hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞免疫記憶に関する細胞外環境の解析

【目的】免疫記憶の中心的な役割を担う記憶T細胞は、臓器特異的に存在し局所の免疫反応を司るエフェクター記憶T(T_<EM>)細胞と、超長期に生存し全身性の免疫反応に関与するセントラル記憶T(T_<CM>)細胞とに大別される。両者共にナイーブT細胞から分化することが知られているが、その存在部位が前者は臓器局所、後者はリンパ組織であるなど、その挙動は大きく異なる。従って、T_<EM>細胞とT_<CM>細胞の分化・生存に関わる細胞外環境も両者で大きく異なるものと推察される。本研究では、CD4陽性T_<EM>細胞とCD4陽性T_<CM>細胞の分化・生存の分子機構を解明し、T細胞免疫記憶構築の制御機構を明らかにすることを目的とした。【研究成果】T細胞副刺激分子0X40からのシグナルがCD4陽性T_<EM>細胞の分化・生存に関与し、CD4陽性T_<CM>細胞の分化・生存には関与しないことを見出した。従って、CD4陽性T_<EM>細胞分化・生存には、樹状細胞などの0X40リガンド発現細胞によって構築される細胞外環境が重要であることが示唆された。他方、記憶T細胞の自己複製機構として、恒常性維持増殖が知られる。最近、恒常性維持増殖にはTCRシグナル特異的な「急激な増殖反応」と、IL-7依存的な「緩徐な増殖反応」が独立に存在することが示された。我々は、0X40シグナルがCD4陽性記憶T細胞の「急激な増殖反応」は促進するが、「緩徐な増殖反応」には影響しないことを見出した。IL-7が「緩徐な増殖反応」のみに関与することから、0X40とIL-7が独立の機序でCD4陽性T_<EM>細胞恒常性維持増殖に関与するという我々の以前からの仮説が支持された。【目的】免疫系の中心的な役割を担うT細胞の発生・分化・増殖は骨髄・胸腺・二次リンパ組織などの免疫系特有の臓器で行われ、その意味でT細胞特異的細胞外環境が深く関わっている。中でも、記憶T細胞の成立・維持に関与する細胞外環境については全く不明である。記憶T細胞成立に関わるT細胞恒常性維持増殖にはレパトア競合という現象が知られ、ある特定のレパトアが生体内に十分量存在すると同一のレパトアは増殖できない。これまでの研究により、T細胞副刺激分子OX40からの細胞内シグナルがCD4陽性T細胞の生存・維持に強く関与するとともにOX40シグナルが各レパトアのニッチ拡大に関わる可能性を見出した。すなわち、T細胞恒常性維持にはレパトア特異的ニッチが存在し、ニッチを介するT細胞恒常性維持にOX40が関与すると考えられる。本研究では生体内におけるCD4陽性記憶T細胞恒常性維持に関わるニッチに必要な機能分子、特にOX40に焦点を当てて、細胞外環境因子の解明を試みる。【結果】CD4陽性T細胞移入実験系において、OX40シグナルがCD4陽性T細胞恒常性維持増殖に促進的に機能することを見出した。次に、上記CD4陽性T細胞移入実験において阻害性抗OX40L抗体および抗IL-7受容体抗体投与を行ったところ、CD4陽性ナイーブT細胞恒常性維持増殖は、抗IL-7受容体抗体投与のみでほぼ完全に抑制され、抗OX40L抗体はほとんど抑制が見られなかった。一方、CD4陽性記憶T細胞の恒常性維持増殖は、どちらかの抗体単独投与により強く抑制され、さらに両者の投与により完全に抑制された。すなわち、CD4陽性ナイーブT細胞とCD4陽性記憶T細胞恒常性維持に関わるニッチは機能的に異なる可能性が示唆された。

IL-7が「緩徐な増殖反応」のみに関与することから、0X40とIL-7が独立の機序でCD4陽性T_<EM>細胞恒常性維持増殖に関与するという我々の以前からの仮説が支持された。
ヘリコバクタ・ピロリ感染のリスク要因および感染経路に関する疫学研究

目的:本研究は、ヘリコバクタ・ピロリ(HP)感染に関連する要因を解明し、その感染経路について推定を行うことを目的としている。方法:住民を対象とした健康診査受診者に対して調査の説明を行い、承諾の得られた住民に生活歴に関する自記式質問票を配布し、IgG抗ヘリコバクタ・ピロリ抗体(HP抗体)およびIgG抗A型肝炎ウィルス抗体(HAV抗体)を測定した。結果:採血と質問票調査に応じた対象者473人(男性252人、女性221人)のうち、HP抗体陽性率は、男性で63.9%、女性で64.3%であった。HP抗体とHAV抗体の一致性に関しては、全体でカッパ値0.17とわずかな一致性が示唆されたが、性・年齢を補正したロジスティック回帰分析では両者には有意な関連が認められなかった(オッズ比1.4;95%信頼区間0.9-2.3)。質問票調査項目で有意に関連していた要因は、幼少期の猫の飼育(1,5;1.0-2.3)、最終学歴が20歳以下(2.9;1.4-6.7)、現在の猫の飼育(1.8;1.1-3.3)、胃内視鏡検査の受診歴(2.4;1.5-3.9)、十二指腸潰瘍の既往(3.1;1.2-9.6)などであった。このうち、胃内視鏡検査の既往については、検査回数が1回および2回以上のオッズ比がそれぞれ2.2および2.5と有意な量反応関係が見られた。考察:HPとHAVの感染には有意な関連が認められず、HPの感染経路はHAVとは異なる様式をとっている可能性が示唆された。最終学歴が比較的低いことに関連が見られ、社会経済状態との関連が示唆された。猫の飼育に関する知見が妥当であれば、HPの感染経路の解明や今後の感染予防の対策として意義があると考える。胃内視鏡検査受診歴については、因果関係が明らかでないものの、受診回数と関連の強さに量反応関係が認められたことから、胃内視鏡検査が原因である可能性が高いことが示唆される。
炎症性腸疾患腸管粘膜におけるsmad7発現亢進のメカニズムと新規治療法の開発

マウスCD4+ T細胞を刺激、至適濃度のサイトカインを添加、ウエスターンブロットでsmad7蛋白の発現レベルを解析した。Smad7発現はIL-1β、IFN-γ、TNF-α添加により著明に低下、TGF-β添加で増加した。消化管内視鏡下生検サンプルを用いてsmad7 mRNAの発現を定量的PCRで解析した。Smad7発現は潰瘍性大腸炎難治例活動期で発現低下していた。IL-1β、IFN-γ、TNF-αなどの炎症性サイトカインがsmad7発現抑制因子、TGF-βが促進因子と考えられた。潰瘍性大腸炎難治例では炎症性サイトカイン過剰発現によりsmad7発現が低下している可能性がある。マウス脾臓より単核球を分離し、CD4+ T細胞分離キットを用いてCD4+ T細胞を分離した。分離した細胞をin vitroで抗CD3抗体+抗CD28抗体で刺激し、7日間培養した。マウスT細胞におけるsmad7発現誘導因子の同定を目的として、7日間の培養終了前にIFN-γ(5ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)、TGF-β1 (5ng/ml)、IL-13 (20ng/ml)、IL-17 (50ng/ml)、IL-1β/IL-1F2(10ng/ml)、IL-6 (20ng/ml)をそれぞれ添加した。細胞から蛋白を抽出し、SDS-PAGEを行い、抗smad7抗体を用いたウエスタンブロットを施行した。Smad7蛋白発現レベルはサイトカイン添加により明らかな変化を認めず、これまでの所、smad7発現を誘導するサイトカインを認めていない。ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸内視鏡下生検サンプルからRNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを作成。Smad7等のmRNA発現レベルを定量的PCRで解析した。smad7 mRNAの発現レベルは潰瘍性大腸炎と対照疾患で有意差を認めなかった。また、Smad7発現レベルは潰瘍性大腸炎患者の中でステロイド抵抗性/依存性の難治例と非難治例で明らかな差を認めなかった。また、smad7が抑制するTGF-β受容体シグナル経路に関して、リガンドであるTGF-β1とsmad2/3をリン酸化するTGF-βI型受容体のmRNA発現レベルを検討した。TGF-β1発現レベルは潰瘍性大腸炎で対照疾患と比較して高く、また、TGF-β1/TGF-βI型受容体の発現比が潰瘍性大腸炎で対照疾患と比較して有意に高かった。BALB/cマウスより脾臓を摘出し、単核球を分離した。CD4+ T細胞単離キットでCD4+ T細胞を分離した。CD4+ T細胞を固相化した抗CD3抗体と可溶性抗CD28抗体で刺激、指摘濃度のIL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、TGF-βを添加し、1時間後、5時間後に細胞を採取しlysateを作成した。LysateをSDS-PAGEで電気泳動し、メンブレンに転写した。抗マウスsmad7抗体でウエスターンブロットを行ない、smad7蛋白の発現レベルを解析した。内因性コントロールとしてβ-actinを用いた。Balb/cマウスより脾臓を摘出し、単核球を分離した。マウスCD4+ T細胞分離キットでCD4+ T細胞を分離した。CD4+ T細胞を固相化した抗CD3抗体と可溶性抗CD28抗体で刺激、至適濃度のIL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、TGF-βを添加し、1時間後、5時間後に細胞を採取しlysateを作成した。抗マウスsmad7抗体でウエスターンブロットを行い、smad7蛋白の発現レベルを解析した。Smad7発現レベルはサイトカイン添加1時間後、コントロールとの比較で、IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、TGF-βの添加により、それぞれ21.4%、90.2%、32.4%、60.3%、108.8%、サイトカイン添加5時間後、それぞれ27.6%、93.4%、28.0%、13.5%、139.6%となり、IL-1β、IFN-γ、TNF-αによりsmad7の著明な発現抑制が認められるとともに、TGF-βによりsmad7発現亢進が認められた。当初、抗smad7抗体によるウエスターンブロットの条件設定が困難であったが、実験系が確立された。マウスCD4+ T細胞におけるsmad7発現抑制因子とsmad7発現促進因子を同定できた。

消化器内科学大腸炎誘導エフェクターT細胞の制御性T細胞に対する感受性の回復を目指した治療法の開発を目指して、今後、更にマウスCD4+ T細胞においてIL-10などの抑制性サイトカインにsmad7発現抑制作用がないかを検討する。マウスCD4+ T細胞で認めたsmad7発現抑制因子とsmad7発現促進因子が、ヒトCD4+ T細胞においても同様の作用を有するか検討する。マウスリンパ球におけるsmad7発現誘導サイトカインが同定できておらず、研究の進行度は当初の予定より遅れている。しかし、実験系は確立しているため、今後は必要な方策が十分とれると考えられる。残高が少なく必要な物品の購入には足りなかったため。これまでの所、検討したサイトカインにsmad7発現誘導能を認めていないが、サイトカイン添加のタイミング、T細胞刺激の回数の変更、サイトカインの組み合わせ等によりsmad7発現が誘導される可能性もあり、引き続き、現在の系で条件を変更しつつ解析を進める。Smad7発現誘導サイトカインを同定できない場合は、smad7 siRNAなどsmad7発現抑制法に切り替えて研究を進める。次年度の予算に加えて、必要な物品等を購入する。研究計画を予定通り進めたが、若干の残金が生じた。サイトカインやマウスの購入費として使用する。
非平衡せん断乱流における速度・圧力相関に関する実験的研究

本研究の目的は、非平衡せん断乱流のエネルギーバランスにおける変動圧力の寄与を実験的に解明することである。本研究では3次元大規模渦構造を含む乱流のテストケースとして翼端渦流れに着目した。翼端渦流れには旋回に伴う強い速度・圧力勾配が発生し、その非定常な揺らぎによって速度・圧力変動が引き起こされることから、乱流のエネルギーバランスにおける大規模渦構造の寄与を調査するのに適している。速度・圧力相関の寄与を解明するためには、流れの任意の位置で変動速度・圧力の同時測定を行う必要がある。従来、その正確な測定は技術的に困難であるとされていたが、本研究では小型静圧プローブもしくは全圧プローブをX型熱線流速計と組み合わせた手法を用い、これらを初めて3次元複雑乱流場に適用した。基礎的な流れでの測定手法の検証を踏まえ、翼端渦における変動速度・圧力の同時測定を行った。翼端渦の発達過程における速度3成分の同時測定結果から、翼端渦の非定常な揺らぎが定量的に示された。翼端渦における速度変動は、翼端渦断面方向の2成分の変動が翼端渦軸方向の乱れよりも10倍程度大きいことを示した。変動静圧分布に関しては、下流領域で2つのピークを示した。これらの統計的な分布の特徴は翼端渦の揺らぎによって説明されることがわかった。さらに、変動速度・圧力の同時測定結果から、速度・圧力相関と乱流エネルギーの圧力拡散項を評価した。翼端渦流れにおいては、乱流拡散項と圧力拡散項は単純な比例関係として対応していないことが実験的に示された。本研究において、静圧プローブ・全圧プローブを用いることで、自由せん断乱流中の変動速度・圧力の同時測定が可能となることを示した。基本的なせん断乱流と3次元複雑乱流のどちらの場合にも速度・圧力相関の分布は乱流の大規模渦構造と強く関連していることが確認された。本研究の目的は、変動全圧プローブを用いた変動速度・圧力の同時測定である。既存の手法である変動静圧プローブを用いた速度・圧力の同時測定と比較した本手法の主な利点は、高い空間解像度にある。ただ、本手法では変動圧力を間接的に評価するため、変動圧力が正しく得られるかどうかについて、不明な点が残っており、この点について検討が必要であった。今年度は、変動全圧・速度の同時測定装置を製作し、その基本的な特性として変動全圧測定プローブの角度特性、周波数応答を調査した。その結果から、間接的に変動圧力を求める際に、変動速度・圧力信号の周波数特性を一致させる必要があることを示した。また、変動全圧プローブとX型熱線流速プローブの相互干渉の影響に関して評価を行った。その結果、相互干渉を避けながら、プローブ間距離を1.0mmに近づけられることを確認した。構築した変動速度・圧力の同時計測手法を用いて、乱流混合層における測定を行い、結果を既存の手法と比較した。変動圧力の2次モーメントに関しては両者に差が見られたが、3次モーメントの符号、速度・圧力相関の分布の傾向に関してはおおむね一致を見せた。本研究では、テストケースとして翼端渦流れに着目し、3次元複雑乱流における速度・圧力相関の、乱流エネルギーバランスへの寄与の解明を目的としている。今年度は、その準備として、翼端渦流れを実験室に再現し、その乱流速度場測定を行った。その結果、翼端渦の発達が確認され、下流へ向かうとともに渦中心の乱れが増大し、主流に沿う方向の平均速度は減少することが確認された。基本的なせん断乱流と
脊椎麻酔下思春期患者の突然死の疫学的調査と臨床的観察

脊椎麻酔中にみられるショック状態および死亡事故を起こした33の症例を文献、裁判例などから収集調査して検討を加えたところ、患者は15歳以下の若年者に多く、異常状態は脊椎麻酔実施後30分以内に起こり、6時間以内に23症例が死亡していることがわかった。脊椎麻酔に使用された局所麻酔薬はジブカインがほとんどで使用量は1.5±0.7mlで、第3ー4腰椎間または第4ー5腰椎間で蜘蛛膜下穿刺後注入されていた。脊椎麻酔の麻酔レベルはほとんどの症例で注入後5分以内に第5ー9胸髄神経領域まで及んでいることがわかった。脊椎麻酔中に発生した異常状態の初期症状としては、チアノ-ゼ、血圧低下、呼吸困難、呼吸停止、喘息発作、派拍触知不能、蕁麻疹などが認められたが、これらは麻酔の経過中一般状態が良好と思われていた時に、急変して表れることが多いことがわかった。異常状態発見後すぐ実施された処置には、人工呼吸、心マッサ-ジ、気道確保、酸素吸入、昇圧薬投与などがあるが、これらの処置が効果的でない症例が多いことがわかった。これらの異常状態の発生に関係するリスク因子について検討したところ、術前合併症の存在、アレルギ-反応、特異体質、高位脊椎麻酔、交感神経系異常反応、術中不完全なモニタリング及び術中不適切な処置をあげることができた。今回の調査で思春期患者では、特異体質やアレルギ-反応で異常状態を来した症例もあり、また思春期では脊椎麻酔のレベルが異常に上昇しやすく、中には異常な交感神経反応を示すものもあることがわかった。また、全体を通じて脊椎麻酔中の患者管理が完全でなく、異常状態に陥った時)処置も適切でないことがわかったが、脊椎麻酔を行なう際にはこれらのリスク因子をできる限り取り除く必要があり、思春期の患者ではとくに注意する必要があることがわかった。脊椎麻酔下思春期患者の突然死は過去10数年来発生頻度が高くなったものではなく,古くから散見されるものである.医療過誤として訴追を請けるようになったのは過去十数年のことである.本研究の対象の殆どが虫垂切除術で占められているのは,脊椎麻酔が本手術に適応となるからである.本年度調査した結果判明した対象例は医療過誤として事われた6例,文献的に報告された8例,神奈川県医師会の資料から過去10年間に10例あり,本年度の調査では24例を収集することができた.共通している事実は術前状態は原疾患以外にあまり問題はなく,ペルカミンあるいはネオペルカミンをくも膜下腔に注入し,一般状態は良好であったものが急変し,呼吸不全,循環虚脱をきたし,早期に心停止をおこしている点が指摘される.急変時の初期症状は悪心あるいは呼吸困難を訴える例が多い(24例中18例).二次的症状はチアノーゼ(14例),血圧測定不能(12例),意識消失(10例)である.蘇生術としては昇圧薬,酸素吸入,人工呼吸が行なわれているが,効果的でない.文献では突然死をペルカミンによるアナフィラキシー・ショックとするもの,専門家鑑定書では胸腺リンパ体質に原因を帰するもの(4例)がある.臨床経過からみると急性循環虚脱,急性呼吸不全と判断できるものが多い.思春期患者に死亡例が多いのはこの年齢層で急性虫垂炎が多いか否かについて疫学的検討を要する.麻酔管理の質的内容をみると,医療レベルから低いものがあると判断できる例がある.

麻酔科医が術中管理に専従していたもので術中死亡したものはない.麻酔管理を看護婦が担当し,術者が手術中にこれを指導監督するという環境下で突然死が発生している.思春期患者の自律神経反応に関しては次年度に検討する.脊椎麻酔による突然死は本研究の成果の報告により麻酔科領域、外科領域、医療事故担当の法律家の間で話題となり注目された。当該年度は下記学会で本研究成果を口述発表した。本年5月下旬米国ワシントン市で開催された第9回世界麻酔学会で(脊椎麻酔にともなう心停止の研究)として報告し、今迄に明らかにされていない麻酔死として注目され、活発な討論があった。類似の経験を期待したが諸外国の中、米国では報告があり研究者は熟知している。9月24日岡山市で開催された第7回日本蘇生学会で(思春期患者の脊椎麻酔死の検討)を口述発表した。このタイプに該当する症例で法廷で争っているという体験を報告した研究者がいた。免疫応答がこの年令層では異なるという意見もあった。本年は神奈川県内で一例死亡例がありこれを詳細に調査した。11月下旬に大阪市を中心に麻酔科医(指導医)四名を訪問し本疫学的調査を行ない情報を集めた。思春期患者を脊椎麻酔で手術する際の法的論点、とくに患者の意志決定については京都大学法学部塚田敬義研究生と意見を交え、その問題点をまとめることとした。本年は事故に遭遇した外科開業医2名に面接し死亡するまでの臨床経過を詳細に聴取できた。患児は13歳男児で元来健康である。160cm、50kg、薬剤アレルギー歴もない。ネオペルカミン1.5mlをL_3、L_4間に注入し、脳脊髄液で3mlとしてバンピングを行った。麻酔レベルは臍部で虫垂切除は無事終了した。手術終了後異常なかったが3時間後に呼吸停止、心停止となり蘇生術を行ない近隣の救命センタに搬送したが死亡した。本症例も過去の症例と同様にモニタされていない時間帯で異常がおこっており原因不明である。過去の30例の中アレルギー反応と考えられるものもあるが共通因子は突然に心停止をきたしたことである。脊椎麻酔下思春期患者の突然死について疫学的調査と臨床経過観察を行うとともに、国内外の学会でも発表した。また多くの研究者や法律家、経験した外科医、医師会の維持紛争関係者と話合いをもつことができた。突然死はここ10数年医療訴訟の増加と供に注目されるようになった。しかし以前より文献的にも認められ決して最近になって発生し始めたというものではない。諸外国の中では米国においては同様の症例が確認されており、麻酔科医の間ではよく知られていた。この3年間で入手し得た症例は36例になった。これらの症例についてまとめて報告する。特徴はいづれも術前検査では問題が無いこと、若年者であること、突然の心停止を発生ないし発見されていること、虫垂切除手術が多いことがあげられる。気づかれた症状所見としてははじめに呼吸困難、続いてチアノ-ゼ、血圧測定不能、意識消失である。心停止までの時間も短い。経過中一般状態が良好と思われていたものが急変したとされている。麻酔薬としてはベルカミン、ネオベルカミンがほとんどを占めていた。発症のはじめから医療従事者がみていた症例や、モニタが十分にされていた症例はむしろ少なく発症時の詳細は不明の事が多い。麻酔専門医が麻酔を行い、術中管理をしていた症例で術中死亡した例はない。多くは外科医、それも開業医が脊椎麻酔を行いその後の管理は看護婦任せであった例である。原因としては局所麻酔薬に対するアレルギ-、アナフィラキシ-、胸腺リンパ質体質、思春期における免疫応答の特異性、低麻酔医療内容等があげられる。単一の決定的なものを示すことはできない。
初成土壌形成に関わる微生物生態系の解析

本年度は1.初成土壌より分離された細菌、Leptospirillum ferrooxidans C2-3株のゲノム解析および、2.三宅島2000年噴火火山灰堆積物のメタゲノム解析を行った。前年度に行った一次アノテーションの結果を元に二次アノテーションを行った結果、L.ferrooxidans C2-3株の炭素固定経路はカルビンベンソン回路ではなく還元的TCA回路を利用している可能性を明らかにした。本結果は難培養微生物であるLeptospirillum属細菌の特徴を知る上で重要な情報を提供したといえる。2.三宅島2000年噴火火山灰堆積物のメタゲノム解析堆積年齢3.5、6.6、9.5年の火山灰堆積物より抽出したDNAをパイロシークエンス解析した結果に対し、バイオインフォマティクス処理を行った。本項の塩基配列決定に係る解析は、指導教員である東京農工大学太田寛行教授及び東京大学服部正平教授により進められた。得られた全塩基配列を用いて研究協力者(服部教授)の指導の下、東京大学柏キャンパスにて解析の一部を行った。また、本解析では1.で得られた情報をデータベースとして利用した。解析の結果、噴火堆積後3.5、6.6、9.5年の間で鉄酸化細菌を始めとする初成土壌微生物群集が遷移したことが明らかにされた。また、炭素固定、窒素固定に寄与する主要な微生物群も変化することが明らかにされた。本研究成果は土壌生成機構の解明で重要な知見となることが期待される。本研究は土壌生成過程に関わる微生物生態糸を明らかにすることを目的とし、三宅島2000年噴火火山灰堆積物の微生物群集を分子生物学的な手法により解析した。22年度は(1)同試料より分離した難培養性の鉄酸化細菌であるLeptospirillum ferrooxidans C2-3株の全ゲノム配列の決定、及び(2)三宅島初成土壌のメタゲノム解析を行った。(1)L.ferrooxidansC2-3株の塩基配列(完全長)が決定された(指導教員・太田寛行教授及び東京大学服部正平教授の協力による)。L.ferrooxidansC2-3株のゲノムサイズは約2.5Mbp、2500遺伝子程度であることを明らかにした。研究代表者は本菌株の塩基配列について遺伝子情報を当てはめる、アノテーション作業を行った。作業は研究協力者(服部教授)の指導の下、東京大学柏キャンパスにて行った。数種のデータベースを用いてアノテーションを行った結果より、信頼性が高いと推定される遺伝子をL.ferrooxidansの各遺伝子の候補として決定し、一次アノテーションを終了した。今後は結果をより詳細に解析(二次アノテーション)し、これまで知られていなかったL.ferrooxidansの代謝系を明らかにする計画である。尚、本研究結果の一部は第13回国際微生物生態学会にて報告した。(2)三宅島2000年噴火火山灰堆積物から直接抽出したDNAについて、網羅的なゲノム解析(メタゲノム解析)を行った。土壌の発達と微生物生態系の遷移について明らかにするため、供試試料は堆積年齢の異なる火山灰堆積物を用いた。22年度は解析のための試料調製(研究代表者)及び一部試料の塩基配列の解読を行った(指導教員・太田寛行教授及び東京大学服部正平教授による)。23年度は解読した塩基配列についてアノテーションを行う計画である。
超臨界流体を抽出・反応媒体とした複合プロセスによる廃プラスチックの総合リサイクル

超臨界流体を利用する廃プラスチックのリサイクルプロセスの構築のための基盤技術を構築した。超臨界メタノールによるPETのモノマー化の反応機構を解明ならびに速度論的解析を行い、ポリマーからモノマーに至る反応過程においてポリマーの低分子化は比較的迅速に進行し、低分子からモノマーへの反応が律速であり、反応初期においては物質移動の影響があり、撹拌が有効なことを示した。また、逐次反応モデルにより解析し速度定数を求めた。さらに、企業との共同研究によりパイロットスケールでのモノマー化が実証され、廃PETボトルをモノマー化・精製した原料を用いて重合したPETからバージン原料からのものと変らないPETボトルが作製できることを示した。超臨界水によるナイロン6およびナイロン12のモノマー化を行い、加水分解ならびに脱水環化反応によりモノマー化が可能であることを見出し、操作温度の最適化を行い、反応機構を明らかにした。ガラス繊維強化プラスチック(FRP)の超臨界水ならびに亜・超臨界DGMM中での分解を検討し、プラスチック部分である不飽和ポリエステルが液化できること、ならびにガラス繊維が回収できることが分かった。電子基板などに用いられるフェノール樹脂の超臨界水による分解を検討し、フェノールやクレゾールなどのモノマー成分を含む低分子成分への液化ならびにガス化が可能であることを示し、操作温度の最適化を行った。また、電子基板材料中の難燃化剤の超臨界二酸化炭素による抽出を検討したところ、難燃化剤であるトリフェニルリンが容易に抽出されることが分かり、抽出挙動を明らかにした。廃プラスチックの1つとして電子基盤材料に含有される難燃化剤(臭素系、リン系)などの有機金属化合物や有機系添加物について調査し、ソックスレー抽出を用いてその含有量を測定した。また、半回分抽出装置にプラスチックを充填し、超臨界二酸化炭素により有機金属化合物である難燃化剤を抽出し、その抽出挙動を測定した。抽出条件(温度、圧力、流量、粒子径)の抽出挙動への影響を調べた。リン系の難燃化剤であるトリフェニルリンが良好に抽出され、高温、高圧ほど抽出速度が大きく、ほぼ100%の抽出率が達成された。難燃化剤などの有機金属化合物の超臨界二酸化炭素への溶解度を測定し、温度・圧力の影響を調べた。溶解度は非常に大きく、測定は容易でないことがわかり、測定装置の再検討を行った。溶解度の推算法を検討した。ケミカルリサイクル技術の開発のため各種プラスチックの超臨界水および超臨界メタノールを用いた加水分解・加アルコール分解・熱分解による低分子化・モノマー化を検討した。小型回分反応器を用いて超臨界メタノール中でのPETおよび超臨界水中でのフェノール樹脂の分解挙動を測定した。反応過程の高分子の分子量変化を測定し、高分子の主鎖の切断による低分子化の過程を追跡し、反応生成物である様々の低分子・モノマーを測定し、収率を評価する。PETの分解では低分子化された成分の反応が律速であることが判明した。フェノール樹脂についても熱分解などによりフェノール、クレゾールなどへのモノマー化が可能であることがわかった。超臨界メタノール中でのPETの分解における反応機構を検討した。PETの分解反応における、主たる生成物はテレフタル酸ジメチル(DMT)とエチレングリコール(EG)であった。サイズ排除クロマトグラムを用いて、PET分解物の分子量分布の経時変化を調べた結果、オリゴマーへの低分子化は短時間で進行し、オリゴマーからモノマーへの反応が律速段階であることが判明した。また、テレフタル酸ビスヒドロキシエチル(BHET)はPETの構成する単位ユットであり、テレフタル酸と2個のエチレングリコールがエステル結合で結合し化合物である。このBHETをPETのモデル化合物として用いて、分解試験を行い反応機構の検討を行った。反応時間の経過とともにEGが一つ取れたテレフタル酸2-ヒドロキシメチルエチル(MHET)の収率が増加し、その後減少する傾向が見られた。

MHETの収率の減少に伴い残りのEGが取れたDMTの収率が増加する傾向が見られた。また、同様の傾向がPETを分解したときにも見られた。以上の結果より、反応はPET→オリゴマー→MHET→DMTと逐次的に進行することが示唆された。亜臨界・超臨界水中でのフェノール樹脂の低分子化を検討した。分解は、温度が高くなるほど短時間での分解が可能となり、液相中に転化したものは、フェノールやクレゾールなどにモノマー化され、成分の一部は2量体・3量体もしくはオリゴマーとして液相中に含まれていると考えられる。アルカリ触媒としてNa2CO3を使用した場合、触媒濃度への依存性が見られ、触媒無添加の場合よりも若干のモノマーの収率が増加する傾向が見られた。気相生成物の回収はできなかったが、一反応温度が高いほど、また亜臨界域でも反応時間が長い場合生成量が増加していることが液相・固相生成量から確認された。超臨界流体を利用する廃プラスチックのリサイクルプロセスの構築のための基盤技術を構築した。超臨界メタノールによるPETのモノマー化の反応機構を解明ならびに速度論的解析を行い、ポリマーからモノマーに至る反応過程においてポリマーの低分子化は比較的迅速に進行し、低分子からモノマーへの反応が律速であり、反応初期においては物質移動の影響があり、撹拌が有効なことを示した。また、逐次反応モデルにより解析し速度定数を求めた。さらに、企業との共同研究によりパイロットスケールでのモノマー化が実証され、廃PETボトルをモノマー化・精製した原料を用いて重合したPETからバージン原料からのものと変らないPETボトルが作製できることを示した。超臨界水によるナイロン6およびナイロン12のモノマー化を行い、加水分解ならびに脱水環化反応によりモノマー化が可能であることを見出し、操作温度の最適化を行い、反応機構を明らかにした。ガラス繊維強化プラスチック(FRP)の超臨界水ならびに亜・超臨界DGMM中での分解を検討し、プラスチック部分である不飽和ポリエステルが液化できること、ならびにガラス繊維が回収できることが分かった。電子基板などに用いられるフェノール樹脂の超臨界水による分解を検討し、フェノールやクレゾールなどのモノマー成分を含む低分子成分への液化ならびにガス化が可能であることを示し、操作温度の最適化を行った。また、電子基板材料中の難燃化剤の超臨界二酸化炭素による抽出を検討したところ、難燃化剤であるトリフェニルリンが容易に抽出されることが分かり、抽出挙動を明らかにした。
インターネット・テュートリアルによる小児医学教育に関する研究

テュートリアル教育の有用性については多くの報告があるが、多くの学習室と教員を必要とする。インターネットは種々の教育に導入されているが、テュートリアル教育への導入は未だなく、より発展した教育が可能と着想した。問題解決能力・コミュニケーション能力に優れ、積極的に自己学習できる小児科医師を養成するために、(1)インターネットにより双方向・少人数・能動的教育法(テュートリアル教育)を行うためのプログラム開発と試験的運用、(2)臨床実例に基づいたテュートリアル教育用コンテンツ(教育素材、データベース)の作成と蓄積をめざし、2年間に以下の成果をあげた。(1)インターネット・テュトーリアル運用プログラムの構築:PCサーバーを用い、インターネット上で問題(シナリオ)閲覧と討論が可能なウェブサイトの構築をほぼ終えた。従来メーリングリストを用いて行っていた学習課題配信(画像を含む)、討論、質疑、発表が、ウェブの掲示板上で可能になり、より多くの参加者対応、討論内容の解析、データベース化が可能となった。メーリングリストによるテュトーリアル実施テーマ(小児科関連)は以下のとおりである。先天代謝異常症、新生児疾患、HIV感染症、SIDS、虐待、一般感染症。(2)症例データベースの構築:教材となる症例データを入力し、検索・加工を可能にするソフトウェアを構築し、小児科医の協力を得て約30例の臨床データを蓄積した。(3)エジンバラ大学とのインターネット・テュートリアルの実施:岐阜大学医学部2年生全員(80名)とエジンバラ大学2年生80名が混合グループを形成し、すべて英語によるインターネット・テュートリアル教育を実施した。学生は英語症例を読み、英語で問題点や学習成果を討論した。また英語によるレポート作成も行った。インターネットは国際協力、英語教育にも大きな可能性があることを明らかにした。岐阜大学では平成7年度から問題解決型少人数教育(テュートリアル教育)を導入し成果をおさめてきた。また平成13年度に全国共同利用施設として岐阜大学に医学教育開発研究センターが設立され、医学教育の拠点として活動を開始している。テュートリアル教育は一定の評価を得ているが、多くの施設(学習室等)を必要とし、また教員を一定時間拘束する。インターネットは時と場所を選ばず情報交換と意思疎通が可能であり、従来型テュートリアル教育の弱点を克服できると着想した。問題解決能力・コミュニケーション能力に優れ、積極的に自己学習できる小児科医師を養成するために、(1)インターネットにより双方向・少人数・能動的教育法(テュートリアル教育)を行うためのプログラム開発と試験的運用、(2)臨床実例に基づいたテユートリアル教育用コンテンツ(教育素材、データベース)の作成と蓄積を目指した。今年度は以下の成果をあげた。(1)インターネット教材配信サーバーシステムの構築:UNIXワークステーションを用い、学習素材の配信・討論内容の閲覧を可能にした。(2)症例データベースの構築:教材となる症例データを入力し、検索・加工を可能にするソフトウェアを開発した。小児科教官・小児科勤務医の協力を得て臨床データの蓄積を開始した。(3)インターネット・テュートリアルの試験運用:インターネット上で学習課題を配信し(画像・動画を含む)、討論、質疑、発表をメーリングリストを利用して実施した(テーマ:先天代謝異常症、新生児疾患、HIV感染症、その他)。
青色LED光刺激による脳内非視覚的作用を介した脂質代謝への影響

眼から入る光刺激は内因性光感受性網膜神経細胞を介し脳内ホルモンやコルチコステロイドの分泌を促進する。このため日常生活における照明光は脂質代謝に影響を及ぼし、脂質代謝異常症の発症や増悪に関与する可能性が考えられる。本研究では、普及の進む新たな照明源であるLED光によって生じる脳内ホルモンならびに脂質分解・合成酵素の変化についてマウスを用いて評価した結果、脂質代謝に影響を及ぼす可能性が示唆された。本研究では、申請者の行ってきた「脂質合成酵素の分析・制御に関する研究」と「LED光の医療応用に関する研究」の成果を活かし、普及の進む新たな照明源であるLED光によって生じる脳内ホルモンならびに脂質分解・合成酵素の変化を正常マウス及び脂質異常症マウスモデルを用いて評価し、脂質代謝に及ぼす照明光の影響を検討するとともに、脂質異常症に対するLED光照明を応用した新しい治療法の確立を目指す。急性ストレスで分泌されるコルチゾールは脂質の分解を促すことが報告されている。LED光照明によってコルチゾールの分泌が促進され、脂質分解が生じるか検討するために、1波長(445, 465, 475 nm)、2照度(1、15、50 W/cm2)3照射期間(1、2、3日間)の組み合わせによる各種条件の青色LED光を正常マウスに短期間照射し、ACTH・コルチゾール系および脂質分解・合成酵素の変化を調べることによって、脂質代謝に影響を及ぼすLED光照明条件を抽出した。また、長期間(12時間×8週間)照射した際の脳内活性部位、血中ACTH濃度、血中コルチゾール濃度、脂質分解・合成酵素の変化を検討し、脂質代謝に影響を及ぼす青色LED光の照明条件を抽出した。このため、日常生活における照明光は脂質代謝に影響を及ぼし、脂質代謝異常症の発症や憎悪に関与する可能性が考えられる。LED光照明によってコルチゾールの分泌が促進され、脂質分解が生じるか検討するために、1波長(445,465,475 nm)、2照度(1,15,50 W/cm2)、3照射期間(1,2,3日間)の組み合わせによる各種条件の青色LED光を正常マウスに短期間照射し、ACTH・コルチゾールおよび脂質分解・合成酵素の変化を検討した。その結果、脂質代謝に影響を与える条件を抽出し、以下の詳細な検討を行った。1体重2副腎重量3視床下部のc-Fosの発現4血中ACTH濃度5脂質代謝酵素の発現分子生物学正常マウスに各種条件の青色LED光を短期間(12時間×13日間)×8週間)照射した際の脳内活性部位、血中ACTH濃度、血中コルチゾール濃度、脂質分解・合成酵素の変化の検討を行った。当該年度の研究計画にあった長期間(12時間×8週間)照射した際の評価項目について一部、次年度に再検討する必要があり、おおむね順調であるとした。正常マウスにおける長期間照射実験の評価を行う。その後は、研究計画通りに以下の実験を行う。脂質異常症モデルマウスに青色LED光を短期間、または、長期間照射した際の脂質分解合成酵素および病態の変化を調べ、青色LED光照明による脂質異常症の治療の可能性を検討する。
ヒト異種反応性自然抗体産生B細胞を用いた異種移植における免疫寛容誘導の試み

1.ヒト細胞をもちいたB細胞寛容誘導の研究αGal抗原を発現しているブタのサイログロブリンを付着させたbeadsを用いて異種抗原に特異的な抗体を産生しているB細胞を選択的に採取し、in vitroにおける抗体産生能を調べるとともに、低濃度の抗原刺激に免疫抑制剤の付加でB細胞寛容が誘導できるかを検討した。Charactarizationの結果では、CD5に関しては従来の報告に反して表現型が少ないこと、CD45RAの発現が多くCD45Oは発現していないことより、異種抗原反応抗体産生細胞はnativeなB細胞が主体をなすことが分かった。また、Plaque-forming cell assayで確認すると選択的に採取したB細胞から産生される抗体はIgM、,IgDが主でありIgGは少なかった。通常の培養ではviabilityが落ちるために抗体産生が低下するので、アデノウイルスを感染させて抗体を定常的に産生する系を開発した。これらのウイルス感染抗体産生細胞に当科で生成した合成αGal抗原やブタの内皮細胞を加えて刺激をしても抗体産生は冗進しなかった。また抗原刺激後にB細胞を抑制するアザチオプリンやデオキシスパガリンを加えても、抗体産生には差を認めなかった。この結果はウイルス感染細胞は自立的に抗体産生を行っているためと考えられ、現段階ではB細胞寛容誘導は得られていない。2.ハムスター、ラット間移植における液性拒絶反応抑制の研究異種移植で超急性拒絶反応の克服された後に問題となる急性液性拒絶反応の主体をなす抗体はIgMであり、T細胞依存性と非依存性の産生がなされるが、非依存性の生成は主として脾臓でなされる。今回ハムスター、ラット間の移植で脾摘とhigh doseサイクロスポリン投与で異種抗体の作成を防止することが出来、異種移植片の長期生着を可能とした。液性抗体の関与する移植への応用が期待できる。平成11年度はαGal抗原を多く発現しているブタのサイログロブリンをbeadsに付着させ,異種抗原に特異的な抗体を産生するB細胞を選択的に採取し、そのcharactarizationを引き続き検討した。更にinvitroの系でそれらの細胞を用いて抗体産生能を調べ、低濃度の抗原刺激後に、B細胞に感受性のある免疫抑制剤を加えることで抗体産生が抑制できるかを検討することとした。charactarizationの検討では、従来異種抗原反応B細胞が多いと言われていた脾臓以外にも末梢血や扁桃に同等に存在することが分かった。また産生される抗体はIgMI、IgDが主でIgGは少なく、CD5に関しては従来の報告に反して表現型が多くないこと,他の末梢血B細胞と比較してCD45RAを多く発現し、CD45Oは逆に発現していないことが明らかになった。これらの検討結果からは異種抗原に対する抗体産生細胞は成熟型のB細胞よりは、nativeな細胞が主体をなすといえる。in vitroの系ではplaqueーformingcell assayにて分離したB細胞が抗体を産生することは確認できたが、培養系ではviabilityが損なわれ産生は極端に減少した。これは抗原刺激としてαGal抗原自体を加えても、ブタの内皮細胞を刺激細胞として用いても変わらなかった。そこでB細胞にアデノウイルスを感染させ抗体を産生させる系を用いた。ウイルス感染後の抗体はαGal抗原に特異的に結合し、ブタの内皮細胞に補体と同時に加えると殺細胞効果を発揮した。ウイルス感染B細胞に低濃度のαGal抗原を加えて抗体産生量に変化が見られるか、つまり何らかの抑制効果があるかを検討したが、抑制はかからなかった。

これはウイルス感染細胞がすでに自立的な抗体産生を行っている結果と考えられた。今後は分離した抗体産生細胞をinvitroで効果的に抗体産生させる方法を考案し、低濃度抗原刺激下での特異的免疫寛容誘導の実験を行う必要がある。1.ヒト細胞をもちいたB細胞寛容誘導の研究αGal抗原を発現しているブタのサイログロブリンを付着させたbeadsを用いて異種抗原に特異的な抗体を産生しているB細胞を選択的に採取し、in vitroにおける抗体産生能を調べるとともに、低濃度の抗原刺激に免疫抑制剤の付加でB細胞寛容が誘導できるかを検討した。Plaque-formingcell assayで確認すると選択的に採取したB細胞から産生される抗体はIgM、IgDが主でありIgGは少なかった。通常の培養ではviabilityが落ちるために抗体産生が低下するのでアデノウイルスを感染させて抗体を定常的に産生する系を開発した。これらのウイルス感染抗体産生細胞に当科で生成した合成αGal抗原やブタの内皮細胞を加えて刺激をしても抗体産生は亢進しなかった。また抗原刺激後ににB細胞を抑制するアザチオプリンやデオキシスパガリンを加えても、抗体産生には差を認めなかった。ウイルス感染細胞は自立的に抗体産生を行っているためと考えられた。2.ハムスター、ラット間移植における液性拒絶反応抑制の研究異種移植で超急性拒絶反応の克服された後に問題となる急性液性拒絶反応の主体をなす抗体はIgMであり、T細胞依存性と非依存性の産生がなされるが、非依存性の生成は主として脾臓でなされる。今回ハムスター、ラット間の移植で脾摘とhigh doseサイクロスポリン投与で異種抗体の作成を防止することが出来、異種移植片の長期生着を可能とした。液性抗体の関与する移植への応用が期待できる。
表皮の免疫担当細胞におけるCD45,Ly48の発現について

ヒト及びマウス正常表皮内にはHLA-DR及びla抗原陽性のLangerhans cells(LC)や、さらにマウス正常表皮内にはThy-1抗原陽性のThy-1 dendritic epidermal T cells(DETC)が存在しており、それぞれ免疫応答において重要な役割を担っていると考えられている。皮膚の大部分を占めるケラチノサイト(KC)は種々のサイトカインを産生しており、これらのLC,DETCへの影響は十分に考えられることである。今回我々はこれらLC,DETCにおけるその表面マーカーについて主にCD45,Ly48を中心に胎仔から新生仔、成人マウスについて検討した。成人マウスではLy48はDETCにのみ発現しており、LCにおいてはその発現は認められていない。我々はLy48のうちモノクローナル抗体であるS11,S15,S7,3E8を使用しその発現を、成長にしたがい観察した。結果としては胎仔から新胎仔においては、やはり成人マウスと同様にLy48はDETCに発現していることが観察されたが、これら発現パターンは成人マウスとはやや異なったパターンを示すのではないかということが推測された。又、ヒト正常表皮においてはCD1a陽性の樹状細胞はほとんどCD45+であるが、しかしCD45RA,RB,ROの発現は弱い発現しか認められなかった。これはCD45のうちCD45RA,RB,RO以外の発現があるのではないかという可能性がある。さらに我々は、マウスの成長に伴いこれら表面マーカーについて検討を加えた。マウス胎仔から新生仔では、表皮内にCD45+細胞が存在し、成長に伴い次第にその数は増加することが確認され、又これらの細胞の形態は大型、円型から成長に伴いdendriticな形態を呈するようになることも確認されたが、これらのCD45+細胞とDETC,LCとの関係についとは、サイトカインによる影響も含めて現在検討中である。
角肉の軟化に関与するマトリツクスメタロプロテアーゼの食品学的研究

魚肉は畜肉に比べて速やかに軟化する。この軟化現象は初期段階において、コラーゲン繊維の崩壊に由来するとされ、その崩壊は特異的に作用する酵素が関与していると推測されている。これらはコラーゲン分解代謝に関わる酵素(マトリックスメタロプロテイナーゼ:MMP)群とも関連すると考えられているが、魚類のMMPに関する情報は非常に乏しい。このような背景のもとに、ニジマスの皮と筋肉の抽出物および血液について哺乳類のコラーゲンを用いて分解活性を調べた結果、ヒトV型コラーゲンを分解する活性が筋肉に認められた。次にゼラチン分解能を有する酵素を検索し簡易的な同定を行った結果、全てにMMP様酵素が検出され、特に血液中には多量に存在することが確認された。また、ニジマスを氷蔵してMMP様酵素の活性を経時的に調べた場合、そのほとんどが残存していた。一方、既にクローニングしたニジマスMMP・13cDNAを大腸菌のタンパク質発現系に導入して組換えニジマスMMP・13を調製し、高等脊椎動物およびニジマスのコラーゲンに対する作用を調べた。発現した組換えMMP・13は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。組換えMMP・13のゼラチン分解活性は明らかに認められ、さらにウシおよびニジマスI型コラーゲンに対する作用を検討した結果、コラーゲン分子の3本鎖らせん構造を分解する活性が検出された。ニジマスV型コラーゲンに対する分解活性は3本鎖らせん構造以外の領域を分解することが明らかとなった。ニジマスMMP・13は高等脊椎動物のMMP・13と基質特異性を若干異にするが、コラーゲン分解代謝を担う酵素であることが判明した。これまで得られた情報から、魚類MMPが魚肉の軟化現象へ関与する可能性は示唆されたが、今後、MMPの分解活性と軟化との相関について定量的な検討を行う予定である。この軟化現象は初期段階において、V型コラーゲン繊維の崩壊に由来するとされ、その崩壊は特異的に作用する酵素が関与していると推測されている。これらはコラーゲン分解代謝に関わる酵素(マトリックスメタロプロティナーゼ:MMP)群とも関連すると考えられているが、魚類のMMPに関する情報は非常に乏しい。このような背景のもとに、既にクローニングしたニジマスMMP-2cDNAを大腸菌のタンパク質発現系に導入して組換えニジマスMMP-2を調製し、高等脊椎動物およびニジマスのコラーゲンに対する作用を調べた。大量に発現した組換えMMP-2は、不溶性画分に局在していたので、アフィニティークロマトグラフィーによる精製はグアニジン塩酸塩共存下の変性状態で行った。カラムの溶出画分を希釈法により再生を行いSDS-PAGEで分析すると、高度に精製された単一の成分(73kDa)が検出された。次に、ゼラチンザイモグラフィーを行い、ゼラチン分解活性を調べた結果、分解活性が73kDa成分に認められた。また、組換えMMP-2のウシI型、ヒトIV型およびヒトV型コラーゲンに対する作用を検討した結果、V型コラーゲンに対してのみ分解活性が検出され、I型およびIV型コラーゲンに対する分解活性は認められなかった。さらにニジマスのI型およびV型コラーゲンに対する作用を検討した結果、V型コラーゲンに対しては分解活性が認められたが、I型コラーゲンに対する分解活性は認められなかった。これらのことから、ニジマスMMP-2は高等脊椎動物のMMP-2と基質特異性を若干異にするが、ゼラチンおよびV型コラーゲン分解酵素としてコラーゲン分解代謝を担う酵素であることが判明した。次に組換えMMP-2を用いてポリクローナル抗体を調製し、ニジマスの組織抽出物に対してイムノブロット分析を行った結果、その存在が血液中に確認された。現在、MMP-2の活性を死後経時的に調べるとともに、他のMMPについても検討を行っている。

ニジマスV型コラーゲンに対する分解活性は3本鎖らせん構造以外の領域を分解することが明らかとなった。ニジマスMMP・13は高等脊椎動物のMMP・13と基質特異性を若干異にするが、コラーゲン分解代謝を担う酵素であることが判明した。これまで得られた情報から、魚類MMPが魚肉の軟化現象へ関与する可能性は示唆されたが、今後、MMPの分解活性と軟化との相関について定量的な検討を行う予定である。
機能性身体症候群にみられる病的疼痛と疲労の発症メカニズムの解析

複合的持続ストレスを負荷するCFSモデルにおいて,ストレス期間を5日間から6日間に変更した結果,脊髄ミクログリアの活性化は後角に加え前角にも生じることが明らかとなった.前角ミクログリアが集積したニューロンは,NeuN陽性であったことから,α運動ニューロンであると示唆された.さらに,このNeuN陽性ニューロンは,ATF3陽性を示したことから,α運動ニューロンが過活動であることが示唆された.ヒラメ筋に逆行性神経トレーサーであるFluoroGold(FG)を注入したCFSモデルにおいて,前角のFG陽性ニューロンにミクログリアが集積していたことから,α運動ニューロンは,ヒラメ筋を支配するニューロンであることが示唆された.ヒラメ筋は,テレメートリーシステムによって測定した筋電図において,ストレス期間中優位に筋活動が亢進していたことから,筋活動を抑制する目的で,片足のみ足関節髄内釘固定術を行ったCFSモデルを作成した.その結果,非固定側はこれまでと同じように脊髄ミクログリア活性化およびDRGのATF3発現を認めたが,髄内釘固定術側は脊髄ミクログリアの活性化およびDRGのATF3発現を優位に抑制した.さらに,前脛骨筋の圧痛閾値を測定した結果,髄内釘固定側は非固定側に比べて優位に圧痛閾値が増加し,疼痛の減弱を認めた.CFSモデルにおいてテレメートリーシステムを用いて自律神経機能検査を行った.その結果,交感神経と副交感神経の両方の活動を反映するLFパワー値はストレス負荷4日目以降で低下し,副交感神経の活動を反映するHFパワー値はストレス期間中低下した.交感神経の活性度の指標となるLF/HFはストレス3日まで高値,4日以降は低値を示した.以上のことからストレス期間中の交感神経は,3日目までは過活動であり,4日目以降は活動が低下することが示唆された.複合的持続ストレスを負荷するCFSモデルにおいて,一部のDRGニューロンにATF3(神経過活動・障害マーカー)が発現する.本研究において,ATF3の発現は,L5のDRGに最も多いことが明らかとなった.また,ATF3を発現したDRGニューロンの約6割がTrkC(固有感覚ニューロンマーカー)免疫反応陽性を示した.さらに,ストレス負荷後に十分な安静期間を与えると,DRGのATF3は消失した.このことから,固有感覚ニューロンの過活動がATF3発現を誘導した可能性が示唆された.疼痛モデル動物の代表とされる神経因性疼痛モデルや炎症性疼痛モデルにおいて,侵害受容ニューロンや触圧覚ニューロンが疼痛の増悪に関与するとの報告はあるが,固有感覚ニューロンが関与する報告はない.複合的持続ストレスにより誘発される疼痛は,他の疼痛モデルとは疼痛誘発に関与するニューロンが異なる点において重要な知見であると考えられた.逆行性神経トレーサーであるFluoro-Goldを後肢の各筋(ひらめ筋,腓腹筋,前脛骨筋)に投与し,CFSモデルを作製した.その結果,Fluoro-Gold陽性ニューロンにATF3を最も多く発現した筋は,ヒラメ筋であった.そこで,抗重力筋であるヒラメ筋の筋電図を,テレメートリーシステムを用いて複合的持続ストレス負荷前からストレス期間中を測定した.その結果,ストレス負荷前に比べてストレス期間中は,昼夜問わず筋活動量の持続的な亢進を認めた.ヒラメ筋の筋活動を抑制する目的で,片側足関節に髄内釘固定術を施して,CFSモデルを作製した.その結果,固定側の脊髄後角ミクログリア活性化が抑制された.また,DRGにおけるATF3発現も,固定側が有意に抑制された.このことから,ストレスによって生じた抗重力筋の異常な活動が,固有感覚ニューロンの持続的な過剰興奮を惹起し,ATF3発現を誘導した可能性が示唆された.固有感覚ニューロンの過活動抑制を目的とする,足関節髄内釘固定術実験において,固定側DRGのATF3発現量が抑制された結果を得られたため.複合的持続ストレスを負荷するCFSモデルにおいて,ストレス負荷日数を5日から6日に増やした結果,筋の機械性痛覚過敏を示す期間が延長され,脊髄ミクログリア(Iba1)の活性化領域に変化が現れた.5日間のストレスを負荷した脊髄ミクログリアは,後角に活性化を示すが,6日間のストレスを負荷したモデルの脊髄ミクログリアは,後角に加え前角にも活性化を認めた.ミクログリアが集積した前角運動ニューロンは,NeuN(α運動ニューロンのマーカー)およびATF3(神経過活動・障害マーカー)で標識された.逆行性神経トレーサーFluoro-Gold(FG)を後肢の各筋(ヒラメ筋,腓腹筋,前脛骨筋)に注入し,CFSモデルを作製した.その結果,FGをヒラメ筋に注入して標識された前角運動ニューロンの周囲にミクログリアが集積した.繰返し寒冷ストレスを負荷するFMモデルにおいて,脊髄ミクログリア活性化領域は,6日間の負荷を行ったCFSモデルと同じ領域(後角と前角)に認めた.FMモデルの一部のDRGニューロンは,CFSモデルと同様にATF3が発現した.CFSモデルのL5DRGに発現するATF3の割合は,6.6%に対して,FMモデルは5.3%であった.また,CFSモデルのATF3陽性DRGニューロンは,6割がTrkC(固有感覚ニューロン)陽性であったが,FMモデルは,4割であった.DRGにおける交感神経線維の局在変化を,CFSモデルを用いて検討した.