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調理素材的立場から見たショウガの機能性成分の有効性に関する研究

【目的】ショウガは様々な機能性を持つことで近年注目を浴びているが、いろいろな調理法により摂取されるので、食材として考慮した場合調理加工過程中におけるそれら活性成分の変化が起こることが考えられる。本研究では、ショウガの調理加工の中でもっとも頻繁なショウガ酢漬げに着目し、昨年度は酢潰けモデル系における機能性香気成分の動態について報告した。今年度は酢漬けにした際に彩りを鮮やかにするショウガの機能性色素成分であるアントシアニン化合物の同定と定量、またショウガの品種、部位による含量の比較について検討した。【方法および結果】試料には市販の数種のショウガを用いた。各試料から酸性メタノールでアントシアニン類を抽出し、HPLC分析に供したところ、全ての試料で共通した二つのピークが検出された。新ショウガを用いて大量抽出し、各種クロマトグラフィーにより化合物の単離・精製を行い、各種機器分析により構造を確認した結果、これらの化合物はpeonidin-3-rutinoside(P3R)とcyanidin-3-glucoside(C3G)と同定した。P3Gはショウガより初めて単離された化合物である。さらに、ショウガの品種、産地、部位、齢の違いによるこれらのアントシアニン化合物の組成や量の違いを検討したところ、その組成および量はショウガの生育および貯蔵過程ではあまり変化は見られなかったが、品種については、葉ショウガ種で多くのアントシアニン成分が存在することがわかった。また、部位については、いずれのショウガにおいても芽部ではC3Gが多く、根茎部ではP3Rが多いという傾向が認められ、これらの化合物は部位によりその存在量および組成が異なり、それぞれの生成部位が異なることが考察された。[目的]ショウガは、様々な機能性があることで近年注目を浴びているが、ショウガは様々な調理法によって摂取されているので、食材として考慮した場合、調理加工過程中におけるそれらの活性成分変化が起こることが考えられる。Geranialは、ショウガの主要香気成分であると同時に、抗菌性、抗腫瘍活性などがあることが知られており、その挙動を知ることはショウガの食品としての機能性を考える上で重要であると思われる。そこで今年度では、ショウガの様々な調理条件の中で、最も摂取量の多いショウガの甘酢漬けに着目し、その香気成分の変化について検討した。[方法]酢酸、シュクロース、NaClからなるモデル甘酢を作成し、12mmにスライスしたショウガを0日、2週間、1ヶ月、2ヶ月貯蔵し、また、コントロールとして水漬けたものを作成し、ビニールパックに充填後4°Cで貯蔵した。各サンプルについて、ショウガと漬け汁に分けてポラパックQを充填したカラム法によって香気成分を捕集、抽出しGC分析に供した。[結果および考察]官能評価により、ショウガを甘酢漬けにすると、強いレモン様の香気が弱まることが分かった。GC分析の結果、香気成分については変化がみられなかった。しかし、主要香気成分であるgeranialが貯蔵することにより減少する傾向を示した。また、ショウガを酢酸水溶液、クエン酸水溶液にショウガを漬けると同様の傾向がみられたことより、酸の影響によって、geranialが減少することが示唆された。一方、漬け汁においては、甘酢漬けにすることによりgeraniol、1,8-cineolなどのアルコール類が増加し、甘いにおいを呈することがわかった。これらのアルコール類のショウガ自体での減少は認められなかったので、水溶性の前駆体と成りうる成分の存在が考えられた。
ルネサンス期北イタリアの小青銅彫刻の研究

ルネサンス期の北イタリアで制作された小型の青銅彫刻に関する基礎を固める本研究は本年度で終結する。同分野に関する基礎文献および現在までの先行研究論文などの情報はおおかた手に入れることができた。また、欧米の主要美術館および聖堂に収蔵される作品を予定した範囲内でハイ・ビジョンの動画映像と写真に収めることができた。これは今後の研究にとって重要な基礎である。次の研究においてはこれをさまざまな角度から分析したい。2007年10月にヴェネツィア、ジョルジョ・チーニ財団美術史研究所で開催された「ルネサンス期のヴェネツィア、および北イタリアにおける青銅の芸術」と題する国際学会において発表の機会を得たうえで、その学会報告書にイタリア語の論文を掲載することができた。日本語論文については現在、発表の場を模索中である。本年度は研究遂行期間が10月以降に限られたこともあり、チーニ財団での発表と報告論文執筆に多くの時間を割いた。2007年10月23日に行なわれた学会での発表では、マントヴァで活躍した青銅作家ピエール・ヤコポ・アラー・リ=ボナコルシ、通称アンティーコの初期の作品と考えられる《ゴンザーガの壺》(モデナ、ガレリア・エステンセ)と、アントニオ・ロンバルドがエステ家のアルフォンソ1世のために制作した大理石浮彫《ヘラクレスの凱旋》(サンクト・ペテルスブルク、エルミタージュ美術館収蔵)の形態上の相似を、エステ、ゴンザーガの両宮廷で行われていたパラゴーネ(諸芸術優劣比較論争)の一環としての新旧論争、およびマントヴァに嫁いだ姉イザベッラとフェルラーラの弟アルフォンソI世の間に存在した競争意識と絡めて論じた。この2作品の関係はこれまで等閑視されており、学会報告(2008年9月刊行予定)掲載予定の論文では、これまでアンドレア・デル・ヴェルロッキオの作品と考えられてきたが、近年アントニオ・ロンバルドがモデリングを行なったという説が提示されたヴェネツィア、サン・マルコ広場の旗竿台座浮彫を加えて、3者の関係を論じた。特に2匹の海馬と二輪戦車に腰掛けるネプトゥヌスやヘラクレスなどの神という構図を詳しく論じることにより、古代ローマの石棺彫刻に棹差しながら新しい図像を創設したのがアンティーコではなかったかという説を提示した。ビデオカメラを購入し、ウィーン美術史美術館とガレリア・エステンセで作品の撮影を行なうことができた。報告者の研究に資するところは大きいが、自ら撮影を行なう報告者の技術的未熟から、当初計画したようにアーカイブスとしてネット上に公開することは現時点では非現実的であると言わざるを得ない。パリ、ルーヴル美術館やフィレンツェ、バルジェッロ美術館などでの撮影は次年度に持ち越す予定である。本研究はフィレンツェに端を発する15・16世紀の小青銅彫刻を特に北イタリア、ヴェネト地方に光を当てて、その社会・文化的機能を検証することを目指すものである。その研究成果の一つとして第11項に挙げた研究論文を2007年10月にロンバルド周辺の小青銅彫刻に関する国際学会を開催されたヴェネツィアでの学会報告(2008年末刊行)に掲載した。当該論文においてはマントヴァ文化圏で活躍した青銅作家アンティーコが同時代の彫刻家、特にフェルラーラ宮廷でエステ家の彫刻家を勤めたアントニオ・ロンバルドにいかなる影響を与えたのかを検証した。第二に、ヴェネツィアの教会や欧米の主要美術館に収蔵される青銅作品を写真・ビデオで撮影し、通常のDVDおよびハイ・ヴィジョンDVD、それぞれ23枚にまとめて公開ができるよう整理した。また最後に北イタリア青銅彫刻関連の文献をほぼ収集することができた。これによって我が国における同分野の研究の基礎がある程度整ったということができよう。参考までに第2点で挙げた撮影場所は、ヴェネツィア(コルレール美術館、黄金宮、セミナリオ・パトリアルカーレ、サン・マルコ広場、サン・マルコ聖堂を始めとする多くの聖堂、)、パドヴァ(イル・サント聖堂、大聖堂、サン・フランチェスコ聖堂)フィレンツェ(バルジェッロ美術館)、モデナ(大聖堂、ガレリア・エステンセ、トレヴィーゾ(大聖堂)ラヴェンナ(サン・フランチェスコ聖堂)、ナポリ(カポディモンテ美術館)、ウィーン(美術史美術館)、パリ(ルーヴル美術館)、ロンドン(ヴィクトリア・アンド・アルバート美術館、ウォレス・コレクション)、ワシントン(ナショナル・ギャラリー)、ニューヨーク(メトロポリタン美術館)である。この成果を基礎に、今度はパドヴァ近郊で活躍した青銅作家アンドレア・ブリオスコ通称イル・リッチョに関する研究を推進したいと考える。
雌ラットの誘惑行動に同期する視索前野ニューロンの活動

雌ラットの生殖行動はエストロゲン依存性に調節されており、その一要素に誘惑行動がある。視索前野(POA)はエストロゲン受容体陽性細胞を多数含み、この部位のニューロンを選択的に脱落させると誘惑行動が消失する。また、誘惑行動は歩行量と密接に関係しており発情期に雌ラットの歩行量が増加するが、エストロゲンがPOAから歩行量を調節する中脳歩行領域へ投射するニューロンの興奮性を調節していることが麻酔下での記録実験から明らかになっている。これらの結果からPOAがエストロゲン存在下で誘惑行動に促進的な役割を持つことが示唆されている。本研究では、8本の白金-イリジウム線を束ねて作成した金属ワイヤ電極を雌ラットのPOAに慢性的に植込み、単一ニューロンの発火活動を記録し、生殖行動と放電頻度の変化を関連づける。さらにPOA内の記録部位の同定を試みることにより、雌ラットの誘惑行動がどのような神経回路による調節を受けているかについて検討することを目的とする。今年度の研究において、191匹のラットのうち27匹からニューロンの単一発火活動が記録され、7個が生殖行動に同期して放電頻度が変化した。これらのうちにはintromissionの終了よりmount前よりも発火頻度が低下するものが4個認められた。これらのニューロンにおいては、intromissionを伴わないmountでは発火頻度の低下が見られなかった。他にもintromissionの間放電頻度が増すニューロンが2個、雄ラットのmountにより放電頻度が増すニューロンが1個それぞれ記録された。このような発火活動はPOAの背外側部より記録された。これらの結果からPOAの背外側部には生殖行動の動機づけに関与するニューロンが存在することが示唆された。
ニューラルネットワークを用いた点字翻訳システムの構築

日本語文書を点字に翻訳する方法として、点訳者が点訳を進める方法や自動点訳ソフトによって点訳を行う方法がある。前者の場合、点訳者の人数自体が少ないうえに、1人の点訳者が翻訳できる数は限られている。このため日々出版される図書の点字化への対応が遅れてしまう問題点がある。また後者の場合は、点訳ソフトが正しく点訳できない場合が多くあり、点訳者による点訳支援システムという形態をとっているのが現状である。本研究は、人間の脳機能をモデルとしたニューラルネットワークを点字翻訳に適応し、その精度を評価・検討するものである。まず点字翻訳のプロセスの中で最も複雑で時間が掛かる「分かち書き」をニューラルネットワークに適用した。ニューラルネットワークは入力と出力の与え方やネットワークの構成によってその性能が大きく異なる。昨年度の研究では、入力に与えるデータとして、(1)点訳前の文書の文字コードをそのまま入力する、(2)文書を漢字とひらがなとカタカナ記号に分類したものを入力する、(3)文書を品詞別に分類したものを入力する、以上3種類の入力方法について計算機シミュレーションを行い、(3)品詞入力の手法が最も正答率が高い結果を得た。そこで今年度は上述した(3)品詞入力の手法を用い、(4)階層型ニューラルネットワークの入力層と中間層の結合を入力の品詞ごとにまとめた構成、(5)通常の全結合のネットワーク構成、以上2種について比較検討した。学習データ数を100パターンとして、計算機シミュレーションを行った結果、(4)品詞ごとに分けたネットワークの分かち書き正答率は92%、(5)全結合ネットワークの正答率は89%となり、(4)のネットワークの方は優れていることが分かった。このネットワーク構成は(5)の場合に比べてネットワークのリンク数も少なくなり、学習に掛かる時間も少なくて済むという結果が得られた。現在、日本語文書を点字に翻訳する方法として、点訳者が点訳を進める方法や自動点訳ソフトによって点訳を行う方法がある。前者の点訳者によって点訳をする場合、点訳者の人数自体が少ないうえに、一人の点訳者が翻訳できる数は限られている。また、後者の点訳ソフトによって点訳する場合は、点訳ソフトが正しく点訳できない場合が依然として多くあり、あくまで点訳者による点訳支援システムという形態をとっている。本研究では、まず点字翻訳のプロセスの中で最も複雑で時間が掛かる「分かち書き」をニューラルネットワークに適用した。そこで、入力に与えるデータとして、(1)点訳前の文書の文字コードをそのまま入力する方法、(2)文書を漢字とひらがなとカタカナ記号に分類したものを入力として与える方法、(3)文書を品詞別に分類したものを入力として与える方法、以上3種類の入力方法について計算機シミュレーションを行い、その結果からシステム性能の評価検討を行った。その結果、点字翻訳のそれぞれの正答率は、(1)75%、(2)93%、(3)95%という結果を得た。現状では、(3)品詞入力の手法が最も正答率が高いと言える。今後の研究計画としては、上記の手法(3)で誤認識をした入力パターンのデータベースを作成し、ニューラルネットワークの前処理としてこれらの入力パターンを除去してやることにより、さらに高い走答率の目指す。さらに、分かち書きが終了した次段階として、分かち書きされたデータを点字仮名遣いに変換するシステムを加える予定である。
酵素蛋白のlipoylation機構に関する研究

グリシン開裂酵素系はP-,H-,L-proteinから構成され,グリシンをテトラヒドロ葉酸とNAD^+存在下メチレンテトラヒドロ葉酸,炭酸ガス,アンモニアに分解する反応を触媒する.構成蛋白質のうちH-proteinはリポ酸を配合族として持つ分子量14kDaの耐熱性蛋白質であり,反応はそのリポ酸がP-,T-,L-proteinの活性中心と順次接触することによって進行する.リポ酸を持つ酵素は他に2-オキソ酸脱水素酵素復合体のE2が良く知られている.これらの蛋白質にリポ酸を結合させる反応を触媒するリポ酸転移酵素の詳細はこれ迄不明であった.我々はリポ酸結合反応の基質となるアポ型H-proteinを大腸菌に発現させそれを用いて酵素をウシ肝から部分精製しその性質を検討した.ウシH-protein前駆体cDNAから成熟型をコードする断片を切出し,発現ベクターpET-3aに組込んだ.これを大腸菌BL21(DE3)pLysSに導入しH-proteinを産生させたところ,得られたH-proteinの80%がリポ酸を特たぬアポ型であったので,これを単一に迄精製し基質として用いた.リポ酸転移酵素は肝ミトコンドリアに局在するので,ミトコンドリア抽出液からhydroxulapatite,MonoQ colymn等を本科学研究費補助金で購入したインテリジェントイナートポンプに接続してクロマトグラフィーを行い精製した.酵素は非常に不安定で精製を進めると失活が著しく,現在のところ完全な精製には至っていない.反応でリポ酸供与体となるのはlipoyl-AMPであり,リポ酸とATPを用いた場合はリポ酸転移は起らないので,酵素はリポ酸活性化反応は触媒しない.リポ酸がアポH-proteinと結合したことは,反応終了後P-proteinと組合せるとグリシンと^<14>CO_2の交換活性が出現することで測定した.またアポ型とホロ型はポリアクリルアミド電気泳動上易動度が異るので,リポ酸の結合はこりによっても判定することが出来る.グリシン開裂酵素系はP-,H-,L-proteinから構成され,グリシンをテトラヒドロ葉酸とNAD^+存在下メチレンテトラヒドロ葉酸,炭酸ガス,アンモニアに分解する反応を触媒する.構成蛋白質のうちH-proteinはリポ酸を配合族として持つ分子量14kDaの耐熱性蛋白質であり,反応はそのリポ酸がP-,T-,L-proteinの活性中心と順次接触することによって進行する.リポ酸を持つ酵素は他に2-オキソ酸脱水素酵素復合体のE2が良く知られている.これらの蛋白質にリポ酸を結合させる反応を触媒するリポ酸転移酵素の詳細はこれ迄不明であった.我々はリポ酸結合反応の基質となるアポ型H-proteinを大腸菌に発現させそれを用いて酵素をウシ肝から部分精製しその性質を検討した.ウシH-protein前駆体cDNAから成熟型をコードする断片を切出し,発現ベクターpET-3aに組込んだ.これを大腸菌BL21(DE3)pLysSに導入しH-proteinを産生させたところ,得られたH-proteinの80%がリポ酸を特たぬアポ型であったので,これを単一に迄精製し基質として用いた.リポ酸転移酵素は肝ミトコンドリアに局在するので,ミトコンドリア抽出液からhydroxulapatite,MonoQ colymn等を本科学研究費補助金で購入したインテリジェントイナートポンプに接続してクロマトグラフィーを行い精製した.酵素は非常に不安定で精製を進めると失活が著しく,現在のところ完全な精製には至っていない.反応でリポ酸供与体となるのはlipoyl-AMPであり,リポ酸とATPを用いた場合はリポ酸転移は起らないので,酵素はリポ酸活性化反応は触媒しない.リポ酸がアポH-proteinと結合したことは,反応終了後P-proteinと組合せるとグリシンと^<14>CO_2の交換活性が出現することで測定した.またアポ型とホロ型はポリアクリルアミド電気泳動上易動度が異るので,リポ酸の結合はこりによっても判定することが出来る.
気象災害防止のための溜池の潜在的洪水調節機能の解明

本研究は河川の水系内のため池群が降水の流出に対してどのように働くか,また洪水調節機能を有することが定量的に示せるかについて観測・解析することを目的とした.まず年度当初に,香川県東部の新川水系内から水位観測を実施するため池を選定した.稼働できる観測器が故障等で2台しかなかったため,観測を実施するため池を2ヶ所だけ選定した.1つは香川県三木町運動公園内の山大寺池,もう1つは鍛冶池で,いずれも山池である.水位観測は水圧式水位計とメモリー型データロガーを利用して実施した.計測開始は平成5年6月下旬で現在も継続中である.今年度の県東部の降水量は例年に比べて多く,結果が期待されたが,短期集中型の豪雨は少なく,また山大寺池については通常秋口に水を落とすところを国体(国民体育大会)のため常時満水状態に調節されていたので,水位変化が7月に入ってからほとんど無く,降水と水位変化の関係を求めるための基礎データは得られなかった.さらに鍛冶池については直接流域が狭く,隣接した間接流域から導水路で取得しており,そぬ運用(セキの開閉)はチェックしていたが,実際にはそれ以外の間接流域もあって,池への水の出入りを完全に把握することはできなかった.現在は,2つのため池水位データの6月から10月の間で利用し得るデータを抜き出し,新川の水位データとあわせて,降水が河川へ流出するまでにため池の空容量(満水時-降雨開始前の水位)がどう関わるかについて定量的な解析を試みている段階である.また,現在はもう1ヶ所,直接流域のみをもつため池を選定し,水位観測を開始している.今後は各ため池への導水路による水の流入経路について再チェックして流入の有無をおさえ,同様な水位観測を実施して,河川流出とため池群の動態を解析する.本研究は河川の水系内のため池群が降水の流出に対してどのように働くか,また洪水調節機能を有することが定量的に示せるかについて観測・解析することを目的とした.まず年度当初に,香川県東部の新川水系内から水位観測を実施するため池を選定した.稼働できる観測器が故障等で2台しかなかったため,観測を実施するため池を2ヶ所だけ選定した.1つは香川県三木町運動公園内の山大寺池,もう1つは鍛冶池で,いずれも山池である.水位観測は水圧式水位計とメモリー型データロガーを利用して実施した.計測開始は平成5年6月下旬で現在も継続中である.今年度の県東部の降水量は例年に比べて多く,結果が期待されたが,短期集中型の豪雨は少なく,また山大寺池については通常秋口に水を落とすところを国体(国民体育大会)のため常時満水状態に調節されていたので,水位変化が7月に入ってからほとんど無く,降水と水位変化の関係を求めるための基礎データは得られなかった.さらに鍛冶池については直接流域が狭く,隣接した間接流域から導水路で取得しており,そぬ運用(セキの開閉)はチェックしていたが,実際にはそれ以外の間接流域もあって,池への水の出入りを完全に把握することはできなかった.現在は,2つのため池水位データの6月から10月の間で利用し得るデータを抜き出し,新川の水位データとあわせて,降水が河川へ流出するまでにため池の空容量(満水時-降雨開始前の水位)がどう関わるかについて定量的な解析を試みている段階である.また,現在はもう1ヶ所,直接流域のみをもつため池を選定し,水位観測を開始している.今後は各ため池への導水路による水の流入経路について再チェックして流入の有無をおさえ,同様な水位観測を実施して,河川流出とため池群の動態を解析する.
口腔がんにおけるCetuximab耐性機構解析と免疫療法併用による新規治療の開発

近年、分子標的薬における獲得耐性による治療効果の低下が問題となっている。我々は口腔扁平上皮がん細胞株にてCetuximab耐性株の樹立に成功した。耐性株を使用して耐性因子を検索したところ、標的であるEGFRおよび下流シグナルのリン酸化Aktが高発現である細胞が高感受性を示し、Cetuximab感受性とPI3K/Akt経路の因果関係が示唆された。また、分子標的薬はNK細胞によるADCC活性や、他の免疫細胞による細胞障害が重要な治療効果因子として働くことが示唆されているため、血液サンプルを用い免疫細胞の変化を確認したが、Cetuximabの効果との関連は認めなかった。われわれは2013年よりMerckよりCetuximabの薬剤提供を獲得し、口腔扁平上皮がん細胞株にてCetuximab耐性株の樹立に成功した。この耐性株を含めた8つの細胞株をもちいてCetuximab感受性を測定し、そのタンパク発現を確認した結果、EGFRの発現量と抗腫瘍効果に正の相関を認めた。また下流であるリン酸化Aktの発現も同様に正の相関を見いだした。また、われわれはHumanのNK細胞を口腔扁平上皮がん細胞株およびCetuximab耐性株と共培養した条件下において、Cetuximab感受性の変化が生じるか確認している。ADCC活性を定量化し、Cetuximab感受性との関連性を追求している。また、実際Cetuximab投与を行っている患者群の腫瘍サンプルをもちいて、Cetuximab感受性に関わる因子の同定を探索中である。また、Cetuximab投与患者の血液サンプルも採取しており、免疫学的な個人の能力とCetuximabにおける抗腫瘍効果との関連を調べる予定である。熊本地震による研究室の損壊および担当者の勤務先変更。近年、多くの領域にて分子標的薬の応用が行われているが、分子標的薬における獲得耐性による治療効果の低下が問題となっており、基礎研究が成されている。申請者らも、2013年よりMerckよりCetuximabの薬剤提供を獲得し、口腔扁平上皮がん細胞株にてCetuximab耐性株の樹立に成功した。耐性株や多数の口腔扁平上皮がん細胞株を使用して、Cetuximab感受性を確認し、耐性因子を検索したところ、標的であるEGFRが高発現である細胞が、Cetuximabに感受性を示し、下流のシグナルではpAktも同様に高発現しており、Cetuximab感受性と、PI3K/Akt経路の因果関係が示唆された。また、既存の抗腫瘍薬と違い、分子標的薬はNK細胞によるADCC活性や、他の免疫細胞による細胞障害が重要な治療効果因子として働くことが示唆されているが、血液サンプルを用い免疫細胞の変化を確認したが、Cetuximabの抗腫瘍効果との有意な関連は認めなかった。また、実臨床ではCetuximabの単剤での使用は少なく、再発・転移症例に対してはCetuximabに加え他の抗腫瘍薬を加えて治療が行われる。また、切除不能症例に対してはCetuximabに加え放射線照射が施行される。我々はこれまでに抗がん剤耐性細胞株を樹立し、抗アポトーシスタンパクであるcellular inhibitor of apoptosis protein 2(cIAP2)の高発現が5-FUへの獲得耐性に関与することを明らかにした。また、放射線耐性株を使用し、放射線獲得耐性へのInterleukin-6/Nrf2 antioxidant pathwayの関与を報告した。、耐性株を使用し以前報告した抗アポトーシス蛋白の発現を確認したが、有意な変化は認めなかった。また、IL-6経路に関しても、Cetuximab耐性への関連は認めなかった。Cetuximabおよび他の抗腫瘍薬や放射線耐性に共通した因子の探索を今後も続けていく予定である。歯科口腔外科学講座の院生が研究を継続。抗がん剤耐性
東南アジアにおけるマメジカ類の生理生態学的調査と増殖保存に関する研究

マメジカは反芻動物の中で進化の早い時期に分かれ、その後大きな変化を経ず現代まで生きのびたため、反芻動物の原始的な特性を残すとされている。反芻動物であるにもかかわらず、非反芻動物さらには非偶蹄動物の特徴をも示す。他の偶蹄類との比較検討を加えマメジカの生理生態学的な特性を明らかにした。1.偶蹄類の脳への血液供給は怪網と呼ばれる特殊な動脈系を介して行われる。マメジカでは内頚動脈が発達し怪網を欠損することを明らかにしたが、他の反芻動物では内頚動脈が残存するものと欠落するものがある。マメジカでの怪網の欠損が進化の過程において、派生的なものか原始的なものかについては解明に至っていない。2.マメジカの胎盤は反芻類に特有な叢毛胎盤(多発性胎盤)ではなく汎毛胎盤(散在性胎盤)である。組織レベルでの母子間の関係は反芻類と同じく結合組織絨毛胎盤であるが、反芻類に特有な二核細胞がつくる合胞体がマメジカでは一過性で、真獣類での基本的な内皮絨毛胎盤や血絨毛胎盤から結合組織絨毛胎盤へ進化する過渡的な段階と考えられる。3.大型のシカ類との比較から、マメジカの後肢の筋では大腿や下腿の近位では外側に、遠位では頭側に集中し、反芻動物の大型化や走行向きに特化する前の跳躍に適する特性を示すものであった。4.反芻動物のパイエル板は空腸パイエル板と回腸パイエル板は機能的に異なる。マメジカも空腸と回腸のパイエル板が識別され、組織学的構造が他の反芻動物に類似することから、機能的にB細胞の発生分化する一次リンパ器官としての回腸パイエル板と二次リンパ器官である空腸パイエル板に分かれることが推測された。マメジカ類は偶蹄目、反芻亜目に属し、現存する全ての有蹄類の中で最も小さいだけでなく、反芻亜目の原型であるとも言われ、家畜の進化の上からも興味ある動物である。我々の過去の研究から、反芻亜目に属するにもかかわらず、反芻亜目や偶蹄目でみられない特異な形質を明らかにしてきた。今年度の調査では、さらに特性を幅広く検討するとともに、比較検討のため、マメジカ同様に3域からなる複合胃をもち、特有の進化をとげた南米のリャマの調査も行った。得られた成果は以下の通りである。1)反芻動物では、一般に唾液腺のうち耳下腺の発達が悪いが、マメジカは体重当たりの重量が大きく(2.5g/kg)、ウシなどの反芻家畜や野生のキョンやニホンシカとの比較においても最大であり、食性変化に対する適応の過程がみとめられた。2)哺乳類のゲノムの大半は「がらくたDNA」である散在性反復因子で占められており、反芻動物ではLineの一つRTE-1エレメントにあるp97Bcnt遺伝子が報告されている、マメジカにはウシとの相同性の高いp97Bcnt遺伝子が存在し、ラクダには存在しないことから、反芻類の早い段階でp97Bcnt遺伝子が創出されることが推測された。

3)マメジカ、キョン、ニホンシカの後肢の筋の比較検討から、マメジカの後肢では、近位部の外側、遠位部の頭側に筋が集中しており、反芻動物の後肢における基本的な役割を明らかにした。4)マメジカの精巣におけるステロイドホルモン産生にかかわる、調節蛋白(StAr)、酵素(P450scc,P450c17,3βHSD)、ステロイド受容体(ERα,ERβ)の局在から、Leydig細胞やSertoli細胞のステロイドホルモン分泌が、ERαを介したLeydig細胞の機能と、ERβを介する精子の成熟に影響を及ぼすことを明らかにした。5)マメジカは偶蹄目に反芻亜目に属するにもかかわらず怪網を欠くが、南米産のリャマでは、怪網は存在するものの、内頚動脈が発達しており、マメジカと反芻家畜の中間の形態を示すことが明らかになった。マメジカは現存する反芻動物の原型とされる動物で、他の反芻動物と異なる特性が明らかになってきた。マメジカ類に特有の形質が進化の過程で保持されたものか、あるいは獲得されたものかを比較形態学的な観点から探究し、種の保全に不可欠な発情周期の解明など繁殖学的な観点からの調査を行った。得られた成果は以下の通りである。1.マメジカは偶蹄目に特有の怪網を欠き、内頚動脈により脳への血液供給が行われる。マメジカと同様に角を欠き牙状犬歯をもつため原始的な反芻動物とされるキバノロでは、内頚動脈を欠き怪網をもつ。南米産ラクダ類のラマでは怪網は発達しているが、内頚動脈も残存する。マメジカは怪網を欠く唯一の反芻動物であることが確認され、怪網の欠損は内頚動脈の存否だけでは説明がつかず、怪網形成が生じる以前に系統樹かち分離したより原始的な反芻動物と考えられる。2.動物の増殖には、発情期を適確に捉え自然交配あるいは人工授精などを適切に行うことが不可欠になる。発情兆候が不明確なマメジカでは性ホルモンの状況をみるため、糞中プロゲステロンの測定を行った。マメジカでもプロゲステロンの測定が可能となったが、国内の動物園やインドネシアでの飼育動物から収集した糞を分析した今回のデータからは発情周期を確定できなかった。3.反芻動物のパイエル板は腸管の部位によりT細胞系(空腸パイエル板)とB細胞系(回腸パイエル板)に分かれる独特のリンパ系をもつ。マメジカの調査では、組織学的観察から機能的にT細胞系とB細胞系のパイエル板をもち、免疫学的には他の反芻動物との類似性が推測された。
脳虚血耐性阻害に関する分子メカニズムの解明

大脳皮質や海馬において、細胞死を誘導しない程度の虚血処置やグルタミン酸受容体刺激(プレコンディショニング)は、その後の致死的な虚血負荷やグルタミン酸受容体刺激による細胞死を抑制することが知られている(虚血耐性/神経保護効果)。これまで海馬スライス培養細胞を用いて、プレコンディショニング後に、シナプスNMDA受容体刺激による神経保護経路の活性化が抑制されることを見出していた。これは、虚血耐性を阻害する反応であると考えられる。本研究では、この現象と虚血耐性形成との関係を明らかにすることを目的としている。この神経保護経路の抑制は、カルパイン阻害薬によって阻害されることから、カルパインを介する細胞内経路であると考えられるが、プレコンディショニングによって脱リン酸化酵素が活性化されても、神経保護経路が抑制される可能性も考えられた。そこで、脱リン酸化酵素阻害剤の効果を調べたところ、脱リン酸化酵素の活性化は、プレコンディショニングによる神経保護経路の抑制には関わっていない事が明らかとなった。また、このプレコンディショニングは、電位依存性カルシウムチャネルを介する神経保護経路の活性化には影響しなかったことから、シナプスNMDA受容体刺激に特異的な反応であることが示された。さらに次年度以降の実験に用いるために、海馬スライス培養細胞に加えて、海馬初代培養細胞におけるプレコンディショニング条件として、細胞死を誘導せず、その後の致死的なグルタミン酸処置による細胞死を抑制するNMDA処置濃度と処置時間の検討を行った。本年度は、今後の実験の基盤とするため、海馬スライス培養に加え、海馬初代培養細胞を用いたプレコンディショニング条件の検討を行った。細胞死を誘導せず、かつ神経保護効果を示すNMDAの処置濃度、処置時間、メディウム等について検討を行った。これらの検討に時間を要したため、当初予定していたCREBリン酸化抑制の経時変化を検討するまでには至らなかった。プレコンディショニング条件や、プレコンディショニングによる神経保護作用およびCREBリン酸化の抑制作用等、基礎的な条件を確定したのち、プレコンディショニング後にみられるCREBリン酸化の抑制作用のメカニズムの解明を行う。当初購入を予定していた超低温冷凍庫が、学内研究費で購入できた。また国際学会参加費、旅費が不要であった。次年度予算と合わせ、研究遂行のための薬品等の消耗品の購入および学会参加費に充てる。また、海馬スライスの作成に用いるティッシュチョッパーの修理を行う予定である。
東アジアにおける日本語観国際調査の実施(準備調査)

平成14年度から3年計画での実施を予定している東アジア(中国,韓国,(台湾))における日本語観国際比較調査(基盤研究(A)(海外学術調査)として申請中)の企画立案を行うため,基盤研究(C)(企画調査)の助成を受けて研究を行った。研究実績の概略は以下のとおりである。(1)先行研究として行われた「日本語観国際センサス」(1997年,1998年実施)の調査結果について,アジアの視点で再分析し,調査項目選定の基盤づくりを行った。分析結果の一部は日本行動計量学会論文集の特集テーマとして掲載される予定である。(2)中国,韓国から海外共同研究者の劉志明,姜錫祐を招聘し,各国の最新事情を聴取するとともに,実施予定の調査に盛り込む項目の枠組みや調査地域について議論を行った。(3)上記議論を踏まえて,中国,韓国の共同研究体制を築くべく,日本を中心とした共同研究者のネットワーク構築に着手した(現在,メーリングリストによる各国10名ほどの討議体制が整っている)。(4)具体的調査項目選定の一助とするため,和文の文献やデータベースから関連情報の収集を開始した。今後中国語,韓国語による情報収集も行う予定である。(5)年度末までの蓄積を基に,来年度実施を予定している「日本語観国際比較調査」の調査票原案を作成した。日中韓の言語イメージ,漢字イメージ,英語公用語論,文化的・経済的・人的接触などの観点が主として盛り込まれた。今後,調査実施まで改訂・推敲を継続する予定である。(6)上記の成果は,国内研究者を中心に行った十数回の研究会での議論により蓄積されたが,メーリングリストによる議論によるところの知見も大であった。
歴史的思考と理解の一体的形成を促すエンパシー（共感）の指導と評価に関する研究

歴史的思考と理解を一体的に形成するためには,生徒にとって遠い存在である過去を身近なもの,我が事と捉えさせることが不可欠であるとの認識の基に,情意的概念であるエンパシーに着目し,エンパシーを働かせることを通して歴史的思考と理解を形成する理論と方法を考察した。まず,米英等の文献研究と研究者への聴き取りを踏まえてエンパシーの指導と評価の理論仮説を構築し,次に優れた歴史授業の観察・分析を踏まえてエンパシーの働きを確認し,理論仮説の妥当性を明らかにした。それらを踏まえて,日本の中等教育段階の歴史授業を対象とする学習指導モデルと評価基準を開発した。研究課題の中核をなす歴史的エンパシーについて、英米の主要な文献、特にロンドン大学のS.フォスター教授とケンタッキー大学のL.レブスティック教授の論攷を中心に整理するとともに、米国プライマリ・ソースのD.カニンガム博士にインタビューすることによって、一定の時代的文脈の中で他者の見方(パースペクティブ)を明らかにする認知的側面と、他者の行為や状況に気をくだく(ケアリング)情意的側面の双方から理解すべきことを確認できた。また、9月には米国のマサチューセッツ州の学校を複数訪問し、過去に州の優秀歴史教師賞の受賞経験のある教師の授業を観察し、エンパシーについての意見交換を行った。その結果、いわゆる一次史料等の読解と相互の議論に基づく生徒主体の歴史探究型授業(doing history)こそが、過去の文脈下で複数の異なる意見に触れることを可能にすること、また学習主題の選択に際しては何らかのディレンマ状況にあった人物や事件を取り上げると効果的なことが明らかになった。これらと並行し、現在中教審分科会で次期学習指導要領改訂の方向性として議論されている資質・能力の育成に関わって、歴史固有のリテラシーの一環にエンパシーを位置づけることの有効性を見出した。その成果の一部は、全国社会科教育学会の第64回全国研究大会(広島大学、2015年10月)のシンポジウムで「今、教科教育学の存在理由が問われている」と題して発表した。そこでは、1930年代の英国首相チェンバレンの対独宥和政策を事例にして、求められる資質・能力を歴史固有のリテラシーの文脈で捉え直し、エンパシーを位置づける方法を提示して、一定の評価を得た。第一に、1年次の目的に掲げた米国訪問を実行し、歴史的エンパシー研究の第一人者ともいうべきD.カニンガム博士に面会して聴き取りができたこと、また歴史的エンパシーを実践する米国の歴史教師の授業を観察し、意見交換し資料も収集できたことである。第二に、上記と並行して文献研究を進めた結果、歴史的エンパシーが認知面と情意面からなることを明らかにできたことである。もともと、日本では情意的側面、米英等では認知的側面が重視されていたが、双方を適切に関連付けて初めて歴史的思考と理解が一体的に形成されることが改めて確認できた。ただし、認知面と情意面の関係を単なる相互作用ないしスパイラルといった抽象的なレベルでしか捉え切れていないことが課題である。これについては、更なる文献研究や調査研究を踏まえ、具体的な歴史の学習指導モデルを通じて説明することが今後に残された課題である。昨年度に引き続き,歴史的エンパシーに関する理論的研究と実践的研究を並行して行った。理論的研究に関しては,文献だけでは十分に納得できない点があることから,本年度は当研究の第一人者である英国のリー教授(Peter Lee)とフォスター教授(Stuart Foster)を訪問し,この問題について意見交換を行った。その結果,エンパシー(共感)というのは歴史理解の本質ではなく,歴史的思考の触発・深化のためのツール(仕掛け)と捉えられていることが判明した。つまり,過去は基本的に異文化であり,生徒にとって容易に理解し得るものではないし,また進んで考えようとするほど関心をひくものでもない。そうした認識を前提にすると,歴史学習を促すためには二つの課題をクリアーする必要が生ずる。一つは生徒の関心・意欲を引き出すことであり,もう一つは過去の人々の考え方や感じ方が現在とは異なり,また多様であったことに気付かせることである。この二つの課題に応えつつ,歴史的思考と理解を一体的に深める仕掛けとして,案出されたのが歴史的エンパシーの概念というわけである。次に実践的研究に関して,エンパシーが生徒の共感に働きかけ,過去の文脈を吟味するための仕掛けであり,それ自体に意味があるわけではないとすれば,エンパシーを働かせた結果,生徒が過去の人物の行為や決断に関心を持ち,その意味や背景を探究する過程で多様なパースペクティブを示す史料を読解することが求められるはずである。こうしたエンパシーの概念が,諸外国の歴史教師にどのように把握され実践に生かされているかを調査するために,米国オレゴン州の中学校・高等学校とドイツのギムナジウムを訪問して,歴史教師の授業を観察しインタビューも試みた。なお,それらのデータを整理・分析し,実態を解明するのは次年度の課題である。第一に,歴史的エンパシー研究の第一人者で,関連論文の多い英国のP・リー教授とS・フォスター教授に面会して意見交換する中で,昨年度来疑問を抱いていたエンパシー概念における情意と認知の関係についての謎が解けたことである。つまり,エンパシーに情意と認知に関する異なる二側面があるのではなく,歴史の探究のための問いの真正性を確保するとともに,過去の文脈に迫るための同時代資料の必要性を納得させる操作的概念として,エンパシーが用いられているということである。

問いの発見には情意への働きかけが有効であり,また情意により生まれた問いを歴史の文脈で探究するには,過去の人々の見方・考え方を示す複数資料の読解が不可欠だからである。第二に,昨年度の米国マサチュセッツ州に続き,本年度は米国オレゴン州の中学校・高校とドイツ(シュトゥットガルト)のギムナジウムで歴史の授業を観察し,エンパシーの生かし方について教師と議論したり,関連資料を収集したりすることにより,歴史的思考と理解の一体的形成を促す指導と評価についての一定の見通しが得られたことである。それについて一部は学会や研究会で報告し,日本史上の事例を取り上げて,教材構成と指導のあり方を雑誌等でも紹介したが,本格的な歴史授業・評価モデルの構築と社会に向けた発信については来年度に持ち越すことになった。以上の大きく二点の理由から、申請時の計画からみて概ね順調に進展しているものと判断した。海外調査と学会等での議論を踏まえ,歴史的エンパシーの本質を他者のパースペクティブへの配慮と捉えた。現代世界にも私(われわれ)と異なる多様な見方や立場があるように,過去にもそれぞれの時代や社会特有の見方や立場があった。それを異文化として捉えることは歴史理解の第一歩である。だが,そのためには過去の時代の文脈や人々の価値観を知らねばならない。それも一様とはいえないとすれば,異なる立場や意見を示す多様な資料(文書・絵画・写真から遺物・遺跡まで)を批判的に読み解かねばならない。また,生徒にそうした多様な資料に向かわせるためには,それなりの仕掛けが必要である。それが歴史固有の概念・ツールとしての「エンパシー」である。empathyは通常「同一視,共感」と訳され,sympathyと同一の概念のように見えるが,欧米諸国では全く異なる概念と捉えられ,歴史教育ではシンパシーではなくエンパシーを重視すべきことが強調されている。オーストラリアの歴史カリキュラムでも,歴史の主要概念の一つにエンパシーが掲げられているが,「出来事を当事者や参加者の観点から見て理解する能力」と定義し,シンパシーやイマジネーションが学習者である「私」の観点からの共感や想像であるのとは明確に区別している。日本では国語教育の影響もあって,歴史上の人物の思いに共感させたり推測させたりしがちであるが,それはシンパシーに留まる。エンパシーは自分がその人物の立場にいたらどう考え,どう行動するかを問うのである。そこに生徒を過去の学習に向かわせる一つの仕掛けが読み取れる。それゆえ,過去の人物の行為なら何でもよいわけではなく,それを学ぶことで今後の社会のあり方を考える(価値観形成につながる)事例でなくてはならない。その点で,エンパシーが新学習指導要領の提起する歴史的な見方・考え方としても作用し得ることを明らかにした。歴史的思考と理解を一体的に形成するためには,生徒にとって遠い存在である過去を身近なもの,我が事と捉えさせることが不可欠であるとの認識の基に,情意的概念であるエンパシーに着目し,エンパシーを働かせることを通して歴史的思考と理解を形成する理論と方法を考察した。まず,米英等の文献研究と研究者への聴き取りを踏まえてエンパシーの指導と評価の理論仮説を構築し,次に優れた歴史授業の観察・分析を踏まえてエンパシーの働きを確認し,理論仮説の妥当性を明らかにした。
肺癌における分子標的治療の研究(siRNAを用いたmTORの抑制)

In vivoにおいては、当初の予定通りに、肺癌細胞を用いて、siRNA(mTOR)を用いて、癌細胞の増殖能、移動能を抑制し、アポトーシスを引き起こすことを証明できた。しかし、ラットを使用したin vitroの実験においては、コントロール群とsiRNA(mTOR)の治療群において、両差に腫瘍径、アポトーシス等に差を認めなかった。このことは、生体内におけるRNAiのtransfectionにおいて何らかの問題があったのではないかと推測される。引き続き、生体でのtransfectionの条件についていろいろと検討し、さらなる実験を行っていく予定である。今年度は,ラパマイシンの副作用を予防する手段として,ラパマイシンの作用蛋白である,mTORをRNA interference(以下RNAi)法によって抑制する方法をin vitroで実験した。材料および方法:細胞株はヒト肺扁平上皮癌細胞株;RERF-LC-AIを用いた。Short interference RNA(mTOR)は,Cell signaling社製とtransfection regentとしてLipofectamine TM2000を用いた。抗腫瘍効果の判定としては,増殖能とApoptosisを調べることにした。コントロール群(C群)と,RNAi群(I群)とにわけてそれぞれ評価した。増殖能の評価;6wellのcultureplatesに5×104cells/wellで細胞を蒔き,24時間インキュベートした後にC群にはLipofectamin2000のみ,I群にはsiRNAをtransfectonさせた。48時間インキュベートした。その後,細胞数をヘモサイトメーターを用いてカウントした。Apoptosisの評価;ELISAキットを用いてC群,I群について測定した。細胞がapoptosisに陥った後に,細胞質に出現するヒストン/DNA断片複合体の吸光度を測定することで評価した。結果:増殖能については,48時間後の細胞数は,C群(151.1±8.6×1万),I群(94.7±3×1万)であった。コントロール群と比較して,RNAi群において有意に細胞数が減少していることが確認した。(p<0.01)Apoptosisについても,吸光度はC群(1.0±0.168)に対して,I群(1.186±0.169)で,C群とI群を比較して,RNAi群が有意にApopotosisを引き起こしていることが確認できた。まとめ:肺癌治療においてラパマイシンの標的蛋白であるmTORに対してsiRNAを用いて,細胞内のmTORを抑制することで癌細胞にapoptosisを起こし,成長を阻害することをin vitroで証明できた。本研究の目的は、肺癌治療において副作用の少ないラバマイシンの標的蛋白であるmTORに対してsiRNAを用いて、細胞内のmTORを抑制することで癌細胞にapotosisを起こすという仮説を証明することである。平成19年度は、in vivoの研究を施行。具体的には、Cell Signaring社siRNA mTORを用いて、ヒト肺癌細胞株(RERF-LC-AI)にtransfbctionした細胞を用いた。その増殖能および遊走能が抑制され、Apoptosisを、引き起こすことを、すでに証明した。平成20年度はin vivoでがん細胞のmigrationを抑制できるかどうかをまず証明した。それらをもとに、我々が以前に確立した、ラットの肺癌リンパ節転移モデルを用いたin vitroでの研究を施行した。ラットに肺癌細胞を移植し、siRNA mTORを腫瘍に局注する。7日後に腫瘍を摘出し、腫瘍の体積、重さを測定したが、両者に有意な差を認めることはできなかった。免疫組織学的にも、mTOR蛋白の抑制を認めなかった。この原因は、生体内においては、siRNA mTORがうまくtransfectionされなかったことによるのだが、現在究明し、ほうほうについて再度検討中である。
医療と介護の「質」確保に関する調査・研究-イギリスとの比較法的視点から-

本年度は、静岡県榛原郡榛原町の被保険者1000名(第1号・第2号:無作為抽出)を対象として、郵送によるアンケート調査を行った。回収したアンケート回答データを入力集計し、昨年度行った調査(同町における介護保険認定者への戸別訪問悉皆調査)とあわせて分析、所属する研究会で報告を行った(民主主義科学者協会法律部会社会保障法分科会合宿、静岡家族問題研究会、など)。この調査検討の結果、概略次のような点が明らかになった。介護保険制度施行後、急速な利用状況の縮減がみられるわけではないが、利用者の経済状況によって利用分化の傾向がみられる。また、費用負担に関する意識とは裏腹に、施策に対する理解、利用者としての主体的な意識は希薄である。さらに、これまでの研究に、本研究成果を反映させ、イギリスの、特に医療保障に関する質的確保の問題に関する研究報告・論文作成を行った(「イギリス医療保障法の展開」〔第39回日本社会保障法学会個別報告〕、「イギリス医療保障の現在-医療サービスの質確保に向けて」)。イギリスの現在の医療保障、介護保障の施策においては、質確保、医療と介護サービスの連携が重要課題として位置づけられ施策が展開されている。そのような政策的な展開に呼応する形で展開されてきている医療保障法(学)は、1998年人権法の制定の影響を受けながら、裁判所=法によるサービスのコントロールの必要性と可能性を探っている。この分析・検討手法は、日本の社会保障法学においても極めて有効である。本年度行った調査・研究は、(1)福祉をめぐるイギリスでの議論状況の把握(裁判例を中心として)、(2)静岡県下での介護保険の実態調査(利用者の視点から)、であった。(1)については、「イギリスにおける保健・医療と福祉の連携-最近の裁判例を手がかりに」としてまとめた。本稿では、まず、これまでしばしば紹介されてきている1948年国民扶助法他関連法の大枠の紹介にとどまらず、一歩踏み込んで、利用者の視点から制度が実務上どのように解釈され運用されているかという点、そして他法との具体的な連関まで含めて紹介した上で、近年実際に生じた問題およびその裁判例を読み解く形で、福祉における裁判所の関り方および法理を検討した。これは「質」確保を考える上でのいわば前提作業となるものであり、次年度はさらにこれを踏まえて具体的な「質」確保の検討を行うことになる。他方、(2)に関しては、静岡県榛原町において、同町内の介護保険被保険者のうち介護認定を受けた全員を対象にアンケート調査を行った。そしてアンケート回収時には、実際に全戸を戸別訪問し(事情により訪問できなかったところを除く。なお、教育的観点・配慮から学生をともなって訪問した)、認定者のおかれている実際の状況や利用者の生の声をあわせて聞き取り、実態の把握を行った。この調査結果については現在分析・検討中であり、これをまず資料としてまとめ、それを踏まえて介護保険実施後の介護サービス利用者の実態に関する分析・検討を論文として公表する。
血管新生遺伝子VEGFを標的としたRNA干渉法による口腔癌遺伝子治療の基礎的研究

VEGFを標的とした血管新生阻害は癌治療として期待されている。そこで我々は、VEGFを標的としたRNA干渉法による扁平上皮癌の遺伝子治療の検討を行った。マウスVEGF mRNAに相補的なオリゴDNAを合成後、ステムループ型siRNA発現ベクターに挿入してsiVEGFプラスミドベクターを構築した。10、20および40μgのsiVEGFプラスミド溶液を、遺伝子導入用のカチオン化ゼラチンと混合し複合体を調整し、この複合体を5日毎に4回、腫瘍(マウス扁平上皮癌NRS-1細胞)局所に投与した。投与されたsiVEGFプラスミドDNAは、10日後も腫瘍局所に存在しており、カチオン化ゼラチンによる徐放効果が確認された。siVEGF群は対照群(カチオン化ゼラチン/siEGFPプラスミド複合体投与群)に比べ有意な腫瘍増殖の抑制効果が認められ、その効果はプラスミドDNAの濃度に依存的であった。抗CD31抗体による免疫組織染色を行い腫瘍局所の血管数調べたところ、siVEGF群では対照群に比べ有意に血管数の減少を認めた。また抗α-SMA抗体による免疫組織染色を行ったところ対照群ではα-SMA陰性の未熟な血管が多かったのに対し、siVEGF群ではα-SMA陽性の成熟した血管が多く認められたことから、siVEGFは未熟な腫瘍血管を標的としている可能性が示唆された。血管の成熟に関与していると考えられているangiopoietin-1(Ang-1)の発現を免疫組織学的に観察したところ、siVEGF群において、α-SMA陽性の血管内皮細胞にAng-1の発現が認められたことから、VEGFは腫瘍血管におけるAng-1の発現を負に抑制している可能性が示唆された。以上、カチオン化ゼラチンを用いたVEGFRNA干渉は扁平上皮癌に対する有効な遣伝子治療になる可能性が示唆された。(1)標的遺伝子配列の選択;5つの異なったmouse VEGFのRNAiの設計を行い、2本鎖RNAを合成した後、iGENE社のRNAi発現ベクターに挿入しVEGF RNAiベクターを完成させた。(2)in vitroでのVEGF発現抑制効果の確認;マウス扁平上皮癌細胞にVEGF RNAiベクター導入後、RT-PCRおよびELISA法により発現を解析したところ、いずれのVEGF RNAiベクターも抑制効果を示したが、特にVEGF RNAiベクター#1においてRNAレベルにおいて90%以上の抑制効果を示した(配列は未発表)。またVEGF RNAiベクター導入後の細胞増殖能を[3H]thymidine法で確認したところ、VEGFの発現抑制は細胞増殖に影響をおよぼさないことが確認された。2,担癌マウスの作製とRNAiによるVEGF発現抑制と抗腫瘍効果についての解析;C3H/Heマウス背部皮下にマウス扁平上皮癌細胞NRS-1細胞を移植し担癌マウスを作製し、腫瘍結節の最大径が5mmになった時点から腫瘍局所にRNAiベクターを投与し腫瘍径を経時的に測定したところ、腫瘍はRNAiベクター投与により、増殖抑制傾向がみられた。現在詳細にin vivoでの効果を解析中である。目的:VEGFは腫瘍血管新生におけるもっとも重要な血管新生促進因子と考えられており、これを標的とした血管新生阻害による抗腫瘍効果が期待できる。そこでVEGFを標的としたRNA干渉法を扁平上皮に対する遺伝子治療に応用可能であるかを担癌マウスを用いて検討した。方法:マウスVEGF mRNAに相補的な21塩基二本鎖オリゴDNAを合成後、ヘアピン型siRNA発現ベクターに挿入してVEGF siRNAプラスミドDNAを構築した。

これをマウス扁平上皮癌NR-S1細胞に導入し解析を行った。結果:in vitroにおけるsiRNA導入で6090%のVEGF mRNAのノックダウン効果を認めた。またC3H/Heマウス皮下にNR-S1細胞を移植し、腫瘍径が35mmに達した時点からカチオニックゼラチンに包埋させたVEGF siRNAプラスミドDNAを腫瘍結節内に投与し遺伝子治療を行ったところ、対照群に比べ腫瘍増殖の抑制と腫瘍局所の血管数の減少を認めた。またVEGF siRNAプラスミドDNA投与群において腫瘍内に残存した血管はα-SMA陽性の成熟した血管であった。血管成熟にangiopoietin-1が関与すると考えられている。そこでangiopoietin-1の免疫染色を行ったところ、α-SMA陽性血管はangiopoietin-1を発現していることが明らかとなった。結論:扁平上皮癌に対するVEGF RNA干渉法による遺伝子治療の有効性が示唆された。今後angiopoietin-1による血管成熟と抗腫瘍効果について解析を行う予定である。マウスVEGF mRNAに相補的な21塩基二本鎖オリゴDNAを合成後、ヘアピン型siRNA発現ベクターに挿入してVEGF siRNAプラスミドDNAを構築した。カチオニックゼラチンに10μg,20μg,50μgのvEGF siRNAプラスミドDNAを含浸させ、腫瘍結節内に投与し遺伝子治療を行った。対照群に比べ腫瘍増殖の抑制効果がみられ、これは濃度依存的な効果であった。Anti-CD31抗体による免疫染色の結果、腫瘍局所の血管数の減少を認めた。VEGFを標的とした扁平上皮癌の抗血管新生治療の有用性が示唆された。