hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無顎類口腔腺分泌液における新規の生理活性物質の探索

もっとも原始的な脊椎動物である寄生性の無顎類口腔腺分泌液について、初めてタンパク質から低分子までを網羅的に分析し新規の生理活性物質を探索した。その結果、血管収縮にかかわる新規カルシウムチャネル阻害タンパク、血液凝固を阻止する線溶酵素、および機能未知の低分子を見いだし、それぞれクローン化、構造解析を実施するとともに、進化的考察をおこなった。これらの物質が血圧調節や血栓治療などに応用される可能性も示した。約5億年前に分化した現存するもっとも原始的な脊椎動物である無顎類(円口類)のヤツメウナギは大型の魚類や海棲ほ乳類に外寄生し、一対の発達した口腔腺(buccal glands)から血液凝固阻止因子を分泌、吸血することが知られている。このことは1927年にScience誌に報告され,魚類学の教科書にもかならず記載されているが、奇妙なことに、その本体はまったく研究されていない。我々は日本産のカワヤツメ(Lethenteron japonicum)の口腔腺分泌液を調べ、やはりヒトの血液凝固時間を延ばす作用があることを見いだした。また、タンパク成分をゲル濾過により分離し、分子量16万の血清アルブミンと相同なタンパクと分子量2万5千のタンパクが主成分であることを見いだした。さらに強い青色の蛍光を示す酸性の低分子が多量に含まれることを見いだした。本年度の研究では、まず、分子量2万5千のタンパクの化学構造をペプチドの配列分析によりほぼ75%を決定し、全体の構造を口腔腺の全RNAからのcDNAクローニングにより明らかにした。その結果、これが蛇毒などは虫類毒に見られるCRISP(cysteine-rich secretory protein)ファミリーに属するタンパクであることがわかった。特にメキシコ毒トカゲの毒成分であるリアノジン受容体チャネルのプロッカーと相同性が高いことが示された。ラット尾動脈平滑筋の小片をもちいた筋収縮阻害実験の結果、このタンパクはリアノジン受容体の阻害活性は無く、電位作動性のLタイプカルシウムチャネルのブロックにより、血管の平滑筋収縮を阻害する新しいカルシウムチャネル阻害タンパクであることが明らかになった。これは血管収縮による宿主の止血反応を抑制して吸血を容易にしているものと推定された。ホモロジーモデリングによる立体構造は蛇毒CRISPと類似するが、ヤツメCRISPには多くの挿入配列があり、これがループアウトしてチャネル阻害特異性を決めていることが示唆される。寄生性のヤツメウナギの口腔腺分泌液には古くよりlamphredinとよばれる血液の抗凝固活性物質などが知られているが、その生化学的本体は未だ明らかでない。昨年度の研究では、まず、分子量2万5千のタンパクについて,これが新規の電位作動性のLタイプカルシウムチャネルのブロッカーであることを明らかにした。本年度の研究では血液凝固阻止活性の本体の解析を実施し,まず口腔腺液のゲルろ過分画における血液凝固阻止活性の分布を検討した。また本研究の実施過程で中国の研究者グループが口腔腺液にフィブリノーゲン分解活性があることを報告したため,この点も検討した。その結果,我々もカワヤツメロ腔腺液によってフィブリノーゲン3本鎖のうちAα鎖、Bβ鎖が特異的に分解されることを確認した。また、ゲルろ過フラクションでは160kDaのアルブミンよりかなり低分子側の画分において、顕著なフィブリノーゲン分解活性が認められた。このフィブリノーゲン分解活性はキレート剤のみが阻害したため、メタロプロテアーゼによると推測された。また2価金属イオンのうちCa^<2+>およびMg^<2+>の添加によってフィブリノーゲン分解活性が回復した。既知のメタロプロテアーゼはすべてZn^<2+>(一部にCo^<2+>)を要求するが,口腔腺のプロテアーゼでは亜鉛の添加は無効であり,Ca^<2+>あるいはMg^<2+>依存性の全く新しいメタロプロテアーゼであることが予想される。この活性を持つゲルろ過画分のアミノ酸配列分析ではアルブミンの断片、クレアチンキナーゼ、サイトケラチンなどと一致する配列を見いだした。今後さらに高度な精製やcDNAクローニングにより新規メタロプロテアーゼの存在を明らかすることができると期待される。
広帯域ストリームデータの安定伝送を支える協調連携型ネットワーク解析システム

ネットワークの広帯域化に伴い,8K/4K超高精細映像のストリームデータを扱うアプリケーションの普及が見込まれている.広帯域でリアルタイム性を持つストリームデータは,伝送状況の影響を非常に受けやすく,安定運用のためには輻輳等の原因箇所の特定が不可欠である.このため提案者は,低遅延で描画表示が可能なover 100Gbps対応の高精度ネットワークモニタ装置と複数装置の連携により問題個所を特定するシステムを開発した.これを様々な8K/4K非圧縮広帯域映像伝送トライアルでの使用を通して,有効性を評価した.本研究では,広帯域ストリームデータを対象に,障害発生の問題箇所を自動的に絞り込む検査分析機能と詳細なパケットキャプチャ情報を基にポスト解析を行う機能を実現する.平成26年度は,システム全体の機能連携に向けた基本検討とリアルタイム分析処理系の拡充を目指して,具体的なアプリケーションとして、over10Gbpsの広帯域ストリームデータ伝送と,OpenFlow等のSDNで制御されたネットワーク上でのGbpsクラスのストリーム伝送における多面的な観測系を取り上げ、具体的な障害時の機能連携シナリオ等の作成を行い,システム化の検討を進めた.over10Gbpsの広帯域ストリームデータアプリケーションに関しては,H26.2の情報通信研究機構(NICT)の雪祭り実験イベントにおいて,8K超高精細映像(24Gbps)を遠隔伝送・蓄積配信するトライアルに参加する機会を得て,この中で,over10Gbps対応のトラヒックモニタのプロトタイプ装置を市販並列処理ボードの応用により開発し評価を進め対外発表に繋げた.これを発展させてパケット解析ノードの1つとして組み入れ,H27.2のNICTの雪祭りイベントの中で実験使用した.NICTのStarBED3の複数台のノードを利用し8K映像蓄積・配信機能を仮想化し,データを多地点に配信する取り組みの中で多面的なトラヒック監視を実現し,関連成果と共に報道発表した.SDNで制御されたネットワークにおける多面的な観測については,H26.11の米国で行われたSC14展示会で複数の日米間の太平洋ラインを含めて10箇所程度を多面的に観測する系を作成し,1秒程度の遅延で可視化し,1.5Gbpsのハイビジョンを非圧縮で伝送する場合の障害箇所を明らかにした.またオペレータがその結果を使ってOpenFlow制御により使用するパスを切り替える実験を行い,公表した.本研究では,広帯域ストリームデータを対象に,障害発生の問題箇所を自動的に絞り込む検査分析機能と詳細なパケットキャプチャ情報を基にポスト解析を行う機能を実現する.前年度から高精度測定の具体的なアプリケーションの1つとして進めた8K超高精細映像(24Gbps)を対象とした広帯域映像ストリーム伝送・蓄積配信については,内外から様々な反響があり,本研究で開発した高精度測定装置が,デバッグや評価データ収集のために活躍した.2015.6のInterop Tokyo 2015の実験においては,NICTのStarBED3を使ったマルチレート仮想サーバの伝送状況を可視化するために利用し,Best of Show Award「ShowNetデモンストレーション部門グランプリ,サイエンス部門審査員特別賞」の受賞に繋がった.また,2015.11のSC16や2016.2のNICT雪まつり実験においても,本研究のリアルタイム分析処理システムを利用した評価実験を進め,研究会で公表した.このような状況を踏まえて,平成27年度の目標であるポスト解析のプロトタイピングと並列手法についても,当初の目標を上回るover10Gbpsの広帯域映像ストリームを対象にした多地点のポスト解析に取り組む事で,Interopの際の8K/4Kマルチレート仮想サーバの同期配信性能やマルチキャストネットワーク制御の動作を明らかにして研究会で公表した他,ポスト解析に必要な処理量についての評価を進めた.さらに高精度ネットワーク処理ノード間でのデータ共有方式の検討・実装を行いperfSONARとの比較により処理性能の評価を進めた.また障害時の検査分析の自動化に向けて,遠隔の任意の回線を動的に選択してキャプチャデータを解析ノードに集約する手段として,市販スイッチのタッピングデータの集約機能を利用したプロトタイプの作成を行った.本研究の目的は,(1)ノードの協調連携による検査分析の自動化方式,(2)伝送状況を多面的に分析しリアルタイムに可視化する機能,(3)高精度時刻情報が付与されたキャプチャデータから該当フローを抽出し相関を取る事で,時間軸での原因追究を可能とするポスト解析機能の検討である.各項目について,現状の進捗と今後の展開を整理する.(1)については,現状までに多地点で映像伝送プロトコルの解析(L7)からパケット伝送特性(L2)を解析実行し,1つの表示装置に集約し画面上に一覧の形で表示し,どの区間が障害を起こしているかを可視化できるシステムが実現できているため,今後は本システムの評価を行うと共に,本年度進めた検査対象の回線の動的選択およびキャプチャ機能を使い,検査分析の自動化および,必要な解析ノードの自動割り当てを行うプロトタイプに発展させる.(2)については,H26年度に作成した高精度ネットワーク測定装置が,8K/4K映像伝送・蓄積配信の実験においてover10Gbpsの広帯域映像の伝送状況を低遅延で可視化できる成果となった.また本年度は,処理ノード間のプロトコルの検討に向けて,高精度ネットワーク測定装置間でのデータ共有方式の提案とプロトタイプによる実装を行った.

今後現状のperfSONARプロトコルとの連携を含めた定量的な評価を進める.(3)については,本年度over10Gbpsのポスト解析を実施し,多地点の高精度測定装置の膨大なキャプチャデータの処理を行うために,時間軸での相関を取りながら解析する簡易ツールを作成した.現状は1台のPCサーバのみでの処理を行っているが,今後並列計算リソースを利用した解析処理に発展させる.本研究では,広帯域ストリームデータを対象に,障害発生の問題箇所を自動的に絞り込む検査分析機能と詳細なパケットキャプチャ情報を基にポスト解析を行う機能を実現する.本年度も8K超高精細映像を題材として,以下のように実現した.(1)ノードの協調連携による検査分析の自動化:上位レイヤの解析機能として,RTPパケットのリアルタイム解析機能を実装し,シーケンス番号の異常検出などを障害報告条件として指定できるようにした他,複数の測定装置で収集した障害情報を汎用ログ収集システム(fluentd)の枠組みを使って集約する事で,障害発生区間の特定を行う機能を実装した.(2)伝送状況の多面的な分析とリアルタイム可視化機能: 8K超高精細映像を扱う事によりover 100Gbpsの回線容量を並列に同時解析する必要性が生じた.このような多地点の高速パケットキャプチャ機構を実現するために,市販の汎用スイッチのタッピングデータの集約機能を用いて,任意の複数回線のキャプチャデータからヘッダ情報を抽出し,これを特定ポートに集約し,一括で処理するモニタ機能を再設計した.集約部では,一括での解析処理を行う必要があるため,高速処理性能が要求されるが,このために,Intel DPDKを使って解析処理にCPUの特定コアを占有させる事により,over 100Gbpsのキャプチャ・分析性能を達成した他,トラヒック表示・障害表示のGUIリアルタイム可視化を実現した.本システムを2017NICT雪まつり実験において利用し,有効性を検証した.(3)高精度時刻情報に基づくポスト解析機能:上記の可視化システムにおいて,過去の任意の時間からのデータをリアルタイムで可視化する機能を付与し,キャプチャ地点毎の障害前後のトラヒックの状況を可視化する事で,問題点の追究を可能とした.ネットワークの広帯域化に伴い,8K/4K超高精細映像のストリームデータを扱うアプリケーションの普及が見込まれている.広帯域でリアルタイム性を持つストリームデータは,伝送状況の影響を非常に受けやすく,安定運用のためには輻輳等の原因箇所の特定が不可欠である.このため提案者は,低遅延で描画表示が可能なover 100Gbps対応の高精度ネットワークモニタ装置と複数装置の連携により問題個所を特定するシステムを開発した.これを様々な8K/4K非圧縮広帯域映像伝送トライアルでの使用を通して,有効性を評価した.高速可視化方式の検討およびリアルタイム解析エージェントの検討の一環として, over 10Gbpsクラスのパケットモニタを題材に検討を加速する事ができた.over 10Gbpsのモニタ
ステロイドホルモンによる両生類の性決定機構の解明

両生類(ツチガエル)の性はステロイドホルモンによって転換する。アンドロゲン(雄化ステロイドホルモン)がはたらくにはその受容体(AR)に結合することが必要である。ツチガエルのAR遺伝子は性染色体にある。Z染色体のZ-ARは正常に発現するがW染色体のW-ARは殆ど発現しないため、Z-AR遺伝子はツチガエルの雄化に有利であると考えられる。そこで、Z-AR遺伝子を雌(ZW)胚に導入して性が転換するかどうかを調べた。その結果、Z-ARの導入により雌の性が不完全ではあるが転換し卵精巣を形成した。本研究は、脊椎動物でAR遺伝子が性決定に深く関わっていることを世界で初めて示した。脊椎動物の性は性染色体に局在する遺伝子、所謂"性決定遺伝子"によって決まると考えられている。哺乳類ではSRY,鳥類のニワトリではDMRT1、魚類のメダカではDMYが見いだされ、性決定遺伝子は多様であることが分かってきた。しかし、性決定遺伝子によって性が決まるとされる脊椎動物でも種によってはステロイドホルモンの投与および環境の変化で比較的容易に性が変わる。今までの研究では孵化温度や体の大きさで性が決まる場合には性決定遺伝子が関与せず、ステロイドホルモンが重要な因子の一つと考えられている。事実、ステロイドホルモンを投与すると簡単に性が転換する動物もいる。性決定遺伝子で性が決まるメダカでもステロイドホルモンによって性が変わる。両生類でも幼生にステロイドホルモンを投与すると性が転換する。これらの事実は、脊椎動物の性決定にステロイドホルモンが深く関与することを示している。当研究室における今までの結果から、ツチガエルyの性決定時期に、(1)ステロイド合成酵素遺伝子が発現すること、(2)未分化性腺に酵素蛋白が存在すること、(3)未分化性腺で実際にステロイドホルモンが合成され、雄ではテストステロンが、雌ではエストロゲンが多く合成されること、(4)アンドロゲン受容体(AR)遺伝子はZ,W性染色体上にありW染色体のARは殆ど発現しないこと、などを見出している。本研究は、ツチガエルをの性決定がステロイドホルモンに依ることを実証するため、RをZW胚に導入したトランスゲニックカエルを作製してARが雄決定遺伝子かどうかを明らかにすることにある。そこで、AR導入用のDNAコンストラクトを作製してツチガエル卵に導入した。その結果、遺伝子の導入には成功したが導入胚数が少なく、ARが雄決定遺伝子かどうか断定するまでに至っていない。次年度は導入胚数を増やしそれを実証する予定である。研究材料のツチガエルは同一種でありながらXY型かZW型の性決定様式をもつユニークなカエルである。この2つの性決定様式は性染色体の逆位と、その後の集団間の交配で生まれたと考えられている。最近、我々はツチガエル性染色体の逆位領域にARはアンドロゲン受容体遺伝子が存在すること、また、ZZ胚とZW胚の発現比は2:1であることを見出した。このことは、このカエルの性決定及び性分化にステロイドホルモンが大きな影響を及ぼしている事ことを示している。本研究は、(1)両生類(ツチガエル)の性(雄)がアンドロゲンとその受容体で決まること、(2)AR遺伝子、(3)CYP17[アンドロステンジオン(AD)合成酵素]遺伝子の転写調節因子を明らかにすること、及び(4)W染色体のAR(W-AR)が致死遺伝子かどうかを明らかにする。ことにある。これらが実証できれば、アンドロゲンによる性決定のしくみが明らかになる可能性があり、脊椎動物の性決定分子機構の解明に大きく貢献すると思われる。本年度の成果を以下に述べる。まず、(1)については、AR遺伝子を受精卵に導入したTG幼生の作製を作製してアンドロゲン添加或は未添加水で飼育した。TG幼生をアンドロゲン添加水で飼育するとZW胚は本来の生殖腺である卵巣ではなく精巣を形成した。この事実はツチガエルの性決定がアンドロゲンとその受容体(AR)で決まる事を見事に示している。ステロイドホルモンとその受容体が性決定に関わる事を世界で初めて示した。(2)(3)は、AR遺伝子及びCYP17[アンドロゲン前駆体合成酵素]遺伝子の転写調節因子を明らかにすることにあるが、そのために1細胞cDNAライブラリーの作製が必要である。この研究課題を開始して2年間でタイターの高いライブラリーを作製する事に成功した。現在、1細胞で発現する遺伝子の解析を行なっている。「研究目的」脊椎動物の性は(1)遺伝的要因、(2)環境的要因、或は(3)社会的要因のいずれかで決まる。爬虫類では(2)の卵の孵化温度、魚類では(3)の体の大きさで性が決まる種もある。

またこれらの因子とは別に、脊椎動物の多くの種では、ステロイドホルモンによって性が転換する。本研究は、ステロイドホルモンによる両生類(ツチガエル)の性決定機構の解明を目的とする。特に、ツチガエルではアンドロゲンとその受容体(AR)が性決定に重要な役割を果たすことを示す。「研究成果」当研究室の研究によって、ツチガエルの性染色体にあるAR遺伝子は、Z染色体のAR(Z-AR)は正常に発現するが、W染色体の(W-AR)は退化していて殆ど発現しないため、雄(ZZ)と雌(ZW)胚のARの発現比が2:1になることを示した。このZ-ARの発現比は生殖腺の雄化(精巣形成)に有利である。そこで、Z-AR遺伝子をツチガエル受精卵に導入して発生させると雌(ZW)が性転換して精巣を形成すると考え、Z-AR遺伝子を導入したトランスゲニックツチガエルを作製した。Z-AR遺伝子を800個の受精卵に導入後、変態完了期まで飼育し、Z-AR遺伝子導入個体の生殖腺を分子及び細胞・組織レベルで解析した。その結果、Z-AR遺伝子を導入した9つの雌個体が不完全ではあるが性転換して卵精巣を形成した。卵精巣は内部形態から3つのタイプに分けられた。不完全性転換雌(ZW)幼生をテストステロン含有水で飼育すると変態後に雄(ZZ)の精巣と全く区別がつかない精巣(ZW)を形成した。「意義・重要性」Z-AR遺伝子導入カエルを作製し、アンドロゲンとその受容体(AR)が脊椎動物の性決定に関わることを世界で初めて示した。この研究成果は、性決定遺伝子とは独立した性決定のしくみを世界で初めて示したもので脊椎動物の性決定機構の解明に大きく役立つと思われる。脊椎動物の性は遺伝的、環境的、及び社会的要因で決まる。多くの脊椎動物の性は遺伝的、即ち受精時の性染色体の組み合わせで決まると考えられ、多くの研究者が性染色体上の性決定遺伝子の特定に多くの力を注いできた。しかし、現在までに発見されている性決定遺伝子は哺乳類や魚類のメダカなど数種でで見つかっているにすぎない。しかも性決定遺伝子は一つではなく、種で異なり多様と考えられるようになった。一方、環境的或は社会的要因による性決定では性決定遺伝子が関与しないと考えられる。また、魚類、両生類及び爬虫類の多くの種では、ステロイドホルモンによって性が転換する。性転換は性染色体の遺伝子が関与しない。つまり性決定の主役は性決定遺伝子だけではなくステロイドホルモンも主役になり得る。ツチガエルでは性染色体にAR遺伝子があり、W染色体のARは殆ど発現しない。従って、雌雄(ZZ/ZW)の発現比は2:1になる。この比はアンドロゲンが雄化に関わるため、雄にも雌にも有利である。本研究は、ステロイドホルモンが性決定因子と考え、(1)両生類(ツチガエル)の性(雄)がアンドロゲンとその受容体(AR)で決まることをトランスゲニックカエルの作製によって実証すること、(2)ステロイドホルモン合成酵素遺伝子の発現調節機構を明らかにすることにある。本年度の研究で、Z-ARをツチガエル受精卵に導入し変態時期まで育てた雌(ZW)カエルの生殖腺が部分的性転換を起すことを見いだした。部分的性転換は幼生の飼育水にテストステロンを加えると完全に性が転換する(投稿中)。
福島第一原子力発電所事故を教訓とした大規模緊急広域避難対策に関する社会情報学研究

東京電力福島第一原子力発電所事故は世界的にも初めての大規模緊急広域避難である。本研究はこの事故を教訓とし、1大規模緊急広域避難の諸動をあらかじめ予測し、避難時の混乱を低減させること、2大規模緊急広域避難にける災害情報の適切な伝達内容・手法など情報提供方策について明らかにすることを目的とする。申請者らが東京電力福島第一原子力発電所事故に関して、これまで調査を実施し取得してきた避難に関する既存のデータに加え、緊急時のShadowEvacuationについて調査を実施し、これらを統合して、東京電力福島第一原子力発電所事故における避難状況をデータセントリックな視座から全体的に把握する。ここから原子力発電所事故のみならず、首都直下地震、南海トラフ巨大津波などの大規模緊急広域避難の防災・減災策を社会情報学的視座から考察するものである。本年度は、昨年度に引き続き、福島原発事故の調査を継続して実施している。過去の調査では十分に実態が把握されていない、20km圏外の住民において避難勧告・指示がなくとも避難をおこなった緊急時の自主避難(自主的避難)「Shadow Evacuation」についての検討を継続し、また、浪江町を中心として、行政組織そのものの避難における課題についても実証調査を進めた。また、今年度より、立地県および隣接県における原子力防災の現状についてのヒアリング調査を開始している。来年度にはこれを完成させ、現状の広域避難を含めた原子力防災の現状を明らかにする予定である。実施予定であった関連するヒアリング、調査票調査を進めることができた。得られた調査データ、あらたなヒアリング結果などを前提に分析・論文化を進めていく。申請者らが東京電力福島第一原子力発電所事故に関して、これまで調査を実施し取得してきた避難に関する既存のデータに加え、緊急時のShadow Evacuationについて調査を実施し、これらを統合して、東京電力福島第一原子力発電所事故における避難状況をデータセントリックな視座から全体的に把握する。本年度は、過去の調査では十分に実態が把握されていない、20km圏外の住民において避難勧告・指示がなくとも避難をおこなった緊急時の自主避難(自主的避難)「Shadow Evacuation」についての検討をすすめた。具体的には、福島県内の双葉8町村以外の市町村において、東京電力福島第一原子力発電所事故後に一時的に避難したが、既に自宅に戻っている人について人数、状況などを把握するための基礎的データを収集するための調査を実施した。来年度、これを集計し、東京電力福島第一原子力発電所事故後の避難の量的な全体像の推計を行うものである。また、浪江町を中心として、行政組織そのものの避難における課題についても実証調査を進めた。初年度実施予定だった調査票調査が回収まで順調にすすんだ東京電力福島第一原子力発電所事故は世界的にも初めての大規模緊急広域避難である。本年度は、昨年度に引き続き、過去の調査では十分に実態が把握されていない、20km圏外の住民において避難勧告・指示がなくとも避難をおこなった緊急時の自主避難(自主的避難)「Shadow Evacuation」についての検討をすすめた。具体的には、福島県内の双葉8町村以外の市町村において、東京電力福島第一原子力発電所事故後に一時的に避難したが、既に自宅に戻っている人について人数、状況などを把握するための基礎的データを収集するための調査を得て、その集計作業をおこなった。現在、東京電力福島第一原子力発電所事故後の避難の量的な全体像の推計を行っている。昨年度に引き続き、浪江町を中心として、行政組織そのものの避難における課題についても実証調査を進めた。また、今年度より、新潟県柏崎刈羽原子力発電所における広域避難についても検討をはじめた。今年度、実施予定であった調査票調査の集計を行った。また関連するヒアリング、調査票調査を進められた。

ここから原子力発電所事故のみならず、首都直下地震、南海トラフ巨大津波などの大規模緊急広域避難の防災・減災策を社会情報学的視座から考察するものである。本年度は、昨年度に引き続き、福島原発事故の調査を継続して実施している。過去の調査では十分に実態が把握されていない、20km圏外の住民において避難勧告・指示がなくとも避難をおこなった緊急時の自主避難(自主的避難)「Shadow Evacuation」についての検討を継続し、また、浪江町を中心として、行政組織そのものの避難における課題についても実証調査を進めた。また、今年度より、立地県および隣接県における原子力防災の現状についてのヒアリング調査を開始している。来年度にはこれを完成させ、現状の広域避難を含めた原子力防災の現状を明らかにする予定である。実施予定であった関連するヒアリング、調査票調査を進めることができた。調査票調査の集計、それを基にした推計をすすめていく。得られた調査データ、あらたなヒアリング結果などを前提に推計、モデル化を進めていく。得られた調査データ、あらたなヒアリング結果などを前提に分析・論文化を進めていく。
移植気道のリモデリング機構の解明:上皮間葉移行現象に着目した新たな試み

移植気道の組織学的経時的検討から線維化に先立つ上皮の劇的な形態変化の中で上皮間葉移行(EMT)が生じている可能性を示唆する所見を得た。一方、遺伝子組換えマウスを用いた検討では、線維化を引き起こす線維芽細胞の大半はレシピエント由来であるという結果を得た。移植臓器線維化過程に上皮の何らかの関与はあると推察されるが、移植片を機能廃絶からrescueするためにはレシピエント骨髄由来細胞の線維芽細胞への分化をブロックすることが重要だと示唆する成果である。上皮間葉移行(Epithelial-mesenchymal transition : EMT)という現象が、臓器機能廃絶の一因となる線維化現象や癌の浸潤過程などで認められている。肺移植においても、長期的な予後を不良にしている線維化を主体としたBronchiolitis obliterans syndrome (BOS)という現象にEMTが関与しているとされる。我々の圏的は、移植気道のremodelingに如何にEMTが関与しているかを明らかにし、当該経路の薬物的修飾によって移植片を機能拒絶よりrescueすることにある。気道remodelingのモデルとしてはマウスの同所性もしくは異所性気管移植がしばしば使用されており、我々は、major histocompatibility complex mismatch pairであるBalb/c→B6のマウスの組み合わせで同所性気管移植をマイクロサージェリー手技にて行い、気道上皮下層の線維化・リモデリングを経時的に観察、再現性を確認した。また、免疫染色を用いて、α-SMA、E-cadherin、ZO-1等の上皮・繊維芽細胞マーカーの発現・分布の経時的変化の観察を開始した。今後、EMTが組織学的に確認可能な時点を明らかにすることが可能と考えており、それが明らかとなればその時点での組織の遺伝子発現解析に着手し、気道が線維化に至るメカニズムが明らかとなれば、当該経路への薬物的修飾によって移植片を拒絶よりrescueすることが可能と考えている。上皮問葉移行(Epithelial-mesenchymal transition: EMT)という現象が、臓器機能廃絶の一因となる線維化現象や癌の浸潤過程などで認められている。肺移植においても、長期的な予後を不良にしている線維化を主体としたBronchiolitis obliterans syndrome(BOS)という現象にEMTが関与しているとされる。我々の目的は、移植気道のremodelingに如何にEMTが関与しているかを明らかにし、当該経路の薬物的修飾によって移植片を機能拒絶よりrescueすることにある。気道remodelingのモデルとしてはマウスの同所性もしくは異所性気管移植がしばしば使用されており、我々は、major histocompatibility complex mismatch pairであるBalb/c→B6のマウスの組み合わせで同所性気管移植をマイクロサージェリー手技にて行い、気道上皮・上皮下層の線維化・リモデリングを観察した。その後、採取した移植気道に免疫染色を行い、EMTマーカーであるαSMAやE-Cadherinの発現が上皮内において経時的に変化することを発見した。中でも上皮内に間葉系マーカーであるαSMAの発現上昇を再現性をもって認めたことは、傷害を受けた上皮が問葉系細胞に移行することを示唆しており、重要な発見であると考えた。それに基づきEMT関連転写因子であるZEB1,SIP1等に関しても免疫染色を行い経時的変化を検討した。マウス主要組織適合性抗原ミスマッチペア(BALB/c, C57BL/6)を用い実体顕微鏡下に同所性気管移植を行った。術後、著しい炎症細胞浸潤・上皮の偽重層化→上皮細胞の剥離→炎症鎮静化・気道上皮扁平化→気道上皮下の線維化が完成、という一連の経過が観察された。術後2日目10日、14日、28日目の各移植片に上皮系マーカーであるE-Cadherin、間葉系マーカーであるα-SMAの免疫組織染色を施行したところ術後7日目(移植片全体の炎症細胞浸潤と上皮の偽重層化が最も著しい時期)の移植片において上皮内α-SMA陽性細胞の出現とその細胞におけるE-Cadherinの減弱が認められた。このことは上皮が傷害を受けた頃に上皮間葉移行(EMT)が起こる可能性を示唆していた。この結果を得て我々は移植気道の線維化におけるEMT関与の可能性を別の方法で示したいと考えた。線維化の主役は線維性物質を産生する線維芽細胞である。移植気道の線維化においてはこの線維芽細胞の起源がEMTを介したドナー上皮細胞であるのかもしくはレシピエントの骨髄由来間葉系細胞であるのかという点において長らく議論があるのだが、異系移植ペアの一方にgreen fluorescent protein(GFP)全身発現マウスを用いることにより線維芽細胞がドナー由来かレシピエント由来かを組織学的に解明することとした。C57BL/6のGFPマウスとnaïve BALB/c

マウスのペアで同様の移植を行い術後28日目の気道上皮下線維化層におけるGFP発現の有無を調べた。結果、この検討においては線維芽細胞の大半はレシピエントに由来することが判明した。前半の経時的変化の組織学的検討より上皮と間質の間にはcross-talkがあると考えられるが、最終的な状態においての線維芽細胞はレシピエント由来のものであることが本研究より明らかとなった。研究室自体がゼロからのスタートであったが、平成24年4月現在、平成24年度7月の国際移植学会(The 24th International Congress of The Transplantation Society)での研究成果の発表が既に決定している。2年間(平成22,23年度)の助走期間を経て平成24年度に研究成果がまとまるというおおむね順調な進展である。24年度が最終年度であるため、記入しない。組織レベルで確認した気管上皮内におけるEMTマーカー発現の経時的変化について、逆転写Realtime-PCRを用いた定量的確認を行う。また一方で、移植ペアの片方にEGFPマウスを用いることにより、線維芽細胞の起源を明らかにする予定である。
ヘテロニッケラサイクルを経由する水素移動型炭素―炭素結合形成反応

不飽和化合物とニッケル(0)より生じるニッケラサイクルにおいて、β-水素脱離、続く還元的脱離により、環状ニッケル中間体から鎖状の有機化合物が得られる。反応は、炭素-炭素結合形成反応以外にもエステル類を与える炭素-酸素結合形成反応にも適用できる。特に、2種類のアルデヒドから選択的に1種類のエステルを与える交差反応はニッケラサイクルを経由することにより可能となる反応である。本研究では、酸化的環化を鍵過程とし水素の移動を伴いながら新しい炭素-炭素結合ができる反応の開発を目的とした。平成21年度は、ヘテロニッケラサイクルを鍵中間体とする単純アルケンの直接共役付加の実現を目指し研究を行ってきた。鍵となる量論反応は既に準備段階において、分子内反応ではあるものの実際に進行することを確かめていた。これを足がかりに、研究の展開を行った。本量論反応を、触媒反応へと展開するにあたり分子内反応での検討を行った。目的とする反応は、高収率で進行するものの非常に高い反応温度を必要とした。これは、酸化的環化を進行させるために必要なη^2:η^2-型の反応中間体が安定すぎるためであると考え、分子間反応での検討を行った。この際には、シリンジポンプを使用し時間をかけてエノンを滴下する必要があったものの目的とする反応を高効率で進行させることに成功した。特に、2-プロペニルフェニルケトンとスチレン類との反応は非常に収率がよく、71-99%の収率で目的とする化合物を与えた。しかし、3-ペンテン-2-オンを用いた場合には、反応時間が長くなり、収率の低下も観測された。これは、酸化的環化に必要なニッケルからの電子の流れ込みが減少する為であると考えている。同様に、2-プロペニルフェニルケトンと1-オクテンや1-デセンとの反応においても反応時間が長くなり、収率の低下も観測された。これは、1-オクテンや1-デセンの配位力が2-プロペニルフェニルケトンに比べて非常に弱いため、エノンと同時にニッケルに配位出来ないためであると考えられる。現時点では、適用できる基質に制限があるものの本反応は、アルケンの炭素-水素結合がエノンへと共役付加する原子変換効率100%の反応であり、またビニル基を共役付加させるのにビニルメタルを必要としない画期的な反応である。新しい分子変換手法の開発は、有機合成化学の大きな柱となる非常に重要な課題である。そのため、以前から活発に反応開発が行われてきた。現在も広く利用されている反応の多くに共通する重要な点は、「原子変換効率」が高いことである。実際に反応効率を向上させることが可能であっても、原子変換効率を向上させることは難しい。そのために、新反応・新手法を開発する際には、可能な限り原子変換効率が高い反応であることが望ましい。申請者は低原子価ニッケルに対してカルボニル化合物、イミン、ニトリルなどが配位しやすいことに着目し、酸化的環化や酸化的付加によりニッケラサイクルを効率よく単離・同定するとともに触媒反応への展開を行ってきた。平成22年度は、エノンニ分子とアルキン-分子との[2+2+2]環化付加反応についての研究を展開した。この反応では、4つの不斉炭素を有するシクロヘキセン誘導体が高収率で得られる。また、生成可能な8種類の化合物のうち1種類のみを選択的に与える。また、水素移動型反応としては、ニッケル錯体触媒によるアルデヒドの二量化エステル合成反応の開発を行った。本反応は、脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒドの両方に対して有効に作用する。また、反応速度定数は、アルデヒドの濃度に対してゼロ次でありアルデヒドの配位は律速段階に影響を与えていない。ここに示した反応は、原子変換効率が100%である。これは、研究目的に合致した成果が上がっているものと考えられる。さらに、シクロプロピルケトンとニッケル錯体との反応において生じる反応中間体の反応性がその配位形式により大きく影響を受けていることを明らかにした。この知見を基に新たな触媒反応を開発することが可能となった。本研究課題である「ヘテロニッケラサイクルを経由する水素移動型炭素ー炭素結合形成反応」においては、これまでに合成あるいは発生方法を確立したヘテロニッケラサイクルを反応中間体とする種々の触媒反応についての検討を行った。本年度においては、特にアルデヒドをアルケンとニッケルとの分子内酸化的環化反応を鍵過程とするヒドロアシル化反応についての検討を行った。本反応の鍵中間体となるオキサニッケラサイクルは2004年に量論反応における合成を達成していた。そのため、触媒的分子内ヒドロアシル化反応へと展開することは研究をより意義深いものに昇華させる重要な鍵である。本ニッケラサイクルを鍵中間体とする反応においては、反応機構的にも脱カルボニル化反応等の副反応が完全に抑制されることが期待される。実際に、同様の分子内ヒドロアシル化反応をロジウムやルテニウムなどの既知触媒にて実施した際には、相当量の脱カルボニル化反応が進行する事が報告されている。

これらの事実は、本研究におけるニッケル錯体触媒による分子内ヒドロアシル化反応が斬新かつ意義深い反応となることを強く示唆している。しかしながら、そのニッケル錯体の熱安定性から触媒反応への展開は未だ達成されていなかった。そこで本年度は、触媒反応に使用する配位子を数多く合成し触媒条件の再検討を行った。その結果、量論反応では非常に良い結果を与えたPCy3やIPr配位子を用いた場合には低収率であったものの、IButやIAdなどの嵩高く塩基性の高い配位子を用いる事で非常に高い収率にて反応を実現する事ができた。さらに、期待通りに脱カルボニル化反応を完全に抑制することができた。これは錯体化学アプローチから予測した触媒設計が有用であることを示している物と考えられる。環状ニッケル錯体を鍵中間体とする触媒反応の開発を行った。従来のヒドロアシル化反応では、アシルメタル中間体を経由するために脱一酸化炭素が副反応として進行する。そのために触媒の失活や目的とするケトンが得られないなどの問題が避けられなかった。本研究課題において開発したアルケンの分子内ヒドロアシル化反応においては、アシルメタル中間体を経由しないために、脱一酸化炭素が起こらない。そのために、いずれの反応においても高収率で目的とする環状ケトンが高収率で得られた。また、6員環ケトンであるテトラロン誘導体も非常に高い収率で得られた。6員環ケトン類は従来の遷移金属触媒を用いての反応では、非常に容易に脱一酸化炭素が進行するために合成が困難であるとされてきた。環状ニッケル錯体を中間体とする本反応ではこれが可能になった。さらに、本反応においても反応中間体の解明を行うために量論反応を検討した。この際には、ニッケル反応中間体の二量化錯体が単離された。この錯体そのものは、触媒サイクルの外側に存在していると考えられるが、実際の反応中間体の構造を反映していいるものと考えている。また、アルキンとイミンとの反応においてはNHC配位子をもちいることで、これまでは不可能であったアルキンとイミンとの組み合わせにおいても対応するジヒドロピリジンが生成物として得られることをみいだした。2007年に発表した窒素上にSO2Phが置換している反応とは異なり、反応の律速段階は二分子目のアルキンが挿入する段階である事が量論反応により明らかとなった。このように、基質の違いにより反応の律速段階が変わる可能性は以前より知られていたが、実際に錯体反応により明らかにした例は殆どなく珍しい例であると考えられる。現在までに概ね順調に進展しているものと考えている。錯体触媒合成に関しては、その設計段階に多少の試行錯誤が必要ではあったものの思い通りの錯体触媒が設計できた。ただし、新たな錯体触媒が示した新反応に関してはその反応機構解析に時間を要した。これは、本研究課題の成果を最大にするためには必要不可欠なプロセスで有り、今後の展開に期待がもたれる。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、得られた知見をもとに新たな研究展開を目指す。具体的には、ニッケル原子のβ位に水素以外の元素を導入すること事で新たな反応の開発を目指したい。そのためには、効率のよい原料合成法の確立を行う。
膵臓癌治療法確立のための膵臓癌浸潤転移機構のシグナル伝達系の解明

2) TGF-β_1の膵癌における役割の検討:現在まで、手術によって得られた膵癌組織21例と慢性膵炎13例、組織学的に正常であった膵組織5例のパラフィン包埋組織においてTGF-β_1とそのI型レセプター、II型レセプターの発現を、それぞれ、ポリクローナル抗体を用いて免疫染色にて検索し、比較検討した。その結果、正常膵組織では、膵管上皮でTGF-β_1とレセプターの発現を認めたが、間質細胞では認めなかった。膵癌の癌細胞と慢性膵炎の膵管上皮細胞においては、TGF-β_1とレセプターの免疫染色陽性細胞数は同程度に認められ、全て同時に発現を認めた例もそれぞれ81.8%と76.2%と同程度であった。間質細胞におけるTGF-β_1とI型レセプター発現は膵癌において、慢性膵炎に比し高い発現傾向が認められ、特にII型レセプターの間質発現は膵癌において有意に高かった(p<0.05)。間質におけるTGF-β_1とレセプターの同時発現例は。膵癌で57.1%と慢性膵炎で40%であった。この実験結果から、TGF-β_1とそのレセプターの膵癌間質での高頻度の発現は、癌間質反応による線維化(desmoplasia)と炎症による線維化の相違を反映している可能性が示唆された。このように、TGF-β_1とそのレセプターが膵癌間質において強く発現していることを明らかにした。2) TGF-β1の膵癌における役割の検討:現在まで、手術によって得られた膵癌組織21例と慢性膵炎13例、組織学的に正常であった膵組織5例のパラフィン包埋組織においてTGF-β1とそのI型レセプター、II型レセプターの発現を、それぞれ、ポリクローナル抗体を用いて免疫染色にて検索し、比較検討した。その結果、正常膵組織では、膵管上皮でTGF-β1とレセプターの発現を認めたが、間質細胞では認めなかった。膵癌の癌細胞と慢性膵炎の膵管上皮細胞においては、TGF-β1とレセプターの免疫染色陽性細胞数は同程度に認められ、全て同時に発現を認めた例もそれぞれ81.8%と76.2%と同程度であった.間質細胞におけるTGF-β1型レセプター発現は膵癌において、慢性膵炎に比し高い発現傾向が認められ、特にII型レセプターの間質発現は膵癌において有意に高かった(p<0.05)。間質におけるTGF-β1とレセプターの同時発現例は。この実験結果から、TGF-β1とそのレセプターの膵癌間質での高頻度の発現は、癌間質反応による線維化(desmoplasia)と炎症による線維化の相違を反映している可能性が示唆された。このように、TGF-β1とそのレセプターが膵癌間質において強く発現していることを明らかにしたが、TGF-β1によって抑制されている可能性のあるMnSODについては、現在同一症例において免疫染色にて蛋白の発現とRT-PCRによってmRNAの発現を検索中である。
慢性骨髄性白血病進展に関わるアポトーシス制御遺伝子とc-kit遺伝子

白血病発症の分子生物学的解析をテーマに研究した。、特に慢性骨髄性白血病(CML)の発症およびCMLの病期進展を分子生物学的手法により細胞レベルで解析・解明することを目的とした。主たる解析遺伝子は白血病細胞のc-kitおよびcalpastatin相同遺伝子である。近年癌抑制遺伝子とされるp51/p63遺伝子、bcl-2,bcl-x,DCC遺伝子も研究のテーマとして本研究に組み入れ、白血病細胞株を樹立し癌抑制遺伝子とされるp73遺伝子の解析も行った。白血球増多が高度のCML症例でstem cell factor(SCF)のレセプターであるc-kit遺伝子に突然変異があることがわかった。この症例では発症およびCML病期進展にc-kit遺伝子の傍細胞膜直下のcodon 541および564に異常を示す。Ba/F3マウス細胞にこの異常c-kit遺伝子を導入し、その機能解析を行ったところtyrosin kinase活性に若干の亢進がみられこれが白血病発症、進展に関与していることを突き止めた。p51/p63遺伝子もCML病期進展に関与し、異常となってくることが判明した。mRNAのisoformもp51-α,-β,-γが存在し、白血病細胞ではp51αの発現がほとんどであり現在機能解析中である。遺伝子変異解析では病期進展にDNA結合領域に点突然変異が集中していた。calpastatin相同遺伝子はなおその異常の機能を解析中である。特に慢性骨髄性白血病(CML)の発症およびCMLの臨床血液像の違いを分子生物学的手法により細胞レベルで解析・解明することを目的とした。主たる解析遺伝子は白血病細胞のc-kitおよびR3-2遺伝子である。CML80症例(慢性期48症例、移行・急性期32例)にてc-kit遺伝子細胞膜直下領域をPCR-SSCP法および、塩基配列決定法にて突然変異を解析した。CML慢性期7症例で遺伝子変異が観察された。このうち6症例はcodon541ATG(Met)→CTG(Leu)を1症例はcodon564AAT(Asn)→AAG(Lys)の遺伝子変異が観察された。これらの変異例では白血球増多が高度の傾向が認められ、急性期パターンも非典型的であった。このc-kit遺伝子に突然変異が生理学的に白血病を発症してくるのかin vitroおよびマウスにて検討したところ、in vitroにて弱いBaf3細胞増殖能を認めたが、マウスには腫瘍を形成しなかった。R3-2遺伝子はCML急性期で高発現されている症例が多く、一部の症例で分子量が変化しているのをつきとめた。特に慢性骨髄性白血病(CML)の発症およびCML臨床血液像の違いを分子生物学的手法により細胞レベルで解析・解明することを目的とした。このうち6症例はcodon541 ATG(Met)→CTG(Leu)を1症例はcodon564 AAT(Asn)→AAG(Lys)の遺伝子変異が観察された。このc-kit遺伝子に突然変異が生理学的に白血病を発症してくるのかin vitroおよびマウスにて検討したところ、マウスには腫瘍を形成しなかった。in vitro Baf3細胞増殖能はcodon564 AAT(Asn)→AAG(Lys)c-kitを発現させるとwild c-kitに比べ増殖能が亢進したが、完全なるIL3自立増殖能ほどではなかった。

codon541はwild c-kitに比べほとんど同じ増殖能であり、ポリモルフィズムの可能性が考えられた。c-kit変異はCML発症に関わる症例があるものの、頻度は低率であり、病型に影響を与えている可能性が考えられた。R3-2遺伝子はcalpastatin類似遺伝子でありCML急性期で高発現されている症例が多く、一部の症例で分子量が変化していた。なお、CML症例でp51/p63遺伝子変異が観察され現在検討中である。
形態と機能画像法による脳変性疾患の統合的解析とその臨床応用

パーキンソニズムや認知症をきたす変性疾患、多発性硬化症などを対象にMR拡散テンソル画像での白質変性、限局性の脳の萎縮、脳血流等画像情報解析したところ、認知障害をきたす疾患においては認知機能と関連する線維の変性を生じ、また複数の構造画像情報を基に識別解析をすることよって鑑別の可能性を示した。この研究は様々な変性疾患を対象に、MRI・脳血流SPECTの検査を行い、MR拡散テンソル画像での白質変性、皮質あるいは白質の萎縮、磁化率強調画像、脳血流SPECTを臨床情報と合わせ、一定のプロトコールに従って検査をし、画像解析することで、各モダリティーの結果を比較し、また経時的変化の評価やfollow upの指標も提示することが目的である。MRI検査では軸位断T1,T2強調画像、冠状断FLAIRなどのルーチンのシークエンスに加え、拡散テンソル画像、磁化率強調画像、形態計測のための3DT1のvolume dataを撮像した。また脳血流SPECTではテクネシウム(^<99m>Tc)-L, L-ethyl cysteillate dimmer(ECD)を静注し、SPECTを撮影した。初年度では25例のアルツハイマー病、30例のパーキンソン病、5例の皮質基底核変性症でMRIと脳血流SPECTの検査を行った。また5例の筋萎縮性側索硬化症、4例の筋ジストロフィー病のMRI検査を行った。それぞれの症例のMRI形態計測の下準備として、SPMのソフトにて灰白質、白質、脳脊髄液のsegementationを施行した。MRI拡散テンソルではDTI Studioのソフトにて全脳のFA map,MD mapを作成し、今後normal data baseと有意差を比較検討するための準備を行った。MRI磁化率強調画像の視覚的評価を、各症例の歯状核、赤核、黒質、淡蒼球、被殻、尾状核、運動皮質で行い、スコアーをつけた。脳血流SPECTでは大脳の脳血流量を測定し、定量と定性の画像を作成した。まだ疾患によっては症例数が少ないものもあるが、さらに検査を進め、来年度は症例のみならず経時的な検査数も増加する見込みで、横断的および縦断的評価と解析を進める予定である。この研究は様々な変性疾患を対象に、MRI・脳血流SPECTの検査を行い、画像解析することで、各モダリティーの結果を比較し、また経時的変化の評価やfollow upの指標も提示することが目的である。MRI検査ではシークエンスに加え、拡散テンソル画像、磁化率強調画像、形態計測のための3DT1のvolume dataを撮像した。また脳血流SPECTではテクネシウム(^<99m>Tc)-L,L-ethylcysteinate dimmer(ECD)を用いた。現在まで30例のアルツハイマー病、30例のパーキンソン病、10例のMSA-P、9例のMSA-C、4例のDLB、7例の皮質基底核変性症でMRIと脳血流SPECTの検査を行った。また7例の筋萎縮性側索硬化症、5例の筋ジストロフィー病のMRI検査を行った。それぞれの症例のMRIの3DT1WIをSPMのソフトにて灰白質、白質、脳脊髄液のsegementationを施行した。MRI拡散テンソルではDTI Studioのソフトにて全脳のFA map,MD mapを作成した。脳血流SPECTでは大脳の脳血流量を測定し、定量と定性の画像を作成した,また今年度より新しい3TのMRI機種が導入され、従来の1.5Tでは撮影できなかった非侵襲的脳血流測定法ASL(arterial spin labeling)の検査も追加するべく、そのシークエンスの設定を行った。Psudocontinuous方を用い、定量化を試みる。今年度は5人の被検者で撮影する時期や頭部のとパルスをかける角度を変えても再現性があることが確認された。今後同一被検者で脳血流SPECTを行いパトラック法にて血流を測定し、定量化の指標とする。また新しい機種での正常データ蓄積も同時に行う。また脳血流SPECTではテクネシウム(^<99m>Tc)-L,L-ethyl cysteinate dimmer(ECD)を用いた。現在まで30例のアルツハイマー病、33例のパーキンソン病、12例のMSA-P、9例のMSA-C、7例のDLB、7例の皮質基底核変性症でMRIと脳血流SPECTの検査を行った。また12例の筋萎縮性側索硬化症、7例の筋ジストロフィー病のMRI検査を行った。

それぞれの症例のMRIの3DT1WIをSPMのソフトにて灰白質、白質、脳脊髄液のsegementationを施行した。MRI拡散テンソルではDTI Studioのソフトにて全脳のFA map,MD mapを作成した。MRI磁化率強調画像の視覚的評価を、各症例の歯状核、赤核、黒質、淡蒼球、被殻、尾状核、運動皮質で行い、スコアーをつけた。脳血流SPECTでは大脳の脳血流量を測定し、定量と定性の画像を作成した。さらに23年度は3TのMRI機種も導入され、従来の1.5TMRIでは撮像できなかった非侵襲的脳血流測定法ASL(arterial spin labeling)の検査を、psudocontinuaus法を用いて定量化することを正常コントロールで信頼できるデータを得られることを確認し、本年度5例のDLB患者と13例の多発性硬化症患者のデータを取得することができた。最終年度は認知症、パーキンソニズムをきたす変性疾患や多発性硬化症など、4年間で集積したMRIデータを中心に解析を行った。MRI拡散テンソルではtract specific analysisにてターゲットの繊維をFA値、MD値を算出した。また非侵襲的脳血流測定法ASL(arterial spin labeling)の検査をpsudocontinuaus法を用いて測定した。いずれも3D volume detaを用いてVBM(voxel based morphometry)にて灰白質のvolumeの解析も行った。16例の進行性核上性麻痺Richardson syndrome (PSP-RS)と正常群と比較したところ、鉤状束のFA値が正常と比して優位に低下し、また鉤状束と下縦束のMD値が優位に上昇していた。またVBMの体積比較においては、正常と比べて前頭葉下面優位の皮質の委縮を認めた。これらの結果よりこれらの変性や委縮が認知機能の低下の原因である可能性が示唆された。また27人の多発性硬化症にて、同様に正常群とASLにて脳血流を比較・解析したところ、両側の視床が正常と比較して優位に低下していた。大脳半球の血流低下は互いに相殺され、各大脳血流低下部位がそれぞれ投射線維が集合する視床にも遠隔効果が表れて血流低下をきたし、有意差をきたしたものと思われる。またDWIの手法を用いて脳室内の温度測定も行ったが、正常群との有意差は出なかった。18例の多系統萎縮症小脳型(MSA-C)と12例の多系統萎縮症パ-キンソン型(MSA-P)と正常群にてtract specific analysisとVBMを用いてdiscriminant analysis techniquesを行ったところ、0.89の識別率を得ることができ、様々な解析値を組み合わせることで正診率向上に寄与できるものと思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。臨床、MRI等の画像検査を施行し、画像のデータ解析を行う。今年度は最終年度であるために、データ蓄積は上半期で終了し、画像処理、解析とまとめを中心に行う。
魚病細菌Listonella anguillaraのプロテイナーゼの新しい機能

魚病細菌Listonellaanguillaraの病原性決定因子の一つに細胞外プロテアーゼがある。しかし、これまではどのようなプロテアーゼが産生され、それらがどのような生理機能を担っているのかについてはほとんど報告がなかった。本研究では、本菌のプロテアーゼが宿主の炎症反応誘発に関わっているのではないか、という仮説のもとに、酵素の気質特異性からその機能を明らかにすることを目的に研究を行った。まず本菌の多数の株についてプロテアーゼ産生プロフィールを基質特異性に基づいて調べたところ、複数のプロテアーゼが産生されていた。そのうち、多くの菌が産生したBoc-LSTR-MCA水解酵素に焦点をあてた。この酵素を精製したところ、メタロプロテアーゼであり、既報ではあるが、機能については不明の酵素であると考えられた。本研究ではこのメタロプロテアーゼの機能を解析した。本酵素が選択的に水解する基質Boc-LSTR-MCAは抗凝血因子の一つactivated protein Cの基質であることから、本酵素が同様の作用を持つことが示唆された。抗凝血反応系に関与するプロテアーゼ群用の基質を用いてアッセイしたところ、本プロテアーゼはactivated protein Cと同様の作用でFactor Vを不活性化することが明らかになった。その結果、Factor VaはFactor Xaとコンプレックスを作ってプロトロンビンをトロンビンへ変換する触媒機能が低下する。そして最終的に血液凝固反応が起きにくくなったと考えられた。本研究では、さらに、ニジマスを使ったin vivoと、MCA基質を使ったin vitroの実験から、本酵素はハ-ゲマン因子の様な働きをして血管の透過性を上げることもわかった。このように、本研究ではL.anguillaraのプロテアーゼの新しい生理機能を解明することができた。現在2、3報目を論文に作成中である。