hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写因子遺伝子導入による疾患感受性制御法の開発

疾患感受性の決定にはT細胞サブセットのバランスが重要であるということが,近年明らかにされつつある.また,Maf群転写因子の一つC-Mafが,IL-4遺伝子の活性化を通じてT細胞サブセットの1つ,Th2細胞を誘導し,T細胞サブセットのバランスの決定と密接に関係しているという報告がなされた.そこで,c-Mafを利用してTh1/Th2の比を変化させ,さらに,疾患感受性を変化させることを目的として以下の実験を行い,後述する結果を得た.CD2,あるいは,LCKの制御領域を利用して,c-MafをT細胞特異的に発現させるための構築を作成して,マウス受精卵に導入し,トランスジェニックマウスを作成した.このマウスにおいて,T細胞サブセットがTh2優位になっていることを示唆する血清学的な解析結果が得られている.また,このマウスは,8-10ヵ月以上の加齢によりリンパ腫を好発することも明らかになった.一方,転写活性化領域を欠失するMaf群転写因子であるMafKをc-Mafに対するドミナントネガティヴな分子として利用し,マウス個体においてc-Mafと同様にT細胞特異的に過剰発現させたところ,このマウスにおいてはT細胞の分化が抑制されるという結果が得られた.今後は,これらのトランスジーンを自己免疫疾患自然発症マウスへ導入して,疾患感受性の変化が起こりえるかを検討する.2)マウスにおけるc-Maf遺伝子破壊実験.ジーンターゲッティングの手法を用いて,マウスにおけるc-maf遺伝子の破壊を行った.c-Maf欠損マウスは,多くが胎生後期で致死であり,レンズの形成異常を示した.T細胞の異常について今後解析を行う予定である.疾患感受性の決定にはT細胞サブセットのバランスが重要であるということが,近年明らかにされつつある.また,Maf群転写因子の一つC-Mafが,IL-4遺伝子の活性化を通じてT細胞サブセットの1つ,Th2細胞を誘導し,T細胞サブセットのバランスの決定と密接に関係しているという報告がなされた.そこで,c-Mafを利用してTh1/Th2の比を変化させ,さらに,疾患感受性を変化させることを目的として以下の実験を行い,後述する結果を得た.CD2,あるいは,LCKの制御領域を利用して,c-MafをT細胞特異的に発現させるための構築を作成して,マウス受精卵に導入し,トランスジェニックマウスを作成した.このマウスにおいて,T細胞サブセットがTh2優位になっていることを示唆する血清学的な解析結果が得られている.また,このマウスは,8-10ヵ月以上の加齢によりリンパ腫を好発することも明らかになった.一方,転写活性化領域を欠失するMaf群転写因子であるMafKをc-Mafに対するドミナントネガティヴな分子として利用し,マウス個体においてc-Mafと同様にT細胞特異的に過剰発現させたところ,このマウスにおいてはT細胞の分化が抑制されるという結果が得られた.今後は,これらのトランスジーンを自己免疫疾患自然発症マウスへ導入して,疾患感受性の変化が起こりえるかを検討する.2)マウスにおけるc-Maf遺伝子破壊実験.ジーンターゲッティングの手法を用いて,マウスにおけるc-maf遺伝子の破壊を行った.c-Maf欠損マウスは,多くが胎生後期で致死であり,レンズの形成異常を示した.T細胞の異常について今後解析を行う予定である.cMafは癌遺伝子として同定されたが,Tリンパ球の細胞系列の分化方向性決定に重要であることが示されている.そこで,Tリンパ球の分化をcMafを用いて操作することにより,疾患感受性を是正することが可能と考えられる.転写因子を利用した疾患感受性の是正という新しい治療法のモデルの開発を目的として,以下の研究を進行させている.1.cMafをTリンパ球に過剰発現するトランスジェニックマウスの作成,現在複数のラインを作成し,免疫学的,血液学的,組織学的解析を行っている.2.cMaf遺伝子の破壊実験,現在ES細胞で相同組み換えをおこしたクローンを分離し,胞胚期マウス胎児に移植して,キメラマウスを作成中である.今度はこれらのマウスの作成と解析を行い,さらに,自己免疫疾患自然発症マウスにcMafを過剰に発現させてみることで,自己免疫疾患の改善が認められるかを検討する予定である.疾患感受性の決定にはT細胞サブセットのバランスが重要であるということが,近年明らかにされつつある.また,Maf群転写因子の一つc-Mafが,IL-4遺伝子の活性化を通じてT細胞サブセットの1つ,Th2細胞を誘導し,T細胞サブセットのバランスの決定と密接に関係しているという報告がなされた.そこで,c-Mafを利用してTh1/Th2の比を変化させ,さらに,疾患感受性を変化させることを目的として以下の実験を行い,後述する結果を得た.CD2,あるいは,LCKの制御領域を利用して,c-MafをT細胞特異的に発現させるための構築を作成して,マウス受精卵に導入し,トランスジェニックマウスを作成した.このマウスにおいて,T細胞サブセットがTh2優位になっていることを示唆する血清学的な解析結果が得られている.また,このマウスは,8-10カ月以上の加齢によりリンパ腫を好発することも明らかになった.一方,転写活性化領域を欠失するMaf群転写因子であるMafKをc-Mafに対するドミナントネガティヴな分子として利用し,マウス個体においてc-Mafと同様にT細胞特異的に過剰発現させたところ,このマウスにおいてはT細胞の分化が抑制されるという結果が得られた.

今後は,これらのトランスジーンを自己免疫疾患自然発症マウスへ導入して,疾患感受性の変化が起こりえるかを検討する.2)マウスにおけるc-maf遺伝子破壊実験.ジーンターゲッティングの手法を用いて,マウスにおけるC-maf遺伝子の破壊を行った.c-Maf欠損マウスは,多くが胎生後期で致死であり,レンズの形成異常を示した.T細胞の異常について今後解析を行う予定である.
２次元フラクタルツリーの非線形振動特性に関する研究

本研究では、フラクタル構造の動的性質に焦点を当て、具体例として2次元フラクタルツリーの非線形振動特性を研究対象とした。2次元フラクタルツリーの中でも2進木構造および3進木構造に対して、試験片の作製、振動試験および高速度カメラを用いた共振時の挙動計測、CAE解析、数式処理ソフトウェアおよび数値解析ソフトウェアを用いた数値シミュレーションを行った。2進木構造では、動吸振器的な特徴を有する挙動が確認された。また、3進木構造に対しては、振動試験では現れるがCAE解析では現れない共振現象が見られ、ハイスピードカメラを用いて複雑な固有振動モードが明らかにされた。平成23年度の研究において、作製した一部の試験片に対する予備的な振動試験の結果、非線形振動特性であると思われる特異な共振現象が観察された。この現象に対して詳細な検討を行うため、平成24年度の研究では平成25年度の研究費を前倒し請求することによってハイスピードカメラと画像処理ソフトウェアの導入を計画した。ハイスピードカメラと画像処理ソフトウェアを用いた共振現象の詳細な解析を行ったところ、3進木構造の試験片に対してある振動数において面内振動と面外振動の連成振動が発生することが明らかになった。しかしながら、試験片の固定端における境界条件によっては連成振動が発生せず、実験を重ねることによって発生条件を検討した。また、同じく3進木構造の別の試験片に対しては、自由端である幹の先端部分がほとんど振れない固有振動モードが観測された。このとき、枝部分が大きく振れており、観測された現象は動吸振器の挙動に非常によく似た現象であると考えられる。この現象についても、実験を重ねることによって発生条件を検討した。平成25年度は、平成23年度および平成24年度の研究を通して観測された2次元フラクタルツリーの特徴的な共振現象について、平成24年度に新規導入した高速度カメラを用いて振動試験結果の詳細な画像分析を行った。研究対象とした共振現象は、極めて再現性の高い面外振動現象であるもののCAE解析では全く現れない現象であるため、非線形振動現象であると考えられる。したがって、振動試験により得られたデータを基に2次元フラクタルツリーの試験片をモデル化し、非線形振動解析を通して理論的に考察する必要がある。しかしながら、平成24年度まで用いてきた試験片は、各枝の根元および先端の変位は計測できるもののたわみ角の計測はできないものであった。そこで、従来の試験片を改良し新たに分枝角の異なる3種類の試験片を作製した。これらの試験片に対して改めて振動試験を行い、高速度カメラを通して画像分析を行ったところ、共振時に面内方向の曲げ振動と面外方向のねじれ振動が同時に起こっており、さらに両者の振動数が異なることが明らかになった。以上の実験結果を基に、平成25年度に導入した解析ソフトウェアを利用してモデル化を試みたが、研究対象とした共振現象が現れるモデルの作成には至っていない。これらの研究成果については、平成26年8月に開催される日本機械学会主催の講演会にて研究発表することが決定しており、投稿論文の執筆も進めている。平成23年度から平成25年度までの研究期間全体を振り返ると、平成24年度までの2年間はほぼ当初の計画通りに研究を進めることができた。しかしながら、最終年度である平成25年度は、研究対象とした共振現象を説明するに足るモデルの作成には至らなかった。したがって、その現象がフラクタルに起因する現象であるかどうかについても不明のままであり、今後も本研究を継続していく必要がある。樹木をモデル化した2次元フラクタルツリーの非線形振動特性を、振動試験、CAE解析、非線形振動解析を通して明らかにするという研究目的に対して、初年度の平成23年度は、研究開始前に得られた振動試験結果と比較しながら試験片の3次元CADモデルを作成すること、さらにいくつかの試験片を実際に作製することを計画した。2次元フラクタルツリーとしては広葉樹と針葉樹に対応する2進木構造と3進木構造を対象とした。当初の計画に対して、CAE解析の結果が振動試験結果と非常に良く一致する2次元フラクタルツリーの3次元CADモデルを作成することができ、現有の2次元CAD/CAMシステムを利用して実際に樹脂製の試験片を作製するに至った。作製した試験片に対して、当初の計画通り、現有の振動試験装置および高速デジタル画像センサを利用して予備的な振動試験を行ったところ、一つの試験片においてCAE解析からは得られなかった固有振動モードを観測することができた。該当する試験片については、2種類の異なる材料で作製してみても同様の固有振動モードが観測されたことから、試験片のフラクタル構造に起因する振動現象が発生したのではないかと考えられる。また、この現象がフラクタル構造の非線形振動特性かどうかを明らかにすることが、平成24年度以降の研究において極めて重要になる。

平成23年度の研究成果については、日本機械学会関東支部ブロック合同講演会ー2011宇都宮ーおよび日本機械学会機械力学・計測制御部門2011年度「非線形振動研究会・振動基礎研究会」合同研究会にて発表し、試験片や試験方法に関して有意義な議論を行うことができた。平成23年度の研究では、当初の計画よりもかなり進めることができたが、平成24年度の研究では、詳細な実験および実験結果の解析に時間を費やした。主な理由は、試験片の作製時間が膨大なものになったことにある。1枚の樹脂板から試験片を削り出して作製したため、作製途中で破断することも多々あったが、ほぼ当初の計画通りの試験片を作製することができた。その結果、ほぼ当初の計画通りとなり、研究成果を平成25年8月に日本機械学会機械力学・計測制御部門講演会(D&D2013)にて発表することとした。当初は、平成24年度の前半に全ての試験片を作製し、予備的な振動試験を通して2次元フラクタルツリーの定性的な非線形振動特性を明らかにする計画であったが、平成23年度の研究において一部の試験片の作製を既に終えており、さらに一つの試験片に対しては非線形振動特性の候補が得られた。この非線形振動特性については、定量的な振動試験を通した詳細な検討を進めるためにハイスピードカメラと画像処理ソフトウェアの導入が必要となり、当初の計画よりも6カ月程度進んでいると考えられる。平成24年度の研究結果より、2次元フラクタルツリーに対して興味深い共振現象が生じることが明らかとなり、実験的に発生条件を検討した。しかしながら、実験的な検討のみでは不十分であり、平成25年度は当初の計画通りCAE解析および非線形振動解析を通して2次元フラクタルツリーの非線形振動特性を明らかにする計画である。CAE解析に関する課題は、振動試験によって発生した連成振動がCAE解析では確認できなかったことであり、諸条件を工夫することによって現有のソフトウェアでも解析可能かどうかを検討する。一方では、非線形振動解析が可能なソフトウェアを導入し、同じ現象を非線形解析することによって、生じた現象がフラクタルに由来するものなのかどうか、見極めていきたい。平成23年度の研究によって、2次元フラクタルツリーの非線形振動特性の一端を捕えることができたため、今後は得られた振動特性がフラクタル構造に起因するものかどうか、さらにその応用可能性について詳しく調べていくことになる。まず実施しなければならないことは、ハイスピードカメラおよび画像処理ソフトウェアを利用して、平成23年度に見つかった現象に対する精密な振動試験結果を得ることである。さらに、他の条件でも同様な現象が発生するのか、あるいは全く異なる非線形現象が存在するのか、実験を重ねて調べていく必要がある。次に、2次元フラクタルツリーの非線形振動特性を工学的に応用するためには、理論解析が必要となる。そのため、数式処理ソフトウェアを活用しながら2次元フラクタルツリーのモデル化方法について検討を進めていく。平成25年度は非線形振動解析が可能な解析ソフトウェアを導入し、これまでに観察された特異な現象について非線形振動の立場から検討する。
1次および2次情報伝達物質としてのスフィンゴシン1ーリン酸の産生と放出の制御機序

スフィンゴシン1ーリン酸(S1P)は最近PDGF,IgEなどの細胞内2次情報伝達物質として機能していることが報告されている。また、最近我々はこのS1Pを各種無傷細胞(ERTL-5甲状腺細胞、ラット肝細胞、HL-60白血病細胞、N1E115、1321アストロサイトマなどの神経系細胞、3T3線維芽細胞など)に作用させるとおそらく細胞膜受容体を介しホルモンなどのような1次情報伝達物質として様々な応答を発揮することを見い出した。このようにS1Pは1次および2次情報伝達物質の機能を兼ね備えたユニークな新規情報伝達物質である。そこで本研究ではS1Pの生成酵素であるスフィンゴシンキナーゼの活性調節とS1Pの細胞外への放出の機構に関して検討した。無傷細胞に標識スフィンゴシンを作用させ生成する標識スフィンゴシン1ーリン酸をYLCにより分取しその活性をスフィンゴシンキナーゼ活性とした。その結果、上記の調べた全ての細胞で程度の差はあるが活性が検出できた。このようにスフィンゴシンキナーゼは広く各種細胞に発現していることが確認された。種々の薬剤で処理し本酵素の活性変化を観察したところホルボールエステルで活性化がおこることが確認できた。しかし、上記細胞で細胞内S1Pが検出できる条件下でも細胞外にはS1Pが検出できない。このようにS1Pを細胞外に放出する機構に関しては今後さらに検討の必要性がある。
マウス胚着床における神経筋接合部形成因子アグリンの役割

本研究は、胚着床に必須な白血病阻止因子(LIF)、及びその下流のアグリン経路を軸に胚着床機構全体の解明を目的とする。インターロイキン6(IL6)ファミリーに属するLIFは、種を越えて保存される胚着床に必要な因子であり、マウスの胚着床には不可欠である。我々は以前、HFに対する中和抗体の腹腔内投与により、マウスにおいて胚着床を阻害する簡便な手法を確立した(J Reprod Dev, Vol 57, 2011)。この手法において、抗体投与による阻害効果はマウスの系統により異なり(全て阻害可能な系統および着床数にばらつきが認められる系統が存在する)、胚着床におけるLIFの作用には、実際には系統差があるのではないかと考えた。IL6ファミリーサイトカインの多くは、LIFと同様、LIF受容体とgp130のヘテロ二量体を介してシグナルを伝達することから、IL6ファミリーサイトカインによる相互補完が胚着床の成否を決定するのではないかと仮定した。複数のマウス系統を用いて、抗LIF抗体投与時の子宮内膜でのIL6ファミリーサイトカインの遺伝子発現の変化とHF阻害による効果(胚着床の有無)を解析した結果、必ずしも着床の有無とは相関しなかったが、LIFの阻害によりLIF以外のいくつかのIL6ファミリーサイトカインの発現が有意に増加することが明らかとなった。また、この発現の増加は、抗LIF抗体の投与により胚着床が全て阻害可能な系統では認められなかった。発現の増加したIL6ファミリーサイトカインの組換え蛋白質を作製し、卵巣除去と持続的プロジェステロン投与により作製する着床不全モデルマウスへの投与を行った結果、単独投与により胚着床を誘導可能なものが存在した。LIFが胚着床において重要な位置を占めるのは間違いないが、LIFだけでなくIL6ファミリー全体としての胚着床に対する役割を明らかにすることが、系統差(個体差)を考慮して胚着床機構を解明するために重要であろう。本年は、胚床に関する分子を、体を用いて機能解析する手法を確立させた。マウスの胚着床に必須な分子のひとつ、白血病阻止因子(LIF)の組み換え蛋白質を精製し、ウサギに免疫することで、抗LIF抗体を得た。胚着床前に、抗LIF抗体を腹腔内に連続投与することにより、C57BL/6マウスで、胚着床を完全に阻害することに成功した。投与した抗体が、子宮の間質、及び上皮で作用していることを示し、また、胚着床時にLIFによって上昇する遺伝子の発現が抑制されることを明らかにした。従来、抗体による機能解析は、子宮内に直接投与することで行われており、複数の抗LIF抗体を用いた研究でも、胚着床は抑制されるだけであった。腹腔内投与は、子宮内投与よりはるかに簡便かつ再現性のあるもので、抗LIF抗体での結果から、ほかの胚着床に関連する分子についても、応用が可能なことが示唆された。本研究では、LIFによって制御される、アグリンの胚着床での役割を明らかにすることを目的としており、アグリンに対する抗体を合成ペプチドを用いて作製し、上記と同じ手法で機能解析を行った。抗アグリン抗体の投与では、胚の着床数に有意な変化は認められなかったが、いくつかのマウスでは、着床数の異常を伴って、脱落膜化の亢進や異常が認められた。このことから、アグリンは脱落膜細胞の増殖・分化を制御することにより、子宮管腔の閉塞を含むマウスの胚着床の過程に重要な役割を持つことが示唆された。本研究は、胚着床に必須な白血病阻止因子(LIF)、及びその下流にあるアグリン-アセチルコリン受容体経路を中心に胚着床の機構を明らかにすることを目的としている。着床現象は、胚の子宮内膜への接触・接着・侵入、及び子宮間質細胞の脱落膜化、子宮管腔の閉塞といった一連の反応が、時間軸に沿って進行する。これらは、プロジェステロンとエストロジェンにより制御されている。本年度の研究では、まず、交配後の卵巣除去により作製する着床不全モデルマウスを用いて、胚着床におけるエストロジェンの作用はLIFにより完全に代償できることを示した。さらに、胚着床におけるプロジェステロン、エストロジェン、LIFの作用を明確にすべく、それぞれがどの段階に必要であるのか考察を行った。胚着床開始時には、子宮上皮細胞の増殖が停止していることから、子宮上皮細胞の増殖の有無を指標とした。子宮上皮細胞の増殖の停止は、プロジェステロンの単独作用で起こり、プロジェステロンの作用で胚の子宮内膜への「接触」までが進行することを明らかにした。さらにLIFとエストロジェンの両者は、「接着」以降の反応開始の刺激となったが、プロジェステロンの作用により停止した子宮上皮細胞の増殖に対しては作用が異なった。すなわち、子宮上皮細胞の増殖の再開は、濃度依存的なエストロジェンの刺激でしか起こらなかった。このことは、胚着床におけるエストロジェンの作用は、胚着床の過程を進めるLIFを介した経路と、それとは異なる経路によって仲介されることを示唆する。

我々は以前、HFに対する中和抗体の腹腔内投与により、マウスにおいて胚着床を阻害する簡便な手法を確立した(J Reprod Dev, Vol 57, 2011)。この手法において、抗体投与による阻害効果はマウスの系統により異なり(全て阻害可能な系統および着床数にばらつきが認められる系統が存在する)、胚着床におけるLIFの作用には、実際には系統差があるのではないかと考えた。IL6ファミリーサイトカインの多くは、LIFと同様、LIF受容体とgp130のヘテロ二量体を介してシグナルを伝達することから、IL6ファミリーサイトカインによる相互補完が胚着床の成否を決定するのではないかと仮定した。複数のマウス系統を用いて、抗LIF抗体投与時の子宮内膜でのIL6ファミリーサイトカインの遺伝子発現の変化とHF阻害による効果(胚着床の有無)を解析した結果、必ずしも着床の有無とは相関しなかったが、LIFの阻害によりLIF以外のいくつかのIL6ファミリーサイトカインの発現が有意に増加することが明らかとなった。また、この発現の増加は、抗LIF抗体の投与により胚着床が全て阻害可能な系統では認められなかった。発現の増加したIL6ファミリーサイトカインの組換え蛋白質を作製し、卵巣除去と持続的プロジェステロン投与により作製する着床不全モデルマウスへの投与を行った結果、単独投与により胚着床を誘導可能なものが存在した。LIFが胚着床において重要な位置を占めるのは間違いないが、LIFだけでなくIL6ファミリー全体としての胚着床に対する役割を明らかにすることが、系統差(個体差)を考慮して胚着床機構を解明するために重要であろう。分子経路の一つを軸に着床現象の解明に取り組んでいるが、着床機構の既存の概念を変えうる研究成果が出てきている。胚の移植実験、電子顕微鏡学的観察など、より直接的な証拠を示すことで分子学的経路の裏付けを行い、着床現象の機構を解明する。
ザイフェルト葉層PL束の研究

ザイフェルト束E上のファイバーに横断的な余次元1葉層構造に関する問題は、Eの底空間の幾何学的基本群から円周の同相群への準同型写像に関する問題に完全に置き変えることができる。この置き変えにより、われわれの研究目的は、次のように言い直される。いつ、上に述べた幾何学的基本群から円周のPL同相群への準同型写像が存在するのか?また、そのPL共役類はそのくらいあるか?さらに、幾何学的基本群の準同型写像を通して円周への作用が例外的なものがあるか?これらの問題に対する研究の成果を報告する。これら、3つの問題を扱う上で円周のPL同相群の元のPL共役類を決定する必要が出てくる。これについては、かなり多くの元に対して、そのPL共役類が決定可能であることがわかった。実際、固定点を持つか、または、総微分がいたるところ零であるPL同相写像のPL共役類は決定可能である。この結果の系として、底空間が2次元球面で、特異ファイバーが3本または4本であるようなザイフェルト束の場合、上のPL葉層の存在は、ミルナ-=ウッド型の不等式で特徴付けられることがわかる。これらについては、現在論文を準備中である。一般にザイフェルト束上の各ファイバーに横断的な葉層を具体的に構成することは、困難である。ここでの構成方法は、非常に具体的なものでありその意義は、非常に大きいものである。また、これらの例のなかには、アノソフ流から、手術理論を用いて、再構成されるものがあるということが多くの研究者により指摘されてきている。これらの研究を理解し、われわれの構成法と比較検討することにより、さらに統一的な構成法を見い出してゆけると思われる。
短鎖ＲＮＡ選択的結合能を有する人工核酸の特性を活用したｍｉＲＮＡ検出法の開発

本研究では独自に開発した人工核酸の特性を活用した新しいmiRNA検出技術の開発を、有機合成化学と核酸検出技術を融合して開発した。まず、既に開発していた人工核酸dAChcmPNAの短鎖RNA選択的結合能をさらに高めるために化学構造を改変した第二世代の修飾核酸の開発を行い新規RT-PCR法への応用を目指した研究を行った。また、蛍光残基で修飾した人工核酸の合成法の開発と蛍光特性の評価を行い、短鎖RNAの蛍光イメージングプローブとしての開発を目指した研究を行った。さらにではdAChcmPNAをスライドグラスに固定化した短鎖RNA選択的microarrayを開発するための基礎技術の開発を検討した。本研究では、miRNAなど生体内でプロセシングを受けるRNAを高精度に検出するために、起案者が開発した短いRNAには強く結合し、それと同じ配列を中央部にもつ長いRNAには結合しない、5'末端に修飾ヌクレオシド^pdA^<ChcmP>を有する人工核酸(^pdA^<ChcmP>NA)をさらに発展させた新手法を開発する。そのために、新規pdA^<ChcmP>の構造を改変した新規誘導体の開発、短鎖RNA結合能を増強する新規ラベル化法、蛍光核酸を用いた新規検出法などの開発を行う。新規誘導体の開発としては、核酸プローブの短鎖RNA選択的結合能を向上させるために、コンポメーションを固定化した第二世代修飾基の合を検討した。塩基部、糖部、リン酸バックボーンを固定化した誘導体の合成を種々検討し、リン酸バックボーン固定化誘導体については合成を完了し、^pdA^<ChcmP>NAと同等の短鎖RNA選択的結合能を有することを明らかにした。また、新規ラベル化法の開発としては、ターゲットRNAの末端を2'-アミノヌクレオシドでラベル化する方法の検討を行うために、アミノ修飾RNAを検討し、2'-アミノヌクレオシドの新規合成法の開発と、アミノ修飾RNAと^pdA^<ChcmP>NAの二重鎖安定性を二重鎖融解温度(T_m値)を測定することで明らかにした。また新規蛍光検出法としては、2'-ピレニル基の性質を検討した、その結果2'-ピレニル基の特性が配列に大きく依存することが明らかとなり、この問題を克服する新規蛍光基の開発が必要であることが分かった。そこで蛍光基の導入位置を塩基部に変更しが5位置換ウリジン誘導体を合成し、その蛍光特性を評価したところ二重鎖形成に伴い蛍光強度が増強することが分かり、蛍光プローブとして望ましい性質を有していることが分かった。本研究では、miRNAなど生体内でプロセシングを受けるRNAを高精度に検出するために、起案者が開発した短いRNAには強く結合し、それと同じ配列を中央部にもつ長いRNAには結合しない、5'末端に修飾ヌクレオシドpdAChcmPを有する人工核酸(pdAChcmPNA)をさらに発展させた新手法を開発する。そのために、新規pdAChcmPの構造を改変した新規誘導体の開発、短鎖RNA結合能を増強する新規ラベル化法、蛍光核酸を用いた新規検出法などの開発を行う。昨年度までに合成した塩基部、糖部、リン酸バックボーンを固定化した誘導体の逆転写酵素のプライマーとしての性質をもとにRT-PCR法への応用を検討し、標的miRNAとわずかに一塩基程度鎖長が異なる、isomiRの識別を検討した。その結果、5'末端にコンホメーションを固定化しない修飾ヌクレオシドdAChcmPを導入した場合に最も優れた識別能を示すことが明らかになり研究も目標を達成することができた。また、並行して検討していた新規ラベル化法の開発も、ターゲットRNAの末端をRNAリガーゼを用いて、2'-アミノヌクレオシドでラベル化する方法を確立することができた。新規誘導体の開発としては、核酸プローブの短鎖RNA選択的結合能を向上させるために、コンホメーションを固定化した第二世代修飾基の合成を検討した。塩基部、糖部、リン酸バックボーンを固定化した誘導体の合成を種々検討し、昨年度合成の完了したリン酸バックボーン固定化誘導体については合成を完了し逆転写酵素のプライマーとしての性質を明らかにした。また、塩基部固定化誘導体についてはホスホロアミダイトの合成とオリゴヌクレオチドへの導入検討まで実施した。

新規ラベル化法の開発としては、ターゲットRNAの末端を2'-アミノヌクレオシドでラベル化する方法の検討を行うために、アミノ修飾RNAを検討し、2'-アミノヌクレオシドの新規合成法の開発と、アミノ修飾RNAとpdAChcmPNAの二重鎖安定性を二重鎖融解温度(Tm値)を測定することで明らかにした。また新規蛍光検出法としては、ピリミジン5位が修飾された蛍光核酸として、独自に開発したPPIを用いハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を明らかにした。新規誘導体の合成については、当初の計画通り誘導体のひとつの合成を完了し、その性質まで明らかにした。末端修飾法についても、2'-アミノヌクレオシドを導入したRNAの性質を明らかにした。また、蛍光検出法についても当初計画した2'-ピレニル基の問題点を明らかにするとともに、新規蛍光ヌクレオシドの合成と性質も達成した。25年度が最終年度であるため、記入しない。新規誘導体の合成については、当初の計画通り誘導体のひとつの合成を完了し、その逆転写プライマーとしての性質まで明らかにした。また塩基部固定化誘導体についてもホスホロアミダイト誘導体の合成とオリゴヌクレオチドへの導入まで検討済みであり、次年度で目的が完了すると予想される。また、蛍光検出法についても蛍光ヌクレオチドPPIのハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を明らかにすることができた。また新規蛍光核酸として7ーデアザグアニン骨格を有する誘導体の合成を検討した。現在、概ね順調に計画が進んでいる。23年度に合成を完了した新規核酸誘導体については、それらの性質を評価し、新規miRNA検出プローブとしての開発をめざし研究を進展する。また、23年度合成が完了しなかった誘導体については、24年度も引き続き合成の検討を行い、優れた性質を有する誘導体の探索を継続する。24年度に性質評価を完了した新規核酸誘導体については、新規miRNA検出法への応用をめざし研究を進展する。また、24年度合成が完了しなかった誘導体については、24年度も引き続き合成の検討を行い、優れた性質を有する誘導体の探索を継続する。
一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスの開発

【目的】一酸化窒素(NO)は、生体の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。NO合成酵素(NOS)には、神経型(nNOS)、誘導型(iNOS)、内皮型(eNOS)の3種類の異なったアイソフォームが存在する。各NOSアイソフォームに由来するNOの役割は、各NOSの単独遺伝子改変マウスを用いて、これまでに広く検討されてきた。しかし、3つのNOSアイソフォーム間には相互連関が存在するため、例えば一つのNOSを欠損させても他のNOSが代償的に作用し、NOSシステム全体としてのNOの究極の役割については依然不明な点が多い。我々は、この点を明らかにするために、NOS完全欠損マウス(トリプルn/i/eNOS-KOマウス)を作製し、その機能評価を行った。【方法と結果】シングルNOS-KOマウスを異種交配させて、3年をかけて、トリプルn/i/eNOS-KOマウスを創出した。n/i/eNOS-KOマウスは、胎生致死ではなく誕生した。Western blot解析で評価したNOS蛋白の発現、及びL-citrullineアッセイで評価した全NOS活性は、lipopolysaccharide投与前後において、全く認められなかった。n/i/eNOS-KOマウスにおける出生率と生存率は、野生型マウスと比較して著明に低下していた。Tail-cuff法で測定したn/i/eNOS-KOマウスの覚醒下の血圧は、eNOS-KOマウスと同程度の高血圧を示した。重要なことには、n/i/eNOS-KOマウスは、低張性多尿、多飲、及びvasopressinに対する腎臓反応(抗利尿反応)の低下を示し、腎性尿崩症の病態を呈していた。【結論】NOS完全欠損マウスの開発に、世界で初めて成功した。このマウスはヒト腎性尿崩症に酷似した病態を示したことから、NOSシステムが特に腎臓の恒常性の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。NO合成酵素(NOS)には、内皮型(eNOS)・誘導型(iNOS)・神経型(nNOS)の3種類の異なったアイソフォームが存在する。現在までに、各NOSアイソフォームが単独に欠損したシングルNOSノックアウト(KO)マウス、及び複合して欠損したダブルNOS-KOマウスが作製され、NO研究において広く使用されている。しかし、3種類のNOSアイソフォームがすべて欠失したNOS完全欠損マウス(トリプルNOS-KOマウス)の樹立は報告されていない。本研究では、このトリプルNOS-KOマウスを、世界に先駆けて開発することを目的とする。【方法】nNOS-KOマウス、iNOS-KOマウス、eNOS-KOマウスの交配により、トリプルNOS-KOマウスの作製を試みた。マウスの遺伝子型は、尻尾から抽出したGenomic DNAを用いたRT-PCRで確認した。【結果】我々は、3年前より、トリプルNOS-KOマウスの開発に着手した。最初に、各シングルNOS-KOマウスを交互に掛け合わせて、3種類のダブルNOS-KO (nNOS/iNOS-KO、iNOS/eNOS-KO、nNOS/eNOS-KO)マウスを誕生させた。次に、これらをさらに交互に掛け合わせて、トリプルNOS-KOマウス(nNOS/iNOS/eNOS-KOマウス)を作製した。また、トリプルNOS-KOマウスの雌雄のペアでの交配にも成功した。現在大量生産を施行中である。【総括】トリプルNOS-KOマウスの作製に世界で初めて成功した。興味深いことに、生体内NOSシステムが完全に破綻してもこのマウスは普通に生存し発育していた。今後はこのマウスを駆使してNO研究を広く展開し、生体内NOSシステムの意義を包括的に解明して行きたい。

重要なことには、n/i/eNOS-KOマウスは、低張性多尿、多飲、及びvasopressinに対する腎臓反応(抗利尿反応)の低下を示し、腎性尿崩症の病態を呈していた。【結論】NOS完全欠損マウスの開発に、世界で初めて成功した。このマウスはヒト腎性尿崩症に酷似した病態を示したことから、NOSシステムが特に腎臓の恒常性の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。
オッセオインテグレーションに関与するmicroRNAの同定

microRNA (miRNA)はmRNAの切断や翻訳抑制を行っており、細胞増殖、分化、発生等多くの生理現象へ影響を与えている。一方、チタンと骨が結合するオッセオインテグレーションには骨芽細胞の接着・分化・増殖が関与していることが知られているが、その全ての分子機序が解明されているとはいえず、そこにはエピジェネティクス機構の一つであるmicroRNA(miRNA)の遺伝子発現調節が関与する可能性がある。本研究ではmiRNAがオッセオインテグレーションにおける骨機能変化のシグナル分子の一つであることを検証し、オッセオインテグレーション獲得の指標または促進させる薬剤標的としてのmiRNAの可能性を探ることを目的としている。本年度は前年度同様、滑沢チタンプレート、サンドブラスト処理チタンプレート、酸エッチング処理チタンプレートの3種類の各種表面処理された試験片を準備し、各試験片の表面像の観察及び表面粗さの測定をレーザー顕微鏡にて行った。表面像の観察では、滑沢チタンプレートに比較しサンドブラスト処理チタンプレートまたは酸エッチング処理チタンプレートにおいて明らかな表面の粗さが確認でき、表面粗さは算術平均粗さ(RaおよびSa)にて測定され滑沢チタンプレートが一番小さく、酸エッチング処理チタンプレートが一番大きくなった。次に、前年度Nano dropおよびバイオアナライザによって品質評価まで行った各試験片上で培養したMC3T3ーE1より抽出したTotal RNAを用い、マイクロアレイにて網羅的検索を行った。解析にはGene Spring 14.9.1を用い、コントロールと比較し1.5倍以上発現上昇または低下を認めたmiRNAを各試験片において確認した。これらをオッセオインテグレーションに関与するmiRNAの候補とした。異なる3種類の表面処理を行ったチタン試験片において、前回測定したポータブル表面輪郭ゲージSRT-6223よりもより詳細な表面粗さを測定するためレーザー顕微鏡を用いて表面像の観察および算術的表面粗さの計測を行った。また、前回Nano dropおよびバイオアナライザにて品質に問題がないことを確認したTotal RNAを用い、マイクロアレイによる網羅的検索およびGene Spring 14.9.1による解析を行い、オッセオインテグレーションに関与する可能性を持つmiRNAの候補を確認するところまで研究が進んでいる。今後は、まず発現変動が認められた候補miRNAについて、RT-qPCRによって発現変動の確認を行う。次に、マイクロアレイ解析、RT-qPCRの両者で発現変動が認められたmiRNAをオッセオインテグレーションに関与するものと考え、miRDBやTarget Scanなどのデータベースを用いて標的mRNA候補を検索・予測する。その後、標的mRNAおよび翻訳されたタンパク質が実際に変動を認めるかRT-qPCRやWestern Blotで確認していく。またMC3T3ーE1のフェノタイプへの影響において、染色法などを用い細胞分化についても検討をしていく予定である。チタンと骨が結合するオッセオインテグレーションには骨芽細胞の接着・分化・増殖が関与していることが知られているが、その全ての分子機序が解明されているとはいえず、そこにはエピジェネティクス機構の一つであるmicroRNA(miRNA)の遺伝子発現調節が関与する可能性がある。本研究ではmiRNAがオッセオインテグレーションにおける骨機能変化のシグナル分子の一つであることを検証し、オッセオインテグレーション獲得の指標または促進させる薬剤標的としてのmiRNAの可能性を探ることを目的とする。今回、まず3種類の各種表面処理されたチタンプレートを準備した。滑沢チタンプレートはチタンプレートを耐水ペーパーで研磨し作製した。サンドブラスト処理チタンプレートはアルミナサンドブラストをチタン表面へ行い作製した。酸エッチング処理チタンプレートは硫酸溶液中で表面処理して作製した。各試験片の表面粗さはポータブル表面輪郭ゲージSRT-6223にて測定し、酸エッチング処理、サンドブラスト処理、滑沢チタンプレートの順に大きくなった。次に各試験片上に骨芽細胞様細胞MC3T3ーE1を24時間、48時間、72時間培養し、MTT Assayにて細胞増殖への影響を検討した。コントロールはプラスティックシャーレ上で同様に培養したものとした。24時間における細胞増殖にはほとんど変化は認められなかったが、48時間、72時間と時間が経過するにつれ表面粗さが大きい試験片上での細胞増殖が抑制された。また、各試験片上で培養したMC3T3ーE1におけるmiRNAの発現状況を網羅的に解析するため、MT3T3ーE1を各試験片上にて24時間培養後、Total RNAを抽出した。抽出したTotal RNAは、NanoDropおよびバイオアナライザーにて分析を行い、マイクロアレイ解析実施前の品質評価を行った。今回、異なる3種類の表面処理を行ったチタン試験片を作製した。表面処理は、表面を滑沢に研磨したものに加え、オッセオインテグレーションの獲得が有利になると報告されているサンドブラスト処理と酸エッチング処理とした。このチタン表面上でMC3T3ーE1を培養したところ、表面粗さが大きな試験片では細胞増殖が抑制されることが確認できた。また、同様にチタン表面上でMC3T3ーE1を24時間培養しsmall RNAを含むTotal RNAを抽出した。このTotal RNAを用いてマイクロアレイ解析を実施する予定であるが、Total RNAの品質に問題がないところまで確認できている。

一方、チタンと骨が結合するオッセオインテグレーションには骨芽細胞の接着・分化・増殖が関与していることが知られているが、その全ての分子機序が解明されているとはいえず、そこにはエピジェネティクス機構の一つであるmicroRNA(miRNA)の遺伝子発現調節が関与する可能性がある。本研究ではmiRNAがオッセオインテグレーションにおける骨機能変化のシグナル分子の一つであることを検証し、オッセオインテグレーション獲得の指標または促進させる薬剤標的としてのmiRNAの可能性を探ることを目的としている。本年度は前年度同様、滑沢チタンプレート、サンドブラスト処理チタンプレート、酸エッチング処理チタンプレートの3種類の各種表面処理された試験片を準備し、各試験片の表面像の観察及び表面粗さの測定をレーザー顕微鏡にて行った。表面像の観察では、滑沢チタンプレートに比較しサンドブラスト処理チタンプレートまたは酸エッチング処理チタンプレートにおいて明らかな表面の粗さが確認でき、表面粗さは算術平均粗さ(RaおよびSa)にて測定され滑沢チタンプレートが一番小さく、酸エッチング処理チタンプレートが一番大きくなった。次に、前年度Nano dropおよびバイオアナライザによって品質評価まで行った各試験片上で培養したMC3T3ーE1より抽出したTotal RNAを用い、マイクロアレイにて網羅的検索を行った。解析にはGene Spring 14.9.1を用い、コントロールと比較し1.5倍以上発現上昇または低下を認めたmiRNAを各試験片において確認した。これらをオッセオインテグレーションに関与するmiRNAの候補とした。異なる3種類の表面処理を行ったチタン試験片において、前回測定したポータブル表面輪郭ゲージSRT-6223よりもより詳細な表面粗さを測定するためレーザー顕微鏡を用いて表面像の観察および算術的表面粗さの計測を行った。また、前回Nano dropおよびバイオアナライザにて品質に問題がないことを確認したTotal RNAを用い、マイクロアレイによる網羅的検索およびGene Spring 14.9.1による解析を行い、オッセオインテグレーションに関与する可能性を持つmiRNAの候補を確認するところまで研究が進んでいる。今後は、まずマイクロアレイ解析を行い各チタン試験片上で培養したMC3T3ーE1におけるmiRNA発現についての網羅的解析を行う。その後、コントロールと滑沢チタン間で発現変動が認められたmiRNAにおいて、さらに滑沢チタンとサンドブラスト処理チタン間または酸エットング処理チタン間で発現変動が認められるものを各々RT-qPCRによって発現変動の確認を行う。これより、マイクロアレイ解析およびRT-qPCR両者において発現変動が認められたmiRNAをオッセオインテグレーションの獲得・促進に関与するmiRNAと仮定し、標的遺伝子候補をmiRDBやTarget Scanなどのデータベースを用いて検索・予測する。
妊娠および産褥におけるサイトカインを介する骨量減少機構の研究

エストロゲンは骨代謝を強く支配しており(エストロゲン・ドグマ),女性に対し一生を通じて骨保護作用を示す。妊娠中は高エストロゲン血症にあるので,妊娠中に骨は保護され骨吸収は抑制され,産褥低エストロゲン血症に加えて高プロラクチン血症にあるので、骨吸収の促進が起こっていると想定されていた。しかし、我々の骨代謝マーカーの分析及び骨量の解析により、妊娠中には骨吸収が促進され、産褥はむしろ骨吸収は抑制された状態になっていることを明らかとした。非妊時で骨吸収が亢進している時は、末梢血単球よりのサイトカイン(IL-1,IL-6,TNF-α等)の分泌が亢進しており、エストロゲンを投与するとサイトカインの分泌減少がおこり骨吸収が抑制される。その視点より、末梢血単球よりのサイトカイン分泌を検討したところ、妊娠中(骨吸収亢進状態)では、エストロゲンが高濃度にあるにも関わらずサイトカインの分泌亢進があることを見いだした。即ち妊娠中は高エストロゲン状態にあるにも関わらずサイトカインの過剰分泌が生じて骨吸収がおこっているのである。極めてパラドキシカルな現象といえる。この現象は非妊時とは異なった骨代謝調節機構が妊娠産褥に存在していることを意味しており、新たな展開が期待される。「エストロゲン・ドグマ」と言われるように、エストロゲンは骨代謝を強く支配しており、女性に対しては一生を通じて骨保護作用を示す。妊娠中は高エストロゲン血症にあるので妊娠中には骨は保護され、骨吸収は抑制されており、産褥では、低エストロゲン血症に加えて高プロラクチン血症にあるので、骨吸収の促進が起こっていると想定されている。しかし、我々のこれまでの予備的な解析ではあるが、逆に妊娠中に骨吸収が促進され、産褥はむしろ骨吸収は抑制された状態になっていることが明らかとなった。非妊時で骨吸収が亢進している時は、末梢血単球よりのサイトカイン(IL-1,IL-6,TNF-α等)の分泌が亢進しており、エストロゲンを投与するとサイトカインの分泌減少がおこり骨吸収が抑制されることが見いだされている。妊娠中の骨吸収の亢進状態では、エストロゲンが高濃度にあるにも関わらずサイトカインの分泌亢進があることを見いだした。極めてパラドキシカルな現象と言うべきである。今年度は、正常な妊婦・辱婦を対象としてインフォームドコンセントを得て骨代謝マーカーの推移と共に、抹消血探求よりのサイトカイン分泌量を正確に測定した。その結果我々の得た予備的な解析結果がほぼ正しいとの結果を得た。次年度はその高エストロゲン状態での抹消血単球のサイトカイン過剰分泌機構を研究する予定である。エストロンゲンは骨代謝を強く支配しており(エストロゲン・ドグマ),女性に対し一生を通じて骨保護作用を示す。妊娠中は高エストロゲン血症にあるので,妊娠中に骨は保護され骨吸収は抑制され,産褥では,低エストロゲン血症に加えて高プロラクチン血症にあるので、骨吸収の促進が起こっていると想定されていた。
糖尿病関連歯周炎の病態指標としての歯肉溝滲出液中オステオポンチンの意義と有用性

糖尿病ラットに実験的歯周炎を惹起させることにより、骨代謝や炎症に深く関連するオステオポンチンが糖尿病における歯周炎の重症化に深く関与している可能性が示されるとともに、歯肉溝滲出液分析では、オステオポンチンは定量できなかったが、1型コラーゲンペプチドが重度歯周炎患者から検出された。一方、糖尿病関連マーカーであるレジスチンが病態の進行に関連していることが示唆された。平成22年度は、糖尿病ラットに惹起させた実験的歯周炎における歯周病の病態とオステオポンチン(OPN)の局在について中心的に実験を行った。はじめに糖尿病状態であることを確認するために、実験群のOLETFラット(糖尿病群)と対照群のLETOラット(非糖尿病群)の体重、空腹時血糖値、HbAlc値を測定した結果、いずれも糖尿病群で有意に高い値が認められた。次に上顎第2臼歯結紮により実験的歯周炎を惹起させ、結紮20日後に同部のマイクロCT観察を行うと、両群とも結紮による歯槽骨吸収が認められたが、とくに糖尿病群では根分岐部が露出する著しい歯槽骨吸収像が認められ、糖尿病群では非糖尿病群の約1.4倍の歯槽骨吸収率を示した。さらに組織切片分析では、結紮側において歯周組織の破壊や炎症性細胞浸潤が両群とも同様に認められた。OPNの免疫染色では、結紮20日目において、歯肉結合組織にOPNの局在が明瞭化しており、とくに糖尿病群ではOPNの発現が上皮直下から結合組織全体に広がっており、炎症の局在と類似していた。以上の結果、ラットにおける実験的歯周炎では、糖尿病群において歯周炎の進展とともに歯槽骨の吸収が著明に増加し、さらに歯周組織の炎症と破壊に伴ってOPNが強く発現することが明らかとなった。これとは別に、糖尿病ラット由来の頭蓋骨由来骨芽細胞におけるBone Nodule形成能、および歯周病患者の歯肉溝滲出液中のOPN量に関する実験を行ったが、予備実験(測定のための条件設定など)に終始したため、平成23年度に継続して行うこととした。1,糖尿病関連歯周炎患者の歯肉溝滲出液中OPNの測定について検討を行った。(1)サンプルの採取徳島大学病院歯科を来院した歯周病患者約30サンプル、コントロール群として健常者約10サンプルの歯肉溝滲出液を採取しペリオトロン^[○!R]を使用して滲出液量を測定した。同時に歯周組織検査およびHbAlcや喫煙の有無など問診を行った。、(2)歯肉溝滲出液中のOPNの測定採取した歯肉溝滲出液はQuantikine^[○!R]Human Osteopontin (OPN)Immnoassay (R & D System)を用いてELIZAを行った。その結果、測定値可能範囲に検出することができなかったため、サンプルを濃縮するなど様々な測定方法を試みたがいずれにおいても検出可能量に満たなかった。そこでTiter Zyme Osteopontin (human), EIA kit (Enzo)に変更し、同様の実験を行ったがOPNの検出はできなかった。数年前に定量したキットと別製品であることが未検出の一因と考えられるが、引き続き検討中である。(3)研究結果の分析当初、歯肉溝滲出液中の糖尿病関連歯周炎の特定のマーカーとしてOsteopontinは有用であると判断していたが、現状で検出することが難しいため、本研究の目的に類似する骨代謝マーカーとしてI型コラーゲン-C-テロペプチド(ICTP)の測定を別途行うこととした。その結果、著しい歯肉の炎症部位において,炎症のない部位に比較し高値を示す傾向を確認できた。平成24年度はOPN測定を再検討するとともにICTPを中心に骨代謝マーカーの検索を行う。本年度は、平成22年度の研究実績の報告として第137回日本歯科保存学会2012年度秋季学術大会にて「糖尿病ラットの実験的歯周炎における歯周組織破壊とオステオポンチンの局在」の学会発表を行い、実験的歯周炎の局所にオステオポンチンの局在が有意に高く認められることを報告した。また、糖尿病関連歯周炎患者の歯肉溝滲出液中のOPNの測定および局所・全身指標について検討すると同時に、その他の骨代謝マーカーとしてI型コラーゲン-C-テロペプチド(ICTP)の測定を行うことによって、糖尿病関連歯周炎における骨代謝マーカーの意義と病態指標としての可能性を追求した。その結果、炎症の強い歯周ポケットからの歯肉溝滲出液において、ICTP蛋白の検出を確認できた。その後、炎症の強い部位でのサンプル採取が必要と思われたが、条件にあう病態を示す被験者が現れず、今回は1サンプルの検出に留まった。今後、継続して検出の分析を行う必要があると思われた。OPNについては、前年度に引き続き、サンプルの濃度や測定条件等を工夫し検出に努めたが、全ての症例において、OPNの発現を確認することはできなかった。

そこで、骨代謝関連の分子に限定せずに、糖尿病の指標にも注目し、GCF中のレジスチンの存在と定量について、ウェスタンブロット分析とELISA分析を行い歯周病の臨床指標との関連について追求した。その結果、非糖尿病の歯周炎患者と糖尿病関連歯周炎患者のGCFからレジスチンを同定し、糖尿病関連歯周炎患者のGCFレジスチン量が非糖尿病の歯周炎患者のそれよりも増加している傾向が認められた。さらに、歯周病治療によってGCF中のレジスチン量が有意に減少することも確認された。以上より、糖尿病関連歯周炎のGCF中のバイオマーカーとして、レジスチンの有用性が示唆された。予定していたOsteopontinの検出ができなかったため、それにともなう手技の確認、検出方法の変更、またサンプルの追加回収に時間を要してしまい、当初予定していた分析にいたることができず、研究に遅れが生じている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、検出蛋白としてOsteopontinを再検討するとともに、マーカーをICTPに変更し歯肉溝滲出液内での動態を検討していく予定である。骨代謝マーカーICTPのGCF中の存在についての報告は少なく、糖尿病との関連についても興味深い分子マーカーになりうると考えられ、他の骨代謝マーカーとの比較も行って歯周病への特異性を検討する。
リアクティブレンジファインダによる物体運動の高速計測

本研究は、対象に応じてアクティブに反応するレンジファインダの開発とそれを用いて動物体の追跡を行う手法について述べたものである。従来は計測速度が遅く実用化が困難であったレンジファインダの進歩により、手軽に距離画像を取得できるようになり、様々な分野において距離画像応用が期待されている。形状認識、人体計測、VR、CGなど非常に広範囲の分野において研究がすすめられるようになった。中でも、動的なシーンの認識および解析を目標として、動距離画像解析の研究が行われている。しかし、レンジファインダを用いて動物体追跡を行った研究は世界でも数例しかなく、十分な処理速度を得られていない現状にある。認識対象の形状や位置によって、効率的な計測を行うことは、レンジファインだの世界では、対象物体のモデルに基づいて投影パターンを変更し、物体の形状・位置姿勢に応じて動的に情報の獲得方法を適応させるという考え方に相当する。このようなアクティブビジョンの考え方に基づいたレンジファインダをリアクティブ・レンジファインダと名付け、近年機能が高くなってきた液晶プロジェクタを用いてシステムを構築した。このシステムを用いた多面体追跡システムは、対象物体のモデルを与えるとそれを追跡するための投影パターンを自動的に生成することができる。それによりリアルタイムに三次元空間内で物体追跡ができる。この報告では、試作システムについてその処理速度や計測精度を詳細に検討している。三次元に物体を計測する目的は、自由曲面を含む未知形状物体の形状を精度よく計測すること(例えば、考古学遺物の形状計測)と、形状が既知な物体の位置や姿勢を高速に追跡するケース(例えば、組立工程などでの動作教示)である。現実の場面においては人工的に生産された物体を操作する場合が多く、このような既知形状(部分的に既知形状でよい)物体の位置や姿勢の検出において、限られた部位の三次元データが得られれば正確に位置や姿勢が推定できる。このような目的に対して、検出側から動く物体に光パターンを投影し、その観測像から物体の位置姿勢を計測し(アクティブ計測)、新たに、より適した光パターンを投影することにより(リアクティブ計測)、さらに正確な情報を取得するといった計測手段が考えられる。これは運動している物体の計測であり、物体の動きを予測する予測機能も含んでいる。コンピュータビジョンの分野では、1台のカメラを目的に応じて視線や視野を能動的に移動するアクティブビジョンの研究が活発であるが、ここで提案するシステムの新規性は、光投影による「アクティブ計測」を物体の移動に応じて投影方向をアクティブに変化させるものであり、Re-Activeに機能することから「リアクティブレンジファインダ」と名付けている。位置や姿勢計測に適した部位に投影することにより計測精度が向上すること、および極く少数の投影データで正確な結果を得ることができるので、特殊なセンサや処理装置を持たなくても、汎用の液晶プロジェクターとビデオカメラにより、高速(リアルタイム)に物体追跡が可能になる。高精細液晶プロジェクタにより、スポット、スリット、マルチスリットなどの投影パターンを生成し、立方体などの三次元物体に投影し、どのようなパターンをどのような戦略で投影するのが効果的かを検証した。三次元的物体認識・追跡の目的の一つに、形状が既知な物体の位置や姿勢を高速に追跡するケース(例えば、組立工程などでの動作教示)がある。現実のニーズにおいては人工的に生産された物体を対象とする場合が多く、このような既知形状(部分的に既知でよい)物体の位置や姿勢の検出では、限られた部位の三次元データが得られれば正確に位置や姿勢が推定できる。このような目的に対して、能動的に物体に光パターンを投影し、その観測像から物体の位置姿勢をアクティブ計測し、さらに目的により適した光パターンを投影することにより(リアクティブ計測)、さらに正確な情報を取得するといった計測手段が考えられる。