hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
16S rRNA遺伝子の異種間水平伝播の可能性を探求する

原核生物では遺伝子の水平伝播が一般的であるため、その分子分類は16S rRNA遺伝子の塩基配列の相同性を基準に行われることが多い。この手法の理論的大前提には「16S rRNA遺伝子は異種間水平伝播が困難である」という仮定(complexity仮説)が存在する。本研究は分子進化におけるcomplexity仮説という、一見確立されたモデルを批判的に検証することを目的としている。そのために大腸菌をモデルとして、メタゲノム由来16S rRNA遺伝子を実験的に水平伝播させる実験を実施した。「16S rRNA遺伝子は異種間水平伝播が困難である」という仮定の元で、本遺伝子の塩基配列相同性は微生物の分子分類指標として重用されている。この仮定(complexity仮説)を批判的に検証・評価するために、大腸菌に環境DNA由来の16S rRNA遺伝子を人為的に水平伝播させる実験を網羅的に行うことにより、本遺伝子の異種間水平伝播能を評価した。実験では、環境試料から直接抽出したメタゲノムサンプルを鋳型とし、PCRで増幅した16S rRNA遺伝子をin-fusion ligation法で発現ベクター上の相同領域と置換した。これらの異種16S rRNA遺伝子の中から大腸菌で機能可能なものを選択するために、大腸菌KT101株(Kitahara and Suzuki, Moll. Cell, 2009)の選択システムを用いた。選択された16S rRNA遺伝子をシーケンスすることにより大腸菌に水平伝播可能な16S rRNA遺伝子のリストを作成した。平成25年度には、35程度(重複を除く)のクローンを取得することに成功している。得られた遺伝子配列は16S rRNA遺伝子の配列解析用のユニバーサルプライマーを用いて配列を決定した。全長配列のアッセンブル後、マルチプルアライメントを行うとともに、分子系統樹を作成した。その結果、意外なことに、大腸菌が属するガンマプロテオバクテリアのみならず、ベータプロテオバクテリアの系統群に属する多くのバクテリア由来の配列も選択されてきた。これらの配列は、大腸菌KT101株で正常に機能できることが明らかになった。この結果は、異種バクテリア間の16S rRNAの交換(水平伝播)は不可能であるとするcomplexity仮説と真っ向から対立しており、本遺伝子を用いた分子系統学の基礎理論の妥当性に疑問を投げかけるものである。バクテリアの分子系統解析の指標遺伝子として汎用される16S rRNA遺伝子の進化能を調べるための研究を行った。実験では、リボソームRNA遺伝子のオペロンであるrrnBを欠失相補した大腸菌株を用いて、rrnBオペロン中の16S rRNAのほぼ全長を、遠縁のバクテリア由来の相同配列に置換した「水平伝播変異株」を作成することに成功した。水平伝播変異株では、変異塩基の数と比較して増殖速度の悪化は少なかった。このことは、遠縁バクテリアの16S rRNA遺伝子と大腸菌のリボソームタンパク質との間に良い和合性が存在することを明確に示している。従来のcomplexity仮説(Lakeら、1999)では、あるバクテリア種の16S rRNA遺伝子の分子進化は、その種のリボソームタンパク質遺伝子との複雑な相互作用により厳密に制限されている(即ち、16SrRNA遺伝子の異種間水平伝播は不可能)とされていた。しかし、本研究の成果によると、16S rRNA遺伝子は高度な水平伝播能を有することが強く示唆された。rRNA遺伝子の分子進化能をより深く探求するために、rRNA遺伝子にエラープローンPCRによるランダム変異を蓄積させた変異株の作成実験も行った。その結果、ランダム変異の場合は水平伝播変異と異なり、より少ない変異塩基数で大腸菌の増殖速度が有為に悪化させる傾向が観察された。この結果は、水平伝播変異と比較して、ランダム点変異はrRNAの分子進化を加速させる要因にはなりにくい可能性を示唆している。両実験結果を総合すると、バクテリアのrRNA配列に進化的多様性が生み出される要因として、点変異よりも水平伝播変異の方が効果的であることが示唆された。ランダム変異による分子進化だけが起こることを前提とした従来の16S rRNAアプローチは、本遺伝子の水平伝播の可能性を過小評価してしまっている可能性が強く懸念される。ゲノム生物学平成25年度の研究計画では、以下の3点を達成目標として挙げていた。[1]水平伝播モデル実験:申請者が独自に開発した大腸菌KT101株(Kitahara et al. Mol Cell 2009)を用い、大腸菌内で機能できる16S rRNA遺伝子を高品位メタゲノムライブラリーより網羅的に探索する。[2]RNA構造の解析:得られた配列のマルチプル

アライメントを行い、分子系統樹と二次構造マップを作成することにより、大腸菌に伝播可能な16S rRNAの配列的・構造的特徴を明らかにする。[3]形質変化の解析: KT101株のフェノタイプを解析し、異種由来16S rRNA遺伝子の中立性を増殖速度解析により明らかにすると同時に、薬剤耐性の「gain of function」が起こるかどうか調べる。「研究実績の概要」にて述べたとおり、本年度の研究では、[1][2]について極めて明確な成果を得ることができた。[3]の目標の内、異種16S rRNA遺伝子を有するKT101株の増殖速度の測定は既に終了しており、その内の多くが正常な増殖速度を示しているところまでは確認することができている。しかしながら、期待していた薬剤耐性の「gain of function」が起こることは確認されなかった。このことの原因は、DNAを抽出した環境試料(土壌・海水・発酵食品)のいずれにも、薬剤耐性菌が元々少なかったためであるかもしれない。平成26年度の研究計画では以下の2点を目標としている。[4]ハイスループット水平伝播実験: [1]の実験をより大規模で行う。スクリーニング用ロボットを使用して多数の異種由来クローンを得る。それらのフェノタイプ解析を行うことにより水平伝播の影響についての統計的な知見を得る。[5]薬剤耐性の「gain of function株」の直接取得:[4]の実験時に、選択培地に抗生物質を添加することにより、薬剤耐性クローンを直接取得する。このことにより、16S rRNA遺伝子が薬剤耐性遺伝子になりうるか直接検証する。また、モデル実験としてC1192G変異を有する16S rRNA遺伝子(ウシ腸内細菌由来)を導入した大腸菌がスペクチノマイシン耐性になるかどうか調べる。[4]の実験は、平成25年度に行ったことのスケールアップであり、労力は必要であるものの、手堅い成果が期待される。この実験により、大腸菌で機能可能な16S rRNA配列がより多く取得され、「16S rRNA遺伝子は異種間を水平伝播しやすい」という私の仮説が一段と説得力をもって議論可能な状態になることが期待される。[5]の実験は、平成25年度に達成できなかった部分([3])を研究内容として含むものであるが、ハイスループット実験を行ったり、使用するメタゲノムの由来を変更したりすることで実現を目指していきたい。この実験がどうしてもうまくいかなかった場合は、C1192G変異の異種16S rRNA配列を用いたモデル実験を行い、16S rRNA遺伝子の水平伝播が、薬剤耐性という具体的な進化的メリットを有する1例があることを報告することを目指したい。本研究では、16S rRNA遺伝子の異種間水平伝播能の探求という、かつてない挑戦的テーマを掲げて実験を行った。それにもかかわらず、次年度使用額が生じた理由は以下の2点である。[1]16S rRNA遺伝子の異種間水平伝播は、分子進化学の分野で考えられていたよりも遥かに起こりやすい現象であり、小規模な実験のみで検証が可能であったため(このこと自体が大きな発見である)。
染色体転座による疾病の発症機構

染色体転座はがんや精神疾患、先天的発生異常症など様々な疾患の原因となる。これらの疾患を理解するためには染色体転座を実験的に再現する、いわば染色体の手術が必要となる。従来の方法に改良を加えることで、簡単に染色体手術を行う方法を確立できた。これを応用して、がんの原因となる2種類の染色体転座を再現した他、染色体内の特定部分を重複・欠失・逆転させたりできること、遺伝子間の距離測定に応用できることを示した。染色体転座を任意に誘導できる実験を開発し、これを用いて転座生成の機構と転座の影響を解析することを目的として以下の実験を行った。緑色蛍光タンパクGFPと赤色蛍光タンパクDsRed遺伝子を分断し、loxPをはさんで互いに融合させた遺伝子2種(Site1とSite2)を作成した。Site1,Site2に含まれる2つのloxPの間で組み換えがおこると細胞は緑色蛍光と赤色蛍光を発する。この発現ユニットの両側に目的とする遺伝子に相同な配列を挿入した。上流と下流の相同領域のうち一方を4kb、他方を2kbとし、それらはゲノム情報に基づくPCRにより増幅単離した。ジフテリアトキシンA遺伝子と直線化制限酵素部位を配置した。これをターゲティングベクターとし以下の実験に用いた。最初に、Nalm-6細胞にタモキシフェンにより活性化できるCre(MerCreMer)を安定導入した。次に、ターゲティングベクターを常法によりMerCreMerを発現するNalm-6細胞に導入し、相同組換え体をPCRとサザンブロット法によるスクリーニングの後に得た。遺伝子ターゲティングを2回行い、異なる2つの染色体にloxP部位が導入された細胞が得られた。これを用いて以下の実験を行った。IgH(14番染色体)にSite1を導入したNalm-6細胞を作製し、さらにIgHから1Mb,6Mb,11Mb,あるいは40Mbはなれた領域にSite2を導入した細胞を作製した。さらにタモキシフェンを7日間培地に添加し、Creによる組換えを誘導し、組換え頻度をフローサイトメトリーにより測定した。Site2がSite1と同じ染色体に導入された細胞ではCreによる組換え頻度と組換え点間の距離は反比例の関係であることが分かった。このことから組換え頻度は遺伝子間の距離の指標となることが分かった。昨年度開発した染色体レベルの遺伝子操作を可能にしたベクター系を用いて、疾患の原因となる転座の再現を試みた。一つ目はc-Myc/IgH転座を再現した。Nalm-6ヒトプレB細胞株の8番染色体c-Myc遺伝子にSite2を導入し、14番染色体IgHにSite1を導入した。この細胞にCre組換え酵素を7日間作用させるとSite1およびSite2に含まれるloxP部位の間で組換えが起こり、これに伴い8番染色体と14番染色体の間の相互転座が生じた。緑色および赤色蛍光を検出できるフローサイトメトリーにより測定した転座がおきている細胞の頻度はの1,5x10^<-5>であった。この細胞をセルソーティングにより単離し、転座がおきている事をPCR法、FISH法、染色体Gバンド解析により確認した。同様に、Nalm-6細胞の22番染色体BCR遺伝子にSite1、9番染色体ABL1遺伝子にSite2を導入し、Cre組換え酵素を7日間作用させるとSite1,Site2間で組換えが生じ、染色体転座が誘発された。フローサイトメトリーによる転座の頻度は5.9x10^<-5>であった。この細胞をセルソーティングにより単離し、転座がおきている事をSKY法により確認した。さらに、Flp組換え酵素を作用させ挿入されている蛍光タンパク遺伝子の除去を行った後、ウェスタンブロット解析を行う事でBCR-ABL1融合タンパクが起きている事を確認した。これらのことから本染色体操作法が任意の染色体転座の誘導に応用できる事が示された。遺伝子は核内で自由に移動することはできず、染色体テリトリーによる制限を受ける。逆に、遺伝子の核内配置が染色体テリトリーの位置に影響すると考えられている。遺伝子の空間的配置を決定する機構を理解する事は遺伝子発現制御や病的染色体転座の発生機構の理解に役立つと考えられる。我々はCre組換え酵素による染色体組換えを蛍光タンパク質の発現を指標に検出する実験系を開発した。ヒトリンパ球細胞株Nalm-6にこの技術を応用し、任意の染色体転座およびcopy-number variaionの誘導が可能である事に加え、組換えの頻度が同一染色体内の遺伝子距離を反映する事を報告した(PLoS ONE 5 : e9846, 2010)。組換え頻度を反映する蛍光タンパク陽性の細胞頻度はフローサイトメーターにより簡便に測定できる。本手法は細胞固定を要するFISHによる距離測定と異なり、生きた細胞で距離を測定できる特長がある。

今回、この実験系とレトロウイルスベクターによるランダムインテグレーションとを組み合わせて、ある特定の遺伝子と組換えを起こしやすい遺伝子が他の染色体上に存在するか検討したところ、遺伝子座がテロメアに近いほど染色体間の組換えを起こしやすいという結果が得られた。テロメアは染色体テリトリーの外側に位置して他の染色体と接触しやすい位置にある可能性が推測された。部位特異的組換え酵素を用いた遺伝子間距離測定が核内遺伝子配置を制御する機構の解析に利用できる事を示した。
慢性骨髄性白血病発症の分子メカニズムの解明

温度感受性変異株のbcr-ablをIL-3依存性マウスBa/F3細胞株に導入して、Bcr-Ablの活性化誘導系を樹立した。IL-3非存在下で温度変化により、速やかにBcr-Ablが活性化され、Ba/F3細胞は不死化(IL-3非依存性に増殖)した。その際、JAK2、STAT5の活性化に伴い、STAT5の標的遺伝子であるpim-1の発現も強く誘導され、温度を元に戻すとpim-1の発現も消失した。このことは、CML細胞で見られるpim-1の高発現は癌化に伴う二次的なものではなく、Bcr-Abl/STAT5による直接の活性化によることを意味する。Pim-1単独の強制発現により、Ba/F3細胞はPim-1の用量依存性にIL-3非依存性増殖を示し、優勢抑制型Pim-1の強制発現によって、Pim-1によって不死化したBa/F3細胞の増殖は抑制された。これに対して、Bcr-Ab1によって不死化したBa/F3細胞においては増殖が抑制されなかった。以上の結果は、Ba/F3細胞においては、Pim-1の高発現は細胞を不死化するのに十分であるが、Bcr-Ablによる不死化には必要不可欠ではないことを意味し、Bcr-Ablにおける下流のシグナルの多重性、相補性が示唆された。最近、マウスにおいて、Bcr-Ablの発現が白血病発症に必要かつ十分であることが報告されたが、Bcr-Ablにより、種々のシグナル伝達経路が多重に活性化されることは、通常のマルチヒット発癌と異なる、Bcr-Ablによるワンヒット発癌モデルの分子基盤になると考えられた。
消化器癌患者管理における合理的サーベイランス法確立に関する研究

(目的)消化器癌治療における治療成績の向上には、如何に効率よくスクリーニングを行えばよいかが問題であり、いわゆる発癌高危険群を的確に把握し、早期に診断・同定することが重要である。マイクロサテライト不安定性(microsatellite instability : MSI)の解析を進めて、発癌高危険群の選別の可能性につき検討する。(検討項目と結果)A.大腸腫瘍組織(癌または腺腫)、大腸正常粘膜組織におけるMSIを解析。MSIの結果と大腸癌の臨床病理学的因子との検討を行った。具体的には手術時年齢、性別、発生部位、組織型、病期、多発癌、重複癌、家族歴の有無、遺伝性非ポリポーシス大腸癌の診断基準に合致する症例などの項目について行った。術後症例においては、その後の長期にさかのぼった病歴の聴取により、患者本人のみならず、家系構成員における病歴も検討することで、発癌高危険群の同定を行った。消化器癌サーベイランスにつき他臓器重複癌について検討した。大腸癌切除症例1330例を対象とし、大腸重複癌は115例(8.6%)であった。対照は単発性大腸癌1154例とした。[結果]性別は同時性で3.14:1と有意に男性に多かった。その他臨床病理学的因子に有意差はなかった。重複臓器について領域別にまとめると、上部消化管(食道,胃,十二指腸)が27例、肝胆膵23例、腎泌尿器14例、呼吸器13例、婦人科領域13例、乳腺9例であった。重複癌においてHNPCCの頻度は8例(7.0%)であった。大腸重複癌におけるMSI(+)の頻度は20例中4例(20.0%)であった。MSI陽性例では、陰性例に比べて多発癌、重複癌の頻度が多かった。また、家族歴聴取においてより多くの癌家族歴が発見された。消化器癌サーベイランスにおいて、特に大腸癌においては、MSIの解析が重要であると判明した。(目的)消化器癌治療における治療成績の向上には、以下に効率よくスクリーニングを行えばよいかが問題であり、いわゆる発癌高危険群を的確に把握し、早期に診断・同定することが重要である。今後は、大腸癌のみならず胃癌、子宮体癌、腎泌尿器系癌についても検討を予定している。B.抗癌剤感受性試験に関しては、5FU系薬剤を行っているがMSIの結果とも対比させ、予後の検討を行っている。今後は、感受性試験の構築をさらに進める予定であり、ひいてはサーベイランス法の確立につながる。
運動継続要因に及ぼす水中歩行の生理・心理学的特性の影響

水中での運動は陸上での運動に比し、体重による負担を軽減するだけでなく、静脈環流を促し、効率よく脂質代謝を亢進させ、その結果、運動の効果発現を早め、運動継続の可能性を高めるのではないかという仮説のもと、以下の研究を行った。対象は健常な成人男子とし、脂質負荷により一過性の高脂血症状態を作り、その後、相対的に同一強度の陸上歩行と水中歩行を行わせ、脂質利用の違いから検討した。脂質の負荷は総熱量657.5kcal、うち脂質が約75%を占める、高脂肪混合食とした。運動はトレッドミルを用いた陸上歩行と水中トレッドミルのついた回流式水槽(フローミル)を用いた水中歩行とした。運動強度はそれぞれの運動で歩行速度漸増負荷を行った際の血中乳酸浪度から求めた乳酸性作業閾値(LT)強度とした。被験者は前日より運動を制限し、10時間以上の絶食を行った後、明朝実験食を摂取した。その後、座位安静を保持した後、血液中の中性脂肪がピークとなる3時間後からLT強度での運動を1時間行った。LT強度での酸素摂取量は水中歩行の方が陸上歩行に比し、やや高値を示すことは昨年度報告した。したがって、運動中の酸素摂取量は水中歩行のほうが高く設定されていたにもかかわらず、脂質負荷後の運動中の呼吸交換比(R)は水中歩行のほうが低くなる傾向を示し、相対的に同一強度にもかかわらず、水中歩行のほうがエネルギー基質として、脂質を多く利用している可能性が示唆された。さらに運動終了後1時間および2時間におけるRにおいても同様の傾向が認められ、運動終了後の回復期においても、水中歩行では脂質代謝亢進が継続している可能性が示唆された。これらのことは血清遊離脂肪酸濃度も運動中・後を通じて、水中歩行の方が高値を示す傾向であったことからも裏付けられると思われる。目的:これまでの運動処方は生活習慣病の改善(二次予防)が中心となり運動の効果のみの追求に終始してきた。しかし、有効であるというだけでは運動の習慣の獲得と継続には結びつかないことが明確となった。そこで著者らは、運動習慣の獲得と継続の要因として、「目標達成の効率」と「運動にともなう快」という2つの要因を重視したモデルを構築しているところである。本研究はこのモデルの一部として下記の2項目を検証することを目的とする。1)水中での運動は循環器系への負担を軽減するとともに静脈還流を促し、糖脂質代謝を亢進する可能性がある。2)重力からの解放と水流により陸上における運動に比し快が高まる可能性がある。方法:健常な一般男子大学生を対象にAT強度での陸上歩行と水中歩行を行わせ、その際の糖代謝動態の違いについて検討した。陸上歩行はトレッドミルを用いた速度漸増法により、負荷を漸増した際の血中乳酸値からATを求めた。水中歩行ではトレッドミルのついた回流式の水槽を用い、トレッドミルの速度を一定(60m/min)とし、水流を漸増した際の血中乳酸値からATを求めた。また、それぞれのATでの酸素摂取量を運動強度として用いた1時間の運動中の糖代謝の変化について検討する。結果:血中乳酸値が4mmol/lを越える付近まで負荷漸増をおこなった結果、陸上歩行と水中歩行中の心拍数と酸素摂取量の関係はほとんど同一であった。しかし、一人の被検者を例に示すと陸上歩行でのATは酸素摂取量が約13001400ml/min付近で出現するのに比し、水中歩行では16001700ml/min付近で出現するというようにAT出現の全体的運動強度は異なった。このことは相対的に同一の運動強度で運動した場合、水中歩行の方がより、高い酸素摂取量で運動することが可能となり、糖代謝亢進につながる可能性が示唆された。

さらに運動終了後1時間および2時間におけるRにおいても同様の傾向が認められ、運動終了後の回復期においても、水中歩行では脂質代謝亢進が継続している可能性が示唆された。これらのことは血清遊離脂肪酸濃度も運動中・後を通じて、水中歩行の方が高値を示す傾向であったことからも裏付けられると思われる。
災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築のための総合的研究

災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築のための総合的研究として、政策動向の検証および、調査研究を行った。「我が事・丸ごと共生社会」の深化を要請する国の動きと連動しつつ地方自治体および各地域の社会福祉協議会、社会福祉法人等がどのように地域福祉実践を行って行くのかを理論的かつ実践的に明らかにしてきた。京都市および大阪府下の先駆的実践についての現地調査では、少子化・高齢化のますますの進行、近隣住民の関係性の希薄化、中壮年期の多忙化が顕著な中でも、当該地域への愛着を深める活動を多様な住民達と共に展開している現状、地域特性に応じた独自の手法で地域福祉活動の担い手を確保している現状、地域の社会資源の活用・開発に力をいれている現状等を確認することができた。また、東日本大震災で甚大な被害を受けた仙台市若葉区での現地調査においては、被災直後から学生を組織し、支援活動を開始した組織の取り組みから、息の長い支援活動を可能とする、まさに住民主体の支援活動の展開手法があること、地元の商店街がまちづくりに取り組む意義と方法、被災した施設が地域住民との協働の中で復興から、まちづくり、人材育成に取り組む手法とその必要性について等を確認することができた。基礎的自治体の役割をベースに、多様な社会福祉事業体が連携し、基本的な地域生活基盤を形成し、地域住民の日所的な取り組みが展開される中でこそ、災害時にも汎用性をもつ地域コミュニティを構築する要件となることを検証できた。本研究は「災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築」の為にはいかなる要件が必要なのか、そして、それはいかなる方法で実現可能となるのかについて総合的に研究することを目的としている。高齢者の役割喪失、障害者の雇用、若者の引きこもり、子どもの不登校、多様な形で進む貧困、孤立した子育て等々の問題は、既存の社会福祉制度のみでは解決が困難である。これは「社会的孤立」概念として説明可能な問題であり、かつ、いわゆる「制度の狭間」と呼ばれる問題で、全国各地で顕在化・潜在化している地域福祉課題でもある。これらの諸課題に何らかの地域的対応を行い、日常的に問題解決に向けた取り組みを行っている地域では、当事者に関わる情報を共有し、必要な支援を行うための社会資源を開発しながら当事者と緩やかにつながりをもっていることが明らかになってきている。そして、日常から、こうした取り組みを行っている地域では、災害に見舞われた際にも、排除されがちな人々の支援を可能にする力を維持できているのである。災害時に顕在化する地域福祉課題は、平常時に潜在化している地域福祉課題と同質性と共通項を有しているといえる。そのため、平常時に地域コミュニティで顕在化している諸問題と共に潜在化している、あるいは潜在化する傾向のある諸問題を明らかにしながら、これらの問題に対処していく方法について検討していくことで、災害時にも誰をも排除しないコミュニティの構成要件を明らかにしていくことが可能となるのである。この間、大きな災害被害にあった地域調査に加え、地域コミュニティ構築に課題を有しながらそれに取り組んでいる地域調査を実施し、分析、検討することを通じて災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築のための総合的研究を進めていく。地域福祉政策に関する動向と理論的研究、地域防災・減災政策に関する動向分析、地域コミュニティ構築をめぐる現状についての専攻研究と動向分析については、各自で取り組み、研究会を通して研究交流を行っている。しかしながら、現地調査実施に際しては、メンバー間の調整、現地受け入れコーディネーターとの調整が予定どおり進まず、福島調査のみを実施できたため。本研究が掲げる「災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ」とは、日常的に何らかの結びつきを意図的に持つことに努め、その関係性を深めるための仕掛けをもったコミュニティを意味している。いわゆる「制度の狭間」と呼ばれる問題、例えば、高齢者の役割喪失、障害者の雇用の困難性、若者の引きこもり、子どもの不登校、多様な形で進む貧困、孤立した子育て等々の問題は、既存の社会福祉制度のみでは解決が困難である。また、これらの諸問題は「社会的孤立」概念としても説明可能な問題であり、かつ全国各地で顕在化・潜在化している地域福祉課題でもある。これらの諸課題に対して、何らかの地域的対応を試み、日常的に問題解決に向けた努力をしている地域においては、問題を抱える本人に関わる情報を共有し、必要な支援を行うための社会資源を開発しながら、本人と緩やかに繋がりを持っていることが明らかになってきている。そして、こうした地域においては、災害に見舞われた際に取り残されてしまいがちな人々の支援を可能にする力を維持している。そのため、平常時に地域コミュニティで顕在化している諸問題と共に潜在化している、ないしは潜在化する傾向にある諸問題を明らかにしながら、これらの問題に対処していく方法について検討していくことで、災害時にも誰をも排除しないコミュニティの構成要件を明らかにしていくことが可能となるのである。この間、大きな災害被害に遭った地域調査に加え、地域コミュニティ構築い課題を有しながらそれに取り組んでいる地域調査を実施し、分析、検討することにより、災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築のための総合的研究を進めていく。地域福祉政策に関する動向と理論的研究、地域防災・減災政策に関する動向分析、地域コミュニティ構築をめぐる現状についての先行研究と動向分析については、各自で取り組み、研究会を通して研究交流を行っている。しかしながら、現地調査実施に際しては、現地受け入れコーディネータとの調整が予定通り進んでいないため。

災害時にも適応可能な地域とそれを支えるしくみづくりについて、昨今の政策動向、各種現場における取り組み状況、地域コミュニティにおける実践等について総合的に検討を進めてきた。東日本大震災の被災地、熊本地震の被災地等をはじめとする、災害時の地域コミュニティの危機的状況を経験した地域のみならず、日常生活上の人間関係の希薄化が顕著な都市部における個人的なレベルでの生活不安と、プライバシーに踏み込まない生活が一般化している地域住民のジレンマをどのようにのりこえるのかについて種々の検討を行ってきているが、必ずしも有効な方法が明らかになっているとは言いがたい。むしろ、一部の熱心な活動者の熱意に依存した活動展開がみられる事例においては、それをどのように地域コミュニティ全体の動きに連動させるのかについての検討は引き続き行って行く必要がある。地域福祉をめぐっては、この間、多様な政策が打ち出され、地域コミュニティ、地域住民、活動者に対して多大な期待がなされるようになってきている。従来の住民主体の地域福祉活動の展開にとどまらず、介護保険制度の受け皿として、障害・児童領域における政策対象外の問題の受け皿として機能することが期待されているわけであるが、それが過大なものとなってくる際には様々なハレーションも生じてきている。各領域の専門職、社会福祉協議会をはじめとするコミュニティワーカー等の専門職にも大きなしわ寄せとなっており、その評価については慎重になる必要があることを明らかにしてきた。とりわけ、地域包括ケアシステムとしての期待と、その実質的な実現のためのケア保障のあり方を包括的に検討してきた。この間の政策動向に対応した調査・分析がおいついておらず、新たな指標に基づく評価が必要になってきているため。とりわけ「我が事・まるごと地域共生社会」が提示される中での、住民主体の地域福祉活動のあり方をどう位置づけ、推進していくのかについての基本的枠組みについての議論が充分できていないこと、新たな仮説の検討に基づく再調査の設計が遅れていることがあげられる。災害時にも適応可能なインクルーシブな地域コミュニティ構築のための総合的研究として、政策動向の検証および、調査研究を行った。「我が事・丸ごと共生社会」の深化を要請する国の動きと連動しつつ地方自治体および各地域の社会福祉協議会、社会福祉法人等がどのように地域福祉実践を行って行くのかを理論的かつ実践的に明らかにしてきた。京都市および大阪府下の先駆的実践についての現地調査では、少子化・高齢化のますますの進行、近隣住民の関係性の希薄化、中壮年期の多忙化が顕著な中でも、当該地域への愛着を深める活動を多様な住民達と共に展開している現状、地域特性に応じた独自の手法で地域福祉活動の担い手を確保している現状、地域の社会資源の活用・開発に力をいれている現状等を確認することができた。
地球温暖化に伴う樹木の肥大成長の変動に関する年輪年代学的研究

本研究では,森林限界付近に生育する樹木から500年分の標準年輪時系列を構築し,温暖化前後の肥大成長や変動の違いを明らかにするとともに,気象観測が行われていない温暖化以前の月平均気温や月総降水量を年輪年代学的手法により復元することを目的した。1998年8月に北海道大雪山系十勝三股・四国石鎚山系瓶ヶ森の両試験地において現地調査を行ったのち,成長錘コアを十勝のアカエゾマツから120本,瓶ヶ森のウラジロモミから220本採取した。年輪幅の計測および軟X線デンシトメーターによる年輪内密度変動の計測の結果,十勝からは510年,瓶ヶ森からは246年の標準年輪時系列を得た。統計解析を行った結果,今回瓶ヶ森から得た得た年輪幅時系列の変動には気温の影響が強く反映されていることが明らかになった。今後さらに,試験地を広げて試料を増やすことにより,過去約300年の気温を復元することができると考えられる。一方,十勝から得た年輪幅・年輪内密度時系列の変動には,気温だけでなく降水量の影響が強く反映されていた。十勝の試料からは,気候復元に使用する重回帰式の説明変数(年輪幅・年輪内密度時系列)が充足していたこことから,過去約500年の帯広の気候を復元することができた。なお,年輪構造の画像解析に関しては,10年度に引き続き,工夫を施したミクロトームを用い,成長錘試料の表面を高精度で切削する方法を検討したが,解析に十分耐えうるな画像を得るにはさらに試料の包埋処理などの方法にさらに工夫を要することが明らかになった。本研究では,森林限界付近に生育する樹木から500年分の標準年輪時系列を構築し,温暖化前後の肥大成長の変動の違いを明らかにするとともに,気象観測が行われていない温暖化以前の月平均気温や月総降水量を年輪年代学的手法により復元することを目的した。8月に北海道大雪山系十勝三股・四国石鎚山系瓶ヶ森の両試験地において現地調査を行ったのち,成長錘コアを十勝のアカエゾマツから120本,瓶ヶ森のウラジロモミから220本採取した。9月2月にかけて成長錐コアに含まれる年輪構造上の欠陥などを検出・補正し,実体顕微鏡観察による年輪幅の計測および軟X線デンシトメーターによる年輪内密度変動の計測を行った。その結果,十勝からは510年,瓶ヶ森からは246年の標準年輪時系列を得た。これにより,11年度に継続して年輪構造の画像解析を進めることにより,地球温暖化が顕著になった1850年前後の肥大成長の変動の違いを評価できることが示された。さらに,統計解析を行った結果,今回得た年輪幅・年輪内密度時系列の変動には気温の影響が強く反映されていることが明らかになった。このことから,両試験地における過去200年から500年の気温の変動を復元できることが示された。なお,この成果については,1999年4月に開催される第110回日本林学会大会にて公表する予定である。年輪構造の画像解析に関しては,工夫を施したミクロトームを用い,成長錘試料の表面を高精度で切削する方法を検討した。その結果,解析に十分耐えうるな画像を得るにはさらに試料の包埋処理などの方法にさらに工夫を要することが明らかになった。この点については,各種包埋処理剤を使用した試料処理方法に関する実験をさらに進めているところである。来年度には,今年度得た年輪試料とさらに来年度採取予定の年輪試料とについて年輪構造の画像解析を行う予定である。
非線形な資産価格付け理論に関する研究

本研究では,非線形な価格付けを行う資産価格理論の構築を目指した.非線形の資産評価は,曖昧さの回避の概念と関連するので,回避したい曖昧さの一種類として,レジームスイッチの推移確率を取り挙げた.経済環境の状態を表す状態変数を規定するパラメータがレジームスイッチする状況における意思決定の問題を無限満期の枠組みで解明した.また,短期金利が,複数の金利モデル間でレジームスイッチする場合の債券価格やデリバティブ価格を検討し,その価格の導出に成功した.本研究では,非線形な価格付けを行う資産価格理論の構築を目指した.非線形の資産評価は,曖昧さの回避の概念と関連するので,回避したい曖昧さの一種類として,レジームスイッチの推移確率を取り挙げた.経済環境の状態を表す状態変数を規定するパラメータがレジームスイッチする状況における意思決定の問題を無限満期の枠組みで解明した.また,短期金利が,複数の金利モデル間でレジームスイッチする場合の債券価格やデリバティブ価格を検討し,その価格の導出に成功した.多くの資産価格理論では一物一価を仮定するので,価格付け汎関数は線形となるが,流動性に乏しい非完備市場の場合では,現実の価格付けは最早線形性を保っていない.そこで,本研究では,リスク尺度による評価方法を踏襲して,原資産の流動性に関する制約や原資産間の相互依存性を考慮しながら個別資産の評価を再構築することを目的とする本年度においては,リスク尺度,曖昧さ回避,無差別価格に着目して相互の関係を整理し,無差別価格の金利商品への応用を試みた.スワップなど相対取引には信用リスクを伴う,その信用リスクは明らかに非線形性を持っており,無差別価格による説明が期待できる無差別価格の原理的な求め方は明快であるが,複数のキャッシュフローの決定時期と支払時期のずれなど金利商品の独自性ゆえに,実際の計算は困難を伴うことがわかった.無差別価格の計算では期待値計算のほかに偏微分方程式を解くことによっても可能である.今後はこの偏微分方程式によるアプローチを検討していきたい多くの資産価格理論では一物一価を仮定するので,価格付け汎関数は線形となるが,流動性に乏しい非完備市場の場合では,現実の価格付けは最早線形性を保っていない.そこで,本研究では,リスク尺度による評価方法を踏襲して,原資産の流動性に関する制約や原資産間の相互依存性を考慮しながら個別資産の評価を再構築することを目的とする.一般的に曖昧さ回避による無差別価格はそのような非線形価格の性質を持っている.本年度においては,回避したい曖昧さの源泉としてレジームスイッチによる不確実性を考察した.経済環境の状態を表す状態変数を規定するパラメータがレジームスイッチする状況における意思決定の問題を無限満期の枠組みで考察した.最適化の条件から,閾値の区間毎に異なる連立2階常微分方程式が導出され,それらを順次解く方法を提示した.また,初到達時刻に関する期待値計算の結果を得た.これらの結果の一部については既存研究で明らかにされているが,簡単なアイデアで普遍的に導出できるよう手法を解明したことは大いに意義があると言える.これらの結果に曖昧さを導入して結果を拡張すれば新たな知見を見出すことが期待できる.ただし,解析的に解いていくことは限界がありそうなので,数値計算に頼らざるをえないことが障害となりえる.多くの資産価格理論では一物一価を仮定するので,価格付け汎関数は線形となるが,流動性に乏しい非完備市場の場合では,現実の価格付けは最早線形性を保っていない.そこで,本研究では,リスク尺度による評価方法を踏襲して,原資産の流動性に関する制約や原資産間の相互依存性を考慮しながら個別資産の評価を再構築することを目的とする.一般的に曖昧さ回避による無差別価格はそのような非線形価格の性質を持っている.前年度に引き続き,回避したい曖昧さの源泉としてレジームスイッチによる不確実性を考察した.主観的割引率は一定と仮定する既存研究が多いが,主観的割引率自体も確率的に変動しうる.また,その確率的な変動も景気動向やイベントなどによって突発的に変化しうる.これらのことを勘案して主観的確率がレジームスイッチする金利モデルに従うと仮定して,そのレジームスイッチリスクの曖昧さを回避するモデルを検討した.その最初の段階として短期金利が,複数の金利モデル間でレジームスイッチする場合の債券価格やデリバティブ価格を検討し,その価格の導出に成功した.金利の変動過程がレジームスイッチする場合に加えて,金利の水準とともにモデルがレジームスイッチする場合でも対応できる.導出には,Feyman-Kac公式とhomotopy perturbation methodを応用した.この方法により,前述の設定においても効用最大化問題や証券価格の無差別価格を導出することは可能であると期待できる.多くの資産価格理論では一物一価を仮定するので,価格付け汎関数は線形となるが,流動性に乏しい非完備市場の場合では,現実の価格付けは最早線形性を保っていない.

そこで,本研究では,リスク尺度による評価方法を踏襲して,原資産の流動性に関する制約や原資産間の相互依存性を考慮しながら個別資産の評価を再構築することを目的とする.一般的に曖昧さ回避による無差別価格はそのような非線形価格の性質を持っている.本年度においては,回避したい曖昧さの源泉としてレジームスイッチによる不確実性を考察し,その結果を精緻化できた.昨年度に,経済環境の状態を表す状態変数を規定するパラメータがレジームスイッチする状況における意思決定の問題を無限満期の枠組みで考察し,最適化の条件から,閾値の区間毎に異なる連立2階常微分方程式の導出とその解法を提示したが,その結果をDirichlet問題として一般化・精緻化できた.レジームスイッチに関する研究は順調に成果を得て各種学会で発表を行っている.ただし,曖昧さ回避への応用や信用リスクへの応用は検討事項が多いためさらなる時間を要する.25年度が最終年度であるため、記入しない。レジームスイッチに関する研究を精緻化できた.曖昧さ回避の導入と信用リスクへの応用を検討する.レジームスイッチに関する曖昧さ回避の理論的研究を行う.解析的に解いていくことは困難が予想されるので,同時に数値計算で新たな知見を示せるよう試みる.25年度が最終年度であるため、記入しない。リスク尺度を用いた債券等のポートフォリオの非線形価格付けを分析する.後向き確率微分方程式を解くことによって価格が得られるので,単純な仮定のもとで同微分方程式を解き,定性的な結果を得ることを目指す.あいまいさによる価格付けは,数学的には複数の確率測度を用いて最も保守的な価値を見出すことに帰着する.その確率測度(ないしはパラメータ)にあいまいさがあるため,種々の意思決定が変化する.ある時点では最適な投資決定を行なっても,時間が経過して不確実性が部分的にでも解消すると,その決定はもはや最適ではない,という時間的非整合性の問題が生じる.そのことを複数の時点でキャッシュ・フローを生み出す債券について考察し,債券ポートフォリオの場合に拡張する.銀行の資産の多くを占める債券や融資のポートフォリを組成するための留意点としてまとめるよう研究を進める.
知的障害児者の体組成と健康・運動プログラムの開発

体育・健康に関する指導効果を実証するため、特別支援学校中学部及び高等部に在籍した生徒の3年間のBMIの経年変化の分析を行った。プログラム実施校における実施期間以前(2001年2003年)の在校生と実施期間中(2012年2014年)の在校生のBMIの年次推移を比較した。分析は2001年と2012年の調査開始時に中学部1年生から高等部1年生であった4つの異なる学年集団に分けて行った。2要因(プログラム×学年推移)分散分析の結果、プログラム実施期間以前とプログラム実施期間中のBMIの年次推移の比較では、調査開始時中学部2年集団と調査委開始時中学部3年集団のデータを用いたとき交互作用が有意だった。知的障害者の身体組成を把握し、食事や身体活動など生活習慣との関連から改善すべき課題を明らかにした。A県の知的障害者通所更生施設の知的障害者124名(男性84名、女性40名)を対象とした。調査内容は、身体組成(TANITA製体組成計MC-980A)と栄養状態(簡易型自記式食事歴質問票[brief-type self-administered diet historyquestionnaire: BDHQ])、身体活動量などの生活項目でであった。BMI及び体脂肪ともの女性の52.5%が肥満と判定された。またBMIが標準地でも体脂肪の値が軽肥満・肥満に該当する人が存在していた。栄養摂取に関しては、脂質、カルシウム、食物繊維、食塩、飽和脂肪酸で不足あるいは取り過ぎと判定された割合が50%以上であった。特に、食塩は調査対象者のほぼ全員が過剰摂取であった。食塩は循環器疾患の発症に影響を及ぼすものである。また、飽和脂肪酸は洋菓子等に多く含まれており、過剰に摂取しているものが多く、一方、食物繊維は不足している者が多くいることを認めた。いずれも生活習慣病のリスクとなるものであり、食事の摂り方に課題があることが明らかになった。以上のことから、知的障害者の健康課題は運動面もさることながら、食事に関しても本人及び保護者に対しての適切な支援が重要である。学齢期における保健教育(保健学習及び保健指導)の重要性が示唆された。初年度(平成25年度)は成人知的障害者124名の身体組成を把握し、食事や身体活動など生活習慣との関連から改善すべき課題を明らかにした。2年目(平成26年度)は、学齢期の知的障害児を対象に同様の調査を実施し、併せて活動量計による身体活動量の測定を行った。知的障害特別支援学校中学部及び高等部生徒49名(男子24名、女子25名)を対象とした。BMIは男子の平均が20.0±3.6、女子の平均が21.3±3.1と標準であり、体脂肪率も男子の平均が13.5±7.1、女子の平均が21.3±3.1と標準であった。一方、身体活動量の結果をみると、男子の平日歩数の平均は9298.7±2932.7歩、女子の平日歩数の平均は9063±3321歩であり十分な活動量が確保されており、生徒の体格に影響を与えていると考えられた。ところが、男子の休日歩数の平均は3344.6±3096.8歩、女子の休日歩数の平均は3672.9±3203.8歩であり、平日に比べ休日の活動量が著しい減少がみられた。栄養摂取に関しては、エネルギー充足率を算出し考察を行った。男子の平均は86.4±21.5%、女子の平均は73.0±16.2%といずれも必要な栄養摂取量を満たしていないことが明らかになった。以上のことから、学齢期における保健教育(保健学習及び保健指導)の重要性が示唆され、そのための保健教育プログラムの作成が急務である。知的障害特別支援学校中学部及び高等部生徒49名(男子24名、女子25名)を対象とし、個別の健康・運動プログラムの作成と体力向上のための運動指導を行った。対象となる特別支援学校では一般に知的障害特別支援学校で「帯状の週日課」として行われている体力向上を目的とした授業について、指導内容及び方法に関する検討を行ってきた。加えて25年度からはICTの活用や身体組成及び身体活動量の測定を実施しながら、運動の日常化や生活習慣の改善を目指した取り組みを行っている。さらに健康教育(保健学習及び保健指導)についても養護教諭との連携のもとですすめてきた。この3年間の取り組みの成果を検証するために、現在の生徒と10年前の生徒とのBMIの推移について比較を行った。中学部2年生から高等部1年生までの3年間、中学部3年生から高等部2年生までの3年間に関して、現在の生徒(健康・運動プログラムを実施してきている群)は10年前の生徒(健康・運動プログラムを実施していたい群)よりもBMIの上昇率が有意に低かった。以上のことから健康・運動プログラムの有効性に一定の効果が見られた。健康・運動プログラムの効果について、10年前と現在の生徒の身体状況(BMIの推移)を基に分析を行った。さらなる効果検証のためのデータ収集、特に対象校からの身長や体重データ収集とその分析に時間を要したため遅れが生じた。

肥満予防のプログラム開発のために2004年から10年間にわたり知的障害特別支援学校の教育課程に位置付け実施してきた体育・健康に関する指導の効果を実証するために、中学部および高等部に在籍した生徒の3年間のBMIの経年変化について分析を行った。対象となったプログラム実施校における実施期間以前(20012003年)の在校生と実施期間中(20122014年)の在校生のBMIの年次推移を比較した。また、プログラム実施校の実施期間中の在校生と、非実施校(対照群)の在校生についても同様の比較を行った。分析は2001年と2012年の調査開始時に、中学部1年生から高等部1年生であった4つの異なる学年集団に分けて行った。2要因(プログラム×学年推移)分散分析の結果、プログラム実施期間以前とプログラム実施期間中のBMIの年次推移の比較では、調査開始時中学部2年集団と調査委開始時中学部3年集団のデータを用いたとき交互作用が有意であった。そこで交互作用が有意であった2つの集団について、プログラム要因の水準ごとに学年推移の単純主効果を分析した結果、いずれの集団もプログラム実施期間以前のデータにおいて有意な主効果が確認され、学年進行とともにBMIが上昇した。一方、プログラム実施期間中のデータでは有意な主効果は認められなかった。また、非実施校との比較では、すべての集団において交互作用が有意であったことから、次にプログラム要因の水準ごとに学年推移の単純主効果を分析した結果、いずれの集団もプログラム非実施校においてのみ有意な主効果が確認され、学年進行とともにBMIが上昇した。以上のことから、本プログラムの有効性が示唆された。体育・健康に関する指導効果を実証するため、特別支援学校中学部及び高等部に在籍した生徒の3年間のBMIの経年変化の分析を行った。プログラム実施校における実施期間以前(2001年2003年)の在校生と実施期間中(2012年2014年)の在校生のBMIの年次推移を比較した。分析は2001年と2012年の調査開始時に中学部1年生から高等部1年生であった4つの異なる学年集団に分けて行った。2要因(プログラム×学年推移)分散分析の結果、プログラム実施期間以前とプログラム実施期間中のBMIの年次推移の比較では、調査開始時中学部2年集団と調査委開始時中学部3年集団のデータを用いたとき交互作用が有意だった。(理由)当初予定していた対象者よりも少ない人数で調査を行ったため。また、特別支援学校生徒の個別の運動プログラムについては、事例で実施した。身体組成、栄養調査、身体活動量の調査を受けて健康課題が明らかになり、3年目に予定していた健康プログラムの一部をクラスルームベースドで実施することができた。健康・運動プログラムの効果の検証をさらにすすめていく。具体的には対象校とのBMI推移の比較を行う。また運動の日常化や生活習慣についても関する調査を実施し、データの収集及び分析を行う予定である。特別支援教育今後は学校教育現場における保健教育の実施状況について調査を実施し、海外の先進的な取り組みや学校現場の体育教師のコメントを参考にしながら、知的障害特別支援学校で活用できる保健教育プログラム(ハンドブック)を作成、学校教育現場で活用し、その有効性について検証していく。当初予定していた調査対象者(200名)よりも少ない人数で調査を行ったため。また身体活動量の調査については、週末の運動・スポーツ活動への参加の有無について調査するにとどまった。研究成果を学会等にて発表する。また学会等にて研究に必要な情報収集を行う。健康・運動プログラムを実施する際に必要となる教材(消耗品)を購入する。論文の英文校正を行う。研究成果を海外の学会にて発表する。
集団的細胞運動を支える細胞内小胞輸送とアクチン細胞骨格再編成のクロストーク制御

集団的細胞運動では、複数の細胞が細胞間接着を介してひとつの集団を形成し、さらに細胞集団の大移動を可能にするために強い力を生み出すことが必要となってくる。そこでは細胞間接着分子および細胞ー基質間接着分子等の細胞内小胞輸送とアクチン細胞骨格の再編成のクロストーク制御が重要となってくるが、我々は、Rab13低分子量G蛋白質とその標的蛋白質JRABがその制御の鍵を握っていると考えている。本研究では、Rab13-JRAB系が制御する集団的細胞運動の分子基盤の解明によって複雑・高度な細胞集団の挙動を説明することができる具体的な制御系の提示を試みているが、本年度は、以下の成果を得ることができた。1.JRABの構造解析と構造の時空間的変化の実体の解明:これまでリコンビナント蛋白質を用いた生化学的解析により、JRABが分子内結合してclosed formをとっており、Rab13の結合により、その分子内結合が解除されてopen formになる可能性を示していたが、本研究では、生化学的な解析に基づいたバイオインフォマティクスの手法を用いた解析により、JRAB-N末端ーJRAB-C末端およびRab13ーJRAB-C末端の複合体の構造モデリングを完成させ、Rab13によるJRABの構造変化モデルを提示することができた。2.Sheet migrationにおけるJRABの構造変化の役割の解明:JRABのclosed formあるいはopen formで維持された構造変異体を発現させた細胞では、集団的細胞運動に異常をきたすことを見出していたが、ライブイメージングとコンピュータサイエンスを組み合わせたアプローチ法によって各々の特徴の抽出・定量化に成功した。さらに、得られたデーターを詳細に解析することにより、細胞集団が一定の秩序や法則性を保って動いていくにはJRABの構造変化が重要であることを証明することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1研究目的の達成度研究代表者は、所属するグループが上皮細胞における細胞間接着分子の分子輸送の制御系として見出していたRab13-JRAB系が、分子輸送だけでなくアクチン細胞骨格の再編成を時空間的に制御することによって、集団的細胞運動で認められる秩序や法則性を生み出している可能性があることを明らかにしつつある。その過程で、Rab13との結合に依存してJRABの構造が変化する(closed formからopen form)ことを生化学的解析によって見出しており、JRABの構造変化とそれに伴う多彩な蛋白質-蛋白質間の相互作用が集団的細胞運動という非常に複雑な細胞機能を可能にするという仮説を提唱している。そこで、本研究では、JRABの構造変化と集団的細胞運動に関する本仮説を証明することを目的とする。前年度においては、Rab13とJRABの結晶化解析のために各々の全長および複数のドメインのリコンビナント蛋白質の発現・精製を試みた。これまでに発現量増加を期待してC末端を一部欠損させた活性型Rab13とRab13との結合部位を含んだJRABのC末端ドメインの複合体を精製することに成功している。また、JRABの構造変化に依存した相互作用を示す分子の探索を行い、JRABのopen formに特異的に結合する分子としてfilaminを同定し、JRAB-filaminがアクチン細胞骨格の再編成の制御に基づく細胞の形態変化(cell spreading)に関わることを明らかにしている。さらに、JRABの構造変異体を発現させた上皮細胞の集団的細胞運動について、理化学研究所の横田秀夫先生のグループとともにコンピュータサイエンスによるアプローチで各構造変異体に特徴的なライブイメージング像の分析を行い、現在までに、各々の構造変異体が示す野生型とは異なった特徴を抽出し、定量することに成功している。

26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、Rab13-JRAB複合体の構造解析のためにRab13活性型変異体およびJRABのリコンビナント蛋白質の発現・精製を試みた。Rab13活性型変異体の発現は非常に悪かったが、JRABとの結合能を維持したC末端欠損変異体を見出してバキュロウイルス発現系で発現させ、発現量を劇的に増加させることに成功した。この活性型Rab13の欠損変異体を用いてRab13-JRABC末端ドメインの複合体をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで高度に精製することができた。これまでにJRABのopen formに特異的に結合する分子としてアクチン結合蛋白質であるactinin-1やactinin-4を見出していたが、今回、別のアクチン結合蛋白質であるfilaminを同定することに成功した。さらに、NIH3T3細胞においてJRAB-filaminの機能解析を進め、JRAB-filaminが細胞の形態変化(cell spreading)を引き起こすことを明らかにした。レトロウイルス発現系を用いてJRABのFRETプローブを恒常的に発現している上皮細胞株を樹立し、現在、集団的細胞運動時にJRABが集団内での細胞の位置や細胞内での局在に応じた構造変化を起こしているか否かをライブイメージングで検討しており、すでに予備的解析結果は得ている。研究代表者は、これまでにJRABの構造変異体を発現させた上皮細胞の集団的細胞運動において各構造変異体に特徴的なライブイメージング像を見出している。今回、理化学研究所の横田秀夫先生のグループとともにそれらのライブイメージング像を分析し、各々の構造変異体が示す野生型とは異なった特徴を抽出し、定量することに成功した。さらに、予想通り、野生型の細胞集団は2つの変異体の特徴を融合した振る舞いをしていることも明らかにできた。本研究では、Rab13との結合によるJRABの構造変化と集団的細胞運動に関する仮説の証明を目的として、下記の4つの項目に焦点を絞って解析を引き続き行う。(1)集団的細胞運動におけるアクチン細胞骨格の再編成の制御機構の解明:集団的細胞運動の集団内での位置に応じて異なるアクチン細胞骨格の再編成をRab13-JRAB系がどのように制御するのかを理解するため、JRABの構造変化のトリガーおよびJRABの構造維持機構に関わるシグナル伝達経路を同定する。(2)集団的細胞運動における細胞内小胞輸送の制御機構の解明:集団的細胞運動の際に形成される細胞-基質間接着および細胞間接着に関わる接着分子群の細胞内小胞輸送とRab13-JRAB系との関係を解析する。具体的には、Rab13および接着分子群をマーカーにして輸送小胞を単離し、LC-MS/MS解析によって小胞上の蛋白質を網羅的に同定し、その足がかりとする。(3)Rab13-JRAB系が制御する集団的細胞運動の数理モデルの構築:前年度は、理化学研究所の横田秀夫先生のグループとともに各構造変異体が示す特徴を抽出・定量することに成功した。