hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カロリ病モデルPCKラットの肝内胆管上皮細胞の増殖機構の解明とその制御

【成績】1.培養胆管上皮細胞を用いた検討:PCKラットの培養肝内胆管上皮細胞はEGF刺激に対し,コントロール(SD)ラットの胆管上皮細胞と比較して約2倍の増殖活性を示した。ウエスタンブロット法による検討では,EGF刺激下の培養胆管細胞において,PCK,コントロールラットともERK1/2は強く発現していたが,p-MEK1/2,p-ERK1/2の発現は殆どなく,一方,MEK5はPCKラットの培養胆管細胞で発現増強がみられ,これに対応してp-ERK5の発現もPCKラットで強かった。古典的MAPK阻害剤(PD98059,U0126)を用いたMAPK阻害実験では,PCK,コントロールラットいずれも培養胆管細胞の増殖活性は阻害されなかったが,MEK5に対するsiRNAおよびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(ZD1839)はPCKラットの培養胆管細胞の増殖を有意に抑制した。2.in vivoでのZD1839投与:PCKラットにZD1839を連日投与したところ,肝内胆管拡張は有意に抑制された。しかし,予想に反して腎嚢胞形成は全く抑制されなかった。【まとめ】PCKラットの肝内胆管上皮細胞の増殖には,MEK5-ERK5シグナル伝達系の亢進が関与していることが示された。また,in vivoでの検討結果から,肝内胆管拡張と腎嚢胞形成のメカニズムは異なることが示唆された。ヒトカロリ病のモデル動物とされるPCKラットを用いて,本年度は,上皮成長因子(EGF)の主要な細胞内シグナル伝達系であるMAPK,特に古典的MAPK(MEK1/2-ERK1/2)とMEK5-ERK5系に着目し,PCKラットの肝内胆管上皮細胞の増殖機構を検討した。【成績】(1)免疫組織化学的検討:肝組織切片上でのEGFの発現は,胆管周囲の肥満細胞に認められ,また,EGFレセプター(EGFR)はPCK,コントロール(SD)ラットとも胆管上皮細胞にびまん性に発現していた。リン酸化(p)-ERK1/2の局在は胆管上皮細胞に散在性にみられるのみであったが,p-ERK5は胆管上皮細胞びまん性,かつPCKラットにおいて陽性シグナルの強度が強かった。(2)培養胆管上皮細胞を用いた検討:PCKラットの培養肝内胆管上皮細胞はEGF刺激(20ng/ml)に対し,コントロールと比較して約2倍の増殖活性を示した。ウエスタンブロット法による検討では,EGF刺激下の培養胆管細胞において,PCK,コントロールラットともERK1/2は強く発現していたが,p-MEK1/2,p-ERK1/2の発現は殆どなかった。一方,MEK5はPCKラットの培養胆管細胞で発現増強がみられ,これに対応してp-ERK5の発現もPCKラットで強かった。古典的MAPK阻害剤発現増強がみられ,これに対応してp-ERK5の発現もPCKラットで強かった。【まとめ】PCKラットの肝内胆管上皮細胞の増殖には,古典的MAPKの関与は低く,MEK5-ERK5シグナル伝達系の亢進が関与していることが示された。【今後】PCKラットにin vivoでZD1839を投与し,肝嚢胞形成が抑制されるか否かを検討する。
現代イランの女性労働

本研究では計4回の現地調査を行った。第1回目の調査ではイランの首都テヘラン市を中心に女性たちの生活実態把握のアンケート調査を行った。この調査では就業中の女性のみならず非労働力人口にカテゴライズされる女性たちにも着目した。その結果,NGOやコミュニティ活動など,社会貢献活動に従事する女性が多く確認された。そこで第2回目以降の調査では分析対象を社会貢献活動にフォーカスして事例を集めながら,現地における女性の「仕事」「役割」について検討した。また,現地のイスラーム思想の研究者とも情報交換を重ね現地の固有事情の整理に努めた。独自の内発的発展理論を掲げる現代イランでは,男女の役割や社会的配置がイスラーム・ベースの世界観によって導き出されている。申請者はこれまで,同国女性が係わる労働市場を対象に現地調査を行ってきたが,その全体構造を解明するにあたり統計的な評価と実態が大きく乖離しているという問題がある。こうした“女性の活動の見えづらさ"には,イスラーム的価値観が大きく影響しているため,イラン女性の活動状況を把握するためには,労働市場のみを対象とするのではなく現地の思考様式と生活実態を考慮した調査設計が重要となる。本研究はテヘラン市を主なフィールドに,私的領域や地域社会におけるイラン女性の活動全般の事例分析を重ね,それと同時に労働市場への関与のあり方も検討することで,同国における女性の社会的配置の解明を目指すものである。以上の問題関心をもとに,今年度は2度(第1回目:2014年9月,第2回目:2015年2月3月,調査期間はそれぞれ2週間)の現地調査を行った。第1回目の調査では,主婦・学生・就業者などさまざまな活動状況の女性を対象に,ライフヒストリーや家事の負担状況ならびに余暇活動に関するアンケート調査を行った。なおこの調査では,テヘラン市の特徴を相対化するために,地方都市に住む女性からも回答を募った。この調査結果をもとに,第2回目の調査ではテヘラン市でNGOや宗教施設との結びつきが強い伝統的な慈善組織における女性の活動状況を検討するべく,インタビュー調査を行った。二度の調査を通じて,市場外での財・サービスのやり取りにイスラーム的価値観が少なくない影響を与えていること,思考様式と行動パターンについては在来のものと外来のものが相互に作用し合い社会状況を改善させるための活動が促進されていること,そして統計上は主婦と分類される人々が社会貢献活動に活発に関与していることー以上の事実が確認された。平成27年度はテヘラン市を主なフィールドに、労働市場だけではなく私的領域や地域社会におけるイラン女性の活動全般について収集した文献や調査データを元に分析を進めた。このようにイランにおける女性の活動領域を重層的に捉えることで、同国女性の「仕事」の領域や社会的配置の構造的な把握を目指した。その成果として、まずはイラン的概念の整理を進めたことが挙げられる。今年度も現地調査を2回行ったが(第1回:2015年9月、第2回:2016年2月3月)、第1回の調査ではイスラーム文化思想研究所(本部:テヘラン、支部:ゴム)で、イスラーム法学者や現地の家族社会学の専門家へのインタビューを重ねた。これにより行動様式の決定要因として「家族」と「個人」がイスラーム社会論的見地からどのように構造化されているか、「利他行為」「利己行為」の峻別をどのようになすべきかなど、現地における最新の学説動向の把握を行った。イラン女性の活動実態については、教育、環境保護、弱者救済、コミュニティ活動等、様々なNGO組織で就業中ないしボランティアに従事する女性にそれぞれアプローチした。その結果、教育機関からキャリアが連続的かつ複線的に形成されている事例が少なくないこと、性別役割規範が就業/ボランティア活動に大きく影響することが確認された。さらに、イラン社会全般の潮流として、貧困や環境問題、公共マナーなど社会問題が広く認知されつつあること、以前よりも組織活動が実践しやすい政治環境になったこと、これらの帰結として女性が経済・社会環境を向上させるための担い手として活動する素地が再編・強化されつつあることー以上の一端が確認された。経済制裁解除の決定以降、イランは現在歴史的転換点に差し掛かっていると言える。これまでの研究領域の空白を埋めると同時に、同国社会の変化とその方向性について、その一端を解明しえたものと考える。当初の計画では,第1回目調査で「大学生」,「就業者」,「主婦」といった活動カテゴリーを念頭に置き,それぞれの基本属性の特徴,活動状況の把握と傾向分析,今後のライフコースの設計を検討し,第2回目の調査で家庭内における意思決定プロセスやそこでの裁量の実態を明らかにしていく予定だった。しかし第1回目の調査で,普段の生活の中で社会貢献活動に携わる女性が多いことが明らかとなったため,第2回目の調査で「社会貢献活動」にフォーカスして検討することとした。

これによって「再生産領域」を家庭内に限定せず,社会的に拡大させて特徴づけることが可能となり,しかもイラン女性が携わる「生産領域/再生産領域」の全体構造の解明が期待される。このように,分析視角や調査対象を検討し直し,即座に調査設計に反映させたことで,現代イランの社会コンテクストから以下の論点を掴みつつある。一つはコミュニティベースの慈善活動がハレとケの両方をカヴァーしうるよう組織化され行われていること,第二にイスラームに由来する慈善活動が社会保障制度や公的教育制度の間隙を埋める役割を果たしていること,第三にかかる状況はイスラーム共和制という独特の政体の下で活性化していること,そして様々な女性の活動ニーズをカヴァーし,且つ女性の潜在能力が有機的に活用されていることである。「イラン女性について生産領域と再生産領域という両側面からのアプローチを通して,その現代的特徴の解明」を目指すという本研究の目的意識をより深化させる形で調査が進展している。また文献ベースの調査についても,イランにおける社会貢献組織に関する法制度や量的資料の収集・分析を順調に進めている。以上より,本研究は当初の計画以上に進展しているものと判断される。27年度が最終年度であるため、記入しない。途上国経済論今後の課題として第一に,社会貢献活動を提供側だけではなく受容する側の状況も合わせて検討することが挙げられる。また,こうした社会貢献活動を次期5ヵ年計画で重点的に促進するための議論が進められている。したがって,かかる活動の管理と活用に関する政策体系の把握も重要となる。加えて,イスラーム的倫理観やそれに基づいた性別役割規範と社会貢献活動がどのように作用し合っているのか,また生産領域/再生産領域における活動の連関性など,課題の全体構造を明らかにする上で検討すべき論点も多い。他方で,イラン独特の現地事情もあり,調査の実施が予定通りに進められるかどうかといった懸念がある。この点については,現地の研究機関とやり取りを重ね信頼関係を構築し現地調査の際には身分を保証してもらう,オンライン上で実施可能な調査については積極的にそうした方法を採用するなど,調査・研究する上で懸念されるカントリーリスクのマネジメントにも積極的に取り組んでいくものとする。なお,既にイスラーム系の現地研究機関とのやり取りは進めており,良好な返事を受け取っている。より多くの事例を検討することで具体的な状況を把握し,イラン女性の活動実態を明らかにしていきたい。
O型糖転移酵素GALNTによる低活性型proBNP糖鎖修飾及び分泌制御機構の解明

脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心保護座要を持つ生理活性ペプチドで、心負荷に応じて主に心室から分泌され、心不全のバイオマーカーとしてその有用性が確立している。近年BNPの前駆体であり、生理活性の弱いproBNPが血中に存在し、不全心において、その分泌が亢進していること、proBNPは糖鎖修飾されていることことなどが報告されてきた。本申請研究では、proBNPの糖鎖修飾・分泌調節に関与するO型糖転移酵素GALNTの役割及びそのmicroRNAなどによる発現調節機序の詳細を明らかにすべく、研究を進めている。本年度は前年度に引き続きproBNPの糖鎖修飾に関与するGALN1及びGALNT2の遺伝子発現調節にmicroRNAであるlet-7の関与について検討し、let-7がGALNT1及びGALNT2の発現調節に関与している可能性を示唆する知見を得た。またシアル酸転移酵素のproBNP糖鎖修飾およびそれに伴うproBNPからBNPへのプロセシングへの関与についてシアル酸転移を生じない変異CHO細胞を用いて検討したところ、proBNPの糖鎖修飾にシアル酸転移酵素が関与している可能性を示唆するデータを得た。更に質量分析を用いた糖鎖構造解析については、野生型ヒトproBNP、及び糖鎖結合を欠如した変異体ヒトproBNPの遺伝子を導入した培養細胞の培養上清を採取し、そこからproBNPを抽出したものを用いて解析をするため、高濃度proBNPを得るためビーズ付きの抗体やカラムでの精製も試みたが、質量分析計での評価で部分的な構造は明らかにしつつあるが今後も継続して解析の予定である。脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心保護作用を持つ生理活性ペプチドで、心負荷に応じて主に心室から分泌され、心不全のバイオマーカーとしてその有用性が確立している。近年、BNPの前駆体であり、生理活性の弱いproBNPが血中に存在し、不全心においてその分泌が亢進していること、proBNPは糖鎖修飾されていることなどが報告されてきた。申請者はproBNPの糖鎖修飾および分泌調節機序の解明に取り組み、既に心筋細胞においてproBNPのN末端に存在するO型糖鎖結合がproBNP分泌に強く関与することなどを明らかにしてきたが、本申請研究ではproBNPの糖鎖修飾・分泌調節に関与するO型糖転移酵素GALNTの役割及びそのmicroRNAなどによる発現調節機序の詳細を明らかにすべく研究を進めている。平成28年度は、糖鎖修飾を介したproBNP分泌制御へのGALNT1,2の関与、及びその発現調節機構におけるmiR-30の関与について検討した。ヒトBNP遺伝子を導入した新生仔ラットの培養心筋細胞(NRVMs)において、肥大刺激はGALNT1、2発現を増加させ、かつ培養上清中のproBNP分泌割合を亢進させた。GALNT1,2のノックダウンは培養上製中のproBNPの割合を増加させた。GALNT1及び2の3'非翻訳領域に共通してmiR-30の認識配列が存在し、肥大刺激によりmiR-30の発現が低下すること、またNRVMsへのmiR-30の過剰発現によりGALNT1及び2の発現が減少し、proBNPの分泌割合が有意に減少することを見出した。これらによりmirR-30-GALNTsによるproBNP分泌調節機序が明らかとなった。糖鎖構造解析についてはproBNPの高濃度の抽出が困難で試行錯誤を加えているところであるが、他について概ね順調に進展していると考える。前年度はGANT1およびGALNT2の関与、及びその発現調節におけるmiR-30の関与について、検討し、miR-30-GALNT1/2によるproBNP分泌調節機序について明らかにしたが、平成29年度は、前年度に引き続き、let-7についての検討を進める一方で、シアル酸転移酵素についての関与について、シアル酸付加不全変異細胞(CHO-Lec2細胞)を用いた検討をした。具体的にはCHO-Lec2細胞にレンチウィルスを用いてヒトproBNP遺伝子及び、糖鎖修飾を欠如した変異体ヒトproBNP遺伝子を導入し、その培養上清中のproBNP及びBNPを測定し、その割合を測定することにより、シアル酸転移酵素がproBNP分泌に関与していることを示唆するデータを得つつある。また糖転移酵素によるproBNP糖鎖構造への影響についての解析のために、質量分析を用いて糖鎖構造解析についても進めている。野生型ヒトproBNP、及び糖鎖結合を欠如した変異体ヒトproBNPの遺伝子を導入した培養細胞の培養上清を採取し、そこからproBNPを抽出したものを用いて解析を試みているが、もともと存在する濃度が薄く、高度の濃縮が必要となり、ビーズ付きの抗体やカラムでの精製を試みている。

概要にも述べたが、糖鎖構造解析において高濃度のproBNPサンプルが必要であり、培養細胞を用いた変異体を含む種々のproBNPを含む培養上清からのproBNPの抽出が困難であることや、変異培養細胞を用いたシアル酸転移酵素に関連した実験についても、シアル酸転移欠損変異培養CHO細胞では、proBNPのプロセシング酵素であるfurinの発現が低く、糖鎖によるプロセシングの違いの評価が困難であったため外来性にfurinを導入するなどの工夫が必要となったことなどより、予定より研究の進捗が少し遅れ気味となった。脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心保護座要を持つ生理活性ペプチドで、心負荷に応じて主に心室から分泌され、心不全のバイオマーカーとしてその有用性が確立している。近年BNPの前駆体であり、生理活性の弱いproBNPが血中に存在し、不全心において、その分泌が亢進していること、proBNPは糖鎖修飾されていることことなどが報告されてきた。本申請研究では、proBNPの糖鎖修飾・分泌調節に関与するO型糖転移酵素GALNTの役割及びそのmicroRNAなどによる発現調節機序の詳細を明らかにすべく、研究を進めている。本年度は前年度に引き続きproBNPの糖鎖修飾に関与するGALN1及びGALNT2の遺伝子発現調節にmicroRNAであるlet-7の関与について検討し、let-7がGALNT1及びGALNT2の発現調節に関与している可能性を示唆する知見を得た。またシアル酸転移酵素のproBNP糖鎖修飾およびそれに伴うproBNPからBNPへのプロセシングへの関与についてシアル酸転移を生じない変異CHO細胞を用いて検討したところ、proBNPの糖鎖修飾にシアル酸転移酵素が関与している可能性を示唆するデータを得た。更に質量分析を用いた糖鎖構造解析については、野生型ヒトproBNP、及び糖鎖結合を欠如した変異体ヒトproBNPの遺伝子を導入した培養細胞の培養上清を採取し、そこからproBNPを抽出したものを用いて解析をするため、高濃度proBNPを得るためビーズ付きの抗体やカラムでの精製も試みたが、質量分析計での評価で部分的な構造は明らかにしつつあるが今後も継続して解析の予定である。平成28年度の研究で得られた成果を受けて、proBNPの分泌機序について、シアル酸転移酵素の関与や、miR30-GALNT経路以外の制御機構についても検討を進めていく。またproBNPの糖鎖構造解析についても進めていく。その際、糖鎖構造解析に必要なproBNPの精製については、抗体の結合した金属ビーズなどを利用した抽出、精製法も検討している。今後については、糖鎖構造解析のための高度に精製されたproBNPを得るための手法が重要であるが、まず培養細胞上清由来のproBNP抽出についてはビーズ付きの抗体やカラムでの精製を試みている。また一方で、患者検体のproBNP値の測定から、proBNP濃度が非常に高値である患者検体が存在し、proBNPやNT-proBNPを患者検体から抽出し、それを分析することも検討している。なお患者検体での解析については京都大学医の倫理委員会の承認を得ている。これらの方法によってproBNPの糖鎖構造解析を進め、その手法や結果に基づいて、実験計画書に則り、種々の条件下での心筋細胞からのproBNPや種々の疾患における血中proBNPについて、その糖鎖構造解析をするなど、研究を進めて予定である。
新規抗アレルギー食品成分シフォナキサンチンの有効利用のための基盤構築

海ぶどうなどの食用海藻に含まれるカロテノイドのシフォナキサンチンについて、個体レベルでの抗炎症作用の評価と既知の抗アレルギー食品成分との併用効果の検討を進めた。シフォナキサンチンの経口摂取によって、マウスの皮膚炎症状が改善する可能性が示された。予想外なことに、皮膚にはシフォナキサンチンよりもむしろシフォナキサンチンの代謝産物の方が多く蓄積しており、今後はそれらの代謝産物の抗炎症作用も明らかにする必要がある。また、シフォナキサンチンの抗炎症作用を増強するような食品成分の発見には至らなかったが、ビタミンE類などによって、シフォナキサンチンの消化管吸収が阻害される可能性が見つかった。申請者は、食用緑藻に含まれるシフォナキサンチンが、細胞膜の構成成分であるスフィンゴミエリンを増加させることによって、マスト細胞の活性化を強く抑制することを見出している。そこで本研究では、この研究成果をさらに深化させ、シフォナキサンチンを新規のアレルギー体質改善食品成分として有効利用するための基盤の構築を目的とした。平成27年度は、実験動物モデルを用い、個体レベルでのシフォナキサンチンの抗アレルギー作用の評価を進めた。シフォナキサンチンは、有機溶媒を用いてミルから抽出し、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーと逆相HPLCを組み合わせて純度97%以上にまで精製したものを用いた。また実験動物はNC/Ngaマウスを用いた。剃毛した背部皮膚および耳介にジニトロフルオロベンゼンを複数回塗布することによってアトピー性皮膚炎を発症させ、その後、胃ゾンデを用いてシフォナキサンチンを1週間毎日経口投与した。なお、シフォナキサンチンは、タウロコール酸、オレイン酸、モノオレイン、リゾホスファチジルコリンと共にミセル化してマウスに投与した。炎症マーカーとして耳介の厚さ(耳介浮腫の程度)を電子ノギスを用いて測定したところ、ジニトロフルオロベンゼン塗布によって有意に厚みが増し、2 mg/kgbody weightのシフォナキサンチンの経口投与によって、それが有意に減少した。しかしながら20 mg/kgbody weightのシフォナキサンチン投与では抑制効果が認められなかった。高濃度の投与で抑制作用が認められなかった原因については、現在のところ不明であり、さらなる検討が必要と考えている。また耳介や背部皮膚組織における炎症関連遺伝子の発現レベルについては、現在検討中である。個体レベルでの評価を実施し、さらなる検討が必要と考えられるものの、低用量においてシフォナキサンチンの抗アレルギー作用が認められたことから、研究は順調に進展していると言える。医薬品とは異なり、食品は自由に選択され、自由なタイミングで摂取される。そのため、研究代表者らが注目している新規食品機能性成分シフォナキサンチンをより良く利用するためには、同時に摂取され得る他の食品成分、特に他の抗アレルギー食品成分との相互作用について検討する必要がある。そこで本年度は、抗アレルギー作用が報告されているビタミンE類やポリフェノール類に注目し、ヒト結腸がん由来細胞株Caco-2から成る小腸上皮様モデルを用いて、それぞれの食品成分がシフォナキサンチンの消化管吸収に与える影響を評価した。その結果、α-トコフェロールとγ-トコトリエノールは、シフォナキサンチンと同時に添加した際に、Caco-2細胞によるシフォナキサンチンの取り込みを強く抑制することを見出した。また、これらのビタミンE類は、前処理ではシフォナキサンチンの取り込みを抑制しなかったため、何らかの競合阻害によって取り込みを抑制するものと考えられた。一方、ビタミンE類とは逆に、ルテオリンは前処理によってシフォナキサンチンの取り込みを有意に抑制したが、同時に添加した際には取り込みに影響を与えなかった。研究代表者らのこれまでの研究から、Caco-2細胞によるシフォナキサンチンの取り込みの少なくとも一部にはNPC1L1が関与していることがわかっている。またNPC1L1は、α-トコフェロールやγ-トコトリエノールの消化管吸収に関与していることが報告されており、さらにルテオリンはNPC1L1の発現量を低下させることが報告されている。以上のことから、NPC1L1によって小腸上皮細胞に取り込まれるような食品成分やNPC1L1の発現量を変化させるような食品成分は、シフォナキサンチンの消化管吸収に影響を与え得ると予想された。現在のところ、シフォナキサンチンの消化管吸収を増加させるような食品成分や抗アレルギー作用を増強するような食品成分の同定には至っていないが、消化管吸収メカニズムや抗アレルギー作用の作用メカニズムの一端は明らかになりつつあり、シフォナキサンチンの有効利用のための基盤の構築に向けて、順調に進展していると言える。申請者は、クビレズタ(海ぶどう)などの一部の食葉緑藻に含まれるカロテノイドのシフォナキサンチンが、細胞膜の構成成分であるスフィンゴミエリンを増加させることによって、マスト細胞の活性化を強く抑制することを見出している。マスト細胞の活性化を抑制する化合物には、花粉症などのI型アレルギーの症状を緩和する効果が期待されるため、本研究では、シフォナキサンチンを新規のアレルギー体質改善食品成分へと昇華させるべく、個体レベルでの評価や他の抗アレルギー食品成分との相互作用(食べ合わせ)の評価を進めてきた。NC/Ngaマウスの耳介にジニトロフルオロベンゼンを反復塗布することによって動物モデルを作成し、シフォナキサンチンの経口投与による症状の緩和度合いを評価したところ、2 mg/kgbody weightのシフォナキサンチンの経口投与によって、耳介の腫れが緩和されることが確認できた。

このことからシフォナキサンチンは個体レベルでも抗アレルギー作用を発揮すると考えられた。同時に、シフォナキサンチンはマウス体内において酸化的に代謝されることも見出し、マスト細胞が局在する真皮においても、シフォナキサンチンの酸化的代謝物が蓄積していたことから、それら代謝産物の生物活性について興味がもたれた。シフォナキサンチンと他の抗アレルギー食品成分の相互作用の評価では、ポリフェノール類とビタミンE類に注目し、消化管吸収における相互作用と炎症反応における相互作用の両方を、培養細胞モデルを用いて評価してきた。その結果、α-トコフェロールやγ-トコトリエノールが共存することによって、シフォナキサンチンの培養細胞への取り込みが抑制されることを見出した。一方、シフォナキサンチンの抗炎症作用(マスト細胞活性化抑制作用)を相乗的に増強するような成分は、本研究に供試したポリフェノール類の中には認められなかった。海ぶどうなどの食用海藻に含まれるカロテノイドのシフォナキサンチンについて、個体レベルでの抗炎症作用の評価と既知の抗アレルギー食品成分との併用効果の検討を進めた。シフォナキサンチンの経口摂取によって、マウスの皮膚炎症状が改善する可能性が示された。予想外なことに、皮膚にはシフォナキサンチンよりもむしろシフォナキサンチンの代謝産物の方が多く蓄積しており、今後はそれらの代謝産物の抗炎症作用も明らかにする必要がある。また、シフォナキサンチンの抗炎症作用を増強するような食品成分の発見には至らなかったが、ビタミンE類などによって、シフォナキサンチンの消化管吸収が阻害される可能性が見つかった。医薬品とは異なり、食品は、人々によって自由に選択され、自由なタイミングで摂取される。そのため、食品機能性成分となるシフォナキサンチンが、他の食品成分、特に他の抗アレルギー食品成分と同時に摂取されることが容易に予想される。そこで、小腸上皮からのシフォナキサンチンの吸収における、他の食品成分との相互作用の有無を検討する。具体的には、ヒト結腸がん由来細胞株Caco-2を小腸上皮様に分化させ、様々な食品成分がシフォナキサンチンのCaco-2細胞への蓄積に与える影響を調べる。また、マスト細胞の脱顆粒反応についても、同様の相互作用の有無の検討を行い、シフォナキサンチンの抗アレルギー作用を増強するような食品成分の探索を試みる。シフォナキサンチンと他の食品成分の相互作用は、小腸上皮細胞のみならず、マスト細胞においても起こり得る。そのため、マスト細胞に作用することによって、シフォナキサンチンの抗アレルギー作用を増強するような食品成分の探索を進めることも重要である。昨年度までも同様の検討は進めていたが、大きな成果は得られていない。そこで本年度は、徐々に明らかになってきたシフォナキサンチンの抗アレルギー作用メカニズムに注目して探索を進める。
大電流遮断後における残留アークの温度低下過程に関する研究

本研究では,電力用遮断器におけるアーク遮断現象の基礎的解明を目的としている。,次に示すように,アーク遮断直後の残留アークの温度を実測することができた。このような残留アークの温度測定例は極めて少なく,非常に重要な基礎データである。・鉄蒸気が高温SF_6ガスに混入した場合において,Fe原子スペクトル線の放射強度の温度依存性を理論的に計算した。この結果,波長426nmおよび443nmのスペクトル線は,放射強度が極めて強いことを明らかにした。しかも,上準位のエネルギーレベルの差が2.6eVと十分に大きいので,それらの放射強度比から精度良く温度を測定できる。・SF_6ガス吹付け平板状消弧室において,意図的に電極材料を鉄として,アーク中に鉄蒸気を混入させた。先のスペクトル線を,ノズルスロート部およびその上下流側それぞれ2地点で観測した。いずれの観測位置においても,電流零点から100μsまで観測することができた。この観測には,今回購入したスペクトル観測装置を使用した。・2本のスペクトル線の強度比から相対強度法を利用して,残留アークの温度を算出した。電流零点前60μsにおいては,温度はノズルスロート部で極大値5,900Kを示す。その後,この位置の温度は,他の位置の温度よりも急速に低下し続ける。電流零点後100μsには,4,200Kにまで低下し,他の位置の温度よりも低くなることを明らかにした。
養殖魚の摂餌量促進のための自発摂餌システムの改良に関する研究

これまでの研究から、自発摂餌の改良課題が2点明らかになってきた。第1点は、スイッチ起動魚が少数であるため、もっと多くの魚の食欲を満たすよう改良することである。第2点は、水槽毎に設置する自発摂餌装置を削減してコストを節約することである。そこで、本研究では自発摂餌スイッチ信号を複数で相互利用(以下「連動」と呼ぶ)し、(1)スイッチ起動魚の増加と、(2)装置削減による効果について調べた。ニジマス各10個体の水槽を2基連動させ、合計9組の連動水槽(合計18水槽)で実験した結果、連動によって9組すべての1日当たりの摂餌量が増加した。連動期間中、スイッチ起動の不安定や減少など、他方依存型の水槽もみられたが、連動による信号の相互利用により、両水槽とも安定した摂餌量が得られた。連動解除後、12水槽中9水槽が直後から、他の3水槽でも10日以内にスイッチ起動数増加と安定摂餌がみられた。連動自発摂餌の実用化の可能性を探るため、研究期間を平成16年度まで延長し、大型水槽を用いて飼育尾数を増やし、二水槽の連動によって摂餌量、成長率、残餌率にどのような影響が現われるのか検討した。また、15年度後半に飼育尾数を1水槽あたり100尾に増やす計画を立てたが、何度か病気が発生したため、1水槽50尾の結果のみで評価した。その結果、連動水槽では単独よりも有意に摂餌量が高く、それに伴って成長率も高くなる一方、残餌率に有意差が認められないことから、飼育尾数を増やしても連動によるメリットがより顕著となる結果が得られた。以上の結果から、連動自発摂餌によって、(1)両水槽のスイッチ起動総数の増加、水槽間の補完的作用による摂餌量増加と摂餌安定性が認められた。また、(2)連動水槽の信号を自動給餌器へ伝送することにより、全ての水槽に自発摂餌装置を用いなくても食欲対応型の給餌を行えることが明らかとなった。自発摂餌は自動給餌や手撒き給餌に比して養魚技術として多くの利点があることが明らかになってきたが、自発摂餌に特有な新たな課題も持ち上がってきた。例えば、自発摂餌装置はそれぞれの水槽に必要であること、また、優占魚の食欲に基づいているため水槽によって起動総数の差,給餌量の差,水槽間の成長のバラツキなどを生じる可能性、などがあげられる。そこで、上記の問題点を改善する目的で連動型自発摂餌に関する研究を行った。平成14年度はシステムの開発、および同システムを使用した小個体群レベルの実験を行った。連動型自発摂餌システムは、少数の特定水槽の起動信号を他の水槽に利用することが基本となっている。そこで、通常の単独自発摂餌で一定期間飼育した後、自発摂餌が活発な2水槽を選択し、これらの起動信号を相互に利用することにより、対になっている相手方へも給餌を行った。実験魚としては体重約80gのニジマスを各水槽に10尾ずつ入れ、また、連動水槽は複数使用した。その結果、(1)自発摂餌が連動前とほぼ同様に行われ、結果的に給餌量が増加した連動水槽があった。しかし、(2)一方が連動前と変わらない自発摂餌を行い、他方の自発摂餌活動が減少する事例がみられたが、両水槽とも結果的に給餌量は同量に保たれた。

(2)のように、片方が自発摂餌を減少させた理由としては、本システムでは連動相手からの信号で給餌されることは自動給餌される状態に等しいことが一因になっているものと考えられる。また、本実験で用いた報酬量は、単独自発摂餌の時と同量であったため、今後は連動型自発摂餌のための報酬量の設定が必要になる。今後さらに連動型の実験例数を増やす計画である。これまでの自発摂餌の研究から、従来の給餌法には見られない特有の問題が2点浮かび上がってきた。第1点は、群れ飼育の場合にスイッチを起動する魚が少数に限られるため、群れ全体に給餌されても必ずしも群れ全体の魚の食欲を満たす給餌が行われない可能性があることである。第2点は自発摂餌装置が水槽ごとに必要なため高価になるという問題である。装置と経費の削減は養殖に応用する際の重要課題である。本研究では複数の自発摂餌装置のスイッチ信号を相互に利用する方法(以下「連動」と呼ぶ)を考案し、(1)スイッチ起動魚の増加、および、(2)自発摂餌装置削減の可能性について調べた。各水槽にニジマス10個体以下からなる水槽を2基連動させ、合計9組の連動水槽(合計18水槽)を用いて実験を行った。その結果、連動によって9組とも1日当たりの摂餌量は増加した。連動期間中、連動水槽の一方でスイッチ起動の不安定、一時的停止など、他水槽依存の摂餌が原因と考えられる変化がみられた。しかし、連動によって信号が相互に補完されたため、連動されたそれぞれの水槽において安定した摂餌量が得られた。連動解除後のスイッチ信号変化と摂餌量を6組で測定した結果、12水槽中9水槽で解除直後にスイッチ信号数が増加し、安定した摂餌量が得られた。他の3水槽においても10日以内に摂餌信号数が増加し、摂餌量が回復した。以上の結果から、自発摂餌水槽を連動させることによって、(1)両水槽のスイッチ起動回数が同等のレベルで加算的には増加しないが、合計起動回数は増加し、摂餌量は増加した。また、一方のスイッチ起動に変動があっても他水槽が補完的に機能するため、結果的には安定した十分な摂餌量が得られた。したがって、(2)これらの連動水槽の信号を自動給餌器に伝送すれば、自発摂餌装置がなくても自発摂餌と同様の給餌が行え、結果的に多数の水槽を用いた養殖でも自発摂餌装置の節減が可能となることが明らかとなった。
機能性材料による実世界と情報世界をシームレスに繋ぐペーパーコンピューティング技術

本研究では,我々が慣れ親しんだ日常素材である紙をシームレスに情報世界と繋ぎ,紙面の表現可能性や利便性を広げるペーパーコンピューティング技術を創出することを目指した.そのために,光・熱・磁力・電気などによる物理的な制御や作用の可能性を有する機能性材料に着目し,紙に手描きや印刷した機能性材料を「制御」「認識」することにより,(1)手描き表現をコンピュータによる処理を介して紙面上で拡張する技術の開発や(2)紙を情報世界にアクセスするためのインタフェースとして活用する技術の検討を進めた.本年度は紙を入力インタフェース化する技術に重点を置きつつ、紙を出力インタフェース化する技術、それらの技術の社会応用の3つの項目に関して基礎的な取り組みを行った。まず、紙を入力インタフェース化する技術に関しては、紙にペンで描いた文字や印字した文字を、コンピュータによる処理を介して、ユーザの行為にインタラクティブに消去可能な紙面インタフェースの基礎的検討を行った。具体的には熱に反応して消去・変色可能なサーモクロミックインクを、紙面に印刷可能な導電性インクで熱するという手法を開発した。次に紙を出力インタフェース化する技術に関しては、光に反応してその発色や消色を制御できるフォトクロミック材料に対し、紫外プロジェクタを開発して2次元の紫外光を投影することで、紙面に手描きや印字と併記しても違和感のない発色型の情報提示技術の開発・検討を進めた。特に多様なフォトクロミック材料の発色や消色の時間特性を計測することや、市販のプリンタで印刷可能なフォトクロミック材料を用い、印刷パターンに工夫をすることで多色化を可能とする技術の基礎検討を行った。最後にこのような技術の社会応用の可能性を探るため、広告会社等において2日間にわたるワークショップを行い、先端メディアをコミュニケーションに応用する可能性について、実践的なディスカッションを行った。本年度は主に昨年度の成果をより高度なインタフェースまたはディスプレイ技術とするための研究の取り組んだ.特に紙を出力インタフェース化(ディスプレイ化)する技術に関して,昨年度開発したフォトクロミック材料と紫外プロジェクタを用いた紙面での発色型動的情報提示メディアの研究成果をまとめることに注力した.具体的にはまず,多様なフォトクロミック材料の発色・消色の時間特性に関して精緻な計測実験を行い,それらの時間特性に応じた紙面上での動的な情報提示のアプリケーション(短い時間で消色する材料の特性をいかした図画のガイドや,比較的長時間情報が発色が保たれる特性をいかした複製・共同書類制作など)を提案した論文が採録された.さらにフォトクロミック材料の印刷・配置パターンに工夫することで1枚の紙面上で同じ波長の紫外光を投影しながら,異なる色での発色を実現する多色化の技術に関しても論文が掲載された.一方,紙を入力インタフェース化する技術に関しては,新たに導電性インク(conductive inks)や容量性インク(capacitive inks)による手描きや印刷が施された紙を,タッチディスプレイ上で認識する技術の基礎検討等を行った.最後にこれらの技術を広く社会に還元するため,日本バーチャルリティ学会学会誌「プロジェクションマッピング特集号」にて解説論文を執筆した.また実際にシステムを一般の人に触ってもらうため,デモ展示のオープンハウスを開き,システムを今後改良していく上でのフィードバックを得ることができた.本年度は実世界の紙を情報世界とシームレスに繋ぎ,紙を入力インタフェース化したり出力インタフェース化する技術の発展課題として,これまでペーパーコンピューティングジャンルでも取り組みの少なかった複数枚の積層した紙を対象とする検討を進めた.具体的には複数枚の積層した紙に対し,同時に任意の枚数の紙面に情報を印字したり編集したりする仕組みを開発した.本研究ではまず磁力が紙やシートを透過する性質に着目し,磁性シートと呼ばれる磁力によって印字や消去が可能なリライタブルシートを複数枚積層した呈示部と,電磁石をPWM制御することで任意の磁束密度を出力できる印字制御部を設計した.次に二つの特性計測実験を行った.一つ目として電磁石の磁束密度に対する磁性シートの色の濃さ(色濃度)の関係を調べ,目視で印字が可能な磁束密度と色濃度の値や,一定の磁束密度になると色濃度が飽和する傾向について明らかにした.二つめの特性計測実験として電磁石の磁束密度と積層させた磁性シートの同時に描画できる枚数の関係を調べ,磁性シートを複数枚積層させた状態で同時に描画できることや,描画できる枚数は磁束密度におよそ比例的に増加することを明らかにした.以上の結果を反映して所望の枚数の紙面に同時描画・編集可能な仕組みを実現した.提案システムに関して学会発表を行うと同時にユーザスタディを兼ねた公開デモ展示を行った.その結果,本研究のポテンシャルに関して高い評価を頂くと共に,システムの小型化や安定化といった課題を得ることができた.本研究では,我々が慣れ親しんだ日常素材である紙をシームレスに情報世界と繋ぎ,紙面の表現可能性や利便性を広げるペーパーコンピューティング技術を創出することを目指した.そのために,光・熱・磁力・電気などによる物理的な制御や作用の可能性を有する機能性材料に着目し,紙に手描きや印刷した機能性材料を「制御」「認識」することにより,(1)手描き表現をコンピュータによる処理を介して紙面上で拡張する技術の開発や(2)紙を情報世界にアクセスするためのインタフェースとして活用する技術の検討を進めた.本年度は,「機能性材料による実世界と情報世界をシームレスに繋ぐペーパーコンピューティング技術」という課題に対し,特に出力インタフェース化(ディスプレイ化)する技術に関して,昨年度開発した技術の実験と改良を行い論文としてまとめることに重点をおいた.さらに新たな紙の入力インタフェース化

技術に関しても検討を進めており,概ね計画通りと考えられる.情報学今後は紙の入力インタフェース化技術や出力インタフェース化技術を応用する日常のシチュエーションに関して多数のアイディアを用意し,そのような実際的な利用に耐えうるメディアの開発・検討を進める.また開発したメディアに関して長短期のユーザスタディを行い、システムの改良に組み入れる.本年度は、「機能性材料による実世界と情報世界をシームレスに繋ぐペーパーコンピューティング技術」という課題に対し、入力インタフェース化技術の開発に重点をおきつつ、出力インタフェース化技術の基礎検討と、このようなメディア技術の社会応用を探求する試みを行っており、概ね計画通りと考えられる。小額の材料や電子機器等に関して、年度末に納品時期が間に合わなかったため,次年度へ繰り越すことにした.今後は紙の入力インタフェース化技術と出力インタフェース化技術の他の方式に関して多数のアイディアを検討すると共に、それらの融合技術についても可能性を探る。また実世界の応用を視野にいれたアプリケーションの開発やユーザスタディを行い、ユーザ視点からのシステム評価なども行っていきたい。今年度は紙の入力インタフェース化技術・出力インタフェース化技術を展示・実験するためのプロトタイプシステムを構築するための電子部品や材料の購入を行う.また,ユーザスタディのための実験機材についても引続き購入を行う.必要な材料や電子機器などを購入した上で、最後に小さな電子部品を購入する計画だったが、納品時期などが間に合わずそのぶんの予算が余った。今年度は紙を出力インタフェース化するための機能性材料と制御のための電子部品やPCを中心に購入を行う。またシステムのプロトタイピングを効率化するための制作・記録関係の機材についても購入を検討する。
微生物が生産するキレート剤を利用したレアメタルおよび放射性物質の回収技術の開発

〈背景と目的〉多くの金属類、特にレアメタルは産業上の利用価値が高まる一方で、そのリサイクル技術の開発は進んでおらず、新たな環境汚染の問題が顕在化しつつある。また現在日本では、放射性セシウムやストロンチウム等による低濃度で広範囲に及ぶ環境汚染が深刻化している。微生物は生育に必要な鉄を取り込むために、様々な構造の鉄キレート剤(シデロフォア)を種特異的に生産することが知られているが、近年、鉄以外の金属もキレートする例がいくつか報告されている。そこで本研究では、シデロフォアを利用したレアメタルおよび放射性物質の回収技術の開発を最終目的として、有用なシデロフォアの探索とその利用法の検討を行った。〈方法と結果〉ある特定の金属に対するキレート作用が強いシデロフォアの生産菌は、結果としてその金属への耐性を有すると予想されるため、このような耐性菌をターゲットとしたスクリーニングを行った。その結果、コバルト、ニッケル、ストロンチウム等にそれぞれ耐性を示すシデロフォアの生産菌を多数取得した。これらのシデロフォアを金属の回収に利用可能か調べるため、まず始めにコバルト耐性菌が生産するシデロフォアの精製を行い、以下の検討に用いた。数ppm程度の比較的低濃度のコバルトイオンを含む水溶液にシデロフォアを添加した後、疎水性の担体にシデロフォアを吸着させ、メタノールで溶出させるという簡単な方法を試したところ、水溶液中の90%以上のコバルトイオンを回収することが出来た。同様に、ニッケルまたはストロンチウムにそれぞれ耐性を示す菌株が生産するシデロフォアの粗抽出物を用いることにより、それぞれの金属を回収できることが示唆された。本研究で取得した菌株は、公的保存機関である独立行政法人農業生物資源研究所のジーンバンクに登録申請を行った(登録番号:MAFF311667311669)。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、シデロフォアを利用したレアメタルおよび放射性物質の回収技術の開発を最終目的として、今年度は特定の金属をキレートするシデロフォアを生産する微生物の探索を行った。ある特定の金属に対するキレート作用が強いシデロフォアの生産菌は、結果としてその金属への耐性を有していると予想されるため、このような耐性菌をターゲットとしたスクリーニングを行った。金属としては、レアメタルの中で工業的な使用量が多く比較的単価の高いコバルト、ニッケル、モリブデンを用いた。金属塩いずれか1種類を添加した細菌用の栄養培地に、研究所の圃場から回収した土壌を添加して集積培養を行った。次に、色の変化でシデロフォアの生産を判別できる鉄キレート剤を添加した培地を用い、金属耐性菌として得られた菌株の中からシデロフォア生産菌を選抜した。その結果、10種類の土壌サンプルより、コバルトまたはニッケルまたはモリブデンを添加した培地で生育可能なシデロフォア生産菌をそれぞれ5、9、20株取得した。このうち、実際に鉄以外の金属をキレートするものを選抜するため、各種金属を配位させたキレート担体を用いて培養上清からシデロフォアの抽出を試みた。その結果、コバルト耐性菌5株のうち3株が生産するシデロフォアがCo^<2+>配位キレート担体により抽出することができ、これらはCo^<2+>をキレートする能力を有していると考えられた。同様にニッケル耐性菌9株のうち1株、モリブデン耐性菌20株のうち2株が、それぞれの金属を配位したキレート担体によって抽出された。これらの結果から、本手法により、鉄以外の金属に対してもキレート作用を示すシデロフォアを取得できることが分かった。そこで本研究では、シデロフォアを利用したレアメタルおよび放射性物質の回収技術の開発を最終目的として、有用なシデロフォアの探索を行っている。〈結果〉ある特定の金属に対するキレート作用が強いシデロフォアの生産菌は、結果としてその金属への耐性を有すると予想されるため、このような耐性菌をターゲットとしたスクリーニングを行い、これまでにコバルト、ニッケル、モリブデン、ストロンチウムをそれぞれキレートするシデロフォアの生産菌を取得した。まず、コバルトをキレートするシデロフォアの生産菌12株について、培養上清から粗抽出したシデロフォアを用いて水溶液中のコバルトを回収可能か検討した。その結果を元に、最も高いコバルト回収率を示した菌株を選抜株としてシデロフォアの精製を行い、その分子量をLC/MSにて解析した。

一方、16S rDNA解析を行った結果、選抜株はPandoraea属細菌に分類されたが、今回取得したシデロフォアの分子量は、この近縁種で報告されているものとは異なっており、新規のシデロフォアが取得された可能性が高いと考えられた。また、精製したシデロフォアを低濃度のコバルトを含む水溶液に添加した後、疎水性の担体にシデロフォアを吸着させ、メタノールで溶出・回収することにより、添加したシデロフォア濃度に比例してコバルトが回収できることを確認した。〈背景と目的〉多くの金属類、特にレアメタルは産業上の利用価値が高まる一方で、そのリサイクル技術の開発は進んでおらず、新たな環境汚染の問題が顕在化しつつある。また現在日本では、放射性セシウムやストロンチウム等による低濃度で広範囲に及ぶ環境汚染が深刻化している。微生物は生育に必要な鉄を取り込むために、様々な構造の鉄キレート剤(シデロフォア)を種特異的に生産することが知られているが、近年、鉄以外の金属もキレートする例がいくつか報告されている。そこで本研究では、シデロフォアを利用したレアメタルおよび放射性物質の回収技術の開発を最終目的として、有用なシデロフォアの探索とその利用法の検討を行った。〈方法と結果〉ある特定の金属に対するキレート作用が強いシデロフォアの生産菌は、結果としてその金属への耐性を有すると予想されるため、このような耐性菌をターゲットとしたスクリーニングを行った。その結果、コバルト、ニッケル、ストロンチウム等にそれぞれ耐性を示すシデロフォアの生産菌を多数取得した。これらのシデロフォアを金属の回収に利用可能か調べるため、まず始めにコバルト耐性菌が生産するシデロフォアの精製を行い、以下の検討に用いた。数ppm程度の比較的低濃度のコバルトイオンを含む水溶液にシデロフォアを添加した後、疎水性の担体にシデロフォアを吸着させ、メタノールで溶出させるという簡単な方法を試したところ、水溶液中の90%以上のコバルトイオンを回収することが出来た。同様に、ニッケルまたはストロンチウムにそれぞれ耐性を示す菌株が生産するシデロフォアの粗抽出物を用いることにより、それぞれの金属を回収できることが示唆された。本研究で取得した菌株は、公的保存機関である独立行政法人農業生物資源研究所のジーンバンクに登録申請を行った(登録番号:MAFF311667311669)。26年度が最終年度であるため、記入しない。全体の研究計画(以下の(1)(4))のうち、今年度の目標である(1)が達成されたため。(1)特定の金属に対してキレート作用が強いシデロフォアの生産菌を自然界から選抜する。(2)シデロフォアの構造と各種金属に対する結合の強さを解析し、以降の実験に用いるものを選抜する。(3)排水処理への応用:シデロフォアを固定化したカラム等を作製し、水中から特定の金属を回収可能か検討する。(4)汚染土壌浄化への応用:シデロフォアを土壌に添加することによる、土壌中からの金属の可溶化や植物体への蓄積量の変化を評価し、シデロフォアによる土壌中の金属の可溶化への寄与を明らかにする。全体の研究計画(以下の14)のうち、今年度の目標である2と3が達成されたため。1特定の金属に対してキレート作用が強いシデロフォアの生産菌を自然界から選抜する。2シデロフォアの構造と各種金属に対する結合の強さを解析し、以降の実験に用いるものを選抜する。3排水処理への応用:シデロフォアを固定化したカラム等を作製し、水中から特定の金属を回収可能か検討する。
オスミウム錯体導入によりメチルシトシンを特異的認識するDNA結合人工蛋白質の創製

DNAメチル化の検出を目的として、メチルシトシンと非メチル化シトシンを認識する人工蛋白質・ペプチドの開発を行った。DNA結合部位の基本骨格として亜鉛フィンガーモチーフに着目し、メチルシトシン認識部位としてオスミウム錯体を亜鉛フィンガーモチーフに導入して分子設計を行った。メチルシトシンとオスミウムとの反応性検討から得られた結果を基に亜鉛フィンガーを作製し、DNA結合能を評価した。DNAのメチル化は細胞の発生や分化を制御し細胞の癌化にも密接に関連しており、メチル化解析技術の開発は生命現象の解明のみならず疾患の原因解明や医療への応用も期待され、重要性が高い。本研究は、DNA結合蛋白質、特に転写因子亜鉛フィンガー蛋白質に着目し、これにメチルシトシン認識能を導入することにより、遺伝子機能に重要な部位におけるメチルシトシン検出を目指している。平成20年度は、(1)メチルシトシンとオスミウムとの反応性、および、(2)メチルシトシン認識能を有する亜鉛フィンガーの分子設計について検討を行った。(1)種々のピリミジン塩基、あるいはメチルシトシン近傍に一塩基ミスマッチを有するDNA配列におけるオスミウム錯体形成の配列依存性について検討した。オスミウム錯体によって酸化されたDNAをピペリジンで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、隣接する核酸塩基がオスミウム錯体の形成反応に重要な役割を果たしているという新しい知見を見出した。(2)DNAのメチル化はCpG配列上のシトシンに存在するため、グアニンとシトシンに富んだ配列を認識する亜鉛フィンガー蛋白質を基本骨格として選択した。CpG配列上のシトシンと相互作用するアミノ酸残基をターゲットとし、このアミノ酸残基自身あるいは近傍のアミノ酸残基を中心にメチルシトシン認識能を導入する部位について、分子モデリング計算を行った。また、同時に亜鉛フィンガーのDNA結合能を制御する手法についても検討を行い、光に応答する亜鉛フィンガーの開発に成功した。DNAのメチル化は細胞の発生や分化を制御し、癌化にも密接に関連しているため、メチル化解析技術の開発は生命現象の解明のみならず疾患の原因解明や医療への応用も期待され、重要性が高い。本研究は、DNA結合蛋白質、特に転写因子亜鉛フィンガーに着目し、これにメチルシトシン認識能を導入することにより、遺伝子機能に重要な部位におけるメチルシトシン検出を目指している。平成21年度は、前年度に得た知見を基に人工亜鉛フィンガーを作製し、これらとメチル化DNAとの相互作用の解析を行った。分子モデリング計算およびオスミウム錯体形成の反応性検討から得られた結果に基づいて、αヘリックスに種々の非天然アミノ酸を導入した人工亜鉛フィンガーペプチドをFmoc固相合成法で作製した。得られた人工亜鉛フィンガーとメチル化DNAとの親和性をゲルシフトアッセイを用いて評価した。オスミウム錯体は標的とする二本鎖DNAに対して十分な親和性が得られなかった一方、リン酸化チロシンを有する人工亜鉛フィンガーがメチル化DNAに対して高い選択性を有することを見出した。CD、UV-vis、およびNMRによる人工亜鉛フィンガーペプチドの構造検討から、導入したリン酸化チロシンは亜鉛フィンガーのフォールディング構造に殆ど影響を与えないことが確認された。さらに、リン酸化チロシンの芳香環とメチルシトシンのメチル基との相互作用やリン酸化チロシンのリン酸基が関与する水素結合によって、メチル化DNA-亜鉛フィンガー複合体が安定化されていることが示唆された。