hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
部分浴の方法・タイミングが睡眠に及ぼす影響の評価

外耳道温は、いずれも3条件間で有意差は認められなかった。終夜睡眠脳波の判定は2例しか実施できていないため有意差がでるかどうかは判らないが、就寝前の時間が短い方が睡眠をより促進するのではないかと推察される。本研究の目的は、42°Cの部分浴の方法・タイミングの差異が睡眠に及ぼす影響を評価することである。本年度は部分浴の方法の差異が睡眠に及ぼす影響、前腕浴のタイミングの差異が睡眠に及ぼす影響について日本睡眠学会第36回定期学術集会及び第31回日本看護科学学会学術集会で発表を行った。部分浴の方法の差異については、PSGでは前腕浴と下腿浴共にコントロールに比べてSWSが多く、特に第1サイクル、第2サイクルに多く見られた。主観的睡眠感では、眠気、気がかり、統合的睡眠感に3条件間で有意差が認められ、前腕浴と下腿浴共にコントロールに比べて高かった。鼓膜温度では、条件間で有意差が認められ、前腕浴が最も高かった。このことから、部分浴はSWSを促進させることが明らかになった。また、前腕浴のタイミングの差異については、PSGでは3条件下で差はなく、主観的睡眠感でも、眠気、気がかり、統合的睡眠感、睡眠維持、寝つきに3条件間で有意差はなかった。また外耳道温でも、いずれも3条件間で有意差は認められなかった。このことから、部分浴の1つである前腕浴のタイミングは、就寝30分前から就寝2時間前のいずれの時間帯に実施しても差はないことが明らかになった。2つの実験から、部分浴は深睡眠を促し、部分浴の1つである前腕浴では、就寝2時間前までに実施すれば睡眠を促進する効果があることが明らかになった。睡眠を促進させるものとして、臨床ではしばしば睡眠薬が用いられているが、現在使用されている睡眠薬のほとんどが、睡眠導入薬であり常用することで依存性をもつものも多い。しかしながら、本研究で実施した部分浴は、自然な睡眠を促進する効果、しかも睡眠の質を促進する効果があるため、その有用性は高いと考える。本研究は20代の健康な女性を対象としており、今後異なる年代での検討が必要である。
百日咳菌の自己凝集能に関する研究

本研究では百日咳菌(Bordetella pertussis)の自己凝集の原因および病原性について解析を行った。百日咳菌自己凝集株と自己凝集消失株の全ゲノム比較および百日咳菌臨床分離株におけるFim3イムノブロット解析により、百日咳菌の自己凝集はFim3の高産生により引き起こされることが明らかとなった。マウス鼻腔感染実験による病原性解析では、in vitroで自己凝集を引き起こすほどのFim3産生量であっても、in vivoでは肺接着に有利に働くことが示唆された。百日咳菌の臨床分離株には、自己凝集を示す菌株が存在することが古くから知られていたが、その明確な要因については明らかにされていなかった。本研究ではまず、強い自己凝集能を示す百日咳菌株を親株として、自己凝集能を欠失した自然変異株を得た。次に次世代シーケンサーを用いて両株の全ゲノム配列を比較解析したところ、type 3 fimbriae (fim3)およびrpoA遺伝子のプロモーター領域にそれぞれ1塩基変異が見出された。mRNA発現解析ではrpoA遺伝子上流の変異は遺伝子発現に影響を与えなかったが、fim3遺伝子上流の変異により、fim3遺伝子の発現が有意に低下した。また、イムノブロット解析により、自己凝集欠失株ではFim3産生が欠損していることが判明した。一方、近年の百日咳菌国内臨床分離株は9割以上がFim3産生株であるが、この中でも自己凝集株/非自己凝集株が存在する。臨床分離株についても抗Fim3抗体を用いたイムノブロット解析を行ったところ、自己凝集株では非自己凝集株よりもFim3の産生量が有意に高いことが判明した。また、百日咳菌の生育培地によりFim3産生量が異なることも明らかとなった。百日咳菌は通常、馬血液加Bordet-Gengou (BG)培地もしくは人工合成培地CSM培地により培養されるが、Fim3はCSM培養時の方が産生量が高く、自己凝集能を有する株でもBG培養した場合は5時間以内の自己凝集を示さなかった。これらのことから、百日咳菌の自己凝集は一定レベル以上のFim3産生が引き起こしていることが示唆された。次に、強い自己凝集能を有する臨床分離百日咳菌BP300株を元に、fim3遺伝子破壊およびfim3 and/or fim2遺伝子の相補実験を行った。この結果、やはりfim3遺伝子破壊により自己凝集能は失われ、fim3遺伝子の相補により自己凝集能の回復が認められた。次世代シーケンサーの利用により、自己凝集株および自己凝集消失変異株の全ゲノムを比較解析したことで、自己凝集を引き起こす遺伝的な要因について網羅的な解析が可能となった。その結果、type 3 fimbriae (Fim3)の産生が自己凝集の要因であることが特定された。またimmunoblotによるFim3産生量の推定から、自己凝集にはある一定レベル以上のFim3産生量が必要であることが明らかとなった。さらに、この知見が臨床分離百日咳菌に一般的に当てはまる条件であることが判明した。初年度は遺伝子レベルでの解析までを計画していたため、現在は当初の予定よりも進展している。本研究では、自己凝集株を親株とした自己凝集消失株の分離を行い、次世代シーケンサー解析により両株の全ゲノムを比較した。その結果、rpoA及びfim3遺伝子のプロモーター領域に変異が見つかった。イムノブロット解析を行ったところ、RpoAタンパク質は両株で同程度産生されていたのに対し、Fim3タンパク質は自己凝集消失株で産生が欠損していることが明らかとなった。近年の百日咳菌国内臨床分離株は9割以上がFim3産生株であるが、この中でも自己凝集株/非自己凝集株が存在する。したがって、百日咳菌の自己凝集を引き起こす要因がFim3産生、特に産生量が多い場合に引き起こされることが明らかとなった。ところで、百日咳菌自己凝集株BP300SmrをCSM培地にて30°C培養(通常培養温度36°Cよりやや低温)すると、顕著に生育の早いコロニーが出現した。BP300Smrは36°C培養ではFim3のみを産生するが、30°C培養で生育の早いコロニーではFim2のみを産生しているものが見出された。一般的にヒト鼻腔は咽頭よりもやや温度が低いことから、百日咳菌は生育温度によりFim2/3の産生スイッチを行い、より効率よく宿主に定着する性質を持つことが示唆された。

初年度の研究が当初の計画以上に進展したため、百日咳菌の自己凝集についてin vitroの知見は概ね得ることができた。そのため、今年度は培養温度とFimbriae産生の関係について新たに検討を行い、次の動物実験に進むにあたり予備的な知見を得ることができた。百日咳は主に百日咳菌(Bordetella pertussis)によって引き起こされる急性呼吸器感染症である。ワクチンの導入により百日咳患者数は激減したが、近年ではワクチン接種率の高い先進諸国でも大規模な百日咳流行が繰り返し発生している。世界で流行している百日咳菌株は、この20年間で急速な遺伝子変異の進行が認められており、百日咳菌の病原性変化や百日咳再興との関連が指摘されている。百日咳菌のうち、in vitroで自己凝集を示す菌株が存在することは以前より知られていたが、その原因および病原性への影響は明らかになっていなかった。本研究事業では、これまでに1)近年の百日咳菌臨床分離株は34割が自己凝集能を有すること、2)百日咳菌の自己凝集は線毛Fim3により引き起こされること、3)Fim3産生百日咳菌のうちFim3を高産生する菌株でのみ自己凝集が認められることを確認した。平成29年度は、自己凝集能およびFim3の高産生が百日咳菌の病原性に与える影響をマウスin vivo接着実験により評価した。本実験ではマウスに百日咳菌を経鼻感染させたのち、肺胞洗浄を行って洗浄液中に回収された菌量および肺組織に残存する菌量を比較解析した。その結果、自己凝集株はFim3低産生株、Fim3非産生株に比べて肺胞洗浄液中に遊離してくる菌量が有意に少なく、肺組織への接着率が高いことが判明した。以上の結果から、百日咳菌のin vitro自己凝集はFim3の高産生によって引き起こされることが明らかとなったが、in vivoではFim3の高産生が菌体の肺内接着に有利に働くことが示唆された。本研究では百日咳菌(Bordetella pertussis)の自己凝集の原因および病原性について解析を行った。百日咳菌自己凝集株と自己凝集消失株の全ゲノム比較および百日咳菌臨床分離株におけるFim3イムノブロット解析により、百日咳菌の自己凝集はFim3の高産生により引き起こされることが明らかとなった。マウス鼻腔感染実験による病原性解析では、in vitroで自己凝集を引き起こすほどのFim3産生量であっても、in vivoでは肺接着に有利に働くことが示唆された。百日咳菌の自己凝集が、病原性に与える影響について検討する。マウス鼻腔感染実験を実施し、自己凝集株のマウス肺内への定着率、菌クリアランス速度を非自己凝集株と比較する。また、現行百日せきワクチン接種の影響も検討したい。動物実験を行うにあたり、自己凝集株では感染菌数の把握がCFU測定では困難であることが予測されるため、リアルタイムPCRを用いた測定系を構築する。マウス経鼻感染モデルを用いて高度凝集株、中程度凝集株、非凝集株を感染させ、気管肺胞洗浄(BAL)を実施する。洗浄液(BALF)中および肺ホモジネート液中に存在する生菌数をカウントし、自己凝集の程度(Fim3産生量)とin vivo接着能の関係を調べる。細菌学年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出学に計上予定。平成27年度分についてはほぼ使用済みである。平成28年度は約6ヶ月間、出産のため研究を中断した期間があった。
絶縁膜直接成長と表面その場観察によるSi上(In)GaAs MOSFETの作製

III-V族化合物半導体の高電子移動度を用いた高速・低消費電力電界効果トランジスタを実現するための基礎検討として,チャネル材料であるInPに着目して,酸化膜形成前の基板表面パッシベーションによる半導体/絶縁膜界面の準位低減を目指して研究を行った.有機金属気相成長によりInPを成長した後に,反応器から基板を取り出さずに行える表面パッシベーション処理として,H2Sによる表面S終端を考案し,その効果を実証した.H2Sにより300°CにてS終端したInP(001)表面を,大気暴露後にXPSにより観察した結果,InおよびPの酸化物がまったく検出されず,S終端が表面パッシベーションとして有効に機能することが実証された.さらに,表面のフォトルミネッセンスを測定した結果,S終端により蛍光強度が増大しており,S終端がInP表面の欠陥を終端して表面準位を低減することが示唆された.このような表面終端の化学的メカニズムをXPSスペクトルから解析したところ,表面近傍のInとSが結合を形成しており,表面からのP脱離により形成されたInのダングリングボンドが,S終端により効果的に終端されるものと考えられた.本結果は,InPを電子チャネル層に用いたMOSFETの結晶層形成プロセスに応用可能なプロセスの改善策を提案するものである.MOSFETのスケーリングによる性能向上には限界が見えてきた現在,化合物半導体チャネルをシリコン基板に導入し,高い電子移動度を活かした高速nチャネルMOSFETの開発が期待されている.本研究では,生産性に優れた有機金属気相成長(MOVPE)により,(1)シリコンウエハ上の高品位化合物半導体結晶層のエピタキシャル成長,(2)化合物半導体結晶層上へのゲート絶縁膜の直接成長,に関して基礎的検討を行うことを目的とする.今年度は,化合物結晶層とゲート絶縁膜の間に界面層を形成しないように,同一反応炉の中で,化合物半導体層の上に直接ゲート絶縁膜を成長するプロセスを検討した,III-V半導体の例としてInP基板を用い,まずゲート絶縁膜形成時にInP表面が酸化されないようにMOVPEリアクタ内でin situパッシベーションを行う手法を開発した.InP成長後に2分間H2Sを供給することで,表面をS終端できることがわかった.このS終端層がInP表面の酸化を抑止する効果を検証するため,S終端後に大気解放したサンプル,さらに酸素アニールを行ったサンプルの表面をXPSで観察した,その結果,酸素アニールを行っても表面のInおよびPは酸化されず,S終端層の表面酸化抑止効果は大きいことが判明した.一方,MOVPE反応器内の酸化膜堆積に関しては,S終端処理後にMOVPE装置内で(CH3)3Alのみを通常のフラックスの1/10で供給して成長を終了し,サンプルを取り出したところ,表面のAlは完全に酸化されてAlOxとなっていることがXPS観察の結果確認された.この極薄AlOx層は,ゲートスタックの絶縁膜の一部として利用できると考えている.III-V族化合物半導体の高電子移動度を用いた高速・低消費電力電界効果トランジスタを実現するための基礎検討として,III-V半導体表面に形成する絶縁膜の新規製膜法を検討した。従来広く用いられている(CH3)3Al(tromethy-aluminum; TMA)を用いたGaAs上のAl2O3のALD(原子層堆積法)に代わって,新規原料である(CH3)2AlH(dimethy-aluminum-hydride; DMAH)を用い,酸素を酸化剤とした連続製膜法(CVD)によりAl2O3を形成した.TMAに比べて酸化が容易なDMAHを用いることにより,有機金属と酸素の同時供給のみで有機金属の酸化が十分に進行し,高品位なAl2O3を得られることがXPS測定により示された.また、TMAを用いた製膜について報告されていたGaAs表面自然酸化膜のセルフクリーニング効果が,DMAHの利用によりより効率的に起こることが確認された。XPSによりセルフクリーニングの過程を詳細に検討したところ,高次のAs酸化物が選択的に除去されることがわかった.一方、Gaの酸化物はDMAHによっても除去することが難しく、HClによるウェットエッチングをAl2O3の製膜前に行うことで,界面にGaやAsの酸化物が存在しないAl2O3/GaAsスタック構造を実現できることが示された.本成果は,GaAsを電子チャネル層とするMOSトランジスタ作製に応用可能な,新規プロセスを提案するものである.III-V族化合物半導体の高電子移動度を用いた高速・低消費電力電界効果トランジスタを実現するための基礎検討として,チャネル材料であるInPに着目して,酸化膜形成前の基板表面パッシベーションによる半導体/絶縁膜界面の準位低減を目指して研究を行った.有機金属気相成長によりInPを成長した後に,反応器から基板を取り出さずに行える表面パッシベーション処理として,H2Sによる表面S終端を考案し,その効果を実証した.H2Sにより300°CにてS終端したInP(001)表面を,大気暴露後にXPSにより観察した結果,InおよびPの酸化物がまったく検出されず,S終端が表面パッシベーションとして有効に機能することが実証された.さらに,表面のフォトルミネッセンスを測定した結果,S終端により蛍光強度が増大しており,S終端がInP表面の欠陥を終端して表面準位を低減することが示唆された.

このような表面終端の化学的メカニズムをXPSスペクトルから解析したところ,表面近傍のInとSが結合を形成しており,表面からのP脱離により形成されたInのダングリングボンドが,S終端により効果的に終端されるものと考えられた.本結果は,InPを電子チャネル層に用いたMOSFETの結晶層形成プロセスに応用可能なプロセスの改善策を提案するものである.
惑星探査機搭載用中間赤外線分光撮像装置の基礎開発

検討途上にある水星探査機及び金星探査機への搭載を念頭に置いた、中間赤外線分光撮像装置の検討を行った。水星探査用の当初案は、10μm/30μmの熱測光と7-14μmの低波長分解能分光を含むものであったが、搭載機器重量制限から分光部搭載は断念している。しかし、将来利用を企図し本研究は当初構成に従い遂行した。1999年度の実績は以下の通りである。(1)中間赤外装置の光学設計:昨年行った全反射光学系の設計を基礎とした撮像/分光光学系を構築した。また、金星探査の必要に応じ、狭帯域広視野撮像を目的とした屈折光学系の設計を行った。(2)検出器の評価:1次元焦電アレイとサーモパイル単素子の性能検証を行い、予定する性能を出すための設計要素を確立した。これにより一部光学系の設計を見直すとともに、熱輻射や迷光の影響を抑制する冷却・バッフル・光変調の必要諸元をまとめた。(3)近赤外線による金星地上観測:岡山天体物理観測所において、近赤外線による金星の分光撮像を実施し、金星下層大気の情報を得られることを確認した。これは中間赤外観測によって得られる上層大気情報と相補的な位置を占めるもので、現在解析を継続中である。今後、以下の作業を継続して行う予定である。(1)2次元アレイの検討:検討してきた検出器では高時間分解能との両立は困難である。幸い二次元アレイ素子の入手目処が立ち、近日中に性能検証を行う。(2)校正法の検討:軽量校正手段の検討を早急に行う。(3)地球・月表面の遠隔テスト観測:上記検討終了後、地球及び月表面の熱測光・分光による性能検証を行いたい。(参考:笠羽康正、今村剛、高橋幸弘、坂野井健、「金星探査と"UV-VIS-IR分光撮像器"の技術検討」、電気関連学会北陸支部大会、富山大、1999年10月.)2005年打上予定で検討進行中の水星探査機搭載を念頭に置いた、中間赤外線分光撮像装置の検討を開始した。当初案は、10μm/30μmの熱測光と7-14μmの低波長分解能分光を含むものである。最近、搭載機器重量制限から分光部搭載は断念したが、将来利用を企図し本研究は当初構成に従い遂行した。1998年度の実績は以下の通りである。(1)水星探査機搭載用の基本設計:カメラ及び光近赤外装置と一体での分光撮像装置の基本設計、特に重量、電力、データ量、部品要素等の検討を行った。(2)中間赤外装置の光学設計:アラインメント負荷軽減のため全反射光学系を基礎とし光学設計を行った。特に、内部熱輻射・迷光の影響軽減、測光部を500gに収めることを目標とした重量軽減を念頭に置いた。部品選定作業に依存する部分が多く、依然仕様は流動的である。(3)部品選定:心臓部たる検出器の選定と評価を行った。海外で実績のある2次元ボロメータアレイの導入を検討したが予算上断念、HgCdTe素子の弱冷却試験も行ったが感度不足にてこれも断念した。幸い、1次元焦電アレイ、焦電及びサーモパイル単素子を選定できた。また、光学系設計と平行し他部品の選定も行い、光学部品、支持部材、電子部品等を購入した。1999年度には、以下の作業を行う予定である。(1)分光撮像系の構築:テスト系を構築し、検出器評価、熱輻射・迷光評価、重量軽減等の検討を開始する。gratingを購入し分光系のテストも行いたい。また、軽量の校正法の検討を行いたい。(2)地球・月表面の遠隔テスト観測:上記検討の終了後、地球及び月表面の熱測光・分光を行いたい。(参考:笠羽康正、岡田敏美、本田理恵、飯島祐一、横田俊昭、水星探査機搭載用可視/近赤外/中間赤外分光撮像器'の開発、電気関連学会北陸支部大会、福井工業大、1998年10月.)検討途上にある水星探査機及び金星探査機への搭載を念頭に置いた、中間赤外線分光撮像装置の検討を行った。

これは中間赤外観測によって得られる上層大気情報と相補的な位置を占めるもので、現在解析を継続中である。今後、以下の作業を継続して行う予定である。(1)2次元アレイの検討:検討してきた検出器では高時間分解能との両立は困難である。幸い二次元アレイ素子の入手目処が立ち、近日中に性能検証を行う。(2)校正法の検討:軽量校正手段の検討を早急に行う。(3)地球・月表面の遠隔テスト観測:上記検討終了後、地球及び月表面の熱測光・分光による性能検証を行いたい。(参考:笠羽康正、今村剛、高橋幸弘、坂野井健、「金星探査と"UV-VIS-IR分光撮像器"の技術検討」、電気関連学会北陸支部大会、富山大、1999年10月.)
自由対流圏のガスおよび大気エアロゾルの化学成分に関する観測的研究

自由対流圏は大気重量の70%を占め、大気境界層に比べて、低温、低湿で風速が大きく、長距離輸送など大気の物質循環にとって重要な場である。しかしながら、観測手法が主として飛行機観測であるため、化学成分に関する連続的な情報は少ない。富士山は孤立峰であることや、山頂の高さに比べて体積が小さいことなどから、夏を除いてほとんどの期間、山頂は自由対流圏にあると考えられ、そこで降水やエアロゾルの化学成分、ブラックカーボン、COS、ラドン濃度などの項目について観測を行った。今年度は特に、2002年で欠けていた初夏のデータを取るために、今年度は5月26から6月13日にかけて集中観測を行なった。方法は前年度と同じであり、得られたデータの量も多い。全体を比較すると山頂の降水は太郎坊の降水に比べて化学成分濃度が低く、pHが高く、きれいな降水であることがわかる。細かく見ると、6月4日から5日の降水は、山頂ではNa^+,Cl^-イオン濃度が高くpHも高く、海洋性の気塊の影響を強く受けていることが示唆される。一方、太郎坊の降水に含まれるこれらのイオン濃度は平均的な値を示しており、海洋性の気塊の影響は山頂の降水に限られたと思われる。気象要素と合わせて検討を続ける必要がある。COS濃度は山頂と太郎坊の濃度変化は同調しているように見え、つねに山頂の方が高濃度を示した。富士山頂のエアロゾルに含まれるBCの発生源を同定するために、父島で採取され、BC濃度の分かっている試料について、炭素同位体比の測定を行ったところ、BC濃度と同位体比の間に明確な関係が得られた。これまでに得られている観測結果だけからも、自由対流圏の連続観測プラットフォームとしての富士山頂の利用が有用であることがわかったが、今後、航空機観測や離島観測などのデータと比較検討することで、この地点の重要性がますます明らかになることと考えられた。自由対流圏の観測プラットフォームとして高所山岳を利用しようという考えが近年注目されている。富士山は孤立峰であることや、山頂の高さに比べて体積が小さいことなどから、夏を除いてほとんどの期間、山頂は自由対流圏にあると考えられている。降水やエアロゾルの化学成分、ブラックカーボン、COS、ラドン濃度などの観測項目について、夏の終わりから初秋のデータを取るため、9月11日24日に集中観測を行なった。降水、霧水、エアロゾルの水溶性化学成分に関しては、試料を冷蔵し、下山後、東京農工大学の実験室に持ち帰って、イオンクロマトグラフィーにより主要化学成分濃度の測定を行った。テトラドバッグに3連で採取した試料大気のCOS濃度は濃縮カラムとガスクロマトグラフィーで測定した。得られたデータの量も多く、解析の結果が期待される。一例として、硫酸イオンとアンモニウムイオン濃度はよい相関を示した。富士山頂のような高所におけるCOSの測定値は報告されていないが、必ずしも低濃度でなかった。
複素環補酵素プテリンを用いた生体内酸化活性種の模倣と酸化触媒への展開

前年度見出した、[RuII(dmdmp)(TPA)]2+ (1)や[RuII(dmdmp)Cl(MeBPA)]+(2)の、PCETを介したC-H結合の酸化能について更なる検討を行った。錯体2の一電子酸化体(2OX)は、塩基性(pKa)が1の酸化体(1OX)よりも高く、電子受容能(酸化還元電位、E1/2)は逆に低いという性質を有する酸化剤となった。PCET酸化反応においてはプロトンと電子がともに動くことになるので、これら二つの受容能、プロトン受容能と電子受容能がどのように反応性や反応機構に影響してくるのかは興味が持たれる。そこで、錯体1OXと2OXの間で反応性を比較することで、そのような、酸化剤の性質とPCET酸化反応性との関係性について詳細に考察することを目指した。有機基質を大過剰量、錯体1OXあるいは2OXへ加えると、プロトン化されたルテニウム二価-プテリン錯体(1-Hあるいは2-H)の出現に由来する速やかな吸収変化が観測され、1OXや2OXが酸化剤としてプロトンと電子を1つずつ受けとることが確かめられた。また、これらの基質の水素の引き抜かれにくさを示す、結合解離エネルギー(BDE)の値を横軸に、反応速度定数の対数値を縦軸にプロットすると、1OXや2OXのそれぞれにおいて直線性が得られた。しかし、これらの直線の傾きαは、錯体1OXで-0.27、錯体2OXで-0.44と異なった。このαは、反応の遷移状態が始状態と終状態のどちらに近いのかを表すとされる。すなわち、αの比較的小さな錯体1OXにおいては、基質のC-H結合から引き抜かれるプロトンが比較的基質上に存在したままの遷移状態を経るのに対し、αの比較的大きな錯体2OXの反応においては、引き抜かれるプロトンが大いに錯体のdmdmpへ引き寄せられ、つまり強い分極を起こした遷移状態を経ることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、中心金属にRu(II)あるいはRh(III)を用い、補助配位子にトリス(2-ピリジル)メトキシメタン(TPMOM)、あるいはビス(2-ピリジルメチル)メチルアミン(MeBPA)を用いて、四種類のN,N-ジメチル-6,7-ジメチルプテリン(Hdmdmp)錯体を合成し、詳細なキャラクタリゼーションを行った。いずれの錯体も、残りの一座にはクロリド配位子を有している。本研究では、目的のパーオキソ架橋錯体を得るために、まず錯体上のプテリンを還元し、その後超酸化物塩を反応させることを計画している。そのために、まず本年度は、各錯体の一電子還元挙動の可逆性を調べた。その結果、[RuII(dmdmp)Cl(TPMOM)]のジプロトン化体、[RuIICl(H2dmdmp)(TPMOM)]2+においてのみ、第一還元過程の可逆性が見出された。一方、[RuIII(dmdmp)Cl(MeBPA)]+(1)や、先行研究で用いられた[RuIII(dmdmp)(TPA)]2+ (2)を酸化剤として、炭化水素のC-H結合の酸化反応が可能であることを見出した。これらの錯体は、塩基性(pKa)や酸化還元電位(E1/2)は異なったが、それらの値から計算される結合解離エネルギー(BDE)はほぼ等しい値を示した。そこで、これらの錯体間で反応性を比較することで、従来BDEの値に支配されると言われているC-H酸化反応において、実際にはどのようなパラメータが反応性に影響してくるのかを調べた。その結果、反応速度は基質のC-H結合のBDEに依存して変化し、錯体1よりも塩基性の高い錯体2による酸化反応において、C-H結合がより分極した遷移状態を経由することがわかった。さらに、E1/2が高い錯体1では、基質の酸化電位によって、反応機構が水素移動律速から電子移動律速へと切り替わることを見いだした。

また、これらの基質の水素の引き抜かれにくさを示す、結合解離エネルギー(BDE)の値を横軸に、反応速度定数の対数値を縦軸にプロットすると、1OXや2OXのそれぞれにおいて直線性が得られた。しかし、これらの直線の傾きαは、錯体1OXで-0.27、錯体2OXで-0.44と異なった。このαは、反応の遷移状態が始状態と終状態のどちらに近いのかを表すとされる。すなわち、αの比較的小さな錯体1OXにおいては、基質のC-H結合から引き抜かれるプロトンが比較的基質上に存在したままの遷移状態を経るのに対し、αの比較的大きな錯体2OXの反応においては、引き抜かれるプロトンが大いに錯体のdmdmpへ引き寄せられ、つまり強い分極を起こした遷移状態を経ることが示唆された。ルテニウム(II)もしくはロジウム(III)を中心金属とした各種プテリン錯体を合成し、その性質を詳細に調べることで、目的に対して有望な錯体を用意することができた。また、ルテニウム(III)-プテリン錯体によるC-H酸化が可能であることを見出し、錯体の性質によってC-H酸化反応の遷移状態が変化すること、基質の酸化電位によって反応機構が変化することを見いだした。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず、前年度に見出した、可逆な1電子還元挙動を見せる錯体、[RuIICl(H2dmdmp)(TPMOM)]2+を用いて、目的のパーオキソ架橋構造の形成を目指す。これを用いても目的を達成できなかった場合、金属中心をルテニウムから変更するなどの方法で、新しいプテリン錯体を合成し、それを用いて目的のパーオキソ錯体の合成を行う計画である。また、C-H酸化における研究においては、アミンに対するN-H酸化を試み、さらに多くの情報を両錯体間の酸化反応性の比較から汲み出すことを計画している。
歯の喪失が学習・記憶能力に及ぼす影響に関する組織学的、免疫組織化学的検討

目的:我々は,臼歯喪失が学習・記憶能力に与える影響について検討するために,老化促進モデルマウスP8(以下SAMP8と略す)を用いて,海馬の形態学的検討を行った。その結果,臼歯を喪失させたSAMP8は臼歯を喪失させていないSAMP8と比較して,海馬CA3領域の錐体細胞数が有意に減少していることが明らかとなった。そこで今回は有意な減少を示した5ヵ月齢において,学習・記憶機能に関係が深いと言われている神経伝達物質であるアセチルコリンの合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(以下ChATと略す)について,免疫組織化学的検討を行った。方法:群の構成としては,2ヵ月齢で上顎臼歯をすべて抜歯し,5ヵ月齢まで飼育したものを実験群,一方,2ヵ月齢で抜歯せず,麻酔処置のみ行い,5ヵ月齢まで飼育したものを対照群とした。5ヵ月齢になった時点で灌流固定し,脳を摘出後,抗ChAT抗体による免疫組織化学染色により対角帯核のChAT陽性細胞の変化を検討した。結果:5ヵ月齢時において臼歯喪失による対角帯核のChAT陽性細胞の有意な変化は認められなかった目的:臼歯喪失期間の違いが,学習・記憶の中枢と言われる海馬に及ぼす影響を明らかするために,老化促進モデルマウスP8//Ymi(以下SAMP8と略す)を用いて,海馬の形態学的検討を行った。方法:実験動物として2ヶ月齢のSAMP8,30匹を使用した。処置動物は,2ヶ月齢で上顎両側全臼歯を抜歯し,3ヶ月齢(若齢期),5ヶ月齢(中年期),8ヶ月齢(老齢期)まで飼育した3群とした。これに対し,無処置動物として2ヶ月齢で抜歯を行わず,3,5,8ヶ月齢まで飼育した3群を設定した。SAMP8が観察月齢に達したところで,脳組織切片を作製し,通法に従いNiss1染色を行い,海馬CA3領域の錐体細胞の形態学的観察を行った。結果:臼歯喪失を伴う処置動物と臼歯喪失を伴わない無処置動物を比較すると,中年期において海馬CA3領域の錐体細胞数ならびに細胞面積の減少が認められたが,若齢期,老齢期において差は認められなかった。また加齢によって処置動物,無処置動物ともに,海馬CA3領域の単位面積当たりの錐体細胞数ならびに細胞面積の減少が認められたが,処置動物では中年期に,無処置動物では老齢期に減少した。結論:臼歯喪失を伴うSAMP8は,臼歯喪失を伴わないものと比較して,早期に海馬CA3領域の錐体細胞数ならびに細胞面積の減少が認められたことから,臼歯喪失は加齢に伴う海馬の形態学的変化を促進させる可能性が示唆された。結果:5ヵ月齢時において臼歯喪失による対角帯核のChAT陽性細胞の有意な変化は認められなかった
破砕・拡散混合により瞬時・大量に改良された微粒珪砂キラの地盤材料への有効利用

(1)微粒珪砂キラ,石灰改良土の力学特性把握と弾塑性モデルによる記述キラに対し粉砕・石灰混合・締固めた試料について力学試験を行い,SYSカムクレイモデルにより力学挙動を再現し,骨格構造の概念に基づく解釈をし,以下に結論を得た.(1)キラは中詰め砂の挙動に類似している.過圧密解消と構造劣化の速度が同程度である.(2)キラ改良土は未改良に比べて構造が高位化し,構造の劣化が遅く,過圧密の解消も遅くなる.養生日数が増加により,構造の高位化が進行し,過圧密比も増大する.(2)PS灰改良土の力学挙動の把握と弾塑性モデルによる記述混合率18%,27%,36%(PS18,PS27,PS36)のPS灰改良土の物性,力学特性を調べ,力学挙動をSYSカムクレイモデルの応答によって再現し,以下に結論を得た.(1)PS灰改良土(PS27)は,締固め曲線での最適含水比を示し,一軸圧縮強度quも286kPa,養生3週間になると495kPaとなり,高品質な材料に転化する.(2)PS27は他のPS灰混合率の改良土に比べ,圧縮性は低い.また圧力水頭100cmに対し体積含水率は0.35程度を保持する保水特性を示す.(3)PS27へのセメント添加(7.5%)により,養生2週間のquが991kPaとなり,圧縮性はPS27よりも低減する.(4)PS灰改良土は石灰改良土と同様の改良効果である.(3)保水性を有する高透水舗装・路盤材の創出に関する研究集合体を構成する粒の強度を上げるため,骨材を混入し,粒の保水性を高めるため骨材の周りにキラ,セメント,PS灰の混合材を付着させ,PS灰の混合率を3種類設定した.(1)一軸圧縮試験結果から,PS27よりも高い強度を示した.ピーク強度における軸ひずみはどの供試体も1%程度で,脆性的な破壊が観察された.保水性についても,100cmの圧力水頭でも砂よりも高い保水性を有する.(1)微粒珪砂キラ,石灰改良土の力学特性把握と弾塑性モデルによる記述キラに対し粉砕・石灰混合・締固めた試料について力学試験を行い,SYSカムクレイモデルにより力学挙動を再現し,骨格構造の概念に基づく解釈をし,以下に結論を得た.(1)キラは中詰め砂の挙動に類似している.過圧密解消と構造劣化の速度が同程度である.(2)キラ改良土は未改良に比べて構造が高位化し,構造の劣化が遅く,過圧密の解消も遅くなる.養生日数が増加により,構造の高位化が進行し,過圧密比も増大する.(2)PS灰改良土の力学挙動の把握と弾塑性モデルによる記述混合率18%,27%,36%(PS18,PS27,PS36)のPS灰改良土の物性,力学特性を調べ,力学挙動をSYSカムクレイモデルの応答によって再現し,以下に結論を得た.(1)PS灰改良土(PS27)は,締固め曲線での最適含水比を示し,一軸圧縮強度quも286kPa,養生3週間になると495kPaとなり,高品質な材料に転化する.(2)PS27は他のPS灰混合率の改良土に比べ,圧縮性は低い.また圧力水頭100cmに対し体積含水率は0.35程度を保持する保水特性を示す.(3)PS27へのセメント添加(7.5%)により,養生2週間のquが991kPaとなり,圧縮性はPS27よりも低減する.(4)PS灰改良土は石灰改良土と同様の改良効果である.(3)保水性を有する高透水舗装・路盤材の創出に関する研究集合体を構成する粒の強度を上げるため,骨材を混入し,粒の保水性を高めるため骨材の周りにキラ,セメント,PS灰の混合材を付着させ,PS灰の混合率を3種類設定した.(1)一軸圧縮試験結果から,PS27よりも高い強度を示した.ピーク強度における軸ひずみはどの供試体も1%程度で,脆性的な破壊が観察された.保水性についても,100cmの圧力水頭でも砂よりも高い保水性を有する.(1)微粒珪砂キラ,及び石灰混合による改良土の力学特性把握と弾塑性モデルによる記述珪砂等の精製時に副産物として産出されるシルト質砂キラは,現在その大半を利用できず,珪砂採掘場の跡地に埋立て処分される.このキラを地盤材料として有効利用することを目的とし,粉砕および石灰混合によりキラを団粒化し,締固めた試料について力学試験を行い,特に養生日数が力学挙動に及ぼす影響を調べた.さらに土の骨格構造の働き(構造・過圧密・異方性)を記述するSYSカムクレイモデルにより力学挙動を再現し,骨格構造の概念に基づく解釈をした.その結果,(1)未改良のスラリー状のキラは,中詰め砂の挙動に類似していること,せん断に伴う過圧密解消と構造劣化の速度が同程度であることがわかった.(2)改良されたシルトは未改良に比べて構造が高位化し,また構造の劣化が遅く,過圧密の解消も遅くなること,さらに養生日数が増えることにより,間隙比は変化しなくても構造の高位化が進行し,それに伴い過圧密比も増大することがわかった.

(2)PS灰により改良された微粒珪砂キラの力学挙動の把握窯業副産物としてのシルト質砂キラを地盤材料として有効利用するために,粉砕およびPS灰(ペーパースラッジ灰,古紙のリサイクル工程で発生する残滓を焼却した燃え殻や煤塵)・セメント混合によりキラを団粒化し,締固めた試料について各種室内試験を行い,特に仮置き期間,養生期間が力学挙動に及ぼす影響を調べた.その結果,(1)PS灰のみでも改良効果はあるが,PS灰とセメント混合物を固化材とする改良土の強度の方が大きくなり,養生期間によって強度が上昇することがわかった.(2)さらに土の骨格構造の働き(構造・過圧密・異方性)を記述するSYSカムクレイモデルにより力学挙動を再現し,骨格構造の概念に基づく解釈をしたところ,改良土は過圧密比が増大し,セメントを入れることにより,限界状態定数が上昇することがわかった.(1)PS灰により改良されたキラの力学挙動の把握と弾塑性モデルによる記述昨年度より継続して,窯業副産物キラを地盤材料として有効利用するために,破砕・混合・締固めにより得られたPS灰改良土,特にPS灰混合率としてキラ乾燥密度に対し18%,27%,36%(PS18, PS27, PS36)の改良土の物性,力学特性を調べた.さらに,力学試験結果を,土の骨格構造の働きを記述できる弾塑性モデル(SYSカムクレイモデル)の応答によって再現し,PS灰によるキラの改良原理を骨格構造概念に基づいて考察した.以下に結論を示す.(1)PS灰改良土(PS27)は,締固め曲線での最適含水比woptを示し,一軸圧縮強度も286kPaで脱水ケーキキラの11倍以上,養生3週間になると495kPaで約20倍となり,高品質な材料に転化する.(2)PS27は他のPS灰混合率の改良土に比べ,圧縮性は低い.(3)PS27は保水能力を維持し,圧力水頭100cmにおける体積含水率は0.35程度を保持している.(4)PS27へのセメント添加(7.5%)により,養生2週間の一軸圧縮強度が991kPaとなり,圧縮性はPS27よりも低減する.(5)PS灰改良土はキラに比べ構造が高位化し,過圧密が増加し,また構造劣化しにくく,過圧密解消しにくい材料に転化する.(2)キラの団粒化を用いた保水性を有する高透水舗装・路盤材の創出に関する研究キラの保水性,PS灰の固化作用と保水性を生かし,保水能力をもつ粒集合体の作製を試みた.集合体を構成する粒の強度を上げるため,骨材を混入し,粒の保水性を高めるため骨材の周りにキラ,セメント,PS灰の混合材を付着させ,PS灰の混合率を3種類設定した.(1)一軸圧縮試験結果から,PS27よりも高い強度を示した.ピーク強度における軸ひずみはどの供試体も1%程度で,脆性的な破壊が観察された.(2)セメント代替材としてその半分をPS灰に置き換えた材料においても,一軸圧縮強度は2.7MPaを示し,保水性についても,100cmの圧力水頭でも砂よりも高い保水性を有する.
多重構造巨大リポソームの人工細胞壁による安定化に関する研究

1.水溶性部分疎水化キトサンの合成とキャラクタリゼーションに関する成果平成11年度の成果に基づき、高分子主鎖にアミノ基を有するカチオン性多糖類(キトサン)を用いてアルキル修飾法による部分疎水化を行い、100単糖あたり約25個のアルキル鎖を有する部分疎水化キトサンを得た。本来キトサンの水溶性は乏しく被覆実験は困難であったが、グリコシド結合の部分加水分解によりキトサンオリゴマーとすることにより溶解性を改善することに成功した。また、得られた部分疎水化キトサンオリゴマーは水溶液中のイオン強度やpHに依存して自己集合化することを見出し、環境に応答して被覆・非被覆をコントロールできることが明らかとなった。2.巨大ベシクルの部分疎水化キトサンオリゴマーによる被覆に関する成果疎水化多糖類として、部分疎水化キトサンオリゴマー(AHC)を採用した。これを蛍光プローブ修飾したFITC-AHCとして蛍光顕微鏡観察に供した。AHCの疎水部と巨大ベシクル膜の疎水性部との間の会合により巨大ベシクルの外表面が被覆されることを確認し、その膜安定性の差を検証した。FITC-AHC被覆巨大ベシクル膜は非被覆の場合に比べて著しい安定化を示し、非被覆巨大ベシクルが約9.2時間で崩壊するのに比べて室温で50時間以上の観察においても被覆ベシクルの崩壊は見られなかった。キトサンオリゴマーがベシクル膜への結合により高分子主鎖の方向が揃った形で集合することが促されたため、被覆膜中のキトサンオリゴマーが溶液中よりも強く結合してベシクル膜の安定化につながったものと考えられる。pHの低下によりアミノ基の正荷電間反発の程度を強めることにより、その崩壊が誘発される傾向にあることは、ベシクルの安定化がキトサンオリゴマーの分子集合化に起因することを示すものである。3.多重構造巨大リポソームの形成に関する成果1.巨大ベシクルの調製に関する成果溶媒蒸発法など、従来から知られている複数の巨大ベシクル調整方法に関してベシクル形成の制御の良否など、本研究の進展に関して必要な点に関して比較・検討した。このうち最近報告された交流電場を利用した方法(Wick et al.,Chemistry & Biology,3,105(1996))を再現することに成功し,更に交流電場の周波数を変化させて巨大ベシクル形成の過程を追跡する実験系を構築した。また、Lee and Menger法(F.M.Menger et al.,Langmuir,11,3685(1995))により形成させた巨大ベシクルの大量調製に成功した。2.巨大ベシクルの疎水化多糖類による被覆に関する成果。疎水化多糖類として、プルランを疎水性のコレステリル基によって部分的に修飾して疎水化したCHPを採用した(K.Akiyoshi et al.,Macromolecules,26,3062(1993))。これを蛍光プローブ修飾したFITC-CHP(E.-C.Kang et al.,J.Bioactive and Compatible Polym.,12,14(1997))を用いて共焦点顕微鏡観察に供した。CHPの疎水部と巨大ベシクル膜の疎水性部との間の会合により巨大ベシクルの内外表面が被覆されることを確認し、界面活性剤(SDS)または膜消化酵素(ホスホリパーゼ)による膜安定性の差を検証した。被覆巨大ベシクル膜はこれらの刺激に対して大きな安定化効果は示さなかったが、高分子であるホスホリパーゼの効果が顕著に抑制されなかったことから、この疎水化多糖類による被覆は固定的なものではなく、結合と解離を繰り返す平衡的結合であることが示唆された。更に、共焦点顕微鏡観察により巨大ベシクル膜断面付近における被覆層の厚さ分布からこの被覆過程が単純なLangmuir型の単一層の吸着ではなく、何重にも重なったBET型等温吸着モデルに従うことがわかった。このBET型等温吸着モデルを仮定することで、各吸着層の平均厚さと積層数が決定され、特に平均厚さは単独の疎水化多糖類が形成する微粒子として知られる大きさとほぼ同程度であることがわかった。

FITC-AHC被覆巨大ベシクル膜は非被覆の場合に比べて著しい安定化を示し、非被覆巨大ベシクルが約9.2時間で崩壊するのに比べて室温で50時間以上の観察においても被覆ベシクルの崩壊は見られなかった。キトサンオリゴマーがベシクル膜への結合により高分子主鎖の方向が揃った形で集合することが促されたため、被覆膜中のキトサンオリゴマーが溶液中よりも強く結合してベシクル膜の安定化につながったものと考えられる。pHの低下によりアミノ基の正荷電間反発の程度を強めることにより、その崩壊が誘発される傾向にあることは、ベシクルの安定化がキトサンオリゴマーの分子集合化に起因することを示すものである。3.多重構造巨大リポソームの形成に関する成果
配位孤立空間を活用した分子の性質・構造変化

電子ドナー性芳香族分子(D)と電子アクセプター性分子(A)は通常交互に積層する(D-A-D-A-...)ため、両者を非対称に配列させることは困難である。本研究では、電子アクセプター性の自己集合性かご型錯体を用いることで、内部にD-Aペアを選択的に包接し、芳香族非対称4重集積体A-D-A-Aを定量的に構築することに成功した。芳香族分子を非対称に配列することで、内部に包接されたゲスト分子の動的挙動を観測することができた。本研究は、自己組織化により形成される錯体空間を活用して、分子の性質・構造を変化させることにより、配位孤立空間の新たな化学を展開することを目的とした。以下、各項目の研究において得られた成果を記載する。(1)自己組織化空間における芳香環の電荷移動集積アクセプター性配位子1、ピラー状配位子2、シス位を保護したパラジウム錯体3(2:3:6の比率)を過剰のピレン(4)存在下、水中で混合することで、ピレンの2重集積体6⊃(4)_2が構築する。今回、ゲストとして、ドナー性の4とアクセプター性のナフタレンジイミド5を用いることで、4と5のヘテロ集積体6⊃(4・5)を構築した。このとき、4と5の対は、アクセプター性配位子1に挟み込まれる形で包接されている。このように、芳香族分子のスタッキングを非対称な配列にすることに成功した。実際に、UV-visスペクトルにおいて、6⊃(4・5)は6⊃(4)_2と異なるCT遷移の吸収を示した。さらに、ヘテロ分子間に働く相互作用を利用して、一度集積したゲストの差し替えを行った。6⊃(4)_2の水溶液に過剰の5を加えて室温で撹件すると、1分子の4が5に差し替わった。(2)自己組織化空間内での分子フォールディング有機ピラー型かご状錯体6を、芳香族分子を導入したひも状ゲスト分子で、非共有結合的に連結することを試みた。まず、片側にピレンを導入したひも状分子7の包接挙動を調べた。7の側鎖が長くなるにつれ、ゲストの回転運動が制御され、錯体6が非対称化した。次に両末端にピレンを導入したひも状分子8を錯体1に包接させた。H^^1 NMRスペクトル上で、6⊃8のピレン部位に由来するピークは、大きく高磁場シフトするグループAと、小さく高磁場シフトするグループBに分かれた。これより8は、錯体6のパネル部位を挟み込んだフォールディング構造を形成していると考えられる。芳香族分子を有限集積し、スタッキングする順番を自在に制御することで、新たな機能の発現を期待できる。電子ドナー性分子(D)と電子アクセプター性分子(A)の間に働く電荷移動(CT)相互作用を駆動力とする自己組織化は、異なる芳香族分子からなる集積体の構築手法として有力である。しかし、自己組織化は熱力学的に最安定な構造を与えるため、DとAがスタッキングする順番は、一般的にD-A-D-A-...のような交互配列になる。一方、自己組織化かご状錯体1は、内部に2つのドナー2(ピレン、ペリレン、トリフェニレン)を集積し、芳香環4重集積体1・(2)_2を構築する。錯体1の上下はアクセプター3(2,4,6-トリス(4-ピリジル)-1,3,5-トリアジン)で構成されるため、集積体1・(2)_2は対称配列A-D-D-Aを与える。そこで本研究では、ナフタレンジイミドを第2のアクセプター4として用いることで、非対称配列A-D-A-Aを有する4重集積体1・(2・4)を構築した。集積体の対称性を崩すことで、集積した芳香族分子の交換挙動を初めて観測した。配列A(3)-D(2)-A(4)-A(3)を有する集積体1・(2・4)の^1H NMRスペクトルから、配列の中心のゲスト分子2,4が互いの位置を速く交換していることがわかった。温度上昇に伴い、集積体1・(2・4)の上下で2つに分裂したシグナルは近づき、最終的に1つに融合した。これは、2つのゲスト分子がNMRのタイムスケールよりも速く交換し、集積体1・(2・4)の上下の区別がなくなったことによる。^1HNMRスペクトルを線形解析することで、交換の速度と活性化ギブズ自由エネルギーを算出し、ドナー2はピレン<ペリレン<トリフェニレンの順番で安定に集積されることがわかった。錯体1内の2つのゲスト分子は連結されてもなお、交換挙動が存在した。
酵素による炭素環合成法構築の可能性:アミノ配糖体アグリコンの環形成酵素の精製

1)ネオマイシン生産放線菌であるStreptomyces fradiae無細胞抽出液からの酵素の精製に関しては、イオン交換やNAD類似構造をもつ色素をリガンドとした各種クロマトグラフィー等を検討しているが、ポリアクリルアミド電気泳動上で単一のバンドをあたえるような精製状態にはまだ至っていない。また、本酵素はこれまで用いてきた条件下では基質の変換率が悪いため精製後の活性の検出が難しく、酸化やプロテアーゼの作用などのためか不安定でもあり、安定化と変換率の向上を図るべく、検討を繰り返している。2)これまでのStreptomyces fradiaeより得られた部分精製酵素を用いた実験で、基質グルコース-6ーリン酸の4位で酸化還元反応が起こることを示唆する結果を得ており、一方NADの要求性があることよりこれは補酵素として基質4位の酸化還元に触媒的に作用していると考えられた。この4位水素が基質-NAD-生成物へと移動してゆく過程を追跡するために、酸素同位体と重水素の二重標識基質を用い、生成物を解析した。これまであまり良い方法の無かった単糖への部位特異的酸素同位体導入を含む二重標識化合物の合成法を開発し、〔4-^2,3-^<18>O〕グルコースの合成を行った。これをこれまで得られている部分精製酵素系に加えインキュベーションし、生成物を誘導体化後、質量分析した。その結果、重水素と酸素同位体の標識はそのまま生成物に取り込まれ、この水素の移動が分子内反応であることを確認することができた。また同位体効果に由来すると思われる現象を観察した(この結果については投稿準備中)。これらは本反応がNADの触媒的作用により基質を酸化還元する単一酵素により行われていることを強く示唆する。今後酵素精製を続け、本酵素の構造と性質を調べ、NADと基質の関係を定量的に解釈し、また実際に糖よりサイクリトールへの変換系を導けるものであるかを検討するとともに、遺伝子側からのアプローチ(突然変異株、薬剤耐性)から、注目している酵素とその周辺の生合成系酵素や、それらの発現機構を検討すべく準備を行っている。
Invitro骨破壊モデルにおける滑膜細胞増殖と破骨細胞への分化メカニズムの解明

関節リウマチ(RA)の骨破壊に破骨細胞が深く関与していることが明らかになっている。本研究では,すでに確立したRA滑膜組織を用いたin vitro骨破壊モデルを用いて,滑膜マクロファージが増殖し破骨細胞に分化する過程に関わる分子を同定し治療法を開発することを目的に検討を行った。RA滑膜組織培養ではOA滑膜組織に比べて有意に破骨細胞の形成が多く骨吸収活性も高かったことから,RA滑膜組織では,滑膜マクロファージを増殖させ破骨細胞へ分化誘導する因子が過剰に産生されている可能性が示唆された。そこで,滑膜組織培養上清中に産生されるサイトカインや成長因子を検討した。RA滑膜組織ではIL1,TNFα,IL-6といった炎症性サイトカインの産生が多く,またマクロファージの分化因子であるMCSFや血管新生誘導因子であるVEGFの産生も有意に多かった。破骨細胞誘導に関与するサイトカインや成長因子の特異的インヒビターのin vitro骨吸収系に対する効果を検討した。Osteoprotegerin(OPG)は破骨細胞および骨吸収窩の形成を抑制したことから,RANKL/RANKを介するシグナルがin vitro骨破壊モデルでは作用していることが示唆された。RANKL/RANK系シグナルを抑制するOPG,モノクローナル抗体は蛋白製剤であり,臨床応用には副作用,コストの点で問題もあることから,RANKのRANKL結合部位のアミノ酸配列探索によりRANKに結合しRANKLの作用を阻害するペプチドを作製した。同ペプチドはOPGに比べて生理活性は弱いものの,マウス骨髄培養系において破骨細胞形成を抑制した。RA滑膜組織培養系にでも同様の破骨細胞形成抑制作用を示した。マクロファージファージの分化調節因子で破骨細胞の分化に必須であるMCSFを阻害するMCSFR-Fc融合蛋白は骨吸収を減少させなかったが、VEGFR-Fc融合蛋白は用量依存的に破骨細胞および骨吸収窩の形成を減少させた。RA滑膜炎組織の病理学的な特徴の一つは新生血管の増生であり,また血管新生と骨破壊の程度が相関するとの報告もみられることからVEGF抑制が骨破壊を抑制したことは興味深い成績である。以上の成績は,滑膜組織からの破骨細胞形成にはRANKL-dependent pathwayとTNF等を介するRANKL-independent pathway,血管新生促進因子が複雑に関与している可能性を示唆する。さらに,本研究ではRANKL/RANK経路の抑制,VEGF阻害,TNF等の炎症性サイトカイン抑制がRAの骨破壊の予防治療戦略になることが明らかになり,RANK部分ペプチドも治療薬となる可能性が示唆された。今後,関節炎モデルなどを用いてin vivoでの効果を検討する予定である。慢性関節リウマチ(RA)では慢性増殖性滑膜炎により骨・軟骨破壊が起こり高度の関節変形を来す。すでに滑膜組織培養によるin vitro

骨破壊モデルを確立し,RA骨破壊に滑膜組織のマクロファージ様細胞(CD68^+, CD9^+)から増値・分化する破骨細胞様細胞が重要な役割を果たしていることを明らかにした。本培養系では前駆細胞である滑膜マクロファージが滑膜繊維芽細胞やTリンパ球とともに増殖し,単核前破骨細胞,多核破骨細胞に分化し,弾力な骨吸収活性を示す。破骨細胞の分化,活性化にはRANKL (receptor activator of NFκB ligand)とRANKL非依存系の2つのシグナルの関与が示されており,後者で明らかなのはTNFα,IL-1による破骨細胞の分化,活性化である。今年度,滑膜組織培養における破骨細胞形成の分子メカニズムを明らかにするため,まずRANK/RANKL系,TNFの阻害をin vitro modelで検討した。OPG融合蛋白やsRANK-Fc融合蛋白は破骨細胞の形成やハイドロキシアパタイト上の骨吸収窩の形成を約40%抑制した。骨髄細胞や末梢血単球培養にM-CSF, RANKL加え破骨細胞を誘導する系ではOPGはほぼ100%抑制するのと比べると,異なったシグナルの存在が示唆された。また,TNFαの活性阻害の目的で,TNFαR-I or II-IgG-Fc融合蛋白の効果を検討すると,臨床で有効性が示されているTNFR-IIFc融合蛋白で破骨細胞や骨吸収窩形成が有意に抑制された。破骨細胞形成には,前駆細胞の増殖やコミットメント因子としてMCSFが必須である。最近,VEGFもMCSFと同様の作用が報告されている。滑膜細胞培養系では培養上清中にMCSF, VEGFが産生,分泌されていることを確認できた。また,培養中に存在するCD68^+,CD9^+陽性細胞はVEGFRを発現しており,VEGFR融合蛋白でVEGF作用を阻害すると破骨細胞形成が抑制された。以上より、RA滑膜組織を用いたin vitro骨破壊モデルではRANKL系にくわえTNFやVEGFも重要な役割を果たしていることが明らかとなった。一方,予備的成績ではRANKペプチドはラット骨髄細胞とTNFαによる破骨細胞誘導系で抑制作用を示し,今後さらに滑膜培養系でも検討する予定である。関節リウマチ(RA)の骨破壊に硬骨細胞が深く関与していることが明らかになっている。本研究では,すでに確立したRA滑膜組織を用いたin vitro骨破壊モデルを用いて,滑膜マクロファージが増殖し硬骨細胞に分化する過程に関わる分子を同定し治療法を開発することを目的に検討を行った。初年度において,RA滑膜組織ではIL1,TNFα,IL-6といった炎症性サイトカインの産生が多く,またマクロファージの分化因子であるMCSFや血管新生誘導因子であるVEGFの産生も有意に多いことが明らかになった。また,RANKL/RANK系シグナルをosteoprotegerinで抑制すると破骨細胞,骨吸収窩形成が減少したことからRANKLとRANKの結合を阻害するペプチドを作製した。RANKのRANKL結合部位に相当するアミノ酸配列を持つ部分ペプチドを合成し破骨細胞形成に及ぼす効果を検討した。