hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
反応場設計に基づく高度に制御された触媒的クロスピナコールカップリング反応の開発

ピナコールカップリング反応は、ビシナルに官能基を導入しながら炭素ー炭素結合を形成させることができる有用な反応である。一方、そのクロスカップリング反応は求電子種どうしのカップリング反応であるため選択性に難があり、未解決で挑戦的な反応の一つとなっている。我々は、反応場設計に基づく高度に制御された触媒的クロスピナコールカップリング反応の開発を目的とし、研究を行った。その結果、ヘキサアリールベンゼンを土台とするバナジウムとチタンの異種2核ヘミサレン型錯体触媒を開発した。これを用いることで、脂肪族および芳香族アルデヒド間の選択的なクロスピナコールカップリング反応が進行することを見出した。クロスピナコールカップリング反応の錯体触媒による制御を行うためには、配位子の空間的なデザインが重要である。そこで、異なる反応性および立体的環境を持つ2つの金属が結合形成に適切な距離で配置された錯体触媒をデザインした。具体的には、フラットで剛直性のあるヘキサアリールベンゼン骨格を土台分子とし、2つの異なるヘミサレン配位子がその面状に位置を固定されながらシスに導入された錯体触媒を設計した。昨年度この指針に基づく、2核バナジウム錯体の合成を報告した。今年度は、異種金属(バナジウムおよびチタン)から成る2核錯体の合成に取り組んだ。また、得られた錯体触媒を用いてクロスピナコールカップリング反応を検討した。ヘキサアリールベンゼン骨格を有するシスージアルデヒドに対し、まずモノヘミサレンを縮合により合成した後に、バナジウム(V)との錯形成を行った。その後、2つ目のヘミサレンを縮合により合成した後に、チタン(IV)との錯形成を行うことで、異種金属(バナジウムおよびチタン)から成る2核錯体を合成した。FABおよびMALDI-TOF MASS分析もこのような異種2核錯体の生成を支持している。合成した異種金属(バナジウムおよびチタン)から成る2核錯体を触媒として用い、亜鉛とトリメチルクロロシランの存在下、脂肪族アルデヒドと芳香族アルデヒドのクロスピナコールカップリング反応を行った。その結果、対応する単核のヘミサレンバナジウム(V)錯体とヘミサレンチタン(IV)錯体を単に混合した実験に比べ、高い選択性でクロスピナコールカップリング反応が進行することが明らかになった。そこで、異なる反応性および立体的環境を持つ2つの金属が結合形成に適切な距離で配置された錯体触媒を考えた。まず、このような配位子の合成に取り組んだ。1,2-ビス(2-メトキシフェニル)エチンのホルミル化を行った後、テトラフェニルシクロペンタジエノンとのDiels-Alder反応と続く脱一酸化炭素によりヘキサアリールベンゼン骨格を構築した。この時、メトキシ基の向きがシスおよびトランスの両方の化合物が混合物として得られた。目的とするシス体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離した。トランス体をアニソール中で150°Cで加熱することにより、一部シス体への異性化が進行した。この混合物を再度精製することによりシス体を得ることができた。なお、構造決定は、メトキシ基を一つだけ脱保護し、2次元NOESY測定により行った。反応のスケールアップも達成し、グラムスケール合成も可能になった。得られたジアルデヒドとアミノフェノールの縮合によりヘミサレン部位の導入された配位子を合成した。次に、VO(OiPr)3との錯形成を検討した。1H-NMRにより錯形成を追跡したところ、望む2核錯体の生成が示唆された。2つのヘミサレン部位の環境が異なる非対称な2核錯体も合成した。MALDI-TOF MASS分析もこのような2核錯体の生成を支持している。クロスピナコールカップリング反応は、非対称な1,2ジオールを直接的に合成するための有用な方法であるが、求電子種どうしのカップリング反応であるため、選択的なクロスカップリングが難しく、挑戦的な反応の一つとである。本研究では、クロスピナコールカップリング反応の錯体触媒による制御を目指した。そのためには、配位子の空間的なデザインが重要である。具体的には、フラットで剛直性のあるヘキサアリールベンゼン骨格を土台分子とし、2つの異なるヘミサレン配位子がその面上に位置を固定されながらシスに導入された錯体触媒を設計した。

昨年度、この錯体の合成とクロスピナコールカップリング反応への応用を報告した。今年度も引き続き、ヘミサレン部位を2つ有する2核錯体触媒を用いたクロスピナコールカップリング反応の検討を行った。反応は、2核錯体触媒存在下、共還元剤である亜鉛とクロロトリメチルシランを用いる条件で行った。錯体触媒の置換基の効果を調べた。また、金属の組み合わせによる反応への影響を調べる目的で、対称および非対称なバナジウム(V)ヘミサレン2核錯体触媒を合成し、クロスピナコールカップリング反応を行った。その結果、それらのバナジウム(V)ヘミサレン2核錯体よりもバナジウム(V)とチタン(IV)異種2核ヘミサレン錯体を有する錯体触媒の方がクロスピナコールカップリング反応には有効であることが明らかになった。さらに、基質適応範囲を調査するとともに、触媒の有用性を示した。また、単核ヘミサレン錯体を用いたクロスピナコールカップリング反応も検討した。有機合成化学、機能有機化学今年度は、昨年度合成法を確立したヘキサアリールベンゼン骨格上に2つの異なるヘミサレン部位を持つ配位子を用いた異種金属から成る錯体合成およびそのクロスピナコールカップリング反応の触媒としての応用を目指してに取り組んだ。結果として、1)異種金属(バナジウムおよびチタン)から成る2核錯体の合成法を確立した。2)それを用いたクロスピナコールカップリング反応を検討し、その優位性を示す知見を得た。以上より、おおむね順調に進展していると考えている。今年度は、クロスピナコールカップリング反応のための触媒として設計された異なる反応性および立体的環境を持つ2つの金属が結合形成に適切な距離で配置された錯体触媒の配位子合成と錯形成を目指して研究に取り組んだ。結果として、1)ヘキサアリールベンゼン骨格上に2つの異なるヘミサレン部位を持つ配位子の合成ルートを確立でき、さらにグラムスケール合成も可能にした。2)バナジウム(V)との錯形成を検討し、2核錯体の生成を明らかにした。錯体の分子設計に基づき、クロスピナコールカップリング反応の更なる収率や選択性の向上に取り組む。合成したヘキサアリールベンゼン骨格を土台分子とする異種2核ジヘミサレン錯体触媒を用いて、クロスピナコールカップリング反応の検討を行う。金属種によるアルデヒドの活性化能の違いを調査するために、錯形成させる遷移金属を検討する。まずは、チタンあるいはバナジウムの組み合わせから、アリールアルデヒドとアルキルアルデヒドのクロスピナコールカップリング反応を検討する。次に、配位子上の種々の置換基を変化させる。触媒化の検討も行う。研究が順調に進展したため、試薬やガラス器具をはじめとする消耗品代を抑えることができたため。今年度は新たにより効率的なクロスピナコールカップリングシステムの開発に取り組む。そのための試薬やガラス器具をはじめとする消耗品代として使用する予定である。
PWM入力による制御:ロバスト制御手法の確立とそれに基づく平均化法の解釈

制御入力を制御対象に加えるにあたり,本来の入力信号ではなくパルス幅変調された信号を入力することがしばしばある.本研究ではそれを一般化して,制御入力が以下の条件を満たす制御系をPWM制御系とよぶ:(1)0または1の2値しかとれない(2)各サンプル区間で最初は1をとる(3)各サンプル区間で1回だけ1から0に切り替えることができる.このPWM制御系に対して,共同研究者であるU. Jonsson(スウェーデン王立工科大)およびC.-Y. Kao(メルボルン大学)両氏との議論に基づき,軌道のロバスト制御問題を定式化し,軌道周りでの線形化に基づく設計法を導出した.具体的には2つの成果を得た.まず初期状態からの終端軌道への収束を偏差のL2ノルムの意味で最適化するLQ制御問題を定式化し,線形化により線形離散時間LQ制御問題に帰着することを示した.この結果はAutomatica誌に採録された。次に外乱から終端軌道との偏差へのL2誘導ノルムを最適化するH∞性能に加えてサンプル点間応答を含めた応答の平均値が目標値を追従するサンプル値H∞サーボ問題を定式化し,線形化により線形離散時間H∞サーボ問題に帰着することを示した.この結果は2006年にIEEEの決定と制御に関する会議(CDC)で結果を公表し,現在学術雑誌に投稿し評価を待っている.いずれの結果もU. JonssonおよびC.-Y. Kaoによる従来結果である厳密な安定性解析手法により,高い性能および(ロバスト)安定性を有することが確認されている.また他の手法との数値シミュレーションおよび実験による比較を行った:シミュレーション結果をAmerican Control Conferenceで公表し,実験結果は投稿準備中である.制御入力を制御対象に加えるにあたり,実装上の理由から本来の入力信号ではなくパルス幅変調された信号を入力することがしばしばある.本研究ではそれを一般化して,制御入力が以下の条件を満たさなければならない制御系をPWM制御系とよぶ:(1)0または1の2値しかとれない(2)各サンプル区間で最初は1をとる(3)各サンプル区間で1回だけ1から0に切り替えることができる.本年度はこのPWM制御系に対して,共同研究者であるU.Jonsson(スウェーデン王立工科大)およびC.-Y.Kao(メルボルン大学)両氏との議論に基づき,軌道のロバスト制御問題を定式化し,軌道周りでの線形化に基づく設計法を導出した,具体的には2つの成果を得た.まず初期状態からの終端軌道への収束を偏差のL2ノルムの意味で最適化するLQ制御問題を定式化し,線形化により線形離散時間LQ制御問題に帰着することを示した.この結果は,IFAC(国際自動制御連盟)の世界大会で発表した.また現在国際学術論文誌に投稿し,評価を待っている.次に外乱から終端軌道との偏差へのL2誘導ノルムを最適化するH∞制御問題を定式化し,線形化により線形離散時間H∞制御問題に帰着することを示した.この結果はIEEEの決定と制御に関する会議(CDC)で結果を公表した.いずれの結果も、U.JonssonおよびC.-Y.Kaoによる従来結果である厳密な安定性解析手法により,高い性能および(ロバスト)安定性を有することが確認されており,ヨーロッパにおけるDC-DC変換器に関するプロジェクトHYCONの会議でも高く評価された.制御入力を制御対象に加えるにあたり,実装上の理由から本来の入力信号ではなくパルス幅変調された信号を入力することがしばしばある.本研究ではそれを一般化して,制御入力が以下の条件を満たさなければならない制御系をPWM制御系とよぶ:(1)0または1の2値しかとれない(2)各サンプル区間で最初は1をとる(3)各サンプル区間で1回だけ1から0に切り替えることができる.本年度はこのPWM制御系に対して,共同研究者であるU.Jonsson(スウェーデン王立工科大)およびC.-Y.Kao(メルボルン大学)両氏との議論に基づき,軌道のロバスト制御問題を定式化し,軌道周りでの線形化に基づく設計法を導出した.具体的には2つの成果を得た.まず初期状態からの終端軌道への収束を偏差のL2ノルムの意味で最適化するLQ制御問題を定式化し,線形化により線形離散時間LQ制御問題に帰着することを示した.この結果はAutomatica誌への採録が決定されている.次に昨年度の成果である外乱から終端軌道との偏差へのL2誘導ノルムを最適化するH∞制御問題を拡張し,H∞性能に加えてサンプル点間応答を含めた応答の平均値が目標値を追従するサンプル値H∞サーボ問題を定式化し,線形化により線形離散時間H∞サーボ問題に帰着することを示した.この結果はIEEEの決定と制御に関する会議(CDC)で結果を公表した.いずれの結果もU.JonssonおよびC.-Y.Kaoによる従来結果である厳密な安定性解析手法により,高い性能および(ロバスト)安定性を有することが確認されており,ヨーロッパにおけるDC-DC変換器に関するプロジェクトHYCONの会議でも高く評価された.制御入力を制御対象に加えるにあたり,本来の入力信号ではなくパルス幅変調された信号を入力することがしばしばある.本研究ではそれを一般化して,制御入力が以下の条件を満たす制御系をPWM制御系とよぶ:(1)0または1の2値しかとれない(2)各サンプル区間で最初は1をとる(3)各サンプル区間で1回だけ1から0に切り替えることができる.

このPWM制御系に対して,共同研究者であるU. Jonsson(スウェーデン王立工科大)およびC.-Y. Kao(メルボルン大学)両氏との議論に基づき,軌道のロバスト制御問題を定式化し,軌道周りでの線形化に基づく設計法を導出した.具体的には2つの成果を得た.まず初期状態からの終端軌道への収束を偏差のL2ノルムの意味で最適化するLQ制御問題を定式化し,線形化により線形離散時間LQ制御問題に帰着することを示した.この結果はAutomatica誌に採録された。次に外乱から終端軌道との偏差へのL2誘導ノルムを最適化するH∞性能に加えてサンプル点間応答を含めた応答の平均値が目標値を追従するサンプル値H∞サーボ問題を定式化し,線形化により線形離散時間H∞サーボ問題に帰着することを示した.この結果は2006年にIEEEの決定と制御に関する会議(CDC)で結果を公表し,現在学術雑誌に投稿し評価を待っている.いずれの結果もU. JonssonおよびC.-Y. Kaoによる従来結果である厳密な安定性解析手法により,高い性能および(ロバスト)安定性を有することが確認されている.また他の手法との数値シミュレーションおよび実験による比較を行った:シミュレーション結果をAmerican Control Conferenceで公表し,実験結果は投稿準備中である.
胎生期内耳における遺伝子発現調節による遺伝子動態の解析

胎生期内耳(耳胞)へDach1を標的とするshort hairpin RNA(shRNA)プラスミドを導入し、内耳特異的Dach1遺伝子発現抑制モデルマウスの作成に成功した。本マウスの胎生期15日目(E15)の頭部を摘出し、in situ hybridazationを用いてDach1発現を確認したところ、Dach1の消失を認め、さらに、Dach1遺伝子に関連すると予想され、蝸牛血管条形成に強く影響を与えると考えられるPax6, Igf1遺伝子の発現減少を認めた。また、本マウスの成熟期蝸牛では、野生型マウスと比較して蝸牛血管条が菲薄化している所見を認めた。聴覚と平衡覚を司る感覚器である内耳形成に重要な役割をもつことが示唆されているDach1遺伝子に着目し、内耳特異的なDach1発現抑制モデルマウスを作成することで、内耳形態の変化と関連遺伝子の動態を解析する。このことを通して、正常マウス胎生期内耳形成のメカニズムの一端を明らかにすることを目的とする。方法としては、キシラジン、ケタミンにて妊娠マウスを全身麻酔後、開腹を行い胎児を子宮とともに体外へ露出し、下方よりファイバー光源で照らしながら耳胞を確認し、Dach1遺伝子を標的とするshRNAプラスミドベクター(shRNA-Dach1)を注入する。このことで内耳特異的Dach1ノックダウン(KD)マウスを作製し、内耳形態の変化と関連遺伝子の動態を解析する。これまでに我々は、複数のshRNA-Dach1を用いて内耳特異的Dach1 KDマウスを作製し、胎生期15日目の胎生期内耳において最も効率的にDach1発現を抑制できるshRNAプラスミドベクターを選択した。また、内耳特異的Dach1 KDマウスの胎生期内耳において、蝸牛血管条形成に強く関与していると予測されるPax6、Igf1遺伝子の発現の消失をin situ hybridizationにおいて確認した。Dach1遺伝子は哺乳類内耳の形成に重要な役割を果たす遺伝子であることが推測されるが、Dach1欠失マウスが致死的であるため、これまでほとんど検討されていないことから、これまで行われてこなかったDach1遺伝子の哺乳類内耳における機能解析が可能となり、胎生期内耳の形成に関する新しい知見を得ることができると考えられ、本研究の意義は大きい。現在までは、遺伝子導入による胎児への傷害が少ないため生存率が高く、十分な検討が行えていると考えている。確実な検討のためには、サンプル数の増加が必要である。聴覚と平衡覚を司る感覚器である内耳の形成に重要な役割を持つことが示唆されているDachshund Family Transcription Factor 1(Dach1)遺伝子に着目し、マウス胎生期における内耳形成のメカニズムの一端を明らかにすることを目指した。本マウスの胎生期15日目(E15)、E18の頭部を摘出し、凍結切片を作成し、in situ hybridazationを用いてDach1発現を確認したところ、Dach1の消失を認めた。さらに、E15の蝸牛凍結切片において、Dach1遺伝子に関連すると予想され、蝸牛血管条形成に強く影響を与えると考えられるPax6, Igf1遺伝子の発現の減少を認めた。また、本マウスの成熟期の蝸牛凍結切片では、野生型マウスと比較して蝸牛血管条が菲薄化していることが明らかとなった。Dach1欠失マウスは胎生致死(Davis, Mol Cell Biol 2001)であり、これまでDach1遺伝子の内耳発生における働きは行われることなく全く持って不明であったが、その役割の一部について明らかにすることができた。今後、Dach1遺伝子と関連する遺伝子について、その分子生物学的な解析を免疫沈降法やReal time RT-PCRを用いて進める必要がある。今後は、shRNA-Dach1プラスミドベクターをE11.5の正常マウスの耳胞へ導入後、E18の時点で帝王切開を行い、胎子を代理母に預け、生後30日(P30)まで生育させる。その時点で形態評価、聴覚評価を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。内耳基礎研究28年度が最終年度であるため、記入しない。
子宮内ウィルス母児感染の防御機構としての胎盤絨毛細胞のアポトーシスに関する研究

多くの感染症おにおいて、母体の感染は胎盤に及んでも、胎児にはその感染が波及しないことが従来より知られており、胎盤のもつこの母体から胎児への感染阻止作用は『胎盤バリア機構』と呼ばれてきた。しかし、『胎盤バリア機構』の機序については不明のままである。Human T-lymphotropic virus type I(HTLV-I)感染では、母体の感染は胎盤に及んでも、胎児にはその感染が波及しない『胎盤バリア機構』が作動していると考えられる。本研究はHTLV-I感染と胎盤絨毛細胞のアポトーシスの関連について研究した。以下の結果が得られた。1.TdT mediated UTP nick end labeling(TUNEL)法を用いて胎盤切片のアポトーシス陽性細胞(核)の頻度を比較したところ、HTLV-Iキャリア妊婦(n=8)では非キャリア妊婦(n=8)に比べ、有意にアポトーシス陽性細胞(核)の頻度が高かった。2.MT-2細胞(HTLV-I感染リンパ球)添加in vitro実験により胎盤絨毛細胞にアポトーシスが誘導された。1、2の結果より、HTLV-Iは胎盤絨毛細胞にアポトーシスを誘導することが判明した。3.HTLV-Iキャリアであることにより、胎盤重量、児の出生体重に影響を及ぼすことが懸念されたが、HTLV-Iキャリア妊婦(n=69)と無造作に抽出した非キャリア妊婦(n=300)との間には統計学的に有意の差はみられなかった。4.胎盤絨毛細胞と共培養したMT-2細胞では、1x10^5個あたりアポトーシス陽性細胞は150±26個(平均±標準偏差、n=3)で、一方MT-2細胞単独培養では3±1個(n=3)であった。HTLV-Iキャリア妊婦の胎盤では胎盤のバリア機構にアポトーシスが関与しているか否かをみるために以下のIn vitro実験を行った。1.抗HTLV-I抗体陰性の正常妊婦から得た正期産の胎盤の絨毛組織を酵素処理し,その後Percoll連続比重遠心法により,胎盤絨毛細胞を得た。2.MT-2細胞添加胎盤絨毛細胞と非添加胎盤絨毛細胞(コントロール)を同じ条件でdishに入れたcoverslipの上で培養した。3.胎盤絨毛細胞のcoverslipへの付着の状態を連日観察し,連日一部のcoverslipを固定した。また,培養液中に浮遊した細胞を採取した。4.coverslip付着細胞のHTLV-I感染,Fas抗原の発現の有無を免疫染色で調べた。また,アポトーシスの有無をTdT mediated UTP nick end labelling法(TUNEL法)で調べた。次のような結果を得た。1.MT-2細胞添加胎盤絨毛細胞では,非添加胎盤絨毛細胞(コントロール)に比べ,coverslip付着細胞の数が少なかった。2.MT-2細胞添加例ではMT-2添加後5日目でHTLV-I感染胎盤絨毛細胞が認められ,添加後7日目でcoverslip付着細胞及び浮遊細胞にTUNEL陽性細胞がみられた。また,TUNEL陽性細胞が出現したのに伴い,付着細胞に占めるHTLV-I感染細胞の数は次第に低下した。さらに,Fas抗原陽性細胞も認められた。MT-2細胞非添加例では10日目になり始めてTUNEL陽性細胞がみられたが,Fas抗原陽性細胞は認められなかった。以上のIn vitro実験により,胎盤絨毛細胞にHTLV-Iが感染しても,Fas抗原を介したアポトーシスがおおこり,感染の拡大がおさえられ,胎児への感染波及が防御されている可能性が示唆された。

これまでの研究で、胎盤はHTLV-Iに感染するとアポトーシスをおこすことを示してきた。平成10年度は、胎盤絨毛細胞がHTLV-I感染リンパ球に対してアポトーシスを誘導する作用をもつか否かをみる実験を行った。1.妊娠末期の抗HTLV-I抗体陰性の妊婦より胎盤を採取し、酵素処理、Percoll比重遠心法によって胎盤絨毛単層細胞を得た。この胎盤絨毛単層細胞はトロホブラストの他に、マクロファージ、ファイブロブラスト、血管内皮細胞を含むものである。3.得られた胎盤絨毛単層細胞、BeWo細胞の単層細胞、CCD 1059SKの単層細胞を十分洗浄し、フラスコ付着細胞のみにした後に、HTLV-I感染リンパ球(MT-2細胞)をそれぞれの単層細胞に加え48時間培養し、浮遊細胞(MT-2細胞)を回収しスライドグラスに固定し、アポトーシスをTUNEL法で調べた。結果胎盤絨毛単層細胞と共培養したMT-2細胞では、BeWo細胞の単層細胞、CCD 1059 SKの単層細胞と共培養したものに比べ、明らかにアポトーシス陽性細胞が多かった。以上のことより、胎盤絨毛細胞にはHTLV-I感染リンパ球(MT-2細胞)にアポトーシスを誘導する作用があることが示唆された。平成9年度と平成10年度の研究で、Human T-Iymphotropic virus type I(HTLV-I)キャリア妊婦の胎盤では、非HTLV-Iキャリア妊婦の胎盤に比べ、アポトーシス陽性細胞が有意に多いことを明らかにし、胎盤絨毛細胞のアポトーシスが母体から胎児へのHTLV-I感染を阻止する機構のひとつである可能性を示してきた。ところで、HTLV-Iキャリア、非キャリア間で胎盤のアポトーシス陽性細胞頻度に差がみられることより、HTLV-Iキャリア、非キャリア間で胎盤重量や児の出生体重に差がある可能性が考えられうる。平成11年度はその点につき検討した。過去9年間に鹿児島大学医学部附属病院産婦人科で分娩した重症妊娠中毒症、糖尿病その他の重篤な合併症のない正期産例のHTLV-Iキャリア妊婦(n=69)と非キャリア妊婦(n=300)を対象とし、胎盤重量、児の出生体重、胎盤重量/分娩時母体体重、児の出生体重/分娩時母体体重、胎盤重量/児の出生体重を比較した。その結果、胎盤重量、児の出生体重をはじめ、いずれも両群間に統計学的有意差はみられなかった。このことより、HTLV-Iキャリアであることは、その妊娠の胎盤重量、児出生体重には影響を与えないことがわかった。HTLV-Iキャリア、非キャリア間でアポトーシス陽性胎盤絨毛細胞の頻度に差があっても、アポトーシス陽性胎盤絨毛細胞の絶対数がHTLV-Iキャリアにおいても少ないために、その胎盤重量、児体重に影響を与えないものと考えられる。
淡水魚類生息環境のダムによる分断と河道直線化による均質化の影響評価

北海道の貯水ダム・砂防ダムのGISデータベースならびに過去50年間の淡水魚類のGISデータベースを作成し、それにもとづいて淡水魚の種多様度、また個々の種の生息確立に及ぼすダムによる生息環境分断の影響を調べた。その結果、種多様度は一般に標高の低い大河川中下流域において高くなる傾向が見られるが、ダムによるダメージもやはり標高の低い地点にそれが建設されるほど大きくなることが分かった。種ごとにその影響を見ると、海と河川を行き来するいわゆる通し回遊魚と呼ばれる淡水魚(サケ・マスや多くのハゼ科など)へのインパクトがもっとも甚大であった。また、魚道はサケマスなどの遊泳力の大きな魚類にとって機能するが、ハゼ科など遊泳力の小さな回遊魚には有効でないということが示唆された。同じく北海道を調査対象地域として、河川の直線化による魚類生息環境の単純化(均質化)を評価する指標を開発し、その指標をいくつかの河川に応用した。エントロピーによる河川形状の複雑度指標を、釧路川の大正・昭和30年代・50年代・平成という4つの時代での河川形状に適応して、河川形状の時代変化を定量化した。その結果、時代とともに捷水路工事などによって河川が直線化され、複雑度が低下してきていることが明白になった。ダムの淡水魚類への影響評価を、日本全国というスケールに広げて行うための研究基盤整備を行った。日本全国でダムの設置状況をGISデータとして整備し、それを基にダムによる流域分断の現況図を作成するためのアルゴリズムを開発した。その現況図から、全国でどの地域がいつの時代から海と分断されているかを一目で把握できるようにした。また、日本全国の淡水魚類の生息状況に関する地理データベースを自然環境保全基礎調査と河川水辺の国勢調査とから作成した。北海道の貯水ダム・砂防ダムのGISデータベースならびに過去40年間の淡水魚類相のGISデータベースを作成し、それにもとづいて淡水魚の種多様度・個々の種の生息確率に及ぼすダムによる生息環境分断の影響を調べた。種ごとにその影響を見ると、海と河川を行き来するいわゆる通し回遊魚と呼ばれる淡水魚(サケ・マスや多くのハゼ科など)へのインパクトがもっとも甚大であることが分かった。しかし一方、一生を河川内で過ごす純淡水魚の中でモツゴやヤチウグイなどがダム上流側で生息確率を低下させることが分かった。これまで河川の平面形状を計る指標として、広く屈曲率が、また近年になってフラクタル次元やアングル(Andrle 1994)などが地形学の分野で用いられてきた。これらの指標に代わるものとしてエントロピーによる河川形状の複雑度指標を考案した。そしてこの指標を、釧路川と千歳川の2河川の大正・昭和30年代・50年代・平成という4つの時代での河川形状に適応して、河川形状の時代変化を定量化した。その結果、2つの河川とも時代とともに捷水路工事などによって河川が直線化され、複雑度が低下してきていることが明白になった。北海道の淡水魚類の生息適地モデルを開発した。そしていくつかの魚種について生息確立の地理分布に及ぼすダムの影響を調べた。ダムの影響を強く受けていたサクラマスは、全道でパッチ状に生息確率を低下させていることが示された。

また特定魚種の保全地域の評価をギャップ分析によって行った。北海道は水産資源保護法によって32の保護水面(禁漁河川)を指定し、サケマスなどの淡水生物資源の保護に取り組んでいる。サケ科魚類の中で水産資源としての価値が高いサクラマスと絶滅危惧IB類にも指定され希少価値の高いイトウの2魚種に注目して、それぞれ生息確率が全道平均よりも有意に高いが、イトウに関してはその傾向がまったく認められないことが分かった。保護水面は、水産資源保護の目的に関しては達成できているようであるが、希少種保護の目的は明らかに不十分と言わざるを得ない。またダムの淡水魚類への影響評価を、日本全国というスケールに広げて行うための研究基盤整備を行った。日本全国でダムの設置状況をGISデータとして整備し、それを基にダムによる流域分断の現況図を作成するためのアルゴリズムを開発した。その現況図から、全国でどの地域がいつの時代から海と分断されているかを一目で把握できるようにした。また、日本全国の淡水魚類の生息状況に関する地理データベースを自然環境保全基礎調査と河川水辺の国税調査とから作成した。さらに大正時代、昭和30年代、昭和50年代、平成の4つの時代で北海道にある釧路川水系の河川図をデジタル化した。同時に河川形状の複雑度を表すインデックスを開発し、それを釧路川に応用した。釧路川では昭和30年代ころから急速に河川の直球化が進行し、河川環境が均質化したことが判明した。
放射線と併用し増感作用を呈する薬剤の検討とその微小環境への影響の検証

膵癌においてヘッジホッグ阻害が、SHHの精製タンパク質による細胞増殖を濃度依存的に部分的に抑制していることを確認し、SHHタンパク質が、線維芽細胞の増殖をソニックヘッジホッグ経路依存的に促進していることが示唆された。RAS/RAF/MEK/ERK経路は、様々な癌腫において過剰発現しており、MEK阻害剤は抗がん作用をもつ新規分子標的薬として注目されている薬剤の一つである。今回、対象として膵癌由来の細胞に注目し、膵癌細胞MIA PACA-2に対し、放射線照射にMEK阻害を行うことにより、放射線照射単独と比して、細胞の生存はさらに抑制されることが示唆された。放射線放射線増感作用が期待されるいくつかの候補の薬剤のなかから、MEK inhibitorに着目した。RAS/RAF/MEK/ERK経路は、BRAF, RAS mutationを含む様々な癌腫において、過剰発現しており、MEK inhibitorは抗がん作用をもつ新規分子標的薬として注目されている薬剤の一つであり、放射線治療との増感作用も期待される。臨床上、放射線治療と併用する可能性がある種々の癌腫由来のcell lineにおけるMEK発現についてdata base,各種論文などから検討し、実験に使用するいくつかの候補を抽出した。まずはClonogenic assayとして適するcell lineかどうかを判別するために、plating efficiencyを測定し、極度にplating efficiencyが低い細胞腫は除外した。さらに、同MEK inhibitorが各cell lineにどのようなtoxicityを持つかを検討した。まず、時間を固定し、濃度を数種類に振り分け、細胞がその時間で死滅する濃度を同定した。さらに、細胞が適度に生存する濃度において、その作用時間を変え、toxicityが出ない作用時間を検討した。最適と思われる濃度、作用時間において、Western blottingによって、MEKならびにERKのリン酸化阻害について検討した。続いて、薬剤の効果を認め、Toxicityが強く出現しないと推察される薬剤の条件下において、放射線照射を行うタイミングを検討した。現在、照射するタイミング、さらに照射する線量をいくつかに振り分け実験を行っている。Cell lineによって、最適化条件が異なるため、各々のcell lineにおける最適な条件を検討中である。当初初年度に予定した計画を実行している段階である共同研究先と協議し、放射線増感作用が期待されるいくつかの候補の薬剤のなかから、MEK inhibitorに着目した。RAS/RAF/MEK/ERK経路は、BRAF, RAS mutationを含む様々な癌腫において、過剰発現しており、MEK inhibitorは抗がん作用をもつ新規分子標的薬として注目されている薬剤の一つであり、放射線治療との増感作用も期待することができると考えられる。臨床上放射線治療と併用する可能性がある種々癌腫由来のcell lineにおけるMEK発現についてdata base,各種論文などから検討し、実験に使用するいくつかの候補を抽出した。まずはClonogenic assayにて、同MEK inhibitorが各cell lineにどのようなtoxicityを持つかを検討した。さらに、薬剤の至適濃度、時間を検討し、Western blottingによって、MEKならびにERKのリン酸化阻害について検討した。薬剤の効果があり、Toxicityが出現しないと考えられる薬剤の条件下において、放射線照射を行うタイミングを検討した。以上の実験を行い、特に注目したのは、膵癌由来の細胞である。膵癌細胞MIA PACA-2に対し、放射線にMEK inhibitorを加えることにより、細胞の生存はさらに抑制されることが分かった。しかしながら、低酸素化においては、その増感効果が打ち消されることが示されたため、現在そのメカニズムを解明中である。そのほか、担癌マウスを使用したin vivoの実験へと移行する準備ならびに、ほかの悪性腫瘍細胞株でMEK inhibitorが放射線増感効果を呈するものはないか、スクリーニングをかけているところである。実験の条件検討に当初の予定より、時間がかかってしまったため、当初の予定よりやや遅れている。放射線増感作用が期待されるいくつかの候補の薬剤のなかから、MEK経路に着目した。RAS/RAF/MEK/ERK経路は、BRAF, RAS mutationを含む様々な癌腫において過剰発現しており、MEK阻害剤は抗がん作用をもつ新規分子標的薬として注目されている薬剤の一つである。今回、対象として膵癌由来の細胞に注目した。膵癌細胞MIA PACA-2に対し、放射線照射にMEK阻害を行うことにより、放射線照射単独と比して、細胞の生存はさらに抑制されることが分かった。しかしながら、低酸素下の条件においては、放射線照射にMEK経路を阻害することで、放射線の増感効果を呈しなくなった。現在このような現象が起こった原因について検索中である。また、もう一つの経路として、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路に注目した。がんの間質繊維芽細胞の増殖をソニックヘッジホッグ経路が促進することが最近注目されている。膵臓癌は、化学放射線治療に抵抗性の難治性の癌であり、がん間質線維芽細胞に富むことが注目されている。豊富な間質線維芽細胞は放射線抵抗性に関わってくることが分かってきている。そこで、膵癌においてヘッジホッグ経路が間質豊富な微小環境にどのような影響を与えるのかについて明らかにすることを目的とした。SHH依存的に細胞増殖が起きるかどうかを調べるため、あるSHH阻害剤を用いて、細胞増殖がSHH経路を介するかどうかを評価した。

同阻害剤が、SHHの精製タンパク質による細胞増殖を濃度依存的に部分的に抑制していることを確認し、SHHタンパク質が、線維芽細胞の増殖を、ソニックヘッジホッグ経路依存的に促進していることが示唆された。このように、SHH経路を阻害することによって、線維芽細胞の増殖を抑制すれば、放射線療法の増感を期待することも可能となる。膵癌においてヘッジホッグ阻害が、SHHの精製タンパク質による細胞増殖を濃度依存的に部分的に抑制していることを確認し、SHHタンパク質が、線維芽細胞の増殖をソニックヘッジホッグ経路依存的に促進していることが示唆された。RAS/RAF/MEK/ERK経路は、様々な癌腫において過剰発現しており、MEK阻害剤は抗がん作用をもつ新規分子標的薬として注目されている薬剤の一つである。今回、対象として膵癌由来の細胞に注目し、膵癌細胞MIA PACA-2に対し、放射線照射にMEK阻害を行うことにより、放射線照射単独と比して、細胞の生存はさらに抑制されることが示唆された。培養細胞を用いた研究を続け、その後担癌マウスを使用したin vivoの研究へと移る。学内研究協力者と共同開発した低酸素部位やDNA損傷部位を可視化できるレポーター遺伝子を使い、分子標的投与後や放射線照射後の腫瘍内の低酸素、DNA損傷部位、細胞周期、血管新生、の変化、局在についてリアルタイムでイメージングする。データ解析ならびに論文作成これらの実験で得られた結果をもとに、各分子標的薬の放射線増感作用、ならびに分子標的薬、放射線照射が腫瘍内の微小環境に及ぼす影響を検証する。そのデータから将来臨床の放射線治療の現場で利用し得ると思われる腫瘍内放射線抵抗性分画を予測する。培養細胞を用いた実験によって得た条件を参考にし、担癌マウスを使用したin vivoの実験へと移行する。学内研究協力者と共同開発した低酸素部位、細胞周期を可視化できるレポーター遺伝子を使い、MEK inhibitor投与時の腫瘍内の微小環境の変化について検討する。さらに、これらの実験で得られた結果を元に、同MEK inhibitorの放射線増感作用、ならびに同薬剤、放射線照射が細胞の微小環境に及ぼす影響について、時間的、空間的な変化、動態を解析、検証する。その基礎データを元に、将来臨床の現場においての利用の可能性のある腫瘍内放射線抵抗性分画を予測し、放射線抵抗性部位への高精度放射線治療による放射線線量増加臨床応用への足がかりとする。予定よりも使用した薬剤の経費が少なかった。動物実験を開始できなかったため、当初確保しいた助成金の一部が残った。本年度は、培養細胞実験を中心としていたので、経費が予想より少なくてすんだが、次年度以降は動物実験も行う予定であり、合わせて経費として使用したい。
地域リハビリテーションの構築に向けた協働学習プログラムの開発と検証

地域に住む人々が障害の有無や年齢に関係なく、その人らしく生活できる地域リハビリテーション(以下リハビリ)の構築が必要である。一方、非リハビリ専門職の中には、リハビリとはすなわち訓練という認識が根強いこと、またリハビリ専門職が不足する地域が多いことからも地域リハビリの普及には至っていない。特にリハビリ専門職が不足する地域では、非リハビリ専門職が地域リハビリを学び、実践していく事が期待される。本研究は、地域において連携協働のリーダーシップを担うプライマリ・ケア医を対象に、1.地域リハビリの熟達化に向けた協働学習プログラムの開発、2.協働学習での学びが実践共同体の構築に与える影響、を明らかにする。
金属配位オレフィンの新規活性化法の開発とその合成化学的利用

前週期遷移金属錯体と有機典型金属試薬との反応により生成するアート型錯体を触媒活性種とする新しい反応系の開発を目的に検討を行ったところ、炭素-炭素不飽和結合の新規活性化を含むアルケン及びジェン類の位置選択的アルキル化及びジリル化反応を見出した。例えば、チタノセン触媒及びブチルグリニャール試薬存在下、アルケン類のアルキルハライドによるアルキル化反応について検討を行ったところ、アルケンにアルキル基が2つ導入されるダブルアルキル化反応を見出した。また、本反応をエーテル溶媒中で行うことで、アルケンの脱水素アルキル化生成物が得られることも明らかにした。さらに、本反応系を応用し、ハライド由来のアルキル基と、グリニャール試薬由来のマグネシウムがアルケン類に導入される新しいタイプのカルボマグネシウム化反応を開発した。さらに、チタノセン触媒系をクロロシランを用いるシリル化反応に適用したところ、アルケン及びジエン類に位置選択的にシリル基が二つ導入されたダブルシリル化反応が効率良く進行することを見出した。また、クロロシランおよびソルキルハライド共存下で反応を行うとアルケン及びジエン類に位置選択的アルキル基とシリル基が導入されることを明らかにした。
要素試験のための舶用燃料から発生する粒子状物質生成装置の開発

2018年度は燃焼予備試験と燃焼装置物品の選定、サンプリング部の作成を実施した。本研究で作成する燃焼装置はプール燃焼を用いたものであり、舶用機関の噴霧燃焼とは異なるため、予備試験を実施した。燃焼予備試験で使用した燃料は、試験機関の運転に使用している燃料油であるA重油とC重油、重油中の成分であるヘキサデカンと1-メチルナフタレンである。燃焼予備試験では、引火点の高い舶用燃料油をどの用に加熱すれば点火できるかの確認と、プール燃焼させることで粒子状物質やすすが生成するのかの確認を実施した。試験燃料をシャーレに入れ、引火点まで加熱式天秤を用いて加熱した。引火点付近でバーナーの火炎を近づけ着火を試みた。すべての燃料が引火点を過ぎればバーナーで着火できることを確認した。また、プール燃焼時にもすすの生成が確認できた。過去の知見から1-メチルナフタレンはすすが生成しやすいとされている。そのため目視の所感ではあるが、1-メチルナフタレンを燃焼した際のすす生成が最も多かった。燃焼装置作製の際も、予備試験同様に加熱式天秤を用い、手動で着火させることでプール燃焼させる方針に決めた。燃焼装置物品の選定は、参考とした論文で使用されているプール燃焼装置を参考にし、燃料供給部や供給する空気の整流方法を検討し、物品を購入した。サンプリング部は、試験機関からの粒子状物質捕集に使用しているフィルタフォルダを使用することとした。観察部の検討が遅れているため、次年度に燃焼装置の作成と平衡して実施することとする。2018年度に予定していた燃焼装置の作成が終了していない。燃焼予備試験は実施し、当所の計画通り、引火点まで試験燃料を加熱した後に着火すれば重油もプール燃焼できることがわかった。重油は引火点が100度を超えるものがあり、過去の知見でプール燃焼装置に使用されている燃料よりも非常に高いため、ヒーターが必要であることが確認できた。装置の詳細は、参考としている論文に使用されている装置を見学し、燃料供給部や空気供給部の構造を検討した。サンプリング部は粒子状物質の捕集に使用しているフィルタフォルダを使用し、サンプリング時には全量を捕集し、温調できるようにすることにした。採取した粒子状物質の分析に使用する機器はGCMSを除いて良好に運転できている。粒子状物質中の炭素成分を分析可能なサーマルオプティカルアナライザーのプロトコルを作成し、より細かい温度で分析できるようにした。GCMSは今後調整が必要なため、来年度の課題とする。2019年度はまず装置の作成を8月までに終了させ、研究計画の遅れを調整する。観察部の検討が終了していないため、燃焼時の温度に耐えられるかつ、火炎を観察できる石英ガラスを第一候補としてテスト装置を作成し、本試験装置の作成を実施する。舶用燃料を想定した試験燃料は必ず加熱が必要となるため、燃料を加熱し、燃焼に使用した燃料量を把握することができる加熱式天秤を用いることとする。装置が作成できたら、フィルタへのサンプリングを実施し、全量捕集に問題がないか、火炎は観察できるか等を確認する。特に捕集量は分析時の検出限界や回収率とも関連するため、分析を実施しながら確認をすることとする。使用する燃料は、ヘキサデカン、1-メチルナフタレン、A重油、C重油とし、捕集量や分析方法が確立できたら、硫黄分や金属分を混合して系統的な試験を実施する。分析はGCMSによって多環芳香族炭化水素および直鎖の炭化水素の分析の実施も試みる。また、硫黄分を含む場合は硫酸・硫酸塩の分析を実施するため、イオンクロマトグラフィーで分析を実施する。また、最終年度で分析装置を検討するサーマルオプティカルアナライザーでの分析も実施し、炭素成分を分析する。

2018年度に予定していた燃焼装置の作成が終了していない。燃焼予備試験は実施し、当所の計画通り、引火点まで試験燃料を加熱した後に着火すれば重油もプール燃焼できることがわかった。重油は引火点が100度を超えるものがあり、過去の知見でプール燃焼装置に使用されている燃料よりも非常に高いため、ヒーターが必要であることが確認できた。装置の詳細は、参考としている論文に使用されている装置を見学し、燃料供給部や空気供給部の構造を検討した。サンプリング部は粒子状物質の捕集に使用しているフィルタフォルダを使用し、サンプリング時には全量を捕集し、温調できるようにすることにした。採取した粒子状物質の分析に使用する機器はGCMSを除いて良好に運転できている。粒子状物質中の炭素成分を分析可能なサーマルオプティカルアナライザーのプロトコルを作成し、より細かい温度で分析できるようにした。GCMSは今後調整が必要なため、来年度の課題とする。2019年度はまず装置の作成を8月までに終了させ、研究計画の遅れを調整する。観察部の検討が終了していないため、燃焼時の温度に耐えられるかつ、火炎を観察できる石英ガラスを第一候補としてテスト装置を作成し、本試験装置の作成を実施する。舶用燃料を想定した試験燃料は必ず加熱が必要となるため、燃料を加熱し、燃焼に使用した燃料量を把握することができる加熱式天秤を用いることとする。装置が作成できたら、フィルタへのサンプリングを実施し、全量捕集に問題がないか、火炎は観察できるか等を確認する。特に捕集量は分析時の検出限界や回収率とも関連するため、分析を実施しながら確認をすることとする。使用する燃料は、ヘキサデカン、1-メチルナフタレン、A重油、C重油とし、捕集量や分析方法が確立できたら、硫黄分や金属分を混合して系統的な試験を実施する。分析はGCMSによって多環芳香族炭化水素および直鎖の炭化水素の分析の実施も試みる。また、硫黄分を含む場合は硫酸・硫酸塩の分析を実施するため、イオンクロマトグラフィーで分析を実施する。また、最終年度で分析装置を検討するサーマルオプティカルアナライザーでの分析も実施し、炭素成分を分析する。装置の作成が遅れているため。特に観察部の検討が遅れている。研究計画当初の予定通り、燃焼装置作成のために使用する。
RANKL逆シグナルを介したSOST分子の経時的な発現制御機構の解析

骨細胞より分泌される骨形成抑制因子SOSTに関して、その発現制御にRANKLを受容体とする「RANKL逆シグナル」の関与を検証した。まず、骨細胞の適切なin vitro培養法の構築を行った。骨基質の主要な成分であるI型コラーゲンにマトリゲルを添加した三次元培養下において、骨細胞はその形質を長期間に渡って保持可能であった。続いて、RANKL逆シグナルを骨細胞に入力した結果、SOST分子の発現量が有意に上昇し、同時にRANKL/OPGの発現量比も増大した。これらはマウスでも同様の傾向が観察され、RANKL逆シグナルによって骨吸収の促進、骨形成の抑制が効率的に行われていることが示唆された。骨細胞から分泌されるSclerostin(SOST)は、骨芽細胞のWnt/β-catenin経路を負に制御し、骨形成に抑制的に作用する。骨吸収・骨形成の進行と同期してSOST発現量が変動することが、両機構が連関するカップリング現象の一端を担うことが示唆されるものの、その詳細はこれまで解明されていない。申請者らのこれまでの研究から、破骨細胞の活性化において主要な役割を担う「受容体」RANKと「リガンド」RANKL間の相互作用によって、RANKL側へもシグナルが発生し、種々の細胞応答を引き起こすことが示されている。これに基づき、骨細胞に発現するRANKLが破骨前駆細胞のRANKを介して骨吸収を活性化すると同時に、骨細胞へとRANKL逆シグナルが入力され、SOSTの発現量を制御する機構を想定した。続いて、上記の培養条件において、骨芽細胞へのRANKL逆シグナル入力能を持つ抗RANKL抗体様分子を添加した結果、SOST発現量の一時的な上昇が認められた。さらに、RANKLやOPGといった骨代謝制御に関わる複数の遺伝子の発現変動が刺激後早期に起こったことから、骨細胞においてもRANKL逆シグナルが機能し、種々の細胞応答を引き起こすことが示唆された。本研究課題は、骨細胞におけるRANKL逆シグナルの生理的な役割の解明を目的として、特に骨形成抑制作用を有するSOST分子の発現制御への関与を想定した。前年度までの検討から、RANKL逆シグナルの入力活性を有するscFv三量体の作成と、また骨細胞の形質を保持可能な3次元培養系の構築が完了していた。H26年度では、マウスにscFv三量体を投与することで、生体においてRANKL逆シグナルがどのような機能を持つのかを検証した。数日間の反復投与後、血清を取得してELISAによる各分子の濃度を測定した結果、scFv投与によりSOST、sRANKL濃度の上昇、OPG濃度の低下が確認された。骨芽細胞に対する作用は否定出来ないが、この結果から、骨細胞へのRANKL逆シグナルの入力によって骨吸収の促進と骨形成の抑制が誘導されていると考えられた。生理的には、骨細胞と破骨前駆細胞の接触が起点となってRANKL逆シグナルが発生すると考えられ、破骨細胞の活性化とともに近隣での効率的な骨吸収が行われていることが示唆された。骨細胞を単離したin vitroでの解析でも同様の作用は確認された。さらに、骨細胞と破骨前駆細胞の共培養系において、骨細胞を予めscFV三量体に曝露することで骨吸収活性の増大が認められ、効率的なRANKL分子の提示においてもRANKL逆シグナルの関与が認められた。現在、シグナル分子の活性化プロファイルを網羅的に検出可能なリン酸化プロテオミクスの測定系を構築中であり、これを用いて骨細胞内のシグナル活性化の詳細な解析を行う予定である。骨代謝本研究課題では、骨細胞におけるRANKL逆シグナルの存在とその詳細、さらにその生理的な役割の解明を目的としており、特に骨形成に対する抑制性分子であるSOSTの発現制御に着目して研究を進めている。骨細胞は、生理的には骨基質中に埋め込まれた環境に存在しており、マウス頭蓋骨等から単離した初代培養骨細胞は通常の平面培養下ではその特徴的な形態や遺伝子の発現を速やかに失うことが知られている。また、骨細胞様培養細胞として頻用されるMLO-Y4細胞ではSOSTの発現が認められないなど、適切なin vitro評価系が存在しないことが骨細胞研究を遂行する上で大きな障害となっていた。研究代表者らは、I型コラーゲンにマトリゲルを適切な濃度で混合し、三次元培養を行うことで、初代培養骨細胞の脱分化による影響を比較的長期に渡って抑制出来ることを見出した。一連の骨カップリングに伴うSOSTの経時的な発現変動を検証するためには、安定した骨細胞培養系が不可欠であり、今後の検討を行う上で十分な培養条件を確立出来た。さらに、骨細胞にRANK刺激を与えることで、短期的にSOSTやRANKL、OPGなどの遺伝子の発現が変動することが明らかとなった。

長期的な影響や細胞内シグナルの詳細など、解明すべき点は多いが、骨芽細胞におけるRANKL逆シグナルの解析から種々の評価法はすでに確立済みであり、今後の検討に大きな支障はないと考えられる。骨細胞におけるRANKL逆シグナルの生理的な役割を明らかにするために、第一に、マウスin vivoでRANKL逆シグナルを入力することでSOST発現量がどのように変動するかを確認する必要がある。RANKL逆シグナルの入力活性を持つ抗RANKL抗体様分子は既に作成済みであり、投与後の血中SOST濃度を経時的に測定することで、RANKL逆シグナルの影響を評価することを計画している。初代培養骨細胞で認められたSOSTの発現量変動と、in vivoでの効果が一致することを確認した後に、続いて、骨細胞内のシグナル分子の活性化状態を評価する。骨芽細胞の場合にRANKL逆シグナルの下流で活性化するPI3K-Akt-mTORC1に加えて、網羅的なリン酸化プロテオーム解析を行う。活性化が認められたシグナル経路に関して、選択的な阻害剤を用いることでSOST発現制御への寄与を検証するなど、骨細胞におけるRANKL逆シグナルの全体像の解明を試みる。さらに、破骨前駆細胞と骨細胞の共培養系、あるいは破骨細胞の培養上清を骨細胞に加えることで、破骨細胞の活性化を起点とする一連の骨カップリング現象において、SOST発現量がどのように変動するかを解析する。一連の解析を行うことで、骨カップリング機構の一端を担うと考えられるSOSTの発現制御に関して、RANKL逆シグナルがどのように関わっているかを明らかにする。本研究課題は2年間を研究期間として申請・採択されている。当初の実験計画に加えて、H25年度では初代培養骨細胞の培養条件の改善を行うことで、より生理的な環境に近いin vitro解析を行うことが可能となった。H26年度では、確立した培養系を用いた種々in vitro解析、及び計画していたin vivo解析を実施することで、本研究課題の目的である骨細胞におけるRANKL逆シグナルの詳細の解明と、骨形成における負の制御因子であるSOSTの経時的な発現制御への関与を明らかにすることを試みる。そのため、実験試薬や実験動物の飼育等に必要な消耗品を購入するための物品費、及び成果を発表するための学会参加費・旅費や論文投稿費用を含む研究費(次年度使用額)が生じた。H25年度での検討から、初代培養骨細胞、及びマウス生体内においてもRANKL逆シグナルが骨細胞内で機能し、SOSTを含む骨代謝に関わる複数の遺伝子の発現を制御していることが示唆された。H26年度では、まず、初代培養骨細胞を用いたin vitro解析からRANKL逆シグナルの下流で活性化される細胞内シグナル経路の同定を試みる。同定された細胞内シグナルの活性化がSOST発現量変動へどの程度の寄与を持つか評価し、また、骨吸収・骨形成のどの時期にRANKL逆シグナルが関与しているかを検証する。以上に加えて、マウスにRANKL逆シグナルの入力活性を有する抗体様分子を投与することで、SOSTの分泌量や骨表現型にどのような効果が認められるかを確認する。申請する研究助成金は、これらの解析に必要な試薬・消耗品の購入に主に使用する予定である。
β-カルボリンを用いたパーキンソニズムモデルの作成による神経細胞死機構の解明

β-Carbolineによるパーキンソニズムモデルの作成とその毒性経路がN-メチル化を介するものであるかを、Norharman(NH)、9-MeNH及び2-MeNHをC57Blackマウスに1日2回7日間投与することによって検討した。最終投与より2日間休薬後、自発運動量・運動能の測定及びチロシン水酸化酵素(TH)染色による組織学的検討を行った。更に、休薬3日後における脳各部位のモノアミン含量を測定した。また、活性化体である2,9-Me2NHの脳内生成量を測定した。確認のため、マイクロダイアリシスによる各化合物の脳血液関門の透過性についても検討を行った。運動能はいずれの化合物によっても低下し、9-MeNH投与群に最も強く認められた。脳内アミンの変化は、NH及び2-MeNH投与群では中脳及び線条体におけるdopamine(DA)とその代謝物の低下が著明であった。しかし、9-MeNH投与群では、その毒性の部位特異性及びDA神経特異性は低下した。脳内の活性化体の生成量は、9-MeNH投与群で著しく高く2-MeNH投与群の約8倍量であり、2-MeNH投与群ではNH投与群の約1.7倍であった。このことは、in vivoでは9位のメチル化が活性化体生成の律速ステップであることを示唆した。また、この生成量の結果は、運動能・モノアミン含量・TH陽性細胞の低下と一致した。従って、pro-toxinであるsimple β-carbolineは、N-メチル化を受け活性化体である2,9-Me2NHとなってDA神経毒性を発現するとを実証した。また、中脳初代培養細胞を用いた場合、2,9-Me2NHのDA神経選択的な毒性は低濃度の狭い範囲内である。このことは、9-MeNH投与群には過剰の活性体が生成したため、その毒性が非選択的となって発現したことを示唆するもの考えられる。