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災害サイクル別障害者用健康ニード査定の国際基準の開発

目的は、災害サイクルに応じて障害者の健康ニード査定ができるアジア基準の構築であった。東日本大震災を経験した肢体不自由者と2013年四川・芦山地震の被災による肢体不自由者を対象に3例の事例研究を行った。面接は、被災状況、健康状態等の基本情報と、WHOの国際生活機能分類(ICF)に従った。結果、1)障害を得た時期により、ニード内容と時期は異なる、2)発災前からの障害者は、災害後1カ月以内と半年前後にニードが見られる、3)追加項目として、情報入手、平常時の備蓄や公共サービスの整備、が明らかとなった。研究協力者を得るのが困難だったが、事例から、ICFは査定基準になりえ、また追加必要な基準も示唆された。研究目的は、障害者の災害サイクルに応じた健康ニード査定のためのアジア基準の構築であった。今年は事例研究による災害サイクル時期毎の障害者健康ニード査定基準の構築を目指した。文献による項目抽出と国際生活機能分類(ICF)から、被災状況、健康状態、コミュニケーションや移動、自立的生活を送るニーズ、医療ニーズ等の半構成的質問項目を用いた。研究協力者は、過去に災害を経験した肢体不自由者とし、被災障害者支援団体を通して研究参加を呼び掛け、3名の協力を得た。東日本大震災を経験した日本人2名は、災害急性期において、排泄や食事あるいは体調管理に関するセルフケアレベルの低下や必要な物の入手困難がみられた。また支援者の不在やライフラインの不通は、外出自体や避難所への移動を難しくしていたが、発災数日中に親族や支援者により、家での生活や被災地外への避難が可能となった。避難所でも家でも、支援者や周囲への遠慮から、支援要請を言い出せない状況もみられた。ICFに含まれない項目として、災害急性期に情報入手の困難さがあり、危険な状態で過ごす、状況把握ができない等が見られた。災害後長期の時点では、災害への備えに関する公共サービス整備ニーズ(安否確認、避難支援、備蓄等)が述べられた。日本人に加え、中国四川大震災を経験した中国人1名は、地震により脊髄損傷を受け、ボランティアにより病院に搬送され、現在も入院中の事例である。入院当初、家族と話したいと希望し、心理カウンセラーと話すことができ助かったと述べた。災害後の長期には、友人との交流に制限があることから交流のニーズや、退院後の仕事獲得へのニーズ、また自立した生活を送りたいというニーズが述べられた。両国において研究協力者を得ることに困難はあったが、事例から見ると、急性期はICFの生活と活動は査定基準となり、さらに情報入手手段等を新たな基準として追加する必要がある。本研究は、障害のある人々の災害サイクルに応じた健康ニード査定のためのアジア基準の構築を目的としている。今年度は、2011年3月に発生した東日本大震災の被災障害者に関する論文や報告から、健康や生活に関するニーズの抽出と、国際生活機能分類(ICF)に基づきニーズの分類を行った。その結果、健康や生活に関するニーズには、一般被災者と同様のニーズと、要援護者・障害者特有のニーズの二つに大別することができた。一般被災者と同様のニーズとして、ICFコードにおける「物品とサービスの入手」、「その他特定のレクリエーションとレジャー」が多く見られた。具体的には、食料品、水、ガソリン不足による物品獲得のニーズ、軽い運動や仲間と行う活動実施のニーズであった。障害者特有のニーズには、ICFコードにおける「公共の建物内の設備の利用を容易にする設計・建設用の生産品と用具/公共の建物の出入りに関連する設計・建設用の生産品と用具」、「同居者との非公式な関係」、「健康の維持増進」が見られた。具体的には、避難所がバリアフリーではないこと、避難所での人間関係に難しさが生じ、避難所に居にくくなること、薬不足、体調不良、医療チームの往診の必要性などであった。これ以外にも様々なニーズが挙げられるが、大半がICFコードにより分類することができたことから、ICFコードを基盤にニード査定の基準を構築できるのではないかという指針を得た。その一方で、情報が入らないことや避難所に行けない様々な現状などICFコードでは分類できない項目も抽出できた。これらは災害時特有な状況と思われるが、詳細が不明なことから、今後調査により基準に精錬していく必要性が示唆された。東日本大震災で被災された障害者の方々の体験や報告等の資料を入手し、情報の分析から基準構築にICFコードが利用できるのではないかという示唆を得ている。また、インタビュー調査を行う際の半構成的質問紙に追加することが望ましい項目内容についての示唆も得ている。面接調査のための研究倫理審査委員会の承認もすでに受けている。

加えて、上記の東日本大震災で被災された障害者の方々の体験や報告から、調査協力を依頼する団体のリストアップも行えており、今年度の面接調査の準備が整っている。5月中旬には、リストアップしている調査協力を依頼する団体に電話で研究の説明を行い、依頼書の送付を行う。依頼書の送付等は、アルバイトを雇用することにより、随時行っていく。調査協力を得られた団体からなるべく多くの調査協力者の紹介をしてもらうことにより、依頼のための時間やインタビュー調査実施のための移動時間などの短縮を行う。さらに、アジアで災害看護に関する研究や実践を行っている面識のある者に、メールでインタビュー方法等を送付し、インタビューを実施してもらう。ICFは世界各国共通であるため、インタビュー内容をICFコードで分類してもらい、その結果を日本の調査結果と統合することに、分析時間の短縮を図る。さらに、TV会議等を行うことにより、渡航する必要がなく、双方の都合の良い時間に会議が行えること、進捗状況の確認ができること、により研究を推進していく。物品費に関しては、調査に必要な文具やUSBフラッシュメモリ等、また最新の知見を知るための本や文献の購入を予定している。旅費においては、インタビュー調査のため、東北被災県への旅費を計上している。また、9月にタイで行われるAPEDNN会議に出席し、参加者との情報交換を予定している。さらに翌2月にフィリピンで行われるEAFONS学会では、国内の調査結果の発表を行う計画である。人件費・謝金はアルバイトの雇用と、質問紙翻訳料を計上している。その他においては、質問紙や謝礼品の郵送、TV会議回線使用料を計上している。
Li濃度オペランド定量分析法の開発に向けた電池電極反応機構の解明

本研究において、リチウムイオン電池正極材料LiFePO4にコンプトン散乱法を適用し、本物質の酸化還元軌道はFe 3d軌道であること、ならびにリチウムイオンの挿入・脱離でFe-O八面体構造が歪み電位シフトが起こることを明らかにするとともに、LiFePO4のFe元素をCo元素またはNi元素で置き換えることで、歪みが低減され高電位正極材料となり得ることを示した。その他にも、コイン型リチウムイオン実電池にコンプトン散乱法を適用し、充放電に寄与するリチウム組成変化を正極と負極同時に非破壊で明らかにした。これまでの我々の行っているLixMn2O4正極材料の研究において、Mn2O4母材にLiが挿入されることでMn3d軌道が非局在化することを示唆する結果が得られていた。そこで、平成27年度はMn3d軌道の非局在化を実験的に検証するために、Li組成の異なるLixMn2O4 (x=0, 0.7, 1.233, 1.5, 1.7, 2.0)の磁気コンプトンプロファイル測定を行った。得られた磁気コンプトンプロファイルは、Li量に依存して異なる形状を示した。磁気コンプトンプロファイルからスピン磁気モーメントを算出した結果、Li量x<1の範囲ではLi量の増加とともにスピン磁気モーメントが増加することが分かった。この傾向は、強磁性状態を仮定した第一原理バンド計算から得られたスピン磁気モーメントのLi量依存性の結果と一致するが、実験から得られたスピン磁気モーメントの絶対値は、第一原理計算のから得られたスピン磁気モーメントの値に比べ一桁程小さかった。一方、x>1の範囲ではLi量の増加とともにスピン磁気モーメントが減少する結果が得られた。X線回折の結果から、X=1を境に構造が異なることが分かり、X>1の領域におけるスピン磁気モーメントの減少は、この構造転移が影響していることが示唆されるが、詳細な原因の究明には、第一原理計算を用いた理論計算との比較が必要であると考えている。また、平成27年度は、LiCoO2正極材料の電子構造について密度汎関数法を用いた計算を行った。その結果、リチウム挿入に伴う酸化還元軌道には、酸素2p軌道が寄与していることが分かった。更なる解析についても現在進めている。平成27年度は、計画通りLixMn2O4(x=0, 0.7, 1.233, 1.5, 1.7,2.0)の磁気コンプトンプロファイル測定を行った。得られたコンプトンプロファイルは、Li組成に依存して、その形状が変化するものの、コンプトンプロファイルから算出したスピン磁気モーメントは、SQUIDで測定した磁気モーメントに対して一桁ほど小さな値なったため、理論計算などとの比較から、より詳細に解析を進める必要があることが分かった。本年度、コンプトン散乱実験をLixFePO4に適用し、コンプトンプロファイルの測定を行なった。LixFePO4は、結晶構造の安定性や熱安定性に優れており、高速充放電可能な正極材料としてすでに実用化されている材料である。これまで、X線吸収分光法やX線発光分光法により、その電極メカニズムには、鉄3d軌道が関与することが報告されている。我々は、化学的にLi組成を変化させたLixFePO4(x=0, 1)のコンプトンプロファイル(電子運動量密度分布)を測定し、その差分コンプトンプロファイル(LiFePO4のコンプトンプロファイルからFePO4のコンプトンプロファイルを引いたもの)を第一原理計算から得られた理論コンプトンプロファイルとの比較を行なった。理論コンプトンプロファイルでは、鉄3d軌道の原子モデル、LixFePO4のFeO6八面体を歪ませないモデル、及び、FeO6八面体を歪ませたモデルを仮定した。その結果、FeO6八面体を歪ませたモデルにより実験結果を再現でき、リチウム挿入により結晶構造が歪むこと、本試料の電極反応にはFe3d軌道が寄与することがわかった。また、差分コンプトンプロファイルから得られる運動エネルギーとDFT+U計算法によるハーバード・パラメータUとの間に線形関係が成り立つこと、さらに、このパラメータUがLiFePO4とFePO4の全エネルギーから計算される電池電圧に比例することを見出した。このことから、本手法が最適な電池容量を予測するための手法として利用できることが示唆される。本年度は、計画通りLixFePO4のコンプトン散乱実験を行い、本試料のリチウム挿入・脱離に伴う酸化・還元軌道には鉄3d軌道が関与することがわかった。また、運動量密度分布の変化から見積もられる運動エネルギーと系の電池電圧との間に線形関係が成り立つことを見出した。本研究により得られた成果を現在論文にまとめており、概ね順調に研究が進展していると考えている。本年度は、以下を行なった。(1)昨年度から継続して解析を進めていたコンプトン散乱法によるLixFePO4正極の電極反応メカニズムについて、論文発表を行ない、本研究課題の目的の一つであるLixFePO4正極材料のLi挿入に寄与する磁気特性の解明を果たした。(2)市販のコイン型リチウムイオン電池を充放電させながら、コンプトン散乱X線エネルギースペクトルの測定を行なった。得られたエネルギースペクトルに、昨年度、我々が開発したSパラメータ解析法を適用することで、リチウムイオン濃度分布を得た。得られたリチウムイオン濃度分布から充放電に伴う電極の体積膨張・収縮によりセパレータ位置が変化することを観測した。また、充電時にセパレータと負極との界面付近にリチウムの偏析を示唆するリチウムイオン濃度の高い部分を観測した。

さらに、充放電に正極と負極に寄与するリチウム量を定量するため、Sパラメータとリチウム量に関する検量線を用いてSパラメータからリチウム量を算出した。その結果、ICP分析で得られたリチウム量と同程度でリチウム量が定量できることを見出し、動作下におけるバナジウム酸化物正極とリチウムアルミ合金負極のリチウム量の変化を非破壊で同時に測定することに成功した。本手法は、物質透過能の高い高エネルギーX線を用いるため、実電池をそのまま測定できる点で大きな意義がある。(3) LixMn2O4正極材料の磁気コンプトンプロファイルの解析を行い、第一原理計算の結果と比較を行った。その結果、リチウム量xが、x=1の時、反強磁性となるが、xが1からわずかにずれることでフェリ磁性となることを見出した。本研究において、リチウムイオン電池正極材料LiFePO4にコンプトン散乱法を適用し、本物質の酸化還元軌道はFe 3d軌道であること、ならびにリチウムイオンの挿入・脱離でFe-O八面体構造が歪み電位シフトが起こることを明らかにするとともに、LiFePO4のFe元素をCo元素またはNi元素で置き換えることで、歪みが低減され高電位正極材料となり得ることを示した。その他にも、コイン型リチウムイオン実電池にコンプトン散乱法を適用し、充放電に寄与するリチウム組成変化を正極と負極同時に非破壊で明らかにした。現在、LixMn2O4から得られた磁気コンプトンプロファイルの解析を進めている。今後の研究の推進方策として、第一原理計算を用いて電子運動量密度の理論計算を行い、実験結果との比較からLixMn2O4の電子構造を明らかにしたいと考えている。今後の研究の推進方策として、一昨年度から続いているLixMn2O4の磁性相における解析を引き続き推進し、論文にまとめたいと考えている。また、これまでに得られた正極材料の電極反応メカニズムを基に、実電池を用いたLi濃度オペランド定量分析法を展開していきたいと考えている。分析化学次年度使用額に差額が生じたことの理由は、国際会議の航空券を想定より安く購入できたことによるものである。平成29年度は、本研究計画の最終年度となる。そのため、論文の執筆、ならびに、国際会議等での研究成果報告を昨年度以上に行うことを考えている。次年度使用額の差額は、論文投稿料や国際会議の旅費の一部として使用する。
列挙アルゴリズムの高速化手法の一般化とその適用

今年度の研究は、平面三角分割と極大マッチングとクリークの列挙アルゴリズムである。どのアルゴリズムも、既存のアルゴリズムに、これまでにはない技法を開発したことにより、計算時間の大幅な短縮に成功している。最初の成果は平面3角分割の仕方を列挙するアルゴリズムの改良である。この問題に対するアルゴリズムはすでに提案されているが、出力の重複を避ける部分が難しいために計算が複雑になり、多くの計算時間を要する結果になっている。今回の研究では、このような平面のグラフ構造の列挙時に出力の重複を避けるための、一般的な手法を開発し、平面3角分割列挙のアルゴリズムに適用した。この結果、計算量を従来のものよりも下げることに成功した。次の成果は、極大2部マッチングを列挙するアルゴリズムの開発である。この問題は既存の、極大クリークを列挙するアルゴリズムを用いると解けるが、計算時間が大きくなる。今回の研究では、極大マッチングに特化したアルゴリズムを開発し、また、このようなタイプの列挙アルゴリズムの反復数を減少する方法を開発した。その結果、既存のアルゴリズムよりも大幅に計算量を減少させることができた。最後の成果は、極大クリークを列挙するアルゴリズムである。この問題に対しては、すでにアルゴリズムが提案されているが、問題が大きくなると非常に時間がかかるようになる。今回の研究では、このような極大なクリークや2部クリークなどの列挙アルゴリズムに対する、大規模かつ疎な問題での高速化手法を考案した。この結果、既存のアルゴリズムでは、何ヶ月もかかるような計算が10分ほどでできるようになった。また、この研究の副産物として、極大クリーク、および準クリークを1つ求める高速アルゴリズムが開発された。これも、実際に使われているアルゴリズムよりも大幅に高速であり、現実問題への適用を進めている。今年度は、列挙アルゴリズムの高速化について主に以下の3つの研究を行った。1つ目は、2部グラフの完全マッチングを列挙するアルゴリズムの高速化である。既存のアルゴリズムは、入力したグラフG=(V, E)に対して、出力する2部完全マッチング1つあたり0(|V|)の計算時間を必要としていた。今回の研究では、現在研究を進めている列挙アルゴリズムの高速化手法を用いてこのアルゴリズムを改良し、出力1つあたりの計算時間を0(log |V|)に減少させることに成功した。この結果は、既存の改良方法では得られないものであり、今回研究を進めている高速化手法の成果といえる。2つ目は一般グラフの極大マッチングを列挙するアルゴリズムの高速化である。既存研究では、極大マッチングの列挙は極大安定集合を列挙するアルゴリズムを用いて行うしか方法がなく、最大次数がΔであるような入力グラフG=(V, E)に対する計算速度は、解1つあたりO(|E|^2|Δ|)であった。今回の研究では、このアルゴリズムを極大マッチング専用に改良し、また現在研究を進めている列挙アルゴリズム高速化手法の基本コンセプトである、ならし解析をうまく働かせるようなアルゴリズム作りに基づいて、さらなる改良を行い、解1つあたりの計算時間をO(|Δ|)まで減少させることができた。3つ目は極小集合被覆を列挙する実用的な高速アルゴリズムの開発である。極小集合被覆列挙問題に対しては、出力多項式時間のアルゴリズムがいまだ提案されておらず、実用の意味でも、列挙には多大な計算時間を必要としていた。今回の研究では、上記2つのアルゴリズムの改良で用いた技術を用いて、理論的な計算量は大きいが、実用的には高速なアルゴリズムの開発を行った。これにより、いくつかの問題例では、既存の方法より100倍以上速い速度で列挙が終了するようになった。
心筋におけるデスミン沈着の同定と線維化機序の解明

本研究は臨床像の異なるデスミン心筋症とその他の心筋症,正常心筋との組織内たんぱく質組成を比較検討し,デスミンの組織内分布やデスミン以外に沈着する蛋白質を調べることで,デスミン沈着の機序に迫ることを目的とする.デスミン心筋症に沈着する蛋白質の多くがデスミンであったが,拡張型心筋症や拡張相肥大型心筋症,正常心筋では,組織内のデスミン量に大きな差はみられなかった.デスミン心筋症は他の心筋症とは明らかに蛋白組成の異なった病態であることがわかった.本研究は臨床像の異なるデスミン心筋症とその他の心筋症,正常心筋との組織内たんぱく質組成を比較検討し,デスミンの組織内分布やデスミン以外に沈着する蛋白質を調べることで,デスミン沈着の機序に迫ることを目的とする.デスミン心筋症に沈着する蛋白質の多くがデスミンであったが,拡張型心筋症や拡張相肥大型心筋症,正常心筋では,組織内のデスミン量に大きな差はみられなかった.デスミン心筋症は他の心筋症とは明らかに蛋白組成の異なった病態であることがわかった.本研究では,心筋におけるデスミン沈着の同定と線維化機序の解明を行うために,まず,心筋症や正常心筋のホルマリン固定検体を用いて質量分析を行った.デスミンは正常な心筋細胞にも存在するため,デスミン心筋症における沈着物は免疫組織学的には目立たず,デスミン心筋症の診断は困難であった.しかし,2種類のイメージング質量分析法を用いることで,正常心筋,拡張型心筋症,肥大型心筋症と比較して,デスミン心筋症の心筋細胞により多くのデスミンが凝集,沈着していることが明らかになった.さらに,液体クロマトグラフィー分析も行い,デスミンのより正確な同定と,デスミンに対する酸化,アセチル化,リン酸化等の翻訳後修飾を検出し,デスミン心筋症に沈着するデスミンが正常心筋にみられるそれとは異なった状態であることが確認できた.以上の結果から,デスミン心筋症の診断に,イメージング質量分析法が非常に有用であることが判明した.本研究は,心筋におけるデスミン沈着の同定と線維化機序の解明を行うことを目的とする.デスミンは正常な心筋組織にも多く存在するため,デスミン心筋症における沈着物と正常心筋組織に存在するデスミンを区別する必要がある.このために,まず,心筋症や正常心筋のホルマリン固定検体を用いてタンパク質の質量分析を行った.質量分析には位置情報を保った質量顕微鏡と高感度の液体クロマトグラフィー質量分析法の2種類の方法を用いて,デスミン心筋症の心筋細胞内に沈着するデスミンのイメージングに成功した.正常心筋や他の心筋症と比べても同一面積あたりに存在するデスミンの量が,デスミン心筋症では著しく高いことが証明された.デスミン以外の蛋白質についても検索したが,デスミン心筋症に特異的な蛋白質は確認できなかった.一方,デスミンには酸化,アセチル化,リン酸化などの翻訳後修飾が確認され,正常心筋に比べて心筋症全般においてデスミンのリン酸化が亢進していることが確認された.今後は,デスミンのリン酸化情報を用いて,デスミン沈着と線維化機序の検討を行う予定であるが,現在のところ症例の蓄積が待たれる状態である.心臓血管病理質量分析器を所有する施設と共同研究をすることにより,円滑に研究が進んだため.今後,デスミン心筋症以外の心筋症や虚血性心疾患の心臓検体を用いて,生理的にデスミンの凝集あるいは沈着した領域を集め,同様の手法で,デスミンのイメージングやデスミンの修飾について検討していく予定である.共同研究施設の装置を利用でき,物品等の支出が少なくできたため.今年度から共同研究施設や利用機器が変わるため,消耗品などの物品購入が増えると考えられる.
エピジェネティクス制御による、膠芽腫の幹細胞化を阻止する新治療戦略開発

本研究、課題名ーエピジェネティクス制御による、膠芽腫の幹細胞化を阻止する新規治療戦略開発」は以下の2つの問題を明らかにし、致死性の高い膠芽腫の新規治療戦略の基礎となることを目標としている。目的1:エピジェネティクス制御によるmyc発現が実際のヒト膠芽腫再発の原因となるのか?目的2:エピジェネティクス制御が膠芽腫の幹細胞化を防ぎ、新たな治療となりうるか?平成30年度は、前年度に引き続き研究計画に従って、膠芽腫の初発および再発組織における幹細胞マーカーの発現を検討したところ、再発腫瘍においてmycを含む幹細胞マーカーの発現上昇が確認された。この事は、腫瘍再発には腫瘍幹細胞が深く関わっていることを示唆する。続いて、患者膠芽腫患者の腫瘍から確立した培養細胞を用いて、myc発現を抑える事で幹細胞の性質を失うかどうかを検討したところ、myc発現を抑制する薬剤によって腫瘍細胞が分化する傾向を示した。この事はmyc発現が腫瘍の幹細胞化に重要かつmyc発現を抑えることが膠芽腫治療の新たな戦略として有用であることを示唆した。以上の結果をまとめて論文作成を行なっている。本研究、課題名「エピジェネティクス制御による、膠芽腫の幹細胞化を阻止する新治療戦略開発」は、以下の二つの疑問を明らかにし、致死性の高い膠芽腫の新規治療戦略の基礎となることを目標としている。目的1:エピジェネティクス制御によるmyc発現が実際のヒト膠芽腫再発の原因となるのか?目的2:エピジェネティクス制御が膠芽腫の幹細胞化を防ぎ、新たな治療となり得るのか?平成28年度は、研究計画書に記載した計画にしたがって、手術にて採取した初発及び再発膠芽腫におけるcMyc、Sox2、Olig2及びEGFRの発現を免疫染色にて解析した。膠芽腫に加え、悪性度の比較的低いグレード2、グレード3神経膠種の手術組織に対しても同様の免疫染色を行った。現時点で約100症例において、上記免疫染色を行っており、現在各遺伝子産物の発現レベルと局在、腫瘍の悪性度と発現の相関などを検討している。膠芽腫における予後との相関は、後1年程度の経過観察が必要である。現在、平成28年度手術症例よりも以前の症例に関しても上記と同様の免疫染色を行っており、本年度に予後との相関を解析予定である。また、手術で摘出した膠芽腫の初代培養細胞株の確立も行った。全症例で培養細胞が確立できるわけではなく、実際は約半数の症例で確立できた。現時点で約10例の初代培養細胞株を確立している。現段階では、本研究の準備段階がようやく確立できた、という状況である。当初予定していた膠芽腫を含めた悪性神経膠種における各種蛋白の免疫染色は予定通り進んでいるが、発現量や局在、EGFRとの相関などの解析がまだ出来ていない状態である。次年度の早期にこれらの解析を行う予定である。また、初代培養細胞株の確立は出来ているが、in vitro sphere assayが行えていない状況であり、今後できるだけ進めていく予定である。目的1:エピジェネティクス制御によるmyc発現が実際のヒト膠芽腫再発の原因となるのか?目的2:エピジェネティクス制御が膠芽腫の幹細胞化を防ぎ、新たな治療となり得るのか?平成29年度は研究計画にしたがって、膠芽腫および周囲浸潤組織におけるMYCやSOX2およびOLIG2発現の解析を進めるとともに、腫瘍再発の相関を検討を行った。しかしながら、これらのマーカーの発現と腫瘍再発との相関を得ることができなかった。理由としては発現と再発の相関を検討できるほど十分なサンプル数ではない可能性と観察期間が短い可能性があるため、今後も引き続きサンプル数を増やし、観察期間を延ばして検討を継続する予定である。また、膠芽腫細胞株および幹細胞株を用いたin vitroでの薬剤感受性の実験に関しては、いくつかの初代継代細胞と既存の細胞株を用いて検討したが、今の所十分な結果が得られていない。今後も引き続き条件検討を行う予定であり、別の薬剤を用いた実験も検討したい。また、動物モデルに関しては、現時点では安定して膠芽腫を形成するモデルが確立できていない状態が続いており、こちらも細胞株を作り直すなど引き続き検討を続けて行く予定である。当初予定していた膠芽腫を含めた悪性神経膠種における各種蛋白の免疫染色は予定通り進んでいるが、発現量や局在と再発の相関に関して、十分な結果が得られておらず、サンプル数と観察期間を伸ばして再度検討予定である。また、初代培養細胞株を用いた薬剤感受性実験の結果が思わしくなく、十分な条件検討がなされていなかったことが原因の一つと考え、これらを進めて行く。

この事は、腫瘍再発には腫瘍幹細胞が深く関わっていることを示唆する。続いて、患者膠芽腫患者の腫瘍から確立した培養細胞を用いて、myc発現を抑える事で幹細胞の性質を失うかどうかを検討したところ、myc発現を抑制する薬剤によって腫瘍細胞が分化する傾向を示した。この事はmyc発現が腫瘍の幹細胞化に重要かつmyc発現を抑えることが膠芽腫治療の新たな戦略として有用であることを示唆した。以上の結果をまとめて論文作成を行なっている。本年度は、上記のcMycを含んだ遺伝子発言の解析及び予後との相関を調べるとともに、初代培養細胞株を用いたin vitro spehre assayを進めていく。また、本年度に計画している、膠芽腫および周囲浸潤領域の腫瘍幹細胞の割合と腫瘍再発の相関の検討を開始する。具体的には以下の通りである。膠芽腫本体および浸潤領域における腫瘍幹細胞(MYC、OLIG2、SOX2およびCD133)発現細胞の割合と、腫瘍再発との相関を解析、以下の検討を行う。前向き研究では、採取部位をナビゲーションで正確に記録し、浸潤部位、幹細胞の存在、再発頻度と部位をより正確かつ緻密に検討できる。1.膠芽腫本体および、周囲浸潤領域における腫瘍幹細胞の割合と腫瘍再発との関係2.膠芽腫周囲の浸潤部位で、腫瘍幹細胞が均一に分布しているのか、それとも連絡繊維の領域に偏って分布しているのか。3.周囲浸潤領域で、再発しやすい部位が存在するかどうかを検討4.再発しやすい部位がある場合は、腫瘍幹細胞の割合との関係を検討上記記載通り、MYCを中心とした幹細胞マーカーの発言や分布と腫瘍再発との相関の検討を進め、in vitro実験を早急に進めて行く。また動物モデル実験も安定したモデル作成を進めて行く。本年度において海外学会出張費用として使用しようとしたが、本年度の残高が足りなかったため、計上することができず、次年度に回すことにした。本年度は研究が予定通りになかなか進まず、物品等の購入も予定より少なかった。次年度は研究に当てる時間を増やして推進する予定である上記に記載の通り、本年度計上できなかった海外学会出張費用として使用する予定である。
腸管感染防御におけるIL-3の生体内作用の研究

ネズミ糞線虫をマウスに感染させた場合、成虫に対する腸管での防御には、腸管粘膜肥満細胞(MMC)が深く関与する。マウスにIL-3を反復投与すると、腸管MMCが顕著に増加し、糞線虫に対する防御を誘導できることから、外因性のIL-3の効果は明確であるが、感染において内因性IL-3がどの程度関与するかは、不明であった。糞線虫感染マウスの腸管膜リンパ節、脾臓、腸管のRNAを抽出し、RT-OCRを用いて、IL-3,IL-4,stem ceii factor (SCF)のmRNAを検出した。IL-3mRNAは、感染7日目の腸管膜リンパ節に検出され、感染11日目にはすみやかに減少した。用いた実験条件では、正常組織、感染脾臓、感染小腸にはIL-3mRNAを検出できなかった。IL-4mRNAは、正常腸管膜リンパ節にわずかに検出され、感染7日目にはピークに達し、正常の7倍に増加した。それは、脾臓では感染11日目がピークであり、小腸では感染7日目がピークであった。SCF mRNAは、正常組織にも比較的強く検出され、腸管膜リンパ節では感染により増加する傾向が見られたが、脾臓、小腸では感染により減少する傾向があった。このように、糞線虫感染における局所のサイトカイン産生は必ずしもIL-3だけが主要なものではなく、IL-4やSCFなどの、in vitroで肥満細胞の分化増殖に関与する他のサイトカインも、深く関与する可能性が示唆された。いっぽう、電子顕微鏡レベルの観察により、糞線虫感染マウスの腸管MMCは、虫体の排除時期に一致して、特徴的な顆粒の結晶化構造を示した。しかし、ヒト結合組織肥満細胞で見られるような、アナフィラキシ-型の脱顆粒像は検出されなかった。糞線虫感染で観察されるものと同様の顆粒変化が、IL-3の連続投与によっても観察され、IL-3により糞線虫感染と同様のMMCの活性化が誘導できることが示された。本年度の予定であったIL-3cDNAを組み込んだX63BMG細胞を大量培養し、上清からrIL-3を得ること、マウス骨髄細胞をrIL-3と共にin vitroで培養し、純粋な粘膜型肥満細胞を得ること、この培養肥満細胞でラットを免疫して、その脾細胞をマウス由来X63.653細胞と融合し、ハイブリドーマを形成することは当初の計画どうり進行した。培養肥満細胞のホモゲネートを抗原として用いるELISAと、IL-3依存性細胞FDC-P2の増殖抑制効果を指標にしてスクリーニングし、7つのモノクローナル抗体産生クローンを選択した。しかし、モノクローナル抗体のスクリーニングにおいて初め陽性であったクローンを増殖させ、大量の上清から抗体を集めた後に再び活性を測定すると、活性が認められないことがたびたび生じた。これは、われわれが用いたものがラット・マウスのハイブリドーマであることが原因で、ハイブリドーマが不安定なために増殖継代を続けるうちに抗体産生を停止するためかもしれない。この問題は、ラット・ラットのハイブリドーマを用いることにより解決可能と思われるが、現状ではラット由来の癌性細胞株を所持せず、早期解決は難しい。

十分に納得できるモノクローナル抗体を選択することが難しい状況の中で、ELISA反応の最も強いクローンIC2の抗体8mg(4mg×2回)を糞線虫感染マウスに腹腔投与し、腸管成虫回収数と粘膜肥満細胞数を調べたが、抗体投与による変化は見られなかった。最近になって、マウスの腸管粘膜肥満細胞の顆粒中に発現されるプロテアーゼと骨髄由来の培養肥満細胞に発現されるプロテアーゼには違いがあることが報告された。このことは両者に機能的な違いがある可能性を示唆し、骨髄由来培養肥満細胞に対するモノクローナル抗体を使ってin vivo効果を調べる妥当性に疑問が生じてきた。したがって、当初予定した骨髄由来培養肥満細胞とIL-3レセプターに対するモノクローナル抗体の作製には未解決の問題が多く、短期間に研究を終了することは難しいと判断した。そこで、モノクローナル抗体作製に関する部分をとりあえず中止し、生体内でのIL-3の作用と粘膜肥満細胞の分化増殖機構を解明することに重点をおくこととした。そこで、rIL-3をマウスに繰り返し投与すると腸管粘膜肥満細胞が顕著に増加し、メディエーターを遊離し、糞線虫に対する防御が起きることが確認された。正常およびネズミ糞線虫感染C57BL/6マウスの腸管、腸管膜リンパ節、脾臓から全RNAを抽出し、サイトカインmRNAの経時変化を調べた。IL-3cDNAを組み込んだX63BMG細胞にIL-3mRNAが検出される条件では、いずれの組織にもIL-3mRNAは検出されなかった。これに反して、actinおよびSCFのmRNAはいずれの組織でも強く検出された。SCFmRNAは腸管膜リンパ節では正常マウスよりも感染により増加する傾向が見られたが、腸管組織では感染による増加は認められなかった。IL-4mRNAは腸管膜リンパ節では感染7日目をピークにし、正常リンパ節でも弱く検出された。しかし、腸管では顕著な発現は7日目に限定され、脾臓では11日目の方が強く検出された。IL-3mRNAはRT-PCRに使うRNA量を増加すると感染7日目のリンパ節に弱く検出され、発現量がIL-4やSCFに比べ少ないことが示唆された。糞線虫感染マウスの腸管膜リンパ節細胞をin vitroで抗原刺激すると培養上清中にIL-3様の肥満細胞増殖因子活性が検出できることはすでに報告した。なぜIL-3はmRNAレベルでの発現が低いのか、興味ある問題が提起された。生体内では、IL-3は抗原刺激で産生された後速やかに産生が止まるか、あるいはIL-3はごく微量しか産生されず、粘膜肥満細胞の増加にはSCFなど他のサイトカインが関与する可能性などが考えられる。IL-3mRNAの検出技術の問題をも考慮しながら、今後さらに検討が必要である。
核酸及び関連塩基の酸化的修飾に関する有機化学的研究

DNAの構成成分であるチミジン類の酸化的損傷は突然変異,老化等と深くかかわっている.チミジン類の生体内での酸化反応に関連し,以下に述べる成果を得た.1.生体内で生成する過酸化物等の酸化剤はチミジン等を酸化し損傷を与えると考えられる.この仮定のもとにチミジン類とメタクロロ過安息香酸との反応を検討し,シスグリコールエステル体を主成績体として,又スーパーオキシドとの反応ではピリミジン環が五員環になった化合物を得,それらの構造を明らかにした.中間体としてエポキシ体あるいはその等価体を想定した.1.前述のエポキシ体のモデル反応として1,3-ジメチルブロムヒドリンから製したエポキシ体とアミン,アミノ酸とのクロスカップリング反応を検討し,各成績体の立体構造を明らかにした.その際三弗化ホウ素で処理するとトランス体からシス体へ異性化する事を見出し,そのメカニズムを明らかにした.1.チミジンエポキシド(A),(B)についても同様に反応を行ない,各成績体の立体構造を明らかにした.その際チミジンブロムヒドリング熱や光で正常チミジンにもどる事を見出した.本反応はラジカル機構を経由して進行している事も明らかにした.以上生体内におけるチミジン類の酸化的損傷およびこれに伴う生体内求核剤によるクロスカップリング反応のみならず,酸化的に損傷を受けたチミジン類の正常チミジン類への修復に関する有用な知見を得た.これらの反応はチミジン固有の構造と機能に由来するものと考えられ,チミジンが生体内における核酸の損傷と修復に関して重要な役割を果していると考えられる.DNAの構成成分であるチミジン類の酸化的損傷は突然変異,老化等と深くかかわっている.チミジン類の生体内での酸化反応に関連し,以下に述べる成果を得た.1.生体内で生成する過酸化物等の酸化剤はチミジン等を酸化し損傷を与えると考えられる.この仮定のもとにチミジン類とメタクロロ過安息香酸との反応を検討し,シスグリコールエステル体を主成績体として,又スーパーオキシドとの反応ではピリミジン環が五員環になった化合物を得,それらの構造を明らかにした.中間体としてエポキシ体あるいはその等価体を想定した.1.前述のエポキシ体のモデル反応として1,3-ジメチルブロムヒドリンから製したエポキシ体とアミン,アミノ酸とのクロスカップリング反応を検討し,各成績体の立体構造を明らかにした.その際三弗化ホウ素で処理するとトランス体からシス体へ異性化する事を見出し,そのメカニズムを明らかにした.1.チミジンエポキシド(A),(B)についても同様に反応を行ない,各成績体の立体構造を明らかにした.その際チミジンブロムヒドリング熱や光で正常チミジンにもどる事を見出した.本反応はラジカル機構を経由して進行している事も明らかにした.以上生体内におけるチミジン類の酸化的損傷およびこれに伴う生体内求核剤によるクロスカップリング反応のみならず,酸化的に損傷を受けたチミジン類の正常チミジン類への修復に関する有用な知見を得た.これらの反応はチミジン固有の構造と機能に由来するものと考えられ,チミジンが生体内における核酸の損傷と修復に関して重要な役割を果していると考えられる.1.チミジン誘導体とメタクロロ過安息香酸(MCPBA)との反応ではシス-グリコールエステル体が主成績体であり、スーパーオキシドとの反応では六員環であるピリミジン環が五員環に縮環する事を明らかにし、ウリジン誘導体とMCPBAとの反応では数種の成績体を得、各々の構造を明らかにした。更にそれらの成分メカニズムについても検討を加えた。2.生体内を生成する酸化剤はチミジン等を酸化し、エポキシド或いはその同等体を生成すると考えられる。そこでそのモデル実験として、1.3-ジメチルチミン(TMU)ブロムヒドリンから製したTMUエポキシドとアミン、アミノ酸誘導体との反応を検討し、各生成体の立体構造を明らかにした。その際三弗化ホウ素で処理するとトランス体からシス体へ異性化する事を見出し、そのメカニズムについても考察を加えた。この結果は生成体の立体化学の決定に有用であった。3.二種のチミジンブロムヒドリン(A)(B)から製したエポキシド(A)(B)とアミン、アミノ酸類との反応を行ない、(A)からは一種の、(B)からは二種の成績体を得た。前述の異性化反応を適用し、それらの立体構造を明らかにした。その際エポキシド(A)から何故一種の成績体しか得られないのか現在検討中である。4.ベンゼン,テトラヒドロフラン,ジメチルホルムアミド,ジメチルスルフィドの四種の溶媒中にてTMUエポキシドとアミン,アミノ酸類との反応を検討し、誘電率の高い溶媒中ではシス体が生成しやすくなることを見出した。この結果はエポキシドというよりイオン的な中間体の寄与が大きい為と考えられる。生体反応との類似性については現在検討中である。
音響センサによる穀物重量・水分の推定及び収量コンバイン・穀物乾燥機への応用

昨今のIT農業における実用的なセンサとして,穀粒の衝撃音をイヤホンで感知し,コンバイン上での収穫質量と水分,穀物乾燥機上で水分の推定を行った。コンバインの穀粒タンク内では別途用意した小型の衝突板に,乾燥機では側壁に市販のセラミックイヤホンを装着した。籾およびコムギの収穫時に出力を積算して実際の収穫質量と対応させると,単純な線形回帰でも標準誤差1 kg程度を得た。時系列の信号を周波数領域の音響スペクトルに演算しなおし,任意の2周波数バンドを選択して水分推定を行うと,標準誤差は籾で0.4%,コムギで0.8%を得た。乾燥機でも同様の手法で籾の水分推定を行ったところ,標準誤差0.1%を得た。水稲籾およびコムギの収穫量と含水率を測定する目的で,セラミックイヤホンを薄い板(鉄・アルミ・塩ビ)に貼り合せたセンサを製作した。まずスピーカと発振器を用いて,セラミックイヤホンの周波数特性を調べたところ,2kHzまで比較的平坦で以降は徐々に減衰するが,概ね8kHz程度まで用いることができると判明した。板の材料については,鉄が最もS/N比が高くとれることがわかった。以上の結果をふまえて収録周波数は20kzとし,小型コンバインのタンク上方から穀粒が吐き出される部分に鉄で試作したセンサを実装し,水田および麦畑で収穫実験を行った。衝撃波の絶対値を用いて積算することで,穀粒タンクに入った穀物重を推定することを試みた。その結果,重量が4kgまでの範囲では決定係数0.8程度を得られた。穀物の含水率を推定するために,1走行につき5回分衝撃の高速フーリエ変換結果を用いた。ここで特定の周波数での振幅を全周波数の振幅和で除した指標と,小麦の水分(1529%)の関係を調べたところ,0.7弱の決定係数が得られた。まだ荒削りな結果ではあるが,現行に比べてきわめて単純な装置で穀物水分が推定できる見通しがついた。同じ原理を用いて,施肥機の繰り出し部下のホッパにイヤフォンを装着する試みも行った。トラクタの振動は空中に比べてかなり拾うものの,肥料のホッパへの衝撃振動がそれ以上に大きく出ることが判明した。これを用いて,運転中に肥料詰まりがないか運転席から確認ができる簡単なモニタ装置を製作し,実機での動作確認ができた。繰り出し量のリアルタイム測定については,まだ実用に耐える精度は得られていない。本年度は,昨年試作したセラミックイヤホン+衝突板からなるセンサのうち,衝突板に鉄および塩ビを用いたものを2条刈自脱型コンバインに搭載し,コムギおよび水稲の収穫実験をそれぞれ6月および10月に行った。昨年同様に,穀物重量の測定には出力の絶対値の積算を用いた。また較正した結果を用いて,簡易な収量マップの作成も試みた。水分の推定も昨年同様に,特定の周波数の振幅比の変化で較正および推定を行った。上記と平行して,既存の穀物乾燥機のコンベアで投てきおよび衝撃が生じている部分にセラミックイヤホンを装着し,穀物水分を推定する実験を行った。これも同様に,コムギおよび籾についてそれぞれ6月および10月に実施した。穀物水分の実測値は乾燥機に表示される値を定点カメラで追跡し,出力はPCMレコーダによりSDカードに記録する方式とした。水分の推定方法は,コンバインで用いた方法と同様とした。同様の装置および原理で,施肥機のホッパにおける肥料の繰り出しを測定する実験を継続した。本年度は特に実用性に着目して,肥料の詰まりを判別するための電子回路を新たに製作し,実機に装着して試運転を行った。コンバイン上での穀物重量の推定には,鉄の衝突板を用いることが適切と判明し,その結果,コムギでの標準誤差は1.2kg(範囲は最大17kg,決定係数0.87),籾での標準誤差は3.0kg(範囲は最大54kg,決定係数0.97)を得た。昨年度は精度が上がらない原因としてセンサ出力の非線形性が疑われたものの,実際には無出力時の微小なノイズを積算していたことがわかり,これを避ける閾値を設定したことで,上記のとおり実用に耐える精度に近づいてきた。この結果を用いて,狭い範囲ながら収量マップを作成したところ,変動が大きい周縁部を除いても,籾収量は約400650kg/10aの幅があることが判明した。コンバイン上での水分の推定には,塩ビの衝突板を用いることが適切と判明し,その結果,コムギでは1526%の水分範囲で,振幅比との相関係数が-0.60(p<0.01,片側検定)を得た。単純な直線回帰を行えば,水分の標準誤差は2.7%であり,大まかな水分の判別に使うことができる。一方,籾では2026%の水分範囲で,振幅比との相関係数は-0.44(p<0.1,片側検定)であった。相関係数の絶対値がコムギより見かけ上小さくなったのは,測定した水分の範囲が狭いことに原因があると考えられ,直線回帰では同程度の標準誤差であった。乾燥機での水分推定では,予想に反して振幅比との相関を見出すに至らなかった。肥料の繰り出し量について,非線形モデルなどを利用した推定をさらに試みたものの,芳しい結果は得られなかった。

ただし,セラミックイヤホンは比較的低周波の機械振動に対して鋭敏でないために,肥料が正常に落下しているかを判別するのに適していることが判明した。本年度の研究は,コンバイン上での穀粒水分の検出に焦点を絞って実施した。用いた音響センサは,鉄製の衝突板にセラミックイヤホンを接着したものである。昨年度の結果では水分推定には塩ビ板がより適しているとの仮結論を得ていたが,実用化を考えると摩耗しやすい素材は避けるべきと判断した。これを2条刈自脱型コンバインの穀粒タンク内に設置し,縦搬送オーガの羽根から穀粒の一部を受け,信号を記録した。イネおよびコムギについて,異なる穀粒水分が得られるように収穫日を変え,短区間の行程で刈り取り,タンク内に貯留した穀粒水分を行程ごとに測定しつつ,信号を記録する圃場実験を実施した。信号処理では,昨年はセンサまたは穀粒の固有振動とみられる周波数の相対振幅を用いることで,音響センサを用いた穀粒水分の推定の可能性を見出してはいたものの,大まかな水分が推定できるに留まっていたため,手法を根本的に見直し開発することとした。まず穀粒が通過していると判断される投てきのみを抽出し,投てきごとに高速フーリエ変換を行い,蓄積した音響スペクトルを刈取り行程で平均することでデータセットを作成した。実測した穀粒水分とスペクトルを関連付ける手法として重回帰分析を用い,周波数ごとの振幅を説明変数として穀粒水分の推定を試みた。重回帰に用いるべき周波数を選定する方法として,あらかじめ周波数ごとに振幅と穀粒水分の単相関をとって比較することで,水分推定に有用と見られる周波数の範囲を絞り込んだ。今年度の手法の特徴である音響スペクトルについては,イヤホンの固有振動によるピークと穀粒の衝突によるピークが明確に現れ,振幅の違いはあるものの,イネ(籾)とコムギ穀粒の衝突によるスペクトルの概形はほぼ同じであることが確認された。安定した穀粒水分の推定のために必要な再現性が担保されていると判断している。周波数ごとの振幅と穀粒水分の相関については,籾でもコムギでも6 kHz以上において,相関係数は-0.8前後でほぼ一定となっていた。これは含水率が高いほど高周波成分を多く含む衝撃音が鈍くなるというオペレータの感覚と合致している。この結果を受け,6 kHz以上の振幅を平均したものから単回帰で穀粒水分を推定してみると,標準誤差は籾で0.8%,コムギで1.7%(いずれも湿量基準での穀粒水分)となった。この水分推定方法は,結果として海外での先行研究(ただし室内で静置したガラス板にコムギ穀粒を衝突させる)での手法とほぼ類似しているが,推定精度は本研究が優れている。次に,相関係数の絶対値が大きい周波数をいくつか選び,その振幅を説明変数にして重回帰により穀粒水分を推定したところ,標準誤差は籾で0.4%(2変数),コムギで1.4%(3変数)であった。説明変数を2に限定し,総当りで標準誤差を計算して最適な周波数の組み合わせを調べたところ,標準誤差は籾で0.36%,コムギで0.77%まで抑えることができた。これらの結果より,低コストで構造が単純な音響センサを搭載し,穀物水分の推定に用いるいくつかの周波数域の信号のみを取り出す回路設計(バンドパスフィルタ)にしておけば,既存の測定法(電気抵抗式,静電容量式など)に匹敵する精度が得られる可能性が示唆された。以上の状況より,当初の計画以上の進展と判断するのが妥当と考える。これまでの研究成果を活かし,コンバイン上での音響センサを穀物乾燥機に応用する試みを行った。完全な非破壊測定であるうえに測定頻度はほぼ連続的であることから,現行の水分測定法を補完しながら新たなプロセス制御を行うための技術シーズをめざした。
顆粒球、単球、マスト細胞に発現する新規ペア型レセプターLMIR3/4の機能解析

(1)LMIR3ノックアウトマウスの解析LMIR3ノックアウトマウスはSPF飼育下において形態や発達に異常を認めず、また、血球系細胞の分化や増殖にも明らかな異常を認めなかった。LMIR3はミエロイド系細胞に発現していることから、自然免疫に関与している可能性があるため、敗血症性腹膜炎モデルであるCLP(cecal ligation and puncture)を施行した。その結果、B6、Balb/cいずれのバックグラウンドにおいてもLMIR3ノックアウトマウスにおいて顕著な生存率の改善が認められた。CLPに対する生体防御には細菌のクリアランスが重要であるため、CLP後の腹腔内細菌数を検討した。CLP24時間後には、LMIR3ノックアウトマウスの菌数はWTと比較して、腹腔内のグラム陰性桿菌であるE.Coln、グラム陽性球菌であるE.faecalisともに約100分の1程度に低下していることが分かった。また、末梢血中細菌数もLMIR3ノックアウトマウスが平均で約30分の1程度に低下していた。この結果は、LMIR3ノックアウトマウスにおける生存率の改善と合致すると考えられた。次に、虫垂局所の病理所見を確認したところ、WTでは4時間から24時間にかけて壊死が進行するが、LMIR3ノックアウトマウスは壊死の程度が軽く、同時に24時間後に虫垂壁への著明な好中球の集積を認めた。また、CLP4時間後に、腹腔中の好中球数を調べたところ、WTと比較してLMIR3ノックアウトマウスでは平均で約4倍の好中球の集積が認められた。これらの所見も、LMIR3ノックアウトマウスにおける生存率の改善と合致していると考えられる。CLP施行にて、LMIR3ノックアウトマウスは腹腔中の何らかのケモカインの産生が亢進し、早期に多くの好中球が腹腔や虫垂局所に遊走し、高い殺菌能を示すことおよび、それに伴い炎症が早期に改善して、生存率が上昇すると考えられる。今後CLP以外の様々な実験を行ってく予定である。自然免疫関連ではLPS投与、E.Coliなどの生菌投与などにおいて差が認められるかを検討する。また、アレルギーや自己免疫疾患モデルなどを検討する。(2)LMIR3リガンドの探索現在、LMIR3の細胞外ドメインにhumanのFc部分をつけたキメラ蛋白を作成し、プローブとしてリガンドを捜すと同時に、レポーター細胞を用いた探索も行っている.新規のペア型レセプターであるLMIR3の解析を通し、生体におけるペア型レセプターの役割を明らかにすることを目的とした。LMIR3はI型膜貫通蛋白で、細胞質内に5つチロシンを持つ(以後Y1Y5と略す)。そのうちY1とY3がITIM配列に、Y5がITSM配列に一致する。LMIR3の細胞質内のチロシンの役割を明らかにするために、様々なYFmutant(チロシンをフェニルアラニンに置換したコンストラクト)を用いた解析を行った。1)LMIR3特異的抗体にて、マスト細胞のFcεRIのシグナルが抑制されることを始めて示した。このLMIR3の抑制作用には、ITIM(Y1,Y3)とITSM(Y5)の両方が重要であることを示した。2)LMIR3はリン酸化したY1,Y3,Y5を介してSHP-1/SHP-2と、リン酸化したY2を介してp85αと会合すること、また、Grb2とも会合しうることを明らかにした。3)LMIR3(Y1/3/5F),LMIR3(Ya11F)は活性化に働き、その活性化作用にはFcRγが必須であることを示した。また、LMIR3とFcRγが会合することを明らかにした。ITIMを細胞質内に持ち、抑制作用を示すレセプターがITAMを持つアダプター分子と会合し、活性化作用を示す報告は例がなく、新規の発見である。4)LMIR3(WT)はLPS存在下で活性化に働くことが示された。この活性化作用に、FcRγとLMIR3細胞質内のチロシンの両方が寄与することを明らかにした。以上より、LMIR3はマスト細胞において、FcεRIに対しては細胞内領域のITIMとITSMを介して抑制化シグナルを伝えるが、一方で、LPS存在下においては、ITAMを有するFcRγとの会合を介して活性化シグナルを伝達するという二重機能を持つことを始めて明らかにした。現在LMIR3ノックアウトマウスの解析を行っている。

また、末梢血中細菌数もLMIR3ノックアウトマウスが平均で約30分の1程度に低下していた。この結果は、LMIR3ノックアウトマウスにおける生存率の改善と合致すると考えられた。次に、虫垂局所の病理所見を確認したところ、WTでは4時間から24時間にかけて壊死が進行するが、LMIR3ノックアウトマウスは壊死の程度が軽く、同時に24時間後に虫垂壁への著明な好中球の集積を認めた。また、CLP4時間後に、腹腔中の好中球数を調べたところ、WTと比較してLMIR3ノックアウトマウスでは平均で約4倍の好中球の集積が認められた。これらの所見も、LMIR3ノックアウトマウスにおける生存率の改善と合致していると考えられる。CLP施行にて、LMIR3ノックアウトマウスは腹腔中の何らかのケモカインの産生が亢進し、早期に多くの好中球が腹腔や虫垂局所に遊走し、高い殺菌能を示すことおよび、それに伴い炎症が早期に改善して、生存率が上昇すると考えられる。今後CLP以外の様々な実験を行ってく予定である。自然免疫関連ではLPS投与、E.Coliなどの生菌投与などにおいて差が認められるかを検討する。また、アレルギーや自己免疫疾患モデルなどを検討する。(2)LMIR3リガンドの探索現在、LMIR3の細胞外ドメインにhumanのFc部分をつけたキメラ蛋白を作成し、プローブとしてリガンドを捜すと同時に、レポーター細胞を用いた探索も行っている.