hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジーンターゲティング法を用いたα1アドレナリン受容体の機能解析

α1アドレナリン受容体にはα1A、α1B、α1Dの3つのサブタイプが存在することが明らかになっている。この中でα1Dアドレナリン受容体の生理的な役割は明らかでなくまた薬理学的にこの受容体に対する選択的な作動薬・拮抗薬も明らかになっていない。このα1Dアドレナリン受容体の生理機能について明らかにするため、マウス未分化胚細胞を用いたジーンターゲティング法を用いてα1Dアドレナリン受容体の変異体を持つマウスの作成を行った。α1Dアドレナリン受容体変異動物は、生体にまで正常に成長できることが明らかになった。今後この変異動物を解析することによりα1Dアドレナリン受容体の生理機能、薬物の選択性が明らかにすることが可能となった。またα1A及びα1Bアドレナリン受容体の変異マウスと組み合わせた二重変異マウスを作製することによりそれぞれのα1アドレナリン受容体サブタイプの相互作用が明らかにされることができるようになった。α1アドレナリン受容体のうち、生理機能が明らかになっていないα1Dアドレナリン受容体について、マウス未分化胚細胞を用いたジーンターゲティング法を用いて受容体の変異体を持つマウスの作成を行い、この変異動物を解析し、受容体の生理機能、薬物の選択性を明らかにすることを目的どして研究をおこなった。遺伝子ライブラリーのスクリーニングの結果、2個の陽性クローンが得られ、マウスα1d-アドレナリン受容体遺伝子は、10kb以上の大きさからなり、2個のエクソンおよび1個のイントロンから構成されていることが明らかになった。イントロンは他のα1アドレナリン受容体と同様に第6膜貫通領域をコードする領域に存在した。ターゲティングベクターの作製を行い、このターゲティングベクターを用いたES細胞への遺伝子導入およびG418薬剤によるスクリーニングにて、相同組み換えをおこし、マウスα1dアドレナリン受容体遺伝子の第1エクソン内の開始コドンを含む約300bpの部位がネオマイシン耐性遺伝子に置き換わる細胞のクローニングを行った。その結果、相同組み換えを正確におこした3個のES細胞がクローニングされた。これらの細胞を用いてマウスの胚盤胞に細胞導入を行い、キメラマウスが得られた。さらにこれらのキメラマウスよりFlマウスが作製された。今後これらのFlマウスを用いてヘテロ接合体、ホモ接合体の作成を行い解析を進める予定である。今後この変異動物を解析することによりα1Dアドレナリン受容体の生理機能、薬物の選択性を明らかにすることが可能となった。
レドックス制御による肥満症改善効果

生体内でのエネルギー代謝は、酸化還元(レドックス)反応により制御されている。ここで、NAD+、NADHはこのエネルギー代謝を制御する重要なレドックス因子である。一方、Tempolは、活性酸素を消去しNADHをヒドロキシルアミン体に還元できる。さらにTempolは、アスコルビン酸ーグルタチオン系によってもNAD+を生成できる。そこで我々は、このTempolの化学特性に着目し、肥満症マウスにおける代謝異常症の改善に関して検討を行った。その結果、Tempol投与によりNAD+/NADHは上昇し、代謝異常は改善された。以上の結果は、肥満症におけるレドックス制御という新しい概念を提案できると考えている。本研究は、これまでの研究成果をもとに「レドックスを制御することで肥満症の発症メカニズムを解析し、その予防・治療法を提案すること」、ならびに、「酸化還元反応を制御できる新たな化合物も開発・探索」を目的としている。以下、各項目につき研究計画を示す。1レドックス不均衡の改善:本研究は、試験管内での酸化還元電位を基に、生体内反応を制御するために、まずツール化合物として安定スピン化合物を用いて検討した。その結果、高脂肪食摂取による肥満症モデルマウスで、化合物投与により増加した体重は有意に減少し、肝臓内でのNAD+/NADH比は増加した。また、その反応制御経路として、2つ存在する可能性が細胞実験にて明らかとなった。2新規化合物の開発:本コンセプトは、酸化還元電位をうまく生体内反応に一致させた化合物を開発し、実際に応用することである。そこで、ツール化合物とは異なる酸化還元電位を有する化合物を新たに5種類合成した。また、次年度以降の研究に向け、スクリーニング系の構築を開始した。以上の検討結果を踏まえ、次年度以降は、発症メカニズムの解析とスクリーニング系を用いた候補化合物の探索を行う予定である。本研究は、「レドックスを制御することで肥満症の発症メカニズムを解析し、その予防・治療法を提案すること」を目的としている。そこで昨年度の研究成果を踏まえ、本年度は、発症メカニズムの解析とスクリーニング系を用いた候補化合物の探索を行った。1発症メカニズムの解析:昨年度までに、高脂肪食摂取マウスで、化合物の投与により肥満症の改善を示した。本年度の研究により、その原因は、ミトコンドリア内膜でNADP+ + NADH →NADPH + NAD+の酸化還元反応を触媒する酵素nicotinamide nucleotide transhydrogenase(NNT)が原因のひとつであることが明らかとなった。また、化合物の投与群において、脂質合成抑制及び分解亢進という二方面での脂質代謝改善作用があることが示唆された。2スクリーニング系の構築:レドックス変動の是正が肥満症の改善につながることから、これらを指標とした新たなスクリーニング系を構築し、評価を開始した。以上の結果より、「ニトロキシドが抗肥満効果を発揮するには、酸化ストレスの抑制とNAD+/NADH制御の両方を必要とする」ということが示唆された。本年度の検討により、酸化還元電位をうまく生体内反応にあわせることで、肥満症を改善できること、一方で新規化合物を開発できたことから、本研究の全体目標に向け、順調に進展していると考えている。生物物理化学今後は、スクリーニング系の構築し、実際に化合物の選別を行うことを目的とする。また、ツール化合物を用いた肥満症制御メカニズムの解明を進める。
クローン化により同定した焦点接着に局在するタンパク質、CBP-1、の機能の解明

1.CAKβ/PYK2結合タンパク質として同定したCBP-1(Hic-5)のチロシンリン酸化は、COS-7細胞でCAKβの共発現により亢進し、そのレベルは細胞を高浸透圧で刺激すると増強した。Y60F変異Hic-5の発現では、Hic-5のチロシンリン酸化が認められなかったので、Hic-5Tyr-60残基がこのリン酸化の主要部位であることを見い出した。CAKβのHic-5結合部位欠失変異体は、Hic-5をチロシンリン酸化することが出来ず、リン酸化には両者の結合が重要であった。リン酸化したHiC-5はGST-CskSH2に結合したが、この結合は特異的で、Fyn、Src、CskのSH2ドメインには結合しなかった。2.CAKβの種々の1アミノ酸置換変異を作成し、これらを培養細胞で発現し、細胞に与える影響を検討した。野生型CAKβは細胞質に局在するにもかかわらず、A点変異を持つCAKβは核にのみ局在することが明らかになった。A点変異CAKβを発現する細胞では、核内におけるチロシンリン酸化が亢進しており、核内においてもCAKβがチロシンキナーゼとして機能していると推定される。CAKβはHic-5と複合体を形成することが知られているので、A点変異CAKβをHic-5と共発現させた時のCAKβとHic-5の細胞内局在性を検討した。Hic-5は通常、焦点接着に局在するタンパク質であるが、CAKβと共発現すると主に細胞質に存在するようになった。A点変異CAKβとの共発現では、細胞質のみならず核内にも存在するようになった。A点変異CAKβとHic-5とを共発現した細胞をLeptomycin B存在下で培養すると、核内に光学顕微鏡下でも観察可能なCAKβとHic-5を含む凝集体を形成した。CAKβの核における機能の解明は今後の課題である。私達は、FAK分子族に属する第2のタンパク質チロシンキナーゼをクローン化し、これを細胞接着キナーゼβ(CAKβ)と命名した。CAKβに共役するシグナル伝達路を明らかにするために、CAKβC-ドメインをプローベに用いてヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングし、CAKβ結合タンパク質(CBP-1)のcDNAをクローン化した。CBP-1は、Hic-5のヒトホモログである事が明らかになった。Hic-5は焦点接着に局在した。Hic-5アミノ酸配列は、焦点接着局在タンパク質であるパキシリンに最も近縁であった。Hic-5とパキシリンは、そのNドメインがCAKβおよびFAKのCドメイン後半部分と特異的に結合した。抗Hic-5抗体を用いて、WFB細胞抽出液からHic-5を免疫沈降すると、CAKβが共沈した。WFB細胞におけるCAKβのチロシンリン酸化は、血清、リゾホスファチジン酸(LPA)、エンドセリンなどによる刺激、および高浸透圧刺激で亢進するが、これらCAKβを活性化する刺激でHic-5のチロシリン酸化も亢進した。Hic-5とCAKβとの結合は、Hic-5のチロシンリン酸化に重要であることを示唆する結果が得られた。Hic-5のチロシンリン酸化部位を同定し、そこに結合するシグナル伝達タンパク質を同定した。tet系やアデノウイルスベクターを用いHic-5を過剰発現したが、焦点接着の形成、細胞の伸展接着性、細胞の運動・浸潤能及び細胞の増殖能に顕著な影響は認められなかった。Hic-5とパキシリンとは共に焦点接着に局在するが、その機能は異なっている可能性が強く、今後の研究により、Hic-5の機能を明らかにする必要がある。A点変異CAKβとの共

発現では、細胞質のみならず核内にも存在するようになった。A点変異CAKβとHic-5とを共発現した細胞をLeptomycin B存在下で培養すると、核内に光学顕微鏡下でも観察可能なCAKβとHic-5を含む凝集体を形成した。CAKβの核における機能の解明は今後の課題である。
H^+ーATP合成酵素等の機能制御におけるソフトな分子間相互作用

われわれが生きていくために必須のエネルギーを生み出すH^+-ATP合成酵素は地球上最小の分子モーターであることが知られている。この酵素の回転触媒反応のメカニズムを核磁気共鳴法により立体構造を基に明らかにした。この酵素は多数のタンパク質単位(サブユニット)が集まってできている。回転の原因となる個々の単位の構造変化はATPとソフトな相互作用に始まり、サブユニット間のソフトな相互作用によって駆動されていることが明らかになった。本年度はH^+-ATP合成酵素の膜に埋まっている部分であるF_0ドメインを構成するcサブユニットの大量精製法を確立し、一定の^<13>C,^<15>N均一標識試料を得ることが出来るようになった。H^+-ATP合成酵素の水相F_1ドメインについては、触媒部位であるβサブユニットのリガンドによる構造変化の解析に溶液NMRを用いて取り組んでいる。βサブユニットは約52000の分子量を持ち、今までの方法では解析が困難である。そこで、中崎等が開発したインテインによる区分標識法を用いて均一標識された^<13>C,^<15>Nの信号の約90%を帰属するのに成功した。さらに、cサブユニットの固体試料について解析を行うために、固体高分解能NMR測定法の開発を行った。まずは、膜蛋白質を研究するモデルとして15残基のペプチド、マストパランX-Glyを対象として、一連の技術の開発に取り組んだ。固体NMRによって、結晶を作ることなく、脂質膜にある蛋白質の構造と機能を解析できる。^<13>Cと^<15>Nで完全標識したマストパランXの固体NMR信号を帰属するために、約5種類の2次元および3次元NMRパルス系列を開発した。これらを用い、主鎖の炭素・窒素とβ炭素について完全な帰属を行った。帰属によりわかる等方化学シフトと立体構造には相関がある。近年の新しい研究成果を利用して化学シフトより構造解析を行った。得られた構造は、2残基目は主鎖が伸びているが3から14残基目まではαヘリックスを作っているというものであった。さらに、構造間のRMSDとそれら構造に対応する化学シフト間RMSDの相関を調べた。その結果、得られたマストパランXの構造は、主鎖RMSDで1Å程度の精度があることがわかった。F_0F_1-ATP合成酵素cサブユニットについて、上記のような方法が適用できることを示すために、^<13>C均一標識試料について固体状態で、^<13>C2次元相関スペクトルを測定した。本年度はモノマーβサブユニットのリガンド結合による構造変化の実態を明らかにすることができた。βサブユニットは分子量5万のため主鎖の帰属は標識部位が異なる4種の区分標識体を作成して行った。その結果90%程度の主鎖の帰属を完了した。帰属したCα,Cβ,C',Nの化学シフト値からTALOSを用いて2次構造を推定し、ADPを加えた時に起こる化学シフト値の変化からおおよその構造変化領域を特定した。さらにN末端およびC末端のみが標識されているものでResidual Dipolar Coupling(RDC)をそれぞれについて測定し、N末端とC末端の相対配置の決定を試みた。2次構造予測、chemical shift perturbationの結果からこれらの領域は固い構造をとっていてヌクレオチドに対する影響もない部分である。RDCはN末端ドメインで65個、C末端ドメインで40個観測された。βモノマーのみの構造は報告されていないためα_3β_3の結晶構造からβサブユニット部分を使って計算値を求めた。観測されたRDCを全て使って実測値と計算値をフィットさせた場合両者に良い一致が見られなかった。これは計算値に正確なモノマーβの構造を使っていないことによるものと考えられる。よって2次構造をとっている領域のみでフィットを行った。その結果、比較的良い一致がみられ、それから求めたN末端とC末端の相対配置はADPがある場合ではopen、ない場合ではclosedに近い結果が得られた。以上よりβサブユニットはモノマーのみでもα_3β_3γ複合体で見られたようなopenからclosedへの構造変化を起こすことが示唆された。このことからリガンド結合によって引き起こされるβサブユニットの構造変化はF_1の回転の駆動力になりうることが示唆された。さらに、H^+-TP合成酵素の膜に埋まっている部分であるF_0ドメインを構成するcサブユニットの^<13>C,^<15>N均一標識試料を得て、有機溶媒中および固体での構造解析を進めている。前者については溶液NMRを用い、後者については固体NMRを用いている。前者は既に構造が見え始めており、後者については既に開発した一連の固体NMR技術を用いて、固体サブユニットcの^<13>Cと^<15>Nシグナルの帰属を進めている。

プロトンATP合成酵素は触媒部位を持つ膜表在性のF_1ドメイン(α_3β_3γδε)と、プロトンチャンネルを形成する膜内在性のF_0ドメイン(ab_2c_<10-14>)から構成され、サブユニットcは1014個集まってドーナツ状のリングを形成している。F_0の中をプロトンが流れるとcリングが回転しATP合成を行う。われわれは熱安定性が高く、生体内でcリングが10個のサブユニットcから構成されていることが唯一明らかにされている好熱菌のサブユニットc(以下、TF_0c)を有機溶媒中に可溶化し、多核・多次元NMRにより構造を決定した。主鎖の重原子のrmsdは0.30Åであった。TF_0cは大腸菌由来のEF_0cと似たようなヘリックス-ループ-ヘリックスの構造をとっていた。しかし、プロトン透過に必須な酸性残基(TF_0cはGlu56、EF_0cではAsp61)の側鎖の向きが二つの構造では異なっていた。さらに、大腸菌の場合と異なり、TF_0cGlu56のカルボキシル基(プロトン移動に必須)のプロトン解離によるcサブユニットの構造変化は見られなかった。したがって、EF_0cの構造変化をもとに提案されている現在のプロトン移動機構に疑問符が付いた。われわれはさらに、得られた構造とmultiple energy minimaの存在、Na^+-ATPaseのcリングの結晶構造を総合することにより、cリングの新しい回転機構、sidechain flipping modelを提案した。このモデルではGlu56側鎖のprotonation/deprotonationに連動してGlu56側鎖が向きを変え、サブユニットaとプロトンの受け渡しが可能になる。これは今まで提案されていたサブユニットcの大きな構造変化を伴うモデルより、エネルギー的な観点から見ても合理的なモデルである。さらに、本年度は脂質膜に結合したシトクロムC_3が引き起こす電子移動のメカニズムを明らかにした。プロトンATP合成酵素は触媒部位を持つ膜表在性のF_1ドメイン(α_3β_3γδε)と、プロトンチャンネルを形成する膜内在性のF_oドメイン(ab_2c_<10-14>)から構成され、サブユニットcは1014個集まってドーナツ状のリングを形成している。F_oの中をプロトンが流れるとcリングが回転しATP合成を行う。われわれは好熱菌のサブユニットcの構造に関する考察とNa^+-ATPaseのcリングの結晶構造を総合することにより、cリングの新しい回転機構、sidechain flipping modelを提案した。サブユニットcリングは膜中に存在するので上記のモデルを確かめるためには固体NMRによる解析を行う必要がある。その第一歩として、大腸菌サブユニットc固体の固体高分解能多次元NMRによる解析を行った。試料はメタノールから沈殿させてつくった。今までに開発した多次元多核高分解能固体NMR測定法を用いて、約70%のシグナルの帰属に成功した。帰属シグナルの化学シフトを基に2次構造予測を行ったところ、有機溶媒中と同じようなヘアピン構造を取っていると推定された。したがって、サブユニットcのヘアピン構造は非常に安定なものであることが分かる。
地表地震断層に対する埋設ライフラインの耐震性向上に関する研究

1999年トルコ・コジャエリ地震および台湾・集々地震は,地表地震断層に対する構造物の耐震性照査の重要性を示した.本研究では,逆断層変位に対する埋設管の耐震性に関する基礎的知見を得ることを目的として,砂層中に埋設管を設置した遠心載荷場での模型実験およびそれを再現する数値解析を行った.遠心載荷場の実験により断層変位による埋設管の変形特性を明らかにし,実験結果をもとに断層の大変位に対する埋設管路の数値解析モデルを構築した.断層変位による埋設管の変形挙動を数値解析で予測する手法について検討した.バイリニア型の地盤復元力特性を考慮した梁-地盤モデルによる数値解析は実験による結果を良好な精度でシミュレーションすることが可能であることを示した.実験では,逆断層変位の増加によって模型管に生じるひずみを測定し,その曲げ成分を主に検討した.模型管は,周辺地盤による拘束力と管の材料特性に影響を受けた変形挙動を示した.管の曲げ剛性に比べて地盤の拘束力が小さい場合,周辺地盤は降伏し,断層変位が増加するにつれて管の曲げひずみのピーク値はほぼ一定の値に収束する.一方,管の曲げ剛性に比べ周辺地盤の拘束力が大きい場合,管は拘束され局部的に大きな変形挙動を示した.次に,数値解析においては,埋設管を弾塑性梁要素,地盤を管軸および管軸直交方向のばね要素でモデル化した.ここで管軸直交方向の地盤ばねは,実験結果に従い上下方向で挙動が異なる非対称非線形としている.解析結果および実験結果の曲げひずみを比較した場合,解析結果のピーク値が若干大きく評価されるものの,分布傾向はよく一致した.しかし管軸直交方向の地盤反力を比較すると,解析結果は管軸上方向の地盤反力は制度良く評価しているものの,管軸下方向の地盤反力を過大に評価する結果となった.逆断層変位に対する埋設管の耐震性に関する基礎的知見を得ることを目的として,重力場及び遠心載荷場での土槽の中にパイプを設置して模型実験を行った.そして、縦ずれ断層の影響を受ける埋設管の挙動を把握するための有効な手段として活用されている数値解析手法の妥当性についての検討を行った.まず、予備実験として重力場での土槽の中に長さ1.5m,外径10mm,肉厚0.5mmのステンレス管を底盤からの高さを15cm,25cmの位置に設置し,土槽の可動部を45°方向に持ち上げ、逆断層変位による管に生じるひずみを測定した.その実験結果より逆断層の模型実験において,地盤の応答変位および土被りが埋設管に影響を及ぼす要因であることがわかった.次に,遠心載荷場での実験でも,重力場と同様のように逆断層変位の上昇によって模型管に生じるひずみを測定し,その曲げ成分を主に検討した.模型管は,周辺地盤による拘束力と管の材料特性に影響を受けた変形挙動を示した.管の曲げ剛性に比べて地盤の拘束力が小さい場合,周辺地盤は降伏し,断層変位が上昇するにつれて管の曲げひずみのピーク値はほぼ一定の値に収束する.また,管は全体的に緩やかな変形挙動を示した.一方,管の曲げ剛性に比べ,周辺地盤の拘束力が大きい場合,管は拘束され,局部的に大きな変形挙動を示した.数値解析においては,埋設管を弾塑性梁要素,地盤を管軸および管軸直交方向のばね要素でモデル化した.ここで,管軸直交方向の地盤ばねは,実験結果に従い上下方向で挙動が異なる非対称非線形型としている.解析結果および実験結果の曲げひずみを比較した場合,解析結果のピーク値が若干大きく評価されるものの分布傾向はよく一致した.しかし,管軸直交方向の地盤属力を比較すると,解析結果は管軸上方向の地盤反力は精度良く評価しているものの,管軸下方向の地盤反力を過大に評価する結果となった.1999年トルコ・コジャエリ地震および台湾・集々地震は,地表地震断層に対する構造物の耐震性照査の重要性を示した.本研究では,逆断層変位に対する埋設管の耐震性に関する基礎的知見を得ることを目的として,砂層中に埋設管を設置した遠心載荷場での模型実験およびそれを再現する数値解析を行った.遠心載荷場の実験により断層変位による埋設管の変形特性を明らかにし,実験結果をもとに断層の大変位に対する埋設管路の数値解析モデルを構築した.断層変位による埋設管の変形挙動を数値解析で予測する手法について検討した.バイリニア型の地盤復元力特性を考慮した梁-地盤モデルによる数値解析は実験による結果を良好な精度でシミュレーションすることが可能であることを示した.実験では,逆断層変位の増加によって模型管に生じるひずみを測定し,その曲げ成分を主に検討した.模型管は,周辺地盤による拘束力と管の材料特性に影響を受けた変形挙動を示した.管の曲げ剛性に比べて地盤の拘束力が小さい場合,周辺地盤は降伏し,断層変位が増加するにつれて管の曲げひずみのピーク値はほぼ一定の値に収束する.一方,管の曲げ剛性に比べ周辺地盤の拘束力が大きい場合,管は拘束され局部的に大きな変形挙動を示した.次に,数値解析においては,埋設管を弾塑性梁要素,地盤を管軸および管軸直交方向のばね要素でモデル化した.ここで管軸直交方向の地盤ばねは,実験結果に従い上下方向で挙動が異なる非対称非線形としている.解析結果および実験結果の曲げひずみを比較した場合,解析結果のピーク値が若干大きく評価されるものの,分布傾向はよく一致した.

しかし管軸直交方向の地盤反力を比較すると,解析結果は管軸上方向の地盤反力は制度良く評価しているものの,管軸下方向の地盤反力を過大に評価する結果となった.
マイナス鎖RNAウイルスの自然免疫回避戦略におけるヌクレオカプシド蛋白質の役割

狂犬病ウイルスは、ヌクレオカプシド(N)蛋白質の機能により、宿主細胞のウイルスRNAセンサーであるRIG-Iの活性化を回避し、I型インターフェロンの産生を抑制している。本研究では、この現象の詳細な分子機序の解明を目的とした。その結果、N蛋白質の273及び3944位のアミノ酸がRIG-I活性化回避に重要であることを示した。また、RIG-I標的分子である可能性が指摘されている欠損干渉RNAの分子構造を明らかにし、その定量のための基盤を確立した。弱毒の狂犬病ウイルスNi-CE株と比較した場合、強毒のキメラウイルスCE(NiN)株は、RIG-I活性化を回避する性質を持つ。両株はN遺伝子を除く全ゲノム領域が同一であることから、N蛋白質がRIG-I活性化回避能を決定することがわかっている。この分子機序を解明することが本研究の目的である。H22年度は、Ni-CE株を用いて、マイナス鎖RNAウイルス感染細胞におけるRIG-I標的RNAを同定することを計画していた。しかし、最近の研究の進展により、様々なウイルスのゲノムRNAならびに複製干渉RNAの両者がRIG-Iにより認識されることが明らかとなった。そこで計画を修正し、次年度に計画されていた狂犬病ウイルスN蛋白質によるRIG-I活性化回避の分子機序の解明を実施した。リアルタイムRT-PCRを用いて、Ni-CE株及びCE(NiN)株感染細胞の間で、RIG-Iの標的となるゲノムRNAの量を比較した結果、両者に有意な差は認められなかった(Masatani et al., J.Virol., 2010)。また、RIG-I活性化に重要な2本鎖構造を持つRNA(dsRNA)を免疫染色により検出した結果、両株感染細胞の間でシグナル強度及び分布に顕著な違いは認められなかった。さらに、両株感染細胞から抽出された総RNAを培養神経細胞に導入した結果、Ni-CE株由来のRNAよりも、むしろCE(NiN)株由来RNAのほうが強くインターフェロンβ・プロモーターの活性を上昇させることがわかった。以上の成績より、Ni-CE株及びCE(NiN)株のRIG-I活性化回避能の違いには、RIG-I標的RNAの量ではなく、その構造が関与することが強く示唆された。本年度は、狂犬病ウイルスN蛋白質によるRIG-Iの活性化回避に、同蛋白質273及び394位のアミノ酸が重要であることを明らかにすることができた(Masatani et al., Virus Res.,2011)。この成績は、ヌクレオカプシド蛋白質による自然免疫回避の機序解明に重要な知見となる。強毒の狂犬病ウイルス固定毒の西ヶ原株は、その派生株で弱毒のNi-CE株と比較した場合、宿主細胞のウイルスRNAセンサー分子であるRIG-Iの活性化を効率的に回避し、I型インターフェロンの産生を抑制する。西ヶ原株N遺伝子をNi-CE株のゲノムに持つキメラウイルスCE(NiN)株がNi-CE株よりも効率よくRIG-Iの活性化を回避することから、西ヶ原株とNi-CE株のRIG-I活性化回避能の違いにN蛋白質が関与することが明らかとなっている。本研究の目的は、この機序を解明することである。最近の研究の進展により、様々なウイルスのゲノムRNA及び複製干渉RNA(DI RNA)がRIG-Iにより認識されることが示唆されている。この知見より、西ヶ原株N蛋白質は、これらのRNAの産生を抑制することによりRIG-I活性化の回避に関与している仮説が考えられた。最初に、Ni-CE株及びCE(NiN)株感染細胞におけるDI RNA産生量の比較実験を計画した。しかし、狂犬病ウイルスの複製干渉RNAの分子構造についてはほとんど報告がなく、この情報不足によりDI RNAの定量システムの構築が困難な状況にあった。そこでまず、Ni-CE株及びCE(NiN)株感染細胞に存在するDI RNAの分子構造の決定を行った。その結果、それぞれの感染細胞に13031461塩基及び12001305塩基からなる種々の長さのDI RNAが存在することが分った。これらの分子構造は、基本的に「3'ゲノム末端配列-N遺伝子(部分)-[L遺伝子(部分)クローンによっては存在しない]-5'ゲノム末端配列」であった。以上より、狂犬病ウイルス感染細胞中のDI RNA定量法を確立するために必要な基盤情報が得られた。上記の仮説とは別に、ゲノムRNAのカプシド化効率の違いがNi-CE株及びCE(NiN)株のRIG-I活性化回避能の相違に関与する可能性が考えられた。そこで、抗N蛋白質抗体で免疫沈降されたヌクレオカプシド中のゲノムRNA量をNi-CE株及びCE(NiN)株感染細胞間で比較した。その結果、両者の間に有為な差は認められなかった。
培養細胞シートとナノコーティングスキャホールドによる歯周組織再生

本研究では、(1)培養骨髄細胞シート作製方法の確立、(2)培養細胞シート、成長因子FGF-2およびコラーゲンスキャホールドの併用による骨増生の有効性について検討を行った。その結果、(1)F344/Jclラット大腿骨から採取した骨髄細胞を用いて多層の骨髄細胞シートを作製できた。また培養期間を延長することでシートの強度が増加した。(2)ラット頭蓋骨に培養骨髄細胞シートとFGF-2およびコラーゲンスキャホールドを用いることで大量の新生骨が認められた。本年度は、最初に昨年度に引き続き培養細胞シートの作製を行った。まずF344/Jclラットの大腿骨骨髄を用いた骨髄細胞シートの作製方法を改善し、効果的な細胞シートの確立に努めた。具体的には5週齢のラットの大腿骨を摘出し、骨髄を採取し、骨髄由来の付着性細胞を10%FBS、1%抗生物質添加αMEMにて培養した。7日後に継代し、1つのフラスコを前述の培地にアスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンを添加させたものに変更した。その後、2、3日置きに積層し、培養14日後にトリプシン-EDTAで処理しディッシュから剥離し、細胞シートを完成させた。次にこの細胞シートを剥離し、コラーゲンスポンジ上に設置後、12週齢F344/Jclラット頭蓋骨に骨窩洞を形成後、埋植し、骨新生状態についての組織学的な評価を行った。H-E染色を用いた組織学的評価から以下の結果を得ることができた。1埋植物周囲には炎症は認められず、生体親和性が良好であることが示唆された。24週後においては埋植物の残存はみられず、吸収性に優れていることが明らかになった。3成長因子FGFを併用した場合が、コラーゲン単体またはコラーゲンと細胞シートのみを併用したものよりも骨新生が起こることが明らかになった。これは従来行われてきた細胞シートを用いた再生療法よりも簡便かつ短期間で行える方法であり、臨床レベルにおいても比較的実現の可能性が高い方法と言える。最終年度は、前年度までと同様に引き続き至適培養細胞シートの作製を試みた。その際、培養期間を延長させると剥離が容易に行える可能性が示唆されたため、培養期間を14日以外に21日、28日も設定し、細胞シートの性状について検討を行った。その結果、培養期間を28日にまで延長させるとシートの形状は安定するが、生細胞が減少する傾向が認められ、培養期間21日が適切な期間であることが示唆された。研究期間全体を通じては本方法で作製した細胞シートをコラーゲンスポンジ上に設置後、12週齢F344/Jclラット頭蓋骨に骨窩洞を形成後、埋植し、骨新生状態について組織学的な評価を行ったところ、以下の結果を得ることができた。3成長因子FGF-2を併用した場合は、コラーゲン単体またはコラーゲンと細胞シートのみを併用したものよりも骨新生が起こることが示唆された。本年度は、最初にF344ラットの大腿骨骨髄を用いた細胞シート作製方法を確立させた。具体的にはラットの大腿骨を摘出し、骨髄を採取。骨髄由来の付着性細胞を10%FBS、1%抗生物質添加MEMにて培養。その後ディッシュに播種してさらに培養を行い、7、9、11日目に追加播種することで多層骨髄細胞シートを作製した。7日目に追加播種してからは培地を10%FBS、1%抗生物質添加MEMにアスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンを添加させたものに変更。培養14日後にトリプシン-EDTAで処理しディッシュから剥離し細胞シート完成させた。この細胞シートは作製期間が短く、特別な設備を必要としない簡便な方法で汎用性が高いと考えられる。次にこの細胞シートをコラーゲンスポンジに付着させ、ラット頭蓋骨骨窩洞部に埋植した際の骨再生について検討を行った。

その結果、細胞シートにコラーゲンスポンジを付着させた場合はコラーゲンスポンジ単体よりも多くの骨形成がみられたが、成長因子FGFを添加することで更に多くの骨形成が確認され、骨再生療法としての有効性が示唆された。本年度はビーグル犬を用いた実験的歯周炎モデルに対して、本細胞シートを用いた新規歯周組織再生療法を用いてその有効性を評価する予定であったが、適切な細胞シートの作製およびスキャホールドへの設置方法の確立に時間を要したため、目標よりは達成度は遅れている。本年度は、ラット骨髄を用いた細胞シート作製方法の確立が目標の一つであったため、その点については達成できたと考える。ただし、論文作成までには至らなかった点ではやや送れている。次年度以降は新規スキャホールド(β-TCPナノコーティングコラーゲンスポンジ)に使用した際の有効性をビーグル犬を用いて評価していく予定である。また細胞シートはスキャホールド上で直接培養し、作製した場合、より簡便かつ確実になる可能性が昨年度の研究から示唆されたため、その方法についてもラットで検討を行う。初年度は、細胞シートの作製方法は確立し、コラーゲンスポンジとFGFを併用した場合の骨再生量をラット頭蓋骨を用いて評価することができた。次年度以降は、さらに新規スキャホールド(β-TCPコーティングコラーゲンスポンジ)に使用した際の有効性をラットおよびビーグル犬を用いて評価していく予定である。その際、ラットでは、細胞シートの付着方法、至適濃度・細胞数を評価し、その結果を元にビーグル犬の実験的歯周炎モデルに使用し、歯周組織再生量を評価していく。本年度も昨年度に引き続き既存の実験動物、実験試料、試薬を使用することができたため、研究費を抑えることができた。さらに他の助成金も獲得できたため、国際学会参加費を抑えることができた。その繰り越し金と合わせて本年度は比較的高価なビーグル犬を用いた動物実験を進める予定である。また得られた知見は国際学会での発表および英文論文誌に投稿を予定しているため、学会参加費、投稿料、英文校正料などにも使用する。初年度は既存の実験動物、実験試料を使用することができたため研究費を抑えることができた。次年度以降は、新規スキャホールドの開発、ラットおよびビーグル犬を用いた組織化学的評価に研究費を使用する予定である。また得られた知見は国際学会および英文論文誌に投稿を予定しているため、学会参加費、投稿料、英文校正料などにも使用する。
知能システム用汎用アナログ機能回路の開発

ファジィ演算,ニューロン演算,それに離散時間カオスの1次元写像演算には,積和演算,区分線形関数演算,MAX・MIN演算などの要素演算の組み合わせで構成できるものが多い.この着想のもとに,BiCMOS乗除算器やCMOSトランスコンダクタ回路をアレイ状に配置し,それらやMOSキャパシタとの間をパストランジスタもしくは乗算器を介した配線で接続し,パスの切り替えあるいは教師付き学習によりユーザがプログラムできる,知能システム用汎用アナログ回路のアーキテクチャの提案とその要素回路の構成を行った.以下に本研究の結果の要点を示す.1.電流モードBiCMOSアナログ乗除算器を設計し,0.8μmプロセスを仮定したSPICEシミュレーションをとおして,1.5Vの電源電圧のもと,フルスケール誤差0.5%以下,線形誤差0.4%以下,消費電力40μW以下,-3dB遮断周波数10MHz以上の特性が得られることを明らかにした.2.0.8μmED-CMOSプロセスを仮定して,電源電圧1.5Vで動作する電流モード完全差動形積分器を構成し,HSPICEによるシミュレーションをとおして,50程度のQと10MHz程度の単位利得周波数が実現可能なことを明らかにした.3.区分線形関数を教師付き学習によって内挿する電流モード回路を構成し,回路シミュレーションおよび試作したブロック回路ごとの実験によって基本回路特性を確認できた.4.アナログ機能回路アレイの配線接続制御用ディジタル回路を,ハードウェア記述言語Verilog-HDLを用いてFPGAとして設計し,機能検証を行った.ファジィ演算,ニューロン演算,それに離散時間カオスの1次元写像演算には,積和演算,区分線形関数演算,MAX・MIN演算などの要素演算の組み合わせで構成できるものが多い.この着想のもとに,BiCMOS乗除算器やCMOSトランスコンダクタ回路をアレイ状に配置し,それらやMOSキャパシタとの間をパストランジスタもしくは乗算器を介した配線で接続し,パスの切り替えあるいは教師付き学習によりユーザがプログラムできる,知能システム用汎用アナログ回路のアーキテクチャの提案とその要素回路の構成を行った.以下に本研究の結果の要点を示す.1.電流モードBiCMOSアナログ乗除算器を設計し,0.8μmプロセスを仮定したSPICEシミュレーションをとおして,1.5Vの電源電圧のもと,フルスケール誤差0.5%以下,線形誤差0.4%以下,消費電力40μW以下,-3dB遮断周波数10MHz以上の特性が得られることを明らかにした.2.0.8μmED-CMOSプロセスを仮定して,電源電圧1.5Vで動作する電流モード完全差動形積分器を構成し,HSPICEによるシミュレーションをとおして,50程度のQと10MHz程度の単位利得周波数が実現可能なことを明らかにした.3.区分線形関数を教師付き学習によって内挿する電流モード回路を構成し,回路シミュレーションおよび試作したブロック回路ごとの実験によって基本回路特性を確認できた.4.アナログ機能回路アレイの配線接続制御用ディジタル回路を,ハードウェア記述言語Verilog-HDLを用いてFPGAとして設計し,機能検証を行った.
巨大深発地震のslow precursorの検出

本研究の目的である深発地震の相転移によるslow presursorが本当に存在するのなら、350-1000秒の非常に長い周期の地震波(地球の自由振動)を解析することにより、原理的に検出可能であることがわかり、現在論文を執筆中である。また、解析に耐えうる精度のよい記録の存在する2つの地震(1982年6月22日、1984年3月6日)について、現在解析中である。予備的な解析によると今のところそのようなprecursorの存在は確認できていない。実際のデータ解析に当たって、深発地震の起きているマントルの遷移層(深さ400-1000km)の性質を調べる必要が起こってきた。日本全国の微小地震観測網(いわゆるJ-array)のデータを使い、大量のデータの重ね合わせ(stacking)で調べたところ、トンガ地域の遷移層について、次の2つの重要な結果が得られた:(1)920kmの深さに全く新しい地震波速度の不連続面が存在する。(2)いわゆる660km不連続面は沈み込んでいるスラブの影響を受け、沈み込み帯では数十キロメートル深くなっている。この二つの結果は全く新しいものであり、マントルのダイナミクスを考える上で大変重要になってくるはずである。本研究の目的にとっても、これらの結果を考慮した地球モデルを構築してから解析を行わなければならないので、最終的な結論が出るにはもう少し時間がかかる。上記の二つの発見については現在論文を準備中である。
酵素触媒重合法による新規バイオベースエラストマーの創成

発酵法により得られるヒドロキシ酸、植物由来のリシノール酸やその還元体である12-ヒドロキシステアリン酸(12HS)などをモノマーを用い、以下に記載した新規バイオベースエラストマーの創製を行った。1生分解性とケミカルリサイクル性を有する、熱可塑性(無架橋型)ポリエステル型エラストマーの酵素合成12HSと大員環ラクトンとの酵素触媒重合により分子量20万程度の新規ポリエステル型熱可塑性エラストマーを合成した。エラストマー物性はソフトセグメントとしての12HSとハードセグメントとしてのラクトンとの比率を変えることで、任意に変えられた。2バイオベース原料を用いる新規ポリエステル型エラストマーの酵素合成リシノール酸にリパーゼ存在下、過酸化水素水を作用させエポキシリシノール酸を合成し、ついで酵素触媒重合により分子量2030万のポリエポキシリシノール酸を得た。これに無水マレイン酸を用いて熱架橋させることによりエラストマーを得、さらに物性の評価を行った。3架橋・解架橋可能なチオール含有ポリエステル型エラストマーの創成酵素触媒を用いたチオール含有ポリエステルの合成とその架橋化について、系統的な研究を行った。さらに、架橋・解架橋反応及び物性評価を行った。合成は遊離チオールをペンダントに有するメルカプトコハク酸を用い、これと一連のジオール類との酵素触媒重合によりポリエステル化を行った。得られた遊離チオールを含有するポリエステルは空気酸化によりジスルフィド型架橋を形成しエラストマーが得られた。また、架橋体はトリフェニルボスフィンによる還元により速やかに解架橋された。さらにポリエステルはリパーゼにより再重合性を有する環状オリゴマーに変換でき、ケミカルリサイクル性を有することが確認された。架橋体の物性評価より、ハロアルカンに対して高吸収性を有することが見出された。本研究では、グリーンポリマー原料としてω-ヒドロキシ酸や12-ヒドロキシステアリン酸(12HS)などバイオベースモノマーを用い、新規熱可塑性(無架橋型)ポリエステル型エラストマーの創製を行った。また、バイオベース原料を用い、ポリエステル鎖に遊離のチオールを有し、特定条件において架橋・解架橋可能な新規ポリエステル型エラストマーの酵素触媒重合法による創成を図った。(1)熱可塑性グリーンポリエステル型エラストマーの創製12HSと長鎖ω-ヒドロキシアルカン酸及びその環状体であるマクロリドとの酵素触媒共重合により、一連の新規ポリエステル型熱可塑性エラストマーを合成した。12HSと各種マクロリドを、固定化リパーゼを触媒として共重合を行い、分子量1429万のランダム性の高いコポリマーを得た。DSC測定および薄膜X線回折により、12HS含量の増加に伴う融点および結晶化度の低下が確認された。コポリマー中の12HS含量の増加に伴い、ヤング率および最大応力が低下する一方、破断点伸びは増大し、エラストマー特性を示した。これらは、12HS含量が多いものほど迅速に生分解されることが見出された。(2)架橋・解架橋可能なチオール含有グリーンポリエステル型エラストマーの創成側鎖チオール含有ポリエステルの合成、架橋および解架橋について検討を行い、さらに架橋フィルムの機械特性および溶媒吸収能について評価を行った。具体的には、アルカンジオール及び2-メルカプトコハク酸ジメチルをリパーゼ触媒により、直接重縮合することで、分子量3万程度の一連の遊離チオール含有ポリエステルを得た。ついで室温で空気酸化することで、架橋ポリマーを得た。引っ張り試験の結果、エラストマー様の挙動を示すことが認められた。また、このものは、トリブチルホスフィンにより解架橋し、元のものと同等のポリマーが生成した。
細胞膜電位活動の光学的リアルタイム多チャンネル測定システム

神経系における情報は活動電位として伝えられ,筋細胞における収縮は細胞膜に発生する電気的興奮すなわち活動電位と関連して発生する.このような活動電位は,通常,先端の直径0.05μm以下の尖ったガラス微小電極を細胞に刺入して測定される.しかしながら,この方法では,細胞が電極の刺入に耐えるほど大きいことが必要であり,また多数個の細胞,あるいは多数ヶ所の部位から活動電位を同時記録するということは技術的にほとんど不可能である.そこで本研究はこのような,従来の電気生理学的方法の適用限界を補いうる方法として,活動電位を光学的に多領域から同時測定するシステム開発を目的としてなされた.本年度は特に分解能の向上についての検討を行った.この測定方法の実際の測定に当たって適用面における限界と困難性として,現在,われわれが直面している問題点は三次元分解能である.この困難性を克服するためには新しい方法の開発が必要である.もう一つは二次元分解能(spatial resolution)である.これに関しては,高倍率かつ閉口数のできるだけ大きい水浸レンズを用いて分解能の向上を図った.この場合,問題となったのは,倍率を上げるにしたがって背景光の強度が小さくなるため, S/N比が小さくなることである.これに対しては,加算平均などの方法を試みることにより,一個のディテクター当り5.2×5.2μm_2の領域から活動電位を検出するところまで,分解能を上げることに成功した.顕微鏡の倍率を変えたときS/N比と背景光強度の平方根の間に直線関係が得られたことから,われわれの測定装置で,雑音は殆どショットノイズのレベルに近くなっていると考えられる.神経系における情報は活動電位として伝えられ,筋細胞における収縮は細胞膜に発生する電気的興奮すなわち活動電位と関連して発生する.このような活動電位は,通常,先端の直径0.05μm以下の尖ったガラス微小電極を細胞に刺入して測定される.しかしながら,この方法では,細胞が電極の刺入に耐えるほど大きいことが必要であり,また多数個の細胞,あるいは多数ヶ所の部位から活動電位を同時記録するということは技術的にほとんど不可能である.そこで本研究はこのような,従来の電気生理学的方法の適用限界を補いうる方法として,活動電位を光学的に多領域から同時測定するシステム開発を目的としてなされた.本年度は特に分解能の向上についての検討を行った.この測定方法の実際の測定に当たって適用面における限界と困難性として,現在,われわれが直面している問題点は三次元分解能である.この困難性を克服するためには新しい方法の開発が必要である.もう一つは二次元分解能(spatial resolution)である.これに関しては,高倍率かつ閉口数のできるだけ大きい水浸レンズを用いて分解能の向上を図った.この場合,問題となったのは,倍率を上げるにしたがって背景光の強度が小さくなるため, S/N比が小さくなることである.これに対しては,加算平均などの方法を試みることにより,一個のディテクター当り5.2×5.2μm_2の領域から活動電位を検出するところまで,分解能を上げることに成功した.顕微鏡の倍率を変えたときS/N比と背景光強度の平方根の間に直線関係が得られたことから,われわれの測定装置で,雑音は殆どショットノイズのレベルに近くなっていると考えられる.
カーボンチューブ及び高次フラーレンの電子物性

平成6年度は以下の研究実績を得た。1.カーボンチューブの軸に垂直方向に磁場をかけた場合に、エネルギーバンドに2種類の振動の構造があることがわかった。このうち磁場の関数として小さな振動は波数空間でエネルギーバンドがずれる効果によるもので、金属・半導体転移をひきおこすことがわかった。また大きな振動は、エネルギーバンド巾を変更させるもので、これはカーボンチューブの螺旋構造と密接な関係があることがわかった。2.C_<60>固体中では261Kの温度で、固体中で分子の回転に起因した相転移現象がおこる。また、87Kでは分子回転が完全に凍結しガラス転移が起きることが知られている。この87Kでの転移とX線によって観測された2a_0の超周期構造を説明するために、モデルポテンシャルを用いて計算を行ない、準安定な構造において、2a_0の超周期構造がa_0の周期構造より安定であることを見い出した。3.C_<60>にLi原子を付加していった場合の安定構造及び電子状態を半経験的分子軌道計算法を用いて計算した。この結果、Li原子はC_<60>表面上でお互いに接近しているほうが安定であること、またLiからC_<60>への電荷の移動量は3以上は移動しないことがわかった。4.C_<60>の生成初期構造である、環状及び鎖状構造の炭素クラスターの構造最適化と振動構造を半経験的分子軌道計算法を用いて計算した。この結果炭素数が24ぐらいで環状構造において1重3重結合から2重結合に変化することがわかった。また炭素数が16ぐらいで、最低の振動モードが0cm^<-1>に近付き、非常に軟らかな構造になることがわかった。
ニワトリの量的遺伝子座の染色体マッピング-我が国初の試み

大シャモ雄3羽と白色レグホーン雌9羽に基づく、ニワトリQTL解析用リソースファミリー(家系)を造成した。本家系は、総計2,930のF_2個体からなる大家系であり、必要に応じ、3つの中家系、9つの小家系に分割可能である。QTL解析の標的形質として、成長、産卵および卵、ならびに肉に関する各種形質を、計測・定量した。上記家系を用いて、マイクロサテライトDNAマーカーのタイピング結果および量的形質の計測・定量値に基づいてQTL解析を行った結果、成長関連形質のうちの20週齢脚長形質に関し、LODスコアーが22.2を示すhighly significant QTLを第1染色体上に検出した。また、産卵および卵に関する形質のうち、300日齢時卵重に関し、LODスコアーが4.4を越えるsignificant QTLsを、第1,2,3,5,7,12および28染色体上に検出した。さらに、300日齢時産卵率ならびに400日齢時産卵率に関し、やはりLODスコアーが4.4を越えるsignificant QTLsを、それぞれ、第1,2,3,4,7,9および28染色体上、ならびに第1,3,4,7,9および28染色体上に検出した。また、以上のQTL解析とは別に、600のマイクロサテライトDNAマーカーを我が国独自に開発し、上記家系を用いて、マーカー連鎖地図作製の可能性を検討した。この結果、265マーカー・27連鎖群からなる我が国独自のマーカー連鎖地図を作製し得た。この連鎖地図の遺伝距離は2,600cM、マーカー間の平均距離は9.8cMであった。現在、この地図と上記家系を用いて、上でQTLsが発見された形質以外の多くの形質についても、QTL解析を順次遂行中である。量的遺伝子の解明のためには、その解析用家系(親、F_1、F_2の1セット)が必要であるが、本研究では、大シャモと白色レグホーンに基づく家系造成が順調に進んだ。例えば、8週齢体重形質に関しては約3,000のF_2個体(データ)を得た。また、QTL解析用のDNAマーカーとして、マイクロサテライトマーカーを、新たに約500開発できた。QTL解析を能率良く行うためには、家系の両親品種がもつ形質が異なっていることが望ましい。そこで、大シャモ、白色レグホーンおよびそのF_1世代につき、それぞれの形質ならびにその遺伝性を調査した結果、本家系は、QTL解析のために有効に活用できる家系であると考えられた。調査項目は、成長関連形質では、体重と脚長、卵関連形質では、産卵率と卵形状(卵重、卵長径、卵短径、卵殻強度、卵殻厚、卵殻重、卵殻色、卵白重、濃厚卵白高、濃厚卵白長径、濃厚卵白短径、卵黄重、卵黄高、卵黄径、卵黄色)、肉関連形質では、肉のアミノ酸含量(グルタミン酸をはじめ20種)、肉のpH、肉色(L値、a値、b値)、および剪断力価であった。3種の形質ともほとんど全ての項目について、大シャモと白色レグホーンの間には顕著な差がみられた。また、F_1世代は、項目により、両親品種の中間的な値、もしくは、両親のいずれかに近い値を示した。この結果から、ニワトリの量的形質に関するQTL解析は、将来、能率的に遂行できると考えられた。また、F_1世代が中間的な値を示した項目については、その複数の支配遺伝子は、形質発現に関し同等な効果をもつものであると考えられ、一方、F_1世代が両親のどちらかに近い値を示した項目については、その複数の支配遺伝子の中に、形質発現に関し特に大きな効果をもつものが1つ含まれていると推測された。

現在、この地図と上記家系を用いて、上でQTLsが発見された形質以外の多くの形質についても、QTL解析を順次遂行中である。量的遺伝子の解明のためには、その解析用家系(親、F_1、F_2の1セット)が必要であるが、本研究では、大シャモと白色レグホーンに基づく家系造成が順調に進んだ。例えば、昨年度の8週齢体重形質に関する約3,000のF_2個体に加え、他の週齢についても、それぞれ約500-3000のF_2個体を準備できた。また、卵関連形質を調査するための約400のF_2個体も準備できえ。QTL解析用のDNAマーカーとして、マイクロサテライトマーカーを、昨年の500に引き続き、約500新たに開発した。さらに、これらのマーカーのうち135マーカー、ならぴに177のF_2個体を用いて、マーカーマッピングを行った。これにより、初義的ではあるが、21の染色体がカバーできた。QTL解析を能率良く行うためには、家系の両親品種がもつ形質が異なっていることが望ましい。昨年度は、大シャモ、白色レグホーンおよびそのF_1世代につき、それぞれの形質ならぴにその遺伝性を調査して、本家系は、QTL解析のために有効に活用できる家系であると推測できたが、本年度は、実際にF_2世代の各形質を計測し、その分散を算出した。調査項目は、成長関連形質では、体重と脚長、卵関連形質では、産卵率と卵形状(卵重、卵長径、卵短径、卵殻強度、卵殻厚、卵殻重、卵殻色、卵白重、濃厚卵白高、濃厚卵白長径、濃厚卵白短径、卵黄重、卵黄高、卵黄径、卵黄色)、肉関連形質では、肉のアミノ酸含量(グルタミン酸をはじめ20種)、肉のpH、肉色(L値、a値、b値)、および剪断力価であった。3種の形質ともほとんど全ての項目について、F_2世代は大きな分散を示した。この結果から、ニワトリの量的形質に関するQTL解析は、将来、能率的に遂行できると考えられた大シャモ雄3羽と白色レグホーン雌9羽に基づく、ニワトリQTL解析用家系を造成した。本家系は、総計3,000のF_2個体からなる大家系であり、必要に応じ、3つの中家系、9つの小家系に分割可能である。QTL解析の標的形質として、成長、産卵および卵、ならびに肉に関する各種形質を、計測・定量した。上記家系に基づき、マイクロサテライトDNAマーカ一のタイピング結果および量的形質の計測・定量値を用いてQTL解析を行った結果、成長関連形質のうちの20週齢脚長形質に関し、LODスコアーが22.2を示すhighly significant QTLを第1染色体上に検出した。また、産卵および卵に関する形質のうち、300日齢時卵重に関し、LODスコアーが4.4を越えるsignificant QTLsを、第1,2,3,5,7,12および28染色体上に検出した。さらに、300日齢時産卵率ならびに400日齢時産卵率に関し、やはりLODスコアーが4.4を越えるsignificant QTLsを、それぞれ、第1,2,3,4,7,9および28染色体上、ならびに第1,3,4,7,9および28染色体上に検出した。また、以上のQTL解析とは別に、600のマイクロサテライトDNAマーカーを我が国独自に開発し、上記家系を用いて、マーカー連鎖地図作製の可能性を検討した。この結果、265マーカー・27連鎖群からなる我が国独自のマーカー連鎖地図を作製し得た。この連鎖地図の遺伝距離は2,600cM、マーカー間の平均距離は9.8cMであった。