hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セントロメア機能調節の細胞高次機能への連係と次世代人工染色体の開発

染色体基本機能の制御に乱れが生じるとゲノム機能を破綻させ、細胞死や老化、異常増殖を引き起こす。ヒト人工染色体(HAC)は、裸のDNAを細胞へ導入すると細胞自身が機能する各クロマチン構造を作り上げ、染色体としての機能を維持するシステムである。本研究では、このヒト人工染色体とtetO配列/各種tetR融合タンパクを用いた構成学的手法を組み合わせ、染色体分配に関わるセントロメア機能形成とヘテロクロマチン集合とのバランス調節メカニズムを明らかにすることを目的とする。これらセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスの撹乱によりゲノム機能がどのように影響を受け、細胞高次調節機能の異常に繋がるのか、その連係機構について解析する。更に、これらの知見を利用してバランスを個別に調節できる次世代型人工染色体の開発を目指す。これまでに(1)セントロメア機能形成の調節因子の解明、(2)クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構解明、(3)クロマチン集合バランスを調節可能な次世代型人工染色体の開発、の3つの研究を進めた。H30年度は特に(3)の研究に重点を置き、tetO配列やLacOを挿入した各種合成アルフォイドDNAを作製して、セントロメアとヘテロクロマチンの両集合バランスをtetR/LacI融合タンパクでそれぞれ個別に調節可能な次世代型人工染色体を開発した。また、tetO配列やLacOを挿入した各種合成アルフォイドDNAを組み合わせて、これまで単一の合成アルフォイドDNAを用いた場合には低下していた人工染色体形成活性を大幅に向上させることに成功した平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、このヒト人工染色体とtetO配列/各種tetR融合タンパクを用いた構成学的手法を組み合わせ、染色体分配に関わるセントロメア機能構造体形成の全容解明とヘテロクロマチンとの集合バランスの調節メカニズムを明らかにする。これらセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスによりゲノム機能がどのように影響を受け、細胞高次調節機能の異常に繋がるのか、その連係メカニズム解明に迫ると共に、これらの知見を利用してバランスを個別に調節できる次世代人工染色体の開発をめざす。具体的には、(1)セントロメア機能形成の調節因子の解明、(2)クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構の解明、(3)クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発、の3つの計画に従って研究を進める。H28年度はそれぞれ以下の成果を得た。(1)正にも負にもセントロメア機能を調節可能なCENP-Bがクロマチン上に集合させる因子を明らかにした。(2)KAT7とSuv39h1はお互いに拮抗的にセントロメアクロマチンとヘテロクロマチンの集合バランス調節に関わることを明らかにした。(3)次世代型人工染色体構築の基盤となる、tetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの各種合成反復DNAを組み合わせた120kbの長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入して、人工染色体形成が可能であることを示した。(1)セントロメア機能形成の調節因子の解明:セントロメア機能集合の核となるCENP-Aクロマチンの集合調節因子の選別を進め、人工染色体上にかずさcDNAライブラリーからの各種融合タンパクを結合させ、CENP-Aシグナルの増加/減少(正/負の調節)させる因子を多数得た。CENP-Bは正にも負にもセントロメア機能を調節可能であり、CENP-Bがクロマチン上に集合させる因子を調べた結果、ヘテロクロマチン側の調節因子と共に多数のオープンクロマチン側のヒストン修飾酵素も集合することを明らかにした。(2)クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構の解明: CENP-Aクロマチンの補充に必須なMis18複合体と相互作用する因子の検索を進めた結果、Mis18複合体はCENP-Aシャペロン(HJURP)とヒストンアセチル化酵素(KAT7)を同時に集合させることを発見し、アセチル化の関わるヒストン交換反応とCENP-Aの新規集合が連係して起こることを明らかにした(Ohzeki et al DevCell 2016)。(3)クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発:クロマチン集合バランスをオープン側にするとセントロメア機能形成が促進されるが、ヘテロクロマチン因子の結合はこれを阻害する。一方でヘテロクロマチンは染色分体のコヒージョン維持にも必要であり、人工染色体や染色体分配機能には必要である。そこで、次世代型人工染色体構築の基盤となるtetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの合成反復DNAを作製し、これらを組み合わせた120kbの各種長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入し、人工染色体形成が可能であるかどうか検定した結果、それぞれから多様な安定性を示す人工染色体が構築できた。以上の成果に示した通り、計画は予定通り進展した。

本研究では、このヒト人工染色体とtetO配列/各種tetR融合タンパクを用いた構成学的手法を組み合わせ、染色体分配に関わるセントロメア機能構造体形成の全容解明とヘテロクロマチンとの集合バランスの調節メカニズムを明らかにする。これらセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスによりゲノム機能がどのように影響を受け、細胞高次調節機能の異常に繋がるのか、その連係メカニズム解明に迫ると共に、これらの知見を利用してバランスを個別に調節できる次世代人工染色体の開発をめざす。H29年度は(1)セントロメア機能形成の調節因子の解明、(2)クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構解明、(3)クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発、の3つの計画に従って研究を進め,以下の成果を得た。(1)正にも負にもセントロメア機能を調節可能なCENP-Bがクロマチン上に拮抗するヒストン修飾酵素ASH1LとSuv39h1を含む多数因子を集合させることを明らかにした。(2)KAT7がセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスやゲノム機能の維持に強い影響を与えることを明らかにした。(3)次世代型人工染色体構築の基盤となる、tetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの各種合成反復DNAを組み合わせた120kbの長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入して、人工染色体形成効率を向上させる結果を得た。(1)セントロメア機能形成の調節因子の解明:セントロメア機能集合の核となるCENP-Aクロマチンの集合調節因子の選別を進め、人工染色体上にかずさcDNAライブラリーからの各種融合タンパクを結合させ、CENP-Aシグナルの増加/減少(正/負)させる因子を多数得た。CENP-Bは正にも負にもセントロメア機能を調節可能な因子と同定され、さらにCENP-Bがクロマチン上に集合させる因子を調べた結果、ヘテロクロマチン側の調節因子Sub39h1、HP1と共に多数のオープンクロマチン側のヒストン修飾酵素ASH1L, NSD1等を含む多数因子を集合させることを明らかにした。2)クロマチン集合バランス調節と細胞高次機能への連係機構の解明: CENP-Aクロマチンの補充に必須なMis18複合体と相互作用する因子の検索から得たヒストンアセチル化酵素(KAT7)を遺伝子破壊して解析した結果、KAT7がセントロメアとヘテロクロマチンの集合バランスやゲノム機能の維持に強い影響を与えることを明らかにした。(3)クロマチン集合バランスを調節可能な次世代人工染色体の開発:クロマチン集合バランスをオープン側にするとセントロメア機能形成が促進されるが、ヘテロクロマチン因子の結合はこれを阻害する。一方でヘテロクロマチンは染色分体のコヒージョン維持にも必要であり、人工染色体や染色体分配機能には必要である。そこで、次世代型人工染色体構築の基盤となるtetOとlacOをそれぞれ挿入した60kbの合成反復DNAを作製し、これらを組み合わせた120kbの各種長鎖合成反復DNAをそれぞれ細胞へ導入し、それまで5%前後であった合成DNAによる人工染色体形成効率を30%以上と大幅に向上される結果を得た。以上の成果に示した通り、計画は予定通り進展した。
陽子ノックアウト反応を用いた酸素同位体のスピン軌道相互作用の研究

1. 2012年5月に理化学研究所RIBFビームラインにおいて、偏極陽子標的を用いた酸素不安定同位体の陽子ノックアウト反応実験を行った。今年度は前年度に引き続き、本実験のデータの解析を行った。・散乱陽子を検出するために用いた検出器のキャリブレーションと分解能の評価を行った。散乱角を決定する多芯線ドリフトチェンバーについて事前の想定通りの分解能が達成されていることを確認した。運動量決定に用いたプラスチックシンチレータに関しては、分解能向上のためにさらなる解析が必要である。・陽子ビームを用いた二陽子弾性散乱事象の解析により、偏極陽子標的のスピン偏極度の較正を行った。・陽子ノックアウト反応の事象を特定する上で、残留核の粒子識別がS/N比を改善するために不可欠であることが分かった。・散乱陽子の散乱角と運動量より、残留核である窒素原子核の励起エネルギーを求めた。酸素14,酸素24のビームを用いた測定について、陽子ノックアウト反応で生成する窒素同位体の励起エネルギースペクトルに基底状態や低励起状態と思われる有意な強度を観測した。窒素原子核の各励起状態を分離するためには、分解能やS/N比を向上させる更なる解析が必要であることが分かった。2. 1.の解析の進捗状況について2014年3月に日本物理学会2014年年次大会において報告を行い、他大学・機関の研究者と有意義な議論を行うことが出来た。この研究発表の旅費は、特別研究員奨励費より支出した。(抄録なし)1.本課題の予備実験として2010年に大阪大学核物理研究センターにて行った実験について、実験結果との比較のために計算コードTHREEDEEによって歪曲波インパルス近似を用いた計算を進め、酸素18の陽子のp軌道のスピン軌道分離を6.58±0.11MeVと決定し、酸素16よりも約400keV狭まっているとの結果を得た。その原因の一つとして、酸素18で1d_<5/2>軌道に入る中性子が陽子に及ぼす2核子テンソル力の効果が考えられる。この結果について2011年5月に国際会議(ARIS)、同9月に日本物理学会秋季大会にて発表を行った。これらの研究発表の旅費は、補助金より拠出した。2.本課題のメイン実験である、理研RIビームファクトリーにて行う酸素不安定同位体の核子ノックアウト実験の準備を進めた。本実験は2012年5月に7.5日のマシンタイムが割り当てられることが決定している。(1)実験に不可欠である実験機器類(偏極陽子固体標的用散乱槽・真空槽、検出器架台、ケーブル)の設計・製作を行った。(2)酸素同位体に対する核子ノックアウト反応の運動学の計算を行い、これを基に陽子分離エネルギーの分解能1MeVを達成可能な検出器セットアップを決定した。(3)本実験で使用する多芯線ドリフトチェンバー(MWDC)のテストを行った。本検出器は長期間使われていなかったために故障などが懸念されたが、宇宙線に対して正しく動作することを確認した。このテストを行うにあたり、補助金を用いて検出器ガスを購入した。1.2012年5月に理研RIビームファクトリーにおいて偏極陽子標的を用いた酸素不安定同位体の核子ノックアウト実験を行った。偏極陽子を用いた逆運動学での核子ノックアウト実験は本実験が世界初である。(1)実験に先立ち、バックグラウンド事象の見積りや識別に用いるプラスチック検出器、炭素標的固定具を製作した。これにより、目的とする事象とバックグラウンド事象のデータの同時取得が可能となり、限られたビームタイムの中での統計量を増加することができた。バックグラウンド事象の評価に用いる炭素標的は補助金により購入した。(2)本実験では、酸素ビームでの核子のノックアウトのデータに加え、陽子弾性散乱のデータも取得した。このデータは偏極陽子標的のスピン偏極度の校正に用いるためのものである。2.1.の実験データの解析を行っている。実験に用いた各検出器が正しくデータを取得できていることを確認し、較正を行った。陽子散乱のデータについては概ね解析が終了した。酸素ビームのデータについては予想していたよりもバックグラウンド事象が多いことが分かった。S/N比をあげてノックアウト事象を抽出するために、前もって想定していたより厳しい事象抽出条件を設定する必要がある。3.解析の進捗状況について2012年9月に日本物理学会2012年秋季大会にて報告をし、その場において国内の研究者と有意義な議論を行うことができた。この研究発表の旅費は、補助金より支出した。

酸素14,酸素24のビームを用いた測定について、陽子ノックアウト反応で生成する窒素同位体の励起エネルギースペクトルに基底状態や低励起状態と思われる有意な強度を観測した。窒素原子核の各励起状態を分離するためには、分解能やS/N比を向上させる更なる解析が必要であることが分かった。2. 1.の解析の進捗状況について2014年3月に日本物理学会2014年年次大会において報告を行い、他大学・機関の研究者と有意義な議論を行うことが出来た。この研究発表の旅費は、特別研究員奨励費より支出した。本計画でメインとなる実験のマシンタイムが当初想定していたよりも早く2012年5月に割り当てられたが、それに向けた準備作業が順調に進んでいるため。計画通り実験を行うことができた。データ解析は着実に進行している。2012年5月までは実験を遂行するための準備に専念する。実験を行った後はデータの解析をすすめ、2012年度中には結果を出す予定である。2013年度はその結果を基に投稿論文を纏め、国内外の会議において成果の発表を行う予定である。前年度に引き続き実験データの解析を進め、2013年7月までに結果を得る。その結果をもとに投稿論文をまとめ、最終的な成果の発表を行う。(抄録なし)
マイクロ波リアルタイムアクティブイメージング装置の開発

本研究は,超広帯域対せき形フェルミアンテナを用いた地震・火災における人命探査,衣服を通した銃・爆発物の検知などに用いるアクティブイメージング装置の開発を目的としている.218GHzのマイクロ波を対象物に照射して散乱波を受信するアクティブイメージング方式において,DC電圧の自己相関関数を用いるという独創的なアクティブイメージング方式を提案した.本手法は,広帯域にわたり挿引された電磁波を散乱体に照射し,物体から散乱された電磁波を二乗検波して得られる広帯域のパワースペクトルをフーリエ逆変換することにより自己相関関数応答を求め,これをパルス応答として用いることにより物体のイメージを得る方法である.自己相関パルス応答は散乱波の振幅のみを用いて求めることができるが,散乱波の複素振幅をフーリエ逆変換して得られるパルス応答の遅延時間に対応しないfalse応答を含んでいる.そこで送受信アンテナの素子間相互結合を利用したfalse応答の低減法を新たに提案した.提案手法を用い,2つの準モノスタティックパルスレーダを用いた物体の位置推定を行った結果,遅延中心位置を利用する高精度な位置推定できることが明らかとなった.さらに,散乱導体の形状推定の高速化を図るため,送信8素子同位相給電アレー・受信8素子アレーの平面走査を用いたベニヤ板背後の物体形状推定を行った.その結果,従来ベクトルネットワークアナライザを用いた場合の計測時間660分が約3分に短縮された.本研究は,超広帯域対せき形フェルミアンテナ(APEA)を用いた地震・火災における人命探査,衣服を通した銃・爆発物の検知などに用いるアクティブイメージング装置の開発を目的としている.218GHzのマイクロ波を対象物に照射して散乱波を受信するアクティブイメージング方式において,DC電圧の自己相関関数を用いるという独創的なアクティブイメージング方式を提案した.本手法は,広帯域にわたり挿引された電磁波を散乱体に照射し,物体から散乱された電磁波を二乗検波して得られる広帯域のパワースペクトルをフーリエ逆変換することにより自己相関関数(ACF)を求め,これをパルス応答として用いることにより物体のイメージを得る方法である.自己相関パルス応答は散乱波の振幅のみを用いて求めることができるが,散乱波の複素振幅をフーリエ逆変換して得られるパルス応答の遅延時間に対応しないfalse応答を含んでいる.そこで送受信アンテナの素子間相互結合を利用したfalse応答の低減法を新たに提案し,モノスタティックパルスレーダを用いた散乱導体の形状推定,及び2つのモノスタティックパルスレーダを用いた物体の位置推定を行い手法の妥当性を確認した.さらに,広角な範囲に置かれた物体を検知できる広角指向性を有する対せき形フェルミアンテナを設計し,アンテナの放射パターン,位相パターンについて,実験とFDTD法による電磁界解析を駆使して求めた.その結果,アンテナの位相中心位置とは大幅に異なる遅延中心位置を利用することにより,高精度に物体の位置を推定できることが明らかとなった.本手法はアンテナの放射パターンの周波数特性が強い場合も適用できるため,フェルミアンテナ以外の広帯域アンテナについても適用可能な手法と考えられる.本研究は,超広帯域対せき形フェルミアンテナを用いた地震・火災における人命探査,衣服を通した銃・爆発物の検知などに用いるアクティブイメージング装置の開発を目的としている.218GHzのマイクロ波を対象物に照射して散乱波を受信するアクティブイメージング方式において,DC電圧の自己相関関数を用いるという独創的なアクティブイメージング方式を提案した.本手法は,広帯域にわたり挿引された電磁波を散乱体に照射し,物体から散乱された電磁波を二乗検波して得られる広帯域のパワースペクトルをフーリエ逆変換することにより自己相関関数応答を求め,これをパルス応答として用いることにより物体のイメージを得る方法である.自己相関パルス応答は散乱波の振幅のみを用いて求めることができるが,散乱波の複素振幅をフーリエ逆変換して得られるパルス応答の遅延時間に対応しないfalse応答を含んでいる.そこで送受信アンテナの素子間相互結合を利用したfalse応答の低減法を新たに提案した.提案手法を用い,2つの準モノスタティックパルスレーダを用いた物体の位置推定を行った結果,遅延中心位置を利用する高精度な位置推定できることが明らかとなった.さらに,散乱導体の形状推定の高速化を図るため,送信8素子同位相給電アレー・受信8素子アレーの平面走査を用いたベニヤ板背後の物体形状推定を行った.その結果,従来ベクトルネットワークアナライザを用いた場合の計測時間660分が約3分に短縮された.
オーロラの微細構造の解析とその生成機構

オーロラは、広大な地球磁気圏尾部や内部磁気圏で生起する様々なスケールのプラズマ過程の一部が磁気圏-電離圏結合系を介して極域の電離層に集約的に投影・可視化された現象である。したがって、その空間構造や時間変動には、磁気圏内の粒子加速や散乱などの素過程や磁気圏-電離圏結合系の実体を解明する上で本質的に重要な情報が含まれている。本研究では、これまで研究が進んでいなかった微小スケールのオーロラの動態解析を行うため、オーロラ輝度のオプティカルフロー追跡に基づくオーロラの運動解析システムを構築し、オーロラの固有運動を定量的に解析する手法を確立した。また、ノルウェー・トロムソにおいてEISCAT(欧州非干渉散乱)レーダーとの同時観測を数回にわたって実施し、ブラックオーロラ、カール、フリッカーリングオーロラ等のオーロラ固有運動および電離圏プラズマ密度、電場との関連を明らかにすることができた。1.ディスクリートオーロラの最小構造はカールを形成するアークでその厚さは約100m程度。2.カール形成時には数100m/sの反時計方向の回転運動を伴う。3.フリッカーリングオーロラには10-20kmスケールの中規模構造に2-3kmスケールの小規模構造が重畳する。4.強いディスクリートアークの両側に約10km規模のイオン温度上昇域がある。5.微小なブラックオーロラ中では90-150kmの高度範囲で、電子密度が周囲のディフューズオーロラ領域に比べ最大50%程度減少するが、オーロラの全くない領域の約2倍の電子密度がある。これらの成果は国際会議や学会等で報告するとともに論文として投稿準備中である。なお、本研究課題の一部として実施したEISCATレーダーオーロラ同時観測で得られたデータは、共同研究を行う名古屋大学理学研究科大学院生の修士論文(平成15年度および16年度、各1名)の基本データとしても活用された。本年度は、3年計画の初年度としてオーロラの微細構造に関する従来の観測ならびにその理論的解釈を整理し、本研究課題にて実施すべき研究方針を検討した。その結果、オーロラ動態解析のためのグラディエント法によるオプティカルフロー検出アルゴリズムの改良を進めるとともに、その妥当性の検証には運動を駆動する局所的電場構造との直接比較が不可欠であるとの認識に立ち、電離圏内の磁力線方向に高度・時間分解能のすぐれたEISCATレーダーを用いて、オーロラ微細構造(数km以下)内の電子密度、電子・イオン温度、電場(3次元イオン速度より算出)を同時観測する特別共同観測を立案、実施した。1.速度場解析アルゴリズムの開発:現状のグラディエント法によるオプティカルフロー検出アルゴリズムの適用限界を見極め、改良方法を探るため、ケオグラム法(任意の1次元スリット上の輝度プロファイルを時系列データとして抽出・スタック・表示)解析により、解析精度の定量的比較を行った。オーロラの運動速度に比べて輝度の時間変動が大きい場合には速度ベクトルの検出エラーが大きく、適用が難しいことが判明した。2.EISCATレーダーを用いた特別共同観測:名古屋大学太陽地球環境研究所グループと共同し、2003年3月1日5日にトロムソ、キルナ、サダンキラの3局のEISCAT/UHFレーダーを用いた高時間分解能(0.44秒)の電離圏観測と狭視野オーロラカメラによるオーロラ微細構造の同時観測を行い、3夜の観測で狭視野カメラによるオーロラ微細構造ならびにISレーダーによる高分解能電離圏の同時観測に成功した。現在データ解析中であるが、今回試みたarcl-uモード(計30時間)により、初めてオーロラ微細構造内外の電場と運動を直接比較することが可能となり、オーロラ動態解析アルゴリズムの定量的検証に大きく寄与することが期待される。

本年度は3か年計画の2年次として、カールやブラックオーロラなど特徴的な微細構造を持つオーロラの動画像解析を進めるとともに、EISCATトロムソ観測所において、UHFレーダーと狭視野オーロラカメラによるオーロラ微細構造の同時観測をトロムソ大学の海外共同研究者と協力して実施した。オプティカルフロー検出アルゴリズムを用いたオーロラ動画像の速度場解析を進め、直径1km程度のカール(最小規模のオーロラ渦構造)の生成消滅過程を33msec(30Frame/sec)の高時間分解能で捉えることに成功した。この成果は、2003年6月に開催されたIUGG国際会議(札幌)で報告するとともに現在投稿準備中である。2003年11月および2004年2月に実施したレーダー/光学同時観測では、高解像度の狭視野デジタルカラーカメラに加えて全天デジタルカメラによる観測を実施した。磁気天頂方向に固定したUHFレーダービームの直径は約1km(高度100km)、狭視野デジタルカラーカメラの視野範囲は約30km×20kmである。2月期の観測では狭視野カメラの撮像間隔の短縮化を行い、約1秒毎の連続撮像が実現した。一方、UHFレーダーデータについてはS/N確保の観点からこれまで積分時間を20秒以下にするのが困難であったが、2重差分法を用いて等価的に4秒毎の物理量変化を議論できるようになった。これによりレーダー観測データとオーロラ微細構造の直接比較が可能となり、強いディスクリートアークの両側に約10kmスケールのイオン温度上昇域があること、逆にブラックオーロラではそうした明瞭なイオン温度上昇が見られないことを示唆する観測事実などが見いだされた。これらは、オーロラ微細構造の生成に関わるエレクトロダイナミクスの遠隔探査手法としてのHISCATレーダーの有用性を示すもので、今後一層の発展が期待される。本研究課題の最終年として、オーロラ微細構造の動態解析のためのグラディエント法によるオプティカルフロー検出アルゴリズムの検証と改良を進めるとともに、EISCAT UHFレーダーによる高解像度のレーダー/光学同時観測とカール、フリッカーリングオーロラ、ブラックオーロラなどの動態解析を実施した。速度場解析アルゴリズムの検証と改良では、アルゴリズムの適用限界を明らかにするため、ケオグラム法(任意の一次元スリット上の輝度プロファイルを時系列データとして抽出・スタック・表示)による二次元解析を用いて定量比較を行った。結果は概ね一致したが、オーロラの固有運動に比べて相対的に輝度変動が大きいオーロラではその差が大きく、こうしたオーロラへの適用には注意が必要であることが判明した。これらの成果は2003年6月のIUGG国際会議等で発表するとともに投稿準備中である。EISCATサイトにおけるレーダー・オーロラ同時観測として2004年10月に4夜(計16時間)の特別実験を計画したが、悪天候のため1夜(4時間)のみ実施できた。このデータを含め、2003年3月以降に名古屋大学太陽地球環境研究所と共同で実施したオーロラ微細構造に関する解析を進めた結果、下記の知見が明らかとなった。1)ディスクリートオーロラの最小構造はカールを形成する薄いアークでその厚さは約100m程度。2)カール形成時には数100m/sの反時計方向の回転運動を伴う。
3D画像解析による外科手術教育定量的評価法の開発

目的は安全な外科手術手技を行うために定量的な教育評価システムを構築することです。術前CTから肝癌の客観的形態分類システムを開発し、凸凹不整のTypeII/IIIでは根治性を重視した系統的切除が望ましいことが示唆されました。次に術前3D画像と切除標本の比較では78%の症例で計画通りの切除が施行されていました。出血量500ccおよび1000ccを境界として術式変更が検討されていました。出血量820ml以下に抑制することが合併症回避ポイントであることが示されました。本研究の目的は、外科医が技術を研鑽する上で、安全性に重点をおき合目的に手術手技を習得できる教育システムと客観的評価システムを確立することである。客観的で定量化された手術手技の教育評価システムを構築するために、デジタルデータを蓄積し既知の医療情報と比較し適切な手術教育か否かを評価する。平成25年度は、デジタルデータの集積に努めた。術前予定術式と実際に施行された術式との一致率を従来からのデータベースと比較する一方、新規に導入した3Dスキャナにより術野と標本を定量測定する第一段階を実施した。まず外科手術(特に肝切除)に関する手技、臓器、切除術式の画像データベース化を行った。1)肝切除予定の患者MDCTからVincentを用いて3D画像を構築し蓄積した。切除予定範囲を設定し切離面に露出する脈管構築、肝離断面積を同定し記録しておく。2)デジタルカメラにより2Dおよび3D画像の集積を行った。肝切除術式を撮影しデータベースとした。同時に患者の背景因子、術前肝機能、切除術式、手術時間、出血量、在院日数、術後合併症、切除標本重量、腫瘍個数、腫瘍径などを集計した。3)切除標本について肝離断面の面積をマニュアルで測定したのち、デジタルカメラにより標本全景、腫瘍割面を撮影した。腫瘍の肉眼形態、内部構造、脈管侵襲など病理学的所見について記録しデータベース化した。4)切除標本の3D構築を3Dスキャナで行った。立体情報を数値化し手術手技教育の評価に採用できるように切離面積を基本とし、標本重量あたりの切離面積、離断面の高低差などの情報を定量化測定した。3Dスキャナによる測定に当たり効果的に画像を獲得するため、一つの検体について複数回の取り込みを行い、どの画像が研究データとして適正化を判定した。客観的で定量化された手術手技の教育評価システムを構築するためにデジタルデータを蓄積し既知の医療情報と比較し適切な手術教育か否かを評価する。平成26年度は前年度に引き続きデジタルデータの集積に努めた。術前予定術式と実際に施行された術式との一致率を従来からのデータベースと比較する一方で、3Dスキャナを用いて標本を定量測定した。外科手術(特に肝切除)に関する手技、臓器、切除術式の画像データベース化を行った。1)肝切除予定患者のMDCTからVincentを用いて3D画像を構築し蓄積した。平成26年度は200例の肝切除患者についてデータ集積が行われた。切除予定範囲を設定し切離面に露出する脈管、肝離断面積、切除容積を記録した。2)デジタルカメラによる2Dおよび3D画像の集積を行った。前記200例について術中写真、標本写真を撮影しデータベースとした。同時に患者の背景因子、術前肝機能、切除術式、手術時間、出血量、在院日数、術後合併症、標本重量、腫瘍個数、腫瘍径などを測定した。3)切除標本について肝離断面の面積をマニュアルで測定しデータベース化した。4)切除標本を3Dスキャナを用いて3Dデジタルデータとして収集した。立体情報を数値化し標本サイズ、面積などを定量化した。前年度に技術的に問題のあった画像収集過程を修正し適切なデータ収集が行えるように改善を行った。【背景と目的】人口の高齢化、手術適応の拡大、腹腔鏡導入による手術手技の多様性など外科手術を取り巻く環境は大きく変化しています。このような中、安全で事故のない外科手術を供給するために効率的な手術手技教育法の確立が求められています。本研究では、外科医が手術技術を研鑽する上で、安全性に重点をおき合目的に手術手技を習得できる教育システムと客観的評価システムを確立することを目的としました。【方法】本研究は術前3D画像と切除標本画像を用いて、術前計画と実際に施行された手術手技との定量的一致率を算定し、客観的な教育評価システムを検討しました。特に系統的肝切除術では肝区域の境界を走行する肝静脈や支配門脈の断端が過不足なく露出されていることが肝要であり、これを追究する一方で手術時間や出血量が妥当な範囲に収まってることが求められます。それぞれのパラメータとして手術時間、出血量、在院日数、術後合併症を評価項目として測定しました。【結果】2013-2015の3年間に施行された肝切除は646例で、うち207例が系統的肝切除かつ高難度手術に該当していました。これらの出血量は中央値377cc(5-3500)、原発性肝癌は320cc、肝転移は285cc、胆道癌は547ccでありました。

術前に構築された3D画像と切除標本との比較で78%の症例で計画通り妥当な切除が施行されておりました。一方、22%では術中の腹水出現、肝生検による肝線維化程度の悪化、肝離断面からの出血過多などの理由で術式変更が施行されており、肝離断面の肝静脈露出は不十分でありました。術中出血が500ccおよび1000ccを境界として術式の変更が検討されていました。【結果】術前3D画像と切除標本を用いて手術手技を評価できる可能性が示唆されました。出血量に基づく危険回避ポイントが設定されたことにより、肝切除技術や出血抑制意識は向上しました。目的は安全な外科手術手技を行うために定量的な教育評価システムを構築することです。術前CTから肝癌の客観的形態分類システムを開発し、凸凹不整のTypeII/IIIでは根治性を重視した系統的切除が望ましいことが示唆されました。次に術前3D画像と切除標本の比較では78%の症例で計画通りの切除が施行されていました。出血量500ccおよび1000ccを境界として術式変更が検討されていました。出血量820ml以下に抑制することが合併症回避ポイントであることが示されました。研究目的の達成度について2年目である平成26年度はおおむね順調に推移した。昨年度に引き続きMDCTから術前3D画像を構築し予定術式と実際に施行された術式との比較が行えるようにデータ収集がなされた。術野と切除標本の2D画像収集は200例が施行された。また前年度に課題として残された切除標本の3D画像構築であるが、条件設定を修正することによりほぼ適切な画像収集が可能となった。一方、得られたデジタルデータの解析方法について適切な条件を設定中であり随時改善を行っている。消化器外科平成27年度は研究最終年度である。これまで比較的順調に進捗しているが、データの解析において条件設定に時間を要するものと思われる。本年度は最終的研究目的である効果的な安全教育に役立つ手術手技と教育システムの確立を根拠を持って示せるように研究を進めていく予定である。研究成果は学会や論文により発表を行っていく予定である。研究目的の達成度について初年度である平成25年度はおおむね順調に進展した。最も順調に進行したのはMDCTから術前の3D画像を構築し蓄積する作業である。約100例の肝切除患者について肝切離面に露出する脈管構造、切離面積、標本予測重量の蓄積が行われた。これらは学内サーバーに保存され患者個人情報に配慮しつつ容易に評価できる状態でデータベース化された。次にデジタルカメラによる手術術式、切除部位の記録は症例を選択して行われた。撮影に当たり十分な術野が得られ、手術手技に支障のない場合を選んで積極的に画像データの確保を行った。約40例の術野記録が行われた。次に切除標本のデータベース化はおおむね順調に進んだ。臓器摘出後に速やかに測定が行われ登録用紙に記載された。現在、これらのデータをデジタルがするために順次、パソコン入力が行われている。3Dスキャナによる定量化は研究開始時はやや進行が遅れていたが、初年度後半になり経験値が増し、順次データの獲得が行われている。しかし、一つの検体について複数回の取り込みを行うための時間的制約があり適切な画像処理のための条件改善を随時行っている。昨年度までに得られたデジタルデータの解析方法について適切な条件を設定中であり、解析に要する予算について本年度に繰り越すこととなった。
超音波の音響放射圧を用いたアクティブ制御式非接触支持・搬送システムの開発

超音波振動子の振動面に平行にごく短いギャップ間隔で平面を配置すると、振動面と平面の間に音響放射圧による反発力が生じる。この力を非接触アクチュエータとして用いることは既に提案されており、非接触搬送や非接触ベアリングなどの研究が行われている。報告者は超音波振動子に振動を励起させる駆動電圧を直接制御することで音響放射圧を直接制御することを提案し、それが有効であることを実証している。この技術を使うことにより、従来超音波放射面に対し平行方向のみに制御可能であった音響放射圧が、面に垂直な方向に、かつギャップ間隔とは独立に制御することが可能となった。そこで、このアクチュエータを水平方向に並べて上に被搬送物体を置き、搬送方向にあるアクチュエータの出力を下げてわずかに被搬送物体を傾斜させてやれば、被搬送物体は傾斜した方向へ移動を始めると予想される。これにより非接触搬送が可能となる。このアイディアに基づき、非接触浮上式アクティブ搬送装置の可能性についての検証実験を行い、非接触搬送が原理的に可能である事を確認した。しかしその際、音響放射圧制御システム自体の安定性・精度が低く、音響放射圧勾配を正確に与える事が極めて困難であること、また音圧の距離依存性が予想以上に大きな非線形として作用する事も同時に明らかとなった。これにより、音圧制御システム自体の改良・動力学的特性の詳細な検討が必要であることを確認した。その結果を受け、音圧制御システムの改良を行っている。音圧制御には,力率調整つまみをサーボモータで電気機械的に制御する手法を用いているが、つまみ部の摩擦の影響による誤差が大きい事が判明しているので、つまみ部に新たに角変位センサを組み込み、その状態を観測量に含めてフィードバック制御を行うことで摩擦の影響を抑止することを目指した。現在ひきつづき制御器の設計・調整により性能向上を目指して実験を進めている。この力を発生するアクチュエータを水平方向に並べて上に被搬送物体を置き、搬送方向にあるアクチュエータの出力を下げてわずかに被搬送物体を傾斜させてやれば、被搬送物体は傾斜した方向へ移動を始めると予想される。このアイディアに基づき、本研究では提案する搬送装置の可能性を実証するために、実際に非接触浮上式アクティブ搬送装置を製作し、搬送が可能であるかの原理的な検証を行った上で非接触浮上式搬送装置を開発することを目的としている。計画に従い、本年度は最初に、非接触浮上式アクティブ制御搬送装置装置を製作した。音響放射圧を発生する超音波振動子は既存の超音波ウェルダーを改造した。被搬送物体は非磁性体のガラス板とし、周囲を支持する枠との間でごく細い糸により水平方向の運動を拘束し、搬送方向以外の方向の静的安定を確保した。この実験システムを用いて搬送の可能性について実験的に検討し、非接触搬送が原理的に可能である事を確認した。すなわち、非接触搬送を実現するためには、一足飛びに搬送を行うのではなく(その前提としての)音圧制御システム自体の改良・動力学的特性の詳細な検討が必要であることを確認した。そこでその後の計画を修正し、音圧制御システムの改良と距離-音圧特性を考慮した制御スキームを考案することを目的として検討を行っている。現在、非接触に振動を制御することに成功した段階であり、引き続き非線形特性の同定と制御スキームの検討を行う予定である。
足部内の力学作用が立位姿勢・バランス保持能力に及ぼす影響

若年者との比較により,高齢者の姿勢保持に関わる足部内力学作用を明らかにすることを目的とした.【方法】対象は健常若年者15名(平均年齢21.6±1.5歳),健常高齢者15名(平均年齢70.7±1.8歳)(それぞれ男性8名,女性7名)とした.三次元動作解析装置,床反力計,表面筋電図計を用い,身体重心,前足部・後足部のそれぞれにかかる外力(床反力),筋活動(母趾外転筋,下腿三頭筋)を計測した.動作課題は,足関節を軸にゆっくり体重を前方・後方へ移動し,最大前後移動時に3秒間静止するよう依頼した.静止立位,最大前方移動位,最大後方移動位の各肢位ともに安定している1秒分のデータを抽出し解析に用いた.統計学的検討には,身体重心前後方向位置座標(身長により正規化),床反力(体重により正規化),筋活動量(最大筋活動量により正規化)に対し,年代(高齢群,若年群)と動作相(静止立位,最大前方移動位,最大後方移動位)を要因とする二元配置分散分析を用い,交互作用と主効果の検討を行った.さらに年代間の比較では,対応のないt検定を用いて多重比較を行った.いずれの検定も有意水準5%未満とした.【結果】年代と動作相のそれぞれで有意な主効果を認めたものの,交互作用は認めなかった.年代間の比較では, 1.身体重心:最大前方移動位(p=0.03),最大後方移動位(p=0.00)において高齢者ては重心移動量が少なかった.2.床反力(前足部):静止立位(p=0.00),最大前方移動位(p=0.03)において高齢者では床反力(前足部)の前方方向成分が大きかった.3.筋活動量:静止立位(p=0.03),最大後方移動位(p=0.01)において高齢者では母趾外転筋の筋活動量が多かった.【本研究の意義】高齢者の静止立位,前後方向の姿勢保持では前足部に対する外力,内在筋活動が若年者と異なることが明らかとなった.高齢者のバランス能力の評価・介入の一助として,静止立位・前方移動時の前足部機能ならびに静止立位・後方移動時の足内在筋の活動に着目することの重要性を示唆した.これらの知見は高齢者の転倒予防などにつながる基礎的データとなりうると考えられる.若年者との比較により,高齢者の姿勢保持に関わる足部内力学作用を明らかにすることを目的とした.【方法】対象は健常若年者15名(平均年齢21.6±1.5歳),健常高齢者15名(平均年齢70.7±1.8歳)(それぞれ男性8名,女性7名)とした.三次元動作解析装置,床反力計,表面筋電図計を用い,身体重心,前足部・後足部のそれぞれにかかる外力(床反力),筋活動(母趾外転筋,下腿三頭筋)を計測した.動作課題は,足関節を軸にゆっくり体重を前方・後方へ移動し,最大前後移動時に3秒間静止するよう依頼した.静止立位,最大前方移動位,最大後方移動位の各肢位ともに安定している1秒分のデータを抽出し解析に用いた.統計学的検討には,身体重心前後方向位置座標(身長により正規化),床反力(体重により正規化),筋活動量(最大筋活動量により正規化)に対し,年代(高齢群,若年群)と動作相(静止立位,最大前方移動位,最大後方移動位)を要因とする二元配置分散分析を用い,交互作用と主効果の検討を行った.さらに年代間の比較では,対応のないt検定を用いて多重比較を行った.いずれの検定も有意水準5%未満とした.【結果】年代と動作相のそれぞれで有意な主効果を認めたものの,交互作用は認めなかった.年代間の比較では, 1.身体重心:最大前方移動位(p=0.03),最大後方移動位(p=0.00)において高齢者ては重心移動量が少なかった.2.床反力(前足部):静止立位(p=0.00),最大前方移動位(p=0.03)において高齢者では床反力(前足部)の前方方向成分が大きかった.3.筋活動量:静止立位(p=0.03),最大後方移動位(p=0.01)において高齢者では母趾外転筋の筋活動量が多かった.【本研究の意義】高齢者の静止立位,前後方向の姿勢保持では前足部に対する外力,内在筋活動が若年者と異なることが明らかとなった.高齢者のバランス能力の評価・介入の一助として,静止立位・前方移動時の前足部機能ならびに静止立位・後方移動時の足内在筋の活動に着目することの重要性を示唆した.これらの知見は高齢者の転倒予防などにつながる基礎的データとなりうると考えられる.
協力行動を促す制度設計に関する実験研究

本研究では,協力を促進するためのインセンティブが与えられたときの,自発的な協力行動について,ラボ実験によって分析をおこなった.本研究では,三つのタイプの公共財供給実験を実施した.協力を助長するためのインセンティブとして,報酬や処罰が用いられた.本実験結果から,自発的な協力を高めることが可能となる制度が示された.また,被験者間での異質性を考慮することで,自発的な協力行動に対する理解が深められた.本研究課題では、地域の財産や資源をお互いに協力しながら守る制度を、実験手法を用いて明らかにすることを目的としている。2014年度は、当初の研究実施計画のとおり、グループメンバーに報酬を与える機会がある公共財供給実験を実施した。さらに、主に社会心理学で発展してきたsocial value orientation尺度を用いて被験者の選好を直接的に測り、その結果を公共財供給実験の結果と照らし合わせることで、人間の協力行動が促されるメカニズムを詳細に分析できるようにした。人間の選好の違いを考慮することは、地域社会で真に機能する制度をつくるために重要であるため、学問的だけではなく、社会的にも意義のある研究であったと考える。また、これまでの研究では、グループメンバーがランダムに変わる場合には、報酬を与える機会がある制度は、処罰を与える機会がある制度よりも、人間の協力行動を促すことが難しいと考えられてきた。2014年度に研究を進めていく過程で、これまでの報酬の仕組みを変えることで、人間の協力行動をさらに促す可能性が生まれることを確認したため、新しい報酬の仕組みを備えた公共財供給実験も実施した。もし、人間の協力行動を十分に促すことができるならば、処罰を与える機会がある制度よりも、報酬を与える機会がある制度のほうが望ましいことが知られているため、新しい報酬の仕組みを考案したことは、本研究課題の目的の達成度をさらに高めることに寄与したと考える。2015年度にも人間の協力行動を促す制度について検討する予定であり、2014年度と2015年度の研究成果によって、地域社会で人間が自発的に協力する制度について提案することができると考える。本年度は、金銭的インセンティブによって人の自発的な協力行動がどのように促されるのかに関する研究をおこなった。人の自発的な協力行動は公共財供給実験における被験者の行動から観察できるため、公共財供給実験を実施した。金銭的インセンティブは報酬や処罰を用いた。また、被験者の内発動機を計測し、その計測結果を実験結果の頑健性や被験者のタイプによる自発的な協力行動の違いに関して分析する際に用いた。はじめに、報酬を与える機会のある公共財供給実験を実施した。この実験ではグループメンバーが毎回ランダムに変わるときを分析対象とした。そして、これまでの研究とは異なる方法で、自発的な協力行動を促す仕組みを考案した。また、報酬を与えるという意思決定について分析することで、考案した仕組みが機能する理由を示した。次に、処罰を与える機会のある公共財供給実験を実施した。この実験ではグループメンバーのうち一人だけ処罰の機会が与えられる実験デザインを用いた。そして、処罰者のタイプに応じてグループ分けをおこなうと、グループの協力やグループメンバーの厚生に違いがあることが示された。最後に、報酬と処罰の機会が両方とも与えられる公共財供給実験を実施し、報酬の機会が多く用いられることを観察した。また、グループの協力とグループで用いられる報酬額には一定の関係があることを確認した。以上の三つの実験によって、報酬や処罰を用いたときの自発的な協力行動に関する知見を総合的に得ることができた。本研究では,協力を促進するためのインセンティブが与えられたときの,自発的な協力行動について,ラボ実験によって分析をおこなった.本研究では,三つのタイプの公共財供給実験を実施した.協力を助長するためのインセンティブとして,報酬や処罰が用いられた.本実験結果から,自発的な協力を高めることが可能となる制度が示された.また,被験者間での異質性を考慮することで,自発的な協力行動に対する理解が深められた.本研究課題では、人間の協力行動を促すメカニズムを詳細に明らかにすることで、地域の財産や資源を自発的に守る制度づくりに貢献することを目的としている。2014年度の研究では、研究実施計画のとおり、グループメンバーに報酬を与える機会がある公共財供給実験を実施することで、人間の協力行動を促す仕組みを分析した。また、これまでの研究よりも、人間の協力行動を促すことができる可能性のある、新しい報酬の仕組みを備えた公共財供給実験を実施し、本研究課題の目的である人間の協力行動を促す制度設計をさらに進めることを可能にした。ただし、実験データを注意深く確認したところ、実験で用いたソフトウェアのプログラムに間違いのある実験が存在することが確認されたため、本研究課題の目的を十分に達成するために追加的な実験が必要である。なお、プログラムの間違いはわずかであるため、2014年度と同様の実験結果が得られると予想しており、実験データを分析する際に用いた手法は、そのまま用いることができるため、研究実施計画を大きく変更する必要はないと考えている。公共経済学2015年度には、グループメンバーに処罰を与える機会がある公共財供給実験、および処罰と報酬を与える機会がある公共財供給実験をおこなう予定である。また、2014年度にプログラムの間違いが見つかった実験も実施する予定である。いずれの実験もsocial value orientation尺度によって、一人ひとりの被験者の選好を測ることで、それぞれの制度が人間の協力行動を促すメカニズムを詳細に明らかにする。最後に論文としてまとめる。

本研究課題の成果は、さまざまなタイプの人間における協力行動を理解できることに加えて、新しい制度を提案することに繋がるため、広く社会に発信する方法についても模索する。一つ目の理由は、2014年度に参加できなかった学会に参加するためである。これは、本研究課題の成果を発表する、または最新の研究成果を聴取するために必要である。二つ目の理由は、2014年度に実施した実験データを注意深く確認したところ、プログラムに間違いのある実験が確認されたからである。プログラムの間違いは僅かではあるが、2014年度に進めた研究を成果として発表するために必要である。また、本研究課題の目的である、人間の協力行動を促す制度設計の実現には、2014年度および2015年度の実験結果を総合的に考えることが必要であるため、本研究課題全体にとっても重要な追加実験となる。なお、本研究課題の全体的な支出は変わらないようにする。2014年度に支出予定であった物品費は、学内および実験施設に備え付けてあるものを利用できるように手続きしたため、研究実施計画のとおりに着実に進めることができる。次年度使用額(214,078円)は、学会出張経費および追加的な実験に使用する。学会出張経費は、本学のある関西圏で開かれる予定の学会に参加するために用いるため、15,0000円程度を想定している。実験費は当日の被験者のパフォーマンスに応じて変わるが、20万円程度が必要になると考えている。いずれの支出も本研究課題全体の目的を達成するために必要となる経費である。
リニアモータータンパク質糖質加水分解酵素の１ナノメートルステップの１分子計測

本研究では、糖質加水分解酵素であるTrCel7Aの1分子蛍光観察と高速AFMによる1分子観察を駆使してTrCel7AによるセルロースIαとセルロースIIIIの加水分解反応のすべての反応素過程の速度パラメーター(結合速度定数、並進運動速度、解離速度定数)を求めて比較した。その結果、セルロースIαとセルロースIIIIで大きな違いはないことが明らかとなった。この結果から、分解性の違いはセルロース結晶面上でTrCel7Aが結合できる表面積の違い、およびTrCel7Aの“渋滞"の度合いの違いによるものであるというモデルを提案した。1.光学顕微鏡の時間分解能・位置決定精度の向上55マイクロ秒の時間分解能で1nmの位置決定精度、および1マイクロ秒の時間分解能で2nmの位置決定精度を達成する全反射型暗視野光学顕微鏡システムを構築した。可視化プローブとして前者は直径40nm、後者は直径80nmの金コロイド粒子を用いた。2-1分子計測用キチナーゼ、セルラーゼ変異体調製と生化学的評価大腸菌での遺伝子組み変えおよび発現が確立しているBacillus circulans由来のキチナーゼを用い、精製用のHisタグや、可視化プローブを結合させるビオチンタグを導入するためのシステイン残基を導入した変異体を多種類作製した。さらに運動方向が異なる別ファミリーについても同様に1分子計測用変異体を作製した。さらに、Trichoderma viride由来のセルラーゼの変異体作製も行った。作製したシステイン導入変異体を発現・精製し、ビオチン導入効率が高い、可視化プローブとの結合効率が高い、結晶性多糖への吸着活性や分解活性等が野生型と同程度である、といった基準でスクリーニングを行った。さらにキチナーゼについては、蛍光1分子観察で運動を可視化することにも成功した。3.高速AFMによるキチナーゼおよびセルラーゼ変異体、キチン、セルロース試料の評価キチナーゼ、セルラーゼの各種変異体を高速子間力顕微鏡(AFM)で観察し、移動速度が野生型に比べどのように変化するかを調べた。特にHisタグやビオチンタグ導入による移動速度の低下がないことを確認した。また、生化学的な分解活性の結果と比較した。また、アンモニア処理により結晶性を変化させた多糖を用いて高速AFM観察を行い、移動速度の変化を評価した。セルロースやキチンを分解する糖類加水分解酵素であるセルラーゼやキチナーゼはリニアモータータンパク質であることが明らかにされており、レールとなる結晶性セルロースやキチンを加水分解する際に放出される化学エネルギーを利用して連続的に一方向に動く。本研究では、セルラーゼやキチナーゼを光学顕微鏡で1分子観察・操作して直進運動の素過程の可視化を行うとともに運動素過程の負荷依存性の計測により、その化学力学共役機構の詳細を明らかにする。H25年度は、子嚢菌Trichoderma reesei由来のセルラーゼTrCel7Aのシステイン変異体を蛍光色素Cy3で修飾し、結晶性セルロース分解反応の1分子蛍光観察を行うことに成功した。これにより、結合速度定数、併進運動速度定数、解離速度定数をすべて求めることができた。特に、TrCel7Aの速度定数は結晶性セルロースIとIIIの分解反応でほぼ同じであり、生化学測定でみられるセルロースIとIIIの分解されやすさの大きな違いは、TrCel7Aの反応素過程の速度定数の差が原因ではなく、セルロースIとIIIの疎水性表面の割合の差によるものであることを明らかにした(Shibafuji et al JBC 2014)。さらに、Serratia marcescens由来のキチナーゼChiAおよびChiBのシステイン変異体を多種作製し、蛍光標識及びビオチン標識でキチン分解活性を保持しているものをスクリーニングした。ChiAについては、1分子蛍光観察による運動測定に成功し、50 nm/sという運動速度を求めることに成功した。結晶性セルロースにはいくつかの結晶形が存在する。自然界に存在するセルロースIαを超臨界アンモニアで処理するとセルロースIIIIに変化する。Cel7によるセルロースIIIIの分解速度はセルロースIαのそれに比べ5倍程度大きいことが報告されていた。この成果はセルロース分解の効率を改善する手法として注目されていたが、何故セルロースIIIIがセルロースIαよりも分解されやすいのかは明らかではなかった。本研究ではTrCel7Aの生化学計測、蛍光1分子計測、および高速AFMによる1分子計測を駆使し、セルロースIαとセルロースIIIIの加水分解反応のすべての素過程の速度パラメーターを求めて比較することで、その分解性の違いの原因を明らかにした。まず、セルロースIαおよびIIIIへの結合・解離のタイムコースから、セルロース単位長さ当たりの結合速度定数(kon)、および解離速度定数(koff)を計測した。興味深いことに、konの分布には等間隔ずつ離れた複数のピークがみられた。高速AFMと蛍光でセルロースを同時観察した結果、複数のピークはセルロース微結晶の束の数に対応していることが明らかとなった。

また、微結晶1本の太さはセルロースIα、IIIIともに20 nm程度でほぼ同じであった。微結晶1本に対応する最も小さいピークを比較すると、セルロースIαとIIIIでkonに大きな違いはみられなかった。またkoffの測定ではセルロースIα、IIIIともに、遅い解離と速い解離の2成分が観察された。遅い成分はセルロース上を運動・分解してからの解離(koffP)、速い成分は運動・分解を伴わない解離(koffNP)に相当する。セルロースIαとIIIIでkoffPとkoffNPの値や、運動・分解後の解離の割合(約50%)に大きな違いはみられないことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学26年度が最終年度であるため、記入しない。1分子計測用のキチナーゼ、セルラーゼ変異体作製が完了し、機能の保持を確認できた。また、1分子蛍光観察や高速AFM観察で運動を可視化することにも成功した。1分子計測用のセルラーゼおよびキチナーゼの作製は完了した。セルラーゼTrCel7Aについては、1分子蛍光観察によりセルロース分解反応素過程の速度定数をすべて求めることに成功した。またTrCel6Aについても同様に速度定数の計測が進んでいる。またキチナーゼChiAについては、1分子蛍光観察による運動計測に成功した。作製したキチナーゼ、セルラーゼ変異体を用い、金コロイドやラッテクスビーズをプローブとする高時間・高空間分解能1分子計測を行う。今後は、ビオチン標識したセルラーゼ、キチナーゼを用い、ストレプトアビジン被覆金コロイドやポリスチレンビーズをプローブとして用いた高時空間分解能計測を行う。また、光ピンセットを用い、基質である結晶性多糖との結合力の測定や運動速度の負荷依存性の測定を行う。当該助成金が発生したのは変異体作製がスムースに進み、当初の計画よりも少ない種類の作製で1分子計測に適したものを得ることが出来たためである。試料調製のための培養試薬、タンパク質ビオチン化試薬、光学部品等、翌年度の1分子計測を迅速に進めるための消耗品費として用いる予定である。H25年度は1分子蛍光計測に注力したため、金コロイド微粒子やポリスチレンビーズの購入に充てる予定の予算を繰り越した。プローブとして用いる金コロイド微粒子やポリスチレンビーズ、および試料調製用試薬の購入に用いる。