hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写伸長反応における制御機構の研究

転写反応は開始・伸長・終結の三段階に分類されている.私の研究対象であるNELFという転写因子は当研究室で精製・同定された新規の転写伸長因子であり、試験管内では転写伸長を負に制御する事が分かっている.しかし、NELFの細胞内における転写伸長制御機構に関してはまだ明らかにされていない.当研究室ではNELFが細胞周期の細胞分裂期(M期)、及びDNAダメージを受けた時にリン酸化されるデタが得ている.従って、私はNELFが細胞周期(特にM期)、及びDNAダメージによる転写伸長反応の制御機構に関わっていると推測し、この関係の解明を目的とした.NELFの細胞内機能に関しては下記の方針を用いて解析を進めている.1,NELFの細胞内局在の解析蛍光タンパク質EYFPを付加したNELFを恒常的に発現するHeLa細胞株を樹立した.蛍光顕微鏡法を用いてこの細胞株の解析を行った結果,NELFは細胞周期、及びDNAダメージによって核内における局在が変化する事を明らかにした.そこで現在、この変化がNELFのリン酸化によるものだと考え、生化学的手法を用いて解析を行っている.2,NELFの細胞内相互作用因子の同定恒常的にFlag-tagNELF融合タンパク質を発現するHeLa細胞株を樹立した.この細胞株からM期の細胞、及びDNAダメージを受けた細胞の核抽出液を取り、抗Flag免疫沈降法を用いてNELFに相互作用する因子を精製した.今後、精製されたタンパク質の同定を質量分析計を用いて行う.3.NELFの発現量を減少させた細胞(ノックダウン細胞)の解析RNAi法を用いてNELFノックダウンHeLa細胞株を樹立した一今後、NELFノックダウン細胞の細胞周期、DNAダメージ感受性、及び遺伝子発現プロファイルの解析を行う.転写反応は開始・伸長・終結の三段階に分類されている.私の研究対象であるNELFという転写因子は当研究室で精製・同定された新規の転写伸長因子であり、試験管内では転写伸長を負に制御する事が分かっている.しかし、NELFの細胞内における転写伸長制御機構に関してはまだ明らかにされていない.当研究室ではNELFが細胞周期の細胞分裂期(M期)、及びDNAダメージを受けた時にリン酸化されるデタが得ている.従って、私はNELFが細胞周期(特にM期)、及びDNAダメージによる転写伸長反応の制御機構に関わっていると推測し、この関係の解明を目的とした.NELFの細胞内機能に関しては下記の方針を用いて解析を進めている.1,NELFの細胞内局在の解析蛍光タンパク質EYFPを付加したNELFを恒常的に発現するHeLa細胞株を樹立した.蛍光顕微鏡法を用いてこの細胞株の解析を行った結果,NELFは細胞周期、及びDNAダメージによって核内における局在が変化する事を明らかにした.そこで現在、この変化がNELFのリン酸化によるものだと考え、生化学的手法を用いて解析を行っている.2,NELFの細胞内相互作用因子の同定恒常的にFlag-tagNELF融合タンパク質を発現するHeLa細胞株を樹立した.この細胞株からM期の細胞、及びDNAダメージを受けた細胞の核抽出液を取り、抗Flag免疫沈降法を用いてNELFに相互作用する因子を精製した.今後、精製されたタンパク質の同定を質量分析計を用いて行う.3.NELFの発現量を減少させた細胞(ノックダウン細胞)の解析RNAi法を用いてNELFノックダウンHeLa細胞株を樹立した一今後、NELFノックダウン細胞の細胞周期、DNAダメージ感受性、及び遺伝子発現プロファイルの解析を行う.
筋骨格系の運動プリミティブに基づいた運動生成モデルとロボット制御への応用

手首運動に関係する筋活動から手首の動きを生成(再構成)できる手首モデルを構築し、様々な手首運動から抽出した運動プリミティブの機能的な意味を付与した。つまり単純な運動指令(一つの運動プリミティブ)で行われるStep-tracking運動では、主に静止ターゲットに対する位置制御が行われることに対し、複数の運動プリミティブの滑らかな組み合わせをもつ追跡運動では滑らかに動くターゲットの動きを再構成するために位置と速度制御を同時に行っていることが分かった。さらに追跡運動の運動プリミティブにおいて、低周波数領域では速度制御優位の運動指令が、高周波数領域では位置制御優位の運動指令が主に含まれていることを確認でき、これらの異なる運動指令をもつ2つの制御器が並列に動作して追跡運動を行っていることが明らかになった。手首運動中の筋電信号から筋骨格系の運動プリミティブを抽出し、それを基づいた新しい運動の計画や生成が可能なモデルを作るためには、手首運動とその原因の運動指令である複数の筋活動との関係を詳細に分析する必要がある。初年度には各運動プリミティブ間の筋活動パターンから「運動プリミティブの滑らかな組み合わせ」に対する脳内のメカニズムを運動指令レベルから明らかにし、「単純な運動指令の滑らかな組み合わせ」で様々な新しい運動が生成できる手首運動制御モデルを作ることを目指した。特に様々な運動プリミティブをもつ手首運動において、筋活動とキネマティクスの因果関係を関節トルクレベルから同定を行い、運動中の筋活動から運動制御における機能的な意味を抽出した。実験の結果として、単純な運動指令(一つの運動プリミティブ)で行われるStep-tracking運動では主に静止ターゲットに対する位置制御が行われることに対し、複数の運動プリミティブの滑らかな組み合わせをもつ追跡運動では滑らかに動くターゲットの動きを再構成するために位置と速度制御を同時に行っていることが明らかになった(Lee et al. Mobiligence 2009)。この結果から解釈すると、運動プリミティブの生成に対する脳内のメカニズムの基本は単純な位置制御として計画され、複数の運動プリミティブを滑らかに組み合わせるために速度制御が並列に付加されることが明らかになった。さらに我々はこの解析方法を東京都立神経病院の入院患者の協力を得て、小脳疾患における運動プリミティブの病態についても検討し、小脳疾患のタイプの違いによる筋骨格系の運動プリミティブの特徴が病態の解明や評価に役に立つことが認められた(国内特許を出願する予定)。今後は運動プリミティブの正常-疾患比較の観点からプリミティブ生成に関わる中枢神経機構の解明を試みる。今年度は1年目の成果に解剖学的及び生理学的な知識を統合し、各運動プリミティブ間の筋活動パターンから「運動プリミティブの滑らかな組み合わせ」に対する脳内のメカニズムを運動指令レベルから明らかにし、「単純な運動指令の滑らかな組み合わせ」で様々な新しい運動が生成できる手首運動制御モデルを作ることを目指した。特に我々は単純な軌道と速度をもつ運動プリミティブに基づいた手首運動の生成モデルを構築するために、一定な軌道と速度をもつ指標を追跡する手首運動を実験課題として行った。そして、様々な指標追跡手首運動において各運動プリミティブ間の筋活動パターンから「運動プリミティブの滑らかな組み合わせに対する脳内のメカニズム」を分析した。その結果、指標追跡運動には、指標との誤差を修正するフィードバック制御器と、指標の動きを予測するフィードフォワード制御器という2つの並列制御系が機能し、2つの制御器からの制御信号が混ぜ合わせられた運動指令(筋活動)によって追跡運動が行われていることを明らかにし、その研究成果を国際学会(Society of Neuroscienece 2010, Neuro2010など)に発表し、現在論文も投稿準備中である。さらにこの並列制御器に基づいた各運動プリミティブの特徴抽出方法が神経疾患による病態の解明や評価に役に立つことが認められ、国内および国際特許(国内特許:特願2010-042301、国際特許:12/807.861)を出願した。今後脳卒中のリハビリにおける機能回復過程を同様の手法で経時的に追跡し、脳卒中患者の機能回復過程を運動プリミティブ生成や回復の観点から評価することを試みる。
メダカを用いたパーキンソン病の遺伝学的研究

パーキンソン病のリスク遺伝子であるGBAー/ーメダカは、脳内神経炎症を伴った神経細胞死とα-Syn蓄積を示す。本研究では、同変異メダカにおいて、神経炎症の病態への関与を解析した。CRISPR/Cas9により、TLRsのアダプター分子であるメダカMyD88とTRIF遺伝子の破壊に成功した。MyD88ー/ー、TRIFー/ーメダカ共に、明らかな表現型の異常を認めなかった。そこで、GBAー/ーMyD88ー/ー、GBAー/ーTRIFー/ーメダカの解析を行ったが、GBAー/ーメダカと比較して神経細胞脱落や生存期間の改善を認めず、MyD88とTRIFを介したシグナル経路の病態への関与は明らかでなかった。まず、メダカMyD88とTRIFをクローニングし、コーディングリージョンの塩基配列を決定した。メダカMyD88は288アミノ酸、メダカTRIFは577アミノ酸よりなる蛋白質であった。次にCRISPR/Cas9systemによる遺伝子破壊を試みた。いずれの遺伝子についても3種類のcrRNAを設計し、一細胞期の受精卵にマイクロインジェクションした。Heteroduplex Mobility Assayにてdouble strand breakを起こす効率を確認したところ、いずれの遺伝子についても良く機能するcrRNAを得ることができた。最終的に、MyD88に関しては4塩基欠失により51番目のアミノ酸からフレームシフト変異を起こす変異体が、TRIFに関しては10塩基欠失により40番目のアミノ酸からフレームシフト変異を起こす変異体が得られた。いずれの遺伝子に関しても、蛋白質の前半部分からフレームシフト変異を起こしており、機能は欠失していることが予想された。いずれの変異体においてもヘテロ接合型変異体同士を交配し、ホモ接合型変異体(MyD88ー/ー、TRIFー/ー)を得た。MyD88ー/ー、TRIFー/ー共に、懸念された易感染性は問題にはならず、いずれも成魚になり得た。また、外観や泳ぎ方からは、明らかな表現型の異常は観察されなかった。そこで、いずれの変異体についてもGBA変異メダカと交配し、GBA+/ーMyD88+/ー, GBA+/ーTRIF+/ーメダカを得た。一方、MyD88変異メダカ、TRIF変異メダカ共に蛋白質レベルで欠失していることを確認するため、メダカMyD88とメダカTRIFに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。当初予定していた通り、CRISPR/Cas9systemによりMyD88変異メダカ、TRIF変異メダカを作製することができた。MyD88ー/ー、TRIFー/ーメダカ共に懸念された易感染性が問題にならないことを確認し、GBAー/ーMyD88ー/ー, GBAー/ーTRIFー/ーメダカの作製に着手することが出来ている(これらの親であるGBA+/ーMyD88+/ー, GBA+/ーTRIF+/ーメダカを得られている)。現在のところ、計画通りに遂行できており、次年度の実験計画に取り掛かることが可能である。メダカMyD88とメダカTRIFに対するウサギポリクローナル抗体を用いてMyD88ー/ー、TRIFー/ーメダカ脳を用いて蛋白質レベルでの欠損の確認を試みたが、ウェスタンブロッティングではいずれの蛋白質の発現も確認できなかった。脳における発現が低い可能性を考えて、今後whole bodyを用いての解析を予定している。また、MyD88ー/ー、TRIFー/ーメダカの易感染性が問題にならないことを確認し、また、GBA+/ーMyD88+/ー, GBA+/ーTRIF+/ーメダカ同士の交配を開始してGBAー/ーMyD88ー/ー, GBAー/ーTRIFー/ーメダカの解析に着手した。GBAー/ーメダカの特徴として、約2か月齢から異常回転運動が観察される。これは中枢神経の変性を反映していると考えており、まずは異常回転運動発現時期に違い(改善)が見られるかを観察した。しかし、GBAー/ーMyD88ー/ー, GBAー/ーTRIFー/ーメダカ共に、GBAー/ーメダカと比較して異常回転運動発現時期に違いは見られなかった。さらに、神経細胞死の程度に改善が見られるか、視床ドパミン神経細胞(ヒト中脳黒質ドパミン神経細胞に相当)と青斑核ノルアドレナリン神経細胞を3ヵ月齢にてカウントした。サンプル数が少なく結論が出せていないものの、現在のところ、いずれの神経細胞群においても脱落の改善に乏しいという結果である。今後、生存期間、上記神経細胞のカウント、炎症抑制効果の評価(魚類ミクログリアのマーカーであるAPOEのin situ hybridization、炎症性サイトカインmRNA定量測定)、α-Syn蓄積の評価(免疫組織染色、ウェスタンブロット)を行い、何らかの所見に改善が見られないか、解析を予定している。

そこで、GBAー/ーMyD88ー/ー、GBAー/ーTRIFー/ーメダカの解析を行ったが、GBAー/ーメダカと比較して神経細胞脱落や生存期間の改善を認めず、MyD88とTRIFを介したシグナル経路の病態への関与は明らかでなかった。まず、メダカMyD88とメダカTRIFに対するウサギポリクローナル抗体を用い、MyD88ー/ー、TRIFー/ーメダカにおいて蛋白質レベルでの欠損を確認する。また、GBA+/ーMyD88+/ー, GBA+/ーTRIF+/ーメダカが生殖可能となれば、それぞれ同士を交配開始し、GBAー/ーMyD88ー/ー, GBAー/ーTRIFー/ーメダカの作製と解析に着手する。解析としては、生存期間の評価、行動解析(ビデオトラッキングシステムを使用)、炎症抑制効果の評価(魚類ミクログリアのマーカーであるAPOEのin situ hybridization、炎症性サイトカインmRNA定量測定)、神経細胞死の評価(特定の神経細胞群として、ドパミン、ノルアドレナリン、セロトニン神経細胞群について免疫組織染色を行ってカウントする)、α-Syn蓄積の評価(免疫組織染色、ウェスタンブロット)、スフェロイドの評価(透過型電顕、免疫組織染色)等を予定している。GBAー/ーメダカと比較してGBAー/ーMyD88ー/ー, GBAー/ーTRIFー/ーメダカいずれも何らかの表現型の改善を認めた場合、三重変異体GBAー/ーMyD88ー/ーTRIFー/ーメダカ作製と解析も検討する。神経内科学既存の試薬やメダカ飼育設備を用いて実験が遂行可能であったため。実験を遂行するための必要な試薬を購入する。また、メダカ飼育設備が老朽化しており、こちらの修繕費用にも充てることを検討する。
プロセッサー作業に伴って発生する枝条の林地への還元に関する研究

プロセッサー作業によって発生する枝条を林地にそのまま還元する方法とチップ化して還元する方法について比較するとともに,放置された枝条堆積物の移動量を明らかにし,以下の2点の課題について研究を実施した。(1)枝条の還元によって,林地の環境はどれだけ違うのか。どのように還元するべきか。(2)堆積した枝条が下方にどの程度移動するのか,枝条の養分はどれだけ流出するのか。初年度には,(1)チップ散布試験プロットを設定し,チップを通過する雨水のpH,土壌養分量および苗木成長量を測定し,枝葉とチップ散布によって酸性緩和効果と養分量の増大を明らかにした。(2)放置された枝条堆積層の数ケ月後の層積変形を測量し,枝条堆積層は下方に移動することなく,その場で沈降することを明らかにした。2年次には,(1)苗木周囲の雑草木現存量と土壌養分量を調査し,チップ散布による雑草木の発生・成長抑制の効果を実証した。(2)人工降雨装置による散布チップの移動量を測定し,チップ厚が小さいほど飛散しやすいことを確認した。3年次には,(1)土壌養分量,苗木成長量および苗木周囲の雑草木現存量を測定し,還元方法について検討し,3年経過後も前述した傾向が継続することを確認した。苗木の成長に対する効果は明確ではない。還元方法としては枝条をチップ化し、架線装置で返送し,林内で待機する不整地走行車によって散布する機械化が必要であることを指摘した。(2)枝条堆積層の変形を測量し,堆積層下方の土壌分析を行い,層積の減少率は1ケ月あたり0.5%であり,堆積枝条の下方林地への影響は数m以内であり,養分量の増大と酸性緩和効果があることを明らかにした。以上の成果から,枝条を林地に還元する方法としては,2mm厚程度の小チップや粉砕処理された材料を苗木周囲に散布することが雑草木の成長抑制・養分供給・土壌の酸性緩和において,効果的であり,積極的に還元する意義が認められた。プロセッサー作業に伴う枝条の集積による森林生産環境への影響を緩和するために,実施した実験調査によって得られた成果を2つの課題に区分して報告する。1.枝条を林内に還元した場合としない場合で林地の環境はどれだけ違うか,どのように還元すべきか。チップを通過した雨水のpHは林外雨に比べて高く,特に技葉のチップで高い。チップを散布した土壌のpHも対照区に比べて高く,酸性が緩和される。土壌の水溶性イオンの量は枝葉のチップを散布したプロットで水溶性K,Ca,Mg,Naが増加した。チップ散布区の苗木の成長は,対照区と比較して成長量に差はないが,チップ散布区で苗高は低く,直径成長が高い。これはチップ散布によるマルチングの効果によって,雑草木との競合が少ないことを反映している。2.堆積した枝条が下方にどの程度移動するのか,枝条の養分はどれだけ流出するか。土場に堆積した枝条は斜面に沿って下方に移動することはなく,その場で鉛直方向に沈降する。形態としてのチップの変化は,枝条チップでは分解しその形状が失われ,材チップでは小さいほど散布時の状態を保っているが,大きくなるにつれ,チップの間隙に表層土が流入し,状態の変化が大きい。

チップの有機物の分解速度は,枝葉のチップが最も速く,材チップは枝葉のチップに比べて分解は遅い。材チップの厚さ4mmが,9mm,17mmに比べて分解が速い。気象条件の相違では,尾根に近い乾燥している調査区と斜面下部で近くに流水のある水分条件の良い調査区と対比してその差は認められない。今後,さらに,実験を継続することで,気象条件の相違や材チップの分解,堆積した枝条の移動量について経年変化を明らかにし,マルチングの効果については樹木の生長期に観察する計画である。また,散布作業の生産性と労働負担についても,事例を積み重ねて作業システムの検討を加える。平成10年度に実施した実験調査によって得られた成果を2つの課題に区分して報告する。1.枝条を林内に還元した場合としない場合で林地の環境はどれだけ違うか,どのように還元すべきか。チップの散布によってマルチング効果を発揮し,雑草木の初期の発生が抑制できる。散布する物質は落葉落枝でも効果があるが,チップの方がより有効であった。また,チップを散布すると1種のみが優占するのを抑え,いくつかの種類が競合するような環境が生じている。チップのサイズについての相違は明確ではなかった。チップの分解による堆積量の減少,その養分の還元によって,一旦定着した雑草木の成長の促進に至る可能性もあり,下刈り作業の省力化となりうるのか,継続した調査が必要である。還元の方法について,チップ化した後あるいは枝条のままH型架線や三角架線などの面集材の技術を用いて林内に運搬散布することが考えられるが,皆伐作業ではこれらの架線技術を利用することが非経済的であるとともに,現実的にも希であることから別途方法を検討する必要がある。2.堆積した枝条が下方にどの程度移動するのか,枝条の養分はどれだけ流出するか。枝条の下方への移動や養分の流出については、平成9年度の調査結果の傾向が継続しており,枝条の移動については,その場で鉛直方向に沈降している。枝条をチップ化して林地に散布した場合の移動について,人工降雨実験装置を用いて観察した。厚さ4mmの材チップについてのみ,降雨強度が強くなるにつれて厚みが減少する傾向にあったが,より厚いチップでは波をうった形状に局部的に変化するものの,いずれの場合においてもプロット下方にまで流出する事例は見られなかった。一方,現地での観測では時間雨量が50mmを超える場合に表層土の流入や下方への移動など状態の変化が著しく,チップの移動は雨滴の大きさに起因しているものと推測される。平成11年度に実施した実験調査によって得られた成果を2つの課題に区分して報告する。1.枝条を林内に還元した場合としない場合で林地の環境はどれだけ違うか,その経年変化について。チップの散布によってマルチング効果を発揮し,植栽直後に見られた雑草木の発生抑制効果は継続しており、対照区(裸地プロット)に比べて現存量が低い。しかし、苗木の成長量には差は認められない。土壌分析の結果から、Ca,Mg,Na,NH_4について水溶性イオンが対照区に比べて増加しており、小チップの効果がより高い。pH(H_2O)についても、小チップや枝葉散布区で、継続して対象区よりも酸性緩和の効果が認められた。以上のことから、散布においては、小チップあるいは枝葉を散布することで、少なくとも2年半の期間にわたって雑草木の抑制効果、養分供給および酸性緩和の効果があり、枝条の還元が森林の更新に極めて有効であることが明らかとなった。しかし、その効果は苗木の成長量としては現れていない。2.堆積した枝条が下方にどの程度移動するか,枝条の養分はどの程度流出するか。還元方法について。
ホルモン依存性癌における細胞・生体イメージングを活用したエネルギー代謝機構の解明

ホルモン依存性がん増殖・進展におけるエネルギー代謝経路を明らかにする目的で、蛍光蛋白質レポーター遺伝子を発現したがん細胞を作製し、環境変化に伴うがん細胞の細胞周期や代謝状態を経時的にモニタリングするシステムを構築した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定発現したがん細胞を作製してマウスがん移植実験を行い、生体イメージングを用いてがん増殖・転移動態を解析した。がん細胞での代謝遺伝子の発現・転写調節について分子生物学的手法にて解析した。これらの結果より、ホルモン依存性がんの診断・治療・予防に応用できる新規分子標的を発見した。がん細胞では、エネルギー代謝において解糖系が優位であると考えられてきたのに対し、近年、酸化的リン酸化(OXPHOS)経路も重要である可能性が示唆され、がんの細胞増殖に加えて代謝状態を把握することが求められている。本研究は、ホルモン依存性がん増殖・進展におけるエネルギー代謝経路を明らかにする目的で、乳がん、前立腺がん等の各種がん細胞に、蛍光蛋白質レポーター遺伝子を発現した細胞を作製し、代謝経路阻害薬や低酸素状態、ホルモンや抗ホルモン薬刺激などの環境変化におけるがん細胞の細胞周期や代謝の状態を経時的にモニタリングするシステムを構築した。がん細胞親株と抗ホルモン薬耐性を獲得したがん細胞での培養系における細胞周期の動態の違いを、タイムラプス顕微鏡下で可視化することができるようになり、マウス心臓へのがん細胞移植実験により、ホルモン耐性細胞におけるがん転移動態を生体イメージングにより解析した。がん細胞での代謝遺伝子の発現について、RT-PCR、マイクロアレイ、次世代シーケンサーを用いたRNAシーケンスの手法を用いて解析した。また、ステロイドホルモン受容体や関連転写因子を介する代謝遺伝子の発現調節機構を次世代シーケンサーを用いたクロマチン免疫沈降法(ChIPシーケンス)にて解析し、ホルモン依存性がんのリガンド応答性やホルモン耐性にかかわる代謝経路を明らかにした。本研究により、ホルモン依存性がんの診断・治療・予防に応用できる新規分子標的を複数発見し、学会発表を行い論文投稿中である。本研究は、乳がん・子宮内膜がん・前立腺がんをはじめとするホルモン依存性がん増殖・進展におけるエネルギー代謝経路を明らかにする目的で、それらがん細胞に、蛍光蛋白質レポーター遺伝子を発現した細胞を作製し、代謝経路阻害薬や低酸素状態、ホルモンや抗ホルモン薬刺激などの環境変化におけるがん細胞の細胞周期や代謝の状態を経時的にモニタリングするシステムを構築した。各がん細胞での代謝遺伝子の発現とその調節機構の解析を行い、ホルモン依存性がんのホルモン応答性やホルモン耐性にかかわる代謝経路を調べた。本研究により、ホルモン依存性がんの診断・治療・予防に応用できる新規分子標的を複数探索できた。環境変化におけるがん細胞のエネルギー代謝動態を経時的にモニタリングするシステムを構築した。ホルモン依存性がんの診断・治療・予防に応用できる新規分子標的を複数探索できた。これらの成果を論文ならびに学会発表した。平成23年度に得られた結果を基にして、ホルモン依存性癌細胞のマウス腫瘍形成モデルにおけるエネルギー代謝経路の生体イメージング解析と次世代シーケンサーおよびマイクロアレイ解析を活用したホルモン依存性癌細胞の新規標的代謝遺伝子の同定を行う。これらの研究結果を統合して、ホルモン依存性癌の増殖・進展・転移の病態におけるエネルギー代謝動態を可視化システムとゲノムワイドな遺伝子発現・転写制御のメカニズムを解析し、成果の発表を行う。特に、ホルモン依存性癌の診断・治療・予防における新規分子標的の発見を目指す。研究経費は主に消耗品、旅費等に使用する。消耗品は、細胞培養、分子生物学、細胞・生体イメージング等の実験に必要な試薬、プラスチック、血清・培地、抗体として使用する。旅費等の経費は、研究成果を発表するために使用する。
マウスモデルを使ったうつ病素因遺伝子群の同定―QTLマッピングを適用して

うつ病は、感情、情動という脳の高次機能の変化をきたす疾患で、病相を繰り返し、発症頻度が高く、早くからアミン受容体仮説、セカンドメッセンジャー仮説などに基づき生化学的な研究が行われてきた。しかしいまだに一致した見解は得られていない。そのような状況の中から遺伝学的な研究が1980年代後半から始まり、双生児研究、養子研究などから発症には多因子遺伝が関与することが解ってきた。現在までに多数の遺伝子座が報告されているが、躁うつ病の遺伝的異質性から一致した結果は少ない。我々はうつ病に関連した遺伝子座を検出するために新しい試みとして動物モデルを使ったQTL(Quantitative Trait Loci)解析法に注目しこれを採用した。この方法は、ある行動に関して異なる表現型をもつ2系統の動物を選び、F2世代において遺伝子解析することによって、その行動を支配する遺伝子座を検出する方法である。うつ病に関連する行動評価として、強制水泳テスト(FST)と尾懸垂テスト(TST)を採用し(このテストは抗うつ薬のスクリーニングテストとして評価されているが、絶望状態を示すことからうつ素因を検出できると考えられる)、無動時間を指標として系統差を検討した。C57BL/6,C3H/He, DBA/2,BalB/Cの4系統のマウス間の系統差を調べた結果、C57BL/6とC3H/Heの間に有意な無動時間の差を確認した。C57BL/6は無動時間が著しく長くストレスを受けやすい系統、一方C3H/Heは無動時間が短くストレスに抵抗を示す系統と判断した。それらを親(FO)として選択しF2世代560匹を作製した。作製したF2世代全個体の行動解析を行い、次いで各個体の尻尾からDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカー120個を用いてジェノタイピングを行った。ジェノタイピングの結果と表現型の結果よりQTL解析を行い、Interval Mapping及び、Composite Interval Mappingにより、うつ病に関連する遺伝子が染色体のどの領域に存在するか検索した。現在迄に、4番、6番、8番、11番、14番、及び、17番染色体で統計的に有意なQTLを見い出すことに成功した。また、染色体どうしのインターラクション解析の結果、6番染色体と11番染色体及び、11番染色体とX染色体間で強い相関を検出した。今後さらに解析を継続して、候補遺伝子座を同定するところまで到達する予定である。うつ病は、感情・情動という脳の高次機能の変化をきたす疾患で、病相を繰り返し、発症頻度が高く、早くからアミン受容体仮説、セカンドメッセンジャー仮説などに基づき生化学的な研究が行われてきた。そのような状況の中から遺伝学的な研究が1980年代後半から始まり、双生児研究・養子研究などから発症には多因子遺伝が関与することが解ってきた。C57BL/6,C3H/He,DBA/2,Ba1B/Cの4系統のマウス間の系統差を調べた結果、C57BL/6とC3H/Heの間に有意な無動時間の差を確認した。ジェノタイピングの結果と表現形の結果よりQTL解析を行い、Interval Mappingにより、うつ病に関連する遺伝子が染色体のどの領域に存在するか検索した。現在、8番、14番染色体でLod score 3以上のピークを示すQTLを見い出すことに成功した。

うつ病に関連する行動評価として、強制水泳テスト(FST)と尾懸垂テスト(TST)を採用し(このテストは抗うつ薬のスクリーニングテストとして評価されているが、絶望状態を示すことからうつ素因を検出できると考えられる)、無動時間を指標として系統差を検討した。C57BL/6,C3H/He, DBA/2,BalB/Cの4系統のマウス間の系統差を調べた結果、C57BL/6とC3H/Heの間に有意な無動時間の差を確認した。C57BL/6は無動時間が著しく長くストレスを受けやすい系統、一方C3H/Heは無動時間が短くストレスに抵抗を示す系統と判断した。それらを親(FO)として選択しF2世代560匹を作製した。作製したF2世代全個体の行動解析を行い、次いで各個体の尻尾からDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカー120個を用いてジェノタイピングを行った。ジェノタイピングの結果と表現型の結果よりQTL解析を行い、Interval Mapping及び、Composite Interval Mappingにより、うつ病に関連する遺伝子が染色体のどの領域に存在するか検索した。現在迄に、4番、6番、8番、11番、14番、及び、17番染色体で統計的に有意なQTLを見い出すことに成功した。また、染色体どうしのインターラクション解析の結果、6番染色体と11番染色体及び、11番染色体とX染色体間で強い相関を検出した。今後さらに解析を継続して、候補遺伝子座を同定するところまで到達する予定である。
Apelin-APJ systemを標的とした腎線維化治療の検討

片側尿管結紮によるマウス腎線維化モデルにおいて、Apelin皮下投与などの実験により、Apelin-APJ systemがAkt-eNOS経路を介しNO産生を亢進することにより、腎保護作用を示すことが示唆された。さらに同モデルにおいてロサルタン投与およびAPJレセプター拮抗剤投与などの実験により、ロサルタンによる腎保護作用は、一部にはApelin-APJsystemを介するものであることが示唆された。マウスUUOモデルにおいて、UUO腎におけるAPJ receptorのmRNAおよび蛋白発現をRT-PCRおよびWestern blotにより検討したところUUO day 7まで経時的にこれらの発現増加を認めた。そこで、UUO day 0からday 7にかけて、ミニ浸透圧ポンプを用いApelin (2mg/kg/day)を持続的に皮下投与したところ、UUO day 7において、Apelin投与群ではコントロール群(生食投与群)と比べ、Masson染色、hydroxyproline定量(HPLC法)による線維化の程度、α-SMA免疫染色によるmyofibroblast蓄積量、Tunel染色による腎尿細管apoptosisの程度はすべて有意に軽減し、またWestern blotによりNitric oxide (NO)合成経路である、Akt、eNOSのリン酸化の亢進がみられた。これらの変化はAPJ receptor拮抗剤であるF13Aの同時腹腔内投与によりすべて消失し、またApelin投与による腎保護的効果はNO合成阻害剤(L-NAME)をApelinと同時に投与することにより消失した。これらの結果は、Apelin-APJ systemがAkt-eNOS経路を介しNO産生を亢進させることにより腎保護的作用を示すことを示唆しており、Apelin-APJsystemを標的とした腎線維化治療への応用の可能性が示された。マウスUUOモデルにおいて、UUO腎におけるAPJ receptorのmRNAおよび蛋白発現をRT-PCRおよびWestern blotにより検討したところUUO day7まで経時的にこれらの発現増加を認めた。そこで、UUO day0からday7にかけて、ミニ浸透圧ポンプを用いApelinを持続的に皮下投与したところ、Apelin投与群ではUUOday7においてコントロール群と比べ、腎線維化の程度、腎尿細管apoptosisの程度は有意に軽減し、またWestern blotにより腎組織中のNitric oxide(NO)合成経路である、Akt、eNOSのリン酸化の亢進がみられた。さらにUUOモデルにおいてアンギオテンシン受容体拮抗薬であるlosartanを投与し同様の検討を行ったところ、losartan投与群でUUO day7においてapelin mRNAの発現およびAkt、eNOSのリン酸化がコントロール群と比べ有意に亢進し、同時に腎線維化とmyofibroblast蓄積の軽減がみられた。これらの変化はAPJreceptor拮抗剤であるF13Aを同時に腹腔内投与することにより消失し、またNO合成阻害剤(L-NAME)を同時に投与することによっても消失した。これらの結果は、Apelin-APJ systemがAkt-eNOS経路を介しNO産生を亢進させることにより腎保護的作用を示すことを示唆しており、さらにlosartan投与による腎保護的作用は、一部にはこのApelin-APJsystemを介するものであることが示唆された。マウスUUOモデルにおいて、UUO腎におけるApelin、APJ receptorのmRNAおよび蛋白発現をRT-PCRおよびWestern blotにより検討したところ、UUO day7においてApelin、APJのmRNA、APJ蛋白の増加を認めた。UUO day 0からday 7までミニ浸透圧ポンプを用いApelinを持続的に皮下投与することにより、UUO day 7においてコントロール群と比べ、腎線維化の程度、myofibroblast蓄積量、腎尿細管apoptosisの程度は有意に軽減し、Western blotにより腎組織中のNitric oxide (NO)合成経路である、Akt、eNOSのリン酸化の亢進がみられた。ところがNOS阻害剤であるL-NAMEをapelinと同時に経口投与することにより、組織障害の程度はコントロール群よりもさらに増悪した。またUUOモデルにおいてlosartanを投与した場合、UUO day7においてapelin mRNAの発現およびAkt、eNOSのリン酸化の亢進がみられ、同時に腎線維化とmyofibroblast蓄積の軽減、間質浸潤マクロファージ数の減少がみられた。これらの変化はAPJ receptor拮抗剤であるF13Aを同時に投与することにより消失した。UUO腎におけるApelin-APJsystemの腎保護的作用およびその機序としてAkt-eNOS-NO系の関与を示した。さらにアンギオテンシン受容体拮抗薬による腎保護作用についてもApelin-APJsystemの関与を示した。

24年度が最終年度であるため、記入しない。Apelin-APJsystemを標的とした腎線維化に対する治療応用の可能性につき、アンギオテンシン受容体拮抗薬とApelinの併用療法の可能性なども検討する。
増殖因子による標的細胞での変異原・癌原物質に対する感受性亢進の機序

(1)増殖刺戟下の変異原・癌原物質の急性染色体切断増強作用:変異原・癌物質投与による骨髄増殖刺激下での骨髄細胞における染色体切断頻度は著明に増加し、逆に骨髄増殖抑制刺戟下では頻度は減少した。多血症にして骨髄抑制したラットでもエリスロポイエチン(EP)を投与するとCA頻度は逆に上昇した。この事実は、増殖刺戟を受けている標的細胞では変異原・癌原物質によりCAが増加することを示しており、増殖中の細胞ではヒストンないし非ヒストン蛋白で防備されたDNAが無防備の状態になっている可能性を示している。染色体内分布では、No.1染色体で動原体からの相対距離で40%の部位に、No.2染色体では30%、55%、80%の部位にCAは集中し、No.1染色体、No.2染色体ともに特定の部位に切断が頻発し、この切断部位でのpeakの出現が増殖刺戟がある場合にはより強調され、増殖抑制がある場合にはpeakの出現は抑制された。(2)増殖刺戟下での変異原・癌原物質による姉妹染色体交換の増強効果:ラット骨髄細胞、肝細胞及び線維芽細胞を用い、それぞれEP、肝細胞増殖因子(LGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)存在下で変異原・癌原物質を投与し、標的細胞の染色体に及ぼす作用についてin vivo及びin vitroで検索した。いずれの実験系でも増殖刺戟下では姉妹染色体交換頻度は著明に上昇し、増殖抑制があるとSCE頻度は減少した。SCE発生部位の染色体内分布では、CAの好発部位と類似し、NO.1染色体では動原体からの相対距離で40%の部位に、NO.2染色体では30%、55%、80%の部位にSCEが頻発した。染色体切断と姉妹染色分体交換は増殖ないし抑制刺戟により同様の変化を示す事が明らかとなり、これらは関連した現象である事が推察される。そして、増殖細胞においてはDNA構造がむきだしとなり、外界からの変異刺激に対して感受性が高まることが推測された。さらに低レベルの放射線で細胞の再活性化によりCA頻度は低下することからDNA修復機構もこの現象に関与している。(1)増殖刺戟下の変異原・癌原物質の急性染色体切断増強作用:正常ラットに変異原・癌原物質を投与すると、骨髄増殖刺戟下での切断頻度を比較してみると、骨髄増殖刺戟のあるほうが著明に上昇し、逆に輸血により多血症にしたラットでは骨髄増殖抑制効果のためCA頻度は減少した。多血症ラットでもエリスロポイエチン(EP)を投与するとCA頻度は再び上昇した。これらの事実は、増殖刺戟を受けている標的細胞では変異原・癌原物質によりCAが増加することを示しており、増殖中の細胞ではヒストンないし非ヒストン蛋白で防備されたDNAが無防備の状態にてっている可能性を示している。染色体内分布は、No.1染色体では動原体からの相対距離で40%の部位に、No.2染色体では30%、55%、80%の部位に切断が頻発し、切断部位の分布はpeakの出現が増殖刺戟がある場合にはより強調され、増殖抑制がある場合にはpeakの出現は抑制された。(2)増殖刺戟下での変異原・癌原物質による姉妹染色体交換の増強

効果:ラット骨髄細胞、肝細胞及び線維芽細胞を用い、それぞれEP、肝細胞増殖因子(LGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)存在下で変異・癌原物質を投与し、標的細胞の染色体に及ぼす作用についてin vivo及びin vitroで増殖刺戟下での姉妹染色体交換頻度は上昇し、SCE発生部位の染色体内分布は、CAの好発部位と類似し、No.1染色体では動原体からの相対距離で40%の部位に、No.2染色体では30%、55%、80%の部位にSCEが頻発した。即ち、いずれの系でも標的細胞に増殖刺戟があるとSCEは著明に上昇し、増殖抑制があるとSCE頻度は減少した。染色体切断と姉妹染色分体交換は増殖ないし抑制刺戟により同様の変化を示す事が明らかとなり、関連した現象である事が推察される。骨髄増殖刺戟下での骨髄細胞における変異原・癌原物質による染色体切断(CA)頻度は著明に増加し、逆に骨髄増殖抑制刺激下ではCA頻度は減少することが明らかとなった。多血により骨髄抑制を行ったラットでもエリスロポイエチンのような骨髄刺激物質を投与するとCA頻度は貧血にした骨髄増殖刺激ラットと同じ頻度を示した。この事実は、増殖刺戟を受けている標的細胞では変異原・癌原物質によりCAが増加することを示している。染色体内分布では、No.1染色体で動原体からの相対距離で40%の部位に、No.2染色体では30%、55%、80%の部位というふうにCAは特定の部位に集中し、この集中部位のpeakの出現は増殖刺戟がある場合により強く現れ、増殖抑制がある場合には逆に抑制されpeakの出現は明らかでなかった。変異原・癌原物質による姉妹染色分体交換はラット骨髄細胞、肝細胞及び線維芽細胞を用い、それぞれEP、肝細胞増殖因子(LGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)存在下で標的となる細胞についてin vivo及びin vitroで検索した。いずれの実験系においても、細胞増殖因子による刺戟下では姉妹染色分体交換(SCE)頻度は著明に上昇し、増殖抑制があるとSCE頻度は減少した。SCEの染色体内での発生部位分布では、CAの好発部位と同一で、No.1染色体では40%の部位に、No.2染色体では30%、55%、80%の部位にSCEが頻発した。老齢ラットでは変異原・癌原物質による骨髄細胞のCAの発生頻度が若年ラットに比べ高くなるが、あらかじめ低レベルの放射線の全身照射を2回行っておくとCAの頻度は減少した。CAとSCEは増殖ないし抑制刺戟により同様の変化を示す事が明らかとなり、これらは関連した現象である事が推察される。そして、増殖中の細胞ではヒストンないし非ヒストン蛋白で防備されたDNAが無防備の状態になっている可能性を示し、外界からの変異刺激に対して感受性が高まることが推測された。低レベルの放射線で細胞の再活性化をおこなうとCA頻度は低下することから、さらにDNA修復機構もこの現象に関与していることが推定される。
振動分光法によるcAMP受容蛋白質とDNAとの相互作用に関する研究

大腸菌の代謝調節因子の一つとして転写開始の調節による酸素合成の制御がある.調節蛋白の一つCAMP受容蛋白質(CRP)は単独ではDNAと特異的な結合はしないが, CAMPを取り込むとDNAの特定部位と結合し, RNA合成酵素の働きを制御する.CAMP-CRP複合体がどのようにしてDNA塩基配列を認識するかを理解する上で, CAMP-CRP-DNA結合体の立体構造を知ることは重要である.本研究では,円偏光二色性と紫外共鳴ラマンを含むラマン分光法によりCRPとDNAとの相互作用を研究することを目的としている.本年度はCRPの精製, DNA22マーの合成, CDスペクトルの測定を行った.また,蛋白-核酸相互作用を理解する上での基礎として,オリゴペプチドLys-Trp-Lys, Lys-Tyr-Lysとポリアデニル酸,ポリ(dA-dT)との複合体のラマンスペクトルを測定し解析した.CRPは大腸菌より単離・精製した.DNA22マーは液相法により合成した.DNA22マーは二重鎖B型構造をとることをCDスペクトルにより確認した.これに, CAMPをとり込んだCRPを加えると複合体を形成し, DNAの構造は一部C型に変化することが明らかとなった.Lys-Trp-LysとLys-Tyr-Lysは,ポリアデニル酸やポリ(dA-dT)と水素結合やスタッキングにより複合体を形成する.Lys-Tyr-Lysでは強い水素結合が複合体形成の主要因であるがLys-Trp-Lysでは, Trpのインドール環とアデニン環とのスタッキングも起こっている.このような,アミノ酸側鎖と核酸塩基の選択的相互作用の組み合せ,積み重ねにより特定の蛋白によるDNA特定部位の認識が可能となると考えられ,今後さらにくわしい検討を行う予定である.大腸菌の代謝調節因子の一つとして転写開始の調節による酸素合成の制御がある.調節蛋白の一つCAMP受容蛋白質(CRP)は単独ではDNAと特異的な結合はしないが, CAMPを取り込むとDNAの特定部位と結合し, RNA合成酵素の働きを制御する.CAMP-CRP複合体がどのようにしてDNA塩基配列を認識するかを理解する上で, CAMP-CRP-DNA結合体の立体構造を知ることは重要である.本研究では,円偏光二色性と紫外共鳴ラマンを含むラマン分光法によりCRPとDNAとの相互作用を研究することを目的としている.本年度はCRPの精製, DNA22マーの合成, CDスペクトルの測定を行った.また,蛋白-核酸相互作用を理解する上での基礎として,オリゴペプチドLys-Trp-Lys, Lys-Tyr-Lysとポリアデニル酸,ポリ(dA-dT)との複合体のラマンスペクトルを測定し解析した.CRPは大腸菌より単離・精製した.DNA22マーは液相法により合成した.DNA22マーは二重鎖B型構造をとることをCDスペクトルにより確認した.これに, CAMPをとり込んだCRPを加えると複合体を形成し, DNAの構造は一部C型に変化することが明らかとなった.Lys-Trp-LysとLys-Tyr-Lysは,ポリアデニル酸やポリ(dA-dT)と水素結合やスタッキングにより複合体を形成する.Lys-Tyr-Lysでは強い水素結合が複合体形成の主要因であるがLys-Trp-Lysでは, Trpのインドール環とアデニン環とのスタッキングも起こっている.このような,アミノ酸側鎖と核酸塩基の選択的相互作用の組み合せ,積み重ねにより特定の蛋白によるDNA特定部位の認識が可能となると考えられ,今後さらにくわしい検討を行う予定である.
腸炎ビブリオ耐熱性溶血毒の溶血機構の生化学的解析

食中毒原因菌である腸炎ビブリオの産生する耐熱性溶血毒(TDH)は、腸炎ビブリオ感染症の主要病原因子と考えられている。TDHの示す生物活性は多彩で、溶血活性をはじめ、細胞毒性、腸管毒性、致死活性(心臓毒性)などが知られているが、それらの作用機構についてはほとんど研究が進んでいない現状にある。われわれはTDHの作用機構解明の一助とするため、比較的解析の容易な系として溶血系を選び、溶血機構の解析に着手した。これまでにTDHと血球の結合に関して、(1)結合の初期に温度依存性のステップがあること、(2)溶血感受性血球にも非感受性血球にも同様の親和性でTDHが結合すること(TDHは種々の動物血球に溶血活性を示すが、ウマ血球は全く溶血しないという特徴をもっている)、さらにpore formationが観察されており、colloidal osmosisによって溶血がおこることなどを明らかにしてきた。本研究では溶血感受性の違いに拘わらず結合した後、感受性血球で起こる特異生化学反応に的を絞って検討した。外部からのシグナルを伝える反応としてよく知られている蛋白リン酸化について調べた結果、感受性血球膜上で特異的に25kDa蛋白のリン酸化が誘導されることが明らかになった。このリン酸化はprotein kinase Cinhibitorによって阻害され、さらに、同じinhibitorによってTDHの溶血阻害も見られた。また、われわれの研究室で作成した変異TDH、R7(溶血活性は著しく低下しているが、血球への結合能は保持している)を用いて調べてみると、R7では25kDa蛋白のリン酸化の誘導は見られず、TDHとR7を共存させるとTDHによる25kDa蛋白リン酸化が競合的に阻害された(結合段階で競合するためと考えられる)。これらの結果から感受性血球膜上で起こる25kDa蛋白のリン酸化は血球を溶血に導くために必須のステップである可能性が示唆された。TDHを含めた細胞破壊型毒素(溶血毒)でこのようなsignal transductionの報告は見られず、本研究で明らかにした成績はTDHの溶血機構の解明に役立つとともに、他の溶血毒の作用機構の解明に有益な情報となりうると考えられる。腸炎ビブリオ食中毒は、日本における食中毒原因菌の首位を占めるとともに、海外からの輸入感染症の原因菌としても高頻度に検出される下痢原性細菌である。主要病原因子と考えられる耐熱性溶血毒(TDH)の作用機構を解析する糸口として比較的解析し易い系として溶血機構を選び本研究の主題とした。本年度選られた研究実績は以下のとうりである。TDHを作用させるとヒト血球(TDHに対して溶血感受性)膜上で25kDa蛋白の特異的りん酸化が見られるが、mutant TDH(血球に結合はできるが、溶血活性は失ったTDH)を作用させても25kDa蛋白のりん酸化は誘導されないことが明らかになった。種々のprotein kinase inhibitorを用いて25kDa蛋白りん酸化の阻害実験を行った結果、protein kinase C inhibitorであるStaurosporineとCalphostin Cで著しく阻害され、25kDa蛋白のりん酸化にprotein kinase Cが大きく関与していることが示唆された。

さらにこれらのprotein kinase C inhibitorはTDHによるヒト血球溶血活性をも著しく阻害することが確認でき25kDa蛋白のりん酸化と溶血との関係が裏付けられた。G蛋白との関係を調べるためにGTP γSの存在下でりん酸化実験をおこなったが非特異的に蛋白のりん酸化が強められたが、25kDa蛋白りん酸化の特異的促進は見られなかったため25kDa蛋白のりん酸化とG蛋白の関係については現時点では不明である。現在25kDa蛋白のcharacterizationのために二次元電気泳動でサンプルを収集中である。食中毒原因菌である腸炎ビブリオの産生する耐熱性溶血毒(TDH)は、腸炎ビブリオ感染症の主要病原因子と考えられている。TDHの示す生物活性は多彩で、溶血活性をはじめ、細胞毒性、腸管毒性、致死活性(心臓毒性)などが知られている、それらの作用機構についてはほとんど研究が進んでいない現状にある。われわれはTDHの作用機構解明の一助とするため、比較的解析の容易な系として溶血系を選び、溶血機構の解析に着手した。これまでにTDHと血球の結合に関して、(1)結合の初期に温度依存性のステップがあること、(2)溶血感受性血球にも非感受性血球にも同様の親和性でTDHが結合すること(TDHは種々の動物血球に溶血活性を示すが、ウマ血球は全く溶血しないという特徴をもっている)、さらにpore formationが観察されており、colloidal osmosisによって溶血がおこるなどを明らかにしてきた。本研究では溶血感受性の違いに拘わらず結合した後、感受性血球で起こる特異的生化学反応に的を絞って検討した。外部からのシグナルを伝える反応としてよく知られている蛋白リン酸化について調べた結果、感受性血球膜上で特異的に25kDa蛋白のリン酸化が誘導されることが明らかになった。このリン酸化はprotein kinase C inhibitorによって阻害され、さらに、同じinhibitorによってTDHの溶血阻害も見られた。また、われわれの研究室で作成した変異TDH、R7(溶血活性は著しく低下しているが、血球への結合能は保持している)を用いて調べてみると、R7では25kDa蛋白のリン酸化の誘導は見られず、TDHとR7を共存させるとTDHによる25kDa蛋白リン酸化が競合的に阻害された(結合段階で競合するためと考えられる)。これらの結果から感受性血球膜上で起こる25kDa蛋白のリン酸化は血球を溶血に導くために必須のステップである可能性が示唆された。TDHを含めた細胞破壊型毒素(溶血毒)でこのようなsignal transductionの報告は見られず、本研究で明らかにした成績はTDHの溶血機構の解明に役立つとともに、他の溶血毒の作用機構の解明に有益な情報となりうると考えられる。
原産地資料からみた南島貝交易の実証的研究

弥生時代の貝交易を琉球列島の貝殻集積の分析を通して再検討した。その結果交易されたゴホウラのほとんどは沖縄諸島で作られた貝輪粗加工品であることが明らかになった。貝殻集積に沖縄諸島で試作された弥生人向けの腕輪試作品が混在していることから、弥生人の腹面貝輪のデザインが沖縄諸島で生まれていたこと、これが貝殻運搬を行う弥生人と沖縄貝塚人によって生み出された可能性のあることがわかった。貝交易は、背面貝輪の粗加工品が登場する「開始期」、腹面貝輪の粗加工品が主体を占め貝殻の質が低下し始める「展開期」、腹面貝輪の粗加工品が登場する「最盛・衰退期」の3段階に区分される。開始期は弥生時代早期に遡る可能性がある。1.貝交易の実態を示す以下の14遺跡(九州・山口県の8遺跡、沖縄県の6遺跡)について資料収集を行った。弥生時代9遺跡、古墳時代5遺跡である。1竹並A10号墳出土ゴホウラ腕輪(福岡県)、2柚比本村遺跡ST4368出土イモガイ腕輪ほか(佐賀県)、3伊礼原遺跡D遺跡試掘ウ出土ゴホウラ腕輪(沖縄県)、4新城下原第二遺跡出土ゴホウラ腕輪(沖縄県)、5嘉門AならびにB貝塚出土ゴホウラ腕輪(沖縄県)、6朝田墳墓群第II地区第2号墳出土イモガイ腕輪、7上之原横穴墓出土イモガイ腕輪、8神領地下式横穴墓出土イモガイ腕輪、9諸岡遺跡出土ゴホウラ腕輪(福岡県)、10金隈遺跡出土ゴホウラ腕輪(福岡県)、11大友遺跡出土ゴホウラ腕輪(佐賀県)、12熱田第二貝塚出土ゴホウラ腕輪(沖縄県)、13塩屋貝塚出土ゴホウラ腕輪作成関連遺物群(沖縄県)、14朝田古墳群第IV地区出土ゴホウラ腕輪(山口県)2.貝交易の原産地の状況について、沖縄県塩屋貝塚出土のゴホウラ77個を対象に悉皆的な調査を行った。出土ゴホウラの計測と残存部分の図化を行い、以下の予測を得た。1ほとんどが腹面貝輪を目指した加工である。2ほとんどが死貝である。3アツソデガイが希である。3.これまで収集した資料を整理して、ゴホウラ腕輪の型式の成立を再検討し、南島人の関与の可能性を示す内容に解釈を改めた。この成果は平成27年度に口頭発表する予定で予稿集に原稿を執筆した(2015年4月25日26、「貝塚研究の最前線」千葉県立中央博物館主催、において発表を行った。)4.学術用語について従来の「南海産貝輪」を「南島産貝輪」に修正する提案を行った。1.貝交易の実態を示す以下の12遺跡(沖縄県の7遺跡、鹿児島県の6遺跡)について資料収集を行った。1嘉門貝塚A地区出土ゴホウラ腕輪、2大久保原貝塚出土ゴホウラ腕輪ほか、3古座間味貝塚出土ゴホウラ腕輪、4具志堅貝塚出土ゴホウラ腕輪、5具志原貝塚出土ゴホウラ装飾品等、6宇堅貝塚出土貝製品、7浜屋原貝塚B地点のゴホウラ製品(以上沖縄県)、8中町馬場遺跡出土弥生土器等、9広田遺跡出土貝製品、10嘉冶遺跡出土弥生土器等、11面縄第一洞穴出土土器等、12ヨオキ遺跡出土弥生土器等、13高橋貝塚出土土製品等(以上鹿児島県)2.貝交易の原産地の状況について、沖縄県具志原貝塚出土のゴホウラならびに粗加工品197個を対象に悉皆的な調査を行った。読谷村、うるま市出土のイモガイ集積を確認し、判明している貝殻集積総数を確定した。これは貝交易を再考するための重要な基礎資料である。3.これまで収集した資料を整理して、弥生時代の貝交易、広田遺跡の貝交易について文章化を行った(未発表)。以上の作業により、弥生時代の貝交易については、沖縄本島中南部西海岸に面した一連の地域が貝交易の中心であったこと、貝交易の前半と後半では交易ルートと物流のしくみが大きく変化すること、種子島広田人の貝交易が弥生人のそれとは構造的に異なったものであったこと、交易品が鉄製品であったこと、広田遺跡の文化が南島との関係を深めてゆく過程を明らかにした。これは次年度にまとめて公表スする予定である。1.現地調査はほぼ予定通りに進行している。2.成果の文章化は、思った取り時間がかかっているが、次年度の公表にむけて進行している。3.年ごとに成果が蓄積され、次年度の計画も無理なく誘導されている。1.沖縄諸島における北部九州型ゴホウラ腕輪を、10遺跡(具志原貝塚、伊礼原遺跡、アンチの上貝塚、嘉門貝塚A、嘉門貝塚B,塩屋貝塚、阿良貝塚、熱田第二貝塚、阿波連浦貝輪、広田遺跡)において悉皆的に調査し、弥生時代のゴホウラ腕輪の形成に、南島人と西北九州沿岸部の弥生人が深く関与していることを確認した(「貝輪粗加工品の流通ー弥生時代貝交易再論ー」『南島考古』第36号、2017)。