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糖尿病患者における「笑い」の生理的および心理的効果に関する研究

本研究では「笑い」が2型糖尿病患者の血糖コントロールに及ぼす影響を明らかにするために、漫才や落語で笑った前後における血糖値の変化(短期効果)と日々の生活の中で笑う機会を増やすことで高血糖状態が改善されるかどうか(長期効果)の2本立ての研究計画を立て実施した。1年目はプロの漫才師の協力を得て、短期効果の検証をおこなった。60歳代の8名の糖尿病患者における笑い前後の血糖値の変化を自己血糖測定法(SMBG)により観察した。短期効果の実験は今回で3回目であり、再度食後2時間血糖値上昇が抑制されることを実証した(笑いの無い状況における血糖変動に比べ-31.4mg/dl)。2年目は24名の2型糖尿病患者を被験者として(60歳代、男性12名、女性12名、非インスリン治療)月1回「笑い」を含む糖尿病教室を9回開催した。この教室では日々笑うことを奨励し、さらに笑いに関与する顔面筋群(大頬骨筋、眼輪筋、口輪筋)の動きをよくする体操(笑み筋体操)を考案し指導した。被験者には体重、食事、運動(歩数)そして笑いの状況を日誌として記録してもらった。血糖変動の原因が明らかである者(薬物変更等)や出席回数が少なかった者を除いた17名について前年同時期の血糖変動と比較したところ、HbA1cの年間平均が前年より改善した者12名(-0.25%±0.22)、不変または悪化は5名(+0.09%±0.08)であった。期間中、本人が笑ったと目覚した日数は月平均10日20日だったが、13日以下になるとHbA1cが上昇する傾向が認められた。POMS短縮版による心理状態の変化では「緊張・不安」が改善した。糖尿病教室に参加した被験者の日誌からは日々の療養生活を改善しようとする前向きな書き込みが多く見られるようになった。血糖コントロールは日常生活のさまざまな要因により変化するため、笑いとの因果関係を客観的指標により明確にするには至らなかったが、「笑い」を指導内容に加えた糖尿病教育プログラムは血糖値の改善に効果があることが示唆された。本研究の目的は、「笑い」が2型糖尿病患者の血糖コントロールに及ぼす影響を明らかにすることである。研究方法として、漫才や落語などで笑った前後における血糖値の変動をみる短期介入実験と日々の生活の中で笑う機会を増やすことによる長期介入実験を計画した。平成16年度は短期介入実験として、12月に8名の糖尿病患者に漫才を鑑賞してもらい血糖値の変動を観察した。この実験は平成15年から継続しているもので、今回は3回目の実験であった。この実験では1日目に500kaclの昼食摂取後、笑いのない講義を聴講し、2日は同様に昼食摂取後、思いっきり笑う漫才鑑賞で食後2時間の血糖の上昇値を比較した。科研費採択以前におこなった2回の実験では、笑った時に食後2時間血糖値の上昇が有意に抑制されるという結果を得ていた(1回目-45.9mg/dl、2回目-13.2mg/dl)が、今回の実験でも、同様の結果(-31.4mg/dl)であり、思いっきり笑うことが食後血糖値の上昇を抑制することが証明された。長期的介入実験では、市販のコメディVTRを用いて日常的に笑う機会を増やすことを考えていたが、個人の好み等により笑いの質や量が変わる可能性があるとの見解から、個人的な価値観に左右されずに笑う方法の開発から着手した。さまざまな検討を経て大脳生理学、表情学等の先行研究に基づいた「笑い誘発VTR : Effective Laugh Maker」を制作した。次年度の計画としては糖尿病専門クリニックに通院する糖尿病患者を対象に笑い教室を月1回半年間にわたり開催し、さらに自宅でもこのVTRを視聴するようにして日常生活の中で笑う実験を実施する。この実験から期待されることは日常的に笑う機会を増やすことで、前向き感情を促進し、さらに活動性を高め、結果として生活習慣の改善から血糖値の安定化を図るというものである。測定項目としては、血糖値やインスリンなどの内分泌因子、万歩計による活動性、健康日誌記入による継続性ややる気の変化、その他POMSなどの気分尺度による心理変化の観察などを予定している。

血糖変動の原因が明らかである者(薬物変更等)や出席回数が少なかった者を除いた17名について前年同時期の血糖変動と比較したところ、HbA1cの年間平均が前年より改善した者12名(-0.25%±0.22)、不変または悪化は5名(+0.09%±0.08)であった。期間中、本人が笑ったと目覚した日数は月平均10日20日だったが、13日以下になるとHbA1cが上昇する傾向が認められた。POMS短縮版による心理状態の変化では「緊張・不安」が改善した。糖尿病教室に参加した被験者の日誌からは日々の療養生活を改善しようとする前向きな書き込みが多く見られるようになった。血糖コントロールは日常生活のさまざまな要因により変化するため、笑いとの因果関係を客観的指標により明確にするには至らなかったが、「笑い」を指導内容に加えた糖尿病教育プログラムは血糖値の改善に効果があることが示唆された。
陰性変時作用を持つ新しいカルシウムセンシタイザーEGIS-9377の生理学的特性

陰性変時作用を持つカルシウムセンシタイザーEGIS-9377の生理学的特性について心臓メカノエナジェティクスの指標を用いて検討した。イヌ交叉灌流摘出心標本にて洞調律下にEGIS-9377を冠動脈内投与したところ1.5mg/minまでは心拍数に影響を及ぼさず、4mg/minでは14%の心拍数減少を認めた。また、冠動脈血流量にも影響を与え、4mg/min投与時に対照群に比較し2.6倍と著明に増加させ、収縮性Emaxを50%増加させた。その成因としてGregg効果が関与していると考え冠動脈血流量を固定したところEmaxの増加は4%であった。血流量の固定により冠動脈圧は低下しており、Gregg効果以外の陽性変力作用があることを確認した。PVAの酸素コストに対してはこれまで報告されてきた陽性変力作用薬と同様に影響を与えなかった。Emaxの酸素コストもドブタミンと同じであった。EGIS-9377急性投与による心臓へのメカノエナジェティクスはこれまでの陽性変力作用薬と同様であり、クロスブリッジでのエネルギー変換効率を改善する効果は認められなかった。βアドレナリン受容体遮断薬は陰性変時作用を持ち、内科的心不全治療の中心的役割を果たしているが、その一つの要因として陰性変時作用が挙げられている。EGIS-9377についても長期予後を改善する可能性があり、慢性効果について検討する予定であったが、動物実験の段階で嘔吐の副作用が強く慢性実験が困難であり、臨床応用には問題があると判断して研究を中断した。現在カルシウム感受性増強薬EGIS-9377の心力学的作用についてイヌ交叉灌流摘出心標本にてEmax、PVA-Vo_2関係のフレームワークによる評価を進めている。心筋の張力は心筋細胞内カルシウム濃度を反映して発生するが、本薬剤は私の用いている標本でもEmaxを指標とする心収縮性を増加させる事を確認した。同時に冠動脈に対する拡張作用を有することが判明したため、冠動脈血流増加に伴う収縮性増強(Gregg効果)を除外するために冠動脈血流量を一定にして収縮性の変化を調べた。これまでの知見では心収縮性増強はGregg効果のみでなくカルシウム感受性増強作用をさめた要素によることを確認した。EGIS-9377投与中の一心拍の総機械的エネルギーPVAと、それに用いられる心筋酸素消費量であるPVA依存性Vo_2との関係は左心室容積に変化によるPVAの増加に対し、PVA依存性Vo_2は正比例の関係を示した。Emaxの増加に伴いPVA非依存性酸素消費量は増加したが、これらの結果はこれまでのカルシウム感受性増強薬と同様であった。今後はカテコラミンやカルシウムなと作用の異なる陽性変力作用を持つ薬剤との比較を行う予定である。また高容量では除神経された心標本の心拍数を減少させるため、活動電位持続時間の変化やカリウムチャネルの挙動についても心筋細胞レベルでの研究成果も待たれるが、当教室が取り組んでいる心筋細胞内カルシウム動態についてのマクロレベルからのアプローチでもカルシウム感受性増強薬に対する新しい統合生理学的知見が得られるものと考える。
立体構造解析に基づくカテプシンL選択特異的阻害剤の分子設計

平成6年度からの3年間、以下に示す研究計画に従い、鋭意い研究を進めてきた。(1)大腸菌からのラットカテプシンLの大量発現。(2)大腸菌からのラットカテプシンLの単離精製。(3)組み替えラットカテプシンLの活性測定による天然体と同一機能の確認(4)カテプシンLのX-線結晶構造解析(5)カテプシンL-阻害剤複合体の調整と物性測定(6)カテプシンL-阻害剤複合体のX-線結晶構造解析(7)カテプシンLおよび阻害剤との複合体のNMR法による溶液構造解析(8)カテプシンLの活性中心の立体構造の構築とその構造的特徴を解明、および触媒機構の解明(9)(4)(8)に基づくカテプシンL選択特異的低分子阻害剤の設計と阻害活性測定既に(1)(3)の研究を完成させ、現在、(4)(7)について鋭意取り組んでいる。これらの研究項目については近い将来の完成を確信している。当初の計画期間内で研究を完成できなかった最大の理由は、カテプシンLの自己消化による不安定性ある。X-線結晶解析やNMRによる溶液構造解析にはサンプルが比較的安定であることが要求されるが、カテプシンL自身の高い自己消化能により、長時間の活性状態での安定維持が困難であることに起因している。このことを解決すべく、数種類の組み替えプロカテプシンLを作成すると共に、カテプシンLに対しては阻害剤との複合体の構造解析を先行させることとした。フリー状態でのカテプシンLの活性中心の立体構造を明らかにすることは出来ないものの、フリーなプロカテプシンLの活性中心の立体構造およびカテプシンL-阻害剤複合体での活性中心の立体構造比較から、本研究課題の目的であるカテプシンL選択特異的低分子阻害剤の分子設計にさほど影響しないものと考えている。以上、当該研究期間で計画していた(1)(9)の研究項目の内、(1)(3)を完成させ、(4)(7)についてはかなりの成果を得ている。しかし、(8)以降の研究課題においては、H9年度以降にずれ込む結果となった。従って、H9年度内に本研究課題の最終目的であるカテプシンL選択特異的阻害剤の分子設計を完成させるべく、現在、鋭意研究を進めている。本年度は,(1)以前からの研究に続きでgene10遺伝子と2種類のプロカテプシンL遺伝子を含むプラスミド(プロ体を27残基含むpMALECLプラスミドとプロ体を2残基含むpMALPCLプラスミド)を大腸菌中で発現させ,融合蛋白質を大量に発現させた.(2)これらgene10タンパク質との融合蛋白質から目的のプロカテプシンLのFactorXaによる切断と単離を試みた。種々検討した結果、0.5M NaCl含有20mM Tris-HCL(pH7.5)緩衝液を用い,融合蛋白質に対し1/400量のFactor Xaを用い,25°C,24時間かけて消化させた場合,比較的多くのプロカテプシンLを得ることに成功した.(3)単離されたプロカテプシンLのカラムクロマトグラフィーによる精製法を確立させた.

(4)得られた2種類の組み換えプロカテプシンLの酵素活性を,基質としてZ-Phe-Arg-NMecを用い,Barrett and Kirschkeの方法に従い測定した.その結果,両タンパク質は共に活性を有していることが確認された.また.プロ体を2残基含むプロカテプシンLの方が,27残基含むプロカテプシンLよりより活性が高いことも示された.(5)我々は既に分子設計し、比較的カテプシンLに対し比較的高い選択性を示すと思われる共有結合性の阻害剤(CA化合物)を合成しているので,この阻害剤と今回得られた組み換えプロカテプシンLとの複合体を作成した(複合体生成によりプロカテプシンLの活性は消滅する)・現在,その結晶化溶媒の検索と結晶化条件の確立を目指している.以上,H6年度においては予定していた(1)(4)の研究計画項目を完成させた.しかし,(5)および複合体結晶の構造解析はH7年度にずれ込む結果となった.H7年度はその構造解析と,それに基づき,本研究課題であるカテプシンL選択特異的阻害剤の分子設計を完成させるべく鋭意研究を進める予定であります.平成7年度は、前年度までの研究を基に、(1)gene10遺伝子と2種類のプロカテプシンL遺伝子を含むプラスミド(プロ体を27残基含むpMALECLプラスミドとプロ体を2残基含むpMALPCLプラスミド)の大腸菌中で発現条件の確率、Factor Xaによる切断条件の確立そして2種類のプロカテプシンLの単離精製法を確立させることに成功し、次いで、(2)得られたプロカテプシンLに対する酵素活性測定法を確立させ、(3)発現させた組み替えプロカテプシンLは低レベルながらもカテプシンLとしての酵素活性を有することを明らかにした。一方、(4)発現カテプシンLの低酵素活性は酵素自体の自己消化に起因する事を明らかにし、よって、安定なカテプシンLを調製する目的で、(5)発現時における組み換えプロカテプシンLの共有結合性阻害剤(カテプシンLに対し比較的高い選択性を示すCA化合物)との複合体調整法を確立させ(複合体生成によりプロカテプシンLの活性の消滅)、(6)その複合体の結晶化条件を種々検討し、蒸気拡散に基づくHanging Drop法による結晶化に成功した。しかし、その結晶はX線回析強度データ測定に十分な大きさでなく、現在、seeding法等の種々の方法による結晶成長を鋭意試みている。以上、本年度において予定していた(1)(3)の研究計画項目は完成させたが、(4)以降の研究課題においては、自己消化能によるカテプシンL自身の不安定性や複合体結晶調製等の問題によりH8年度以降にずれ込む結果となった。H8年度はその複合体結晶の構造解析の完成と、それに基づくカテプシンL選択特異的阻害剤の分子設計を完成させるべく鋭意研究を進める予定であります。平成8年度は、前年度までの研究成果を基に、(1)発現条件の確立したプロカテプシンLの大腸菌からの単離精製法を確立させ、(2)得られた組み替えプロカテプシンLは天然体とほぼ同程度のの酵素活性を有し、スペクトル的にも同一であることを確認し、(3)X-線およびNMRによる構造解析の試料供給ルートを確立した。一方、(4)組み替えカテプシンLは自己消化のため不安定であることから、安定なカテプシンLを調製する目的で、カテプシンLの発現時での共有結合性阻害剤(カテプシンLに対し比較的高い選択性を示すCA化合物)との複合体調整法を確立させた。
一酸化炭素による細胞死誘導・保護作用の分子機構に関する研究

外来性あるいは内因性一酸化炭素(CO)は、NF-κBあるいはミトコンドリアのATP依存のK^+チャンネルにより、虚血またはリポ多糖類によって生起された障害から心筋と血管内皮を保護することが示されている。一方、ヘム酸素添加酵素(HO)-1は、COを生成し、細胞を保護する。私たちは、Ca^<2+>依存のプロテアーゼcalpainがα-fodrin蛋白質分解によって、低酸素下のラット心筋起源のH9c2細胞のネクローシスを促進することを示した。本研究において、私たちは、COがL-タイプCa^<2+>チャンネルを通るCa^<2+>流入を抑制することにより、H9c2細胞の虚血細胞死を抑制するという初めての証拠を示した。虚血はfluo-3蛍光によって検出される細胞内Ca^<2+>流入を増加させ、それは、L-タイプCa^<2+>チャンネル作動薬BAYK 8644によって増強された。また、色素排除法、LDH放出あるいはpropidium iodide浸透性の測定から、その細胞死はネクローシスであると確認した。Ca^<2+>流入、Western blottingで示されるα-fodrin分解、虚血細胞死は、すべてCOあるいはL-タイプCa^<2+>チャンネル抑制剤ベラパミルによって抑制された。また、蛍光色素JC-1の測定により、虚血はミトコンドリアの膜電位の低下を引き起こすが、COまたはベラパミルは抑制することも見出した。一方、虚血により、活性酸素種(ROS)生成は増加したが、COにより抑制されなかった。低酸素下ヘミン処理により、HO-1は誘導された。虚皿によるCa^<2+>流入および細胞死は、HO-1誘導により抑制された。したがって、外来性あるいは内因性COは、L-タイプCa^<2+>チャンネルよるCa^<2+>流入を抑制、および、それによるcalpain活性化を抑制することにより虚血細胞死を抑制することが明らかとなった。さらに、ミトコンドリアの関与についても研究を進める予定である。一酸化炭素(CO)はよく見られる中毒死の原因である。また、その毒性は、CO-Hb形成によって引き起こされる低酸素によるものと考えられてきたので、虚血性心疾患患者への影響が問題になる場合が少なくない。そこで、COの虚血心筋の細胞死に対する影響とその機序について検討した。ラット胎児心筋由来H9c2細胞について、(1)normoxia、DMEM(10%FBS)(2)2%O_2、HBSS(serum free, glucose free)(3)1%CO+2%O_2、HBSS(serum free, glucose free)の条件下で培養した。24時間後の細胞死を色素排除法および蛍光染色法・α-fodrin分解・DNA agarose gelを用いて検討したまた、活性酸素種(ROS)生成についてはDCF生成・MAPK knaseの活性化についてwesternblotting法で検討した。

HBss、低酸素下、血清・ブドウ糖除去による細胞死は、R0S生成とMAP kinase活性化を伴っており、α-fodrin分解・細胞膜破綻を伴うネクローシスであった。1%CO暴露はMAP kinase活性化を増強し、ROS生成・.脂質過酸化・虚血細胞死を抑制したが、PD98059によるMAP kinase活性化阻害により、COの細胞保護効果は抑制された。低濃度COは、心筋由来細胞の虚血細胞死(ネクローシス)を抑制した。これは、MAP kinaseの活性化を介していると考えられる。COは虚血性心疾患に保護的に働く可能性が示された。外来性あるいは内因性一酸化炭素(CO)は、NF-κBあるいはミトコンドリアのATP依存のK^+チャンネルにより、虚血またはリポ多糖類によって生起された障害から心筋と血管内皮を保護することが示されている。一方、ヘム酸素添加酵素(HO)-1は、COを生成し、細胞を保護する。私たちは、Ca^<2+>依存のプロテアーゼcalpainがα-fodrin蛋白質分解によって、低酸素下のラット心筋起源のH9c2細胞のネクローシスを促進することを示した。本研究において、私たちは、COがL-タイプCa^<2+>チャンネルを通るCa^<2+>流入を抑制することにより、H9c2細胞の虚血細胞死を抑制するという初めての証拠を示した。虚血はfluo-3蛍光によって検出される細胞内Ca^<2+>流入を増加させ、それは、L-タイプCa^<2+>チャンネル作動薬BAY K 8644によって増強された。また、色素排除法、LDH放出あるいはpropidium iodide浸透性の測定から、その細胞死はネクローシスであると確認した。Ca^<2+>流入、Western blottingで示されるα-fodrin分解、虚血細胞死は、すべてCOあるいはL-タイプCa^<2+>チャンネル抑制剤ベラパミルによって抑制された。また、蛍光色素JC-1の測定により、虚血はミトコンドリアの膜電位の低下を引き起こすが、COまたはベラパミルは抑制することも見出した。一方、虚血により、活性酸素種(ROS)生成は増加したが、COにより抑制されなかった。低酸素下ヘミン処理により、HO-1は誘導された。虚血によるCa^<2+>流入および細胞死は、HO-1誘導により抑制された。したがって、外来性あるいは内因性COは、L-タイプCa^<2+>チャンネルよるCa^<2+>流入を抑制、および、それによるcalpain活性化を抑制することにより虚血細胞死を抑制することが明らかとなった。
小胞体から出芽する輸送小胞の形成調節機構の解明と応用

小胞体は高等動物細胞の分泌タンパク質輸送の出発点であり、輸送小胞COPIIによって分泌タンパク質が小胞体から搬出される。本研究では、COPIIの外被覆構成タンパク質Sec31Aにカルシウム依存的に結合するタンパク質ALG-2に着目し、ALG-2の新規結合タンパク質として、TFG、MISSLとMAP1Bを同定した。これらとALG-2の複合体にはSec31Aは含まれず、ALG-2はSec31Aとは独立した機能を有することが示唆された。また、アネキシンA11はSec31Aの小胞体膜への局在を安定化させるが、その筋委縮性硬化症の発症に関連する変異によりS100A6との結合が異常となることを見出した。本研究は、高機能タンパク質を大量に分泌可能な培養細胞系の樹立を最終目標とし、哺乳類細胞の小胞体からゴルジ体への順行輸送を担う輸送小胞COPIIの小胞体からの出芽を調節するタンパク質の同定とその機能改変を目指している。これまでに、カルシウム結合タンパク質ALG-2がCOPIIの外被覆構成タンパク質Sec31Aに作用することを明らかにしている。本年度は、(課題1)Sec31Aに結合する新規タンパク質の探索と(課題2) ALG-2のカルシウム依存的アダプター機能を介してSec31Aと間接的に相互作用するタンパク質の探索を行なった。まず、課題1において、酵母Two-Hybrid法を用いてSec31Aのカルボキシ末端領域に結合するタンパク質のスクリーニングに着手した。しかし、予備実験においてSec31AとALG-2を発現させた酵母の生育が不良になり、また複数のcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行ったが陽性クローンは取得できなかった。一方で、動物培養細胞に、Sec31Aの同様の領域を緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質として恒常的に発現させ抗GFP抗体で免疫沈降したところ、カルシウム依存的にALG-2の共沈降が確認された。そこで免疫沈降産物をSDS-PAGE展開後、銀染色により解析したところ、複数のタンパク質の存在が確認された。現在、質量分析によりこれらの同定を進めている。次に、課題2において、ALG-2の相互作用タンパク質候補の中から、小胞体からゴルジ体への物質輸送への関与が報告されているTFG(Trk-fused gene)に着目し、ALG-2とのカルシウム依存的結合を確認し、その結合領域を同定した。また、GFPを融合させたTFGの生細胞解析から、ALG-2の結合領域を欠くことでTFGの小胞体のCOPII輸送小胞出芽領域への親和性が低下することを明らかにした。課題1では、実験計画に沿って酵母Two-Hybrid法によるスクリーニングを進めたが、ヒトSec31Aのカルボキシル末端領域の発現は酵母の生育に影響を与えなかったが、ALG-2との共発現により酵母の生育が著しく悪化するという予想外の結果となった。よって、酵母Two-Hybrid法に依る新規制御タンパク質の同定は難しいと考えられ、実際にcDNAライブラリーを用いたスクリーニングでは陽性コロニーが得られなかった。しかし、Sec31Aのカルボキシル末端領域のGFP融合タンパク質を恒常発現する動物細胞は、その増殖と細胞形態などに異常は観察されず、また抗GFP抗体の免疫沈降産物中には、特異的な結合タンパク質候補と考えられる複数のバンドが検出されたことから、この実験系による新たな制御タンパク質の同定が期待できる。さらに、課題2として、ALG-2の標的タンパク質の中から小胞体からゴルジ体への順行輸送を制御するTFGについて、そのALG-2結合領域を同定した。TFGのALG-2結合領域を欠いた変異体を用いることで、TFGの機能におけるALG-2の役割が解明されることが期待される。以上のように、本研究はおおむね順調に進展している本研究は、哺乳類細胞の小胞体からゴルジ体への輸送を担うCOPII小胞の出芽の調節機構を解明することで、高機能タンパク質を大量に分泌可能な細胞系樹立の一助とすることを目的としている。すでに、COPII小胞の外被覆を構成するSec31Aにカルシウム結合タンパク質ALG-2が結合し、COPII小胞が出芽する特別な領域(ERES, ER exit sites)に動員されることを報告しているが、昨年度、ERESに局在するタンパク質TFG(Trk-fused gene)にALG-2が結合することを明らかにした。本年度は、ALG-2とTFGの相互作用の生理的意義を解明する目的で解析を進め、以下の結果をまとめ報告した。1) ALG-2二量体がもつアダプター機能によって、Sec31AとTFGがALG-2を介してカルシウム依存的に相互作用する可能性を免疫沈降実験により検討したところ、Sec31Aの免疫沈降産物中にALG-2は検出されたが、TFGは検出されなかった。よって、ERESにおいて、ALG-2/TFG複合体はALG-2/Sec31A複合体と独立して存在することが考えられた。2)免疫染色実験によりALG-2の過剰発現がTFGのERES局在を増強することを見出した。3)組換体タンパク質を用いた試験管内架橋実験により、多量体を形成しているTFGをALG-2がカルシウム依存的にポリマー化することを明らかにした。4) TFGの点変異(R106C)を引き起こす一塩基多型は遺伝性痙性対麻痺の発症と関連するが、ALG-2はTFGのR106C変異体とは結合しないことを示した。

また、Sec31Aの免疫沈降産物から、質量分析により相互作用するタンパク質の網羅的同定を試み、Sec31Aの正常な折りたたみに関与する可能性のあるタンパク質複合体が含まれることを見出している。COPII小胞が出芽する小胞体の膜区画ERESにおいて、カルシウム結合タンパク質ALG-2がカルシウム依存的にTFGをERESへ動員すること、またTFGのポリマー化を促進するという新たな分子機構を明らかにし、報告した。ALG-2がカルシウムに応答して、ERESのSec31AとTFGをそれぞれ独立に制御していることから、カルシウムシグナルによって初期分泌経路が巧妙に調節されている可能性があり、今後の展開が期待される。一方で、Sec31Aのカルボキシル末端領域のGFP融合タンパク質を恒常発現する動物培養細胞を樹立した。その細胞溶解液から抗GFP抗体を用いて免疫沈降し、沈降産物中に含まれる結合タンパク質候補を質量分析技術により数多く同定した。それらのいくつかについてSec31Aとの結合の検証実験を行ったが、特異的な結合は検出されなかった。そのため、この実験系によってSec31Aの新規相互作用タンパク質を同定することは困難と判断し、全長のSec31Aに結合するタンパク質の同定を試みた。その結果、Sec31Aの正常な折りたたみを担う可能性のあるタンパク質複合体が同定された。現在、複数の実験系でその結合の検証を進めており、一部の実験系では特異的な結合が確認できている。以上のように、本研究は全体としておおむね順調に進展している。本研究は、哺乳類細胞の小胞体からゴルジ体への輸送を担うCOPII小胞の小胞体からの出芽の調節機構を解明することで、高機能タンパク質を大量に分泌可能な細胞系の樹立の一助をすることを目的とした。昨年度、COPIIの外被覆を構成するSec31Aに結合するタンパク質を探索し、タンパク質の折畳みを担う複合体の全てのサブユニットを同定したが、今年度はその中のひとつのサブユニットが、Sec31Aのアミノ末端領域に結合することを明らかにした。また、繊維芽細胞を用いてI型コラーゲン前駆体の小胞体からゴルジ体への輸送を追跡したところ、このサブユニットの発現抑制により輸送が遅延する様子が観察された。Sec31Aの正常な折畳みがコラーゲン輸送に必要である可能性が考えられた。一方で、申請者らはカルシウムイオン(Ca2+)結合蛋白質ALG-2がSec31AにCa2+依存的に結合することで小胞体のCOPII小胞が出芽する特別な領域(ER exit site、ERES)に動員されることを見出しているが、ALG-2の相互作用タンパク質としてMISSLとMAP1Bを同定しALG-2がこれらのタンパク質と3者複合体を形成することを報告した。MISSLはERESに局在するが、生化学的解析の結果、この複合体にはSec31Aが含まれていなかったことから、ALG-2はERESにおいてSec31Aとは独立した機能も有することが考えられた。さらにMAP1BのALG-2結合領域を同定し、これまでに申請者らが明らかにしたALG-2相互作用蛋白質との結合様式とは異なるユニークな性質を有していることを見出し、報告した。また、初期分泌経路を制御するアネキシンA11のミスセンス変異が筋萎縮性側索硬化症の発症に関連することを報告した。
脳動脈瘤塞栓術における瘤の完全閉塞をめざしたコイルの開発-血管内皮増生をきたす生理活性物質の併用

近年脳動脈瘤に対する瘤塞栓術は、開頭によるclipping術に代わる治療法となりつつあるが、そのdeviceは生理的にinartな白金コイル(GDC)であり血栓促進効果は低く,破裂を予防する目的を果たしているか不確実である。我々は、その塞栓物質であるコイルに血栓形成能を有する無機質の生体適合物質であるアパタイトをコーティングし、血管修復に重要なbFGF(human recombinant)をその表面に固定化し瘤の解剖学的な完全閉塞をめざした。3-4カ月の体重25-30Kgの豚7頭を用いて全麻下で両側の頚動脈に静脈-動脈端側吻合を行いneckが5-6mm、sacが8-10mmの実験的動脈瘤を計14個作成した。ヘパリン静注にてACT250以上を維持した環境下で、大腿動脈からFasguide 6Fr+Turbotracker 18にて瘤内に留置しApatite-GDC(n=6),Apatite+FGF-GDC(n=3)とnormal GDC(n=4)を瘤内に5-10個塞栓した。、塞栓術を施行した。1-2週間後脳血管撮影にて閉塞率を確認後、豚を屠殺し、瘤を血管と共に摘出し瘤のorificeをmacroscopicに観察し、historesin+methyl methacrylate包埋後光顕で動脈瘤頸部の内皮化、瘤内コイル周辺の血栓の器質化についてコントロールと比較した。臨床では、広頚部の比較的大きい動脈瘤や、bifurcation typeの動脈瘤において、recanalizationやcoil compactionの報告があり、今後これらの動脈瘤モデルを作製し、我々が開発したコイルによる瘤内塞栓術を施行し効果および安全性について検討したい。我々は、cell adhesion,migrationを起こすnoncollagen extracellular matrixであるfibronectinと、bFGFを離脱型コイルにcoatingし、その上に比較的血小板を介さない凝固機序で、内皮細胞増殖、繊維化に影響を与えるhydroxyapatiteに着目しこれを固定化する研究を進めている。これにより、塞栓後2-4週間以内に、動脈瘤頸部の内皮細胞が早期に形成されるように工夫し、これを動物実験による動脈瘤に使用し、安全に完全閉塞が得られるか検討する。1)実験的脳動脈瘤の作成3-4カ月の体重30-40kgの豚3頭を用いて全麻下で両側の頚動脈に静脈-動脈1端側吻合を行いneckが5-6mm、sacが8-10mmの実験的動脈瘤を計6個作成した。ヘパリン4000単位静注にてACT200-250を維持することでヒトと同じ環境下で、塞栓術を行い、大腿動脈からFasguide6Fr+Turbotracker 18にてGDCを用いて塞栓術を施行した。12年1月よりmodified GDCとnormalGDCを一側ずつ塞栓し、1週間後に、豚をsacrify後、瘤を血管と共に摘出し瘤のorificeを含めたマクロの写真をとり、modified GDCで塞栓した瘤のneck付近でfibrin layerに覆われた部分を確認した。今後14日後、一ヶ月後にpsudomembraneが覆うかどうか光顕も加えて観察する予定である。白金コートしたPETフィルムへのfabronectin、bFGFを固定化させたコイルの作成とその物理的特性の評価は、現在実験中である。ヒトさい帯静脈内皮細胞上で固定化されたタンパク質の接着、増殖挙動の評価は本年度に予定している。、塞栓術を施行した。
ファミリーサポートセンターでの病児・病後児対応と支援者コンピテンシーに関する研究

1病児・病後児に対応する際のアドバイザーとしての必要な能力(コンピテンシー)の抽出面接調査のデータから、アドバイザーが意識している役割について分析を行った。その結果、アドバイザーが病児・病後児の預かりで意識している役割として、【ボランティア活動の前提を守る】、【提供会員の量と質を保つ】、【丁寧に確実にマッチングする】、【良好な関係を築く】、【安全な預かりをめざす】の5つのコアカテゴリーが抽出された。コアカテゴリーは25のサブカテゴリー、11のカテゴリーで構成されていた。アドバイザーが意識している役割として、子どもの安全な預かりを目指すこと、求める支援に適切に応じるためのマッチングに関することが多く語られており、それぞれが重要なコアカテゴリーを形成していた。背景として、センター事業に求められる支援の多様化が考えられた。地域での子育ての手助けから始まった相互援助活動が、現在は病児・病後児預かりを含めた多様なニーズに対応するようになってきている。アドバイザーは子どもの病状等から受け入れの判断をし、依頼会員から留意内容を確認して提供会員と共有するようにしていた。また、預かり児の病状の急変やサポーターの家族への感染予防など、予期的危機管理も役割として意識されていた。2病児・病後児対応に関するサポーター、アドバイザー双方の立場からの現状分析アドバイザーの調査から、ファミリーサポートセンターでの病児・病後児預かりについてはマッチングに苦慮することが多く、「依頼は最終的にサポーターが受諾すること」によって成立している現状が明らかになった。一方、サポーターは病児・病後児を預かる際の不安として、病状、1人での対応、未受診の子ども、家族への感染を上げていた。やりがいとしては、子どもとの良い関係、役立っていることの実感、感謝される、子どもの成長が見られるなどが述べられていた。ファミリーサポートセンター事業における病児・病後児対応について、この3年間に依頼会員(援助を受けたい保護者)、サポーター(援助を提供する会員)、アドバイザー(援助活動の支援調整)3者のそれぞれの認識を明らかにしてきた。病児・病後児対応については子どもの安全と安心が第一優先であることから、コーディネートするアドバイザーの対応能力(コンピテンシー)がより重要となるが、病児・病後児対応に焦点をあてたアドバイザーの役割意識に関する分析に予想以上に時間がかかり、平成30年度前半までずれ込んだため、これを基盤として行う質問紙調査の実施が遅れた。しかし、コンピテンシーの構造が明らかになったことから、研究補助期間を延長し、当初計画していた質問紙調査およびプログラムの考案が行える見込みである。ファミリー・サポート・センターでの病児・病後児対応をより安全で安心できるものにするための支援者の行動能力(コンピテンシー)を明らかにし、それに基づいた研修プログラムを考案する。平成2830年度の研究成果に基づき、2019年度に実施する全国のアドバイザーへの調査結果もふまえて、子育て援助活動支援者であるアドバイザーのコンピテンシーについて研究者間で検討し、コンピテンシーリストを作成する。これに基づき、支援者の研修プログラムを考案する。ファミリー・サポート・センターの協力を得て学習会を実施し、内容をブラッシュアップして、最終的な研修プログラムを作成する。平成28年度はファミリー・サポート・センターに関わる三者(利用者である親、サポーター、コーディネーター)に対して面接調査を実施した。(コーディネーターについてはアドバイザーという名称を使用するセンターが多いことから、本報告以降はアドバイザーとする。)調査対象は東北地方A県のファミリー・サポート・センター6か所の利用者、サポーター、アドバイザーであった。それぞれの属性に応じて作成したインタビューガイドに基づき、病児・病後児預かりに関する現状と認識、および課題についてインタビュー調査を実施した。これまでにアドバイザー8名、サポーター15名、利用者5名のデータを得ることができた。この中でアドバイザーについて分析をすすめ、活動概要と病児・病後児対応に関する認識を分析中である。各ファミリー・サポート・センターの運営主体は市直営が3か所、社会福祉協議会・NPO法人、公益法人が各1か所であり、アドバイザーの配置人数は平均2人であった。2施設以外はすべて非常勤採用で、半年1年の任期採用であった。アドバイザーの業務内容は、依頼会員と提供会員のマッチング・調整、トラブル対応、講習会の企画、統計データの取りまとめなど多様であった。活動内容としては保育所・幼稚園への送迎や退園・下校後の預かりが多く、平成27年度の送迎に関わるサポートは全活動の45.2%であった。一方、病児・病後児の預かり・送迎は各センターの活動の1.75.4%であり、「病児・緊急対応強化事業」を行っているA市センターでは219件、6.7%であった。「病児・緊急対応強化事業」を実施しているセンターでは病児・病後児の預かりを前提とした調整や研修が実施されており、原則として病児・病後児を預からないとしているセンターでは、病児・病後児保育室の紹介など、別のサポートにつないでいる状況がみられた。平成28年度の計画として、面接調査の実施を計画していた。サポーター、アドバイザーについては順調にデータ収集が行えており、結果の分析も進行中である。これについては平成29年度に4件学会での報告予定であり、論文も3件投稿している。利用者に対する調査はサポーター、アドバイザーへの調査に比較してやや収集できたデータ数が少ないが、データ収集は今後も順調に継続できる見込みである。平成29年度の研究計画の基盤となる質的データ分析が進行中であり、これにより29年度の質問紙調査の見通しが立っていることから、おおむね順調に推移していると評価する。

平成29年度は、昨年度実施したサポーターとアドバイザーに対する調査の分析を行い、その結果以下のことが明らかになった。1病児・病後児預かりについてのサポーターの認識:対象者14名のうち13名が病児・病後児預かりを経験していた。預かりは乳幼児が多く、発熱、腹痛、下痢、咳嗽等が見られていた。また、インフルエンザ、胃腸炎、風疹の児に対応した例もあった。2名のサポーターが預かり中に熱性けいれんを経験していた。主な活動内容は保育園や学校へのお迎え、祖父母宅への送迎等であり、病院の受診、点滴の付き添い、依頼された買い物、入院時の付添い等も行っていた。病児・病後児を預かる時に不安に思うことについて、【子どもの症状】【症状悪化時に一人で対応すること】【子どもが未受診である】【マッチングをしていない】【家族や自分への感染】が明らかになった。また、病児・病後児を預かる上で気をつけていることについては、【症状の悪化を察知する】【緊急時を想定して備える】【感染予防行動を徹底する】【症状による不快・苦痛に対応する】【子どもが安静に過ごせるように工夫する】【子どもの不安を緩和する】【預かり中の状態を親に報告する】が抽出された。2病児・病後児預かりについての現状とアドバイザーの認識:病児・病後児預かりを行っているA県内5か所の活動の現状とアドバイザー8名の認識を分析した。病児・病後児の受け入れ条件は、「病院受診後であること」「回復期であること」「提供会員が受諾した場合に受け入れる」などで、「感染力の強い感染症は預からない」ことがほぼ共通していた。母親が「就労のためのもしもの対応策」として病児・病後児のみに限定して依頼会員になっている例も多い状況であった。アドバイザーは依頼会員と提供会員の「事前打ち合わせ」を重視して対応していた。平成29年度は、前年度のインタビュー調査の実施が年度末近くになったものもあったことから、未分析のデータが残ったため、それらを加えてサポーター、アドバイザーそれぞれの病児・病後児対応の現状と認識をさらに詳細に明らかにする作業を起こった。これについては平成30年度に3件の学会報告をエントリー済みである。質問紙調査の実施については現在項目作成中で、当初の予定から少し遅れてはいるものの、今年度の前半で実施できる見込みである。1病児・病後児に対応する際のアドバイザーとしての必要な能力(コンピテンシー)の抽出面接調査のデータから、アドバイザーが意識している役割について分析を行った。その結果、アドバイザーが病児・病後児の預かりで意識している役割として、【ボランティア活動の前提を守る】、【提供会員の量と質を保つ】、【丁寧に確実にマッチングする】、【良好な関係を築く】、【安全な預かりをめざす】の5つのコアカテゴリーが抽出された。コアカテゴリーは25のサブカテゴリー、11のカテゴリーで構成されていた。
一分子観察/操作法による細胞間接着の動力学的解析

本研究の目標は、細胞中での構造形成において、細胞はどのように時間的な制約と、エネルギーの節約とをバランスさせているのかを理解することであった。具体的なパラダイムは、E-カドヘリンによる細胞間接着構造の形成であった。本研究では、接触した2細胞にあるカドヘリン間で、まず最初に2数分子間の弱い結合が生起した時に、それがどのようにして多数の分子の集合を誘起するのか、その機構の解明を目的とした。このため、E-カドヘリンを含む再構成ベジクル(内側から金コロイド粒子で標識する)を用い、以下の実験を行った。(1)GFP-E-カドヘリンを強制発現させたMDCK細胞(既に作製済)にカドヘリンベジクルを接触させてカドヘリンの運動を一分子追跡した。この際、カルシウム濃度によって接着の状態を制御した(カドヘリンによる接着はCa2+依存的)。(2)アクチン脱重合剤(サイトカラシンDなど)を用いて、分子の方向性のある挙動の起源を明らかにした。(3)カドヘリンの協同的な集合機構を調べた。本研究の目標は、細胞中での構造形成において、細胞はどのように時間的な制約と、エネルギーの節約とをバランスさせているのかを理解することである。具体的なパラダイムは、E-カドヘリンによる細胞間接着構造の形成である。これは最近、我々の研究室において、生細胞中の1分子を観察/操作する方法に、以下の大きな進展をみたために可能になったものである。(1)世界ではじめて、生細胞中で、個々のGFP分子の観察に成功した。(2)一粒子追跡法において、時間分解能を25μsまで高めた(世界最高速)。(3)金コロイドと抗体のFabフラグメントの結合法を改善し、大抵の細胞膜上の膜タンパク質に対して、1分子ラベルができるようになった。本年度は以下の研究をおこなった。(1)一分子走査光学力顕微鏡を開発した。これは、金コロイド粒子に結合した膜タンパク質をプローブとし、それを捕捉する光ピンセットをカンチレバーとする原子間力顕微鏡で、膜タンパク質1分子をプローブとして、細胞膜中の構造を調べることができるのが特徴である。これを用いて、世界で初めて、生細胞中での膜骨格をイメジングすることに成功した。(2)次に、接触した2細胞にあるカドヘリン間で、まず最初に2数分子間の弱い結合が生起した時に、それがどのようにして多数の分子の集合を誘起するのか、その機構の解明に取り組んだ。このため、GFP-E-カドヘリンを発現する細胞と、E-カドヘリンを含む再構成ベジクル(細胞質側から金コロイド粒子で標識する)の作製をおこなった。さらに、この系を用いて、結合した直後のE-カドヘリン分子1分子の運動を追跡しているところである。接着領域への分子の集合は、単純拡散では説明できない早さでおこるので、自由拡散していた分子が、接着構造へ方向付けられた運動に変化するところを捉えるための努力をおこなっている。
清掃工場周辺の酪農地域における有害元素降下物の同定とそのリスク評価

本研究では清掃工場から大気中に放出され降下物として周辺環境を汚染する有害元素に注目し、平成1213年度に野外調査を実施した。その結果、清掃工場近傍において表面土壌中にアンチモン(Sb)が自然界値を越えて存在し、近傍(300m程度の範囲内)ほどSb濃度が高まっていることが水平分布、鉛直分布から確認された。牧草中Sb濃度も清掃工場から離れると減少すること、洗浄することでSb濃度が減少し、清掃工場から離れると牧草中Sb濃度が減少すること、さらに清掃工場近傍の大気中からSbが検出されることから、Sbは清掃工場に由来する有害元素降下物であると断定できる。野外調査おいて清掃工場に起因するダイオキシン類以外の有害元素として同定したSbに注目し、Sbに関わる人間への健康リスクアセスメントに必要な知見を日本及び日本人について集積し、リスク評価モデルの重要な一部分となる人体内のSb挙動を評価する数学モデルの構造を検討した。その結果、鉛についての体内代謝モデルをSb独自の決定臓器(標的臓器)や排泄機構を考慮して改良することで、Sbについての体内代謝モデル案を構成した。今後は計算シミュレーションを実施して、モデルの改良およびモデルの検証を行ってゆく必要がある。また平成14年度には、牛乳摂取にともなう人間へのSb曝露に関して最も重要な基礎資料となるSbの牧草への経根吸収特性をポット実験により把握した。その結果、ほとんど全ての牧草試料でSbが検出されることから、Sbは牧草に経根吸収されること、葉中Sb濃度が茎中Sb濃度を上回り、Sbは茎よりも葉に濃縮されることがわかった。土壌中Sb濃度が極端に高くなると牧草中Sb濃度は明らかに増加する。その場合、牧草の収穫を重ねても牧草中Sb濃度に変化がほとんどみられないことから、牧草が吸収できるSbの量には上限がある可能性が示唆された。ダイオキシン類を筆頭に清掃工場(焼却炉)から放出される有害物質による環境汚染が危惧されている。特に清掃工場周辺に農地が存在する場合には、農産物への影響が懸念されながらも調査自体がやっと始められたところである。調査項目はダイオキシン類にほぼ限定され、対象は葉菜が中心という現状から、本研究ではダイオキシン類以外の有害元素に注目し、清掃工場から大気中に放出され降下物として周辺土壌環境を汚染する経路を対象に調査した。岩手県は非常に酪農が盛んであり、盛岡市北西部のT村には酪農地域の中に村営の清掃工場(処理能力30t/日:年間焼却量約1万t)があり、本研究の調査地点として最適な条件にある。今年度は清掃工場周辺において、大気中の汚染元素と土壌中の汚染元素を中性子放射化分析法で測定し、大気環境中に放出され、ケミカルフォールアウトとして降下沈着して表層土壌を汚染している元素を同定するとともに高濃度汚染地区を評価することを目的とした。水平方向の元素分布において、清掃工場近傍から水平距離でおよそ1.5kmまでは、急激に土壌中濃度が減少する傾向がアンチモン(Sb)にみられた。水平方向で最も高濃度のSbを示した地点においては、地表面から深さ方向にSb濃度が減少してゆく分布を示している。地表面の2mg/kgを超える濃度から、深さ約5cmまでは直線的に1.5mg/kgまで減少し、その後深さ約12cmまでは、濃度1.5mg/kgでほぼ一定であり、その下層約13cmより深いところで急激に濃度が減少し、1mg/kgより小さい値を示している。

この地域のSbのバックグランド値は、文献や対照地点の検討から高々1mg/kgである。このことから、この地点では、Sbが土壌表面へ蓄積していることを明確に示している。また、同じ地点の大気から6.7×10^<-3>μg/m^3のSbが検出され、対照地点ではSbは検出されなかった。以上の調査結果より、清掃工場が周辺の牧草地を含む表面土壌をSbで汚染していると考えられた。本研究では有害元素に注目し、清掃工場から大気中に放出され降下物として周辺土壌環境を汚染する経路を対象に調査した。M市北西に隣接するT村には酪農地域の中に村営の清掃工場(処理能力30t/日:年間焼却量約1万t)があり、本研究の調査地点として最適な条件にある。今年度は清掃工場の近傍において、大気、牧草(リードキャナリーグラス)、土壌中の有害元素を中性子放射化分析法で測定し、大気環境中に放出され、降下沈着して周辺環境を汚染している元素を確実に同定することを目的とした。水平方向の元素分布において、清掃工場から水平距離でおよそ200mまでの4地点では、土壌中Sb濃度は自然界値(1mg/kg)よりも大きな値(2倍)を示しているが、それを超えて離れるとほぼ自然界値を示した。高いSb濃度を示した牧草地内の土壌中鉛直分布は、地表面から深さ方向にSb濃度が減少してゆく分布を示している。蓄積深さは2cm程度であり、それより深い場所では自然界値を示していた。また、牧草中のSb濃度において、清掃工場から200mまでの3地点では、平均して94μg/kgを示し、牧草もSbで汚染されていることが確認された。さらに離れた地点の牧草中濃度は、不検出28μg/kgであり濃度はかなり減少する。この牧草を水道水で洗浄したところ、清掃工場から200mまでの3地点では、平均して30μg/kgを示し、洗浄しない場合の1/3になった。牧草中のSbは植物表面に付着している成分が多く、水洗いで濃度を半分以下に減少させることが可能である。さらに離れた地点の洗浄済み牧草中濃度は、不検出27μg/kgであり、低濃度になると明確な洗浄効果はみられなかった。清掃工場から200mまでの3地点の大気では、平均濃度5.5x10^<-3>μg/m^3のSbが検出され、昨年の調査結果とほぼ等しい大気中Sb濃度を示した。以上の調査結果より、清掃工場が継続的に周辺の牧草地を含む環境全て(土壌、大気、牧草)をSbで汚染していることが分かった。牛乳については、牧草地所有者の協力が得られず、分析できなかった。本研究では清掃工場から大気中に放出され降下物として周辺環境を汚染する有害元素に注目し、野外調査を実施した。その結果、清掃工場近傍において表面土壌中にアンチモン(Sb)が自然界値を越えて存在し、近傍(300m程度の範囲内)ほどSb濃度が高まっていることが水平分布、鉛直分布から確認された。牧草中Sb濃度も清掃工場から離れると減少すること、洗浄することでSb濃度が減少し、清掃工場から離れると牧草中Sb濃度が減少すること、さらに清掃工場近傍の大気中からSbが検出されることから、Sbは清掃工場に由来する有害元素降下物であると断定できる。野外調査おいて清掃工場に起因するダイオキシン類以外の有害元素として同定したSbに注目し、Sbに関わる人間への健康リスクアセスメントに必要な知見を日本及び日本人について集積し、リスク評価モデルの重要な一部分となる人体内のSb挙動を評価する数学モデルの構造を検討した。
咬合感覚異常症診断に向けての歯根膜感覚閾値検査の確立

超小型アクチュエータを用いて、歯の接触感覚閾値を術者の手技に依存することなく容易に計測できるシステムを確立することに成功した。本システムを応用して正常者および顎関節症患者における歯の接触感覚閾値を計測した結果、正常者においては平均43mN程度,顎関節症患者においては平均53mN程度であることが示され,これらの間には有意差が存在することが明らかになり,本システムが臨床的に応用されうることが示された。咬合接触関係に明瞭な異常がみられないにもかかわらず咬合異常を訴える咬合感覚異常症は、今後その原因・診断・治療についての介入を行う必要性の高い疾患である。歯科を受診した患者のなかで"咬み合わせが落ち着かない","どこで咬めば良いかわからず、違和感がとれない"などの不定愁訴的な訴えのある患者に対して、現状では個々の歯科医師の臨床観察能力のみに頼って補綴再治療の必要性等を判断している状況である。再治療によって症状改善が認められる場合もあるが、治療が奏功しない場合には益々その訴えが強くなるなど診療上のみならず社会的対処にも苦慮する場合もある。これまで、咬合感覚異常症患者、顎関節症患者ならびにブラキシストにおける咬合感覚の変化については臨床経験から示唆されていたが、歯根膜感覚閾値の再現性のある計測方法がないために、これまで正確な評価を行うことができなかった。当該年度には、我々が開発した小型軽量かつ再現性を有するアクチュエータをさらに改良し、今後臨床検査として確立するために必要とされるデータを収集することを目的とした。1)アクチュエータ作動レンジの拡大アクチュエータのフォースレンジを拡大を行った。広い範囲の閾値検査に適合するよう,当初2種類のアクチュエータ作製を検討したが,構造の改良によって1つのアクチュエータによって,012gfの範囲をカバーするアクチュエータの開発に成功した。2)アクチュエータ作動プログラミング上記のアクチュエータの制御について、当初は手動による制御を行うことによって閾値解析を行っていたが,本研究においてコンピュータ制御用のプログラミングを完成させた。制御は、刺激強さ(g・f)、duration、sequenceについて行い、1)ランダムな強さによる刺激、2)上昇法による刺激、3)下降法による刺激について半自動計測を実施できるシステムを完成した。これにより、本閾値計測から測定者バイアスを取り除くことが可能となった。3)『定度』の評価定度を評価するために、顎口腔機能に異常を認めない被験者について、歯根膜感覚の反復計測を行い,良好な定度がえられることが確認された。咬合接触関係に明瞭な異常がみられないにもかかわらず咬合異常を訴える咬合感覚異常症は、今後その原因・診断・治療についての介入を行う必要性の高い疾患であると考えられる。本研究は、我々が開発した小型軽量かつ再現性を有するアクチュエータをさらに改良し、今後臨床検査として確立するために必要とされる歯根膜感覚閾値データを収集することを目的としている。本年度は健康成人60名を対象としたブラキシズムスクリーニングならびに顎機能診査を実施した。被験者に対しては本学倫理委員会で承認を受けたインフォームドコンセントを行い,さらにスクリーニングのためのブラキシズム記録が不完全であったものを除外した結果,対象は32名となった。各被験者は歯根膜感覚閾値測定前夜に夜間筋電図を採得し,睡眠中の咬筋筋活動時間を計測した。歯根膜感覚閾値の計測に際しては,計測時の環境因子のコントロールのために、ヘッドホーンを装着しノイズ音によって機能的なシールドを行うとともに、アイマスクを装着した。これらの被験者における夜間睡眠中の咬筋筋活動記録における20%MVC以上の総筋活動持続時間は20.6秒885.4秒(平均249.1秒)であった。これらのうち,総筋活動時間が3分間未満(平均総筋活動時間:100.3秒)の被験者における上顎大臼歯の撃力に対する平均歯根膜感覚閾値は39.6±13.8mNであった。一方,総筋活動時間が3分間以上(平均総筋活動時間:398.0秒)の被験者における上顎大臼歯の撃力に対する平均歯根膜感覚閾値は33.6±9.1mNであった。咬合接触関係に明瞭な異常がみられないにもかかわらず咬合異常を訴える咬合感覚異常症や顎関節症患者ならびにブラキシストにおける咬合感覚の変化については歯根膜感覚閾値の簡便かつ再現性のある計測方法がないために、これまで正確な評価を行うことができなかった。

本研究においては、独自に開発した小型軽量かつ再現性を有するアクチュエータを用いて,正常有歯顎者ならびに顎機能異常患者を対象として,歯根膜感覚閾値データを収集した。被験者として,岡山大学病院補綴(咬合・義歯)科顎関節症外来を受診した患者20名を対象とした。また,顎口腔機能に自覚的他覚的に異常を認めない正常被験者20名を対照群とした。顎機能に関する臨床診査は、バイアスを避けるために、診査トレーニングを受けた1名の検者が診査を行った。歯根膜感覚閾値の計測は上顎左側第一大臼歯を対象として実施した。計測に際しては環境因子のコントロールのために、ノイズキャンセリングヘッドホーンを装着しピンクノイズによって機能的なシールドを行った。アクチュエータによる撃力刺激はコンピュータ制御下に下降系列を用いて実施した。結果として,顎関節症群における左側上顎第一大臼歯の撃力刺激に対する感覚閾値は平均約53±14mNであり,正常対照群における同閾値は約43±10mNを示した。これら2群の平均値間には有意な差が認められた。また,顎関節症の病態によっても歯根膜感覚閾値は異なっている可能性が示唆され,今後の臨床応用への可能性および有用性が強く示唆された。