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ケベック民法典における財産管理の一般法とその理論的基礎

そして、同インタヴューを踏まえ、本研究を総括し、「ケベック民法典における「他人の財産の管理」制度の法典化の意義について」金沢大学59巻2号117-155頁を公表した。まず本研究によって、1299条から1370条に及ぶケベック民法典第4編第7章「他人の財産の管理」の個々の規定の意義や立法背景が明らかにされた。なお、この条文検討はまだ概説的なものにとどまり、個々の規定をめぐる議論の詳細や、カナダ他州おけるコモンローとの関連については、いくつかの重要条文を取り上げて個別に検討する必要があることが明らかとなった。次に、個々の条文の体系化の視座として、従来、着目してきた権限(pouvoir)理論がケベック州内で一定の支持を得ており、その背景として、コモンローと対峙するうえで、大陸法上の概念が求められたことが確認された。その一方で、「他人の財産の管理」の章が財産編に設けられた理由は、インタヴューなどを通じて、積極的理由ではなく、従来から財産編に位置づけられてきた信託や充当資産との関連の深さが理由であったことが明らかとなった。以上を踏まえ、本研究ではケベック州内の文脈を超え、我が国のどのような議論につながるかを検討した。一つ目に「他人の財産の管理」を設ける法典論上の意義について、債権法改正における「役務提供契約」の重層型の規律や中間理論との相似性、二つ目に「自己の財産の管理」を基礎づける「権能」と目的的な権限(pouvoir)の区別の理論的要否について検討を加えた。本研究によりケベック民法典における第4編第7章の「他人の財産の管理」の個々の条文の意義とともに、その理論的基礎に権限(pouvoir)概念が据えられうることが明らかになった。また、ケベック民法典が財産編に設けられた理由としては、信託と充当資産との密接関連性があることが明らかになった。ケベック民法典が「他人の財産の管理」を包括的に規定した発想は、我が国の債権法改正における「役務提供契約」の総則的規定を設ける議論と通底するところがある。さらに、所有権理論や、自己の財産の管理を再検証する契機としての意義を有する。平成26年度においては、次年度の在外調査に向けて、国内文献を可能な範囲で渉猟したうえで、「他人の財産の管理」の制度概観の把握に取り組むことを課題としていた。研究の結果、国内文献はもちろんのこと、国内でケベック文献の入手が困難ななか、「他人の財産の管理」に関する極めて貴重な文献(とりわけ、John B. Claxton, Studies on the Quebec law of trustおよびM. Cantin Cumyn=Michelle Cumyn, L'administration du bien d'autrui, 2nd edition )を入手できた点は重要であった。これにより、「他人の財産の管理」の正確な制度把握が可能となったことに加え、次年度の在外調査において必要な作業を前倒しして行うことができた。また、平成26年度の研究について、北陸フランス法研究会において報告する機会を得ることができ、ケベック法の母法たるフランス法に造詣の深い諸専門家より貴重な示唆を得ることができ、また今後の課題を明確にすることができた。次年度はケベック民法典「他人の財産の管理」研究の総括を行うこととなる。それにあたり、これまでの国内調査および基礎理論をまとめあげるとともに、国内調査において欠落が残った部分についてケベックでの在外調査およびインタヴューを通じて補うこととする。
外国語活動との効果的な連携を通して言語能力の育成をめざす国語科学習の実践検証

1研究の目的から本研究の目的は,国語科と外国語活動との効果的な連携を図った教科横断的なカリキュラムによる学習事例を開発し,実証及び検証を通して,求められる言語能力(コンピテンシー)の育成・方途を明らかにするものである。そこで,まず本研究で育成する言語能力の具体化を図ることとした。2本研究で育成する言語能力(コンピテンシー)の具体化について本研究では,ことば(母語と第二言語)の機能を思考,伝達,創造の3つでとらえて,言語能力の具体化を図ることとした。具体的には,以下の3つで整理した。(1)創造性:ことばに関する課題について,筋道立てて表現したり,新たな自分の考えを創り出したりすることができる態度や能力。(2)協働性:ことばに関する課題について,目的や意図に応じて,相手を意識しながら自分の思いや考えを伝え合おうとすることができる態度や能力。(3)向上性:ことばに関する課題の解決を通して,自他の変容や高まり,ことばについての気付きを価値付けようとすることができる態度や能力。3授業-第2学年せかいの「三びきのくま」くらべ-実践について本実践ではイギリスの民話をもとに,日本や外国で再話された複数の「三びきのくま」を比べて読み,同じ様子でも様々に表すことができる日本語の多様性に気付く向上性をねらった。例えば,「his greatvoice」という原文の英語と「さけびました」,「ほえました」,「どなりました」と作者によって訳が違う日本語を提示し,それぞれのことばから受ける印象の違いを話し合った。その結果,同じ大きな声でも高い声,動物的な感じ,怒りの大きさなど場面の解釈によって,作者がことばを選んでいることに気付く姿が見られた。こうしたことばへの気付きは英語との比較によってとらえることができるものであり,国語科だけでは育成することの難しい言語能力である。また,英語の日本語訳は1つではないことや解釈によって多様な表現ができる日本語のおもしろさに気付く上でも価値があった。一方で外国語と関連させたからこそ育成できた言語能力をさらに具体的に示すことが今後の課題となった。
植物の紫外線耐性からみた垂直分布要因としての紫外線

本研究の当初目的は植物葉中のクロロフイル蛍光を、山岳の異なる高度に生育する同種植物や低地に移植されたそれら植物を用いて、環境要因として重要な紫外線との関わりを解析する予定であった。しかし、クロロフイル蛍光測定装置の入手のおくれ、また植物の生育最盛期における長雨とそのための低温によって、当初の計画に沿って研究をすすめることができなくなった。そこで、紫外線耐性としては紫外線除去機能という点で間接的ではあるが、紫外線吸収物質と紫外線の関係を、人工気象器内で育てた幼植物について調べた。オオバコでは、紫外線吸収物質として8成分が検出されたが、オオバコ幼植物からはそれらのうち6成分が検出された。1成は「プランタギニン」と同定されたが、他の1つは未同定である。この「プランタギニン」の生成能は高地由来の幼植物ほど高いことから、紫外線吸収物質の生成能は親植物の生育した紫外線環境に対応して、遺伝的である可能性が高い。ただし、この生成能は紫外線の存在下でのみ発現することから、紫外線に対してはきわめて適応的である。クロロフイル蛍光については、イタドリでは生育高度との関係は明らかではなかったが、モミジカラマツでは、高地に生育するものほど紫外線耐性は大であると結論された。山地帯に生育する5種のクロロフイル蛍光の解析から、垂直分布高度の上限が高いものほど紫外線耐性は大であると推測された。人工気象器内で育てられたオオバコ幼植物でも、高地由来のものの方が紫外線耐性は大になる傾向があった。紫外線傷害回避機能については、これの遺伝性と共に、一層の検討が必要であろう。研究課題遂行の主要機器である光合成酸素・クロロフィル蛍光反応測定装置の購入時期が、諸般の事情から著しく遅れる見通しとなったため、山岳域高所に生育する植物についての蛍光反応測定は時期的に不適当と予想された。そこで、紫外線耐性に生理的に関係するとされ、紫外線除去機能を持つとされるフラボノイド,アントシアン系の色素量について、生育高度との関係を調べた。紫外線量は海抜高度の増加につれて増加した。この紫外線条件のもとで、垂直的に広く分布するイタドリの色素量は海抜620m,1000m,1400mではほぼ同じであったが、海抜1900mでは増加した。オオバコの色素量はイタドリのほぼ半分であったが、高度的変化はイタドリと同じであった。乗鞍岳の高山帯海抜2700mで、モミジカラマツ群落の1部を萌芽直前に紫外線除去ビニ-ルフィルタ-で敝い、開花までのいくつかの生育期に、色素量,色素生成に関与したphenylalanine ammonialyase(PAL)活性などを測定した。フィルタ-で敝われたモミジカラマツは、成熟期まで萌芳直前の色素量のままで変化しなかった。しかし、被ふくされなかったものは萌芳と同時に増加して、その値が成熟期まで続いた。この色素量変化とPAL活性の間には、必らずしも平行関係はなかった。海抜620mのガラス室内(室外に対する紫外線量比はUVーAが75%,UVーBが20%)で、ほぼ10年間栽培し続けたモミジカラマツの色素量は、移植前の生育高度に応じて、低地から高地へ多くなった。しかし、ガラス室外の自然光にさらした時には、このような違いはみられなくなった。ガラス室内で栽培されたオオバコでも、生育高度による同様の違いがみられた。1、白色光のみのグロ-スキャビネット内で、原生育地高度の異なるオオバコの種子を発芽、生育させた幼植物に紫外線(AとB)を照射後に実験に用いた。〔UVーB吸収物質の検出〕ー葉から塩酸ーメタノ-ル可溶性物質を抽出し、UVーB域の吸光度を測定した。またこれら物質を薄尸クロマトグラフで分離、同定した。

吸光度から計算した物質の相対量は、紫外線照射も含めて種々の生育条件の間で、原生育地高度によって違いがなかった。しかし、生育地高度の増加につれて個体間の変異が大きくなった。プランタギンと同定された抽出物中の1成分は、強紫外線を照射した時にのみ、すべての高度のオオバコで検出された。また未同定の1成分は、紫外線照射した時に、これの強弱に関系なくすべての高度のオオバコで検出された。〔クロフィル蛍光〕ーオオバコ葉のクロロフィル蛍光の変化量は、600m産のものでは生育温度,UV照射に関系なくほぼ同しであったが、高所のものではいずれも対照より有意に大きくなった。蛍光最大値を基準にした蛍光変化率は原生地高度が高いものほど紫外線照射されたもので小さくなり、最大蛍光値が半減する時間は逆に長くなって、高所のものほど紫外線耐性が大であった。2.野外に生育する成熟植物のクロロフィル蛍光ー野外の異なる高度に生育していた同種の成熟個体で、紫外線照射8時間後の蛍光の減少の割合いは、イタドリでは生育高度と一定の関係がみられなかった。しかし、モミジカラマツでは、生育高度が高くなるにつれて減少の割合いが少なくなり、紫外線耐性が増加した。山地帯下部に生育する5種の草本では、垂直的にもっとも高所まで分布しているイタドリの蛍光減少がもっとも小さかった。ツユクサでは、陽地型の方が陰地型より顕著に小さかったが、亜高山帯の陽地型はさらに小さくなった。
規制緩和によって促進された金融機関の競争が個人利用者に与える影響の分析

本研究は、金融市場の規制緩和が個人に与えた影響を分析するものであり、はじめに金融機関店舗の分布の推移を市町村単位で集計した。データを分析することにより、店舗数は地域人口と面積からの影響が強く、他のデモグラフィックな変数は業態により影響の程度が異なることがわかった。それをもとに店舗が供給する金融サービスを測る指標を考案し、新な実証分析を進めている。ただし、個人年金保険市場の分析においては既に有効性が確認されている。現時点で、個人の金融サービス需要量は供給チャネルの密度から正の影響を受けており、地域によっては競争がむしろチャネルを減少させていることを明らかにできた。平成25年度の研究は、前年度までに得られた研究成果を論文としてまとめる作業から開始した。具体的には、2002年10月の銀行窓口販売解禁以降、国内及び外国生命保険会社が供給した個人年金保険の新契約件数と国内銀行店舗数との関係に変化がみられることを、2001年から2009年までの隔年都道府県データを用いて検証した。統計的分析における特徴は、保険会社の都道府県内契約金額シェアから算出したハーフィンダール指数と、本研究で新たに作成した金融機関店舗数を表す指標とを、説明変数に加えたことである。その結果、国内生命保険会社が供給する個人年金保険の新契約件数は、銀行窓販開始以降に銀行店舗数を表す指標から有意に正の影響を受けていることが示された。この結果は、既存の手法では得ることができず、本研究独自の発見といえる。同時に、2000年代後半は競争度が高い地域ほど契約件数が増えているという傾向も明らかになった。上記を含めて平成25年度前半までに得られた研究成果を国際学会で報告し、その議論を経て次の作業に取りかかった。まず、個人年金保険においては、主要な保険会社ごとにデータ期間を増加させてパネルデータを構築し、分析した。その結果、新契約件数と国内銀行店舗数との間に有意な正の相関が観測された保険会社がいくつか存在することがわかった。一方、既存研究では、個人年金保険は生命保険契約金額等で代理される遺産動機と負の相関があるとされるが、本研究ではその結論は得られなかった。続いて、金融機関の競争が体現される店舗分布に関する研究においては、市区町村レベルでの分析を進展させた。ゆうちょ銀行を除く銀行及び協同組織金融機関については、店舗を設置していない地域が多数あり、地域の店舗数を決定する要因を実証的に示す際、問題となっていた。そこで、これを打ち切りデータとしてトービット・モデルで推定し、OLS推定よりも高い説明力があることを確認した。平成24年度の主要な作業の一つは、本研究に関連する既存研究の整理と2000年代以降の金融機関店舗数及び金融サービス需給に関わる諸変数の地域ごとに区分されたデータベースの作成である。日本よりも早く金融部門の規制緩和が進んでいる欧米諸国の事例については、その影響を分析した研究が数多く報告されているため、所属研究機関が備える文献検索データベースを活用して効率的に整理を行った。本事業による助成を受ける以前に研究者が蓄積した成果を活用できるため、平成24年度に主に取り扱う対象は個人年金保険である。そこで、契約件数・金額に関するデータは、国内、外国生命保険会社、かんぽ生命、農業協同組合に分類して2001年から2010年までを都道府県レベルで整備した。個人年金保険について都道府県レベルで地域を細分化し、各地域での競争状況を分析した既存研究が存在しないため、保険会社の各都道府県内のシェアを求め、集中度を表すハーフィンダール指数を算出した。そして、業態ごとに銀行店舗数や集中度との関係を概観し、より高度な回帰分析を行うための準備作業を行った。一方、金融機関店舗に関するデータは、都市銀行(メガバンク)、地方銀行、第二地方銀行、信用金庫、信用組合、労働金庫の6業態を主要分類として、2008年度末時点で地域を市区町村レベルにまで細分して整理した。その他、地域の人口や世帯数、可住地面積、高齢者人口比率、事業所数等、金融機関の店舗設置に関係するデータを入手し加工した。これらのデータを基に店舗設置関数を推定する作業と、一つの店舗が供給する金融サービスの量を指標化する作業を行った。前者は特定の都道府県においては既存研究で行われているが全国レベルでは実績がなく、後者は既存研究自体がほとんどないものである。以上の研究実績の中で、まとまりをもって公表できるものに関しては、以下に示す学会報告等で公表した。本年度の研究において現時点でまとまった結果が得られているものは、農業協同組合が提供する年金共済に関する分析である。年金共済を保険会社が販売する個人年金保険と同等な商品とみなし、農業に関連する諸変数との関係、保険会社との競合関係について主に分析した。初めに共済及び個人年金保険の契約実績に加えて地域人口などの情報を用い、2001年度から2010年度までの10か年の時系列と47都道府県で構成されるパネルデータセットを作成した。

全データをプールして共済年金新契約実績と他の変数間との相関関係を調べると、地域の農業生産額、組合員数とともに強い相関関係は確認されなかった。また、主な保険会社の契約実績との相関を見ると、明確な負の相関を示す会社はなかった。このことから、農業協同組合の年金共済は、組合員以外に少なからず利用されている反面、保険会社と競合はしていないという仮説が立てられた。そこで、仮説を検証するためにパネルデータ分析を行った。世帯当たりの共済年金新契約実績を被説明変数として、地域人口に占める組合員数及び他の保険会社の世帯当たり新契約実績を含む説明変数によって推計した。これによると、組合員の比率について正組合員のみの場合、正組合員と准組合員の合計の場合、いずれについても回帰係数は統計的に有意とならなかった。また、生命保険会社の新契約の回帰係数で有意に負となるものはなく、競合性は観測されなかった。続いて、農業協同組合と生命保険会社との競合性に関する結果の頑健性を見るため、各生命保険会社の契約実績を被説明変数とし、農業協同組合の契約実績を説明変数に含むモデルの推計を行った。8社及び1グループに対して、新契約と保有契約に分けて検証したところ、新契約については1社、保有契約については2社、回帰係数が有意に負となった。これら3社はそれぞれ異なっており、現時点で明確な競合性は検出されていない。応用経済学平成25年度の研究実施計画は、(1)データベースの拡充、(2)統計的分析、(3)研究発表、(4)データの追加、である。預金取扱金融機関の店舗数に関するデータベースについては予定通り整備できた。しかし、それを用いた統計的分析を試みると、一部の仮説に対して頑健な結果を得ることができなかった。そこで、データを都道府県単位から市区町村単位に、精度を上げる方向で再整備することにした。そこで改めて地域に存在する店舗数が影響を受ける要因を探った。得られた結果は所属する研究会での発表、及びそこでの議論を経て学術論文として公刊した。データの追加は、個人生命保険と個人年金保険を予定していたが、主に後者のデータをより充実させた。具体的には、各保険会社単位での契約について、件数と金額、新規と保有による4種類で、2001年から2010年までの10期間を整備した。このデータベースについては、都道府県単位によるパネルデータ分析を行い、アジア太平洋リスク保険学会(Asia Pacific Risk and Insurance Association)の年次大会で結果を発表する機会が得られた。学会における議論を踏まえて研究結果は論文にまとめ、専門誌に投稿した。現在掲載審査が行われている。これに先立つクロスセクション・データを用いた分析についても論文を作成し、国内の学会誌から公刊した。ここまでについては、当初計画よりも進んで研究が実行されている。しかし、実施可能であれば行う予定だった金融機関へのアンケート調査は実行しなかった。
呼吸器画像診断学の病理学的基礎に関する研究

近年呼吸器X線診断学の進歩には著しいものがある。それを支える要因として撮像機器や感光材料の改良がある。特にX線CTの解像力の向上には瞠目すべきものがある。これらによって病態のより精密な描出が可能となり、それと共に肺標本の観察に基づく画像・病態対応の研究の進歩も見逃がせない。我々は昭和62,63年の両年に渡り肺末梢構造の基本的単位である2次小葉に着目し、これが各種のびまん性肺疾患の病態解析に重要であることを証明し、さらに2次小葉そのものの構造についても独自の研究を行なった。以下その成果を要約する。我々は過去10年間遂行して来た剖検肺の観察により肺の2次小葉と各種病変の進著が重要な関係を持つことを認識して来た。例えば炎症性病変が小葉間隔壁で阻止され隣接する健常小葉と明瞭な境を形成することは良く知っていたが、これが実際の臨床画像で描出されるかどうか不明であった。ところが高分解能CTにより類似の所見が細菌性肺炎、肺結核、肺梗塞、肺水腫、過敏性肺臓炎、DAD、BOOP、肺胞蛋白症で見られることが確認された。これらの疾患と対称的にUIPでは病変が小葉内で斑状に分布することを反映して小葉境界は明らかとならない。一方DPBも小葉中心部に粒状病変が形成され、それがCTで描出されることが判明して以来我々の研究にとり重要な疾患となっている。ところで肺の2次小葉には現在2種類の定義があり、これらが混同されて用いられている。Millerの小葉は小葉間隔壁で境され0.52cmの大きさがあり中に複数のReidの小葉を含むことが分かった。そしてMillerの小葉に含まれる細葉数は、従来多くのテキストが35個と誤まって記述しているのに反し320数個と幅があることを証明した。以上の研究により異なる立場から定義された2つの2次小葉はそれぞれに特徴があり、臨床画像の解析には両者とも有用であると結論した。多くのびまん性肺疾患が末梢肺を主要な病変の場とする.この場合一口に末梢肺と言っても肺胸膜下にも肺内部の区域気管支周辺にも分布する.特に肺内部に分布する末梢肺が主軸気管支とどう結び付いているのかについて多くの臨床医が疑問を持っている.その切っ掛けを造ったのがX線CTである.これにより肺内部の末梢肺病変が明瞭に摘出されるようになった.そこで今回の研究はX線CT読影の基礎を固める目的で気管支娘枝の解剖とその関連病変について剖検肺を対象に行なった.剖検肺は固定液で伸展固定されスライス後軟X線撮影と実体顕微鏡観察により分折された.肺門に最も近い娘枝(娘枝*)に注目するとそれが出現する親枝の頻度はiV>III>V>VI

>II次気管支の順であった.娘枝*の平均直径は2.0±0.5mm(n=185)で,親枝径との比は0.55±0.09(n=100)であった.娘枝*径とそれが支配する領域の最大径とは高い相関があった(γ=0.919, ρ<0.001).娘枝*は親枝からほゞ直角に分岐し,同じ側で支配域を広げつつ,縦隔面や葉間面,葉支や区域支の周囲に達した.娘枝*の支配域内にもRoidの2次小葉の存在が確認された.娘枝*に続く数次分枝は小葉外に位置した.X線CT読影に関係の深い代表的娘枝領域について責任娘枝*を同定した.たとえば気管背後に分布する末梢肺はB^1のV次分枝を親とする娘枝*の支配下にあった.右上葉支背後の末梢肺はB^2aから分岐する娘枝*の支配下にあった.以上の基礎的検討を基に疾患肺を用いて娘枝*関連を検討した.気腔性病変を示唆する空気気管支影(air bronchogram)は親枝を囲む複数の娘枝*支配域の含気消失で説明された.肺内部に発生した末梢型肺癌には主軸枝は関与せず,替りに複数の娘枝*が直接関与した.近年呼吸器X線診断学の進歩には著しいものがある。それを支える要因として撮像機器や感光材料の改良がある。特にX線CTの解像力の向上には瞠目すべきものがある。これらによって病態のより精密な描出が可能となり、それと共に肺標本の観察に基づく画像・病理対応の研究の進歩も見逃がせない。我々は昭和62、63年の両年に渡り肺末梢構造の基本的単位である2次小葉に着目し、これが各種のびまん性肺疾患の病態解析に重要であることを証明し、さらに2次小葉そのものの構造についても独自の研究を行なった。以下研究成果を要約する。1.びまん性肺病変のCT像とその病理学的背景高分解能CTの導入により剖検肺標本で認識される肉眼所見の一部が臨床的に観察可能となった。その代表例が小葉間隔壁による病変の境である。これが見易い疾患として小葉性肺炎、肺結核、肺胞蛋白症、びまん性肺胞領域損傷(ARDS)、BOOP、好酸球性肺炎、肺水腫、過敏性肺臓炎等が挙げられる。いずれも病変部が0.52cmの直線的境界で区切られ健常部とのコントラストは良好である。肺胞性、間質性の両方のタイプの疾患で認めた。2.肺小葉の構築について肺の2次小葉には現在2つの定義があり、どちらも臨床的に有用であるが混同されて使われている。我々は剖検肺標本のスライスを連続的にトレースし、小葉間隔壁で定義されたMillerの小葉と細気管支分岐形式によるReidの小葉の相互関係を明らかにした。それによるとMillerの小葉は0.52.0cmの大きさで中に複数のReidの小葉を含んでいる。そしてReidの小葉内の細葉数は35個であるが、Millerの小葉内には320数個の細葉が含まれることが証明された。
関節軟骨がアポトーシスを起こすメカニズム:NF-kB増強による顎関節炎の治療

1)ウェスタン法TNFαの存在下で、NF-kB阻害剤(Caffeic acid phenethyl ester(CAPE))で処理したUSACより全細胞タンパク質を抽出し、NF-kB、I-kBの発現量を比較し、その局在および発現様式を検索した。その結果、p65、I-kBともにTNF-αとCAPEを併用して処理した場合、蛋白レベルにおいてその発現が減少しているのが認められた。USACをTNF-α単独、またはTNF-αとCAPEを併用して処理し、30分後、60分後のNF-κBのサブユニットであるp65のmRNAの発現をRT-PCR法にて検索した。その結果、両者の間にmRNAレベルにおいては差が認められなかった。3)TUNEL法USACにおけるアポトーシスの発現を検索するため、USACをチャンバースライド上で培養、TNF-αおよびNF-κB阻害剤を併用して処理し、TUNEL法による染色を行った。未処理、TNF-α単独での処理では細胞の核はほとんど染色されなかったが、CAPEを併用して処理した細胞は核が染色され、アポトーシスが亢進していることが認められた。USACをTNF-α単独で処理した場合、蛋白レベル、mRNAレベルともにp65の発現に変化は見られなかった。しかしCAPEを併用して処理すると細胞はアポトーシスが亢進し、p65の発現の抑制が蛋白レベルにおいて認められた。また、以前CAPE単独での処理によりNF-κBを阻害することで時間、濃度依存的に細胞にアポトーシスがおこり、蛋白レベルにおいてもp65の発現の抑制が認められたことを報告しており、これらのことより軟骨細胞様細胞においてもNF-κBは、アポトーシスの抑制に働くことが示唆された。1)EMSA法による細胞質中、核中のNF-kBのDNAへのBinding Activityの測定:ヒト軟骨芽細胞様細胞(USAC)を炎症性サイトカインであるTNF-αの存在下で、アポトーシス誘導剤(抗癌剤:シスプラチン)およびNF-kB阻害剤(CAPE)にて24、48,72,96時間処理したのち、核抽出タンパク質(NE:nuclear extracts)、細胞質抽出タンパク質(CE:cytoplasmic extrats)を測定したところ、TNF-α処理によりNF-kBの活性は上昇し、また、シスプラチンを添加した場合はNF-kBの活性がさらに上昇した。しかし、CAPEの添加ではNF-kBの活性はほぼ抑制され、アポトーシスが促進した。これらより、ヒト軟骨細胞様細胞においてNF-kBはTNF-αによるアポトーシスを抑制する働きを持つことが分かり、また、その作用はアポトーシス誘導剤で増強し、NF-kB阻害剤でほぼ抑制されることが分かった。2)免疫染色によるNF-kB発現とIKK、I-kB発現の比較:TNF-αの存在下でアポトーシス誘導剤、NF-kB阻害剤で、24、48、72、96時間処理したUSACをNF-kB、IKK、I-kBの各抗体を用い、免疫組織化学染色したところ、TNF-α単独処理ではIKKおよびNF-kBの発現が認められ、I-kBの発現量は低かった。また、シスプラチン添加ではIKKおよびNF-kBの発現がTNF-α単独の場合と同程度認められたが、CAPE添加ではI-kBのみの発現が認められ、IKK、NF-kBの発現は抑制された。よって、ヒト軟骨細胞様細胞でIKKはI-kBに対して抑制的に働き、それによりNF-kBが活性化されることが分かった。そしてそれはアポトーシス誘導剤では変化がなかったが、NF-kB阻害剤ではIKKの発現が抑制されることによりNF-kBが抑制されることも分かった。
B型肝炎ウイルスXタンパク質によるミトコンドリア障害機構の解明

(1)Xタンパク質による電子伝達系阻害機構の解析これまでに、B型肝炎ウイルス(HBV)のX遺伝子導入細胞が産生するXタンパク質がミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアの膜電位の低下、ATP産生の減少、活性酸素生成等によりアポトーシスを引き起こすことを明らかにしてきた。得られた知見より、Xタンパク質はミトコンドリア電子伝達系を障害し、細胞死を誘発していることを推定した。そこで、Xタンパク質が電子伝達系のどのステップを障害しているのかを生化学的手法により解析した。ヒト肝がん培養細胞およびマウス肝臓より単離したミトコンドリアを用いたin vitro系に、大腸菌で発現させ精製したリコンビナントXタンパク質あるいはその変異体を加え、電子伝達系複合体の酵素活性を測定する方法を用い、電子伝達系のどの過程に作用しているかを直接的に調べた。(2)Xタンパク質のタンパク質導入ドメインの同定HBVXタンパク質はHIV TATタンパク質と同様に、培地に加えることによって細胞に導入されることを明らかにした。Xタンパク質の場合、感染細胞に隣接した細胞にもXタンパク質が伝播し、by stander効果による肝炎症状の増悪化をひき起こしている可能性もあり、タンパク質導入法によるその性質の解明は臨床面でも重要である。そこで、種々のXタンパク質の変異体を作成し、大腸菌で発現、精製し、導入に必要なドメインと、アポトーシスに関与するドメインの同定に成功した。タンパク質導入能を持つタンパク質は、HIV TAT以外にも今までに数多く報告されてきているが、これらタンパク質の多くはウイルスのタンパク質である。なぜウイルスタンパク質に細胞内導入能を持つものが多いかその理由は不明であるが、ウイルス性疾患を理解する上で興味深い。(1)Xタンパク質による電子伝達系阻害機構の解析これまでに、B型肝炎ウイルス(HBV)のX遺伝子が産生するXタンパク質がミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアの膜電位の低下、ATP産生の減少、活性酸素生成等を引き起こすことを明らかにしてきた。得られた知見より、Xタンパク質はミトコンドリア電子伝達系を阻害していることが推測される。そこで、Xタンパク質が電子伝達系のどのステップを阻害しているのかを生化学的手法により解析した。培養細胞およびマウス肝臓より単離したミトコンドリアを用いたin vitro系で、電子伝達系複合体の酵素活性を測定する方法を用いて、in vitro系にリコンビナントXタンパク質あるいはその変異体を加え、電子伝達系のどの過程に作用しているかを調べた。Xタンパク質の場合、そのタンパク質導入能は、感染細胞以外にもXタンパク質が伝播し、bystander効果による肝炎症状の増悪化をひき起こしている可能性もあり、その性質の解明は臨床面でも重要である。そこでさらに、Xタンパク質の変異体を作成し、大腸菌で発現、精製後、導入に必要なドメインの同定を行った。なぜウイルスタンパク質が細胞内導入能を持つのが多いかその理由は不明であるが、進化上興味深いことである。

ヒト肝がん培養細胞およびマウス肝臓より単離したミトコンドリアを用いたin vitro系に、大腸菌で発現させ精製したリコンビナントXタンパク質あるいはその変異体を加え、電子伝達系複合体の酵素活性を測定する方法を用い、電子伝達系のどの過程に作用しているかを直接的に調べた。(2)Xタンパク質のタンパク質導入ドメインの同定HBVXタンパク質はHIV TATタンパク質と同様に、培地に加えることによって細胞に導入されることを明らかにした。Xタンパク質の場合、感染細胞に隣接した細胞にもXタンパク質が伝播し、bystander効果による肝炎症状の増悪化をひき起こしている可能性もあり、タンパク質導入法によるその性質の解明は臨床面でも重要である。そこで、種々のXタンパク質の変異体を作成し、大腸菌で発現、精製し、導入に必要なドメインと、アポトーシスに関与するドメインの同定に成功した。
時空間波形整形超短パルス光による可変指向性THz波の発生

超短光パルスの時間および空間二次元の制御を達成した。超短光パルスの時間波形制御は回折格子対とレンズによる4f光学系に空間分解能をもつ位相変調器を組み合わせることで行える。本研究では4f光学系を二重に用いることで空間二次元と時間波形の同時制御を行った。空間分解能は約0.1 mmであり、これは二重4f光学系の配置による制約であり、改善が可能である。また、現在の位相変調器では時間波形のパターン数に制限はあるものの、当初の理論予測通りに制御が行えることが実証された。THz波発生については、シミュレーションにより時空間制御された光パルスによる指向性と空間分解能の確認を行った。レーザーを光源とする光発生技術は近年大きな進歩を遂げており、時間的に波形整形された超短光パルスや空間的に制御された光ビームが発生されている。しかし、光パルスの時間特性と空間特性を同時に制御する試みはほとんど行われていなかった。本研究では、光位相変調器を用いて時間と空間二次元の制御を行い、その応用として指向性と周波数が自在に可変なTHz波を発生することを目的とした。平成25年度は現有システムであるチタンサファイアレーザーシステムの超短パルス光を用いて、時空間波形整形パルスの評価光学系の製作を行った。和周波発生と光カー効果を用いた評価方法を比較した。2次の非線形光学効果である和周波発生の方が測定感度は高いが、観測される光パルスの運動量が保存される光カー効果が本研究では適切であることを明らかにした。測定領域を5mmほどに広げた場合でも十分な測定感度が得られており、光学系を最適化することで時間測定精度20 fs以下、空間分解能10μm以下が達成されたことを参照パルスの測定により確認した。時空間波形整形の光学系を、現有の光位相変調器を用いて構築した。まず、空間的には一次元の制御を行い光位相変調器の最適な制御条件を調べた。その結果、光位相変調器の歪み補正を改めて最適化する必要があることがわかった。評価光学系での測定結果をフィードバックすることで、目的とする時空間制御パルスの発生を行った。空間二次元の波形整形については空間一次元の波形制御から得られた字結果をもとに光学系の設計を行った。時空間波形整形による出力パルスの特性を考慮してTHz波発生光学系の設計を開始した。すでに基本設計と部品の購入は終了している。超短光パルスの時間および空間二次元の制御に初めて成功した。超短光パルスの時間波形制御は回折格子対とレンズによる4f光学系に空間分解能をもつ位相変調器を組み合わせることで行えることが広く知られている。しかし、空間を含めた制御は空間一次元の制御が報告されているだけであり、空間二次元の制御は従来の方法では不可能であった。本研究では、二重4f系というまったく新しい光学系を用いることで空間二次元と時間波形の同時制御を可能とした。超短パルス光源としては現有のチタンサファイアレーザーを用いた。内側の4f光学系は時間波形整形用であり、本研究では位相変調器ではなく強度変調による制御を行うマスクを利用した。外側の4f光学系が空間制御用であり、現有の二次元光位相変調器を用いて任意の制御を可能とした。時空間整形された光パルスの測定は、光カーゲートを用いた交差相関測定を行い、空間特性は購入したCCDカメラで検出した。開発された波形整形装置の空間分解能は約0.1 mmである。これは光学系配置の制約によるものであり改善が可能である。また、位相変調器の素子数の関係で時間波形のパターン数に制限はあるものの、当初の理論予測通りに二次元空間と時間の三次元制御が行えることが実証された。THz波発生については、本研究で得られる光パルスによりどのようなTHz波が発生されるかをシミュレーションにより検討した。その結果に基づいて、THz波発生および計測のための光学系の製作を行った。THzの発生と検出には非線形光学結晶であるZnTeを用いている。結果から、単色性や空間分解能をさらに高めるために必要な条件について検討を行った。本研究による方法では、THz波の掃引に機械的機構を必要としないため、高速かつ高精度の掃引が可能となることが大きな特徴である。光物性時空間波形整形パルスの評価光学系として、光カー効果を用いた十分な精度をもつ装置の開発に成功した。空間分解能が十分に得られるかが開発の鍵となっていたが、光カー効果を用いることとCCD検出器への結像を最適化することで、回折限界に近い分解能を得ることができた。

現有の光源のパルス幅が約150 fsであるため高い時間分解能は得られないが、ピーク時間の決定精度は20 fs程度となっている。非同軸光パラメトリック増幅器(NOPA)の出力である超短パルス光を用いれば10 fs以下の時間分解能も可能となる。評価光学系はリアルタイムでの測定が望まれるため、検出および解析の自動化を進めている。時空間波形整形器としては、現有の光位相変調器を用いて空間的には一次元を制御するシステムを構築した。光位相変調器の歪み補正を最適化する必要があったため当初予定よりも開発に時間を要したが、空間位置により時間特性が異なるパルスの発生にすでに成功している。具体的には、繰り返しおよびタイミングの異なるパルス列を空間的に異なる位置に集光することができる。ただし、空間的な分離がまだ不十分であり光学系の調整が残されている。開発した評価光学系の測定結果をフィードバックすることで光位相変調器を最適に制御する方法を開発中である。THz光の発生および計測については平成25年度中に発生を確認する予定であったが、開発がやや遅れている。開発中の時空間波形整形器の出力特性に合わせた光学系の設計はすでに終了しており、時空間波形整形器の調整が完了後に構築する予定である。平成25年度に得られた結果を基にして、空間的には一次元の時空間波形制御装置の最適化を達成する。得られた超短光パルスを用いてTHz波を発生する。発生には非線形光学結晶(ZnTe)を用いる。既に購入した自動ステージを用いて空間分解能をもつTHz波検出装置を製作し、一次元ではあるがTHz波の指向性が容易に制御できることを確認する。また、指向性制御と同時にTHz波の単色化と周波数制御が行えることも確認する。第二段階として二次元の空間制御を可能とする時空間波形整形器を製作する。ただし、本研究では簡易型の波形整形器とする。具体的には、液晶の二次元位相変調器ではなく、位相マスクを用いた波形整形を行う。この方法では任意のパルス波形の発生はできないが、本研究の目的である三次元時空間光パルス整形器の原理実証には十分である。発生したパルス列を光位相変調器を用いた空間的に制御することにより、三次元時空間光パルス整形を達成する。光パルス特性は製作した測定装置を用いて確認する。さらに、三次元制御された光パルスにより発生したTHz波の特性を調べる。三次元の時空間波形整形および指向性THz波発生について得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
電極接合多点アンカー部位を導入した被覆型オリゴチオフェン分子ワイヤの創製

本研究では単分子デバイスの実現を指向した拡張共役系化合物の創製を目的としている。この目的実現のため、金属電極と有機分子の接合部の局所電子状態を明らかにするのに適した分子、および、単分子の電気伝導特性を明らかにする目的に適した被覆型共役オリゴマーの創製に着目している。前者に関しては、電極との確実で強固な接合が可能なアンカー分子開発の観点から、申請者はこれまでに三脚型アンカー分子に着目して研究を行っている。今年度は従来の金-硫黄結合に置き換わる電極接合系開発の観点から有望視されているセレン官能基に注力して検討を行うため、セレノシアノ基、セレノール基を有する三脚型化合物の開発を行った。金基板に作製した単分子膜のサイクリックボルタンメトリー測定を行った結果、いずれのセレン官能基を用いた場合も金表面に吸着する事が明らかとなった。また、セレノシアノ基を用いた場合、セレンーシアノ結合が切断され、金-セレン結合が形成している事も明らかとなった。また、それぞれの単脚型アンカーと比較すると三脚型アンカーの方が吸着量が増加したことから金表面上で期待通り自立していることを示唆する結果が得られた。後者に関しては、昨年度までに、立体的に嵩高い置換基を効果的に共役平面の上下に配置できる分子設計に基づき、チオフェン環にフルオレン環を縮環させた新規被覆分子ユニットを開発しチオフェン3量体までの合成を達成している。今年度は鎖長を伸長させるための合成検討を行い、チオフェン6量体を得ることに成功した。得られたオリゴマーの被覆効果を化学的な手法で検証した結果、π電子に由来する強い分子間π-π相互作用は被覆置換基導入により完全に阻害出来たことが明らかとなった。この目的実現のため、今年度より金属電極と有機分子の接合部の局所電子状態を明らかにするのに適した分子、および、単分子の電気伝導特性を明らかにする目的に適した被覆型共役オリゴマーの創製に着手した。前者に関しては、電極との確実で強固な接合が可能なアンカー分子開発の観点から、申請者は三脚型アンカー分子に着目した。三脚型アンカー分子は、電極との接点が三カ所あるため、官能基と電極との結合が弱くても共同効果によって接合が可能であり、さらに、三脚型構造をとるため電極に対して垂直に自立する事が期待された。本研究では従来のチオール基に代わる新たなアンカー官能基の開発と同時にアンカー官能基による電極-分子間の接合能を系統的に明らかにするため、チオール基以外に、ピリジン環、アミノ基、カルボキシル基、エチニル基、セレノシアノ基を導入した三脚型化合物の合成に着手し、いずれも合成を達成した。後者に関しては、有用な分子ワイヤとして期待されているオリゴチオフェンに着目して被覆型分子ワイヤの開発を目指した。分子ワイヤの共役平面を被覆することで分子間相互作用による影響を排除できるため、単分子伝導特性が明らかとなる事が期待された。そこで、本研究では立体的に嵩高い置換基を効果的に共役平面の上下に配置できる分子設計に基づき、チオフェン環にフルオレン環を縮環させた新規被覆分子ユニットの開発に成功した。さらにこのユニットを基本単位に用いたオリゴマー合成の予備検討を行い3量体までの合成を達成した。
分化最適化させた骨髄間質細胞と人工マトリクスを用いた脊髄及び末梢神経損傷の治療

神経幹細胞を用いた脊髄再生の研究:ラット胎児の海馬および脊髄より神経幹細胞を採取し培養した。ラットの脊髄に挫滅損傷を与え、第4脳室の脳脊髄液中へ神経幹細胞を注入した。移植細胞は脳脊髄液に浮遊してクモ膜下腔を移動し、損傷部では脊髄実質へ遊走し、突起を出して宿主組織に組み込まれていた。免疫組織染色によりアストロサイトなどの中枢神経系の細胞への分化が観察された。しかし、ニューロンやオリゴデンドロサイトへ分化している細胞はほとんどなかった。骨髄由来の間質細胞を用いた脊髄再生の研究同じ方法で骨髄間質細胞を投与した実験でも損傷部への間質細胞の遊走が観察された。間質細胞を移植しなかった群に比べ組織学的に有意に損傷によってできる脊髄の空洞の体積は小さく、麻痺した行動の回復もよいことがわかった。つぎに、ラットの脳脊髄液を神経幹細胞のニューロスフェアーが浮遊しているシャーレに添加した。神経幹細胞は多数の突起を出しシャーレの底に付着していた。急性期脊髄損傷に対する培養自家骨髄間質細胞移植による脊髄再生治療の検討第I-II相臨床試験:<プロトコール>腸骨より骨髄海綿骨を採取し、細胞プロセッシングセンターで間質細胞の分離培養を行なう。培養間質細胞を腰椎穿刺の要領で脳脊髄液内に投与する。受傷後6ヶ月の時点での運動機能の回復量を主要エンドポイントとした。<症例>35歳男性。仕事中約7mより転落し、C5レベルの脊髄損傷、ASIAのAであった。脊椎の骨折整復を腸骨移植で行い、同時に腸骨より骨髄海綿骨を採取し培養増殖させた。受傷後13日目に腰椎穿刺の容量で骨髄間質細胞を脳脊髄液内に投与した。主要エンドポイントである運動機能のスコアーは8点から6ケ月後には17点まで改善した。ASIAの機能障害尺度はAのままであった。<症例>35歳男性。これまで神経幹細胞や骨髄間質細胞を保持する人工マトリクスとして、アルギン酸ゲルを用いてきた。神経損傷後の細胞の変質に注目し、腫瘍壊死因子(TNF : Tumor Necrosis Factor)を特異的に抑制するペプチドを開発し(K.kajiwara, et al., BAA,1699,131-137(2004))アルギン酸に添加した。このアルギン酸と神経幹細胞を脊髄損傷部と皮下に移植し、細胞の維持と分化に対する効果を検証した。方法妊娠16日目のラット胎児海馬より、細胞を取り出しB-27 supplement、bFGFを含む培地で2週間培養を行い、ニューロスフェアを形成させた。ニューロスフェアをpKH67で標識後、ペプチドを添加したアルギンサンゲルと混合し、生後4週目ラットの脊髄損傷部に移植した。移植後2,3,4週目に組織を取り出し蛍光顕微鏡で観察を行った。次に同様の方法で調整したアルギン酸ゲルを生後4週目ラット皮下に移植し、1週間後に観察を行った。結果移植後3週、4週目の脊髄ではTNFα抑制ペプチドを添加したアルギン酸ゲル中ではニューロスフェアが保持され、球状のニューロスフェアは菱形に成長していた。皮下移植後1週目においてもゲル中にニューロスフェアが保持されていた。考察TNFα抑制ペプチドを添加したアルギン酸は生体内でも神経幹細胞の分化を促進させると考えられた。また脊髄や皮下において細胞の保持に効果があった。

今後は、移植後長期の観察を行うことと、移植する細胞の量やアルギン酸の固さを調整して、細胞の保持や分化の効率を高める予定。1.人工コラーゲンを足場とする脊髄損傷治療法の開発これまで神経幹細胞の集合体であるニューロスフェアを細胞死抑制作用を持つペプチド、TNFRPを含むアルギン酸上で培養すると多数の軸索が伸長し、神経への分化が促進されることが報告された。ラットの脊髄を半切断しTNFRPを含むアルギンを担体にニューロスフェアを移植し、3週間後と4週間後に観察を行った。移植されたニューロスフェアはひし型に分化したように存在していた。また人工コラーゲンを担体にニューロスフェアを脊髄損傷部に移植した。これまで人工コラーゲンを脊髄損傷に用いるとアルギン酸と比べ神経の伸長がよくなかったことから、人工コラーゲンにTNFRPを添加し改良されたものを用いた。妊娠16日目ラット胎児の海馬より細胞を採取しB27supplementとbFGFを含むDMEM/F12培地で培養しニューロスフェアを形成させた。1週間毎に継代し採取3週間後にPKH67で染色し、人工コラーゲンゲルに混ぜラット脊髄損傷部に移植、7日後脊髄を取り出し蛍光観察した。アルギン酸の時よりニューロスフェアの直径が小さく分化はなかったが今後ペプチドの濃度を変えて検討する予定。2.新規ペプチドを含むヘパリン結合アルギン酸ゲルによる末梢神経の再生bFGFはヘパリン結合性の神経成長因子であるが、bFGFを含むヘパリン共有結合アルギン酸ゲルを末梢神経の切断部に移植すると神経の再生を促進することが確認された。次に新規bFGFペプチドを開発し、ヘパリン共有結合アルギン酸ゲルに含ませたもので末梢神経の再生を試みた。ラット坐骨神経に10mmのギャップを作り、新規bFGFペプチド+ヘパリン共有結合アルギン酸、およびbFGFペプチド+ヘパリン共有結合アルギン酸、ヘパリン共有結合アルギン酸をそれぞれ移植した。1ヶ月後、2ヵ月後に組織を取り出し観察した。<プロトコール>急性期脊髄損傷の治療を積極的に行っている関西医科大学高度救命救急センターに搬入された脊髄損傷患者の中でも比較的重症な患者を対象とする。脊椎整復手術では通常腸骨を脊椎骨折部に移植する。移植骨を採取する時に腸骨より骨髄海綿骨を採取し、細胞プロセッシングセンターで間質細胞の分離培養を行なう。培養により増殖させた間質細胞を腰椎穿刺の要領で脳脊髄液内に投与する。投与後経時的に機能回復、有害事象の発生等を調べる。受傷後6ヶ月の時点での運動機能の回復量を主要エンドポイントとした。<症例>35歳男性。仕事中約7mの高さより転落し、C5レベルの脊髄損傷を受傷し四肢麻痺、ASIAの機能障害尺度はAであった。NASCISIIにそってメチルプレドニゾロン投与を行った。脊椎の骨折整復を腸骨移植で行い、同時に腸骨より骨髄海綿骨を採取し細胞プロセッシングセンターで培養増Bさせた。そして、受傷後13日目に腰椎穿刺の容量で3.1×107個の骨髄間質細胞を脳脊髄液内に投与した。リハビリテーションは通常通り行われた。機能回復は6ヶ月目まで経時的に行った。
ニトロゲナーゼのモノクローナル抗体による反応機構の解析

ニトロゲナーゼは窒素固定を行う酵素であり、Component IとComponent IIとからなる。Component IIはComponent Iを還元するreductaseというべきもので、Component Iが中心的役割をはたしている。Component IはMo-Fe蛋白で種々の反応を触媒する。N、CNの還元はもとより、アセチレン(C_2H_2)、さらに基質が存在しないときには、H^+を還元し、H_2を発生する。このような種々の機能を持った蛋白のペプチド構造を変化させたとき、機能がどのように変化するかといううことを目的として、まずすでに取得したA,vinelandiiのComponent I(Mo-Fe蛋白)の変異(W-Fe蛋白)のペプチド部分をコードしているDNA領域(1,4Kb)をクローニングし、現在sequencingを行い、塩素配列を決定中である。決定した塩基配列を野生型のComponent Iの塩基配列と比較することで、ペプチドの一次構造のどこに変化がおこったためにMoのかわりにWを金属として要求するようになったかが明らかになると思われる。また、われわれはすでにComponent Iに対するmonloclonal抗体を数種取得しており、それらのうちのあるものはアセチレン還元活性を選択的に阻害しており、抗体の結合部位の差異が基質に特異的な反応阻害のパターンを作りだしていると考えられる。そこでこれらの抗体の抗原決定部位をComponent I分子上で同定することで種々の反応の活性中心等に関する知見が得られるものと期待される。そのため野生型A,vinelandiiのComponent Iのペプチド部分をコードするDNA領域を断片化してexpression vectorに組み込み、抗体を反応させて抗原決定部位の塩基配列を持つクローンのDNAをsequencingしたところ、アセチレン還元を阻害する抗体、H^+還元を阻害する抗体、両活性をともに阻害する抗体の3種の抗原決定部位が異なることを確認した。ニトロゲナーゼは窒素固定を行う酵素であり, Component IとComponent IIとからなる.Component IIはComponent Iを還元するreductaseというべきもので, Component Iが中心的役割をはたしている.Component IはMo-Fe蛋白で種々の反応を触媒する. N_2, CNの還元はもとより,アセチレン(C_2H_2),さらに基質が存在しない時には, H^+を還元し, H_2を発生する.このような種々の機能を持った蛋白のペプチド構造を変化させたとき,機能がどのように変化するかということを目的として,まずすでに取得したA.vinelandiiのComponent I(Mo-Fe蛋白)の変異(W-Fe蛋白)のペプチド部分をコードしているDNA領域(1.4Kb)をクローニングし,現在sequencingを行い,塩基配列を決定中である.決定した塩基配列を野生型のComponent Iの塩基配列と比較することで,ペプチドの一次構造のどこに変化がおこったためにMoのかわりにWを金属として要求するようになったかが明らかになると思われる.また,我々はすでにComponent Iに対するmonoclonal抗体を数種取得しており,それらのうちのあるものはアセチレン還元活性を選択的に阻害し,またあるものはH+還元を選択的に阻害するということを確認しており,抗体の結合部位の差異が基質に特異的な反応阻害のパターンを作りだしていると考えられる.それでこれらの抗体の抗原決定部位をComponent I分子上で同定することで種々の反応の活性中心等に関する知見が得られるものと期待される.そのため現在野生型A.vinelandiiのComponent Iのペプチド部分をコードするDNA領域を断片化してexpression vectorに組み込み,生成されたfusion proteinにmonoclonal抗体を反応させることで,抗原決定部位の塩基配列を持つクローンを選択し,その挿入DNA断片をsequencingすることで抗原決定部位を同定する作業を進行中である.ニトロゲナーゼは窒素固定を行う酵素であり、Component IとComponent IIとからなる。

Component IはMo-Fe蛋白で種々の反応を触媒する。N_2、CNの還元はもとより、アセチレン(C_2H_2)、さらに基質が存在しない時には、H^+を還元し、H_2を発生する。このような種々の機能を持った蛋白のペプチド構造を変化させたとき、機能がどのように変化するかということを目的として、まずすでに取得したA,vinelandiiのComponent I(Mo-Fe蛋白)の変異(W-Fe蛋白)のペプチド部分をコードしているDNA領域(1.4Kb)をクローニングし、現在sequencingを行い、塩基配列を決定中である。決定した塩基配列を野生型のComponent Iの塩基配列と比較することで、ペプチドの一次構造のどこに変化がおこったためにMoのかわりにWを金属として要求するようになったかが明らかになると思われる。また、我々はすでにComponentIに対するmonoclonal抗体を数種取得しており、それらのうちのあるものはアセチレン還元活性を選択的に阻害し、またあるものはH^+還元を選択的に阻害するということを確認しており、抗体の結合部位の差異が基質に特異的な反応阻害のパターンを作りだしていると考えられる。そこでこれらの抗体の抗原決定部位をComponentI分子上で同定することで種々の反応の活性中心等に関する知見が得られるものと期待される。そのため野生型A,vinelandiiのComponentIのペプチド部分をコードするDNA領域を断片化してexpression vectorに組み込み、抗体を反応させて抗原決定部位の塩基配列を持つクローンのDNAをsequencingしたところ、アセチレン還元を阻害する抗体、H^+還元を阻害する抗体、両活性をともに阻害する抗体の3種の抗原決定部位が異なることを確認した。