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世紀転換期の日本人ロシア研究者の国際的系譜とその対露認識の包括的実証研究

2016年11月8日)にて、1914年の大庭柯公のロシア軍従軍の実態について、同行した五名のロシア人記者たちの従軍記と比較考察し、大庭の従軍記が本格的なロシア研究の萌芽であったことを提示した。この成果に、大庭と共に従軍したイギリス人ロシア研究者、B.ペアズ(1867-1949)のテクストの分析を加えて改稿した論文を、所属大学院の『超域文化科学紀要』に投稿した(2016年4月現在、査読中)。ウ.来日ロシア人研究会第97回例会(青山学院大学(東京都渋谷区)、2016年2月6日)にて、ロシア人教授、A.ブラント(1855-1933)と大庭の交流の様相をテクストの分析から検討した。その結果、ブラントの回想記は大庭の対露認識を探る上で重要な一次資料であり、ブラントがアマチュアの日本研究家として活躍していた可能性が高いことが解明された。研究指導委託先のロシア・モスクワにてロシア語による口頭発表ならびに論文投稿を行ったほか、日本国内で最も重要な学会誌における査読付き論文が掲載されるなど、目に見える研究成果が多く得られた上、国内外での文献資料調査も当初の計画以上に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度に国内外で行った文献資料調査の結果とそれによって得られた考察を、次年度に国際学会・国内学会・研究会の計3回の口頭発表、ならびに所属研究科の発行する紀要への査読付き論文の投稿により、具体的な研究成果として公表していく所存である。
金属ーGaAsショットキ界面の欠陥と雑音に関する研究

金属ーGaAs界面近傍の欠陥を測定するために、試料温度を変化させながら雑音の測定を行なった。その結果、リアクティブイオンエッチング(RIE)により損傷欠陥が導入された試料の雑音には、100MHz付近に顕著な雑音の温度依存性があり、欠陥準位が熱励起されることに起因するものが含まれていることが分かった。この雑音スペクトラムが再結合雑音と同じスペクトラムを持つと見なして、欠陥の活性化エネルギ-等を求めることが出来ると考えられる。現在までの結果では、欠陥準位が伝導帯中に存在しているかのようなデ-タ-となっている。この原因については、界面に極めて近いところの欠陥による雑音の影響が大きく、比較的深い部分の欠陥の効果を隠しているためと考えられる。そのため、デ-タ-の処理方法の検討を、現在行なっている。次に、欠陥と雑音の関係について理論的検討を行なった。モデルとして、トンネリングによるトラップの電子捕獲/放出速度を計算する方法を用いた。これらの結果によれば、界面近傍に欠陥が存在する場合には試料の温度を下げるに従い、雑音が増加することや雑音のスペクトラムの傾向等が実験結果と一致することが分かった。また、測定した雑音の絶対値と計算値を比較して欠陥密度を見積もると、10^<20>cm^<ー3>eV^<ー1>オ-ダ-となり、nーGaAs表面に不活性化膜を堆積した場合の界面準位密度の報告例(10^<11>10^<14>cm^<ー2>eV^<ー1>)と一致することが分かった。
多結晶試料中の特定粒界に沿った拡散係数の新規決定法の構築

近年、火力発電所や原子力発電所において材料の破損に伴う事故が頻発している。応力腐食割れが主な原因であり、これは高温においてステンレス鋼中のクロムが粒界に沿って拡散してクロム欠乏層が形成するために起きる。このようにステンレス鋼中のクロムの粒界拡散係数は材料の信頼性評価に重要なパラメータである。粒界拡散係数は粒界性格によって10倍以上異なることが純銀、純金および純銅などのバイクリスタルを用いた粒界拡散実験から知られているが、構造材料として実用上重要な鉄やステンレスにおいては粒界拡散係数の粒界性格依存性は全く得られていない。この情報を得るにはバイクリスタル試料が不可欠であるが、多結晶中に存在するすべての粒界傾角に対応したバイクリスタルを作製することは困難である。多結晶試料における粒界拡散係数の粒界傾角依存性などの詳細な情報が発電プラント材料の信頼性向上のために必要不可欠であり、新たな手法が求められている。本研究の目的は、半導体分野で用いられているマスキング技術を拡散試料に適用し、多結晶試料中の特定の粒界に沿う拡散係数の決定法を新たに構築することである。用いた多結晶試料は純Agおよび純Cuである。試料はあらかじめ結晶粒粗大化熱処理を行い、拡散熱処理中に粒界が移動しないようにした。多結晶試料において着目する特定粒界は光学顕微鏡観察およびEBSPによる局所方位解析を用いて決定した。放射性同位元素^<57>Coを多結晶試料にめっき後、拡散熱処理を施した。多結晶試料の特定粒界以外をマスキングし、イオンビームスパッタマイクロセクショニングを行った。自動測定装置を試作することによって測定時間を大幅に増加させることが可能になった。マスキングによって単位時間あたりの^<57>Coの放射能強度は減少したが、自動測定装置を用いて長時間測定を行うことによってマスキングによる放射能強度の減少分を補うことができた。この結果、多結晶Cu試料中の特定粒界に沿った拡散係数を決定することが可能になった。
大自由度系のダイナミクスと分岐の研究のための位相的および厳密な計算的方法

偏微分方程式の平衡解に対する厳密な計算的方法を2次元と3次元の領域におけるSwift-Hohenberg方程式やCahn-Hillard方程式に適用した.より具体的に,論文[1]では,Marcio GameiroとJean-Philippe Lessard(Rutgers University,USA)はこの方法を高次元の偏微分方程式に適用して,2次元と3次元のSwift-Hohenberg方程式,およびCahn-Hillard方程式の平衡解の存在を示した.また,この方法を用いて高次元領域での偏微分方程式の平衡解のなめらかな分枝を計算する方法を提示し,それを2次元と3次元のCahn-Hilliard方程式に応用し,さらに,2次元のSwift-Hohenberg方程式の孤立分枝の2次分岐の検証に用いた.その過程で,論文[1]の方法の改良も与え,2次元のSwift-Hohenberg方程式については,精密な計算結果も与えた.今年度の研究成果は大別して以下の3項目にまとめられる.まず第1に,高次元長方形領域に置ける偏微分方程式の平衡解の厳密な数値計算法の開発を行ったことが挙げられる.これを2次元および3次元領域で定義されたSwift-Hohenberg方程式とCahn-Hillard方程式の定常問題に対して適用して結果を得た.これはJean-Philippe Lessardとの共同研究で,以前に行った1次元の場合の結果を拡張したものである.第2の研究成果は,多次元パラメータを持つ写像族に対するConley指数の計算を行ったことである.これは多次元パラメータ族の問題を,多価写像を介してある種の組合せ多価写像に対する問題に還元することによって計算がなされる.すなわち,この組み合わせ多価写像からMorse集合の外近似を求めて,それのホモロジーConley指数を計算するのである.本研究では,これまでの計算アルゴリズムを改良して,より高次元の空間上で定義される写像や,円筒のようなこれまでのアルゴリズムでは扱えなかったトポロジーを持つ空間に対しても適用できるようにした.また,この新しいアルゴリズムを用いて,bouncing ballの結合系,logistic写像の大域結合系,さらに3次元空間上で定義されるある種の生物モデルに対する計算を開始した.第3の研究成果は,3次元燃料電池の位相的構造の解析である.我々はホモロジーなどの位相計算的方法を用いて,燃料電池の連結性などの位相的性質を解析した.このような位相的性質についての情報は,燃料電池の性能を決定するために本質的に重要である.我々はまたここで開発した方法を,固体酸化物形燃料電池のカソードとアノードでの反応の3次元再構成に応用して,いくつかの結果を得た.偏微分方程式の平衡解に対する厳密な計算的方法を2次元と3次元の領域におけるSwift-Hohenberg方程式やCahn-Hillard方程式に適用した.より具体的に,論文[1]では,Marcio GameiroとJean-Philippe Lessard(Rutgers University,USA)はこの方法を高次元の偏微分方程式に適用して,2次元と3次元のSwift-Hohenberg方程式,およびCahn-Hillard方程式の平衡解の存在を示した.また,この方法を用いて高次元領域での偏微分方程式の平衡解のなめらかな分枝を計算する方法を提示し,それを2次元と3次元のCahn-Hilliard方程式に応用し,さらに,2次元のSwift-Hohenberg方程式の孤立分枝の2次分岐の検証に用いた.その過程で,論文[1]の方法の改良も与え,2次元のSwift-Hohenberg方程式については,精密な計算結果も与えた.
鉄筋腐食によるひび割れ発生機構の解明

コンクリート構造物の設計は、これまでは新設に重みを置いてきたが、いかにして今まで構築されてきた構造物を永く共用して行くかに重点が移行してきている。コンクリート構造物は、耐久性が高いといわれてきたが、それらの寿命が土木技術者が考えてきたよりもかなり短いことが最近の研究でわかってきた。港湾、鉄道、道路構造物などでの寿命の短さが顕著となっている。そのため、現在使用している構造物があと何年利用できるかなどの補修時期を遅らせるための診断技術等が数多く研究されている。本研究では、劣化を受けた既設コンクリート構造物のひび割れモードを考えることで、第三者障害を考慮した使用限界状態の予測モデルを開発した。コンクリート構造物の劣化には、鉄筋腐食までの潜伏期、鉄筋腐食膨張によりひび割れが発生するまでの進展期、その後、腐食進展が加速する加速期がある。使用限界状態で問題となる時期は、ひび割れが発生する進展期であり、それもひび割れモードにより大きく異なる。ひびわれモードは、鉄筋径、間隔、かぶり、コンクリート強度により変化することが自明であり、たとえば、鉄筋間隔が狭い場合、鉄筋同士を結んだ水平ひび割れのはく離となるのに対し、間隔が大きい場合、鉄筋に沿ったひび割れとなる。鉄筋同士の間隔が大きい場合、かぶりによりひび割れモードは異なる。かぶりが小さい場合ははく離ひび割れとなり、大きい場合は鉄筋に沿ったひび割れとなる。ひび割れが発生する限界腐食量を鉄筋に沿ったひび割れおよび水平剥離ひび割れについて乾湿繰返実験により求めた。はく離と鉄筋に沿ったひび割れモードの境界となる無次元量D/φは2.03.0となり,これより小さい場合は表面はく離ひび割れ,大きい場合は鉄筋に沿ったひび割れとなる。水平剥離ひび割れと鉄筋に沿ったひび割れモードの境界となる無次元量1/φは5.57.0となり,これより小さい場合は水平はく離ひび割れ,大きい場合は鉄筋に沿ったひび割れとなる。ひび割れ発生限界腐食量の特性値は、15%危険確率を容認するならば、はく離ひび割れモードでは39mg/cm2、水平はく離ひび割れモードでは30mg/cm2が特性値として得られた。本研究の目的は、劣化を受けた既設コンクリート構造物のひび割れモードを考えることで、第三者障害を考慮した使用限界状態の予測モデルを開発することである。鉄筋同士が間隔が大きい場合、かぶりによりひび割れモードは異なる。平成15年度は、ひび割れモードを調べるために試験体を作成し、乾湿繰返試験により腐食によるひび割れモードを調べた。試験体は、鉄筋間隔、かぶり、鉄筋径、コンクリート強度、鉄筋の位置を因子にひび割れモードを(1)鉄筋に沿ったひび割れ、(2)水平はく離ひび割れ(鉄筋同士を結んだひび割れ)、(3)はく離ひび割れの3種類を発生することを念頭に作成した。乾湿繰返試験は現在3ヶ月を経過しており、剥離ひび割れや鉄筋に沿ったひび割れが発生している。しかし、水平ひび割れはまだ発生していない。

乾湿繰返試験と平行して理論モデルを構築した。理論モデルの計算からD/φ(D=2C+φ、C:かぶり、φ:鉄筋径)が1.5を超えると、鉄筋に沿ったひび割れが卓越し、それ以下では、剥離ひび割れが卓越することが明らかになった。さらに、乾湿繰返試験でもD/φ=1.5程度のときにどちらともいえないひび割れが発生し、理論モデルを裏づけできた。水平ひび割れでは、鉄筋間隔1_pに対するかぶりCの比1_p/Cが、5.0以下では水平ひび割れが卓越する計算結果となった。乾湿繰返試験では、まだ裏づけできる結果は得られていない。本研究の目的は、劣化を受けた既設コンクリート構造物のひび割れモードを考えることで、第三者障害を考慮した使用限界状態の予測モデルを開発することである。コンクリート構造物の劣化には、鉄筋腐食までの潜伏期、鉄筋腐食膨張によりひび割れが発生するまでの進展期、その後、腐食進展が加速する加速期がある。使用限界状態で問題となる時期は、ひび割れが発生する進展期であり、それもひび割れモードにより大きく異なる。ひびわれモードは、鉄筋径、間隔、かぶり、コンクリート強度により変化することが自明であり、たとえば、鉄筋間隔が狭い場合、鉄筋同士を結んだ水平ひび割れのはく離となるのに対し、間隔が大きい場合、鉄筋に沿ったひび割れとなる。鉄筋同士が間隔が大きい場合、かぶりによりひび割れモードは異なる。かぶりが小さい場合ははく離ひび割れとなり、大きい場合は鉄筋に沿ったひび割れとなる。平成16年度は、ひび割れモードを調べるために試験体を作成し、乾湿繰返試験により腐食によるひび割れモードを調べた。試験体は、鉄筋間隔、かぶり、鉄筋径、コンクリート強度、鉄筋の位置を因子にひび割れモードを(1)鉄筋に沿ったひび割れ、(2)水平はく離ひび割れ(鉄筋同士を結んだひび割れ)、(3)はく離ひび割れの3種類を発生することを念頭に作成した。乾湿繰返試験は現在3ヶ月を経過しており、剥離ひび割れや鉄筋に沿ったひび割れが発生している。しかし、水平ひび割れはまだ発生していない。水平ひび割れでは、鉄筋間隔l_pに対するかぶりCの比l_p/Cが、5.0以下では水平ひび割れが卓越する計算結果となった。乾湿繰返試験では、その結果を裏付けることができた。さらに、限界となるひび割れ発生の腐食量を求めた。限界腐食量は、鉄筋に沿ったひび割れでは93mg/cm^3、はく離水平ひび割れでは68mg/cm^3となり、はく離水平ひび割れの限界腐食量の方が小さい。
原腸形成期の内胚葉は分泌性因子によって内臓中胚葉を誘引する

ショウジョウバエ胚の原腸陥入では内胚葉と中胚葉がそれぞれ別経路で陥入し、その後両者が合体する。本研究計画は、内胚葉と中胚葉が合体する過程で内胚葉から何らかの因子が放出されているという仮定に基づいている。その目的のため、ショウジョウバエ胚の原腸陥入期に、内胚葉で発現する遺伝子を、in situ画像データベースで網羅的に探索し、候補遺伝子のスクリーニングを行ってきた。その結果、アンジオテンシン転換酵素であるAnceが陥入中の内胚葉で特異的に発現することを見出し、内胚葉性の分泌因子の有力候補と考えて、変異体の表現型や他の遺伝子との制御関係等について発生遺伝学的解析を行った。Ance突然変異胚では、内臓中胚葉の分化が阻害され、内胚葉との合体が起こらないことを見出した。しかしながら、その後の詳細な遺伝子学的検討の結果、Ance突然変異系統としてストックセンターで維持されている系統には、Ance以外の変異が入っており、その変異は相補性検定の結果、内臓中胚葉の決定過程で働くjeb変異である、という予想外の事実が判明した。この発見を受けて、本年度は内胚葉そのものが形成されない突然変異系統について、内臓中胚葉形成の異常を詳細に観察することに注力した。内胚葉の決定過程の遺伝子制御の最上流に位置する接合子性遺伝子hkbとその下で活性化するsrpの両者について内臓中胚葉の発生を観察したところ、そのいずれも、内臓中胚葉の分化そのものは起きていたが、中胚葉の本体からの分離が起こらず、また、部分的な分離が起きてもその分布に著しい偏りが生じるなどの異常が生じていることがわかった。これらの研究成果の一部は、動物学会中国四国支部大会においてポスター発表を行っている。当初、内胚葉が分泌し、内臓中胚葉の発生に作用する因子としてアンジオテンシン転換酵素Anceに着目して研究を行っていた。Ance突然変異胚では内臓中胚葉の分化が全く見られないことを見出したからである。使用した変異系統は、ストックセンターから入手した研究者間で流通している系統であるが、詳細な遺伝学的解析を進める過程で、この系統の表現型は、Anceによるものではなく、別の座位の変異である可能性が高いことに気付き、その後の解析で、内臓中胚葉そのものの初期発生に不可欠なjebと同一である、という予想外の問題が相補性検定の結果明らかとなった。それを受けて、内胚葉で発現する遺伝子のスクリーニングに立ち戻って研究計画を修正したことにより、当初期待したよりも研究の進行がやや遅れた。現時点で研究計画の変更は必要なく、計画に沿って研究を進めていく。具体的には、内胚葉で発現する遺伝子で、内臓中胚葉の発生、および内胚葉そのものの発生に関係する遺伝子のスクリーニングを引き続き行うとともに、内胚葉欠失変異胚における内臓中胚葉発生の詳細な解析を継続して行う方針である。また、内胚葉性の遺伝子をスクリーニングする過程で、内胚葉の後半部でのみ発現する遺伝子が見つかり、この遺伝子が原腸形成や中腸の発生にどのような役割を果たしているか、検討を始めている。当初の研究計画からはやや副産物的な発見と言えるが、内胚葉と中胚葉の相互作用による原腸形成、という観点から同じ学術的意義があると考えており、研究計画に沿った実験と並行して進めていく方針である。

使用した変異系統は、ストックセンターから入手した研究者間で流通している系統であるが、詳細な遺伝学的解析を進める過程で、この系統の表現型は、Anceによるものではなく、別の座位の変異である可能性が高いことに気付き、その後の解析で、内臓中胚葉そのものの初期発生に不可欠なjebと同一である、という予想外の問題が相補性検定の結果明らかとなった。それを受けて、内胚葉で発現する遺伝子のスクリーニングに立ち戻って研究計画を修正したことにより、当初期待したよりも研究の進行がやや遅れた。現時点で研究計画の変更は必要なく、計画に沿って研究を進めていく。具体的には、内胚葉で発現する遺伝子で、内臓中胚葉の発生、および内胚葉そのものの発生に関係する遺伝子のスクリーニングを引き続き行うとともに、内胚葉欠失変異胚における内臓中胚葉発生の詳細な解析を継続して行う方針である。また、内胚葉性の遺伝子をスクリーニングする過程で、内胚葉の後半部でのみ発現する遺伝子が見つかり、この遺伝子が原腸形成や中腸の発生にどのような役割を果たしているか、検討を始めている。当初の研究計画からはやや副産物的な発見と言えるが、内胚葉と中胚葉の相互作用による原腸形成、という観点から同じ学術的意義があると考えており、研究計画に沿った実験と並行して進めていく方針である。実験計画では内胚葉が産生する分泌性因子について、計画段階で期待の持てる候補遺伝子Anceを突き止めており、その分子遺伝学的解析に経費を使う予定であったが、当該遺伝子の突然変異系統として流通している系統が、別の座位に変異を持っていること、および、内臓中胚葉の欠損が、Ance座位ではなく別の座位の変異によることがわかり、実験計画の一部見直しを行ったことによる。繰越し額については、当初の使用計画を踏襲し、核酸用試薬、及び、飼育培地の経費に充てる。
副腎アルドステロン合成酵素の発現制御を基盤とした糖尿病性腎症の新規治療法の開発

本研究で我々は、ヒト副腎H295R細胞においてD-glucoseによる高血糖刺激が、転写因子Nurr-1を介してアルドステロン合成酵素(CYP11B2)遺伝子のプロモーター活性・mRNA発現を増強し、その結果としてアルドステロン分泌を亢進させることを初めて明らかにした。本研究結果から、糖尿病患者における高血糖状態が、アルドステロンの分泌増加を介して高血圧・動脈硬化や糖尿病性腎症の進展に関与している可能性が強く示唆された。1)高血糖刺激によるCYP11B2発現・アルドステロン分泌亢進メカニズムの解明:i)DNAマイクロアレイ:我々は、高血糖刺激+/-後のヒト副腎H295R細胞からRNAを抽出した後に、DNAマイクロアレイを施行した。その結果、アルドステロン合成酵素CYP11B2の発現亢進が確認されたことに加え、カルシウムシグナル伝達に関与する多くの遺伝子の変動が認められた。ii)定量PCR:高血糖刺激+/-後のヒト副腎H295R細胞から抽出したRNAを用いて定量PCRを行ったところ、CYP11B2の発現亢進の他、T型カルシウムチャネルや転写因子Nurr1やNGFIBの発現亢進が認められた。iii)細胞内Ca2+測定:高血糖刺激下のH295R細胞にアンジオテンシンIIや塩化カリウムを投与したところ、非刺激下の場合に比して細胞内Ca2+の上昇が認められた。iv)阻害剤実験:Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMK)阻害薬であるKN-93の添加により、高血糖誘導性のCYP11B2発現亢進の抑制が認められた。また、カルシウムチャネルブロッカー(特にL/T型)によっても高血糖誘導性のCYP11B2発現亢進の抑制が認められた。2)iNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウス腎病変とcyp11b2発現・アルドステロン分泌の連関の検討:我々は、生後8週間の野生型マウス、iNOS TGマウス、iNOS/RAGEダブルTGマウスから腎臓を摘出した後にRNAを抽出し、現在cyp11b2の定量PCRを施行中である。尿中アルドステロン測定に関しては、ELISA前に尿中アルドステロンを抽出する必要があり、現在、その条件検討が終了したところである。また、同RNAを用いて、DNAマイクロアレイも施行し、現在得られた結果の解析中である。1)高血糖刺激によるCYP11B2発現・アルドステロン分泌亢進メカニズムの解明:CYP11B2プロモーター領域のdeletion mutants/pointmutantを用いた検討から、副腎H295R細胞における高血糖刺激によるCYP11B2発現誘導が、同領域内-766/-759のNBRE-1を介して招来されることが明らかとなった。各種転写因子の発現変動を検討したところ、NBRE-1に結合する転写因子であるNURR1のmRNA発現が、高血糖刺激により著明に誘導されることが示された。NURR1のsiRNAをH295R細胞に添加したところ、高血糖刺激によるCYP11B2発現誘導が有意に抑制されることが認められた。以上の結果から、高血糖刺激により発現が誘導されたNURR1がNBRE-1を介してCYP11B2の発現を誘導することが明らかとなった。2)iNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウス腎病変とcyp11b2発現・アルドステロン分泌の連関の検討:我々は、野生型マウス、iNOS TGマウス、ならびにiNOS/RAGEダブルTGマウスのそれぞれに、離乳後から高タンパク・高カロリー食を投与し、定期的に尿中アルブミン・血糖値を測定した後に16週齢でsacrificeを行った。その際にDynabeads®を灌流することにより腎臓から糸球体を単離し、RNAの抽出を行った。それらのRNAを用いてDNAマイクロアレイを施行し、パスウェイ解析を行った。3)高血糖刺激によるCYP11B2発現亢進を抑制する新規薬剤のスクリーニング:昨年度に作成したCYP11B2プロモーター安定発現株(Mol Cell Endocrinol. 2014; 383: 60-68)を用いて、アンジオテンシンIIおよび塩化カリウム刺激を指標としたハイスループットスクリーニング(HTS)系を確立した。糖尿病患者は高頻度に高血圧を合併しているが、高血圧と高血糖の間の連関は未だ不明の点が多い。本連関を解明する一環として、我々は高血糖刺激がアルドステロン合成酵素遺伝子(CYP11B2)発現に及ぼす影響を検討した。興味深いことに、高血糖刺激(D-glucose)が刺激時間・濃度依存的にヒト副腎H295R細胞においてCYP11B2プロモーター活性・mRNA発現を増強することが見出された。CYP11B2プロモーターdeletion mutantsを用いた解析から、本作用はCYP11B2プロモーター上のNBRE-1領域を介する可能性が示唆された。このNBRE-1に結合する転写因子であるNurr-1とNGFIBも、D-glucose刺激によりmRNA量の増加を示した。更に、D-glucose刺激によるアルドステロン分泌量の増加や細胞内Ca濃度の増加も認められた。

D-glucoseによるCYP11B2増強作用はARBやPKC-β阻害薬(LY333531)の添加によって抑制されなかった一方で、CaMK阻害薬(KN93)により抑制された。また、Ca拮抗薬はいずれも同作用を抑制したが、T/L型Ca拮抗薬(塩酸ベニジピン)の作用が最も強力であった。さらにD-glucoseによるT型CaチャネルmRNA量の発現増加も認められた。以上の結果から、高濃度D-glucose刺激はT型Caチャネルの発現増加を介してCaMKの活性化、Nurr-1・NGFIBの発現増強、ならびにNBRE-1領域の転写活性亢進を介して、CYP11B2発現を誘導すると考えられた。本作用はアルドステロンの分泌増加を介して高血圧・動脈硬化の進展に関与する可能性が示唆された。本研究で我々は、ヒト副腎H295R細胞においてD-glucoseによる高血糖刺激が、転写因子Nurr-1を介してアルドステロン合成酵素(CYP11B2)遺伝子のプロモーター活性・mRNA発現を増強し、その結果としてアルドステロン分泌を亢進させることを初めて明らかにした。本研究結果から、糖尿病患者における高血糖状態が、アルドステロンの分泌増加を介して高血圧・動脈硬化や糖尿病性腎症の進展に関与している可能性が強く示唆された。研究実績の概要で示した様に、まず「1)高血糖刺激によるCYP11B2発現・アルドステロン分泌亢進メカニズムの解明」に関しては、当初の予定より更に詳細な検討を行うことが可能となり、高血糖刺激によるCYP11B2発現亢進におけるNURR1の関与を明らかにすることが出来た。「2)iNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウス腎病変とcyp11b2発現・アルドステロン分泌の連関の検討」に関しては、当初の予定には記載されていなかったDNAマイクロアレイ・パスウェイ解析を、これらマウスの単離糸球体から抽出したRNAを用いて施行することが技術的に可能となり、今後、各ステージの糖尿病性腎症における特異的な遺伝子発現変動が明らかとなることが期待される。「3)高血糖刺激によるCYP11B2発現亢進を抑制する新規薬剤のスクリーニング」に関しては、CYP11B2プロモーター安定発現株を用いたHTS系が確立し、東京大学創薬オープンイノベーションセンターからご譲渡頂いた化合物ライブラリーを用いてのスクリーニングが順調に進んでいる。以上の結果から、本プロジェクトはおおむね順調に進んでいると判断した。内分泌・代謝学平成27年度は、これまでの年度に引き続いて、iNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウスを用いた糖尿病性腎症の病態解明を進めるとともに、CYP11B2プロモーター安定発現株を用いたHTS系にて化合物ライブラリーのスクリーニングを進め、得られたヒット化合物の合成展開を行う。さらに、それら新規薬剤のiNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウスへの早期の投与実験を目指す。研究実績の概要で示した様に、1)高血糖刺激によるCYP11B2発現・アルドステロン分泌亢進メカニズムの解明の、i)DNAマイクロアレイ、ii)定量PCR、iii)細胞内Ca2+測定、iv)阻害剤実験に関しては、予定していた研究を全て遂行する事が出来た。2)iNOS TGマウス・iNOS/RAGEダブルTGマウス腎病変とcyp
結晶性高分子による自己組織化ダイナミクス

本研究では、典型的なソフトマテリアルである結晶性高分子の高次構造に見られる自己組織化ダイナミクスを明らかにすることを目的とした。高分子の結晶化では単純液体では出現し得ない非常に複雑で多彩な高次構造が自己組織化される。その典型的な例として、融液からの高分子球晶の成長において、数μm数+μm程度の幅を持つ同心円状の周期構造(いわゆる標的パターンと類似のもの)が自発的に出現することが知られている。本研究では、まず電子顕微鏡による観察と電子線回折により、周期構造の原因となるラメラ状微結晶間のねじれについて明らかにすることを目的とした。具体的には、分子構造にカイラリティーのないポリフッ化ビニリデン(PVDF)において、どのようにしてラメラ状微結晶間のねじれが生じるのかを、単結晶の3次元的形態の電子顕微鏡による観察で明らかにした。実験は、非晶性高分子であるポリエチルアクリレートとのブレンド物からの結晶化を行い、電子顕微鏡による明視野、暗視野、電子線回折像を観察した。電子顕微鏡内で傾斜された単結晶からの暗視野、電子線回折像から、PVDF単結晶における分子鎖の傾斜が確認され、この分野で論争になっていた傾斜の有無について最終結論を得た。また、同心円状のパターンが見られる結晶化条件では、単結晶の3次元形態が椅子型になることが初めて見いだされた。電子顕微鏡法によって得られるこれらの知見に加え、原子間力顕微鏡による球晶表面の観察を行った結果、以下のことが明らかになった。まず、球晶表面でのラメラ状微結晶のねじれが実際に確認された。さらに、捻れ方に関して、球晶の中心から成長する上記の椅子型結晶で期待される捻れ方の整合構造が確認された。以上の結果を総合し、分子構造にカイラリティーのないポリフッ化ビニリデンのバンド球晶では椅子型結晶における歪みが周期的パターンの構成要素を作り出す要因であることが明らかになり、この分野における長年の課題であった周期構造の由来を明らかにすることができた。その典型的な例として、融液からの高分子球晶の成長において、数μm数十μm程度の幅を持つ同心円状の周期構造(いわゆる標的パターンと類似のもの)が自発的に出現することが知られている。本年度の研究では、光学顕微鏡・電子顕微鏡による観察と電子線回折により、周期構造の原因となるラメラ状微結晶間のねじれについて明らかにすることを目的とした。また、同心円状のパターンが見られる結晶化条件では、単結晶の3次元形態が椅子型になることが初めて見いだされ、椅子型結晶における歪みが周期的パターンの構成要素を作り出す要因であることを明らかにできた。これらの知見を元にして、ソフトマテリアルの特徴であるflexibilityが顕著に現れていると考えられる結晶内部における応力場の影響により、巨視的な同心円状のパターンの生々機構を明らかにするという立場で来年度の研究を進めていく。

以上の結果を総合し、分子構造にカイラリティーのないポリフッ化ビニリデンのバンド球晶では椅子型結晶における歪みが周期的パターンの構成要素を作り出す要因であることが明らかになり、この分野における長年の課題であった周期構造の由来を明らかにすることができた。本研究では、典型的なソフトマテリアルである結晶性高分子の高次構造に見られる自己組織化ダイナミクスを明らかにすることを目的とした。高分子の結晶化では単純液体では出現し得ない非常に複雑で多彩な高次構造が自己組織化される。その典型的な例として、融液からの高分子球晶の成長において、数μm数十μm程度の幅を持つ同心円状の周期構造(いわゆる標的パターンと類似のもの)が自発的に出現することが知られている。本研究では、まず電子顕微鏡による観察と電子線回折により、周期構造の原因となるラメラ状微結晶間のねじれについて明らかにすることを目的とした。具体的には、分子構造にカイラリティーのないポリフッ化ビニリデン(PVDF)において、どのようにしてラメラ状微結晶間のねじれが生じるのかを、単結晶の3次元的形態の電子顕微鏡による観察で明らかにした。実験は、非晶性高分子であるポリエチルアクリレートとのブレンド物からの結晶化を行い、電子顕微鏡による明視野、暗視野、電子線回折像を観察した。電子顕微鏡内で傾斜された単結晶からの暗視野、電子線回折像から、PVDF単結晶における分子鎖の傾斜が確認され、この分野で論争になっていた傾斜の有無について最終結論を得た。また、同心円状のパターンが見られる結晶化条件では、単結晶の3次元形態が椅子型になることが初めて見いだされた。電子顕微鏡法によって得られるこれらの知見に加え、原子間力顕微鏡による球晶表面の観察を行った結果、以下のことが明らかになった。まず、球晶表面でのラメラ状微結晶のねじれが実際に確認された。さらに、捻れ方に関して、球晶の中心から成長する上記の椅子型結晶で期待される捻れ方の整合構造が確認された。
ADF/human Thiredoxinの犬肺移植における再灌流障害抑制効果

肺移植後のgraft failure,肺水腫は再灌流時に発生する活性酸素が主な原因と原因と考えられている。この様な再灌流障害を抑制することは移植医療における少ないドナー臓器のvibilityを保つうえで非常に重要である。ADF(Adult T-Cell Leukemia derived Factor)は生体内における酸化還元反応を調節するhuman thiredoxinであることが明らかにされた。本研究では犬左肺移植モデルを用いて、温阻血後の再灌流障害に対するADF,既知noスカンベンジャーであるn-acetylcyteine(NAC)の効果について検討した。19頭の雑種成犬に対し100分の温阻血後、左肺同種移植を行った。再灌流後130分間移植肺の機能を測定した。ADF群(n=6)では30mg/kgのADFが再灌流中に経静脈的に投与された。NAC群(n=5)では150mg/kgのNACが同様に投与された。コントロール群(n=8)ではPBSのみが投与された。ADF,NAC群ではコントロール群と比較して有意に良好な酸素化能を示した。組織学的にも、ADF,NAC群の肺は正常構造を保っていたが、コントロール群では著名な肺水腫の所見が見られた。また、Ex-vivoラット肺灌流モルにおけるADFの効果を検討した。90分、37°Cの虚血においたラット肺をKrebs-Heneleit液で灌流し、肺の機能を評価した。ADFとL-cysteinを併用した場合、肺の虚血再灌流障害は有意に軽減されたが、ADF,L-cystein単独の投与ではその効果は認められなかった。これらの実験から、肺の虚血再灌流障害に対しADFの効果が期待された。ADFそのものに重篤な副作用がないことより、臨床肺移植においても、再灌流障害予防のために使用できる可能性がある。肺移植における術後肺水腫は再灌流時に発生する活性酸素がその主な原因と考えられている。このような再灌流障害を抑制することは移植治療における少ないドナー臓器のvibilityを保つ上で非常に重要である。ADF(adult T-cell leukemia derived factor)は生体内の酸化還元反応を調節するhuman thioredoxinであることが明らかにされた。我々はすでにラットの虚血再灌流モデルにおいてこのADFがラジカルスカベンジャー効果を持つことを明らかにしている。本研究の目的は、雑種成犬を用いた同種左肺移植モデルにおいて、このADFの虚血再灌流障害抑制効果を検討することである。我々はすでに雑種成犬を用いた自家左肺移植において温阻血の許容時間は120分間であることを確認している。雑種成犬に左肺移植を行なうモデルで温阻血後の再灌流障害に対するADFの効果を検討した。100分の温阻血の後に左肺移植を行ない、ADF(30mg/kg)を再灌流直前から30分かけて投与した。移植後10,40,70,130分後の移植肺の酸素可能はコントロール群では125±30、125±21、145±22、96±10mmHg(Fi02=0.5)と低下したが、ADF群では256±29、263±36、261±35、260±33mmHgと保たれており、ADFの効果が明らかになった。ADFの肺移植後再灌流障害に対する効果は明らかになり、平成6年度の目標はおおかた達成された。以後は予定通り、長期保存後の再灌流障害に対するADFの効果を検討する予定である。

ADFそのものに重篤な副作用がないことより、臨床肺移植においても、再灌流障害予防のために使用できる可能性がある。肺移植後のgraft failure,肺水腫は再潅流時に発生する活性酸素が主な原因と原因と考えられている。この様な再潅流障害を抑制することは移植医療における少ないドナー臓器のvibilityを保つうえで非常に重要である。ADF(Adult T-cell Leukemia derived Factor)は生体内における酸化還元反応を調節するhuman thioredoxinであることが明らかにされた。本研究では犬左肺移植モデルを用いて、温阻血後の再潅流障害に対するADF、既知のスカベンジャーであるN-acetylcyteine(NAC)の効果について検討した。19頭の雑種成犬に対し100分の温阻血後、左肺同種移植を行った。再潅流後130分間移植肺の機能を測定した。ADF群(n=6)では30mg/kgのADFが再潅流中に経静脈的に投与された。NAC群(n=5)では150mg/kgのNACが同様に投与された。コントロール群(n=8)ではPBSのみが投与された。ADF,NAC群ではコントロール群と比較して有意に良好な酸素化能を示した。組織学的にも、ADF,NAC群の肺は正常構造を保っていたが、コントロール群では著明な肺水腫の所見が見られた。また、Ex-vivoラット肺潅流モデルにおけるADFの効果を検討した。90分、37°Cの虚血においたラット肺をKrebs-Heneleit液で潅流し、肺の機能を評価した。ADFとL-cysteinを併用した場合、肺の虚血再潅流障害は有意に軽減されたが、ADF,L-cystein単独の投与ではその効果は認められなかった。これらの実験から、肺の虚血再潅流障害に対しADFの効果が期待された。ADFそのものに重篤な副作用がないことより、臨床肺移植においても、再潅流障害予防のために使用できる可能性がある。
光環境に応答する抗菌性バイオアクティブＴｉ金属の創製

NaOH-NH4OH-加熱処理チタンはSBF中でその表面にアパタイトを形成したが、NaOH-HNO3-加熱処理チタンはアパタイトを形成しなかった。NaOH-NH4OH-加熱処理チタン表面に形成されたアナターゼ型TiO2にはごく少量のNが含まれ、NaOH-NH4OH-加熱処理チタンは、可視光下において、未処理チタンあるいはNaOH-HNO3-加熱処理チタンよりもやや多量のメチレンブルーを分解した。以上より、チタンをNaOH処理後、NH4OHで処理し、さらに加熱処理すれば、同金属に生体活性と可視光下での光触媒活性を付与させ得ることが分かった。人工関節置換術や脊椎固定術における術後感染は、最悪の場合インプラントの再置換が必要になり、患者の大きな負担となる。そこで、インプラント表面に抗菌性を付与し、感染症を予防すること目的とした研究が広く行われている。我々は体内蓄積の不安がない光触媒系の物質に注目した。光触媒系の物質の中でも、窒素ドープ型酸化チタンが可視光に応答して抗菌性を示すことが既にわかっているため、人工関節などに多く用いられているチタン金属表面に窒素ドープ型酸化チタンを導入することを試みた。また、その金属のアパタイト形成能を評価した。10×10×1 mm3のチタン金属を#400のダイヤモンドシートで研磨した後、アセトンおよび超純水で10分間超音波洗浄した。これを5M NaOH水溶液5 mlに60°Cで24時間浸漬した後、0.11.0M硝酸あるいは尿素7 mlに40°Cで24時間浸漬した。その後試料を600°Cで1時間加熱した。チタン金属にNaOH処理を施すと表面にチタン酸ナトリウムが形成した。この試料に硝酸(0.11.0M)処理および加熱処理を施すと、試料表面にルチル型酸化チタンが形成した。また、0.1Mで硝酸処理を施した試料のみアナターゼ型酸化チタンも形成した。また、硝酸処理によって窒素原子がわずかに導入されていた。SBF中でのアパタイト形成能評価を行った結果、0.1Mで硝酸処理を行った試料のみアパタイトが形成した。また、同試料は、可視光下において少量のメチレンブルー(MB)を分解した。一方、チタン金属にNaOH、尿素(0.11.0M)および加熱処理を施すと、尿素の濃度にかかわらず全ての試料表面にルチル型およびアナターゼ型酸化チタンが形成したが、可視光照射によるMB分解反応は確認できなかった。以上より、NaOH処理後に硝酸処理を施すことでチタン表面に窒素原子が導入された酸化チタン層を形成させることができ、同処理チタンは可視光下での光触媒特性を示すことがわかった。本研究では、チタン(Ti)金属をNaOH処理後、アンモニア水(NH4OH)あるいは硝酸(HNO3)処理し、さらに加熱処理することにより、同金属表面に窒素ドープTiO2層を形成させることを試み、得られた試料の表面構造、擬似体液(SBF)中でのアパタイト形成能および可視光下での光触媒特性(メチレンブルー(MB)分解特性)を調べた。これら処理を施した試料をSBFに浸漬したところ、NaOH-NH4OH-加熱処理試料はアパタイトを形成したが、NaOH-HNO3-加熱処理試料はアパタイトを形成しなかった。NaOH-HNO3-加熱処理試料がアパタイトを形成しなかったのは、NaOH処理によって形成された表面層が高濃度のHNO3処理によって溶解したためと考えられる。また、NaOH-NH4OH-加熱処理試料は、未処理あるいはNaOH-加熱処理試料に比べ、やや多量のMBを分解した。以上より、Ti金属をNaOH処理後、NH4OHで処理し、さらに加熱処理すれば、同金属にアパタイト形成能と可視光下での光触媒活性を付与させ得ることが明らかとなった。平成24年度の研究により、Ti金属をNaOH処理後、NH4OHで処理し、さらに加熱処理すれば、同金属にアパタイト形成能と可視光下での光触媒活性を付与させ得ることが明らかとなった。また、この成果を学会にて発表し、特許を出願した。さらに、NaOH-H2SO4-加熱処理Ti金属に関しても、基礎的な知見が得られた。従って、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。今後、NaOH-NH4OH-加熱処理Ti金属については、その最適条件を明らかにし、NaOH-H2SO4-加熱処理したTi金属については、そのアパタイト形成能および可視光下でのメチレンブルー分解特性を調べる。また、良好なメチレンブルー分解特性を示したTi金属について、抗菌性試験および細胞適合性評価を行う。次年度の研究費は、主にTi基板、薬品類、実験器具類として使用する。これは、Ti基板の最適な処理条件を追究し、抗菌性試験および細胞適合性試験を円滑に遂行するために必要である。
菊池病(組織球性壊死性リンパ節炎)の病因、増殖細胞の特異性と進展機構の解明

400例を越える症例についての臨床像については、これまでに得られている成績と同様に若年成人女性の頚部に主に見られ、白血球減少を伴い、一部に皮疹を認めるという臨床像は同様であった.組織学的には、芽球化細胞が増加し、壊死の傾向に乏しい基本的な組織像を示す症例が増加している.病変部に多数みられるアポトーシスを示す細胞は主に増殖しているCD8陽性細胞であり、アポトーシスの形式はgranzime B,perforinが関与する系とfas,fas ligandが関与する2つの系ともに見られることが明らかとなった.このことは本疾患の発生機転にウイルスの関与を示唆する成績であった.ヒトヘルペスウイルス6型については、特にこれまでの成績と差異は見られないが、同ウイルス急性感染で皮疹とリンパ節腫大を示した若年成人の症例のリンパ節病変は、傍皮質拡大を示し、免疫芽球反応を示すウイルス感染像を示したが、本疾患と同様な病変を認め得なかった.最近幾つかの報告のみられるパルボウイルスB19との関連に関しては、本疾患症例のリンパ節では、免疫反応陽性細胞の存在を認めるが、陽性反応を示す細胞は病変部よりむしろ非病変部に多く、さらに本疾患以外のリンパ節にも同様な反応を示す細胞を多く認め、その出現率に差異を認めないことから、非特異的な不顕性感染と考えられ、本疾患との関連は明らかでなかった.HLAとの関係については80例のリンパ節より抽出したDNAについて検索中である.A11ならびにDR12が高率に見られ、A24の頻度が低いとの成績はあるがDRB,DQA,DBならびにDR-DQ,DQA-DQBの連鎖平衡に関しての検討では日本人の平均的頻度分布との間に有意差は見られなかった.DQA-1-0103,0302,DQB1-0601は比較的高率に、そしてDQA-1-DQB1の連鎖平衡では0103-0601が高率に見られた.検索症例はすでに400例を越えたが、その臨床像については、これまでに得られている成績との違いはなかった.ただ最近の症例では男性の比率が増加している.組織学的には、芽球化細胞が増加し、壊死の傾向に乏しい基本的な組織像を示す症例の比率が増加し、広範な壊死を示す症例や、泡沫細胞の多い症例は減少している.また病変部に多数みられるアポトーシスを示す細胞は主に増殖しているCD8陽性細胞であることを明らかにし得た.ヒトヘルペスウイルス6型については、特にこれまでの成績と差異は見られないが、同ウイルス急性感染で皮疹とリンパ節腫大を示した若年成人の症例のリンパ節病変は、傍皮質拡大を示し、免疫芽球反応を示すウイルス感染像を示したが、本疾患と同様な病変を認め得なかった.最近幾つかの報告のみられるパルボウイルスB19との関連に関しては、本疾患症例のリンパ節では、免疫反応陽性細胞の存在を認めるが、陽性反応を示す細胞は病変部よりむしろ非病変部に多く、さらに本疾患以外のリンパ節にも同様な反応を示す細胞を多く認めその出現率に差異を認めないことから、非特異的な不顕性感染と考えられ、本疾患との関連は明らかでなかった.SLEとの関連に関しても従来注目されているが、自験例では好中球反応に差異が見られること、SLEの診断基準に一致する症例では壊死が強いことから多くの症例で組織学的に鑑別可能であった.ただその発生機転に何らかの類似性を有する可能性は否定できず、この点については検討の必要がある.HLAとの関係については80例のリンパ節より抽出したDNAについて検索中であるが、A11ならびにDR12が高率に見られ、A24の頻度が低いとの成績はあるが他の抗原に関しても検討中であるがまだ明らかな成績は得られていない.400例を越える症例についての臨床像については、これまでに得られている成績と同様に若年成人女性の頚部に主に見られ、白血球減少を伴い、一部に皮疹を認めるという臨床像は同様であった.組織学的には、芽球化細胞が増加し、壊死の傾向に乏しい基本的な組織像を示す症例が増加している.病変部に多数みられるアポトーシスを示す細胞は主に増殖しているCD8陽性細胞であり、アポトーシスの形式はgranzime B,perforinが関与する系とfas,fas ligandが関与する2つの系ともに見られることが明らかとなった.このことは本疾患の発生機転にウイルスの関与を示唆する成績であった.ヒトヘルペスウイルス6型については、特にこれまでの成績と差異は見られないが、同ウイルス急性感染で皮疹とリンパ節腫大を示した若年成人の症例のリンパ節病変は、傍皮質拡大を示し、免疫芽球反応を示すウイルス感染像を示したが、本疾患と同様な病変を認め得なかった.最近幾つかの報告のみられるパルボウイルスB19との関連に関しては、本疾患症例のリンパ節では、免疫反応陽性細胞の存在を認めるが、陽性反応を示す細胞は病変部よりむしろ非病変部に多く、さらに本疾患以外のリンパ節にも同様な反応を示す細胞を多く認め、その出現率に差異を認めないことから、非特異的な不顕性感染と考えられ、本疾患との関連は明らかでなかった.HLAとの関係については80例のリンパ節より抽出したDNAについて検索中である.

A11ならびにDR12が高率に見られ、A24の頻度が低いとの成績はあるがDRB,DQA,DBならびにDR-DQ,DQA-DQBの連鎖平衡に関しての検討では日本人の平均的頻度分布との間に有意差は見られなかった.DQA-1-0103,0302,DQB1-0601は比較的高率に、そしてDQA-1-DQB1の連鎖平衡では0103-0601が高率に見られた.400例を越える症例についての臨床像については、これまでに得られている成績と同様に若年成人女性の頚部に主に見られ、白血球減少を伴い、一部に皮疹を認めるという臨床像は同様であった.組織学的には、芽球化細胞が増加し、壊死の傾向に乏しい基本的な組織像を示す症例が増加している.病変部に多数みられるアポトーシスを示す細胞は主に増殖しているCD8陽性細胞であり、アポトーシスの形式はgranzime B,perforinが関与する系とfas,fas ligandが関与する2つの系ともに見られることが明らかとなった.このことは本疾患に見られるアポトーシスの発生機転は単一の経路でないことを示すものであり、このことはさらにアポトーシスにウイルスの関与を否定できない成績であった.ヒトヘルペスウイルス6型については、特にこれまでの成績と差異は見られないが、同ウイルス急性感染で皮疹とリンパ節腫大を示した若年成人の症例のリンパ節病変は、傍皮質拡大を示し、免疫芽球反応を示すウイルス感染像を示したが、本疾患と同様な病変を認め得なかった.HLAとの関係については80例のリンパ節より抽出したDNAについて検索した.A11ならびにDR12が高率に見られ、A24の頻度が低いとの従来の成績の確認がなされたが、DRB,DQA,DBならびにDR-DQ,DQA-DQBの連鎖平衡に関しての検討では日本人の平均的頻度分布との間に有意差は見られなかった.またDQA-1-0103,0302,DQB1-0601は比較的高率に、そしてDQA-1-DQB1の連鎖平衡では0103-0601が高率に見られた.今後はさらにAについても連鎖平衡の解析を行うとともに、本疾患の発生が希である白人に於けるHLAとの差異についての解析を行い、本疾患と関連の深いHLA型の存在ならびにその意義について明らかにする予定である.
液胞へのたんぱく質輪送経路の分子メカニズムの解明〜SNARE分子を中心にして〜

シロイヌナズナゲノム中に存在する全SNARE分子の細胞内局在の決定シロイヌナズナゲノムデータベースよりSNARE分子をコードする遺伝子を54種類同定した。これらを配列の類似性を元にして5種類(Qa,Qb,Qc,R,SNAP)に分類し、それぞれの遺伝子が実際発現しているかを、RT-PCR法を用いて確認した。その結果、R-SNAREの一種であるYKT61を除く、全てのSNAREをコードする遺伝子が何らかの組織で発現していた。これらのSNAREの細胞内での局在を調べるために、mRNAより逆転写酵素によってcDNA合成し、それらを鋳型としてPCR法によりDNAを合成した後、GFP融合タンパク質を発現するためのベクターp35S-GFP/pUCβにGFPの読み枠とイン・フレームになるように結合した。このようにして作成した融合タンパク質発現用ベクターをシロイヌナズナの培養細胞に一過的に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡によって、細胞内局在の観察を行った。その結果、小胞体に存在するSNAREが6種類、ゴルジ体に局在するSNAREが9種類、トランスゴルジ網に局在するSNAREが8種類、エンドソームには2種類、細胞膜には20種類、液胞膜には9種類のSNAREが、それぞれ存在することが明らかとなった。この研究により、細胞内小器官全てのSNARE分子の同定に成功した。細胞内小器官の中で、特に細胞膜には多くのSNAREが存在するととが明らかとなったが、これは細胞膜への極性輸送、細胞周期的な発現の違いなどを考えると、それぞれの条件、あるいは輸送経路に特有のSNARE分子があることが予想され、非常に興味深い結果である。今後、これら細胞膜上のSNAREを発現する遺伝子組み換えシロイヌナズナを用いて、極性輸送と,SNAREの関係について調べていく予定である。高等植物細胞は、高度に発達した細胞内小器官(オルガネラ)を持ち、それらのオルガネラにタンパク質を輸送するための複雑な細胞内小胞輸送システムを持つ。一方、輸送小胞が標的オルガネラが融合するためには、それぞれの輸送経路に特異的なSNARE分子が必要であることが判っているが、高等植物のモデルであるシロイヌナズナのゲノム中には全部で54種類のSNARE分子をコードする遺伝子が存在するが、それらの局在の大部分は不明である。私は、これらSNARE分子の局在を調べる目的で、それぞれのSNAREタンパク質とGFPとの融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、それらをシロイヌナズナ培養細胞に導入後、共焦点レーザー顕微鏡により観察することにより、各SNARE分子の細胞内局在を決定した。それと同時に、他の生物種のSNARE分子との系統解析を行うことにより、細胞内局在とSNARE分子の進化の関係についても解析を行った。その結果、Qa,Qb,Qcに属するSNARE分子はそれぞれ他の生物種との間に配列の類似性と細胞内局在の相関が認められたが、R/VAMPファミリーに属するSNAREは、配列の類似性と細胞内局在の明確な相関は認められなかった。Qa,Qb,Qc-SNAREはオルガネラに局在するSNARE,R/VAMPは輸送小胞に存在するSNAREであることを考えると、真核生物では、それぞれの門が分化する前にオルガネラの進化が完了し、種分化が起こった後に、細胞内輸送経路がそれぞれの種において進化したことを示唆している。
Bリンパ球の増殖分化と細胞内シグナル伝達の分子論的解析

TRF/IL-5(以下IL-5と略す)はBリンパ球増殖分化因子として単離されたが、骨髄細胞に作用し好酸球を成熟させたり未熱Tリンパ球CTLへの分化を促進するコファクタ-としても作用する。本研究により、IL-5がIgA産生の増強することを明らかにした。抗原感作マウスの脾臓よりB細胞を調製し抗原とIL-5を添加しIgA産生を調べたところ、IL-5は表面IgA陽性B細胞に抗原と共に作用し、抗原に特異的なIgA産生を誘導することがわかった。他のサイトカインにこのような作用はなかった。精製B多細胞をリポ多糖体で刺激する系においてはIL-5のみならず、TGF-βもIgA産生を促進し、IL-5とTGF-βは相加的にIgA産生を増強した。この場合TGF-βは表面IgA陰性に作用しIgA産生を増強し、IL-5はこの過程にも相加的に作用した。このようにIL-5はTGF-βとは異なる機構によりIgA産生を増強させることが判明した。次にIL-5レセプタ-(IL-5)の物性を調べた。IL-5応答性株化B細胞(T88-M)は2種類のIL-5Rを発現していた。この細胞の膜画分でラットを免役しその脾細胞とマウス骨髄腫細胞を細胞融合し、抗IL-5R抗体(H7、T21)を作製した。H7抗体は分子量約60kdの蛋白を認識し、その蛋白はIL-5結合性を有することが明らかとなった。H7はIL-5の生物活性を完全に阻害する。H7を用いた膜蛍光抗体法により正常細胞亜集団を検索したところ、Ly-1陽性の膜腔内B細胞がH7陽性であり、IL-5に応答しIgM産生細胞に分化することが明らかとなった。このような特異性を示す抗体の作製は世界で初めてであり、現在この抗体を用いてIL-5R遺伝子のクロ-ニングをしている。2年間に目的の研究課題を順調に達成した。TRF/IL-5(以下IL-5と略す)はBリンパに球増殖分化因子として単離された。しかしながらIL-5はBリンパ球のみならず未熟Tリンパ球や骨髄の好酸球前駆細胞に作用しそれらの増殖、分化を促進することも判明した。本研究においては、Bリンパ球の増殖分化に関し、IL-5とそのレセプター系を中心に解折した。IL-5遺伝)を導入した細胞を培養し、その上清よりIL-5抗体カラムおよびHPLCシステムを用いIL-5を精製し実験に供した。本年度は(i)Tリンパ球-Bリンパ球の直接接触型抗体産生系においてもIL-5が重要な役割を果していることをIgA産生を中心に明らかにした。(ii)骨髄細胞を試験管内で培養する系にIL-5を添加し、骨髄細胞からのBリンパ球、好酸球、マクロファージなどへの増殖分化に対しIL-5に感受性のstageがあること、IL-5に依存性に増殖する初期株化B細胞の樹立をした。(iii)放射標識精製IL-5を用い、IL-5応答性細胞の膜表面上にはIL-5を特異的に反応するレセプターが存在すること、IL-5のレセプターへの結合は37°C