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分子進化の新しい指標に基づく転写基本因子TFIIDを含む巨大複合体の立体構造解析

応募者はこれまでにTFIIDの大量精製法を確立してきたが、TFIID単独では形状が不安定なため、さらに5種類の相互作用因子を精製した。次の問題は因子を混合する順序だが、我々は近年開発した分子進化の新しい指標に基づき、進化の過程で誕生した順に混合するという着想に至った。本研究では、A. TFIIDの結晶化と結晶構造解析、B.分子進化的解析、C. TFIIDを含む複合体の再構成と立体構造解析、を行う。平成30年度は、A.C.に注目して研究を進めた。TFIIDは分子量が巨大でサブユニット数も多い複雑な複合体であるため、結晶化だけでなく、クライオ電子顕微鏡による解析も進めた。平成30年4月に、200kVのクライオ電子顕微鏡(Talos Arctica, Falcon3)がKEKに導入されたことを受けて、まずはその立ち上げを行なった。12月には110kDaのタンパク質を2.85angstrom分解能で決定することに成功し、立ち上げが完了したと考えている。現在、KEKクライオ電顕の装置責任者として共同利用を推進しつつ、TFIIDと相互作用して形状を安定化するRNA polymerase IIのクライオ電顕解析を行い、現在、8angstrom分解能での単粒子解析に成功している。平成30年度は、TFIIDなどの巨大複合体の立体構造解析に必須な技術である、クライオ電顕の立ち上げに成功したので、当初の計画以上に進展していると考えている。A. TFIIDの結晶化と結晶構造解析:結晶が得られ次第、PFやSPring-8等の放射光実験施設を活用して回折データの収集を行う。回折データに基づいて、結晶の質の改善及び抗凍結剤の検討を行い、分解能の向上を試みる。抗凍結剤を利用しても分解能の向上が望めない場合は、当研究室で独自に開発した多段階凍結法を活用する。良好な回折データが得られた場合は、単波長異常分散法や分子置換法を駆使して結晶構造の決定を行う。必要に応じて、重原子クラスター等の利用も検討する。もし電子顕微鏡観察で良い像を得られれば、そのまま単粒子解析に進む。B.分子進化の新しい指標を利用して、TFIIDを含む複合体の集合順序を予測:引き続き、dDRに基づく解析を通して、分子集合や構造解析にヒントが得られないかを探る。C. TFIIDを含む複合体の再構成と立体構造解析:B.の結果を受けて、dDR値を利用した分子進化的解析に基づいてTFIIDとその他の因子を混合する。もし、総当たりで検討するなら、単純に考えても7x6x5x4x3x2の5040通りを試みないといけないし、二者同時・三者同時の可能性を考慮するとさらに組み合わせが増える。本研究課題ではdDR値を踏まえてpol II, TFIIBなどを先に混合してコアを作り、その後TFIIDや他の因子を加えることとする。複合体形成については、熱安定性測定・動的光散乱・X線小角散乱・電子顕微鏡観察を組み合わせて確認し、得られた情報に基づいて、TFIIDを含む複合体の再構成・結晶化を行う。A.TFIIDの結晶化と結晶構造解析:結晶が得られ次第、PFやSPring-8等の放射光実験施設を活用して回折データの収集を行う。また、KEKにおいてクライオ電顕が立ち上がったので、積極的に電子顕微鏡観察を行い、良い像を得られればそのまま単粒子解析に進む。
骨格系の制御プログラムにおける骨形成因子の機能と役割

骨形成因子(BMP)のシグナル伝達のメカニズムについて、ユビキチン・プロテアソーム系によるレセプターと細胞内シグナル伝達分子Smadの分解に焦点を絞って検討した。今年度は、昨年までに明らかにしたSmurfが抑制型Smadを介してTGF-β/BMPシグナルを制御していることについてさらに研究を進めた。まず、Smurf1と抑制型Smadの協調作用をin vivoで証明するために、Smurf1とSmad6を軟骨特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製し、両者を掛け合わせてそのフェノタイプを解析した。その結果、Smad6トランスジェニックマウスは短肢症を呈したが、Smurf1トランスジェニックマウスは外見上正常だった。ところが両者を掛け合わせると、Smad6単独トランスジェニックマウスよりも強いフェノタイプを示した。以上のことは加in vivoで両者が協調的に作用することを示唆する。次に、Smad7に結合してその作用を調節する新たな分子を探索する目的で、Smad7をベイトに酵母Two-hybrid法を施行した。その結果、Smurf様E3ユビキチンリガーゼNEDD4-2とWWP1がSmad7と結合することを見いだした。さらに実験を進め、両者がSmurf1同様にSmad7を介して、レセプターの分解に関与していることを明らかにした。また、発現解析からこれらのE3ユビキチンリガーゼは発現組織や細胞が異なることを明らかにした。骨形成因子(BMP)のシグナル伝達のメカニズムについて検討し、以下の知見を得た。まず、ユビキチン・プロテアソーム系による、BMPとTGF-bのシグナル伝達制御について解析した。HECT型E3ライゲースSmurf1は、BMP特異型Smad1/5に結合し、その分解を促進することでBMPの制御している。ところが我々の検討では、Smurf1はSmad1/5のみならず抑制型SmadであるSmad6やSmad7とも強く結合した。そして核内に局在するSmad6/7はSmurf1存在下に核外に移行した。さらにSmurf1はSmad7を介してI型TGF-bレセプターに結合し、Smad7とレセプターのユビキチン化とプロテアソームにおける分解を促進した。以上のことから、BMPとTGF-bのシグナルが同じE3ライゲースによって制御されているというユニークなメカニズムが明らかになった。次に、抑制型SmadであるSmad6とSmad7のdeletion mutantとキメラ蛋白を作製し、両者の機能的差異に対するドメインの役割を検討した。その結果、Smad7がSmad6と異なりBMPのみならずTGF-bのシグナルも強力に抑制することは、Smad7のN末端側によって規定されていることを明らかにした。さらに、東京大学医科学研究所の山本雅先生との共同研究で、BMPシグナルの新しい制御因子としてTobを解析した。その結果、TobはSmad1のMH2領域に結合し、その細胞内局在を変化させ、転写を阻害した。tob遺伝子欠損マウスの骨量は増加することから、TobはSmadに結合し、BMPのシグナルを負に制御していると考えられる。まず、昨年までに明らかにした、Smurf1がSmad7を介してTGF-bのI型レセプターに結合し、Smad7とレセプターのユビキチン化とプロテアソームにおける分解を促進する系について、そのメカニズムを詳細に検討した。すると、Smurf1のN末端に存在するC2ドメインが、Smurf1-Smad7複合体を、レセプターの存在する細胞膜に局在させるのに重要な働きをしていることがわかった。Smurf1がレセプターに結合するためにはSmad7が必要だが、Smurf1が細胞膜へのSmad7の局在を促進することから、Smurf1とSmad7は互いに協調的に作用して、TGF-bのシグナルを抑制していることがわかった。次に、Smurf1-Smad7複合体のBMPのI型レセプターに対する機能を調べてみた。するとSmurf1-Smad7複合体はTGF-bのレセプターの場合と同様に、BMPのI型レセプターにも結合し、その分解を促進することがわかった。さらに、Smurf1-Smad7複合体は、BMP特異型Smadである、Smad1とSmad5にも結合し、そのユビキチン化依存的分解を促進した。これらは、Smurf1は多段階にわたりBMPのシグナルを制御していることを示唆する。今回の研究から、TGF-b/BMPシグナルにおいて、ユビキチン・プロテアソーム系は、細胞内のSmadの量を調節してリガンドに対する応答性を制御したり、活性型Smadや活性型レセプターを分解することで、シグナルの強さに依存した転写量を厳密に調節していると考えられた。Smurf1はHECT型E3ユビキチンリガーゼである。我々は昨年までに、Smurf1がSmad7と結合して細胞質へ移行したのちTGF-βのI型受容体をユビキチン化してその分解を促進する事を明らかにした。そこで今回我々はまず、Smurf1-Smad7複合体の核外移行のメカニズムを解析した。

その結果、Smurf1はCRM1依存的に核外移行することを示した。さらに、Smurf1のC端側に存在する核外移行シグナル(NES)を同定した。Smurf1のNES変異体はSmad7と結合するがSmad7を核外へ移行することは出来ず、Smad7によるTGF-βシグナル阻害作用を促進しなかった。以上から、Smad7の核外移行にはSmurf1のNESが重要な役割を果たしており、Smurf1-Smad7の複合体の核外移行はTGF-βシグナルの抑制に重要であることが明らかとなった。次に、SmurflがBMP特異型Smadに直接結合しユビキチン化するだけでなく、抑制型のSmad6/7を介することによって、BMPのI型受容体及びBMP特異型Smadに結合し,これらをユビキチン化してプロテアソームでの分解に導くことを示した。この結果から、Smurf1と抑制型Smadの複合体が多段階にわたり協調的にBMPシグナルを抑制していることが示唆された。今回の研究から、TGF-β/BMPシグナルにおいて、ユビキチン・プロテアソーム系は、活性型Smadを分解する以外に、抑制型Smadの局在を変えたり、レセプターを分解したりして、多段階にわたりシグナルを抑制していることが考えられた。骨形成因子(BMP)のシグナル伝達のメカニズムについて、ユビキチン・プロテアソーム系によるレセプターと細胞内シグナル伝達分子Smadの分解に焦点を絞って検討した。まず、昨年までに明らかにした、Smurf1がSmad7を介してTGF-bのI型レセプターに結合し、Smad7とレセプターのユビキチン化とプロテアソームにおける分解を促進する系について、その分子メカニズムの詳細を検討した。その結果、Smurf1はそのC末端に核外移行シグナルを持ち、Smurf1-Smad7複合体の核外移行においてCRM1が重要な働きを担っていることを明らかにした。次に我々はArkadiaについて、その作用の分子機構を解析した。Arkadia mRNAはヒト組織、種々の細胞株に広くその発現を認めた。ArkadiaはそのC端のユビキチン化に関わるRINGドメイン依存的に、TGF-βおよびBMPによる転写活性を増強した。ArkadiaはSmadファミリーのうち抑制型SmadであるSmad6/7と結合し、そのポリユビキチン化と分解を促進することが確認された。しかしSmurf1と異なり、ArkadiaはI型TGF-βレセプターのポリユビキチン化・分解を促進しなかった。内因性Arkadiaの発現をsmall interfering RNA (siRNA)で抑制すると、内因性Smad7蛋白量が増加し、TGF-β及びBMPによる転写活性の低下が認められた。以上のことから、ArkadiaはTGF-βのみならずBMPシグナルも増強し、その作用機構の一つとして、抑制型SmadであるSmad7のポリユビキチン化、プロテアソーム系での分解の促進が考えられた。またTGF-βシグナルがArkadiaとSmurfという2種類のユビキチンリガーゼによって正と負の両方向に制御されていることが明らかになった。
サルES細胞から内耳有毛細胞の効率的なin vitro分化誘導法の開発

本研究では難聴に対する細胞移植治療を目指し、まずは多分化能を有する胚性幹細胞(ES細胞)より内耳有毛細胞へのin vitro分化誘導法の開発を目的とした。よりヒトに近い種の細胞を用いることで分化プロセスの解明を行う目的で、カニクイザルES細胞(cES)を用いたが、この場合、フィーダー細胞を必要とし、それらの細胞が分化誘導に対する何らかの影響を及ぼす可能性があるため、本年度はフィーダーフリーのカニクイザルES細胞(ff-cES細胞)を樹立し、さらに昨年度得られた知見を元に、内耳有毛細胞へのin vitro分化誘導を行った。ff-cES細胞は、ヒトES細胞用培地およびコーティング剤(リプロセル社)を用いることで馴化培養し、樹立した。この年ff-cES細胞は、内在性ALP活性の維持および、Oct-3/4、Nanog等の未分化関連遺伝子マーカーの発現が維持され、さらにSCIDマウスの皮下に移植することで、テラトーマの形成も認められたことから、多分化能を有するフィーダーフリーのcES細胞が樹立できたことが確認された。そこで、昨年度得られたデータを元に、ff-cES細胞を4日間胚様体形成させ、さらにストローマ細胞由来の培養上清を用いることで、内耳有毛細胞への分化誘導を試みた。最終的には、分化誘導約1カ月後に内耳有毛細胞マーカー(Math 1, Brn3.1, Myosin Vlla)の遺伝子発現および免疫染色によるタンパク質発現を認め、有毛細胞様細胞が分化誘導し得る条件を得ることができた。今後、さらにストローマ細胞から得られる液性因子のスクリーニングを行うことで、カニクイザルES細胞から内耳有毛細胞への分化プロセスを解明する予定である。カニクイザルES細胞(以下サルES細胞)から内耳有毛細胞のin vitro作成方法、とくに遺伝子操作を使用しない分化誘導法の開発のために、サルES細胞と補助細胞との共培養を行い、候補補助細胞株数種の中から最も効率よくサルES細胞を内耳有毛細胞に分化誘導させ得る最優良細胞株の選定を試みた。共培養する細胞株として、細胞バンクより入手した細胞株数種(PA6, OP9, ST2など)を用いた。ハンギングドロップ法にて作成した4日目胚様体(EBs)と補助細胞とを次の3つの方法で共培養した。すなわち、(1)直接混合培養法、(2)パラホルムアルデヒド固定した補助細胞と直接混合培養、(3)液性因子交通許容の隔膜を用いた間接混合培養である。28日間培養後、内耳有毛細胞マーカー(Math 1, Brn3.1, Myosin VIIa)の遺伝子発現を調べたところ、ST2細胞株との直接混合培養法および隔膜介在間接混合培養においてマーカー遺伝子発現が観察され、同時に免疫染色において陽性細胞の存在も確認できた。さらに、他の内耳有毛細胞マーカーEspin, AchR9α9, parvalbumin 3などの遺伝子発現および免疫染色陽性細胞出現も確認し得た。一方、EBsとST2以外の細胞種との共培養では、一部のマーカー遺伝子の僅かな発現は認める細胞株も存在したが、免疫染色では陽性細胞はほとんど出現しなった。これらの成績より、サルES細胞の内耳有毛細胞への分化誘導に最適の共培養細胞株としてST2細胞株を選定した。なお、マウスES細胞との共培養においても同様の成績が得られつつある〔日本発生生物学会2010(京都)、にて、In vitro differentiation of mouse embryonic stem cellsinto inner earhair cells usingstromal cellsとして発表予定〕。
病原体とその媒介者の両方をターゲットにしたマツ材線虫病の微生物的防除

マツ材線虫病の病原体であるマツノザイセンチュウに対しては、その餌となる青変菌の繁殖を抑制する「兵糧攻め菌」と線虫を直接殺す能力のある「線虫寄生菌」を、線虫の媒介者であるマツノマダラカミキリ成虫に対しては、成虫を直接殺す能力のある「昆虫病原菌」を微生物的防除の候補菌として用いた。兵糧攻め菌と昆虫病原菌はそれぞれ単独でもマツノマダラカミキリ成虫によってマツ健全木に伝播される線虫の数を減少させる効果があるが、両菌を併用するとより有効であることが明らかになった。本研究の目的は、病原体マツノザイセンチュウ(以下線虫と略記)とその媒介者マツノマダラカミキリ(以下カミキリと略記)成虫の両方をターゲットにしたマツ材線虫病の微生物的防除法を開発することである。線虫に対しては、その餌となる青変菌の繁殖を抑制する「兵糧攻め菌」および線虫を直接殺す能力のある「線虫寄生菌」をマツが枯死した晩夏から初秋にかけて施用する。カミキリ成虫に対しては、カミキリを直接殺す能力のある「昆虫病原菌」を翌年の初夏(カミキリが羽1化脱出する時期)に施用する。線虫に対して抑制の仕方が違う2つの菌を用いることで、また病原体とその媒介者の両方をターゲットにすることで、カミキリによる健全木への線虫の伝播を阻止するという微生物的防除法において相乗効果が期待できる。1.前年に施用した兵糧攻め菌・線虫寄生菌の効果の判定前年に菌を施用した予備試験の結果、繰り返しの数は少ないが、兵糧攻め菌・線虫寄生菌にカミキリが保持する線虫数を減少させる効果が見られた。2.線虫寄生菌の増殖・施用方法の開発線虫寄生菌は種駒で増殖・施用するとよいこと、及び兵糧攻め菌・線虫寄生菌の種駒は少なくとも4か月は冷蔵保存が可能であることが明らかになった。3.枯死木への兵糧攻め菌・線虫寄生菌の施用上記の結果を踏まえ、夏に線虫を接種して衰弱させ、カミキリが産卵したアカマツを伐倒・切断し、そこに種駒で兵糧攻め菌・線虫寄生菌を施用した。その際、兵糧攻め菌および線虫寄生菌の単独施用区と両者同時施用区を設けた。丸太は野外網室に入れ、その後定期的に施用菌の広がりを確認している。線虫に対しては、その餌となる青変菌の繁殖を抑制する「兵糧攻め菌」および線虫を直接殺す能力のある「線虫寄生菌」を、カミキリ成虫に対しては、カミキリを直接殺す能力のある「昆虫病原菌」を用いることで、カミキリによるマツ健全木への線虫の伝播を阻止する。1.施用菌の繁殖の確認兵糧攻め菌は接種したアカマツ枯損木丸太での繁殖が確認できたが、線虫寄生菌の繁殖は確認できなかった。2.兵糧攻め菌・線虫寄生菌・昆虫病原菌接種の効果の判定兵糧攻め菌には、丸太からの脱出時にカミキリ成虫が保持していた線虫数を対照区と比べて減少させる効果が見られたが、線虫寄生菌にはその効果が認められなかった。脱出直後に昆虫病原菌を接種されたカミキリは、接種後平均8.6日で死亡したのに対し、対照区のカミキリは全個体が調査期間(32日)内には死亡しなかった。その結果、昆虫病原菌は、生存(摂食)期間を短縮することで、カミキリが脱出時に保持していた線虫数に占める摂食時にマツ健全枝に伝播した線虫数の割合を低下させた。以上のことにより、兵糧攻め菌と昆虫病原菌を併用することで、健全枝への線虫の伝播数を各菌単独接種の場合より減少させることができ、両菌に線虫伝播数減少における相乗効果が見られた。線虫に対しては、その餌となる青変菌の繁殖を抑制する「兵糧攻め菌」および線虫を直接殺す能力のある「線虫寄生菌」を、カミキリに対しては、カミキリを直接殺す能力のある「昆虫病原菌」を用いることで、カミキリによるマツ健全木への線虫の伝播を阻止することを目指した。脱出後の日齢が異なるカミキリ成虫の昆虫病原菌感受性を調べたところ、1)脱出直後に感受性が最も高いこと、2)脱出後2週間までは時間の経過とともに感受性が低くなること、及び3)脱出後4週間では再び脱出直後に近いくらいまで感受性が高くなることが分かった。

このことより、マツ健全木の線虫伝播を阻止するためには、脱出直後のカミキリに昆虫病原菌を感染させるのが最もよいことが確認できた。兵糧攻め菌には、枯死木からの脱出時にカミキリ成虫が保持している線虫数を対照区と比べて減少させる効果が見られた。一方、線虫寄生菌にはその効果が見られなかった。脱出直後のカミキリに感染させた昆虫病原菌は、生存(摂食)期間を短締することで、カミキリが脱出時に保持していた線虫数に占める摂食時にマツ健全木の枝に伝播した線虫数の割合を減少させた。以上のことより、兵糧攻め菌と昆虫病原菌はそれぞれ単独でもカミキリによって健全木に伝播される線虫の数を減少させる効果があるが、両菌を併用するとより有効であることが明らかになった。カミキリを対象に2008年4月から製造販売されている昆虫病原菌の不織布製剤と組み合わせることが可能な兵糧攻め菌製剤の開発につながる成果である。
高速実験炉を用いた核融合炉材料の中性子模擬照射研究

本研究は、中性子を用いる核融合炉材料の模擬照射研究の中心となる研究であり、高速実験炉を用いて、核融合炉の開発のためには不可欠である材料重照射挙動の基礎研究をおこなうものである。本研究では広範囲に跨がる重々の照射研究の実効を高めるための支えとなる活動を中心として行ない、具体的には以下の項目を実施した。(1)「常陽」及び「FFTF/MOTA」での照射計画の検討及び全体計画の検討・調整作業を行いFFTF/CYCLE11の具体的な計画作成・試料製作、FFTF/CYCLE10の照射後試験計画作成を完了した。(FFTF/MOTAを利用する研究では便宜的に主として材料別にグループを編成しており、各グループ毎に研究計画の調製がおこなわれ、全体計画が作成された。本研究での分担者はそれぞれのグループ幹事としての役割を担っており、既に本研究を推進する為に6グループ、88名の研究の研究組織が編成され、約3年間の準備活動を行なっていた。(2)「常陽」及び「FFTF/MOTA」での照射試料の東北大学金属材料研究所付属材料試験炉利用施設(大洗)への搬入を実施し、照射後試験・研究を行なった。(3)従来行なわれて来た照射実験よりも1桁以上高い照射量での照射後実験に伴う問題点の抽出・検討・強度特性及び微細構造に対する高速中性子の効果の基礎的理解の体系化を進め、全自動強度特性試験装置の基礎設計を完成させた。(4)本研究は単年度の課題であったが、過去の研究の積み重ねの上で多大な成果が得られた。本研究を通じて得られた成果は報告書として刊行され、成果報告書ではFFTF/MOTA照射研究に関する成果概要および高速中性子照射研究結果の報告を行ない、別冊ではITER設計活動の一部として参加した材料データベース専門家会議の報告を行なっている。
ケイ素を蓄積する新規土壌細菌の分子メカニズムの解析とケイ素循環における役割の解明

我々はこれまでに土壌細菌Bacillus cereusとその近縁種が胞子形成時にケイ酸を取り込み、生体内で重合反応を起こしてシリカを形成・蓄積する事を発見した。シリカが蓄積される胞子殻は多数のタンパク質で構成されることから、シリカの蓄積(ケイ酸の重合によるシリカ形成)にはタンパク質が関与していると考えられた。本研究では、シリカ形成・蓄積メカニズムの解析を行い、胞子殻タンパク質のひとつであるCotB1が、シリカ形成に関与していることを明らかにした。シリカが蓄積される胞子膜は多数のタンパク質で構成される膜であることから、シリカの蓄積(ケイ酸の重合によるシリカ形成)にはタンパク質が関与していると考えられた。これまでの研究において、胞子コートタンパク質であるCotB1B2をコードする遺伝子を破壊するとシリカの重合が起こらなくなることが分かっていた(cotB1B2遺伝子はゲノム上に並んで存在していたため同時に破壊した)。本年度は、CotB1B2によるシリカ蓄積メカニズムの解析を行った。遺伝子相補実験を行い、cotB1またはcotB2を単独でcotB1B2破壊株に相補したところ、cotB1を相補した場合はシリカ蓄積能が回復したのに対し、cotB2を相補してもシリカ蓄積能は回復しなかった。CotB1とCotB2のアミノ酸配列は互いに相同性が高いが、CotB1のみC末端領域が長くなっていることから、この領域がシリカ蓄積に関与していると予想された。この領域を削除したC末端欠損CotB1遺伝子を相補した場合にはシリカ蓄積能は回復しなかったことから、この領域がシリカ蓄積に関与していることが支持された。また、この領域に相当する合成ペプチドをケイ酸溶液に添加したところ、ケイ酸が重合してシリカを形成する様子が観察されたことから、本C末端領域が生体内でもシリカ形成に直接関与していることが強く示唆された。平成25年度の研究においてシリカ形成・蓄積メカニズムの解析を行い、胞子タンパク質のひとつであるCotB1がシリカ蓄積に必須であり、特にそのC末端領域が重要であることが明らかとなった。当初の計画では、シリカ蓄積に関わる遺伝子をプローブとして、環境中のシリカ蓄積菌の存在量ならびに群集構造を解析する予定であったが、本タンパク質のホモログは非シリカ蓄積細菌を含む多くのBacillus属細菌に共通して存在しているため、シリカ蓄積細菌特異的なプローブとして利用できないことが分かった。そのため、別のシリカ蓄積細菌特異的タンパク質の同定を進める必要があった。ケイ酸の取り込みは胞子形成期に起こることから、母細胞中へのケイ酸取り込みに関与するトランスポーターの存在が強く示唆されており、本年度はその探索を行った。真核生物由来の既知のケイ酸トランスポーターのアミノ酸配列を基に、候補となるトランスポーター様遺伝子を絞り込み、複数の候補遺伝子の破壊株を作製した。その結果、ケイ酸取り込み量が顕著に低下する株が得られた。前年度までの研究においてシリカ形成・蓄積メカニズムの解析を行い、胞子殻タンパク質のひとつであるCotB1をコードする遺伝子を破壊するとシリカ蓄積量が顕著に低下することを明らかにした。このことからCotB1がシリカ形成に関与していることが強く示唆された。しかし、別の可能性として、胞子殻タンパク質であるCotB1の遺伝子を破壊したことで、胞子殻が正しく形成されなくなり、そのことがシリカ蓄積量の低下につながっていることも考えられた。そこで、本年度はcotB1遺伝子破壊株の胞子切片の電子顕微鏡観察を行い、本遺伝子破壊株においても野生株と同様に胞子殻が形成されていることを明らかにした。また、cotB1遺伝子の発現解析を行ったところ、その発現時期はケイ酸取り込みのタイミングとよく一致した。さらに、発現したCotB1タンパク質の局在を確認したところ、アミノ配列から予想されたとおり、シリカが蓄積される胞子殻への局在が認められた。これらの結果から、CotB1がシリカ形成に関与していることが強く支持された。

B. cereusの胞子タンパク質のひとつであるCotB1のC末端領域がシリカ蓄積に関与していることを明らかにしたが、本タンパク質のホモログは非シリカ蓄積細菌を含む多くのBacillus属細菌に共通して存在しているため、シリカ蓄積細菌特異的なプローブとして利用できないことが分かった。その他のシリカ蓄積細菌特異的なタンパク質の同定を進める必要があるため、当初の計画よりも若干の遅れが生じている。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物工学本年度の研究において得られたケイ酸トランスポーター候補遺伝子の破壊株について詳細な解析を行い、ケイ酸トランスポーターの同定を行う。得られた遺伝子をプローブとして、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行い、土壌サンプル中におけるシリカ蓄積細菌の存在量および群衆構造を解析する。CotB1以外のシリカ蓄積細菌特異的タンパク質の同定を進める必要があるため、当初の計画よりも若干の遅れが生じている。シリカ蓄積細菌に特異的なタンパク質の候補であるケイ酸トランスポーターの同定を行い、得られたケイ酸トランスポーター遺伝子をプローブとして、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行い、土壌サンプル中におけるシリカ蓄積細菌の存在量および群衆構造を解析する。
論理関数高速処理機構に関する基礎的研究

本研究では、共有二分決定グラフを中心に、論理関数処理の高速化に関して理論と応用の両面から基礎的研究をおこなった。1.論理関数処理のアルゴリズム・計算複雑さに関する研究二分決定グラフによる基本的な論理関数処理である、論理演算、既約化の並列アルゴリズムを示し、その計算複雑さを明らかにした。また、二分決定グラフによる論理関数の表現能力について、多項式サイズの二分決定グラフで表現できる論理関数のグラフと他のクラスの関係を明らかにした。さらに、しきい値関数を表現する二分決定グラフのサイズについて研究をおこなった。2.論理関数処理機構に関する研究二次記憶を用い、従来手法とは異なる幅優先の処理手法を適用することにより、主記憶上に記憶できない非常に大規模な共有二分決定グラフを高速に処理する手法を開発し、実験により評価をおこなった。また、メモリの高集積化技術の発展にともない非常に高い並列性を実現できる可能性を持つ、内容アドレスメモリ(CAM)上で共有二分決定グラフ処理をおこなうための手法を提案した。3.論理関数処理に基づく設計支援に関する研究論理関数処理の論理設計支援への応用として、スキャン付き順序回路に対する短いテスト系列の生成手法、および、非同期式順序回路の種々の状態割り当てについて、その解を得る手法を提案した。また、論理設計支援以外の分野への応用として、ブール処理を用いて種々の組合せ問題を解くアルゴリズムを提案した。本研究では、二分決定グラフによる論理関数の効率的処理手法について基礎的な研究を進めたほか、論理関数処理の論理設計支援への応用手法についても研究をおこなった。1.論理関数処理のアルゴリズム・計算複雑さに関する研究共有二分決定グラフによる論理関数処理の並列アルゴリズムを提案し、十分なプロセッサ数があれば高い並列性が得られることを示した。これにより、それらの処理の計算複雑さを理論的に明らかにした。また、二分決定グラフによる論理関数の表現能力について、論理回路等の他のモデルとの比較をおこない、二分決定グラフにより効率的に表現できる論理関数のクラスを明らかにした。2.論理関数処理機構に関する研究二分決定グラフを用いた論理関数処理について、二次記憶を用いて大規模な二分決定グラフを処理する手法を開発した。これについて実験により評価をおこない、その有効性を示した。また、内容アドレスメモリ(CAM)上で二分決定グラフを処理するための基本的手法を提案した。3.論理関数処理に基づく設計支援に関する研究パイプライン制御方式のマイクロプロセッサの形式的検証手法として、順序回路としてモデル化をおこなうことにより検証をおこなう手法を提案した。これにより、従来から研究を進めていた論理関数処理を用いた検証手法を応用した、パイプライン制御方式のマイクロプロセッサの検証が可能となり、その基礎的実験をおこなった。本研究では、共有二分決定グラフによる論理関数処理の高速化に関して理論と応用の両面から基礎的研究をおこなった。1.論理関数処理のアルゴリズム・計算複雑さに関する研究しきい値関数を表現する二分決定グラフのサイズについて研究をおこなった。その結果、変数の重みが指数的な大きさを持つしきい値関数族の中には、どのような変数順序においても指数サイズとなるものが存在することを明らかにし、さらに、変数順序とサイズの関係についても考察をおこなった。2.論理関数処理機構に関する研究メモリの高集積化技術の発展にともない非常に高い並列性を実現できると考えられる、内容アドレスメモリ(CAM)上で、その並列性を用いて、共有二分決定グラフの既約化の処理をおこなう手法を提案した。本手法では、部分一致検索によるデータアクセスに加え、並列書き込み機能を利用し高速化を図っている。3.論理関数処理に基づく設計支援に関する研究論理関数処理の論理設計支援への応用として、非同期式順序回路の種々の状態割り当てについて、その解を得る手法を提案した。各状態への状態変数の割り当てが満たすべき条件を論理式の形で与えることにより、小規模な例については最小状態変数の解を得ることに成功した。また、論理設計支援以外の分野への応用として、ブール処理を用いて種々の組合せ問題を解く手法を提案した。この手法は、解の条件を論理式で表すだけで容易に種々の問題に適用が可能である。
低侵襲手術における腹腔内の実時間三次元計測に関する研究

腹腔鏡下手術は視野が限定され特殊な手術器具を扱うことなどから習得が困難とされている.解決策の一つとして申請者は,低侵襲手術中の患者の体表に映像を投影表示することで,術者に視覚的支援情報を提供するシステムを提案した.しかしこれまでは実時間で位置や形状が変化する腹腔内臓器の三次元情報を取得・提示することができなかった.そこで,本研究では専用画像デバイスの開発,異種モダリティの融合アルゴリズムの提案,全体システムの構築と有効性評価を行った.腹腔鏡下手術は視野が限定され特殊な手術器具を扱うことなどから習得が困難とされている.解決策の一つとして申請者は,低侵襲手術中の患者の体表に映像を投影表示することで,術者に視覚的支援情報を提供するシステムを提案した.しかしこれまでは実時間で位置や形状が変化する腹腔内臓器の三次元情報を取得・提示することができなかった.そこで,本研究では専用画像デバイスの開発,異種モダリティの融合アルゴリズムの提案,全体システムの構築と有効性評価を行った.我々は体表に腹腔内の立体映像を投影することで一般的な開腹手術状態を仮想的に再現する透過型腹腔鏡下手術システムを構築することを目的に研究を進めている.本研究テーマでは特に低侵襲条件下で腹腔内の三次元情報を実時間で取得する手法を提案し,実現に向けた臨床実験を実施することを計画した.平成22年度の成果として腹腔内形状の計測手法の検討を行った.複数のカメラによる受動的計測手法,そして光投影とカメラを併用した能動的計測手法を対象に計測精度の比較検討を行った結果,受動的手法は対応点の個数,精度に欠け,再現された三次元形状の精度は低くなった.そこで能動的手法に焦点を当てて計測精度を向上させるために既存アルゴリズムの改善を行った.誤差発生の主要な要因であるフェーズアンラップ処理を必要としない手法を提案し,加えてハードウェア並列演算による実時間処理を実現した.その結果,人体体表のような動きのある物体においても高精度に三次元形状を計測することができた.さらに,映像投影と形状計測を同じプロジェクタを使って行うための基礎技術を提案した.形状計測のための構造光を映像に埋め込むことで,体勢の変更や呼吸性の体表形状の変動に対応したリアルタイム形状補正画像投影技術を確立した.映像に埋め込む構造光の知覚量と形状計測の精度がトレードオフの関係となるため,主観評価実験を行い最適なパラメータを決定することができた.将来的にはプロジェクタの投影速度(リフレッシュレート)が向上することで,提案した構造光の埋め込み技術がさらに有効に機能すると考えられる.23年度は臨床的実現可能性のある画像デバイスを開発した.腹腔内にアクセスする方法は腹腔鏡と鉗子2本のために開けられた穴しかないと考え,これらの穴から工夫して複数のカメラや光投影装置を導入する方法を検討した.候補案として以下の4種類の手法を検討した.(1)開脚式マルチカメラ腹腔鏡(細い状態から腹腔内で傘のように展開するマルチカメラ装置),(2)カメラ付きトラカール(トラカールとは腹壁に固定して腹腔鏡・鉗子を把持する道具であり必ず利用される.このトラカールにカメラを装着する),(3)小型無線カメラ(回収可能な小型カメラを挿入し,腹壁に貼り付けて使用する),(4)小型プロジェクタ(構造光投影に特化することで超小型化を図る).試作は全て手作りで行いドライボックス実験を経て豚を使った臨床試験を行った.次に,事前に撮影された三次元形態情報であるCT・MRIと融合することで計測精度の向上を図った.CTやMRI画像に対して多臓器同時抽出手法を適用し,骨,膵臓,肺,腎臓など比較的移動や変形の少ないオブジェクトについて,三次元形状の先見情報として利用し,画像計測の結果に効果的に融合する手法を検討した.また,超音波を体側部または背面部からあてることで,腹腔内の三次元情報を実時間で取得・融合する方法も検討した.23年度の研究成果により,腹腔内の三次元再構成を実現するためには(2)カメラ付きトラカールが最も効果的であることが判明した.腹腔鏡下手術は器具と腹腔鏡を体内に挿入してモニタに映し出された映像を見ながら外科的措置を行う方法であり,低侵襲・早期回復手術として大変期待されている.しかし視野が腹腔鏡によって撮影した平面モニタ映像に限定され,鉗子など特殊な手術器具を扱うことなどから習得が困難であり、技量の未熟な医師が行えば重大な医療事故を招く可能性が高い.その解決策の一つとして申請者は低侵襲手術に対しては体表に体内の情報を提示することで,術者に視覚的支援情報を与える研究が進めてきた.このシステムでは実時間で位置や形状が変化する腹腔内臓器の三次元情報を取得・提示することができないため,腹腔鏡下手術の支援としては不十分という課題が残っていた.そこで,本研究では専用画像デバイスの開発,異種モダリティの融合アルゴリズムの提案,全体システムの構築と有効性評価を行うことを目標に進めてきた.

平成24年度は最終目標である透過型腹腔鏡下手術システムの構築に向け,既に我々の研究チームで確立している体表面立体映像提示技術と,本研究の成果である腹腔内の実時間三次元情報計測システムを集約する.専用画像デバイスは試作と改良を繰り返し,動物実験により精度,耐久性の向上が得られた.格納動作に加え,カメラの曇り除去や,穿孔手段など様々な機構に関する新しいアイデアを創出した.また,この専用画像デバイスを複数用いることで3眼以上のマルチカメラを用いた実時間形状復元を実現するため,独自に効率化した計算アルゴリズムと,GPUを使った並列演算を提案した.3眼で誤差約5mm程度,0.5秒/回,4眼で誤差約5mm程度,1秒/回の計算速度を実現した.目標としていた検討項目の実施をクリアし,動物を使った臨床実験も行うことができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度は透過型腹腔鏡下手術システムの構築に向け,既に我々の研究チームで確立している体表面立体映像提示技術と,本研究の成果である腹腔内の実時間三次元情報計測システムを集約する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
レーザー焼結および切削加工されたメタルフレームへのハイブリッドレジンの接着強化

本研究は補綴装置を長期間口腔内で機能させるために、ミリング法やレーザー焼結法で製作されるチタンとCr-Cr合金に対する前装用コンポジットレジンの接着耐久性を高めることを目的とした。レーザー焼結Cr-Cr合金試料ではリン酸エステル系モノマー(MDP)が接着性向上に有効であった。また、維持装置を付与することにより鋳造試料よりも接着耐久性を高めることができた。一方、切削加工による純チタン製試料ではアルミナブラスティング後,酸エッチングを行うことで、接着耐久性を向上させることができた。このような表面処理は製作された補綴装置においてレジンの破折や剥離などの合併症を減らすことに貢献できることが示唆された。作製した補綴物を長期間口腔内で機能させるために、ミリング法やレーザー焼結法で製作されるチタンとCr-Cr合金製のフレームワークへのハイブリッド型コンポジットレジンとの接着耐久性を高めることを目的とする。本年度はレーザー焼結用Cr-Cr合金パウダーをレーザー焼結装置によりφ10 x 2.5 mmの円板状に積層造形したものとその表面にビーズ様の維持装置を付与し、維持装置の間隔が異なる試料を作製した。接着性モノマーとしてリン酸エステル系モノマー(MDP)、チオリン酸系モノマー(MEPS)、ホスホン酸系モノマー(6-MHPA)を含むプライマーで試料の表面処理を行い、歯冠用ハイブリッド型コンポジットレジンとの接着耐久性ついて検討した。その結果、レーザー焼結試料のビーズ様の維持装置を付与することで維持力を高めることができた。ビーズ様の維持装置を付与しない試料ではMDPとMEPSが接着性改善に有効であった。ビーズ様の維持装置の付与は機械的な維持、MDPとMEPSは化学的結合を向上させ、両者を併用することによって、レーザー焼結によるフレームワークとハイブリッド型コンポジットレジンで作製された補綴物においてレジンの破折や剥離などの補綴的な合併症をさらに減らすことに貢献できることが示唆された。また、ミリング法を想定したチタンのφ10 x 2.5 mmのディスク状試料を作製し、アルミナブラスティングまたはMDPをコーティングした改質材を用いてチタンの表面処理を行い、ハイブリッド型コンポジットレジンの初期の接着強さを検討した。その結果、アルミナブラスティングを行ったものよりもMDPモノマーをコーティングした改質材を用いてチタンの表面処理を行ったものの方が初期接着強さは高かった。しかしながら、他のモノマーの使用や接着耐久性も検討する必要がある。切削加工法やレーザー焼結法で製作したチタンとCo-Cr合金製のフレームワークにハイブリッド型コンポジットレジンで前装した補綴装置を長期間口腔内で機能させるために、メタルフレームと前装材の接着耐久性を高めることを目的とした。1レーザー焼結装置により積層造形したCo-Cr合金製の円板状試料とその表面にビーズ様の維持装置を付与した試料、比較検討のために鋳造による同じ形状のCo-Cr合金製試料とリテンションビーズを付与した試料を製作し、表面処理法と維持装置による金属試料への歯冠用ハイブリッド型コンポジットレジンの接着耐久性ついて検討した。その結果、レーザー焼結試料は鋳造試料と同様に接着性モノマーとしてリン酸エステル系モノマー(MDP)が接着性向上に有効であった。また、レーザー焼結試料のビーズ様の突起物を適度な間隔で付与することでリテンションビーズを付与した鋳造試料よりも接着耐久性を高めることができた。2切削加工により純チタン製円板状試料を作製し、表面改質材を用いてチタンの表面処理を行い、ハイブリッド型コンポジットレジンの接着強さを検討した。その結果、アルミナブラスティングを行ったものよりもMDPモノマーをコーティングした改質材を用いてチタンの表面処理を行ったものの方が初期接着強さは高くなった。また、チタン表面にアルミナブラスティング後,45wt% H2SO4 + 15wt% HClエッチングを行うことにより、ミクロとナノメカニカルリテンションを示唆する多くのサブミクロンキャビティが観察され、接着耐久性を向上させることができた。このように表面処理やメカニカルリテンションを付与することにより、フレームワークへハイブリッド型コンポジットレジンして作製された補綴装置においてレジンの破折や剥離などの補綴的な合併症を減らすことに貢献できることが示唆された。CAD/CAMによる補綴物のフレーム作製にはミリング法の他に、レーザー焼結の技術がある。しかし、ミリング法ではブロック材料からフレームワークを削りだすためリテンションビーズのような維持装置を付与することができない。したがってハイブリッド型コンポジットレジンを築盛する場合、フレームワークとの接着は主として化学的結合力に依存するが、それだけでは十分とはいえない。

また、レーザー焼結法は付加造形方式のためフレームワーク表面にビーズ様の突起物を付与することは可能であるが臨床応用されたばかりで不明な点が多く、接着方法を確立する必要がある。そこで作製した補綴物を長期間口腔内で機能させるために、ミリング法やレーザー焼結法で製作されるチタンとCr-Cr合金製のフレームワークへのハイブリッド型コンポジットレジンとの接着耐久性を高めることを目的とする。本年度はレーザー焼結用Cr-Cr合金パウダーをレーザー焼結装置によりφ10 x 2.5 mmの円板状に積層造形したものとその表面にビーズ様の突起物を付与したもの、比較検討のために鋳造用Cr-Cr合金を鋳造して同じ形状のものとリテンションビーズを付与したものを製作し、歯冠用ハイブリッド型コンポジットレジンの接着耐久性ついて検討した。その結果、レーザー焼結試料は鋳造試料と同様に接着性モノマーとしてMDPが接着性改善に有効であった。また、レーザー焼結試料のビーズ様の突起物を適度な間隔で付与することでリテンションビーズを付与した鋳造試料よりも接着耐久性を高めることができた。ビーズ様の突起物の付与とMDPモノマーを併用することによって、レーザー焼結によるフレームワークとハイブリッド型コンポジットレジンで作製された補綴物においてレジンの破折や剥離などの補綴的な合併症を減らすことに貢献できることが示唆された。おおむね研究計画に従って実験を行い、レーザー焼結によって製作されたCo-Cr合金試料に関しては、ビーズ様維持装置を付与と接着性モノマーを併用する方法で得られたデータから接着耐久性を高めることができ、十分に臨床で使用できることが示唆された。おおむね研究計画に従って実験を行い、得られたデータから接着耐久性を高める方法が示唆されている。ミリング法を想定したチタンのディスク状試料を作製し、MDPモノマーのほかにもMEPSモノマーをコーティングした改質材を用いてチタンの表面処理を行い、ハイブリッド型コンポジットレジンを築盛する。接着した試験片を37°Cの水中に24時間浸漬し、万能試験機オートグラフAGS-10kNG(島津製作所)で引張り荷重を加え、破断時の荷重を測定し,接着強さを求める。また、接着した試験片を熱サイクル試験機を使用して、4°Cと60°Cの水中に1分間ずつ浸漬する水中熱サイクル試験に供した後、同様に接着強さを求める。接着試験後、試料の破断面を観察し、破壊様式を評価する。そして、破壊の原因が前裝材の強度に起因するものなのか、オペーク材の強度に起因するものなのか、前裝材と金属の接着に起因するのか、破断の原因を検討する。得られたデータから臨床において十分な耐久性があるか検討を行い、新しい知見が得られた部分に関しては、コントロールとなるデータと比較し、学会発表や論文の作成を促進し、情報を発信する。ミリング法を想定したチタンのディスク状試料を作製する。接着性モノマー含有のプライマーと接着性モノマーコーティングした改質材を用いてチタンの表面処理を行い、ハイブリッド型コンポジットレジンの接着力強化を試みる。また、接着試験後、試料の破断面を観察し、破壊様式を評価する。
量子モンテカルロ法による高精度電子状態計算の実現とフント第一、第二則の統一的解釈

フント則は、電子間斥力エネルギーの低下により解釈されてきたが、この従来解釈はビリアル定理に違反し誤りである。基本的ハミルトニアンから直接導出されるビリアル定理は、パウリの排他原理と共に将来的材料設計に向けて、第一原理手法を有意に発展させるための最も重要な指導原理である。本研究は、これまでに2p、3p原子についてフント第一、第二則は核遮蔽の低下に起因した原子核電子間引力エネルギーの低下により統一的に解釈されることを示した。この研究を3d遷移金属原子に拡張し、より安定なLS項において原子核電子間引力エネルギーは低下し、これは電子間斥力エネルギーの増加を伴うことをビリアル定理を満たす高精度計算から確かめた。HF法によるエネルギー差の過大評価は相関を考慮することで改善し、実験とのより良い一致が得られた。また、相関の影響をビリアル定理に基づき解析し、相関は電子間斥力エネルギーの低下のみならず、核遮蔽を弱め電子密度分布をHFと比べ更に収縮させることにより原子核電子間引力エネルギーを低下させることを確かめた。3d原子について配置間混合により主として静的相関を考慮する多配置HF法では相関の回復率は50%程度であったが、電子間距離に陽に依存した多電子波動関数を用いて動的相関を考慮するVMC、DMC法では、それぞれ70%、93%の回復率が得られ、3d原子の相関の定量評価において後者の手法が優位であることが分かった。計算においては本研究でプログラムを改良し評価した電子密度についてカスプ条件、核遠方での漸近関係を検証し、これを高精度に満たすことを確認した。上記の研究成果は、磁性を初めとする物性科学の基礎理論に対する重大な問題提起となっており、ベトナム・ハノイで開催された国際会議(ACCMS5)において発表した他、国際的専門誌へ向けて論文を投稿中である。フント第一則については電子間斥力の低下による解釈が一般的である(従来解釈)。しかしビリアル定理を満たす高精度計算からフント則の成立要因は電子間斥力エネルギーの増加を伴う、原子核電子間引力エネルギーの低下によることが報告されている(新解釈)。従来解釈はビリアル定理に違反し、その誤りが指摘されてきた。この問題においてHe,Be原子等の励起配置では定理に基づき相関を高精度評価した研究が行われているが、これらに第二則は適用されない。第一、第二則の適用される中性原子基底配置に関してはHF近似の範囲でしか研究されていなかった。本研究はDMC法により2p,3p原子の基底状態に対し第一則解釈の検証を行い、DMC法により相関を高精度評価した場合にも新解釈が有効であることを確認した。しかし現在、DMC法の結果は2状態間のエネルギー差を実験と比べ過大評価している。DMC法による高精度電子状態計算を実現するには系の電子構造への交換・相関の影響について正確な知識を蓄積した上で現状の問題点を明瞭にすることが重要である。本研究はエネルギー差の過大評価は一重項の試行節が適切でないためと考え、これを明らかにするため一重項について、従来試行節の構成に用いていたGAUSSIAN98によるHFR計算と、HF解である数値解法によるHF計算の両者で電子密度分布を求め比較を行った。その結果、GAUSSIAN98によるHFR計算ではHF解と比較して深刻な誤差が確認され全軌道角運動量の異なる2つの一重項の混じった状態であることを確かめた。続いて本研究は、MCHF法により相関を高精度評価し第一、第二則の検証を行い、第一、第二則ともに新解釈により統一的に説明されることを実証した。MCHF法により相関を高精度評価した結果、HF法によるエネルギー差の過大評価は大幅に改善され、実験との良い一致が得られた。

上記の研究成果は、磁性を初めとする物性科学の基礎理論に対する重大な問題提起となっており、ベトナム・ハノイで開催された国際会議(ACCMS5)において発表した他、国際的専門誌へ向けて論文を投稿中である。
学校トイレの教育社会史－“衛生意識”形成のヒドゥンカリキュラム－

平成30年度は、本研究課題の最終年度として、今年度の調査研究と研究期間全体を通じての成果をまとめる考察との2点の研究に取り組んだ。この1年間に行った調査研究としては、平成29年度に行ったガーナ調査等の成果をふまえて、学校外の社会インフラもふまえてアフリカの学校トイレ事情を調査するべく、エチオピアにおいてフィールドワークを行った。具体的には、首都のアディスアベバと隣接する州の合計6校の特徴の異なる学校を訪問して、学校の概要、主な教育内容、トイレと手洗い場の状況と衛生に関わる指導について調査した。その結果、学校のトイレと手洗い場が使えるかどうかは、地域のインフラ状況に大きく左右されていることがわかった。研究期間全体を通じて、4年間の研究成果をまとめたところ、日本の状況については、予想よりも早く、明治の中頃にはトイレの整備が制度上も求められており、実態が後追い的に整備されていったことがわかった。その一方で、制度上は求められていない手洗い場について、ある時期からトイレや昇降口以外にも設置されるようになっており、その整備過程をたどることが、教師の衛生的なまなざしを探るうえで必要であるという次の課題を見出すに至った。アフリカの状況については、個人で調査したザンビアも含めてガーナとエチオピアの3ヶ国のフィールドワークから、科学の教科には衛生に関する教育内容が含まれているにもかかわらず、トイレや手洗い場の未整備、地域の水道の未整備などから、教育内容を実践できない状況があること、その背景には社会インフラの状況が影響していることがわかった。その結果、衛生意識と衛生的なふるまいが身についていかないのではないかとの考察結果を導き出し、全体としては、「学校教育の社会疫学的研究」のモデル図を作成して、今後のさらなる研究のきっかけを提供するに至った。以上の成果をまとめた簡易報告書を作成した。平成27年度には、1学校トイレの先行研究の状況、2学校トイレなどに関わる制度・法規程の状況、そして3学校トイレに関する明治期から昭和中期にかけての学校文書の状況を確認することを目的としていた。第一に、先行研究を調べることによって、学校トイレに関する研究は、これまでほとんどなされていないことがわかったが、その一方で、研究テーマを既存の学術領域に位置づけるならば、公衆衛生や社会疫学の領域に位置づき、また学校においては保健教育や、養護教諭が担当する教育領域など、学校環境衛生の問題などに位置づくことがわかってきた。第二に、制度や法規程については、上記の範囲で明治期から昭和中期にかけて調査を進めているが、かなり広範囲に及ぶため、そのすべてを見る必要があるのか、学校に関わるところに絞り込んでよいのかを、今後検討していく必要がある。第三に、学校トイレの学校建築上の発展のようすや、それと並行して、学校の中で子どもたちの衛生状況などへの教師のまなざしの誕生と変化・発展のようすを捉えるべく、適切な学校文書等の歴史資料を調査した。当初、学校建築の発展のしかたの異なる地域として、東京、長野、京都の3箇所を調べる予定であったが、東京と京都には適切な資料が残っていないことと、長野には十分な資料が残っていることがわかった。とくに、明治期の学校建築の図面が、複数の郡の学校文書に残されており、明治中期に、学校建築の法整備が進む前後での学校建築のようすと学校トイレの位置を確認することができた。また、子どもたちの衛生状況などへの教師のまなざしに関しては、いくつかの小学校に、明治期以降の学校日誌類が保存されていることがわかり、その中から、研究代表者がこれまでにも研究上の関わりをもっていた地域の学校を選んで、次年度以降にていねいな資料蒐集と考察を行っていく予定である。「研究実績の概要」に書いたとおり、当初予定していた研究課題のいずれにも取り組むことができたこと、なかでも、今後の研究の中心となる学校文書について、残念ながら資料保存状態の問題から、複数の都道府県での調査はかなわないことがわかったものの、長野県には、それを補ってあまりある資料が保存されていることがわかったことと、学校建築の図面については、写真撮影により蒐集することができたことから、今後の方向性を見定めることもでき、1年目に進めたかったところまでは十分に進めることができたと考えている。平成28年度には、前年度に調べた、学校保健及び学校施設・設備の法制度の歴史的展開をふまえて、1学校建築上、学校のトイレがあった場所の確認、2教師の児童に対する衛生・健康面でのまなざしや指導の歴史的変遷を捉える資料の蒐集と考察、3アフリカの公衆衛生状況と学校の環境衛生状況の文献による把握の3点を主な目的としていた。前年度の史料調査により、明治昭和初期の学校日誌等が十分に保存・整備されていることがわかっている長野県に調査地域を限定して、第一に、長野県立歴史館に保存されている明治期の学校建築の図面から、学校のトイレの場所があったところを確認した。トイレの記入のない図面も多いが、記入がある場合、ほとんどが校舎の外にあることが確認された。トイレが校舎内に設置されるようになるのは、昭和以降、鉄筋コンクリート製の校舎が普及していくこと、下水道の整備・普及、屎尿を肥料として使わなくなっていったことなどが背景にあると思われる。第二に、松本の開智学校、飯田の追手町小学校と座光寺小学校の3校の学校日誌、看護日誌を対象に、トイレの使い方に関わる記述等を調べた。非常に汚い使い方をしている記述が多々みられることがわかった。