hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「コミュニティ・エフェクト」を明らかにするオンチップ-細胞計測解析技術の開発

本研究では、孤立細胞が持つ特性、細胞集団が持つ特性を構成的なアプローチによって明らかにすることに成功した。以下に主な成果を列挙する。(1)微量細胞培養マイクロチャンバシステムを用い、運動する大腸菌中でのGFP修飾Tarタンパク質の細胞内局在の変化が、環境からの刺激によってどのように応答するかを計測し、細胞膜に発現したTarタンパク質の空間局在が、細胞分裂時に世代間で伝承して後天的情報を継承することを発見した。また、酵母中にGFP修飾プリオンを発現させ、環境からの刺激の変化によって凝集体がどのように凝集・乖離するかを、細胞の世代をまたがって初めて計測することに成功した。(2)世界で初めて神経細胞のAxonとDendriteを区別して神経細胞ネットワークを構築し、この神経細胞ネットワークの各細胞の電気刺激・応答を1細胞単位で計測することに成功した。(3)心筋拍動細胞のネットワークパターンを経時的に変化させる技術を確立し、心筋細胞の拍動安定性と細胞集団数の関係を明らかにし、拍動安定性に対するコミュニティ・エフェクトの効果を実験的に示すことに初めて成功して、さらに心臓臓器に近い「リエントリーモデル」の構築に成功し、これを用いることで、期外収縮の発生をモデル上で実験的に再現することに成功した。さらに、薬剤による影響を検証しQT延長などの個体レベルで確認されている現象がこの「組織モデル」でも同様に観察されることが確認された。(5)同様に、前年度開発に成功した、軸索、樹状突起の方向性を制御した神経細胞ネットワークを用いて、これにテタヌス刺激を与えたところ、テタヌス応答が確認され、この応答が24時間の間に徐々に消失すること、消失の過程でのダイナミクスを連続して計測することに成功した。(6)免疫系についても、マクロファージに貧食をさせて、細胞に与える刺激を複数の抗原で与えたところ、その順序を細胞表面は記憶していることを確認した。本年度は、まず各要素技術の開発を開始し、開発中の装置を細胞計測に利用してデータを採取することで実用性についても検討を行った。具体的には、(1)(細胞相互作用制御+細胞培養+細胞状態観察)技術を組み込んだ微量細胞培養マイクロチャンバシステムの開発では、(1)マイクロファブリケーション技術により数十ミクロン程度の大きさのマイクロチャンバを作成し、これの上面に半透膜のシールを行い、その上に培養液を循環させる。これにより、各細胞の自由な相互作用を抑制するシステムを構築し、これを用いて、運動する大腸菌中でのGFP修飾Tarタンパク質の細胞内局在の変化が、環境からの刺激によってどのように応答するかを計測した。(2)細胞間の相互作用を制御することが可能な新しいマイクロチャンバシステムの開発とこれを用いた細胞培養手法の開発を通じて、世界で初めて神経細胞のAxonとDendriteを区別して神経細胞ネットワークを構築し、この神経細胞ネットワークの各細胞の電気刺激・応答を1細胞単位で計測することに成功した。(3)また、心筋拍動細胞のネットワークパターンを経時的に変化させる技術を確立し、心筋細胞の拍動安定性と細胞集団数の関係を明らかにし、拍動安定性に対するコミュニティ・エフェクトの効果を実験的に示すことに初めて成功した。(2)1細胞mRNA発現解析技術については、金ナノ粒子にプローブDNAを結合させ、この金ナノ粒子が細胞中のターゲットmRNAとどのような相互作用をするか計測し、PCR等の増幅手段を用いなくても、ターゲットの存在を定量的に計測できることを確認した。

本年度は、さらに各要素技術およびシステム技術の開発を継続し、さらに開発中の装置システムの具体的な利用方法(プロトコル)の開発を中心に行った。具体的には(1)(細胞相互作用制御+細胞培養+細胞状態観察)技術を組み込んだ微量細胞培養マイクロチャンバシステムの開発では、(1)白血球マクロファージ細胞を1細胞培養している状況で、複数の餌を異なる細胞表面に接触させて刺激を与えたところ、その応答については1個の餌ごとに順次対応することを見出した(論文投稿中)、(2)またアガロースマイクロチャンバーの3次元加工技術の開発に成功し、これを用いて、容積が制限された領域内で増殖した細胞がある一定細胞数以上になってマイクロチャンバー外壁からの圧力を受けるようになると、増殖速度が大きく減少する細胞周期に対する圧力効果を見出した(論文投稿中)、(3)大腸菌を用いた液性因子が細胞に与える刺激の履歴についても、Stationary Phaseをもたらす液性因子はすぐに細胞周期に影響を与えるが、細胞中には履歴として残らないことが明らかになった(論文投稿中)。(4)また、前年度開発に成功した「心筋細胞ネットワークモデル」チップを用いて、この薬剤による影響を検証し、QT延長などの個体レベルで確認されている現象が、この「組織モデル」でも同様に観察されることが確認された(論文投稿中)。(5)同様に、前年度開発に成功した、軸索、樹状突起の方向性を制御した神経細胞ネットワークを用いて、これにテタヌス刺激を与えたところ、テタヌス応答が確認され、この応答が24時間の間に徐々に消失すること、消失の過程でのダイナミクスを連続して計測することに成功した(論文投稿中)。(2)1細胞mRNA発現解析技術については、金ナノ粒子にプローブDNAをSH基を介して結合させ、この金ナノ粒子が、ターゲットDNAフラグメントと結合することを確認した。さらに、この金ナノ粒子の空間分布の確認方法としてAFMを利用して、平坦でない基板上であっても、金ナノ粒子の存在を確認できるプロトコルの開発をした(論文投稿中)。さらに、抗体に替わる標識プローブとしてDNAアプタマーの利用を検討し、原理的に利用可能であることを確認した。(1)微細加工技術を用いた1細胞ベースでの(細胞相互作用制御+細胞培養+細胞状態観察)技術の開発今年度はまず、神経細胞、心筋細胞に焦点を絞って、細胞がネットワークを形成することによって獲得する新しい情報を計測することができる技術の開発と、この技術によって得られる情報の解析を目指した。具体的には、神経については、1次元に直線状に配置しながら長期刺激・計測ができる培養システムに改良して、軸索・樹状突起方向制御によって細胞の情報伝播方向が制御された神経ネットワークに対して、テタヌス刺激を与え、その応答の時間変化を日単位の長期たわたって計測し、他の雑音がない場合に、獲得された情報がどのように保持され、消滅するのかを計測することに成功し、さらにその特性を定量的に解析することに成功した。
MuLVアクセサリー蛋白発現のメカニズムとウイルス播種の制御の解明

同種指向性マウスレトロウイルス受容体mCAT1とGFPの融合蛋白を恒常的に発現させたイヌ腎上皮由来MDCK細胞に、神経病原性KPウイルスあるいは弱毒ウイルスKP41を感染させ、各種ウイルス蛋白の発現や細胞内局在を解析した(両ウイルスの違いは、MuLVアクセサリー蛋白、すなわち糖鎖修飾Gag蛋白:Glycogagの細胞質内ドメインをコードする領域の5アミノ酸だけである)。KP41感染細胞におけるGlycogagの発現量は、KPに比べて増加し、外被蛋白SUは著しく減少していた。外被蛋白前駆体の減少はSUに比べて顕著ではなかった。細胞内局在を解析すると、KP感染細胞に於いてGlycogagとエンドソームとの共局在が認められた。GlycogagはKP感染細胞では先端側細胞膜(apical membrane)、KP41では細胞膜全周性に局在していた。SUは、KP感染細胞では主に先端側細胞膜(apical membrane)に認められたのに対して、KP41では細胞質を中心に局在し、細胞膜上への局在は明瞭ではなかった。KP41感染細胞から培養上清中に放出される感染性ウイルスの総量は、KP感染細胞に比べ低下していた。ウイルスの放出部位を検討したところ、KP感染細胞では先端側(apical)から有意にウイルスが放出されるのに対して、KP41感染細胞では先端側・基底側に有意な差は認められなかった。培養上清中に放出されるウイルス粒子に於いて、ウイルス構造蛋白GagとSUとの比をとると、KP41ウイルスのSUが著しく減少していた。ウイルス感染細胞に於いてGlycogagの発現部位とウイルスの出芽方向が一致すること、KP41感染細胞ならびにウイルス粒子中で外被蛋白SUが減少していたことは、GlycogagがSUの発現、ウイルスの出芽、並びにウイルス粒子の感染性に重要な影響を及ぼすことを示唆する知見である。このことはまた、in vivoにおいてGlycogagがウイルス播種に重要な役割を果たすことと合致する。本研究はKPとKP41ウイルスのphenotypeの違いをin vitroで初めて示した系であり、構築した実験系は今後、レトロウイルスの複製機構・ウイルス播種の制御やGlycogagのウイルス生活環における役割を解明する上で有用であると考えられる。2002年度は実験遂行に十分量のウイルスストックを作成し、ウイルス産生量を経時的に測定するアッセイ系をM. dunniマウス繊維芽細胞を用いて確立した。この系を用いてマウス由来の様々な培養細胞株に神経病原性MuLV(KP)およびその糖鎖修飾Gag蛋白の発現能を失った変異体ウイルスを感染させ、両感染細胞のウイルス産生量を経時的に測定した。これまでマウス繊維芽細胞、リンパ球系由来の種々の細胞を用いたが、糖鎖修飾Gag蛋白によるウイルス増殖促進効果を認める細胞株を同定するに至っていない。現在、マウスのグリア細胞由来の細胞株を入手し、解析中である。糖鎖修飾Gag蛋白の細胞内局在を蛍光抗体法により検討した。これまで糖鎖修飾Gag蛋白のによるウイルス増殖促進効果が生体内でのみ認められるため、慣例として用いられている線維芽細胞ではなく、ウイルスの生体内侵入の門戸となる上皮細胞を用いて検討することとした。マウス由来の上皮細胞株はほとんど無かったため、MuLV感染受容体mCAT1をGFP標識した融合蛋白をイヌ腎由来MDCK細胞及びヒト子宮頸ガン由来HeLa細胞に導入し、発現細胞を得た。ウイルス非感染時にはMuLV受容体mCAT1はbasolateral membraneに局在していた。ウイルスの感染・伝搬経路を解明する上で興味深い知見である。この細胞を神経病原性MuLV(KP)と糖鎖修飾Gag蛋白のN-末側のアミノ酸配列を変異させた弱毒ウイルス(KP41)に感染させたところ、KP感染細胞では糖鎖修飾Gag蛋白がApical側に、KP41感染細胞ではBasolateral側に局在していた。これは、ポストゴルジネットワークにおける蛋白輸送機構の違いを示唆している。現在、MuLV受容体mCAT1、および糖鎖修飾Gag蛋白の局在、細胞内輸送経路の違いがウイルス産生、播種に果たす役割を明らかにすべく各種輸送小胞、アダプター蛋白に対する抗体等を用いて比較検討中である。MuLVの糖鎖修飾Gag蛋白の発現は、in vivoでのウイルスの増殖および播種に重要であるが、その詳細なメカニズムは不明である。糖鎖修飾Gag蛋白の発現が個々の細胞によるウイルス産生を促進させる可能性を探るため、神経病原性MuLV(KP)、その弱毒化した変異体ウイルス(Kp41)、および糖鎖修飾Gag蛋白の発現を阻止した変異体ウイルスをマウス由来の様々な培養細胞株に感染させ、ウイルス産生量を経時的に測定した。これまで入手可能な種々のマウス由来細胞株を試してきたが、この蛋白の発現がウイルスの産生量に影響を及ぼす細胞株は確認されなかった。これまで試してきた細胞株はいずれも線維芽細胞などの非極性細胞であり、in vivoでのウイルス播種の出入門戸となり得る上皮・内皮系の細胞は無かった。そこで昨年度に樹立した同種指向性マウスレトロウイルス受容体mCAT1をGFP標識した融合蛋白を導入したイヌ腎由来上皮細胞株MDCK並びにヒトHeLa細胞を用いて各種ウイルスを感染させ、経時変化およびウイルスの出芽方向の差異(基底側・先端側)について現在検討を進めている。

また、これら感染細胞において、細胞膜上での糖鎖修飾Gag蛋白の局在を蛍光抗体法にて調べたところ、KPでは先端側に、KP41では基底側全周性に局在することが分かった。さらに細胞内輸送経路の詳細を共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光抗体法にて解析した。現在、この結果を免疫沈降法にて追試中である。同種指向性マウスレトロウイルス受容体mCAT1とGFPの融合蛋白を恒常的に発現させたイヌ腎上皮由来MDCK細胞に、神経病原性KPウイルスあるいは弱毒ウイルスKP41を感染させ、各種ウイルス蛋白の発現や細胞内局在を解析した(両ウイルスの違いは、MuLVアクセサリー蛋白、すなわち糖鎖修飾Gag蛋白:Glycogagの細胞質内ドメインをコードする領域の5アミノ酸だけである)。KP41感染細胞におけるGlycogagの発現量は、KPに比べて増加し、外被蛋白SUは著しく減少していた。外被蛋白前駆体の減少はSUに比べて顕著ではなかった。細胞内局在を解析すると、KP感染細胞に於いてGlycogagとエンドソームとの共局在が認められた。GlycogagはKP感染細胞では先端側細胞膜(apical membrane)、KP41では細胞膜全周性に局在していた。SUは、KP感染細胞では主に先端側細胞膜(apical membrane)に認められたのに対して、KP41では細胞質を中心に局在し、細胞膜上への局在は明瞭ではなかった。KP41感染細胞から培養上清中に放出される感染性ウイルスの総量は、KP感染細胞に比べ低下していた。ウイルスの放出部位を検討したところ、KP感染細胞では先端側(apical)から有意にウイルスが放出されるのに対して、KP41感染細胞では先端側・基底側に有意な差は認められなかった。培養上清中に放出されるウイルス粒子に於いて、ウイルス構造蛋白GagとSUとの比をとると、KP41ウイルスのSUが著しく減少していた。ウイルス感染細胞に於いてGlycogagの発現部位とウイルスの出芽方向が一致すること、KP41感染細胞ならびにウイルス粒子中で外被蛋白SUが減少していたことは、GlycogagがSUの発現、ウイルスの出芽、並びにウイルス粒子の感染性に重要な影響を及ぼすことを示唆する知見である。このことはまた、in vivoにおいてGlycogagがウイルス播種に重要な役割を果たすことと合致する。本研究はKPとKP41ウイルスのphenotypeの違いをin vitroで初めて示した系であり、構築した実験系は今後、レトロウイルスの複製機構・ウイルス播種の制御やGlycogagのウイルス生活環における役割を解明する上で有用であると考えられる。
網脈絡循環における血管内皮由来過分極因子(EDHFとK+チャンネル機構の解明

実験1.まず主要なneurotransmitterの一つであるアセチルコリン(ACh)による脈絡膜細胞動脈弛緩に作用する因子について検討した。モルモットの脈絡膜を取り出し、チェンバー内に固定しKrebs液で持続灌流した。ノエルピネフリン(NE)あるいは高濃度K+前収縮させた細動脈がアセチルコリンによって弛緩する際に関与するK+チャネルを同定するために、種々のK+チャネル抑制薬を使用した。NE(10-5M)で前収縮させた細動脈のACh(10-6M)による弛緩はニトロアルギニン(N-Arg,10-4M)とインドメサシン(Ind,10-5M)によって24%抑制された。高濃度K+で前収縮させた細動脈のAChによる弛緩はN-ArgとIndで完全に抑制された。次にN-ArgとIndの存在下でNEで前収縮させた細動脈は、tetraethylammoium(10-3M)、apamin(10-7M)、chrybdotoxin(ChTX,10-7M)によって抑制されたが、Glibenclamide(2'10-5M)では抑制されなかった。ApaminとChTXを同時に作用させると弛緩は85%減少した。以上のことから、モルモット脈絡膜細動脈のAChによる弛緩では、NOとプロスタサイクリンの作用は小さく、大及び小コンダクタンスCa^<2+>感受性K+チャネルが同時に活性化されることが主要な要因であることが明らかとなった。実験2.虚血下における脈絡膜細動脈の弛緩に関与する因子を検討した。実験1と同様にモルモット脈絡膜をチェンバーに固定し、Glucose-free/NaCN(10-3M)の状態で灌流することにより細胞内虚血を作成した。N-Arg,Glb、ChTXでそれぞr47%、62%、24%弛緩が抑制されたが、Indでは抑制されなかった。N-ArgにGlibとChTXを同時に作用させると弛緩は、86%抑制された。高濃度K+では、虚血によりわずか(11%)に弛緩したが、この弛緩はN-Argにより有意に抑制された。このことから、モルモット脈絡膜細動脈で虚血による弛緩では、NOとKATPチャネルの関与が主体であること、NOによる弛緩にはK+チャネルが関与する部分と関与しない部分があることが示された。実験1,2の結果から、脈絡膜弛緩に関する因子はその原因によって異なるが、K+チャネルが重要な役割を果たしていることは間違いないと考えられる。目的;脈絡膜循環におけるacetyl choline(ACh)による血管弛緩に関与する因子を明らかにするため,モルモットの眼球を用いて脈絡膜細動脈血管径の変化を分析した.

材料と方法:モルモットを安楽死後,眼球を摘出し,その脈絡膜を一塊としてシート状に剥離し,シリコンプレートに伸展固定した.プレートは35°Cに保ったKrebs液で持続還流した(4ml/min).脈絡膜細動脈をビデオ顕微鏡下で観察記録し,コンピュータープログラム(DIAMTRAK)で,その血管径の変化を算出した.NO阻害剤としてNω-nitro-L-arginine(nitroarginine),prostacyclin阻害剤としてindomethacin,K+channel抑制薬としてglibenclamide,tetraethacin(TEA),apamin,charybdotoxin(ChTX)を使用し,AChによる血管弛緩をあらかじめnorepinephlin(NE)もしくは高濃度のK+含むKrebs液で収縮した状態で計測した.結果;NE(10-5M)で前収縮した細動脈では,nitroarginine(10-6M)とindomethacin(10-5M)の両者を同時投与すると,ACh(10-6M)による血管弛緩は24%抑制された.高濃度のK+を含むKrebs液で前収縮させた場合は,AChによる血管弛緩はnitroarginineとindomethacinにより完全に抑制された.またnitroarginineとindomethacinの存在下では,AChによる血管弛緩は,NEで前収縮させた細動脈にたいしてTEA(10-3M),apamin(10-7M)およびChTX(10-7)で抑制がみられたが,glibenclamide(2×10-5M)では抑制されなかった.同時にapaminとChTX投与するとAch(10-6M)による血管弛緩は85%抑制された.結論;モルモット脈絡膜細動脈では,NOおよびprostacyclinはAChによる血管弛緩の要なメディエータではない.二種類のCa2+活性化K+チャンネルが同時に活性化されることがAChによる血管弛緩の主体であり,その因子として内皮由来過分極因子(EDHF)が有力と考える.脈絡膜循環の調節に関与する血管内皮由来の因子を明らかにするために、特にK+チャネルに注目して実験を行った。実験1.まず主要なneurotransmitterの一つであるアセチルコリン(ACh)による脈絡膜細動脈弛緩に作用する因子について検討した。モルモットの脈絡膜を取り出し、チェンバー内に固定しKrebs液で持続灌流した。ノルエピネフリン(NE)あるいは高濃度K+で前収縮させた細動脈がアセチルコリンによって弛緩する際に関与するK+チャネルを同定するために、種々のK+チャネル抑制薬を使用した。NE(10-5M)で前収縮させた細動脈のACh(10-6M)による弛緩はニトロアルギニン(N-Arg,10-4M)とインドメサシン(Ind,10-5M)によって24%抑制された。高濃度K+で前収縮させた細動脈のAChによる弛緩はN-ArgとIndで完全に抑制された。次にN-ArgとIndの存在下でNEで前収縮させた細動脈は、tetraethylammoium(10-3M)、apamin(10-7M)、charybdotoxin(ChTX,10-7M)によって抑制されたが、Glibenclamide(2'10-5M)では抑制されなかった。ApaminとChTXを同時に作用させると弛緩は85%減少した。以上のことから、モルモット脈絡膜細動脈のAchによる弛緩では、NOとプロスタサイクリンの作用は小さく、大及び小コンダクタンスCa2+感受性K+チャネルが同時に活性化されることが主要な要因であることが明らかとなった。実験2.虚血下における脈絡膜細動脈の弛緩に関与する因子を検討した。
肝発癌例での次世代シークエンサーを用いたHBV遺伝子変異と宿主遺伝子多型の解析

核酸アナログ開始後の肝発癌例の特徴を、1)臨床的要因、2)ウイルス側要因、3)宿主側要因の観点から検討した。1)臨床的要因は、肝硬変例や肝線維化マーカー(APRI)高値例で肝発癌が多いことが示された。2)ウイルス側要因は、次世代シークエンサーでHBV遺伝子変異を網羅的に解析した。全ゲノムのうち、polymerase領域のアミノ酸変異が、肝発癌に関与していることが示唆された。3)宿主側要因は、リアルタイムPCR法で宿主遺伝子多型(SNP)を網羅的に解析した。18種類のSNPのうち、HLAにおけるSNPが肝発癌に関係していることが示唆された。B型肝炎ウイルス(HBV)の遺伝子変異が、肝発癌に影響を与えるかどうか、さらにはウイルス側要因だけでなく、肝発癌に寄与する宿主側要因を明らかにする目的で、核酸アナログ投与例での、肝発癌とHBV全遺伝子配列および宿主遺伝子多型(SNP)との関連性を検討するために、次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析を行った。1.エンテカビル(ETV)開始後の肝発癌例の臨床的特徴の検討:B型慢性肝疾患に対してETVを1年以上投与した138例を対象とした。ETV開始後の肝発癌例は10例であった。肝発癌例の臨床的特徴として、1)肝発癌は、肝硬変例や肝線維化マーカー高値例に多いことが示された。2)肝線維化マーカーは、ETV開始後の肝発癌予測に有用なマーカーであり、特にAPRI高値例では、肝発癌例が多いことが示された。2.肝発癌とHBV遺伝子変異の関連性の検討:ETV投与例のうち、約100例で血清の採取・保存が可能であった。Miseqを用いてDeep sequencingを行い、HBV全塩基配列を決定した。現状では、80例で全塩基配列が決定できており、さらに2030例を追加解析した後、CLC Genomics Workbenchを用いて肝発癌と関連するHBV遺伝子変異を探索する。3.肝発癌と宿主遺伝子多型の関連性の検討:ETV投与例のうち、約100例で全血の採取・保存およびゲノムDNAの抽出ができており、概ね順調に進捗している。次年度は、HBV肝発癌と関連性が報告されているSNPについて解析予定である。HBV-DNA量の少ない検体では、特にPCRでの増幅過程において、さまざまな調整を要するために時間を要している。現状では対象症例の約80%で全塩基配列を決定した。全対象症例で解析終了後に、肝発癌とHBV遺伝子変異との関係性を検討する予定であるため、現状では、具体的な遺伝子変異の探索までには至っていない。B型肝炎ウイルス(HBV)の遺伝子変異が、肝発癌に影響を与えるかどうか、さらにはウイルス側要因だけでなく、肝発癌に寄与する宿主側要因を明らかにする目的で、核酸アナログ投与例での、肝発癌とHBV全遺伝子配列および宿主遺伝子多型との関連性を検討するために、次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析を行った。1)エンテカビル(ETV)開始後での肝発癌例の臨床的特徴の検討:B型慢性肝疾患に対してETVを1年以上投与した138例を対象とした。肝発癌は、肝硬変例や肝線維化マーカー高値例に多い。また、肝線維化マーカーは、ETV開始後の肝発癌予測に有用なマーカーであり、特にAPRI高値例では、肝発癌例が多いことが示された。2)肝発癌とHBV遺伝子変異の関連性の検討:1)の症例にうち、ETV開始時に血清を採取・保存できた115例を対象とした。Miseqを用いてDeep sequencingを行い、HBV全遺伝子配列を決定した。CLC Genomic WorkbenchとGeneniousによって発癌例10例、非発癌例110例を比較し、肝発癌と関連する遺伝子変異を解析した。3)肝発癌と宿主遺伝子多型(SNP)の関連性の検討:1)の症例にうち、ETV開始時に全血を採取・保存できた127例を対象とした。当初はDeep sequencingで解析予定であったが、Real-time PCR system(TaqMan SNP Genotyping Assay)でも十分な解析が可能であるため、SNP解析法を変更した。当初は56種類のSNPを対象としたが、SNP解析法の変更により18種類(KIF1B、GRIK1、MICA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、STAT4、PNPLA3、C2、HLA-DQA2、HLA-DQ、GLB1、SLC10A1、TCF19、LOC101929604、DEPDC5、HLA-DQA1/DRB1)のSNPまで解析対象を拡大した。発癌例10例、非発癌例117例を比較し、肝発癌と関連するSNPを解析した。

3)宿主側要因は、リアルタイムPCR法で宿主遺伝子多型(SNP)を網羅的に解析した。18種類のSNPのうち、HLAにおけるSNPが肝発癌に関係していることが示唆された。1.肝発癌とHBV遺伝子変異の関連性の検討:本年度はさらに2030例で追加解析を行い、予定している約100症例で、Deep sequencingを用いてHBV全塩基配列を決定する。その後に、ウイルス側要因と肝発癌との関連性を速やかに検討する。2.肝発癌と宿主遺伝子多型の関連性の検討:全血の採取・保存およびゲノムDNAの抽出は約100以上の症例で終了している。HBV肝発癌と関連性が報告されているSNPとして56種類が候補として挙げられる。当初、SNPの解析もDeep sequencingで行う予定であったが、Real-Time PCR System(TaqMan SNP Genotyping Assay)でも十分な解析が可能であるため、多数のSNPを解析することを優先し、SNP解析法を変更する予定である。肝臓学予定していた学会出席に伴う旅費については、大学の経費から支出したため、本年度は科研費から支出しなかった。このため、次年度使用額が生じたと考えられる。次年度は海外での学会出席も計画しているため、旅費として、使用する予定である。
超高速時間分解振動分光法による半導体光触媒反応の速度・分子論的解明

本研究は、SFG分光法を用いた半導体光触媒表面上における表面光反応の観測手法の確立と、表面光反応をピコ秒の時間分解能で実時間追跡し、反応の進行にともなう吸着分子の構造変化や反応中間体の観測、さらには光触媒反応の素過程について微視的立場から検討を行うことを目的としている。これまで時間分解SFG分光法と表面温度ジャンプ法を組み合わせ、Ni(111)上に形成される短寿命フォルメート種(DCOO)の検出を行ってきた。超高真空容器内(base pressure 1x10^<-10> Torr)内にあるNi(111)に、273Kでギ酸(DCOOD)を導入するとフォルメートが表面に吸着する。SFG測定により2196cm^<-1>および1328cm^<-1>に観測されるピークはフォルメートのν(CD)伸縮およびν(OCO)伸縮振動にそれぞれ帰属される。このピーク強度は、共にポンプ光(800nm)照射直後に大きく減少した。この励起直後の初期過程には、SFG強度変化量のNi基板温度依存性および励起光度依存性の測定から、Ni基板内に過渡的に生成したホットエレクトロンを介したnonthermalなプロセスが存在することが示唆された。また、SFG強度の回復過程においては、ν(CD)の方がν(OCO)よりも早い時間で回復することが分かり、同一吸着分子内で、振動モードにより緩和のダイナミクスが異なることを初めて明らかにした。また、SFG分光法をPt電極上のメタノール酸化反応に適用し、その反応機構の解明を試みた。電気化学測定には三電極式の分光電気化学セルを用い、作用極としてPt(111)、対極にPt線、参照極にRHE電極をそれぞれ用いた。支持電解質として0.1M HClO_4溶液を用い、電極電位を+20mVに保持した状態でメタノールをセル内に導入しSFG測定を行った。メタノールの解離吸着が進行し始める電位(+300mV)に電極電位をしばらく保持した状態でのSFG測定により1800cm^<-1>付近と2240cm^<-1>付近にPtのbridgeサイトとon topサイトに吸着したCOに帰属される二つのピークが出現した。このことから、従来言われてきたように、メタノールはPt表面でCOとして解離吸着していることが今回確認された。この両ピークの経時変化から、吸着COは、その吸着初期においてPtのon topサイトに比べbridgeサイトに優先的に吸着が進行することが明らかとなった。また、吸着COの電極電位依存性から、低電位側では、COはPt表面でisland上に吸着層を形成し、高電位側では、吸着層内均一にCOの酸化が進行化するのではなく、islandの周囲から酸化が進行することが分かった。

また、吸着COの電極電位依存性から、低電位側では、COはPt表面でisland上に吸着層を形成し、高電位側では、吸着層内均一にCOの酸化が進行化するのではなく、islandの周囲から酸化が進行することが分かった。
核融合燃料ペレット入射用レールガンの高繰り返し化

アイスペレット入射装置として数種のペレット加速方式が研究されているが、現在のところ、二段軽ガス銃方式によって3km/sまでの速度領域でペレットサイズ及び射出速度を制御できるようになった。しかしながら、軽ガス銃方式でそれ以上の速度を達成する子とは原理的に不可能であり、他の加速方式の開発が望まれる。我々は、5km/s以上の速度を原理的に達成可能なレールガン方式のペレット加速装置の開発を行っている。これまでに、永久磁石を利用した磁場増強型レールガンを考案し、従来型に比べてレールガン内壁の熱的損傷が減少すること、及びレールガン内において二次的な電流の発生が抑制されることを実験的に確信した。本研究では、永久磁石によって加速管に印加される磁場がレールガンの動作、特にプラズマ電機子に及ぼす作用について調べた。また、レールガン内部における熱伝導シミュレーションを行い、レールとして最適な金属材料について検討した。1)プラズマ電機子の振舞の観察50cmの永久磁石付き磁場増強型及び同じ長さの従来型の2台のレールガンを用い、両者におけるプラズマ電機子の振舞をピックアップコイル及び高速度カメラを用いて調べた。永久磁石を使用した磁場増強型レールガンの方が速度の立ち上がりが速く、動作の再現性が非常に良い。レールガン従来型レールガンでは全てのショットにおいて二次的な電流が発生しているのに対し、磁場増強型レールガンでは二次電流の発生率が半減した。ショット後のレールの表面を解析すると、永久磁石を使うことによってレール表面の損傷が10分の1以下になっていることがわかった。これらの永久磁石を用いたことによるレールガン動作の改善は、駆動電流の低減によってレールガン内壁への熱負荷が減少したためであると考えられる。2)レール材質の最適化銅、真鍮、ステンレス及びタングステンをレール材としてサンプルした場合の熱伝導計算機シミュレーションを行った。その結果、レールの損傷に関して熱伝導率と融点が非常に重要なパラメータであることがわかった。タングステン、銅、真鍮、ステンレスの順で損傷が小さく、レールの材料としてタングステンが最も良いことがわかった。
ケアにおける「微妙さ」の定量化に関する研究：ポジショニングケアを対象として

我が国は高齢者・単身者急増社会であり、従来の家人(他者)の目と手に頼るケアの継続は困難な状況であり、不足する目と手の代替の開発や発展的解決方法の検討は急務である。本研究では目と手に依存するケアの中でも日常的な姿勢保持に注目し、臨床熟練者が観察と経験で調整している「微妙さ」を定量化することにより、安楽・安定・安心できるケア技術の抽出を行なった。その結果、心地よい姿勢や動作の生体指標特定、非侵襲・無拘束での「微妙さ」抽出法、レジリエンスエンジニアリング的な支援のあり方について新たな知見を得た。ケアにおける「微妙さ」の定量化、特にポジショニングにおける安楽・安定・安全の検出について看護師がどのように見極めているのか、その「粋」の抽出を目的として研究を行い(1)、同時にそれが工学的にはどのように検出可能か(2)を検討する。今年度は以下の研究を進めた。(1)看護師の意思決定の「粋」を探る:自分では体位変換できない患者に対するポジショニングケア実施において看護師が何に基づいて安楽・安定・安全を評価しているかについて自記式アンケートとインタビューにより調査した。その結果、脈拍や血圧など定量的な値とともに表情や息づかい、筋肉の緊張感を観察していること、当該病棟に長く勤務している看護師の方が質問に対し多くの項目を返答(言語化)していたこと等が明らかとなった。なお今後の研究方向として高齢者や寝たきり患者へのポジショニングケアを考える場合、急性期ケアよりも慢性期ケアや重症心身障害者のケアを行っている看護師の観察視点が有効であることを確認した。(2)工学的なアプローチで「粋」を検出する:看護師のポジショニングケアは、仰臥位など一定の状態だけでなく「体位変換」や生活動作の一環としての安楽・安定・安全を考えたものである。工学的なアプローチにおいても動作観察からの検討が必要であり、まず健常人との比較が実施しやすく、被験者への負担が少ない立位、起立動作を対象とすることとした。微妙な不安定性の検出を課題とし、高速度カメラによる動作パタンの抽出、簡易重心計測機器による重心移動の特徴抽出、両者を組み合わせた動作の特徴抽出方法の検討等の研究を進めた。その結果、腰痛や膝痛などを持つ場合には重心移動だけでも微妙な変化が見られること等を見出した。計画では、倫理審査申請についてポジショニングケアに対する介入研究では承認が難しいと予想していたが、実際は観察研究・介入研究ともに承認を得ることができた。病棟看護師のインタビュー調査により看護師の専門的な観察眼の検討を慢性期患者ケアに絞ることができた。行動観察、解析について順調に計測機器・分析システム・ソフトウエアを購入できたことにより、短時間での計測が可能となり、実験室外、施設、医療機関、現場での出張計測ができた。また、「微妙」な行動変化の観察対象として、ポジショニングという患者の受け身な状況から起立動作へ、腰痛や膝痛の早期発見へと研究を展開することができた。以上より、次年度に向けて計画以上に進捗が見られたと判断した。本研究はケアにおける「微妙さ」の定量化を目的としており、特にポジショニングについて、単に静止した状況ではなく動作の過程と広く捉え、コミュニケーションの難しい患者や感情の把握しにくい患者等も含めた対象者における安楽・安定・安全の検出について、(a)看護師、理学療法士等臨床の専門家がどのように見極めているのか、(b)それが工学的にどのように検出可能か、検討を進めている。初年度には、対象者の設定、注目する動作・ポジショニングケア、計測方法等について検討し、それを踏まえて今年度は主として以下のような研究を進めた。(1)コミュニケーションの難しい患者や感情の把握しにくい患者における安楽状態の把握に関する研究:光音刺激時の患者の状況について、臨床専門家による詳細な時系列観察記録とWebカメラ等を用いた動作観察と生理学的記録とを照合することにより、情緒の変動を推察するアルゴリズム構築を行なった。その結果、同じ刺激でも感情の高揚状況について疾患により反応に違いが見られること、光音刺激の内容が楽しく刺激的なものと穏やかな雰囲気を目指したものとでも反応に違いが見られることなどが示唆された。同じ体位でも工学的な観察により安楽の状態を非接触・無拘束で把握できる可能性が見出された。(2)安楽、安定した動作・ポジショニングの検出に関する研究:非接触・無拘束での動作観察結果から判別指標を考案し、その指標を用いて動作の安定性・巧緻性の評価を機械学習により検討した。その結果、提案した評価指標を用いた判別の正答率は実用的な値であり、今後症例を増やすことにより臨床的にも有効な判別論理を提案できる可能性が示唆された。計画では、倫理審査申請についてポジショニングケアに対する介入研究では承認が難しいと予想していたが承認を得ることが出来、臨床的に検討できた。意思や感情の把握が難しい患者に対する精神的安楽を目的とした光音刺激、感動や楽しさを喚起することを目的として開発された光音刺激イベント等の機会における生体情報計測が実施できた。行動観察機器として高速度カメラ、Webカメラとともに非接触・無拘束で生理学的情報のモニタリングが可能となったことで、情緒反応を客観的に精密に計測できるようになり工学的アプローチの研究が大きく進んだ。ポジショニングという患者の受け身的な状況から起立動作や起立支援動作まで、動きのある観察・解析が可能となり、興味深い知見が得られ始めた。これらの結果を国際学会、学術誌にて発表を開始している。

以上から、次年度へ向けて、計画以上に進捗が見られたと判断した。我が国は高齢者急増社会であり、単身者急増社会でもある。従来の家人(他者)の目や手を基盤とする保健医療福祉体制は継続困難であり、不足する目や手の代替、さらに発展的に解決する方法の検討を進める必要がある。本研究では「目や手」に依存しているタスクプロセスの中でもポジショニングに着目し、ポジショニングにおける安楽・安定・安全の検出において(1)看護師、理学療法士等臨床の専門家がどのように微妙な変化を見極めているのか、(2)工学的にはどのように検出可能か、非侵襲・無拘束でどのようにアプローチできるか、すなわちケアにおける「微妙さ」の定量化を目指すものである。初年度には、対象者の設定、注目する動作・ポジショニングケア、計測方法等について検討し、2年目にはコミュニケーションを取ることが難しい患者における情緒変化の計測可能性の検討と安楽・安定した動作・ポジショニングの検討方法の実験的検討を行った。本年度は今までの研究によって具体的になった課題解決の方向性を軸に、今後の「微妙さを測る」研究の発展的展開のための課題抽出を念頭に起きつつ、(a)ポジショニングにおける安定性と安楽の確認:心地よい姿勢や動作であることを生体計測等に基づく客観的データから評価する指標の検討、(b)非侵襲・無拘束計測:「よろけそう」「怖い」など心理的な状況も反映した特定の状況を検出する方法の検討、等について研究を進めた。その結果、(1)安定感・心地よい状態であることについては非接触・無拘束にて観察が可能であることを実証的に提示(2)臨床療育の専門家による観察と高い相関を示す心理状況のvisualization法を提案等の成果を得た。我が国は高齢者・単身者急増社会であり、従来の家人(他者)の目と手に頼るケアの継続は困難な状況であり、不足する目と手の代替の開発や発展的解決方法の検討は急務である。本研究では目と手に依存するケアの中でも日常的な姿勢保持に注目し、臨床熟練者が観察と経験で調整している「微妙さ」を定量化することにより、安楽・安定・安心できるケア技術の抽出を行なった。その結果、心地よい姿勢や動作の生体指標特定、非侵襲・無拘束での「微妙さ」抽出法、レジリエンスエンジニアリング的な支援のあり方について新たな知見を得た。今までの成果を踏まえ、今後は以下のように進める。(1)専門家(看護師、理学療法士、医師等)は微妙な変化をどのように検出し、危険に結びつく変化とそうでないものとを判断しているか:インタビュー及び自記式アンケート調査を事例検討的に進め、観察の要点等を明らかにする。(2)その微妙な変化と、判断について、工学的に非侵襲・無拘束でどのようにアプローチできるか:高速度カメラや重心動揺計での計測に加え、心拍数及び心拍リズム、呼吸数・呼吸の深さ・呼吸リズムなどの生理学的変化も同時計測して総合的な変動の把握を目指す。(3)ポジショニングの安楽、安定、危険性に結びつく微妙な変化の判断についてレジリエンス・エンジニアリングの観点からシミュレーション等の方法を用いて明らかにできるか等について検討を進める:どの程度の観察項目や観察期間で判別が可能か、検討を進める。
内耳初期発生に必要な耳板陥入シグナルの解明

内耳発生初期に必要な耳板陥入シグナルを発する細胞群は詳細には理解されていない。発生中の内耳近傍において、菱脳から遊走する神経堤細胞は耳板が陥入していく部位の間葉と共に、耳窩上皮内に存在する事を見出した。神経堤細胞を含む菱脳から耳板へのシグナルが伝達されない環境においても、耳胞は正常発生する事を明らかにした。これらの研究成果から、耳板陥入に必要なシグナルは耳板上皮自身、あるいは耳板周囲の間葉組織由来であることが示唆された。菱脳からのシグナルが内耳原基である耳胞の形成に関与している事が知られている。この耳胞形成に必要な耳板陥入シグナルを発信する細胞群は詳細に理解されていない。平成24年度は菱脳からのシグナルが耳板陥入に必要であるかを検証する実験を行なった。この実験には、耳板陥入を含む内耳形態形成の挙動を容易に観察することができるニワトリ胚を用いた。まず、耳板陥入前のニワトリ胚菱脳領域の神経堤右外側にアルミホイルを突き刺して留置し、菱脳から耳板へのシグナルを物理的に阻害した。次に、37°C恒温槽にて24時間ニワトリ胚の発生を進めた後、耳板が陥入して耳胞が形成されるか観察を行った。実験のポジティブコントロール(対照)は耳板陥入前のニワトリ胚菱脳領域の神経堤左外側にアルミホイルを突き刺した直後抜去した左側の耳胞発生とした。なお、実験手技の外科的侵襲等によりニワトリ胚の発生途絶や頭頸部の奇形が発生したものは観察対象から除外した。実験の結果、菱脳左側の耳胞(ポジティブコントロール)と同様に、菱脳右側にも楕円球状の構造物が形成された。さらに、whole in situ hybridization法を用いて、内耳初期発生に必要な事が知られている遺伝子の発現パターン解析を行った。結果、左側耳胞と菱脳右側の楕円球状の構造物において、Dlx5(耳胞背側マーカー)とPax2(耳胞腹側マーカー)は共に同様の発現パターンを示した。これらの結果より、右側の楕円球状の構造物は耳胞であることが明らかとなった。今回の研究成果から、耳板陥入に必要なシグナルは耳板上皮自身、あるいは耳板周囲の間葉組織の領域から分泌されていることが示唆された。内耳発生初期に必要な耳板陥入シグナルを発する細胞群は詳細に理解されていない。また、内耳発生初期における未分化な神経堤由来細胞の潜伏部位も不明であった。本年度は神経堤で特異的発現を示すWnt1遺伝子のプロモーター下でCreリコンビナーゼが発現するトランスジェニックマウスとGFPレポーターマウスの交雑(以後、Wnt1-Cre/ GFPマウスとする)を用いて、発生中の内耳近傍に遊走する神経堤由来細胞の挙動を観察した(Cre- loxPシステムによりこの交雑の神経堤由来細胞は永続的にGFP標識される)。まず、Wnt1-Cre/ GFPマウス胎生9日目の水平断切片を作製して、抗GFP抗体を用いて免疫組織化学法により詳細に観察した。GFPで標識された神経堤由来細胞は(1)耳板が陥入していく部位の間葉だけではなく、(2)耳板上皮内にも存在した。この像から、神経堤由来細胞は、耳板近傍の間葉から耳板へ陥入シグナルを送っている可能性と、耳板上皮内で耳板陥入シグナルを放出している可能性が考えられた。次に、耳板が陥入していく部位の間葉に存在する神経堤由来細胞が耳板陥入に必要であるかを検証する予備実験を行なった。この予備実験には、内耳原基や神経管等の表皮外胚葉由来細胞の挙動を容易に観察することができる、鶏胚を用いた。マウスの胎生8日(耳板形成期)に相当する鶏胚の菱脳神経堤腹側にアルミホイルを突き刺して、神経堤由来細胞の耳板陥入部への移動を阻害させ、耳板陥入の終了するマウス胎生9.5日相当までの観察を試みた。しかしながら、鶏胚の発生が途絶してしまったため、耳板が陥入していく部位の間葉に存在する神経堤由来細胞が耳板陥入に必要であるかを検証することが困難となった。現在、鶏胚の発生が順調に進む実験の条件検討を行なっている。実験モデルとして用いた鶏胚の発生が順調に進まなかったため。内耳発生初期に必要な耳板陥入シグナルの解明に向けて、現在、鶏胚の発生が順調に進む実験の条件検討を行なっている。実験モデルとして用いた鶏胚の発生が順調に進まなかったため、本年度の直接経費に残金が生じた。鶏胚の発生が順調に進む実験の条件検討後、内耳発生初期に必要な耳板陥入シグナルの解明を行うために、本年度の直接経費と次年度の直接経費を使用する予定である。
再発性糸球体腎炎における腸内細菌叢変化の解明

慢性糸球体腎炎は直接的な原因が未解明なため、治療によっても徐々に腎機能が悪化する疾患である。動物モデルでは腸管免疫と糸球体腎炎の関連が報告されており、腸管免疫細胞が腸内細菌叢との相互作用で恒常性を維持していることを考え合わせると、糸球体腎炎の活動性と腸内細菌叢変化が相関することが予想される。本研究では、特定の細菌叢変化の同定のため、糸球体腎炎患者の腸内細菌叢を治療前後で経時的に解析し、糸球体腎炎患者の腸内細菌叢の変化と特徴を解明する。最終的には糸球体腎炎の活動性を評価できる検査の開発を目指す。この成果は糸球体腎炎の病因解明に寄与し、さらなる治療法の開発につながる可能性がある。
運動負荷と薬物投与の併用治療が廃用性骨減少症における骨微細構造に及ぼす影響

廃用性骨減少症のモデルラットを用いて、副甲状腺ホルモン(PTH)あるいわアレンドロネート(ALN)とジャンプ運動を組み合わせた場合の骨量および骨微細構造に対する相乗効果について検討した結果、薬物投与とジャンプ運動は、骨量増加や構造的な増強に有効であることが示されたが、薬物治療は運動負荷と相乗効果には薬剤により差がみられることが示唆された。私は前回の研究で、「尾部懸垂解除後の異なる運動形式が骨梁構造劣化の回復に及ぼす影響」を検討し、ジャンプ運動の方が、ランニング運動よりも尾部懸垂後の骨委縮の回復に有効であることを示した。さらに、「尾部懸垂による骨微細構造に対する運動負荷と薬物投与(アレンドロネート(ALN)と副甲状腺ホルモン(PTH))の治療効果」を検討し、薬物投与と運動負荷は異なった機序で骨梁構造の劣化を回復することが考えられ、相乗効果が期待された。したがって、骨粗霧症治療薬と運動負荷との間には相乗効果が予想され、今回は、運動負荷と薬物投与の併用による骨梁構造の相乗効果の有無を検討した。生後8週齢のWistar系雄性ラットを安静群、ジャンプ運動群、PTH投与群、ALN投与群、PTH+ジャンプ運動群、およびALN+ジャンプ運動群の6群に分けた。PTH投与群にはhuman PTH(1-34)を投与(60μg/kg/day)、ALN群にはALNを投与(20μg/kg/day)し、ジャンプ運動は、1日10回のジャンプ運動を行わせた。実験終了後、大腿骨遠位骨幹端領域の骨梁微細構造および骨幹部の幾何学的特性を、マイクロCTにより解析した。次いで、3点支持の破断試験を行って骨強度を測定した。その結果、ジャンプ運動とPTH投与は、主として骨梁の厚さに寄与しているのに対して、ALNは骨梁数の増加に寄与して骨梁構造を変化させることが示唆された。また、皮質骨の幾何学特性と骨強度はジャンプ運動により増加したが、薬物投与の効果は少ないことが示唆された。しかし、運動と薬物投与を併用した場合は、骨梁構造および骨強度に相乗効果がみられた。以上の結果より、薬物投与とジャンプ運動は、骨量増加や構造的な増強に有効であることが示された。また、薬物投与とジャンプ運動との併用は、大腿骨遠位骨幹端領域の骨梁微細構造に相乗効果を生み出すことが示された。アレンドロネート(ALN)あるいは副甲状腺ホルモン(PTH)とジャンプ運動の併用による骨量および皮質骨のgeometryに対する相乗効果の有無について検討した。Wistar系雄性ラット60匹を安静群(C)、ジャンプ運動群(J)、PTH投与群(P;60μg/kg/day)、ALN投与群(A;20μg/kg/day)、J+P群(J+P)およびJ+A群(J+A)の6群に分けた。実験終了後、大腿骨の骨密度、骨幹中央部の幾何学的特性および3点支持破断強度を測定した。大腿骨の骨密度は、J群、P群およびA群のいずれもC群より有意な高値を示し、J+P群とJ+A群は他の4群より有意な高値を示した。皮質骨の厚さと幅は、J群がC群とA群より有意な高値を示した。J+P群では、皮質骨の厚さがC群、A群およびJ+A群より有意な高値を示し、皮質骨の幅がすべての群より有意な高値を示した。骨強度は、C群がA群以外のすべての群より有意な低値を示したのに対し、J+P群は全ての群より有意な高値を示した。ジャンプ運動とALNあるいはPTHの併用は、骨量増加に対して相乗効果を示した。皮質骨の幾何学的特性と骨強度については、ジャンプ運動とPTHの併用では相乗効果がみられたのに対して、ALNとの併用では相乗効果を認めなかった。以上の結果より、薬物治療は運動負荷と相乗効果を示し、その効果には薬剤により差がみられることが示唆された。尾部懸垂中のアレンドロネート(ALN)あるいは副甲状腺ホルモン(PTH)とジャンプ運動の併用による骨微細構造および皮質骨のジオメトリーに対する相乗効果の有無について検討した。生後8週齢のWistar系雄性ラット60匹を安静群(C)、ジャンプ運動群(J)、PTH投与群(P)、ALN投与群(A)、J+P群(J+P)およびJ+A群(J+A)の6群に分けた。3週間の尾部懸垂中にPTH投与群には、humanPTH(1-34)を間欠投与(60μg/kg/day)、ALN群にはALNを投与(20μg/kg/day)し、ジャンプ群には懸垂を中断させ1日10回のジャンプ運動(高さ40cm)を行わせた。薬物投与および運動負荷の終了までの時間は3分以内であった。実験終了後、大腿骨の骨密度をDXA装置により測定した。次いで、大腿骨遠位骨幹端海綿骨領域の骨梁微細構造および骨幹中央部の幾何学的特性をマイクロCTにより解析した。また、3点支持破断試験を行って骨強度を測定した。

ジャンプ運動とPTHの併用は、大腿骨全体の骨密度、骨幹端海綿骨の骨量、骨梁の厚さ、骨幹中央部の皮質骨の厚さおよび骨強度の増加に対して相乗効果を示した。一方、ALNでは、大腿骨全体の骨密度以外は運動との併用によって骨に対する効果が相殺される傾向がみられた。以上の結果より、骨粗鬆症治療薬と運動負荷の間の相乗効果には、骨吸収抑制剤と骨形成促進剤とで差がみられ、それぞれの薬剤の作用機序の相違を反映した結果と考えられた。