hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
現代日本画制作における伝承的日本画技法の実践的検討

現代では汎用されなくなった伝承的日本画技法のうち、大根の絞り汁と鶏卵の白身の塗布による銀箔の変色防止技法の有効性を認めることができた。同時に、比較のために塗布した各種液体の効果についても、変色防止効果の有無を確認する事ができ、有効な液体については今後の制作への実用性を確認することができた。また、笹の葉による膠液の防腐作用についての実験では、現代の膠に用いられている防腐剤の影響により、防腐効果を確かめるまでには至らなかった。しかし、これらの伝承的技法を検討したことで、それらの現代における有効性とともに、別の素材による技法についての可能性を確認することができた。【内容】研究代表者:太田は、古典技法書に書かれている大根の絞り汁と卵の白身に加え、緑茶、紅茶、みかん果汁等の塗布による銀箔の変色防止についての経年変化を、実験並びに実制作品において考察し、その効果を確認した。笹の葉による膠液の防腐作用については、通年の実験を通して、季節ごとの効果の差異を考察した。コラージュに用いる糊については、薄い和紙のみではあるが、ほぼ予測通りの効果を確かめることができ、技法的にも確証を得ることができた。研究協力者・程塚には、従来から自作品に用いている銀箔の経年変化についての考察を依頼していた。その防止法はドーサ液の塗布によるものであるが、良好な結果を得たとの報告を受けている。研究協力者・吉田には、膠液の成分分析と、笹の葉の防腐効果ならびに抗菌作用との関連性について、そのメカニズムの解析を依頼した。大根の絞り汁の変色防止については、平成25年度の実験のための準備を進めている。【意義】伝承的技法を資料で読むだけでなく、実際の技法として検証することは、研究代表者が勤務する、筑波大学の芸術専門学群及び大学院博士前期課程及び後期課程の学生の実技指導のために必要なことである。近代以前から伝承されて来た日本画技法に対して、科学的根拠を伴って今後の制作ならびに指導に活用するところに本研究の意義がある。【重要性】伝承されて来た「これまでの技法」をベースとして、それらを現代に適合ならびに応用させ「これからの技法」として実用化することの意義は大きいと考える。それらの情報を筆者を含めた日本画制作者に対して提供することは、現代日本画の今後の在り方を考える意味でも重要である。日本画作品の耐久性とも関わる伝承的技法の検証は、今後の日本画制作において重要な位置を占めると思われる。【内容】研究代表者・太田は、主に2件の実験を行った。1前年までの大根の絞り汁と鶏卵の卵白の塗布による本銀箔の変色防止効果について、引き続き経過観察を行うとともに、変色防止効果の経年変化の比較のためのサンプルを新たに作成した。その結果、伝承的技法による変色防止効果は依然持続していることを認めることができた。また比較のために用いた各種の液体については、その効果に大きな差が出現しており、実用には不向きであるものを指摘することができた。2絵の支持体の一つである桐板へのドーサ液の塗布方法についての実証実験では、水分の有無で収縮を繰り返す桐板の性質と塗布方法を確認することができた。二人の研究分担者からは、日本画作品の銀箔部分の変色状況についての継続的な考察結果と2件の実験結果の提供を受けた。1件目の実験では、制作に用いられる絵具に含まれる膠による塗膜が形成されることで、安定的な変色防止効果を得られることが確認された。2件目の実験では1笹の葉を用いた膠液の防腐作用の実証実験で、実験用に用いた膠に防腐成分が混入されているため、笹の葉の防腐効果があまり認められなかったこと。2本銀箔の変色防止について、概ね予想されたメカニズムを解明したが、引き続き検証実験を続けている旨の報告を受けた。【意義等】制作された日本画作品は、作品自体が安定的な状態であることと、それを保証する環境において長期間保存されることが望ましい。それを可能にするのは、前者では確かな技法や技術力である。今回の研究では、その技法に関する再現実験を行うとともにそのメカニズムを解明することであったが概ね目標を達成することができた。なお、銀箔の変色防止については今後も長期にわたって継続的に考察を行うことが必要である。その間の状況の変化については、随時、情報提供という形で日本画の専門教育の現場に還元し後世に伝えていく必要がある。【内容】銀箔関係では、「大根の絞り汁」および「鶏卵の白身」の塗布による変色防止に関する記述に基づいた実験を行った。この実験では塗布から9ヶ月後の現在でも変色を防いでいることが確かめられた。その他、比較のために「緑茶」「紅茶」「みかん果汁」「フィクサチーフ」など13種類の物質を塗布したが、現代では主流となっている「ドーサ液」とともに効果が確かめられた。

一方、「日本酒」と「梅酒」では銀箔上ではじかれた部分が変色することで思わぬ模様が得られた。銀箔の変色については現在も経過を考察中である。また、「膠液に笹を入れておくと腐りにくい」という記述から、膠液に対する笹の葉の抗菌性実験を行った。この実験は現在も実験を継続中で、平成24年度以降に分析が行われる予定である。コラージュに用いる糊については、分析用資料として研究代表者が実験制作において用いているが、平成24年度において詳細な考察ならびに科学的分析を行う予定である。【意義】銀箔の変色防止実験ならびに変色実験は、実用的な結果と科学的な裏付けが求められるものである。また、膠液に対する笹の葉の抗菌性実験については、これまで長い間用いられてきた三千本膠の生産終了に伴い、新たに市販される三千本膠への効力を分析することが必要になった。今後主流になるであろう膠を調査する意義が新たに生じてきた。【重要性等】現代日本画制作では、これまで科学的根拠を確認しないまま、経験に基づく"勘"によって制作を行ってきた。その技法的な再現実験は研究代表者と一名の研究分担者(程塚)が行ない、その科学的根拠を証明するための実験を、もう一名の研究分担者(吉田)が行う。このように異領域の研究者による共同研究により、有効性が失われることになる従来品のデータに変わる新しい素材や技法の科学的検証は、現代日本画の制作現場への情報還元として待ち望まれているところであると考えている。【研究代表者】大根の絞り汁の銀箔の変色防止効果についてと笹の葉のもつ防腐作用についての実践では、その効果は認められたが、その科学的根拠についての検証がやや遅れている。様々な液体の塗布による変色防止効果について、平成25年度は、本金箔・水金箔・青金箔・白金箔・銅箔でも検証する予定である。【分担者A】自作品における銀箔部分の変色についての考察を依頼している。分担者の技法はドーサ液の塗布によるものであるが、制作数年経た程度では影響はないようであることがわかった。【分担者B】古典技法の根拠となる分析実験を依頼しており、平成24年度は笹の葉の膠液に対する抗菌作用についての実験を継続する中で、随時途中経過の報告を受けていた。現在データを集計・分析中である。また、大根の絞り汁による銀箔の変色防止に関しては、その分析等の実験準備をしている。研究代表者(太田):資料調査については近現代の日本画技法資料を対象としているが、おおむね予定通り現在市販されている資料の調査が進行中である。。新旧技法比較では、様々な液体の塗布による銀箔の変色防止策の実験を行い、現在状況変化を考察中である。主目的の「大根の絞り汁」と「鶏卵の白身」の塗布効果の他、13種類の物質を塗布した比較実験を行うことができた。コラージュの糊については、その分析用資料作成としての制作を予定通り行うことができ、今後の分析のための資料作成を進めることができた。再現実験では、和紙と木材(桐)へのにじみ止めについての効果を作品制作を通して考察中である。研究分担者(程塚)は、銀箔の変色防止の効果について、実際の制作での銀箔使用を通じて経過観察と報告をしている。
超ナノ微結晶ダイヤモンド/アモルファスカーボンの伝導型制御と太陽電池への応用

粒径10nm程度のナノダイヤモンド結晶がアモルファスカーボンマトリックスに内在する,超ナノ微結晶ダイヤモンド薄膜似下,UNCD膜)は,可視から紫外域にかけて大きな光吸収係数を有し,キャリア濃度制御を伴うpn伝導型制御が可能であることから,新規太陽電池材料として興味深い.第3年度目(平成24年度)は,UNCD膜のホモ接合フォトダイオードの創製に向けた基礎研究を行った.デバイス設計に先立ち,マイクロ波光導電率減衰法を用いてフォトキャリアのライフタイムを評価した.その結果,p形UNCD膜において同一材料中で最長である平均寿命2.1マイクロ秒が確認され,受光アクティブ層として有望であることが明らかとなった.これは光吸収とキャリア生成が数百ナノメーターオーダーの膜厚で設計可能であることを意味している.ホモ接合評価では,導電性Si基板上へ縦型ホモpin接合素子を作製し評価した.暗状態・室温下で整流比4桁,理想因子1.0のダイオード特性が得られた.明状態においては光起電力特性が確認され,波長分解フォトレスポンス測定から,ダイヤモンド結晶のバンドギャップ端の光吸収に対応した深紫外光域でのレスポンスに加え,可視光域での光キャリア生成が観測された.可視光吸収による光電変換メカニズムは議論中であるが,膜中に存在する多数の中間準位を介したバンド伝導が関連している可能性がある.1-1のpnヘテロ接合型ダイオード試作では,暗状態において整流比10^3(±1V間)以上の明確な整流特性を確認し,UNCD膜中のキャリア濃度は1.4×10^<17>cm^<-3>,膜側に広がる空乏層幅は-5V逆方向電圧印加下で50nm以上となることを明らかにした.結果を査読付学会誌Japanese Journal of Applied Physicsにまとめた.界面付近でのキャリアの伝導機構については,低電界領域では拡散電流,高電界領域ではトンネル電流が支配的になることを考察している.これはUNCDに特徴的な粒界がトンネルセンターとして働いているためと考えられる.ダイオードの深紫外線照射下における受光特性は70%を超える高い外部量子効率を確認した.このことは生成したフォトキャリアがトラップされることなく有効に回収できていることを意味している.太陽電池特性ではA.M.1.5の疑似太陽光照射下において光起電力特性を確認した.今後UNCD膜中のドーピング量を変化させ,キャリア濃度の最適化を図ることで高い効率が期待できる.1-2のUNCDのn型化では,Li3PO4ドープ,Nドープをそれぞれ試みた.Li3PO4ドープではアンドープ膜に比べて僅かな伝導度の上昇が見られたものの,シンクロトロン光を用いたNEXAFS, XPS, XRD測定では,ドープによって膜構造の大幅な変化が確認され,n型機構の発現には至らなかった.Nドープに関しては有益な結果を得ている.ドープ量によって電気伝導度が10^210^3程度上昇し,キャリア濃度制御が可能であることが明らかとなった.結晶ダイヤモンドと異なり低い活性化エネルギー(約100meV)を形成し,室温でデバイス応用可能である.NEXAFS, FTIRの結果からは,N原子はUNCD膜中の結晶粒界に優先的にドープされることが分かった.結果を査読付学会誌Applied Physics Express, Diamond and Related Materialsにまとめている.第2年度目にあたる平成23年度の研究は,「n型超ナノ微結晶ダイヤモンド(UNCD)膜の創製とそのキャリア濃度コントロール」に重点をおいて実施した.IV族半導体の代表的なn型ドーパンドとして窒素が挙げられるが,ダイヤモンドにおける窒素ドーピングではドナー準位が伝導帯下端より1.7eVの深い位置に形成されてしまい,キャリア濃度の上昇が困難であった.これはダイヤモンド結晶内の置換原子位置に窒素が組み込まれることに起因している.これに対し,本研究では結晶ダイヤモンドとは構造の観点から大きく異なるUNCD膜中への窒素ドープを試みた.その結果,室温で数から数十meVの低い活性化エネルギーが発現することが明らかとなった.これは窒素原子が置換原子位置ではなく,UNCD結晶粒界中に優先的に組み込まれたことによる効果であると考察している.膜の電気伝導度はドープ量に応じて約3桁の変化を示し,室温で最高18[ohm・cm]までコントロールが可能であることを確認した.これは窒素ドープUNCD膜が,n型半導体材料として効果的に機能することを意味している.電気デバイスとしての動作確認のために,p型Si上にn型UNCD膜をヘテロ接合させ電流電圧(J-V)特性を評価したところ,μAオーダーの極めて低いリーク電流を伴う明確な整流特性が確認された.逆方向耐圧特性試験では,-100Vまでブレイクダウン現象は認められず,ダイヤモンド同様に高い破壊電界強度を有していると考えられる.前年度のボロンドープによるp型UNCD膜に続き,今年度は窒素ドープによるn型半導体化を確立することができた.粒径10nm程度のナノダイヤモンド結晶がアモルファスカーボンマトリックスに内在する,超ナノ微結晶ダイヤモンド薄膜似下,UNCD膜)は,可視から紫外域にかけて大きな光吸収係数を有し,キャリア濃度制御を伴うpn伝導型制御が可能であることから,新規太陽電池材料として興味深い.第3年度目(平成24年度)は,UNCD膜のホモ接合フォトダイオードの創製に向けた基礎研究を行った.デバイス設計に先立ち,マイクロ波光導電率減衰法を用いてフォトキャリアのライフタイムを評価した.

その結果,p形UNCD膜において同一材料中で最長である平均寿命2.1マイクロ秒が確認され,受光アクティブ層として有望であることが明らかとなった.これは光吸収とキャリア生成が数百ナノメーターオーダーの膜厚で設計可能であることを意味している.ホモ接合評価では,導電性Si基板上へ縦型ホモpin接合素子を作製し評価した.暗状態・室温下で整流比4桁,理想因子1.0のダイオード特性が得られた.明状態においては光起電力特性が確認され,波長分解フォトレスポンス測定から,ダイヤモンド結晶のバンドギャップ端の光吸収に対応した深紫外光域でのレスポンスに加え,可視光域での光キャリア生成が観測された.可視光吸収による光電変換メカニズムは議論中であるが,膜中に存在する多数の中間準位を介したバンド伝導が関連している可能性がある.窒素ドープによる超ナノ微結晶ダイヤモンド(UNCD)膜のn型化とキャリア濃度コントロールが再現性良く実現可能であることを明らかにした.これは本課題最大の目標であるUNCD膜のpn接合フォトダイオードの創製に向けた重要な基盤研究であり,前年度のp型化に引き続きn型化が実現できたことは大きな成果であると考えている.UNCD膜のpn接合フォトダイオードの創製に取り組み,光電気物性を詳細に明らかにする.
連続的に把握可能な掃流砂量計の新規開発とその普遍化

掃流砂量計の開発,実験を主とした試験と研究の取りまとめを行った。研究期間内で成果の見通しの悪い項目も実験的に検討し,当初開発メニューに到達させた。まず,掃流砂量計の開発を行い,その後,水中荷重計のフレーム内の水圧開放に関する最終的な検討を行った。次に,当該期間中に構築された流砂理論の適用により水流の底面流速と掃流砂流の平均速度の推定等の演繹された理論を用いて流砂量を算出し,水中荷重計の流砂量の計測データに対する相関関係を検討し,水中荷重計を用いた予測値に対する実験係数を求めた。さらに,副次的な成果として荷重計等を用いた土石流の検知センサー(LVPセンサー)の試作と現地適用性の検証を行った。平成27年度の当初予定では,掃流砂量計一式の開発のための準備を行うと共に,室内水路実験を推進する予定であった。事前の予備検討により,水中重量を計測するための水没するロードセルの仕組みに関する新たなアイディアが生まれたため,これを実現するために,掃流砂量計一式の試作機の作製に注力した。そのため,物品費として,特注品の改良型水中荷重計(一式)の予算を執行した。試作した掃流砂量計の作動確認等を空気中・水中で行い,計測機器の準備を行った。申請者らが,以前に取得した室内水路・現地水路実験データを用いて,掃流砂の移動速度に関する検討を行った。掃流砂流の水中重量や底面付近の水流速度に関する連続データの解析を行った。計測では,カメラ等による流況(静止画,動画)の撮影,ポイントゲージ等による水深,底面流速計による底面付近の清水流速の計測を行った。これらの機器は,研究代表者の組織が所有のものを用いた。一方,流砂理論の適用による水流の底面流速と掃流砂流の平均速度の推定等の理論展開について,掃流砂を含む清水流について,砂礫の移動速度と底面付近の清水流の流速との関係を理論的に演繹し,初年度の段階で,フレームワークの見通しをつけた。例えば,既往の他の手法のレビューを行うと共に,粗面乱流の対数型の流速分布を仮定し,清水流の鉛直方向の流速分布を解き,底面付近(河床から0.3cm)の清水流速を求めた。その流速と掃流砂流の移動速度が比例関係であると仮定し,比例係数を実験データを用いて逆算した。なお,研究成果の一部は,査読付き論文等の学術雑誌への投稿を行い,速報性の高いもの及び本成果を通じて派生的に生まれたアイディア等は,口頭発表(査読なし)に発表している。特段,研究の進捗に関する問題はない。当該年度においては,主として,掃流砂量計一式の試作機を用いて,現地実験を推進した。実験においては,京大穂高観測所(研究協力者1)の所有する現地水路を用いた実験を行った。出水に応じた流水・流砂のある場での底面流速計のデータと掃流砂量計による土砂の重量に関する計測データを収集した。前年度までに,掃流砂の移動速度の予測式を用いた掃流砂量と比較し,室内の水路実験で同定された実験定数との比較検証を行う予定であったが,現地実験において,水中荷重計のフレーム内の水圧(内圧)の開放が緩慢となることが原因で計測荷重が過小となると共に,2組の荷重時系列の波形から相互相関法により求められる流砂の移動時間の予測が過小となった。一方,前年度および今年度において検討した水の底面流速および流砂移動速度の関係に関する理論的な解析と比較しても,その過小性が明らかになった。荷重プレート上に,砂礫を通さず,水のみを通過させる金属フィルターと連通管を用いて,荷重計フレーム内の内圧を開放するための改良を行い,簡易的な現地試験を行って,現地出水をとらえる準備を行った。例年,数回程度の出水が,現地観測水路で発生するが,今年度は発生出水が少なく,現地観測データの取得が困難であった。そのため,次年度において,室内の水路実験を行い,金属フィルターと連通管を用いた水中荷重計の内圧開放に関するデータ取得を行うための計画を策定した。また,現地に設置した掃流砂量計一式の試作機の設置後以降の耐久性・維持管理に必要なデータを取得した。すなわち,フレームや金属天板等の腐食等の発生の有無や,使用機器の劣化等に関する情報であるが,今のところ,いずれにおいても不具合は生じていない。引き続き,これらに関する経年変化に関するデータを取得していく。さらに,掃流砂量計の開発によって付随的に開発できたLVPセンサーの現地データ取得もできた。平成29年度においては,研究の取りまとめを行った。研究期間内で成果の見通しの悪い項目についても,実験的に検討して,当初成果の到達に努めた。まず,水中荷重計のフレーム内の水圧(内圧)開放に関する最終的な検討を行った。内圧の除去のために,フレーム天板に金属フィルターを設置し,フレームに連通管を用いた構造とすることで,内圧開放が実現できることを室内直線水路実験により確認した。この改良構造をもった水中荷重計を京大穂高砂防観測所(研究協力者1)の試験水路に設置し,現地での簡易試験を行ったところ,若干の内圧開放が行われない場合もあったが,全般的に,改良前よりも改善されたデータが取得された。

次に,前年度に構築された流砂理論の適用による水流の底面流速と掃流砂流の平均速度の推定等の演繹された理論を用いて流砂量を算出し,水中荷重計の流砂量の計測データに対する相関関係を検討し,水中荷重計を用いた予測値に対する実験係数を求めた。算定された実験係数は砂礫の粒径のみの関数となり,一意的な普遍定数を得るまでには至らないと云う課題が残った。さらに,平成27年度の当初予定では想定していなかった副次的な成果も生まれた。現地計測における荷重計の有用性が明らかとなったため,水中荷重計の製作に適用した知見を用いて,荷重計,加速度計,圧力センサーによる土石流の検知センサー(LVPセンサー)の試作を行い,現地適用性の検証が行えるレベルまで,センサーの検証が進展した。掃流砂量計の開発,実験を主とした試験と研究の取りまとめを行った。研究期間内で成果の見通しの悪い項目も実験的に検討し,当初開発メニューに到達させた。まず,掃流砂量計の開発を行い,その後,水中荷重計のフレーム内の水圧開放に関する最終的な検討を行った。次に,当該期間中に構築された流砂理論の適用により水流の底面流速と掃流砂流の平均速度の推定等の演繹された理論を用いて流砂量を算出し,水中荷重計の流砂量の計測データに対する相関関係を検討し,水中荷重計を用いた予測値に対する実験係数を求めた。さらに,副次的な成果として荷重計等を用いた土石流の検知センサー(LVPセンサー)の試作と現地適用性の検証を行った。平成28年度においては,主として,掃流砂量計一式の試作機を用い,室内・現地実験を推進する。室内実験においては,粒径が一様な複数種類の砂礫を購入し,定常・等流場における掃流砂量と掃流砂量計による計測データとの相関関係を確認し,掃流砂量計の計測範囲等に関する検討を行う。現地実験においては,京大穂高観測所(研究協力者1)の所有する現地水路を用いた実験を行う。出水に応じた底面流速計のデータと掃流砂量計による土砂の重量に関する計測データを収集する。得られたデータを理論検討において構築された掃流砂の移動速度の予測式を用いた掃流砂量と比較し,水路実験で同定された実験定数の普遍性の検証を行う。さらに,現地設置された機器一式の耐久性・維持管理に必要なデータも取得する予定である。また,京大穂高観測所の観測水路には大型バケット式のピット流砂箱があるため,これが一杯になるまでの間は掃流砂の土砂量が計測されているため,掃流砂量計一式で計測されるデータとの比較検討を行う予定である。流砂速度は2つの荷重計の波形の相互相関法を用いていたが,粒径・流砂量に対して,同法の適用性の限界が見えつつあり,他の手法の適用性等の検討により流砂移動速度の精度を向上させる。また,底面せん断力・流速および流砂移動速度の関係に関する理論的な検討を行う。掃流砂量計一式の機器の補修のための消耗品(鉄材等)や全般的な消耗品を予定している。当該年度においては,前年度に得られた水路実験のデータ等の結果について,外部からの意見を伺うために,国外内の関連学会発表の旅費・参加費,研究協力者や外部学識者への意見聴取の旅費や謝礼も見込む。当初,協力者(研究協力者2)であったロードセル等の開発者(団体)の荷重計の水中での適用性において不備が生じたため,平成28年度以降では,他の協力者を得て,掃流者量計の改良等を推進する予定である。平成29年度においては,当初の予定通りに,研究成果の取り纏めを行う。さらに,掃流砂量計一式の機器の実用化に向けた最終確認を機器・理論の両面から行う予定である。
海洋光合成カロテノイドの超エネルギー伝達効率解明に向けた有機合成からのアプローチ

多官能性カロテノイドのペリジニン及びフコキサンチンは、海洋光合成初期過程を担う補助集光性色素である。これらは、クロロフィルやタンパクと超分子複合体を形成し、吸収光エネルギーを85-95%以上の超効率でクロロフィルへ伝達する。本研究では、両カロテノイドの特徴的官能基や共役鎖長を変えた類縁体をシリーズで合成し、それらの分光学的性質を天然物と比較することにより、両天然物の構造的特徴と機能の関係をほぼ明らかにした。多官能性カロテノイドのペリジニンおよびフコキサンチンは、海洋光合成の初期過程を担う主要な補助集光色素である。これらは、クロロフィルおよびタンパク質とアンテナ色素超分子複合体を形成し、吸収光エネルギーを80-95%の超効率でクロロフィルへ伝達する。本研究では、両天然物の構造的特徴と機能の関係を解明したい。先ず1.ペリジニンの特徴的官能基であるイリデンブテノリド環の存在意義を検討するため、この官能基を中央へシフトさせた誘導体の合成法を検討した。その結果、極めて効率的な4段階ワンポット反応を実現し、その合成法の開発に成功した。この合成法は立体化学を十分に制御するばかりでなく、広く応用可能である。次いで、2.類縁体合成にも適用可能な効率的かつ立体選択的なフコキサンチンの全合成を試みた。フコキサンチンは、特に塩基に不安定なβ-ケトエポキシ構造を持ちその合成はこれまでに1例しかなく、その合成も6員環部およびオレフィン部の立体化学は制御されていない。そこでペリジニン合成と同様に、アレンセグメントとβ-ケトエポキシセグメントの2成分から合成することとし、不安定なβ-ケトエポキシ部は合成の最終段階に構築する計画を立てた。検討の結果、ホモアリルアルコールを利用した不斉エポキシ化反応により立体選択的エポキシ化を実現し、手掛かりとした水酸基の立体化学を光延反応により反転させ、6員環部の立体選択的な構築に成功した。その後、共役鎖の伸長を経てエポキシセグメントとし、改良ジュリア反応により両セグメントの結合、アリル位水酸基の選択的酸化、共役オレフィンの異性化を経て、初の立体化学を制御したフコキサンチンの全合成を達成した。1.昨年度開発した共役鎖長を有するイリデンブテノリドのワンポット合成法を基にして、ペリジニンにおけるイリデンブテノリド環を中央方向へ共役オレフィン一つ分および二つ分移動させた二種の類縁体A,Bの合成を達成した。合成した二種の類縁体A,Bの超時間分解吸収スペクトルを測定したところ、イリデンブテノリド環がほぼ中央に位置する類縁体Bでは、溶媒によらず、S_<ICT>(Intramolecular Charge Transfer State)は観測されなかった。このように、メタノール中でもS_<ICT>が観測されないイリデンブテノリド環を有した化合物は初めてであり、S_<ICT>が観測されるためにはカルボニル基に対して分子が非対称でなければならないことが実証されたと言える。2.一方、すでに立体化学を制御したフコキサンチンの全合成を達成しているが、この合成法をさらに発展させ、フコキサンチンに存在する7つの共役オレフィンが2つ少ないC35類縁体、1つ少ないC37類縁体、および1つ多いC42類縁体の合成を達成した。特にC42類縁体は、天然物より共役オレフィン数が1つ多いためその安定性が懸念されたが、特に問題はなかった。またC35、C37類縁体合成では、工程数を減らした効率よい合成法を新たに開発することができた。次いで、これらの超時間分解吸収スペクトルを測定した結果、先にペリジニンで得たS_<ICT>の特異な性質を実証する結果を得た。このようにして、これまで全く解明されていなかった新規な励起エネルギー準位であるS_<ICT>の特異な性質を初めて確証することができた。海洋の光合成初期過程では、多官能性カロテノイドであるペリジニンやフコキサンチンが主な補助集光性色素として働き、クロロフィルが吸収できない青緑色の波長の光を吸収し、クロロフィルおよびタンパクとから形成する超分子複合体において85%以上の超効率でクロロフィルへエネルギー伝達する。本研究では、これらカロテノイドの様々な類縁体を効率よく合成し、両者の構造的特徴と機能の関係を明らかにし、超効率的エネルギー伝達機構の解明を目的とする。この目的のため24年度は以下の成果をあげた。1.ペリジニンのイリデンブテノリド官能基が示す特異な性質の解明と、超効率的エネルギー伝達機能を有する新奇な化合物の開発を目指し、ペリジニンにおいてイリデンブテノリドのみを有する新規類縁体として、C30類縁体の合成に成功した。今後、C32類縁体などを合成し、これらの性質を、酸素官能基を全く持たないβ-カロテンの相当する類縁体と分光学的に比較・検討する。

2.超効率的エネルギー伝達の鍵となる新規なエネルギー準位として注目されるSICT励起エネルギー準位(intramolecular charge transfer state)の特異な性質を解明するため、アレンに共役したオレフィンの数が4のC29ペリジニン類縁体の新規なワンポット合成を実現した。この分子のSICT準位について、既に合成したフコキサンチンの相当する類縁体と、分光学的に比較検討する。3.フコキサンチンにおける分子内電化移動状態に対し、アレン結合がどのような効果を及ぼすかを検討するため、アレンをオレフィンに変換したC32類縁体の合成に成功した。また、この分子は酸で容易に異性化することを見いだした。今後、この類縁体の超高速時間分解吸収スペクトルを測定し、アレンの果たす効果を検討する。以上のように、本年度は十分に予定した成果を上げることが出来た。当初の計画以上に進展している。特にフコキサンチンおよびその類縁体の合成法を確立したことにより、S_<ICT>エネルギー準位の新たな特性の観測に成功している。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.ペリジニンのイリデンブテノリド官能基が示すユニークな性質の解明を目指し、β-カロテンとの比較対照を意図してβ-カロテンのイリデンブテノリド類縁体の開発とその特性を検討する。2.ペリジニンにおけるイリデンブテノリド官能基のS_<ICT>エネルギー準位に対する効果を検討するため、共役オレフィンの数が4のC31類縁体の合成を検討する。3.フコキサンチンにおけるアレン結合のS_<ICT>に及ぼす効果を検討するため、アレンをオレフィンに変えたC32、C40類縁体の合成を検討する。
多発性筋炎における筋崩壊機構の解明と治療法の開発

多発性筋炎における筋崩壊機構を解明するために、細胞照会性T-リンパ球に存在する膜障害タンパク質パ-フォリン及びセリンエステラ-ゼに関する研究を行い、次の新しい知見が得られた。1、酸性ムコ多糖がパ-フォリン活性を増大させることを明らかにした。脱硫酸化した化合物には活性増大作用はなく、硫酸基あるいは負電荷が重要な働きをしていると考えられた。酸性ムコ多糖のうちでは、ヘパリンが最も活性増大の効果が大きく、数ng/ml以上の濃度でパ-フォリン活性を増大させた。またヘパリンはパ-フォリンの標的細胞への結合は促進せず、パ-フォリン重合による膜障害作用に直接関与することを明らかにした。2.パ-フォリンはGa^<2+>依存的に細胞を障害することは知られていたが、今回Ca^<2+>はパ-フォリン分子が標的細胞膜に結合(Ka=200μM)する過程にも、パ-フォリン重合による「穴」形成過程(Ka=50μM)にも必要であることが明らかとなった。3.従来、細胞障害性T-リンパ球に特異的に存在するプロテア-ゼの基質としてBLTとpro-Rhe-ArgMCAが使用されていたが、BLTの方がこのプロテア-ゼに特異的な基質であることを明らかにした。またこの活性はPMSF、ピュ-ロマイシンで強く阻害され、セリンエステラ-ゼであることも確認された。しかし、セリンエステラ-ゼ分画によってはミオシンの分解は観察されなかった。4.細胞分画法によってパ-フォリンとセリンエステラ-ゼが異なる細胞内顆粒に存在している可能性が高いことを示した。5.ヒト血清より分子量500KDのパ-フォリンインヒビタ-タンパク質が精製され、ヘパリンとは異なりパ-フォリンの膜結合過程を抑制する事が明らかになった。多発性筋炎における筋崩壊機構を解明するために、細胞障害性T-リンパ球に存在する膜障害タンパク質パーフォリン及びセリンエステラーゼに関する研究を行い、次の新しい知見が得られた。1.酸性ムコ多糖がパーフォリン活性を増大させることを明らかにした。酸性ムコ多糖のうちでは、ヘパリンが最も活性増大の効果が大きく、数ng/ml以上の濃度でパーフォリン活性を増大させた。またヘパリンはパーフォリンの標的細胞への結合は促進せず、パーフォリン重合による膜障害作用に直接関与することを明らかにした。2.パーフォリンはCa^<2+>依存的に細胞を障害することは知られていたが、今回Ca^<2+>はパーフォリン分子が標的細胞膜に結合(Ka=200μM)する過程にも、パーフォリン重合による「穴」形式過程(Ka=50μM)にも必要であることが明らかになった。3.従来、細胞障害性T-リンパ球に特異的に存在するプロテアーゼの基質としてBLTとPro-Rhe-ArgMCAが使用されていたが、BLTの方がこのプロテアーゼに特異的な基質であることを明らかにした。またこの活性はPMSF、ピューロマイシンで強く阻害され、セリンエステラーゼであることも確認された。しかし、セリンエステラーゼ分画によってはミオシンの分解は観察されなかった。4.細胞分画法によってパーフォリンとセリンエステラーゼが異なる細胞内顆粒に存在している可能性が高いことを示した。多発性筋炎における骨格筋崩壊機構を解明するために本疾患に特異的浸潤細胞である細胞障害性Tー

リンパ球(CTL)に注目した。CTL中に存在する膜障害性タンパク質パ-フォリン及びタンパク分解酵素を抽出し、その物理化学的、細胞生物学的特性を検索して来たが、本年度はヒト血清がパ-フォリン活性を強く抑制する事を見出しこの抑制物質の抽出を試みた。血清中に存在するパ-フォリン活性抑制物質の抽出四名の健康成人男子から調整したヒト血清20mlを5mMPB(pH7.0)により透析したのち、30mlのDEAEセルロ-スカラムにアプライしNaCl直線濃度勾配にてタンパク質の溶出を行うと、パ-フォリン活性阻害タンパク質はNaCl0.51.5Mにて溶出された。この活性分画を5mMPBにて透析したのち、固型硫酸アンモニウムを加えてタンパク沈澱を行うと活性阻害タンパク質は硫酸アンモニウム30g/dlにより沈澱することが明らかとなった。この活性分画をHPLCゲルろ過(TSKーG3000SW)カラムにアプライすると活性阻害タンパク質は素通り分画(分子量約500KD)に得られた。更にこの活性分画を5mMPBによ透析したのち10mlのHydroxylapatiteカラムにアプライし、5mM0.5MPBによるStepーwise gradientで溶出すると、インヒビタ-活性タンパク質は0.3MPBにより溶出された。以上の過程によりSDSゲル電気泳動上分子量約500KDのパ-フォリン活性阻害タンパク質が精製された。このインヒビタ-タンパク質についてパ-フォリンの膜結合および細胞傷害作用におよぼす影響を検討したところ、このインタヒビタ-タンパク質は主としてパ-フォリンの膜結合過程を抑制することが判明した。
気管支喘息の病態における好酸球機能発現の多面性

気管支喘息の重症化・慢性化には好酸球による気道炎症が重要な役割を果していると考えられている。そして気道組織内に浸潤した好酸球は種々のサイトカインや化学伝達物質により機能的に活性化され組織傷害性を発揮する。本研究では抗好酸球モノクロ-ナル抗体を確立しそれがいかなる活性化好酸球を認識するかを検討した。その結果本抗体は,好酸球増多症患者の好酸球とのみ反応し,健常者好酸球とは反応しないことが明らかにされ,本抗体は活性化好酸球の解析に有用と考えられた。次に好酸球を活性化することが知られているサイトカイン(ILー3,ILー5,GMーCSF)によりヒト末梢血好酸球をin vitroで活性化させ,本抗好酸球抗体との反応性をFACSにて解析した。本抗好酸球抗体はGMーCSFと培養した好酸球とのみ強く反応し,ILー3或いはILー5と培養した好酸球とは反応しなかった。したがって,本抗好酸球抗体はヒト好酸球がGMーCSFにより活性化された際に特異的に発現される細胞表面分子を認識すると考考えられた。本研究では次に,ヒト臍帯血単核球をILー3とILー5と共に4週間培養することにより好酸球のみを選択的に誘導する実験系を確立し,これにより各種サイトカインの好酸球の分化増殖に対する効果を検討した。IFNーγは非常に低濃度(5単位/ml)で好酸球の分化増殖を抑制した。ILー4も同様に10単位/mlから用量依存性に好酸球の分化増殖を抑制した。しかしILー4の添加ではT細胞の増加を認めた。ILー2も低濃度で好酸球の分化増殖を抑制した。以上からILー2,ILー4,IFNーγはいずれも直接または間接的にヒト好酸球の分化増殖を抑制すると考えられた。最後にサブスタンスP(SP)の好酸球活性化作用を検討した。その結果神経性炎症の惹起物質であるSPは好酸球を直接活性化し,気管支喘息の発症に関与することが示された。好酸球は気管支喘息の慢性化・遷延化に重要な役割りをはたしていると考えられている。本研究では、ヒト好酸球の機能を解析をするために、気管支喘息患者および好酸球増加症候群患者末梢血液からフロ-サイトメトリ-をもちいて、好酸球を精製した。その結果,好酸球のもつ自家蛍光を指標として純度95%以上の好酸球の分離に成功した。好酸球増加症候群の数例について濃度勾配比重遠心法で分離し、細胞表面に低親和性IgEレセプタ-(FcεRI)が発現されるかいなかを観察した。その結果、低比重好酸球のみに発現していた。この精製好酸球でマウスを免疫してモノクロ-ナル抗体を2クロ-ン得た、一つの抗体(A E700)は好中球,好酸球,単球に反応した。第二の抗体(AE 700)は、好酸球増加を示す患者の好酸球および好中球のみと反応し、リンパ球、単球等とは反応しない抗体であることがわかった。現在この抗体が認識する抗原の解析を進めている。好酸球の分化とその分化段階における好酸球の機能を解析するために、ヒト臍帯血から単核球を分離し、ヒトリコンビナントIL-5を用いて好酸球の培養を試みた。

その結果、ある分化段階の好酸球が得られた。現在この好酸球を用いてマウスを免疫し、モノクロ-ナル抗体を作成している。気管支喘息の慢性化には好酸球による気道炎症が重要な役割を果していると考えせれている。そして気道組織内に浸潤した好酸球は種々のサイトカインや化学伝達物質により機能的に活性化されていることが示唆されている。本研究では前年度に開発した抗好酸球モノクロ-ナル抗体がいかなる活性化好酸球を認識するかを検討した。すなわち,好酸球を活性化することが知られているサイトカイン(ILー3,ILー5,或いはGMーCSF)によりヒト末梢血好酸球をin vitroで活性化させ,本抗好酸球抗体との反応性をFACSにて解析した。その結果,本抗好酸球抗体はGMーCSFと培養した好酸球とのみ強く反応し,ILー3或いはILー5と培養した好酸球とは反応しなかった。したがって,本抗好酸球抗体はヒト好酸球がGMーCSFにより活性化された際に特異的に発現される細胞表面分子を認識すると考えられた。次に,ヒト〓帯血単核球をILー3とILー5と共に4週間培養することにより好酸球のみを誘導する実験系を確立した。これにより純度90%以上の好酸球を試験管内で得ることができた。しかしこの好酸球には本抗好酸球抗体は反応しなかった。最後に,気管支喘息の発症には神経性炎症の関与が考えられていることから,サブスタンスP(SP)の好酸球活性化作用を検討した。まずSPによるヒト好酸球のECP遊離,O^-_2産生およびLTC_4産生を検討した。その結果,SPはECP遊離とO^-_2産生を惹起したが,LTC_4産生は認められなかった。この作用はC末端ペプチドSP_<6ー11>でも同様に惹起されたが,N末端ペプチドSP_<1ー9>では惹起されなかった。したがって,神経性炎症の惹起物質であるSPは好酸球を直接活性化することにより気管支喘息の発症に関与することが示された。気管支喘息の重症化・慢性化には好酸球による気道炎症が重要な役割を果していると考えられている。そして気道組織内に浸潤した好酸球は種々のサイトカインや化学伝達物質により機能目に活性化され組織傷害性を発揮する。本研究ではまずヒト臍帯血単核球をILー3とILー5と共に4週間培養することにより好酸球のみを誘導する実験系を確立し、この好酸球の増殖・分化に対する各種サイトカインの調節的役割を検討した。はじめにIFNーγ(5ー500unit/ml)をDay0から添加すると、非常に低濃度(5unit/ml)で好酸球の増殖分化が80%以上抑制された。ILー4(10ー300unit/ml)を添加し好酸球の増殖分化に対する効果が見ると、ILー4も同様に10unit/mlから用量依存性に好酸球の増殖分化の抑制(70ー86%の抑制)を示した。しかしILー4の添加では全細胞数の低下は軽度で、T細胞の増加を認めた。ILー2も低濃度で好酸球の分化増殖を抑制した。以上からILー2、ILー4、IFNーγはいずれも直接または間接的にヒト好酸球の増殖分化を抑制すると考えられた。次に好酸球増多を呈する患者末梢血より得られた精製好酸球を用いて,各種抗アレルギ-薬に化学伝達物質遊離抑制作用を検討した。実験系としては精製ヒト好酸球をカルシウムイオノフォアまたは血小板活性化因子にて刺激し、ロイコトリエンC_4(LTC_4)産生とECP遊離を調べた。その結果β_2刺激薬プロカテロ-ルはLTC_4産生とECP遊離共に抑制し、LTC_4産生をより強く抑制した。さらに新しい抗アレルギ-薬TBXも上記刺激によるヒト好酸球からの化学伝達物質遊離を用量依存性に抑制した。
カルバゾール発色団の光電子物性の解明と新規な光誘起電子伝達系の開発

カルバゾール発色団の励起状態における光電子物性を調べた。ポリ(N-ビニルカルバゾール)が光照射下で生成するエキシマー、ならびにテレフタレート(アクセプター)共存下で生成するエキシプレックス(エキシタープレックス)の構造および物性を解明した。さらに、カルバゾール-アクセプター系の光誘起電子伝達系の開発も行った。1.エキシマーについて2架橋系[3.n](3,9)-および3架橋系[3.3.n](3,6,9)カルバゾロファン類を系統的に合成し、それらの発光挙動を蛍光およびりん光スペクトルから調べた。部分重なり型と完全重なり型エキシマーが生成するための構造上の特徴、すなわち二つのカルバゾール環の相対配置を明らかにすることができた。特に、完全重なり型については三重項エキシマーの生成を確認することができた。2.エキシプレックスについてテレフタレート-カルバゾール型シクロファン1を合成し、その蛍光スペクトル測定からエキシプッレクス型発光であることを見出した。発光波長と溶媒の極性との関係を調べるため、Lippert-Matagaプロットを行ったところ直線関係が成立した。この特異な発光現象を利用して、1のエキシプレックス発光波長から種々の高分子のような媒体中での局所的な極性の見積もりが算出できること(蛍光プローブとしての応用)を明らかにした。3.光誘起電子伝達系の開発についてカルバゾロファンと種々のテレフタレート誘導体の連結系を合成した。テレフタレート誘導体のアクセプター性が弱いときはカルバゾロファンのエキシマー発光が現れ、アクセプター性の増大とともにエキシマー発光の減少とエキシタープレックス発光の出現、さらなるアクセプター性の増大はエキシタープレックス発光の減少と光誘起電子移動が起こることがわかった。カルバゾール発色団は、光電導性を示すことで有名なポリ(N-ビニルカルバゾール)の構成単位であり、その励起状態における光電子物性は興味が持たれている。ポリ(N-ビニルカルバゾール)は光照射下でエキシマーを、またカルバゾールとスチレンの共重合体はテレフタレートのようなアクセプター共存下でエキシプレックスを生成することが知られているが、それらの構造ならびに物性は未解明なことが多い。そこで今回、カルバゾールとテレフタレートとの種々の連結体の合成を行い、エキシプレックスの性質を調べるとともに、その蛍光プローブとしての応用を検討することにした。以下に得られた結果を示す。[2.2]パラシクロ(3,6)カルバゾロファン骨格のベンゼン環にジエステルを導入したテレフタレート-カルバゾール型シクロファン1を合成し、各種スペクトルからその電子物性を検討した。まず、^1HNMRやX線結晶解析から1の構造は極めて堅固なことを明らかにし、吸収スペクトルから基底状態では電荷移動相互作用はほとんど起こっていないことを確かめた。一方、発光スペクトルにおいて、1はエキシプッレクス型発光のみを示し、しかも発光波長は溶媒の極性に依存して極性溶媒ほど長波長側で発光することがわかった。発光波長と溶媒の極性などからLippert-Matagaプロットを行ったところ直線関係が成立した。よって1のエキシプレックス構造における双極子モーメントは13Dであること、1のエキシプッレクス構造は溶媒によって変化しないことがわかった。さらに、このような1の特異な発光現象を利用して、1の発光波長からある与えられた温度における種々のポリマー中での局所的な極性の見積もりが可能なこと(蛍光プローブとしての応用性)を明らかにした。カルバゾール発色団は、光電導性を示し青色発光することから、その励起状態における光電子物性は大変興味が持たれている。

光照射下、カルバゾール発色団は部分重なり型と完全重なり型の2種類のエキシマーを生成すると言われている。そこで、二つのカルバゾール環が重なった三架橋系カルバゾロファンを合成し、蛍光スペクトルから完全重なり型のエキシマーの性質を調べた。さらに、2架橋系カルバゾロファンの時間分解EPRスペクトルから、三重状態における性質について検討した。また、前年度はカルバゾールーテレフタレート型シクロファン1の合成を行い、エキシプレックスの性質を明らかにすることができた。そこで、今年度は1のエキシプレックス発光から高分子内での光誘起電荷分離過程について検討することにした。以下に得られた結果を示す。カルバゾールの3,6,9位で架橋した[3.3.n](3,6,9)カルバゾロファン2n(n=36)を合成した。nの数が増大するにつれて二つのカルバゾールの面角は大きくなることをNMR,X線結晶解析から明らかにした。2nは蛍光スペクトルにおいて、すべてエキシマー型発光を示し、しかもnの数が増大するにつれて発光波長が短波長シフトしていた。以上のことからカルバゾール環がほとんど平行になった[3.3.3]系で最も安定なエキシマーが生成することがわかった。次に2架橋系カルバゾロファンのEPR測定におけるゼロ磁場分裂パラメータから、T_1状態において上下のカルバゾール環に励起子が非局在化する割合は、部分重なり型では約40%、完全重なり型では約90%にも達することがわかった。さらに、1のエキシプッレクス構造は溶媒によって変化しないこと利用して、1の発光波長からガラス転移温度以下における種々のポリマー中での局所的な極性の見積もりが可能なこと(蛍光プローブとしての応用性)を明らかにした。前年度に引き続き、カルバゾール発色団の光電子物性を解明するためにカルバゾロファン(カルバゾール系シクロファンの合成を行った。カルバゾロファンのアミン誘導体は、これまではジカルバゾリルアルカンのジブロモ体から三段階で合成可能であったが、その合成収率が低かったので収率改善を検討した。その結果、ジブロモ体から一段階で合成できる方法を見出し、従来に比べて収率が約2倍に向上した。また、カルバゾールの3位と9位で架橋した2架橋の酸素およびシアンアミド系のカルバゾロファンを合成し、その構造をX線解析から明らかにするとともに、光物性を電子吸収スペクトルと蛍光スペクトルから検討した。その結果、部分重なり型のエキシマーが生成するためには、二つのカルバゾール環の二面体角が8度以下であること、二つのカルバゾールの非結合N-N距離が3.5Å以下であることが必要条件であることがわかった。さらに、カルバゾールはドナーとしても作用でき、アクセプター存在下でエキシプレックスや光誘起電子移動をすることが知られている。今年度はカルバゾロファンと種々のテレフタレート誘導体の連結系を合成した。それらの光挙動は、テレフタレート誘導体のアクセプター性と溶媒の影響を大きく受けることがわかった。すなわち、アクセプター性が弱いときはカルバゾロファンのエキシマー発光が現れ、アクセプター性の増大とともにエキシマー発光の減少とエキシタープレックス発光の出現、さらなるアクセプター性の増大はエキシタープレックス発光の減少と光誘起電子移動をもたらすことがわかった。
MYCN-PRC2を基軸にしたエピゲノム異常による神経芽腫発生機構の解明

神経芽腫を含む小児がんではゲノム異常は少なく、正常発生の分化過程(≒エピゲノム)に異常が起きることでがん化すると考えられている。先行研究により、がん遺伝子MYCNによる神経芽腫のがん化にエピゲノム制御複合体のPRC2が大きく寄与することを報告した。本研究ではエピゲノム異常が引き起こす神経芽腫の発生機構を解明に取り組んでいる。具体的に、MYCNとEZH2(PRC2の責任分子)の物理的な結合が神経芽腫の発生に必須であるという仮説を検証した。新しく確立したスフェア培養法で神経芽腫の発生を検証し、N-MycとEzh2の局在やエピゲノム修飾、遺伝子発現を網羅的に解析している。これにより、MYCN-PRC2による神経芽腫の発生を多角的に捉え、エピゲノム異常によるがん化機構を解明し、新たな治療法開発の基盤を創る。今年度は、まず始めにMYCNとEZH2の結合について先行研究の再現性を調べた。予想外なことに共免疫沈降実験により、EZH2との結合領域とされていたMB3ドメインを欠損したMYCNもEZH2と結合しうるという結果が明らかになった。このため、MYCNのどの領域にEZH2が結合するかを再度調べ直す必要が出てきた。また、MYCNとEZH2が結合するゲノム領域を同定するためにクロマチン免疫沈降ハイスループットシーケンスを行ったが、残念ながら結合のピークがはっきり見られず解析出来る状態のデータを得ることが出来なかった。これについては再度実験を繰り返す必要がある。神経芽腫におけるPRC2の役割とターゲット遺伝子の発現抑制機構はほとんど分かっていないが、MYCNとPRC2の責任分子であるEZH2が物理的に結合するこを報告した。また、EZH2がN-MycのドメインMyc box III(MBIII)を介して結合するという報告がある。このMYCNとの結合を手がかりにして、神経芽腫へのEZH2(を含むPRC2)の寄与とその分子機構を明らかにするため、本研究課題では以下の3つの実験を遂行している。(実験1)MYCNとEzh2の結合がMYCNによる神経芽腫の発生に必須かどうか。MYCN、EZH2との結合領域を欠損したMYCN(ΔMBIII)、及びEZH2を、未分化な神経芽細胞もしくは分化細胞(交感神経細胞や副腎髄質細胞)に導入し、主にin vitroでのスフェア形成能やin vivoでの皮下腫瘍形成能を指標として形質転換能の比較を行う。本実験について、まず初めに先行研究の再現性を調べたが、予想外なことにEZH2との結合領域とされていたMB3ドメインを欠損したMYCNもEZH2と結合しうるという結果が共免疫沈降実験により明らかになった。そのため、MYCNの真のEZH2結合領域を改めて調べなおすことにした。(実験2)MYCNとEzh2の複合体によって発現制御される遺伝子群の網羅的な同定。本実験について、神経芽腫細胞株を対象にクロマチン免疫沈降シーケンスを行ったが、残念ながら結合のピークがはっきり見られなかった。再度実験を繰り返す必要がある。(実験3)MYCNとEzh2の複合体構造解析。上記2つの実験によってN-MycとEzh2の結合が神経芽腫の発生や悪性化に必須であることが明らになった後に、構造解析による詳細な機構解明を目指す。平成30年度の実験結果から、主に再現性を確かめる実験を計画している。当初の予定とは異なって研究の進捗が遅れているが、MYCNとEZH2の結合がMB3を介して結合している事実を証明するまでは、先の研究が出来ない状況であるため、最優先して今後は調べていく。(実験1)については、EZH2との結合領域とされているMB3領域について再度詳細にMYCNとの結合について再実験を行い、真の結合領域を詳細に調べる。具体的に、MYCNの各種フラグメントを大腸菌で発現させ、in vitroでのEZH2との結合を詳細に調べる。(実験2)については、クロマチン免疫沈降の実験手技や使用した抗体などに問題があったと思われるため、実験プロトコルを改めて見直し再実験を行う予定である。これまで報告されている幾つかの抗体を用いながらMYCNとEZH2のゲノム上での結合領域を明らかにしたい。

また、MYCNとEZH2が結合するゲノム領域を同定するためにクロマチン免疫沈降ハイスループットシーケンスを行ったが、残念ながら結合のピークがはっきり見られず解析出来る状態のデータを得ることが出来なかった。これについては再度実験を繰り返す必要がある。神経芽腫におけるPRC2の役割とターゲット遺伝子の発現抑制機構はほとんど分かっていないが、MYCNとPRC2の責任分子であるEZH2が物理的に結合するこを報告した。また、EZH2がN-MycのドメインMyc box III(MBIII)を介して結合するという報告がある。このMYCNとの結合を手がかりにして、神経芽腫へのEZH2(を含むPRC2)の寄与とその分子機構を明らかにするため、本研究課題では以下の3つの実験を遂行している。(実験1)MYCNとEzh2の結合がMYCNによる神経芽腫の発生に必須かどうか。MYCN、EZH2との結合領域を欠損したMYCN(ΔMBIII)、及びEZH2を、未分化な神経芽細胞もしくは分化細胞(交感神経細胞や副腎髄質細胞)に導入し、主にin vitroでのスフェア形成能やin vivoでの皮下腫瘍形成能を指標として形質転換能の比較を行う。本実験について、まず初めに先行研究の再現性を調べたが、予想外なことにEZH2との結合領域とされていたMB3ドメインを欠損したMYCNもEZH2と結合しうるという結果が共免疫沈降実験により明らかになった。そのため、MYCNの真のEZH2結合領域を改めて調べなおすことにした。(実験2)MYCNとEzh2の複合体によって発現制御される遺伝子群の網羅的な同定。本実験について、神経芽腫細胞株を対象にクロマチン免疫沈降シーケンスを行ったが、残念ながら結合のピークがはっきり見られなかった。再度実験を繰り返す必要がある。(実験3)MYCNとEzh2の複合体構造解析。上記2つの実験によってN-MycとEzh2の結合が神経芽腫の発生や悪性化に必須であることが明らになった後に、構造解析による詳細な機構解明を目指す。平成30年度の実験結果から、主に再現性を確かめる実験を計画している。当初の予定とは異なって研究の進捗が遅れているが、MYCNとEZH2の結合がMB3を介して結合している事実を証明するまでは、先の研究が出来ない状況であるため、最優先して今後は調べていく。(実験1)については、EZH2との結合領域とされているMB3領域について再度詳細にMYCNとの結合について再実験を行い、真の結合領域を詳細に調べる。具体的に、MYCNの各種フラグメントを大腸菌で発現させ、in vitroでのEZH2との結合を詳細に調べる。(実験2)については、クロマチン免疫沈降の実験手技や使用した抗体などに問題があったと思われるため、実験プロトコルを改めて見直し再実験を行う予定である。これまで報告されている幾つかの抗体を用いながらMYCNとEZH2のゲノム上での結合領域を明らかにしたい。