hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転位構造・配列制御新セラミックスデバイスの創出

薄膜中の転位密度は変形による転位密度よりも約10倍高く,薄膜中転位が高密度ナノ細線の作成に適していることが示された.・転位配列の精密制御法の確立小傾角粒界を有するサファイアバイクリスタルの構造解析を行い,同粒界には317の奇数個に分解した部分転位が存在していることを突き止めた.詳細に解析を行った結果,部分転位はバーガースベクトル=1/3[10-10]と1/3[01-10]を有しており,0.1°のねじり量を補償するために導入されていることが明らかになった.このことからうねじり成分を変えることにより転位配列を制御できることが明らかとなった.・ナノ細線セラミックスデバイスの創出AIN薄膜中に導入されている高密度転位にMnを添加し,高密度ナノ細線の作成を行った.その結果,Mn添加は転位近傍数nmの領域に局在し,特にextra half plane下側の引っ張り応力領域に存在していることが分かった.物性を調べた結果,Mn添加ナノ細線において電気伝導性を得ることができた.本研究をとおし,転位配列の制御法を確立し,高密度ナノ細線を作成することができた.
慢性疲労症候群患者にみられるリムルス陽性化物質と病因・病態との関連についての研究

我々は、慢性疲労症候群の多くの症例では細菌感染や炎症などの所見がまったく見られないにもかかわらず、リムルス反応が陽性になるという新たな知見を見い出した。リムルス反応を陽性化させるカスケードは2つあり、1つはエンドトキシンなどのC因子活性化物質で、他の1つはβグルカンなどのG因子活性化物質である。CFS症例に見られるリムルス反応陽性化は、G因子を含まないエンドスペシー検査の陽性率が低いことより、エンドトキシンではなくG因子活性化物質によると思われる。CFS症例には真菌感染症などを疑わせる成績が全く見られないことより、βグルカンとも異なる物質の可能性もある。そこで、CFS患者血漿をカラムクロマトグラフィーなどにより分画し、活性化物質の性状を明らかにすべく試みているが、現在のところその単離・精製に至っていない。従来我々が採用していた阻害物質除去法(PCA法)では、蛋白結合型の活性化物質自体を除外してしまう可能性が考えられ、現在阻害物質の除去法として希釈加熱法を採用し、また感度・精度を上げるためゲル化転倒法を比濁時間分析法に改良して各フラクションごとの活性化物質について検討を行っている。次に、我々はCFSの多くの患者では脱力、筋肉痛、軽度の労作後の強い倦怠等の筋症状を伴っていることに着目し、筋肉におけるエネルギー代謝にとって欠かすことのできないカルニチンの測定を行なったところ、CFS患者では正常人と比較して脂肪酸と結合したアシルカルニチンが血清中において明らかに減少している事を世界で初めて見い出した(Clin Infect Dis,1994)。我々が見い出したCFS患者における血清中アシルカルニチンの減少は、フリーカルニチンの濃度は正常であり、従来報告されてきた2次性カルニチン減少症とは全く異なる病態である。血清中アシルカルニチン濃度は、CFS患者における病状が回復するにともなって増加が認められ病状と良く相関しており、CFSの病因・病態を解明する上で極めて重要な手がかりであると思われる。我々は、当院を受診した慢性疲労症候群の多くの症例に、エンドトキセミアをきたす様な細菌感染や炎症などの所見がまったく見られないにもかかわらず、リムルス反応が陽性という今まで気付かれていなかった成績を見い出した。リムルス反応を陽性化させるカスケードは2つあり、1つはエンドトキシン(リピドA)にて代表されるC因子活性化物質で、他の1つはβグルカンにて代表されるG因子活性化物質である。CFS症例に見られるリムルス反応陽性化は、G因子を含まないエンドスペシー検査の陽性率が低いことより、エンドトキシンとは異なりG因子活性化物質と思われ、かつCFS症例には真菌感染症などを疑わせる成績が全く見られないことよりβグルカンとも異なる物質と考える。そこで、CFS患者血漿をカラムクロマトグラフィーなどにより活性化物質分画を明らかにすべくその単離・精製を試みているが、従来我々が採用していたリムルス反応を阻害する物質の除去法(PCA法)では、蛋白結合型の活性化物質自体を除外してしまう可能性が考えられた。そこで、現在阻害物質の除去法として熱希釈法を採用し、各フラクションごと活性化物質について検討を行っている。また、我々はCFSの多くの症例に脱力や筋肉痛、運動後の倦怠感を認めることより、筋組織におけるエネルギー代謝に重要な役割をはたしているカルニチンについて検討を行ったところ、CFS症例では血清中におけるAcylカルニチンが有意に低下していることを見いだした。

いままでに報告されてきたカルニチン欠乏症は、そのほとんどがfreeのカルニチンの減少によるものであり、この血清中におけるAcylカルニチンの減少がどの様な病態と結び付くのかはこれからの研究が必要であるが、このAcylカルニチンの異常を介したエネルギー代謝の異常が脱力や筋肉痛、運動後の倦怠感などの臨床症状と関連していることが考えられ、さらに詳細な検討を行っている。我々は、多くのCFS患者では筋肉の明かな異常がないにもかかわらず、脱力、筋肉痛等の筋症状を伴っていることに着目し、筋におけるエネルギー代謝にとって欠かすことのできないカルニチンの測定を行なったところ、CFS患者では正常人と比較して脂肪酸と結合したアシルカルニチンが血清中において明らかに減少している事を世界で初めて見い出した(Clin Infect Dis,1994)。CFS患者における血清中アシルカルニチンの減少は、フリーカルニチンの濃度は正常であり、従来報告されてきた2次性のカルニチン減少症とは全く異なる病態である。CFS患者におけるアシルカルニチンは、病状が回復するにともなって増加が認められており、アシルカルニチンの減少という特異な現象は、CFSの病因・病態を解明する上で極めて重要な手がかりであると思われる。現在、CFS症例におけるアシルカルニチン減少の機序の解明とともに、この生理学的意義を明らかにするため、カルニチン及びアシルカルニチンの代謝ならびに生体内動態の検討を行っている。次に、我々は慢性疲労症候群の多くの症例ではリムルス反応が陽性になるという新たな知見も見い出している。リムルス反応を陽性化させるカスケードは2つあり、1つはエンドトキシンなどのC因子活性化物質で、他の1つはβグルカンなどのG因子活性化物質である。CFS症例に見られるリムルス反応陽性化は、G因子を含まないエンドスペシー検査の陽性率が低いことより、エンドトキシンではなくG因子活性化物質によると思われる。そこで、CFS患者血漿をカラムクロマイトグラフィーなどにより分画し、活性化物質の性状を明らかにすべく試みているが、現在のところその単離・精製に至っていない。従来我々が採用していた阻害物質除去法(PCA法)では、蛋白結合型の活性化物質自体を除外してしまう可能性が考えられ、現在阻害物質の除去法として希釈加熱法を採用し、また感度・精度を上げるためゲル化転倒法を比濁時間分析法に改良して各フラクションごとの活性化物質について検討を行っている。
エクトイン合成系遺伝子を利用した耐塩性付与に関する研究

本研究は、エクトインを主たる高浸透圧保護物質として合成蓄積するHalomonas elongataのゲノムDNAより得たエクトイン合成酵素遺伝子(ectA,ectB,ectC)の発現様式を明らかにし、さらに非耐塩性菌の大腸菌及び酵母における遺伝子導入、発現、エクトイン合成能の付与を目的として行われた。3つのエクトイン合成系遺伝子はクラスターを形成しているので、大腸菌由来の浸透圧応答遺伝子プロモーター制御下でこれらを発現させる前に、まず、H.elongataにおけるこれらの発現制御機構を明らかにするため、最上流に位置するectBの5'上流域をゲノムDNAより新たにクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ectBの5'側に約340塩基の非翻訳領域があり、大腸菌の形質転換体では、この部分の全長が含まれるとき最も高いエクロイン合成活性が得られた。しかし、培地中の0.5M NaCl添加の影響はエクトイン合成活性には負の効果が、細胞内のエクトイン蓄積量には正の効果があった。エクトイン蓄積量がその合成酵素活性の変動と一致しない原因は、(1)発現酵素タンパク質が基質レベルで細胞外の塩による制御を受けている、(2)菌体内で合成されたエクトインが低浸透圧環境下では保持できず培地中に漏洩した、のいずれかによると考えられる。酵母Saccharomycescereviseaeにエクトイン合成能を付与する試みとして、フォスホグリセロリン酸キナーゼプロモーターによる構成性発現ベクターを用いてエクトイン合成系遺伝子をまず、単独で導入し、その発現を調べた。形質転換体の粗酵素液中には合成系酵素のいずれも活性を確認することができたので、酵母におけるエクトインの合成蓄積の可能性は充分にあることがわかった。しかし、3酵素遺伝子すべてを同時に導入した形質転換体は得るに至らなかった。
癌・免疫のクロストーク機構および免疫バイオマーカー解析による乳癌治療戦略の検討

近年の研究からは、癌局所の免疫状態を評価することが、癌の再発や予後に対する重要なbiomarkerとなることが示され、一方で、有効な癌治療のためには、免疫抑制的癌微小環境の解除を目指した治療戦略が必要なことが示唆されている。本研究では現在までの研究の発展を図り、乳癌において、癌細胞と免疫抑制的癌微環境を軸とした宿主免疫システムの間の相互干渉が癌治療成績に及ぼす影響とそのメカニズムについて解析し、免疫バイオマーカーの探索を行うことを目的とする。また、その相互干渉メカニズムについて、特に癌幹細胞様細胞および薬剤耐性癌細胞を対象として解析することを目的とする。近年、各種癌における新規治療薬として抗PD-L1および抗PD-1抗体の可能性が報告され、臨床応用が進んでいる。PD-L1は、癌細胞の表面に発現しており、T細胞の表面に発現するPD-1受容体に結合し、それによってT細胞の抗腫瘍免疫活性は抑制されることになる。共同研究者の研究からは、EGFR遺伝子変異を伴う肺癌(NSCLC)においてはPD-L1が過発現しており予後因子となっていることが示された(Azuma et al. Ann Oncol 2014,)。PD-L1が受容体型チロシンキナーゼ(RTK)からのシグナルにより制御され、免疫環境へ影響を及ぼすことが示唆され、RTK阻害薬の治療効果の一機序として、PD-L1発現抑制を介した癌免疫機構への作用も考えられた。本年度は、乳癌におけるPD-L1発現を軸として、その局所免疫環境・予後との関係について、主に免疫組織学的検討を行い報告した(Okabe et al. Cancer Sci. 2017)。近年、各種癌における新規治療薬として抗PD-L1抗体の可能性が報告されている。本年度は、乳癌におけるPD-L1発現を軸として、その局所免疫環境・予後との関係について、主に免疫組織学的検討を行い解析中である。ivvitro実験系の構築:EMT関連転写因子導入細胞からの安定発現細胞株の製作や、薬剤耐性癌細胞解析に、予定より遅れがみられる。引続き、免疫組織学検討をはじめとする臨床検体を用いた解析を継続。Laser Microdissection法を用いた発現解析による局所免疫環境の検討を行う。また、併せてiv vitro実験系の構築を進める。抗体などの試薬について、一部共同研究により共用することができた。
戦後日本における性教育実践の社会運動史研究

本研究の目的は、性教育を中心にすえた人権教育の今後のあり方を展望するため、「性」と「人権」の関係がいかに理解されてきたかを、社会運動史として明らかにすることである。そのため、“人間と性"教育研究協議会(性教協)について、第1にその歴史を複数の系譜の相互関係として見ることで性教育をめぐる人権意識の多元性を明らかにすると同時に、第2に同会関係者への聞き取りを通して性教育実践の多様な足跡を辿り、「性」と「人権」との関係づけ方を時代状況に即して明らかにする。以上の研究の前提的な作業として、2018年度においては第1に『同時代史研究』誌上(第11号、2018年12月発行)に特集「「性教育」の同時代史」を組み、研究代表者による趣旨説明とあわせて、研究分担者3名による論考を掲載した。これによって、戦後日本における性教育の歴史を、文部省の動向を中心に概略的に把握すると同時に、性教育実践の今日的な課題を人権教育と性の多様性の2つの視点から整理することができた。第2に、性教育実践の社会運動史を研究するさいの課題の所在について、研究代表者による研究ノートを『東京学芸大学紀要』に掲載した。第3に、性教協の創設者の1人である山本直英の著作を収集した。これらの作業をふまえ、2019年1月17日には、性教協関係者3名(安達倭雅子、佐藤明子、狛潤一)による座談会形式のヒアリングを実施した。録音・録画記録は次年度に原稿化する。また、5月には村瀬幸浩からのヒアリングを行う予定である。日本教育学会での準備報告を経て、『同時代史研究』と『東京学芸大学紀要』誌上で、研究代表者と研究分担者それぞれが、研究テーマに関連する論考を公表することができた。また、ヒアリング作業も、準備作業にやや手間取ったが順調に開始することができた。対象者によっては質問項目を変更するなど、今後工夫を要するが、概ね軌道に乗りつつあると言って良い。授業実践の研究については、参観校がまだ少ないが、1校については継続して実施しており概ね順調である。山本直英関連の文献を引き続き収集すると同時に、村瀬幸浩関連の文献収集にも着手する。また、聞き取り作業をある程度システム化し、体系的に実施できるような態勢を整える。あわせて、録音・録画データのテープ起こしを業者に発注し、そのチェック態勢を整える。これらの作業を、性教協において取り組まれている40年史の編纂作業や、機関誌『セクシュアリティ』の編集作業などと連携させながら進める。また、研究代表者が同時並行的に進めている『現代日本社会運動史研究(仮題)』の出版計画とも連動させることで、性教育実践に関する歴史像をより立体的で具体的なものにできる。

また、研究代表者が同時並行的に進めている『現代日本社会運動史研究(仮題)』の出版計画とも連動させることで、性教育実践に関する歴史像をより立体的で具体的なものにできる。ヒアリングの始動が遅れ、謝金の支払いが次年度回しになるなど、予算消化が追いつかなかったため。新年度は、すでに実施したヒアリングの支払い手続きを早急に行うとともに、他のヒアリングも順次行い、ペースをあげていく計画である。
哺乳類卵子活性化に伴う表在タンパク質動態のプロテオミクス解析

近年、哺乳類の卵の質・胚の質に関する理解はいつになく強く求められている。本研究では、非侵襲的な胚の質判別法の開発も視野に、基礎生物学的な胚の質の理解を進めるために受精直後の胚表面タンパク質の動態を明らかにする。受精直後は、卵子活性化と呼ばれる多様な諸過程が短時間で進行するため、卵子活性化の時間制御や低侵襲性イメージングなどの新規技術を駆使して、受精卵の状態を正確に捉え、かつ卵子活性化の一部過程を欠く受精卵を意図的に作出する工夫により、解析効率を飛躍的に深める。本研究の成果は、基礎生物学的貢献だけでなく胚の質評価という重要課題に関わる因子の発見も十分期待できる。
地形図から高分解能DEMを自動生成するための画像処理システムの開発

本研究では,既開発の基本システムをベースとして,地形図から高分解能DEMを自動生成するための画像処理システムの開発を行った。具体的には,基本システムにおける多数の適用実験を踏まえて,地形図とDEMから各種地形特徴を効率的に抽出して処理するための輪郭線画像処理を主体とした各種画像処理アルゴリズムの開発と性能改善を行うとともに,システムとしての統合化を行い,ユーザ・フレンドリーなトータルシステムとしての実現を図った。本年度は,既開発の基本システムをベースとして,地形図から高分解能DEMを自動作成するための実用化システムの開発を目指して,以下の4項目に重点を置いて研究を進めた。(1)多数の適用実験を踏まえて,基本システムの各種処理アルゴリズムの性能改善を行う。(2)作成した小規模DEMを張り合わせて,1つの統合DEMにまとめる技法の開発を行う。(3)DEMから各種地形特徴を効率的に抽出するための基本処理アルゴリズムの開発を行う。(4)システムとしての統合化を行い,ユーザ・フレンドリーなトータルシステムとしての実現を図る。まず(1)については,基本システムを多数の地形図に適用して問題点を洗い出した結果,生成DEM表面に残存する不自然な段差,瘤,凹みなどを解消する整形後処理法の改善が必要となっており,具体的に2つの処理手法(拡張型Grimsor正則化法,選択的平滑化法)の改良を行い,良好な実験結果を得た。続けて,各種の適用実験を多角的に実施しながら,実用化システムを実現するための各種処理アルゴリズムの性能改善を行う予定である。次に(2)については,市販の地形図では図面の境界同士で若干のずれを発生しており,その対策が小規模DEMを張り合わせて統合DEMにまとめる上での検討課題となっている。そこで,境界部分において両者をDEM上でモーフィング的に融合する手法を検討しているが,システムとしての実現化作業はまだ未着手である。また(3)については,地形の斜度と方位,流域部,尾根部,谷部などを地形図とDEMから正確に決定することが必要となるが,これらの各種地形特徴を効率的に抽出するために,ウェーブレット変換を用いた輪郭線抽出処理アルゴリズム,差分チェインコードの統計的性質を利用した輪郭線画像の効率的な圧縮符号化法,などの開発を行った。(4)については,グラフィック・ユーザ・インターフェイス(GUI)を駆使したユーザ・フレンドリーな処理システムとしての実現化作業を継続中である。また,既存の地理情報システムとのインターフェイスをはじめとする各種ユーティリティ機能を充実する作業も継続中である。まず(1)については,基本システムを多数の地形図に適用して問題点を洗い出した結果,生成DEM表面に残存する不自然な段差,瘤,凹みなどを解消する整形後処理法の改善が必要となっており,具体的に2つの処理手法(拡張型Grimson正則化法,選択的平滑化法)の改良を行っている。本年度は,既開発の基本システムをベースとして,地形図から高分解能DEMを自動作成するための画像処理システム(実用化システム)の開発を目指して,以下の3項目に重点を置いて研究を進めた。1.多数の適用実験を踏まえて,実用化システムにおける各種画像処理アルゴリズムの性能改善を行う。2.地形図とDEMから各種地形特徴を効率的に抽出するための画像処理アルゴリズムの開発を行う。3.システムとしての統合化を行い,ユーザ・フレンドリーなトータルシステムとしての実現を図る。

まず1については,実用化システムを多数の地形図に適用して問題点を洗い出した結果,生成DEM表面に残存する不自然な段差,瘤,凹みなどを解消する整形後処理法の改善が必要なことが判明したので,それらの改良策について検討を行った。さらに各種の適用実験を多角的に実施して,実用化システムにおける輪郭線画像処理を主体とする処理アルゴリズムの性能改善についても検討を行った。次に2については,地形の斜度と方位,流域部,尾根部,谷部などを地形図とDEMから正確に決定することが必要となるが,これらの各種地形特徴を効率的に抽出するために,ウェーブレット変換を用いた輪郭線抽出処理アルゴリズム,差分チェインコードの統計的性質を利用した輪郭線画像の効率的な圧縮符号化法,などの開発を行った。3については,グラフィック・ユーザ・インターフェイス(GUI)を駆使したユーザ・フレンドリーな処理システムとしての実現化作業を前年度に継続して行った。
シストリックアレー構成を用いた移動通信用アダプティブアンテナの研究

ディジタル無線通信において,遅延多重波による周波数選択性フェージングの対策として期待される技術の一つにアダプティブアンテナがある.これは不要波にアンテナの指向性の零点(ヌル)を向け,所望波のみを良好に受信するシステムである.このシステムの実用化,特に移動通信への適用を考える場合,制御速度,システムに要求される精度など,解決すべき多くの問題が残されている.移動通信用としては,すべてディジタルで処理をするディジタルビームフォーミング(DBF)方式のアダプティブアンテナが有望である.本研究の目的は,計算機シミュレーション及び試作システムによる実験を通して移動通信に適したDBFアダプティブアンテナ用の制御アルゴリズムを開発することである.その研究成果は以下の通りである.まず,アダプティブアンテナを動作させる制御アルゴリズムはLSI化が容易なシストリックアレー方式を採用した.この方式は,同一の演算機能をもつセルを複数個用意し,これらによるパイプライン処理を基本アルゴリズムとする.本研究では,さらに,シストリックアレー構成を実現しやすいようにアダプティブアンテナとしてビームスペース方式を採用し,ビームフォーミングネットワーク(BFN)について検討した.その結果,電波環境に適応したビーム形成が可能である固有ビームスペース方式を提案し,その有効性を計算機シミュレーションによって示した.また,アダプティブアンテナの動作原理としてディジタル移動通信に適したCMA(Constant Modulus Algorithm)を用いて多重波抑圧特性を調べたところ,収束特性,出力SINR(Signal-to-Interference-plus-Noise Ratio)特性とも,従来のエレメントスペース方式よりも優れていることがわかった.最後に試作システムによる簡単な室内実験(1.5GHz,4素子リニアアレー)を通してその良好な特性を確認した.今後,符号誤り率によるシステムの評価や室内実験によるより詳細な検討が課題である.ディジタル無線通信において,遅延多重波による周波数選択性フェージングの対策として期待される技術の一つにアダプティブアンテナがある.これは不要波にアンテナの指向性の零点(ヌル)を向け,所望波のみを良好に受信するシステムである.このシステムの実用化,特に移動通信への適用を考える場合,制御速度,システムに要求される精度など,解決すべき多くの問題が残されている.移動通信用としては,すべてディジタルで処理をするディジタルビームフォーミング(DBF)方式のアダプティブアンテナが有望である.本研究の目的は,計算機シミュレーション及び試作システムによる実験を通して移動通信に適したDBFアダプティブアンテナ用の制御アルゴリズムを開発することである.その研究成果は以下の通りである.まず,アダプティブアンテナを動作させる制御アルゴリズムはLSI化が容易なシストリックアレー方式を採用した.この方式は,同一の演算機能をもつセルを複数個用意し,これらによるパイプライン処理を基本アルゴリズムとする.本研究では,さらに,シストリックアレー構成を実現しやすいようにアダプティブアンテナとしてビームスペース方式を採用し,ビームフォーミングネットワーク(BFN)について検討した.その結果,電波環境に適応したビーム形成が可能である固有ビームスペース方式を提案し,その有効性を計算機シミュレーションによって示した.また,アダプティブアンテナの動作原理としてディジタル移動通信に適したCMA(Constant Modulus Algorithm)を用いて多重波抑圧特性を調べたところ,収束特性,出力SINR(Signal-to-Interference-plus-Noise Ratio)特性とも,従来のエレメントスペース方式よりも優れていることがわかった.最後に試作システムによる簡単な室内実験(1.5GHz,4素子リニアアレー)を通してその良好な特性を確認した.今後,符号誤り率によるシステムの評価や室内実験によるより詳細な検討が課題である.
新規合成レチノイド(Am80,Ch55,Re80)によるヒト神経芽腫の細胞分化

レチノイド化合物は、個体の発生と成長、細胞分化、生殖、視覚、聴覚や味覚受容器などに対する様々な生理作用を有し、ビタミンというよりもホルモンとしての側面が知られてきた。そのレセプターは、核内レセプター遺伝子ファミリーを構成し、レチノイン酸レセプター(RAR)のRARα、RARβ、RARγと9-cisレチノイン酸レセプターのRXRα、RXRβ、RXRγがクローニングされている。今回、急性前骨髄球性白血病株で分化誘導能が報告されている新合成レチノイドであるAm80、Ch55、Re80を用いて、神経芽腫(NB)の分化誘導とそれに伴うRAR発現の変動を検討した。NB株のKP-N-RTをAm80、Ch55、Re80を含むRPMI1640メディウム(10%FCS)で培養し、形態的変化を観察した。陽性コントロールとして合成レチノイドE5166、また、陰性コントロールとしてレチノイド無添加のメディウムを用いた。分化誘導細胞とは細胞体の2倍以上の突起有するものと定義した。研究結果は以下の通りであった。1.新規合成レチノイドの分化誘導に用いる至適濃度、分化誘導に要する日数の決定:E5166は1.7X10^<-5>M、Am80、Ch55とRe80は5.0X10^<-10>Mが至適濃度で分化には4日間要した。2形態学的変化に伴う分化の免疫組織学的変化:形態学的分化に伴い、Neurofilamentが増加し、神経細胞への分化が判明した。3.分化に伴うRAR(α、β、γ)の発現の経時的変化:分化によりRAR(α、β、γ)の発現が増強した。分化に伴う神経栄養因子受容体(trkA、trkB)の発現の有無と経時的変化:4分化によりtrkAとtrkBの発現は増強した。以上レチノイドによりNBの分化が誘導され、レチノイン酸レセプター、神経栄養因子受容体発現が増強されることより、NBの分化誘導療法の可能性が判明した。神経芽腫(Neuro blastoma:以下NBと略)は神経冠より発生する腫瘍で、以下の臨床的特徴をもつ。(1)小児期固形悪性腫瘍の中で最も頻度が高い。(2)臨床経過中に分化・成熟がおこることがある。(3)in vitroでは種々の化学物質や生物学的活性物質により分化誘導が可能である。(4)1歳以下の進行NB(病期IVS)の予後は、1歳以上の進行NB(病期IV)と異なり、良い。これらNBの臨床的特徴は、NB細胞の分化・成熟とアポトーシスに関係していると考えられる。一方、我々は既にNBの神経細胞への分化誘導を、種々の分化誘導剤を用いて検討してきた。そして合成retinoidであるE5166は、in vitroでのNBの神経細胞への分化誘導能が最も強いことを報告してきた。さらに最近になってAm80、Ch55とRe80などの合成retinoidが首藤氏により開発された。そこで今回これら3種のretinoidによるNBの分化誘導能を検討した。NB細胞株KP-N-RTに上記のretinoidを添加し10日間培養し、分化したNB細胞(細胞突起が細胞の直径の2倍以上と定義)の出現を観察した。50%以上の分化細胞を誘導出来るretinoidの濃度は、Ch55とRe80(1.0X10^<-11>M)とAm80(1.0X10^<10>M)、E5166(1.7X10^<-5>M)であった。すなわちCh55、Re80とAm80は、我々が従来用いてきたE5166よりもさらに10^<-5>10^<-6>の低濃度でNBを分化誘導することが明らかとなった。またretinoid添加により形成された細胞突起は、neurofilament陽性であることが蛍光抗体法で証明された。すなわち形態学的のみならず細胞骨格蛋白の点でも分化した神経細胞に誘導されたことが分かった。今後これら3種のretinoidによるNBの分化誘導能の機構について、(1)retinoic acid受容体(retinoic acid receptorとretinoid X receptor)と(2)アポトーシスとの点よりさらに検討し、NBの細胞生物学的特徴を明らかにしたい。

1.新規合成レチノイドの分化誘導に用いる至適濃度、分化誘導に要する日数の決定:E5166は1.7X10^<-5>M、Am80、Ch55とRe80は5.0X10^<-10>Mが至適濃度で分化には4日間要した。2形態学的変化に伴う分化の免疫組織学的変化:形態学的分化に伴い、Neurofilamentが増加し、神経細胞への分化が判明した。3.分化に伴うRAR(α、β、γ)の発現の経時的変化:分化によりRAR(α、β、γ)の発現が増強した。分化に伴う神経栄養因子受容体(trkA、trkB)の発現の有無と経時的変化:4分化によりtrkAとtrkBの発現は増強した。以上レチノイドによりNBの分化が誘導され、レチノイン酸レセプター、神経栄養因子受容体発現が増強されることより、NBの分化誘導療法の可能性が判明した。
オルガネラに局在する植物核tRNAスプライシング酵素の新規機能の探索

植物が持つ核tRNA遺伝子の中にはイントロンを持つものがある。前駆体tRNA分子のスプライシングは核内で進行するが,エキソンの連結反応に関わるtRNAリガーゼは核以外に葉緑体にも局在する。tRNAリガーゼが葉緑体tRNAの修復に関与する可能性を検討するために,tRNAリガーゼのリガーゼドメインに置換を導入した変異遺伝子を作製し,タバコで過剰発現させたドミナントネガティブ変異体を作出した。野生型と変異植物に対して酸化的ストレスを与えて,細胞質と葉緑体tRNAを抽出して特異プローブを用いたノーザン法でintactなtRNAとその分解物の割合を求めた。この結果,10mM H_2O_2を用いた酸化的ストレス条件では幾つかの細胞質tRNA分子種において分断が観察されるものの,葉緑体RNAは野生型,変異体いずれでもintactなものと分断されたものに差異は見られなかった。真核生物の核tRNA遺伝子の中にはイントロンを含むものが存在する。tRNA^<Tyr>とtRNA^<Met-e>をコードする核遺伝子のみが植物ではイントロンにより分断されている。tRNAイントロンのスプライシングはtRNAに特異的な3種類の酵素による切断・連結反応により進行する。これら酵素は核以外に葉緑体とミトコンドリアにも局在することから、核内でのtRNAスプライシング反応とは異なる、何らかの機能を担っているものと推察される。本研究は植物前駆体tRNAスプライシング装置を構成する酵素タンパク質の新規機能を探索・解明することを目的として行う。平成20年度においてこれら3種の酵素タンパク質の細胞内局在を生化学的な手法で確認するために、シロイヌナズナ由来のスプライシング酵素をコードするcDNAとGFP遺伝子とのキメラ遺伝子を植物形質転換ベクターに組み込んだ。ベクターはアグロバクテリウムEHA105株を介した形質転換法によりタバコ培養細胞BY-2への導入を行っている(形質転換効率を改善するための条件検討を進めている)。また、tRNAエンドヌクレアーゼ遺伝子のイネ過剰発現株を確立した。平行して、BY-2細胞をプロトプラスト化し、細胞核、プラスチド、ミトコンドリアの単離の条件検討を進めた。確立した条件に従いGFP融合発現株から各種細胞画分を調製し、GFP抗体を用いたウエスタン法によりそれぞれのタンパク質の局在を明確にする。来年度においては、tRNAリガーゼ(RL)と2'-フォスフォトランフェラーゼ(Pt)のオルガネラでの機能探索を行うために、これら酵素をコードするcDNAの核、オルガネラのみでの過剰発現とノックダウンのための遺伝子コンストラクトの構築を進めている。植物ではtRNA^<Tyr>とtRNA^<Met-e>をコードする核遺伝子がイントロンにより分断されている。tRNAスプライシング機構は境界部位の切断とエクソンの連結が酵素タンパク質により協調的になされる。tRNAスプライシング酵素はオルガネラにも局在することから、オルガネラで何らかの機能を担っているものと推察される。平成21年度では連結反応に関わるtRNAリガーゼの葉緑体での機能解析に的を絞って研究を進めた。シロイヌナズナのtRNAリガーゼをコードする遺伝子(AtRL)を鋳型にして試験管内突然変異法により、1)核移行シグナル(NLS)の除去(ΔNLS)、2)リガーゼドメインの保存された触媒アミノ酸残基の置換(K152AまたはE326A)を行い、これらの組み合わせから各種変異遺伝子を構築した(AtRL ΔNLS, AtRL-K152A, AtRL-E326A, AtRLΔNLS-K152A, AtRLΔNLS-E326A)。これらを構成的に発現する組換え体(タバコ、イネ,`シロイヌナズナ)の作出をほぼ完了した。これと平行して、各種ストレスを生物に暴露することで、特定の細胞質tRNAの切断が起こり、tRNAリガーゼがその修復に関与する可能性が示唆されている。これらの報告を踏まえて、野生型タバコとタバコ培養細胞BY-2に酸化的ストレス(10mM過酸化水素)を一定時間暴露後に、破砕した組織から全tRNAを抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりRNAをサイズ分画し、細胞質tRNA及び葉緑体tRNAに特異的なRNAプローブ(細胞質tRNA : 18種、葉緑体tRNA : 28種)を用いてそれぞれのtRNAを検出した。

その結果、酸化的なストレスにより細胞質tRNAでは特異的な切断が観察されたものが2種、発現パターンの増減が見られたものが3種見出された。一方、葉緑体tRNAは用いた条件では有意な切断は見出されなかった。植物ではtRNA^<Tyr>とtRNA^<Met-e>をコードする核遺伝子がイントロンにより分断されている。tRNAスプライシング機構は境界部位の切断とエキソンの連結が酵素タンパク質により協調的になされる。tRNAスプライシング酵素はオルガネラにも局在することから,オルガネラで何らかの機能を担っていると推察される。平成22年度においては葉緑体に局在が観察されたtRNAリガーゼの機能を解明するために以下の2つの観点から研究を進めた。1)tRNAリガーゼのドミナントネガティブ変異体に対する酸化ストレスの暴露とtRNA分解:tRNAリガーゼが葉緑体RNAの修復に関与する可能性を検討するために,シロイヌナズナtRNAリガーゼをコードする遺伝子(AtRL)のリガーゼドメインの保存されたアミノ酸残基に変異を導入した変異遺伝子を構築しタバコでの過剰発現体を作成した。これに対して10mM H_2O_2を用いた酸化ストレスに暴露し,葉緑体RNAの分解の程度を野生型のものと比較した。この結果,少なくともtRNAでは分解の程度は野生型と変異体では差が見られなった。2)tRNAリガーゼのシロイヌナズナのタグラインの解析:シロイヌナズナのtRNAリガーゼのタグライン(SALK_126293,SALK_037164,SALK_059581)を入手して解析に供した。先の二つはプロモーター領域に,残り一つは転写開始点付近にT-DNAが挿入されていた。ホモ系統を確立して,発現量と表現系を調べた。この結果,mRNAレベルで有為な発現低下が観察されず,表現型も野生型と芽生えの段階で差異は見られなかった。ストレスによるtRNA分解は細胞内での普遍的な現象である(Thompson & Parker,2009)。今回,葉緑体に局在するtRNAリガーゼが修復に関与する明確な検証ができなかったが,tRNAリガーゼ活性が律速となる暗条件下でのストレス条件を検討することで,修復反応をより検出しやすい実験系の確立が可能になるものと期待される。また,tRNAリガーゼは生存に必須であるために,コンディショナルなプロモーターでtRNAリガーゼ発現をノックダウンする系の確立も検討すべきである。
分散アクティブカメラからの部分情報に基づく複数人間の広域追跡

広い空間で複数の人間が動く場所で,複数のカメラの画像を分散協調的に処理することによって,人間を追跡するとともに,人間を識別するという目標を達成するために以下の研究を行なった.具体的には,・項目1:オプティカルフローを用いて,廊下を歩く複数の人を追跡しする研究を行なった.つぎに,人がいると廊下の色ががどのように変化するかを学習し,その結果に基づいて確率的に人の位置を求め方法を得た.(白井,先山)・項目2:人の位置から顔の大体の位置を予測し,目や鼻などの顔の部品の候補を確率的に推定し,その幾何学的な拘束から任意の方向の顔を検出する研究を行なった.また,顔の識別の不確かさは,顔の向きに依存することを実験的に確かめ,識別の不確かさを顔の向きによってモデル化する手法を確立した.(白井,久野)・項目3:動いている人に関して将来得られる情報とその確率を推定する定式化を行った.これに基づいて,カメラがどこを見たらいいかを決定するための評価関数を,画像内の人に関してこれまでに得られている情報と将来得られる情報の確率に関して定式化した.(白井,三浦)・項目4:長い廊下でカメラが多数ある場合,1つのカメラの視界から消える人に関して将来得られる情報を再帰的なシミュレーションによって確率的にモデル化した.(白井,島田)・項目5:PCクラスタシステム構築し,複数カメラ間のコミュニケーションに基づく分散処理によって,広域を高速にモニターする実験を行なって,その効果を確認した.(三浦,島田)広い空間で複数の人間が動く場所で,複数のカメラの画像を分散協調的に処理することによって,人間を追跡するとともに,人間を識別するという目標を達成するために以下の研究を行なった.具体的には,・項目1:オプティカルフローを用いて,廊下を歩く複数の人を追跡しする研究を行なった.つぎに,人がいると廊下の色ががどのように変化するかを学習し,その結果に基づいて確率的に人の位置を求め方法を得た.(白井,先山)・項目2:人の位置から顔の大体の位置を予測し,目や鼻などの顔の部品の候補を確率的に推定し,その幾何学的な拘束から任意の方向の顔を検出する研究を行なった.また,顔の識別の不確かさは,顔の向きに依存することを実験的に確かめ,識別の不確かさを顔の向きによってモデル化する手法を確立した.(白井,久野)・項目3:動いている人に関して将来得られる情報とその確率を推定する定式化を行った.これに基づいて,カメラがどこを見たらいいかを決定するための評価関数を,画像内の人に関してこれまでに得られている情報と将来得られる情報の確率に関して定式化した.(白井,三浦)・項目4:長い廊下でカメラが多数ある場合,1つのカメラの視界から消える人に関して将来得られる情報を再帰的なシミュレーションによって確率的にモデル化した.(白井,島田)・項目5:PCクラスタシステム構築し,複数カメラ間のコミュニケーションに基づく分散処理によって,広域を高速にモニターする実験を行なって,その効果を確認した.(三浦,島田)広い空間で複数の人間が働く場所で,複数のカメラの画像を分散協調的に処理することによって,人間を追跡するとともに、人間を識別するという目標を達成するために以下の研究を行った.1.実画像から抽出される特徴の不確かさと,その特徴から得られる人の種類と位置に関する情報の不確かさを表現する確率モデルを構築するため,さまざまな実画像系列を既存のマルチカメラスシステムを用いて撮影し,画像から特徴を抽出し,人の位置,顔の位置を求める研究を行った.背景によって,使う特徴がことなることがわかった.2.部分情報のモデルを作成するため,人の位置,人を見る方向,他の人による隠れなどによって,得られる情報がどのように変化するかの実験を行ない,観測条件と不確かさの関係を明らかにした.3.対象環境に依存する確率過程のモデルと観測行動の関係の定式化のため,ドアが多数ある建物の廊下を対象環境とし,複数カメラの行動計画を立てる方法を検討した.それぞれのカメラが分散的に計画を作るためには,情報を考慮できないので,隣のカメラ受け持ちに関する情報は詳しくもち,それ以外に関しては近似する方法が有効であることがわかった.4.パンチルトカメラを廊下に設置し,一台のカメラでいろいろな方向を見ることが出来るようにした.また,柔軟な処理を高速に行ないために,複数のパソコンの並列処理を行なう環境を整えた.本年度は,複数の人間を分散アクティブカメラで追跡する最適計画に必要な以下の項目を研究した.●項目1:1台のカメラから得られる人の顔画像からどのような情報が得られるかを調べた.顔の識別は,種々の方法を試した結果,照明の変化に強い特徴を抽出し,それを用いた部分空間法がいいことがわかった.この方法は,モデルとして多数の画像から得られる部分空間を用いるので,顔の表情の変化にも強い.また,識別の不確かさは,顔の向きに依存することがわかったので,識別の不確かさを顔の向きによってモデル化する手法を確立した.(白井,久野)●項目2:動いている人に関して将来得られる情報とその確率を推定する研究を行った.また,現在得られている情報が与えられた時,将来得られる情報や,カメラと人との距離,人を見る方向,隠れなどの条件と,得られる情報の不確かさの関係を用いて,次にどこを見るのが最適であるかを決定する手法を決定し,それを用いて簡単な例に関してシミュレーションを行なった.(白井,島田)

●項目3:複数カメラ間のコミュニケーションに基づく分散処理によって,広域を高速にモニターするために,購入予定の複数のPCと従来のPCによってPCクラスタシステム構築した.そのシステムを活かした画像処理を行なう予備実験を行なって,その効果を確認した.(三浦,島田)これまで行なった,廊下のシーンからの人の検出,人が検出された場合の顔の位置の決定,顔の位置ががわかった場合の顔の向きの決定,種々の方向を向いた顔からの人の認識の研究を統合して動かすことにより,全体の整合性を確かめた(全員).具体的には,1:廊下を歩く複数の人を追跡し,顔を抽出する研究を行なった.すでに,オプティカルフローを用いた手法を得ているので,今度は色の変化を用いることにした.廊下の正反射特性により,単純な背景差分では人を検出することができない.そこで,人がいると廊下の色ががどのように変化するかを学習し,その結果に基づいて確率的に人の位置を求め方法を得た.(白井,先山)2:カメラがどこを見たらいいかを決定するための評価関数を,画像内の人に関してこれまでに得られている情報と将来得られる情報の確率に関して定式化した.また,長い廊下でカメラが多数ある場合,1つのカメラの視界から消える人に関して将来得られる情報を再帰的なシミュレーションによって確率的にモデル化した.(白井,島田)3:PCクラスタシステム構築し,複数カメラ間のコミュニケーションに基づく分散処理によって,広域を高速にモニターする実験を行なって,その効果を確認した.(三浦,島田)
脂質分子構造からの高度不飽和脂肪酸の安定化と栄養学的機能性の向上化

1.エイコサペンタエン酸(EPA)含有各種脂質の構造が自動酸化時のヒドロペルオキシドの組成に与える影響EPAとパルミチン酸(P)を組み合わせたトリアシルグリセロール(TG)を自動酸化させた結果、モノヒドロペルオキシドの組成はTGの構造の影響を受けなかった。しかし、ジアシルグリセロール(DG)およびモノアシルグリセロール(MG)は、TGより酸化しにくく、また、TGでほとんど生成しなかった5位異性体の比率が順次上昇し、メチルエステルでは約20%に達した。2.高度不飽和脂肪酸含有TGの構造が自動酸化時の揮発性生成物に与える影響EPAとPからなる各種合成TGを自動酸化させたときの揮発性成分を分析したところ、主成分のアルデヒドは1分子中のEPAのモル数が多くなるほど量、種類とも多くなり、酸化臭の発生しやすさから見ると、高度不飽和脂肪酸の濃縮は好ましくないことが明らかになった。3.ドコサヘキサエン酸(DHA)からなるTG、DGおよびMGの消化、吸収性の比較化学合成したDHA-TG、DG、MGおよびエチルエステル(EE)を胆汁酸でエマルション化し、胸管リンパにカニュレーションを行ったラットに強制経口投与し、リンパ液への移行を比較した。その結果、移行速度、回収率ともMG>>DG>TG≧EEの順で、MGが有意に優れていた。4.DHAからなるTG、DG、MG、EEのラット脂質代謝への影響飼料に混ぜて投与したDHAの吸収率には、DHA含有脂質の構造は影響しなかった。DHA投与群は、いずれも血漿コレステロール、TGを低下したが、とくに血漿TGはDHA-TGの投与により、有意に他群より低下した。高度不飽和脂肪酸としてエイコサペンタエン酸(EPA)を使用し、化学合成により、パルミチン酸と組み合わせた各種トリアシルグリセロールを調製した。本年度に合成したトリアシルグリセロールは以下の分子種である。これらのTGについて、トリパルミチンと混合し脂肪酸組成を各系ともEPA/パルミチン酸比を1:2に調整して25°Cの暗所で保存し、酸化臭の原因となる揮発性物質を固相マイクロ抽出法によるヘッドスペースガスクロマトグラフィー分析で比較した。さらに各種TGから生成するEPAヒドロペルオキシドの異性体組成をHPLCを用いて分析した。その結果、揮発性物質の生成量は、TG分子中のEPAのモル数と密接に相関し、EEE/PPP(1:2)>EEP/PPP(1:1)>EPPの順になった。主要物質はいずれのTGでも2,4-Heptadienal、2,4,7-Decatrienalを初めとするアルデヒドで共通していたが、EEEには1-Propanol、2-Butenalなどの特有な成分を検出された。ヒドロペルオキシドの構造は、TGの間ではほとんど差がなかった。しかし、メチルエステルとは大きく異なり、TGでは5-ヒドロペルオキシドがほとんど生成せず、グリセロールによる保護作用が示唆された。前年度に引き続いて、高度不飽和脂肪酸としてエイコサペンタエン酸(EPA)を使用し、EPAからなるジアシルグリセロール(DG)とモノアシルグリセロール(MG)を合成し、トリアシルグリセロール(TriEPA、TG)と同じ条件で自動酸化させたときのヒドロペルオキシド(OOH)の異性体組成をHPLCにより比較した。その結果、DGとMGのOOH組成はよく類似し18-OOHが多い点はTGと一致したが、TGではなかった5-OOHが少量生成し、DGやMGでは5位への酸素付加の障害が部分的に起こったことが推定された。また、高度不飽和脂肪酸はエマルション系では極めて酸化安定性に優れているとされているので、水系におけるOOH組成を種々の構造を有するEPA含有脂質について検討した。その結果、鉄-アスコルビン酸で酸化開始した場合、TGからは空気中では見られなかった5-OOHが生成し、メチルエステルでは空気中で多かった5-OOHが減少した。

また、本系では空気中ではなかった6-および17-OOHが生成した。これらの結果は、水系では高度不飽和脂肪酸分子の形状が空気中(バルク)とは変わり、ラジカル攻撃を受けやすい位置が異なったことを示唆している。DHAについても各種アルコールのエステルを調製し、バルク系での自動酸化を行いOOH組成を比較した。その結果、アルコールの炭素数が多くなるに従い、20-OOHが減少し、4-OOHが増加した。また、高度不飽和脂肪酸含有TGを微生物を利用して合成することを試み、MucorによりTriEPA含量が50%を超える脂質を調製した。ドコサヘキサエン酸(DHA)を唯一の構成脂肪酸とするトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール(1(3),2-型、70%)およびモノアシルグリセロール(1(3)-型、90%)を化学的に合成し、DHAのモル数が等しい量をSD系雄ラット(4週齢)に強制的に経口投与し、リンパ管に挿入したチューブからリンパ液を回収した。その結果、リンパ液への移行は、モノアシルグリセロール>ジアシルグリセロール>トリアシルグリセロール≧エチルエステルとなり、とくにモノアシルグリセロールは有意に速かった。リンパ液中では、投与した脂質構造に関わりなく、DHAの大部分はトリアシルグリセロールとして存在した。また、リンパ中トリアシルグリセロールにおいて、DHAのグリセロールとの結合位置には、投与脂質構造の影響は認められなかった。つぎにDHAの含有脂質の構造の違いがDHAの体内分布や脂質代謝にどの程度反映されるか、短期飼育により比較した。SD系雄ラット(5週齢)にAIN-93G飼料中の油脂の10%を上記と同じDHA含有脂質で置き換え、1週間飼育した。飼育終了後、麻酔下で採血、各臓器の摘出を行い、脂質分析に供した。DHAの見かけの吸収率は、モノアシルグリセロールが有意に他より高かったが、その差はわずかで、もっとも低かったエチルエステルでも95%を超えた。すべてのDHA投与群で血漿総コレステロール、HDL-コレステロールは対照群より有意に低下したが、DHA群間に有意差はなかった。しかし、血漿トリアシルグリセロール、リン脂質値はDHA群間で異なり、トリアシルグリセロール投与により、モノアシルグリセロールやエチルエステルより有意な低下が見られた。血漿中のDHA量はトリアシルグリセロール群で有意に低かったが、DHAの総脂肪酸に対する比率は、DHA群間に差はなかった。肝臓中のDHA量は、すべてのDHA群間に差がなかった。
骨再生の三要素を併用した難治骨欠損の再建

(1)オクタカルシウムフォスフェート(OCP)を人工合成し顆粒状に整粒し、ブタ皮膚由来アテロコラーゲン濃縮液と混練・凍結乾燥・成型し、OCP・コラーゲン複合体(OCP/Col)スポンジを作製した。(2)骨粗鬆症の治療に用いられている副甲状腺ホルモン(PTH)の活性部分であるテリパラチド(TPTD)はシグナル分子の一種であり、投与方法を工夫することで、骨再生を促すことが報告されている。それらを参考にしてTPTDを埋入手術時にOCP/Colに併用するよう事前調整した。(3)難治性骨欠損モデルの埋入手術には実験動物として雄性ビーグル犬(成犬)を用いた。第14前臼歯部の下顎骨を前後径15 mmに連続離断し骨欠損を作製する。その後、作製した骨欠損内にOCP/ColあるいはOCP/ColにTPTDを滴下したもの(OCP/Col/TPTD)を埋入し、再建用チタンプレートをスクリュー固定した。OCP/Colの対照として市販のヒドロキシアパタイト・コラーゲン複合体(HA/Col)およびHA/ColにTPTDを滴下したもの(HA/Col/TPTD)を用いた。各群56頭、計4群を用い、その後、経時的な肉眼的、エックス線学的観察を行い、術後6ヶ月で標本採取し、エックス線学的・組織学的に骨再生能を評価した。(4) OCP/Col/TPTD群では術後12か月の早期にX線不透過像が確認され,6か月後には全例で十分な骨形成により離断部位の連続性(骨架橋)を回復し,口腔内では良好な顎堤が形成された。また、OCP/Col群では50%で骨架橋を認めたのに対し、HA/Col群およびHA/Col/TPTD群では全く骨架橋を認めなかった。従って、OCP/ColにTPTDを併用することで、難治性骨欠損モデルでの骨再生が再現性を持って実現できること示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.リン酸オクタカルシウム(OCP)を人工合成し顆粒状に整粒し、ブタ皮膚由来アテロコラーゲン濃縮液と混練・凍結乾燥・成型作製後、熱架橋処理し、OCP・コラーゲン複合体(OCP/Col)スポンジを作製した。また、OCP/Colスポンジに副甲状腺ホルモン(PTH)を添加・凍結乾燥し、OCP/Col・PTH複合体(OCP/Col/PTH)を作製した。2.間葉系幹細胞(MSC)を併用することでより迅速な骨再生が期待されることから、MSCを得るためにイヌ腸骨より骨髄穿刺針による吸引法にて骨髄間質細胞を回収した。3.成犬下顎骨離断モデルの作製を行なった。具体的には下顎骨離断手術に先行して第1期手術(抜歯手術:下顎前臼歯部)を行い、創部安静期間として一定期間経過観察する。そして第2期手術(試料埋入手術)として下顎骨体部に自然治癒の望めない臨界骨欠損を作製し、同部にOCP/Col等の試料を埋入し、病的骨折予防および咬合状態の保全のために再建用チタンプレートをスクリュー固定した。4.成犬下顎骨離断モデルにOCP/Col、OCP/Col/PTHを埋入し、一部の検体については骨再生能を検討した。具体的には術後の同一個体を経時的に歯科用X線写真撮影し、手術部における骨再生状況を検討した。あるいは摘出標本をマイクロCT装置で撮影し、それぞれの欠損作製部位での骨再生について検討した。さらに、摘出標本をメタクリル樹脂包埋の後、自動精密切断機、研磨機で非脱灰研磨標本を作製し、コンタクトマイクロラジオグラム(CMR)撮影し手術部における骨梁構造を観察した。本研究開始以前からの長年の研究の蓄積により、安定的な実験系の確立が大変難しかった成犬下顎骨離断モデルの再現性がほぼ視野に入って来た。一方、腸骨骨髄穿刺によって得られた間葉系幹細胞(MSC)の安定的な回収や増殖は道半ばであり、今後の課題と考えている。

あるいは摘出標本をマイクロCT装置で撮影し、それぞれの欠損作製部位での骨再生について検討した。さらに、摘出標本をメタクリル樹脂包埋の後、自動精密切断機、研磨機で非脱灰研磨標本を作製し、コンタクトマイクロラジオグラム(CMR)撮影し手術部における骨梁構造を観察した。本研究開始以前からの長年の研究の蓄積により、安定的な実験系の確立が大変難しかった成犬下顎骨離断モデルの再現性が担保される状況になってきた。同モデル内にOCP/Colを埋入する実験は概ね順調に進み、今後OCP/Col群における骨再生能の解析が行われる予定である。また、OCP/Col・PTH複合体(OCP/Col/PTH)の作製も順調に進み、本研究と並行して進めたOCP/Col/PTHを小動物に用いた骨再生研究によって、OCP/Col/PTHの骨再生能がOCP/Col単独を上回ることを見出し、学会発表を行なった。そして、大型動物の骨欠損でのOCP/Col/PTH埋入を行い、引き続きその骨再生能について検討を行っている。一方、腸骨骨髄穿刺によって得られた間葉系幹細胞(MSC)の安定的な回収や増殖は道半ばであり、引き続き今後の課題となっている。(1)オクタカルシウムフォスフェート(OCP)を人工合成し顆粒状に整粒し、ブタ皮膚由来アテロコラーゲン濃縮液と混練・凍結乾燥・成型し、OCP・コラーゲン複合体(OCP/Col)スポンジを作製した。(2)骨粗鬆症の治療に用いられている副甲状腺ホルモン(PTH)の活性部分であるテリパラチド(TPTD)はシグナル分子の一種であり、投与方法を工夫することで、骨再生を促すことが報告されている。それらを参考にしてTPTDを埋入手術時にOCP/Colに併用するよう事前調整した。(3)難治性骨欠損モデルの埋入手術には実験動物として雄性ビーグル犬(成犬)を用いた。第14前臼歯部の下顎骨を前後径15 mmに連続離断し骨欠損を作製する。その後、作製した骨欠損内にOCP/ColあるいはOCP/ColにTPTDを滴下したもの(OCP/Col/TPTD)を埋入し、再建用チタンプレートをスクリュー固定した。OCP/Colの対照として市販のヒドロキシアパタイト・コラーゲン複合体(HA/Col)およびHA/ColにTPTDを滴下したもの(HA/Col/TPTD)を用いた。各群56頭、計4群を用い、その後、経時的な肉眼的、エックス線学的観察を行い、術後6ヶ月で標本採取し、エックス線学的・組織学的に骨再生能を評価した。(4) OCP/Col/TPTD群では術後12か月の早期にX線不透過像が確認され,6か月後には全例で十分な骨形成により離断部位の連続性(骨架橋)を回復し,口腔内では良好な顎堤が形成された。また、OCP/Col群では50%で骨架橋を認めたのに対し、HA/Col群およびHA/Col/TPTD群では全く骨架橋を認めなかった。従って、OCP/ColにTPTDを併用することで、難治性骨欠損モデルでの骨再生が再現性を持って実現できること示された。本年度は成犬下顎骨離断モデルにOCP・コラーゲン複合体(OCP/Col)を埋入した実験群について、摘出標本を用いてOCP/Colの骨再生能についてさらに検討を加える。また、OCP/Col・PTH複合体(OCP/Col/PTH)埋入群についても同様に検討し、OCP/Col群の骨再生能との違いの有無について検定を進める。なお、場合によってはOCP/Colに添加するPTHの量についても検討を加え、臨床的に最適な量を模索したい。さらにOCP/Colに間葉系幹細胞(MSC)を加えた系で研究を加速させて行きたい。