hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵癌に対する診断・治療を目的としたナノ粒子によるバイオマーカーの確立

EGFR-TKIによるオートファジー誘導は細胞保護的に機能し,これをマクロライド化合物で阻害することで膵癌細胞死を誘導でき,chemo-sensitizerとしてのマクロライドの臨床使用の可能性が示唆された.その細胞死増強は,ERストレス負荷によるアポトーシスを想定していたが,アポトーシスはほとんど観察されず,ネクロプトーシスが誘導された。マクロライドのオートファジー阻害活性における分子標的の同定ならびにオートファジー阻害によるネクロプトーシス誘導の分子基盤は今後の検討課題である.本研究では,gold/Cy3のナノ粒子(サイズ50-100nm)に抗EGFR抗体で修飾を行い,膵癌における細胞増殖抑制効果,アートファジー/アポトーシス誘導効果を観察し,そのオートファジー誘導の生物学的意義・シグナル伝達因子を解明し,より効率の良い治療法を確立することを目的に研究を行っている.本研究で用いるナノ粒子は治療および診断に利用することができ,暗視野顕微鏡/蛍光顕微鏡とMRIを用いることによって細胞への取り込みをリアルタイムに行うことが可能と思われる.昨年度に引き続き,本年度も上記ナノ粒子を作成し,EGFRの発現/非発現の膵癌細胞株を用いて,細胞増殖抑制効果,さらにはナノ粒子の検出を暗視野顕微鏡/蛍光顕微鏡を用いて行っているが,やはりナノ粒子の安定性が図れず,再現性に難渋している.これまで同様にEGFRの発現した膵癌細胞においては上記ナノ粒子添加にて細胞増殖抑制効果を認めているが,ナノ粒子作成後に時間経過したものでは,その効果が失活してしまう場合があり,現在もその安定性について引き続き検討を行っている.特に作成過程や保存状況の検討を行っている.これらのナノ粒子の安定性を確認した後,申請時に予定していた上記ナノ粒子による細胞内シグナル伝達因子,オートファジー/アポトーシスの検出を行う予定であるが,全体に若干の遅れがある.EGFR-TKIによるオートファジー誘導は細胞保護的に機能し,これをマクロライド化合物で阻害することで膵癌細胞死を誘導でき,chemo-sensitizerとしてのマクロライドの臨床使用の可能性が示唆された.その細胞死増強は,ERストレス負荷によるアポトーシスを想定していたが,アポトーシスはほとんど観察されず,ネクロプトーシスが誘導された。マクロライドのオートファジー阻害活性における分子標的の同定ならびにオートファジー阻害によるネクロプトーシス誘導の分子基盤は今後の検討課題である.本研究では、gold/Cy3のナノ粒子(サイズ50-100nm)に抗epidermal growth factor receptor (EGFR:上皮成長因子受容体)抗体で修飾を行い、膵癌における細胞増殖抑制効果、オートファジー/アポトーシス誘導効果を観察し、そのオートファジー誘導の生物学的意義・シグナル伝達因子を解明し、より効率のよい治療法を確立することを目的に研究を行っている。本研究で用いるナノ粒子は治療および診断に利用することができ、暗視野顕微鏡/蛍光顕微鏡とMRIを用いることによって、細胞内への取り込みをリアルタイムに行うことが可能と思われる。本年度は、上記ナノ粒子を作成し、EGFRの発現/非発現の膵癌細胞株を用いて、細胞増殖抑制効果、さらにはナノ粒子の検出を暗視野顕微鏡/蛍光顕微鏡を用いて行っているが、ナノ粒子の不安定性があり、その再現性に関してやや難渋している。EGFRの発現した膵癌細胞においては上記ナノ粒子添加にて細胞増殖抑制効果を認めているが、ナノ粒子作成後経過の経ったナノ粒子ではその効果が失活してしまう場合があり、現在その安定性について検討を行っている。これまでのナノ粒子研究においても、これらの問題を克服してきたため、作成過程・保存状況の検討を行い克服する予定である。ナノ粒子の安定性を確認した後、申請時に予定していた上記ナノ粒子による細胞内シグナル伝達因子、オートファジー/アポトーシスの検出を行う予定である。これらの問題は想定内であり、本研究はほぼ予定通りに行われている。膵癌細胞株(PANC1,BxPC3,Capan1)においてEGFR-TKI(ゲフィチニブ:GEF)を添加培養することでオートファジーが誘導された。一方,マクロライド系抗生剤であるクラリスロマイシン(CAM),アジスロマイシン(AZM)や新規12員環マクロライド系化合物のEM900を膵癌細胞株に添加培養するとオートファジー後半部のプロセスが阻害され,細胞質内に数多くのオートファゴソーム/オートリソソームの蓄積が観察された。種々の濃度下でマクロライド3剤間のオートファジー阻害活性を比較すると,AZMが最も強く,EM900,CAMの順であった。これらマクロライドは単剤では細胞毒性をほとんど発現しないが, GEFと併用することでGEFに殺細胞効果を増強することが3剤全で観察された。これは,マクロライドのオートファジー阻害活性と相関し,AZM,EM900,CAMの順であった。以上より,GEFによるオートファジー誘導は細胞保護的(cytoprotective)に機能し,これをマクロライドで効率的に阻害することで膵癌細胞死を強力に誘導できると考えられ,EGFR-TKIの治療効果を上げる“chemo-sensitizer"としてのマクロライドの臨床使用の可能性が示唆された。興味深いことに,GEF/マクロライド併用による細胞死増強は,当初ERストレス負荷によるアポトーシスを想定していたが,アポトーシスはほとんど観察されず,ネクロプトーシス(necroptosis)が誘導された。マクロライドのオートファジー阻害活性の分子標的の同定ならびにオートファジー阻害によるネクロプトーシス誘導の分子基盤は今後の検討課題と考える。

尚,ナノ粒子を用いた研究に関しては,ナノ粒子の不安定性,データーの再現性を本研究期間内に解決する事ができず,プロジェクトの軌道修正を行った。本研究成果は現在,論文投稿準備中である。医歯薬学(消化器内科学)本研究においてナノ粒子の不安定性が解決されておらず,その作成過程や保存方法の見直しを行っているため.しかし,ナノ粒子の安定性確認後には予定通り研究が行えると思われる.本研究においてナノ粒子の不安定性が問題となり、その作成過程・保存方法に試行錯誤が必要となったため、申請時の研究内容からやや遅れを生じている。しかしながら、ナノ粒子の安定性が確認後には、予定通り研究を行えると思われる。ナノ粒子の安定性が確認されたら,それを用いて申請時の研究を引き続き行う予定である.ナノ粒子の安定性が確認されたら、現在やや遅れを生じている研究内容に取り掛かる予定である。ナノ粒子による細胞内シグナル伝達因子、オートファジー/アポトーシスの検出を行う予定である。申請時の研究の本幹となるナノ粒子の安定化が得られておらず,その安定化の試行錯誤にさらに研究費がかかるため.次年度は,引き続きナノ粒子の安定化を図るべく実験を行う.具体的にはこれまでの報告・研究内容より,ナノ粒子によって誘導されるオートファジー/アポトーシスの生物学的意義を明らかにする.すなわちオートファジーが細胞保護作用あるいは細胞死誘導として機能しているかを解明するために,オートファジー関連遺伝子(PTEN遺伝子を含む)をsiRNAによって発現抑制およびオートファジー阻害薬を用いることによって検討する.さらに膵癌細胞における既知のオートファジー誘導療法(BCL-2阻害薬など)および塩酸ゲムシタビンを併用することによって,細胞増殖抑制効果およびオートファジー誘導効果の相加・相乗効果について検討を行う.また,これら薬剤併用による細胞内へのナノ粒子の取り込み効果について検討を行い,引き続きより効率のよいナノ粒子との併用療法を確立する.次年度は、これまでの報告・研究内容より、ナノ粒子によって誘導されるオートファジー/アポトーシスの生物学的意義を明らかにするため,すなわちオートファジーが細胞保護的作用あるいは細胞死誘導として機能しているかを解明するために,オートファジー関連遺伝子(PTEN遺伝子を含む)をsiRNAによって発現抑制およびオートファジー阻害薬を用いることによって検討する.さらに,膵癌細胞における既知のオートファジー誘導療法(BCL-2阻害薬など)およびGEMを併用する事によって,細胞増殖抑制効果およびオートファジー誘導効果の相加・相乗効果について検討を行う.また,これら薬剤併用による細胞内へのナノ粒子の取り込み効果について検討を行い,より効率のよいナノ粒子との併用療法を確立する.
自然免疫を制御するシグナル伝達カスケードとネットワーク形成

ショウジョウバエでは、真菌とグラム陽性菌の感染によりToll経路が、グラム陰性菌と一部のグラム陽性菌の感染では、imd経路が活性化され、抗菌ペプチドが分泌される。これまで、いずれの経路においてもパターン認識受容体は同定されていなかった。本研究では、imd経路を選択的に活性化するパターン認識受容体PGRP-LEを同定し、PGRP-LEがimd経路を活性化するグラム陰性菌と一部のグラム陽性菌のDAP型ペプチドグリカンを認識し、Toll経路を活性化するグラム陽性菌のリシン型ペプチドグリカンは認識しないことを明らかにした。また、PGRP-LEがimd経路の活性化するだけでなく、体液中のフェノール酸化酵素(proPO)系を活性化することを明らかにした。その後、PGRP-LEのPGRPドメインが、DAP型ペプチドグリカンのモノマーに結合し、多量体化を引き起こすこと、PGRP-LEのN末端側に存在するRHIM-likeモチーフが、imd経路とproPO系の活性化に重要であることを明らかにした。加えて、PGRP-LEは、体液中でパターン認識受容体として機能するだけでなく、免疫応答細胞表面でのペプチドグリカンの認識に関わると共に、免疫応答細胞内でも機能する多機能性のパターン認識受容体であることを明らかにした。ヒトPGRPファミリーが、炎症を惹起することなく、感染防御を行う際に機能していることを示唆した。一方、落合らは、液性防御の要であるproPOカスケードの活性化機構の解明を目的として、新たな構成因子3種(βGRPII, GNBP, Factor S, Factor H)をカイコ血液から単離精製した。さらに、proPOカスケードの構成因子であるセリンプロテアーゼの活性型がpro-Spatzleに作用してSpatzleを生成すること証明し、proPOカスケードが途中から分岐して抗菌ペプチド産生経路に繋がっていることを初めて示唆した。高畑らは、PGRPは無脊椎動物では非常に頻繁に遺伝子の数を増減させているが、脊椎動物では比較的少ない数を安定的に維持していること、PGRPドメインの機能的重要性は脊椎動物と無脊椎動物で差がないこと、またPGRPドメイン以外ではさまざまな配列との組み合わせの存在が示唆され、このことがPGRPの様々な機能分化に影響を及ぼしていること、を明らかにした。生体防御機構は,個体に遺伝的に備えられている「自然免疫」と,異物の侵入によって獲得される「獲得免疫」に大別できる.獲得免疫が遺伝子の再構成を基に多様な異物を認識するのに対して,自然免疫ではゲノムにコードされた有限の因子でその多様性に対応しなければならない.ショウジョウバエ自然免疫における異物認識の機構は不明であったが,研究代表者が行った機能獲得型変異体スクリーニングにより,ペプチドグリカン認識タンパク質(PGRP)がDiptericin(Dip)の発現を誘導することを見出した.本研究では,PGRPとDipの発現に関わるImd経路とその転写因子Relishとの関わりを,突然変異体を用いて遺伝学的に解析した.その結果,PGRPはImd, Relishの上流で機能していることがわかった.さらに,PGRPファミリーの中でこのPGRPを選択的に発現しているショウジョウバエマクロファージ様細胞株を見出した.そして,この細胞株において,RNA-i法によりPGRPの発現抑制を行った.

その結果,PGRPがImd経路で活性化される自然免疫活性化に必須であることが明らかとなった.自然免疫は、全ての多細胞生物が有する感染防御システムであり、近年その重要性が認識され注目されている。本研究の目的は、これまでにその存在を明らかにした、2つの新規な自然免疫シグナル伝達カスケード、すなわち、PGRP-LEが介する抗菌ペプチド発現とproフェノールオキシダーゼ(PO)カスケードの活性化までの分子カスケードと、脂質メディエーターが介在するシグナル伝達系、の分子基盤を明らかにし、自然免疫カスケードの全貌(ネットワーク)の解明を目指すと共に、このようなネットワークがどのようにして構築されたのか、分子進化の面から解析することである。本年度は、(1)すでに全身性の免疫応答においては、PGRP-LEがimd経路を特異的に活性化して、抗細菌ペプチドDiptericin (Dip)の発現を誘導することを見出しているが、上皮性の免疫応答では、PGRP-LEは同じimd経路を活性化するものの、Dipではなく、抗真菌ペプチドDrosomycinの発現を誘導することを見出した。この結果は、全身性と上皮性の免疫応答において、同じシグナル伝達カスケードが異なる免疫応答を誘導することを示している(Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99,13705-13710.2002)。(2)脂質メディエーターが介在するシグナル伝達系がimd経路の活性化に必要であることが明らかとなった。これは、異なる自然免疫カスケードがネットワークを形成していることを示している(Biochem.J. 371,205-210,2003.)。これらの知見を基に、二つの特許出願を行った(出願日:平成14年(2002年)8月7日、出願番号:特願2002-23006、出願日:2002年10月4日、出願番号:特願2002-292976)。自然免疫は、全ての多細胞生物が有する感染防御システムであり、近年その重要性が認識され注目されている。本研究の目的は、2つの自然免疫シグナル伝達カスケード、すなわち、PGRP-LEが介する抗菌ペプチド発現誘導経路とproフェノールオキシダーゼ(PO)カスケードの活性化の分子基盤を明らかにし、自然免疫カスケードの全貌(ネットワーク)の解明を目指すことである。本年度は、PGRP-LEの欠損変異体を作成し、PGRP-LEが抗菌ペプチド産生誘導のimd経路の主要な調節因子であり、同じPGRPファミリーのPGRP-LCと機能的に相補することを明らかにした。さらに、PGRP-LEとPGRP-LCとの関係を解析したところ、PGRP-LEは部分的にPGRP-LCの上流で働き、さらに部分的にPGRP-LCとパラレルに存在する経路で作用することがわかった。このことから、PGRP-LEの下流に存在し、PGRP-LCとパラレルに働く細胞膜受容体が存在することが示唆された。そこで、PGRP-LEが実際に体液中に存在するかどうかPGRP-LEの抗体を作成し調べた結果、PGRP-LEが体液中に常在する分子であることが明らかとなった。
不連続性を生み出す機構としての染色体進化

まず、全ゲノムリシークエンス配列に基づいて、site frequency spectrumを利用して集団の履歴を推定した。淡水進出年代を推定し、淡水進出年代と遺伝子流動率の異なる複数の集団が確認できた。同じ全ゲノム配列を利用して、ゲノム分化の程度やロングハロタイプ解析などのゲノムスキャンを実施し、適応進化に重要であったと推測されたゲノム領域も同定できた。この領域のうち、異なる淡水集団間で重複しているもの、各集団でユニークなものを同定した。また、ゲノム分化と組換え率に有意な相関が見られるなど、予想通りの結果も得られた。これらの成果のみでも既に論文化が十分な内容であるが、さらにデータを加えるべく、連鎖地図作成とQTL解析、Pacbioシークエンスもいくつかの淡水集団については実施完成した。残りの集団の解析に必要な家系もすでに確立した。当初の計画通り、ゲノムスキャンと集団履歴の解析は既に完了し、一部の交配家系の連鎖地図作成とQTL解析も完成している。残りの解析に必要な材料もすでに調達できていることから。連鎖地図作成とQTL解析を残りの集団について完了する。また、残りの集団についても、染色体構造変化について、PacbioやHi-Cなどを利用して明らかにし、これら成果をまとめて論文執筆に持っていく。生物に見られる重要な特徴の一つは、連続性から不連続性が生まれ、それが維持される現象である。換言すると、生物が多様化しつつ、均一なものへとマージしてしまわない仕組みの解明が、生命の理解に必須である。淡水化年代、及び、海型イトヨとの交雑率の異なるような複数の淡水型イトヨ集団を用いて以下の問いを明らかにする。交雑のある集団では、染色体構造変化が進化しやすいのか?また、染色体構造変化が適応的分化に重要なのか?本年度は、日本の淡水集団の複数について、複数個体の全ゲノム解読を実施した。また、海型と淡水型の交配家系を作出した。一部の既作出の家系については、QTL解析を開始した。クロマチン構造解析の条件検討も行った。当初の予定通り、必要な全ゲノム配列を得ることができた。また、解析に必要な交配家系も確立できたから。クロマチン構造解析の条件検討もできたから。全ゲノム配列より過去のデモグラフィーを推定するとともに、淡水型のゲノムにかかった選択圧を明らかにする。交配家系を利用して連鎖地図を作出し、QTL解析を実施する。また、クロマチン構造解析を実施する。具体的には、全ゲノムデータからアリルスペクトラム分析を利用して淡水化年代の推定と同時に、海型との遺伝子流動の有無を解析する。また、QTL解析のために、F2個体の各組織のRNA精製を行うとともに、体型の幾何学的解析を行う。また、RAD解析によってF2個体の連鎖地図を作出し、組換え抑制領域の有無を調べるとともに、当該領域にQTLが集積するかなどを解析する。また、既に得られているHi-Cデータを解析する。生きた魚を実験に用いる以上、年度末に実験を実施するべきか、あるいは、年度明け早々に実験を実施するべきかは、魚の育成具合をみて判断せねばならず、1ー2週間の精度で実験計画を正確に予測するのは困難である。この残高は、魚の育成具合に応じて必要となる試料調整のための消耗品に当てることを目的として準備していたものであるが、魚の育成状況から年度明け早々に実験を実施する方が好ましいと判断されたため残高が出ることなった。翌年度への繰越額は少額であり、新年度早々にものであり、当初の計画に大きな変更を加えるものでは全くない。飼育生物の成長が予測よりも若干遅く、年度末に実験を実施するよりも次年度早々に実施した方がよいと判断されたため。20,464円の残高は、次年度に使用する酵素類に使用する。研究内容自体の変更を伴うものではない。
遺伝子相補性試験によるクラミドモナスのチャンネル遺伝子の単離と解析

細胞の物質代謝にはいろいろな種類のトランスポーターが関与している。本研究では前年度の研究により得られたクラミドモナスのリン酸トランスポーターの遺伝子の解析を行った。カリウムトランスポーターのノックアウト大腸菌をレスキューする遺伝子として単利されてきたcDNAは部分配列であったので5'RAXCEにより全長を決定した。全体として625アミノ酸の分子量約67KDaの蛋白であった。この配列を元に遺伝子データベースを検索したところクラミドモナスのESTライブラリに約80%の相同性のある遺伝子が登録されていることが分かった。これが、使っているstrainの違いによるかどうかをRT-PCRにより検討したところ、現在我々が使っているstrainには両方の遺伝子があることが判明した。そこで、ESTに登録されている5'側の配列を元に3'RACEにより第2の遺伝子の全長(600アミノ酸)を決定した。これら2つの遺伝子はともにナトリウム駆動性のリン酸トランスポーターと相同性が高く、プロトン駆動性のリン酸トランスポーターとは相同性が低かった。一般に植物ではナトリウム駆動性のリン酸トランスポーターの存在を疑問視されていることから、原生生物で葉緑体があるクラミドモナスがナトリウム駆動性のリン酸トランスポーターを持っていることは進化を考える上で興味深い。今回同定できたリン酸トランスポーターの発現様式を調べたところ、リン酸欠乏培地にクラミドモナスを移すとmRNA量が約8時間後に約8倍に増えることが分かった。従って、機能的にも活性のあるリン酸トランスポーターであろうと推論できた。細胞の浸透圧調節、体積調節には多くのチャンネルやトランスポーターが関与している。本研究ではこれらの膜タンパクをクラミドモナスを用いて遺伝子レベルで明らかにすることを目的とする。そのためにクラミドモナスのcDNAライブラリーを用い、その中から浸透圧調節ができない大腸菌の株をrescueする遺伝子を単離した。クラミドモナスcDNAのプラスミドライブラリーを用いて大腸菌のカリウム輸送系のノックアウト株を形質転換した。用いる株はTK2463でTrkA,Kdp,Kupの既知のすべてのカリウム輸送系がノックアウトされている株である。この株は40mM以上のカリウム濃度の培地でないと育成できない。形質転換した細胞を低カリウム濃度の培地にまき、増殖可能なコロニーを約70単離した。これらのクローンの遺伝子配列を決定した結果、クラミドモナスでは既報告の遺伝子3クローン、未報告の遺伝子28クローンを得た。未報告の遺伝子をホモロジーで検索したところ10クローンは全く類似の遺伝子がなかったが、11クローンはリボゾームタンパク、2クローンはDNA結合タンパク、さらに、注目すべきことにリン酸トランスポーターと思われる遺伝子が1クローン含まれていた。これは酵母ではPho89と似ていて、ナトリウム依存性高アフィニティタイプのリン酸トランスポーターと推測される。動物などではこのタイプのリン酸トランスポーターの研究は進んでいるが、原生生物や植物では存在するまだ疑問視されている。従って、この新しく単離したリン酸トランスポーターがクラミドモナスでどのような生理的意味を持つかはとても興味深い。今後はこの遺伝子産物の発現、トランスポーターとしての活性などを調べる予定である。
ヘテロクロマチンにおけるＤＮＡ修復メカニズムの解明

新規DNA損傷応答タンパク質SCAI/HPB66が53BP1のCDKによるリン酸化(リン酸化S/T-P site)を認識して結合し、DNA損傷部位集積していることを示した。また、SCAI/HPB66ノックダウンによる影響を調べたところ、Homologous recombination (HR)に関わる重要なタンパク質郡のDNA損傷への集積が顕著に減退することが分かった。HRの効率をレポーターアッセイ系で評価したところ、SCAI/HPB66ノックダウンによりHRが抑制されていることが明らかとなった。2013年、53BP1のATMによるリン酸化(リン酸化S/T-Q site)に結合するタンパク質としてRif1が同定され、HRに抑制的に働いていることが報告された。SCAIとRif1の関係を調べてみると、認識する53BP1のリン酸化サイト、制御しているリン酸化酵素が異なること、SCAIとRif1の53BP1の結合領域が同じであること、Rif1ノックダウン細胞ではSCAIと53BP1の結合が強くなることが分かった。これらの結果から、SCAIとRif1は排他的に53BP1と結合し、SCAIはRif1のHR抑制機能を更に阻害することでHRを促進していることが考えられた。実際、HR進行に重要なタンパク質の集積の減退は、SCAI, Rif1ダブルノックダウンの細胞では見られなくHR進行が回復した。また、Rif1に結合するタンパク質として脱リン酸化酵素PP1が知られており、我々のRif1のプロテオミクスの解析からもRif1結合タンパク質としてPP1が同定された。PP1はRif1依存的にDNA損傷部位に集積すること、PP1阻害剤を添加すると、BRCA1の集積が増加することから、PP1とDNA損傷に関しても新たな展望が得られそうである。以上の研究結果を論文にし、現在投稿中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、RNA千歩法を用いて新規HP1結合タンパク質HPB66のDNA損傷部位集積には、DNA損傷応答パスウェイにおいて重要な働きを示す53BP1に依存していることを示した。また、HPB66ノックダウンによる影響を調べたところ、53BP1のDNA損傷への集積は遅延が見られるが、時間経過とともに集積すること、Homologous recombination (HR)に関わる重要なタンパク質BRCA1、Rad51のDNA損傷への集積が顕著に減退すること、HPB66ノックダウン細胞は放射線感受性を示すことを明らかとした。HPB66と53BP1の相互作用を免疫沈降法とウエスタンブロッティングを用いて解析したところ、放射線照射依存的にHPB66と53BP1は結合が強くなるが、ATMキナーゼによるリン酸化と独立であること、細胞周期同調した細胞を用いると、M期に結合が強くなることが分かった。ヘテロクロマチンタンパク質HP1、HBAT1、HPB66の相互作用を免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法を用いて解析したところ、HBAT1は2つのHP1結合モチーフと、約50アミノ酸のHPB66結合領域を持つことを明らかにした。また、HBAT1はDNA結合モチーフを持ち、これらの結合を破壊した変異体を用いて解析したところ、HBAT1のペリセントロメア局在はHP1に依存し、HPB66結合とは独立であること、DNA結合モチーフを欠損するとペリセントロメア局在が増加して観察されることが分かった。これらの結果からHBAT1はHP1結合を介してヘテロクロマチンに局在し、SCAIと結合することでDNA修復に寄与していることが想定される。

26年度が最終年度であるため、記入しない。ヘテロクロマチンにおけるDNA修復メカニズムから少し研究内容が外れてきているが、新規HP1結合タンパク質HPB66、HBAT1の機能解析が進み、特にHPB66がDNA損傷にどのように関わっているかが明らかになりつつあると思われるため。53BP1はDNA二重鎖切断修復経路のスイッチングに関わると現在考えられており、53BP1と結合するHPB66もスイッチングに関わると想定される結果が得られている。そのため、修復経路のHRまたはnon-homologous recombinationのレポーターアッセイ、sister chromatid exchangeやtelomefe fusionなどの染色体観察によりHPB66がスイッチングに関わることを明らかとして論文の形式にまとめる。
微生物増殖速度を制御因子とする生物系廃棄物コンポスト化法の確立

基質濃度や、菌体濃度が測定可能な系や、比較的基質濃度の変化が測定されやすい活性汚泥プロセスなどの溶液反応においては微生物の動力学的検討が数多くなされ、測定データの蓄積がある。しかし、コンポスト化のような固体反応においてはその直接測定が困難であることが影響し、動力学的検討はされにくく、活性汚泥法による比増殖速度のデータをそのまま用いているものが多く、その値は0.013から0.17(1/h)である。筆者らが断熱条件下で詳細にコンポスト化反応速度を検討した結果、比増殖速度が従来の10倍以上に相当する1.7(1/h)にも達する能力を持ち合わせていた。この能力を引き出す最適環境として、試料含水率約55%w.b.があげられる。これは試料固体周囲に付着する水膜厚さによる酸素供給速度の支配と微生物活性に及ぼす水分ポテンシャルの両因子の結果である(農業機械学会誌投稿中)。水膜厚さは材料固有の表面積に、水ポテンシャルは水分特性に左右されるため、これのデータをいろいろな材料を対象として収集する必要がある。また水分状態を、より一般化するためには重量含水率による表示ではなく、水膜と水分ポテンシャルによる関数化が必要である。最適環境としての酸素濃度、菌種等は現在研究を継続中である。
コレステロール－胆汁酸代謝に着目した非アルコール性脂肪肝炎の食事療法の開発

肝臓におけるコレステロールー胆汁酸代謝の何らかの障害が非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の発症に関与していると考え、それを正常化してNASHを予防・治療することを目的として研究を行っている。2017年度にはオウバクおよびその主成分であるベルベリンが肝臓のコレステロール蓄積を抑制する作用を有することを見出した。本年度の研究成果は以下の通りである。1)コレステロール代謝経路に対するオウバクの作用点の解析:オウバク投与群において肝臓コレステロール含量が低値を示したことから代謝に関わる因子を網羅的にReal-time PCRで解析した結果、肝臓のコレステロール排出因子が増加したなどといった結果は得られず、代謝経路へのオウバクの作用は明らかにできなかった。2)肝臓の病理学的解析:NASH病態コントロール群の肝臓では肝実質細胞の間に明るく大きな細胞がみられ、それは脂質を貪食したマクロファージの集簇像であることがわかった。その数はオウバク投与群で少なく、これがオウバクによる肝臓のコレステロール低下作用に関連している可能性を考え、現在解析を行っている。3)オウバクの肝線維化に対する作用の検討:NASHを発症した肝臓ではマクロファージの活性化を含む慢性的な炎症によって線維化を発症することが知られている。オウバクがマクロファージに何らかの影響を及ぼしていることが示唆されたため、NASHより重篤な病態である肝線維化に対するオウバクの作用も検討するため、食餌によって誘導される肝線維化モデル動物を開発した。病理組織学的解析によりオウバクによる肝臓への作用はマクロファージを介している可能性が示唆された。これによりオウバクの作用は肝臓への脂肪変性や炎症のみならず、より重篤な病態である肝線維化をも抑制できることが期待され、当初の計画では予定していなかった肝線維化モデルに対するオウバクの効果の検証をするため、モデル動物の確立を同時に行った。NASHおよび肝線維化に対するオウバクの作用機序を病理学的および生化学的手法を用いて詳細に解析する。また、オウバクの効能を最大に引き出すための濃度や投与形態などをNASH線維化モデル動物を用いて検討する。肝臓におけるコレステロールー胆汁酸代謝の何らかの障害が非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の発症に関与していると考え、それを正常化してNASHを予防・治療することを目的として研究を行った。1)コレステロールおよび胆汁酸代謝促進作用を有する食品の探索:まず、文献的探索を行い、食品・医薬品として用いられる天然成分から、漢方薬の成分やアミノ酸、食物繊維などを代謝促進の候補物質として挙げた。そのうち、生薬として知られるオウバクを食餌によって誘導した非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)モデルマウスに投与したところ、肝臓中のコレステロール量の低下が確認された。コレステロール代謝に関与する遺伝子(ABCG5/8やCyp7a1など)の発現をreal-time PCRによって解析したところ、有意な変化はみられなかった。オウバクが肝臓のコレステロール量を低下させる物質であるとしてその成分に注目することとした。2)オウバクに含まれる成分による肝臓脂質代謝への影響の検討:オウバクの主成分としてベルベリンやリモニンなどが挙げられる。高脂肪食誘導性NASHモデルマウスにベルベリンを摂取させたところ、非投与群に比べて肝臓コレステロール量低値、血清ALT低値、ならびに組織学的に肝脂肪化の改善がみられたことから、オウバクに含まれる成分のうちベルベリンが肝臓のコレステロール代謝の改善作用を有することが示唆された。肝臓の組織学的所見の変化やベルベリンの詳細な作用機序について、現在解析を行っている。本年度の目標はコレステロールおよび胆汁酸の代謝に関与する食品成分を明らかにすることであった。オウバクおよびその主要成分のベルベリンがコレステロール代謝を促進する可能性を示せたため、次年度にはその成分の詳細な生理作用機序を検討することが可能となった。

これによりオウバクの作用は肝臓への脂肪変性や炎症のみならず、より重篤な病態である肝線維化をも抑制できることが期待され、当初の計画では予定していなかった肝線維化モデルに対するオウバクの効果の検証をするため、モデル動物の確立を同時に行った。生体においてコレステロールは、取り込み、合成、排出、胆汁酸への異化によってその濃度が制御されている。ベルベリンには肝臓のコレステロール低下作用がみられたため、今後はその詳細な作用を探るため、肝臓等で代謝に関連する遺伝子やタンパク質の発現を解析する。また、NASHに対する予防・治療効果を明らかにするため、適切なNASHモデル動物を用いて、投与濃度の検証を行っていく。NASHおよび肝線維化に対するオウバクの作用機序を病理学的および生化学的手法を用いて詳細に解析する。また、オウバクの効能を最大に引き出すための濃度や投与形態などをNASH線維化モデル動物を用いて検討する。コレステロールおよび胆汁酸代謝を改変しうる作用を有する食品(成分)をスクリーニングする際、当初予想していたよりも少ない種類の食品のうちから当該成分を見つけることができた。よって、動物や飼料等の飼育に係る費用が少なく済んだため、次年度に繰り越すこととした。次年度には、本研究成果をまとめて発表するための費用および消耗品の購入に繰り越し額を充てることとする。(理由)3月に納品となり、支払いが完了していないため。(計画)4月に支払いが完了する予定である。
競争とオプションに基づく設備投資・事業撤退の実証分析

本研究は設備投資行動の解明である。投資に含まれるリアルオプションや、財・資本市場の影響などのファイナンス分野の近年の研究を考慮して投資のミクロ的基礎付けを再度模索し、従来の設備投資の推定方程式の改良につながる検討を進め、より精度の高い推定結果を提示することが目的である。前年度に設備投資のミクロ理論を見直し再定義する理論研究やその関連の実証結果のレビューを進めた結果、当初の分析計画では不完全競争下のリアルオプションを投資の最適化の主たるモデルとして考えていたが、ファイナンス並びに会計学の分野から、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えうることが強く指摘されてきており、その研究報告は国際的に大きな増加傾向にあることが判明した。近年のファイナンス・会計学分野の理論及び実証研究では、企業の投資プロジェクトが生む収益に対する予想に経営陣の認知バイアス(overconfidence)が存在する場合、それは企業価値最大化の観点からみて非効率な投資を導き、また肯定的な収益情報と否定的な同情報とを非対称に扱う保守的会計方針(Conservative accounting, Timelyloss recognition)により、投資の効率が逆に改善することを主張する。ミクロデータによるその実証分析は国際的に増加しており、多くの先行研究からそれが設備投資と撤退に及ぼす影響が確認される。前年度は、リアルオプションに加え、経営陣の認知バイアスと会計方針選択とを本分析に導入し、投資行動の実証研究を行った。研究実績の概要に記載した通り、前年度に本研究に関連する設備投資の理論研究と実証結果のレビューにより、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えることを指摘する研究が欧米を中心に急速に増加していることが判明した。多数の先行研究において、企業の経営陣がその投資収益の予想にバイアスを持つ場合、それは企業価値最大化を損なう非効率な投資を導く可能性を生み、その逆に、企業が投資の実現収益に関する肯定情報と否定情報とを非対称に扱う保守的会計方針を採用する場合、それは投資の効率性を改善させる効果を持つという主張を確認できる。本年度の研究では日本の上場企業の財務データ、経営陣の特性データなど必要なミクロデータを用意して、現段階では設備投資に絞り、その効率性に関する実証分析を行った。以上の通り、先行研究のレビューから十分な成果を得たとともに実証分析では良好な結果を得ており、本研究は概ね順調に進んでいる。具体的には、前年度に日本政策銀行『企業財務データバンク』(上場企業有価証券報告書財務データを数値ファイルにしたCDROM)を購入し、実証分析作業を開始した。ただし、経営陣の認知バイアスを表す指標として、本分析では決算短信などの業績予想データを利用する必要があり、そのデータの入手を日本政策投資銀行設備投資研究所の中村純一氏に依頼し、中村氏との共同研究名義で論文を執筆した。執筆論文は日本金融学会での報告とSSRNへの掲載を済ませ、現在、国際ジャーナル誌への投稿を準備中である。上述の通り、企業のミクロデータによる設備投資の実証研究について、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えることが先行論文では指摘されており、その研究報告は国際的に大きな増加傾向にある。具体的には、企業の経営陣がその投資収益の予想にバイアスを持つ場合、それは企業価値最大化を損なう非効率な投資を導きうるとともに、また他方では、企業が投資の実現収益に関する肯定情報と否定情報とを非対称に扱う保守的会計方針を採用するなど会計方針の選択によって投資の効率性が改善する可能性が近年主張されてきた。特に経営陣の認知バイアスはリアルオプションの行使に影響しうると予見できる。以上の点は当初の研究計画では捉えていなかった特性であり、新たな研究テーマとして導入し研究計画を修正した。本研究では、以上の国際的な研究動向に着目し、リアルオプションによる効果とともに、経営陣の特性、会計方針の選択が設備投資と撤退に与える効果の実証分析を進めてゆく。今年度の実証研究では設備投資に絞ったミクロ分析を行い、国際査読誌への投稿作業へと進めたが、次年度はリアルオプション効果、経営属性、そして会計方針選択の影響を考慮した投資効率の問題に焦点を当て、撤退に関する実証分析モデルとそれに必要なデータの調査を進めてゆく。本研究は企業レベルのデータを利用した設備投資と撤退の解明であり、投資価値に包含されるリアルオプション、不完全競争状態を前提とした市場構造の影響など、近年のファイナンス分野の理論研究を考慮して企業の投資行動を再びミクロ的に基礎付け、従来の実証分析モデルの改良とその推定結果とを提示することが目的である。本年度の実施計画は実証分析モデルの提示に向けた準備であり、最近のファイナンス理論に基づく設備投資モデルの先行研究のレビューを広範に行い、従来の設備投資の推定方程式の改良につながる検討を進めた。ただし、近年の設備投資のミクロ理論を見直し再定義する理論研究やその関連の実証結果のレビューを進めた結果、当初の分析計画では不完全競争下のリアルオプションを投資の最適化の主たるモデルとして考えていたが、ファイナンス並びに会計学の分野から、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えうることが指摘されており、その研究報告は国際的に大きな増加傾向にあることが判明した。近年のファイナンス・会計学分野の理論及び実証研究では、企業の投資プロジェクトが生む収益に対する予想に経営者の認知バイアスが存在する場合、それは企業価値最大化の観点からみて非効率な投資を導き、また肯定的な収益情報と否定的な同情報とを非対称に扱う保守的会計方針(Conservative accounting, Timely loss recognition)により、投資の効率が逆に改善することを主張する。

ミクロデータによるその実証分析は国際的に増加しており、多くの先行研究からそれが設備投資と撤退に及ぼす影響が確認される。この研究課題は日本のデータを用いた分析が少なく、その実証結果の提示は意義がある。よって当初の計画を修正し、リアルオプションに加え、経営認知バイアス、会計方針選択も本研究分析に導入する。「研究実績の概要」に記載した通り、本申請課題に関連する設備投資の理論研究や実証結果のレビューを進めた結果、本研究申請の当初では考慮が欠けていた分析方法を発見でき、大きな成果を得ることができた。具体的には本年度のレビューにより、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えうることが先行研究で指摘されており、その研究報告は国際的に大きな増加傾向にあると判明した。多くの先行研究から、企業の経営陣がその投資収益の予想にバイアスを持つ場合、それは企業価値最大化を損なう非効率な投資を導く可能性を生み、その逆に、企業が投資の実現収益に関する肯定情報と否定情報とを非対称に扱う保守的会計方針を採用する場合、それは投資の効率性を改善させる効果を持ちうることが主張される。以上に関連するミクロデータを利用した実証分析の国際的な増加をうけ、本研究は上場企業の財務データ、経営陣の特性データなど必要なミクロデータを準備して、次年度から設備投資と撤退の効率性に関する実証分析を行う予定である。本年度に日本政策銀行『企業財務データバンク』(上場企業有価証券報告書財務データを数値ファイルにしたCDROM)を購入し、次年度の実証分析の前段階で必要となる変数の作成、同様に分析サンプルから異常値を取り除く作業などを開始した。以上の通り、先行研究のレビューから十分な成果を得たとともに、分析データの準備作業についても概ね順調に進んでいる。本研究は設備投資行動の解明である。投資に含まれるリアルオプションや、財・資本市場の影響などのファイナンス分野の近年の研究を考慮して投資のミクロ的基礎付けを再度模索し、従来の設備投資の推定方程式の改良につながる検討を進め、より精度の高い推定結果を提示することが目的である。前年度に設備投資のミクロ理論を見直し再定義する理論研究やその関連の実証結果のレビューを進めた結果、当初の分析計画では不完全競争下のリアルオプションを投資の最適化の主たるモデルとして考えていたが、ファイナンス並びに会計学の分野から、企業の経営陣の属性、採用する会計方針が設備投資量に大きなバイアスを与えうることが強く指摘されてきており、その研究報告は国際的に大きな増加傾向にあることが判明した。
バイオマスの変換プロセスに適した木材糖化効率を高める白色腐朽菌の分子育種

担子菌類(きのこの仲間)のリグニン分解能力を利用して木質バイオマスの変換利用の際に障害となる高分子リグニンを分解除去する系は、常温常圧で反応が進み環境へのインパクトが少ない点が特徴である。担子菌の中でも白色腐朽菌類は、一般に菌体外に分泌するラッカーゼやペルオキシダーゼによって初発される連鎖的ラジカル反応によって、高分子リグニンの低分子化を促し、これによって生成する多様な芳香族有機化合物を分解・資化するとされている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、木材糖化能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、高分子リグニンをも直接分解することが可能な多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離し、本菌において多機能型ペルオキシダーゼの高発現を確認し、続いて難分解性環境汚染物質であるベンゾaピレンの分解を行って、野生型の数倍の除去能を獲得していることを明らかにした。また、野生型がMnP2を生産しない条件下でも、著量のMnP2を発現する条件を振蕩培養を用いた系で確立した。さらに本酵素の高分子基質との反応性における構造機能相関の解明を目的として、部位特異的変異導入によるアミノ酸置換変異体の解析を行って、本酵素のユニークな特徴である高分子基質との反応部位の特定、反応部位周辺部のアミノ酸の基質特異性決定への関与、野生型よりも高分子基質酸化能力が増強されたスーパー酵素の単離、に成功した。また、担子菌類における遺伝子破壊系の構築を目指して、ヒラタケから非相同末端結合系のKu70タンパク質をコードする遺伝子を単離し、解析を行った。担子菌の中でも白色腐朽菌類は、一般に菌体外に分泌するラフカーゼやペルオキシダーゼによって初発される連鎖的ラジカル反応によって、高分子リグニンの低分子化を促し、これによって生成する多様な芳香族有機化合物を分解・資化するとされている。このため、硫酸や塩基置換性の芳香族化合物など、他のシステムに置ける問題点をクリアできることが知られている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、木材糖化能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、高分子リグニンをも直接分解することが可能な多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離し、分解能が高められた株のスクリーニングを行った。ヒラタケのmnp2遺伝子を単離して、これまでに作成されたsdi1遺伝子の発現シグナルを有する組換えプラスミドpTM1上で、制限酵素的にコード領域の置き換えを行って組換えプラスミドpIpM2gの構築を行った。この発現プラスミドをP.ostreatusに導入するため、カルボキシン耐性マーカープラスミドpTM1との共形質転換を行い、カルボキシン2μg/mlを含む再生培地上でコロニーを作る形質転換体を単離した。これらの形質転換株に対しPCR法による検出を行い、mnp2発現プラスミドpIpM2gも導入された共形質転換株を多数単離した。

このようにして得られた株を用いて、培地中に高分子色素PolyR-478を含む培養条件下で多機能型ペルオキシダーゼの生産能についてスクリーニングしたところ、野生型がMnP2を生産しない条件下でも、著量のMnP2を発現する組換え体が複数見つかった。担子菌類(きのこの仲間)のリグニン分解能力を利用して木質バイオマスの変換利用の際に障害となる高分子リグニンを分解除去する系は、常温常圧で反応が進み環境へのインパクトが少ない点が特徴である。担子菌の中でも白色腐朽菌類は、一般に菌体外に分泌するラッカーゼやペルオキシダーゼによって初発される連鎖的ラジカル反応によって、高分子リグニンの低分子化を促し、これによって生成する多様な芳香族有機化合物を分解・資化するとされている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、木材糖化能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、これまでに高分子リグニンをも直接分解することが可能な多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離に成功している。本年度は、まず組換え体においてリグニン分解系が強化されていることを確認する目的で、多機能型ペルオキシダーゼの高発現を確認し、続いて難分解性環境汚染物質であるベンゾaピレンの分解を行って、野生型の数倍の除去能を獲得していることを明らかにした。さらに様々な培養条件で、多機能型ペルオキシダーゼの生産性についてスクリーニングしたところ、野生型がMnP2を生産しない条件下でも、著量のMnP2を発現する条件を振蕩培養を用いた系で確立した。このことは、ヒラタケが本来持っている野生型の酵素の発現が無い条件下で、組換え体のみを大量に調整できる培養条件を見つけたことを意味し、多機能型ペルオキシダーゼの部位特異的変異導入による構造機能相関解析を可能にするものである。一方、担子菌類における遺伝子ターゲッティング系の開発を目指して、相同組換えの頻度に影響を与えるKu70遺伝子のクローニングに着手し、他の生物旬の保存配列から設計したプライマーでヒラタケから本遺伝子の一部配列をクローン化することに成功した。この配列は担子菌類から初めての、Ku70のクローニングを意味し、現在引き続き全長配列の取得を試みている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、木材糖化能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、これまでに高分子リグニンをも直接分解することが可能な多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離し、本菌において多機能型ペルオキシダーゼの高発現を確認し、続いて難分解性環境汚染物質であるベンゾaピレンの分解を行って、野生型の数倍の除去能を獲得していることを明らかにした。さらに野生型がMnP2を生産しない条件下でも、著量のMnP2を発現する条件を振蕩培養を用いた系で確立した。
インド仏教哲学文献のネットワーク型テクスト・データベースの構築

ネットワーク上に研究分野の核となる原典テクストのデータベースを中心にして様々な関連情報を集積するシステムを構築して、当該テクストに関連した研究を営む全ての人にとって利用可能なものしてそれを公開する「ネットワーク型テクスト・データベース」の構築を試み、今後の文献学一般におけるコンピュータ利用の一つの可能性を模索しようというのが本研究の目的であった。具体的には、インド仏教哲学文献の一つPrajnakaraguptaのPramanavarttikalamkaraを取り上げた。昨年度の基礎的検討を踏まえ、今年度はサンプルとしてPramanavarttikalamkara第3章「他者のための推理」の冒頭部分(Pramanavarttika第4章の第1偈から第12偈前半に対する註釈部分)をとりあげ、その部分に関してサンスクリット原典テクスト、チベット訳、ジャヤンタとヤマーリのチベット訳註釈、デーヴェーンドラブッディとマノーラタナンディンの同じ箇所に対する註釈を校訂・入力し、それらのテクスト間の関連づけを行い、ネットワーク型テクスト・データベースの構築作業を行った。その際、作業領域をWebサイト上に設定し、他の研究分担者の作業を容易に行えるようにした。そのサイトは、サンプルとして近日中に研究者間に公開の予定である。この間、小野と稲見は、各々Pramanavarttikalamkaraの第2章と第3章の二つの箇所を中心に、テクスト校訂・翻訳と、註釈の解読研究に携わった。佐久間はPrajnakaraguptaにおける唯識思想的要素を抽出を行った。吉水はチベット撰述文献の中からPrajnakaraguptaの思想を主題的に取り上げている文献を収集した。宇野はジャイナ文献におけるPramanavarttikalamkaraの引用を収集する作業を包括的に行い、関連文献のリストを作成した。ネットワーク上に研究分野の核となるテクストのデータベースを中心にして様々な関連情報を集積するシステムを構築して、そのテクストに関連した研究を営む全ての人にとって利用可能なものしてそれを公開する「ネットワーク型のテクスト・データベース」の構築を試み、今後の文献学一般におけるコンピュータ利用の一つの可能性を模索しようというのが本研究の目的であった。具体的には、インド仏教哲学文献の一つPrajnakaraguptaのPramavarttikalamkaraを取り上げた。今年度はまず、ネットワーク型データベースの包含すべきテクスト群、関連文献群の妥当な範囲を設定し、また同データベースにもたせるべき機能を、有用性、準備状況、実現性(時間的および技術的観点からの)に鑑みて総合的に検討した。小野と永崎を中心に、他の研究分担者とも連絡を取りながら、データベース構築作業を行う場としての暫定的データベースをWebサイト上に設定し、同時にさまざまな作業のマクロ化を行い、また他の研究分担者・研究協力者への作業のティーチングを行う準備を遂行した。この間、他の研究分担者・研究協力者は、暫定的データベースの適正化、校正作業に携わった。小野、稲見は、それぞれPramanavarttikalamkaraの第3章、第2章を中心に、テクスト校訂、翻訳と、註釈の解読研究に携わった。佐久間はPrajnakaraguptaにおける唯識思想的要素を抽出の作業に着手した。吉水はチベット撰述文献の中からPrajnakaraguptaの思想を主題的に取り上げている文献を収集にあたった。宇野は8-12世紀頃のジャイナ文献におけるPramanavarttikalamkaraの引用を収集する作業を包括的に行った。
突然変異mtDNAを用いたミトコンドリア間機能的相互作用の証明

本年度は、ミトコンドリア間の相互作用にはミトコンドリア同士の融合が必須であることを作業仮説とし、ミトコンドリア融合因子(Fzo:2つのアイソフォームが存在し、それぞれをFzo1,Fzo2とする)がミトコンドリア間相互作用に与える影響について検証した。まず、ミトコンドリア間相互作用を検証するためモデル細胞として、mtDNAに異なる点突然変異を持ったヒト培養細胞(mtDNA3243番点突然変異とmtDNA4269番点突然変異をそれぞれ導入した2つの細胞株)を樹立し、それぞれの細胞におけるFzo1とFzo2の発現量をRT-PCRによって比較した。その結果、両細胞におけるFzoアイソフォームの発現量に違いは見られなかった。また、突然変異型mtDNAを含まないヒト培養細胞と比較しても、その発現量に大きな違いは見られなかった。これらの結果は、ミトコンドリア呼吸機能の異常に関わらず、細胞内のミトコンドリアは活発に融合していることを示唆している。次に、mtDNA3243番点突然変異とmtDNA4269番点突然変異をそれぞれ導入した2つの細胞株を融合させ、ハイブリット細胞を得た。このハイブリッド細胞の細胞質では、ミトコンドリア融合を介して機能を失っていた遺伝産物を交換できるため、おのおのの突然変異によって消失していた呼吸活性が回復する。この時のミトコンドリアの微細形態を観察すると、ミトコンドリア間で連結した構造が観察された。これは、ミトコンドリアの融合はエンドサイトーシスやエクソサイトーシスのような大規模な膜融合ではなく、連結構造を発達させ、遺伝子産物を交換している可能性を示唆している。現在、このような構造にFzo1とFzo2が特異的に局在しているか否か、さらに、Fzo1とFzo2をノックダウンしたハイブリッド細胞を作製し、ミトコンドリア呼吸機能の回復を阻害できるか否かを検討している。欠失突然変異ミトコンドリアDNA(mtDNA)を導入したマウス(Nakada et al.,Nature Medicine)と異なる点突然変異mtDNAsを導入した2種のヒト培養細胞株(Ono et al.,Nature Genetics)を用いて、単一細胞内に含まれる個々のミトコンドリアは互いの遺伝子産物を交換し、突然変異によって失われていた機能を相補し合うという「ミトコンドリア間相互作用」の存在を証明する事ができた。特に、このミトコンドリア間相互作用は、ヒトのmtDNA突然変異によって発症するミトコンドリア病における病態発症を調節している基本機構である事も明らかにする事ができた(Nakada et al.,Nature Medicine;Biochem.Biophys.Res.Commun.)。更に、このミトコンドリア間相互作用の証明によって、ミトコンドリア病の遺伝子治療法の開発に着手する環境が整ったと言える。即ち、欠失突然変異mtDNAを導入したマウスの受精卵に、突然変異によって失われたmtDNA領域を組み込んだレスキューDNAを持つミトコンドリアを導入すれば、ミトコンドリア間相互作用によって、失われていた機能が回復すると予想される。このような生体機能を用いた遺伝子治療法は新たな研究分野の開拓、さらには臨床応用の可能性が期待できる画期的な治療法になると確信している。