hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
房水流出路プロテオグリカン発現制御による緑内障遺伝子治療の開発

まずヒト及びウシの線維柱帯細胞を培養し、RT-PCR法にて線維柱帯細胞の産生するPGを同定した。この実験で、デコリン、ルミカン、フィブロモデュリンという三種類のPGの遺伝子発現が見られた。次に線維柱帯細胞に生理活性因子であるTGF-β2を加えて培養し、これら3種のPGの遺伝子発現量の変化を解析した。線維柱帯細胞においてデコリン、ルミカン、フィブロモデュリンがTGF-β2刺激によって発現が上昇した。また、ヒトの様々な病型の緑内障眼と白内障眼から房水標本を採取し、ELISA法にて房水中のTGF-β2濃度を測定した。房水中のTGF-β2濃度はPOAG眼において白内障眼より高かった。また、偽落屑症候群眼ではPOAG眼よりも房水中TGF-β2濃度が低く、緑内障の病型によって房水中TGF-β2濃度が異なることがわかった。さらに線維柱帯細胞にTGF-β2発現遺伝子を遺伝子導入させ、オートクリン、パラクリン的に線維柱帯細胞のPG産生を上昇させることにより、実験的開放隅角緑内障モデル眼作成を試みた。培養線維柱帯細胞及びサル眼の隅角における線維柱帯細胞にHVJリポソームを用い遺伝子導入を行い、効率よく遺伝子を導入できた。これらの結果は、遺伝子導入によって線維柱帯細胞のPG発現を制御し、新しい緑内障遺伝子治療開発の可能性を示唆している。以上の実験より、原発開放隅角緑内障の房水流出抵抗上昇メカニズムに房水中TGF-β2の異常上昇が線維柱帯細胞のPG産生上昇が関与している可能性と遺伝子治療による緑内障治療開発の可能性を示唆された。
患者由来ｉＰＳ細胞より疾患モデル細胞・動物作製と発症機序及び遺伝子治療評価系構築

グルコース-6-リン酸トランスポーター遺伝子変異による糖原病Ib型患者の好中球減少のメカニズムを明らかにするために、ヒト骨髄性白血病細胞HL-60細胞を用いて研究を行った。その結果、グルコースの濃度依存的に酸化ストレスが高くなるのが原因であることが明らかになった。そこで、糖原病Ib患者の線維芽細胞より樹立したiPS細胞を用いて検討した。患者由来iPS細胞より分化した肝細胞のグリコーゲン、ピルビン酸、乳酸、脂質含量は、健常人由来iPS細胞と比較して増加していた。また患者由来iPS細胞より分化した好中球は患者と同じ病態を示した。そこで、糖原病Ib患者の繊維芽細胞よりiPS細胞を樹立した。iPS細胞由来肝細胞内の解糖産物を定量した結果、グリコーゲン、ピルビン酸、乳酸、脂肪含量が健常人由来iPS細胞と比較して2-5倍増加していた。好中球分化後の細胞は、好中球表面マーカーCD13/16/45を発現し、貪食能を有していた。さらにGSDIb患者由来iPS細胞では健常人由来iPS細胞と比較して、活性酸素によるジヒドロエチジウムの酸化的発色が強まり、L-012との化学発光は2倍高値を示した。また、アポトーシス時に起こるphosphatidylserineの膜転移が認められ、caspase-3,9活性は2-3倍上昇した。糖原病Ib型(GSDIb; MIM232220)患者ではG6Pase系機能低下により、細胞内糖代謝系が異常亢進することが知られているが、本研究にて樹立されたiPS細胞由来肝細胞についても同様にglycogen、G6P、pyruvate、lactate、lipid、ureic acidの蓄積を認めた。さらにGSDIb患者iPS細胞由来肝細胞はglucagon負荷によるG6P代謝遅延及びG6Paseの持続的発現上昇、galactose負荷によりlactate蓄積上昇といったGSDIbにおける肝細胞の典型的な糖代謝応答を示した。これらの結果から樹立したGSDIb患者由来iPS細胞が患者自身の表現型を示しうるモデルとして妥当であることが示された。好中球への分化は血管内皮様細胞及び血液前駆細胞を誘導し、顆粒球コロニー刺激因子刺激にて好中球へ誘導する方法(iPS-sac法)を用いた。誘導によって得られた細胞を免疫染色したところ好中球表面抗原CD13、16、45の発現が認められたことから好中球に分化していることを確認した。GSDIb患者由来iPS細胞から分化誘導した好中球において、ホルボールエステル非存在下、アポトーシス亢進の指標となるO2-産生およびカスパーゼ活性亢進が確認された。これは健常人iPS細胞由来好中球ではほとんど認められず、GSDIb患者由来iPS細胞から分化誘導した好中球に固有のものであった。また、GSDIb患者iPS細胞由来好中球は、健常人と比較し、酸化ストレスの上昇が認められた。酸化ストレス及びアポトーシスの上昇は抗酸化剤投与によって軽減されたことからGSDIbにおける好中球減少症の治療として抗酸化剤投与が有効であることが示唆された。HL-60細胞をDMSO処理により好中球に分化し、G6PT阻害薬を用いることで糖原病Ib型患者モデルを構築し、酸化的ストレスが高くなるのを明らかにした。そこで、糖原病Ib型患者由来の線維芽細胞よりiPS細胞を樹立、その細胞より分化誘導した好中球は酸化的ストレスが高いことが明らかとなった。これは、当初の予想を指示する結果であり、おおむね順調に進展している。幹細胞生物学糖原病Ib型(GSDIb)患者では好中球細胞膜上に発現するNAD(P)Hオキシダーゼ2(NOX2)からのスーパーオキシドアニオン(O2-)産生亢進による好中球減少症を伴うことが知られているが、その機序は未だ解明されていない。そこでGSDIb患者から樹立した人工多能性幹(iPS)細胞を用いて、病態解明や治療法の検討を行う予定である。消耗品等の使用において差額208,847円が生じた。ヒトiPS細胞分化誘導後の解析において、一部が来年度繰越になったため。平成27年度の助成金に平成26年度繰越金208,847円を加えるが、平成27年度はヒトiPS細胞分化誘導後の解析に加え、本来実施を予定しているモデル動物の作成などに使用する予定であり、大きな変更は生じない。
アジアデルタ地帯の総合地盤環境保全ストラテジーに関する研究

アジアデルタ地帯の沿岸環境は、海岸準の変化、土砂供給・流出、地盤沈下、波浪、潮位変化などにより影響を受け、刻々と変化している。特に本研究で対象としたタイ国チャオプラヤ川河口地域では、深刻な海岸浸食の危機にさらされているが、現在のところ海岸浸食問題に対する抜本的な対策は行われていない。本地域の平成15、16年度における1987年から2000年までの衛星データの解析からは、海外浸食の原因としてマングローブの伐採、エビ養殖場の汚染・放置、地盤沈下、土砂供給量の減少、および海水準の上昇が挙げられ、沿岸環境システムにそれぞれの原因が複雑に絡み合っていることが解明された。本年度の研究では沿岸環境問題の中でも海岸浸食問題の中心に据え、海岸浸食と個々の原因要素との関係という視点で沿岸環境について解析を進めた。特に、1950年代の航空写真を近年の衛星データと比較可能なレベルまで向上させる処理技術を確立し、1950年代から現在まで半世紀以上にわたる時系列解析から海岸線の変動の要すを明示し、より信頼性のある海外浸食の原因を追及し、沿岸環境マネジメントに関する提言へとつなげた。海岸線の変動と人間活動の歴史を見比べると、それぞれの時代における海岸線の前進と後退の原因について説明することができ、これらの結果をもとに、チャオプラヤ川河口域の沿岸環境マネジメントに関する指針として、「海外浸食をいかに食い止めるか」ではなく、「放置・汚染されたエビ養殖場跡である閉水域をどのようにすべきか」という課題の転換を提言するに至った。アジアのデルタ地帯では、タイのバンコクおよびその周辺域に代表されるような海岸浸食、地盤沈下、エビ養殖場の廃棄、それに伴う低地の塩水化等によって経済学的にも、社会学にも深刻な影響が現れている。この様な問題は、アジアの代表的河川においても顕著で、問題解決への足がかりが求められている。本研究では、バンコクチャオプラヤ川河口デルタ地帯の最新衛星データによる調査分析、既存地質データの解析、さらには現地踏査による俯瞰調査を行い、海岸浸食並びに土地利用改変等の地盤環境の詳細な実態把握のための調査研究を行った。また韓国釜山の洛南河口域において、河口堰の影響に関する現地予備調査を行なった。本年度は特にバンコク周辺における地質学的データの収集を現地研究機関と共同で行うと共に、地形図、地質図、植生図等を収集し、パーソナルコンピュータ上のGISに取り込み、「デルタ地帯総合環境データベース」のプロトタイプ作りを重点的に行った。衛星画像データを用いたデルタ周辺環境の俯瞰的解析から、とりわけ、海岸浸食においては、干潮時満潮時、異なる季節の画像を複数解析することにより、マングローブ林の活性度を考慮した詳細な環境分析が行えることが分かった。また画像解析によってデルタ域の水路分析を行い、かつての自然状態から現在までの変遷の過程を分析できた。一方、タイにおけるエビの養殖がデルタ環境に与えた影響、すなわちマングローブ林の伐採により設置されたエビ養殖場とその酸性化によって、廃棄された養殖場の分布を現地調査並びに衛星画像の濁度分析から明らかにできた。地盤環境調査からは、地盤沈下の著しい地域の地盤構造調査が不可欠であること検証された。今後これらの一連の調査研究結果から、次年度以降の調査ストラテジーが検討された。文明の価値観に関する様々な葛藤が世界各地で顕在化してきている.我が国においては近隣のアジア各国との新たなパートナーシップを構築する事は,国際社会において戦略的重要性を持つと考えられる.特にアジアデルタおよびその周辺域に住む人々の安心,安全のための技術開発や総合マネジメント戦略が重要であり,海岸侵食,地盤沈下,海老養殖場の廃棄,それら,に伴う低地の塩化によって,環境,経済,社会的にも深刻な影響が現れ,これらの問題解決への足掛かりが早急に求められている.このため本研究では,タイ王国のチャオプラヤ川河口デルタ地帯を重点に,当該国の環境省,エネルギー省の研究者と協力し,総合的な環境変化の詳細な調査を行なった.

具体的には最新の衛星画像データならびに既存の地質データの解析,さらには現地踏査やヘリコペターによるデルタ周辺環境の俯瞰的調査,解析を行い海岸浸食ならびに土地利用改変等の地盤環境の詳細な実態把握のための調査研究を行った.とりわけ海岸侵食状況について干潮,満潮時や異なった季節の画像を解析し,マングローブ林の活性度を考慮した詳細な環境分析を行った.その結果,最新の衛生画像を含めたデルタ域の海老養殖場跡の分析や水路分析から,かつての自然状態から現在までの変遷の過程が解明された.また地盤環境調査から地盤沈下の著しい地域の地盤構造が推定された.最後に本年度のまとめとしてタイの現地研究機関と共同で,「持続可能なタイ湾沿岸開発戦略に関するタイ国-日本共同セミナー」(平成17年1月27日)をバンコクで開催し,環境面ならびに社会面から様々な問題に対する理解を深め,今後の対策に向けた指針に関する議論を行った.これらの研究調査結果から,デルタ域の総合的な地盤環境の調査ストラテジーの方向性が見いだされたものと考えている.アジアデルタ地帯の沿岸環境は、海水準の変化、土砂供給・流出、地盤沈下、波浪、潮位変化などにより影響を受け、刻々と変化している。特に本研究で対象としたタイ国チャオプラヤ川河口域では、深刻な海岸浸食の危機にさらされているが、現在のところ海岸浸食問題に対する抜本的な対策は行われていない。本地域の平成15,16年度における1987年から2000年までの衛星データの解析からは、海岸浸食の原因としてマングローブの伐採、エビ養殖場の汚染・放置、地盤沈下、土砂供給量の減少、および海水準の上昇が挙げられ、沿岸環境システムにそれぞれの原因が複雑に絡み合っていることが解明された。本年度の研究では沿岸環境問題の中でも海岸浸食問題を中心に据え、海岸浸食と個々の原因要素との関係という視点で沿岸環境について解析を進めた。特に1950年代の航空写真を近年の衛星データと比較可能なレベルまで向上させる処理技術を確立し、1950年代から現在まで半世紀以上にわたる時系列解析から海岸線の変動の様子を明示し、より信頼性のある海岸浸食の原因を究明し、沿岸環境マネジメントに関する提言へとつなげた。海岸線の変動と人間活動の歴史を見比べると、それぞれの時代における海岸線の前進と後退の原因について説明することができ、これらの結果をもとに、チャオプラヤ川河口域の沿岸環境マネジメントに関する指針として、「海岸浸食をいかに食い止めるか」ではなく、「放置・汚染されたエビ養殖場跡である閉水域をどの様にすべきか」という課題の転換を提言するに至った。
網羅的遺伝子解析データに基づく婦人科癌に対するペプチドワクチンターゲットの同定

子宮体癌に着目して研究解析を行った。582例の子宮体癌、および53例の正常臓器のmRNA sequenceによる遺伝子発現データをTCGAおよびGTEよりダウンロードし、子宮体癌にのみ発現している遺伝子を同定した。HLA-A*24およびHLA-A*02に親和度の高い遺伝子配列をニューラルネットワークを用いたソフトウェア(netMHC)により同定した。正常臓器に比して子宮体癌に発現が高い71遺伝子のうち、上位10遺伝子に関して親和度の高いペプチドを検索したところ、HLA-A*24において21個、HLA-A*02において146個のペプチドが同定され、特に親和度の高いペプチドをHLA-A*24において15個、HLA-A*02において58個有す遺伝子A(遺伝子名未公表)を同定した。遺伝子発現レベルを既存の免疫治療のターゲットとして用いられているWT1と比較すると、遺伝子Aは子宮体癌において約31倍の発現を認めるものの、正常組織においては0.0003倍にしか満たず、極めて腫瘍特異的な免疫治療ターゲットと考えられた。また、遺伝子Aにおける蛋白質発現を20の癌腫(子宮体癌を含む)にて検索を行った所、卵巣癌および子宮体癌を含む13の癌腫において子宮体癌と比し高頻度で発現を認めた。特に尿管癌、頭頚部癌、メラノーマ、甲状腺癌、肝細胞癌においては20%を超える患者において高発現率を示し、子宮体癌のみならずその他の癌腫においても本遺伝子が免疫治療のターゲットとなりうる事が示された。本遺伝子Aに対するペプチドを作成し、現在それにより誘導されるCTLによる抗腫瘍効果を現在評価している。同時に、免疫治療法としてどのような形で提供するのが良いかを検討する予定としている。in silicoの研究に関しては上記のように順調に進行している。一方、in vitroの研究に関しては研究者の施設異動(埼玉医科大学から日本大学医学部への異動予定)があり、開始出来ていない。現在進行が遅れていると言わざるを得ない状況にある。現在の日本大学医学部産科婦人科学教室は研究施設が整っており、倫理委員会の承認後に速やかに研究が再開できる予定にある。今後、in vitroの研究に関し、上記解析により同定された遺伝子における蛋白発現を卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌各20症例ずつ、immunohistochemistryもしくはmRNAの発現をRT-PCRにて確認する事を予定している。その後、HLA-A24所持者のボランティアの末梢血より、それぞれの治療ターゲット特異的なCytotoxic Tcellを誘導する予定としている。それらを用いて殺細胞能を同種の細胞株をターゲットとして検証するとともに、実際に殺細胞能が見られたものはその背景にある遺伝子の発現パターンの変化やサイトカインの変化をmRNA sequencing、Bioplex multiple cytokine assayを用いて検証する事を予定している。研究者の異動があり、in vitroの研究がやや遅れ、次年度使用額が生じた。来年度は、今年度の解析により同定された遺伝子における蛋白発現を卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌の症例においてimmunohistochemistryもしくはmRNAの発現をRT-PCRにて確認する事を予定している。生じた使用額は、このin vitro研究のために使用する計画である。
NeedlExによる血中シアン化水素の簡易迅速分析法の検討

【研究目的】シアン化合物はメッキ等で広く用いられる関係で入手しやすく、猛毒のため自他殺に用いられることが多い。また、火災時にはシアン化水素(HCN)が発生することはよく知られており、一酸化炭素以外の中毒死の原因といわれているため、血中のHCNを簡便・迅速に分析することは、中毒原因や死因究明に重要である。そこで本研究では、シアン化合物水溶液(CN液)を酸性にして発生するHCNを直接捕集して濃縮できる注射針NeedlExを開発することにより、ガスクロマトグラフ(GC)による簡単迅速分析法を検討し、救急救命や死因究明に役立てることを目的とした。【研究方法】NeedlExはルアーロック式注射針中に濃縮媒体を充填した試料濃縮用注射針で、検知管用ガス採取器に付属のテフロンチューブを用いて装着し試料ガスを吸引するという簡便な操作で吸着・濃縮を行うことができる。濃縮が終了したNeedlExをガスタイトシリンジに取り付け、GCの注入口に挿入することで吸着した試料を脱離させGC分析できる。本研究では、HCN用のNeedlExを試作し、CN液をバイアル瓶にいれ密栓した後、リン酸を加えて発生するHCNを効率よく濃縮できるNeedlExの検討を行った。また、濃縮時の温度、平衡時間の検討も行った。【研究成果】既存のNeedlEx(有機溶剤用、トリメチルアミン用、脂肪酸用、石油用、アルコール用)ではHCNの濃縮効率が高くなかったため、新たにHCNに対して濃縮効率のよいNeedlExを検討したところ、濃縮媒体にリン酸をコーティングした活性炭を用いたものが最も良い濃縮効率が得られ、ヘッドスペース(0.5mL)の分析と比較して約6倍の濃縮効果があった。また、濃縮時のバイアルの温度は室温でも問題なく吸着され、リン酸を加えてからの平衡時間をとらなくても濃縮効率に違いは無いことがわかった。このことから、加熱器などの器具を使用することなく、迅速にHCNを濃縮、分析することができるようになった。
L型ハンセン病の病態形成における免疫グロブリン分解産物が及ぼす役割の解明

ハンセン病は、世界で年間20万人以上の新規患者が認められ、依然として国際的に重要な公衆衛生学的課題である。本研究は、L型ハンセン病病変部位のLILRA2発現および免疫グロブリン部分分解産物の存在について、その存在が認められた場合は、ヒトから分離したLILRA2発現白血球亜群細胞等を用いて、免疫グロブリン分解産物がらい菌感染免疫応答へ及ぼす影響を解析し、L型ハンセン病の病態形成に関与するを解明することを目的とする。これらが判明すれば、ハンセン病の病態の解明につながり、ハンセン病の早期診断と早期治療の開始、発症ハイリスク者の発症予防対策等に対し、大いに貢献することが可能となる。
末梢性三叉神経損傷がおよぼす痛覚伝達機構の可塑性変化に関する研究

1膜電位画像解析法による三叉神経脊髄路核尾側亜核の神経興奮伝の解析(1)脊髄路への単発電気刺激にて、AMPA/Kinate型グルタミン酸受容体を介した短時間の尾側亜核深層への興奮伝播が観察された。(2)脊髄路への高頻度電気刺激にて、NMDA型グルタミン酸受容体またはNK1受容体を介した長時間持続型の尾側亜核深層への興奮伝播が観察された。(3)脊髄路への電気刺激による膜興奮伝播の方向や面積は生後の発達に伴う、異なった生後変化を示す。(4)侵害刺激としてのフォルマリンの頬部への注射は、単発刺激による尾側亜核内への興奮伝播を拡大した。2三叉神経脊髄路核における伝達物質としての神経ペプチドの機能解析(1)脊髄路核尾側亜核においてサブスタンスPはI, II層の浅層と深層に分布が見られ、深層のサブスタンスPは消退するが、浅層部分は変化しない。(2)NK1受容体は浅層と深層に分布が認められ、これは生後発達変化を示さない。3臨床的な神経損傷後の生理学的特徴の解析(1)求心性線維のなかで有髄線維の損傷がspontaneous paresthesiaの発生に関与する可能性がある。これは受傷後に発生し自然消失する経過をとる。(2)無髄線維の損傷はelicited paresthesiaの発生に何らかの影響を及ぼし、中枢性の興奮性に変化を誘発する可能性がある。受傷後ひとたび発生頻度は減少し、その後数週間で再び増加するという特異な経過をとる。以上より、末梢神経損傷後には無髄線維の機能障害が侵害刺激の中継核である脊髄路核尾側亜核にサブスタンスP・NK1受容体を介した広範囲のまた長時間持続する膜電位の興奮をもたらす。これは臨床的な術後異常感覚の病態と類似した点があり、何らかの関係があることを示唆するものと思われる。8週齢の成熟ラットの顎関節に催炎性かつ発痛物質であるマスタードオイルを注射すると顎二腹筋の筋活動は両側性に亢進する。この反応は生後4週目にはみられず、その後成長に伴って認められるようになる。4週目に去勢を行なっておくとこの反応は成長しても生じなく、また去勢直後テストステロンを注射しておくと反応が回復することから痛み反射は生後4週以降に性ホルモンの影響を持って完成される。一方、痛み刺激による中枢の持続性興奮はホルモンと関係なく4週目以降に生じ始め成長に伴って完成されることがわかった。形態学的には生後3週目以降で、tractとsubstantia gelatinosaは完成していた。求心路刺激による三叉神経脊髄路核尾側亜核内の興奮拡大を膜電位画像の解析で検討した。単発刺激により誘発される神経細胞の脱分極の同核内への広がりは出生直後には大きくその後低下すること。頻回刺激では刺激後に大きく脱分極の範囲が広がり長期にわたって持続する。ここの反応は生後3から4週目より生じ始め6週には完成する。これら3つの研究により、痛み刺激による神経の興奮を調べる研究には生後6週目以降の動物を使用することが適当であることがわかった。そこで6週自以降のマウスの顔面に5%ホルマリンを注射してその投射部位である三叉神経脊髄路核尾側亜核の求心路刺激による反応変化を調べている。これはニューロパシックペインのモデルとなる。痛み刺激によってひとたび同核に興奮が誘発されると、同核へさらに頻回刺激を与えても神経の興奮は広がらないことが今までにわかってきている。

今後はそのメカニズムについて詳細に検討する。さらに臨床的な検討をも加えた。すなわち外科的顎矯正術後に生じた知覚神経障害を調べたところ、知覚閾値に異常がなくとも患者は「しびれ」という表現の異常感覚を生じていることが明らかになり、動物実験との関連の検討が必要である。三叉神経の侵害性求心性活動は、三叉神経脊髄路核尾側亜核を経由して上位中枢へ伝えられるが、これを膜電位画像の解析で検討した。求進路の単発刺激により誘発される脱分極の広がりは出生直後には大きくその後低下する。すなわち1次ニューロンの尾側亜核内への投射が生後小さくなることを意味する。一方、頻回刺激では刺激後に大きく脱分極の範囲が広がり長期にわたって持続する。これはNK1受容体またはNMDA受容体を介して伝播し、これはこの受容体を介する興奮伝播機構は生後3から4週目より生じ始め6週には完成するという発達ととることがわかった。一方、マウスの顔面に5%ホルマリンを注射してこの反応変化を調べた結果、侵害刺激による同核内の興奮伝播は抑制されることがわかってきたが、それがどのような抑制系が作用しているのかは現在検討中である。臨床的な神経障害に対する病態とその治療法に関しても検討を加えた。すなわち三神経末梢枝の神経障害により生じた知覚障害が治癒過程にあるときには、患者は「しびれ」という表現の異常感覚を生じていることが明らかになり、さらにこれには自発性と誘発性の2種類があることがわかった。この知覚障害は受傷後のステロイドの内服によって回復することが示された。さらにこのステロイド投与は受傷後早期に行なっても無効であり、受傷以後3週間以上待ってから投与するほうが良いことが示された。これは神経障害に対するひとつの治療法の可能性を示唆するものである。以上により、三叉神経の末梢枝に加えられた刺激の知覚の中枢内伝播神経に及ぼす影響と、その生後発達を検討することが出来た。今後はさらに同核内の変化を電気現象として詳細に検討する。三叉神経の侵害性求心性活動が引き起こす中枢神経内の神経興奮伝達様式の変化について基礎的または臨床的な研究を加えて、神経損傷後にみられる異常感覚の発生のメカニズムについて考察を加えた。三叉神経末梢枝に加えられた神経損傷は、その損傷部位から障害電流を生じさせてそれを延髄での中継核である三叉神経脊髄路核尾側亜核に送り、同核内において興奮伝達様式の変化をもたらすことを今までに報告した。そこで今回はそのメカニズムに関与する因子について検討した。高速光学的膜電位画像解析法により神経ペプチドであるサブスタンスPやグルタミン酸がその伝達または変調を引き起こす物質として、それぞれNK1受容体、NMDA受容体を介して興奮伝達機構の変調を引き起こすことが認められた。さらにこれが動物の生後発達において特異な分布様式の変化をもたらすことも認められた。すなわち出生直後では尾側亜核の浅層と深層に多くのサブスタンスPの分布が認められるが、浅層部分は成長に伴う変化が見られないのに対して、深層部分の分布は消失する。臨床的観察では健康成人と外科的顎矯正術を受けて異常感覚を生じた患者で知覚機能の変化を比較検討した。測定には求心性線維のAβ線維、Aδ線維、C線維の閾値を別々に測定することによってそれらの伝達障害を調べるCurrent Perception Thresholdを用いた。
新保険法下における保険法理論の再構築

新しい保険法において、保険法が施行される以前の判例理論等が、そのまま適用されるのか否かを検討した。その上で、適用されないとした場合、新たな理論的な問題について、どのように考えるべきであるかについて検討を行った。告知義務違反による契約解除、重大事由解除、傷害保険における偶然性の立証責任に関する問題等について、論文、判例研究等の研究成果を公にした。平成25年度は以上の研究目的に関連して、無免許者による免許証の色の告知が告知義務違反にあたり、詐欺にもあたるとして保険者の免責が認められるとした仙台高判平成24年11月22日判決(判時2179号141頁)について、検討を行い、保険法下における告知義務が申告義務となったこと、告知義務違反の事実と保険事故との間の因果関係不存在特則との関係、民法の意思表示との関係について、判例解説を行い検討を加えた。保険法下における危険増加による契約解除、重大事由解除、保険者の免責に関する問題について研究を行った。研究成果は出版物の刊行時期の関係で、平成26年度となっている。法律専門職業人賠償責任保険における保険者免責条項が保険法17条2項との関係でどのように解釈すべきであるかについても検討を行った。研究成果として「法律専門職業人賠償責任保険における一考察」と題する論文を執筆した。任意自動車保険契約の基本契約の1つとなっている人身傷害補償保険契約に関して、実際に販売されている保険商品との関連で生ずる問題等について、実務家との研究会に参加し、意見等を述べる機会を得ることができた。損害保険判例研究会において、集中豪雨、道路冠水から下車避難中の濁流による被保険者の溺死につき運行起因性の要件を満たさないとして自賠責保険金請求を棄却した事案である東京高裁平成25年5月22日判決の判例研究を行った。平成24年度は以上の研究目的を関連して、任意自動車保険における酒気帯免責条項が保険法29条の危険増加による契約解除との関係でどのように捉えるべきか、また当該免責条項を巡る裁判例等を検討した論文を保険学雑誌に掲載した。また人身傷害補償保険を巡る近時の裁判例を素材に、保険法との関連性も踏まえた論点に関して論文を阪大法学に掲載した。さらに無保険車傷害保険の法的性質も踏まえた最高裁判決の解説を公にした。また第27回日司連中央研修会「司法書士の業務責任業務賠償責任保険を通じて」第1講「保険法から見た司法書士業務賠償責任保険」、第3講(パネルディスカッション)「司法書士業務責任と賠償責任保険の有り様をめぐる諸問題」において、新保険法下における専門職業人賠償責任保険である司法書士業務賠償責任保険との関係について報告及びパネリストとして発言を行った。平成22年4月1日より施行された保険法においては、民法との関係が非常に重視され、また片面的強行規定の導入などから、平成20年改正前商法における任意規定を前提として構築された様々な保険法理論について修正や新たな理論の構築が求められる問題も生じてくるものと考えられる。これらの問題について、重大事由解除、危険増加による契約解除、未必的保険金請求権の帰属、傷害疾病定額保険契約における保険者免責、請求権代位、等の解釈問題について研究を進めた。具体的には、火災共済契約における詐欺行為を理由として生命共済契約の解除を認めた裁判例について判例研究を執筆し、重大事由解除に関して保険法施行前の解釈と保険法施行後における解釈について言及した。同様に、傷害疾病定額保険契約における保険者免責について、特に被保険者による故意による事故招致免責と、傷害保険における保険事故概念である傷害の3要件の1つである偶然性の立証責任との関係について、保険法施行後の議論等も踏まえて検討を行い、分担執筆の書籍において言及した。また重大事由解除の片面的強行規定と、保険事故発生後の不実申告との関係や、暴力団排除条項との関係、危険増加による解除に関する解釈問題等についても、保険法施行後との関係について検討を行った。さらに、保険事故発生前の未必的保険金請求権の帰属を巡り、保険事故発生前にも具体的に誰かだ保険金受取人である必要性があり、第三者のための生命保険契約を締結していた場合でも、該当する死亡保険金受取人が不存在の場合には、一般原則に戻り、自己のためにする保険契約となる場合についても理論的は問題について研究会において報告を行った。保険法生命保険契約における保険契約者の任意解除、危険増加による解除、重大事由による解除、傷害疾病保険契約における保険者免責に関する各論点についての解説の原稿を執筆したが、刊行が遅れており平成25年度の実績とはなっていない。同様に、保険法コンメンタールの分担執筆の原稿については、平成26年度の刊行となるため、平成25年度の実績となるもは少なくなっている。保険法制定後における人身傷害補償保険や無保険車傷害保険の法的性質に関する理論的な問題、損害保険の偶然性、傷害保険における傷害概念を定義付ける偶然性の意義、保険者の請求権代位における差額説との関係、について約款条項も踏まえた検討を行うことができ、不十分ながらも研究論文をまとめそれを公にすることもできた。

保険法下における告知義務と詐欺取消・詐欺無効に関する新たな争点に関する理論的な検討について実務家とやり取りをする機会も得られて、それを次年度以降、さらに理論的な展開として論文にまとめることを考える機会も得られた。また保険法下における専門職業人賠償責任保険に適用される約款についても検討する機会を得られた。保険法における重大事由解除を巡る裁判例として福岡高判平成24年2月24日判タ1389号273頁の判例研究報告を予定しており、保険法制定前における議論と保険法制定後での理論的な問題について検討を加えることを予定している。また人身傷害補償保険が保険法における契約分類との関係や保険者代位との関係で、どのような法的問題があるかについても検討を行うことを考えている。本年度が最終年度もあることから、比較法的な観点からも、ベルギー、フランス、カナダと対比も行いたいと考えている。研究成果をまとめる前に、中間報告という方法で、実務家が集まる研究会や、日本保険学会での部会報告等での研究報告を考えている。保険法施行後2年を経過した関係もあり、保険法の規定を直接の論点とする裁判例も出てきた。保険法において告知義務を質問応答義務として片面的強行規定とした趣旨と、民法の詐欺との適用や、告知義務解除・免責に関する因果関係不存在特則との関係等が争点とされた仙台高判平成24年11月22日を素材に、平成20年改正前商法における議論との相違等を踏まえて、保険法での理論的問題について研究を進めることを考えている。また、保険金受取人変更と相続との関係で問題となった裁判例も出てきたことから、この裁判例も検討することを考えている。また、保険法17条2項において責任保険契約における重過失免責が任意規定であるが免責から外れているとこと、法律職業人賠償責任保険契約に適用される約款で免責条項として規定されている、いわゆる認識ある過失との関係について、再度、諸外国での法律職業人賠償責任保険での運用を踏まえた上で、検討を行うことを計画している。またヨーロッパ保険契約法に関する専門家グループが2013年度を目処に、ヨーロッパ保険契約法原則に関して一定の見解を示す予定とされており、その内容も比較法的に重要な内容と考えられることから、資料等の入手ができれば、研究対象としたいと考えている。平成25年度の研究成果の刊行が遅れたことや、研究成果が少なかったために、抜刷別刷のための費用が掛からなかった点が1つである。債権法改正に関連する書物の購入を控えてしまった点も理由となる。平成26年度は研究の最終年度であることから、研究成果をまとめ、抜刷別刷費用や研究会での報告機会を増やすことから、平成25年度の残金部分はそれに充てることを考えている。保険契約法は、実務的な学問分野であることから、実務状況を正確に把握する必要性から、保険会社の実際の運用についての専門的な意見を伺う必要がある。そのため、各保険会社の商品開発運用又は支払部署を訪問し、実務的な情報の提供をお願いする必要性がある。そのため、国内旅費は主に、資料収集・情報提供を受けるために、東京への出張費にあてられる。
FGFR2IIIcアイソフォームの発現制御による子宮頸癌の新たな治療戦略

Fibroblast growthfactor receptor2(FGFR2)は新しい癌治療標的として注目されており、今回我々は子宮頸癌について, FGFR2のアイソフォームであるFGFR2IIIcの発現とその役割について検討した。FGFR2IIIcは、子宮頸癌で特異的に発現している重要な増殖因子受容体であり、FGFR2IIIcによる子宮頸癌細胞増殖にはMAPキナーゼのERKとAKTのシグナル伝達経路が関与している可能性が示唆された。さらに、子宮内膜癌においても、FGFR2IIIcが発癌、進展に関与しており、治療の標的となりえる可能性が考えられた。Fibroblast growth factor receptor2(FGFR2)は新しい癌治療標的として注目されており、今回我々は子宮頸癌について, FGFR2のアイソフォームであるFGFR2IIIcの発現とその役割について検討した。FGFR2IIIcは、FGFR2のアイソフォームの1つで、前立腺癌や膀胱癌においては、FGFR2IIIbからFGFR2IIIcへのクラススイッチが癌の進展に深く関与することが報告されている。これまでに、子宮頸部異形成および子宮頸癌組織を用いて、組織中でのFGFR2IIIcの局在について検討しており、子宮頸部異形成の進行にしたがってIIICの発現が高くなり、子宮頸癌においては全症例で過剰発現していることを報告している。また、培養子宮頸癌細胞の一つであるCaSki細胞にFGFR2IIIc発現ベクターを導入した安定過剰発現株を作成したところ、in vitroにおける細胞増殖能が亢進した。また、ヌードマウスの皮下移植モデルにおいても腫瘍形成能が亢進していることも報告している。今回、FGFR2IIIcを介して子宮頸癌細胞の細胞増殖能を亢進させるシグナル伝達経路を検討した。FGFR2IIIc過剰発現CaSki細胞株を用いて細胞増殖に関わる主要なキナーゼであるERKとAKTの活性について確認を行った所、対照細胞株に比べてERK、AKTともに活性が亢進していることが明らかとなった。このことから、FGFR2IIIcによる子宮頸癌細胞増殖誘導にはERKとAKTの両方のシグナル伝達経路が関与していることが考えられ、FGFR2IIIcの発現または活性を抑制することは子宮頸癌の新たな治療法となる可能性が示唆された。今後は、siRNAを用いたFGFR2IIIcの発現抑制や抗体を用いたFGFR2IIIcの活性抑制について培養細胞を用いたin vitroでの検討及びマウスを用いたin vivoでの検討を行い、新たな治療法の確立を目指す。Fibroblast growthfactor receptor2 IIIc(FGFR2IIIc)蛋白は、FGFR2遺伝子産物であるFGFR2蛋白の選択的スプライシングのアイソフォームの1つで、前立腺癌、膀胱癌や膵臓癌においては、免疫グロブリンドメインであるIII領域のFGFR2IIIbからFGFR2IIIcへのクラススイッチが癌の進展に深く関与することが報告されている。これまでに、子宮頸部異形成および子宮頸癌組織を用いて、組織中でのFGFR2IIIc蛋白の局在について検討し、子宮頸部異形成の進行にしたがってFGFR2IIIc蛋白の発現が高くなり、子宮頸癌においては全症例で過剰発現していることを報告している。また、培養子宮頸癌細胞の一つであるCaSki細胞にFGFR2IIIc発現ベクターを導入した安定過剰発現株を作成したところ、in vitroにおける細胞増殖能が亢進したが、細胞形態や遊走能には変化を認めなかった。また、ヌードマウスの皮下移植モデルにおいても腫瘍形成能が亢進することも明らかとなった。今回、新たに子宮内膜癌におけるFGFR2IIIc蛋白の発現を免疫染色法にて確認を行った。32例の子宮内膜癌組織を用いて検討した結果、FGFR2IIIc蛋白は全ての症例において発現していることが明らかとなった。また、臨床病理学的因子との関連を検討した所、癌の分化度と関連があることも明らかとなった。今後、さらに子宮内膜癌の前癌病変におけるFGFR2IIIc蛋白の発現と関連遺伝子や蛋白発現を検討することで、癌の進行におけるFGFR2遺伝子およびFGFR2IIIc蛋白が果たす役割を解明して行く予定である。これらのことから、FGFR2遺伝子およびFGFR2IIIc蛋白は子宮頸癌だけではなく子宮内膜癌やその前癌病変についても新たな治療標的となる可能性を考えている。
二次元半導体ナノ結晶を用いた光エネルギー変換材料の創製

層状化合物の剥離によって得られる二次元ナノ結晶は、表面が原子レベルで平滑でありその厚さも原子レベルで均一であるという特徴を持つ。このようなナノシートを利用すると、従来の手法では作製が非常に難しい極限のデバイスや触媒構造等を作成・評価することができる。本研究では、ナノシートの特徴を活かして厚さ1nm程度のナノシートpn接合体の作製に成功し、極薄の接合体が光エネルギー変換機能を有することを明らかにした。また、ナノシートを用いることで、光触媒の水素生成サイトとなる1原子反応サイトの直接観察に成功し、ヒドリド種が水素生成反応の中間体に関与していることを計算と実験の両方のアプローチから明らかにした。本年度は0.7nmのn型-酸化チタンナノシートと0.3nmのp型-酸化ニッケルナノシートを張り合わせた厚さ1.0nmのナノシートpn接合の作製と作製した極薄のpn接合体が光エネルギー変換素子として機能するか実証することを目的とした。pn接合の作製に関しては、予定通り0.7nmのn型-酸化チタンナノシートと0.3nmのp型-酸化ニッケルナノシートの作製は達成され、それらを接合した酸化チタン/酸化ニッケルナノシートからなるpn接合体が得られた。接合の厚さが1.0nm程度になっているかどうかの評価は原子間力顕微鏡を用いて評価し、約1.5nm程度の厚さであることが分かった。理論的な厚さ1.0nmよりも厚い結果となったが、これは表面吸着水の影響であり、目的とする極薄のpn接合体が作製できたことを確認した。次に作成した極薄のpn接合体が光エネルギー変換素子として機能するかどうかの実証は光堆積反応を用いて行った。pn接合が形成された場合、光励起した電子と正孔は接合部に生じた電位勾配を駆動力として電子はn型半導体側へ、正孔はp型半導体側へ移動する。つまり、作製したpn接合が光エネルギー変換素子として機能する場合、光酸化還元サイトが空間的に明確に分かれる。光還元サイトと光酸化サイトの確認はAg+イオンの還元に伴うAgメタルの堆積箇所と、Mn2+イオンの酸化に伴うMnOxの堆積箇所をオージェ電子分光法により確認した。その結果、AgとMnOxの堆積箇所が異なることが分かった。しかしながら、堆積箇所がpn接合のどこであるかの判断を下すためには測定データの質が不十分であり、次年度に引き続き実施する予定である。接合箇所に電位勾配が形成しているかどうかについては、ケルビンフォース顕微鏡により評価し、接合箇所と未接合箇所で明確な電位勾配が形成されていることを確認した。本年度に目標としていた0.7nmのn型-酸化チタンナノシートと0.3nmのp型-酸化ニッケルナノシートを張り合わせた厚さ1.0nmのナノシートpn接合の作製に成功し、また、作製した極薄のpn接合体が光エネルギー変換素子として機能するために必要な接合間の電位勾配の形成が確認できたため。ただし、光反応サイトの観察にまだ曖昧な点がある点を考慮すると、計画としては90%程度達成と判断したため、区分としてはおおむね順調に進展していると考えている。光触媒反応における水素生成は、触媒表面上にナノサイズの金属粒子等を担持することで劇的に向上する。しかしながら、その反応機構については不明な点が多い。高効率の光触媒を開発するためには、それらの不明な点を解明し新しい設計概念を更新していく必要がある。そこで本年度は、光触媒反応における水素生成システムについて、実験と計算の両方のアプローチから詳細に検討した。具体的には、単原子Rh助触媒サイトをチタニアナノシートのチタンサイトに導入した光触媒を開発し、透過型電子顕微鏡を用いて、反応サイトの具体的な結晶構造を原子レベルで可視化した。このナノシートの光触媒活性を評価すると、未ドープのサンプルにくらべてRhドープのサンプルは5-10倍程度高い水素生成活性を示したことから、Rhがドープされた単原子サイトは水素生成の活性点になっていると考えられる。次にその構造を用いたDFT計算を行い、Rh単原子反応サイトでどのようなプロトンの還元吸着がおこるか調査した。その結果、Rh-HとO-Hの結合が表面にでき、さらに水素が結合している酸素とロジウムが結合を形成している吸着構造が最も安定であることがわかった。計算で最も安定な水素の還元吸着状態が明らかになったので、実験的にRh-HとO-Hの結合が形成されるか赤外分光法を用いて調査すると、それらの結合に対応するシグナルが検出された。またNMRを用いて分析したところ、Rh-Hの結合が存在することを示すスペクトルが得られた。Rh-Hの水素は溶液中のフリープロトンと反応して水素を生成することが予想されたので、ナノシート表面にRh-D結合を表面に形成して水と反応させたところ質量数3の水素が検出された。Rh-Hの水素のような状態が助触媒サイトで観察されたのは本研究が初めてであり、本研究成果により助触媒表面における水素の生成機構が完全に解明されると期待してい実験と計算の融合により光触媒反応の助触媒上での水素生成機構の解明が大きく進展したため。水分解光触媒の研究は古くから続けられているが、助触媒上でどのような経路で水素生成が進行しているかは依然として不明な点が多かった。そこで、本研究では、助触媒サイトの構造が限定できるRh-doped TiO2ナノシートを用いて水分解光触媒の水素生成機構の解明を目指した。

これまでの研究でRh-doped TiO2ナノシートではRh原子がTiO2ナノシートのTiサイトに単原子ドープされていることを透過型電子顕微鏡を用いた評価により確認しており、またドープされたRhサイトが水分解の水素生成サイトとしては働いていることを確認している。今年度はそのRhサイトでどのような経路で水素生成が進行しているか計算と実験の両方のアプローチから精密に調査した。その結果、2種類以上のDFT計算により水素生成の中間体としてRhサイトでヒドリド種が形成されている可能性が非常に高いことが得られた。そのため、実験によりこのヒドリド中間体の検出を試みたところ、FT-IRやNMR測定により、RH-Hからなるヒドリド種がRh-doped TiO2ナノシートに形成されていることを支持する強い結果が得られた。まだ、重水素を利用したラベル反応でもRh-Dがナノシート上に形成していることが分かり、このナノシート光触媒での水素生成の中間体には、ヒドリド種が形成されていることが明らかとなった。これまで、光触媒の水素生成中間体としてヒドリド種が形成されていることを明確に示した報告はなく、本研究成果は助触媒上での水素生成機構の解明に大きく進展すると期待している。また、遷移金属もしくは貴金属ドープTiO2ナノシートを用いて計算と実験のアプローチにより水の酸化がどのように進行するか調査し、ドーパントの電子軌道がその活性と相関があることを見出した。層状化合物の剥離によって得られる二次元ナノ結晶は、表面が原子レベルで平滑でありその厚さも原子レベルで均一であるという特徴を持つ。このようなナノシートを利用すると、従来の手法では作製が非常に難しい極限のデバイスや触媒構造等を作成・評価することができる。本研究では、ナノシートの特徴を活かして厚さ1nm程度のナノシートpn接合体の作製に成功し、極薄の接合体が光エネルギー変換機能を有することを明らかにした。また、ナノシートを用いることで、光触媒の水素生成サイトとなる1原子反応サイトの直接観察に成功し、ヒドリド種が水素生成反応の中間体に関与していることを計算と実験の両方のアプローチから明らかにした。今後の研究計画は以下のように実施する予定である。Rh-doped TaO3ナノシートを作製した後、Rhドーパントの直接観察を実施し、直接観察により得られた具体的な構造を元に光触媒的水素生成がどのような反応経路で起こっているかをDFT計算により予想し、実験データと比較しながら、光触媒的水分解の反応経路をより明確にするこことを目指す予定である。また、ナノシートpn接合表面の反応サイトの観察も引き続き実施する予定である。具体的には、ドーパントの直接観察は透過電子顕微鏡を用いて実施する。Rh(Z=45)とTa(Z=73)は原子番号が離れているため、高角度散乱暗視野(走査透過電子顕微鏡)法を用いて像のコントラストにより区別できる。次に、ドーパントの直接観察によって得られたドープ環境を元に計算する構造を決定し、反応経路や障壁はNudged Elastic Band (NEB)法を用いて実施する。この手法は化学反応における遷移状態を探し出すための手法であり、化学反応の初期構造と最終構造を入力することにより、原系と生成系の間の反応経路を探索し、遷移状態と活性化エネルギーを求めることができると考えている。また、計算で得られた表面での結合の変化を実験的に赤外分光法等で確認しながら、光触媒的水分解の反応
ウエルシュ菌α毒素の生体膜破壊機構の分子生物学的解析

ウエルシュ菌によるガス壊疽発症のモデルとして通常の方法であるマウス後肢に筋注すると、病理組織学的に注射部位での組織破壊はほとんど無く、各臓器の血管に溶血によるヘモグロビンと筋肉溶解によるミオグロビンが確認、さらに、腎臓の部分的破壊が観察され、毒素中毒症が明らかとなった。そこで、ガス壊疽を再現するためウエルシュ菌とCa^<2+>を同時投与後、病理組織学的検討すると、感染部位におけるガス壊疽と類似の組織破壊が観察された。α毒素遺伝子をトランスフォームした枯草菌を同様の条件でマウスに筋注すると、ウエルシュ菌と同様の組織破壊が観察された。従って、α毒素はガス壊疽の原因毒素であることが証明された。次に、α毒素の作用機構を解明するため本毒素によるウサギ赤血球溶血を解析し、毒素処理によって低分子量Gタンパク質が関与している内因性ホスフォリパーゼD(PLD)の活性化が重要な役割を演じていることを明らかにしてきた。そこで、ウサギ網状赤血球からRho-GDIとRho遺伝子のcDNAを作成、そして各遺伝子を作成後、各タンパク質をGSTフュージョンタンパク質として大腸菌で発現させ、単離した。Rho-GDIとRhoを取り込ませたスキンド化ウサギ赤血球を毒素処理した結果、Rho-GDIは、毒素による溶血を用量依存的に阻害したが、Rhoは、いかなる効果も示さなかった。最近、Rhoは、GDPと結合し活性化状態をとらないこと、さらに、変異Rho(G14V)は活性化状態を示すことが報告された。そこで、変異Rho(G14V)遺伝子を作成、GSTフュージョンタンパク質として大腸菌で発現させ、そして、この変異Rhoを精製後、変異Rhoを取り込ませたスキンド化ウサギ赤血球を毒素処理した結果、毒素による溶血を用量依存的に亢進した。従って、α毒素は、内因性PLDを活性化してリン脂質代謝を亢進し、溶血を惹起すると考えられる。ウエルシュ菌のα毒素によるウサギ赤血球膜中のリン脂質代謝系の活性化と溶血の間に密接な関係が存在すること、そして、この活性化に関与するホスフォリパーゼD(PLD)と低分子量Gタンパク質の間にも関係があることを明らかにしてきた。そこで、他の細胞のPLD活性化と低分子量Gタンパク質の関係から、PLDとRhoあるいはARFの関係に焦点を絞り検討した。まず、RhoとRho-GDIの遺伝子をウサギ網状赤血球のmRNAからcDNAとして単離した。いずれの遺伝子も、ヒト由来の遺伝子とほとんど同じであることが判明した。次に、単離された遺伝子をグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子につないで大腸菌にトランスフォーム後、・その大腸菌から融合タンパク質の形で精製を試みた。その結果、Rhoに相当するタンパク質は、融合タンパクからトロンビンで切断時に分解され単離されなかったが、Rho-GDIに相当するタンパク質は単離され、このタンパク質は、抗Rho-GDI抗体を用いたウエスタンプロットで確認されたことから、-Rho-GDIと確認した。ARFの遺伝子も酵母から単離し、常法に従いARFをGSTフ-ジョンタンパクとして発現させ精製した。黄色ブドウ球菌由来のEDIN、そして、ボツリヌスC2酵素でウサギ赤血球溶解物を処理すると、SDS-PAGEにおいて約42kDaのタンパク質がADPリボシル化されるのに、毒素のホスファチジン酸合成亢進作用は阻害されなかったが、Rhoの作用を阻害するRho-GDIは、用量に依存してα毒素の作用を阻害した。

一方、ARFは、この作用を阻害しなかった。従って、α毒素によって活性化されるリン脂質代謝系はRhoによるPLDの活性化が重要であると推察される。一方、ARFは関与していないと推察される本年度の第一のプロジェクトであるウェルシュ菌α毒素によるウサギ赤血球の溶血に関与する内因性ホスフォリパーゼDとRhoタンパク質との関係をウサギのRho-GDI遺伝子を用い証明したが、Rhoと内因性ホスフォリパーゼD遺伝子はいずれの場合も単離できたが、これらタンパク質の発現と単離が困難なため、初期に計画したように、この酵素と制御タンパク質をリポソームに組み込む人工膜モデル系の確立は出来なかった。従って、α毒素作用発現における情報伝達系でのRhoの役割を解析することは次年度に持ち越した。一方、本年度の第二のプロジェクトである、マウスにおいて病理学的、生化学的、薬理学的立脚点からヒトと同様の本菌ガス壊痕モデルを確立することには成功した。これまで、本菌にまるガス壊痘は、多くの場合、本菌をマウスなど動物の腹腔や大腿部に注入して、16から24時間内に死に至った場合、本症として扱ってきた。しかしながら、このような実験条件での各組織の変化を病理学的に検討すると、ウェルシュ菌の産生する毒素が血流にて全身に広がり、激しい溶血現象が観察され、さらに、注射部位の筋肉層の融解に伴うミオグロビン遊離により、腎臓の血管細胞表面への蓄積により、腎血管の損傷がみられ、さらに、肝臓、肺臓、脾臓にも同様の結果が観察された。従って、この条件での動物の死は、本菌が産生する毒素による中毒症である事が判明した。そこで、ガス壊痕成立には、感染部位の血流障害が必要であることから、局所の血流低下を引き起こすCa^<2+>を本菌と共にマウスの大腿部に投与して観察すると、マウスは死亡することなく、ガスの貯留と筋肉の融解が病理学的に観察され、全身的にはミオグロビン、α毒素も分布せず、局所の感染症実験系が確立された。さらに、この系を用いて、α毒素遺伝子をトランスフォームした枯草菌でのガス壊痕の成立を証明した。従って、ガス壊痕は、本菌の産生するα毒素が主たる因子であることが証明されたと考える。11年度は、本研究課題の最終年で前年度未解決の問題に焦点を絞り、以下のように解決した。ガス壊疽の原因毒素であるウエルシュ菌α毒素の作用機構を解析する系として、本毒素による内因性ホスフォリバーゼD(PLD)を介するウサギ赤血球の溶血系を検討してきた。本毒素による溶血とPLDの活性化は、前年度構築したRho-GDIによって阻害されたことから、この溶血機構に細胞内のRhoの活性化の関与が推察された。一方、ウサギ網状赤血球からRhoのcDNAを単離、そして、作成したRho遺伝子を大腸菌で発現、そして、精製したRhoを用いても、本毒素の溶血とPLDの活性化は、認められなかった。最近、このようにして単離されたRhoは、GTP結合型の活性型をとらず不活性型であることが報告されている。そこで、活性型を示すと報告されている変異Rho(14位グリシンをバリンに置換した変異Rho;G14V)とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)とのフージョンタンパク質遺伝子を構築した。この遺伝子を大腸菌で発現、そして、このGSTフージョンタンパク質を単離、トロンビンで切断後、変異Rho(G14V)の精製に成功した。
コンビナトリアル手法を用いた微構造データに基づく動的磁歪挙動の解明と高性能化

近年,磁歪材料を利用した環境振動発電が注目を集めており,磁歪現象の構造科学的解明による発電性能の向上が期待される.本研究では,多様な微構造を有する磁歪合金薄膜を集積製作し,変動磁場下で発生するバルクハウゼンノイズ(微小な磁気ノイズ)の計測・評価を実施する.得られたノイズ波形に対する機械学習を援用したスペクトル解析により,磁歪材料の高性能化に寄与する微構造パラメータの抽出が可能となり,新たな多結晶磁歪合金の設計指針構築が実現する.近年,磁歪材料を利用した環境振動発電が注目を集めており,磁歪現象の構造科学的解明による発電性能の向上が期待される.本研究では,多様な微構造を有する磁歪合金薄膜を集積製作し,変動磁場下で発生するバルクハウゼンノイズ(微小な磁気ノイズ)の計測・評価を実施する.得られたノイズ波形に対する機械学習を援用したスペクトル解析により,磁歪材料の高性能化に寄与する微構造パラメータの抽出が可能となり,新たな多結晶磁歪合金の設計指針構築が実現する.
トランスジェニックマウス作製によるC型肝炎発症機序の解明

C型肝炎ウイルス(HCV)の遺伝子(HCV・RNA)加分離され,HCV感染個体にHCV・RNAおよびHCV関連蛋白に対する抗体の産生がみられる.HCVはヒトおよびチンパンジ-に感染するが、なお、培養細胞への感染は成功していない。HCV感染の動態,肝炎とくに慢性肝炎の発症病理の検討のため、HCV感染の動物モデルとして,HCV遺伝子導入トランスジェニックマウスの作製を行なっている。:HCV抗体陽性慢性肝炎患者血清から,RNAを抽出し,逆転写によりcDNAを作製し,HCVの構造蛋白(core蛋白および外被蛋白)を支配する構造遺伝子のcDNAを作製した。:HCV構造蛋白の肝細胞における特異的発現を目的として、HCV構造遺伝子cDNAに,プロモ-タ-/調節遺伝子として,エンハンサ-およびプロモ-タ-を含むアルブミン遺伝子を結合した。3.トランスジェニックマウスの作製:アルブミンのエンハンサ-およびプロモ-タ-を結合したHCV構造遺伝子cDNAをマウス(C_<57>B1/6)受精卵の初期胚に,マイクロインジェクションにより導入し,里親にもどし,トランスジェニックマウスの作製を現在実施している。4.今後の計画(1):マウス染色体DNAに組み込まれたHCV遺伝子の組み込まれ方,安定性を検討する。mRNAおよび構造蛋白の検索により,HCV遺伝子の発現を検討する。(2):HCV構造蛋白免疫同系マウスの液性抗体およびリンパ球を構造蛋白発現マウスへ移入し,肝炎を誘発し,標的抗原の解析を行なう。