hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Sp6分子構造の機能解析

Sp6は歯胚特異的に発現する転写因子であり、Sp6欠損は過剰歯やエナメル質形成機転の異常をもたらすと報告されている。Sp6分子の構造と機能の解析は歯胚形成機序の解明、さらに将来の再生の臨床応用に重要な知見となると考えられ、Sp6の翻訳後修飾の有無を確認した本研究の成果はその一助となると考えられる。SUMOはC末端部分が加水分解されてGG(グリシン、グリシ)が露出し成熟型(GG)になるが、HA-SUMOIGはGGを欠損させたベクターで目的タンパクと共有結合できない。これらのベクターをCos7細胞に共発現させHA抗体でウエスタンブロットを行った結果、SUMO aclive form存在下でSDS-PAGE上の移動度が遅いバンドとadditionalなバンドが検出された。Sp6がSUMO化を受ける部位やSUMO化の細胞内局在や転写活性への変化は現在解析中である。またSp6の遺伝子発現制御に重要な役割を果たしていると思われるDNAメチル化の状態を解析するために慎重に検討している。DNAメチル化解析はバイサルファイトシークエンスにより行い、メチル化誘導化剤を添加した場合などの諸条件によりメチル化マップの変化を比較することを検討している。また、翻訳後修飾のリン酸化、ユビキチン化の有無や転寧活性化能への影響も検討する予定である。Sp6は歯胚特異的に発現する遺転子であり、Sp6欠損は過剰歯やエナメル質形成機転の異常なをもたらすと報告されている。Sp6分子構造と機能解析は歯胚形成機序の解明,さらに将来の再生の臨床応用に重要な知見となると考えられ、Sp6の翻訳語修飾の有無を確認した本研究の成果はその一助となると考えられている。本研究では、歯胚特異的に発現する転写因子Sp6の翻訳後修飾の有無を確認し、その転写因子としての機能的意義を明らかにすることを目的としている。前年度において、まずSUMO化の存在の有無を確かめるために、HA-SUMO1 active form、HA-UBC9、HA-Sp6の発現ベクターをCos7細胞に共発現させHA抗体でウエスタンブロットを行った結果、SUMO1 activeform存在下でSDS-PAGE上の移動度が遅いバンドとadditionalなバンドが検出された。このことから、共発現させている細胞の中でSUMO化が起こっていることが示唆された。検出されたバンドがSUMO化したSp6なのかを確認するためHA-Sp6の発現ベクターの5'末端にFlagのタグ3'にHisタグをつけFlag抗体・His抗体によっで発現を確認したが、バンドの移動・additionalなバンド共に確認されなかった。SUMOタンパク質にはSUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4が存在する。そこでSUMO1と同じく発現頻度が高いSUMO2・SUMO3の共発現によりその翻訳後修飾の有無を確認するためHAタグを付加した発現ベクターを作成し発現をSDSページにて試験したが、Sp6のSUMO化したバンドは確認されなかった。このことから現在まずSUMO化酵素カスケードを用いて、イソペプチド結合を通したターゲットタンパク質上の特定のリジン残基に対する、SUMO1、2もしくは3のC末端の共有結合により、SUMO化タンパク質を検出する方法により直接in vitroの実験で発現のSUMO化の有無を確認することを検討している。歯胚特異的に発現するSp6遺伝子の欠損は過剰歯やエナメル質形成機転の異常をもたらす。また、我々のグループではSp6遺伝子の過剰発現が歯の正常な発生分化を阻害することを見出している(2010. 4月ゴードンカンファレンスにて発表、論文投稿準備中)。Sp6分子構造と機能解析は歯胚形成機序の解明、さらに将来の再生の臨床応用に重要な知見となると考えられ、Sp6の翻訳語修飾の有無を確認した本研究の成果はその一助となると考えられた。
肺小細胞癌と脳神経組織のHuD抗原に対する生体免疫応答の交差性に関する研究

HuD抗原は、肺小細胞癌患者における癌性ニューロパチーの発症にかかわる免疫応答と癌抑制免疫応答の標的分子である可能性が指摘されている。本研究の目的はHuD抗原遺伝子DNAワクチン法により賦活化される液性免疫と細胞性免疫が肺小細胞癌及び脳神経組織に対してどのように作用するかをマウスを用いた肺小細胞癌モデル細胞による皮下腫瘍増殖抑制効果で評価し、さらに、惹起された免疫応答によって脳神経病変が引き起こされるか検討することである。2年間の研究期間において、マウスHuD抗原遺伝子発現プラスミドを用いたDNAワクチン法を確立し、HuD抗原に対して惹起された液性免疫および細胞性免疫が、ヒト肺小細胞癌モデル細胞であるHuD抗原発現マウス由来大腸癌細胞(Colon 26)からなる皮下腫瘍の発育抑制にかかわることを見い出した。しかしながら、DNAワクチン付加マウスおよびDNAワクチン付加後にヒト肺小細胞癌モデル細胞を皮下接種し、抗原の負荷をさらに加えたマウス大脳、小脳、延髄組織においても癌性ニューロパチーを示唆する所見が得られなかった。このことは、DNAワクチン法によって惹起される宿主免疫応答が、必ずしも神経系の炎症を引き起こす程強いものではなかった可能性を示唆する。より強力な抗腫瘍効果または癌性ニューロパチーのモデルを得るための免疫賦活化の改良を今後も目指していく予定である。本研究の目的は、HuD抗原遺伝子DNAワクチン法により賦活化される液性免疫(抗体産生)と細胞性免疫(細胞障害性T細胞)が、肺小細胞癌組織および正常脳神経組織に対してどのように作用するか、腫瘍移植実験動物モデルで評価し、肺小細胞癌(ここではHuD抗原発現細胞株を用いる)と神経細胞に対する免疫応答の交差性を検討することにある.本年度は、HuD抗原遺伝子発現プラスミドの作製およびHuD抗原発現マウス細胞株を確立した.すなわち、HuD抗原cDNAをBALB/cマウス正常脳より得られたRNAからRT-PCR法を用いて取得し、哺乳類細胞発現プラスミドに挿入し、HuD抗原遺伝子発現プラスミドを作製した。塩基配列の確認および抗HuD抗原抗血清を一次抗体として用いたウヱスタンブロット法で、in vitroでHuD抗原の発現を確認した.次に、このHuD抗原遺伝子発現プラスミドをマウス由来大腸癌細胞株colon26に遺伝子導入し、G418で選別し、肺小細胞癌のモデル細胞であるHuD抗原発現マウス細胞株を確立した.さらに予備実験としてHuD抗原遺伝子DNAワクチン法による抗腫瘍免疫の実験を行った.すなわち、HuD抗原遺伝子発現プラスミドを1回100μg、2週間毎3回、BALB/cマウス(5週齢メス)に筋注し、抗HuD抗原免疫応答の賦活化を促す.プラスミドの最終投与より1週間後にHuD抗原発現マウス細胞株と非発現細胞(colon26親株)を一定細胞数、左右の側腹部に個々に皮下注射し皮下腫瘍の発育を比較した.HuD抗原遺伝子発現プラスミド投与群は、コントロールプラスミド投与群に比して、HuD抗原発現マウス細胞皮下腫瘍の発育を有意に抑制した.次年度、抗腫瘍実験の例数を増やすとともに神経組織に対する免疫応答の評価を行う予定である.HuD抗原は、肺小細胞癌患者における癌性ニューロパチーの発症にかかわる免疫応答と癌抑制免疫応答の標的分子である可能性が指摘されている。
ミトコンドリ3DNAをもちいたメダカ亜目魚類の系統とその上位分類に関する研究

Oryzias属12種(O.latipes,O.curvinotus,O.luzonesis,O.mekongnesis,O.javanicus,O.melastigma,O.minutillus,O.celebensis,O.marmoratus,O.matanensis,O.nigrimas,O.profundicola)とXenopoecilus属2種(X.oophorus,X.saracinorum)の計14種の魚類からチロクロームb遺伝子、12sリボソームRNA遺伝子をPCR法により増幅しその塩基配列を決定して、Oryzias属およびXenopoecilus属の系統関係を解析した。その結果、スラベシ島の淡水に分布する染色体融合グループは単系統的であることが明らかなった。またスラベシ島に分布するXenopoecilus属の2種は、ミトコンドリア12sリボソームRNA遺伝子の塩基配列からみたかぎり染色体融合型グループに強い関連をもつことが示された。日本メダカを含む両腕型染色体グループも単系統的であることが、ミトコンドリア12sリボソームRNA遺伝子および核DNAにある反復配列の解析から明らかとなった。単腕型染色体グループもO.minutillusを含み単系統であることが示唆された。染色体の形態から宇和により提唱されたメダカ属の3グループはミトコンドリアDNAの塩基配列に基ずく系統解析によってもそれぞれ単系統を形成することが示された。またO.javanicusと記載されている種にはインドネシアのジャカルタ周辺の潅漑用水や沼に分布する系統とシンガポール周辺の汽水域のマングローブ林に分布する系統の2つが存在することが示唆された。スラベシ島の学術調査で新たに発見された汽水性のメダカ属1種はシンガポール周辺に分布するO.javanicusと近縁であることが示された。
細胞膜・分泌タンパク質の機能保証における新規分泌経路の役割

膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質(APP)は、ERで生合成後、ゴルジ体に輸送され、さらに細胞膜に局在した後、エンドサイトーシスにより取り込まれて最終的に代謝・分解される。この膜タンパク質の輸送・分泌系の異常は、β-アミロイドのように細胞の生存に好ましくない分解産物を多く産生するようになり、細胞病態を引き起こす。本研究では、APPに焦点を当て、細胞膜に至るまでの移動を管理する細胞システムの解析に取り組んだ。APPの細胞内輸送を制御するタンパク質の候補としてAPP細胞質ドメイン結合タンパク質群が考えられた。研究代表者が見い出したAPP細胞質ドメイン結合タンパク質の1つ過剰発現させた細胞では通常のゴルジ体を経由する経路と異なる輸送経路でAPPが細胞膜に運ばれた。これは、細胞の免疫染色および生化学的な細胞分画法による解析で明らかになった。通常のタンパク質分泌経路の不全により膜タンパク質の輸送に対応できなくなった場合の緊急経路として、二次的なタンパク質分泌経路が存在し、機能している可能性が考えられる。APPや他の膜タンパク質輸送におけるこのアダプタータンパク質の機能と二次的なタンパク質分泌経路の解析を行い、その分子機構の解明に取り組んだ。
DDS(ドラッグデリバリーシステム)を目的とした機能付き超音波造影剤の研究

微小気泡超音波造影剤に特定の標的をターゲティングする機能を持たせる方法として、(a)微小気泡の表面をビオチン化する生化学的方法と、(b)微小気泡の表面に磁性体を吸着させ、外部磁場で誘導する物理的方法の2種類の方法について基礎検討し、両者の方法とも流れのない静水状態では特定の標的をターゲティングできることが確認できた。また、実際の応用を想定した擬似血管モデル内の流れの中におけるターゲティング能力についても、低流量では標的をターゲティングできることが一部確認できた。しかし、流量が増加するにつれて、そのターゲティング能力が著しく低下することもわかった。そこで、上記問題点の克服に関する研究を進めるとともに、音響キャビテーションを応用した新しい方法に関する調査も開始した。溶液内に強力超音波を照射し、キャビテーションを発生させると、それによって水分子がH_2O→H・+OH・とラジカルに開裂し、活性酸素種の一つであるOH・(ヒドロキシルラジカル)が発生する。さらにキャビテーションにより発生する微小気泡は、周囲の生体組織と著しく音響インピーダンスが異なり、超音波の散乱特性に優れていることから、超音波造影剤としても大いに診断画像の画質向上が期待できる。すなわち、人体内の問題のある部位、例えば各種臓器の腫瘍や癌細胞などの疾患を持つ組織のごく近傍で選択的にキャビテーションを起こすことができれば、その様子を超音波診断装置で観察しながら、さらにそこで局在的に発生する活性酸素による癌細胞の死滅の過程を超音波診断装置を使って、リアルタイムに診断できるという従来にない画期的な治療方法が実現できる可能性がある。研究ではまず、我々が作製した音響キャビテーション発生装置により発生する活性酸素種の同定および定量に関して、ESR(Electron Spin Resonance)法を使って明らかにすることができた。次に、キャビテーションで発生した活性酸素が癌細胞に与える影響について検討した。実験では、10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養したマウスの胸腺リンパ系癌細胞(EL-4)を使用し、超音波照射システムを使って、強力超音波を癌細胞に照射したところ、超音波照射を受けた癌細胞が、培養時間の経過とともに減少していくことが確認できた。微小気泡造影剤にターゲティング機能を持たせる方法として、(a)微小気泡造影剤の表面をビオチン化することで,生体内のアビジン化した標的に造影剤を結合させる方法と、(b)微小気泡造影剤の表面に磁性体を吸着させ、生体外部から印加した磁場により生体内の標的に誘導する方法の2種類の方法を検討した。(a)の方法として、我々が研究している界面活性剤を主材料として微小気泡造影剤は、静電気的には負に帯電しているので、正に帯電しているビオチン化試薬を使い、静電気的結合によってビオチン化試薬を微小気泡の表面に結合させた。次に、このビオチン化微小気泡のターゲティング機能を評価するために、アビジン化された標的をビオチン化した微小気泡と混合したところ、アビジン化標的に選択的にビオチン化微小気泡が結合することが確認できた。(b)の方法として、磁性体を陰イオン界面活性剤でコーティングすることで負に帯電させる、それを同様に負に帯電している微小気泡との間で、2価の陽イオンであるカルシウムイオンを仲介にして、静電気的に結合させた。

表面に磁性体を吸着させた微小気泡のターゲティング機能を評価するために、外部から磁場を印加した誘導を試みたところ、微小気泡が印加した磁場の方向に向かって誘導される様子が確認された。次に、ビオチン化微小気泡が流れの中でアビジン化標的に選択的に結合することができるかの検討を行ったが、末梢血管内の血流に相当する低流量においても、アビジン化標的に対するターゲティング能力を確認する事ができなかった。同様に、表面に磁性体を吸着させた微小気泡についても外部磁場による標的への誘導が確認できなかった。この原因としては、静電気的結合によるビオチン化試薬や磁性体の微小気泡表面への結合が弱いために、流れの中でそれが引き離されてしまったためと考えられる。微小気泡超音波造影剤に特定の標的をターゲティングする機能を持たせる方法として、(a)微小気泡の表面をビオチン化する生化学的方法と、(b)微小気泡の表面に磁性体を吸着させ、外部磁場で誘導する物理的方法の2種類の方法について基礎検討し、両者の方法とも流れのない静水状態では特定の標的をターゲティングできることが確認できた。また、実際の応用を想定した擬似血管モデル内の流れの中におけるターゲティング能力についても、低流量では標的をターゲティングできることが一部確認できた。しかし、流量が増加するにつれて、そのターゲティング能力が著しく低下することもわかった。そこで、上記問題点の克服に関する研究を進めるとともに、音響キャビテーションを応用した新しい方法に関する調査も開始した。溶液内に強力超音波を照射し、キャビテーションを発生させると、それによって水分子がH_2O→H^・+O^・とラジカルに開裂し、活性酸素種の一つであるOH^・(ヒドロキシルラジカル)が発生する。さらにキャビテーションにより発生する微小気泡は、周囲の生体組織と著しく音響インピーダンスが異なり、超音波の散乱特性に優れていることから、超音波造影剤としても大いに診断画像の画質向上が期待できる。すなわち、人体内の問題のある部位、例えば各種臓器の腫瘍や癌細胞などの疾患を持つ組織のごく近傍で選択的にキャビテーションを起こすことができれば、その様子を超音波診断装置で観察しながら、さらにそこで局在的に発生する活性酸素による癌細胞の死滅の過程を超音波診断装置を使って、リアルタイムに診断できるという従来にない画期的な治療方法が実現できる可能性がある。研究ではまず、我々が作製した音響キャビテーション発生装置により発生する活性酸素種の同定および定量に関して、ESR (Electron Spin Resonance)法を使って明らかにすることができた。次に、キャビテーションで発生した活性酸素が癌細胞に与える影響について検討した。実験では、10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養したマウスの胸腺リンパ系癌細胞(EL-4)を使用し、超音波照射システムを使って、強力超音波を癌細胞に照射したところ、超音波照射を受けた癌細胞が、培養時間の経過とともに減少していくことが確認できた。
行政学の基礎概念の歴史的変遷と現代的再構成

行政学を支える基礎的な概念は、主として1920・30年代のアメリカにおいて形成された。そこでは、(1)行政が自律した体系を構成しており、(2)その体系には最良唯一の管理方式が存在する、という前提の下に基礎的な概念が形成されたといってよい。「予算管理」「人事制度」等の概念は、この時期から出発している。1940年代以降、「行政国家」化の現象にともなって行政の領域が拡大する一方で、社会との間の相互作用によって行政の効率性や有効性が評価されるようになる。それにともなって、固有の管理方式をもつ自律した体系としての行政にかわって、社会経済に組み込まれた公共的意思決定の体系としての行政観を前提とした概念構成が試みられた。「意思決定」「計画・調整」等の概念は、このような行政観の変化を反映しているといえよう。さらに、行政が他のシステムとの相対的な位置から捉えられるようになって、その関係を主軸とした概念構成が試みられた。「政府間関係」「内閣制度」などは、この関係を主軸とした概念把握の試みであった。社会経済に組み込まれた公共的意思決定としての行政が、社会からの入力を中心とした概念構成を生み出したのに対して、行政から社会経済への働きかけとしての出力を中心とした視座も1960年代以降登場する。「政策手段」「情報活動」「政策評価」といった、個別機能を手がかりとした概念形成がその例である。以上述べてきたような実態概念・管理概念から機能概念を中心とした視座の変化は、新しい公共管理論によって加速される一方で、これへの対応も試みられている。「行政責任」論の再構成は、このような脱構築に対して行政学の留め針を確保しようという試みでもある。本研究の目的は、様々な行政学の基礎概念の歴史的変遷を再検討し、それらの概念の果たしてきた役割や位置を確定し、その上で現在の転換期の行政現象を捉える上でいかなる現代的再構成が必要であるかを具体的に検討することであった。対象となる基礎概念は、行政責任、財務管理、政策作成、行政国家、行政手続、地方自治、内閣制度、政策手段、政官関係、政策評価、官僚制、情報、空間管理、人事管理、計画調整、地方制度であった。本年度は、共同研究の第1年目として、各研究分担者が各々の担当する基礎概念に関係する基礎的文献を再検討し、それぞれの概念が現代抱えている課題とそれらの概念が今後の行政を分析・設計する上での可能性について検討した。そして、特に、行政国家、地方自治、官僚制、内閣制度、財務管理人事管理、計画調整といった、行政学における伝統的な基本的制度・概念に関して、現在大きな衝撃が与えられつつあること、また、現代の行政変容に対応して、行政責任(責任確保の手段としての市場の利用も含む)、行政手続(市民合意形成手法)、政策手段(イギリスにおけるエイジェンシー化・強制競争入札、国際連盟以来の歴史を持ち近年特にGATTのもとで強化された国際化対応のための様々なハ-モナイゼーション)、政策評価(様々な評価手法)、空間管理(地方自治体における総括管理のための優越的資源としての空間の利用)、情報(金・人・権限に次ぐ新たな資源としての情報の利用・管理)に関して、新規の制度的革新と概念創出が起こりつつあることが確認された。これらの変化の内容を具体的事例に即して詳細に検討し、その上で概念の再検討を行うことが次年度以降の課題である。日本の政治行政システムが大きく変動しつつある今日において、その分析に適した概念の創出をめざしている本総合研究では、研究分担者がそれぞれ、従来の行政学において、また今日および今後の行政分析において重要と思われる主要な概念を選択し、それが形成された経緯、それをめぐる議論、そしてそれがこれからの行政現象の分析においてもちうる意義について考察を行った。

本総合研究で取り上げた概念は、行政国家、政官関係、地方自治、内閣制度、官僚制、行政責任、計画・調整、財務管理、人事管理、空間管理、意思決定、政策手段、政策評価、情報、政府間関係、行政手続、非営利市民団体(NGO・NPO)であり、地方制度・官僚制、地方自治のように、これまでの行政学の主要概念と呼びうるものから、空間管理、情報、行政手続のように、現在そして、これからの行政現象を分析するうえで有効と思われるものも含まれている。もとより、含まれていない重要な概念も多数あるが、主要な概念はカバーされており、行政学の基礎的な概念の明確化に貢献しうると考えている。本総合研究は、当初より、成果を一冊の書物として刊行することを目的として、進められてきた。現在、ほぼすべての分担者から研究結果が提出され、本年度内に数回の研究会を開催して、それらについて検討を実施してきた。最終的な成果は、計画通り次年度中に刊行する予定である。行政学を支える基礎的な概念は、主として1920・30年代のアメリ力において形成された。そこでは、(1)行政が自律した体系を構成しており、(2)その体系には最良唯一の管理方式が存在する、という前提の下に基礎的な概念が形成されたといってよい。「予算管理」「人事制度」等の概念は、この時期から出発している。1940年代以降、「行政国家」化の現象にともなって行政の領域が拡大する一方で、社会との間の相互作用によって行政の効率性や有効性が評価されるようになる。それにともなって、固有の管理方式をもつ自律した体系としての行政にかわって、社会経済に組み込まれた公共的意思決定の体系としての行政観を前提とした概念構成が試みられた。「意思決定」「計画・調整」等の概念は、このような行政観の変化を反映しているといえよう。さらに、行政が他のシステムとの相対的な位置から捉えられるようになって、その関係を主軸とした概念構成が試みられた。「政府間関係」「内閣制度」などは、この関係を主軸とした概念把握の試みであった。社会経済に組み込まれた公共的意思決定としての行政が、社会からの入力を中心とした概念構成を生み出したのに対して、行政から社会経済への働きかけとしての出力を中心とした視座も1960年代以降登場する。「政策手段」「情報活動」「政策評価」といった、個別機能を手がかりとした概念形成がその例である。以上述べてきたような実態概念・管理概念から機能概念を中心とした視座の変化は、新しい公共管理論によって加速される一方で、これへの対応も試みられている。「行政責任」論の再構成は、このような脱構築に対して行政学の留め針を確保しようという試みでもある。
非単調神経回路網による連続的時系列パターンの認識

非単調神経回路網は簡単な学習アルゴリズムによって,その状態空間に軌道アトラクタを形成することができる.本研究の目的は,このような性質を利用して,連続的に変化する時系列パターンを空間パターンに展開することなく認識するモデルを構成することである.昨年度の研究では,比較的単純な時系列パターンの認識過程を解析し,中間部(隠れ素子)と学習信号生成回路を導入することによって,より複雑な時系列パターンを認識できるモデルを構築した.この結果を踏まえ,今年度は以下の研究を行った.まず,計算機上で条件を変えつつシミュレーション実験を大規模に行い,モデルの構造(各部の素子数)と認識能力との関係を調べた.また,中間部の動作を解析し,認識の失敗がどのような状況で起こるかを明らかにした.その結果,系列情報をどのようなパターンにコードするかという情報表現の重要性が浮かび上がったが,この問題についての詳しい検討は今後の課題である.また,双方向型構造であるというこのモデルの特徴を生かし,出力部に与えた単純なパターンから,複雑な時系列パターンを入力部に再生するという,逆方向のパターン変換に関する研究を行った.その結果,認識を目的として学習した回路網であっても,逆方向の再生がある程度可能であることがわかった.但し,この場合,出力部にパターンを与えるだけでなく,入力部に系列の先頭部分を与える必要があった.この問題を解決するためには,やはり情報表現についての再検討が必要である.以上のように,新しい原理に基づく時系列パターン認識の神経回路モデルを構成するという所期の目的が達せられただけでなく,パターンの認識と発生,すなわちボトムアップ及びトップダウンの情報処理を統合するモデルへの発展性が示された.これまでの研究により,非単調神経回路網はコバリアンス則に基づく簡単な学習則によって,入力された連続的な時系列パターンを学習できることが明らかになっている.また,昨年度の研究により、非単調神経回路網のこのような性質を利用して簡単な時系列パターンの認識ができることがわかった.そこで本研究では,その認識過程を解析し,より複雑なパターンの認識を可能にするモデルの構成を行った.まず,基本的なモデルの認識過程を解析したところ,入力パターンをまだ認識不可能な段階では,回路網の状態が複数の軌道アトラクタの中間的な状態を取ることが重要であること,そのためにはそれらの軌道アトラクタがある程度接近している必要があることなどがわかった.このことから,複雑な時系列パターンを認識するためにはモデルの入出力部の間に中間部を設け,そこに入力部の軌道と出力部の軌道の中間的な軌道をアトラクタとして形成すればよいと考えられる.このような考えのもとにモデルを改良し,中間部への学習信号を生成する回路を付加した.この回路は,基本的にはランダム変換回路を用いて,入出力部への学習信号から中間部への学習信号をリアルタイムに生成する.これにより,誤差逆伝搬法などに比べてはるかに容易に中間部の学習を行うことができる.シミュレーション実験の結果,このモデルは,重複の多い複雑な時系列パターンを柔軟に認識できることが示された.非単調神経回路網は簡単な学習アルゴリズムによって,その状態空間に軌道アトラクタを形成することができる.本研究の目的は,このような性質を利用して,連続的に変化する時系列パターンを空間パターンに展開することなく認識するモデルを構成することである.昨年度の研究では,比較的単純な時系列パターンの認識過程を解析し,中間部(隠れ素子)と学習信号生成回路を導入することによって,より複雑な時系列パターンを認識できるモデルを構築した.この結果を踏まえ,今年度は以下の研究を行った.まず,計算機上で条件を変えつつシミュレーション実験を大規模に行い,モデルの構造(各部の素子数)と認識能力との関係を調べた.また,中間部の動作を解析し,認識の失敗がどのような状況で起こるかを明らかにした.その結果,系列情報をどのようなパターンにコードするかという情報表現の重要性が浮かび上がったが,この問題についての詳しい検討は今後の課題である.また,双方向型構造であるというこのモデルの特徴を生かし,出力部に与えた単純なパターンから,複雑な時系列パターンを入力部に再生するという,逆方向のパターン変換に関する研究を行った.その結果,認識を目的として学習した回路網であっても,逆方向の再生がある程度可能であることがわかった.但し,この場合,出力部にパターンを与えるだけでなく,入力部に系列の先頭部分を与える必要があった.この問題を解決するためには,やはり情報表現についての再検討が必要である.以上のように,新しい原理に基づく時系列パターン認識の神経回路モデルを構成するという所期の目的が達せられただけでなく,パターンの認識と発生,すなわちボトムアップ及びトップダウンの情報処理を統合するモデルへの発展性が示された.
C型肝炎ウイルスの遺伝子型・感染ウイルス量と肝細胞癌発症リスクに関する疫学的研究

本研究では、患者対照研究の手法により、C型肝炎ウイルス(HCV)感染と肝細胞癌発症リスクの関連、特にHCVの遺伝子型・血中HCV-RNA量によって肝細胞癌発症リスクに差があるかどうか、に着目して検討を行った。第2世代抗HCV抗体(anti-HCV)の測定系として、immunoradiometric assay・recombinant immunoblot assayを用い、またpolymerase chain reactionによるHCV-RNAの検出・typingおよびDNAプロープ法による血中HCV-RNA量の定量を行った。患者群は昭和60年平成元年にかけて九大病院を受診した肝細胞癌患者91名・対照群は福岡市内某保健所の成人健診受診者410名である。当初、献血者からもanti-HCV陽性の対照者を選択する予定であったが、特に年令の点で適切な対照者を得る事が困難であった。Anti-HCV陽性率は肝癌群78%・対照群7%であり、anti-HCV陽性者の内、肝癌群80%・対照群83%に血中HCV-RNAが検出された。anti-HCV陰性の肝癌患者についても、1名にHCV-RNAが検出された。HCVの遺伝子型について検討すると、最も多いのは岡本分類II型であり、HCV-RNA検出者中、肝癌群の86%・対照群の60%を占めた。II型のHCVに感染した者の相対危険は、III型のHCVに感染した者(肝癌群11%・対照群28%)に比べて、3.8倍(95%信頼区間0.1-13.9;p=0.04)上昇していた。一方、血中HCV-RNA量については、肝癌群と対照群間で有意差に見られず、10Meq./ml以上の高濃度者は肝癌群9%・対照群24%と、むしろ対照群に多い傾向が見られた。以上の結果より、HCV感染者においてHCVの遺伝子型、特にII型が肝癌発症に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
先天性心疾患モデルラットの全胎仔培養による心奇形発生機序の組織学的解明

1動物の種が同じでも系が異なれば、化学薬品による心奇形発生率に差がみられる妊娠9.5日、10.5日、11日のSprague-Dawley系の母ラットにビスダイアミンを投与すると、各々35.1%、64.1%、10.5%の頻度で心血管奇形が生じたのに対して、同じ妊娠日のWister系母ラットに投与した場合には、各々100%、92.8%、45.6%の頻度であった。この結果をふまえ、Wister系ラットを用いて胎仔培養を行った。2心血管奇形モデルラットの胎仔培養下での心臓発生の観察妊娠10.5日のWister系母ラットにビスダイアミン200mgを経口投与し、6時間後に胎仔を摘出してNewらの方法により培養を開始した。同じ妊娠日のWister系母ラットから摘出した胎仔も同様に培養し、コントロールとした。また、同じ妊娠日の先天的に心奇形を生じるWKY/NCrjラットについても同様の検討を加えた。(1)形態的変化の経時的観察:培養開始24時間後には両者の形態に明らかな差はみられなかったが、48時間後にはビスダイアミン投与胎仔において動脈幹隆起の発達の悪いのが明らかとなった。(2)心臓発生過程の組織学的検討:ビスダイアミンを投与したラット胎仔の48時間培養後の動脈幹隆起において、HNK-1やN-CAM陽性の間葉細胞がコントロールに比して少ないのが認められた。また、コントロールでは神経堤周囲から第3、4鰓弓や第3、4、6動脈弓内へ連続したHNK-1やN-CAM陽性組織(おそらく移動した神経堤細胞)がみられるのに対して、ビスダイアミン投与ラットではどの時期でも確認できなかった。さらに、WKY/NCrjラットでは、このような形態的および組織学的所見は軽度であった。ビスダイアミンは心臓に進入する神経堤細胞に障害を与え、正常な動脈幹分割をさまたげるものと推測された。胎生10.5日のSprague-Dawley系ラット胎仔を用いてNew(1973)らの方法により全胎仔培養を行った。ビスダイアミン50mgを添加した培養ビン中では胎仔の発育はコントロールに比してよくないにも関わらず、心臓形成過程で形態的に明らかな差を認めなかった。添加するビスダイアミンを100mgに増量すると胎仔の発育はきわてめ不良となり、コントロールと比較することは適当でないと思われた。そこで、Sprague-DawleyおよびWisterの2系統の母ラットにビスダイアミンを投与し、それぞれで心奇形発生の頻度に差があるかどうかを検討した。その結果、Sprague-Dawley系では、妊娠9.5日、10.5日、11日に投与した場合に各々35.1%、64.1%、10.5%の奇形発生率であったが、Wister系では妊娠9.5日、10.5日、11日に投与すると心奇形の発生率は各々100%、92.8%、45.6%でラットの系により差のあることが明らかとなった。このため、コントロールおよび実験に使用する系をWisterに変更した。現在のところ、観察し得た心臓発生過程において、ビスダイアミン投与群やWKY/NCrjラット胎仔とコントロール群との間に形態的な差を認めるには至っていない。しかし、ビスダイアミンを投与したWister系胎仔を検索したところ、コントロールと対比して第3、4鰓弓や第3、4、6動脈弓でのN-CAMの発現の少ないことが明らかになった。

今後、これと心血管系との関連について検討を進めていく。また、Wister系ラットはビスダイアミンに対する感受性がSprague-Dawley系より高いと考えられ、Wister系を用いればビスダイアミンが作用する器官や時期がより特異的に示されると同時に、さらに低濃度のビスダイアミンでも予定した実験を遂行できる可能性が示されたと考えられる。平成7年度の研究結果(Splague-Dawley系ラットに比してWister系ラットの方がビスダイアミン投与により高率に心血管奇形を発生する)をふまえ、胎生10.5日のWisterラット胎仔を用いてNew(1973)らの方法により全胎仔培養を行った。しかし、ビスダイアミン50mgを添加した培養ビン中では心臓形成過程で形態的に明らかな差を認ず、また、ビスダイアミンを100mgに増量すると胎仔の発育は極めて不良となりコントロールと比較することは不適当と考えられた。そこで、妊娠10.5日のWister系母ラットにビスダイアミン200mgを経口投与し、その6時間後に胎仔を摘出して培養を開始した。その結果、培養開始24時間後、48時間後とも外見上コントロールと形態的な差は認めなかったが、48時間後の胎仔において動脈幹隆起の発達が悪く、組織学的には動脈幹隆起に分布するHNK-1やN-CAM陽性間葉細胞の数がコントロールに比して少ないのが確認された。さらに、胎生12.5日から13.5日のコントロールでは神経堤周囲から第3,4鰓弓や第3,4,6動脈弓内へ連続したHNK-1やN-CAM陽性組織(おそらく移動を開始した神経堤細胞)がみられるのに対して、48時間培養した胎仔ではこれらの部位にHNK-1やN-CAM陽性細胞が少なく、一連の組織としては確認できなかった。また、先天的にビスダイアミン投与ラットと同一の心血管奇形を発生するWKY/NCrjラットではこのような形態的、あるいは組織学的所見は軽度であった。これより、ビスダイアミンは神経堤細胞の心臓への移動と間葉細胞への形質変換を障害し、正常な動脈幹の分割を妨げると推測された。そして、同じ種の動物でも系により奇形発生の程度に差が見られることは、薬剤に対する感受生や障害に対する対賞機転に差があるか、あるいは二次的な血行動態の影響が強いかのいずれかと考えられ、今後検討すべき課題と思われた。
脳死判定における無呼吸テストの基礎的検討

無呼吸テストは脳死判定上最も重要な検査項目である。従来の判定基準は人工呼吸の停止後、体内の炭酸ガスの蓄積と酸素の低下が呼吸を刺激しても自発呼吸運動が観察されないことを確認するとされている。この基準では、自発呼吸運動の観察が視診・触診によるため客観性がない。また、呼吸刺激法として高炭酸ガスあるいは低酸素を用いる点に重大な問題がある。低酸素は呼吸を抑制する可能性があり、危険でもある。また、高炭酸ガスは常に呼吸刺激とはなりえない。従って、より適切な呼吸中枢活動の記録法と呼吸刺激法を開発する必要がある。本研究では、麻酔ラットを用いた基礎的実験から、舌咽神経の茎突咽頭筋枝の吸息性活動が横隔神経など他の呼吸神経よりも種々の呼吸抑制因子に対して抵抗性があることを応用した。また、呼吸刺激法として短時間で安全に有効な刺激となりうる気道内陰圧負荷法を用いた。低酸素や低炭酸ガス、呼吸に関する化学感受性のある延髄腹側表層の冷却などで呼吸リズムの発生を停止させた状態で、終末呼気時気道内陰圧負荷により確実に呼吸リズムが再開した。終末呼気時気道内陰圧負荷中でも人工換気は行われており、従来の呼吸刺激法より優れていると判断された。なお、低炭酸ガス状態が著しいと呼吸リズム再開が不可能であり、このテストを実施する際は血中の炭酸ガスレベルを正常に保つ必要がある。自発呼吸運動の指標として茎突咽頭筋の筋電図を記録するためには、皮膚表面電極よりも、表面に電極と貼付したバルーンを経口的に咽頭部に置いて記録するべきと判断された。今後実用化に向けて、記録電極の開発とヒトの気道内陰圧負荷程度の確立が必要がある。本年度は無呼吸テストを安全かつ確実に実施するために、適切な呼吸刺激法と呼吸活動の評価記録法に記録に関する実験動物(麻酔ラット)を用いた基礎研究を行い、以下の新知見を得た。1.自発呼吸リズムが発生しているかどうかを判定するには、呼吸中枢活動を忠実に反映する神経またはその支配筋活動を記録する必要がある。従来から横膜神経活動が呼吸中枢活動の最も重要な指標とされてきたが、本研究により、舌咽神経(茎突咽頭筋枝)の吸息性活動が種々の呼吸抑制因子(麻酔、低酸素、低炭酸ガス、肺伸展、延髄腹側表層冷却など)に対してより抵抗性を示すことが明らかになった。したがって、呼吸中枢活動の指標として舌咽神経茎突咽頭筋枝またはその吸息性筋電活動を記録することが最も適切であると判断された。2.呼吸刺激法として従来より高炭酸ガスまたは低酸素負荷が用いられてきたが、これらが常に有効な呼吸刺激となり得ないことは明らかであり、また、逆に安全性に問題がある。本研究により、種々の呼吸抑制状態(低酸素、低炭酸ガス、延髄腹側表層冷却など)においても、人口呼吸中に気道内に陰圧を負荷することによって容易に呼吸リズムを再開させうることを確認した。したがって、安全に呼吸刺激を行なうためには、気道内陰圧負荷が最も適切であると判断された。3.以上より、無呼吸テストの評価法と、安全かつ確実な呼吸刺激法についての基礎的方向づけができたと判断された。従来の判定基準は人工呼吸の停止後、体内の炭酸ガスの蓄積を酸素の低下が呼吸を刺激しても自発呼吸運動が観察されないこととされている。この基準では、自発呼吸運動の観察が視診・触診によるため客観性がないばかりでなく、呼吸刺激法として高炭酸ガスあるいは低酸素を用いる点に重大な問題がある。

本年度は呼吸刺激法として、安全性が高く、短時間で適応可能であり、確実な方法としての気道内陰圧負荷法を検討した。この目的のために、前年度に自発呼吸の有無を観察記録する方法として明らかにした舌咽神経茎突咽頭筋枝の吸息性活動を指標として、種々の呼吸抑制因子によって呼吸リズムを停止させた後、気道内陰圧負荷を行い呼吸リズムの再開過程を検討した。麻酔ラットを人工呼吸し、呼気終末時に気道内に陰圧(-5-15cm水柱)を1020秒間加えて横隔神経と舌咽神経茎突咽頭筋枝の吸息性活動の変化を観察した。呼吸リズムの発生を人工呼吸の周期と一致させるため、肺迷走神経求心路は切断しなかった。はじめに正常酸素、炭酸ガス状態で呼気終末時気道内陰圧負荷の効果を調べたところ、人工呼吸周期に同期したリズムのまた、吸息性活動の増加を認めた。次に過剰換気による低炭酸ガス性無呼吸、さらに化学感受性領野のある延髄腹側表面の冷却による無呼吸によるリズム停止時に、呼気終末時気道内陰圧を負荷することによってリズムが再開した。呼吸の周期性活動はまず舌咽神経茎突咽頭筋枝に出現し、次いで横隔神経にも周期性吸息性活動が回復した。低炭酸ガス状態が著しいリズムは再開しなかったので、無呼吸テスト時には炭酸ガスを正常レベルに維持する必要があると判断された。無呼吸テストの自発呼吸観察法として、舌咽神経茎突咽頭筋の筋電図活動を記録する必要があるので、記録手枝の検討を行った。同筋は頸部深くに位置し、大きさも小さいので、皮膚表面電極あるいは針状電極刺入による記録は困難である。従って。表面に電極を貼付したバルーンを経口的に咽頭部まで挿入して、内部から記録する必要があるとの結論に達した。
環境浄化材としての無機陰イオン交換体-特性把握とその評価-

ハイドロタルサイト様化合物は、水酸化マグネシウムのブルーサイト型構造を基本とする層状化合物で、天然にも存在するが合成も比較的容易であり、基本層ならびに層間に様々な元素が使用できる。層間の陰イオンは交換可能であるために、無機化合物の中では数少ない陰イオン交換体であるが、イオン交換能以外にも、表面がプラスに荷電していることや、Mg^<2+>の溶出に伴ってOH^-層が形成されるなど水処理材として興味深いいくつかの特徴を持っている。しかしながら、各種陰イオンなどの除去と、ハイドロタルサイト様化合物の組成(あるいは安定性)との関係やその機構などについては充分な検討を行なうまでに至っていない。そこで本研究においては組成の異なる種々の無機陰イオン交換体について、それらのもつ機能やこれらの機能に影響を及ぼす因子を一覧するとともに、この化合物の表面近傍での物理的、化学的な特性を明確にしたいと考えた。本年は、昨年度の結果を基に、特に近年除去方法が模索されているフッ素について、実用化を念頭においた検討を行った。カルシウムとアルミニウムを構成元素とするものはフッ素の除去に適することが明らかとなったっていたので、フッ酸を含む鉄鋼系の排水に適用した。ハイドロタルサイト様化合物を添加後にpHを中性付近に調整することにより、処理水中のフッ素濃度を8mg/l以下にまで低減させることが可能であった。また、表面が強アルカリ性となることを利用した殺菌効果の発現についても検討を継続している。培養法によらない手法による検討から、アルカリ溶液の場合には塩素とは明らかに異なる殺菌機構で殺菌が進行していることが示唆されている。本年は、基本層を構成する元素であるカルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウムの存在比の異なる化合物を用い、主として陰イオンの除去について検討を行った。鉄、マグネシウムを構成元素として持つ化合物は、硝酸イオンの除去に優れるが、アルミニウム、マグネシウムを構成元素として持つ化合物はリン、ホウ素、ヒ素などの除去に適すること、カルシウムとアルミニウムを構成元素とするものはフッ素の除去に適することが明らかとなった。これらの結果は、従来考えられているようなイオン交換機能によると考えるより、化合物の安定性や表面での水酸化物層の形成と関連させれば、構成元素と陰イオン除去特性との関連性を説明できることも明らかになっている。

そこで本研究においては組成の異なる種々の無機陰イオン交換体について、それらのもつ機能やこれらの機能に影響を及ぼす因子を一覧するとともに、この化合物の表面近傍での物理的、化学的な特性を明確にしたいと考えた。本年は、昨年度の結果を基に、特に近年除去方法が模索されているフッ素について、実用化を念頭においた検討を行った。カルシウムとアルミニウムを構成元素とするものはフッ素の除去に適することが明らかとなったっていたので、フッ酸を含む鉄鋼系の排水に適用した。ハイドロタルサイト様化合物を添加後にpHを中性付近に調整することにより、処理水中のフッ素濃度を8mg/l以下にまで低減させることが可能であった。また、表面が強アルカリ性となることを利用した殺菌効果の発現についても検討をした。培養法によらない手法による検討から、アルカリ溶液の場合には塩素とは明らかに異なる殺菌機構で殺菌が進行していることが示唆されている。
ノンケミカルな調湿材料を用いた住宅床下の防腐・防蟻効果の検証

本研究は、木炭やゼオライトなどの調湿材とグラスウール等の断熱材を用いて住宅床下の湿度管理と物理的遮蔽を積極的に施すことによって、木質材料の耐久性がノンケミカルな手法によっても確保できることを実証しようとしたものである。研究では、防腐・防蟻の技術開発や研究の現状について調査するとともにその課題について整理した。また、調湿材としての木炭利用を考えるため、その空隙構造、表面性状、調湿性能などについて基礎的検討を行うとともに、B型シリカゲル、珪藻土、ゼオライト、火山れきなど木炭以外の多孔質材料の調湿性能についても検討を行った。さらに、住宅床下モデルを屋外に設置し温湿度の計測とシロアリ等による食害の観察を行った。結果をまとめると以下のようになる。1.布基礎部に通気口を確保した床下モデル:モデル設置の初年度において、床下温度は調湿材の有無による差がなくほぼ同じであったが、相対湿度は調湿材有りモデルで無い場合よりも低くなる傾向が認められた。しかしながら2年目のシーズンでは、調湿材の有無による相対湿度の差は認められなくなった。各床下モデルの周囲に設置した餌木には2年目のシーズンにかなりの食害が認められたが、シロアリの進入を示すものはなかった。2.布基礎部に通気口を設けない床下モデル(グラスウール基礎、スタイロフォーム基礎):半密閉となるこれらモデルでは調湿材の効果が約6ヶ月程度認められたが、その後床下部の相対湿度が調湿材の有無に関係なく飽和状態となった。各床下モデル周囲の餌木には食害が認められた。シロアリによる断熱材の食害および内部への進入は認められなかった。木炭,ゼオライト,珪藻土および市販の調湿剤(B型シリカゲル)の調湿性能を密閉系での性能評価により数値化した。シリカゲルとの比較では、重量基準と容積基準の2つを用いた。重量基準、容積基準ともシリカゲルよりも調湿能力が高い材料はなかった。見かけ密度が大きいゼオライトでは,シリカゲルと同等の能力を発揮するのに23倍量の材料(重量および容積基準)を必要とした。一方、見かけ密度の小さい珪藻土と木炭では重量基準と容積基準で必要量が異なった。たとえば珪藻土では、おおよそ3倍と6倍の量が必要であった。検討結果をまとめると、ゼオライト、珪藻土、木炭はB型シリカゲルよりは調湿能力が劣るけれども、実用上は十分な能力をもっていると考えられた。その能力は710グラム程度の重さで、1リットルもの容器中の湿度をほぼ一定値(±1%程度)に保つことができる。調湿剤とガラスウール製断熱材を組み合わせた床下モデルをシロアリの活性が高い野外に設置し(鹿児島県日置郡吹上町),床下温湿度環境の連続測定を開始した。定期的に温湿度データの回収を行うとともに室内の劣化状況の観察を行い,木質の耐久性がノンケミカルな手法によっても確保できることを検証する。また,調湿剤の能力や外気の環境条件を考慮した水分環境モデルを構築するとともに実測データとの整合性についても検討する予定である。1目的・趣旨本研究では、木炭やゼオライトなどの調湿材とガラスウール製断熱材を用いて住宅床下の湿度管理と物理的遮蔽を積極的に施すことによって、木質材料の耐久性がノンケミカルな手法によっても十分に確保できることを実証しようとするものである。2研究経過の概要本研究は、次に示す4つの課題で構成している。(1)調湿材の能力評価(2)木材腐朽菌の水分依存性の検討(3)シロアリの水分依存性の検討(4)野外実験用床下モデルを用いた実証試験。このうち(4)に関わる野外試験を、京都大学生存圏研究所「生活・森林圏シミュレーションフィールド」(LSF)を利用して行った。3研究成果の概要

調湿能力の数値評価を行った結果、火山礫の調湿能力は極めて低かった。その他の材料では、B型シリカゲルと同等の能力を発揮するのに、重量基準で、スギ木炭1.8倍、ゼオライト2.5倍、珪藻土3.2倍の重量を必要とした。また、これを容積基準で表すと見掛け密度の低いスギ木炭と珪藻土が共に6.4倍、ゼオライトが2.2倍の容量を必要とした。布基礎部に通気口を確保した床下モデルでは、調湿材の有無で比較すると、床下温度は両者でほぼ同じであったが、調湿材有りの相対湿度が試験期間中を通して低い傾向が認められた。また、布基礎部に通気口を設けない床下モデル(ガラスウール基礎、スタイロフォーム基礎)では、床下内部の相対湿度が調湿材の有無に関係なく飽和状態に達した。現在、モデルの改良など試験方法について再検討を進めている。なお、シロアリの断熱材食害とモデルへの侵入は今のところ認められないが、周辺餌杭にはシロアリが侵入しているので、今後推移を観察する必要がある。本研究では、木炭やゼオライトなどの調湿材とガラスウール製断熱材を用いて住宅床下の湿度管理と物理的遮蔽を積極的に施すことによって、木質材料の耐久性がノンケミカルな手法によっても十分に確保できることを実証しようとするものである。床下モデル設置後約2年の温湿度計測と観察を行った。結果をまとめると以下のようになる。1.布基礎部に通気口を確保した床下モデル:モデル設置の初年度において、床下温度は調湿材の有無による差がなくほぼ同じであったが、相対湿度は調湿材有りモデルで無い場合よりも低くなる傾向が認められた。しかしながら2年目のシーズンでは、調湿材の有無による相対湿度の差は認められなくなった。各床下モデルの周囲に設置した餌木には2年目のシーズンにかなりの食害が認められたが、シロアリの進入を示すものはなかった。2.布基礎部に通気口を設けない床下モデル(ガラスウール基礎、スタイロフォーム基礎):半密閉となるこれらモデルでは調湿材の効果が約6ヶ月程度認められたが、その後床下部の相対湿度が調湿材の有無に関係なく飽和状態となった。各床下モデル周囲の餌木には食害が認められた。シロアリによる断熱材の食害および内部への進入は認められなかった。
リン脂質に結合する脂肪酸種の多様性による筋線維特性の制御

生体内には数多くの脂質分子種が存在し、その多様性が生体機能制御に関与することが類推されているが、その分子実体やメカニズムについては不明な点が多い。生体膜の構成成分であるホスファチジルコリン(PC)は、結合している脂肪酸の組み合わせから数多くの分子種が存在する。申請者らはこれまでに、骨格筋に含まれるPC分子種が筋線維タイプによって異なることを明らかにし、それが筋線維の特性に寄与している可能性を示唆している。本研究課題は、骨格筋の筋線維タイプによるPC分子種の相違を手がかりに、未だ解明されていない「“生体を構成する脂質の質"と生体機能の関係」を明らかにしようとする挑戦的な研究課題である。
循環再生材料としての海藻の分解における酵素カクテルによる糖の回収に関する研究

コンブを組換え酵素カクテルにより分解し、糖の回収を目的とした。海洋から2種類の新規なコンブ分解菌を単離した。Reinekea sp. KIT-YO10はマンナナーゼを、Microbulbifer sp.KIT-19はアルギナーゼを高生産している。両酵素を精製して、その性質を明らかにした。両酵素とも基質であるマンナンおよびアルギン酸からオリゴ糖を生成することから、コンブ分解酵素として利用可能である。また、新規なアルギナーゼ遺伝子をPCRにより取得した。本研究は海藻類からのバイオエタノール生産のための糖の回収を目的としている。そのためには、海藻を効率良く分解する菌の探索が、第一段階として重要となる。海藻は、ヌメリ成分であるアルギン酸やアガロース、細胞骨格多糖であるセルロースやヘミセルロース、ガラクトマンナン、貯蔵多糖のラミナランやアミロース、ペクチンなど多種多様な糖から構成されている。従って酵母によるアルコール発酵を最終的に考えた場合、酵母の栄養源となる糖にまで分解する必要がある。平成25年度においては、コンブあるいはワカメといった世界的にみても生産量が多い褐藻類の分解菌を海洋から探索した。その結果、海藻分解菌として最終的に4株を分離した。分離菌の16SrDNA解析の結果、Reinekea sp.、Agarivorans albus、Gilvimarinus agarilyticus、Microbulbifer elongatusかもしくはこの近縁株と推定された。いずれも海洋細菌である。Reinekea sp.の生産するマンナナーゼについては酵素を精製し、その特性に関して、Bioscience, Biotechnology and Biochemistryに論文投稿を行い受理され現在は、掲載手続き中である。また、9月に開催された日本生物工学会の広島大会において発表を行った。海藻分解菌として分離された4株は、アガラーゼ、アルギナーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ活性が高い。従って今後、本研究を遂行していく上での海藻分解菌として上記4株と決定した。本研究では、種々の海藻を効率よく分解し、糖を回収するための汎用的な酵素カクテルの提供および酵素の海藻分解過程を解明することを目的とする。そのために、(1)自然界から海藻構成多糖を強力に分解する微生物の分離、(2)分離菌由来の海藻分解酵素を用いた海藻成分の分解機構の解明、(3)枯草菌を宿主とした遺伝子組換え技術による酵素の大量生産技術の開発を行う。現在、海藻分解菌として新規Reinekea属およびMicrobulbifer属の海洋細菌を分離した。いずれの菌株も単独で、コンブを炭素源とした培養で、コンブを分解することを確認した。海藻分解酵素として、海藻の構成多糖であるアガロース、ラミナリン、アルギン酸、マンナンを分泌しているいことが分かった。そこで、先ず、Reinekea属細菌のマンナナーゼを精製し、酵素学的諸性質を検討した。その中で、マンナンからオリゴ糖を生成することがわかり、長時間反応させても単糖が遊離してこないことからエキソ型の酵素であることが分かった。また三糖や四糖からそれぞれ四糖および五糖を生成することから、糖転移反応を有することをを明らかにした。またMicrobulbifer属の海洋細菌は強力なアルギナーゼを分泌していることが分かったので、そのアルギナーゼを培養液中から精製している。Microbulbifer属細菌のゲノムよりミックスプライマーを用いてPCRによりアルギナーゼ遺伝子の一部を解読し、プライマーウォーキングによりアルギナーゼ全長の塩基配列を決定した。現在は、ゲノムからの当遺伝子のクローニングを行っている。Reinekea属細菌からは、残り3種類の多糖分解酵素遺伝子をショットガンクローニングで取得中である。海藻(コンブ)を組換え酵素カクテルにより分解し、糖を回収することを目的とした。最終年度(平成27年度)には、新たに海藻分解菌として海洋から分離したMicrobulbifer sp. KIT-19株のアルギナーゼを精製し、アルギン酸に対する分解活性を検討した。また、本菌のゲノムからPCRにより、新規なアルギナーゼ遺伝子をコードするDNA断片をサブクローニングし、pColdIIベクターへ乗り換えた。このキメラプラスミドを有する大腸菌の形質転換体から組換えアルギナーゼをHisタグカラムで精製し、その性質を調べた。本酵素は、コンブのヌメリ成分であるアルギン酸をランダムに分解するエンド型の酵素でありアルギン酸からオリゴ糖を生成することがTLC解析により判明した。研究全体を通じて、先ず、海洋から新規な海藻分解菌としてReinekea sp.KIT-YO10株とMicrobulbifer sp.KIT-19を分離した。これらの菌は海藻成分の1種である、マンナンおよびアルギン酸を優位に分解する菌であった。マンナナーゼを菌体の培養液から抽出、精製し、その性質を検討した。本酵素は他の海洋性細菌由来のマンナナーゼに比べ、熱に対する安定性が高いことが分かった、この性質は酵素を加工するうえで重要な特性である。更に本精製酵素はアルカリ性領域に最適反応pHを有するアルカリマンナナーゼであり、更にマンナンに作用し2から6個程度のオリゴ糖を生成することが判明した。その分解様式からエンド型の酵素と推定され、海藻成分のマンナンを分解する上で有効であると考えられた。しかも、オリゴ糖を生成する過程で糖転移反応も生じており、糖の修飾にも応用可能であることが推察された。