hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レドックス機能共役分子の動的ナノ組織化と電子構造制御

われわれは、光や電気などに応答する外場応答分子を機能ユニットとして強く相互作用させながら集積する共役組織化材料の開発を行っている。分子を機能ユニットとして集積する以上、分子単独では実現できない組織体構造に特異な電子機能を目指している。本研究では、ピリジニウム基をレドックス機能ユニットとする共役組織体を合成し、多段階レドックス過程、多電子還元種のハイスピン状態、およびスピン間相互作用に着目した相互作用経路の解析を目標とした。βジケトンの1位と3位にピリジニウム基を置換したレドックス活性βジケトンを合成した。錯形成によってエノレート共役系の電子状態が変化するため、金属イオンによる1位と3位に置換したピリジニウム基間の(配位子内)相互作用の制御が可能である。さらに、金属イオンとのd-π相互作用を介した配位子間の相互作用も期待できるため、ピリジニウムβジケトン配位子は共役組織化の多様なリンカーとしてだけでなく、相互作用経路を理解するための有用な材料と言える。CU^<2+>、Ni^<2+>、Zn^<2+>との1:2型の金属錯体の還元電位は金属イオンに強く依存した。新たにピリジニウム基とフェニル基を置換したβジケトン配位子を合成し、ふたつのピリジニウム基の配置に関する異性体の電子構造をピリジニルジラジカルの磁気特性として解析した。ピリジニウム基のN位にデンドロンを導入したβジケトン金属錯体を設計し、これを新たなビルディングブロックとする2次的な自己組織化を検討した。その結果、(1)基板に垂直配向した金属錯体の積層シリンダー構造、(2)気/水界面に展開した安定な単分子膜、および(3)溶媒蒸発過程の散逸構造が転写された構造形成が確認された。これら2次集積体は、構成要素である金属錯体の特異な光・電子・磁性機能を反映した新規な分子機能材料として期待される。われわれは、光や電気などに応答する刺激応答分子を機能単位として強く相互作用させながら集積する分子機能材料の開発を行っている。本研究では、レドックス活性な配位子としてピリジニウムβジケトンを設計し、(1)各種金属イオンとの錯形成反応による共役組織体の構築、(2)多段階レドックス過程とハイスピン状態を実現、さらに(3)これら金属錯体をビルディングブロックとする高次の組織化を試みることを目的とする。平成14年度は、この多段階レドックス活性金属錯体の相互作用経路の解析と周辺にデンドロン置換することによる2次的組織化について検討した。1,3位に2つのピリジニウム基が置換したβジケトン配位子は各種金属イオンと容易に錯形成し、その電子的な相互作用は(1)配位子内のエノレート共役系の経路と(2)金属イオンを介した配位子間経路でトランス配置とシス配置が含まれる。配位子は2段階、量論比1:2で表される亜鉛、銅、ニッケル錯体は金属イオンに依存した分裂幅をもつ4段階還元過程を示した。ピリジニウム基のN位にデンドロン-を導入したβジケトン金属錯体を設計し、これを新たなビルディングブロックとする2次的な自己組織化を検討した。
超音波造影剤気泡におけるシェルが気泡振動に及ぼす影響と臨床応用における役割の解析

日本に来てから参加した学会は非常に有意義な経験となっている.2004年の5月末から6月初めに横浜で行われた「第5回国際混相流会議」では,シェルを有す超音波造影剤の崩壊挙動について発表を行い,有意義な質疑応答の機会を得ることができた.このような造影剤の崩壊現象は,体組織でのパフュージョンの観察や,薬剤の担体としての超音波造影剤を超音波で意図的に破壊することによって局所的に薬効を得る「ドラッグ・デリバリー・システム」などにおいて重要な役割を担っている.しかしながら,この超音波造影剤の破壊メカニズムに関しては,実験的な検証に比べて理論やモデル化が遅れており,その理解が不十分であるのが現状である.そのため,東京大学在籍中には,ドラッグ・デリバリーで用いられる超音波造影剤について自身の理論の拡張,および2重の層になった超音波造影剤モデルの開発も行った.さらに,当研究室の超音波研究グループの成果をサマライズした論文の作成に携わった.本論文は2005年の1月に発行されている.論文中では主として超音波造影剤の発熱作用増強効果の部分に貢献したほか,論文全体の文章校正にも参加している.また,当外国人特別研究員は2004年9月からハワイ大学の助教授となっているが,2004年の9月に行われた「第4回治療超音波に関する国際会議」においても当研究室の超音波造影剤に関する研究を行っている発表者の共同研究者となるなど,引き続き当研究室と協力した研究活動も行っている.日本に来てから参加した学会は非常に有意義な経験となっている.2004年の5月末から6月初めに横浜で行われた「第5回国際混相流会議」では,シェルを有す超音波造影剤の崩壊挙動について発表を行い,有意義な質疑応答の機会を得ることができた.このような造影剤の崩壊現象は,体組織でのパフュージョンの観察や,薬剤の担体としての超音波造影剤を超音波で意図的に破壊することによって局所的に薬効を得る「ドラッグ・デリバリー・システム」などにおいて重要な役割を担っている.しかしながら,この超音波造影剤の破壊メカニズムに関しては,実験的な検証に比べて理論やモデル化が遅れており,その理解が不十分であるのが現状である.そのため,東京大学在籍中には,ドラッグ・デリバリーで用いられる超音波造影剤について自身の理論の拡張,および2重の層になった超音波造影剤モデルの開発も行った.さらに,当研究室の超音波研究グループの成果をサマライズした論文の作成に携わった.本論文は2005年の1月に発行されている.論文中では主として超音波造影剤の発熱作用増強効果の部分に貢献したほか,論文全体の文章校正にも参加している.また,当外国人特別研究員は2004年9月からハワイ大学の助教授となっているが,2004年の9月に行われた「第4回治療超音波に関する国際会議」においても当研究室の超音波造影剤に関する研究を行っている発表者の共同研究者となるなど,引き続き当研究室と協力した研究活動も行っている.
数mm×数mmの可動範囲を持つ超高精度平面三自由度インパクト駆動機構の開発

圧電素子の急速変位により発生する衝撃力を駆動力とする,数mm×数mmの広い位置決め可能範囲とサブマイクロメートルオーダの高い位置決め分解能を持つ駆動機構が開発された.この機構の外寸は80(W)×100(L)×25(H)とコンパクトであるので,真空チャンバなどの狭小空間内を作業領域とすることが可能である.以下に研究結果を示す.1.それぞれの圧電素子の駆動波計を変化させることで,発生する駆動力のベクトルを適宜調整した結果,平面三自由度(X,Y方向並進+γ方向回転)に対しての移動が可能であった.同様に自由曲線上をトレースすることも可能であった.2.静電容量型変位計により,機構の位置および姿勢を測定した.本機構の位置決め分解能はX,Y方向に対して0.05μm,γ方向に対して0.6"であった.この値は測定器の性能と同程度である.3.機構の位置および姿勢を上述の測定システムにより逐次観測し,駆動力のベクトルを修正することで,機構の位置および姿勢のフィードバック制御を行った.ここでは運動誤差の補正を行った結果,X軸に沿う直線運動(移動範囲【plus-minus】25μ)時に発生する運動誤差:Y方向シフトとγ方向ヨ-イングは(1μm,20")から(0.03μm,0.6")まで減少した.また同様にγ方向の回転運動時(回転範囲【plus-minus】250")に発生する運動誤差:XおよびY方向シフトは(1.5μm,2.0μm)から(0.03μm,0.03μm)まで減4.摺動面との摩擦状態は本機構の位置決め特性に極めて大きな影響を与える.ここではZ方向(鉛直方向)に変形する圧電素子を配置し,この圧電素子の変形パターンにより垂直抗力を変化させ,摺動面との摩擦力の大きさを制御した.この結果,駆動機構の位置に伴う摩擦力変動の影響が小さくなり,オープンループ制御下における位置決めのばらつき誤差が減少した.圧電素子の急速変位により発生する衝撃力を駆動力とする,数mm×数mmの広い位置決め可能範囲とサブマイクロメートルオーダの高い位置決め分解能を持つ駆動機構が開発された.この機構の外寸は80(W)×100(L)×25(H)とコンパクトであるので,真空チャンバなどの狭小空間内を作業領域とすることが可能である.以下に研究結果を示す.1.それぞれの圧電素子の駆動波計を変化させることで,発生する駆動力のベクトルを適宜調整した結果,平面三自由度(X,Y方向並進+γ方向回転)に対しての移動が可能であった.同様に自由曲線上をトレースすることも可能であった.2.静電容量型変位計により,機構の位置および姿勢を測定した.本機構の位置決め分解能はX,Y方向に対して0.05μm,γ方向に対して0.6"であった.この値は測定器の性能と同程度である.3.機構の位置および姿勢を上述の測定システムにより逐次観測し,駆動力のベクトルを修正することで,機構の位置および姿勢のフィードバック制御を行った.ここでは運動誤差の補正を行った結果,X軸に沿う直線運動(移動範囲【plus-minus】25μ)時に発生する運動誤差:Y方向シフトとγ方向ヨ-イングは(1μm,20")から(0.03μm,0.6")まで減少した.また同様にγ方向の回転運動時(回転範囲【plus-minus】250")に発生する運動誤差:XおよびY方向シフトは(1.5μm,2.0μm)から(0.03μm,0.03μm)まで減4.摺動面との摩擦状態は本機構の位置決め特性に極めて大きな影響を与える.ここではZ方向(鉛直方向)に変形する圧電素子を配置し,この圧電素子の変形パターンにより垂直抗力を変化させ,摺動面との摩擦力の大きさを制御した.この結果,駆動機構の位置に伴う摩擦力変動の影響が小さくなり,オープンループ制御下における位置決めのばらつき誤差が減少した.
膜タンパク質の細胞内選別輸送の分子機構

主に出芽酵母を材料に用い,膜タンパク質の選別機構に関して以下のような研究成果を得た。1)Rer1pを中心とした選別レセプターに関する研究:ゴルジ体膜タンパク質Rer1pは,ゴルジ体に誤って輸送されてきた一群の小胞体膜タンパク質の膜貫通領域の極性残基配列を直接認識し,COPI小胞を介して小胞体へと送り返す分子選別装置であることを明らかにした。2)レクチン型選別レセプターに関する研究:レクチン様膜タンパク質Emp46/47pが,小胞体一ゴルジ体間をリサイクルする過程で糖タンパク質レセプターとして機能している可能性を示唆した。またその機能に小胞体とゴルジ体におけるオリゴマー形成が重要であることを示した。3)輸送小胞形成時における膜タンパク質積み荷の選別の完全再構成系の構築:積み荷膜タンパク質依存性のCOPII小胞形成を,全て完全に精製した因子のみを用いて試験管内で再構成した。この系で,Sar1pのGTP加水分解が荷の選別に重要であることを明らかにした。さらに全反射顕微鏡を用いて,輸送小胞形成を可視化することに成功した。4)膜タンパク質選別における脂質およびユビキチンの役割に関する研究:トリプトファン輸送体Tat2pと細胞膜ATPase Pma1pの細胞表面への輸送にユビキチン化が関与していることを明らかにした。とくに前者の選別輸送にはステロール脂質が密接に関与していることを示した。5)膜タンパク質の選別過程のリアルタイム可視化の研究:高速高感度共焦点レーザー顕微鏡を用い,ゴルジ体の槽間のタンパク質輸送が槽の成熟によって起こることを証明した。その過程でダイナミックな膜の選別・分離が起こり,COPIに依存性と非依存性の機構があることを示した。出芽酵母を材料に用い,膜タンパク質の選別機構に関して以下のような研究を行った。1.小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送における積み荷レセプターの候補として,レクチン様膜タンパク質Emp46/47pに注目した。C末端領域にCOPI, COPII結合モチーフがあり,これらに依存して小胞体-ゴルジ体間をリサイクルしていること,順行輸送が機能に重要であることを明らかにした。また,Emp46/47pの欠損株では一群の糖タンパク質の分泌損傷がみられ,これらが糖タンパク質レセプターとして機能している可能性を示唆した。2.ゴルジ体膜タンパク質Rer1pは,ゴルジ体に誤って輸送されてきた一群の小胞体膜タンパク質の膜貫通領域(TMD)を認職し,COPI小胞を介して小胞体へと送り返す分子選別装置である。荷としてSec71pに注目し,そのTMDが小胞体膜へのターゲティングおよび局在化に必要十分であり,Rer1pに直接認職されることを明らかにした。また,この認識にはTMDにおける極性残基の空間的な位置が重要であることを示した。一方,Rer1pの4つのTMDにおける極性残基についても網羅的に変異解析を行った結果,ある特定のチロシン残がSec12pの小胞体局在化には必須であるが,Sec71pの局在化には関与しないことを明らかにした。3.エルゴステロール合成に欠損を示す酵母erg6変異株では,トリプトファン輸送体Tat2pの誤輸送が2つのオルガネラで起こっていた。Tat2pはゴルジ体から細胞膜ではなくてエンドソームへ運ばれ,さらにそこで内腔側へ取り込まれて限界膜から消失した。これら2つの誤輸送は,ユビキチンリガーゼの機能の低下によって矯正された。この結果から,ユビキチンによる翻訳後修飾がTat2pの輸送シグナルとして機能しており,その選別にステロール脂質が密接に関与していることが明らかになった。

主に出芽酵母を材料に用い,膜タンパク質の選別機構に関して以下のような研究を行った。1.酵母の小胞体-ゴルジ体間輸送の積み荷レセプターの候補として同定したレクチン様膜タンパク質Emp46/47pが,小胞体においてオリゴマーを形成すること,またこのオリゴマー形成が小胞体からのCOPII小胞の出芽に必須であることを示した。Emp47pは単独でオリゴマーを形成し,小胞体を出ることができるが,Emp46pはEmp47pとヘテロオリゴマーを作ることで初めてゴルジ体に進むことができる。またこのヘテロオリゴマーは,小胞体内およびCOPII小胞内では維持されるが,ゴルジ体に到達すると解離することがわかった。2.このオリゴマー形成に依存したCOPII小胞形成を,精製Emp46/47Pとリン脂質からなるプロテオリポソームを用いて試験管内で完全に再構成することに成功した。この系を用い,Sar1 GTPaseによるGTPの加水分解は積み荷の良し悪しにかかわらず起こること,つまりGTPの加水分解がタイマーとして働いて,正しい積み荷のチェックに利用されている可能性を示唆した。3.酵母鉄イオン輸送体はFet3p/Ftr1pというヘテロ2量体からなり,そのいずれが欠失しても細胞膜に正しく発現しない。この現象は小胞体における品質管理機構によるものであるが,Fet3pが小胞体に留まるのは,静的残留ではなくゴルジ体に存在する逆送レセプターRer1pに依存したリサイクリングによるものであることを明らかにした。またRer1pによる認識には,Fet3pの膜貫通領域にある極性アミノ酸残基が必須であることがわかった。1.小胞体から輸送される積み荷タンパク質の選別は,輸送小胞を被覆するCOPIIコートとよばれるタンパク質複合体が,積み荷がもつ輸送シグナルに直接結合することによりなされている。この小胞体からのCOPII小胞の形成反応を,精製因子のみを用いたプロテオリポソームで積み荷依存的に完全再構成し,さらにこの系とFRETを組み合わせて、COPIIコートと積み荷タンパク質のリアルタイムでの結合,解離の様子をモニターする実験系を構築した。この実験系で解析を行った結果,この反応の鍵分子である低分子量GTPase Sarlpは,GTP加水分解により輸送されるタンパク質の選別を行っているということを明らかにした。2.やはり低分子量GTPaseであるArfタンパク質は,ゴルジ体等からのCOPI小胞の形成時における積み荷選別の鍵を握っている。酵母arf1温度感受性変異アレルarf1-16の多コピーサプレッサーとして,Arf GAP (GTPase活性化因子)であるGLO3を得た.arf1-16に対する抑圧効果は,出芽酵母内に複数存在するArf GAPの中でもGLO3特異的であり,その特異性にはGlo3pのC末部分が重要な役割をもつことを明らかにした.Glo3pのC末には,ヒトから植物にいたるさまざまな真核生物において保存されている特徴的な配列があり,その配列がin vivoにおけるGlo3pの機能に重要であることを示唆した。
新生児における脳循環、酸素代謝状態に基づく輸血基準作成の為の基礎的検討

医療技術の進歩により、出生時極めて未熟な状態である在胎28週未満の超早産児の生存退院が一般的となり、神経学的予後を改善することの重要性が高まっている。超早産児で貧血は、ほぼ全例に認められる病態であり、治療として輸血はごく一般的に行われている。貧血に対する治療の長期的目標は神経学的予後の改善であり、脳の酸素需要を満たすようにすることが輸血の目的である。脳の酸素代謝状態をモニタリングできれば、脳の酸素需要を過不足なく管理でき、脳保護を目的とした新たな輸血基準を作成しえる。本研究では早産児における脳血液量値(CBV)による「脳酸素需要に基づく後遺症無き生存を目標とした早産児輸血基準作成」を目指す。
デュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッドの開発と超高密度磁気記録システムへの応用

超高密度記録用の垂直磁気記録システムにおいて、従来の単磁極型垂直磁気ヘッドの欠点である開磁路構造を閉磁路構造に替える「デュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッド」を提案・試作し、高効率の記録・再生システムの可能性を確認することを目的とした。前年度でヘッド中のコア用の大飽和磁化、低保磁力、高透磁率を有する窒化鉄Fe_xN薄膜の形成に成功している。今年度はこの窒化鉄磁性膜に加えて、Ni-Feと常磁性Co-Cr層を積層した構造を有する薄膜や、Co-Zr-Ta薄膜等の軟磁気特性向上に成功した。またこれらの軟磁性膜については実用上重要となる透磁率・損失分の周波数特性の測定を行い、薄膜ヘッド用コア材料として十分な特性を持っていることを確認し、磁気回路の透磁率向上に目処を得ることができた。またイオンビームスパッタ装置により作製したMRヘッド用のNi-Fe/Cuの多層膜の巨大磁気抵抗効果についても特性改善を行い、室温で16%以上の磁気抵抗変化率を有する多層膜が作製できることや、その磁界感度がFeバッファ層の結晶配向度に大きく依存しており、Fe結晶子の(100)面を配向させた方が磁界感度が高くなるなど、今後の応用にとって重要な知見を得ることができた。一方、実際の薄膜ヘッドの作製については、フォトリソグラフィによる微細加工技術であるリフトオフ法を用いてデュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッドの構造に加工することに成功した。このリフトオフ法によって磁性膜、配線膜のエッジ部分が非常に直線性良く加工できることがわかった。このヘッドのインダクタンスは0.060.18μHの値であり、高密度記録領域における高周波での動作において有利となる低インダクタンスが形成されていることがわかった。本方式の原理を確認するための実験を行い、通常の薄膜ヘッドを改造したヘッドにおいて、高密度の記録再生信号が検出されることを確認し、本方式の有効性が実証された。超高密度記録にも最も適している垂直磁気記録システム用に、従来の単磁極型垂直磁気記録用ヘッド欠点である開磁路構造を閉磁路構造に替える「デュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッド」を新たに設計・試作し、高効率の記録・再生システムを構成し、その実用化の可能性を確認することを目的とした。まずヘッド中のコア用に大飽和磁化、低保磁力、高透磁率の全てを満たす窒化鉄Fe_XN薄膜をイオンビーム堆積装置によって作製した。この結果、20kG程度の大飽和磁化を有し、10e程度の低保磁力、2000程度の高い透磁率を有する超軟磁性窒化鉄薄膜を作製することに成功した。またイオンビームスパッタ装置によりNi-Fe/Cuの多層膜を作製したところ、室温で11%以上の巨大な磁気抵抗変化率を有する多層膜が作成できることを実証した。このときの膜の保磁力は50e程度であり、従来報告されてきた巨大磁気抵抗効果を有する多層膜では数百数千Oeであったことを考えれば、きわめて低い保磁力を有する磁気抵抗効果素子を作製することに成功した。またこれらの軟磁性膜に付いては実用上重要となる透磁率・損失分の周波数特性の測定を行い、ヘッド用コア材料として十分な特性を持っていることを確認した。また、フォトリソグラフィ技術による微細加工技術を持いて、湿式プロセスではあるものの上記のデュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッドのコア形状のパターニングに成功した。

実際には巻線等の配線もリソグラフィー技術で作製する必要があるが、位置合わせ誤差や多層配線技術の困難さなどの理由により本研究で提案した方式での薄膜ヘッドの作製はできなかったが、配線を手巻にする方式やバルクフェライトを用いたヘッド、あるいは市販の薄膜ヘッドを改造したヘッド等において、本方式の原理的な確認を行ったところ、予想通りの記録再生信号が検出されることを確認し、本方式の有効性が実証された。超高密度記録用の垂直磁気記録システムにおいて、従来の単磁極型垂直磁気ヘッドの欠点である開磁路構造を閉磁路構造に替える「デュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッド」を提案・試作し、高効率の記録・再生システムの可能性を確認することを目的とした。前年度でヘッド中のコア用の大飽和磁化、低保磁力、高透磁率を有する窒化鉄Fe_xN薄膜の形成に成功している。今年度はこの窒化鉄磁性膜に加えて、Ni-Feと常磁性Co-Cr層を積層した構造を有する薄膜や、Co-Zr-Ta薄膜等の軟磁気特性向上に成功した。またこれらの軟磁性膜については実用上重要となる透磁率・損失分の周波数特性の測定を行い、薄膜ヘッド用コア材料として十分な特性を持っていることを確認し、磁気回路の透磁率向上に目処を得ることができた。またイオンビームスパッタ装置により作製したMRヘッド用のNi-Fe/Cuの多層膜の巨大磁気抵抗効果についても特性改善を行い、室温で16%以上の磁気抵抗変化率を有する多層膜が作製できることや、その磁界感度がFeバッファ層の結晶配向度に大きく依存しており、Fe結晶子の(100)面を配向させた方が磁界感度が高くなるなど、今後の応用にとって重要な知見を得ることができた。一方、実際の薄膜ヘッドの作製については、フォトリソグラフィによる微細加工技術であるリフトオフ法を用いてデュアルトラック相補型薄膜磁気ヘッドの構造に加工することに成功した。このリフトオフ法によって磁性膜、配線膜のエッジ部分が非常に直線性良く加工できることがわかった。このヘッドのインダクタンスは0.060.18μHの値であり、高密度記録領域における高周波での動作において有利となる低インダクタンスが形成されていることがわかった。本方式の原理を確認するための実験を行い、通常の薄膜ヘッドを改造したヘッドにおいて、高密度の記録再生信号が検出されることを確認し、本方式の有効性が実証された。
胆道閉鎖症の病因としてのレオ3型ウイルスー免疫組織化学および分子生物学的研究

第一の目的は胆道閉鎖症患児の肝組織からレオ3型ウイルスの抗原および核酸を同定することであった。免疫組織化学として蛍光抗体法および酵素抗体法を行い、抗原陽性部位は門脈域周囲の肝細胞および増生胆管上皮細胞の細胞質に著明に認められた。この結果、本症患児25例全例の肝組織にレオ3型ウイルスの抗原を見いだした。これに対して肝疾患コントロ-ル8例のうち6例と非肝疾患コントロ-ル3例ではこの抗原は陰性であった。免疫電顕では光顕レベルでのレオ3型ウイルス抗原がライソゾ-ム様の空胞に局在することがわかった。一方、本症患児の肝組織から核酸を抽出し、精製したレオ3型ウイルス全体をプロ-ブとしてノザン・ブロット法を行った。この結果、患児の肝組織にはレオ3型ウイルスRNA分節のうち、M_1分節が共通して認められた。さらにM_1分節に対するプロ-ブを生成し、肝組織から抽出したRNAをDNAに変換した上でPCR法を行った。この結果、本症患児3例全例でM_1分節が同定され、そのシ-クエンスは既知のそれと一致した。以上から胆道閉鎖症患児の肝組織では肝細胞または増生胆管上皮細胞のライソゾ-ム様空胞に、レオ3型ウイルスRNAのうち少なくともM_1分節が存在して複製していることが示唆された。このことから本症患児は、離乳直後のマウスに胆管閉塞を来すレオ3型ウイルスに感染したものと考えられた。本研究の第二の目的は本症モデルの作成であったが、離乳後マウスにレオ3型ウイルスを接種して肝組織内にウイルス抗原を見いだしたが、胆管閉塞のメカニズムまで解明するところには至らなかった。本研究の目的は第1にヒトの胆道閉鎖症生検肝組織において、レオ3型ウイルスのRNAが存在することを免疫組織化学、免疫電顕およびノ-ザン・ブロット法によって証明することであった。これについては13名の本症患児全例でレオ3型ウイルスの抗原が免疫組織化学的に陽性であり、うち1例で免疫電顕を行ったところ上記の陽性部位はライソゾ-ム様の空胞であることが確認された。さらに6例の本症肝組織からRNAを抽出し、^<35>Pでラベルしたレオ3型ウイルスプロ-ブを用いてノ-ザン・ブロット法を行った。この結果、全例でレオ3型ウイルスのRNAが検出された。以上から我々の検索した胆道閉鎖症の患児がレオ3型ウイルスに感染していたことは確実であると考えられた。本研究の第2の目的は、レオ3型ウイルスを幼弱な実験動物に接種することにより、ヒトの胆道閉寒症と同一の病態を作成できるか否かを明らかにすることであった。このことはまた、レオ3型ウイルスが胆管を閉寒させる病態生理を明らかにするものと考えられる。平成元年の12月からこの動物実験に取り掛かっているが、現在まだ予備実験を行っている段階で結果は得られていない。平成2年度においては、第1の目的についてレオ3型ウイルスの抗原陽性部位がライソゾ-ムであることを酸性フォスファタ-ゼ染色で確認すること、第2の目的については動物実験モデルを完成して胆管閉寒の機序を明らかにすることで、研究を完成させたいと考えている。免疫組織化学として蛍光抗体法および酵素抗体法を行い、抗原陽性部位は門脈周囲の肝細胞および増生胆管上皮細胞の細胞質に著明に認められた。

これに対して肝疾患コントロ-ル8例のうち6例と非肝疾患コントロ-ル3例ではこの抗原は陰性であった。免疫電顕では光顕レベルでのレオ3型ウィルス抗原がライソゾ-ム様の空胞に局在することがわかった一方、本症患児の肝組織から核酵を抽出し、精製したレオ3型ウイルス全体をプロ-ブとしてノザン・ブロット法を行った。この結果、患児の肝組織にはレオ3型ウイルスRNA分節のうち、M_1分節が共通して認められた。さらにM_1分節に対するプロ-ブを生成し、肝組織から抽出したRNAをDNAに変換した上でPCR法を行った。この結果、本症患児3例全例でM_1分節が同定され、そのシ-クエンスは既知のそれと一致した。以上から胆道閉鎖症患児の肝組織では肝細胞または増生胆管細胞のライソゾ-ム様空胞に、レオ3型ウイルスRNAのうち少なくともM_1分節が存在して複製していることが示唆された。このことから本症患児は、離乳直後のマウスに胆管閉塞を来すレオ3型ウイルスに感染したものと考えられた。本研究の第二の目的は本症モデルの作成であったが、離乳後マウスにレオ3型ウイルスを接種して肝組織内にウイルス抗原を見いだしたが、胆管閉塞のメカニズムまで解明するところには至らなかった。
高度技術社会における学校教育での「数」概念の変容に関する研究

文献研究を中心に,「数」概念の発達を調べた.特に,子供の「数」概念の発達段階を,暗算と筆算,そして,見積りとの関連で,概算・概測についての役割を明らかにするとともに,子供の認知メカニズムを解明した.実態調査では,子供の誤答を中心に,暗算・筆算と見積りとの関連で行い整数,小数,分数に関する四則計算を行った.これから,暗算・筆算と見積りとの関連を数の系統性を,見直す必要があることがわかった.今回の研究では,カリキュラムの提言まで行うことができなかった.この点については今後の課題の一つとして残す.なお,代表者が, 62年6月8日から10月8日迄,「フルブライト」のフェローシップを得て,北アメリカとカナダで,上記の研究課題と関連した内容について研究と調査を行った.特に,コンピュータや電卓の利用状況について,現職の先生と子供との授業場面での活用は,今後の我が国の数学教育に役立つものがあると思われる.この点については,現在,我が国で行われている「教育改革」の情報化社会の進む中での教育のあり方と国際社会が進む中での数学教育の在り方について,多くの示唆を得た.たとえば,「数」概念の利用は,子供が用いる道具,つまり,コンピュータや電卓によって,飛躍的に増大すること,さらに,データーを見直すことによって,数の多様な見方を発見することができるなどである.今後の話題として,見積りを中心にした「数の計算」のカリキュラムについての研究が残されていると同時に,中・高学年の生徒について,計算力はある程度身についているが,数を用いた多様な見方,つまり,思考力については,必ずしも望ましい成果は得られなかった.この点については,更に研究する必要があろう.文献研究を中心に,「数」概念の発達を調べた.特に,子供の「数」概念の発達段階を,暗算と筆算,そして,見積りとの関連で,概算・概測についての役割を明らかにするとともに,子供の認知メカニズムを解明した.実態調査では,子供の誤答を中心に,暗算・筆算と見積りとの関連で行い整数,小数,分数に関する四則計算を行った.これから,暗算・筆算と見積りとの関連を数の系統性を,見直す必要があることがわかった.今回の研究では,カリキュラムの提言まで行うことができなかった.この点については今後の課題の一つとして残す.なお,代表者が, 62年6月8日から10月8日迄,「フルブライト」のフェローシップを得て,北アメリカとカナダで,上記の研究課題と関連した内容について研究と調査を行った.特に,コンピュータや電卓の利用状況について,現職の先生と子供との授業場面での活用は,今後の我が国の数学教育に役立つものがあると思われる.この点については,現在,我が国で行われている「教育改革」の情報化社会の進む中での教育のあり方と国際社会が進む中での数学教育の在り方について,多くの示唆を得た.たとえば,「数」概念の利用は,子供が用いる道具,つまり,コンピュータや電卓によって,飛躍的に増大すること,さらに,データーを見直すことによって,数の多様な見方を発見することができるなどである.今後の話題として,見積りを中心にした「数の計算」のカリキュラムについての研究が残されていると同時に,中・高学年の生徒について,計算力はある程度身についているが,数を用いた多様な見方,つまり,思考力については,必ずしも望ましい成果は得られなかった.この点については,更に研究する必要があろう.1.文献研究を中心にした知見上記の文献から「数」概念を誤答からの分析と同時に、筆算と暗算から、これから重要と思われる概算、概測、そして見積りへの「数」概念の役割を明らかにした。一方、研究方法として、認知的メカニズムを明らかにするための手続きをシーケンシャルとフレーム型で行うことがわかった。2.実態調査上記の文献研究で得た認知的メカニズムを用いて、小学生の1年から6年まで、整数、小数、分数の加減乗除の四則計算について調査研究を行った。そこでは、暗算と筆算を中心とするアルゴリズム思考の系統性と数範囲についての知見を得た。このことは、今後、電卓、コンピュータの導入においての教育上の留意点が明らかにされた。また、概数、概算から見積りへの指導の系統性についての知見も得た。3.今後の課題電卓、コンピュータの使用による数概念の形成過程を解明し、効果的な指導法を究明する。
細菌のリグナン変換反応を利用したリグニン芳香核組成の単純化

ドラフトゲノム配列が公表された嫌気性ヒト腸内細菌のBlautia producta ATCC27340株により、リグナンの一種であるセコイソラリシレジノールおよびマタイレジノールの芳香核メトキシ基が脱メチル化されることを示した。また、同菌による脱メチル化は、マタイレジノールよりセコイソラリシレジノールの方が早く進行すること、マタイレジノールではB環芳香核メトキシ基の脱メチル化が優先的に生じることを示した。ゲノム配列解析の結果、同菌はテトラヒドロ葉酸依存性の芳香核メトキシ基の脱メチル化反応に必要な4種類のタンパク質をコードするクラスターを1個有することが見出され、これらの相補的DNAを取得した。まず、植物系食品原料(アマ)中に高濃度で含まれるリグナンを入手した。さらに、リグニンをウメ内果皮より大量に調製した。次いで、これらのリグナン及びリグニンをラットに給餌し、ラット排泄物を経時的に採取しメタゲノム解析に供した。一方、腸内細菌メタゲノムデータベースを用い、リグナン変換反応を触媒する候補酵素遺伝子の絞込みを行うとともに、脱メチル化を行う微生物を入手した。以上に基づき、リグナン変換反応を触媒する酵素遺伝子の絞込みを継続中である。リグニンの有効利用法の確立は、再生可能資源の内で最も多量に蓄積している木質(リグノセルロース)の利活用において至要の課題である。リグニンの有効利用法の確立においては、リグニンの構造の複雑性の低減がかぎとなる。そこで、本研究では、従来未開拓の反応系を適用して、リグニン芳香核の置換基の改変除去による構造単純化を図ることを最終目的としている。本年度は、ウメ果皮から大量に調整したリグニンをラットに給餌し、腸内細菌の変動を次世代シークエンサーを用いてメタゲノム解析した。また、脱メチル化酵素(Sphingomonas pautimobilus SYK-6由来)を大腸菌にて発現させ、粗酵素液を得た。この粗酵素液に各種リグナン類(secoisolariciresinol、matairesinol、pinoresinol、medioresinol)を基質として窒素雰囲気下で反応させ、生成物質をGC-MSにて分析したが、対応する脱メチル化リグナンと思われるピークは検出されなかった。そこで、嫌気性菌の脱メチル化酵素について網羅的に文献検索し、候補遺伝子および産生菌に絞込みを行った。平行して、脱メチル化反応において生成する標準物質を有機合成した。これまで、2つのメチル基が脱離したdemethylsecoisorariciresinolおよびdemethylmatairesinolを合成した。また、matairesinolに存在する2つのメチル基のうち、片方のメチル基が脱離した2種類の異性体の合成を進めた。概ね計画通り進行しているため。哺乳動物リグナンは、摂取した植物系食物中のリグナンから哺乳動物の腸内細菌の作用により生成し、乳がんリスクの減少につながることが知られている。食物中のリグナンからの生成過程において、デメチル化および脱水酸化を経る。しかし、その生成の分子機構はほとんど未解明である。哺乳動物リグナンの分子機構の解明により、哺乳動物リグナンの生物学的生産だけでなく、リグナン様部分構造を持つリグニンのデメチル化、および脱水酸化への応用が考えられ、リグニンバイオリファイナリーの進展に貢献することが期待される。本年度は、リグナンから哺乳動物リグナンへの変換経路において、デメチル化を行うと報告されているBloatia productaのうち、ドラフトゲノム配列が公表されているATCC27340株を入手し、培養系を構築した。次に、この菌株にセコイソラリシレジノールやマタイレジノールを投与し、経時的に生成物をGC-MS分析に供することにより、中間体であるデメチルセコイソラリシレジノールおよびデメチルマタイレジノールを経て、最終産物であるジデメチルセコイソラリシレジノールおよびジデメチルマタイレジノールが生成することを見出した。さらに、セコイソラリシレジノールに関しては、投与後2時間で盛んにデメチル化が起こっていることが見出された。そこで、セコイソラリシレジノール投与後の2時間経過したB.producta菌体を回収し、得られた粗酵素を用いて既報の芳香核O-デメチラーゼの反応条件に従ってセコイソラリシレジノールのデメチル化酵素反応を行ったが、活性が見出されなかった。現在、昨年度のインフォマティクス解析により見いだされたデメチル化酵素遺伝子クラスターにコードされているデメチル化にかかわる4種類のタンパク質のcDNAを取得し、発現させた組換え酵素を活性試験に供することを進めている。当初の予定にないリグニンの変換についても検討を進めると共に、次年度計画を前倒してすすめているため。前年度に引き続き、ラット腸内におけるリグナン及びリグニンの変換反応を網羅解析する。さらに、昨年度のデータベース解析で脱

メチル化酵素遺伝子群のクラスターの存在が見出されたBlautia productaにつき、理化学研究所バイオリソースセンターから菌株を入手し、嫌気培養を行う。B. producta菌液にsecoisolariciresinolおよびmatairesinolを投与し、脱メチル化リグナンを同定する。ついで、B. producta菌液より粗酵素を嫌気性条件で抽出し、secoisolariciresinolおよびmatairesinolを基質として脱メチル化反応を行い、生成物をGC-MS分析する。大腸菌にB. productaクラスター由来の遺伝子を発現させ、secoisolariciresinolおよびmatairesinolを基質とした脱メチル化反応活性を確認する。さらに、本酵素について、種々のリグニン関連メトキシ化芳香族化合物に対する脱メチル化活性を検証する。以上に基づき、リグニン由来低分子芳香族化合物の芳香核組成単純化の基盤構築を進める。植物代謝機能化学前年度に引き続き、ラット腸内に於けるリグナン及びリグニンの変換反応を網羅解析により追跡し、脱メチル化及び脱水酸化酵素遺伝子を絞り込む。平行して、メタゲノムデータベースの解析に基づき、脱メチル化及び脱水酸化酵素候補遺伝子を絞り込む。次いで、得られた候補遺伝子に就き組換え酵素を作成し、リグナン変換反応(脱メチル化及び脱水酸化)活性を確認する。以上に基づき、リグニン由来低分子芳香族化合物の芳香核組成の単純化を進める基盤を構築する。年度末の出張において、先方負担が発生したことによる。研究打ち合わせ旅費として執行する。
不斉分子認識可能なカリックスアレーン誘導体の合成と機能評価

剛直で環の反転を起こさない大環状ファンの4つの水酸基に位置選択的にメチル基、エチル基やイソプロピル等の置換基を導入し不斉分子へ誘導する方法として異なる二つの方法論を見いだした。1)対応するハライドを用いる一段階合成法は置換基の小さい場合は主生成部として四置換体だけを生成するがメチル、エチル、プロピル基と大きくなるとラセミ体の二置換体が主として生成する。さらに、加える炭酸塩を代えることで選択性を向上できることも明らかとなった。2)四置換体から不斉分子を合成する方法は、種々ルイス酸を検討したところ温和な四臭化チタンを用いる条件が最も効率的であった。メチル、エチル四置換体ではまずラセミ三置換体が優先的に生成し、さらに反応すると三置換体の減少につれてラセミ二置換体が生成してくることがわかった。このようにして得られたラセミ体の三さいし二置換体は液体クロマトグラフィーでそれぞれのエナンチオマーに95%以上の光学純度で分割できた。分割した分子の残りの水酸基に捕捉部位となりうる官能基を導入する条件を検討した。酢酸エチル残基や鎖長の異なるポリエーテル鎖を炭酸カルシウムを用いることで目的物である不斉分子レセプターを収率よく合成できた。得られた化合物と有機物との相互作用を評価するためアンモニウム塩の抽出を検討した結果、反対のキラリテイーを持つ1-フェネチルアミンを効率良く抽出し、不斉認識することがわかった。また、アルカリ金属も良く抽出し選択性はエーテル鎖の大きさに依存することがわかった。以上述べたように今年度計画した課題は達成された。
教職大学における学修の成果としての報告書にみる教科教育学研究の現状と課題

本研究の目的は教職大学院における「学修の成果としての報告書」を教科教育学の視点から分析し,その実態と課題を明らかにする。黎明期設置の13の教職大学院の報告書,2013年度から3年分の1341件分を分析した。比較対照としてフィンランドの2つ大学の修士論文194件も分析した。分析方法には教科教育学の構想案(佐藤裕)とテキストマイニング法である。分析の結果,これら報告書においては「授業」を中核とし,「教授ー学習」に関わる研究が行われていることが量的にも構造的にも認められた。また,これらの教職大学院は,「授業」,「教科」,「子供」,「学習」などのキーワードの結び付きにより特徴づけることができた。平成27年度は27年10月1日時点で、設置されている教職大学院27校の教職大学院の履修の手引き、およびシラバスを収集した。また同大学院のもとで作成された学修の成果としての報告書の抄録をできる限り収集した。収集した報告書はそれぞれの大学院について過去3年分を収集した。収集できた大学院は北海道教育大学、上越教育大学、東京学芸大学、山梨大学、そして、兵庫教育大学の授業実践開発コースと小学校教員養成特別コースである。学修の成果としての報告書は学位論文扱いの大学が多く、貸し出し不可となっているケースが多い。抄録についても作成されていない大学院もある。2年目に向けて計画の見直しが必要となった。それでも収集できた大学院の報告書は膨大な量があり、現在、分析しているところである。教職大学院協会の平成27年度研究大会において、参加大学の10校の教職大学院関係者から報告書の実情についてインタビュー調査を行った。報告書の分析の視点は、当初の計画通り、蛯谷米司(1976)や佐藤裕(1989)の教科教育学研究の視点を援用して、分類・類型化した。さらに、最近注目されているテキストマイニングの手法も導入し、現時点で収集できている報告書における全体像、各大学ごとのキーワードの構造を抽出した。後者については収集した各大学のカリキュラムやシラバスと照合してその関連を分析した。現時点でのキーワード構造については、各大学に共通する構造を抽出することができたが、教科内容学的側面については、それぞれの報告書に固有性が高く、共通構造を抽出するまでには至っていない。平成27年度計画では各教職大学院の資料を収集することにあった。履修の手引きやシラバスについて全ての大学から現物を取り寄せることができた。それによって、各教職大学院の教育課程を同定することができた。インタビュー調査によって、半数近くの大学院の報告書の実情についても情報を収集することができた。これらの事項については、計画どおりに研究を進めることができた。報告書の分析については、予想はされていたものの報告書の原本が貸出禁止になっていること、抄録が作られていない大学院があること等で当初の予定ほど報告書を収集することができなかった。2年目に1年目の予定も含めて現地に赴いて情報収集する必要がある。集められた報告書についてはかなりの部分が計画どおり分析するすることができている。分析手法はほぼ確立しているので、十分に研究を推進することは可能である。平成28年度は、前年度収集した北海道教育大学、上越教育大学、東京学芸大学、山梨大学、兵庫教育大学に加え、宮城教育大学、群馬教育大学、山梨大学、山形大学、福井大学、早稲田大学、鳴門教育大学、宮崎教育大学の計13校の教職大学院の報告書を収集することができた。また、フィンランドのヘルシンキ大学、ユバスキュラ大学については現地訪問を行い、教育学研究科の修士論文を収集するとともに、院生、修了生、受け入れ先の小学校、中学校の校長からもインタビュー調査を行った。前年度と平成28年度の一部の教職大学院の報告書(7大学院785編の報告書)については日本教科教育学会(10月開催)において分析した結果を報告した。分析手法については、佐藤裕(1989)の「教科教育学の構想」をもとにしたカテゴリー分類とテキストマイニング法による構造分析を行った。それらの結果から、教科を形成する認識様式にかかわらず「教授-学習論に関する報告書」が多いことが明らかとなった。さらに、「教科」を対象としない報告書については「社会要請」や「個別要請」のものが多くなっていた。また,どちらにおいても「最先端科学分野・総合人間科学」に該当する報告書はほとんど見当たらなかった。テキストマイニングの分析からは、4割近い報告書が「授業」や「教科」をキーワードとすることが認められた。また、それらの報告書は「学習」「指導」「実践」「活動」などのキーワードと結びつき、それぞれの教職大学院で特徴的な構造をしていることが明らかとなった。27年度に収集した教職大学院の学修の成果としての報告書に加えて、現地調査により8つの教職大学院の報告書を収集することができた。また、年度末になってしまったがフィンランドで現地調査を行い、膨大な修士論文の資料を入手することができた。加えて、主に初年度に収集した報告書については計画通りにカテゴリー分析とテキストマイニングによる構造分析を行い、学会報告を行うことができた。ただ、フィンランドの修士論文については収集の段階でとどまっており、分析するところまでは至っていない。平成29年度は、前年度までに収集した北海道教育大学、上越教育大学、東京学芸大学、山梨大学、兵庫教育大学、宮城教育大学、群馬教育大学、山梨大学、山形大学、福井大学、早稲田大学、鳴門教育大学、宮崎教育大学に加えて、岩手大学、金沢大学、横浜国立大学の計16校の教職大学院の報告書を収集することができた。

また、フィンランドのヘルシンキ大学、ユバスキュラ大学の教育学研究科の修士論文についてデータベースを作成した。これまでに収集した報告書(16大学院1394編)とヘルシンキ大学の修士論文158編について,佐藤裕(1989)の「教科教育学の構想」をもとにしたカテゴリー分類とテキストマイニング法による構造分析を行った。それらの結果から、教科を形成する認識様式にかかわらず「教授-学習論に関する報告書」が多いことが明らかとなった。さらに、「教科」を対象としない報告書については「社会要請」や「個別要請」のものが多くなっていた。また,どちらにおいても「最先端科学分野・総合人間科学」に該当する報告書はほとんど見当たらなかった。テキストマイニングの分析からは、4割近い報告書が「授業」や「教科」をキーワードとすることが認められた。この結果は前年度までの分析結果とほぼ同様な結果となった。また、それらの報告書は「学習」「指導」「実践」「活動」などのキーワードと結びつき、それぞれの教職大学院で特徴的な構造をしていることが明らかとなった。フィンランドの修士論文については現在も分析を継続している。本研究の目的は教職大学院における「学修の成果としての報告書」を教科教育学の視点から分析し,その実態と課題を明らかにする。黎明期設置の13の教職大学院の報告書,2013年度から3年分の1341件分を分析した。比較対照としてフィンランドの2つ大学の修士論文194件も分析した。分析方法には教科教育学の構想案(佐藤裕)とテキストマイニング法である。分析の結果,これら報告書においては「授業」を中核とし,「教授ー学習」に関わる研究が行われていることが量的にも構造的にも認められた。また,これらの教職大学院は,「授業」,「教科」,「子供」,「学習」などのキーワードの結び付きにより特徴づけることができた。2年目の平成28年度は1年目に収集できなかった大学院の報告書を積み上げしていくことになる。さらにフィンランドの修士論文とそれらに関わるカリキュラムについて情報を集め、分析する。フィンランドの教員養成は修士課程修了をもって完結する。初等教員についても修士論文の執筆が課されている。研究協力が得られるヘルシンキ大学、ユバスキュラ大学の修士論文を分析して、1年目に分析した日本の報告書と比較分析をする。なお、10月に開催される日本教科教育学会(於鳴門教育大学)で研究の進捗状況を報告する予定である。27,28年度に収集することができなかった教職大学院の報告書についても、さらに収集を行っていく。これらを加えた形で最終的な報告書の分析を行っていく予定である。さらに28年度に収集したフィンランドの修士論文の分析を行い、日本のものと比較することで、日本の教職大学院の特徴を明らかにしていく予定である。教科教育学平成27年度に計画していた東北地方、四国地方、九州地方の教職大学院の学修の成果としての報告書について、現地調査ができなかった。
転写因子遺伝子を用いた胚幹細胞のインスリン産生細胞への分化誘導

本研究では、膵ベータ細胞への効率的な分化誘導を目的として、ベータ細胞の分化に重要と考えられる転写因子pdx-1の発現を制御できるシステムを導入したES細胞を用いて、in vitroで分化誘導した状態での細胞における遺伝子発現プロファイルを検討した。まず、テトラサイクリン制御下にpdx-1遺伝子の発現制御可能なES細胞を作製した。このpdx-1発現細胞を胚様体形成などで分化誘導した場合、インスリン産生細胞への分化が誘導されるかどうかを、RT-PCR、免疫染色などで検討した。その結果、インスリン産生細胞の分化誘導が可能であることが示された。しかし、この細胞は継代を重ねるとインスリン産生は減少した。そこで、ベータ細胞の分化に重要と考えられる種々の転写因子を発現するアデノウイルスベクターを作製し、この細胞に導入、同様な解析を行った。その結果、neuroD遺伝子を導入した細胞について、インスリン2遺伝子の発現上昇のみならず、インスリン1遺伝子が発現してくることが示された。また、グルカゴン、ソマトスタチンなど膵内分泌細胞遺伝子の発現を認めた。さらに、分化誘導の効率を上げる目的で、内胚葉系の細胞で発現するsox17遺伝子をテトラサイクリンで発現制御可能な細胞を作製し、同様な検討を行った。その結果、sox17の発現を誘導した細胞を分化させた状態で、pdx-1、mafAを導入すると、インスリン2遺伝子が発現することが確認された。以上、これらのベータ細胞の発生分化に重要と考えられる遺伝子の発現を誘導可能な細胞を用いることにより、関連すると考えられる転写因子、増殖因子の遺伝子を発現させ、in vitroにおけるベータ細胞への分化誘導のさらなる効率化に寄与する知見が得られるものと考えられる。本研究では、ベータ細胞への分化に関係すると考えられる転写因子を誘導発現が可能な形でES細胞に遺伝子導入し、EB形成過程、あるいは形成後にそれを誘導発現させ、ベータ細胞への効率的な分化誘導を試みている。導入する転写因子遺伝子は、膵ベータ細胞分化に重要であるとされているisl-1、pdx-1、neurogenin3などである。(1)テトラサイクリン(Tc)制御下における検討。Tc制御下にpdx-1遺伝子の発現制御可能なES細胞を開発した。この細胞を分化誘導させると、pdx-1遺伝子の発現により、インスリン産生細胞が効率的に分化してくるかどうかを、RT-PCR、免疫染色などで検討した。(2)アデノウイルスベクターを用いた検討。アデノウイルスベクターはさまざま細胞にも効率的に感染するので、一過性の遺伝子発現の効果を研究するために効果的である。我々が最近開発したアデノウイルスベクター作製法を用いて、転写因子遺伝子(isl-1、pdx-1、neurogenin3、HNF3、HNF6、Pax4、mafA)を組み込んだアデノウイルスベクターを作製した。(3)インスリン分泌細胞への分化の評価。上記で得られた分化細胞からRNAを抽出し、RT-PCRにより解析した。最終分化の指標となるインスリン遺伝子発現を用いて、分化誘導の条件を検討した。その結果、pdx-1遺伝子の誘導発現により、効果的にインスリン産生細胞が分化することが示された。膵臓関連遺伝子、グルカゴン、ソマトスタチン遺伝子などの発現も認められ、インスリンなどでは免疫染色でも発現が確認された。膵ベータ細胞への効率的な分化誘導を目的として、ベータ細胞への分化に関与すると考えられる転写因子の発現を誘導できるシステムを導入したES細胞において、胚様体形成過程、あるいは形成後に対象遺伝子を発現させ、その影響を検討している。導入する転写因子遺伝子は、isl-1、pdx-1、neurogenin3などベータ細胞分化に重要とされる因子を検討した。この細胞を分化誘導した場合、pdx-

1遺伝子の発現によりインスリン産生細胞が効率的に分化してくるかどうかを、RT-PCR、免疫染色などで検討した。さらにグルカゴン、ソマトスタチンなど膵臓関連遺伝子についても同様の検討を行い、分化してくる細胞の解析を行った。次にアデノウイルスベクターを用いて導入した遺伝子の影響を検討した。種々の転写因子(isl-1、pdx-1、neurogenin3、HNF3、HNF6、Pax4、mafAなど)の遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、細胞に導入した。これらの方法により得られた細胞について、RT-PCR、免疫染色により、インスリンを始め膵臓関連遺伝子の発現を検討した。その結果、pdx-1遺伝子の発現誘導により、効果的にインスリン産生細胞が分化することをが示された。また、グルカゴン、ソマトスタチン遺伝子などの発現も認められた。さらに、neuroD遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを導入した細胞について、RT-PCR解析を行った結果、インスリン2遺伝子の発現上昇のみならず、インスリン1遺伝子が発現してくることが示された。現在、さらにそれぞれの遺伝子について、詳細な解析を進めている。本研究では、膵ベータ細胞への効率的な分化誘導を目的として、ベータ細胞の分化に重要と考えられる転写因子pdx-1の発現を制御できるシステムを導入したES細胞を用いて、in vitroで分化誘導した状態での細胞における発現遺伝子の影響を検討した。まず、テトラサイクリン制御下にpdx-1遺伝子の発現制御可能なES細胞を作製した。このpdx-1発現細胞を胚様体形成などの分化誘導した場合、インスリン産生細胞への分化が誘導されるかどうかを、RT-PCR、免疫染色などで検討した。その結果、インスリンを発現する細胞を認め、分化誘導が可能であることが示された。しかし、継代を重ねるとインスリン産生は減少した。そこで、ベータ細胞の分化に重要と考えられる種々の転写因子を発現するアデノウイルスベクターを作製し、この細胞に導入、同様な解析を行った。その結果、neuroD遺伝子を導入した細胞について、インスリン2遺伝子の発現上昇のみならず、インスリン1遺伝子が発現してくることが示された。また、グルカゴン、ソマトスタチンなど膵臓関連遺伝子の発現を認めた。さらに、分化誘導の効率を上げる目的で、内胚葉系の細胞で発現するsox17遺伝子をテトラサイクリンで発現制御可能な細胞を作製し、同様な検討を行った。その結果、sox17の発現を誘導した細胞を分化させた状態で、pdx-1、mafAを導入すると、インスリン2遺伝子が発現することが確認された。以上、これらのベータ細胞の発生分化に重要と考えられる遺伝子の発現を誘導可能な細胞を用いることにより、関連すると考えられる転写因子、増殖因子の遺伝子を発現させ、in vitroにおけるベータ細胞への分化誘導のさらなる効率化に寄与する知見が得られるものと考えられる。