hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聞き手による吃音と正常発話との聴覚認識バウンダリーに関する研究

しかし,発吃時の発話速度が倍速,通常の1/2の速度の発話サンプルを聞いた者は,1ユニット数以上の連発性吃音を含むサンプルを聞いた場合,0ユニット数の場合と比較すると,有意により非流暢と判定することが分かった。単語を繰り返すタイプの連発性吃音の場合は,発吃時の発話速度が通常,通常の1/2の速度の発話サンプルを聞いた者は,2ユニット以上の連発性吃音を聞いた場合,有意により非流暢と判定し,発話速度が倍速の発話サンプルを聞いた者は1ユニット以上の連発性吃音を聞いた場合,有意により非流暢と判定した。本研究では,人工的に作成した無声音の難発性吃音を含む非流暢発話のサンプルを,非吃音成人(男性30名,女性30名)に聞かせた。実験の条件は3つで,(1)難発性吃音が発症している長さ(200,300,400ms),(2)難発性吃音の発症頻度(5%,10%,15%),それから(3)難発性吃音が発症する位置(単語と単語の間,文と文の間,単語内)であった。実験参加者対し,(1)については全種類の長さを含む発話サンプルを聞かせ,(2)についてはそのうちの1つを聞かせた。各サンプルを聞き終えた後,実験参加者には,コンピュータプログラム化されたマグニチュードスケール(1=流暢,100=非流暢)によって各発話サンプルの流暢度を判定させた。この実験を(1)難発性吃音が単語と単語の間に発症する場合,(2)難発性吃音が文と文の間に発症する場合,(3)難発性吃音が単語内で発症する場合に分けて実施した。その結果,無声音の難発性吃音が発症する位置に関わらず,難発性吃音の長さが300ms以上の時,聞き手はその発話サンプルをより非流暢と判定することがわかった。ただし,難発性吃音が発症している長さに関わらず,平均得点の比較では,(3)難発性吃音が単語内で発症する場合,(1)難発性吃音が単語と単語の間に発症する場合,(2)難発性吃音が文と文の間に発症する場合の順に,聞き手は発話サンプルをより非流暢であると判定した。また,難発性吃音の発症頻度が10%と15%の時,難発性吃音が420msの時の方が,300msの時よりも,聞き手はより非流暢であると判定した。しかし,難発性吃音の発症頻度が5%の時に関しては,これら2種類のサンプルに対する聞き手の判定に有意差は認められなかった。本研究では,人工的に作成した有声音の難発性吃音を含む非流暢発話のサンプルを,非吃音成人(男性30名,女性30名)に聞かせた。
公共空間としてみた都市内中小河川の地域共同管理に関する研究

地域住民が河川利用や維持管理することには一定の法的制約があるため、公共空間として都市内を流れる中小河川や農業用水が有効に利用され、適切に維持管理されるためには、法的管理者と共同した河川の管理運用が期待される。本研究は、法的管理者と地域住民等が共同して公共空間を管理運営することを地域共同管理と呼び、その実態と地域住民等が河川管理に参加する可能性について検討したものである。以下、その概要を示す。(1)住民の河川、農業用水への関わりの把握東海4県の県および市町村、土地改良区を対象にアンケート調査を行い、整備のための計画策定、維持管理、河川を使った活動について、地域住民等の関わりを把握し、これら3つの組み合わせから地域共同管理を類型的に把握した。(2)地域共同管理の事例分析(1)の類型の中から計画策定、維持管理、河川利用の側面において、地域住民や市民活動組織の積極的な参加がある事例として県管理河川の愛知県豊橋市朝倉川、農業用水である静岡県三島市源兵衛川と豊橋市牟呂用水を取り上げ、地域住民や市民活動組織が計画策定や維持管理に参加するようになった経緯を把握した。これらの事例から、河川管理者による計画づくりへの参加の働きかけが、地域住民や市民活動組織の参加のきっかけになっていたことがわかった。(3)地域住民が維持管理に参加する条件の解明アンケート調査を行い、県および市町村、土地改良区が地域住民等の参加に期待する条件、河川愛護団体が今後も河川の維持管理活動を継続するための条件を分析した。さらに、愛知県豊橋市朝倉川において、住民へのアンケートなどを行い、市民活動組織が河川管理者と共同して活発な地域共同管理を展開することが、地域住民等の参加の拡大と継続性につながる可能性があることを明らかにした。本研究は、河川から便益を受ける地域住民が河川管理者と共同して、河川環境を維持改善するための営為を地域共同管理と定義し、その成立条件を明らかにするために取り組んだ。東海4県の出先機関および市町村を対象としたアンケート調査によって、計画策定、維持管理、河川利用の3つの段階にわけ、住民等が積極的な関わりをもつ事例を収集した。地域共同管理としては、維持管理のみが65%と多いが、複数の段階にわたって住民等が関わりをもつ河川が17%あった。河川管理者が住民等の参加に期待する河川は、計画策定では地域の声を反映した整備が必要な場合、維持管理では河川管理者だけでは維持管理が困難な場合、河川利用では地域に親しまれてきた河川の利用を促したい場合であった。一方、住民等が維持管理に参加する理由を把握するために、各県の河川維持管理組織の支援事業に登録されている組織を対象にアンケート調査をした。維持管理に取り組む理由は、河川への愛着、環境悪化による危機感、昔からの慣習等であった。さらに、住民等が河川利用する理由を把握するために、日本河川協会の「川や水の活動団体名簿」を使ってアンケート調査をした。親水活動する理由は川に親しむ実践、きれいな河川景観の維持、清潔な河川環境の維持、生態系保全等であった。したがって地域共同管理が成立するためには、河川管理者が住民等の参加に期待している河川であり、かつ住民等が維持管理や河川利用に関わる意向をもつ河川であることが必要と考えられる。次に、地域共同管理の効果を検証するために、住民等が維持管理と河川利用に関わっている豊橋市朝倉川、維持管理のみの豊橋市柳生川の沿線住民を対象にアンケート調査によって、維持管理への参加、河川利用の実態および河川環境に対する評価を把握した。朝倉川の沿線住民の方が、河川利用や維持管理に幅広い参加があり、愛着をもつものが多いことがわかった。本年度は、都市内を流れる農業用水路を対象に、管理者としての土地改良区と住民による地域共同管理を取り上げた。

東海4県の土地改良区を対象としたアンケート調査から、農業用水の問題点として、漏水や断面不足など農業用施設としての物的状態ばかりでなく、ゴミの増加や雑排水による汚濁に対応するための維持管理、時代のニーズにあわせた親水空間整備などを指摘する土地改良区が少なくないことがわかった。そこで農業用水の整備計画づくり、農業用水の維持管理あるいは農業用水を活用した催事への参加の3つの段階にわけ、地域共同管理の実態を把握した。住民関与がない農業用水を管理する土地改良区が59%あるが、維持管理のみに関わりがあるもの18%、農業用水を活用した催事への参加だけがみられるもの10%、複数の段階に住民が関わりをもっている土地改良区が13%あることがわかった。地域共同管理の展開が農業用水沿川住民の参加意識に及ぼす影響を検証するために、複数の段階に住民関与がある土地改良区の中から三島市源兵衛川と豊橋市牟呂用水を取り上げ、地域共同管理の経緯と特徴を把握した。前者はNPO、後者は豊橋市や町内会、小中学校が中心となった地域共同管理である。沿川住民を対象にアンケート調査から、清掃活動へ参加したことがある住民は源兵衛川22%、牟呂用水42%であるが、農業用水を地域全体で管理すべきと考える住民が前者57%、後者40%、さらに今後の清掃活動への参加意志も前者では61%、後者では75%もいた。これらの参加意志のある住民が清掃活動に参加する条件は、農業用水の利用実態、愛着、維持管理に参加しない理由などの分析から、利用によって農業用水から何らかの便益を享受していること、農業用水に愛着を持っていること、清掃活動に関する情報が伝わること、時間的都合がつくことなどであることがわかった。本年度は、地域共同管理が継続的に行われる条件を検討するために、沿川住民や市民団体が都市内中少河川の清掃活動に参加する条件について調査研究を行った。前年度の調査をもとに、農業用水管理者である土地改良区と市民団体が住民に参加を働きかけながら清掃活動をしている愛知県豊橋市の牟呂用水、市民団体と地縁組織が住民に働きかけて清掃活動している静岡県三島市の源兵衛川、土地改良区が用水管理し、特に住民に働きかけていない愛知県豊川市の松原用水を抽出し、用水管理者へのヒアリングと沿川住民へのアンケート調査を実施した。その結果、土地改良区や市民団体による働きかけの有無が住民の清掃活動への参加に影響していること、清掃活動に参加した経験がある住民は用水に対する愛着の向上につながっていることがわかった。また、清掃活動へ参加経験のあるものには今後の参加意向が多いため、土地改良区や市民団体の働きかけが住民の継続的な参加につながる可能性があることが示唆された。このように市民団体が参加の機会と場を提供することが地域共同管理の継続性につながっているので、日本河川協会に登録レた市民団体の中から東海・近畿にある480団体を対象にアンケート調査を行った。市民団体は市民サークルのほか、NPO・地縁組織・学校などである。河川の清掃活動はその約8割が行っていた。その理由は景観や生態系保全など河川環境の維持であるが、多項目選択の理由を踏まえると川に親しむという活動目的に適うことや流域の生活環境向上につながることが清掃活動に取り組む要因と考えられる。
大量虐殺と集団暴力の比較研究:その普遍的形態の分析と防止策の考察

本研究では、以下の四点に重点的に取り組んだ。ルワンダ、ブルンジにおける過去の大量虐殺と集団暴力、コンゴ民主共和国の集団暴力、少数民族(特に脅威にさらされている少数民族と先住民族の権利)のための国際的な人権保護機構について。1.中央アフリカにおける実地調査は、主要アクターへのインタビューと観察調査により行った。ルワンダには「ガチャチャ(フランス語ではガカカ)」として知られる大量虐殺を裁く法廷がある。この調査では、近代化し、改良されたガカカ法廷の進展に注目した。試験期間を2005年に終了したガカカ法廷は、100万を超える事例を抱え、大量虐殺を裁く世界最大の法廷となった。事例のうち8割はすでに取り上げられている。シェラーは199495年以降、大量虐殺後の裁判に深く関与している。2.破綻国家ブルンジとコンゴ民主共和国での活動-ブルンジ新政府の政策は、国家統一を目標としている。しかし、同国は説明責任を欠き、裁判の開廷にも解放国民軍(FNL)との話合いにも失敗し、その結果として人権侵害が増加した。キヴ州における衝撃的状況のため、コンゴ民主共和国は世界最悪の緊急事態に陥っており、国連組織と国際救済委員会の調査によると、1998年以来、530万人が亡くなっている(現在も紛争と大量虐殺による残虐行為が続いている)。3.人権保護機構に関する活動は、2007年の7月8月にかけて、ジュネーブにある国連で継続して行われた。しかし、そこでは、国連人権理事会によって、主要アクターである国連先住民作業部会(WGIP)が、時期尚早の段階で廃止されていた。先住民族の人権保護を目的とした恒久的な機構に関する交渉は、滞っている。WGIPの主な業績である「先住民族の権利に関する国連宣言」の草案は、2007年9月に国連総会によって採択された。2004年から2005年の初年度における研究活動は、主として以下4つのテーマを中心に行った。1.ルワンダ問題2.少数民族保護及び人類に対する犯罪への説明責任のための国連メカニズム3.スリランカにおけるジェノサイド防止と少数民族保護4.2004年10月14日から16日のジェノサイドに関する国際会議において発表された基調講演(米カリフォルニア州サクラメントにて開催)1.ルワンダのジェノサイドから10年が過ぎた。これを記念して2004年4月3日から6日までキガリにおいてジェノサイドに関する国際会議が開催されたのであるが、筆者は同会議のための寄稿文を手掛けた。その内容はルワンダのジェノサイドに加担した諸外国の責任を問うもので、本来のプログラムには含まれていなかったテーマである。更に、ルワンダ政府に対する提言作成にも参加した。そして翌日の4月7日には、やはりキガリで催された、ジェノサイド10周年国家記念式典にも参列した。その後、政府関係者、NGO指導者、ジェノサイド研究者等との会合を持った。中でも司法関連問題については、Jean de Dieu Mucyoルワンダ検事長、Richard Renaud国連ルワンダ国際法廷(ICTR)主席捜査官、それにDallaire将軍らも交えた最高レベルの会議となった。ガチャチャ・プロセスの上級顧問を務めるAnastase Balinda氏との会合では、近々予定されている裁判に向けての体制作りが話題になった。【ガチャチャ裁判の傍聴が2005年から2006年にかけて予定されている。】ICTR主席捜査官Renaud氏との話し合いの一部、及びガチャチャ裁判に関する報告の一つがスイス・ロマンド放送に送られた。

(http://www02.couleur3.ch/rwanda/archives/2004/05/07/)ルワンダでの調査における主眼は、ガチャチャ(gachacha、フランス語の綴りはgacaca)と呼ばれる伝統的裁判形態が現代社会においてどのような機能を果たしているか考察することにあったが、これについては以下の人々にインタビューを行った:最高裁判事Muzinsi氏、第7ガチャチャ部門関係者(a/o. Balinda)、人権委員会ガチャチャ監視官Ph Kagabo博士、否認に関する検査官Ndahiro氏、最高裁副長官M.Ngoga氏(ルワンダ-ICTR間の折衝担当)、国連ルワンダ支援団前司令官RomeoDallaire将軍(4月1日、アディス・アババにて)、ジェノサイド研究者(Erwin Staub教授、Eric Markusen博士など)、ルワンダ人学者Anastase Shyaka博士、地元NGO指導者達2.2004年7月19日から29日まで、ジュネーブにおいて先住民に関する作業部会第22次会合、及び国連人権委員会第二小委員会開会式に参加した。「先住民と紛争解決」という主要テーマに関する筆者の講話が人権高等弁務官のサイトに掲載されている。アドレスは以下の通り:又、第二小委員会に対する更なる勧告を特別報告者Alfonso Martinez氏及び人権高等弁務官事務所(OHCHR)に対して行った。8月13日には、ハーグのユーゴスラビア法廷(ICTY)主任検察官であるCarla Del Ponte氏にインタビューを行い、刑事裁判やミロセビッチ氏の処遇、具体的にはジェノサイドに関する告訴などについて同氏の見解を尋ねた。説明責任を追求する上での非政府間国際機構(INGO)の役割に関しては、アムネスティ・インターナショナル事務局長Irene Khan氏にインタビューを行った。ルワンダのジェノサイド、その事後処理、及びジェノサイド発生の危機全般における同組織の役割などについても尋ねた。3.2005年2月に行ったスリランカの現地調査は、津波やバティカロアでのタミール人指導者殺害に大きく影響された。この調査の大きな収穫は何といっても、ジャフナで国連人権委員会北東事務局(NESOHR)局長のKarunaratnam神父に会うことが出来、同じくジャフナのLTTEメンバーであるElamparithi氏、そしてタミール人国会議員でありTNA指導者でもあるSampanthan氏などに直接話を聞くことが出来たことである。バティカロアでは1990年7月のスリランカ軍による大量虐殺の証人を何人か探し当てることが出来た。更に、特にユニセフなどの国連機関や国内外のNGO協力者、政府関係者に対しても聞き取り調査を行った。2年目となる2005年-2006年の研究活動として重点的に取り組んだのは、大量虐殺および集団暴力問題である。(1)スレブレニカの大虐殺から10年後のボスニア:司法および説明責任はどうなのか?--暫定司法に対する選択肢(2)集団虐殺から11年後のルワンダ:ガチャチャ(gacaca)の大量虐殺に関する裁判の全国的な開始および試験段階分野での裁判の開始(全管轄区の約10%):キガリおよび5つの州でのガチャチャの観察;主な関係者のインタビュー
新規抗糖鎖抗体を用いたがん悪性化における糖鎖の機能解明と糖鎖バイオマーカーの探索

独自に樹立した抗糖鎖抗体のがんバイオマーカーとしての有用性を検証するとともに、がん転移における糖鎖の機能を解明することを目的として、以下の研究を行った。はじめに、抗糖鎖抗体を用いた組織学的検討の結果、大腸がん組織において90%以上の高頻度でF2抗体反応性のシアリルルイスX糖鎖抗原が発現することを見出した。そこで、シアリルルイスXを効率よく検出する糖鎖バイオマーカー検出系の樹立を行うとともに、シアリルルイスXを過剰発現するマウス大腸がん細胞株を樹立し、同糖鎖抗原のがん転移における機能解明を行った。本研究の成果は、がんの早期診断・早期治療に寄与することが期待される。独自に確立した方法に基づいて作製したフコシル化糖鎖シアリルルイスXに対する抗糖鎖モノクローナル抗体を用いた解析の結果、数種のヒト大腸がん細胞株において同糖鎖抗原の明確な発現を認めた。そこでシアリルルイスXを発現しないマウス大腸がん細胞株CT26に同糖鎖抗原の発現に関わるフコース転移酵素Fuc-TVII遺伝子を導入し、安定発現株を樹立した。同細胞株および親株をBALB/cマウスに尾静脈内注射し、肺への転移を比較解析したところ、転移結節の数には有意な差を認めなかった。現在、それらのがん細胞株を尾静脈内注射したマウスに一定間隔で抗シアリルルイスX抗体を投与し、肺転移巣におけるFucT-II安定発現株および親株の増殖に対する効果を検討中である。シアリルルイスX糖鎖抗原を発現するがん細胞を同定するとともに、同糖鎖抗原安定発現株の樹立に成功したため。がん関連フコシル化糖鎖抗原であるシアリルルイスX(Sialic acidα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-R)に対する新規抗糖鎖モノクローナル抗体を用いた解析により、同糖鎖抗原の明確な発現の認められたヒト大腸がん細胞株の培養上清を用いてウエスタンブロット解析を行った。その結果、シアリルルイスX糖鎖抗原が高分子量の糖タンパク質上に選択的に存在することが明らかとなった。そこで次に、この糖鎖抗原の簡便かつ高感度な検出系の開発を試みた。その結果、非標識およびビオチン標識した同抗体を用いたサンドイッチELISA系を樹立し、ヒト大腸がん細胞株の培養上清中における同糖鎖抗原を検出することに成功した。血清存在下でも同糖鎖抗原を高感度で検出できたことから、このサンドイッチELISA系はがんバイオマーカー検出系として有用と考えられた。次に、この糖鎖発現のがん転移における役割を解析するために、シアリルルイスX糖鎖抗原の発現に関わるフコース転移酵素Fuc-TVII遺伝子を導入したマウス大腸がん細胞株CT26および親株をBALB/cマウスに静脈内投与して比較解析を行った。しかし、予想外なことに肺転移に有意差を認めなかった。一つの可能性として、正常の肺血管にはシアリルルイスX糖鎖抗原と結合するセレクチン等の糖鎖結合分子が発現しない可能性が考えられる。そこで現在、同遺伝子導入株と親株をBALB/cマウスの脾臓内に移植し、門脈経由で肝臓に転移する過程を比較解析しているところである。シアリルイルイスX発現がん細胞のマウス移植実験を継続する必要が生じたため。我々は、独自に開発した新しい方法論に基づいて様々な新規抗糖鎖抗体を樹立し、種々の疾患における糖鎖発現とその病理学的機能を解明し、疾患の早期診断および新規治療薬の開発に寄与することを全体構想として研究を推進している。本研究では特に、フコース転移酵素欠損マウスをその強制発現株で免疫することによって新規抗フコシル化糖鎖抗体を樹立し、糖鎖のがんバイオマーカーとしての有用性を検証するとともに、腫瘍の悪性化およびがん転移における糖鎖の機能を解明し、がんの早期診断・早期治療に向けた分子基盤を整備することを目的とする。これまでに我々は、フコース転移酵素-VIIを安定発現する遺伝子導入株でフコース転移酵素Fuc-TIV/Fuc-TVIIダブルノックアウトマウスを免疫することによって作製した新規抗フコシル化糖鎖抗体はがん関連糖鎖抗原であるシアリルルイスXを特異的に認識することを明らかにした。この抗体を用いてヒト大腸がん組織の免疫組織染色を行ったところ、90%以上の高頻度で陽性染色が認められた。そこで前年度から引き続き、マウス大腸がん細胞株CT26の親株(CT26-WT)およびシアリルルイスX強制発現株(CT26-F7)を用いた検討を行った。両細胞株を脾内投与して門脈経由で肝臓に形成される転移巣を観察したところ、CT26-F7においてCT-26-WTよりも転移巣が縮小する傾向が認められた。シアリルルイスX糖鎖抗原は、セレクチンのリガンドとなりがん細胞の転移に有利に働くと考えられてきたが、生体内にはシアリルルイスX糖鎖発現細胞の転移もしくは増殖を制御する機構が備わっている可能性が示唆された。

本研究の成果は、がんの早期診断・早期治療に寄与することが期待される。当初計画に従って着実に研究を推進する。シアリルルイスXを強制発現させたマウス大腸がん細胞株およびその親株をBALB/cマウスに脾内移植し、肝転移を解析する。免疫学、生化学物品購入経費の節約のため。シアリルルイスX糖鎖抗原を発現するがん細胞のマウスへの移植実験の結果、想定外の結果が得られたため。次年度の研究の経費に充当。がん細胞の投与経路を変更した実験の実施に必要な物品の購入に使用する。
デンプン糖化工程の効率化をめざした枝切り酵素の構造機能解析と機能改変

澱粉枝切り酵素とは、アミロペクチンやグリコーゲンなどの分岐鎖を特異的に加水分解する酵素で、澱粉糖化工業などに利用される産業的に重要な酵素である。本研究では、食品加工プロセスによく用いられる数種の澱粉枝切り酵素の立体構造と機能の関係を明らかにし、工業的な加工プロセスに最適な酵素を設計することを目的とした。その結果、酵素の活性中心に位置する可動ループ上のアミノ酸残基に変異を加えることにより、反応速度と熱安定性が向上した産業的に価値の高い変異酵素を得ることができた。デンプン枝切り酵素は、アミロペクチンなどのα-1,6-グルコシド結合を特異的に加水分解する酵素で、微生物由来酵素は澱粉糖化や食品加工に使われる産業的に重要な酵素である。枝切り酵素は、基質特異性の違いによりイソアミラーゼ(ISA)とプルラナーゼ(PUL)に大別され、産業利用目的ではそれぞれ一長一短がある。そこで本研究では両酵素の構造・機能解析を進め、両酵素の長所を生かしたより利用価値の高い酵素を創製する事を目標としている。この観点から平成20年度に行った研究成果は以下の通りである。まず京都大学の三上、SPring-8サービスの勝矢らと共同で、産業的に最もよく利用されるBacillus由来PULについて酵素の立体構造解析を進めた。その結果、活性中心構造が基質特異性の異なるPseudomonas由来ISAとよく似ている事がわかった。この研究成果から、両酵素の構造を比較する事により同酵素の基質特異性を改変したり、より産業的に利用価値の高い酵素を設計したりする事が可能になると考えられる。実際に本研究でも得られた立体構造を参考にKlebsiella由来PULの基質特異性の改変を試みたところ、基質特異性は変化したものの酵素活性が大きく低下した変異酵素が得られた。この点は今後の検討が必要である。立体構造解析に関しては、現在澱粉糖化工程の現場で使用されているBacillus由来PULの立体構造解析を進めている。次に基質特異性とともに利用の現場で重要なファクターである熱安定性獲得機構について、立体構造情報をもとにCa、Mgなどの金属イオンの役割について明らかにした。本研究成果により、熱安定性発現に大きく関与する金属イオンの部位を特定することができ、より熱安定な酵素の設計に役立つかもしれない。さらに現在可動性ループ構造が関与するデンプン枝切り酵素のユニークな活性発現機構の解明を行っている。デンプン枝切り酵素は、アミロペクチンなどのα-1,6-グルコシド結合を特異的に加水分解する酵素で、デンプン糖化や食品加工に用いられる産業的に重要な酵素である。本研究では、工業的なデンプン糖化や食品加工に用いられるデンプン枝切り酵素の立体構造や基質特異性発現機構を明らかにし、新規有用酵素を創製することを目的としている。平成21年度にはこれまでに得られた研究成果に基づき、次のような研究を行った。Bacillus由来プルラナーゼについては、昨年に引き続き酵素-基質アナログ複合体のX線結晶構造解析を行い、Klebsiella由来プルラナーゼと比較した。次にKlebsiella由来プルラナーゼについては、プルラナーゼと基質特異性が大きく異なるPseudomonas由来イソアミラーゼと基質アナログ複合体の立体構造を比較することにより、基質特異性発現機構の解明を試みた。最初にプルラナーゼのサブサイト中最も親和力が高いサブサイト-2の構造をイソアミラーゼと比較したところ、プルラナーゼの方が酵素-基質間の水素結合数が1本多い事がわかった。この水素結合数の違いが、両酵素の基質特異性の違いと関係するかどうか確かめるため、水素結合に関与するアミノ酸残基を置換した変異酵素を作成して解析したところ、サブサイト親和力に違いは見られたが、基質特異性とはあまり関係しないことがわかった。一方、サブサイト+2の構造の違いについても検討した。Klebsiella由来プルラナーゼでは、活性中心に基質が結合すると、Trp727の側鎖が回転して+2のサブサイトに結合するグルコース残基とスタッキング相互作用する。そこで本残基をAlaやPheに置換した変異酵素を作成して解析したところ、本残基を含むループの主鎖のコンホメーション変化が、活性発現には必須であることが示唆された。デンプン枝切り酵素は、アミロペクチンなどのα-1,6-グルコシド結合を特異的に加水分解する酵素で、デンプン糖化や食品加工に用いられる産業用酵素である。本研究では、このデンプン枝切り酵素の立体構造や基質特異性発現機構を明らかにし、新規有用酵素を創製することを目的としている。最終年度である今年度は、これまでに得られた研究成果に基づき次のような研究を行った。まずBacillus由来プルラナーゼについては、昨年に引き続き酵素-基質アナログ複合体のX線結晶構造解析を行い、Klebsiella

由来プルラナーゼと比較した。次に幻Klebsiella由来プルラナーゼについては、活性中心に位置しα-アミラーゼファミリーの保存領域3を含むフレキシブルループの構造と機能について検討した。アポおよび基質アナログ複合体のX線結晶構造解析を比較した結果、本フレキシブルループは基質(アナログ)が存在する場合としない場合でそのコンホメーションを大きく変化させることがわかった。まず活性中心に基質(アナログ)が結合すると、フレキシブルループ上にあるTrp727がサブサイト+2のグルコース残基とスタッキング相互作用するように側鎖を約90°回転させ、これに伴いループ全体のコンホメーションが変化し、ループ上にある触媒残基Glu725が触媒位置へと約4.4AÅ移動して活性を発現すると推定される。一方同じデンプン枝切り酵素で、基質特異性が異なるイソアミラーゼではこの様にフレキシブルな構造が見られない事から、両酵素の保存領域3のアミノ酸配列を比較し、ループのフレキシビリティーを生み出すと推定されるGly724とGly726に変異を導入することにより、基質特異性が変化した変異酵素を作成することに成功した。
医療・環境浄化用ナノ粒子プラズマ流体システムの最適制御

本研究の目的は,汎と用的・高効率・高精度のサイズ選別性および高制御性を有する医療・環境浄化用ナノ粒子創製のためのプラズマ流体システムの最適制御を実現することで,医療(バイオ)工学・環境科学・ヘルスサイエンスの分野に学術的かつ社会的に貢献することである.機能性ナノ粒子創製の素過程は当該研究により明らかにされつつあるが,依然として詳細は未解明であり,産業レベルにおける粒径・組成・物質機能の制御性は高くはない.そこで本研究では原料の瞬間的蒸発および核生長を同時に行えるプラズマ流を利用した創製プロセスに焦点を当てきた.プラズマ流は流体力学・熱力学・伝熱学・電磁気学の立場から複雑干渉系として定式化され,さらに異種気体の混合により化学反応場さえ制御可能になるという利点に着目し,実験計測の困難な熱流動場の詳細な情報を数値計算によって得ることに成功した.加えて機能性ナノ粒子の核生成および共凝縮過程のみならず,凝集,拡散,熱泳動をも考慮した創製過程の新たな物理モデルを構築し,実験研究結果との比較を行い,粒径分布や組成の一致が得られたことから,プラズマ流による機能性ナノ粒子創製プロセスのモデル化に成功し,創製機構を明らかにすることができたと言える.さらにナノ粒子創製プロセスを促進するための効果的な急冷方法についても数値計算を用いた仮想実験を行うことで,最適な装置の設計指針を明示することができた.自動車の排ガス浄化触媒として,またドラッグ・デリバリー・システムといった医療の分野において,粒径が制御された機能性ナノ粒子の創製が急務である.しかし金属・非金属からなる化合物のナノ粒子創製の素過程および機構は未解明であり,目的とする粒径や組成,物質機能の制御性が依然として低い.特にシリサイドやボライドのナノ粒子創製は蒸気圧の異なる物質の共凝縮過程を伴うため,極めて困難なプロセスであるが,本研究では高エンタルピーを有し,かつ急冷速度が大きいことで,原料の瞬間的蒸発および核生長を同時に行えるプラズマ流を利用した創製プロセスに焦点を当てた.プラズマ流は流体力学・熱力学・伝熱学・電磁気学の立場から複雑干渉系として定式化され,さらに異種の気体を混合することで化学反応場をも制御可能になるという利点に着目し,2原子分子の解離・電離・再結合に起因する化学的非平衡性を組み込むことで,実験計測の困難な熱流動場のより詳細な情報を数値計算によって得ることに成功した.加えて機能性ナノ粒子の核生成および共凝縮過程のみならず,ナノ粒子間凝集,拡散,熱泳動をも考慮した創製過程の新たな物理モデルを構築し,実験的研究結果との比較を行った結果,粒径分布や組成の一致が得られたことから,プラズマ流による機能性ナノ粒子創製プロセスのモデル化に成功し,創製機構を明らかにすることができたと言える.本研究の目的は,汎と用的・高効率・高精度のサイズ選別性および高制御性を有する医療・環境浄化用ナノ粒子創製のためのプラズマ流体システムの最適制御を実現することで,医療(バイオ)工学・環境科学・ヘルスサイエンスの分野に学術的かつ社会的に貢献することである.機能性ナノ粒子創製の素過程は当該研究により明らかにされつつあるが,依然として詳細は未解明であり,産業レベルにおける粒径・組成・物質機能の制御性は高くはない.そこで本研究では原料の瞬間的蒸発および核生長を同時に行えるプラズマ流を利用した創製プロセスに焦点を当てきた.プラズマ流は流体力学・熱力学・伝熱学・電磁気学の立場から複雑干渉系として定式化され,さらに異種気体の混合により化学反応場さえ制御可能になるという利点に着目し,実験計測の困難な熱流動場の詳細な情報を数値計算によって得ることに成功した.加えて機能性ナノ粒子の核生成および共凝縮過程のみならず,凝集,拡散,熱泳動をも考慮した創製過程の新たな物理モデルを構築し,実験研究結果との比較を行い,粒径分布や組成の一致が得られたことから,プラズマ流による機能性ナノ粒子創製プロセスのモデル化に成功し,創製機構を明らかにすることができたと言える.さらにナノ粒子創製プロセスを促進するための効果的な急冷方法についても数値計算を用いた仮想実験を行うことで,最適な装置の設計指針を明示することができた.
GaN系HEMTにおける電流コラプス現象の抑制と耐圧向上に関する研究

Feドープ半絶縁性バッファ層を対象とし,伝導帯下端から0.5 eV程度の位置に深いアクセプタを有するAlGaN/GaN HEMTのオフ状態耐圧特性を計算した。特に耐圧のパシベーション膜比誘電率依存性やゲート・ドレイン間距離依存性を調べた。その結果,パシベーション膜の比誘電率が高いいわゆるhigh-k膜を有する場合に高い耐圧が得られ,またゲートドレイン間距離が長い程高い耐圧が得られた。具体的には,パシベーション膜の比誘電率が60の時,ゲートドレイン間距離が1.5um, 3um及び5umに対し,耐圧はそれぞれ504 V, 932 V,及び1362 Vとなった。これらは,それぞれゲート・ドレイン間の平均電界強度が3.3 MV/cm, 3.1 MV/cm及び2.7 MV/cmとなりGaNの理論限界3.3 MV/cmに近い値となっている。また,フィールドプレート構造を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性のSiNパシベーション膜厚依存性を計算した。その結果,パシベーション膜が薄くなると耐圧が極端に低下することを見出した。これは,パシベーション膜が薄いとフィールドプレートがゲート電極と同じ働きをし,フィールドプレート端の電界が著しく高くなってしまうためと解釈された。このほか,SiN膜と高誘電率膜(high-k膜)からなる2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性の解析を続け,高い耐圧を得る条件について検討した。Feドープ半絶縁バッファ層と高誘電率パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性のゲート・ドレイン間距離依存性の解析をこの距離が10um程度となる場合まで続け,耐圧がどの程度向上するか検討する。フィールドプレートを有するAlGaN/GaNHEMTの耐圧特性のパシベーション膜厚依存性を調べ,この膜厚の最適値について検討する。2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの解析を続け,その設計指針について検討する。Feドープ半絶縁性バッファ層を対象とし,GaN禁制帯中央より上に深いアクセプタを有するAlGaN/GaN HEMTの過度応答特性を計算し,アンドープ半絶縁性バッファ層を有する場合(禁制帯中央より上にある深いドナーが禁制帯中央より下にあるアクセプタを補償するとモデル化した)と比較した。その結果,Feドープ半絶縁性バッファ層内の深いアクセプタとアンドープ半絶縁性バッファ層内のドナーのエネルギーレベルや電子や正孔に対する捕獲断面積を同じように設定した場合,いわゆるドレインラグや電流コラプスといった緩やかな電流応答が極めて似た特性になることを見出した。また,両者のアクセプタ濃度が等しい場合,ラグや電流コラプスの程度が定量的に極めて類似した値になることを見出した。これらより,Feドープ半絶縁性内の深いアクセプタとアンドープ半絶縁性バッファ層内の深いドナーが電子トラップとして極めて似た挙動を示すことが示された。また,ラグ現象や電流コラプスのFeドープ半絶縁性バッファ層内アクセプタ濃度依存性について調べた。その結果,いわゆるフィールドプレートを有しない場合は,予想どうりアクセプタ濃度が高くなると共にラグ現象や電流コラプスの程度は大きくなった。しかしながら,フィールドプレートを有する場合には,アクセプタ濃度が高くなるにつれラグ現象や電流コラプスの程度が小さくなることを見出した。これは,アクセプタ濃度が高い場合,電子がバッファ層内に余り進入せず,従ってデバイス表面のフィールドプレートの効果が大きく現れたものと解釈された。さらに,SiNと高誘電率薄膜の二重パシベーション膜を有するAlgaN/GaN HEMTの耐圧特性を計算した。その結果高誘電率薄膜の導入により,耐圧が向上することを見出した。Feドープ半絶縁性バッファ層内の深いアクセプタとアンドープ半絶縁性バッファ層内の深いドナーが電子トラップとして似た働きをすることを示すことができた。また,フィールドプレートを有するAlGaN/GaN HEMTでは,バッファ層内のアクセプタ濃度が高い程ラグ現象や電流コラプスが抑えられうるという新たな知見を得た。さらに,SiNと高誘電率薄膜を有する二重バシベーション構造AlGaN/GaN HEMTでは耐圧が向上することを示すことができた。Feドープ半絶縁バッファ層を対象とし,GaN禁制帯中央より上に深いアクセプタを有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性を計算した。特に,耐圧の深いアクセプタ濃度依存性,及びパシベーション膜の比誘電率依存性を調べた。その結果,パシベーション膜の比誘電率が高い程高い耐圧が得られたが,これはゲートのドレイン端の電界が軽減されるためと解釈された。また,バッファ層内の深いアクセプタが高い程高い耐圧が得られたが,これはバッファ層を介するリーク電流が軽減されるためと解釈された。比誘電率を60,ゲート・ドレイン間距離を1.5 umとした時,アクセプタ濃度が高い場合耐圧は約500Vとなり,ゲート・ドレイン間の平均電界が3.3 MV/cmとほぼ理論限界に近いものが得られた。また,フィールドプレートと高誘電率パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性を計算した。その結果,高誘電率膜を有することによる耐圧の向上は,フィールドプレート長が短い場合に顕著となることがわかった。

これは,フィールドプレートによる寄生容量を増やさないという点で好都合である。フィールドプレート長がある程度長い場合にも耐圧の向上が得られたが,これは高誘電率膜を有する場合フィールドプレート端とドレイン間の電界がより一様に近いものになるためであることが示された。さらに,SiN膜と高誘電率膜の2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性を計算した。それぞれの層の膜厚と耐圧特性の間の関係を明らかにし,その設計指針を与えた。Feドープ半絶縁性バッファ層を対象とし,伝導帯下端から0.5 eV程度の位置に深いアクセプタを有するAlGaN/GaN HEMTのオフ状態耐圧特性を計算した。特に耐圧のパシベーション膜比誘電率依存性やゲート・ドレイン間距離依存性を調べた。その結果,パシベーション膜の比誘電率が高いいわゆるhigh-k膜を有する場合に高い耐圧が得られ,またゲートドレイン間距離が長い程高い耐圧が得られた。具体的には,パシベーション膜の比誘電率が60の時,ゲートドレイン間距離が1.5um, 3um及び5umに対し,耐圧はそれぞれ504 V, 932 V,及び1362 Vとなった。これらは,それぞれゲート・ドレイン間の平均電界強度が3.3 MV/cm, 3.1 MV/cm及び2.7 MV/cmとなりGaNの理論限界3.3 MV/cmに近い値となっている。また,フィールドプレート構造を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性のSiNパシベーション膜厚依存性を計算した。その結果,パシベーション膜が薄くなると耐圧が極端に低下することを見出した。これは,パシベーション膜が薄いとフィールドプレートがゲート電極と同じ働きをし,フィールドプレート端の電界が著しく高くなってしまうためと解釈された。このほか,SiN膜と高誘電率膜(high-k膜)からなる2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性の解析を続け,高い耐圧を得る条件について検討した。SiNと高誘電率薄膜を有する二重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTについて,それぞれの膜厚や高誘電率薄膜の比誘電率により耐圧がどのように変化するのか詳細に調べる。また,フィールドプレートと高誘電率薄膜を有する構造の耐圧特性を計算し,どのように耐圧特性が変化するか調べる。Feドープバッファ層と高誘電率パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性についてさらに検討し,それらのゲート長やゲート・ドレイン間距離依存性などを明らかにする。また,2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性についてさらに検討する。Feドープ半絶縁バッファ層と高誘電率パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの耐圧特性のゲート・ドレイン間距離依存性の解析をこの距離が10um程度となる場合まで続け,耐圧がどの程度向上するか検討する。フィールドプレートを有するAlGaN/GaNHEMTの耐圧特性のパシベーション膜厚依存性を調べ,この膜厚の最適値について検討する。2重パシベーション膜を有するAlGaN/GaN HEMTの解析を続け,その設計指針について検討する。物品費としてワークステーションを購入する予定であったが,諸般の事情より既存のものを活用することにしたため。
ポリアミントランスポーター群を標的とする新規抗がん剤DDSに関する基礎的研究

マイクロアレイ解析及びヒト遺伝子データベースのバイオインフォマティクス解析により,ポリアミントランスポーターの同定を試みたが,その同定には至らなかった.一方,HEK293細胞をジフルオロメチルオルニチン処理することにより,未処理時とは異なる特性を持つポリアミントランスポーターが誘導される可能性が示唆された.ポリアミントランスポーターを利用した薬物輸送システムを確立するにあたり,有用な情報を得ることができた.(1)ポリアミントランスポーターの分子実体の探索ヒト遺伝子データベースのバイオインフォマティクス解析及びマイクロアレイデータの解析により,複数回膜貫通タンパクをポリアミントランスポーター候補遺伝子として選び出した.これら数十種のトランスポーター候補遺伝子を発現ベクターに単離し,コンストラクトを作製した.一過性発現系により,放射性ラベルしたプトレスシンを用いてその輸送活性を評価したが,ポリアミン輸送活性を示すトランスポーターは見出だせず,その分子実体の同定には至らなかった.(2)ポリアミン枯渇処理による輸送特性の変化ポリアミン生合成の律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン(DFMO)を用い,ポリアミン枯渇処理によるプトレスシン取り込み活性への影響を検討した.モデル細胞として,プトレスシン取り込み活性の低いHeLa細胞及びその活性の高いHEK293細胞を用いた.両細胞株においてポリアミン枯渇処理により,その取り込み活性が著しく増加し,取り込みの誘導現象が観察された.さらに,取り込み溶液中のNaClをマンニトールで置換した際,その取り込み活性が上昇することを見出した.その一方で,DFMO未処理のHEK293細胞においてはマンニトール置換による取り込み活性の上昇はみられなかった.このことから,DFMO未処理のHEK293細胞及び両細胞株のポリアミン枯渇時に誘導されるポリアミン取り込み機構は,異なる駆動力をもつメカニズムである可能性が示唆された.なお,プトレスシン輸送のpH依存性及びその濃度依存性については,DFMO処理の有無に対し,大きな差はみられなかった.ポリアミントランスポーターの分子実体の同定には至らなかったが,その特性を生かした応用を検討するにあたり,有用な情報を得ることができた.マイクロアレイ解析及びヒト遺伝子データベースのバイオインフォマティクス解析により,ポリアミントランスポーターの同定を試みたが,その同定には至らなかった.一方,HEK293細胞をジフルオロメチルオルニチン処理することにより,未処理時とは異なる特性を持つポリアミントランスポーターが誘導される可能性が示唆された.ポリアミントランスポーターを利用した薬物輸送システムを確立するにあたり,有用な情報を得ることができた.放射性同位体ラベルされたプトレスシンを用い,各種培養細胞におけるポリアミン取り込み活性を検討した結果,HEK293細胞においてプトレスシン取り込み活性が高く,一方,Hela細胞においてその取り込み活性が低いことを見出した.ポリアミン生合成の律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤であるジフルオロメチルオルニチンを用い,ポリアミン枯渇処理によるプトレスシン取り込み活性への影響を検討した結果,Hela細胞においてその取り込み活性が著しく増加し,取り込みの誘導現象が観察された.この取り込み活性のイオン要求性を検討した結果,HEK293細胞における通常時の取り込みとは異なる特性を示すことを見出した.このことから,HEK293細胞の通常時及びHela細胞のポリアミン枯渇時に誘導されるポリアミン取り込み機構は,異なる駆動力をもつメカニズムである可能性が示唆された.ポリアミントランスポーターの分子実体について,いくつか報告はあるものの,未だ不明な点は多い.ポリアミン枯渇処理によるmRNA発現変動を調べるため,マイクロアレイ解析を行った.既にポリアミン取り込みに関わるとの報告があるSLC22A16の発現は観察されず,SLC12A8及びglypican-1においては,ポリアミン枯渇処理によるmRNAの発現変動は観察されなかった.現在,ポリアミン枯渇処理により,これらタンパクの膜局在が変化する可能性や,未知のポリアミントランスポーター分子が存在する可能性を含め,その検討を進めている.ポリアミン輸送活性を有する細胞株とともに,輸送活性のバックグラウンドの低い細胞株を見出すことができた.これらはポリアミンの輸送解析実験に用いるためのツールとして有用である.また,マイクロアレイ解析の結果は,未知のポリアミントランスポーターの同定に役立つものと期待される.HEK293細胞における通常時のプトレスシン取り込み機構及びHela細胞においてポリアミン枯渇時に誘導される取り込み機構の輸送特性を詳細に検討し,既知のタンパクによるポリアミン取り込み機構との比較を行う.また,並行してマイクロアレイ解析の結果に基づき,未知のポリアミントランスポーター分子の同定を目指す.さらに,ジフルオロメチルオルニチンとは異なる機序により細胞内ポリアミンを枯渇させる,ポリアミン代謝酵素の誘導剤であるジエチルスペルミンを用い,プトレスシン取り込み活性への影響を検討する予定である.マイクロアレイ解析にかかった費用が現在処理中であり,「次年度使用額」の大半を占める.残りの研究費は次年度分とともに,概ね上記の計画に従い,ポリアミン輸送実験及びポリアミントランスポーターの同定のための実験等に使用する試薬及び器具等の消耗品購入に充てる予定である.また,情報収集のための研究旅等にも一部を充てる予定である.
線虫を用いた表皮水疱症の分子機構の解析

膜4回貫通タンパク質テトラスパニンは、ヒトでは30種類以上の分子ファミリーを形成し、細胞の接着・遊走・癌転移・細胞膜融合など、細胞間相互作用におけるさまざまな生理現象に機能していることが示唆されている。線虫C.elegansを用いることによって、テトラスパニンの生理的役割を遺伝学的アプローチで明らかにする研究を開始したところ、線虫テトラスパニンのひとつであるtsp-15遺伝子の遺伝子機能低下(ハイポモルフ)個体において皮膚疾患である表皮水疱症に類似する表皮の剥離を見いだした。tsp-15機能低下個体の表皮異常はクチクラ層の剥離だけでなく下皮細胞の変性も伴う新しいタイプのものであり、またtsp-15変異体では表皮のバリア機構の維持に異常が生じていることが分かった。この維持機構の異常によって下皮細胞の変性が惹起され、結果、下皮細胞およびクチクラ層の機能と形態に影響を与えていると思われる。以上の結果より、テトラスパニンが表皮統合性に関与する分子であること、また線虫のテトラスパニンの機能を初めて明らかにした。また機能欠失解析と同時に全ての線虫テトラスパニンの発現様式を明らかにした。その結果、少なくとも数種類のテトラスパニンが表皮細胞において機能していることが示唆された。また最近tsp-15の新たな遺伝子変異座が複数単離され、これらは機能欠失(ヌル)変異体であることが示唆された。この変異体では全ての個体においてハイポモルフ変異体よりも早い時期に致死となることから、tsp-15は成体の表皮における機能だけでなく、個体の正常な発生に必須の因子であることが明らかとなった。一方で、tsp-15ハイポモルフ変異体の表皮異常を抑制する変異体の探索を開始したところ、9系統の抑制変異体を得た。その変異遺伝子座の連鎖解析とマッピングを行ったところ、そのうちのひとつは第3染色体の中央にマップされた。これまでのゲノム情報との比較から、この変異の責任遺伝子はtsp-15の遺伝的上流に位置する新規遺伝子と思われる。膜4回貫通タンパク質tetraspaninは20種類以上の分子ファミリーからなり、細胞の接着・遊走・癌転移・細胞膜融合など、細胞間相互作用におけるさまざまな生理現象に機能していることが示唆されている。一方でtetraspaninは分子的特徴に乏しく、また実際の生理的機能がほとんど不明であることから、特に遺伝学的手法により生体内での役割を明らかにしていくことが必要である。そこで遺伝学的解析に優れた特質を持つ線虫C. elegansにおいてRNA干渉法(RNAi)を用い、線虫に存在する20種類すべてのtetraspanin機能欠失個体を作製することを試みた。すべての線虫tetraspaninのcDNAを単離し、RNAiを試行した結果、tsp-15遺伝子のRNAi個体において表皮の異常を見いだした。この表皮異常は我々が新たに分離したtsp-15変異体と一致し、tsp-15遺伝子の導入によって補償されることからTSP-15の機能欠失によるものと判断された。tsp-15機能欠失個体の表皮異常はクチクラ層の剥離だけでなく下皮細胞の変性も伴う新しいタイプのものであり、これまでに知られている表皮異常の変異体とは一致しないことから、表皮の発生・維持において未知の分子機構が関与していることが示唆された。現在までのところTSP-15の機能を補償する哺乳類tetraspaninは同定されていないが、tsp-15変異体を用いた機能補償実験からTSP-15タンパク質の細胞内領域がその機能に必要である可能性が示された。GFP融合遺伝子法と免疫電子顕微鏡観察によってTSP-15の発現様式を解析した結果、TSP-15は下皮細胞において発現されており、特に基底膜側に局在することが示された。現在TSP-15の機能と表現型の関連について解析中である。膜4回貫通タンパク質テトラスパニンは30種類以上の分子ファミリーからなり、細胞の接着・遊走・癌転移・細胞膜融合など、細胞間相互作用におけるさまざまな生理現象に機能していることが示唆されている。一方でテトラスパニンは分子的特徴に乏しく、また実際の生理的機能はほとんど不明である。そこで線虫C.elegansを用いることによって、テトラスパニンの生理的役割を遺伝学的アプローチで明らかにする研究を開始したところ、テトラスパニンのひとつであるtsp-15遺伝子の遺伝子機能欠失個体において皮膚疾患である表皮水泡症に類似する表皮の剥離を見いだした。GFP融合遺伝子法と免疫電子顕微鏡観察によってTSP-15の発現様式を解析した結果、TSP-15は下皮細胞において発現されていた。またモザイク個体の解析から、TSP-15の下皮細胞における発現が生体に必要かつ十分であることが明らかになった。電子顕微鏡による形態観察から、tsp-15機能欠失個体の表皮異常はクチクラ層の剥離だけでなく下皮細胞の変性も伴う新しいタイプのものであること、また膜不透過性蛍光色素を用いた機能検証実験から、tsp-15変異体では表皮のバリア機構の維持に異常が生じていることが分かった。一方で、新たにtsp-15変異体の表皮異常を抑制する変異体の探索を開始したところ、現在までに4系統の抑制変異体を得ており、現在その変異alleleのマッピングを行っている。変異体の単離とそれらの原因

遺伝子の性状同定を通して、tsp-15が制御している表皮統合性における遺伝的階層を明らかにしたい。膜4回貫通タンパク質テトラスパニンは、ヒトでは30種類以上の分子ファミリーを形成し、細胞の接着・遊走・癌転移・細胞膜融合など、細胞間相互作用におけるさまざまな生理現象に機能していることが示唆されている。線虫C.elegansを用いることによって、テトラスパニンの生理的役割を遺伝学的アプローチで明らかにする研究を開始したところ、線虫テトラスパニンのひとつであるtsp-15遺伝子の遺伝子機能低下(ハイポモルフ)個体において皮膚疾患である表皮水疱症に類似する表皮の剥離を見いだした。tsp-15機能低下個体の表皮異常はクチクラ層の剥離だけでなく下皮細胞の変性も伴う新しいタイプのものであり、またtsp-15変異体では表皮のバリア機構の維持に異常が生じていることが分かった。この維持機構の異常によって下皮細胞の変性が惹起され、結果、下皮細胞およびクチクラ層の機能と形態に影響を与えていると思われる。以上の結果より、テトラスパニンが表皮統合性に関与する分子であること、また線虫のテトラスパニンの機能を初めて明らかにした。また機能欠失解析と同時に全ての線虫テトラスパニンの発現様式を明らかにした。その結果、少なくとも数種類のテトラスパニンが表皮細胞において機能していることが示唆された。また最近tsp-15の新たな遺伝子変異座が複数単離され、これらは機能欠失(ヌル)変異体であることが示唆された。この変異体では全ての個体においてハイポモルフ変異体よりも早い時期に致死となることから、tsp-15は成体の表皮における機能だけでなく、個体の正常な発生に必須の因子であることが明らかとなった。一方で、tsp-15ハイポモルフ変異体の表皮異常を抑制する変異体の探索を開始したところ、9系統の抑制変異体を得た。その変異遺伝子座の連鎖解析とマッピングを行ったところ、そのうちのひとつは第3染色体の中央にマップされた。これまでのゲノム情報との比較から、この変異の責任遺伝子はtsp-15の遺伝的上流に位置する新規遺伝子と思われる。