究では活性化Bリンパ球に発現されるCD5抗原の意義を明らかにすることを目的とした。Bリンパ球はリンパ組織で処女Bから記憶B細胞か形質細胞に分化するが、どちらの方向に分化するかという選択性に関してはCD40抗原を介するT細胞とB細胞の相互作用が重要であることが最近判明してきた。これをin vitroで再現するためにCDw32L細胞を培養皿にcoatingして、ここに抗CD40単クロン抗体を添加してBリンパ球を培養する実験系を作成した。この系で培養したB細胞のDNA合成能を測定することによって増殖能を、また上清に分泌された免疫グロブリン量をELISA法で測定して抗体産生能を調べることによりBリンパ球の分化能を判定することができる。ここに抗CD5単クロン抗体を添加してCD5抗原の作用を調べた。結果は、抗CD5抗体はBリンパ球の増殖反応にはなんら影響をおよぼさなかったが、抗体産生能を濃度依存的に抑制した。次にこの抑制のシグナルはBリンパ球の成熟にいかなる影響を与えるかを調べるため、培養Bリンパ球を抗CD38単クロン抗体と抗IgD単クロン抗体を用いた蛍光抗体二重染色法にて染色してフローサイトメトリーで解析した。抗CD5抗体添加群ではCD38-、sIgD-細胞(記憶B細胞フェノタイプ)の比率が増加し、CD38+sIgD+細胞(germinal centerB細胞フェノタイプ)やCD38-、sIgD+細胞(処女B細胞フェノタイプ)の比率が低下していた。この結果はCD5抗原を解するシグナルが、処女B細胞からGerminal centerB細胞を経て記憶B細胞への分化を阻止する方向に作用していることを示唆する。今後はこのCD5抗原の作用と、CD5+B細胞に発現されるFas抗原とそのアポトーシス作用の関係についてさらに検討を加えてゆく予定である。
植物受精卵の極性形成および不等分裂機構の解明

被子植物の受精卵第一分裂により生じる頂端および基部細胞は異なる分化能をもっており、この分裂過程は植物生活環における最初の発生・分化のステップである。本研究では、イネin vitro受精系や単細胞オーム解析などにより、それぞれの細胞で特異的に発現する遺伝子の同定に成功した。また、卵細胞アクチン繊維の可視化形質転換体の作出により、受精卵の極性形成時におけるアクチン繊維の動態観察が可能となった。本研究課題では、イネin vitro受精系を用いることで、受精によりイネ受精卵中で発現が誘導され、かつ、イネ受精卵中の頂端部または基部に極性分布しているmRNAをマクロアレイ解析で網羅的に同定し、それらmRNAの受精卵中における細胞内局在機構を明らかにすることで、植物の胚発生過程の最初におこる細胞分化の機構の一端を明らかにすることを主な自的とした。また、細胞内における物質輸送に深く関与しているアクチン繊維および微小管を蛍光タンパク質で可視化した形質転換植物を作製し、それらの配偶子をin vitro受精させることで、受精卵の極性形成過程における細胞骨格の動態を明らかにすることも研究目的の一環とした。イネ卵細胞、受精卵、2細胞胚、頂端細胞、基部細胞を用いて1細胞・胚からcDNAを合成・増幅し、そのcDNAをテンプレートとしてcRNAプローブを作製しマイクロアレイ解析を行った。その結果、受精卵頂端部または基部に局在すると推定されたmRNAをコードする候補遺伝子を10程度同定したが、アレイデータのノイズが大きいのが候補遺伝数を増やせない原因であったことから、cDNAを合成・増幅過程を改変することで、よりノイズの小さいアレイデータを得ることで、候補遺伝子数を増やす予定である。また、受精卵の極性形成に関与すると推定される細胞骨格(アクチン繊維)を蛍光タンパク質により可視化する目的で、AtFimbABD2-GFPを発現する形質転換イネ作製を作成した。しかしながら、根の表皮細胞等ではアクチン繊維の可視化が確認できたが、卵細胞および受精卵中ではAtFimbABD2-GFP自体の蛍光が観察されなかった。このことは、プロモーターを卵細胞高発現プロモーターに置換した形質転換体の必要性が示している。本研究課題では、イネin vitro受精系を用いることで、受精によりイネ受精卵中で発現が誘導され、かつ、イネ受精卵中の頂端部または基部に極性分布しているmRNAをマクロアレイ解析で網羅的に同定し、それらmRNAの受精卵中における細胞内局在機構を明らかにすることで、植物の胚発生過程の最初におこる細胞分化の機構の一端を明らかにすることを主な目的とした。また、細胞内における物質輸送に深く関与しているアクチン繊維を蛍光タンパク質で可視化した形質転換植物を作製し、それらの配偶子をin vitro受精させることで、受精卵の極性形成過程における細胞骨格の動態を明らかにすることも研究目的の一環とした。その結果、「受精卵で発現し、かつ、2細胞胚の頂端細胞でのみ発現する遺伝子」および「受精卵で発現し、かつ、2細胞胚の基部細胞でのみ発現する遺伝子」の候補が同定された。イネ受精卵中では、約14,000個の遺伝子が発現しており、そのうちの約0.5-1%の遺伝子転写産物が、頂端または基部細胞のみで検出された。このことは、特定のmRNA群が受精卵中で極性分布している、あるいは2細胞胚中の一方の細胞内で分解を受けることを示唆する。また、受精卵の極性形成に関与すると推定される細胞骨格(アクチン繊維)を蛍光タンパク質により可視化する目的で、AtFimbABD2-GFPを発現する形質転換イネの作製を試みた。その結果、卵細胞のアクチン繊維が可視化された形質転換体が5ライン得られた。

「卵細胞/受精卵で発現し、かつ、2細胞胚の頂端細胞でのみ発現する遺伝子」および「卵細胞/受精卵で発現し、かつ、2細胞胚の基部細胞でのみ発現する遺伝子」を絞り込んだところ、2細胞胚の頂端細胞でのみ発現する遺伝子が61個、基部細胞でのみ発現する遺伝子が57個それぞれ同定された。また、受精卵の極性形成に関与すると推定される細胞骨格(アクチン繊維)を蛍光タンパク質により可視化する目的で、Fimbrin-GFPおよびLifeact-tagRFPを発現させた形質転換イネを作製し、蛍光顕微鏡により卵細胞のアクチン繊維が可視化されているラインを選抜した。詳細な観察の結果、イネ卵細胞中ではLifeact-tagRFPによって太く長いアクチン繊維が標識される一方で、Fimbrin-GFPでは細かいアクチン繊維が標識されることが明らかになった。
新規骨格を有するNF-kappa B阻害剤の探索と難治性がん治療への応用

転移の抑制剤は副作用の少ない抗がん剤として期待される。私たちの発見したNF-kappa B阻害剤DHMEQは動物実験で多くの疾患モデルを抑制するが、不安定性の問題点がある。今回、より安定で、新規骨格のDHMEQ誘導体SEMBLをデザイン・合成した。SEMBLは卵巣がん細胞の遊走・浸潤をDHMEQよりより強く抑制した。(2017論文発表)。植物の葉から得られる新規フラボノイドdesmalもNF-kappa Bを阻害し、卵巣がん細胞の遊走・浸潤を阻害することを見出した(2016論文発表)。これらの化合物は転移の機構解析や新しい抗がん剤のシードとして有用と考えられる。新規epoxide-free (-)-DHMEQ誘導体の生物活性:私たちが発見した特異性が高いNF-kappa B阻害剤(-)-DHMEQはNF-kappa B構成因子のp65やRelBの特異的cysteineに共有結合してDNA結合能を消失させる。一方、(-)-DHMEQは構造にcysteine結合部位であるepoxideを有しているが、epoxideは反応性が高く、安定性を低下させると考えられるのでepoxideのかわりにexomethylene carbonylを導入したExo-ene EQを分子デザインして合成している。Exo-ene EQは(-)-DHMEQと同等の濃度でp65とkappa B DNAの結合を阻害し、マクロファージ様マウスRAW264.7細胞においてLPSに誘導される炎症因子の発現と分泌を抑制する。線維芽細胞腫HT1080細胞のMatrigel浸潤も抑制することがわかっている。H26年度に悪性度の高い明細胞卵巣がんES-2細胞の遊走と浸潤を抑制することがわかった。さらに水溶液中の安定性を調べ、Exo-ene EQは(-)-DHMEQよりPBS中で安定で、より活性が強く保たれることがわかった。現在、DHMEQは抗炎症剤、抗癌剤として開発が進んでいるが、Exo-ene EQはDHMEQより合成が容易であり、より安定で、第二世代DHMEQとして将来開発される可能性がある。新しいNF-kappa B阻害剤のスクリーニング:約1500株の放線菌の培養液から、培養マクロファージ細胞を用いてLPSに誘導されるiNOS-NO産生の阻害剤をスクリーニングした。すでに既知物質quercetinやquercetin glycosideが単離され、そのほかの化合物も構造決定の途中にある。NF-kappa Bを阻害する新規物質および新規活性物質の発見を目指している。新しいepoxide-free DHMEQ誘導体の合成と生物活性:NF-kappa B阻害剤DHMEQは多くの動物疾患モデルを抑制する。安定性や特異性を軽減させるepoxideのないDHMEQ誘導体SEMBL(exo-ene EQから改名)を既にデザイン・合成した。今までに培養細胞で炎症性サイトカインの発現抑制や浸潤抑制を明らかにしている。27年度、動物実験や機構研究のため再度、合成した。それを使ってHPLCの条件を決め、水溶液中での安定性を残存量で調べ、DHMEQより顕著に安定であることがわかった。これらの結果は投稿準備中である。植物由来フラボノイドdesmalによるNF-kappa Bとがん細胞浸潤の抑制:既に約3000株の放線菌からマクロファージにおけるLPS誘導NO産生阻害剤のスクリーニングを行った。その結果、放線菌1株の培養液から既知物質のgenistein、genistein 7-O-alpha-L-rhamnoside、daidzein 7-O-alpha-L-rhamnosideが得られた。これらはフラボン化合物であることから、次に私たちがチロシンキナーゼ阻害剤として、以前にタイの植物Desmos chinensisの葉から単離した新規フラボンdesmalの活性を調べた。その結果、desmalはgenisteinと同等にLPSに誘導されるNO産生を阻害し、さらに上流シグナルのNF-kappa Bの活性化を阻害することがわかった。さらにヒト明細胞卵巣がんES-2細胞を用いて、遊走と浸潤の阻害活性を調べたところ、desmalはいずれにも毒性を示さない濃度で阻害活性を示した。機構解析の結果、desmalは浸潤に関与するurokinase-type plasminogen activator (uPA)の発現を低下させた。これらの結果は27年度論文発表した。本プロジェクトで26年度から研究しているepoxideのないDHMEQ誘導体は前年度までexo-ene EQと呼んでいたが、化合物名(S)-beta-salicyloylamino-alpha-exo-methylene -ganmmaーbutyrolactoneを省略してSEMBLと呼ぶようにした。この化合物はDHMEQと同等またはより高いNF-kappa B阻害活性を示し、難治性の卵巣がんのなかでも難治性の高い明細胞卵巣がん細胞の遊走・浸潤を阻害する。今年度はHPLCを用いて解析し、水溶液中でDHMEQより優れた安定性を示すことがわかった。一方で、本プロジェクトで行っている放線菌からの新しいNF-kappa B阻害剤スクリーニングにおいて放線菌培養液から既知フラボン類が活性物質として得られ、それをヒントに新規植物性フラボンのdesmalが候補に浮かび、そのNF-kappa B阻害活性と明細胞卵巣がん細胞の遊走・浸潤阻害活性を示すことができた(27年度論文発表済み)。年度毎に新しい骨格のNF-kappa B阻害剤を見出し、目的の生物活性を示すことを目標にしてきて、そのとおりに進展しているので「おおむね順調」とした。

がん・白血病や難治性炎症疾患に対する副作用の少ない分子標的医薬が求められている。そして私たちはNF-kappa B阻害剤DHMEQを分子デザインにより発見し、その作用機構を明らかにするとともにがん・白血病を含む数十の疾患動物モデルで、顕著な抑制作用があることを示した。しかし、この化合物は血液中で不安定という短所がある。そこで本研究では、より安定で新しい骨格のNF-kappa B阻害剤を天然物スクリーニングおよびDHMEQの一部骨格を利用した分子デザインから探索した。その結果、微生物からのスクリーニングで、既知フラボンのquercetinとdaidzeinが見出され、さらに研究室の新規フラボンライブラリーから植物由来desmalがNF-kappa B阻害剤であることがわかった。desmalはマクロファージ細胞においてLPS誘導NO産生を阻害し、ヒト卵巣がん細胞においては細胞遊走と浸潤を阻害した(論文は発表済み)。一方、DHMEQのNF-kappa B阻害機構として、p65, p50, RelBなどの特異的cysteine SHに共有結合してDNA結合能を阻害することが知られている。そこで、SHが結合するepoxideのかわりにexomethylene carbonylを導入した、骨格の異なるDHMEQ誘導体SEMBLをデザインして合成した。SEMBLはDHMEQと同等のNF-kappa B阻害活性を示し、培養細胞においては、より強くNF-kappa Bを阻害し、下流のiNOS発現、NO産生、各種サイトカイン分泌を阻害した。卵巣がん細胞においては、より強く遊走と浸潤を阻害した。さらにSEMBLは水溶液中ではDHMEQより高い安定性がみられた(論文発表済み)。そのほか、先行しているDHMEQの多くの抗がん活性・抗転移・抗炎症活性を培養細胞と動物実験で示した。転移の抑制剤は副作用の少ない抗がん剤として期待される。私たちの発見したNF-kappa B阻害剤DHMEQは動物実験で多くの疾患モデルを抑制するが、不安定性の問題点がある。今回、より安定で、新規骨格のDHMEQ誘導体SEMBLをデザイン・合成した。SEMBLは卵巣がん細胞の遊走・浸潤をDHMEQよりより強く抑制した。(2017論文発表)。植物の葉から得られる新規フラボノイドdesmalもNF-kappa Bを阻害し、卵巣がん細胞の遊走・浸潤を阻害することを見出した(2016論文発表)。これらの化合物は転移の機構解析や新しい抗がん剤のシードとして有用と考えられる。新しい(-)-DHMEQ誘導体であるExo-ene EQが水溶液中で、より安定なことが示せたのは、有用性が理解されることで大きな進展だった。さらに、特に悪性度の高い明細胞卵巣がん細胞の遊走と浸潤を抑えられることも示すことができた。
ナノメートル単位での触媒的反応空間制御と細胞内のタンパク質構造解析への応用

タンパク質1分子の大きさはおおよそ510 nmである。一方で、研究代表者は一電子移動触媒を使ったラジカル反応を用いたタンパク質の共有結合形成反応(ラベル化)を見出している。また、前年度までの知見により、ラベル化に用いる低分子化合物(ラベル化剤)のラジカル種の安定性を制御することで、触媒からのラベル化の有効距離を数nm数十nmで制御することが可能であることが示唆されていた。触媒から数nmの距離で完結する反応は、“タンパク質の部位特異的ラベル化"に応用でき、触媒から数十nm以上の有効距離によるラベル化は“タンパク質の会合状態を検出する方法"に発展できる。最終年度である2018年度では1)触媒からごく近接した空間(< 2nm)で選択的に起きるラベル化反応の応用、と2)触媒から数十nmの空間で起きるラベル化反応の応用を研究し、以下の成果を得るに至った。1)触媒周辺のチロシン残基と共有結合を形成するラベル化剤を2018年度開始までに見出していた。触媒とリガンドを担持した磁気ビーズを作成し、ビーズ表面から数nmの局所空間で選択的にタンパク質のチロシン残基を修飾する手法を開発し、一過性の分子認識の解析、抗体の部位特異的修飾に成功した。本研究課題ではラジカル反応による触媒的なタンパク質ラベル化と、ラジカル種の安定性制御による触媒周辺の反応空間制御という新しい概念を提唱することができたと考えている。今後の発展により、タンパク質部位特異的修飾、タンパク質によるリガンド認識、タンパク質間相互作用の解析における有用な手法論への発展が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質1分子の大きさはおおよそ510 nmであり、タンパク質-タンパク質相互作用におけるタンパク質間の距離を考慮すると、触媒から数nmの距離で完結する反応は“タンパク質の部位特異的ラベル化"に応用できる。また。触媒から数十nm以上の反応有効空間を達成することで、“タンパク質の会合状態を検出する方法"の開発に直結する。H27年度の成果においては、ラジカル反応誘起触媒と反応点の位置を精密に制御する実験系と、細胞の任意のオルガネラに触媒を導入する実験系を構築した。ラジカル反応誘起触媒ー反応点距離の精密制御:申請者はこれまでに、Ru光触媒を用いたタンパク質チロシン残基の修飾法を開発してきた。この修飾反応においてチロシン残基からRu錯体へと一電子が移動する過程は生体環境下での一電子移動範囲を考慮するとRu錯体から数nmの範囲で完結すると考え,このRu錯体とチロシン残基の反応点間距離を解明することを目的とした。本年度、新たに作成したRu錯体ーpoly Pro linkerーTyr残基のペプチドでは、同一分子内に触媒部位と反応店部位を持ち、nmスケール以下での反応点間の距離調節が可能になった。本ペプチドを用いた実験によって、反応点間距離の重要性を明らかにするとともに、触媒からの特定の反応有効距離を持つ修飾剤をスクリーニング的に評価する実験系を構築することに成功した。さらに、細胞内環境でタンパク質複合体解析を可能にする基盤技術開発に向けて、有用な実験系を確立することができた。すなわち、細胞内にラジカル有機触媒となる特定のperoxidaseを発現させ、それを用いたタンパク質修飾を評価する実験系を構築した。これにより、細胞内環境で機能するタンパク質修飾剤のスクリーニングが可能になった。これは、次年度以降の研究計画の足掛かりとなる重要な結果であると考える。H27年度の達成目標は、ラジカル誘起触媒と反応点となるチロシン残基間の距離を精密に制御できるペプチド基質の開発と、それを用いたnmスケールの反応有効距離を持つ修飾剤の創成であった。H27年度の結果においては反応点間の距離を制御したペプチドを合成し、それを用いた評価系によって反応点間距離の重要性を明らかにするとともに、触媒からの特定の反応有効距離を持つ修飾剤をスクリーニング的に評価する実験系を構築することに成功した。また、修飾剤、触媒の酸化還元電位測定により、ある程度系統的に、修飾剤の構造ー機能性を予測することが可能になりつつある。現在は適切な、修飾剤の合成、選定に発展しており、異なるラジカル種寿命を持つ修飾剤を効率的に入手するための評価系構築に研究が進展している。さらに、H28年度以降に計画していた、細胞内環境で機能するラジカル的タンパク質修飾剤についても着手した。具体的には細胞内の特定のオルガネラ局在タンパク質にperoxidaseをタグとして発現させ、それをラジカル誘起触媒として、細胞内のタンパク質ラベル化を行った。本実験系の構築により、細胞内環境でのタンパク質ラベル化、タンパク質複合体解析に適用できる修飾剤、ラベル化手法への発展に繋がると期待される。以上の結果より、研究開始当初の計画以上に順調に進行していると評価した。タンパク質1分子の大きさはおおよそ510 nmであり、タンパク質-タンパク質相互作用におけるタンパク質間の距離を考慮すると、触媒から数nmの距離で完結する反応は、“タンパク質の部位特異的ラベル化"に応用できる。また、触媒から数十nm以上の反応有効空間を達成することで、“タンパク質の会合状態を検出する方法"の発展に直結する。平成28年度までの成果で、以下の項目を達成している。1.Ru光触媒によるTyr残基修飾の反応有効距離の精査