hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重金属類による免疫応答攪乱作用に関する研究

IL-8はがん細胞の増殖や血管新生を促進することが知られており、ヒ素とIL-8との関係をさらに検討する必要がある。2.バングラデシュのヒ素汚染地域で採取した血液試料中の炎症性タンパク質(CRP, S100A8/A9)とヒ素の曝露レベルとの相関を調べた結果、ヒ素の曝露レベルとCRPに有意な相関が認められた。今後、サイトカインレベルについて検討する必要がある。3.昨年度の検討により、神経細胞SH-SY5Y細胞にIL-6を作用させると、ZIP8、ZIP14などの金属輸送体の発現が上昇し、マンガンの蓄積が促進されることを明らかにした。本年度は、IL-1β、TNF-αでも同様の発現誘導が起こることを確認した。また、神経細胞以外の細胞においても同様の現象が観察されるか検討したところ、消化管や肝臓、腎臓由来細胞においてもサイトカインによるZIP8, ZIP14の発現誘導が認められた。今後、炎症反応によって金属の体内動態が変化する際、金属輸送体の発現変化がどのように関与しているか、動物レベルでの実験が必要と考えられる。初年度の研究で、アレルギーに関与するマスト細胞、感染免疫に関与するマクロファージ、2年目の研究で腫瘍免疫に関与するナチュラルキラー細胞を用いた実験を行い、いずれの免疫担当細胞の機能に対してもヒ素が抑制的な影響を示すことを見出した。初年度にはマンガンとIL-6との相互作用について十分に解明できなかったが、2年目の研究で神経細胞においては明らかに両者が相互作用を示すことを見出した。人体試料については、バングラデシュのみならず、カンボジアのヒ素汚染地域からも収集することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ヒ素が免疫能に及ぼす影響について、これまでマスト細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞での検討を行った。これに加えてT細胞の機能に対する影響を検討する予定である。また、複数の免疫担当細胞の間でのクロストークについても検討する予定である。ここまでの研究はすべて培養細胞を用いた研究であり、これらの結果を踏まえて、今後は動物実験も行う必要がある。しかし、この研究期間内に動物実験が可能かどうかは研究の進行状況に依存する。ヒト人体試料について、当初はバングラデシュのヒ素汚染地域のみを予定していたが、カンボジアのヒ素汚染地域からも試料収集が可能となったので、2年目の研究ではカンボジアの試料収集も行った。バングラデシュとカンボジアでは食習慣、ヒ素の汚染レベルなど様々な相違があるので、これらの影響についても検討する必要性が生じた。
大規模リン酸化プロテオーム解析による大腸癌の早期診断バイオマーカー探索

多検体の手術組織標本のタンパク質リン酸化プロファイルをプロテオミクス手法(Phospho-iTRAQ法)を用いて比較し、大腸癌で特異的に変動しているタンパク質リン酸化修飾を200種類以上同定した。さらに、癌特異的リン酸化修飾変動をハイスループットに検証する方法(Phospho-SI-SRM法)を確立した。これらの技術とバイオインフォマティクス解析を駆使して、大腸癌のリン酸化バイオマーカー候補と新規の大腸癌関連タンパク質を発見した。大腸癌は進行すると予後不良であるため、早期診断や再発モニタリングを可能にする血中バイオマーカーが必要である。タンパク質リン酸化シグナルの異常は癌の原因となりうるため、その異常を早期に検出する事は癌の診断に有用だと考えられる。リン酸化プロテオーム解析はリン酸化バイオマーカー探索の最も良い方法の一つだが、血液検体の大規模なリン酸化プロテオーム解析は難しい。本研究では、先ず大腸癌組織のリン酸化プロテオーム解析により大腸癌のバイオマーカー候補を探索し、その中から血中検出が可能なリン酸化バイオマーカーを感度の良い方法で検証する。現在までに、定量的リン酸化プロテオーム技術(Phospho-iTRAQ法)を用いて、多検体の大腸組織手術標本を解析する方法を確立し、実際に非腫瘍部組織、大腸ポリープ(良性腫瘍組織)、大腸癌(悪性腫瘍)組織のそれぞれ6検体ずつを解析した。定量された5000種類のタンパク質リン酸化の中から、300種類の癌特異的リン酸化変動を見出した。いくつかのバイオマーカー候補については50検体以上の大腸組織で免疫学的手法を用いた検証を行った。これらの検証から、細胞生存関連シグナルが大腸癌で変動していることが示唆された。免疫学的手法でリン酸化変動の検証を行うには、リン酸化特異的抗体が必要となるため多くのバイオマーカー候補の検証ができなかった。そこで本研究では、リン酸化抗体を必要としないSelected reaction monitoring(SRM)法(質量解析計を用いた定量法)による検証方法を取り入れた。SRM法ではプロテオーム解析で同定された全てのリン酸化バイオマーカー候補が検証の対象であり、一度の解析で数十種類のリン酸化バイオマーカー候補を定量することが可能である。現在、リン酸化バイオマーカーの検証を進めており、有用性が示唆されたリン酸化に関しては、血中検出を検討する。大腸癌は進行すると予後不良であるため、早期診断や再発モニタリングマーカーが必要である。タンパク質リン酸化シグナルの異常は癌と密接に関連するため、そのタンパク質リン酸化の異常は癌のバイオマーカーとなりうる。本研究の目的は大腸癌手術標本のリン酸化プロテオーム解析により大腸癌に特異的なリン酸化シグナル分子を同定し、大腸癌バイオマーカーへの応用を検討する事である。平成22年度に、大腸癌(悪性腫瘍)、大腸ポリープ(良性腫瘍)、非腫瘍組織の定量的リン酸化プロテオーム解析を行い、大腸癌に特異的なタンパク質リン酸化修飾を246種類見出した。本年度は、リン酸化バイオマーカー候補の検証に用いるSelected reaction monitoring(SRM)法の技術開発を進めた。安定同位体標識スタンダードペプチドを用いたSI-phospho-SRM法による検証方法を検討し、その有用性を乳癌リン酸化バイオマーカーの検証を例にして実証した。現在、大腸癌のリン酸化バイオマーカーの検証を進めている。本研究の最終目標は、リン酸化バイオマーカーの血中検出であるが、血液を用いたSI-phospho-SRM検証法の開発は今後の課題と考えている。また、本研究で得られた大腸癌のタンパク質リン酸化プロファイルを用いて、大腸癌のリン酸化シグナル伝達機構の解明も試みた。バイオインフォマティクスを駆使して、大腸癌で変動しているリン酸化シグナルパスウェイをいくつか見出した。さらに、リン酸化シグナルを制御することで大腸癌の増殖や運動能を制御する新規癌関連タンパク質を見出した。本研究から新規の大腸癌バイオマーカー候補および治療ターゲット候補を見出すことができた。
刺激応答性多核金属錯体の創製とその集合・包接制御に基づく機能発現

サリチルアルジミナト配位子と金属とによって得られる多様で柔軟な配位様式に基づく集合・包接制御の創出研究の過程で、N-アルキルサリチルアルジミナト配位子とPtCl2(dmso)2前駆体とを反応させることで、不活性なアルキル基への位置選択的な分子内C(sp3)-H活性化を経由してO^N^C型配位構造を有する新規のシクロメタレート型Pt(II)錯体が得られることを見出した。本錯体の合成ではサリチルアルジミン部位の4位または5位にメトキシ基を導入したものや、配位子であるDMSOをピリジンやトリフェニルホスフィンに置換したもの、鎖長を変化させたものを得ることにそれぞれ成功している。各錯体の構造は各種分光法と単結晶X線解析により同定した。本錯体群は溶液状態で発光能を有し、その発光色はサリチルアルジミナト部位に導入するメトキシ基の位置を変化させることで青色から黄色までチューニングできることを見出した。一連の錯体群の2-MeTHF中における低温ガラス状態での発光色は、無置換体が緑色(λmax = 488 nm, Φ77 K = 0.81)、4-メトキシ体が青色(λmax = 464 nm,Φ77 K = 0.54)、5メトキシ体が黄色(λmax = 553 nm, Φ77 K = 0.49)であった。これらメトキシ基の置換位置による発光色の差異はDFT計算の結果とも一致し、無置換体と比較した4メトキシ体における発光色のブルーシフトはLUMOレベルの上昇によるHOMO-LUMO間のエネルギーギャップの増加によるもので、5メトキシ体における発光色のレッドシフトはHOMOレベルの上昇によるHOMO-LUMO間のエネルギーギャップの減少によるものとそれぞれ理論づけられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。金属配位平面をペンタメチレン鎖で2重に渡環したキラルな洗濯バサミ型環状2核トランス-ビス(サリチルアルジミナト)パラジウム及び白金錯体(1a: Pd及び1b: Pt)が有する強い連続的ヘテロキラル会合特性を利用し、超分子配列中にパラジウム及び白金原子を交互に並べることに成功した。さらに、本錯体の特性を応用することで超音波刺激を鍵とした種々の分子集合様式の制御を達成した。(+)-1a及び(-)-1bのヘテロキラルな異種金属混合溶液は室温静置により透明なゲルを与えた一方、(+)-1a及び(+)-1bのホモキラルな混合系ではゲル化が進行しなかった。ヘテロキラルな系で観測されたゲル生成過程に関して1H NMR及びHPLC解析により精査した結果、溶液中の(+)-1a及び(-)-1bが常に1:1の比率で消費されていること及び、生成したゲル線維中に(+)-1a及び(-)-1bが常に1:1の比率で存在していることが示された。以上の結果は、本系において異種金属の交互配列[(+)-Pd(-)-Pt(+)-Pd(-)-Pt...]が達成されたことを示唆する。この本錯体が有するヘテロキラル会合特性を基にした異種金属の配列制御により以下3つの現象の発現を確認した。(1)パラジウム錯体と白金錯体の混合比を変化させることで、超音波刺激に対するゲル化応答性のチューニングに成功した。(2) (+)-1a:(-)-1a:(+)-1b = 1:1:1等の3成分混合溶液より得られたゲルを溶液系中から遠心分離することで、光学純粋な(+)-1bとラセミの1aを原料に、光学純粋な(+)-1aを得る、異種金属間でのエナンチオ過剰率の変換に成功した。(3)キラルなパラジウム及び白金錯体が交互に配列したゲル線維は、元の溶液状態のときと比較してCDスペクトルの強度が増大し、超分子キラリティが発現することを見出した。この変化は超音波の有無により異なる結果を与えることも判明した。キラルな洗濯バサミ型パラジウム複核錯体は、リンカーの剛直性が溶液中での会合キラリティに大きな影響を与えることを見出した。本研究で用いた洗濯バサミ型錯体は、リンカーに剛直なメタキシリレン鎖を有する錯体1と、柔軟なペンタメチレン鎖を有する錯体2である。それぞれの錯体の合成は、対応するジイミン配位子と酢酸パラジウム(II)を反応させることで行った。合成した錯体の構造は単結晶X線構造解析で同定し、2枚のパラジウム金属配位平面が2本のリンカーで連結された、特異な洗濯バサミ型構造をとることを確認した。剛直なリンカーを有する錯体1について、ラセミ体および光学活性体それぞれのCDCl3中における濃度可変1H NMRスペクトルを解析した結果、錯体1が溶液中でヘテロキラル会合に対してホモキラル会合が優先的に誘起されることを見出した。このときホモキラルおよびヘテロキラル会合それぞれの会合定数の比はKD(homo)/KD(hetero) = 120であった。この結果は柔軟なリンカーを有する錯体2のものとは対照的である。

錯体2は同様の条件下でヘテロキラル会合が優先的に誘起され、このときの会合定数の比はKD(homo)/KD(hetero) = 0.033であった。剛直なリンカーを有する錯体1と柔軟なリンカーを有する錯体2との間で見られた会合キラリティの対照性について、それぞれの錯体の会合様式の差異により定性的に説明することに成功した。サリチルアルジミナト配位子と金属とによって得られる多様で柔軟な配位様式に基づく集合・包接制御の創出研究の過程で、N-アルキルサリチルアルジミナト配位子とPtCl2(dmso)2前駆体とを反応させることで、不活性なアルキル基への位置選択的な分子内C(sp3)-H活性化を経由してO^N^C型配位構造を有する新規のシクロメタレート型Pt(II)錯体が得られることを見出した。本錯体の合成ではサリチルアルジミン部位の4位または5位にメトキシ基を導入したものや、配位子であるDMSOをピリジンやトリフェニルホスフィンに置換したもの、鎖長を変化させたものを得ることにそれぞれ成功している。各錯体の構造は各種分光法と単結晶X線解析により同定した。本錯体群は溶液状態で発光能を有し、その発光色はサリチルアルジミナト部位に導入するメトキシ基の位置を変化させることで青色から黄色までチューニングできることを見出した。一連の錯体群の2-MeTHF中における低温ガラス状態での発光色は、無置換体が緑色(λmax = 488 nm, Φ77 K = 0.81)、4-メトキシ体が青色(λmax = 464 nm,Φ77 K = 0.54)、5メトキシ体が黄色(λmax = 553 nm, Φ77 K = 0.49)であった。これらメトキシ基の置換位置による発光色の差異はDFT計算の結果とも一致し、無置換体と比較した4メトキシ体における発光色のブルーシフトはLUMOレベルの上昇によるHOMO-LUMO間のエネルギーギャップの増加によるもので、5メトキシ体における発光色のレッドシフトはHOMOレベルの上昇によるHOMO-LUMO間のエネルギーギャップの減少によるものとそれぞれ理論づけられた。今後は引き続き、特異な柔軟性を示すサリチルアルジミナト金属配位平面を有する錯体の応用的展開として、(1)洗濯バサミ型錯体の種々の配列制御の達成及び、(2)配位平面の柔軟性を活かした新規機能性錯体の創出を行っていく。具体的には、(1)メシチレン骨格をリンカーに有する3核錯体を開始剤とする新たな3方向拡張型分子集合による、高粘弾性・高発光性材料等の高機能性材料開拓を目指す。また、(2)3枚の柔軟な金属配位平面を持つtripod型錯体や4枚の可動性芳香環を有するtetrapod型錯体による外部刺激応答性の機能性分子種を創出する。さらに、金属配位平面の柔軟性を活かした角度可変ジャンクションを有する金属有機構造体を構築し、温度センサーやガスセンサーとしての応用を目指す。今後は引き続き、枝分かれ分子配列の達成を目的に、新規3核錯体を合成し、洗濯バサミ型錯体との混合系で超分子形成を試みる。また、サリチルアルジミナト金属配位平面の柔軟性を活かした機能発現を目的に、tripod型錯体、tetrapod型錯体及び角度可変ジャンクション錯体を合成する。合成における検討内容として、tripod型錯体では、内部のキャビティサイズをゲストに合わせて最適化するために、金属配位平面どうしをつなぐスペーサーの種類を検討する。Tetrapod型錯体では、フラーレンを認識捕獲するために、側鎖上から伸びる芳香環部位の種類を検討する。角度可変ジャンクション錯体では、特定の金属配位部位を残したまま金属錯体を形成する必要があり、そのための保護基や反応条件の検討を行う。合成した錯体群に関してその特性解析と機能評価を行う。
カオス発振器ネットワークに生じる疑似同期現象とカオス的遍歴現象の解明

本研究では、カオスを発生する連続時間電子回路を多数結合したネットワークに見られるカオスの疑似同期現象を対象とし、発生するクラスタリング現象とそのカオス的遍歴現象などについての調査を行った。クラスタリングにより特徴付けられる多様な空間パターンの解明は、近年盛んに研究されているカオスを用いたニューラルネットワークへの情報の埋め込みに対して有効な知見を与えると考えられる。また、発生する空間パターンが時間的にランダムであるかのように変化していくカオス的遍歴現象についての調査は、電子回路のような連続時間実物理系ではまだほとんど研究されておらず、解明されていない点が多いため、ニューラルネットワークへの応用だけでなく、様々な分野での研究に貢献することが期待される。本研究で特に詳細な調査を行った系は、連続時間系としては最も簡単である3次元自励振動カオス発生電子回路を帯状に結合したネットワークであるが、このネットワークは局所的には4つのカオス発生電子回路を1つの抵抗で結合した構造を有している。研究代表者の以前の研究で、このような結合は位相差を伴うカオス疑似同期を引き起こすことがわかっており、そのことから全ネットワークを見たとき局所的な位相差によって特徴づけられる空間パターンが生成される。しかしながら、ネットワークを大規模化し、さらに外乱を加えると、このような空間パターンに乱れが生じ、ネットワークがいくつかのサブグループに分断されたように各々のグループ内のみが同期するクラスタリング現象が発生することを明らかにすることができた。また、回路パラメータによっては、サブグループ間の境界が時間的にランダムであるかのように移り変わるクラスタのカオス的遍歴現象が発生することも確認できた。
培養実験によるガス放出微生物過程の生元素アイソトポマー解析

一酸化二窒素(N_2O)、メタン(CH_4)、および硫化水素(H_2S)は温室効果やエアロゾル形成を介して地球の気候変動と密接に関わっている。これらN_2O、CH_4、H_2Sのアイソトポマー比を用いた循環解析を発展させるために、微生物ガス代謝過程に着目し、(1)単一微生物種の純粋培養実験、(2)複数種(共存・競合)培養実験、および(3)環境試料の室内培養実験および観測を利用して、種々の微生物ガス代謝とアイソトポマー比の関係を定量化した。微生物ガス代謝とアイソトポマー比の関係について、純粋培養系と現場環境観測で得られる知見のギャップを埋めるべく、いくつかの微生物代謝過程に注目し、より現場環境に近い微生物共存・競合培養実験系(複数の微生物過程が共役したり競合したりする系)を考案し、微量アイソトポマー比測定技術を駆使することで、実験で発生するガス種および基質のアイソトポマー比計測を実現することを目的として研究を行っている。本培養(濃度・アイソトポマー比測定実験)を行うために、ジャーファーメンター、pH・溶存酸素・栄養塩濃度調節器、送液ポンプなどから成る連続培養装置を設置し、運転条件や気体・液体試料の採取方法について検討した。定常状態で系内のCH_4、CO_2、H_2S、SO_4の定量を行う方法を構築した。H_2Sに関しては四種硫黄同位体分析の高精度化のため、硫化銀のフッ化によるSF_6法を改良した。フッ化およびSF_6ガスの精製の前処理装置により、すでに<33>^S/<32>^S比の測定は本研究目的に十分な精度(±0.01‰)で分析が可能であった。一方<36>^S/<32>^S比は±0.5‰の精度で分析可能であるが、現段階で十分な精度(<±0.2‰)に達していなかった。多段階ガスクロマトグラフィーを新たに適用して、まずSF_6ガスの精製法を改善し四種硫黄同位体分析法の高精度化を達成した。純水製造装置と、新たに設置したターボポンプにより、水質と不純ガスの排除を保障した系で微生物過程により放出された各種成分を新たに購入したGCMSにより定量したのち、アイソトポマー比を現有の同位体比計測用質量分析計で計測した。得られた結果を解析し、微生物ガス代謝とアイソトポマー比の関係を関数化するとともに、実験系の評価と再設計を行った。平成20年10月に第4回国際アイソトポマー会議(ISI 2008)を東京で開催した。全ての研究代表者および研究分担者は主宰、セッションチェアーなど主催者として組織するとともに、当研究チーム全体では30件ほどの口頭発表あるいはポスター発表を行い、14カ国120人強の出席した国内外の研究者とフィールドや培養実験でのアイソトポマー分別、存在度について、情報交換を行った。これまでの同位体・アイソトポマー研究の歴史についてレビューし、それらを基に今後アイソトポマー研究を発展させるための基礎となる学問分野体系化の提案を行った。また、“アイソトポマー"の定義に関する議論を行い、より広義での使用を提言した。また、近年急速な発展が見込まれるアイソトポマー研究の一つの要素である、質量非依存同位体分別(Mass Independent Fractionation:MIF)と分子内同位体分布、二重同位体置換化学種について、申請者が行った研究結果を紹介した。この研究の詳細については共同研究者が本会議で発表を行った。実施者は本発表を含め30件の共著論文を本会議で報告した。会議は会期中にはExtended abstractを配布した。会議初日までに予定通り、持参されたものと、後日督促したものを合わせて、編集し、292ページに及ぶProceedingsとして別予算で出版し、出席者に配送した。今回の会議では、本研究の成果について国際発信する絶好の機会となった。国内外の第一線の研究者が集まり、現在の最先端の研究情報を共有し、今後の展開に向けて議論する場として大いに機能した。本研究で目指す方向性とその到達度の確認を行った。微生物ガス代謝におけるN_2O、CH_4および硫黄化合物のアイソトポマー分別を求め、分別係数と環境変数の関係の関数化を目指し研究を行った。本年度の主な結果を2つ以下に示す。まずN_2Oに関しては、アンモニア酸化菌N.oceaniおよび脱窒菌P.aureofaciensについて種々の条件下で純粋培養を行い、生成するN_2Oのアイソトポマー比を調べた。N.oceaniが生成するN_2Oの平均窒素同位体比と分子内^<15>N分布は酸素濃度に依存し、低酸素条件ではNH_3から生成したNO_2^-からN_2Oが生成し、高酸素条件ではNO_2^-の前駆物質であるヒドロキシルアミン(NH_2OH)から生成したものと考えられた。

P.aureofaciensが生成するN_2OのSP値はこれまでに報告されている他の菌とくらべて約5‰低い値を示し、脱窒過程の寄与率の推定においては菌種によるSP値の変動幅を考慮する必要があることが明らかになった。CH_4に関しては、東京都浮間水再生センターの嫌気槽・無酸素槽・好気槽、反応槽前後、および返送汚泥の表層・中層・深層からそれぞれ水試料を採取し溶存CH_4の濃度・δ^<13>C_<CH4>値測定を行い、下水処理場で発生するCH_4の各処理槽における環境が同位体比に与える影響を解析した。CH_4は反応槽を通じて概ね濃度は減少し、δ^<13>C_<CH4>値は上昇傾向となった。このことから、CH_4は3次処理槽を通じて酸化されているのがわかった。しかし、反応槽後の第二沈殿地および塩素処理槽ではメタン濃度が上昇しδ^<13>C_<CH4>値は減少した。これは、この二点においてCH_4生成が生じていることだと考えられ、放流水のCH_4濃度は大気平衡よりも高く放出している可能性を示唆している。このことから下水処理場が大気への直接的なCH_4の排出ではないが、河川への間接的な排出をしている可能性が示唆された。
電荷を有するチオール基の保護試薬の創製及びタンパク質工学への応用

大腸菌にシステイン残基を有する外来性タンパク質を生産させるシステムの有用性を高めるために、変性タンパク質を変性剤なしに可溶化できる電荷を有するSH基の新しい保護試薬を合成し、タンパク質工学への応用を試みた。まず、変性タンパク質の溶解度と総電荷及び疎水性との関係を調べるために、ジスルフィド結合を還元した4種のタンパク質のSH基を電荷を持つアルキル化試薬で修飾した。その結果、変性タンパク質は、その総電荷が疎水性残基1個当り+0.17以上または-0.32以下であれば、1mg/ml以上の溶解度を示すことがわかった。次に反応を可逆的にするためにSH基と速やかに混合ジスルフィド結合を形成し、かつ電荷が導入できるメタンチオスルホネート誘導体を種々合成した。これらの試薬を還元タンパク質のSH基と反応させた結果、塩基性タンパク質には正電荷を、酸性タンパク質には負電荷を導入すると、予想通りこれらの修飾タンパク質は変性状態でも水によく溶けた。また本法で導入したジスルフィド結合はプロテアーゼ消化の条件では安定であったが、還元により元のSH基に戻すことができた。さらに大腸菌に不溶性のインクルージョンボディとして生産させたが、従来の方法では菌体から抽出ができなかったヒトリボヌクレアーゼ4及び分泌型ヒト線維芽細胞成長因子受容体を還元後、正電荷を有するトリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホネート(TAPS-スルホネート)でSH基を修飾(保護)したところ、容易に可溶化され、精製することができた。本法で精製したヒトリボヌクレアーゼ4はグルタチオンの酸化・還元系で活性構造に巻き戻った。したがって、大腸菌にインクルージョンボディとして生産させたジスルフィド結合を持つ外来性タンパク質の抽出、N末端プロセッシング、巻き戻しにTAPS-スルホネートは極めて有用であると結論される。1.蛋白質工学上の諸問題を解決するための一環として,SH基と特異的に反応し,混合ジスルフィド結合を速やかに形成するメタンチオスルホネート誘導体を種々合成した.これらの試薬は側鎖に正電荷,負電荷,あるいは中性親水基を持ち,還元蛋白質と反応させるとSH基にそれぞれ正電荷,負電荷あるいは中性親水基が可逆的に導入できる.2.大腸菌にジスルフィド結合を有する外来性蛋白質を生産させると,N末端が天然蛋白質とは異なる不溶性の変性蛋白質が得られるので,これを天然型に変換するためには変性蛋白質を水に可溶性とし,酵素的にN末端をプロセスした後,SH-SS交換反応により天然構造に巻き戻す必要がある。そこでジスルフィド結合を有する種々の蛋白質を還元後,生じたSH基を不可逆的にアルキル化することにより種々の電荷を導入した変性蛋白質を調製した。その結果,変性蛋白質の総電荷が疎水性残基1個当り+0.17以上または-0.32以下であれば1mg/ml以上の溶解度を示すことが明らかになった.3.化学修飾リゾチームを用いて還元状態からの巻き戻しの収率に及ぼす総電荷の影響を調べた結果,総電荷が大きいほど高濃度でも高収率で巻き戻ることが明らかになった。4.1.で調製した可逆的SH基の修飾試薬で還元蛋白質のSH基に電荷を導入した結果,塩基性蛋白質であるリゾチームには正電荷を,また酸性蛋白質であるBSAには負電荷を導入すると,水に可溶性となることを確認した。

また生成した混合ジスルフィド結合は中性または酸性で安定であった.5.これらの試薬を大腸菌に生産させた外来性蛋白質のN末端プロセッシングに利用するために,可逆的修飾部位[(Cys)_8]とFactorXaプロテアーゼに特異的なアミノ酸配列をN末端に持つ融合リゾチームを大腸菌に発現させる系を確立した。蛋白質工学上の諸問題を解決するための一環として前年度には環元蛋白質のSH基と特異的に反応し,混合ジスルフィド結合を速やかに形成するメタンチオスルホネート誘導体を種々合成した.それらは側鎖に正電荷,負電荷,あるいは中性親水基を持ち,還元蛋白質のSH基にそれぞれ正電荷,負電荷あるいは中性親水基を可逆的に導入できるものである.昨年度はこれらの試薬を還元蛋白質のSH基と反応させた結果,塩基性蛋白質であるリゾチームには正電荷を,酸性蛋白質であるBSAには負電荷を導入すると、これらの蛋白質は変性状態でも水に溶けることを示したが,本年度はこれらの試薬の性質のさらなる検討と蛋白質工学への応用を試みた。1.ジスルフィド結合はアルカリ性では不安定なことが知られているので,これらの試薬でSH基を可逆的に修飾(保護)した還元リゾチームをpH8,40°Cでトリプシン消化し,消化ペプチドの分析を行った結果,導入した保護基はこの条件で少なくとも17時間は安定であり,したがって大腸菌に生産された外来性蛋白質をこれらの試薬で可溶化し,さらにN末端を酵素的にプロセスすることが十分に可能であることがわかった。2.5種類存在するヒトの膵臓型リボヌクレアーゼ(8個のシステイン残基を含む塩基性蛋白質)の内の4種類(RNase14)を大腸菌に不溶性のインクルージョンボディとして菌体内に大量生産させる系を開発した。このうち多量の細胞壁断片を含むインクルージョンボディからは直接活性型に巻き戻すことができなかったRNase2とRNase4について、SH基を上記カチオン型の保護試薬で修飾したところ可溶性となり,細胞壁成分から簡単に抽出できた。しかも抽出したRNase2とRNase4は効率よく活性型に巻き戻った。さらに大腸菌にインクルージョンボディとして生産させた分泌型FGFリセプターの抽出と巻き戻しにもカチオン型の試薬は非常に有効であった。
圧電薄膜カンチレバーを用いた近接場音響顕微鏡の開発

(1)圧電性薄膜(PZT)カンチレバーの動作性能評価PZTカンチレバーの基本的なAFM動作を評価するために、サファイア基板を1400°Cで熱処理することにより得られる原子ステップ構造のAFM観察を行った。観察されたステップの高さは約2nmであり、AFM動作に対しても本装置が十分なZ方向の感度をもつことが確認された。(2)高分子材料の局所音響・力学物性評価ポリフッ化ビニリデン-3フッ化エチレン共重合体P(VDF-TrFE)薄膜の局所音響・力学物性の評価をダイナミックモードのAFMにより行った。薄膜を構成しているグレインの表面は分子鎖が複雑に絡まった構造あるいはアモルフォス構造であるために、最表面の情報を検出する通常の走査プローブ顕微鏡では、高分解能観察は困難であった。しかしながら、探針をさらに試料表面に近づけてその相互作用を大きくすると音響・力学的結合により、グレイン内部の弾性的情報が得られることが分かった。この結果、グレインにはさらに数10nm程度径のサブグレイン構造から成ることが分かった。(3)音響散逸エネルギー検出系の開発さらに高い分解能を得るために、ダイナミックAFM動作における圧電薄膜カンチレバーの振動エネルギーの散逸量から、試料の音響・力学情報を測定することを試みた。この動作では、カンチレバーの共振周波数の変化が試料の形状情報として、振幅変化が音響散逸情報として測定される。周波数検出部は、カンチレバーの自励振動部と周波数シフト検出部の2つから構成され、散逸情報は自励振動部内の振幅制御系により測定が可能となる。本研究では、応答追従性の改善を目指して周波数検出感度をさらに向上させるために、水晶発振器を用いた電圧制御発振器(VCXO)による独自の周波数検出回路を開発した。これによって周波数安定度は0.01Hz(1kHz周波数帯域)と飛躍的に向上した。本研究では、圧電薄膜を堆積した原子間力顕微鏡(AFM)微細加工カンチレバーを開発するとともに、AFM動作が可能でかつ圧電薄膜により試料を伝搬する局所超音波を捉えることが可能な新たな近接場音響/原子間力(SNAM/AFM)複合顕微鏡を開発することを目的としている。これまで開発された圧電薄膜カンチレバーは、主にAFM動作を目的としていることから、その製作プロセスが比較的容易でかつ先端の尖鋭化プロセス(sharpening process)が確立している窒化膜(SiN)ピラミッド探針を用いていた。しかしながら、SNAMでは超音波信号の減衰が少なくかつ力学的性質に優れるSi探針を用いる方が有利である。本年度の研究では、AFMにおける4面体(tetrahedral)探針を製作するプロセスを応用して、Si探針を圧電薄膜カンチレバー先端に設けるためのプロセス設計を行い、実際にSi4面体探針の試作を行った。また高感度で高周波音響信号を検出するには、圧電薄膜の共振条件を利用する必要があることから、圧電薄膜の堆積膜厚の最適化について検討を行った。SNAM探針によって検出される音響信号は必ずしも試料形状を反映しないことから、安定な動作を確保しかつ形状情報と独立に音響波による物性情報を測定するためには、音響信号とは異なる探針-試料間の間隙制御を行う必要がある。本研究の圧電薄膜カンチレバー方式のSNAM/AFM複合顕微鋳では、AFM接触動作におけるカンチレバーの直流的な変位(たわみ)信号を利用することで、安定な間隙制御(力一定モード)を可能とした。

このため現有の走査型プローブ顕微鏡(SPM)装置に組み合わせ可能な圧電薄膜カンチレバー用の直流変位検出(光てこ方式)ヘッドを製作した。これにより、これまでのSNAMでは容易でなかった探針-試料間の間隙制御が、表面力検出によって安定に動作した。本研究では、圧電薄膜を堆積した原子間力顕微鏡(AFM)微細加工カンチレバーを開発するとともに、AFM動作が可能でかつ局所音響力学情報を捉えることが可能な新たな近接場音響/原子間力(SNAM/AFM)複合顕微鏡を開発することを目的としている。本年度の研究では、試料の音響力学情報をAFM動作での間欠接触モードにおける圧電薄膜カンチレバーの振動エネルギーの散逸量から測定することを試みた。この動作は、近年進展の著しい非接触AFMにおいて用いられ、高感度な検出法である周波数変調検出法(FM検出法)を適用することにより実現される。すなわち、カンチレバーの共振周波数の変化が試料の形状情報として、振幅変化が音響散逸情報として測定される。FM検出法は、カンチレバーの自励振動部と周波数シフト検出部の2つから構成される。カンチレバー自励振動部は、カンチレバーをその共振周波数で発振させる。試料表面の音響力学物性の変化によってカンチレバーの実効的なばね定数が変化するため、その共振周波数もまた変化する。この周波数変化が後段の周波数シフト検出部により測定され、AFMの主帰還信号として用いられる。一方、散逸情報は、自励振動部内の振幅制御系によって測定が可能となる。さらに、周波数検出感度を向上するため、独自のFM検出回路を開発した。この回路では、周波数検出に位相同期ループ(PLL)回路を採用しているが、通常問題となる電圧制御発振器(VCO)の周波数安定性を改善するため水晶発振器を用いたVCO(VCXO)を用いた。これによって周波数安定度は0.01Hz(1kHz周波数帯域)と飛躍的に向上した。この回路を用いて、平坦処理を行ったSrTiO3(100)面の原子ステップ構造を観察することができ、本検出系が十分な感度をもつことが確認できた。
ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の細胞、生体、病態における作用メカニズムの解明

ミトコンドリアの呼吸活性はあらゆる細胞、組織において重要な役割を担っており、その機能障害は様々な病態に関連していると考えられている。我々はミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を促進するCOX7RPを初めて報告したが、このようなミトコンドリア呼吸鎖超複合体の制御に関わる因子はほとんど解明されていない。本研究では、COX7RPをはじめとするミトコンドリア呼吸機能に関わる因子の発現解析、siRNAなどを用いた機能解析を行い、細胞周囲環境における制御機構を解析した。ミトコンドリアの呼吸活性はあらゆる細胞、組織において重要な役割を担っており、その機能障害はミトコンドリア病を含む、循環器障害、生活習慣病、脳機能障害、がん、老化など様々な病態に関連していると考えられている。申請者らは、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を促進するCOX7RPを初めて報告したが、このようなミトコンドリア呼吸鎖超複合体の制御に関わる因子はほとんど解明されていない。本研究は、COX7RPの結合因子の探索、呼吸鎖サブユニットの細胞内動態の可視化、siRNAを用いた新規のミトコンドリア呼吸鎖超複合体の制御因子のスクリーニング等を行い、呼吸鎖超複合体の制御機構を解明し、培養細胞系とCOX7RPノックアウトマウスを用いた生体モデルを活用して検証し、超複合体と細胞機能ならびに各種疾患との関連を解き明かすことを目的とする。本年度は複数の培養細胞株からミトコンドリア分画を調整した。また、これらの細胞に対して、低グルコース、低酸素などの処理を行って同様にミトコンドリア分画を調整した。これらのミトコンドリアを可溶化剤で処理した後、Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)による2次元電気泳動を行い、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成などを解析した。COX7RP遺伝子改変マウスの骨格筋、脳などの各組織よりミトコンドリア分画を調整し、同様にBN-PAGEを用いて解析し、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を解析した。COX7RPと結合する因子の解析として、免疫沈降法を用いて電子伝達系のサブユニットとの結合を検討した。複数の培養細胞株を低グルコース、低酸素などの環境で培養し、ミトコンドリア分画を精製しており、これらの材料を用いて独自に改良したBN-PAGEによる2次元電気泳動を行い、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成システムを構築した。1次元目のBN-PAGE、2次元目のSDS-PAGEと複合体I(NDUFA9)、III(UQCRC2)、IV(COX4)などのサブユニットに対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を組み合わせることで、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を効率よく解析できるようになった。また、COX7RP遺伝子改変マウス由来のサンプルも用いて同様にミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を解析している。さらに、COX7RPと結合する因子を免疫沈降法を用いて検討しており、おおむね順調に研究が進展していると考えている。本研究は、COX7RPの結合因子の探索、呼吸鎖サブユニットの細胞内動態の解明、siRNAを用いたミトコンドリア呼吸鎖超複合体の制御因子等の解析を行い、呼吸鎖超複合体の制御機構を解明し、培養細胞系とCOX7RPノックアウトマウスを用いた生体モデルを活用して検証し、超複合体と細胞機能ならびに各種疾患との関連を解き明かすことを目的とする。本年度は複数のがん細胞株からミトコンドリア分画を調整した。また、COX7RPを過剰発現する細胞株を作製し、トランスクリプトーム解析を行い、呼吸鎖超複合体の制御に関わるシグナル経路の探索を行った。COX7RP遺伝子改変マウスの骨格筋、脳、肝臓などの各組織よりミトコンドリア分画を調整し、同様にBN-PAGEを用いて解析し、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を解析した。前年度の解析を引き続き行い、各種培養細胞株ならびにそれぞれの刺激による特異的なミトコンドリア呼吸鎖超複合体の制御と呼吸活性の変化を明らかにする。この解析により、代謝、ホルモン、低酸素による超複合体の制御で特徴的な役割を担う遺伝子を明らかにする。

この候補遺伝子に関しては、がん細胞におけるノックダウンもしくは過剰発現系を構築し、細胞増殖、移動能、低酸素応答、ホルモン応答などにおける作用を解析し、がん細胞における役割を検証する。また、COX7RP遺伝子改変マウスを用いた解析においては、高脂肪食負荷、絶食、ホルモン欠乏、運動負荷などの条件において、脳、内臓脂肪、褐色脂肪、骨格筋、心筋、肝臓、膵臓、骨などの各組織よりミトコンドリア分画を調整し、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成やターゲットとなるサブユニットの超複合体への取込みなどを明らかにする。COX7RPと相互作用する分子に関して、さらに解析を進める。ミトコンドリアに局在して機能すると考えられるミトコンドリア呼吸鎖のサブユニットとその調節因子、ミトコンドリア生合成・分裂・融合に関わる因子、脂肪酸酸化酵素などを対象にsiRNAを合成し、培養細胞に導入してミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を解析し、未知の制御因子を探索する。以上の研究成果を統合して、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の細胞、組織、生体、病態における意義を解明し、臨床医学に応用できる分子標的を同定する。分子生物学培養細胞ならびにCOX7RP遺伝子改変マウスを用いたミトコンドリアの調整とBN-PAGEを用いた解析を改良することにより、効率よくミトコンドリア超複合体の解析が行えるようになったため、蛋白の精製・解析、細胞培養などに必要な試薬・キット、チューブ、ピペットなどの消耗品が減少したため。解析対象とする候補遺伝子について、ミトコンドリア呼吸鎖のサブユニットとその調節因子、ミトコンドリア生合成・分裂・融合に関わる因子、TCAサイクルに関わる酵素、脂肪酸酸化酵素、アポトーシス関連因子、物質輸送に関わる因子をはじめ、その他のホルモン、シグナル、低酸素、低栄養環境に関与する遺伝子も対象として増加させて、siRNAの合成や定量的PCR法により解析を進めることにより、より広範囲にミトコンドリア呼吸鎖超複合体の形成を制御する未知の制御因子の可能性を探索することにより、最終年度(本年度)内に全て使用する。
新規c-Myc結合タンパク質MM-1のがん抑制遺伝子産物としての機能と癌化

更に、MM-1の転写抑制ターゲット遺伝子の探索のために、MM-1発現ノックダウン細胞を樹立し、親株とのDNA microarray解析により遺伝子を同定した。1つの遺伝子としてc-Myc経路の上流に存在するWnt4遺伝子が同定され、MM-1が転写レベルでWnt4遺伝子の発現抑制をしており、MM-1発現減少がWnt4シグナルの活性化を誘起し、c-myc遺伝発現促進につながることを明らかにした。また、MM-1はプロテアソームサブユニットRpt3と直接結合することでc-Mycをプロテアソームにリクルートし、c-Myc分解を促進する。今年度、この系を詳細に解析し、ElonginB, Elongin C, Cullin2によるc-Mycのユビキチン化をMM-1が促進すること、更にこれら関与する複数のタンパク質の遺伝子に対するsiRNAを使い、endogenousなレベルでこの系が存在することを明らかにした。このように、MM-1なc-Mycとの結合による転写抑制と分解、Wnt4遺伝子の抑制の3つの経路によりc-Myc機能を抑制していることが明らかとなった。1).MM-1が仲介する新規c-Myc転写抑制経路とターゲット遺伝子の同定MM-1はTIF1βのC末に直接結合し、HDAC1,mSin3などの転写コリプレッサー群をc-Mycにリクルートすることを既に報告した。次にestrogenによってc-Myc活性が制御できるMyc-ER細胞にTIF1βのC末のdominant-negative体を導入した細胞でのDNAマイクロアレイ法により、c-Myc-MM-1転写抑制ターゲット遺伝子としてc-fmsを同定した。c-fmsプロモーターに存在する2カ所のc-Myc結合配列E-boxの内、2番目のE-boxがc-Myc/MM-1の認識配列であることを明らかにした。c-fmsは通常、MM-1によりc-Mycによる転写活性化が抑制されているが、MM-1変異によりこの抑制系路が遮断され活性化され細胞癌化をもたらすと考えられる。次に、siRNAによるMM-1ノックダウン細胞を樹立し、DNAマイクロアレイ法によりMM-1ターゲット遺伝子としてc-myc経路にあるWnt4遺伝子を同定し現在詳細に解析している。2).MM-1によるc-Myc分解MM-1遺伝子はヒト染色体12q12-12q13にマップされる。splicingの違いによるMM-1α,-β,-γ,-δの4つのisoformの存在を明らかにした。更に、現在までに解析してきたMM-1はMM-1αにヒト染色体14由来の13アミノ酸がN末に付加されたものであることが明らかとなった。MM-1,MM-1α,-γは主として核に局在するが、-β,-δは細胞質に局在し,エクソン1、2がその局在を規定していた。基本的にいずれのformもc-Mycとの結合性は存在するが、MM-1,MM-1α,-γのみがc-Myc転写抑制能を持っていた。MM-1結合タンパク質として昨年度同定したゴルジ体に局在するCog complex subunitである核に存在するCog4のsplicing isoformCog4Sに加えて、Cog4そのものもMM-1に結合した。以上より、Cog4を通じてのMM-1の核と細胞質での機能分担が示唆された。1つの遺伝子としてc-Myc経路の上流に存在するWnt4遺伝子が同定され、MM-1が転写レベルでWnt4遺伝子の発現抑制をしており、MM-1発現減少がWnt4シグナルの活性化を誘起し、c-myc遺伝子発現促進につながることを明らかにした。今年度、この系を詳細に解析し、ElonginB, Elongin C, Cullin 2によるc-Mycのユビキチン化をMM-1が促進すること、更にこれら関与する複数のタンパク質の遺伝子に対するsiRNAを使い、endogenousなレベルでこの系が存在することを明らかにした。
原核生物30Sリボソームの成熟プロセスの解明

本研究では、これまでに応募者が明らかにしてきた「RsgAとRbfAの関係」を足がかりとして、細菌のリボソーム30Sサブユニット生合成(成熟)過程後期に必要とされる4種類の成熟因子(RsgA、RbfA、RimM、Era)に焦点を当て、遺伝学、生化学的アプローチを用いて各因子の30Sサブユニット成熟に対する役割を解析していく。同時に、生合成中間体の構造解析を行うことによりその分子メカニズムを詳しく解析し、リボソームの生合成後期過程の全容解明につなげる。また、各成熟因子を欠損させた細胞に蓄積している30Sサブユニット生合成中間体から成熟した30Sサブユニットをin vitroで構築する系を確立し、新規抗生物質開発に向けての基礎とする。・EraのGTP加水分解活性がリボソーム30Sサブユニットによって活性化されるという新たな知見が得られた。成熟した30SサブユニットによってはGTP加水分解活性の活性化は起こらなかったが、未成熟の30Sサブユニット前駆体によって大きく活性化された。これは、以前、我々が明らかにしたRsgAのGTP加水分解活性の活性化の場合、すなわち「RsgAのGTP加水分解活性は成熟した30Sサブユニットによって活性化されるが、未成熟の30Sサブユニット前駆体によっては活性化されない」ことと逆であった。この実験結果は、RsgAが30Sサブユニットの成熟過程の最終段階で働くのに対して、Eraはそれよりも早い段階で働くことを示している。・バイオレイヤー干渉法等により30Sサブユニット生合成中間体と各種成熟因子の相互作用解析を行うために、分子間相互作用解析システムBLItzを導入した。また、蛍光標識可能なRsgAおよびEra作製した。・RbfA欠損株の表現型(生育速度の低下および16S rRNA前駆体の蓄積)の復帰突然変異株(revertant)を取得した。・リボソーム30Sサブユニット前駆体によりEraのGTPase活性が活性化されることを明らかにした。予定通りであった。・予定通り、分子間相互作用解析システムBLItzを導入した。・GTPase型成熟因子(RsgAおよびEra)のGTP加水分解の活性化の解析および阻害因子の探索---RsgAおよびEraについて、30Sサブユニット(前駆体)よるGTP加水分解の活性化を指標にして速度論的解析を行う。成熟度の異なる30S前駆体を用いて実験を行い、結果を比較する。同時に、GTP加水分解の阻害因子を探索する。これにより、RsgAおよびEraが働くステップを明らかにする。・30Sサブユニット生合成中間体と各種成熟因子の相互作用解析---バイオレイヤー干渉法およびフィルター結合法により、各成熟段階にある30Sサブユニット前駆体と各成熟因子の結合(解離定数)を解析する。・各種成熟因子欠損株の復帰突然変異株の解析---RbfA欠損株あるいはRimM欠損株の表現型(生育速度の低下および16S rRNA前駆体の蓄積)の復帰突然変異株(revertant)の解析を行う。予定通りであった。・GTPase型成熟因子(RsgAおよびEra)のGTP加水分解の活性化の解析および阻害因子の探索---RsgA

およびEraについて、30Sサブユニット(前駆体)よるGTP加水分解の活性化を指標にして速度論的解析を行う。成熟度の異なる30S前駆体を用いて実験を行い、結果を比較する。同時に、GTP加水分解の阻害因子を探索する。これにより、RsgAおよびEraが働くステップを明らかにする。・30Sサブユニット生合成中間体と各種成熟因子の相互作用解析---バイオレイヤー干渉法およびフィルター結合法により、各成熟段階にある30Sサブユニット前駆体と各成熟因子の結合(解離定数)を解析する。・各種成熟因子欠損株の復帰突然変異株の解析---RbfA欠損株あるいはRimM欠損株の表現型(生育速度の低下および16S rRNA前駆体の蓄積)の復帰突然変異株(revertant)の解析を行う。
NaBrO_3およびNaClO_3の晶相変化と成長機構

本研究の目的は結晶の形が、成長条件によってどのように制御されるかを調べることである。この問題は結晶成長の素過程に関連した純粋学問としてのみならず、鉱物結晶の生成環境を知る手がかりとして、また晶析工業分野での応用としても大変重要な問題である。本研究の特徴は、成長温度をパラメータの一つに取りいれたことである。そしてNaBrO_3結晶の晶相変化を、縦軸に成長温度、横軸に過飽和度をとったダイアグラム(モルフォドロム)にまとめた。成長条件と晶相変化との関係は、温度制御のできる顕微鏡用加熱冷却ステージを用いて調べた。すなわちこのステージ上に成長セルを置き、成長する結晶を微分干渉顕微鏡を用いてその場観察した。成長条件は(1)過飽和度σ=lnC/Ce=0-0.4,(2)成長温度=20-60°C、(3)不純物;酢酸1.15モル%、酢酸ナトリウム1.0モル%、である。成長の様子は間欠的に写真撮影したり、ビデオ録画した。過飽和度や成長温度の違いによって、cubic form,tetrahedral formおよびintermediate formの三つの晶相を示すことが判った。結果を要約すると次のようである。(1)いずれの場合もcubic formのほうがtetrahedral formより高温側で形成された。しかしこの転移温度は不純物の種類によって大きく変化した。σ<0.1においては、ノンドープでは約34°C、酢酸ドープでは44°C、酢酸ナトリウムドープのときは25°Cであった。これより酢酸は{111}の成長を抑制するが、酢酸ナトリウムは{100}の成長を抑制することが判った。(2)いずれの場合もσの増大につれてこの転移温度は減少する傾向があった。本研究の特徴は、成長温度をパラメータの一つにとりいれたことである。そしてNaBrO_3結晶の晶相変化を、縦軸に成長温度、横軸に過飽和度をとったダイアグラムにまとめた。成長条件と晶相変化との関係は温度制御のできる顕微鏡用加熱冷却ステージを用いて行った。このステージ上に成長セルをおき、成長する結晶を微分干渉顕微鏡を用いてその場観察した。試薬には和光純薬のNaBrO_3(99.5%)を用いた。成長条件を以下のように変化させて晶相変化との関係を調べた。(i)過飽和度[σ=In(C/Ce)=0-0.2,Ce;平衡濃度]、(ii)成長温度;20-56°C、(iii)不純物添加;酢酸1.15mol.%である。成長の様子は間欠的に写真撮影をしながら記録した。過飽和度や成長温度の違いによって、polyhedron,cube(正六面体)やtetrahedron(正四面体)の三つの晶相を示すことがわかった。(i)cubicのほうがtetrahedralよりも高温側で形成される。この変移温度は、不純物を添加した場合のほうが添加しない場合よりも高くなる(不純物添加なし;34°C、酢酸添加;44°C,ただしσ<0.1)。(ii)不純物を添加した場合もしない場合も、tetrahedralからcubicへの変移温度はσ>0.1で急激に減少することがわかった。(iii)

Polyhedralの形成領域は不純物を添加した場合もしない場合もいずれも低過飽和度、高温度領域であった。本研究の目的は、NaBrO_3結晶の晶相が成長条件によってどのように変化するかを調べることである。ノンドープの水溶液や酢酸1.15mol.%水溶液からの成長の場合についての結果は昨年度の本研究報告書で発表した。本年度は酢酸濃度を2.8mol.%にした場合の結果について報告する。結晶成長は温度制御のできる顕微鏡用加熱冷却ステージを用いて行った。成長条件を以下のようにして晶相変化との関係を調べた。(i)過飽和度(σ=1n(C/Ce)=0-0.42,Ce:平衡濃度)、(ii)成長温度:1552°C,(iii)酢酸濃度:2.8mol.%である。成長の様子はビデオ録画した。また結晶の面指数は本年度購入した複円反射測角器(日本地科学者)を用いて決定した。結果を要約すると次のようである。(1)本実験においても、過飽和度や成長温度に依存して、結晶は3つの形で成長した。すなわち、cube,tetrahedronおよびその中間形のintermediate formである。これらの結果は、縦軸に成長温度、横軸に過飽和度をとったダイアグラム(モルフォドロム)にまとめた。こうした結果は昨年報告したもの(ノンドープや酢酸1.15mol.%の場合)と同じであった。ただしモルフォドルムの中での各形の形成領域は異なっていた。(2)1.15mol.%酢酸をドープした場合には、低過飽和度領域(σ=1nC/Ce<0.1)でのtetrahedronの形成温度は、ノンドープの場合にくらべてはるかに高温領域までひろがっていたが、ドープ量を増やした(2.8mol.%)今回の実験では、予想に反してこのtetrahedronの形成温度はノンドープの場合よりも低温域に限られていた。(3)高過飽和度領域(σ>0.1)では、酢酸ドープの影響は小さいものの、濃度が高くなるにつれてtetrahedronの形成域は狭くなる傾向があった。(3)複円反射測角器を用いてintermediate formの結晶の面指数を測定したところ、この形は{111}と{100}から構成されていることがわかった。結晶の形は、たとえ同一種の結晶であっても様々な形で成長する。本研究ではNaBrO_3を試料として結晶の形(晶相)が成長条件によってどのように変化するかを調べてきた。このテーマは成長の素過程に関連した興味ある問題であると同時に工業的にもまた地球科学にとっても重要なテーマである。本年度はこの科学研究費の最終年度にあたる。いままでに(1)ノンドープの水溶液からの成長における晶相変化、(2)酢酸1.15mol.%ドープおよび(3)酢酸2.8mol.%ドープの場合に就いて研究してきたが、本年度は酢酸ナトリウム1mol.%ドープの場合に就いて研究した。不純物としてこれを選んだ理由は、酢酸を不純物とした場合にはこれの一部がNaBrO_3と反応して、少量の酢酸ナトリウムが生成されることがわかり、どこまでが酢酸の不純物効果で、どこからが酢酸ナトリウムの効果なのか区別できなったからである。つまり酢酸ナトリウムだけの効果を調べる目的で研究を行った。