hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海水中における黄砂粒子の鉄成分の溶解性

黄砂粒子に含まれる鉄成分の海水への溶解性について検討を行った。これまでの研究により、水透析法によって黄砂粒子中のFeが溶解する粒子の存在が確認された。そこで、実際に海水へ沈着した場合の溶解性を調べるために、人工海水を用いて個別粒子におけるFeの溶解性を調べた。純水への溶解性と比較するため、同一黄砂イベント時に採取した黄砂粒子を用いて、海水透析、水透析における溶解性を比較した。走査電子顕微鏡とEDX(エネルギー分散型X線)分析器を用いて個別粒子分析を行い、海水透析法と水透析法を用いて溶解性成分を除去し、透析前後の相対重量比を比較した。その結果、海水、純水の両方において、透析前後でFeの溶解性はほとんど確認されなかった。水透析においてFeの溶解性が確認された粒子と比較した結果、透析前の黄砂粒子の組成が異なっていた。これらの結果から、黄砂粒子に含まれるFeの溶解性について、黄砂イベントごとに異なっている事が示された。Fe溶解性の変化は、(1)長距離輸送過程における硫黄化合物質との混合、(2)黄砂粒子の鉱物組成、(3)黄砂粒子の粒径、(4)黄砂粒子の濃度、などにより異なると考えられる。また、Ca,Mgの溶解性が海水と純水で異なっていた。特にCaは水にほとんど溶解したが、海水には溶解しないものが見られた。海水透析後に含まれていたCaは非水溶性であったことから、これらの相違は海水透析による変化であるといえる。従って、海水透析により黄砂粒子中のCa及びMgにおいて、溶解性が変化することが示唆された。Feについては海水及び純粋の両方でほとんど溶解しなかったことから、今後さらに様々なケースで採取された粒子の溶解性を調べる必要がある。黄砂粒子に含まれる鉄は、海洋における鉄の供給源の1つであると考えられている。鉄は、海洋における重要な微量元素であり、鉄濃度が海洋生産性を左右する海域もあると考えられているが、実際に黄砂粒子に含まれる鉄の化学組成や海洋への鉄の供給量などは明らかになっていない。そこで本研究において、電子顕微鏡と透析法を用いて個々の黄砂粒子を分析することにより、黄砂粒子に含まれる鉄の溶解性や変質過程を明らかにすることを目的とする。本年度は、電子顕微鏡を用いて熊本県で黄砂飛来時に採集した黄砂粒子の元素組成を調べた。主な元素を含む粒子の個数割合については、Al,Siを含む粒子の割合が高く(80%)、次いでNa,Mg,S,Caを含む粒子の割合が4060%であった。また、黄砂粒子を海水中に浸すことにより、海水へ溶解する成分を除去する方法(海水透析)を新たに開発し、用いる人工海水の検討や処理方法についても検討を行った。その後、分析を行った粒子に対して人工海水を用いた海水透析を行い、黄砂粒子に含まれる元素の海水への溶解性について調べた。その結果、海水透析により粒子中のNa,Sはほとんどが溶解していた。一方、透析前後における同一粒子の鉄の相対重量比はあまり変化がみられなかった。そこで、同日に採集した粒子の蒸留水を用いた水透析の分析結果と海水透析の結果を比較したところ、各溶液への溶解性についてあまり差異は認められなかった。また、他の黄砂時に採集した粒子の水透析の分析結果と、海水透析を行った粒子の変化を比較した結果、水透析を行った黄砂粒子の方が透析前後の変化が顕著であった。これは、海水には様々な成分が溶解しているため、水透析で用いた蒸留水と溶解性に差があったためだと考えられる。また、海水や蒸留水への溶解性については、黄砂飛来時の状況など、黄砂粒子の輸送過程や大気中における変質過程が影響している可能性があることが示唆された。
ウシ卵巣における糖質コルチコイドの生理的役割の評価

糖質コルチコイドは副腎皮質で生産され全身の器官で様々生理機能を調節する。卵巣の卵胞や黄体は糖質コルチコイドの標的器官であり、糖質コルチコイドによる機能促進、あるいは抑制が知られている。すなわち正常な卵巣機能を維持するためには、卵巣局所における糖質コルチコイドが適切なレベルに保たれて行なければならないはずである。本研究ではウシの卵巣組織における局所的糖質コルチコイド作用調節のメカニズムを検証した。屠場由来のウシ新鮮卵巣から卵胞および黄体を切り出し、各組織からtotalRNAの抽出を行い、糖質コルチコイドの代謝酵素(活性型11β-HSD1および非活性型11β-HSD2)および糖質コルチコイドレセプターmRNAの発現をsemi-quantitativeRT-PCRにより定量した。卵胞液中のコルチゾール、エストラジオール、プロジェステロンはEIA法により測定した。得られた主な結果は次のとおりである。1.ウシの卵胞や黄体で糖質コルチコイドレセプターと糖質コルチコイドの代謝酵素である2種類の11β-HSDが発現していること(代謝と受容からなる糖質コルチコイドシステムの存在)。2.これらの代謝酵素の発現が卵胞発育、黄体形成と退行に伴って変動すること(生理状態の変化に伴う糖質コルチコイド環境の変動)。3.成熟卵胞における代謝酵素の発現レベルと卵胞液中コルチゾール(活性型糖質コルチコイド)濃度の間に負の相関関係が認められたこと(代謝酵素による糖質コルチコイドの非活性化)。4.卵胞液中コルチゾールと成熟卵胞の指標であるエストロジェン濃度の間に負の相関関係が認められたこと(糖質コルチゾールによる卵胞成熟の阻害)。これらの結果から卵巣が体内を循環する糖質コルチコイドにただ曝されているだけではなく、それを代謝することで、合目的的に卵巣内糖質コルチコイド環境を調節している可能性が示唆された。標的器官における糖質コルチコイド作用の高低は、2つの糖質コルチコイドの代謝酵素、活性型11β-HSD1と非活性型11β-HSD2、および糖質コルチコイドレセプター(GR)の発現具合によって決定される。近年ラットやヒト卵巣でこれらの因子が発現していること、そして糖質コルチコイドが卵巣に直接作用することが示されている。しかしウシを含めた家畜の卵巣生理に糖質コルチコイドが関与しているかはのかは不明だった。本研究ではウシ卵巣における糖質コルチコイド作用機序を解明する一環として、これらの因子の卵巣諸組織における発現動態を検証した。屠場由来の卵巣から卵胞と黄体を採取し、顆粒層、卵胞膜および黄体組織における11β-HSD1と2、およびGR mRNAの発現をquantitative RT-PCR法によって解析した。結果は以下の通りである。1)黄体で典型的な糖質コルチコイド標的器官(肝臓)や代謝器官(腎臓)と比較しうるレベルの11β-HSD1と2、およびGR mRNAの発現が認められた。一方卵胞の顆粒層、卵胞の顆粒層、卵胚膜組織では11β-HSD1とGR mRNAの発現は明確に認められたが、11β-HSD2の発現は非常に低かった。2)顆粒層、卵胞膜組織における11β-HSD1とGR mRNAの発現レベルは発情周期(黄体期vs卵胞期)もしくは卵胞性状(正常vs閉鎖)にかかわらずほぼ一定であった。3)黄体における11β-HSD1と2、およびGR mRNAの発現レベルは黄体退行に伴い低下した。

以上のことからウシ卵巣の諸組織が糖質コルチコイドに対して感受性をもつこと(GRの存在)、そしてこれら標的組織における糖質コルチコイドレベルが活性型(11β-HSD1)および非活性型(11β-HSD2)糖質コルチコイド代謝酵素によって局所で調整されている可能性が示唆された。糖質コルチコイドは副腎皮質で生産され全身の器官で様々生理機能を調節する。卵巣の卵胞や黄体は糖質コルチコイドの標的器官であり、糖質コルチコイドによる機能促進、あるいは抑制が知られている。すなわち正常な卵巣機能を維持するためには、卵巣局所における糖質コルチコイドが適切なレベルに保たれて行なければならないはずである。本研究ではウシの卵巣組織における局所的糖質コルチコイド作用調節のメカニズムを検証した。屠場由来のウシ新鮮卵巣から卵胞および黄体を切り出し、各組織からtotalRNAの抽出を行い、糖質コルチコイドの代謝酵素(活性型11β-HSD1および非活性型11β-HSD2)および糖質コルチコイドレセプターmRNAの発現をsemi-quantitative RT-PCRにより定量した。卵胞液中のコルチゾール、エストラジオール、プロジェステロンはEIA法により測定した。得られた主な結果は次のとおりである。1.ウシの卵胞や黄体で糖質コルチコイドレセプターと糖質コルチコイドの代謝酵素である2種類の11β-HSDが発現していること(代謝と受容からなる糖質コルチコイドシステムの存在)。2.これらの代謝酵素の発現が卵胞発育、黄体形成と退行に伴って変動すること(生理状態の変化に伴う糖質コルチコイド環境の変動)。3.成熟卵胞における代謝酵素の発現レベルと卵胞液中コルチゾール(活性型糖質コルチコイド)濃度の間に負の相関関係が認められたこと(代謝酵素による糖質コルチコイドの非活性化)。4.卵胞液中コルチゾールと成熟卵胞の指標であるエストロジェン濃度の間に負の相関関係が認められたこと(糖質コルチゾールによる卵胞成熟の阻害)。これらの結果から卵巣が体内を循環する糖質コルチコイドにただ曝されているだけではなく、それを代謝することで、合目的的に卵巣内糖質コルチコイド環境を調節している可能性が示唆された。
人の空間認知能力を評価し改善するためのユーザインタフェースに関する研究

人の空間認識能力や形状構築能力の評価は,脳の負傷や障害を検査し診断するための重要な医療ツールであり,さらに,脳の認知機能を解明しようとする研究においても不可欠なものである.これらの評価は,患者や被験者に,心的回転(mental rotation)のような純粋な認知タスクを与えるだけではなく,ブロックを配置したり,提示された通りにパズルのピースを並べるといった構築タスクを与えることによって実施されるのが一般的である.これらの構築タスクは,空間認識能力のみならず,知覚・計画・実行といった実際に日常生活で必要とする能力を評価することが可能である.これまでにいくつかの研究において,2次元ではなく3次元形状を用いた構築タスクによる評価が重要であり,有益であることが示されている.我々は,ブロックを提示された形状の通りに組み立てるという,3次元形状を用いた構築タスクを被験者に与え,コンピュータでその構築データを取得し,解析することで,人の空間認知能力評価を行うユーザインタフェースを提案し,検討を進めてきた.本研究では,このユーザインタフェースを子供の脳障害の一つである発達性協調作業障害(DCD)に適用することを目的に,システムの変更と実際の被験者による被験者実験を行った.このシステムの被験者は子供であるため,これまである程度,力の必要であったブロックの接続を,強力な磁石を用いてサポートすることで,子供でも容易にブロックの構築ができるようにし,さらに組み立て形状が崩れてしまう問題の解決を平成17年度に図った.平成18年度は実際に被験者実験を行った.その結果,これまで崩れていたためにノイズが多く含まれていた実験データのノイズが低減され,実験データの信頼性が向上した.また,被験者は形状の構築に集中できるようになった.一方で新たな課題として,DCDとそうでない被験者を決定づける閾値の導出が挙げられる.これは数学的に算出できるものではなく,より多くの被験者実験を通して行う必要がある.人の空間認識能力や形状構築能力の評価は,脳の負傷や障害を検査し診断するための重要な医療ツールであり,さらに,脳の認知機能を解明しようとする研究においても不可欠なものである.これらの評価は,患者や被験者に,心的回転(mental rotation)のような純粋な認知タスクを与えるだけではなく,ブロックを配置したり,提示された通りにパズルのピースを並べるといった構築タスクを与えることによって実施されるのが一般的である.これらの構築タスクは,空間認識能力のみならず,知覚・計画・実行といった実際に日常生活で必要とする能力を評価することが可能である.これまでにいくつかの研究において,2次元ではなく3次元形状を用いた構築タスクによる評価が重要であり,有益であることが示されている.我々は,ブロックを提示された形状の通りに組み立てるという,3次元形状を用いた構築タスクを被験者に与え,コンピュータでその構築データを取得し,解析することで,人の空間認知能力評価を行うユーザインタフェースを提案し,検討を進めてきた.本研究では,このユーザインタフェースを子供の脳障害の一つである発達性協調作業障害(DCD)に適用することを目的に,システムの変更と実際の被験者による被験者実験を行った.このシステムの被験者は子供であるため,これまである程度,力の必要であったブロックの接続を,強力な磁石を用いてサポートすることで,子供でも容易にブロックの構築ができるようにし,さらに組み立て形状が崩れてしまう問題の解決を平成17年度に図った.平成18年度は実際に被験者実験を行った.その結果,これまで崩れていたためにノイズが多く含まれていた実験データのノイズが低減され,実験データの信頼性が向上した.また,被験者は形状の構築に集中できるようになった.一方で新たな課題として,DCDとそうでない被験者を決定づける閾値の導出が挙げられる.これは数学的に算出できるものではなく,より多くの被験者実験を通して行う必要がある.人の空間認識能力や形状構築能力の評価は,脳の負傷や障害を検査し診断するための重要な医療ツールであり,さらに,脳の認知機能を解明しようとする研究においても不可欠なものである.これらの評価は,患者や被験者に,心的回転(mental rotation)のような純粋な認知タスクを与えるだけではなく,ブロックを配置したり,提示された通りにパズルのピースを並べるといった構築タスクを与えることによって実施されるのが一般的である.これらの構築タスクは,空間認識能力のみならず,知覚・計画・実行といった実際に日常生活で必要とする能力を評価することが可能である.これまでにいくつかの研究において,2次元ではなく3次元形状を用いた構築タスクによる評価が重要であり,有益であることが示されている.我々は,ブロックを提示された形状の通りに組み立てるという,3次元形状を用いた構築タスクを被験者に与え,コンピュータでその構築データを取得し,解析することで,人の空間認知能力評価を行うユーザインタフェースを提案し,検討を進めてきた.本年度は,このユーザインタフェースを子供の脳障害の一つである発達性協調作業障害(DCD)に適用することを目的に,システムの変更や被験者実験の検討を行った.子供がシステムを利用するために,これまである程度,力の必要であったブロックの接続を,強力な磁石を用いてサポートすることで,子供でも容易にブロックの構築ができるようにし,さらに組み立て形状が崩れてしまう問題の解決を図った.

さらに,子供が楽しみながら評価実験を行えるように,遊び場を模した概念を取り入れ,遊び場にある様々な物体(ブランコや滑り台など)を手元のブロックで構築するタスクとした.まだ,構築後は,これらの物体を,手元のブロックを用いて操作することで遊べるようにデザインし,子供らが飽きることなくこのシステムを用いることができるようにした.人の空間認識能力や形状構築能力の評価は,脳の負傷や障害を検査し診断するための重要な医療ツールであり,さらに,脳の認知機能を解明しようとする研究においても不可欠なものである.これらの評価は,患者や被験者に,心的回転(mental rotation)のような純粋な認知タスクを与えるだけではなく,ブロックを配置したり,提示された通りにパズルのピースを並べるといった構築タスクを与えることによって実施されるのが一般的である.これらの構築タスクは,空間認識能力のみならず,知覚・計画・実行といった実際に日常生活で必要とする能力を評価することが可能である.これまでにいくつかの研究において,2次元ではなく3次元形状を用いた構築タスクによる評価が重要であり,有益であることが示されている.我々は,ブロックを提示された形状の通りに組み立てるという,3次元形状を用いた構築タスクを被験者に与え,コンピュータでその構築データを取得し,解析することで,人の空間認知能力評価を行うユーザインタフェースを提案し,検討を進めてきた.本年度は,このユーザインタフェースを子供の脳障害の一つである発達性協調作業障害(DCD)に適用することを目的に,システムの変更と実際の被験者による被験者実験を行った.このシステムの被験者は子供であるため,これまである程度,力の必要であったブロックの接続を,強力な磁石を用いてサポートすることで,子供でも容易にブロックの構築ができるようにし,さらに組み立て形状が崩れてしまう問題の解決を昨年度は図った.今年度は実際に被験者実験を行った.その結果,これまで崩れていたためにノイズが多く含まれていた実験データのノイズが低減され,実験データの信頼性が向上した.また,被験者は形状の構築に集中できるようになった.一方で新たな課題として,DCDとそうでない被験者を決定づける閾値の導出が挙げられる.これは数学的に算出できるものではなく,より多くの被験者実験を通して行う必要がある.
漢方製剤を用いた周術期における胆汁うっ滞性肝機能障害に対する新しい分子標的療法

漢方製剤のインチンコウ湯(ICKT)は胆汁うっ滞や黄疸の治療薬に広く使用されている.我々は本剤生薬成分のgeniposideとその活性体であるgenipinの急性投与は有機陰イオン輸送蛋白のmultidrug resistance-associated protein 2(Mrp2)を介在した胆汁酸非依存性の強力な胆汁分泌促進(利胆)作用を発揮することが明らかにした.本剤はラットおよびヒト肝において胆汁酸非依存性に胆汁分泌を強力に促進することも判明した.ICKTは胆汁うっ滞性肝胆道疾患の治療薬として高い有用性が示唆された.漢方製剤のインチンコウ湯(ICKT)は胆汁うっ滞や黄疸の治療薬に広く使用されている.我々は本剤生薬成分のgeniposideとその活性体であるgenipinの急性投与は有機陰イオン輸送蛋白のmultidrug resistance-associated protein 2(Mrp2)を介在した胆汁酸非依存性の強力な胆汁分泌促進(利胆)作用を発揮することが明らかにした.本剤はラットおよびヒト肝において胆汁酸非依存性に胆汁分泌を強力に促進することも判明した.ICKTは胆汁うっ滞性肝胆道疾患の治療薬として高い有用性が示唆された.胆汁うっ滞症の治療にはステロイドホルモン,フェノバルビタール,コレスチラミンなどが経験的に使用されてきたが,その効果は不安定であり有効性も確立されていない。今回は,ICKTの生薬成分であるcapillarisinが薬物代謝や抗酸化作用のマスタージーンであるNrf2に対して,in vitroで活性化作用を持つことを確認した.一方で,Nrf2活性化剤として報告されている01tiprazがin vivoにおいてMrp2-4の発現量を増加させることが報告されている.したがって,Nrf2活性化作用が確認されているcapillarisinにおいてもNrf2を介してMrp2-4発現量を増加させる可能性が考えられた.そこで,ICKTおよびcapillarisinによる,Nrf2を介した生体防御活性化作用がin vivoでも観察されるか否かを検討した.In vivoでのNrf2活性化作用を確認するために実験条件の検討を行様々な条件で投与及び肝採取を行い,採取した肝組織の全ホモジネート液を用いて,Western Blot解析によりMrp2-4の発現量を比較したCorn oilに懸濁させて4日間経口投与したところ,01tiprazほど顕著ではないものの,輸送蛋白の発現量の増加傾向観察され,in vivoにおいてもNrf2活性化作用が認められたと考えられた.しかしながら,マウスの系統により異なるため,今後においては使用予定のノックアウトマウスの供給性の良さ等も考慮に入れて検討を行う必要がある.胆汁うっ滞症の治療にはステロイドホルモン,フェノバルビタール,コレスチラミンなどか経験的に使用されてきたが,その効果は不安定であり有効性も確立されていない.今回は, ICKTの生薬成分であるcapillarisinが薬物代謝や抗酸化作用のマスタージーンであるNrf2に対して.in vitroで活性化作用を持つことを確認した.一方で, Nrf2活性化剤として報告されているOltiprazがin vivoにおいてMrp2-4の発現量を増加させることが報告されている.したがって, Nrf2活性化作用が確認されているcapillarisinにおいてもNrf2を介してMrp2-4の発現量を増加させる可能性が考えられた.そこで, ICKTおよびcapillarisinによるNrf2を介した生体防御活性化作用がin vivoでも観察されるか否かを検討した.In vivoでのNrf2活性化作用を確認するために実験条件の検討を行った.様々な条件で投与及び肝採取を行い,採取した肝組織の全ホモジネート液を用いて, Western Blot解析によりMrp2-4の発現量を比較した.Cornoilに懸濁させて4日間経口投与したところ. Oltiprazほど顕著ではないものの,輸送蛋白MrD2-4の発現量の増加傾向が観察され,in vivoにおいてもNrf2活性化作用が認められたと考えられた.現在,これらICKTのNrf2介在性の薬理効果について, Nrf2遺伝子改変マウスを用いて検討中である.
アルツハイマー病βアミロイド線維の試験管内形成及び分解機構の解明

今年度われわれは、アルツハイマー病βアミロイド線維(fAβ)の分解機構、及びこれらの過程を修飾する生体分子、あるいは有機化合物を明らかにすることを目的とした。1.表面プラズマ共鳴法(ビアコア)を駆使し、fAβ形成・分解をリアルタイムで解析できる開放反応系を確立した。最初にAβ_<1-40>蛋白よりpH7.5でfAβを形成させ、これを重合核としてセンサチップ上に固定化した。次いで、リン酸緩衝液(pH7.5)に溶解した各種濃度(0-30μM)のAβ_<1-40>蛋白溶液を連続的に添加し、37°CにおけるfAβの伸長及び脱重合過程をリアルタイムで測定した。また、センサーチップ表面を原子間力顕微鏡で観察し、fAβの伸長を確認した。以上より、fAβが試験管内でゆっくりと脱重合を起こすこと、及び線維伸長過程と共に脱重合過程も一次反応速度論モデルで説明できることを証明した。2.種々の有機化合物のfAβ分解作用を比較解析した。抗酸化剤NDGA、リファンピシン(RIF)、テトラサイクリン(TC)等の有機化合物を添加後、pH7.5、37°CにおけるfAβの分解過程をチオフラビンT法および電顕を用いて経時的に測定した。その結果、NDGA、次いでRIF、TCが強力な線維分解能を有すること明らかにした。興味深いことに、NDGA、RIF、TCはいずれも、分子構造の中にフリーラジカルスカベンジャーのモチーフを持っている。NDGAを始めとするこれら分子の線維形成抑制、あるいは分解機構の詳細は不明だが、上記モチーフを介してAβ蛋白、あるいはfAβに結合し、Aβ蛋白の立体構造や安定性に影響を与えていると考えられる。また、NDGAに代表される一群の抗酸化剤は、アルツハイマー病をはじめとする種々のヒトアミロイドーシスの治療薬開発に向け、有力な基本分子となる可能性がある。
骨梁強度特性と分子・結晶構造特性に基づく海綿骨強度予測モデル

骨粗鬆症は骨強度が低下し骨折リスクが増大する疾患であり、海綿骨の多い部位での骨折が多い。海綿骨強度の評価には、骨密度や骨梁配向の他に、骨梁自体の強度特性、組織の力学的特性を決定する分子・結晶レベルの構造特性が重要であるが、これらは明らかでない。そこで本研究では、海綿骨強度予測モデルの開発のため、(1)骨梁強度特性、(2)分子・結晶レベルの構造特性、(3)これらの海綿骨強度への寄与を調査した。補助事業期間全体を通じて、以下の成果を得た。(1)棒状・板状の骨梁形態によらず単一骨梁の計測が可能な骨梁強度特性計測システムを開発した。骨梁強度特性として、骨梁弾性率に着目した。ウシ大腿骨頸部および近位骨幹端の海綿骨より単一骨梁試験片を採取し骨梁弾性率を計測した結果、採取部位による有意な差および骨梁配向との有意な相関は認められなかった。また、棒状骨梁と板状骨梁の弾性率を比較した結果、明らかな差は認められなかった。(2)広角X線回折および小角X線散乱による単一骨梁試験片内の分子・結晶レベルの構造特性の計測方法および計測条件を整理した。棒状骨梁において、ハイドロキシアパタイト結晶c軸が骨梁長軸に配向する傾向が認められた。骨梁弾性率と配向度の有意な相関は認められなかった。また、単一骨梁試験片の小角X線散乱像を取得することができ、コラーゲン線維による3次回折ピークを観察することができた。(3)骨梁の大きさを考慮し、海綿骨の力学試験に適した試験片形状及び試験条件を検討した。単一骨梁試験片と同一部位より海綿骨立方体試験片を採取し圧縮試験を行った結果、海綿骨の見かけの弾性率や圧縮強度が有意に異なることを確認した。海綿骨の見かけの弾性率や圧縮強度が異なる一方、骨梁弾性率には明らかな差が認められなかったことから、骨梁弾性率に加えて骨梁形状の影響を含む骨梁剛性が海綿骨強度特性に寄与する可能性が示唆された。骨粗鬆症は骨強度が低下し骨折リスクが増大する疾患であり、海綿骨が多く占める部位での骨折が多く、海綿骨強度を正確に評価することが重要となる。海綿骨強度の評価には、骨密度や骨梁配向の他に、骨梁自体の強度特性や組織の力学的特性を決定する分子・結晶レベルの構造特性が重要であると予想されるが、これらは未だ明らかでない。そこで本研究では、海綿骨強度予測モデル開発のため、(1)骨梁強度特性計測システムを開発し、骨梁強度特性を明らかにすること、(2)分子・結晶レベルの構造特性の計測方法を整理し、骨梁強度特性との対応を調査すること、(3)骨梁強度特性および分子・結晶レベルの構造特性が海綿骨強度に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。2カ年計画のうち初年度に当たる今年度は、以下の成果を得た。(1)棒状・板状等の骨梁形態によらず単一骨梁が計測可能な骨梁強度特性計測システムを開発した。骨梁形態を考慮した片持梁曲げ負荷が可能な機構とした。ウシ大腿骨の頸部および近位骨幹端の海綿骨より骨梁試験片を採取し、骨梁弾性率を計測した結果、採取部位による骨梁弾性率の有意差は認められなかった。一方、皮質骨と海綿骨組織の違いに着目し、皮質骨ー海綿骨遷移領域の骨梁弾性率を計測した結果、海綿骨内部に比べて有意に低いことを示した。(2)X線回折計測により、骨梁試験片内のハイドロキシアパタイト結晶の配向性は、骨梁採取部位によらず、骨梁弾性率とは有意な相関を示さないことを確認した。(3)骨梁強度特性および分子・結晶レベルの構造特性が海綿骨強度に及ぼす影響を調査するため、部位による海綿骨強度の差異を確認した。(1)と同様のウシ大腿骨について、頸部および近位骨幹端より採取した海綿骨立方体試験片の圧縮試験を実施し、海綿骨圧縮強度および見かけの弾性率が有意に異なることを確認した。当初研究計画では、初年度に当たる今年度は、(1)骨梁強度特性計測システムを開発し、骨梁強度特性を明らかにすること、および(2)分子・結晶レベルの構造特性の計測方法を整理することとしていた。研究実績の概要に記載の通り、(1)骨梁形態によらない単一骨梁の強度特性計測システムを開発した。また、海綿骨内の採取部位による骨梁弾性率の違いの有無を確認した。骨梁組織と皮質骨組織の違いに着目し、皮質骨との遷移領域の骨梁強度特性を調査した。(2)結晶レベルの構造特性について、骨梁採取部位によらず、骨梁弾性率と有意な相関を示さないことを示した。以上、概ね当初研究計画通りである。これらの研究成果の一部は、国際会議および国内学会において公表した。また、次年度実施予定であった(3)骨梁強度特性および分子・結晶レベルの構造特性が海綿骨強度に及ぼす影響の調査について、海綿骨試験片の力学試験方法を検討し、骨梁強度特性等との関係の調査に着手した。これらの成果は、次年度開催の国際会議にて公表予定である。以上より、概ね順調に進展している。

海綿骨強度の評価には、骨密度や骨梁配向の他に、骨梁自体の強度特性、組織の力学的特性を決定する分子・結晶レベルの構造特性が重要であるが、これらは明らかでない。そこで本研究では、海綿骨強度予測モデルの開発のため、(1)骨梁強度特性、(2)分子・結晶レベルの構造特性、(3)これらの海綿骨強度への寄与を調査した。補助事業期間全体を通じて、以下の成果を得た。(1)棒状・板状の骨梁形態によらず単一骨梁の計測が可能な骨梁強度特性計測システムを開発した。骨梁強度特性として、骨梁弾性率に着目した。ウシ大腿骨頸部および近位骨幹端の海綿骨より単一骨梁試験片を採取し骨梁弾性率を計測した結果、採取部位による有意な差および骨梁配向との有意な相関は認められなかった。また、棒状骨梁と板状骨梁の弾性率を比較した結果、明らかな差は認められなかった。(2)広角X線回折および小角X線散乱による単一骨梁試験片内の分子・結晶レベルの構造特性の計測方法および計測条件を整理した。棒状骨梁において、ハイドロキシアパタイト結晶c軸が骨梁長軸に配向する傾向が認められた。骨梁弾性率と配向度の有意な相関は認められなかった。また、単一骨梁試験片の小角X線散乱像を取得することができ、コラーゲン線維による3次回折ピークを観察することができた。(3)骨梁の大きさを考慮し、海綿骨の力学試験に適した試験片形状及び試験条件を検討した。単一骨梁試験片と同一部位より海綿骨立方体試験片を採取し圧縮試験を行った結果、海綿骨の見かけの弾性率や圧縮強度が有意に異なることを確認した。海綿骨の見かけの弾性率や圧縮強度が異なる一方、骨梁弾性率には明らかな差が認められなかったことから、骨梁弾性率に加えて骨梁形状の影響を含む骨梁剛性が海綿骨強度特性に寄与する可能性が示唆された。2カ年計画のうち最終年度である次年度は、主に以下を実施予定である。(1)未だ明らかでない骨梁形態と骨梁強度特性の関係を明らかにする。これまでに、骨梁形態を示す海綿骨構造パラメータが海綿骨強度と有意な相関を示すことが報告されてきた。しかし、そのメカニズムは明らかでなかった。そこで、本研究課題において開発した骨梁強度特性計測システムを用いて、骨梁形態による骨梁弾性率の違いを検証する。(2)骨梁内の分子レベルの構造特性計測方法について整理し、分子・結晶レベルの構造特性と骨梁強度特性との対応を引き続き調査する。(3)力学試験に供する海綿骨試験片について、マイクロフォーカスX線CT撮影により骨梁構造を取得し、骨密度、骨梁形態、および骨梁構造特性を解析する。海綿骨強度が異なると予想される複数の部位から海綿骨試験片を採取し、骨梁構造特性、および(1)で明らかにする骨梁強度特性、(2)で明らかにする分子・結晶レベルの構造特性が、海綿骨強度に及ぼす影響を整理する。以上により、骨梁強度特性および分子・結晶レベルの構造特性が海綿骨強度に及ぼす影響を調査する。(理由)当該年度では、骨梁強度特性計測システムを開発したが、一部構成要素に現有装置が代用できたため、物品費を節約することができた。(使用計画)最終年度である次年度は、(1)骨梁強度特性の解明、(2)分子・結晶レベルの構造特性の計測方法の整理を継続して実施し、(3)骨梁強度特性および分子・結晶レベルの構造特性が海綿骨強度に及ぼす影響の調査に取り組む。そのため、骨梁強度特性計測システム開発における物品費を節約して発生した未使用額は、(2)骨梁内の分子・結晶レベルの構造特性計測にかかる物品費、および(1)・(3)における試験片作製・保存等に掛かる消耗品費に充当する計画である。
企業グループ経営と雇用システム、労働市場

平成17年度においては、企業グループ経営と雇用システム、労働市場のあり方にかかわる資料分析および調査を主として行った。第1に、資料分析により、企業グループの形成実態に関する日米比較を行った。具体的には、政府統計および民間の企業データベース、米国のデータアーカイブに収められた企業調査データの個票等を用いて、業種別、企業規模別の平均子会社数、母集団に占める子会社比率等を算出し、わが国の企業グループ形成の特性を明らかにした。第2に、平成16年度に実施した企業グループ内での労働者派遣に関するヒヤリング調査を踏まえ、登録型労働者派遣企業に対するアンケート調査を実施した。調査対象には、特定の事業会社グループに属する派遣企業とそれ以外の派遣企業の両方を含め、企業グループ内で行われる労働者派遣の特徴を看取できるよう設計した。その結果、企業グループ内での派遣は、相対的に派遣期間が長く、派遣労働者も派遣企業に対して定着的であることが確認された。ただし、ヒヤリング調査の結果も踏まえて結論づけるならば、そのような取引関係は必ずしも安定的なものではなく、企業グループとしての経営戦略や、派遣労働者に求められる技能の種類と水準の変化次第で、容易に解消されうる性質のものであることも明らかになった。第3に、大手電機企業グループでのヒヤリング調査に着手した。現在、設計・開発・製造部門の子会社人事部門にて調査を進行中であり、終了次第、親会社人事部門、労働組合へと調査対象を広げる方針である。本年度においては、期初の計画に基づき、以下の作業を行なった。第一に、かねてより用いていた「連結雇用システム」概念を再検討し、これを人事労務管理、ないしは雇用慣行と呼び替え、それらにかんする先行研究のなかに位置づけるべきとの結論を得た。第二に、国内上場企業の有価証券報告書を資料として、1985年から現在にかけての、企業グループ内(中核企業および子会社)の役員構成の変化を数量的に跡付けた。その結果、多少の変動はあるものの、出資比率や企業規模、設立後経過年数をコントロールすれば、中核企業から子会社へ安定的に人材が供給されていることが明らかになった。また、同時に、これら役員供給構造には、企業グループごとの差が大きいことも確認された。第三に、2つの企業グループにおいて、企業グループ内人材派遣会社(いわゆる系列系派遣会社)の役割にかんする調査を行なった。その結果、そこにおいて包括的な人材供給がなされる要因としては、人事労務管理上の方針だけでなく、企業グループ内でのコンプライアンスにかかわる共通方針、顧客となる中核企業・子会社と当該派遣会社との取引関係的特性などが指摘できることを明らかにし、企業グループ内における人事労務管理、雇用慣行の特性を分析するためには、人的資源論と取引関係論とを接合した枠組みが求められることを確認した。第四に、近接分野である計量経済学における、近年のミクロデータを用いた実証分析をレビューし、企業合併など組織再編にともなう正社員層の雇用変動、賃金変動の実態について確認した。
ナトリウム重炭酸共輸送体を標的とした近位尿細管性アシドーシスの分子治療法の開発

ナトリウム重炭酸共輸送体(NBC1)の遺伝子異常により眼症状を伴う近位尿細管性アシドーシスが引き起こされる。我々は非常に稀なこの疾患の遺伝子解析を続けてきた。今研究ではこのNBC1の一変異体である開始アミノ酸コドン29番目で読み込みが中止となるQ29Xにおいて、アミノグリコシドによるreadthrough効果を介した分子治療の可能性を探るため実験を行った。しかし、この方法によっても電気生理活性は出現せず、またウェスタン法においての野生型への蛋白を認めなかった。次にNBC1のC末端欠損を持つΔ65baseの機能解析を行った。XenopusOocyteにおいて野生型と電気生理活性に差は認めないため次にCAIIとの結合能の差異を検討した。C端部のみをGST蛋白と融合させCAIIとのプルダウンアッセイを行ったが野生型も含めて結合は確認できなかった。一方、GFPをN端に付加したコンストラクトを作成し、培養細胞(HUVEC、MDCK)にトランスフェクションをし、蛍光顕微鏡による観察をしたところこのΔ65baseは野生型と異なり細胞膜への発現を認めず、細胞内局在に留まったこの結果からこの変異体は蛋白自体には機能低下はないが、細胞膜への移動が障害されるために各種症状を引き起こすことが示された。またNBC1にはスプライスヴァリアント(腎臓、膵臓、脳型)が存在するがXenopusOocyteにおける機能解析ではkNBC1(腎臓型)と比べて明らかにpNBC1(膵臓型)の電気活性が低下しており、培養細胞の結果と比較してその原因は不明であった。今回、細胞内局在蛋白でIP_3受容体結合蛋白の一つであるIRBITがpNBC1の特異的配列であるN端部に結合することを見出した。OocyteにおいてpNBC1を共発現させるとpNBC1活性は著明に増大し、kNBC1とのほぼ同等の電気活性を認めた。この結果はNBC1のヴァリアント内で細胞内活性化機構に大きな差がある可能性を示した。NBC1の変異体は眼症状を伴う遺伝性近位尿細管性アシドーシス(pRTA)を引き起こす。ほとんどの変異はNBC1輸送活性を低下させるが、Δ65base del変異は野生型とほぼ同様の輸送活性を保持していた。そこでGFPタグつきコンストラクトを作製し、MDCK細胞での発現実験を行ったところ、野生型と異なりその発現は細胞膜には認めずに細胞質、細胞核周囲に限局していた。これらの結果からNBC1の特徴あるC端部は細胞膜への細胞内輸送に必須であり、Δ65base del変異によるpRTAの機序の一因として十分に合理性があることが示唆された。また、Anion Exchanger(AE)はC末端で炭酸脚水化酵素II型(CAII)と結合しAEの活性化に関与すると報告されている。Δ65base変異は提唱されているCAII結合部位を喪失している。そこでNBC1野生型とΔ65base変異のC末端部をGSTに結合させプルダウンアッセイを施行したが、両者ともCAIIに対して明らかな結合は認めなかった。またOocyteと培養細胞においてCAIIの有無でのNBC1の輸送活性の変化を検討したが野生型においてもまたΔ65base変異にも明らかな変化は認められず、CAIIとの相互作用の重要性は確認されなかった。一方、腎型NBC1のN端末内で停止コドンを引き起こす変異体(Q29X)が既に報告されている。このQ29Xの発現実験をOocyteにおいて試みたがNBC1の輸送活性は全く認めなかった。最近、アミノ配糖体が早期停止コドンRNAの転写に影響を与え例えばCFTRΔ508においては正常なCFTR全長蛋白が発現する可能性が示された。同様な実験をこのQ29Xに対して検討するために、GFPタグつきQ29Xコンストラクトを作製し、アミノ配糖体の効果を検討中である。

今回、細胞内局在蛋白でIP_3受容体結合蛋白の一つであるIRBITがpNBC1の特異的配列であるN端部に結合することを見出した。OocyteにおいてpNBC1を共発現させるとpNBC1活性は著明に増大し、kNBC1とのほぼ同等の電気活性を認めた。この結果はNBC1のヴァリアント内で細胞内活性化機構に大きな差がある可能性を示した。
コリン作動性ニューロンによる情動調節における時計遺伝子Bmal1の役割

我々はこれまでの研究において、情動行動異常を示す時計遺伝子Rev-erbαKOマウスが、コリン作動性ニューロンの機能低下を示すことを明らかにした。これを受けて、本研究では、Rev-erbαの下流にある時計遺伝子Bmal1がコリン作動性ニューロン特異的にKOされたマウスを作成し、生体リズムと気分障害を繋ぐ分子メカニズムの解明に迫る。本年度は、まずChATプロモーター下流域にCreを発現させたマウス(ChAT-creマウス)と、Bmal1がfloxedされたマウス(Bmal1-floxedマウス)を掛け合わせ、コリン作動性ニューロン特異的Bmal1 KOマウス(ChAT-Bmal1KOマウス)を作成した。このマウスを用いて、オープンフィールドテスト、高架式十字迷路テストおよび強制水泳テストの3種類の行動テストを行った。その結果、オープンフィールドテストにおける移動距離(自発運動量)および中央滞在時間(不安の指標)、強制水泳テストにおける無動時間(うつの指標)は、コントロールとして用いたBmal1 floxedマウスと比べて、有意な差はみられなかった。一方、高架式十字迷路テストにおいては、不安様行動の指標であるOpened Armsへの進入回数および滞在時間に有意な差はみられないものの、同じく不安様行動の指標として扱われるClosed ArmsおよびNeutral Zoneの滞在時間がコントロールマウスと比べて有意に長いことがわかった。このことから、Chat-Bmal1KOマウスは不安様行動示す可能性が示唆され、コリン作動性ニューロンにおける時計遺伝子の発現異常は、不安を含めた何らかの情動行動異常を引き起こすことが判明した。研究代表者の所属機関異動(平成30年4月に異動)に伴い、ChAT-creマウスおよびBmal1-floxedマウスを現所属機関の飼育施設へ移動する必要があった。しかし、移動手続きおよび検疫の遅延(到着が平成30年11月、検疫終了が平成31年2月)に加え、前所属先でのmatingに関わるトラブルにより、Bmal1-floxedマウスに別の遺伝子が混入してしまっている。そのため、現在はその遺伝子を抜くためのMating作業および新規実験環境のセットアップを同時に行っているので、研究の進捗は遅れている。今後は研究期間を1年延長し、次年度から本格的に研究を再開する予定である。ChAT-Bmal1KOマウスが不安に似た情動行動異常を示す可能性が示唆されたが、表現型としては少し弱い。そのため、今回実施した3つのテストと異なる指標の行動テストを実行し、行動異常の種類を明確にする必要がある。行動の表現型を明確にした後、コリン作動性の神経核であるBasal of Mynertおよび投射先であるPrefrontal cortexの機能と時計遺伝子との関わりを検討し、行動異常発現の原因を探る予定である。

次年度使用額が生じた理由として、研究代表者の所属機関異動により、当該年度に購入予定であった遺伝子改変動物および研究機器が購入できなかったことが挙げられる。また、研究期間を1年延長することから、本来使用するはずであった旅費や研究にかかる物品の購入がなかったことも理由の1つである。次年度は、現所属機関における研究室の立ち上げおよび実験環境のセットアップにかかる費用との兼ね合いをみて、これらの導入を検討する。
高地居住慢性低酸素性肺高血圧とその回復過程における細胞内外のカルシウムイオン動態

正常ラット、低圧低酸素性慢性肺高血圧ラットおよび低圧低酸素暴露中止後性慢性肺高血圧回復ラットの摘出肺血管において、各種収縮物質(KCl、PGF2α)およびニフェジピンに対する収縮および弛緩反応を以下の順に検討した。(方法)ラットを低酸素暴露(1/2大気圧;380mmHg)チャンバー内で10日間飼育することにより慢性肺高血圧(PH)モデルを作成し、10日間低酸素暴露後、大気圧で3日間または14日間飼育することにより、慢性肺高血圧回復モデルを作成した。前年度と同様に、肺外(EPA)および肺内(IPA)肺動脈において、内皮温存および内皮除去肺血管リング状血管片を作成し、収縮物質および弛緩物質に対する等尺性張力変化を検討した。(結果)PGF_<2α>による収縮については、PH肺血管と正常肺血管で、内皮温存、内皮除去血管ともに、中等度の濃度においてPHラットの収縮が有意に増強していた。14日回復過程のIPA内皮除去血管を除いて、回復過程でも収縮は増強していた。PGF_<2α>による前収縮後のNifedipineに対する弛緩については、内皮温存、内皮除去血管ともに、PH肺血管の方が正常肺血管に比べて、弛緩反応が有意に増強した。この弛緩反応の増強は、内皮温存、内皮除去血管ともに、EPAでは14日回復で、IPAでは、3日回復でもとに戻り、それぞれ正常肺血管と有意差がなくなった。これらのことから低酸素暴露によるNifedipineの弛緩反応の亢進に内皮細胞の関与は低く、細胞内外のカルシウムイオン動態に関わる血管平滑筋の機能の変化が原因となっていると考えられ、それが、低酸素暴露中止後の回復過程で徐々に回復した事が観察された。また、Nifedipineに対する弛緩増強の原因として、1)10日PHラットの血管平滑筋の膜電位が正常ラットと比較して上昇していた、2)10日PHラットでは血管平滑筋に存在する活性型L型Ca^<2+>チャネルの数が増加していた、3)10日PHラットの平滑筋細胞膜上のCa^<2+>チャネルに対するNifedipineの親和性が高まっていた、4)収縮タンパクのCa^<2+>に対する感受性が亢進していたことが推測されるが、さらなる検討が必要である。正常ラットおよび低圧低酸素性慢性肺高血圧ラットにおいて、各種収縮物質(KCl、PGF2α)およびニフェジピンに対する収縮および弛緩反応を以下の順に検討した。(方法)ラットを低酸素暴露(1/2大気圧;380mmHg)チャンバー内で10日間飼育することにより慢性肺高血圧(PH)モデルを作成する。ラットをペントバルビタール腹腔内麻酔後、肺外(EPA)および肺内(IPA)肺動脈において、内皮温存および内皮除去リング状血管片を作成する。クレブス液20mlで満たしたマグヌス管に至適張力で懸垂し、等尺性張力変化を測定する。

リング片は70mM KClで2回収縮させ、2回目の収縮を最大収縮とする。次に、PGF2α(10^<-8>-10^<-5>M)を低濃度から段階的に加え、等尺性張力変化を測定し、KCl収縮を最大収縮に対する割合として用量作用曲線を作成する。最後にKCl、PGF2αのいずれかの収縮物質を用いてKCl最大収縮の40-70%の前収縮を得た後、ニフェジピン(10^<-10>-10^<-5>M)を低濃度から段階的に加え、等尺性張力変化を測定し、最後にパパベリン10^<-4>Mにより最大弛緩を得、各濃度において惹起された弛緩をパパベリンによる最大弛緩に対する割合として用量作用曲線を作成する。得られた用量作用曲線の結果を正常肺血管、PH肺血管について比較する。(結果)PGF_2αによる収縮については、PH肺血管と正常肺血管で、内皮温存、内皮除去血管ともに、中等度の濃度において10日PHラットの収縮が有意に増強していた。PGF_2αによる前収縮後のNifedipineに対する弛緩については、内皮温存、内皮除去血管ともに、PH肺血管の方が正常肺血管に比べて、弛緩反応が有意に増強した。これらのことから低酸素暴露によるNifedipineの弛緩反応の亢進に内皮細胞の関与は低く、細胞内外のカルシウムイオン動態に関わる血管平滑筋の機能の変化が原因となっていると考えられた。低圧低酸素性慢性肺高血圧ラットおよび低圧低酸素暴露中止後性慢性肺高血圧回復ラットにおいて、各種収縮物質(KC1、PGF2_α)およびニフェジピンに対する収縮および弛緩反店を以下の順に検討した。(方法)ラットを低酸素暴露(1/2大気圧;380mmHg)チャンバー内で10日間飼育することにより慢性肺高血圧(PH)モデルを作成し、10日間低酸素暴露後、大気圧で3日間または14日間飼育することにより、慢性肺高血圧回復モデルを作成した。前年度と同様に、肺外(EPA)および肺内(IPA)肺動脈において、内皮温存および内皮除去肺血管リング状血管片を作成し、収縮物質および弛緩物質に対する等尺性張力変化を検討した。(結果)PGF_<2α>による収縮については、PH肺血管と正常肺血管で、内皮温存、内皮除去血管ともに、中等度の濃度においてPHラットの収縮が有意に増強していた。14日回復過程のIPA内皮除去血管を除いて、回復過程でも収縮は増強していた。PGF_<2α>による前収縮後のNifedipineに対する弛緩については、内皮温存、内皮除去血管ともに、PH肺血管の方が正常肺血管に比べて、弛緩反応が有意に増強した。この弛緩反応の増強は、内皮温存、内皮除去血管ともに、EPAでは14日回復で、IPAでは、3日回復でもとに戻り、それぞれ正常肺血管と有意差がなくなった。これらのことから低酸素暴露によるNifedipineの弛緩反応の亢進に内皮細胞の関与は低く、細胞内外のカルシウムイオン動態に関わる血管平滑筋の機能の変化が原因となっていると考えられ、それが、低酸素暴露中止後の回復過程で徐々に回復した事が観察された。また、Nifedipineに対する弛緩増強の原因として、1)10日PHラットの血管平滑筋の膜電位が正常ラットと比較して上昇していた、2)10日PHラットでは血管平滑筋に存在する活性型L型Ca^<2+>チャネルの数が増加していた、3)10日PHラットの平滑筋細胞膜上のCa^<2+>チャネルに対するNifedipineの親和性が高まっていた、4)収縮タンパクのCa^<2+>に対する感受性が亢進していた、ことが推測された。
新しい電気化学的アレイ・チップによる心疾患関連遺伝子異常の早期診断法の確立

日本人に高頻度に認められる中程度の高トリグリセリド(TG)血症は、動脈硬化性心疾患の危険因子と考えられている。高TG血症は、リポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子と肝性トリグリセリドリパーゼ遺伝子異常ヘテロ接合体の遺伝素因と環境因子(肝臓でのTG合成を亢進する因子:アルコール多飲や高インシュリン血症等)の負荷で発症する。それ故、LPL遺伝子異常ヘテロ接合体を早期診断することは、将来の動脈硬化症に対する予防医学に於いて重要な課題である。現在、我々によって検出・集積された日本人のLPL遺伝子変異は18種類である。この内、エキソン5のG188EとArita変異(916のG→deletion)、エキソン9のS447Xをモデル変異として選択して、遺伝子型を決定できる電気化学的アレイ(Electrochemical array:ECA)チップの開発を試みた。それぞれの変異を検出する為の変異プローブ(15mer)と対応する正常プローブ(15mer)を電極表面に固定化し、検出用電極として使用した。それぞれの変異を含むLPL遺伝子エキソン5および正常LPL遺伝子エキソン5のPCR産物を検出用電極とハイブリ後、縫い込み型FNDインターカレーターを含む0.25xSSC緩衝液中で、Differential Pulse Voltammetry (DPV)を行ない、遺伝子型を決定した。正常/正常のホモ接合体は、正常プローブ電極で、最大電流値を示し、変異/変異のホモ接合体は、変異プローブ電極で、最大電流値を示し、正常/変異のヘテロ接合体は、正常および変異プローブの両電極で、同程度の電流応答が得られた。確立したECAシステムを用いて、10例の検体に対してブラインドテストを行った結果、全例、遺伝子型を確定することが可能であった(研究成果は、Bioconjugate Chemistry,13:1193-1199,2002;Analytical Sciences,19:79-83,2003に発表)。日本人に高頻度に認められる中程度の高トリグリセリド(TG)血症(IV型高脂血症)は、動脈硬化性心疾患(CHD)の危険因子と考えられている。高TG血症は、リポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子と肝性トリグリセリドリパーゼ(HTGL)遺伝子異常ヘテロ接合体の遺伝素因と環境因子(肝臓でのTG合成を亢進する因子:アルコール多飲や高インシュリン血症等)の負荷で発症する。現在、我々によって検出・集積された日本人のLPL遺伝子変異は、15種類で、本年度(14年度)は、エキソン5のGly-188-Glu(818のG→A)とAla-221-del(916のG→deletion)の遺伝子型を決定できる電気化学的アレイ(Electrochemical array : ECA)チップの開発を試みた。それぞれの変異を検出する為の変異プローブ(15mer)と対応する正常プローブ(15mer)を単電極表面にチオール基を介して固定化し、検出用電極として使用した。それぞれの変異を含むLPL遺伝子エキソン5および正常LPL遺伝子エキソン5のPCR産物を検出用電極とハイブリ後、縫い込み型FNDインターカレーターを含む0.25xSSC

緩衝液中で、Differential Pulse Voltammetry(DPV)を行ない、遺伝子型を決定した。正常/正常のホモ接合体は、正常プローブ電極で、最大電流値を示し、変異/変異のホモ接合体は、変異プローブ電極で、最大電流値を示し、正常/変異のヘテロ接合体は、正常および変異プローブの両電極で、電流応答が得られた。確立したECAシステムを用いて、10例の検体に対してブラインドテストを行った結果、全例、遺伝子型を確定することが可能であった(研究成果は、Bioconjugate Chemistry,13:1193-1199,2002に発表)。日本人に高頻度に認められる中程度の高トリグリセリド(TG)血症(IV型高脂血症)は、動脈硬化性心疾患(CHD)の危険因子と考えられている。高TG血症は、リポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子と肝性トリグリセリドリパーゼ(HTGL)遺伝子異常ヘテロ接合体の遺伝素因と環境因子(肝臓でのTG合成を亢進する因子:アルコール多飲や高インシュリン血症等)の負荷で発症する。それ故、LPL遺伝子異常ヘテロ接合体を早期診断することは、将来の動脈硬化症に対する予防医学に於いて重要な課題である。現在、我々によって検出・集積された日本人のLPL遺伝子変異は、15種類で、本年度(15年度)は、エキソン3のY61X,エキソン5のV200A,A221-del,エキソン6のR243C,A261T,エキソン7のA334T,エキソン8のW382Xの変異をモデル系として、電気化学的アレイ(Electrochemical array:ECA)チップによる検出プロトコールの開発を試みた。それぞれの変異を検出する為の変異プローブ(15mer)と対応する正常プローブ(15mer)を25ピン電極表面に固定化し、検出用電極として使用した。それぞれの変異を含むLPL遺伝子の各エキソンをPCR増幅し、各PCR産物をテンプレイートとし、アシンメトリックPCRを行い、プローブとハイブリ後、縫い込み型FNDインターカレーターを含む0.25xSSC緩衝液中で、Differential Pulse Voltammetry (DPV)を行ない、遺伝子型を決定した。確立したECAシステムを用いて、50例の臨床検体に対してブラインドテストを行った結果、全7例の遺伝子型を確定することが可能であった(研究成果の一部は、Analytical Sciences,19:79-83,2003に発表)。