hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体超構造によるディラック電子系の設計と作製

半導体平面超格子構造を用いて質量ゼロのDirac電子系を実現することを目的とした。第1段階としてミニバンド構造を持つ2次元Bloch電子系の実現を試みた。そのためにGaAs/AlGaAs基板上に6080nm周期で格子状に穴を穿ったZEPを絶縁膜としてゲート電極を形成したFET素子を作製し条件の最適化を試みた。しかしバンド再構成を示唆する結果は得られず、格子の不均一性の局限が今後の課題となった。本研究は、微細構造技術を用いて作製した半導体ナノスケール構造の中に質量ゼロのディラック電子系を実現することを目的とするものである。具体的にはGaAs/AlGaAs界面の2次元電子系に3角格子型変調ポテンシャルを導入してバンド再構成を起こし、ディラック・コーン分散を持つミニバンド構造を実現しようとした。S. Louieらが理論的に提案したアンチドット構造では微細ポテンシャル構造の導入が困難なため、Albrechtらが磁場中ブロッホ電子系のHofstadter準位の観測に用いた変調ゲート構造を採用した。この場合、基板表面の変調ゲート電極から2次元電子系までの距離が離れるほど変調振幅が減衰してしまうため、浅い位置に2次元電子系が存在する高移動度基板が必要になる。そこで浅チャネルGaAs/AlGaAsヘテロ接合(HEMT)基板を分子線エピタキシー法で成長し、最終的に従来の半分の深さ(50nm)深さで低温移動度2×105 cm2/Vs程度の基板を得た。この基板上に膜厚50nmの電子線レジスト(ZEP)を塗布して、60nm周期の正方格子パターンを電子線描画装置で形成し、金薄膜で覆い変調ゲート電極とした。この試料について希釈冷凍機温度で磁気抵抗測定を行ったところ、周期的変調によるバンド再構成を示す信号(Hofstadter準位の微細構造)は得られなかった。変調ゲート電極のSEM観察を行ったところパターンの乱れが大きいことがわかり、周期的変調によるバンド再構成がぼけてしまっていると推測された。実際に3角格子パターンでディラック電子系を実現するためには、乱れの局限が実験技術上の課題となることがわかった。本研究の目的である半導体超構造による2次元ディラック電子系の実現は、グラフェンと同等な系をよく制御された半導体上に実現するという意味で、基礎的かつ応用的にも重要な課題である。平成23年度はその実現のための準備研究を行った。(1)質量ゼロのディラック電子型バンド構造を有する半導体2次元超構造の検討Park-Louieの提案による2次元電子系に3角格子状に多数の穴(アンチドット)を周期的に穿ったアンチドット格子は、現実のGaAs/AlGaAsヘテロ界面ではアンチドット周辺の電子系が空乏化して実効的にアンチドット径が400nm程度も増大してしまい、さらにアンチドットの不揃いのため系に大きな乱雑さを導入してしまうため、ブロッホ電子系の形成は極めて困難であるという結論に達した。より現実的で有望な構造として、周期的変調ゲート電場により2次元電子系に周期ポテンシャルを導入する方法を検討した。この方法はAlbrechtらがHofstadter準位構造を観測した際に用いられ平面超格子でブロッホ電子系を形成した実績のある方法である。静電的に周期ポテンシャルを導入するため、各周期の不揃いによる乱雑さが小さくブロッホ状態を形成可能なコヒーレントな電子系を実現できる。周期ポテンシャルの振幅が小さい困難があるが、この構造を用いて研究を行うこととした。(2)質量ゼロのディラック電子型サブバンド構造を有する半導体2次元超構造の作製(1)に基づきナノスケール周期変調ゲート構造を持つ半導体2次元電子FET構造の試料を作製する。高移動度GaAs/AlGaAsヘテロ接合基板上に周期的変調構造を導入した電子線レジスト(PMMA)膜を形成してゲート絶縁膜とする。しかし電子線描画装置のトラブルのため、素子構造作製には至らなかった。ゲート絶縁膜の変調構造を作製するために使用する電子線描画装置の故障(電子線偏向用電源の故障)により、試料作製の不可能となったため、試料の試作と伝導特性の実験に関する部分に遅れが生じた。電子線描画装置の修理は年度末に完了したので、今後は研究を遂行できる。今後は試料作製と伝導実験による評価を繰り返して行い、ディラック電子系の実現に向けた条件最適化を行っていく。具体的には、作製した周期変調ゲート構造を持つ試料の電気特性を極低温下で測定し、超格子効果の有無、ディラック電子系形成の有無の判定を行う。測定には現有の希釈冷凍機+超伝導マグネットシステムを使用する。磁気抵抗の磁場依存性に現れる量子振動の解析から、超格子効果でバンドがサブバンドに裁断されているか否かを判定する。また抵抗のゲート電圧依存性(キャリア数依存性)がゼロギャップ系特有のピーク構造を持つか、磁場を加えるとディラック系特有のランダウ量子化つまりゼロモード準位(n=0)が現れるかどうかなどを調べ、ディラック電子系の形成を判定する。

ディラック電子系が実現できた場合には、半整数量子ホール効果の確認、デバイス形状を細線に絞り込んだ場合(ナノリボン)のエネルギーギャップ形成の確認、周期変調パターンを途中で変えることにより導入したポテンシャル段差におけるクライントンネルの実験、周期ポテンシャルに人為的に乱れを導入することによる反局在と弱局在の競合の実験、などの各種実験を試みる。物件費として、作製した素子の微細加工状況の確認に必要な場合、デジタルマイクロスコープの導入を検討する。その他、蒸着材料等の消耗品費に使用する。旅費として、2012年7月にフランスで開催される半導体強磁場国際会議(HMF2012)に参加費を予定している。
イネばか苗病菌が生産するジベレリンは単なる病徴発現因子か

イネばか苗病菌は、ジベレリン(GA)を生産し、イネに徒長症状を引き起こす。本研究では、ばか苗病菌の野生株とGA欠損株を用いて、GAが病徴発現だけでなく、菌のイネ組織内での増殖にも関与することを明らかにした。また、ばか苗病菌胞子を混合した土壌に非宿主植物の種子を播種すると、イネだけでなく他の植物にも菌が感染し、徒長を引き起こすことを見出した。同様な土壌接種条件では、GA欠損株も非宿主植物に感染することを確認した。以上の結果から、本菌は宿主範囲の広い内生菌であることが示唆された。本研究では、ばか苗病菌のGA欠損株(GA^-株)とイネのGA関連変異体を用いて、ばか苗病菌が生産するGAの病理学的機能の解明を目指す。ばか苗病菌野生株(GA^+株)とGA^-株に、GFP遺伝子をジェネティシン耐性遺伝子とともに導入し、ジェネティシン耐性のGFP発現株を作出した。イネ短銀坊主種子を両株の胞子懸濁液に浸漬接種し、寒天培地に植え付け育成したところ、GA^+株は徒長を引き起こしたが、GA^-株はイネの生育に全く影響しなかった。接種イネからの菌の再分離、共焦点レーザー顕微鏡を用いたイネ組織中の菌の観察によって、GA^+株は地際部周辺からのみ検出され、植物体に蔓延しないこと、GA^-株も地際部に侵入するが、その増殖能力が低下していることが明らかとなった。イネのGA生合成変異体(d18)、GA受容体変異体(gid1)、GA情報伝達因子変異体(gid2、slr1)の種子を両菌株の胞子懸濁液に浸漬接種し、育苗培土に播種、1カ月間育成した。経時的に草丈を計測するとともに、他の外部病徴(黄化、枯れ症状など)を観察した。その結果、予想通り、d18変異体では、GA^+株接種によって生育が回復、さらに徒長した。一方、他の変異体はGA非感受性であるため、GA^+株、GA^-株のどちらを接種した場合にも生育に変化は認められず、また他の外部病徴も出現しなかった。GA^+株胞子を混和した育苗培土に、イネ、トマト、メロン、ダイズ、オオムギを播種したところ、イネだけでなく、他の植物にも徒長が引き起こされ、イネばか苗病菌が他の植物にも侵入する能力を持つことが示唆された。また、トマト苗とメロン苗の根にGA^+株の胞子を浸根接種した場合には、徒長は引き起こされず、本菌はこれら植物の種子発芽時にのみ侵入できることが示唆された。本研究では、ばか苗病菌のGA欠損株(GA^-株)を用いて、ばか苗病菌が生産するGAの病理学的機能について検証した。GFP遺伝子を導入したばか苗病菌野生株(GA^+株)とGA^-株の胞子(10個または100個)を開花期のイネ頴花に注入接種し、籾の登熟、発芽などへの影響を調べた。その結果、GA+株接種区、GA-株接種区ともに籾は正常に登熟し、登熟率、籾重、発芽率は水注入区と同様であった。登熟した籾、玄米を蛍光顕微鏡で観察したところ、両菌株とも旺盛には蔓延していなかった。しかしながら、接種玄米を育苗土で育成したところ、GA^+株接種苗は顕著な徒長または成育異常を、GA^-株接種苗のほとんどが成育異常を示し、両菌株とも種子内に定着していたことが確認された。以上の結果は、ばか苗病菌が種子の形成、登熟時に籾内で旺盛に増殖しないこと、本菌の頴花感染(種子感染)にはGAが関与しないことを示した。GFP発現GA^+株胞子を混和した育苗培土に、イネ、オオムギ、トマト、メロン、ダイズ、エンドウを播種したところ、イネだけでなく、他の植物にも徒長が引き起こされ、徒長植物の地際部組織内から接種菌が再分離された。一方、これら植物の根をGA^+株の胞子懸濁液に浸漬した後、無菌培土で育成したところ、徒長症状は引き起こされなかった。この結果は、本菌が根には感染できないが、イネ以外の植物にも種子発芽時には感染できることを示した。さらに、GA^+株胞子をトマト、メロン、ダイズの胚軸に注入接種したところ、徒長が引き起こされ、注入部周辺に定着した菌が観察された。

また、GA^-株胞子を注入した苗でも、注入部周辺から定着した菌が検出された。以上の結果は、イネばか苗病菌が本来宿主範囲の広い、感染能力の低い内生菌であり、ジベレリン生産性を獲得することによって病原化したことを示唆した。
ポリリン酸による代謝経路の調節機構解明と発酵プロセス制御への応用

ポリリン酸は高エネルギーリン酸結合を持つ無機リン酸のポリマーである。バクテリアにおいてポリリン酸はATPを基質として合成されるため、細胞内の代謝と密接に関係していると考えられる。本研究課題では申請者がポリリン酸蓄積株(phoU変異株)において新規に見出したポリリン酸蓄積時に起こる代謝経路の変化について、生理学的な意味を明らかにするとともに、ポリリン酸蓄積機構との関係を解析した。その結果、phoUがPhoレギュロン支配下にあるポリリン酸蓄積経路の制御以外に、硝酸呼吸経路を支配している可能性が示唆された。また、ポリリン酸合成酵素(PPK)の相互作用因子を解析した結果、TCA回路、NADH生成などのエネルギー合成に関与する多数のタンパク質と相互作用していることが明らかになった。これらの結果は、ポリリン酸合成が代謝活性と直接関係していることを示唆しており、PPKによるポリリン酸の合成の制御機構を明らかにする上においても重要な知見になると考えられる。本年度は大腸菌におけるポリリン酸蓄積と代謝活性変化との関係を調べるために、ポリリン酸を高蓄積するPhoU破壊株について生化学的なデータの取得を行った。マイクロアレイ解析の結果から、PhoU破壊株において硝酸呼吸関連遺伝子の発現が上昇することが確認されていた。そこでPhoU破壊株の硝酸呼吸活性の測定を行った。その結果、PhoU破壊株は好気的な培養条件にも関わらず硝酸呼吸活性が大きく上昇していることが明らかになった。ポリリン酸合成酵素(PPK)およびPstの過剰発現によってポリリン酸を強制的に蓄積させる条件では硝酸呼吸は活性化されず、また、嫌気的な培養により硝酸呼吸活性を上昇させた野生株においてもポリリン酸蓄積の上昇は確認されなかった。これらの結果から、硝酸呼吸経路はPhoUによってポリリン酸蓄積とは独立に制御されていることが分かった。つまり、PhoUにはこれまで知られていたリン酸レギュロンの制御以外の機能を有している可能性が示唆された。次に、ポリリン酸による中央代謝経路制御の可能性を調べるために、まずPPKとピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの共通のサブユニットであるLpdAの相互作用を調べた。ヒスチジンタグを付加したPPKを野生株菌体内に発現させ、Ni-NTAレジンを用いたPull-down解析により細胞抽出液からPPK複合体を精製した。LpdAの結合状態をポリリン酸蓄積時および非蓄積時において比較したところ、LpdAとPPKの結合はポリリン酸蓄積時に増加しており、ポリリン酸の合成と関連している可能性が示唆された。大腸菌におけるポリリン酸蓄積と代謝活性変化の関係を調べるため、大腸菌PPK複合体の解析を行った。栄養十分条件とアミノ酸飢餓条件におけるPPK複合体をPull-down解析で調べた結果、アミノ酸飢餓時にグルタミン酸シンターゼ、NADHデヒドロゲナーゼ、リボフラビン合成酵素などのタンパク質のPPKに対する結合量が増加していることが明らかとなった。これらの破壊株におけるポリリン酸合成能には大きな差は見られなかったが、アミノ酸飢餓時複合体のポリリン酸合成活性は栄養十分条件複合体の2倍以上の活性を示すことが分かった。このことから、栄養条件によってPPKの結合因子が変化し、それによってポリリン酸合成活性が大きく変化する事が明らかとなった。次に、PPK-GFP融合タンパク質を発現させた大腸菌を用いて、栄養条件によってPPKの細胞内局在がどのように変化するかを調べた。PPKは栄養十分条件で増殖する期間は細胞内に散在していたが、アミノ酸飢餓時には数カ所に凝集することが明らかとなった。このことから、栄養条件によってPPK結合因子の変化とPPK局在、そしてポリリン酸合成活性の変化が連動して起こることが示唆された。栄養十分条件においてポリリン酸合成が亢進しない理由を明らかにするため、PPKに結合する因子のひとつとして同定されたリン酸レギュロンの制御因子PhoUのポリリン酸合成活性に及ぼす影響をin vitroで解析した。その結果、PhoU存在条件下では非存在下に比べてPPK活性が低下することが明らかになった。このことから、栄養十分条件におけるポリリン酸合成の抑制にPhoUが関与している可能性が示唆された。
無血清培養系での口腔癌患者由来活性化リンパ球からのiPS細胞の樹立とその治療応用

本研究は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件で誘導したヒトiPS細胞(hiPSC)を細胞傷害活性の高いリンパ球に再分化させ大量培養し、口腔癌の免疫細胞治療へ応用することを目的としている。本年度は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件での末梢血単核球(PBMC)由来hiPSCの誘導法の効率化を検討した。口腔癌患者から採取したPBMCを、IL-2を添加した無血清培地RD5F(当研究室で開発)にて初代培養を行い増殖した活性化リンパ球にインテグレーションフリーのセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入し、無血清培地hESF9(当研究室で開発)を用いてlaminin-E8上に播種しPBMC由来hiPSCを樹立した。更に効率よくhiPSCを誘導するために条件検討を行った。1分離したPBMCを0、3、6日の各日数で初代培養しSeVdpに感染させた。2SeVdp感染時のMOIを3、6、9の各種濃度とした。3SeVdp感染後の細胞を100000、200000、500000cells/wellの各密度で6wellプレート1wellに播種した。これらの条件検討から、PBMCを6日間初代培養し、SeVdpをMOI6で感染させ、100000 cells/wellの密度で播種した条件が最も効率良くhiPSCを誘導できることが示された。さらに誘導されたPBMC由来hiPSCの未分化性の評価をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて検討した。誘導されたhiPSCは未分化マーカー遺伝子および蛋白発現を示した。また三胚葉への分化多能性をin vitroでは胚様体培養法を用い、in vivoではSCID mouseでのテラトーマ形成能を用いて評価したところ、いずれにおいても三胚葉への分化能を有していた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
酸化ストレスによる歯周組織障害機構の解明

酸化ストレスにより形成された不飽和リゾリン脂質LPAはRANKL存在下で破骨細胞の形成を促進した。さらに、LPAは骨髄共存培養系においても破骨細胞形成を促進する事とこの形成増加には破骨細胞形成関連遺伝子の発現が関与しない事が明らかとなった。近年、破骨細胞への分化には活性酵素種の関与が不可欠であるという報告があり、酸化ストレスが骨代謝を調節している可能性が示唆された。また、最近では、ラット歯周炎モデルの大動脈において誘導される脂質過酸化反応がアテローム性動脈硬化症に関与するという報告がある。動脈壁から取り込まれたLDLは、酸化ストレスにより不飽和リゾリン脂質LPAを形成する。そこで本研究では、酸化ストレスにより形成されたリゾリン脂質LPAが破骨細胞前駆細胞株Raw264.7の細胞増殖、並びに破骨細胞形成に与える影響を検討した。まず最初にRaw264.7細胞からRNAを抽出し、RT-PCR法にてLPA受容体が存在するか否かを検討した。種々のLPA受容体のうちLPA1の発現のみを確認した。LPAは細胞増殖を促進することが知られている。そこで、LPAの破骨細胞前駆細胞の細胞増殖に与える影響を調べた。MTT assayの結果、LPAは破骨細胞前駆細胞の増殖には効果を示さなかった。最後に破骨細胞形成に対するLPAの影響を観察した。RANKL存在下で破骨細胞形成を観察した所、LPA処理した群では破骨細胞数は対象群と比較して有意に増加していた。以上の結果より、酸化ストレスによって生じるLPAは破骨細胞形成を促進することが示唆された。近年、破骨細胞への分化には活性酵素種の関与が不可欠であるという報告があり、酸化ストレスが骨代謝を調節している可能性が示唆されている。前年度、不飽和リゾリン脂質LPAが破骨細胞前駆細胞の増殖には関与しないが、破骨細胞形成を促進することを明らかにした。より生理的な破骨細胞形成におけるLPAの効果を検証するために、骨髄細胞を用いた共存培養系にLPAを添加した。すなわち、マウス骨髄より得られた骨髄細胞を骨芽細胞・破骨細胞前駆細胞が混在した状態でディッシュに播種し、Vitamin D,Dexamethasoneで誘導をかけた後、LPAを加え、破骨細胞形成数を測定した。前年度の結果と同様に、LPA投与群では対象群に比較して、形成された破骨細胞数は有意に増加していた。LPAによる破骨細胞形成促進のメカニズムを明らかにするために、破骨細胞前駆細胞(Raw264.7)における破骨細胞関連遺伝子のmRNA発現をリアルタイムPCR法にて検証した。ポジティブコントロールとして用いたRANKLは破骨細胞前駆細胞関連遺伝子であるNFATc1,RANK,AP-1の発現を有意に増加させた。一方、LPA投与群ではこれら破骨細胞関連遺伝子発現は対象群と同等であり、有意な差は見られなかった。以上の結果より、LPAは骨髄共存培養系においても破骨細胞形成を促進する事とこの形成増加には破骨細胞形成関連遺伝子の発現が関与しない事が明らかとなった。
バクテリア全ゲノム交換法の開発

バクテリアゲノムの交換を目指し、その方法を開発する研究を行った。ゲノム交換を行うためには、宿主バクテリアのゲノムを取り除く必要がある。制限酵素の発現系を利用してゲノム破壊株の作成に成功した。さらに導入するゲノムも切断から守るため、認識部位のメチル化にも成功した。ゲノム入れ替えを試みたところ、いくつかのコロニーを得ることが出来たが、それらの持つゲノムはキメラ状態になっていることが示唆された。本研究の目的は、バクテリアのゲノムを入れ替えることを目的とした技術開発である。具体的には、ゲノムを破壊したバクテリアプロトプラストを調製し、そこへリポソームに封入した別のゲノムを加え、融合させることで交換を行う。本年度は、ゲノム破壊したバクテリアプロトプラストの調製法を最適化し、簡単に得ることができる方法を確立した。また、ゲノムを破壊したバクテリアプロトプラストと、破壊していないバクテリアの融合によって、ゲノム入れ替えを試みた。結果、いくつかコロニーが得られる条件を見いだすことができた。現在得られたコロニーの解析を行っている。最終的には次世代シークエンサーによる全ゲノムシークエンスを行いゲノムの入れ替えが起こっているのか、もしくはキメラゲノムを形成しているのかなどを明らかにしていく。しかしながら、合成されたゲノムにこの方法は適用できないため、リポソームへのゲノム封入の検討を進めていく。現在は、無傷のゲノムを調製する手法を検討しており、これが完了後に、界面通過法によってゲノムをリポソーム内に封入することを試みる。この技術が確立すれば、自らデザインしたゲノムを合成し、それをバクテリア内部に戻すことで望む機能を持ったバクテリアを自在に生み出すことができるようになる。これによって、様々な諸問題(エネルギーや、温室効果ガス、レアメタル回収など)において、バクテリアを培養することで解決できるようになるかもしれない。バクテリアゲノムを大規模に改変したり入れ替えたいという要望は確実に存在する。それは、ミニマムゲノムに代表されるような生命に必要な最小限の遺伝子の決定や、微生物の代謝経路を遺伝子的にデザインし制御することで、有用物質を効率的に生産させるということである。これまでこのようなバクテリアはゲノムを相同組換えによって部分的に欠失させることで作成されてきた。しかしながら、Gibson D.G.らは800kbp程度のMycoplasma全ゲノム合成が可能であると報告したのである(Science 319,1215(2008))。つまり、この全ゲノム合成とバクテリアゲノム導入法が組み合わされば、最小ゲノムバクテリアの創出や物質生産バクテリアの創出がきると考えられる。そこで我々は、大腸菌のゲノムを他種の大腸菌もしくは他属の細菌と完全に入れ替える技術開発を行う。昨年度、サルモネラと大腸菌の融合をおこない、その菌株の解析を行った。Solidシステムを用いた全ゲノム解析では、大腸菌標準株のゲノム配列に対して50%程度一致した。しかしながら、Solidシステムから得られる配列情報はそれらすべてをアセンブリして一つのゲノム配列を作成するといった目的には向かない。これは、1本当たり得られる配列情報が75bpと短いためである。そのため、今後は未知配列のアセンブリをおこなうことが可能なイルミナシステムでのシークエンスを計画している。また、大腸菌の融合方法もPEG法のみならず、他の方法も検討を行った。1細胞同士の融合を可視化し、融合から再生までを可視化することを目的として、顕微鏡下に電極を作成し、バクテリアプロトプラストの融合を試みた。融合に先立ち、パールチェーンが形成される様子を観察することに成功した。今後は条件を検討し、融合が起こる条件を確立する。しかしながら、GibsonD.G.らは800kbp程度のMycoplasma全ゲノム合成が可能であると報告したのである(Science 319, 1215 (2008))。昨年度は、ゲノム融合に使用する巨大化大腸菌の性質を主に調べた。巨大化大腸菌はその体積が本の大腸菌の1000倍以上に達することが知られているが、それが分裂し子孫を残すかについては分かっていない。たとえ、巨大化大腸菌と他のゲノム生物の融合が成功しても、その後分裂しなければ入れ替えが起きたか確認不可能である。そこで、巨大化大腸菌が分裂できるかを確認したところ、5マイクロメートル以下の直径であれば比較的効率よく分裂することを確認した。

本結果は、巨大化大腸菌が分裂できることを示した初めての結果であり、また、大腸菌の分裂機構がかなりロバストなシステムであることを示した結果である。研究期間中には間に合わなかったが、本成果を論文として投稿する予定である。バクテリア融合をおこない、その解析を行っており、当初計画通りに進んでいる。しかしながら、ゲノム交換株の取得は今後の課題である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでは、計画通り研究が遂行できているため大きな計画の変更はない。しかし、来年度は最終年度であるため、これまでの成果発信をおこなっていく。
民事訴訟における主張過程の規律

日本では、現在、主張段階の充実による争点の確定が重要な問題となっている。本年度は、この点について、前年度(平成5年度奨励研究(A)・課題番号05852008)までの研究におけるドイツ法の探求に引き続き、アメリカ法の探求から示唆を得ることを目指した。日本(及びドイツ)と手続の基本構造を異にするアメリカでは、ディスカヴァリ-やプリーディングが争点確定の機能を果たしていると考えられるが、近時のアメリカでは、連邦民訴規則をはじめとして、そのディスカヴァリ-やプリーディングについて、改革が試みられている。この改革の動きは、基本的には、ディスカヴァリ-の濫用を防ぎ、ひいては民事訴訟にコストがかかりすぎることを防ぐためのものである。中心となるのは、標語的には「ディスカヴァリ-からディスクロージャーへ」と表現される改革であり、より具体的には、プリーディングで特定的に主張された事実について争いがある場合に、その事実に関連する情報を、相手方からの要求を待たずに自ら開示することを、当事者に義務づけるものである。これに対しては、弁護士と依頼者の信頼関係やアドヴァサリ-・システムの観点等からする批判がある。ディスカヴァリ-の濫用が大問題となっているアメリカと異なり、日本ではむしろ開示手段の不十分性が問題となっているため、アメリカ法の議論を直ちに日本法に持ち込むことは当然ながら困難であるが、弁護士・依頼者間の関係やアドヴァサリ-・システムを巡る議論は日本法にも一定の示唆を与えるように思われる。
Wntシグナル伝達経路の新規制御分子の同定と臨床応用

本研究課題の遂行により、3種類のWntシグナル伝達経路の新規抑制分子が単離できた。それらはAxin、Dvl、β-カテニンの結合蛋白質であり、それぞれAxam、Idax、Duplinと名付けた。AxamにはN末端側にimportin αと結合する核移行シグナルが存在して、中央部分にAxin結合部位が存在した。C末端側には、脱SUMO化酵素Senp1の触媒部位と相同性が高かった。Axamにはin vitroと細胞レベルで脱SUMO化酵素活性を示した。Axamはβ-カテニンの分解促進活性を有するが、これにはAxin結合部位と触媒部位の両者が必要であった。また、脱SUMO化酵素を消失した変異体(AxamCS)はβ-カテニンの分解促進活性が減弱した。したがって、Wntシグナル伝達経路の制御にSUMO化が関与していることが明らかになった。Idaxは特徴的な構造は存在しないが、DvlとAxinの結合を阻害して、Wnt依存性のβ-カテニンの蓄積とTcfの転写活性化を抑制した。また、IdaxはWntシグナルによるアフリカツメガエルの体軸形成を阻害した。DuplinのC末端側には塩基性アミノ酸領域とβ-カテニン結合部位が存在した。塩基性アミノ酸領域はimportin αと結合した。また、塩基性アミノ酸領域がDuplinの核内移行に必須であった。Duplinにはβ-カテニン依存性のTcfの転写活性化を抑制し、アフリカツメガエルの体軸形成を抑制したが、塩基性アミノ酸領域を除去したDuplinにはその作用が消失した。したがって、Duplinが機能するためには、核内に存在することが必須であると考えられた。以上の結果から、Axam、Idax、DuplinはいずれもWntシグナル伝達経路の負の制御因子であり、癌抑制遺伝子産物として機能する可能性があると考えられる。私共がWntシグナル伝達経路の負の制御因子として解析してきたAxinとAxilの変異がヒト肝癌と大腸癌で発見された。今後は、ヒト癌におけるAxam、Idax、Duplin異常を検索する予定である。本年度はまず癌抑制遺伝子産物APCのβ-カテニン分解における役割について、解析を行った。APCはAxinを介して蛋白質リン酸化酵素GSK-3と複合体を形成し、AxinはAPCを介してβ-カテニンと複合体を形成することができた。また、Axinに結合したGSK-3は、APCに結合したβ-カテニンをリン酸化した。さらに、Axinがβ-カテニンの分解を促進するためにはAPCと結合することが必要であった。したがって、APC/Axin複合体中で、GSK-3によるβ-カテニンのリン酸化が促進され、その結果、β-カテニンが分解されると考えられた。Axinの作用機構から、Axinが癌抑制遺伝子であると予想されていたが、実際に肝癌においてAxinの変異が報告された。また、私共はAxinのホモログとしてAxilを同定していたが、Axilの変異も大腸癌で発見された。AxinやAxilに変異のある症例ではAPCやβ-カテニンの変異は認められないが、β-カテニンは蓄積している。したがって、Axin(Axil)、APC、β-カテニンのいずれか一つに変異が生じるとβ-カテニンの分解が抑制され、細胞が癌化すると考えられる。

さらに、Axin、Dvl、β-カテニンの新規結合蛋白質を単離して、それぞれAxam、Idax、Duplinと名付けた。AxamとIdaxはβ-カテニンの分解を促進して、Duplinはβ-カテニンによる転写因子Tcfの活性化を抑制した。さらに、これらの蛋白質はWntシグナルによるアフリカツメガエルの体軸形成を阻害した。したがって、Axam、Idax、DuplinはいずれもWntシグナル伝達経路の負の制御因子であり、癌抑制遺伝子産物として機能する可能性があると考えられた。来年度はこれらの新規分子と発癌との関連を解析していきたい。昨年度、Axin、Dvl、β-カテニンの新規結合蛋白質を単離して、それぞれAxam、Idax、Duplinと名付けた。本年度はこれらのうちで、AxamとDuplinの機熊解折を行った。AxamのC末端側は、脱SUMO化酵素Senp1の触媒部位と相同性が高く、脱SUMO化酵素活性を示した。Axamはβ-カテニンの分野促進活性を有するが、これにはAxin結合部位と触媒部位の両者が必要であった。また、脱SUMO化活性を消失させた変異体(AxamCS)はβ-カテニンの分解促進活性が減弱した。さらに、Axamをアフリカツメガエル初期胚の背側に発現されると頭部構造が欠損したが、この腹側化活性にも脱SUMO化活性が必要であった。アフリカツメガエルのWntシグナル伝達経路の標的遺伝子であるSiamoisの発現がAxamにより抑制されたが、AxamCSではその抑制作用は減弱した。したがって、Wntシグナル伝達経路の制御にSUMO化が関与していることが明らかになった。DuplinのC末端側には核移行シグナルとβカテニン結合部位が存在した。Duplinにはβ-カテニン依存性のTcfの転写活性化を抑制し、アフリカツメガエルの体軸形成を抑制する働きがあるが、核移行シグナルを除去したDuplinにはその作用が消朱した。一方、Duplinからβ-カテニン結合部位を欠失させると、β-カテニン依存性のTcfの転写活性化を抑制する作用は消失したが、アフリカツメガエルの体軸形成を抑制する作用は保持された。さらに、Siamoisを発現させると二次体軸が形成されたが、β-カテニン結合部位を欠失させてもDuplinはSiamois依存性の二次体軸形成を抑制した。したがって、Duplinは複数の作用点でWntシグナル伝達経路を制御することが明らかになった。AxamもDuplinもWntシグナル伝達経路の抑制因子として作用するので、癌抑制遺伝子産物である可能性があり、今後ヒト癌での異常を検索する予定である。
高血圧自然発症ラットにおけるインスリン抵抗性遺伝子欠損マウスの解析

1)KAT-1欠損マウスの各組織において、KAT-1の発現がmRNAおよび蛋白レベルで欠損していることを確認した。KAT-1欠損マウスは正常に出産・発育し、SHRと同様に、2)普通食下において、tail-cuff法およびtelemetryシステム法により有意な血圧と脈拍の上昇を示し、12週間高塩食下において、血圧の更なる上昇を示し、さらに、3)高塩食下における24時間蓄尿中のカテコラミン分泌の亢進を呈し、4)普通食下において、空腹時血糖値の有意な上昇とインスリン負荷試験によるインスリン抵抗性の亢進を示し、そして、5)高脂肪食下における体重・脂肪組織重量の増加率の減少を示した。【目的】metabolic syndromeのモデル動物であるSHRの原因候補遺伝子産物KAT-1のノックダウン系及び欠損マウスを用い、その生物学的機能を調べる。【方法】KAT-1のRNAiアデノウイルスベクターを作製し、WKYの延髄吻側腹外側野(RVLM)への選択的投与、マウスへの経血管的投与により、それぞれ延髄及び肝臓でのノックダウンによる解析を行った。また、ES細胞を用いたジーンタ-ゲテイングの手法に従い、欠損マウスを作製し、解析を行った。【成績】1) micromjection法により、WKYのRVLM領域での選択的なKAT-1のノックダウン、経血管的投与による肝臓でのノックダウンがwestern blot法やリアルタイムPCR法で確認された。LacZに比べてKAT-1のRNAiアデノウイルスベクターを投与したwKYでは、2)血圧や脈拍の上昇、3) 24時間尿中カテコラミンの亢進、4)空腹時血糖値の高値が認められ、予想通りにSHRのRVLMへのKAT-1過剰発現系の結果と相反していた。5)一方、マウス肝臓でのKAT-1ノックダウンにより、脂肪組織重量、肝臓重量の変化や、糖脂質代謝への影響が確認された。6)KAT-1の欠損マウスが得られ、Southern blot法、リアルタイムPCR法、northern blot法、western blot法にて確認された。7) KAT-1欠損マウスでは、血圧の上昇、空腹時血糖値の高値、insulin tolerance testでインスリン感受性の増悪等が認められた。【結論】KAT-1の異常がSHRにおける高血圧や交感神経活動元進、インスリン抵抗性などの病因の一部を成す可能性が示唆された。現在、KAT-1欠損マウスに高塩食、高脂肪負荷による影響について、肥満モデル動物、動脈硬化モデル動物との交配により、KAT-1の肥満やインスリン抵抗性、動脈硬化への関与について、検討中である。【方法】KAT-1のRNAiアデノウイルスベクターを作製し、WKYの延髄吻側腹外側野(RVLM)への選択的投与により、延髄でのノックダウンによる解析を行った。また、ES細胞を用いた遺伝子相同組み換えにより開始コドンを含むエクソン12の領域を欠失する欠損マウスを作製し、解析を行った。【成績】1)microinjection法により、WKYのRVLM領域におけるKAT-1発現の選択的ノックダウンをwestern blot法とリアルタイムPCR法により確認した。LacZのRNAiに比べKAT-1のRNAiアデノウイルスベクターを投与したWKYでは、2)血圧や心拍数の上昇、24時間尿中カテコラミン分泌の亢進、空腹時血糖値の上昇を認めた。一方、3)欠損マウスの各組織において、KAT-1の発現がmRNAおよび蛋白レベルで欠損していることを確認し、欠損マウスが正常に出産、発育するが、8週齢以降は、4)普通食下において、tail-cuff法およびtelemetryシステム法により有意な血圧と心拍数の上昇を示し、12週間高塩食下および高脂肪食下において、血圧の更なる上昇を示し、この傾向がマウスの交感神経活動が高まる夜間により顕著であることを確認した。さらに、欠損ホモマウスは、5)高塩食下における24時間尿中カテコラミン分泌の亢進を呈し、6)普通食下において、空腹時血糖値の有意な上昇とインスリン負荷試験によるインスリン抵抗性の亢進を示し、高脂肪食下における空腹時血糖値の更なる上昇を示した。そして、7)活動度の増加に伴い、高脂肪食負荷による体重・脂肪組織重量の増加率が減弱し、血清総コレステロール値も減少を示した。【結論】マウスにおいてKAT-1の欠損が血圧の上昇や交感神経活動の亢進、インスリン抵抗性の亢進や糖・脂質代謝異常を引き起こすことが示された。現在、肥満モデル動物、動脈硬化モデル動物との交配により、KAT-1の肥満や動脈硬化への関与について検討中である。【目的】メタボリックシンドロームのモデル

動物であるSHRにおける原因候補遺伝子KAT-1(kynurenine aminotransferase-1)のノックアウトマウスを作製し、KAT-1の生理機能とメタボリックシンドロームの成因を探る。【方法】発生工学的手法を用い、遺伝子相同組み換えにより開始コドンを含むエクソン1-2の領域を欠失するデザインに基づきMT-1を完全欠損するノックアウトマウスを作製し、血圧、糖脂質代謝、肥満等の各種表現型の解析を行った。また、12週間高塩食、高脂肪食負荷下における解析も行った。【成績】1)欠損ホモマウスの各組織において、KAT-1の発現がmRNAおよび蛋白レベルで欠損していることを確認した。欠損ホモマウスは正常に出産・発育し、SHRと同様に、2)普通食下において、tail-cuff法およびtelemetryシステム法により有意な血圧と脈拍の上昇を示し、12週間高塩食下および高脂肪食下において、血圧の更なる上昇を示し、この傾向はマウスの交感神経活動が高まる夜間により顕著に認めた。さらに、3)高塩食下における24時間蓄尿中のカテコラミン分泌の亢進を呈し、4)普通食下において、空腹時血糖値の有意な上昇とインスリン負荷試験によるインスリン抵抗性の亢進を示し、高脂肪食下における空腹時血糖値の更なる上昇を示した。そして、5)活動度の増加に伴い、高脂肪食下における体重・脂肪組織重量の増加率の減少を示した。一方、6)SHRには認められない多飲・低張性多尿などの尿崩症症状を呈した。【結論】SHRにみられる多様な病態の背景にKAT-1の異常が深く関わる可能性が再確認された。また、それらの異常がラットとマウスの種差を越えてKAT-1の異常によって引き起こされていることが強く示唆された。
食物アレルギー原因食品を摂取する子どもを支援する看護師育成プログラムの開発

本年度は、食物アレルギーの看護経験豊富な小児アレルギーエデュケーター(以下、PAE)よりコンセンサスの得られた、小児の食物経口負荷試験(以下、負荷試験)を担当する看護師に教育すべき内容を明らかにすることを目的に研究を行った。昨年度実施したPAE14名を対象にしたフォーカス・グループ・インタビューでは、負荷試験時の具体的な看護支援として132項目が明らかになった。その結果をもとに、デルファイ法による2回の質問紙調査を行った。負荷試験の看護経験のあるPAE89名に調査を依頼し、同意を得たPAE62名を対象とした。1回目の調査では、質問紙に具体的な看護支援項目を示し、負荷試験を担当する看護師にどの程度教育すべき内容と考えるかという質問に対して、「5:非常にそう考える」「1:全くそう考えない」の5段階のリッカートスケールで回答を求めた。また、追加すべき項目を自由記載で回答してもらった。2回目の調査では、1回目の調査で、同意率(「5:非常にそう考える」、「4:そう考える」の割合)80%以上の項目に自由記載のあった項目を追加し、1回目の調査と同様に5段階で回答を求めた。2回目の調査で同意率80%以上の項目をPAEよりコンセンサスを得た「負荷試験を担当する看護師に教育すべき内容」とした。その結果、「スムーズな負荷食品摂取のための支援」に関する34項目、「症状の早期発見と確実な対応」に関する57項目、「負荷試験の時間を利用した心理社会的支援」に関する34項目が、負荷試験を担当する看護師に教育すべき内容であるとコンセンサスを得た。明らかになった内容を「食物経口負荷試験の看護実践テキスト:伝えたい小児アレルギーエデュケーターの経験知」として冊子にまとめ、テキストを用いた看護師育成プログラムの素案を作成した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。食物アレルギーの小児は増加している。食物アレルギーの診断、管理のためには、食物経口負荷試験が必要である。食物経口負荷試験はアナフィラキシー発症のリスクを伴う検査であり、医師、看護師の管理のもとで実施されなければならない。しかし、食物経口負荷試験を受ける小児に対する具体的な看護援助は明らかになっていない。小児アレルギーエデュケーター連絡協議会Aブロック会に対して、研究協力依頼を行い、研究協力者の紹介を受けた。研究協力への同意の得られた対象者は、小児アレルギーエデュケーター14名であった。平成29年12月に、食物経口負荷試験を受ける子どもへの具体的な支援内容を明らかにすることを目的とし、フォーカスグループインタビューを実施した。フォーカスグループインタビューの対象は、1グループ34名の4グループであった。許可を得て録音し、録音内容から逐語録を作成し、質的記述的に分析した。分析の結果、3のコアカテゴリーを見出した。第1のコアカテゴリーは「スムーズな負荷食品摂取のための支援」で、第2のコアカテゴリーは「症状の早期発見と確実な対応」で、第3のコアカテゴリーは、「負荷試験の時間を利用したアプローチ」であった。小児アレルギーエデュケーターの実践している、食物経口負荷試験を受ける小児に対する具体的な看護支援が明らかになった。明らかになった経験知は、食物経口負荷試験を担当する看護師の現任教育に活かすことができると考える。食物アレルギーの看護経験豊富な小児アレルギーエデュケーターよりコンセンサスの得られた、小児の食物経口負荷試験を担当する看護師に教育すべき内容を明らかにするため、デルファイ法による調査の準備している。調査票第1版を、小児アレルギーエデュケーターを対象としたフォーカスグループの分析結果から作成した。平成30年5月に倫理審査の受諾予定である。明らかになった内容を「食物経口負荷試験の看護実践

テキスト:伝えたい小児アレルギーエデュケーターの経験知」として冊子にまとめ、テキストを用いた看護師育成プログラムの素案を作成した。小児アレルギーエデュケーター連絡協議会4ブロック会に、研究協力を依頼し、研究協力者の紹介を受ける予定である。研究協力者の同意を得て、平成30年8月に、調査票第1版の調査を実施し、結果分析を行う予定である。その分析結果をもとに、調査票第2版を作成し、平成30年10月に第2回調査を行う予定である。調査結果の分析を行い、経験豊富な小児アレルギーエデュケーターのコンセンサスを得られた、食物経口負荷試験を担当する看護師に教育すべき内容を明らかにする。その内容をもとに、看護師育成プログラム作成を検討する。また、平成29年度の研究成果は、学会で演題発表を行い、学会誌への論文投稿を目指す予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
透過型超解像度顕微鏡の開発とそれを用いた光合成初期過程の可視化

試料を染色することなく超解像度顕微鏡画像を取得するための新規方法の探索を行った.本研究では特に,光合成細菌の光合成初期過程の可視化を目指す.そのため,近赤外領域において高感度で超解像度画像の取得が可能となる装置の開発を行った.代表的な光合成色素について,超短パルス光励起の顕微鏡下で起こることが期待される超高速光学応答や光学非線形性について調べた.クロロフィル分子においては,アンチストークス蛍光が顕著に表れることを見出した.更に,カロテノイド分子の光学応答の理論と実験の整合性を調べた.研究課題を遂行するために,超解像度顕微鏡を構築することを第一の目標とした.研究計画にあるように,トロント大学との共同研究を行い,現有のCWチタンサファイアレーザーとHe-Neレーザーに倒立型顕微鏡を組み合わせて,超解像度顕微鏡を構築した.その結果,回折限界を超えた,通常の光学顕微鏡の空間分解能を超えた高い空間分解能(すなわち超解像度)の画像が取得できるようになった.信号の検出には,フォトマルチプライヤーチューブとロックインアンプを用いた.本研究において,最終的には光合成色素タンパク複合体の超解像度画像を取得する方法の確立を目指している.しかし,色素タンパク複合体の試料調製には長い作業時間を必要とするため,装置の構築の効率が下がってしまう.そこで,その作業時間を短縮するために,ローダミン色素由来の標準ビーズを海藻由来のジェルに固定した疑似的な試料を用いて,構築した超解像度顕微鏡の評価を行った.このような擬似的な試料を用いることで,光学応答の波長領域が近く,かつ耐光性の強いために,試料の劣化にとらわれずに装置の評価をすることができる.超解像度顕微鏡画像を得るという目的は達成することはできたが,その一方で測定時間がかかりすぎるという問題があることもわかってきた.すなわち,超解像度顕微鏡画像を広範囲の試料領域で測定する間に,試料の劣化が起こるという問題を克服する必要が出てきた.その対策の一つとして,検出をアバランシェフォトダイオードとフォトンカウンターの組み合わせでも行うことができるように装置構成の拡張も行った.前年度に引き続き,超解像度顕微鏡の改良を行った.後述するように,本年度から,主たる研究対象となる光合成色素の観測を開始し,光学系を最適化を行った.すなわち,約700nmに現れる信号を効率よく検出器に導くための配置をほぼ完成させた.しかし,予算の都合で一部を簡略化した光学系に於いて,信号損失が生じていることも分かっている.この点の修正は次年度予算を用いて実施することを予定している.研究初年度は,試料調製による作業時間を短縮し光学系の構築に専念するために標準試料を用いていたが,本年度は,測定対象を光合成色素へと移行させることができた.これは前年度末に導入したアバランシェフォトダイオードとフォトンカウンターにより,顕微画像を取得する際に励起光強度を下げることができるようになったため,試料の劣化を抑えることが可能になったことが最大の要因と考えている.しかしながら今のところ,完全に単一分子レベルでの観測には成功していない.これは,分子が会合していることが原因と予想しているため,試料調製の条件をいろいろと変えて観測を続けている.最適条件をまだ見つけられていないため,この点については,次年度以降も継続して調査する予定である.より良い顕微鏡画像を取得するためには,対物レンズで集光したレーザー光のスポットが,励起光とSTED光で同じ形状をしている必要があると考えられる.しかし実験で用いたレーザーのビーム形状がわずかに異なっているため,これを調整するための光学系を設計し予備測定を開始した.この点の調整をさらに追い込むことにより,今後,画質が向上していくものと期待している.年度途中に実験装置の故障が起こり,計画していた実験の一部を実施することができなかったため.光学系を改良することにより,従来よりも効率よく超解像度画像を取得できるようになった.すなわち,ビームの収差をなるべく小さくするとともに,バックグラウンドとなるダークノイズを最小限に抑えた.特にダークノイズについては,検出器の限界まで落とすことができるようになった.昨年度までは主に,光合成色素に近いスペクトル領域に信号が現れる標準試料を用いた測定を行ってきたが,本年度は高等植物を中心に広くみられる光合成色素であるクロロフィルaについて顕微分光測定を行った.標準試料に比べ非常に大きな非線形信号が現れることが分かった.そのため,超解像度顕微鏡観測を行うためには,通常の方法とは異なる波長と時間領域のレーザー光を用いる必要があるという考えに至った.画像観測からスペクトル観測に手法を変更し,エネルギーを失活させるための経路を検討した.この手法を拡張することにより,新たな超解像度顕微鏡法の開拓につながるものと期待をしている.本研究においては,当初,光合成色素の高速応答を顕微鏡下で観測することを目標としていたが,予算の都合によりその計画を一部変更する必要が出てきた.当初計画を将来的に実施するために,マクロ条件下ではあるが,光合成色素であるカロテノイドの非線形光学応答をスペクトル領域で観測することにも成功した.測定結果を理論モデルにより解析をしたところ,一見するとモデルが実験結果を定性的に説明できているように思われるが,詳細な検討を行うと吸収端近傍では定量的には不一致があり,エネルギー準位の再検討をする必要があるという結果が得られた.以上の結果の一部を学会で報告を行った.近日中に論文投稿をすることを計画している.試料を染色することなく超解像度顕微鏡画像を取得するための新規方法の探索を行った.本研究では特に,光合成細菌の光合成初期過程の可視化を目指す.そのため,近赤外領域において高感度で超解像度画像の取得が可能となる装置の開発を行った.

代表的な光合成色素について,超短パルス光励起の顕微鏡下で起こることが期待される超高速光学応答や光学非線形性について調べた.クロロフィル分子においては,アンチストークス蛍光が顕著に表れることを見出した.更に,カロテノイド分子の光学応答の理論と実験の整合性を調べた.当年度予定した,超解像度顕微鏡の構築はほぼ終了することができた.標準試料を用いた画像の測定にも成功することができた.しかし,次年度以降用いる消耗品のスペックの決定に予想以上の時間がかかってしまったため.故障した装置は,次年度初めに製造元による修理から戻ってくる予定のため,本年度に行うことができなかった実験を早急に終わらせる.次年度は最終年度に当たるため,これまでの研究成果をまとめ,公表する.生体物性物理学当初の研究計画にあるように,試料の励起状態を効率よく励起するために,パルスレーザーを導入した配置へと顕微鏡を改良する.実験装置の故障のため,当該年度に計画をしていた実験を実施することができなかった.その実験を次年度に実施するために次年度使用額が生じた.研究実績の概要に記したように,超解像度顕微鏡を実際に構築し,試料観察を行ったところ,信号の検出効率を上げることが必要であることが分かった.そのため本年度は,この問題の克服をすることを優先的に行った.研究計画にあるように,今後,パルス光源に拡張していく.その前に不確定要素を排除しなければ,目標とする装置開発ができなかったため,次年度へ研究の一部を持ち越す必要が生じた.年度途中に故障をした装置と超解像度顕微鏡の本体を結ぶ光学系を構築し,さらにそれを最適化させる.研究計画にあるように,本年度行う予定であったレーザー光源と顕微鏡をつなぐ光学系の拡張に用いる.具体的には,一部をコンピュータでコントロール可能なミラーやレンズ類の購入を行う.
頭蓋内血管(特に脳動脈瘤)に用いるバル-ンカテ-テルの開発

3年間にわたる本研究において、まず成犬を用いて総頚動脈に外頚静脈を吻合することにより実験動脈瘤を作成し、これをほぼ80%の成功率で作成せしめた。この動脈瘤を試作中の離脱式バル-ンにより血管内より治療した。これは同一犬の左右総頚動脈に作成した動脈瘤を血管内より閉塞し、両者の治療効果について、組織学的検討が行いえた。これによるとラテックスバル-ンは動脈瘤の閉塞率においてシリコ-ンにまさっているものの親血管の閉塞もひきおこす危険があることが判明した。一方シリコ-ンは動脈瘤の閉塞率において劣るものの、親血管の開存率は良好であった。しかしながら動脈瘤の破裂する率も大であった。これは圧計測によると動脈瘤内残存部位で圧は異常に上昇しこれが動脈瘤破裂にみちびくと考えられた。この残存スペ-スをうめるため金属コイルを用いた実験も行った。これによるとバル-ン間に生じる残存スペ-スで上昇する圧を金属コイルが首尾よく下降できることが判明した。また試作中の血管内視鏡を用いることによりこれら血管内治療を直視下に観察し、血管内治療の遂行状況を判定可能となった。以上の如き動脈瘤の血管内治療は実験的にはほぼ完成したといえ、臨床応用にいたる時間も遠くないといえる。犬総頸動脈に外頸動脈を吻合することにより実験的動脈瘤モデルを作製し、本モデルにおいて、当研究者により開発中のバルーンカテーテルを試用し、動脈瘤の閉塞をX線透視下に行ない、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡を用いて組織学的検索を施行した。この際超音波血流計を用い、血流の変化を親動脈及び動脈瘤内で測定し、血栓形成に及ぼす影響についても検討した。この結果からは開発中のシリコーンバルーンの強度がやや不足しており、更に改良が必要と判明した。一方、当研究者が新たに開発した形状記憶合金コイルを用い、動脈瘤内閉塞を行なった。上記実験と同様に組織学的検索、及び血流検査を行ない、その実用性への見通しを検討した。この結果からは、コイル自体の硬度がつよく、親血管内腔を傷つける可能性があり、改良が必要と思われた。以上、実験的動脈瘤を用いた開発は初期の研究段階を終りつつある。前年度に報告したごとく、ひきつづき成犬を用いて総頚動脈に外頚動脈を吻合することにより実験的動脈瘤モデルを作成し本モデルにおいて当研究者らにより開発中のバル-ンカテ-テルを用い、動脈瘤の閉塞をX線透視下に行っている。今回は前年度に作成使用しているラテックスバル-ンと現在試作中のシリコ-ンバル-ンをそれぞれ用い、同一犬の左右総頚動脈に作成した動脈瘤を血管内より閉塞し、シリコ-ンバル-ン、ラテックスバル-ンとの比較を行った。この間、現在試用中の血管内視鏡を用いて閉塞状態を観察した。この結果では試用中のシリコ-ンバル-ンでは動脈瘤の血栓形成が不充分な例があり、バル-ンと動脈瘤内腔に遺残スペ-スが残りやすく、不完全閉塞がおこりやすいことが判明した。これからバル-ン形状を考案することにより遺残スペ-スが生じないように研究をすすめている。特にシリコ-ンバル-ンによる不完全閉塞例は閉塞後出血にむすびつきやすく、犬の直接死因となっている。同様のことは人における臨床例でも充分生じうるため、注目しなければならない事実と考えられる。一方ラテックスは不完全閉塞例に移行することが多く、比較的安全と考えられた。これらの実験結果の一部は、第5回日本脳神経血管内手術法研究会にて発表した。前年度にも報告したごとく、ひきつづき成犬を用いて総頚動脈に外頚静脈を吻合することにより実験的動脈瘤モデルを作成し本モデルにおいて当研究者らにより開発中のバル-ンカテ-テルを用い、動脈瘤の閉塞をX線透視下に行っている。今回も前年度と同様に現在試作中のラテックス及びシリコ-ンバル-ンを用いて、同一犬の左右総頸動脈に作成した動脈瘤を血管内より閉塞し、両者の治療効果について、光顕,電顕を用いて組織学的検討を行いその比較を行った。

また閉塞時にバル-ン内に充填する物質についても検討を行った。この結果ではラテックスバル-ンでは動脈瘤の完全閉塞を生じやすく再破裂はないものの、親血管の閉塞も来しやすいこと、組織学的にはバル-ン周囲をとりまく繊維構造が厚く、破裂防止には充分であることが判明した。一方シリコ-ンバル-ンでは動脈瘤の不完全閉塞例が多くなり動脈瘤の破裂を生じやすいこと、しかし親血管の閉塞は生じないことまたバル-ン周囲をとりまく繊維組織はうすく、これが再破裂の原因と考えられた。電顕的にはラテックスバル-ンでは血管内皮細胞の再生がよくたしかめられた。バル-ン充填物質として通常の造影剤とHemaとの比較を行ったが、Hemaは明らかに長期間存続し有用と考えられたが、使用時に操作上複雑な部分がある点から臨床使用時には留意が必要と考えられる。これらの結果の一部は、第6回日本脳神経血管内手術研究会にて発表した。