hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
hANPによる心筋細胞内PPARγ賦活系の解明と心筋虚血再灌流障害の抑制への応用

ANP (Atrial Natriuretic Peptide:心房性ナトリウム利尿ペプチド)の心筋保護効果に関して種々の報告がある。一方で、PPARγ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ:ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)のアゴニストが心筋虚血再灌流障害抑制効果を持つことが知られている。ブタ心筋虚血再灌流モデルを作成し、ANP製剤であるカルペリチドの投与の有無により2群に分けて検討した。本研究により、ANPが心筋虚血再灌流障害後の心筋細胞内のPPAR γの発現に対して保護効果を有することが示唆された。本研究を進めるにあたり、まずブタ心筋虚血再灌流モデルの作成を行った。まず全身麻酔の方法を確立させ、正中切開での開胸を行うこととした。血行動態の測定系を確立し、左冠動脈前下行枝を30分遮断してその後再灌流させ、1時間ごとに4時間目まで経過を追った。その後犠牲死させ、心筋組織を採取した。虚血によりブタの心臓は容易に心室細動におちいるため、安定した実験を行うための工夫を行い、数頭について虚血再灌流4時間後まで実験を行い得た。合成ANPであるhANP (human atrial natriuretic peptide)を投与した群・投与しない群に分けて実験を行い、血行動態の変化を比較した。両群で再灌流中に血行動態の指標であるdP/dTの低下がみられたが、その低下の仕方には群間で違いがみられた。しかし、この段階で有意な血行動態上の優劣はみられなかった。その他、血圧や心拍数・中心静脈圧・心拍出量・左室拡張終期圧といったパラメータの解析を行っている。心筋組織は虚血中心部、辺縁部、非虚血部の3領域から採取した。この組織においてqRT-PCRを行い、PPARγおよびその下流分子であるLXRα(Liver X receptor α)のmRNA発現量の解析を行っている。また、PPARγおよびLXRαタンパクの発現量をWestern blotting法にて解析するため、まずPPARγタンパクのpositive controlを求めた。そのために、マウスの3T3 L1 cellを培養・分化させ、ここタンパクを抽出してWestern blottingによる評価を行った。これらの解析を通して、分子レベルでのANP反応系の解明を行うとともに血行動態評価についても更なる解析を行っていく。まずブタ心筋虚血再灌流モデルをつくるところから始まったが、当初は麻酔薬の量の調整や開胸法に試行錯誤が必要であり、虚血から致死性の不整脈を起こし死にいたるブタも多かった。至適な麻酔深度・呼吸器設定を得るまでにさまざまな条件の調整が必要であり、開胸手技の向上や冠動脈の遮断位置の検討、不整脈対策等を経て、固定した条件で比較的安定した血行動態を保つことができるようになった。この条件のもと、hANPの投与・非投与による2群について当面の比較をすることができた。血行動態の指標として当初はエコーを直接にあてて評価していたが、測定の誤差が大きく、左室拡張終期圧とdP/dTを主な指標としてデータを集めている。血行動態変化以外の心筋障害の指標として血中のCK-MB、トロポニンTの測定を行っている。採血は虚血前と再灌流後1時間ごとに行い、そのピーク値での比較を行っている。組織評価に関しても分子レベルでの各反応分子の発現評価を開始しており、mRNAの発現に関するデータが出始めている。本研究は、心筋虚血再灌流障害におけるhANPの保護反応系の中に、一部PPARγを介した経路が関わることを仮説として、ブタ心筋虚血再灌流モデルを用いてその証明を試みたものである。当初はブタ心筋虚血再灌流モデルの確立に難渋したが、試行錯誤を経て、心筋虚血中のブタの生存率を上昇させることができた。その上で、合成ANPであるhANP (human atrial natriuretic peptide)を投与した群・投与しない群に分けて実験を行い、血行動態の測定および心筋組織の評価を行った。両群について当面の目標の頭数の実験を遂行し、血行動態の比較を行ったところ、両群で虚血後にdP/dTの低下が見られたが、虚血再灌流4時間後における群間の差はみられなかった。その他、血圧や心拍数・中心静脈圧・心拍出量・左室拡張終期圧といったパラメータの解析を行った。虚血再灌流4時間後のhANP投与群の血圧、心拍出量はhANP非投与群よりも低値であった。この組織においてqRT-PCRを行い、PPARγおよびその下流分子であるLXRα(Liver X receptor α)のmRNA発現量の解析を行った。またPPARγ蛋白の発現をWestern blotting法にて解析した。その結果、hANP投与群において虚血中心部におけるPPARγmRNAおよびPPARγ蛋白がhANP非投与群のそれよりも多く発現していることが分かった。このことは、心筋虚血再灌流障害組織においてhANP投与がPPARγ賦活系に関与することを示すものであり、同系統に焦点をあてた報告は他にない。具体的反応系の解明や他の因子との相関の考察といった部分を今後発展・検討していく必要あるものの、虚血後の心筋障害を改善させるストラテジーの一助となり得る知見を得たこととなる。

初年度はブタ心筋虚血再灌流モデルをつくるところから始まり、試行錯誤を経て麻酔法や心筋虚血の方法を確立した。それをもとに、hANPの投与・非投与による2群について心筋虚血再灌流の実験をすすめ、各々の群についてほぼ目標とする頭数のデータを集めることができた。血行動態の指標として、左室内のdP/dTやLVEDPを測定し、比較を行った。また分子的評価として、虚血部、辺縁部、非虚血部から心筋祖域を採取し、PPARγmRNAとPPARγ蛋白の発現を評価した。その結果、血行動態の明らかな差はみられなかったが、hANP投与群の虚血部心筋組織におけるPPARγの発現は、hANP非投与群と比較して有意に保たれていることが示された。これをまとめて論文化し、ここまでの結果を発表することができた。hANPからPPARγへの詳細な経路や反応過程の解明やPPARγantagonistを用いた検討までは至らず、今後まだ研究をすすめていく余地はあるものの、仮説の一部を証明することができ、おおむね順調に進展していると評価できる。心筋梗塞後や開心術後の心筋虚血再灌流障害は予後を左右する重要な因子である。ANP (Atrial Natriuretic Peptide:心房性ナトリウム利尿ペプチド)の心筋保護効果に関しては近年種々の報告がある。一方で、PPARγ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ:ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)のアゴニストが心筋虚血再灌流障害抑制効果を持つことが知られてきている。ANPが心筋細胞内でPPARγを誘導するシステムがあるかどうかを明らかにするために、ブタ心筋虚血再灌流モデルを作成し、ANP製剤であるカルペリチド(human atrial natriuretic peptide: hANP)の投与の有無により2群に分けて検討した。心筋虚血再灌流の過程を通して、血行動態や生化学指標の測定の他、心機能の主な指標として左室圧波形を微分して得られるdP/dTを測定した。そして、再灌流終了後に、心筋3領域(虚血域、虚血周辺域、非虚血域)のPPARγmRNA、PPARγ蛋白の定量を行った。その結果、hANP投与群のPPARγmRNA発現は虚血域において有意に高く、同部位のPPARγ蛋白発現もhANP投与群で有意に高かった。しかし、再灌流終了時のdP/dTの値に有意な差はみられず、再灌流中の心筋逸脱酵素のピーク値にも群間の差がみられなかった。本研究により、ANP投与による心筋虚血再灌流後急性期の血行動態上の心保護効果を確認することはできなかったが、ANPが心筋虚血再灌流障害後の心筋細胞内のPPAR γの発現に対して保護効果を有することが示唆された。ANP (Atrial Natriuretic Peptide:心房性ナトリウム利尿ペプチド)の心筋保護効果に関して種々の報告がある。一方で、PPARγ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ:ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)のアゴニストが心筋虚血再灌流障害抑制効果を持つことが知られている。ブタ心筋虚血再灌流モデルを作成し、ANP製剤であるカルペリチドの投与の有無により2群に分けて検討した。本研究により、ANPが心筋虚血再灌流障害後の心筋細胞内のPPAR γの発現に対して保護効果を有することが示唆された。
骨盤内臓器神経クロストークの病態解明と難治性骨盤痛症候群における新規治療法の開発

慢性骨盤痛症候群・膀胱痛症候群は膀胱に炎症所見がないにも関わらず、同部に痛みや頻尿等の排尿症状を呈する難治性疾患である。この病態はいまだ不明な部分が多いが、骨盤の臓器に炎症が生じると、他の炎症を認めない骨盤臓器についても、疼痛などの関連症状を引き起こす「骨盤内臓器神経クロストーク」の関連が示唆されている。この病態解明のため、子宮内膜症モデルラットを作成し、炎症の無い膀胱の疼痛や過活動症状が引き起されるか、そのメディエーターとしてどのような神経伝達物質が関与しているか研究を行った。病態モデルはSDラットの双角子宮の片方を切除し内膜面を腸間膜に2か所縫い付けることで作成した。昨年度は、このモデルを利用して、膀胱内圧測定を行い、膀胱過活動が起こる傾向を確認した。また、膀胱内に刺激物質であるレシニフィラトキシンを注入し、膀胱の痛みを示す行動であるフリージングを多く示すことを認めた。今年度は、この病態モデルから得られた膀胱粘膜と尿の検体を用いて、骨盤内蔵神経クロストークのケミカルメディエーターを同定するため、強発現しているmRNAやタンパクの探求を行った。以前我々は、腸炎により引き起こされる膀胱痛に関連する神経伝達物質として、神経成長因子(NGF)が異常増殖することを報告しており、また、子宮内膜症患者の腹水中にレプチンが異常上昇していることの報告から、これらの物質をケミカルメディエーターと想定し、ターゲットを定め検討したが、今回の検討では何れもの有意な上昇は認めなかった。当該年度の計画では、確立された病態モデルをの試料を用い、ターゲットとなるケミカルメディエーターを同定し、その治療モデルへの研究へ移行予定であった。しかしながら、現時点では病態モデルで、膀胱内圧測定では膀胱過活動を認めること、痛み行動実験では、膀胱知覚神経Cファイバーの刺激物質である、レシニフィラトキシンで有意に強い疼痛行動を示すことを確認したところまでにとどまっている。我々はこれまで、結腸と膀胱の骨盤内蔵神経クロストークに関連するメディエーターとしてNGFを報告した。今回、子宮内膜症と膀胱の骨盤内蔵神経クロストークにおいては、NGFは有意な上昇がみられず、別の神経伝達物質が関連する可能性を示唆している。そのためさらなる探求が必要な状態となった。子宮内膜症と膀胱痛に関連する、骨盤内蔵神経クロストークに関連するケミカルメディエーターを、子宮内膜症で上昇が報告されている他の神経伝達物質に拡大して探求する。これまでの子宮内膜症ラットモデルを修正し、双角子宮の切片の内膜を、2か所腸間膜に縫合することに加えて、腹壁と膀胱壁付近にも追加で植え付けたモデルを作成し、膀胱内圧測定、痛み行動、膀胱粘膜・尿中の神経伝達物質の変化について検証する。慢性骨盤痛症候群・膀胱痛症候群は膀胱に炎症所見がないにもかかわらず、同部に痛みや頻尿等の排尿症状を呈する難治性疾患である。この病態を解明するため、骨盤内臓器に炎症が他の骨盤内臓器の疼痛を引き起こす「骨盤内臓器神経クロストーク」に注目し、子宮内膜症モデルラットを作成し、膀胱の知覚過敏や膀胱過活動が引き起こされるか、その場合に関連するケミカルメディエーターの同定の研究を行った。今年度は子宮内膜症モデルを、SDラットの双角子宮の1つを切除し内膜面を腸間膜に縫い付けることで作成した。そのモデルを用い、膀胱内圧測定と痛み行動実験により、膀胱過活動、知覚過敏について評価した。子宮内膜症ラットモデルが、手術施行後どの時期において病態を呈するのか未知である。モデル作成の手術施行後、上記実験を何点かで評価を行うことにより、至適評価時期が定まりつつあるところである。平行して、痛み行動実験では同モデルに対し、膀胱に刺激物質であるレシニフィラトキシンを注入し、膀胱痛の行動(フリージング)と尿道痛の行動(会陰部なめ行動)を観察評価中である。これらの行動・生理実験はいずれも偽手術ラットと比較している。さらに、関連するケミカルメディエーターの同定の同定のため、病態モデル、偽手術ラットの膀胱・尿道組織を今後検討を予定している、遺伝子・蛋白発現の過多の評価のため、採取中である。膀胱組織採取については、筋層と上皮粘膜層でメディエーターの発現が異なる可能性があり、膀胱採取後分層し凍結保存している。分子生物学的検討は今後予定している。本年度は、計画の初年度であり、病態モデルの作製、至適評価時期の選定と実験プロトコールの核となる部分である。子宮内膜症モデルの作製については、再開腹手術で子宮移植部のチョコレートのう胞が作成されており、モデル成立と考えている。子宮内膜症が膀胱機能にどの点で影響を最も与えるがについて、検討中でおおむね至適評価時期が定まりつつあるところである。よって、おおむね順調に進展していると評価した。

昨年度は、このモデルを利用して、膀胱内圧測定を行い、膀胱過活動が起こる傾向を確認した。また、膀胱内に刺激物質であるレシニフィラトキシンを注入し、膀胱の痛みを示す行動であるフリージングを多く示すことを認めた。今年度は、この病態モデルから得られた膀胱粘膜と尿の検体を用いて、骨盤内蔵神経クロストークのケミカルメディエーターを同定するため、強発現しているmRNAやタンパクの探求を行った。以前我々は、腸炎により引き起こされる膀胱痛に関連する神経伝達物質として、神経成長因子(NGF)が異常増殖することを報告しており、また、子宮内膜症患者の腹水中にレプチンが異常上昇していることの報告から、これらの物質をケミカルメディエーターと想定し、ターゲットを定め検討したが、今回の検討では何れもの有意な上昇は認めなかった。当該年度の計画では、確立された病態モデルをの試料を用い、ターゲットとなるケミカルメディエーターを同定し、その治療モデルへの研究へ移行予定であった。しかしながら、現時点では病態モデルで、膀胱内圧測定では膀胱過活動を認めること、痛み行動実験では、膀胱知覚神経Cファイバーの刺激物質である、レシニフィラトキシンで有意に強い疼痛行動を示すことを確認したところまでにとどまっている。我々はこれまで、結腸と膀胱の骨盤内蔵神経クロストークに関連するメディエーターとしてNGFを報告した。今回、子宮内膜症と膀胱の骨盤内蔵神経クロストークにおいては、NGFは有意な上昇がみられず、別の神経伝達物質が関連する可能性を示唆している。そのためさらなる探求が必要な状態となった。子宮内膜症ラットモデルの膀胱機能評価のプロトコールを確立し、痛み行動とともに、偽手術ラットと比較し差異を評価する。子宮内膜症モデルと偽手術ラットの膀胱上皮粘膜より、RNA、蛋白を抽出し、病態モデルでNGF、レプチンが上昇しているか、qPCR、ウエスタンブロッティング、ELISA法にて測定する。また尿中についても同様の評価を行う。当初想定していた、NGF、レプチンに差異がなかった場合には、サンプル尿を用いてプロテオミックス解析を行い、病態モデルで過剰発現している蛋白を同定する。子宮内膜症と膀胱痛に関連する、骨盤内蔵神経クロストークに関連するケミカルメディエーターを、子宮内膜症で上昇が報告されている他の神経伝達物質に拡大して探求する。これまでの子宮内膜症ラットモデルを修正し、双角子宮の切片の内膜を、2か所腸間膜に縫合することに加えて、腹壁と膀胱壁付近にも追加で植え付けたモデルを作成し、膀胱内圧測定、痛み行動、膀胱粘膜・尿中の神経伝達物質の変化について検証する。おおむね計画通り使用した。46522円については、実験度物の購入等の消耗品が計画より少なかったことによる。次年度も、病態モデルを用いての実験が中心であり、ラット等の消耗品購入に使用する予定である。ラット病態モデルを用いての生理実験と、その組織を用いての分子生物学的解析の消耗品購入において予定より安く購入し物品もあり、4780円の差額が生じた。これについては、次年度の試薬当の消耗品購入に充てる予定としたい。
スピンギャップ磁性体の相互作用制御と多重極限環境下における量子相転移

スピンギャップ磁性体とは,基底状態が非磁性のスピン1重項状態で励起状態との間に有限のエネルギーギャップをもつ磁性体である.また,量子相転移とは磁場や圧力等の変数の連続的変化によって引き起される異なる量子力学的基底状態間の相転移である。スピンギャップ磁性体TlCuCl_3の磁場誘起反強磁性相転移は,磁気励起マグノンのボース凝縮(BEC)として記述される。我々はTlCuCl_3の磁化を70mKまでの極低温で詳細に測定して,マグノンの臨界密度と相転移温度の関係を求め,相互作用定数を決定した。また,この相互作用定数と実際の分散関係を用いたBEC理論によって,相境界(転移温度と磁場の関係)が完全に再現できることを示した。更に,相境界が低温でφ=3/2の冪乗則で表されるというBEC理論の結果を実験的に検証した。我々は,KCuCl_3においてギャップが静水圧を加えると減少し,臨界圧力8.2kbarで反強磁性状態に相転移することを,磁化測定と中性子散乱実験で発見した。この磁気量子相転移は磁気励起のソフト化によって引き起されることが予測されている。我々は中性子透過率の高いmesoalite製高圧セルを開発し,これを用いてKCuCl_3の圧力下中性子非弾性散乱を行い,明瞭な磁気励起の観測に成功した。得られた磁気励起の分散関係の圧力依存性から,磁気励起のソフト化が確認された。我々磁場中の素励起が量子sine-Gordon模型で記述できる1次元反強磁性体をKCuGaF_6の純良単結晶育成に成功した。我々はKCuGaF_6のESR測定を3He温度で行い,量子sine-Gordon模型が予言するsoliton励起,3次迄のbreather励起,及びbreather間の遷移を全て観測することに成功した。そしてこれらの素励起が定量的に量子sine-Gordon場理論と一致することを示した。我々は新たにS=1/2籠目格子反強磁性体Rb_2Cu_3SnF_<12>を合成し,その磁性を磁化測定で詳細に調べた。そしてRb_2Cu_3SnF_<12>の基底状態が,理論が予言するスピンギャップをもつスピン1重項状態になることを実験的に初めて示した。1.TlCuCl_3における磁場誘起相転移の磁場と相転移温度の関係を希釈冷凍機を用いた極低温磁化測定で詳細に調べ,相境界が冪乗則で表され,臨界指数がマグノンのボース・アインシュタイン凝縮(以下ボース凝縮と略す)の理論から導かれる値に一致することを示した。TlCuCl_3の熱膨張の実験を行い,熱膨張の磁場及び温度依存性がボース凝縮の立場からよく説明できることを示した。2.TlCuCl_3とKCuCl_3においてギャップが静水圧を加えると減少し,ある臨界圧力で反強磁性状態に相転移することを磁化測定と中性子散乱実験で発見した。

この圧力誘起量子相転移は,スピンギャップ磁性体では初めて観測されたものである。ギャップの圧力依存性と臨界圧力以上で起こる反強磁性相転移温度の圧力依存性を詳細に測定し,いずれも圧力の冪乗則で表されることを示した。また臨界圧力では磁化が磁場の3乗に比例することが理論的に示されているが,これを検証した。この量子相転移は,圧力によってダイマー内の交換相互作用が小さくなり,ダイマー間の交換相互作用が大きくなるために起こることを磁化率の解析から示した。3.スピンギャップ系TlCuCl_3に非磁性不純物を入れた系TlCu_<1-x>Mg_xCl_3において磁場中比熱測定と中性子散乱実験を行い,不純物誘起反強磁性相が磁場誘起反強磁性相に相転移を経ずに連続的に移り変わることを実証した。また,TlCu_<1-x>Mg_xCl_3とKCu_<1-x>Mg_xCl_3において圧力下磁化測定を行い,不純物誘起反強磁性相転移温度が圧力によって増加することを見出し,これが不対スピン間に働く有効交換相互作用がギャップの減少によって増大したために起こることを示した。また,不純物誘起反強磁性相が圧力によって誘起される一様な反強磁性相に相転移を経ずに連続的に移り変わることを実証した。4.スピンギャップ系Ba_3Mn_2O_8の磁場誘起相転移を強磁場比熱測定で詳細に調べた。1.々は昨年度KCuCl_3においてギャップが静水圧を加えると減少し,臨界圧力8.2kbarで反強磁性状態に相転移することを磁化測定と中性子散乱実験で発見した。この磁気量子相転移の機構を解明すべく,新たに中性子散乱用の高圧セルを開発し,KCuCl_3の圧力下中性子非弾性散乱を行い,明瞭な磁気励起の観測に成功した。得られた磁気励起の分散関係の圧力依存性から,明瞭な磁気励起のソフト化が観測された。また,分散関係の解析から,個々の交換相互作用の圧力依存性が求められた。本実験から,圧力によってダイマー内の交換相互作用が小さくなり,ダイマー間の交換相互作用が大きくなるために量子相転移が起こることが分かった。このような高圧下での中性子非弾性散乱の成功例は世界的に少なく,本成果は圧力下中性子非弾性散乱の新展開を切り開くものでもある。2.スピンの大きさがS=1/2の1次元反強磁性体をKCuGaF_6の純良単結晶育成に成功した。この系は外部磁場を加えると,内部に交替磁場が発生する。そのため,この系は理論的には量子sine-Gordon模型で記述できる。KCuGaF_6の磁化測定と磁場中比熱測定を行い,これらが量子sine-Gordon模型が予言する結果と一致することを示した。また,この系に特徴的な素励起であるsolitonの質量の磁場依存性を求め,これが場の理論が予想する磁場の2/3乗に比例することを示した。更に,ESR測定を行い,素励起であるsolitonとbreatherを直接観測した。また,量子効果によって生ずる2次と3次のbreatherも明瞭に観測した。3.2次元S=1/2三角格子反強磁性体ではフラストレーション効果と量子効果の相乗効果によって飽和磁化の1/3と2/3にプラトーが生ずることを我々は以前に発見したが,今年度は高磁場中での比熱測定によって,プラトー相への磁場誘起相転移を詳細に調べた。また,磁場と結晶軸のなす角度を変えながらも比熱測定を行い,角度に依存した複数の新しい秩序相の存在を確認した。スピンギャップ磁性体TlCuCl_3の磁場誘起反強磁性相転移は,磁気励起マグノンのボース凝縮(BEC)として記述される。
多様化する外国人集住地域の日本語のリテラシー問題：その実践的文脈から支援施策へ

本年度は昨年度に続き、千葉県の外国人集住団地(公営団地)を訪問し、団地の周辺(団地の敷地内の掲示、周辺公園、公民館など)の言語環境や地域の多文化共生の取り組みに関するフィールド調査を行った。また実際その団地に居住する8名の外国人住民の方々に日本での言語環境をはじめ、日本語のリテラシー問題についてインタビュー調査を行うこともできた。それに加え、さらに、調査者らは団地の自治会や集住地域の小学校に対しても分担してフィールド調査を行った。まず自治会の調査では、自治会長へのインタビュー調査と共に、実際自治会が主催するイベントにも参加し、外国人住民への情報提供から、実際のイベントの参加におけるインターアクション、またそこでの言語問題と調整過程を一通り観察することができた。次に、団地周辺の小学校の調査では、小学会の先生に外国につながる児童に対する学校側の共生教育の取り組みを窺ったり、実際に小学校で行う日本語の取り出し授業の様子を見学することができた。昨年度はこうしたフィールド調査を通して、当該地域における外国人住民の社会参加や、それに伴うリテラシーの問題の概要を得ることができた。また、次年度に行う予定の海外の集住地域の予備フィールド調査も行った。中でも多文化政策が進み、外国人集住が増加している韓国の安山市の多文化特区における言語環境と外国人住民への支援の取り組みを調べた。それにより、本調査に向けての課題や次年度の調査計画を考えることができた。分担者や研究協力者にも調査内容や対象も分担してもらっており、今のところ研究は概ね順調に進んでいる。3年目である本年度は、2年間の予備フィールド調査で明らかになった課題を検討し、また修正しながら、集住地域の形成時期や環境が外国人住民の社会参加にどのように影響しているかをさらに検討する。そのために、浜松や群馬など従来の外国人集住地域と、集住地域の形成が新しく、比較的にコミュニティ形成が弱い千葉などの集住地域を比較・分析する。その際、昨年度の同様に集住地域の外国人住民の当事者へのインタビュー調査をも欠かせず行う予定である。また、海外の調査として、イギリスのタワーハムレット・ロンドン地域や、ドイツのベルリンにおける外国人集住を調べる予定である。イギリスには日本の公営団地と類似する団地があり、そこにおける言語環境と外国人住民への支援の事例に関する情報や資料収集を行っていく。また韓国の方も昨年に引き続き、安山市やソウル市、釜山市などの大都市における外国人集住地域を調べていく予定である。さらに、本年度は研究の実績報告にも力を入れ、6月の日本言語政策学会での発表をはじめ、後期には関係者を招いた公開シンポジウムを開く予定で、本研究の実践的なリテラシーや社会的な貢献に向けた可能性も検討していく。本研究は、日本の外国人居住者をめぐる言語環境とリテラシー問題の実態を明らかにすることを目的とする。とくに、多様化する外国人居住者のリテラシー問題をとらえるために、移民コミュニティが発達している従来からの外国人集住地域と、近年新たに形成されているコミュニティ形成が弱い外国人集住地域における言語環境とリテラシー問題について、実践的リテラシーの視点に基づき、生活と社会参加の実践的な文脈から明らかにすることを目的としている。初年度である昨年度は、文献調査と調査候補として考える外国人集住地域の予備フィールド調査を行なった。まず文献調査では、これまで外国人居住者の言語問題をとりあげてきた先行研究を中心に、国内外で進められている外国人居住者のリテラシー研究を考察した。次に予備フィールド調査では、外国人居住者の人口、住居の形、世代の構成、外国人居住者の使用言語、移民コミュニティとネットワークの関わりなどの諸条件を検討しながら、本研究の調査候補地を選定した。とくに、本年度はそのうち、神奈川県と千葉県の2箇所の外国人集住団地を訪問し、団地の周りの多言語環境を中心に外国人リテラシーに関わる情報収集を行った。中でも千葉県の集住団地の調査では、実際その団地に居住する2名の外国人の方に日本での言語環境をはじめ、日本語のリテラシー問題についてインタビュー調査を行った。その他、自治体および支援団体が出しているイベントなどに参加し情報収集も行い、当該地域におけるリテラシー施策の概要を得た。初年度に計画していた文献整理と調査候補地域の予備フィールド調査は順調に実施された。とくに予備フィールド調査では、1970年の後半から形成された外国人集住団地と、比較的最近外国人集住団地として注目されている団地の調査を行った。その結果をもとに外国人集住地域をめぐる社会的・言語的環境が過去と現在とでどのように変わってきているかを検討し、次年度の本調査に向けての調査計画や分析の枠組みを練り直した。

昨年度はこうしたフィールド調査を通して、当該地域における外国人住民の社会参加や、それに伴うリテラシーの問題の概要を得ることができた。また、次年度に行う予定の海外の集住地域の予備フィールド調査も行った。中でも多文化政策が進み、外国人集住が増加している韓国の安山市の多文化特区における言語環境と外国人住民への支援の取り組みを調べた。それにより、本調査に向けての課題や次年度の調査計画を考えることができた。分担者や研究協力者にも調査内容や対象も分担してもらっており、今のところ研究は概ね順調に進んでいる。前年度の予備フィールド調査で明らかになった問題点を修正しながら、本研究で注目しているコミュニティ形成が弱い集住地域を中心に本調査に取り掛かる。本年度は選定地域で15名ほどの外国人居住者の調査協力者に対しインタビュー調査を行う。調査の手順としては、1調査する地域の社会的・言語的環境に関する情報収集と支援に関わる自治体や仲介者(ボランティアや言語能力の高い周囲の人びと)などへのヒアリングを行う。2外国人居住者側に対し、(i)移住目的や来日前後の言語環境を把握するための言語バイオグラフィー調査を行い、調査協力者の社会言語学的プロフィールを作成する。(ii)日本語のリテラシーの接触に関するインターアクション・インタビューを行う。さらに、(iii)リテラシー・テキストの収集と追加インタビュー、(iv)実際のリテラシー・イベント場面を参与観察できる場合は、実際の会話データを含めたデータ収集を行う。これらのデータをもとに、外国人居住者が抱える言語環境やリテラシー問題が、彼らをめぐるネットワークや移民コミュティ、日本語のリテラシー能力、支援の受入れ方(評価)などとどのように関係しているかを分析し、その全体の傾向を把握する。3年目である本年度は、2年間の予備フィールド調査で明らかになった課題を検討し、また修正しながら、集住地域の形成時期や環境が外国人住民の社会参加にどのように影響しているかをさらに検討する。そのために、浜松や群馬など従来の外国人集住地域と、集住地域の形成が新しく、比較的にコミュニティ形成が弱い千葉などの集住地域を比較・分析する。その際、昨年度の同様に集住地域の外国人住民の当事者へのインタビュー調査をも欠かせず行う予定である。また、海外の調査として、イギリスのタワーハムレット・ロンドン地域や、ドイツのベルリンにおける外国人集住を調べる予定である。イギリスには日本の公営団地と類似する団地があり、そこにおける言語環境と外国人住民への支援の事例に関する情報や資料収集を行っていく。また韓国の方も昨年に引き続き、安山市やソウル市、釜山市などの大都市における外国人集住地域を調べていく予定である。さらに、本年度は研究の実績報告にも力を入れ、6月の日本言語政策学会での発表をはじめ、後期には関係者を招いた公開シンポジウムを開く予定で、本研究の実践的なリテラシーや社会的な貢献に向けた可能性も検討していく。
カチオン交換輸送系の構造・機能相関の研究

細胞膜カチオン交換輸送分子の構造・機能相関並びに細胞内情報伝達系との相互作用を研究して、細胞生理及び病態におけるこれらの輸送系の役割を明らかにすることを目指している。本年度は医科の成果を得た。1)Na^+/H^+ exchanger(NHE1)の活性調節に細胞内Ca^<2+>がどの程度関与するかを検討するため、Na^+/Ca^<2+>exchanger(NCX1)をCCL39繊維芽細胞に過剰発現し、増殖因子による細胞内Ca^<2+>動員が著しく抑制された細胞系を作成した。様々な刺激によるこの細胞のNHE1活性化を検討したところ、a)細胞内Ca^<2+>の関与は刺激の種類によって異なり、トロンビン>PDGF>>PMA及び高浸透圧刺激の順であり、b)トロンビンによるNHE1活性化は、Ca^<2+>とPKCを介してNHE1の異なるドメインに依存して調節される、c)トロンビン刺激した場合、見かけのCa^<2+>動員が一過性であるにも関わらず、カルモデュリン結合によるNHE1活性化は長時間持続することを示唆するデータが得られた。2)NHE1とNHE2は高いアミノ酸配列のホモロジーを示すにも関わらず、前者はcell shrinkageで活性化され、後者は活性化されない。NHE1のcell volume変化を感受する機序を検討するため、NHE1とNHE2の種々のキメラを作成し、これらを発現した細胞の高浸透圧刺激に対する反応を解析した。その結果、NHE1細胞質ドメインのカルモジュリン結合ドメインが、この作用に関与することを強く示唆する実験結果が得られた。3)CCL39細胞の外液Na^+をNHE1の基質となるLi^+で置換するとpH_iが上昇することが見いだされた。このpH_i上昇は、choline^+による置換やNHE1阻害剤(EIPA)存在下ではおこらず、また、NHE欠損株(PS120)ではおこらないことから、NHE1の活性化によると結論された。Na^+→Li^+置換によってCa^<2+>動員、PI代謝亢進は起こらない。また、Na^+→Li^+置換によるpH_iの上昇は、Gタンパク質(G_i,G_o)阻害剤IAP,MEK阻害剤PD98059,PI3kinase阻害剤LY294002によって阻害されず、PMA処理によりPKCを枯渇させてもほとんど阻害されないが、比較的低濃度のチロシンリン酸化阻害剤genisteinによって著明に抑制された。これらの結果は、細胞外に添加したイオンからNHE1活性化に至る新しいタイプの細胞内情報伝達機構が存在する可能性を示唆するのかもしれない。
がん免疫始動システムの解明

現在、悪性腫瘍が免疫系から逃れるシステムについては多くの知見が蓄積し、臨床にも応用されている。しかし、すでに多数の変異が蓄積した悪性腫瘍の治療には莫大な医療費がかかり、患者の精神的・身体的負担も大きい。一方、悪性腫瘍になる前には免疫系によってがんが積極的に排除されるが、この段階については不明な点が多く、特に「がん免疫が始動するメカニズムは何か?」という視点での研究はほとんど行われていない。本研究ではマウスを用いて発がんの初期段階を模倣するシステムを構築し、がん免疫が始動するメカニズムを詳細に解析することにより、悪性化する前の初期がん段階での排除または検出に繋がる知見の獲得を目指す。
酸化タンパクを識別するユビキチンリガーゼHOIL―1の機能解析

ユビキチン修飾系は、E1(活性化酵素)/E2(結合酵素)/E3(ユビキチンリガーゼ)の3種の酵素群の働きによって標的蛋白質にユビキチンを結合させ、その機能を制御するシステムである。ユビキチン系の重要性はその選択的な基質識別能力によるものであり、E3:ユビキチンリガーゼが選択的な基質識別の中核を担うが、その識別にはリン酸化などの基質への翻訳後修飾が識別シグナルとなっていることが多い。本年度はユビキチン研究代表者らが明らかにしてきたユビキチン化の始動シグナルである酸化修飾とそれを識別するユビキチンリガーゼ:HOIL-1の研究を進めた。我々はHOIL-1を酸化IRP2蛋白質を選択的に識別するユビキチンリガーゼとして同定し、酸化修飾を識別するユビキチン系の本体の少なくとも一部を明らかにし報告した(Nature Cell Biology in press)。また、HOIL-1はB型肝炎ウイルス発癌に重要なHBx蛋白質と結合するが、HOIL-1はHBxと結合することにより、HBxの機能に影響を与えることを見出しており、現在、解析を進めている。
自在な立体制御を目指した有機・酵素ワンポット不斉合成反応の開発

本研究は金属触媒反応と生物触媒反応を組み合わせたマルチステップワンポットchemo-enzymatic反応システムを構築することを目的としている。平成30年度は金属触媒反応としてパラジウム-銅を用いたワッカー酸化反応を行い、メタノール-水の混合溶媒中で99%の転化率でアセトフェノンを得ることができた。生物触媒反応としてはケトンを光学活性なアミノ基に変換することのできるトランスアミナーゼによるアミノ基交換反応を検討した。Vibriofluvialis由来(VF-TA)等4種類のトランスアミナーゼを準備し、アセトフェノンを基質としたアミノ基交換反応を行った。種々のトランスアミナーゼのうち、初期条件で49%の転化率を示したVF-TAについてさらなる条件検討を行ったところ、補酵素(NAD+)の再生をGDHで行った系で最大91%の収率と99%の光学収率を達成することができた。続いて、それぞれの反応を組み合わせたワンポット反応を行ったところ、酵素によるアミノ基交換反応が銅に阻害されて進行しなかった。この問題点を解決するために、昨年度同様にポリジメチルシロキサン(PDMS)で作成した膜容器を用いて酸化反応とアミノ基交換反応にしきりをして逐次反応を行った。最適化した条件を基に反応を行った結果、スチレンから(S)-1-フェニルエチルアミンが収率93%、光学収率99%で得られた。これにより、PDMS膜を用いたワッカー酸化反応とトランスアミナーゼアミノ基交換反応がともに進行しし、PDMS膜を用いたワンポットchemo-enzymaticプロセスの例を新たに加えることができた。平成30年度の研究目標は、PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスが有効に機能することを示すことである。研究のステージは1素反応(ワッカー酸化とアミノ基交換反応)の最適化、2素反応同士の組み合わせの確認、3うまく行かない場合にPDMS膜の有効性を確認すること、4PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスの最適化による科学収率と光学収率の改善、5分析条件の確立、であるが、1ではそれぞれの反応の最適化と酵素の選定をすることができた。2では、単純な素反応同士の組み合わせではchemo-enzymatic反応が進行しないことがわかり、その原因が銅イオンであることを突き止めた。3では、PDMS膜を導入することにより酸化触媒と酵素の接触を断ち、化学収率は低いものの、chemo-enzymaticプロセスが進行することを示した。4では、酵素反応の触媒サイクルを見直すことにより、光学収率99%を下げることなく最大化学収率93%を達成した。5では導入したGCによる分析とキラルHPLCを組み合わせることにより分析条件を確立した。以上のように、平成29年度に計画されていたすべての計画について良好な結果が得られており、研究は順調に進展している。次年度の計画では、本年度までの蓄積を基に、基質と生成物の絶対配置が逆となるような、光学反転法などの応用研究について検討を行う。併せてさらなる応用研究として、基質、酸化剤、酵素など諸条件について検討を行い、PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスの有効性を示していく。平成29年度は金属触媒反応として酸化マンガンを用いた酸化反応の最適化を行い、ジクロロメタン中転化率99%以上で(rac)-1-フェニルエタノールアルコールを得る反応系を開発した。一方、生物触媒反応としてデヒドロゲナーゼLK-ADHを用いた還元反応の最適化では、アセトフェノンの還元により光学活性な(R)-フェニルエタノールを96%の化学収率と99%ee以上の光学収率で得る反応系を開発した。以上より、金属触媒反応と生物触媒反応がそれぞれ良好に進行する反応条件を見つけることができた。続いて、それぞれの反応を組みあわせたワンポット反応を行ったところ、酵素による不斉還元が進行せず、中間体となるアセトフェノンが95%で得られることがわかった。この原因は酸化マンガンによる酵素の失活であり、酸化マンガンの添加からわずか10分で活性が1/10に低下することがわかった。この問題点を解決するために、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作成した膜容器を用いて酸化反応と還元反応にしきりをして逐次反応を行った。最適化した条件を基に、PDMS膜を用いた逐次反応を行った結果、(R)-1-フェニルエタノールが収率31%、光学収率99%eeで得られた。これにより、PDMS膜を用いた酸化反応と還元反応がともに進行し、互換性のない金属触媒反応と生物触媒反応がPDMS膜を用いることでワンポットchemo-enzymatic反応システムとして有効に機能することがわかった。それぞれの触媒量、補酵素の再生に必要なイソプロピルアルコール量を最適化することにより、最終的に収率92%、光学収率99%eeの系を開発することができた。平成29年度の研究目標は、研究の骨子となる光学活性な1-フェニルエタノールのchemo-enzymatic生成プロセスを開発することである。研究のステージはそれぞれの1素反応の最適化、2素反応同士の組み合わせの確認、3うまくいかない場合にPDMS膜の有効性を確認すること、4PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスの最適化による化学収率と光学収率の改善、5生成物のHPLC分析条件の開発であるが、1ではそれぞれの素反応が定量的に進行する条件を見つけ出すことができた。

2では、単純な素反応同士の組み合わせではchemo-enzymatic反応が進行しないことがわかり、これが酸化マンガンによる酵素あるいは補酵素の失活であることを突き止めた。3ではPDMS膜を導入することにより酸化マンガンと酵素の接触を断ち、化学収率は低いもののchemo-enzymaticプロセスが進行することを示した。4では各試薬の量を最適化することにより92%の化学収率と99%eeの光学収率を達成した。5では1-フェニルエタノールの芳香環にメチル基やクロロ基が導入された誘導体について、その光学異性体を分離できる条件を確立した。以上のように、平成29年度に計画されていたすべての計画について良好な結果が得られており、研究は順調に進展している。本研究は金属触媒反応と生物触媒反応を組み合わせたマルチステップワンポットchemo-enzymatic反応システムを構築することを目的としている。平成30年度は金属触媒反応としてパラジウム-銅を用いたワッカー酸化反応を行い、メタノール-水の混合溶媒中で99%の転化率でアセトフェノンを得ることができた。生物触媒反応としてはケトンを光学活性なアミノ基に変換することのできるトランスアミナーゼによるアミノ基交換反応を検討した。Vibriofluvialis由来(VF-TA)等4種類のトランスアミナーゼを準備し、アセトフェノンを基質としたアミノ基交換反応を行った。種々のトランスアミナーゼのうち、初期条件で49%の転化率を示したVF-TAについてさらなる条件検討を行ったところ、補酵素(NAD+)の再生をGDHで行った系で最大91%の収率と99%の光学収率を達成することができた。続いて、それぞれの反応を組み合わせたワンポット反応を行ったところ、酵素によるアミノ基交換反応が銅に阻害されて進行しなかった。この問題点を解決するために、昨年度同様にポリジメチルシロキサン(PDMS)で作成した膜容器を用いて酸化反応とアミノ基交換反応にしきりをして逐次反応を行った。最適化した条件を基に反応を行った結果、スチレンから(S)-1-フェニルエチルアミンが収率93%、光学収率99%で得られた。これにより、PDMS膜を用いたワッカー酸化反応とトランスアミナーゼアミノ基交換反応がともに進行しし、PDMS膜を用いたワンポットchemo-enzymaticプロセスの例を新たに加えることができた。平成30年度の研究目標は、PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスが有効に機能することを示すことである。研究のステージは1素反応(ワッカー酸化とアミノ基交換反応)の最適化、2素反応同士の組み合わせの確認、3うまく行かない場合にPDMS膜の有効性を確認すること、4PDMS膜を用いたchemo-enzymaticプロセスの最適化による科学収率と光学収率の改善、5分析条件の確立、であるが、1ではそれぞれの反応の最適化と酵素の選定をすることができた。2では、単純な素反応同士の組み合わせではchemo-enzymatic反応が進行しないことがわかり、その原因が銅イオンであることを突き止めた。
抗原分子を基盤とした癌免疫療法の基礎的研究

本年度の主たる成果は次の様である(1)TL^+皮膚で免疫されたマウスはTL抗原を腫瘍抗原として認識すること、また細胞障害性T細胞(CTL)のTL抗原の認識にはTL拘束性が認められること等を示した。(高橋)(2)マウスRL♂1白血病固有抗原に対するCTLが認識する抗原ペプチドを同定し、Akt癌遺伝子産物との関連を明らかにした。(中山)(3)MAGE遺伝子群は消化器癌、肺癌、卵巣癌等にも広く発現していること、またリコンビナントMAGE-1とのin vitro混合培養により、CTLの産生が可能であることを示した。(伊東)(4)抗GM3抗体に対する抗イディオタイプ抗体、及びc-erbB-2産物に対するマウス・ヒトキメラ抗体の抗腫瘍活性をヒト腫瘍ヌードマウス移植系を用いて示した。(日野田)(5)ヒト頭頸部癌に於いてシリアルLewis^a抗原の発現を示すとともに、本抗原を標的にしたバイスペシフィック抗体療法の可能性を示した。(西村)(6)^<99>Tm標識抗CA125抗体を用いて卵巣癌の、また^<99>Tm標識抗NCAM抗体(NE150)を用い、肺小細胞癌の画像診断を試みた。(遠藤)(7)増殖関連抗原gp125の遺伝子導入トランスフェクタントでは、増殖促進が認められること、またアンチセンスオリゴヌクレオチドは本細胞の増殖抑制効果を示すことを明らかとした。
早期アルツハイマー病(軽度認知障害を含む)の画像診断

軽度認知障害(MCI)のうち早期にアルツハイマー病(AD)へ進行する患者群と進行しない患者群は、脳MRIによる海馬領域の萎縮、脳血流SPECTによる頭頂側頭葉の血流低下所見、記憶障害に対する病識の有無、記憶検査の学習効果の有無について明らかな相違がみられた。さらに、これら各検査成績を総合的に判定するとMCIのうち早期に進行する患者群としない患者群とはおよそ80%以上の識別率が得られ、MCIの予後予測やADの早期診断に役立つ成績と考えられた。当科「物忘れ」外来において、1年間に軽度認知障害(MCI)や早期アルツハイマー病(AD)患者57例を登録した。対象の内訳は、早期ADが15例、MCIが42例である。これらの患者について、神経心理学的検査とともに、頭部MRIと脳血流SPECT検査を同時に施行した。神経心理学的検査はMMSE、WMS-R、ADAS、FABに加えて、病識を評価するために生活健忘チェクリストを患者と介護者者から同時に得た。また、学習効果の有無を評価するために1週間後に同じ記憶検査(WMS-Rの論理記憶、category fluency等)を行った。MRI検査は通常の一般的な撮像法に加えて、客観的、統計学的な萎縮の評価のためにvoxel-based morphometryを加えた。さらに、組織の特性評価が期待できるmagnetization transfer法やdiffusion-weighted imagingを加えた。脳血流検査は、IMP-SPECTを用い、健常者の正常データベースと3D-SSPを用いて解析した。ただし、一部の患者で画像データの解析が困難な症例が3例あり、残り54例を解析の対象とした。本研究は、約3年間の追跡調査中にMCIからADへ進展した患者群と進展しなかった患者群との神経心理学的検査、画像データの相違を比較し、ADの早期診断を可能とするような知見を探求することを目的とするが、この1年間ですでに一部のMCI患者がADへの進展が確認されたため、解析を開始しつつある。この1年間の解析の結果では、早期AD群、MCIからADへ進展した群では、進展しなかった群と比べて、海馬の萎縮、側頭頭頂葉の血流低下が明瞭であり、また自己の記憶障害を過小に評価する"病識の低下"や学習効果の低下などが確認されつつある。今後、少なくとも2年間の追跡調査および解析が必要である。当科「物忘れ」外来において、1年間に軽度認知障害(MCI)や早期アルツハイマー症(AD)患者57例を登録した。これらの患者について、神経心理学的検査や遺伝学的検査とともに、頭部MRIと脳血流SPECT検査を同時に施行した。神経心理学的検査はMMSE、WS-R、ADAS、FABに加えて、病識を評価するために生活健忘チェクリストを患者と介護者から同時に得た。MRI検査は通常の一般的な撮像法に加えて、客観的、統計学的な委縮の評価のためにvoxel-based morphometryを加えた。本研究は、約3年間の追跡調査中にMCIからADへ進展した患者群と進展しなかった患者群との神経心理学的検査、画像データの相違を比較し、ADの早期診断を可能とするような知見を探求することを目的とするが、この2年間ですでに一部のMCI患者がADへの進展が確認されたため、解析を開始しつつある。この2年間の解析の結果では、早期AD群、MCIからADへ進展した群では、進展しなかった群と比べて、海馬の委縮、側頭頭頂葉の血流低下が明瞭であり、また自己の記憶障害を過小に評価する"病識の低下"や学習効果の低下などが確認されつつある。今後、少なくとも1年間の追跡調査および解析が必要である。初年度に登録された軽度認知障害(MCI)と早期アルツハイマー病(AD)患者を約2年間フォローした。その結果、MCIから進展のみられなかったMCI/MCI群が18例、MCIからADへの進展がみられたMCI/AD群が21例となり、さらに早期AD19例とともに初回各検査成績の相違を比較した。頭部MRIをVSRADから解析し、海馬領域の萎縮(z-score)を求めると、MCI/MCI群に比しAD群で有意なz-scoreの高値がみられ、MCI/AD群でも高値となる傾向がみられた。

脳血流SPECTは側頭頭頂葉や後部帯状回の血流低下所見を定性的に評価した結果、MCI/MCI群と比べて、MCI/AD群やAD群で高率に側頭頭頂葉や後部帯状回の血流低下所見を認めた。病識(生活健忘チェックリストによる介護者スコアと患者スコアの差)はMCI/MCI群と比べてAD群で有意にスコア差が大となった。学習効果(1週間後の同じ認知機能検査)は一部の患者で施行されたが、MCI/MCI群で学習効果が認められたのに対して、MCI/AD群では学習効果は認められなかった。なお、ApoE4の頻度は、3群の間で有意な相違は認められなかった。次に、MRI、SPECT、病識の3項目について、ロジスティック回帰からMCI/MCI群とMCI/AD群の識別率を求めた。各1項目だけでは60%代の識別率であったが、2項目にすると6570%代となり、3項目すべてを含むと84%という高い識別率が得られた。以上から、MRI、SPECTによる画像検査とともに、病識の評価や学習効果の有無など総合的な臨床情報を含めると、MCIの予後予測やADの早期診断につながり、早期の治療や対応、ケアが可能になることが判明した。
変性構造転移による膜蛋白質シグナル伝達機構の固体ＮＭＲによる解明

ppR二量体およびppR・pHtrII複合体など膜蛋白質の変性領域について固体NMR法で解析を行った。その複合体の試料調製で、必要な数mgの安定同位体標識試料を作り、機能のある状態で脂質二重膜へ再構成した。対象の分子量が約10万と大きく、NMR感度が十分でないため、固体NMRの新しい非線形サンプリングなどの手法で分解能・感度を向上させる。構造解析では、NMRプロテオミクス研究や計算機科学の最先端の技術として、データベースに基づくNMRスペクトルシミュレーション法と脂質膜を考慮したレプリカ交換動力学法を組み合わせて利用した。この方法論を確立した。複合体を活性状態に転移させるために、超伝導磁石内のNMR試料に光照射できるよう装置を改造すした。特にpHtrIIの水溶性領域の天然変性構造の変化に注目してNMR測定するために、J結合相関に基づく高速試料回転多次元NMR法や電子スピンとの距離測定法も開発して応用した。24年度が最終年度であるため、記入しない。ρpR二量体およびρpR・ρHtrII複合体など膜蛋白質の変性領域について固体NMR法で解析を行った。H22年度では、その複合体の試料調製で、必要な数mgの安定同位体標識試料を作り、機能のある状態で脂質二重膜へ再構成する。構造解析では、NMRプロテオミクス研究や計算機科学の最先端の技術として、データベースに基づくNMRスペクトルシミュレーション法と脂質膜を考慮したレプリカ交換動力学法を組み合わせて利用する。特にρHtrIIの水溶性領域の天然変性構造の変化に注目してNMR測定するために、J結合相関に基づく高速試料回転多次元NMR法や電子スピンとの距離測定法も開発して応用した。
先天性第VII因子以常症(R79Q)の組織因子による凝固活性の乖離原因の解明

また、Swiss Pdb Viewer version3.5を用いてヒト第VII因子とヒト組織因子との複合体の結晶解析データー(1DNA PBD)に基づき、ウサギ組織因子およびウシ組織因子とヒト第VII因子との複合体モデルを構築した。発現した変異第VII因子の生物活性と構築した複合体モデルの第VII因子分子のアミノ酸79位に近接する3種類の組織因子のアミノ酸を比較する。FVIIの4種の遺伝子組換え変異型FVII(VII79Q、VII79G、VII79P、VII79W)およびwild type(VII79R)作製して、異なる動物種のTFとの反応性を検討した。COS-1細胞培養上清中にwild type;18ng、VII79Q;22ng、VII79W;12ng、VII79;14ng、VII79P;40ngのFVIIを発現した。wild-typeのVIIcはヒトとウサギTFによる差異はなかったが、variant typeのVIIcはいずれもwild typeに比べて低値となった。wild typeを100%としてVIIag当りのVIIcに補正した時、VII Q79とW79は30%、G79とP79は10%となった。VIIG79はウサギとヒトTFによるVIIcが同程度であったが、VII Q79、W79、P79はウサギTFによるVIIcが明らかに低値となった。wild typeではFVII R79位とTFのQ24位,E56位とは水素結合をなし、3Aの距離に位置するが、VII Q79は水素結合が消失し、TFのE24位とE56位がFVIIのQ79位から78Aの距離となり、反応性が低下すると考えられた。VII W79、G79、P79はTFの近接アミノ酸との距離と荷電変化などの関与でVIIcが低下するものと考えられた。ヒトFVIIaとsTFとの立体構造モデルはヒトとウサギsTFでは大きな差はなった。VIIQ79はヒトとウサギTFとのcomplexの間で大きな立体構造の差はないものの相互反応にかかわるアミノ酸との微細構造変化と距離の差が7倍のVIIcの差となったものと考えられ、著者らが報告した患者血漿での成績と一致した。VII G79はwild typeとのcomplexの微細構造は変わるもののGlyは分子として小さいため、ヒトとウサギTFの周辺構造の差を変えることがないため、VIIcに差を示さないと考えられた。VIIP79とVIIW79はヒトとウサギTFによるVIIcに明らかな違いがあるものの、単純なFVIIa-sTF複合体立体構造モデルではほとんど差異がなく、解離原因の説明を明確にすることは困難であった。