hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
共感覚に関する認知心理学的研究の深化と展開

共感覚に関する認知心理学的研究の深化と展開に取り組む。色字共感覚について、色に付随する質感についても調べ、超長期にわたる縦断的研究にも取り組み、共感覚研究を深化させる。さらに、色字共感覚に加えて色聴共感覚の研究も展開するとともに、非共感覚者における感覚間協応や絶対音感についても調べ、共感覚との関係を明らかにする。共感覚的認知におけるこれらの取り組みによって、共感覚全般のメカニズムの解明を目指す。
デジタルマンモグラフィ診断支援システムの開発

日本人女性のがん罹患率の1位は乳癌である。費用対効果に優れたマンモグラフィ併用検診のみが、乳がん死亡率を減少できる方法である。しかし。マンモグラフィ診断には、医師の負担が大きく、読影医間のバラツキも多い。読影講習会などを行い高い精度管理を維持している。マンモグラフィはデジタル撮影法へと進歩したことで、デジタル技術を活用した自動診断支援(CAD)への期待が高まっている。そこで、我々は、独自の読影支援システムの開発し、その評価を行った。目標とするCADは感度、特異度ともに高いものとする。単純写真から高輝度領域を抽出する手法のCADは石灰化病変には99%前後の高検出率を得ることができる。人が見逃しやすい淡い微小石灰化でも指摘してくれる。しかし、腫瘤陰影や、構築の乱れの発見は人が優れていた。人の画像認識は日常生活や経験から非連続の線状構造も病変として認識できる。最近、人の認識脳に近い深層学習技術が開発され、我々も深層学習法を取り入れたCADを開発する。このプログラムを完成させるためには、多彩ながん病変の学習とともに、多くのバリエーションの正常乳房を学ぶことが求められる。そこで、がん、非がんの最終確認できたマンモグラフィ画像(匿名化、非連結DICOMデータ活用、倫理委員会承認後)3万例以上のデータベース構築を図り、このデータを用いて研究を進めた。CAD開発と同時に読影レポート支援を進めた。将来の乳がんはリスクファクターを考慮した個別化検診に進むと考えられる。乳腺密度との相関が注目されているが、日本人の正確なデータは無い。また、乳がん罹患歴、家族歴なども読影時には考慮されていない。そこで、我々はそのリスクファクターを自動入力支援できるビューアを開発した。CADソフトを含め、研究協力メーカのデジタルマンモ専用ビューアにベータ版を搭載し、ソフトウェアの検証を行った。乳がんは日本人女性のがん発症率の1位となり、早期発見、早期治療が求められている。早期発見のために、我が国でもマンモグラフィを中心とした乳がん検診が導入された。最終目標は検診導入による死亡率低下を目指すが、そのためには多くの国民が受診早期の乳がんが発見されることである。さらに擬陽性の少ない検査で、無駄な医療費を使わないことである。しかし、日本の受診率は40%前後で、目標にはほど遠いのが現状である。さらに精度を高めるために医師の二重読影を義務付けていることで、検診費用の負担と、専門医の負担が重いことが問題視さている。近年マンモグラフィも装置の進歩とともにデジタルマンモグラフィ装置が一般的となっている。しかし、デジタル画像技術を駆使した診断支援システム(CAD)や断層技術の普及は欧米諸国より遅れている。特に、現在使用されているCADに関しては乳がんの石灰化検出率は優れるものの、腫瘤や構築の乱れという所見の検出率は満足すべきものではなく、CADを検診に導入した欧米各国での結果では医師の二重読影より劣るとの報告も有り、日本での導入に踏み切れていない。我々は過去の研究にて独自に開発したCADソフトなどを搭載したデジタルマンモグラフィビューア(Sumire)を開発してきた。しかし、既存のCADは閾値などから石灰化病変などを抽出する手法を用いるものであった。しかし、昨今の人工知能(AI=Artificial Intelligence)技術の進歩によって、CADにも人間の判断力を超える性能が期待できるようになってきた。本研究では既存のCADをベースにAI技術を導入し、感度、特異度ともに高く、医療費抑制に役に立つビューアシステム開発を目指すものである。さらに、乳腺量抽出などから、個人別のリスクファクターを明らかにして、将来の個別の検診計画のサポートを目指す。本研究では、世界的にAI技術として注目されているDeep Learning技術を導入し、既存のCADを改良し、新たなデジタルマンモグラフィCADを開発した。本年度はDeep Learning技術を導入したデジタルマンモグラフィCADのコア部分を開発し、その基礎的結果が得られた(文献2)。また、すでに開発済みのデジタルマンモグラフィ診断システムに搭載した乳腺密度測定ソフトについてもその精度を確認した。乳癌検診、診療に用いるデジタルマンモグラフィ支援読影システム構築、開発である。乳癌検診はすでに多くの施設でデジタルマンモグラフィ装置にて撮影されているにも関わらず、フィルムにて読影、判定されていることが多い。撮影装置によって画像データ量や、処理法が異なるなどの理由が挙げられている。デジタルマンモグラフィのデータの利点を最大限に活用することで、効率的で精度の高い検診普及ができると考えられている。特に注目されている診断支援システム(CAD)の普及と個別化医療を踏まえた乳癌リスク管理と考えられている。我々の目指すデジタルマンモグラフィ支援読影システムは、精度の高い診断支援(CAD)システムを搭載することで、全国で行われている医師の二重読影の代わり、医師+CAD読影によって全国の読影精度管理、費用対効果に寄与することを目指している。また、乳癌リスクで注目されている乳房密度を自動測定し、高密度でリスクのある患者に対してのインフォームや超音波やMRIなどの二次検査の必要な患者のリストアップに寄与することである。我々は、以前から診断支援システム(CAD)および乳房密度自動抽出ソフトの開発を行ってきた。しかし、開発した診断支援システム(CAD)では、乳房石灰化の抽出率は良好であるが腫瘤陰影、構築のみだれに関しては、人の判定に及ばず、精度が不十分であった。そこで、注目しした方法は、多くのAI技術に用いられている深層学習機能を活用したソフトの判定精度向上である。

そのためには非常に多くの正常およびがん症例を含む臨床例が必要と判明した。そのために29年度に研究協力いただける検診機関と共同研究契約を結び、両者の倫理委員会での承認の後に、匿名化非連結のDICOMデータとして3万件におよぶ大量のデジタルマンモグラフィデータを入手した。このデータを用いて、現在開発中のソフトの改良と、システムの判定を行っている。乳房密度の自動抽出ソフトはほぼ出来上がっているが、管球、ターゲットや検出器が異なる撮影装置、及びMLO,CCなどの撮影方法による差異の補正が不十分で有り、現在基準となる乳腺ファントムでの撮影を用いた補正に関して検討中である。もともとの日本人の乳房密度による乳癌リスクの差異に関しては他医療機関などから報告が出始めているがまだ正確なリシクファクターの値はないのが現状で有り。また、医師などの観察者間のばらつきも多く、本年度行った臨床読影実験ではカテゴリ別で5ー20%もあることが判明し、今後の高密度乳房のインフォームの問題点も明らかとなった。診断支援システム(CAD)の開発には、深層学習法でのソフト改良のために大量のデジタルマンモグラムを入手し、学習を開始した。より精度の高いCADとするために石灰化の位置、形状、分布、腫瘤、構築の乱れに関した医師の読影データを基に、CAD SRデータを取得し、同様の判定が出来るようにチューニング中である。日本人女性のがん罹患率の1位は乳癌である。費用対効果に優れたマンモグラフィ併用検診のみが、乳がん死亡率を減少できる方法である。しかし。マンモグラフィ診断には、医師の負担が大きく、読影医間のバラツキも多い。読影講習会などを行い高い精度管理を維持している。マンモグラフィはデジタル撮影法へと進歩したことで、デジタル技術を活用した自動診断支援(CAD)への期待が高まっている。そこで、我々は、独自の読影支援システムの開発し、その評価を行った。目標とするCADは感度、特異度ともに高いものとする。単純写真から高輝度領域を抽出する手法のCADは石灰化病変には99%前後の高検出率を得ることができる。人が見逃しやすい淡い微小石灰化でも指摘してくれる。しかし、腫瘤陰影や、構築の乱れの発見は人が優れていた。人の画像認識は日常生活や経験から非連続の線状構造も病変として認識できる。最近、人の認識脳に近い深層学習技術が開発され、我々も深層学習法を取り入れたCADを開発する。このプログラムを完成させるためには、多彩ながん病変の学習とともに、多くのバリエーションの正常乳房を学ぶことが求められる。そこで、がん、非がんの最終確認できたマンモグラフィ画像(匿名化、非連結DICOMデータ活用、倫理委員会承認後)3万例以上のデータベース構築を図り、このデータを用いて研究を進めた。CAD開発と同時に読影レポート支援を進めた。
NT-fileによる根管形成の自動化に関する研究

本研究は,研究代表者の一連の電気的根管長測定法に関する研究の過程に位置するものである.当初の予定通り,ニッケルチタンファイルによる自動根管形成のためのハンドピ-ス「トライオートZX」の開発に成功し,モリタより商品化することができ,平成8年の3月から一般にも発売された.国内はもとより,海外からの引き合いも多く,米国でも高く評価されている.我々の,この3年間の大部分の努力は,使いやすくファイルを折らないための自動機構を備えた器械の開発と,ファイルを折らないための術式の開発に費やされた.ファイルを折らないための自動機構としては,Auto-torque-reverse機構を考察した.エンジンとニッケルチタンファイルによる根管形成の最大の問題はファイルの破折である.ニッケルチタンファイル自体発展途上にあり,毎年改良を加えた新しいものが市場に現れている.これらのファイルの中から最も優れたものを選び出し,そのファイルに対応した器械の開発と,そのファイルに最適な術式が必要とされる.現在までの我々の回答は,Tulsa社のProFileの.04,.06taper,あるいはOrifice Shaperであり,術式としてはクラウンダウン法である.ファイルの動かし方は,pecking motionとすることによって,大幅にファイル破折の危険を避けることができるようになった.我々は,今後とも,器械および術式の改良に取り組む所存である.本研究は,研究代表者の一連の電気的根管長測定法に関する研究の過程に位置するものである.当初の予定通り,ニッケルチタンファイルによる自動根管形成のためのハンドピ-ス「トライオートZX」の開発に成功し,モリタより商品化することができ,平成8年の3月から一般にも発売された.国内はもとより,海外からの引き合いも多く,米国でも高く評価されている.我々の,この3年間の大部分の努力は,使いやすくファイルを折らないための自動機構を備えた器械の開発と,ファイルを折らないための術式の開発に費やされた.ファイルを折らないための自動機構としては,Auto-torque-reverse機構を考察した.エンジンとニッケルチタンファイルによる根管形成の最大の問題はファイルの破折である.ニッケルチタンファイル自体発展途上にあり,毎年改良を加えた新しいものが市場に現れている.これらのファイルの中から最も優れたものを選び出し,そのファイルに対応した器械の開発と,そのファイルに最適な術式が必要とされる.現在までの我々の回答は,Tulsa社のProFileの.04,.06taper,あるいはOrifice Shaperであり,術式としてはクラウンダウン法である.ファイルの動かし方は,pecking motionとすることによって,大幅にファイル破折の危険を避けることができるようになった.我々は,今後とも,器械および術式の改良に取り組む所存である.コードレスの充電式のエンジンにRoot ZXを組み込み,電気的根管長測定しながらニッケルチタンファイルで根管形成するシステムを開発した.この装置は,3つのオート機構を持つ,(1)オートスタート・ストップ機構:ファイルが根管内にあるときだけモーターが回転する,(2)オートトルクリバース機構:過剰なトルクがファイルに発生したときにファイルを逆回転し,トルクから解放しファイルの破折を予防する,(3)オートアピカルリバース機構:ファイルの先端が根尖狭窄部に達したときにファイルの回転を逆転し,ファイルを歯冠側に戻す.つぎに,このシステムでヒト抜去歯の根管を形成したときの,荷重,トルク,回転数,モーターに流れる電流を測定した.歯に加えられた最大荷重は約800gであった.このシステムで観察された最大トルクは約450g-cmであった.トルクの大きさとモーターに流れる電流の大きさとの間には,直線関係があった.ProFileあるいはMcXIMファイルが用いられた時には,オートトルクリバース機構は,約40-80g-cmのトルクで起動すべきであることが分かった.このトルクは130260mAのモーター電流に相当した.モーターの回転数は,荷重あるいはトルクが増大すると減少したが,変化は小さい範囲にあった(240280rpm).Root ZXを内蔵し、電気的根管長測定しながら根管形成できる充電式コードレスハンドピ-ス「トライオートZX」の開発が本年2月に終了した。このハンドピ-スは、300KPM以下で回転する.また、3つのオート機構をもつ。(1)オートスタートストップ機構、(2)オートトルクリバース機構、(3)オートアピカルリバース機構である。(1)オートスタートストップ機構により、ファイは根管内に入ると自動的に回転を開始し、ファイルを根管から引き抜くと自動的に回転が停止する。この機構により、ファイル交換が楽になった。(2)オートトルクリバース機構により、ファイルに無理な応力が加わったときに、ファイルはいったん停止後逆回転する。これによりファイルの破切を防止できる。30g-cm以上のトルクで作動させることができる。(3)オートアピカルリバース機構により、ファイルの先端が根光狭窄部に達したときに、ファイルが逆回転し、歯冠側にもどってくるので、根光孔を破壊してしまう危険を避けることができる。トライオートZXと、0.04のTaperをもつニッケルチタン製のProFileを用い、crown-down法で根管形成すると臨床的にも良好な成績が得られることが明らかになった。

平成9年度は,トライオートZXを臨床応用した.ファイルとしては,Tulsa社のProFile0.04taper,あるいはProFile0.06taperが有効であり,根管口の拡大にはTulsa社のOrifice shaperが有効であることが分った.術式としては,crown-down法が最適であることが分った.Tycom社のQuantec series2000ファイルは,切れるもののやや折れやすく根管が直線化しやすい傾向があった.また,ニッケルチタンファイルおよびトライオートZXに不慣れな歯科医を集めて数回の実習を行ない,トライオートZX使用上の問題点を探った.それらの結果,ファイルの破切は,ファイルが根管内に強く引き込まれたときに生じやすいことが明らかになった.ファイル破切防止のためには,なるべく根尖方向に加圧せず,pecking motion(鳥が嘴でつっつく動作)でハンドピ-スを動かし,可能な限り細いファイルは用いないほうがよいことが分った.また,ヒト抜去歯で,CMR(contact-micro-radiography)法により,ニッケルチタンファイルとトライオートZXで根管形成し,術前,術後の根管の形態を比較した.それにより,ProFile0.04taper,あるいはProFile0,06taperのcrown-down法により,根管の移動・ledge形成等の危険なく,能率的に根管形成可能なことが明らかになった.Quantec series 2000ファイルは,突通能力が強く,使用方法を誤ると根尖孔近くで偶発的穿孔を生じやすいことが分った.
人権教育と市民性教育の展開にかんする研究

本研究では、1人権教育の観点から、わが国における市民性教育の実践の展開を把握し、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを構築した。また、その過程において、2そのカリキュラムや教育方法をデータベース化し、小中学校教員等の教育実践者の授業づくりや学校づくりを促進する資料と視座を提供した。そして、3人権教育にねざした市民性教育の評価の枠組みを構築した。それは、多様な人々の思いから社会参画を構想し、実践を評価する授業モデルである。本研究の目的は、1人権教育の観点からわが国における市民性教育の実践の展開を把握し、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを構築することである。またその過程において、2そのカリキュラムや教育方法をデータベース化し公開することで、小中学校教員等の教育実践者の授業づくりや学校づくりを促進する資料と視座を提供することを目指す。そして、3人権教育に根ざした市民性教育の評価の枠組みを構築するものである。そのために、平成25年度は、国内の市民性教育や人権教育の実践について情報収集を行うとともに、小学校、中学校、高等学校への聞き取り調査をおこなった。さらには、仮説的にではあるが、市民性教育の類型化を図り、学会発表を行った。具体的には、第1次調査として、市民性教育の実践事例の情報収集を行い、全国で行われている市民性教育の事例をできるだけ多く掘り起こし、リストアップした。第2次調査として注目すべき実践校への現地調査(その1)を行った。現地調査は、平成26年度も継続して行う予定である。本研究の目的は、1人権教育の観点から我が国における市民性教育の実践の展開を把握し、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを構築することである。また、その過程において、2そのカリキュラムや教育方法をデータベース化し公開することで、小中学校教員等の教育実践者の授業づくりや学校づくりを促進する資料と視座を提供することをめざす。そして、人権教育に根ざした市民性教育の評価の枠組みを構築するものである。そのために、平成26年度は、前年度の実践校の現地調査を継続し、市民性教育の事例収集を行った。また、人権教育に基盤を置いた市民性教育の先進的な実践校については、複数回訪問し、授業を観察し、教員に対する聞き取り調査を行った。さらに、実践校の教員と共同で授業づくりを行い、実践を深めるとともに、評価方法についても検討を行った。最終年度にあたる平成27年度にはこの知見をもとに、質問紙調査を行い、評価の枠組みを構築していく予定である。本研究の目的は、1人権教育の観点から我が国における市民性教育の展開を把握し、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを構築することである。そして、人権教育に根差した市民性教育の評価の枠組みを構築するものである。平成27年度は、前年度までに蓄積した実践校の現地調査の分類、類型化を試みた。また、継続して事例収集に努めるとともに、複数の小中学校の教員とともに授業を設計し、アクションリサーチをおこなった。来年度にむけ、市民性教育のモデル構築とデータベース公開の準備を行っている。平成27年度は、研究のまとめであったが、最終段階の市民性教育のモデル構築と教育実践のデータベース公開が遅れている。事例の収集や現場の教員との授業案作りは順調に進み、多くの資料を収集、作成することができた。本研究の目的は、1人権教育の観点から、わが国における市民性教育の実践の展開を把握し、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを構築することである。また、その過程において、2そのカリキュラムや教育方法をデータベース化し公開することで、小中学校教員等の教育実践者の授業づくりや学校づくりを促進する資料と視座を提供する。そして、3人権教育に根差した市民性教育の評価の枠組みを構築する。今年度は、研究のまとめとして、継続的に行ってきた小中学校の教員との授業実践とその評価をもとに、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデル化を行った。また資料として市民性教育実践のデータ作成した。さらに、大阪府人権教育研究協議会の研修会や複数の市教育委員会、学校での講演会や研修会において、人権教育に基盤を置いた市民性教育のモデルを紹介した。人権教育に基盤を置いた市民性教育は、社会で生きる人々の多様な「思い」から出発し、社会をよりよくしていく過程に参加する市民を育成することをめざす。それは、自己を認め、お互いを認め、ものごとを肯定的にみる「あたためあう関係」を前提にして、社会をよりよく変えていく過程に参加する市民の育成である。「よりよい」とは、より多くの人が、すなわち社会的マイノリティの人々が多様な生き方を認められる社会のことである。そのためには、社会的マイノリティの人々と出会い、その思いを受け取り、それに応答することが求められる。また、厳しい現実社会を生き抜くための基礎的な力を育むことも同様に大切である。市民性教育には、知的な側面が欠かせないが、それ以前に人々の聞き取りにくい「声」に耳を傾け、応答することが欠かせないことを明らかにした。

そして、3人権教育にねざした市民性教育の評価の枠組みを構築した。それは、多様な人々の思いから社会参画を構想し、実践を評価する授業モデルである。平成26年度は、1フィールド調査による市民性教育の実践事例の収集、2その類型化、3次年度のインテンシブなフィールド調査と質問紙調査の準備が主な目的としていたが、いずれも目的を達成している。実践事例については着実に数を蓄積し、それを項目ごとに整理するための枠組みを検討した。また、次年度のインテンシブなフィールド調査対象校として小学校1校と中学校区1校(小学校2校、中学校1校)を選定した。市民性教育のモデル構築と教育実践のデータベース公開を早急に行う。教育学研究は順調に進んでおり、大きな変更は予定していない。ただし、インテンシブな調査を行う対象校は、小学校単独の1校と、中学校区1対象の2対象にすることとした。後者については、小学校2校、中学校1校からなる中学校区での連携のもと人権教教育に基盤を置いた市民性教育に取り組もうとしており、調査対象としてより適切と考えられるため、対象校とした。この2つの対象に対して子どもたちへの効果を探るための質問紙調査を行うとともに、その項目の妥当性についても検討する。また、平成27年度は最終年度にあたるので、3年間の研究成果をまとめるとともに、実践事例をデータベース化し広く公開する。平成25年度は、市民性教育と人権教育の諸実践を収集することを主な目的としていたが、西日本を中心に、小学校、中学校、高等学校と幅広く情報を得ることができた。特に、人権教育に長く取り組んできていた学校で、市民性という枠組みで教育実践を行うようになってきている学校の情報を得ることができた。それは身近な人間関係を大切にしながら、それを超え構造的な問題へ目を向けようとする、また社会を担う市民へと育てようとする教育実践である。また、諸実践の類型についても得られたデータより仮説を立てることができた。すなわち、所与の社会への適応型と貢献型、さらには多文化化する現代社会を視野に入れた変革型である。今後各型が、人権教育とどう関連付けられるのかを検討していく予定である。平成26年度以降の研究へとつながることができており、研究はおおむね順調に進んでいるということができる。市民性教育の事例をデータベース化し、公開する作業が遅れており、次年度使用額が生じた。平成26年度に予定していた質問紙調査の項目精査および印刷が次年度にずれ込んだため。これまで蓄積してきた教育実践事例を整理し、DVD化する。資料整理、DVD作成のためのアルバイト代、および消耗品費として使用を計画している。研究は順調に進んでおり、特に研究計画の変更は予定していない。市民性教育の類型化の仮説をもとに、典型的な実践校の取り組みをより深く分析する。各型が、人権教育とどう関連付けられるのかを検討していく予定である。そのため、典型的な実践校を選択し、複数回訪問調査を行う。教育実践を観察し、教員等にインタビューを行うことで人権教育と市民性教育の関連について理論化を図りたい。
乳酸菌におけるクエン酸透過酵素およびクエン酸分解酵素遺伝子のクローニングと解析

Lactococcus lactis subsp.lactis biovardiacetylactis(L.diacetylactis)18-16およびNIAI N-7より,各種代謝機能欠損(ラクトース代謝能;Lac^-,タンパク質分解能;Prt^-,クエン酸代謝能;Cit^-)株を得て,それらを18-16由来のLac^-Prt^-Cit^+株(SY181),Lac^-Prt^-Cit^-株(SY184)およびNIAI N-7由来のLac^-Prt^-Cit^+(N7-16)とした.まず,エリスロマイシン耐性(Em^r)を有するベクターpIL253を用いてLactococcus lactis subsp.lactis NIAI 1061およびSY184の形質転換条件を検討した.受容菌の調製には0.75%のDL-スレオニン含有のRPMI1640液体培地を用いて培養し,6時間後に集菌した.その結果,NIAI1061においては,その形質転換頻度が非常に高く,10^5/mug(pIL253)レベルであったが,SY184については10^1/mug(pIL253)レベルであった.SY184の形質転換頻度がかなり低かったのは,その菌株作出の際,プラスミドDNAの複製阻害剤であるアクリジンオレンジによって処理した(それに対する耐性能を示した)ため,細胞壁などに何らかの変化が起こったことによるものと思われる.次に,N7-16よりクエン酸透過酵素をコードしたプラスミドDNA(pN7CP)を抽出・精製し,pIL253と同様に制限酵素Xba Iで消化した。ライゲーションを行い,まずそれを用いて形質転換頻度が高かったNIAN1061を形質転換した.Em^r形質転換体を選択し,それらの保有するプラスミドDNAを抽出・精製し,Xba Iで消化したところ,pIL253とpN7CP由来のフラグメントが確認された.その構築プラスミドDNAを用いてSY184を形質転換したが,Em^r形質転換体を得るには至らなかった.その理由は,この菌株における形質転換頻度に問題があると思われ,今後その形質転換頻度の改善あるいは別のCit^-株の作出が必要である.Lactococcus lactis subsp.lactis biovardiacetylactis(L.diacetylactis)18-16およびNIAI N-7より,各種代謝機能欠損(ラクトース代謝能;Lac^-,タンパク質分解能;Prt^-,クエン酸代謝能;Cit^-)株を得て,それらを18-16由来のLac^-Prt^-Cit^+株(SY181),Lac^-Prt^-Cit^-株(SY184)およびNIAI N-7由来のLac^-Prt^-Cit^+(N7-16)とした.まず,エリスロマイシン耐性(Em^r)を有するベクターpIL253を用いてLactococcus lactis subsp.lactis NIAI 1061およびSY184の形質転換条件を検討した.受容菌の調製には0.75%のDL-スレオニン含有のRPMI1640液体培地を用いて培養し,6時間後に集菌した.その結果,NIAI1061においては,その形質転換頻度が非常に高く,10^5/mug(pIL253)レベルであったが,SY184については10^1/mug(pIL253)レベルであった.SY184の形質転換頻度がかなり低かったのは,その菌株作出の際,プラスミドDNAの複製阻害剤であるアクリジンオレンジによって処理した(それに対する耐性能を示した)ため,細胞壁などに何らかの変化が起こったことによるものと思われる.次に,N7-16よりクエン酸透過酵素をコードしたプラスミドDNA(pN7CP)を抽出・精製し,pIL253と同様に制限酵素Xba Iで消化した。ライゲーションを行い,まずそれを用いて形質転換頻度が高かったNIAN1061を形質転換した.Em^r形質転換体を選択し,それらの保有するプラスミドDNAを抽出・精製し,Xba Iで消化したところ,pIL253とpN7CP由来のフラグメントが確認された.その構築プラスミドDNAを用いてSY184を形質転換したが,Em^r形質転換体を得るには至らなかった.その理由は,この菌株における形質転換頻度に問題があると思われ,今後その形質転換頻度の改善あるいは別のCit^-株の作出が必要である.
小・中学校における法的対話の意識・能力の育成に関する基礎的研究

本研究は,市民のための法教育のあり方を考える基礎的研究である。本研究では,市民に必要な法的対話の意識・能力の育成を目指す法教育の理論と実践を多面的に分析し,小・中学校の法教育のカリキュラムを構想するために必要な視点の提出を試みた。その際,アメリカの「法教育」(Law-Related Education)を先行モデルとして取り上げた。さらに,小・中学校における法的対話の意識・能力の育成を目指す法教育の授業を開発し,考察を行なった。本研究は,日本の法化社会の進展を踏まえ,市民のための法教育のあり方を考える基礎的研究である。本研究は,市民に必要な法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の理論と実践を分析し,日本の小・中学校の法教育のカリキュラムを構想するために必要な視点を提出することを目的としている。その際,アメリカの「法教育」(Law-Related Education)を先行モデルとする。本年度は,アメリカ法教育における市民に必要な法的対話の意識・能力の育成の理念・実態解明を行った。本年度の研究の成果は,具体的には,下記の四つである。(1)国内外における法教育,司法教育,合衆国憲法学習,法的対話の学習,模擬裁判の学習に関する基本的文献,先行研究,実践事例報告を広く検索,収集し,データベース化を図った。(2)アメリカ合衆国における法教育,司法教育,合衆国憲法学習,法的対話の学習,模擬裁判の学習を取り扱った先行研究,授業実践を明らかにするために,アメリカ教育省の外郭団体であるEducational Resource Information Centerのデータベースの文献データの収録状況の調査・分析を行った。(3)法教育,司法教育,合衆国憲法学習,法的対話の学習,模擬裁判の学習を重視したカリフォルニアの州の様々な関連財団・団体の開発したカリキュラム,教科書,教材,学習指導案を収集した。(4)カリキュラムや教材を分析するために,本研究課題の法的対話の意識・能力の視点を抽出した。本年度には,日本の小・中学校の法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の授業モデルを開発した。本年度の研究の成果は,具体的には,以下の通りである。(1)収集したアメリカのいくつかの州のフレームワーク,カリキュラム,教科書,教材,学習指導案を調査し,法教育の内容構成の位置づけを分析した。収集した関連財団・団体の開発したカリキュラムの内容構成を,「法教育」「法的対話」の視点から分析した。(2)収集した資料の分析結果について,アメリカの法教育および司法教育研究の専門家に意見を求めた。カリフォルニア州の法教育関連機関を訪問し,カリフォルニア州における公民教育および法教育の動向の聞き取り調査を行った。(3)以上の得られた知見に基づき,静岡県小・中学校教員および静岡県法教育関連機関と連携を図り,小・中学校における法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の授業モデルを開発した。法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の授業モデルの実践を踏まえて,考察を行った。現在までの達成度が(2)である理由は,以下の四つである。(1)収集したアメリカのいくつかの州のフレームワーク,カリキュラム,教科書,教材,学習指導案を「法教育」「法的対話」の視点から分析できた。(2)収集した資料の分析結果について,アメリカの法教育および司法教育研究の専門家に意見を求めることができた。(3)以上の得られた知見に基づき,静岡県小・中学校教員および静岡県法教育関連機関と連携を図り,小・中学校における法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の授業モデルを開発することができた。平成26年度,平成27年度で得られた知見から,本年度には,日本の小・中学校における市民に必要な法的対話の意識・能力を育成するための課題を解明した。これら三カ年の研究の成果をまとめ,日本の小・中学校における市民に必要な法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の理論的・実践的枠組を創造し,日本の小・中学校の法教育における法的対話の意識・能力の育成の原理を提示した。本年度の研究の成果は,具体的には,以下の四つである。1.平成26年度,平成27年度の得られた知見に基づき,小・中学校における法的対話の意識・能力の育成を目指した法教育の授業モデルを実践し,分析結果の精緻化を図った。2.収集した資料の分析及び集録した授業の分析結果について,アメリカの法教育および司法教育研究の専門家に意見を求めた。同時に,資料の追加収集し,分析結果の精緻化を図った。3.以上の研究成果を,アメリカの全米社会科評議会,オーストリアのUNODC,日本社会科教育学会,日本公民教育学会の研究大会および国際会議等で,研究発表および研究交流を行い,広く内外に研究成果を報告した。

静岡県弁護士会法教育委員会との連携を図り,小・中学校教員を対象に研究成果の普及を試みた。4.以上の研究成果をまとめ,法教育の意義や可能性について考察するとともに,日本における市民に必要な法的対話の意識・能力を育成するため法教育の今後の課題を提出した。本研究は,市民のための法教育のあり方を考える基礎的研究である。本研究では,市民に必要な法的対話の意識・能力の育成を目指す法教育の理論と実践を多面的に分析し,小・中学校の法教育のカリキュラムを構想するために必要な視点の提出を試みた。その際,アメリカの「法教育」(Law-Related Education)を先行モデルとして取り上げた。さらに,小・中学校における法的対話の意識・能力の育成を目指す法教育の授業を開発し,考察を行なった。現在までの達成度が(2)である理由は,以下の四つである。(1)法教育,司法教育,合衆国憲法学習,法的対話の学習,模擬裁判の学習に関する文献目録を作成し,本研究課題の法的対話の意識・能力の理念を解明できた。(3)法教育,司法教育,合衆国憲法学習,法的対話の学習,模擬裁判の学習を重視したカリフォルニアの州の様々な関連財団・団体の開発したカリキュラム,教科書,教材,学習指導案の収集によって,本研究課題の法的対話の意識・能力の分析に必要な基礎的な資料を整理できた。(4)カリキュラムや教材を分析するために,本研究課題の法的対話の意識・能力の視点を抽出した。本年度に得られた成果から,アメリカの法教育における法的対話の意識・能力の育成の原理の一端が明らかになった。次年度以降,(1)小・中学校における法教育の授業モデルの開発・実践,(2)研究成果の公表・普及を行うことで,アメリカの法教育における法的対話の意識・能力の育成の原理の精緻化を図っていく。さらに,法教育の意義や可能性について考察するとともに,日本における市民の法的対話の意識・能力を育成するため法教育の今後の課題を提出する。教育学・教科教育学・社会科教育学本年度に得られた成果から,アメリカの法教育における法的対話における紛争解決の意識・能力の育成の原理の一端が明らかになった。次年度以降,(1)アメリカの州社会科フレームワーク,カリキュラム,教科書,教材,学習指導案の分析,(2)専門家からの意見聴取・情報収集,(3)小・中学校における法教育の授業モデルの開発・実践を行うことで,アメリカの法教育における法的対話の意識。能力の育成の原理の精緻化を図っていく。本年度は,静岡県社会科・法教育研究会での連携を生かして,小・中学校における法教育の授業モデルの開発・実践に取り組んでいく。
Ｃａ２＋チャネルの過渡的複合体形成による神経活動依存的な転写制御機構に関する研究

我々は、これまでに電位依存性Ca2+チャネルβサブユニットとB56δ(プロテインホスファターゼ2A副サブユニット)との相互作用を明らかにしてきた。本年度はβサブユニットによって制御される遺伝子の発現の制御に関して詳細に検討した。遺伝子発現の網羅的な解析に関しては、DNAマイクロアレイを用いて評価した。βサブユニット変異マウスであるLethargicマウスと野生型マウスと遺伝子発現を比較してみたところ、Lethargicマウスにおいてチロシンヒドロキシラーゼの遺伝子発現が向上していることがわかった。リアルタイムPCRを用いて定量的な解析を行ったところ、確かにLethargicマウスにおいてチロシンヒドロキシラーゼの遺伝子発現が上昇していることがわかった。次に核に移行したβサブユニット複合体の核内での振る舞いに関して、免疫沈降法を用いて評価した。その結果、βサブユニット複合体は、ゲノム上においてチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の上流配列に結合していることがわかり、βサブユニット複合体が直接的にチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現制御を行っていることがわかった。プロテインホスファターゼ2Aはヒストンの脱リン酸化を行うことが知られる。従って、βサブユニット複合体は活動電位依存的に核内移行しチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子に結合することで、βサブユニット複合体に含まれるプロテインホスファターゼ2Aがヒストンの脱リン酸化を行い、転写を制御していると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々は電位依存性Ca2+チャネルβ4サブユニットとB56δ(プロテインホスファターゼ2A副サブユニット)との相互作用を明らかにしてきた。本年度は、β4サブユニットとB56δの過渡的複合体形成の確認を行うべく、それらの相互作用がどのような条件下で引き起こされるのかについて評価した。HEK293細胞の組換え発現系を用いて、特に電位依存性Ca2+チャネルの活性化を誘導するhigh K+(脱分極)刺激に伴うβ4サブユニットとB56δとの結合を生化学的に評価した。その結果、high K+刺激後にβ4サブユニットとB56δの相互作用が劇的に増大することを確認できた。すなわち、電位依存性Ca2+チャネルの活性化を引き起こす神経活動に伴いβ4サブユニットとB56δが相互作用することが示唆された。次にどのような機構で核に移行するのかを評価した。特に、電位依存性Ca2+チャネルを経由して流入したCa2+が重要なのか、それとも脱分極に伴う電位依存性Ca2+チャネルの構造変化が重要なのかに焦点をあてて評価した。上記のHEK293細胞を用いた実験系を用いて実験を行ったところ、細胞外のCa2+が存在すると脱分極に伴うβ4サブユニットとB56δの相互作用が確認されたのに対して、細胞外のCa2+をEGTAでキレートしておくと、その相互作用は確認できなかった。すなわち、電位依存性Ca2+チャネルを介して流入したCa2+によって、電位依存性Ca2+チャネルからβ4サブユニットが離れてB56δと相互作用すると考えられる。本年度の成果から、β4サブユニットとB56δとの相互作用が、電位依存性Ca2+チャネルの活性と深く関連していることを確認できた。また、その相互作用が電位依存性Ca2+チャネルの構造変化によるものではなく、Ca2+チャネルを介して流入してきたCa2+によって引き起こされることも確認できた。これらの結果から、当初の計画通り、β4サブユニットとB56δとの相互作用の分子メカニズムを明らかにすることができた。来年度は、β4サブユニットとB56δとの過渡的複合体形成により引き起こされる生理現象を明らかにして行く予定である。具体的には、DNAマイクロアレイやRT-PCRを用いて、β4サブユニットによって転写制御される遺伝子の解析を行う。転写制御される遺伝子が同定できたら、β4サブユニット複合体がその遺伝子上流に結合しているかどうかをクロマチン免疫沈降法を用いて評価する。結合が確認できた場合は、どのような分子メカニズムで複合体を形成しているのかを明らかにする予定である。
メダカ初期胚を用いた血栓止血因子の血管形成・新生における役割の解明

血管の形成と新生には多くの細胞増殖促進因子や抑制因子、細胞遊走因子、細胞接着因子、プロテアーゼとインヒビターなどの関与が示唆されている。最近の種々の遺伝子ノックアウト(KO)マウスの解析から、血管の形成に血栓止血関連因子が極めて重要なことが明らかになってきた。しかし、これらのKOマウスの多くは胎生期に死亡するため、詳細な解析が困難である。他方、最近、メダカなどの硬骨魚類は哺乳動物と多くの共通点を有し、組織の構造も単純で胚形成に関与する細胞も少なく、かつ体外発生で発生過程を容易に継続的に観察できることから、マウスに変わる実験動物として注目されている。この背景の下、本研究では遺伝子トランスジェニック(TG)魚や遺伝子KO魚を作製し、血管形成や血管新生における血栓止血因子の役割を解析することを目的とした。本年度は、昨年に続きメダカの組織因子(TF)のcDNAクローニングを試みた。先ず、ヒト組織因子cDNAをプローブとして、メダカの全身由来のmRNAのノザンブロット解析を行ったところ、特異的なmRNAは検出できなかった。次に、種間でその配列が比較的よく保存されている部分に種々のプライマー対を作製し、メダカの全身のmRNAに対するcDNAを鋳型としてPCR法を用いて増幅を試みたが、特異的な増幅DNA断片は得られなかった。そこで、さらにメダカ遺伝子DNAを鋳型として、同様のプライマーを用いて増幅を試みたところ、約120塩基対からなるメダカTFをコードするDNA断片が増幅された。このメダカTF cDNAは、マウスTFとDNAレベルでは92.2%、アミノ酸レベルで87.2%の相同性を示した。現在、5'RACE法および3'RACE法を用いて、完全長メダカTF cDNAの単離を行うとともに、トロンボモジュリンやプロテインCなどの抗血栓性因子のcDNAクローニングを実施している。血管の形成と新生には多くの細胞増殖促進因子や抑制因子,細胞遊走因子,細胞接着因子,プロテアーゼとインヒビター等の関与が示唆されているが,最近,血液凝固やその制御に関わる血栓止血因子が血管形成に極めて重要であることが種々の凝固関連因子(組織因子,第V因子,プロトロンビン,トロンビン受容体など)の遺伝子欠失マウスを用いた研究から示唆されている。一方最近,脊柱を有する硬骨魚類は哺乳動物と比較して組織の構造が単純であるにも関わらず,多くの共通点を有し(閉鎖血管系を持つことからヒトと似た血液凝固系が存在する),また体外発生で,かつ胚形成に関与する細胞数も少ないため発生成長過程を継続的に容易に観察できる。しかも,遺伝子導入魚は遺伝子導入マウスに比較して発生の後期過程まで生存して種々の生物学的特徴を示す等,血管形成や血管新生の分子病態学的解析には極めて優れた実験動物として注目されている。この背景の下,本研究では脊椎動物の発生成長や創傷治癒などに不可欠な血管形成と,癌細胞の腫瘍組織からの遊離や転移,あるいは糖尿病性網膜症,動脈硬化症,慢性間接リウマチ炎などの多くのヒトの疾患の増悪化に関係する血管新生に対して,これまで申請者らが永らく研究に関わってきた血栓止血因子がどの様な役割を果たしているかを明らかにすることを目的として,硬骨魚類のメダカの遺伝子導入魚を作製して解析を行った。その結果,ヒトの組織因子を導入したメダカ受精卵は,成長の血管形成時に血栓を形成して致死することが判明した。この結果はヒトの組織因子遺伝子がメダカの胚内で蛋白発見し,凝固開始因子として機能し,凝固血栓の形成を促すことを示唆している。現在,メダカを用いて作成したcDNAライブラリーからメダカ組織因子のcDNAクローニングを行っている。

現在、5'RACE法および3'RACE法を用いて、完全長メダカTF cDNAの単離を行うとともに、トロンボモジュリンやプロテインCなどの抗血栓性因子のcDNAクローニングを実施している。
吸入麻酔薬による術後認知機能低下の機序に関する研究

吸入麻酔薬による術後認知機能低下の機序の一つとして吸入麻酔薬が脳中に長期間残存することが関与しているのではないかとの仮説を検証した。その結果(1)ラットではセボフルラン麻酔後7日経過しても血液中および脳中にセボフルランが残存し、脳中の濃度は血液中の約6倍であった。(2)ヒトでもセボフルラン麻酔後7日経過しても血中にセボフルランが残存した。(3)一方、ラットでプロポフォール麻酔後2日目にはプロポフォールは血中、脳中ともに検出されなかった。【仮説】従来、吸入麻酔薬の一部は代謝されるが、多くは短時間で呼気により体内から排出されると考えられてきた。しかし実際は脳内に長期間残存し、そのために認知機能低下が長期化するのではないか。【仮説実証のための方法】雄のSDラット(9週)を用い、空気-酸素-セボフルラン(2.0%)で2時間麻酔した。麻酔終了3分後(n=7)、2日目(n=7)、7日目(n=7)に血液採取および脳を灌流、摘出し氷冷した共栓付きガラス管に入れた。脳は-80°Cで凍結保存した。血液:ヘパリン加血液2mlに生理食塩水2ml(4°C)を加え、冷却した共栓付ガラス遠沈管で撹拌した。内部標準物質としてハロタン100ppmを含有するクロロホルム(0.3ml)を加え撹拌後、Ultrafree-CLフィルターを通すため遠心した。下層のクロロホルム層液を-20°Cで保存した。脳:測定予定日に解凍、6%過塩素酸を加え、氷冷しながらホモジュナイズした。以下血液と同様に処理した。セボフルランの検出法:脳、血液のクロロホルム層液1μLをガスクロマトグラフ質量分析計に注入した。検出はSIM分析を用いライブラリーのセボフルランと照合した。セボフルランの定量法:内部標準法にて検量線を作成し定量した。また、コントロールとして、無麻酔のラット(n=7)についても測定した。【研究結果・意義・重要性】セボフルラン麻酔後7日目でも、血液内および脳内にセボフルランが残存していた。コントロールではセボフルランは検出されなかった。2日目、7日目共に脳内のセボフルランの濃度は血液中の約10倍であった。以上の結果はこれまでの吸入麻酔の常識を覆すものであり、脳内に残存したセボフルランが認知機能低下の長期化に関与している可能性を示唆している。FGP細胞は生後8-14日で、脳内の血管周囲細胞からマクロファージ系の細胞へと分化する。セボフルラン麻酔後、セボフルランの脳内残存にFGP細胞が重要な役割を果たしていると仮定すると、成年ラットと新生ラットではセボフルランの残存期間が異なる可能性がある。そこで、新生ラットと成年ラットにセボフルラン麻酔を2時間行った後、2日目に摘出された脳からセボフルランの検出を試みた。その結果、セボフルランは新生ラットでは検出されなかったが、成年ラソトでは検出された。この結果は、セボフルランの脳内長期間残存にFGP細胞が重要な役割を果たしている可能性を示唆するものである。2、ヒトでのセボフルラン麻酔後の血中セボフルラン濃度についてラットでは、セボフルラン麻酔後7日目でも血液内、脳内にセボフルランが残存し、脳内には血液内の約10倍のセボフルランが存在することを昨年度報告した。今回、ヒトでセボフルラン麻酔後2日目、7日目の血中セボフルラン濃度を測定した。その結果セボフルラン麻酔後2日目、7日目ともセボフルランは血液中に存在した。ラットの実験結果より考えると、ヒトでも血液中より脳内にははるかに高濃度のセボフルランが残存していることが予想され、このことが術後認知機能低下に関与している可能性がある1、セボフルラン麻酔後とプロポフォール麻酔後の脳内、血液内の濃度の相違についてラットにおいて空間認知機能は、吸入麻酔後には低下するがプロポフォール麻酔後には低下しないと報告されている。一方、セボフルランは7日以上、脳内および血液内に残存することを我々は報告してきた。もし、残存麻酔薬が術後認知機能低下に関与しているとすると、プロポフォールはセボフルランよりも速く脳から消失するはずである。そこで、プロポフォール麻酔後の脳内および血液内のプロポフォール濃度を測定した。その結果、プロポフォールは24時間後には脳内および血液内に存在したが、48時間後には脳内・血液内ともに消失していた。2、セボフルラン麻酔後とイソフルラン麻酔後の脳内、血液内の濃度の相違についてイソフルラン麻酔後の認知機能低下の機序に関する報告は多いが、セボフルラン麻酔後についての報告はほとんどない。

そこでセボフルラン麻酔後とイソフルラン麻酔後の脳内および血液内の濃度を比較するためイソフルラン麻酔後の濃度を測定した。その結果、イソフルラン麻酔5分後のイソフルラン濃度はセボフルラン麻酔5分後のセボフルラン濃度の1.8倍(血液)、2.3倍(脳)であった。一方、セボフルランは7日以上脳内および血液内に残存していたのに対し、イソフルランは2日後には脳内・血液内ともに消失していた。この結果はセボフルランとイソフルランでは認知機能低下の機序が異なる可能性を示唆しているものと考えられる。
ゲノム編集とデグロン法によるヒト新細胞遺伝学を応用した複製フォーク再生機構の解明

私達は、ゲノム編集技術と標的タンパク質を瞬時に分解することが可能なデグロン法を応用し、ヒト細胞における「新細胞遺伝学」的な解析法を立ち上げた。今後は、酵母などの一部の生物種においてのみ可能であった、詳細な分子細胞遺伝学的な解析が、ヒト細胞においても遂行できる。また、本解析法をもとに、複製フォークの再生機構の研究を行った。DNAの分岐構造である複製フォークは大変脆弱である一面を持ち、内的外的ストレスによって破壊され、その再生が必要になることがある。私達は、Mcm2-7複製ヘリカーゼに類似した、Mcm8-9ヘリカーゼが、複製フォークの再生に重要な役割を果たしていることを明らかとした。DNA複製フォークは染色体の倍加に必須である一方、大変脆弱であるという一面を持ち、鋳型上のDNA二本鎖間架橋(ICL)などの傷害が原因で構造的に解消されることがある。その際、フォークの再生が必要となるが、そのメカニズムについて高等生物ではほとんど理解されていない。本研究では、ヒト細胞の次世代細胞遺伝学を確立しつつ、以前の研究からフォーク再生における役割が示唆されているMcm8-9複合体の解析を中心に行っている。本年度はまず、新ゲノム編集技術CRISPR法を用い、2種類のヒト培養細胞株においてMCM8またはMCM9遺伝子のノックアウト株を作成した。次に、これらの細胞株の様々なDNA傷害に対する感受性の検定を行い、ICLに特異的に強い感受性を示すことを明らかとした。さらに、免疫染色法を用い、ICL修復に必須な組換え酵素Rad51の下流においてMcm8-9複合体が働いていることを示した。本結果は、以前ニワトリ細胞で提唱されたモデルと一致し、Mcm8-9の機能は種間で高く保存されていることがわかった。また、Mcm8-9複合体のICL修復以外でのフォーク再生における役割を調べるため、複製フォーク構成因子であるMcm2遺伝子のC末端にオーキシン誘導デグロンを付加した株を、CRISPR法を用いて作成した。今後、人為的なフォークの解消が可能になり、フォーク再生の研究が大きく進むだろう。ただ、内在性MCM2遺伝子にデグロンを付加しただけでタンパクの発現量が減ることが分かり、これを改善するのが今後の課題である。また、ヒト細胞でゲノム編集をより容易に行うための工夫・条件検討を行った。CRISPR法で細胞を処理した後、より効率的に目的のクローンを同定するため、一時的な薬剤選択や制限酵素サイトの利用などにより、1ヶ月以内に両遺伝子座を改変した細胞株を樹立することが可能になった。DNA複製フォークは染色体の倍加に必須な構造であるが、大変脆弱であるという一面をもち、DNA二本鎖間架橋(ICL)など鋳型上の様々な傷害が原因で、構造的に崩壊する。DNA合成の再開には、フォークを再生する必要があるが、その機構に関して高等生物ではほとんど分かっていない。本研究では、ヒト細胞における次世代細胞遺伝学を確立しつつ、それを最大限に活かして複製フォークの再生機構の解析を行った。前年度には、構築したヒトMCM8およびMCM9遺伝子破壊株の解析から、Mcm8-9は、ICL修復時の相同組換えの後半、つまりフォークの再生において役割があることが明らかとなっていた。まず、前年度に引き続き、ヒト細胞におけるゲノム編集技術の応用を進めた結果、ヒトHCT116細胞株にて、CRISPR/Cas法による遺伝子のノックアウトやノックイン(内在性遺伝子のGFPタギング等)が容易にできるようになり、これまで酵母等の一部の生物種のみで可能であった詳細な分子細胞遺伝学的な解析が可能になった。次に、この成果を活用し、Mcm8-9のICL修復以外でのフォーク再生における役割の解析を進めた。具体的には、フォークの構成因子であるMcm2の内在性遺伝子に、オーキシン誘導デグロンを付加した細胞株を構築し、オーキシン添加後数時間以内にMcm2タンパク質を分解することを可能にした。分解後、細胞のDNA合成は瞬時に停止し、DNA二重鎖切断(DSB)の初期マーカーであるγ-H2AXのフォーカスが多数核内に蓄積した。興味深いことに、このフォーカスには、組換え因子のRad51に加え、Mcm8も共局在することが明らかとなった。これらの結果から、ICL修復以外にも、Mcm8-9がフォークの再生において重要な役割を果たしていることが分かった。今後、この系を用いて、フォーク再生メカニズムのさらなる詳細な解析が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。染色体複製・分配、ゲノム科学26年度が最終年度であるため、記入しない。複数種のヒト細胞株においてヒトMCM8-9遺伝子破壊株の作成に成功し、またMCM2遺伝子のタギングも可能にした。

これらの実験を通して、本研究課題の重要なステップの一つであるであるゲノム編集が、比較的容易に行えるようになり、今後のさらなる応用に向けての技術的基盤が完成した。また、作成した細胞株を用いてMcm8-9複合体のICL修復における機能解析も開始することができ、Mcm8-9複合体の機能が進化的に保存されていることが分かった。一方、用いる細胞株の種類によってはゲノム編集の効率が低く、株の作成が少々難航した面もあった。それぞれの実験や目的に適した細胞株を選択をすることが今後大変重要である。また、染色体の再複製に関する研究は、平成26年度に着手する予定である。平成25年度に得られた結果について、国内外合わせて計3つの学会で口頭・ポスター発表を行い、他の研究者からのフィードバックを数多く得ることができた。これらは次年度からの研究に大変有意義なものとなると考えられる。今後は軌道に乗り始めたヒトゲノム編集技術を駆使し、Mcm8-9複合体に関連する遺伝子の破壊株や、それらとの2重破壊株を作成し、細胞遺伝学的な解析を行う。遺伝学的に相互作用する因子の網羅的な解析おいては、最近開発された、CRISPRを利用したノックアウト株作成用ライブラリ(GeCKOなど)を利用すると、shRNAライブラリを用いた解析より、明確な結果が得られると考えている。これまでの実験から、ゲノム編集技術を用いて内在遺伝子にタグを付加する際、導入された遺伝子配列内で高頻度に欠失や挿入が生じることが分かったが、このような問題点はこれまであまり報告されていない。遺伝子導入時の予期しない再編成が生じにくくなるような工夫(導入配列の改変など)が必要である。この問題を解決しつつ、GFPや精製タグをMCM8-9や他の遺伝子に付加し、核内での局在解析や物理的相互作用する因子の網羅的解析にも着手する。また、学会などにおける積極的な情報交換を通して、本研究の遂行をより促進する。