hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ASPAC再考:アジア地域主義の一事例として

本研究は、ASPACの発足、ASPACの閣僚会議や常任委員会で行われた加盟国の地域協力のあり方を巡る協議、ASPACおよびその下部機関で実際に行われた活動、さらに米中和解を直接的契機としてASPACが機能停止に至る過程を改めて一次資料を用いて明らかにすることを目的としている。今年度は最終年度であるが、引き続き資料収集作業とその分析作業を行った。オーストラリア国立公文書館において、ASPACに関わる様々な資料が新たに公開されていたことが確認されたからである。この度の調査で改めてわかったことは、いくつかある。まず、ASPACを巡る各国の動きは、ASEAN、SEAARC,APOなど当時存在していたその他の様々な国際組織における各国の動きとの関連を考察しなければいけないということである。今後、ベトナム戦争やグアムドクトリンの発出、米中和解など、当時の様々な動向が、いかにアジアにおける諸地域主義に影響を及ぼしたか、という広い文脈の中でASPACを位置づける必要がある。もう一つは、1972-73年の動向についてである。この時期、日本とオーストラリアを中心として、ASPACに代わる組織の設立を模索していたことを示唆する資料がいくつか存在している。単にASPACに見切りをつけ、そこから実質的に脱退していくのみならず、新しい状況に対応した形の地域組織を志向する動きが両国にみられたことは非常に興味深い。さらにこの時期には、フィリピンによりAsian Forumが開催されるなど、東南アジア諸国から地域主義への動きが活発化した。ASEANが事実上政治協力を強化する時期とも重なり、この70年代初頭の動きを追うことは、単にASPAC研究や地域主義研究という観点からではなく、東南アジアにおける国際政治史の観点からも意義があると思われる。今後、この時期についての検討もさらに深めていく必要がある。平成20年度は最終年度であったが、上記のような新たな問題意識のもと、今後も研究を進めていく所存である。予定がかなりずれ込んでいるが、この三年間で得た成果は、論文や研究ノートの形でなるべく早くまとめるつもりである。本年度は、これまでキャンベラのオーストラリア国立公文書館において入手したASPACに関する一次資料を整理し、改めて精読することで、入手済みの資料によって、ASPACの発展および活動に関する事前調査に費やすことになった。本来ならば、本年度中にアメリカへの資料収集に向かう予定であったが、それよりも事前調査を十分に行い、効率的な海外調査を来年度以降に行うほうが研究を進める上で有益と考えた。また、1960年代から1970年代にかけてのアジア情勢、および当時の加盟各国の外交政策を扱った書籍、研究論文などの二次資料の収集に随時努め、事前調査をさらに充実させた。また、資料の目録のデータ化などの研究補助作業のため研究補助者の助けを借りた。今年度の事前調査により、アジアにおける地域主義の具現化の一例としてのASPACの概要についての仮説をある程度確認できたといえる。ASPACは、アメリカの対アジア政策の大きな影響下において形成されたという側面は否定できない。しかし、加盟各国がその制約された状況の中で、政治/経済/社会問題についての協議や具体的な協力を進めようという動きを見せていたことも事実であった。そしてどのように協議や協力を進めようとするかについては、様々な路線対立が存在していた。その際に特に注目すべきなのは、日本、オーストラリア、フィリピン、タイ、マレーシア、中華民国、韓国の動きである。またASPACにおける「アジア太平洋」という「我々」=「地域」の紐帯は、明らかに外部の敵としての中国を意識したうえでのそれへの対抗という要素を強く含んでいた。しかしこうした各国の中国への脅威認識や域内協力についての思惑が、アメリカの意思をどれほど忠実に再現し得るようなものであったかは疑わしい。よって、ASPACをアメリカの「下請け」と単純化するのは誤りであろう。ASPACの展開を規定していた(1)アメリカの対アジア政策(2)中国の動きに対する各国の認識(3)あるべき域内協力についての上記主要加盟国の認識の三つがどのように絡み合っていたか、さらに明確にする必要がある。

さらにこの時期には、フィリピンによりAsian Forumが開催されるなど、東南アジア諸国から地域主義への動きが活発化した。ASEANが事実上政治協力を強化する時期とも重なり、この70年代初頭の動きを追うことは、単にASPAC研究や地域主義研究という観点からではなく、東南アジアにおける国際政治史の観点からも意義があると思われる。今後、この時期についての検討もさらに深めていく必要がある。平成20年度は最終年度であったが、上記のような新たな問題意識のもと、今後も研究を進めていく所存である。予定がかなりずれ込んでいるが、この三年間で得た成果は、論文や研究ノートの形でなるべく早くまとめるつもりである。
成人の自閉性障害とアスペルガ-障害の診断補助尺度日本版作成と信頼性・妥当性の検討

自閉性障害とアスペルガー障害は、社会的交流の障害・言語理解の障害・興味の対象の制限を臨床的特徴とする乳幼児期発症の精神神経疾患である。近年、凶悪犯罪を犯してしまった自閉性障害及びアスペルガー障害の成人の存在が、両障害に対する社会の関心を高めてきた。両障害ともに、幼児期においての診断が可能ではあるが、微かな兆候である場合は観過ごされ易く、言葉の遅れが目立たない場合は、成人に至るまで未診断のままということがありうる。その背景には、絶対的に不足している児童精神科医の数のみならず、時間がかかる成人の成育歴聴取や、マンパワーに余裕のない臨床現場といった実情も挙げられる。そこで、成人における自閉性障害やアスペルガー障害の可能性を、高い精度で評価出来、自宅や臨床現場における限られた時間内で、簡便に自己記入できる診断補助ツールの開発をすべく、米国のRitvoらが作成した診断補助ツールRitvo Autism-Asperser's Diagnostic Scale(RAADS)の日本語版作成に着手した。まず、pilot studyとして、RAADSを研究代表者が邦訳後、日英バイリンガルの精神科医が文章校正を行った上で、back-translationを翻訳業者に委託した。2名の翻訳者(内1名はnative-speaker)が英訳した内容をRAADS元版作成者のRitvoに返信し、内容の確認を行いつつ適宜修正を加え、これをRAADS-J(仮)とした。RAADS-J(仮)を、自閉性障害もしくはアスペルガー障害の診断がついている18歳以上の男性6名(ASD群)と、control群としての大学生49名に施行し、結果を分析した。ASD群の6名の総得点は全てcut-off値を超え、ASD群とcontrol群において、RAADS-J(仮)の総得点には有意差が認められた。また、RAADSの3つの下位領域[social relatedness/language and communication/sensorimotor and stereotypes]における内部一貫性も十分に保たれていることが確認された。この3つの下位領域毎の得点も、ASD群とcontrol群において有意差が認められた。その一方で、21個の質問においては、2群間を有意に区別するに至らなかった。そこで、次年度は、より理解し易いように更なる邦訳の修正をすべく、研究分担者・協力者とdiscussionを行い、modified RAADS-Jを作成する予定とした。研究分担者・協力者とdiscussionを行いながら邦訳の修正を重ねた結果、尺度の内的一貫性はoriginal同様に保たれていることが判明し、21項目の項目において、臨床群とcontrol群の得点に有意差がみられた。pilot studyの結果を踏まえ、米国と日本の文化差を考慮した邦訳修正後に、邦版RAADS(RAASD-J)を完成させ、再度、自閉性障害・アスペルガー障害の臨床群と、健常群、他の精神障害(統合失調症・不安障害・気分障害)もつ3群の成人にRAADS-Jを施行した。基準関連妥当性検討の為に、参加者はAQ-Jにも記入することが求められた。また、RAADS-Jは尺度の信頼性検討の為に、4週間後に再び3群に対して施行された。その結果、pilot study同様に、RAASD-Jの内的一貫性・再施行に拠る回答の信頼性・AQ-Jとの基準関連妥当性が支持された。また、自閉性障害・アスペルガー障害の臨床群と、健常群において、RAADS-Jの総得点に有意差がみられたことから、成人を対象とした自閉性障害・アスペルガー障害の診断補助を目的に、アセスメントの一環としてRAASD-Jを用いることが可能となった。
神経回路の成熟と特異的機能発現のメカニズム

神経回路の成熟と特異的機能発現のメカニズム(略称「神経回路」)総括班では、6年間の特定領域研究を締めくくる研究班会議を京都で開催した(平成17年1月26-28日)。現在の研究班員83名全員が発表した。各班員の研究成果は、班友および平成12年度以降、一時的に研究班に参加した公募研究者も含めて冊子体の研究成果報告書にまとめた。なお、こうした班員の多くが班会議には参加し、活発な討論が行われた。総括班会議を、同班会議の終了後開催した。4名の評価委員が総括班会議に参加し、様々な角度から、神経回路研究の現状と将来展望を討議した。神経回路は神経科学の中でも、分子的なアプローチと、高次脳機能に象徴されるシステム的なアプローチの両方の研究を展開することのできる場であることを、改めて認識し、将来ともに活発な研究を展開できる研究領域であるとの評価を得た。総括班では、神経回路という特定領域研究を過去5年間に亘って進めるに際しては、この領域を単に研究費を配分するだけの役割に留めず、班員相互間の良いコミュニケーションに支えられた研究者のフォーラムとすることを目的としてきた。今回、研究班会議を開催し、さらに研究報告書をまとめるに際して、非常に多くの共同研究が行われていることが明らかとなった。また、こうした共同研究が研究領域内に留まらず、さらに多くの共同研究が研究領域外の研究者との間で行われていることも明らかとなった。こうした意味においても、本特定領域研究は、実質5年間の研究期間内に十分な社会的役割を果たし得たものと確信することができた。本特定領域研究(A)「神経回路の形成と特異的機能発現のメカニズム」(略称、神経回路)では4つの研究項目を立てて、神経回路の形成、成熟そして機能発現のメカニズムを、分子的な立場と機能的な立場からアプローチする方針である。分子的立場からは、新しい分子を探索しその働きを明らかにするための研究を進める。機能的な立場からは、神経回路の形成と機能発現のメカニズムを明らかにする為の研究を進める。こうした研究は相互に密接に関連したものであり、研究相互の連絡を緊密に図ることを考えている。こうした意図のもとに総括班は特定領域研究「神経回路」発足の研究会と総括班会議を京都で開催した(芝蘭会館、平成12年1月22日)。計画研究代表者21名全員によるこれまでの研究成果の概要と今後の研究方針の発表を聞くと共に今後の本特定領域研究の進め方を議論した。個々の計画研究課題を検討した結果、現時点で特に取り上げるべき研究推進上の問題点はなく、むしろすべての研究計画が非常に魅力的でありかつ強力な研究能力を持った研究者によって進められていることが明らかとなった。また、本特定領域研究を運営する方策として次のことを議論した。(1)インターネットを活用した連絡体制を整備し、研究上の具体的な情報を班員間でできるだけ共有する。この為のサーバーを群馬大学医学部に設置した。(2)さらに総括班が主催するシンポジウムおよびワークショップをそれぞれ夏・冬に開催するが、ここでは特定領域研究(A)「総合脳」との共催も考え、2つの特定領域研究を協調的に進めることが提案され積極的に可能性を探ることとした。本特定領域研究(A)「神経回路の成熟と特異的機能発現のメカニズム」は、発足以来始めて研究費を配分し本年度は実質的な研究を開始した。それぞれの班員の研究内容は個々の実績報告書にゆだねる。総括班としては、夏に札幌で班会議およびワークショップを開いた。班会議では公募班員を対象として詳細な研究発表を行い、活発な議論があった。おのずから優れた研究とそうでない研究が明らかになり,来年度以降の班員の公募及び班の運営に非常に大きな指針となった。ワークショップは神経回路機能の解析に画像技術をどのように応用するかを主たるテーマとして、GFPから内在性光信号の解析までの広い範囲でアメリカから1名、研究領域外から1名、班員及び班友それぞれ1名の講師が講演した。全体として非常に充実した会を持つことができた。さらに、冬のシンポジウム及び班会議は東大文学部で行った。シンポジウムはA04班が主催し、関連する特定領域研究である「総合脳」と共催した。アメリカおよびカナダからそれぞれ1名と班員3名の講師による、学習と分子機構を主たるテーマとしたシンポジウムであった。討論が活発であり、刺激的な会であったと参加した評価委員からのコメントが得られた。班会議は計画班員を中心として発表があり、こちらも多くの討論があって充実した会であった。本特定領域研究では、年2回の班会議およびシンポジウムあるいはワークショップを来年度以降も継続して開くが、その際の連絡の全てを群大に設置したサーバーによるインターネットおよびe-mailで行っている。基本的に印刷物は発行していない。今年度は多少のトラブルがあったものの、抄録集の発行を含めて充分に活用できた。事務的経費を極端に減少させるごともでき有意義であると考える。次年度以降も、インタ-ネットの利用を主とした班の運営を行い、他の研究領域との協力も積極的に進めて行きたい。本特定領域研究(A)「神経回路の成熟と特異的機能発現のメカニズム」は、夏(札幌)・冬(東京)2回の班会議と冬のシンポジウム「Plasticity and integrative functions of neural circuits」(東京)を開催した。

本特定領域研究の本来の目的を推進することに加えて、特定領域研究の社会的役割として班員相互間の研究協力体制を整備する事を重視した運営を今年度と来年度は試みている。本研究領域は分子から機能に及ぶ4つの研究項目で構成され、研究の手段も対象も事にする多数の班員で構成されている。こうした多岐にわたる研究手段を持つ班員が共同して研究を進めることが本研究領域を進める上で重要である。そのためにはお互いの研究内容を正確に理解することが必要であると考え、班会議は全員参加の下に個々人の研究発表を充分な時間をかけて行い討論している。H13年度末にアンケート調査を行ったところ、多数の班員がこうした班会議の開催方法に好感を示し自身の研究領域あるいは科学的な興味が広がったことを述べている。さらに共同研究も具体的に開始されており、その中には成果が得られた研究も出始めている。冬のシンポジウムは米国からの参加者1名を含む、5名が講演した。皮質バレル構造の形成、眼優位性カラム形成の臨界期におけるGABA受容体の働き、逆行性シナプス修飾機構、失語症と関連した皮質の可塑性、そして内在性蛍光シグナルを用いた神経活動の解析など、神経回路の可塑性と統合機能を中心課題としてまとまりのある講演が行われた。講演は英語で行われたが、大学院生をはじめとする若手研究者からの質問・討論も多く、非常に活気のある会となった。なお、アンケート調査では日本人が大多数であるこのような会で英語の講演・討論を行うことに関しては批判的な意見もあり、今後の立案に際して参考にしたい。「神経回路」総括班は、夏の班会議および冬のシンポジウムを主催した。夏の班会議では1人20分の講演発表、及び本年度からポスター発表を加えた。班会議に出席した評価委員からは若手の研究者を中心に意欲的な研究が多数見られるとのポジティブな評価が得られた。アンケート調査の結果、AO3の分子の探求を目的とする研究班を核として、情報・実験素材(KIおよびKOマウス、抗体、クローン)の提供、実験手技の伝授など多数の共同研究が実施されていることも明らかになった。秋のヒアリングにおいてはポジティブな一定の評価がえられている。しかし、「神経回路」が掲げている「分子から脳高次機能の関連を明確にする」という目的が具体化できるのかが今回の発表では不明確であることと、計画班員に関する評価を厳しくし、成果の上がっていない班員に関しては今後の成果を期待したい。」とのコメントもあった。こうした評価を受けて、今後、特に計画班員の研究発表を中心として班会議を一層充実させる必要のあることが認識され、次のH15年度夏の班会議から実施する予定である。冬のシンポジウムは、「神経回路」の成果を社会に広くアピールする目的で演題を絞り優れた研究を紹介した。多くの参加者が有り盛会であった。さらに、「神経回路」の研究成果の中間発表として蛋白質・核酸・酵素の増刊特集号を発行することになった。また、他の特定領域研究との連携を進める目的で、先端脳の研究グループとの間で柔軟性を持った新しい研究領域創成の可能性の議論を進めた。神経回路総括班では、夏の班会議を札幌で、冬のシンポジウムを東京で開催した。夏の班会議では、班員全員が発表した。
発光物質の生成反応を利用した糖尿病重症化のバイオマーカー簡便定量法の基盤構築

日本国内には生活習慣の乱れにより発症する2型糖尿病の患者が1000万人いると推計されている。2型糖尿病は重症化すると様々な合併症を引き起こし、患者とその家族の生活の質を低下させることにつながる。2型糖尿病の重症化を防ぐ方法の一つは、2型糖尿病の重症化の予測に資する糖代謝産物の体内での量を指標に、重症化の予防策をとることである。しかしながら、臨床レベルでの利用に適した取扱いが容易な機器を用いる糖代謝産物の定量法は確立されていない。そこで本研究では、安価で容易に取り扱える機器により検出できる化学発光という現象を利用した、2型糖尿病の重症化の予測に資する糖代謝産物の簡便な定量法の基盤構築を目指す。
大脳皮質における層特異的な神経回路形成を担う分子機構に関する研究

発生期の大脳皮質において視床軸索は標的である4層で特異的に枝分かれを形成しシナプス結合を作る。この層特異的な神経回路の形成機構を明らかにするために、特定の層に発現する分子を探索する過程において、EphA4レセプターが表層に発現すると共に新皮質に投射する視床部位に非常に特異的に発現することが分かった。本研究では、領域特異的・層特異的な視床-皮質投射の形成におけるEphシステムの関与を明らかにすることを目的とした。まず、EphA4レセプターに対するリガンドが、視床軸索の標的認識を制御する可能性を検討するために、発生期ラットの大脳におけるephrinリガンドの発現分布をin situハイブリダイゼーション法により解析した。その結果、リガンドの一つであるephrin-B3が大脳辺縁系において強く発現することがわかった。さらに、大脳新皮質においては発現は弱いものの、視床軸索が投射する4層を除く2/3層、5層に顕著な発現が認められた。次に、ephrin-B3がEphA4を発現する視床外側部から発する軸索伸長に対してどのような影響を及ぼすかを調べるため、ephrin-B3をタンパク分子として発現させたCOS7細胞の膜分画を作製し、この膜分画上で視床組織を培養した。その結果、EphA4を発現していない視床内側部由来の軸索がその膜分画上で成長を示したのに対して、視床外側部由来の軸索は成長はわずかであった。以上の結果から、ephrin-B3がEphA4を発現する視床外側部の軸索伸長を抑制する作用をもっており、視床外側部から大脳新皮質への領域特異的な、また大脳新皮質において4層への層特異的な投射パターン形成に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
東アジアの地域主義と市民社会-争点志向型地域ガバナンスから東アジア共同体へ

東アジアおける市民社会によるトランスナショナルなネットワークの実体を実証的に把握し、それらが東アジアの地域主義と東アジア共同体の形成過程でいかなる役割を果たしてきたのかを明らかにした。基盤C東アジアおける市民社会によるトランスナショナルなネットワークの実体を実証的に把握し、それらが東アジアの地域主義と東アジア共同体の形成過程でいかなる役割を果たしてきたのかを明らかにした。本年度は、環境保護の分野の市民団体のフォローアップに努めるとともに、2年目の研究対象である安全保障の分野の市民団体の調査にも可能な限り取り組んだ。本研究の第1の目的である市民社会の実態把握に関しては、ほぼ計画通りに進んだと言える。マレーシア、シンガポール、インドネシア、韓国、台湾で現地調査を行い、環境保護だけでなく安全保障の分野で活動する代表的な市民団体の指導者とスタッフに聞き取り調査を行い、市民団体の活動実態についての有益な情報と膨大な一次資料を入手した。現地調査を行えなかった国(タイ、フィリピン、中国、モンゴルなど)については、2年目にあわせて調査を行う予定である。研究成果としては、まず『東アジアの中の日本-環境・経済・文化の共生を求めて』の中で「東アジア共同体の共生空間と市民社会の地平」という論文を公表した。同論文は、環境保護と安全保障の分野で活動する市民団体の意義を東アジアの共生という視座から検討したもので、本研究課題の予備的論稿と位置づけられる。環境保護については、関連するシンポジウムやワークショップへの参加を通じて得た知見をもとに、「東アジアの環境ガバナンスと市民社会」と題する論文を執筆中であり、今後、学会誌などに投稿する予定である。なお、学会のテーマ性との兼ね合いから、10月に開催された北東アジア学会で「東北アジアの紛争予防と市民社会一GPPACを中心とする下からの地域安全保障共同体の可能性」と題する報告をした。同報告については、今後の現地調査を踏まえて、学術論文として学会誌などに投稿する予定である。また、調査を通じて東アジア共同体形成では市民社会ネットワークに労働組合が積極的に参加するようになっていることが明らかとなった。この関係で、『北東アジアにおける労働組合の国際交流の役割』と題する報告書の中で韓国の労働組合に関する論文を公表した。本年度は、紛争予防に関わる市民団体への聞き取り調査に取り組むことが目的であった。この目的のために、東北アジアにおいては日本、韓国、中国、香港、モンゴルの市民団体への聞き取り調査と一次資料の収集を行った(台湾は前年度に調査を終了)。東南アジアについては、前年度にマレーシアとシンガポールの市民団体の訪問を行っていることから、今年度はフィリピン、タイ、カンボジアへの訪問を予定していたが、タイについては現地の事情から、カンボジアについては時間的制約から調査を断念し、最終年度に訪問することとし(インドネシアは前年度に調査を完了)、フィリピンでのみ現地調査を行った。研究成果としては、論文として「東北アジアの紛争予防とトランスナショナルな市民社会-GPPAC東北アジアプロセスに注目して」を完成させ、2010年1月に富山大学で開催された「東アジア共生課題研究会ワークショップ-地域からの「東アジア共生」へのアプローチを探る」で公表した。この成果を、4月以降にワーキングペーパーとして京都大学グローバルCOE「親密圏と公共圏の再編成をめざすアジア拠点」で公表した後、学会誌へ投稿する予定である。また、2009年12月に公表した「東南アジアの新しい地域秩序とトランスナショナルな市民社会の地平」『国際政治』第158号、は、急速に地域主義が発展する東南アジアの動向を先取りし、特集号にあわせて公表した論文であり、ASEAN共同体形成過程におけるトランスナショナルな市民社会の関与の実態を詳細に論じている。同論文では、最終節で出稼ぎ労働者の権利を含む人権の保護に従事する市民団体の動向を概観しており、これをさらに発展させ、人権に焦点を当てた調査を行う最終年度へとつなげる予定である。人権擁護に関わる市民団体への調査を目的とする本年度は、人権という枠組みの中で先鋭化する移民労働というイシューにも目を向けながら調査活動と研究活動に取り組んだ。その主たる成果として、10月30日に開催された日本国際政治学会のASEAN部会において、「ASEAN共同体形成におけるトランスナショナルな市民社会の地平-移民労働者をめぐる下からの『オルターナティブな地域主義」の可能性と限界-」と題する報告を行った。また、11月26日に開催された、京都大学大学院グローバルCOE「親密圏と公共圏の再編成をめざすアジア拠点」のコアプロジェクト研究会において、「東南アジアの移民労働者と市民的公共圏の再編-トランスナショナル市民社会の政策関与の実態と課題-」と題する報告を行った。いまだ十分に把握されていない市民社会ネットワークの実像とそれが創出する「下」からのオルターナティブな地域主義の効用を明らかにしたこれらの研究報告は、実証面で先行研究の隙間を埋めるだけでなく、国家中心的な既存の地域主義研究の理論面に修正を迫る性格を有する。また、同様の視点から、前年度の研究の焦点であった紛争予防に関わる市民社会ネットワークに関する成果を「東北アジアの新しい安全保障秩序とトランスナショナルな市民社会-批判的国際関係論の視座から-」と題する学術論文にまとめた。同論文は、現在学会誌に投稿中である。これらに加えて、関連する研究成果として、市民社会に関する理論的・実証的考察をフィリピンを事例として行った著書『民主化と市民社会の新地平-フィリピン政治のダイナミズム-』(早稲田大学出版部、2011年3月)を刊行した。基盤C
無細胞転写系によるチトクロ-ムpー450c遺伝子発現調節の分子機構の解析

チトクロ-ムpー450cはメチルコランスレン処理により誘導発現される。その誘導機構の主なものとして、細胞質に存る受容体にメチルコランスレンが結合した複合体が核内に移行して染色体上にあるチトクロ-ムpー450c遺伝子のエンハンサ-に作用して、その発現を転写開始レベルで促進することが考えられる。本研究の目的は、メチルコランスレンによる誘導発現機構を無細胞転写系を用いて分子レベルで解析することである。メチルコランスレン処理および未処理HeLa細胞から核抽出液を体製し、両者の転写活性を比較して得られた結果は、メチルコランスレン誘導発現が部分的ではあるが無細胞転写系で確認出来た。エンハンサ-の効果は検出できなかったが、プロモ-タ-内のー55か5ー44塩基対の領域がメチルコランスレン誘導発現に関与することが明らかになった。これまでの解析を通じて、遺伝子であるDNA上の特異塩基配列を認識し結合する転写因子を効率良く分離・精製することが必要となった。そこで、DNA結合性転写因子を簡便に精製する技術開発を試みた。従来、セファロ-ズレジンを支持体として特異塩基配列を含む人工合成DNA断片をそれに付加したDNAアフィニティカラムを用いていたが、非特異性タンパク質の混入が多く、核抽出液から直接に目的とする転写因子を精製することは困難であった。我々は支持体をラテックス粒子に交換した。ラテックス粒子を作製するに当り、非特異的吸着が低い素材を検討し、選択した素材からなる粒子にエポキシ結合により多量のDNA断片を粒子表面に結合した。このアフィニティ粒子を用いて、核抽出液から直接にいくつかの転写因子を精製することが出来た。このアフィニティ粒子を用いて、メチルコランスレンとその受容体複合体ならびにー55/ー44領域に結合する転写因子を分離・精製し、それら因子の生化学的解析を今後行う予定でいる。
比較発生学的解析による哺乳類大脳外套領域の進化起源の解明

羊膜類における大脳外套の形態的多様性の発生基盤を明らかにするため、本年度は哺乳類、爬虫類、鳥類の各系統に属する動物胚(マウス、ソメワケササクレヤモリ、スッポン、ニワトリ)の大脳外套領域におけるSonic hedgehogシグナル活性を伝達する遺伝子の発現解析をin situ hybridization法により行った。その結果、Sonic hedgehogの受容体であるPatched1はマウスでは外套下領域に限局して発現し、かつPatched2の発現は大脳元基ではまったく発現が観察されなかった。一方ニワトリ胚ではPached2の発現はマウスと同様に外套下領域のみで発現が見られたが、Patched2が予定DVR領域を含む腹側・外側外套で強く発現していた。またソメワケササクレヤモリやスッポンではPatched1が予定DVR領域で発現が確認された。さらにSonic hedgehogシグナルを検出するリポーターベクター(GliBS-dGFP)をソメワケササクレヤモリ胚の大脳に導入した結果、予定DVR領域でリポーターの活性を確認することに成功した。これらの結果より、爬虫類・鳥類胚では外套下のみならず外套領域でもSonic Hedgehogシグナルが活性化されていること、この活性化にはPatched1あるいはPatched2の種特異的な発現制御が関わっている可能性が示唆された。また本年度は、マウスおよびニワトリ胚の背側外套、腹側外套および外套下領域の神経前駆細胞の増殖分化率の違いについて、S期を標識するEdUのパルスラベルにより検討し、それぞれの領域における神経前駆細胞の動態を定量化した結果、特にマウス外套下領域とニワトリDVRにおける前駆細胞の動態の類似性を検出することができた。爬虫類、鳥類のDVRにおけるPatched1/2の特異的な発現を確認できたこと、爬虫類DVRにおけるhedgehogリポーターの活性が検出できたことにより、Sonic hedgehogシグナルのヘテロクロニックな変化が外套形態の多様性進化に寄与した可能性を裏付ける強固なエビデンスを得ることができた。これにより最終年度にSonic hedgehog経路の人的操作による表現型模写実験に移行できることが可能になったため。羊膜類の各系統の胚におけるSonic hedgehogシグナルを人為的に操作することにより、外套形態の表現型模写実験を試みる。具体的には、マウス腹側外套にSonic hedgehogあるいは受容体の恒常活性化型フォームであるSmoM2をエレクトロポレーション法により強制発現することにより、神経細胞の増殖・分化率の変化、さらにDVR様構造物の誘導がマウス胚で可能かを検討する。また、ソメワケササクレヤモリ、スッポン、ニワトリ胚の腹側外套にリプレッサー型Gli3をエレクトロポレーション法で強制発現しSonic hedgehogシグナルを阻害した場合、これらの胚におけるDVR構造が消失するかを検討する。また、こうした遺伝子操作によりそれぞれの種の外套の形態的変化が誘導された場合、視床からの入力線維の投射パターンの変化を軸索トレーサーを用いて検討する。さらに、種特異的な発現が観察されたPatched1およびPatched2のゲノム配列を比較し、エンハンサー領域の同定とその活性の種間差異についてリポーターアッセイにより検討する。ヒトを含めた哺乳類の大脳外套領域は高度に特殊化した形態と機能を備えているが、こうした神経解剖学的構造が進化の過程でどのようにして獲得されたのかは未だ明らかとなっていない。特に哺乳類の大脳に存在する大脳皮質、扁桃体、前障といった構造は、他の脊椎動物の大脳には観察されない独特の脳構造である。このような哺乳類大脳に固有の神経解剖学的構造が進化の過程でどのようにして獲得されたのかについては、多くの神経解剖学者が100年以上に渡り考察と論争を続けているが、未だに決着がついていない。そこで本研究課題では、哺乳類と非哺乳類(爬虫類、鳥類)の大脳初期発生過程の遺伝子発現や細胞の挙動について定性的、定量的な比較解析を行い、種に固有の大脳外套構造を生みだす発生学的基盤を明らかにすることを目標とする。本年度は哺乳類(マウス)、爬虫類(ヤモリ、カメ)および鳥類(ニワトリ)の発生期の大脳原基における遺伝子発現様式の比較とその機能解析を行った。特に、外套および外套下領域を区分する転写因子であるPax6についてその発現様式と機能解析を行ったところ、哺乳類と鳥類の外套神経前駆細胞の増殖・分化率における種特異的なPax6の機能を同定することに成功した。また、羊膜類の外套におけるShhとその受容体であるPtchdの発現を種間で比較した結果、受容体の発現様式とDVRの領域が一致することを見出した。さらに、Shhシグナルを伝達する主要な転写因子であるGli3の抑制型変異体を鳥類大脳で強制発現したところ、鳥類のDVRの隆起が消失することを見出した。これらの結果から、爬虫類、鳥類の外套に独特な構造であるDVRはShhシグナルの時間的・空間的な発現変化によって引き起こされた可能性が考えられた。脊椎動物の外套領域に普遍的に発現する転写因子Pax6の種特異的な機能について、遺伝子強制発現やゲノム編集ツールを用いて明らかにすることができた。また、Shhシグナル分子の種特異的な発現と外套形態の多様性との間の因果関係を示唆するデータを得たことにより、大脳皮質と扁桃体の進化過程の基盤を理解する上での足がかりを掴んでいる。

羊膜類における大脳外套の形態的多様性の発生基盤を明らかにするため、本年度は哺乳類、爬虫類、鳥類の各系統に属する動物胚(マウス、ソメワケササクレヤモリ、スッポン、ニワトリ)の大脳外套領域におけるSonic hedgehogシグナル活性を伝達する遺伝子の発現解析をin situ hybridization法により行った。その結果、Sonic hedgehogの受容体であるPatched1はマウスでは外套下領域に限局して発現し、かつPatched2の発現は大脳元基ではまったく発現が観察されなかった。一方ニワトリ胚ではPached2の発現はマウスと同様に外套下領域のみで発現が見られたが、Patched2が予定DVR領域を含む腹側・外側外套で強く発現していた。またソメワケササクレヤモリやスッポンではPatched1が予定DVR領域で発現が確認された。さらにSonic hedgehogシグナルを検出するリポーターベクター(GliBS-dGFP)をソメワケササクレヤモリ胚の大脳に導入した結果、予定DVR領域でリポーターの活性を確認することに成功した。これらの結果より、爬虫類・鳥類胚では外套下のみならず外套領域でもSonic Hedgehogシグナルが活性化されていること、この活性化にはPatched1あるいはPatched2の種特異的な発現制御が関わっている可能性が示唆された。また本年度は、マウスおよびニワトリ胚の背側外套、腹側外套および外套下領域の神経前駆細胞の増殖分化率の違いについて、S期を標識するEdUのパルスラベルにより検討し、それぞれの領域における神経前駆細胞の動態を定量化した結果、特にマウス外套下領域とニワトリDVRにおける前駆細胞の動態の類似性を検出することができた。爬虫類、鳥類のDVRにおけるPatched1/2の特異的な発現を確認できたこと、爬虫類DVRにおけるhedgehogリポーターの活性が検出できたことにより、Sonic hedgehogシグナルのヘテロクロニックな変化が外套形態の多様性進化に寄与した可能性を裏付ける強固なエビデンスを得ることができた。これにより最終年度にSonic hedgehog経路の人的操作による表現型模写実験に移行できることが可能になったため。外套領域の神経前駆細胞の細胞周期と神経分化率の種間比較哺乳類、鳥類、爬虫類の外套領域の神経前駆細胞の増殖と分化頻度を解析するため、DNA合成時に取り込まれるチミジン同位体(BrdUあるいはEdU)による積算標識法あるいは二重標識法により、神経前駆細胞の細胞周期を免疫組織化学的手法により解析する。また、Taliイメージングサイトメーターを用いて個々の細胞のDNA含有量からG1/G0 - S - G2/M期の細胞の割合を定量化する。さらに、蛍光リポーター発現遺伝子の導入によって神経前駆細胞を標識した脳標本をスライス培養し、タイムラプス観察を行うことで前駆細胞の分裂頻度や子孫細胞の運命を解析する。シグナルカスケード・リポーターによるモルフォジェン応答活性の種間比較外套領域の神経前駆細胞の予定運命や増殖・分化率を決定する機構を探るため、大脳原基の局所的シグナリングセンターより分泌されるモルフォジェンであるSonic hedgehog (Shh)の発現量と外套における受容領域の種間比較を行う。
下部尿路症候における脊髄内の神経可塑性変化について-特に抹消組織内の神経成長因子と脊髄内のproto-oncogeneの発展について-

1.下部尿路臓器(膀胱、前立腺、外尿道括約筋)に対する急性の侵害刺激の後、脊髄内に発現するproto-oncogene由来蛋白c-Fosは、3臓器においてその発現部位がほぼ同様であった。またこれらへの急性侵害刺激後のplasma extravasationも、その発現皮膚領域は同様であった。したがって侵害刺激下においては、これらからの求心性経路には共通性があることが推察された。2.膀胱に対する慢性的侵害刺激により、脊髄内ではsubstance Pおよび、NK1受容体の染色性の増強が認められた。Substance Pは、主として一次求心性線維由来であり、NK1受容体は脊髄内の受容ニューロンに存在するため、慢性的な侵害刺激が脊髄内のsubstanceP-NK1受容体系の機能昂進をもたらす可能性が示唆された。3.前立腺に対する急性侵害刺激により、脊髄内でのsubstance Pの染色性が増強した。このことは前立腺においても侵害刺激の伝達物質としてsubstance Pが役割を担っていることを示すものと考えた。更にこの染色性の増強は、交感神経α遮断薬により、その程度が減弱した。この現象は前立腺の炎症においては、交感神経系が一定の役割を果たしていることを示している。4.下部尿路に対する侵害刺激により発現するc-Fosは、同時に第一仙骨孔からの電気刺激を加えることにより、その発現が電気刺激単独と変化のない数となることが判明した。このことは電気刺激により、下部尿路からの侵害性入力がマスクされてしまうことを示し、電気刺激が下部尿路症候に有用である理由の説明となり得るものと考えられた。現在までの検討で以下の点が明らかとなった。1.前立腺・膀胱・外尿道括約筋の急性化学的刺激(侵害刺激)により、脊髄内で誘発されるC-Fosの分布は、何れの臓器においてもほぼ同様であった。したがって、侵害刺激時にこれら臓器から入力される侵害情報は、その神経路に重複を認める可能性があること。2.同様に、前立腺・膀胱の化学的侵害刺激時においては、neurogenic plasma extravasationの皮膚分節における分布がほとんど同様であった。従って1.と同じくこれら臓器からの侵害性求心路には重複を認める可能性が高いこと。以上より、骨盤内のいずれかの臓器からの侵害刺激が、neurogenic inflammationを介して、他の臓器の機能に対しても影響をおよぼす可能性があること。3.慢性的な下部尿路刺激(cyclophosphamide cystitis)後においては、脊髄内でsubstance PおよびNK1レセプターの免疫染色における染色性が増強した。したがって下部尿路の慢性刺激により、脊髄内ニューロンの侵害刺激に対する反応性に機能的昂進が生じ得ること。これが下部尿路症候の原因となり得ると考えられる。4.慢性的下部尿路刺激によっても脊髄内のnNOS陽性ニューロンの染色性や数には変化を認めなかった。このことは、慢性的下部尿路刺激症状の維持に対して、NOS系は大きな意義を持たない可能性が示唆された。またこれらへの急性侵害刺激後のplasma extravasationも、その発現皮膚領域は同様であった.したがって侵害刺激下においては、これらからの求心性経路には共通性があることが推察された。Substance Pは、主として一次求心性線維由来であり、NK1受容体は脊髄内の受容ニューロンに存在するため、慢性的な侵害刺激が脊髄内のsubstance P-NK1受容体系の機能昂進をもたらす可能性が示唆された。

更にこの染色性の増強は、交感神経α遮断薬により、その程度が減弱した。この現象は前立腺の炎症においては、交感神経系が一定の役割を果たしていることを示している。4.下部尿路に対する侵害刺激により発現するc-Fosは、同時に第一仙骨孔からの電気刺激を加えることにより、その発現が電気刺激単独と変化のない数となることが判明した。このことは電気刺激により、下部尿路からの侵害性入力がマスクされてしまうことを示し、電気刺激が下部尿路症候に有用である理由の説明となり得るものと考えられた。
薬草の栽培利用を活用したまちづくりの認知症予防効果に関する実証的研究

薬用植物の栽培活用は、社会交流、脳の刺激、そして中低強度の身体活動を日常的にもたらしている可能性がある。農村地域在住の65歳以上の高齢者を対象にインタビュー及び質問紙調査を行い、社会関係資本や認知機能に与える効果を質的及び量的に検証した。結果、町による栽培活用の普及振興事業は、多様な知識や技術を持つ住民同士を結びつけるネットワークとして機能しており、個人およびグループで薬用植物の栽培加工利用に関わることで構造的ソーシャル・キャピタルを強化できる可能性が示唆された。さらに薬用植物の栽培加工利用に興味を示したものの自宅で実践できていないものは、認知症のハイリスク群である可能性が示唆された。本研究は、涌谷町が2012年より復興総合計画の一つとして取り組んでいる薬用作物の栽培利用の促進がソーシャルキャピタルの醸成と認知症予防に与える影響を検証することを目的としている。本年度は、ソーシャルキャピタルの醸成過程について既存質的・量的データを用いて上記の検証を行った。町と協働して栽培利用促進活動に従事している自主グループ及び支援者に対する聞き取りデータからは、都市部に比較的多く見られる橋渡し型ソーシャル・キャピタルを形成していることが示唆された。また、生薬まちづくりのイベントに積極的に参加している高齢者は、全くまたはあまり参加していない高齢者と比べて、生活機能や年齢に関わらず、地域の人々は親切であると思う割合、町の人々の交流が活発であると思う割合、楽しいお祭りやイベントがあると考える思う割合が高く、ソーシャル・キャピタルの醸成に寄与していることが示唆された。健康面については、薬用作物を用いて自身の日々の生活における健康管理意識を高めることが、支援者による各イベントの目標設定及び参加者に対する聞き取りから示唆された。認知機能検査及び質問紙を開発し、自治体と連携して実施するためのロジスティックが整った。質的分析についてもベースラインの分析は終了し、現在フォローアップ聞き取りの準備が進行中である。目標としている研究課題を期間内に遂行できると考えている。医療過疎化・少子高齢化が進行する農村部を中心に全国各地で普及振興している薬用植物の栽培加工利用は、日常的に五感を刺激する他、身体活動、緑黄色野菜の摂取、互恵的地域コミュニティの醸成を促すことが示唆されており、認知症を予防する可能性がある。今年度本研究では、地域住民に薬用植物の栽培加工利用を促進している農村地域の自治体と協働し、65歳以上の高齢国保住民全員に健康推進員を通じて自記式郵送式質問紙を配布した。質問紙では、自宅及び地域協働による薬用植物の栽培加工利用状況、日常生活における主観的物忘れの訴えのほか、年齢や性別、教育歴等の基本特性、身体活動や食習慣、地域住民との交流や帰属意識を測定した。合計1722票の有効回答票と1039件の認知機能検査結果が得られた。質問紙及び認知機能検査双方に参加したものは481名であった。施設入居者及び認知症患者を除外して解析した結果、日常的な物忘れ及び軽度認知障害の疑い者が、高年齢層(後期高齢者vs前期高齢者)と低教育歴層(12年未満vs12年以上)において多く観察された。薬用植物の栽培加工利用状況については、自宅にて個人で行っている人が56.5%、グループで行っているものが3%であった。年齢や性別、教育歴を調整し、自宅及び地域協働による薬用植物の栽培加工利用状況と自覚的な記憶障害の訴え及び客観的な認知機能障害との関連性を検証したが、統計的に有意な関連性は見られなかった。地域在住の65歳以上の高齢者住民に対して、特定健診/後期高齢者健診会場にて認知機能検査を実施すると共に質問紙を配布し、薬用植物の栽培利用活動、ソーシャル・キャピタルそして認知機能の関連性について量的に分析する。また薬用植物の栽培利用活動を熱心に行っている自主グループに対して経年変化を踏まえた聞き取りを行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。公衆衛生学29年度が最終年度であるため、記入しない。
神経接着分子L1のメンブラントラフィックにおける糖鎖修飾の役割

細胞間接着現象は、脳の形態形成や記憶・学習などの高次機能において大変重要な役割を果たしている。神経接着分子であるL1は、細胞表面に局在する膜貫通型のN-型糖タンパク質で、神経軸索形成や細胞接着といった生理機能の制御を司っている。一般的に糖鎖修飾された接着分子は、その糖鎖を介して様々な接着分子との相互作用が行われていることが知られているが、L1におけるN-型糖鎖修飾の生理学的な機能については不明である。大変興味深いことに申請者は、水頭症などの重篤な脳神経疾患の発症に至ることが知られるL1変異体の中に、N-型の糖鎖修飾が行われず細胞膜表面に輸送されないものがあることを見出した。実際にL1のN-型の糖鎖修飾を抑制するような薬剤(ツニカマイシン等)存在下で培養細胞に処理すると、細胞膜表面にほとんど発現できずに、細胞内のゴルジ体やエンドソーム内に異常に蓄積していた。これらのことはN-型糖鎖修飾されることがL1の細胞内メンブラントラフィックに大変重要であることを示唆している。さらにこうした変異体は、高分子量の凝集体を形成し、リジン63で繋がったポリユビキチン化修飾が野生型に比較して異常に亢進されていた。即ち、水頭症などの原因となるL1変異体は、細胞内での正常な糖鎖修飾が行われていないために、コビキチン化修飾された後、ゴルジ体からエンドソームを介して最終的にリソソームで分解除去されているというとが考えられた。そこで申請者はL1を糖鎖修飾するタンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッドシステムを行った。しかしながらL1と相互作用すると知られているクローン以外、目的とする糖鎖修飾関連酵素は同定できず、今後の研究課題として残された。神経接着分子L1は、免疫グロブリンファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質である。L1の細胞外ドメインには、6個のイムノグロブリン様ドメイン及び5個のタイプIIIフィブロネクチン様ドメインがあり、細胞内ドメインには、様々なジグナル伝達会子と相互作用するためのシグナルペプチド配列がある。神経発生段階において、L1ほその細胞外ドメインを介してL1同士あるいはインテグリン等との相互作用により、神経軸索形成や神経細胞運動などの機能を担っている。実際に140種類以上のヒトL1遺伝子のミスセンス変異により水頭症などの重篤な脳神経疾患の発症に至ることが知られているが、その作用機序は不明である。そこで私はこれら重篤な症状を引き起こすL1遺伝子変異体(およそ30種類ほど)を神経細胞内に発現させた結果、12種類ほどの変異体が、細胞膜に局在できずERやゴルジ体などの細胞内小器官に蓄積し、細胞接着能を失っていることを明らかとした。興味深いことに、L1は神経軸索特異的な局在を示すが、これら変異体は、軸索特異的な局在を示さず樹状突起や細胞体に局在した。これらに変異体に共通して確認されたタンパク質レベルでの変化としては、トランスゴルジ体での糖鎖修飾が全く行われずにポリユビキチン化修飾を受け、凝集体を形成していることが確認された。これら糖鎖修飾されなかった変異体のほとんどは、L1の細胞外ドメインにあるタイプIIIのフィブロネクチン様ドメインに点変異の入った変異体であった。このようにL1の糖鎖修飾め異常により、細胞膜への分泌経路が阻害され神経軸索に局在化できないために重篤な神経疾患を引き起こすことが考えられた。現在、フィブロネクチンtypeIIIドメインと相互作用するタンパク質分子のスクリーニングを行い、分泌経路における糖鎖修飾の役割の解明を目指していている。
果実発育・成熟関連遺伝子の完全長cDNA配列と選択的スプライシングの網羅的解析

第3世代の次世代シークエンサーの普及により,ゲノム解読だけではなく転写産物の解読に利用されている.本研究ではメロン果実のIso-seq解析を行い,完全長cDNA配列と選択的スプライシングについて解析を行った.3つの異なる方法で完全長cDNA配列ライブラリーを構築し,PacBioとNanoporeを用いて配列解読を行った.得られたIsoformをメロンゲノムにマッピングして比較した結果,PacBioの解読では約6,500遺伝子座,Nanoporeの解読では12,000の遺伝子座からの転写産物が得られた.そのうち,509遺伝子座が新規の遺伝子座であった.Illumina社のHiSeqに代表される第2世代の次世代シークエンサー(NGS)の登場により,ゲノム,トランスクリプトーム研究は劇的な変化を遂げた.HiSeqでは1度の解析でGbp単位のデータが得られ発現解析には適しているが,リード長が100 bp前後と短く遺伝子配列を明らかにするにはリードをつなぎ合わせるde novo assemblyが必要である.しかし,高等生物では1遺伝子座から多数のsplicing variantsが転写されるため,transcriptomeであっても,de novo assemblyは困難である.近年,PacBioやNanopore社などから10 kbp以上の長鎖を解読可能なシークエンサーが発表され,Iso-seqと呼ばれる転写産物の解析がモデル生物では盛んになってきた.そこで,本研究では園芸作物であるメロンやカキなどでIso-Seq解析とHiSeqを利用して発現の量的・質的な動態を調査する.平成28年度は,カキに関しては果実成長の後期でのエチレンへの反応性の品種間差異を,エチレン合成と果実軟化の観点から調査した.さらに,RNA-seq用のサンプリングも行い,平成29年度にRNA-seq解析を行う予定である.メロンに関しては, PacBioRSIIを利用したIso-Seq解析は高価なため,様々な条件検討が困難であると考えられた.そこで,比較的安価なNanoporeを利用してライブラリー構築の条件検討を行うことにした.成葉,果実のRNAからSmarter cDNAライブラリーキットを利用して,ライブラリーを構築しNanoporeの1D kitでシークエンスを行った.1セルあたり200万リードを得ており,十分なデータ量が得られることが明らかとなった.現在,得られた配列のの評価をおこなっているところである.2つの非モデル植物を材料としており,カキに関してはtranscriptome解析用のサンプリングなどが完了し,解析を実行するだけの状況になっている.メロンに関しては,条件検討が予定していた程は進んでいないが,気軽で迅速に解析が出来るNanoporeが利用可能である事が明らかとなったことで,今後の解析のスピードアップがはかれると期待される.メロン果実において発現している完全長cDNA配列の単離を行った.ライブラリー作成と解読方法についてについて検討を行った.メロン果実からtotal RNAからClontech社のSMARTer kit,LexogenのTeloprime kit,さらにOligo capping法を利用したライブラリーを作成した.得られたライブラリーをSequelで解読し,バーコードごとに配列を解析した.その結果,SMARTer法では25,915(2,020bp),Teloprimeでは26,666(1,863bp), Oligocapping法では2,082(1340bp)のIsoformaが得られた.STARを用いて公開されているメロンゲノムにmappingしたところ,90%の配列がmappingされていた.さらに転写開始点,転写終結点をメロンゲノムのアノテーションと比較した.その結果,アノテーションのTSSよりの上流側にTSSがあるのはそれぞれ,26%,32%,19%のIsoformであり,Teloprimeが最も良かった.上記と同じライブラリーを,Nanoporeを利用して解読した.PacBioのCCSのように解読精度の向上を図るのは困難である.そのため得られた生のリードをmappingしても5%以下のリードしかマップされない.そこで,de novo assemblerであるcanuの補正機能を利用して配列を補正してmappingした.その結果,map率が70%以上に向上した.しかし,多くのリードが部分配列であり,完全長配列の取得にはスクリプトの改善が必要であると考えられた.mappingのスプライシング・ジャンクションについては精度高いと推測されるので,intron情報の取得には十分なレベルであると考えられた.第3世代の次世代シークエンサーの普及により,ゲノム解読だけではなく転写産物の解読に利用されている.本研究ではメロン果実のIso-seq解析を行い,完全長cDNA配列と選択的スプライシングについて解析を行った.3つの異なる方法で完全長cDNA配列ライブラリーを構築し,PacBioとNanoporeを用いて配列解読を行った.得られたIsoformをメロンゲノムにマッピングして比較した結果,PacBioの解読では約6,500遺伝子座,Nanoporeの解読では12,000の遺伝子座からの転写産物が得られた.そのうち,509遺伝子座が新規の遺伝子座であった.カキに関しては,このままRNA-seq解析をおこなう.メロンに関してはIso-seq解析のためのライブラリー構築について条件検討を続ける.ライブラリー構築法が確立されたら,Nanoporeだけでは無くPacBio Sequelの利用も検討しつつ大規模な解読を行う予定である.園芸学メロンのIso-seqライブラリー構築に関して,当初は高価なPacBioの利用を検討していた.年度途中でNanopore社が同等のスペックで安価なシークエンサーの発売を開始したので,条件検討についてはNanoporeを利用することにした.

そのため,シークエンス解読料を抑えることが出来た.1回あたりの解読料を抑えることが出来たので.詳細な条件検討を実施する.また,本番の解読についても解読料の増強を予定している.