hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸素プラズマによる植物機能のエピジェネティックな発現および遺伝機構の解明

プラズマ照射種子から成長した植物の細胞では遺伝子発現の際にエピジェネティクスが生じる場合があるが,このときのプラズマ条件の特定を試み,電子密度が10^12-13 /m^3程度,電子温度が2eV以下,プラズマ照射時間が60分程度の場合に遺伝子発現がエピジェネティクスが効率的に生じることが分かった.これら以外のパラーメータでは植物の成長促進がほぼ生じないことから,酸素プラズマによる植物成長促進はエピジェネティックな遺伝子発現により誘導されると推察される.このとき,マイクロアレイを用いた遺伝子発現網羅的解析によりAT2G,DME,Jmjc等のエピジェネティクスを誘導する遺伝子群が優位に発現しており,5メチルシトシンの生成量が増加していることからDNAメチル化が生じていることが明らかとなった.また,エクスパンシンやシャペロン等の遺伝子も発現することから,細胞伸長や遺伝子修復によって植物の成長が促進すると考えられる.上述のような,エピジェネティクス的な発現を伴う各遺伝子が発現するプラズマのパラメータ(電子密度,電子温度,照射時間)の領域を実験よって見出し,プラズマ照射遺伝子発現マップを作成した.本マップを用いることで,植物の栽培,成長を待たずにプラズマによる成長促進効果がより精密に予測でき,本分野の研究者だけでなくプラズマを農業に応用する生産者等にとっても大きく貢献すると考えられる.本年度は次年度に行う予定のエピジェネティクス関連遺伝子群の発現量の定量化に対して,定量化する遺伝子の種類,リアルタイムRT-PCR法を用いる際のプライマーの選択・設計を行った.また最適なハウスキーピング遺伝子も特定した.これまで本研究では,研究計画調書に沿って以下の17に関する研究を行い,所定の結果を得てきた.1.エピジェネが生じるプラズマの特定,2.エピジェネおよび遺伝子シーケンス解析,3.プラズマ照射遺伝子発現マップの作成,4.エピジェネを誘導する活性酸素種の生成,5.粒子種依存遺伝子発現および植物成長特性,6.エピジェネおよび遺伝子シーケンス追加解析,7.プラズマ照射遺伝子発現マップの追加作成従って,本研究は順調に進展していると判断される.1.プラズマ照射効果とエピジェネティックな遺伝子発現との定量的な相関性の確認これまではマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子発現変動解析により,プラズマ照射により特発現量が変動するエピジェネティクス関連遺伝子を特定した.本年度はリアルタイムPCRを用いてエピジェネティクス関連遺伝子の発現量を定量的に調べ,プラズマが遺伝子発現を制御するメカニズムを明らかにする.2.プラズマ照射からエピジェネティクスへ至るパスウェイの解明酸素プラズマを照射した植物種子遺伝子の発現量計測より,植物種子への酸素プラズマ照射からエピジェネティクスへ至るパスウェイを同定し,プラズマ照射効果の発現および次世代への継承メカニズムの解明を行う.プラズマ照射種子から成長した植物の細胞では遺伝子発現の際にエピジェネティクスが生じる場合があるが,このときのプラズマ条件の特定を試み,電子密度が10^12-13 /m^3程度,電子温度が2eV以下,プラズマ照射時間が60分程度の場合に遺伝子発現がエピジェネティクスが効率的に生じることが分かった.これら以外のパラーメータでは植物の成長促進がほぼ生じないことから,酸素プラズマによる植物成長促進はエピジェネティックな遺伝子発現により誘導されると推察される.このとき,マイクロアレイを用いた遺伝子発現網羅的解析によりAT2G,DME,Jmjc等のエピジェネティクスを誘導する遺伝子群が優位に発現しており,5メチルシトシンの生成量が増加していることからDNAメチル化が生じていることが明らかとなった.また,エクスパンシンやシャペロン等の遺伝子も発現することから,細胞伸長や遺伝子修復によって植物の成長が促進すると考えられる.上述のような,エピジェネティクス的な発現を伴う各遺伝子が発現するプラズマのパラメータ(電子密度,電子温度,照射時間)の領域を実験よって見出し,プラズマ照射遺伝子発現マップを作成した.本マップを用いることで,植物の栽培,成長を待たずにプラズマによる成長促進効果がより精密に予測でき,本分野の研究者だけでなくプラズマを農業に応用する生産者等にとっても大きく貢献すると考えられる.本年度は次年度に行う予定のエピジェネティクス関連遺伝子群の発現量の定量化に対して,定量化する遺伝子の種類,リアルタイムRT-PCR法を用いる際のプライマーの選択・設計を行った.また最適なハウスキーピング遺伝子も特定した.これまで本研究では,研究計画調書に沿って以下の17に関する研究を行い,所定の結果を得てきた.1.エピジェネが生じるプラズマの特定,2.エピジェネおよび遺伝子シーケンス解析,3.プラズマ照射遺伝子発現マップの作成,4.エピジェネを誘導する活性酸素種の生成,5.粒子種依存遺伝子発現および植物成長特性,6.エピジェネおよび遺伝子シーケンス追加解析,7.プラズマ照射遺伝子発現マップの追加作成従って,本研究は順調に進展していると判断される.研究目的は,エピジェネティクスおよび遺伝子変異が生じるプラズマ条件の特定である.以下の(i),(ii)を実施した.(i)エピジェネティクスおよび遺伝子変異の確認高周波酸素プラズマを照射したArabidopsis(シロイヌナズナ)の種子を以下に記述する方法で解析した.DNAシーケンス解析による遺伝子配列の確認により,遺伝子変異の発生は生じていないことを確認した.エピジェネティクスの発現については,DNAメチル化により確認を行った.メチル化したDNAをスクリーニングかつ定量化するために,メチル化DNA濃縮法を採用した.本方法では,ゲノムDNAの抽出および断片化→DNAメチル化領域の濃縮→濃縮産物の解析といった手順で定量化を行った.定量化のプロトコルは以下の通りである.1.植物種子よりDNAを抽出,2.ゲノムDNAの断片化,3.アガロース電気泳動により断片化したDNAのサイズを確認する,4.メチル化したDNAを抽出,5.溶出したDNAを解析し定量化した.その結果,エピジェネティクスの発現が確認された.(ii)

プラズマ照射遺伝子発現マップの作成前項(i)で得られた結果を1エピジェネティクスのみが生じる場合,2遺伝子変異のみが生じる場合,3エピジェネティクスと遺伝子変異が同時に生じる場合に分類し,これら三つの場合を酸素ガス圧力と高周波電力をパラメータとしてマッピングし,酸素プラズマ照射による“遺伝子発現マップ"の作成を試みた.得られた遺伝子発現マップと,発芽・成長促進や抗酸化活性向上等の発現した生体機能とを対比し,これらの現象がエピジェネティクスまたは遺伝子変異であることの同定を試みた.エピジェネおよび遺伝子シーケンス解析を行ったところ想定外に多くの遺伝子変異が認められた.本現象を精密に確認する必要があり,追加の解析を実施した.この解析は実験植物の育成(粒子種依存遺伝子発現解析および植物成長の特性確認)後でなければ実施できず,また本現象により結果として計画が12ヶ月延長となったものの,追加のエピジェネティクスおよび遺伝子シーケンス解析により,以下の二点が明らかとなった.・エピジェネティクスを誘導する活性酸素種の特定・粒子種依存遺伝子発現と植物成長特性との相関また,プラズマ照射遺伝子発現マップの作成数が倍増したが,遺伝子発現マップと発芽・成長促進や抗酸化活性向上等の発現した生体機能とを迅速に対比する方法を見出したことで,これらの現象がエピジェネティクスまたは遺伝子変異であることを容易かつ迅速に確認可能となった.1.プラズマ照射効果とエピジェネティックな遺伝子発現との定量的な相関性の確認これまではマイクロアレイ解析による網羅的な遺伝子発現変動解析により,プラズマ照射により特発現量が変動するエピジェネティクス関連遺伝子を特定した.本年度はリアルタイムPCRを用いてエピジェネティクス関連遺伝子の発現量を定量的に調べ,プラズマが遺伝子発現を制御するメカニズムを明らかにする.2.プラズマ照射からエピジェネティクスへ至るパスウェイの解明酸素プラズマを照射した植物種子遺伝子の発現量計測より,植物種子への酸素プラズマ照射からエピジェネティクスへ至るパスウェイを同定し,プラズマ照射効果の発現および次世代への継承メカニズムの解明を行う.今後の推進方策:エピジェネティクスを誘導する活性酸素種の特定(i)活性酸素の選択的生成低圧酸素プラズマ中で選択的に生成する活性酸素種と,DNAメチル化やヒストン修飾によるエピジェネティックな遺伝子発現変動との関係を明らかにする.酸素プラズマ中の活性酸素種の持つ酸化エネルギーは100150 kcal程度であり,活性酸素の種類によっては二重らせん構造を持つ遺伝子の核酸塩基の配列を変化させることが可能である.そのため,真空容器内の圧力や電源電圧の制御により,酸素プラズマ中の電子のエネルギーを変化させ,異なる種類および励起状態の活性酸素種の生成を行う.
炭素同位体における直鎖クラスター構造

本課題では、ヘリウム4原子核が直線上に並んだ特異な原子核構造、直鎖クラスター構造の探索を目的としている。特に、中性子が過剰な炭素同位体を対象とし、それら余剰中性子がどのような役割を担うか調べている。本研究では、1年目および2年目において、炭素14における直鎖クラスター構造の存在を予言し、観測可能な証拠を提示した。この時、炭素14における直鎖クラスター構造は、余剰中性子が占有する軌道によってパイ軌道とシグマ軌道の2種類存在することも明らかにした。そしてこのうち、パイ軌道の直鎖クラスター構造の候補となりうる共鳴状態が国内・国外を問わず観測されているため、その存在は極めて確からしいことを本研究で初めて示してきた。一方、シグマ軌道の直鎖クラスター構造は、観測的証拠が依然乏しく、理論予測にのみとどまっていた。そこで当該年度は、炭素14におけるシグマ軌道の直鎖クラスター構造の立証を目指して、観測的証拠となりうるさらなる物理量を探索した。具体的には、炭素14の陽子数と中性子数を逆にした原子核である酸素14に着目した。直鎖クラスター構造におけるシグマ軌道のように空間的に拡がった余剰陽子が存在すると、クーロンエネルギーが減少するため、炭素14と酸素14の励起スペクトルの間には差が生じる。この差が理論・実験ともに示されれば、シグマ軌道の直鎖クラスター構造の存在を示す新たな証拠となると考えた。以上の仮説のもと、酸素14に対して励起スペクトルを計算した。その結果、シグマ軌道の直鎖クラスター状態のみ、励起エネルギーに大きな差が生じることを明らかにした。したがって、この差が観測されればシグマ軌道の直鎖クラスター構造の存在を示す強力な証拠となる。以上の結果は、論文として発表済である。また、当該年度は炭素16に対しても同様の計算を行い、直鎖クラスター構造の崩壊モードを調べ、この結果も論文として発表した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。原子核の極めて特異な構造の一つに直鎖クラスター構造があり、これはアルファクラスター(4He核)が直線上に並んだ構造である。直鎖クラスター構造は非常に変形度が大きく、従来の常識を超えた特異性を持つため、長らく興味を持たれ研究されている。3個のアルファクラスターを構成要素とする炭素同位体において、直鎖クラスター構造の存在可能性が理論的に提唱されており、近年、実験による探索も活発になってきている。本課題の目的は、実験と比較可能な励起エネルギーやアルファ崩壊幅などの物理量を定量的に予言し、直鎖クラスター構造の存在と性質を解明することである。炭素同位体の中でも14Cにおける直鎖クラスター構造の実験的探索が近年最も盛んであり、2014年にイギリス、2016年にアメリカ、2017年に日本、中国の実験グループによって論文が発表されている。いずれの実験も独立に行われたにも関わらず、励起エネルギーが互いに近い所に共鳴状態が観測され、これらは直鎖クラスター状態の有力な候補と考えられている。そこで本研究では、反対称化分子動力学と呼ばれるクラスター構造を仮定しない微視的手法を用いて、14Cにおける直鎖クラスター構造の存在可能性を調べた。結果として、余剰中性子の占有する分子軌道が異なる、2種類の直鎖クラスター構造が存在することを示した。1つ目の、パイ軌道の直鎖クラスター構造は観測された共鳴状態と励起エネルギーが非常に近く、やはり観測された共鳴状態は直鎖クラスター状態の有力な候補であることを示した。2つ目の、シグマ軌道の直鎖クラスター構造が存在する可能性は本研究で初めて示された。また、14Cの直鎖クラスター構造は基本的に10Beと4Heに崩壊するが、直鎖クラスター構造がパイ軌道かシグマ軌道かによって崩壊先の10Beの状態が変わることを明らかにした。これは実験的に両者を区別する上でも重要である。2014年から2017年までに観測で報告されている14Cの共鳴状態は、先行研究で予測されていたパイ軌道の直鎖クラスター状態と励起エネルギーが近い。したがって、これらの共鳴状態はパイ軌道の直鎖クラスター状態の有力な候補であると考えられていた。本研究もこの予見に則り、パイ軌道の直鎖クラスター状態について、先行研究よりさらに定量的に励起エネルギーを計算し、また、観測では得られているが理論予測が存在しないアルファ崩壊幅についても計算する予定であった。実際、この計画は順調に進み、励起エネルギーやアルファ崩壊幅を実験と定量的に比較することで、パイ軌道の直鎖クラスター状態の存在可能性をより強く示すことに成功した。しかし、本研究ではパイ軌道の直鎖クラスター構造に加えて、当初予期していなかったシグマ軌道の直鎖クラスター構造が存在する可能性を示した。14Cにおいてシグマ軌道の直鎖クラスター構造が存在する可能性は、実験・理論ともに今まで予測されておらず、本研究が最初の報告となった。以上の結果を、7月に北京大学で行われた研究会にて報告したところ、北京大学の実験グループはシグマ軌道の直鎖クラスター構造も観測できている可能性が高いと判明した。これは、観測された状態がシグマ軌道の直鎖クラスター状態と励起エネルギーが近いだけでなく、その崩壊先の10Beがシグマ軌道である可能性が高いと報告されたからである。この結果を受け、本研究も2種類の直鎖クラスター構造の崩壊パターンに着目し、崩壊先の10Beの状態が異なるアルファ崩壊幅を計算した。

その結果、14Cのパイ軌道の直鎖クラスター構造は10Beのパイ軌道の状態へ、14Cのシグマ軌道の直鎖クラスター構造は10Beのシグマ軌道の状態へ崩壊するアルファ崩壊幅が大きいことを明らかにした。以上のように、理論と実験が連携することで、直鎖クラスター構造の理解が大きく進んだ。本課題は、直鎖クラスター構造と呼ばれる、He4核が直線上に並んだ極めて特異な原子核構造の探索を目的としている。現在、直鎖クラスター構造の探索は、中性子過剰な炭素同位体を中心に行われている。これは、He4核とは別に中性子が増えることでその余剰中性子が糊のような役割をし、直鎖クラスター構造がより安定に存在する可能性があるためである。余剰中性子の振る舞いは分子軌道によって説明され、直鎖クラスター構造の場合にはパイ軌道とシグマ軌道の2種類が重要と考えられている。近年、C14において直鎖クラスター状態となりうる共鳴状態が、国内・国外を問わず相次いで観測されており、非常に注目を集めている。特に、C14におけるシグマ軌道の直鎖クラスター構造は昨年度、本研究において初めてその存在が提唱されており、その候補となりうる共鳴状態も観測された。そこで当該年度は、C14におけるシグマ軌道の直鎖クラスター構造のより確実な立証に向けて追加の検証を行った。具体的には、パイ軌道およびシグマ軌道の直鎖クラスター構造は異なる崩壊モードをもつことに着目した。それぞれの軌道のC14がアルファ崩壊する際、娘核となるBe10はそれぞれの軌道に対応した配位を占有すると考えた。得られたアルファ崩壊幅の結果から、2種類の直鎖クラスター構造ははっきりと異なる崩壊モードをもつことがわかり、これは実験において両者を区別する際の観測的証拠となることを示した。また、シグマ軌道の直鎖クラスター構造のみ、He6核と2個のHe4核へと3体崩壊することを示し、この結果もやはりシグマ軌道の直鎖クラスター構造を観測で区別するための重要な証拠となる。以上の結果を論文として発表した。C16も直鎖クラスター構造の存在しうる原子核として注目されており、同様の解析を行った。こちらの結果も論文として投稿しており、現在査読中である。現在、C14における直鎖クラスター構造は、国内・国外を問わず相次いで実験が行われており、国際的に見ても非常に注目を集めている。この状況の中、本研究は新しいタイプの直鎖クラスター構造を提唱し、実験と比較可能なアルファ崩壊幅という物理量を定量的に予言した。また、アルファ崩壊幅から直鎖クラスター構造の崩壊モードを議論することができ、この結果は実際に観測された崩壊モードと良く一致しているため、直鎖クラスター構造の存在の立証に向けて前進したといえる。以上の結果は、すでに論文として発表済みであり、国際会議でも報告を行った。また、同様の解析をC16に対しても行っており、本研究はより広く波及・拡大している。以上のことから当初の計画以上に進展しているといえる。本課題では、ヘリウム4原子核が直線上に並んだ特異な原子核構造、直鎖クラスター構造の探索を目的としている。特に、中性子が過剰な炭素同位体を対象とし、それら余剰中性子がどのような役割を担うか調べている。
補体レクチン経路の活性化機構の解明

血清レクチンのマンノース結合レクチン(MBL,MBPとも呼ばれる)は、二種類の相同性のあるセリンプロテアーゼ(MASP-1,MASP-2)と複合体を形成しており、マンノース等の糖鎖を持つ微生物に結合後、補体レクチン経路を活性化する。本研究の主目的はレクチン経路の活性化機構を解明することであったが、次の様な主な成果を得た。1. MBL-MASP画分にはMASP-1に結合した分子量22kDaの蛋白(sMAP)があり、クローニングの結果これがMASP-2遺伝子のalternative polyadenylationで生成される成分であることが判明した。2. MASP-1のELISAを確立して、これを用いて健常人の血清中のMASP-1量を測定した。その結果、MASP-1量とMBL量とは相関しないことがわかった。また、MBLと結合して複合体を形成しているMASP-1の他に、非結合性のMASP-1が存在することが明らかとなった。この非結合性のMASP-1にはsMAPが結合したタイプと結合していないタイプが存在した。3. MASP-1とMASP-2のプロテアーゼ活性を検討したところ、MASP-1にC3をMASP-2にC4を分解する活性があることがわかった。4. MBLは分子量の異なる様々な分子種として血清中に存在する。これらの一つの解析したところMASP-2はなく、MASP-1とsMAPと複合体を形成していた。血清中のレクチンの一つのマンノース結合蛋白(MBP)は、マンノース等の糖鎖を持つ病原体に結合後、補体系を活性化してこれらを殺すことにより、生体防御において重要な役割を担っている。MBPによる補体活性化において血清中でMBPはCls様のセリンプロテアーゼのMASPと複合体を形成しており、MBPが糖鎖リガンドに結合すると、MASPによりC4,C2の分解反応が起こる。このようなMBP-MASPによる補体活性化は第三の補体活性化経路としてレクチン経路と呼ばれている。私は、MASPに分子量22、000の蛋白(P22)が結合していることを見出した。本研究はこのP22の構造と機能を解析して、レクチン経路の活性化機構を解明を行うことを主目的とした。一年目の得られた成果は次の通りである。1)P22のN末端部分アミノ酸配列をもとにcDNAクローニングを行い、P22の全一次構造を決定した。その結果、P22はMASP,Clr,Clsに共通にあるインターナルドメインとEGFドメインを持つことが判った。最近、デンマークのオ-フス大学のグループは、我々が明らかにしたMASP(MASP1)とは異なる構造をした分子量約80、000のMASP(MASP2)がMBP画分にあることを報告した。P22とこのMASP2のN末端部分アミノ酸配列は完全に一致した。しかし、P22のcDNAにはポリAシグナルがあることから、P22はMASP2の分解産物ではなく、splicing variantであると推定された。2)MBPは分子量が異なる様々な分子量として血清中に存在するが、抗体を用いて調べたところ、MASP1とP22は大部分のMBPと結合して複合体が形成しているが、MASP2は限られた分子量のMBPとのみ複合体を形成していることが示唆された。3)MASP1に対するモノクローナル抗体を作製し、ELISA法を確立した。血清レクチンのマンノース結合蛋白(MBP,最近MBLとも呼称される)は、C1r/C1s様のセリンプロテアーゼのMASPと複合体を形成しており、マンノース等の糖鎖を持つ微生物に結合後、レクチン経路を活性化することにより生体防御レクチンとして働いている。MBPには二つのタイプのMASP(MASP1とMASP2)が結合しており、C4,C2及びC3を分解する。

私は、MBP画分には更に分子量22,000の蛋白(P22)が存在することを見出した。本研究の主目的はこのP22の構造と機能を解析して、レクチン経路の活性化機構を解明することであったが、初年度では、P22のcDNAと遺伝子解析から、これがMASP2のsplicing variantであることを明らかにした。本年度の得られた成果は次の通りである。1)初年度に確立されたMASP1のELISAを用いてMASP1量を測定して、MBP量とは相関しないことを明らかにした。これに関連してMBPに結合しているMASP1の他に、ヒト血清中には非結合性のMASP1が存在することがわかった。2)MASP1とMASP2の分離は困難であったが、部分精製したMASP1にC3分解活性が、一方MASP2にC4分解活性があると推定された。また、1)より明らかになったMBP非結合性のMASP1を精製したところ、MASP1にはP22が結合したタイプと非結合性のタイプが存在することがわかった。P22の推定される機能の一つとして、MASP1活性の阻害があるが、MASP1-P22にもC3分解活性があったことから、P22のこのような機能はないものと考えられた。
ポテンシャル表面ダイナミクスに基づく反応経路探索

分子やクラスターの構造および化学反応は、量子化学計算によるポテンシャルエネルギー表面(PES)を調べることによって理論解析できる。PESは振動の自由度と同数の変数を持つ多変数関数であり、PES上の系統的な自動探索は非常に難しい課題であった。申請者らはPES上の反応経路をエネルギーの低い方から高い方へと向かって上っていくことのできる一般的な手法(超球面探索法)を初めて開発し、PES上の反応経路ネットワークを直接辿ることを可能にした。これにより、反応経路以外の無駄な部分を計算せずに効率よくPES上を自動探索できる。本研究では超球面探索法を以下の解析に応用した。(1)プロトン化水クラスターH^+・(H_2O)_n(n=5-8)の安定構造の系統的な自動探索を行い、温度変化に伴って構造がどのように転移するかを明らかにした。それらの構造は、実測の赤外スペクトルに現れている特長を良く再現するものであり、観測されている構造の同定に本手法が非常に有効であることを示すことが出来た。(2)エンジン内での燃焼反応によって生じる過酸化物を分解するための酸化防止剤として用いられているCuDDP(cuprous dialkyldithiophosphate)について、CuDDPによるCH_3COOHの分解経路を本手法によって系統的に調べ、その反応機構を解明した。(3)大気中での反応として興味が持たれているギ酸(HCOOH)分子とヒドロキシ(OH)ラジカルとの反応について、余計な水単分子が周囲に存在する場合の反応経路を系統探索し、水単分子によってCOOH/HCOOラジカルの生成反応(HCOOH+OH→COOH/HCOO+H_2O)の障壁が低下することを示した。また、水単分子の存在によって、存在しない場合とは異なり、HCOOラジカルよりもCOOHラジカルが優位に生成することを予測した。化学反応は、量子化学計算に基づくポテンシャルエネルギー曲面(PES)上の遷移状態(TS)を求めることによって解析できる。反応経路はTSから始まる最急降下経路で近似することができ、より定量的な解析のためのダイナミクス計算の出発点としても利用することができる。TSは、PES上の一次鞍点に相当するため、化学反応の理論解析は、PES上の一次鞍点を探索する問題であると考えることができる。しかし、PESは分子の振動の自由度と同数の変数を持つ多次元関数であり、多次元空間内で一次鞍点を探索するには、膨大な手間と計算量がかかってしまう。申請者らは、平衡構造(EQ)から出発して、エネルギーの高い方へと反応経路を辿ってPESを上り、TSを自動探索できる手法を開発した。本手法の開発により、EQからTsへ、TSから別のEQへと反応経路を辿って、PES上のEQとTSを次々と芋づる式に探索することが可能となり、PES全体の系統的な自動探索が可能となった。本研究では、超球面探索法を用いてEQとTSを探索し、さらに、得られたEQやTSからのダイナミクス計算を行うことによって、分子構造と化学反応メカニズムの解析を行った。今年度は、水素吸蔵物質として注目されているアミンボラン1(BH_3NH_3)からの、触媒を用いた水素分子脱離反応に応用し、実験の反応メカニズムを解明した。また、酸性水溶液のモデルクラスターであるプロトン化水クラスターH^+(H_2O)_nに応用し、得られた最安定構造からのダイナミクス計算と、得られた多数のEQにおける振動数解析の結果に基づく熱力学シミュレーションを行って、有限温度におけるクラスターの構造を明らかにした。(1)プロトン化水クラスターH^+・(H_2O)_nなどの水素結合クラスターでは、水素結合が容易に組み変わるため、温度変化に伴って構造転移が起こる。そこで、PES上を系統的に調べ、多数の安定構造の候補を探索し、それらを用いた熱力学解析を行う必要がある。これまでは、量子化学計算のPES上で安定構造の候補を効率的に自動探索する手法が存在しなかったため、十分系統的な解析はできなかった。本研究で、超球面探索法によりH^+・(H_2O)_n(n=5-8)の安定構造を探索し、それらを用いた熱力学解析を行った結果、いくつかの研究グループが別々に発表した様々な温度条件での実験結果を統一的に再現でき、各実験で観測したクラスター構造を量子化学計算に基づいて同定できた。(2)CuDDP(cuprous dialkyldithiophosphate)は、エンジン内での燃焼反応で生じる過酸化アルキルラジカルを分解する酸化防止剤として用いられてきたが、その機構は理論的に十分解析されていない。本研究で、超球面探索法によってCuDDPの異性化および分解経路、および、CuDDPによるCH_3COOラジカルの分解経路を系統的に調べ、その反応機構を解明した。

分子やクラスターの構造および化学反応は、量子化学計算によるポテンシャルエネルギー表面(PES)を調べることによって理論解析できる。PESは振動の自由度と同数の変数を持つ多変数関数であり、PES上の系統的な自動探索は非常に難しい課題であった。申請者らはPES上の反応経路をエネルギーの低い方から高い方へと向かって上っていくことのできる一般的な手法(超球面探索法)を初めて開発し、PES上の反応経路ネットワークを直接辿ることを可能にした。これにより、反応経路以外の無駄な部分を計算せずに効率よくPES上を自動探索できる。本研究では超球面探索法を以下の解析に応用した。(1)プロトン化水クラスターH^+・(H_2O)_n(n=5-8)の安定構造の系統的な自動探索を行い、温度変化に伴って構造がどのように転移するかを明らかにした。それらの構造は、実測の赤外スペクトルに現れている特長を良く再現するものであり、観測されている構造の同定に本手法が非常に有効であることを示すことが出来た。(2)エンジン内での燃焼反応によって生じる過酸化物を分解するための酸化防止剤として用いられているCuDDP(cuprous dialkyldithiophosphate)について、CuDDPによるCH_3COOHの分解経路を本手法によって系統的に調べ、その反応機構を解明した。(3)大気中での反応として興味が持たれているギ酸(HCOOH)分子とヒドロキシ(OH)ラジカルとの反応について、余計な水単分子が周囲に存在する場合の反応経路を系統探索し、水単分子によってCOOH/HCOOラジカルの生成反応(HCOOH+OH→COOH/HCOO+H_2O)の障壁が低下することを示した。また、水単分子の存在によって、存在しない場合とは異なり、HCOOラジカルよりもCOOHラジカルが優位に生成することを予測した。
インビボホールセル記録による無麻酔ラット皮質ニューロン膜電位と脳波との連関の解析

脳波とは大脳皮質に発生するリズム性電位変化の集合であり、樹状突起に起こるシナプス後電位の集積であると教科書的には言われている。しかし、いまだその波形の成り立ちは詳細に解明されてはいない。従来の研究では、技術的な問題から麻酔下動物の記録しか安定せず、覚醒動物の様々な脳波とニューロン膜電位変化との比較は困難であった。本研究では、無麻酔覚醒ラットの前肢レバー押し運動中の脳波とニューロン膜電位を同時誘導し、両者の連関を解析することを試みた。技術的困難は克服され解析に耐えうるデータ取得に成功した。無麻酔ラットの脳波とニューロン膜電位の間には高い相関があり、それが行動の局面によって変動することが分かった。脳波とは、大脳皮質ニューロンに発生するリズム性の電位変化を巨視的にとらえたものであり、様々な周波数帯域の波形から構成される。現象論的に、脳波が様々な高次機能と密接に連関した周波数を示すことが分かっており、その電位変化は「樹状突起に起こるシナプス後電位が集積されたもの」と教科書的には説明されているが、いまだその波形の成り立ちについての詳細は明らかになっていない。したがって、当然ながら皮質ニューロンのうち、2/3層、および5層の錐体細胞、さらには介在細胞のうちの、どのニューロンへの入力が脳波波形に対する貢献度の高いものなのか、などの疑問に答えられる知見も皆無である。本研究課題は、「無麻酔」のラットの脳波を記録しながら、主に運動野錐体細胞の膜電位変化を、インビボホールセルパッチクランプ法を用いて記録し、課題遂行時などにおける脳波と膜電位やシナプス入力との連関を解明することを目的として申請され、採択された。初年度(平成25年度)は研究実施計画にのっとり、まずは覚醒ラット大脳皮質ニューロンからのホールセルパッチクランプ記録の技術の改良と安定化に努めた。その過程において、パッチ電極をさらに深く挿入すれば、線条体ニューロンからの膜電位記録も可能であることが明らかになったので、これらについても記録を行うこととした。すなわち、皮質ー線条体神経回路と脳波との連関についても検討を加えることとした。最初の解析対象脳波として、動物が覚醒状態でありながら無動状態である時に特徴的に現れる8Hz前後のhigh voltage spindleに着目し、この脳波と大脳皮質5層錐体細胞や線条体中型有棘神経細胞の膜電位との連関の解析を目標に実験を進めている。脳波とは大脳皮質神経細胞に発生するリズム性の電位変化を巨視的にとらえたものであり、その電位変化は「樹状突起に起こるシナプス後電位が集積されたもの」と教科書的には説明されているが、いまだその波形の成り立ちについての詳細は明らかにされていない。本研究課題では、無麻酔ラットの脳波を記録しながら、主に大脳皮質運動野錐体細胞と線条体中型有棘神経細胞の膜電位を、インビボホールセルパッチクランプ法を用いて記録し、運動時や覚醒無動時などにおける脳波と膜電位との連関を解明することを目的としている。初年度(平成25年度)は覚醒ラット大脳皮質神経細胞からのホールセルパッチクランプ記録の技術改良と安定化に努め、無麻酔運動中のラットからコンピュータ解析に耐えうる時間長の膜電位記録ができるように研鑚した。次年度(平成26年度)は脳表面から3mm以上深い場所までガラス製パッチ電極を刺入し、線条体中型有棘神経細胞からの膜電位記録の安定化に挑戦した。さらに、記録に成功した中型有棘神経細胞が、大脳基底核運動制御神経回路のうち、直接路ニューロンなのか間接路ニューロンなのかを特定する目的で、間接路ニューロンに特異的に発現するプレプロエンケファリンと、記録ニューロンに注入したバイオサイチンとの二重免疫染色を試みた。膜電位記録を行っている時には必ず脳波を同時記録した。現在までのところ、コンピュータ解析による詳細な結果は出ていないが、動物の状態が変化した時に起こる脳波の変化にともない、各ニューロン膜電位の周波数や振幅、シナプス入力の大きさなどに顕著な変化が認められている。初年度(平成25年度)は覚醒ラット大脳皮質神経細胞からのホールセルパッチクランプ記録の技術改良と安定化に努め、無麻酔運動中のラットからコンピュータ解析に耐えうる時間長の膜電位記録ができるように研鑽した。

最終年度(平成27年度)は、研究代表者の勤務先が変わったため、実験機器の整備と補充を行いつつ、引き続き組織学的な検索を続け、記録データの解析を行った。脳波とは大脳皮質に発生するリズム性電位変化の集合であり、樹状突起に起こるシナプス後電位の集積であると教科書的には言われている。しかし、いまだその波形の成り立ちは詳細に解明されてはいない。従来の研究では、技術的な問題から麻酔下動物の記録しか安定せず、覚醒動物の様々な脳波とニューロン膜電位変化との比較は困難であった。本研究では、無麻酔覚醒ラットの前肢レバー押し運動中の脳波とニューロン膜電位を同時誘導し、両者の連関を解析することを試みた。技術的困難は克服され解析に耐えうるデータ取得に成功した。無麻酔ラットの脳波とニューロン膜電位の間には高い相関があり、それが行動の局面によって変動することが分かった。1研究代表者は無麻酔脳定位固定動物を用いたインビボホールセルパッチクランプ法にさらに習熟し、脳表面から12mmの大脳皮質錐体細胞へのパッチクランプなら、大脳皮質スライスパッチと同じ感覚で成功するようになった。2覚醒動物が無動状態であるときに特徴的に出現するhigh voltage spindle(HVS)と、大脳皮質錐体細胞や線条体中型有棘神経細胞の膜電位が同期して振動することを確かめた。この膜電位振動の過分極がGABA作動性入力によるのかどうかを調べるために、高クロライドパッチ内液を用いた。もしクロライド平衡電位の上昇により膜電位の過分極が興奮性に転じたら、GABA入力の寄与が大きいと結論付けられる。しかし、現在までの実験からは、高クロライド内液でも低クロライド内液でも膜電位振動に大きな違いが見られていない。さらなる検討を要するが、GABA作動性介在細胞が錐体細胞や中型有棘細胞の膜電位を周期的に抑制するためにHVSのリズムが発現しているとは考えがたい、という結果が得られた。3同志社大学・脳科学研究科・藤山文乃教授のご指導ご協力のもと、間接路ニューロンを特異的に染色する免疫組織学的実験を試み、バイオサイチンが注入された線条体中型有棘神経細胞の一部はプレプロエンケファリン陽性の間接路ニューロンであったことが示された。パッチ内液による細胞内液ウォッシュアウトに耐えてプレプロエンケファリンが染色されたのは大きな前進である。神経生理学平成27年度は、電気生理学および組織学実験データの取得・整理を行い、続いて連携研究者である玉川大学・脳科学研究所・礒村宜和教授のご指導ご協力を得て、パワースペクトル解析や相互相関関数など最適な周波数解析法を用い、脳波と個々のニューロン膜電位との連関を明らかにする予定である。これらの解析から、大脳皮質-基底核の運動制御に関わる神経回路構成ニューロンと脳波に発現するリズム活動の発生機序について考察したい。1研究代表者は無麻酔脳定位固定動物を用いたインビボホールセルパッチクランプ法を用いた大脳皮質5層錐体細胞膜電位記録に習熟し、成功率が年度当初に比べ格段に上昇している。さらに、ガラス電極の改良などにより、脳表面から3ミリ以上深い位置にある線条体においても中型有棘神経細胞(MSN)の膜電位記録を可能とした。2脳波記録用電極は、パッチクランプ用電極の取り回しに支障が無いようにマニュピレータでの操作を避け、接地・参照電極と同様の埋め込み型に工夫した。さらに、安全策として2本用意することで実験の成功率を高めた。
二点配位型ルイス酸触媒の精密デザインと合成的応用

本研究では、次世代の精密有機合成化学への多大な進展に向けて、二点配位型ルイス酸触媒の合理的、合目的な触媒設計を行い、他の反応触媒では及びもつかないような反応性、選択性が獲得できるような、精密合成反応プロセス(触媒的不斉合成も含む)の確立を目指した.その結果、酸素架橋された光学活性チタンルイス酸触媒によるニトロンの1, 3-双極子付加環化反応において、配位子および基質の分子デザインにより、二点配位型ルイス酸触媒に特異的な優れた基質一般性を有する反応系の構築に成功した.また新たな精密ルイス酸触媒の創製では、触媒の活性中心として典型金属や前周期遷移金属のみならず、二つのカルボン酸部位を単一分子内に有する触媒設計に取り組んだ.本研究では、次世代の精密有機合成化学への多大な進展に向けて、二点配位型ルイス酸触媒の合理的、合目的な触媒設計を行い、他の反応触媒では及びもつかないような反応性、選択性が獲得できるような、精密合成反応プロセス(触媒的不斉合成も含む)の確立を目指した.その結果、酸素架橋された光学活性チタンルイス酸触媒によるニトロンの1, 3-双極子付加環化反応において、配位子および基質の分子デザインにより、二点配位型ルイス酸触媒に特異的な優れた基質一般性を有する反応系の構築に成功した.また新たな精密ルイス酸触媒の創製では、触媒の活性中心として典型金属や前周期遷移金属のみならず、二つのカルボン酸部位を単一分子内に有する触媒設計に取り組んだ.本研究では、次世代の精密有機合成化学への多大な進展に向けて、二点配位型ルイス酸触媒の合理的、合目的な触媒設計を行い、他の反応触媒では及びもつかないような反応性、選択性が獲得できるような、精密合成反応プロセス(触媒的不斉合成も含む)の確立を目指している。すなわち、精密ルイス酸触媒の創製では、本研究室で開発された「二点配位型ルイス酸」の適用範囲を拡張するため、今年度は二点配位型キラルチタン触媒を用いる不斉1,3-双極子環状付加反応や多置換型シクロプロパン化反応などの開発を行なった。とくにニトロンとメタクロレインとの不斉1,3-双極子環状付加反応では、ニトロンの窒素上の置換基をかさ高くすることによって、3,4-エンド体が高エナンチオ選択的に得られることを見出した。この際、従来の触媒で見られるような3,5-エンド体はほとんど生成しなかった。窒素上の置換基効果をさらに詳細に検討したところ、ジフェニルメチル基が最も良い結果を与えることが判った。また、二点配位型ブレンステッド酸として光学活性ビナフチルジカルボン酸の3,3'-位にアリール置換基を導入した触媒を設計した。とくに、ビナフチルジカルボン酸の3,3'-位に2,6-ジメチル-4-tert-ブチルフェニル置換基を導入した二点配位型キラルブレンステッド酸触媒は従来汎用されているキラルビナフトキシリン酸触媒に較べて、ジアゾ酢酸エステルやジアゾリン酸エステルと活性イミン化合物との不斉マンニッヒ反応において高いエナンチオ選択性が発現することを見出した。本研究では、次世代の精密有機合成化学への多大な進展に向けて、二点配位型ルイス酸触媒の合理的、合目的な触媒設計を行い、他の反応触媒では及びもつかないような反応性、選択性が獲得できるような、精密合成反応プロセス(触媒的不斉合成も含む)の確立を目指している。すなわち、精密ルイス酸触媒の創製では、本研究室で開発された「二点配位型ルイス酸」の適用範囲を拡張するため、昨年に続き、今年度は二点配位型キラルチタン触媒を用いる不斉1,3-双極子環状付加反応における局選択性獲得のための触媒設計を行なった。とくに光学活性配位子としての光学活性ビナフトールの6,6'位の置換基効果を詳細に検討し、電子吸引基としてブロモ基を導入したところ、ほとんど効果が見られなかったものの、塩素やヨウ素基ではエナンチオ選択性が少し向上し、トリフルオロメチル基を用いると97%eeになることを見出すことができた。また、二点配位型ブレンステッド酸として光学活性ビナフチルジカルボン酸の3,3'-位に2,6-ジメチル-4-tert-ブチルフェニル置換基を導入した二点配位型キラルブレンステッド酸触媒は、アルデヒドのN,N-ジアルキルヒドラジンと活性イミン化合物との不斉イミノアザエナミン反応において高いエナンチオ選択性が発現することを見出した。さらに、このキラルブレンステッド酸触媒は、ジアゾ酢酸アミドと活性イミン化合物との不斉アジリジン化反応においても、反応がトランス選択的に進行することが判り、高いエナンチオ選択性が認められた。
腫瘍抗原提示と樹状細胞の機能改変を同時に行う遺伝子免疫療法の新規治療戦略

IAPファミリーの一つである、survivinを樹状細胞(dendritic cell : DC)に遺伝子導入した遺伝子免疫療法の基礎研究を行った。survivinが腫瘍細胞にのみ強く発現しており標的遺伝子として有用であることを証明した。survivinは抗癌剤抵抗性になった癌でも発現が認められ、抗癌剤耐性がん細胞にも有用である可能性を示唆した。またsurvivinは抗アポトーシス作用により、survivinを導入したDCがより長期にわたって生存することが可能になる。このことによりsurvivinを導入したDCでは長期間にわたり細胞障害活性を誘導できることを示した。I各種膀胱癌細胞株におけるsurvivinの発現の確認、抗癌剤耐性株の作製とsurvivin発現増強の検証(1)膀胱癌だけでなく各種泌尿器癌細胞株(T-24、)からRT-PCRでmRNA、western blotでタンパク発現を確認した。どの細胞株でもsurvivinの発現を認めた。しかしその発現強度においては有意差を認めなかった。(2)T-24を用いて低濃度の抗癌剤(cisplatin、Paclitaxel)存在下で培養しそれぞれの抗癌剤耐性T-24(T-24-CDDPR、T-24-PTXR)を作製した。抗癌剤耐性能をMTT assayで確認し、薬剤耐性であることを確認した。survivinのmRNA、タンパク発現レベルを確認したが、耐性獲得前の細胞株の発現レベルと有意差はなく、survivinによらない耐性獲得が類推された。この耐性株は最近樹立されたものであり、今後詳細に検討を加える予定である。(1)survivin発現アデノウィルスベクターの作製をおこなった。これをT-24に遺伝子導入を行ったが、十分なウィルス濃度が得られず、survivinの導入効率が悪く(発現の増強葉は認める。)抗癌剤の耐性の獲得にまで至っていない。現在ウィルス濃度をあげるべく調整中である。IIIアデノウィルスベクターによるDCへのsurvivin遺伝子の導入と発現についての検討を行った。IV survivin遺伝子導入でDCの生存期間、生存率の延長が得られるかについての検討前年度IIIIに引き続き、下記の研究を行った。IV survivin遺伝子導入でDCの生存期間、生存率の延長が得られるかについての検討V膀胱癌細胞株(母細胞と抗癌剤耐性株の双方)に対するCTL誘導能の検討(1)膀胱癌細胞株(母細胞および抗癌剤耐性株)に対する細胞傷害活性の検討膀胱癌細胞株T-24に対してコントロールに比して高い障害活性(E/T比25で約40%)を認めた。抗がん剤耐性株に対しては、現在検討中である。(2)誘導された細胞傷害活性の解析誘導された障害活性については抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗MHCclassI、抗MHCclassII抗体を用いたantibody blocking assayを行い、MHC classI拘束性、CD8優位な障害であることを認めた。(3)DCへのsurvivin導入時期についての検討CTLを誘導する時期をsurvivinの遺伝子導入時期から1週間ずらしても行ったが、即時でCTL誘導を行った時に比べて強度は落ちるものの高い細胞障害活性が得られることを認めた。
臨床的根拠に基づく新しいカクテル治療の研究-各種治療法・装置を効果的に組み合わせたカクテル療法に関する基礎研究-

矯正治療を安全で効果的に実施するため各症状(I、II、III級不正咬合)に対する治療方法、使用装置の組み合わせ治療、すなわちカクテル療法に関する基礎的研究を行った。資料には若年I級抜歯(18)、非抜歯(16)、成人抜歯(13)、非抜歯(17)、著年II級抜歯(41)、非抜歯(35)、成人抜歯(24)、非抜歯(11)、III級若年(27)、非抜歯(22)、成人抜歯(20)、非抜歯(12)の計256名を用いた。また合わせて治療の安全性に留意しなければならない歯根吸収、歯肉退縮の出現状況を調査し次の結果を得た。1.エッジワイズ装置と他の矯正装置(EOA、MPA、顎間ゴム)の組み合わせは効果的な付加的な装置の使用により治療成績の向上が認められた。2.治療法の特徴的な差(抜歯、非抜歯)は認められないものIII級若年成入群で治療成績の低下が認められた。3.治療法の差(抜歯、非抜歯)と治療の危険因子(歯根吸収と歯肉退縮)出現状況を調査したところ若年、成人群ともに抜歯症例群の方が出現が多く、また若年者に比べ成人群の方により高い出現傾向を認めた。4.以上のことから治療成績を上げるためのエッジワイズ装置+他の装置との効果的な使用、すなわちカクテル療法の有効性が示唆された。しかし治療に伴う危険因子としての歯根吸収や歯肉退縮の出現状況も確認されたことから治療の効率と危険因子との関連性の追求が課題として残された。平成12年に整理されたは下記動的治療終了時の資料をもとに平成13年度は各治療関連因子の組み合わせによる治療成績ならびに効果の判定を行った。【治療関連因子の組み合わせについて】1.骨格性の異常による分類(ANB角)2.治療法による分類(抜歯・非抜歯)3.使用装置による分類(マルチブラケット単独・顎骨の成長発育に関与する装置)4.治療経過による分類(治療期間・回数)5.治療危険因子の出現の有無による分類(歯根吸収・歯肉退縮)6.保定の安定度による分類(再治療群・安定群)【中間結果(報告)について】1.骨格性の症状の差により、各群間での治療結果・成績に差異が見られた。2.同類の症状であっても抜歯、非抜歯の治療差により治療結果・成績に差異を認めた。3.顎骨の成長発育コントロール(促進・抑制)では、その後のマルチブラケット装着期間・治療回数の減少が見られた。4.治療危険因子(歯根吸収・歯肉退縮)の出現は治療期間が長いものほど出現率が高かった。5.保定の安定度による分類(現在分析中)。平成12年度に資料整理、13年度に治療の効率化に関与する治療関連因子を探索した。その結果、13年度の実績報告書に述べた(1)骨格性、(2)治療開始時期、(3)治療法としての抜歯非抜歯の選択、(4)装置の組み合わせなどを考慮することにより治療の効率化(治療期間の短縮化、医療費の削減)が図れることが示唆された。一方、効率化と並行して探索してきた治療危険因子としての歯根吸収ならびに歯周疾患等の発現に関しては、必ずしも治療の短縮化と並行した結果は得られなかった。さらに、動的治療を終了し獲得された個性正常咬合の維持に関しては、治療法の差(抜歯、非抜歯)や保定装置の種類とは関連正が低く、むしろ保定装置の長期使用が推奨された。以上の結果を平成14年度作成の報告書(冊子)にて報告する。
希土類・遷移金属複合酸化物相の安定性と錯体からの合成プロセスの開発

希土類とクロムおよびマンガンの2-エチルヘキサン酸錯体を合成し、これらの混合物を適当な有機溶媒に溶解してこの溶液を焼成して希土類-遷移金属複合酸化物の単一相を得た。X線により生成物の同定をしている。特に通常の個相反応では合成困難なLnMn_2O_5相が比較的容易にこの方法により合成できたことは成果の一つである。次にLaCrO_3とNdCrO_3の熱容量を室温付近で測定した。測定方法は示差走査熱量計(DSC)を用いその昇温パターンを工夫して精度良く測定する方法を本申請者らが開発しているのでこれを用いた。LaCrO_3については磁性転移と結晶転移に伴なういわゆるλ型比熱ピークを観測した。またNdCrO_3についても磁気転移を観測できた。順次各希土類についてこれら熱力学的な基本量を測定、解析した。一方NdMn_2O_3についてはこの物質の相安定性は温度と酸素分圧に大きく依存するために、DTA-TGを用いて1000°C近辺の温度にて酸素分圧を変えた下での分解平衡点を求めPo_2-T線図を作成した。さらに分解生成物のX線回折法による同定によりこの物質の分解反応式が決定でき、この式と実験的な相図より反応に関与する各熱力学量(自由エネルギー、エンタルピー、エントロピー等)を求めることができた。これによりNdMn_2O_5相の安定性を議論できるようになった。この相はペロブスカイト相と隣り合っているが、ペロブスカイト相は極めて安定性の高いものであるのに対し、NdMn_2O_5相はその存在領域が狭く、このために個相反応での生成の困難な原因も解明できた。このように希土類マンガナイト系の特に高温での熱力学量を求め、クロマイト系にてもデータを出した。
19世紀ヨーロッパ印象派を中心とした風景画に描かれた都市景観の視点場調査

本年度は、19世紀ヨーロッパ印象派の視点場を探索し、視点場と視対象の空間的特徴を検討した。主な内容は、次の5つである。1.19世紀ヨーロッパの都市的風景画の視点場調査を行い、視点場空間の特徴や視対象の特徴を調べた。その結果、視点場の多くは、道路の交差点やその近傍のオープンスペースであり、視対象は、まちなみのスカイラインを特徴づける教会が仰角10度程度で望めることがわかった。2.ピサロが描いた都市風景画にしぼりその視点場空間を調査した。その結果、ピサロは、特定の地点から多数の絵画を描いており、それらを左右に絵画をつなぎ合わせると、パノラマ的な景観となる絵画を描いていることがわかった。このような景観を可能にした視点場は、港湾や広場に面した建物の上階、河川沿いに面した建物の上階であることを明らかにした。3.ユトリロが描いたモンマルトル地区の絵画は、視点場と主な視対象までの距離が300m以内の近景、その仰角は1020度であることをなどを明らかにした。さらに、それらの視点場をむすびつける散策ルートを提案した。4.シスレーは、橋、教会、門それに河川を含めて河川景観を好んで描いているが、河川沿いの広場が視点場として有効に利用されていることがわかった。5.ヴェネツィア景観を描いたカナレットは、広場を中心として描いた絵画と大運河を中心に水辺の景観を描いた絵画の2つのタイプの絵画を描いていること、また複数の視点場から描いた絵画が多数あり、遠くに見える景観要素をわかりやすく描いた。平成12年度は、既往研究の調査対象の絵画の視点場空間調査を実施した。調査対象の絵画は、コロー、モネ、ピサロ、スーラなどが描いた都市的風景画であり、その描かれた国(都市)は、フランス(都市7)、イタリア(都市4)、ベルギー(都市1)、オランダ(都市2)、ドイツ(1都市)の計5国(15都市)である。今年度の現地調査では、比較分析のため同様な調査を、韓国山水画の視点場(韓国・ソウル)で実施した。1)視点場の実測:視点場となる道路の交叉点や広場などの幅員、舗装の仕上げ面、樹木等の実測調査を行い、図面化した。他の交叉点に比べ視点場となる交叉点は、変形交叉点であり開放性が高いことがわかった。2)視対象の計測:主な対象物までの距離を計測、近景、中景、遠景、さらに視対象の比高の検討、視野の水平角の計測、視対象周辺の建物用途分布を調査した。街の全貌を見渡す景観では、遠景の仰角が5度以下、シンボリックな建造物を見る景観では、近景で平均仰角が25度、道路と建築のパースペクテイブな景観では、中景で仰角1020度であること、道と河川のパースペクテイブな景観と河川とまちなみの景観、港湾の景観では、中景で510度であること、遠景になると5度程度であることがわかった。3)絵画、その視点場の地図、現地の写真のデーターベースの作成:調査データの整理のために地図および現地写真のデーターベースの作成をおこなった。共同研究者、協力者のためであるが、最終年度には、これを公開できるような形のデーターベースの作成をめざしている。今年度は、ピサロとユトリロの絵画に限定した現地調査を行なった。また、フランス国土地理院(IGN)を訪問して、各都市の1/25,000の地図、および1/5,000の地図(1970年版)を収集し、詳細な視点場を計測した。1.パノラマ景観の視点場の現地調査:ピサロが描いたフランスの3都市(パリ、ルーアン、デウユッペ)で私たちが視点場を確定できた絵画は、144点である。