hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異なる環境間で起る微生物遺伝子の循環の証明-薬剤耐性・病原性遺伝子の環境中での変遷と運命を知るために-

本研究では,異なった環境に住む微生物間での遺伝子の伝達機構を明らかにし,さらに遺伝子が環境間を循環しながら広範囲に広がってゆくことを観測と実験で解明することを目標としている。研究代表者鈴木と分担者中野のグループおよび分担者那須はそれぞれ薬剤耐性遺伝子,病原性遺伝子を標的とし,それらの分布と伝達様式を調べ,分担者千浦は最近発見された非特異的遺伝子伝達粒子での特定遺伝子の伝達性を調べている。鈴木は,本年度は新規オキシテトラサイクリン耐性遺伝子tet34の環境中分布,およびリボソーム保護タンパク遺伝子tetMが海洋環境,魚類腸内に広く分布することをはじめて明らかにした。那須は大阪の河川にベロ毒素遺伝子を持つ菌が増殖可能な状態で棲息していることを明らかにした。さらに,あたらしい遺伝子検出法を開発し,今後環境試料への適応が期待される。千浦はtet34とtetMを保有するVibrioが伝達粒子を産生し,それが大腸菌へ感染して薬剤耐性能を付与することを明らかにした。分担者木暮は同種でも変異のある細胞の分離法開発およびlux遺伝子の進化を調べている。発光能をもつ魚類ヒイラギに共生するVibrio, Photobacteriumにおけるlux遺伝子の多様性と伝達が明らかになってきた。luxはVibrio, Alteromonas, Enterobacteriaceae間でも水平伝播している可能性が強く示唆された。以上のように,2年目は全ての分担者が研究を加速的に展開し,予定通りの成果をあげている。微生物は自分では地理的移動能力がないにも関わらず、同じ遺伝子が異なる環境の異なる微生物種から見つかることがある。本研究では、微生物間での遺伝子の伝達と拡散の現状把握と機構解明を目的とした。本研究では主に薬剤耐性遺伝子と病原性遺伝子を標的遺伝子とした。まず、テトラサイクリン(TC)耐性遺伝子では、これまでヒトや家畜の臨床菌でしか見つかっていなかった耐性遺伝子tet(M)が養殖魚腸内および養殖場環境に生息する海洋細菌も保有することを明らかにした。このことは、tet(M)が陸上環境と海洋環境両方に存在し、かつ、養殖場でのTCの使用頻度とtet(M)の出現頻度の相関から考えて、tet(M)は海洋中で独自に増殖していることが示唆された。海洋環境には陸上・臨床環境と同様に様々な遺伝子が存在し、異なる細菌間で伝達されていることが示唆される。次に、ベロ毒素遺伝子に関しては、O157 Sakai株のそれと同じものが河川中に常在していることが明らかになった。さらに、本遺伝子は底泥中で活発に発現しており、水中よりは底泥でファージを介したベロ毒素遺伝子の伝達が高頻度で起っていることが示唆された。以上の2つの事例から、沿岸底泥や河川底泥中が種々の遺伝子の増殖・伝達場所であることが強く示唆される。また、ヒトの病原菌である緑膿菌が海洋でも広く分布していることが明らかになり、本菌は地球上で最も広範囲に生息する生物であることが明らかになった。このような菌が陸上と海洋で遺伝子を伝達させることが考えられる。伝達ベクターとしては、非特異的にどのような微生物間でも遺伝子伝達が可能なウイルス様粒子(VLP)が発見され、tet遺伝子もこのベクターで伝達可能であることが示唆された。
高精度・高次元医用画像時代における次世代「人体アトラス」の構築

本研究の目的は、高精度・高次元医用画像時代の到来を踏まえた、全く新しい形での「次世代人体アトラス」構築に関する研究を行うことである。本研究では,「人体構造情報に関してどのような形で計算機上に蓄積するのか?」「蓄積された情報をどのように利用すれば、例えば計算機支援画像診断などに活用可能なのか?」に関して、組織的な調査研究を行った。ここでは,前年度における仕様策定結果を基に「次世代胸部アトラス」構築に取り組んだ。その成果を用いて、3次元胸部CT像自動認識実験などを行い、本研究成果の有効性などの検証を行った。以下,各研究項目の結果を示す.(1)次世代胸部アトラス拡充昨年度までに開発されたアトラス入力システムを用いて、胸部領域に存在する臓器に関するアトラスを構築する。また、アトラス構築に用いる症例数を増加させることで、個人間のばらつきも記述された「次世代アトラス」の拡充を図った,特に呼吸器専門医の協力を得ることで気管支枝名に関するアトラスを65症例から構築した.また,同様に縦隔部における臓器領域アトラスの構築を行った.(2)アトラスと個別画像との対応付け手法の実装平成16年度での検討結果を基に、領域情報、構造情報、解剖学的構造の個人間相違、記述情報に関するそれぞれのアトラスと個々の被験者の高次元医用画像を対応付ける手法を開発した.特に先述の気管支枝名,縦隔部臓器領域抽出手法を開発した.(3)次世代アトラスを利用した医用画像処理システムの試作これまでの研究成果を基にして、次世代アトラスを利用した医用画像処理システムを試作し、臨床医による評価を行った.本研究の目的は,高精度・高次元医用画像時代の到来を踏まえた,全く新しい形での「次世代人体アトラス」構築に関する研究を行うことである.本研究では,「人体構造情報に関してどのような形で計算機上に蓄積するのか?」「蓄積された情報をどのように利用すれば,例えば計算機支援画像診断などに活用可能なのか?」に関して,組織的な調査研究を行った.対象を胸部領域に限定し,計算機が理解可能な形の胸部アトラス実現を目指した.ここでは主に,胸部アトラス実現に関する基礎的な手法の検討を行った.ここでは,(1)領域情報に関するアトラス,(2)分岐構造といった構造情報に関するアトラス,(3)解剖学的構造の個人相違に関するアトラス,(4)解剖学的名称といった記述情報に関するアトラス,の4つを軸として,それぞれに関する検討を行った.(1)各アトラスの仕様検討領域情報,構造情報,解剖学的構造の個人間相違,記述情報に関するそれぞれのアトラスをどのように実現するのかを組織的に検討した.特に計算機上でのデータ構造の実現のしやすさ,アトラスを入力する労力の妥当性,各個人の高次元医用画像とアトラスとの照合のしやすさなどといった複数の観点から検討を行った.(2)各アトラスと各高次元医用画像との対応付け方法の検討計算機上に実現されたアトラスと各個人の医用画像とどのように対応付けるのかを検討した.(3)アトラス入力システムの構築対象として胸部の気管支を取り上げ,気管支に関する「領域情報」「構造情報」「解剖学的構造の個人相違」「記述情報」それぞれを入力するためのシステムを構築した.入力者の負担を軽減可能なアトラス入力システムを実現した.(4)症例画像データベースの構築「次世代胸部アトラス」構築に必要な3次元胸部CT像データベースの構築を行った.本研究の目的は、高精度・高次元医用画像時代の到来を踏まえた、全く新しい形での「次世代人体アトラス」構築に関する研究を行うことである。また、アトラス構築に用いる症例数を増加させることで、個人間のばらつきも記述された「次世代アトラス」の拡充を図った,特に呼吸器専門医の協力を得ることで気管支枝名に関するアトラスを65症例から構築した.また,同様に縦隔部における臓器領域アトラスの構築を行った.(2)アトラスと個別画像との対応付け手法の実装平成16年度での検討結果を基に、領域情報、構造情報、解剖学的構造の個人間相違、記述情報に関するそれぞれのアトラスと個々の被験者の高次元医用画像を対応付ける手法を開発した.特に先述の気管支枝名,縦隔部臓器領域抽出手法を開発した.(3)次世代アトラスを利用した医用画像処理システムの試作これまでの研究成果を基にして、次世代アトラスを利用した医用画像処理システムを試作し、臨床医による評価を行った.
少子高齢化や新しい技術の進歩の下での経済成長に関する理論的・実証的分析

本研究の目的は、人口減少や新技術の進歩が経済成長に与える影響を理論的・実証的に分析することにある。これまでの世界経済では正の人口成長率が通常だったため、人口が減少する場合に何が起こるかを明示的に分析した先行研究は限られている。また、労働力を代替する新技術が経済成長に与える影響を考察した研究は始まったばかりである。本研究では、まず経済成長理論の枠組みを使って、人口減少下の成長メカニズムを理論的・実証的に考察する。次に、新技術が労働力を代替するモデルで、人口減少下での経済成長を考察する。労働力の減少を新技術が代替する経済には、正の側面だけでなく、さまざまな負の側面があることを解き明かしていく。
癌細胞の糖鎖のガラクトシル化を制御する転写因子ネットワークの解明

本研究では細胞の癌化に伴う細胞膜糖タンパク質糖鎖のガラクトシル化の変化の有無、及びβ-1, 4-Ga1T II及びV遺伝子の転写制御機構を解析した.本研究から、細胞の癌化に伴う糖鎖のガラクトシル化、及びこのガラクトシル化機構に関わる糖鎖遺伝子の転写制御機構の一端が初めて明らかになった.また、転写因子の発現を制御することで癌細胞の糖鎖のガラクトシル化を制御し、癌細胞の悪性形質を抑制できる可能性が示唆された.本研究では細胞の癌化に伴う細胞膜糖タンパク質糖鎖のガラクトシル化の変化の有無、及びβ-1, 4-Ga1T II及びV遺伝子の転写制御機構を解析した.本研究から、細胞の癌化に伴う糖鎖のガラクトシル化、及びこのガラクトシル化機構に関わる糖鎖遺伝子の転写制御機構の一端が初めて明らかになった.また、転写因子の発現を制御することで癌細胞の糖鎖のガラクトシル化を制御し、癌細胞の悪性形質を抑制できる可能性が示唆された.細胞膜糖タンパク質に結合したN-型糖鎖は、細胞の癌化に伴って著しく構造が変化し、癌細胞の腫瘍形成や転移に関わっている。我々は、細胞の癌化で著しく発現が変化するβ-1,4-ガラクトース転移酵素(β-1,4-GalT)IIやV遺伝子の発現を制御して、癌細胞の増殖や腫瘍形成を抑制できることを見出した。本研究では、細胞の癌化に伴う細胞膜糖タンパク質糖鎖のガラクトシル化の変化の有無と、マウスβ-1,4-GalT II及びV遺伝子の転写制御機構を解析し、両遺伝子の発現を制御する転写因子の同定を試みた。β-1,4-ガラクトース残基と結合するRCA-Iを用いたレクチンプロット解析の結果、マウス線維芽細胞に比べて、癌化した細胞では幾つかの糖タンパク質でRCA-1との結合性が増大していた。従って、細胞の癌化に伴って糖鎖のガラクトシル化は亢進すると考えられた。マウスβ-1,4-GalT II遺伝子の転写制御機構を解析するために、PCR法によりマウスゲノムDNAからこの遺伝子の5'-上流を単離し、塩基配列を決定した。次に、ルシフェラーゼ遺伝子に様々な長さの5'-上流領域を繋いだプラスミドを作製し、種々のマウス線維芽細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行なった。その結果、プロモーター活性は開始コドンから-247-1の領域に検出された。この領域をビオチン化し、これをマウス線維芽細胞NIH3T3の細胞溶解液と振盪した後に、ストレプトアビジンビーズを用いて、この領域と相互作用する転写因子を単離した。現在、MALDI-TOF質量分析によりタンパク質を同定中である。また、マウスβ-1,4-GalT V遺伝子についても同様に解析中である。本研究から、細胞の癌化に伴う糖鎖のガラクトシル化と、β-1,4-GalT II遺伝子の転写制御機構の一端が初めて明らかになった。細胞膜糖タンパク質に結合したN-型糖鎖は細胞の癌化に伴って著しく構造が変化し、癌細胞の腫瘍形成や転移に関わっている。我々は、細胞の癌化に伴って著しく発現が変化するβ-1, 4-ガラクトース転移酵素(β-1, 4-GalT) IIやV遺伝子の発現を制御して、癌細胞の増殖や腫瘍形成を抑制できることを見出した。本研究では、マウスβ-1, 4-GalT IIやV遺伝子の発現を制御する転写因子の同定、及び転写因子を用いて癌細胞の糖鎖のガラクトシル化を制御し、癌細胞の悪性形質の抑制が可能かどうかを試みた。前年度に同定したマウスβ-1, 4-GalT II遺伝子のプロモーター領域と相互作用する分子を、ビオチン化したプロモーター領域を用いたアフィニティー精製により複数単離した。MALDI-TOF質量分析により、分子量28Kの分子はsplicing factor、分子量32Kの分子はCH-rich interacting match of PLAG1、分子量33Kの分子はhnRNPA2/B1、及び分子量58Kの分子はnovel zincfinger proteinと同定した。この中で、前2者はRNAのスプライシングに関わる分子であるが、後2者は分子内にzinc finger motifを有する分子であり、β-1, 4-GalT II遺伝子の発現を制御する転写因子である可能性が考えられる。一方、マウスβ-1, 4-GalT V遺伝子のプロモーター領域には複数のSp1結合部位が存在し、ヒト遺伝子の場合と同様にSp1で制御されている可能性が考えられた。Sp1は、様々な癌細胞で発現が増大することが報告されている。そこで、ヒト肺癌細胞においてRNA干渉法によりSp1の発現をノックダウンすると糖鎖のガラクトシル化が低下し、in vitroでの増殖や足場非依存的増殖能が抑制された。本研究から、転写因子の発現を制御することで糖鎖のガラクトシル化を制御し、癌細胞の悪性形質を抑制できる可能性が示唆された。
顎関節構成体のメカニカルストレスに対する細胞応答の遺伝子解析による解明

ヒト顎関節滑膜細胞株の樹立とその特性インフォームド・コンセントの十分得られた顎関節症患者および顎関節突起骨折患者の手術標本から滑膜細胞を分離,培養し,ヒト顎関節由来の滑膜細胞株を樹立した.この細胞は線維芽細胞様の形態をした均一な細胞群で,線維芽細胞のマーカー(vimentin, prolyl-4-hydroxylase)を発現していたが,T細胞(CD4),B細胞(CD19),血管内皮細胞(CD31, von Willebrand factor)のマーカーは発現しておらず,線維芽細胞様の性質を有していた.さらに,すべての細胞が滑膜B型細胞のマーカーであるlamininおよびHsp27の両者を発現しており,滑膜B型細胞であることが示唆された.しかし,一部の細胞がマクロファージのマーカー(CD68)を発現しており,A型とB型の中間型の細胞が存在しているものと考えられた.ヒト顎関節由来の滑膜細胞のメカニカルストレスに対する細胞応答の解析滑膜細胞に過剰な伸展ストレスを加えた後に,経時的にtotal RNAを回収してRT-PCRに供し,iNOSおよび炎症性サイトカインの遺伝子発現を調べた.滑膜細胞に伸展ストレスを加えると,iNOS,IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8の発現が増加した.特に,TNF-αは伸展刺激前には検出できなかったが,刺激後早期(30分)にその発現が最大となった.IL-1βは徐々に増加して12時間で約8倍となり,IL-6,IL-8,iNOSは3時間6時間で最大となった.これらの結果から,メカニカルストレスは滑膜細胞にiNOSおよび炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8)の遺伝子発現を誘導することが明らかとなり,これらの滑膜細胞から産生された炎症性メディエーターが複合的に作用して顎関節症の発症および病態形成に関与している可能性が示唆された.ヒト顎関節滑膜細胞株の樹立顎関節内障患者の関節鏡視下手術でパンチバイオプシーにより得られた滑膜組織,および下顎頭骨折患者の円板切除術によって得られた関節円板組織から器官培養法あるいは酵素処理による細胞分散法により滑膜細胞株を樹立した.器官培養法では滑膜組織をI型コラーゲンでコートした培養皿上でそのまま培養し,細胞分散法では滑膜組織をトリプシンおよびコラゲナーゼにより酵素処理して細胞分散液を調整し,I型コラーゲンでコートした培養皿に播種して培養した.器官培養法および細胞分散法の両者で細胞株が樹立でき,これらは線維芽細胞様の形態をした均一の細胞からなる細胞株と,卵円形をした均一の細胞からなる細胞株の2種類であった.樹立細胞株の表現型を,線維芽細胞のマーカー(vimentin, prolyl-4-hydroxylase),マクロファージのマーカー(CD68),T細胞のマーカー(CD4),内皮細胞のマーカー(CD31,von Willebrand factor)の抗体を用いて免疫細胞化学染色およびウェスタンブロット法により確認した.これらの細胞はVimentinおよびprolyl-4-hydroxylaseが陽性で,CD68, CD31, CD4, von Willebrand factorは陰性であり,線維芽細胞様の性質を有した細胞であることが示唆された.ヒト顎関節滑膜細胞のメカニカルストレスに対する細胞応答の解析現在,樹立した滑膜細胞株にメカニカルストレス(伸展刺激)を加えて,iNOSあるいは各種炎症性サイトカイン(IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γなど)の発現についての解析を行っている.伸展刺激を加えた細胞を経時的に回収し,RT-PCR法によりこれらのmRNAの発現量および時期の検索を行い,メカニカルストレスに対する滑膜細胞の応答を解析している.ヒト顎関接由来の滑膜細胞の特性インフォームド・コンセントの十分得られた顎関節内障患者および顎関節突起骨折患者の手術時に採取した滑膜組織から滑膜細胞を分離,培養し,その表現型を免疫細胞化学的に検索した.継代培養が可能となった滑膜細胞は線維芽細胞様の形態をしたほぼ均一な細胞群であった.この細胞は線維芽細胞のマーカー(vimentin, prolyl-4-hydroxylase)を発現していたが,T細胞のマーカー(CD 4),B細胞のマーカー(CD 19),血管内皮細胞のマーカー(CD 31,von Willebrand factor)は発現しておらず,線維芽細胞様の性質を有していたが,一部の細胞がマクロファージのマーカータンパク質であるCD 68を発現しており,A型細胞とB型細胞の中間型の細胞が混在しているものと考えられた.さらに滑膜表層B型細胞のマーカーであるlamininおよびHsp27の抗体を用いて免疫細胞化学染色を行ったところ,この細胞はlamininおよびHsp27の両者を発現しており,滑膜表層B型細胞に近い細胞であることが示唆された.ヒト顎関接由来の滑膜細胞のメカニカルストレスに対する細胞応答の解析分離,培養した滑膜細胞に伸展ストレスを0.5,1,3,6,12.時間加えた後に,total RNAを回収してRT-PCRに供し,iNOSおよび炎症性サイトカインの遺伝子発現について検索を行った.滑膜細胞に伸展ストレスを加えると,iNOS, IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8の発現が増加した.TNF-αは伸展刺激前には検出できなかったが,刺激後早期(30分)にその発現が最大となった.

IL-1βは徐々に増加して12時間で約8倍となり,IL-6,IL-8,iNOSは3時間6時間で最大となり,その後減少していった.これらの結果から,メカニカルストレスは滑膜細胞にiNOSおよび炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8)の遺伝子発現を誘導することが明らかとなり、これらのメカニカルストレスに応答して滑膜細胞から産生された炎症性メディエーターが複合的に作用して顎関節症の発症および病態形成に関与している可能性が示唆された.ヒト顎関節滑膜細胞株の樹立とその特性インフォームド・コンセントの十分得られた顎関節症患者および顎関節突起骨折患者の手術標本から滑膜細胞を分離,培養し,ヒト顎関節由来の滑膜細胞株を樹立した.この細胞は線維芽細胞様の形態をした均一な細胞群で,線維芽細胞のマーカー(vimentin, prolyl-4-hydroxylase)を発現していたが,T細胞(CD4),B細胞(CD19),血管内皮細胞(CD31, von Willebrand factor)のマーカーは発現しておらず,線維芽細胞様の性質を有していた.さらに,すべての細胞が滑膜B型細胞のマーカーであるlamininおよびHsp27の両者を発現しており,滑膜B型細胞であることが示唆された.しかし,一部の細胞がマクロファージのマーカー(CD68)を発現しており,A型とB型の中間型の細胞が存在しているものと考えられた.ヒト顎関節由来の滑膜細胞のメカニカルストレスに対する細胞応答の解析滑膜細胞に過剰な伸展ストレスを加えた後に,経時的にtotal RNAを回収してRT-PCRに供し,iNOSおよび炎症性サイトカインの遺伝子発現を調べた.滑膜細胞に伸展ストレスを加えると,iNOS,IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8の発現が増加した.特に,TNF-αは伸展刺激前には検出できなかったが,刺激後早期(30分)にその発現が最大となった.IL-1βは徐々に増加して12時間で約8倍となり,IL-6,IL-8,iNOSは3時間6時間で最大となった.これらの結果から,メカニカルストレスは滑膜細胞にiNOSおよび炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8)の遺伝子発現を誘導することが明らかとなり,これらの滑膜細胞から産生された炎症性メディエーターが複合的に作用して顎関節症の発症および病態形成に関与している可能性が示唆された.
ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ　ペプチドレパトアによるＴ細胞の正の選択機構の解明

本研究は、適応免疫系において中心的な役割を担うT細胞の胸腺における正の選択機構を、T細胞の選択を決定する根源的な機構である抗原提示の観点から解明することを目的としたものである。正の選択には胸腺皮質上皮細胞(cTEC)のMHCクラスI(MHC-I)上に提示されているペプチドと、未熟T細胞のTCRとの相互作用が重要とされているが、詳細な分子機構は不明である。胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアを解析しT細胞の正の選択機構が明らかになることで、免疫不全や自己免疫疾患の新たな切り口からの治療に繋がることが期待される。マウス胸腺からcTECを精製し、その細胞表面に発現するMHC-I上に提示されているペプチドレパトアを質量分析により解析した。cTECは1匹のマウスから10,000個ほどしか得ることができないため、これまではMHCクラスIペプチドレパトアを解析するために必要な数を用意することは困難であった。しかし、飛躍的に機能の向上した高感度のOrbitrap型質量分析装置を用いることでcTEC由来のMHC-Iペプチドレパトアを解析することが可能になった。野生型マウスと胸腺プロテアソーム欠損マウスそれぞれのcTEC由来MHC-Iペプチドレパトアの解析に成功し、その特徴と差異が明らかになった。正の選択に関わるペプチドの同定のためには、胸腺プロテアソーム特異的に産生されるペプチドについて、in vivoで実際に正の選択を誘導できるか否か検証する必要がある。未熟T細胞の成熟には胸腺の微小環境が必須であるため、胸腺の器官培養系であるFetal Thymic Organ Culture(FTOC)の構築を行った。同定された胸腺プロテアソーム特異的に産生されるペプチドのうち、FTOCで効率的に正の選択を誘導するものについては、マウス個体レベルでさらに正の選択の誘導能を評価していく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。適応免疫において中心的な役割を担うT細胞は、胸腺において成熟する。T細胞は、自己と非自己を判別するために、自己を識別可能な有用な細胞を選別する正の選択と、自己反応性の細胞を除去する負の選択を受ける。当研究室では、胸腺皮質上皮細胞(cTEC)特異的に発現する触媒サブユニットβ5tおよびβ5tが触媒サブユニットとして組み込まれた胸腺プロテアソームが、正の選択において必須の役割を担っていることを明らかにしている。正の選択にはcTECのMHC上に提示されている内在性タンパク質由来のペプチドと、未熟T細胞のT細胞受容体(TCR)との相互作用が重要とされており、胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアが正の選択を可能にしていると推測されるが、具体的にどの様な特徴を有するペプチドが正の選択を可能にしているかは未だ不明である。本課題を進める上では、マウスcTECを精製してMHCクラスI上に提示されているペプチドを野生型マウスとβ5t欠損マウスとで比較解析するのが理想的であるが、cTECは1匹のマウスから10,000個ほどしか得ることができないため、MHCクラスIペプチドレパトアを解析するために必要な数をマウスから用意することは非現実的であった。そこで、これまで免疫プロテアソームもしくは胸腺プロテアソームを発現するMEFを用いてMHCクラスI上に提示されているペプチドの特徴を、定量質量分析法を用いて比較解析してきた。その結果同定された胸腺プロテアソーム特異的ペプチドについて、in vitroでの切断実験によって胸腺プロテアソーム特異的に産生されると考えられるものを選別した。本課題は、正の選択の鍵となるMHCクラスI結合ペプチドに着目して抗原提示の観点から正の選択機構を明らかにするものであり、胸腺プロテアソームによる正の選択機構を直接的に解析することができると期待される。質量分析による定量解析、およびin vitroでの免疫または胸腺プロテアソームによる切断効率の比較から、胸腺プロテアソームによって作り出されると考えられるペプチドを同定した。最終的な目的の1つである正の選択に関わるペプチドの同定のためには、CD8+T細胞の成熟を検証する必要がある。未熟T細胞の成熟には胸腺の微小環境が必須であるため、Fetal Thymic Organ Culture (FTOC)と呼ばれる胸腺の器官培養系の構築を行った。また、実際にcTECのMHCクラスI上に提示されているペプチドの解析については、高感度のorbitrap型質量分析装置を用いることにより解析が可能となった。現在はcTECの調製が容易な胸腺肥大マウスを用いての条件検討を進めている。

cTECは1匹のマウスから10,000個ほどしか得ることができないため、これまではMHCクラスIペプチドレパトアを解析するために必要な数を用意することは困難であった。しかし、飛躍的に機能の向上した高感度のOrbitrap型質量分析装置を用いることでcTEC由来のMHC-Iペプチドレパトアを解析することが可能になった。野生型マウスと胸腺プロテアソーム欠損マウスそれぞれのcTEC由来MHC-Iペプチドレパトアの解析に成功し、その特徴と差異が明らかになった。正の選択に関わるペプチドの同定のためには、胸腺プロテアソーム特異的に産生されるペプチドについて、in vivoで実際に正の選択を誘導できるか否か検証する必要がある。未熟T細胞の成熟には胸腺の微小環境が必須であるため、胸腺の器官培養系であるFetal Thymic Organ Culture(FTOC)の構築を行った。同定された胸腺プロテアソーム特異的に産生されるペプチドのうち、FTOCで効率的に正の選択を誘導するものについては、マウス個体レベルでさらに正の選択の誘導能を評価していく予定である。胸腺の器官培養系で胸腺プロテアソーム特異的ペプチドを加えることにより、未熟T細胞がCD8+T細胞へと正常に分化するかをもって候補ペプチドが実際に正の選択を誘導するか否かを確認する。同定されたペプチドのうち、FTOCで正の選択を効率的に誘導するペプチドについては、このペプチド/MHCクラスI複合体のみを発現するマウスを作製しする。そして、β5t欠損マウスと掛け合わせることにより、β5t欠損マウスのCD8+T細胞の減少を回復することができるか解析する。また、胸腺プロテアソーム特異的ペプチドからβ5t特異的に切り出されるペプチド配列を予測し、それを元に胸腺プロテアソーム活性を測定する蛍光基質を作製する。これをもって胸腺プロテアソーム活性の定量化を可能にすることで、胸腺プロテアソーム機能異常の定量、活性制御因子の探索、阻害剤の探索につなげていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
高校「倫理」教科書の読解学習を支援する標識化の有効性に関する実証研究

本研究は,綱要集の形式を持つ高校「倫理」教科書を対象に,その読解学習における概要把握に着目し,その基底にある構造方略の使用支援に用いる標識化の有効性を検証した。調査研究では標識化を用いた支援の有効性が示された。開発研究では構造方略の持続的な使用を時系列的に評価するPCシステムを開発した。評価研究では,上記システムを用いて,高校生で標識化の恩恵を受けるのは構造方略の未熟達者より熟達者であることが示された。本研究は,高校「倫理」教科書の読解学習を支援する標識化の有効性を構造方略の利用という観点から検討する。23年度は,綱要集の性格を持つ「倫理」教科書の学習で重要になると考えられる構造方略に着目し,これに起因する高校生のつまずきの様相を検討した。これを受けて,続く,24年度は,高校生における構造方略の熟達差が「倫理」教科書の学習を規定するメカニズムを2つの研究により検討した。研究1では,高校1年生225人(平均16.1歳)を対象として(大学生184人(同20.7歳)を比較データとして採取),高校生の構造方略の熟達差が「倫理」教科書の学習のおよぼす影響を検討した。ここから,構造方略の熟達の基礎には,語彙や認知の発達といった前提要因が関わり,これらが下支えする形で発露する構造方略の熟達差が,「倫理」教科書の学習を規定していることが示された。研究2では,高校1年226人(平均15.7歳)を対象として(大学生162人(同19.2歳)を比較データとして採取),高校生における構造方略の熟達差が「倫理」教科書を通じた学習目標の遂行を規定するメカニズムを検討した。ここから,「先哲の思想形成過程の分かりやすさ」を介して,「日本人としての在り方・生き方を考える手がかりとしての分かりやすさ」や「人間としての在り方・生き方を考える手がかりとしての分かりやすさ」を高めるプロセスに,構造方略の熟達差が介在するプロセスの存在が示された。上記から,高校生における構造方略の熟達差が「倫理」教科書の学習を規定するメカニズムが示されることになった。このようにして得られた知見は,冒頭で記した本研究の目的を25年度に遂げるための重要な礎になったと考えられる。最終年度は,前年度に開発したPCシステムを用いて,綱要集の形式を持つ高校「倫理」教科書を対象に,その読解学習における概要把握に着目し,その基底にある構造方略の使用支援に用いる標識化の有効性を検証した。高1と大学生がともに120人参加した実験において,構造方略の未熟達群と熟達群の両群を見出し無条件と見出し有条件に割り振った。材料は高校「倫理」教科書より絶対他力思想の形成過程を概説した12文のテキストであった(見出し有群には第1,5,9文に見出しが挿入)。文を1文ずつランダムにPC画面上に提示し,マウスを使って配列させた。自己ペースで文配列をさせ,配列の体制化過程を時系列にPCが記録した。その後,理解度評定,再生課題と再構成課題を実施させた。まず,体制化連得点,体制化率得点,ランク内修正数の分析から,大学生の未熟達群では見出しの効果が体制化過程で認められ,序盤から終盤を通じて正しいランクに文を配列する割合が高まったが,これはMeyer et al (2012)の仮説を支持した。ところが,高校生では熟達群で見出しの効果が部分的に認められたが,未熟達群で効果は認められなかった。ここから,高校生では大学生とは対照的に,未熟達群に見出しを提示しても,読解過程を通じて見出しから恩恵を受け難いことが示された。次に,理解度評定,再生課題と再構成課題の分析からは,読解の体制化過程を通じて見出しから受けた効果がその後も引き継がれていき,高校生と大学生とで異なることが示された。大学生とは違って,高校生の未熟達群は見出しの恩恵を受けがたく,理解度評定の結果を見る限り,学習目標の達成にまで引き継がれることが示された。総じて高校生は,熟達群でも標識化による支援の有効性の受給が難しく,本研究はこの受給メカニズムを解明する基礎資料となった。このために,23年度は,高校生の構造方略の利用に関する発達的制約に起因するつまずきの様相を4つの調査と実験で検討した。調査1では大学生に小中高時代の教科学習のつまずきを調査した結果,社会のつまずきが高校で急増した。調査2では高校での教科のつまずきで最も深刻だったものを記述させた結果,公民のつまずきが際立ち,「倫理」の多さが示された。調査3では高校「倫理」のつまずきの原因を帰属させた結果,教科書学習における体制化過程への帰属の多さが示された。

調査4では,概念中心に記述するテキストと,思想形成過程を説明するテキスト(順序型)を活用し,それぞれに標識無版と有版を作成。「思想形成過程の分かりやすさ」の評定では,順序型テキストを提示した高校生で,標識化効果が不鮮明だった。実験は調査4に従い,4つのテキストを高1と大学生に提示し評定させた。構造方略利用の評定平均値より下位・上位群を構成し,方略利用×テキスト×標識の分散分析を行った。その結果,順序型テキストの場合,大学生では標識の無い場合には構造方略の利用程度によって評定値に差が出ても,標識を挿入すると差が解消された。一方,高校生では方略利用の程度により評定値に差は出るが,標識により差は解消しなかった。ここから,高校生の「思想形成過程の分かりやすさ」が高校段階独自の構造方略の利用を介して規定されることが示された。上記から,高校になり教科学習のつまずきが増える中で,「倫理」のつまずきが顕著になり,これは教科書の読解学習に帰属されることが多いが,この基礎には構造方略の利用に関するつまずきが関わっていることが示された点は研究全体の推進に重要である。本年は,高校生を対象に大規模な調査を2つ行うことができた。参加者も800人を数える大規模な調査であった。収穫として何より得難いのは,高校「倫理」教科書の読解学習を構造方略の熟達が規定しているという事実を得たことである。この知見は,25年度に実施する大規模な実験研究の貴重な基礎になったと評価できる。当初は実験のみを企画していたが,4つの調査を実験の前に設定することで,実験のresearch questionをより確たるものにすることができた。結果として,調査は4回を重ねることになり,調査参加者も1000名を超えることになり,相応のコストを予定外にかけることになった。けれども,このために,繰り返すが,当初予定の実験において,期待以上の成果を上げることができた。平成23年度で行った4つの研究により,綱要集の性格を持つ「倫理」教科書の学習で重要になると考えられる構造方略に着目し,これに起因する高校生のつまずきの様相を検討する中で,research questionの明確化を進めることができた。これを受けて,24年度は,「研究実績の概要」で書いたように,高校生における構造方略の熟達差が「倫理」教科書の学習を規定するメカニズムを2つの研究により検討することができた。いずれの年度においても,研究の実施に際して協力頂いた協力校の存在が大きかった。これは「有難い誤算」であり,研究者側がなすべき調査票の実施や授受といった実務上の手続きを代替してくれたことが,円滑で十分なデータ収集につながったと考えている。総じて,上記のような「有難い誤算」も加わり,2年間の計画が遂行され,当初の目標が着実に進行している。最終年である25年度においては,本研究の目標が遂行できるように当初計画を着々と実行していくだけである。平成23年度で行った4つの調査と実験により,当初予定の目的を果たすことができたとともに,「現在までの達成度」で述べたように,research questionの明確化を進めることができたことは思いもかけぬ成果であった。同時に,23年度は達成は,当初計画の適切さをさらに裏付けることにもなった。よって,平成24年度においては,自信をもって,当初計画を進めることができると考える。また当初予定を超える成果を得ることができた背景には研究実施に協力頂いた協力校の存在が大きいことも述べておかなければならない。調査実施の説明,調査票の授受,実施と,本来,研究者側がなすべきことを代替してくれた点は大きい。
トーリック多様体の環論的研究

この研究では,モノミアル曲線が集合論的完全交叉になるかという問題を主に取り扱い,その問題に対して部分的ではあるが肯定的な結果を得ることに成功した。まず,最初に示したのは準素イデアル分解の束イデアルバージョンである。すなわち,二項イデアルに対し,それを含むような束イデアルと単項式イデアルの和からなるようなイデアルの交わりをとると,元の二項イデアルのradicalに等しくなるという結果である。この結果により,up to radicalな生成を考えるときには束イデアルのみをかんがえればよいことに結論付けられた。次に,アフィン空間内のモノミアル曲線について,この研究の始まる前の集合論的完全交叉を示す方法では絶対にそのことを証明できない例を発見した。すなわち,以前の証明方法では,埋め込まれた空間の次元マイナス2個の二項式と1個の多項式でup to radicalな生成系を形成していた。この研究では,そのような生成系を持つための必要十分条件を与え,その判定法を用いることにより,17,19,25,27で定義されるモノミアル曲線がそのような生成系を持たないことを示した。なお,この曲線も集合論的完全交叉であることも別の論文で証明した。さらに,これらの結果の一般化を考え,アフィン4次元空間内のbalanced半群に付随したモノミアル曲線の場合に,それらが集合論的完全交叉であることを証明した。この結果は前述の17,19,25,27で定義されるモノミアル曲線が集合論的完全交叉であるという結果を含んでいる。主にアフィントーリック多様体の定義イデアルであるトーリックイデアルおよびその一般化であるlatticeイデアルに関する研究をおこなった。まず、二項式イデアルのlatticeイデアルによる分解を用いて、イデアルの生成系を求める方法を研究した。その分解は、一般の環のイデアルの準素分解の類似物であることを注意しておく。それによれば、二項式を整数環上の自由加群のベクトルに対応させ、考える二項式イデアルの生成系からえられるベクトルの組より新たな数量的不変量を定義する。その値がそれらによって生成されるベクトル空間の次元と、ベクトルの個数からなるある等式をみたすとき、ある条件のもとで二項式イデアルがlatticeイデアルになるかどうかを判定できることが証明された。これにより、latticeイデアルが完全交叉となるための必要十分条件をえ、また同様に概完全交叉となるための必要十分条件をえた。特に完全交叉の場合はFischer, Morris, Shapiroによる結果の言い換えになっている。さらにそのことによって、ある種のlatticeイデアルの変形によっても、完全交叉、概完全交叉の性質は保たれることがわかった。さらに付随した結果として、二項式の根基イデアルがlatticeイデアルと等しくなる条件を与えていることになる。したがって、今後これを用いて、monomial曲線の定義イデアルとなるようなlatticeイデアルが集合論的完全交叉であることの証明されることが期待され、実際現在そこを研究している最中で、部分的な結果をえている。昨年に引き続き,主にアフィントーリック多様体の定義イデアルであるトーリックイデアルおよびその一般化であるlatticeイデアルに関する研究をおこなった。まず、アフィン概完全交叉モノミアル曲線の分類を完成させ,それらが集合論的完全交叉であることを証明した。この結果は,今まで5次元以下の場合はすでに知られていたが,今回は任意の次元の概完全交差モノミアルに関して証明がなされた。これにより,一般次元について照明されたのは,Patilの結果である,等差級数で定義されるモノミアル曲線は集合論的完全交叉である,という結果についで2例目である。また,射影的概完全交叉モノミアル曲線の分類もおこない,それらも集合論的完全交叉であることも示すことに成功した。

射影的モノミアル曲線に関して,それらが集合論的完全交叉になることについては,一般には疑問視されていることを付け加えておく。さらに,証明の過程において,概完全交叉latticeイデアルの変形理論が大きな役割を果たしている。これは昨年度の科学研究費研究での成果であった。これ以外の結果として、ある種の4次元アフィンモノミアル曲線が集合論的完全交叉であるという成果も得た。それ以外にも,次元がnのモノミアル曲線がn-2個の二項式と1個の多項式で定義される必要十分条件も得た。これらの結果は,研究発表はすでにおこなったが,論文としてはまだ出版されていないので,詳しい内容は来年度の研究実績報告に譲ることとする。昨年に引き続き,主にアフィントーリック多様体の定義イデアルであるトーリックイデアルおよびその一般化であるlatticeイデアルに関する研究をおこなった。本年最大の成果はlatticeイデアルがその高さマイナス1個の二項式と1つの多項式でup to radicalに生成されるための必要十分条件の発見である。この結果により,N次元アフィン空間内のアフィンモノミアル曲線の定義イデアルがN-2個の二項式と1個の多項式でup to radicalに生成されるための必要十分条件をZ-加群の言葉に翻訳することができた。このことを用いると,今まで集合論的完全交叉になるようなアフィンモノミアル曲線の例,たとえばHerzogらによる3次元アフィン空間内のもの,Bresinskyによる4次元Gorensteinモノミアル曲線の場合など,すべてはこの結果と最初にあげた必要十分条件で判定できることがわかった。さらに,具体的に数字の組が与えられたとき,それらの定義するモノミアル曲線の定義イデアルがそのような形のup to radicalな生成系を持つかどうかの判定法も作成し,それを用いて,17,19,25,27から定義されるモノミアル曲線はそのような形のup to radicalな生成系を持たないことを示した。しかしながら,この組合せから定義されるモノミアル曲線は集合論的完全交叉であることが証明できた。ここで,その定義イデアルのup to radicalな生成系は1個の二項式と2個の二項式でない多項式からなる。さらにこの一般化も着手しているが,その報告は来年度に譲ることにする。本年度は、4次元アフィン空間内のモノミアル曲線に関して進展あった。モノミアル曲線がbalancedと呼ばれる条件をみたすとき、集合論的完全交叉であることを証明した。これは昨年度証明した17、19、25、27で定義されるモノミアル曲線が集合論的完全交叉であるという結果の一般化になっている。もちろん、昨年度証明されたことから、は2つの二項式を含むようなup to radicalな生成系を一般には持たず、これまでは全くその証明が知られていなかったものに含まれている。この結果は欧文雑誌に掲載されるとが決定している。それ以外に得られた成果としては、Erdogduのプレプリントの間違いの発見、etale cohomologyのarithmetical rankの計算への応用、local cohomologyのflat morphismに対する挙動の調査(川崎)などである。
Rb1 遺伝子欠失ヒトiPSの網膜分化系を用いた網膜芽細胞腫発症機構の解析の試み

網膜のがんとして最も症例数の多い網膜芽細胞腫は、多くの場合乳児期に発見され、胎児期にすでにがんが発症していると考えられている。網膜芽細胞腫はtwo hit theoryが初めて提唱されたこと、また初めてのがん抑制遺伝子としてRB1遺伝子が原因遺伝子として単離されたことで極めてよく知られたがんである。しかし、RB1遺伝子の変異は他のがんより網膜芽細胞腫に指向性がはるかに高いことについての分子基盤は明らかではない。その大きな理由はマウスではRB1遺伝子の変異により代償的にp107, p130などが発現するために、マウスのモデル化が困難であることがある。本研究では、human iPSから網膜分化を誘導する系を利用することにより、RB1変異により、どのように網膜芽細胞腫が発症し、進展していくのか、またその網膜特異性が説明しうるのかを明らかにすることを目的とした。まずヒトiPSを網膜オルガノイドに分化させた時のRB1遺伝子の発現を検討したところ、網膜分化に伴い、RB1の発現レベルは強く上昇することを見出した。RB1遺伝子をCRISPRを用いて欠損させたヒトiPS株を作成した。dCASを用いた系が十分にRd1の発現を抑制しなかったため、二つのgRNAを用いて第一エクソンを飛ばして発現を落とす系を構築した。この系による効率について、樹立細胞株を用いて良好であることを確認した。未分化なiPSとして培養している段階で、RB1欠損株について、細胞数の増加、EdU取り込みなどのFACSによる検討により、親株と増殖能に差があるか検討を行った。その結果増殖能は、RB1を抑制しても影響がなかった。次に、網膜分化させた状態でRB1の発現を抑制した場合の分化、増殖能への影響の検討を行った。網膜の初期分化についてはRB1発現の抑制は影響を与えなかった。増殖については、継続的に分化の時間軸にしたがって検討を行った。まずはじめに、dCAS-KRABシステムを用いて、RB1遺伝子の発現をTamoxifen依存的に抑制、あるいは抑制解除が可能な系を入れ込んだヒトiPSを作成した。次に、網膜分化させた状態でRB1の発現を抑制した場合の増殖能への影響の検討に入った。分化を開始してからTamoxifenを添加すると、おそらくゲノムのメチル化の影響か、Tamoxifenを添加しても十分なRB1の発現の抑制がかからないことが明らかになった。様々な条件でTamoxifenの添加を行ったが、抑制が不十分で病態を反映しないと考え、CRISPR-dCASでの解析を断念することとした。そこでストラテジを変更しATG付近にguide RNA (gRB1)を設計し、guide,Cas9,EGFPのall-in-oneプラスミドをhumaniPS lineにエレクトロポレーションで導入し、EGFP陽性細胞をセルソーターで精製した後、クローンを単離することとした。Genomeの配列を確認し、両アリールにnonsense mutation (STOPコドンがATG近傍にはいっている)がはいっているクローンを選択することを試みたがこうしたクローンが取れる効率が悪いため、ストラテジを変更し、二つのgRNAを用いて第一エクソンを飛ばして発現を落とす系を構築した。本来の計画どうりにほぼ進行している。RB1遺伝子の発現抑制の系を途中で変更したが、この変更は当初から可能性を予期していたもので、スムーズに変更が進んだ。未分化iPSでのRB1の抑制が増殖に影響を与えないなど一定の成果もすでに得ている。

その結果増殖能は、RB1を抑制しても影響がなかった。次に、網膜分化させた状態でRB1の発現を抑制した場合の分化、増殖能への影響の検討を行った。網膜の初期分化についてはRB1発現の抑制は影響を与えなかった。増殖については、継続的に分化の時間軸にしたがって検討を行った。ほぼ当初の計画どうりに進めていく。系の変更を行ったため、やや遅れは生じているが、アッセイ系の立ち上げを行ったため、十分に遅れを取り戻せると考えている。本年度、当初始めた実験系が十分な結果を得られなかったため、系を変更し(変更の可能性は研究計画でも想定済み)、このため解析がやや後ろ倒しになったため。解析の系はすでに樹立していたため、初年度、次年度で計画していた解析を同時に行うために予算の一部を次年度使用することとした。
bZIP型転写因子によるシュートの成長制御の解析

RSGは塩基性領域ロイシンジッパー(bZIP)構造を持つ新しい転写因子で、高等植物の光合成の場を形成するシュートの成長を制御する。植物体における転写因子RSGの機能を探るため野生型RSGの機能を阻害するドミナントネガティブ型RSGをタバコ個体で発現させた。RSGの機能が抑制された形質転換タバコでは茎の節間成長が著しく阻害され対照植物に比べて背丈が1/7程度となった。さらにこの形質転換タバコでは細胞伸長の方向を制御すると考えられている表層微小管の構造破壊が観察された。本研究ではbZIP型転写因子RSGを中心とした転写制御系がどのようにして光合成の場を形成するシュートの成長を制御するのかを明らかにすることを目的とした。ドミナントネガティブ型RSGを発現する形質転換タバコの形態変化にはジベレリン(GA)が関与していると考えられたので、GA合成系の中間体を定量しGA合成系のどのステップが阻害されているか調べた。その結果、形質転換タバコでは少なくともGA_<53>より上流の合成系に異常がある事が示唆された。正の転写因子であるRSGは、ジベレリン合成酵素または代謝に関係するタンパク質遺伝子の発現を直接あるいは間接的に制御していると考えられる。シュートの成長に関する転写制御系のネットワークを明らかにするため、RSGと相互作用するタンパク質14-3-3について解析した。14-3-3タンパク質は多くの場合、標的タンパク質のリン酸化されたセリンと結合して、その機能を調節する。RSGの114番目のセリン残基が14-3-3との結合に必須であることが明らかになった。このセリンのリン酸化によりRSGと14-3-3との結合が制御されていると予想された。トランジェントアッセイの結果、14-3-3と結合できない変異型RSG^<S114A>はRSGよりも強い転写活性化能を持つ事が示された。14-3-3は転写活性化因子RSGの機能を負に制御していると考えられた。
血管におけるジアシルグリセロールキナーゼのTRPチャネル分子制御機構の解明

ラット大動脈構成細胞におけるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)アイソザイムの発現を解析した。ラット大動脈平滑筋細胞(RASMC)にはα,ε,ζ型DGKのmRNA発現が確認され、免疫細胞化学によってα型は細胞全体に、ε型は細胞骨格状に、ζ型は核内にそれぞれ局在していることが明らかとなった。DGK_εはファロイジンとの二重染色によりストレスファイバーに発現し、セロトニンによる収縮刺激を与えると細胞質へと局在が変化することから、同アイソザイムが収縮制御に関わる可能性を示唆した。ラット大動脈血管内皮細胞(RAEC)において、免疫細胞化学によりDGK_γがゴルジ体に発現すること、さらにIL-1βで刺激するとDGK_γmRNA発現が亢進することを明らかにした。本研究ではさらにIL-1βにより発現誘導されるcyclooxygenase-2(COX-2)のラット大動脈およびRASMCにおける発現解析を行った。COX-2は正常では主に外膜に発現が誘導されるが、内膜除去によって中膜にも発現することを明らかにした。これらの結果はDGKアイソザイムの血管構成細胞における機能解析をする上で重要な知見であり、DGKによるTRPチャネル分子制御機構を解明するうえで意義がある。本研究の目的は、血管におけるジアシルグルセロールキナーゼ(DGK)によるtransient receptor potential(TRP)チャネルの調節機構を解明することである。平成20年度は血管壁構成細胞のうち、血管平滑筋細胞に着目した研究を行った。まずラット胎児大動脈由来のA7r5細胞およびラット大動脈から単離した血管平滑筋細胞におけるDGKアイソザイムのmRNA発現をRT-PCR法により解析した。その結果、強いDGKαおよびζの発現と比較的弱いε型の発現が検出された。これらアイソザイムの細胞内局在を特異抗体を用いて免疫細胞化学的に解析したところ、DGKαは核内および細胞質にびまん性に、ζは核内に顆粒状に免疫陽性反応が検出された。一方DGKεは細胞長軸に沿った線維状の免疫陽性反応として検出され、ファロイジンとの二重染色の結果、アクチンストレスファイバーに局在することが明らかとなった。血管平滑筋細胞を血管収縮性アゴニストであるセロトニンにより刺激するとDGKεのmRNAおよびタンパク発現が亢進することが明らかとなった。この時、DGKεの細胞内局在はストレスファイバー状から細胞質へと変化し、びまん性の免疫陽性反応が検出された。既報では遺伝子導入実験や生化学的な細胞分画実験によってDGKεが小胞体に局在することが示されているが、今回の免疫細胞化学的研究の結果、正常の血管平滑筋細胞においてDGKεはストレスファイバーに局在し、その安定化に寄与する可能性が示唆された。本研究は血管平滑筋細胞におけるDGKアイソザイムの詳細な発現解析を行った最初の報告であり、血管平滑筋におけるTRPチャネルの制御機構を解明する上で重要なデータである。本研究の目的は、血管におけるジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)によるtransient receptor potential(TRP)チャネルの調節機構を解明することである。平成21年度は血管壁構成細胞のうち、血管内皮細胞に着目した研究を行った。ラット大動脈から単離した血管内皮細胞におけるDGKアイソザイムのmRNA発現をRT-PCR法により解析した。その結果、主にDGKα,γ,ζのmRNA発現が検出された。これらアイソザイムの細胞内局在を特異抗体を用いて免疫細胞化学的に解析したところ、DGKαは核内および細胞質にひまん性に、ζは核内に顆粒状に免疫陽性反応が検出された。一方DGKγは核周部の細胞質に筒状および網状の免疫陽性反応として検出され、ゴルジ体マーカーであるGM130抗体と二重染色を行った結果、ゴルジ体に局在することが明らかとなった。血管内皮細胞をIL-1βで刺激するとDGKγのmRNA発現は亢進し、この充進はp38MAPキナーゼインヒビター、SB203580により抑制されることが明らかとなった。

本研究では血管平滑筋細胞においてDGKγと同様にIL-1βにより発現に誘導がかかるcyclooxygenase-2の挙動を明らかにし、DGKとの関連の可能性を考えた。これらの結果はDGKアイソザイムの血管内皮細胞および平滑筋細胞における機能的役割を示唆するものであり、DGKによるTRPチャネルの制御機構を解明する上で重要なデータであると考える。