hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウスES細胞から分化誘導した膵島細胞のアロ免疫原性に関する研究

平成16年度は,研究計画に従って,研究を遂行し,以下の結果を得た.McKayらの方法(Science 2001;292:1389)に準じて,未分化マウスES細胞からインスリン分泌可能膵島様細胞集塊(insulin-secreting pancreatic islet clusters)の分化を試みた.しかしながら,最近報告されている通り,McKayらの報告しているようなclusterの分化誘導は困難であった.その結果,以下の実験では,ある程度未分化な状態のES細胞をマウスの腎皮膜下に移植し,in vivoでの分化誘導を試みた.マウスの腎皮膜下への顕微鏡下での移植は,技術的には全く問題なく行えた.2週間後にマウスを犠牲死させ,腎臓を摘出し,組織学的に検討したところ,約60%と高率に奇形腫と思われる組織が観察された.したがって,やはり移植時の分化度の低さが大きな問題である事が判明した.一部には,膵島様にみられるものもあり,免疫染色にて,それらがinsulin陽性であることを確認した.より安定した分化誘導を行うために,さらに奇形種の発生を抑制する方法を確立しようと種々の試みを行ったが,現在までに有効な方法は確立し得なかった.これらの結果に基づいて,今後,さらにより特異的な分化誘導を行うために,内胚葉由来ES細胞を用いて,同様のin vivoでの検討を試みることを計画している.平成15年度は,研究計画に従って,研究を遂行し,これまでに以下の結果を得た.McKayらの方法(Science 2001;292(5520):1389-94)に準じて,未分化マウスES細胞からインスリン分泌可能膵島様細胞集塊(insulin-secreting pancreatic islet clusters)の分化を試みた.しかしながら,最近になって,報告されている通り,McKayらの報告しているようなclusterの分化誘導は困難であった.その結果,以下の実験では,ある程度未分化な状態のES細胞をマウスの腎皮膜下に移植し,in vivoでの分化誘導を試みた.マウスの腎皮膜下への顕微鏡下での移植は,技術的には全く問題なく行えた.2週間後にマウスを犠牲死させ,腎臓を摘出し,組織学的に検討したところ,約60%と高率に奇形腫と思われれる組織が観察された.したがって,やはり移植時の分化度の低さが大きな問題である事が判明した.一部には,膵島様にみられるものもあり,現在insulin染色にて,それらを確認中である.来年度は,安定して,分化誘導を行うためにもう一度,in vitroでの検討を行うと同時に,in vivoにおいて,さらに詳細にES細胞移植後の形態変化を経時的に観察し,teratomaの発生を抑制する方法を確立し,実験計画の目的であるアロ免疫原性について検討を進める予定である.平成16年度は,研究計画に従って,研究を遂行し,以下の結果を得た.McKayらの方法(Science 2001;292:1389)に準じて,未分化マウスES細胞からインスリン分泌可能膵島様細胞集塊(insulin-secreting pancreatic islet clusters)の分化を試みた.しかしながら,最近報告されている通り,McKayらの報告しているようなclusterの分化誘導は困難であった.その結果,以下の実験では,ある程度未分化な状態のES細胞をマウスの腎皮膜下に移植し,in vivoでの分化誘導を試みた.マウスの腎皮膜下への顕微鏡下での移植は,技術的には全く問題なく行えた.2週間後にマウスを犠牲死させ,腎臓を摘出し,組織学的に検討したところ,約60%と高率に奇形腫と思われる組織が観察された.したがって,やはり移植時の分化度の低さが大きな問題である事が判明した.一部には,膵島様にみられるものもあり,免疫染色にて,それらがinsulin陽性であることを確認した.より安定した分化誘導を行うために,さらに奇形種の発生を抑制する方法を確立しようと種々の試みを行ったが,現在までに有効な方法は確立し得なかった.これらの結果に基づいて,今後,さらにより特異的な分化誘導を行うために,内胚葉由来ES細胞を用いて,同様のin vivoでの検討を試みることを計画している.
ナノスケール強磁性体円盤配列の磁気的性質と電子輸送に関する研究

本研究では超高密度磁気記録媒体用材料として注目されているL1_0型強磁性合金Fe-Ptのシングルバリアント状態の単結晶を作製し、熱アシスト式磁気記録の開発において重要な知見となる結晶磁気異方性の温度依存性を調べた。L1_0型強磁性合金はfcc不相からL1_0相への規則化に伴って発生する弾性エネルギーを緩和するために、異なるc軸配向方位を有するマルチバリアント状態となる。c軸は磁化容易軸であり、マルチバリアント状態では結晶磁気異方性エネルギーを精確に評価することはできない。そこで本研究では810MPaの圧縮応力場中で規則化を行い、c軸を一軸配向させてシングルバリアント状態とした。140kOeまでの強磁場中で磁化測定を行い、結晶磁気異方性定数を決定した。X線回折測定の結果、Fe-Pt合金のc軸は規則化熱処理時に印加された圧縮応力方向に一軸配向した。Sucksmith-Thompson法で決定した結晶磁気異方性定数K_1(T)のと飽和磁化Ms(T)の温度依存性の関係を調べた。一般に、結晶磁気異方性定数の温度依存性はK_1(T)∝M_s(T)^nと記述され、従来は正方対称性を有する強磁性合金ではn=3とされていた。これに対し、シングルバリアント状態の単結晶を用いて高精度に評価したK_1ではn>4であることを示した。本研究で得られたL1_0型強磁性合金における指数nの増大は軸比c/aの温度依存性を用いて定性的に説明できる。強磁性体をナノスケールまで微細加工した磁気記録媒体は記録密度が増大する一方で熱揺らぎの効果が顕著となり記録された情報が不安定となる。媒体に用いる強磁性体として大きな結晶磁気異方性を有するL1_0型規則合金を用いることで微小な強磁性体に対する記録の書き込み、および読み取りを安定に行うことが可能となる。また、基板との格子不整合が存在する場合には磁気弾性結合により弾性エネルギーが磁気的性質に影響を与えることが推察される。L1_0型FePd合金は10^7erg cm^<-3>台の結晶磁気異方性を有しており高密度記録媒体用材料として有望であり、本研究ではL1_0型FePd合金について、記録媒体の記録密度を決定する因子である結晶磁気異方性定数K_Uと磁歪を評価した。L1_0型FePd合金は規則化にともなって磁化容易軸であるc軸が混在した多重双晶組織を形成するため、圧縮応力場中で規則加熱処理を行ってc軸の配向性を制御し、シングルバリアント状態のL1_0型FePd単結晶を作製した。飽和磁場H_Sと飽和磁化M_Sを用いてM_SH_S/2で定義したT=4.2Kでの結晶磁気異方性定数の値はK_U=2.5.×10^7erg cm^<-3>である。結晶磁気異方性の温度依存性はCallen-Callenモデルに良く従い、温度の上昇とともに磁化Mの3.3乗に比例して減少する。a軸、c軸および不規則相の001方向の縦磁歪の値はそれぞれ100×10^<-6>、20×10^<-6>、および60×10^<-6>ある。磁化困難軸であるa軸では不規則相の001方向よりも縦磁歪の値が大きく、c軸方向ではa軸および001方向よりも縦磁歪の値が小さい。本研究では超高密度磁気記録媒体用材料として注目されているL1_0型強磁性合金Fe-PdおよびCo-Ptの単結晶を作製し、磁気記録媒体の熱安定性の指標となる物理量である結晶磁気異方性について調べた。そこで本研究では圧縮応力場中での規則化熱処理を用いて、c軸を一軸配向させたシングルバリアント状態のL1_0型強磁性合金単結晶を作製し、強磁場磁化測定を行って精確な結晶磁気異方性定数を決定した。X線回折測定の結果、Fe-PdおよびCo-Pt合金のc軸は規則化熱処理時に印加された圧縮応力方向に一軸配向した。一軸結晶磁気異方性定数K_Uはc軸方向とa軸方向の磁化曲線で囲まれた面積で定義した。L1_0型Fe-Pd合金の一軸結晶磁気異方性定数K_UはPd濃度の増大に伴って減少する。Fe-Pd合金において軸比c/aはPd濃度の増大に伴って減少し、正方歪が増大する。L1_0型Fe-Pd単結晶を用いて実験的に得られた結晶磁気異方性と正方歪の関係は、線形化されたマフィンティン軌道法を用いた第一原理計算の結果と良く対応する。4.2KにおけるK_Uの値は等比組成でK_U=2.1×10^7erg cm^<-3>となる。L1_0型Co-Pt合金のK_Uを140kOeまでの強磁場磁化測定の結果を用いて決定した。

K_Uの値は等比組成で最大となり、K_Uの温度依存性から求めた0Kへの外挿値は6.5×10^7erg cm^<-3>である。本研究では超高密度磁気記録媒体用材料として注目されているL1_0型強磁性合金Fe-Ptのシングルバリアント状態の単結晶を作製し、熱アシスト式磁気記録の開発において重要な知見となる結晶磁気異方性の温度依存性を調べた。L1_0型強磁性合金はfcc不相からL1_0相への規則化に伴って発生する弾性エネルギーを緩和するために、異なるc軸配向方位を有するマルチバリアント状態となる。c軸は磁化容易軸であり、マルチバリアント状態では結晶磁気異方性エネルギーを精確に評価することはできない。そこで本研究では810MPaの圧縮応力場中で規則化を行い、c軸を一軸配向させてシングルバリアント状態とした。140kOeまでの強磁場中で磁化測定を行い、結晶磁気異方性定数を決定した。X線回折測定の結果、Fe-Pt合金のc軸は規則化熱処理時に印加された圧縮応力方向に一軸配向した。Sucksmith-Thompson法で決定した結晶磁気異方性定数K_1(T)のと飽和磁化Ms(T)の温度依存性の関係を調べた。一般に、結晶磁気異方性定数の温度依存性はK_1(T)∝M_s(T)^nと記述され、従来は正方対称性を有する強磁性合金ではn=3とされていた。これに対し、シングルバリアント状態の単結晶を用いて高精度に評価したK_1ではn>4であることを示した。本研究で得られたL1_0型強磁性合金における指数nの増大は軸比c/aの温度依存性を用いて定性的に説明できる。
酵素反応で定着・除去可能なゲルを形成するバイオプリンタ用インクライブラリの開発

本研究では、再生医療や組織工学分野において、その有用性が広く認識されるようになっているバイオプリンティング技術のなかでも、特に大きな可能性を有しているとされるインクジェット式バイオプリンティングに関する研究を実施した。具体的には、ゼラチンやヒアルロン酸、アルギン酸など、細胞に対して異なる作用を示すことが知られているさまざまな材料を、インクとして用いることを可能とする知見を獲得し、新たなインクを開発するとともに、それらを用いて細胞の生存をほとんど妨げることなく、3次元構造物を造形する技術の開発に成功した。本研究では、バイオプリンタを用いた3次元組織体の作製技術に関して、細胞に穏和な酵素反応により定着(ゲル化)するとともに、細胞の増殖・機能化・組織化を促進し、必要なタイミングで除去可能なゲルを形成するインク材料の開発を行うことを目的としている。平成27年度は、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)の酵素反応によりゲル化する水溶液成分となる現有の高分子材料を用いて、インク材料設計指針獲得のための検討を行った。具体的には、溶液の物性を把握するために、溶液の粘度、表面張力、曳糸性に関して測定を行った。そして、それらとインクジェトノズルから吐出された溶液の飛翔形態を測定することで、溶液物性と吐出可能性の相関を明らかにした。次いで、この検討によってインクジェットノズルからの吐出が可能であることが示された物性の高分子水溶液をHRPにより架橋可能なフェノール性水酸基を導入したアルギン酸誘導体より調製し、バイオプリンタを用いてバイオプリンティングが可能であることを確かめた。この場合には、HRPとアルギン酸誘導体の溶液を一方のノズルから吐出し、他方のノズルから別のインクとして過酸化水素を含むアルギン酸誘導体溶液を吐出した。さらに、HRPによりゲル化可能なアルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ゼラチンの各誘導体から調製したインク溶液を使用して、複数のインク成分を含む三次元ゲルを作製できることを実証するとともに、各成分を徐々に分解・除去できることも実証した。平成27年度の検討項目の目標として設定していた事項をすべてクリアすることができたため。平成28年度は、前年度に得られた知見にもとづいて、アルギン酸、ヒアルロン酸、ゼラチン誘導体が有望なインク材料であることを実証するための検討として、まず、それらのインクから得られるゲルの中に細胞の生存を保ったまま包括できることを確認するための検討を行った。この検討では、微量の過酸化水素を含む溶液中に、細胞を分散させたそれらのインクをインクジェットノズルから滴下し、その際に、粒子径分布の小さな(変動係数5%以下)、細胞包括ゲルビーズを直径20-60マイクロメートルの範囲で、いずれのインクからも作製可能であることを実証した。また、作製直後の細胞の生存率が約90%であり、さらにゲルを分解して培養した細胞が増殖できることから、細胞に対するダメージが極めて低いことを示した。さらに、ゼラチンを含むゲルの中で線維芽細胞が伸展しながら増殖できることを実証した。これらに加えて、それらのインクを使って、前年度よりも複雑な構造を持つ三次元ゲルを作製できることを実証した。具体的には、部分的にインク材料が異なる構造物や、複数の微細なラインを異なるインクなら印刷した表面を持つ構造物などである。すでに複数のインク材料より3次元ゲルの造形が可能であることに加えて、細胞への影響がほとんど無いこと、さらにインク材料に適切な材料を選ぶことで細胞の増殖や伸展をコントロールできることを実証できていることから。おおむね順調に進展しているとした。本年度と同じく、年度初めに設定した検討項目を達成できるよう、計画的に検討を進める。平成29年度は、本研究の最終年度であり、これまでの検討結果を活かして、血管内皮細胞と肝細胞(株化肝がん細胞)から肝臓模倣組織を作製することを目指す。そして、前年度の研究において明らかとなった、血管内皮細胞への過酸化水素の影響を低減するための、細胞保護技術の開発に取り組む。具体的には、過酸化水素から細胞を保護するために、細胞表面にそれを実現するための機構を組み込む。そして、その処理を行った血管内皮細胞を、血管内皮細胞用に機能化したバイオインクに分散させ、一方で肝細胞の増殖に有効なゼラチンをベースとするインクに肝細胞(株化肝がん細胞)を分散させたものを用いて、構造体を作製する。この構造体に対して、アルブミン分泌、アンモニア代謝、シトクロム酵素発現を評価することで、肝臓模倣組織としての有効性を評価する。生物化学工学初年度の検討が終了したところであり、まだ成果の発信は行っていない。
植物の組織形成を規定するリン酸とピロリン酸の濃度バランス

ピロリン酸(PPi)は核酸、タンパク質、多糖の生合成、脂肪の代謝の過程で生ずる代謝副産物であり、PPiを反応系から除去できなければ、これらの高分子合成は抑制される。一方、植物にはPPiを利用する酵素も存在し、PPi濃度の過度な低下も生育に負の影響を与える。細胞質PPiを無機リンに加水分解する酵素として、液胞膜H+輸送性ピロホスファターゼ(V-PPase)と可溶性ピロホスファターゼ(sPPase)が存在する。本研究は、これらの酵素がPPi濃度を適切に維持する機構を明らかにし、単純な無機化合物による形態形成制御という現象を深く理解することを目的とした。二重破壊株V-PPaseとsPPaseは、低張液で根端が破裂するが、根端でセルロース量が大幅に減少していることを組織染色により実証した。細胞壁成分の化学分析においてもグルカンの低下を検出した。V-PPase欠失株では培地窒素源にアンモニアが含まれない場合、本葉の萎縮という表現型が出現する。組織の萎縮はPPiの蓄積による細胞壁とクチクラ層の弱体化が原因と考えられる。また、アンモニアのほかに、アルギニンの培地添加も萎縮を顕著に抑制することを見出した。硝酸は地上部、アンモニアは根で主に同化されることから、硝酸限定条件では窒素代謝で生成するPPiが地上部に集中するため、V-PPase欠失株ではPPi加水分解能力を超えてしまうと推定した。V-PPase発現量の極端に低い根端コルメラ細胞において、V-PPaseを異所発現させるとデンプン量の減少が見られたが、逆に発現量の極端に高い蜜腺では、開花に伴いV-PPaseとsPPaseが増加すること、遺伝子破壊株において蜜成分の量が減少することを発見した。V-PPaseとsPPaseが組織毎にPPiレベルを調節することでそれぞれ最適な糖の流れを決定していると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。ピロリン酸(PPi)加水分解酵素の機能欠失株の研究から、PPiが関わる代謝は植物の形態形成に大きな影響を与えることが明らかになった。PPiは核酸、タンパク質、多糖の生合成、脂肪の代謝の過程で生ずる代謝副産物である。PPiを反応系から除去できなければ、これらの高分子合成は停止または抑制される。一方、植物にはPPiを必要とする酵素も存在し、PPi濃度の過度な低下も生育に負の影響を与える。細胞質PPiを加水分解する酵素として液胞膜H+輸送性ピロホスファターゼ(H+-PPase: FUGU5)と可溶性ピロホスファターゼ(sPPase: PPa1PPa5)が存在する。これらの酵素によって適切なPPi濃度が維持される機構を明らかにし、単純な無機化合物による形態形成制御という現象を深く理解することを目的とする。組織中のPPi定量実験により、H+-PPaseとsPPaseの二重破壊株では、PPi濃度が野生型の6倍、fugu5株の3倍もの極めて高い値であるのに対し、sPPase欠失株の一種ppa1株は野生型と同程度であった。この結果は、H+-PPaseとsPPaseがともにPPi加水分解に寄与し、細胞質PPi濃度の抑制に働くという仮説を強く裏付ける。上記二重変異株ではデンプンが過剰蓄積するが、この現象がfugu5株でも見られることを発見した。VHP1が殆ど検出されない根端コルメラ領域において、この領域特異的にVHP1を発現させた株では、糖制限下において、デンプン量がコントロールと比較して減少することを見出した。コルメラ領域では、VHP1を発現させないことでPPi濃度を高く保ち、糖欠乏時にもデンプンの合成を促進し、分解を抑制するよう調節されていると推定される。この結果は、PPi濃度が組織あるいは細胞で一様ではなく、細胞の機能に応じて調節されていることを示す。無機ピロリン酸PPiの濃度調節には液胞膜のH+-PPaseと細胞質の可溶性PPaseが関わると予測し、それぞれの機能欠失株を調製し、さらにH+-PPaseとsPPaseに多重機能欠失株を作出することで、各遺伝子産物の代謝上の機能を検定した。その結果、液胞膜H+-PPaseの働きに大きな役割があることが判明した。細胞質型sPPaseには5種類あり、その役割の大きさを推定していたが、結果は、その推定と異なっていた。すなわち、液胞膜H+-PPaseがどの細胞においても基幹的なPPi加水分解酵素として機能し、各種sPPaseは組織特異性を持ちつつ、液胞膜H+-PPaseの機能を補完する役割を果たしていることが見えてきた。これらの機能分担は、当初想定していなかった成果である。各種sPPaseの組織特異性についても研究成果が得られ、包括的な議論が可能となってきた。以上を総合して、当初の計画以上に進展したと判断している。

本研究は、これらの酵素がPPi濃度を適切に維持する機構を明らかにし、単純な無機化合物による形態形成制御という現象を深く理解することを目的とした。二重破壊株V-PPaseとsPPaseは、低張液で根端が破裂するが、根端でセルロース量が大幅に減少していることを組織染色により実証した。細胞壁成分の化学分析においてもグルカンの低下を検出した。V-PPase欠失株では培地窒素源にアンモニアが含まれない場合、本葉の萎縮という表現型が出現する。組織の萎縮はPPiの蓄積による細胞壁とクチクラ層の弱体化が原因と考えられる。また、アンモニアのほかに、アルギニンの培地添加も萎縮を顕著に抑制することを見出した。硝酸は地上部、アンモニアは根で主に同化されることから、硝酸限定条件では窒素代謝で生成するPPiが地上部に集中するため、V-PPase欠失株ではPPi加水分解能力を超えてしまうと推定した。V-PPase発現量の極端に低い根端コルメラ細胞において、V-PPaseを異所発現させるとデンプン量の減少が見られたが、逆に発現量の極端に高い蜜腺では、開花に伴いV-PPaseとsPPaseが増加すること、遺伝子破壊株において蜜成分の量が減少することを発見した。V-PPaseとsPPaseが組織毎にPPiレベルを調節することでそれぞれ最適な糖の流れを決定していると考えられる。液胞膜H+-PPaseと各種sPPaseの多重変異株について、形態、生育度合いも含めて詳細を定量的に解析する。かつそれらの組織におけるPPi濃度の正確な測定方法を改善、確立することで、液胞膜H+-PPaseと各種sPPaseのPPi濃度維持への寄与度を定量的に議論する基盤をつくる。次年度は、これらの知見を論文としてまとめ国際誌に投稿する予定である。また、これらの酵素の機能欠失株が、アンモニアを含まない培地で生育させると壊死する現象について、壊死に至る過程、特定の組織のみに壊死が生ずる原因を解析する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
海馬皮質における視床入力情報処理回路の形態学的解析

記憶情報処理は、海馬体ー嗅内野系と乳頭体ー視床前核に代表される間脳系との相互作用で行われている。本研究では、海馬体・嗅内野系に対し視床投射線維がどのように関与するかを形態学的に解析している。平成9年度は、視床前核群から入力を受ける前海馬台の皮質性入出力結合について、ラットを用い、PHA-L,WGA-HRPなどのトレーサー方によって解剖学的に調べた。皮質性入力:同側海馬台の乳頭体投射細胞、内側嗅内野のIII層細胞(両側)、II・V層細胞(同側)、嗅脳溝周囲皮質III・V層細胞(同側)、顆粒性脳梁後部皮質V層細胞(両側)からの投射があった。また、無顆粒性脳梁後部皮質III・V層、および前障からも少量の投射があった。皮質性投射:主として内側嗅内野と前海馬台へ投射した。そして、前海馬台II層細胞は両側の前海馬台内の長軸方向の連合性結合に関与し、III層細胞は両側嗅内野III層に濃密に投射することが判った。また、III層細胞からは、前海馬台VI層への結合も見られた。前海馬台VI層からは、同側の内側嗅内野V/VI層への投射があった。ほかに、前海馬台からは、顆粒性脳梁後部皮質、前頭葉皮質へも少量の投射が見られたが、外側嗅内野への投射は明らかでなかった。この研究によって,視床入力が複数の経路によって内側嗅内野に収斂することが明らかとなった。すなわち、AD核、AM核はV-VI層に直接投射するとともに、AV・AD核からの入力は前海馬台を経由して、内側嗅内野I、III、VI層へ投射する。さらに、CA1からはVI層に、海馬台からはV層に投射している。Papez回路を経由して海馬および周辺皮質へ戻ってくる回路は非常に複雑であり、今後、視床入力情報が海馬領域でどのように広がり、どのような回路を形成しているかを知るためには、それぞれの皮質領野での局所回路の形態解析が必要である。
最適潜在分布を用いた学習推論モデルの設計原理

機械学習法の性質を情報理論における圧縮限界から特徴づけ、学習法の設計論を構築するための各部分課題に関し、以下のような成果が得られた。レート歪み関数は歪み有りデータ圧縮における歪みと圧縮率の間の最適なトレードオフ関係を示す。スパース線形回帰符号は、貪欲法によるスパース推定の考え方を用いた歪み有り圧縮法であり、二乗損失においてレート歪み関数を達成することが証明された。スパース線形回帰符号を、絶対損失の場合に拡張し、二乗損失に特化した従来法を改良した成果について共同研究者が口頭発表を行った。また、近似メッセージ伝搬法を用いた実装の性能評価により、従来の貪欲法に比べ、より詳細なパラメータ調整が必要なことがわかった。レート歪み関数を求める確率分布の最適化問題とその最適解に関する研究とその最近の進展ついて、電子情報通信学会総合大会チュートリアルセッションにおいて招待講演を行った。ディリクレ過程(DP)平均法は、効率的な計算量でクラスタ数の推定が可能なクラスタリング手法として提案された。DP平均法について、最大歪みや外れ値への頑健性をもつ歪み尺度を含む拡張とその有効性を示し、情報理論分野の国際会議、国内会議において共同研究者が口頭発表を行った。事象の有無を表す2値系列から生成確率の時間変動を予測する問題において、近似の上でミニマックス最適性を持つ予測手法を開発し、共同研究者がポスター発表した。疎性に基づいた推定法の構成に利用されるL1正則化に関し、経験ベイズ法の厳密解を解析し、近似法の精度を定量的に明らかにした。この成果について共同研究者が筆頭著者である論文が英文誌に掲載された。外れ値に対する頑健性のために用いられるイプシロン不感応損失関数についてレート歪み関数の下界および上界評価を与えた。実際の量子化法の性能と比較を行った結果と合わせて英文誌上にて発表した。また、柔軟に損失関数を設計できるカーネル関数を用いた歪み尺度のレート歪み関数の上下界を与え、国際学会での発表を行った。最も代表的なクラスタリング手法のK平均法の拡張であり、クラスタ数を柔軟に推定するディリクレ過程(DP)平均法の制御パラメータに関する推定クラスタ数の変化について考察した。DP平均法のクラスタ数の変化は最大歪みによるレート歪み関数と捉えられることを示し、カウントデータのモデルとして用いられる二項分布の場合に数値実験による検証を行い、学会発表を行った。また、逐次的に与えられるデータに対し適応的に予測を変化させていく枠組みであるオンライン学習について、データセットの出方についての損失の最悪値によって評価される精度の最適値を効率よく近似する漸近的ミニマックス性の達成条件を考察した。離散データの生成モデルである多項モデルにおいては、漸近的ミニマックス性を達成するためにはデータ数の知識が必要であることを示し、データ数に対する単純な依存性を持つ共役事前分布を用いたベイズ予測により、漸近的ミニマックス性が達成できることを示し、論文誌上で発表した。イプシロン不感応損失に関するレート歪み関数の評価を与え、多様な歪み尺度を構成することができ、機械学習分野で広く用いられるカーネル関数を用いた歪み尺度についてレート歪み関数の評価を与えることができた。漸近的ミニマックス性は正規化最尤符号を簡単な計算法で近似するための基礎となる。その達成条件の明確化に成功している。スパース線形回帰符号を、絶対損失の場合に拡張し、二乗損失に特化した従来法を改良した。この成果に関し、共同研究者が国内学会において発表を行った。一般化ガウス情報源に対し、べき乗で定義される損失関数についてレート歪み関数の高精度な上界を導出し、国際会議にて口頭発表を行った。また、柔軟に損失関数を設計できるカーネル関数を用いた歪み尺度に対するレート歪み関数の上下界を与えた成果を国際会議へ投稿した。DP平均法のクラスタ数の変化は最大歪みによるレート歪み関数と捉えられることを示し、目的関数を最大歪みや外れ値に対する頑健性を持つ歪み尺度に一般化し、従来のDP平均法と同程度の計算量で、同様の収束性を持つことを示した。この成果について、共同研究者が国内学会での発表を行った。レート歪み理論によるベイズ推論の解釈を与えた。具体的には、学習モデルと歪み尺度の対応を与えることで、ベイズ推論において用いられる一般化事後分布が、レート歪み関数を与える最適解となることを示し、潜在変数を持つ学習モデルの性能を示す学習係数と、レート歪み関数から求められるレート歪み次元との間の関係を明らかにした。この結果について、国際ワークショップおよび国内学会での発表を行った。べき乗による歪み尺度や、柔軟な損失関数の設計が可能なため機械学習法において広く用いられるカーネル関数を用いた歪み尺度について、レート歪み関数の評価を与えることができた。また、スパース線形回帰符号やDP平均法等の実用的な歪み有り圧縮法、クラスタリング法を多様な歪み尺度に応用するための拡張に成功している。

機械学習法の性質を情報理論における圧縮限界から特徴づけ、学習法の設計論を構築するための各部分課題に関し、以下のような成果が得られた。レート歪み関数は歪み有りデータ圧縮における歪みと圧縮率の間の最適なトレードオフ関係を示す。スパース線形回帰符号は、貪欲法によるスパース推定の考え方を用いた歪み有り圧縮法であり、二乗損失においてレート歪み関数を達成することが証明された。スパース線形回帰符号を、絶対損失の場合に拡張し、二乗損失に特化した従来法を改良した。レート歪み関数を求める確率分布の最適化問題を確率分布の射影として捉える情報幾何学的な解釈を与えた。機械学習手法において柔軟に損失関数を設計する仕組みとして用いられているカーネル法に関し、カーネル法の損失関数のレート歪み関数を評価した。ディリクレ過程(DP)平均法は、効率的な計算量でクラスタ数の推定が可能なクラスタリング手法として提案された。これまでの研究で得られた一般化したDP平均法について、画像のデータ圧縮および機械学習分野のベンチマークデータに対するクラスタリング性能を評価する実験を行い、最大歪みや外れ値への頑健性をもつ歪み尺度を含む拡張した手法の有効性を示した。ベイズ推論の学習係数は予測性能を示すものの、その評価は一般には困難である。これまでの研究で、一定の仮定の下、学習係数とレート歪み関数との関係が示された。数値実験により学習係数とレート歪み関数から決まるレート歪み次元との間の関係を検証し、理論解析の仮定が成り立つことを確認した。前年度までの理論解析結果の拡張と合わせて、国際学会での発表を行った。また、ベイズ推論において事前分布の設定法として広く用いられている経験ベイズ法の振る舞いを、ラプラス事前分布の場合に解析した。学習法や最適化法の情報幾何学的な解釈は、その動作原理に関する直観的な理解を与え、手法の改善等に重要な知見を与える。レート歪み関数を求める確率分布の最適化問題に対し、情報幾何学的な解釈を行うことができた。柔軟な損失関数の設計が可能なため機械学習法において広く用いられるカーネル関数を用いた歪み尺度について、レート歪み関数の評価を与えることができた。また、スパース線形回帰符号やDP平均法等の実用的な歪み有り圧縮法、クラスタリング法を多様な歪み尺度に応用するための拡張やその有効性の検証に成功している。これまでに得られたベイズ推論とレート歪み理論の関係は、事前分布の設定法として広く用いられている経験ベイズ法とも直接関連することがわかり、当初の計画を拡げる発展をしている。スパース線形回帰符号を、絶対損失の場合に拡張し、二乗損失に特化した従来法を改良した成果について共同研究者が口頭発表を行った。
低分子メタボロームの質量分析による歯周病と全身疾患の相互連関メカニズムの解明

本研究では、歯周病と全身疾患が相互に関連する分子機構を明らかにすることを目的として、肥満病態によって誘導される代謝産物と、歯周病によって変化する代謝産物の関係を、メタボローム解析およびリピドーム解析により検討した。その結果、末梢血中のメタボローム、リピドームを解析することにより、肥満病態によって生じる代謝系の変化を捉えることが可能であること、また歯周病によっても、これらの分子が変動することが示された。この結果から、これらの特定の分子が、歯周病と全身疾患を繋ぐ鍵となっている可能性が示唆された。平成27年度は以下の研究を実施した。1.肥満モデル動物および歯周病モデル動物の作製:5週齢のC57BL/6マウスに4ヶ月間にわたり高脂肪食の給餌を行うことで、肥満モデルマウスを作製した。この間、経時的にグルコース負荷試験、インスリン負荷試験を行って、マウスの全身状態を観察した。またC57BL/6マウスの上顎第二臼歯に絹糸を結紮して放置することで、歯周病モデルマウスを作製した。そしてこれらのモデル動物の外側尾静脈から、検体として20μLの末梢血を採取した。2.検体前処理法の確立:検体の前処理法を確立した。採取した血液に、メタノール/水/クロロホルムおよび2-イソプロピルリンゴ酸を添加して遠心濃縮および凍結乾燥を行った後、ピリジンに溶かしたメトキシアミン塩酸塩(20mg/mL)を添加して30°Cにてインキュベートし、さらにN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを添加して37°Cでインキュベートすることで、誘導体化する前処理法を確立した。3.マルチターン飛行型質量分析計を用いた低分子メタボロームの検出:上記の方法で誘導体化を行った後、ガスクロマトグラフ/マススペクトロメトリー(GC/MS)による質量分析を行った。カラムにCP-Sil 8 CBを、キャリアガスにヘリウムを用いて、試料を80°Cから330°Cまで15°C/minで昇温した後、注入温度230°C、スプリット比10:1で試料をカラムに注入した。質量分析計にはMULTUM-S IIを使用し、低分子メタボロームの検出を行った。4.肥満および歯周病モデル動物におけるメタボロミクス相関解析:GC/MSによって得られたデータを基にTICクロマトグラムを描出し、さらに主成分分析や相関解析を行うことで、肥満モデル動物および歯周病モデル動物における、末梢血中のメタボライトの変動の解析を実施している。平成27年度の実施を予定した各項目のうち、肥満モデル動物および歯周病モデル動物の作製、検体前処理法の確立、ガスクロマトグラフ-質量分析による低分子メタボロームの検出は完了しており、研究は概ね順調に進展している。現在はモデル動物におけるメタボライトの変化の解析を進めているが、この結果を受けてH28年度に実施予定の、モデル動物への歯周病原性細菌の経口接種および実験的歯周炎の惹起によるメタボローム変動の比較解析を実施する計画としている。1.肥満モデル動物および歯周病モデル動物の作製と歯周病原性細菌の経口接種:5週齢のC57BL/6マウスに高脂肪食の給餌を4ヶ月間行うことで、肥満モデルマウスを作製した。この間、グルコース負荷試験、インスリン負荷試験を経時的に行い、マウスの全身状態を確認した。またC57BL/6マウスの上顎第二臼歯に8-0絹糸を結紮することで、実験的に歯周炎を惹起させた歯周病モデルマウスを作製した。そしてこれらのマウスの外側尾静脈から末梢血を採取した。またこれらのマウスにP.gingivalisを経口接種し、同様に末梢血を採取した。2.検体前処理と前処理法の改良:平成28年度はメタボロームの解析に加えて、リピドームの解析法の開発を行った。各検体に抽出溶媒を添加して振盪した後、16,000×gで遠心して上層(水層)と下層(クロロホルム相)を分離し、それぞれの層の溶液を回収した。この下層の溶液からクロロホルムを気化蒸散させた後に、一定量の内部標準物質を添加して、超臨界流体抽出/超臨界流体クロマトグラフシステム(Nexera UC, Shimadzu Co.)にて超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)分析を行い、さらにそのカラム溶出液をハイブリッド四重極-オービトラップ質量分析計(Q-exactive, Thermo Fisher Scientific, Inc.)にて分析した。3.質量分析計を用いたリピドームの検出:上記の方法でリピドーム解析を行った結果、高脂肪食を給餌した肥満モデルマウスでは、通常食を給餌したマウスに比べて血清中のスフィンゴミエリン量が約1.4倍に増加(p < 0.05)する反面、リゾホスファチジルエタノールアミン量が約60%に減少(p < 0.05)することが明らかになった。平成28年度に実施を予定した各項目のうち、肥満モデル動物および糖尿病モデル動物への歯周病原性細菌の経口接種と実験的歯周炎の惹起、検体前処理と前処理法の改良、質量分析計を用いた低分子メタボロームの検出、肥満モデル動物におけるメタボローム変動の解析は、概ね順調に進展した。

現在は、歯周病原性細菌の経口接種モデル動物や実験的歯周炎の惹起におけるメタボライトの変化の解析を進めており、この結果を受けて、H29年度には予定どおり、病態の異なる歯周炎が発生するモデル動物における歯周病原性細菌の経口接種および実験的歯周炎の惹起によるメタボローム変動の比較解析や、歯周病と全身疾患の相互影響に関するメタボロミクス相関解析を実施する予定としている。1.肥満モデル動物の作製: C57BL/6マウスに高脂肪食の給餌を行うことで、肥満モデルマウスを作製した。またC57BL/6マウスの上顎第二臼歯に絹糸を結紮し、実験的に歯周炎を惹起させた歯周病モデルマウスを作製した。さらにこれらのマウスにP.gingivalisを経口接種し、外側尾静脈から末梢血を採取した。2.血清検体の前処理法の開発とオミクス解析:各検体に抽出溶媒を添加して遠心し、水層とクロロホルム相を分離回収した。そして上層を凍結乾燥した後に誘導体化し、質量分析装置(JMS-Q1000GC )を用いて、ガスクロマトグラフ/マススペクトロメトリー(GC/MS)によるメタボローム解析を行なった。一方、下層はクロロホルムを気化蒸散させた後に一定量の内部標準物質を添加し、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)装置(Nexera UC)とハイブリッド四重極-オービトラップ質量分析計(Q-exactive)を用いて、リピドーム解析を行った。メタボローム解析の結果、31種の主要なピークが検出されたが、高脂肪食を給餌した肥満モデルマウスでは、通常食のマウスに比べて、27種の代謝産物量が上昇(うち6種では2倍以上の上昇)していることが明らかとなった。またリピドーム解析の結果、肥満モデルマウスでは通常食マウスに比べて、血清中のスフィンゴミエリン量が約1.4倍に増加(p < 0.05)する反面、リゾホスファチジルエタノールアミン量が約58%に減少(p < 0.05)することが明らかになった。さらに主成分分析を行った結果、メタボローム分析とプロテオーム分析のいずれにおいても、肥満モデルマウスと通常食のマウスを識別可能で、両者のプロットパターンには類似性が見られることが示された。また変動率が高いメタボロームのうち、数種の特定の代謝物が、分析への寄与率が高いことが明らかとなった。本研究では、歯周病と全身疾患が相互に関連する分子機構を明らかにすることを目的として、肥満病態によって誘導される代謝産物と、歯周病によって変化する代謝産物の関係を、メタボローム解析およびリピドーム解析により検討した。その結果、末梢血中のメタボローム、リピドームを解析することにより、肥満病態によって生じる代謝系の変化を捉えることが可能であること、また歯周病によっても、これらの分子が変動することが示された。この結果から、これらの特定の分子が、歯周病と全身疾患を繋ぐ鍵となっている可能性が示唆された。平成28年度は以下の研究の実施を予定している。1.肥満モデル動物および糖尿病モデル動物への歯周病原性細菌の経口接種と実験的歯周炎の惹起:肥満モデルマウスおよび糖尿病モデルマウスにP.gingivalis FDC381株を経口接種する。またこれらのモデル動物の上顎臼歯に絹糸を結紮して、実験的歯周炎を惹起させる。そして外側尾静脈から末梢血を検体として採取する。採取した検体は解析まで-80°Cで凍結保存する。2.検体前処理と前処理法の改良:上記の方法により採取した検体に、平成27年度の研究で確立した方法で前処理を行う。その一方で、検出対象への脂溶性物質の追加や検出のハイスループット化を目的とした、前処理法の改良を行う。
矯正ブラケット用チタン合金の耐摩耗性評価と透過電子顕微鏡を用いた摩耗機構の解明

より安全で長期使用に耐えうる歯科・生体材料として,チタン及びチタン合金の歯科医療への応用が注目されている.チタンは耐腐食性,生体適合性が高く,また低密度で高弾性率を有する.更に,金属の利点として展性・延性があるなど,様々な利点を持っている.歯列矯正用のブラケット素材は現在SUS360等のステンレス鋼が主流であるが,アレルギー体質の児童生徒の増加や,成人の審美歯科への関心増加に対応して,生体安全性の高いチタン合金やセラミックス製の矯正材料の需要も高まると考えられる.これら歯科生体材料で必ず問題となるのが耐摩耗性である.摩擦摩耗は材料の機械的性質の中で最も重要なものの一つであるにも関わらず,その評価の難しさから,材料学的研究対象になりにくい.しかし,歯科に限らず,人口関節のステム等その他の生体材料としても,チタン合金は大きな可能性を秘めている材料であり,従ってチタン及びチタン合金の摩擦摩耗挙動を知ることは重要であるといえる.本研究では,鏡面研磨したCP Ti(純度99.5%),Ti-6Al-7Nb, SUS316LスチールのTiと摩耗挙動を,ボールオン/ピンオン方摩擦摩耗試験機を用いて調査た.摩耗試験は,純水中及び人口唾液(商品名Saliveht,帝人)中で行い,口腔内温度を想定して,310Kとした.実験条件は回転半径1mm,回転速度95.5rpm(線速度1.0cm/s),試験時間は5.4ksと21.6ksとした.また負荷荷重は100.300,500gfで行った.摩耗試験の結果,SUS316Lの平均運動摩擦係数μは,純水中でμ=0.5,Saliveht中でμ=0.28と,異なる値を示した.一方,CP Ti及びTi-6Al-7Nbはいずれの液中でもμ=0.28-0-30と低い値を示した.荷重によるμの変動は特に見られず,本試験結果の範囲ではクーロンの法則が成立するといえる.また,摩擦による重量変化について,荷重300gf,21.6ksで試験を行ったが,Saliveht中のCP Tiを除き,Tiボールよりも試料の摩耗が顕著であった.試験後の摩耗表面を電子プローブマイクロアナライザ(EPMA)及び分析走査電子顕微鏡(SEM-EDX)で観察した.Ti-6A1-7Nb及びCP Tiの摩耗表面ではボール側のTiが凝着の有無は不明であるが,SUS316Lの場合,純水及びSaliveht中ともに試料表面にTiの凝着が顕著であった.更に,試料表面には,Oも大量に固溶あるいは酸化物として含有されている.主にOが多量に検出される部分では,Feの検出量の方がTiのそれより高めであり,おそらくは鉄酸化物相と考えられる.Tiボールの表面にもFe, Cr, Niなどのステンレスの成分が凝着していた.さらに,Saliveht中では,液中の成分,特にP, Ca等も含まれていた.実際に臨床で用いられる矯正ブラケットの摩擦部には,未知の表面生成物が出来ているという報告があり,この場合も,本試験と同様な唾液成分とメタル,Oとの複合化合物が形成されていることが示唆された.そこで,Salivht中で試験した試料の摩耗表面生成物を同定するため,透過電子顕微鏡による構造解析を試みた.しかし,現段階では試料作成に成功しておらず,電解研磨,イオンミリング,微少領域イオンポリッシング(PIPS)等,様々な方法で透過電子顕微鏡試料作成を試みている段階である.なお,本研究結果は2002年日本金属学会春期大会(3月)で発表する.矯正ブラケット材を想定した純Tiの摩耗挙動を調査した.CPTiを0.5mm厚の板状に切断し,平行研磨機で粒径0.3μmのアルミナ粉まで研磨,鏡面にしたものを被摩耗材)とした.摩耗試験機はレスカ製FPR-2000Sで,ボールオンまたはピンオンディスク形式で行った.摩耗材はZrO_2とステンレス鋼(SUJ2)とした.摩擦摩耗試験は乾式,室温中で行った.試験条件は,回転半径1mm,回転速度95.5rpm(線速度1.0cm/s),試験時間は3.6ksで行った.最初に,Tiの摩耗に対する摩耗材の影響を調査した.荷重は100gとした.その結果,SUJ2の定常摩耗時の平均動摩擦係数は0.75,ZrO_2のそれは0.7であり,金属同士の摩耗の方がセラミック-金属の摩擦より高い摩擦係数を示す.また,試験後の摩擦表面を光学顕微鏡で観察すると,SUJ2では茶色い摩耗粉が発生していた.ピン自体も摩耗していたため,この摩耗粉はピンの摩耗による酸化鉄と考えられる.また,Ti表面に茶色の酸化物の凝着が見られた.一方,ZrO_2の場合,Ti摩耗表面は黒くなり,はがれが見られた.また,ZrO_2側に僅かに黒い摩耗粉が付着していた.この場合,Tiの硬さがZrO_2に比べ小さいため,一方的にTiが削られ,Ti酸化物が摩耗粉として発生したと考えられる.続いて,摩擦係数及び摩擦力への荷重の影響を調査した.この試験はTi-ZrO_2で行った.試験加重を100g,200g,300g,500gと変化させ,摩擦係数の変化を測定した.摩擦力は,荷重の増加に伴い増加するが,平均動摩擦係数は100g-300gまでは0.7で,ほぼ一定の値であったが,荷重500gになると,0.5と小さくなった.

これは,摩擦の機構が荷重増加に伴い変化した事を示唆している.以上の予備試験の結果,当初予定していたワイヤ用の摩耗装置改良を行わなくても,充分な実験結果が得られることが判った.その為,今後もピンオン,ボールオンディスク方式で摩擦摩耗試験を行い,今後はTi-Nb-Al合金,SUS316の摩擦摩耗試験を湿式で行い,TEMによる表面の微細組織観察を行う予定である.より安全で長期使用に耐えうる歯科・生体材料として,チタン及びチタン合金の歯科医療への応用が注目されている.チタンは耐腐食性,生体適合性が高く,また低密度で高弾性率を有する.更に,金属の利点として展性・延性があるなど,様々な利点を持っている.歯列矯正用のブラケット素材は現在SUS360等のステンレス鋼が主流であるが,アレルギー体質の児童生徒の増加や,成人の審美歯科への関心増加に対応して,生体安全性の高いチタン合金やセラミックス製の矯正材料の需要も高まると考えられる.これら歯科生体材料で必ず問題となるのが耐摩耗性である.摩擦摩耗は材料の機械的性質の中で最も重要なものの一つであるにも関わらず,その評価の難しさから,材料学的研究対象になりにくい.しかし,歯科に限らず,人口関節のステム等その他の生体材料としても,チタン合金は大きな可能性を秘めている材料であり,従ってチタン及びチタン合金の摩擦摩耗挙動を知ることは重要であるといえる.本研究では,鏡面研磨したCP Ti(純度99.5%),Ti-6Al-7Nb, SUS316LスチールのTiと摩耗挙動を,ボールオン/ピンオン方摩擦摩耗試験機を用いて調査た.摩耗試験は,純水中及び人口唾液(商品名Saliveht,帝人)中で行い,口腔内温度を想定して,310Kとした.実験条件は回転半径1mm,回転速度95.5rpm(線速度1.0cm/s),試験時間は5.4ksと21.6ksとした.また負荷荷重は100.300,500gfで行った.摩耗試験の結果,SUS316Lの平均運動摩擦係数μは,純水中でμ=0.5,Saliveht中でμ=0.28と,異なる値を示した.一方,CP Ti及びTi-6Al-7Nbはいずれの液中でもμ=0.28-0-30と低い値を示した.荷重によるμの変動は特に見られず,本試験結果の範囲ではクーロンの法則が成立するといえる.また,摩擦による重量変化について,荷重300gf,21.6ksで試験を行ったが,Saliveht中のCP Tiを除き,Tiボールよりも試料の摩耗が顕著であった.試験後の摩耗表面を電子プローブマイクロアナライザ(EPMA)及び分析走査電子顕微鏡(SEM-EDX)で観察した.Ti-6A1-7Nb及びCP Tiの摩耗表面ではボール側のTiが凝着の有無は不明であるが,SUS316Lの場合,純水及びSaliveht中ともに試料表面にTiの凝着が顕著であった.更に,試料表面には,Oも大量に固溶あるいは酸化物として含有されている.主にOが多量に検出される部分では,Feの検出量の方がTiのそれより高めであり,おそらくは鉄酸化物相と考えられる.Tiボールの表面にもFe, Cr, Niなどのステンレスの成分が凝着していた.さらに,Saliveht中では,液中の成分,特にP, Ca等も含まれていた.実際に臨床で用いられる矯正ブラケットの摩擦部には,未知の表面生成物が出来ているという報告があり,この場合も,本試験と同様な唾液成分とメタル,Oとの複合化合物が形成されていることが示唆された.
五感を活用した製造・マーケティング戦略の発展ー国際比較による経営史的研究

今年度はこれまでの調査や分析の実績発表を主に行うとともに、今後の調査に向けた情報収集を重点的に行った。具体的にはシドニーで行われたSociety for Social Studies of Science (4S)年次大会、及びBusiness History Conference (BHC)年次大会で発表をし、大変有意義なフィードバックを得ることができた。4Sでは、米国における1960年代の食品着色産業の拡大とそれに対する政府の規制を中心に発表を行い、産業の変化と新たな食品規制により、いかに人々の「食」や「自然観」が変化してきたのか分析を行った。加工食品や着色された食品が増大する中で、「自然らしさ」を表現するために人工的手法(着色料等)を用いることが一般的になり、「自然」と「人工」の境界が曖昧になってきた。こうした変化は、食品産業のみの問題ではなく、人々が自然や社会をいかに理解し認知するかとも深く関わっており、本課題全体の主なテーマの一つの事例分析を報告する形となった。BHCでは、私がセッションオーガナイザーとなって、発表セッションを企画・提案し、他2名の研究者とともに今後の経営史研究をいかに実践していくべきか討論を行った。私自身の発表では、経営史研究の中でいかに感覚が重要な分析軸となりうるかを、食品の色の歴史を事例に発表を行った。いずれの学会発表においても、専門分野が近い研究者だけでなく、広く様々な分野の研究者とも交流することができ、今後調査を進める上で、調査先や内容を広げることが期待できる。また、発表内容に対しても概ね評価を得ることができ今後調査を進める上での指針ともなった。当初の予定通り、主に米国(ハーバードビジネススクール)のアーカイブスで調査を行うとともに、国際学会に業績報告を行った。また学会では他の参加者らからフィードバックなどを得ることができ、予想していた以上に情報収拾が進んでいる。今後はそれらの情報をもとにアーカイブスで調査を進める。今後は、米国、ヨーロッパ(主にイギリス、スイス、オランダ)、日本のアーカイブスで資料収集を行う予定である。また、年間2回程度国際学会で調査の成果報告を行う。調査先を更に調べたり、他の研究者からのアドバイスを得たことで調査先が当初の予定よりも増えることとになったため、来年度に使用する必要が出てきた。また未定となっていたオランダで開催される学会での発表が確定したため、それに合わせて調査・学会発表の旅費が必要となった。
海洋窒素循環に寄与するアンモニア酸化古細菌の生態特性評価

1.qPCRによるamoAとureCの分布特性の把握:各海域試料からDNAを抽出し、その中のamoA遺伝子、ureC遺伝子のコピー数を定量PCR法で測定した。各遺伝子コピー数から、単位海水試料当たりの各微生物の現存量を定量的に算出し、AOAや他の細菌の分布構造を明らかにした。さらにamoAとureC遺伝子の海域毎、深度毎の分布を比較し、AOAのどのくらいがureC遺伝子を持つのを推測し、分布構造に影響を及ぼす環境因子について解析した。2.逆転写定量PCRによるamoAとureC遺伝子の転写活性の測定:各海水試料からmRNAを抽出し、一般的な逆転写プライマーを用い、逆転写PCR法でcDNAを作った。その後a.と同様に、定量PCR法により遺伝子のコピー数を測定し、それぞれのcDNAコピー数から、単位海水試料当たりの各遺伝子の転写活性を定量的に把握した。さらにcDNAとDNAのコピー数を比較することで転写率が高い場所の特定と環境因子との関係解析を行った。同時にureCの転写活性も測定することで、AOAが実際に尿素を利用している可能性について検討した。3.次世代シーケンス法によるメタゲノム解析:北極海で得られた水深100 mと1000 mの試料から、それぞれのDNAを抽出、精製し、得られたDNAを断片化した。その後、DNAフラグメントに特定アダプターを付加し、サイズセレクションを行った。同じ長さのDNAフラグメントをPCRで増幅し、ライブラリーピュリフィケーションを行った後、Illumina社製Hi-Seq次世代シーケンサーでシーケンシングを行った。得られたメタゲノムデータについて初期解析を行い、その結果をこれまで定量PCR及びクローンライブラリー法で得られた結果と比較することで、北極海表層及び深層での微生物多様性を全面的に把握した。29年度が最終年度であるため、記入しない。a.定量PCRによるamoAとureCの分布特性の把握:各海域試料からDNAを抽出し、その中のamoA遺伝子、ureC遺伝子のコピー数を定量PCR法で測定した。各遺伝子コピー数から、単位海水試料当たりの各微生物現存量を算出し、AOAや他の細菌の海域ごとの垂直分布構造を明らかにした。b.逆転写定量PCRによるamoAとureC遺伝子の転写活性の測定:各海水試料からmRNAを抽出し、一般的な逆転写プライマーを用い、逆転写PCR法でcDNAを作った。その後、a.と同様に、定量PCR法によりamoA遺伝子のコピー数を測定し、それぞれのcDNAコピー数から単位海水試料当たりの各遺伝子の転写活性を把握した。さらにcDNAとDNAのコピー数を比較することで転写率の高い場所の特定を行った他、環境因子との関係解析を行った。同時にureCの転写活性も測定し、AOAが実際に尿素を利用している可能性について検討した。c.SIP法を用いた培養法によるAOA栄養基質の解析(予備的な実験):安定同位体基質添加培養系(Stable Isotope Probe法、SIP法)を行うための、予備的な現場培養実験を駿河湾で実施した。駿河湾でureC遺伝子コピー数が最大値であった50 m水深の海水試料を採集し、暗所且つ現場水温で安定同位体標識基質(13C標識NaHCO3、13C標識Pyruvate)を添加して28日間培養を行った。その後試料中微生物のDNAを抽出し、-80°Cに冷凍保存した。H28年度中に等密度遠心法によって分別し、シークエンスにより添加基質を取り込んだAOA群集の同定を行う予定である。北太平洋航海及び駿河湾調査で得られた試料に関する遺伝子解析及び環境因子測定が完了したことから、その結果について2016年度のOcean Sciences Meeting (21-26,Feb, New orleans, USA)にて発表した。また、アンモニア酸化古細菌の深度による棲み分け、及び生態特性を把握し、アンモニア酸化古細菌の利用できる栄養基質について検討するため、SIP法を用いた安定同位体標識基質添加培養実験(予備的な実験)を駿河湾で計画通り実施した。得られた試料について、等密度遠心法による分別、シーケンスによる添加基質を取り込んだAOA群集の同定を予定しており、等密度遠心法及びその後の核酸分画などの条件検討を現在行っている。したがって、DNA-SIP法による解析そのものは平成28年度中に行うことが可能であり、H27年度の研究はおおむね順調に進展したと判断している。1.定量PCRによるamoAとureCの海域分布特性の把握:各海域試料からDNAを抽出し、amoA遺伝子、ureC遺伝子のコピー数を定量PCR法で測定した。各遺伝子コピー数から、単位海水試料当たりの各微生物現存量を算出し、AOAや他の微生物の海域ごとの垂直分布構造を明らかにした。2.逆転写PCR法によるamoAとureC遺伝子の転写活性の測定:各海水試料からmRNAを抽出し、一般的な逆転写プライマーを用い、逆転写PCRでcDNAを作成した。その後、1.と同様に、定量PCR法によりamoA遺伝子のコピー数を測定し、それぞれのcDNAコピー数から単位海水当たりの各遺伝子の転写活性を把握した。さらに、cDNAとDNAのコピー数を比較することで転写率の高い場所の特定を行った他、環境因子との関係解析を行った。3.次世代シーケンス法によるメタゲノム解析:北極海航海で得られた水深100m及び1000mの海水試料から、それぞれのDNAを抽出、精製、純化し、得られたDNAを断片化した。