hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎癌多段階発癌機構の解明と革新的治療法開発の基盤形成

近年の次世代シーケンスによる大規模ゲノム変異解析から淡明細胞型腎細胞癌において、発がんに促進的に働くと考えられるドライバー遺伝子変異が明らかにされており、他のがんと同様に腎細胞癌においても多段階発癌説が当てはまると考えられる。一方で淡明細胞型腎細胞癌以外の腎細胞癌においては、発がんの初期過程の遺伝子変異(がん抑制遺伝子の機能欠損やがん遺伝子の活性化)は明らかにされているものの、発がんに促進的に働くドライバー遺伝子変異やその発がんに果たす役割は未解明である。本研究ではがん抑制遺伝子FLCNの機能欠損が発がんの引き金となるBHD症候群関連腎細胞癌、および転座によるキメラTFE3遺伝子の発現を認める転座型腎細胞癌を対象に、腎癌モデルマウス、ヒト臨床検体ならびに各種細胞株を解析し研究を推進してきた。平成29年度は以下の様に研究を進めた。・ヒトFLCN欠損腎細胞癌の全エクソンシーケンス解析により、ドライバー遺伝子候補を同定した。そのうち、有望なドライバー遺伝子候補であるクロマチンリモデリング関連因子は、転座型腎細胞癌においても遺伝子変異が認められる。このクロマチンリモデリング関連因子の遺伝子改変マウス(コンディショナルノックアウトマウス)を作製し、解析用の交配を進めた。・転座型腎細胞癌で認めるキメラTFE3蛋白質が異常な機能を獲得した転写因子として発がんに寄与する事を、細胞株並びにマウスモデルの作製・解析を通して明らかにした。・Flcnは細胞の代謝調節を介して、細胞内シグナルと遺伝子発現を制御する事を明らかにした。・転座型腎細胞癌の診断に有効なマーカーを同定し、臨床検体でその有効性を確認した。がん抑制遺伝子FLCNの欠損を認めるBHD関連腎細胞癌と、転座による融合TFE3遺伝子を認める転座型腎細胞癌を対象に、遺伝子改変マウス、ヒト臨床検体、細胞株を用い、発がん分子機構の解明、発がんに促進的に働く遺伝子変異の解析、新たな診断・治療方法の開発を目的として研究を進めた。FLCNは代謝制御を介して細胞内シグナルを制御している事を見出した。BHD関連腎細胞癌では、FLCNの欠損と併せてクロマチン再構成関連遺伝子に高率に変異を認めた。融合TFE3が異常な機能を獲得した転写因子として発がんに寄与する事を明らかにした。さらに転座型腎細胞癌の診断に有効なマーカーを同定し、臨床検体で有効性を確認した。作製した遺伝子改変マウスの観察・解析を計画通りに進める。臨床検体の収集・解析を継続して行う。引き続き遺伝子改変マウスの解析を継続し、腎癌ドライバー遺伝子の候補を同定する。並行してドライバー遺伝子候補のインビトロ評価システムを立ち上げるとともに、有望なドライバー遺伝子候補に関しては遺伝子改変マウスの作製を継続する。29年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
PKIの安全性向上化技術の研究

近年、災害やテロなどが頻繁に起こっており、電子社会システムをハザードから守る必要性が高まってきた。そのシステムでは暗号を核とする情報セキュリティ技術が必須であるが、支えとなるのは公開鍵暗号基盤PKI(Public Key Infrastructure)である。そこで、それらに強いPKIを提案した。すなわち分散化方式を導入し、これにより証明書発行機関CA(Certificate Authority)の権限集中、不正者に暗号鍵を解読されても使い続けてしまう問題点などを解決した。とくに、楕円曲線状のPairingを用いて、PKIの安全性を保ち、かつ、管理の容易な方式を提案した。また、評価およびまとめを行った。(1)システムの実現暗号鍵更新方式、管理機能分散方式を統合化したシステムを構築し、トータルとしてハザードに強いPKIを実現した。楕円曲線上のPairing関数を用いて、これらを実現した。(2)評価楕円曲線上のPairing関数を用いたシステムをプログラム化し、実際に評価し、最後に報告書にまとめた。ハザードに強いPKIを実現するため、次のような項目を研究した。(1)PKIの脆弱性の調査災害やテロなどのハザード時における脆弱性を明らかにした。(2)自動鍵更新方式の提案定期的に鍵を変更して、ある鍵が解読されてもその影響はその期間だけにとどまる方式とする。楕円曲線におけるPairing等を利用することを念頭に、従来のForward Security方式を改良した。(3)管理機能分散方式の提案分散化によりセキュリティの安全性を高める仕組みを提案した。これにより、分散処理端末は、他の端末の秘密に関する情報や処理を知ることができず、かつごまかしもできないようになった。(4)統合化システムの検討上記の方式を統合化したシステムを検討した。これにより今後トータルとしてハザードに強いPKIを実現できる。
成長データ解析の理論とソフトウェアの開発

本研究では、成長あるいは経時測定データに対する解析法とソフトウェアの開発を目指している。本研究による主要な成果の一つは、説明変数に階層構造がある場合の成長曲線モデル導入し、その解析法についていくつかの成果を得た。具体的には、階層構造モデルの重要性を指摘し、最尤法に基づく推定法、平均パラメータの検定法、いくつかの成長曲線に対する同時信頼区間構成法、共分散構造検定法、モデル選択基準、等を与えた(Ann.Inst.Statist.Math.,Comm.Statist.,Multivariate Anal.)。また、アンバランスデータの場合には、ランダム共分散構造を想定し、従来の推測法を拡張した(投稿中)。さらに、これらの成果を取り入れたソフトウェアとして、「"GROWT3"Ver1.0:母数に線形構造を持つ成長曲線モデルによる統計解析のためのWindows対応プログラム」(大瀧慈・佐藤亜香里・佐藤健一・藤越康祝)を開発した。このソフトに関連して、正規混合分布を推定するためのソフトウェアも開発した。ヒトの身長および体重の成長についての追跡調査と解析にも取り組んだ。本研究では、非線形モデルに基づく推測法を提案した。とくに、生物的パラメター間の性質について新たな知見を得た(Acta Med.Auxol.,Environmentrics)。関連した基礎的研究として、モデル選択基準の改良、および、基本的性質の研究に取り組んだ。これに関して、多変量線形モデルにおける修正AIC基準の導出(Hiroshima Math.J.)、および、成長曲線モデルにおける交互確認基準の基本的性質を明らかにした(投稿中)。この他、2値経時データによる誤判別確率の推定法を提案した(Biometrics)。成長データの理論開発については、いくつかの新しい成果が得られた。まず、階層型個体内計画行列をもつ成長曲線モデルについて、最尤推定量を具体的に与え、その基本的性質を明らかにした。また、成長曲線の同等性検定法を提案した。これらの結果はAnn.Inst.Statist.Math.に掲載予定である。次に、二つの階層型個体内計画行列をもつ成長曲線モデルにおいて、それぞれの成長曲線について同時信頼領域を構成する方法を与えた(Comm.Statist.に掲載予定)。成長曲線モデルの選択に対して、交差確認基準が提案されているが、この基準に関して改良基準を提案した。ここでの改良はモデル選択リスクに対して、より忠実な基準量への改良である(投稿予定)。離散型データを含む経時データモデルとして、一般化線形モデルと個体内相関を考慮したモデルが導入され、二つの推定法(独立推定方程式推定量、一般化推定方程式推定量)が提案されている。この二つ推定法の比較を漸近相対効率にもとずいて行い、説明変数のタイプによる相違を明らかにした(投稿予定)。上記の理論成果に関連したコンピューター処理のための、概要的システム設計やアルゴリズムの設計についても取り組んだ。また、実際の経時データの分析と関連して、生物学的効果比の区間推定法を提案した(広島医学に掲載)。また。級内相関の推定における非対データの影響を明らかにした(Comm.Statist.に掲載予定)。成長データの理論開発については、拡張成長曲線モデルに関して新たな結果が得られた。まず、種々のランダム係数共分散構造の適合性に対する尤度比検定法および修正尤度比検定法を開発した(J.Multivariate Anal.に掲載)。また、これまで二つの階層型個体内計画行列をもつ拡張成長曲線モデルにおいて、それぞれの成長曲線について同時信頼領域を構成する方法を与えたが(Comm.Statist.に掲載)、この結果を複数個の階層型個体内計画行列をもつ場合に拡張した(Hiroshima Statistical Group TR99-16に発表)。日本人の体格測定についての追跡データに対して、非線形モデルを用いた分析を行った(Acta Medica Auxologicaに掲載)。また、永久歯の欠損と年齢との関係について、経時データモデルを用いた分析を行った(Japan J.Biometricsに掲載)。

上記の理論成果に関連したコンピューター処理のための、概要的システム設計やアルゴリズムの設計についても取り組んだ。また、相互モニタリングが可能な遠隔共同作業支援システムの開発を行った(日本バーチャルリアリテイ誌に掲載)。成長データの理論に必ずしも限定されたものではないが、統計量の変換に対しても新たな結果を得た。一つは、検定の統計量の平均と分散を考慮した改良単調カイ二乗変換の提案である。(J.Multivariate Anal.に掲載)。他は、相関係数に対する分散安定化変換の提案である(Statistics&Probability Lettersに掲載)。本研究では、成長あるいは経時データに対するモデルと解析法を発展させ、多様性を考慮した汎用的で、かつ、より効率の高い解析法とソフトウェアの開発を目指している。本年度の成果の一つは、階層構造がある場合の経時データ解析法の発展、および、そのソフト開発である。具体的には、まず、階層構造に関連した共分散構造の検定法を与えた(J.Multivariate Analysis)。また、ランダム共分散構造をもつアンバランスデータに対する推測法を提案した(投稿中)。さらに、一般共分散構造の場合において、最尤法に基づく推測法、改良AIC基準を導出した。これらの結果は、目下、投稿中あるいは準備中のものである。さらに、これらの成果を取り入れたソフト開発として、「"GROWT3" Ver 1.0:母数に線形構造を持つ成長曲線モデルによる統計解析のためのWindows対応プログラム」(大瀧慈・佐藤亜香里・佐藤健一・藤越康祝)を発表した。これに関連した基礎的研究として、多変量線形モデルにおける修正AIC基準の導出(Hiroshima Math.J.)、および、交互確認基準の基本的性質を明らかにした(投稿中)。この他、2値経時データによる誤判別確率の推定法を提案した(Biometrics)。また、ヒトの身長等の成長について非線形モデルを利用して、身長と初潮との関連を明らかにする(日本小児科会報)と共に、生物的パラメター間の性質について新たな知見を得た(Environmentrics)。さらに、正規混合分布を推定するためのソフトウェアを開発した。
階層型神経回路網による情報分散処理の研究

かくれ層素子がシグモイド関数を活性化関数として持つような3層神経回路網にて情報分散処理を行うための基礎的研究を行った。シグモイド関数の台は有界集合ではないので、その様な神経回路網に局所情報の分散処理を行わせるのは困難のように思えるが、他方、ニューロンの入出力関数はシグモイド関数なのでシグモイド関数を活性化関数とする回路網の研究は、神経生理学的にも重要である。容易に分かるが、活性化関数がシグモイド関数であっても、5層の神経回路網は局所的な情報処理により関数を近似する能力を持つ。局所情報を担当するお互いに独立なモヂュ-ルを作ることが出来るからである。4層神経回路網の場合、局所情報を担当しお互いに線形独立なモヂュ-ルを構成することが出来る(Y.Ito,1994)。しかし、3層神経回路網の場合、現在の所、局所を担当するモヂュ-ルを構成することはできない。その様なモヂュ-ルを構成することが出来るか否かについても、よくは分かっていないのが現状であるが、その解答に至るべき中間的な結果が本年の研究によって得られた。すなわち、適当な条件を満たすシグモイド関数によって定義された平面波はパラメータが本質的に異なれば、お互いに線形独立であることを証明した(次頁Y.Ito,1996)。これはSussmann(1992)によって得られた結果の拡張となっている。この結果は、3層神経回路網においても局所情報を担当するモヂュ-ルが存在し得る事を示唆する。それを具体的に研究するのは次年度以降となるが、本年度の結果の応用としては、活性化関数のスケイリングを伴わない3層神経回路網による有限写像の実現がある(次頁Y.Ito,K.Saito,1996)。
音声対話システムのための言語的・メタ言語的知識の構築に関する研究

音声対話ロボットがその理解や行動を修正しようとするユーザからの割り込みに適切に応じるために必要な,言語的・メタ言語的知識の収集に取り組んだ.対話システムがユーザの割り込みに適切に応じるには,ユーザの発話を理解するだけでなく,適切な言語表現を生成してユーザとコミュニケーションを取る必要がある.特に物理的な世界で活動するロボットは,単に論理的に正しいだけでなく,人間の状況認識に沿った物体参照表現を生成する必要がある.しかし従来の研究では,言語表現の論理的正確性と簡潔性が重視され,人間の認識との一致性については十分に議論されていない.そこで,人間の認識との一致性が重要となる状況に注目し,心理言語学実験によって言語表現を収集した.具体的には,物体の集合と集合間の関係を用いないと自然な表現が生成できない状況を取り上げた.そのような状況では,従来の研究によっても論理的に正確な表現は生成できるが,自然で理解しやすい表現は生成できない.そのような状況を12個用意し,42人の大学生から476表現を収集した.そして別の44人の大学生にそれらの言語表現の適切さを評価させ,人間がどのような言語表現を生成し,そして好むかを調べた.調査結果を反映させた生成アルゴリズムは,用意した状況に対して人間と同等の言語表現を生成できた.前年度に引き続き,割り込み発話の収集に取り組んだ.前年度に行った収集実験では人間対人間の対話を対象としたが,そこで得られた対話データは機械処理には複雑すぎるものであった.そこで,人間対機械の対話を模擬し,複雑さを抑制した対話データを収集するためのツールを作成した.対話システムを用いて対話データを収集しようとしてもシステムの能力不足によって対話が破綻することが問題になるが,このツールを用いれば人間が対話システムに成り済ますことで複雑さの抑制された対話データを安定して収集できる.対話における,聞き手の誤解や話し手の意図の変更に伴う割り込みと修正を観察するために,心理言語学を専門とする研究者の協力を得て映像付き音声対話データを採集した.対話の種類は,二名一組の対話者からなる共同問題解決対話である.二名の対話者はそれぞれ指示者と行動者のいずれかの役割を分担し,指示者にだけ与えられる視覚的なヒントを基にタングラムパズルを解く.パズルの直接的な操作は行動者にだけ許され,指示者は行動者に音声で指示を与えることでしかパズルを操作できない.このような課題設定で対話を収集する事で,多くの修正が現れる対話を採集できた.音声の収録に加え,解決過程におけるパズルの状態と両対話者の表情を撮影し,対話数35,合計8時間のマルチモーダルコーパスを構築した.映像付き対話コーパスは希少でその価値は高い.また現存するほとんどの対話コーパスが,情報探索や宿泊予約など音声での情報交換に限定された問題領域を対象としており,行動を伴う対話を扱った本コーパスは貴重な言語資源である.音声はすべて時問情報付きのテキストに書き起こした.また,ビデオ映像と書き起こしを同期させて再生できるツールを作成した.これらを利用する事で効率的に対話を観察できる.コーパスは一組の対話者が二つのパズル課題に取り組むように設計されており,役割を交代する場合/しない場合での対話の変化なども観察できる様に考慮されている.そのため,対話における言語運用の変化に関する研究等にも利用できる.音声対話ロボットがその理解や行動を修正しようとするユーザからの割り込みに適切に応じるために必要な,言語的・メタ言語的知識の収集に取り組んだ.対話システムがユーザの割り込みに適切に応じるには,ユーザの発話を理解するだけでなく,適切な言語表現を生成してユーザとコミュニケーションを取る必要がある.特に物理的な世界で活動するロボットは,単に論理的に正しいだけでなく,人間の状況認識に沿った物体参照表現を生成する必要がある.しかし従来の研究では,言語表現の論理的正確性と簡潔性が重視され,人間の認識との一致性については十分に議論されていない.そこで,人間の認識との一致性が重要となる状況に注目し,心理言語学実験によって言語表現を収集した.具体的には,物体の集合と集合間の関係を用いないと自然な表現が生成できない状況を取り上げた.そのような状況では,従来の研究によっても論理的に正確な表現は生成できるが,自然で理解しやすい表現は生成できない.そのような状況を12個用意し,42人の大学生から476表現を収集した.そして別の44人の大学生にそれらの言語表現の適切さを評価させ,人間がどのような言語表現を生成し,そして好むかを調べた.調査結果を反映させた生成アルゴリズムは,用意した状況に対して人間と同等の言語表現を生成できた.前年度に引き続き,割り込み発話の収集に取り組んだ.前年度に行った収集実験では人間対人間の対話を対象としたが,そこで得られた対話データは機械処理には複雑すぎるものであった.そこで,人間対機械の対話を模擬し,複雑さを抑制した対話データを収集するためのツールを作成した.対話システムを用いて対話データを収集しようとしてもシステムの能力不足によって対話が破綻することが問題になるが,このツールを用いれば人間が対話システムに成り済ますことで複雑さの抑制された対話データを安定して収集できる.
有機触媒触媒を用いた天然物の全合成

インフルエンザ治療薬であるタミフルの有機触媒を用いた効率的な全合成研究において、鍵反応となるdiphenylprolinol silyl ether触媒によるアルデヒドとニトロアルケンとの不斉触媒マイケル反応の最適化を行った。その過程で、反応に酸を添加剤として加えると反応が著しく加速される事を見いだした。この酸の効果の原因を究明すれば、diphenylprolinol silyl ether触媒を他の反応に適用する際に、重要な知見が得られるものと考え、その研究を押し進めた。種々の酸を加えて反応を行ったところ、酸が強すぎても、また弱すぎても反応が効率的に進行せず、p-nitrophenolが最適である事を明らかにした。反応はアルデヒドと触媒であるdiphenylprolinol silyl etherが反応し、まずエナミンが生成する。このエナミンがニトロアルケンに付加し、イミニウム塩を形成する。イミニウム塩が加水分解して、マイケル付加体を与え、触媒が再生するという機構を想定していたが、それぞれの素反応のNMRを詳細に検討したところ、エナミンとニトロアルケンのマイケル反応が進行しているのではなく、シクロブタン誘導体を与える2+2付加環化反応が進行することを見いだした。エナミンの生成、エナミンとニトロアルケンの2+2付加環化反応、シクロブタン誘導体の分解によるマイケル体への変換反応、それぞれの反応において、酸の効果を調べたところ、どの反応においても、酸は反応を加速する効果のあることがわかった。特に顕著な効果はシクロブタン誘導体のマイケル付加体への分解反応であることが明らかになった。タミフルの効率的な合成法の開発を目的としていたが、その研究の過程で鍵反応に酸を添加剤として加えると反が著しく加速される事に気がついた。その理由を解明した。化学的に新しい知見が得られ、化学の分野に寄与する発見と考えているが、当初予期した研究は遅れる事となった。酸の役割の解明が終わったので、当初の計画通り、タミフルの簡便な合成法の確立に向けて研究を推進する予定である。有機触媒は、一般に安価であり、水や酸素に安定で、毒性が少ないなどの利点がある。有機触媒は実用的な触媒として現在盛んに研究されている。今回,天然物の全合成を視野に入れ,まず我々の研究室で開発したdiphenylprolinol silyl etherを用いたアルデヒドとニトロアルケンとの反応に焦点を絞り,より短時間で反応が完結し、より高い収率で付加体が得られる条件について検討を行った。その結果,反応に酸を添加すると著しく反応が加速されることを見いだした。また種々の酸性度の異なる酸について詳細に検討を行ったところ,酸が強すぎても、また弱すぎても反応が効率的に進行しないことを明らかにした。本反応における酸の効果についてさらに検討を行った。反応はアルデヒドと解媒であるdiphenylprolinol silyl etherが反応し、まずエナミンが生成する。イミニウム塩が加水分解して,マイケル付加体を与え,触媒が再生するという機構が想定される。エナミン形成時における酸の効果を検討した。また当量のエナミンとニトロアルケンの付加反応における酸の効果を調べた。その結果、いずれの反応においても、酸を添加することにより,反応が加速されることを見いだした。しかし,どちらが本反応大きな影響を及ぼしているのかは不明である。今後は反応速度論的な解析を行い,反応の律速段階を決定し,その過程における酸の加速効果の原因を解明する。さらに、酸存在下において、反応性の乏しいアルデヒドを用いたときに、付加反応が進行するかを調べ,本反応の一般性の拡張を検討する。その理由を解明した。

化学的に新しい知見が得られ、化学の分野に寄与する発見と考えているが、当初予期した研究は遅れる事となった。酸の役割の解明が終わったので、当初の計画通り、タミフルの簡便な合成法の確立に向けて研究を推進する予定である。
新生児虚血性脳障害の新規モデルを用いた、臍帯血及び骨髄単核球による再生治療

既存の新生児虚血性脳障害モデルは、脳障害の程度の個体差が大きく、研究の妨げになっていた。我々はCB17という特定系のマウスを使用し、片側中大脳動脈を永久閉塞することにより、均質な脳障害を呈する新生児脳梗塞モデルの作製に成功した。同モデルを使用し臍帯血幹細胞治療の効果を検討した。ヒト臍帯血造血幹細胞を動脈閉塞48時間後に静脈内投与したところ、形態的および行動学的脳障害の軽減を認めた。作用機序の一因として血流改善が示唆された。以上から「新生児低酸素性虚血性脳症に対する自己臍帯血幹細胞治療」の臨床試験開始に役立つ知見が得られた。本研究の目的は、新生児虚血性脳障害に対する新規治療法として、臍帯血幹細胞の静脈内投与の効果を検討することである。また、本研究遂行のためには再現性の高い新規の虚血性脳障害モデル作製が不可欠であるため、そのようなモデルの新規作製を行うことも本研究の目的である。新生児虚血性脳障害の新規モデルマウス作製は、平成24年度にモデル作製を完了しており、25年度は論文投稿・改訂を行った。同モデルマウスを使用し、虚血性脳傷害に対する臍帯血幹細胞の効果を検討した。造血幹細胞を多く含む分画であるヒト臍帯血CD34陽性細胞を、動脈閉塞48時間後に静脈内投与した。異種間移植であるため免疫不全マウス(SCIDマウス)を使用した。この細胞投与により、脳傷害発生7週後において形態的な脳傷害の軽減を認めた。細胞投与による悪影響(死亡率の増加や体重増加不良など)は認めていない。細胞投与による脳血流の変化を二次元Laser speckle法にて解析したところ、細胞投与24時間後において血流の低下している領域の減少を認めた。また、脳梗塞の境界域において細胞投与による血管径の拡張を組織学的に認めた。投与細胞は脳内にごく少数認めた。行動実験においては、Rotarod試験で細胞投与群はコントロール群(脳傷害+PBS投与)に比してやや良好な成績を呈したが有意な改善ではなかった。Open-field試験においても有意な改善は認めなかった。これらの結果を論文にまとめた。以上の結果は、臍帯血細胞治療の有効性・安全性を示すものであり、現在臨床試験の準備が行われている新生児低酸素性虚血性脳症に対する自己臍帯血幹細胞療法を支持する。このように本研究は、前臨床試験としての意義が大きい。平成24年度は、研究実施計画に則り、モデル作製を行った。生後12日の特定系統のマウスを使用し、開頭後に片側中大脳動脈を電気メスにより焼灼することにより、中大脳動脈永久閉塞モデルを作製した。期待したとおりの高い再現性をもって脳梗塞が全てのマウスにおいて発生した。梗塞体積比率を定量したところ、動物個体差は最小17.8%、最大30.4%と、非常に均質であった。梗塞部位はほぼ大脳皮質に限定されていた。急性期の脳血流低下の度合いも一定であった。行動評価においても、一定の神経機能障害を呈していた。長期生存率も8週間で85%と非常に良好であった。本モデルは新生児脳梗塞のモデルであり、既存の新生児低酸素性虚血性脳症モデルとの比較検討も行った。早速論文を執筆し投稿した。同モデルを使用し、虚血性脳傷害に対する臍帯血幹細胞の効果を検討した。この細胞投与により、形態的に脳傷害の軽減を認めた。現在、細胞投与による脳血流の変化や、血管に対する影響などを現在解析中である。以上の結果は、臍帯血細胞治療の有効性・安全性を示し、現在臨床試験の準備が行われている新生児低酸素性虚血性脳症に対する自己臍帯血幹細胞療法を支持するものである。本研究の目的は、1)新生児虚血性脳障害に対する新規治療法として、臍帯血幹細胞の静脈内投与の効果を検討すること、2)本研究遂行のために再現性の高い新規の虚血性脳障害モデル開発を行うこと、である。

特定系統(CB17)のマウスを使用し、開頭後に片側中大脳動脈を電気メスにより焼灼することにより、中大脳動脈永久閉塞モデルを作製した。全てのマウスが高い再現性をもって脳梗塞を来した。脳障害の程度は非常に均質(梗塞体積比率は最小の個体が17.8%、最大の個体が30.4%)で梗塞部位はほぼ大脳皮質に限定されていた。一定の神経機能障害を呈し、生存率は8週間で85%と良好であった(Tsuji et al., Exp Neurol 2013)。同モデルを使用し、臍帯血幹細胞治療の効果を検討した。造血幹細胞を多く含む分画であるヒト臍帯血CD34陽性細胞を動脈閉塞48時間後に静脈内投与した。異種間移植であるため免疫不全マウス(SCID/CB17マウス)を使用した。細胞治療によって脳傷害発生7週後において形態的な脳傷害の軽減を認めた。細胞投与による悪影響(死亡率の増加や体重増加不良など)は認めなかった。細胞投与24時間後において血流の低下している領域の減少を認めた。脳梗塞の境界域において血管径の拡張を組織学的に認めた。投与細胞は脳内にごく少数認めた。行動実験では、Rotarod試験において部分的な改善を認め、Open-field試験では有意な変化は認めなかった(Tsuji et al., Neuroscience 2014)。以上の結果は、臍帯血細胞治療の有効性・安全性を示すものであり、多施設共同で「新生児低酸素性虚血性脳症に対する自己臍帯血幹細胞治療」の臨床試験を開始した。小児神経学もう1つの目標である、新生児虚血性脳傷害に対する幹細胞静脈内投与の効果検討も最近論文として発表することができた(Neuroscience 2014;263:148-158)。本研究の目的は2つであり、その1つは再現性の高い新規脳傷害モデルの作製である。こちらは既に達成でき、初年度(平成24年度)に論文投稿まで進めることができた。もう1つの目標である、新生児虚血性脳傷害に対する幹細胞静脈内投与の効果検討も順調に進んでいる。同治療が形態的に脳傷害を軽減することを見出すことができた。現在、自己臍帯血幹細胞療法の臨床試験が準備中であることから、臨床に直結した問題解決型の前臨床試験を行う。最近、低体温療法の有効性が欧米での大規模二重盲検臨床試験により証明され、本邦でも平成24年に治療ガイドラインが作成された。低体温療法が標準治療となったことから、臍帯血幹細胞治療も今後は、低体温療法との併用で効果を検証すべきである。その動物実験実施に向けて検討を行う。さらに、臨床でも検査可能なものとして、MRI/PET画像検査での評価を想定し、その予備実験を行う。本モデルを使用し、細胞治療の有効性の検討を、形態だけでなく、神経機能検査においても行う。また、有効性の機序検討を行う。具体的には、脳血流への影響を二次元血流解析装置を用いて行い、また、免疫組織染色により血管への影響などを検討する。本モデルよりは脳傷害の再現性において劣るものの、確立したモデルである既存の低酸素性虚血モデルにおいても、同治療の効果を検討する。「新生児低酸素性虚血性脳症に対する自己臍帯血幹細胞療法」の臨床試験を多施設共同で計画している。臨床試験実施に先だって、厚労省「ヒト幹指針」に基ずいて審査を受けた際に、本多施設共同研究グループ自身の前臨床試験結果の公表を求められた。
励起蛍光マトリクスを用いたカビ毒の迅速検知・可視化手法の開発

人間や家畜などに生理的・病理的障害を与えるカビ毒汚染は、食品の安全性や安定供給の観点から深刻な問題である。中でもDeoxynivalend(DON)はコムギ、トウモロコシ、コメなどの主要穀類を中心に汚染が報告されており、人間だけでなく家畜への影響も強い。そのため日本でのDONの安全基準は2004年に暫定基準値が設定されたが、その簡易な検出法はない。本研究の目的は,カビ毒の迅速・簡易な検出法の開発およびその局在性の可視化である。本年度の研究では、成分に固有な励起蛍光マトリクス(EEM)に着目し、光学的手法によるDON検出のアルゴリズムの構築と食品内の汚染部位の可視化を目指した。なお、本年の成果は主に下記2点に集約される。A)多変量解析によるDON固有の波長条件の検出本研究では蛍光分光光度計を用いて、1)EEMの計測条件の設定、2)DON溶液のEEM計測およびデータ取得、3)DON溶液特有の蛍光が見られる波長条件の探索、の3段階で実験を遂行し、以下の知見を得た。1)これまで蛍光の検知が不可能とされていたDONにおいて、微弱ではあるもののDON由来の蛍光の観察が可能であった。また、特に蛍光が観察された波長領域のデータを主成分分析により解析することで、第1主成分がDONと純水の判別に、第2主成分がDONの濃度に関与することが示唆され、DON識別に資する蛍光パターンの検出に成功した。本研究では蛍光分光光度計を用いて、1)DON溶液のEEM計測、2)EEMの数値化、3)多変量解祈によるDONの判別関数の算出、の3段階で実験を遂行することで、DONおよび純水の2グループの判別が3つの変数(波長条件)を用いた判別関数で可能となった。そのため、今回算出されたモデル式が他の混合試料中でのDON判別に展開できる可能性が示唆された。
魚油の精密分析法の開発とその応用

本研究は銀イオン高速液体クロマトグラフィー(HPLC),キラルHPLC及び逆相HPLCなどのクロマトグラフィーの先端技術と質量分析法(MS)を組み合わせて魚油成分の分子種構造を位置異性体や光学異性体を含めて精密に分析する方法の確立を目的とし,本年度は以下のことを明らかにした.(2)上記の方法にMSを併用して,魚油(カツオ油)から初めてに適用して,16:0/16:0/22:6と16:0/22:6/16:0の位置異性体が2:1の比率で存在することを明らかにした.本研究では銀イオンクロマトグラフィーやキラルクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーの先端技術と質量分析法を組み合わせて魚油成分の分子種構造を光学異性体を含めて精密に分析する方法の確立を目的とし、本年度は以下のことを明らかにした.(1)トリアシルグリセロール(TAG)やリン脂質,糖脂質の基本骨格を形成しているジアシルグリセロール(DAG)の位置異性体(reverse isomer)を銀イオンHPLCで分析する方法を検討した.Chromsher 5 Lipidsカラム(25cm×4.6mm i.d.)とヘキサン/アセトニトリル系の移動相を用いてDAGの3,5-ジニトロフェニルウレタン(DNPU)誘導体を分析した結果,16:0-18:1と18:1-16:0のような不飽和度の低い異性体では,両者は少量(12%)のアセトニトリルを含む移動相で良好に分離されたが,高度不飽和酸を含む異性体(たとえば,16:0/22:6と22:6/16:0)を溶出させるためには5%以上のアセトニトリルが必要であった.しかしながら,高い濃度ではカラムの劣化が著しく,DNPU誘導体は高度不飽和異性体の銀イオンHPLC分析には適さないことが認められたことから,他の誘導体(3,5-ジニトロベンゾエート,アンスリルウレタンなど)の検討が必要であるとの結論が得られた.(2)逆相HPLC分析(Supershere ODS,25cm×4mm i.d.,移動相アセトニトリル/イソプロパノール,光散乱検出器使用)により,トリアシルグリセロールの位置異性体(16:0/16:0/18:1と16:0/18:1/16:0)を部分的に分離することにはじめて成功した.このことは,魚油に含まれる高度不飽和酸を含む位置異性体の分離も可能であることを示唆するもので,今後の発展に繋がる良い結果が得られた.本研究は銀イオン高速液体クロマトグラフィー(HPLC),キラルHPLC及び逆相HPLCなどのクロマトグラフィーの先端技術と質量分析法(MS)を組み合わせて魚油成分の分子種構造を位置異性体や光学異性体を含めて精密に分析する方法の確立を目的とし,本年度は以下のことを明らかにした.(2)上記の方法にMSを併用して,魚油(カツオ油)から初めてに適用して,16:0/16:0/22:6と16:0/22:6/16:0の位置異性体が2:1の比率で存在することを明らかにした.
側頭葉てんかん発症機序の研究-新しいけいれん重積モデルを用いた実験的検討-

側頭葉てんかんの動物モデルとして、てんかん発作重積を起こして一定期間の後てんかん原性が新たに海馬などに獲得されるものが種々あるが、薬物投与によるモデル、電気刺激によるモデルいずれもそれぞれ問題点がある。今回我々は、てんかん発作終焉機序において重要な役割を持つとされる、adenosine受容体拮抗薬であるaminophyllineを、それ自体ではなんらてんかん性活動を惹起しない用量で前投与したラットを用い、海馬またはDPCにmassed stimulationを与えたところ、極めて効率的に発作重積を招来することができた。海馬焦点ではaminophylline前投与の有無は大きな差異を生み出さなかったが、発作重積そのものが弱く、一方DPC焦点ではaminophylline前投与で発作重積は100%の動物に起こり、かつ長時間の重積を招来した。また、DPC焦点の発作重積後、2および8週問の時点で腹側海馬に入れた深部電極から重積時と同様のプロトコールで10回のみ刺激するテスト刺激を与えると、時間が経つにつれて刺激に対しての発作段階の強さや、後発射持続時間が対照群より有意に延長し、海馬においてけいれん準備状態が長期的に亢進していることがわかった。さらにDPC焦点重積ラットの重積後16週まで脳波上、発作間欠期放電あるいはてんかん性活動が認められた。このラットは両側の海馬において萎縮と細胞脱落がみられ、側頭葉てんかんに合致する所見が得られた。これらの結果から、aminophylline前投与下にDPCにmassedstimulationを与える発作重積モデルが、短い刺激時間できわめて効率良く発作重積を起こし、かつ長期的には側頭葉てんかん発症機序を良く模倣するモデルであることが示された。平成12年度は、SDラット(N=19)の腹側海馬に深部電極を挿入し、その電極を通じて、20Hz,20秒間の双極矩形波の間欠的電気刺激を1分毎に最大100回与えた。ラットは3群に分け、うち2群は電気刺激30分前にそれぞれadenosine受容体拮抗薬であるaminophylline20mg/kg(SA群)または生理食塩水(S群)を腹腔内投与した。もう1群はaminophylline投与のみを行い、電気刺激は与えなかった(C群)。電気刺激により重積を惹起させた後、2および8週間の無刺激期間後に最初と同じ刺激条件で10回の再刺激を加え(retest)、その反応を観察した。S,SA群とも最大100回までの間欠的電気刺激により、自己維持性の発作発射が認められ、発作重積に至った。C群では行動上、脳波上ともに変化は見られなかった。Retestに対する反応ではC群に対しS,SA両群において最大発作段階が有意に増加(重積後2,8週とも)し、また最大後発射(脳波上発作活動)持続時間が有意に延長(重積後8週のみ)していた。これらの結果から、腹側海馬を焦点とする間欠的電気刺激によって発作重積を起こした動物では、重積後2-8週間のあいだ刺激を加えなくても、retestに対する発作反応が次第に増大し、いわゆるdelayedkindling effectが観察された。これは、発作重積エポックをトリガーとする側頭葉てんかんの発症機序を模倣するモデルとしての重要な意義を持つものと考えられる。(投稿準備中)なお深部梨状葉皮質を刺激焦点として、海馬でretestを行う実験も進行中であり、今後この実験シリーズを完成させ、さらに免疫組織化学法を使った興奮性アミノ酸受容体や前シナプス蛋白などの変化について、さらに重積エポック後におこるdelayed kindling effectの予防が薬理学的に可能であるか否かについて実験を重ねる予定である1年目(平成12年度)に腹側海馬の間欠的電気刺激による発作重積モデルを作成し、重積後の海馬に長期持続性のけいれん準備状態が亢進していることを示した。

しかし、刺激部位そのものの非特異的な興奮性増強である可能性も残るため、平成13年度では深部梨状葉皮質(deep prepiriform cortex, DPC)を刺戟焦点とする発作重積モデルを作成し、海馬に長期持続性のけいれん準備状態が成立するかどうかを検討した。SDラットの左DPCおよび左腹側海馬に麻酔下で慢性深部電極を挿入し、刺戟群(S群、N=6)と対照群(C群、N=6)に分けた。S群ではaminophylline 30 mg/kgを腹腔内投与し、30分後に20Hz, 20秒、双極矩形波の刺戟を1分毎に最大100回DPCに与え発作重積を惹起させた。C群はaminophyllineの投与のみとした。刺戟後2, 8週間の時点において腹側海馬へ再刺激(重積刺戟と同じパラメーターで10回のみ)を与え、その反応を観察した。重積刺戟ではS群の全てに強い自発性けいれん活動が認められ、発作重積に至った。C群では脳波、行動上の変化は見られなかった。海馬再刺激に対する反応では、C群に対しS群で海馬からの後発射持続時間およぴ発作段階が2,8週後ともに有意に増強していた。このことから、海馬外の辺縁系組織であるDPCを焦点とする発作重積の後においても、梅馬に長期持続性のけいれん準備状態、いわゆるdelayed kindling effectが形成されることが示された。なお予備的実験で8週後のAMPA受容体の減少や細胞変性を海馬に認めたものの結果は未だ不充分であるため、現在重積後16週までの脳波・行動の観察および組織像を得る実験を行っている。これら一連の実験により本モデルの特徴を明らかにし、さらに免疫組織化学法を使った興奮性アミノ酸受容体や前シナプス蛋白などの変化について検討を加える予定である。平成12、13年度に得られた成果として、aminophylline前投与による海馬あるいは深部前梨状葉皮質(DPC)を焦点とした電気刺激けいれん発作重積モデルにおいて、いずれの場合にも海馬において長期持続性のdelayed kindling effectがみられ、このモデルが発作重積エポックを引き金とする側頭葉てんかんの発症機序を模倣していることが示唆された。平成14年度は、再びaminophylline存在下に深部前梨状葉皮質を刺激焦点として発作重積動物を作成し、重積の16週後の長期にわたって観察を行い、自発発作の有無の検討や、組織学的検討を加えた。7匹の動物を使用し(刺激群5匹,対照群2匹)、深部前梨状葉皮質への間欠的電気刺激によって刺激群動物の全てに発作重積が誘導された.今回の実験では5匹中2匹が重積中に死亡したため残りの3匹から得られた結果を使用した.対照群の2匹は未刺激対照群とした.発作重積誘導の7週間後から毎週脳波および行動を観察したところ、8週後より発作間欠期放電がしばしば観察された.しかし、明らかな自発発作や発作脳波活動は観察することができなかった。発作間欠期放電は観察期間である重積発作誘導の16週間後までみられた.
富栄養化の進んだ閉鎖水系における浚渫ヘドロ及び水生雑草を活用した干潟造成の一試行

本研究は、岡山県南部に位置し富栄化の進んだ児島湖を対象地とし、湖内の浚渫ヘドロを利用した人工干潟にて、水生雑草群落を発達させ、ビオトープを創出すると共に、水質の汚濁削減を試みるものである。そして、干潟を構成する物理化学的因子の変化を把握することにより、干潟内の生物間、水界、底泥間の物質収支を予測し、継続的なビオトープの維持管理を提案するものである。得られた成果は下記の通りである。1.干潟造成地の生態系創出及び発達への基礎研究自然状態における植栽種の群落拡大を調査した結果、マコモ、フトイ、ヒメガマが群落を拡大して植生護岸を形成した。また、植物群落が存在するほど貝類の発生が多かった。一方、多孔質セラミックに沈水植物を植え付け、植栽方法を開発した結果、波浪による消滅が多く見られた。2.干潟造成地の物理化学的因子の形成過程の把握水際線より湖水側の土壌EC・pHの値は表層・地下5cm共に陸域側より高い値であった。台風襲来の有無により堆砂や洗掘が生じるが、植物群落の地下部の発達が大きく関与した。3.児島湖へ流入する農地からの汚濁負荷量調査農地は窒素の削減作用はあるが、リンは施肥量や降雨量の増加に伴い、外部への負荷がかかる傾向にあった。4.児島湖内の水生雑草分布調査及び水質調査ヒシの大発生が毎年生じたが、沈水植物の再生の兆しは認められなかった。水質はリンの削減傾向が認められなかった。5.データー処理による干潟造成地のモデル解析児島湖に生じる流れを人造干潟周辺で数値的に解析した。6.児島湖流域エコウェブの活動支援渚護岸におけるヨシの植栽の指導、フォーラムの開催、「児島湖読本」の出版事業への支援に、本研究成果を反映させた。以上より、人工干潟に大型水生雑草を植栽することにより、食物連鎖による生態系の確立、有機物の蓄積、水質の浄化が確認されたが、ビオトープの維持管理法の提言には、さらなる継続調査が必要と思われた。本研究は、岡山県南部に位置し富栄養化の進んだ湖沼である児島湖を研究対象地とし、児島湖内の浚渫ヘドロを活用した人工干潟を造成し、水生雑草群落を発達させ、ビオトープを創出すると共に、水質の汚濁削減を試みるものである。そして、干潟を構成する物理化学的因子の時系列変化を把握することにより、干潟内の生物間、水界、底泥間の物質収支を予測し、継続的なビオトープの維持管理を提案するものである。まず、初年度は下記の事項を明らかにした。1.干潟造成地の生態系創出及び発達への基礎研究(1)植栽2年目の25草種の群落再生を定期的に調査した。灌漑期の初期は群落の順調な発達が認められたが、その後、8月から9月にかけて3回大型台風が直撃したので、大きな被害に遭遇した。しかしながら、雑草群落を活用しているのでウチワゼニグサ等、回復が速いことが確認された。(2)植栽1年目と比較して、マシジミ、ドブガイ、ヒメタニシ等の貝類に加えてメダカ等の魚類も多く発生していることが確認された。

(3)沈水植物はキレモを活用することにより、新シュートの形成や定着が効率よく行える技術の開発が可能となった。(4)浮葉植物の非灌漑期における植栽法については、ヤシ繊維マットを活用した方法の試作を行った。2.干潟造成地の物理化学的因子の把握(1)灌漑期におけるSS及び硝酸態窒素は沖側より水際線付近で値が減少していることが把握された。(2)干潟面の微地形は、波浪や台風による砂の移動により、当初より標高が大きく変化した。(3)植物体枯死による覆砂部への有機物の添加量を検討した結果、陸域部の根圏域における寄与が認められた。3.データー処理による干潟造成地のモデル解析及び数値シミュレーション児島湖に生じる流れを人造干潟周辺で数値的に解析した。児島湖から児島湾への締切堤防の樋門を通しての排水により,どのように流れが生じるかを説明するための例を示した。先ず,人工干潟の構造がない場合の全領域での流れを解析し、次に,そのデータを人工干潟を含む比較的小さい領域の解析に導入した。本研究は、岡山県南部に位置し富栄養化の進んだ児島湖を研究対象地とし、湖内の浚渫ヘドロを利用した人工干潟にて、水生雑草群落を発達させ、ビオトープを創出すると共に、水質の汚濁削減を試みるものである。そして、干潟を構成する物理化学的因子の時系列変化を把握することにより、干潟内の生物間、水界、底泥間の物質収支を予測し、継続的なビオトープの維持管理を提案するものである。本年度は下記の事項を明らかにした。1.干潟造成地の生態系創出及び発達への基礎研究(1)水際線より湖水側において、管理を最小限に留め、自然状態における植栽種の群落拡大及び草種間の競合を調査した結果、マコモ、フトイ、ヒメガマが群落を拡大して植生護岸を形成した。(2)貝類の分布を調査した結果、シジミ類、ヒメタニシ、ジャンボタニシ、ドブガイが多く認められた。なお、植物群落が存在するほど貝類の発生が多いことが認められた。(3)多孔質セラミックに沈水植物セキショウモを植え付け、現場にて植栽方法を開発した結果、ヒメガマ群落の前部にて植栽後の生育が良好であったが、波浪による消滅も多く見られた。2.干潟造成地の物理化学的因子の形成過程の把握調査(1)水際線より湖水側の土壌EC・pHの値は表層・地下5cm共に陸域側より概して高い値であった。(2)台風の襲来が少なかったので、昨年ほど大きな堆砂や洗掘は認められなかった。これは、植物群落の地下部の発達も関係している。3.児島湖へ流入する農地からの汚濁負荷量調査農地は窒素においては一般には削減作用があるが、リンにおいては施肥量や降雨量の増加に伴い、外部への負荷がかかる傾向にあった。4.児島湖内の水生雑草分布調査及び水質調査本年度は早い時期からヒシの大発生が生じたが、沈水植物のササバモ群落の再生の兆しは認められなかった。5.児島湖流域エコウェブのプロジェクト活動支援渚護岸におけるヨシの植栽の指導、児島湖フォーラムの開催、「児島湖読本」の出版事業への支援を行った。1.干潟造成地の生態系創出及び発達への基礎研究ヒメガマ、フトイ、マコモ群落が優占種として人工干潟の構成種となり安定した群落が形成された。
中性子量子ビートによるトンネル時間の測定

我々は、中性子スピン干渉法により、磁気膜による中性子束縛ポテンシャルによるトンネル状態の↑↓中性子スピン波動関数の位相差を世界最初に測定した。この位相差は、1次元磁気ポテンシャルによるSchrodinger方程式解と良く一致する。トンネル時間の概念は、量子力学でも定義が様々で定説がない。我々は、古典的観測時間でトンネル時間を測定するために、時間ビート干渉計を制作した。この原理は、磁気共鳴により中性子スピンを複数回反転させ、同じ方向スピンの異なるエネルギー状態の波動関数を重ね合わせて中性子強度の時間ビートを得る。経路中に中性子の飛行時間遅れが存在する時はビートの位相は、変化する。したがって、時間ビートの周波数が十分短ければ、束縛トンネルポテンシャルによる束縛時間を時間ビートに位相変化とし測定可能である。現在400KHzの周波数まで量子ビートの周波数を上げることに成功し、波長120Åの中性子を用いて100μm以下の中性子の飛行時間の測定が出来る。一方トンネル位相の変化は、10連続磁気量子井戸を用いて8πまで向上させた。これを粒子像でも中性子飛行距離に換算すれば、約50Åで、約2000倍周波数を上げる必要がある。我々は、偏極中性子の共鳴スピン反転により全エネルギーの異なる固有状態の↑スピン中性子波動関数を干渉させ、中性子時間ビートの生成に成功してきた。これらの中性子時間ビート原理を応用して時間エコー中性子分光計を開発した。類似の原理で中性子時間エコー分光器を開発中のハーンマイトナー研究所や、ミュンヘン工科大学のクリスト博士や、ケラー博士と共同研究を行い、JRR3M原子炉C3-1-2冷中性子導管で、時間ビートの周波数を400KHzまで向上させることに成功した。中性子偏極アナライザーより下流側に試料を挿入させると、時間変調は非弾性散乱による中性子エネルギー遷移によって中性子の粒子速度が変化し、時間ビート位相の変化によりこのエネルギー遷移を測定出来る。このとき、非干渉性弾性散乱や、磁場ポテンシャルにより時間ビートは変化しないことが確かめられた。また、多連結磁気ファブリペロー膜中に中性子波をトンネル状態で束縛させ、量子井戸の束縛位相時間を0.1マイクロ秒まで伸ばした。この結果は、Phys.Rev.A61(2000)013607-1-8に発表した。粒子の群速度トンネル時間を求めるためには、磁気ファブリペロー膜を時間振動させるなどの時間変調をかけた状態で、中性子の時間ビートにより時間位相変化を測定する必要がある。平成12年度は、トンネル群速度の実験に取り組む予定である。これを粒子像での中性子飛行距離に換算すれば、約50Åで、約2000倍周波数を上げる必要がある。
ストレス応答プロテアーゼ欠損変異株を用いたサルモネラワクチンの開発

研究目的1.ストレス応答プロテアーゼと病原性の関係を明らかにする。2.ストレス応答プロテアーゼ欠損Salmonellatyphimurium経口接種により誘導させる免疫応答を明らかにする。3.ストレス応答プロテアーゼ欠損サルモネラのワクチンとしての可能性を明らかにする。研究成果1.S.typhimuriumのストレス応答プロテアーゼであるlon遺伝子あるいはclpXP遺伝子を欠損させるとマウスに対する菌の病原性が低下する。lon欠損変異株は、上皮細胞への菌の侵入性が向上するが、マクロファージ内での増殖性が低下した。lon欠損変異株は多鞭毛体を形成するが、やはりマクロファージ内での菌の増殖性が低下した。2.S.typhimurium lon欠損変異株およびclpXP欠損変異株をBALB/cマウスへ経口投与すると、一回の投与のみで、1年以上に渡り、強毒株の攻撃を防御した。両変異株を投与されたマウスは体液性免疫(血清中の抗サルモネラIgGと粘液中の抗サルモネラIgAの値の上昇)と細胞性免疫(マクロファージの活性化)の両方が誘導され、経口のみならず皮下よりの攻撃に対しても完全に感染を防ぐことができた。また、同時にListeria monocytogenesの感染に対しても防御効果を示した。3.マウスモデルにおいては特にS.typhimurium lon欠損変異株がワクチン効果が確認された。BALB/cマウスのみならず、S.typhimuriumに対する感受性が極めて高いC57BL/6においても安全性と有効性が確認された。更に、C57BL/6マウスから作製したのIL-5レセプターノックアウトマウスにおいてもワクチン効果を示した。以上の結果より、産業動物(ウシ、ブタ、ヒツジ、等)のサルモネラワクチンとしての応用が期待される。本年度の研究実施計画と成果を列挙する。1.計画ClpXP或いはLon欠損S.typhimuriumマウスへ感染させた各組織での感染菌の変化と組織から回収された菌の性状及び病原性を調べる(松井担当)。成果in vitroではClpXP欠損S.typhimuriumは多鞭毛化し、Lon欠損S.typhimuriumはフィラメント化する。5x10^8CFUを6週齢の雌BALB/cマウスへ経口感染後、感染組織(パイエル坂、腸間膜リンパ節、脾臓)のホモジネートを一度平板に塗布し、生じたコロニーの菌の形態は感染前と同じく多鞭毛化とフィラメント化を呈していた。また、回収されたワクチン株はいずれも感染前と同じく弱毒株であった。以上の結果よりワクチン株は宿主内で強毒化する可能性は無いと考えられた。2.計画ClpXPと鞭毛形成遺伝子或いはLonとSulAの組み合わせで二重欠損変異株を作製し、菌の形態変化と病原性の関係を明らかにする(松井、関矢担当)。成果いずれの二重欠損変異株も菌の形態変化(多鞭毛化とフィラメント化)は消失したが、マウスに対する病原性は弱毒化したままであった。従って、ClpXP欠或いはLon欠損S.typhimuriumとも菌体の形態変化と病原性は無関係であると言える。3.計画ClpXP或いはLon欠損S.typhimuriumは1回のみの経口投与でBAL/cマウスに強力な体液性免疫と細胞性免疫を誘導でき、強毒株からの攻撃を完全に防御できる。そこでこれらワクチン株により誘導される免疫応答を詳細に解析する(松井、江口担当)。成果

ワクチン株をBALB/cマウスに経口投与後の血清中の抗Salmonella LPS IgGのサブクラスと脾臓における各種サイトカインmRNAの発現量の推移から、ワクチン投与後、12週間はTh1タイプの細胞性免疫が感染防御に働いていると考えられた。一方体液性免疫はワクチン投与4週間後から誘導され、1年後でも感染防御に十分なレベルを維持していた。興味深いことにワクチン投与12週間はリステリアを皮下投与で攻撃しても感染を防御できた。また、粘膜でのIgAの産生が低下しているIL-5 KOマウスを免疫した場合も、通常マウスの免疫の場合と全く同じように強毒株の攻撃を防御できたことから、本ワクチンにより誘導される細胞性免疫が感染防御に重要な役割を担っていると考えられる。本年度(平成17年3月31日)の研究実施計画及び研究成果2.計画構築したワクチン株の有効性をマウス感染モデルにより調べる。成果BALB/c及びC57BL/6マウスを用いた感染実験で、1で構築したワクチン株の安全性と有効性を調べた。その結果、lonとsulAの両遺伝子を欠損させた株が、serovar Typhimuriumとserovar Enteritidisの両方で安全性と有効性において優れていた。lon/shlA欠損株は1回の経口投与のみで長期に渡り、強毒株の経口及び皮下からの攻撃を完全に防御した。3.計画ワクチン株の形態を透過型電子顕微鏡(TEM)により観察し、野生株と比較する。成果lon/sulA遺伝子を欠損させたワクチン株の形態は野生株と類似しており、lon遺伝子単独の欠損で見られる著しいフィラメント化は認められなかった。また増殖速度においても野生株との差を認められなかった。4.計画ワクチン株の経口投与後の腸管での抗サルモネラ分泌型IgA(sIgA)産生細胞数の変化をELISPOT法により調べる。成果BALB/cあるいはC57BL/6両マウスにおいて小腸粘膜固有層において特に抗サルモネラsIgA産生細胞数の増加を認めた。以上の結果からlon/sulA欠損変異株は非常に優れた生ワクチン株であると言える。