hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小さな遷移金属と大きな配位子で実現する酸化的環化反応

酸化的環化反応は、1段階で一気に3つの結合をつくる効率のよい反応であり多様な触媒反応の鍵課程として提案されてきた。これまでには、アルキン類、アルケン類とアルデヒド、ケトン、エノン類との反応を検討してきた。この過程において、アルデヒドとアルキン類との反応において、これまでは触媒反応の中間体として提案されていた型の錯体を単離同定することに成功した。この錯体の構造はX線構造解析により決定した。この錯体はTHF中においてゆっくりと分解してα,β-不飽和ケトン(エノン)を与えた。この結果は、ニッケル触媒によるアルキンのヒドロアシル化反応の反応過程が従来あまり考えにくいものとして提案されていた反応機構が正しことを示す重要な知見を与えた。さらには、この錯体とジメチル亜鉛との反応においては、3成分カップリング反応の中間体としてこの錯体が作用していることをも明らかにした。この場合には、中間体錯体とジメチル亜鉛だけでは生成物はほとんど得られずに、基質であるアルデヒドが反応系中に存在しているときに目的とする生成物が得られたことは非常に興味深い結果である。このほかにも、アルキンとイミンから得られたヘテロニッケラサイクルも同様の反応を示すことも分かってきた。さらに、この場合は[2+2+2]環化付加反応が触媒的に進行しジヒドロピリジンを与えるとともに、反応鍵中間体として機能していることが明らかになった。これらは、本研究計画によって得られた成果であり、目的とした錯体が多様な反応性を示すことを意味している。ジエンとニッケルの反応は古くから研究されており、η^<3->アリルニッケル錯体を与える反応が広く知られている。しかし、ジエンとアルデヒドからの錯体生成の例はなく我々はこの組み合わせからの錯体合成を検討した。多様なジエン、アルデヒドの組み合わせにおいて、容易に生成物を単離することができた。このうち、2,3-ジメチルブタジエンとブタナールから得られた錯体の反応性を検討した。ジメチル亜鉛との反応ではメチル基がニッケルに結合した、形式的にはトランスメタル化が進行した型の錯体がほぼ定量的に生成した。この錯体も単離することが可能であり元素分析もよい一致を示す。これを加熱すると還元的脱離によって亜鉛化合物が生成した。加水分解するとホモアリルアルコールが得られる。これは、既に報告されているジエン、アルデヒドと有機亜鉛のニッケル触媒による多成分カップリングが本反応経路で進行していることを強く示唆している。潜在的に不飽和炭化水素であるシクロプロパン環とカルボニル基を同一分子内に有する分子としてシクロプロピルケトンを用いてニッケラサイクル生成を試みた。シクロプロピルフェニルケトンを室温にてNi(cod)_2,PCy_3と反応させるとカルボニル基がニッケルに対してπ配位した錯体が効率よく発生した。その後、シクロプロパン環が開環し続いて二量化により六員環ニッケラサイクルが生成した。本反応はケトン部のπ配位を足がかりにしてシクロプロパン環の炭素-炭素結合を開裂させたものでありカルボニル基はシクロプロパン環をニッケル上に誘導する役割も担っている。六員環ニッケラサイクルにエノンを反応させるとエノンの挿入が起こりオキサπ-アリルニッケル錯体が得られた。なおこの研究成果は、Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,6788-6790.にてHighlightsに取り上げられた。

この錯体はTHF中においてゆっくりと分解してα,β-不飽和ケトン(エノン)を与えた。この結果は、ニッケル触媒によるアルキンのヒドロアシル化反応の反応過程が従来あまり考えにくいものとして提案されていた反応機構が正しことを示す重要な知見を与えた。さらには、この錯体とジメチル亜鉛との反応においては、3成分カップリング反応の中間体としてこの錯体が作用していることをも明らかにした。この場合には、中間体錯体とジメチル亜鉛だけでは生成物はほとんど得られずに、基質であるアルデヒドが反応系中に存在しているときに目的とする生成物が得られたことは非常に興味深い結果である。このほかにも、アルキンとイミンから得られたヘテロニッケラサイクルも同様の反応を示すことも分かってきた。さらに、この場合は[2+2+2]環化付加反応が触媒的に進行しジヒドロピリジンを与えるとともに、反応鍵中間体として機能していることが明らかになった。これらは、本研究計画によって得られた成果であり、目的とした錯体が多様な反応性を示すことを意味している。
大腸におけるmicroRNA機能異常を介した炎症性発癌の病態解明と制御法開発

、慢性炎症に伴う続発性腫瘍形成の病態に関わるmicroRNA機能減弱の観点から、まだ解決されていない、1) microRNA機能減弱から発癌に至る分子機構の解明、2)慢性炎症刺激によるmicroRNAのRISC取り込み阻害の分子機構、を解明して因果関係をさらに明確にするとともに、代表的な大腸癌の発生機序としてしられる、良性の腺腫が癌化する経路(adenoma-carcinoma sequence)におけるmicroinflammationのmicroRNA機能攪乱を介した病態形成への関与について検討することを目的としている。本年度は、がん抑制性のmicroRNAの代表であるlet7の機能を回復する化合物を探索するべくlucieferase遺伝子の下流にlet7の応答配列を連結したコンストラクトを用いてFDAで認可されている800の薬剤の中からそのような効果を持つ可能性のある薬剤をスクリーニングしたところ、降圧薬のひとつであるアムロジピンにその種の効果があることが確認された。しかし二次スクリーニングで他のmicroRNAの機能をみるコンストラクトやレポーター以外の方法で効果を確認をしたところ、当初見られていたmicroRNA機能増強効果は見られず、おそらくmicroRNAの種類特異的な働きか、luciferase遺伝子の発現そのものに影響を与えていることが想定された。したがって、さらに広範囲なライブラリーを用いて効果を持つ化合物の探索を続けている。今後、その種の化合物が同定できれば、その機序およびアウトカムを検索し、慢性炎症億発腫瘍を抑制する化合物としての応用法を検討していく。遺伝子改変マウスによって、microRNAの働きを生体でモニターできるレポーターマウスを樹立し、このマウスを用いて炎症続発性腫瘍モデルの実験を試み、大腸に慢性的な炎症を起こすことができる化学物質で炎症を引き起こしたところ、炎症を起こしている腸管上皮細胞でのmicroRNAの働きが減弱していることが確認された。このとき、腸上皮内のmicroRNAの発現量は大きくは変化していなかったため、microRNAの働きの減弱は、microRNAの「発現量」よりもむしろ「機能」が低下していることによって起きていることが示唆された。このmicroRNAの機能減弱は、炎症に関わるサイトカイン(TNF-αやIL1などを培養細胞に添加する実験でも確認された。次に、この原因を探索するため、炎症性刺激の存在するところでmicroRNAの機能に関わる因子の状態を検討したところ、APOBEC3Gというタンパク質の分解が、炎症性刺激によって促進されていることが示された。APOBEC3Gは、microRNAの機能が発揮される際に重要なArgonaute2と呼ばれるタンパク質を中心とした複合体にmicroRNAを導いて機能させるのに重要な因子として働いており、APOBEC3Gが炎症刺激で分解されるためにmicroRNAの機能が減弱することが示唆された。以前、腸管上皮内のmicroRNAの発現を全体的に減らした遺伝子改変マウスモデルで大腸の腫瘍ができやすくなることを報告しており、慢性炎症に伴うmicroRNAの機能低下は、ちょうどmicroRNAの発現を減らした状況と類似の状態をもたらし、それによって腫瘍形成が促進されることが示唆された。慢性炎症に続発する腫瘍の形成には、炎症持続に伴うmicroRNAの機能低下が背景にあるのではないかという当初の仮説の検証がおわり、ほぼ仮説通りの結果が得られた。また、その分子機構の解明まで踏み込み、中心分子としてのAPOBECの同定にまで至った。今年度は個々のmicroRNAの機能をみるためのレポーターマウスの作製に着手した。個々のmicroRNAの機能を見るためのレポーターマウスの作製用コンストラクトの作製に時間がかかってしまい、若干の遅れが出ている。

本年度は、がん抑制性のmicroRNAの代表であるlet7の機能を回復する化合物を探索するべくlucieferase遺伝子の下流にlet7の応答配列を連結したコンストラクトを用いてFDAで認可されている800の薬剤の中からそのような効果を持つ可能性のある薬剤をスクリーニングしたところ、降圧薬のひとつであるアムロジピンにその種の効果があることが確認された。しかし二次スクリーニングで他のmicroRNAの機能をみるコンストラクトやレポーター以外の方法で効果を確認をしたところ、当初見られていたmicroRNA機能増強効果は見られず、おそらくmicroRNAの種類特異的な働きか、luciferase遺伝子の発現そのものに影響を与えていることが想定された。したがって、さらに広範囲なライブラリーを用いて効果を持つ化合物の探索を続けている。今後、その種の化合物が同定できれば、その機序およびアウトカムを検索し、慢性炎症億発腫瘍を抑制する化合物としての応用法を検討していく。今後はここまでの検討結果で、microRNA機能の減弱が発癌に寄与することを見出したので、易発癌性状態の時にmicroRNA機能を増強する、あるいはmicroRNAの発現を増やすことによって発癌抑止につながるかを検討していきたい。今後、レポーターコンストラクトを含んだトランスジェニックマウスの作製を急ぎ、慢性炎症の場におけるmicroRNA機能の変化を検討していきたい。
免疫担当細胞間相互作用に認められる免疫制御の分子機構

1、サプレッサーT(Ts)細胞を中心とする解析1)CD4^+のcognateタイプのTs細胞を主に用いて解析してきた。Ts細胞は、抗原提示細胞とのcognateタイプの細胞間相互作用によって、MHC拘束性に活性化され、MHC非拘束性にヘルパーT(Th)細胞活性を抑制した。Ts細胞による抑制はTs→Th細胞へと一方向性で、かつ細胞の種類に特異的であった。2)Ts細胞クローンを固相化抗CD3抗体あるいは抗TCR抗体で刺激することによって、培養上清中に抑制活性が検出され、ゲル濾過で6070kdの分画に活性が認められた。Th1タイプあるいはTh2タイプT細胞クローンを同様に刺激しても、このような抑制活性物質は得られなかった。3)Ts細胞クローンの抗CD3抗体刺激上清は、Th細胞クローンのIL2産生およびヘルパー活性を抑制したが、抗原特異的増殖反応を抑制しなかった。また、TCRを介するTh細胞刺激後のIL2R、CD69およびCD28分子の細胞表面発現量には変化がみられなかった。4)前項で述べたように、Ts細胞はTh細胞のIL2産生を抑制し、ヘルパー活性を抑制するが、外来性にいわゆるヘルパータイプのリンホカイン(IL2、IL5)を加えても、Ts細胞によるTh細胞活性の抑制は解除されなかった。2、ヘルパーT(Th)細胞を中心とする解析1)Th細胞クローンのヘルパー活性は、ナイーブT細胞の共存によって著しく増強された。この時、Th細胞クローンの特異的活性化が必要であった。またヘルパー活性の増強は、Thlタイプ、Th2タイプいずれのクローンを用いても認められた。2)Th細胞クローンからIL2/IL4を産生しないサブクローンが得られた。このクローンの抗CD3抗体刺激培養上清中に、T細胞を刺激し、IL2R、CD69の表現量を増加させ、IL2産生を増強させる活性が認められた。またTCRの表現量のdownmodulationが見られた。ConA刺激培養上清中には、このような活性は認められなかった。3)このような活性は、ゲル濾過で50kd分画に、非還元条件のSDS-PAGEで30kd以下の分画に認められた。
極域の雪氷試料から解明する気候・環境変動の基礎的手法に関する研究

本研究において、南極氷床上で採取されたH231沿岸コア(1980年、90m)とMD364(2001年、80m)ドームふじ南方内陸コア(1997年採取、56m深)、H72沿岸コア(1998年、73m)の計4本の雪氷コアの基本解析を終了した。基本解析では、層位、密度、通気度、固体電気伝導度、酸素同位体比、化学主成分解析、放射性同位体解析(トリチウム)を行った。またH72コアについては研究解析として、化学主成分の高時間分解能解析を行った。H72コアにおいては、1)H72に設置した雪尺の過去26年間の平均表面質量収支、2)異なる3つの方法(圧密モデル、火山層検出、ECM・層構造による年層検出)によるコア年代、3)コア中の化学主成分や酸素同位体の変動に加え、ECM(固体電気伝導度)の電流値の季節変動に層構造を組み合わせることにより、コア中のイオン濃度の季節変化を連続的に抽出することを試み、73.285m深のコア底(西暦1831年と推定)までの年層境界を最大13年程度の誤差で確定することができた。このように精密な年代決定が可能になったことにより、過去数百年間の気候環境変動の年々変動や季節変動などを高い時間分解能で復元できることが期待される。今後は、本研究で確立した手法を用いた他のコアの解析結果と比較することにより、東南極東ドロンニングモードランドおける過去の堆積環境の変遷像を面的に明らかにする。解析に用いた雪氷コアは、南極ドームふじ南方内陸コア(1997年採取、56m深)とH72沿岸コア(1998年、76m)の2本である。雪氷コア解析として基本解析を行った。基本解析とは、南極や北極などで採取した雪氷コアに対して共通に行う項目で、層位、密度、通気度、固体電気伝導度、酸素同位体比、化学主成分解析、放射性同位体解析(トリチウム)を行った。2年次には研究解析を行い、観測地域に特徴的な成分の検出や高時間分解能解析、さらに基本解析結果から明らかにされた情報を基にした詳細な研究を行う予定である。基本解析の主目的であるコアの年代決定は、トリチウム及び固体電気伝導度解析により行った。特に沿岸コアに関しては固体電気伝導度のシグナルに季節変動が明瞭に現れていて、高時間分解能の降水量・環境因子変動の解明が期待できる。雪氷コアの層位から堆積環境の復元を行うことに関しては、プログレッシブ式のデジタルビデオカメラで撮影した映像を解析することで、今まで離散的で主観的な可視情報であった層位を、客観的な連続した物理情報として扱うことができるようになった。これにより物理的手法の情報と化学的手法の情報が融合でき、興味ある解析が期待できる。H72地点では、フィルン中の空気を採取して温室効果ガスなどの成分が測定されている。フィルンは通気性はあるが、重力と拡散効果によりフィルンの空気に含まれる成分は一様ではなく、深さ方向に現在から過去の空気の混合体となる。氷化が進むと通気性がなくなるが、この時に封じ込められた空気の経歴を明らかにすることは、雪氷コアから過去の大気状態を復元する上で必要不可欠であり、そのための詳細な通気度測定も行った。さらにフィルンから氷に移り変わる深さで封じ込められている空気の分析を行う予定である。解析に用いた雪氷コアは、南極氷床上で採取されたH231沿岸コア(1980年、90m)とMD364(2001年、80m)の2本である。平成12年度に解析を行った南極ドームふじ南方内陸コア(1997年採取、56m深)とH72沿岸コア(1998年、73m)と合わせて計4本の雪氷コアの基本解析を終了した。

基本解析では、層位、密度、通気度、固体電気伝導度、酸素同位体比、化学主成分解析、放射性同位体解析(トリチウム)を行った。またH72コアについては研究解析として、化学主成分の高時間分解能解析を行った。H72コアにおいては、1)H72に設置した雪尺の過去26年間の平均表面質量収支、2)異なる3つの方法(圧密モデル、火山層検出、ECM・層構造による年層検出)によるコア年代、3)コア中の化学主成分や酸素同位体の変動に加え、ECM(固体電気伝導度)の電流値の季節変動に層構造を組み合わせることにより、コア中のイオン濃度の季節変化を連続的に抽出することを試み、73.285m深のコア底(西暦1831年と推定)までの年層境界を最大13年程度の誤差で確定することができた。このように精密な年代決定が可能になったことにより、過去数百年間の気候環境変動の年々変動や季節変動などを高い時間分解能で復元できることが期待される。今後は、本研究で確立した手法を用いた他のコアの解析結果と比較することにより、東南極東ドロンニングモードランドにおける過去の堆積環境の変遷像を面的に明らかにする。
内臓の非対称とその配置の非対称

昨年に引き続き初期胚心臓のループ形成研究のまとめの作業を行った。前回の報告でのべたもう一つのらせんループ形成機構についてでである、3次元空間で軸についての非対称の幾つかを組み合わせたモデルによりキラル構造を形成する考えを進めて論文原稿にまとめた。内容は、円筒の腹側が背側よりも大きく成長し屈曲する(背腹軸に関する非対称)。これと共に左右非対称な力がかかり(左右軸に関する非対称)、しかもこれが円筒の上半と下半で異なる(頭尾軸に関する非対称)という仮定をつかった。これにより円筒はらせんループになる。この結果の意味するところは、三軸の非対称でキラル構造ができるのであるが、この中の左右軸に関する非対称には、体の左右非対称をつかさどる遺伝子として知られているNodalシグナル系が心臓のキラル構造に関与している可能性を示したことである。心臓キラル構造を説明するために残された問題は、体の非対称と我々の使った<左右非対称な力>を結びつけることである。論文原稿は現在投稿中である。上記のようにマウスとトリの初期心臓の非対称についての研究を行ってきたが、次に計画している心臓以外の臓器の非対称の研究を行う前に、サカナ(zebrafish)の初期心臓形成を手がけている。これはマウス・トリとはまた異なった非対称を示す。ここでも背腹軸に関する非対称にくわえて、前後の非対称および左右の非対称がはたらいている。心臓という共通の器官であるのに非対称形成機構が詳しく見ると異なることは明らかにしておきたい。これは他の臓器の非対称を手がけるにあたって重要だと考えている。心臓の非対称性形成についてこれまで考えてきたものと別の要因もある事に気がついた。この要因についての詳しい検討は今後の内臓非対称性の研究に広く役立つ可能性があり、このプロジェクト全体としては順調に進んでいると考える。内臓の非対称について軸に関する非対称ばかりでなく3次元空間ではねじれなどのキラル構造があり、非対称とキラルの関わりにさらに複雑な内臓の構造ができていることが明らかになってきた。軸に関する非対称それ自体はキラルではない。しかし3次元空間でこの非対称が幾つか組み合わさることでキラル構造ができる。これは数学では自明のことである。これが生物体でも実現されていることを明らかにするという研究ができるようになってきた。「内臓の非対称とその配置の非対称」の研究を進めるにあたって、これまで行ってきた初期胚心臓のループ形成研究のまとめの作業に入った。はじめ単純な円筒形の初期心臓であるが、心筋細胞が増殖を繰り返しながららせんループであるキラル構造を形成する機構についての研究である。このとき分裂した細胞の一つひとつがキラルな配置を呈すると仮定すればらせんループができることを数理的細胞モデルを使ったコンピュータシミュレーションで示した。このシミュレーションは要素のキラルな性質が積み重なって全体としてキラルな形を形成するというわかりよい機構であるのだが、その要素のキラルは何に由来するのかという問題がおこる。細胞一個がキラルな振る舞いを呈する事実は幾つか知られているが、心筋細胞については知られていない。そこでもう一つのらせんループ形成機構として、3次元空間で軸についての非対称の幾つかを組み合わせたモデルでキラル構造を形成することを考えた。円筒の腹側が背側よりも大きく成長し屈曲する。これと共に左右非対称な力がかかり、しかもこれが円筒の上半と下半で異なるという仮定である。ニワトリ初期心臓では屈曲したチューブが右に回転することが知られている。マウスの心臓でも最近右に傾く測定結果が出された(これらの事実は現在盛んに研究されている左右非対称な遺伝子発現とつながる可能性がある)。現在、細胞のキラルな性質モデルと非対称の組み合わせモデルの比較検討を行っている。内臓の非対称性形成についてこれまで考えてきたものと別の要因もある事に気がついた。

心臓という共通の器官であるのに非対称形成機構が詳しく見ると異なることは明らかにしておきたい。これは他の臓器の非対称を手がけるにあたって重要だと考えている。心臓の非対称性形成についてこれまで考えてきたものと別の要因もある事に気がついた。この要因についての詳しい検討は今後の内臓非対称性の研究に広く役立つ可能性があり、このプロジェクト全体としては順調に進んでいると考える。内臓の非対称について軸に関する非対称ばかりでなく3次元空間ではねじれなどのキラル構造があり、非対称とキラルの関わりにさらに複雑な内臓の構造ができていることが明らかになってきた。軸に関する非対称それ自体はキラルではない。しかし3次元空間でこの非対称が幾つか組み合わさることでキラル構造ができる。これは数学では自明のことである。これが生物体でも実現されていることを明らかにするという研究ができるようになってきた。論文原稿英文校正など必要な出費があるが予算を超過するおそれがあり次年度に使用することにした。論文掲載料を確保していたが支払いが次年になったため。
先天性心疾患における細胞成熟度と虚血耐性

当初の研究計画としては未熟心筋の成熟過程における電気生理学的変化を捉える予定であったが、未熟心筋の扱いが困難であるため、平成17年度から成熟心筋の虚血前後でのイオンチャネルおよびイオン交換の生理学的特性を明らかにすることとした。細胞内アシドーシス是正のために生じるナトリウムの細胞内流入が、細胞内カルシウム過負荷を助長し細胞傷害に働くことは以前より知られている。1)心筋細胞の形質膜を介するナトリウムイオンと水素イオンの交換機構(Na^+/H^+ exchange)が虚血再灌流障害にどのように関与しているかをラット摘出灌流心モデルで実験を行い検討した。再灌流時にNa/H交換機構を抑制するアミロライドを投与すると心筋保護効果が得られた。このことから細胞外水素イオンの洗い出しと、それに起因する水素イオン移動と交換されたナトリウム流入の関与が考えられた。2)再灌流時のナトリウム流入が、細胞外水素イオンの洗い出しのみが関与するのか、または再灌流時の好気的代謝復活で産生されたCO2から水素イオンが生じ、その細胞外排出が関与するのかを検討した。再灌流時に無酸素緩衝液で再灌流(5分間)し、その後にアミロライド投与群と非投与群を比較したが、投与群が非投与群に比較し有意に心筋保護効果を有した。このことより好気的代謝の急激な再開が細胞内へのナトリウム流入を惹起する可能性が示唆された。3)再灌流時のナトリウム流入が、ナトリウムイオンと重炭酸イオンの共輸送(Na^+-HCO_3^- co-transport)によって生じる可能性を調べるため、重炭酸を含まないHEPES緩衝液で再灌流したところ、対照群との差はみられず、Na^+-HCO_3^- co-transportの関与は否定された。以上より成熟心筋の虚血再灌流傷害では再灌流時におけるNa^+/H^+交換機構の関与が重要であるが、好気的代謝の再開と関連する傷害メカニズムが存在すると考えられた。平成16年度の研究計画は、先天性心疾患患者の右心耳を術中(虚血前と虚血再灌流後)に採取し、生後発達期に心奇形を有する心筋の虚血前後でのイオンチャネルおよびイオン交換の生理学的特性を明らかにすることである。(1)右心耳肉柱の活動電位を測定し、膜興奮の特性を明らかにすることに関して:開心術中にヒト右心耳を採取しており、凍結標本として保存している。別に新鮮組織の電気生理学的研究のため、右心耳肉柱に電極を当て活動電位を計測した。活動電位の安定性は乏しく組織の採取および機能温存が極めて重要であることが判明した。右心耳の右心耳肉柱の電気生理学的特性を明らかにするために必要な標本の採取法と保存法を検討した。その結果、採取直後の温度、表面灌流の安定性が重要であることが推測された。(2)右心耳単離心筋細胞の作成に関して:右心耳単離心筋細胞の作成は、従来の心室細胞採取より難しく、実験に適切な細胞が得られる比率が低かった。灌流温度および灌流液組成を変化させると、生存細胞の比率が変化したことより、細胞のバイアビリティーが至適となる条件の設定が重要と判断した。(3)右心耳単離心筋細胞を材料とし、細胞内Ca^<2+>の時間的変動を見ることに関して:顕微2波長分光蛍光測定を用いて心房筋細胞のCa^

<2+>測定を行ったが、測定値のバラツキが大きく信頼性の高い数値は得られなかった。安定性の高いデータを得るために細胞のバイアビリティー向上と測定精度の改善に必要な手技上の工夫を行った。平成17年度の研究計画として成熟心筋の虚血前後でのイオンチャネルおよびイオン交換の生理学的特性を明らかにすることとした。進行の遅れと変更が生じてきている。ナトリウムの細胞内流入が細胞内カルシウム過負荷を助長し、細胞傷害に働くことは以前より知られている。1)心筋細胞の形質膜を介するナトリウムイオンと水素イオンの交換(Na/H交換機構)が虚血再灌流障害にどのように関与しているかをラット摘出灌流心モデルで実験を行い検討した。再灌流時にNa/H交換機構を抑制するアミロライドを投与すると心筋保護効果が得られた。このことから細胞外水素イオンの洗い出しと、それに起因する水素イオン移動と交換されたナトリウム流入の関与が考えられた。2)再灌流時のナトリウム流入が、細胞外水素イオンの洗い出しのみが関与するのか、または再灌流時の好気的代謝復活で産生されたCO2から水素イオンが生じ、その細胞外排出が関与するのかを検討した。再灌流時に無酸素緩衝液で再灌流(5分間)し、その後にアミロライド投与群と非投与群を比較したが、投与群が非投与群に比較し有意に心筋保護効果を有した。このことより好気的代謝の急激な再開が細胞内へのナトリウム流入を惹起する可能性が示唆された。以上より成熟心筋の虚血再灌流傷害では再灌流時におけるNa/H交換機構の関与が重要であるが、好気的代謝の再開と関連する傷害メカニズムが存在すると考えられた。当初の研究計画としては未熟心筋の成熟過程における電気生理学的変化を捉える予定であったが、未熟心筋の扱いが困難であるため、平成17年度から成熟心筋の虚血前後でのイオンチャネルおよびイオン交換の生理学的特性を明らかにすることとした。細胞内アシドーシス是正のために生じるナトリウムの細胞内流入が、細胞内カルシウム過負荷を助長し細胞傷害に働くことは以前より知られている。1)心筋細胞の形質膜を介するナトリウムイオンと水素イオンの交換機構(Na^+/H^+ exchange)が虚血再灌流障害にどのように関与しているかをラット摘出灌流心モデルで実験を行い検討した。以上より成熟心筋の虚血再灌流傷害では、好気的代謝の再開と関連する傷害メカニズムが存在すると考えられ、再灌流時のナトリウム流入におけるNa/H交換機構の関与が重要と思われるが、ナトリウムイオンと重炭酸イオンの共輸送(Na^+-HCO_3^- co-transport)の関与の可能性についてはまだ不明である。
膵癌に対する新しい治療戦略-キメラ化モノクローナル抗体を用いた免疫ターゲット療法

今回検討したキメラNd2抗体は、膵癌のムチン分画を免疫原として作製した抗体で、定常領域(Fc部)を遺伝子工学的手法によりヒト型に変換した抗体である。その認識抗原エピトープは、MUC5ACムチンのコア蛋白および癌関連糖鎖の一部で、正常組織にはほとんど発現していないと推測され、免疫組織染色の結果からも、膵癌に特異性が高い。そこで本抗体が、近年注目されている抗体治療への応用に際し、ADCCやCDCの誘導が可能かを検討した。結果、in vitroの検討にて、膵癌細胞に本抗体が結合することにより、Fcレセプターを有するエフェクター細胞が抗体のFc部に結合し細胞障害をきたすADCC活性の誘導が可能であることが明らかとなった。またそのエフェクター細胞としては、単球、NKのみならず好中球も作用することが判明し、好中球を賦活するG-CSFにてADCC活性が増強された。また、CDCの誘導の検討でも、キメラNd2抗体がCDC活性も誘導可能であることが判明した。以上の結果を踏まえ、これらin vitroで誘導可能なADCCまたはCDCを介した細胞障害によりin vivoで抗腫瘍効果を示すかを検討した。その結果、膵癌担癌ヌードマウスにおいて、キメラNd2抗体の投与により、皮下腫瘍での抗腫瘍効果が判明し、同所移植モデルにては生存期間の延長が、また膵癌に特徴的な肝転移の抑制効果も認められ、さらに好中球賦活剤であるG-CSF投与にてその抗腫瘍効果の増強が確認された。これらの効果は、in vitroの結果と合わせ、いずれもADCCあるいはCDC誘導によるものと考えられ、キメラNd2抗体が膵癌に対する抗体治療薬として、非常に有用性が高い抗体であることが示唆された。現在、本抗体について免疫原性、副作用の軽減目的にヒト化抗体を作製中であり、今後切除不能進行膵癌や再発症例に対する集学的治療の一つとして臨床応用に向け、検討を重ねていく予定である。キメラNd2のin vitroでのADCC活性誘導能を、種々のヒト膵癌細胞株と健常人末梢血よりFicol遠心分離法にて分離した単核球、好中球との混合培養を行い、その際抗体添加による癌細胞の細胞障害活性を検討した。その結果、末梢血単核球(マクロファージ、NK)をエフェクター細胞として、Nd2抗原発現陽性のSW1990,RWP-1,Capan-1の3種の膵癌細胞株において、キメラNd2添加(1-100μg/ml)にてマウスNd2抗体およびコントロール(PBS)添加に比し、濃度依存性に癌細胞障害活性が増加した。一方、Nd2発現陰性細胞株ではキメラNd2添加にても細胞障害はみられず、抗体依存性障害すなわちADCC活性であると考えられた。また好中球をエフェクターとしても単核球と同等のADCC活性がキメラNd2添加にて認められ、さらにこの癌細胞障害はG-CSFにて活性化した好中球で増強し、ADCCを介したキメラNd2による癌細胞抑制には単核球のみならず好中球も関与していると考えられた。これらの結果をもとに、in vivoでのキメラNd2による膵癌に対する抗腫瘍効果を検討したところ、SW1990皮下移植ヌードマウスへのキメラNd2,100μg/bodyの2回腹腔内投与にて、マウスNd2およびPBS投与群に比し、有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた。

また膵同所移植モデルにおいてもキメラNd2投与にて有意な生存期間の延長が、また癌細胞脾臓内注射による肝転移モデルにおいても肝転移形成能の有意な抑制効果が認められた。キメラNd2抗体はin vitroにおいてヒト膵癌細胞株(SW1990)に対し抗体依存性細胞障害(ADCC)活性を誘導することが明らかとなった。ターゲット細胞SW1990に対しE/T比50としキメラNd2を0.1-100μg/ml添加した際の細胞障害活性の検討から、エフェクター細胞として末梢血単核球のみならず好中球も同等に抗体濃度依存性にSW1990の細胞障害を誘導していることが判明した。この好中球による細胞障害活性はin vitroでの同様のE/T比50としたassayにおいてFc receptor IIIの抗CD16抗体を1,10μg/ml添加にて抑制されることから、この細胞障害活性がキメラNd2を介したADCCであることが確認された。さらに好中球によるADCC活性の誘導に関してin vitroでのADCC解析時にGranulocyte-colony stimulatingfactor (G-CSF)を添加した結果、G-CSF 10,100ng/mlの濃度での添加にて、好中球の活性化によりキメラNd2を介した好中球細胞障害活性の増強が認められた。in vivoにおいてもヌードマウスにおけるSW1990皮下移植モデルでの解析において、キメラNd2 100μg×4回の腹腔内単独投与群ではコントロール(non-specific IgG1;100μg×4回)群およびG-CSF 1μg×4回単独投与群に比し有意な腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらにキメラNd2 100μg+G-CSF 1μg×4回の腹腔内混合投与群ではこれら各群に比べより強い腫瘍増殖抑制効果が認められた。この混合投与群の皮下移植腫瘍での好中球エラスターゼ抗体を用いた免疫組織学的検討を行った結果、好中球の腫瘍内への強い浸潤が確認され、この腫瘍増殖抑制が好中球をエフェクター細胞としたキメラNd2によるADCC活性誘導による効果が一因であることがin vivoにおいても判明した。以上の結果により、キメラNd2を用いた膵癌に対する抗体免疫ターゲット療法におけるG-CSFなどのBRM製剤併用による抗腫瘍効果増強の有用性が示唆された。これまで膵癌のムチン分画を免疫原として作製されたキメラNd2抗体が、in vitroおよびin vivoにおいて膵癌細胞株に対し、単核球ならびに好中球をエフェクター細胞として抗体依存性細胞障害活性(ADCC)を誘導し、抗腫瘍効果を示すことが判明しており、近年乳癌、悪性リンパ腫を中心とした抗体治療と同様に、極めて予後不良な膵癌に対するしい治療戦略として免疫ターゲット療法への臨床応用の可能性が示唆されている。今回、さらに抗体治療において、ADCC以外に抗体を介した抗腫瘍効果に作用する免疫活性の一因を担っている補体依存性細胞障害活性(CDC)誘導の有無を検討した。In vitro,CDC活性は、ヒト膵癌細胞株SW1990、1.5×10^5個/25μlを96well microplateに調整し、キメラNd2を0,0.1,0.2,0.5,1.0μg/mlを添加、さらに補体として15倍希釈の健常人ヒト血清を25μl添加し、37°C,45分間インキュベート反応させ、その後癌細胞をトリパンブルーにて染色、検鏡し、生細胞数および死細胞数をそれぞれカウント、CDC活性を%lysis=(死細胞数/死細胞数+生細胞数)×100で算出し、検討した。
毛組織における免疫担当細胞の役割

毛組織における免疫担当細胞の役割を検討することにした。毛嚢をEDTAにより単離した。軟毛は手技的に比較的容易であるが、終毛では毛嚢の途中で断列しやすいために特に慎重を要した。我々はメルケル細胞の研究の蓄積により抗体の特異性によっては、毛組織における種々の細胞の局在を三次元的に明瞭に染色しうることを確認している。今回の結果では複数の抗体を用いたが、メラノサイトを認識する抗体NKl/betebにより良好な成績を得た。NKl/beteb陽性の樹枝状細胞が毛嚢内に観察された。軟毛及び終毛では毛球部に強陽性のメラノサイトが散在していたが、このような結果は従来のドーパ反応の観察結果と併せて考えると、活性化メラノサイトの局在を示しているものと考えられる。中等度陽性細胞が毛漏斗部から毛球部まで散在していたが、このような所見は従来よりメラノサイトのreser voirとしての意義が考えられており、尋常性白斑などの色素再生時のメラノサイトの供給源とされる。興味深いことにはメラノサイトが毛隆起部にのみ局在する軟毛の毛組織を見出した。そこで毛隆起部に注目し、ホルマリン固定、パラフィン切片でフォンタナ・マッソン染色でメラニン顆粒の分布を検討したところ、明らかに毛球部以外では毛隆起部にメラニンの局在をみた。さらに樹枝状のメラノサイトも特異的に毛隆起部にのみ認められた。このような所見は従来報告はなく、毛隆起部のメラノサイトもしくはメラチノサイトの特性を示しているもの考えられる。
循環代謝免疫コンティニウムによる負荷応答と組織再構築の基盤的分子機構の解明

メタボリックシンドロームと心血管疾患の発症・進展メカニズムを明らかにするために、細胞のストレス受容と、それに対して、遺伝子の発現を制御する分子機構を鍵として、心血管系・代謝系・免疫系をストレス応答の一つの連続体(コンティニウムcontinuum)として解析することを目的とする。そのため、心血管系と代謝系の両者で、Toll-like受容体(TLR)などによる代謝ストレスの受容機構とその情報伝達機構を解析するとともに、Kruppel型転写因子ファミリーを中心としたストレス応答と組織リモデリングの遺伝子発現制御プログラムに関して検討を進めた。まず遊離脂質が心血管系と代謝系の両者でストレス要因となること、その情報伝達に小胞体ストレス、TLR、および酸化ストレスが重要であることを見いだした。また、線維芽細胞組織特異的KLF5ノックアウトマウスを作成することにより、KLF5が心臓間質の機能制御を担い、線維芽細胞と心筋細胞の相互作用が心臓へのストレス応答に必須であることを示した。この時、線維芽細胞でIGF-1の発現を制御することが重要である。代謝系に関しても、KLF5が膵β細胞の機能障害に重要であることを明らかとした。さらに、KLF5が摂食を調整している可能性を見いだした。メタボリックシンドロームと心血管疾患の分子機構を明らかにするために,細胞のストレス受容と,それに対する遺伝子発現制御による応答の分子機構を鍵として,心血管系,代謝系,免疫系をストレス応答の一つの連続体(コンティニウムcontinuum)として解析することを目的とする。そのため,心血管系と代謝系の両者で,Toll-like受容体(TLR)やアディポネクチン受容体などによる代謝ストレスの受容機構とその情報伝達機構を解析するとともに,Kruppel型転写因子ファミリーおよび免疫応答に重要なInterferon response factor (IRF)ファミリーを中心としたストレス応答と組織リモデリングの遺伝子発現制御プログラムに関して検討を進めた。まず遊離脂質が心血管系と代謝系の両者でストレス要因となること,その情報の少なくとも一部はTLRを介していることを明らかとした。平滑筋細胞においては形質変換をもたらし,血管の組織リモデリングを惹起することが示唆された。また,転写因子KLF5が翻訳後修飾によって機能制御を受けること,代謝系における代謝ストレス応答に重要なことを明らかとした。また,組織特異的KLF5ノックアウトマウスを作成することにより,KLF5が心臓肥大,線維化に重要であることを明らかとした。代謝系に関しても,組織特異的なKLF5ノックアウトマウスの確立を進めた。メタポリックシンドロームと心血管疾患の分子機構を明らかにするために、細胞のストレス受容と、それに対する遺伝子発現制御による応答の分子機構を鍵として、心血管系・代謝系・免疫系をストレス応答の一つの連続体(コンテイニウムcontinuum)として解析することを目的とする。そのため、心血管系と代謝系の両者で、Toll-like受容体(TLR)やアディポネクチン受容体などによる代謝ストレスの受容機構とその情報伝達機構を解析するとともに、Kruppel型転写因子ファミリーおよび免疫応答に重要なInterferon response factor(IRF)ファミリーを中心としたストレス応答と組織リモデリングの遺伝子発現制御プログラムに関して検討を進めた。代謝系に関しても、組織特異的なKLF5ノックアウトマウスの確立を進め、膵β細胞や脂肪細胞特異的なKLF5過剰発現・ノックアウトマウスを作成した。KLF5が膵β細胞の遊離脂肪酸への応答に重要であることを明らかとした。メタボリックシンドロームと心血管疾患の分子機構を明らかにするために、細胞のストレス受容と、それに対する遺伝子発現制御による応答の分子機構を鍵として、心血管系・代謝系・免疫系をストレス応答の一つの連続体(コンティニウムcontinuum)として解析することを目的とする。

そのため、心血管系と代謝系の両者で、Toll-like受容体(TLR)やアディポネクチン受容体などによる代謝ストレスの受容機構とその情報伝達機構を解析するとともに、Kruppel型転写因子ファミリーおよび免疫応答に重要なInterferon response factor(IRF)ファミリーを中心としたストレス応答と組織リモデリングの遺伝子発現制御プログラムに関して検討を進めた。まず遊離脂質が心血管系と代謝系の両者でストレス要因となること、その情報伝達に小胞体ストレス、TLR、および酸化ストレスが重要であることを見いだした。また、線維芽細胞組織特異的KLF5ノックアウトマウスを作成することにより、KLF5が心臓間質の機能制御を担い、線維芽細胞と心筋細胞の相互作用が心臓へのストレス応答に必須であることを示した。この時、線維芽細胞でIGF-1の発現を制御することが重要である。代謝系に関しても、KLF5が膵β細胞の機能障害に重要であることを明らかとした。さらに、KLF5が視床下部で発現し、摂食を調整している可能性を見いだした。
心大血管と鰓弓の形態形成を支える分子シグナル機構の解明

(1)エンドセリン(ET-1)欠損マウス胚の表現型および遺伝子発現の解析から、鰓弓上皮や中胚葉組織から産生されるET-1が頭部神経堤細胞のETARに作用し、ホメオボックス型転写因子であるDlx5,6の遺伝子発現を誘導することによって、鰓弓の背腹軸方向のパターン形成という形態形成の基本プログラムに関与することが明らかになった。(2)ET-1シグナルの下流遺伝子として同定されたbHLH型転写因子であるdHANDが、平滑筋細胞分化の過程で中間段階の移行に関与し、最終分化に関しては抑制的に働いている可能性を示した。(3)dHANDのさらに下流遺伝子としてカルパインプロテアーゼファミリーの一員であるカルパイン6を同定し、この分子が細胞骨格に作用して細胞形態や増殖を制御する因子である可能性を明らかにした。(4)神経堤細胞の分化や遊走に関与するPaired box型転写因子Pax3が結合する因子として、転写コアクチベーターであるTAZを同定し、Pax3の転写活性の正の調節因子として機能しうることを明らかにした。(5)ETA受容体遺伝子プロモーターにGFPおよびトリレトロウィルス受容体TVAを結合した遺伝子コンストラクトによりトランスジェニックマウスを樹立した。これにより、神経堤細胞や血管平滑筋細胞の標識や単離、トリレトロウィルスベクターを介した細胞特異的遺伝子導入などが可能となった。このマウスは心大血管および鰓弓の形態形成の解析に有用性が期待される。i)DNAチップによる遺伝子変異マウスの解析:胎生10.5日正常マウス胚とET-1ノックアウトマウス胚の鰓弓領域に発現する遺伝子プロファイルをDNAチップによって網羅的に解析し、12,489遺伝子のうちHAND1,2やDlx3,5,6を含む146遺伝子が1/2以下の発現低下、83遺伝子が2倍以上の発現増加とカウントされた。これらのうちでin situハイブリダイゼーションで発現の差が明らかになったものについて、ノックアウトを含めて解析を進めている。ii)酵母two-hybrid法による転写因子結合蛋白と関連シグナルの同定:神経堤細胞による大血管形成に重要なPax-3の2つの転写因子について、これまでtwo-hybrid法によって転写コアクチベーターのTAZが結合し、Pax-3の転写活性を亢進させること、神経管背側部や神経堤由来組織などでTAZが発現していることを明らかにした。この他いくつかの核内蛋白がPax3に結合することが明らかになり、その解析を進めている。iii)A型エンドセリン受容体(ETAR)プロモーターを用いた新たな遺伝子改変マウスを用いた解析:ETAR遺伝子プロモーターによって蛍光蛋白GFPを発現させるトランスジェニックマウスを作成し、その発現パターンとソーティングによる発現遺伝子の解析から、GFPが鰓弓へ遊走する神経堤細胞および血管平滑筋細胞の一部に発現していることを明らかにした。さらにこのプロモーターを用い、これらの細胞にトリレトロウィルス受容体TVAを発現させることにより、細胞特異的遺伝子導入の系を樹立した。このマウス胚より切り出して培養した神経堤細胞、鰓弓の神経堤由来間葉細胞に対し、GFPを組み込んだトリレトロウィルスを感染させ、GFPによる蛍光シグナルが認められた。この系を用いて、血管平滑筋分化を制御する細胞内シグナルの解析が進むことが期待される。i)DNAチップによる遺伝子変異マウスの解析:胎生10.5日正常マウス胚とET-1ノックアウトマウス胚の鰓弓領域に発現する遺伝子プロファイルをDNAチップによって網羅的に解析し、2倍以上の発現増加が認められin situハイブリダイゼーションで発現の差が明らかになった遺伝子として、Calpain6を同定した。この分子はプロテアーゼ活性を持たないCalpainファミリーメンバーであるが、胎生期に鰓弓・心臓・肢芽などで発現し、細胞骨格構築に重要な役割を果たしている可能性が明らかになった。ii)酵母two-hybrid法による転写因子結合蛋白と関連シグナルの同定:神経堤細胞による大血管形成に重要な転写因子Pax-3の結合因子として、two-hybrid法によって転写コアクチベーターTAZを同定した。

TAZがPax-3の転写活性を亢進させること、胎生期においてPax3とTAZが神経管や体節などで共発現することを明らかにした。iii)鰓弓形成におけるET-1シグナルの役割の解明:全胚培養を用いて、ET-1シグナルがマウス胚形成における鰓弓形態のパターン形成期に働いていることを証明した。さらに、ET-1遺伝子欠損マウス胚の形態学的及び遺伝子発現解析により、ET-1遺伝子欠損マウス胚において転写因子Dlx5,6の発現が消失しているとともに下顎弓が上顎弓へとホメオティック様形態変化を起こしていることを証明した。これにより、ET-1はDlx5,6の発現誘導を介して鰓弓の背腹軸方向のパターン形成を制御していることを明らかにした。
半導体超微粒子を固定した電極の調製とその光電気化学特性

本年度は,電気泳動電着によりTiO_2超微粒子ゲル膜を固定した電極の調製法,ならびに金電極上の自己集合膜へのCdS超微粒子の固定法を確立し,各電極のキャラクタリゼイションと光電気化学特性を調べた.TiO_2ゲル膜を固定した電極の調製と,それを用いた二酸化炭素の光還元反応1)塩酸および安定化剤としてポリピロリドンを含むイソプロパノールにチタンイソプロポキシドを滴下することにより,TiO_2超微粒子を合成する.それへ白金電極を入れて30V/cmの電圧を印加することにより,陰極上にTiO_2超微粒子のゲル膜が生成することを見出した.膜中のTiO_2量は63wt%であり,また超微粒子の粒径は24nmであることが,TEM観察により明らかとなった.2)白金メッシュ電極上にTiO_2超微粒子膜を固定し,それを正孔捕捉剤としてイソプロパノールを含む炭酸プロピレン溶液に浸漬して二酸化炭素を飽和させた後に高圧水銀アーク燈の光を膜に照射すると,二酸化炭素の還元生成物としてメタノールのみが選択的に生成した.^<13>CO_2を用いたラベリング実験を行い,生成物を質量分析と^<13>C-NMRにより調べたところ,生成したメタノールは全てCO_2の還元によって得られた物であることが明らかとなった.CdS超微粒子の電極への固定と,そのSTM観測1)2-アミノエタンチオールで表面修飾したCdS超微粒子(平均粒径:3nm)を合成し,それを分散させた水溶液に3,3′-ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)の自己集合単分子膜で被覆した金電極を浸漬することにより,CdS超微粒子の固定を試みた.2)調製した電極を,STMにより観察したところ,平均粒径が3nm粒子が観測され,CdS超微粒子が固定されていることが明らかとなった.観測した粒子がCdSであることは,STS測定によるバンドギャップが分光的に調べたものと一致することからも確認することができた.本年度は,電気泳動電着によりTiO_2超微粒子ゲル膜を固定した電極の調製法,ならびに金電極上の自己集合膜へのCdS超微粒子の固定法を確立し,各電極のキャラクタリゼイションと光電気化学特性を調べた.TiO_2ゲル膜を固定した電極の調製と,それを用いた二酸化炭素の光還元反応1)塩酸および安定化剤としてポリピロリドンを含むイソプロパノールにチタンイソプロポキシドを滴下することにより,TiO_2超微粒子を合成する.それへ白金電極を入れて30V/cmの電圧を印加することにより,陰極上にTiO_2超微粒子のゲル膜が生成することを見出した.膜中のTiO_2量は63wt%であり,また超微粒子の粒径は24nmであることが,TEM観察により明らかとなった.2)白金メッシュ電極上にTiO_2超微粒子膜を固定し,それを正孔捕捉剤としてイソプロパノールを含む炭酸プロピレン溶液に浸漬して二酸化炭素を飽和させた後に高圧水銀アーク燈の光を膜に照射すると,二酸化炭素の還元生成物としてメタノールのみが選択的に生成した.^<13>CO_2を用いたラベリング実験を行い,生成物を質量分析と^<13>C-NMRにより調べたところ,生成したメタノールは全てCO_2の還元によって得られた物であることが明らかとなった.CdS超微粒子の電極への固定と,そのSTM観測1)2-アミノエタンチオールで表面修飾したCdS超微粒子(平均粒径:3nm)を合成し,それを分散させた水溶液に3,3′-ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)の自己集合単分子膜で被覆した金電極を浸漬することにより,CdS超微粒子の固定を試みた.2)調製した電極を,STMにより観察したところ,平均粒径が3nm粒子が観測され,CdS超微粒子が固定されていることが明らかとなった.観測した粒子がCdSであることは,STS測定によるバンドギャップが分光的に調べたものと一致することからも確認することができた.
脳 GTP シクロヒドロラーゼ I の生化学的研究によるドーパ反応性ジストニーの病態解明

ドーパ反応性ジストニー(DRD)症例の多くはGTPシクロヒドロラーゼI(GTPCH)遺伝子に変異を有しているが、ヒト脳内GTPCH蛋白質量の報告はなくDRDにおける病態も不明である。ヒト剖検脳を用いて世界で初めてGTPCH蛋白質の定量を行い(1)線条体で発現が高いこと、(2)GTPCH欠乏性DRD線条体における低下はパーキンソン病より著しく-60%以上に至ること、(3)この蛋白質は線条体にて生後1日目から28日目まで急激に増加し、その後プラトーとなり、17歳から減少することを見出した。ヒトの凍結剖検脳において、世界で初めてGTPシクロヒドロラーゼI蛋白質の定量をウェスタンブロッティングを用いて行った。まず神経/精神学的に正常なヒト剖検脳7例における脳内分布を検索したところ、GTPシクロヒドロラーゼI蛋白質の量は赤核で最も高く、赤核>黒質(緻密層)>淡蒼球(内節・外節)>被殻>尾状核>扁桃核>視床>海馬>島皮質>他の皮質(小脳皮質・前頭葉皮質・側頭葉皮質・頭頂葉皮質・後頭葉皮質)、となっていることが明らかとなった。GTPシクロヒドロラーゼIは、テトラヒドロビオプテリン(ドーパミン合成系のチロシン水酸化酵素およびセロトニン合成系のトリプトファン水酸化酵素の補酵素)生合成の律速酵素であるため、7例中5例では脳内の主要部位における総ビオプテリンの値も高速液体クロマトグラフィー/蛍光検出器で測定したところ、赤核>淡蒼球(内節・外節)>被殻>尾状核>皮質(小脳皮質・前頭葉皮質・後頭葉皮質)、と同様の脳内分布を呈していた。次に黒質線条体ドーパミンニューロンが変性・脱落することを特徴とするパーキンソン病7例と、これらと死亡年齢および剖検までの時間が一致している正常コントロール8例の被殻・尾状核・前頭葉皮質を用いてGTPシクロヒドロラーゼI蛋白質を定量し比較したところ、パーキンソン病の被殻と尾状核で有意な低下が認められたが、前頭葉皮質では有意差を認めなかった。今後、ヒト脳の発達と老化がGTPシクロヒドロラーゼI蛋白質量におよぼす影響を検討した上で、GTPシクロヒドロラーゼIの遺伝子変異を有するドーパ反応性ジストニー剖検脳の生化学的検索を行い、このGTPシクロヒドロラーゼI欠乏性ドーパ反応性ジストニーの発症機序を解明する。ドーパ反応性ジストニー症例の多くは、テトラヒドロビオプテリン(ドーパミン合成系のチロシン水酸化酵素およびセロトニン合成系のトリプトファン水酸化酵素の補酵素)生合成経路の律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼIの遺伝子(GCH1)に異常を有している。今回ヒトの凍結剖検脳を用いて世界で初めてGTPシクロヒドロラーゼI蛋白質の定量を行い、神経/精神学的に正常な剖検脳では赤核・黒質(緻密層)・淡蒼球(内節と外節)・被殻・尾状核等において発現が高く、その脳内分布はテトラヒドロビオプテリンの分布と一致している事を明らかにした後、黒質線条体ドーパミンニューロンの変性・脱落をきたすパーキンソン病および多系統萎縮症の被殻と尾状核では、正常コントロール群(死亡年齢と剖検までの時間は疾患群と一致)と比較し、GTPシクロヒドロラーゼI蛋白質量はそれぞれ有意に低下していることを示した。また、GCH1に変異を有するドーパ反応性ジストニー症例(19歳)の線条体で、GTPシクロヒドロラーゼI蛋白質量は同年齢の正常コントロール群と比較して明らかに低下しており、その程度は被殻で-83%・尾状核で-66%に至り、パーキンソン病および多系統萎縮症において認められた減少よりも著しいことを見出した。ドーパ反応性ジストニー症例の淡蒼球外節でも-73%に至る低下を確認した。以上の結果より、この常染色体優性遺伝を示すドーパ反応性ジストニーでは転写または翻訳レベルでdominant-negative効果が存在していることが初めて示唆された。今後、他のドーパ反応性ジストニー症例(無症候性キャリアを含む)剖検脳の検索を行い、またヒト脳の発達と老化が線条体GTPシクロヒドロラーゼI蛋白質量におよぼす影響をさらに検討し、常染色体優性ドーパ反応性ジストニーの発症機序を解明する。ドーパ反応性ジストニー(DRD)症例の多くは、テトラヒドロビオプテリン生合成経路の律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼIの遺伝子に異常を有しているが、ヒト脳内GTPシクロヒドロラーゼI蛋白質量の報告はなくDRDにおける病態も不明である。