hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内在性ボルナウイルスによるウイルス感染抑制メカニズムの解明

由来のタンパク質と複合体を形成することで機能することが考えられた。次に、ポリアデニル化されたヒストンmRNAの発現量を調節することから、BDVとヒストンタンパク質の相互作用を解析した。BDVは核内でウイルスタンパク質とウイルスゲノムRNAからなる凝集体(vSPOT)を形成し持続感染を成立させる。そこでヒストンがvSPOTに局在するかを検討した。その結果、翻訳後修飾を受けたヒストンタンパク質のvSPOTへの局在が観察された。このことから、hsEBLN-3由来RNAによるポリアデニル化されたヒストンmRNAの発現調節がBDV感染に必要なヒストンタンパク質の発現量を変化させることによりBDV感染を抑制する可能性が考えられた。これらは、hsEBLN-3由来RNAによるBDV感染抑制の分子機序に関しての全く新しい知見であり、今後さらに詳細な分子機序を解明するにあたり重要な情報である。今後は、「ポリアデニル化されたヒストンmRNAによるBDV感染の分子機序」と「hsEBLN-3の形成及び種間での保存」について解析を行う。BDVは核内での持続感染を成立させるためにヒストンタンパク質を利用することが知られている。そこで、hsEBLN-3由来RNAによるポリアデニル化されたヒストンmRNAの発現調節がBDV感染に必要なヒストンタンパク質の発現量を変化させることによりBDV感染を抑制する可能性が考えられる。この仮説をもとに、ポリアデニル化されたヒストンmRNAの発現量の変化がBDV感染に必要なヒストンタンパク質の発現量を変化させるのかを解析する。この解析によりhsEBLN-3によるBDV感染抑制のより詳細な分子機序を明らかとすることができると考えている。また、hsEBLN-3の形成及び種間での保存について進化学的な解析を行う。ヒトゲノムには複数のボルナウイルス由来の配列が存在するが、hsEBLN-3のみが多くのヒト組織でユビキタスに発現している。このことはhsEBLN-3が進化の過程でプロモーターを獲得し、その後宿主の遺伝子として適応進化したことを示唆する。hsEBLN-3の形成及び種間での保存を進化学的に解析することで、ボルナウイルスから宿主への遺伝子の水平伝搬が宿主の新たな遺伝子獲得及びウイルスとの攻防の歴史にどのように寄与したのかを明らかとすることができると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヌードマウス移植頭頚部固形腫瘍を用いた抗癌剤耐性発現に関するモデル実験

プラチナ系薬剤に対する耐性獲得は、頭頚部腫瘍の治療においては、重大な問題となっている。これらプラチナ系薬剤に対する耐性の機構と機序とを解明することが、重要と考えた。今回我々はヌードマウスに株化口腔腫瘍(KB)を用いて移植固形腫瘍を作製しプラチナ系薬剤(254-S)をさまざまな投与方法で腹腔内に投与し腫瘍増殖抑制効果の有無を観察した。実験には各群5匹のヌードマウスを用い254-Sの投与方法によって下記の4群とした。1)コントロール群[254-S(-)] 2)1回全量投与群[15mg/kg×1] 3)3回分割投与群[5mg/kg×3]4)5回分割投与群[3mg/kg×5]各群における初回投与を0週とし、12週間にわたり腫瘍重量を計測し比較した。9週目に再度254-Sを今回は2)3)4)の各群に同量の254-S(15mg/kg)を投与した。初回の254-S投与時には薬剤の投与を受けた3群間に明らかな腫瘍増殖抑制効果の差は認めなかった。しかし9週目の2回目の薬剤投与時には、4)の群においては薬剤の投与後も腫瘍増殖抑制はなく直後より腫瘍は増殖を示し、その他の3群に比して明らかな腫瘍増殖抑制効果を認めた。腫瘍細胞内Pt濃度、フローサイトメトリーを用いたPCNA測定、腫瘍細胞の形態学的観察結果などもこのことを指示していた。これらの事より低濃度の薬剤の頻回反復投与により生態内において実験的な耐性モデルを作製できたと考える。この実験的薬剤耐性モデルを用いて薬剤耐性の解明と克服をしたいと考える。
インフラマソームを介した心血管病の分子基盤の解明

NLRP3インフラマソームはIL-1β産生を制御し、無菌性炎症に関わる細胞内分子複合体である。NLRP3インフラマソームの構成分子の欠損マウスを用いて解析を行い、腹部大動脈瘤やドキソルビシンによる心不全、妊娠高血圧症といった心血管病におけるインフラマソームの重要性を明らかにした。また、NLRP3に直接結合する新規E3ユビキチンリガーゼであるARIH2を同定し、ARIH2がインフラマソーム活性を負に制御することも明らかにした。これらの所見から、NLRP3インフラマソームが心血管病における重要なメディエーターであることが示され、その制御機構の解明は新たな治療法の開発に繋がることが期待される。心血管病におけるインフラマソームの役割を明らかにするため、インフラマソーム構成分子(NLRP3・ASC・カスパーゼ-1)欠損マウスに、腹部大動脈瘤やドキソルビシンによる心不全、妊娠高血圧症モデルを作製して解析した。特に、腹部大動脈瘤では、大動脈外膜へと浸潤するマクロファージにおいてミトコンドリア由来酸化ストレスによってNLRP3インフラマソームの活性化が引き起こされ、血管炎症から血管壁の脆弱性が誘導されることを明らかにした。また、インフラマソーム制御機構の解明として、内因性インフラマソーム制御分子であるCARD16とCARD17の解析を行い、CARDドメインを介した新たなインフラマソーム活性化の制御機構について報告した。さらに、申請者らが最近、同定した新規のNLRP3インフラマソーム結合分子Aの解析を進め、分子AがNLRP3に結合してユビキチンE3リガーゼとして機能すること、分子A欠損細胞ではインフラマソーム活性化が亢進し、逆に分子Aの強制発現細胞ではその活性化が抑制されることを見出したことから、分子Aがインフラマソームの活性化を負に制御していることが明らかになった。今後、さらに詳細な機序を検討することにより、インフラマソーム制御機構の解明とこれを標的とした新たな治療法の開発が期待される。心血管病をはじめとするいくつかの病態モデルを用いて、NLRP3インフラマソームの役割を解析して報告した。また、インフラマソーム活性化の分子機構についても、CARDドメインを介した新たなインフラマソーム活性化の制御機構について報告するとともに、申請者らが新たに同定したNLRP3結合分子Aの解析を行った。具体的には、NLRP3変異体および分子Aの変異体の作製によるそれぞれの結合部位の同定、リジン変異体を用いたユビキチン修飾部位の同定、分子Aの欠損・強発現によるインフラマソーム活性化の解析等を検討した。一方、組織特異的にインフラマソーム構成分子を欠損するマウスおよびインフラマソーム構成分子の時間的制御マウスの作製にも成功しており、今後、これらのマウスを用いて病態モデルを作製し、解析を遂行していく。以上のことから、本研究課題に関しては、おおむね順調に進捗しており、当初の研究計画も達成している状況にある。心血管病や生活習慣病におけるインフラマソームの役割を明らかにするため、インフラマソーム構成分子(NLRP3・ASC・カスパーゼ-1)欠損マウスに、病態モデルを作製して解析した。具体的には、強心配糖体であるウワバインの投与が、心臓のマクロファージにおいてカリウム流出を介したNLRP3インフラマソームの活性化を誘導し、炎症と心機能障害を引き起こすことを明らかにした。また、高脂肪食負荷による肥満モデルでは、予想に反してカスパーゼ-1欠損により内臓脂肪における炎症や肥満が増悪することも報告した。インフラマソームの時空間的制御マウスについては、マクロファージ特異的欠損マウスおよびドキシサイクリン投与によるカスパーゼ-1欠損マウスを用いて、病態モデルでの解析を進めている。さらに、申請者らが最近、同定した新規のNLRP3インフラマソーム結合分子AがK48とK63のユビキチン修飾を介してインフラマソームの活性化を負に制御していることを明らかにした。分子A欠損マウスは胎生致死であるため、分子Aのfloxマウスの作製を行った。これまで心血管病を中心とした病態モデルを用いて、NLRP3インフラマソームの役割を解析して報告している。また、インフラマソームの時空間的制御マウス(マクロファージ欠損・ドキシサイクリン投与による欠損)についても使用可能な状況にあり、現在、解析を進めている。インフラマソーム活性化の分子機構については、新規に同定したNLRP3結合分子Aの解析を進めており、NLRP3と分子Aの結合部位をのより詳細な同定を行うとともに、分子Aの欠損・強発現マクロファージを作製して、インフラマソーム活性化における制御機構の解析を行った。さらに、この分子Aの欠損マウスは胎生致死であることから、分子Aのfloxマウスを作製し、現在、各種Creマウスとの交配を進めている。今後、分子Aの時空間的制御マウスを用いて、病態モデルを作製し、解析を行っていく。インフラマソームは強力な炎症性サイトカインであるIL-1β産生を制御する自然炎症経路の一つであり、心血管病の病態に共通する無菌性炎症の惹起に寄与する細胞内分子複合体である。

申請者はこれまで、心血管病におけるインフラマソームの重要性を報告し、その制御機構の解明が新たな治療法の開発に繋がることを明らかにしてきた。今年度は、脂肪酸による炎症惹起機構を解析し、飽和脂肪酸が過剰になるとマクロファージの細胞質内に結晶を形成し、リソソーム傷害を介したインフラマソーム活性化が引き起こされることを見出した。この結晶形成およびインフラマソーム活性化は、不飽和脂肪酸によって阻害されたことから、飽和・不飽和脂肪酸の不均衡がこの反応を制御していることが明らかになった。一方、好中球由来のプロテアーゼが、インフラマソーム非依存性にマクロファージ由来のIL-1β前駆体をプロセシングして炎症惹起や組織傷害に寄与していることを、肝虚血再灌流モデルを用いて明らかにすることができた。また、インフラマソームの構成分子であるNLRP3に直接結合する新規RBR型E3ユビキチンリガーゼであるARIH2を同定し、ARIH2がインフラマソーム活性を負に制御することを報告した。このARIH2はNLRP3のNACHTドメインに結合し、ARIH2のRING2ドメインを介してユビキチン化することもわかった。さらに、ARIH2はユビキチン鎖のK48/K63を介してNLRP3インフラマソームの活性化を制御していることも明らかにした。ARIH2欠損マウスは胎生致死であることから、現在、ARIH2のコンディショナル遺伝子改変マウスを作製しており、今後、生体や病態モデルにおけるARIH2を介した炎症制御機構の解明とこれを標的とした新規治療法の開発が期待される。NLRP3インフラマソームはIL-1β産生を制御し、無菌性炎症に関わる細胞内分子複合体である。NLRP3インフラマソームの構成分子の欠損マウスを用いて解析を行い、腹部大動脈瘤やドキソルビシンによる心不全、妊娠高血圧症といった心血管病におけるインフラマソームの重要性を明らかにした。また、NLRP3に直接結合する新規E3ユビキチンリガーゼであるARIH2を同定し、ARIH2がインフラマソーム活性を負に制御することも明らかにした。これらの所見から、NLRP3インフラマソームが心血管病における重要なメディエーターであることが示され、その制御機構の解明は新たな治療法の開発に繋がることが期待される。組織特異的にインフラマソーム構成分子を欠損するマウスに関しては、すでにマクロファージおよび線維芽細胞におけるいくつかの欠損マウスの作製に成功しており、今後、病態モデルを作製して解析していく予定である。一方、インフラマソーム構成分子の時間的制御マウスについては、ドキシサイクリン投与による構成分子欠損の経時的な変化を確認した上で、病態モデルを作製して解析を行う。また、レンチウイルスベクターと骨髄移植を利用した骨髄由来の炎症細胞で構成分子を欠損させるマウスの作製を行う。これらの研究を進めるとともに、新たに同定したユビキチンリガーゼ分子Aによるインフラマソーム制御機構の解析を継続して行っていく予定である。これまでに作製しているマクロファージ特異的インフラマソーム欠損マウスやドキシサイクリン投与によるカスパーゼ-1欠損マウスを用いて、心血管病の病態モデルを作製して解析を継続していく。また、線維芽
並行複発酵に最適なキシロース発酵性酵母創製に向けた基盤研究

当該年度では、昨年度にゲノムDNAライブラリーのスクリーニングにより単離したKluyveromyces marxianus DMB1株由来の高温耐性遺伝子について、Saccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換することにより、高温耐性(DMB1では生育可能でBY4742株では生育が著しく低下する41°Cの高温条件下において良好な生育を示す)のみならず、酵母の増殖に悪影響を与える各種薬剤に対しても耐性を示すことを確認した。すなわち、高温耐性遺伝子を形質転換したSaccharomyces cerevisiae株は、1.5mM過酸化水素、0.3%酢酸、0.1%塩酸、2M塩化ナトリウム、15mMフルフラール、及び8%エタノールを含む各寒天培地において、高温耐性遺伝子発現株は対照株と比較して良好な生育を示した。また、41°Cで嫌気的に培養することにより、高温耐性遺伝子発現株は対照株と比べてグルコースを1.6倍多く消費し、エタノールを1.7倍多く生産した。このように、Saccharomyces cerevisiaeにおいてKluyveromyces marxianus DMB1株由来の高温耐性遺伝子を発現させることで、高温条件下でのエタノール発酵性を向上させることが可能であることが明らかとなった。さらに、メタボローム解析を実施し、キシロース発酵時にDMB1株の代謝物がどのように変動するのか調べた。その結果、他の出芽酵母株と比較して、ペントースリン酸経路における複数の代謝物が増加した一方、細胞内のアミノ酸やピルビン酸が著しく減少することが判明し、DMB1株のキシロース発酵時の律速段階を特定することに成功した。昨年度に単離したDMB1株由来の高温耐性遺伝子について、当該年度でさらに解析を進めた結果、高温耐性のみならず過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、エタノールにも耐性を示すという予期しない結果を得たため、こちらの研究計画に少し多めの時間を費やした。一方で、当該年度の研究計画であるDMB1株のメタボローム解析やキシロース代謝系酵素の耐熱化なども並行して進めており、本研究課題はおおむね順調に進展している。今後は、耐熱化したキシロース代謝系酵素をDMB1株に導入し、キシロースや糖化液を基質とした高温下での発酵性を評価する。また、DMB1株を対象としてグルコース抑制解除変異体の探索や、DMB1株のゲノムDNAライブラリーの中から、キシロースを含む培地で増殖を早める輸送体遺伝子のスクリーニングを試みる。これらの結果から、高温条件下でも効率良くキシロースをエタノールに変換できる次世代型の耐熱性酵母を開発し、並行複発酵の最適なツールとしての展開を目指す。当該年度では、耐熱性酵母Kluyveromyces marxianus DMB1株の耐熱性機構の解明を目的に、DMB1から高温耐性遺伝子の単離を試みた。そのために、まずDMB1株のゲノムDNAライブラリー(DMB1株から抽出したゲノムDNAを切断後、5kb以上のゲノム断片をマルチコピーベクターpPGKに挿入して構築)を、Saccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換し(ゲノムカバー率50倍以上)、41°Cで培養した。尚、この温度ではDMB1株は生育できるが、BY4742株は生育が著しく低下することを確認した。その結果、生育が良好な高温耐性酵母として5コロニー取得し、この中の1株からプラスミド(pPGK-KmClone1と命名)を単離し、再度BY4742株へ形質転換した株が、41°Cにおいて、ゲノム断片を含まない対照株よりも優れた増殖を示すことを確認した。シークエンス解析によりpPGK-KmClone1に挿入されたゲノムDNAの塩基配列を決定した結果、2種類のコーディング領域と推定される塩基配列が含まれていることを確認した。これらの推定遺伝子のアミノ酸配列を基に他の出芽酵母種とのホモロジー検索を実施したところ、一方はS. cerevisiae由来のタンパク質と60%の高い相同性を示したが、もう一方は30%以上の相同性を示すタンパク質は検出されなかった。pPGK-KmClone1上に含まれる2種類の遺伝子のうち、どちらの遺伝子が高温耐性の機能に寄与するかを検討するために、それぞれの遺伝子のクローニングを行い、BY4742株に形質転換した。高温耐性能を調べた結果、相同性の低いタンパク質をコードする遺伝子が高温耐性に寄与していることが判明した。高温耐性遺伝子発現株は対照株と比べて、41°Cにおいて、最大OD差が2.2倍増加し、良好に増殖することを確認した。当該年度の研究計画であるDMB1株から高温耐性遺伝子の単離において、DMB1株のゲノムDNAライブラリーをS. cerevisiaeの実験株に導入し、DMB1株が生育可能かつS. cerevisiaeが生育できない高温域(41°C)で生育可能な高温耐性株を単離し、高温耐性に寄与するDMB1株由来の遺伝子を同定した。当該年度の研究計画である高温感受性DMB1株の取得については、紫外線照射や薬剤処理によりDMB1株に突然変異を誘導して高温感受性変異体を単離することを複数回試みたが、現在までのところ高温感受性変異体は単離できていない。そのため、今回の手法で高温感受性変異体を単離するのは困難との結論に至った。

当該年度では、昨年度にゲノムDNAライブラリーのスクリーニングにより単離したKluyveromyces marxianus DMB1株由来の高温耐性遺伝子について、Saccharomyces cerevisiae BY4742株に形質転換することにより、高温耐性(DMB1では生育可能でBY4742株では生育が著しく低下する41°Cの高温条件下において良好な生育を示す)のみならず、酵母の増殖に悪影響を与える各種薬剤に対しても耐性を示すことを確認した。すなわち、高温耐性遺伝子を形質転換したSaccharomyces cerevisiae株は、1.5mM過酸化水素、0.3%酢酸、0.1%塩酸、2M塩化ナトリウム、15mMフルフラール、及び8%エタノールを含む各寒天培地において、高温耐性遺伝子発現株は対照株と比較して良好な生育を示した。また、41°Cで嫌気的に培養することにより、高温耐性遺伝子発現株は対照株と比べてグルコースを1.6倍多く消費し、エタノールを1.7倍多く生産した。このように、Saccharomyces cerevisiaeにおいてKluyveromyces marxianus DMB1株由来の高温耐性遺伝子を発現させることで、高温条件下でのエタノール発酵性を向上させることが可能であることが明らかとなった。さらに、メタボローム解析を実施し、キシロース発酵時にDMB1株の代謝物がどのように変動するのか調べた。その結果、他の出芽酵母株と比較して、ペントースリン酸経路における複数の代謝物が増加した一方、細胞内のアミノ酸やピルビン酸が著しく減少することが判明し、DMB1株のキシロース発酵時の律速段階を特定することに成功した。昨年度に単離したDMB1株由来の高温耐性遺伝子について、当該年度でさらに解析を進めた結果、高温耐性のみならず過酸化水素、酢酸、塩酸、塩化ナトリウム、フルフラール、エタノールにも耐性を示すという予期しない結果を得たため、こちらの研究計画に少し多めの時間を費やした。一方で、当該年度の研究計画であるDMB1株のメタボローム解析やキシロース代謝系酵素の耐熱化なども並行して進めており、本研究課題はおおむね順調に進展している。今後は、DMB1株の耐熱性分子機構を解明するために、引き続きDMB1株由来の高温耐性遺伝子の機能解析を行う。また、S. cerevisiaeの知見を応用したDMB1由来遺伝子の発現解析も実施し、酵母間で耐熱性の仕組みが保存されているか否かを検証する。DMB1株に導入するキシロース代謝系酵素群の耐熱化の課題においては、キシロース代謝系酵素変異体の作製に着手し、耐熱性が向上した変異体(改変型酵素)の作製を試みる。得られた改変型酵素については、DMB1株に導入し、高温下での発酵性を評価する。さらに、グルコース抑制解除変異体やキシロースの取り込みが強化される遺伝子のスクリーニング等も試み、DMB1株のキシロース代謝制御機構の解析を進める。今後は、耐熱化したキシロース代謝系酵素をDMB1株に導入し、キシロースや糖化液を基質とした高温下での発酵性を評価する。また、DMB1株を対象としてグルコース抑制解除変異体の探索や、DMB1株のゲノムDNAライブラリーの中から、キシロースを含む培地で増殖を早める輸送体遺伝子のスクリーニングを試みる。これらの結果から、高温条件下でも効率良くキシロースをエタノールに変換できる次世代型の耐熱性酵母を開発し、並行複発酵の最適なツールとしての展開を目指す。
多発性筋炎における筋傷害機序の解析－新たな細胞傷害メカニズム－

in vitroにおける細胞傷害性T細胞(CTL)の筋傷害モデルを作成した。具体的には、C2C12細胞にOVAペプチドを遺伝子導入し、OVAを認識するトランスジェニックマウス(OT-Iマウス)由来のCTLと共培養することで筋傷害の再現を行った。プラスミドベクターを用いる予定であったが、効率的な遺伝子導入が困難であった。そこで、ウイルスベクターを作成して遺伝子導入を行い、OVA発現C2C12細胞の樹立に成功した。この細胞は、野生型と同様に筋線維に分化可能であった。これを用いてOT-I由来CTLとの共培養を行うも細胞死の誘導は認められず、今後はCTLをより活性化させて再実験を行うこととしている。in vitroにおける細胞傷害性T細胞と筋線維細胞の共培養実験に用いる細胞株の作成を主に行った。具体的には、卵白アルブミン由来ペプチド(SIINFEKL, OVAp)とC57BL/6マウス由来のMHC class I分子(H2-Kb)を結合したペプチド配列を発現させるためのプラスミドベクターを作成した。当初はFugeneHD試薬を用いた遺伝子導入を試みたが、遺伝子導入率が極めて低かったことからプラスミドベクター内のH2Kb-OVAp配列をウイルスベクターに移し替え、ウイルスベクター作成して遺伝子導入に用いることとした。H2Kb-OVApの移し替えに際しては、プラスミドベクターをテンプレートとし、N末端・C末端に各々制限酵素認識部位を付加したペプチドをPCRによって作成、このDNAに制限酵素処理を行い、レトロ・ウイルスベクターにライゲーションした。このウイルスベクターをパッケージング細胞に遺伝子導入したのちにその培養上清を回収し、この上清をC2C12細胞の培地に加えることで感染を行った。ウイルス感染後のC2C12細胞を2.5ng/mlのpuromycinでselectionした後に、これをH2Kb-OVAp発現C2C12細胞として保存した。作成したOVAペプチド発現C2C12細胞株について、anti-H2KbOVAp抗体を用いたFACSおよび免疫染色によりOVApの発現確認を行った。さらに、C2C12細胞を40%FBS含有DMEM培地において培養したところ通常の筋芽細胞と同様に筋線維に分化可能であり、分化後にも導入したOVAペプチドの発現は保たれていた。また、in vitroにおけるC2C12細胞とOT-I由来細胞傷害性T細胞の共培養実験で用いる遺伝子改変動物(OT-Iマウス)を入手した。当初は繁殖に難渋したが、雌雄の組み合わせを複数試みることで繁殖に成功した。細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が筋線維へ直接的に浸潤し、筋傷害を来しうるか否かをin vitroで再現する系の確立を行った。この系では、筋細胞と、それを特異的に認識しうるCTLをin vitroで共培養することにより、その細胞傷害を可視的に評価する。また、その際の細胞死のパターンや必要な因子について、筋細胞側およびCTL側の双方から解析を行う。具体的には、マウスの筋線維芽細胞株であるC2C12細胞を用い、これにOVAペプチドおよびOT-Iマウス(C57BL/6由来)のMHC classI分子(H2-Kb)をレトロ・ウイルスベクターを用いて遺伝子導入し、OVA発現C2C12細胞株の樹立を行った。この細胞株は従来のC2C12細胞と同様の条件で筋線維に分化させることが可能であり、また分化後にもOVAペプチドの発現は保たれていた。また、細胞を傷害するCTL側の準備として、OVAを認識するT細胞受容体のトランスジェニックマウスであるOT-Iマウスを入手し、交配を行っている。細胞傷害性T細胞(CTL)が筋組織を傷害するメカニズムを解析する目的にて、in vitroにおけるCTLの筋傷害モデルの作成を行った。具体的には、C2C12細胞株にOVApを遺伝子導入して、transfectantを筋線維に分化誘導し、この筋線維にOVApを認識するT細胞受容体トランスジェニックマウス(OT-Iマウス)由来のCTLを共培養することでCTLによる筋傷害の再現を行った。当初の計画ではpCAGプラスミドにOVAp配列を導入したプラスミドベクターを用いた遺伝子導入を計画していたが、FugeneHD試薬などを用いた複数の遺伝子導入プロトコルを用いるも効率的な遺伝子導入が行えなかった。そこで、OVAp配列をウイルスベクターに入れ替え、ウイルス液を作成して遺伝子導入を行った。その結果、OVAp導入C2C12細胞の樹立に成功した。このC2C12細胞は、Wild typeのC2C12細胞と同様に分化誘導培地で培養することで筋線維に分化が可能であった。次に、このOVAp発現C2C12細胞とOT-Iマウス由来のCTLとの共培養を行った。

しかしながら、WTのC2C12細胞を用いた場合や、WTマウス由来CTLを用いた場合との比較においてOVAp発現C2C12細胞とOT-Iマウス由来CTL共培養にて筋線維の細胞死誘導は認められず、OVAp依存的な細胞傷害は観察されなかった。この一因として、OT-I由来CTLが無刺激では十分な細胞傷害活性を有していない可能性が考えられる。そのため、今後はCTLを抗CD28抗体やIL-2、IL-12等のサイトカインで刺激した上で共培養に用いることを計画している。また、CTL活性のpositive controlとして、OVApでパルス刺激を行ったEL-4細胞などをターゲットとして、CTLとの共培養で培養上清中のIFN-γ上昇を観察する予定である。膠原病内科学本研究に用いる遺伝子改変動物(OT-Iマウス)について、他研究室からの譲渡を受けるに際して感染症スクリーニング検査が必要となり時間を要した。さらに本学の動物実験施設改修工事に伴う利用可能飼養施設の縮小が重なり、遺伝子改変動物の入手・繁殖が困難であった。本研究には上記遺伝子改変動物由来の細胞傷害性T細胞の使用が不可欠であることから、研究の遂行が困難な状況であった。C2C12細胞への遺伝子導入について、当初は、非リポソームタイプのトランスフェクション試薬(Fugene HD)を用いて行ったが効率的な遺伝子導入が出来なかった。そこで、レトロ・ウイルスベクターを再構築し、遺伝子導入に成功した。当初の予定を繰り下げ、平成25年度中に行う予定であった解析を平成26年度に行う。具体的には、OT-Iマウス由来の脾臓リンパ球とOVAペプチド発現筋芽細胞(C2C12細胞)の共培養実験を中心的に行う。樹立されたOVA発現C2C12細胞と、OT-I由来CTLの共培養によりCTLによる抗原特異的筋傷害をin vitroで再現する。また、OT-IマウスとGFP発現マウスを交配することでOT-I/GFPマウスを作製し、そのCTLを用いて蛍光観察を行う。これにより、CTLが一つの筋線維を障害する際の細胞の動きを継時的に観察することが可能となり、CTLの標的細胞内浸潤メカニズムの存在を明らかとする。さらに、標的細胞内に浸潤したCTLが、実際に標的細胞に細胞死を誘導しうるか否かの検証のため、アポトーシス・ネクローシスの解析を継時的に行う。Annexin V、PI(propidium iodide)は、それぞれ初期アポトーシスおよびネクローシスのマーカーとして知られており、これらを観察することでCTLが細胞内に浸潤したC2C12細胞の細胞死を観察する。Annexin V、PIは、いずれも細胞を固定することなく生きた状態で観察可能であることが報告されており、これを用いることにより細胞死の誘導を継時的に観察することができる。本研究に用いる遺伝子改変動物(OT-Iマウス)について、入手に時間を要し実験の遂行が困難であったため。具体的には、主にOT-Iマウス由来の脾臓リンパ球とOVAペプチド発現筋芽細胞の共
希ガス同位体分析等を用いた微小宇宙物質の惑星科学的研究

本年度の研究成果は以下である。(1)南極とっつき岬で採取された宇宙塵のうち、直径100ミクロン程度の、溶融して球状になった宇宙塵(スフェルール)に対してレーザー加熱法を用いて希ガス同位体分析をおこなった。その結果、31個のスフェルールのうち9つの試料で地球外起源の希ガスが保持されていることが判明し、これまで地球外起源物質である証拠が得られていなかった小さなスフェルールに関して地球外起源である明確な証拠を得た。また、アルゴンの同位体組成において、40Ar/36Ar比が地球大気よりも高いものが2つ発見された。40Ar/36Ar比は非溶融宇宙塵では例外なく全て地球大気の値よりも低いため、スフェルールの中には非溶融宇宙塵とは異なった起源を持つものが存在していることが判明した。(2)様々な種類の炭素室コンドライトに対して赤外吸収スペクトルを測定した結果、炭素室コンドライトの種類によって水に起因する3400cm-1前後のスペクトルの形に差が存在することがわかり、スペクトルの形態から阻石種を簡便に分類可能であることが分かった。また、様々な粘土鉱物に対しても同様の実験を行い、CIコンドライト特有の3685cm-1のピークが蛇紋石由来であることがわかった。またCM、CRコンドライトにおいてこのピークが見られないことは結晶化度の低さに起因していることが予想された。(3)ガスリッチなポリミクト角礫岩に対しての希ガスの段階加熱実験を行ったところ、宇宙塵や月阻石にみられるような比較的最近の太陽風希ガス成分とは明らかに異なった組成を持っていることが判明し、これは太陽が核融合を開始した直後の時期の太陽風の組成が現在と大きくことなっていた事実を反映しているものと思われた。
象牙質う蝕の進行性を促進する口腔細菌種構成の解明

32名の被検者からう蝕象牙質を採取し、分子生物学的手法を用いて、う蝕象牙質に存在する細菌叢の網羅的解析を試みた。う蝕象牙質サンプルの細菌構成のクラスター解析を行った結果、Lactobacillusの比率の違いにより大きく3グループ(I、II、III)に分類された。グループIはLactobacillus属が全体の70%を占めるシンプルな細菌構成であった。グループIIIは最も多く存在する菌属がPropionibacterium属やOlsenella属という今までに報告のない日本人特有の細菌構成であり、両菌属の主要な菌種はP. acidifaciensとO. profusaであった。今年度はまず本研究により新たに成人のう蝕象牙質中に高い比率で認められたPropionibacterium属とOlsenella属、さらに、象牙質う蝕では注目されてこなかったStreptococcus属に焦点をあてた。バーコードパイロシーケンス法にて、これらの菌属がそれぞれ10%以上を占める16個のう蝕象牙質サンプルについて、クローンライブラリー法を実施し、サンプル中に存在する菌種の同定を試みた。1サンプル8596クローンの16S rRNA内の約700 bpのシーケンスを解析した結果、Propionibacterium属は9サンプルより283クローンが検出され,その中の280クローンがP. acidifaciensで、9サンプルすべてに認められた。残りの3クローンのP. propionicumは1つのサンプルより検出された。Olsenella属は9サンプルより201クローンが検出され,その中の200クローンがO. profusaであり、P. acidifaciensと同様に9サンプルすべてに認められた。Streptococcus属は7サンプルより123クローンが検出され、S. mutansが5サンプルより107クローン、S. oralisが1クローン、S. salivariusが1サンプルより2クローン、S. sanguinisが2サンプルより9クローン、S. vestibularisが1サンプルより4クローン認められた。また、Lactobacillus属についても調べた結果、検出された126クローンの中で、L. paracaseiが50クローンで最も多かった。続いてL. gasseriとL. salivariusが19クローンであった。以上の結果より、P. propionicumとO.profusaが主に成人の象牙質う蝕に関与していることが示唆された。また、Streptococcus属ではS. mutansが高比率で存在することがわかった。今年度はまず、九州大学病院歯科部門歯内治療科および共同研究施設において同意を得られた被験者(平均年齢は25.4歳(4歳から76歳)、男性17名、女性15名の合計32名)の32歯(乳歯10本、永久歯22本)からう蝕象牙質44サンプルを採取した。同時に、縁上プラークおよび唾液の採取も行った。う蝕象牙質44サンプルについて16S rRNAアンプリコンパイロシーケンス解析を行い、う蝕象牙質中の細菌叢を調べた結果、同じ被験者から得られたう蝕象牙質の細菌構成は類似していることがわかった。そこで、32サンプルについて解析したところ、真正細菌の9種類の門(Firmicutes、Actinobacteriaなど)、71種類の細菌属(Lactobacillus、Propionibacteriumなど)が検出された。細菌構成の類似性で分類すると、大きく3つのクラスターに分類された。クラスターIはLactobacillus属が大半を占めるグループである。クラスターIIはLactobacillus属が半分程度存在するグループであり、残りの半分に数種類の細菌属が少しずつ存在するタイプと残りの半分のほとんどがPropionibacterium属とOlsenella属で占められるタイプとに分けられる。クラスターIIIはLactobacillus属が優勢でないグループで、Olsenella属が優勢なタイプ、Prevotella属が優勢なタイプ、Actinomyces属が優勢なタイプに分けられる。年齢に着目すると、クラスターIは15歳未満が多く、クラスターIIIのActinomyces属が優勢なタイプは30歳以上が多いことがわかった。性別やう蝕の深さと細菌叢には関連は認められなかった。この一年間で32名の被験者からサンプルを採取し、う蝕象牙質中の細菌叢の解析を細菌種レベルまで終了し、類似性によりクラスター解析した結果、3つのクラスターに分けられることが明らかとなった。よって、当研究はおおむね順調に進展していると思われる。まず、昨年度に実施された細菌叢のクラスター解析の結果を踏まえて、各クラスターから典型的なパターンを示すう蝕象牙質試料を10個程度ずつ選び、クローンライブラリー法を用いて、各クラスターに優勢に存在する細菌種を特定する。

次に、象牙質う蝕のなかで優勢な菌として同定された細菌種の酸産生能、耐酸性能やコラーゲナーゼ活性などを測定し、象牙質分解能を評価する。さらに、同定された細菌種と同一細菌叢に属する他の細菌種との相互作用を調べる。以上の結果より、象牙質う蝕の進行を活性化している細菌種を同定する。さらに、被験者の縁上プラークや唾液について、T-RFLP法を用いて細菌叢を解析する。同一被験者において、う蝕象牙質、縁上プラークおよび唾液の細菌属構成を比較し、その類似性ならびに相違性を調べる。平成24年度に行った16S rRNAアンプリコンパイロシーケンス解析が当初予定していた予算より低く抑えられたため、次年度に持ち越した。平成25年度は持ち越した助成金を考慮し、クローンライブラリー法を行うサンプルの数を調整する予定である。
複素粘度解析によるマイクロバブル流体の不可説明要因の一掃

マイクロバブル混合液体の層流域から乱流域までのレオロジー特性を実験的に研究したものである.層流域では,非定常なせん断応力場において気泡形状と応力の関係に非平衡性が表れる場合,平衡を仮定した実効粘度よりも10倍以上大きな運動量伝達特性をもつことがわかった.遷移域では周波数の変調による乱流への初期遷移が抑制されることがわかった.また乱流域では乱流渦干渉による乱流エネルギー低下,気泡クラスタリングによる新しい境界層構造の出現や伝熱促進が観測された.マイクロバブル混合液体の層流域から乱流域までのレオロジー特性を実験的に研究したものである.層流域では,非定常なせん断応力場において気泡形状と応力の関係に非平衡性が表れる場合,平衡を仮定した実効粘度よりも10倍以上大きな運動量伝達特性をもつことがわかった.遷移域では周波数の変調による乱流への初期遷移が抑制されることがわかった.また乱流域では乱流渦干渉による乱流エネルギー低下,気泡クラスタリングによる新しい境界層構造の出現や伝熱促進が観測された.代表者の村井は,落球レオメトリによるデータから気泡流の複素粘度をモデリングした.これはキャピラリ数とその時間変化率をパラメータとするモデルであり,実験と同じスピン流れと管内振動流での周波数応答をシミュレートする数値解析法を開発し,周波数選択現象の再現に成功した.分担者の武田は,超音波ドップラー流速計(UVP)をレオメータとして利用する新しい原理を設計・製作し,スピン流れに対してその性能試験を行った.この結果,粘弾性流体の非線形せん断領域を含めてシングルランの試験で4つのレオロジー物性を同時計測することに成功した.分担者の田坂は,テイラークエット流れ場に電気分解発生したマイクロバブルを注入し,流れの時空間構造をUVP計測した.これにより僅かな体積率でも波動テイラー渦の周方向波動速度が大幅に低下すること,ならびに変調波動モードが消失し,初期乱流遷移を抑制する効果を確認した.分担者の北川は,水の電気分解により発生したマイクロバブルを鉛直加熱平板に沿う自然対流場に注入し,画像処理による気泡径計測と熱電対による多点同時温度計測を行った.その結果,マイクロバブルの注入により,熱伝達率および熱伝達ゲインが大幅に増加することを明らかにした.分担者の石川は,気泡を含む上昇噴流において,粒子画像流速測定法(PIV)を用いて,気泡周囲の液相流速分布を計測した.その得られた時系列の変動速度を用いて,固有直交分解法(POD)により,時間的・空間的な流動構造に分解し,周波数およびモードを選択することで,大規模な渦構造を確認した.代表者の村井は,周期的せん断応力場でキャピラリ数が1を跨ぐ振動応力を与えたときの運動量拡散係数から実効粘度を計測し,従来の平衡変形理論および実験に比べてボイド率に対する粘度変動感度が10倍以上であることを明らかにした.またマイクロバブルを含む液体を低レイノルズ数向けのギアポンプに適用した結果,遷移域付近における乱流強度の低下が確認され,流体機械内におけるマイクロバブル複素粘度の機能的応用例を初めて提示することができた.分担者の田坂は,回転二重円筒内の波動テイラー渦領域におけるマイクロバブルの時空間的な数密度の疎密波の形成とそれに伴う変調波動テイラー渦への遷移の抑制を明らかにした.また疑似二次元水槽内でのマイクロバブルプルームの成長過程の可視化計測を行い,マイクロバブル対流がもつ自己組織化機能の実験的確認に成功した.分担者の北川は,水の電気分解により発生したマイクロバブルを鉛直加熱平板に沿う自然対流場に注入し,熱電対を用いた多点同時温度計測と画像処理を用いた気泡径および気泡層厚さ計測を行った.その結果,気泡注入時の熱伝達率の増減と気泡層厚さの変動との関連性を示した.分担者の石川は,気泡を含む上昇噴流において,粒子画像流速測定法(PIV)を用いて,気泡周囲の液相流速分布を計測した.その周囲流体の時系列の流速分布を固有直交分解(POD)法により,モードごとの時間的・空間的な流動構造に分解し,大小の渦を含む流動構造の時空間特性を調査した.以上の結果,マイクロバブルが混入した液体の渦運動への影響,組成対流の構造,ならびに熱対流とそれらの複合的なメカニズムが究明された.代表者の村井と分担者の田坂は,マイクロバブル混合流体のせん断応答について,層流域のレオロジー問題から乱流域の非定常応答特性まで幅広く実験的研究を行った.本課題では気泡変形の周囲応力場に対する非平衡変形特性がもたらす周波数応答特性すなわち複素粘度特性について焦点を当てた.計測対象は,円筒内の非定常スピン流,振動平板によるレーリー流れ,水平乱流チャネル流,二重円筒間クエット流,および円柱カルマン渦列流,ギアポンプ内部流である.これら一連の条件で共通して得られた知見は,液体中にマイクロバブルを混入すると,乱流カスケードの初期段階の変調モード成長を抑制する効果があることである.つまり,流線上のラグランジュ観測系でせん断歪みに非定常性をもつとき,マイクロバブルがその成長を妨げる.また,マイクロバブルの局所的濃度集積は負の拡散係数をもつ分散性二相流の特徴をつくりだし,プルームの自己組織化を伴う逆カスケード成長などが観測された.北川は,マイクロバブルインジェクションによる鉛直加熱平板上の自然対流熱伝達の促進メカニズムを解明することを目的とし,熱電対を用いた温度計測と,画像処理による気泡径・気泡速度・気泡層厚さ計測を行った.

その結果,気泡注入時の熱伝達率が,気泡径および気泡流量に強く依存し,また,その変化が,高速度で上昇する気泡群による強制対流効果と気泡層厚さの変動に伴う混合効果に密接に関係することを明らかにした.石川は,気泡を含む上昇噴流において,上昇噴流の流動様式の分類を示すとともに,あるボイド率条件において,粒子画像流速測定法(PIV)を用いて,気泡周囲の液相流速分布の同時計測した.さらにその応用として,気泡を含む上昇噴流の周囲流体の時系列の流速分布を固有直交分解(POD)法により,モードごとの時間的・空間的な流動構造に分解し,大小の渦を含む流動構造の空間特性および時間的特徴を調査した.
最小酸素ナノバブルを利用した副作用を伴わない放射線増感効果の誘導を目指して

がん治療において放射線治療は食道扁平上皮癌の根治も目指すことが可能な重要な治療ツールであることは間違いない。これまで放射線治療抵抗性を克服するべく、そのメカニズム解明が進められてきたが、腫瘍が増大し組織内に低酸素領域を持つ腫瘍はHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit (HIF-1α)タンパクが蓄積することで放射線抵抗性が誘導されることが明らかとなってきた。この低酸素誘導性HIF-1α蓄積を標的とした放射線抵抗性克服の様々な試みがなされているが実臨床への展開はなされていない。本研究では組織内の酸素化改善により低酸素誘導性HIF-1α蓄積を阻害するためにナノバブルという1μm以下の小型の泡に着目した。申請書にも記載したようにすでに酸素ナノバブル水については開発、報告済みであり本研究では食道癌細胞株に対する酸素ナノバブルの効果を検証している。その結果、食道癌細胞株TE8において放射線治療抵抗性に関与することが報告されているHIF-1α発現が酸素ナノバブル処理により有意に抑制されることを明らかにした。また、TE8細胞株に酸素ナノバブル水を投与して次世代シークエンスによる発現プロファイルの変動も検証したが、有意なシグナルを現時点では検出することができておらず現在、さらなる条件検討、再実験を予定している。今後は別の細胞株であるKYSE70において再現性を検証するとともに、細胞実験レベルで放射線増感効果を酸素ナノバブルが示すのか?動物実験モデルでの放射線増感効果の検証を行う計画である。本研究の最終的な目標は食道癌細胞株2種類を用いて酸素ナノバブル水によるHIF1α抑制効果、放射線増感効果を細胞実験、動物実験で検証することである。これまでの検討で食道癌細胞株1種類(TE8)細胞において酸素ナノバブルがHIF1αを抑制することが検証できており、重要な基礎データを得ることができたと考えている。また予備実験レベルだが放射線増感効果を示すことも検証できており実験は概ね順調に進展していると考えている。前述のごとく、本研究では食道癌細胞株2種類で酸素ナノバブルの薬効を細胞レベル、動物実験モデルで検証する計画である。今年度は細胞実験レベルの放射線増感効果の検証と次世代シークエンサーを用いたナノバブル関連遺伝子発現プロファイルを2種類の食道癌細胞株で明らかにしたい。さらに動物実験での放射線照射システムの調整、準備も今年度中に進める計画である。
イオンマイグレーションによる金属デンドライト創製の応用基盤の構築

平成30年度は、イオンマイグレーション(IM)を活用して創製する金属(酸化物)微細構造の応用展開基盤の構築を実施し、以下の研究実績を得た。1.金属(酸化物)微細構造からなる透明導電膜作製のための分散液作製昨年度にはIMによりポリエチレンテレフタレート基板上に金属微細構造を直接創製することで透明導電膜の試作に成功していたが、多分野への応用を容易にするためIMにより析出した金属微細構造からなる分散液の作製に着手し、これを達成した。界面活性剤と超音波を駆使した分散液作製技術と分散液を基板上にスピンコートする塗布技術を確立することで、金属微細構造を均一に塗布した透明導電膜の作製に成功した。2.金属(酸化物)微細構造からなる透明導電膜の信頼性および特性評価実現した透明導電膜について、光透過率と表面抵抗の計測を実施した。異なる分散液作製条件と塗布条件において透明導電膜の光透過率と表面抵抗の相関関係を実験的に示し、IMを用いた金属微細構造分散液による透明導電膜の有効性を示した。3.創製の影響因子解明と応用検討前年度で方向付けに成功したIMにおける創製と構造の相関関係解明において、力学的作用に着目した塑性ひずみのIM微細構造創製量に及ぼす影響を実験的に調査した。陽極に与える塑性ひずみの増大が、陰極への微細構造析出量を増大させることを実験的に示し、力学的作用による微細構造析出量および析出形態の制御可能性を提案した。また異なる試みとして、眼鏡レンズを用いた曲面におけるIMに他に先駆けて挑戦し、金属微細構造の創製に成功した。さらに微細構造の応用検討として、前年度に創製した微細構造をもつハイブリッドCu-Cu2Oを用いて、リチウムイオン電池(LIB)用負極としてのサイクル特性を実験的に調査し、微細構造の導入が良好なサイクル特性を実現する知見を得た。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成29年度は、イオンマイグレーション(IM)を活用して創製する金属(酸化物)微細構造を用いた応用基盤構築を軸として、様々な基板上における金属(酸化物)微細構造創製に関する研究を遂行し、以下の研究実績を得た。1.透明基板上における金属微細構造の創製IMを活用し、印加電圧および電極周辺の界面の状態を変化させることで、ワイヤ・粒子積層構造、粒子薄膜構造、島状構造なる3つの異なるAg微細構造の大規模創製を透明基板であるポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム上に実現した。また創製したAg微細構造を用いた銀粒子の創製を実現した。2. Cu箔表面における金属(酸化物)微細構造の創製異種金属電極間におけるIMに他に先駆けて挑戦し、金属(酸化物)微細構造の創製を成功させた。具体的にはアクリル絶縁セルにCu箔とSn箔をそれぞれ陰極と陽極として設置し、一定の間隔に保持した実験系を構築した。これを用いて脱イオン水をセルに滴下し、直流電圧を印加し、IMを誘起させ、陰極であるCu箔表面にSn系微細構造を創製した。3.創製ー構造の相関関係の解明IMによる金属(酸化物)微細構造の創製に及ぼす影響因子を解明した。異種金属電極(Cu/Sn)によるSn系微細構造の創製において、印加電圧の変化によって創製したSn系微細構造は星状のナノ粒子からスポンジ状の構造体に遷移することがわかった。またセル温度の上昇により創製された粒子のサイズが増大するが、一定の温度で飽和することがわかった。同種金属電極(Cu/Cu)によるCu系微細構造の創製において、温度の上昇により創製した構造体は海綿状から笹の葉型に遷移することがわかった。また純水の代わりに塩酸を電解液として用いた場合に、ナノデンドライトの創製が実現できた。その他、陰極電極周辺の界面が析出形態に及ぼす影響を調査した。研究実績の概要に記載の通り、申請時に計画した研究を遂行し、IMを活用した金属(酸化物)微細構造の創製を実現し、印加電圧・印加時間といった影響因子の調査を通じて、創製と構造の相関関係解明への方向付けに成功した。また透明基板上へのAg微細構造の大規模創製の試みとCu箔表面における微細構造創製を実施することで、金属(酸化物)微細構造の応用基盤構築に着手し、順調に実績を得ている。

異なる分散液作製条件と塗布条件において透明導電膜の光透過率と表面抵抗の相関関係を実験的に示し、IMを用いた金属微細構造分散液による透明導電膜の有効性を示した。3.創製の影響因子解明と応用検討前年度で方向付けに成功したIMにおける創製と構造の相関関係解明において、力学的作用に着目した塑性ひずみのIM微細構造創製量に及ぼす影響を実験的に調査した。陽極に与える塑性ひずみの増大が、陰極への微細構造析出量を増大させることを実験的に示し、力学的作用による微細構造析出量および析出形態の制御可能性を提案した。また異なる試みとして、眼鏡レンズを用いた曲面におけるIMに他に先駆けて挑戦し、金属微細構造の創製に成功した。さらに微細構造の応用検討として、前年度に創製した微細構造をもつハイブリッドCu-Cu2Oを用いて、リチウムイオン電池(LIB)用負極としてのサイクル特性を実験的に調査し、微細構造の導入が良好なサイクル特性を実現する知見を得た。研究計画調書に記載の通り、研究を推進する。平成30年度は、研究計画の(II)に記載の内容を実施することで、金属(酸化物)微細構造の特性評価と信頼性評価を行う。全光線透過率と表面抵抗の測定により、IMを活用した金属(酸化物)微細構造の透明導電膜への適用可能性を示す。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
下廃水処理プロセス中バクテリオファージの水処理性能との関連の解明と応用

下廃水処理プロセス中のバクテリオファージについて、解析手法を開発し、水処理性能との関連を調べた。溶菌後宿主から放出されるDNAを検出する事で、溶菌された宿主を知ることができる可能性を示した。日々汚泥中の細菌の数%が溶菌されているとの知見が得られた。ファージDNAはそのままでは制限酵素により切断されない事から、宿主とファージの関係の複雑さが伺われた。一方、処理性能との関連についてはなお検討を積み重ねる必要が残った。本年度はバクテリオファージの解析に供するための実験室活性汚泥リアクター(人工下水によるもの、および畜産排水によるもの)の運転を開始し、試料採取の体制を検討した。また、バクテリオファージおよびその宿主について解析するために、以下のような検討を行った。まず、モデルファージとしてλファージのDNAをDNA Polymeraseを用いて増幅する検討を行った。良好に増加させることができたものの、DNAを添加しない対照系においてもDNA増幅産物が生成してしまった。産物が生成されるまでの時間はDNAを添加した場合と対照系では異なっていた。今後、反応時間について検討を進め、ファージDNAの所要量と適切な反応時間の関係を求める。また、バクテリオファージによって溶菌された宿主細菌由来の核酸が下水処理過程で上澄水中に放出されてくる可能性がある。そこで、実験室にて運転する活性汚泥リアクターからの処理水を0.2μm孔径のろ紙でろ過し、その中のDNAおよびRNAをPCR法またはRT-PCR法(逆転写PCR法)により増幅できないか検討を行った。試料は生成せず、直接PCR法またはRT-PCR法に供した。DNAについては16SrRNAの部分塩基配列を対象とするプライマーを用いてPCR反応を行なった。35サイクルの増幅により、ごくわずかであるが産物を得ることができた。試料を濃縮することで産物の量を増やすことができないか険討する。一方、RT-PCR法を用いた場合は35サイクルにてその後の解析(クローニング、T-RFLP法等)を行うに十分な量の産物を得ることができた。しかし、処理水中のRNA分子は分解速度がはやいものと考えられ、実際、RNA分解酵素の阻害剤を利用しない場合は産物を得ることができなかった。本年度は活性汚泥処理水中のファージを制限酵素切断断片多型(RFLP)法によって分類する可能性について検討した。ファージDNAに対して制限酵素を作用させたところ、ほとんど切断されなかった。一方、ファージDNAをPhi29 DNA polymeraseを用いて増幅させて得られた産物は、制限酵素によって切断され、RFLPを行うことができた。この結果は、処理水中にあらわれるファージDNAがメチル化等による修飾をうけている事を示すものである。DNAのメチル化とそれによる制限酵素による切断からの保護は、ファージではなく宿主側についてよく知られている。また、それとの対比で、ファージDNAはメチル化修飾をあまりうけておらず、そこで、宿主の制限酵素によって切断されやすいと考えられている。今回の結果はそれとは逆の結果であり、非常に興味深い。従来の知見と異なる結果であり、再試験を繰り返し、得られた結果の再現性をなお確認した上で、公表したい。また、Phi29 DNA polymeraseによる増幅産物のRFLPパターンは、PFGE法による分離結果よりもさらに変化を鋭敏に捉えることができるとの結果も得ることができたが、結果の信頼性について、なお慎重な検討が必要である。また、畜産廃水を処理する活性汚泥から、サルモネラ菌の宿主・ファージ系をいくつか確立することができた。その系を用いて、溶菌に伴って上清中に宿主のDNAが放出されないか検討した。さらに、いくつかの下水処理場・畜産廃水処理設備から活性汚泥上清または処理水を収集する体制を整えた。本年度は、次の調査を行う予定であった。1)実験室活性汚泥プロセスの運転状況とファージの挙動の関連性の解明、2)下水処理水に出現するバクテリオファージのメタゲノム解析および外套タンパク質解析、3)ファージの活動とバルク水中にあらわれる宿主rRNAの関係の確認、の3つである。このうち1)については人工下水を処理する活性汚泥プロセスのリン除去が悪化する際、処理水のリン酸濃度の上昇に先だって、ファージDNAの濃度が高まる時期が見られることがあったが、処理性能にファージが影響を及ぼす事を明確に示すデータは得ることができなかった。また、回分式活性汚泥プロッスにおける上清中のファージDNA濃度の変化を調べたところ、ファージDNA濃度は嫌気条件下ではなく好気条件下に増加する事がわかった。2)については、実下水処理場の処理水から採取した試料中のファージDNAの精製法を確立するところでやや時間がかかってしまった。最終的には収率50%程度で回収する手法を確立することができた。今後、試料を高速シークエンシング法により分析し、その解析を進めていく。

3)については、純菌系(Salmonellaとそのファージ)を用いて検討した結果、溶菌液中には検出可能なrRNAはなく、また、宿主DNAも一時的に見いだされるが、速やかに分解されることがわかった。すなわち、溶菌液中には高いDNaseおよびRNase活性が見いだされた。しかし、一部の宿主DNAが溶菌液中に一定時間でも検出されたことから、溶菌液中あるいは処理水中にあらわれる核酸を調べる事で溶菌した宿主細菌を特定できる可能性が示されたと言える。本研究の成果を総括する。PFGE法やRFLP法といったプロファイリング法やファージDNA全量の定量法を導入又は確立することができたし、また、溶菌された宿主を特定する手がかりも、得ることができた。水処理とバクテリオファージの関係について、本研究にて開発された手法・得られた知見を用いてさらに地道に調査を続ける必要がある。