hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境微生物の機能解明に不可欠なシングルセルレベルでの視覚的な遺伝子検出技術の開発

微生物の機能遺伝子を細胞を破壊せず視覚的に検出可能な技術を開発することを目的とした。その結果、我々が開発したtwo-pass TSA-FISH法とオリゴヌクレオチドプローブあるいはポリヌクレオチドプローブを用いて、検出可能な技術を開発した。技術の特異性など様々な特徴を調査した。また環境サンプルに適用することで、技術の将来性を示すことが出来た。本研究はmicrobial autecology(微生物をシングルセルレベルで解析すること)の確立に貢献すべく、微生物の機能遺伝子を細胞を破壊せず視覚的に検出可能な技術を提供することを目的として行われている。そこで申請者の研究グループが開発したtwo-pass TSA-FISH法を用いた遺伝子検出技術の開発を行った。プローブにはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプローブを用い、モデル微生物系としてメタン生成古細菌のMethanococcus maripaludis、Methanococcus vannileii、Methanoculleus chikugoensisを用いた。標的遺伝子にはメタン生成反応を触媒するMetbyl co-enzyme M reductaseをコードするmcr遺伝子とした。オリゴヌクレオチドプローブは、mcrに特異的なPCRプライマーをプローブとして用いた。ポリヌクレオチドプローブは標的微生物のゲノムDNAをテンプレートとしたPCR法により、プローブ中にDNP標識dUTPを取り込ませたものを合成して用いた。その結果、純菌レベルではオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプローブ共に微生物の遺伝子をtwo-pass TSA-FISH法を用いれば可視化することが可能であった(TSA-FISH法では困難)。シグナルノイズ比で見るとポリヌクレオチドプローブを用いた方が明らかに高かった事から、より実用的なのはポリヌクレオチドプローブであると判断した。ポリヌクレオチドプローブを用いた場合、150bp、465bp、756bpのいずれの長さでも検出可能であった。またプローブの長さが長い方が、より高い検出率およびシグナルノイズ比を示した。一方で、より短いプローブを用いた方が、より特異的な検出が可能となった。この他大腸菌のgap遺伝子、硫酸還元菌のaps遺伝子の検出にも成功し、本技術が様々な遺伝子および微生物に対して適用可能であることを示した。プローブにはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプローブを用い、モデル微生物系としてメタン生成古細菌および硫酸還元菌を用いた。標的遺伝子にはメタン生成反応を触媒するMethylco-enzyme M reductaseのアルファサブユニットをコードするmcrA遺伝子および硫黄呼吸反応を触媒するadenosine-5'-phosphosulfate kinaseのアルファサブユニットをコードするapsA遺伝子とした。オリゴヌクレオチドプローブは、mcrAに特異的なPCRプライマーをプローブとして用いた。その結果、オリゴヌクレオチドプローブを用いた場合、two-pass TSA-FISH法を用いてメタン生成古細菌のmcrA遺伝子を可視化することが可能であった。ポリヌクレオチドプローブを用いた場合は、メタン生成古細菌についてはTSA-FISH法で、硫酸還元菌についてはtwo-pass TSA-FISH法を用いて可視化可能であった。また本技術の環境サンプルへの適用性を評価した。まずmcrA遺伝子については、環境サンプルから抽出したDNAからmcrA遺伝子特異的なプライマーセットを用いてクローンライブラリーを構築し、その際に作成したプラスミドを用いてプローブを合成した。apsA遺伝子についてはapsA遺伝子特異的なプライマーセットを用いて環境サンプルから抽出したDNAをテンプレートとしてプローブを合成した。嫌気性汚泥サンプルに本技術を適用したところ、シグナルを得ることが出来た。DNase処理や高ストリンジェンシーでの実験など、幾つかのコントロール系と比較すると、得られたシグナルは特異的であり、標的遺伝子を有している微生物を特異的に検出できていたと考えられる。一連の研究を通して、機能遺伝子を視覚的に検出可能な技術が開発できたと言える。
ティーチャー・トークにおける談話構造に関する研究

本年度の研究では、ティーチャー・トークを含む教室活動の転写から分析単位の検討を行うと同時に、敬語表現を抽出し、分析カテゴリーの検討という側面から調査研究を進めてきた。分析単位の検討の面からは、邦文及び英文の先行研究の文献研究を進めると共に該当分野の学会・研究会に参加し、研究レビュー等を通して知見を得た。また、設備備品により敬語表現の効果的な抽出を行い、分析カテゴリーの面からは、分析単位の検討と同様の手法によりカテゴリー化を行った。その上で、設備備品により分析単位に基づき分析カテゴリー別に統計処理を行った。さらに、データの記憶保存方法としてAVIファイルを用いて事例のカテゴリー化を実施した。今後、記録保存及びライブラリー化の在り方に関する・調査研究を継続して展開する予定である。現在、1資料転送方法の検討、2資料変換方法の検討、3プラグインソフトウェアの機能比較、4画質等の劣化研究、5再生時の画質研究、6インターネットを用いたウェップページ等によるオンラインでの資料提供等の調査研究を継続中である。特に、ウェップページに関しては、現時点において技術的に発展途上にあり、セキュリティ・著作権・肖像権・プラウザの仕様・閲覧機器の性能への依存度等、多方面に渡る知識・経験を要するとの知見が得られたため、これに対処すべく文部大臣認定資格であるマルチメディア検定・CG検定を取得し、将来の研究調査に備えた基本的な体制作りも整える努力を重ねている。本年度の研究では、マルチメディアによるティーチャー・ト-クを含む教室活動の正確な記録化及びマルチメディアの積極的活用による精緻な転写という側面から調査研究を進めてきた。教室活動の正確な記録化の面からは、国内の日本語教育機関の協力を仰ぎ、外国人留学生対象の日本語クラス及び学習者・教師のインタビューを行動分析システムを用いて記録し、検討を行った。また、精緻な転写の面からは、現有の備品及び上記の行動分析システムの設備構成でデジタル技術により、記録を精緻に転写した。また、タイムコード機能を用い、検索の簡便性を追及する研究を行った。一方、技術的な課題として、現在、ワールド・ワイド・ウェッブ上で用いられ始めており、神戸大学留学生センターの情報提供システムであるオンラインインフォーメーションサービスKISCにおいても導入を図ったAVIファイルによる記憶保存方法について、1クロスメディアによる資料転送方法の検討、2資料変換方法の検討、3数種類のプラグインソフトウェアの機能比較、4画質等の劣化研究、5再生時の画質研究等を継続中である。特に、画像と音声を用いた資料の活用は、現時点において技術的に発展途上にあり、質的向上を目指せば、保存時における記憶容量が膨大になり、再生・保存に時間的・経済的に負担が増え、マイナスになる反面、記憶容量を減少させれば、質的劣化が生じ、正確な記録が得られないという知見が得られたため、これに対処できるシステムの在り方に関する調査研究を今後展開する予定である。
遺伝性パーキンソン病における共通分子基盤の解明

パーキンソン病の約10%に遺伝性のものが存在し、そのなかに常染色体劣性遺伝型式を呈する若年発症パーキンソン病がある。その原因遺伝子としてPINK1、Parkin、ATP13A2がある。細胞やモデル動物を用いてそれら遺伝子産物の機能解析をおこなったところ、タンパク質分解システムに関与する因子が多いことが判明した。遺伝子変異による分解システムの破綻と、その結果生じた異常なミトコンドリアやタンパク質の蓄積が早期発症の要因であると推測された。パーキンソン病(PD)はその多くが孤発性だが、約10%の患者は近親者に複数の発症者を認める家族歴がある。従ってパーキンソン病の病態を理解するためには、患者の遺伝的背景を明らかにすることが非常に重要である。vacuolar protein sorting35(VPS35)は欧米の高齢発症優性遺伝性パーキンソン病家系からエクソーム解析法を用いて単離された常染色体優性遺伝性パーキンソン病(ADPD)の新規原因遺伝子である。これまで報告された変異または多型は全て欧米人PDから同定されており、日本人を含めアジアからの報告はない。そこで順天堂大学PDゲノムバンクに登録されている日本人優性遺伝性PD300家系、孤発性PD433名、非血縁健常者579名に対して同遺伝子の変異の検索を行った。その結果、D620N(c.1858G>A)を優性遺伝性PD3家系(1.0%)、孤発性PD1例(0.23%)からヘテロ接合体で同定した。当該アミノ酸は酵母からヒトまで種を超えて保存されていた。他の非同義置換は認めなかった。また、健常群ではいずれの変異も認めなかった。VPS35のD620N変異の頻度を欧米人PDの頻度と比較すると欧米人PDでは0.1-0.2%でD620Nが陽性である。また既報のアジア人(台湾人、中国人)は合計1000例以上で解析が施行されているが全例で変異陰性である。本研究では、VPS35 D620NはPD全体の0.55%(4/733)であり、欧米から報告された頻度やアジアからの陽性例報告が未だないことを考慮すると頻度は高いと言える。vacuolar protein sorting 35 (VPS35)は欧米の高齢発症優性遺伝性パーキンソン病家系からエクソーム解析法を用いて単離された常染色体優性遺伝性パーキンソン病(ADPD)の新規原因遺伝子である。一昨年、我々はD620N (c.1858G>A)を優性遺伝性PD 3家系(1.0%)、孤発性PD 1例( 0.23% )からヘテロ接合体の家系が本邦にも存在することを報告した。本年度はVPS35の機能異常がパーキンソン病に与える影響を明らかにすべく培養細胞とマウスにVPS35の病的変異体を一過性あるいは安定的に発現させin vitroあるいはin vitroにおける神経細胞死を評価すべく実験を開始した。Kufor-Rakeb syndrome(KRS)は若年発症パーキンソニスムに認知症、錐体外路症状、ミオクローヌスを合併する常染色体劣性の原因不明の疾患群であるが、その原因遺伝子としてATP13A2が同定された。ATP13A2はリソソームに局在するP-type ATPaseであるが、その機能については不明な点が多い。これまでの解析によると遺伝子の変異によって2種の局在を呈することがわかってきた。すなわち変異の導入によりERに留まるタイプと、リソソームに局在するタイプからなる。本邦で見出されたF182Lの変異体はERに留まるタイプの変異である。遺伝形式から考えられる病態としてLoss of functionが推測されるがリソソームに局在できないことが病因のひとつであると考えられた。解析の一端として恒常的にATP13A2を欠損した安定細胞株を採取し観察を行ったところ神経系の細胞で特異的に細胞死を引き起こした。このことはATP13A2が神経において重要な機能を有していることを示唆している。さらにリソソームの特徴を明確にするために電顕観察を行ったところ、オートファゴソーム様のリソソームとフィンガープリント構造を有する凝集体の集積を認めた。その機能を評価するためにリソソームの代表的な分解酵素であるカテプシンDの活性を測定したところノックダウン細胞では有意に活性の低下を認めた。ATP13A2ノックアウトマウスでも同様な特徴を認めデータをまとめ投稿準備中である。常染色体優性パーキンソン病の原因遺伝子であるVPS35についても細胞レベルで機能解析を行った。VPS35は複合体を形成しており、病的変異により複合体タンパクが不安定になることを見出した。

複合体はリソソームに至るタンパク輸送に関連することからタンパク質の輸送障害ならびに分解障害がパーキンソン病の病態の背景にあることが推測された。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経学26年度が最終年度であるため、記入しない。本邦にも新規の遺伝子変異を有する患者の報告ができたため。病的変異体の発現の程度によりマウスの繁殖能力に影響を与える印象があり繁殖にやや時間がかかっているがおおむね順調である。遺伝子産物の機能を明らかにするために培養細胞を用いたin vitroの実験、ならびにD620Nトランスジェニックマウスを利用したin vivoの解析を行う。培養細胞あるいはトランスジェニックマウスを用いた機能解析を継続する。次年度はトランスジェニックマウスの飼育匹数が拡大することが予想される。その結果解析実験に使用する消耗品購入費が拡大するため24年度の経費を繰り越す。病的変異体の発現の程度によりTGマウスの繁殖能力に影響を与え、繁殖にやや時間がかかり研究の進行がややずれこんでいる。そのため備品などの消耗品の使用も遅れ、経費も次年度にずれこんだ状況である。引き続き、培養細胞あるいはTGマウスを用いた機能解析を継続する予定である。
リンセットポイントを規定するセンサー分子の統御機構解明

これまでリン代謝調節は、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD、カルシトニンなどの古典的な骨代謝を中心としたカルシウム調節ホルモンの付随的な作用として行われると考えられていた。しかしながら、我々は、脳室、消化管、骨および腎近位尿細管を中心とした、リン調節系を担う新たなリンセンサー蛋白(Growth-related Na/Pi cotransporter, type IIc)とその下流の存在する新規リン代謝モルモン(FGF23, Staniocalcin, PHEX, Klotho etc)の生理作用、さらに細胞外に反応するリン応答転写因子(Pho4,TFE3)を発見した。本研究期間にリン代謝調節機構の中核をなすリンセンサーによるリン感受機構の全貌を解明すること、さらにリンセンサーからのシグナルを伝える新規リン代謝ホルモン群(PHEX,FGF23とKlothoの相互作用)の機能を明らかにすることで、新しいリン代謝系を司るネットワーク分子によるシグナル伝達系の解明を目指した。平成19年度はリンセンサー(NaPi-IIc)ノックアウト動物のミネラル代謝異常について解析し、骨細胞におけるFGF23およびDMP-1の発現異常がカルシウム/リン代謝異常の原因であることを明らかにした。さらに、NaPi-IIa/NaPi-IIcのW-KOダブルノックアウトマウスの解析から、脳室内のカルシウム/リン代謝に関与するklothoの過剰分泌と、脳室内リン濃度の低下が確認された。これらの異常は全身のリン代謝異常の原因である事を明らかにした。また、W-KOマウスに観察されるクル病/骨軟化症の発症原因と腎尿細管リン輸送異常との関係を明らかにした。しかしながら、我々は、脳室、消化管、骨および腎近位尿細管を中心とした、リン調節系を担う新たなリンセンサー蛋白(Growth-related Na/Picotransporter, type IIc)とその下流の存在する新規リン代謝モルモン(FGF23,Staniocalcin,PHEX,Klotho etc)の生理作用、さらに細胞外に反応するリン応答転写因子(Pho4,TFE3)を発見した。本研究では、リン代謝調節機構の中核をなすリンセンサーによるリン感受機構の全貌を解明すること、さらにリンセンサーからのシグナルを伝える新規リン代謝ホルモン群(PHEX,FGF23とKlothoの相互作用)の機能を明らかにすることで、新しいリン代謝系を司るネットワーク分子によるシグナル伝達系の解明を目指した。平成18年度は、日本人HHRH患者におけるリンセンサー遺伝子異常とセンサー機能との関係解明を行った。日本人HHRH患者において遺伝子異常を見出した。また部位の変異をもとにリンセンサ-蛋白の機能について検討し、機能部位を明らかにした。さらにリンセンサー遺伝子ノックアウトマウス(type IIc-KO mice)におけるリン感受機構の解析を行った。腎近位尿細管における食事リン負荷によるリン輸送の反応性に対する検討および脳室内におけるリンセンサ-の機能異常を明らかにした。さらに、リンセンサー(type IIc)/リントランスポーター(typeIIa)ダブルノックアウト動物の作製と解析の検討では、骨石灰化異常の分子機構を明らかにし、骨と脳室におけるリン調節系の存在を明らかにした。しかしながら、我々は、脳室、消化管、骨および腎近位尿細管を中心とした、リン調節系を担う新たなリンセンサー蛋白(Growth-related Na/Picotransporter,type IIc)とその下流の存在する新規リン代謝モルモン(FGF23, Staniocalcin, PHEX, Klotho etc)の生理作用、さらに細胞外に反応するリン応答転写因子(Pho4,TFE3)を発見した。

本研究期間にリン代謝調節機構の中核をなすリンセンサーによるリン感受機構の全貌を解明すること、さらにリンセンサーからのシグナルを伝える新規リン代謝ホルモン群(PHEX, FGF23とKlothoの相互作用)の機能を明らかにすることで、新しいリン代謝系を司るネットワーク分子によるシグナル伝達系の解明を目指した。平成19年度はリンセンサー(NaPi-IIc)ノックアウト動物のミネラル代謝異常について解析し、骨細胞におけるFGF23およびDMP-1の発現異常がカルシウム/リン代謝異常の原因であることを明らかにした。さらに、NaPi-IIa/NaPi-IIcのW-KOダブルノックアウトマウスの解析から、脳室内のカルシウム/リン代謝に関与するklothoの過剰分泌と、脳室内リン濃度の低下が確認された。これらの異常は全身のリン代謝異常の原因である事を明らかにした。また、W-KOマウスに観察されるクル病/骨軟化症の発症原因と腎尿細管リン輸送異常との関係を明らかにした。
筋フィラメント長制御の1分子ナノ解析-筋タンパク質動態の可視化-

筋タンパク質動態の可視化を試みるため、生細胞内分子イメージングに適した高度発達型培養筋細胞系の開発と、作成した高度発達型培養筋細胞内における分子イメージングを行った。高度発達型培養筋細胞は、常法で得たC2C12筋管細胞に電気パルス刺激を与え、運動させることによって作成した。得られた高度発達型培養筋細胞は常法で得られる筋管細胞よりも発達したサルコメア構造を持ち収縮力も大きかった(Fujita et al., Exp. Cell. Res. 2007)。この高度発達型培養筋細胞を用い、筋肉におけるインスリン依存的糖取り込みに重要な役割を果たすGLUT4分子の動態解析を行った。GLUT4分子を従来の蛍光色素よりも明るく退色しにくい蛍光量子ドットでラベルし、リアルタイム共焦点顕微鏡とEMCCDカメラによって観察した。また、GLUT4分子の位置は蛍光強度分布を2次元ガウス近似し、頂点の座標を求めることによってナノ精度で求めた。GLUT4分子は基底状態では筋構造に固く固定されていたが、インスリン刺激を与えることによってゆっくりと動き出した。さらに、周期的に収縮中の筋肉において、弛緩時のGLUT4分子の座標を追跡すると、運動中の筋肉では運動していない筋肉中と比べてGLUT4分子の動きが激しくなっていることがわかった。これは脂肪細胞中のGLUT4分子には見られない特色であり、筋肉と脂肪細胞では、GLUT4分子は全く異なるメカニズムによって膜移行を達成している可能性が示唆された。横紋筋は細いフィラメントと太いフィラメントが交互に並んだ規則的な高次構造を持っており、この構造が筋肉の効率的な収縮・力発生に大きく寄与している。培養筋細胞を用いた研究から、この複雑なサルコメア構造の形成と発達には自発的にゆっくりと繰り返される細胞内Ca^<2+>濃度の反復上昇(Ca^<2+>振動)が重要な役割を果たしていることが示唆されているが、その詳細は不明である。そこで、本研究では培養筋芽細胞株(C2C12細胞)を用い、電気的脱分極刺激によってCa^<2+>振動を人為的にコントロールして、サルコメア構造の形成とそれに伴う収縮能力獲得におよぼすその影響について調べた。C2C12筋管細胞を定法に従った低血清状態で分化させても、各種筋構造蛋白群が十分に発現しているにもかかわらず、サルコメア構造は未熟で収縮能力は全く認められなかった。一方、1Hzの電気パルス刺激を負荷すると、刺激に反応して活発に収縮活動を開始する筋管細胞が約1時間後から多数認められ、2時間後においてその刺激依存性の収縮活動量は最大値となった。その収縮運動能力の獲得に必要な時間は、刺激の周波数に依存しており、0.1Hzの遅い周期の刺激では動き出すまでにより長い時間を必要とした。この分子メカニズムを探るため蛍光顕微鏡による観察を試みたところ、電気刺激による初期サルコメア構造にはα-アクチニン分子と共にインテグリン分子やタリン分子が局在していることが判明した。詳細な検討の結果、サルコメア構造形成にはCa^<2+>によって活性化されたカルパイン分子によるタリン切断が必須であり、インテグリンβ1-タリン-αアクチニン複合体からなる初期サルコメア構造が成熟したサルコメア構造へと発達するうえで欠かせない事が明らかとなった。
血管内皮細胞におけるプロスタサイクリン産生調節機構の解析

精製したウシプロスタサイクリン合成酵素の部分アミノ酸配列より混合プライマーを設計し、PCR法によりウシ血管内皮細胞mRNAを鋳型として用い、まず、ウシプロスタサイクリン合成酵素cDNA断片を単離した。このcDNA断片の塩基配列をもとにプライマーを合成し、5′-RACE法および3′-RACE法によりウシプロスタサイクリン合成酵素の全長をコードするcDNAを得た。また、得られたcDNA断片をプローブに用い、PCR法およびプラークハイブリダイゼーション法によりヒトプロスタサイクリン合成酵素cDNAの単離にも成功した。得られたcDNAを発現ベクターSRαに組み込み、COS細胞にトランスフェクトしたところ、トランスフェクトした細胞ミクロソームに酵素活性が発現することが確認された。また、ジデオキシ法により得られたcDNAの塩基配列を決定し、その配列より本酵素の全アミノ酸配列を決定した。その結果、ウシ酵素、ヒト酵素ともに500個のアミノ酸よりなるタンパクであること、また、プロスタサイクリン合成酵素がチトクロームP-450の中で既知のものと異なる新しいファミリーを形成することがわかった。さらに、得られたcDNAを用い、RNAブロット解析を行った。その結果、プロスタサイクリン合成酵素が心臓や肺をはじめとし、幅広い組織において発現していることがわかった。また、ウシやヒトの培養血管内皮細胞を腫瘍壊死因子(TNF)などの炎症性サイトカインで刺激すると、プロスタサイクリン合成酵素mRNA発現の上昇が観察された。
麻酔薬の中脳ドパミンニューロンカリウムチャネルに及ぼす影響

本研究では麻酔薬による耽溺性の細胞レベルおよび神経ネットワークでのメカニズム解明の手がかりとすることを目的として、静脈麻酔薬の一つであるpropofolが、薬物依存と関係が深いと考えられている腹側被蓋野(ventral tegmental area ; VTA)ドパミンニューロンの興奮性に及ぼす作用を、平成18年度はラット脳スライスを用いたパッチクランプ法を用いて検討し、平成19年度はラット脳スライスにおけるドパミン放出に及ぼす影響と、VTAにおけるシナプス伝達への影響について検討した。生後1725日齢ラットからVTAおよびVTAドパミンニューロンの投射先である側坐核を含む脳スライスを作成しチャンバー内に静置した。人工脳脊髄液(aCSF)に0.550μMのpropofolを加算的に加え還流し、5分毎に分注した。後に高速液体クロマトグラフを用いてaCSF中に含まれるドパミンとセロトニンを定量した。ドパミンおよびセロトニンは検出可能であったが、propofolによるこれら神経伝達物質放出に及ぼす一定の影響は見出せなかった。また、当初計画していた炭素電極を用いたamperometry法による脳スライスに対する神経近傍のおよび側坐核でのドパミン遊離測定は、技術的に困難であり十数回の試行の後断念した。本研究の一部は2007年北米麻酔科学会にポスター演題として発表し、英文学術誌への投稿準備中である。本研究では麻酔薬による耽溺性の細胞レベルおよび神経ネットワークでのメカニズム解明の手がかりとすることを目的として、静脈麻酔薬の一つであるプロポフォールが、薬物依存と関係が深いと考えられている腹側被蓋野(ventral tegmental area ; VTA)ドパミンニューロンの興奮性に及ぼす作用をラット脳スライスを用いたパッチクランプ法を用いて検討した。生後14から21日のラットからVTAを含むスライスを作成し0.5から50μMのプロポフォールを潅流液中に加算的に加えて電流固定法および電位固定法を用いて細胞の興奮性を検討した。プロポフォールはGABA受容体を活性化させることから、GABA受容体アゴニストであるTHIP(4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo [5,4-c]pyridine-3-ol, 3 and 30μM)を用いて同様の実験を行った。膜電流固定法において0.5から5μMの低濃度のプロポフォールによって8/18個のVTAニューロンが活動電位の発生頻度を増加させた(control : 9.3±4.2 spikes/min, 0.5μM:27.5±10.1 spikes/min, 5μM : 19.0±8.2 spikes/min, washout : 1.8±0.8 spikes/min, p<0.05)。他の10個のニューロンでは活動電位の頻度は不変ないし軽度に減少した(control : 0.75±0.71 spikes/min, 0.5μM : 0.43±0.37 spikes/min, 5μM : 0.06±0.04 spikes/min, washout : almost no spikes, p>0.05)。プロポフォールによって活動電位が増加したニューロンはそうでないものに比べ有意に膜電位が浅く活動電位の頻度が多かった。THIPにおいても同様の結果が得られた。膜電位固定法において低濃度のプロポフォールは有意に内向き電流を増加させ、Kチャネルを抑制している可能性が示唆された。合わせてVTAおよび側座核(NAcc)を含むスライスにおいて潅流液中にドパミンが放出されていることが高速液体クロマトグラフィーによる分析から判明し、プロポフォールにより遊離ドパミン濃度がどのように変化するのかを解析中である。今年度は加えてドパミン放出の量子的分泌を解析するためのセットアップおよびVTAにおけるシナプス伝達を測定するための予備実験を行った。

本研究では麻酔薬による耽溺性の細胞レベルおよび神経ネットワークでのメカニズム解明の手がかりとすることを目的として、静脈麻酔薬の一つであるpropofolが、薬物依存と関係が深いと考えられている腹側被蓋野(ventral tegmental area; VTA)ドパミンニューロンの興奮性に及ぼす作用を、平成19年度はラット脳スライスにおけるドパミン放出に及ぼす影響と、VTAにおけるシナプス伝達への影響について検討した。生後1725日齢ラットからVTAおよびVTAドパミンニューロンの投射先である側坐核を含む脳スライスを作成しチャンバー内に静置した。人工脳脊髄液(aCSF)に0.550μMのpropofolを加算的に加え還流し、5分毎に分注した。後に高速液体クロマトグラフを用いてaCSF中に含まれるドパミンとセロトニンを定量した。ドパミンおよびセロトニンは検出可能であったが、propofolによるこれら神経伝達物質放出に及ぼす一定の影響は見出せなかった。また、当初計画していた炭素電極を用いたamperometry法による脳スライスに対する神経近傍のおよび側坐核でのドパミン遊離測定は、技術的に困難であり数回の試行の後断念した。また、生後1725日齢ラットからVTAを含む脳スライスを作成し、当研究室に導入された多点皿電極法を用いてpropofolがVTAでのシナプス伝達に及ぼす影響を細胞外電位記録法により検討した。条件設定に時間がかかったため結果をまとめるには至っていないが、ごく低濃度(0.5μM)のpropofolがVTAにおけるシナプス伝達をおおよそ25%程度増強することが明らかになった。現在より高濃度のpropofolによるシナプス伝達への影響を検討している。同時に同システムを用いて長期増強(LTP)を記録することに成功し、propofolのLTPに及ぼす影響を検討中である。本研究の一部は2007年北米麻酔科学会にポスター演題として発表した。
クラスレート,Ce及びYb化合物における新規熱電変換物質の探索

・Sr_8Ga_<16>Si_<30-x>Ge_xのカゴ体積はGe組成xの増加により3%増える。これに伴う格子熱伝導率の減少とゲストの振動エネルギーの低下とが強く相関することから,低エネルギーの非中心ラットリングが音響フォノンの散乱源であると結論した。・Ba_8Ga_<16>Sn_<30>のα相とβ相の単結晶育成に始めて成功した。β相の14面体中でBaは中心から0.43Åもずれた四つの位置を占める。低温の格子熱伝導率はタイプIクラスレートの中で最も小さい。その原因は,分裂サイト間のBaゲストのラットリング/トンネリングが音響フォノンを激しく散乱するためであると結論した。・超音波実験によって,Ba_8Ga_<16>Sn_<30>(α相),Sr_8Ga_<16>Ge_<30>,Eu_8Ga_<16>Ge_<30>では特定のモードの弾性率,超音波吸収において,数十Kで超音波分散を観測した。Ba_8Ga_<16>Sn_<30>(β相)では,全てのモードの弾性率,横波のモードの超音波吸収で超音波分散を観測した。この分散をラットリングに起因するとしてデバイ型モデルで解析し,それぞれの物質の特性となる緩和時間や励起エネルギーを決定した。・タイプIクラスレートの熱伝導率を統一的に理解するために,14面体中におけるゲストの可動長という量を導入した。既報17種類の化合物の150Kでの格子熱伝導率は,可動長が増大するにつれて直線的に減少することが判明した。この普遍的な関係は,ラットリングが格子熱伝導率を抑制していることを支持している。新規なクラスレート,Ce及びYb化合物を創製し,その熱電物性を研究した。1.電荷キャリア及びカゴサイズを制御したクラスレート単結晶の育成と熱伝導率抑制機能の解明Ba_8Ga_<16>X_<30>(X=Sn,Ge),Eu_8Ga_<16>Ge_<30>,Sr_8Ga_<16>(Si_<30-x>Ge_x)の良質単結晶をフラックス法で作製した。X=SnではVIII型に加えてI型の存在を発見した。比熱、熱伝導率、ラマン散乱、超音波吸収などの実験を実施した。その解析から,ゲストとカゴのサイズ差が大きいほどラットリング振動の非調和性が増加し,それが熱伝導を抑制することを明らかにした。特に1型のBa_8Ga_<16>Sn_<30>の熱伝導率は,これまでに報告されているI型の内で最小であることを見出した。2.希土類イオンを内包するクラスレート化合物の合成と磁気・熱電物性の研究Eu_8Ga_<16>Ge_<30>のGeを共有結合半径の小さなSiで置換することによって,カゴの体積を連続的に減少させることに成功した。この体積減少に伴ってEuの磁気モーメントが僅かに減少することを確認した。3.Ce及びYbを含む新規化合物の探索と熱電物性の研究4f電子と遍歴的3d電子を併せ持つ重い電子系化合物であるYbNiSi_3の良質単結晶を育成し,その磁性を磁場で抑制したときの量子臨界現象を調べた。磁気容易軸であるb軸方向に磁場を印加すると,8.5Tで反強磁性が消滅するが,非フェルミ液体的挙動は出現しなかった。これらの果を国際熱電会議及び日本物理学会で発表し、情報を収集した。
マルチパラメーターによる微量残存白血病の同定とその臨床意義の検討

本研究ではこれまて進めてきたpreB-急性リンパ性白血病(ALL)細胞における免疫グロブリン超可変部領域の多様性を利用した残存白血病(MRD)の同定を引き続き行うとともに、急性前骨髄球性白血病(APL)におけるPML-RARAキメラ転写物の検出によるMRDの検出も行い、それぞれの臨床的意義について検討した。また後者においては、mRNAを検体とした場合と、DNAを検体としたゲノムPCR法の両者に於ける特異性、感度もあわせて検討した。まず7例のALL症例において、腫瘍特異的CDR3シークエンスに基づき、腫瘍特異的プライマーまたはプローブを合成し、MRDの推移を、寛解導入療法後、地固め療法後、自己骨髄移植後の検体を用い半定量を行った(観察期間14年)。いづれの症例でも、寛解導入療法直後の寛解時では、高々21og程度の殺細胞効果にとどまるが、その後の地固め療法によりMRD量は減少し、地固め療法の有用性を支持した。一方、自己骨髄移植におけるexvivo purgingでは1-21ogの減少に留まった。7例中4例にその後再発を認めたが、いづれの症例でも再発の2-7カ月前のMRD検索では陰性であった。このことは、ALLにおけるMRD検索は治療効果を反映するが、再発の予知は困難であることを意味する。一方、APLにおけるRT-PCRによるAPL残存腫瘍の検出感度は10^<-5>であった。未治療例15例、再発・難治例12例について、残存腫瘍の検出を行った(観察期間837カ月)。未治療例では寛解導入後も10^<-3>レベル以上の残存腫瘍が残るが、地固め・強化療法中にRT-PCRは陰性化し、治療終了時には15例中12例で陰性化した。しかし再発・難治例12例では9例が陽性のままであった。予後との関係をみると、治療終了時に陽性であった14例では全例寛解を維持しているが、陽性であった13例中10例は再発した。またゲノムPCRの方が検体の安定性は勝るが、特性・感度ともmRNAを検体としたRT-PCRの方が優れていた。APLではMRDと予後とが相関し、ALLの場合と異なる結果となったことは、各々の細胞特性によるものであろう。
熱力学ガラス転移を示す統計力学模型の探索と特徴抽出

熱平衡状態において不規則に固まった状態である「理想ガラス相」を実現することを目標に掲げ、原子分子の運動と巨視的な物質の状態をつなぐ平衡統計力学にもとづいて、様々な数理模型を解析した。その結果、不規則なままに巨視的な重なりがあらわれる相を示す有限次元模型を構成することに成功した。その模型は転移点では潜熱を示す1次転移である可能性が高いが、さらに潜熱がでないランダム一次転移を示す有限次元模型も見出した。これらはいずれも世界で最初の発見であり、現実に存在するガラスの深い理解に向けた一歩となる。ガラス転移を示す統計力学模型の探索に関する試行錯誤を膨大に行った。交付申請書に記したBiroli-Mezard(BM)模型のクラスだけでなく、棒状分子模型やタイル模型など他の格子模型も調べた。その結果、以下の2点について、有意義な結果を得た。第一に、数値計算技術の進展である。BM模型に拘束条件付き格子ガス模型に広く適用できるモンテカルロ法の状態更新アルゴリズムを改良し、実際に、BM模型において,高密度領域で通常の方法よりも緩和時間が数百倍短くなることが示された。また、この方法を熱力学的ガラス転移が起こるランダムグラフ上のBM模型に適用し、密度変化に伴う位相空間の分割を数値的に検証することができた.現在、論文準備中である。第2に、「エントロピー密度がゼロにとどまる程度には秩序だった不規則な基底状態(不規則秩序状態)が無限個あること」がガラス系の必要条件だと考えるに至り、そのような不規則秩序状態を持ち、かつ、その基底状態と関係する相転移が生じる模型を提案した。この模型は、双対性によって転移点を決めることができるので、そのような相転移が存在することは間違いない。共存線上で無限個の秩序状態がありえるかどうかが論点になるところまでおいつめたが、ガラスの問題としては、まだ最終解答には至っていない。これは論文として出版されている。ワングタイルとよばれる辺に色がついたタイルをハードな拘束条件のもとで充填する模型を考察した。タイルの種類をうまく選ぶことにより、ほとんど全ての基底状態が不規則であることを厳密に示すことができる。しかし、その不規則な状態は有限温度では凍結しないことが示され、熱力学ガラス転移は存在しなかった。この解析をすすめることで、非常に広いクラスの2次元模型について、熱力学転移がないことが分かった。そこで、苦肉の策として、ひとつの方向については均一でそれに垂直な面には不規則充填を示す3次元模型を考察した。この模型は、不規則な配置でかたまることが大らかな議論で示すことができ、また、数値実験でもその証拠を得た。この結果は論文として出版された。ひとつの方向について均一な状態を持つので、それは目標としている熱力学ガラスではない。しかし、それでも、不規則な配置でかたまる相の秩序変数の定義の仕方やその統計力学的考察の核心について理解を深めていった。そして、ついに、不規則な基底状態とマクロな重なりをもつ相を示す模型の強い候補を構成することができた。数値実験では、見事な1段階レプリカ対称性の破れを示している。また、局所最小配置のエネルギー分布をランダムエネルギー模型に読み直すことでその現象論的な議論を展開した。これは、現在、論文投稿中である本研究課題の一つの大きな目標は、平衡状態の熱力学的なガラス転移を示す有限次元統計力学模型を構築することだった。スピングラス模型の平均場描像からは、ガラス転移は、潜熱が生じないまま重なりの秩序変数が不連続に出現するタイプの熱力学相転移として特徴付けられる。この相転移はRandom First Order Transition(RFOT)と呼ばれ、有限次元系でRFOTが実現する統計力学模型が探索されてきた。昨年までに、重なりの秩序変数が不連続に出現する熱力学相転移を示す有限次元模型を構築したが、その転移点では潜熱があることが数値的に観測されており、RFOTではない。そこで、様々な複雑な模型の構築を継続的に行ってきたが、極めて単純な方針でRFOTを示す模型を見出した。具体的には、クエンチされた乱れのある3次元ポッツグラス模型を考える。元来、実験系のガラス転移は外的な乱れの少ない状況でも起こるために、対応する統計力学模型は並進対称性を持つことが期待されるが、ここでは数理模型の構築を優先した。この模型の平均場極限ではRFOTが実現することが理論的に分かっており、純粋に有限次元のゆらぎに対するRFOTの頑健性の検証に焦点を絞ることができる。ところで、Cammarotaらによる議論(2013)では、3次元ポッツグラス模型ではRFOTは極めて起きにくいとされている。そこで、彼らの指摘する困難点を回避するために考えたのが、第三近接相互作用の導入である。大規模なモンテカルロ・シミュレーションにより調べた結果、有限温度でRFOTを示すことが明らかになった。

さらに、臨界指数の評価により、現象論的に示唆されているRFOT普遍性クラスに属することと矛盾しないことが分かった。この結果は、RFOTを基盤とする熱力学ガラス転移の理解へ向けた重要な一歩を提示しており、論文として公開する準備をすすめている。熱力学ガラスとは、平衡統計力学の範囲でブラッグピークがないままに並進対称性が破れる相である。有限次元系において熱力学ガラス相を示す数理模型を探索することが大きな目標のひとつだった。そして、昨年度の終わりに見出した模型について、今年度に詳しく調べ、その強い候補を与えることが分かった。これについては、論文として出版した。今年度に入って詳しく調べることで以下の点が明らかになった。1)見出した模型において、ガラス相への転移点近くの振る舞いを詳細に調べた。小さいサイズの範囲だが異なるサイズのエネルギーゆらぎのデータから有限サイズスケーリングを行い、2次転移ではなく潜熱をともなう1次転移である可能性が高いことになった。2)転移点近くの動力学を詳細に調べた。ランダム1次転移シナリオで期待されているような「中間領域でのプラトー」を示す温度領域は観測されず、不規則パタンへの凍結は相関時間の発散がないままに生じる。ただし、平衡への緩和時間は転移点近くで極端に大きくなっている。また、ガラスの平衡状態への緩和促進などを念頭において,詳細釣り合い条件に依らないマルコフ連鎖モンテカルロ法の開発を行った.モデルケースでの例から,秩序変数に共役な外場を確率的に振動させることにより,外場のない平衡状態への緩和が詳細釣り合い条件を緩めることにより短くなることを解析的に確かめることができた.さらに,ランダムグラフ上の格子充填問題において,レプリカ対称性の破れの実現とある種のアルゴリズムの適応限界が完全に一致することを解析的に示した.ガラス理論の基礎を与える可能性のあるレプリカ対称性の破れの予言をレプリカ法に頼らない観測量から検出した一つの例と考えられる.交付申請書で述べた研究計画は早々に実行したが、その方向では目的を達成することができなかった。しかしながら、理解の深まりとともに、新しい展開を見せ、熱力学転移を示す模型を構成することができたので、概ね順調だとみなしてよいだろう。25年度が最終年度であるため、記入しない。熱力学ガラスの模型を具体的に構成でき、それが論文として出版された意義は大きい。現在までに、有限次元空間において熱力学ガラスを示す候補として認知されているのは提案した模型だけである。実際、この問題に興味をもつ海外の先端的研究者からは、セミナーや議論の招待を複数受け取っている。しかし、その一方、候補にとどまっており、理論的な理解をさらにすすめる必要がある。また、転移のタイプが1次転移であるなど、「ガラス」の理想化としては不満足な状態である。今後は、その模型の簡単化するなど最小模型に向けていく一方、より強固な証拠を集める。また、動力学への展開を積極的に考えていく。研究計画を変更する必要はなく、熱力学ガラス相を特徴づける性質を積極的に暴いていく。
胃癌発症に関わる東アジア型ヘリコバクターピロリの新しい免疫学的診断法の開発と応用

日本人の胃癌発症にはHelicobacter pylori(H.pylori)感染性胃炎が深く関与している。しかしH.pyloriによる胃炎は胃癌の少ない欧米人にも高頻度にみられることから、欧米人に感染するH.pyloriと本邦に蔓延しているH.pyloriの違いが注目されてきた。最近になってH.pyloriが有する毒性因子CagAの構造が異なっていることが明らかになり、発癌性の差をもたらすものと推測されている。最近になってH.pyloriが有する毒性因子CagAの構造の違いが、発癌性の差をもたらすものと推測されている。これまでに我々は強毒型である東アジア型CagAを有するH.pyloriを特異的に認識するポリクローナル抗体の作製に成功しており、H.pyloriから抽出したDNAを解析して遺伝型を決定していた47例について、同一患者から採取された胃生検材料を用いて免疫組織化学の結果を比較した結果、DNA解析によるcagA遺伝子型と免疫組織化学の結果とは高率に一致しており、我々が開発した抗体を用いた胃生検組織の免疫組織化学的手法を用いたcagA遺伝子型の決定が有用である可能性を示唆した。また、H.pylori感染によって細胞内に注入されたCagAが感染後短時商で核に移行していることを明らかにした。これらの研究結果を学術論文として発表した(Can Sci.2007 April)。さらに、開発した強毒型東アジア型CagA抗体を用いた免疫組織化学的診断法の有用性を明らかにするためにより多数例(149例)で検討を行い、有用であることを証明し論文として投稿中である(Pathol Int 2008 in press)。私は、現在まで強毒型である東アジア型CagAを有するH.pyloriを特異的に認識するポリクローナル抗体の作製に成功しており、胃生検組織を用いた免疫組織化学で東アジア型CagAを有していると判断された胃炎患者について、塩基配列を検討したところ、感染しているH.pyloriのcagAはすべて東アジア型であり、両者は完全に一致していた。本研究で、先ず既にH.pyloriから抽出したDNAを解析して遺伝型を決定していた47例について同一患者から採取された胃生検材料を用いて免疫組織化学を行った。その結果、DNA解析によるcagA遺伝子型と免疫組織化学の結果は非常に高率に一致しており、我々が開発したポリクローナル抗体が胃生検材料を用いての免疫組織化学的手法を用いたcagA遺伝子型の決定に有用であることを証明した。また、H.pylori感染によって細胞内に注入されたCagAが感染後短時間で核に移行していることを明らかかにした。これらの研究結果を学術論文として投稿している。
MHCクラスII遺伝子を固定したヤギ系統の生産と抗病性育種への挑戦

1ヤギ系統の維持と生産MHCクラスIIハプロタイプをホモ型に固定した3系統についての計画交配により、各系統の個体数の増加と世代更新を行った。東京農業大学生物生産学部動物資源学研究室ではこのうち2系統につき、血漿および血球蛋白27遺伝座位の変異を検索し、PA-3およびAlpの2座位において多型を見出した。2系統における多型座位の割合および平均ヘテロ接合体率を算出したところ、それぞれ0.0740.037、0.02390.0049と、系統により斉一化に差異が生じていることを明らかにした。また同大学農学部家畜育種学研究室では3系統につきマイクロサテライトマーカーを使用した個体識別と親子判定を行った。様々な染色体上に存在する50種のマーカーを使用したところ、このうちMCHII-DRマーカーの単独使用、またこの他の18マーカーの組み合わせ使用により3系統のヤギの識別に成功した。また系統別に45マーカーの組み合わせで複数候補から父親を特定することを可能にした。3系統のヤギの平均ヘテロ接合体率は0.245から0.292で、これはザーネンの0.535より低く、シバヤギの0.253と同程度であった。2細菌性乳房炎発症におけるスーパー抗原の関与東京理科大学生命科学研究所では泌乳期の上記ヤギ乳房内にスーパー抗原を直接投与することにより、乳房炎様の臨床症状を誘導することに成功した。このとき乳腺T細胞はスーパー抗原依存的な活性化を起しており、これらのことから少なくともスーパー抗原を産生する黄色ブドウ球菌に起因する乳房炎に、同抗原が関与している可能性が示唆された。また現在までのところMHCクラスIIハプロタイプ依存的なTCRVβの偏りは認められていない。1)ヤギ系統の維持と生産1986年3月に東京農業大学農学部畜産学科家畜育種学研究室に韓国在来ヤギ(雄1頭、雌2頭)を導入し増殖した集団から、MHCクラスII遺伝子をホモ型に固定した3系統(A系、D系、E系)を作出するに至った。11年度はこの3系統について計画交配を行い、個体数の増加とあわせてクラスII遺伝子のモニタリングを行いながら世代の交配をはかった。一方1991年8月から同大学生物産業学部動物資源学研究室(北海道網走市)にこのうち2系統(AおよびE)を導入し、クラスII遺伝子を固定し、かつ寒冷地に適応したヤギ系統の造成を行っている。またクラスII遺伝子の系統に毛色を一致させる計画交配を行い、平成11年度はこのうちA系のホモ化と黒色毛を一致させるに至った。2)各種ブドウ球菌性スーパー抗原(sAg)ヤギ免疫細胞の黄色ブドウ球菌由来のsAgに対する反応性をin vitroにおいて解析し、sAg(SEA、SEBおよびTSST-1)は、ヤギ末梢リンパ球に対し極めて強い増殖誘導活性を持つが、この増殖誘導が見られたリンパ球はCD4陽性T細胞であり、sAgの種類により、それぞれ反応するCD4 T細胞レパトアーは異なり、それはT細胞レセプターVβ鎖に対し特異的であるとの知見を得た。またこれまでのところMHCハプロタイプの違いによるリンパ球の反応性に差はみられていない。1ヤギ系統の維持と生産平成11年度に引き続き、MHCクラスIIハプロタイプをホモ型に固定した3系統についての計画交配により、各系統の個体数の増加と世代更新を行った。一方東京農業大学生物産業学部動物資源学研究室においてはこのうち2系統の生物学的特性を分析し、遺伝的均一性について、血液タンパク27座位によれぱPpolyおよびHはそれぞれ0,074および0,027で、シバヤギと同レベルにあることを明らかにした。またこれらの結果は東京農業大学生物産業学部

動物資源が句研究室報告書としてまとめた。2ヤギリンパ球サブセットの解析東京理科大学生命科学研究所においてはハプロタイプが異なるヤギの系統毎に末梢リンパ球サブセットを解析し、その季節変動性についても調査した。その結果、系統ごとにはリンパ球サブセットに差異を認めながったが、αβT細胞およびB細胞の割合に季節変動性を認めた。3乳房炎発症と細菌性スーパー抗原との関連性スーパー抗原を直接ヤギ乳房内に単独投与するin vivo実験により乳房炎症状の誘導に成功した。このことよりスーパー抗原が乳房炎の発症要因であることを明らかにした。1ヤギ系統の維持と生産平成12年度に引き続き、MHCクラスIIハプロタイプをホモ型に固定した3系統についての計画交配により、各系統の個体数の増加と世代更新を行った。東京農業大学生物産業学部動物資源学研究室においてはこのうち2系統の温度ストレスに対する血液性状の変動を分析し、厳冬期(-2.4度)のアルブミンの減少、グロブリン、ASTおよびCPKの増加と、盛夏期(25.4度)のALPの上昇を見出した。このほか血球数、血小板、Ht値等15項目の検査値で厳冬期と盛夏期に有意差を認めた。またリンパ球サブセットはCD2+δγおよびCD2-δγが雄が雌より低く、雌雄とも冬季に低い事を認めた。2黄色ブドウ球菌性乳房炎発症機序の解明泌乳期の上記ヤギ乳房にスーパー抗原(SEB)を直接投与したところ、投与量2μg/kgで致死性のショックを、1μg/kgで体温と脈拍の有意な上昇、乳房の硬化、乳汁の凝集とTCRVβ遺伝子の発現レベルの上昇を認めた。これらのことからヤギ黄色ブドウ球菌性乳房炎発症に細菌性スーパー抗原が関与する可能性が示唆された。1ヤギ系統の維持と生産平成13年度に引き続き、MHCクラスIIハプロタイプをホモ型に固定した3系統についての計画交配により、各系統の個体数の増加と世代更新を行った。東京農業大学生物生産学部動物資源学研究室ではこのうち2系統につき、血漿および血球蛋白27遺伝座位の変異を検索し、PA-3およびAlpの2座位において多型を見出した。2系統における多型座位の割合および平均ヘテロ接合体率を算出したところ、それぞれ0.0740.037、0.02390.0049と、系統により斉一化に差異が生じていることを明らかにした。また同大学農学部家畜育種学研究室では3系統につきマイクロサテライトマーカーを使用した個体識別と親子判定を行った。様々な染色体上に存在する50種のマーカーを使用したところ、このうちMCHII-DRマーカーの単独使用、またこの他の18マーカーの組み合わせ使用により3系統のヤギの識別に成功した。また系統別に45マーカーの組み合わせで複数候補から父親を特定することを可能にした。3系統のヤギの平均ヘテロ接合体率は0.245から0.292で、これはザーネンの0.535より低く、シバヤギの0.253と同程度であった。2細菌性乳房炎発症におけるスーパー抗原の関与東京理科大学生命科学研究所では泌乳期の上記ヤギ乳房内にスーパー抗原を直接投与することにより、乳房炎様の臨床症状を誘導することに成功した。
鉄筋により曲げ補強する木造集成材の曲げ剛性に関する試験的研究

本研究は、木造集成材に細径鉄筋を簡易的に挿入・接着して曲げ補強し、集成材自体の曲げ剛性を増大させることにより、梁の長期荷重時の変形を小さくすること、また水平耐力発揮時の部材の変形を小さくする効果を明らかにすることを目的としている。曲げ補強は、集成材の制作過程において、ラミナ材に溝を加工しておき、そこへ細径鉄筋を挿入・接着し、鉄筋入りのラミナ材を制作した後、通常と同様に集成材を制作することで行った。鉄筋入りのラミナ材は曲げ縁側に設置した。研究計画は、補強を施さない集成材梁を比較試験体として、鉄筋で曲げ補強した集成材梁を3体制作し、2点集中形式の繰り返し加力実験を行った。鉄筋で曲げ補強した試験体は、D13の普通鉄筋で補強したもの、D16の普通鉄筋で補強したもの、D13の高強度鉄筋で補強したものを用意した。木材は杉材の異等級対称断面集成材でE65-F225を使用した。鉄筋の径と強度を試験体変数とした。実験結果は、今回の試験体では、D13で曲げ補強したものでは7375%、D16で曲げ補強したものでは116%曲げ剛性が増大していた。実験結果の曲げ剛性は、鉄筋コンクリート構造で用いられている評価方法で精度よく評価することができた。本研究の重要性は、通常の集成材を製造する過程に一工程を加えることで、簡易的に部材の曲げ剛性を約2倍にまで増大させることができることである。この手法では木材のクリープに関しても有効的であると考えている。部材の曲げ剛性を増大させ、クリープを抑えることで、長スパンの木造ラーメンの設計が可能となる。