hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱帯果樹における染色体解析法の確立とその遺伝資源およびゲノム研究への適用

染色体は遺伝子の担体であり、これに関する情報を蓄積することは、育種・遺伝研究の発展に欠かせない。しかし、熱帯果樹においてはこの分野の研究が遅れている。そのため、我が国の主要熱帯果樹であるパインアップルおよびピタヤを供試して、昨年度に開発した染色体標本技術を用いて、リボゾームDNA(rDNA)の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を実施した。パインアップルにおいては、18S-5.8S-25SrDNAおよび5SrDNAのFISHを実施した。両rDNA遺伝子座は、ともに2本の染色体の端部に観察された。18S-5.8S-25SrDNAと5SrDNA遺伝子の座上する染色体は異なった。18S-5.8S-25SrDNA遺伝子座とCMA+/DAPI-領域は一致し、この部分がグアニンおよびシトシンが豊富であることを確認できた。50本中46本の染色体にはrDNA遺伝子座は観察できなかった。ピタヤにおいては二倍体のHylocereus undatusおよび四倍体のSelenicerus megalanthusを供試して18S-5.8S-25SrDNAのFISHを実施した。rDNA遺伝子座は、二倍体系統では2本の染色体の端部に、四倍体系統では4本の染色体の端部に観察できた。rDNA遺伝子座とCMA+/DAPI-領域は一致し、この部分がグアニンおよびシトシンが豊富であることを確認できた。二倍体の22本中20本の染色体および四倍体の44本中40本の染色体には18S-5.8S-25SrDNA遺伝子座は観察できなかった。本研究の対象熱帯果樹であるパインアップルおよびピタヤにおいて、FISHによりrDNA遺伝子座の検出に成功した。本年度の計画を達成することができた。パインアップルおよびピタヤにおいてFISHによる遺伝子座の検出が可能になった。今後はこの技術を利用して様々な遺伝子の染色体上での位置を検出することを目的とする。まずパインアップルを用いて連鎖地図と染色体との関係をFISHを用いて検討するとともに、葉のトゲの有無や果肉色といった有用遺伝子の染色体上での位置の解明を進める。そのため、今年度は我が国の主要熱帯果樹であるパインアップルおよびピタヤにおける染色体標本作製技術の確立を目的とした。本研究では小型染色体の観察に適している酵素解離空気乾燥法による技術開発を行った。パインアップルにおいては、交雑実生の種子を材料とした。パインアップルは染色体が非常に小さいため、染色体を収縮させる効果のある前処理は行わない方がその識別には効果的であった。染色体標本作製に効果的な酵素条件は、2%セルラーゼオノズカRSおよび0.5%ペクトリアーゼY-23、37°Cで45分であった。ピタヤにおいては、挿し木苗の根端を材料とした。採取後、10°C、2mM、8ーハイドロキシキノリンで4時間前処理した。2%セルラーゼオノズカRS、0.75%マセロザイムR200および0.15%ペクトリアーゼY-23、37°Cで45分の酵素処理で良好な染色体標本が得られた。続いて、両者において、CMAおよびDAPIによる蛍光染色を実施した。パインアップルでは2個の染色体の端部にCMA+、DAPI-領域が観察された。CMAおよびDAPIの特性からこの部分はGCが多い領域であると考えられた。ピタヤでも2個の染色体の端部にCMA+、DAPI-領域が観察された。30年度においては、29年度に確立した染色体標本作製技術を用いて、さらに研究を発展させる予定である。本研究の対象熱帯果樹であるパインアップルおよびピタヤにおいて、酵素処理空気乾燥法による染色体標本作製技術を確立した。さらに、両者においてCMAおよびDAPIを用いた蛍光染色を実施することにより、これらの染色体構成の特徴を解明し、一部の染色体を確実に識別することが可能となった。

rDNA遺伝子座は、二倍体系統では2本の染色体の端部に、四倍体系統では4本の染色体の端部に観察できた。rDNA遺伝子座とCMA+/DAPI-領域は一致し、この部分がグアニンおよびシトシンが豊富であることを確認できた。二倍体の22本中20本の染色体および四倍体の44本中40本の染色体には18S-5.8S-25SrDNA遺伝子座は観察できなかった。本研究の対象熱帯果樹であるパインアップルおよびピタヤにおいて、FISHによりrDNA遺伝子座の検出に成功した。本年度の計画を達成することができた。パインアップルおよびピタヤについて酵素解離空気乾燥法による染色体標本作製技術が確立できたので、これによって作成した染色体標本を用いて今後の研究を進める。特に、特定の遺伝子の染色体上での位置を解明することができる蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法による研究を進める。はじめは、これら熱帯果樹におけるFISH法の確立および染色体構成の特徴を解明するため、染色体上のリボゾームDNAの位置・数を解明する。その後は、さらにFISH法による研究を進展させる。パインアップルでは染色体識別に有効であると考えられる動原体部分を検出するFISH、トゲの有無や果肉色等有用遺伝子の染色体上での位置を検出するFISHを実施する。ピタヤにおいては染色体構成の種間差異をリボゾームDNAの位置・数の点から明らかにし、染色体の面から遺伝資源を評価する。パインアップルおよびピタヤにおいてFISHによる遺伝子座の検出が可能になった。今後はこの技術を利用して様々な遺伝子の染色体上での位置を検出することを目的とする。まずパインアップルを用いて連鎖地図と染色体との関係をFISHを用いて検討するとともに、葉のトゲの有無や果肉色といった有用遺伝子の染色体上での位置の解明を進める。当初、29年度に蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を実施する予定であったが、詳細に酵素処理空気乾燥法を検討し、パインアップルおよびピタヤにおいて多数の種・品種を供試することとしたので、FISHは実施しなかった。30年度にはプローブの作製およびFISHの実施に次年度使用額を使用する。物品費については、当初、次年度に速やかにFISHを実施するため、プローブとなる遺伝子の準備を今年度中に実施する予定であったが、遺伝子のクローニングに予定以上の期間を要したため、それが実施できなかった。旅費については予定していた学会に参加ができなかった。その他については論文作成が間に合わなかったため、投稿代金が発生しなかった。次年度使用額はプローブ遺伝子の調整、論文投稿に使用する。
アクアポリン４抗体陰性視神経脊髄炎の診断および治療法開発に関する研究

視神経脊髄炎(NMO)は視神経と脊髄が冒される中枢神経疾患である。NMO患者特異的な血中自己抗体抗アクアポリン4(抗AQP4抗体)が発見され、病態形成に重要な役割を果たしていると考えられている。我々は最近、NMOにおいてB細胞亜分画プラズマブラスト(Plasmablast, PB)が増加し、末梢血中の主要な抗AQP4抗体産生細胞であることを報告した。NMOでは、多くの患者において抗AQP4抗体が陽性であるが、抗AQP4抗体陰性の一群の患者(seronegative NMO, SNNMO)が存在する。SNNMOには特異的なバイオマーカーが存在しないため、その診断は臨床診断のみに頼らざるを得ない。本研究においては、SNNMO病態におけるB細胞および液性免疫の関与を明らかにし、SNNMO血中自己抗体およびその標的分子の同定と特異的治療法の検討を行うことを目的とする。その第一段階として、SNNMO患者末梢血PBの割合を解析した。また、SNNMO患者血清のヒトアストロサイトに対する細胞障害活性の検討を行った。その結果、抗AQP4抗体陽性患者のみならず、抗AQP4抗体陰性NMO患者においてもRRMS患者や健常人と比較して末梢血中のPBの割合が増加していた(p<0.05)。SNNMO患者におけるPBの増加は抗AQP4抗体に依らない病態分類の指標となりうる。SNNMOにおいてもPBが何らかの自己抗体を産生し、病態形成に関与している可能性が示唆される。また、NMOにおいては、患者血清が正常ヒトアストロサイト(NHA)に対して、細胞障害活性を有することが報告されている。現在は予備実験の段階であるが、私はSNNMO血清のNHAに対する細胞障害活性測定系の予備実験を行っており、SNNMO血清の細胞障害活性を、多数の患者血清で測定することが今後の課題である。【目的】視神経脊髄炎(Neuromyelitis Optica, NMO)は視神経と脊髄が冒される中枢神経疾患である。従来は多発性硬化症(MS)の一病型と考えられていたが、近年NMO患者特異的な血中自己抗体抗アクアポリン4(抗AQP4抗体)が発見されて以来、MSとは異なる病態であると考えられている。【方法】年齢・性別のマッチした抗AQP4抗体陽性患者39人、SNNMO患者10人、MS患者17人、健常人20人を対象として末梢血および患者髄液中のPBの割合をフローサイトメトリーで解析した。【結果】抗AQP4抗体陽性患者のみならず、抗AQP4抗体陰性NMO患者においてもRRMS患者や健常人と比較して末梢血中のPBの割合が増加していた(p<0.05)。また、NMO患者では髄液中にPBの増加を認めたが、RRMS患者では認めなかった.【考察】SNNMO患者におけるPBの増加は抗AQP4抗体に依らない病態分類の指標となりうる。

SNNMOにおいてもPBが何らかの自己抗体を産生し、病態形成に関与している可能性が示唆される。本研究においては、SNNMO病態におけるPBの関与を明らかにする必要がある。その意味において、一定数のSNNMO患者末梢血中のB細胞に占める、PBの割合が、抗AQP4抗体陽性NMOと同様、MS或いは健常者と比べて増加していることが明らかとなった。これは、今年度の研究計画の重要部分であり、予定症例数には若干届かなかったものの、まとまった数のSNNMO患者データを解析することができた。この意味で、本研究は概ね順調に進捗していると考えられる。SNNMO自己抗体の有無を解析する。NMOにおいては、抗AQP4抗体が正常ヒトアストロサイト(NHA)に対して、細胞障害活性を有し、病態形成に重要な役割を果たすと考えられている。現在は予備実験の段階であるが、少数例のSNNMO血清が、NHAに対して細胞障害活性を持つという結果を得ており、想定された結果を得てはいる。しかし、症例数を増やした際に、SNNMO血清がNHAに対して細胞障害活性を示さなかった場合、補体依存性細胞障害活性が無く、それでもNHAに対する結合活性を有する可能性はあるので、NHAとSNNMO血清を反応させた後、2次抗体として蛍光標識抗ヒトIgG抗体を反応させ、SNNMO血清がNHAに結合しているか否かをフローサイトメトリーで検討することも行う。また、一方で、NHAよりcDNAライブラリを作成し、それをCHO細胞に導入し、NHA由来の導入遺伝子産物を発現したCHO細胞を、SNNMO血清と反応させ、血清中の抗体が結合したCHO細胞をセルソーティングし、インビトロで増殖させる。この手法により、自己抗体の標的抗原を同定するという手法も、前記の細胞障害活性試験と平行して行い、自己抗原および自己抗体の同定研究の促進を図る。細胞障害活性およびフローサイトメトリー、さらには免疫組織化学染色を用いた解析を行うことを考えている。そのため、細胞障害活性試験で用いる抗体および血清、さらにフローサイトメトリー解析で用いる蛍光標識抗体、免疫組織化学染色で用いるラット脊髄切片に研究費を使用する予定である。CHO細胞の遺伝子導入も行い、研究費を使用する予定である。
ホメオボックス転写因子CDX2による腸管粘膜免疫防御機構の解明

クローン病や潰瘍性大腸炎に代表される炎症性腸疾患は、遺伝的素因に環境因子が加わることなどにより生じる難治性の慢性炎症性疾患である。また、主に内科的治療が施されるが、根本的治療法が未確立となっており、より良い治療薬の開発が急務となっている。しかし、本疾患の発症メカニズムについて解明されている機序は少なく、病因の解明が大きな課題となっている。本研究課題では、腸管上皮細胞に特異的に発現するホメオボックス転写因子CDX2が、腸管上皮細胞の機能制御を介して腸管の粘膜免疫をコントロールする発見を基に、新たに確立した炎症性腸疾患モデルマウスを用いて、腸管上皮細胞による新たな粘膜免疫防御の制御基盤の解明として研究を進めている。Cdx2遺伝子変異マウスに、DSSを投与して炎症を誘発させたが、野生型と比べて特に顕著な差は生じかなった。一方で、細菌感染により腸炎を誘発したところ、Cdx2変異マウスでは、腸炎の誘発が増悪することが分かった。この結果は、病理学的な解析などもからも確認できた。これらの結果から、固体レベルにおいてCdx2が、細菌感染などにより誘発される腸炎の発症を抑制していることが遺伝学的に明らかになった。また、Cdx2やCdx1/Cdx2変異マウスの腸からオルガノイド細胞を作成して、解析を行ったところ、Cdx1やCdx2の遺伝子変異によりオートファジーが抑制されることが分かった。加えて、CDX2とATG7の双方に結合する分子を同定した。今後、これらの結合分子の機能解析を進めることで、CDX2によるオートファジーの活性化機構を解明する。〈CDX2による腸管の粘膜防御機能の個体レベルの解析〉DSS腸炎を誘発するために、野生型マウス、Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウス(Cdx1はCdx2の機能を補償するため)をDSS(dextran sodium sulfate)を投与した。野生型マウスと比べてCdx2欠損マウスに発症する腸炎について顕著な違いは見られなかった。そこで、細菌性腸炎を誘発するために野生型マウス,Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウスに、赤痢菌S. flexneri、C. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24を感染させる実験を行った。赤痢菌は、マウスへの感染効率が悪く炎症は誘発されなかった。C. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24はCdx2欠損マウスに感染し、炎症を誘発することがわかった。また、感染した細菌数を正確に決定するために、常在細菌と区別する必要がある。そこで、上記の細菌を、アンピシリンなどの薬剤に耐性して、感染実験を再度行った。その結果、Cdx2およびCdx1/Cdx2欠損マウスでは、上記の細菌感染により衰弱(体重減少など)が早く、Cdx2を欠損すると、細菌感染への感受性が上昇することがわかった。組織学的解析からも、より炎症が増悪していることなどが分かった。〈CDX2によるオートファジー活性化機構の解析〉CDX2複合体に結合する分子の質量分析の解析から、3個のオートファジー関与分子を同定した。また、そらの分子の遺伝子クローニングを行いタグを融合させた後、細胞に強制発現することで、CDX2やATG7と複合体を形成することを免疫沈降実験により確認した。〈CDX2による腸管の粘膜防御機能の個体レベルの解析〉2019度の結果を統計的なデータとするために、一群10匹程度の野生型マウス、Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウスにC. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24を感染させて、1腸管上皮細胞内の細菌数の解析、2LC3B-II発現量の定量、3炎症度の病理組織学的評価を再度行う。〈CDX2によるオートファジー活性化機構の解析〉同定したCDX2結合分子の性質から、そらの結合分子は、CDX2やATG7の細胞内局在を制御していると考えている。まず、同定した分子をテトラサイクリン誘導性に発現する細胞を作成する。作成した細胞を用いて、それらの分子の発現を誘導し、まずは、オートファジーの活性などを解析する。さらに、CDX2, ATG7の細胞内局在などを共焦点顕微鏡などを用いて解析する。また、得られる結果により分子機構の解析をさらに進める。

一方で、細菌感染により腸炎を誘発したところ、Cdx2変異マウスでは、腸炎の誘発が増悪することが分かった。この結果は、病理学的な解析などもからも確認できた。これらの結果から、固体レベルにおいてCdx2が、細菌感染などにより誘発される腸炎の発症を抑制していることが遺伝学的に明らかになった。また、Cdx2やCdx1/Cdx2変異マウスの腸からオルガノイド細胞を作成して、解析を行ったところ、Cdx1やCdx2の遺伝子変異によりオートファジーが抑制されることが分かった。加えて、CDX2とATG7の双方に結合する分子を同定した。今後、これらの結合分子の機能解析を進めることで、CDX2によるオートファジーの活性化機構を解明する。〈CDX2による腸管の粘膜防御機能の個体レベルの解析〉DSS腸炎を誘発するために、野生型マウス、Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウス(Cdx1はCdx2の機能を補償するため)をDSS(dextran sodium sulfate)を投与した。野生型マウスと比べてCdx2欠損マウスに発症する腸炎について顕著な違いは見られなかった。そこで、細菌性腸炎を誘発するために野生型マウス,Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウスに、赤痢菌S. flexneri、C. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24を感染させる実験を行った。赤痢菌は、マウスへの感染効率が悪く炎症は誘発されなかった。C. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24はCdx2欠損マウスに感染し、炎症を誘発することがわかった。また、感染した細菌数を正確に決定するために、常在細菌と区別する必要がある。そこで、上記の細菌を、アンピシリンなどの薬剤に耐性して、感染実験を再度行った。その結果、Cdx2およびCdx1/Cdx2欠損マウスでは、上記の細菌感染により衰弱(体重減少など)が早く、Cdx2を欠損すると、細菌感染への感受性が上昇することがわかった。組織学的解析からも、より炎症が増悪していることなどが分かった。〈CDX2によるオートファジー活性化機構の解析〉CDX2複合体に結合する分子の質量分析の解析から、3個のオートファジー関与分子を同定した。また、そらの分子の遺伝子クローニングを行いタグを融合させた後、細胞に強制発現することで、CDX2やATG7と複合体を形成することを免疫沈降実験により確認した。〈CDX2による腸管の粘膜防御機能の個体レベルの解析〉2019度の結果を統計的なデータとするために、一群10匹程度の野生型マウス、Cdx2欠損マウス、およびCdx1/Cdx2欠損マウスにC. rodentium、EHEC EDL933、EHEC 86-24を感染させて、1腸管上皮細胞内の細菌数の解析、2LC3B-II発現量の定量、3炎症度の病理組織学的評価を再度行う。〈CDX2によるオートファジー活性化機構の解析〉同定したCDX2結合分子の性質から、そらの結合分子は、CDX2やATG7の細胞内局在を制御していると考えている。まず、同定した分子をテトラサイクリン誘導性に発現する細胞を作成する。作成した細胞を用いて、それらの分子の発現を誘導し、まずは、オートファジーの活性などを解析する。さらに、CDX2, ATG7の細胞内局在などを共焦点顕微鏡などを用いて解析する。また、得られる結果により分子機構の解析をさらに進める。
精神治療領域におけるインフォームドコンセントに関わる熟練看護師の実践的知識

精神治療領域におけるインフォームドコンセント(IC)に関わる熟練看護師の実践的知識について、6カテゴリー(関係性の構築、コミュニケーション、信頼性の構築、服薬の導入と協働、退院への環境調整、チームアプローチ)が前年度のグランデッドセオリーアプローチ(GTA)により抽出された。今年度調査は、当該力テゴリーに基づき質問項目を設定し、概念の妥当性、信頼性について質問紙調査により定量的に検証することが目的である。まず、内容妥当性に基づき生成された概念についてアイテムプール作成後、各力テゴリーに関連する質問紙を構成し、約100名の看護師に対する予備調査を行った。質問項目のワーディング等の再検証を行い、探索的因子分析により質問項目のconvergentおよびdiscriminant validityについて検討し、質問項目の精緻化を図った。その後、研究協力依頼に同意した精神科病床200床以上の16病院を選定し、精神科看護師713名を対象者として自記式質問紙の郵送回収による本調査を行い、535名から回答を得た(回収率約75%)。探索的因子分析により7概念(関係性の構築、コミュニケーション、信頼性の構築、服薬の導入と協働、入院体制の調整、治療計画(方針)の習熟と退院への連携、チームアプローチ)を抽出したが、各因子の因子負荷量や因子間の相関分析により、概ね妥当性は確保されているものと推察された。また、各概念領域のChronbachのα係数は、概ね0.8以上を示し、領域内の十分な内部一貫性が得られていることも示された。各領域の平均得点では、コミュニケーション、関係性の構築、服薬の導入と協働、チームアプローチの順に高く、当該領域に対する認知度・実践度が非常に高いことが明らかとなり、精神科看護領域における実践的知識として極めて重要であることが示唆された。精神医療とインフォームド・コンセント(以下IC)は、1988年施行の「精神保健法」において、本人および保護義務者に対する説明と、本人同意を基本とした"入院時告知事項"4項目が規定されている。精神医療モデルにおいては、身体的医療モデルと異なり情報の一般化、客観化が困難であり実証的コンセンサスが得られにくいといわれている。しかし、このような状況下にあっても、ICの実践には、患者の主体的かつ積極的な関わりが不可欠である。そこで、精神治療領域において、ICを効果有らしめるための実践的アプローチの手法を探る目的として本研究を実施する。研究方法:1)研究デザインは、グラウンデッド・セオリー・アプローチ(GTA)とし、分析手法はStrauss & Corbin版(1998)を採用した。2)研究対象者は、A・B2ヶ所の精神医療施設の看護部長に推薦された計8名の熟練看護師に対して倫理的配慮の下で、半構造化面接を実施した。3)データの分析は、面接時の録音を語り手の考えに沿って分類し、それらの特性と次元の類似性をもとに、パラダイムとカテゴリー関連図及び現象全体をあらわすカテゴリー構造図を作成した。結果と考察:被研究者8名の構成は、女性6名男性2名、30歳54歳(平均43歳)、臨床経験年数は10年34年(平均21年)、そのうち精神科勤務は6年28年(平均15年)であった。入院から退院までの時間的経過に沿って、【関係性の構築】【コミュニケーション】【信頼関係の構築】【服薬導入と協働】【社会性とセルフケア】【退院への環境調整】の6つのカテゴリーを抽出した。これらのカテゴリーは、チームアプローチを前提として展開しており、熟練看護師として培ってきた知識とコミュニケーション技術を駆使し、プロセスモデルに沿って、患者の主体的かつ積極的な関わりを支えていた。
芳香族新規求核置換反応の開拓とそれを用いる高機能性ビフェニル誘導体の合成

先に我々は、エステル基がoー位のアルコキシル基を求核置換反応に対して著しく活性化するという興味ある事実を見出し、この知見を利用して、1ーアルコキシー2ーナフトエ酸エステルとナフチルグリニヤ-ル試薬の反応により、高収率で1,1'ービナフチル誘導体を合成する方法を確立した。本研究では、上記の芳香族求核置換反応をビフェニル誘導体の合成に展開し、以下の成果を得た。1.上記のビナフチル合成においては、2ーナフトエ酸エステルにイソプロピルエステルを用いれば、グリニヤ-ル試薬のエステルカルボニル基への付加を完全に抑制でき、求核置換反応を効果的に進行させることができた。しかるに、oーアニス酸エステル類とフェニルグリニヤ-ル試薬との反応では、よりかさ高い2,6ージアルキル置換フェニルエステルとして、エステル基を保護することが必要であることが分った。また、用いるフェニルグリニヤ-ル試薬に応じて、2,6ージアルキルフェノキシ基の立体的大きさを調節することにより、高収率でビフェニル類が合成できることを明らかにした。2.カンナビノ-ルは大麻中に含まれる幻覚発現作用を有する生理活性化合物の一つであり、古くから生合成機構や代謝経路に興味が持たれ、種々の合成法が報告されている。本研究では、上記の芳香族置換反応によりビフェニル骨格形成法を鍵反応とする形式合成法を完成した。即ち、2ーメトキシー4ーメチル安息香酸エステルと2,6ージメトキシー4ーペンチルグリニヤ-ル試薬とをTHFーベンゼン中で反応させ、ビフェニル体を90%の高収率で得ることができた。3.2ー(-)ーメントキシ安息香酸エステルとの反応では、ビフェニルカップリングにおいて軸不斉が誘導できることを見出した。本方法は、光学活性ビフェニル類の有用な合成法となるものと期待される。
動脈硬化形成における制御性T細胞の関与の解明と新規動脈硬化予防法・治療法の開発

動脈硬化症の発生・進展における制御性T細胞(Treg)の役割を検討した。高脂血症下においてTregはT細胞を中心とした免疫細胞の活性化を抑制していることが示唆されたが、Tregの減少により血液中のコレステロール値の低下を認め、動脈硬化形成には影響を与えなかった。動脈硬化モデルマウス(apoE-KO)に紫外線(UVB)照射を行うことにより動脈硬化形成が有意に抑制され、その抑制の機序として強い抑制能を有するTregの関与が考えられた。動脈硬化症の発生・進展における制御性T細胞の役割の検討薬剤(ジフテリアトキシン)誘導性に制御性T細胞(Treg)を減らすことができるDEREG (Depletion of regulatory T cell)マウスと動脈硬化モデルマウス(apoE-KOマウス)とを交配して、DEREG/apoE-KOマウスを作製した。このマウスで効果的にTregを減少させるためのジフテリアトキシンの投与量および回数を検討し、適切な投与プロトコールを決定した。高脂血症下でTregを減少させると全身における著明なT細胞の活性化を認め、高脂血症下において、TregはT細胞を中心とした免疫細胞の活性化を抑制していることが示唆された。予備実験の結果において、Tregを減少させたマウスでは血液中のコレステロール値の低下を認め、Tregの減少は動脈硬化形成に影響を与えなかった。エフェクターT細胞の活性化による動脈硬化促進作用に対して、血液中コレステロールの減少が動脈硬化抑制的に作用したために、結果として動脈硬化病変は不変であったのではないかと予想される。制御性T細胞を誘導・制御することによる新規動脈硬化予防法・治療法の開発apoE-KOマウスを用いて1週間に1回の紫外線(UVB)照射を6週齢から開始して20週齢までの合計14回行い、大動脈基部での動脈硬化の定量評価を行った。UVB照射により全身でのTregの増加とともに動脈硬化形成が有意に抑制されることが分かった。UVB照射による動脈硬化抑制におけるTregの関与を直接的に証明するために、上記で作製したTregを減少させることのできるマウスを用いてUVB照射の実験を行った。このマウスではUVB照射による動脈硬化抑制効果が消失する傾向が見られ、UVB照射による動脈硬化抑制の機序としてTregの関与が示唆された。動脈硬化症の発生・進展における制御性T細胞の役割の検討薬剤(ジフテリアトキシン)誘導性に制御性T細胞(Treg)を減らすことができるDEREGマウスと動脈硬化モデルマウス(apoE-KOマウス)とを交配して、DEREG/apoE-KOマウスを作成した。予備実験を行い、このマウスで効果的にTregを減少させるためのジフテリアトキシンの投与量および回数を検討したが、多量のジフテリアトキシンはマウスの健康に影響を与えることが分かった。現在、マウスの健康に影響を与えないような投与量を検討中である。予備実験の結果ではあるが、高脂血症下でTregを減少させると全身における著明なT細胞の活性化を認め、高脂血症下においても、TregはT細胞を中心とした免疫細胞の活性化を抑制していることが示唆される。制御性T細胞を誘導・制御することによる新規動脈硬化予防法・治療法の開発予備実験の結果より、apoE-KOマウスを用いて1週間に1回の紫外線(UVB)照射を6週齢から開始して20週齢までの合計14回行い、大動脈基部での動脈硬化の定量評価を行った。UVB照射により動脈硬化形成が有意に抑制されることが分かった。動脈硬化病変部での炎症関連免疫細胞(Treg、T細胞、マクロファージ、樹状細胞)の評価は免疫染色を用いて行い、炎症性サイトカインの発現はリアルタイムRT-PCRを用いて行った。動脈病変部でのTregの増加を認め、炎症細胞は減少し、炎症性サイトカインの発現については有意に抑制されていた。また、全身でのT regsの増加に伴い、リンパ組織でのヘルパーT細胞の活性化の抑制を認め、UVB照射により免疫抑制が起こることが示唆された。ある程度計画通り進展しているが、ジフテリアトキシン誘導性にTregを減らす実験については、予想外の副作用を認め、これについては検討が必要であり、今後計画より遅れる可能性がある。おおむね研究計画通りに進んでおり、動脈硬化症の発生・進展における制御性T細胞の役割の検討については、DEREG/apoE-KOマウスを用いて実験を進める。紫外線を用いたTregを誘導・制御することによる新規動脈硬化予防法・治療法の開発については、動脈硬化抑制の機序について詳細に検討する。研究費の使用計画としては、動物実験に使用する遺伝子組み換えマウスの維持管理費用、免疫染色およびフローサイトメトリーに用いる抗体の購入などを考えている。また、研究成果を報告するための学術集会参加費用、論文投稿費用などにも使用する予定である。
ガラス転移点でのトリプシンと水和水の相互作用様式に関する結晶学的構造研究

本研究では、低温蛋白質X線結晶構造解析によって、(1)水溶性蛋白質の水和構造の詳細な解析、(2)蛋白質熱振動のガラス転移と蛋白質の水和構造様態の関連の探究(3)低温蛋白質X線回折実験技術のより多くの蛋白質立体構造解析への応用を目的として行われた。(1)トリプシンの3種類の結晶について低温構造解析を行い、詳細な水和構造検討の結果、蛋白質の折れ畳みに不可欠と考えられる水和水およびその結合サイトの同定を行うことができた。また、溶媒領域に露出した疎水性アミノ酸残基の水和形態を直接論じることができた。その結果、疎水性アミノ酸残基の水和は、その周辺に存在する水和サイトに制限されて形成されるため、その溶媒和エネルギーは、それらの環境に大きく依存することが示された。蛋白質表面の水和水は、蛋白質の原子や他の水和水と水素結合して、蛋白質表面を覆う程度に大きな水和クラスターを形成することが明らかとなった。特に、これらのクラスターは、蛋白質の低振動ダイナミクスを液体窒素温度で凍結していることが強く示唆された。また、同様の解析をシタロン脱水素酵素やイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素についても行った。(2)については、トリプシン結晶に対して、100、115、130、145、160、170、210、293Kの温度で1.6Å分解能での測定と構造精密化を行い、水和構造を比較検討した。100Kから170Kの温度範囲では、水和構造に大きな変化がなかったが、210Kでは、水和水の量が293Kで見い出されたものと大きな差異がないことが明らかとなった。この結果は、蛋白質のガラス性転移が蛋白質表面の水和ネットワークに大きく左右されていることを示す結果である。(3)本研究で熟成された低温X線結晶構造解析法は、一酸化窒素還元酵素、tRNA合成酵素、Ca-ATPase、キシラーゼの各結晶の回折強度データ収集に適用された。
包括的解析技術を用いた細胞分化における遺伝子発現の学習則の探索

細胞が分化する過程において、遺伝子の発現はオンまたはオフに固定化される。このような遺伝子発現の固定化を、脳の学習のアナロジーとして見立てることが可能である。先行研究から、プロモーターに関連した非コードRNA(PASR)が遺伝子発現の固定化に関与することが予想された。そこで、本研究では包括的解析技術を用いることにより先行研究を一般化し、細胞分化における遺伝子発現の学習則「PASRを介した遺伝子発現状態の固定化」があるかを調査する。本年度は、昨年度行ったメチル化DNA免疫沈降法(MeDIP)に加え、より高いダイナミックレンジを担保するため、MBD(Methyl CpG binding domain)による親和性沈降実験を行い、細胞分化の前後におけるDNAメチル化の変化を調べる実験を行った。さらに、エピジェネティクス変化を包括的に理解するために、MBD沈降産物を次世代シーケンシングで解析中である。また、昨年度に行ったマイクロアレイ解析の結果をもとに、数種類の未分化・分化状態特異的に発現するプロモーターRNAをRACE法によって同定した。同定した未分化状態特異的RNA及び分化状態特異的RNAについては、cDNAに変換し発現ベクターに組込み、それぞれ、分化細胞と未分化細胞にエレクトロポレーションを行った。プロモーターRNAの細胞導入が細胞状態や遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べるために、フローサイトメトリー・細胞ソート・RT-qPCRを用いて解析を行った。先行研究から、プロモーターに関連した非コードRNA(以下プロモーターRNA)が遺伝子発現の固定化に関与することが予想された。そこで、本研究では包括的解析技術を用いることにより先行研究を一般化し、細胞分化における遺伝子発現の学習則「プロモーターRNAを介した遺伝子発現状態の固定化」があるかを調査する。本年度はまず、分化時の定量的遺伝子発現解析を可能とするin vitro分化系の選定を行った。時系列サンプリング及び定量的PCR法を行ったところ、薬剤処理により転写因子の活性化を引き起こし、高効率にマウス胚性幹細胞から原始内胚葉へと分化誘導をする系は、分化規則の探索に必須である定量的な遺伝子発現解析に適していることがわかった。この誘導系を用いて、分化前後の包括的遺伝子発現を調査し、既知の未分化・分化マーカー及び機能未知遺伝子の発現がダイナミックに変動することを確認した。一部のマーカー遺伝子については、バイサルファイトPCR法及びメチル化DNA免疫沈降法により、そのプロモーター領域のメチル化状態の変化をとらえた。さらに、転写されたRNAを、そのセンス鎖・アンチセンス鎖を区別して増幅してプロモーターマイクロアレイにハイブリダイゼーションすることにより、分化前後のプロモーターRNA発現を包括的に解析した。
高次視覚パターン認識のダイナミクス：心理実験と数理モデル化

人の視覚系では,初期の領野で単純な画像特徴を抽出し,高次の領野でこれらを統合することにより,複雑なパターン認識を実現している.こうした階層的認識メカニズムは工学的にも応用され,大きな成功を収めている.また,視覚的な情景の理解がボトムアップによる一撃計算で実現されるという考え方は,近年の心理物理学にも大きな影響を与えている.しかし,もちろん我々の視覚認知が一撃計算だけで実現されるわけではない.本研究課題は,高次物体認知に関する心理実験を行うとともに,大規模な階層型パターン認識モデルを構築し,これらを対比することで人のパターン認識のダイナミクスを明らかにすることを目的としている.平成26年度は,心理実験の実施に向けた準備と,数理モデルの構築を行った.まず,心理実験の準備については,実験環境の構築とプログラムの作成,および刺激の生成を行った.実験には,複数の自然画像と,その間を滑らかにつなぐモーフィング合成画像を用いる.このため,合成比率を細かく変えながら大量の画像を生成する必要がある.ここでは,Psychological Image Collection at Stirlingデータベースの顔画像を用いて,様々な合成顔を生成した.また,数理モデルについては,シミュレーション環境の構築およびプログラムの開発を行った.手書き文字パターン認識モデルとして広く知られているネオコグニトロンを6層構造に拡張し,自然画像から高次特徴を学習できるようにした.学習には,McGill Calibrated Colour Image Databaseの自然画像を,ランダムな位置で切り出した画像パッチを用いた.学習後の最上位層の特徴応答は,未知の自然画像とその間の合成画像に対し滑らかに変化し,定性的に人と同様の残効効果も示すことを確認した.当初計画の通り,心理実験の実施に向けた準備,および数理モデルの構築と性能評価を行い,その成果を学会等で発表した.このため,現在までのところおおむね順調に進展していると判断できる.平成26年度に準備した実験設備等を用いて心理実験を実施するとともに,モデルを用いた実験刺激の分析を行う.心理実験としては,モーフィング合成した刺激を用いて物体残効実験を行う.これにより,刺激の特徴空間内での相互関係を評価し,特徴空間マップを作成する.残効は,一般に,順応刺激とテスト刺激の認知的距離に応じてその効果が変化する.従って,様々な物体の組み合わせで残効量を測定することで,特徴空間内での相互関係が明らかになる.なお,この実験はヒトを対象とした視覚心理実験であるため,実験計画の倫理的評価を受ける必要がある.このため,まず学内の研究倫理審査委員会の承認を受け,その後実験を実施する.また,モデルが学習した特徴空間上でも,実験刺激の関係を評価するマップを作成する.これは,最終年度の検討の基盤となる.心理実験等に使用する設備はすでに準備している.このため,次年度の研究費は,研究発表にかかる費用(旅費,学会参加費,論文投稿料)が主要なものとなる.次年度使用額についても,研究成果発表にかかる費用の一部として使用する.人の視覚系では,初期の領野で単純な画像特徴を抽出し,高次の領野でこれらを統合することにより,複雑なパターン認識を実現している.こうした階層的認識メカニズムは工学的にも応用され,大きな成功を収めている.また,視覚的な情景の理解がボトムアップによる一撃計算で実現されるという考え方は,近年の心理物理学にも大きな影響を与えている.しかし,もちろん我々の視覚認知が一撃計算だけで実現されるわけではない.本研究課題は,高次物体認知に関する心理実験を行うとともに,大規模な階層型パターン認識モデルを構築し,これらを対比することで人のパターン認識のダイナミクスを明らかにすることを目的としている.平成26年度は,心理実験の実施に向けた準備と,数理モデルの構築を行った.まず,心理実験の準備については,実験環境の構築とプログラムの作成,および刺激の生成を行った.実験には,複数の自然画像と,その間を滑らかにつなぐモーフィング合成画像を用いる.このため,合成比率を細かく変えながら大量の画像を生成する必要がある.ここでは,Psychological Image Collection at Stirlingデータベースの顔画像を用いて,様々な合成顔を生成した.また,数理モデルについては,シミュレーション環境の構築およびプログラムの開発を行った.手書き文字パターン認識モデルとして広く知られているネオコグニトロンを6層構造に拡張し,自然画像から高次特徴を学習できるようにした.学習には,McGill Calibrated Colour Image Databaseの自然画像を,ランダムな位置で切り出した画像パッチを用いた.学習後の最上位層の特徴応答は,未知の自然画像とその間の合成画像に対し滑らかに変化し,定性的に人と同様の残効効果も示すことを確認した.当初計画の通り,心理実験の実施に向けた準備,および数理モデルの構築と性能評価を行い,その成果を学会等で発表した.このため,現在までのところおおむね順調に進展していると判断できる.平成26年度に準備した実験設備等を用いて心理実験を実施するとともに,モデルを用いた実験刺激の分析を行う.心理実験としては,モーフィング合成した刺激を用いて物体残効実験を行う.これにより,刺激の特徴空間内での相互関係を評価し,特徴空間マップを作成する.残効は,一般に,順応刺激とテスト刺激の認知的距離に応じてその効果が変化する.従って,様々な物体の組み合わせで残効量を測定することで,特徴空間内での相互関係が明らかになる.なお,この実験はヒトを対象とした視覚心理実験であるため,実験計画の倫理的評価を受ける必要がある.

このため,まず学内の研究倫理審査委員会の承認を受け,その後実験を実施する.また,モデルが学習した特徴空間上でも,実験刺激の関係を評価するマップを作成する.これは,最終年度の検討の基盤となる.平成26年度の成果の一部を年度をまたいで次年度に発表するため.心理実験等に使用する設備はすでに準備している.このため,次年度の研究費は,研究発表にかかる費用(旅費,学会参加費,論文投稿料)が主要なものとなる.次年度使用額についても,研究成果発表にかかる費用の一部として使用する.
有機保護剤を利用したPt－Mナノ粒子の構造制御とヘテロ構造化による触媒機能の向上

液相還元法を用いて炭素担持Pt系ナノ粒子を合成する際の保護剤の分子構造の効果を調べた。これまでにカルボン酸塩の炭素鎖が長いほどPt-Cu粒子が微細化することを見出してきた。今年度は更に、アクリル酸塩や安息香酸塩などの共鳴構造を含む保護剤を用いるとPtイオンが安定化しメタノール水溶液中で還元しないことがわかった。また、二価の芳香族カルボン酸塩(フタル酸塩)を用いると微細な結晶が得られ、保護剤の官能基の種類や数によって白金イオンの還元性と白金粒子の安定性を調節できることがわかった。Pt単元系及びPt-Cu,Pt-Ru,Pt-Co,Pt-Niの各二元系ナノ粒子について、保護剤無添加の場合、長鎖カルボン酸ナトリウム、ホスフィン酸ナトリウム、それらの両方を添加して合成した場合のそれぞれの粒子構造と触媒特性を調べた。保護剤を添加して合成した触媒はいずれも保護剤無添加の条件で合成した触媒よりも微細な粒子が得られ、Pt-Ru二元系触媒を除き、ホスフィン酸ナトリウムを添加して合成した触媒が他の保護剤を用いて合成した触媒よりもメタノール酸化活性に優れる傾向が認められた。触媒に残留した保護剤成分が反応中間体の酸化を促進していると考えられた。メタノール、2-プロパノール、ギ酸の酸化反応を回転電極装置で行ったところ、いずれの反応も電極の回転数が高くなるに従って電流が低下したことから、反応中間体が触媒表面から脱離して拡散することがわかった。ギ酸の酸化反応では、触媒表面から脱離しうる生成物は炭酸塩類と考えられ、炭酸塩類が触媒表面を被毒物から保護している可能性も示唆された。炭素担持Pt-Cuナノ粒子をアルコール還元法で合成する際に添加するカルボキシレートの分子構造を変えてナノ粒子の構造と形状を調べ、ナノ粒子保護メカニズムを探った。炭素鎖が長いほどサイズが小さく炭素上によく分散したPt-Cuナノ粒子が生成したが、各粒子の組成を走査電子顕微鏡とX線分光法で調べると分散した粒子はCu含有量が少なく、凝集した粒子はCuがPtとよく合金化していることがわかった。金属表面への保護剤の吸着とCuイオンの吸着が競争し、保護剤が吸着すればCuがPtの格子に取り込まれにくいが分散性の高い粒子が生成し、Cuイオンが吸着すれば保護効果が小さいために凝集しやすくなる一方、吸着Cuイオンが還元されて合金化が進むことが示唆された。金属担持量を増加させた場合でも保護剤の炭素鎖を更に長くすることで分散性が保たれることもわかった。第一原理計算により、Pt上に保護剤が吸着する際、Ptからカルボキシレートの酸素原子に電荷が移動することも明らかとなった。表面のPtとCuの元素配列によっても吸着エネルギーが異なり、現在表面の元素配列と保護剤分子種を変えたシミュレーションを行っている。触媒のメタノール酸化活性を評価したところ、炭素鎖長が中間のコハク酸ナトリウム用いて合成した触媒の活性が最も高く、適度なサイズの分散した粒子が高い活性に起因するものと考えられた。1ナノメートル程度の微細な粒子は組成がPt単元触媒に近く、燃料のアルコールや中間体を強く吸着して反応が進みにくい事がわかった。炭素鎖の長いカルボキシレートが高担持量のPt-Cu触媒に有効であることを見出し、また第一原理計算によってもPtからカルボキシレートの酸素原子に電荷が移動することも突き止めた。吸着力や立体障害が保護効果のパラメーターであることを裏付けた。粒子サイズおよび組成とメタノール酸化性能の相関も調査済みである。炭素担持Pt-Cu、Pt-Ru、Ptナノ粒子をアルコール還元法で合成する際に添加するカルボキシレートの分子構造を変えてナノ粒子の構造と形状を調べ、ナノ粒子保護メカニズムを探った。2030 wt%程度の実用的な金属担持量であっても炭素鎖の長いセバシン酸ナトリウムを保護剤に用いると1 nm程度のPt-Cu粒子を炭素上に高分散に担持できた。X線回折ピークは認められず、CuのXAFSは酸化銅のそれに近かったが、エネルギー分散型X線分析を併用した電顕ではPtとCuの分布がほぼ一致していることから、Cuは合金に近い状態でPtの近傍にあることが示唆された。一方、PtやPt-Ru系粒子の合成にはカルボキシレート系の保護剤の効果は小さかったが、ホスフィン酸ナトリウムを保護剤に用いると炭素上に分散担持することができた。Pt-Cuの場合には数個の粒子からなる凝集体が担体上に分散した構造となり、ホスフィン酸濃度が高いほどCuのPtへの固溶が進んだ。これらの結果から、カルボキシレートが立体効果により粒子成長を抑制するのに対し、ホスフィン酸塩はPtイオンの還元を抑制する効果もあることが示唆された。炭素担体の影響も調べた。比表面積が低くても、揮発分が多い、即ち表面官能基が多いSunblack X15上には凝集体が認められずPt-Cu粒子が炭素表面に密に分散担持された。ホスフィン酸塩を用いて合成したPt-Cu触媒は2ープロパノール酸化活性に優れ、中間体に対するPt-Cu合金の被毒抑制効果と触媒に残留したリンの酸化促進効果によるものと考えられた。この他、含浸法で炭素担持Pd触媒を調製しPd源の影響を調べた。含浸法でも金属源のカウンターアニオンは触媒構造と活性に大きな影響を与えることがわかった。硝酸塩よりも酢酸塩を用いた方が粒子サイズが小さく、より広い電位範囲にわたりギ酸酸化活性を示すことがわかった。

カルボキシレートとホスフィン酸塩を保護剤に用いて炭素担持Pt-Cu、Pt-Ru、Ptナノ粒子触媒を調製し、各保護剤の効果と各組成における粒子生成メカニズムを明らかにした。二種の保護剤を共存させて粒子合成を行い、Pt-Cu系、Pt-Ru系、Pt系のそれぞれに対する各保護剤の効果から、異種粒子が共存したヘテロ構造触媒の設計指針を得た。含浸法によりPd系触媒を調製し、含浸法においてもPd源のカウンターアニオンが粒子サイズと触媒特性に影響することを見出し、現在粒子サイズと触媒特性の関係の調査、液相合成の検討を行っている。液相還元法を用いて炭素担持Pt系ナノ粒子を合成する際の保護剤の分子構造の効果を調べた。これまでにカルボン酸塩の炭素鎖が長いほどPt-Cu粒子が微細化することを見出してきた。今年度は更に、アクリル酸塩や安息香酸塩などの共鳴構造を含む保護剤を用いるとPtイオンが安定化しメタノール水溶液中で還元しないことがわかった。また、二価の芳香族カルボン酸塩(フタル酸塩)を用いると微細な結晶が得られ、保護剤の官能基の種類や数によって白金イオンの還元性と白金粒子の安定性を調節できることがわかった。Pt単元系及びPt-Cu,Pt-Ru,Pt-Co,Pt-Niの各二元系ナノ粒子について、保護剤無添加の場合、長鎖カルボン酸ナトリウム、ホスフィン酸ナトリウム、それらの両方を添加して合成した場合のそれぞれの粒子構造と触媒特性を調べた。保護剤を添加して合成した触媒はいずれも保護剤無添加の条件で合成した触媒よりも微細な粒子が得られ、Pt-Ru二元系触媒を除き、ホスフィン酸ナトリウムを添加して合成した触媒が他の保護剤を用いて合成した触媒よりもメタノール酸化活性に優れる傾向が認められた。触媒に残留した保護剤成分が反応中間体の酸化を促進していると考えられた。メタノール、2-プロパノール、ギ酸の酸化反応を回転電極装置で行ったところ、いずれの反応も電極の回転数が高くなるに従って電流が低下したことから、反応中間体が触媒表面から脱離して拡散することがわかった。ギ酸の酸化反応では、触媒表面から脱離しうる生成物は炭酸塩類と考えられ、炭酸塩類が触媒表面を被毒物から保護している可能性も示唆された。分散性の高い粒子が得られたが、わずかに生成する凝集体をなくし、更なる分散性の向上を目指す。PtとCuの配置が異なる金属表面への保護剤の吸着シミュレーションを行い、PtとCuそれぞれの吸着サイトでの電荷の移動とそのエネルギー変化、立体的な効果を詳細に調べ、実験結果を裏付ける。触媒のヘテロ構造化には分散度が不均一な触媒に熱処理を施し分散性の良くない粒子のみシンタリングさせる。構造特性の各素反応への寄与を抽出するため、アルコール燃料種、燃料濃度、溶液のpH、反応温度をパラメータとして各触媒の酸化反応特性を比較する。燃料としてアルコールの他にその酸化中間体と考えられるギ酸や一酸化炭素も含める。液相法で保護剤を用いることにより、実用的な金属担持量のPt-Cu、Pt-Ru、Ptナノ粒子触媒を調製する事が可能となった。今後、保護剤を活用して異種ナノ粒子が共存するヘテロ構造触媒の調製に応用する。アルコールの酸化中間体と酸素の吸着バランスが異なる二種の粒子を互いに近接するよう配置し、低電位域での被毒の低減と酸化の促進を目指す。メタノール、2ープロパノールの他、バイオマスから得られるエタノールとエチレングリコールの酸化に触媒を適用する。
行動の性差を生み出す内側視索前野の機能解剖学的解析

性的二型は性特異的もしくは性差のある行動の制御に関わっていると考えられており、脳の構造的性差が行動に与える影響は不明であった。内側視索前野は養育行動や性行動の中枢として知られ、攻撃行動への関与も指摘されているが、解剖学的知見に乏しく亜領域レベルでの機能は検討されてこなかった。研究代表者らはこの領域において新たに複数の性的二型細胞集団があることを発見した。本研究では、この性的二型細胞集団が行動の性差の責任領域の一つなのかについて検討するため、その解剖学的特徴づけを行うと共に、その機能を解明することを目的とした。内側視索前野は性差のある行動を制御する領域であることから、多くの構造的性差があると予想されていた。研究代表者が新たに見出した複数の性的二型核、もしくは二型集団の分子マーカーを利用し、組織学的解析による細胞群の形態学的特徴づけと、投射解析と神経活性操作を行い、その機能解明に取り組んでいる。初年度は、入手した様々なCreドライバーマウスを用いて、そのCre発現がmRNA発現と一致することをまず明らかにした。これにより、Creドライバーマウスの有用性を確認できた。また、内側視索前野に膜移行型GFPをCre依存的に発現するAAVベクターを投与することにより、その投射先を組織学的に確認することが出来た。これらの知見は、これまで不明であった内側視索前野の各細胞群の機能解明に大きく貢献することが予想される。また、人工変異受容体であるDREADDシステム及び光遺伝学システムを用いて、細胞活性の操作にも着手しており、性的二型を示す細胞群ごとにそれぞれ異なる表現型が得られつつある。今後、さらに実証的な機能に関するデータを得るために、in vivoイメージングの系を立ち上げている。計画で予定していた実験は滞りなく遂行できており、それぞれのマウスの表現型も当初期待していた以上に確認ができている。利用しているマウスの系統は8系統と数が多いが、スムーズに実験も進行している。実験計画に準じて、細胞構築の解析と細胞の形態解析、投射解析と神経活動操作を予定通り行っていく。また、これらの実験に加えて、より近代的な手法としてin vivoイメージング系や狂犬病ウイルスを用いた特異的な投射解析を実行することも視野に入れつつ、さらなる実験系の拡充を図っていく。初年度予定していたマウス実験が、予想以上に成功し、実験の失敗が少なかったために必要最小限の実験を行ったため、余剰金が発生した。この余剰金を用いて、実験をさらに進め、in vivoイメージング等の先端的技術を用いた解剖学的解析を進めていく予定である。また、想定よりも早期に実験結果が出そろう可能性も高く、解析を行うための人件費にも多く配分していく予定である。
緑内障における網膜神経節細胞死の抑制と網膜神経分化の分子生物学的・遺伝学的研究

緑内障における網膜神経節細胞の細胞死の過程にはグルタミン酸等の興奮性アミノ酸によるNMDA受容体の刺激と、それに続く細胞内へのCa2+の流入が関与していることがわかってきた。一方、Ca2+の流入に伴い細胞内では一酸化窒素(NO)の活性化によりNO合成が行なわれると考えられ、このNOがグルタミン酸による細胞毒性の経路に関与していると思われる。これまでに我々は培養網膜神経節細胞においてNO合成酵素が発現しており、NOが作られることを確認した。また、神経栄養印栄養因子の欠乏が一つの因子として関与していると考えられるため、神経栄養因子のひとつであるBDNFについて検討した。幼若期、成熟期および老齢期のマウスおよび,老化促進マウスとしてSAMマウスを用いてBDNFタンパクの発現を免疫組織学的手法、さらにはウエスタンブロット法を用いて比較定量したところ、網膜におけるBDNFの発現の低下がみられた。緑内障における神経細胞死にはBDNFなど神経栄養因子の欠乏も要因のひとつとして関与している事が示唆された。これらの研究により緑内障における網膜神経細胞死のメカニズム解明の端緒となることが期待される。これまでにクローニングした眼発生に関わる新規遺伝子の情報を元に、蛋白質レベルでの機能の解析やこの遺伝子に結合する蛋白質の検索も行うこととした。遺伝子情報を元にウサギを用いて抗体を作成し、この抗体が新規の蛋白質を認識することをウエスタンブロット法にて確認した。今後のさらなるタンパク質レベルで解析や、人の未分化な細胞への遺伝子導入による分化様式をみることで眼球奇形などの先天性遺伝性疾患の解明につながると考えられる。1.グルタミン酸刺激下における網膜神経節細胞の一酸化窒素(NO)合成能緑内障における網膜神経節細胞死の誘因の一つに、グルタミン酸刺激が考えられている。単離培養したラット網膜神経節細胞(RGC)を用いて、免疫化学染色を行ったところ、ラットRGCに一酸化窒素合成酵素(NOS)が発現していることが確認された。培養RGCよるNO合成は、グルタミン酸刺激によって促進し、一方NOS阻害剤によって阻害された。特に、NOSのサブタイプの一つであるnNOSの特異的阻害剤による、NO合成抑制効果が顕著であった。2.グルタミン酸誘発網膜神経節細胞死に関する電気生理学的検討培養RGCには、グルタミン酸受容体の3糖類のサプタイプ(NMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体)が発現・機能している事をパッチクランプ法を用いて確認した。神経ステロイドである20-HEは、主にNMDA受容体を抑制したことから、グルタミン酸による神経細胞毒性を抑制するものと考えられた.3.網膜分化を誘導する新規遺伝子ODAGのクローニングと機能解析生後2日および10日におけるマウス眼球内の様々な遺伝子の発現パターンをDNAマイクロアレイを用いて調べ、その中から生後2日目には高い発現があるものの10日目には発現がほぼ消失する新規遺伝子ODAGをクローニングした.マウスODAGは266アミノ酸から構成されていた。データベースの検索から、ODAGはヒトにおいても保存されていることが分かった。またin situ hybridizationにより、生後2日および7日のマウスでは、ODAGは網膜に強く発現する他に、眼球内の様々な組織で発現していることが確認された。一方、生後14日のマウス眼球内では発現が全くみられなかった。これらの発現パターンから、ODAGは眼球の発育に関与する遺伝子と考えられた。