hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キャリアー細胞を用いた卵巣癌特異的癌ワクチン療法の開発

非小細胞性肺癌細胞A549にGFP遺伝子を導入したGFP-A549にオンコリティックアデノウイルスAdE3-IAI.3Bを感染したキャリアー細胞は、AdE3-IAI.3BとGFP両者とも翌日に腫瘍内濃度が最高となり、1週間まで発現が認められ、2週間後には消失した。A549細胞から限界希釈法により、A549細胞より10倍抗腫瘍効果の高いEHK-2細胞を樹立した。AdE3-IAI.3B感染EHK-2細胞を皮下注射したところOVHMの皮下腫瘍は40%のマウスにおいて腫瘍形成が抑制され自家抗腫瘍免疫が誘導されていることが明らかとなった。感染条件を検討したところ、200MOI、33時間が最も良好な抗腫瘍効果を示した。凍結融解による影響を検討したところ、非感染では影響はなく、AdE3-IAI.3B感染により核膜の分葉化が認められ、凍結融解により核膜の破綻とアデノウイルス粒子の細胞質への遊出が認められた。この条件下で、20%のin vitroにおける抗腫瘍効果の増大が認められ、in vivoにおいても事前免疫後90%のマウスが完全治癒となった。腹腔内播種性モデルにおいて、AdE3-IAI.3B感染キャリアー細胞では、1匹も完全治癒とはならないが、Ad-mGM-CSF同時感染において100%のマウスが完全治癒となった。これらのマウスにOVHMを皮下移植したところ、すべてのマウスに腫瘍拒絶が認められ自己抗腫瘍免疫が誘導されていることが明らかとなった。A549細胞にGFP遺伝子を導入したGFP-A549を作成し、キャリアー細胞としての局所停滞率を検討した。ヌードマウスに移植した人卵巣癌PA-1細胞腫瘍内に、オンコリティックアデノウイルス感染キャリアー細胞を注射し、real time-PCRにてGFPの発現により検討したところ、翌日に腫瘍内濃度が最高となり、1週間まで発現が認められ、2週間後には消失した。これは肝臓等の他臓器においても同様であったが、血液、卵巣には認められなかった。オンコリティックアデノウイルスの発現は、同様に翌日がピークとなったが、血液、卵巣中の発現も認められ、2週間後には消失した。オンコリティックアデノウイルス単独投与に比べ、キャリアー細胞投与ではオンコリティックアデノウイルスの腫瘍内発現量がほぼ10倍となった。抗腫瘍効果判定には、卵巣癌腹腔内播種モデルを用いた。オンコリティックアデノウイルス単独腹腔内投与では、アデノウイルスによる事前免疫なしでは抗腫瘍効果は認められたが、事前免疫して中和抗体存在下では、抗腫瘍効果は認められなかった。このため、アデノウイルスに事前免疫後3週間後にマウス卵巣癌細胞株OVHMを1x10^6個腹腔内投与したマウスを実験モデルとして用いた。OVHM移植後4日目、8日目にアデノウイルスーGM-CSF感染A549細胞を5x10^6個腹腔内投与すると抗腫瘍効果が認められた。今後は、匹数を増加し、抗腫瘍効果をマウスの生存率曲線により評価し、100%のマウスに完全治癒となるよう投与方法を最適化する必要がある。また、OVHM移植後8日目程度の進行例に対しても同様な効果があるか検討し、さらにオンコリティックアデノウイルスとの併用においても、抗腫瘍効果の相乗効果が認められるか検討する必要がある。新たなワクチン用細胞を作成するため、非小細胞性肺癌細胞より限界希釈法により53種類のクローンをスクリーニングし、オンコリティックアデノウイルスを感染したキャリアー細胞としての抗腫瘍効果を抗体存在下において比較検討した場合、従来の最も強力な抗腫瘍効果を示す非小細胞性肺癌細胞株A549の4倍の抗腫瘍効果を有するEHKを樹立した。

これから、さらに限界希釈法により35種類のクローンをスクリーニングし、同条件においてEHKより3倍、2倍の抗腫瘍効果を有するEHK-1、EHK-2細胞を樹立し、同条件においてそれぞれA549細胞より9倍、8倍の抗腫瘍効果を示した。ワクチン作用発現のためには、アデノウイルス-GM-CSFの感染あるいは放射線照射が必要であるため、これらの操作を除外できるようにするため、pcDNA3.1-mGM-CSF-GFPを同細胞に導入し、G418によりselectionをし、蛍光顕微鏡によりGFP蛋白発現によりEHK-mGM-CSF細胞を樹立した。同様に293細胞にもmGM-CSFを導入し293-mGM-CSF細胞を樹立した。OVHMマウス卵巣癌腹腔内モデルに対し、両細胞を腹腔内投与したところ、完全治癒症例は認められなかったが、有意の生存期間の延長を認めた。さらに両細胞にオンコリティックアデノウイルスを感染したところ、2回腹腔内投与において有意の生存期間の延長を認めた。完全治癒症例は、さらにEHK-mGM-CSF細胞にアデノウイルス-m-GM-CSFを感染したところ、ほぼ全例に認められ、アデノウイルスがアジュバントとして作用していることが明らかとなった。平成21年度においてクローニングされたオリジナルの肺癌細胞より約10倍ほど抗腫瘍効果の高いEHK-1、EHK-2細胞について比較したところ、AdE3-IAI.3B感染にてEHK-2細胞のほうが抗腫瘍効果が高いため、以後の実験においてEHK-2細胞を用いて実験を行った。AdE3-IAI.3B感染EHK-2細胞を皮下注射したところOVHMの皮下腫瘍は40%のマウスにおいて形成が抑制され自家抗腫瘍免疫が誘導されていることが明らかとなった。感染条件を検討したところ、200MOI、33時間が最も良好な抗腫瘍効果を示した。凍結融解による影響を検討したところ、非感染EHK-2細胞では影響はなく、AdE3-IAI.3B感染により核膜の分葉化が認められ、凍結融解により核膜の破綻とアデノウイルス粒子の細胞質への遊出が認められた。抗体存在下、非存在下において20%のin vitroにおける抗腫瘍効果の増大が認められ、in vivoにおいても事前免疫後90%のマウスが完全治癒となった。腹腔内播種性モデルにおいて、AdE3-IAI.3B感染キャリアー細胞では、1匹も完全治癒とはならないが、Ad-mGM-CSF同時感染において100%のマウスが完全治癒となった。これらのマウスにOVHMを皮下移植したところ、すべてのマウスに腫瘍拒絶が認められ自己抗腫瘍免疫が誘導されていることが明らかとなった。
ヒト造血細胞での細胞周期制御機構の解析

MDM2によるp53蛋白の分解を抑制するARF遺伝子とG1/S移行を促進する細胞周期制御因子CDK4を抑制するINK4A遺伝子は同一のINK4A/ARF遺伝子座から発現する.両者の発現を137例のヒト造血器腫瘍患者検体で解析したところ,これまでの報告と同様INK4A/ARF遺伝子座の欠失に相当する両者の発現欠損は比較的増殖の早い腫瘍で認められ,予後と関連していた.しかし,INK4AではなくARF遺伝子の発現に臨床的意義が見出された.その高発現が濾胞性リンパ腫で,また発現欠損がび慢性大細胞型リンパ腫で予後不良と関連した.また,多発性骨髄腫患者よりサイクリンD1過剰発現にp53変異を伴う細胞株を樹立した.いずれも,造血器腫瘍でのp53経路の異常が重要であることを示している.そこで,p53変異が腫瘍細胞で獲得される機序を解明するため,p53遺伝子変異の続発するC-MYCと活性型H-RAS遺伝子共導入細胞を用いて実験を行った.ラット胎児線維芽細胞にC-MYCと活性型H-RAS遺伝子を導入し,形質転換した細胞をクローン化し,r選択とK選択によってもたらされる変化を解析した.r選択では,細胞密度の低い培養条件で細胞を継代し,K選択では,細胞密度の高い培養条件で細胞を継代した.増殖率(r)で淘汰されるr選択では,期待通り徐々にrは高まり,p53点突然変異株ではもう一方の野生型アレルの消失が次々に現れた.つまり,p53変異は増殖を早め,r選択下で有利に選択される.一方,K選択ではp53変異(野生型アレルの消失)は必ずしも促進されず,r選択では見られない多倍体の台頭が観察された.今回は,INK4a/ARF遺伝子座については言及できなかったが,造血器腫瘍を含めヒト腫瘍におけるp53経路の異常はr選択によってもたらされることが示唆された.137例の血液系腫瘍患者検体でのRT-PCRによるINK4A/ARF遺伝子座の発現解析の結果と、臨床所見との関連を解析した.疾患特異的な発現欠損のほかに、発現レベルについても今回興味深い結果が得られた.INK4A遺伝子の高発現は急性白血病などの増殖の早い疾患で多いことが示され、増殖自体と関連していることが示唆された。しかし、INK4Aの発現レベルと予後との関連について臨床的意義を見い出すことはできなかった.一方、ARF遺伝子では、発現レベルの低いびまん性大細胞型リンパ腫例は予後不良で、INK4A/ARF遺伝子座欠失例は予後不良だとするこれまでの報告と一致していた.発現欠損の見られなかったろ胞性リンパ腫では高発現例の予後が有意に不良であった.以上より、INK4A遺伝子とARF遺伝子の発現は同一の遺伝子座にありながら、疾患によって異なった制御を受け、その発現レベル、特にARF遺伝子発現には臨床的意義があることが示された.また一方で、多発性骨髄腫患者よりt(11;14)(q13;q32)に伴うサイクリンD1過剰発現とp53変異を有する細胞株を樹立した.このような例を踏まえて、どのようにINK4A/ARF遺伝子座の欠失やp53遺伝子変異が生ずるのかを明らかにする必要があると考え、c-MYCがん遺伝子の導入に伴ってINK4A/ARF遺伝子座の欠失やp53変異が生じることに着目した.まず、ラット胎児線維芽細胞にc-MYCとRASがん遺伝子を導入する発がんモデルにおいてINK4A/ARF遺伝子座の欠失やp53遺伝子異常が生じることをSouthern解析やPCR-SSCP法で確認した.また、どのような培養条件で遺伝子異常が誘導されるかなどを現在検討中である。MDM2によるp53蛋白の分解を抑制するARF遺伝子とG1/S移行を促進する細胞周期制御因子CDK4を抑制するINK4A遺伝子は同一のINK4A/ARF遺伝子座から発現する.両者の発現を137例のヒト造血器腫瘍患者検体で解析したところ,これまでの報告と同様INK4A/ARF遺伝子座の欠失に相当する両者の発現欠損は比較的増殖の早い腫瘍で認められ,予後と関連していた.しかし,INK4AではなくARF遺伝子の発現に臨床的意義が見出された.その高発現が濾胞性リンパ腫で,また発現欠損がび慢性大細胞型リンパ腫で予後不良と関連した.また,多発性骨髄腫患者よりサイクリンD1過剰発現にp53変異を伴う細胞株を樹立した.いずれも,造血器腫瘍でのp53経路の異常が重要であることを示している.そこで,p53変異が腫瘍細胞で獲得される機序を解明するため,p53遺伝子変異の続発するC-MYCと活性型H-RAS遺伝子共導入細胞を用いて実験を行った.ラット胎児線維芽細胞にC-MYCと活性型H-RAS遺伝子を導入し,形質転換した細胞をクローン化し,r選択とK選択によってもたらされる変化を解析した.r選択では,細胞密度の低い培養条件で細胞を継代し,K選択では,細胞密度の高い培養条件で細胞を継代した.増殖率(r)で淘汰されるr選択では,期待通り徐々にrは高まり,p53点突然変異株ではもう一方の野生型アレルの消失が次々に現れた.つまり,p53変異は増殖を早め,r選択下で有利に選択される.

一方,K選択ではp53変異(野生型アレルの消失)は必ずしも促進されず,r選択では見られない多倍体の台頭が観察された.今回は,INK4a/ARF遺伝子座については言及できなかったが,造血器腫瘍を含めヒト腫瘍におけるp53経路の異常はr選択によってもたらされることが示唆された.昨年度,MDM2によるp53蛋白の分解を抑制するARF遺伝子の発現欠損が,造血器腫瘍でも比較的増殖の早い腫瘍で認められ,同一のINK4A/ARF遺伝子座から発現するINK4A遺伝子の発現と比較して,予後と関連していることを見出した.すなわち,INK4A/ARF遺伝子座の欠失におけるp53経路の重要性が示された.本年度,ヒト腫瘍全般で高頻度に検出されるp53経路の変異がどのような機序で発生するのかを明らかにするため,p53遺伝子変異の続発ずるC-MYCと活性型H-RAS遺伝子共導入細胞を用いて実験を行った.細胞はラット胎児線維芽絹胞で,C-MYCと活性型H-RAS遺伝子の導入で形質転換した細胞をクローン化し,r選択とK選択によってもたらされる変化を解析した.r選択では,細胞密度の低い培養条件で細胞を継代し,増殖率rによって選択を行なった.一方,K選択では,増殖率ではなく生存率の高い細胞を選択するため細胞密疫の高い培養条件で細胞を継代した.r選択では.期待通り徐々に増殖率は高まり当初16時間の倍化速度が10時間程度に短縮した.と同時に,p53点突然変異株ではもう一方の野生型アレルの消失が次々に出現した.つまり,p53変異は増殖率rを高め,r選択下で有利に作用することが示された.一方,K選択ではp53変異(野生型アレルの消失)は必ずしも促進されず,r選択では見られない多倍体の台頭が観察された.これまで、p53変異は遺伝子不安定性を誘導し多倍体などの異数体出現の原因とされてきたが,rとK選択でp53変異と多倍体出現を分離することができた.今回は,INK4A/ARF遺伝子座については言及できなかったが,rとK選択が遺伝子異常の出現に重要な役割を果たしていることが示された.
アイカメラを用いた農作業技術継承マニュアルの提案

当該年度では、まず「農作業技術継承WEBマニュアル生成・表示システム」を提案した。提案システムでは,WEBアプリケーション上で容易にマニュアルを生成することができる。加えて、栽培方法が類似している作物のマニュアル作成の省力化を図るための「代替えマニュアル生成機能」についても検討した。さらに、アイカメラで撮影した視線情報を含んだ映像を物体インスタンスセグメンテーションアルゴリズムであるMask R-CNNを用いて映像を解析することにより、自動で映像を1フレームごとに分割した画像の注釈を行う手法についても検討した。Mask R-CNNを用いて映像内の物体を明確にし、アイカメラの視線データと重ね合わせることにより、熟練営農者がその時何を見ていたかを自動で文章化させる手法について検討した。実験の結果、Mask R-CNNを用いて農作業具であるプラグトレイを検出することができた。H28年度に1年間の在外研究があったため、研究が遅れている。そのため1年間の研究期間の延長を申請した。今後は、農作業技術継承WEBマニュアル生成・表示システムの実運用を行う。また、Mask R-CNNを用いた画像の自動注釈技術について完成する。アイカメラを用いた農作業技術継承マニュアルの自動生成手法について,研究分担者との打ち合わせを行い,機械学習を用いた画像自動分析を採用することに決定した.また農水省の行う異分野融合共同研究プロジェクトの取り組みと連動する形で,農作業マニュアルをアップロードするためのサーバシステム(iFarmサーバ)をあらたに整備・構築し,全国の連携高専(30拠点)へIDの配布・導入を行った.これによりH29年度以降の,マニュアル配布のための環境整備を整えた.研究担当学生の学期途中の退学があった.学期途中での退学であったことで,新たな研究担当学生の配置が難しく,担当学生の不在によりやむを得ず研究進捗の遅れが生じた.本研究では農作業技術継承マニュアル表示システム(以下,提案システム)を提案した.提案システムでは,WEB上で農作業技術継承マニュアル(以下,マニュアル)を表示する“マニュアル表示機能",マニュアル生成用の素材データをアップロードし,フォーム画面からテキスト編集を行い生成ボタンを押すことでマニュアルを生成する“マニュアル生成機能",WEBサーバ上に保存されたマニュアルの中から代替が可能なマニュアルを検索し合成する“代替マニュアル合成機能"の3つを持つ.以下に詳細を示す.【マニュアル表示機能】画像,テキストに加えて,アイカメラで撮影した作業者の視線映像とハンディーカメラで撮影した作業の全体映像を表示することができる.【マニュアル生成機能】タイトルの編集,画像・動画ファイルのアップロード,テキストの編集,農機具の説明の追加/編集/削除/並び順の変更ができる.画像ファイルは1作業マニュアルにつき最大3つまでとした.【代替マニュアル合成機能】代替マニュアル合成機能は,マニュアルの素材コンテンツを用意できていない作物&作業に対して既存マニュアルの中から素材を流用する仕組みである.同一分類(葉菜類,根菜類など)の作物では同一の作業が存在する場合があり,素材の流用によるマニュアル作成の省力化を目的としている.例えば既存のマニュアル(レタス)を元に別の作物のマニュアル(キャベツ)を作る場合の手順は,以下のとおりである.(1)同じ作業に対して素材コンテンツ単位での自動リンク(2)参照作物は作物のマスタ画面で予め設定.本例であればキャベツのマスタ画面で「参照:レタス」と設定(3)代替マニュアルであることがわかるように,代替(レタス)とマニュアル上に表示する.平成29年度は,在外研究で国外での研究を行った.そのため,卒研生等担当の学生を配置することができず,研究の進展が遅れた.当該年度では、まず「農作業技術継承WEBマニュアル生成・表示システム」を提案した。類似マニュアル表示システムについての実装を行う.マニュアル閲覧者によるフィードバック(マニュアル評価)機能を実装し,類似度の動的な変更が行えるように工夫する.ディープラーニングを用いた,アイカメラの視線計測からの暗黙知表出に関する研究を行う.また,iBeaconを用いた農作業記録の自動化と農作業技術の定量化についても検討する.今後は、農作業技術継承WEBマニュアル生成・表示システムの実運用を行う。研究に遅れた生じたことで,H28年度に使用予定の経費がH29年度への使用へとずれ込んだため.平成29年度は在外研究で国外での研究となったため,担当の卒研生の配置が出来なかった.そのため,研究の進捗が遅れ未使用金額が生じた.H28年度に1年間の在外研究があったため研究が遅れた。次年度は、農作業技術継承WEBマニュアル生成・表示システムの実運用を行う。
大規模水田作経営の展開のための高度情報システムに関する研究

大規模水田作経営の展開を支援する目的で高度情報システムに関する研究を実施し、経営管理の高度化に結びつく経営情報システムの理論的整理を行うと共に、その結果を反映させながらパソコンによる経営情報システムの開発を行った。そして、作製したソフトウェアについて現地実証試験を実施し、有効性を確認した。それらの経営管理用ソフトウェアは、研究用としてばかりでなく、生産現場で広く利用され顕著な成果をあげている。大規模水田作経営における経営情報システムの役割と具体的構成内容について実態分析を実施し、その理論的な整理をシステム開発に反映させるように努めた。本研究で開発に取り組んだのは、大規模水田作経営における経営情報システムの主要部分を構成する農業簿記会計(「農業経営簿記」)、農業経営計画(「線形計画法システム」)、圃場管理(「一筆圃場管理システム」)の3つのソフトウェアである。いずれもWindows版として開発した。農業簿記会計に使用する「農業経営簿記」では、一般的な簿記会計システムにおける情報処理機能に加えて、キャッシュフローやマトリックスによる会計手法を収り込んで、資金繰りに関する分析・計画機能を重点的に搭載した。農業経営計画の策定に用いる「線形計画法システム」では、標準線形計画法とその拡張モデルを適応し、最適作付計画を始めとする大規模水田作経営の意志決定行動を支援できるようにした。圃場管理に適用する[一筆圃場管理システム」では、地理情報システムの技法を採用して、大規模水田作経営の生産管理場面から生じる作付や農作業等の各種の圃場情報を高度処理し、計画的水田利用の推進に結びつけるよう機能開発を行った。これらのソフトウェアのうち農儀容経営簿記については、ユーザー数が1.000人を超える状況になっている。大規模水田作経営の経営情報システムの高度化を目標にして、経営管理に使用するパソコン用ソフトウェアの開発研究に取り組み、開発ソフトの現地実証試験を実施した。システム開発を行ったのは、農業簿記と農業経営計画の二つである。農業簿記については、鳥取大学農学部生産情報システム学研究室で従来より手がけているWindows版「農業経営簿記システム」の開発研究を、引き続いて実施した。今年度は、農業簿記から作成される財務諸表を用いて行う経営分析に重点をき、収益性分析、安全性分析、損益分岐点分析の各機能を開発した。あわせて、資産計画法の考え方にもとづき、資金繰り実績表を用いて資金繰りの計画シミュレーションができるようにした。また、開発したソフトウェアによって現地適用試験を実施し、経営分析及び資金繰りのシステムが、経営状態の把握、経営計画立案、合理的な資金運用などの支援に、効果を発揮することを確認した。農業経営計画については、数理計画法の手法にもとづいて標準線形計画法、そして、その拡張モデルであるバラメトリック線形計画法、目標計画法、リカーシブプログラミング等についてソフトウェア開発を行う計画である。今年度は、これらの手法のうち、既にMs-Dos版として開発されている標準線形計画法について、Windows版への移植・変換作業を中心に研究を進めた。上記の開発ソフトウェアを高水準のものとするため、生産現場の大規模水田作経営を対象に経営実態調査を実施して、基礎的な経営データを収集するとともに、ソフトウェアに対するニーズ調査を行った。大規模水田作経営の経営情報システムの高度化を目標にして、経営管理に使用するパソコン用ソフトウェアの開発研究に取り組み、それらの現地実証試験を実施した。システムの開発を行ったのは、圃場管理と農業簿記会計、農業経営計画の3分野である。圃場管理に関しては、鳥取大学農学部生産情報システム学研究室で従来より開発を手がけてきているWindows版「水田作経営の一筆圃場管理システム」について、今年度は水田圃場から収集した土壌診断データを、コンピュータ画面上で地図情報と重ねて表示し、分析結果をより効果的に活用するための機能を新しく付加した。高品質生産のねらいで生産現場から強いニーズが寄せられている領域の研究であり、現地実証試験を通じて好評を得た。

農業簿記会計に関しては、本研究室で開発中のWindows版「農業経営簿記システム」について、キャッシュフロー会計の視点にもとづき、資金繰りシステムの機能を新しく付加した。具体的には、マトリックス会計表を応用した詳細な資金繰り実績分析、キャッシュフロー計算書を応用した明確な資金区分、借入金返済にシミュレーションを導入した資金繰り計画の作成が可能なシステムとした。農業経営に関しては、標準線形計画法及びパラメトリックス線形計画法の二つのモデルについてMs-Dos版からWindows版への移植・変換を行うとともに、本ソフトウェアを用いて水稲の不耕起直播栽培を導入した大規模水田作経営の最適作付計画の検討を行って有効性を実証した。大規模水田作経営の経営情報システムの高度化を目指して、経営管理に使用するパソコン用ソフトウェアの開発研究に取り組み、それらの現地実証試験を実施した。システム開発を行ったのは、圃場管理と農業簿記会計の2分野である。また、大規模水田作経営を対象にした実態調査結果にもとづき、経営発展に果たす農業経営情報システムの役割について考察し、理論的整理を行った。ソフトウェア開発の圃場管理に関しては、鳥取大学農学部生産情報システム学研究室で開発を手がけてきているWindows版「水田作経営の一筆圃場管理システム」について、今年度は水田で生産された酒米の品質分析の結果を、コンピュータ画面上で地図情報と重ねて表示し、分析結果を有効利用するための機能を新規に付加した。前年に開発した土壌分析・診断システムの機能と併用することによって水稲の高品質生産に役立てることが可能であり、現地実証試験を通じて普及に移しうるとの評価を得た。農業簿記会計に関しては、本研究室で開発中のWindows版「農業経営簿記」について、前年開発した資金繰り実績分析及び資金繰り計画のシステムを適用し、大規模水田作経営を対象にして実証試験を重ねた。そして、鳥取県の特定農業法人Aを事例にして考察した結果、当該システムが大規摸水田作経営の計画的な資金運営に対し、有益なツールとして貢献することを明らかにした。
本邦初,電界放射電子顕微鏡による高解像度重金属微粒子を用いた土壌・大気汚染解明

電界放射電子顕微鏡を用いて,国道43号線付近の道路脇粉塵中の重金属微粒子を観察分析した結果,タイヤダストやブレーキダストに由来する亜鉛や鉛,鉄等が多数見られ,人間の健康に大きな影響を与えることが明らかとなった.また,尼崎国道43号線付近のデイーゼル車由来の浮遊粒子状物質(SPM)の産状を見た結果,DEPと呼ばれる2.5マイクロメータ以下のデイーゼル車排気微粒子が多数大気中に浮遊し定ることも判明した.これらは炭素から主になるが,鉛や一部カドミウムを含んでいた.松の葉の気孔中の微粒子を電界放射電子顕微鏡を用いて観察すると,製鉄所や工場,石炭火力発電所由来の鉄球やフライアッシュが大気中に拡散し,これらが松の気孔中に捕獲されていた.これらを多数測定すると,工場から離れるに従い,その量は減るが,神戸市全域に拡散していた.次に,鉱山周辺の河川底質中の重金属微粒子を電界放射電子顕微鏡を用いて観察した、その結果,鉱山周辺では高い砒素,亜鉛,銅,鉛含有量を示した.これらを電界放射電子顕微鏡でみると,鉱山由来の斑銅鉱や黄鉄鉱,閃亜鉛鉱など鉱山由来の微粒子であることが明らかとなった.特に,湧水が多い地域ではバクテリアで鉄が濃集し,そこに砒素が多いことが明らかとなった.さらに,銅の2次酸化鉱物(オリーブ銅鉱)中にも砒素が濃集する.さらに,市街地での河川底質を電界放射電子顕微鏡でみると,工場由来の鉄球や金属微粒子が多数発見された.市街地の河川では,このように人為的な汚染が顕著である.交通量の多い国道43号線付近でローエアーサンプラーで採取した大気から,フィルターに捕集された重金属微粒子を電界放射電子顕微鏡でみると,土壌粒子のほかにデイーゼル車排気微粒子が多数存在し,それに鉛や鉄などの重金属微粒子が多く付着していた.六甲山の中腹でローエアーサンプラーで採取した大気から,電界放射電子顕微鏡で微粒子を観察した.その結果,粗大粒子は自然に存在する土壌粒子や海塩粒子が多いが,細粒粒子は人為由来の工場や自動車走行に由来する粒子が多いことが明らかとなった.また,黄砂をみると,土壌粒子に重金属微粒子が多く付着していることが判明し,中国大陸由来のものであることが明らかとなった.電界放射電子顕微鏡を用いて,本邦で初めてSPMと呼ばれるデイーゼル車由来の浮遊粒状物質の撮影に成功した。これらは,2.5ミクロン以下で,多くが50ナノ以下の微粒子で,通常の走査電子顕微鏡では画像を得ることができないものである。電界放射電子顕微鏡で,これらの鮮明画像の撮影に成功したばかりでなく,この微粒子の化学組成を電顕にリンクしたエネルギー分散型蛍光X線で分析に成功した。その結果,この浮遊粒子状物質(SPM)は,単体の球でなく,球がつながった葡萄の房状につながっていることが明らかとなった。また,その化学組成は大部分炭素からなり,さらに一部硫黄が含まれており,少量の重金属,カドミウムや亜鉛などが含まれていることが,本邦で初めて明らかとなった。また,これら浮遊粒子状物質(SPM)の定量的検討を行った結果,尼崎の国道43号線付近の車の通行量がおおいところで浮遊粒子状物質(SPM)が多いことが判明し,車の通行量と浮遊粒子状物質(SPM)とは相関した。さらに,NO2とも相関性が高いことが判明した。さらに,浮遊粒子状物質(SPM)は六甲山の登山道である灘区高羽付近でも高く,坂道や交差点でも高くなる傾向を有する。次に,道路脇粉塵を,同じ電界放射電子顕微鏡を用いて分析を行った。その結果,この粉塵中には高い亜鉛やチタンなど重金属微粒子に富むことが判明した。これらは多くがタイブレッド片で、タイヤとアスファルトの摩擦でタイヤの摩耗で生じたもので,この中に,加硫物質として亜鉛が混入されているためであることも判明した。さらに,道路の白線に由来するカルシューム,黄色線に由来するクロームなども存在する。数マイクロメータの鉄球も大気中や道路脇粉塵中に多数存在することが判明した。これらは近隣の製鉄所に由来したものである。電界放射電子顕微鏡を用いて、神戸大学屋上に設置したアンダーセンサンプラーを用いて、大気中の微粒子を粒径ごとに採取した。その結果、粗粒子は自然起源の土壌粒子が多いが、細粒子の多くは人為起源で、しかも50ナノサイズのDEP(ディーゼル排気微粒子)から多くなることが判明した。さらに、黄砂時と非黄砂時では、土壌粒子に大きな差異がみられ、中国大陸由来の土壌粒子には重金属微粒子が付着していることが電界放射電子顕微鏡での画像解析結果から明らかとなった。また、道路脇の粉塵中には多数の重金属微粒子がみられ、そのなかにはチタン鉄鉱も多数存在することやいったん道路に堆積した粉塵が自動車の走行風で巻き上げられ、大気中に飛散していることも明らかとなった。その中で、電界放射電子顕微鏡により、松の気孔中にタイヤダストなどの有害物質が入っていることが明らかとなり、この飛散は人間の健康にも大きな影響をもたらす可能性があることを示唆している。猪名川流域の河川底質中の批素を蛍光X線で化学分析したところ、環境基準値を超える高いヒ素含有量が検出された。

上流には多田鉱山があり、その銅鉱石を電界放射電子顕微鏡で、詳細に画像解析したところ、斑銅鉱のリンを置き換えて、砒素が入っていることが明らかとなった。これは斑銅鉱が酸化され、砒酸塩鉱物となり、その過程で砒素がリンを置き換えたものであることが明らかとなった。この酸化した斑銅鉱は容易に水に溶出し、その結果、砒素は湧水に多量に入り込み、河川底質中に蓄積されたものと考えられる。さらに、河川底質中には硫砒鉄鉱がナノサイズの微粒子としても存在することが明らかとなった。このように、電界放射電子顕微鏡を用いた大気や土壌中の微粒子の観察から、その由来が明瞭となってきており、汚染起源の特定には電界放射電子顕微鏡はきわめて有効であることが証明されてきている。電界放射電子顕微鏡を用いて,国道43号線付近の道路脇粉塵中の重金属微粒子を観察分析した結果,タイヤダストやブレーキダストに由来する亜鉛や鉛,鉄等が多数見られ,人間の健康に大きな影響を与えることが明らかとなった.また,尼崎国道43号線付近のデイーゼル車由来の浮遊粒子状物質(SPM)の産状を見た結果,DEPと呼ばれる2.5マイクロメータ以下のデイーゼル車排気微粒子が多数大気中に浮遊し定ることも判明した.これらは炭素から主になるが,鉛や一部カドミウムを含んでいた.松の葉の気孔中の微粒子を電界放射電子顕微鏡を用いて観察すると,製鉄所や工場,石炭火力発電所由来の鉄球やフライアッシュが大気中に拡散し,これらが松の気孔中に捕獲されていた.これらを多数測定すると,工場から離れるに従い,その量は減るが,神戸市全域に拡散していた.次に,鉱山周辺の河川底質中の重金属微粒子を電界放射電子顕微鏡を用いて観察した、その結果,鉱山周辺では高い砒素,亜鉛,銅,鉛含有量を示した.これらを電界放射電子顕微鏡でみると,鉱山由来の斑銅鉱や黄鉄鉱,閃亜鉛鉱など鉱山由来の微粒子であることが明らかとなった.特に,湧水が多い地域ではバクテリアで鉄が濃集し,そこに砒素が多いことが明らかとなった.さらに,銅の2次酸化鉱物(オリーブ銅鉱)中にも砒素が濃集する.さらに,市街地での河川底質を電界放射電子顕微鏡でみると,工場由来の鉄球や金属微粒子が多数発見された.市街地の河川では,このように人為的な汚染が顕著である.交通量の多い国道43号線付近でローエアーサンプラーで採取した大気から,フィルターに捕集された重金属微粒子を電界放射電子顕微鏡でみると,土壌粒子のほかにデイーゼル車排気微粒子が多数存在し,それに鉛や鉄などの重金属微粒子が多く付着していた.六甲山の中腹でローエアーサンプラーで採取した大気から,電界放射電子顕微鏡で微粒子を観察した.その結果,粗大粒子は自然に存在する土壌粒子や海塩粒子が多いが,細粒粒子は人為由来の工場や自動車走行に由来する粒子が多いことが明らかとなった.また,黄砂をみると,土壌粒子に重金属微粒子が多く付着していることが判明し,中国大陸由来のものであることが明らかとなった.
ＬＲＧノックアウトマウスの解析による新規シグナル分子としてのシトクロムｃの役割

機能未知の血清タンパク質の一つであるロイシンリッチα2-グリコプロテイン(LRG)は、血液中で細胞外シトクロムc(Cytc)と強く結合して複合体を形成することを見いだした。この結合にはCytcの8位、13位、72位、73位、79位の正電荷が重要であった。Cytc-LRG複合体は、骨髄マクロファージなどの免疫細胞に働いてG-CSFの発現を誘導し、骨髄における好中球の増殖を促進する危険シグナルとして機能すると思われる。野生型マウスとLRGノックアウトマウスに、PBS、PBSに溶解した50ugまたは1mgのウマCyt cを7日間連続して腹腔内に投与した。これらのマウスから骨髄細胞を回収し、PE標識抗マウスGr-1抗体を用いてフローサイトメトリーで解析し、骨髄中の好中球の割合を調べた。その結果、野生型マウスではCyt cの投与量に依存して骨髄細胞中の好中球の割合が増加したが、LRGノックアウトマウスでは好中球の増加は認められなかった。また、Cyt c投与したマウスの血清を、抗Cyt cモノクローナル抗体と抗マウスLRG抗体を用いたウェスタンブロットにより解析したところ、血清中のCyt cは野生型マウスでのみ検出されたが、LRGノックアウトマウスでは全く検出されなかった。このことは、LRGノックアウトマウスでは投与したCyt cは直ちに尿中に排泄されるが、野生型マウスではCyt cはLRGと複合体を形成することによって血中に維持されることを示す。すなわち、血中Cyt cはLRGと複合体を形成し、それが好中球の増加を引き起こすシグナルとして機能すると考えられた。LRGとCyt cの相互作用については、大腸菌でLysをAlaに置き換えた変異型Cyt cを多数作製した。これらの変異型Cyt cは大腸菌で発現させた後、イオン交換カラムクロマトグラフィーとHPLCを用いて精製しつつある。一方、LRGが血管新生に関与するという報告があったので、HUVEC細胞を用いてLRGとCyt cの血管形成に及ぼす影響について調べた。しかし、LRGもCyt cもCyt c-LRG複合体も、HUVEC細胞における血管新生作用に対して特に影響を与えなかった。野生型マウスとLRGノックアウトマウスに、ウマCyt cを腹腔内に投与した。その結果、Cyt cの投与により、野生型マウスでは骨髄細胞中の好中球の割合が増加したが、LRGノックアウトマウスでは好中球の増加は認められなかった。このとき、血清中のG-CSFをELISAで定量することにより、骨髄細胞中での好中球の増加は血中G-CSF量の増加によると考えられた。また、Cyt cを投与したマウスの血清を、ウェスタンブロットにより解析したところ、血中Cyt cは野生型マウスでのみ検出され、LRGノックアウトマウスでは全く検出されなかった。すなわち、血中Cyt cはLRGと複合体を形成し、それがG-CSFの発現を促進し、好中球の増加を引き起こすシグナルとして機能すると考えられた。また、大腸菌でヒトCyt cを発現するプラスミドpBTR1を用いて、ヒトCyt cのLys残基をそれぞれAlaに置換したpBTR1変異体を多数作製し、これらの変異体とヒトLRGとの相互作用をBiacoreで測定した。その結果、K8A, K13A, K72A, K73A, K79Aでは解離定数が大きくなり、LRGとの相互作用が低下することがわかった。特にK8Aの解離定数は265pM、K72Aは734pMとなり、これらのLys残基がAlaに置換すると、結合力がそれぞれ100倍以上弱くなることがわかった。以上の結果から、Cyt cの8位、13位、72位、73位、79位の正電荷がLRGとの相互作用に重要であり、これらの残基はCyt cの露出したヘムcを取り囲む領域に位置しているので、この領域にLRGが結合すると考えられた。LRGノックアウトマウスの表現型に関連して、ケージ交換などの刺激によって、強直間代発作などのてんかん様症状を示すノックアウトマウスが何匹か見られた。LRG遺伝子のノックアウトとてんかんが関連しているのか調べるため、野生型、ヘテロ体、ホモ体の各マウスで、Pentylenetetrazole(PTZ)に対する感受性に違いがあるのか、現在検討している。また、野生型とLRGノックアウトマウスの血清について、蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動(2D-DIGE)による解析を行ったところ、IgGに由来するスポットにおいて顕著な発現量の違いが見られた。

そこで野生型、ヘテロ体、ホモ体の各血清中のIgG量をELISAで定量したが、個体によるIgG量のバラツキが多く、明確な違いは確認できなかった。好中球の機能にLRGが関与するのかどうかを明らかにするため、野生型、ヘテロ体、ホモ体のマウスからそれぞれ好中球を採取した。それぞれの好中球にCyt cを添加し、好中球細胞外トラップ(NETs)形成に違いがあるかどうか調べたが、NETs形成にはCyt cとLRGは関与しないことがわかった。また、Cyt cに対する好中球の遊走活性は見られず、好中球の脱顆粒反応にもCyt cは関与しないことがわかった。野生型、ヘテロ体、ホモ体の各マウスに、1週間Cyt cを腹腔内投与し、骨髄細胞中の免疫細胞をFACSを用いて解析した。その結果、野生型に比べてヘテロ型、ホモ型では骨髄細胞中の好中球の割合が減少していた。また、LRGノックアウトマウスの骨髄細胞では野生型マウスの骨髄細胞に比べて、IL-6,TNFα, MCP-1などの炎症性サイトカイン遺伝子が2倍以上多く発現していることがわかった。しかし、Cyt cを添加してもこれらの発現に影響をあたえないことがわかった。LRGはCyt cのクリアランスに関与するという当初の仮説は否定されたが、Cyt cはLRGと複合体を形成することにより、Danger Signalとして機能することがわかってきた。LRGとCyt cの相互作用に関して、複合体のアセチル化によって結合しているLys残基を同定する方法は間接的な証明となるので、より直接的な方法に変更することにした。すなわち、大腸菌でLysをAlaに置換した変異型Cyt cを作製し、この変異型Cyt cとLRGとの相互作用を直接Biacoreで調べることにより結合に関与するLys残基を同定する方法である。ヒトCyt cを発現する大腸菌発現系は確立したが、変異Cyt cの作製と精製に時間がかかっている。Cytc投与による好中球増加は、血中G-CSFの増加によるものなのか、ELISAで検討するとともに、G-CSFを産生する骨髄マクロファージを培養して、Cyt c-LRG複合体の作用について検討する。また、Cyt c-LRG複合体に対する受容体が存在すると考えられるので、その実体を明らかにしたい。大腸菌で多数の変異型Cyt cを作製したので、Biacoreを用いてLRGとの相互作用を詳細に調べる予定である。最近、LRGが血管新生に関与し、LRGの抗体やアンタゴニストが増殖性糖尿病性網膜症などの血管形成異常疾患の治療薬になるいう国際特許が申請されていることを知った。そこで、LRGが実際に血管新生に関与しているのかどうか調べるとともに、血管新生に及ぼすCyt cの影響を調べていきたい。また、LRGがてんかんの発症と関係しているのか、PTZに対する感受性を調べるとともに、てんかん症状を示すLRGノックアウトマウスの脳組織を観察し、てんかんの原因を調べていきたい。LRGとCyt cの相互作用については、大腸菌で作製した変異型Cyt cとLRGの相互作用をBiacoreで調べて、結合に関わるLys残基を同定する予定である。また、昨年度に引き続き、Cyt cがDanger Signalとして免疫系細胞に作用するかどうか調べていきたい。具体的には、Cytc存在下で野生型およびノックアウトマウス由来の骨髄細胞を培養し、FACSで解析することによって免疫細胞の種類や分布がどのように変化するか調べる予定である。次年度の研究費はすべて消耗品費に充てる。
フレーベルの家庭育児書『母の歌と愛撫の歌』のシンボル論的研究

本研究は,昭和61年度科研(一般研究C)「フレーベルのシンボル概念とその〈遊具論〉への展開」の成果を基礎に,フレーベルの家庭育児書『母の歌と愛撫の歌』(Mutter=und Koselieder, 1844以下『母の歌』と略記する)を歌詩・絵画の両面からシンボル概念の具体的展開として論究したものである.〔研究成果〕:本研究から得られた主要な知見を要約すれば,以下の通りである.〈前提〉;フレーベルの「シンボル」概念は,多様にみられるので,一義的に規定することは困難であるが,基本的に,「象徴的なもの」をキリスト教信仰との関連において捉えている.従って,『母の歌』の挿絵もこの観点から考察されねばならない.その論拠としては,1.挿絵の成作者, F・ウンゲル(18111858)は,フレーベルの下で勉学し,その後,ミュンヘンの王室美術学校で, P・コルネリウス(17831867,ナザレ派)の教えを受けたが,むしろその画風は, O・ルンゲ(17771810), K・フリードッヒ(17741840)のロマン主義的プロテスタント的傾向が強い.例えば,ルンゲの作品「一日の四つ時」(Vier Zeitem, 1805)の構図がウンゲルの『母の歌』の挿絵の基本モチーフを形成していることからもうかがえる.2.『母の歌』を他の類書,とりわけ,『グリム童話』と比較考察すると,その特徴として,以下の点が明らかとなった.(1)『母の歌』は,挿絵,歌詩と母親への指示内容とが密接に結合し,その意図が親と子の関係を成立させる原理,教育の目的,方法,内容を含むものとして構成されているのに対して,『グリム童話』は,民話を中心にして作られたもので,その根本的意図において相違している.それが逆に『童話』の普及に連がっている.本研究は,昭和61年度科研(一般研究C)「フレーベルのシンボル概念とその〈遊具論〉への展開」の成果を基礎に,フレーベルの家庭育児書『母の歌と愛撫の歌』(Mutter=und Koselieder, 1844以下『母の歌』と略記する)を歌詩・絵画の両面からシンボル概念の具体的展開として論究したものである.〔研究成果〕:本研究から得られた主要な知見を要約すれば,以下の通りである.〈前提〉;フレーベルの「シンボル」概念は,多様にみられるので,一義的に規定することは困難であるが,基本的に,「象徴的なもの」をキリスト教信仰との関連において捉えている.従って,『母の歌』の挿絵もこの観点から考察されねばならない.その論拠としては,1.挿絵の成作者, F・ウンゲル(18111858)は,フレーベルの下で勉学し,その後,ミュンヘンの王室美術学校で, P・コルネリウス(17831867,ナザレ派)の教えを受けたが,むしろその画風は, O・ルンゲ(17771810), K・フリードッヒ(17741840)のロマン主義的プロテスタント的傾向が強い.例えば,ルンゲの作品「一日の四つ時」(Vier Zeitem, 1805)の構図がウンゲルの『母の歌』の挿絵の基本モチーフを形成していることからもうかがえる.2.『母の歌』を他の類書,とりわけ,『グリム童話』と比較考察すると,その特徴として,以下の点が明らかとなった.(1)『母の歌』は,挿絵,歌詩と母親への指示内容とが密接に結合し,その意図が親と子の関係を成立させる原理,教育の目的,方法,内容を含むものとして構成されているのに対して,『グリム童話』は,民話を中心にして作られたもので,その根本的意図において相違している.それが逆に『童話』の普及に連がっている.
製造業における意匠登録出願の戦略性に関する研究

本研究は、意匠登録出願の戦略性に関する筆者の一連の研究を集大成するとともに新たに研究を進め、また改めて国内製造業の中から特に意匠権競争が熾烈であり係争事件が発生しやすい家電機器メーカー数社を対象として、意匠登録出願の戦略的手法を類型化して、各々の特性を明らかにすることを目的としている。日本デザイン学会と芸術工学会において、筆者が過去に発表してきた論文と口頭発表などの研究成果をはじめ、それらに関連する研究内容を敷衍、編集、体系化するとともに、更に新たな視点から意匠登録出願研究を進めて総合的に水準を高めた。また、家電機器メーカー数社の知的財産部門へのアンケート調査と担当者の聞き取り調査を実施して企業の実態を把握するとともに、意匠公報により意匠登録出願の事例を調査のうえ、それらの戦略的手法特性を明らかにし、最終的に戦略レベルと戦術レベルの意匠登録出願方法論について明らかにし論述した。尚、意匠登録出願は、攻撃と防御の両側面を吟味して立案されるものであるが、今回の研究では、各登録事例の仮想コンペティターを特定することができなかったため攻撃面の観点からのみの考察となった。
電界印加制御による色素吸着アゾベンゼンLB膜の作製と光・電気特性の評価

拡散吸着LB法は、水溶性分子の会合体形成・配向制御に優れた方法である。本研究では、さらに累積基板に電圧を印加して分子の会合体形成・配向制御を能動的に行った。これによってLB膜の構造と光学的・電気的特性を制御すると共に、両親媒性分子に光異性化分子であるアゾベンゼン(Az)を用い、Az光異性化によるLB膜の諸物性の変化についても検討した。これらの結果は、LB膜の光・電子機能制御や、光異性化分子LB膜による光メモリ・スイッチング素子構築などに役立つものと思われる。シアニン色素は光増感材の一種であり、多様な会合体を形成することで知られている。まず、水溶性シアニン色素吸着アラキジン酸LB膜について、電圧印加して試料を作製し、その光学的・電気的特性を測定した。水面および水相中においてシアニン色素は正、アラキジン酸は負に帯電しているが、累積基板に電圧を印加することによってこれらの相互作用は変化し、LB膜内における色素会合体の形状と配向性、色素吸着量は変化した。さらに、これらの会合体の形成は水相となるシアニン色素水溶液濃度に強く依存した。また、LB膜の電流電圧特性は電圧印加と色素濃度によって大きく変化し、LB膜の光学的・電気的特性の制御が可能であることが示された。次に、両親媒性Azについて電圧を印加しない状態でシアニン色素吸着LB膜を作製し、その、光・電気特性について検討を行った。これより、可動イオンがLB膜の分極および電気伝導に関連していること、またAzの光異性化によるシアニン色素会合体形状、伝導電流、分極現象、短絡光電流の変化も確認した。また、熱処理による光特性変化について光吸収と全反射減衰(ATR)法によって詳しく調べた。すなわち、可視光吸収特性からKramers-Kronigの関係式を使って熱処理前後の複素誘電率の計算を行い、ATR法での結果と比較した。これらはよい対応を示し、ATRスペクトル熱処理変化の波長依存性が、LB膜の異常分散によって説明された。これらの結果は、光メモリや光スイッチング素子などの光デバイスへの応用に役立つものと思われる。なお、現在電圧印加によって試料を作製し、LB膜の構造と光・電気特性についてさらに詳しく調べている。
凝集体非依存的なタウ神経毒性機構の解明

多くの加齢に伴い発症する認知症では、変性神経細胞の中に微小管結合タンパク質タウの凝集と蓄積が観察され、タウオパチーと総称される。その発症機構は不明であり、タウとの相互作用を有するタンパク質が深く関与すると考えられる。本研究は、凝集体形成を伴わずに、異常なタウを発現したタウオパチー線虫モデルを用い、タウ神経毒性に関与の可能性があるタンパク質を網羅的に解析を行った。超高齢化社会が現実化した現在、認知症発症機構の解明は急務といえる。アルツハイマー病をはじめとする多くの加齢に伴い発症する認知症では、変性神経細胞の中に微小管結合タンパク質タウの凝集と蓄積が観察される。これらの疾患はタウオパチーと総称される。その発症機構は不明であるが、生理的に発現するタンパク質であるタウの何らかの異常と深く関連すると考えられる。我々はモデル生物である線虫(C. elegans)の神経系にタウを発現させることによって、神経形態異常及び機能障害が出現したタウオパチー線虫モデルを樹立した。神経細胞に発現したタウは、微小管からの解離及び異常リン酸化など、病態脳に蓄積したタウとよく似た状態を呈する。この異常なタウと相互作用をするタンパク質は、タウオパチーの発症機構に深く関与すると考えられる。本年度はタウとの相互作用する因子との結合条件の最適化、質量分析感度の向上、及び免疫共沈に用いる抗体の選択を行なった。さらに、電気泳動法と質量分析法を組み合わせた異常タウ結合因子の網羅的解析を試みた。その結果、アクトミオシン系のタンパク質のほか、リン酸化を含めた修飾にかかわる酵素及びシナプス局在分子など、新規のタウと相互作用しうるタンパク質を20種類同定した。タウはこれらの分子との間にネットワークを作り、タウオパチーを発症させる可能性が考えられる。さらに、新たに同定された相互作用分子の機能及びタウ毒性に対する作用を調べるため、数種の候補因子の遺伝子配列をもとに、RNAi発現ベクターを作製した。本研究により同定されたタウ結合候補タンパク質の中にタウの神経毒性発揮に関与する因子があると考えており、今後の研究によりさらなる絞り込みを予定している。加齢に伴い発症する認知症の多くには変性神経細胞内に微小管結合タンパク質・タウの蓄積が観察される。このような病理変化を有する疾患群はタウオパチーと総称される。我々は、樹立したタウオパチー線虫モデルにおいて、タウの発現により、神経細胞の機能障害および形態異常が誘導される事実を見出した。線虫の神経細胞に発現したタウは、異常なリン酸化および微小管からの解離など、病態脳に蓄積するタウとよく似た異常状態を呈していた。タウオパチー発症機構としては、この異常なタウと相互作用する因子が深く関与すると考えられる。本年度は、線虫の神経細胞に発現した異常タウと結合する因子について、電気泳動と質量分析の組み合わせによる同定を進めた。申請者らにより作製した抗タウ抗体を磁気ビーズに固定させ、線虫からタウを免疫沈降し、アクリルアミド電気泳動をさせた後、銀染色を行った。対照実験グループと比較し、タウ発現線虫に特異的に認められるバンドを切り出し、質量分析による同定を試みた。その結果、数種の同定された結合因子の中に、アクチンが存在することを明らかにした。アクチンは細胞中の細胞骨格タンパク質一種であり、細胞形態の変化と維持などの重要な働きを持つ。神経細胞においても軸索伸長、スパインの形態形成など神経機能における重要性が明らかである。タウオパチー発症メカニズムの現行研究の多くがタウと微小管との関連を標的としているが、タウとアクチン結合の生理学的および病理学的意義については不明なところが多い。タウの機能異常がアクチン系に影響を与える可能性を示唆している。本研究の目的は、タウの毒性責任配列と相互作用する因子を同定することにより、タウオパチー発症機構を解明することである。当初の計画では、線虫に発現させたタウの全長およびフラグメントを精製して、アフィニティーカラムを作製し、結合因子の精製、電気泳動と質量分析を組み合わせにより、結合因子の同定を進める予定であった。しかし、これまで、カラムの作製に必要な純度のタウは取れていない。その理由の一つとして、全タンパク質の発現パターンにおいて、線虫はマウス脳および大腸菌との間に違いがあり、従来のタウの精製法では充分な純度、量のタウが得られなかったと考えている。この現状のもとで、研究方法を転換し、抗タウ抗体を利用して免疫共沈法を試みた。さらに、電気泳動と質量分析の組み合わせにより、タウ全長と結合する因子の同定まで進めた。本年度に引き続き、抗タウ抗体のみならず、抗タグ抗体も利用し、タウの全長およびフラグメントを免疫共沈させ、電気泳動と質量分析の組み合わせにより、異常なタウとの結合因子の同定を進める予定である。本年度中、免疫共沈した特異的なバンドの中には、質量分析で特定できないバンドが幾つか存在した。したがって、質量分析における検出感度の向上によりさらに詳細なタウ結合因子の同定が可能になると考えている。

この目的で、使用する抗体の種類および量、線虫の量などを検討する予定である。さらに、リストアップされた結合因子をもとに、アクチンを含め、タウ毒性に関与する可能性が高い有力な候補因子を選び、RNAiで発現抑制、必要に応じて過剰発現を行い、神経系におけるタウとの関連、タウオパチー発症機構との関与などを調べる予定である。平成24年度の解析により、当初計画していた方法よりもより少量の線虫を用いて結合タンパク質を同定する方法の開発に成功した。それにより、動物飼育経費を削減する事が出来た。一方、平成25年度では候補因子の同定、および機能解析により大量の線虫を要すると試算された。したがって、平成24年度に計上した動物飼育、タウ精製に関する経費の一部を平成25年度に計上し、動物飼育、および候補タンパク質の同定に関する実験経費に用いることとした。