hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいヒト主要組織適合抗原(MHC)およびその遺伝子についての研究

新しいヒトHLAクラスI遺伝子のクローニングをするために, (1)マウスのQ4遺伝子特異的な190bpのDNAをプローブとして,あるいは(2)HLA-B7CDNAをプローブとして,ヒトのジェノミックライブラリーからクローニングを試みた. (1)の方法で得られたクローンからは,その発現をマウスL細胞に遺伝子移入した場合は確認できなかった.一方, (2)の方法で得られたクローンをマウスL細胞に遺伝子移入して,抗HLAクラスI単クローン抗体を使ってその発現を調べたところ,ヒトのhomozygote cell line LKT-2(HLAA2/2, B51/51, C-/-)からA2およびB51以外に1種類のクラスI遺伝子を,また正常人末梢血(A11/24, Bw52/52, Cw7/-)より作成したライブラリーより, A11, A24, Bw52, Cw7以外に2種類の遺伝子をクローニングすることができた.以上の3種類の遺伝子のうち2種類は, EchRI fragmentが7.6kbと大きく,またW6/32抗HLAクラスI抗体のbindingが弱く, C-locusに属するHLA抗原遺伝子と考えられ, C-blank遺伝子の可能性が示唆された.一方他のもう1つの遺伝子はHLA-A, B, C以外の遺伝子と考えられた. C-blank遺伝子の1つであるLKT-2-21のシークエンス解析をおこなったところ,そのcoding regionのアミノ酸配列はきわめてCw1と類似しており,わずかにα_1ドメインで3つ, α_2ドメインで2つのアミノ酸配列の置換がみられた.これらの5つの置換はすべてβシート上にあり,このことはβシートでの変化が,クラスI抗原の三次構造上のconformatialな変化をおこしていることを示唆している.しかし,この抗原特異的血清がみつからない理由は不明である.現在,他のC-blank遺伝子およびHLA-A, B, C以外の遺伝子のシークエンス解析をおこなっている.新しいヒトHLAクラスI遺伝子のクローニングをするために, (1)マウスのQ4遺伝子特異的な190bpのDNAをプローブとして,あるいは(2)HLA-B7CDNAをプローブとして,ヒトのジェノミックライブラリーからクローニングを試みた. (1)の方法で得られたクローンからは,その発現をマウスL細胞に遺伝子移入した場合は確認できなかった.一方, (2)の方法で得られたクローンをマウスL細胞に遺伝子移入して,抗HLAクラスI単クローン抗体を使ってその発現を調べたところ,ヒトのhomozygote cell line LKT-2(HLAA2/2, B51/51, C-/-)からA2およびB51以外に1種類のクラスI遺伝子を,また正常人末梢血(A11/24, Bw52/52, Cw7/-)より作成したライブラリーより, A11, A24, Bw52, Cw7以外に2種類の遺伝子をクローニングすることができた.以上の3種類の遺伝子のうち2種類は, EchRI fragmentが7.6kbと大きく,またW6/32抗HLAクラスI抗体のbindingが弱く, C-locusに属するHLA抗原遺伝子と考えられ, C-blank遺伝子の可能性が示唆された.一方他のもう1つの遺伝子はHLA-A, B, C以外の遺伝子と考えられた. C-blank遺伝子の1つであるLKT-2-21のシークエンス解析をおこなったところ,そのcoding regionのアミノ酸配列はきわめてCw1と類似しており,わずかにα_1ドメインで3つ, α_2ドメインで2つのアミノ酸配列の置換がみられた.これらの5つの置換はすべてβシート上にあり,このことはβシートでの変化が,クラスI抗原の三次構造上のconformatialな変化をおこしていることを示唆している.しかし,この抗原特異的血清がみつからない理由は不明である.現在,他のC-blank遺伝子およびHLA-A, B, C以外の遺伝子のシークエンス解析をおこなっている.マウスのQa領域にある遺伝子にあたるヒトの主要組織適合抗原遺伝子をクローニングするために、1.マウスのQa領域の遺伝子に特異的な190bpのDNAをプローブとして、2HLAB7cDNAをプローブとしてヒトのジエノミック・ライブラリーからのクローニングを試みた。まず1.の方法でのクローニングの可能性を検討するために、様々のヒト培養細胞および正常ヒト末梢血白血球からのDNAをサザンブロット法により検討したが、このプローブがハイブリダイズするバンドがみられた。一方クローニングされたHLAB7の遺伝子は、このプローブとほとんどハイブリダイズしないので、明らかにHLA-A,B,Cのの遺伝子とは別の遺伝子が存在することがわかった。そこで、正常人末梢血白血球のDNAからジエノミック・ライブラリーを作製して、この遺伝子のクローニングを試みた。現在のところ、190bpのこのプローブによって、1つのクローンがクローニングされておりその制限酵素地図を作製中である。この遺伝子がヒトのQa領域遺伝子に相当するかをさらに検討するために、次のことをおこなう予定である。(1)マウスL細胞に遺伝子移入してその発現と遺伝子産物を検討する。(2)この遺伝子を作って、各種ヒト培養細胞での発現を調べる。(3)cDNAを作製する。(4)塩基配列を決定し、HLA遺伝子およびマウスのQa遺伝子と比較する。一方、2の方法でクローニングしたクローンのうち、HLA-A,B,C,に属さないと考えられる遺伝子が、えられた。現在この遺伝子をマウスL細胞に遺伝子移入して検討中である。

昨年度,新しいヒトHLAクラス工遺伝子のクローニングをするために, (1)マウスのQa領域の遺伝子に特異的な190bpのDNAをプローブとして,あるいは,(2)HLAB7CDNAをプローブとして,ヒトのジェノミックライブラリーからクローニングを試み,その候補のクローンを得た.本年度は,これらのクローンをマウスL細胞に遺伝子移入し,その発現を調べたところ, (1)の方法で得られたクローンの発現は確認できなかった.一方, (2)の方法で得られたクローンをマウスL細胞に遺伝子移入し,抗HLAクラスI抗体を使ってその発現を調べたところ,現在認められていないHLA抗原を発現していると考えられるクローンを3個同定することができた.このうちのいくつかは, C-locusに属するが,血清で確認できないC-blankの遺伝子である可能性があるが,現在遺伝子のシークエンス解析をおこなっており,これにより,全く新しいHLAクラスI遺伝子かあるいはC blankの遺伝子が確認できると考えられる.
高いイオン伝導性を示す新規なカルシウムイオン伝導性固体の開発

2016年度にNASICON型構造を有する(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3が高いCa2+イオン伝導性を示すことを明らかにし、さらに2017年度にナシコン型構造を有する種々の2価イオン伝導体を開発した。これらの結果を踏まえ、2018年度は、Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3の開発を行った。Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3では、x=0.7までナシコン型構造単相試料が得られ、同組成において最も高いCa2+イオン伝導性を示すことが明らかとなった。Cz0.15Zr1.3Nb0.7(PO4)3の導電率は、母体であるCaZr4(PO4)6と比較して600°Cで約4500倍であり、2016年度に得られた(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3よりも約5倍高いCa2+イオン伝導性を示した。また、Ca2+イオン伝導の活性化エネルギーは46.7 kJ/molであり、(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3の55.8 kJ/molよりも低い値であった。これは、(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3の耐熱性(焼結温度)が1250°Cであるのに対し、Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3は1300°Cで焼結できたこと、および格子体積が大きくなったことから、粒内でのCa2+イオン伝導が容易になったためと考えられる。本研究では、高いイオン伝導性を示す新規なカルシウムイオン(Ca2+)伝導体の開発を目指し、三次元網目構造を有するナシコン型構造を選択した。高いイオン伝導性を実現するため、母体結晶に複数の高価数カチオンを含むHfNb(PO4)3を選択し、Hf4+イオンサイトをCa2+で部分置換した(CaxHf1ーx)4/4ー2xNb(PO4)3を合成した結果、Ca置換量(x)が0.05までは単相のナシコン型構造が得られたのに対し、xが0.05を超える試料では不純物相の生成が確認され、混相となることが明らかとなった。また、単相領域ではCa置換量の増加とともに導電率も単調に増加し、固溶限界組成である(Ca0.05Hf0.95)4/3.8Nb(PO4)3において最大の導電率を示すことが明らかになった。また、種々の酸素分圧雰囲気中での交流および直流導電率測定や直流電気分解法により、本試料は電子伝導や酸化物イオン(O2-)は伝導せず、Ca2+イオンのみが伝導していることを直接的に実証することに成功した。なお、本試料で得られたCa2+イオン導電率はこれまでに報告されている純粋なCa2+イオン伝導体と比較すると2桁以上高いだけでなく、伝導の活性化エネルギーも低いことから、ナシコン型構造を選択することでイオン伝導性に優れたCa2+イオン伝導体が得られることが判明した。一方、Hf4+と化学的性質のみならずイオン半径も近いZr4+を用いても単相のナシコン型構造が得られる可能性が高いことから、Hfの代わりにZrを用いた(CaxZr1ーx)4/4ー2xNb(PO4)3の合成を試みた結果、現時点では単相試料が得られなかった。平成28年度はナシコン型Ca2+イオン伝導体の合成とイオン伝導特性の評価を行う予定であり、当初の目的をほぼ達成できてた。また、当初はHfの代わりにZrを用いても単相試料が得られると予想していたが、現時点ではZrを用いた場合には単相試料が得られていない。化学的性質およびイオンサイズが似通っているにも関わらずZrの系で単相試料が得られていない理由は明確ではないが、本理由を解明することでより高いイオン伝導性の実現が期待されることから、初年度に一つの解決すべき課題が出てきたことは良い傾向であると判断する。平成29年度当初は、平成28年度で得られた(CaxHf1-x)4/4-2xNb(PO4)3よりも高いイオン伝導性が期待できる(CaxZr1-x)4/4-2xNb(PO4)3の単相試料の合成およびそのイオン伝導性の評価を検討したが、前年度と同様の手法では単相試料が得られなかった。そこで、Zrを含み2価のCaイオンを伝導種とするナシコン型固体電解質が合成できない原因を解明するため、伝導イオン種としてMg, Ni, Ba, Kを用いたナシコン型固体電解質の開発を行った結果、MgおよびKを用いた試料では4価カチオンとしてHf, Zrいずれを用いた場合でもナシコン型構造単相が得られ、Ni, Baを用いた場合にはHfを用いた場合のみナシコン型構造単相が得られることが明らかとなった。それら試料の構造およびイオン伝導性を詳細に比較したところ、イオン半径、価数に共通点はないこと、また単相試料が得られなかった系で見られた不純物相も一致しなかったことから、試料合成における原料カチオン比率や混合状態が単相試料を得るのに重要であるとの知見が得られた。

そこで、原料カチオン比率を変化させた場合の構造的変化を検討した結果、平成29年度末になりCa(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3の組成式においてナシコン型単相試料が得られることが明らかとなった。なお、Ni, K, Baを伝導イオン種とした試料について、そのイオン伝導性を評価した結果、いずれも高いイオン伝導性を示す新規なナシコン型固体電解質であることを明らかにしている。当初は、前年度より優れたCaイオン伝導体を開発する予定であったが、目的組成の試料が単相で得られず、原因解明のために伝導イオン種を変更した試料を合成した。その結果、目的とするCaイオン伝導体を得るための条件が明らかとなり、次年度の研究進捗に大いに役立つ知見が得られたが、当初の予定が達成できていないため。2016年度にNASICON型構造を有する(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3が高いCa2+イオン伝導性を示すことを明らかにし、さらに2017年度にナシコン型構造を有する種々の2価イオン伝導体を開発した。これらの結果を踏まえ、2018年度は、Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3の開発を行った。Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3では、x=0.7までナシコン型構造単相試料が得られ、同組成において最も高いCa2+イオン伝導性を示すことが明らかとなった。Cz0.15Zr1.3Nb0.7(PO4)3の導電率は、母体であるCaZr4(PO4)6と比較して600°Cで約4500倍であり、2016年度に得られた(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3よりも約5倍高いCa2+イオン伝導性を示した。また、Ca2+イオン伝導の活性化エネルギーは46.7 kJ/molであり、(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3の55.8 kJ/molよりも低い値であった。これは、(Ca0.05Hf0.95)40/39Nb(PO4)3の耐熱性(焼結温度)が1250°Cであるのに対し、Ca(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3は1300°Cで焼結できたこと、および格子体積が大きくなったことから、粒内でのCa2+イオン伝導が容易になったためと考えられる。当初の予定通り、平成29年度以降では、まずより高いイオン伝導性を示すナシコン型Ca2+イオン伝導体の開発を行う。また、平成28年度に明らかとなったZrを用いた場合に単相試料が得られない理由の解明および単相試料合成手法の確立を目指す。ナシコン型Ca2+イオン伝導体の開発に関して目途が立てば引き続き、未だ開発されていないペロブスカイト型構造を有し、高いイオン伝導性を示すCa2+イオン伝導体の開発に着手する。平成30年度(3年目)では、平成29年度末に得られたCa(1-x)/2Zr2-xNbx(PO4)3の組成で試料合成を行い、高いCaイオン伝導性の実現を目指す。また、主研究対象とはことなるが、同じく平成29年度の研究において発見した新しいナシコン型固体電解質についても物性測定を行い、ここで得られた知見を活かし、ナシコン型カルシウムイオン伝導体におけるさらなるイオン伝導性の向上を試みる。
ポリオキシテトラメチレンより成る光応答性および抗血栓性エラストマー

テトラヒドロフランの開環カチオンリビング重合,あるいはその重合体である末端に官能基を有するポリテトラヒドロフランを利用して,種々の機能性エラストマーの合成が可能であることを実証した.テトラヒドロフランのリビングカチオン重合において,分子量のコントロールと末端へのジメチルアミノ基の定量的な導入に成功した.また,オリゴマーの反応,いわゆる高分子反応において,溶媒その他反応条件の制限が低分子有機反応の場合に比べてかなり厳しいとはいえ,反応条件の探索により,多様な化学修飾が可能であった.アイオネン型ポリ(オキシテトラメチレン)がテトラヒドロフラン鎖に基づく疎水性セグメントとイオン点による親水性セグメントを有する両親媒性ポリマーであることを溶液物性から明らかにし,気体透過性で評価した.ビオローゲン単位を組み込んだポリ(オキシテトラメチレン)アイオネンの合成に成功し,フィトクロミズム,フォトメカニカルの挙動を実証した.これらアイオネンエラストマーはまた,優秀な力学的特性を示し,親水性をも有する新しい機能性エラストマーとして興味深い.ポリ(オキシテトラメチレン)セグメントにさらにポリオキシエチレン単位を導入したプレポリマーを合成し,これにより作製したセグメント化ポリウレタンウレアの生体適合性を, in vitroおよびin vivoの種々の試験,さらに補体系の活性化測定により明らかにした.補体活性化まで含めたこれだけ広範囲の試験に適合した生体医用材料は他にあまり例を見ないと思われる.さらに,ここで得られたポリウレタンは優れた力学的特性を示しており,オキシテトラメチレンより成るポリマーの優秀性を詳細かつ全面的に解明できたのではないかと考えている.残された課題として,光応答性に関してはフォトメカニカル挙動のメカニズムの解明,抗血栓性については機械的寿命の評価がある.テトラヒドロフランの開環カチオンリビング重合,あるいはその重合体である末端に官能基を有するポリテトラヒドロフランを利用して,種々の機能性エラストマーの合成が可能であることを実証した.テトラヒドロフランのリビングカチオン重合において,分子量のコントロールと末端へのジメチルアミノ基の定量的な導入に成功した.また,オリゴマーの反応,いわゆる高分子反応において,溶媒その他反応条件の制限が低分子有機反応の場合に比べてかなり厳しいとはいえ,反応条件の探索により,多様な化学修飾が可能であった.アイオネン型ポリ(オキシテトラメチレン)がテトラヒドロフラン鎖に基づく疎水性セグメントとイオン点による親水性セグメントを有する両親媒性ポリマーであることを溶液物性から明らかにし,気体透過性で評価した.ビオローゲン単位を組み込んだポリ(オキシテトラメチレン)アイオネンの合成に成功し,フィトクロミズム,フォトメカニカルの挙動を実証した.これらアイオネンエラストマーはまた,優秀な力学的特性を示し,親水性をも有する新しい機能性エラストマーとして興味深い.ポリ(オキシテトラメチレン)セグメントにさらにポリオキシエチレン単位を導入したプレポリマーを合成し,これにより作製したセグメント化ポリウレタンウレアの生体適合性を, in vitroおよびin vivoの種々の試験,さらに補体系の活性化測定により明らかにした.補体活性化まで含めたこれだけ広範囲の試験に適合した生体医用材料は他にあまり例を見ないと思われる.さらに,ここで得られたポリウレタンは優れた力学的特性を示しており,オキシテトラメチレンより成るポリマーの優秀性を詳細かつ全面的に解明できたのではないかと考えている.残された課題として,光応答性に関してはフォトメカニカル挙動のメカニズムの解明,抗血栓性については機械的寿命の評価がある.1.テトラヒドロフラン(THF)のトリフルオロメタンスルホン酸無水物によるリビングカチオン重合を行い、ジピリジン誘導体と反応させてビオローゲン構造を主鎖に含むアイオネン型ポリマーを合成した。ピリジン環が直接結合しているもの(PTV),ピリジン環の間がジメチレンのもの(PTS),およびビニレン基のもの(PTU)の三種が合成可能であった。2.PTV,PTS,PTUはアルコール溶液のキャストにより柔軟なフィルムに成形される。各フィルムを真空脱気下可視光照射を行った。PTVおよびPTUは無色あるいは淡黄色から、それぞれ緑色および赤褐色に変化し、空気に接触することにより元に戻った。すなわち、ビオローゲン単位の存在に基づくフォトクロミズムを示すことが判明した。一方、2つのピリジン環が共役していないPTSではフォトクロミズムは観測されなかった。3.今年度、新たに発見された現象はPTVとPTUのサーモクロミズムである。すなわち、両ポリマーフィルムを空気中加熱して昇温させることにより、190°C付近で光照射の場合と同様な色変化が観察された。4.前年度に合成された水酸基末端プレポリマーを用いてセグメント化ウレタンウレアの合成を行った。in vitroの血液適合性試験に加えて犬静脈への短期埋入法によるin vivo試験を行い、エチレンオキシド(EO)単位導入の効果を確認した。5.SPUUが優れた引張物性を示し、動的弾性率の温度分散からミクロ相分離構造を有すること、そして相分離状態が血液適合性と相関していること,応力緩和挙動および長期加水分解安定性についてもEO単位導入の効果が存在することなどが判明した。6.次年度は、ビオローゲン系ポリマーのクロミズムを更に追究し、全体のまとめを行う予定である。
低エネルギー放射光による薄膜界面近傍の残留応力測定

昨年度までに,(1)Cuとその被成膜面の表面エネルギーの違いにより,成膜時にCu粒子が付着した際の濡れ性が異なるため結晶子サイズが異なる.また,膜の成長にともない被成膜面の表面エネルギーの影響が減少し結晶子サイズが変化するため,膜厚方向に結晶子サイズの分布ができる。また,(2)完全に膜状となる数百nm以上の膜厚においても,発生する残留応力は結晶子サイズに依存する.つまり,今回測定した残留応力の主要因は結晶の接触時に発生する真性応力であることが明らかとなった.今年度の研究では,基板温度が結晶子サイズにおよぼす影響について検討するために,基板温度を昨年度の室温から200°Cに変更し,また,Al膜を新たな評価対象として加えた.これらの試験片を用いて,残留応力測定およびイメージングプレートを用いた結晶子サイズ観察を行った.その結果,Cu薄膜の膜厚100nmにおいては基板温度の上昇による結晶成長と,引張残留応力の低下が確認できた.Cu薄膜では膜厚50nm以下の残留応力測定および細束X線回折測定は困難であった.Al薄膜では,膜厚の増加により圧縮残留応力から引張残留応力へ変化することが確認できた.昨年度までに,(1)Cuとその被成膜面の表面エネルギーの違いにより,成膜時にCu粒子が付着した際の濡れ性が異なるため結晶子サイズが異なる.また,膜の成長にともない被成膜面の表面エネルギーの影響が減少し結晶子サイズが変化するため,膜厚方向に結晶子サイズの分布ができる。また,(2)完全に膜状となる数百nm以上の膜厚においても,発生する残留応力は結晶子サイズに依存する.つまり,今回測定した残留応力の主要因は結晶の接触時に発生する真性応力であることが明らかとなった.今年度の研究では,基板温度が結晶子サイズにおよぼす影響について検討するために,基板温度を昨年度の室温から200°Cに変更し,また,Al膜を新たな評価対象として加えた.これらの試験片を用いて,残留応力測定およびイメージングプレートを用いた結晶子サイズ観察を行った.その結果,Cu薄膜の膜厚100nmにおいては基板温度の上昇による結晶成長と,引張残留応力の低下が確認できた.Cu薄膜では膜厚50nm以下の残留応力測定および細束X線回折測定は困難であった.Al薄膜では,膜厚の増加により圧縮残留応力から引張残留応力へ変化することが確認できた.低エネルギーのシンクロトロン放射光を用いて,Cu薄膜の深さ方向残留応力分布測定を試みた.測定した回折線は,Cu220およびCu310であり,用いた放射光のエネルギーは,それぞれの回折面に対して,4.98keVおよび5.84keVとした.本研究では,放射光を試料に照射する角度を種々に変えることにより,試料への放射光の侵入深さを制御し,種々の深さまでのひずみデータを取得する.次いで,得られたデータにフィットするような深さ方向残留応力分布を最適化理論を用いて推定する.この方法をCu薄膜に適用した.また,以上から得られた残留応力と,従来からのX線応力測定法であるsin^2ψによって測定した残留応力との比較も行った.本年度得られた成果を以下に示す.(1)本研究で用いている深さ方向残留応力解析法では,応力分布の関数形を推定する必要がある.そこで,応力分布を直線,2次曲線,および3次曲線と仮定して,実験データ(2θ-sin^2ψ線図)にフィットする応力分布を求め,その結果から関数形を決定できることを示した.(2)2種類の回折線を用いて解析した結果,両者の深さ方向の応力分布は等しかった.したがって,求められた薄膜の深さ方向の応力分布は妥当である.(3)今回用いた方法により求めた残留応力とsin^2ψ法により求めた残留応力は大きく異なった.特に,薄膜と基板,または中間層との界面近傍ではsin^2ψ法により求めた値と比べ大きな引張残留応力が存在することがわかった.薄膜は集積回路の配線やMicro Electro Mechanical Systems(MEMS)の配線・構造材に用いられており,その用途は今後ますます拡大すると予想される.一方で,薄膜内には成膜時に残留応力が発生し,剥離やストレスマイグレーションなど種々の現象に影響を与えることが知られている.薄膜成膜時の基板温度や基板の電位,基板の材質など,基板の状態や性質は,発生する残留応力に影響を及ぼすと考えられ,基板の影響も含めた検討が必要である.基板温度や基板電位の影響については多くの報告があるが,基板すなわち薄膜が積層する被成膜面の表面エネルギーが残留応力に及ぼす影響については,十分な検討はなされていない.本研究では,基板上にCu薄膜を成膜した場合と,表面エネルギーが無機材料と比べ非常に小さなPolytetrafluoraethyren(PTFE)を基板上に成膜し,その上にCu薄膜を成膜した場合との,結晶子サイズの違いについて細束X線回折測定およびTransmission Electron Microscope(TEM)観察により検討した.そして,被成膜面の表面エネルギーと残留応力との関係,膜厚と残留応力との関係の説明を試みた.残留応力の測定には、低エネルギー放射光を用いて材料へのX線侵入深さを浅くし、基板が回折線に及ぼす影響を出来る限り小さくした。その結果,以下のことが明らかとなった.(1)Cuとその被

成膜面の表面エネルギーの違いにより,成膜時にCu粒子が付着した際の濡れ性が異なるため結晶子サイズが異なる.また,膜の成長にともない被成膜面の表面エネルギーの影響が減少し結晶子サイズが変化するため,膜厚方向に結晶子サイズの分布ができる。(2)完全に膜状となる数百nm以上の膜厚においても,発生する残留応力は結晶子サイズに依存する.つまり,今回測定した残留応力の主要因は結晶の接触時に発生する真性応力である.昨年度までに,基板の表面エネルギーが小さいほどCu薄膜の結晶子サイズが小さくなり,また,残留応力は結晶子サイズが小さいほど高くなることが明らかとなった.本年度は,まず,薄膜の厚さが異なる場合の結晶子サイズおよびその膜厚方向の分布と,残留応力との関係を実験的に検討した.次いで,残留応力の,基板表面エネルギー依存性と膜厚依存性の両者を,統一的なモデルで説明できるかどうか検討した.・試験片:昨年度までと同様に,シリコン単結晶基板,および,シリコン単結晶基板上にPTFEをスパッタにより形成したものの,計二種類の基板を用い,その上にCuのスパッタ薄膜を形成する.膜厚を0.5mmから3mmまで数段階で設定した.・結晶子サイズ観察:透過電子顕微鏡により,薄膜内の膜厚方向の結晶子サイズ分布を検討した.・残留応力測定:X線回折を原理としたsin^2ψ法により残留応力を測定した.なお,実験室のX線管球から発生するX線では,薄膜においては輝度(フラックス)が足りないため,シンクロトロン放射光を用いた.ただし,ビームエネルギーは5keV前後の低い領域を用いて,基板からの散乱X線を低減し,高精度な残留応力測定を行った.・解析:真性応力モデルを用いて,Cu薄膜の残留応力における基板表面エネルギー依存性と膜厚依存性の両者を統一的に説明できるかどうか検討した.以上から,以下の結論を得た.(1)Cuとその被成膜面の表面エネルギーの違いにより,成膜時にCu粒子が付着した際の濡れ性が異なるため結晶子サイズが異なる.また,膜の成長にともない被成膜面の表面エネルギーの影響が減少し結晶子サイズが変化するため,膜厚方向に結晶子サイズの分布ができる.(2)完全に膜状となる数百nm以上の膜厚においても,発生する残留応力は結晶子サイズに依存する.つまり,今回測定した残留応力の主要因は結晶の接触時に発生する真性応力である.(3)被成膜面の材質あるいはCu層の膜厚によって,Cu層の残留応力が異なるという実験結果は,被成膜面の表面エネルギーの違いに起因する結晶子サイズの違い,およびその膜厚方向の分布の違いから説明できる.
自律神経系を介した新たな視神経再生のメカニズムの解明

本研究により、自律神経作動薬の一種であるα2アドレナリン作動薬の腹腔内投与により成熟ほ乳類の視神経が再生させることが可能であることが明らかとなった。麻酔下のラットの視神経を挫滅させ、α2アドレナリン作動薬であるキシラジン、クロニジンの連目投与を行い、挫滅後2週目の視神経内では、順行性標識された挫滅視神経繊維が中枢側へ再伸展していた。α2アドレナリン受容体拮抗薬であるアチパメゾールを前投与させると、作動薬による視神経再生効果は顕著に抑制されていた。このα2アドレナリン作用薬による視神経再生効果のメカニズムを明らかにするため、視神経挫滅後の網膜内での神経栄養因子の発現をRT-PCR法を用いて検討すると、ciliarv nerve growthfactor(CNTF)が上昇していることが分かった。次に、CNTF蛋白の発現を免疫組織化学により検討すると、キシラジンあるいはクロニジン投与3日後の網膜内において、ミューラー細胞にCNTFが発現上昇していることが明らかとなった。また、α2アドレナリン受容体の3つのサブタイプの網膜内における局在を免疫組織化学にて検討すると、α2b受容体がミューラー細胞に発現していることが分かった。さらに、培養ミューラー細胞の培養液中にキシラジンあるいはクロニジン溶液を添加させると、添加後6時間目にはCNTFmRNAの発現上昇がみられた。以上の結果より、α2アドレナリン作動薬による視神経再生効果は、ミューラー細胞に発現してるα2b受容体を介して、ミューラー細胞内のCNTF発現上昇が強く関与していることが示唆された。ラット左視神経の挫滅直後から、α2アドレナリン作動薬であるキシラジン、クロニジンを連日腹腔内投与すると、挫滅後14日目の視神経内において、順行性標識された視神経線維が中枢側へ再伸展された。また、軸索再生のマーカーであるGAP-43の発現も、α2アドレナリン作動薬投与により視神経・網膜において上昇していた。さらに、α2アドレナリン受容体拮抗薬の前投与により、軸索再生効果が抑制されるか否かを検討したところ、キシラジン、クロニジンともに軸索再生効果は有意に抑制された。α2アドレナリン作動薬による軸索再生の作用機序を明らかにするため、RT-PCR法を用いてこれまでに報告されている軸索再生促進効果のあるCNTF, BDNF, FGF-2のmRNAの発現レベルを検討した。その結果、CNTFの発現レベルが挫滅後早期から上昇していることが明らかとなり、免疫染色にてCNTFの発現上昇はミューラー細胞に強くみられた。これらのCNTFの発現上昇は、アドレナリン受容体拮抗薬により、顕著に抑制された。さらに、α2アドレナリン受容体の局在に関しては、α2B受容体が正常網膜のミューラー細胞に発現していたため、以上の結果から、α2アドレナリン作動薬投与により、網膜ミューラー細胞のα2B受容体を介したCNTFの発現上昇が誘発され、軸索再生に至った可能性が示唆された。現在、培養ミューラー細胞を用いて、軸索突起伸展の促進物質の検討を行っている。
カチオン輸送性P‐型ATPaseにおけるイオン輸送ドメインの同定

本分担研究では、イオンポンプのうちサブユニット組成が単純なNa/K-及びCa-ATPaseに着目し、これらイオンポンプ間の“キメラATPase"を用いた分子生物学的、電気生理学的手法、及び原始間力顕微鏡(AFM)を用いた形態学的手法使って、機能ドメイン(特にイオン輸送ドメイン)の同定を目指す。これまでに以下のことがらを明らかにした:(1)Ca-ATPaseには、Ca-感受性部位以外に、Na-及びK-感受性部位が存在し、ATPase活性、イオン輸送活性に重要な役割を果たしている(雑誌論文1、図書2)。(2)Na/K-ATPaseの疎水性領域とCa-ATPaseの親水性領域とから構成されたキメラはK-イオンを内向き輸送する。従って、疎水性膜貫通領域には複数のイオン結合部位が存在し、これらが共同してイオン輸送に関与するものと考えられる(原稿準備中)。(4)新しいP-型ATPase4種を含む計12種のP-型ATPase遺伝子をテトラヒメナからクローニングした(雑誌論文2)。(5)ニワトリとショウジョウバエのNa/K-ATPaseにおいてもFoF1ATPaseのFo(H-ポンプ)においてもpore構造が存在することを示し、Foのサブユニット構造も提唱した(雑誌論文3)。(7)DNA-タンパク質複合体を用いてAFMの定量的解析に於ける応用性を確立した。タンパク質の大きさの決定、重合度の検討、特異的高次構造の検出等にAFMは有効であることが明らかになった(雑誌論文4と5)。
3次元組織学的解析法を用いた顎外力の下顎骨への影響に関する研究

成長期の骨格性反対咬合の治療に多用されるchincap装置は、下顎骨の後方移動および下顎骨の成長抑制効果を目的として利用され、その作用機序については様々な方面から研究がなされている。しかしながら、現在までの研究の多くは二次元レベルでの検索でありchin cap装着後下顎骨に生じる初期変化についての報告もわずかである。それで今回我々は、ウイスタ-系ラット35匹に対して(35日齢、雄)chin cap様装置を装着して片側10gの力で下顎を後方に牽引し、装着後初期の下顎骨の骨改造現象を三次元解析システムを用いて経時的かつ三次元的に検索するとともに、顕微X線装置および時刻描記法とにより下顎骨形態の変化をX線学的かつ組織学的に検討した。まずX線装置を用いたセファログラムの結果では、装着後初期に下顎切歯の挺出がみられ、その後下顎骨自体に歪みが生じて下顎骨体前方部に上方への力が作用し、下顎骨はcounter clockwiserotationをおこして下顎骨の前下方への成長が抑制されていることが推察された。次に組織学的所見をみると、関節頭では経時的に関節頭全体で軟骨層が薄くなり、下顎枝部分の骨梁も疎で配列が不規則となって、下顎頭および下顎枝における細胞増殖が抑制されていると考えられた。一方顎角部では、時刻描記により下縁部の骨添加がほとんどみられず、咬筋付着部移行部付近において外側方向に活発な骨添加が認められた。最後に三次元解析装置を用いた結果についてみると、関節頭中央部ではやや陥凹がみられ装着期間が長くなるに従って陥凹は深くなっていく傾向にあった。これは組織学的所見により推論したことを裏ずけるもので、関節頭上方部の形態はchin cap装着により変化していることがより明確になった。本研究の目的は、成長期の骨格性反対咬合の治療に多用されるChin cap装置の作用機序の解明にある。Chin cap装置は歯槽骨、顎角部のみならず下顎骨全体に影響を及ぼすと報告されてはいる。現在までは組織学的手法によるものが主であり、内容も2次元レベルの検索に留まっている。今回、Chin capの顎骨に対する影響を3次元的にとらえるため、3次元画像解析システム、顕微X線装置を用いることとした。まず、成長期ラット(35月齢、20g)を実験群と対象群に分け、実験群にChin capを装着した。両群にテトラサイクリン、カルセイン、アリザリン・レッドの3種のラベリング剤を0日、10日、20日に投与し、経時的に骨のラベリングを行った。Chin cap装着30日後にト殺し、ポリエステルレジンに包埋した。現在、両群の連続切片を作成し、63年度購入の顕微X線装置を用いて石灰化度の動きを検討し、同年度購入の3次元解析システムにて下顎骨の骨改造現象を立体構築している。その結果、Chin capから受けていると予想される応力分布に応じ、下顎骨全体の骨改造に変化が生じていることがわかった。特に下顎角部の咬筋付着部でその変化は最も著明で、下顎骨体、下顎枝までChin capの影響が及んでいた。成長期の骨格性反対咬合の治療に多用されるchincap装置は、下顎骨の後方移動および下顎の成長抑制効果を目的として利用され、その作用機序については様々な方面から研究がなされている。

それで今回我々は、ウイスタ-系ラット35匹に対して(35日齢、雄)chin cap様装置を装着して片側10gの力で下顎を後方に牽引し、装着後初期の下顎骨の骨改造現象を三次元解析システムを用いて経時的かつ三次元的に検索するとともに、顕微X線装置および時刻描記法とにより下顎骨形態の変化をX線学的かつ組織学的に検討した。まずX線装置を用いたセファログラムの結果では、装着後初期に下顎切歯の挺出がみられ、その後下顎骨自体に歪みが生じて下顎骨体前方部に上方への力が作用し、下顎骨はcounter clockwiserotationをおこして下顎骨の前下方への成長が抑制されていることが推察された。次に組織学的所見をみると、関節頭では経時的に関節頭全体で軟骨層が薄くなり、下顎枝部分の骨梁も疎で配列が不規則となって、下顎頭および下顎枝における細胞増殖が抑制されていると考えられた。一方顎角部では、時刻抽記により下縁部の骨添加がほとんどみられず、咬筋付着部移行部付近において外側方向に活発な骨添加が認められた。最後に三次元解析装置を用いた結果についてみると、関節頭中央部ではやや陥凹がみられ装着期間が長くなると従って陥凹は深くなっていく傾向にあった。これは組織学的所見により推論したことを裏ずけるもので、関節頭上方部の形態はchin cap装着により変化していることがより明確になった。
電子状態理論による複核錯体の還元的脱離反応の反応機構の研究

錯体の環元脱離反応(又は逆反応である酸化的付加反応)はC-HやC-C結合の生成(切断)の触媒反応の重要な素反応であり、その反応機構の理論的研究は触媒設計のための基礎的知見を得る上で興味が持たれる。特に複核錯体ではいくつかの反応経路が考えられ、それぞれの経路を特徴づける電子的要因を明らかにすることが本研究の目的である。本研究では、中心金属の非結合性d電子の役割に注目した。系としてはPt【H_2】(μ【-H_2】P【CH_2】P【H_2】)をとり上げ、まず、1中心脱離のモデルとしてPt【H_2】【(PH_3)_2】の【H_2】脱離反応の反応経路にそって非結合性d電子のエネルギーを非経験的MO弦で解析した。反応経路はGoddardらがすでに発表しているのを用いた。非結合電子のエネルギーは、電子が配位子上に非局在化できないという制限をつけることによって持たらされる不安定化エネルギーを求めるもので、Pt【H_2】【(PH_3)_2】では08個までの電子を中心金属に局在化させても不安定化エネルギーは小さいが、10個局在させると約140kcal/mol不安定になることから、2の錯体では非結合性d電子の数は8であるという結果が得られ、形式酸化数から求められる非結合性d電子数に対応している。反応経路にそって同様の解析を行ったところ、6個の電子は反応を通じてほとんど変化せず非結合のまま止まっているが、残り24個の電子は大きく結合交代に関与していることが分った。この反応は形式的には2電子酸化反応であるが、本計算から、さらに2電子が重要な関与をしていることが分った。今後、この解析法を2中心脱離反応の経路にも適用して、両経路を比較することにより非結合性d電子の役割を明らかにしてゆく予定である錯体の環元脱離反応(又は逆反応である酸化的付加反応)はC-HやC-C結合の生成(切断)の触媒反応の重要な素反応であり、その反応機構の理論的研究は触媒設計のための基礎的知見を得る上で興味が持たれる。今後、この解析法を2中心脱離反応の経路にも適用して、両経路を比較することにより非結合性d電子の役割を明らかにしてゆく予定である
ヒトSRP 7S RNAと枯草菌scRNAの機能相関に基づく枯草菌蛋白質分泌系の改良

枯草菌および類縁菌は非常に高い蛋白質分泌能を持ち、洗剤用プロテアーゼや澱粉糖化用α-アミラーゼの工業的な生産菌として利用されてきている。この高い蛋白質分泌能を維持するためには何か特別の蛋白質分泌装置を内在させている可能性が考えられる。一方高い分泌能を遺伝子工学的に利用して、ヒト血清アルブミンやインターフェロンなどの有用蛋白質を分泌させる試みが数多くなされてきた。しかし真核生物に由来する蛋白質の遺伝子を枯草菌に導入した場合、その遺伝子は発現しても遺伝子産物が培養液中に蓄積することには成功していない。またこの目的のために多くのプロテアーゼ欠損株が開発され、培養条件なども詳しく解析されたが、どの場合も充分には目的を達していない。そこで本研究では、枯草菌に含まれるシグナル認識様粒子(SRP-like particle)に着目し、第一に枯草菌の蛋白質分泌装置の特色を解析し、第二にその結果を基礎に菌の改良を行うことを目的とした。ヒトSRPの構成成分の一つであるSRP 7S RNAは300ヌクレオチドから成り、また大腸菌におけるその類似RNAである4。5S RNAは114ヌクレオチドから構成される。しかし枯草菌scRNAは271ヌクレオチドからなり二次構造上もヒトSRP 7S RNAに類似している。しかも枯草菌scRNA欠損変異株にヒトSRP 7S RNA遺伝子を導入し、発現させると、枯草菌の生育が相補できることを明らかにした。そこで枯草菌SRP様粒子の単利・精製を試み、本粒子がscRNAと3種類の蛋白質成分からなっていること、また本粒子の大きさは8。2Sであることあきらかにした。また蛋白質構成成分のうち50kDa成分はヒトSRP 54と類似しており、scRNAおよび分泌蛋白質前駆体の両方に結合することを明らかにすることができた。これらの研究成果および突然変異株の解析を基に枯草菌蛋白質分泌装置の改良を行う予定である。枯草菌はα-アミラーゼやプロテアーゼなどの有用酵素を大量に分泌生産する能力を持っている。この高いタンパク質分泌能を利用してインターフェロンやワクチンなど高等生物に由来する有用タンパク質を分泌生産させる数多くの研究がなされてきた。宿主としての枯草菌もプロテアーゼ欠損株の作成や培養条件の検討など詳しい検討が行われた。しかしタンパク質の分泌生産量は低く、倍地中に多量蓄積させることには成功していない。そこで枯草菌のタンパク質分泌系そのものを分子生物学的に解析し、改変しようとしている。ヒトすい臓細胞などにおけるタンパク質分泌ではER膜を通過する際に主役としてシグナルペプチド認識粒子(SRP)が機能している。SRPは300塩基のRNA(SRP 7S RNA)と6種類のタンパク質から構成されている。一方枯草菌には多量しかも安定なRNAとしてsmall cytoplasmic RNA(scRNA,271塩基)が存在する。これらの2種類のRNAは塩基配列上約50%の相同性を示し、また立体構造上も類似している。特にドメインIVは相同性が高い。そこでヒトSRPドメインIVに結合するタンパク質、SRP54、に類似している枯草菌Ffhを解析した。枯草菌ffh遺伝子を染色体DNAよりクローン化し、塩基配列を決定して、アミノ酸配列を推定した。相同性は32.6%であった。次に大腸菌で高発現させ、純化し、抗体を調製した。

枯草菌細胞内ではFfhとscRNAがcomplexを形成していることを明らかにした。また枯草菌SRP様粒子は細胞質と細胞膜の両方に約1:1の割合で分布していた。細胞膜よりSRP様粒子を抽出し、カラムクロマトグラフィー、庶糖密度勾配超遠心法によって純化した。scRNA-分子に4種類の蛋白質が結合し、8Sのcomplexを形成していることを明らかにした。枯草菌はα-アミラーゼやプロテアーゼなどの有用酵素を大量に分泌生産する能力を持っている。この能力を利用してヒトインターフェロンやワクチンなどの異種生物由来有用蛋白質を分泌するために宿主を作製することを最終的な目的としている。ヒトやイヌのすい臓細胞における蛋白質分泌装置では主にシグナル認識粒子(SRP、SRP・7S・RNAと6種類の蛋白質から構成されているRNP)が作用していることが明らかになり、主に大腸菌で研究されているSecA蛋白質の類似物は現在までのところ検出されていない。昨年来の研究で枯草菌にはSecA蛋白質ばかりでなくSRP様粒子も存在していることを明らかにしてきた。このことについて本年度中に以下のことを明らかにした。1)枯草菌SRP構成成分のうち、RNA成分であるscRNA、およびヒトSRP54類似蛋白質Ffhは蛋白質分泌系で働いていることを分泌蛋白質のpulse-chase実験によって明らかにした。2)枯草菌SRP様粒子の構成成分であるscRNAをヒトSRP・7S・RNAに置き換えた場合、枯草菌の成長は対数増殖期の間に正常であることを示した。3)枯草菌SRP様粒子の生化学的性質を調べるために対数増殖期の細胞をリゾチームで処理後、音波処理し、可溶化部分からアミノペンチルカラム、DEAEセルロースカラムクロマトグラフィー、などによって純化した。未だ完全に純化している訳ではないが、調製された粒子は89Sの大きさで、scRNA、Ffh蛋白質以外に数種類の蛋白質を含んでいた。枯草菌および類縁菌は非常に高い蛋白質分泌能を持ち、洗剤用プロテアーゼや澱粉糖化用α-アミラーゼの工業的な生産菌として利用されてきている。この高い蛋白質分泌能を維持するためには何か特別の蛋白質分泌装置を内在させている可能性が考えられる。一方高い分泌能を遺伝子工学的に利用して、ヒト血清アルブミンやインターフェロンなどの有用蛋白質を分泌生産させる試みが数多くなされてきた。しかし真核生物に由来する蛋白質の遺伝子を枯草菌に導入した場合、その遺伝子は発現しても遺伝子産物が培養液中に蓄積することには成功していない。またこの目的のために多くのプロテアーゼ欠損株が開発され、培養条件なども詳しく解析されたが、どの場合も充分には目的を達していない。そこで本研究では、枯草菌に含まれるシグナル認識様粒子(SRP-like particle)に着目し、第一に枯草菌の蛋白質分泌装置の特色を解析し、第二にその結果を基礎に菌の改良を行うことを目的とした。ヒトSRPの構成成分の一つであるSRP7SRNAは300ヌクレオチドから成り、また大腸菌におけるその類似RNAである4。5S RNAは114ヌクレオチドから構成される。しかし枯草菌scRNAは271ヌクレオチドからなり二次構造上もヒトSRP7SRNAに類似している。しかも枯草菌scRNA欠損変異株にヒトSRP7SRNA
脳構造形成機構におけるCNR分子群の機能と系統進化

マウス大脳皮質層構造形成機構に必須の分子であるReelinの受容体であるCNR分子群は系統進化の過程で徐々に増加しており、系統進化の過程での大脳皮質層構造の多層化を大脳皮質構造形成に関与する分子の多様化との相関として理解できる可能性が示された。各脊椎動物種におけるCNR遺伝子のゲノム構造解析、発生生物学的解析等を行い、脳の形成と進化に関するCNR分子機構の解明を目的とする。BAC(Bacterial artificial chromosome)ライブラリーを用いて、各脊椎動物種におけるCNR遺伝子のゲノム構造を明らかにし、系統進化の過程でのCNR遺伝子の分子構造およびゲノム構造での分子進化の解析を行う。また、各CNR特異プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法により、各脊椎動物種における各CNR遺伝子の発現様式を明らかにし、発現様式より想定されるCNR分子の機能解析を行い、各脊椎動物種において各CNR分子がどのような機能を担っているのかを解析する。これまでに、哺乳類(ヒト、マウス)については既にBACクローンが単離されている。今回、魚類(ゼブラフィッシュ、メダカ)、鳥類(ニワトリ)のCNR BACクローンの単離に成功した。ゼブラフィッシュについてCNR全ゲノム配列が決定され、マウス、およびヒトCNRゲノム構造との比較解析を行った。その結果、ゼブラフィッシュにおいても、マウスおよびヒトとほぼ同数の13種のCNRが存在したが、Reelin結合配列をもつCNR分子は存在せず、また、ヒト、マウスと比べるとゼブラフィッシュ特有のCNR遺伝子分子進化が認められた。以上の結果は、CNRゲノム構造の分子進化が種特異的CNRの分子機能に関与している可能性を示唆する。
複数臍帯血ユニットを用いた新規移植法の開発

本研究では複数の臍帯血から純化された造血幹・前駆細胞を効率的に採取する方法の確立を目指してきた。前年度に引き続き、我々は、凍結臍帯血由来造血幹・前駆細胞を一貫した閉鎖系で採取することにより、清潔かつ簡便な細胞採取のプロセス開発を行った。我々の開発した方法では、培養を介さないことにより、コンタミネーションのリスクを軽減するのみならず、コストダウンにもつながることも期待される。本年度は、Miltenyi Biotec社のCliniMACS Prodigy機を用いて前年度までに検討してきた各プロセスの細胞処理条件を洗練するとともに、この方法で得られた細胞の造血能力を評価することに努めた。臍帯血移植では好中球だけでなく特に血小板回復の遅れが予後を規定することもあり、臨床的に極めて重要な問題点であるため、得られた複数臍帯血由来のCD34陽性細胞の骨髄球系、赤芽球系並びに巨核球系コロニーの形成能に焦点を当てて、in vitroのコロニーアッセイを行い、造血活性を評価した。我々が考案した方法で得られた造血幹・前駆細胞を用いて、in vitroのコロニーアッセイを行ったところ、骨髄球系や赤芽球だけではなく巨核球のコロニー形成能も十分に有していることが確認された。また、本法での造血幹細胞の取り残しがないかを確認するために、造血幹細胞以外の細胞分画も同時に全てbag内に回収した。フローサイトメトリーによる解析では、この細胞の中にCD34陽性細胞の残存は少なく、またこの細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、骨髄球系、赤芽球系並びに巨核球系のコロニー形成能も有していないことが確認された。さらに凍結臍帯血のみならず、採取後48時間以内の臍帯血を用いて、同様の処理を行い、造血幹・前駆細胞を一貫した閉鎖系で採取する方法も開発した。本研究では複数の臍帯血から純化された造血幹/幹前駆細胞を効率的に採取する方法の確立を目指している。さらに、ひいては、得られた細胞群を共移植することで臍帯血移植後早期の血球回復を促進することを最終的な目標としている。この目標に向け、当該年度内に我々は、過去に報告した採取法についての至適化をさらに模索した。これまでの報告の通り、我々は実際のヒト凍結臍帯血サンプルをMiltenyi Biotec社のCliniMACS Prodigy機を用いて処理しているが、当該年度ではこの方法の各プロセスにおける細胞処理条件を検討し、細胞採取効率の改善を試みた。具体的には、DNaseへの反応時間や細胞の遠心速度、細胞の洗浄回数の条件を変えて、複数回にわたり、細胞採取実験を試行した。また、これまでの細胞採取は、CliniMACS Prodigyを用いて凍結臍帯血から有核細胞までを分離するまでの段階を報告したものであったが、今回、我々は新たに、凍結臍帯血からCD34陽性細胞までを一貫して閉鎖系にて採取する方法を試行した。本法では極めて高い純度のCD34陽性細胞を採取することができた。一方で、十分な細胞数を採取する為には、beadsの反応方法、細胞洗浄の方法といった条件検討をさらに重ねる必要があり、引き続き実験を繰り返している。また、臍帯血移植では好中球だけでなく特に血小板回復の遅れが臨床的な問題点であるため、得られた複数臍帯血由来のCD34陽性細胞の骨髄球系並びに巨核球系コロニーの形成能に焦点を当てて、in vitroのコロニーアッセイを行い、造血活性を評価する予定である。これまでの細胞採取は、CliniMACS Prodigyを用いて凍結臍帯血から有核細胞までを分離するものであった。そこで、今回、我々は、当該年度内に、本機器により凍結臍帯血からCD34陽性細胞までを一貫して閉鎖系にて採取し、製剤化されうる細胞を採取する方法の確立を試みた。現在までに試行してきた方法では極めて高い純度のCD34陽性細胞を採取することができたが、一方で十分な細胞数を採取するにはまだ十分でなく、試行条件の至適化を現在進めている状況であることから、上記の通りに判定した。

我々が考案した方法で得られた造血幹・前駆細胞を用いて、in vitroのコロニーアッセイを行ったところ、骨髄球系や赤芽球だけではなく巨核球のコロニー形成能も十分に有していることが確認された。また、本法での造血幹細胞の取り残しがないかを確認するために、造血幹細胞以外の細胞分画も同時に全てbag内に回収した。フローサイトメトリーによる解析では、この細胞の中にCD34陽性細胞の残存は少なく、またこの細胞を用いてコロニーアッセイを行ったところ、骨髄球系、赤芽球系並びに巨核球系のコロニー形成能も有していないことが確認された。さらに凍結臍帯血のみならず、採取後48時間以内の臍帯血を用いて、同様の処理を行い、造血幹・前駆細胞を一貫した閉鎖系で採取する方法も開発した。CliniMACS Prodigyを用いて、凍結臍帯血からCD34陽性細胞までを一貫して閉鎖系にて採取し、最終産物として製剤化されうる細胞を採取することを引き続き目指していく。また、臍帯血移植では好中球だけでなく特に血小板回復の遅れが臨床的な問題点であるが、今回、開発した方法で得られた複数臍帯血由来のCD34陽性細胞について、骨髄球系並びに巨核球系コロニーの形成能に焦点を当てて、造血活性を評価する予定である。予定していた実験の施行時期が新年度にずれ込んだこと、一部必要物品の販売キャンペーンなどを利用したことなどから、次年度使用額が生じた。翌年度には、凍結臍帯血から一貫した閉鎖系にてCD34陽性細胞を採取する方法を確立し、得られた細胞の造血活性を評価することを目指す。