hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロRNAの量的・質的変動を解析するシステムの構築

マイクロRNAをはじめとするncRNAの量的・質的変動を評価するために、質量分析を基盤とする分離分析システムの高機能化と高性能化を図った。RNAの精密分離やRNAの断片化を迅速に行える様々なモノリス型キャピラリーデバイスを開発するとともに、それらを繋ぎ合わせてncRNAの分析に特化した分離計測システムを構築した。また、ヒトiPS細胞やヒト肝がん細胞(HepG2)を様々な条件下で培養し、その細胞内に発現してくるncRNAの網羅的な分析を実施した。化学物質の暴露により、複数種のncRNAの発現量が顕著に増加し、なかには、その近傍に存在する遺伝子の発現量に多大な影響を及ぼすものもあることが分かった。miRNAの動態を定量的に評価する分析法の確立を目指し、初年度(H27年度)は以下に示す要素技術の開発を中心に研究を実施した。ESI-MSにおける検出感度は試料導入流量と密接に関係している。本研究では、nano-spray ESI-MSに適した最善のnano HPLCを構築するために、内径が250 μm以下のピークシルチューブをカラム管として用い、その中で様々なモノマー溶液をin situ重合することにより、逆相やイオン交換、親水性相互作用(HILIC)など種々の分離モードのキャピラリーカラムをカスタムメードすることに成功した。また、RNAの同定作業で汎用される酵素消化のオンライン化を図るために、モノリス担体表層にリボヌクレアーゼ(RNase)を固定化したマイクロリアクターを試作し、その切断能を合成オリゴヌクレオチドを用いて評価した。数マイクロメートルの微小空間を利用するマイクロリアクターでは数秒もあればほぼ定量的に消化が進み、通常のバルク空間(エッペンドルフチューブなど)での反応と比較して格段に効率が向上することを確認した。2. nano HPLCとMALDI-TOFMSとのハイフネーテド分析システムの構築nano HPLCとMALDI-TOFMSのインターフェースとして市販のナノスポッティング(分注)装置をカスタマイズし、その使用条件の最適化を図りながら、miRNAのイオン化に適したマトリックス試薬の探索を並行して行い、sub-fmolレベルのmiRNAを検出できるところにまで到達した。細胞内におけるmiRNAの生合成と代謝分解過程を定量的に評価するための分析技術の開発を目指して、H27年度はその要素技術となるモノリス型キャピラリーデバイスの開発とマイクロ-ナノフローシステムの構築を図ってきた。また、質量分析装置との結合のためのインターフェースの改善にも着手しており、概ね順調に研究は進んでいると判断される。ncRNAの動態を定量的に評価する分析法の確立を目指し、H28年度は以下の研究を中心に取り組んだ。1) Ce (IV)固定化モノリス型マイクロリアクターによるリン酸エステル結合の切断(加水分解能の評価)及びトルラ酵母由来のtotal RNAの断片化.モノリス担体表層に様々な希土類金属イオンを固定化したマイクロリアクターを試作し、その加水分解能を調査した。p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)を用いてリン酸エステル結合の切断能を評価したところ、Ce (IV)を固定化したマイクロリアクターでは、反応時間1分で90%以上のpNPPがp-ニトロフェノール(pNP)に分解されることを確認した。続いて、トルラ酵母由来のtotal RNAの断片化を試みたところ、1分程度でほぼヌクレオチドにまで切断され、さらに5分反応させるとヌクレオシドにまで切断が進行することを確認した。なお、核酸塩基由来のピークは観測されなかったことからN-グリコシド結合の切断は起きないことも分かった。さらに、反応時間やセリウムの活性を制御することで、オリゴヌクレオチドまでの切断に留めるといったリボヌクレアーゼ様の選択的な切断の可能性も見出せた。2) ncRNAをバイオマーカーとして用いる化学物質暴露影響調査に関する基礎研究.未分化のヒトiPS細胞をフィーダーレスにて培養した後、神経幹細胞へと分化させる技術を習得した。この幹細胞にシクロヘキシミドや過酸化水素、塩化亜鉛、塩化水銀を暴露し、mRNAやncRNAの発現量の変化を定量PCRによって調査した結果、複数種類のncRNAが顕著に増加することを確認した。また、そうしたncRNAのなかには、隣接する遺伝子の発現量に深く関与しているものがあることを見出した。近年、注目を集めている長鎖(200 nt以上)のncRNAにまで研究対象を拡げるべく、断片化技術の開発を進め、セリウム(IV)触媒を利用したマイクロリアクターに関して興味深いデータを収集しつつある。また、分担研究者の谷らが中心となって、ncRNAをバイオマーカーとして用いる化学物質暴露影響調査に関する研究を進めるなど、当初の計画以上に進展している部分もあり、全体として順調に進んでいると判断される。ncRNAの動態を定量的に評価する分析法の確立を目指し、最終年度であるH29年度は以下の研究を中心に取り組んだ。1)ハイフネーテッド質量分析技術の開発元素の高感度分析が可能な誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)では、金属元素であれば概ね90%以上がイオン化されるため、精度よく定量分析を行える。一方、リンや臭素のような非金属元素はイオン化効率が悪いため、通常はICP-MSの分析対象となることは少ない。しかし、10%程度はイオン化されており、その割合は安定しているため、選択性に優れ精度もよい定量法として潜在的価値を有する。本研究では、質量分析計に負担が少ないように内径の小さなキャピラリーHPLCシステムを採用するとともに、バックグラウンドノイズを低減するべく適切な溶離液の選択と共存成分

由来のピークの除去を図り、RNAの構成要素であるリン(P)、および標識として導入したハロゲン元素の定量に成功した。2) ncRNAをバイオマーカーとして用いる化学物質の暴露影響評価技術の開発ヒトiPS細胞やヒト肝がん細胞(HepG2)を様々な条件下で培養し、その細胞株に発現するncRNAやmRNAの分析を定量PCR法により行った。過酸化水素や塩化水銀、シクロヘキシミド、エトポシドのような化学物質に暴露させた際に顕著に増加するncRNA(バイオマーカー候補)をいくつか見出すことができ、それらの経時的な代謝分解過程を詳細に調査した。その結果、分解が抑制されることによってncRNAが細胞内に蓄積されていくということが分かった。さらに、RNA干渉法を用いてRNA分解酵素をノックダウンする実験により、暴露によって増加したncRNAの分解に関与する酵素をいくつか特定することができた。マイクロRNAをはじめとするncRNAの量的・質的変動を評価するために、質量分析を基盤とする分離分析システムの高機能化と高性能化を図った。RNAの精密分離やRNAの断片化を迅速に行える様々なモノリス型キャピラリーデバイスを開発するとともに、それらを繋ぎ合わせてncRNAの分析に特化した分離計測システムを構築した。また、ヒトiPS細胞やヒト肝がん細胞(HepG2)を様々な条件下で培養し、その細胞内に発現してくるncRNAの網羅的な分析を実施した。化学物質の暴露により、複数種のncRNAの発現量が顕著に増加し、なかには、その近傍に存在する遺伝子の発現量に多大な影響を及ぼすものもあることが分かった。本研究は臨床応用に資する情報の収集を目指している。したがって、要素技術の開発に留まることなく、次年度からは積極的にライフサイエンスへの応用を見据えた基礎研究を開始していく。特に、本研究ではmiRNAの分解制御を切り口としてmiRNAの分解速度の違いから、がんをはじめとする各種疾病に特徴的なmiRNAの探索を行うことをポイントとして挙げており、今後は核酸アナログ(ブロモウリジン)を用いたmiRNAの運命予測を中心に研究を展開していく。本研究は、化学物質の安全性評価や疾病の早期診断等の実用的な応用を出口として見据えており、要素技術の開発に留まることなく、最終年度はさらにライフサイエンスへの応用を意識して研究を展開していく。特に、本研究では代謝分解を受けやすい短寿命のncRNAに注目し、その発現量や分解速度の違いを基にして、各種疾病に特徴的なncRNAの探索を試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。分析化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
核酸と蛋白質の特異的認識反応に関する量子化学および分子動力学による研究

生体高分子間の特異的認識作用は、水素結合やイオン結合によって担われている。生体高分子間の認識反応をシミュレートする際には、用いるポテンシャルがこのような水素結合による系の安定化を表現できることがまず第一に重要である。そこで、これまでに生体高分子の構成分子間の非経験的分子軌道法による量子化学計算だけに基づいて導出したab initio potentialが、蛋白質の荷電側鎖間の相互作用をどの程度良く表現できるのかについての検討をおこなった。その結果、非経験的分子軌道法によって得られる相互作用の距離依存性や角度依存性をかなり良く再現することが分かった。すなわち、ab initio potentialによる計算は、蛋白質の荷電側鎖間の構造を良く表現することができる。非経験的分子軌道法計算を生体高分子の相互作用系の動的な性質を得るためにそのまま適用することは計算時間が非常にかかりすぎるために事実上できないが、その代わりにこのab initio potentialを用いて系の動的な性質の解析を信頼できる精度ででることを、本研究の結果は示している。生体においては、多くの場合、生体高分子は水分子の存在を無視した状態では存在しえない。水溶液中における生体高分子の構造を知ることが、生体における分子間の特異的相互作用を理解する上で重要である。水溶液中における糖の高次構造を求めるために、ab initio potentialを用いて水分子を顕に考慮した分子動力学法による計算を適用した。その結果、水分子が糖と直接水素結合を形成し、そのために、水溶液中における糖の高次構造やその変化のしやすさが真空中とは大きく異なることを明らかにした。
環太平洋地域の文化とシステムのダイナミクスに関する研究

本研究では、環太平洋地域における文化のダイナミクスを政治経済システムとの連関において理解するために、選択した特定地域で人類学的調査を行い、以下の諸点について成果を得た。1.インド南部からシンガポールへ移民した人々のヒンドゥー教の実践が、少数民の共同体と文化多元的国民国家の双方の象徴となるようなエスノ=ナショナリゼーションのプロセス。2.マレーシアで移民労働に従事するインドネシア東部の人々の、「伝統の言説」と「発展の言説」の対比と、そこでの市場経済の位置づけ。3.ニュージーランドのサモア人移民社会の、サモア人社会全体との文化関係、及び世代による新しいアイデンティティ創出のプロセス。4.メキシコ西部のメスティソ共同体における、米国への移民、土地所有制度、政治的アイデンティティの変化のプロセス。5.グローバル資本主義の周辺に位置するフィジーで、貨幣への欲求が文化的社会的問題を増大させ、経済的な行き止まりへと導くプロセス。6.ニュージーランドとオーストラリアで発展してきた地域通貨のシステムと、それが共同体的社会関係を生み出す過程。7.インドネシア「伝統」産業としてのバティック布生産の、市場競争と技術革新の中でのダイナミックな発展のプロセス。8.ペルーの農民が、クレオールの都市としての首都リマに移住し旧体制を圧倒し、アンデスの伝統に基づく新たな資本主義的再編成をもたらす過程。9.中米グアテマラ北西部から米国へ向かう労働移民が、巨額の資金を得てコーヒー生産を開始する経済的インパクトと、移民の基点としての農村共同体の安定性。労働の移動と共同体の生成の問題は、どの地域にも共通してみられる。システムの側では、労働需要に起因する人的移動、非効率化した国民国家、グローバル化した市場構成が際立つ。文化の側では、対面交渉のもとに社会関係を成立させ、アイデンティティ成立の基盤となるような共同体が際立つ。このように、システム面の「(グローバル)市場」と、文化面の「(ローカル)共同体」が相互に関わるところに現れるさまざまなかたちを、理念型として整理し提示した。本研究では、環太平洋地域における文化のダイナミクスを、政治経済システムを含むマクロ・システムと連関するプロセスとして人類学的に分析する。環太平洋地域の網羅的把握よりは、サンプル的地域についての集中調査とシステム分析を行っており、本年度はグアテマラ北西部、メキシコ西部、フィジ-、インドネシア中部、インドネシア東部、ハワイにおける調査が中心であった。本研究の代表者と分担者が既に行ってきた先行調査を基礎に、諸文化と諸システムのダイナミクスを、特定の〈システム〉に還元せずに理解する方法を探っている。以下の問題について研究の進展をみた。1.グアテマラ北西部の地方都市と農村部における文化の動態と、国家レベルの政治システム、国際レベルの移民システム、世界レベルの経済システムとの連関。2.フィジ-の農村部と都市における、市場経済システムの拡大と文化の動態。3.インドネシアのフローレス島からマレーシアへの出稼ぎ移民の言説を通じた、国家と移民のシステムの分析。4.インドネシアのジャワ島の「伝統的」繊維産業の成立・発展と、「近代的」経済システム・国家システム・国際資本主義システムとの関わり。5.ハワイのタミール人移民の、宗教文化におけるダイナミクス。6.メキシコ西部の農村部における、社会的アイデンティティの形成と政治文化の変容のプロセスと、土地所有・国家政治・米国移民のシステムとの関係。本研究では、環太平洋地域における文化のダイナミクスを、政治経済システムを中心とするマクロ・システムと連関するプロセスとして人類学的に分析することを試みている。環太平洋地域の網羅的把握よりは、民族誌的資料の蓄積があるサンプル的地域について集中調査を行い、そこにマクロ要因を見出そうとしている。

本年度は中央アメリカ、メキシコ、フィジー、ニュージーランド、インドネシア中部、インドネシア東部、マレーシア、シンガポール、中国における調査が中心であった。本研究の代表者と分担者が行ってきた先行調査を基礎に、諸文化と諸システムのダイナミクスを、特定の〈システム〉に還元せずに理解する方法を探っている。以下の問題について研究の進展をみた。1.グアテマラ北西部において国内政治と国際移民と世界市場の連関のもとに生まれる文化のダイナミズム。2.フィジーの経済システムの変容と社会文化的要因による経済的困難の拡大。3.インドネシアのフローレス島からマレーシアへの経済移民の言説とその文化的コンテクスト。4.インドネシアの「伝統的」繊維産業における商品流通の広域化と意味の変化。5.シンガポールのヒンドゥー移民文化におけるテキスト化とコンパクト化の進行。6.ニュージーランドにおける相互扶助システムとしての地域通貨と市場経済の関係。7,中国上海の新たな資本主義の展開における文化的歴史的要因。8.メキシコ西部の農村部における政治文化の変容のプロセスと国家レベルの政治経済。本研究では、環太平洋地域における文化のダイナミクスを、政治経済システムを中心とするマクロ・システムとの連関において理解する方途を探ってきた。環太平洋地域から選択した特定地域について人類学的調査を行い、その蓄積に基づいて、文化の動態とシステム要因の関わりを特定の〈システム〉に還元せずに分析した。平成11年度には、中央アメリカ、アメリカ合衆国、メキシコ、ニュージーランド、フィジー、インドネシア東部、インドネシア中部、シンガポール、マレーシアを中心に現地調査を行い、以下の諸点について研究の進展をみた。1.グアテマラ北西部における経済システムと人的移動と文化変化の相関。2.移民が経済システムを変容させるメキシコ西部の政治的社会的アイデンティティのダイナミクス。3.ペルーの経済システムを変えつつある都市移民の文化的起源。4.ニュージーランドの移民社会における文化変化と経済システムの連関。5.フィジーにおける経済システムの発展とその文化的社会的限界。6.ニュージーランドとオーストラリアにおける地域通貨の発展と共同体の意味の変化。7.インドネシア東部からマレーシアヘの労働移民における経済システムの文化的意味。8.インドネシア中部の伝統的繊維産業の発展における文化的現代性の問題。9.南アジアからの経済移民によるシンガポールの宗教文化の展開のプロセス。これらの調査資料に基づき、国内外から研究分担者と研究協力者を集めて国際会議を開き、環太平洋地域全体のコンテクストにおける比較検討によって研究の集約をはかった。
半導体ナノ粒子薄膜を用いた新規光メモリーデバイスの開発

コロイド化学的にCdSe・ZnSコアシェル型ナノ粒子を合成し、スピンコート法によりガラス基板上にナノ粒子薄膜を作製した。この薄膜を窒素雰囲気下で連続励起すると、蛍光強度が時間とともに増加し、最終的に飽和値に達することが観察されている。また前年度の研究において以下のような仮説が提案されていた:励起したナノ粒子は、発光再結合とイオン化の大きく分けて2つのパスが存在する。粒子がイオン化した場合、電子が基板へ放出される。基板へ放出された電子は静電気的ポテンシャルを生み出し、周囲の粒子のイオン化が抑制されるため、発光再結合を行う確率が上昇して発光効率が上昇する。本年度の研究において以上の仮説を検証するため、現象の基板依存性について調べた。まず真空中で励起光を照射しながら蛍光スペクトルを測定できる装置を組み立て、ナノ粒子薄膜を様々な基板上に作成した。金基板上の薄膜を励起した場合、蛍光強度は弱いまま一定であった。一方、ガラス基板とシリコン基板上の薄膜を励起した場合には、蛍光強度の増加が観察された。この結果から、基板が導電性である場合には電子が基板にトラップされず、蛍光強度増加現象の原因となる静電気的ポテンシャルが生み出されないことがわかった。基板中に存在する電子のトラップサイトについて詳細に調べるため、スパッタによって様々なxの値を持つSiOx基板を作成し、その上にナノ粒子を塗布した。この薄膜を連続照射すると、x=1.9の場合には蛍光強度は著しく増加したが、x=0.6の場合には増加率が低かった。この結果から、酸素原子由来の欠陥が電子のトラップサイトとして働いており、欠陥の多い膜において蛍光強度増加現象が大きく見られることがわかった。以上の内容は論文にまとめ、現在投稿中である。今後この現象を光メモリーに応用していくために、基板中に存在する酸素欠陥を制御する必要があることが示唆された。スピンコート法により、ガラス基板上にCdSe/ZnSコアシェル型の半導体ナノ粒子薄膜を作成した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、「記録の書き込み」として7.4μm四方の微小領域に強度の強い励起光(11nW1370nW)を照射した。その後、「記録の読み出し」として60μm四方の領域に強度の弱い励起光(0.6nW)を照射することで、直前書き込みを行った7.4μm四方の微小領域と、書き込みを行っていないその他の領域の蛍光強度の差を読み取った。記録の書き込み、読み出しに用いた励起光の波長はすべて488nmで行った。その結果、書き込み操作で使用した照射強度が強いほど該当領域の蛍光強度の増加率が低く、照射強度が弱いほど蛍光強度の増加率が高いことが確認された。この現象を用いて、照射強度による蛍光強度の多値記録が可能であることが示された。さらに、強度11nWの励起光を用いて、微小領域の蛍光強度を初期蛍光強度の約3倍に増加させた後、強度1370nWの励起光を同じ領域に照射すると、蛍光強度が初期蛍光強度の約1.6倍まで減少することが観察された。この同一領域における、11nWの励起光による初期蛍光強度の3倍の値の記録と、1370nWの励起光による初期蛍光強度の1.6倍の値の記録は、5回繰り返されることが実験により示された。すなわち、多値記録の書き込みと消去(記録の再書き込み)をすべて同一波長で行うことが可能であることを示した。これはCDやDVD等の従来の光記録が、記録用の波長の光と読玲出し用の波長の光の二種類の光を用いていることに比べ、大きな利点である。また、この蛍光強度の励起光強度依存性は高湿度雰囲気下においても確認されたため、以前より報告されている水分子の光吸着以外のメカニズムが本現象に関与していることが示唆された。今後、デバイスの開発とともに、本現象のメカニズムの解明を検討する必要がある。コロイド化学的にCdSe・ZnSコアシェル型ナノ粒子を合成し、スピンコート法によってガラス基板上にナノ粒子薄膜を作製した。この薄膜を窒素雰囲気下において連続励起することで蛍光強度を増加させ、最終的に飽和値に達することを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。このとき蛍光強度の増加率が照射する励起光の強度に依存し、またこの蛍光強度の増加が可逆的に行われることについて論文として発表した。さらに同じ共焦点レーザー顕微鏡によって蛍光強度増加現象の膜厚依存性・励起光強度依存性・励起波長依存性について調べた。まず多層膜の場合には増加率が小さく、単層膜の場合には増加率が大きいことがわかった。この結果からガラス基板が蛍光強度増加現象のメカニズムに深く関与することが示された。次に励起光の照射強度が強いほど増加率が小さいということと、励起波長が長いほど増加率が小さいということが観察された。以上の結果から、蛍光強度が増加するメカニズムとして、以下の仮説を考えた。ナノ粒子に光を照射した励起状態において、発光再結合とイオン化の大きく分けて2つのパスが存在する。この仮説において、多層膜の場合には上層にあるナノ粒子は基板から十分距離が遠いため静電気的ポテンシャルの影響を受けないと考えると、多層膜の蛍光強度の増加率が小さくなることが説明できる。

またイオン化がAuger-assistedionizationによって行われると考えることにより、励起光強度依存性・励起波長依存牲について説明することができた。コロイド化学的にCdSe・ZnSコアシェル型ナノ粒子を合成し、スピンコート法によりガラス基板上にナノ粒子薄膜を作製した。この薄膜を窒素雰囲気下で連続励起すると、蛍光強度が時間とともに増加し、最終的に飽和値に達することが観察されている。また前年度の研究において以下のような仮説が提案されていた:励起したナノ粒子は、発光再結合とイオン化の大きく分けて2つのパスが存在する。粒子がイオン化した場合、電子が基板へ放出される。基板へ放出された電子は静電気的ポテンシャルを生み出し、周囲の粒子のイオン化が抑制されるため、発光再結合を行う確率が上昇して発光効率が上昇する。本年度の研究において以上の仮説を検証するため、現象の基板依存性について調べた。まず真空中で励起光を照射しながら蛍光スペクトルを測定できる装置を組み立て、ナノ粒子薄膜を様々な基板上に作成した。金基板上の薄膜を励起した場合、蛍光強度は弱いまま一定であった。一方、ガラス基板とシリコン基板上の薄膜を励起した場合には、蛍光強度の増加が観察された。この結果から、基板が導電性である場合には電子が基板にトラップされず、蛍光強度増加現象の原因となる静電気的ポテンシャルが生み出されないことがわかった。基板中に存在する電子のトラップサイトについて詳細に調べるため、スパッタによって様々なxの値を持つSiOx基板を作成し、その上にナノ粒子を塗布した。この薄膜を連続照射すると、x=1.9の場合には蛍光強度は著しく増加したが、x=0.6の場合には増加率が低かった。この結果から、酸素原子由来の欠陥が電子のトラップサイトとして働いており、欠陥の多い膜において蛍光強度増加現象が大きく見られることがわかった。以上の内容は論文にまとめ、現在投稿中である。今後この現象を光メモリーに応用していくために、基板中に存在する酸素欠陥を制御する必要があることが示唆された。
階層的な確率モデルにおけるベイズ学習の汎用的利用法の確立

本研究では,ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルなどの階層モデルに対して,ベイズ学習の汎用的な利用を目的とする.交換モンテカルロ法によるベイズ学習を取り扱い,工学的なインプリメントとして,交換モンテカルロ法の並列化を行うことにより,ベイズ学習の大幅な高速化による効率面の大幅な改善を目指す.また,交換モンテカルロ法の最適設計の構築や,動径基底関数ネットワークによるスペクトル分解に適用する.本研究では,ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルなどの階層モデルに対して,ベイズ学習の汎用的な利用を目的とする.交換モンテカルロ法によるベイズ学習を取り扱い,工学的なインプリメントとして,交換モンテカルロ法の並列化を行うことにより,ベイズ学習の大幅な高速化による効率面の大幅な改善を目指す.また,交換モンテカルロ法の最適設計の構築や,動径基底関数ネットワークによるスペクトル分解に適用する.本研究では,階層的な確率モデルに対する学習アルゴリズムとしてベイズ学習を考え,ベイズ学習の汎用的な利用を確立することを目的とする.その実現法として,交換モンテカルロ法によるベイズ学習の近似手法を取り扱う.平成22年度では,動径基底関数ネットワークによるスペクトル分解問題にベイズ学習を適用し,その有効性を検証した.カンラン石の反射スペクトルの複合吸収帯の分離を行ったところ,惑星科学の専門家がその知見を駆使して得られた結果と同様の結果をデータのみから抽出することに成功した.また,別の実データとして,X線光電子分光(XPS)のスペクトル分解にもベイズ学習を用いた.スペクトルのピーク分離を行う前処理となるバックグラウンドの除去に,ピーク毎にバックグラウンド増加量を変化させるモデルを提案し,二硫化モリブデンのXPSデータに適用したところ,得られたバックグラウンド増加量のパラメータから,ピークの由来源が表面か内部かを示唆する結果が得られ,従来推定の邪魔になるバックグラウンドから,物性の情報を抽出することが可能になった.また,交換モンテカルロ法の挙動を調べることで,ベイズ学習の性質を明らかにする.そのために,系の性質がよくわかっている連想記憶モデルにおいて,交換モンテカルロ法を行い,得られた経験分布に主成分分析やクラスタリングを適用し,理論解析との比較により交換モンテカルロ法の挙動を明らかにした.本研究では,階層的な確率モデルに対して,学習精度の優れたアルゴリズムとしてベイズ学習を考え,ベイズ学習の汎用的な利用を目的とする.具体的に,交換モンテカルロ法によるベイズ学習の近似手法を取り扱い,交換モンテカルロ法の最適設計の構築や,動径基底関数(RBF)ネットワークによるスペクトル分解問題に適用する.平成23年度の研究では,二硫化モリブデンにおけるX線光電子分光法(XPS)のスペクトルデータについても,S2p軌道を示すピークが二つのピークに分離され,それぞれのピークがS2p1/2軌道S2p3/2軌道のピークと一致することを明らかにした.これらの結果は,与えられたスペクトルデータのみから,特別な分野の専門的な知見なしに同様の知見が導出できたことを表し,その有効性を示している.さらに,交換モンテカルロ法を用いたベイズ推定の最適設計指針についても予備的な結果が得られた.具体的には,メトロポリス法における平均採択率の漸近的な挙動を明らかにした.この結果は,メトロポリス法におけるステップサイズと採択率の関係を示し,さらに,汎化性能を特徴づける学習係数と深く関係があることも示している.また,交換モンテカルロ法を代表とするマルコフ連鎖モンテカルロ(MCMC)法によるベイズ学習を用いた応用として,マルコフランダム確率場による地震波速度分布から地球内部の流体分布の推定問題への適用を行った.これは,交換モンテカルロ法を用いたベイズ学習の普遍性を示す一例であるとともに,地震のメカニズムを明らかにするといった社会的インパクトも非常に大きな研究である.本研究では,階層的な確率モデルに対して,学習精度の優れたアルゴリズムとしてベイズ学習を考え,ベイズ学習の汎用的な利用を目的とする.具体的に,交換モンテカルロ法によるベイズ学習の近似手法を取り扱い,交換モンテカルロ法の最適設計の構築や,動径基底関数(RBF)ネットワークによるスペクトル分解問題に適用する.RBFネットワークは,階層的な構造を持つ確率モデルであるため,従来のモデル選択規準であるAICやBICを利用することができないといった問題点が知られている.こうした学習モデルでは,自由エネルギーや汎化誤差の主要項の係数である学習係数を知ることがモデルや学習の性質を知る上で重要となる.学習係数を導出する手法としては,代数幾何学を用いた手法が確立されているが,その計算はモデル毎に行う必要があり,新たな導出法を確立することが重要な課題であった.本年度の研究では,学習係数と交換モンテカルロ法における平均交換率の解析的な関係に着目し,学習係数を求めるアルゴリズムとして,交換モンテカルロ法のシミュレーションにより導出される平均交換率から学習係数を導出するアルゴリズムを開発した.また,RBFネットワークのベイズ推定の問題に適用することで,その有効性を明らかにした.交換モンテカルロ法を代表とするマルコフ連鎖モンテカルロ(MCMC)法を利用した応用として,地球科学分野におけるイメージングデータ解析や,拡散係数といった対象の物理過程を抽出する目的で,ハイパーパラメータの推定精度の解明を行った.さらに,高次元データにおける変数選択問題において,系統的な解の全数探索手法に交換モンテカルロ法を利用し,データを再構成できる最適解の枚挙を行うと同時に,そうした最適解の個数を推定する手法を開発した.従来の研究課題であるRBFネットワークによるスペクトル分解の問題や,交換モンテカルロ法の最適設計指針の確立について,それぞれ成果をあげるだけでなく,マルコフランダム確率場による地震波速度分布から地球内部の流体分布推定の問題を行う等,予想外の成果を上げることに成功している.24年度が最終年度であるため、記入しない。

本年度の研究では,引き続きRBFネットワークによるXPSスペクトルのスペクトル分解の問題に着手する.従来のXPS測定では,正確な物性情報を抽出するために,測定時間を長くし,放出される光電子数を多くすることで,S/N比のよいスペクトルを測定していた.しかしながら,物性のダイナミクスを知る時間分解XPSでは,質の高いスペクトルを得るためには時間解像度を下げざるを得ない.この周波数解像度と時間解像度のトレードオフのため,どの程度の測定時間で,どれだけの物理量が抽出できるかの設計指針が必要となる.本年度の研究では,ベイズ推定に光電子の離散性をポアソン分布で取り入れ,スペクトル分解と同時にノイズも推定する自動SIN分離のベイズ学習を確立する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
脳傷害時のグリア細胞の機能変化と脳浮腫形成

アストログリア-脳血管内皮細胞共培養系BBBモデルにおけるエンドセリンの透過性促進作用:血液脳関門(BBB)を担う脳血管内皮細胞の物質透過性に対するエンドセリンの作用を脳血管内皮由来bEnd.3細胞とラット大脳アストロサイトの共培養系で検討した。エンドエリンはbEnd.3細胞の物質透過性を亢進させた。またRT-PCRによるエンドセリン受容体の発現について検討し、bEnd.3細胞には、ETBタイプのエンドセリン受容体が多く発現していることが示された。この結果は脳病態時に傷害部位で発現増加することが知られるエンドセリンが、傷害に伴う脳浮腫の惹起因子であることを示唆すると同時に、エンドセリンEB受容体の遮断薬が脳浮腫の改善作用を持つ可能性を示唆する。エンドセリンによるアストロサイト由来血管透過性亢進因子の産生:血管内皮細胞と共にBBBを形成するアストロサイトは、内皮細胞の透過性を亢進させる種々の因子を産生する。培養アストロサイトに対してエンドセリンは、血管透過性亢進因子であるVEGF、MCP-1およびIL-8のmRNA発現を増加させた。また細胞外マトリックス分子を分解し、脳血管の新生を促進するマトリックスメタロプロテイナーゼ-2および-9(MMP-2、MMP-9)の発現も増加させた。ETB受容体の選択的刺激薬(Ala-ET-1)を投与したラット脳においても、これらの発現増加が観察された。これらの結果は、エンドセリンがアストロサイトの血管透過性亢進物質の産生を介して、脳浮腫を惹起することを示唆する。アストログリア-脳血管内皮細胞共培養系におけるBBBモデルの構築:血液脳関門(BBB)を担う脳血管内皮細胞の物質透過障壁は、隣接するアストログリアにより形成される。そこでアストログリアと脳血管内皮細胞の共培養によるin vitroBBBモデルの作成を行った。ニトロセルロース膜上に単層培養されたマウス脳微小血管由来細胞株bEnd.3のマーカー分子に対する透過障壁性は、ラット初代培養アストログリアとの4-6日の共培養により約3倍に高まった。このin vitro BBBモデルにおいて、脳傷害時にアストログリアが産生するエンドセリンは、マーカー分子の透過性を増加させた。bEnd.3細胞に対し、エンドセリンは細胞内Ca濃度の増加と細胞骨格アクチンの再構成を引き起こした。これらのことは、アストログリアが脳血管内皮細胞の透過障壁性を高める因子および低下させる因子の両者を産生していることを示唆する。また、末梢の血管内皮細胞の物質透過性を高めるトロンビン、VEGFおよびアンジオテンシンIIもbEnd.3の透過性を高めることが示された。新規Na-Ca交換系阻害薬の脳浮腫抑制作用:In vivoの脳浮腫モデル作成のため、ラジオ波による脳傷害後の浮腫形成を検討した。ラジオ波傷害は脳浮腫の指標である水分含量の増加とEvans Blue(EB)とSodium Fluorecein(SF)の脳組織への漏出を起こした。新規Na-Ca交換系阻害薬SEA400は、これら脳浮腫指標の増加を抑制した。

エンドセリンによるアストロサイト由来血管透過性亢進因子の産生:血管内皮細胞と共にBBBを形成するアストロサイトは、内皮細胞の透過性を亢進させる種々の因子を産生する。培養アストロサイトに対してエンドセリンは、血管透過性亢進因子であるVEGF、MCP-1およびIL-8のmRNA発現を増加させた。また細胞外マトリックス分子を分解し、脳血管の新生を促進するマトリックスメタロプロテイナーゼ-2および-9(MMP-2、MMP-9)の発現も増加させた。ETB受容体の選択的刺激薬(Ala-ET-1)を投与したラット脳においても、これらの発現増加が観察された。これらの結果は、エンドセリンがアストロサイトの血管透過性亢進物質の産生を介して、脳浮腫を惹起することを示唆する。
血清パネル検査による食道癌の個性診断と治療への応用

食道癌の悪性度診断・個性診断の手法として癌細胞の遺伝子解析の重要性が報告されている。しかし、遺伝子解析のためには、癌細胞を採取してDNAあるいはRNAを抽出するという手法が必要であることに加えて、採取した部位の細胞が必ずしも癌全体の遺伝子情報を正確に反映していないという問題点がある。そこで、本研究においては、より簡便かつ低コストの血清検査が癌の悪性度診断として有用であるか否かを検討した。癌細胞の遺伝子情報は、血清中のタンパク情報として、反映されていると考えられる。対象は、1997年以降に当科にて入院加療した食道癌340例である。入院時血清をELISA法にて解析し、種々のバイオマーカーの血清濃度をスクリーニングし、その臨床病理学的意義を検討した。検討したバイオマーカーは、p53抗体,VEGF, PDECGF(dThdPase),1-CTP, IAP, CRP, SCC-Ag, CYFRA21-1,Midkineである。すべてのマーカーでTNMstageとの相関を認めた。多変量解析で独立した予後因子であったのは、p53抗体,VEGF, PDECGF,1-CTP, SCC-Ag, CYFRA21-1,Midkineであった。VEGF, PDECGFは、放射線治療感受性をよく反映していた。複数のバイオマーカーを組み合わせることにより、遺伝子解析を凌駕する正確な悪性度診断も可能であると思われた。今後、TNM分類と併用することで、個々の症例の個性に立脚した治療を提供できる可能性がある。本研究は、癌患者血清中の微量タンパクをELISA法にて検出することで、癌の悪性度を診断するものであり、(i)化学療法・放射線療法感受性の予測、(ii)再発の高危険群の選別、(iii)患者免疫能の評価、(iv)治療効果の判定を行うことを目的としている。従来の予備研究の成果より、食道癌の悪性度診断をするために血清マーカーとして、抗p53抗体、VEGF、PyNPase(PDECGF)、Endostatin、FasL、IL-10、IL-12、Midkine、ICTPについて検討する。すでに、200例以上の食道癌患者の血清を治療前後にわたり経時的に採取し保存しており、予後ならびに臨床病理学的因子との関係を検討した。解析結果は以下のごとくである。(1)食道癌患者における血清中p53抗体を検索し、その臨床病理学的意義について検討した。化学・放射線療法後治療前に治療に対する感受性の予測が治療前に可能であるか否かを検討する。化学療法単独、放射線療法単独、及び両者併用療法での感受性とp53抗体の存在との関係を検討する。(2)血管新生因子として血清VEGF値、PyNPase(PDECGF)値についても同様に免疫染色と比較検討する。治療経過・効果との比較検討を行う。(3)患者免疫能のマーカーとして血清FasL値、IAP値、IL-10、IL-12についても同様に検討した。以上のデータについて単変量解析、多変量解析を行い、独立した予後因子となるか否かを検討中である。今後、複数の因子を組み合わせることによって、より鋭敏なマーカーになりうる組み合わせを考案する予定である。最終的には、各マーカー別のスコア表を作成して、総合スコアによりTNM分類を補完する指標を提唱したい。血清パネル検査による食道癌の悪性度診断に関する研究。研究目的のために350例の食道癌患者から文書による同意の基に血清を採取し保存している。予後ならびに臨床病理学的因子との関係を検討した。

ELISAによる解析結果は以下のごとくである。(1)p53抗体は、約30%の症例で陽性であり、早期癌でも陽性症例を認め、予後ならびに化学・放射線療法の治療効果と有意に関係していた。(2)血管新生因子である血清VEGF値、血清PyNPase(PDECGF)値は、腫瘍の進行度と相関関係を認め、予後と有意に相関した。(3)患者免疫能のマーカーとして血清IAP値は、腫瘍進行度と有意に相関し、予後因子であった。(4)血清FasL値は、早期癌症例でも陽性例を認め、有意に予後因子であった。以上のデータについて単変量解析、多変量解析を行い、独立した予後因子となるか否かを検討中である。今後、複数の因子を組み合わせることによって、より鋭敏なマーカーになりうる組み合わせを考案する予定である。最終的には、各マーカー別のスコア表を作成して、総合スコアによりTNM分類を補完する指標を提唱したい。食道癌の悪性度診断・個性診断の手法として癌細胞の遺伝子解析の重要性が報告されている。しかし、遺伝子解析のためには、癌細胞を採取してDNAあるいはRNAを抽出するという手法が必要であることに加えて、採取した部位の細胞が必ずしも癌全体の遺伝子情報を正確に反映していないという問題点がある。そこで、本研究においては、より簡便かつ低コストの血清検査が癌の悪性度診断として有用であるか否かを検討した。癌細胞の遺伝子情報は、血清中のタンパク情報として、反映されていると考えられる。対象は、1997年以降に当科にて入院加療した食道癌340例である。入院時血清をELISA法にて解析し、種々のバイオマーカーの血清濃度をスクリーニングし、その臨床病理学的意義を検討した。検討したバイオマーカーは、p53抗体,VEGF, PDECGF(dThdPase), 1-CTP, IAP, CRP, SCC-Ag, CYFRA21-1, Midkineである。すべてのマーカーでTNM stageとの相関を認めた。多変量解析で独立した予後因子であったのは、p53抗体,VEGF, PDECGF, 1-CTP, SCC-Ag, CYFRA21-1, Midkineであった。VEGF, PDECGFは、放射線治療感受性をよく反映していた。複数のバイオマーカーを組み合わせることにより、遺伝子解析を凌駕する正確な悪性度診断も可能であると思われた。今後、TNM分類と併用することで、個々の症例の個性に立脚した治療を提供できる可能性がある。
肥満における血清中高分子量アンジオテンシノーゲン(AGT)の発現変化

【目的】RAS(レニンーアンジオテンシン系)構成因子の1つであるAGTは,脂肪量の増加および血圧上昇など生理機能に重要な役割を担っている。AGT発現はラット皮下及び腹腔内脂肪組織において複数の分子サイズを示すが血清AGTの分子サイズについては十分な解析が行われてはいない。また,従来はAGTの産生臓器は肝臓であると考えられていたが,脂肪組織でのAGTの発現が明らかとなり,さらには血清中AGTからAngIIへの変換が行われていると考えられることから,肥満での血清中AGTの産生量ならびにRAS阻害剤投与時における血清中AGTの産生抑制を明らかにすることは,肥満での髙血圧の改善効果を予測する上で重要である。本研究では,ラット肝臓,脂肪組織および血清AGTの分子サイズ並びに発現量を定量的に解析し,肥満での血清中AGTが肝臓または脂肪組織のどちらから主に分泌供給されているのかを解明することを目的とする。【方法】Sprague-Dawleyラット(雄,体重150g, 4週齢,各群n=5)にRAS阻害剤(captopril, imidapril olmesartan, losartan)を毎日約9週間腹腔内投与した。投与後, 2週間(低用量及び髙用量), 3週間および6週間(低用量)投与したラット肝臓,腹腔内および皮下脂肪組織,血清を採取し,これらの試料中AGT濃度についてimmuno-blot法にて解析した。なお,定量については,現在市販用AGTキットを用い解析中である。また,抗体はラットAGTのC末端ペプチドを合成し,作成した自作抗体を用いた。【結果】腹腔内脂肪組織AGTの発現は, ACE阻害剤で有意に発現抑制が認められたが, ARBでは顕著な抑制効果は認められなかった。RAS阻害剤低用量長期投与群では, ACE阻害剤およびolmesatan群においてAGTの発現抑制が認められた。皮下脂肪組織AGTは, captorpil投与群においてのみ著名な発現抑制が認められ,長期間投与群では, ACE阻害剤およびolmesartan群にAGTの産生抑制が認められた。肝臓ではAGTの発現量は各群で著名な変化は認められなかった。血清中AGTでは,高度に糖が付加した高分子量AGTのみが検出され,それらはRAS抑制剤の短期間投与では,高濃度のcaptorpil投与群においてのみ発現が抑制されたがRAS阻害剤低用量を投与した各群では, 6週間投与において,いずれの群もAGTの発現抑制が認められた。この結果は,降圧薬として使用されたRAS阻害剤は, RASの前駆物質であるAGTの産生も抑制し降圧効果を示す可能性も示唆された。さらに,従来AGTの産生臓器と考えられていた肝臓でのAGTの発現量には変化が認められず,脂肪組織においてAGTの発現量が減少していたことから,血清中AGT量は脂肪組織でのAGTの発現量に影響を受ける可能性が強く示唆された。

この結果は,降圧薬として使用されたRAS阻害剤は, RASの前駆物質であるAGTの産生も抑制し降圧効果を示す可能性も示唆された。さらに,従来AGTの産生臓器と考えられていた肝臓でのAGTの発現量には変化が認められず,脂肪組織においてAGTの発現量が減少していたことから,血清中AGT量は脂肪組織でのAGTの発現量に影響を受ける可能性が強く示唆された。
モンゴルにおける食習慣が歯の咬耗および顎関節形態に及ぼす影響に関する調査研究

口腔疾患は個人の体質、口腔環境及び生活環境(生活習慣)によって成立する。近年、顎関節症において顎関節円板の位置異常の誘因として、食生活と筋肉・骨格系の欧米化が問題視されている。そこで、日本人の生活環境の変化が顎口腔領域におよぼした影響を知る手がかりを得ることを目的として、日本人のルーツとされる蒙古民族の歯や顎関節を調査することは、顎関節症の発症原因を究明する上で極めて有意義であると考えられる。今回は、その第一段階として中国吉林省北方地方の都市部において、2歳から70歳までの男女428名(男性207名、女性221名)について齲蝕、歯周疾患、口腔粘膜、口腔清掃状態、顎関節症状の有無、および食習慣などについてアンケート調査と集団検診及び顎関節X線検査を行い、以下の結果を得た。(1)各年代層の主食は米や小麦で、肉類は過半数が食べていた。(2)齲蝕を自覚している割合は54%であった。また、歯痛の経験は48%にみられ、歯科治療は39%の人が経験していた。(3)顎関節の疼痛の経験は12%、雑音の自覚は20%、開口障害は7%にみられ、発症の低年齢化が認められた。(4)顎関節の形態的異常は日本人に比較して極めて少なかった。(5)歯石はみられたが歯槽骨の吸収は少なく、歯の動揺も殆どみられなかった。(6)咬耗は各年代層にみられ、加齢とともに進行する傾向がみられた。今回の調査では、前回と異なり齲蝕や顎関節症の症状が多くみられ、歯科治療経験の割合が高かったことが特徴的であった。これらの口腔疾患の発症は、生活環境(主食)等が現代日本に近似していることが大きな要因と考えられた。今後、更に生活環境の異なる都会において同様な調査をする必要性が示唆された。
新しい年齢依存性発現遺伝子の分子生物学的解析と法医学的年齢推定への応用

年齢依存性発現生体分子を"マーカー"とした法医学的年齢推定法を開発するための基礎的研究を行い,以下の成果を得た。(1)マウス肝において年齢依存性発現を示す遺伝子を検索し, 6個の既知遺伝子を同定した。(2)若年者の尿に特異的に見い出される糖タンパク質Ugl-Yについて解析を行ない, Ugl-Yがfibronectinの一部の配列に完全に一致すること,また,血清に由来することを明らかにした。(3)マウス腎で見い出された年齢依存性発現生体分子M-LPはヒトにも存在し,活性酸素の代謝機構に関与していることが示された。1.年齢依存性発現タンパク質M-LPのヒトのホモログの構造・機能の解析我々は先にマウス腎を対象として年齢依存性発現遺伝子の検索を行い、糸球体硬化症の発症に関連するMpv17 proteinに高い相同性を示す新規タンパク質M-LPを同定した。そこで、今回はM-LPのヒトのホモログの遺伝子構造、細胞内局在および臓器分布について解析を行なった。ヒトM-LP遺伝子は第16番染色体上にあり、3個および4個のエクソンからなる2種類の転写物が発現していること、さらに両者はそれぞれ異なるイソフォームをコードしていることが示された。また、これらのイソフォームはいずれもペルオキシソームに局在し、腎、肝、膵などの臓器でユビキタスに発現していることが明らかとなった。2.マウス肝の年齢依存性発現遺伝子のスクリーニング生後3日ないし15ヵ月のマウス(C57B L/6)の肝より抽出したTotal RNAについて、ディファレンシャルディスプレイ(DD)法を実施した結果、年齢依存的な発現パターンを示すバンド計8本を見出した。これらのcDNAの塩基配列を決定し、DNAデータベース(BLAST)によるホモロジー検索を行った。8個のうち5個は、それぞれaldehyde dehydrogenase、complement component 8などの既知遺伝子の一部とほぼ一致していた。また、残り3個については、データベース上に類似した配列は存在しなかったことから、未知遺伝子の一部である可能性が示唆された。1.研究経過我々はこれまでに、マウス臓器中の年齢依存性発現遺伝子の検索を行い、生後6週以降の腎で特異的に発現する新規タンパク質Mpv17-like protein (M-LP)を同定した。また、M-LPが糸球体硬化症の発症に関連するMpv17 proteinに高い相同性を有することや抗酸化酵素の発現を誘導することを明らかにした。今回は、M-LPの年齢依存性発現調節機構を解明するため、M-LPのプロモーター領域の転写因子結合部位についての解析をレポーターアッセイやゲルシフト法を利用して行なった。2.方法M-LPのプロモーター領域(-1923+314)やその1部をルシフェラーゼ遺伝子に結合した14種類のベクターを作製し、M-LP発現細胞に導入したのち転写活性を測定した(レポーターアッセイ)。また、M-LP発現細胞より抽出した核タンパク質を、転写因子が結合すると予測されるDNA断片(DNAプローブ)と反応させたのちSDS-PAGEにより展開して膜に転写し、転写因子とDNAとの結合を調べた(ゲルシフト法)。3.結果レポーターアッセイの結果から、-374から-284の領域に転写を抑制する因子が、また、-284から+8までの領域の少なくとも4箇所に、転写を活性化する因子が結合することが明らかとなった。さらに、この結果は、ゲルシフト法による結果ともよく一致していた。年齢依存性発現は、これらの因子によって調節されているものと考えられた。1.研究目的本研究の目的は、1)年齢依存性の発現を示す既知および未知遺伝子の系統的検索・同定2)見い出された年齢依存性発現未知遺伝子の構造、機能および年齢依存性発現調節機構の解明3)年齢依存性発現遺伝子の遺伝子レベルまたはタンパクレベルでの検出法および定量法の確立4)年齢依存性の変化のパターンの評価の4項目についての実験を遂行し、法医学的年齢推定に有用な生体分子マーカーを開発することである。今年度は、主として、マウスの肝において年齢依存性の発現を示す既知および未知遺伝子の系統的検索・同定を行なった。2.研究方法および結果生後3日ないし15カ月のマウス(C57BL/6)の肝より抽出したtota1RNAについて、ディファレンシャルディスプレイ(DD)法を実施した結果、年齢依存的な発現パターンを示すバンド計6本を見出した。、これらのcDNAの塩基配列を決定し、リアルタイムPCR解析装置で分析してそれぞれの遺伝子発現量を測定し、DD法と同様な年齢依存的発現パターンを示すことを確認した。DNAデータベース(nucleotide BLAST)によるホモロジー検索の結果、6個の遺伝子のうち、4個はそれぞれmitochondrion genome, aldehyde dehydrogenase, cell division cycle 2-like5, complement component8の一部とほぼ一致していた。

残りの2個は未知遺伝子のESTに一致したことから、これらの配列についてさらにgenomic BLASTで検索したところCWF19-like 1およびEvi5遺伝子の一部と一致した。1.研究経過2.研究方法および結果(1) SOD 10個の非同義置換型SNPのうち2個(SOD2 Ala16Val, SOD3 Ala58Thr)がすべての集団において多型性を示し、頻度分布は集団間で大きく異なっていた。SOD2 Ala16Val(SOD2のミトコンドリア局在シグナル内の多型)の遺伝子型は血清中のSOD2活性と、また、SOD3 Arg231Gly(SOD3のヘパリン結合領域内の多型)の遺伝子型は血清中のSODの総活性と相関することが示された。(2) Gpx 11個の非同義置換型SNPのうち1個(Gpxl P200L)がすべての集団において多型性を示し、頻度分布は集団間で大きく異なっていた。
黄色ブドウ球菌の血球崩壞毒素の膜孔形成及び毒素機能発現機構の解明

γヘモリジン並びにロイコシジンの分子的実体並びに毒素機能発現機構について以下の事実を解明した。1.膜孔(membrane pore)として作動するγ-ヘモリジンの発見、並びに膜孔の分子的実体の解明:γ-ヘモリジンによる赤血球の崩壊には、赤血球膜上に約200kDaの水不溶性[LukF-Hlg2]複合体の形成が必須であることを明らかにした。更に複合体の電子顕微鏡下での観察、化学分析及び実効内外径測定結果より、(1)本複合体は内径及び外径がそれぞれ約2.4nm、9nmの親水性のリング状の膜孔本体であること、(2)本膜孔はLukFとHlg2をモル比1:1で含有していること、(3)膜孔複合体は7個のモノマー分子から構成されていること、(4)γヘモリジンはLukF及びHlg2の2成分が交互に配置しているヘテロヘプタマー構造をとり、その中の成分比は3:4または4:3であること、等を明らかにした。2.LukFのヒト赤血球膜結合部位の同定:LukFのリム領域に存在するY72及びY203残基がヒト赤血球への初発の結合に重要なアミノ酸残基であることを明らかにした。さらに本結合が、上記2で示したLukFのW177及びR198残基を介しての赤血球膜上のフォスファチジルコリンへの結合に必須であることを解明した。3.ロイコシジンのファージ変換と毒素遺伝子の安定化機構の解明:PVLの2成分の遺伝子を保有する新規溶原化ファージ群を見出し、ファージゲノムの全塩基配列を決定してPVLのファージ変換を証明した。4.ヒト血清中におけるロイコシジン並びにγヘモリジン活性阻害物質の発見並びに本物質の同定:ヒト血清中にロイコシジン並びにγヘモリジン活性阻害物質を発見し、ビトロネクチンと同定した。ロイコシジンによる白血球の崩壊には、LukSがLukFに先行して白血球膜へ結合し、次に白血球膜上に約200kDaの水不溶性[LukF-LukS]複合体の形成が必須であることを明らかにした。更に複合体の血球膜からの分離精製に成功し、電子顕微鏡下での観察、化学分析および実効内径測定結果より、(1)本複合体は内径および外径がそれぞれ約2.4nm、9.0nmの親水性のリング状の膜孔本体であること、(2)膜孔はLukFとLukSが1:1の組成比の6量体で構成されていることが判明した。米国コロンビア大学のGouauxらのグループとLukFの3次元構造の解明に成功した。本結晶のX線解析よりステム領域に相当するグリシンおよび疎水性アミノ酸を多く含む18アミノ酸残基から成る領域がLukFにおいては"プレステム"の状態でLukF表面に折りたたまれて存在すること、ならびにプレステム領域を形成しているアミノ酸残基の疎水基がキャップ領域のアミノ酸残基と疎水結合して存在し、その結果プレステム領域の表面が親水性になっていることが判明した。これらの結果よりγヘモリジンの水溶性分子が膜孔形成時においてプレステム領域の劇的な構造変化がおきることが証明された。本発見は、黄色ブドウ球菌の細胞崩壊毒素の細胞膜上におけるアッセンブリー機構を明らかにしたばかりでなく、広く水可溶性膜孔形成毒素蛋白分子が標的細胞膜上で水不溶性分子へ構造変化を起こす機構について新しい概念を打ち立てた画期的なものとなった。