hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
補強性フィラーを添加した高分子電解質系セメントの凝結性に関する研究-超微粒シリカおよびカップリング処理フィラー複合系について-

従来の高分子電解質系セメント(ポリカルボキシレートセメントおよびグラスアイオノマーセメント)の強度、耐酸性を改善することを目的として、新しいセメント組成物すなわちポリカルボン酸のゲル化材に少量の酸化カルシウムを用い、微細なアルミナ粉末を補強性フィラーとして比較的多量配合したセメントを試作し、その凝結性、強度、耐酸性を検討した。その結果、セメントとしての操作時間および硬化時間は、酸化カルシウムに1020%酸化マグネシウムおよびフッ化ナトリウムを添加し、焼成(9001000°C)を行なうことにより調節することができた。また、ゲル化材粉末の粒度を変化させることによっても調節することができた。セメント硬化体のかたさは、ポリカルボキシレートセメントの約2倍で、グラスアイオノマーセメントより若干高い値が得られたが、圧縮強さは、ポリカルボキシレートセメントよりやや低かった。SEMで硬化体の微細構造を観察したところ、フィラーの分散状態が不均一であることが圧縮強さを低くしていることが判明した。従って、フィラーの配合方法の検討が課題として、残された。セメント硬化体の緩衝液(pH5)中における溶解率は、従来のセメントより大きかったが、その原因として、ゲル化材中のフッ化ナトリウム等の溶解とフィラーの不均一分散によることが分かった。そこで、フッ化ナトリウムに代わって溶解性の低いクリオライトを用いたところ、溶解性が著しく減少した。以上のことから、本系セメントを開発するための基礎的な指針が得られた。
マウス気管平滑筋をモデルとした間充織細胞極性化機構の解明

生命機能を支える臓器は、管腔構造を基本とする。内腔を覆う上皮細胞とそれらをささえる間充織細胞によって構成される。発生の過程では、上皮組織と間充織組織が互いに相互作用しながら正常な臓器を形づくっていく。本研究では、間充織細胞、特に、気管平滑筋前駆細胞が放射状極性を獲得する分子機構の解明を目指している。申請者は、先行研究において平滑筋前駆細胞の極性化が、マウス気管の伸長に必要であることを報告している。極性化機構の解明は、臓器の形態形成の根本的理解に繋がる。気管平滑筋前駆細胞は上皮組織近傍に形成され、上皮組織に向かう極性を獲得することから、気管上皮組織が間充織組織の極性化を許容している可能性が高い。申請者らは初年度の検討において、平滑筋前駆細胞が上皮細胞由来のスフェロイドに向かって移動することを発見した。この観察結果は上皮組織が平滑筋前駆細胞の極性化を誘導している事を示している。さらに、極性化の生じる胎生11.5, 12.5日目の上皮近傍の間充織ではShh, Wnt signalingが活性化することを発見した。加えて、間充織細胞極性化のタイミングと一致して、上皮組織ではShh, Wnt7bが発現していることを見出した。最終年度において、Wnt signalingの間充織極性化における役割を調べるため、間充織特異的にb-cateninを欠損するマウスを樹立、解析した。その結果、平滑筋組織の配向性が顕著に乱れることが分かった。これらの結果は、上皮由来のWntが平滑筋前駆細胞の極性化を誘導している可能性を強く示している。本研究課題では、マウス気管をモデルとして上皮近傍の間充織細胞、特に平滑筋細胞が上皮組織に向かって極性化するメカニズムの解明を目的としている。平滑筋細胞は上皮に向かって極性化するため、上皮組織が間充織の極性化を許容している可能性が高い。本年度は、この仮説を立証するため、まずin vitroの上皮・間充織の再構成系の確立により、平滑筋細胞の極性化の意義を直接的に観察することを試みた。胎生12.5日目のマウス胎仔気管から上皮細胞と間充織細胞を回収して、マトリゲル内で培養すると間充織組織がSphere化した上皮細胞に向かって移動する様子が観察された。さらに、上皮細胞に向かう移動はWnt5aを欠損することによって阻害された。これらの結果は、上皮が間充織の極性化を誘導すること、さらにWnt5a signalが間充織細胞の極性化・移動に必須であることを示している。次に、上皮由来の極性誘導因子を同定するため、間充織のおいて活性が上昇するシグナルを各種レポーターマウスと免疫染色により検討した。その結果、気管平滑筋ではWntおよびShhシグナルが活性化していることを見出した。さらに、in situ hybridizationより、Wnt7b, Shhが上皮組織に発現していることを発見した。また、平滑筋の力学的作用が極性化に与える影響を調べるため、平滑筋細胞の分化のマスターレギュレーターであるSerum response factor (Srf)の組織特異的ノックアウトマウスを樹立した。このマウスの上皮近傍の間充織は平滑筋マーカーが発現していないにもかかわらず、間充織組織の極性や細胞形態が正常に維持されていることを発見した。この結果は、上皮近傍の間充織細胞は平滑筋分化・収縮に依存せず、極性を獲得することを示している。本研究課題では、上皮組織が近傍の間充織組織を極性化するメカニズムを解明することを目的としている。本年度の研究において、気管上皮細胞と間充織細胞のin vitroの共培養系を確立し、間充織細胞が上皮に向かって移動する様子をLive imagingでとらえることに成功した。この結果は、上皮が間充織の極性化を誘導するという仮説を直接的に証明するものである。これらの結果は、上皮由来の間充織極性化誘導因子として上記因子が候補となりうることを示している。これらのシグナルの機能的な重要性についても今後、検討する必要があるものの、概ね、研究は順調に進行しているといえる。一方、気管において平滑筋細胞への分化を阻害されるSrf欠損マウスにおいても、間充織組織の極性化は維持されていたことから、間充織細胞の極性化に平滑筋の収縮運動および分化は必要ないことが分かった。これらの結果をうけて、平滑筋以外の上皮近傍の間充織細胞の極性を調べたところ、平滑筋細胞以外の軟骨前駆細胞もまた上皮組織に向かって極性化していることを発見した。今後は平滑筋細胞に限らず、上皮近傍の間充織細胞全般を対象として間充織細胞極性化のメカニズムを探索していく必要がある。

本研究では、間充織細胞、特に、気管平滑筋前駆細胞が放射状極性を獲得する分子機構の解明を目指している。申請者は、先行研究において平滑筋前駆細胞の極性化が、マウス気管の伸長に必要であることを報告している。極性化機構の解明は、臓器の形態形成の根本的理解に繋がる。気管平滑筋前駆細胞は上皮組織近傍に形成され、上皮組織に向かう極性を獲得することから、気管上皮組織が間充織組織の極性化を許容している可能性が高い。申請者らは初年度の検討において、平滑筋前駆細胞が上皮細胞由来のスフェロイドに向かって移動することを発見した。この観察結果は上皮組織が平滑筋前駆細胞の極性化を誘導している事を示している。さらに、極性化の生じる胎生11.5, 12.5日目の上皮近傍の間充織ではShh, Wnt signalingが活性化することを発見した。加えて、間充織細胞極性化のタイミングと一致して、上皮組織ではShh, Wnt7bが発現していることを見出した。最終年度において、Wnt signalingの間充織極性化における役割を調べるため、間充織特異的にb-cateninを欠損するマウスを樹立、解析した。その結果、平滑筋組織の配向性が顕著に乱れることが分かった。これらの結果は、上皮由来のWntが平滑筋前駆細胞の極性化を誘導している可能性を強く示している。本年度の解析より、上皮組織が上皮近傍の間充織細胞に作用して極性化を誘導していることを突き止めた。さらに、上皮近傍の間充織細胞においてShh, Wnt signalingが活性化していることを見出した。今後の研究ではまず、これらのシグナルが間充織細胞の極性化に与える影響を調べる。Shh欠損マウス、b-cateninの欠損マウスの気管を用いて免疫染色によって、間充織組織の極性の有無を調べる。間充織細胞の極性化の過程でWnt7bとShhが上皮組織で発現していることが分かった。これらの因子が平滑筋細胞の極性化を誘導するか否か検討する。具体的には、Shh, Wnt7bに浸したビーズと間充織細胞を培養することによって、間充織細胞がビーズに向かって移動するか否かをLive imagingにより観察する。これらの検討によって上記因子が極性誘導因子として働くか否かについて明らかにする。ShhやWntシグナル以外の他の因子を探索するため、阻害剤を用いたスクリーニングを行う。阻害剤処理した間充織細胞と呼吸器上皮細胞を共培養することにより、極性化が阻害される分子を同定する。また各シグナルの作動薬やペプチドを用いて、間充織細胞の極性化を誘導できるかについて検討する。
中高齢精神遅滞者のQOL:その実態と面接法による測定の試み

本研究は,個人のQOLを重視する立場から,1.精神遅滞者の高齢化に向けての対策の現状を明らかにし,2.合わせて中高齢精神遅滞者自身のニーズや意見を把握することを目的とした。本研究では,1の目的のために内外の文献レビューと施設関係者へのヒアリングを行い,2の目的のために中高齢精神遅滞者を対象にした面接調査を実施した。1.精神遅滞者の高齢化に向けての対策:精神遅滞者の高齢化問題は一部施設では非常に深刻になっている。諸外国では,別施設化やノーマラーゼーションの文脈でこの問題が頻繁に取上げられているが,我が国では医学的な研究が先行し,処遇の在り方についての議論は未熟である。大規模成人精神薄弱者施設関係者およびこの分野における研究者数名へのヒアリングでは,個人のライフサイクルやライフコースへの配慮,家族関係の調整の難しさ,精神薄弱者個人のニーズの把握の難しなどが指摘された。いずれも我々の先行調査研究において既に指摘しておいたものである。その他,我が国特有の制度的,法制的側面の問題点,現場の指導員や擁護・看護者への教育体制の不備や待遇の悪さなどの問題点も指摘された。2.中高齢精神遅滞者のQOLの測定の試み:入所施設の中高齢精神遅滞者を対象に面接法を用いたQOL測定を試みた。遅滞程度が軽度(あるいは中度)であれば非構造化集団面接を中心にして個人面接でそれを補う方法によって個人の意見やニーズをある程度把握できることが確認された。ただし,信頼性の高い面接を効率よく実施するためには,個人の経歴や施設での生活の実態について十分な知識をもった第三者が面接に当たることが重要である。発言内容を分析した結果,施設生活の諸側面に対してきわめて多様な意見があることがわかった。今後は,その内容の分析を深め,面接の構造化・標準化を進める必要がある。
BmMLV持続感染成立のコアメカニズムの解明

Bombyx mori latent virus (BmLV)は、カイコ、及びクワコ由来培養細胞特異的に持続感染しているプラス鎖RNAウイルスである。興味深いことに、系統解析の結果、BmLVは植物ウイルスであるチモウイルス科のウイルスに高い類縁性を示すにもかかわらず、その宿主はカイコ、及びクワコ由来の培養細胞に限られ、カイコ幼虫における増殖性を示さない。しかしながら、その宿主域がカイコ、及びクワコへ限定されていることから本質的にカイコを宿主とするウイルスであると推定されている。そこで、本年度はBmLVのライフサイクルの一環を明らかにするため、カイコを宿主とするカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)とBmLVを共接種する共感染実験を行った。まず、培養細胞へとBmLVとBmNPVを共接種した結果、BmNPVの増殖は有意に遅延することが明らかになったことから、両ウイルスの相関が示唆された。次に、カイコ幼虫へ両ウイルスを共接種した結果、単独では増殖しないBmLVのRNA量がBmNPVとの共接種によって増加し、ウイルスが増殖することが明らかとなった。更に、詳細な解析を行った結果、BmLVは増殖したBmNPVのウイルス封入体へと封入されており、しかも、感染性を維持していることが明らかとなった。これは、BmLVがBmNPVのウイルス封入体へと相乗りしていることを示すものであり非常に興味深いものであった。今後、他の植物ウイルスなどでもこのような相乗り減少があるのかどうか解析を進めていきたい。Bombyx mori macula-like virus (BmMLV)は、カイコ、及びクワコ由来培養細胞特異的に持続感染しているプラス鎖RNAウイルスである。特に、BmMLVをウイルス陰性VF細胞へ接種したRNA-seq解析では、BmMLVのリードは全トランスクリプトのおよそ16%にも達することから、その持続感染メカニズムは非常に興味深い。このメカニズムを解明するため、本年度はRNA-seq解析を更に詳細に行うと共に、その転写レベルをRT-qPCRで確認した。その結果、ウイルス遺伝子の旺盛な転写だけではなく、広汎なウイルスゲノム由来のsmall RNAを見出した。また、およそ150個に及ぶ宿主遺伝子の転写量が、ウイルスの感染継時的に変動していることが明らかとなり、中でも細胞接着因子遺伝子の転写量が増大し、ウイルス感染細胞の接着性を高めていることが示された。この宿主細胞の接着性の向上は、RT-qPCRでも確認され、ウイルスの細胞間感染に寄与していると考えられた。一方で、BmMLVが致死性のカイコバキュロウイルス(BmNPV)の感染にどの様に関与するのか調査した結果、BmMLVがBmNPVのウイルス封入体に取り込まれることを明らかにした。詳細に調査した結果、この取り込みが、BmMLVの生活環に必須であるとは言えなかったが、この様なウイルスーウイルス間相互作用が認められたことは興味深い。今後、上記small RNAの更なる解析、宿主側遺伝子の機能解析を進めるとともに、BmMLVとBmNPVの相互作用の意義について解明していく予定である。本研究の目的はBmMLVの持続感染に関するコアメカニズムの解明である。その一環としてウイルス由来のsmall RNAの解析は順調に進んでおり、現在論文を投稿し修正中である。また、宿主側に与える影響として細胞接着因子等の解析も順調に進んでいる。加えて、その由来や自然界におけるライフサイクルを考慮し、BmNPVとのウイルスーウイルス間相互作用についても新たな知見が得られた。以上より、本年度は概ね順調に研究が進展していると自己評価した。特に、BmMLVをウイルス陰性VF細胞へ接種したRNA-seq解析では、BmMLVのリードは全トランスクリプトのおよそ16%にも達することから、その持続感染のコアメカニズムは非常に興味深い。このメカニズムを解明するため、本年度はRNA-seq解析を更に詳細に行うと共に、ウイルスゲノム由来のsmall RNAを詳細に解析した。その結果、siRNAはBmMLVのゲノム全体から産生されている一方で、近年新たなクラスとして着目されているpiRNAがサブゲノミックRNA領域から産生されていることが判明した。そこで、急性感染と持続感染を比較するため、ウイルス非感染細胞へ新たにウイルスを感染させたサンプルと、ウイルスを既に2年以上持続感染状態にさせたサンプルを準備し、small RNAの比較を行った。その結果、急性感染ではsiRNAが産生される一方で、持続感染ではsiRNAだけでなくpiRNAが産生されていることが明らかとなった。そこで、siRNAやpiRNAの関連因子をノックダウンした結果、予想通り、急性感染ではsiRNA関連遺伝子のノックダウンによってBmMLVのRNA量が増加し、持続感染ではsiRNAとpiRNAの関連遺伝子のノックダウンによってBmMLVのRNA量が増加した。これらの結果は、BmMLVの初期(急性)感染では、宿主の生体防御としてsiRNA経路だけが発動していたにも関わらず、旺盛なBmMLVの増殖に対応してpiRNA経路が新たに発動することを意味し、即ち、この様なウイルスと宿主のせめぎあいが、結果としてウイルスの持続感染状態をもたらしていると考えられた。本研究成果は非常に興味深く、今後、サブゲノミックRNA領域へと変異導入可能なベクター作りに取り組み、piRNA産生経路が発動する仕組みを明らかにしていきたいと考えている。

本研究の目的はBmMLVの持続感染に関するコアメカニズムの解明である。その一環としてウイルス由来のsmall RNAの解析は順調に進んでおり、本年度DNA Research誌へと論文を発表することが出来た。併せて、本研究成果は大学からプレスリリースされており、学会等の発表と併せ、その研究成果を広く伝えることが出来た。また、宿主側に与える影響として細胞接着因子等の解析、更にBmNPVとのウイルス-ウイルス間相互作用についても新たな知見が得られた。以上より、本年度は当初の計画以上に研究が進展していると自己評価した。Bombyx mori latent virus (BmLV)は、カイコ、及びクワコ由来培養細胞特異的に持続感染しているプラス鎖RNAウイルスである。興味深いことに、系統解析の結果、BmLVは植物ウイルスであるチモウイルス科のウイルスに高い類縁性を示すにもかかわらず、その宿主はカイコ、及びクワコ由来の培養細胞に限られ、カイコ幼虫における増殖性を示さない。しかしながら、その宿主域がカイコ、及びクワコへ限定されていることから本質的にカイコを宿主とするウイルスであると推定されている。そこで、本年度はBmLVのライフサイクルの一環を明らかにするため、カイコを宿主とするカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)とBmLVを共接種する共感染実験を行った。まず、培養細胞へとBmLVとBmNPVを共接種した結果、BmNPVの増殖は有意に遅延することが明らかになったことから、両ウイルスの相関が示唆された。次に、カイコ幼虫へ両ウイルスを共接種した結果、単独では増殖しないBmLVのRNA量がBmNPVとの共接種によって増加し、ウイルスが増殖することが明らかとなった。更に、詳細な解析を行った結果、BmLVは増殖したBmNPVのウイルス封入体へと封入されており、しかも、感染性を維持していることが明らかとなった。これは、BmLVがBmNPVのウイルス封入体へと相乗りしていることを示すものであり非常に興味深いものであった。今後、他の植物ウイルスなどでもこのような相乗り減少があるのかどうか解析を進めていきたい。次年度は、得られたsmall RNAのデータを元に、これらsmall RNA生産のキーとなる要因の解明を感染性クローンを用いて試みる。また、細胞接着因子を始めとする種々の宿主因子についても、その意義を明らかにするための機能解析を進める。これらの研究によって、BmMLVがどの様に宿主を制御しているのか、或いは宿主がどの様にBmMLVに抗っているのか、その結果生じる持続感染とは何か、新たな知見を得るため研究を遂行する予定である。次年度は、piRNAを始めとしたsmall RNAの解析を進めるだけでなく、細胞接着因子を始めとする種々の宿主因子について、ウイルス感染後における転写誘導の意義を明らかにするための機能解析を進める。更に、BmNPVとBmMLVとのウイルス-ウイルス間相互作用について解析を進める予定である。
米の吸水過程が米飯の食味に及ぼす影響

炊飯における米の吸水過程は米飯の食味に影響するが、これまで米粒内の水分含量や水分分布という視点から吸水過程を把握した報告はない。本研究では米の吸水過程に着目し、加熱中断で起こる異常炊飯米の生成条件および吸水特性を明らかし、その生成メカニズムを検討した。その結果、65°C、4時間浸漬すると再炊飯しても粘らず食味が低下しており、デンプンの一部が糊化した異常糊化状態となり、吸水は進むが、米粒が割れて正常な炊飯米とならないことが明らかになった。1.浸漬条件の検討精白米2gに脱イオン蒸留水2.8gを加えて20°Cで1時間浸漬後、20-90°Cの各温度で4時間まで浸漬し、温水処理米とした。これを通常炊飯し、再炊飯米とした。米粒の表層および全体の硬さ、粘り、付着性を測定した結果、芯があって粘らないめっこ飯に相当するのは65°Cで4時間浸漬だった。75,90°C浸漬米は軟らかいが粘らない飯になった。2.炊飯特性各温水処理後および再炊飯後の炊飯特性試験における加熱吸水率は温度が高いほど増加し、75,90°Cでは温水処理後と再炊飯後にほとんど差はみられなかった。3.飯洗液の分析各再炊飯米に脱イオン蒸留水を加え、攪拌後、篩で米粒と液部に分け、飯洗液の溶出固形分を測定した結果、65°C浸漬が最も多くなった。この溶出固形分の大部分はでんぷんであった。75,90°C浸漬では20°C浸漬より少なく、吸水が進んだことが示唆された。4. NMRイメージングの測定NMRイメージングにより米粒への吸水過程を観察した結果、65°C浸漬処理により米は特異的に変化することがわかった。65°C浸漬米および65°C浸漬炊飯米には腹割れが多く見られ、65°C浸漬炊飯米はこの腹割れした飯粒の存在により、べちゃっとした部分と硬い部分がある不均一な食感を呈することが考えられた。1.試料米の糊化度の測定まず浸漬条件を20,65,75,90°Cで4hとしたときの温水処理米および再炊飯米にエタノールを加え、ホモジナイズ後、脱水乾燥させた試料の糊化度をBAP法により測定した。また示差走査熱量計(DSC)により糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化エネルギーを測定した。その結果、めっこ飯の生成条件である65°C浸漬米では糊化度25%、75%では83%、90°Cでは93%となり65°Cと75°Cに大きな差があることがわかった。DSCの結果は65°C浸漬米の糊化温度が全体に高温側にシフトし糊化しにくくなっていた。75°C、90°C浸漬米では新たな吸熱ピークがみられなかった。2.試料米のFI-IRの測定FT-IRの測定結果は糊化度の情報が1000cm-1付近のピークにあらわれ、吸収の強さとBAP法のよる糊化度の値に相関がみられた。すなわち、糊化度が低い65°C浸漬米では1000cm-1付近の吸収が湯御わかった。浸漬炊飲米のFT-IRスペクトルは試料間にほとんど差がみられなかった。3390cm-1付近にピークがみられたが、これはFT-IR/ATRのダイアモンド結晶の表面に接触する水分に対応するとの報告に対応するものと考えられた。2.X線回折の測定浸漬条件を20,65,75,90°Cで4hとしたときの浸漬米ならびに再水飯米および0.2%NaOHにより除タンパクして米粉から調製したデンプンの脱水粉末試料を調製し、これらの結晶状態をX線回折を行った。その結果、65°C浸漬処理米粉はA型図形の特徴を有するピークの強度が低く、ほぼV型デンプンの回折パターンが得られた。このことから65°C浸漬米は生デンプンの結晶構造を示すA型から糊化デンプンのV型へと変化していることが示唆された。当該年度ではめっこ飯が65°C付近の浸漬で明瞭に起こり、また75°C、90°Cでは明瞭でないながら粘らないという炊き損じ飯の特徴を有することから浸漬温度を20°C(対照)、65°C、75°C、90°Cで4時間の温水処理後、米粒と浸漬液にわけ、それぞれについて成分分析を行った結果、溶出固形分および全糖量は浸漬温度が高いほど増加した。還元糖量は65°C浸漬液が最も多かった。65°C浸漬液中に溶出している糖質はデンプン以外の低分子の糖の割合が高いことが還元糖/全糖比から明らかになった。

タンパク質量は65°C、20°C、90°C浸漬の順となった。ついで浸漬液中のタンパク質についてSDS-PAGEを行った結果、65°C浸漬には20°Cに比べて分子量の小さなタンパク質が多く含まれ、65°C浸漬ではタンパク質の低分子化が起こっていることが示された。浸漬液中の糖質のゲル濾過クロマトグラフィの結果、20°C浸漬液の溶出ピークはほとんどがアミロースであったが、65°C浸漬液中にはわずかながらアミロペクチンの溶出がみられ、デンプン溶出が多いことが示された。飯洗液の成分分析を行った結果、20°C浸漬炊飯米に比べて75,90°C浸漬炊飯米の全糖量とタンパク質量が有意に少ないことが明らかとなった。20°C浸漬炊飯米に比べて65,75,90°C浸漬炊飯米は還元糖/全糖の比が小さく、粘りの低い飯の表面の糖質は低分子の糖質の割合が高いことが示された。各浸漬処理より脱水粉末試料を調製し、プロトンNMR測定を行った結果、65°C浸漬処理では部分的糊化が起こりはじめていることが示唆された。
同種腱移植と人工靭帯による膝前十字靭帯再建術の基礎的研究

(目的)本研究では同種腱を用いた前十字靭帯(ACL)再建術に靭帯補強材を用いることの効果を家兎を用いて組織学的にまた生体力学的に検討した。(方法)日本白色家兎14羽(平均体重3.2kg)を用い、2群にわけた。同種再建群では、別の家兎から採取し、-80°Cで1ヵ月保存したアキレス腱を移植腱として用い、pull-out法にて右膝の前十字靭帯をドリル穴法で再建した。補強群は同様に処理したアキレス腱に3mm幅のポリプロピレン製の靭帯補強材(LAD)を縫いつけて再建術を行った。術後はプラスチック製ギプスにて4週固定しケージ内にて飼育した。術後3ヵ月にて屠殺し各群で2羽はマイクロアンギオを行った後に軟線X線撮影を行い、10%ホルマリンにて固定し、組織標本を作成した。残りの5羽は膝関節全体の前後動揺性を10Nでの繰り返し実験後、大腿骨ー再建ACLー脛骨複合体としてインストロン万能試験機にて破断試験を行った。(結果)マイクロアンギオでは補強群で血行がやや乏しい傾向が認められた。組織像では両群ともに正常の靭帯と比較して細胞成分が豊富であり、補強群では靭帯中央部に壊死部の残存が認められた。生体力学試験では補強群で有意に前後動揺性が少なく、強度にも補強群で優れていた。(検討)同種腱をLADで補強することにより術後3ヵ月の時点で同種腱単独よりも力学的に優れた前十字靭帯が再建されたが、以前に行われた自家腱単独の例と比較して組織学的にはやや靭帯の成熟過程は遅れていると判断された。今後自家腱群との比較とより長期の経過を観察する必要があろう。
サル肋間神経移行後の中枢神経系における可塑的変化

カニクイザルを用いて第3、第4肋間神経を剥離し、上腕二頭筋の支配神経である筋皮神経に神経移行手術を行った。移行手術後10ヶ月後に上腕二頭筋、上腕三頭筋、手術側第5肋間筋、三角筋に筋電図記録のためにステンレスワイヤー電極を留置した。動物が安静状態では肋間神経移行上腕二頭筋からの筋電図には呼吸性の弱い筋電図活動が見いだされることがあるが、肋間神経移行上腕二頭筋を使って、随意運動を行えるようになることを見出した。二酸化炭素を吸気に付加すると呼吸性の筋電図が変化することから、肋間神経運動ニューロンへの呼吸性シナプス入力は完全には消失していないことが分かった。サルを麻酔し無菌下で第2、3肋間神経を剖出し筋皮神経から派生する上腕二頭筋の支配神経を筋皮神経から分離する部分で切断し切断部に第2肋間神経と第3肋間神経を神経縫合した。手術後、手術後8ヶ月経過してから肋間神経移行神経上腕二頭筋、上腕三頭筋、三角筋にワイヤー電極を留置した。筋電図と動作画像の同時記録を行い肋間神経移行上腕二頭筋IC-bicepsの筋電図を解析した。餌を取り口に運ぶ動作について上肢を前に伸ばすときにはIC-bicepsと三頭筋は同時収縮することが見いだされた。餌を口に運ぶ時には三頭筋は抑制されIC-bicepsのみの筋電図が見いだされた。上肢運動において三頭筋とIC-bicepsが強調して働いていることが分かった。覚醒状態ではIC-bicepsに時に極弱い呼吸性の筋電図が認められた。さらにサルに麻酔下で5%二酸化炭素を吸入させると肋間筋とともにIC-bicepsにも呼吸性の筋電図が明瞭に現れた。これらの実験結果はIC-bicepsを支配する肋間神経運動ニューロンにこれまでの呼吸性シナプス入力が減弱し、大脳皮質からの随意性シナプス入力が神経移行により新たに加わることが分かった。これまで運動野の障害後に運動野あるいはその周辺領域での可塑的変化で運動回復が説明されてきたが運動野下行路での可塑的変化の可能性が見出された意義は大きいと思われる。年度は肋間神経移行上腕二頭筋IC-bicepsへの大脳皮質運動野の可塑的変化を調べるために正常カニクイザルの運動野の体部位局在の詳細を調べた。サルをケタミンで麻酔し自発呼吸下で脳定位固定装置に固定した。事前にMRI撮像で大脳皮質中心溝の位置を決め、中心溝の直上の頭蓋骨を除去し、チャンバーを取り付け大脳皮質表面を流動パラフィンで保護した。麻酔は実験中、ケタミンの筋注、あるいはプロポフォール静注で維持した。硬膜を切開し先端を研磨したタングステン微小電極を刺入し電気刺激した。刺激側と対側の上腕二頭筋、上腕三頭筋、第二肋間筋、第三肋間筋、第四肋間筋、腹斜筋に筋電図記録用ワイヤー電極を留置した。運動野を電気刺激し、上肢筋と体幹筋の誘発筋電図を指標にして運動野の体部位局在を調べた。実験終了後、フォルマリン潅流固定後、脳を取り出し、凍結後厚さ100μmの連続切片を作成しニッスル染色を施し包埋し刺激部位を同定した。大脳皮質内側部に体幹領域があり外側部に上肢領域が存在していた。カニクイザルでは上肢領域に近接する領域には体幹部領域がなく、これまで報告されている体幹支配領域が内側部と上肢領域に近い部位と2か所存在するアカゲザルの体部位局在と異なることが分かった。カニクイザルでは上肢支配領域と体幹支配領域が離れていることは本研究で明らかにしたい肋間神経移行後の大脳皮質運動野の可塑的変化を調べる上で詳細な実験ができることが分かった。サルをガス麻酔し無菌下で第2、3肋間神経を剖出し筋皮神経から派生する上腕二頭筋の支配神経を筋皮神経から分離する部分で切断し切断部に第2肋間神経と第3肋間神経を神経縫合した。手術後、サル用のジャケットを着せ縫合した神経の損傷をふせぐために手術側の前肢の動きを緩く制限した。手術後8ヶ月経過してから肋間神経移行神経上腕二頭筋、上腕三頭筋、三角筋にワイヤー電極を留置した。運動野の位置を確定するためにゼロ点のイヤーバーから吻側へ2mmごとにMRI撮影を行い中心溝の位置を確定した。左右の運動野の存在する位置に慢性実験用チャンバーを取り付けた。

微小金属電極を刺入し、上肢領域を微小電流刺激し肋間神経移行神経上腕二頭筋が上肢支配領域、あるいは体幹領域のどちらから興奮入力を受けるか調べた。実験終了後深麻酔で脳をホルマリン固定し100ミクロンの冠状断連続切片を作成しニッスル染色を行い、微小電流刺激したトラックの位置、深さ、微小破壊の場所、ニッスル染色された切片での錐体路細胞の分布から運動野の上肢支配領域、あるいは体幹領域のどちらの場所が肋間神経移行上腕二頭を収縮させるか検索しス。現在、データ解析中であり決定的な結論を得るには至っていないが、現時点では正常側を同様に微小電流刺激して得られた正常側の体部位局在のデータを指標にして移行側での大脳皮質での体部位局在を比較検討をして大脳皮質の可塑的変化ではなく移行側大脳皮質運動野下行路の可塑的変化がおきた可能性が見出された。これまで運動野の障害後に運動野あるいはその周辺領域での可塑的変化で運動回復が説明されてきたが運動野下行路での可塑的変化の可能性が見出された意義は大きいと思われる。本研究計画の最終年度であり、当初の計画では肋間神経移行したサルを作成し、運動野の存在する位置に慢性実験用チャンバ-を取り付け単一錐体路細胞の活動電位をトリガーとして神経移行された上腕二頭筋の筋電図を全波整流し高域遮断平均加算を行い単一錘体路細胞が単シナプス性に運動ニューロンを神経支配することを実験する予定であったが動物が死亡し計画を達成できなかった。しかしながら、霊長類の慢性実験に最適な留置極細記録電極ワイヤーを民間企業と共同開発し、実際に使用することによって一部の成果は得られた。記録電極はステンレス母材を線材として伸線加工し金メッキした30μmの極細線を作成した。この極細線7本をより合わせリード線を作成し、電気手絶縁するためにテフロンで皮膜した。1頭のサルにおいてセボフレン+O2+N2+笑気の混合ガスで麻酔導入し、手術中維持した。無菌下で上腕二頭筋、三頭筋、三角筋に電極の先端の約2mmテフロン皮膜を取り除き、筋に刺入させ筋膜に固定した。電極は頭に固定したコネクターに接続した。電極から記録される電気現象は増幅器(AB-610日本光電)で増幅し、データーレコーダーに記録し、解析ソフト(Spike2、CED)で解析した。筋電図電極を留置して、肋間神経移行を行う前に餌取り動作の訓練を行った。新たに開発したワイヤー電極で筋電図は安定して記録できた。訓練には長期間かかったが人から餌を取る動作ができるようになった段階で肋間神経移行手術を行った。腕神経叢の神経走行が通常のサルとは大きく異なり上腕二頭筋を支配する筋皮神経が腕神経叢から分離せず、複数の神経を経由して筋皮神経に合流する個体であった。縫合可能な太さの神経を探したため手術は長時間にわたり神経縫合直後に心臓停止で死亡して今年度の目的とするデータは得られなかった。神経生理学肋間神経移行後の運動野の可塑的変化の解明に向けてデータを取得できている。カニクイザルの一側の第2、3肋間神経を上腕二頭筋を支配する筋皮神経に神経移行する手術は順調にできた。これまで運動野の位置を確定し、左右の運動野の存在する位置に慢性実験用チャンバーを取り付けた。正常側を同様に微小電流刺激して得られた正常側の体部位局在のデータを指標にして移行側での大脳皮質での体部位局在を比較検討をして大脳皮質の可塑的変化ではなく移行側大脳皮質運動野下行路の可塑的変化がおきた可能性が見出している。肋間神経移行後、餌取り動作などの随意動作をさせ二頭筋の筋電図を解析し呼吸活動と随意運動がかい離することを確かめることができた。大脳皮質の運動野を微小電流刺激し上肢支配領域と思われる領域から肋間神経移行した二頭筋から単潜時で誘発筋電図が記録できた。
非侵襲的脳内グルタミン酸、ＧＡＢＡ測定による痛みの脳機能評価法の確立

プロトンMRスペクトロスコピー(1HMRS)を用い、慢性疼痛患者の前帯状回の機能的変化を明らかにすることを目的として研究を行った。慢性疼痛患者では、健常被験者と比べ、NAA濃度およびGABA濃度が有意に低下していた。慢性疼痛患者における前帯状回のNAA濃度およびGABA濃度の低下は、抑制性の神経伝達効率の低下が生じている可能性を意味し、慢性疼痛の病態成立や遷延化に関与する可能性が示唆された。1HMRSは、実際の臨床現場で患者にタスクをかけることなく、脳内の神経伝達物質濃度を測定できるので、慢性の痛みの客観的な評価法として臨床応用できる可能性がある。罹患期間6ヶ月以上の慢性痛患者24人(35歳75歳,女性16人,男性8;慢性腰痛13,複合性局所疼痛症候群(CRPS)5,頸部痛2,線維筋痛症1,糖尿病性神経障害性痛1,帯状疱疹後神経痛1,慢性頭痛1)を対象に、24人の年齢、性別が相関する健常被験者を対照群とし、前帯状回におけるGABA濃度、グルタミン酸(Glu)濃度、およびNAA濃度を3T MR装置を用いて測定した。T2強調画像上の前帯状回領域で得られた磁気共鳴スペクトルをLC model、Mega-Press法を用いて解析した。さらに、NAA濃度が低下するほどGABA濃度が低下する傾向を認めた。一方、グルタミン酸濃度は両群間で有意差がみられなかった。慢性疼痛患者で心理療法を必要とした75%の患者で、1H-MRSで、前帯状回でNAA濃度の低下を認めた。心理療法を必要とした慢性疼痛患者では、VBMで扁桃体(Amygdala),島,海馬傍回,吻側前帯状回(BA32)など痛みに伴う情動、認知に関連する領域、眼窩前頭皮質,側坐核(Nac)などドーパミン鎮痛系抑性系に関連する領域で灰白質密度の低下を認めた。慢性疼痛患者における前帯状回のNAA濃度およびGABA濃度の低下は、抑制性の神経伝達効率の低下が生じている可能性を意味し、慢性疼痛の病態成立に関与する可能性が示唆された。1H-MRS,VBMは、慢性痛患者の非侵襲的かつ客観的な評価手段、治療法選択の指標になりえる可能性が示唆された。慢性腰痛の病態では、遷延する痛みに加えて、強い不安や不快感が症状を増悪している場合も少なくない。前帯状回は、不快情動の処理に関連する重要な脳領域であり、不安障害やパニック障害などの病態では、その解剖学的構造や伝達機構に変調をきたす可能性が報告されている。MRスペクトロスコピーを用い、慢性腰痛患者の前帯状回における脳内代謝物を測定し、その機能的変化を明らかにすることを目的として疾患での研究を行った。NRS4以上かつ罹患期間6カ月以上の21人の慢性腰痛患者を対象とし、年齢、性別が相関する27人の健常被験者を対照群とした。正常神経細胞の指標となるNアセチルアスパラギン酸(NAA)、グリア細胞活性化の指標となるミオイノシトール(MI)、興奮性伝達物質であるグルタミン酸(Glu)、抑制性伝達物質であるガンマアミノ酪酸(GABA)の濃度を測定し、LCモデルを用いて解析した。またMRS測定時に、慢性腰痛患者に同時にVBM(Voxel-based morphometry)を施行し、有意な灰白質密度の低下領域を調査した。VBMはSPM8を用いてDARTEL法による解析を行い、各年代89人118人の健常人で得られた正常値と比較した。慢性腰痛患者では健常被験者と比べNAAおよびGABAが有意に低下していたが、MIおよびGluは有意差を認めなかった。非異的腰痛では58%で、特異的腰痛では7%にVBMに有意な灰白質密度の低下を認めた。低下領域は、扁桃体が最も多く、扁桃体z値とPDAS, HADSのDに相関を認めた。また左扁桃体z値とPCSサブスケールの反芻に弱い相関を認めた。慢性腰痛の病態では、前帯状回における正常神経細胞が減少し、抑制性の神経伝達機能の低下が生じる可能性が示唆された。1H-MRS,VBMは、慢性腰痛患者の非侵襲的な評価手段の一つとなる可能性が示唆された。難治性の慢性疼痛患者(脊椎手術後腰痛、脊椎手術後頸部痛、慢性腰痛、CRPS2、幻肢痛1)を対象に、前帯状回におけるグルタミン酸(Glu)濃度、GABA濃度およびNAA濃度を3T MR装置を用いて測定し、健常人(N=27)と比較した。

T2強調画像上で前帯状回の領域を決定し、磁気共鳴スペクトルをLC model、Mega-Press法を用いて解析した。1:慢性疼痛患者では、健常人と比較して前帯状回において、左右平均NAA(N-アスパラギン産)濃度(NAA:正常神経の密度、神経機能の指標)は、有意に低下していた。2:前帯状回領域において3T MRI装置を用いることで、1.5T装置では測定不可能な、グルタミン酸濃度、GABA濃度の測定が可能になった。健常被験者(N=27)において、いずれの濃度も年齢や性別に関わらず、ほぼ一定の値であった。3:難治性の慢性疼痛患者では、健常群と比較して、有意にGABA濃度及びNAA濃度が低下していた。一方、グルタミン酸濃度は両者間において有意差がなかった。慢性疼痛患者では、健常群と比較して、有意にGABA濃度及びNAA濃度が低下していたことから、慢性疼痛では、前帯状回における抑制系の神経機能低下が病態の成立や遷延化に関与する可能性があると考えられる。MRSは、患者にタスクをかけることなく、脳内の神経伝達物質濃度を測定できるので、慢性の痛みの客観的な評価法として臨床応用できる可能性が示唆された。また治療前後で測定すれば、治療成果を判定できる評価法にさらに発展していく可能性があると考えられる。MRS測定時に、同時にVBM(voxel-based morphometry)で前帯状回、島、視床、海馬、扁桃体、海馬傍回、等の局所脳の委縮状態を測定できるように設定した。今後は両者の結果を合わせて評価していく予定である。前帯状回領域において3T MRI装置を用いて、磁気共鳴スペクトルをLC model、Mega-Press法を用いて解析することで、1.5TMRI装置では測定不可能な、GABA濃度、グルタミン酸濃度の測定が可能になった。MRSは、実際の臨床現場で患者にタスクをかけることなく、脳内の神経伝達物質濃度を測定できるので、慢性の痛みの客観的な評価法として臨床応用できる可能性がある。また治療前後で測定により、治療成果を判定できる評価法として、さらに発展していく可能性があると考えられる。前帯状回領域において3T MRI装置を用いることで、1.5T装置では測定不可能な、グルタミン酸濃度、GABA濃度の測定が可能になった。得られた結果は動物実験の先行結果と一致しており、MRSは、実際の臨床現場で患者にタスクをかけることなく、脳内の神経伝達物質濃度を測定できるので、慢性の痛みの客観的な評価法として臨床応用できる可能性があると考えられた。慢性痛患者では、健常群と比較して、有意にGABA濃度及びNAA濃度が低下していたことから、慢性痛では、前帯状回における抑制系の神経機能低下が病態の成立や遷延化に関与する可能性があると考えられる。MRSは、患者にタスクをかけることなく、脳内の神経伝達物質濃度を測定できるので、慢性の痛みの客観的な評価法として実際の臨床現場で臨床応用できるか検討していく。また治療前後で測定し、治療成果を判定できる評価法になりえるか検討していく。
マウス初期胚における母性RNA情報の伝達と消長

本研究では、実施計画に従い以下の成果を得た。(1)鎖長の伸長・短縮の実体を塩基配列レベルで明らかにする新たな方法として、RNA鎖の3'末端に合成オリゴリボヌクレオチドをT4RNAリガーゼにより直接付加した後、逆転写反応とPCRにより、SSEC-DRNAの3'領域を増幅し、この増幅産物を直接に塩基配列決定するという方法に挑戦した。これにより、SSEC-DRNAの3'末端領域に約370個のアデニンに相当するピークが得られた。母性型SSEC-DmRNAには元来100ヌクレオチド程度のpoly(A)鎖がついており、これが受精後さらに300ヌクレオチド程度伸長されることにより鎖長が増大しているものと考えられた。しかし、この300ヌクレオチド内には他の塩基が挿入されている可能性もあり、今後明らかにするべき課題と考える。(2)接合子型mRNAの合成をα-Amanitinによって阻害する、あるいは受精後のDNA合成をAphidico1inにより阻害した実験では、薬剤を添加しない場合と同様に母性型SSEC-DmRNAが1-2細胞期に伸長した後、短縮し、その後分解されることを観察したが、シクロへキシミドを添加した場合は、伸長が直ちに停止し、このRNAサイズの変化はタンパク質の合成が必要であることが判明した。未受精卵でも受精の刺激なしに基本的に同様の変化が見られることから、今後このRNA長変化に関わるcis elementとtrans acting factorを明らかにするとともに、その生物学的意義を明らかにしていきたい。
東アジアの漢字圏における漢字使用の諸相

日本語の黎明期、文字を発明しなかった日本において、中国語文の伝来以降、どのように日本語の書記を獲得していったかについて、ナシ語の調査を手がかりにして解明した。今もナシ族の中に混在する書記言語と口頭言語の在り方を、ナシ族の詩人による歌謡の歌詞等の所謂万葉仮名のごときナシ語の歌詞を漢字音で記したものを題材にして、ナシ族にアンケート調査をし、その在り方を黎明期の日本語の書記言語の成り立ちに当てはめてみることによって、奈良時代の書記言語としての日本語のあり方を解明した。研究目的は、古代日本語の書記言語を解明することにある。中国少数民族のナシ族の書記規範を調査することによって、固有の文字を持たなかった日本に中国語文が将来し古代中国の漢語文の書記規範が古代日本語の書記をいかに制限し、またいかなる理由によってその制限から離れてゆくかを明らかにすることである。今年度は、毛利正守「倭文体の位置づけをめぐって-漢字文化圏の書記を視野に入れて」(『萬葉』202号、2008年)を踏まえて、まず7月30日から8月5日まで、中国雲南省麗江においてフィールドワークを実施した。ナシ族の成人男女に語序に関する正文と非文、非文に対する許容の程度について、こちらで作成したアンケートを元に個別面談調査を行った。これまで(20052007年)に行った調査をもとに、今回は被験者の人数を増やし、アンケートの内容文をより緻密に工夫することによって、これまでの結果を更に補強することができた。ナシ族が日常用いる口頭言語は語序・語法など日本語に近似するナシ語であるが、書記言語は中国語文であり、中国語文はナシ族にとって「書記における自国語」となっている。このようなシステムを古代の日本語と比較しつつ、現在のナシ族における活きたかたちでの観察や調査が可能な口頭言語と書記言語とを一方に対置してみることで、黎明期の日本語の書記言語の成り立ちが浮き彫りとなり、古代語の文体を「漢文体」と共に、「倭文体」の概念で捉えることの論拠が確固たるものとなってきた。本調査を元に、連携研究者との研究会においてさらに討議を重ねており、日本で研修中のナシ族・白族の研修員とも研究会をもっている。また、中国南京大学でも朝鮮族・モンゴル族の方々にアンケート調査をするなど、幅広くサンプルや情報を収集している。中国雲南省の麗江において、ナシ族の詩人・歌手である肖煌光氏に長時間のインタビューを行い、同氏作詩のナシ語の歌謡曲『朋友』等の歌詞を分析調査した。これによって日常語より、より洗練・推敲されたナシ語の詩における漢字音の書記の実体の解明をおし進めることができた。その実体と古事記・日本書紀の歌謡に用いられる万葉仮名、及び萬葉集の仮名主体表記と訓字主体表記の万葉仮名のあり方、とくに略音仮名と二合仮名の問題を比較検討した。また、同地において、前年度に引き続きナシ族の成人男女にアンケート調査を実施した。口頭語においてナシ語と漢語のバイリンガルであるナシ族が書記をする場合(ナシ族の日常的な書記は中国語のみ)、語序の転倒がいかほど発生するかの問題を主として考察対象とした。アンケートを基にしてのナシ語の書記規範を調査・研究することによって、古代日本の文体と表記の関係、書記される日本語が古代中国の漢語からいかに離れ、独自の日本語を獲得していったかについてこれまでの研究をなお一層推し進めることができた。また、日本におけるナシ語研究の第一人者である黒沢直道氏との研究会において、中国語専攻のナシ語研究者の立場からの有益な示唆を得ることによって、最新の言語情報を採り入れつつ、広角的な研究視野をもって本研究に取り組むことができた。加えて雲南省麗江より派遣されているナシ族出身者の岐阜県高山市自治体交流研修員との研究会では、中国でのアンケート調査の確認や補強を行うことができ、大変有益であった。今年度も中国少数民族のナシ族の言語であるナシ語についてのアンケート調査を実施した。語法や文法的な傾向を分析すると共に、複雑な例文に対するアンケートの回答も多く集計し、彼らの正文や非文に対する許容の程度を分析、そこを手がかりに古代日本語の書記過程を解明するという新しい視点からの研究を推し進めた。また、ナシ族の詩人による歌謡を新しい題材にして、所謂万葉仮名のようなナシ語の歌詞と漢字音とを対置することによって、古代日本語における書記言語の成り立ちを追求した。以上のようなフィールド調査をもとに古代日本語の表記と文体のあり方を解き明かした。膠着語としての日本語は、中国語のような語尾変化等がなく単語は実質的な意味を示すだけで主として語順によって文法的機能が表される孤立語とは異質である。しかし古代日本では固有の文字を持たず、中国で孤立語を背景に誕生した漢字が日本に将来した。

漢文は、日本語の語順からすれば所謂倒置方式を多く有し、その使用期間が相応に長い期間続くと、日本の口頭言語からは考え難いことであるが、書記ではかくあるものと認識され、それ以降、日本語文を記すことを目指す文章が生まれても、倒置方式はそのかたちで活かされ、その倒置の漢字にも倭語を与える訓字としての用い方が行われるようになり、その文章は漢文体から離れることとなったことなどについて、中国での膠着語であるナシ語のあり方を運用しつつ解明した。
特異反応場を有する界面ナノ組織体の構築

本研究では、活性酸素種の生成,反応制御及び検出のための電極システムの構築に,自己組織化単分子層(self-assembled monolayer, SAM)を用いる電極界面のナノ組織化を展開し,さらにその電子移動及び触媒機能を制御することを目的として行われ,本年度は次の成果を得た。1.新規環状金属錯体として14員環のペンタアザ環状ニッケル及び銅ニ重体のテンプレート合成法を確立し,さらにAu-S結合を利用して金属電極表面上にこの環状錯体が自己組織化した単分子層(SAM)修飾電極を構築した。これらのSAM電極はH_2O_2の0_2への著しい電極酸化触媒能を有し,その触媒酸化電位を電解質アニオンの選択によって制御できることを見い出し,そのメカニをin situ FTIR分光法で解明した。2.チオフェノール誘導体を電極表面に自己組織化した電極を用いることによって,水溶液系でスーパーオキシドイオンを電解生成できることをはじめて見い出し,その確証実験を行った。3.非対称アルキルビオロゲンのSAMを一電子電解還元すると,単分子層内でビオロゲンの2量化,さらには界面モノマー/ダイマーの平衡が起こることを明らかにし,またO_2のH_2O_2への還元を著しく電極触媒することを見い出した。
染色体分配における新規核蛋白質p35の機能解析

(1)p35誘導高発現系の確立:HA-tag付加p35をドキシサイクリン(Dox)で誘導過剰発現できるHeLaの安定なクローン細胞、2株を分離した。これらの細胞でHA-tag-p35の細胞内局在は内在性p35と同一だった。今後この系で、p35の細胞周期における役割を詳細に解析できることが期待される。(2)p35の細胞内局在:p35特異抗体(#23)を93-112番目のアミノ酸配列に対するペプチド抗体として作成した。正常ラット細胞とヒHeLaを#23、中心体特異蛋白質γ-tubulinに対する抗体、Hoechst33342(染色体を染色)で三重蛍光染色を行なった。p35は間期細胞では中心体と核に局在した。M期の前中期から後期ではp35は細胞質と中心体に局在したが、終期では中央体にも存在した。(3)p35はM期特異的にリン酸化され異常な分子量シフトを示すリン酸化蛋白質である:1)ノコタゾール(Noc)処理によりM期前期に停止した3Y1細胞抽出液を#23でWestern blotをおこなった。間期細胞での35Kのかわりに44Kと46K(44/46K)の新たなバンドが検出された。44/46Kバンドは中期の細胞まで検出されるが後期、終期の細胞では消失し、代わりに35Kが検出された。2)M期前期の3Y1細胞抽出液をphosphatase処理すると、44/46Kバンドは消失し約36Kバンドが出現した。Noc処理3Y1細胞を^<32>Piで標識し#23抗体で免疫沈降するとリン酸化44/46Kのみが検出された。リン酸化アミノ酸分析の結果、44/46Kはセリンとスレオニンがリン酸化されていた。GFP-tag-p35(65K)を高発現する細胞をもちい同様の実験を行った。但し免疫沈降は#23と抗GFP抗体を用いておこなった。M期でのみリン酸化75Kが両抗体で検出され、セリンとスレオニンとがリン酸化されていた。尚、#23で内在性リン酸化44/46K(リン酸化75Kの20%弱)も免疫沈降した。さらにリン酸化部位もリン酸化75Kと同一だった。間期では弱いながら65Kのリン酸化が認められ、その部位はセリンのみであった。以上から、M期でのp35はリン酸化され、高次構造が変化し、SDS-PAGEでの10Kに及ぶ分子量シフトをしめす。リン酸化による高次構造の変化にはスレオニンのリン酸化が重要であることが強く示唆された。(投稿準備中)(1)p35誘導高発現系の確立:HA-tag付加p35をドキシサイクリン(Dox)で誘導過剰発現できるHeLaの安定なクローン細胞、2株を分離した。