hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
6-位に修飾を受けたグルコシドを認識する加水分解酵素の反応機構と擬似糖

申請者らは微生物由来ジグリコシダーゼと植物由来ジグリコシダーゼの基質認識の違いを明らかにするため,6-位に種々の修飾基を導入したp-ニトロフェニルグルコシド(6-modified pNPGlc)を合成し,これらに対する活性をそれぞれの酵素に対して測定した.申請二年目において,6-modified pNPGlcの植物由来ジグリコシダーゼに対する結合実験を行った.その結果,用いた3つの植物由来ジグリコシダーゼのうちプリメベロシダーゼおよびフルカチンハイドロラーゼは,6-modified pNPGlcに対して結合能を全く示さなかったのに対して,ビシアニンハイドロラーゼは炭素鎖長が3および4の6-modified pNPGlcに対して結合活性を示した.進行した反応は,活性は低いながらも,与えた基質の水酸基に対する糖転移反応であった.この転移反応系にグルコースを糖受容体として混在させても,転移反応はグルコースに対して進行せず,与えた基質の水酸基に対してのみ生じた.植物由来の3つのジグリコシダーゼのアミノ酸配列を立体構造を考慮して比較すると,活性ポケット入り口に位置するTrpが6-modified pNPGlcに対して結合・糖転移能を示したビシアニンハイドロラーゼのみに存在することが分かった.その他2つのこの位置はAlaであった.このことからこのTrpが芳香環π-π相互作用により基質認識,とくにアグリコンの芳香環認識だけでなく,糖転移反応における糖受容体の認識に関わっていることが示唆された.さらに用いた基質の水中での立体構造を1D-1H,2D-NMR,およびNOE, NOESYを用いて解析を行っている.植物由来のジグリコシダーゼとして、チャ葉β-プリメベロシダーゼ(PRD)およびムシカリ葉由来のフルカチンヒドロラーゼ(FH)の大量発現系を構築し、これら植物および微生物(Penicillium multicolorおよびAspergillus fumigatus)由来のジグリコシダーゼ、あわせて4種のジグリコシダーゼの基質特異性を比較した。微生物由来の2つのジグリコシダーゼはβ1,6-結合を有する二糖配糖体ばかりでなく、6-O-置換のβ-D-glucopyranosideも基質とすることに注目して、6-位周辺の構造情報を得るための様々な擬似糖β-D-glucopyranosideを合成しこれらに対する上記ジグリコシダーゼの基質特異性を調べた。β-p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosideの6-位に、硫黄原子を介して、xylopyranoside構造を、もしくは炭素数2から6の直鎖の末端に水酸基を有するもの、炭素数3に水酸基を2つ持つもの、炭素数4で分岐鎖を持つもの、および天然にも存在する6-O-malonyl体をそれぞれ25段階で合成した。それぞれの酵素の加水分解活性を検討したところ、植物由来および微生物由来の酵素に対して以下のことが明らかとなった。1)単糖に対する活性との比較から、微生物由来の酵素二者では6位に導入される構造は必ずしも糖の構造である必要はなく、ある程度の大きさを持ち、かつ水酸基などの極性基を有する擬似糖であれば基質として認識しうる。2)PRDは天然の基質であるβ-primeveroside以外の合成した擬似糖を基質として認識しなかったことから、xylose構造周辺には立体障害があり、基質の大きさ、構造に対する許容範囲は微生物由来の酵素に比べて非常に小さい。(2005年度農芸化学会発表予定)申請者らは微生物由来ジグリコシダーゼと植物由来ジグリコシダーゼの基質認識の違いを明らかにするため,6-位に種々の修飾基を導入したp-ニトロフェニルグルコシド(6-modified pNPGlc)を合成し,これらに対する活性をそれぞれの酵素に対して測定した.申請二年目において,6-modified pNPGlcの植物由来ジグリコシダーゼに対する結合実験を行った.その結果,用いた3つの植物由来ジグリコシダーゼのうちプリメベロシダーゼおよびフルカチンハイドロラーゼは,6-modified pNPGlcに対して結合能を全く示さなかったのに対して,ビシアニンハイドロラーゼは炭素鎖長が3および4の6-modified pNPGlcに対して結合活性を示した.進行した反応は,活性は低いながらも,与えた基質の水酸基に対する糖転移反応であった.この転移反応系にグルコースを糖受容体として混在させても,転移反応はグルコースに対して進行せず,与えた基質の水酸基に対してのみ生じた.植物由来の3つのジグリコシダーゼのアミノ酸配列を立体構造を考慮して比較すると,活性ポケット入り口に位置するTrpが6-modified pNPGlcに対して結合・糖転移能を示したビシアニンハイドロラーゼのみに存在することが分かった.その他2つのこの位置はAlaであった.このことからこのTrpが芳香環π-π相互作用により基質認識,とくにアグリコンの芳香環認識だけでなく,糖転移反応における糖受容体の認識に関わっていることが示唆された.さらに用いた基質の水中での立体構造を1D-1H,2D-NMR,およびNOE, NOESYを用いて解析を行っている.
分散型電源による電力系統制御とその効果検証に関する研究

本研究では、分散型電源が配電系統に接続されている場合の分散型電源の集中制御ならびに自律分散制御による配電線電圧、過負荷、周波数等の制御効果について定量的な検証を行うことを目的に、シミュレーション等による研究を行い、以下のような研究成果を得た。(1)分散型電源の自律分散制御による配電電圧制御について、自端電圧だけを制御する手法、分散型電源毎に制御領域を指定する手法の開発を行い、シミュレーションによって後者が前者に比べ効果的であることを検証した。(2)配電系統に単相分散型電源が設備された場合の解析に用いるための、三相不平衡時にも適用可能な、かつ、線路対地キャパシタンスや変圧器モデルを含む三相潮流計算プログラムを開発し、その正当性を確認した。(3)熱電併給型分散型電源が多数設備された場合の負荷平準化効果について検証した。(4)FRIENDS又はMicroGridsの概念を導入した場合の、ガスタービン等の分散型電源による風力発電等自然エネルギー発電出力の平滑化手法を開発し、その効果をシミュレーションで確認した。(5)分散型電源の周波数調整効果について、周波数制御用発電機の容量にもよるが、通常は、分散型電源の周波数調整効果はほとんど期待できないことを確認した。これらの研究成果については、11.の研究発表論文で発表してきている。本研究では、多数の回転機型およびインバータ型の分散型電源が、放射状配電系統またはループ状配電系統に接続されている場合の、分散型電源の集中制御ならびに自律分散制御による配電線電圧、過負荷、周波数等の制御効果について定量的な検証を行うことを目的としている。本年度は、配電系統に設備される複数の分散型電源を利用した配電系統電圧制御の可能性を検証するために、シミュレーション等による研究を行い、以下のような研究成果を得た。1自律分散制御方式について、手法の現状を調査し、制御モデル構築に資した。2対象とする放射状配電系統及びループ状配電系統モデルを構築するとともに、分散型電源モデル、分散型電源の最適運用を基礎とした集中制御方式、ならびに、得られる情報が限定される場合の自律分散制御方式を開発した他、三相潮流計算プログラムの高度化を計った。3上記で開発されたモデルに基づいて、これまでに開発済みのFRIENDSシミュレータ並びに改良した三相潮流計算プログラムを使って、分散型電源の配電系統電圧制御効果について以下のような結果を得た。(1)分散型電源の無効電力制御による配電系統電圧制御の効果は大きい。(2)分散型電源をまとめて集中制御可能であれば、多くの場合、電圧制約違反が発生することは少ない。(3)自端のみを監視する自律分散型制御では、必ずしも、すべての電圧制約違反を解消できない。これらの研究成果については、11.の研究発表論文で発表してきており、今後も引き続き発表の予定である。本年度は、配電系統に設備される複数の分散型電源を利用した電力系統制御の可能性を検証するために、シミュレーション等による研究を行い、以下のような研究成果を得た。(1)分散型電源の自律分散制御による配電電圧制御について、分散型電源毎に制御領域を指定する新しい手法の開発を行い、シミュレーションによって、開発手法が、これまでに開発した自端電圧だけを制御する方式に比べ効果的であることを検証した。(2)配電系統に単相分散型電源が設備された場合の解析に用いる三相潮流計算プログラムに関し、線路対地キャパシタンスや三相不平衡時にも適用可能な変圧器モデルを開発し、その正当性を確認した。(3)熱電供給型分散型電源が多数設備された場合の負荷平準化効果について検証した。(4)FRIENDS又はMicroGridsの概念を導入した場合の、ガスタービン等の分散型電源による風力発電等自然エネルギー発電出力の平滑化効果をシミュレーションで確認した。

本研究では、多数の回転機型およびインバータ型の分散型電源が、放射状配電系統またはループ状配電系統に接続されている場合の、分散型電源の集中制御ならびに自律分散制御による配電線電圧、過負荷、周波数等の制御効果について定量的な検証を行うことを目的としている。本年度は、配電系統に設備される複数の分散型電源を利用した電力系統制御の可能性を検証するために、シミュレーション等による研究を行い、以下のような研究成果を得た。(1)分散型電源の効果的な利用による系統負荷平準化効果検証モデルを用いて、分散型電源へのインセンティブの与え方の違いによって、負荷平準化効果に影響があることを、計算機シミュレーションにより検証した。(2)分散型電源を用いた自然エネルギー発電(風力発電、太陽光発電)出力の平準化手法を開発し、計算機シミュレーションにより効果を確認した。また、30分同時同量の調整量を制限した場合の平準化効果の統計的検証を行い、効果を確認した。(3)分散型電源の周波数調整効果についてシミュレーションにより検証した。周波数制御用発電機の容量にもよるが、分散型電源の周波数調整効果はほとんど期待できないことを確認した。(4)以上の研究結果について報告書を取りまとめた。これらの研究成果については、11.の研究発表論文で発表してきている。
新しいHDL機能制御タンパク質の活性発現機序の解明と創薬への応用

高密度リポタンパク質(HDL)の血中濃度が高いほど、動脈硬化性疾患のリスクは減少する。HDLは、末梢組織および動脈硬化病変からの余剰脂質(コレステロール、リン脂質)の引き抜き(脂質搬出反応)や、抗炎症作用、抗酸化作用など、様々な効果により抗動脈硬化的に作用する。本研究では、HDLの抗動脈硬化作用に関与することが示唆されているapoA-I binding protein(AIBP)について、その役割と生理的意義との解明を目的とした。前年度において、ヒトマクロファージ細胞に対して、大腸菌発現系にて作製したAIBPタンパク質がリポポリサッカリド(LPS)によって誘導される炎症性サイトカインの発現を減少させることを明らかにした。そこで平成30年度は、作製したリコンビナントAIBPのin vivoでの抗炎症効果について評価した。LPSをマウスに腹腔内投与し、2時間後に血液を回収して炎症性サイトカインであるTNFの量をELISA法により測定したところ、投与後1ー2時間で血液中のTNF量は大きく上昇した。これに対して、AIBPを静脈内に単回前投与したマウス個体ではTNF量の増加が抑制される傾向を示し、AIBPは生体においても抗炎症作用を示すことが明らかとなった。さらに、動脈硬化モデルマウスを作製し血液中のAIBP量を測定したところ、動脈硬化の進展とともにAIBP量が増加することが明らかとなり、AIBPが生理的な抗動脈硬化的因子であることを強く示唆した。作製したリコンビナントAIBPを用いて、細胞およびマウスで抗炎症作用を示す結果を得ており、概ね当初の予定通りに進んでいると考えている。引き続き、細胞およびマウスを使った実験によりAIBPの抗炎症効果のメカニズム解析を行い、さらに、AIBPの生理的な役割について検証する。高密度リポタンパク質(HDL)は血中濃度が高いほど動脈硬化性疾患のリスクが減少するとされ、その本態は、HDLが末梢組織(動脈硬化巣)に蓄積した余剰脂質(コレステロール、リン脂質)を膜トランスポーターABCA1またはABCG1を介して引き抜き(脂質搬出反応)、最後は肝臓へと運ばれ異化されるという、いわゆる「コレステロール逆転送」活性にある。人工的に作製したHDL様粒子を投与して一時的にHDL濃度上昇を促すことにより、動脈硬化病変が縮小したという臨床知見が報告されており、HDLには積極的な病態治癒効果があることが証明されている。本研究では、HDL上のアポリポタンパク質A-I (apoA-I)に結合するapoA-I binding protein (AIBP)の生理的意義の解明を目的とした。平成28年度は、まず、大腸菌発現系で作製したリコンビナントAIBPタンパク質のapoA-I及びHDLへの結合について検討した。AIBPは、HDL、apoA-Iまたは大腸菌発現系で作製したリコンビナントapoA-I、リン脂質とのディスク型人工HDL粒子に対して、すべて同程度結合することが明らかとなった。このことは、AIBPはapoA-Iと直接結合しており、その結合はapoA-Iの二次構造に依存しない可能性が高いことを示唆している。さらに、細胞からのapoA-I及びHDL依存的な脂質搬出活性に対するAIBPの効果を検討したところ、AIBPはapoA-Iによる脂質搬出反応に対しては影響を与えなかったが、HDLによる脂質搬出反応を有意に増加させることを明らかにした。AIBPの脂質搬出反応への影響などが明らかになっており、概ね当初の予定どおり順調に進んでいると考えている。平成29年度は、リコンビナントAIBPの作製において、大腸菌由来LPSの糖鎖を欠損させたClearColi BL21を使用し、AIBPタンパク質精製法について改良を行った。IPTGによるタンパク質発現の時間と温度の最適化、界面活性剤の種類と含量の検討、さらに、Niカラム精製の後に行っていたLPS除去カラムの代わりに陰イオン交換カラムによる精製を追加することにより、これまで得られていたAIBPタンパク質の約5倍程度の収量を得ることができた。また、ヒトマクロファージ細胞に対して、AIBPがLPSによって誘導される炎症性サイトカインの発現を減少させる効果を示すことが明らかとなった。マウスを使用した実験に向けて、リコンビナントタンパク質作製手法を改良することで、LPSフリーでかつ収量を増やすことに成功し、さらに、AIBPの抗炎症効果などが明らかになっており、概ね当初の予定通りに進んでいると考えている。

前年度において、ヒトマクロファージ細胞に対して、大腸菌発現系にて作製したAIBPタンパク質がリポポリサッカリド(LPS)によって誘導される炎症性サイトカインの発現を減少させることを明らかにした。そこで平成30年度は、作製したリコンビナントAIBPのin vivoでの抗炎症効果について評価した。LPSをマウスに腹腔内投与し、2時間後に血液を回収して炎症性サイトカインであるTNFの量をELISA法により測定したところ、投与後1ー2時間で血液中のTNF量は大きく上昇した。これに対して、AIBPを静脈内に単回前投与したマウス個体ではTNF量の増加が抑制される傾向を示し、AIBPは生体においても抗炎症作用を示すことが明らかとなった。さらに、動脈硬化モデルマウスを作製し血液中のAIBP量を測定したところ、動脈硬化の進展とともにAIBP量が増加することが明らかとなり、AIBPが生理的な抗動脈硬化的因子であることを強く示唆した。作製したリコンビナントAIBPを用いて、細胞およびマウスで抗炎症作用を示す結果を得ており、概ね当初の予定通りに進んでいると考えている。予試験的結果において、AIBPが脂質搬出反応だけでなく、炎症を顕著に抑制することが示唆された。そこで今後はマクロファージ等を用いた炎症反応に与える影響についても、メカニズムを含めて検討する予定である。AIBPの抗動脈硬化について細胞及びマウスを使った実験により検証する。具体的には、抗炎症効果のメカニズムと、マウスを使ったAIBPの生理的な機能について評価する予定である。引き続き、細胞およびマウスを使った実験によりAIBPの抗炎症効果のメカニズム解析を行い、さらに、AIBPの生理的な役割について検証する。血清一括購入のための費用を翌年度に繰り越した。理由:一部の物品が3月に納品となり、支払いが完了していないため。使用計画:全ての物品の支払いが4月に完了予定である。今年度の予算とあわせて、血清購入の費用にする予定である。
ZIP10を標的とした癌転移開始細胞の抑制を基盤とした新しい抗転移療法

癌転移開始細胞(Metastasis-initiating cell,以下MIC)は、原発癌に巣喰う微量な細胞集団であり、癌転移を積極的に仕掛けることが分かってきた。我々はスキルス胃癌患者より、このMICを高い純度で単離することに成功している。本課題では、このMICで高発現するZIP10を分子標的として、以下の研究をする。1MICにおいて、ZIP10をゲノム編集でKOし、癌転移におけるZIP10の生物学的意義を解明する、2ZIP10がin vivoで癌転移抑止の分子標的と成り得るか否かを検討する、3癌患者の血中循環癌細胞を対象にZIP10が癌転移予測のバイオマーカーと成り得るか否かを検討する。以上の3点を明らかにするところまでを具体的な目的とする。
行動性体温調節機構の解析を目的とした小動物用温度勾配装置の試作研究

小動物の行動性体温調節と自律性体温調節の関わり合いを理解するため、ラットなどが自由にその至適環境温度を選ぶことの出来る小動物用温度勾配装置・サーモクリン・を試作した。このサーモクリンは、内寸200×16×18(H)cmで、両端に溶接した銅製パイプにそれぞれ独立して冷水と温水を循環させ、装置内に長軸に沿って約8°Cから約45°Cの温度勾配を持たせた飼育実験装置であり、その中にラットを入れて複数日にわたって連続的に、ラットの居る位置の環境温度(至適環境温度)、行動量、体温その他の自律機能を以下の各種の条件下で測定した。1.発熱時の行動性体温調節と日内変動。体温は夜間に高く昼間に低いが至適環境温度はその逆であった。夜間、ラットは発熱物質の投与で体温が上昇する直前に高い至適環境温度を、また解熱の前に低い至適環境温度を選択した。2.暑熱耐性ラットの体温調節行動。普通のラットに比しFOXラットの体温と至適環境温度は低かった。FOXラットでは、それぞれの体温調節反応が昴進する低および高閾値環境温のいずれも低くなった。3.エンドトキシンショック。大量の発熱物質投与で体温は逆に下降し至適環境温度も同様に下降した。4.摂食後の行動性体温調節反応。摂食直後には体温の上昇に伴って低い至適環境温度を選択したが、体温の回復とともに旧に復した。5.ケージスイッチテストの機序。実験環境にナイーブなラットでは、少なくとも3日間は高い体温とともに高い至適温度を選択した。6.ストレス負荷。拘束によるストレス負荷ラットでは、体温が高く、体温調節反応の閾値温度は高温側に移動した。7.運動鍛練ラットの体温調節反応。このラットでは常に非蒸発性の熱放散反応が昴進した。6.ストレス負荷。小動物が自由に選ぶ至適環境温度と熱産生量、熱放散量、体温、摂食量、行動量とが、どのような日内変動を示し、どのように関連するか、更に特殊環境への馴化でいかに変容するかなど、行動性体温調節と自律性体温調節の関わり合いを理解する目的で、選択温度と共に上記の自律機能を無侵襲で連続的に測定するための、環境に厳密な温度勾配をもたせた小動物用の長期飼育環境装置を設計試作した。試作した装置は以下のごとくであった。(a)内寸200×16×18(H)cmのアルミ板(厚さ5mm)で作った箱の両端に銅製パイプを熔接し、それぞれに独立して冷水(約4°C)と温水(約50°C)を循環させ、装置内の空気に温度勾配(約8°Cから約45°C)を作った。中にアクリル板と金網で作った飼育ケージ(180×14×14(H)cm)を入れ、外箱の両端を塞いだ。(b)環境装置の壁面(外箱と内箱とも)に10cm間隔に光電スイッチを設置し、環境装置内のラットの位置を連続記録した。また、ラットが一定時間内に最も多く留まった部位の気温から選択温度を、光電スイッチの作動回数から運動量を測定した。(c)自動給水、給餌装置、糞尿処理装置を設置した。ガス代謝測定の目的で、環境装置内の空気を採取出来るよう、装置上面に複数の穴を設けた。(d)体温の連続測定のためのテレメトリー装置の受信部の設置と改良を行った。(e)光ファイバー照明装置の設置とそれによる明暗のコントロール、データのon-lin処理の方法とソフトウエアーの開発を開始した。

予備実験として、環境温度を一定にした飼育装置内で、あるいは一日の内一定時間だけ暑熱又は寒冷に暴露したラットの行動と体温調節反応の関係を連続観察した。飼育環境に温度勾配をもたせる実験装置(いわゆるサーモクリン)を試作し、それを用いてラットなど小動物に自由に環境温度を選択させ、選択した温度すなわち至適環境温度と熱産生量、熱放散量、体温、摂食量、行動量との関連、日内変動、特殊環境への馴化によるそれらの変容などにつき追求し、行動性体温度調節と自律性体温調節の関わり合いを理解することを目的にこの研究を行った。えられた結果は以下のごとくであった。平成5年度に完成したサーモクリンを、この研究の目的にさらによく合ったものにすべく、付属装置を含めて改良した。改良の結果この装置は、常温の室内では、20°Cから32°Cまでほぼ直線的な温度勾配を維持し、ラットの至適温度とともに体温の連続測定(腹腔内に埋め込んだテレメータ用温度センサーによる)が出来るようになった。ラットの体温は活動期に高く非活性期に低かったが、選んだ環境温度は活動期に低く非活動期に高かった。活動期にラットの腹腔内に発熱物質(LPS 10μg/1)を投与したところ、ラットが選んだ至適環境温度は体温が上昇する以前に高温側に移動し、解熱がおきる以前に旧のレベルにもどった。ラットの非活動期に発熱物質の投与を行うと、発熱のパターンは同じであったが、選択環境温度には変化がおきなかった。その意義については現在まだ十分には把握しておらず、今後検討を続ける予定である。発熱物質の大量投与では体温と選択環境温度はともに下降したが、下降の理由については検討中である。さらに絶食時には、はじめラットは高い至適温度を選択したが後には低いそれを選び、絶食を始めてからの時期により体温のセットポイントが移動するごとき結果が得られた。この機序についても今後さらに検討する。長軸に沿って温度勾配をもたせた細長い飼育・実験装置を試作し、それを用いてラットなどの小動物に自由に環境温度を選択させ、選択した温度すなわちその動物の至適環境温度と熱の産生量と放散量、体温、摂食量、行動量などの同時観察、その日内変動、特殊環境への馴化による影響などにつき追求し、行動性と自律性の体温調節の関わり合いを理解することを目的にこの研究をおこなった。本年度えられた結果は以下のごとくであった。A:試作した装置の改良、補修をおこなった。B:ラットを用いた実験で以下の成績をえた。1、体温調節行動と日内変動;深部体温は活動期に高く非活動期に低かったが、選択した環境温度はその逆であった。2、ケージスイッチテスト;ナイーブなラットでは、活動期、非活動期とも深部体温が高く、至的環境温度は低かったが、馴れるにつれて前項で示す日内変動が再現した。3、発熱時の行動性体温調節反応と日内変動;活動期に発熱物質を投与すると、深部体温の上昇以前に高い至適環境温度を選択、解熱開始以前に安静時より低い至適環境温度を選択した。非活動期にはかかる至適環境温度の変化は起きなかった。4、エンドトキシンショックと行動性体温調節反応;大量の細菌由来の発熱物質投与では深部体温も至適環境温度もともに急激に下降した。ショックからの回復にともにそれら温度は上昇したが、至適環境温度の下降、上昇は深部体温のそれよりも常に早かった。5、暑熱耐性ラット(FOK)の体温調節行動;FOKラットの深部体温、至適環境温度は対照ラットのそれより常に低かった。
植物の環境適応力と系統進化-生態的に放散したヒルムシロ属における比較ゲノム解析-

水生植物ヒルムシロ属のササバモは高水温でも生育を続けるが、同属の近縁種ヒロハノエビモは生存できない。本年度は、高温順化に重要な、葉緑体局在性低分子熱ショックタンパク質(cshsp)について、遺伝子発現パターンと遺伝子構造を解析することにより、生態的分化の遺伝的背景について検討した。またササバモとヒロハノエビモ間の自然雑種について成長解析をすすめた。得られた結果のうち1、2は論文作成中であり、3については論文の掲載が決定した。1.cshspの遺伝子発現発現している2種類のcshspのうち、cshsp2が順化処理により発現量が増大し、高温順化に関わることが示唆された。ヒロハノエビモのcshsp2は、保存されているはずのドメインにおいて欠失があった。さらに高温ストレス処理1-2時間において、cshsp2の発現量はササバモの方が、ヒロハノエビモに比べ高い。2.cshspのプロモーターCshsp2上流の塩基配列解析から、HSE因子とABA応答配列が確認された。これら転写因子結合配列は、種間で保存されていた。これらのことからササバモは系統進化の過程でHSFやABAを介した情報伝達経路を変化させることにより高温順化能力を獲得してきたと考えられた。3.自然雑種における沈水条件の成長とSLA自然雑種は母系により生育型可塑性の程度が異なる。しかし水中培養では、成長やSLAに違いが認められない。今後は雑種において、光強度以外の要因(温度や光質)への応答を中心に生理学的解析をすすめ、生態型の多様化に関わるゲノムの実態を明らかにしていきたい。水生植物は,真夏の渇水時や水底で発芽した植物が成長し水面に到達した時に空気中に曝されることがある.その際,水分条件や高温,強光等,複数の環境条件が,植物に対してストレスを与えていると考えられる.本年度の私の研究では,水生植物ヒルムシロ属近縁3種(ヒロハノエビモ,ガシャモク,ササバモ)において高温条件への応答性について,個体レベルと遺伝子発現レベルで比較解析した.個体レベルの解析では,室内水槽で35°C高温耐性実験を行った.また遺伝子発現レベルの解析では,高温耐性,浸透圧調整,ホルモン合成系,光合成に関連する分子種のデータベース登録情報をもとにオリゴプローブを設計し,それをのせたスライドを用いたアレイ解析を行った.得られた結果は以下のとおりである.1.35°C高温培養条件において,ヒルムシロ属の近縁3種は高温耐性が段階的に異なった:ササバモは生育を続け,ガシャモクは生育を続けたがその速度は遅く,ヒロハノエビモは枯死した.2.アレイ解析では分子量や細胞局在が異なる20種類のHsp遺伝子のうち,18種類が35°C高温処理1時間により遺伝子発現が増大した.一方,2種類のHsp遺伝子は,ヒロハノエビモやガシャモクでは発現が増大したが,ササバモでは発現が検出されなかった.3.Hsp遺伝子には,高温処理時間とともに高い発現量が維持されるものと低下するものが存在した.このようなストレス処理の時間変化に伴う遺伝子発現パターンは,種によって異なっていた.一般に,高温耐性とHsp遺伝子の発現は密接に関連している.これらヒルムシロ属3種における高温耐性の分化に関わるゲノムレベルの差異を明らかにするため,現在,cDNAライブラリーおよびゲノムDNAにおけるHsp遺伝子の存在や構造を解析している.水生植物ヒルムシロ属のササバモは高水温でも生育を続けるが、同属の近縁種ヒロハノエビモは生存できない。
リアル・プラズマの波動過程とソリトン的励起

本研究は,リアル・プラズマの非線形波動過程においてソリトン的励起が惹き起こす諸現象の整理とその解析理論の確立を目指し,種々の摂動効果のために個性保存が不完全なソリトン系の力学過程を明らかにし,いわゆる"ソリトン運動論(Kinetic Theory of Solitons)"の大系化に寄与することを目標として,実験と計算機シミュレーションのグループと理論および応用数学のグループの協力のもとに研究を行ったもので得られた成果のおもなものは以下のとおりである.(1)ビームプラズマの不安定波の成長過程でソリトン放出が安定化に作用することが明らかになった.また, Sine-Gordon系において不安定平衡点から安定点への移転でソリトンの放出が重要であることが示された.(2)プラズマシース領域からのソリトンの反射の過程が実験と理論の両面から調べられ,反射機構が明らかにされた.(3)負イオンを含むプラズマのソリトン過程が詳細に調べられ,高次の非線形効果が及ぼす影響が調べられた.(4)不均一プラズマにおける大振幅ソリトンの伝播特性が計算機実験により詳細に調べられた.また,層状構造を持った媒質や,複雑な磁場配位の中でのソリトンの伝播の理論的研究が行われるなど,従来の摂動理論の枠で扱えない非線形過程が考察が始められた.(5)プラズマの非線形過程について大規模な計算機シミュレーション研究が行われ,プラズマ運動における散逸構造の出現とエネルギー緩和過程の関連,高周波場のコラップス過程,大振幅波による粒子加速などの機構が定量的に解析されるようになった.(6)厳密解法についての数学理論の基礎付けが行われ,非線形散逸効果を含む過程におけるソリトン的なパルス解の存在,戸田分子方程式の解の構成と新しいソリトン方程式の発見など,多くの成果があった.本研究は,リアル・プラズマの非線形波動過程においてソリトン的励起が惹き起こす諸現象の整理とその解析理論の確立を目指し,種々の摂動効果のために個性保存が不完全なソリトン系の力学過程を明らかにし,いわゆる"ソリトン運動論(Kinetic Theory of Solitons)"の大系化に寄与することを目標として,実験と計算機シミュレーションのグループと理論および応用数学のグループの協力のもとに研究を行ったもので得られた成果のおもなものは以下のとおりである.(1)ビームプラズマの不安定波の成長過程でソリトン放出が安定化に作用することが明らかになった.また, Sine-Gordon系において不安定平衡点から安定点への移転でソリトンの放出が重要であることが示された.(2)プラズマシース領域からのソリトンの反射の過程が実験と理論の両面から調べられ,反射機構が明らかにされた.(3)負イオンを含むプラズマのソリトン過程が詳細に調べられ,高次の非線形効果が及ぼす影響が調べられた.(4)不均一プラズマにおける大振幅ソリトンの伝播特性が計算機実験により詳細に調べられた.また,層状構造を持った媒質や,複雑な磁場配位の中でのソリトンの伝播の理論的研究が行われるなど,従来の摂動理論の枠で扱えない非線形過程が考察が始められた.(5)プラズマの非線形過程について大規模な計算機シミュレーション研究が行われ,プラズマ運動における散逸構造の出現とエネルギー緩和過程の関連,高周波場のコラップス過程,大振幅波による粒子加速などの機構が定量的に解析されるようになった.(6)厳密解法についての数学理論の基礎付けが行われ,非線形散逸効果を含む過程におけるソリトン的なパルス解の存在,戸田分子方程式の解の構成と新しいソリトン方程式の発見など,多くの成果があった.全体を2グループに分けて、リアルな状況下におけるプラズマ波動の非線形現象の整理とその解析的理論の研究を進めてきた。1.リアル・プラズマのソリトン現象:主として実験や計算機シミュレーションにより、プラズマの非一様性,外力,不安定性,散逸性などが、コヒーレント波動構造の生成・成長・減衰・相互作用などに対して、どのような影響を及ぼすか調べた。(イ)プラズマの磁気平衡に於ける安定配位ならびに準安定配位の形成に関連した計算機シミュレーションにより、それらの過程のダイナミックスが追及されている。(ロ)計算機シミュレーションにより、プラズマ内を伝播する大振幅波の波面構造や、その内部での粒子の加速機構や加熱効果に関連した興味ある現象が見出されている。(ハ)イオン波の非線形反射過程や負イオンプラズマの非線形波動伝播,位相空間に於けるホール構造の形成,ビーム系での不安定波の非線形結合や飽和過程などの実験が進められた。2.不完全ソリトン系の力学過程:主として理論解析の立場から、摂動効果によってソリトンの個性保存が破れるような状況下でどのような非線形現象が起こるかを調べた。(ニ)不均一系や不安定系に於ける逓減摂動法の拡張が、ビーム系やシアー磁場系での非線形波動の具体例と関連して進められた。(ホ)外力や不均一効果などの摂動を受けたソリトン系の解析的取扱いが、多自由度力学系の摂動理論との関連で進められた。(ヘ)散逸系を含めて、非線形微分方程式や差分方程式の厳密解法が双1次形式理論の拡張を通じて展開された。
超新星ニュートリノによる非標準相互作用の探索

現在の素粒子物理学の標準理論には、ニュートリノの小さな質量の起源や暗黒物質の正体などの未解決問題が数多く残されており、標準理論を超える新しい物理の探索は素粒子・宇宙物理学の喫緊の研究課題となっている。本研究では非標準相互作用と呼ばれる標準理論の枠組みでは説明のできない現象論的な有効ラグランジアンを重力崩壊型超新星内部におけるニュートリノ輸送計算に導入する。非標準相互作用による電子、反電子型ニュートリノのスペクトルの変化を明らかにし、非標準相互作用の実証可能性を探る。
熱ショックタンパク質が骨格筋ＡＭＰＫ／ＳＩＲＴ１活性増強に及ぼすメカニズムの解明

近年、骨格筋におけるheat shock protein(HSP)72の発現増加が耐糖能障害を改善する可能性が報告されているが、そのメカニズムは不明な点が数多く残されている。当初の本研究では、ラットへの熱刺激や薬剤負荷によって骨格筋のHSP72を増加させた状態を作成し、糖代謝活性の変化やそのメカニズムについて検討する予定であった。しかしこの研究過程において、ラット単離骨格筋に対して短時間(30分以内)の温熱刺激(42°C)を与えると、HSP72が増加しないにもかかわらず、糖代謝の重要過程である骨格筋糖輸送が亢進することを見出した。さらに糖輸送亢進のメカニズムとして、糖代謝制御分子である5' AMP activated protein kinase(AMPK)が活性化され、glucose transporter(GLUT)4のトランスロケーションが誘導されることが示唆された。また、温熱刺激はエネルギー代謝の指標であるグリコーゲン貯蔵量を有意に減少させ、グリコーゲン合成速度を有意に亢進させた。一方、温熱刺激はタンパク質合成シグナルを負に制御することが示された。したがって、温熱刺激によって骨格筋内へ取り込まれたグルコースは、グリコーゲン合成を促進させ、枯渇したグリコーゲンを補充するために利用されると推察される。今回の検討では、温熱刺激はグリコーゲン合成速度を有意に亢進させることが明らかとなり、運動類似の生理学的作用を有する可能性が示唆された。温熱刺激が運動類似効果を有するのであれば、怪我や疾病、加齢により運動が困難になった人に対する、骨格筋糖代謝機能の維持・改善を目的とした運動擬似効果を得るための物理療法になる可能性を示唆している。さらに今回の研究は、短時間の温熱刺激がHSP72とは独立して、骨格筋糖代謝を急性的に亢進する可能性を示唆する有力な結果であることがいえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年、骨格筋におけるheat shock protein(HSP)72の発現増加が耐糖能障害を改善する可能性が報告されているが、そのメカニズムは十分には明らかではない。当初、本研究では、ラットへの熱刺激や薬剤負荷によって骨格筋のHSP72を増加させた状態を作成し、糖代謝活性の変化やそのメカニズムについて検討する予定であった。しかしこの研究過程において、ラット単離骨格筋に対して短時間(30分以内)の熱刺激(42°C)を与えると、HSP72が増加しないにもかかわらず、糖代謝の重要過程である糖輸送(glucose transport)が亢進することを見出した。さらに糖輸送亢進のメカニズムとして、糖代謝制御分子である5'-AMP-activated protein kinase(AMPK)が活性化され、glucose transporter(GLUT)4のトランスロケーションが誘導されることが示唆された。一般にAMPK活性化は細胞内エネルギーの減少に伴って生じることが知られているが、骨格筋細胞のエネルギー指標であるATP、クレアチンリン酸、グリコーゲン量は熱刺激によっていずれも減少した。一方、AMPKとは独立して骨格筋の糖輸送促進に関与するとされるインスリンシグナル分子ならびにCa2+ /calmodulin-dependent protein kinase IIに変化は見られなかった。これらは、短時間の熱刺激がHSP72と独立して、骨格筋糖代謝を急性的に亢進する可能性を示すものである。本研究は2年計画で実施され、平成26年度で1年目が終了した。これまでの研究で、短時間の熱刺激が糖輸送を亢進させること、さらにはその作用機序に、骨格筋細胞内エネルギー状態の低下を介したAMPK活性化が関与していることが示唆されている。これらの知見は現在、原著論文として国際的専門誌に投稿準備中である。

以上のことから、現在の研究が順調に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。熱刺激を骨格筋糖代謝機能の維持・改善を目的とした治療法として臨床応用を目指すには、熱刺激によって生じる骨格筋糖輸送の生理学的意義や分子メカニズムの詳細を追求する必要があると考える。また、糖のみならずタンパク質代謝に与える影響を検討することも重要である。来年度は今年度に引き続きラット単離骨格筋を用いて、熱刺激がグリコーゲン合成とタンパク質合成に及ぼす影響を検討することを中心課題に据えながら、熱刺激が骨格筋に与える生理学的役割を総合的に明らかにしていく予定である。
高次生命機能システムを支えるエキソサイトーシスのしくみ

高次生命機能システムの獲得や発現・維持は、細胞外の環境に応じて細胞同士が情報交換し、個々の細胞機能が系全体として統括されることによって成立する。細胞内小胞輸送の主要経路であるエキソサイトーシスは、その統括機構の本体として重要な役割を担っていると考えられる。本研究は、器官形成時の細胞間接着形成および神経発生・再生時の神経突起伸長・シナプス形成に注目し、高次生命機能システムの獲得におけるエキソサイトーシスの制御機構を明らかにすることを目的とする。本研究は、器官形成時の細胞間接着形成および神経発生・再生時の神経突起伸長・シナプス形成に注目し、高次生命機能システムの獲得および発現・維持におけるエキソサイトーシスの制御機構を明らかにすることを目的としている。これまでにRab13とJRABが接着分子の細胞膜への輸送を制御することを見出していたが、本研究では、Rab13との結合に依存したJRABの構造変化が細胞間接着形成に先立つ、または伴うダイナミックなアクチン細胞骨格の再編成と細胞間接着が構築された後の安定的なアクチン細胞骨格の制御の精巧な調節に関与することを示してきた。さらに、本年度の本研究では、アクチン結合蛋白質であるFilaminを新たなJRAB結合蛋白質として同定し、JRABがその構造依存的にFilaminとの相互作用を変化させながらNIH3T3線維芽細胞におけるアクチン細胞骨格の再編成を制御していることを明らかにした。本研究の成果から、現段階では、接着分子を運んできたRab13との結合に依存したJRABの構造変化、および、それに伴ったFilaminをはじめとするアクチン細胞骨格に関連する分子群との多彩な相互作用が細胞間接着形成過程に認められる小胞輸送とアクチン細胞骨格の再編成のクロストークを可能にすると予想している。さらに、本研究ではRab13とJRABの各ノックアウトマウスを作製しており、現在、これらのマウスを用いて、特に、神経発生・再生時の神経突起伸長・シナプス形成におけるRab13-JRAB系の役割について組織学的および行動学解析を行っている。高次生命機能システムの獲得や発現・維持には、担当細胞同士が情報交換し、細胞外の環境に応じて個々の細胞機能が系全体として統括されることが必要である。その統括機構の本体は、小胞輸送の主要経路であるエキソサイトーシスと考えられる。本研究では、器官形成時の細胞間接着形成および神経発生・再生時の神経突起伸長・シナプス形成に焦点を当てて、高次生命機能システムの獲得におけるエキソサイトーシスの制御機構を明らかにすることを目的とする。本年度の本研究では、Rab13-JRAB系によりエキソサイトーシスされる小胞のcargoの候補となる膜蛋白質を見出し、その輸送の制御と神経突起伸長・シナプス形成との関係を明らかしつつある。また、これまでに上皮細胞においてRab13とJRABが接着分子の細胞膜への輸送を制御することを見出してきたが、本研究ではRab13との結合に依存したJRABの構造変化が細胞間接着形成に先立つ、または伴うアクチン細胞骨格の再編成を精巧に調節していることを示した。具体的には、複数のアクチン結合蛋白質を新たなJRAB結合蛋白質として同定し、JRABがその構造依存的にアクチン結合蛋白質群との相互作用を変化させながらアクチン細胞骨格の再編成を統合的に制御していることを明らかにした。現段階では、Rab13-JRAB系が細胞間接着形成過程に認められる小胞輸送とアクチン細胞骨格の再編成のクロストーク機構に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。さらに、本研究ではRab13とJRABの各ノックアウトマウスを作製しており、現在、これらのマウスを用いて、Rab13-JRAB系の作用機構について個体レベルの解析を行っている。本研究では、Rab13-JRAB系について細胞間接着形成および神経突起伸長・シナプス形成におけるエキソサイトーシスの作用機構の一部を解明できたが、ノックアウトマウスを用いた個体レベルの解析が期間内に終了できなかった。本研究で作製したRab13とJRABのノックアウトマウスにつき、個体レベルの解析を引き続き行う。物品費155万円旅費15万円次年度への繰越額2,730円は4月に支払済である。
アミノ酸バランスを感知し、細胞機能を制御するシステムのプロテオーム解析

(1)プロテオーム解析系の確立:部分精製蛋白質や哺乳細胞のlysate・細胞分画をSDS-PAGEによる1次元電気泳動、あるいは等電点電気泳動と・SDS-PAGEによる2次元電気泳動で展開し、蛋白を分離、染色を施す。スポットを切り出し消化後、得られたペプチドをハイブリッド型質量分析計(Q-TOF)あるいはMALDI-TOF型質量分析計で解析し、検出された質量の値を用いてデータベースから蛋白を同定するという蛋白質のプロテオーム解析系を確立した。MS/MS法を用いたアミノ酸配列の決定法も確立した。(2)アミノ酸バランスの変化に伴う蛋白発現変動のプロテオーム解析:哺乳細胞をアミノ酸を含む、または含まない培養液で処理後、上記の要領でプロテオーム解析を行なった。しかし、細胞のlysateや細胞分画をサンプルとした場合、画像解析システムで量的変動がみられるスポットはごくわずかであり、また再現性に問題があり、改善が必要と思われた。(3)アミノ酸バランスの変化に伴うmTORの翻訳後修飾の解析:リン酸化されたmTORを消化し、質量分析計で分析。質量変化に基づき複数のリン酸化部位を同定した。このリン酸化部位に点変異を導入し、mTOR機能に及ぼす影響を検討中である。(4)今後の展望哺乳細胞のlysateを2次元電気泳動で分離し、その量的変動を捕らえることはかなり困難であると思われる。今後は、全体の蛋白を相手にするのではなく、ある基準を決定し、それに合致した蛋白群・翻訳後修飾にfocusし、解析法を考える必要性がある。たとえば、アミノ酸変動に伴うリン酸化蛋白質にfocusした解析などを開発していく予定である。
西南アラスカ原住民(エスキモ-とアリュ-ト)の言語学的調査

当初の予定どおり、昭和63年度から平成2年まで、三次にわたる現地調査を中心とした資料蒐集ならびに現地研究者(招へい)との共同討議によって、西南アラスカで話されるエスキモ-語とアリュ-ト語にかんする文法面と音声面の分析と記述の深化を図ってきた。さらに、副次的ながら、言語人類学的視点を加味して、語彙資料の蒐集をもおこなった。平成元年からは、大学院生を研究協力者にくわえて、エスキモ-・アリュ-ト語の近隣言語(アサバスカ語など)についての予備的調査にもあたらせた。エスキモ-語については、音韻論、形態論、統語論の諸分野にまたがる概括的な文法を準備する基礎を固めることができた。もとより、悉皆的な調査というにはほど遠く、細部にわたる問題は多く残っており、また、とりわけ語用論についての情報は、今後の調査に俟たなければならない。しかし、このエスキモ-語が、平成2年度の研究実績報告書で触れたように、形態論と統語論がユニ-クに絡みあう世界でも珍しいタイプの言語であるという事実からするならば、今回の研究計画で得ることができた理解にもとづく、詳細な記述が一般的な言語理論にも重要な寄与となりうることが期待できる。アリュ-ト語については、音声面と語彙面にいくぶん力点を傾けた調査がすすめられ、とりわけ音声面のうち、この言語にかんする難題として存在してきた母音脱落について解決の見通しがたったことは、重要な成果というべきであって、その一部は国際学会での発表となった。この言語にかんしては、しかしながら、文法面での調査研究が今後のおおきな課題として控えており、継続的な現地調査がさらに続けられる必要がある。アラスカ原住民の言語は、ほとんどが消滅の危機にたっており、エスキモ-語とアリュ-ト語の関連からだけであっても、その他の近隣の言語の調査に緊急に着手することが必要である。今回の研究計画において、それらの言語の予備調査にあたらせた2名の大学院生は、それぞれの地域においてラポ-ルを見事に確立し、今後、順調な調査をすすめる基盤を固め、調査研究の力をも実地において高めることができた。対象とすべき言語の実態を考えると、今後ますます、若手研究者の活躍が必要とされるなかで、これら両名の成長は、あらたな希望を抱かせるものである。わが国からの、これら有能な若手研究者の派遣が、当学術調査の成果をより実りあるものとするのみならず、調査研究の緊急度がきわめて高い当分野における国際的寄与をさらに高める上でも、きわめて重要な意味をもちうるという期待は、ひとり我々の抱くところに留まらず、はやくも、現地研究者からも寄せられているところである。3年にわたる今回の研究計画の成果は、今後、参加者が個別に、あるいは、結集して、さまざまな刊行物に纏めあげる計画がすでに立てられつつある。のみならず、われわれ(協力者もふくむ)が中心となって、平成元年5月に開いたシンポジウム「北の言語類型と歴史」(於北海道大学)ですでに具体的な成果の一部が公表され、さらに、同シンポジウム全体の成果が平成2年末に約500ペ-ジの研究書として出版(三省堂)されるべく、現在、準備が進行中である。日本とカリフォルニアをひとまず南限においた環北太平洋地域は、言語的、すなわち、類型的ならびに系統的多様性がひときわ眼にたつ、ひとつの連続体であるとすれば、その要というべきアラスカの言語研究は、今後、東北アジアと北アメリカ北西部の諸言語にもしだいに関与を深めていく必要がある。

今回の研究計画において、それらの言語の予備調査にあたらせた2名の大学院生は、それぞれの地域においてラポ-ルを見事に確立し、今後、順調な調査をすすめる基盤を固め、調査研究の力をも実地において高めることができた。対象とすべき言語の実態を考えると、今後ますます、若手研究者の活躍が必要とされるなかで、これら両名の成長は、あらたな希望を抱かせるものである。わが国からの、これら有能な若手研究者の派遣が、当学術調査の成果をより実りあるものとするのみならず、調査研究の緊急度がきわめて高い当分野における国際的寄与をさらに高める上でも、きわめて重要な意味をもちうるという期待は、ひとり我々の抱くところに留まらず、はやくも、現地研究者からも寄せられているところである。3年にわたる今回の研究計画の成果は、今後、参加者が個別に、あるいは、結集して、さまざまな刊行物に纏めあげる計画がすでに立てられつつある。のみならず、われわれ(協力者もふくむ)が中心となって、平成元年5月に開いたシンポジウム「北の言語類型と歴史」(於北海道大学)ですでに具体的な成果の一部が公表され、さらに、同シンポジウム全体の成果が平成2年末に約500ペ-ジの研究書として出版(三省堂)されるべく、現在、準備が進行中である。日本とカリフォルニアをひとまず南限においた環北太平洋地域は、言語的、すなわち、類型的ならびに系統的多様性がひときわ眼にたつ、ひとつの連続体であるとすれば、その要というべきアラスカの言語研究は、今後、東北アジアと北アメリカ北西部の諸言語にもしだいに関与を深めていく必要がある。
動脈硬化症におけるスカベンジャー受容体と変性LDLの分子遺伝学

わが国における成人死亡原因の最大の要因の1つである動脈硬化症の抜本的予防,治療法の開発を目指し,本研究はその決定的段階であるコレステロールが血管壁に沈着し泡沫細胞を形成する機構の分子レベルでの解明と,その治療法の開発を集学的に進めた。第一に,コレステロールが血管壁のマクロファージヘスカベンジャー受容体を介してとりこまれる分子機構を明かにし,第二に,LDLの変性が脂質ラジカルを介する一連の過程で進行すいること,第三にLDLの変性抑制剤の作用機構の検討をすすめ,動脈硬化の新しい治療法の基礎をつくる成果をあげた。(1)マクロファージのスカベンジャー受容体cDNAを4種の動物でまた染色体遺伝子をヒトおよびマウスでクローニングしその全構造をきめた,スカベンジャー受容体の6つのドメインの細胞生物学,および蛋白質工学による解析からアセチルLDL,酸化LDLの受容体との結合の分子機構を解明した。またスカベンジャー受容体遺伝子の全構造を決定し,そのプロモーター構造を明かにし,3種の遺伝的多型性を発見した。(2)LDLの酸化は,ラジカルの産生方法に依存して進展するが,コレステロールエステルのラジカルの連鎖反応からアポBの変性がすすむとスカベンジャー受容体を介して泡沫細胞形成をひきおこすと共にマクロファージの状態を変化させる,LDLのみならずHDLも酸化され動脈壁からのコレステロールひきぬきの能力を失うことがわかった。(3)LDLの変性抑制剤として,従来より知られるプロブコール,ビタミンEなどと,新規に開発されたLDL特異抗酸化剤の比較検討をすすめ,動脈硬化進展抑制のためには,第一にLDLに親和性の高いこと,第二にLDLのcoreの脂質の酸化を防ぐこと,第三にマクロファージからのコレステロールの逆転送を促進すること,をみたす薬物が有効であることがわかった。変性LDLがスカベンジャ-受容体を介してマクロファ-ジに取り込まれ泡沫細胞を形成し、動脈硬化を進展させるメカニズムの解明とその抑止による動脈硬化治療法につき検討をすすめた。1)LDLの変性機構の解析LDLの変性を様々なラジカルの産生方法を用いて比較検討した。マクロファ-ジによるとりこみは、CuSO4,AAPH,AMVNなどラジカルの与え方による差異はすくなくLDLが酸化されれば、マクロファ-ジにとりこまれることがわかった。2)HDLの酸化がおこることを示し酸化HDLはコレステロ-ルの逆転送能力を失い、動脈硬化をさらに促進させることが判った。3)マウスの腹腔マクロファ-ジを用いたLDL抗酸化剤のスクリ-ニング法(児玉他、一般研究B、2454507成果報告書参照)をもちいて、種種のLDL抗酸化剤のマクロファ-ジへのコレステロ-ル取り込み抑制能力を検討した。LDLの酸化抑制のためには、LDLのcore脂質へ局在することが大切であることなどがわかり新規薬物のなかには、従来のプロブコ-ルより10倍以上強力な抗酸化作用のものも発見された。4)スカベンジャ-受容体の変性LDLとの結合は、コラ-ゲン様ドメインが大切なことが知られるが、蛋白工学の手法を用いて、このドメインの337番目のリジンを中心とする陽性荷電のアミノ酸のクラスタ-が陰性荷電の巨大分子とインタラクションすることが解明された。5)スカベンジャ-受容体の1型2型それぞれ特異抗体を作成し、動脈硬化病巣には、両方とも発現していることが明かとなった。6)相同組換えによりスカベンジャ-受容体の遺伝的異常をゆうするembryonal stem細胞(ES細胞)の樹立に成功し、スカベンジャ-受容体の遺伝子異常をゆうするキメラマウスの作成に成功した。

本年度は、第一にスカベンジャー受容体の構造と機能,第二にLDLの変性機構,第三にLDLの変性抑制剤の検討をすすめ,血管壁における動脈硬化の細胞レベルでの成因の解明と,それに基づく治療法の開発が進んだ。(1)ヒトスカベンジャー受容体遺伝子の構造解析をすすめ,染色体8番の120kbの遺伝子のエクソン・イントロン構造,プロモーター配列を決定し,さらに3種のRFLPにもとずく多型性を発見した。ヒト,ウシ,マウスにつづきウサギcDNAの全配列を決定した。蛋白質工学に基ずくリガンド結合ドメインの解析より,コンピューターモデリングにより受容体とリガンドの結合モデルを作成した。アセチルLDLと酸化LDLのスカベンジャー受容体への結合の37°Cにおける差異が明かとなり,動脈硬化にいたる変性LDLの取り込み機構がはじめて分子レベルで明かとなった。(2)LDLの酸化をひきおこすラジカルの産生方法に,金属イオン(CuSO4),化学物質(AAPH,AMVN),酵素(lipoxygenase)の各種を検討し,そのいずれもが,LDLcoreの脂質(コレステロールエステル)のラジカル産生をひきおこし,スカベンジャー受容体を介する取り込みにつながることが証明された。(3)LDLの変性抑制剤の作用機構の解析をin vivo(WHHLウサギ)およびin vitroで進めた。LDLの抗酸化剤の作用の比較からコレステロールエステルのラジカルの産生を抑制することが抗動脈硬化に重要と思われた。この結果をもとに従来よりしられる抗酸化剤と新規に合成されたLDL抗酸化剤の作用の比較をすすめ,従来最も有効なプロブコールより強力な作用が確認された。さらにプロブコールがWHHLウサギ肝臓でコレステロールエステル転送蛋白のmRNAの発現を誘導することが証明された。