hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
完全水溶液プロセスによる低欠陥酸化物薄膜の作製とその太陽電池応用

本研究では、大面積に安価に製膜が可能な電気化学成長法による酸化物半導体の導電性を、欠陥の導入もしくは抑制によって制御することを目的とした。理論計算から、Cu2Oの電気伝導を支配する欠陥は銅欠損もしくは格子間酸素である可能性が示されている。これらの欠陥はキャリア(ホール)の起源となる。すなわち、酸化銅としての結晶構造を維持しかつ化学量論組成から酸素過剰もしくは銅不足の状態にすることで、キャリアが増加しp型半導体としての電気電導を大きくすることが期待される。電気化学反応による酸化銅の生成過程を考えると、酸素原料として溶液中のOH-と溶存酸素の2つが考えられる。本研究課題では電解液中のそれぞれの濃度を変化させて電気化学的にCu2O薄膜を作製した。また、電気化学法では基板に導電性があることが必須であるためキャリア濃度をホール効果測定で求めることができないため、上記欠陥の濃度によって変化するとの報告がある格子定数を欠陥濃度変化の指標とした。その結果、銅イオン濃度一定のもとでOH-濃度を増加させても、また溶存酸素濃度を増加させても、得られたCu2Oの格子定数は小さくなった。これは酸素源濃度を増すことによって銅欠損等の欠陥が増加したことを示唆するものである。また、OH-濃度はおよそ9桁にわたる範囲で変化させることができ、それに対して格子定数は比較的緩やかに変化する。一方溶存酸素は高々1-2桁しか変化させ得ないが、その変化に対して格子定数は極めて急峻に変化する。今後はこの格子定数が実際に欠陥濃度の変化に起因するものであり、またキャリア密度の増大をもたらしていることを確認するため、光励起発光、DLTS、電気化学インピーダンス等の評価を進める。評価の前提となる試料作製は,ZnO, Cu_2Oともに順調に進んでいる。得られた試料の欠陥評価の足がかりとしてI-V特性と大まかな抵抗率の算出を行い、配向との相関を評価中。PLのシステムは構築がやや遅れていたが、23年度末でほぼ完了した。24年度が最終年度であるため、記入しない。電気化学成長ZnOならびにCu_2O薄膜の欠陥評価を従来の光学的評価に加え電気的特性からも評価する。また、ZnOについては太陽電池のn層のみならずi層として使用できる高抵抗薄膜の作製をめざす。Cu_2Oは異相の排除と電気抵抗の低減を試みる。試料作製は順調に進んでいるとは言えその数はまだまだ十分ではなく、今後は欠陥評価の結果を製膜条件にフィードバックさせて再結合中心等になり得る欠陥の低減を図る。また太陽電池用窓層ならびに吸収層として求められる電気伝導特性実現のために、欠陥の低減のみならず意図的な導入の方法をも探索する。
微小切り込み運動の転写現象の解析にもとづくフィードフォワード型テクスチャ加工法

工具刃先運動の工作物への転写量を調査するために,加工機の運動と工作物の形状を機上で測定する加工システムを開発した.正弦波形状の加工における刃先運動と工作物形状の全振幅比を転写率と定義し,転写率を求める方法を提案した.提案した方法により,工具と被削材をそれぞれ変化させた場合の転写率を調べた.工具では,単結晶・多結晶ダイヤモンド工具の転写率を調べた.被削材には無電解ニッケルと,より一般的な材料の中からアルミニウム合金を選択した.単結晶ダイヤモンド工具を用いて無電解ニッケルを加工した場合,転写率は0.91.1であり,刃先運動がほぼ完全に転写されていることがわかった.しかし,多結晶ダイヤモンド工具を用いて無電解ニッケルを加工した場合は,転写率が1.2程度となる場合があることがわかった.この転写率には正弦波の谷の部分の切り過ぎ・掘り起こしが大きな影響を与えていた.そこで,多結晶ダイヤモンド工具を用いた無電解ニッケルの加工において,転写量に対する切込み量,すくい角,逃げ角の影響を調べた.その結果,切り過ぎが生じたのは正弦波の谷の部分ですくい角が減少し,逃げ角が増大することが原因であると考えられる.従来では,マイクロオーダの刃先運動の形状への転写精度を調べた研究はほとんどない.このため,高精度な形状創成を行うための刃先運動の制御はどうあるべきか,また加工機の動的な設計はどうあるべきかが明らかになっていない.本研究では,刃先がマイクロオーダで運動した際の転写率はほぼ1であること示し,従来は報告されていなかった掘り起こしや切り過ぎなどの現象で転写率が変化することを発見した.工具刃先運動の工作物への転写量を調査するために,加工機の運動と工作物の形状を機上で測定する加工システムを開発した.正弦波形状の加工における刃先運動と工作物形状の全振幅比を転写率と定義し,転写率を求める方法を提案した.提案した方法により,工具と被削材をそれぞれ変化させた場合の転写率を調べた.工具では,単結晶・多結晶ダイヤモンド工具の転写率を調べた.被削材には無電解ニッケルと,より一般的な材料の中からアルミニウム合金を選択した.単結晶ダイヤモンド工具を用いて無電解ニッケルを加工した場合,転写率は0.91.1であり,刃先運動がほぼ完全に転写されていることがわかった.しかし,多結晶ダイヤモンド工具を用いて無電解ニッケルを加工した場合は,転写率が1.2程度となる場合があることがわかった.この転写率には正弦波の谷の部分の切り過ぎ・掘り起こしが大きな影響を与えていた.そこで,多結晶ダイヤモンド工具を用いた無電解ニッケルの加工において,転写量に対する切込み量,すくい角,逃げ角の影響を調べた.その結果,切り過ぎが生じたのは正弦波の谷の部分ですくい角が減少し,逃げ角が増大することが原因であると考えられる.従来では,マイクロオーダの刃先運動の形状への転写精度を調べた研究はほとんどない.このため,高精度な形状創成を行うための刃先運動の制御はどうあるべきか,また加工機の動的な設計はどうあるべきかが明らかになっていない.本研究では,刃先がマイクロオーダで運動した際の転写率はほぼ1であること示し,従来は報告されていなかった掘り起こしや切り過ぎなどの現象で転写率が変化することを発見した.
血痕から事件現場を推定する方法の開発

血中ヘモグロビンは、2価の鉄イオンを配位する磁性体であることから、血痕は地磁気により帯磁し、その磁場方向を記録している可能性がある。本研究の目的は超伝導量子干渉素子(SQUID)磁束計を用いて、帯磁した血痕の磁化方向を決定することにあった。血中のヘム鉄と同等量の鉄イオンを含有する9 mM塩化鉄(III)溶液を、地磁気の約1.5倍強さの磁場の中に置いた担体に滴下して斑痕を作製したところ、SQUID磁束計で磁化方向に矛盾しない磁気シグナル波形を得ることができた。しかし、血痕では磁気シグナルを検出することができなかった。我々が開発した超高感度SQUID磁束計を用いて、血液が担体に付着・乾燥し、血痕となる際に保存された磁場情報を検出できるか否か検討した。血痕の磁化は非常に微弱だが、血痕を左右に揺動しながら本SQUIDで測定し、さらに50回の計測データを加算平均することで、明瞭なシグナルを検出できるようになった。揺動の向きを変えると、シグナル波形は変化することから、シグナル波形は磁化方向を反映することが示唆された。当初は地上に血痕を放置して、地磁気の情報を検出することを試みていたが、フラックスゲート磁束計で実験台周辺の磁場を計測したところ、実験機器、スチール製の什器など様々な磁性体の影響を受けて、周辺の磁場に歪みが生じていることが明らかになったため、まずは基礎実験として、ソレノイドを用いて任意の強度・方向の磁場を作製した中で血痕を磁化させ計測することにした。その結果、磁石のような強磁場に曝すと瞬時に血痕は磁化するが、地磁気程度の磁場(50μT)では長時間(1晩程度)印加しないと磁化しないことが明らかになった。また、一旦微弱な磁場で磁化した血痕を強磁場に曝すと、保存されていた磁場情報は書き換えられることが明らかになった。以上から、本高感度SQUID磁束計を用いて血痕の磁化情報を計測することにより、血痕の置かれた磁場の強度や方向、周囲の環境磁場との異同(血痕が移動したかどうか)などが推定できる可能性が示唆された。当初は実験台の上で血痕を地磁気に曝し、血痕に保存される磁場情報を計測する予定であったが、実験を進めていく中で、地上には様々な磁場の歪みがあることが判明した。そこで、まずは基礎実験のために、磁気シールド内でソレノイドを利用して任意の磁場を作製し、血痕に印加することにしたため、当初の計画よりも少し遅れが生じた。前年度の実験で、我々が開発した超高感度SQUID磁束計を用いて、血痕をセンサー下で揺動させることにより、地磁気に2週間暴露(室内に放置)した血痕から磁気シグナルを得ることができた。しかし、そのシグナルの形状は再現性がなく、磁場の方向から予測される形状と矛盾するものもあった。血痕を置いた場所の磁場を測定すると、様々な磁場の歪みがあることが明らかになったことから、磁気コイルを作製し、磁場の方向や強度をコントロールした中で血痕を暴露させて実験を行なうことにした。50 μT(地磁気程度)、5mTあるいは9 mTの磁場で100 μLの血液を滴下した血痕を数時間から10日間暴露し、超高感度SQUID磁束計で計測したが、磁気シグナルは得られなかった。また、血痕にするとヘモグロビン(Hb)は直ちに反磁性体の脱酸素化Hbとなることから、亜硝酸ナトリウムで磁性体のメトHbに変化させた血痕を用いても、磁気シグナルは得られなかった。そこで、血液中の鉄量と同等の鉄イオン液を作製し、磁気シグナルを得ることができるか検証した。9 mM塩化鉄(III)の斑痕を50 μTの磁場に暴露すると、30分で磁気シグナルを得た。磁気シグナルは鉄イオン濃度依存的に大きくなった。斑痕の磁化に必要な暴露時間は約1分であり、暴露時間によるシグナル強度の差異はなかった。一旦磁化した斑痕を0 μT(磁気シールドボックス内)あるいは経験した磁場とは異なる方向の磁場に暴露すると、30分でややシグナルは衰退するが、それ以降は変化がなく、斑痕に記録された磁場情報は保持されることが明らかになった。予備実験で地磁気に暴露(室内に放置)した血痕から磁気シグナルを得たため、本研究を計画したが、血液を付着させる担体のコンタミネーションによるアーチファクトである可能性が大きくなった。血痕からは地磁気の約100倍の磁場に暴露しても磁化しないことが明らかになったが、一方、血液と同程度の鉄イオンを含有する水溶液では予想通りのシグナルを得ることができた。そこで、本年度途中で鉄水溶液を用いた実験に切り替え、血痕では磁化されない原因を追究することにした。当初の計画とは異なる実験となったが、磁場情報が記録される機序解明は意義があると考え、研究期間を1年延長することにした。血痕は傷害事件、殺人遺棄事件、ひき逃げ事件などの犯罪捜査において極めて重要な証拠資料である。しかし、出血時の状況を知り得る血痕検査としては、血痕の陳旧度の推定、血痕の形状の観察(付着の仕方)、出血量の推定などしかない。

本研究の目的は、磁性体であるヘモグロビンを含有する血液が,血痕となるときに外部磁場(地磁気)の影響を受けて磁化し、その磁化情報(方位や経緯度)を超高感度な超伝導量子干渉素子(Superconducting QUantum Interference Device: SQUID)磁束計を用いて検出できるか検討することにある。SQUIDは心磁や脳磁など、自発磁場を測定するものであるため、そのままでは血痕の残留磁化を検出することはできない。そこで、血痕をセンサー下で反復通過させるモーター装置を作製し、血痕の縁がセンサ下を通過するごと得られる磁性シグナルを加算平均したところ、残留磁化を検出できるようになった。そこで、血痕を50μT(地磁気程度)あるいは9 mTの磁場で数時間から10日間暴露したが、磁気シグナルは検出されなかった。一方、血痕の上に磁石を置き、強磁場に曝すと、数秒で明瞭な磁気シグナルを得た。また、血痕にするとヘモグロビン(Hb)は直ちに反磁性体の脱酸素化Hbとなることから、亜硝酸ナトリウムで磁性体のメトHbに変化させた血痕を用いてみたが、磁気シグナルは得られなかった。そこで、血液中の鉄量を同等の鉄イオン液(9 mM塩化鉄(III))で斑痕を作製し、磁気シグナルを得ることができるか検証した。その結果、鉄イオン液では50μTの磁場でも、約1分で斑痕を磁化することを確認した。また、磁気シグナルは鉄イオン濃度依存的であった。一旦磁化した斑痕を0μT、あるいは経験した磁場とは異なる方向の磁場に暴露しても、磁気シグナルの波形はほぼ変化せず、斑痕に記録された磁場情報は保持されることが明らかになった。血中ヘモグロビンは、2価の鉄イオンを配位する磁性体であることから、血痕は地磁気により帯磁し、その磁場方向を記録している可能性がある。本研究の目的は超伝導量子干渉素子(SQUID)磁束計を用いて、帯磁した血痕の磁化方向を決定することにあった。血中のヘム鉄と同等量の鉄イオンを含有する9 mM塩化鉄(III)溶液を、地磁気の約1.5倍強さの磁場の中に置いた担体に滴下して斑痕を作製したところ、SQUID磁束計で磁化方向に矛盾しない磁気シグナル波形を得ることができた。しかし、血痕では磁気シグナルを検出することができなかった。引き続き、ソレノイドを用いて任意の強度や方向に作製した磁場で印加した血痕を計測し、血痕の磁化と磁場強度や印加時間との相関関係、磁化情報の書き換えに必要な磁場強度等について検討する。そのために、より強い磁場を発生させるためのソレノイドを新たに作製する。また、様々な環境(車や電化製品の近くなど)の磁場を計測し、血痕の磁化に与える影響について考察し、本法が出血現場の磁場情報を推定し得るものになるか検討する。鉄イオン溶液で作製した斑痕を様々な方向の磁場に暴露し、磁場の方向が瘢痕に特徴的な磁気シグナル形状として記録されるかどうかを検討する。また、血痕では磁化されない原因について考察する。法医学血痕磁場計測を本年度に5-6回行なう予定であったが、揺動装置の改良やソレノイドの作製などが必要になり、計測が3回しか行なえなかったため、計測に用いる液体ヘリウムの購入予定費用が残った。血痕から得られた磁気シグナルが担体のコンタミネーションによることが明らかになり、血痕からは磁場情報を得ることができなかった。一方、血液と同程度の鉄イオンを含有する水溶液でs作製した斑痕からはシミュレーション通りのシグナルを得ることができた。この予想外の結果を追求するべく研究期間を延長することになったため、次年度使用額が発生した。次年度は計測回数を当初計画よりも増やす予定なので、その分の液体ヘリウム費用が必要となる。
脊椎固定手術における脊柱配列矯正が隣接椎間に与える影響

過去の当施設における頚椎固定手術症例を後向きに調査し、正常脊椎配列に固定された例と配列異常をきたして固定された症例を比較し、それらが固定隣接椎間の変性に与える影響を検討した。頚椎症や頚椎椎間板ヘルニアなどの変性疾患に対して施行した前方除圧固定術後5年以上経過して追跡できた42例について、画像診断において評価した。平均追跡9.8年で、頚椎全体が後弯や逆S状位をとるmalalignment症例12例中9例に、また固定椎間が後弯位に固定された13例中10例にそれぞれ固定隣接椎間の明らかな変性進行が認められ、それは頚椎の生理的前弯位が保持されたまま固定された症例に比べて統計学的に有意に多かった(Fischers exact method)。つまり、脊椎固定手術において配列以上をきたして固定が成された場合、長期的に固定隣接椎間の変性が促進されることが判明した。過去の当科における脊椎固定手術症例(頚椎)を、retrospectiveに調査し、正常脊椎配列に固定されたものと、配列異常をきたして固定されたものを比較し固定隣接椎間の変性に与える影響を検討した。頚椎症や頚椎椎間板ヘルニアなどの変性疾患に対して施行した前方除圧固定術後5年以上経過して追跡できた42例についてX線学的に評価した。その結果、頚椎全体が後弯や逆S状位などのmalalignment症例12例中9例に、また固定椎間が後弯位に固定された13例中10例に、それぞれ固定隣接椎間の変性進行が認められ、それは、頚椎の生理的前弯位が保持されたまま固定された症例に比べて有意に多かった。つまり、脊椎固定手術において配列異常をきたして固定が成された場合、長期的に固定隣接椎間の変性が、促進されることが判明した。
非対称照明を用いた道路照明による横断歩行者事故防止に関する研究

本研究では、一般に広く使われている対称照明と比較し、プロビーム照明下における歩行者視認性のメリットを明らかにすることを目的に、対称照明と簡易プロビーム照明をテスト走路に設置し、実験参加者12名による車内から歩行者を視認させる実験を実施した。理想配光に近い簡易プロビーム照明を製作し、実験に使用した。実験時は霧雨で路面が若干湿った状態であった。評価実験の結果、プロビーム照明は対称照明に比べて歩行者を視認しやすく、また視認距離や車両と歩行者の位置関係による影響も小さいことが分かった。道路上の歩行者を視認する上で、プロビーム照明は潜在的に高い性能を有することが示唆された。本研究では、対称照明を用いた道路照明が提供する視環境の課題を踏まえ、非対称照明、特にプロビーム照明とすることによる道路の視環境改善について検討した。プロビーム配光の道路灯の目標路面輝度分布を設定し、具体的な配光を決定し、視環境シミュレーションを実施した。その中で、走行車線の路面輝度、走行車線と歩道の鉛直面照度、走行車線・対向車線・歩道のグレア(TI値)を求めた。道路照明をプロビーム照明とすることによって,道路空間全体が明るくなったい暗くなったりすることがなく、鉛直面照度が20lx前後となり,ドライバから見て道路上の対象物を発見しやすい視環境を提供できることがシミュレーションからわかった。特に,ドライバから見て,歩道の鉛直面照度が高く、道路を横断する前の歩行者を認知しやすくなる点はメリットと言えた。しかし,歩道の歩行者がまぶしく感じる、対称照明の倍の道路灯を設置する必要があるなど、デメリットもあった。ただし、ここで試行したプロビーム照明の配光は、多数ある中で任意に決めたものであり、最適化を行ったものではない。多様な視認対象物と多様な道路利用者が共存する道路空間の中で,全体を一様に明るくする道路照明は,いろいろな意味で大切な役割を担っている.しかし,道路照明を設置することはヘッドライトとの融合が起きる.本研究では,道路の進行方向側にビームを向けるプロビーム方式となる配光技術を道路照明で実現し,ヘッドライトと調和できる道路全体を逆シルエット視となる方式(配光)の道路灯を提案した.これによって,歩行者と道路照明装置の位置関係によってその視認性が一定とならない課題を克服し,かつ歩行者の被視認性レベルを高めることが可能となることを示した.既存の灯器を応用したプロビーム照明を使い,テストコースにおけるドライバによる歩行者視認性評価実験を平成27年度の秋に行った。対称照明と比較し,プロビーム照明の歩行者視認性のメリットを明らかにすることを目的とした。本実験では,屋外のテストコース(片側2車線)にて3本の照明ポール(8m)を32m間隔に設置した。各々のポールに対照照明とプロビーム照明を設置し、切り替えて両者の比較を行った。プロビーム照明専用の灯具はないため、既存の灯器を用い理想のプロビーム照明に近い配光を実現した。歩行者として、高さ165cm・最大幅80cmの歩行者を模擬したダンボール製自立式の人形を作成した。人形には黒色の紙(反射率8%)と灰色の紙(反射率23%)を用いた。照明ポールの位置と車両の位置を相対的に変化させ、人形の視認性がどのように変化するのかをプロビーム照明と対照照明で計測した。車両から人形までの距離は22m,44mとした。実験参加者はロービームを点灯している車内から人形の視認性を評価した。車両に乗って、歩行者視認性を評価した実験参加者は12名である。実験参加者はランダムに提示される人形を見てその全体の視認性を7段階で評価した。ただし、実験時に霧雨となり、路面が若干湿った状態であった。視認性評価実験の結果、プロビーム照明下において、左歩道を除き人形の視認性評価は「やや見えやすい」から「見えやすい」となった。プロビーム照明による視認性は、人形の反射率にかかわらず対照照明と同様あるいは高くなった。また、対称照明下に比べプロビーム照明下では照明のポールと車両の位置関係によって視認性の変化が少ない結果となった。本実験で用いたプロビーム照明は、既存の灯具を組み合わせ理想のプロビーム配光に近づけたものである。このような試作であっても、プロビーム照明による潜在性能の高さを示すことができた。本研究では。街路の夜間における道路上の歩行者の視認性を高めることを目的とし、これまでと正反対の照射方法を道路照明で採用することを試みる。これまでの道路照明(対照照明)は、路面を明るくする。このとき路面上の歩行者は路面より暗い。明るい路面と暗い路面上の歩行者の対比が視認性の原理となっている。これに対し、本研究で検討するプロビーム照明ではヘッドライトと同様に車両の進行方向に道路照明を照射する。暗い路面と明るい路面上の歩行者との対比が視認性の原理となっている。歩行者が「明」で安定して見えることから、夜間における横断者との事故の軽減に資すると考えられる。平成26年度、プロビーム照明の配光を提案し、光学シミュレーションにて歩行者の視認性を検討した。最初にプロビーム照明の配光を設計した。

配光を設計するため、対向車のグレアを小さくしかつ歩行者の視認性を高くする路面理想輝度分布を想定し、それから水平面照度分布を求め、照明器具の目標配光を決定した。目標配光から路面輝度分布を再計算し、再計算した路面輝度分布が前述の路面理想輝度分布となるまで繰り返し計算した。このようにして決めた配光によるプロビームを設定し、ロービームを点灯した条件で、歩行者の鉛直面照度とコントラストを求めた。同様な条件の対照照明条件に比べ歩行者の視認性を安定して高くできる結果と得た。次に、平成27年度、光学シミュレーションの結果を実際の道路で検証することにした。平成26年度の配光に近いプロビーム照明を既存の灯具を用いて作成し、実験参加者による歩行者視認性実験を実施した。ただし、費用の制約もあり、片側1車線のみを対象とした。研究実績の概要に記したように、テストコースにおける実験でも光学シミュレーションと同様、対照照明より歩行者の視認性は同等以上となり、かつ安定した視認性を提供できることが明らかとなった。街路の夜間における道路上の歩行者の視認性を高めることを目的とし、プロビーム照明による路上の歩行者視認性に関する基礎的検討を試みた。本研究では、プロビーム照明において対称照明より歩行者の視認性は同等以上となり、かつ安定した視認性を提供できることを視認性実験で検証する。具体的には、理想配光に近い簡易プロビーム照明を既存の灯具を用いて作成し、歩行者視認性実験を実施した。既存の灯具を基に製作した簡易プロビーム照明を用いて、テスト走路におけるドライバによる歩行者視認性評価実験を行った。歩行者を模擬したダンボール製自立式の人形を作成し、人形には黒色の紙(反射率8%)と灰色の紙(反射率23%)を貼った。照明ポールの位置と車両の位置を相対的に変化させ、ヘッドライト(ロービーム)を点灯した条件で人形の視認性がどのように変化するのかをプロビーム照明と対称照明で測定した。視認性評価および鉛直面照度の測定結果から、対称照明条件下に比べてプロビーム照明条件下では人形の視認性が高く、かつ照明のポールと車両の位置関係によって視認性の変化が少ないことが示された。また、反射率8%でも、プロビーム照明条件による視認性は、対称照明条件と同様あるいはそれ以上であった。既存の灯具を組み合わせて理想のプロビーム配光に近づけた簡易プロビーム照明による実験となったが、プロビーム照明方式の潜在性能の高さを示すことができたと。本研究では、一般に広く使われている対称照明と比較し、プロビーム照明下における歩行者視認性のメリットを明らかにすることを目的に、対称照明と簡易プロビーム照明をテスト走路に設置し、実験参加者12名による車内から歩行者を視認させる実験を実施した。理想配光に近い簡易プロビーム照明を製作し、実験に使用した。実験時は霧雨で路面が若干湿った状態であった。評価実験の結果、プロビーム照明は対称照明に比べて歩行者を視認しやすく、また視認距離や車両と歩行者の位置関係による影響も小さいことが分かった。道路上の歩行者を視認する上で、プロビーム照明は潜在的に高い性能を有することが示唆された。本研究では、対称照明を用いた道路照明が提供する視環境の課題を踏まえ、非対称照明、特にプロビーム照明とすることによる道路の視環境改善について検討した。プロビーム配光の道路灯の目標路面輝度分布を設定し、具体的な配光を決定し、視環境シミュレーションを実施した。
種苗生産廃水の環境負荷低減効果からみた新しいワムシ培養システムの比較

海産魚種苗生産工程からの廃水のうち、汚濁物質の量、濃度ともに高い値を示すのは海産ワムシの培養廃水であるが、その培養は、ワムシの生態・生理面で十分な解析のないまま対症療法的な実用化・技術化が急速に進んだことが裏目に出て、汚濁負荷軽減に最適なシステムを選択する際に生物学的な情報の不足が最大のネックとなっている。そこで本研究では、従来誰も顧みなかった海産ワムシ個体群が持っている「増殖の内在リズム」を、ケモスタット装置により12時間ごとの個体数と残餌密度から検出し、システムの構成以前に考慮すべき問題、また管理方法改良以前に検討すべき事項の有無を精査した。また、急速に普及し始めた海産ワムシの簡易ケモスタット式連続培養が今後は、ホンモロコおよびニゴロブナなど淡水魚の種苗生産で用いられる淡水ワムシにも普及することを予測し、試験研究機閑の持つ1トン衰置で、最適な運転条件等、管理手法を詳細に検討した。その結果、海産ワムシBrachionusplicatillsでは、培養槽への給餌量が一定であるにも関わらず周期的な個体群サイズの変動が検出され、反対にB.rotundiformisでは、近縁種であるにも関わらず、そのような周期的な変勤は起こらなかった。種苗生産現場では、両種を同じプログラムで管理することが多く、内的リズムを無視していることが培養の好不調を招いていることが証明された。一方淡水種B.calyciflorusは、上記海産2種と近縁、かつサイズもB.rotundiformisと酷似しているが、海産種よりも培養槽中のアンモニア、低酸素など一般的な環境抵抗に対する耐性の低いことが明らかになったため、その数値を基に海産ワムシのケモスタット式連続培養の管理手法とは異なる運転指針を作成した。海産魚種苗生産工程からの廃水のうち、汚濁物質の量、濃度ともに高い値を示すのは海産ワムシの培養廃水であるが、近年ワムシの培養技術は突然に多様化し始め、むしろ、各生産機関の実態に見合った汚濁負荷軽減に最適なシステムを選択するうえで一種の混乱状況を招く事態にもなっている。そこで17年度は、従来誰も顧みなかったワムシ個体群が持っている「増殖の内在リズム」を検出し、システムの構成以前の問題、また管理方法改良以前に検討すべき事項の有無を精査することにした。生態学的研究に最適とされているケモスタット式連続培養装置を構築し、12時間ごとに個体数と残餌密度を計測した結果、Brachionus plicatilisでは、培養槽への給餌量が一定であるにも関わらず周期的な個体群サイズの変動が検出された。一方、B.rotundiformisでは、近縁種であるにも関わらず、そのような周期的な変動は起こらなかった。個体密度の計数誤差が統計的解析時にノイズとなるケースが多く、困難を極めているが、さらに他のストレイン、個体の大きさに関する変異株なども用いて、給餌量との関係、環境要因との関係にまで実験範囲を拡大する予定である。海産魚種苗生産工程からの廃水のうち、汚濁物質の里、濃度ともに高い値を示すのは海産ワムシの培養廃水であるが、その培養は、ワムシの生態・生理面で十分な解析のないまま対症療法的な実用化・技術化が急速に進んだことが裏目に出て、汚濁負荷軽減に最適なシステムを選択する際に生物学的な情報の不足が最大のネックとなっている。

そこで本研究では、従来誰も顧みなかった海産ワムシ個体群が持っている「増殖の内在リズム」を、ケモスタット装置により12時間ごとの個体数と残餌密度から検出し、システムの構成以前に考慮すべき問題、また管理方法改良以前に検討すべき事項の有無を精査した。また、急速に普及し始めた海産ワムシの簡易ケモスタット式連続培養が今後は、ホンモロコおよびニゴロブナなど淡水魚の種苗生産で用いられる淡水ワムシにも普及することを予測し、試験研究機関の持つ1トン装置で、最適な運転条件等、管理手法を詳細に検討した。その結果、海産ワムシBrachionus plicatilisでは、培養槽への給餌量が一定であるにも関わらず周期的な個体群サイズの変動が検出され、反対にB.rotundiformisでは、近縁種であるにも関わらず、そのような周期的な変動は起こらなかった。種苗生産現場では、両種を同じプログラムで管理することが多く、内的リズムを無視していることが培養の好不調を招いていることが証明された。一方淡水種B.calyciflorusは、上記海産2種と近縁、かつサイズもB.rotundiformisと酷似しているが、海産種よりも培養槽中のアンモニア、低酸素など一般的な環境抵抗に対する耐性の低いことが明らかになったため、その数値を基に海産ワムシのケモスタット式連続培養の管理手法とは異なる運転指針を作成した。
感染による甲状腺遺伝子発現パターン変化と自己免疫発症との因果関係に関する研究

甲状腺においては、ウイルス感染症に引き続いて亜急性甲状腺炎を発症し、さらにバセドウ病へと進展する症例も報告されているが、自己免疫疾患の発症における感染や組織傷害の関与は未だ明確になっていない。バセドウ病患者の濾胞上皮細胞に主要組織適合性抗原(MHC)class IIの異常発現が報告され、実験的にもMHCと甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)をともに誘導した線維芽細胞でマウスを免疫するとバセドウ病が発症することが確認され、MHC異常発現が自己免疫発症の引き金になる可能性が強く示唆されている。我々は本研究において、感染や組織傷害にともなって、病原体や宿主細胞のゲノムから遊離・放出される二本鎖DNA(dsDNA)などの核酸成分が、甲状腺細胞などの自己免疫標的組織にI型インターフェロンや炎症性サイトカイン、ケモカインなどの分泌を誘導するとともに主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)を初めとする様々な遺伝子発現を誘導し、in vivoで強いアジュバント作用を有することを示した。また、病原体構成成分を認識し自然免疫系を活性化する役割を担うToll様受容体が甲状腺濾胞上皮細胞や肥満細胞に機能的に発現することを示した。特に2本鎖RNA(dsRNA)やLPSによって自然免疫系が活性化するとともに、ヨードの取込みや甲状腺ホルモンの合成・分泌などの甲状腺内分泌機能は抑制される事が明らかとなった。これらのことから、感染を契機として、甲状腺機能低下を来すとともに、自然免疫系が活性化されることによってアジュバント効果が高まり、最終的に甲状腺自己抗原の提示とそれに対する抗原特異的獲得免疫系の発動を誘導して自己免疫を発症する誘因ともなる可能性が示唆された。感染に伴う甲状腺細胞の遺伝子発現変化が自己免疫発症の病因とどのように関わるかについて明らかにする目的で、甲状腺機能を最もよく維持している培養細胞であるFRTL-5を用いて以下の検討を行った。FRTL-5にヒト単純ヘルペスウイルス(HSV)を感染させると、主要組織適合性抗原(MHC)の発現が増強したが、サイログロブリン(Tg)の発現はmRNAレベルで減少し、これは、HSVゲノムDNA断片を細胞にトランスフェクションすることによって再現された。種々のDNAを用いた検討により、二本鎖DNA(dsDNA)特異的に、しかしその由来や塩基配列とは無関係に、MHC class I発現増強、MHC class II発現誘導などとともに、Tgの発現量抑制作用があることが明らかとなった。Tg発現抑制は、dsDNAの長さや容量依存性であり、刺激後72時間まで時間とともに顕著となった。また、FRTL-5細胞に電気パルスによる細胞傷害を与えると、自己DNAの漏出とともにMHC発現増強、Tg発現抑制が引き起こされた。IFNγは、FRTL-5にMHC class IIを強く誘導したが、Tg発現をごく軽度抑制したのみであった。dsDNAにより甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)やヨードトランスポーター(NIS)の発現も軽度減少したが、TSH受容体(TSHR)の発現量はほとんど変化しなかった。これらの現象は、感染やそれに伴う組織傷害時にdsDNAによって甲状腺細胞に抗原提示能が誘導されるが、その際、強い自己抗原であるTg発現を抑制することによる自己防御反応の一つと考えられる。また、その際、TSHR発現量はあまり変化しなかったことから、これが自己抗原としてリンパ球に提示される確率が増し、バセドウ病発症へとつながる可能性が推察された。感染によってもたらされる二本鎖RNA(dsRNA)や非メチル化CpG DNAは、Toll様受容体(TLR)によって認識され、自然免疫発動に重要であることが明らかとなった。そこで、甲状腺細胞自身が自然免疫能を有するか否かを明らかにする目的で、甲状腺細胞におけるToll様受容体の発現と機能について検討した。ラット甲状腺FRTL-5細胞を用いてRT-PCRを行ったところ、複数のTLR mRNAが確認された。

それらが実際に機能しているかどうかを検討するために、FRTL-5細胞にNFκB依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびIFNβプロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入した後に、各TLR特異的リガンドで刺激したところ、TLR3リガンドであるdsRNAでこれらが活性化することが判明した。このTLR3活性化が与える甲状腺機能への影響を検討する目的で、ヒト甲状腺濾胞培養をdsRNAで刺激すると、濾胞内への放射性ヨードの取込みおよび有機化されたヨードの培養液中への放出が有意に抑制された。LPSやPGNなど他のTLRリガンドにはそのような作用はみられなかった。我々は既に、甲状腺細胞はdsRNAやdsDNAに反応することによって抗原提示能を誘導されることを報告しているが、今回の検討により、dsRNAの作用の一部はTLR3を介したものであること、および、dsRNA刺激が甲状腺機能に対しては抑制的に働くことが明らかとなった(投稿準備中)。我々はこれまでに、感染や組織傷害にともなって放出される二本鎖DNA(dsDNA)が、自己免疫標的臓器である甲状腺細胞などに主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)を初めとする様々な遺伝子発現を誘導し、in vivoで強いアジュバント作用を有することなどを示した。これらのことから、dsDNAによる作用が自己免疫発症誘因の一つである可能性が考えられたが、その詳細は不明であった。本年度は、まずdsDNAによってI型インターフェロンやケモカインなど、自然免疫活性化の際と同様の遺伝子発現が誘導されることを証明した。病原体由来の核酸による自然免疫活性化は、非メチル化CpG DNAやdsRNAがToll様受容体(TLR)やRIG-Iなどによって認識されることで開始される。ところが今回我々は、dsDNAの作用はTLRやRIG-Iを介さない未知の機構によることを明らかにするとともに、右巻き二本鎖構造をとるB-DNAに特異的であることを示した。さらにdsDNAは、TBK1とIKKiやIPS-1などのアダプター分子を介して、NF-κBやIRF3などの転写因子を誘導し、最終的にType I IFNの転写を誘導するという経路を示した。dsDNAは、多くの病原体とともに自己細胞にも豊富に存在することから、組織の変性、傷害時に漏出することによって、より普遍的な内因性アジュバントとして様々な免疫反応の局面で重要な役割を果たしていることが考えられた。我々はこれまでに、感染や組織傷害にともなって、病原体や宿主細胞のゲノムから遊離・放出される二本鎖DNA(dsDNA)などの核酸成分が、自己免疫標的臓器である甲状腺細胞などにI型インターフェロンや炎症性サイトカイン、ケモカインなどの分泌を誘導するとともに主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)を初めとする様々な遺伝子発現を誘導し、in vivoで強いアジュバント作用を有することなどを示した。それらの研究過程でToll様受容体(TLR)のリガンドが甲状腺機能に影響を与えることを認めたところから、今年度はこの機序を中心に検討を行った。
網膜機能のシステム的理解

網膜は光受容器であるとともに、視細胞が捕らえた視覚情報から像の形、色、動きなどの情報を階層的に処理して抽出する神経組織である。最近の研究によって、視細胞→双極細胞→神経節細胞へとつながる縦の回路については理解が進んだ。しかし、アマクリン細胞など横の回路の動作に関しては不明な点が多い。そこで本研究ではアマクリン細胞の機能に注目し、単離培養したアマクリン細胞の脱分極性電流注入による膜電位応答と活動電位発生の特性を調べ、そのメカニズムとなる電流を解析した。また、細胞体と樹状突起に同時パッチクランプ法を行い、活動電位がどのように樹状突起に伝わるかを記録した。ラット新生仔(出生後2日以内)の網膜からアマクリン細胞を単離培養し、倒立顕微鏡下で、ホールセルパッチクランプ法を適用し、膜電位および電流記録を行った。アマクリン細胞の同定はこの細胞に特異的に発現しているHPC-1/Syntaxinに対する抗体と、アマクリン細胞が伝達物質としてもつGABAに対する抗体の二重免疫染色により行った。その結果、アマクリン細胞は一過性のNa^+電流の他に持続性Na^+電流と、L-およびN-型のCa^<2+>電流を持つこと、これらの持続性電流がシナプス入力を増強していることが見出された。また、活動電位の発生部位と伝導様式を明らかにするために、細胞体と樹状突起への同時ホールセルパッチクランプ記録を行い電位変化を記録した。脱分極性の電流注入を細胞体もしくは樹状突起に対して行ったところ、活動電位が細胞体でも樹状突起でも記録された。また、細胞体で記録された活動電位の波形で電位固定し、活動電位をシミュレートし樹状突起で記録される活動電位のTTX感受性を調べたところ、TTXによって樹状突起で記録される活動電位が小さくなった。このことから、活動電位の樹状突起への広がりには、TTX感受性のI_<Nap>が関与しているものと考えられた。
プロテアソームの発現機構の解明とアンチエイジングへの応用

老化の原因として、加齢に応じたタンパク質分解酵素プロテアソームの機能低下があげられる。プロテアソームが機能低下すると、細胞内に変性タンパク質が蓄積し、その機能が破綻する。したがってプロテアソーム活性あるいは発現を維持できれば老化予防(アンチエイジング)が可能になる。しかしながら、これまでプロテアソームの発現機構やその転写因子すら解明できていなかった。最近申請者らは、転写因子Nrf1がプロテアソームの誘導的発現を制御していることを見出し(Tsuchiya Y. (2011) Mol Cell Biol)、研究のきっかけを掴んだ。そこで本研究では、(1)プロテアソームの構成的・誘導的な発現機構と(2)細胞のアンチエイジングにつながるNRF1によるタンパク質恒常性機構の全容解明を目的とする。まず(1)については、NRF1と関連因子NRF3がガン細胞においてプロテアソーム遺伝子の構成的発現を協調的に制御していることを明らかにした。さらにNRF3は翻訳制御因子CPEB3を誘導することで、NRF1タンパク質の翻訳を抑制していることを見出した。このようにNRF1とNRF3の複雑な協調作用によりプロテアソームの活性を維持し細胞のタンパク質恒常性をもたらしていた。次に(2)については、NRF1が選択的オートファジーに関わるGABARAPL1を誘導することを発見した。現在、GABARAPL1誘導における生理機能を解析中であるが、選択的オートファジーを介したNRF1の新たなタンパク質恒常性機構につながることが期待される。以上の知見は、タンパク質恒常性維持による細胞のアンチエイジング法の開発に対して重要な知見を与える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。老化の原因の1つとして、タンパク質分解酵素プロテアソームの機能低下があげられる。プロテアソーム活性が低下すると、変性タンパク質が蓄積し細胞機能が破綻する。したがってプロテアソーム発現を維持できれば老化予防(アンチエイジング)が可能になる。最近申請者らは、この問題を解明する基礎データとして、転写因子Nrf1がプロテアソームの誘導的発現を制御していることを見出した(Mol Cell Biol (2011))。つまりNrf1の活性を制御することで、加齢に応じたプロテアソーム活性の低下を抑制し、ひいてはアンチエイジングをもたらすことが強く期待される。ところでNrf1は通常小胞体にアンカーされ核移行が阻害されていることから、転写因子としての機能は阻害されている。したがってNrf1は誘導的転写因子であり、それゆえにプロテアソームの発現を誘導的に制御するわけである。しかしNrf1がどのような刺激で活性化し核移行するのか、どのようにプロテアソーム遺伝子を発現制御するのかは不明である。さらにNrf1を誘導することで加齢に応じたプロテアソーム活性を相補できるのか、マウス個体レベルでは検証されていない。そこで以上の観点から、本研究では下記の問題について解析する。(1)細胞レベルでのNrf1によるプロテアソーム誘導のアンチエイジング効果の検証(2)プロテアソーム誘導を引き起こすNrf1活性化機構の解明とNrf1活性化物質の同定(3)マウス個体レベルでの加齢に応じたプロテアソーム活性低下とNrf1の機能連関現在までに、Nrf1によるプロテアソーム遺伝子の発現機構について、いくつか解明されつつある。(1)Nrf1活性化機構の解析通常Nrf1は小胞体にアンカーされており核移行が阻害されることで、転写因子としての機能が抑制されている。したがってNrf1が核移行するためのメカニズムならびにNrf1の核移行をもたらす活性化シグナルが存在するはずである。最近、Nrf1が核移行するためにはタンパク質切断酵素DDI2が必要であるという報告がなされたが(Koizumi (2016) eLife)、実際その追試に成功した。さらにDDI2によるNrf1の切断には、ユビキチン結合酵素HRD1によるNrf1のユビキチン化が必要である可能性を見出した。したがってNrf1がDDI2によるタンパク質切断を受けて核移行するためには、Nrf1のユビキチン化後にDDI2により切断を受けるか、あるいはプロテアソームによりタンパク質分解されるのかという制御メカニズムが存在する可能性を見出した。(2)Nrf1による遺伝子発現機構の解析Nrf1によるプロテアソーム発現機構を解明する目的で、網羅的にNrf1結合因子を同定するプロテオーム解析を行い、エピジェネティック制御因子HCF1を同定した。さらにHCF1がNrf1によるプロテアソームの発現に関わることを、RNA干渉法のノックダウン実験で確認した。ところで、プロテアソームは33サブユニットから構成される巨大タンパク質複合体であり、これらは33遺伝子座から転写されるという特徴をもつ。これだけの多数の遺伝子群を同時に過不足なく発現制御するためには、一般的な転写制御機構をは異なるメカニズムの存在が想起される。このメカニズムにHCF1によるエピジェネティック制御が存在すると仮説を立て、今後研究を進めていく予定である。逆にプロテアソームを過剰発現させた線虫は、寿命が延長されることが知られている。

しかしながら、これまでプロテアソームの発現機構やその転写因子すら解明できていなかった。最近申請者らを初めとする複数のグループが、この問題を解明する基礎データとして、転写因子Nrf1がプロテアソームの誘導的発現を制御していることを見出した(Mol Cell (2010), Mol Cell (2010), Mol Cell Biol (2011))。つまりNrf1の活性を制御することで、加齢に応じたプロテアソーム活性の低下を抑制し、ひいてはアンチエイジングをもたらすことが強く期待される。本年度は、以下の点について解明することができた。(1)タンパク質品質管理におけるNRF1の遺伝子発現ネットワークの解明NRF1が制御するプロテアソームをはじめとする標的遺伝子を網羅的に解明するために、ChIP-seq解析とマイクロアレイ解析を行い、NRF1が直接転写誘導している遺伝子を複数同定することに成功した。(2)関連因子NRF3によるタンパク質分解機構の発見NRF3は20Sプロテアソームの遺伝子発現というよりも20SプロテアソームのアセンブリシャペロンUMP1遺伝子を誘導することで、20Sプロテアソームを活性化することを見出した。(1)タンパク質品質管理におけるNRF1の遺伝子発現ネットワークの解明NRF1が制御するプロテアソームをはじめとする標的遺伝子を網羅的に解明するために、ChIP-seq解析とマイクロアレイ解析を行った。ChIP-seq解析では、ヒト大腸ガン由来HCT116細胞とNRF1抗体によりNRF1が結合した領域を単離し次世代シークエンスにより遺伝子座を同定することに成功した。さらにマイクロアレイ解析ではプロテアソーム阻害剤によりNRF1を安定化させることで発現上昇した遺伝子群を同定した。これら両解析から抽出された遺伝子データを統合し、NRF1が直接転写誘導している遺伝子を複数同定することに成功した。これらNRF1標的遺伝子群の中には、プロテアソームのみならず、様々な生命現象に関わる遺伝子が含まれている。現在、各遺伝子の吟味とタンパク質品質管理ならびにアンチエイジングとの関連を精査中である。(2)関連因子NRF3によるタンパク質分解機構の発見NRF1が属するCNCファミリー転写因子群には酸化ストレス応答で有名なNRF2と申請者が世界に先駆けて発見したNRF3が存在する。すでにNRF2は酸化ストレス下でのプロテアソーム遺伝子の発現に関わることが知られているが、NRF3については不明なままであった。今回、NRF3もまたプロテアソーム遺伝子群の制御に関わる可能性を見出したが、NRF3は20Sプロテアソーム特異的であった。さらに精査したところ、NRF3は20Sプロテアソーム遺伝子というよりも20SプロテアソームのアセンブリシャペロンUMP1遺伝子を誘導することを見出した。この生理機能の意義をガン発症過程において見出しており、本研究の新たな展開を見せている。
細胞内シグナル応答型薬物および遺伝子送達システムの開発と新規薬物送達概念の創製

細胞内プロテインキナーゼとしてAキナーゼに応答する薬物カプセルと遺伝子キャリヤー、及び細胞内プロテアーゼとしてカスパーゼ3に応答する遺伝子キャリヤーについて、詳細に検討した。Aキナーゼ応答型薬物カプセルでは、基質ペプチドにPEGを連結させたマクロモノマーを開発し、これとイソプロピルアクリルアミドを共重合することで、これまでより表面基質濃度を高くしたナノカプセルの開発に成功し、極めて応答性の良い薬物内包カプセルを実現できた。Aキナーゼ応答型の遺伝子キャリヤーとしては、種々の分子設計上の検討を行ない、DNAとの複合体の粒径の調節や、溶液での安定化に成功した。この複合体をセンダイウイルスのエンベロップに封入する手法を用いて細胞へ導入する手法を確立し、細胞を薬物刺激してAキナーゼを活性化させたときにのみ、遺伝子を発現させることに成功した。各種薬物で刺激した細胞内のAキナーゼ活性を、プロモータアッセイにより評価し、本システムでの遺伝子制御と比較したところ、細胞内Aキナーゼの活性と導入遺伝子の発現量は完全に相関し、確かに細胞内Aキナーゼにより遺伝子発現が制御されていることを確認した。また、これらの基質や細胞内のAキナーゼ活性を質量分析法を用いて評価するための独自のアッセイ系を確立した。さらに、このシステムを利用してRhoキナーゼに応答するキャリヤーの開発にも成功した。これは循環器疾患への適用を目指したものであり、これを評価するために、血管障害を診断できるシステムとして新しい血管造影剤の開発も手がけて成功した。カスパーゼ3に応答するキャリヤーについては、高分子鎖の疎水性、及び、ペプチド配列の荷電や生化学的性質を種々変化させた様々なキャリヤーを開発し、その遺伝子発現制御能と細胞導入効率を検討して、分子設計の基本理念を確立した。遺伝子制御は、細胞内でも可能であった。この概念を応用してHIVプロテアーゼに応答するキャリヤーも開発し、感染細胞特異的な遺伝子制御に成功した。Aキナーゼ応答型薬物カプセルでは、基質ペプチドにPEGを連結させたマクロモノマーを開発し、これとイソプロピルアクリルアミドを共重合することで、これまでより表面基質濃度を高くしたナノカプセルの開発に成功した。Aキナーゼ応答型の遺伝子キャリヤーとしては、これまで基質ペプチドとアクリルアミドを共重合したものを開発してきたが、細胞導入効率が悪かったため、基質ペプチドに細胞膜透過型のTat配列をジスルフィド結合で連結したキャリヤーを合成した。このキャリヤーは、細胞内に遺伝子を導入後、細胞内のグルタチオンでTat部分が除去されることを狙ったが、細胞内への導入率向上は顕著でなかった。そこで、センダイウイルスのエンベロップに封入する手法を用いてキャリヤーと遺伝子の複合体を細胞へ導入する手法を検討したところ、細胞内に導入が可能であり、しかも、細胞を薬物刺激してAキナーゼを活性化させたときにのみ、遺伝子を発現させることに成功した。また、これらの基質や細胞内のAキナーゼ活性を評価するための独自のアッセイ系を確立した。カスパーゼ3に応答するキャリヤーについては、高分子鎖の疎水性、及び、ペプチド配列の荷電や生化学的性質を種々変化させた様々なキャリヤーを開発し、その遺伝子発現制御能と細胞導入効率を検討したところ、疎水性を向上した高分子では、単純なカチオン性ペプチド配列であっても細胞へ導入されるが、親水性高分子では、導入するペプチドに膜透過能が必須であった。

また、遺伝子制御能は、多くの組み合わせで問題なく見られたが、カチオン部位がオリゴアルギニンでのみ、タンパク合成系に対する毒性が見られた。また、細胞へ導入されたキャリヤー-遺伝子複合体は、いずれも細胞内でもカスパーゼ3により遺伝子発現制御が可能であった。全年度開発したプロテインキナーゼA(PKA)応答型キャリヤーを用いて、高分子主鎖の疎水性やPEGの導入などの検討を行ない、非常に安定かつ粒子径の小さな遺伝子とのナノ複合体を形成可能なキャリヤーの開発に成功した。また、細胞内での遺伝子発現制御が、確かにPKAによるものであることを確かめるために、細胞を各種薬物で刺激し、PKAで活性化するCREプロモータを組み込んだ遺伝子を別途細胞に導入した系を用いることで、細胞内PKA活性と本キャリヤーでの遺伝子発現制御の相関を検討した。その結果、確かに本システムが細胞内で活性化されたPKAにより遺伝子発現を制御していることが証明された。また、プロテアーゼ応答型キャリヤーとして、あらたにHIVプロテアーゼ応答型キャリヤーを開発した。この場合、基質ペプチドと主鎖を連結するリンカー部位の構造にフレキシブルなトリエチレングリコール鎖を組み込むとよい応答を示すことを見出し、まず、ゲル電気泳動、無細胞発現系で,実際にHIVプロテアーゼに応答した遺伝子発現制御が転写レベルで可能であることを確かめた。さらに、本システムをHIV感染細胞に適用し、ウイルス感染細胞特異的な遺伝子発現を実現することに成功した。さらに循環器系疾患への応用を目指し、Rhoキナーゼ応答型キャリヤー開発のための基質ペプチドの設計を試み、実際にRhoキナーゼ特異的にリン酸化される、優れた基質の設計に成功した。また、循環器疾患への遺伝子治療の適用のために、血管疾患部位を診断・評価できるシステムが必要になり、新たに、血管傷害部位を特異的に検出できる新しい造影剤の開発に成功し、実際にラットの内皮傷害部位を検出することに成功した。
肺癌治療の新しい分子標的としてのRhoGEF活性化機序の検討

低分子量GTP結合蛋白質Rhoは種々の細胞内シグナルの下流で細胞骨格、遺伝子発現、細胞分裂など広範な細胞機能を制御し、これらを通して細胞の癌化、転移に深く関与している。細胞の癌化、転移においてはRho自体の発現が亢進すること以上にRhoの活性化亢進が重要であると考えられる。従ってRhoの活性化因子であるGDP/GTP交換反応促進因子guanine nucleotide exchange factor(RhoGEF)の発現、とそれによるRho活性化状態の解析は癌の発生、転移機序の解明ならびに新しい分子標的療法の開発に結びつくことが期待される。私は平成15年度研究で肺癌細胞株におけるRhoGEFの発現状態とRhoの活性化状態を検討し、RhoGEF発現量は各種肺癌細胞株では由来組織に関わらずLARGがもっとも強く、次にp115-RhoGEFで、PDZ-RhoGEFは弱いこと、ならびにRhoの活性化は小細胞肺癌細胞で特に高いことを明らかにした。平成16年度研究では小細胞癌で見られるRhoの活性化亢進について検討した。小細胞癌のautocrine的な成長因子としてGRPが知られていることから小細胞肺癌細胞株H69を用いて、GRP-G蛋白供役受容体-RhoGEF-Rhoの経路の検証を行い、本細胞においてはGRP-Gq, G12/13-LARG-Rhoの活性化経路があることを明らかにした。平成17年度研究ではGqを特異的に阻害する低分子化合物を用いて、この経路を分析した。その結果からGqを阻害してもRho活性化にはほとんど影響がないこと明らかにした(投稿準備中)。これら研究から、小細胞癌細胞株においてはGRP-G12/13-LARG-Rhoが主なRho活性化経路であり、本経路の阻害が小細胞癌治療の新しい分子標的になりうることが明らかになった。低分子量GTP結合蛋白質Rhoは種々の細胞内シグナルの下流で細胞骨格、遺伝子発現、細胞分裂など広範な細胞機能を制御し、これらの細胞機能を通して細胞の癌化、転移に深く関与している。私は平成15年度研究で各種肺癌細胞株におけるRhoGEFの発現状態とRhoの活性化状態を検討し、RhoGEF発現量は各種肺癌細胞株では由来組織に関わらずLARGがもっとも強く、次にp115-RhoGEFで、PDZ-RhoGEFはどの肺癌細胞株でも弱いこと、ならびにRhoの活性化は小細胞肺癌細胞で特に高いこと等の新しい知見を得た。平成16年度研究では小細胞癌で見られるRhoの活性化亢進の機序について検討をおこなった。小細胞癌のautocrine的な成長因子としてGRPが知られていることから小細胞肺癌細胞株H69を用いて、GRP-G蛋白供役受容体-RhoGEF-Rhoの経路の検証を行った。その結果H69においてはGRP-Gq, G12/13-LARG-Rhoの活性化経路があることを明らかにした(投稿準備中)。今後、この経路の阻害剤あるいはRNAiによる阻害が小細胞癌の新たな分子治療に結びつくかどうかを検討する予定である。