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睡眠における手続的記憶の統合・定着機能に関する精神生理学的研究

本年度は,手続的記憶の統合と定着における睡眠の機能について,睡眠中の脳波活動のである睡眠紡錘波の活動性について精神生理学的に分析した.睡眠紡錘波を2種類(fast spindleとslow spindle)に分類し,slow spindleの活動性(出現数,出現密度,振幅値,持続時間)を,学習夜と非学習夜とで比較検討した.その結果,運動技能の課題成績の向上率とslow spindleとの間に有意な相関関係はみられなかった.一方ですでに昨年度明らかにしたように,fast spindleは終夜を通じて出現密度は高く,振幅値は大きく,持続時間は長く,新しい学習を行った後の睡眠中では行わなかった睡眠中と比較し,高振幅,長持続であった.このことから,2種類の睡眠紡錘波の中でもfast spindleの発生機構(視床-皮質経路)が睡眠中に進行する脳の可塑性に寄与していると考えられた.この成果は,日本睡眠学会で発表した後,睡眠科学の専門誌で最高位のインパクトファクターをもつJournal SLEEPに掲載された.さらに睡眠紡錘波を構成する波の電位振幅値を頭皮上25部位について求めた.その結果,視覚運動学習を行った学習夜では学習を行わなかった非学習夜と比較し,前頭部から頭頂部にかけての活動が高まっていた.条件間の差分を求めたところ左前頭部におけるfast spindleの活動が高まっていることが分かった.この成果は,国際学会(Worldsleep07)で発表し,現在原著論文として投稿している.本年度は,手続的記憶の統合と定着における睡眠の機能について,睡眠をはさんだパフォーマンスの向上(1),パフォーマンスの向上に関連する睡眠段階(2),睡眠中の脳波活動(3)について,行動指標および脳波活動の分析により,精神生理学的に検討した.(1)視覚運動学習課題(回転図形描写課題)を実施し,睡眠の効果を検討した結果,新規に獲得させた課題の成績は,覚醒していた群よりも睡眠をとった群の方が課題成績の向上が高く,20.1%もの技能の向上が認められた.学習日に先立ち獲得させておいた技能については明瞭な群の違いはみられなかった.睡眠は,特に新しく獲得する難易度の高い視覚-運動技能の向上に効果のあることが示された.(2)技能向上と睡眠変数の関連を検討した結果,ノンレム睡眠段階2と向上率との間には負の相関関係,徐波睡眠との間には正の相関関係がみられた.運動技能学習とその基礎を成す手続的記憶の再構築過程には,複数の睡眠段階が関与することが示唆された.睡眠段階を修飾する脳波活動に着目し詳細に検討する必要があると考えられた.(3)睡眠紡錘波を2種類(Fast SpindleとSlow Spindle)に分類し,各睡眠紡錘波の活動性を,学習夜と非学習夜とで比較検討した.その結果,成績の向上率が高いほど,Fast Spindleは終夜を通じて高密度,高振幅,長持続であり,新しい学習を行った後の睡眠中では行わなかった夜よりも,高振幅,長持続であった.Fast Spindleの発生機構である視床-皮質経路は,睡眠維持という役割を果たす一方で睡眠中に進行する脳の可塑性にも寄与していると考えられた.以上を踏まえ,最終年度となる来年度は,Fast SpindleおよびSlow Spindleの電流発生源を分析し,視覚-運動学習に関わる電流発生源についてさらに検討を進めたい.本年度は,手続的記憶の統合と定着における睡眠の機能について,睡眠中の脳波活動のである睡眠紡錘波の活動性について精神生理学的に分析した.睡眠紡錘波を2種類(fast spindleとslow spindle)に分類し,slow spindleの活動性(出現数,出現密度,振幅値,持続時間)を,学習夜と非学習夜とで比較検討した.その結果,運動技能の課題成績の向上率とslow spindleとの間に有意な相関関係はみられなかった.一方ですでに昨年度明らかにしたように,fast spindleは終夜を通じて出現密度は高く,振幅値は大きく,持続時間は長く,新しい学習を行った後の睡眠中では行わなかった睡眠中と比較し,高振幅,長持続であった.このことから,2種類の睡眠紡錘波の中でもfast spindleの発生機構(視床-皮質経路)が睡眠中に進行する脳の可塑性に寄与していると考えられた.この成果は,日本睡眠学会で発表した後,睡眠科学の専門誌で最高位のインパクトファクターをもつJournal SLEEPに掲載された.さらに睡眠紡錘波を構成する波の電位振幅値を頭皮上25部位について求めた.その結果,視覚運動学習を行った学習夜では学習を行わなかった非学習夜と比較し,前頭部から頭頂部にかけての活動が高まっていた.条件間の差分を求めたところ左前頭部におけるfast spindleの活動が高まっていることが分かった.この成果は,国際学会(Worldsleep07)で発表し,現在原著論文として投稿している.
ミトコンドリアと放射線感受性

(1)ρ^++cell(親株)(2)ρ^0cell(ミトコンドリアDNA欠失株)(3)syn-cell(ミトコンドリアDNA変異株)これら3つの細胞を用いて、colony formationassayとDye exclusion testにより生存率・増殖能を、flow cytometryにより細胞周期・アポブトーシスの検討を行った。ミトコンドリアDNA欠損株においては親株に比して放射線感受性・アポプトーシス頻度が低く、syn一細胞ではいずれも回復した。syn一細胞では親株のρ十細胞に近い放射線感受性・アポプトフシス頻度が観察された(投稿中)。以上の結果の再現性を検討するために同様のミトコンドリアDNA欠損の肉腫細胞株で同様の検討を行っている。その際一部の細胞がコロとー形成が不良であるためにマイクロヌクレウスアッセイを導入した。Schiff試薬・DAP1など複数の染色法が報告きれているため現在どの方法が適しているか検討中である。またApo-tag Kitによりアポブトーシスを光学顕微鏡レベルでも確認している。さらに(1)酸素分圧を変更する系および(2)重粒子線を照射する実験系を構築中である。酸素分圧の変更系ではCHO細胞において通常/低酸素状態のRBEが2を越えることを確認した。重粒子線実験は98年12月に第一回の実紐が行われ、条件設定のための予備実験として線維芽細胞にたいして陽子線の照射を行いcolony formation assayとDye exclusion testを行った。コロニー形成能を検討するコロニーフォーメイションアッセイおよび生存細胞数を検討するトリパンブルー染色法により、ミトコンドリアDNAの有無と線維芽細胞における放射線感受性の相関を検討した。結果、ミトコンドリアDNAが存在しないρ^O細胞では放射線抵抗性であり、親株である正常ミトコンドリアDNAをもつρ^+細胞では放射線感受性が高いことを見出した。さらにρ^O細胞にミトコンドリアDNAの変異DNAが組み込まれたsyn-細胞で、放射線感受性が回復することを示した。また同時に細胞周期を測定し、いずれの細胞にも同様にG2期ブロックがかかっていることを見出した。これにより放射線感受性の違いが細胞周期の違いによるものではないことを示した。さらにアポトーシスの比率を検討したところ、ρ^+およびsyn-細胞において高くρ^O細胞で低いことが判明した。これは細胞死の全体を説明するには足らないが、アポトーシスの比率の差が放射線感受性の差に何らかの影響をおよぼしている可能性がある(以上の結果をまとめて現在投稿中)。この現象の普遍性を検討するため他の細胞系(内種細胞)で同様のミトコンドリアDNAが存在しないρ^O細胞、親株であるρ^+細胞、ミトコンドリアDNAの変異DNAが組み込まれたsyn-細胞を入手して追試している。さらにミトコンドリアDNAの存在により、放射線感受性に及ぼす酸素効果が修飾されると考えられる。そこで、酸素分圧を変化させて(95%、20%、0%)上述の実験を行うために装置を導入し、現在実験系の条件設定を行っている。
壊死毒ファミリー毒素の構造機能相関と細菌感染における役割の解析

壊死毒ファミリー毒素に分類されるパスツレラ毒素の立体構造を決定し、その結果から本毒素の酵素活性を推定した。また、ドメイン構造を解析して当研究グループが命名したC1ドメインに毒素分子を細胞膜に局在させる機能が存在することを明らかにした。さらに、本毒素の作用をin vitroおよびin situで検出するために、毒素の酵素作用産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した。(1)種々の粘膜上皮組織に感染する百日咳菌、大腸菌、パスツレラは実験動物に皮膚壊死を起こす壊死毒を産生する。これらの毒素は作用と構造において相互に部分的に相同性を示すため、壊死毒ファミリーとして分類されている。壊死毒ファミリーの遺伝子が粘膜上皮感染性の複数の病原細菌によって共通に維持されていることから、壊死毒が感染成立に重要な役割を果たしていると考えられるが、それぞれの感染病態との関係は明らかではない。本研究課題では、壊死毒ファミリーにおいて未解決な点(受容体同定、パスツレラ壊死毒の作用機序解明、全分子立体構造など)の解明をおこない、それを基盤に各毒素産生菌の感染モデルにおける毒素の動態を解析し、感染過程における毒素の役割を解明する。(2)本研究は、以下の方法で行ない、その成果を総合して細菌感染における各毒素の役割を解明する。(1)各毒素の立体構造の解析百日咳菌壊死毒(DNT)とパスツレラ壊死毒(PMT)の全長、および大腸菌壊死毒(CNF)の受容体結合領域について、該当の精製標品を結晶化し、X線回折法により立体構造を決定する。(2)各毒素の受容体同定DNT、PMT、CNFがRho依存性情報伝達系路を共通に活性化することを利用して、Rho依存性のプロモーターによるレポーター遺伝子を作製し、これをcDNAライブラリーのスクリーニング系に用いて受容体遺伝子をクローニングする。(3)PMTの作用機序の解明これまでに、PMTの作用機序解析に格好の細胞株を見いだした。これらの細胞株にsiRNAライブラリーを導入し、PMT不応答となる細胞を選別し、PMT作用に関与する遺伝子をクローン化する。これらの遺伝子の性状解析をもとにPMTの作用機序を解析する。立体構造の類似性から作用が予想できる場合はそのデータも活用する。(4)細菌感染過程における毒素動態の解析細胞レベルおよび動物レベルでの適当な感染モデルを確立し、モデルにおける細菌感染時の各毒素あるいはその機能断片の作用、消長、存在局所等を免疫学的方法その他で検出し、毒素の動態を時空間的に解析する。この際、(1)、(2)、(3)の計画で得られたデータを充分に活用する。また、同時に欠失変異株を用いて野性株との感染病態の異同を検討する。本年度はパスツレラ(Pasteurella multocida)の産生する毒素(PMT)の結晶構造を試みた。PMTはパスツレラで確認されている唯一のタンパク毒素である。その作用には不明な点が多いが、少なくともGqあるいはG12/G13のヘテロ三量体のGTPaseに依存した細胞内情報伝達系を活性化することが知られている。本年度の研究は以下のように行った。PMTのC末領域の組換えタンパク(569-1285残基、以下C-PMT)を作製し、HVJリポソーム法で標的細胞内に導入しPMT活性を確認した。このC末端領域を結晶化し、X線構造解析の手法を用いて、その結晶構造を決定した。立体構造は重原子法を用いて行い、SPring-8でのデータ測定から、1.9Å分解能の詳細な構造を決定することができた。C-PMT分子は711残基のアミノ酸を有し、760個の水分子と1つのリン酸イオン、2つのトレハロースが結合していた。分子全体は、87×84×30Åの大きさで、Trojan Horse様の外観を呈し、N末側からそれぞれTrojan Horseのfeet, body, headに相当するC1,C2,C3の3つのドメインを有し、33個のヘリックスと16個のベータ構造からなることが分かった。C1ドメインは、helicalな構造を持ち、3次元構造のホモロジー検索と細胞内局在解析の結果により、PMTの膜局在に関与することがわかった。C2は、2つのα/βバレルを持つ大きなドメインであるが、その機能は不明であった。C3ドメインは、活性に関与する残基が存在するサイトであるが、α/βhydrolase構造を有し、システインプロテアーゼとの相同性があることが示唆された。そこで、C1ドメインの細胞膜局在性を調べた。動物細胞に発現させたC-PMTとC1ドメインの部分的欠失体(ΔC1(4H))の細胞内局在を調べたところ、発現したC-PMTは細胞膜に局在し、その局在能はC1ドメイン欠失により消失した。さらに欠失体を作製して解析したところ、C1ドメインN末端側を構成するどのヘリックスを欠失しても膜局在化能が失われることが分かった。

またPMTが活性化するシグナル経路下流のSRFとNFATのレポーターアッセイを行ったところ、ΔC1(4H)を発現させた場合には全く活性が認められなかった。一方、ΔC1(4H)の組換えタンパクをHVJリポソーム法により細胞質に導入してPMT活性(DNA合成とPLC活性化)を調べたところ、ΔC1(4H)では肌C活性化能のみが低下していた。以上の結果から、C1はC-PMT膜局在化と、PLC活性化能の発揮に関与していることがわかった。すなわち、PMTの標的分子は、膜に局在するものとそうでないものの少なくとも二種類があり、膜局在分子はPLC活性化能に関与し、そうでない分子はPMTのDNA合成促進能に関与することが推測された。種々の粘膜上皮組織に感染する百日咳菌、大腸菌、パスツレラの産生する壊死毒素群(それぞれDNT、CNF、PMT)は作用と構造において相互に部分的に相同性を示すため、壊死毒ファミリーとして分類されている。本研究課題では、壊死毒ファミリー毒素において未解決な点(受容体同定、パスツレラ壊死毒の作用機序解明、全分子立体構造など)の解明を試みる。それぞれの毒素の構造機能相関を明らかにすることによって、細菌毒素の多機能性の分子基盤を理解し、また各壊死毒素産生菌の感染過程における毒素の役割を解明する。PMTが標的細胞内の細胞質膜近傍に局在するために必須の領域(C1ドメイン)の機能解析を行った。C1ドメインを欠失し、細胞質局在能を失ったPMTの細胞内活性領域(C-PMT)は少なくともフォスフォリパーゼCの活性化能も失っていたが、N-ミリストイル化を介した細胞質局在シグナルペプチドをC1ドメインに代えてC-PMTに付加すると、本活性が回復した。表面プラズモン共鳴法による解析の結果から、C-PMTが種々のリン脂質と相互作用することがわかった。C1ドメインを欠失したC-PMTではリン脂質との相互作用は認められなかった。以上の結果から、C1ドメインは細胞質膜の成分である各種のリン脂質と相互作用することにより、C-PMTを細胞質膜にリクルートするものと考えられた。一方、DNTの標的細胞への結合に必要な最小領域が、N-末端側の30アミノ酸領域に存在することを明らかにした。現在、この30アミノ酸領域をカバーする合成ペプチドを作製し、これをプローブにした受容体の単離方法を検討中である。食中毒の原因となるウエルシュ菌エンテロトキシン(Clostridium perfringens enterotoxin, CPE)の受容体認識機構を解析した。CPEは標的細胞膜の選択的透過性を破壊する膜孔形成毒素で、タイトジャンクションを構成する4回膜貫通型タンパク質のクローディン(Cldn)を受容体として認識する。Cldnには20種類以上の相同分子が、すべてのCldnがCPE受容体として機能するわけではない。また一方、CPE感受性あるいは非感受性のCldnの中に明らかな共通モチーフは認められていない。本研究ではCPE感受性のCldnと非感受性Cldnとのキメラ分子をCPE非感受性細胞に構成的に発現させて、発現細胞にCPE感受性が付与されるかどうかを検討した。その結果、Cldnの二つの細胞外ループのうち、第二ループのC末端側の12アミノ酸の領域(CPE-Sensitivity Related Region, CPE-SR)がCPE感受性に関与していることを見いだした。
障害者差別禁止法をめぐるアジアを中心とする障害者運動の国際比較

前年度に引き続き、香港および韓国における障害者差別禁止法制定の動きを追った。社会服務連会(香港)や障害者差別禁止法推進連帯(韓国)のスタッフや当時の議員など計19名(香港8名、韓国11名)を対象に半構造化面接を行った。今年度の成果は以下の2点である。以下は論文にまとめる予定である。第1に、ニューズレター等の資料や関係者からのインタビューに基づいて香港における障害者差別禁止条例(Disability Discrimination Ordinance,1995年制定)制定過程を明らかにしたことである。政府と緊密な関係を持つ社会服務連会(1947年成立)のスタッフやさまざまな障害に関わるセルフヘルプグループ(1960年代)のメンバーたちが市民社会において障害者差別禁止条例制定運動を支えた。戦後からの香港のリハビリテーション分野の発展の中に障害者差別禁止条例成立が位置づけられる必要が明らかになった。第2に、インタビュー調査によって関係者たちが持つ障害観を明らかにした。香港においては、中国語で「弱能」と「残疾」という障害を表す2つの用語を手掛かりにした。韓国においては、「われわれ」(障害者団体のスローガンが「われわれのいく道が歴史だ」である)、「当事者」などといった言葉の意味合いを問うた。人びとの持つ言葉の意味づけによって、香港及び韓国の障害者差別禁止条例/法における障害の定義や法の対象範囲が規定されたことを示した。これらは福祉国家論への貢献をなすだけではなく、日本の政策提言という実践的意義を持つものである。本研究は障害者差別禁止法をめぐる障害者運動について東アジアを軸に据えて比較を行なうものである。本年度は,第一に,障害者差別禁止法自体の位置付けや内容を考察すること,第二に,障害者差別禁止法制定時の機会構造を明らかにすることを計画した。障害者を恩恵の対象としてではなく、権利の対象としてみなす障害者差別禁止法の発想は障害観に関する新しいパラダイムに基づいている。香港・韓国の障害者差別禁止法も、こうした障害観を受け継いでおり、その点ではほかの国々(とくに、アメリカ、オーストラリア)の影響を受けている。しかしながら、法律はそうした伝播の影響のみから制定されるわけではなく、その国/地域固有の状況が法律の内容に反映していると考えられる。そこで、第一の点に関して,障害者差別禁止法の「障害」および「差別」についての定義の比較分析を行い、香港・韓国の社会のあり方を考える手がかりを得るための考察を行った。第二の点に関して,障害者差別禁止法制定時における機会構造を理解するために,香港・韓国の議事録の分析を行った。また,立法作成者に対するインタビューを行った。これらのインタビューからは、彼ら立法作成者たちが障害団体の連帯をひとつの力として認識していたことが明らかになった。当時の幅広いコンテクストを理解するために、のべ15人に及ぶ障害団体のメンバーや学術経験者にインタビューを行った。以上は福祉国家研究,社会運動論への貢献を目指すものであり,また,今後日本で制定される可能性のある障害者差別禁止法への示唆となるという点で意義があると考えられる。
地域統合組織および統合深化過程への参加に関する国民投票についての研究

スウェーデンにおいては、EU加盟に関する国民投票が行われる前に4回の国民投票が実施されていたが、いずれも国内政策を問う内容であった。おおむね政府や議会は投票結果を尊重する政策を採ってきたが、再びの国民投票を経ずに後に投票結果と異なる政策が採られている事例もある。EUに関する国内投票は国内政策に関する国民投票と比較して投票率が高く、政府の政策と異なる結果となっても、現在のところ政府は国民の選択に従っている。EUに関する国民投票は、政府の対外政策を国民が選択するという点において、スウェーデン政治に大きな影響を与えたと考えられる。国民投票における投票キャンペーンでは、既存の政党、利益団体、経済社会組織の間で賛否が分かれ、スウェーデン政治ではこれまで見られなかった組み合わせで賛否の陣営が形成された。また同時に、EUに対する政策に関しては、政治・経済・社会組織の内部を分断して賛否が分かれることとなり、既存組織を横断する形でキャンペーンが進められた。その中では、エリートと大衆、国際産業と国内産業、大都市と地方、性別、などの違いで賛否の相違が顕著であった。EUに関する問題は、スウェーデン国内政治において新たな対立軸となりつつあるといえる。また、国民投票の実施時期、EU加盟やユーロ導入などをめぐる問題は、政党内部、内閣構成、連立形成などに影響を与えており、それまで政党政治に大きな変化がないことが特徴とされていたスウェーデン政治において、変容が現れ始めているといえる。また、スウェーデンの政治に大きな影響を与えてきた労働組合においても、対EU政策に関しては組織内で賛否が分かれ、EU問題については結束を保てない状況が現れている。今後、EUの政策がますます各国に直接適用されるようになれば、EU問題をめぐってスウェーデン国内政治が対立的な構造に変化する可能性もあると考えられる。1991年時点の世論調査で、スウェーデン国民の欧州連合(EU)への加盟賛成は60%を超えていたにもかかわらず、1994年11月のEU加盟を問う国民投票の直前には賛否は拮抗した。国民投票のキャンペーンにおいて活動を行った加盟反対派は、多くの有権者を反EU加盟へと動員することができず、国民投票では賛成がかろうじて半数を超え、スウェーデンは1995年にEUに加盟した。国民のEUの経済通貨同盟(EMU)への支持率は世論調査において大きく増減していたが、2003年9月のEUの共通通貨であるユーロの導入を問う国民投票直前には、賛否は拮抗した。国民投票のキャンペーンにおいては、ユーロ導入反対派が論戦をリードし、国民投票の結果は反対が過半数を占め、ユーロ導入は否決された。共通通貨の導入という統合深化への参加に対しては、スウェーデン国民は拒否の姿勢を見せた。両国民投票を比較すると、賛成派は共通して、経済的安定・成長や企業競争力の強化といった面での利点を主張し、EUへの影響力増大のためにもEUの経済統合過程に参加することを訴えた。反対派は共通して、EUでは民主主義が徹底されていない点を問題として挙げ、EUの統合過程に組み込まれることによって、国家の独立性を失い、スウェーデンの高水準の社会福祉、雇用対策、男女平等の質が低下し、特に女性が不利益を被る可能性を強調した。相違点は、1994年には当時の経済危機を脱する手段としてEU加盟が捉えられ、経済問題としてEU問題が議論されたのに対して、2003年には共通通貨の導入が、経済問題というよりも、政治問題として議論されたことが挙げられる。また、2003年では投票のかなり前に態度を決定していた有権者が多数であり、EUでの統合や協力に対しては肯定的であっても、ユーロの導入に対しては否定的な姿勢をとる国民が多いという特徴が見られた。スウェーデンにおけるEUに関する国民投票は、1994年の加盟を問う内容に対しては賛成が過半数となり、2003年のユーロ導入に対しては反対が半数を超えた。2003年の国民投票の詳細について分析すると、1994年と比較して反対派の主張にはほとんど変化が見られなかったが、スウェーデン経済が他のEU加盟国よりも好調であったことと、反対派が賛成派に先駆けて国内での議論を仕掛けるなど、賛成派のキャンペーンが予想通りに進まなかったことが相違点として存在していた。その結果、賛成派は国民を賛成に動員することが出来なかったと考えられる。スウェーデンは他のEU加盟国と比較して反EU傾向が強いことが各種世論調査で表れており、1990年にEU加盟が争点として挙がった時から反EU組織が設立され、その後も活動を継続している。国民レベルでは1994年のEU加盟国民投票時には賛成が多数を占めていたが、加盟後は反対派が増加した。ユーロに対しては賛否が大きく変動していたが、2003年の国民投票以降は反対が賛成を上回る世論調査結果が続いている。欧州議会選挙では反EUの政党が躍進し、2004年の欧州議会選挙ではEUに対して懐疑的姿勢を示す新設の政治団体が、スウェーデンで第3党となる議席数を獲得した。国内政治においても、反EUを掲げる政党が支持率を伸ばし、EUに懐疑的な新党が国政選挙への参加を表明するなどの変化が生じている。性別で比較すると、2回のEUに関する国民投票結果において反対の割合が女性で10ポイント程度高く、その後の世論調査でもスウェーデン女性の反EU・EU懐疑傾向が明白に表れている。しかし、すべての女性がEU加盟およびユーロ導入に反対の姿勢を示しているわけではなく、保守・自由主義政党の支持者や、大都市居住、高学歴、高所得、専門職の女性は、EUおよびユーロを支持する傾向が継続している。

スウェーデンにおいては、EU加盟に関する国民投票が行われる前に4回の国民投票が実施されていたが、いずれも国内政策を問う内容であった。おおむね政府や議会は投票結果を尊重する政策を採ってきたが、再びの国民投票を経ずに後に投票結果と異なる政策が採られている事例もある。EUに関する国内投票は国内政策に関する国民投票と比較して投票率が高く、政府の政策と異なる結果となっても、現在のところ政府は国民の選択に従っている。EUに関する国民投票は、政府の対外政策を国民が選択するという点において、スウェーデン政治に大きな影響を与えたと考えられる。国民投票における投票キャンペーンでは、既存の政党、利益団体、経済社会組織の間で賛否が分かれ、スウェーデン政治ではこれまで見られなかった組み合わせで賛否の陣営が形成された。また同時に、EUに対する政策に関しては、政治・経済・社会組織の内部を分断して賛否が分かれることとなり、既存組織を横断する形でキャンペーンが進められた。その中では、エリートと大衆、国際産業と国内産業、大都市と地方、性別、などの違いで賛否の相違が顕著であった。EUに関する問題は、スウェーデン国内政治において新たな対立軸となりつつあるといえる。また、国民投票の実施時期、EU加盟やユーロ導入などをめぐる問題は、政党内部、内閣構成、連立形成などに影響を与えており、それまで政党政治に大きな変化がないことが特徴とされていたスウェーデン政治において、変容が現れ始めているといえる。また、スウェーデンの政治に大きな影響を与えてきた労働組合においても、対EU政策に関しては組織内で賛否が分かれ、EU問題については結束を保てない状況が現れている。今後、EUの政策がますます各国に直接適用されるようになれば、EU問題をめぐってスウェーデン国内政治が対立的な構造に変化する可能性もあると考えられる。
サイン音に対する中高齢者の聴覚的注意に関する研究

本研究では,中高齢者の日常生活場面における聴覚的注意を支援するサイン音の検討を目的とする.中高齢者とは,おおよそ45歳から75歳程度であり,聴力機能の低下が始まる時期である.日常生活場面では騒音を背景にして,複数の電化製品からのサイン音を聞き分けながら同時に個々のサイン音の意味を判断しなければならない.本研究では同時複数音分散聴取と加齢との関連性を明らかにすると共に,中高齢者にも聴覚的注意が容易なサイン音の特性を検討する.変動強度に焦点を当てて新たなサイン音を提案し,その有用性を心理学的実験'及び日常生活場面を想定した評価実験により明らかにする.視覚に障害のある成人,中高年者の注意を喚起しやすい情報音(サウンドアイコン),報知音をデザインするための基礎的知見を得るために,本研究は行う.本年度は,製品やパソコンなどで使用されている正弦波を題材として,そのごく短時間の聴覚刺激に対する中高年成人の聴覚印象を検討した.使用された聴覚刺激は,数十ミリ秒の極短時間の正弦波純音とその正数字倍音からなる複合音であった.具体的には,基本周波数4000Hzの純音及びその2次倍音の8000Hzを重畳させた複合音(4000Hzと8000Hz)を組み合わせた音とした.中年成人のうち,半数は健聴者,残りの半数は軽度の難聴(自己報告)であった.その被験者には,4000Hzの純音の後に複合音を聴取する場合と,複合音を聴取後純音を聴取する場合の2条件を課した.二つの条件において,標準刺激は共に4000Hzとした.被験者にはテスト音が標準刺激に比べて高く聞こえたか否かを報告させた.この結果では正弦波純音と複合音の聴取に統計的な有意な差が認められなかった.家電製品のサイン音やパソコンのサウンドアイコンなどで使用される正弦波のみに焦点を当てた実験では,聴覚的な注意の低下した成人に有効な音のデザインには限界があるように思われた.そこで,立ち上がりと立ち下がりの勾配が明確なクリック,トーンバーストを一つの要素として,その断続音系列を使用した聴取実験を来年度行う.本研究では、いわゆる「当事者研究者参加型」アプローチにより、中高齢の重度視覚障害者を対象として、聞き分けやすいサイン音を試作しその評価を行った。サイン音の開発に当たり、基本コンセプトを下記のように設定した。1家電製品の動作状況をリアルタイムに認知することを可能にすること。2サイン音が生態学的に妥当であること。つまり、サイン音が家電製品の動作状況あるいは機能イメージを直感的に伝達できること。3高齢者にとって4kHzを超える可聴音が聴取しにくいことを考慮すること。4過渡音(バースト)及びスウィープ音など定常音以外の音を念頭に置くこと。まず始めに、ごく短時間持続するバーストを用いて、先行するバースト音が後続のピッチ弁別に果たす影響を検討する基礎実験を実施した。継時弁別課題の結果、バーストは継時的に聴覚印象が変化することから、バースト音を構成要素としたサイン音は不適切とみなした。次に、生態学的妥当性及びピッチ変化に着目して、4000Hz以下の6個の純音とその変調からなるサイン音の試作を行った。すなわち、電気ポットなどの水を湧かす電化製品のプロセスモニタリングを想定し、水が沸騰するまでのプロセスをモニタリングするようなピッチ変化のある報知音を試作した。試作した報知音とケトルの沸騰までの音を刺激として、異なる水の状態(沸騰状態/沸騰直前)を判断する実験を行った。その結果、ケトル音と同様に、試作した報知音において、異なる水の状態を試作報知音から推定できることが示唆された。さらに、試作報知音が日常生活における有用性を検討するために、複数の既存サイン音、日常騒音が混在する聴取条件での聞き取りやすさを検討したところ、試作報知音が特定しやすいことが示唆された。以上より、生態学的に妥当であり、動作状況の継時的変化を直感的にイメージ可能な報知音の有用性が示された。本研究では,中高齢者の日常生活場面における聴覚的注意を支援するサイン音の検討を目的とする.中高齢者とは,おおよそ45歳から75歳程度であり,聴力機能の低下が始まる時期である.日常生活場面では騒音を背景にして,複数の電化製品からのサイン音を聞き分けながら同時に個々のサイン音の意味を判断しなければならない.本研究では同時複数音分散聴取と加齢との関連性を明らかにすると共に,中高齢者にも聴覚的注意が容易なサイン音の特性を検討する.変動強度に焦点を当てて新たなサイン音を提案し,その有用性を心理学的実験'及び日常生活場面を想定した評価実験により明らかにする.平成23年度は,科学研究費補助金の全額交付が大きく遅延した.そのため,8月まで研究計画の実施を見送り,文献調査を行ってきた.1.文献調査:高齢者の聴覚知覚の特性,及び中高年者の聴覚的注意の特質に関する文献調査を実施した.また,これまでに普及しているサイン音の音響特性についても文献調査を実施した.ラウドネス感覚において1kHzから4kHz程度の感受性は相対的に維持されていることから,この周波数領域を基本周波数とすることが望ましいという調査結果を得た.2.トーンバースト,クリックピッチ,クリックに関する検討:自然環境音に存在する短時間トーンバースト,否正数次倍音,クリックを含む音を録音し音響解析した.我々が選んだのは水流の落下,具体的には滝の音とした.FFTの結果,おおよそピンクノイズ的なパワーエンベロープであったが,傾きは急峻であった.

予備実験として,滝の自然環境音聴取時の脈波インターバル(RRI),重心動揺,呼吸を測定し生体信号への自然環境音聴取の効果を検討した.その結果,滝の音を聴取している際に,副交感神経系の亢進,呼吸数の減少が見られた.本研究成果に関して2011年11月に開催された感性工学会生命ソフトウエア研究部会にて口答発表を行った.3.トーンバーストピッチ,クリックピッチの知覚に関する検討:16ms程度の持続時間のトーンバースト及びクリックの作成を試みた.トーンバースト複合音,クリック複合音の特性を変化させると聴覚印象,例えば音質,印象,ピッチ感覚が異なることが示唆された.昨年度,サイン音聴取実験及び日常生活サイン音使用の調査が研究代表者の予定した計画通りに行うことができなかった.今年度は,研究代表者が申請当初の目的を達成するために実験計画を全面的に見直して最終年度の成果をあげるために努力する.研究着手が遅れたため,昨年度の研究計画は完全に達成できていない.昨年度の研究計画を圧縮して行うと共に,文献調査から得た示唆を基に今年度の研究を実施し,本研究が目的とする,中高年層の健常成人及び盲人にとって知覚的分離が容易なサイン音の開発を達成する.(1)サイン音の制作と改良クリック音を構成要素とするサイン音を作成する.クリックは立ち上がりと立ち下がりからなるバーストとする.バーストの構成要素である立ち下がりと立ち下がり及びバースト間の時間をパラメータとしてサイン音のプロトタイプを作成し,聴取実験を行う.加えて,プロトタイプのサイン音の音質評価をsound qualityスケールにより定量的に解析する.解析には新規購入するLabViewソフトウエアを使用する.行った実験結果は今年度開催される日本感性工学会及びヒューマンコミュニケーションシンポジウムで発表する.昨年度の研究開始が補助金予算の関係で遅れたため,中高年齢者を対象とした聴覚印象実験,日常生活における聞き取りにくいサイン音の調査に着手できなかった.平成24年度には,次の研究を計画し,中間的な成果発表を予定している.1.日常生活における高齢者のサイン音聴取に関する調査:大学生及び高齢者を対象として、日常生活場面でのサイン音への注意の実際について調査を実施する.2.トーンバーストピッチ、クリックピッチの知覚に関する実験:成人を対象として、短時間の持続時間を持つトーンバースト複合音,及びクリックに対するピッチ知覚を明らかにする実験を行う.3.サイン音のデザイン:上記,1及び2を基に,サイン音のプロトタイプを作成する.作成にあたり,複合音のrise及びdecay時間,基音に対する高調波音のriseとdecayのずれ,及びバースト音の持続時間の逆数となるゆらぎなどを考慮する.日本感性工学会発表旅費10万円HCGシンポジウム発表旅費20万円サイン音発生装置制作費30万円実験被験者謝金10万円平成23年度の補助金交付が遅延したことに伴い,研究実施が計画通りに行うことができなかった.故に,昨年度97万円の残額となった.昨年度,遂行できなかった研究計画を本年度に実施すると共に,当初の計画の研究をも実施する.80万円サイン音作成及び聴覚印象評価実験実施用機材の購入,20万円実験実施に当たり必要とする謝金等,20万円日常生活場面での聴取に関するアンケート調査費,30万円学会発表旅費
神経管閉鎖障害における性差の分子メカニズム

ヒト神経管閉鎖障害(NTDs)は女児に多い。我々の系統維持しているPdnマウス(責任遺伝子はGli3)のホモ型では、約16%の確率でNTDsが発症し、雌のみである。ここに、カビ毒であるオクラトキシンAを曝露すると、雄に偏ってNTDsが発症した。このことから、胎生7.5日にオクラトキシンAを曝露し、9日に胚仔を摘出し、その遺伝子発現の変化を調べた。オクラトキシンA曝露によって、Daam,Hoxbl,Tbx,Hmx3,Dlxl,Tlxh遺伝子の発現が大幅に増加し、Fgf8,Emx2では異所性の発現を示した。これらの遺伝子発現の変動とGli3発現抑制の総合作用によって、オクラトキシンAによるNTDsが雄に発症したものと考えた。遺伝性多指症/無嗅脳症マウス(Pdn/Pdn)の胎生7.5日にカビ毒であるオクラトキシンAを曝露し、胎生18日に胎仔を外形観察すると、雄Pdn/Pdnに神経管閉鎖障害を多発していた。このことから、オクラトキシンAは性に関連する遺伝子発現に影響を与え、この発現変動とGli3発現抑制の相乗効果で神経管閉鎖障害が発症したと考えた。そこで、胎生7.5日のPdnマウスにオクラトキシンAを曝露し、胎生9日に胚仔を取り出して、卵黄嚢膜からDNAを抽出し、PCRで遺伝子型および雌雄を決定した。胚本体は、WISK法で発現部位の変化を調べ、また胚本体からmRNAを抽出し、Rea1-time PCR法で発現量の測定を行った。DNAマイクロアレイによって、Gli3の影響下にある遺伝子群を探索し、その中から、Gli3以外に、Wnt7bとDmrt3遺伝子発現を調べた。Gli3では、Pdn/Pdnで発現抑制が認められ、オクラトキシンA曝露によっても発現抑制が認められたが、+/+でもPdn/Pdnでも雌雄差は認められなかった。Wnt7bは、Pdn/Pdnで発現抑制が認められ、オクラトキシンA曝露によっても発現抑制が認められ、+/+では雌雄差も認められたが、Pdn/Pdnでは雌雄差が認められなかった。Dmrt3では、Pdn/PdnPで発現抑制が認められ、オクラトキシンA曝露でも発現抑制が認められたが、雌雄差は+/+でもPdn/Pdnでも認められなかった。昨年度までの研究において、Wnt8bおよびFez1でも、今回のWnt7bと同様の結果を得ているので、これらの遺伝子群が総合的に働いて、神経管閉鎖障害を発症させているのではないかと考えた。さらに性に関連する遺伝子群の発現にっいて調べる予定である。来年度は、さらに、広範な性に関連する遺伝子群の発現変動について調べる予定である。遺伝性多指症/無嗅脳症マウス(Pdn/Pdn)の胎生7.5日にカビ毒であるオクラトキシンAを曝露し、胎生18日に胎仔を外形観察すると、雄Pdn/Pdnに神経管閉鎖障害(NTDs)を多発していた。その結果、オクラトキシンAを曝露されたPdn/Pdnで、Daam, Hoxb1, Tbx, Hmx3, Dlx1, Tlxhは、+/+、Pdn/Pdnとも、オクラトキシンA処理により大幅に発現量が増加したが、性差が認められなかった。Fgf8, Emx2は発現量に差は認められなかったが、無処理Pdn/PdnおよびオクラトキシンA処理Pdn/Pdnで異所性発現を示した。これらの遺伝子発現量の変化や異所性発現の総合作用によって、オクラトキシンAによるNTDsが雄に発症したものと考えた。
頭頸部癌における腫瘍エスケープ機構の解明

前年度の研究で、大腸癌、肺癌にてみられる宿主に対するエスケープ機構が頑頸部癌においても存在することがわかった。さらにApoptosisを来す経路においてExtrinsic pathwayよりもIntrinsic pathwayが主経路であり、これを抑制することがApoptosisからのより効率的な回避につながることが示唆された。近年海外でもその主たる蛋白であるIAP(Inhibitor of apoptosis protein)ファミリーに関する論文もみられ、その中でも特にSurvivinにおけるものは多数報告されている。これは正常な成人の組織では発現せず、さらに種種の癌細胞において非常に強く発現するIAPで、我々が行った実験でも、癌組織の90%以上が発現しており、この発現を抑制することがもっとも癌細胞のApoptosisを誘導するものと考えた。そこで今回は7種類のヒト由来の頭頸部癌細胞株7種類を用いて実験を行った。細胞を培養し、これらよりmRNAを抽出。さらにRT-PCR法にてSequence detection systemを用い、Survivinの発現をみた。その結果全ての細胞株でSurvivinの発現を認めた。さらにこれらのプレートを電気泳動に流したところ、すべての細胞株にバンドの形成がみられた。そこでSurvivinを発現している細胞株に対し、SurvivinをコードするmRNAに対するAntisenseを結合させたところ、明らかに細胞が、Apoptosisに陥っていることがわかった。今後はAntisense treatmentに抗癌剤投与あるいは放射線照射をあわせで行い、さらにApoptosisが誘導されるかどうかにつき検討したい。癌細胞は宿主に対し、細胞表面に種々のアポトーシス抑制蛋白を発現し、それらにより生体の免疫学的監視機構から逃れていること(エスケープ機構)が近年明らかにされ、特に肺癌や大腸癌においては一部解明されつつある。しかし、頭頸部領域ではまだ研究がなされていないのが現状である。我々はアポトーシス抑制蛋白であるDcR3,FLIP、FLICE、Survivin、Smac/DIABLOの発現につき検討した。生検や手術にて得られた38検体1525mgを細切し、RNAを抽出し、RTにてcDNAを合成した。プローブ、プライマーを作成しreal-time PCRにかけ、その発現をみた。その結果DcR3は全例に発現を認めた。さらに、FLIPで42.1%,FLICEで84.2%、Survivinでは92.1%、Smac/DIABLOでは71.1%の発現を認めた。このことから頭頸部癌においてもこれらのアポトーシス抑制蛋白を介するエスケープ機構が存在することが示唆された。今回の結果では、その中でも特にアポトーシスを来す経路のうちIntrnsic pathwayを経てアポトーシスを誘導することが主経路ではないかと思われた。またDcR3においてはT分類別、組織別、部位別に有意差は認められなかった。FLIP、FLICE、Survivin、Smac/DIABLOに関しては現在検討中である。さらに来年度では症例数を増加させデータを蓄積し、その一方で、頭頸部癌の細胞株を用い組換えレトロウィルスベクターを用いこれらアポトーシス抑制蛋白をコードする遺伝子を導入しFasLを加え、これらの蛋白を発現している癌細胞がアポトーシス抵抗性を宗すか否かにつき検討を行う。
吸息相の維持に関する延髄内ニューロン機構の電気生理学的研究

呼吸リズム吸息相の期間中、延髄の呼息性ニューロンの発火は抑えられる。これは吸息性ニューロンからの抑制によると考えられるが、これまでに同定されている抑制性の吸息性ニューロンは漸減型発火のニューロンのみである。この抑制のみでは、吸息相の後半から最後にかけて呼息性ニューロンが発火を開始してしまい、時間的に十分な吸息相が維持されないのではないかとの疑問が出されている。これまでに報告されていない抑制性の吸息性ニューロンの同定が本研究の目的である。0)ネンブタール麻酔・非動化したネコを用いて、腹側呼吸ニューロン群(VRG)とBotzinger complex(BOT)と呼ばれる領域から細胞外記録と細胞内記録を行った。1)呼息性ニューロンには、吸息相の間、漸増的にその膜電位が過分極するものが存在した。まだ数個のニューロンの細胞内記録で観察されたのみであるが、漸増型吸息性ニューロンの中に抑制性ニューロンも存在するはずであるとの示唆を得た。2)漸増型吸息性ニューロンの記録部位を色素(Fast Green FCF)でマークする作業を系統的に行ったところ、大多数はこれまでの報告通りVRGに密集して存在していた。しかしVRGの吻側部からBOTにかけてもまばらではあるが分布していた3)これら吻側部の漸増型吸息性ニューロンの延髄内への軸索投射を逆行性微少電流刺激法を用いて調べた。多数は延髄内の呼吸ニューロンの領域に軸索を投射していた。4)漸増型吸息性ニューロンのスパイクでトリガーし、細胞内記録した呼吸ニューロンの膜電位を加算平均する「スパイクトリガーによる加算平均法」により、100個以上のVRGの漸増型吸息性ニューロンを試したが、興奮性ニューロンしか同定されていない。現在BOTの漸増型吸息性ニューロンの検索を継続中である。
LC-MS/MSを用いたリウマチ治療に用いる抗体医薬品の血中濃度測定法の確立

本申請研究では、関節リウマチ患者やクローン病患者などに対して用いられる抗体医薬品インフリキシマブ(IFX)の血中濃度測定による薬物動態解析や、IFXに対する抗体(抗IFX抗体)の発現機序解明のための重要なツールとなりうる"LC-MS/MS法を用いたIFXおよび抗IFX抗体の濃度測定法の確立"を目的として検討を行った。第一に、IFXおよびヒト血液中のタンパク質をタンパク分解酵素により断片化しSDS-PAGE法を用いて未処理のIFXやヒト血液中のタンパク質と分子量を比較することで最も消化効率の良い前処理条件を検討した。第二に、得られたサンプルをLC-MS/MSで分析し、主成分解析(PCA解析)を行うことでIFX特有のイオンピークを複数種類抽出した。これらのピークのうち、比較的強いピーク強度を有し、なおかつIFXを含むサンプルに特異的に存在するピークを選択してIFXの濃度測定を行った。その結果、前処理条件としてはジチオスレイトールによる還元処理、ヨードアセトアミドによるアセチル化処理およびトリプシンによるタンパク断片化としてについて最適な前処理条件を設定することが出来た。次に、PCA解析によって得られた複数種類のIFX特異的なピークのうちで最も強度が強かったイオンピークについてproductionの探索を行った結果、最も特異的かつ強度の強いイオンピークを得ることが出来た。そしてブランク血清にIFXを添加したサンプルを測定した結果、絶対検量線法ではあるがこれまで報告されているIFXの血中濃度範囲におけるリニアな検量線を得ることが出来た。現在は、固相抽出によるイオンサプレッションの軽減やサンプルの濃縮などによる感度向上を目的とした検討を行っている。
ビタミンＤ由来光反応異性体の新規構造展開：骨作用増強と生体内半減期増長分子の開発

後者に関する論文を本年度、新たに発表した。ヒト皮膚での光反応により、7-デヒドロコレステロールはプレビタミンD3に変換され、次いで体温による[1,7]シグマトロピー転位でビタミンD3が生成する。この過程は酵素が全く関与しない化学変換であり、生体内反応であるにもかかわらず、純粋な光反応により数種類の副生成物を体内にもたらす。プレビタミンD3への光反応ではタキステロールとルミステロールが、ビタミンD3への光反応ではスプラステロールIとIIが同じく皮膚で生成する。これらの副生成物は、確実にヒト体内に存在するものの、ビタミンD受容体を介する作用は弱く、現在のところ積極的な生理的存在意義は未知のままである。本研究課題では、詳細な生理活性が不明な光反応によるこれらビタミンD異性体を効率よく化学合成し、これまで我々がビタミンD誘導化で得た知見や受容体とのX線共結晶構造解析を活かして高度にその誘導化を施し、強い骨形成作用を有する誘導体を取得する。また一方では、受容体を介さない、すなわちホルモン量ではヒトの恒常性維持に関与していないが、ある程度の血中濃度でヒトの健康維持に関与し、脂質代謝や免疫系に働きかけている可能性が否定できないので、動物実験に堪えうる量を確保する合成法が望まれる。平成27年度は、1.タキステロールを安定な形で取り扱える8,9-ジヒドロタキステロール全4種の異性体合成に成功した。2.スプラステロールについては、ビタミンD2とビタミンD3それぞれから光反応により、スプラステロールIとIIを合計4種類合成に成功した。また、25-ヒドロキシビタミンD3からのスプラステロールIとIIをそれぞれ合成することができた。現在共同研究者とともに、以上10種の新規化合物の生物活性探索研究を進めている段階である。目的とする初期の合成計画化合物であるスプラステロール(6種)と7,8-ジヒドロタキステロール(4種)について、合成と単離精製を完了することができた。後者4種のうち2種はプレビタミンD型の構造をとっており、このような化合物が得られることは当初考えていなかった予想外の生成物であり、それらを含めて新規ビタミンD誘導体の生物活性を調べることは今後の研究展開に重要な知見を与えるものと考えられる。一方、ビタミンD3を不活性化する代謝酵素CYP24A1阻害剤を設計・取得し、合成したリガンド分子や活性型ビタミンD3の生体内半減期を増長する分子を開発する目的でも本研究課題は進行している。2α方向にテトラゾールエチル基を導入した活性型ビタミンD3誘導体において、CYP24A1による第一段階の代謝産物が、生物活性を有しながらCYP24A1への代謝抵抗性を示すことを見出した。この知見は、新たなビタミンD誘導体の分子設計に重要な指標を示すものと考えられる。現在、第一段階の代謝産物の生物活性を調べている。7,8-cis-19-ノルビタミンD3合成にも成功し、活性的には弱いものの、ビタミンD受容体とのX線共結晶構造解析を進めることができ、構造的には重要な知見が得られた。成果が英文論文として受理され、現在印刷中である。皮膚での光反応によるビタミンD3生合成において、酵素が全く関与しない純粋な光反応であることから、数種類の副生成物を体内にもたらす。すなわち、プレビタミンDへの光反応ではタキステロールとルミステロールが、ビタミンDへの過剰な光反応ではスプラステロールIとIIが皮膚で生成する。これらの副生成物はヒト体内に存在するものの、ビタミンD受容体を介する生理作用は弱く、現在のところ積極的な生理的存在意義は不明である。本研究課題では、詳細な生理活性が不明な光反応によるこれらビタミンD異性体を効率よく化学合成し、さらなる誘導化を施し、強い骨形成作用を有する誘導体を取得する。また一方では受容体を介さない、すなわちホルモン量ではヒトの恒常性維持に関与しないが、ある程度の血中濃度でヒトの健康維持に関与し、免疫系や脂質代謝に働きかけている可能性があり、動物実験にまで堪えうる量を化学合成により確保する。これまでに、タキステロールの新規安定誘導体4種を合成し、ビタミンD2とD3由来のスプラステロール6種を合成したまた、ビタミンD3を不活性化する代謝酵素CYP24A1による代謝産物として、カルシトロン酸と側鎖ラクトン体がヒトの場合4:1で生成することが知られているが、後者の生理作用についてはこれまで単なる不活性代謝産物として理解されている。ホルモン量では不活性でも、ある程度の血中濃度でヒトの健康維持に関与している可能性があり、代謝産物の量的化学合成により正しい理解へと進めるために、ビタミンD3側鎖ラクトン代謝産物の化学合成を行った。1.タキステロールの新規安定誘導体4種の合成に成功した。2.ビタミンD2とD3由来のスプラステロール6種の合成に成功した。共同研究により、その中にはこれまでに知られていない生理活性を示す化合物が見出された。3.既存のビタミンD3側鎖ラクトン代謝産物の合成法を改良することにより、活性探索研究に十分量の化合物を確保することができた。4.我々が見出した骨形成作用の極めて強い2α-テトラゾールエチル基を有する活性型ビタミンD3のCYP24A1代謝産物の推定構造を化学合成により明らかにし、合成法と構造証明について外国誌に論文発表した。この代謝産物にはビタミンD受容体結合親和性が保持されており、親化合物のみならず、代謝産物にも骨形成作用があるものと考えられる。

この代謝産物の生体内半減期は長く、親化合物の骨形成作用が強い一因と考えられる。なお、この親化合物には高カルシウム血症をともなう副作用が極めて低いことも、骨粗鬆モデルラットにおいてin vivoで証明し、すでに論文発表をしている。5.7,8-cis-19-ノルビタミンD3を化学合成し、オステオカルシン転写活性評価とビタミンD受容体との複合体X線共結晶構造解析を終えたので、今年度はさらに7,8-cis-19-ノルビタミンD3の2位置換体を合成し、ビタミンD受容体を介する生物活性の強弱を比較し、やや活性が劣るものの本成果を論文発表することができた。これまで先行研究例の少ないタキステロール骨格(ビタミンD生合成時の副生成物)誘導体合成研究により、骨粗鬆症治療薬エルデカルシトールと同等以上の骨形成選択的作用を有するタキステロール誘導体やタキステロールと同じコンフォメーションでヒトビタミンD受容体(hVDR)と結合する7,8-cis-19-ノルビタミンD誘導体を見出した。また、それら新規リガンドとヒトビタミンD受容体との複合体におけるX線共結晶構造解析に成功し、学会・論文発表した。また、我々がこれまでに見出した骨形成作用の極めて強い2α-テトラゾールエチル基を有する活性型ビタミンD3誘導体AH-1のCYP24A1代謝産物の推定構造を化学合成により明らかにした。合成法と構造証明について論文発表した。この代謝産物にはビタミンD受容体結合親和性が保持されており、親化合物のみならず、代謝産物にも骨形成作用があるものと考えられた。この代謝産物の生体内半減期は長く、親化合物AH-1の骨形成作用が強い一因と考えられる。なお、この親化合物AH-1には高カルシウム血症をともなう副作用が極めて低いことも、骨粗鬆モデルラットにおいてin vivoで証明した。ビタミンDは、ヒトの皮膚で太陽光のもと生合成されるが、その生合成反応(光反応)はルミステロールやタキステロールなどの副生成物を生じる。それらの詳細な生理活性は不明であり、本研究課題ではタキステロール誘導体の効率的化学合成を開発し、さらなる誘導化を施し、強い骨形成作用を有する誘導体を取得して論文発表している。また、新規タキステロールのヒトビタミンD受容体への結合様式を共結晶構造解析により証明し、ビタミンDとは微細にわたり異なる結合様式を解明した。また、我々が見出した骨形成作用の極めて強い2α-テトラゾールエチル基を有する活性型ビタミンD3のCYP24A1代謝産物の推定構造を化学合成により明らかにし、合成法と構造証明について論文発表した。この代謝産物にはビタミンD受容体結合親和性が保持されており、親化合物のみならず、代謝産物にも骨形成作用があるものと考えた。7,8-cis-19-ノルビタミンD3を化学合成し、オステオカルシン転写活性評価とビタミンD受容体との複合体X線共結晶構造解析を終え、さらに2位置換体についても合成し、ビタミンD受容体を介する生物活性の強弱を比較し、本成果を論文発表した。後者に関する論文を本年度、新たに発表した。スプラステロールは25位OH基の有無で、脂質代謝に影響を及ぼすことが示唆され、どのような作用機序であるのか、今後共同研究で検証していく方針である。