hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
秋植物のゲノミクスで迫る日本の草地の興亡史―林業復活の優先地域の特定―

経済的価値を失った草地は現在急速に減少しており、草地に依存した生物も大きく減少している。私たちは全国各地の70か所を超える草地を訪問し、代表的な8種類の草本植物(キキョウ、ツリガネニンジン、オミナエシ、ワレモコウ、センブリ、リンドウ、カワラナデシコ、アキノキリンソウ)の葉を収集した。このうち草地性スペシャリスト4種(オミナエシ、センブリ、ワレモコウ、カワラナデシコ)を対象に、各種で全国から10地域の草地のサンプルの遺伝子配列情報を得た。コアレセントシミュレーションを行なったところ、これら解析対象種は過去数万年間にわたり、集団サイズは維持もしくは増加傾向にあることが全国的に示された。初年度である今年度は、現地の植物専門家と連絡を取り、サンプリングを全国的に行なうことができた。全国の70を超える草地から、代表的な8種類の草本植物(キキョウ、ツリガネニンジン、オミナエシ、ワレモコウ、センブリ、リンドウ、カワラナデシコ、アキノキリンソウ)のサンプルを収集することができた。対象とする秋植物が開花する時期に調査地を訪問すれば、最も効率的にサンプリングが行なえると事前調査から考えられた。また、事前調査とこれまでの経験から、北海道は開花・落花時期が最も早く、温暖な南方はこれらの時期が遅いと想定された。そこで、サンプリングは最北の北海道から始め、東北、関東、中部、関西、中国、四国、九州と南下する形で計画を立てた。北海道は7月末から8月上旬に調査を行ない、東北は8月中旬、関東・中部は8月中旬から下旬、関西は8月下旬、中国・四国・九州は9月に調査を行なった。現地では、上記8種を一度に採取できる草地はほぼ存在しなかった。これはこれらの種が必ずしもすべての草地に分布していないことが大きな理由と考えられた。一方で、多くの種を採取できる時期として上記の時期を選択したが、アキノキリンソウ、特にリンドウとセンブリは中でも生長・開花時期が遅く見つけるのが困難だった可能性もある。しかし、集中的なサンプリングとその後の再訪などにより、上記のように一定の成果を挙げることができた。二年目である今年度は、初年度に収集した、阿蘇の遺伝子サンプルの解析を行なった。サンプリングを行なった種から、カワラナデシコ、アキノキリンソウ、オミナエシ、センブリの4種を選び、RAD-seqによりそれぞれ29976466座の一塩基多型(SNP)を得た。このうちホモログの疑いが低く集団内の多くの個体で観察された座が4171021座存在した。このうち120座をランダムに選出し、それぞれの座で作成した系統樹に基づくデモグラフィ推定を行なったところ、最長過去4万年の有効集団サイズの推移を推定することが出来た。この結果、種によって増減の傾向が異なったものの、過去数万年間にわたり、これらの種の個体群が長期間にわたって維持されてきたことが示された。センブリに関しては最近1万年間の減少傾向が示され、アキノキリンソウは逆に明確な増加傾向を示した。現在、花粉分析などの研究の蓄積が豊富で、過去の植生の変遷が明らかになっている曽爾高原のサンプリングの解析を進めている。植物個体群の動態の解析結果と既往の知見を比較し、解析で全国展開する対象種などを決定する予定である。また、現地の植物専門家と連絡を取り、調査対象である8種類の草本植物(キキョウ、ツリガネニンジン、オミナエシ、ワレモコウ、センブリ、リンドウ、カワラナデシコ、アキノキリンソウ)の分布情報を整理した。この情報をもとに、最終年度である来年度の追加サンプリングを行なう予定である。阿蘇の遺伝子サンプルの解析を行ない、過去の個体群動態を複数種で推定することができたため。最終年度である本年度は、これまで行なえなかった場所での調査を行ない、全国的な標本を整理した。そしてカワラナデシコ、オミナエシ、センブリ、アキノキリンソウ、キキョウについて、全国5か所のサイトからのサンプルを解析した。各種で各サイトの15サンプル程度を対象に次世代シーケンス(RAD-seq法)を行ない、塩基配列情報を得た。サンプルを対象にコアレセントシミュレーション(DIYABC法とBEAST法)を行なった。その結果、一集団あたり3-4桁の遺伝子座標を得た。センブリは集団間で現在と過去の動態が大きく異なること、アキノキリンソウはすべてのサイトで最近1万年以内に集団サイズが増加した傾向が示された。それ以外の種では、全国的な傾向は大きく変わらず、過去2万年程度にわたって安定的に集団が維持されてきたことが推測された。次に遺伝子解析を全国展開するため、解析対象種を草地のスペシャリスト4種(オミナエシ、センブリ、ワレモコウ、カワラナデシコ)に絞り、各種で全国から10地域(東北海道、西北海道、北東北、南東北、関東、中部、関西、中国、四国、九州)のサンプルを抽出し、次世代シーケンスを行なった。このデータをもとにコアレセントシミュレーションを行ない、これら解析対象種は過去数万年間にわたり、集団サイズは維持もしくは増加傾向にあることが全国的に示された。今後はこの結果をもとに、地形学や土壌学、人類学的な視点から草地性生物の保全や林業再生の意義について論文を執筆する予定である。

私たちは全国各地の70か所を超える草地を訪問し、代表的な8種類の草本植物(キキョウ、ツリガネニンジン、オミナエシ、ワレモコウ、センブリ、リンドウ、カワラナデシコ、アキノキリンソウ)の葉を収集した。このうち草地性スペシャリスト4種(オミナエシ、センブリ、ワレモコウ、カワラナデシコ)を対象に、各種で全国から10地域の草地のサンプルの遺伝子配列情報を得た。コアレセントシミュレーションを行なったところ、これら解析対象種は過去数万年間にわたり、集団サイズは維持もしくは増加傾向にあることが全国的に示された。初年度に全国的な調査(サンプリング)を行なうことができたため。追加のサンプルの収集を行ない、欠けている種・地域のサンプルを補完する。遺伝子解析を進め、遺伝子解析手法及び解析対象種を特定する。全国的な遺伝子解析を実施し、草地性植物の過去の個体群動態、そしてその地域差の有無を検証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。森林の生物多様性今後は収集したサンプルの遺伝子解析を進め、必要に応じて追加のサンプリングを行なう予定である。DNAの抽出・分析・事後解析に時間がかかり、年度内に支出が間に合わなかったため。DNAの解析が想定以上の時間を要し、予定をすべて実施できなかったため。解析作業は進捗しているため、今年度未使用分も含めて、次年度は計画通りに予算を使用する予定である。実施できなかった解析にかかる経費に使用する。
極端条件下における電荷・軌道相関と相分離のX線散乱による研究

本研究では、遷移金属や希土類を含む化合物においてあらわれる電荷・軌道・磁性の秩序とその発現機構の解明を目的とし、温度の他に磁場や圧力といった極端条件下でX線散乱実験を行い、磁性の変化や原子間距離の変化により誘起された相転移を調べた。具体的な結果は以下の通りである。1.極端条件下でのペロフスカイト型マンガン酸化物の相転移と構造変化についてX線回折法により調べた。Eu_<0.6>Sr_<0.4>MnO_3について磁場誘起絶縁体金属転移に伴う構造変化を調べた結果、相転移に伴うMn-O-Mn結合角の変化は二重交換模型に矛盾しなかった。また、電荷軌道秩序を示す物質について高圧低温下でのX線回折実験を行い、新しい秩序化や秩序の崩壊を示唆する結果を得た。2.混合原子価物質Fe_2BO_4についてシンクロトロン放射光を用いた粉末X線回折実験をおこない、その結果をリートベルト法により解析し、電荷の秩序化に対して構造変化が現れることを示した。3.低次元物質RNiC_2(Rは希土類元素)について電気抵抗率の特異な温度依存性について明らかにした。さらに、低温下でのX線回折実験により、衛星反射が絶縁体・金属転移温度以下で現れることを見いだした。この結果は電荷密度波転移であることを示唆している。4.コヒーレントX線による光子相関分光実験の技術的開発とその評価をおこなった。さらに、秩序無秩序転移をおこす物質についてスペックルパターンを得た。5.低次元性や多極子秩序を示す物質について、SPring-8からの放射光を用いた強磁場中でのX線回折実験を行った。本研究では、ペロフスカイト型マンガン酸化物を中心として、電子格子相互作用を通した電荷・軌道の相関が、特異な物性発現に果たす役割を、X線散乱により詳細に調べることを目的とする。本年度は特に、磁場中や圧力下といった極端条件下における構造変化について研究をおこなった。主な結果は以下のとおりである。1.ペロフスカイト型マンガン酸化物の圧力誘起相転移電荷軌道整列を示す物質について、高圧低温単結晶X線回折実験を行った。その結果、従来から知られていた電荷および軌道の整列のパターンとは異なる新たな電荷軌道の秩序相が、圧力により誘起されることが明らかとなった。さらに、高圧下で電荷軌道が無秩序となる相が誘起されることが分かった。これらの結果のまとめとして、圧力温度相図を作成し、高圧下における相の安定性を明らかにした。2.ペロフスカイト型マンガン酸化物の磁場誘起構造変化磁場の印加により常磁性絶縁体相から強磁性金属相へと転移する物質について、放射光を用いて回折実験を行い、格子定数の磁場依存性や、絶縁体相と金属相の構造の違いを調べた。その結果、金属相への転移は結晶学的な対称性の変化を伴わないが、原子パラメータが格子歪みを緩和するように変化していることがわかった。3.放射光を用いた磁場中X線回折磁場中でのX線回折実験を放射光を用いて行い、FeCl_22H_2OやCeB_6の磁気散乱や超格子の磁場変化を測定し、一次磁気転移の共存や軌道秩序について調べた。本研究では、圧力や磁場といった外場により多彩に変化する物性の発現メカニズムを、X線散乱により結晶構造の立場から微視的に明らかにすることを目的として研究を行った。特に、強相関電子系を中心として、電荷や軌道の自由度がその物性変化に大きく寄与している現象について詳しく調べた。磁場下でのX線回折実験を、ペロフスカイト型マンガン酸化物についておこなった。

磁場により常磁性絶縁体状態が強磁性金属状態に変化する物質について、構造変化を詳細に調べたところ、構造歪みが緩和されていくことが分かった。また、絶縁体状態では電荷秩序が起こっていないことを明らかにし、さらに、絶縁体状態と金属状態の結晶構造をリートベルト法により決定した。電荷秩序を示すペロフスカイト型マンガン酸化物について、圧力下でX線回折実験を行ったところ、圧力をかけることにより新しい秩序状態が誘起されることが分かった。さらに高圧をかけるとこの秩序は崩壊し、無秩序状態に転移することが明らかとなった。これらの結果をまとめて、電荷軌道秩序に関する相図を作成した。また、マンガン酸化物以外の低次元系や軌道秩序を示す系などについて、高輝度および高分解特性を有する放射光を用いて、磁場中でのX線回折実験を行い、その性質を明らかにした。X線散乱実験以外にも、低温や磁場や圧力下といった極端条件下でも電気抵抗率の測定ができるように装置を整備し、電荷密度波状態について系統的に調べた。本研究では、低温や圧力・磁場といった極端条件下で現れる物性を結晶構造の立場から微視的に明らかにすることを目的として、主にX線散乱により研究を行った。特に、遷移金属酸化物や希土類化合物を中心として、電荷や軌道の自由度がその物性変化に大きく寄与している現象について詳しく調べた。主な結果は以下のとおりである。・電荷秩序を示すFe_2BO_4について、電荷秩序による結晶構造の変化に着目して、シンクロトロンを用いたX線粉末回折により構造変化を調べた。その結果、従来考えられてきた電荷整列相転移温度以外の温度でも構造に変化が現れることを示唆する結果を得た。他の報告と比較すると、この変化は電荷の部分秩序化に伴っておこっている可能性がある。・二次元的な結晶構造を持つ希土類と遷移金属からなる物質について、低温や磁場や圧力といった極端条件下においてX線・電気抵抗率・磁化の測定を行い、低温で金属非金属転移が起こること、その原因が電荷密度の変調にあることを示した。・干渉性の良いシンクロトロン放射光を用いた強度ゆらぎ分光実験の実現に向けて研究開発を行った。現在のところスペックルの観測には成功しているが、強度が微弱なため、ペロフスカイト型マンガン酸化物の電荷や軌道の短距離相関のゆらぎの観測には至っていない。・希土類化合物や低次元磁性体について、超伝導マグネットを用いた強磁場中での振る舞いをシンクロトロン放射光を用いたX線回折により調べた。
光遺伝学と組織工学の技術を用いた子宮内膜機能の制御と治療への展開

前年度に行ったin vivo LED照射の条件設定の実験で得られた至適な条件に基づいて,本年度は光応答性CRISPR/CAS9システムによる生殖能のin vivo制御を試みた.着床制御・責任因子として知られているLIFに着目し, LIFに対するguide RNA (gRNA)を作成し,ICRマウス交配確認後,2.5dpcにLIF-gRNAと光CAS9プラスミドを腹腔内投与し,3.5dpcにLEDを24時間照射した.7.5dpcで着床数を検討したところ,コントロールgRNA+LED照射では無処置群と同様の着床数が得られた一方, LIFgRNA+LED照射では着床数が有意に低下した(高尾,他,論文準備中).この光CAS9による生殖能のin vivo制御の成功を受けて,抑制ではなく発現増強を目的とした光応答性CRISPR-dCas9システム(光dCAS9)を立ち上げて, in vitroにおいては目的の遺伝子発現をLED照射により増強させることに成功した.一方,光応答性遺伝子改変子宮(幹)細胞を脱細胞骨格に搭載して子宮に移植することにより,光応答性に子宮全体を制御する治療戦略の実現のために, in vivoでの実験を行ったが,子宮細胞への遺伝子導入効率が低く細胞も十分に増殖しなかった.そこで搭載する候補細胞を無限増殖が可能なiPS細胞として検討した結果, iPS細胞を子宮内膜間質細胞へ分化誘導する方法を共同研究により世界に先駆けて確立した(Miyazaki, et al., 2018).さらに脱細胞子宮骨格の生体マテリアルとしての特性解析を行うなかで,その脱細胞骨格の構造極性が再生される子宮組織の構造に反映されることが判明し,正しいオリエンテーションで脱細胞骨格を用いる必要性が示された(Miki, et al., 2019).平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究「光遺伝学と組織工学の技術を用いた子宮内膜機能の制御と治療への展開」では,1光照射により子宮内膜の特定の細胞における特定の遺伝子の発現を時空間的に制御するシステム,2子宮内膜から細胞を除去して得られた細胞外基質のみを有する足場(脱細胞化子宮内膜骨格, Decellularized Endometrial Scaffold,DES)を細胞・組織の導入・運搬・維持の担体として用いるシステム,の二つのシステムを統合的に開発することを通じて,子宮内膜の構造・機能不全に対する新しい細胞治療の基盤知見および基盤技術を得ることを目的とした.本年度は,1の基盤となる光応答性ゲノム編集システムを確立した研究グループから,そのシステムを構成する各種ベクターを入手するのが遅れたため,主に上記2について,ラット子宮を用いて重点的に行った.【A】内膜のみを全層性に除去・欠損させた群と【B】内膜の子宮腔内面を擦過することで表層のみを欠損させた2群を作成し,それぞれにDESを移植させることにより,欠損部位の構造ならびに機能の再生・修復が起きるかを調べた.その結果,前者【A】については,組織の再生・再構築は一部に留まり,明らかな管腔構造などは呈しなかったものの,後者【B】については管腔・腺管構造やmassとしても組織の再構成・再構築が認められた.【A】の方がより広範囲・重度の内膜欠損を反映しているので,管腔構造の形成をアシストするデバイスも含めたモデル開発を現在行っている.少なくとも【B】は,内膜(部分)欠損および修復モデルとして,本研究の今後の実験のプラットフォームになり得る知見が得られた.本研究の基盤となる光応答性ゲノム編集システムを確立した研究グループから,そのシステムを構成する各種ベクターを入手するのが遅くなったため,本年度予定していたそれらに関連する実験が遅れた.その代わり,平成2930年度に予定していた「脱細胞化骨格を用いた子宮内膜の再生・再建の開発」の実験を行った結果,基盤となるデータが得られつつあるので,全体での進捗状況としては「やや遅れている」とした.今年度は前年度に遅れていた光照射による子宮内膜細胞における時空間的制御システムについて研究を進めた。まずin vitroでの光応答性ゲノム編集が可能なベクター(光応答性CAS9)を293細胞に導入し、青色LED光によりCAS9の発現を免疫染色法により確認した。さらにEpCAM(CD326)プロモーターでluciferase遺伝子が制御されるベクター(EpCAMprom-Luc)や蛍光蛋白質Venusを組み込んだ子宮癌細胞株を作製し、各々のプロモーター領域のgRNAを作成した。光応答性CAS9ベクターとgRNAを共導入し、青色光24時間照射を行った。結果として、青色光により発光・蛍光の減弱が発光バイオイメージング(IVIS)や蛍光免疫染色法により認められた。次にin vivoにおいて光応答性CAS9が機能するかについて検討した。免疫不全マウスに先述のEpCAMprom-Lucを組み込んだ子宮癌細胞株をマトリゲルと共に注入し、皮下腫瘍を形成させた。その腫瘍内または腹腔内に光応答性CAS9ベクターとgRNAを共導入し、青色光を24時間照射した。その結果、光照射により腫瘍内および腹腔内投与群共に発光・蛍光の減弱がIVISで確認できた。さらに子宮は消化管より後腹膜側に位置することから、青色光の到達が子宮に到達し得るかについての検討も行った。免疫不全マウスの子宮下部を強制的に結紮し、子宮内に上記と同様の子宮癌細胞を注入し生着させた。その後、腹腔内に光応答性CAS9ベクターとgRNAを共導入し、青色光24時間照射を行った。

その結果、発光・蛍光の減弱をIVISにより確認することができた。これらのことから少なくともマウスレベルでin vivoの光応答性ゲノム編集システムは機能することが明らかとなり、脱細胞化子宮内膜骨格と統合した研究へ発展させることが可能となった。In vitro及びin vivoにおける光応答性CAS9システムが稼働することは確認できたが、子宮内膜細胞への光応答性CAS9システムの確立までには至ることは出来なかった。この点から全体の進捗として「やや遅れている」とした。前年度に行ったin vivo LED照射の条件設定の実験で得られた至適な条件に基づいて,本年度は光応答性CRISPR/CAS9システムによる生殖能のin vivo制御を試みた.着床制御・責任因子として知られているLIFに着目し, LIFに対するguide RNA (gRNA)を作成し,ICRマウス交配確認後,2.5dpcにLIF-gRNAと光CAS9プラスミドを腹腔内投与し,3.5dpcにLEDを24時間照射した.7.5dpcで着床数を検討したところ,コントロールgRNA+LED照射では無処置群と同様の着床数が得られた一方, LIFgRNA+LED照射では着床数が有意に低下した(高尾,他,論文準備中).この光CAS9による生殖能のin vivo制御の成功を受けて,抑制ではなく発現増強を目的とした光応答性CRISPR-dCas9システム(光dCAS9)を立ち上げて, in vitroにおいては目的の遺伝子発現をLED照射により増強させることに成功した.一方,光応答性遺伝子改変子宮(幹)細胞を脱細胞骨格に搭載して子宮に移植することにより,光応答性に子宮全体を制御する治療戦略の実現のために, in vivoでの実験を行ったが,子宮細胞への遺伝子導入効率が低く細胞も十分に増殖しなかった.そこで搭載する候補細胞を無限増殖が可能なiPS細胞として検討した結果, iPS細胞を子宮内膜間質細胞へ分化誘導する方法を共同研究により世界に先駆けて確立した(Miyazaki, et al., 2018).さらに脱細胞子宮骨格の生体マテリアルとしての特性解析を行うなかで,その脱細胞骨格の構造極性が再生される子宮組織の構造に反映されることが判明し,正しいオリエンテーションで脱細胞骨格を用いる必要性が示された(Miki, et al., 2019).光応答性ゲノム編集システムを構成する各種ベクターを入手することが出来たので,これを用いて,まずin vitroでの細胞,特に内膜関連細胞を用いて,このシステムが予想通り作動するかを確認し,その至適条件を探索し決定する.既に,光源装置および光(LED)照射装置は入手済みなので,スムーズに推進していくことが可能である.また,内膜欠損モデルについては,より重度の内膜全層欠損モデルの開発を行う一方,ほぼ確立出来たと考えられる内膜部分欠損モデルを同時に用いていくことで,実験を停滞させることなく推進していく予定である.安定的に光応答性CAS9システムを搭載した細胞を確立し、光応答性CAS9搭載した細胞または特定の遺伝子導入内膜細胞を利用したゲノム編集システムと脱細胞化子宮内膜骨格を統合させ、任意の時空間で遺伝子発現制御を行えるモデルを構築する予定である。また脱細胞化
大脳皮質・視床間の特異的投射形成における遺伝子再構成産物の関与

大脳皮質視覚野にはカラム構造が存在する。齧歯類において一次視覚野の各カラムは外側膝状体の各層と対応し、トポグラフィーを保っている。近年の研究結果によれば、この外側膝状体と視覚野との関係は、神経活動に依存せず、胎生期より特異的な投射経路を選択して形成されることが示唆されている。この特異的な投射形成には多数の細胞表面分子が関わっている可能性があり、その場合には限られたゲノムから多様な分子を産生できるものでなければならない。研究代表者は、この膜表面分子の候補として、T細胞受容体を想定した。本研究の目的は、大脳皮質・視床間の選択的投射形式におけるT細胞受容体遺伝子産物の関与を検討することである。なお、この内容は冒険的であり、それゆえ萌芽研究として実施した。大脳皮質におけるT細胞受容体の発現の検討昨年の結果はいまだ予備実験のレベルであったため、昨年に引き続き、大脳皮質と視床でのT細胞受容体の発現をin situ hybridization法により再度検討した。T細胞受容体α鎖の定常領域をプロd-ブとして検討した結果、やはり大脳皮質深層に発現が認められた。しかしながら、PCR法では、得られる結果が安定せず、その発現については、明瞭な結果が得られなかった。本研究は、免疫形においてT細胞受容体と結合し、抗原認識に重要な役割を担うmajor histocompatible complex(MHC)が、発達期の大脳皮質視覚野に発現し、回路形成に重要であるとの報告をもとに計画したものであったが、MHCの結合相手の検索も含め、今後の方向を検討している。視覚野はカラム構造をとっており,一次視覚野の各カラムは外側膝状体と一対一の特異的投射を形成している.近年の研究結果より,これらの投射は神経活動に依存せず,胎生期より特異的な投射経路を選択して形成されることが示唆されている.この特異的な投射形成には多数の細胞表面分子が必要と考えられ,限られたゲノムから多様な分子を産生することができるT細胞受容体(TCR)は,この表面分子の候補としてふさわしいと考えられた.本研究の目的は,大脳皮質,視床間の選択的投射形成におけるTCRなどの遺伝子再構成産物の関与を明らかにすることである.大脳におけるTCR発現の検討大脳皮質,視床でのTCRの発現をin situ hybridizationにより検討した.TCRα鎖のconstant regionをprobeとして検討した結果,大脳皮質深層に発現が認められた.さらに,発現しているTCRが遺伝子再構成を終えた分子であるか検討するため,大脳皮質よりmRNAを抽出しRT-PCRにより遺伝子産物の配列を確認することを試みているが,現在までのところ再構成の存在は確認できていない.その原因のひとつとして,再構成を終えていない細胞も混在する混合集団をサンプルとして用いるため,再構成を終えていない段階での転写産物が大量に混入している可能性が考えられる.そこで,今後は神経幹細胞を単離し均一な細胞集団を得た上で,RT-PCRを行い,遺伝子再構成の存在を確認するとともに,ゲノムレベルでの検討も行う予定である.また,これらの遺伝子産物が実際にタンパク質に翻訳され,分子として機能しているかどうかの検討も併せて行う予定である.大脳皮質視覚野にはカラム構造が存在する。
磁化シート・プラズマ-ガス直交系によるフリーラジカル-その生成と定量的測定-

本研究の目標としてはプラズマとガスとの接触により生成するフリーラジカルや荷電粒子の同定と生成の空間分布の特定をプラズマの特性と結びつけながら行うことである。そのため磁化シート・プラズマと酸素及び水素又はそれらの混合を垂直に接触させ、生成したフリーラジカル種の特性(密度分布、寿命等)をレーザ誘起蛍光法により測定し、それらをプローブや四重極質量分析器等により求めたプラズアの基礎特性(電子のエネルギー分布、密度、平均エネルギー、質量分析等)と関連づけて定量的に解明することを目指した。磁化シート・プラズマは、イオンのラ-マ半径がほぼ厚さ程度(y方向)であって、その上イオンガイディングセンターが幅方向(x方向)に揃った高電離・高密度のプラズマである。前述した通り、プラズマとガスを互い垂直に接触させることにより、磁化シート・プラズマの幅方向で生成フル-ラジカルの定量的問題を解決し、厚さ方向では誘起蛍光法によりフリーラジカルの生成領域の特定化と生成過程の空間分布を知る。また最近核融合プラズマの加熱に正イオンに比べ中性粒子の加速に効率的な負イオンが登場し、他方半導体工業でもエッチング等で負イオンの重要性が囁かれている。本研究でも磁化シート・プラズマと酸素ガス又は水素ガスを接触させて生成する各種負イオンの同定と生成領域の特定化を行うため、レーザとプローブ法を組み合わせた光脱離法を本装置内に組み込み、新しい知見を得たので、併せてここに紹介する。このように複雑な過程を極めて単純化したところに本研究の特徴がある。プラズマとガスとの接触現象により生成されるフリーラジカルや荷電粒子の同定と空間分布の特定をプラズマの特性と結びつけて研究を行う。そのため磁化シート・プラズマに酸素及び水素などの反応性ガスを垂直に接触させ,生成したフリーラジカル種の特定をレーザ誘起蛍光法により測定し,それらをプローブや質量分析器などの測定により求めたプラズマの基礎特性と関連づけて定量的に解明することを目的としている。定常な高電離・高密度のシート・プラズマを10^<-4> torr程度の真空領域に軸方向に生成させ,そのプラズマに対し垂直方向からガスを接触させると,プラズマ内で生成したフリーラジカルはプラズマを通過し垂直方向へ,荷電粒子は磁場で拘束されるために軸方向へ移動し,それぞれ分離される。分離されたフリーラジカルや荷電粒子は,以下に述べる方法により解析を行った。生成されたラジカルの密度をレーザ誘起蛍光(LIF)法で,またプラズマの諸特性(電子温度,電子密度,電子のエネルギー分布関数)をLangmuirプローブで測定した。レーザはNd:YAG励起の色素レーザの第2高調波(282nm)を用い,309nm付近のLIF蛍光を分光器を通しマルチチャンネルアナライザ(SMA)で検出した。実験の結果,アルゴン流量を増加させると,ラジカル密度は始め急激に増加し流量が10sccm程度でピーク値3.6x10^<-9>cm^<-3>となり,その後ラジカル密度は減少した。この点については,アルゴンの流量を増加させると,シート・プラズマの電子温度が30eVから数eV程度まで減少することから,ラジカル生成に電子温度が影響するらしいことがわかった。特にラジカルが効率よく生成している条件下では,電子のエネルギー分布の8eV以上の電子が減少しており,酸素の解離過程が主に起こっているものと考えている。本研究の目標としてはプラズマとガスとの接触により生成するフリーラジカルや荷電粒子の同定と生成の空間分布の特定をプラズマの特性と結びつけながら行なうことである。そのため磁化シート・プラズマと酸素及び水素又はそれらの混合を垂直に接触させ、生成したフリーラジカル種の特性(密度分布、寿命等)をレーザ誘起蛍光法により測定し、それらをプローブや四重極質量分析器等により求めたプラズマの基礎特性(電子のエネルギー分布、密度、平均エネルギー、質量分析等)と関連づけて定量的に解明することを目指した。

磁化シート・プラズマではイオンのラ-マ半径がほぼ厚さ程度(y方向)であって、その上イオンガイディングセンターが幅方向(x方向)に揃った高電離・高密度のプラズマを指す。前述した通り、プラズマとガスを互いに垂直に接触させることにより、磁化シート・プラズマの幅方向で生成フリーラジカルの定量的問題を解決し、厚さ方向では誘起蛍光法によりフリーラジカルの生成領域の特定化と生成過程の空間分布を知る。また最近核融合プラズマの加熱に正イオンに比べ中性粒子の加速に効率的な負イオンが登場し、他方半導体工業でもエッチング等で負イオンの重要性が囁かれている。本研究でも磁化シート・プラズマと酸素ガス又は水素ガスを接触させて生成する各種負イオンの同定と生成領域の特定化を行うため、レーザとプローブ法を組み合わせた光脱離法を本装置内に組み込み、新しい知見を得たので、併せてここに紹介する。このように複雑な過程を極めて単純化したところに本研究の特徴がある。
母子境界領域のサイトカインの免疫応答：胎盤特異情報付加再構築組織による検討

母子境界領域における免疫応答を理解するために,様々なマウスモデルを用いて,免疫担当細胞の分化/増殖と胎盤特異因子との相関関係ならびにサイトカインネットワークを解析した。特に,PlGFとVEGFの動態に注目した。調べた腫瘍抑制因子,オートファジー関連因子,流産誘発因子,糖尿病因子,血圧調整因子,肥満因子はPlGFとVEGFの動態に影響を与え,流産あるいは子宮内発育遅延を誘発していることが分かった。本研究の目的は,胎盤における免疫回避機構、特に母子境界領域におけるサイトカインの動態と役割を明らかにすることである。そのため,自然流産および実験流産モデルにおいて,生殖能力,妊娠中の子宮NK細胞/前駆細胞を含む免疫担当細胞の形態・動態,子宮内サイトカインの変化,MHC発現動態,CD46とCD55発現の有無を調べた。これと平行して,着床誘導因子の同定を遺伝子および蛋白質の両レベルで実施した。注目すべきは,MHCクラス1発現の異なる雄雌交配による自然流産モデルにおいて,子宮内サイトカインの大きな変化が認められたことである。本モデルの流産部位(流産率約35%)では,非流産部位と比較して,Th1/Th2比が有意に高かった。各着床部位でのTh1/Th2比におけるTh1シフトが流産の原因であることがよく知られているが,さらに,IGFsも有意に高く,一方,TGF-bは有意に低かった,IGFsもTGF-bも脱落膜細胞から分泌されるが,IGFsは胎盤形成初期に,特に着床に重要とされるが,過剰な発現は着床阻害を誘導する。一方,TGF-bは脱落膜化誘導に必須の因子である。これらは互いに逆の働きをし,IGFsはTGF-b分泌を抑制することから,本モデルでは有意に高いIGFsがTGF-b分泌を抑制した可能性がある。PIGFは有意に低かったが,VEGFは顕著な変化を見せなかった。流産部位では,PIGFの主要産生細胞である栄養膜が既に機能傷害を起こしていることによるが,VEGFは栄養膜だけでなく,脱落膜細胞および血管内皮が分泌することによるものと示唆された。これは,PDGFが流産部位で有意に高かったことからも支持される。すなわち,本モデルにおいて,Th1シフトした着床部位は補体やアデプシンの沈着により,栄養膜機能傷害,さらには脱落膜内血管において血栓が形成され,局所での高血圧状態を招き,胎盤形成不全を起こしたものと思われた。これまでに,MHCクラス1発現の異なる雄雌交配による自然流産モデルにおいて,非流産部位と比較して,Th1/Th2比が有意に高く,さらに,IGFsも有意に高く,一方,TGF-bは有意に低かった,IGFsもTGF-bも脱落膜細胞から分泌されるが,IGFsは胎盤形成初期に,特に着床に重要とされるが,過剰な発現は着床阻害を誘導する。これらは互いに逆の働きをし,IGFsはTGF-b分泌を抑制することから,本モデルでは有意に高いIGFsがTGF-b分泌を抑制したことを示した。PlGFは有意に低かったが,VEGFは顕著な変化を見せなかったことは,流産部位では,PlGFの主要産生細胞である栄養膜が既に機能傷害を起こしていることによるが,VEGFは栄養膜だけでなく,脱落膜細胞および血管内皮が分泌することによるものことを示した。すなわち,本モデルにおいて,Th1シフトした着床部位は補体やアデプシンの沈着により,栄養膜機能傷害,さらには脱落膜内血管において血栓が形成され,局所での高血圧状態を招き,胎盤形成不全を起こしたことを明らかにした。さらに,オートファジー関連遺伝子MAPLC3を調べると,3種のホモログが知られているが,各々の妊娠ステージ,さらには部位により,各発現が異なった。これは,妊娠ステージにより,部位で起こるオートファジー,あるいはアポトーシスが異なることを示唆している。そのために,自然流産モデルおよび実験流産モデルにおいて,母子境界領域におけるp53遺伝子群およびMAP1LC3ファミリーに関する遺伝子群の発現に関して調べた。p53は各部位間、各日齢間での変動は見られなかったが、胎盤完成期であるD14においてLC3Bが増加する傾向にあり、逆にLC3Cでは減少する傾向にあることを明らかとした。LC3Aについては全日齢で基底脱落膜部での発現が有意に高かったことから、D14における栄養膜侵入制御にLC3Bを介するオートーファジーが関与していること、脱落膜の恒常性維持にLC3Aが関与していることを示した。絶食したマウスを用いて,栄養欠乏状態の胎盤におけるLC3ファミリー、オートファジー関連因子の変動を調べた結果、LC3ファミリーの中で、LC3Bが絶食により誘導されたオートファジーに関連して特異的に増加することを明らかとした。

また、D12,14,16において絶食により変動したオートファジー関連因子に差が見られたことから、胎盤血管系の構築、胎盤完成度の違いや胎子栄養要求量の違いなどでグルコース不足の程度に差があることがわかった。本研究の目的は,胎盤における免疫回避機構、特に母子境界領域におけるサイトカインの動態と役割を明らかにすることである。そのために,自然流産モデルおよび実験流産モデルにおいて,母子境界領域における心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP),コリン,グレリン,そのレセプター,旨味レセプター(T1R1およびT1R2),Kiss1,そのレセプター,苦味レセプター(T2Rs)を調べ,これまでのサイトカインとの関連を追跡した。ANPとコリンの発現は通常妊娠では,進行に伴い増加するが,流産モデルでは一定で変化せず,満期には減少する傾向にあった。グレリンとそのレセプター並びに旨味レセプター発現は,通常妊娠では,進行に伴い増加するが,流産モデルでは有意に減少した。Kiss1とそのレセプター発現は通常変化しなかったが,流産モデルでは有意に減少した。苦味レセプターは変化が見られなかった。これらのホルモンおよびレセプターの変動は,胎盤成長因子の変動と相関していることが分かり,母子境界の免疫応答不全による習慣性流産や着床不全等の生殖学的難問を解決する糸口を見つけることができた。母子境界領域における免疫応答を理解するために,様々なマウスモデルを用いて,免疫担当細胞の分化/増殖と胎盤特異因子との相関関係ならびにサイトカインネットワークを解析した。特に,PlGFとVEGFの動態に注目した。調べた腫瘍抑制因子,オートファジー関連因子,流産誘発因子,糖尿病因子,血圧調整因子,肥満因子はPlGFとVEGFの動態に影響を与え,流産あるいは子宮内発育遅延を誘発していることが分かった。MAPLC3ファミリーの動態を明らかにしたことは大きい成果であったが,LC3AおよびLC3Cの関与の解明が不十分である。絶食による胎子発育遅延モデルを用いたが,その他のモデルを検討する必要がある。27年度が最終年度であるため、記入しない。生殖免疫学p53欠損モデルを入手したので,これを用い,MAPLC3ファミリーの動態をさらに明らかにする。胎盤腫瘍部位,すなわち迷路部,基底脱落膜,間膜腺各部位を分離して実施する必要がある。他の成長因子,特に胎盤成長因子との関連を明らかにする必要がある。また,胎子発育不全を示す高血圧モデル,糖尿病モデルなどの疾患モデルで検討することも視野に入れる。いくつかのサイトカインの動態を明らかにし,流産の解明に一歩近づいたが,遺伝子発現の変化まで解析できていない。アポトーシスおよびオートファジーに関する解析を続けている。いくつかの遺伝因子に絞って,アポトーシスおよびオートファジーに関する解析を続ける予定である。当初予定した器機が,学部内で整備されたため,不要となったため。栄養膜および脱落膜に発現するアポトーシスおよびオートファジー関連遺伝子の動態・変化を調べる。
電界制御によるカーボンナノチューブ3次元中空構造物の作製

電界及び磁界を印加することにより、気相成長中のカーボンナノチューブの形状を制御して、曲面形状を有する中空構造の作製を行った。最も有効に制御できたのはサマリウムコバルト磁石をヨーク形に配置し、マイクロ波プラズマ化学蒸着装置の外部から磁界を印加する方式であり,シリコン基板を設置しているマッフル炉の温度(700°C)でも済磁が少ないことが形状制御の原因であったと考えられる。カーボンナノチューブに印加されている磁界の強さは約100Gと推定されている。カーボンナノチューブの作製に用いた触媒は鉄のナノ粒子で平均粒径は約5nmである。水素流量100sccm、メタン流量10sccm、反応温度700°C、反応圧力20Torrの条件で複雑形状を持つカーボンナノチューブストランド(約4000本)の作製を行った。磁力線の方向に従うようにカーボンナノチューブが成長し、アーチ形状、梯子形状、車輪に近い形状の構造物を作成することができた。磁界印加によるカーボンナノチューブの形状制御の効果は極めて有効であることが判明した。磁界によるカーボンナノチューブの形状制御の原因の1つは鉄のナノ粒子がカーボンナノチューブの先端に位置しながら成長することによる。鉄は強磁性体であるので,外部磁界の影響を受けやすいことは本研究が成果をあげる大きな要因となっている。しかしながら、鉄のナノ粒子の磁区構造などは理学的にも解明されておらず,ナノ磁性の研究はその端緒についたところである。工学的立場から考えると、磁界を用いて比較的簡単にカーボンナノチューブの複雑人工構造物を製作できることは多くの応用性に富み,例えばナノマシンの骨組み構築やバイオ・薬品・酵素などのコンテナとして将来応用される可能性がある。従って本研究は、その萌芽性を考慮すると極めて価値あるものと自負することができる。マイクロ波プラズマCVD法において、バイアス電圧を印加することによってカーボンナノチューブの成長方向を制御する実験を行ってきたが、本研究においては簡便な熱CVD法を基本として、かつ電界及び磁界等を作用させることで、カーボンナノチューブの立体構造物作製のアプローチを試みた。Feナノ微粒子触媒を用いてカーボンナノチューブを成長させる場合、その形状やアニール温度等を制御することでカーボンナノチューブ薄膜の形状を制御できることが明らかとなった。すなわち、カーボンナノチューブの高密度化は垂直配向カーボンナノチューブ薄膜形成に関与することが判った。一方、粗密度のFe微粒子の場合はスパゲッティー状になることが判り、外部制御なしに垂直配向とスパゲッティー状との作り分けが可能となった。さらに、カーボンナノチューブをコイル状に創製することを試み、Fe微粒子の中にFe_2O_3を犠牲層として導入することによって、カーボンナノコイルの大量合成を行うことが可能となった。以上のように、Feナノ微粒子の形状や組成を制御することにより、カーボンナノチューブの形状を制御できることを明らかとした。これらに加え現在、電界および磁界を用いて外部から直接制御がすることによって、カーボンナノチューブの生成中においても形状を制御し、精度よく任意のカーボンナノチューブの形状制御を行う実験を継続している。Fe微粒子を用いたカーボンナノコイルの作製は現在まで報告されておらず、本研究は安価にカーボンナノチューブの3次元構造物の作製を可能にするものと考えられる。
窒素のグロー放電プラズマを利用する窒化アルミニウムの迅速合成プロセスの研究

本研究では、高周波減圧窒素グロープラズマを用いることにより、様々な形状のバルク状アルミニウムの直接窒化を試み、実際にこれらのアルミニウムを迅速に窒化することに成功した。以下に研究成果の概要をまとめる。まず、Alのアトマイズ粉をペレット状(13×1.7mm)に成形した試料を用いた場合、温度1000°C、10分という非常に低温、短時間に、窒化率94%をもって窒化させることができた。高周波電源のプレート出力は1.85kWが最適であった。得られた試料は直径約1μmの繊維状の窒化アルミニウムが密になった組織を持っていた。他の窒化法ではこのような低温、短時間にしかも繊維状にAlNが得られることはなく、これはプラズマ中の活性化された窒素(N,N^+,N_2^+など)の効果によるものと考えられた。さらに、直径6.2mm、高さ5.5mmの粒状、0.5×10.0×10.0mmの板状、10.0×10.0×4.0mmの直方体、粒径2mmの塊状Alについても、高い窒化率をもって窒化を完了させることができた。ついで、窒化に先立ってバルク状アルミニウムにArまたはH_2プラズマにより前処理を行い、その効果を検討した。Arプラズマ、およびAr+H_2プラズマを用いた場合は窒化促進の効果は得られなかった。しかし、H_2プラズマにより前処理をした場合は効果が認められ、550°Cで10分前処理した場合にその後の窒化における窒化率は未処理の場合の94%から97%へと増加した。さらに、窒化の際の反応を途中で止め、窒化の過程について調べた。Alのアトマイズ粉をペレット状(13×1.8mm)に成形した試料を用いた場合、明確に反応過程が観察された。この場合、窒素グロープラズマによる窒化は試料の表面で始まり、内部のアルミニウムは次々に表面に移動して、プラズマ中の活性窒素と反応して外表面にAlNとして析出する。その結果として試料の下側はアルミニウムが欠乏するため、空隙となる。さらに、生成物の形状は樹枝状であり、AlとN_2との反応は気相で起こるものと推定された。バルク状アルミニウムを高周波誘導型窒素グロープラズマによって、約10分という短時間で、ほぼ完全に窒化することに成功した。反応条件はプラズマ出力1.85kW、反応温度約800°C、系内圧力65Pa、窒素流量100SCCMであった。得られた生成物は、SEM観察によると、直径約1μmの繊維状物質よりなり、上層部の方が比較的緻密であった。さらに、円柱状、板状、四角柱状など、様々な形状を持ったアルミニウムでも同様の条件ではほぼ完全に窒化した。ケルダール法により求められた生成物の窒化率は94%であった。またLECOにより、生成物に存在する酸素含有量は上層部が0.218%、下層部が0.316%と測定され、非常に少なかった。さらに、窒化反応前にアルゴンおよび水素プラズマによって前処理を行い、その効果について検討したところ、水素プラズマ前処理を行った場合において、得られた生成物の窒化率が向上し、窒化反応時間が短縮する傾向が見られた。

この現象について調べるため、表面を酸化させたAlを作成し、その試料を水素プラズマにさらした。この時系内のガス中の水の量を、残留ガス分析装置(購入設備)を用いて測定したところ、水分子の量は水素プラズマ処理時に増加した。このことから水素プラズマは、Al表面の酸化皮膜を除去する働きがあるものと考えられる。これらの点については今後さらに検討を行う予定である。以上、本法は窒化アルミニウム製造プロセスを一変させ得る画期的な方法であり、さらなる最適条件の検討によってより迅速かつより高純度の窒化アルミニウムを作成できる可能性があると考えられる。本研究では、高周波減圧窒素グロープラズマを用いることにより、様々な形状のバルク状アルミニウムの直接窒化を試み、実際にこれらのアルミニウムを迅速に窒化することに成功した。以下に研究成果の概要をまとめる。まず、Alのアトマイズ粉をペレット状(13×1.7mm)に成形した試料を用いた場合、温度1000°C、10分という非常に低温、短時間に、窒化率94%をもって窒化させることができた。高周波電源のプレート出力は1.85kWが最適であった。得られた試料は直径約1μmの繊維状の窒化アルミニウムが密になった組織を持っていた。他の窒化法ではこのような低温、短時間にしかも繊維状にAINが得られることはなく、これはプラズマ中の活性化された窒素(N,N^+,N_2^+など)の効果によるものと考えられた。さらに、直径6.2mm、高さ5.5mmの粒状、0.5×10.0×10.0mmの板状、10.0×10.0×4.0mmの直方体、粒径2mmの塊状Alについても、高い窒化率をもって窒化を完了させることができた。ついで、窒化に先立ってバルク状アルミニウムにArまたはH_2プラズマにより前処理を行い、その効果を検討した。Arプラズマ、およびAr+H_2プラズマを用いた場合は窒化促進の効果は得られなかった。しかし、H_2プラズマにより前処理をした場合は効果が認められ、550°Cで10分前処理した場合にその後の窒化における窒化率は未処理の場合の94%から97%へと増加した。さらに、窒化の際の反応を途中で止め、窒化の過程について調べた。Alのアトマイズ粉をペレット状(13×1.8mm)に成形した試料を用いた場合、明確に反応過程が観察された。この場合、窒素グロープラズマによる窒化は試料の表面で始まり、内部のアルミニウムは次々に表面に移動して、プラズマ中の活性窒素と反応して外表面にAlNとして析出する。その結果として試料の下側はアルミニウムが欠乏するため、空隙となる。さらに、生成物の形状は樹枝状であり、AlとN_2との反応は気相で起こるものと推定された。
核内受容体Ad4BPによるレギュロンスイッチングの制御メカニズムの解明

Ad4BPの翻訳後修飾を同定するために、FLAGタグを付加したAd4BPを安定的に発現するHEK293細胞(293-FLAG-Ad4BP)を樹立した。293-FLAG-Ad4BPの核抽出液からFLAG抗体による免疫沈降を行い、FLAG-Ad4BPを単離し、質量分析によりその翻訳後修飾の同定を行った。その結果、これまでに報告のない、3カ所のリジン残基のアセチル化修飾が同定された。そのうち2カ所のリジン残基はC末端側のリガンド結合ドメインに存在した。Ad4BPのリガンド結合ドメインは、β-カテニン等との相互作用に必要であることが分かっていることから、今回同定したAd4BPのアセチル化がAd4BPと共役因子との相互作用の調節に関与している可能性が示唆される。また、アセチル化の修飾基の供与体であるアセチルCoAは糖、および脂肪酸の代謝によって産生されることから、細胞内のエネルギー代謝状態のセンサーの一つであると考えられている。実際、Ad4BPのアセチル化修飾は高糖濃度条件下で亢進していることから、糖濃度に応じたAd4BPの機能制御をおこなっている可能性が十分に考えられる。そこで、今回同定した3カ所のリジン残基がそれぞれアセチル化されたAd4BPを特異的に認識するモノクローナル抗体の作成を行った。その結果、K45がアセチル化されたAd4BPを特異的に認識する抗体が得られた。また、K392、およびK435アセチル化Ad4BPに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもすでに数10種ずつ得られており、順次スクリーニングを行なっている。今後、免疫染色により生体内におけるアセチル化Ad4BPの時空間的局在を調べる。また、アセチル化Ad4BPが制御する標的遺伝子をChIP-seqにより明らかにすることで、外界刺激に応答したAd4BPによるレギュロン制御メカニズムを理解する。本研究では、レギュロン制御の視点から代謝調節系のメカニズムを明らかにすることで、生体恒常性維持機構の理解を目指す。なお本研究では、細胞内エネルギー代謝がAd4BP/SF-1レギュロンによって制御されていることが既に明らかになっている副腎および生殖腺に焦点を当てる。以下の3つ実験項目を設定し、糖濃度に応答したAd4BPのレギュロンスイッチングの分子メカニズムを多方面から検討することで、その実体解明を目指している。各実験項目に関して、当該研究期間中に得られた結果に関して下記に記す。実験(1)糖濃度の変化に応答したAd4BP/SF-1の翻訳後修飾の同定とその機能解析:様々な糖濃度条件下で培養した細胞におけるAd4BPの翻訳後修飾の同定を試みた。翻訳後修飾を同定したのち、その修飾を受けたAd4BPのクロマチン結合領域をChIP-sequenceにより明らかにする予定である。実験(2)糖濃度の変化に応答したAd4BP/SF-1の共役因子の同定とその機能解析:免疫沈降及び質量分析によりAd4BPの共役因子の同定を行った。これまでに幾つかの共役因子の候補が得られた。これらの因子の糖濃度に応答したレギュロンスイッチングへの関与について検討を行う。実験(3)糖濃度の変化に応答したAd4BP/SF-1結合領域のクロマチン構造変化の検討:糖濃度の変化に応答し、クロマチン構造の変化する領域をFAIRE-sequence法にて同定した。これらの領域とAd4BP/SF-1結合領域の比較を行った。実験(2)に関しては、Ad4BP/SF-1と共免疫沈降される因子群を質量分析により同定することで、これまでに幾つかの共役因子の候補を得ることに成功した。これらの候補因子の中には通常細胞質でエネルギー代謝に関与していることが知られている酵素タンパク質が含まれていることから、これらのタンパク質が核内で未同定の機能を発揮している可能性が考えられる。実験(3)に関しては、FAIRE-sequenceにより糖濃度の変化に応答してクロマチン構造が変化する領域をゲノムワイドに同定した。これらの領域をAd4BP/SF-1の結合領域と比較することにより、Ad4BP/SF-1依存的なクロマチン構造変換によって制御される遺伝子を幾つか同定した。実験(1)に関しては、これまでに糖濃度の変化に応答したAd4BP/SF-1の翻訳後修飾の同定には至っていない。理由として、翻訳後修飾を受けているAd4BP/SF-1の全体に占める割合が低い可能性が考えられる。「糖濃度の変化に応答したAd4BPの翻訳後修飾の同定とその機能解析」Ad4BPの翻訳後修飾を同定するために、FLAGタグを付加したAd4BPを安定的に発現するHEK293細胞(293-FLAG-Ad4BP)を樹立した。そのうち2カ所のリジン残基はC末端側のリガンド結合ドメインに存在した(図)。実際、Ad4BPのアセチル化

修飾は高糖濃度条件下で亢進していることから、糖濃度に応じたAd4BPの機能制御をおこなっている可能性が十分に考えられるこれまでに糖濃度の変化に応答した新規のAd4BP/SF-1の翻訳後修飾を複数同定しており、研究は概ね順調に進んでいると考える。Ad4BPの翻訳後修飾を同定するために、FLAGタグを付加したAd4BPを安定的に発現するHEK293細胞(293-FLAG-Ad4BP)を樹立した。293-FLAG-Ad4BPの核抽出液からFLAG抗体による免疫沈降を行い、FLAG-Ad4BPを単離し、質量分析によりその翻訳後修飾の同定を行った。その結果、これまでに報告のない、3カ所のリジン残基のアセチル化修飾が同定された。そのうち2カ所のリジン残基はC末端側のリガンド結合ドメインに存在した。Ad4BPのリガンド結合ドメインは、β-カテニン等との相互作用に必要であることが分かっていることから、今回同定したAd4BPのアセチル化がAd4BPと共役因子との相互作用の調節に関与している可能性が示唆される。また、アセチル化の修飾基の供与体であるアセチルCoAは糖、および脂肪酸の代謝によって産生されることから、細胞内のエネルギー代謝状態のセンサーの一つであると考えられている。実際、Ad4BPのアセチル化修飾は高糖濃度条件下で亢進していることから、糖濃度に応じたAd4BPの機能制御をおこなっている可能性が十分に考えられる。そこで、今回同定した3カ所のリジン残基がそれぞれアセチル化されたAd4BPを特異的に認識するモノクローナル抗体の作成を行った。その結果、K45がアセチル化されたAd4BPを特異的に認識する抗体が得られた。また、K392、およびK435アセチル化Ad4BPに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもすでに数10種ずつ得られており、順次スクリーニングを行なっている。今後、免疫染色により生体内におけるアセチル化Ad4BPの時空間的局在を調べる。また、アセチル化Ad4BPが制御する標的遺伝子をChIP-seqにより明らかにすることで、外界刺激に応答したAd4BPによるレギュロン制御メカニズムを理解する。実験(1)に関しては、引き続き糖濃度の変化に応答したAd4BP/SF-1の翻訳後修飾の同定を試みる。実験(2)に関しては、これまでに得られている共役因子候補との相互作用の検証を行い、共役因子であることが確定したものに関しては遺伝子のノックダウンを行い、その影響を検討する。実験(3)に関しては、糖濃度の変化に応答してクロマチン構造が変化する領域に結合する因子の予測を行う。今回同定した3カ所のリジン残基がそれぞれアセチル化されたAd4BPを特異的に認識するモノクローナル抗体の作成を行っている。抗体が得られ次第、免疫染色により生体内におけるアセチル化Ad4BPの局在を調べる。また、アセチル化Ad4BPが制御する標的遺伝子をChIP-seqにより明らかにする。物品費の使用額が当初の予想よりも少なくなったため今年度の物品費として使用する