hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ANITA植物群4種の受粉生物学

1.チョウセンゴミシ雌花、雄花ともに約1週間の寿命を保ち、柱頭もその間receptiveのように見えた。双翅類と鞘翅類の多種多様な昆虫が有効なポリネーターであるとともに、アザミウマも重要なポリネーターであった。これらのことから、この種はジェネラリスト型の受粉様式を持つと言える。自家和合性があることが分かった。2.マツブサ雄花は1日の寿命、雌花は開花2日目の夕方までに花被片を落下させる。主要なポリネーターはタマバエ(種は未同定)であった。マツブサは雄花の雄蕊群と花被片、及び雌花の花被片をタマバエの産卵場所として提供する共生関係にある。開花期間は2週間以内で、一度に多数の花を咲かせた。タマバエは開花期間中、世代が変わるように見えなかった。3.サネカズラ雄花は1日の寿命、雌花は開花2日目の夕方までに花被片を落下させ、主要なポリネーターはタマバエ(種は未同定)であり、雄花の雄蕊群と花被片、及び雌花の花被片をタマバエの産卵場所として提供する共生関係にある、という点でマツブサと同様に受粉様式をもっていた。しかし、タマバエの種類は明らかに異なる。開花期間は2ケ月に及び、少しずつ花を咲かせた。また、開花初期は雄花のみが開き、雌花は1週間以上後に咲き始めた。タマバエは約10日で世代交代をするので、開花期間中数世代が出現すると思われる。4.シキミ花は両性で、1020日間寿命があり、初めの1/41/5の期間が雌性期、残りが雄性期であった。鞘翅類と双翅類の多種多様な昆虫が主要なポリネーターで、膜翅類の昆虫も受粉に貢献すると思われる。従って、これはジェネラリスト型の受粉様式を持つと言える。1.チョウセンゴミシ長野県南佐久郡の3集団で、花の機能維持期間の観察、人為受粉実験、訪花昆虫の行動観察と採取、及び花の紫外線吸収の解析を行った結果、以下のことが判明した。・雌花では、開花直後から約1週間柱頭がreceptiveのように見え、花被片はその期間正常な形状を保った後落下する。雄花では、開花直後から葯が裂開し、数日間は花被片が正常な形状を保ち、その後花被片及び雄蕊ともに落下する。・人為的な自家受粉と他家受粉の実験ではどちらも高率に結実し、自家和合性がある。・花にはハナアブ類と甲虫類が訪れ、その大部分が送粉に有効であるように見える。・雌花、雄花ともに全体が紫外線を強く吸収する。2.マツブサ岐阜県高山市近郊で、花の機能維持期間の観察、訪花昆虫の行動の観察と採取、及び紫外線吸収の解析を行い、以下のことが明らかになった。・雄花は夕方17時19時に開き始めて翌朝までにほぼ完全に開き、その翌日の朝までには花柄から離脱する。雌花は、夕方に花被が緩んでくるが、少し開く少数の花を除き、大部分の花は開くまでは至らない。翌朝までにほぼ完全に開き、その翌日の夕方までに花被片は落下する。・雄花にはタマバエ類とショウジョウバエ類が訪れる。タマバエは開花前に花の先に止まり、開花を待っている。

先が開き始めてしばらくすると花の中に入り、雄蕊や花被片に産卵する。タマバエは翌日の完開した花にもよく訪れて産卵する。ショウジョウバエも日中訪れて、同様に産卵する。雌花へはタマバエが訪れて、花被片に産卵する。タマバエは雌花を訪れた個体にもマツブサの花粉が付着していたので、有効な送粉者であると思われる。しかし、ショウジョウバエが雌花に訪れる様子は観察されない。落下した花期間に産み付けられた卵は数日以内に孵化し、幼虫はその組織を食料とする。・雌花、雄花ともに全体が紫外線を強く吸収する。1.サネカズラ岐阜市の4集団での観察と実験の結果、以下のことが判明した。・大部分の個体では、開花当日の夕方までに雄花は全部が落下し、雌花では花被片のみが落下する。すなわち1日花である。少数の個体ではどちらの花も数日間落下しなかったが、生理的な花の寿命は1日のみのように見えた。・主要な訪花昆虫はタマバエ類であるが、ショウジョウバエ類も時々訪れる。タマバエは雄花では雄蕊と花被片に産卵し、雌花では主に花被片に、時に雌蕊にも産卵する。タマバエは雌花を訪れた個体にもサネカズラの花粉が付着していたので、有効な送粉者であると思われる。産み付けられた卵は数日以内に孵化し、幼虫はその組織を食料とする。ショウジョウバエは雄蘂、時に雌蕊にも産卵するが、送粉にはあまり有効でない。・人為的な自家受粉と他家受粉の実験でどちらも結実し、自家和合性がある。2.シキミ岐阜県伊自良村での観察の結果、以下のことが判明した。・花は両性で雌性先熟である。すなわち、開花2日目までに雌蘂の花柱・柱頭部は外へ曲がって、内側にある柱頭を露出させる。柱頭が現れたときには既にreceptiveのように見える。3日目に雌蘂は直立してきて、外輪雄蘂が開葯し始める。4日目、雌蘂は完全に直立して互いに密着することにより内側に柱頭部を隠し、雄蘂群は全部開葯する。10日目くらいまでは花被は着いたままである。ただし、この開花進行は気温によって多少変異がある。・ハエ類、甲虫類、ハナバチ類が訪花する。・花は紫外線を強く吸収する。3.チョウセンゴミシ長野県南佐久郡の3集団で、昨年に引き続き、人為受粉実験及び訪花昆虫の行動観察と採取を行った。訪花昆虫の観察では、新たにアザミウマ類の重要性が明らかになった。アザミウマは雄花と雌花の両方を訪れ、雌花を訪れた個体にもチョウセンゴミシの花粉が付着しおり、また訪花個体数が多いことから、重要な送粉者と思われる。1.チョウセンゴミシ長野県南佐久郡の3集団と塩尻市の1集団で、訪花昆虫の種類とそれらの行動に関する調査を行った。特に重要なポリネーターの一員であることが判明したアザミウマについて、その生活史と花との関係を重点的に調べた。その結果、アザミウマは花に産卵することはなく、外部から訪れることが判明した。2.マツブサ高山市と静岡県富士宮市で訪花昆虫の種類とそれらの行動に関する調査を行った。どちらも花に産卵するタマバエが主要なポリネーターであることが確認された。また、タマバエは両集団とも同じ種類であり、この種のタマバエとマツブサは強い共利共生の関係にあることが強く示唆された。3.サネカズラ・岐阜市の野生個体と岐阜大学栽培の個体について、日毎の開花数とその雌雄性について、連続調査を行った。その結果、どの個体も1日に平均数個の花をほぼ2ヶ月に渡って咲かせ続けること、雄花が圧倒的に多く(8割前後)、雌花は遅く開花し始めて、後半に多く咲くことが判明した。・岐阜市、山県市、及び美濃市で人為受粉実験並びに訪花昆虫の種類とそれらの行動に関する調査を行った。どの集団も主要なポリネーターは花に産卵するタマバエであった。
施設内障害老人の心身の活性化のための動作法適用の試み

施設内障害老人の現況について2施設を中心に動作現況を調査した結果、補助具なしで単独歩行が可能な者は約7%であり、歩行器、杖等の補助具により単独歩行可能な者は約10%で、単独車椅子移動の者は約6%、残りの約76%は介助による車椅子移動のものとなる。だがこの76%の者の中の約25%は食事、排泄もベッドで行い、実際にはほとんど施設内の移動の機会がない。この数値は2施設を平均化したものであり、施設内老人の平均年齢によって多少の差が認められ、開所からの経年によっても差があることが推定される。補助具使用の単独歩行者2名、介助車椅子移動者2名および移動機会僅少者2名に動作を実施した。その結果、単独歩行者では1名が補助具を使用しなくなり、介助車椅子移動者は車椅子に乗る時に自分で立って車椅子に腰掛けられるようになった。移動機会僅少者は、顕著な動作面での変化は認められなかった。しかし動作法による老人への関わりは動作の改善を目的とするだけではないので日常生活における情動や行動の変化をも期待した。その結果、表情の変化、訓練者のみならず施設職員との関わりにおいても言語的・非言語的応答が改善した。変化の見られなかった老人は、痴呆化が著しくかつ身体が痩せ細っているため動作法適用が難しい事例であったといえる。また、言語的コミュニケ-ションの可否は、動作法適用には大きな要因ではなかったが、体力すなわち身体的な状態は動作法適用上の重要な要因となる。また、動作面での効果は障害発生からの年〓と関係があることが示唆された。以上から老人が自らの身体を自分自身で動かすように援助する動作方法は、障害があるゆえに、自らの動きが制限されている老人の心身の活性化の一助となろう。今後は、動作法適用の適否の検討も必要となる。1.施設(特別養護老人ホ-ム)に在所する85名の老人について日常生活及び動作現況の調査を行ったところ、食事、入浴、排泄について職員による何らかの介助を要する者が100%であった。そのうち、歩行等の動作面では顕著な不自由はないものの痴呆等による問題行動があり行動面での介助を必要とする者は、5%であった。残りの95%は、下肢、上肢のいずれか、または上下肢両方に動作の不自由が認められた。動作不自由がある者のうち25%が食事をベッドでするようなまったくの寝たきりの状態であった。このような寝たきりの老人の8割は、痴呆化がすすんでいた。このような老人は、適切な言語的コミュニケ-ションを持つことに困難があった。食事時間には、介助に依って車椅子で食堂に行き、自分で食事をすることが出来るもののそれ以外はほとんどベッドで寝ている下肢に重い障害のある老人は、動作不自由を持つ者の約40%であった。これらの老人は発語に不自由が認められる者もいるが必ずしも痴呆化している訳ではない。しかし、在所年数が3年を越えると痴呆化が著しくなる。このことは、ホスピタリゼイションの問題としても考えられ得る。施設内老人の対人的関係をみると、約2割の者が相互に交流しているだけである。それ以外の者は、食事、入浴、排泄等の介護を受けるときのみ職員との会話だけが中心となることが多い。面会は、毎日:0%、1週12回:5%、2週1回:約10%、3週1回:約5%、1カ月1回:約25%であった。半分以上の者は、1カ月に1回の面接もないようなこともある。2.以上のような施設内老人の状況から、動作法による動作への働きかけにより、動作の改善とコミュニケ-ションの改善を計るため5ー10名の老人を抽出して、動作法の適用を始めた。その経過及び適用方法、効果等の検討は次年度となる。

以上から老人が自らの身体を自分自身で動かすように援助する動作方法は、障害があるゆえに、自らの動きが制限されている老人の心身の活性化の一助となろう。今後は、動作法適用の適否の検討も必要となる。
胚性幹細胞(ES細胞)からの造血幹細胞誘導システムの構築に関する研究

ES細胞はほぼ無限に増やせることから、これらの細胞から造血幹細胞だけに分化させる培養系を確立することができれば、造血幹細胞を大量に作り出すことができると考えられる。現在、世界中の多くの研究室でマウスES細胞から移植可能な造血幹細胞の作成が試みられているが、成功していない。本研究では、マウスES細胞を種々の条件下で培養し、同系マウスの長期骨髄再構築能を有する真の造血幹細胞を特異的に誘導する技術を開発する事を目的として行われ以下の成果が得られた。1.マウスAGM領域からクローニングしたストローマ細胞株A9は造血幹細胞が発生する以前の胎生8日の胚体、卵黄嚢細胞から共培養により長期骨髄再構築能を持った造血幹細胞を生み出す能力を持つことが明らかとなった。A9以外に同様の能力をもったストローマ細胞は現在のところ見つかっていない。造血幹細胞になりうる細胞は胎生8日の胚体、卵黄嚢どちらにも存在し、A9上に発現している分子と接触することにより造血幹細胞としての機能を獲得すると考えられた。現在この分子の遺伝子クローニングが進行中である。2.ストローマ細胞との共培養によりES細胞からも造血幹細胞を生み出すことができるか検討した。ES細胞を分化培養系に移した後、中胚葉系のマーカーであるFlk-1陽性、VE-カドヘリン陰性、PECAM-1陰性の中胚葉細胞を分離後、種々のストローマ細胞株と共培養し、致死量放射線照射マウスに移植した。A9と共培養後移植したマウスにおいてFACSでは検出できなかったが、PCRレベルでドナー由来のメッセージが移植後6ヶ月の時点でも観察できた。A9と共培養することによりES細胞から造血幹細胞を生み出すことが可能と考えられ、今後培養条件など検討する予定である。マウスES細胞から中胚葉細胞だけを誘導にもっとも適した培養条件を検討した。Flk-1陽性、VE-カドヘリン陰性、PECAM-1陰性細胞が中胚葉細胞の指標になることが確認された。ES細胞から誘導した中胚葉細胞を種々のストローマ細胞株と共培養すると、赤血球、マクロファージ、巨核球、肥満細胞など様々な血液細胞が出現した。ストローマ細胞を含まない培地中でもサイトカイン存在下に各種血液細胞が出現した。ES細胞からの造血幹細胞の特異的な誘導の有無を、致死量放射線照射マウスへの移植実験にて検討しているが、現在のところ明らかな骨髄再構築能は認められていない。造血幹細胞は胎生10.5日のマウスAGM領域で発生し、それ以前の卵黄嚢や胚体中には長期骨髄再構築能を持った造血幹細胞は存在しないことが諸家の報告通り確認された。実際、胎生9.5日以前の卵黄嚢や胚体の細胞をいくら多数移植しても生着は全く得られなかった。しかし、これらの細胞をAGM領域からわれわれが樹立したストローマ細胞株(AGMS3)と共培養後移植すると、骨髄はドナー細胞によって完全に置き替わることが明らかとなった。血流が始まる以前の胎生8日の胚体、卵黄嚢細胞をAGMS3と共培養してから移植しても同様に長期骨髄再構築が得られた。他の数種類のストローマ細胞では同様の現象は観察できなかった。以上の結果は造血幹細胞になりうる細胞は胎生8日の胚体、卵黄嚢細胞どちらにも存在し、AGMS3上に発現している分子と一定時間接触することにより造血幹細胞としての機能を獲得すると考えられた。すなわちこのAGMS3は造血幹細胞を生み出す(stem cell genesis)のに必要な分子も発現していると考えられた。

ES細胞からの造血幹細胞の誘導にもこの分子が関与している可能性が考えられ実験を行っている。ES細胞はほぼ無限に増やせることから、これらの細胞から造血幹細胞だけに分化させる培養系を確立することができれば、造血幹細胞を大量に作り出すことができると考えられる。現在、世界中の多くの研究室でマウスES細胞から移植可能な造血幹細胞の作成が試みられているが、成功していない。本研究では、マウスES細胞を種々の条件下で培養し、同系マウスの長期骨髄再構築能を有する真の造血幹細胞を特異的に誘導する技術を開発することを目的として行われ以下の成果が得られた。1.マウスAGM領域からクローニングしたストローマ細胞株A9は造血幹細胞が発生する以前の胎生8日の胚体、卵黄嚢細胞から共培養により長期骨髄再構築能を持った造血幹細胞を生み出す能力を持つことが明らかとなった。A9以外に同様の能力を持ったストローマ細胞は現在のところ見つかっていない。造血幹細胞になりうる細胞は胎生8日の胚体、卵黄嚢どちらにも存在し、A9上に発現している分子と接触することにより造血幹細胞としての機能を獲得すると考えられた。現在この分子の遺伝子クローニングが進行中である。2.ストローマ細胞との共培養によりES細胞からも造血幹細胞を生み出すことができるか検討した。ES細胞を分化培養系に移した後、中胚葉系のマーカーであるFlk-1陽性、VE-カドヘリン陰性、PECAM-1陰性の中胚葉細胞を分離後、種々のストローマ細胞株と共培養し、致死量放射線照射マウスに移植した。A9と共培養後移植したマウスにおいてFACSでは検出できなかったが、PCRレベルでドナー由来のメッセージが移植後6ヶ月の時点でも観察できた。A9と共培養することによりES細胞から造血幹細胞を生み出すことが可能と考えられ、今後培養条件など検討する予定である。
集計結果および質的資料の社会学的説明モデルの開発

集計結果(量的データ)の説明モデルとしては、人口と社会分化(集団数と集団規模)という集計レベルの制約を所与として、その量的制約が、社会関係の取り結びに関する個人選択と規範的作用との関係をどのように条件付けるか、を説明する確率的組合せモデルを開発した。これは平成8年度奨励研究(A)(筆者代表)からの展開である。さらに、社会関係が次々と展開(ないし消滅)していくようなダイナミックなネットワーク形成の側面を取り込むべく、拡張を試みているが、今回の成果としてまとめるには至らなかった。質的資料(質的データ)としては、大学生を対象とした家庭内役割イメージに関する自由記述式の調査データを多角的に分析する中で、質的データの社会学的解読性を高めるいくつかの工夫を試みた。第一の工夫は記述内容のコウディング法である。具体的には記述内容の類似性による分類、役割の性的な非対称性に留意した記述内容のジェンダー性分類、文章の構文や人称に着目した分類等を試み、性別分業意識との関係でそれぞれが異なる意味側面を引き出すことを確認した。第二の工夫は分析方法としてのブール代数アプローチの適用である。これにより、役割イメージのどのような内容が性別分業意識を規定するかの論理関係を析出した他、ブール代数によって役割をフォーマルに定式化し、そのモデルにもとづいて操作化された役割共有度の指標から性別分業意識の賛否が分かれる論点を引き出した。この研究については数名の研究協力者の協力を得ることができ、ある程度まとまった形になったので、研究成果報告書として公表した。平成10年度の研究実績は、大きく次の2点に整理できる。(1).集団間での比率の相違を構造効果の観点から説明する確率的モデル(平成8年度奨励研究(A)で開発)に、社会規範の効果と人びとの選択を組み込んで展開を試みた。これは、集団規模による構造効果を所与としたときに、集団成員が集団内結合(友人選択や結婚)を合理的だと考えるためには、どれくらいの強さの内部結合規範が必要になるかを、モデル解析的に考察したものである。この中途成果は国際社会学会モントリオール大会(1998年夏)で報告し、そこでのコメントや、本補助金のもとでいくつかの大学を訪問して得られた資料・コメントをもとにモデルを改良中である。(2).C.C.Raginのブール代数アプローチを、集団内部および集団間の役割共有度の問題に展開した。役割に、それを構成する要素が階統的に結びついた内部構造を想定し、それをブール式で定式化した。そして、ある役割の内部構造に対する人びとのイメージが必ずしも一致していないときに、当該役割の識別が人びとの間で可能になるための一般的条件を吟味した。役割の内部構造パターンと識別困難性との関係を、数学的な条件式で整理することが目標だが、現在のところはまだそこまで精緻化を進めきれていない。一方で学部学生を対象とした役割イメージに関する簡単な調査を実施し(1998年12月)、そのモデルにもとづいて集団内部および集団間の役割共有度を測定する、という実証的展開を試みた。この中途成果は日本社会分析学会第96回例会(1998年12月)で報告した。いずれの方向性についても、学会報告でのコメントや、本補助金のもとでいくつかの大学を訪問して得られた資料・コメントをもとに、さらに精緻化と展開を企図している。
肺がん患者における治療前食習慣・腸内細菌とPD－１阻害剤治療の関連について

免疫チェックポイント阻害剤は、現在行われている肺がん治療の外科治療、薬物治療、放射線治療に続く、第4の治療方法として注目されており、治療方法の狭まる重篤な患者において使用が可能であり、治療選択の幅が広がる。また治療効果の高い治療方法として期待がもたれている。しかし、治療効果については奏功例の効果は高いが、無効例の割合は未だ高く、その原因解明までには至っておらず、治療効果を阻害する要因の解明は緊急の課題である。そこで、本研究では腸内細菌に着目し、治療開始前・治療中の腸内細菌が治療開始前の食生活や治療効果とどのように関連しているか明らかにしていく。
分子修飾ナノ粒子を用いた核内受容体を標的とする簡易薬剤スクリーニング法の開発

活性化された核内受容体が結合できるペプチドを粒子表面上に修飾することで構築した機能性金ナノ粒子を用いて、核内受容体のリガンドを迅速に評価できるセンサを開発した。本センサは、リガンド結合時における核内受容体の選択的複合体形成を、機能性金ナノ粒子の吸収スペクトル変化で簡便に評価できる。また、30分以内に解析することが可能であり、核内受容体を創薬の標的とした新規薬剤スクリーニング法として期待できる。核内受容体を分子標的とした医薬開発時での薬剤候補物質のスクリーニング法を、従来法より大幅に迅速・簡便化する為、金ナノ粒子を用いた新規評価法の開発を行った。本年度は、核内受容体結合分子の評価のための機能性金ナノ粒子の構築を行った。金ナノ粒子上に修飾するペプチド配列は、核内受容体に結合するコアクチベータ(SRC-1)に含まれる配列である。コアクチベータペプチド(CLTERHKILHRLLQEGSPSD)をペプチド自動合成機で合成し、N末端のシステインにより、自己組織化単分子膜法(SAM)で金ナノ粒子上に修飾し機能性金ナノ粒子を作成した。SRC-1ペプチド修飾金ナノ粒子の分散特性および構造評価を次の方法で実施した。作成した機能性金ナノ粒子の緩衝液中(pH7.4、HEPES-NaCl)における特性を、UV/Vis吸収スペクトル、動的光散乱粒径測定およびゼータ電位測定により評価した。ナノ粒子の溶液中での分散特性は、粒子表面のゼータ電位に依存する。ゼータ電位を測定した結果およびUV/Vis吸収スペクトルの結果から、核内受容体が機能する溶液条件で分散を維持できることが分かった。また、得られた機能性金ナノ粒子は粒径約25nmであった。さらに、機能性金ナノ粒子上のSRC-1ペプチドの構造評価をCDスペクトル、分子シミュレーションソフトウェアによりおこなった。その結果、結合領域が粒子表面に露出しない可能性が判明した。そのため、PEG分子を導入した新規SRC-1ペプチドを合成し、そのペプチドを修飾した新規機能性金ナノ粒子を構築した。新規に合成したナノ粒子は分散性に優れ、ナノ粒子を用いた新規評価法の構築に期待できる。昨年度合成した新規SRC-1ペプチドと核内受容体との結合評価を、免疫評価法および表面プラズモン共鳴測定により行った。その結果、新規に構築したペプチドはアゴニストにより活性化された核内受容体と選択的に結合することが明らかとなった。この新規ペプチドを修飾した金ナノ粒子の分散特性を、動的光散乱粒径測定およびゼータ電位測定およびUV/Vis吸収スペクトルで解析した。その結果から、核内受容体が機能する溶液条件で分散を維持できることが分かった。エストロゲン受容体α(ERα)を分子標的として、リガンド結合時における核内受容体の選択的複合体形成を、機能性金ナノ粒子のスペクトル変化によって評価することができた。また、そのスペクトル変化はリガンドの作用の仕方によって違いがあることがわかった。これはリガンドと結合した核内受容体がリガンド選択的に機能性ペプチドと複合体形成することで、金ナノ粒子の凝集度合いに変化が生じていると考察する。この機能性ペプチドを修飾した金ナノ粒子は、核内受容体のリガンド選択性をスペクトル変化によって評価できるセンサとして機能すると結論した。また、このセンサは、核内受容体とリガンドにラベル化等の標識をする必要が無く、そのうえ、リガンドのアゴニスト活性を30分以内に網羅的な解析することが可能である。これは、現状の評価法と比較して、迅速・簡便化において優位性があり、核内受容体をターゲットとした新規スクリーニング手法として期待できる。
植物とVA菌根菌との共生を制御する化学因子の解明

アーバスキュラー菌根(AM)共生におけるAM菌と宿主植物の相互認識機構はほとんど明らかになっていない。AM菌の菌糸は根の近傍に達すると菌糸先端が激しく分岐し、この形態分化はAM菌が最初に示す宿主認識反応と見なされており,根分泌物中に含まれる脂溶性の低分子化合物によって引き起こされることが報告されている。本物質はbranching factor (BF)と呼ばれているものの,これまでに単離・同定がなされていない。そこで、本研究ではミヤコグサとニンジン、ソルガムの根分泌物からBFの精製および構造の解明を目指した。BF活性は新たに開発したGigaspora margaritaの発芽胞子を用いたペーパーディスクアッセイにより評価した。三種類の植物を低リン酸栄養条件下で水耕栽培し、得られた水耕液をDiaion HP-20カラムに通した後,アセトンで溶出して脂溶性の根分泌物を回収した。これを酢酸エチルで抽出したところ,活性はいずれの植物においても中性物質画分のみに見られた。この画分を各種クロマトグラフィーで精製し、ミヤコグサから新規物質である5-デオキシストリゴールを明らかにした。また、ニンジンとソルガム根浸出液に含まれる活性物質がストリゴラクトン類の新規物質であることを併せて明らかにした。5-デオキシストリゴールは1ng/disc30pg/discの範囲でブランチング活性を示した。ストリゴラクトン類は根寄生雑草の種子発芽刺激物質として知られているものである。今回、植物界における普遍的な現象である菌根形成における宿主認識シグナルとしての機能が見出されたことから、根寄生雑草の被宿主植物からも単離されていることも理解できることとなった。アーバスキュラー菌根(AM)共生においてAM菌がどのようにして宿主植物を認識するのかほとんど明らかになっていない。AM菌の菌糸は根の近傍に達すると菌糸先端が激しく分岐する。この形態分化はAM菌の宿主認識反応と見なされており,根分泌物中に含まれる脂溶性の低分子化合物によって引き起こされることが分かっている。本物質はAM共生研究者の間でbranching factor(BF)と呼ばれているものの,これまでに単離・同定がなされていない。本研究ではミヤコグサとニンジンの根分泌物からのBFの精製を行った。ミヤコグサおよびニンジンを低リン酸栄養条件下で水耕栽培し、得られた水耕液をDiaion HP-20カラムに通した後,アセトンで溶出して脂溶性の根分泌物を回収した。これを酢酸エチルで抽出したところ,活性は両植物共に中性物質画分のみに見られた。この画分を各種クロマトグラフィーで精製したところ、ミヤコグサとニンジンとでは活性物質の溶出画分が全く異なることから、これら植物が異なるBFを生産することが明らかとなった。ミヤコグサでは160lの水耕液からBFの精製を行い、最終的に逆相ODS HPLC分取により20ng/disc以下で活性を示す精製画分を得た。また、ニンジンも同様に250lの水耕液からBFの精製を行い、最終的に逆相ODS HPLC分取により活性ピークを1つ特定した。しかしながら両者ともに得られた活性物質が極めて微量であったため、スペクトル解析は困難であった。

本物質はbranching factor (BF)と呼ばれているものの,これまでに単離・同定がなされていない。そこで、本研究ではミヤコグサとニンジンの根分泌物からのBFの精製を行い、構造の解明を目指した。BF活性は新たに開発したGigaspora margaritaの発芽胞子を用いたペーパーディスクアッセイにより評価した。ミヤコグサおよびニンジンを低リン酸栄養条件下で水耕栽培し、得られた水耕液をDiaion HP-20カラムに通した後,アセトンで溶出して脂溶性の根分泌物を回収した。これを酢酸エチルで抽出したところ,活性は両植物共に中性物質画分のみに見られた。この画分を各種クロマトグラフィーで精製したところ、ミヤコグサとニンジンとでは活性物質の溶出画分が全く異なることから、これら植物が異なるBFを生産することが明らかとなった。ミヤコグサの水耕液からBFの精製を行い、最終的に逆相ODS HPLC分取により10pg/disc以下で活性を示すBFを得た。また、ニンジンからも同様に水耕液からBFの精製を行い、最終的に逆相ODS HPLC分取によりBFを分取した。両活性成分について現在構造解析を進めている。
カルシウム感知受容体による尿酸性化調節機構の解析

腎髄質にある太いヘンレの上行脚を用手的に単離した後に、灌流実験を行い、カルシウム感知受容体を介するpH調節機構を解析した。その結果、生理的な重炭酸イオンを含む灌流液の下では、カルシウム感知受容体を刺激する薬剤を投与すると細胞内がアルカリ化されることが分かった。そして、この調節機構はナトリウムイオンには非依存性で、カリウムイオンに依存していることを初めて立証することに成功した。我々は、微小単離尿細管灌流法を用いた実験により、腎髄質部の太いヘンレの上行脚(mTAL)の血管側に、カルシウム感知受容体(CaR)作動薬であるネオマイシンを投与すると、細胞内が酸性化されるという現象を報告した。しかしながら、この実験系では、重炭酸イオンを含まない灌流液を用いたので、より生理的な重炭酸イオンを含む灌流液で、再度実験を行った。その結果、従来の我々の報告とは反対に、この実験条件下では、ネオマイシン(0.4mM)を血管側に加えると細胞内がアルカリ化するという新しい事実が判明した。この結果を検証するために追加実験を行い、最終的には重炭酸イオンを含む灌流液下で、定常状態のmTALの細胞内pHは7.17±0.01であり、ネオマイシンを投与すると7.28±0.02まで細胞内がアルカリ化されることがわかった。この結果を受けて、Na-H交換体・H-ATPaseやH-K-ATPaseがmTALにおけるカルシウム感知受容体作動薬投与時の細胞内アルカリ化に関与していないかを確認するため、様々な実験条件下で研究を推し進めた。その結果、ネオマイシン投与によるmTALの細胞内アルカリ化に、Naイオンは関与しておらず、一方、Kイオン非存在下では細胞内アルカリ化が消失することが明らかになった。今後は、Kイオンに依存するCaR作動薬投与時のmTALにおける細胞内アルカリ化現象の詳細を解明するために、研究を継続する予定である。昨年度までに、我々は微小単離尿細管灌流法を用いた実験により、腎髄質部の太いヘンレの上行脚(mTAL)の血管側に、カルシウム感知受容体(CaR)作動薬であるネオマイシンを投与すると、生理的な重炭酸イオンを含む灌流液の下では、細胞内がアルカリ化するということを明らかにした。さらに、灌流液中のNaイオンあるいはKイオンを除いた液を用いて実験を行い、この現象にはNaイオンは関与しておらず、Kイオンに依存しているという事実も見出した。今年度は、CaR作動薬投与時の細胞内アルカリ化に対し、Kイオンが、どのようなメカニズムを介して寄与しているかを明白にするため研究を推し進めた。初めにH^+-K^+-ATPaseの阻害薬であるSch28080を管腔側に投与した際に、細胞内アルカリ化が影響を受けるか否かを確かめた。その結果、ネオマイシン投与前の細胞内pHはiPH7.07±0.02だったが、管腔側に20μmol/lのSch28080存在下にネオマイシンを投与した際はiPH7.08±0.01とほとんど変化がみられず、細胞内アルカリ化が抑制されることがわかった。次年度は、微小単離尿細管灌流法を用いたmTALの解析がほぼ終了したので、集合尿細管などの他の尿細管分節におけるCaRの細胞内pH制御について研究を継続する。また、尿中落下尿細管細胞培養系を用いた腎結石症症例からの尿細管上皮でのCaRの発現や機能異常についての検討を行う予定である。今年度は、腎結石症症例から尿中落下尿細管細胞培養系を用いて、尿細管上皮でのカルシウム感知受容体(CaR)の発現や機能解析を行う予定だった。しかし、個人情報保護の理念を遵守する旨をお話したにも関わらず、御同意を得ることができず、最終的には本研究手法を用いた検討を行うことが出来なかった。一方、昨年度までに微小単離尿細管灌流法を用いて、腎髄質部の太いヘンレの上行脚(mTAL)の血管側に、CaR作動薬投与時の細胞内アルカリ化がKイオンに依存性であることを立証した。今年度は、この事実をさらに裏付けるためにH+-K+-ATPaseの阻害薬であるウアバインを用いた実験を行った。管腔側に1.5mMのウアバイン存在下または非存在下に、血管側に0.4mMのネオマイシンを投与して、その前後の細胞内pHを測定した。その結果、投与前のipHは7.06±0.03で投与後は7.08±0.03とほとんど変化がみられず、ウアバインによってネオマイシンによる細胞内アルカリ化が抑制されることがわかった。なお、今年度はmTAL以外の尿細管分節におけるCaRを介した細胞内pH制御について研究を推し進める予定であったが、細胞活性を維持した状態で尿細管を単離することが予想外に困難だったため、報告に値する十分な検討が出来なかった。

最終的に、今年度の研究ではCaR作動薬の一つであるネオマイシンをmTALの血管側に添加した際にみられる細胞内アルカリ化は、管腔側に発現しているH+-K+-ATPaseを介したプロトンの分泌亢進によって生じるものと結論付けた。
上下地震動を受ける単層及び複層立体ラチスドームの崩壊機構の分析と耐震性能評価

偏平ドームは曲面構造物のひとつである。この種の構造が上下地震動を受ける場合には、その構造特性によってはドーム中央部にきわめて大きな加速度応答の発生が報告されている。また、この種の構造の耐震安全性の検討手法の整備の必要性が指摘されている。そこで、本研究では、偏平ドームの構造形式のひとつである単層並びに複層立体ラチスドームを対象とした。そしてそれらの上下地震時動的崩壊機構の分析・検討に基づいた耐震性評価のために以下のことを明らかにした。単層ドームの上下地震時の荷重については以下の結果が得られた。1.幾何学的非線形及び両端ピン支持部材の部材座屈の復元力特性を考慮した弾塑性動的解析法の実用解析としての能率性の検討を行ない、解の精度ならびに計算時間に対する効率性を明らかにした。2.動的解析のために設計されたドームの固有振動数ならびに振動モードの分析を行なった。3.本ドームの動的座屈性状を分析するとともにドームを動的崩壊にいたらしめるのに必要な最大加速度を明らかにした。複層ドームの上下地震時の荷重については以下の結果が得られた。1.ドームを崩壊に至らしめるに必要な入力波の最大加速度の算定(崩壊最大加速度)を行った。2.崩壊最大加速度の推定法を提案し、その妥当性の検討も行われた。3.推定法の誘導の過程から算出される崩壊時のドームの耐震性を静的な震度に換算した崩壊静的震度の資料蓄積に基づいた耐震性能評価法を提案した。
レトロウイルスの複製と細胞のスプライシング機構との関係の解明

本研究は、レトロウイルスが、env-mRNAへとスプライスされるはずのRNAを、非スプライスRNAのままでも核から細胞質へ移送している機構を解明することを目的に行なった。マウス白血病ウイルスのGag蛋白を効率よく発現するウイルスベクターを構築する際に、pol領域に2.4kbの欠失をもち、gag及びenvをコードするウイルスGE6.4は、よくGag(並びにEnv)蛋白を発現したが、GE6.4から残存pol-env部分の殆どを欠失し、gagだけをコードするようにしたG3.6では、RNA、蛋白の発現が大きく減少した。この原因として、Env蛋白発現の有無は無関係だったが、GE6.4からスプライスアクセプターを含む441塩基を欠失すると、gag-RNAの発現がG3.6と同じレベルまで低下することが分かった。G3.6のgag遺伝子下流にこの441塩基部分だけを戻すことで、gagをコードする非スプライスRNA量を上昇し、Gag蛋白発現を回復できた。しかし、GE6.4で、この441塩基部分を逆位させても、欠失させた場合と同様にgag発現量が減少したので、この部分はエンハンサーとして機能しているわけではない。核と細胞質とを分けてRNA量を比較したところ、G3.6の非スプライスRNAは、GE6.4に比して、核内に多く留まっていることが分かった。従って、スプライスアクセプターを欠くG3.6のRNAは、核から細胞質への移行が悪く、核内で壊れてしまうため発現量が低下すると結論された。gag遺伝子をneomycin耐性遺伝子に変えた場合には、上のような現象は認められず、スプライスアクセプターの有無に係わらず、非スプライスRNAが効率よく発現した。gag遺伝子が自らのRNA(=非スプライスRNA)発現のためにスプライスアクセプターを必要とすることは、ウイルスが非スプライスとスプライス両方のRNAを発現する上で合理的であると考えられるが、gag遺伝子配列内にそのような決定配列があるのかは今後の検討を要する。
自然言語処理の手法を用いた自律的言語学習支援システムの開発と評価

(1)言語学習タスクとしてのアノテーションワークショップ言語学習タスクとして自然言語アノテーションワークショップをデザインしパイロット調査を実施した。学習者が翻訳とその評価に取り組むことで、言語意識を高めることを目標としている。また、学習の振り返りと実際の成果をデータとして収集できるようにし、継続的に学習状況を把握できるように設計した。この研究についてCALL分野の国際会議で発表を行った。(2)翻訳と言い換えのデータセットの構築ワークショップで使用する翻訳と言い換えのデータセットを構築した。昨年度作成したデータセット構築に用いた機械翻訳手法とは別の手法で言い換えの文対を収集してデータを拡張した。また、翻訳のバリエーションを追加するために人手翻訳も追加した。昨年度構築したデータセットに関して、自然言語処理分野の国際会議併設のワークショップで発表を行った。(3)評価極性分析のためのデータセットの構築句単位で評価極性情報をレビュー文書に付与しデータセットを構築した。この研究については、国内の学会全国大会で発表を行った。単語より長く、文より短い単位で極性を付与することで、学習者の振り返りのエッセイなどからより詳細に学習者の評価を捉えることができるようになると考えられる。学習者の振り返りのエッセイの特徴を抽出する実験とモデル化は今後の課題である。29年度が最終年度であるため、記入しない。(1)学習者の自己評価に使われることばの特徴を調査するためにデータを収集した。英語学習者を対象に、約3ヶ月間、毎週の学習の振り返りエッセイとその週のモチベーションのレベルを収集した。収集したデータを今後、分析・活用するために、前処理を行った。(2)学習支援実践の一部として言語学習ワークショップを実施する計画を立て、そのデザインに着手し、必要なデータを構築した。自然言語処理研究分野の一タスクである「言い換え認識」に使用するコーパスを構築する新手法を提案し、日本語の言い換えコーパスを構築した。本手法は二つのパートからなる。一つは、複数の機械翻訳器を用いて言い換えの候補文対を生成するもので、もう一つは単言語コーパスからランダムに文対を収集するものである。これらの候補文対の単語一致率を用いてサンプリングすることで、バランスのとれたコーパスを構築することができた。このコーパスは自然言語処理の分野でも有用であり、本研究においても重要なデータセットとなる。言語学習ワークショップは二部構成で、「翻訳」と「言い換え(平易化)」のタスクをデザインした。先述のコーパス構築で用いた手法をワークショップに応用する。翻訳タスクに使用する翻訳器に関しては、本タスクにおいて教育効果を最大限に引き出すためにはどのような翻訳器を採用するのが妥当か、現在、実験をしながら選定作業を進めている。(3)自然言語処理分野の著名な国際会議に聴講参加し、他機関の研究者と意見交換を行った。また、次年度に滞在予定の大学を訪問し、研究協力の依頼・相談を行った。さらに、関連する国内のシンポジウム・全国大会等で発表した。本研究は言語学習者の自律性を促進するための言語学習支援システムを開発することが目的である。自然言語処理の手法を用いて言語学習環境をデザインし評価する本研究は、言語教育分野と自然言語処理分野の融合であるが、これらを統合する段階にはまだ十分に到達していない。データの構築に関しては予定を変更して取り組んだため若干全体の進捗に遅れが生じているが、本研究における重要なデータセットを構築することができた。これまでの成果を国内外で発表している(国内シンポジウム・全国大会でのポスター発表が2件、国際会議採択1件)。このように全体的にはおおむね順調に進展しているが、当初の計画からはやや遅れていると判断する。予定通り実践を行いデータを収集する。収集したデータを分析するとともに学習プロセスの可視化に取り組む。実践は、日本の英語学習者とデンマークの日本語学習者を対象に自然言語処理の手法を用いた言語学習ワークショップを実施する。アクションリサーチの枠組みで、機械翻訳と言い換えを主に利用しコミュニケーションストラテジーの育成と言語意識を高めることを目的としたワークショップを複数回実施し、データを収集する。この研究成果を国内外の会議で発表し、論文誌への投稿を予定している。学習プロセスの可視化に関しては、最終年度中に当初計画していた方法でできない可能性があるが、再度手法を検討中である。
全血を試料とした単剤及び多剤併用時の薬毒物中毒評価に関する基礎データの構築

昨年度まで全血中のフェノチアジン化合物を珪藻土カラム(K-Soute)と酢酸エチルの組み合わせで抽出すると化合物が検出できない現象に遭遇した。一方、血清においては、検出されるものの低濃度では検出されない傾向が認められた。珪藻土カラムは、全血を用いた抽出に於いてエマルジョンを形成しない利点があり法中毒学的にも有意義な抽出方法である。本年度は、異なる珪藻土カラム、Chem Elut、EXtrelut NT1、ISOLUTE、K-Soluteを用い、異なる有機溶媒で全血及び血清中のフェノチアジン化合物の抽出を行い結果を比較した。溶出溶媒には、酢酸エチル、メチルt-ブチルエーテル、ジクロロメタン:イソプロパノール(8:2)、ヘキサンー酢酸エチル(9:1)、クロロホルム:メタノール(9:1)を用いた。化合物の分析は、液体クロマトグラフ質量分析計で行った。前年度まで、K-Soluteと酢酸エチルの組み合わせは、フェノチアジン化合物の抽出には不向きであったが、メチルt-ブチルエーテルを用いることで改善が認められた。しかし、同溶媒は、Chem Elutに対して回収率が低いためより多くの溶媒が必要となることが判明した。対象とした珪藻土カラムを用いて全血及び血清中のフェノチアジン化合物を抽出する際には、酢酸エチルとメチルt-ブチルエーテルが有効であることが判明した。一方、全ての珪藻土カラムの抽出後、N-oxide等の酸化された化合物が検出された。入手可能であった酸化物の標準品を用い定量したところ、約10%以下の割合で酸化物が検出された。同定には至らなかったが他の酸化物と思われるピークも検出されたことから、珪藻土カラムを用いてフェノチアジン化合物を抽出する際は、ある程度の割合で化合物が酸化される可能性が示唆された。他の化合物に於いても同様の酸化が惹起される可能性が考えられる。抽出方法の問題点は、本年度で改善されたが回避できない事実も判明した。一方、実際の急性中毒事例は、中毒起因化合物がほぼ限定される傾向にあり、化合物の種類を増やす点に於いて困難である。現在まで集めた全血及び血清中の化合物定量値を用いて解析を実施する。また、代謝物の測定を実施することで、何らかの傾向が認められるか解析を行う予定である。本年度は、当院高度救命救急センターへ搬送された急性中毒患者を対象とした血清及び全血中の中毒起因化合物の分析を行った。試料は、同じ時間に採血された試料を用いて濃度の比較を行った。抽出は、固相抽出で行った。その結果、化合物によって主に3つのパターンに分かけられた。カフェインは、血清と全血の濃度比は、濃度によらずほぼ1であった。また、多くの化合物は、血清の方が全血よりやや高い濃度(12倍の範囲)で検出される傾向があった。これは、濃度に依存しないと思われた。更に、クエチアピンは、低濃度にでは血清の方が高濃度であったが、濃度上昇に伴いほぼ同じ割合に減少する傾向が認められた。また、フェノチアジン系化合物に於いては、全血中濃度が極端に低くなる傾向が認められた。最近の法医解剖試料は、QuEChERS法が薬物抽出に用いられる。また、全血からの薬物抽出には、しばしば珪藻土カラムが用いられる。そこで、QuEChERS法と珪藻土としてK-Soluteを用いて全血からの抽出の比較を行ったところ、QuEChERS法では血清と同じように抽出が可能であった。しかし、K-Soluteでは濃度に関係なく全く検出されなかった。次にメーカーの異なる珪藻土、K-Solute、ChemElut、ISOLUTEを用いて比較したところ、K-Solute以外は、似たような結果が得られた。更に、K-Soluteの抽出液のスキャン分析を試みたところ、フェノチアジン化合物が酸化を受けている可能性が考えられた。そこで、フェノチアジンの酸化代謝物の試薬で確認したところ、現在までN-オキサイド体が確認された。ChemElut、ISOLUTEによる抽出に於いても、N-オキサイドが確認された。また、フェノチアジンの構造上、他の部位も酸化を受ける可能性がある。検出されない原因が酸化によるものか否か、現在、解明を行っている。今年度は、急性薬物中毒患者の搬送症例が例年と比べ極端に少なかったため、データの収集が例年の症例数からの予想より少なかった。これは冬期の寒冷が影響していることに起因すると考えられる。更に薬剤の安全性の問題から、ごく最近、販売を中止した薬剤がある。これも減少した一因と考えられる。一方、集めた薬物データには、化合物としての偏りがあるため、更に多岐にわたるデータの蓄積を行う必要がある。また、フェノチアジン系化合物を珪藻土で抽出する際、製品により異なるデータが得られることが判明した。現在、この点を通常の固相抽出を含めて解明あるいは回避する方法を見つけている。

本年度は、異なる珪藻土カラム、Chem Elut、EXtrelut NT1、ISOLUTE、K-Soluteを用い、異なる有機溶媒で全血及び血清中のフェノチアジン化合物の抽出を行い結果を比較した。溶出溶媒には、酢酸エチル、メチルt-ブチルエーテル、ジクロロメタン:イソプロパノール(8:2)、ヘキサンー酢酸エチル(9:1)、クロロホルム:メタノール(9:1)を用いた。化合物の分析は、液体クロマトグラフ質量分析計で行った。前年度まで、K-Soluteと酢酸エチルの組み合わせは、フェノチアジン化合物の抽出には不向きであったが、メチルt-ブチルエーテルを用いることで改善が認められた。しかし、同溶媒は、Chem Elutに対して回収率が低いためより多くの溶媒が必要となることが判明した。対象とした珪藻土カラムを用いて全血及び血清中のフェノチアジン化合物を抽出する際には、酢酸エチルとメチルt-ブチルエーテルが有効であることが判明した。一方、全ての珪藻土カラムの抽出後、N-oxide等の酸化された化合物が検出された。入手可能であった酸化物の標準品を用い定量したところ、約10%以下の割合で酸化物が検出された。同定には至らなかったが他の酸化物と思われるピークも検出されたことから、珪藻土カラムを用いてフェノチアジン化合物を抽出する際は、ある程度の割合で化合物が酸化される可能性が示唆された。他の化合物に於いても同様の酸化が惹起される可能性が考えられる。抽出方法の問題点は、本年度で改善されたが回避できない事実も判明した。一方、実際の急性中毒事例は、中毒起因化合物がほぼ限定される傾向にあり、化合物の種類を増やす点に於いて困難である。フェノチアジン系の化合物を抽出する際の最適な方法を検討しているため、これを継続的に行う。臨床データに関しては、継続的にデータの蓄積を行うが、進捗により論文化することを計画している。現在まで集めた全血及び血清中の化合物定量値を用いて解析を実施する。また、代謝物の測定を実施することで、何らかの傾向が認められるか解析を行う予定である。本年度、薬物の抽出方法により定量値が異なる現象が見つかった。特にフェノチアジン系化合物に顕著に認められた。この原因と解決策を見つけるために時間を要しているため本年度中に使用することができなかった。次年度は、この点の解決策を見いだすことを課題の1つに加えて使用する消耗品代に充当する計画である。本年度は、実際の中毒症例数が予測より少なかったため、消耗品として使用できなかった。次年度は、当初の計画に加え、代謝物の分析も実施する予定である。これに関しては、前年度からの繰り越し額を充当する計画である。
δ-アミノレブリン酸合成酵素の発現が赤血球分化に果たす役割の解析

マウス赤白血病(MEL)細胞はジメチルスルフオキシド(DMSO)処理等により赤血球分化を始める。我々はMEL細胞由来でありながら赤血球分化を行なわないDR株を樹立し、赤血球型δ-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS-E)が発現していないことを明らかにした。DR細胞ではALAS-E以外のヘム合成系酵素の分化に伴う誘導は認められたが、誘導の程度はMEL細胞の1/3以下であった。さらにβ-グロビンmRNAはMEL細胞では分化誘導と共に50倍以上に増加するにもかかわらず、DR細胞においては1/10以下に低下していた。このことはALAS-Eが発現していないDR細胞ではヘムが減少し、結果として赤血球系の転写因子に異常が起きたことを示している。そこで赤血球系転写因子の代表であるGATA-1を調べてみたが何の異常もなかった。次にNF-E2の大サブユニット(p45)と小サブユニット(p18)の発現を調べたところ、DR細胞ではp45の発現が抑制されていた。そこで、ALAS-Eの発現がp45の発現を調節していることを確かめるために、正常なMEL細胞にALAS-EのアンチセンスRNAを発現させた。その結果、ALAS-Eの発現抑制の程度に比例したヘム合成系諸酵素とβ-グロビンの発現の抑制と、細胞内ヘム濃度の減少が明らかになった。さらにこの細胞系に於てもp-45の発現が著明に抑制されていた。NF-E2はALAS-E以外の赤血球系のヘム合成酵素とグロビンの転写を調節している事が最近明かとなったので、これらの事実から赤血球分化時に於てはALAS-Eの誘導がまず起き、結果として増加したヘムによりNF-E2(特にp45)が誘導され、さらにNF-E2によりALAS-E以外のヘム合成系酵素とグロビンの転写が高まるという正のフィードバック調節が行なわれていることが示された。血色素合成に必要なヘムとグロビンを協調的に合成調節されることは昔から知られており、また双方の転写調節に関与する赤血球特異的転写因子の存在が最近明かにされてきている。しかしながら、その相互調節の上でヘムとグロビンのいずれが優位にあるのかについてはまだ明かではなかった。そこで、DR-1細胞におけるヘムとグロビンの合成調節の研究を行ない、ヘム合成系の誘導がグロビン遺伝子の発現に必須であること、調節は転写及び転写後の双方のレベルで行われていることを明かにした(Blood、印刷中)。またDR-1細胞を用い、ヘム合成系の最終酵素であるフェロキラターゼmRNAの安定な発現のためにヘムが必須であることを見出した。(Brit.J.Haematol.、印刷中)。一方、正常MEL細胞にALAS-EアンチセンスRNAを導入・発現しそのヘム系に及ぼす影響を観察した。その結果ALAS-Eの発現の減少に伴い、後続するヘム合成系諸酵素の発現が減少することを明かにした。この減少は我々が既にCR-1細胞で観察したものとよく一致している。そこで、その機構を解明するために赤血球特異的転写因子のひとつであるNFE-2に着目し、予備的実験でALAS-Eの減少によるヘム合成の抑制がNFE-2の遺伝子発現を抑制するのではないかという結果を得た。この結果が正しければ、最近NFE-2の結合領域がヘム合成系諸酵素においても存在することが明かにされたので(Regulation of Heme Protein Synthesis,H Fujita,ed.,AlphaMed Press,Ohio,1994)赤血球系ヘム

代謝調節の解明に繋るのではないかと期待される。更に、平成6年度の研究の準備としてALAS-EcDNAを導入・発現したDR-1細胞を作成した。マウス赤白血病(MEL)細胞はジメチルスルフオキシド(DMSO)処理等により赤血球分化を始める。我々はMEL細胞由来でありながらDMSO処理にもかかわらず赤血球分化を行なわないDR株を樹立し、赤血球型δ-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS-E)が発現していないことを明らかにした。DR細胞ではALAS-E以外のヘム合成系酵素のDMSO処理後の誘導は認められたが、誘導の程度はMEL細胞の1/3以下であった。さらにβ-グロビンmRNAはMEL細胞では分化誘導と共に50倍以上に増加するにもかかわらず、DR細胞においては1/10以下に低下していた。このことはDR細胞ではALAS-Eが発現していないためにヘムが減少し、その結果として赤血球系の転写因子に何らかの異常が起きたことを示唆している。そこで赤血球系転写因子の代表であるCATA-1の発現を調べてみたが何の異常も認められなかった。次にNF-E2の大サブユニット(p45)と小サブユニット(p18)の発現を調べたところ、DR細胞ではp45の発現が抑制されていることが明らかとなった。そこで、ALAS-Eの発現がp45の発現を調節していることを確かめるために、正常なMEL細胞にALAS-EのアンチセンスRNAを発現させその影響を調べた。その結果、ALAS-Eの発現抑制の程度に比例したヘム合成系諸酵素とβ-グロビンの発現の抑制と、結果としての細胞内ヘム濃度の減少が明らかになった。さらにこの細胞系に於てもp-45の発現が著明に抑制されていることが示された。NF-E2はALAS-E以外の赤血球系のヘム合成酵素とグロビンの転写を調節している事が最近明かとなったので、これらの事実から赤血球分化時に於てはALAS-Eの誘導がまず起き、結果として増加したヘムによりNF-E2(特にp45)が誘導され、さらにNF-E2によりALAS-E以外のヘム合成系酵素とグロビンの転写が高まるという正のフィードバック調節が行なわれていることが示唆された。我々は鉄芽球性貧血においてALAS-Eの発現の異常が起きることを見いだしており、今後この現象と赤血球系転写因子によるヘム代謝調節との関連を明らかにしたい。