hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低コヒーレンス干渉計を用いたスペクトル測定システムの構築と散乱計測への応用

低コヒーレンス干渉計を用いた動的散乱光スペクトル測定システムを用いて、高濃度懸濁液中に分散する微粒子の動特性測定を行った。測定システムは、2×2光ファイバーカップラーマイケルソン干渉計とスーパールミネッセントダイオード(中心波長811nm、コヒーレンス長30μm)からなり、光検出器によって検出された光強度を、A/D変換器を通してコンピュータに取り込み、動的散乱光のパワースペクトルを計測する。本測定システムでは、参照光との光路長差が光源のコヒーレンス長以内の散乱光のみが参照光と干渉するため、干渉信号の時間揺らぎのスペクトルを測定することで、高濃度媒質に対して、単散乱光のみの測定が可能となり、高精度な動特性測定が可能となる。体積濃度10%の単分散ポリスチレンラテックス懸濁液に対して粒子径分布測定を行った結果、粒子径誤差と分散がそれぞれ数%以下という非常高精度な粒子径測定が可能であることを示した。市販の動的光散乱装置を用いて得られた結果と比較しても、これらの結果は、非常に高精度である。2種類の粒子を混合した多分散媒質に対しても粒子径分布測定が可能であることも示した。また、本測定システムを用いて、粒子の体積濃度変化に対する懸濁液の粘度測定を行った。体積濃度を1%から30%の範囲で変化させ、懸濁液の粘度を測定した結果、理論予測、および、拡散波分光法で測定された粘度変化とよく一致する結果が得られた。それらの結果より、本測定システムが、体積濃度1%から30%の広範囲に対して適用可能であること、懸濁液の粘度測定にも有効であることを明らかにした。さらに、動特性の空間分布測定として、ガラス-懸濁液境界近傍での粒子のブラウン運動の測定を行った。境界近傍では、粒子のブラウン運動は境界によって制限されるため、球界面へ接近するにしたがって粒子の拡散定数は減少する。本測定システムより測定された拡散定数の空間分布には、この境界面の影響が現れていることを明らかにした。本測定システムの分解能が30μmと大きいため、完全に空間分布を測定できていないが、分解能の向上によりこれらの測定の可能性を示した。初めに、低コヒーレンス干渉計を用いた動的散乱光スペクトル測定システムの構築を行った。干渉計としては、2×2光ファイバーカップラー用いたマイケルソン干渉計を採用した。光源には、スーパールミネッセントダイオード(中心波長811nm、コヒーレンス長30μm)を用いた。光検出器によって検出された光強度は、A/D変換器を通してコンピュータに取り込まれ、光強度のパワースペクトルが計算される。本測定システムの動作確認実験として、回転粗面板からの散乱光スペクトルの測定を行い、本測定システムが光路長分解した散乱光振幅のパワースペクトルを測定可能であることを確認した。さらに、測定された散乱光振幅のパワースペクトルが、レーザー光を用いた従来の測定法より得られるパワースペクトルと一致することも確認した。また、本測定システムを用いて検出される光強度のパワースペクトルの理論解析を行い、本測定システムが光路長分解した散乱光振幅のパワースペクトルを測定可能であることを理論的にも示した。次に、本測定システムを体積濃度10%の高濃度単分散ポリスチレンラテックス懸濁液からの散乱光スペクトル測定に適用し、本測定システムを用いた高濃度媒質に対する動的光散乱計測の可能性について検討を行った。その結果、本測定システムにより測定された散乱光振幅パワースペクトルが、単散乱理論からの予測とよく一致した。さらに、測定された散乱光強度の光路長依存性も単散乱理論からの予測と一致した。したがって、本測定システムが、多重散乱光の影響を抑え、高濃度媒質からの多重散乱光から単散乱光成分のみを取り出し、スペクトル測定が可能であることが明らかになった。これにより、これまで測定が不可能であった高濃度媒質に対しても動的光散乱計測法が適用可能となることを示した。昨年度構築した低コヒーレンス干渉計を用いた動的散乱光スペクトル測定システムを用いて、高濃度懸濁液中に分散する微粒子の粒子径推定を行った。測定システムは、2×2光ファイバーカップラーマイケルソン干渉計とスーパールミネッセントダイオード(中心波長811nm、コヒーレンス長30μm)からなり、光検出器によって検出された光強度を、A/D変換器を通してコンピュータに取り込み、動的散乱光のパワースペクトルを計算する。粒子径推定には、従来の動的光散乱法で粒子径分布の解析に用いられているCONTIN法を利用した。粒子径、300、460、600nm、体積濃度10%の単分散ポリスチレンラテックス懸濁液に対して測定を行い、数%の誤差で粒子径推定が可能であり、粒子径分解能が数10nmであることが明らかにした。これらの結果より。本システムを用いることで、従来の動的光散乱法では測定不可能であった高濃度懸濁液中の粒子径推定が可能であることを示した(従来法では、体積濃度0.1%程度まで)。さらに、2種類の粒子径の懸濁液を混合した多分散媒質に対して測定を行った結果、それぞれの粒子の大きさ、及び割合を推定できることも明らかにした。これにより、本システムが高濃度多分散媒質に対する粒径分布計測に適用可能であることを示した。一方、本システムにおける多重散乱光の影響を調べるための数値解析法の開発を行った。

解析法は、低コヒーレンス干渉計を用いて測定される動的散乱光のスペクトルを解析するものであり、光子輸送理論、および、拡散波分光理論を基に構築され、モンテカルロアルゴリズムを用いて数値計算を行う。数値解析結果が、本システムにより測定された実験結果とよく一致しており、解析法の妥当性が示された。これにより、本測定システムの性能向上が見込まれる。低コヒーレンス干渉計を用いた動的散乱光スペクトル測定システムを用いて、高濃度懸濁液中に分散する微粒子の動特性測定を行った。測定システムは、2×2光ファイバーカップラーマイケルソン干渉計とスーパールミネッセントダイオード(中心波長811nm、コヒーレンス長30μm)からなり、光検出器によって検出された光強度を、A/D変換器を通してコンピュータに取り込み、動的散乱光のパワースペクトルを計測する。本測定システムでは、参照光との光路長差が光源のコヒーレンス長以内の散乱光のみが参照光と干渉するため、干渉信号の時間揺らぎのスペクトルを測定することで、高濃度媒質に対して、単散乱光のみの測定が可能となり、高精度な動特性測定が可能となる。体積濃度10%の単分散ポリスチレンラテックス懸濁液に対して粒子径分布測定を行った結果、粒子径誤差と分散がそれぞれ数%以下という非常高精度な粒子径測定が可能であることを示した。市販の動的光散乱装置を用いて得られた結果と比較しても、これらの結果は、非常に高精度である。2種類の粒子を混合した多分散媒質に対しても粒子径分布測定が可能であることも示した。また、本測定システムを用いて、粒子の体積濃度変化に対する懸濁液の粘度測定を行った。体積濃度を1%から30%の範囲で変化させ、懸濁液の粘度を測定した結果、理論予測、および、拡散波分光法で測定された粘度変化とよく一致する結果が得られた。それらの結果より、本測定システムが、体積濃度1%から30%の広範囲に対して適用可能であること、懸濁液の粘度測定にも有効であることを明らかにした。さらに、動特性の空間分布測定として、ガラス-懸濁液境界近傍での粒子のブラウン運動の測定を行った。境界近傍では、粒子のブラウン運動は境界によって制限されるため、球界面へ接近するにしたがって粒子の拡散定数は減少する。本測定システムより測定された拡散定数の空間分布には、この境界面の影響が現れていることを明らかにした。本測定システムの分解能が30μmと大きいため、完全に空間分布を測定できていないが、分解能の向上によりこれらの測定の可能性を示した。
結晶を立体特異構造発現の場とする重合反応の研究

これまでの[2+2]トポケミカル光反応の挙動のほとんどについては、出発化合物の結晶構造と結晶内での分子の熱運動を考慮することにより合理的に理解されてきた。混晶からは多くの場合、トポケミカル共重合によってランダムコポリマーが生成することが見出されている。これら混晶は、再結晶によらず、2種の結晶を乳鉢で混合するだけで再結晶によって得られるものと同一の結晶構造を有する光反応性混晶が得られることを見出した。ここで混晶の生成速度のおもな支配因子は、混合粉砕のための攪拌回数,温度,時間,湿度などである。これらについての定量的な実験から、生成する混晶モル分率と攪拌回数,温度,時間との関係を示す実験式(一定温度下での)を誘導した。ここで、Mは混晶のモル分率,tは2種の結晶を混合した時からの時間,Nは乳鉢中での結晶の粉粋攪拌回数である。混晶からはコポリマーが得られる場合がほとんどであるが、顕著なトポケミカル重合性を示すDSP結晶とEthyl4-[2-(2-pyrazyl)ethenyl]cinnamate結晶からは光重合性分子錯体が生成することを見出した。この錯体からはコポリマーは生成せず、2種のホモポリマーが1:2に割合で定量的収率で生成する。光照射後に得られるポリマー結晶中では、モノマー分子錯体の結晶構造から、それぞれのホモポリマーからなる単分子層と二分子層の交互層状構造を形成していることがわかる。このように数々の興味ある新しいトポケミカル挙動が見出された。エステル基とピリジル基をもつ一達の非対称ジオレフィン化合物のエステル残基を変えた場合のこれら結晶のトポケミカル反応性を検討した。その結果,多様なトポケミカル挙動を確認するとともに,結晶構造解析により,これらのすべての挙動を合理的に説明することができた。1)Alkylαーcyanoー4ー[2ー(4ーpyridyl)ethenyl]cinnamate結晶に光照射すると,Meーエステルからはβー型homo付加ダイマ-をへてオリゴマ-が,Etーエステルからはαー型homo付加ポリマ-が,また,Prーエステルからはαー型homo付加ダイマ-が生成する。また,中間体ダイマ-(EtーおよびPrーエステル)を再結晶すると,溶媒を取込んだ数種の光重合性の異なる包接体結晶がえられる。EtーおよびPrーエステルの結晶構造は酷似しているが,それらからえられる混晶はβー型hetero配列をとり,光を照射すると定量的に[2.2]パラシクロファン誘導体をあたえる。2)Alkyl4ー[2ー(4ーpyridyl)etheyl]cinnamateについては,光照射によりMeーエステル結晶は線状ポリマ-が,Etーエステル結晶キラル結晶)は光学活性ダイマ-(e.e.>90%)を,Prーエステル結晶は2種類のダイマ-をあたえる。ここで,Etーエステルでは,再結晶時に(+)または(-)結晶をseedingすると,一方のキラル結晶が大量にえられる(“Amplification of Asymーmetry")。Prーエステル結晶内には,2種のダイマ-(αーおよびβー型)をあたえるような分子配列が存在し,光照射すると結晶構造から予想される2種のダイマ-がえられる。アルキル-4ー[2ー(ーまたは4ーピリジル)エテニル]シンナメ-ト誘導体結晶のトポケミカル挙動について系統的に検討し、以下のような興味ある反応例を見出した。これら挙動については、結晶構造解析や光照射条件(波長、温度)に関連する物理化学的検討を加えた。1)2分子が重なり合って配列しているβー型結晶は、照射温度により生成物が変化する(Product Control)。低温では一般に、高歪み2量体である[2.2]パラシクロファンが得られる。常温以上では、結晶内での分子の熱運動によりコンホ-メ-ションが変化して、シクロファンは生成しないが、分子鎖がさらに生長して、ジグザグー線状の主鎖から成るシンジオタクチック構造の生成物が得られることがある。(Topoche mical Induction)3)数種の光反応性混晶を合成して、トポケミカル共重合体の合成に成功した。混晶は、一般には、混合溶液からの共再結晶によって得られるが、物理的な混合によるだけでも混晶を生成する数種の系を見出した。また、2種モノマ-が個々にコラムを作る混晶も見出した。この場合には、共重合体は生成せず、2種ポリマ-の混合物が生成する。4)2,5ーDSPを2,3ーDSP誘導体に拡張してトポケミカル反応を検討した。その結果、新規な8員環構造をもつシクロファン2量体を与える数種の2,3ーDSP誘導体を見出した。

これらについての定量的な実験から、生成する混晶モル分率と攪拌回数,温度,時間との関係を示す実験式(一定温度下での)を誘導した。ここで、Mは混晶のモル分率,tは2種の結晶を混合した時からの時間,Nは乳鉢中での結晶の粉粋攪拌回数である。混晶からはコポリマーが得られる場合がほとんどであるが、顕著なトポケミカル重合性を示すDSP結晶とEthyl4-[2-(2-pyrazyl)ethenyl]cinnamate結晶からは光重合性分子錯体が生成することを見出した。この錯体からはコポリマーは生成せず、2種のホモポリマーが1:2に割合で定量的収率で生成する。光照射後に得られるポリマー結晶中では、モノマー分子錯体の結晶構造から、それぞれのホモポリマーからなる単分子層と二分子層の交互層状構造を形成していることがわかる。このように数々の興味ある新しいトポケミカル挙動が見出された。
カーボンナノチューブを用いた超高速単一分子スイッチング素子の開発

本研究の目的は,多層CNT先端の五員環上で生じる単一ガス分子の吸着・脱離現象を人為的に制御することで,これに伴う電界放出電流の再現性よい変化を利用した単分子デバイス開発の可能性を探ることである。具体的には,Nd:YAGパルスレーザ照射により吸着分子の人為的脱離を試みると共に,放出電流の変化およびCNTの損傷を電界放出顕微鏡法(FEM)により調べる。最終年度の本年は,吸着分子種として水素を用い,また,照射光にYAGの2倍波(波長532nm)を用いて以下の知見が得られた。(1)水素吸着前の清浄な五員環への光照射実験では,照射に伴い放出電流が階段状に増加した。またこの電流増加量は,光強度に対して指数関数的な振る舞いを見せた。レーザ照射による温度上昇に起因して,電子放出機構が電界放出からショットキー放出へ移行したものと思われる。なお,放出電流は時間経過とともに光照射前の電流値まで減少した。(2)水素吸着した五員環への光照射実験では,CNT先端の電界強度が弱い場合において五員環に損傷を与えることなく水素の脱離が観察された。この場合の放出電流の変化にはCNT先端の温度上昇は観測されないことから,水素の脱離機構は熱脱離ではなく,光刺激脱離であることを示唆した。(3)CNT先端の電界強度が強い場合においては,水素は脱離するものの五員環には損傷が見られた。この場合,吸着水素はCNTから炭素を奪い,炭化水素として脱離するものと考えられる。カーボンナノチューブ(CNT)は、高いアスペクト比を持ち、また炭素原子間の強固な結合に起因する化学的不活性や耐イオン衝撃性を備えることから、理想的な電界放射用陰極材料の1つである。一般にCNTは、グラファイトシートがロール状に巻いた構造をしており、その先端は五員環が6個導入されて多面体的に閉じている。五員環は多面体の各頂点部に位置するため、電界放射においては電界が五員環部に集中し、優勢的に電子放出が生じると考えられる。実際に我々は、電界放射顕微鏡法(FEM)により、清浄表面を持つ単一の多層CNTの電子放出像の観察を行い、チューブ先端に存在する6個の五員環の明瞭な像の検出に成功した。さらに、各五員環面上での単一ガス分子の吸着・脱離現象に伴い、放出電流が2値化されて再現性良く増加・減少することを見い出した。単一分子の挙動は分子ダイナミクスに従うフェムト秒領域の超高速現象であり、またCNT中の伝導電子はバリスティック伝導による高い移動度を持つことから、超高速デバィスへの応用が期待できる。そこで本研究はこの応用の1つとして、五員環面上での単一ガス分子の吸着・、脱離をON/OFFに対応させた新しい動作原理に基づく超高速スイッチング素子開発の可能性を検討中である。具体的には,Nd:AGパルスレーザ照射により吸着分子の人為的脱離を試みると共に,放出電流の変化およびCNTの損傷を電界放出顕微鏡法(FEM)により調べる。

(2)水素吸着した五員環への光照射実験では,CNT先端の電界強度が弱い場合において五員環に損傷を与えることなく水素の脱離が観察された。この場合の放出電流の変化にはCNT先端の温度上昇は観測されないことから,水素の脱離機構は熱脱離ではなく,光刺激脱離であることを示唆した。(3)CNT先端の電界強度が強い場合においては,水素は脱離脱離するものの五員環には損傷が見られた。この場合,吸着水素はCNTから炭素を奪い,炭化水素として脱離するものと考えられる。
硝子体の基盤病態の解明と制御機構の研究

硝子体の生物学的特徴を解明するために、以下の事を行った。硝子体中の分子について、細胞破壊物を中心に解析した。代表的成分として、HMGB-1とhistoneの濃度を測定した。いずれも、網膜剥離や眼内炎で高濃度であった。これらを培養系に添加すると、炎症性サイトカインの産生を増加させたり、アポトーシスなどの細胞死を誘導したりした。このことから、網膜傷害時は網膜機能が損なわれるのみならず、周囲組織にも障害を及ぼすため、速やかにそれらを除く治療が必要である。探索的研究を行った所、ヒアルロン酸が有効なことがわかったため、この原理を用いた新しい手術法を考案した。これらのメカニズムについても、詳細に解析した。当該年度は、以下のことを中心に研究した。研究目的にあるように、眼科各種疾患におけるデグラドーム関連蛋白の測定を行った。まず、HMGB-1についは、眼内炎において、極めて高い値を示した。次に網膜剥離、増殖糖尿病網膜症などが高値であった。しかし、網膜剥離の最終段階である、増殖硝子体網膜症においてはむしろ定値を示した。このことは、細胞破壊によるデグラドームの消長と矛盾がない。一方、もう一つのデグラドームの一つであるhisotne H3は予備実験段階であるが、同じように網膜剥離眼硝子体中で高値を示し、黄斑円孔、網膜前膜、糖尿病黄斑症では定値であった。ただし、活動性の高い網膜剥離眼でも定値を示すものがあったため、histoneと硝子体主成分のヒアルロン酸を混ぜた所、直ちに沈澱を作った。つまり、陽性荷電のhistoneは陰性荷電を示す細胞外基質と電気的に結合するために、ELISAで検出できない可能性がある。そこで、その点を改良するためにヒアルロニダーゼを用いたELISAシステム開発を試みた。その結果、ヒアルロニダーゼ4時間処理後に、活性を止めて、ELISAを行うと、HMGB-1と同じ程度の、検出力を取り戻すことが分かった。その方法を用いて、再度計測を行った所、網膜剥離では全ての症例において、histone蛋白量が高値を示すことがわかった。次に、この蛋白が細胞にどのような影響を及ぼすかを、R28細胞を用いて検討した。その結果、低用量ではほとんど影響がないが、高容量になると、細胞毒性を示すことがわかった。つまり、histoneは細胞崩壊産物であり、好中球による殺菌作用の主体であるが、生体にも有害である。その作用から防御しているのが、細胞外マトリクスであることが示唆された。次年度は、この作用をひとつひとつ検証していく予定である。当該年度は、以下を中心に研究した。昨年度に網膜剥離眼内に高値を示した、hisotne H3についてその機能を研究した。Histone H3は昨年までの研究で、硝子体内でELISA測定が不確実であったが、その原因についてHistonの持つ強い陽性荷電と硝子体・ヒアルロン酸が持つ陰性荷電により凝集体を作ることが主因であることがわかった。このHistoneを、網膜細胞であるR28に添加しても強い変化は起こさないが、網膜色素上皮細胞に添加すると、強いproinflammatory cytokineの誘導がおこることがわかった。さらに濃度を上げると、細胞傷害性が惹起されることもわかった。この作用は、Toll-like receptor 4を介し、p38 MAPKinaseで誘導されることもわかった。網膜剥離でhistoneが眼内に誘導されることがわかったので、実際の網膜剥離モデルを用いて、これらが明らかに存在することを、免疫染色で確認した。網膜剥離においては、アポトーシスなどを中心とした網膜細胞死が誘導される。そのことから、histonesもその現象に関与していることが推測される。そこで、実験的網膜剥離眼において、ニワトリ抗histone抗体を網膜下に投与すると、細胞障害が明らかに抑制された。このことは、網膜剥離における網膜傷害にhistoneが関与することを示すのみならず、抗histone薬が治療薬としての可能性があることを示したものである。次年度は、網膜剥離以外の病態における、デグラドームの役割、およびその点に焦点を当てが治療薬開発にまで、探索を展開する予定である。昨年までの研究から、HMGB-1やhistone H3といった細胞破砕物がToll-like receptorを介して、周辺組織に炎症やダメージを与える仕組みを解明した(damage-associated molecular pattern)。また、硝子体や関節腔の主成分であるヒアルロン酸が、その電荷により、damage associated molecular patternを中和させることを見出した。

そこで、この作用が白内障手術時にもみられるか否かについて、ブタモデルを用いて検証した。摘出ブタ眼に超音波水晶体乳化吸引装置を用いて白内障手術を行った。その眼について、histoneの存在を検索した所、手術前は細胞核内に全て包埋されていたものが、細胞外特に前房内に湧出していることが確認された。そこで、培養角膜内皮細胞についてhistoneを作用させたところ、interleukin (IL)-6などが有意に多く産生された。また、過剰に投与すると、細胞死も誘導した。従来は抗ヒストン抗体でその作用をブロックしたが、今回は臨床的に用いられる眼科用ヒアルロン酸を用いて、ヒストンの作用をブロックした。その結果、有意に有害作用は抑制された。このことは、生体に広く分布しているヒアルロン酸は、関節などの動きを滑らかにする潤滑剤としてだけではなく、組織破壊による2次的有害作用から周辺健常組織を守る働きがあるものだと言える。この概念を用いて、網膜手術時にヒアルロン酸を用いて網膜を保護する「ソフトシェルテクニック」を開発している。これは、既に臨床応用されているOVDとパーフルオロカーボンリキッドを利用する方法であり、その概念をアメリカ眼科学会で報告した。現在症例を集積中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学26年度が最終年度であるため、記入しない。我々は細胞崩壊産物デグラドームが、疾患形成あるいは生体反応におよぼす影響について検討することを目的として研究を開始した。臨床検体の多数の解析により、HMGB-1および核酸崩壊産物ヒストンが、網膜剥離眼内に増加していることを発見した。その定量方法が確立されていなかったが、その原因が硝子体自身が陽性荷電物質と電気的に強い結合をすることであると見出して、問題を解決して、再現性の高い定量システムを構築した。現在この方法を用いて、定量を進めている。また、この情報を生かして、培養細胞などで効果の詳細研究を進めている。その一部は、論文化されているが、随時投稿を進めている。昨年に引き続き、デグラドームの代表である、extracellular histoneおよびそれに惹起される炎症物質tumor necrosis factor-alphaについて、検討した。それぞれが、各種病態でどのようなメカニズムで働いているかを証明することができて、いずれも論文発表、国際学会発表を行った。当初の予定通りにデグラドーム研究の対象物質が絞れたので、その点について追及して行く予定である。当初の予定通りにデグラドーム研究の対象物質が絞れ、網膜剥離における役割について一定の成果を得ることができた。今後は、その他の疾患における作用や、今回の成果に基づいた治療の確立へ展開して行く予定である。
インドネシア・スラバヤ地方における新規下痢原因菌の発見と疫学的解析

1.スラバヤ地方における臨床、及び、環境分離株のPCRスクリーニングを行った。PCRによる毒素原性大腸菌(ETEC)以外の菌株の陽性反応のシグナルは弱く、シグナル強度は、再デザインされたプライマーを用いても改善されなかった。2.PCRスクリーニングで陽性を示した菌株については、グラム陰性の桿菌でチトクローム・オキシダーゼ試験陽性であった。本菌株は、栄養最小限培地やLuria-Bertanibrothでは、ETECなどの大腸菌と比較して著しく増殖が遅かった。そこで、他の種々の複合培地で培養を行ったところ、栄養豊富な複合培地では増殖速度の上昇が認められるが、これら条件で培養した菌株では、PCR反応による毒素遺伝子シグナルが陰性化する傾向にあることが判明した。3.スラバヤ地方から分離されたETEC以外のPCR陽性株について菌体DNAを種々の制限酵素で消化し、パルスフィールド電気泳動を行った後、ゲル中のDNA断片をニトロセルロース膜に転写し、ETECの易熱性エンテロトキシン遺伝子に対するプローブに対してハイブリダイゼーションするバンドの検出を試みた。その結果、low stringency条件下で本プローブに反応するバンドが検出されることが判明したので、このハイブリダイゼーションシグナルを示すバンドをアガロースゲルから切り出し、クローニングべクターにライゲーション後、大腸菌コンピテントセルにトランスフォーメーションした。平板培地上に形成されるコロニーをピックアップし、PCR反応により易熱性エンテロトキシン類似遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。PCR陽性反応を示すクローンをピックアップし、このクローン中のプラスミドの精製が完了した。PCRによる毒素原性大腸菌(ETEC)以外の菌株の陽性反応のシグナルは弱いため、PCRプライマーの再デザインによるシグナルの増強を試みたが、新たに作製したPCRプライマーにおいても得られるシグナルは弱いか、または、検出限界以下であった。2.PCRスクリーニングで陽性を示した菌株について、グラム染色を行ったところ、グラム陰性の桿菌であることが判明した。また、本菌株は、栄養最小限培地では、ETECなどの大腸菌と比較して著しく増殖が遅かった。さらに、チトクローム・オキシダーゼ試験を行ったところ、ETEC等の大腸菌が陰性であるのに対し、PCR陽性株では陽性の反応が認められたことから、PCR陽性株は、チトクローム系を有する細菌であることが判明した。その結果、high stringency条件下では易熱性エンテロトキシン遺伝子に対するプローブに反応するバンドは検出されなかった。しかしながら、low stringency条件下では、本プローブに反応するバンドが検出されることが判明した。
違法ドラッグの新分析法の開発:超高速型HPLCとTOF-MSとの結合

既設の飛行時間型質量分析(TOF-MS)装置に、今回の科学研究費で購入した超高速型液体クロマトグラフ(UPLC)を結合させ、薬毒物検出装置としての長所・短所を検証した。最初TOF-MS装置とUPLC装置のメーカーが異なるため、オンラインで制御する工夫が必要であったが、克服した。次にきのこ毒であるα-アマニチン、β-アマニチンならびにファロイジンの同定・定量法を確立し、一定の成果を得ることができた。最後に、6種類のトリプタミン系違法ドラッグについて、single-stage TOF-MSとタンデムquadrupole-TOF-MSでのマススペクトルの測定を行った。その結果、single-stage-TOF-MSによって得られるプロトン付加分子イオンのアイソトープマススペクトルパターンが各物質の同定に利用できることが判明した。さらにタンデム方式においてもCID電圧を調節することにより、100Da以上のプロダクトイオンが出現し、特異性の高い定量も可能であることも判明した。1.超高速型液体クロマトグラフィー(HPLC)の立ち上げ超高速型HPLCは粒径の小さな充填剤をつめたカラムに高圧をかけ、急速に目的物質を分離溶出するものである。今回導入したものはオートサンプラーが装備されており、すべてコンピュータ制御される。とりあえず、超高速型HPLCの立ち上げに用いる化学物質として、きのこ毒であるα-アマチニン、β-アマチニン、ファロイジンの標準品、さらに内部標準としてマイクロシスチンを用いて実験を開始した。当初期待していた程のHPLCレベルでの高感度は得られなかったが、保持時間はかなり短縮されることが判明した。2.超高速型HPLCシステムとTOF-MS-MSとの結合今回導入した超高速型HPLCと既設のTOF-MS-MSとの連結制御を上記物質類を用いて実際に試みたところ、HPLC制御コンピュータとMS制御のコンピュータを統合するためには、さらにChemStation等の応用性の高い制御システムが必要なことが判明した。このシステムも高価であるため、とりあえずHPLCとMS別々かつ同時に制御しながら分析操作を行うことにした。3.対象薬物の収集・合成合成は現在行いつつあり、数種の物質を合成した。これからは合成されたものを広く収集しつつある段階である。1.超高速型HPLCとTOF-MSのon-line結合の確立既設のTOF-MS装置に、今回の科学研究費で購入した超高速型HPLCをon-lineで結合させ、オートサンプラーを用いて、24時間稼働させ、多検体を分析できる様に設定した。設定するに際して、対象とした毒物はドクツルタケキノコ毒素であるα-アマニチン、β-アマニチンならびにファロイジンである。これらは環状ペプチドであり、分子量788919とやや大き目な分子構造をもち、一般的なODSカラムでは分離が悪い。そのため順相のTSK-gel Amide-80(トーソー、東京)分離カラムを用いて良好な結果を得た。オートサンプラー、HPLCならびにTOF-MSのon-line作動は良好で、多数バイアル検体を用意すれば、夜を徹して自動分析可能であった。得られた結果を法中毒学専門学術雑誌ForensicToxicologyに投稿し、現在web上に発表されている。世界各国において、いわゆる規制薬物の構造の一部分を化学的に変えると、その物質が規制薬物ではなくなる。構造の一部分が修飾されても、同様な作用を有したり、むしろ強い作用を呈することもある。この様なことが検証されれば数年後に規制薬物に指定されることとなるが、それまでは使用しても罰せられない。この様な薬物をデザイナードラッグと呼んでいる。これらの多くが日本では違法ドラッグとして扱われており、薬事法で、ある程度製造・販売等が制限されている。現時点で、ようやく16種類の違法ドラッグを収集することに成功した。従って、16種を一斉に分析するか、もしくは未だ分析法が確立されていない薬物を選別し、今回新しい検出法であるTOF-MS検出技術のメリットをフルに生かしながら、分析法の詳細を検討する。22年度の実験のために収集した違法薬物は:DOC,TMA-6,4FMP,N-メチル-4FMP,HMDMA,BDB,PMMA,MMDA-2,DOI,4-AcO-DIPT,5-MeO-MIPT,5-MeO-DALT,5-MeO-DET,4-OH-DIPT,5-MeO-AMTならびに5-MeO-DPTである。

1.超高速型HPLCとTOF-MSとの結合のメリットとデメリット既設のTOF-MS装置に、今回の科学研究費で購入した超高速型HPLCを結合させ、まず手始めとして、きのこ毒の典型であるα-アマニチン、β-アマニチンならびにファロイジンを用いて、本法のメリットとデメリットを検証することができた。まずメリットとしては、TOF-MSは分解能10,00012,000と高く、HPLC-single stage TOF-MSで得られるプロトン付加分子イオン部分の横軸を拡大すると、炭素原子のアイソトープピークによるプロトン付加分子の同位体ピークが4個程出現し、それぞれの精密質量数とピーク強度が一定の条件下では一定のパターンを示す。このパターンをsingle stage MSにもかかわらず、各物質固有のマススペクトルとして利用できることが判明した。デメリットは、意外と検出感度が低かったことである。シグナル/ノイズ比が3とする検出限界は、α-アマニチン、β-アマニチン、ファロイジンでそれぞれ、30、30ならびに10ng/gと最新鋭のHPLC-MS装置としては低感度であった。前回の実績報告書に記載したとおり、16種類の違法ドラッグを入手しているが、今回は報告の少ないトリプタミン系違法ドラッグ6種類に的を絞り、それぞれの化合物について、single stage TOF-MSとタンデムquadrupole-TOF-MSでのマススペクトルの測定を行った。対象薬物は4-OH-DIPT、5-MeO-AMT、5-MeO-DALT、5-MeO-DET、5-MeO-DPTならびに5-MeO-MIPTである。single stage TOF-MSのプロトン付加分子イオンでは5-MeO-AMTで2本、その他の5種類の物質では3本のアイソトープピークが出現し、理論値との誤差はいずれも5mDa以下であった。この事から、これらトリプタミン系違法ドラッグについても、プロトン付加分子イオン部分のアイソトープマススペクトルパターンが各物質の同定に利用できることが判明した。タンデムquadrupole-TOF-MSでのマススペクトルでは、CID電圧の違いで、プロダクトイオンスペクトルパターンは変化するものの、定量に利用できる100Da以上のプロダクトイオンが出現し、特異性の高い定量を実現できる可能性を示した。
OTC欠損症のモデル動物作製とその応用

ヒトの遺伝性疾患の研究を行い、治療を開発するには動物モデルが必要であるが、動物は代謝、吸収などの薬物動態がヒトとは異なっており、開発を行う上で問題となることがしばしばである。この問題を解決するために肝臓が高度にヒトの肝細胞に置換された動物を用い、TALEN/CRISPR/Casシステムにより標的遺伝子をknockoutすることによりヒトの疾患を模倣し、in vivoで薬物動態などが評価できるモデルを構築することとした。研究対象としてまずOTC欠損症のモデルを作製するためにTALENのconstructを作製し、切断活性を確認した。肝臓を疾患の主要臓器とする遺伝性疾患はα1 anti-trypsin欠損症、血友病、OTC欠損症、ウイルソン病、ヘモクロマトーシスなど多数存在する。これらの疾患の病態の解析、治療の開発にはノックアウトマウスが用いられていることが多い。しかし、マウスとヒトの病態は必ずしも同一ではなく、またマウスで良好なモデルが作製できないものもある。我々は肝臓がほぼ完全にヒト肝細胞に置換されたキメラマウスを作製して、ヒトとチンパンジーにしか感染しないB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスの感染モデルを作製し、創薬研究に成果を上げてきた。さらに、最近我々は理学研究科との共同研究でTALENやCRISPR/Casシステムを用いて複数の遺伝子を同時にknockoutする系を構築した。また、BacMamシステムを使用して、高効率にヒト肝細胞キメラマウス由来の培養ヒト肝細胞にGFP遺伝子を導入できることも確認した。そこで、本研究ではこれらの技術を使用してヒト肝細胞キメラマウスの肝細胞の標的遺伝子をknockoutし、創薬研究が可能なマウス、細胞系を創出することとした。平成26年度にはOTC欠損症のモデル作製に必要なknockout constructを作製し、BacMamのシステムに導入した。現在BacMamシステムでマウス中のヒト肝細胞に遺伝子が導入し、実際に切断が得られるかどうかについて検討を行っている。今後はこのようにして正常の遺伝子を破壊した細胞を選択し、さらにそれをキメラマウスに戻すことにより、全てのヒト肝細胞が遺伝子欠損を有する動物モデルを作製することが出来るが、さらにこの動物から取り出した肝臓を再潅流して播種することにより薬剤のスクリーニングに使用できる細胞を作製することが出来ると考えられるため、この方向でさらに研究を進めていく。肝臓病学
短期免疫療法に適した遺伝子導入シュワン細胞を用いるハイブリッド型人工神経の開発

未分化シュワン細胞をワーラー変性した大人の神経組織より効率よく採取し、in vitroにて高純度培養する技術を開発した。しかしながら、継代に従いシュワン細胞本来の機能が失われる事が明らかとなった為細胞移植に必要な大量の細胞確保には自家に加え同種シュワン細胞の活用が不可欠と結論した。そこで本課題にては自殺遺伝子の導入により移植した同種シュワン細胞を除去する技術を開発し、これにより短期免疫療法にて移植可能なハイブリッド型人工神経を開発する事を試みた。シュワン細胞柱の構成、高い軸索誘導能の温存の為に基質にラミニンが不可欠な事を明らかにし、また、3次元培養におけるマトリゲルの有用性を示した。この研究の過程において未分化シュワン細胞がin vitro,in vivoの何れの状況でも長期間は生存せず、アポトーシスに陥ること、NGF/NGFRを介してdeath signalが生ずる事、sphingomyelin cycleを介し、転写因子NFkBの活性化により細胞死が生ずる事を明らかにした。また、同じシグナルが低レベルの発現ではシュワン細胞柱の構成に不可欠であり、NGFRの発現レベルによりシグナルのレベルが調整される事も示した。以上の結果より移植シュワン細胞は自殺遺伝子を導入せずともNGFRの発現レベルを調整する事で排除可能である事がわかった。そこで一過性且つ部分的にNGFRの発現を抑制し、高い軸索誘導能を持ったシュワン細胞柱構造を維持する事を目的としたアンチセンス療法の開発に着手した。現在in vitroにて3次元コンストラクトでほぼ目的とする作用を発揮できるところまで開発は進行し、特許出願準備中である。当初、自殺遺伝子の導入により同種シュワン細胞に対し選択的に細胞死を誘導する事を検討していたが、その研究過程においてシュワン細胞は生理学的状況においてアポトーシスを生ずる事が分かった(論文-6)。更に、このアポトーシスが軸索再生における神経ネットワークの混乱を回避する為に不可欠な現象であることが明らかとなった(論文-7)。そこで、シュワン細胞におけるアポトーシスの分子機構を検討した。その結果、神経栄養因子およびそのレセプターを介したアポトーシスの機構が明らかとなった(詳細に関しては現在論文にまとめて投稿中であり、公表は現時点では避けたい)。また、シュワン細胞の3次元培養系を確立し、これを用いてアポトーシス誘導機構の制御が軸索再生に及ぼす影響をex-vivoで調べた。その結果、アポトーシス誘導機構は一方ではワーラー変性におけるシュワン細胞の分化制御、ひいては論文-2,3,4で検討されたシュワン管構造の形成に深く関与し、これにより再生軸索の誘導に非常に重要な役割を果たす事が明らかとなった(同様の理由により詳細の公表は現時点では避けたい)。以上の事はシュワン細胞のアポトーシス誘導機構が末梢神経系における軸索再生の鍵を握っている事を示しており、遺伝子導入によりこの機構を制御する事の有用牲を示唆していた。そこで、現在アポトーシスの制御機構に関係する遺伝子およびそれらのアンチセンスの導入を試みており、遺伝子導入同種シュワン細胞と自己シュワン細胞を組み合わせた移植の有用性を確認している。軸索再生におけるシュワン細胞のアポートシスは神経成長因子(NGF)とその低親和性レセプターであるp75NTRの結合により細胞内cearmideレベルが上昇し、これにより転写因子NF-kBの活性化されもたらされることを明らかにしてきた。更に同じシグナルが低レベルで発現する際にはアポトーシスではなくシュワン細胞の分化を誘導し軸索再生に重要な役割を果たしていること、また、シュワン細胞のレスポンスはp75NTR発現レベルにより調整されていること、を明らかにした。以上の結果により人工神経に用いる同種シュワン細胞の分化、細胞死の制御は当初考えていた自殺遺伝子を導入するよりもこのシグナルのレベルを調整することで行う方が合目的であるとの結論に達した。

そこで現在(1)p75NTR,NF-kBに対するアンチセンスを作成し、リポフェクションによりこれをシュワン細胞に導入し分化、細胞死への影響を調べる、(2)後根神経節exvivoモデルに対しこれらのアンチセンスを投与し軸索再生への影響を調べる、(3)後根神経節とシュワン細胞を3次元共培養しこれらアンチセンスの軸索再生と移植シュワン細胞への影響を調べる、という三つの実験を行った。詳細は論文作成であり避けたいがin vitroでは期待した結果が得られたことより今後はハイブリット型人工神経を移植したモデルにおいてin vivoでの検討を行う予定である。昨年までの研究で、(1)培養シュワン細胞が単層培養では2週程度で、人工基底膜中での3次元培養でも4週程度で非定型的apoptosisを生ずる事、(2)apoptosisは神経成長因子(NGF)とそのレセプターの結合により細胞内セラミドが上昇し、NFkBが過剰に活性化されることで生じていること、(3)同じシグナルが低レベルで発現している際にはシュワン細胞柱の形成、維持が誘導されていること、(4)NGFの産生レベルに変動は見られず、NFkBの過剰な活性化はシュワン細胞膜表面におけるNGFレセプターの密度の上昇によりもたらされること、(5)NGFレセプター或いはNFkBの発現を抑制する、スフィンゴミエリンサイクルに関与する酵素を阻害することでシュワン細胞柱形成、シュワン細胞のapoptosisを抑制できる、(6)軸索とのコンタクトにより非髄鞘形成未分化シュワン細胞の表現型の変化が生じ、細胞死が抑制される、(7)軸索とコンタクトしていない未分化シュワン細胞は正常の軸索を刺激して側副発芽を誘発し、神経ネットワークを混乱させうる、(8)軸索とコンタクトした未分化シュワン細胞は発芽を抑制し、神経束形成を促進する、事を明らかにしてきた。以上の知見より培養シュワン細胞を組み込んだハイブリット型人工神経の開発には培養シュワン細胞のapoptosisを抑制し、より長期観にわたりシュワン細胞柱構造が保たれる必要がある一方で、軸索再生の完了した部分では過剰な培養シュワン細胞が排除される必要があることが分かった。そこで、今年度はNFkB,NGFレセプターに対するantisense oligonucleotideを用い祖の過剰発現を抑制することでシュワン細胞構造を長期間維持することを試みた。一般的に用いられているphosphorothioate oligonucleotideでは、しかしながら、シュワン細胞への毒性が強くnon-antisense effectにより期待した結果は得られなかったが、毒性を落とした独自のantisense(詳細は公表を避けたい)により高い軸索誘導能を示すシュワン細胞柱構造をもつハイブリット型人工神経の構築を実現できた。
宇宙環境での前庭有毛細胞の発生と維持機構の解明

内耳前庭有毛細胞の発生について、マウスES細胞を用いて、内耳組織の分化誘導についても重力環境の影響について検討したところ、微小重力環境下では内耳有毛細胞系への分化誘導が抑制される傾向を認めた。また、マウスの前庭耳石器組織を採取し、コラーゲン内で器官培養を行い、感覚毛を免疫組織学的に検討し、実験系のセットアップを確立し、通常重力環境下および微小重力環境下での培養で前庭組織有毛細胞の感覚毛について比較検討した。微小重力環境ではコントロール群と比較して、感覚毛がやや減少する傾向を認めたが、有意ではなかった。上記結果より、有毛細胞の発生には重力の影響があると考えられた。生後3-5日目のICRマウスから前庭有毛細胞を採取し、3Dクリノスタット微小重力環境下で器官培養を行うために、内耳前庭組織の器官培養系の確立を行った。通常の内耳前庭組織の器官培養では3Dクリノスタットを用いた場合に、感覚毛に振動刺激が加わるため、微小重力の影響を正確に検討する事が出来ないと考えられる。そのために、コラーゲン内で内耳前庭組織を培養する方法を検討した。但し、感覚毛の形態評価を行う必要があるため、コラーゲンの濃度、量などの最適条件の検討を行った。また予備実験として3Dクリノスタットを用いて6時間微小重力環境下で器官培養を行ったが、感覚毛には明らかな変化は観察されなかった。マウス生後2日目のマウスの前庭耳石器組織を採取し、コラーゲン内で器官培養を行い、感覚毛も免疫組織学的に検討し、実験系のセットアップを確立した。通常重力環境下および3Dクリノスタット微小重力環境下での培養で前庭組織有毛細胞について比較検討した。微小重力環境での培養を1日間から5日間まで行い検討した。有毛細胞の評価方法としては、phalloidin染色にて感覚毛の形態について観察検討した。24時間では感覚毛は正常との明らかな差は認めなかったが、36時間以上になると感覚毛数が減少しており、前庭耳石器が長時間の微小重力環境により障害を受ける可能性があることが示唆された。またES細胞を用いて、内耳組織の分化誘導についても重力環境の影響について検討した。従来の報告では微小重力は分化を抑制する方向に働くとされているが、内耳については未だ明らかではない。今回、Math-1-ES細胞から従来の報告の方法を参考にして内耳有毛細胞を誘導し、通常重力および微小重力での分化誘導の差について検討したところ、微小重力環境下では内耳有毛細胞への分化誘導が抑制される傾向にあることがわかった。さらにTRIOBP欠損マウス(生後2日令)にても前庭耳石器組織を採取し1週間器官培養を行った。TRIOBPマウスでは感覚毛の根の形成不全があり、有毛細胞の変性を来すとされているが、今回の実験で有毛細胞の感覚毛については通常重力環境でも微小重力環境でも明らかな差は認めなかった。正常マウスでは微小重力環境が長くなると感覚毛に障害が生じる可能性が示唆された。また感覚毛の根に障害があるTRIOBPノックアウトマウスも用いて微小重力環境の影響を検討したが、今回の検討では明らかな差は認めなかったことから、根の成熟への重力の関与は低いと考えられた。昨年度までにES細胞から内耳細胞への分化誘導およびマウス前庭耳石器の器官培養を3Dクリノスタット下で行い、下記の結果を得た。1)ES細胞を内耳細胞へと分化誘導を通常重力状態と微小重力環境下で行ったところ、通常重力状態ではMath1-GFP陽性で有毛細胞系への分化が見られたが、微小重力環境では内耳への分化が抑制される傾向を認めた。このことから、微小重力による内耳発生分化抑制については従来の報告と一致しており、重力が分化に影響する可能性があると考えられた。2)マウス耳石器を微小重力負荷時間を変更して器官培養したところ、微小重力負荷時間と感覚毛微小重力環境ではわずかに減少傾向を認めたが、明らかな差認めなかった。このことより、微小重力負荷時間と感覚毛数変化には明らかな相関が見られず、微小重力時間が感覚毛に影響を及ぼす影響は少ないと考えられた。3)培養日数と感覚毛微小重力負荷直後では感覚毛の減少傾向あり、微小重力負荷直後には感覚毛数減少が見られたが、遺伝子発現変化の報告もあり遺伝子との関連も示唆された。上記内容を第75回めまい平衡医学会にて発表し、ポスター賞を受賞した。研究者の所属先が変更になり、臨床業務による実験従事時間の減少および新たに実験セットアップが必要になり、実験を従来通りに行うことがで出来なくなったためこれまでにES細胞から内耳細胞への分化誘導およびマウス前庭耳石器の器官培養を3Dクリノスタット下で行い、内耳細胞の分化誘導に対する重力の影響および前庭耳石器の有毛細胞の形態学的変化を観察した。最終年度はデータの再評価および論文作成に必要な追加実験について検討した。1)ES細胞を内耳細胞へと分化誘導を通常重力状態と微小重力環境下で行ったところ、通常重力状態ではMath1-GFP陽性で有毛細胞系への分化が見られたが、微小重力環境では内耳細胞の発現細胞割合が減少しており、内耳細胞への分化が抑制される傾向を認めた。

このことから、微小重力による内耳発生分化抑制については従来までの微小重力が分化誘導を抑制するという報告と一致しており、内耳においても重力が分化に影響する可能性があると考えられた。2)マウス耳石器を微小重力負荷時間を変更して器官培養を行い、微小重力負荷時間と感覚毛数について検討した。微小重力環境ではわずかに減少傾向を認めたが、明らかな優位差は認めなかった。このことより、微小重力負荷時間と感覚毛数変化には明らかな相関が見られず、微小重力時間が感覚毛に影響を及ぼす影響は少ないと考えられた。3)培養日数と感覚毛微小重力負荷直後では感覚毛の減少傾向あり、微小重力負荷直後には感覚毛数減少が見られたが、遺伝子発現変化の報告もあることから有毛細胞関連遺伝子の関与も示唆された。(上記内容を第75回めまい平衡医学会にて発表し、ポスター賞を受賞した)内耳前庭有毛細胞の発生について、マウスES細胞を用いて、内耳組織の分化誘導についても重力環境の影響について検討したところ、微小重力環境下では内耳有毛細胞系への分化誘導が抑制される傾向を認めた。また、マウスの前庭耳石器組織を採取し、コラーゲン内で器官培養を行い、感覚毛を免疫組織学的に検討し、実験系のセットアップを確立し、通常重力環境下および微小重力環境下での培養で前庭組織有毛細胞の感覚毛について比較検討した。微小重力環境ではコントロール群と比較して、感覚毛がやや減少する傾向を認めたが、有意ではなかった。上記結果より、有毛細胞の発生には重力の影響があると考えられた。前庭組織の微小環境での器官培養のために、3D培養が必要となるが、3D培養では全体の感覚毛の形態学的評価が困難になる。当初は耳石をつけたままの培養が生理的であるため、耳石付着状態で培養を行ったが、感覚毛全体の形態学的評価が出来なかった。感覚毛の評価が可能な3D培養の条件を検討するために、約半年間を要したために、達成度はやや遅れている。また生後の前庭器だけでなく、胎生期の内耳組織の培養も行ったが、形態評価が困難であった。今年度のデータをまとめて、微小重力環境での内耳前庭有毛細胞感覚毛の成熟への影響をまとめる。その際に必要な条件での実験が必要であれば、再度実験を行い検討する。可能であれば胎生期での前庭組織を用いて、感覚毛の発達における重力の関与を検討したい。今までの研究成果を新しい環境で再検証を行い、今年度中にまとめて論文作成を行う耳鼻咽喉科微小重力環境下で生後前庭組織の器官培養の系がほぼ確立されたので、今後は3Dクリノスタットを用いて感覚毛に影響を及ぼす時期、期間などを検討する。また、胎生期についても同様の方法で感覚毛が評価可能か検討し、感覚毛の発生に及ぼす微小重力環境についても検討する予定である。実験計画よりも購入物品が少量で済んだためと思われます。また使用動物実験数も少量で済んだためと考えられます。研究者の所属先が京都大学から京都医療センターに変更になり、臨床業務で多忙のため、実験をスムースに行えなかったため。また実験環境の変化に伴い、従来通りに実験を行えなかったため。器官培養系の確立に予想以上の期間を生じたため、実際に微小重力環境での器官培養実験を行う事が出来なかったために次年度使用額が生じました。論文作成に際して、不十分な実験を追加で行います。また英文校閲や論文掲載料などに使用する計画です。新しい環境で実験を再度行い、結果を検証する予定である。動物や薬剤などの使用料や論文作成のために、使用する予定である。培養系がほぼ確立されたので、予定以上のペースで器官培養実験を行い、実験の遅れを取り戻す予定です。
造血幹細胞移植の獣医学領域への適応に向けた基礎研究

1.イヌ同種骨髄移植における骨髄採取法、前処置法および生着促進法の検討:1)骨髄採取法の検討:骨髄細胞の吸引採取法と灌流採取法を比較したところ、灌流法で採取したほうが造血前駆細胞比較的多く採取でき、赤血球数の混入を有意に低くすることができたため、よりすぐれていると判定した。2)移植前処置法の検討:骨髄破壊性前処置法と骨髄非破壊性前処置法を組み合わせたいくつかの前処置法によって移植骨髄の生着が認められた。3)生着促進法の検討:ドナーリンパ球輸注を行ったところ、末梢血白血球数の増加率が高まり、移植した造血細胞の生着を促進された。2.イヌ髄中の造血幹細胞の純化と特性の解析:イヌ髄中の有核細胞を比重、小麦胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin : WGA)の結合偉およびRhodamine123(Rh)の染色性に基づき分画したところ、低比重で、WGAの結合性が高く、且つRhの染色性が低い細胞中にほとんどすべての多能性造血前駆細胞が集積しており、造血幹細胞も同様な特性を有することが判明した。3.イヌ多能性造血前駆細胞を認識するモノクローナル抗体の作製:低比重骨髄細胞をマウスに免疫し、イヌ造血幹細胞に対するモノクローナル抗体の作製を行ったところ、多能性造血前駆細胞の表面抗原を認識するモノクローナル抗体を数クローン得た。4.免疫抑制効果を示す抗イヌT細胞抗体の作製:イヌ末梢血のT細胞に対するモノクローナル抗体の作製を行ったところ、in vitroで免疫反応を抑制し、イヌに静脈内注射をした場合、イヌ末梢血中のT細胞を減少させる特性を持った1クローンを得た。1.イヌにおける骨髄細胞採取標本の解析:骨髄細胞を両側大腿骨および上腕骨を生理的食塩水で灌流して採取した。4匹のイヌを用いて行い、平均3.7×10^9個の骨髄細胞が得られた。これら骨髄細胞をフローサイトメートリーにて解析したところ、CD34陽性細胞が1.2%、CD4陽性細胞が6.2%、CD8陽性細胞が1.1%、surface IgM陽性細胞が8.5%であった。末梢血単核球分画においては、CD34陽性細胞が0%、CD4陽性細胞が40.2%、CD8陽性細胞が18.6%、surface IgM陽性細胞が24.7%であるので、骨髄灌流によって末梢血の混入の少ない骨髄細胞が採取できるものと思われた。2.ドナー骨髄細胞の生着の検討:レシピエント末梢血中のドナー骨髄由来細胞を検討するため、末梢血白血球からDNAを分離し、イヌ主要組織適合抗原classl中の塩基配列をprimerとしたマイクロサテライトの多型性を利用したPCRによる個体識別を行った。3.レシピエントのコンディショニングの設定と移植骨髄の性着性:コンディショニングとして、レシピエントの造血および免疫細胞を排除するmyeloabrative conditioningと抗T細胞抗体や免疫抑制剤によって拒絶反応のみを抑制し、レシピエントの造血および免疫細胞の排除が少ないnonmyeloabrative conditioningがある。myeloabrative conditioningは、効果的であるが、レシピエントに大きなダメージををあたえる。よって、安全でより効果的なドナー造血幹細胞の生着をもたらすため、コンディショニングの中からどの様なものをどの様な割合で用いるか検討する必要がある。