hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経験学習における学習者の迷いを最適化する"相互作用制御"教材設計法の開発

ゲーム教材発問の要件と学習成果の組み合わせによる評価(D)については,数学教材において,5名程度の学習者によるディスカッションにおける発話内容の,収束と発散をプロトコル分析により明らかにする手法を確立しつつある.学習成果と学習者の状態の組み合わせによる評価(E)については,たとえば,撮影技法においては,課題への到達経路を,学習者に提供された選択肢に対する結果について被写体に目盛りを付すなどして定量化した上で,学習者の試行と発話を時系列で評価する技法を確立しつつある.平成24年度前半は,予備実験の最終段階として,これまで試作を重ねてきた,数学,撮影技法,発想法それぞれの学習コンテンツを,WEB上に実装し,これまで,教授者の同席,もしくはグループ学習によっていた実験を,独習の環境で実施可能なものとする.あわせて,テキストマイニングおよび脳波計測を用いた,評価を実施し,これらの状態検出方法について,本研究遂行における問題点および対策を確定させる.これらを総合した上で,実験に用いるパラメータおよび評価方法を定め,それに応じた標本数を定めた実験計画を作成する.現在の課題は,数学については,個別の学習内容については,ほぼ試作が完了しているが,学習内容をつなぐための,仕組みづくりに取り組んでいる段階である.また,撮影技法については学習者による試行と発話を組み合わせると同時に,演習中に,学習者の随意に参照できる技法解説のインターフェイスを開発中である.発想法については,テキストマイニング法を用いて,試行の発散と収束とを視覚的に表現するインターフェイスを開発中である.これらはともに早いもので7月,遅くとも8月末頃までの完成を見込んでいる.平成24年度後半は,実験計画にしがって実験を行う.この時,実験および解析が円滑に遂行できるよう,学生等による研究補助者をチーム体制で整備し,効率化を図る.また,研究補助者が単なるデータ入力等の単純労働のみに終始してしまわぬよう,能力や興味関心等をふまえて,研究補助者にとって有意義なものとなるよう配慮する.また,年度の途中より,学会発表・論文投稿等を,前年度以上に積極的に行い,研究成果の公開につとめる.平成24年度は,機材については,実験用教材のWEB実装用機材,実験用機材を整備し,人件費については,年度後半における研究補助体制を整備する.また,旅費等については,国内学会での発表を予定している.はじめに,WEB実装用機材については,オーサリングソフトおよび画像処理能力の高いPCを整備する.実験用機材については,実験用PC,脳波計,画像処理ソフト等を整備する.特に脳波計は近年数万円程度の製品が市販されており,数セットを揃えることで,実験の効率を向上させると同時に,グループ学習の記録を可能する.研究補助体制については,学生から有志を募り,6カ月程度の期間,原則的に固定のメンバーによるプロジェクトとして体制を整備する.具体的な業務内容は,機材搬入等の実験環境の整備やデータ入力作業に加え,メンバーの能力や希望に応じて,実験結果の解釈等のディスカッションや,今後に向けての改善課題の抽出,実験時のインストラクション等を予定している.
自発神経活動に依存した大脳長距離軸索投射の形成・再編・再生

本研究の目的は、大脳の代表的な長距離神経回路である脳梁投射をモデルに、その神経活動依存的な形成・再編・再生のメカニズムを明らかにすることである。そのために必要な(1)時期特異的神経活動操作の実験系はすでに確立し、(2)生後初期のマウスin vivo脳における脳梁軸索投射の経時観察の実験系の構築を進めた。共同研究者から提供を受けたsuper nova法を用いて生後初期の片側大脳2/3層の興奮性神経細胞を少数、蛍光タンパク質で標識し、反対側皮質の頭蓋骨に手術を施して観察窓を作成し、共同研究先の2光子顕微鏡にて生後9、11、13日の3点で同一の脳梁軸索の形態変化を観察・記録する実験を進めた。1本の軸索分枝から分岐が生じて成長する例、途中で見られた分枝が退縮する例が観察され、軸索発達に伴うダイナミックな形成過程が示唆された。一方、9日齢、11日齢、13日齢の3点ともで同一軸索を観察できる効率が高くないこと、実験後に脳透明化を行ったときに、in vivo経時観察したものと同一の軸索を見つけることが困難であることなど、解決すべき課題も明らかになった。前者に関しては、観察用の窓を3日間クリーンに保つための薬剤投与(感染予防など)、一度に観察できる軸索数を増やすために標識される脳梁軸索の本数を増やしつつ密度は高くならないようにする条件検討、窓を少し広めにとるなどの脳手術の工夫などを進めている。後者に関しては、13日齢でin vivo観察を終了後、脳を固定する前に観察窓の周辺に目印をつける工夫を行った。さらに、軸索のどの分枝が維持されてさらに成長し、どの分枝が退縮するのかのルールを明らかにするための工夫も行った。これらの改良をふまえ、正常の脳梁軸索の発達ダイナミクスを明らかにする実験を鋭意進めている。今後、神経活動操作時にそれがどのように変化するかを明らかにする実験へと進む。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。そのために必要な(1)時期特異的神経活動操作の実験系(2)生後初期のマウスin vivo脳における脳梁軸索投射の経時的観察の実験系(3)脳梁投射細胞の自発活動パターンをみる実験系のうち、(1)をほぼ確立し、(2)(3)の確立に向けて研究を進めている。(1)について、脳梁軸索投射を可視化するための蛍光タンパク質とともに、Kir2.1、DREADDs、ChR2等の神経活動を操作する分子ツールを子宮内電気穿孔法によってマウス大脳皮質2/3層神経細胞に発現させる。Kir2.1の場合はTet-OFFシステム、DREADDsの場合は特異的な活性化リガンドCNO投与、ChR2の場合は小型LEDによる光照射により、時期特異的に神経活動を操作する。脳梁軸索投射は、マウスにおいて、生後2週間で形成される。この時期の神経活動(自発神経活動)抑制により脳梁軸索投射は阻害され、生後10日目以降に神経活動を回復させると、脳梁軸索投射も回復した。(3)によりどのような自発活動パターンが回復したら軸索投射が回復するかを検証し、この発達期に現れるある特徴的な自発活動パターンが脳梁軸索投射に重要であること、これが脳梁投射細胞に特異的な同期活動である可能性を示唆する結果が得られた。この結果は、生後3週以降に神経活動を回復させても軸索投射が回復しない結果と合うものであり、様々な時期特異的神経活動操作により自発活動パターンと軸索投射回復の有無を比較する実験、軸索投射に有効な自発活動パターンがどのような細胞に由来する活動かを明らかにする実験を進めている。本研究の目的達成に必要な3つの要素技術のうち、1つを確立、2つは確立に向けた進展があり、おおむね順調に進展している。

前者に関しては、観察用の窓を3日間クリーンに保つための薬剤投与(感染予防など)、一度に観察できる軸索数を増やすために標識される脳梁軸索の本数を増やしつつ密度は高くならないようにする条件検討、窓を少し広めにとるなどの脳手術の工夫などを進めている。後者に関しては、13日齢でin vivo観察を終了後、脳を固定する前に観察窓の周辺に目印をつける工夫を行った。さらに、軸索のどの分枝が維持されてさらに成長し、どの分枝が退縮するのかのルールを明らかにするための工夫も行った。これらの改良をふまえ、正常の脳梁軸索の発達ダイナミクスを明らかにする実験を鋭意進めている。今後、神経活動操作時にそれがどのように変化するかを明らかにする実験へと進む。(1)(2)(3)を確立し、合わせて進めることで、脳梁軸索投射の形成・再編・再生における自発神経活動の役割を明らかにするという本研究の目的達成をめざす。特に(2)(3)は自研究室でin vivo imagingの基本的な実験系の整備を進めつつ、特に高額なため整備が難しい部分や技術に関して共同研究を進めており、合わせてより一層の進展をめざす。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
流速に着目した浸透破壊規準とその天然堰止めダムへの応用

本申請課題では、土の浸透破壊現象について、流速および動水勾配に着目したそれぞれの評価規準を評価するための試験装置を作成し、それらを用いた評価手法を提案した。そして、それら評価規準の関係を土の物理的性質と関連づけて、それらの適用条件を明らかにした。また、それら規準のうち、土粒子個々の運搬に着目したモデルの応用として、天然ダムの現場での事例に適用を試みるための模型実験を実施し、適用性の可否と問題点を整理した。1)土木工学分野を対象に浸透破壊に関わる文献を収集し、およそ60を収集した。これらから、浸透破壊の評価基準に、初歩的な勘違いと思われる、力学系が混乱した評価方法が多く認められ、それが、評価基準を複雑にしていることを確認した。2)土粒子そのものの性質としての限界流速を捉えることを試みて、それを計測するための装置を作成した。そして、この装置を用いてガラスビーズ、まさ土、しらす等の資料を対象に実験を行った。その結果、限界流速が、単に土粒子そのものの性質として表すことが困難で、土粒子の形状や大きさに依存して引き起こされる土粒子近傍に発生する水の流れ状態に、大きく影響を受けることが解った。土粒子近傍に生じる流れ状態の影響を取り除いた限界流速値は、理論式から得られる値とほぼ同じになることを確認した。そこで、この値を利用して、土粒子の形状を流れの乱れ状態から評価する方法を提案した。3)水路模型実験装置を作成し、その性能確認を進めた。流量制御型実験装置に、購入した非接触型変位計を取り付け、ガラスビーズを対象とした実験を行って、性能確認した。4)BREACHモデル、DAMBRKモデル等、10の既存のモデルについて、それぞれのモデルパラメータと特徴を整理した。本申請課題では、土の浸透破壊現象について、主として(1)流速および動水勾配に着目したそれぞれの評価規準を評価するための試験装置を作成し、それらを用いた評価手法を提案する。(2)そして、それら評価規準の関係を土の物理的性質と関連づけて、それらの適用条件を明らかにする。(3)それら規準を天然ダムの現場での事例に適用を試みるための模型実験を実施し、適用性の可否と問題点を整理する。の3点を目的に進めている。昨年度は、以下のような成果を得た。1)浸透破壊や土粒子の運搬に係る文献について、地質学の分野にまで範囲を広げて調査、収集した。その結果、地盤工学分野の研究には水圧のつり合いを考慮する力学系がみられるが、地質学、水理学の分野での研究は、概ね土粒子と流体力のつり合いを考慮する力学系であった。また、ほぼ全てが、静力学に置換した系を取り扱っており、時間次元を取り入れたものはなかった。そこで、土が浸透流から受ける力を、静水圧と動水圧に配分されると考える概念を導入し、その方法の提案を行った。2)前年度作成した限界流速測定装置を用いて、いくつかの試料を対象とした、1)で述べた概念を適用した実験を実施した。特に、土の間隙比が及ぼす影響について調べたところ、静水圧から評価される抵抗力は、間隙比に依存するが、動水圧から評価される値は、間隙比によらないことが判った。このことは浸透破壊現象が、土の状態によって、静水圧で破壊する場合と、動水圧で破壊する場合とがあり、それが現象を複雑にしていることを裏付ける一方、破壊に対する評価を整理できる可能性が示唆されたと考えている。3)水路模型実験装置を作成し、この装置での実験を進めた。その結果、侵食現象が経時現象であり、土の表面で土粒子の交換が生じて粗粒化が生じることを確認した。このことは、上記評価規準での動水圧からの評価と密接に関連していると考えられ、この視点からの評価を目指す目処を立てた。本申請課題では、土の浸透破壊現象について、主として、1流速および動水勾配に着目したそれぞれの評価規準を評価するための試験装置を作成し、それらを用いた評価手法を提案する。2そして、それら評価規準の関係を土の物理的性質と関連づけて、それらの適用条件を明らかにする。3それら規準を天然ダムの現場での事例に適用を試みるための模型実験を実施し、適用性の可否と問題点を整理する。の3点を目的に進めた。

2)前年度作成した限界流速測定装置を用いて、いくつかの試料を対象に、1)で述べた概念を適用した実験を実施した。特に、土の間隙比が及ぼす影響について調べたところ、静水圧から評価される抵抗力は、間隙比に依存するが、動水圧から評価される値は、間隙比によらないことが判った。このことは浸透破壊現象を複雑にしていた。一方、動水圧に起因する破壊には、進行性の傾向が認められ、この点を評価する必要性があることが解った。昨年3月の東日本大震災で、その調査・報告のために成果の報告が滞った。また、装置が転倒・破損する等の被害を生じた。震災後1年を過ぎ、成果の報告に支障はなくなった。また、一部試験に影響のない部分の破損を除いて概ね復旧できた。そのため、予定よりもデータの精度が落ちる箇所が若干の超されていたものの、予定通り実験を進めることができ、当初の目的をほぼ達成できたものと評価している。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで、ほぼ当初の仮説通りの結果を得ているので、当面はこれまで通り研究を推進する。但し、東日本大震災に伴い、成果の公開に支障が生じたとともに、実験装置の破損が未だ完全には修復されていないので、これらについて以下のようにする予定である。(1)実験装置を、これまでの経験から得た改善点も考慮して新しい装置の開発・作成を行って研究を進める。(2)データの精度を高めるために、新たな計測器を購入して交換する。また、昨年8月の台風災害で、紀伊地方で多くの土砂ダムが形成されて社会問題化した。本申請課題では、その成果を土砂ダムのような天然堰止めダムの危険度評価等に活用することを目指していることから、得た結果の公開を早急に進めることにしている。
初期胚における中胚葉性分化誘導物質と形態形成

両生類胚における中胚葉誘導現象は,神経誘導に先だっておこり、個体の基本的体制の「形づくり」に最も重要な反応である。私達の研究室ではこのような現象をおこす中胚葉分化誘導物質として,世界で初めてアクチビンAを同定した。この物質は未分化な予定外胚葉に対して濃度依存的にすべての中胚葉組織を分化誘導することができる。低濃度(0.31ng/ml)では腹側の血球や体腔内上皮を分化し,高濃度(1050ng/ml)では筋肉や脊索など背側の中胚葉を分化誘導する。このようにアクチビンAの濃度勾配によって腔体内の勾配を再現できたことは初めての結果である。またこの物質を胞胚腔中にマイクロインジェクションによって注入を行うと1個の卵あたり13pg/mlで二次軸をもった胚を形成することができた。つぎにアクチビンに特異的に結合するタンパク質であるフオリスタチンを混合して未分化細胞に与えると,アクチビン1に対してフォリスタチン5の割合で完全にその分化誘導活性を抑制することが初めて明らかになった。このことは胚の中でのアクチビンの活性化を考える上で非常に重要なアプロ-チを可能にするものと考えられる。つぎにそれではツメガエルやイモリの卵内や胚内に実際にアクチビン物質が存在するのであろうか。私達はアクチビンのcーDNAをツメガエル肝の中からスクリ-ニングし,cーDNAライブラリ-をつくった。これらツメガエルのアクチビンプロ-ブを用いて初期胚の中でのmーRNA合成をノ-ザン法によって調べたところ検出されなかった。ところが,このアクチビン様タンパク質はすでに未受精卵の時からタンパク質の形として存在していることが初めて明らかになった。このことはアクチビンが未受精卵の中に不活性な型で存在し,胚発生という発生のプログラムの進行に伴って,しだいに植物半球側から活性化されてくると思われる。
代謝とヒストン修飾の制御による安全かつ効率的な心筋細胞リプログラミング法の確立

遺伝子導入によるリプログラミングの手法は、線維芽細胞からiPS細胞のみならず種々の目的の細胞を直接的に誘導できる新たな再生医療のツールとして期待されている。心臓再生療法の実現に必要な安全性とコスト削減に貢献する目的で、申請者は、これまでiPS細胞へのリプログラミングに関する分子機構の解析をすすめ、iPS細胞誘導過程で出現する特定の細胞集団から直接的に心筋細胞を誘導することに成功した。本研究では、これまでの知見をもとに、リプログラミングで代謝経路とクロストークするアセチル化やメチル化の制御因子の詳細を明らかにし、線維芽細胞から直接的に心筋細胞を安全かつ効率的に誘導する心臓再生療法の基盤構築を目標とし、次の4つのテーマに沿って研究を着手した。テーマ1直接的心筋細胞誘導過程におけるヒストン修飾領域と代謝産物の網羅的解析、テーマ2ヒストン修飾と代謝経路が心筋細胞特異的遺伝子に及ぼす影響の解析、テーマ3ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析、テーマ4ヒストン修飾と代謝経路の制御による腫瘍形成リスクの少ない心筋細胞作製法の開発平成30年度は、テーマ1, 2の研究成果をもとに、テーマ3「ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析」を試みてきた。すなわち、リプログラミング誘導初期でiPS細胞と心筋細胞への誘導に共通して作用する核内受容体の発現量が心筋細胞誘導では継続して高い状態であること、これにより好気性の代謝が恒常的に活性化していることが考えられた。また、酸化的リン酸化の亢進が細胞周期に与える影響や、がん遺伝子・がん抑制遺伝子のエピゲノムに与える影響について解析を試みてきた。今後も上記の解析を継続するとともに、テーマ4に基づいて、安全かつ効率的な心筋細胞誘導法を確立し、生体イメージングと移植モデルなどにより安全性の検証を行っていきたい。平成30年度は、テーマ1, 2の研究成果から得られた「直接的な心筋細胞誘導に重要な代謝経路」や「この代謝経路とヒストン修飾とのクロストーク」の情報をもとに、テーマ3「ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析」を試みてきた。iPS細胞形成に重要な転写因子Xの活性は、直接的な心筋細胞誘導過程では低く酸化的リン酸化の亢進が継続される。また、リプログラミング初期でiPS細胞と心筋細胞への誘導に共通して作用する核内受容体Yの発現量が心筋細胞誘導では継続して高い状態であること、これにより好気性の代謝が恒常的に活性化している可能性が見出された。酸化的リン酸化の亢進が細胞周期に与える影響や、がん遺伝子・がん抑制遺伝子のエピゲノムに与える影響について解析を試みてきた。予想以上に解析に時間を要しており、今後も解析を継続する必要があることから、本研究はやや遅れていると考えられる。今後も、テーマ1, 2の研究成果から得られた「直接的な心筋細胞誘導に重要な代謝経路」や「この代謝経路とヒストン修飾とのクロストーク」の情報をもとに、テーマ3「ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析」を継続していきたい。すなわち、リプログラミング初期でiPS細胞と心筋細胞への誘導に共通して作用する核内受容体Yの機能解析と、酸化的リン酸化の亢進が細胞周期に与える影響や、がん遺伝子・がん抑制遺伝子のエピゲノムに与える影響を解析結果から、安全かつ効率的な心筋細胞誘導に必要な代謝産物や化合物などを同定していく予定である。さらに、テーマ4に基づいて、「誘導した心筋前駆細胞あるいは心筋細胞の特性解析」や、「心筋梗塞モデルへの細胞移植と生体リアルタイムイメージング」を目標に研究を加速していきたい。テーマ1直接的心筋細胞誘導過程におけるヒストン修飾領域と代謝産物の網羅的解析、テーマ2ヒストン修飾と代謝経路が心筋細胞特異的遺伝子に及ぼす影響の解析、テーマ3ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析、テーマ4ヒストン修飾と代謝経路の制御による腫瘍形成リスクの少ない心筋細胞作製法の開発初年度は、主にテーマ1のための材料を得ることができた。すなわち、初期化誘導過程の細胞においてiPS細胞になる予備群と心筋細胞になる予備群との間に代謝様式の違いや転写因子Xの活性が異なることが見いだされた。今後、ヒストン修飾の解析を推進させ代謝経路とのクロストークとして重要な因子を同定していく予定である。初年度は、心臓線維芽細胞や胎仔線維芽細胞へ、ウイルスベクターにより初期化4因子を遺伝子導入して心筋細胞誘導実験を行い、テーマ1「直接的心筋細胞誘導過程におけるヒストン修飾領域と代謝産物の網羅的解析」に焦点をあてて研究を施行した。その結果、次の3点に要約されるように研究がなされ、やや遅れている点もあるが概ね順調に進展していると考えられる。i)直接的心筋細胞誘導過程における網羅的遺伝子発現データをマイクロアレイにより入手した。

ii)直接的心筋細胞誘導過程におけるヒストンアセチル化・メチル化領域の網羅的解析を行うためのChIP sequenceを行う準備が完了した。iii)直接的心筋細胞誘導過程における代謝産物を網羅的に解析するため細胞選別後のサンプルを採取することが出来た。遺伝子導入によるリプログラミングの手法は、線維芽細胞からiPS細胞のみならず種々の目的の細胞を直接的に誘導できる新たな再生医療のツールとして期待されている。心臓再生療法の実現に必要な安全性とコスト削減に貢献する目的で、申請者は、これまでiPS細胞へのリプログラミングに関する分子機構の解析をすすめ、iPS細胞誘導過程で出現する特定の細胞集団から直接的に心筋細胞を誘導することに成功した。本研究では、これまでの知見をもとに、リプログラミングで代謝経路とクロストークするアセチル化やメチル化の制御因子の詳細を明らかにし、線維芽細胞から直接的に心筋細胞を安全かつ効率的に誘導する心臓再生療法の基盤構築を目標とし、次の4つのテーマに沿って研究を着手した。テーマ1直接的心筋細胞誘導過程におけるヒストン修飾領域と代謝産物の網羅的解析、テーマ2ヒストン修飾と代謝経路が心筋細胞特異的遺伝子に及ぼす影響の解析、テーマ3ヒストン修飾と代謝経路が細胞周期・発癌経路に及ぼす影響の解析、テーマ4ヒストン修飾と代謝経路の制御による腫瘍形成リスクの少ない心筋細胞作製法の開発平成29年度は、主にテーマ1の解析結果をもとにテーマ2の研究が推進された。すなわち、初期化誘導過程の細胞においてiPS細胞になる予備群と心筋細胞になる予備群との間に代謝様式の違いが明らかとなった。あるメタボライトの細胞内量の違いにより転写因子Xの活性が異なることが見いだされた。さらに、心筋細胞予備群では、iPS細胞予備群と比較してヒストン修飾領域が異なる可能性が示唆された。今後も、ヒストン修飾と代謝経路とのクロストークの詳細を明らかにしていく予定である。平成29年度は、心臓線維芽細胞や胎仔線維芽細胞へ、ウイルスベクターにより初期化4因子を遺伝子導入して心筋細胞誘導実験を行い、テーマ1で得られた「直接的心筋細胞誘導過程における代謝産物の網羅的解析」の結果をもとに、テーマ2「ヒストン修飾と代謝経路が心筋細胞特異的遺伝子に及ぼす影響の解析」に着目して研究を推進した。すなわち、メタボローム解析により、iPS細胞になる予備群と心筋細胞になる予備群との間に代謝様式の違いが明らかとなり、あるメタボライトの細胞内量の違いにより転写因子Xの活性が異なることが見いだされた。この結果は、リプログラミング誘導によりiPS細胞だけでなく、直接的に心筋細胞が誘導されるメカニズムの解明に繋がるものと期待される。上記の理由から、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。
唾液を測定検体とした非侵襲的薬物濃度測定法の確立

本研究では非侵襲的手法による薬物濃度測定を目的として、唾液を検体とした測定手法の確立を行った。安定した測定精度を担保するために適切な内部標準物質と唾液中からの目的薬物である免疫抑制剤(エベロリムス)の精製法を検討し、血中濃度と同程度であれば良好な精度で唾液中濃度の測定が可能な系を確立した。確立した系を用い患者唾液検体の測定を試みたが、検出限界以下であったため、今回の検討では唾液中エベロリムス濃度と副作用発現との間の詳細な検討は困難であるが、エベロリムスの副作用である口内炎発現は高濃度の口腔内薬物暴露が要因ではないと示唆された。平成28年度は、UPLC/MS法によるエベロリムスとタクロリムスの同時測定系の条件最適化、唾液中濃度測定を行う上での前処理法の条件検討と問題点の抽出を行った。具体的には本研究を遂行する上で必須となる内部標準の検討としてエベロリムス-d4を選択しその濃度やイオン化条件、測定時における測定化合物との影響の検討および測定条件の最適化を行った。その結果、UPLC/MSによりエベロリムス-d4、エベロリムスおよびタクロリムスを同時に測定可能な測定系の構築に成功した。また、唾液中からの薬物の抽出法や濃縮の必要性およびその手法を検討し、液液抽出での測定限界を定めた。唾液からのエベロリムスを液液抽出し測定した結果、唾液からのエベロリムス抽出は可能であったが測定値は期待した濃縮効率には達しなかったことから、リン脂質などの混入がイオン化効率を低下させていることが示唆された。この問題は計画段階で予想していたよりも大きく、臨床検体を測定する上での定量性や精度への影響を考慮し、固相抽出での抽出条件を検討している。平成29年度に使用予定の臨床唾液検体は患者の同意を得た上で随時収集し保存している。エベロリムス血中濃度は診療にて測定し診療録に記載されていることから、臨床検体による唾液中エベロリムス濃度が測定でき次第、薬物血中濃度と唾液中薬物濃度の比較を行い唾液測定の臨床的有用性を検討していく予定である。同様に、唾液中エベロリムス濃度と口内炎等の副作用発現についてもデータを収集し、その相関について検討していく。申請者の所属施設が変更となったため条件検討や機器施設を行うために府県の移動を伴うこととなり予定していた実験量には達していない。唾液検体の前処理法の検討はやや遅れているもの、その他については平成28年度内に行うことを計画していた内容は概ね進行している。なお、唾液検体の前処理法検討で発生した問題点としては当初予想していた範囲内であったため(詳細は後述する)、液液抽出に比べ汎用性ではやや劣るものの固相抽出法での条件を検討することで対応している。UPLC/MS法によるエベロリムスとタクロリムスを同時に検出することが可能な測定系は、エベロリムス-d4を内部標準物質としてその濃度やイオン化条件の最適化を検討し、構築に成功したといえる。臨床検体の測定を見越した模擬検討として、健常人の唾液に規定濃度のエベロリムスとエベロリムス-d4を添加し唾液中エベロリムス濃度の測定を試みたが、液液抽出による前処理ではリン脂質などの唾液由来物質の残存によると思われるイオン化効率の低下のため検出量が予想以上に低く、臨床検体では測定値が検出限界以下となることが予想された。そのため、前述の通り前処理法として簡便さでは液液抽出にやや劣るものの脂質の除去により適した手法である固相抽出による検体の処理を検討している。本手法では液液抽出よりも濃縮効率が向上することが予想され、また作業者の手技によるばらつきも少ないことから、低濃度域においてより高い定量性と精度が担保されると思われる。幾つかの条件による固相抽出法の検討は行っており、今後最適化を行い臨床検体を用いた測定を行う予定である。平成29年度は、昨年度において問題として挙がった唾液抽出時の夾雑物除去法の最適化とそれに伴う内部標準物質の変更、測定条件の検討と臨床唾液検体の測定を行った。昨年度は液液抽出にて条件検討を行い標準液における測定条件を確立させたが、唾液中に混在するリン脂質等によるイオン化効率の低下が原因と思われ、十分な測定感度を得ることはできなかった。また、内部標準であるエベロリムス-d4を安定した感度維持に必要な濃度まで上昇させた場合、標準液に混在しているエベロリムスが検出されてしまったため、内部標準の変更が必要となった。内部標準をエベロリムスと分子構造・物性が類似したアスコマイシンに選択し、イオン化条件の検討を行った。各標準液を用いた混合液の測定で良好な分離と直線性が得られたことから、内部標準をアスコマイシンとしてイオン化効率を維持した唾液中からの薬物抽出条件の検討を行った。種々の固相抽出担体とデバイスを検討し、唾液特有の高い粘度においても溶出及び目的薬物の精製が可能な固相抽出デバイスとして、粒度の粗い珪藻土担体のIsolute SLE+を精製用デバイスに選択した。イオン化等の測定条件は概ね平成28年度に確立したものを使用し、臨床検体測定用に確立したメソッドでの検量線の作成、実臨床検体のエベロリムス唾液中濃度測定を行った。唾液スパイク検体による測定条件の検討から、濃度域3-50ng/mLにおいて検量線は相関係数(r2)

>0.9の高い相関性を示し、血中濃度と同程度であれば良好な精度で濃度測定が可能な系を確立した。患者検体測定においてはトラフ濃度のみならず起床時、内服後1,2,3時間後の唾液検体のいずれもが測定限界以下であった。現段階では唾液中エベロリムス濃度と副作用発現との間の詳細な検討は困難であるが、エベロリムスの副作用である口内炎発現は高濃度の口腔内薬物暴露が要因ではないと示唆された。本研究では非侵襲的手法による薬物濃度測定を目的として、唾液を検体とした測定手法の確立を行った。安定した測定精度を担保するために適切な内部標準物質と唾液中からの目的薬物である免疫抑制剤(エベロリムス)の精製法を検討し、血中濃度と同程度であれば良好な精度で唾液中濃度の測定が可能な系を確立した。確立した系を用い患者唾液検体の測定を試みたが、検出限界以下であったため、今回の検討では唾液中エベロリムス濃度と副作用発現との間の詳細な検討は困難であるが、エベロリムスの副作用である口内炎発現は高濃度の口腔内薬物暴露が要因ではないと示唆された。UPLC/MSによる測定系構築は達成できていることから、引き続き固相抽出による唾液からの薬物抽出効率の向上とイオン化を阻害するリン脂質の除去を行うための前処理法を検討する。前処理法を含めた唾液検体の測定条件の最適化が終了し次第、唾液中エベロリムス濃度の測定と血中濃度との比較を行う。なお、臨床唾液検体は平成28年度より継続して収集し、随時測定していく予定である。唾液中濃度の測定と並行し、診療にて測定しているエベロリムス血中濃度や患者の副作用発現状況などの情報を収集し、唾液中濃度と血中濃度との比較および口内炎などの副作用発現状況との相関について検討する。また、血中濃度と唾液中濃度との間に相関の見られない症例については、その要因を調べるための基礎的検討として、薬物の唾液分泌に関与するトランスポーターの遺伝子多型解析を行う予定である。収集した情報に基づき、投与量の調節や副作用発現への対策など臨へのフィードバックが可能な内容について検討していく。なお、平成29年度より申請者の所属施設が神戸大学医学部附属病院へ戻ったため、前年度のように実験や条件検討を行うにあたっての移動および詳細な日程の調整を必要とせず所属施設の所持している設備が使用可能である。医療薬学消耗品等の物品費は、申請者の所属施設が神戸大学医学部附属病院から京都大学に変更したことにより神戸大学医学部附属病院にて実験を行うための身分取得(神戸大学医学研究員)に時間を要した。また、研究遂行に必要な設備を神戸大学医学部附属病院に備え付きのものを使用するため、実験および条件検討を行うために府県をまたがる移動を必要とし、それに伴い実験量が減少したことによる。申請者の所属施設が神戸大学医学部附属病院に戻り、所属施設が保有する設備を使用するための移動や打ち合わせの調整が不要となったことにより平成28年度と比較して実験量は増加する。平成29年度は、固相抽出の条件検討や測定に使用する物品を購入し唾液検体の測定系を構築する。条件検討終了後は確立した測定系での測定に必要となる消耗品等の購入を行い臨床検体の測定と薬物血中濃度との相関について検討する。UPLC用カラムやガードカラムを臨床唾液検体測定用に、遺伝子多型解析用試薬を薬物血中濃度と唾液中濃度との間に相関の見られなかった症例についての検討のために購入予定である。
SCRAPPERを介した神経伝達制御機構の解明

ユビキチンプロテアソーム系による選択的タンパク質分解は様々な細胞機能の制御に重要である。ユビキチン代謝異常が様々な神経変性疾患を引き起こすことが知られており、神経系の制御においてもその重要性が近年明らかとなりつつある。シナプスにおけるユビキチンプロテアソーム系の関与についても近年明らかにされつつある(YaoらCell 2007)。そこで、本研究では、申請者らが最近同定した新規ユビキチンリガーゼ遺伝子に特に着目し、この変異マウスをツールとして用いることにより、タンパク質分解を介した神経伝達の調節機構を明らかにすることを目的とする。申請者はバイオインフォマティックスの方法を用い新規のユビキチンリガーゼを単離しSCRAPPERと名づけた。申請者はこれまでにSCRAPPERが神経シナプスに局在しシナプス終末からの伝達物質放出を調節していることを見出している。平成21年度は、Scrapper変異マウスを用いてScrapper遺伝子ノックアウトマウスおよび海馬での過剰発現トランスジェニソクマウスを作製し、これらの遺伝子改変マウスに対して脳における解剖学的所見を得るとともに、網羅的行動テストバッテリーによる解析を行った(統合脳第5領域宮川剛教授との共同研究)。129sv/C57BL6Jバックグラウンド系統のノックアウトマウスは野性型マウスと比較して体が小さく短命であり、成体脳では神経変性が見られた(YaoらCell 2007, Proteomics 2008)。C57BL6J系統にバッククロスを行ったノックアウト個体は生後1日で致死となってしまうことから、行動解析はヘテロ型SCR-HKOマウスにより行った。SCR-HKOマウスは行動バソテリー試験において恐怖条件付けの障害が見られた。一方、トランスジェニックマウスは野性型マウスと比較して行動に異常はないことが明らかとなった。シナプスにおけるユビキチンプロテアソーム系の関与についても近年明らかにされつつある(Yao et al., Cell 2007)。平成20年度は、Scrapper変異マウスを用いてマウス脳におけるタンパク質の局在の変化を調べることによりSCRAPPERによるタンパク質分解を介した神経伝達調節の分子基盤を明らかにした。すなわち、野性型とノックアウトマウスの脳で質量顕微鏡法を用いて比較を行い、局所的に量の変動している質量情報を得ることに成功した。この成果を論文としてProteomics誌に報告した。平成19年度および平成20年度に発表した論文については各方面から大きな反響を得、関連する内容について、学会発表として日本分子生物学会年会・日本生化学会大会、神経科学学会をはじめとして多くの学会で発表を行った。
間葉系幹細胞の機能低下から見た歯周病やインプラント周囲炎発症の新規理解と対策

本申請研究は,骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)の機能が,宿主の加齢変化によってどのような影響を受け,歯周病やインプラント周囲炎などの口腔粘膜における感染性炎症性疾患の発症や進行に関与するのかを分子生物学的に解明することで,これまでにない新規治療法の開発を目的としている.その為,1)週齢の異なるマウスに実験的歯周病を誘導し,病態の形成,進行具合の差を比較検討し,2)その差が何によって生じるのか,間葉系幹細胞をそれぞれ単離し多分化能,免疫調節能の差を検討した上で,骨髄成分の網羅的比較を行う.上記目的を達成するために,これまで,週齢の異なるマウス(5,20,35,50,65週齢)において,歯周病を誘導し,骨吸収の差を比較検討した結果,週齢が上がるに連れて,歯周病による骨吸収が進行し,さらには,50週以後の週齢では,骨吸収の程度に有意差が認められなかった.そこで,5週および50週齢のマウス大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞を単離培養し,その機能を分析したところ,5週齢に比べて,5 0週齢では細胞増殖,骨芽細胞分化能力が明らかに低下する一方で,脂肪細胞への分化能力が亢進していることが明らかとなった.さらには, 5週齢と比較して50週齢では,免疫調節能の低下が認められた.間葉系幹細胞機能の差を生じさせる要因として,間葉系幹細胞自身の老化の可能性と骨髄ニッチの変化による結果機能低下が引き起こされた可能性が考えられる.そのため,それぞれの週齢の大腿骨骨髄を回収し,nono LC/MS解析にてタンパクレベルでの網羅的解析を実施した.現在はその結果を解析しているところである.高齢マウスを発注した際に,メーカーに十分な高齢マウスが居ない場合があるため,入手するまでに期間が必要な場合がある.そのため,実験計画をマウス入手に合わせる必要があり,わずかながら計画の遅れが生じているのが現状である.今年度の計画として,1)タンパクレベルでの網羅的解析結果を詳細に検討し,間葉系幹細胞機能に影響を与える候補因子群を同定する.2)候補因子を間葉系幹細胞培養にて添加し,実際に機能変化が生じるか検討する.3)さらには候補因子によるシグナル活性経路を特定し,シグナル経路を刺激することで幹細胞機能に変化が生じるか検討する.4)最終的に,候補因子を高齢歯周病モデルに遺伝子導入もしくは投与することで歯周病病態形成に変化が生じるか検討する.これらの成果をまとめて学会発表を行うととともに論文作製する.本研究は,歯周病やインプラント周囲炎の病態形成・進行機序を宿主の老化に関連した間葉系幹細胞のさまざまな機能低下に着目して解明し,その解決策を開発することを目的としている.この目的を達成する第一段階として,本年は,歯周病の病態形成,進行が宿主の加齢により,どのように変化するかをマウスモデルを用いて検討したところ,5週齢マウス歯周病モデルに対して,20,35週齢で年齢の増加とともに下顎第一臼歯の近心ならびに根分岐部の骨吸収が著明に増大し,50週齢で最大の骨吸収量を示した.その後,65,80週齢における骨吸収は,50週齢におけるものと有意な差を認めなかった.さらには,骨吸収の差が最も大きい5週齢と50週齢における歯周病病態形成周囲の間葉系幹細胞の集積を組織学的に検討したところ,5週齢では,歯周病誘導モデルにおいて,骨吸収のみられる歯根周囲に間葉系幹細胞マーカーの一つであるPDGFRa陽性細胞が数多く集積している像が観察されたものの,50週齢ではPDGFRa陽性細胞の集積は著明に減少している像が観察された.このことは,宿主の加齢による歯周病の病態形成の変化に間葉系幹細胞が大きく関わっている事を示唆しており,高齢マウスより単離した間葉系幹細胞の機能を詳細に検討することで,歯周病の病態形成・進行メカニズムを解明するだけでなく,新たな分子生物学的治療法の開発につながると考える.当初研究計画では,5,20,35,50,65週齢のマウスを比較検討する計画であったが,50週齢以上の高齢マウスは定期的な購入が困難であり,実験の進行がある程度制限されている現状である.しかしながら,これまでの予備的研究では50週齢以上では歯周病の進行に急激な変化は認められず,50週でプラトーに達するような感覚を得ているため,今後は50週齢とそれ以下の週齢にターゲットを絞り検討して行く予定である.本申請研究は,骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)の機能が,宿主の加齢変化によってどのような影響を受け,歯周病やインプラント周囲炎などの口腔粘膜における感染性炎症性疾患の発症や進行に関与するのかを分子生物学的に解明することで,これまでにない新規治療法の開発を目的としている.その為,1)週齢の異なるマウスに実験的歯周病を誘導し,病態の形成,進行具合の差を比較検討し,2)その差が何によって生じるのか,間葉系幹細胞をそれぞれ単離し多分化能,免疫調節能の差を検討した上で,骨髄成分の網羅的比較を行う.上記目的を達成するために,これまで,週齢の異なるマウス(5,20,35,50,65週齢)において,歯周病を誘導し,骨吸収の差を比較検討した結果,週齢が上がるに連れて,歯周病による骨吸収が進行し,さらには,50週以後の週齢では,骨吸収の程度に有意差が認められなかった.

そこで,5週および50週齢のマウス大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞を単離培養し,その機能を分析したところ,5週齢に比べて,5 0週齢では細胞増殖,骨芽細胞分化能力が明らかに低下する一方で,脂肪細胞への分化能力が亢進していることが明らかとなった.さらには, 5週齢と比較して50週齢では,免疫調節能の低下が認められた.間葉系幹細胞機能の差を生じさせる要因として,間葉系幹細胞自身の老化の可能性と骨髄ニッチの変化による結果機能低下が引き起こされた可能性が考えられる.そのため,それぞれの週齢の大腿骨骨髄を回収し,nono LC/MS解析にてタンパクレベルでの網羅的解析を実施した.現在はその結果を解析しているところである.高齢マウスを発注した際に,メーカーに十分な高齢マウスが居ない場合があるため,入手するまでに期間が必要な場合がある.そのため,実験計画をマウス入手に合わせる必要があり,わずかながら計画の遅れが生じているのが現状である.これまでの予備的検討では,5週齢と50週齢で歯周病の病態形成が大きく異なったため,この週齢における間葉系幹細胞の機能を比較していく予定である.具体的には5週齢および50週齢マウス大腿骨ならびに顎骨より骨髄由来間葉系幹細胞を単離・培養し,コロニー形成能,増殖能,多分化能,免疫調節能を比較検討し,さらには,本研究の中核をなす,幹細胞機能の差を生む骨髄ニッチの差をタンパクレベルで網羅的に解析する予定である.今年度の計画として,1)タンパクレベルでの網羅的解析結果を詳細に検討し,間葉系幹細胞機能に影響を与える候補因子群を同定する.2)候補因子を間葉系幹細胞培養にて添加し,実際に機能変化が生じるか検討する.3)さらには候補因子によるシグナル活性経路を特定し,シグナル経路を刺激することで幹細胞機能に変化が生じるか検討する.4)最終的に,候補因子を高齢歯周病モデルに遺伝子導入もしくは投与することで歯周病病態形成に変化が生じるか検討する.これらの成果をまとめて学会発表を行うととともに論文作製する.
コンクリート充填角形鋼管構造立体架構の弾塑性挙動に関する実験的研究

コンクリートを充填した角形鋼管の柱は、コンクリートによる鋼管の局部変形の抑制や、鋼管によるコンクリートのコンファインド効果・剥離防止など、両者の相互作用による力学的利点をもった、耐力・靭性ともに優れた構造部材であるが、冷間成形角形鋼管を用いた柱はり接合部の脆性破壊や、柱はり接合部近傍におけるコンクリートのコンファインド効果など、架構として未解明の問題もある。本研究は、冷間成形角形鋼管にコンクリートを充填した柱にH形鋼はりを配した立体架構、特にこれまで研究資料がほとんどない、外柱・隅柱周辺架構を対象にして、耐力・変形能力に及ぼす3次元載荷の影響を調べ、破壊形式や柱・はり構成形式の異なる架構の終局限界状態を解明することを目的とした実験的研究である。立体架構の実験では、試験体柱に一定軸力と長期荷重に相当する一定のはり端鉛直力を加えた後、直交する構面のはり端に地震力に相当する鉛直力を漸増変位振幅下で正負交番繰り返し載荷した。実験変数としては、軸力比、柱・はり構成形式(外柱・隅柱周辺立体架構、平面架構)、長期荷重の許容値に対する比、および破壊形式(柱曲げ破壊型、接合部パネル破壊型)が選ばれている。実験の結果から、(1)接合部パネル破壊型の中柱架構・外柱・隅柱架構の最大耐力は、パネルの終局せん断耐力の計算値を大きく上回り、やがて柱鋼管に局部座屈が発生するため、柱破壊型も含めて試験体の最大耐力はいずれも柱の終局曲げ耐力の計算値と一致すること、(2)外柱・隅柱架構の試験体の履歴挙動を中柱架構の対応する試験体と比較すると、前者には耐力の低下がみられ、その耐力の低下は柱破壊型において顕著であること、(3)変形能力は接合部パネル破壊型の試験体が柱破壊型の試験体よりも高く優れていること、(4)立体架構試験体の破壊形式は、いずれも柱鋼管の局部座屈に起因する架構の変形性状に左右されること、などの知見を得た。本研究は、冷間成形角形鋼管にコンクリートを充填した柱にH形鋼はりを配した立体架構、特にこれまで研究資料がほとんどない、側柱・隅柱周辺架構を対象にして、耐力・変形能力に及ぼす3次元載荷の影響を調べ、破壊形式や柱・はり構成形式の異なる架構の終局限界状態を解明することを目的とした実験的研究である。実験の載荷条件は、立体架構試験体柱に一定軸力と長期荷重に相当する一定のはり端鉛直力を加えた後、直交する構面のはり端に地震力に相当する鉛直力を漸増変位振幅下で正負交番繰り返し載荷した。実験変数としては、軸力比、柱・はり構成形式(側柱・隅柱)、長期荷重の許容値に対する比、および破壊形式(柱曲げ破壊型、接合部パネル破壊型)が選ばれている。実験の結果から、

(1)接合部パネル破壊型の中柱架構・外柱架構の最大耐力は、パネルの終局せん断耐力の計算値を大きく上回り、やがて柱鋼管に局部座屈が発生するため、柱破壊型も含めて試験体の最大耐力は、いずれも柱の終局曲げ耐力の計算値と一到すること、(2)外柱架構の試験体の履歴挙動を中柱架構の対応する試験体と比較すると、前者には耐力の低下がみられ、その耐力の低下は柱破壊型において顕著であること、(3)変形能力は接合部パネル破壊型の試験体が柱破壊型の試験隠よりも高く優れていること、(4)立体架構試験体の破壊形式は、いずれも柱鋼管の局部座屈に起因する架構の変形性状に左右されること、などの知見を得た。コンクリートを充填した角形鋼管の柱は、コンクリートによる鋼管の局部変形の抑制や、鋼管によるコンクリートのコンファインド効果・剥離防止など、両者の相互作用による力学的利点をもった、耐力・靭性ともに優れた構造部材であるが、冷間成形角形鋼管を用いた柱はり接合部の脆性破壊や、柱はり接合部近傍におけるコンクリートのコンファインド効果など、架構として未解明の問題もある。本研究は、冷間成形角形鋼管にコンクリートを充填した柱にH形鋼はりを配した立体架構、特にこれまで研究資料がほとんどない、外柱・隅柱周辺架構を対象にして、耐力・変形能力に及ぼす3次元載荷の影響を調べ、破壊形式や柱・はり構成形式の異なる架構の終局限界状態を解明することを目的とした実験的研究である。立体架構の実験では、試験体柱に一定軸力と長期荷重に相当する一定のはり端鉛直力をに加えた後、直交する構面のはり端に地震力に相当する鉛直力を漸増変位振幅下で正負交番繰り返し載荷した。実験変数としては、軸力比、柱・はり構成形式(外柱・隅柱周辺立体架構、平面架構)、長期荷重の許容値に対する比、および破壊形式(柱曲げ破壊型、接合部パネル破壊型)が選ばれている。実験の結果から、(1)接合部パネル破壊型の中柱架構・外柱・隅柱架構の最大耐力は、パネルの終局せん断耐力の計算値を大きく上回り、やがて柱鋼管に局部座屈が発生するため、柱破壊型も含めて試験体の最大耐力はいずれも柱の終局曲げ耐力の計算値と一致すること、(2)外柱・隅柱架構の試験体の履歴挙動を中柱架構の対応する試験体と比較すると、前者には耐力の低下がみられ、その耐力の低下は柱破壊型において顕著であること、(3)変形能力は接合部パネル破壊型の試験体が柱破壊型の試験体よりも高く優れていること、(4)立体架構試験体の破壊形式は、いずれも柱鋼管の局部座屈に起因する架構の変形性状に左右されること、などの知見を得た。
統計解析における位相的代数的側面の研究とその応用

主として、構成比データの主成分に関する分析手法にかかわる研究を行なった。これらに関しては、Aitchison(1983)によるlog-ratio法、多賀谷(1984)による開平法のようにデータを特定の関数によって変換して、通常の主成分分析法を適用する方法以外にも、構成比データを1つの確立分布とみなすことによって、データ間に直接色々な距離を定義し、Mardia(1979)による距離分析を適用する方法が考えられる。この研究では、後者の立場に立って、以下のような距離について考察した。理論的側面として、(1)、(2)についてはEuclideanであることを示すことができたが、(3)、(4)については示すことができなかった。又、数量化III類といわれる分析法も、一種の距離分析とみなせることが示せた。応用的側面として、上記、(1)、(2)、(4)及びAitchison等の方法を統合した構成比データ分析のソフトをACOS-350上で開発し、現在パソコン上に移殖中である。さらに、数値計算の結果、(4)による方法と多賀谷の方法とが非常によく似た布置を与えることが判明した。
脂肪細胞グリセロールチャネル・アクアポリンアディポースの生活習慣病における意義

本研究では、まず、AQPapが生活習慣病の基盤病態である肥満に関与するのかどうかを検討した。野生型(WT)と欠損マウス(KO)を比較すると、10週齢までは体重に差を認めなかったが、12週齢以降はWTに比しKOでは有意に体重及び体脂肪量は増加していた。WTに比べKOの脂肪細胞はより大きく中性脂肪含量も高値であった。さらに、2型糖尿病を誘発する高脂肪・高ショ糖食をWTおよびKOに与え、経時的に観察したところ、若年齢よりKOでは肥満とインスリン抵抗性の増悪が認められた。このメカニズムには、AQPap欠損時に、脂肪細胞におけるグリセロールキナーゼ活性が増加することが関与しており、このために、脂肪細胞の肥大・増加が生じることが示唆された(PNAS, 2005)。さらに、AQPapの機能解析を進め、AQPapが脂肪細胞の分化に及ぼす影響を調べた。野生型(WT)およびAQPap KOマウスの白色脂肪組織からstromal vascularcell (SVC)を単離し、脂肪細胞に分化させた。分化誘導後2,4,6日目においてそれぞれoil red O染色およびPPARγ遺伝子発現を検討したが、WTおよびKO由来SVC脂肪細胞間では明らかな差は見られなかった。また、エピネフリン誘発性脂肪分解時には、KO由来SVC脂肪細胞において有意に培地中グリセロール濃度が低下していた。以上のことから、AQPapは脂肪細胞の分化には影響を与えずに、グリセロールチャネルとして機能していることが明らかになった。さらに、AQPap,AQP9の転写調節機構の解析では、3T3-L1脂肪細胞や293細胞を用いて、AQPapプロモーターに影響を及ぼす因子を検討した結果、フォークヘッド型転写因子Foxo1を同定することが出来た。Foxo1発現ベクターの感染量に応じて、AQPapプロモーター活性は上昇した。さらに、Foxo1を特異的に抑制するRNAiにより、その活性はRNAi用量依存性に低下した。また、Gel shift assayによりFoxo1はAQPapプロモーター上のinsulin response element (IRE) 1に結合することが確認できた。これら私たちの一連の業績について、Nature誌2005年11月号のNews & Viewsに紹介され、さらに、AQPsとグリセロール代謝に関するReviewをBBA誌2006年1月号に発表するに至った。これまでの研究により、私たちがクローニングしたAQPap(AQP7)が脂肪細胞におけるグリセロールチャネルとして機能し(JBC 2000)、本分子の発現が絶食で増加、摂食で低下すること、インスリンにより抑制されることを明らかにした(JBC 2001)。また、摂食下では血中インスリンの上昇により脂肪細胞AQPap、肝臓でのグリセロールチャネル分子AQP9はともに発現が低下するが、肥満動物ではインスリン抵抗性があり両チャネルの抑制がかからず、高グリセロール血症が持続し糖代謝異常が発症することを明らかにしている(Diabetes 2002)。

さらに、AQPap欠損マウスの作製に成功し、AQPapが生体内においてグリセロールの恒常性に直接大きく関与しており、さらに、欠損マウスは絶食状態において著明な低血糖を呈し、肝糖新生の基質として脂肪細胞由来のグリセロールが非常に重要であることを実証した(PNAS 2004)。本研究では、さらに、AQPapが生活習慣病の基盤病態である肥満に関与するのかどうかを検討した。野生型(WT)と欠損マウス(KO)を比較すると、10週齢までは体重に差を認めなかったが、12週齢以降はWTに比しKOでは有意に体重及び体脂肪量は増加していた。WTに比べKOの脂肪細胞はより大きく中性脂肪含量も高値であった。さらに、2型糖尿病を誘発する高脂肪・高ショ糖食をWTおよびKOに与え、経時的に観察したところ、若年齢よりKOでは肥満とインスリン抵抗性の増悪が認められた。このメカニズムには、AQPap欠損時に、脂肪細胞におけるグリセロールキナーゼ活性が増加することが関与しており、このために、脂肪細胞の肥大・増加が生じることが示唆された(PNAS,2005)。また、これらAQPap(AQP7)に関連する私たちの一連の業績について、Nature誌11月号のNews&Viewsに紹介された。前年度の本研究におけるAQPap欠損(KO)マウスの解析により、AQPapが生活習慣病の某盤病態である肥満に関与し、そのメカニズムには、AQPap欠損時に脂肪細胞におけるグリセロールキナーゼ活性が増加することにより、脂肪細胞の肥大・増加が生じることが明らかとなった(PNAS 2005)。さらに、本年度は、AQPapの機能解析を進め、AQPapが脂肪細胞の分化に及ぼす影響を調べた。野生型(WT)およびAQpap KOマウスの白色脂肪組織からstromal vascularcell(SVC)を単離し、脂肪細胞に分化させた。分化誘導後2、4、6日目においてそれぞれoil red O染色およびPPARγ遺伝子発現を検討したが、WTおよびKO由来SVC脂肪細胞間では明らかな差は見られなかった。また、エピネフリン誘発性脂肪分解時には、KO由来SVC脂肪細胞において有意に培地中グリセロール濃度が低下していた。以上のことから、AQPapは脂肪細胞の分化には影響を与えずに、グリセロールチャネルとして機能していることが明らかになった。また、ヒトAQPap、AQP9の遺伝子変異・多型解析については、肥満症症例ならびに2型糖尿病症例のAQPapおよびAQP9遺伝子変異・多型解析、および血中グリセロール濃度を測定中である。さらに、AQpap、AQp9の転写調節機構の解析では、3T3-L1脂肪細胞や293細胞を用いて、AQPapプロモーターに影響を及ぼす因子を検討した結果、フォークヘッド型転写因子Foxo1を同定することが出来た。Foxo1発現ベクターの感染量に応じて、AQPapプロモーター活性は上昇した。さらに、Foxo1を特異的に抑制するRNAiにより、その活性はRNAi用量依存性に低下した。また、Gel shift assayによりFoxo1はAQpapプロモーター上のinsulin response element(IRE)1に結合することが確認できた。