hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低分子量可溶性CD14サブタイプによる感染症迅速診断法の開発

これまで抗CD14抗体を利用した可溶型CD14の免疫化学的測定系を種々作製してきたが、このうち特定の抗CD14抗体を利用した測定系において、可溶型CD14分子のうち一部の分子、すなわち可溶型CD14サブタイプを発見した(従来のCD14と分子量が異なる)。我々はこの可溶型CD14サブタイプのELISA法による定量法を開発し、感染症の診断に際して感受性、特異性共に現存する炎症マーカーの中では最も優れていることを見出した。イムノクロマトグラフィー法を利用し、血清あるいは血漿を微量(約200μl)滴下するだけの単純操作で、かつ短時間(約10分)に結果が得られる可溶型CD14サブタイプの測定キットを作成した(キット化)。現在、1)イムノクロマト法とELISA法による可溶型CD14サブタイプのデータの比較検討を行っている。(精度の確認)。2)感染の違い(グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、ウイルス)による可溶型CD14サブタイプ発現量の差について臨床検体を用いて検討する(鑑別診断能力)。3)可溶性型CD14サブタイプの発現量と感染症のSOFAスコア、APACH IIスコアとの関連について検討する(重症度判定)。4)術期の感染症合併の有無を予測する診断能力について検討している(生体肝移植、食道ガン、心臓・大血管手術など)。(感染の予知)溶型CD14サブタイプの産生細胞を検索するとともに、発現時の生体反応について臨床検体およびミニブタを用いて検討している。(生物活性の検討)リポポリサッカライド(LPS)に高い親和性を持つ受容体であるCD14は、単球やマクロファージの細胞表面に発現されている糖タンパクである。著者らは、従来知られていなかった敗血症患者で上昇する新規のCD14を同定し、可溶型CD14サブタイプ(sCD14-ST)と命名した。血漿中のsCD14-ST濃度を測定するため、抗CD14-ST抗体を作製し、酵素免疫測定法(EIA)を確立した。この測定系を用いて、正常人、全身性炎症反応症候群(SIRS)患者、敗血症患者の血漿中のsCD14-STレベルを比較したところ、敗血症患者血中sCD14-STは正常人及びSIRS患者に比較して有意に高値であった。また、敗血症の診断マーカーとしてsCD14-STを用いた場合、ROC曲線下面積は0.817であり、血中で上昇するsCD14-STが他のマーカーに比較して敗血症の診断マーカーとしてより優れていることが示された。sCD14-STはまたプロカルシトニン(PCT)、敗血症に関連する組織傷害アセスメントスコアであるSOFAスコアと相関し、さらに、sCD14-ST濃度の変動は敗血症の重傷度と相関した。以上まとめると、これらの結果よりsCD14-STは敗血症の早期診断及び本疾患の重症度のモニタリングに有用であることが示唆された。(精度の確認)。(生物活性の検討)
フエムト秒フオトニクス

[超高速光工学の調査]フェムト秒フォトニクスはレーザの物理学、工学や光物生工学、および光電子デバイス工学、光システム工学にまたがる境界領域的性格を有する新しい学問分野であり、拾い立場から現況を把握する必要がある。関連した研究として平成5年度まで行われた重点領域研究「超高速超並列光エレクトロニクス」の研究成果をもとに我が国の大学における研究の特色を生かした研究の進め方について調査および討論をおこなった。研究現況の調査にあたってはデータベースの利用のほか、電子協調査報告、NEDO先導研究報告も利用した。これによってフェムト秒領域において基礎科学的研究および端緒的な工学研究は行われているものの、物質から光システムにわたる総合的視点からの工学研究が不十分であることが認識された。[分担研究者の研究現況の把握と研究課題の討論]シンポジウムの開催により分担研究者がこれまでにおこなってきた準備的研究の成果と問題意識の発表を行い、今後重点的に攻略すべき研究課題の整理をおこなった。[重点領域研究計画の立案と申請書作成]以上の調査、討論をもとに平成9年度から開始される3年間に同題目の重点領域研究を実施することを計画し、申請書の作成を行い、2月に文部省に提出した。研究の目的としては「光の時間軸上の極限、すなわちフェムト秒台の超高速領域における発生、検出および物質応答に関わる物理的課題を探究するとともにこれを利用して光による超高速の情報伝達、処理、計測を可能とする新工学概念の創出を目指した研究をおこなう」ことに整理し、主要研究項目として(1)フェムト秒フォトニクス物理、(2)フェムト秒非線形物性、(3)ナノ構造フォトニクス(4)超高速フォトニックシステム、の柱をたてた。
Bacterial Translocationに対する小腸上皮増殖因子の効果(腸管上皮増殖因子グリセンチンの効果)

【目的】腸管粘膜防御機能の破綻に伴う"Bacterial Translocation(BT)"は、長期経静脈栄養法施行時の廃用性萎縮、放射線曝射や制癌剤投与時の腸粘膜障害などの病態で発症する危険性があり、これらの病態下ではBT予防のために消化管粘膜を維持する何らかの対策が必要であると考えられている。我々は腸管グルカゴンの一つであるグリセンチンが腸粘膜上皮細胞増殖作用を有することを報告してきた。今回はグリセンチンの腸管免疫系へ及ぼす効果をヒトグリセンチンを用いてin vivoで検討した。【方法】1)wiustar系ラット(200250g)に中心静脈栄養を施行群、2)同様に中心静脈栄養内にグリセンチン(110μg/kg/day)を混合し1週間施行した群、3)中心静脈栄養内にグリセンチン(10μg/kg/day)+GLP-2(10μg/kg/day)を混合し施行した群、4)固形飼料摂食群を作製し1週間飼育後以下の検討を行った。1)体重、腸管重量、2)回盲部より10cm口側の回腸及び幽門部より10cm肛門側の空腸の絨毛高、Brd-U染色、IgA染色【結果】体重、腸管重量は10μg/kg/day添加群で非添加群の約1.2倍と明らかな増加が見られた。(固形飼料摂食群の約0.6倍)絨毛高、Brd-U染色、IgA染色でも、同様の結果が得られたが、回腸より空腸においてその効果は強かった。また、それらの効果はグリセンチンにGLP-2を添加することにより相乗された(体重、腸管重量は非添加群の約1.6倍と明らかな増加が見られた。(固形飼料摂食群の約0.8倍)【考察】今回の実験により、細胞レベルのみならずin vivoにおいても腸管粘膜上皮の増殖及び機械的・免疫学的バリア機能の増強が確認された。また、その効果はGLP-2を加えることにより相乗された。【目的】腸管粘膜防御機能の破綻に伴う"Bactdal Translocation(BT)"は、長期経静脈栄養法施行時の廃用性萎縮、放射線曝射や制癌剤投与時の腸粘膜障害などの病態で発症する危険性があり、これらの病態下ではBT予防のために消化管粘膜を維持する何らかの対策が必要であると考えられている。今回はグリセンチンの腸管免疫系へ及ぼす効果を遺伝子工学的に精製されたヒトグリセンチンを用いてin vitroで検討した。【方法】1)Wister系ラット(200250g)に中心静脈栄養を1週間施行群、1)同様に中心静脈栄美内にグリセンチン(1μg/kg)を混合し1週間施行群を作り以下の実験を行なった。1)体重、腸管重量、2)回盲部より約10cm口側の回腸、及び幽門部より約10cm肛門側の空腸の絨毛高、IgA染色による比較検討した。【結果】今回の実験では、グリセンチン添加群と非添加(コントロール)群の間に有意な差がみらなかった。【考察】細胞レベルでのグリセンチンの腸管粘膜上皮の機械的・免疫学的バリア機能の増強効果は認されているため、グリセンチンの投与法及び、投与濃度に問題があるものと思われた。また、中心静脈栄養での飼育期間も2週間までのばし、再度検討する予定である。【目的】腸管粘膜防御機能の破綻に伴う"Bacterial Translocation (BT)"は、長期経静脈栄養法施行時の廃用性萎縮、放射線曝射や制癌剤投与時の腸粘膜障害などの病態で発症する危険性があり、これらの病態下ではBT予防のために消化管粘膜を維持する何らかの対策が必要であると考えられている。今回はグリセンチンの腸管免疫系へ及ぼす効果をヒドグリセンチンを用いてin vivoで検討した。【方法】1)Wiustar系ラット(200250g)に中心静脈栄養を1週間施行群、2)同様に中心静脈栄養内にグリセンチン(1μg/kg)を混合し1週間施行した群、3)中心静脈栄養を2週間施行群、4)中心静脈栄養内にグリセンチン(1μg/kg)を混合し2週間施行した群を作製し以下の実験を行った。1)体重、腸管重量、2)回盲部より10cm口側の回腸及び幽門部より10cm肛門側の空腸の絨毛高、Brd-U染色、IgA染色による比較検討をした。【結果】体重、腸管重量では中心静脈栄養2週間施行群において1週間施行群より有意な体重増加が見られたが腸管重量には有意差を認めなかった。また1週間施行群と2週間施行群の各々のグリセンチン添加群と非添加群の間では有為な差は見られなかった。空腸の絨毛高・Brd-U染色、IgA染色では、2週間施行群において1週間施行群よりやや絨毛高が低くなる傾向が見られたが染色結果を含めて有意差は認められなかった。また1週間施行群と2週間施行群の各々のグリセンチン添加群と非添加(コントロール)群の間でもやはり有為な差は見られなかった。【考察】

今回の実験により、中心静脈栄養の期間は2週間に延長してもその差はわずかであり、1週間での検討で充分であると考えられた.細胞レベルでの腸管粘膜上皮の機械的・免疫学的バリア機能の増強は確認されているため、やはりグリセンチンの投与法(シリンジ、チューブ内のグリセンチンの吸着等)及び、投与濃度に問題がある(100μg/ml以上が必要な可能性が示唆される。)ものと思われた。【目的】腸管粘膜防御機能の破綻に伴う"Bacterial Translocation(BT)"は、長期経静脈栄養法施行時の廃用性萎縮、放射線曝射や制癌剤投与時の腸粘膜障害などの病態で発症する危険性があり、これらの病態下ではBT予防のために消化管粘膜を維持する何らかの対策が必要であると考えられている。我々は腸管グルカゴンの一つであるグリセンチンが腸粘膜上皮細胞増殖作用を有することを報告してきた。今回はグリセンチンの腸管免疫系へ及ぼす効果をヒトグリセンチンを用いてin vivoで検討した。【方法】1)wiustar系ラット(200250g)に中心静脈栄養を施行群、2)同様に中心静脈栄養内にグリセンチン(110μg/kg/day)を混合し1週間施行した群、3)中心静脈栄養内にグリセンチン(10μg/kg/day)+GLP-2(10μg/kg/day)を混合し施行した群、4)固形飼料摂食群を作製し1週間飼育後以下の検討を行った。1)体重、腸管重量、2)回盲部より10cm口側の回腸及び幽門部より10cm肛門側の空腸の絨毛高、Brd-U染色、IgA染色【結果】体重、腸管重量は10μg/kg/day添加群で非添加群の約1.2倍と明らかな増加が見られた。(固形飼料摂食群の約0.6倍)絨毛高、Brd-U染色、IgA染色でも、同様の結果が得られたが、回腸より空腸においてその効果は強かった。また、それらの効果はグリセンチンにGLP-2を添加することにより相乗された(体重、腸管重量は非添加群の約1.6倍と明らかな増加が見られた。(固形飼料摂食群の約0.8倍)【考察】今回の実験により、細胞レベルのみならずin vivoにおいても腸管粘膜上皮の増殖及び機械的・免疫学的バリア機能の増強が確認された。また、その効果はGLP-2を加えることにより相乗された。
小分子転写因子の開発と応用

前年までに、レンチノロールの各種誘導体を合成し、遺伝子発現をより強く誘導する誘導体を得た。さらに、この誘導体を用いて、筋細胞への分化を誘導する転写因子MyoDを模倣することに成功した。次になぜこの誘導体の転写活性化能が上がったかを調べることにした。この誘導体は、レンチノロールのビピペリジン部位にベンゼン環を挟むことによってレンチの幅を長くしか誘導体であり、コアクチペータSur2との結合が強くなっていると推測される。そこで、レンチノロール及びこの誘導体と結合するSur2の量を比較することにした。ビオチン化したレンチノロールとその誘導体を核抽出物とインキュベートし、ストレプトアビジンビーズで結合タンパク質を精製した。結合タンパク質をウェスタンプロットにより解析し、結合しているSur2の量を評価した。その結果、この誘導体はレンチノールと比較して、Sur2とより強く結合することが示唆された。さらにレンチノロールとこの誘導体に蛍光物質を導入し、Sur2との解離定数を蛍光偏光法によって測定した。その結果、この誘導体の解離定数は0.32μMでありレンチノロール(0.86μM)よりも約2.6倍の強さでSur2と結合していることがわかった。一方、脂肪合成遺伝子の発現を抑制する分子であるファトスタチンの作用機構について研究を行った。DNAマイクロアレイなどによる解析から、この化合物はSREBPという転写因子の経路に作用することを明らかにした。SREBPは脂肪合成において鍵となる転写因子である。生化学・細胞生物学的研究により、ファトスタチンはSCAPというタンパク質に結合することによって、SREBPの活性化プロセスを抑制することを明らかにした小分子転写因子はDNA結合部位であるポリアミドと転写活性化部位であるレンチノロールからなる。ポリアミドはDNA配列特異的に結合し、レンチノロールはコアクチベータSur-2との結合を介して基本転写因子群・RNAポリメラーゼを特定のプロモーターにリクルートする。そこで、まずDNA結合部位となるポリアミドを固相合成した。このポリアミドにリンカーを結合させ、レンチノロールと反応させ、目的とする小分子転写因子を得た。今後、この小分子転写因子のin vitroならびに細胞系での転写活性化能を検討する予定である。リンカーの長さや種類の異なる小分子転写因子も合成し、同様にこれらの転写活性化能を評価する。また、レンチノロールとコアクチベータSur-2との結合能を上げるために、レンチノロール誘導体を合成し構造活性相関を調べた。14種類のレンチノロール誘導体を合成し、それぞれの誘導体にリンカーを介してビオチンを導入した。これらのビオチン化レンチノロール誘導体、Gal4-ストレプトアビジン融合タンパク質、Gal4結合部位をプロモーターに導入したレポーター遺伝子、細胞核抽出物を用いてin vitrotranscriptionを行い、これらの誘導体の転写活性化能を評価した。この結果レンチノロールのビピペリジン環に水酸基を導入することにより、転写活性化能が上がることを見出した。現在さらに誘導体を合成中であり、これらについても転写活性能を評価する予定である。より活性の高い誘導体が得られたら、上記のようにポリアミドと結合させ、小分子転写因子を合成したいと考えている。レンチノロールとコアクチベータSur-2との結合能を上げるために、レンチノロール誘導体を合成し構造活性相関を調べた。これらのビオチン化レンチノロール誘導体、Gal4ーストレプトアビジン融合タンパク質、Gal4結合部位をプロモーターに導入したレポーター遺伝子、細胞核抽出物を用いてin vitro transchptionを行い、これらの誘導体の転写活性化能を評価した。その結果、レンチノロールにフェニル基を導入することにより、転写活性化能が上がることを見出した。さらに、この誘導体が細胞内でレポーター遺伝子の発現を活性化するか調べた。Gal4結合部位をプロモーターに導入したレポーター遺伝子及びGal4-ストレプトアビジン融合タンパク質を発現する遺伝子を細胞に導入し、ビオチン化したレンチノロール誘導体で処理した。その結果、この化合物はレポーター遺伝子の発現を9倍高くすることが明らかになった。さらにこの誘導体が細胞内の内在性の転写因子MyoDを模倣できるか評価した。MyoDは様々な遺伝子の発現を誘導し、筋芽細胞から筋細胞へ分化を開始させる。筋芽細胞にストレプトアビジンとMyoDのDNA結合部位のみ(転写活性化部位は存在しない)を融合したタンパク質を導入し、ビオチン化したレンチノロール誘導体で処理した。その結果、この化合物は、筋芽細胞から筋細胞への細胞の分化を誘導することが示唆された。今後はこの化合物と、DNA結合部位であるポリアミドと結合させ、小分子転写因子を合成したいと考えている。

さらにレンチノロールとこの誘導体に蛍光物質を導入し、Sur2との解離定数を蛍光偏光法によって測定した。その結果、この誘導体の解離定数は0.32μMでありレンチノロール(0.86μM)よりも約2.6倍の強さでSur2と結合していることがわかった。一方、脂肪合成遺伝子の発現を抑制する分子であるファトスタチンの作用機構について研究を行った。DNAマイクロアレイなどによる解析から、この化合物はSREBPという転写因子の経路に作用することを明らかにした。SREBPは脂肪合成において鍵となる転写因子である。生化学・細胞生物学的研究により、ファトスタチンはSCAPというタンパク質に結合することによって、SREBPの活性化プロセスを抑制することを明らかにした
車載電子機器の波源モデル化による自動車車内外の電磁環境の推定

車載電子機器の自動車車内外における放射電界推定法の確立を目的として、波源モデル化法とフルウェーブ解析手法を用いた車載電子機器の放射電界解析法について検討している。車載電子機器の実機モデルと波源モデルの比較検証により、車載電子機器を自動車に搭載した場合の放射パターンの傾向や最大放射レベル、自動車車内外のマクロな電界強度分布の事前予測に本推定方法が有効であることを示す。本研究の目的は、"電子機器の波源モデル化法"を車載電子機器に適用し、車載電子機器を自動車に搭載した時の自動車車内外の電磁環境を推定する方法を確立することである。従来法による"開かれた空間(自由空間または半無限空間)の電界強度推定"では、波源モデルからレイトレーシング法により任意地点の電界強度を求めているが、自動車のように比較的閉じられた空間への適用には、モーメント法やFDTD法などのフルウェーブ解析手法で波源モデルを使用できるようにする必要がある。今年度は、フルウェーブ解析手法として、誘電・磁性材料の扱いは困難であるが計算負荷が比較的小さいモーメント法を使用し、モーメント法に適用可能な波源モデル化法について検討した。1.波源モデル化アルゴリズムの精度向上従来法に比べて、波源モデル化に要する時間を増加させることなく、複数の波源モデル候補の中から統計的処理によって精度の高い波源モデルを選択する方法を検討した。2.波源モデルにおける波源間結合の低減化波源モデル化アルゴリズムにおいては波源間の結合が考慮されていないため、波源モデルをモーメント法解析空間に反映される際に放射特性に差異が生じる。そこで、波源間結合を低減させるワイヤグリッド波源モデルを検討した。3.簡易車体モデルによる本モデル化法の評価金属ワイヤのみで構成された簡易車体モデルと模擬機器を用いて、解析、実測の両面から本モデル化法の評価を行った。その結果、放射電界強度分布を良好に推定できることを確認した。従来法による"開かれた空間(自由空間または半無限空間)の電磁環境推定"では、波源モデルからレイトレーシング法により任意地点の電界強度を求めているが、自動車のように比較的閉じられた空間への適用には、モーメント法やFDTD法などのフルウェーブ解析手法で波源モデルを使用できるようにする必要がある。今年度は、フルウェーブ解析手法として、計算負荷は比較的大きいが、誘電・磁性材料の扱いが容易なFDTD法を使用し、FDTD法に適用可能な波源モデル化法について検討した。1. FDTD法に適用可能な波源モデル化法の検討直交座標系に適した波源モデルについて検討し、セルサイズ、波源間結合、周囲散乱体などが波源モデルに及ぼす影響を評価した。その結果、要求精度に応じた波源モデル化指針(波源モデル化条件、計算パラメータ)を得ることができた。簡易車載電子機器(放射源)と金属散乱体および非金属散乱体を含む系において、解析、実測の両面から本波源モデル化法の検証を実施し、近傍電磁界分布および放射特性共に良好に推定できることを確認した。2.簡易電波暗室の高精度化H23年度に実施予定の「簡易電波暗室の測定データを使用する場合の波源モデル化精度の改善」を一部前倒し、発泡ピラミッド吸収体による簡易電波暗室の高精度化について検討した。発泡ピラミッド吸収体配置の最適化により16GHzの周波数帯域においてSVSWR≦6dBを達成することができた。今年度は、汎用性を向上させるために、国内で広く普及している簡易電波暗室の測定データを使用可能な波源モデル化手法について検討した。1.測定データの精度改善3m法電波暗室と比べて顕著となる壁面からの反射波の影響を、(1)ピラミッド電波吸収体、クロスウェッジ電波吸収体の追加によりハード的に低減させる方法、(2)事前測定結果を基にソフト的に補正する方法、について検討した。2.計算パラメータの最適化サンプリング範囲の減少による波源モデル化精度の劣化を改善するため、計算パラメータおよびサンプリング方法について検討し、模擬機器および実機を用いて、解析、実測の両面から検証を実施した。MHz帯においては近傍電磁界分布、放射特性共に良好に推定することができたが、GHz帯においては推定精度の劣化が見られた。3.他機関保有の簡易電波暗室における検証1で検討した電波吸収体の追加による精度改善方法を3機関の簡易電波暗室に適用した。
ふなずし中の各種成分の熟成による消長ならびに機能性の検討

ふなずし熟成過程における成分の経時的変化について分析を行い、飯と魚との間の栄養成分の移動と消長について検討を行った。あわせて、微生物相の変化について検討した。また、魚の鮮度に関する成分を経時的に測定し、魚としての品質についても明らかにするとともに、食品の機能性の中から、抗酸化性に着目し、その有無の検討を行った。その結果、水分は魚肉・卵巣において徐々に減少したタンパク質は魚肉においてわずかに減少したが、飯においてはわずかに増加した。脂質は個体差が大きく、魚肉、卵巣での変化は明確でなかったが、飯ではわずかに増加した。灰分は魚肉と卵巣においては共に少し、飯では増加する現象が見られ、特に塩漬けふなから1ヶ月めの試料において、ふなから飯への移行が顕著に見られた。総アミノ酸量は魚肉・卵巣・飯のいずれにおいても増加が見られた。また、魚肉中の細菌の生菌数は本漬け後、1ヶ月で10^7オーダーまで大きく増加し、乳酸菌および嫌気性細菌はその後10^8オーダーまで達し、好気性細菌は10^4まで減少した。米飯中の乳酸菌および嫌気性細菌の生菌数は本漬け後、10^8オーダーでありその後の増減の傾向は魚肉と類似していた。また、すべての期間において、米飯中の生菌数は魚肉中の生菌数よりも1オーダー高かった。熟成期間中に観察された乳酸菌はヘテロ発酵型のLactobacillus buchneriであった。鮮度の指標である揮発性塩基窒素は、塩漬けふなでは19mg%、3ヶ月で39mg%となり、その後大きな変化は見られなかった。また、もう一つの指標としてK値の分析を行った。その結果、ふなずし熟成中において、本漬け後1ヶ月で漁の旨味成分の一つであるイノシン酸はほとんど分解していることが明らかとなった。ふなずしの水溶性画分およびメタノール画分について、DPPHラジカル消去能を指標とし、抗酸化性について測定したが、いずれの画分にも抗酸化性は見られなかった。ふなずしは塩漬けした鮒を飯に長期間漬け込んで発酵させた馴れずしである。滋賀県下では古くから漬けられ、様々な行事のご馳走として欠かせないものであったが、近年、食品の流通機構の発展や、食品の保存方法・加工技術の進歩から、ふなずしのような伝統食品が受け継がれにくくなる傾向にある。そこで、本研究では、ふなずし熟成過程における一般成分の移動と消長について分析を行った。その結果、水分は魚肉・卵巣において徐々に減少した。タンパク質は魚肉においてわずかに減少したが、飯においてはわずかに増加した。灰分は魚肉と卵巣においては共に減少し、飯では増加する現象が見られ、特に塩漬けふなから1ケ月めの試料において、ふなから飯への移行が顕著に見られた。ほとんどのアミノ酸は熟成中に増加したが、グルタミン酸、アルギニンは熟成期間を通して著しく減少した。また、熟成に関与する微生物についても分析を行ったところ、魚肉中の細菌の生菌数は本漬け後、1ケ月で10^7オーダーまで大きく増加し、乳酸菌および嫌気性細菌はその後10^8

オーダーまで達し、好気性細菌は10^4まで減少した。米飯中の乳酸菌および嫌気性細菌の生菌数は本漬け後、10^8オーダーでありその後の増減の傾向は魚肉と類似していた。また、すべての期間において、米飯中の生菌数は魚肉中の生菌数よりも1オーダー高かった。熟成期間中に観察された微生物を同定したところ、乳酸菌はヘテロ発酵型のLactobacillus buchneriであることが明らかとなった。鮮度に関する分析としては、実験室にて、塩漬けふなを飯に漬け込み、1ヶ月ごとにサンプリングして、魚の鮮度指標である揮発性塩基窒素についてConwayの微量拡散法を用いて経時的に測定した。その結果、塩漬けふなでは19mg%、3ヶ月で39mg%となり、その後大きな変化は見られなかった。一般に揮発性塩基窒素が30mg%を超えると初期腐敗と見なされ、腐敗臭が感じられると言われているが、ふなずしの場合は、腐敗臭は感じられなかった。また、もう一つの指標としてK値の分析を行った。その結果、ふなずし熟成中において、本漬け後1ヶ月で魚の旨味成分の一つであるイノシン酸はほとんど分解していることが明らかとなった。次に、ふなずしの抗酸化性について検討を行った。ふなずしを凍結乾燥し、水とメタノールでそれぞれ抽出を行い、水溶性画分およびメタノール画分を調製し、各抽出画分について、DPPHラジカル消去能を指標とし、抗酸化性について測定した。その結果、いずれの画分にも抗酸化性は見られなかった。
環状ヌクレオチドによる血管平滑筋細胞Ca輸送系の作用調節機構の研究

ラット大動脈培養平滑筋細胞を用いて、その細胞膜Caポンプ活性に対する環状ヌクレオチド(cGMP、cANP)及びプロテインキナーゼC(PKC)の効果を調べた。我々は既に、外液にNa^+がない条件での細胞からの^<45>Ca排出が細胞膜Caポンプによることを明らかにした。そこで、細胞内cGMP濃度を上昇させる処理を行ない、外液にNa^+が存在しない条件下での細胞からの^<45>Ca排出と、同条件下での〔Ca^<2+>〕_1を測定してCaポンプ活性の〔Ca^<2+>〕_1依存性を調べた。細胞内cGMP濃度上昇作用をもつニトロプルシド(SNP)、心房性利尿ペプチド(ANP)或いはcGMPアナログの8Br-cGMPで平滑筋細胞を処理した場合は、いずれも未処理の細胞に比べて、細胞からの^<45>Ca排出活性が有意に上昇した。特に、〔Ca^<2+>〕_1の静止レベル近傍(-log〔Ca^<2+>〕_1__<_>7.0)での活性促進が著しく、Caポンプの〔Ca^<2+>〕_1に対する親和性が増大すると結論出来る。従って、細胞内cGMP濃度を上昇させる亜硝酸薬(SNP、ニトログリセリン等)やANPの血管拡張作用の1つのメカニズムとして、cGMPによる細胞膜Caポンプの活性化と〔Ca^<2+>〕_1の減少が考えられる。他方、細胞内cAMP濃度を上昇させる処理は、細胞膜Caポンプ活性に有意な変化を及ぼさなかった。従ってcAMP濃度上昇によって引き起こされる弛緩には細胞膜Caポンプは関与しないものと考えられる。次に、PKC活性化の細胞膜Caポンプ作用に及ぼす効果について調べた。細胞をPKCの活性化剤のPMAで処理すると未処理の細胞に比べてCaポンプ活性は有意に増大した。しかし、cGMPの場合と異なり、Caポンプ活性の最大値が増加しCa^<2+>に対する親和性は変化しなかった。一般に、Ca^<2+>動員刺激に際しては、同時に産生されるジアシルグリセロールによって、PKCの活性化がおこる。従って、PKCによるCaポンプの活性化は、刺激によって上昇した〔Ca^<2+>〕_1を速やかに元のレベルに戻すフィードバック調節機構としての役割をになうものと考えられる。
不妊治療後に流産を経験した女性のレジリエンス促進支援システム構築に関する研究

少子化対策が強化されている中、女性の就業増加、晩婚化等婚姻をめぐる変化に伴い、生殖補助医療を受ける女性は益々増加していくことが予測されている。本研究では、女性の健康支援として、性と生殖に関する健康と権利を守るひとつである不妊治療を受ける女性への支援に着目した。生殖補助医療の普及により、生殖補助医療による出生数は全出産の約1.8%にまで達している。しかし、生殖補助医療で妊娠が成立した女性の2025%は流産すると言われており、加齢とともに増加し40歳以上では3050%である。本研究の目的は、不妊治療後に流産を経験した女性が、流産という危機的状況から心理的に回復していく過程において、人が困難な状況に直面した時に、それにうまく適応するプロセスであるレジリエンスに着目し、心理的に回復し、立ち直るためのレジリエンスを促進させる看護支援システムを構築することである。レジリエンスを促進させる看護支援システムを構築することで、流産という危機的状況から、より早く立ち直ることが可能となる。本研究はこれまでの成果をもとに臨床応用へ発展させるものである。不妊治療後に流産を経験した女性は、入院期間の短さや死産と比べると悲嘆も少ないと認識されていることから、支援も少なく看護者の支援を受ける機会もない中、自らの喪失体験に向き合い、自身で適応し、回復していかなければならない現状である。ここに困難な状況から立ち直る力すなわちレジリエンスが存在することに着目し、看護支援システムを構築することは、女性のもつ力すなわちレジリエンスを促進する支援の観点からも重要であり、またその女性の人生にも重要なかかわりであると考える。従って、この視点からの研究結果の意義は大きいと考えられ、そこに本研究の独創性があり、研究の実施の意義があると考える。同僚の産休により、大学院および学部教育の代替業務が増え、研究にかかる時間が確保できなかった。11年目に計画していた、不妊治療後に流産を経験した女性への支援を実施した医師・助産師・看護師(10名)に対し、看護支援の実態および問題点などについてのインタビューを継続する。21のインタビュー内容を元にした看護支援の実態と問題点の明確化のための質問紙調査を実施する。そのために、研究にかかる時間を効率的に確保するよう努めたい。人権費については、研究の進捗が遅滞し資料やデータ整理に至らなかったため使用しなかった。次年度はインタビューおよび質問紙調査を実施するため、データ整理などに活用したい。謝金については、研究対象者が謝金を辞退することが多く使用しなかった。謝金支払い方法については、再検討したい。
夫婦関係と注意欠陥多動性障害児の破壊性行動障害との関連

本研究は注意欠如・多動症(以下、ADHD)児の不適応問題と夫婦の関係性を含む家族機能との関連を明らかにすることである。今回の研究では、母親を対象として、1現在を起点に過去の養育のこと、2どのような子どもの行動が親を困らせるか、3子どもの問題行動に直面した時のエピソード(その時母親が覚えた感情や対処方法等)、4育児を手伝ってくれる人がいるかなどの質問項目を準備して半構成的面接を行った。また、プレ調査の結果、ADHD児の親の特性として、親自身がADHD(発達障害)の特性を持っていることがあり、この場合、実行機能や自己制御に関連した養育面での困難さがあることが子どもの不適応行動や夫婦関係にも影響している可能性が考えられた。そこで親が持つADHDの特性に関しても把握していった。合計10名の母親に対してインタビューを実施することができた。面接内容を正確に逐語化し、夫婦関係や子どもの行動と関連した語りを抽出して切片化しコーディングした。次にコードの意味内容の類似性と相違性を検討し、類似するコードを複数集めて抽象度を上げたサブカテゴリー名を付け、サブカテゴリーについてのコードと同様の方法で分析を行い、抽象度を上げてカテゴリーとした。分析の結果、夫婦関係、父親側の要因、母親側の要因、養育環境のカテゴリーに分類できた。分析結果の妥当性確保のため、母子関係を専門とする研究補助者に対して申請者と独立してデータ分類を依頼した。ADHDは本来の病態像に加え、周囲へのひどい反抗や家庭内暴力、抑うつやひきこもりといった行動や情緒面に二次性の不適応問題を多くの場合に併せ持っている。一般人口を対象とした研究では、子どもの不適応問題の出現には、夫婦関係をはじめとする家族機能との関連が指摘されている。そこで本研究は、ADHD児の不適応問題と家族機能との関連を検討することを目的とする。平成27年度はまず、ADHD児の家族の特徴に関する先行研究、子どもの不適応問題に関する先行研究、家族機能に関する先行研究、ADHD児の行動特徴に関する先行研究を整理するとともに、家族機能と子どもの不適応問題(問題行動)を把握できる既存の質問紙を吟味した。その結果、家族機能と子どもの不適応問題を把握する既存の尺度のほとんどは、一般人口を対象として信頼性と妥当性が検討されているため、ADHD児やその親に適用することは、厳密には適切ではないと判断した。そこで、まずはADHD児の家族(父母)を対象として、親子関係、夫婦関係、子どもの行動特性に関するインタビュー調査を実施し、質的にADHD児の行動特徴や家族の状態を明らかにすることとした。インタビュー調査のためのインタビューガイドを作成し、現在は被験者を募っているところである。インタビュー調査から得たデータをもとに、ADHD児(家族)に関する特徴を加味した、ADHD児の家族に特化した家族機能の質問紙、ADHD児向けの行動特徴把握のための質問紙を作成する。申請書提出時の研究計画に従って、家族機能、子どもの不適応問題(問題行動)を探るためにすでに信頼性と妥当性が検討されている質問紙を使って調査をする予定であった。しかし、それらの質問紙はADHD児の母親に特化して作成されたものではないことを主な理由として、信頼性と妥当性の面で課題があると判断した。そこで、本研究用に質問紙を作成していくこととし、その準備としてまずはADHD児の家族に対して、インタビュー調査を実施することとしたため。本研究の目的は、注意欠如/多動性障害(以下、ADHD)児の不適応問題(問題行動)と夫婦関係をはじめとする家族機能との関連を明らかにすることである。ADHD児の症状は、子どもが乳児、幼児、学童へと成長・発達するにしたがって状況依存的に変化していくと言われている。そこで今回は、ADHDと診断を受けた子どもの家族である父母を対象として、ADHD児の成長にともなう行動上の特徴と家族機能、夫婦関係との関連について質的に明らかにするため、昨年度に作成したインタビューガイド(現在を起点に過去の養育のこと、どのような子どもの行動が親を困らせるか、問題行動に直面した時の気持ちとそれへの対処方法、育児を手伝ってくれる人がいるかなど)をもとに半構成的面接を行った。その結果、限られた対象者ではあるが、子どもの不適応問題(問題行動)と家族機能(夫婦関係)との関連を示す結果が得られた。さらに、子どもの不適応問題(問題行動)以外にも、父親が持つ特性や母親が持つ特性が、家族機能(夫婦関係)と関連していることを示唆する結果も得られた。インタビューへの協力者を依頼する際、父親への協力依頼は日程調整の面で困難であった。次年度の課題は、夫婦両者にインタビュー調査をすることである。今年度は第57回日本児童青年精神医学会総会に参加して、ADHD児と母親との関係性について発表するとともに、今後の調査に役立つ発達障害に関する最新の知見に関する情報収集を行った。当初の研究計画では、子どもの不適応問題(問題行動)と家族機能(夫婦関係)についての関連性を既存の質問紙を用いて明らかにする予定であった。しかしながら既に信頼性と妥当性が検討されている質問紙を再度吟味した結果、ADHD児に特化して作成されているものではないことから、信頼性と妥当性の面で課題があると判断した。そこで質問紙を作成するためにも、まずはインタビュー調査に取り組むこととしたために時間を要した。また、インタビュー調査への協力者依頼を行うことに時間を要した。

本研究は、注意欠如・多動症(以下、ADHD)児の不適応問題(特に破壊性行動障害)と夫婦の関係性を含む家族機能との関連を明らかにすることである。夫婦関係や家族機能、子どもの行動特徴の見方は、父親と母親とで認知の仕方が異なっていることが考えられるが、今回の研究では、まずは母親を対象として、母親からみた子どもの行動特性と夫婦関係・家族機能に関するデータを収集することとした。ADHDの症状は、子どもが乳児、幼児、学童へと成長・発達するにしたがって状況依存的に変化していき、多くの子どもの場合、集団行動が求められる小学校入学後に問題が多発するようになり、受診に至って診断を受ける場合が多い。そこで本研究の被験者は、1ADHDと診断された学童の母親、2診断を受けて1年程度経過している子どもの母親、3再婚等ではなく、両親がそろっている母親と設定した。これらの条件を前提として研究協力者である医師から被験者の紹介を受け、研究参加への同意を得てインタビュー調査を行った。データ収集の途中の段階でデータ分析した結果、ADHD児の親の特性として親自身がADHD(発達障害)の特性を持っていることがあり、この場合、特に親子関係、夫婦関係の難しさがあることが考えられた。そこで、ADHD(発達障害)の特性を持つ母親に関する先行研究をレビューし、児童精神医学、発達障害を専門とする研究者にも相談し、親が持つADHD(発達障害)の特性をどのような方法で明らかにし、その特性をどのように分析して結果に反映していくかの検討を行った。今後は、その示唆に沿ってデータを収集していく予定である。夫婦関係や家族機能、子どもの行動特徴の見方は、父親と母親とで認知の仕方が異なっていることが考えられる。当初の研究計画では「ADHD児をもつ父母」を被験者として設定していた。しかし、父親と母親の両者からデータ収集への協力を募ることは予想以上に困難で、被験者募集に時間を要した。そこで、今回の研究では、まずは母親を被験者として、母親から見た家族機能・夫婦関係に関するデータを収集することとした。その後、データ収集をし、いくつかの症例を分析した結果、ADHD児の親の特性として親自身がADHD(発達障害)の特性を持っていることがあり、この場合、特に親子関係、夫婦関係の難しさがあることが考えられた。親が持つADHD(発達障害)の特性をこの研究で明らかにして結果に反映すべきかどうかを含め、検討が必要になった。以上の理由で遅延が生じた。本研究は注意欠如・多動症(以下、ADHD)児の不適応問題と夫婦の関係性を含む家族機能との関連を明らかにすることである。今回の研究では、母親を対象として、1現在を起点に過去の養育のこと、2どのような子どもの行動が親を困らせるか、3子どもの問題行動に直面した時のエピソード(その時母親が覚えた感情や対処方法等)、4育児を手伝ってくれる人がいるかなどの質問項目を準備して半構成的面接を行った。また、プレ調査の結果、ADHD児の親の特性として、親自身がADHD(発達障害)の特性を持っていることがあり、この場合、実行機能や自己制御に関連した養育面での困難さがあることが子どもの不適応行動や夫婦関係にも影響している可能性が考えられた。そこで親が持つADHDの特性に関しても把握していった。合計10名の母親に対してインタビューを実施することができた。
リンパ球の選択的誘導を用いた犬炎症性腸疾患に対する新規治療法の開発

本研究はイヌの炎症性腸疾患に対し、ラパマイシン(シロリムス)を投与することにより、1.犬炎症性腸疾患におけるラパマイシンの新規治療薬としての有用性、2.犬炎症性腸疾患の病態におけるTregおよにTh17の関与、についての検討をおこなうことを目的とした。ConA刺激条件下で培養した犬末梢血リンパ球にラパマイシン、IL-2、TGFbをさまざまな組み合わせで添加したが、いずれの組み合わせもConA単独添加と比較してTregの割合および絶対数の大幅な増加を誘導することができなかった。ConA刺激以外の条件下における検討が必要なものと考えられた。本研究は犬の炎症性腸疾患に対しラパマイシン(シクロリムス)を投与することにより、(1)犬炎症性腸疾患におけるラパマイシンの新規治療薬としての有用性、(2)犬炎症性腸疾患の病態におけるTregおよびTh17の関与、についての検討を行うものである。本年度はラパマイシンを用いた犬リンパ球のin vitroにおけるTregの選択的誘導効果を検証した。○Tregの検出方法の検討○犬リンパ球のin vitroにおける選択的誘導犬PBMCをConA, IL-2,ラパマイシン存在下および非存在下で培養し、上述の検出方法によりTreg数の増減を検討した。Tregの割合はConA、IL-2、ラパマイシンいずれの存在下においても増加した。さらにConA, IL-2,ラパマイシンすべてを同時に作用させたところその作用は強まり、Tregの割合は大きく増加した。一方、ConA, IL-2,ラパマイシン存在下で培養を行うと死細胞も増加してしまうため、正確なTreg数を算出することができなかった。これまで使用していたFACSCaliburではCD4, CD25, FoxP3の3パラメーターの検出しか行えなかったが、さらに死細胞の検出を行うためには4パラメーターのフローサイトメトリーが必要であり、現在検討を行っている。本研究は犬の炎症性腸疾患に対し、ラパマイシン(シクロリムス)を投与することにより、1.犬炎症性腸疾患におけるラパマイシンの新規治療薬としての有用性、2.犬炎症性腸疾患の病態におけるTregおよびTh17の関与、についての検討を行うものである。本年度はin vitroにおける犬リンパ球の選択的Treg誘導効果を検証した。◯Treg検出方法の検討昨年度行ったフローサイトメトリーによるCD4, CD25, FOXP3の三重染色条件では、培養によって増加する死細胞の影響が大きく、Tregの正確な測定を行うことができなかった。本年度はレーザー数の多いフローサイトメーター(FACSVerse)を用いることにより、死細胞検出色素(FVD780)の併用が可能となった。◯犬リンパ球のin vitroにおける選択的Treg誘導犬PBMCをConA, IL-2,ラパマイシン存在下および非存在下で培養し、上述の検出方法によりTregの増減を検討した。まずConA存在下において犬リンパ球を培養したところ、ConA非存在下と比較してTregの割合は大きく増加し、さらに生存するTregの絶対数も増加していることが示された。しかし、ConAに加えてIL-2, TGFb,ラパマイシンを添加したところ、いずれの場合もConA単独添加と比較してTregの割合、絶対数ともに大幅な増加は認められず、Tregの選択的誘導は得られなかった。IL-2, TGFb,ラパマイシンの濃度を変化させてさまざまな条件下で検討してもこの傾向は同様であり、ConA刺激以外の条件における検討が必要なものと考えられた。死細胞の検出を行うための4パラメーターフローサイトメトリー解析が決定していないため、Treg数の測定を行うに至っていないが、ラパマイシンを含むいくつかの培養条件下においてTregの割合が増加することが示された。4パラメーター測定が可能なフローサイトメーターとしては現在使用するFACSCaliburに代わり、共通機器のFACSVerseを使用するものとする。獣医内科学今後はRT-PCRを用いたTh17の検出方法を確立し、ラパマイシンのTregおよびTh17に対する作用を合わせて検討することとする。また、さらに実験犬に対するラパマイシンの試験的投与を行うものとする。
リンパ管新生因子VEGF-Cとその受容体VEGF-R3の発現抑制による癌転移抑止

遠隔転移あるいはリンパ節転移した進行癌の治療はとても困難で、『転移』は癌による死亡の決定的要因である。腫瘍のリンパ管新生因子であるVEGF-Cとその受容体VEGF-R3に着目し、腫瘍内部において、これらの因子の発現・生合成を抑え込むRNAiシステムを構築。構築したRNAiを実際のヌードマウス癌転移モデルに応用し、in vivoレベルでの癌転移抑制を検討した。(1)ヒトVEGF-Cの発現を抑制するsiRNAを作成した。ヒトVEGF-C遺伝子のmRNAを解析し、効果が予測される10種のsiRNAを化学合成した。これらのsiRNAをVEGF-Cを高発現するヒト前立腺癌細胞(PC-3)に対して、リポフェクション法による導入を行い、VEGF-Cの発現を抑制するsiRNA塩基配列数種を決定した。蛋白レベルでの抑制効果をELISA法で、RNAレベルでの抑制効果をRT-PCR法で証明した。最もVEGF-C発現の抑制効果の高いsiRNAについてのELISA測定値は下記の如くであった。(VEGF-C siRNA,178±24pg/ml ; No treatment,4088±229pg/ml[n=4 dishes])。RNAiによって約96%のVEGF-Cを消去できた。(2)ヒトVEGF-R3の発現を抑制するsiRNAを作成した。ヒトVEGF-R3遺伝子のmRNAを解析し、RNAi効果が予測される14種のsiRNAを化学合成した。これらのSiRNAをVEGF-R3を高発現する癌細胞に導入し、有効siRNA塩基配列1種を決定した。蛋白レベルでの抑制効果をウエスタンブロット法およびELISA法で、RNAレベルでの抑制効果をRT-PCR法で検討した。
筋萎縮性側索硬化症におけるLIN28の細胞生存寄与に関する研究

はじめにヒト胚性幹細胞(ES細胞)由来運動神経細胞を用いた各種筋萎縮性側索硬化症(ALS)関連因子の導入実験系を確立した.成人ヒト脊髄組織において,仮説としていたLIN28の発現は認められなかったが,マグネトフェクション技術を応用した結果,ヒト運動神経細胞においてALS病態に関連の深いTDP-43の26k-Da C末アイソフォームおよび変異型TDP-43が直接的な細胞毒性作用を有することが証明された.筋萎縮性側索硬化症(ALS)は,意識を清明に保ったまま数年内に上位,下位運動神経細胞が変性死を引き起こす,世界的に見ても治療法の開発が一刻も早く期待されている疾患の一つである.今回,我々は過去のTDP-43ノックダウンに伴う網羅的解析の報告から, ALSにおいてlet-7bの上昇とそれに伴い制御されるLIN28の発現低下が起こっているとの仮説をまず始めに立てた.そして,ヒトの成熟した脊髄組織で,仮説に置いたLIN28の発現は認められなかったため,より重要性が高いと思われるTDP-43のヒト運動神経細胞への毒性を新たに検討する方針とした.これまでヒト正常運動神経細胞への各種病態因子の導入により細胞死が誘導されるか否か,についての検討はまだなされておらず,病因と示唆されてきたいくつかの候補因子が実際のヒト運動神経細胞にとってgain of toxic functionを呈するものであるかどうかは不明のままであった.今回,ヒトES細胞由来運動神経細胞への遺伝子導入に際し,至適遺伝子導入条件を検索し,マグネトフェクションを活用した至適条件下において, C末にV5タグを付加したTDP-43全長,35-kDa C末アイソフォーム, 26-kDa C末アイソフォーム,p.A315T変異体,p.A382T変異体を導入した.その結果, TDP-43 26k-Daアイソフォームおよびp.A315T, p.A382T変異体のいずれもがヒト運動神経細胞に対して直接的な細胞毒性作用を有することが証明された.また,ALS病態に関連した現象として知られているRNA編集異常を引き起こす系としてRNA編集酵素ADAR2のshRNAによるより効率的なノックダウン系を確立し,ADAR2活性の低下がTDP-43の26k-Da C末断片の生成には影響を及ぼさないことも証明した.はじめにヒト胚性幹細胞(ES細胞)由来運動神経細胞を用いた各種筋萎縮性側索硬化症(ALS)関連因子の導入実験系を確立した.成人ヒト脊髄組織において,仮説としていたLIN28の発現は認められなかったが,マグネトフェクション技術を応用した結果,ヒト運動神経細胞においてALS病態に関連の深いTDP-43の26k-Da C末アイソフォームおよび変異型TDP-43が直接的な細胞毒性作用を有することが証明された.我々の研究室では, in vitroで分化誘導した運動神経細胞を用いて,ALS病態機序による細胞死を再現し得るモデル作りを治療開発へ向けての最初のステップとして考え,その確立を目指してきた.一方もう一つの柱としてALSにおける疾患特異的,細胞選択的変化の検索についても進めてきた.そして今回,本助成を受けて我々は,ALSの細胞生存に関わる因子としてLin28を候補に挙げて研究を行った.まず初めに,in vitroにおけるLin28の発現系とノックダウンの系を確立した.そしてコントロール症例のヒト全脊髄抽出液を用いて免疫ブロットを行ったところ,LIN28がタンパク質レベルでほとんど発現していないことを確認した.従ってコントロール症例, ALS症例のLIN28タンパク質, lin28 mRNAの発現レベルの検討は,組織内における細胞レベルを対象としての免疫染色,in situ hybridizationで検討する方針で現在研究を進めている.また,各種TDP-43バリアント,変異型TDP-43の細胞毒性を検討するため,ヒトES細胞由来の運動神経細胞への各種ベクター導入条件の検討も試み,すでにこれを確定した.さらに細胞死のスクリーニングについても,我々の用いているES細胞由来運動神経細胞の系で適切にこれを評価できる方法を確立した.また,各種TDP-43バリアントフォームに関連する可能性のあるTDP-43ゲノムの特定領域をシークエンスした結果,single nucleotide polymorphism(SNP)が集中して高頻度に存在する可変性の高い領域の同定に至った.さらにALSにおいて重要なRNA編集酵素ADAR2のshRNAによるレンチウイルスおよびその構成ベクターを活用することにより,ES細胞由来の成熟運動神経細胞においてもADAR2のノックダウンが可能となった.現時点では,LIN28Aに関してはin vitroの系において発現,ノックダウンが可能な段階にある.成人(成熟)ヒト全脊髄組織においてはタンパク質レベルでのLIN28の検出は困難であったが,免疫染色,in situ hybridizationでヒト脊髄組織前角内の運動神経細胞での変化が同定できた場合,in vitroの運動神経細胞の系を活用することでLIN28の細胞死への寄与の検討がすぐに可能な段階にある.また,細胞死との関連が明らかになれば,TDP-43その他関連分子への影響もin vitroで検討することができる.一方で,仮にLIN28のALSにおける特異的変化が認められない場合においても,各種TDP-43バリアントおよび変異型TDP-43の導入による検討はin vitroでは他の細胞(HeLa細胞)を用いた時の実績がある上,すでにin vitroでの運動神経細胞への導入,その他の実験条件は確立済みである.現在行っている各種TDP-43,変異型TDP-43の運動神経細胞への影響の検討についてのデータの信頼性を増すことにより,少なくともそのgain of toxic functionへの寄与の有無を明らかにすることができる見通しが立っている.以上の研究の推進状況からおおむね順調に進展していると判断する.

1)ヒト脊髄成熟運動神経細胞でのLIN28のコントロール症例とALS症例の運動神経細胞での発現レベルおよび局在の変化の有無の検討をタンパク質,RNA両レベルにおいて行う.そのために,確実な染色評価に必要な適切なコントロールを選択し,免疫染色条件,in situ hybridization条件の確立をまず目指す方針である.2)各種TDP-43バリアント,変異型TDP-43の細胞毒性を検討する.3) ADAR2をノックダウンした系におけるLIN28, lin28 mRNAを含むALSの各種関連分子変化,細胞死寄与について検討を行う.4)ゲノムの過剰可変領域周辺のスプライシング等のRNAプロセシング変化を実際のコントロール症例とALS症例とを比較して検討する.ヒトES細胞由来の運動神経細胞のトランスフェクションに必要な試薬一式,細胞維持,遺伝子操作のために必要な試薬,RNAプローブ作成のための試薬,その他分子生物学的手法一般に用いる試薬および消耗品一式,国内,国際学会参加に要する費用,データの取得,解析,保存に必要な消耗品一式に使用する予定である.なお,論文の内容充実を図るため平成23年度の投稿は見送られたことから,平成23年度に使用が予定されていた英文校正,印刷費,論文別刷等の論文作成のための諸経費は,翌年度の同目的のために使用する予定である.また,効率的な物品調達を行った結果発生した平成23年度の未使用額も平成24年度の消耗品購入に充てる予定である.
引張ひずみに基づいた破壊規準に関する理論的研究

材料科学の分野で広く用いられている分子動力学法(数値解析法の一種で、経験的ポテンシャルに基づいて原子1つ1つについて運動方程式を解いていく方法)を用いて10^<-9>mオーダーの寸法を有する微小なCuとNaClについて引張・圧縮時の変形・破壊挙動を解析した結果、巨視的スケールの材料試験と同じように、ひずみ軟化挙動を含む非線形な荷重-変位線図が得られた。さらに、Cuについては以下の知見が得られた。(1)引張強温度が圧縮強度よりやや大きい、(2)引張試験時の大変形に伴いネッキングが観察される、(3)側圧による圧縮強度の増大が少ない、(4)圧縮試験における最大荷重点の偏差変位(せん断ひずみに対応する量)は側圧に依存しない。これらの特徴は巨視的な金属材料と一致する。一方、NaClについては以下の知見が得られた。(5)引張強度が圧縮強度より小さい、(6)側圧により圧縮強度が、あたかもCoulombの破壊規準に従うように、増加する、(7)最大荷重点の載荷軸方向変位(軸ひずみに対応する)は側圧と共に増加するが、横方向変位(横ひずみに対応する)は側圧に依存しない。これらの特徴は巨視的な岩質材料と一致する。もちろん、本研究で得られた結果がそのまま岩石に対して適用できるわけではないが、以上は、欠陥の無い極く微小な結晶でも巨視的材料にみられる特性を失っておらず、分子動力学法を岩石の変形・破壊のメカニズム解明に援用する価値があることを示唆している。クラックの導入により、さらに実際的な解析が可能になるものと期待される。SiO_2等の共有結合物質の解析は、当面の最も大きな課題として残された。先端的ないくつかの研究例を参考にして検討を続けていきたい。