hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニホンザル母子間の葛藤(conflict)と社会的知性に関する研究

ニホンザルでは、子ザルが離乳期を迎える頃になると、授乳を求める子ザルと離乳を求める母ザルとの間に葛藤が生じる。この離乳をめぐる母ザルとの葛藤において、子ザルは初めて、他個体との激しい利害の対立を経験する。母ザルとの間に生起する葛藤に対して子ザルがどのように対処しているのかを明らかにするために、1歳齢の子ザルと母ザル15組の授乳をめぐる相互交渉を観察し、総計225時間分の個体追跡データを得た。分析の結果、(1)母ザルが子ザルの授乳要求を受け入れるかどうかは、母ザルの状況によって異なることが明らかになった。一方で、(2)子ザルは、母ザルの状況の変化に応じて授乳要求を行うタイミングを調節していた。この事実は、母ザルが寛容な態度をとりやすい状況と拒否的な態度をとりやすい状況とを子ザルが認知していて、葛藤が生じにくい状況をねらって子ザルが授乳要求を行っていることを意味している。さらに11組の母子ペアを対象に、授乳をめぐる母子相互交渉を子ザルの誕生から2歳齢まで縦断的に観察し、総計570時間分の個体追跡データを収集した。その結果、(3)子ザルは、成長とともに、母ザルの状況に合わせた上手な授乳要求ができるように発達していることが明らかになった。子ザルは、生後半年間は母ザルの状況とは関係なく授乳要求を行っていた。一方で、母ザルの拒否行動が頻発する1歳齢になると、子ザルは、母ザルが採食をしている時ではなく、他個体から毛づくろいを受けている時に頻繁に授乳要求を行うようになった。この結果は、授乳をめぐる母ザルとの葛藤を通して、子ザルが「他個体(母ザル)との利害の対立に対処する能力」を発達的に獲得していくことを示していると考えられた。生後初期の母ザルと子ザルは、身体接触や授乳を通じて極めて密接な関係にある。しかし、子ザルが離乳期を迎える頃になると、母ザルは乳を求める子ザルに対して、咬んだり、威嚇したり、払ったりするなどの拒否行動を示すようになる。つまり、授乳を求める子ザルと、離乳を求める母ザルとの間に、葛藤が生じる。この授乳をめぐる母ザルとの相互交渉において、子ザルは初めて、他個体との激しい利害の対立を経験する。本研究の目的は、離乳期に生じる母ザルとの葛藤に対して、子ザルがどのように対応しているのかを明らかにすることである。1歳齢前半の子ザルを対象とした調査の結果、子ザルが母ザルの乳首を口にくわえられるかどうかは,その時の母ザルの状況によって異なることが明らかになった。母ザルが採食をしている時に子ザルが乳首をくわえようと試みると、母ザルは多くの場合その試みを拒否した。しかし、母ザルが他個体から毛づくろいを受けている時には、乳首をくわえようと試みる子ザルを拒否することは少なかった。母ザルが他個体から毛づくろいを受けている時は、子ザルがより頻繁に母ザルの乳首をくわえようと試みていたが、母ザルが採食している時、子ザルが乳首をくわえようすることはほとんどなかった。これらの結果は,母ザルが寛容な態度をとりやすい状況と拒否的な態度をとりやすい状況とを子ザルが認知した上で、乳首をくわえるタイミングを自ら調節している可能性を示唆している。現在、生後初期から子ザルを縦断的に観察したデータを詳細に分析することによって、「母ザルの状況にあわせて,乳首をくわえるタイミングを調節する能力」を子ザルが発達的に獲得する様子が明らかになりつつある。分析結果を学術論文として投稿し、国際学術雑誌での受理を目指す。
新規抗リーシュマニア薬の開発研究

Leishmania majorのpromastigotesに対する新規創薬シーズ探索研究を行った。68種の化合物の中から、EC50値が27 nM、42 nMと低い化合物2種類を見出した。一方、コントロールとして用いたAmphotericin Bでは、リーシュマニア原虫でEC50値が63 nMと46倍の選択毒性を示すことから、構造-活性相関に基づいた評価をさらに行う。作用機序解析のツールとしてHSP90と反応する抗体を見出し、リーシュマニア原虫のHsp90複合体の構成因子を解析できる基盤を構築した。また、新規阻害剤としてGeldanamycinとその誘導体、及び低分子のHsp90阻害剤が3040 nMでリーシュマニア原虫阻害能を示すことを明らかにした。本研究は、難治性寄生虫感染症であるリーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア原虫に強い阻害活性を示す治療薬の開発を目的としている。化合物のスクリーニングは、皮膚リーシュマニア原虫であるLeishmania majorの前鞭毛型(Promastigotes)リーシュマニア原虫を用いて抗リーシュマニア活性を測定し、哺乳動物細胞(FM3A細胞)を用いて細胞障害性を評価した。平成24年度は以下の研究成果を得た。(1) Hsp90阻害剤であるGeldanamycinとその誘導体、及びGeldanamycin系とは異なる低分子Hsp90阻害剤を用いて抗リーシュマニア活性評価を行ない、リーシュマニア原虫に対する50%増殖阻害濃度(EC50)が3040 nMの化合物を見出した。これら化合物の細胞障害性評価を行ったところ、原虫阻害能と同程度の細胞障害性を有することが判った。(2)従来の治療剤であるアンチモン製剤を含めリーシュマニア症治療薬は副作用が強いことが問題となっている。そのため、民間療法で使われる天然生薬資源を用いて抗リーシュマニア効果を評価した。評価したいずれの化合物もEC50値は1000 nM程度であり、一桁以上の選択性を示す化合物は見出せなかった。現在、これら化合物の構造類縁体を用い、構造ー活性相関解析を行っている。(3)リーシュマニア原虫の分子シャペロンHsp90と反応する抗Hsp90抗体を見出した。(4)プロテオミクスの手法を用いたリーシュマニア原虫のHsp90複合体の構成因子を解析できる基盤を構築した。今後、宿主であるヒトとリーシュマニア原虫のHsp90、及びHsp90複合体の構成因子の違いを明らかにし、リーシュマニア原虫のHsp90を選択的に阻害する化合物の探索を行ないたい。本研究は、難治性の寄生原虫感染症であるリーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア原虫に対して高い増殖抑制効果を示す化合物を探索し、新規抗リーシュマニア薬を開発することを目標としている。平成23年度は、皮膚型リーシュマニア原虫であるLeishmania majorの培養が比較的容易な前鞭毛型(Promastigotes)リーシュマニア原虫を用いて抗リーシュマニア活性を測定し、哺乳動物細胞を用いて細胞障害性を評価した。一次スクリーニングは化合物を1μM、100nM、10nMの3段階に希釈し、抗リーシュマニア活性を評価した。一次スクリーニングの結果、当研究室で有している化合物ライブラリーから38種類の化合物を選抜し、これら化合物に関しては、二次スクリーニングとして化合物を6段階に希釈し、抗リーシュマニア活性を評価するとともに、哺乳動物細胞を用いた細胞毒性の評価も行った。38種類の化合物の中から、リーシュマニア原虫に対する50%増殖阻害濃度が27 nM、42 nMと低い化合物2種類(化合物WA及び化合物WB)を見出した。しかし、哺乳動物細胞を指標とした選択毒性が数倍程度しか無く、高い選択毒性は得られなかった。我々のin vitroスクリーニングにおいて、化合物の選抜指標として用いている抗リーシュマニア薬Amphotericin Bの50%増殖阻害濃度は、リーシュマニア原虫では63 nM、哺乳動物細胞では2.9μM(選択毒性46倍)である。本年度は我々のスクリーニングからAmphotericin Bより優れた選択毒性を示す有効な化合物が選抜されていない。そのため、平成24年度も継続して別の基本骨格を示す化合物ライブラリーの中から抗リーシュマニア薬候補化合物の探索を行う。平成23年度中に、in vitroスクリーニングから複数の有望な抗リーシュマニア薬候補化合物を見出し、in vivoスクリーニングで、その抗リーシュマニア効果を評価している予定であったが、in vitroスクリーニングにおいて既存の薬剤と比較して数十倍以上の選択毒性を示す化合物を見出す事が出来なかった。

実験の遂行上の問題は無いが、結果として、当初、期待していた基本骨格の化合物群の中から有望な新規阻害剤の選抜が出来なかったことからやや遅れていると判断した。平成23年度の研究から抗リーシュマニア効果が強く選択毒性の高い化合物を見出すことは出来なかったが、リーシュマニア原虫に対する50%増殖阻害濃度が27 nM、42 nMと低濃度で抗リーシュマニア効果を示す一連の化合物WA及びWBを見出すことができた。そのため、これら2種類の化合物は哺乳動物細胞においては標的タンパク質が明らかになっている化合物の誘導体であることから、関連化合物のスクリーニングをさらに行なう。また、リーシュマニア原虫における本標的タンパク質の重要性を探るとともに、薬剤標的分子になり得るか評価する。選択毒性は低いが抗リーシュマニア効果の高い化合物を見出すことは出来ているので、この化合物の誘導体及び関連化合物のin vitroスクリーニングを行なうために研究費を使用する。また、抗リーシュマニア効果の高い化合物は哺乳動物細胞においては標的タンパク質が明らかになっている化合物の誘導体であることから、リーシュマニア原虫における本標的タンパク質の重要性を探るとともに、薬剤標的分子になり得るか評価するための研究費としても使用する計画である。
弱い中枢性統合理論を背景とした認知的柔軟性の弱さが音声知覚に及ぼす影響の検討

発話知覚では視覚情報が音声の聞き取りの助けになることが知られており、この働きはMcGurk効果(McGurk & MacDonald, 1976)という錯覚に反映されている。自閉症スペクトラム障害(ASD)ではMcGurk効果の生起が少ないが、錯覚が低下する要因については明らかでない。本研究課題では、ASD診断群・一般健常者の間で自閉症傾向の連続性を仮定した自閉症スペクトラム仮説(Baron-Cohen et al., 2001)に基づき、この問題についての検討を行った。本年度は、発話刺激の顕在性を実験的に操作して検討した(研究1:視覚刺激の顕在性の操作、研究2:音声刺激の顕在性の操作)。研究1では、多義図形(ルビンの杯)の映像と音声を組み合わせた発話刺激を作成し、McGurk効果の生起を検討した。予備実験では、発話映像として認識しづらい多義図形の映像であってもMcGurk効果が生起することが示された。続いて、自閉症スペクトラム質問紙(AQ)に回答した大学生(471名)の中からAQ得点の高群・低群各10名を抽出し、視聴覚発話課題を実施した。主な結果として、AQ高群でも錯覚の生起が有意に生じるが、低群と比べて錯覚の生起率が相対的に低いことが示された。研究2では音声に対するノイズレベルを操作し、自閉症傾向との関連性を検討した。実験1と同様に、AQ得点の高群・低群各13名を参加者(研究1に参加していない)として抽出した。主な結果として、音声の聞き取りや読唇の正答率では群間差はないが、AQ高群は低群と比べて、視覚情報の利用が相対的に低いことが示された。一方で、このような傾向は、音声がターゲットとなる課題でのみ有意に見られることが示された。これらの成果は、現在論文化の手続きを行っている。これらの研究実施に加えて、本年度は、これまでの研究結果について、国際誌へ3報の論文発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、音声知覚の個人差が生じる過程において、自閉症者に特異的にみられる処理バイアスが影響しているか検討することを目的としている。本研究はアナログ的手法により自閉症指数を用いた検討を行うが、診断基準の改定(DSMー5)により新たに追加された「感覚過敏・鈍麻」の領域は、既存の自閉症指数に含まれていない。そこで本年度ではまず、「感覚過敏・鈍麻」の経験と既存の自閉症指数との関連性について研究1で検討し,次に、自閉症指数の高低による音声錯覚の個人差と、感覚異常、処理バイアスの関連性を研究2で検討した。研究1では、感覚異常の評価尺度(Glasgow sensory questionnaire: GSQ)と自閉症指数(Autism-spectrum quotient: AQ)を用いて、大学生(両尺度の有効回答417名)を対象に質問紙調査を行った。結果では、各得点の連続性と両尺度の低い相関は見られたが、因子分析の結果では、尺度間の項目の重複は少なく、それぞれ独立した変数として検討が可能であると示された。この成果を国際誌に投稿し、修正採択された。研究2では、AQに回答した大学生(504名)の中からスクリーニングを行い、自閉症指数の高群・低群各15名を参加者とした。これらの参加者に、GSQ、視聴覚音声干渉課題(マガーク効果)、視空間干渉課題(Global Local task等)を実施した。主な結果として、自閉症指数の高い参加者は錯覚の生起率が低いが、生起率と感覚異常の経験との関連は示されなかった。また、自閉症指数の高い参加者の中で、音声錯覚の生起に文脈情報利用の弱さが関連していることが示された。この成果は、現在論文化の手続きを行っている。

実験1と同様に、AQ得点の高群・低群各13名を参加者(研究1に参加していない)として抽出した。主な結果として、音声の聞き取りや読唇の正答率では群間差はないが、AQ高群は低群と比べて、視覚情報の利用が相対的に低いことが示された。一方で、このような傾向は、音声がターゲットとなる課題でのみ有意に見られることが示された。これらの成果は、現在論文化の手続きを行っている。これらの研究実施に加えて、本年度は、これまでの研究結果について、国際誌へ3報の論文発表を行った。初年度は、実施した研究の論文化も含め、概ね順調に進展した。現在は、研究3で用いる刺激(顕在性の操作)の作成において、操作の妥当性を得るための予備実験を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、刺激の顕在性を実験的に操作して、視聴覚音声錯覚における処理バイアスの影響を検討する予定である。
ベトナム東北部諸言語に見られる借用漢語音の研究

本年度は、吉川が2018年12月から2019年1月にかけてベトナム東北部のクアンニン省で、2019年3月にはバクザン省で、それぞれ1地点について野外調査を行った。調査内容は主に基礎語彙の収集であるが、クアンニン省では民謡の録音と歌詞の撮影も行った。調査終了後は速やかに音声データの分析に着手し、音節を構成する各要素についてレパートリーのリストアップを行った。清水は2017年度に収集したタイー族の基礎語彙に含まれる漢語由来の借用音、および同民族の宗教儀礼で用いられる経文に記される漢字の音価について、データベースを作成し、初歩的分析を行った。本年度の研究成果は次のとおりである。吉川は学会での口頭発表と市民講座での講演を行った。口頭発表は、日本漢字学会第1回研究大会(於京都大学)で中国湖南省のミエン族が宗教儀礼で唱える『盤王大歌』の一段落を取り上げ、その韻律パターンを論じた。市民講座は、東洋文庫アカデミア講座「漢字研究最前線ー漢検漢字文化研究所東京講座」(於東洋文庫)で「中華圏の漢字系文字と変形漢字」と題し、チワン語の変形漢字を含む東アジア大陸部の諸文字について講演を行った。その他には、前年度に口頭発表を行った北米漢語言語学会議(NACCL-29)のプロシーディングスが刊行され、ミエン語漢字音についての投稿論文が掲載された。清水は口頭発表を第51回シナ・チベット語学会とベトナム文化ワークショップで行った。研究代表者、研究分担者とも各自の調査対象言語について順調に調査および分析、考察を進めることができている。本年度の野外調査が順調に進展し、収集された言語データに対する分析も予定どおり進んだことを踏まえ、翌年度も研究期間開始時に立てた予定に従い野外調査とデータ分析を進め、適切な場で口頭発表を行う。特に、研究代表者が調査を行っている言語種については、既に3地点の地理的変種を確認し、且つその基礎語彙を収集できているため、変種間の比較を行い、得られた知見について学会で口頭発表を行う。本研究の調査研究実施国・地域はベトナム社会主義共和国の東北部であり、調査・考察の対象とする言語種はそこに分布する少数民族語である。本年度は、研究代表者(吉川)が2018年1月にタイグエン省で、研究分担者(清水)が2017年9月にバッカン省で、協力者(讃井)が2017年9月にランソン省で、それぞれ1地点を選出し、野外調査を行った。調査内容は主に基礎語彙の収集である。調査終了後は速やかに音声データの分析に着手し、音節構成要素である頭子音と脚韻部(主母音と末音)、声調についてレパートリーのリストアップを行った。本年度中の研究成果は次のとおりである。吉川は口頭発表、論文投稿、図書執筆をそれぞれ行った。口頭発表としては、第29回北米漢語言語学会議(NACCL-29)で中国湖南省のミエン語の宗教職能者が読経の際に用いる漢字音について論じた。ミエン語はベトナム東北部にも広く分布する言語種である。参会後に、発表内容に部分的修正を施した論文を、当該学会のプロシーディングズに投稿した。図書執筆としては、中越国境を挟んでベトナム東北部の対岸に位置する中国広西のチワン語(壮語)について、方言学の視点から紹介と初歩的考察を試みたのをはじめ、計2件の共著に関わった。清水は口頭発表、図書執筆をそれぞれ行った。口頭発表としては、日本漢字学会の設立総会記念シンポジウムにて、字喃(チュノム)に関する講演を行った。ベトナム東北部の諸言語で使用される変形漢字や変用漢字は、ベト族の字喃と密接な関連を有しており、当該地域の諸言語がベト語や漢語と接触した歴史を考察する際の重要な資料である。論文投稿としては、ベトナムに於ける漢字研究を取り上げた論文が学術誌に掲載された。図書執筆としては、共著1件に関わった。讃井は国際セミナーで講演1件を行った。研究代表者、研究分担者、協力者とも各自の調査対象言語について順調に調査を行うことができ、当初予想した量の言語データを収集できた。また、それに対する分析も当初の予定どおり進んでいる。

その他には、前年度に口頭発表を行った北米漢語言語学会議(NACCL-29)のプロシーディングスが刊行され、ミエン語漢字音についての投稿論文が掲載された。清水は口頭発表を第51回シナ・チベット語学会とベトナム文化ワークショップで行った。研究代表者、研究分担者とも各自の調査対象言語について順調に調査および分析、考察を進めることができている。本年度の野外調査とデータ分析が順調に進展したことを踏まえ、翌年度も研究期間開始時に立てた予定に従い野外調査とデータ分析を進める。但し、研究代表者が行う野外調査については、言語の地理的変種に対する把握が可能になるように、調査地点を複数の省に設けて行うことを検討する。また、データの収集と分析が更に進んだ段階で、学会での口頭発表を行う。本年度の野外調査が順調に進展し、収集された言語データに対する分析も予定どおり進んだことを踏まえ、翌年度も研究期間開始時に立てた予定に従い野外調査とデータ分析を進め、適切な場で口頭発表を行う。特に、研究代表者が調査を行っている言語種については、既に3地点の地理的変種を確認し、且つその基礎語彙を収集できているため、変種間の比較を行い、得られた知見について学会で口頭発表を行う。
グリアに着目した急性脳炎・脳症の病態解明と新規治療法の開発

グリアは脳内微小環境の恒常性維持に関与し、その機能異常は中枢神経疾患に関与しうるが、従来の急性脳炎・脳症研究はニューロンの障害を対象としたものがほとんどで、グリアに着目した研究は乏しい。現在、急性脳炎・脳症に対して明らかに有効といえる治療法はないが、グリアの役割を明らかにすることは新規治療の開発につながる可能性がある。ラットの脳からミクログリアを分離培養し、LPSと低酸素・低糖濃度環境刺激に対する反応を観察した。刺激は単独または両者を組み合わせて負荷し、炎症性サイトカインTNFα、IL-6、IL-1βおよび一酸化窒素合成酵素(iNOS)を測定した。その結果、LPS刺激では炎症性サイトカインとiNOSの上昇を認めたが、低酸素・低糖濃度刺激のみではiNOSのみ上昇し炎症性サイトカインの上昇を認めなかった。LPS及び低酸素・低糖濃度環境を組み合わせた場合は、iNOSがより高値となり、炎症性サイトカインは上昇するもののLPS単独刺激ほどは上昇しなかった。これらの結果から、低酸素・低糖刺激のみでは急性脳炎・脳症のモデルとなりうる反応を惹起することは困難であること、低酸素・低糖刺激とLPS刺激では、ミクログリアで惹起される反応が異なることを示唆し、急性脳炎・脳症を一元的な機序で説明することの困難さを反映していると考えられた。脳炎・脳症に関与するその他の因子として、ミエリンが挙げられる。我々は、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症(MERS)の家族例2家系において、MYRF遺伝子にミスセンス変異を同定した。MYRFはミエリン関連遺伝子の発現に関与しており、急性脳症に関与する多様な病態の解明についての重要な手がかりとなりうる。今後は、MYRFによって発現が制御されている遺伝子と脳炎・脳症との関連を解析することで、脳炎・脳症の機序の解明および治療法の開発につなげたい。培養ミクログリアを用いた実験系で、サイトカインや環境温変化などの各種刺激による変化の測定を行った。今年度はLPS刺激、低酸素・低糖濃度刺激についての解析に加えて、高温(37°C)および低温(34°C)での反応の違いについて解析した。その結果、低温ではLPS刺激による炎症性サイトカインおよびiNOsの放出が抑制された。これらの結果を踏まえても、低酸素・低糖刺激のみでは急性脳炎・脳症のモデルとなりうる反応を惹起することは困難であった。急性脳炎・脳症の遺伝学的背景の解明のための遺伝子解析では、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症(MERS)の家族例2家系において変異が同定されたMYRF遺伝子を軸に解析を行なった。反復性および家族性のMERS症例を対象に、MYRFで制御される可能性のある約700の遺伝子についてのバリアントを次世代シーケンサーを用いて解析し、神経疾患をもたない対照群と比較した。その結果、バリアントをもつ遺伝子の数には差を認めなかったが、MERS症例と対照群ではバリアントを認める遺伝子が異なっていた。ミクログリアを用いた実験は、上記に加えてHMGB1などの自然免疫刺激物質刺激なども行って、その変化を解析する予定である。それにより、急性脳症の病態により近い実験モデルを選択できると考える。また、変化の指標として、サイトカイン以外にも、興奮性アミノ酸・酸化ストレスマーカー(8ーOHDG)についても測定しミクログリアの多様な反応を解析する。サイトカイン・ケモカインはタンパク質多項目同時測定システム・マルチプレックスアッセイシステム(Merick Millipore社)にて網羅的に測定する。8-OHDGの測定は市販のキットを用いて測定する。NOxはGriess反応、興奮性アミノ酸はウエスタンブロット法で測定する。また、それぞれのケミカルメディエーター遺伝子の発現を、定量的PCRを用いて解析する。MYRF遺伝子の関与する急性脳症も、発熱を契機に発症することが多い。MYRFの活性化を測定するルシフェラーゼアッセイを低温および高温下でおこない、変異MYRFの温度による機能変化を解析できるよう準備を進めている。小児の急性脳炎・脳症は死亡・後障害を約3分の1に認める重篤な転帰をとり、現状ではエビデンスが確立した治療法がない。一方、グリアは脳内微小環境の恒常性維持に関与し、その機能異常は中枢神経疾患に関与しうるが、従来の急性脳炎・脳症研究はニューロンの障害を対象としたものがほとんどで、グリアに着目した研究は乏しい。我々は以前から、新生児の低酸素性虚血性脳症などにおいてグリアに着目した研究成果を挙げており、急性脳炎・脳症においてもその知見を生かすことができる。急性脳炎・脳症におけるグリアの役割を明らかにすることは新規治療の開発につながると考えられる。そこで我々は急性脳炎・脳症におけるグリア機能異常の機序とニューロンへの影響、グリアを対象とした新規治療の開発をこの研究の目的とした。まず、ラットの脳からミクログリアを分離培養し、LPS投与と低酸素・低糖濃度環境刺激を単独または組み合わせて負荷することに対するミクログリアの反応を観察した。上記の刺激ごとに、炎症性サイトカインTNFα、IL-6、IL-1βおよび一酸化窒素合成酵素(iNOS)を測定した。iNOSは低酸素や虚血により発現が誘導される酵素で、活性酸素による神経障害に関与している。

その結果、LPS刺激では炎症性サイトカインとiNOSの上昇を認めたが、低酸素・低糖濃度刺激のみではiNOSのみ上昇し炎症性サイトカインの上昇を認めなかった。LPS及び低酸素・低糖濃度環境を組み合わせた場合は、iNOSがより高値となり、炎症性サイトカインは上昇するもののLPS単独刺激ほどは上昇しなかった。計画に沿って培養ミクログリアを用いた実験系で、サイトカインや環境温変化などの各種刺激による変化の測定を行った。今年度はLPS刺激、低酸素・低糖濃度刺激についての解析を行った。その他の高環境温負荷やサイトカイン刺激についても同様の実験系を用いて行えるよう体制を整えている。また、急性脳炎・脳症の遺伝学的背景の解明のため、急性脳症症例の遺伝子解析も進めている。我々は、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症(MERS)の家族例2家系において、MYRF遺伝子に常染色体優性遺伝形式でのミスセンス変異を同定した。MYRFはミエリン関連遺伝子の発現に関与しており、ヒトでの疾患関連の報告は初である。急性脳症にとってもミエリン関連遺伝子の関与は初であり、急性脳症に関与する多様な病態の解明についての重要な手がかりである。グリアは脳内微小環境の恒常性維持に関与し、その機能異常は中枢神経疾患に関与しうるが、従来の急性脳炎・脳症研究はニューロンの障害を対象としたものがほとんどで、グリアに着目した研究は乏しい。現在、急性脳炎・脳症に対して明らかに有効といえる治療法はないが、グリアの役割を明らかにすることは新規治療の開発につながる可能性がある。ラットの脳からミクログリアを分離培養し、LPSと低酸素・低糖濃度環境刺激に対する反応を観察した。刺激は単独または両者を組み合わせて負荷し、炎症性サイトカインTNFα、IL-6、IL-1βおよび一酸化窒素合成酵素(iNOS)を測定した。これらの結果から、低酸素・低糖刺激のみでは急性脳炎・脳症のモデルとなりうる反応を惹起することは困難であること、低酸素・低糖刺激とLPS刺激では、ミクログリアで惹起される反応が異なることを示唆し、急性脳炎・脳症を一元的な機序で説明することの困難さを反映していると考えられた。脳炎・脳症に関与するその他の因子として、ミエリンが挙げられる。我々は、可逆性脳梁膨大部病変を有する軽症脳炎・脳症(MERS)の家族例2家系において、MYRF遺伝子にミスセンス変異を同定した。MYRFはミエリン関連遺伝子の発現に関与しており、急性脳症に関与する多様な病態の解明についての重要な手がかりとなりうる。今後は、MYRFによって発現が制御されている遺伝子と脳炎・脳症との関連を解析することで、脳炎・脳症の機序の解明および治療法の開発につなげたい。培養ミクログリアを用いた実験系で、サイトカインや環境温変化などの各種刺激による変化の測定を行った。今年度はLPS刺激、低酸素・低糖濃度刺激についての解析に加えて、高温(37°C)および低温(34°C)での反応の違いについて解析した。
PACAPの合成、分泌調節に関する研究

正常、および、性腺摘出後の雄雌のラットを使用。断頭屠殺後、視床下部を摘出。実験顕微鏡下で分離した正中隆起を95%CO_2、5%O_2、37°C、KRBGbuffer中で20分間培養した。アドレナリン、コリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、プロスタグランデインE2、F2alphaを添加してこれら中枢作用物質のPACAP38分泌に対する作用を調べた。PACAP38は、疎水性クロマトグラフィーにより培養液より抽出した後にRIAにより測定した。回収率は85%であった。アドレナリン10^<-8>M10^<-5>M、プロスタグランディンE_210^<-9>M10^<-7>M添加により有為にPACAP38分泌の増加がみられた。この際、培養終了後の正中隆起をホモゲナイズした後に組織中のPACAP38を測定してみると逆に組織中PACAP38は減少しており、これらのことよりアドレナリンとプロスタグランディンE2は正中隆起よりのPACAP38合成には影響せずに、分泌を促進することが推測された。2.性腺ホルモンのPACAP38合成、分泌に及ぼす影響に関する実験正常性周期(4日周期)を有する雌ラットを用い、ディエストラス1日目、2日目、プロエストラス、エストラスの午前10時に断頭屠殺後、視床下部よりPACAP38を抽出し測定した。組織中のPACAP38はプロエストラスで有意に高値であった。また、卵巣摘出ラットを用いた実験では、エストロゲン投与によりLHsurgeに先行して視床下部組織中PACAP38の増加が認められた。以上より、脳下垂体よりのLH分泌に視床下部レベルでのPACAP38が関与していることが推測された。
多糖の位置特異的誘導体化と高機能性付与に関する研究

天然に豊富に存在するらせん高分子であるセルロースやアミロースを出発原料とし、水酸基を高度に位置特異的誘導体化することで、優れた機能を有する多糖誘導体を創製することを目的として本研究を行った。セルロース、アミロースはともに繰り返し単位であるグルコース環が多数つながってできた高分子であり、グルコース環には3つの水酸基がついている。この水酸基にエステルやカルバメートなど異なる置換基を位置特異的に導入したところ、得られた誘導体は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用の固定相として高い光学分割能(鏡像の関係にある異性体を識別する能力)を示した。本研究は、高度に高次構造制御された光学活性高分子であるセルロースやアミロースを出発原料とし、『水酸基を位置特異的に誘導体化した多糖誘導体の合成手法の確立』と、『導入する置換基の精査による機能発現』に関する研究を目的とするものである。本年度はまずアミロースについて、グルコース環に3つある水酸基に導入する置換基と光学分割能の関係について検討を行った。アミロースはDMSO中、ビニルエステルとの交換反応により2位の水酸基のみをエステル化することが可能である。まずは2位にメチルエステルを導入し、残りの3,6位の水酸基にはメチル基やクロロ基を有する様々なフェニルイソシアナートを反応させ、得られた誘導体をHPLC用のキラル固定相に用いてその光学分割能の評価を行った。その結果、3,6位を4-クロロ、および3,5-ジクロロフェニルカルバメートへと変換した誘導体が高い光学分割能を示すことが明らかとなり、電子吸引性のハロゲンの導入が有効であることがわかった。そこで次に、より電子吸引性の高いフルオロ基を導入することで光学分割能が向上するかどうか調べた。3-フルオロ、4-フルオロ、および3-トリフルオロメチルフェニルカルバメート化を行った結果、得られた誘導体の分割能は比較的高かったものの、その能力はクロロ基を導入したものには及ばず、またクロロ基を導入したものよりも誘導体の溶解性が高くなり、使用できる溶離液に制限が出ることが明らかとなった。一方、セルロースについてはテキシルジメチルシリルクロライドを反応させることで2,6位を保護し、3位にアリルエーテルを導入可能であることを確認したがNMRの結果からは完全に100%位置特異的には入っていないことも分かった。完全に位置特異的に置換できる条件を見つけ、今後、様々な置換基を導入した誘導体の合成と能力評価を行う予定である。アミロースについては、グルコース環の2位にアセチル基を導入した後、3,6位を4-クロロフェニルカルバメート化したものが高い光学分割能を有することが昨年度までに明らかになっていた。そこで平成22年度は、3,6位を4-クロロフェニルカルバメートとしたまま、2位に導入するエステルをプロピオニル基に変えた誘導体の合成と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用キラル固定相としての評価を行った。その結果、光学分割を試したいくつかのラセミ体で分離係数値に向上がみられ、2位のエステル部位の構造が光学分割能に大きく影響を与えることを見出した。引き続き、2位のエステルをさらにかさ高くした誘導体を合成し、光学分割能に及ぼす影響について検討を行う。一方、セルロースについてはグルコース環の2,6位の水酸基にテキシルジメチルシリルクロライド(TDMS-Cl)を反応させてシリル化させた誘導体を合成し、HPLC用キラル固定相に用いてその光学分割能を評価した。その結果、溶離液にヘキサン/2-プロパノールを用いる順相系では誘導体が全く光学分割能を示さずラセミ体も固定相と相互作用しないのに対して、メタノール/水の逆相系では特異的な光学分割能を示すことを見出し、高い分離係数値で完全分割されるラセミ体もみられた。この結果より、かさ高いテキシルジメチルシリル(TDMS)基が作り出す疎水性空間が有効な不斉識別空間として機能することを明らかにした。平成23年度は昨年度に引き続き、セルロースの位置特異的誘導体の合成と評価について検討を行った。まずはグルコース環の2,6位の水酸基にテキシルジメチルシリルクロライド(TDMS-Cl)を反応させて保護し、3位の水酸基をアリルエーテルに変換した後に、2,6位を水酸基に戻してフェニルイソシアナートを反応させた。

得られた誘導体は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用キラル固定相に用いて光学分割能の評価を行った。しかし、誘導体は位置特異的に合成できたものの高い光学分割能は示さなかった。3位に導入したアリル基のかさ高さが低く、またフレキシブルであることが原因として考えられる。そこで次に、TDMS基で2,6位を保護したセルロースの3位の水酸基にイソシアナートを反応させた後、2,6位を脱保護し、3位とは異なるイソシアナートを反応させることで2,6位と3位とは異なるカルバメート部位を有する誘導体を合成した。結果は、3位にアリル基を有する誘導体とは異なりTDMS基の完全な脱保護が達成できず、一部、2,6位に導入したカルバメート基の切断も確認されたため完全な位置特異的誘導体の合成が行えなかった。しかしながら、光学分割能評価では、高い能力を持つことが確認され、3位にはかさ高さの高い側鎖の導入が必要であることがわかった。今後、脱保護条件等を検討することで完全な位置特異的誘導体が得られれば、より高い光学分割能を有する誘導体が得られることが期待される。本研究は、高度に高次構造制御された光学活性高分子であるセルロースやアミロースを出発原料とし、「水酸基を位置特異的に誘導体化した多糖誘導体の合成手法の確立」と「導入する置換基の精査による機能発現」に関する研究を目的とするものである。本年度はセルロースの位置特異的誘導体について、グルコース環の2,6位の水酸基にエステル、3位にエステルまたはカルバメート基を導入した新規誘導体の合成を行い、その光学分割能の評価を行った。合成では、まずセルロースの2,6位をかさ高いテキシルジメチルシリル基により位置特異的に保護した後、3位の水酸基をベンゾエートまたは4-メチルベンゾエートへと変換した。次いで、2,6位を脱保護して水酸基に戻し、酸クロライド、またはイソシアナートを反応させることでベンゾエートもしくはフェニルカルバメートへと変換した。得られた誘導体はシリカゲルに物理的に吸着させ、これを充填剤としてHPLC用キラルカラムを調製し、様々なラセミ体に対する光学分割能を評価した。その結果、2,6位と3位に異なるベンゾエート部位を導入した誘導体は完全な位置特異的誘導体へと変換することができず、光学分割能も低かった。一方、3位にベンゾエート、2,6位にフェニルカルバメートを有する誘導体については、完全な位置特異的誘導体は得られなかったものの、2,6位に3,5-ジクロロフェニルカルバメートを導入した誘導体が高い光学分割能を示すことが明らかになった。また、この誘導体を用いることにより、3つの水酸基全てに3,5-ジクロロフェニルカルバメートを導入した誘導体よりも高い分離係数値で光学分割できるラセミ体もあり、部分的にでもベンゾエートを導入した効果が見られ、セルロースに異なる側鎖であるベンゾエートとカルバメートとを導入した誘導体について光学分割剤としての可能性を見出すことができた。研究自体は順調であるが、今年度途中で研究を一時中断することとなったため、研究に十分な時間と労力が割けなかったことが、全体的な進行を遅らせた。来年度途中から研究を再開し、引き続き申請課題を継続する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
補償作用に見られる細胞の大型化におけるプロトンポンプ機能制御の役割

葉のサイズ決定機構を明らかにするためには、「補償作用」の理解が鍵である。補償作用とは、ある種の突然変異により、葉の細胞数が減少すると、過剰な細胞伸長が誘導される現象である。補償作用を示す変異体群の中からfugu5に着目した。その結果、種子発芽時に過剰蓄積するピロリン酸によるショ糖生合成の阻害が、fugu5における細胞増殖の阻害の主要因であることを見いだした。さらに、fugu5変異体に重イオンビームを照射してランダム突然変異を誘発し、表現型が野生型に回復、またはfugu5に見られる細胞肥大が抑制ないし促進される変異株も複数単離した。また、fugu2-1変異体及びKRP2 o/eに見られる細胞肥大にはV-ATPaseが関与することが示唆された。葉のサイズ制御機構の理解には、補償作用の理解が鍵である。補償作用とは、葉原基において細胞増殖活性が低下すると、個々の細胞が大型化する現象である。本計画では、fugu5変異体を用い、以下追求・解明を目的としている。1. fugu5変具体ではピロリン酸の異常な蓄積により細胞分裂が抑制されているのか?FUGU5は液胞膜局在型のH^+-PPaseをコードする。FUGU5はピロリン酸(PPi)の加水分解と、プロトン輸送による液胞の酸性化という、2つの機能を持つ。本解析では、この2つの機能のどちらが重要なのか、分割して解析するため、出芽酵母のIPP1遺伝子をfugu5変異体に導入した。IPP1タンパク質は細胞質でPPi分解の機能のみを持ち、プロトンの液胞内輸送には関与しない。興味深いことに、IPP1遺伝子の導入によりfugu5の表現型は完全に相補された。現在これについて論文にまとめているところである。2.補償作用で見られる細胞の大型化はどのように起こるのか?(1)マイクロアレイ解析から、fugu5変異体において12遺伝子の発現量が変動していることが判明した。これまでに、その内5遺伝子のT-DNA挿入変異系統を確立した。現在、細胞レベルの表現型解析を進めている。(2) fugu5変異体の種子に重イオンビーム照射を行い、表現型が回復した変異体の選抜を開始した。その結果、興味深い変異体を多数単離することに成功し、現在継続解析中である。3.液胞サイズと細胞サイズの関係:植物の液胞膜のプロトンポンプの役割:補償作用を示す変異体(fugu5, fugu2, an3とKRP2過剰発現体)とdet3-1との二重変異体の作成が完了した。現在、得られた二重変異体を用いて、補償作用で見られる細胞の大型化がV-ATPaseの影響を受けるのかどうかを調べている。葉のサイズ制御機構を理解するためには、補償作用の理解が鍵である。今年度は、ショ糖とFUGU5との関係をさらに解析した。1.fugu5変異体ではピロリン酸の異常な蓄積により細胞分裂が抑制されているのか?fugu5変異体におけるβ-酸化活性及び、暗所発芽個体における貯蔵脂質の経時変化を調べたところ、fugu5はいずれも正常であった。しかしショ糖非存在下で暗所生育したfugu5変異体は、胚軸伸長が著しく阻害されており、これはショ糖投与により回復した。全ての結果を合わせると、種子発芽時に過剰蓄積するPPiによるショ糖生合成の阻害が、fugu5における細胞増殖の阻害の主要因と考えられる。これはシロイヌナズナを用いてH^+-PPaseの役割を明らかにした初の知見であり、現在、論文にまとめて投稿中である。2.補償作用で見られる細胞の大型化はどのように起こるのか?(1)マイクロアレイ解析から、fugu5変異体において発現量が変動している12遺伝子の内5遺伝子について、T-DNA挿入変異系統の表現型を解析した結果、葉細胞の数やサイズに異常のないことが判明した。(2)fugu5-1変異体の種子に重イオンビームを照射し、表現型が野生型に回復、またはfugu5-1に見られる細胞肥大が抑制ないし促進される変異体を、それぞれ多数単離することに成功した。現在、原因遺伝子の同定を進めている。3.液胞サイズと細胞サイズの関係:植物の液胞膜のプロトンポンプの役割補償作用を示す変異体群とV-ATPaseの機能欠損型変異体であるdet3-1との二重変異体を作成し解析したところ、補償作用がV-ATPase活性に依存するものとしないものとがあることが、判明した。
ストックオプション等株式関連報酬の会計処理に関する考察と国際比較

本年度は、ストックオプション等株式関連報酬の会計処理について、事業再編におけるコーポレート・ガバナンスの観点から考察してきた。また、昨年度に引き継ぎ、自社の株式を支払手段として用いるケースが多発したことに考察を加えるため、負債の定義と自己株式についても再考の対象とした。コーポレート・ガバナンスの観点からは、持株会社経営についてとりあげ、会社分割や株式交換移転制度の会計について議論した。特に、持株会社のみが上場・店頭公開している場合、グループとしての会計情報はどうあるべきか、ストックオプションが子会社従業員に付与されるケースはどのようになるか、についてとりあげた。加えて、事業再生における債務の株式化についてもコーポレート・ガバナンスをどう関与させるかを問題にした。最後に、ストックオプション等の株式購入権の所有者が株主と同等であるかについて議論を試みた。本年度は、ストックオプション等株式関連報酬の会計処理について.株価を意識した経営スタイルという観点から考察した。その際、合併・買収など企業組織の再編成との関わりを検討対象とした。まず、株式関連報酬が付与された場合に費用を認識するのか、認識するならばどのように測定するかについて考察した。その際、オプション価値を公正価値で評価し費用認識する考え方をとりあげ、報酬だけではなく株式による支払一般について論理を組み立て、事例分析を行った。さらに、新株方式と自己株式方式については、両者を整合的に扱う会計処理を検討した。日本では商法により自己株式の取得を資産の取得と同じとみていることに注意し、国際比較を行った。その結果、自己株式の取得を資本控除とみて、再売却を新株発行と同じにみるべきであるという結論に達した。企業組織の再編成との関わりについては、ストックオプションがコーポレートガバナンスの改善に役立つことに注目し、コーポレートガバナンスの視点で合併・買収や持株会社制度について考察した。合併・買収の際にストックオプションがどのように活用されるか、また持株会社における利用状況について検討した。
単分散エマルションゲルの動的・静的粘弾性と油脂感覚

本研究では、膜乳化法により調製した均一な1.5、3.3、6.5及び12.2μmの平均粒径を有するコーン油エマルションを用いて、エマルション含有寒天ゾルを調製し、二段重ねにしたガラスリングに流し込み、室温で1時間、3°Cで18時間放置することによりゲル化し、高さ19mmに切断して粘弾性測定用の試料とした。このエマルションゲル中で、油滴は均一に分散していることが予め確認された。エマルションゲルの直径よりも大きい直径を有するプランジャーで大変形による圧縮破断試験(全圧縮)を行ったところ、エマルションゲルの破断応力及びエネルギーは、油滴径及び油の体積分率の増大により明らかに低下し、破断歪みは、明確な変化を示さなかったが、油滴径が増大するほど低い傾向を示した。一方、ゲルの直径よりも小さい直径を有するプランジャーで貫入破断試験を行ったところ、油滴径によるゲル物性の変化は見られなかった。また、小変形による静的粘弾性(クリープ測定)及び動的粘弾性について調べたが、粒径による影響は現れなかった。このことから、エマルションゲル物性の測定には、小変形よりも大変形による試験、特に、全圧縮破断試験の方が適切であると考えられた。平均粒径1.5、6.5及び12.2μmのエマルションゲル(油の体積分率は0.1)の咀嚼時における硬さ及び油脂感覚(脂っこさ)の官能性を、18人のパネラー(香川大学農学部学生)により一対比較法で調べた。その結果、3種類のゲルの間では、大きい粒径の油滴を含むゲルほど柔らかく、また脂っこく感じる傾向を示し、統計的に有意であった。以上より、エマルションゲル中の油滴の大きさが増大すると、ゲルの強度は低下し、脂っこさを強く感じることが分かった。即ち、柔らかいゲルほど脂っこいことになる。本研究では、膜乳化法により調整した均一な1.5、3.3、6.5及び12.2μmの平均粒径を有するコーン油エマルションを用いて、エマルション含有寒天ゾルを調製した。これを二段重ねにした内径24mm、高さ19mmのガラスリングに流し込み、室温で1時間、3°Cで18時間放置することによりゲル化し、高さ19mmに切断して静的粘弾性測定用の試料とした。大変形の測定法である圧縮破断試験においてエマルションゲルの破断応力及びエネルギーは、油滴径及び油の体積分率の増大により明らかに低下した。微少変形によるクリープ測定では、破断強度ほど明確な差は現れなかったが、フォークト体粘性率は、粒径の増大により有意に低下した。動的粘弾性は、エマルションゲルを高さ19mm、直径10mmに成形し、周波数3Hzで測定した。貯蔵弾性率、損失弾性率及び損失正接のいずれもが油滴径に対して殆ど変化しなかった。平均粒径1.5、6.5及び12.2μmのエマルションゲル(油の体積分率は0.1)の咀嚼時における硬さの官能性を、18人のパネラ-(香川大学農学部学生)により一対比較法で調べた。その結果、3種類のゲルの間では、大きい粒径の油滴を含むゲルほど柔らかい傾向を示し、統計的に有意であった。これは、圧縮破断試験及びクリープ測定によるフォークト体粘性率の結果と一致した。

以上より、ゲルの物性評価には静的粘弾性の測定が適切であり、特に、圧縮破断試験の結果が実際の口中感覚と良く一致することが見いだされた。本研究では、膜乳化法により調製した均一な1.5、3.3、6.5及び12.2μmの平均粒径を有するコーン油エマルションを用いて、エマルション含有寒天ゾルを調製した。これを二段重ねにした内径24mm、高さ19mmのガラスリングに流し込み、室温で1時間、3°Cで18時間放置することによりゲル化し、高さ19mmに切断して静的粘弾性測定用の試料とした。このエマルションゲル中で、油滴は均一に分散していることが予め確認された。エマルションゲルの直径よりも大きい直径を有するプランジャーで圧縮破断試験(全圧縮)を行ったところ、エマルションゲルの破断応力及びエネルギーは、油滴径及び油の体積分率の増大により明らかに低下し、破断歪みは、明確な変化を示さなかったが、油滴径が増大するほど低い傾向を示した。一方、ゲルの直径よりも小さい直径を有するプランジャーで貫入破断試験を行ったところ、油滴径によるゲル物性の変化は見られなかった。このことから、ゲル物性の測定には、貫入破断試験よりも全圧縮破断試験の方が適切であると考えられた。平均粒径1.5、6.5及び12.2μmのエマルションゲル(油の体積分率は0.1)の咀嚼時における油脂感覚(脂っこさ)の官能性を、18人のパネラー(香川大学農学部学生)により一対比較法で調べた。その結果、3種類のゲルの間では、大きい粒径の油滴を含むゲルほど脂っこく感じる傾向を示し、統計的に有意であった。以上より、エマルションゲル中の油滴の大きさが増大すると、ゲルの強度は低下し、脂っこさを強く感じることが分かった。即ち、柔らかいゲルほど脂っこいことになる。
走磁性細菌から分離した磁気微粒子への酸素および抗体の固定化

走磁性細菌の合成する磁気微粒子は人工の磁気微粒子と比較しても非常に優れた点が多い.そこで走磁性細菌から分離した磁気微粒子に酵素,抗体を固定化し医療や計測への応用を行った.走磁性細菌は酸素分圧, PH,炭素源窒素源等の条件を検討することで汚泥中において40倍まで増殖させることができた.また,磁性細菌粒子はマグネタイト(Fe_3O_4であり,周囲を一様に有機薄膜によって覆われていることが明らかとなった.磁性細菌粒子への酵素,抗体の固定化は,磁気微粒子をγ-アミノプロピルトリエトキシシラン,グルタルアルデヒド処理した後,酵素,抗体溶液中で4°C, 12時間放置することで行った.その均一な形状,微小なサイズから磁性細菌粒子には非常に多くの酵素,抗体が固定化され,高活性を示した.そこでグルコースオキシダーゼを磁気微粒子に固定化し,グルコース濃度の測定を試みた.酵素固定化磁気微粒子を攪拌素子として用い,グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応により生成するH_2O_2とo-ジアニシジンの酸化発色による吸光度変化を測定したところ, 0.14.0mg/mlの範囲でグルコース濃度の測定が可能であった.次に,磁性細菌粒子に抗大腸菌抗体を固定化し,細胞の選択的分離を試みた.大腸菌懸濁液中に大腸菌抗体を固定化した磁気微粒子を加え磁気的に攪拌,分離したところ,大腸菌数が減少した.これに対し乳酸菌,酵母では菌数の変化が見られなかったことから,細胞の選択的分離が可能であることが示された.また,磁性細菌粒子に抗偏平上皮がん関連抗原(SCC)抗体を固定化し超音波で分散させた後SCCを加えると抗原抗体反応により強い凝集が数分で形成した.これより抗体固定化磁気微粒子を用い,光学顕微鏡観察することで非常に微量な抗原の迅速な検出が可能となった.以上の結果,磁性細菌粒子に酵素,抗体を固定化することで医療,計測への応用が可能となった.走磁性細菌の合成する磁気微粒子は人工の磁気微粒子と比較しても非常に優れた点が多い.そこで走磁性細菌から分離した磁気微粒子に酵素,抗体を固定化し医療や計測への応用を行った.走磁性細菌は酸素分圧, PH,炭素源窒素源等の条件を検討することで汚泥中において40倍まで増殖させることができた.また,磁性細菌粒子はマグネタイト(Fe_3O_4であり,周囲を一様に有機薄膜によって覆われていることが明らかとなった.磁性細菌粒子への酵素,抗体の固定化は,磁気微粒子をγ-アミノプロピルトリエトキシシラン,グルタルアルデヒド処理した後,酵素,抗体溶液中で4°C, 12時間放置することで行った.その均一な形状,微小なサイズから磁性細菌粒子には非常に多くの酵素,抗体が固定化され,高活性を示した.そこでグルコースオキシダーゼを磁気微粒子に固定化し,グルコース濃度の測定を試みた.酵素固定化磁気微粒子を攪拌素子として用い,グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応により生成するH_2O_2とo-ジアニシジンの酸化発色による吸光度変化を測定したところ, 0.14.0mg/mlの範囲でグルコース濃度の測定が可能であった.次に,磁性細菌粒子に抗大腸菌抗体を固定化し,細胞の選択的分離を試みた.大腸菌懸濁液中に大腸菌抗体を固定化した磁気微粒子を加え磁気的に攪拌,分離したところ,大腸菌数が減少した.これに対し乳酸菌,酵母では菌数の変化が見られなかったことから,細胞の選択的分離が可能であることが示された.また,磁性細菌粒子に抗偏平上皮がん関連抗原(SCC)抗体を固定化し超音波で分散させた後SCCを加えると抗原抗体反応により強い凝集が数分で形成した.これより抗体固定化磁気微粒子を用い,光学顕微鏡観察することで非常に微量な抗原の迅速な検出が可能となった.以上の結果,磁性細菌粒子に酵素,抗体を固定化することで医療,計測への応用が可能となった.1.走磁性細菌の分離及び培養を試みた。淡水性走磁性細菌以外に海洋性走磁性細菌を発見した。走磁性細菌は池,沼,海岸等の沈殿物の表層にその90%が分布していた。培養は沈殿物に炭素源,窒素源,鉄,抗生物質等を加えることで、従来10倍程度しか増殖させることができなかった走磁性細菌を40倍まで増殖させることができた。また、最適塩濃度(淡水性0.1%以下,海洋性3%)、微好気条件(気相酸素濃度0.56%)、pH6.06.5が走磁性細菌の最適生存条件として示された。2.走磁性細菌からの磁気微粒子の分離とキャラクタリゼーションについて検討した。磁気微粒子は走磁性細菌をリソチーム,リパーゼ,トリプシン,NaOHで処理することで分離できた。エネルギー分散型分析装置により主元素は鉄と酸素であり、磁気微粒子を覆う被膜は有機質であることが示された。電子線回折,高分解能透過型電子顕微鏡によりこの磁気微粒子はマグネタイトであることが明らかになった。試料振動式磁力計により磁化50emu/g保持力230Oeであることが示された。

3.走磁性細菌より分離した磁気微粒子への酵素の固定化について検討した走磁性細菌からリゾチーム,リパーゼ,トリプシン及びアルカリ処理により磁気微粒子を分離し、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン及びグルタルアルデヒドで処理することでグルコースオキシダーゼ,ウリカーゼが固定化できた。人工磁気微粒子(Znフェライト及びマグネタイト)に酵素を固定化した場合、担体である磁気微粒子自体の金属の溶出により酵素活性が阻害された。これに対し走磁性細菌の磁気微粒子は人工磁気微粒子に比べ酵素固定化量は約100倍高く、酵素活性も1040倍高く、酵素活性への阻害はなかった。また、固定化された酵素は少なくとも5回の再使用が可能であり、酵素の溶出もなく安定に固定化された。