hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨格筋のリアノジン,ジヒドロピリジン両受容体間両方向性連絡の分子機構

本研究は、骨格筋細胞の筋小胞体(SR)膜に存在するRyRと細胞形質膜(T管膜)に存在するDHPRとの間で交わされる両方向性連絡の特性とその分子機構の解明を目的として遂行された。1)細胞形質膜DHPRからSR膜のRyRへの順行性連絡:Sa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離(CICR)の促進剤であるカフェインの投与により持続的にCa^<2+>放出を起こしている時に、電圧固定法により膜を持続的に脱分極すると、引き続く再分極によりCa^<2+>放出が全面的に停止する(RISC ; PNAS 91,5725,1994)脱分極パルス直後に初めてカフェインを投与してもCICRが起こらないことから、再分極時に確かにCICRが抑制されていることが示唆された。この抑制はDHPR欠損筋細胞(RyRは発現している)では観られず、DHPRを遺伝子導入で発現させると再現されたため、DHPRを介した効果であることが示された。また、同様の抑制は脱分極パルスの代わりにフィールド刺激により活動電位を高頻度に発生させた場合にも観られ、生理的条件下でも起こりうることが示された。一方、脱分極によるCa^<2+>放出はこの種の抑制を受けず、CICRと異なる機構で起こることが示唆された。我々がこれまで実験に用いてきた筋管細胞とその細胞骨格を破壊したmyoballの両者を電顕で調べたところ、興奮収縮連関に必須であるT管膜とSR膜との近接構造は保持されており、成熟筋細胞と本質的な差はないと結論された。2)SRから細胞形質膜への逆行性連絡:培養ラット骨格筋細胞において、SRのCa^<2+>取り込みを抑制しつつカフェインでCa^<2+>を放出させると、細胞外からのCa^<2+>流入と思われる細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が観られた。また、DHPRを介さずに静止膜電位で活性化される新しいCa^<2+>流入系を検出した。これらがRvRを介した容量件Ca^<2+>流入であるかどうか現在検討中である。本研究は、骨格筋の筋小胞体(SR)膜に存在しCa^<2+>放出チャネルとして機能するリアノジン受容体(RyR)と、形質膜に存在し電位センサーとして機能するジヒドロピリジン受容体(DHPR)との間で交わされる両方向性連絡の特性とその分子機構を明らかにしようとするものである。[研究課題1]骨格筋細胞の収縮は形質膜の脱分極によるSRからのCa^<2+>放出により起こる。この過程で形質膜の電気信号を化学信号(Ca^<2+>)へと変換しているのが、形質膜のDHPRとSR膜のRyRであり、両者の直接的相互作用によりRyRチャネルの開口(SRのCa^<2+>放出)が起こると推定される。ところが、生筋のSR膜上ではDHPRと連結しているRyRと連結していないRyRが交互に配列しているため、DHPR連結型RyRチャネルの開閉特性に関しては解析が困難であり、DHPR連結型RyRの開口特性や両受容体間の静止時の相互作用などは明らかでない。本研究では近接場蛍光顕微鏡や蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を適用し、DHPRおよびRyR 1分子の挙動を観ることによりこれらの問題点の解決を試みる。予備実験としてRyRのN末にGFPを発現させた。この際、DHPRのCa^<2+>電流やSRのCa^<2+>放出に本質的影響はみられなかった(Lorenzon et al., Arch Biochem Biophys, 388, 13-17, 2001)ので、次のステップとして、RyRとDHPRの相互作用部位近傍にGFPおよびAequorinを発現させるベクターの作成にとりかかっている。本年度は筋細胞培養系および全反射型蛍光顕微鏡系を構築し、培養筋細胞の細胞表層膜近傍(<100nm)に存在する蛍光分子のみを励起できる系を確立した。[研究課題2]筋疲労時のようにSRのCa^<2+>濃度が減少する条件下で、弛緩期にCa^<2+>流入の起こること(容量性Ca^<2+>流入)が骨格筋細胞にて報告されている。そこで申請者は「RyRがSRのCa^<2+>濃度を感知し、Ca^<2+>濃度減少時にDHPRを逆行性に活性化する」とする作業仮説をたてた。本研究では正常およびDHPR欠損筋細胞にパッチクランプを適用し、この仮説を検討する。もしDHPRがSR内Ca^<2+>濃度の低下で活性化されるならば、静止時に大きな電気化学駆動力でCa^<2+>が細胞内に流入することとなり、骨格筋DHPRのCa^<2+>チャネルとしての生理的意義が確立される(Suda, Jpn J Physiol, in press)。本年度はSRと細胞質のCa濃度の同時測定が可能な蛍光顕微鏡系にパッチクランプを組み合わせた系を構築した。

1)細胞形質膜DHPRからSR膜のRyRへの順行性連絡:Sa^<2+>誘発性Ca^<2+>遊離(CICR)の促進剤であるカフェインの投与により持続的にCa^<2+>放出を起こしている時に、電圧固定法により膜を持続的に脱分極すると、引き続く再分極によりCa^<2+>放出が全面的に停止する(RISC ; PNAS 91,5725,1994)脱分極パルス直後に初めてカフェインを投与してもCICRが起こらないことから、再分極時に確かにCICRが抑制されていることが示唆された。この抑制はDHPR欠損筋細胞(RyRは発現している)では観られず、DHPRを遺伝子導入で発現させると再現されたため、DHPRを介した効果であることが示された。また、同様の抑制は脱分極パルスの代わりにフィールド刺激により活動電位を高頻度に発生させた場合にも観られ、生理的条件下でも起こりうることが示された。一方、脱分極によるCa^<2+>放出はこの種の抑制を受けず、CICRと異なる機構で起こることが示唆された。我々がこれまで実験に用いてきた筋管細胞とその細胞骨格を破壊したmyoballの両者を電顕で調べたところ、興奮収縮連関に必須であるT管膜とSR膜との近接構造は保持されており、成熟筋細胞と本質的な差はないと結論された。2)SRから細胞形質膜への逆行性連絡:培養ラット骨格筋細胞において、SRのCa^<2+>取り込みを抑制しつつカフェインでCa^<2+>を放出させると、細胞外からのCa^<2+>流入と思われる細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が観られた。また、DHPRを介さずに静止膜電位で活性化される新しいCa^<2+>流入系を検出した。これらがRvRを介した容量件Ca^<2+>流入であるかどうか現在検討中である。DHPR, RyR両受容体間の直接的相互作用(順行性シグナル)の解析:細胞形質膜直下のCa^<2+>濃度を全反射型蛍光顕微鏡を用いて測定を開始したが、収縮による動きにより蛍光信号が強く影響されるため、現在、筋小胞体(SR)のCa^<2+>放出に影響せず収縮のみを抑制する系の確立に努めている。一方、骨格筋が速やかに弛緩する機構の解明を目的とした実験を開始した。強縮中の骨格筋が速やかに弛緩するためには、運動神経を介した筋細胞膜の電気刺激を停止した直後にSRのCa^<2+>放出が停止し、細胞質のCa^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)が速やかに減少する必要がある。ところが、SRのCa^<2+>放出機構には、筋細胞膜の電気的興奮によって直接活性化されるCa^<2+>放出機構のみならず[Ca^<2+>]_iの増加によって自己再生的に誘起されるCa^<2+>によるCa^<2+>放出(CICR)機構も存在する。従って、[Ca^<2+>]_iが増加している強縮刺激停止直後にCa^<2+>放出が停止するならば、その時点でCICRは抑制されているはずである。現在、CICRの促進剤であるカフェインを用いて、この仮説を検証中である。カフェイン拘縮中に刺激電極を用いて強縮刺激を起こし、電気刺激を停止した直後(再分極時)にカフェイン拘縮(Ca^<2+>によるCa^<2+>放出またはCICR)が停止した。また、強縮刺激直後に初めてカフェインを投与した場合にもカフェインによるCa^<2+>放出(CICR)が抑制されていることを確認した。しかし、強縮直後の電気刺激(膜の脱分極)でCa^<2+>が放出された。従って、脱分極によるCa^<2+>
細胞内情報伝達における癌遺伝子の役割

(1)Crk癌遺伝子による発癌機構の研究v-Crkによる細胞の癌化においては、PI3K/AKT経路の活性化が非常に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらにFocal Adhesion Kinaseのチロシンリン酸化とH-Rasの活性化が、このv-CrkによるPI3Kの活性化に必須であることを示し、v-CrkのSH2、SH3両ドメインが如何にして協調しながら細胞を癌化させるシグナルを生み出すのかを分子レベルで初めて明らかにすることができた。c-CrkIIがRhoを活性化することを見出した。また、c-CrkIIが定量的にNIH3T3細胞をトランスフォームすることをはっきりと示し、トランスフォーミング活性がv-CrkだけにとどまらずCrkタンパクに共通の性質であることを明らかにした。(3)ショウジョウバエを用いたCrk及びCrk結合因子の遺伝学的解析ショウジョウバエにおいてCrkはthorax closureと呼ばれる発生過程で、PDGF/VEGFレセプターホモログからJNK pathwayへのシグナル伝達に関与していることを遺伝学的に初めて見出した。この過程にはCrkのSH3に直接結合するDock180と、その活性に必須な因子であるELMOが関与し、Racを介したJNK pathwayの活性化が起こることを明らかにした。(4)非受容体型チロシンキナーゼc-Ablの制御機構の解析c-Ablが、c-Srcやc-Crkなどのトランスに働くタンパクで活性の調節を受けることを示した。また、c-Abl遺伝子を欠失した細胞は、正常な細胞よりもSV40T抗原の発現により癌化しやすいという現象を見つけ、c-Ablが癌抑制遺伝子として機能し得ることを見出した。さらに、Abiがc-AblとMenaを結ぶアダプター蛋白として機能することを明らかにした。(5)ヒト正常繊維芽細胞が示す癌遺伝子に対する抵抗性の解析ヒト正常繊維芽細胞は、テロメラーゼの導入により不死化しても、なお、ラット正常繊維芽細胞に比べて活性化Ras+SV40T抗原の組み合わせによる癌化誘導に対して、より強い抵抗性を示すことを明らかにし、テロメラーゼの発現抑制以外の、ヒト細胞に特異的な、未知なる抗癌化機構が存在することが強く示唆された。v-Crkによる細胞のトランスフォーメーションにおいて下流の如何なるシグナルが重要なのかを明らかにするためにJNK、MAPK、PI3K/AKTの3つの経路を調べたところ、PI3K/AKTの系路のみがv-Crkでトランスフォームしている細胞で恒常的に活性化されていることがわかり、この系路がv-Crkによる細胞のトランスフォーメーションに非常に重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された(2)ショウジョウバエの系を用いたCrk.C3Gに関係する情報伝達系の解析Crkに結合するC3Gのショウジョウバエの相同タンパク質(DC3G)がMAPKとJNKを共に活性化することを既に見出していたが、遺伝学的な解析から、DC3GによるMAPKの活性化はRas1とRap1の両方を介している事を明らかにした。この事より、ショウジョウバエの生体内では哺乳動物の繊維芽細胞とは異なり、Rap1はMAPK活性化にH-Rasと協調的に働いている事がわかった。

一方、DC3GによるJNKの活性化はRas1やRas2ではなくRap1を介している事を示唆する結果を得た。さらに、ショウジョウバエに於いてもCrkによる情報伝達系が保存されている事を、Crkの相同遺伝子(DCrk)、Crkと直接あるいは間接的に相互作用する数種の因子(Paxillin等)の相同遺伝子のクローニングより確かめた。(3)非受容体型チロシンキナーゼの制御機構の解析キナーゼ活性のないc-Src変異体がc-Ablの活性を抑制することを見つけ、SrcのSH3ドメインがCblと結合することが、その作用に必須であることを明らかにした。また、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子であるBcr-Ablでは、このキナーゼ活性のないc-Src変異体による活性の抑制が起こらないこともわかった。v-Crkによる細胞のトランスフォーメーションにおいてP13K/AKT系路の活性化が非常に重要な役割を果たしており、さらにこの過程にFAKのチロシンリン酸化が深く関わっていることを明らかにした。(2)ショウジョウバエを用いたCrk及びCrk結合因子の遺伝学的解析CrkのSH3に強く結合するRASfamily small G proteinのGEFであるC3Gのショウジョウバエの相同タンパク質(DC3G)によるJNKの活性化は、そのC末端側のGEFドメインを欠いた分子でも起こることを新たに見つけた。(4)非受容体型チロシンキナーゼの制御機構の解析SV40ラージT抗原存在下でc-Abl欠損初代培養繊維芽細胞は軟寒天培地中でコロニーを作る能力(足場非依存性)を獲得することが判明し、c-Ablがtumor suppressor(癌抑制遺伝子)として機能し得ることを発見した。DNAマイクロアレイを用いて解析から、コラーゲンタイプ6やマトリクスメタロブロテアーゼ2(MMP2)等の細胞外基質の遺伝子群とそれを制御していると思われる転写因子Cbfa1/Runx2の発現の上昇が、この足場非依存性の獲得に関与している可能性が示唆された。1.Crk癌遺伝子による発癌機構の研究v-CrkによるPI3K/AKT経路の活性化の分子機構を解析し、v-CrkがSrc-family tyrosine kinaseの活性化を通してFocal Adhesion Kinaseのチロシンリン酸化を誘導し、そこにPI3K p85が会合することがこの経路の活性化に必須であることが分かった。2.ショウジョウバエを用いたCrk及びCrk結合因子の遺伝学的解析RNA干渉によりショウジョウバエDCrk、DC3Gの発現を抑制することで生じる表現型が、JNK pathwayのloss-of-function変異体のそれと一致することが分かった。更に、DC3GがJNK及びMAPK pathway以外の情報伝達系の活性化にも関わっている事を強く示唆する新たな表現型も明らかになった。CrkIIによるRhoAの活性化をGST-pull down法にて直接確認し、この活性化がCrkIIのSH2、SH3両ドメインに依存することがわかった。
紫外線照射と老化によって生じる皮膚のD-アミノ酸含有タンパク質の性質

【目的】生体を構成するタンパク質はすべてL-アミノ酸から構成されているが、我々は最近、老人の顔の皮膚に、異常アミノ酸であるD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が多量に蓄積していることを見いだした。そこで本研究では下記の項目について明らかにすること目的として研究を行った。(1)D-β-Asp含有タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて年齢の異なる皮膚、紫外線被爆部位と非被爆部位の皮膚、及び光線性角化症等の皮膚疾患の免疫組織染色を行い、D-β-Asp含有タンパク質と老化、紫外線被爆、皮膚疾患との関連について検討する。(2)皮膚のエラスチンはその配列に3残基のAspを含むので、その周辺配列と同一配列のペプチドを化学合成し、ラセミ化反応のキネテイックスを行う。(3)老人の顔の皮膚からD-β-Asp含有タンパク質を抽出し、プロテオーム解析によってその異常タンパク質を同定する。【結果と考察】(1)D-β-Asp含有タンパク質は加齢が進行するにつれてヒトの顔の皮膚の真皮層に蓄積することが明らかとなった。しかし、腹部などの太陽紫外線非被爆部位などでは老化した皮膚のタンパク質中でもAsp残基のD-β-Asp化は見られなかった。また、光線性角化症の皮膚ではタンパク質中のAsp残基の異性化の量は増加していることが判明した。これらの結果からD-β-Aspは皮膚の老化と紫外線照射の両者によって増加することが明らかとなった。(2)エラスチン合成ペプチドを用いたAspラセミ化反応のキネテイックスの結果からエラスチンに含まれるすべてのAsp残基は37°Cで50-100年(=ヒトの一生に対応)で十分にラセミ化しうるということが判明した。(3)ヒトの老化した皮膚では複数のタンパク質中でAsp残基の反転と異性化が生じており、これらのタンパク質は、エラスチンとkeratin 10である可能性が高いことが明らかとなった。皮膚の他のタンパク質にはAsp残基のD-β-異性体化が見られなかったことより、これらのタンパク質中ではこの様な反応が起こりやすい性質があるものと考えられた。目的:生体を構成するタンパク質はすべてL-アミノ酸から構成されているが、我々は、従来の研究で、眼の水晶体の主要構成成分であるαA-クリスタリン中に通常では見られないD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在し、その量は加齢に伴い増加することを見出した。さらにその生成機構について詳細に検討したところ、本反応はAsp残基の隣接残基が立体障害が小さいとき、また、そのAsp残基周辺の立体構造が反転の反応場を提供しているときに、容易に生じることを明らかにした。このことは老化組織にはD-β-Asp含有タンパク質が普遍的に存在することを示唆している。又、本反応は紫外線、放射線の照射によっても促進されることがわかったので、紫外線照射の影響が著しい皮膚においてD-β-Asp含有タンパク質が存在するか否かを検討することにした。方法と結果:ヒトαA-

クリスタリン中のD-β-Aspを含む前後数残基と同一配列からなるペプチドを3回繰り返したペプチド、peptide3R(Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr)を合成した。これを抗原としてこのペプチドを特異的に認識する抗体を調製した。また、本抗体がD-β-Aspのみを認識するかどうかを検討するため、lle-Gln-Thr-Gly-Leu-Asp-Ala-Thr-His-Ala-Glu-Argの配列でAspをL-α-Asp, L-β-Asp, D-α-Asp, D-β-Aspにした4種類の異性体ペプチドを合成し、本抗体との反応をELISAで確認した。その結果、本抗体はD-β-Asp含有ペプチドのみを特異的に認識することが明らかになった。そこで本抗体を用いて紫外線被爆の影響が直接的である顔の皮膚の免疫組織染色を行ったところ、老人の顔の皮膚に顕著にD-β-Asp含有タンパク質が認められた。又、幼児の顔の皮膚および、老人でも紫外線被爆の少ない、腹や胸にはD-β-Asp含有タンパク質は存在しなかった。これらの結果はタンパク質中でのD-β-Asp生成が老化と紫外線照射に密接な関連があることを強く示唆している。次いで、老人の顔の皮膚組織から抽出したタンパク質を2次元電気泳動にかけ、本抗体でwestern blotを行ったところ、分子量50KDaと70KDaめタンパク質がD-β-Aspを含むタンパク質であることが明らかとなった。現在、本タンパク質を同定中である。目的:生体を構成するタンパク質はすべてL-アミノ酸から構成されているが、我々は、従来の研究で、皮膚のタンパク質中に通常では見られないD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在し、その量は加齢に伴い増加することを見出した。さらに二次元電気泳動やWestern blotによって、皮膚のD-β-Asp含有タンパク質は分子量が約50kDaでエラスチンの抗体とも交叉反応を示すことが分かった。そこで、本年度はこのD-β-Asp含有タンパク質をエラスチンであると仮定した上で、エラスチン中に存在するAspの周辺と同一配列のペプチドを合成し、この合成ペプチド中におけるAspのラセミ化反応速度と活性化エネルギーを求めた。方法:エラスチンに存在するAsp周辺と同一配列のペプチド、1)GVADAAAA、2)REGDPSSS、3)AGADEGVRをそれぞれ合成した。これらの合成ペプチドを蒸留水に溶かし、50°C、60°C、70°C、80°C、90°Cで132日間保温した。各温度で、8日間ごとに各ペプチド中でのAspのD/L比を測定し、Aspのラセミ化反応速度定数を算出した。さらにこのラセミ化反応速度定数とArrheniusの式から、各ペプチド中でのAspがラセミ化反応する活性化エネルギーを算出し、ヒトの体温(37°C)においてAspのD/L比が1.0(0.99)に達するまでの時間を求めた。結果:合成ペプチド中のAspのラセミ化は、3)>2)>1)のペプチドの順で早く進行することが明らかとなった。活性化エネルギーはそれそれ約25,26,29k cal/molであった。またヒトの体温(37°C)において、エラスチン中に存在するAspのD/L比が1.0(0.99)に達する時間は約50年100年であることが分かり、ヒトの皮膚中のエラスチンでも同様にラセミ化反応が進行するとすれば、エラスチン中に存在するAspは一生の間に非常にラセミ化を起こしやすいということが明らかになった。
オオムギの統合的・革新的ゲノム機能解析

本研究は、コムギのオオムギ染色体断片系統とRHマッピング(radiation hybrid mapping)の手法を用いて、日本国内外で開発されているESTデータベースから得られるESTマーカーの物理的染色体地図を作成しようとするものである。この目的のために、本年度は、当初、オオムギ5H染色体の断片を有するパンコムギ系統のGISH (genomic in situ hybridization)法による二次選抜と系統確立までを目指したが、ESTデータの整備が急務であることが判明したので、以下のようにESTデータベースの整備を優先した研究を行った。1.GISHにより選抜された(一次選抜)構造変異5H染色体を有するパンコムギ約150系統の自家受精種子を得た。2.岡山大学資源生物科学研究所で開発されたESTマーカーの内、PCRによりオオムギでは増幅するがパンコムギでは増幅しない約1400のESTについて、岡山大学からPCRプライマーを分譲していただいた。3.これらのプライマーを用いてオオムギ染色体添加系統の全てについてPCR分析を行い、約700のESTについて、座乗するオオムギの染色体を確定することに成功した。5H染色体には108のESTマーカーが座乗していた。4.座乗染色体が決定したESTのマッピングと解析を行う前に、オオムギ380,000ESTデータベースを解析し、ESTクラスタリングを行い、ESTの重複を除いた。この作業には、京都大学化学研究所のスーパーコンピュータを利用させていただいた。5.このESTクラスタリングの後、現在、これらを各種の代謝経路に当てはめる研究を遂行中である。これにより特定の代謝経路に関与する遺伝子(EST)が物理的に染色体上配置されているかが明かになることが期待される。
自己調整過程についての社会心理生理学的検討

自己調整資源の枯渇の影響を扱った従来の研究は,その多くが実験的な操作によって枯渇の水準を設定し,その後の課題遂行量を測定することで枯渇の影響を捉えようとするものであった。このようなアプローチでは,実際には枯渇の程度が測定されてはいない点,そして枯渇の短期的な影響しか扱えていない点で,必ずしも十分な検討が行われてきたとは言えない。本研究課題では,これらの問題を克服するため,生理的な指標を用いて枯渇の程度を測定すること,そして,枯渇の長期的な影響を把握することを目指した。3年の助成期間の最終年度である本年度は,まず,昨年度までの成果を,本年3月に刊行した「排斥と受容の行動科学-社会と心が作り出す孤立」(サイエンス社)において報告した。具体的には,特性的な自尊心の社会的痛みの緩和機能についてfMRIを用いて行われた実験の結果が報告された。また,昨年度の研究において,生理的な指標を用いて確認された,ハイメインテナンスな活動が自己調整資源の枯渇に及ぼす影響に関して,今年度は社会心理学的な指標を用いてその長期的な影響過程を検討した。そのテーマは,ハイメインテナンスな相互作用が自己調整資源の枯渇を招く結果として自己確証的な傾向を高める可能性を検討するものであった。具体的には,質問紙調査によって,刑法犯の容疑者に対する規範的な判断に及ぼす,公正なる世界観と自己調整資源の枯渇ならびに制度への信頼感の影響について検討した。分析の結果は,ハイメインテナンス相互作用によって自己調整資源が枯渇した者は,社会制度への信頼が低いほど自らの公正なる世界観を規範的判断に反映させやすくなることを示していた。本研究課題によって得られた一連の結果は,自らの欲求を抑えて環境からの要請に合わせるという行動パターンが自己調整資源を枯渇させる可能性が,脳電位というマイクロレベルの指標においても,規範的判断における自己確証バイアスというメゾ-マクロレベルの指標においても認められることを示した。またfMRIを用いた検討の結果は,自己調整資源の枯渇が特性的自尊心によって緩和される可能性を示唆するものである。自己調整過程とは,自分の目標や理想に対して自己の行為・状態を評価し,基準に達しようとする過程である。自己調整を行うためには意識的な制御処理が必要であり,そこには有限である処理資源(調整資源)が使われる。先行研究から,この資源を一度使うとすぐには回復せず,資源が枯渇した状態では自己調整に失敗することが示されている。本研究では,従来から用いられてきた質問紙・行動測度に加え,脳の電気活動(脳波の一種である事象関連電位)を測定することにより,このような自己調整過程の神経基盤の解明とそれに基づく理論枠組みの精緻化を目指す。本年度は,社会的認知の研究において多用される"内的な認知資源"という説明概念を定量的に測定する方法の開発に焦点をあてた。実際の研究に先立ち,従来の社会的認知の分野で使われてきた構成概念と認知心理学・認知神経科学の分野で使われてきた構成概念が微妙にずれていることが明らかになった。そこで,数回の研究会を通じて,概念の整理と研究課題の明確化を行った。その結果,(1)調整資源は,タイムシェアリング研究で想定されている注意資源とは異なり,疲労に似た性質を持っており,時間的な変化をおさえることが重要であること,(2)調整資源の容量には個人差がありそうなので,調整資源を測る指標の妥当性を確認するには,調整資源を実験的に枯渇させたのち,回復させるという参加者内デザインで検討するのが適していることが明らかになった。そのため,調整資源を枯渇させる実験操作だけでなく,調整資源を回復させる実験操作をみつける必要がある。現在は,この作業仮説に従い,反応時間・誤反応率を測定する行動実験を計画しており,次年度以降,事象関連電位の実験につなげていく予定である。社会心理生理学的な観点から自己調整か諦観する2つの研究を行った。まず脳の電位変化(event-related Potential : ERP)を指標として自己調整過程について検討した。具体的には、自己調整資源の減損の程度がERPに反映されるかを検討した。実験操作として,ダウンロード時間が長いブラウザを用いてネットサーフィンを行わせた。自分の欲求を抑えてコンピュータのペースにあわせる」という作業は,自己調整資源を減損させると考えられる。ERPの測定にはGo/Nogo課題を用いた。画面上に2つの刺激(0かX)がランダムな順序で1秒に1回ずつ呈示し,一方の刺激にのみできるだけ速くボタンを押すように参加者に求めた。自己調整資源が減損しているときは反応抑制機能が低下し,この課題における行動成績の低下がみられると予想される。Go/Nogo課題を用いた先行研究と同様,Go刺激にはP3,Nogo刺激にはNogo N2とP3が惹起されることが確かめられた。次に、社会的な排斥を受けたときの自己調整資源としての自尊心の働きについて、fMRIを用いた実験を行った。サイバーボール課題中に排斥を受けた場合の脳活動と個人の特性的自尊心との関連を分析した。排斥時の前部帯状回腹側部(vACC)の活性の程度と特性的自尊心得点との間に有意な負の相関が認められた。また排斥時に感じる主観的なディストレスと特性自尊心得点との間にも有意な負の相関が認められた。

前部帯状回腹側部の活性は情動的な不快さを反映するものであると考えられることから、特性的な自尊心は社会的な排斥による心理的な痛みを緩和することを通じて自己調整資源の減損を抑制する機能を持つ可能性が示唆される。自己調整資源の枯渇の影響を扱った従来の研究は,その多くが実験的な操作によって枯渇の水準を設定し,その後の課題遂行量を測定することで枯渇の影響を捉えようとするものであった。このようなアプローチでは,実際には枯渇の程度が測定されてはいない点,そして枯渇の短期的な影響しか扱えていない点で,必ずしも十分な検討が行われてきたとは言えない。本研究課題では,これらの問題を克服するため,生理的な指標を用いて枯渇の程度を測定すること,そして,枯渇の長期的な影響を把握することを目指した。3年の助成期間の最終年度である本年度は,まず,昨年度までの成果を,本年3月に刊行した「排斥と受容の行動科学-社会と心が作り出す孤立」(サイエンス社)において報告した。具体的には,特性的な自尊心の社会的痛みの緩和機能についてfMRIを用いて行われた実験の結果が報告された。また,昨年度の研究において,生理的な指標を用いて確認された,ハイメインテナンスな活動が自己調整資源の枯渇に及ぼす影響に関して,今年度は社会心理学的な指標を用いてその長期的な影響過程を検討した。そのテーマは,ハイメインテナンスな相互作用が自己調整資源の枯渇を招く結果として自己確証的な傾向を高める可能性を検討するものであった。具体的には,質問紙調査によって,刑法犯の容疑者に対する規範的な判断に及ぼす,公正なる世界観と自己調整資源の枯渇ならびに制度への信頼感の影響について検討した。分析の結果は,ハイメインテナンス相互作用によって自己調整資源が枯渇した者は,社会制度への信頼が低いほど自らの公正なる世界観を規範的判断に反映させやすくなることを示していた。本研究課題によって得られた一連の結果は,自らの欲求を抑えて環境からの要請に合わせるという行動パターンが自己調整資源を枯渇させる可能性が,脳電位というマイクロレベルの指標においても,規範的判断における自己確証バイアスというメゾ-マクロレベルの指標においても認められることを示した。またfMRIを用いた検討の結果は,自己調整資源の枯渇が特性的自尊心によって緩和される可能性を示唆するものである。
生産者支持推定量によるアジア途上国農業政策分析

OECDが開発したPSE(生産者支持推定量)手法を、インド、タイなどアジア6カ国に当てはめ、最近20年の農業保護政策の変容を数量的に分析した。推定結果から、(1)これら諸国の生産者保護水準は低く、台湾を除き+-10%程度に収まる、(2)先進国と異なり保護が負になることも多い。(3)90年代の財政危機による為替変動と2008年の国際価格高騰が水準に影響。(4)政策としては価格支持政策が最も大きな影響を与えているが、市場には中立的。(5)タイやインドなどでは、生産者への直接移転より一般公的サービスによる農業部門の支援が大きい。(6)予想された農業課税から農業保護への移行、あるいはWTOなどの農政改革への影響は明確には認められなかった。H20年度(初年度)は、本研究遂行のために必要な研究の枠組みの確定と、定量分析手段の改良とテスト、および主要国の農業農政の予備的調査を行った。予備調査の結果の一部は、年度末の日本農業経済学会で報告した。具体的な活動とその主な成果は次のとおり。1.アジア生産性機構と合同での専門家会合(H20年7月):OECD事務局や主要国農政担当者・研究者等を交えて研究の枠組みや分析方法、最近のアジア諸国の農業政策動向の検討を行った。その結果、インド、パキスタン、タイ、マレーシア、インドネシア、台湾が研究協力者として加わることになった。また、約50のリンクされた表からなる農業生産者支持量(PSE)計測のための標準スプレッドシート・テンプレートを作成・提案した。2.テンプレートのテストと改善:国別専門家と共同でテストランを試み、アジア途上国の実情に合う形に改善を図った。すなわち政策別支出細目の整理とグループ化、飼料の間接的影響(excess feed cost)割愛、派生的変量計算の自動化などを行った。また、牛乳や砂糖など生産と貿易段階で産物の形態が異なる品目の内外価格差計算にも応用ができるよう拡張を図った。3.主要国農政動向の情報収集と分析:H20年9月にパキスタンとタイ、11月にインドネシアを訪問し、またH21年1月と3月にはインド、タイ、台湾の協力専門家を招いて、農業・農政の動向についてデータ・情報の収集を行うと共に、各国のPSE試算の問題個所の修正と簡易診断、試算数値結果の解釈の検討などを行った。4.今年度の成果:ア)実用的な途上国向けPSE計算標準テンプレートがほぼ完成した、イ)アジア諸国の農政改革が想像以上に進んでいる、ウ)多くの国で何らかの価格支持政策が採用されているが保護の程度には国別品目別に大きなばらつきがある、エ)ASEAN諸国では為替レートの影響が大きく出る、などが判明した。H21年度は、本研究の2年月として、研究参加6カ国(インド、パキスタン、タイ、マレーシア、インドネシア、台湾)の6カ国の担当者とともに国別PSEの具体的推定に取り掛かった。その際、内外価格差推定に関連する各国特有の諸問題を一つ一つ整理するとともに、最新データ(2008年)の取り込み、検証を行った。平成21年1月には、国際機関APOと共同で、関係者による中間発表会を開催し、最終報告作成に向けての問題点の整理と、総合報告のアウトラインを決定した。具体的な活動とその成果は、次のとおり。1.国別PSEの第1次推定:参加6カ国について、前年度に開発したPSE標準テンプレートを用いて、1990-2006までの国別、品目別PSE,CSE,TSEの第1次推定を行った。データのそろっているインド、インドネシア、台湾については、PSEの水準及びその変化方向について政策動向と整合的な推定結果が得られた。すなわち、農業保護における価格支持の比重が依然高いこと、国際市場動向や為替変動とPSE水準が相互に打ち消しあうように動くこと、全体としては緩やかに改革の方向に進みつつあることなどが確認された。2.パキスタン、タイ、マレーシアのPSE推定:データの不備などで、説明しがたいPSEの変動が観察され、データの正確さの吟味、内外価格差推定方式の検証などが必要と感じられた。今後穀物や畜産物など主要品目についてより良い価格・コストデータへの置き換えや、コメなど一物二価となっているケースの内外価格差の分離推定による補完が不可欠である。3.技術係数等の吟味:各国のPSE試算から、内外価格差推定に用いられる、2つの技術係数、すなわち重量感算係数と品質調整係数が、PSEの水準に大きく影響することが判明した。特に、生産者段階とで商品の性質ゆ形態が異なる、畜産物、サトウキビ、ゴム、タバコなどでこの傾向が著しい。

今後さらに感応度テストを行うとともに、技術専門家や市場関係者による検証を進めたい。4.APOとの合同会議:平成22年1月19-20の両日、東京のAPO本部で、6カ国の国別研究者と、OECD及びタイからPSE推定の専門家(OECD農業局レッグ課長、タイ・カセサート大学ブンジット教授)も交えて中間発表会合を開催した。その結果、1990年以降貿易の自由化や農政改革が行われてきたとされるアジア途上国において、(1)まだデカップリング進んでいない、(2)農業生産者支持水準が経年的に低くなる傾向は認められない、(3)支持水準は為替や国際価格の変動に応じて大きく揺れ動く、(4)一部諸国では、マイナスの支持になる時期がある、ことなどが明らかになった。これら中間結果は、方法論とデーターの再吟味を行ったうえ、来年度に統合して報告書とすることになった。5.九州大学アジア総合センター紀要への投稿:本年度の中間成果は、2010年3月に発行の、紀要に投稿し、採択、掲載された。本年度(22年度、最終年)は、これまで行ってきた、インド、パキスタン、タイ、マレーシア、インドネシア、台湾の6カ国について、最近の農業政策動向についての国別報告を取りまとめるとともに、それぞれの国について計測した生産者支持推定量の相互比較検討を行い、計測手法の統一やデータの修正・アップデートを行って、最終的な統合推定表を策定した。これらの統合推定表から得られる、各国のPSE(生産者支持推定量)、CSE(消費者支持推定量)、GSSE(一般サービス推定量)、TSE(全体支持推定量)、NPC(名目生産者保護係数)の推移及びその政策タイプ別構成の変化を計量的に分析した結果、これらアジア主要国の農業政策について次のような知見が得られた。(1)これら諸国の生産者支持水準は低く、台湾を除きプラス・マイナス10%程度に収まる、(2)先進国と異なり、生産者への移転が負になることも多い。(3)90年代のアジア危機による為替変動と2008年の国際価格高騰が水準に影響。(4)価格支持政策が最も大きな影響を与えているが支持価格水準が国際価格とあまりかい離していないため、マーケットには中立的。(5)肥料・電気料など投入補助金も多く、負の価格支持を相殺する形になるケースが多い。これらの成果の概要(暫定)は、H22年11月末OECD本部で開催された世界農業フォーラムで発表した。またH23年2月には主要執筆者を招いて明治大学でワークショップを開催し、最終的検討と成果の公表を行った。なお、主要成果は本研究のパートナーであるアジア生産性機構から、近日中に英文で発表する予定である。
代数的手法による数理科学の研究

本研究の主旨に従って次の研究会を組織ないし支援した.(1)代数幾何学シンポジウム(1991.10.1-4,京都大学理学部)(2)不変式論の新しい流れ(1991.12.16-18,大阪大学理学部)(3)現象としての双対性(1992.8.4-6,函館市)(4)量子群とその周辺(1992.10.3-5,名古屋大学理学部)(5)代数群の表現(1992.10.29-31,東北大学理学部)詳細は別冊「研究成果報告書」に譲る.ここでは,成果の要点のみを述べる.(1)においては,最近数理物理学でも注目を引いている,ベクトル束のモジュライの構造に関する成果の報告が中心的な話題であった.(2)は代表者および分担者が自ら組織したもので,古典代数学の中心テーマの一つである不変式論が,現代の解析学・数理物理学まで込めてどのような役割を果しているか綜合を試みた研究会である.超幾何型微分方程式,量子群の表現,共形場の構成等の話題で盛り上りを見せた.(3)は,数学の各分野のアクティブを集めて,数学を貫く「双対性」という概念を軸に数学の今後を掘り下げようという,稀有な研究会である.数論から物理までを横断して,雄大な議論が展開された.成果は近々論集として別途出版の予定である.(4)は,量子群と物理学をめぐる最新の話題を中心にした研究会で,報告集作成を援助した.(5)は,伝統的な表現論の最新の問題を論じた研究会である.3人の外国人研究者を交えて,小規模ながら技術的詳細まで込めた発表討論が行われた.若手研究者に良い刺激を与えた企画であった.本研究の主旨に従って次の研究会を組織ないし支援した.(1)代数幾何学シンポジウム(1991.10.1-4,京都大学理学部)(2)不変式論の新しい流れ(1991.12.16-18,大阪大学理学部)(3)現象としての双対性(1992.8.4-6,函館市)(4)量子群とその周辺(1992.10.3-5,名古屋大学理学部)(5)代数群の表現(1992.10.29-31,東北大学理学部)詳細は別冊「研究成果報告書」に譲る.ここでは,成果の要点のみを述べる.(1)においては,最近数理物理学でも注目を引いている,ベクトル束のモジュライの構造に関する成果の報告が中心的な話題であった.(2)は代表者および分担者が自ら組織したもので,古典代数学の中心テーマの一つである不変式論が,現代の解析学・数理物理学まで込めてどのような役割を果しているか綜合を試みた研究会である.超幾何型微分方程式,量子群の表現,共形場の構成等の話題で盛り上りを見せた.(3)は,数学の各分野のアクティブを集めて,数学を貫く「双対性」という概念を軸に数学の今後を掘り下げようという,稀有な研究会である.数論から物理までを横断して,雄大な議論が展開された.成果は近々論集として別途出版の予定である.(4)は,量子群と物理学をめぐる最新の話題を中心にした研究会で,報告集作成を援助した.(5)は,伝統的な表現論の最新の問題を論じた研究会である.3人の外国人研究者を交えて,小規模ながら技術的詳細まで込めた発表討論が行われた.若手研究者に良い刺激を与えた企画であった.数理物理学・情報科学を始めとして,およそ数学的思考が有効であるすべての分野に代数的手法はますます急速に浸透しつつある。それと同時に,古典代数学の内容が見直され,その豊かな遺産が新しい装いをまとって再現してきている。不変式論におけるCapelli恒等式の9アナログ(日比・若山・梅田・野海による)等に象徴されるその流れを集大成しようと,1991年12月16日18日の3日間,大阪大学理学部においてシンポジウムを開催した(世話人:川中宣明・谷崎俊之)。「不変式論における新しい流れ」と題したこの集会は,当初の予想を遥かに越えた約100人近くの参加者を集めた。この成功は狭い意味の代数学に留らぬ広い,しかし古典に根ざした深いテ-マが多くの興味をそそったものと思われる。発表および議論された成果は次のように大別される。1.不変式論における古典的アイデアの現代的再生(梅田・若山・行者)。2.9アナログの発展(若山・三町・野海)。3.数理物理学における代数系(黒木・塚田・小須田)。4.D加群の応用と現状(関口・堀田)。今年度は予算の制限上,これらの集成の報告集は作成出来なかったが,次年度の計画において,これらの発展を含む形で成果をまとめる予定である。さらに,1991年10月1日4日に京大数理研で行われた「代数幾何学シンポジウム」の主要講演者の数人に旅費の補助を行った。主にベクトル束の幾何を主題にしたこの集会の成果は,まもなく数理解析研講究録として出版される予定である。本年度の主な成果は,次の2つのシンポジウムに集約される.(1)現象としての双対性(1992.8.4-6,函館市)(2)代数群の表現(1992.10.29-31,東北大学理学部)

(1)の研究会では,数学のすべての分野を貫いて,主軸の如く出現する「双対性」という概念をめぐって,各分野の活動的な研究者に講演をお願いし,掘り下げた討論を行った。詳しくは別冊子「研究成果報告集」を参照されたいが、数論におけるゼータ関数等の関数等式が現象する双対性と,物理学における場の理論の中核をなす概念との共通性が指摘されたことが著しい。これは,未だ理論化されていない巨大な群の表現論を期待させるものである。詳細な論説集が別途出版の予定である。(2)の研究会では,伝統的な表現論の最近の成果と今後の問題が中心課題であった。丁度来日中の3人の外国人,H.H.Andersen,D.N.Verma,時儉益の講演に加えて,この分野で活動的な我国の中堅研究者達によって,各種の成果が発表された。特に,代数群のモジュラー表現と量子群の結がり,指標層と指標サイクルに関する新しい成果,Verma加群に付随するb関数の詳しい結果が著しい。上記以外にも,名古屋大学における研究会「量子群とその周辺」(1992.10.3-5)の成果報告集の作成に資金援助した。トレンドであるこの分野の最新成果を収めた本冊子は,多くの研究者にとって有益なものであると信ずる。
昆虫の保有する共生器官－菌細胞塊の発生過程および特異的に発現する遺伝子群の解析

昆虫類は微生物との高度な共生関係をむすぶことにより新たな生物機能を獲得し、さまざまな環境や食物資源に適応していることがわかっている。そのような昆虫種の体内には共生微生物の維持のための特殊な共生器官が進化していることが知られている。中でも、昆虫の細胞内に共生細菌を維持する共生器官-「菌細胞塊」の分化・形成ついてはこれまで古典的な記載研究は行われていたものの、分子発生学的な解析が進んでおらず、その遺伝的基盤や発生学的な起源は未解明である。そこで本研究では、主にヒメナガカメムシの菌細胞塊を対象に、菌細胞塊に発現する遺伝子群を網羅的に解析する同時に、発生学的な解析を行うことで、昆虫類における共生器官の遺伝的基盤と進化発生学的な起源を解明することを目指した。本年度は、これまで取得した器官・形態形成を制御する転写因子群について、ヒメナガカメムシの共生器官形成に対する影響を検証するため、Dll、Ubx、abd-AについてRNAiによる発現抑制解析を行ったところ、胚発生時の菌細胞塊形成に顕著な影響がみられ、正常な菌細胞塊の形成が阻害された。さらに、in situハイブリダイゼーションの結果、菌細胞塊に特異的な発現を示す遺伝子が明らかとなり、その遺伝子が菌細胞塊形成の制御に関わることが示唆されだ。また、次世代シークエンサーで取得したヒメナガカメムシ成虫の菌細胞塊と中腸に由来する配列データのアセンブルおよび相同性、発現解析を行ったところ、上述の転写因子は成虫の菌細胞塊にも特異的に発現していることが明らかとなった。これらの成果は昆虫類の共生器官形成に関するきわめて新規性の高い知見であり、今後の当該分野の研究発展が期待される。加えて、ヒメナガカメムシ類の組織より検出された新規任意共生細菌について、他のカメムシ類195種への感染を調査したのち、微生物学的同定を行いこの細菌の暫定学名を提唱した。本研究は、昆虫が有する共生器官である菌細胞塊の形成・維持に関わる遺伝的・発生学的基盤を解明するため、菌細胞塊に特異的に発現する遺伝子群を網羅的に解析し、それらの機能を同定するとともに、菌細胞塊の発生過程を詳細に解析することにより、菌細胞塊の進化的起源に迫ることを目指す。初年度は主にヒメナガカメムシ類を対象として飼育系統の維持、共生細菌の同定と感染局在の解析、そして遺伝子取得・解析法の確立に取り組んだ。まず、ヒメナガカメムシ類を各地から採集し、人工気象器内で植物種子を餌として飼育、維持することに成功した。ついで菌細胞塊から16S rRNA遺伝子を取得し、共生細菌叢の解析を行ったところ、主に1種の共生細菌を発見した。分子系統学的解析によりこの共生細菌は腸内細菌科に属しており、wFISH法・透過電顕観察によって菌細胞塊と卵巣細胞内に感染していることが確認された。さらに抗生物質処理により、共生細菌が除去されると宿主卵は正常に艀化しないことから、宿主にとって共生細菌は必須であることがわかった。ここまでの成果はヒメナガカメムシ類の共生系に関する重要な基礎的情報である。次に、菌細胞塊に発現する遺伝子の網羅的取得のためヒメナガカメムシ類の菌細胞塊と腸管からRNAを抽出し、SMART法によりcDNAライブラリを作製した。一方で、ヒメナガカメムシ類を用いて、遺伝子の機能解析のためのRNAi法を検討した。昆虫のクチクラ着色に必要なlaccase2遺伝子をクローニングし、その配列を標的にしてdsRNAを注射すると、羽化後に着色が阻害されRNAiの効果を確認できた。実験条件の最適化を行い、母性効果があることも確認した。これによって、菌細胞塊に発現する遺伝子の機能解析が可能となった。菌細胞塊の発生経路については、卵から卵殻を除去し、胚発生の過程と菌細胞塊の発達に着目して観察した。本年度達成されたこれらの成果および取り組みは、今後の研究においての発展性を十分に保証している。本研究は、昆虫が有する共生器官-菌細胞塊の形成・維持に関わる遺伝的・発生学的基盤を解明するため、菌細胞塊に特異的に発現する遺伝子群を網羅的に解析し、それらの機能を同定するとともに、菌細胞塊の発生過程を詳細に解析することにより、菌細胞塊の進化的起源に迫ることを目指す。昨年度から取り組んでいた菌細胞塊と中腸のcDNAライブラリの作製および遺伝子配列の取得は、中腸においてのみ順調に作業が進行したが、菌細胞塊由来のライブラリは大腸菌の生育を妨げる何らかの因子により遺伝子配列の取得が難航した。そこで本年度半ばより、基礎生物学研究所の重信秀治氏の協力のもと、イルミナ社の次世代シークエンサーHiSeq2000によるRNA-seq、つまり大腸菌を介さない大規模な遺伝子発現の解析を行った。結果、ヒメナガカメムシの菌細胞塊と中腸より合計リード約1.61億(各100塩基)の塩基配列データを取得することに成功した。現在、配列のアセンブルおよびBLASTによる相同性解析を行っている。予備的な解析結果では、菌細胞塊に多く発現するいくつかの候補遺伝子が得られている。さらに今回得られた大量の遺伝子配列は、本研究に留まらず将来的に有益な遺伝子情報源となる可能性がある。一方で、昆虫の発生を制御する複数の重要な転写因子群について、菌細胞塊形成への関与を検証するためヒメナガカメムシとその他カメムシ種より、PCRおよびサブクローニングを行い、D11,Lab,pb,Dfd,Antp,Ubx,Abd-A,zenの部分配列を得た。

次に、ヒメナガカメムシとウスイロヒラタナガカメムシの卵を経時観察し、それぞれの胚発生過程を明らかにし、蛍光in situハイブリダイゼーション法により共生細菌の挙動および菌細胞塊形成の部位と時期を明らかにした。結果、ヒメナガカメムシの菌細胞塊の形成過程は半翅類昆虫においてかなり特殊であることが判明した。また、今後の遺伝子発現解析の実験において注目すべき部位と時期が明確となった。昆虫類は微生物との高度な共生関係をむすぶことにより新たな生物機能を獲得し、さまざまな環境や食物資源に適応していることがわかっている。そのような昆虫種の体内には共生微生物の維持のための特殊な共生器官が進化していることが知られている。中でも、昆虫の細胞内に共生細菌を維持する共生器官-「菌細胞塊」の分化・形成ついてはこれまで古典的な記載研究は行われていたものの、分子発生学的な解析が進んでおらず、その遺伝的基盤や発生学的な起源は未解明である。そこで本研究では、主にヒメナガカメムシの菌細胞塊を対象に、菌細胞塊に発現する遺伝子群を網羅的に解析する同時に、発生学的な解析を行うことで、昆虫類における共生器官の遺伝的基盤と進化発生学的な起源を解明することを目指した。本年度は、これまで取得した器官・形態形成を制御する転写因子群について、ヒメナガカメムシの共生器官形成に対する影響を検証するため、Dll、Ubx、abd-AについてRNAiによる発現抑制解析を行ったところ、胚発生時の菌細胞塊形成に顕著な影響がみられ、正常な菌細胞塊の形成が阻害された。さらに、in situハイブリダイゼーションの結果、菌細胞塊に特異的な発現を示す遺伝子が明らかとなり、その遺伝子が菌細胞塊形成の制御に関わることが示唆されだ。また、次世代シークエンサーで取得したヒメナガカメムシ成虫の菌細胞塊と中腸に由来する配列データのアセンブルおよび相同性、発現解析を行ったところ、上述の転写因子は成虫の菌細胞塊にも特異的に発現していることが明らかとなった。これらの成果は昆虫類の共生器官形成に関するきわめて新規性の高い知見であり、今後の当該分野の研究発展が期待される。加えて、ヒメナガカメムシ類の組織より検出された新規任意共生細菌について、他のカメムシ類195種への感染を調査したのち、微生物学的同定を行いこの細菌の暫定学名を提唱した。ヒメナガカメムシにおける菌細胞塊由来遺伝子配列の取得実験が難航したこと、また、東日本大震災により、所属する研究所の上下水道管の破損による使用制限、立ち入り制限、節電による実験設備の使用制限、飼育生物系統の喪失などの実験を妨げる事態が発生し、H23年3月から8月末まであまり研究が進捗しなかった。そのため、当初の実験計画より遅れている。本研究では今後、主にヒメナガカメムシに絞って、これまでに取得した遺伝子群の発現解析および機能解析を遂行する。当初の実験計画ではヒメナガカメムシ以外にも、他のカメムシ類、カイガラムシ類、セミ類を用いて、胚発生過程における菌細胞塊の形成を観察、種間比較するとともに、菌細胞塊に発現する遺伝子配列の取得および機能解析を行う予定であったが、全体の進捗が遅れていることを鑑みて、ヒメナガカメムシ以外では数種のカメムシ類に限定して研究を行うこととする。このように対象種を限定することで、研究の幅は狭くなるが、最終目的は同一であることから、本研究の本質的な意義が損なわれることはない。
脳老化と神経変性疾患発症の分子機構の解明

インスリン様シグナルの主要調節因子であるIRS2は中脳ドーパミン(DA)神経細胞に発現していることから、IRS2の欠損がDA神経細胞に与える影響を解析する事を通じ、パーキンソン病態を導くマシーナリーを理解する事を目的として、申請書に記載した項目について研究を行い、以下の成果が得られた。1.DA神経細胞変性に与える影響:DA神経細胞マーカー(TH)抗体を用いた免疫組織学的解析から、中脳黒質線条体DA神経細胞変成誘導薬MPTP投与の老齢脳特異的IRS2欠損(変異)マウスの中脳黒質線条体ではDA神経細胞死が有意に抑制されることが判り、DA神経細胞内IRS2の欠失は神経保護作用を有することが示唆された。2.ドーパミン代謝経路の変化についての解析:MPTP投与後の老齢変異マウス脳内のドーパミンとその代謝産物をHPLC法によって測定し、ドーパミン代謝率はDA神経細胞死が抑制された老齢変異マウスで高いことが判った。この結果から、IRS2はドーパミン代謝経路にも直接関与する可能性が示された。3.酸化ストレスについての解析:蛍光プローブ法、ELISA法により、老齢変異マウスの脳内活性酸素種(ROS)および尿中酸化ストレスマーカー(8-OHdG)を測定した結果、ROSの値に変化は見られなかったが、尿中の8-OHdGは低下しており、脳IRS2の欠損が体系的酸化ストレスレベルに影響を与えることが示唆された。4.脳内エネルギー動態についての解析:老齢変異マウス脳内のATPおよびミトコンドリア転写因子A (TFAM)を蛍光プローブ法、定量PCR法を用いて解析を行い、ATP及びTFAMのレベルは有意では無いものの、増加傾向にあることが判った。一方、若齢変異マウス脳内のTFAMのレベルは顕著に増加しており、脳IRS2の欠損が発生前期におけるTFAMの発現に影響を与える可能性が示された。25年度が最終年度であるため、記入しない。脳老化と神経変性疾患発症の分子機構の解明を目指して交付申請書に記載した本年度の項目について研究を行う予定であったが、項目中の最重要実験である薬物投与実験が使用施設の改修工事のため遅延したため、この実験に必要な研究費分(1000000円)の繰越し手続きを行った。当初の計画より遅れることとなったが、当該実験を行い以下の成果が得られた。1)脳IRS2の欠損が神経細胞変性に与える影響:インスリン様シグナルの主要調節因子IRS2の脳における欠損がドーパミン(DA)神経細胞に与える影響について解析を行った。DA神経細胞マーカー(TH)に対する抗体と抗IRS2抗体を用いた二重免疫染色により、IRS2が中脳黒質線条体DA神経細胞に発現することを確認した。さらに、22ヶ月齢の脳特異的IRS2欠損(変異)および同齢対照マウスに対して中脳黒質線条体DA神経細胞変成誘導薬MPTPを投与し、DA神経細胞死を誘発させた後、抗TH抗体を用いた免疫組織学的解析を行い、老齢変異マウスのDA神経細胞死は有意に抑制されることが判った。これらの結果から、DA神経細胞内IRS2の欠失は神経保護作用を有することが示唆された。2)酸化ストレスとエネルギー動態についての解析:神経保護作用を有する細胞内ATPやミトコンドリア転写因子A (TFAM)と酸化ストレスのマーカーである活性酸素(ROS)レベルを蛍光法及び定量PCR法によりそれぞれ測定した。老齢脳IRS2欠損マウス脳内ATPレベル及びTFAPの発現は同齢コントロール群に比べ増加傾向にあったがROSの値に差は見られなかった。