hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類の世代間エピジェネティック継承と子孫の環境適応に及ぼす親世代の経験環境の影響

生息環境の破壊や汚染、地球温暖化などの急激な環境変化に対する生物の適応機構の解明は、食料としての長期的な生物資源の利用と生物多様性の保全につながる。近年、世代間におけるエピジェネティック制御(transgenerational epigenetics)のような、DNA配列に依存しない遺伝子発現制御機構により、次世代(子孫)の環境適応能力を向上させる機構の存在が明らかになり注目を浴びている。しかし、魚類における世代間エピジェネティック制御の分子機構に関する知見が乏しく、正確に各生物種の環境変化に対する世代間の適応能力の度合いを測ることは困難である。本研究では、魚類が環境変動(特に気候変動)に対してどのようなメカニズムで環境応答するのか、特に次世代のフィットネスの向上に関わる繁殖機構エピジェネティクスの役割と作用機序の解明を目指す。本年度は、地球温暖化や気候変動起因で生じると考えられる環境変化のうち、特に水温の影響に注目し、モデル生物の飼育試験をスタートさせた。計画当初は、メダカ等の小型魚類をモデルとする予定であったが、本研究室において繁殖生理学的な基礎知見が蓄積され、かつ周年で卵仔稚の入手が容易なトウゴロウイワシ類をモデルとした。本種の特徴である幅広い水温範囲での産卵を利用し、低温期(冬春先)および高温期(夏秋)で生まれる子孫の表現型の変化や内分泌的プロフィール(性ステロイドホルモン各種およびストレスホルモンのコルチゾール)測定、ならびに世代間エピジェネティック制御機構の伝達の調査を開始した。来日後、およそ半年余りで環境制御型飼育システムを立ち上げ、対象魚の馴致飼育を行い、飼育試験を開始した。現在までに、実際に異なる水温条件で飼育個体の産卵を確認し、卵と仔魚のサンプリングも開始することができた。さらに、卵と仔魚の内分泌プロフィール測定および遺伝子発現解析に必要なスキルを修得し、現在定期的に採集したサンプルについて解析を開始していることから、研究活動は概ね計画通りに遂行できていると考えている。次年度は、これまでに得られているサンプルの解析を進めると同時に、発生初期に異なる環境条件(低温または高温)を経験した各区の供試魚を性成熟するまで飼育する。それら成熟個体の繁殖形質を確認するとともに、得られた受精卵を2区に分け、一方を親世代と同じ環境条件(対照区:低温または高温)で、他方を異なる環境条件(高温または低温)で飼育試験を行う。また将来的な温暖化を見据え、高水温環境下で新たに親魚を馴致飼育し、これまでと同様の試験デザインで飼育・解析を行い、環境起因と考えられる表現型の差異が世代間で伝達されるか否かを調査する。さらに、飼育試験のF0、F1、F2世代から摘出した各組織(体表組織、生殖腺、肝臓、脳等)からゲノムDNAを抽出し、各種繁殖形質に関わる遺伝子群のDNAメチル化解析を行い、世代間エピジェネティック制御機構を調査する予定である。

さらに、飼育試験のF0、F1、F2世代から摘出した各組織(体表組織、生殖腺、肝臓、脳等)からゲノムDNAを抽出し、各種繁殖形質に関わる遺伝子群のDNAメチル化解析を行い、世代間エピジェネティック制御機構を調査する予定である。
機能性蛋白質を共合固定した人工血管における内皮化および器質化特性に関する研究

内径6mmの人口血管2種をビーグル犬の腹大動脈に移植し、超音波ドップラー血流計、超音波画像診断装置により、術後(1-14日)の血流速とグラフトの開存性を調べるとともに、摘出(術後1、2、4、8、12、16週)後光学顕微鏡による組織学的観察(HE染色、EV染色、MT染色Collagen TypeI, III、α-smooth muscle actin、PDGAによる免疫組織科学的染色)を行った。人口血管は機能性タンパク質であるインスリン、フィブロネクチン、メタクリル酸を化学固定した繊維長60μmのePTFEで、全層にわたって固定したもの、外層にのみ固定したものを用いた。移植血管の開存率は摘出時100%であった。吻合後1-2日目に血流速の一時的な低下が認められたが、その後即座に回復し術前値を維持した。吻合後14日目のものではいずれの血管も内皮細胞の被覆は吻合部にわずかに認められるのみであった。8週のものでは、機能性タンパクを全層固定したもので全域にわたって内皮化が認められたが、外層のみ固定したものでは中央までの伸展はなかった。両人口血管とも4週目より結合組織の腺維内進入が観察されたが、完全な気質化は全層固定のもので8週、外層のみ固定したものでは16週を要した。今回の結果から、内皮細胞の被覆にはその足がかりとなる繊維の器質化が必須であり、細胞接着能や増殖能を有するフィブロネクチン、メタクリル酸、インスリンなどの機能性タンパク質を化学固定した人口血管の有効性が示された。内径6mmの人工血管をビーグル犬の腹大動脈に移植し、超音波ドップラー血流計、超音波画像診断装置により、術後(1-14日)の血流速とグラフトの開存性を調べるとともに、摘出(術後14日、30日)後光学顕微鏡による組織学的観察(HE染色)を行った。人工血管は機能性タンパク質であるインスリン、フィブロネクチン、メタクリル酸を化学固定した繊維長60μmのePTFEで、全層にわたって固定したもの、外壁にのみ固定したもの、対照として機能性タンパク質を固定していないもの(プレイン)を用いた。全ての摘出血管に開存か認められた。30日目のものでは、機能性タンパクを固定したものよりもプレインの方が内皮化が進んでいた。今回の結果は総頚動脈に移植した内径4mmの小口径人工血管の組織学的結果に相対するものであった。これには血流速度の違いが大きく関与しているものと思われる。今後、吻合後の観察期間を延長し、他の染色法(EV染色、MT染色Collagen type I,III、α-smooth muscle actin、PDGAによる免疫組織化学的染色)により、内皮化と器質化にかかわる人工血管周囲構成細胞のメカニズムについてさらに詳細に検討する。内径6mmの人工血管2種をビーグル犬の腹大動脈に移植し、超音波ドップラー血流計、超音波画像診断装置により、術後(1-14日)の血流速とグラフトの開存性を調べるとともに、摘出(術後1、2、4、8、12、16週)後光学顕微鏡による組織学的観察(HE染色、EV染色、MT染色Collagen type I,III、α-smooth muscle actin、PDGAによる免疫組織化学的染色)を行った。人工血管は機能性タンパク質であるインスリン、フィブロネクチン、メタクリル酸を化学固定した繊維長60μmのePTFEで、全層にわたって固定したもの、外層にのみ固定したものを用いた。

吻合後1-2日目に血流速の一時的な低下が認められたが、その後即座に回復し術前値を維持した。吻合後14日目のものではいずれの血管も内皮細胞の被覆は吻合部にわずかに認められるのみであった。8週のものでは、機能性タンパクを全層固定したもので全域にわたって内皮化が認められたが、外層のみ固定したものでは中央までの伸展はなかった。両人工血管とも4週目より結合組織の線維内進入が観察されたが、完全な気質化は全層固定のもので8週、外層のみ固定したものでは16週を要した。いずれも内皮細胞が被覆した領域の人工血管繊維では器質化が進んでいた。今回の結果から、内皮細胞の被覆にはその足がかりとなる繊維の器質化が必須であり、細胞接着能や増殖能を有するフィブロネクチン、メタクリル酸、インスリンなどの機能性タンパク質を化学固定した人工血管の有効性が示された。
超音波ドップラー流速計を用いた海氷の厚さの計測手法の開発

一般に、海氷厚の係留観測には特殊な測器である超音波氷厚計が用いられる。海洋観測に広く用いられている超音波ドップラー流速計を用いた海氷厚の計測手法の開発を行うために、アラスカ北部の沖合で、これらの両方の測器を含む係留系による観測を実施した。3年間に延べ4箇所で両方の測器で良好なデータを取得することに成功し、一部のデータについて超音波氷厚計の生データから海氷厚を算出した。本研究の観測で取得された海氷・海洋のデータを用いて、沿岸定着氷の崩壊、ポリニヤにおける過冷却水とフラジルアイスの生成、電磁誘導センサーによる海氷厚計測とレーダーによる海氷漂流速度の計測との比較研究についての成果をまとめた。2009年8月から2010年7月までの1年間に渡ってアラスカ州北部バロー沿岸沖のチャクチ海で取得した超音波氷厚計による海氷データについては、昨年度までに暫定的な海氷厚を算出していたが、その海氷厚データの精度を向上させるための様々な処理を実施した。具体的に行った処理は、以下の通りである。1.海氷厚を導出する際に最も重要な要素となる音速データの補正を、超音波氷厚計のデータのみでなく、超音波ドップラー流速計の海氷漂流データおよび水温・塩分計の水温データも用いて、より精密に実施した。2.暫定的に導出された海氷厚のデータについては、海氷底面だけでなく海水面のデータも含まれているので、海水面のデータを客観的な指標に基づいて削除し、海氷のみについてのデータセットを作成した。2012年7-8月にはアラスカ州バローに研究分担者の大島らが出向き、前年に設置した2つの係留系の回収を行うと共に、更なるデータの取得を行うために、再度2つの係留系の設置を実施した。この際に回収したデータは全ての測器について良好なものとなっており、それらのデータについてもこれまでに回収したものと同様に初期的な処理を開始している。2013年7-8月にはアラスカ北部沖の沿岸海域において、係留系の回収と設置を実施した。2012年8月に設置した2系の係留系のうち、岸側の系については回収することが出来なかったが、超音波氷厚計と超音波ドップラー流速計を含む係留系を再び2系設置した。回収に成功した沖側の系については全ての測器で良好なデータが取得されていた。これまでに取得されたデータについては、昨年度までに処理が進んでいた2009-2010年のものに加えて、2010-2011年のものについても処理を進め、超音波氷厚計による海氷厚のデータを導出した。これにより、2年間のデータに基づいた超音波氷厚計と超音波ドップラー流速計による海氷厚の比較が可能となった。また、これまでに本研究による観測で取得されたデータに基づく成果の発表を日本海洋学会や国際雪氷学会などの国内外の学会において行った。更に、超音波氷厚計と超音波ドップラー流速計だけでなく、同時に計測されている水温・塩分のデータも用いた海氷の生成過程に関する研究(Ito, Ohshima, Fukamachi et al.)および海氷の厚さや漂流速度についての係留観測とヘリコプターによって牽引するセンサーや地上のレーダーなどの上空からの観測とのデータの比較研究(Mahoney, Eicken, Fukamachi et al.)については、成果をまとめてAnnals of Glaciologyに投稿した。2009年8月から2010年7月までの1年間に渡って、アラスカ州北部バロー沿岸沖のチャクチ海で取得した超音波氷厚計による海氷データの処理を進め、海氷厚を算出した。算出された海氷厚については、精度を向上させるための更なる処理が必要であるが、超音波ドップラー流速計と水圧計のデータから導出される独立した海氷厚の見積りとの比較準備がほぼ整った。2011年7-8月にはアラスカ州バローに出向き、前年に設置した2つの係留系の回収を行うと共に、更なるデータの取得を行うために、再度2つの係留系の設置を実施した。更に、この際に回収したデータについても、前年に回収したデータと同様に、処理を進めた。また、2009-10年に取得した海洋データに基づいて、この海域における定着氷の流出に及ぼす海洋の影響について議論した結果を論文に盛り込んだ(Petrich, Hicken, Zhang, Krieger, Fukamachi, and Ohshima, 2012)。更に、2年間の観測で得られた海洋の流速および水温・塩分のデータをまとめて、アメリカ地球物理学連合の秋季大会で発表した。比較データとなる超音波氷厚計による海氷厚は十分な精度で導出が出来ている。

2012年夏に回収した2つの係留系については、全ての測器で良好なデータが取得出来ており、それらのデータの初期的な処理が順調に進んでいる。また、2012年夏の係留系の再設置も予定通りに実施することが出来た。成果の発表についても、国際シンポジウムおよび国内学会で実施出来た。2011年夏に回収した2つの係留系については、その1つの系に取り付けていた超音波氷厚計のデータが浸水のために取得出来ないというトラブルがあった。しかしながら、それ以外の測器では良好なデータが取得出来ており、それらのデータの処理がほぼ順調に進んでいる。また、2011年夏の係留系の再設置も予定通りに実施することが出来た。その他では、共著ながら、国際誌への論文の掲載と国際学会での発表も実施することが出来た。超音波ドップラー流速計と水圧計のデータから独立した海氷厚のデータを導出し、この値を既に導出している超音波氷厚計による値と比較することによって、前者の手法でどの程度の精度の海氷厚データを取得することが出来るかを明らかにする。更に、その成果発表を学会において行い、最終的には国際誌に論文を投稿する。また、2013年夏には、アラスカ州バローに再度出向いての係留系の回収および再設置を予定している。超音波氷厚計データによる海氷厚の精度を高めると共に、超音波ドップラー流速計と水圧計のデータからも独立した海氷厚のデータを導出し、これらの値を比較することによって、後者の手法がどの程度の精度の海氷厚データを取得することが出来るかを明らかにする。また、2012年夏には、アラスカ州バローに再度出向いての係留系の回収および再設置を、2013年夏には回収のみを予定している。なお、当該研究費の今年度未使用額については、研究の進捗状況を見極めながら予算執行を行ったために79,270円の未使用額が発生したが、データのバックアップや資料の整理を行うための消耗品を3月中に購入し、この額については既に使用済である。該当なし平成23年度の交付申請書には、今年度の観測に必要な水圧水温計の購入を計上していたが、これについては他の予算で昨年度に購入することが出来た。よって、そのために予定していた費用については、国内旅費、データ処理のための謝金、観測機材運搬費、水圧水温計のキャリブレーション等に充てる予定である。なお、アラスカ州への海外旅費については予定通りに支出予定である。
水素結合鎖を持つビイミダゾール型遷移金属錯体の開発

キンヒドロンのようなプロトン-電子連動(PET)現象を金属イオンを含む新しい電子系で実現することを目指している。その第一段階として金属錯体同士が直接、分子間水素結合鎖を形成する(HB錯体)ものを探索してきた。ビイミダゾール(2,2'-biimidazole)配位子の金属単核錯体がその配位子のプロトンを1つ乖離して新しいNH-N分子間水素結合を配位子数n(n=1-3)に応じてDimer,Chain,Networkの構造を持つことを予想した。そして、そのDimer,Networkの構造については実際にX線構造解析を用いて証明した。このダイマー構造は〔Cu(SalenNMe_2(Hbim)〕_2の錯体の構造解析を成功することによって初めて2.83ÅのNH-N分子間水素結合を持つことを実証した。1次元の分子間水素結合Chainを持つ錯体は〔Ni(Hbim)_2(Pyrazine)〕0.5H_2Oとして合成しており単結晶化の最中である。IRからこの化合物は中程度に強いNH-N型水素結合を有し、磁化率を測定した結果、弱い反強磁性相互作用を持つことから水素結合鎖の他にピラジンを架橋基としたNi間の相互作用を持つ2次元系の錯体であることがわかった。Network構造を持つトリスビイミダゾレートNi錯体(〔Ni(Hbim)_3〕^-)は分子間水素結合を利用した超分子的な集合体を形成し、その構造はカチオンの種類によって異なることを明らかにした。^nPr_4N^+を持つ構造は光学異性体であるLAMBDA,DELTAが交互に現われる1次元のZigzag Chain構造を持つ。また、Et_4N^+をもつ錯体構造は1つのフリーのビイミダゾールを含み光学異性体であるLAMBDA,DELTAとともにグラファイトのような6角形(内径^20Å)の分子間水素結合型錯体を単位としたしたダブルシートを形成し、これが直角に交差しているような複雑な構造を持つ。さらに、Ph(Me)_3N^+を持つ錯体はC軸方向に内径約9.5Åの垂直な親水性のホールが結晶を貫いており、この中には溶媒であるMeOHのカラムが存在することがわかった。
脊椎動物における視覚情報処理過程の形態学的研究

視覚の端末感覚受容装置である綱膜では、光受容、神経伝達物質、神経回路綱などの研究が幅広い手法を用いて行われ、超微形態学的綱膜研究は、生理学、生化学、分子生物学、生物物理学の業績と相補しつつ、綱膜に関する知識を飛躍的に増加させてきている。今回機能を構成分子の形態学的研究を綱膜においててかに展開すべきかを論じ、ともすれば閉鎖的になる学問を協会領域との切磋琢磨の中から更に発展させようと、形態学的発想から視覚研究を行っている研究者を中心に第一線の研究者を集めて、総合研究「脊椎動物における視覚情報処理過程の形態学的研究」を展開した。視細胞の微細構造と結合様式(外崎)並びにモノクロ-ナル抗体作製と同抗体による細胞解析(外崎)、視細胞光受容過程でのphsphodiestrase活性の賦活の組織化学(齋藤)、ロドプシン遣伝子組み替えによる疾患解析(臼倉)。綱膜色素上皮に特異モノクロ-ナル抗体の作製とこれを用いた解析(廣澤)、水平細胞のヌペクル特性による結合様式解析(橋本)、アマクリン細胞における神経活性物の解析(根岸)、神経節細胞の軸索・樹状突起再生解析(田内)、片眼鰹の視覚投射(伊藤)、綱膜への遠心性線維投射(大塚)、イオン電流モデルによる綱膜神経回線のシミュレ-ション解析(臼井)、退行的光受容器官である松果体におけるビタミンA代謝解析(松島)、松果体細胞におけるビシニン分布(近藤)と幅広い研究を行うと共に、発表論文52篇、学会発表82篇の多数を数えると共に、研究会「光情報系の学際的理解」(平成1年8月4、5日)[生理研]、「視覚神経情報系への学際的アプロ-チ」(平成2年7月1921日)[生理研究]、及び最終報告会(平成3年2月2日)を開催して、広い研究分野間での意見交換を行っており、総合研究を通して成果を挙げることが出来た事に感謝を捧げたい。脊椎動物網膜は形態と機能の解析のモデルとして,今世紀初頭より多くの研究者の研究対象となってきた。電子顕微鏡にかかわる手技または生理学的手技の進歩はこの古くて新しい研究対象の再検討を求めている。このコンセプトの基に開始された総合研究班は昨年夏,国立岡崎共同研究機構で第一回の会合をもち,その成果は生理学研究所報に掲載されている。その概略は次の通りである。1.視覚発現に重要な支持細胞である色素上皮細胞の単クロ-ン解析をはじめた(廣澤)。視細胞の系統発生学的研究は抗ロドプシン抗体と抗ビシニン抗体により行われ,桿状体および錐状体細胞の識別が可能となった(外崎,徳永)。視細胞円板膜中の酵素を急速凍結置換法により,染め出すことに成功し,cGMPカスケ-ド酵素群の解明の途が開けた(斉藤)。シナプスレベルでは急速凍結法によりシナプスリボンを中心とする細胞骨格系が明らかとされつつある(臼倉)。光受容タンパクの生体膜中への出現と合成時期とのずれの解明が行われた(近藤)。2.生理学的手技をとり入れた形態解析は,魚類の視細胞種の同定(橋本),魚類のアマクリン細胞間に線維網が形成されていること(根岸)などが示された。3.色素情報処理に関する研究は錐体細胞間のシナプス結合の発見(大塚)とコンピュ-タシミレションによる神経節細胞の色覚処理機構の解明(臼井)が行われた。

4.上記以外に,神経節細胞再生の基礎実験(田内),視覚中枢投射の再構築(伊藤)および明期暗期での松果体細胞活動の変動(松嶋)などが報告された。平成2年度も1回の研究集会を夏期に開催する予定である。視覚の受容装置である網膜を形態学的発想から研究を行っている広い分野(解剖、生理、生化、分子生物、生物物理)の研究者を集めて行われた総合研究「脊椎動物における視覚情報処理過程の形態学的研究」は、本年度、視細胞に対するモノクロ-ナル抗体による網膜細胞構築の解析を行うと共に、レクチン結合による糖質解析(外崎)、新しいphsphoーdiestrase検出法の凍結超薄切片酵素組織化学への応用(齋藤)、ロドプシン遺伝子組み替えによる遺伝疾患解析(臼倉)。一方網膜色素上皮小胞体に対するモノクロ-ナル抗体を作製して、小胞体膜構成の特異性を明らかにしている(廣澤)。水平細胞のスペクトル特性による細胞回路網解析を(橋本)、コンピュ-タ-シミュレ-ションにおいて行い、網膜神経回路のイオン電流モデルを提出した(臼井)。また、アマクリン細胞における神経活性物質の解析(根岸)、神経節細胞の軸索・樹状突起再生解析(田内)、片眼鯉の視覚投射再構築の解析(伊藤)、網膜への遠心性投射線維の証明を行う等(大塚)多くの成果を挙げた。また、網膜機能解析と進化の道筋を明らかにするため退行光受容器官である松果体において日内変動の実体をビタミンA欠乏状態下で示すと共に(松島)、松果体細胞におけるビシニン分布を明らかにした(近藤)。これらの成果は他の網膜研究者と合同で岡崎国立生理学研究所において開催した研究会「視覚神経情報系への学際的アプロ-チ」(平成2年7月1921日)において巾く意見交換を行うと共に、平成3年2月2日最終報告会を開いて総合研究Aを締めくくった。他の分野の研究者との交流も2年目に入るとよりスム-ズに、協力は緊密となり、新しい研究の協力発展数多く見られ、総合研究としての成果を挙げることが出来た事に感謝したい。
バイオポリマーリアクターにおける高粘性塑性流体中の気泡分散状態の測定法

1測定対象流体のレオロジー測定気泡を分散させる対象流体としてニュートン流体と考えられるグリセリン、水飴水溶液、擬塑性流体であるヒドロキシエチルセルロース水溶液、あるいは上記の試料にガラスビーズ、又は炭酸カルシウムを加えた塑性流体と考えられる試料について、初期降伏応力、塑性粘度等の測定を行い、レオロジー特性を得た。2気泡分散槽、及び測定系の作成気泡分散槽は200mm、400mm円筒平底槽としバッフル着脱が可能なものを作成した。また、気泡分散翼は翼径が槽径の1/2ラシュトンタービン翼を作成し使用した。測定系については検出部の高分解能化、分解槽内で気泡を捕らえる、吸引プローブの先端形状に関する種々の検討を行った。その結果、分散能については、20μlの微細な気泡まで測定が可能となった。また、プローブの先端形状に関しては直径16mmのロ-ト形状のものが気泡を合一、分裂させずに測定できることを明らかにした。高粘性塑性流体中の気泡分散状態の測定上記(1)の項で述べた試料中の気泡分散状態の測定を行った。測定は吸引プローブを分散槽内でトラバースし、槽内の数カ所の測定で500個1000個の気泡の球相当径分布を得た。その結果、擬塑性、及び塑性流体中ではニュートン流体に比較して、槽内全域において球相当径が小さい気泡が分散していることを明らかにした。これは、擬塑性、及び塑性流体中では、翼近傍の見かけ粘度が小さい領域で、球相当径の小さい気泡が発生し、その気泡が翼から離れた見かけ粘度の大きい領域でも、合一することなく保存されるためと考えられる。上記のように、本研究により高粘性流体中の気泡分散状態の迅速かつ詳細な測定法が確立された。
人および家畜に下痢症を引き起こす新規細菌毒素の構造解析と阻害剤の開発

29年度が最終年度であるため、記入しない。
Beyond VEGFのアンメットニーズ：線維化と虚血へのマクロファージ教育療法

糖尿病網膜症や加齢黄斑変性への抗VEGF療法の幅広い使用とともに、抗VEGF療法では効果のない病態が明らかになってきた。その中で虚血や網膜下線維化は抗VEGF療法時代のアンメットニーズと言えるが、その詳細なメカニズムは不明であり、それらに対しての有効な治療法はない。今回、われわれは2つのモデル動物1虚血を誘導する網膜視細胞VEGF強制発現マウス(Kimbaマウス)2レーザー誘導網膜下線維化モデルを用いて、検討を行っている。昨年、虚血モデルにおいて虚血部位にM1マクロファージの存在を確認している。そこで本年度はこのモデル動物の網膜からマクロファージ分画を抽出しシングルセルアナライシスを実施した。現在、虚血特異的なマクロファージの発現サイトカインやマーカーを検索中である。また、2のモデルにおいては炎症細胞の解析にCX3CR1-GFP, CCR2-RFPマウスを入手し炎症細胞の時間経過を観察中である。さらに色素上皮細胞の関与も報告されているためRPEがROCKシグナルを介してEMTを起こし線維化を生じることも観察した。助成いただいた研究費によりマウス繁殖が順調に行き、実験系も順調であった。さらに共同研究などの発展性も生じており、概ね順調に進展していると考える。H31年度は施行したシングルセルアナライシスを元に遺伝子発現の解析を検討している。これにより虚血特異的なマーカーやサイトカインが発見されれば、治療ターゲットと考え阻害実験などを行って行く予定である。また、網膜下線維化に関してはROCK阻害剤により線維化が抑制されることを確認しているため、in vivoでのfate mappingを用いてターゲットとなる細胞を同定し、よりエビデンスの高い治療法開発へと繋げたい。現在、抗VEGF療法の幅広い使用とともに、抗VEGF療法では効果のない病態が明らかになってきた。。今回、われわれは網膜虚血、網膜下線維化の病態形成に炎症、とくにマクロファージが関与するとの仮説を立て、二つのモデル動物1虚血を誘導する網膜視細胞VEGF強制発現マウス(Kimbaマウス)2レーザー誘導網膜下線維化モデルを用いて、虚血または線維化関連マクロファージについて検討を行った。M1マクロファージマーカーとしてCD80 F4/80, M2マクロファージマーカーとしてCD206 F4/80を用いた。従来の計画である生後8週齢kimbaマウスにおいて、免疫染色において網膜内にM1M2マクロファージの浸潤を認めた。M1マクロファージは主に虚血部位、新生血管領域に、またM2マクロファージは網膜表層と新生血管領域に観察された。さらにCD80, CD206を含めたその他のM1 (CD86, NOS2, CD40), M2マーカー(CD163, CD204)においてもwild typeマウスと比較し、mRNAレベルの有意な増加を認めた。次にday10, 3週, 8週と時間経過を追ったところ、3週で多くのM1, M2マーカーがピークに達していることを観察した。また、Kimbaマウス8週齢のFACSにおいてもCD80/F4/80, CD206/F4/80の浸潤を観察した。さらにKimbaマウスにおいて、電子顕微鏡を用いても網膜内へのマクロファージ浸潤を確認している。網膜下線維化モデルにおいては、免疫染色において同様に線維化部位におけるCD80 F4/80細胞, CD206 F4/80細胞がtype1 collagen陽性組織周囲への浸潤を確認している。しかし、FACSを用いた検討は未施行である。マウス繁殖が順調に行き、実験系も順調であったが、FACSにおける条件決めに時間を要しており、両モデルでのgating含め条件設定を行う必要がある。H30の予定として、モデル動物の網膜からマクロファージを抽出する予定であり、昨年度既に予備実験を別モデルマウスで行った。腹腔内マクロファージでは約80%の生細胞が24時間で得られるが、網膜ではCD11b陽性細胞のソーティングにて35%の回収率であった。

また6時間では40-60%と生細胞の回収率増加を観察したため、この条件にて虚血網膜・線維化網膜におけるマクロファージに遺伝子発現検討を予定している。同時に虚血部位のマイクロダイセクションにmRNA検討もpreliminaryであるが、結果を得ており、2つの方法から虚血網膜関連マクロファージ・線維化関連マクロファージの同定を目指して検討したい。また、M1M2マクロファージ分画を硝子体内投与することにより網膜虚血と網膜下線維化について動物モデルを用いて検討を行っていく。H31年度は施行したシングルセルアナライシスを元に遺伝子発現の解析を検討している。これにより虚血特異的なマーカーやサイトカインが発見されれば、治療ターゲットと考え阻害実験などを行って行く予定である。また、網膜下線維化に関してはROCK阻害剤により線維化が抑制されることを確認しているため、in vivoでのfate mappingを用いてターゲットとなる細胞を同定し、よりエビデンスの高い治療法開発へと繋げたい。今回、FACSなど解析において若干の計画遅延があるため、翌年度分として請求した助成金と合わせてFACSなど解析費用として使用する予定である。今回、動物実験など解析において若干の計画遅延があるため、翌年度分として請求した助成金と合わせて解析費用として使用する予定である。
ホウ素クラスターの特徴を利用した検査、診断、治療を目的とする創薬研究

ホウ素クラスターの物理化学的特性を利用して、生体内に影響をもたらす分子を認識する化合物を創製した。本研究で見出したフッ素イオンを選択的に認識し蛍光を発する化合物は、環境汚染物質であるフッ素イオンの検出に利用可能である。塩素イオンを選択的に認識する化合物は、イオンチャネルとして嚢胞性線維症などの難治性疾患に応用が期待される。また、本研究で合成したアニオン認識化合物の中から、癌細胞の増殖を抑制する化合物も見出し、その活性にホウ素クラスターの構造が重要であることを確認した。本研究の成果は、ホウ素クラスターによる分子認識を創薬へ応用するきっかけとなる新たな発見である。アニオンと結合するProdigiosinは、塩素アニオンと結合する際にプロトンとも同時に結合したのち、細胞内へ移行することで細胞内pHを上昇させアポトーシスを誘導する化合物として知られている。この種の化合物は新規メカニズムを有する抗腫瘍薬として期待されている。そこで、既に見出しているアニオン認識化合物が癌細胞の増殖効果に影響するか検討した。いずれの化合物も癌細胞の増殖には影響することはなく、プロトンとの共輸送は難しいことが明らかとなった。ただ、これらの化合物が細胞の生存に影響を与えないことは細胞毒性を示さないということであり、アニオン輸送体として副作用の少ない嚢胞性線維症の治療薬に応用できる可能性を示している。また、既存のアニオンレセプターを構造修飾し、高選択性および高結合親和性を有する新規アニオンレセプターの構築では、化合物の溶解性や合成的難しさにより難航している。高機能性化合物を得ることは重要であるが、その取扱いや入手のし易さも優れた化合物としては重要な因子である。これについては、化合物の再デザインやアニオン認識部位以外への化学修飾などにより、これらの諸問題を解決する予定である。フッ素イオンセンシングでは、FDBPを用いたchemodosimetory法を構築した。フッ素アニオン選択的にカルボランとFDBPの反応が進行し、FDBPの蛍光が完全に消光した。しかしながら、各種条件を変更しても蛍光の消光に要する時間は長いままであり、実用的なフッ素イオン検出薬とまではいかない。FDBPもしくはカルボランに化学修飾を行うことにより、短時間かつ高感度のフッ素イオン検出薬が構築可能と考えられる。環境中や生体内に存在する生体機能性アニオンを選択的に認識する化合物は、環境汚染を測定できる検査薬や疾病の診断薬、もしくは生体内でアニオンの移動を制御できる疾病の治療薬となり得る。今年度は、既に見出したアニオン認識化合物の蛍光センサーとしての可能性を探るべく、フルオレセイン誘導体を用いたアニオン検出を試みた。カルボラン誘導体存在下ではフルオレセインとの複合体形成のため蛍光は消失したが、塩素アニオンの添加によりフルオレセインが遊離し、その蛍光は回復した。次に、新規アニオン認識化合物の創製を目指し、ジフェニルアミン誘導体にカルボランを結合した化合物を合成した。空間的に狭いのかフッ素アニオンや塩素アニオンに結合するもののリン酸アニオンや硫酸アニオンにはほとんど結合しなかった。しかし、化合物にビフェニル構造を導入したところ、蛍光を示すようになった。当初の目的であったリン酸選択的なアニオンレセプターの創製は叶わなかったが、新規フッ素イオン選択的蛍光センサーを見出した。これは蛍光が生じたり消えたりするセンサーとは異なり、波長シフト型のセンサーであった。クマリンを利用したフッ素イオン高選択的蛍光センサーについて、リンカー部の長さおよびリンカーについて検討した。リンカー部位は炭素鎖が長くなるにつれ蛍光強度の低下が見られた。リンカーは長くてもエステルにするとフッ素イオン選択性を示したことから、この場合は分子内反応によりクマリンが遊離して蛍光が生じたと考えられる。これはエステル誘導体がChemodosimeterとなる可能性を示している。生体内におけるアニオンの濃度はチャネルなどにより厳密に維持されているが、何らかの要因によりアニオンの濃度バランスが崩壊すると、細胞内pHの変化や体液の粘性の変化などにより細胞死を引き起こすことが知られている。初年度に、今までに見出したアニオンレセプターについて癌細胞における細胞死誘導効果を精査したが、特に望む生物活性を示す化合物を見出すことはできなかった。本研究期間内に新たに合成したアニオン認識化合物について細胞死誘導効果を精査したところ、トロポロン環およびFDBP構造を有する幾つかのアニオン認識化合物に細胞死誘導活性を見出した。類似構造を有する化合物の活性を比較したところ、カルボラン環が活性発現に必須であった。しかしながら、本研究期間内に、アニオン認識と細胞死誘導がどのように関係しているのか、そのメカニズムについては検証することができなかった。これについては現在検討中である。

本研究者が見出したジフェニルアミン骨格を有する新規アニオンレセプターに蛍光発現構造を組み込み、カルボランを結合させたところ、フッ素イオンの認識により強い黄色の蛍光を発する化合物を創製することに成功した。ジフェニルアミン骨格は、合成が容易であり構造修飾も簡便であることから、カルボランと組み合わせることによりアニオン認識ポリマーや生体制御化合物への応用が可能と考えられる。また、カルボラン誘導体の新たな機能を探るため、創薬研究も並行して進めカルボランの医薬構造としての有効性および優位性を確認している。本研究は、無機化合物であるホウ素クラスターの電気的、物理化学的、構造的性質を、有機化学的視点で理解し、新しい切り口で創薬化学へアプローチすることを目的としていた。研究の進行は計画から遅れたものの、アニオン認識と医薬化学を融合させる出発点と成り得る成果が得られた。創薬化学新たにデザインしたアニオン認識化合物の合成が難しく、また化合物の各種溶媒に対する溶解性が非常に悪く、予定より遅れが生じている。それ以外に、研究に使えるまとまった時間を取ることが難しく、これが研究全体に遅れを生じている主たる原因でもある。特に、化合物の合成にはまとまった時間が必要であり、化合物の物性プロファイリングは比較的計画通りに進行している。アニオン認識化合物に対する細胞増殖試験は、当研究室が所有する化合物ライブリーへの登録とランダムスクリーニングにより容易に行うことができた。また、細胞増殖への影響以外の生物活性プロファイリングも行うことができた。フッ素アニオンセンシングは実用的な検出薬を目指し、簡便、短時間、高感度、高選択性の達成すべく条件の検討を行った。簡便、高感度、高感度は当初予想していた以上の結果が得られたが、時間だけは短縮されなかった。FDBPとカルボランの反応速度が遅いことに起因するので、この反応が速やかに進行するようそれぞれの基質に化学修飾を施し、実用化へ向け再度条件の調整を行う。設計している化合物のアニオン認識部位が狭いためか、リン酸アニオン選択的なアニオンレセプターを見出すことに苦労している。今年度も研究の進行が遅れることが見込まれる。そこで、まとまった時間が必要な化合物合成による新規分子レセプターの探索を縮小し、既存の化合物の物性プロファイリングに時間を掛け、化合物の持つ性質に新たな知見を加えられるよう努める。特に、ホスト化合物のアニオンを含めた小分子に対する選択性および結合定数は、診断薬、検査薬、治療薬へ応用する上で極めて重要であり、その結合様式を明らかにすることは化合物を新たにデザインする際に大変有用である。そこで、溶液や結晶中におけるホストゲスト複合体形成の詳細と、新たな相互作用様式や分子認識機構の解明に視点を置き研究を進める。最近、弱い分子間相互作用に注目が置かれ、様々な新たな相互作用が明らかになってきている。本来反発を起こすと考えられているハロゲンとハロゲンの接近は、接近する方向によりお互いが引き合うことが示され、創薬や超分子化学に応用されつつある(ハロゲンーハロゲン相互作用)。
頭頸部癌に対する癌化学療法の開発に関する研究-固形癌腫瘍モデルによるシスプラチン耐性癌の克服-

培養細胞株HEp-2およびKB細胞の、DDP耐性細胞を用いた実験系においてPaclitaxel(タキソ-ル)について、その効果を詳細に検討した。結果は用量および時間依存性に殺細胞効果の上昇が認められた。特に、24時間以上の投与では、HEp-2細胞において単層培養細胞、多細胞スフェロイドともに、0.1μg/mlの低濃度でも、生存率10%未満の高い殺細胞効果を認めた。KB細胞では、HE-p2細胞に比べてpaclitaxelの効果がやや悪く、耐性株において約10%以上の高い殺細胞効果を得るのに、単層培養細胞、多細胞スフェロイドともに72時間の長い作用時間を要した。DDP耐性MTSでも親株MTSと同等にPaclitaxelに反応する事が確認された。すなわち殺細胞効果は、時間、濃度、両方に依存することが解明された.DDP耐性癌に対する有効性も示唆された。PaclitaxelとDDPの併用実験では、投与スケヂュ-ルに関する検討をおこなった.この結果、Paclitaxelを先に投与してからDDPを投与する方法がいずれの細胞株においても、相乗効果が高かった.頭頸部扁平上皮癌におけるシスプラチン耐性癌に対してpaclitaxelの抗腫瘍効果が期待される。従来より臨床材料から直接MTSを作成するのは困難とされていたが、酵素処理を行わずに、鋏で細切し、これを寒天皿に播くことによりMTS作成に成功した.この臨床MTSでは5FUの効果を検討した.250ug/mlの濃度で、コロニー形成率の低下を認めた.5FUでは250ug/mlの付近の薬剤濃度がMTSによる感受性試験での、陽性、陰性の判定材料の参考になると思われた.この症例は、臨床的にも5FUが著効を示し、臨床との相関が示された。臨床材料よりのMTS作成は、症例数を重ね、これまでに10例施行した。扁平上皮癌以外では、悪性多形腺腫、悪性リンパ腫が含まれている。この臨床材料とMTSとの組織型の比較を行い、MTSにしても原腫瘍の特長は良く保たれていることが確認された。臨床例より確実にMTSを作成する手法を、ほぼ確立したと考えている。今後は、この臨床MTSを用いて、薬剤感受性試験のみならず、癌遺伝子の発現形態、テロメア-に関する研究などを進めていきたい。HEp-2細胞を用いた実験系においてシスプラチン(DDP)、5フルオロウラシル(5FU)の長期投与に関する検討を行った。この結果、単層培養細胞(mono)、多細胞スフェロイド(MTS)ともに薬剤の増量とともに殺細胞効果が上昇し、2つの薬剤ともに頭頸部癌(固形癌)に有効な事が示唆された。また、作用時間に関しては、DDPでは1時間から24時間と時間が長くなると効果が増すが、24時間から72時間の延長では、生存曲線に有意差が認められなっかた。すなわちこの実験系においてDDPでは24時間の持続投与は意味を持ちない事が示された。

一方、5FUでは1時間から24時間、72時間と作用時間が長くなると効果の増加がみられた。HEp-2細胞の倍加時間は、約24時間なので、5FUは細胞倍加時間の少なくとも3倍以上に薬剤接触時間を設定する事が、より有効な投与方法であると思われた。臨床での少量長期投与が支持される。併用療法の検討では、この2剤の併用を72時間の作用時間で検討すると、DDP0.1ug/ml,5FU 1ug/ml以上の濃度での併用では、2剤の薬剤濃度が高ければ高いほど相乗的に働く事が確認された。ちなみにこれらの濃度は十分に臨床で到達可能な濃度である。一方、薬剤耐性細胞(DDP)によるMTS作成は、プレートに播く細胞の数を調節する事により可能になった。KB, HEp-2細胞ともに親株に較べてコロニー形成率の変化が認められ、MTSも硬い感じで、形態の変化も認めた。このDDP耐性細胞を用いた検討では、KB細胞において、monoでは約10倍の耐性であったのが、MTSでは耐性の増強が認められた。Paclitaxelの効果を検討すると、DDP耐性MTSでも親株MTSと同等にPaclitaxelに反応する事が確認された。培養細胞株HEp-2細胞の実験系において、DDP耐性細胞を用いた検討では、単層培養細胞からMTSにすると耐性の程度が増強した。すなわち、細胞レベルで耐性を獲得すると、固形癌のレベルでは、より耐性の程度が強くなることが示唆された。また、近年、注目されているPaclitaxel(タキソ-ル)について、その効果を検討すると、DDP耐性MTSでも親株MTSと同等にPaclitaxelに反応する事が確認された。殺細胞効果は、時間、濃度、両方に依存することも解明された。DDP耐性癌に対する有効性が示唆された。PaclitaxelとDDPの併用実験では、投与スケヂュ-ルに関する検討をおこなった。この結果、Paclitaxelを先に投与してからDDPを投与する方法が一番、相乗効果が高かった。一方、手術時に採取した臨床材料よりMTSを作成して薬剤感受性試験を施行した。従来より臨床材料から直接MTSを作成するのは困難とされていたが、酵素処理を行わずに、鋏で細切し、これを寒天皿に播くことによりMTS作成に成功した。条件が整えば、直径が1mm位の球形のMTSが作成され、約4ヶ月間、培養が可能であった。この臨床MTSでは5FUの効果を検討した。250ug/mlの濃度で、コロニー形成率の低下を認めた。5FUでは250ug/mlの付近の薬剤濃度がMTSによる感受性試験での、陽性、陰性の判定材料の参考になると思われた。この症例は、臨床的にも5FUが著効を示し、臨床との相関が示された。今後の展開が期待される。培養細胞株HEp-2およびKB細胞の、DDP耐性細胞を用いた実験系においてPaclitaxel(タキソ-ル)について、その効果を詳細に検討した。結果は用量および時間依存性に殺細胞効果の上昇が認められた。特に、24時間以上の投与では、HEp-2細胞において単層培養細胞、多細胞スフェロイドともに、0.1μg/mlの低濃度でも生存率10%未満の高い殺細胞効果を認めた。KB細胞では、HE-p2細胞に比べてpaclitaxelの効果がやや悪く、耐性株において約10%以上の高い殺細胞効果を得るのに、単層培養細胞、多細胞スフェロイドともに72時間の長い作用時間を要した。
アルコールオキシダーゼアイソザイムを用いた酵母の新規異種遺伝子発現系の開発

本研究ではメチロトローフ酵母Pichia methanolicaが持つ2つのAOD遺伝子を利用することにより、より強力で、同一環境下で発現量比・発現時期の調節可能な複数の有用タンパク質の発現を自在にコントロールできる新たな分子生物学の研究ツールの開発を目指しており、本研究ではAODアイソザイムの発現制御機構の解明からP.methanolica新規異種遺伝子発現系の開発を目的としている。・本年度の研究内容および成果・MOD1およびMOD2プロモーターを用いた発現系の開発MOD2プロモーターを用いた異種遺伝子発現系を開発した。MOD2プロモーターとMOD1ターミネーター、さらにはPmADE2をマーカー遺伝子とした発現ベクターを構築し、出芽酵母PHO5をレポーター遺伝子としてMOD2プロモーター支配下に挿入し、P.methanolica ade2^-株に形質転換した。MOD1プロモーターを用いた発現ベクターはpMETB (Invitrogen)を用いた。その結果、MOD2プロモーター支配下でメタノールにより十分なAP活性が認められ、MOD2プロモーターを用いた発現系を構築することができた(1)。また、MOD1プロモーターとMOD2プロモーターの発現パターンは、昨年度の研究成果であるMOD1およびMOD2の発現制御パターンと同様であり、今回開発できたMOD2発現系と、すでに開発されているMOD1発現系との組み合わせによる様々な有用タンパク質の発現生産に結びつけられるものと確信している。(1)稲垣篤史ら,2004.メチロトローフ酵母Pichia methanolicaのアルコールオキダーゼアイソザイムを用いた新たな異種遺伝子発現系の開発.日本生物工学会平成16年度大会本申請者はメチロトローフ酵母Pichia methanolicaが持つ2つのAOD遺伝子を利用することにより、より強力で、同一環境下で発現量比・発現時期の調節可能な複数の有用タンパク質の発現を自在にコントロールできる新たな分子生物学の研究ツールの開発を目指しており、本研究ではAODアイソザイムの発現制御機構の解明からP.methanolica新規異種遺伝子発現系の開発を目的としている。・本年度の研究内容・成果(AODアイソザイムおよびメタノール代謝酵素の挙動、AOD遺伝子破壊株の解析)1.MOD1とMOD2の発現制御に関する解析MOD1とMOD2は異なる発現機構によりその発現が制御されていた。MOD1はメタノールのみならずグリセロール、キシロース等を誘導炭素源として利用できるのに対し、MOD2はメタノール以外での発現は観察されなかった(Ref.4)。また、メタノール濃度および酸素濃度によってもAOD発現が調節でき、その発現は転写レベルで制御されていた。このことは両プロモーターを用いて有用遺伝子発現を炭素源、酸素濃度により制御でき、新規異種遺伝子発現系への応用が可能であることを示唆している。また、メタノール代謝の鍵酵素ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現誘導についても詳細な解析を行った。2.AOD遺伝子破壊株の生育特性mod1Δmod2Δ株の生育特性について詳しく観察した。AOD遺伝子破壊株はメタノールに対する生育能を完全に失っていたが、MOD1の誘導炭素源グリセロール、キシロースにおける生育には影響を示さなかった。このことはAOD遺伝子破壊株を形質転換系の宿主として利用できる可能性を示しており、AOD遺伝子破壊株を用いることで、(1)プロモータの重複による発現量の低下が防げる、(2)発現量の多いAODの合成に使われるアミノ酸、エネルギーを節約できる、(3)AODの占めるスペースを異種タンパク質に用いることができる、等の理由からさらなる高収率が見込める宿主として期待できる。(1)稲垣篤史ら,2004.メチロトローフ酵母Pichia methanolicaのアルコールオキダーゼアイソザイムを用いた新たな異種遺伝子発現系の開発.日本生物工学会平成16年度大会
低アディポネクチン血症における病態生理

アディポネクチンは脂肪細胞が血液中に放出するタンパク質で、炎症を抑制し糖尿病や動脈硬化などを防止する。我々が作成したアンチセンストランスジェニックマウスは野生型マウスと比べてアディポネクチンの血中濃度に有意な差は無く、通常の飼育下では異常は認められないが、炎症を誘導すると易炎症性で重症化や遷延化がみられる。そこでアンチセンストランスジェニックマウスのこの未病状態を網羅的に解析した。その結果、代謝系やエネルギー源の蓄積に関わる遺伝子群の発現が低下しており、エネルギー産生ができない状態が易炎症性や重症化をもたらしていることが示唆された。RAW264.5細胞の10μg/mLHMWアディポネクチン有り無しで48時間処理後のGeneChipアッセイの結果、HMW処理で劇的な変化は認められなかったが、ケモカインレセプターやIL-1などからのシグナル系、PLD4やAlox5など炎症性物質産生に関与する遺伝子の発現低下、CHOPなど転写を阻害する遺伝子、metallothionein 1や2、solute carrier family、IFNにより誘導される種々のタンパク、NosやPG合成系のPla2やPtgs、cAMPに応答するCreb3やAtf3、NFkBの活性化を抑制するHSPなどが増加していた。これらの変化を踏まえて、ヒト血漿から精製したHMWアディポネクチンや、ヒトやマウスのCHO細胞での組換えアディポネクチン、球状ドメインのみのグロブラーアディポネクチンを用いて、前処理での変化、その後のLPS処理への応答について詳細に解析を行った。その結果、前処理無しではLPSに対する応答を抑制しないが、前処理4時間以上でLPSによるIL-1βの発現を抑制すること、一方、これまで報告されているようなTNF-αの発現抑制は起こらないことが全てのアディポネクチンで確認できた。アディポネクチンによる効果は、AKTのリン酸化(活性化)阻害によりAKTがGSK3βをリン酸化(不活性化)できず、GSK3βがC/EBPβをリン酸化してC/EBPβの核移行を阻害することにより、IL-1βの発現が抑制されることによることが分かった。更に、AMPKをAICARで活性化してもこの抑制効果は認められないことや、PI3K阻害剤で同様の効果が認められること、HSPがアディポネクチン前処理で誘導されているにも関わらずNFkBの阻害は起こらず、結果としてTNFαの発現抑制は起こらないなど、アディポネクチン48時間処理による変化やこれまで報告されているAMPK経路、PI3K/PIP3経路だけではその後の応答が説明できないことが分かった。平成26年度と平成27年度は、RAW264.5細胞を用いてヒト血漿より精製したHMWアディポネクチンやヒト及びマウスのリコビナントアディポネクチン、球状ドメインのみのリコビナントアディポネクチンのLPSによる炎症の抑制機構、特にTNF-αの発現は抑制しないが、IL-1βを抑制する機構、すなわちAKTのリン酸化(活性化)阻害によりAKTがGSK3βをリン酸化(不活性化)できず、GSK3βがC/EBPβをリン酸化してC/EBPβの核移行を阻害することにより、IL-1βの発現が抑制されることを解明し、現在、投稿中である。また、各種リコンビナントを使用しての解析中、リコンビナントに含まれる極微量のLPS、<0.002EU/μgは大丈夫だが、<0.05EU/μgによりTNF-αの発現が抑制され、この効果はポリミキシンBによる前処理でなくなることを見出し、これについてもデータとして論文に記載している。一方、当教室が所有する血中アディポネクチン濃度が低いアディポネクチンアンチセンストランスジェニックマウス(adiponectin anti-sense transgenic mouse)と野生型マウスを用いたin vivoでのその表現型の解析については、8週令と15週令の血漿、脂肪、肝臓、骨格筋のアミノ酸解析、血漿のサイトカイン解析、8週令の肝臓と脂肪、15週令の骨格筋で発現している遺伝子のGeneChipによる解析、26週令までの表現型解析として血算や尿検査、血清の生化学検査、ブドウ糖負荷試験、骨密度・体脂肪測定、脾臓細胞のFACS、26週での剖検まで終了し、得られた膨大なデータについて比較検討を行っている。研究実績の概要の項に記載したように、アディポネクチンがAKTのリン酸化(活性化)を阻害することにより、LPSによるIL-1βの発現を抑制しているが、これにはアディポネクチンによるAMPKの活性化を介さないこと、また、アディポネクチンによるPI3K活性化によるAKTのリン酸化という既知の経路を逆に阻害していることなど未解明な部分が多い。現在、アディポネクチンの個別のシグナル経路の解析を、cAMPアナログ、AC阻害剤、PKA阻害剤、cAMPを増やすPDE阻害薬を用いたcAMP/PKA経路の解析や、PPARαのアゴニストやアンタゴニストを用いたPPARαを介した遺伝子発現の貢献に関する検討などを継続しており、まだ、終了していない。一方、in vivoでの状態を確認するためにアディポネクチンアンチセンストランスジェニックマウス(adiponectin anti-sense transgenic mouse)と野生型マウスを用いてその表現型の解析を実施しているが、採取した全ての試料の調整や測定が終了しておらず、また、すでに得られているデータも膨大であることより、得られたデータの一部を相関図を作成したりなどして面白い現象は得ている。しかし、データの完全取得ができていないことや、膨大なデータ量の関係で比較解析がまだ十分に実施できていない。

当教室が所有する易炎症性のアディポネクチンアンチセンストランスジェニックマウス(adiponectin anti-sense transgenic mouse、AsTg)の常在性腹腔マクロファージではIL-6、TNF-αの発現が亢進し、抑制性サイトカインであるIL-10が低値を示していた。しかし、このマクロファージを通常のFCS入りの培地で一晩培養するとこの表現型は消失し、wtマウスと同様の表現型に回復する。このことは、アディポネクチン濃度が少し低いだけのin vivo環境下で炎症応答に傾いた表現型を獲得していることを示している。そこで、平成27年度から、AsTgと野生型マウス(wt)を用いたin vivoでの表現型の解析を計画し、8週令と15週令の血漿、脂肪、肝臓、骨格筋のアミノ酸解析、血漿のサイトカイン解析、肝臓と脂肪、骨格筋で発現している遺伝子のGeneChipによる解析、血算や尿検査、血清の生化学検査、ブドウ糖負荷試験、骨密度・体脂肪測定、脾臓細胞のFACS解析、26週での剖検を実施している。驚いたことに、オスの15w骨格筋の遺伝子発現に大きな違いが認められることが判明した。マウス骨格筋ではアディポネクチンが高発現しているが、AsTgではこれがほぼ抑制されており、その結果、AsTgオスの骨格筋ではWtに比べ非常に多くの遺伝子の発現が低下していた。もともとアディポネクチンが多く発現しているため発現抑制がそれほど強くない脂肪や発現が極わずかな肝臓ではこれほどの違いは認められないが、やはりオスの脂肪で多くの遺伝子に発現の違いが認められている。これ以外の解析でもサイトカインや免疫細胞に少しずつ様々な違いが認められており、原因やそれらが持つ生理的意味について今後解明していきたい。平成28年度より所属大学が変わり、研究環境の整備に時間を要したためかなりの期間実験ができていない。また、同じ研究室で共同研究していた職員も全員別の教室や大学に移動し、それぞれが研究ができるようになるまでに時間を要したため、共同研究者の大学での実験もできなかった。1年がたち、それぞれが実験できる環境になったので、今後急いで解析を進めたいと思っている。アディポネクチンは炎症を抑制し糖尿病や動脈硬化などを防止する脂肪細胞が血液中に放出するタンパク質である。糖尿病などの生活習慣病の人ではその血中濃度が低いことが分かっている。また、我々が作成したアディポネクチンのセンストランスジェニックとアンチセンストランスジェニックマウスを用いた検討で、センストランスジェニックマウスでは血中濃度が野生型と比して有意に高く炎症モデルでの検討で抗炎症性であったが、一方、アンチセンストランスジェニックマウスでは野生型と比して血中濃度に有意な差はないものの易炎症性で炎症の重症化や遷延化が認められた。そこでアンチセンストランスジェニックマウスのこの未病状態を網羅的に解析することを目的に、野生型マウスを対照として、8週令と15週令の血漿、脂肪、肝臓、骨格筋のアミノ酸解析、血漿のサイトカイン解析、8週令の肝臓と脂肪、15週令の骨格筋で発現している遺伝子のGeneChipによる解析、26週令までの表現型解析として血算や尿検査、血清の生化学検査、ブドウ糖負荷試験、骨密度・体脂肪測定、脾臓細胞のFACS、26週での剖検を行い、膨大なデータを取得した。これらの表現型