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難治性てんかん患者における中枢型睡眠時無呼吸と原因不明の突然死(SUDEP)

てんかん患者の睡眠時に中枢型無呼吸は目立たなかったが,両側側頭葉てんかん患者の発作時に「中枢型無呼吸が左側頭部起始の発作では脳波変化に先行し,右起始では脳波変化に引き続く」という興味深い所見が得られた.また,側頭葉てんかん発作時にみられる心拍変化のパターンも,左右側頭部に由来する発作でそれぞれ異なることが明らかになった.発作時の中枢型無呼吸や心拍変化の出現に,発作起始の側方性が関与している可能性が示唆された.初年度は、我が国における「てんかん患者にみられる原因不明の突然死,SUDEP (Sudden Unexpected Death in Epilepsy)」の実態が不明であったため、まず自験例の調査を行った。SUDEPの危険因子を後方視的に検討したところ、基本的には従来の欧米における報告と変わらなかったが、抗てんかん薬の多剤併用や発作コントロール不良といった従来危険因子と考えられてきた因子が必ずしも危険因子とはならない可能性が示唆された。SUDEPの原因・病態を解明する上で興味深い結果であり、2011年のアメリカてんかん学会で報告した。研究計画時にSUDEPの危険因子として注目していた中枢型睡眠時無呼吸に関しては、てんかん患者の発作間欠時(発作でない時)に観察されることが多い訳ではないと判明した。一方、発作時の中枢型無呼吸に関しては興味深い知見が得られた。すなわち、家族性両側側頭葉てんかん患者において、ビデオ脳波モニタリングと終夜睡眠ポリグラフの同時記録中に発作時の中枢型無呼吸を記録することに成功した。左右側頭葉に由来する発作を両方捉えることができ、左右で脳波上の発作起始と中枢型無呼吸の起始の時間的関係が異なる(左側頭葉起始の発作では無呼吸の出現が脳波上の発作起始に先行する)という興味深い結果が得られた。SUDEPの病態を考える上で重要な中枢型無呼吸の出現に、左右側頭葉の関わりが異なる可能性を示唆しており、2012年3月の日本神経学会東北地方会、2012年の日本てんかん学会で報告した。さらに、本研究を通じて、心臓自律神経機能に関する重要な知見も蓄積された。とりわけ、側頭葉てんかんの発作時にみられる頻拍の出現や心拍変動パターンが、左右側頭葉に由来する発作でそれぞれ異なるということが明らかにされたため、結果を本年6月の国際てんかん学会で発表する予定である。てんかん患者の睡眠時に中枢型無呼吸は目立たなかったが,両側側頭葉てんかん患者の発作時に「中枢型無呼吸が左側頭部起始の発作では脳波変化に先行し,右起始では脳波変化に引き続く」という興味深い所見が得られた.また,側頭葉てんかん発作時にみられる心拍変化のパターンも,左右側頭部に由来する発作でそれぞれ異なることが明らかになった.発作時の中枢型無呼吸や心拍変化の出現に,発作起始の側方性が関与している可能性が示唆された.本研究を開始するに当たり、我が国における「てんかん患者にみられることが知られている原因不明の突然死,SUDEP (Sudden Unexpected Death in Epilepsy)」の実態が不明であったので、まずは自験例の調査を行った。SUDEPの危険因子を後方視的に検討したところ、基本的には従来の欧米における報告と変わらなかったが、多剤併用や発作コントロール不良といった従来危険因子と考えられてきた因子が必ずしも危険因子とはならない可能性が示唆された。SUDEPの原因・病態の解明を追及する上で興味深い結果であり、昨年のアメリカてんかん学会で報告した。てんかんモニタリングユニットにおけるビデオ脳波モニタリングを行う検査体制はすでに確立され、毎週4名のモニタリング検査を行うことが可能となった。加えてこのうちの1例で終夜睡眠ポリグラフの同時記録を行っている。データ収集は順調に進んでおり、この中で同時記録中にてんかん発作を起こした興味深い症例も経験し日本神経学会東北地方会で報告した。この症例は発作時に中枢型無呼吸を呈した家族性両側側頭葉てんかんで、同時記録中に左右側頭葉に由来する発作を両方捉えることに成功し、左右で脳波上の発作起始と中枢型無呼吸の起始の時間的関係が異なるという興味深い所見を示した。SUDEPの病態を考える上で重要と考えている中枢型無呼吸の出現に、左右側頭葉で重要度が異なる可能性を示唆していた。心拍変動の周波数解析に関しても、発作間欠時のみならず発作時記録を順調に蓄積しており、発作時に特異的な心拍変動パターンを明らかにできる可能性がある。結果は現在集計中で本年12月のアメリカてんかん学会での発表を予定している。検査体制の確立、データ収集がほぼ計画通り、順調に進んでいるので。2011年3月11日に発生した東日本大震災の影響で若干の遅れがあり、151,190円の次年度使用額が生じてしまった。しかし、概ね目標は達成しており、ほば計画通り順調に進展している。消耗品に関しては長時間ビデオ脳波モニタリングや終夜睡眠ポリグラフに用いる電極類・ペースト類・ディスポのセンサ類が初年度と同様に次年度にも必要となる.データの移送・保存のためにHDやUSBメモリーも必要である.これらに加え,年1回の国際学会,年数回の国内学会での発表を予定しており,研究代表者・研究協力者の2名分を計上している.
大空間における熱輸送と上下温度勾配形式の構造に関する数値シュミレーション

室内の自然対流に関する精密模型実験は東京大学生産技術研究所所有の恒温質にて行った。恒温室内に基礎的な形状の室内模型を設置しこの内部の自然対流を2次元2カラーレーザー流速計等により詳細に計測し、室内気流の平均値のみならず、2次相関量であるレイノルズストレス、乱流散逸量等の解析も行った。又、応力方程式モデル及び代数応力方程式モデルにより、浮力の影響下の室内気流を解析する手法の開発を行い、レイノルズ及び温度フラックスの輸送方程式中の各項のオーダーの検討を行った。
複合添加によるアルミニウムーリチウム合金の機械的性質の改善

当該科学研究費補助金の交付を受けて行った研究実績の概要は次のようにまとめられる。2.これらの析出物はいずれもL1_2型の規則構造をもつ準安定相Al_3Mであった。3.Al-Li合金に対する複合添加の場合、各元素は次のような効果をもつことが組織観察から明らかとなった。Zr、Ti、Hf:高温の第一段目時効において準安定Al_3Mとして析出する。この析出物は第二段目の低温時効によって析出するAl_3Liの核となる。Cr:高温時効の極く初期に粒界に不均一析出して粒界をピン止めする。その結果、粒界移動を伴う粒界反応析出が抑制され、球状微細析出領域を広くする。Si:Al_3M(MiZr、Ti、Hf)の粒内球状(連続)析出を促進し、最高到達硬さを著しく上昇させる。当該科学研究費補助金の交付を受けて本年度に行った研究の実績についての概要は以下のようである.1.母合金の溶製2.急冷凝固各母合金と純アルミニウムおよびシリコンをAl-2.5%Li, Al-2.5%Li-2%Hf-0.3%SiおよびAl-2.5%Li-0.6%Zr-0.3Si合金となるように配合し,それら約10gを赤外線加熱炉内のアルゴン雰囲気中で溶解し, 2.4mm間隙をもつ水冷銅鋳型へ急冷凝固した.この時の凝固速度は約3000K/Sと算出された.3.時効処理急冷凝固試料を小片に分割し,アルゴンガス封入したのち,まず773Kの高温で,ついて523Kの低温でそれぞれ種々の時間,時効した.その結果, Al-Li合金にZr, HrおよびSiを複合添加することで,著しい時効硬化が示されることがわかった.4.組織観察各時効試料を電子顕微鏡により組織観察した.その結果,低温時効で析出するAl_3Li相は,高温時効によって析出した準安定のL1_2型規則構造をもつAl_3Zr,またはAl_3Hf相の周りに成長することなどが明らかとなった.これらの複合析出挙動におよぼすCr添加の影響などが次年度で研究される予定である.当該科学研究費補助金の交付を受けて本年度に行った研究実績の概要は以下のようである。1.急冷凝固法による合金試料の作製昭和62年度に溶製したAl-Hf、Al-SiおよびAl-Li母合金に加え、Al-10%Cr母合金を溶製した。これらの母合金と純アルミニウムおよびシリコンをAl-2.5%LiおよびAl-2.5%Li-3%Cr-0.3%SiおよびAl-2.5%Li-3%Cr-2%Hf-0.3%Si合金となるように配合し、それら約10gを赤外線加熱炉内のアルゴン雰囲気中で溶解し、2.4mm間隙をもつ水冷銅鋳型へ急冷凝固した。この時の凝固速度は約3000K/Sと算出された。2.時効処理および時効した試料の機械的性質急冷凝固試料を小片に分割し、アルゴンガス封入したのち、まず773Kの高温で、ついで523Kの低温でそれぞれ種々の時間1時効した。その結果、Al-Li2元合金にHf、SiおよびCrを複合添加することで、著しい時効硬化性の改善のみられることがわかった。3.組識観察各時効試料を電子顕微鏡により組識観察した。その結果、Al-Ti-LiおよびAl-Zr-Li系合金と同様、Al-Hf-Li系合金においても複合析出が見出された。殊に、今回新たに添加したクロムは時効の極く初期に粒界析出して、粒界反応型析出を抑制し、その結果として粒内の微細球状の連続析出領域が増加することが、機械的性質の改善に大きく貢献すると結論された。
フルオロメチレンホスホン酸の特性に基づく機能性分子の設計と新たな創薬手法の開発

リン酸は生体内に普遍的に存在し、核酸の加リン酸分解やシグナルタンパク質のリン酸化など多くの生体機能に関与している。本研究課題では、ヌクレオシド加リン酸分解酵素およびリン脂質分解酵素を分子標的とした創薬研究をfragment-based drug design (FBDD)およびLigand-based drug design(LBDD)に基づいて展開させた。その結果、臨床で治療効果を発揮し得る高い阻害活性を有するPNP阻害剤の創製に成功した。また、当教室で見いだされたスフィンゴミエリナーゼ阻害剤SMA-7の構造展開を企図して、SMA-7関連化合物の第一世代改良合成法を確立した。本研究課題では、ヌクレオシド加リン酸分解酵素を分子標的とした創薬研究をfragment-based drug design(FBDD)に基づいて展開させた。すなわち、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)阻害剤の創製研究では、PNPと親和性を示す9-デアザグアニン誘導体とリン酸ミミック(CF_2PO_3H_2)をスペーサで連結したPNP二基質複合型アナログを設計・合成した。その結果、臨床で治療効果を発揮し得る高い阻害活性を有する阻害剤の創製に成功した。今後のPNP阻害剤創製において有用なリード化合物となることが期待される。また、スペーサ部に窒素原子を導入したPNP二基質複合体アナログの合成を行った。このアナログは、リン酸ミミックを組み入れたPNP遷移状態アナログと見なすことも出来、生体内の低いリン酸濃度においても高い阻害活性及び高い選択性を示すPNP阻害剤となると推定される。一方、チミジンホスホリラーゼ(TP)阻害剤の創製研究においては、TPと親和性を示すチミジン誘導体とリン酸ミミック(CF_2PO_3H_2)をクリック反応で連結し、新規TP二基質複合型アナログの創製を企図した。本年度は、リン酸ミミック(CF_2PO_3H_2)を有するアジド誘導体とエチニル基を有するピリミジン誘導体のHuisgen反応について詳細な検討を加えたところ、所望のクリック生成物が高収率で生成することを見出した。その他、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤SMA-7の構造展開を企図して、SMA-7関連化合物の新規合成法を確立した。このアナログは、リン酸ミミックを組み入れたPNP遷移状態アナログと見なすことも出来、生体内の低いリン酸濃度においても高い阻害活性及び高い選択性を示すPNP阻害剤となると期待される。さらに,ベンゼン環をスキャフォールドとする多官能性スペーサの開発にも着手した。リン酸ミミック(CF_2PO_3H_2)を有するアジド誘導体とエチニル基を有するピリミジン誘導体のHuisgen反応について詳細な検討を加えたところ、所望のクリック生成物が高収率で生成することを見出した。その他、スフィンゴミエリナーゼ(SMase)阻害剤SMA-7の構造展開を企図して、SMA-7関連化合物の改良合成法を確立した。また、SMA-7の臨床応用にに関する知見を総説としてまとめた。
セント・カテリーヌ修道院文書の歴史的研究

本年度の計画通りマイクロフィルムで収集したセント・カテリーヌ修道院文書の解読作業を継続した。とりわけ、法廷文書に重点を置いた。法廷文書とは、裁判官の立会いのもとに執り行われたさまざまの司法手続きを意味する。具体的には、さまざまな法的手続きの証明書、裁可、供述書、マフダル(調査記録)、遺言書などである。法廷文書のうち、とりわけ、マフダルに注目した。マフダルにはキッサという嘆願文が添付してある。キッサは、筆者のこれまでの研究では、直訴という形式をとり政治権力者に直接提出されていた。ところが、このマフダルに添付されているキッサは政治権力者ではなく裁判官に提出されている。したがって、これは直訴という形式はとらず、通常の訴願であることがわかる。マフダルは、調査記録である。すなわち、訴願が起こされたことにより、本件を担当する裁判官が任命される。裁判官はまずその事実関係を関連する文書などを手がかりに詳細な調査を実行する。その調査に基づき本件の裁決を行うのであるが、マフダルは、その調査から裁決に至るまでを記録したものである。本研究により、これまでほとんど研究されることのなかったマムルーク朝時代における訴願の実態の一端にふれることができた。以上の成果を、文部省新プロ方式研究「現代イスラーム世界の動態的研究」6班の第二回オスマン文書研究会発表し、論文「マムルーク朝時代の法廷文書-マフダルの事例から-」『中央大学文学部紀要』(史学科)第46号にまとめた。本年度の研究計画は、できるだけ多くの文書の解読作業に重点をおくことであった。この文書群の中から、主として「証書」と分類されたものの解読を行った。その結果、これらの証書類は、個人の財産の何らかの方法による処分に関するものが大半を占めていることが分かった。とりわけ注目したのは、死亡した人々の財産の処分、すなわち、遺産相続を記した文書である。そして、遺産相続が具体的にどのようなプロセスをへて行われたのかを大まかに明らかにした。財産の処分方法は、次のとおりである。(1)遺言書Wasayaによるもの:個人は任意に遺言書を作成することができたが、ムスリムの場合は財産の3分の1を超えないで、法定相続人以外に、個人や慈善のために相続をすることが可能であった。(2)財産証書によるもの:財産を残さなかった場合は、財産証書を作成して財産処分を行うことが可能であった。この証書作成の目的は、相続人が相続分を確実に受け取るためであり、また、相続人のいない財産の目録を作成することにあった。この財産は国庫Bayt al-Malに帰属した。したがって、この証書作成の際には、しばしば国庫や復帰財産庁Diwan-al-Mawarth al-Hashriyaの役人が立ち会っている。この証書の作成は、遺言書と違って任意のものではなかった。(3)両者の組み合わせによるもの。修道院文書のうち、252番、275番の文書からはマムルーク朝時代の遺産相続がこのようなプロセスをへて行われたことがわかった。本年度の計画通りマイクロフィルムで収集したセント・カトリーヌ修道院文書の解読作業を行なった。同文書のなかの法文書に重点を置いたが、とりわけ財産処分に関するものに着目した。マムルーク朝時代の財産処分方法については、三通りの選択が可能であった。すなわち、(1)遺言書によるもので、ムスリムの場合は法定相続人以外に財産の3分の1を超えないで、ある個人や慈善のために遺産を残すことを明示できた。(2)財産証書によるもの。ある個人が遺言を残さなかった場合、財産証書を作成して財産処分を行うことが可能であった。これは裁判官の認可のもとに公証人によって作成された。

この文書が作成される目的のひとつは、文書なかで特定された相続人が確実に相続分を受け取ることであり、もう一つの目的は、相続人のいない財産の目録を作成することであった。というのは、相続人によって相続されなかった残余部分は国庫に帰属したからである。マムルーク朝時代には復帰財産庁があり、この文書の作成の際には、国庫や復帰財産庁の役人が立ち会っている。(3)両者の組み合せによるもの。以上の処分方法を手掛かりにして、同修道院文書のなかから、252番、275番を取りあげ、分析を行った。その結果、マムルーク朝時代のエジプトやシリアでは、普通に日常生活を送る人々は、遺産相続の際には、遺言書や財産証書を作成し、一般的には遺産を売却して、負債の返済、埋葬の費用などにあて、残りを相続したことが分る。また、国家権力の介入から逃れるためワクフ化することも行われていた。以上を論文「マムルーク朝における遺産相続-セント・カテリーヌ修道院文書事例から-」にまとめた。本年度の計画通りマイクロフィルムで収集したセント・カテリーヌ修道院文書の解読作業を継続した。とりわけ、法廷文書に重点を置いた。法廷文書とは、裁判官の立会いのもとに執り行われたさまざまの司法手続きを意味する。具体的には、さまざまな法的手続きの証明書、裁可、供述書、マフダル(調査記録)、遺言書などである。法廷文書のうち、とりわけ、マフダルに注目した。マフダルにはキッサという嘆願文が添付してある。キッサは、筆者のこれまでの研究では、直訴という形式をとり政治権力者に直接提出されていた。ところが、このマフダルに添付されているキッサは政治権力者ではなく裁判官に提出されている。したがって、これは直訴という形式はとらず、通常の訴願であることがわかる。マフダルは、調査記録である。すなわち、訴願が起こされたことにより、本件を担当する裁判官が任命される。裁判官はまずその事実関係を関連する文書などを手がかりに詳細な調査を実行する。その調査に基づき本件の裁決を行うのであるが、マフダルは、その調査から裁決に至るまでを記録したものである。本研究により、これまでほとんど研究されることのなかったマムルーク朝時代の訴願の実態の一端にふれることができた。以上の成果を、文部省新プロ方式研究「現代イスラーム世界の動態的研究」6班の第二回オスマン文書研究会発表し、論文「マムルーク朝時代の法廷文書-マフダルの事例から-」『中央大学文学部紀要』(史学科)第46号にまとめた。
多次元メタボロミクス脳解剖

本研究では、質量分析を用いて動物モテルからヒトの脳におけるメタホロミクスを解明することを目的としている。平成20年度は、成獣マウスを用いて発達、老化、性別の違いにおける脳内、特に海馬をモテルとして解剖学的メタボロームの変化を測定することを計画し、二次元電気泳動からのピッカーを導入して立ち上げた。幸い、5月に若手Sに採択されたことから若手Aは発展的に解消し、一カ月の研究期間は滞りなく終了した。本研究では質量分析イメージフグを用いて動物モデルからヒトの脳にお可るメタボロミクスを解明することを目的としている。平成19年度は目標達成に向けて知見の蓄積に努め、以下の3点の業績を発表した。まず新規ルミネセンス顕微鏡法の開発により個々の細胞のルミネセンスを可視化することを可能とした(S.Asai、2008, Neuroscience Letters).2つ目として蛋白質翻訳後修飾のうち微小管へのグリシン付加を行う酵素がTTLL10であることを明らかにし、さらに免疫沈降法とタンテム質量分析の融合により、TTLL10の基質がNAP1であることを明らかにした(K.Ikegami.2008,FEBS Letters).3つめとしてユビキチンリガーゼであるSCRAPPERが活性帯にあるタンパク質RIM1に直接結合し、SCRAPPER依存的なユビキチンープロテアソーム系がRIM1を介したシナプス小胞の放出確率の調節に寄与していることを明らかにした。その成果はcell誌の表紙となった(I.Yao et. al., 2007, cell).さらにはSCRAPPERノックアウトマウスと正常マウスとの比較を質量分析イメージングを用いて行い、タンパク質の発現が橋/髄および視床下部において増加し、線条体および大脳皮質において減少する結果を得た。以上、我々が目標に掲げている発達、加齢、記憶学習や飢餓、飽食、睡眠といった様々な生理応答による多次元メタボロニムの変化め可視化を達成する上での基礎的な知見を蓄積できた。
プラズマローゲンによる脳神経細胞死抑制作用の分子機構

本研究はプラズマローゲン(Pls)の脳神経細胞死抑制作用について、細胞実験、機器分析、動物実験を用いて解明することを目的として実施した。細胞実験によりPlsの脳神経細胞アポトーシス抑制作用の証明を行うとともに、LC-MS/MSによるPls分子種の生体組織と食品中の分析法を検討し、最も抗アポトーシス効果の強いDHA含有Plsのスクリーニングを行った。また、アルツハイマーモデルラットを作成し、海産物由来Plsの投与試験を行い記憶学習能維持効果を確認した。本研究はプラズマローゲン(Pls)の脳神経細胞死抑制作用について、細胞実験、機器分析、動物実験を用いて解明することを目的として実施し、昨年度は細胞実験によりPlsの脳神経細胞アポトーシス抑制作用の証明を行うとともに、LC-MS/MSによるPls分子種の生体組織と食品中の分析法を検討した。本年度は、昨年度の研究で作成されたアルツハイマーモデルラットを用い、アミロイドβによって引き起こされるモデルラットの空間認知力の低下が有意に抑制されることの確認を行った。すなわち、ほやよりDHAを高含有含むPls(マリンPls)を抽出し、食品由来DHA含有Plsのラットへの経口投与実験を行い、アルツハイマーモデルラットでの空間認知力抑制に対するPlsの改善作用について調べたところ、Plsの経口投与がアルツハイマーモデルラットでの空間認知力を向上させることを明らかにした。さらに、アルツハイマーモデルラットの脳中のPls含量および脂肪酸組成を測定したところ、Plsの経口投与による脳中のPlsの上昇は見られなかったが、脳のDHA含量が増加した。また、正常ラットへのPls経口投与試験を行い、血漿と赤血球膜のDHA含有Pls濃度を非投与ラットと比較したところ、Plsの経口摂取により、血中のPls濃度が上昇したことを明らかにした。以上、本研究により、Plsが神経細胞の保護機能をもつことが証明され、アミロイドβ凝集阻害活性をもつのは多価不飽和脂肪酸を2位にもつプラズマローゲンであり、海産物、特にホヤにはDHA高含有プラズマローゲンが豊富に含まれていることを明らかにした。さらに、このホヤ由来プラズマローゲンをアルツハイマーモデルラットに経口投与し、空間認知力の向上を明らかにした。この結果より、プラズマローゲンの神経細胞保護機能が、生体でも期待できることが示唆された。1)Neuro-2A細胞のPlsによるアポトーシス抑制分子機構の解明マウスの脳由来神経芽細胞腫であるNeuro-2Aを低栄養状態や、酸素ストレス条件で培養し、再現性のよいアポトーシス誘発モデル系を検討し、無血清培地による低栄養条件がよいアポトーシスモデルであるとの結果を得た。2)4000QTRAP LC-MS/MSによるPls分子種の生体組織と食品の分析法開発ラット脳、赤血球、血清、そして食品中のPls分子種(18:0p/oleoyl(18:1) PE、18:0p/arachidonyl(20:4) PE、18:0p/docosahexaenoyl(22:6) PE)の測定条件を決定し、食品における分布を明らかにした。その結果、ホヤにDHA含有Plsが豊富に含まれていることを明らかにしたので、平成24年度はホヤからプラズマローゲンを抽出し、アルツハイマーモデル動物試験に供する予定である。3)Pls分子種によるアミロイドβ(Aβ)の凝集阻害および分解作用の相違の検証脳におけるアミロイドβ(Aβ)の蓄積は神経細胞死を誘発する(Nature,1987:325:733-736)。そこで各種のPls分子種によるAβ分解促進作用とAβ凝集抑制作用の効果をin vitro試験で検証し、Plsに凝集阻害作用があることを確認した。4)Aβ脳室注入アルツハイマーモデルラットへの活性型DHA-Pls給与による学習・記憶・行動への影響についての評価研究PaxinosとWatsonのブレインマップに従い、ラットの脳室にアミロイドβを浸透圧ポンプで連続的に注入し(J.Neurochem.,2008:107, 1634-1646)、アルツハイマーモデルラットの作成の予備検討を行った。本研究はプラズマローゲン(Pls)の脳神経細胞死抑制作用の分子機構について、細胞実験、機器分析、動物実験を用いて解明することを目的としている。平成23年度は細胞実験によるPlsのアポトーシス抑制作用の証明、LC-MS/MSによるPls分子種の生体組織と食品の分析法の開発およびDHA含有Plsのスクリーニング、in vitro試験によるPlsのアミロイドβの凝集阻害および分解の証明を行うとともに、アルツハイマーモデルラットの作成に着手した。このうち細胞実験によるPlsのアポトーシス抑制作用の証明では、無血清培地による低栄養条件による培養をアポトーシスモデルとして確立し、プラズマローゲンの添加試験を今後進めていく予定である。LC-MS/MSによるPls分子種の生体組織と食品の分析法の開発およびDHA含有Plsのスクリーニングでは、Pls分子種分析条件を行い、生体組織、細胞、食品の分析を行った。

その結果、ホヤにが高含量含まれていることを示し、アルツハイマーモデル動物試験への投与試験のための試料の調製を現在進めている。in vitro試験によるPlsのアミロイドβの凝集阻害および分解の証明ではPlsに凝集阻害作用があることを確認した。さらにアルツハイマーモデル作成の予備試験を行い、プラズマローゲンの投与試験の準備がととのいつつある。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。平成23年度の研究結果より、PlsのNeuro-2Aのアポトーシス抑制作用および、in vitro試験によるPlsのアミロイドβの凝集阻害および分解作用を明らかになり、本研究の目的であるPlsの脳神経細胞死の抑制分子機構が明らかになりつつある。一方、食品からのPL摂取が脳認知機能に与える影響を評価については、ホヤのPlsがDHAを高含量含んでおり、脳のPlsに近い構成脂肪酸をもつことが明らかになった。そこで、本年度は昨年度の研究で作成されたアルツハイマーモデルラットを用い、食品由来DHA含有Plsのラットへの経口投与実験を行いアルツハイマーモデルラットでの空間認知力抑制に対するPlsの改善作用について検証する。さらにラットへのPls経口投与試験を行い、血漿と赤血球膜のDHA含有Pls濃度を非投与ラットと比較し、経口摂取したPlsの体内動態を明らかにする。研究費の主な使途は物品費であり、ラット血漿および赤血球膜のによるPls分子種分析に使用するための、標準品、抽出溶媒、チップやバイアル等の消耗品、LC-MS/MSの保守管理に必要な物品、さらに動物試験に必要なラット、飼料、手術道具、麻酔等の消耗品の購入に用いる。また、研究成果発表のための旅費と論文投稿料を計画している。
化合物半導体の光物性の制御

IーIIIーVI_2族化合物半導体に添加された鉄イオンにもとづく赤外発光線の性質を明らかにするため、発光線の励起スペクトルおよび過渡応答特性の測定を行った。この結果CuAlS_2、CuGaS_2ともに配位子から鉄イオンへの電荷移動型吸収帯の立上り以上のエネルギーによって発光が励起されることが明らかになった。また緩和時間は0.61ms程度であることがわかった。さらにCuAlxGa_<1-x>S_2混晶中での発光スペクトルの測定を行い、それが鉄イオンの周囲の第2隣接位置での局所原子配列を反映していることが見いだされた。蛍光体としてのIIaーVIb結晶の機能を微視的に解明する目的で、CaS等の単結晶に付加着色処理を行い、Sイオン空孔によって生じた2電子中心(F中心)、1電子中心(F′中心)の電子状態を、吸収・発光スペクトル、ESRなどにより詳しく調べた。また半導体での固有の励起子束縛中心として知られる各種の等電子不純物(たとえばCaS中のSe)に関係した発光機能を篠森ー豊沢理論により詳しく解析した。新しい磁気光エレクトロニクス材料である半磁性半導体の単結晶、薄膜結晶の作製を行い、その磁気光学的機能性をピコ秒発光分光およびラマン分光により調べた。その結果、励起子磁気ポーラロンの生成・消滅に関する超高速過程を明らかにした。また、巨大ファラデー効果を利用した機能素子として、ファラデー素子を試作した。薄膜結晶はホットウォール法によりエピタキシャル成長膜を得て、その物性を調べた。CdS結晶における高密度電子・正孔系の非線形緩和に関してトラジェントグレーティング法による測定を行い、60K以下の低温で、縮退電子正孔系では電子正孔間の2分子再結合過程が、非縮退系ではキャリア励起子のモット遷移が主要な非線形緩和過程になることを明らかにした。また光照射下でZnSeのMBE成長を行い、光照射が表面分子のマイグレーションを促進回し、膜質改善に寄与することを示した。
カオス時空間解析法によるドングリ豊凶予測と生態系管理支援システムの構築

広葉樹堅果豊凶野時空間ダイナミクスのモデリングを現場レベルにおいて可能とするために、GISベースで駆動するモデル構築を行った。対象区域は航空リモートセンシングによって取得・抽出された樹冠オブジェクト4703個に対してCMLを構成した。モデル出力は、距離相関関数としてMoran'sIおよびPearsonの空間自己相関関数を用いた。また、同調性の検定は、個体間変動係数、年時間変動係数を用いた。これらの結果、従来の等間隔で設定したCMLとの相違を示すことができた。また、マルチエージェントモデルにおいて、広葉樹植生に時空間ダイナミクスを与えてGIS上に実装した。気象合図とRBMを融合モデルも開発した。マスティングの理論モデルの構築(理論モジュール)CML(coupled map lattice:結合写像格子)は偏微分方程式の対象となる時空間変動現象を、数値計算で記述するに適した手法を基盤として、より現実の豊凶現象に近づけるために、(1)花粉の拡散プロセスおよび昆虫による食害機能、(2)外部(気温等)のトリガー機能をCMLモデルに組み込んだモデルを構築した。空間分布の時系列をMatlabで計算し、その結果をエクセルにデータベース化し、これをGISへオーバーレイするシステムを構築した。分光画像空撮システムの試作(計測モジュール)小型ロボットヘリコプタによる分光画像航空撮影システム試作を23年度に集中的に行った。デジタルカメラを実装し、FM府中(農学部附属農場)において予備飛行実験上を実施し、機体のペイロード、航行安定性、撮影制御システムなどが所期の性能を確保できるか否かを確認した。また、野外での操作技術の向上のために研修を行った。カオス時空間解析のアルゴリズム開発(解析モジュール)理論モジュールと計測モジュールによって得られた空間パターンの時系列データを対象に、カオス時空間解析手法を検討した。2次元フーリエ変換などの周波数解析によって、相空間への埋め込みのためのタイムラグと空間ラグを算出する。埋め込み法によって、時空間ダイナミクスの再構成法について検討した。相関次元(およびマルチフラクタル次元)の算出した。推定された次元に基づいて、空間Lyapunovスペクトルを算出方法を検討した。コナラを想定して、農工大FM多摩丘陵(演習林)想定して、航空画像データをGISに取り込み、樹冠セグメンテーションを行った。特に、風による花粉飛散を想定した花粉結合を分布関数を用いて定式化した。これを5000個体程度の樹木を対象にしてCMLによる時空間ダイナミクスモデリングを行った。花粉の飛散に関する数値実験を行い、その評価をMoran'sIやCVなどを用いて行った。既存の実データによる解析結果と整合性のある結果が得られた。理論モジュールにおいて重要なより現実的などんぐりの生活史を反映するために、従来には顧慮されて来なかった虫害や未熟堅果を考慮したRSBモデルを構築した。これらによって、より現実のデータおよび実際の林分施業を念頭に置いたモデルとすることが可能となった。上記のダイナミクスモデルと並行して、ブナなミズナラを想定した回帰モデルを基盤として過去の堅果数だけではなく、気象合図を取り込んだモデルを構築した。これらによって、さらに精度の高いモデルを構築することができた。熊のGPS軌跡データをマルチエージェントのGIS上に組み込み、新たなエージェントとした。さらに、目視によるみずならの豊凶データを地形情報上に取り込み、これらを補間することによってマッピングを行った。なお、自律飛行ヘリコプターにて撮影されるRGB画像から、樹幹5m程度に接近することにより、コナラなどの堅果を個別認識可能であることも確認した。これらの各モジュールを統合して、生態系管理のプラットフォームを構築した。マスティングの理論モデルの構築(理論モジュール)RBMに関して、より現実の豊凶現象に近づけるために、1花粉の拡散プロセスおよび昆虫による食害機能、2外部(気温等)のトリガー機能をCMLモデルに組み込んだモデルを構築した。これらをCMLモデルとして空間分布をIDLによりGIS(ENVI)上にオーバーレイした。分光画像空撮システムの試作(計測モジュール)小型ロボットヘリコプタによるFM府中(農学部附属農場)において予備飛行実験(67月)を行い、機体のペイロード、航行安定性、撮影制御システムなどが所期の性能を確保できるか否かを確認した。時空間ダイナミクスの再構成に必要な、相関次元(およびマルチフラクタル次元)の算出する。推定された次元に基づいて、空間Lyapunovスペクトルを算出アルゴリズムを実装した。再構成された時空間ダイナミクスに決定論的非線形予測の際に、カラードノイズの識別法を考案した。予定していた機材(小型ロボットヘリコプター)については配備が完了し、年度当初に示した計画通り作業を実施する事ができため。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画した3つの個別改題に関してほぼ予定通り進捗した。

その成果についても1件の学術論文およぶ4件の学会発表として公表できた。具体的には、実績に示したようなRBMの改良を行うことができ、また、これらをGIS上に実装することもできた。特に、MASによるプラットフォームも試作でき、どんぐり及び野生動物行動データの実データの搭載が可能であることも確認できた。ロボットヘリによる撮影も良好に行えることが確認できた。以上より、計画が概ね達成できたと考えられる。GISとしては、Arcviewが有効であることが確認できたので、これを用いてモデリングを推進する。また、モデル結果の検証を行うためのFM多摩丘陵(農工大八王子演習林)等において、モデル検証のための実収量計測を実実施することが特に重要と考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画に沿って研究を推進する。特に、MASによって構築したプラットフォームに個別開発要素を搭載し、計画通りのシステム構築を達成する。これらの成果を国際学会、国内学会において発表するとともに、原著論文として投稿・公表する。
超高速実空間イメージング分光法による半導体ナノ構造の光励起ダイナミクスの研究

1.超高速実空間イメージング分光装置の開発半導体ナノ構造からの微小な光信号を長時間にわたって安定に測定するため,近紫外近赤外にかけての波長範囲において高空間分解能かつ安定な顕微分光測定を可能とする光学システムを構築した.倒立型顕微鏡に能動フィードバック制御付試料ステージを装備することにより,1μm程度の空間分解能をもち,かつ試料の位置精度を長時間保ち得ることを可能とした.次に,現有のピコ秒チタンサファイアパラメトリック増幅器システムを光源として用いた光カーゲート蛍光分光法による時間分解イメージングシステムの構築とその性能評価を行った.カー媒質としてCS_2を用いることによって,2ps程度の時間分解能かつ十分な信号強度をもつシステムを構築できることがわかった.2.半導体ナノ構造物質の光物性評価GaAs(411)A面に成長させたGaAs/AlGaAs量子ドットの高分解能顕微発光測定を行い,アンチストークス発光などの特異な光学的性質について調べた.CuCl量子ドットにおける赤外過渡吸収スペクトルの測定をピコ秒程度の時間分解能で行うことにより,半導体量子ドット中の励起子分子状態からの過渡吸収を初めて捉えることに成功した.CuCl薄膜をCaF_2基板上にMBE成長させる際の条件を制御することで,良質な薄膜試料や三角錐状の島構造をもつ試料を作製することに成功した.1.超高速実空間イメージング分光装置の開発・調整倒立方顕微鏡を改造し、低温でのレーザー共焦点顕微分光が可能な顕微分光システムを構築した。光学部品の選択により、近紫外(8160)16近赤外にかけての波長範囲で測定が可能なシステムとした。このシステムからの光信号を感度良く分光・イメージングするための装置として二次元光子計数型分光測光装置を新規に導入し、調整を進めている。また、超高速時間分解測定系を行うための光源である再生増幅チタンサファイアレーザ・パラメトリック増幅システムを、上記の顕微分光装置と組み合わせて用いるための調整を行っている。2.半導体ナノ構造試料の基礎光物性の測定GaAs(411)A面に成長させたGaAs/AlGaAsの単一量子ドットの高分解能顕微発光測定を行った。その発光スペクトルや発光励起スペクトルには、単一量子ドットに由来する非常に鋭い共鳴構造が確認された。又、単一量子ドット中の励起子の基底状態からの発光線の位置を共鳴励起した際、その励起状態に対応するエネルギー位置に顕著な反ストークス発光が生じるという新奇な現象を見出した。この興味深い現象が生じる機構は現時点では明らかではなく、今後本研究で明らかにしていく予定である。1.超高速実空間イメージング分光装置の開発半導体ナノ構造からの微小な光信号を長時間にわたって安定に測定するため,近紫外近赤外にかけての波長範囲において高空間分解能かつ安定な顕微分光測定を可能とする光学システムを構築した.倒立型顕微鏡に能動フィードバック制御付試料ステージを装備することにより,1μm程度の空間分解能をもち,かつ試料の位置精度を長時間保ち得ることを可能とした.次に,現有のピコ秒チタンサファイアパラメトリック増幅器システムを光源として用いた光カーゲート蛍光分光法による時間分解イメージングシステムの構築とその性能評価を行った.カー媒質としてCS_2を用いることによって,2ps程度の時間分解能かつ十分な信号強度をもつシステムを構築できることがわかった.2.半導体ナノ構造物質の光物性評価GaAs(411)A面に成長させたGaAs/AlGaAs量子ドットの高分解能顕微発光測定を行い,アンチストークス発光などの特異な光学的性質について調べた.CuCl量子ドットにおける赤外過渡吸収スペクトルの測定をピコ秒程度の時間分解能で行うことにより,半導体量子ドット中の励起子分子状態からの過渡吸収を初めて捉えることに成功した.CuCl薄膜をCaF_2基板上にMBE成長させる際の条件を制御することで,良質な薄膜試料や三角錐状の島構造をもつ試料を作製することに成功した.1.超高速実空間イメージング分光装置の開発・調整倒立型顕微鏡,収差補正回折格子型分光器および冷却型CCDカメラを組み合わせ,近紫外近赤外にかけての波長範囲において低温でのレーザー顕微分光が可能な光学システムを構築した.顕微鏡のステージシステムに能動帰還型位置制御システムを導入することにより,低温クライオスタットを用いた観察時においても長時間にわたる位置安定性に優れていることを確認した.また,再生増幅チタンサファイアレーザ・パラメトリック増幅システムを用いたカーゲート法による超高速分光を行うシステムを構築し,上記の顕微分光システムと組み合わせて超高速イメージング分光を行うための光源の開発を行った.2.半導体ナノ構造試料の基礎光物性の測定GaAs(411)A面に成長させたGaAs/AlGaAs量子ドットの高分解能顕微発光測定を行い,アンチストークス発光などの特異な光学的性質について調べた.CuCl量子ドットにおける赤外過渡吸収スペクトルの測定をピコ秒程度の時間分解能で行うことにより,従来から知られている励起子状態からの吸収に加えて,励起子分子状態からの過渡吸収を初めて捉えることに成功した.CdSe/ZnSe量子ドットの発光励起スペクトルの特異な振る舞いから,この物質系における励起子・フォノン複合体の性質について調べた.コロイド法で作成したCdS量子ドットの顕微分光測定を行い,その単一量子ドットからの発光信号を捉えることを試みている.
廃棄物中の灰分を利用した炭化挙動の制御

種々のバイオマス炭化物の二酸化炭素によるガス化速度は一次反応で整理できることがわかった。また,見かけの反応速度定数と炭化物の比表面積との環系について検討した結果,比表面積と反応速度との間には,明確な関係は見出せなかった。また,灰分量の関係について検討すると,速度定数と灰分量との間には,灰分量が多いと速度定数が大きくなる傾向にあるが,灰分量の多いビール粕の速度定数は小さかった。灰分中に含まれる金属種と速度定数との関係について検討した結果,アルカリ金属,アルカリ土類金属が多く含まれるほど,速度定数が大きいことが明らかとなった。活性炭を製造する際にもこのガス化(賦活)過程が重要となる。そこで,ガス化速度と得られた比表面積との関係について検討したところ二酸化炭素との反応性が高いと得られる活性炭の比表面積は同じ賦活度であっても小さくなることが明らかとなった。このことより、塩酸を用いた脱灰処理を行った後に賦活操作を行うことにより、比表面積が大きく増加することが明らかとなった。また,アルカリ金属を含む炭化物の調湿能(水蒸気の吸脱着性能)は,含まないものと比較して優れていることが明らかとなった。次に,バイオマス中の灰分をガス化触媒として利用することについて検討した。カリウムを多く含むおからに含まれる灰分をヤシガラ炭化物に機械的に混合して二酸化炭素によるガス化速度を測定した結果,灰分を混合しない場合と比較して反応速度が非常に大きくなった。また,繰り返して灰分を用いてもガス化速度は大きくは減少しないことが明らかとなったことから,バイオマスの灰分をガス化触媒として利用できることがわかった。本年度は,種々のバイオマスに含まれる灰分について分析を行い,二酸化炭素によるガス化速度に及ぼす影響について検討した。具体的には,ビール粕、ピーナッツ、パームシェル、ヤシガラ、酒粕、リグニンの6種類のバイオマスを窒素気流中900°Cで炭化した。そして,得られた炭化物について灰分量および蛍光X線による灰分中の無機成分について分析を行った。灰分量が最も多かったのはおから(19.9wt%)であり,最も少なかったのは,酒粕(1.8wt%)であった。また,おからの灰分中にはアルカリ金属とくにカリウムが多く含まれていることがわかった。ビール粕も灰分量(16.1wt%)は多かったが,アルカリ金属はほとんど無く,シリカとリンが多く含まれていることがわかった。バイオマス炭化物の二酸化炭素によるガス化を新規購入した熱重量測定を用いて行った結果,みかけの反応速度は一次反応で整理できることがわかった。また,見かけの反応速度定数と炭化物の比表面積との環系について検討した結果,比表面積と反応速度との間には明確な関係は見出せなかった。灰分量の関係について検討すると,速度定数と灰分量との間には,灰分量が多いと速度定数が大きくなる傾向にあるが,灰分量の多いビール粕の速度定数は小さかった。灰分中に含まれるカリウム量と速度定数との関係について検討した結果,カリウム量が多いほど速度定数が大きいことが明らかとなった。以上のことから,カリウムバイオマス中に含まれるカリウムの量がガス化の際の触媒として作用することが明らかとなった。つまり,おからの様にカリウムを多く含むバイオマスとの共炭化により,ガス化に適した炭化物を得られる可能性が示唆された。本年度は、さらに多くのバイオマス(廃酵母、バガス、アーモンド殻を追加)に含まれる灰分について分析を行った。そして昨年度と同様に(1)二酸化炭素との反応性と灰分量およびその無機成分が反応性に及ぼす影響について検討した。本年度より、(2)バイオマス炭化過程での一酸化炭素、水素の生成挙動を測定し、灰分の影響について検討した。

そして得られたバイオマス炭化物の調湿能を測定し、(3)灰分が調湿能に及ぼす影響についての検討を行った。さらに、バイオマスからのガス賦活法による活性炭の製造を念頭におき、(4)二酸化炭素との反応性が得られる活性炭の細孔構造にどのように影響するかについても検討を加えた。その結果、灰分にカリウム、カルシウムなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属が含まれると二酸化炭素との反応性が大きくなることが明らかとなった。炭化過程においてカリウムを多く含むと800°Cを越えると一酸化炭素の生成が顕著となることが明らかとなった。そこで、カリウムを多く含むおからをセルロースに添加すると一酸化炭素の生成量が増加することがわかった。次に、得られた炭化物中にカリウムを含むと、高湿度における水蒸気の吸着量が増加し、調湿能が市販の調湿用木炭よりも大きくなることがわかった。最後に、二酸化炭素との反応性が高いと得られる活性炭の比表面積は同じ賦活度であっても小さくなることが明らかとなった。このことより、塩酸を用いた脱灰処理を行った後に賦活操作を行うことにより、比表面積が大きく増加することがあきらかとなった。今後、種々のバイオマスの灰分を利用した共炭化による影響について検討する。本年度は、(1)灰分の繰り返し添加によるガス化特性,(2)ナトリウム分を多く含む醤油粕炭化物の調湿能,(3)脱灰がバイオマス炭化物の細孔構造に及ぼす影響について検討した。おからを空気中で燃焼した後に残った灰分をヤシガラ炭化物に物理的に混合して二酸化炭素によるガス化速度を測定した。さらに,このガス化実験の後に得られた灰分を同様にヤシガラ炭化物に物理的に混合して二酸化炭素によるガス化速度を測定した。この結果,繰り返して灰分を利用しても灰分を添加しない場合と比較してガス化速度が大きいことが明らかとなった。繰り返して使用することによりわずかではあるが,反応速度の低下が見られた。しかし,石炭炭化物に同様の実験を行うと,繰り返して利用するたびに反応速度の大きな低下が見られた。これは,石炭炭化物中に含まれる灰分(Al,Si)がガス化触媒として作用しないために,ガス化触媒として作用するおからから得られた灰分(K)の割合が減少するためだと考えられた。昨年度にアルカリ金属を含むと、高湿度における水蒸気の吸着量が増加し、調湿能が向上することが明らかとなったので,本年度はナトリウムを多く含む食品廃棄物である醤油粕の炭化物に対する調湿能の評価を行った。その結果,調湿能が非常に大きなことが明らかとなった。また,繰り返して水蒸気の吸脱着を行ってもその調湿能は低下することはなかった。バガスに対して酸(塩酸,硝酸,硫酸)による脱灰を行った。脱灰したバガスの炭化物の細孔構造を測定したところ,硝酸で処理した場合にミクロ孔容積の大きな増加が見られた。また,どの酸の場合にもミクロ孔径分布がシャープになった。しかし,これが,脱灰による効果か,あるいは酸によるバイオマス(セルロース,リグニン)の改質による効果か明らかでないと考えられた。
実験室における安全管理と安全対策の取扱マニュアルの作成

1.「目的」実験室には、多くの危険が内在している。なかでも実験中の安全に大きな影響をおよぼす器具破損と実験室設備に着目した。前者は、以前の研究でその80%が不注意で発生しており安全の面から実験者への意識改革を促すことにした。後者は、実験設備の安全管理と安全対策について解明し、取扱マニュアルを作成しようとした。2.「方法」1)これまでの調査研究データに加え、国内と海外の大学の実験担当者の協力を得て、器具破損状況(器具破損届使用)と実験室の設備について、安全管理と安全対策の両面から調査した。2)協力施設:中国:北京林業大学(農)、首都医科大学(医)天津科技大学(理)、河南工業大学(工)、アメリカ:アラバマ大学(理)、ジョージア医科大学(医)。宇都宮大学農・工学部、他大学:東京大学(理)、茨城大学(工)、東京農工大学(農)。3.「成果」1)宇都宮大学(研究者勤務大学)における器具の破損件数を見ると平成15および18年と平成19年度比で約30%減少した。安全対策として流しにスノコを敷くと共に、実験前(講義時)・中・後に注意を促すことが要因となることを明らかにした。他大学でも器具の破損では、毎年多数出ているおり、また安全管理の面では、国内の大学で安全シャワー・洗眼蛇口・排気装置等の有無と品質差が明らかになった。2)海外の安全管理では、実験室に教育信条(安全管理・対策含)が額入で掲示してあった。(中国全大学)。実験装置の取扱方法・注意事項が箇条書きで掲示してあった。(アメリカ・中国)。アメリカの安全対策の特徴として、実験に入室する際に安全メガネ着用が義務となっていた。さらに排気装置等では、実験者に優しい安全対策が講じられていた。当大学を含めて日本の大学で見習う必要性を痛感し、日本とアメリカの安全管理と対策の相違が明らかになった。3)以上を考慮に入れた実験室における安全管理と安全対策の取扱マニュアルを作成した。(中国全大学)。(アメリカ・中国)。
遺伝子ノックアウトを用いた放射線DNA切断修復過程の解明

放射線に被ばくした細胞内にはDNA二重鎖切断が生じる。DNA二重鎖切断の修復には、切断端を適当に再結合する非相同末端結合と、複製後の姉妹染色分体などを用いて正確に修復する相同組換えの少なくとも2つの機構が存在する。放射線高感受性や染色体不安定性を示す常染色体劣性遺伝病、ナイミーヘン症候群(NBS)の原因遺伝子はNBS1遺伝子である。NBS1遺伝子産物は754アミノ酸をコードし、放射線によるDNA損傷修復に中心的に関わっているタンパクであると考えられている。NBS1タンパクはMRE11/RAD50と複合体を形成しDNA損傷部位に集まることが知られているが、DNA再結合反応における機能の詳細については明らかでない点も多い。我々は、放射線によるDNA二重鎖切断の再結合過程におけるNBS1の機能を明らかにするために、ニワトリBリンパ球由来のDT40細胞を用いてNbs1遺伝子をノックアウトし、Nbs1欠損に起因する表現型を解析した。相同組換えの解析には特定部位にDNA二重鎖切断を導入できるSCneoレポーターを用い、非相同末端結合の解析には特殊なプラスミドレポーターを用いた。その結果、Nbs1ノックアウト細胞では相同組換え頻度が野生型細胞の約1/200にまで低下し、さらには染色体間での乗り換えを防ぐような「組換え中間体の正常な解消」ができなくなることがわかった。その一方で、Nbs1ノックアウト細胞でも非相同末端結合は起きることから、Nbs1が放射線によって生じたDNA二重鎖切断修復系路のうちでも相同組換え修復に中心的に機能していることが示唆された。さらにNBS患者細胞を用いた組換えレポーターによる相同組換え能の解析結果から、ヒトNBS1もDNA二重鎖切断の相同組換え修復に必須であるということが明らかとなった。電離放射線に被ばくした細胞内で生じるDNA二重鎖切断の修復機構には、相同組み換え(HR)による修復と非相同末端結合(NHEJ)の2つが存在している。本研究では、DNA修復に重要であり、その欠損が放射線高感受性遺伝病、ナイミーヘン症候群を引き起こすNbs1遺伝子に着目し、遺伝子ノックアウト細胞の作成を行ってその表現型の解析からDNA二重鎮切断修復過程を解明することを目指している。これまでの研究でNbs1ノックアウト細胞は作成済みであるので、今年度はまず、Nbs1ノックアウト細胞におけるDNA二重鎮切断修復機構を詳細に解析した。その結果、NBS1がNHEJにはあまり重要ではない一方でHRには必須であり、なかでも組換え中間体の正常な解除にも重要な機能があることが明らかになった。また、NBS1と他の修復関連タンパクとの相互作用を解明するために、NHEJ経路、損傷シグナルの制御、HR経路のそれぞれに働く修復遺伝子とNbs1とのダブルノックアウト細胞の作成にとりかかっている。現在までにこれら遺伝子のダブルヘテロ細胞、あるいはコンディショナル-ヘテロ細胞まで作成済みであり、ダブルノックアウト細胞の完成は間近である。さらに、相同組換えが詳細に解析できるSCneoレポータ遺伝子を導入した各種遺伝子ノックアウト細胞の作成も行っており、今後これらの細胞を用いることで、HRやNHEJにおけるDNA損傷修復関連タンパク単独あるいはタンパク相互作用の役割が解明できるものと考えられる。DNA二重鎖切断の修復には、切断端を適当にプロセッシングして再結合する非相同末端結合と、複製後の姉妹染色分体などを用いて正確に修復する相同組換えの少なくとも2つの機構が存在する。

NBS1タンパクは754アミノ酸から成り、放射線によるDNA損傷修復に中心的に関わっているタンパクであると考えられている。NBS1タンパクはMRE11/RAD50と複合体を形成しDNA損傷部位に集まることが知られているが、DNA再結合反応における機能の詳細については明らかでない点も多い。代表者は、放射線によるDNA二重鎖切断の再結合過程におけるNBS1の機能を明らかにするために、ニワトリBリンパ球由来のDT40細胞を用いてNbs1遺伝子をノックアウトし、Nbs1欠損に起因する表現型を解析している。相同組換えの解析には、特定部位にDNA二重鎖切断を導入できるSCneoレポーターを用い、今年度は生じた相同組換え体の解析およびヒト細胞での解析も行った。その結果、Nbs1ノックアウト細胞では相同組換え頻度が低下するのみならず、染色体間での乗り換えを防ぐような「組換え中間体の正常な解消」ができなくなっていることがわかった。このことからNbs1が放射線によって生じたDNA二重鎖切断修復系路のうちでも相同組換え修復に中心的に機能していることが強く示唆された。さらにNBS患者細胞を用いた組換えレポーターによる相同組換え能の解析結果から、ヒトNBS1もDNA二重鎖切断の相同組換え修復に必須であるということが明らかとなった。