hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分散システムの自己最適化理論

本研究では,分散システムが環境変化や故障に追従して自身の機能を最適に保つ,自己最適化能力を持つ分散システムを実現するための基礎理論の確立を目指す.研究期間中を通して分散環境での最適性に様々な側面から取り組み,特に,モバイル計算主体群の分散協調能力,自己組織化能力の限界について多数の結果を得た.さらに,各計算主体の利己的な自己最適化を考慮したゲーム理論における,局所性の影響を示した.本研究により,集中型システムで知られている性能限界や数理構造が,局所性・非同期性・並列性が不可避である分散環境へ適用でき,自己最適化能力の根拠となることが分かった.相互に通信を行いながら協調動作する多数の計算主体から成るシステムを分散システムと呼ぶ.本研究では,環境変化や計算機故障が発生しても,分散システムがそれらに追従して自身の機能を最適に保つ,自己最適化能力を持つ分散システムの実現を目指す.特に,分散システムにおける最適化をシステム全体の性能に関する大域的な最適化,各計算主体における局所的な最適化の2つの観点からとらえ,自己最適化を保証する数学的な構造を解明する事を目指す.本年度は以下の4点について結成果を得た:(i)自己最適化の理論的なバックグラウンドである安全収束性の連結支配集合問題への適用,(ii)個体群プロトコルモデルの振動問題の解析,(iii)エージェント群による分散グラフ探索の特徴づけ,(iv)オンライン予測問題を用いた自己最適化データ構造の解析.安全収束性とは,分散システムが最低限の機能要件を保証しつつ最適化を行う性質であり,(i)では局所的な協調動作のみでは安全収束性の実現が容易ではない連結支配集合問題に対して,安全収束性の実現可能性を示した.分散システムの自己最適化を環境に対して最適なシステム(=解)状況を出力とする計算ととらえれば,収束せず振動する分散計算システムの性質を把握することも重要である.(ii)では分散システムがある種の振動を起こすことが,リーダー選挙問題を解くことと等価であることを示した.分散環境での種々の問題はある種のオンライン最適化問題ととらえられる.(iii)では複数エージェントによるグラフの探索問題について,オフライン探索とオンライン探索で必要とするエージェント数にほぼ違いがないことを示した.(iv)ではオンライン自己最適化の一例として,クエリ列に対して二分探索木の構造を随時変更し,更新,探索コストを削減する二分探索木問題について,オフライン予測問題の解析手法をもとにコスト解析を行った.本年度は自己最適化の一般的な理論背景となりうる安全収束性,分散計算の振動について結果を得るとともに,エージェントによるグラフ探索や自己最適化データ構造などについて,オンライン最適化とオフライン最適化の関係を解明しており,研究計画はおおむね順調に進んでいる.相互に通信しながら協調動作を行う多数の計算主体から成るシステムを分散システムと呼ぶ.本研究では,環境変化や計算機故障が発生しても,分散システムがそれらに追従して自身の機能を最適に保つ,自己最適化能力を持つ分散システムの実現を目指す.本年度は,計算機ネットワークや空間中を自律的に移動する計算主体の分散協調について,計算主体の能力や台数などの多様な最適化指標の観点から取り組み,以下の成果を得た.(i)エージェント群による分散協調型のオンライングラフ探索:グラフ中を移動するターゲットを探索者群で探索する問題に対し,集中型のオフライン探索と比較することで,最適な探索者数で未知のグラフをオンライン探索できることを示した.(ii)無記憶な位置同定アルゴリズム:メモリやGPSを持たず,限定的な範囲のみが観測できる,非常に弱い能力のみを備えた自律移動ロボットによる直線上での位置同定問題に取り組み,数論に基づく位置同定アルゴリズムを提案した.(iii)3次元空間でのロボット群の一点集合:3次元空間中を自律的に移動するロボット群の分散協調において基本的な問題である1点集合問題に対して,無記憶アルゴリズムを提案した.(iv)グラフの探索に関する成果:分散協調型のグラフ探索に関連し,乱歩を決定的に模倣できると考えられているローターウォーク,またグラフの巡回問題であるハミルトンサイクル問題の一般化などに取り組んだ.様々な観点から分散システムの最適化に関する結果を得ており,いずれも自己最適化への拡張が期待できることから,研究はおおむね順調に進展している.相互に通信しながら協調動作を行う多数の計算主体から成るシステムを分散システムと呼ぶ.本研究では,環境変化や計算機故障が発生しても,分散システムがそれらに追従して自身の機能を最適に保つ,自己最適化能力を持つ分散システムの実現を目指す.特に,分散協調と自己最適化の限界や性能の背景となる数理構造の発見,個々の計算主体における局所的な最適化とシステム全体の大域的な最適化の関係の解明を目標とする.平成29年度の主要な研究成果は以下の2点である.(i)局所的な最適化としてゲーム理論に着目し,各プレイヤーが接続辺の追加削除によってネットワーク構造を変更するネットワーク構成ゲームのうち,特に辺交換ゲームに分散環境下での局所性(観測可能な戦略の限定)を導入し,局所性の程度が均衡における大域的なコストに与える影響を示した.(ii)匿名なモバイル計算主体群による形状(パターン)形成に関して,計算主体群がもつ対称性が支配的であることを示した.一連の結果により,対称性が複数のモバイル計算主体群モデルに共通して本質的であることを示した.さらに,モバイル計算主体の位置同定問題と計算可能性の関係を示した.研究期間全体を通じて,多様なモデル,問題に取り組み,分散協調と自己最適化に本質的な数理構造を多数発見した.主要な結果3点を挙げる.集中型システムとの比較により,モバイルエージェント群が最適な台数でネットワークを探索できることを示した.

ゲーム理論の応用により,辺交換ゲームにおける視界の範囲と均衡での性能の関係を示した.群論に基づく対称性の議論により,モバイルロボット群をはじめとするモバイル計算主体群の協調能力が対称性によって決まることを示した.これらの手法や数理構造は関連分野では既知のものであったが,本研究により局所性・非同期性・並列性をもつ分散環境への適用が可能であることが判明した.本研究では,分散システムが環境変化や故障に追従して自身の機能を最適に保つ,自己最適化能力を持つ分散システムを実現するための基礎理論の確立を目指す.研究期間中を通して分散環境での最適性に様々な側面から取り組み,特に,モバイル計算主体群の分散協調能力,自己組織化能力の限界について多数の結果を得た.さらに,各計算主体の利己的な自己最適化を考慮したゲーム理論における,局所性の影響を示した.本研究により,集中型システムで知られている性能限界や数理構造が,局所性・非同期性・並列性が不可避である分散環境へ適用でき,自己最適化能力の根拠となることが分かった.平成27年度の研究課題を継続するとともに,当初の計画通り,利己的な計算主体による局所的な最適化と分散システムとしての協調動作の関係の解明に取り組む.特に,ゲーム理論の観点を参考に,局所性,非同期性,並列性を考慮した利己的な計算主体の協調動作理論の確立を目指す初年度に得られた安全収束などの自己最適化の基礎理論や本年度の分散協調型の探索,位置同定などの成果の融合を検討するとともに,従来計画していた局所性,非同期性,並列性といった分散システム特有の状況の下での局所的な最適化と大域的な最適化の関係の解明に取り組む.解説記事山内由紀子,ロボット群の分散協調と対称性オペレーションズ・リサーチ, 63巻,3号,pp.167--173,2018年3月.山内由紀子,分散協調理論の研究:多様なモデルと問題の中に原理を探して,科研費NEWS,2017 Vol.1,p.12 (2017).分散協調理論本年度得られた結果の多くは国際会議での採択が期待されるが,本年度内には投稿・採択に至らなかったものの,既に国際会議等へ投稿準備が完了しているものもあり,来年度には採択,口頭発表が見込まれるため,海外渡航費用などを次年度に繰り越す.本年度得られた結果のうち,国際会議での採択が期待されるが,年度内には投稿・採択に至らなかったものの,すでに国際会議等への投稿準備が完了しているものがあり,来年度には採択,口頭発表が見込まれるため,海外渡航費用などを次年度に繰り越す.本年度得られた結果が国際会議での採択がほぼ確実であると見込まれるため,主に国際会議参加のための海外渡航費用,参加費等に充当する.本年度得られた結果が国際会議での採択がほぼ確実であると見込まれるため,主に国際会議参加のための海外渡航費用,参加費等に充当する.
再構成可能生産システムにおけるダイナミック設備レイアウト法の開発

近年の生産システムは,不確実な需要に対応するために,月単位でシステム構成を変化させる極めて柔軟なケースも存在するようになった.本研究では,このような生産システムに対して,計画対象期間における設備間搬送コストと配置位置変更コストの総和を最小化するための設備レイアウト法を開発した.本手法は,生物の進化を模倣した最適化法である進化戦略に基づくものであり,良好な設備レイアウトを効率的に求めることが出来る.近年の生産システムは,不確実な需要に対応するために,月単位でシステム構成を変化させる極めて柔軟なケースも存在するようになった.本研究では,このような生産システムに対して,計画対象期間における設備間搬送コストと配置位置変更コストの総和を最小化するための設備レイアウト法を開発した.本手法は,生物の進化を模倣した最適化法である進化戦略に基づくものであり,良好な設備レイアウトを効率的に求めることが出来る.本研究課題では、製造環境の変化に応じた継続的なレイアウト変更、部分的なレイアウト変更などを考慮したダイナミック設備レイアウト法の開発を目的としている.本研究のように、連続する期の設備配置位置の差異を議論する場合には、レイアウト問題本来の実数平面上への配置を考えなければ詳細なレイアウト案はもとより実行可能解をも得られない場合が生じ、かつ対象とする現実問題は、数理計画法では解くことのできない規模である.しかし、従来の効率的な解法は、レイアウト問題を単位正方格子に基づく組合せ最適化問題として定式化する場合が多かった.これを解決するために、本年度は、進化型計算の一手法であり、実数型の決定変数を扱うことのできる進化戦略を用いることにより、実数平面上への設備の配置位置を効率的に決定しうるマスターレイアウト決定法を開発した.その際、高精度な実行可能解を得るために、各設備が重なって配置された場合に占める面積に着目した重複配置のペナルティー項、ならびに配置変更コストに対する感度向上のための補正項からなる進化戦略の評価関数を提案した.生産システムの再構成時には、設備台数の増減を含めた部分的な設備変更が伴うため、既存設備の配置位置を考慮した上で、新規設備や入れ替え設備の配置位置を決定する必要がある.よって、本年度は、複雑に入り組んだ既存設備の配置位置を考慮した上で、新規設備や入れ替え設備の配置位置を決定しうる部分的なレイアウト決定問題に対する解法も併せて提案した.本研究課題では,製造環境の変化に応じた継続的なレイアウト変更,部分的なレイアウト変更などを考慮したダイナミック設備レイアウト法の開発を目的としている.本研究のように,連続する期の設備配置位置の差異を議論する場合には,レイアウト問題本来の実数平面上への配置を考えなければ詳細なレイアウト案はもとより実行可能解をも得られない場合が生じる.これに対して,前年度は,進化型計算の一手法であり,実数型の決定変数を扱うことのできる進化戦略を用いることにより,実数平面上への設備の配置位置を効率的に決定しうる設備レイアウト法を開発した.しかし,そこでは主なオペレータである突然変異操作を各決定変数に独立して適用している.最良な探索の方向は,探索空間の座標軸の向きに一致しているとは限らず,決定変数の間に相関がある場合,決定変数ごとに独立した突然変異を行うと,良好な個体を生成することができない.そこで,本年度は,決定変数間の相関を考慮したCorrelated Mutationに基づく設備レイアウト法を提案した.64種類の再結合操作のパターンを設定し,シミュレーション実験により,提案法の有効性を検証した.その結果,提案法によれば,ILOG-cplexにより求めた最適解と同精度のレイアウトが得られ,計算時間を大幅に短縮できること,決定変数間の相関を考慮しない場合に比べて,収束世代数を約75%削減できることなどを明らかにした.
ひきこもり者の「居場所」支援における実践知の解明、および支援理論の構築

本研究の主たる目的は、「ひきこもり」の若者たちが集う「居場所」において、かれらにかかわるワーカーの実践知を明らかにし、その専門性について検討することである。参与観察とワーカーとの議論を経て、1場づくりという視点の重要性、2ワーカーが若者の能動性に注目する際に、Narrative Inquiryの考え方が示唆的であること、3若者たちの変容はストーリーの再構築という観点から捉えられること、が明らかとなった。本研究の目的は、ニート・ひきこもりの若者が集うフリースペースでおこなわれている「居場所」支援の実践知・専門性の一端を明らかにすることである。2015年度におこなったことは以下である。第一に、データ整理をおこなった。本研究は、2010年2015年におこなった参与観察データに基づく実践分析を主軸としている。そのため、これまでに蓄積したフィールドノーツ、録音データなどの整理をおこなった。また、不足している情報を補うとともに、主たる考察対象とする対象者の選定などもおこなった。第二に、対象実践の分析をおこない、当該現場スタッフとの協同的な実践検討をおこなった。途中、現場スタッフの入れ替えや繁忙により、検討体制の再考をおこなった。結果、当初予定していた回数より少なくはなったが、具体的な事例・場面に基づき、支援に内包される実践知の所在を支援者と共に検討する機会を得ることができた。Narrative Inquiryの視点を援用することにより、現場と共に、ストーリー概念から対象者や実践を捉え分析することが可能となった。第三に、検討したことを踏まえ、成果報告をおこなった。フリースペース参加者を中心に据えていた検討から、フリースペースという〈場〉への着目とそこでの対象者の変容へと視点をずらしたことで、「居場所」支援の実践知・専門性を明らかにする端緒となった(掲載は翌年度)。現場との協同検討をおこなう機会の確保が困難であった。また、執筆しまとめていく作業が遅れている。2016年度におこなったことは以下である。第一に、1970年代から子ども・若者支援を担ってきた民間支援団体との協同的な実践検討を継続した。具体的な事例・場面に基づき、支援に内包される実践知の所在を支援者と共に検討する機会を得た。また、滋賀県内に新たに開設されたフリースペースにおいても協同検討をおこなう機会があった。こちらは、新たに若者支援に参入してきた団体が担っており、支援者も手探りの状況であった。そのため、結果的には、古参と新参双方の団体・支援者にかかわり協同検討をおこなうことができ、比較を含めた検討が可能となった。第二に、個別事例に留まることのないよう、青年期・社会教育領域で蓄積されてきた知見と重ねた検討をおこない、実践知・専門性の要となる要素の考察をおこなった。特に、近年若者支援職員の専門性として提示されてきている事柄について、その異同の検討を進めた。また、欧州で伝統的におこなわれてきたユースワークと、若者支援の重なりについての検討もおこなった。その一部を、公開研究会において発表した。引き続き、現場との協同検討をおこなうとともに、まとめの作業をおこなう。28年度が最終年度であるため、記入しない。青年期教育28年度が最終年度であるため、記入しない。
チロシナーゼ陽性型白皮症の遺伝子診断

先天性白皮症はチロジナーゼ陰性型と陽性型に分類される。前者はチロジナーゼ遺伝子の変異により、活性のある酵素蛋白が生合成されないために発症することが富田らにより明らかにされている(BBRC 164:990,1989)。一方、後者のチロジナーゼ陽性型白皮症について、Rinchikらは膜結合性のP蛋白の遺伝子変異により発症すると最近報告した(Nature 361:72,1993)。P蛋白は、アミノ酸の一つであるチロシンのキャリア蛋白である。この蛋白の遺伝子変異により、この蛋白の機能が失われて、メラノソーム内にメラニン生成の出発物質であるチロシンの供給が出来なくなるために、メラニン生成が起こらなくなるのであろう。ところでチロジナーゼ陽性型はチロジナーゼ活性が存在するというだけで一つのカテゴリーに分類されているので、P蛋白異常以外の病因も含まれているはずである。本研究の目的は、P蛋白遺伝子を利用した陽性型白皮症の遺伝子診断を確立し、それによって陽性型白皮症患者のうちP蛋白異常がどの程度占められるのかを、明らかにすることである。そこでまずチロジナーゼ遺伝子の蛋白codingregionに変異のないことが確認されている陽性型白皮症患者のP蛋白遺伝子異常の検索を行ったが、なんら変異は見い出されなかった。この結果は、チロジナーゼ陽性型白皮症には明らかにP蛋白以外の異常により発症する患者が存在することを示している。
下顎骨の骨粗鬆症診断：組織から画像へのインタープリテーション

卵巣摘出後のラットで、骨粗鬆症の下顎骨における病態を明らかにし、組織学的所見と画像所見とを対比させ、組織学的な骨変化が画像にどのように反映されるかを検討することを目的とした。すなわち、下顎骨の経時的な骨吸収形態の観察、骨吸収部での骨代謝の特徴、骨吸収部と骨髄部の組織・細胞の特徴を、形態学的、免疫組織化学的に検討することとした。平成27年度は、1)実験動物を用いた研究のための環境整備、2)閉経後骨粗鬆症モデル作成、3)卵巣摘出後3か月および6か月のラットの、(i)軟X線、(ii)マイクロCT、(iii)組織切片、(iv)血清CRPおよびアデイポネクチン値についてのデータ収集・観察・評価を計画した。実際には、環境整備を行い、動物実験倫理委員会の審査承認(5月)を得た。また、卵巣摘出術式の確認および訓練のためラット2頭を購入し、研究分担者2名と術式に沿って実際に卵巣摘出モデルを作成した(6月)。研究代表者に海外転出の可能性が生じたため、動物実験を中断した。その間、Journal of Medical Casesに顎骨壊死の症例を報告し掲載された(9月)。
作業療法学生を対象とした精神障害領域の臨床実習に対する自己効力感尺度の開発

作業療法学生にとって臨床実習は、作業療法士としての素養を身につける重要な場である。しかし、精神障害領域の臨床実習では、障害者との接触経験の乏しさから学生の問題が露呈することが多い。本研究では、実習を遂行可能にする要因の一つとして自己効力感に着目し、作業療法学生を対象とした精神障害領域の臨床実習に対する自己効力感尺度の開発を目的とする。方法は、1作業療法学生と作業療法士に対して実習に関する聞き取り調査の実施、尺度項目の作成、2作業療法学生を対象とした予備調査、3尺度の妥当性と信頼性の検討である。尺度の開発により、学生の自己効力感に合わせた教育の介入や教育の効果判定が可能になると考えられる。
アポトーシス実行過程の分子機構に関する研究

アポトーシス実行メカニズムがクロマチン構造変化にあると考え、検討を行なった。カリキュリンAによりアポトーシスが誘発された胸腺細胞ではDNA断片化に先行してヒストンH1、H2AおよびH3リン酸化が亢進していた。これらのヒストンリン酸化はクロマチンのα-ヘリックス構造を減少させることにより構造変化を引き起こし、DNA断片化酵素に対する感受性を増大させた。以上はタンパク質脱リン酸化酵素阻害薬処置により得られた結果であるが、ヒストン化学修飾がアポトーシスの共通の機構であることを示すため、ヒトアストロサイト培養系を用いて検討した。ヒトアストロサイトを生理食塩水に暴露後、正常培地で培養するとアポトーシスが誘発された。この細胞死にはヒストンH2Aリン酸化が先行していた。上記の研究成果により示唆されたアポトーシス実行におけるクロマチン構造変化の重要性を明確にするため、新規アポトーシス誘導剤を探索した。プラスミン阻害薬であるYO-2は胸腺細胞にアポトーシスを誘発させたことから、本化合物はアポトーシス誘発におけるクロマチン構造変化を検討する材料として有用であると考えられた。培養アストロサイトを過酸化水素や低Ca^<2+>培地に暴露後、正常培地で培養すると遅発性のアポトーシス様障害が誘発された。この細胞障害はT-588、CV-2619およびイブジラストにより抑制された。さらに、cGMPはミトコンドリアpermeable transition poreを抑制し、抗アポトーシス作用を示すことを実証した。以上より、ヒストンリン酸化、特にヒストンH2Aのリン酸化がアポトーシス実行の共通の機構として重要であることが示唆された。ヒストンリン酸化はクロマチン構造を弛緩させ、DNA分解酵素に対する感受性を増大させる可能性が示された。また、アストロサイトにおける検討からcGMPの抗アポトーシス活性の分子機構を明らかにした。アポトーシスは生理学的な細胞死の過程であり、この細胞死の誘発に関しては多くのシグナル伝達系の関与が示されている。しかしながら、シグナル受容以降の分子機構については不明な点が多く残されている。そこで私たちはシグナル受容以降のアポトーシスの分子機構、すなわちこの細胞死の生化学的な特徴であり、かつ実行過程でもあるDNA断片化の分子機構を解明するために検討を加えてきた。DNA断片化の標的であるDNAは核において塩基性タンパク質のヒストンとともにクロマチンと呼ばれる複合体を形成している。クロマチンは通常さらに密に折りたたまれて核内に収納されているが、転写や複製などの核内でのイベント時にはヒストン化学修飾などにより、その構造が変化することで酵素の触媒を受けられるようになると考えられている。そこで、DNA断片化におけるクロマチン構造変化の関与についてヒストン化学修飾を亢進させた細胞核を調製して検討を加えた。その結果、DNA分解酵素に対する感受性が亢進することを明らかにした。したがって、ヒストンのアセチル化やリン酸化などの化学修飾がアポトーシス実行過程の引き金となることが示唆された。さらに、アポトーシス誘発時のクロマチン構造変化の有無について、円二色性分散計を用いて実際に計測したところ、タンパク質の二次構造の一種であるα-ヘリックスの減少を示す結果が得られた。今後、このクロマチン構造変化がアポトーシスの共通の分子機構であるかどうかについてさらに検討する予定である。アポトーシスの生化学的な実行過程はDNA断片化であり、これに関与するDNA断片化酵素の実体についても明らかにされつつある。しかしながら、DNA断片化の分子機構についての詳細は十分には解明されていない。私たちは、アポトーシス実行過程の分子機構がDNAの存在するクロマチン構造変化にあると考え、以下の検討を行なった。(1)アポトーシス実行過程

おいて化学修飾されるヒストン分子種の同定、さらに(2)それに伴うクロマチン構造の変化を調べた。その結果、カリキュリンAによりアポトーシスが誘発された胸腺細胞ではDNA断片化に先行してヒストンH1、H2AおよびH3のリン酸化が亢進することを見いだした。また、これらのヒストンのリン酸化はクロマチンのα-ヘリックス構造を減少させることにより構造変化を引き起こすこと、さらにクロマチン構造変化に伴いDNA断片化酵素に対する感受性が増大することを明らかにした。これらの研究成績はクロマチンの構成成分であるヒストンの化学修飾がアポトーシスの引き金となることを示唆するものであり、クロマチン構造変化がアポトーシスの実行過程において重要な役割を有することが考えられた。これまでの研究成果は胸腺細胞にタンパク質脱リン酸化酵素を阻害する薬物を用いることにより得られたものであるが、ヒストンの化学修飾がアポトーシスの共通の機構として重要なものかどうかを知るためヒトアストロサイト培養系におけるヒストン化学修飾の役割について検討を加えた。ヒトアストロサイトを生理食塩水に暴露後、通常の培養液に交換して培養すると細胞障害が観察され、これが一部アポトーシスによることを明らかにした。また、この細胞死に先行してヒストンのリン酸化が起こることを見いだした。リン酸化されるヒストンはH2Aであることをシークエンス法により同定した。以上の結果から、アポトーシスの実行過程にヒストンリン酸化が関与することが明らかとなり、種々のヒストンのうち、特にヒストンH2Aのリン酸化がアポトーシス実行過程の共通の分子機構である可能性が示された。
プレート沈み込み帯に持ち込まれる物質の多様性により生じる摩擦特性変化に関する研究

プレート沈み込み帯では,巨大地震をはじめ様々なタイプの地震が観測されている.このような多様なすべり挙動は,プレート境界断層面上で摩擦の安定性が,空間的に不均質な分布をしていることを反映していると考えられる.その要因の一つに,摩擦特性の異なる物質が沈み込み帯に持ち込まれ,それらがプレート境界断層面上で空間的に不均質に分布することが挙げられる.本研究は,沈み込み帯に持ち込まれる堆積物に含まれる生物起源非晶質シリカが,プレート境界断層の摩擦特性に与える影響を明らかにすることを目的として行った.本年度以前に,生物起源堆積物である珪質・石灰質軟泥,およびそこから酸処理によって取り出した生物起源非晶質シリカ等の摩擦特性を調べた.本年度は,天然試料の主成分の化学組成および最大粒径を模擬した試料として,カルサイト,人工非晶質シリカ,およびそれらの混合物を用いて摩擦実験を行った.これら模擬試料が天然試料とは異なる摩擦特性を示したことから,主成分の化学組成や粒径ではなく,生物起源堆積物に含まれる粒子の生物の殻の形が,摩擦特性を決める重要な要素であると考えられる.さらに,堆積物が沈み込み帯深部の高温条件下に持ち込まれ,堆積物中の生物起源非晶質シリカが結晶化することによる摩擦特性の変化を調べた.生物起源非晶質シリカを含む堆積物を水熱反応させたところ,非晶質シリカをほとんど含まない試料が得られた.この試料を用いて摩擦実験を行った結果,堆積物が生物起源非晶質シリカを含むことでプレート境界断層の摩擦を不安定化させる傾向があること,さらに,このような堆積物が沈み込み帯深部に持ち込まれ,生物起源非晶質シリカが結晶化すると,断層の摩擦を安定化させる傾向があることが示唆された.これらの知見は,プレート沈み込み帯で発生する地震の多様性を明らかにする上で重要である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
好中球性皮膚症に対する顆粒球吸着療法の奏功機序の解明

壊疽性膿皮症、膿疱性乾癬(GPP)など好中球性皮膚症に有用である顆粒球吸着療法(GMA)の作用メカニズムを検討した。GMA治療の前後におけるリンパ球、樹状細胞をフローサイトメトリーを用いて解析し、これらの細胞がサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。活動期GPPではCD14+CD16+ proinflammatory monocyte/CD14+ monocyte比が非活動期や健常人に比べて有意に増加し,血中CXCL8,CCL3,CCL4濃度も有意に上昇していることを示した。またGMAはproinflammatory monocyte比を減少させ,サイトカイン産生を制御する可能性を示した。好中球性皮膚症の新しい治療法として、好中球浸潤を主体とする炎症性腸疾患の有効な治療である顆粒球吸着療法(GCAP)が注目されている。しかし、その治療のメカニズムは単なる顆粒球の吸着除去のみでは説明できず、不明な点が多い。そこで、多面的にこの治療法の作用機序を明らかにするため、GCAPの前後をリンパ球、樹状細胞(DC)の面からフローサイトメトリー(FCM)を用いて解析し、さらにこれらの細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。岐阜大学治験管理委員会の承認を得て、同意を得た好中球性皮膚症患者に対してGCAPを週1回、計5回実施した。カラム開始前(A)、15分後の安定した時期のカラム流入前(B)と流出直後(C)、60分間のGCAP終了後の末梢血(D)を各回毎に採取した。顆粒球、単球、リンパ球数の変化を検討し、さらに細胞表面マーカーを用いたFCM、および磁気細胞分離法(MACS)によりTh1、Th2、Th17、Treg、DCの各画分の変化を検討した。(B)と(C)画分の差からカラム内での吸着、(A)と(D)を比較することによりカラム後の末梢血内細胞表面マーカーの変化を観察した。その結果、GCAP後にはproinflammatory monocyteが減少することが明らかになり、結果をFujisawa T, et al. Acta Derm Venereol. 2013; 93: 364-5.で報告した。現在はin vitroの実験としてセルロースアセテートビーズを充填したミニカラムを作成し、健常人血液を注入を行っている。カラム注入前/後およびカラム内に吸着した顆粒球、単核球を採取し、同様にリンパ球、DCの変化を測定しているが実験条件の設定に苦慮している。今後は好中球性皮膚症の患者血液でも同様の操作を行い、細胞表面マーカー発現変化の差異を健常人血液と比較する予定である。好中球性皮膚症の新しい治療法である、顆粒球吸着療法(GCAP)の作用メカニズムは単なる顆粒球の吸着除去のみでは説明できず、不明な点が多い。そこで、多面的にこの治療法の作用機序を明らかにするため、GCAP治療の前後をリンパ球、樹状細胞の面からフローサイトメトリーを用いて解析し、さらにこれらの細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。岐阜大学医学部倫理委員会の承認を得て、同意を得た好中球性皮膚症患者に対してGCAP療法を実施した。その結果、GCAP後にはproinflammatory monocyteが減少することが明らかになった。この結果は、Fujisawa T, et al. Acta Derm Venereol. 2013; 93: 364-5.で報告した。in vitroの実験としてセルロースアセテートビーズを充填したミニカラムを作成し、健常人血液を注入する実験を行ったが、十分量の血球の流出を得ることができずin vivoの再現には至らなかった。次に、血管内皮増殖因子(VEGF)に注目した。乾癬の発症にTIP-DC(TNF-αand iNOS-producing dendritic cell)の活性化、それによるhelperT細胞の分化およびその産生するサイトカインが大きく関与するといわれているが、詳細なメカニズムは未だ不明である。一方で、VEGFは血管新生作用と血管透過性亢進作用を有し、皮膚においては表皮ケラチノサイト由来であることが知られている。さらに、われわれは血液中のVEGF濃度が健常人と比較して有意に増加していること、その増加はTNF-α阻害薬投与により抑制されること、ヒト培養ケラチノサイトではIFN-γ, TNF-α刺激によりVEGF mRNA発現が増加することを明らかにした。また、TNF-α阻害薬下でIFN-γ, TNF-α刺激によるヒト培養ケラチノサイトのVEGF mRNA発現は抑制された。これらの所見からVEGFは病勢および治療効果を反映する、有効なバイオマーカーになり得ると考えられた。これらについては2015年度に皮膚科関連の雑誌に投稿予定である。

好中球性皮膚症好中球性皮膚症の患者として膿疱性乾癬・関節症性乾癬・掌蹠膿疱症の患者より同意を得たうえで検体を採取した。カラム開始前、開始15分後、30分後、60分後に採取し顆粒球、単球、リンパ球数の変化を検討した。開始後から30分をピークとして末梢血中の顆粒球は半減し、その後代償されて開始時とほぼ同程度まで回復することが分かった。In vitroでの実験では吸着が安定する15分を目安とした。今後はin vitroでのミニカラム処理前後の細胞画分の変化を中心に行いたいと考える。セルロースアセテートビーズを充填したミニカラムを作成し、健常人血液を注入する。カラム注入前、注出後およびカラム内に吸着した顆粒球、単核球を採取し、細胞表面マーカーを用いたフローサイトメトリー、MACSでTh1、Th2、Th17、Treg、DCの変化を測定する。また、好中球性皮膚症(膿疱性乾癬、壊疽性膿皮症、ベーチェット病、スイート病)の患者血液でも同様の操作を行い、細胞表面マーカー発現変化の差異を健常人血液と比較する。GCAPあるいはミニカラムにより得られた各細胞画分のサイトカイン産生能の検討するため、これまでの実験、すなわちGCAPおよびミニカラム実験からフローサイトメトリーおよびMACSにより各細胞画分を得る。これらをリポ多糖(LPS)〔LPS:10μg /mL〕で刺激後培養に供し〔Cell:1.0×10mL〕、LPS培養上清中のサイトカイン・ケモカイン(TNF-α、IFN-α、IL-1β;、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-20、IL-22、IL-23、MIP-1、MCP-1)濃度と、細胞中のサイトカイン・ケモカインmRNAをRT-PCRを用いて測定する。
海洋における溶存有機炭素の循環を支配する新しいメカニズム

1.海洋に蓄積している有機ポリマーである細菌細胞壁主成分(ペプチドグリカン)の分離、精製、定量法を検討した。2.海洋細菌を用いてペプチドグリカンの放射標識標品を調製する方法を検討した。3.上記の検討に基づき、海洋における高分子有機ポリマーの循環速度を高感度に測定するアッセイ法を新規構築することに成功した。4.沿岸、外洋海域における培養実験を行い、高分子有機ポリマーの分解速度と、分解過程を詳細に解析した。その結果、海洋環境における複合ポリマーの加水分解と取り込みが脱共役していることを明らかにした。5.有機ポリマーおよび溶存有機物の分解に関わる微生物量と活性の広域分布データ(北部北太平洋)の解析から、高分子分解活性の鉛直プロファイルに顕著な東西差が存在することをはじめて明らかにした。その要因の解析から、たんぱく質加水分解酵素の活性触媒である亜鉛の供給量が、有機ポリマー分解の地理的パターンの決定要因のひとつであるという新しい仮説を提案した。6.太平洋の広範な海域における細菌活性の分布データから、海洋中深層では、沈降有機粒子から溶出する溶存有機物を細菌が消費する経路を通しての有機物酸化が、炭素フラックスの中で大きな役割を果たしていることを示唆した。この知見は、海洋の有機物循環をモデル化するうえできわめて重要である。7.有機ポリマーを含む、溶存有機物の生成過程をモデル化し、細菌群集およびその捕食者(特に原生生物)を介在する有機物の変質過程が、海水中での有機ポリマー蓄積に重要な役割を果たしていることを示した。海水中に多量に蓄積する細菌由来の有機ポリマーの生成、蓄積機構を解明するために、放射トレーサーを用いた、高感度アッセイシステムを新たに構築することに成功した。14Cないしは3H標識N-アセチルグルコミンサンを含むペプトン培地中で培養した海洋細菌(Vibrio属)から、超遠心分離法により、細胞壁成分ペプチドグリカンを抽出した。高解像度有機解析システムを用いて、放射能の分子内分布を調べたところ、調製された標品には、夾雑物の混入がほとんどないこと、また、標識は標的分子に特異的であることが示された。これを海水中に添加し、基質の低分子化、無機化を測定することにより、有機ポリマーの変性、分解過程を現場生態系条件下で詳査することが可能になった。とくに重要なのは、標識化合物の非活性が高いため、広範な海洋環境に本方法が適用可能な点である。大槌湾、東京湾、デラウェア湾(アメリカ合衆国)における観測の結果、ポリマーの断片化と、断片化した化合物の微生物代謝の間に脱共役が生じていることが初めて見いだされた。また、汽水域におけるポリマー分解速度が塩分と正の相関を示す減少も発見された。以上の結果と、現場での細菌由来ポリマーの分布データから、有機ポリマーの蓄積過程に関する予備的なモデルの構築を開始した。次年度は、ここで確立した手法をより広範な環境に応用することにより、細菌ー炭素循環システムの解明を推進する予定である。本研究は、近年、海洋中に大量に蓄積していることが明らかになった、細菌起源の有機ポリマーの安定化・蓄積機構を、学際的なアプローチから追及し、海洋炭素循環の新しいメカニズムを解明することを目的とした。本年度の研究では、昨年度に引き続き、細菌起源の高分子ポリマーであるペプチドグリカンの安定化・蓄積機構を解明するために、放射トレーサー法を用いた解析を推進した。また、北部北太平洋における細菌群集の有機ポリマー分解活性にかんするデータを総合的に解析することにより、海洋の炭素・窒素循環における溶存有機物(ポリマー)-微生物系の変動パターンに関する新しい知見を得ることに成功した。主な成果を以下にまとめる。1.ペプチドグリカンを放射標識する手法、特に、糖鎖とペプチド鎖を選択的に標識する手法を確立した。これにより、海洋における細菌由来有機ポリマーの変質・分解過程を分子レベルで解明することが初めて可能になった。2.本研究において新たに開発した上記手法を用いることにより、細菌由来有機ポリマーの中に、難分解性部位が存在する可能性が示唆された。

このことは、海洋に大量に存在する溶存有機炭素の蓄積機構の理解のうえで重要である。3.北部北太平洋において、細菌によるポリマー分解活性の特性(ペプチド分解活性と糖鎖分解活性比)に顕著な東西勾配が存在するという現象をはじめて発見した。この事実から、ポリマーと細菌の相互作用の様式が、海域によって、大きく異なることを明らかにするとともに、また、それが、大気経由の微量元素負荷パターンと相関するという新しい仮説を導いた。
化学反応コンデンサ　～概念確立に向けた研究～

電気回路にはコンデンサと呼ばれる回路が組み込まれており、電圧の安定化・ノイズ除去・電気信号の取り出しといった電気回路において重要な役割を担っている。コンデンサの役割を化学反応で再現できれば、化学反応においても収率向上・生成物選択性向上などの精密制御が可能性となる。しかし、このようなコンセプトで化学反応を能動的に制御する試みはない。研究代表者らは、層状酸化物半導体(LMOSs)の積層体中においてラジカルなどの従来不安定な化学種が、溶液と比べ著しく安定に存在することを見出している。また、安定化された化学種に対して気体状の反応試薬を導入すると、ラジカルの消失が確認された。このようなラジカル種の安定化挙動は、電気回路におけるコンデンサの蓄電・放電挙動に類似していると考えられ、コンデンサの役割を化学反応に適応・再現する「化学反応コンデンサ」という着想に至った。本研究では、レニウムジイミン錯体(Re錯体)による二酸化炭素の光還元を中心とする様々な反応系を用いて、LMOSs層間での光ラジカル生成およびLMOSs層間での安定化挙動などを仔細に調査する。さらにLMOSs層間で安定化したラジカルとガス状分子との反応を行うことで、ラジカルの蓄積と放出が可能な化学反応コンデンサの概念確立およびプロトタイプ作成を目指す。このような研究目的のもと、LMOSsと複合化可能なカチオン性Re錯体や光機能性分子の合成・Re錯体と層状化合物(clay)との複合化と光化学挙動・透明膜状のLMOSsの合成と光機能性カチオン性分子との複合化を行い、それぞれ特徴的な成果を得た。昨年度までの研究成果として、1)カチオン性Re錯体の新規合成:LMOSs表面は負電荷を帯びているため、カチオン性の分子を層間導入可能である。しかし、明確な点電荷を有するカチオン性レニウム錯体はほぼ存在しない。Re錯体配位子を有機合成的に修飾することで、新規カチオン性Re錯体の合成に成功した。2)カチオン性Re錯体とclayとの複合化と光化学挙動:LMOSs層間は、比較的強い相互作用で結びついているため、金属錯体類を挿入することは通常困難である。LMOSsに代わり、多様な錯体との複合化が報告されている層状粘土鉱物(clay)を用いて、層状化合物/Re錯体複合体の合成とその光化学挙動について観測を行なった。層状化合物表面で、Re錯体の励起寿命が著しく長寿命化すること、光に対してRe錯体が安定化しclay上でCO2還元が進行することが示唆された。3)透明膜状のLMOSsの合成:本研究目的では、光学的に透明なLMOSsの膜が必要である。LMOSsを適切な化学処理で単層剥離したのち、低温焼成を行うことで透明なLMOSs膜を得ることに成功した。5)前述の低温焼成膜ではRe錯体の複合化が困難であることが明らかになった。別の複合化手法として、Layer-by-Layer (LbL)法によるカチオン性分子/LMOS複合膜の作成を行なった。LbL法は、高分子を積層する手法であり、低分子量の分子積層実績はなかったが、独自の手法開発により低分子化合物でも良好な透明膜を得ることに成功した。このように複合化手法を根本的に見直す必要に迫られたため、進捗が遅れている。昨年度までの研究実績からLMOSsなどの層状化合物とRe錯体との複合化に成功し、本複合体が非常に特異的な光化学挙動を示すこと、CO2還元においても高いポテンシャルを有する可能性を見出した。しかし、通常のイオン交換反応では、LMOSs薄膜とRe錯体の複合化が十分に進行しないことが明らかとなった。この点を改善するため、H30年度は別の手法でLMOSとの積層複合化の探索を行なった。種々の検討の結果、Layer-by-Layer (LbL)法とカチオン性ビピリジニウム(BP)により、低分子系の化合物であっても積層化と透明薄膜化が可能であることを見出した。BP類は、光によりラジカル種を生成するとともに酸素ガスによりラジカル種を消失させる機能があり、Re錯体に加えて本研究のコンセプトを満たす分子である。これらの検討を受けて、1) Re錯体に先行してBP/LMOSsのLbL膜を用いて、光ラジカル生成と消滅を観測し、本研究の基本コンセプトを確認する。2) LbL法によるRe錯体との複合化を行い、目的とする膜を得る。3) 1)手法を参考に、2)で得られたRe錯体/LMOSs複合膜に対して、還元剤存在下でLMOSsが光吸収する波長の光を照射することで、Re錯体のラジカル種の観測を行う。特に、雰囲気制御した条件でラジカル種を観測しラジカル種の寿命などを分光学手法にて決定する。これらの分光分析には、我々が独自開発した薄膜専用マルチ瞬間分光分析装置を用いる。電気回路にはコンデンサと呼ばれる整流回路が組み込まれており、電圧の安定化・ノイズ除去・電気信号の取り出しといった電気回路において重要な役割を担っている。研究代表者らは、層状酸化物半導体(LMOSs)の積層体中においてラジカルなどの不安定化学種が、溶液と比べ10億倍以上もの時間、安定に存在することを見出している。

また、安定化された化学種に対して気体状の反応試薬を導入すると、ラジカルの消失が確認された。このようなラジカル種の安定化挙動は、電気回路におけるコンデンサの蓄電・放電挙動に類似していると考えられ、コンデンサの役割を化学反応に適応・再現する「化学反応コンデンサ」という着想に至った。本研究では、レニウムジイミン錯体(Re錯体)による二酸化炭素の光還元をモデル反応として、LMOSs層間でのRe錯体の光ラジカル生成およびLMOSs層間での安定化挙動などを仔細に調査する。さらにLMOSs層間で安定化したRe錯体ラジカルと二酸化炭素との反応を行うことで、ラジカルの蓄積と放出が可能な化学反応コンデンサの概念確立およびプロトタイプ作成を目指す。このような研究目的のもと、LMOSsと複合化可能なカチオン性Re錯体の合成・Re錯体と層状化合物(clay)との複合化と光化学挙動・Re錯体と粉末状LMOSsとの複合化と光CO2還元・透明膜状のLMOSsの合成とRe錯体との複合化を行い、それぞれ特徴的な成果を得た。昨年度までの研究成果として、1)カチオン性Re錯体の新規合成:LMOSs表面は負電荷を帯びているため、カチオン性の分子を層間導入可能である。しかし、明確な点電荷を有するカチオン性レニウム錯体はほぼ存在しない。Re錯体配位子を有機合成的に修飾することで、新規カチオン性Re錯体の合成に成功した。2)カチオン性Re錯体とclayとの複合化と光化学挙動:LMOSs層間は、比較的強い相互作用で結びついているため、金属錯体類を挿入することは通常困難である。LMOSsに代わり、多様な錯体との複合化が報告されている層状粘土鉱物(clay)を用いて、層状化合物/Re錯体複合体の合成とその光化学挙動について観測を行なった。層状化合物表面で、Re錯体の励起寿命が著しく長寿命化すること、光に対してRe錯体が安定化しclay上でCO2還元が進行することが示唆された。3) Re錯体と粉末状LMOSsとの複合化と光CO2還元:膜状のLMOSとRe錯体との複合化に先立ち、代表的なLMOSsである粉末状Nb4O17との複合化に成功した。光照射に伴い水素の発生が観測されたことから、本系が光触媒として機能することを確認した。4)透明膜状のLMOSsの合成:本研究目的では、光学的に透明なLMOSsの膜が必要である。LMOSsを適切な化学処理で単層剥離したのち、低温焼成を行うことで透明なLMOSs膜を得ることに成功した。5)膜状LMOSsとRe錯体との複合化:一般的なイオン交換反応による膜状LMOSs層間へのRe錯体の導入を行なったが、イオン交換反応が十分に進行しないことを明らかにした。電気回路にはコンデンサと呼ばれる回路が組み込まれており、電圧の安定化・ノイズ除去・電気信号の取り出しといった電気回路において重要な役割を担っている。コンデンサの役割を化学反応で再現できれば、化学反応においても収率向上・生成物選択性向上などの精密制御が可能性となる。しかし、このようなコンセプトで化学反応を能動的に制御する試みはない。研究代表者らは、層状酸化物半導体(LMOSs)の積層体中においてラジカルなどの従来不安定な化学種が、溶液と比べ著しく安定に存在することを見出している。
ヒトEC細胞の分化に伴う糖転移酵素の発現の解析-フコース転移酵素を中心に-

(目的)我々の研究質では、子宮体癌由来培養細胞株SNGIIを免疫原として作成したモノクローナル抗体MSN-1が子宮体癌組織と高率に反応することから、その認識抗原であるルイスbの構築に必要なFT-III遺伝子(=Le遺伝子)の変化についてヒトEC細胞を用いて検索してきたが、実験方法の確立を目指して、まずは各種婦人科悪性腫瘍由来の培養細胞を用いて、そのゲノムDNAにおけるLe遺伝子の点突然変異を、PCR-RFLP法を用いて検出することとした。(対象)子宮頸癌由来培養細胞株(SKGIIIa、SKGIIIb)、子宮体癌由来培養細胞株(SNGII、Hec108)、卵巣癌由来培養細胞株(RMGII、RTSG)の6細胞を用いた。(方法)各種培養細胞より抽出したゲノムDNAをテンプレートとし、FT-III遺伝子に特異的なプライマーを設定し、PCR法を行った。そのプロダクトを、制限酵素PvuIIにて切断したフラグメントの検出により、点突然変異による劣性遺伝子型の一つであるle1を検出した。さらに異なるプライマーを用いてPCRを行い、制限酵素HindIIIにて切断することで、もう1つの劣性遺伝子型le2を検出した。(結果)RMGIIは、Le/le1、RTSGは、Le/le2の各々ヘテロ接合体であり、他の4細胞はLe/Leのホモ接合体であった。(考察)癌化にともなうFT-III遺伝子の何らかの変化が示唆されていることから、leのホモ接合体である細胞株を対象とし、今回と同様のPCR-RFLP法を用いて検索することにより、in vivoでの癌化にともなう遺伝子上の変化と、それより引き起こされる表現形質の変化の解明の端緒となり得ると思われた。
性フェロモン受容系の遺伝的機能改変による高感度匂いセンサカイコガの開発

キイロショウジョウバエ一般臭嗅覚受容体の一つであるOr82aをカイコガ性フェロモン主成分であるボンビコールの受容体遺伝子BmOR1プロモータ制御下で発現する遺伝子組換えカイコガを作出した。この組換えカイコガは、Or82aのリガンドであるgeranylacetate刺激に対して濃度依存的に、フェロモン源探索行動を発現した。また、Or82aの発現による、ボンビコール受容細胞の神経投射パターンの変化は見られなかった。これらの結果から、一般臭の嗅覚受容体の遺伝的導入によりカイコガのフェロモン源探索行動の匂い選択性を人為的に改変できることが示され、本手法を用いてオスカイコガ生体をさまざまな匂いのセンサとして利用する可能性が示された。カイコガのオスはわずか170分子のフェロモン(ボンビコール)の匂いを触角中のボンビコール受容細胞で検知すると、匂い源への定位行動を発現する。本研究課題では、昆虫の一般臭嗅覚受容体をボンビコール受容細胞で発現することで、カイコガの定位行動の匂い選択性を改変する技術を確立し、カイコガ生体の匂いセンサとしての利用可能性を検証することを目的とした。まず、キイロショウジョウバエの一般臭嗅覚受容体遺伝子から匂い選択性の異なる2遺伝子(Or82a、Or43b)を選択し、これらのタンパク質翻訳領域をUAS下流につないだUAS-Or82aとUAS-Or43b組換え遺伝子をもつ系統を作出した。これらの系統を、ボンビコール受容体遺伝子BmOR1のプロモーターでGAL4を発現する系統と交配し、ボンビコール受容細胞での遺伝子発現の誘導を行った。RT-PCRによる遺伝子発現解析の結果、GAL4とUASの両方の組換え遺伝子を持つオスの触角におけるキイロショウジョウバエの嗅覚受容体遺伝子の発現が確認できた。そこで、Or82aのリガンドである酢酸ゲラニルに対する匂い源定位行動を羽ばたき行動を指標として検証した。その結果、Or82aを発現する系統のオスは酢酸ゲラニルに対して、羽ばたき行動を発現したが、酢酸ゲラニルに反応しないOr43bを発現する系統のオスは同濃度のゲラニル酢酸に対して羽ばたき行動を示さなかった。以上より、遺伝子組換えによる一般臭嗅覚受容体遺伝子の導入によりカイコガの定位行動の匂い選択性を改変できる可能性が示唆された。並行して、受容体遺伝子導入カイコガの高感度化に向けて、匂い結合タンパク質とsensory neuron membrane protein-1の解析を行い、これらが嗅覚受容体の応答の高感度化に有効である可能性を示唆する結果を得た。これらの成果をとりまとめ国内学会で発表を行った。
がん幹細胞抑制型腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗癌化学併用療法の開発

胃癌細胞株MKN28、MKN45、MKN74、MKN1、TMK-1、KatoIII、AZ521、OCUM-1を培養後、回収して表面マーカーCD24、CD44、CD133、CD166、SSEA-1、SSEA-4の蛍光標識抗体およびフローサイトメトリー法およびセルソーティングにて腎癌幹細胞表面マーカーの解析を行った。また、胃癌手術症例からの胃癌組織をサンプルとして同様にフローサイトメトリー法およびセルソーティングによる解析を予定していたが、腫瘍細胞のみの単離が困難で行えなかった。表面マーカーによるセルソーティングで得られた胃癌細胞株をヒト組換え20ng/mlのEGFおよび10ng/mlのbFGF存在下にて培養を行い、細胞生存率をトリパンブルーで測定し、4-5週間後に光学顕微鏡でspheroid colony formationがあるものを自己複製能のある胃癌幹細胞マーカーの候補と考えた。続いて8-12週齢のSCIDマウス皮下にこの癌細胞を3万個ずつ注射して移植し、16週まで腫瘍増殖を観察し、腫瘍形成のあるマーカーをその細胞の癌幹細胞マーカーの候補とした。さらに表面マーカー陽性でソーティングした胃癌細胞株を5FU等の抗癌剤存在下で培養しMTTアッセイで生存細胞数を計測し、表面マーカー毎に各細胞株での生存率が有意に高いものをそれぞれの細胞株の癌幹細胞マーカーと同定した。現在、胃癌幹細胞マーカーに対するsiRNAオリゴDNAを設計してタカラバイオ社製のsiRNA発現型プラスミドpBAsi-hU6に挿入して胃癌幹細胞抑制型プラスミドを構築中である。
ES細胞を用いた未分化細胞が分化する過程の網羅的解析

テトラサイクリンで転写因子Oct-3/4の発現を調節することが可能なES細胞ZHBTc4において、テトラサイクリン投与後0,24,48、72、96時間目の細胞からそれぞれRNAを精製し、これを始原生殖細胞由来cDNAマイクロアレイで解析し、全ての結果の収集を完了した(理化学研究所・阿部博士との共同研究)。一方で、これらのサンプルをNIHの洪博士との共同研究により、23K cDNAマイクロアレイを用いても解析を進めている。今後、全てのデータの収集が完了次第、その解析に着手する予定である。テトラサイクリンで転写因子Gata6の発現を調節することが可能なES細胞G6SKOについては、その発現によって誘導される細胞が壁側内胚葉であることを最終的に確認した(Fujikura J et al.,Genes Dev.,2002)ので、現在マイクロアレイ解析用の時系列RNAサンプルを収集している。また、最近ES細胞における遺伝子マーキングによる解析から、従来均一と考えられていたOct-3/4を発現する未分化細胞集団が、さらに遺伝子発現パターンの異なるサブグループに分離可能であることを見出した。現在、これらのサブグループを系統的に純化する方法の開発を進めており、その進捗を見た後に、マイクロアレイを用いた系統的遺伝子発現解析に進む予定である。マイクロアレイ法による遺伝子発現解析の有効性は、洪博士との共同研究によるES細胞とTS(trophoblast stem)細胞の遺伝子発現比較検討により確認することが出来ているので(Tanaka, TT et al., Genome Res.,2002)、今後同様の手法を用いた上記サンプルの解析結果から、細胞分化のメカニズムの一端が明らかにされるであろう。