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モラルスキルトレーニングのプログラム開発と理論構築

平成30年度から小学校道徳の教科化が行われ、一年が経過した。また、一年遅れて中学校でも道徳教科化がスタートした。この一年間、本研究との関連で、さまざまな学校で特色ある道徳科授業の実践を見学し、新しい知見を得たが、そうした実践の中で、道徳科の指導法の一つとして「問題解決的な学習」とともに「道徳的行為に関する体験的な学習」が注目されていることに気づかされた。本研究では、後者の体験的な学習による指導法の一つとして位置付けられるモラルスキルトレーニングの効果を検証することに取り組んできた。平成30年度は、福島県の二本松市のA小学校にご協力していただいて、モラルスキルトレーニングを取り入れた道徳科授業を複数の学年で複数回実施し、道徳性検査ハートで子どもの変化を見取ると同時に、質的な効果を検証するため、子どもの感想を収集した。またこの授業実践に協力していただいた授業実践者は、子どもの変化を示すエピソードを集積し、それを授業評価および子どもの評価に生かそうと試みており(こうした取り組みは「エピソード評価」とよばれている)、本研究では、それらを含め、すべてのデータを総合的に分析・考察することに取り組んできた。こうした平成30年度までの本研究の成果は、平成31年度6月26日30日にインドネシアで開催されるアジア太平洋地区道徳教育学会(Asia-pacific Network for Moral Education)において、授業実践者と連名でポスター発表をすることを予定しており、すでにエントリーをすませている。平成30年度末までに研究全体を終了する予定であったが、この6年間副学長の職にあり、とくに平成30年度は、平成31年4月から教職大学院の定員を大幅に増やし、学士課程や修士課程のカリキュラムも大幅に変更する改革をおこなうことになったため、その関連の業務に忙殺されて、十分に研究のための時間を確保することができなかった。そこで、1年間の延長をお認めいただき、平成31年度も継続して研究を進めることとなった。平成31年度は、副学長の職を解いていただき、教授職の業務に専念することにしたため、平成31年度末までには本研究を完成させる予定である。すでに平成30年度末までに収集したデータがあるので、まずその分析考察を継続して行う。さらに複数の学校にご協力いただいて、同様の道徳科授業実践を行い、さらなるデータの収集を行う。後半には、それらを論文としてまとめ、学内紀要や学会誌等に投稿する形で公表する予定である。平成28年度は、(1)道徳教科化にともなう道徳教育実践の変化についての情報収集、(2)これまで修士論文等で取り上げられてきたモラルスキルトレーニングの効果についての検討、(3)新たなモラルスキルトレーニングプログラムの構想、(4)そのプログラムの検証、の4つを行う予定であった。(1)については、道徳教育関連の学会、研修会等に参加し、情報収集を行うとともに、日本道徳教育学会の機関誌『道徳と教育』第335号に、「「考え、議論する道徳」の可能性と課題ー「アクティブ・ラーニング」の視点から」という論文を発表し、私見を公表した。(2)については、本研究室で取り組み、成果としてまとめられた論文などを検討した。(3)と(4)については、次のように、新たなプログラムの実施について情報収集と分析を行った。すなわち、平成28年9月30日に東京都武蔵村山市立第八小学校において実施された小学校1年生を対象とするモラルスキルトレーニングによる道徳授業を参観し、許可を得てビデオ撮影を行い、そのビデオを用いて授業分析を行った。また、中学校における「モラルスキルトレーニングによる道徳授業の効果」について明らかにするため、平成29年1月16日に新潟県柏崎市立第5中学校に依頼して13年まで全校生徒を対象とした道徳授業を実施していただき、参観し、授業者と意見交換を行い、その特質等を明らかにした。上記のデータから、モラルスキルトレーニングが、平成30年度以降に「特別の教科」として教科化される道徳授業において有効な手段になりうるということをまとめ、中国武漢の華中師範大学で4月21日から24日まで開催される予定のAPNME(Asia-pacific Network for Moral Education)で発表すべく申し込みを行った(この報告書をまとめている現時点ではすでに発表済みである)。すでに、情報収集や分析、プログラムの開発を行い、平成30年度に予定していた国際学会(APNME)での発表も、平成28年度にまとめて、平成29年4月には発表を行っているので、おおむね順調に進んでいると判断した。しかし、28年度中に予定していた2群比較による授業研究がまだ実施されていないので、これは29年度中に実施する予定である。平成29年度には小学校版の道徳教科書が作成され、平成30年度から「特別の教科道徳」が始まった。その道徳科の指導法の一つとして「道徳的行為に関する体験的な学習」が学習指導要領にも記載されている。しかし、その具体的な方法の提示は、従来の道徳の時間にも用いられてきた役割演技などにとどまっており、新たな指導法の提案が望まれている。そこで、本研究では、そうした指導法の一つとしてモラルスキルトレーニングを提案し、その効果を検証しようとしてきた。これまでの取り組みで、道徳科授業においては、道徳性の尺度などを用いた量的な調査研究ではその効果を明らかにすることが難しいということが分かってきた。そこで、本研究では、平成29年度は、質的な授業研究に切り替えて、研究をすすめることとした。平成29年度は、武蔵村山市立第八小学校など、スキルトレーニングを道徳授業に導入し、積極的に推し進めている学校の実践を参観し、その質的な様相を見取るなど、実践現場での取り組みに近い形での授業研究に取り組んできた。

この方法で、モラルスキルトレーニングの効果検証だけでなく、道徳授業研究の在り方に新しい知見をもたらすことができるのではないかと考えている。研究の成果は、11月18日(土)19日(日)に神戸親和女子大学で開催された日本道徳教育学会第90回大会において、「『特別の教科道徳』に求められる質の高い指導法」と題するシンポジウムの場でシンポジストの一人として発表した。今後、福島県や愛知県の教員にも協力をいただいて、さらに道徳科授業研究という形で、モラルスキルトレーニングの意義を明らかにする予定である。すでに、道徳教科化による道徳教育の変化についての情報収集や、モラルスキルトレーニングのプログラム開発などを行い、その中身についても平成28年度中に国際学会(APNME)などで発表している。しかし、副学長職を兼務しているなどの理由により、県外の小中学校での調査研究については計画通りには進めることができなかった。平成30年度から小学校道徳の教科化が行われ、一年が経過した。また、一年遅れて中学校でも道徳教科化がスタートした。この一年間、本研究との関連で、さまざまな学校で特色ある道徳科授業の実践を見学し、新しい知見を得たが、そうした実践の中で、道徳科の指導法の一つとして「問題解決的な学習」とともに「道徳的行為に関する体験的な学習」が注目されていることに気づかされた。本研究では、後者の体験的な学習による指導法の一つとして位置付けられるモラルスキルトレーニングの効果を検証することに取り組んできた。平成30年度は、福島県の二本松市のA小学校にご協力していただいて、モラルスキルトレーニングを取り入れた道徳科授業を複数の学年で複数回実施し、道徳性検査ハートで子どもの変化を見取ると同時に、質的な効果を検証するため、子どもの感想を収集した。またこの授業実践に協力していただいた授業実践者は、子どもの変化を示すエピソードを集積し、それを授業評価および子どもの評価に生かそうと試みており(こうした取り組みは「エピソード評価」とよばれている)、本研究では、それらを含め、すべてのデータを総合的に分析・考察することに取り組んできた。こうした平成30年度までの本研究の成果は、平成31年度6月26日30日にインドネシアで開催されるアジア太平洋地区道徳教育学会(Asia-pacific Network for Moral Education)において、授業実践者と連名でポスター発表をすることを予定しており、すでにエントリーをすませている。平成30年度末までに研究全体を終了する予定であったが、この6年間副学長の職にあり、とくに平成30年度は、平成31年4月から教職大学院の定員を大幅に増やし、学士課程や修士課程のカリキュラムも大幅に変更する改革をおこなうことになったため、その関連の業務に忙殺されて、十分に研究のための時間を確保することができなかった。そこで、1年間の延長をお認めいただき、平成31年度も継続して研究を進めることとなった。平成31年度は、副学長の職を解いていただき、教授職の業務に専念することにしたため、平成31年度末までには本研究を完成させる予定である。
証拠法の形式的合理化と実体的真実主義

刑事訴訟は13世紀以降、拷問を導入することによって、糾問主義化した。Eb.Schmidtに代表されるかつての通説は、これがローマ法の体系的継受に先立つドイツ法独自の発展であると考えていたが、今日では、いわゆる早期継受を含めた「法の学問化」というより包括的な観点から評価し直さなければならない。この点で大きな貢献をしたのが、W.Trusenであった。まず第一に、法的な意味での拷問が問題になるのは、ようやく中世中期以降になってからであることが確認される。得に教会は、告解の自由意思性の原則から、拷問に対しては基本的に敵対的であった。この警戒的態度は、大逆罪について認められていた拷問を神に対する大逆罪としての異端にも適用するローマ法の影響の下に、教会法上の異端審問に拷問が導入された後も維持され、拷問を行う用件の限定や、拷問によって得られた自白の真正性の検討が要求されるようになった。一方、教会法上の糾問訴訟は、拷問とは一応無関係に、悪評手続から発展したものであった。すなわち、イノセント3世は、悪評手続に証言証拠を導入することによって、一定の場合に雪寃宣誓を不可能としたのである。この場合の刑罰は、教会の秩序維持という行政的観点から科されたもので、正規の刑罰ではない。ところが、刑事訴訟の糾問主義化で問題になるのは、かかる特別裁判手続としての糾問訴訟の形成ではなく、「証拠の女王」としての自白の拷問による獲得である。これは、伝統的訴訟において自白が持っていた手続上の意味から理解される。すなわち、自白は神判ないし雪寃宣誓と二者択一の関係にあった。だから、後者を排除するために、自白の獲得が目差ざれたのである。その意味では、確かに証拠手続の合理化の方向にはあるのだが、主眼はむしろ「7人による帰罪宣誓」と同様、否認の可能性を遮断して、断罪の可能性を拡大する点にあった。実質的意味において合理化された証拠手続は、16世紀になって自白の真正性を問われるようになったときに始めて成立したといえるのである。
柔構造をもつ架橋配位子の設計による高反応活性複核金属錯体の合成と触媒反応への展開

本研究は、フレキシブルに活性金属中心を発生する架橋配位子を開発することにより、触媒反応開発の鍵となる複核構造をもつ配位不飽和種=高活性複核有機金属錯体の合成をおこなうとともに、2つの金属の相乗効果による反応基質の特異的な活性化を達成し、それを生かした有機合成用新規分子触媒反応の開発をおこなうこと、目的としている。触媒サイクルにおける反応活性種は、基質の活性化、化学変換の過程において、柔軟に構造変化を起こす。本特定領域の骨子であるこの錯体の動的な性質を、アミジナート、アミノホスフィンの2つの架橋配位子の配位的フレキシビリティーを利用して、複核錯体に導入することにより、世界的に萌芽期にあるバイメタリック触媒の開発を達成する。平成15年度の成果として、とくに、すでに報告している2つのペンタメチルシクロペンタジエニル基を有するカチオン性複核ルテニウムアミジナート錯体の誘導体のシクロペンタジエニル誘導体の合成経路を新たに開発し、構造的な特徴、アミジナート配位子の動的挙動、さらにその配位不飽和性を活かした基礎的な反応性を明らかにした。また、これらの複核錯体の触媒作用として、有機ハロゲン化合物の活性化反応を検討し、原子移動型ラジカル環化反応、原子移動型ラジカル重合への応用が可能であることを示した。また、アミノホスフィン配位子をもつチタン錯体を設計、合成し、それらと後周期遷移金属種との反応により、新規ヘテロバイメタリック錯体の合成を達成した。以上の成果は、反応性複核錯体の化学の重要な糸口を与える成果として、今後の触媒反応への展開が期待される。
花芽形成遺伝子 agamous の分子系統・進化学的解析

シダ類の中から世代時間が短く、通年栽培ができる熱帯性のミズワラビを材料に選んだ。これまでのHickok、Banksらによる研究の蓄積があることからHnn系の栽培を試みた。申請した光照射用恒温庫を用いて同時に100個体の胞子体をバ-ミキュライトと液体肥料(ハイポネックス)を用いた培地で培養できることがわかった。また、液体培養で配偶体を培養し、実験材料とすることにも成功した。これらの材料を用いて、全DNA、RNAを抽出した。ミズワラビには大量のポリサッカライド状の物質が含まれており通常の方法(Hasebe and Iwatsuki 1990)では、純粋なDNAを単離することができなかったが、CTABを用いて数回抽出することにより克服できた。RNAは植物で通常用いられるグアニジン法で抽出できた。アラビドプシスの花芽形成遺伝子であるAgamousとそれに深く関係しているleafyのクローンを用いてlow stringentな条件でゲノミックサザンを行ったところ、薄いバンドを検出することができた。さらに感度を上げるため、両遺伝子の保存的な部分のオリゴヌクレオチドを合成し、プローブとして用いたところアラビドプシスからのクローンを用いた場合とほとんど同じ断片にハイブリダイズしたので、これらの遺伝子のホモログが花を付けないシダ類にも存在している可能性が高いことがわかった。さらに全RNAからpoly(A)+RNAを精製し、合成したオリゴヌクレオチドを用いてRTPCRを行ったところいくつかの断片をクローンすることができ、これらのクローンはミズワラビのゲノミックDNAとハイブリダイズした。現在、この断片の塩基配列を決定中である。さらに、RTPCRによってできた断片と先にゲノミックDNAにハイブリすることを確認した合成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子をスクリーニングするため、ゲノミックとcDNAライブラリーを作成した。現在これらのプローブを用いて相同な断片の探索中である。今後、これらの遺伝子のクローン化、塩基配列の決定を順次行い、配列データを種子植物の花芽形成遺伝子と比較し、その進化について考察する予定である。
デジタル信号処理を用いた中性子分布計測による高速イオンと波動の非線形相互作用研究

検出器の出力信号のデジタル信号処理により、弁別精度良く世界最高レベルの計数率で中性子の分布計測が可能となった。高計数率が得られたことで高速イオンと高速イオン起因不安定性の非線形相互作用の解明に貢献出来る高時間分解能計測が可能となった。しかし、期間中に高速イオン起因不安定性の実験を実施できなった。そこで本計測器で新たに測定可能となったDT核融合反応起因の中性子の分布測定を行い、発生源の高速トリトンの輸送研究に資するデータ取得に成功した。高速イオンと高速イオン起因不安定性の非線形相互作用の物理機構を解明するため、高速イオンの空間分布を高時間分解能で計測することを目的としている。そこで空間分解能を重視し、デジタイザの計測時間を当初の予定の半分2.5秒とし、使用するチャンネルを2倍とすることとした。この方針により7視線の計測を行うことができるようにした。デジタル処理化のための検出回路の改造、デジタイザなどの電子機器の据え付け調整、計数率向上に伴うコリメータの改造、データ収集ソフトウェアの改造、検出器の較正、データ解析ソフトウェアの改造を行った。1放電当り、7GBのデータを取得、解析する必要があるため、安定したデータ収集保存が行えるようデータ収集保存システムを構築し、加えて、データ解析ソフトの改良を行った。特にデータ解析ソフトの改良により、解析時間が数十倍(IGB当り約1時間から約1分)以上改善した。プラズマ実験において、初期データの取得に至っているが、検出器の電子回路の特性にばらつきがあることが、明らかになり、較正手続きとデータ処理手法の再検討を行っている。本年度行ったデータ解析手法とソフトウェアの改良については、研究分担者馬場の研究室所属の奥地俊夫の修士論文「デジタル信号処理手法を用いた核融合中性子の高速計数」としてまとめられている。また、篠原により17th Topical Conference on High Temperature Plasma Diagnosticsにて発表予定である。平成19年度に行ったハードウェア、及び、ソフトウェアの整備により、初期的なデータが得られたが、中性子とガンマ線の弁別手法や光電子増倍管の設定電圧の調整と最適化が必要であることがわかったため、ソフトウェアの整備や必要なハードウェアの改造により調整等をおこなった。結果、高い弁別性能での中性子計測が可能となった。本システムを用いて高速イオン起因不安定性による高速イオン輸送の研究を行う予定であったが、短時間に多量の高速イオンを発生出来る負イオン源中性粒子ビームが、調整の都合で、このような実験に必要な入射パワーで運転出来ず、充分な量の高速イオンを発生出来ず、本研究で求められるタイプの高速イオン起因不安定性を励起出来なかった。そこで、本システムのもう一つの開発課題であったDT核融合反応起因の中性子の測定をめざし、実験を行った。結果、DT中性子を発生させる高速トリトンの輸送研究が可能なレベルのデータの取得に成功した。初期的な成果はReview of Scienti fic Instruments誌に論文として掲載され、また、5件の学会発表を行った。今後、システムの較正を原子力機構の核融合中性子源(FNS)装置を用いて実施し、中性子分布の定量的な評価が可能となるようする予定である。
ＥＳＲスピントラップ法を活用した複数活性酸素種に対する食品の抗酸化能評価法の開発

ESRスピントラップ法を活用した複数活性酸素種に対する食品の抗酸化能評価法の開発を行った。ヒドロキシラジカル、スーパーオキシドラジカル、アルコキシルラジカル、ペルオキシラジカル、アルキルラジカル、一重項酸素について、ラジカル生成に光分解を用いた、最適な測定条件を決定した。開発した手法により54種の野菜抽出液を測定し、標準物質当量として再現性高く抗酸化能を評価することができた。同一抽出液をORAC法で測定した結果、ヒドロキシラジカルに対する抗酸化能力はORAC法と相関はなかった。しかし、スーパーオキシドラジカルとアルコキシラジカルに対する抗酸化能はORAC法と高い相関が認められた。本研究課題の最終目的は、ESRスピントラップ法により複数の活性酸素種に対する食品の抗酸化能評価法を確立することである。平成24年度の具体的な研究内容は、各活性酸素種を特異的に消去する物質を各々の抗酸化能力を表す標準物質として選択し、確立した方法で食品を測定が可能であるかを検討した。ESRスピントラップ法で求めた抗酸化能力は、スーパーオキシドラジカルをSODユニットとして評価するように、標準物質当量として表される。標準物質には他にTrolox、GSHなどがあり、それぞれ消去することができる活性酸素種が異なる。また、確立した本計測法は活性酸素種発生系に紫外光(UV系)を用いているため、UVによって分解することがない標準物質を選択した。スーパーオキシドラジカルと一重項酸素はGSH (Glutathione)、アルコキシラジカルはTrolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-carboxylic acid)、ヒドロキシラジカルはマンニトール(mannitol)、過酸化ラジカルはαリポ酸(α-lipoic acid)、アルキルラジカルはCYPMPO (2-(5,5-Dimethyl-2-oxo-2λ5-[1,3,2]dioxaphosphinan-2-yl)-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole 1-oxide)が本計測法に適していることを確認し、6種の活性酸素種すべてについて、抗酸化能力を表す標準物質を選択することができた。以上、抗酸化能を評価するために不可欠である標準物質について、全ての活性酸素種に適した物質を選択し、実際に食品の抗酸化能計測及び評価を可能にしたことは、食品の抗酸化能評価法として広く世間に利用されるために不可欠のことであり、非常に重要な成果であるといえる。平成25年度の具体的な研究内容は、開発したESRスピントラップ法を用いて食品が有する抗酸化能を複数の活性酸素種に対する能力として評価した。さらに、同じ食品サンプルを一般的に用いられているORAC法で測定し、開発した手法から得られた各抗酸化能との相関を求めた。開発したESRスピントラップ法により54の異なる野菜の抽出液が有する抗酸化能を測定し、昨年度までに定めた標準物質当量として評価することができた。本手法の抗酸化能評価法は、ラジカルアダクトの信号強度をアダクト量として定量、アダクト量を活性酸素種ごとに適切な標準物質当量として算出し、抗酸化量として評価した。同一試料を複数回計測した結果、標準偏差は4%未満であり、飛翔に再現性か高い評価法であると結論した。開発したESRスピントラップ法で計測した野菜の抽出液は、ORAC法で定められた手法によって抽出された溶液を使用した。同一抽出液を測定し、抗酸化能を評価することで、その結果を正当に比較検討することができた。その結果、ヒドロキシラジカルに対する抗酸化能力はORAC法と相関はなかった。以上、ESRスピントラップ法により複数の活性酸素種に対する食品の抗酸化能評価法を確立したことは、食品の抗酸化能を総合的な活性酸素消去能として評価するために不可欠のことであり、非常に重要な成果であると言える。平成23年度の具体的な研究内容は、スピントラップ剤CYPMPOを用いたESRスピントラップ法の開発のため、6種の活性酸素種の発生系およびESR測定条件(測定パラメータ)の検討を行った。各活性酸素種の発生系は次のようになった。スーパーオキシドラジカルはリボフラビンに波長500600nmの可視光を60秒照射して発生させた。アルコキシラジカルはAAPHに、ヒドロキシラジカルは過酸化水素に、一重項酸素はPterineに、過酸化ラジカルはtert-ブチルヒドロペルオキシドに、アルキルラジカルはDMSOを含む過酸化水素に、それぞれ波長300400nmの紫外線を5秒照射して発生させた。

全ての発生系について、発生試薬の濃度、光照射時間から最も観測されるアダクトの量が多い条件を求めた。本年度の研究成果によって、6種の活性酸素種全てについて、簡易で再現性の高い光照射発生系を開発することができた。また、スピントラップ剤と活性酸素種によって生成されるアダクト観測に最適なESR機器の磁場範囲、マイクロ波強度、磁場変調の測定パラメータについて検討した。その結果、全てのアダクトについて共通の測定パラメータを得ることに成功した。以上、全ての活性酸素種について、同一計測機器を用い、光反応によって活性酸素種を発生、同一測定パラメータによって計測可能にしたことは、食品の抗酸化能評価法として広く世間に利用されるために不可欠のことであり、非常に重要な成果であるといえる。当初の研究計画通り、6種の活性酸素種について、それぞれ適した標準物質を選択することができた。さらに、実際の食品をサンプルとして本計測方法を試みたところ、6種の活性酸素種に対する抗酸化能を評価することができた。当初の研究計画では、5種の活性酸素種について研究を進めていたが、新たにアルキルラジカルを加えた6種の活性酸素種について検討を行うことができた。また、発生系の情報収集を行う過程で、24年度の研究計画である各活性酸素種を特異的に消去する標準物質についての有益な情報を得ることができた。開発したESRスピントラップ法を用いて、成分が異なる様々な食品が有する抗酸化能力を複数の活性酸素種に対する能力として評価する。さらに、同じ食品をORAC法で測定し、開発した手法から得られた各抗酸化力との相関を求める。相関関係が得られない場合、食品成分から要因を検討する。ESRスピントラップ法で求めた抗酸化能力は、スーパーオキシドラジカルをSODユニットとして評価するように、標準物質濃度として表される。標準物質には他にTrolox、GSHなどがあり、それぞれ消去することができる活性酸素種が異なる。ESRスピントラップ法では基準となる標準物質が明確に定められていない。そこで、23年度に確立した6種の活性酸素種について、特異的に消去する物質を検討し、個々の活性酸素種ごとに標準物質を選択する。ESRに関する国際学会(APNMR)およびロシアにあるESRを開発した研究所(Zavoisky研究所)へ参加し、解析についての情報を収集する。本計測法に関する種々の試薬、次年度に行うORAC法に関する試薬、食品成分分析に関する試薬を購入する。得られた成果は逐次論文発表するため、英文校閲、投稿料に研究費を使用する。本研究課題推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画通り使用する。ESRに関する国際学会(ICMRBS)に参加し、解析についての情報を収集する。23年度に確立した活性酸素種の測定に関する試薬、次年度に行う各活性酸素種を特異的に消去する標準物質を購入する。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり使用する。
生体内血管新生イメージングを基盤とした革新的新生血管誘導療法の開発

本研究の一番目の目的である、血管壁細胞と血管内皮細胞を同時イメージングするために、独自のヘテロ標識二量体のVEGFないしPDGFの作成に成功し、培養細胞においてその生理活性が保たれている事、それぞれの受容体発現細胞にVEGFもしくはPDGFー蛍光粒子複合体を投与した際、有意に高い蛍光強度を示す事に成功した。それを元にしてin vivo imagingを試みたが、血管壁細胞と内皮細胞の同時イメージングの画像取得方法の調整に難航し、また、血管新生療法を実現するウイルス粒子の作成にも難航し、当初の計画の目的を十分に達成する事が出来なかった。今後も研究をつづけ、課題を解決していく予定である。平成25年度は前年度に引き続き、遺伝子工学的手法を用いたPDGF-高輝度蛍光粒子複合体の作成を行い、更に同様の手法を用いたVEGF-高輝度蛍光粒子の作成を目指していた。タンパク質発現には大腸菌の系を利用していたが、タンパク質を誘導発現させるための遺伝子コンストラクトの作成に思いのほか労力を費やした。努力の末、目的の血管新生因子を安定的に発現する大腸菌株を樹立する事に成功した。しかし、発現した血管新生因子は封入体にトラップされており、不溶化分画として発現した。そこから封入体タンパク質を可溶化し、二量体化・refoldingを行う条件を検討し、さらにリコンビナントタンパク質の精製法検討に多くの時間を費やした。最終的に、生理活性を保ち、且つ蛍光粒子に結合可能な血管新生因子を作成する事に成功した。現在、各血管新生因子受容体の無発現、低発現、高発現細胞を用いたin vitro imagingに着手し始めたところである。また、本年度は、昨年同様に下肢虚血モデルを作成し、血管新生による血流回復過程をさらに詳細に、継時的に可視化する為、PEG化した金粒子を用いたマイクロX線CT撮影を行った。その結果、虚血誘導後の血流回復過程において、angiogenesisとarteriogenesisが経時的に高度に統制され、相乗的に作用していることが明らかになりつつある。結果については、現在論文投稿中である。平成24年度は1PDGF結合蛍光分子の作成とin vitroアッセイ2下肢虚血モデルマウスを用いたPDGF蛍光粒子の動態とPDGFR分布の生体内解析を行う予定であった。1の予備実験として、PDGFタンパク質の一部のアミノ基のビオチン化を行い、それと蛍光が高輝度で、かつ定量評価可能なアビジン化量子ドットを結合させたPDGF蛍光粒子を作成した。これをPDGFR無発現、低発現、強発現細胞に投与して蛍光量の定量分析を行ったところ対照群に比して約5倍程度の有意な結合能の差を見出した。現在遺伝子工学的手法を用いたより反応性の高いPDGF蛍光粒子複合体を開発中である。2に関しては、下肢虚血モデルマウスの質を更に高めることから始めた。血管処理後、約2ヶ月フォローし、レーザードップラーによる血流測定に加え高解像度のCTを用いて血管増生の仮定をより定量的に捉える方針とした。レーザードップラーでは先行研究と同様安定した結果が得られ、高解像度CTの撮影条件が固まった。その条件下では、対照肢に比べ、虚血誘導直後では有意に血管の密度が低下している像が捉えられており、さらに経時的に新生血管が増成しているという結果が得られている。生体内のPDGF蛍光粒子の分布と生体内分布の解析については、予備的に前述のPDGF蛍光粒子を投与してイメージングを行い、虚血を誘導してから一ヶ月程でPDGF蛍光粒子の分布に不均一性が出現することが捉えられている。平成26年度は、昨年度作成に成功した高輝度蛍光粒子への選択的結合タグを一か所のみ持つリコンビナントVEGF、PDGFを作成し、その生理活性を確かめる実験を行った。VEGF受容体発現血管内皮細胞やPDGF受容体発現壁細胞の培養細胞株を用い、作成したタンパク質が培養細胞の増殖能、移動能に与える影響を定量した。その結果、結合タグを持たないリコンビナントVEGFもしくはPDGFと同等に細胞増殖、移動能促進効果を持つ事が証明できた。更に、作成したリコンビナントVEGFないしPDGFと量子ドットを結合させ、各血管新生因子受容体無発現・低発現・高発現細胞株に投与した。その結果、後者になればなるほど一細胞当たりの蛍光強度が高い事が定量評価できた。これらの蛍光は、VEGFあるいはPDGF抗体を使用する事で有意に低下する事も証明できた。さらに今年度は、VEGFR受容体遺伝子を封入したウイルス粒子を作成し、それを投与した虚血モデルマウスにVEGF-量子ドット複合体ないし、PDGF-量子ドット複合体を投与して、血管新生の場をin vivo imagingする予定であった。しかし、ウイルス粒子作成にことの他難渋し、思うような結果が得られなかった。次年度以降、研究を継続し、課題をクリアしていく事を目指している。

血管新生遺伝子コンストラクトの作成と、大腸菌を利用して血管新生因子を発現させ、かつ活性を保つ手法の確立に思いのほか難渋したために、当初の計画より大分遅れが生じた。現在、ようやく血管新生因子-高輝度蛍光粒子が作製できたところである。現在は、PDGF無発現、低発現、高発現細胞を用いたin vitro imagingを開始している。従って、当初より研究計画は遅れていると判断する。実験条件や手法の検討に時間がかかり、当初の計画よりは遅れているが、それらも確立されてきており、来年度以降に十分挽回可能であると判断する。生細胞を用いた検討をようやく始めたところであり、当初の目標である新規治療法の開発に至るのは難しいと判断される。しかし、当初の次年度目標であった下肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞モデルマウスの樹立を急ぎ、各種モデルマウスにおける血管新生の場において、生体内イメージングを行い、血管新生因子受容体の分布局在を高精度にイメージングし、以降の治療法開発につなげるべく努力する。計画は遅れているが、実験結果は出始めており、効率的な計画の推進は求められるが、方針は従来どおりに計画を遂行していく予定である。該当なし。
光学演算を利用した高速非接触変位計の研究

近年の工業技術の急激な発達とそれに勝る要求の多様化から,微小変位を広範囲に渡って高精度に,かつ,高速に測定する技術が必要となってきている.これまでに,ホログラフィック素子であるゾーンプレート原器が距離の測定に応用できることに着目して,「ゾーンプレート原器を用いた距離測定法」を提案し,精度の良い測定が行えることを確認している.しかし,ここで開発を行った方法では,直接得られる出力が干渉縞画像となり,距離のデータを得るために計算機を用いて干渉縞の解析を行うことが必要であった.そのため,測定時間が長く,問題となっていた.本研究では,複雑で時間のかかる演算処理を光学的な演算で置き換えて測定を高速化することを目的として研究を行った.ゾーンプレート原器を用いた距離測定用干渉計によって得られる、距離の変化を示す干渉縞を高速に解析する方法として、レンズによる光学的フーリエ変換を利用することを提案し、実験を行った。キャリア成分を付加した距離変化を表わす干渉縞は、距離に比例してそのピッチが変化する。ここで得られる干渉縞をCCDカメラで撮影して、これを液晶パネルに表示し、そのフーリエ画像を観察したところ、スペクトルが距離に比例して移動することを確認した。また、この方法で移動方向も検出することができた。さらに、このスペクトルの移動をPSDによって検出することを検討したが、実験に用いた液晶の分解能が低いため、スペクトルの分離が完全には行えず、距離信号を直接得ることはできなかった。しかし、レンズによる光学的フーリエ変換を利用することで干渉縞の変化をビデオレートで取り出すことができたため、今後、スペクトルの分離に関して研究を行い、実験を継続して、変位計としての性能を評価していく予定である。
第16番染色体に連鎖する常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症の原因遺伝子の解明

本研究の目的は,第16番染色体に連鎖する常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症(Ishikawa K.et al.,Neurology,54:1971-5;2000)の原因遺伝子を解明することである.遺伝子の単離には,まず10cMと広い遺伝子座領域をできるだけ狭める必要があった.このため,まず我々はこの領域に存在する多型性DNAマーカー20個について全家系を解析し,家系が異なっても共通するハプロタイプが存在する領域を探した.その結果,約3cMの領域で全家系の発症者が共通するハプロタイプを有することが判明し,候補遺伝子座を3cM領域に狭めることが可能となった.この結果を学術雑誌に投稿し,現在掲載準備中である(Takashima M.,et al.J.Hum Genet 2001,in press.).次に我々はこの3cM領域をBACクローンによるcontigの構築を行い,この領域に存在する遺伝子を同定することとした.このためBACライブラリーと自動シークエンサーなどを用いて,多型性DNAマーカやSTSマーカーなどをアンカーにそれを有するBACクローンを同定した.その結果,この3cMの染色体領域を完全にカバーする,33個のBACクローンからなるcontigを構築した.この領域はごく最近報告されたヒトゲノム配列情報(Nature 409;745-964,2001)にも掲載されていない,我々が独自に完成させた染色体物理地図である.この領域ですでに公表されている塩基配列情報などをコンピュータで検索し,3塩基などの繰り返し配列を同定することができる.我々はこの方法で多数の繰り返し配列を網羅的に収集し,発症者においてそのいずれかが異常に伸長していないかを解析した.その結果現在まで30ほどの繰り返し配列について検索したが,発症者に特異的な異常伸長は見い出していない.このため,類縁疾患では原因とされている繰り返し配列の異常な伸長は,本疾患では関連しない可能性があげられる.今後はこの領域に存在し中枢神経系に発現する遺伝子に変異が否かを検索する予定である.本研究の目的は,第16番染色体に連鎖する常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症(Ishikawa K.et al.,Neurology,54:1971-5;2000)の原因遺伝子を解明することである.遺伝子の単離には,まず10cMと広い遺伝子座領域をできるだけ狭める必要があった.このため,まず我々はこの領域に存在する多型性DNAマーカー20個について全家系を解析し,家系が異なっても共通するハプロタイプが存在する領域を探した.その結果,約3cMの領域で全家系の発症者が共通するハプロタイプを有することが判明し,候補遺伝子座を3cM領域に狭めることが可能となった.この結果を学術雑誌に投稿し,現在掲載準備中である(Takashima M.,et al.J.Hum Genet 2001,in press.).次に我々はこの3cM領域をBACクローンによるcontigの構築を行い,この領域に存在する遺伝子を同定することとした.このためBACライブラリーと自動シークエンサーなどを用いて,多型性DNAマーカやSTSマーカーなどをアンカーにそれを有するBACクローンを同定した.その結果,この3cMの染色体領域を完全にカバーする,33個のBACクローンからなるcontigを構築した.この領域はごく最近報告されたヒトゲノム配列情報(Nature 409;745-964,2001)にも掲載されていない,我々が独自に完成させた染色体物理地図である.この領域ですでに公表されている塩基配列情報などをコンピュータで検索し,3塩基などの繰り返し配列を同定することができる.我々はこの方法で多数の繰り返し配列を網羅的に収集し,発症者においてそのいずれかが異常に伸長していないかを解析した.その結果現在まで30ほどの繰り返し配列について検索したが,発症者に特異的な異常伸長は見い出していない.このため,類縁疾患では原因とされている繰り返し配列の異常な伸長は,本疾患では関連しない可能性があげられる.今後はこの領域に存在し中枢神経系に発現する遺伝子に変異が否かを検索する予定である.
TEFとVestigialに注目した脊椎動物の体軸形成機構の解析

脊椎動物胚の体軸形成は胚形成の基礎となる重要な現象であり、本研究は、私がFoxa2の制御因子として同定した転写因子TEFに注目して、その分子機構を解明しようとするものである。マウスには4つのTEF遺伝子が存在するが、胎生6.5日胚においては、TEF1を除く3つのTEF遺伝子は体軸形成領域(ノードと原条)を含む胚体および胚体外の広い領域で、それぞれ特徴的なパターンで発現していた。7.5日以降の胚では、すべての遺伝子が同様のパターンで体軸形成領域を含み広く発現していた。そこで、4つのTEFとそのコファクター候補である2つのVestigial遺伝子について、その体軸形成における機能を遺伝学的に解析するために、遺伝子ノックアウトマウスの作成を進めている。一部については完成したが、変異をホモに持つ個体でも生存しており、それらについては、今後、多重変異体を作成して機能解析をする予定である。ゼブラフィッシュ胚から3つのTEFをクローニングし、その初期胚における発現を調べたところ、マウス同様に広く発現しているがオーガナイザー(シールド)および脊索においては周囲よりも有意に強い発現が認められた。TEFの活性はさまざまな機構により制御されることが知られているため、TEFを正あるいは負の転写因子に改変した物をゼブラフィッシュ胚に過剰発現させて、その体軸形成における機能を解析した。シールドで発現するFoxa2遺伝子は、胚にVP16-TEFを過剰発現すると発現領域が拡大し、逆にTEF-EnRで抑制され、TEFの正の転写因子としての機能がシールド形成に重要であることが示唆された。さらに、VP16-TEFは単独ではシールドを誘導できず、Wntシグナルあるいはその下流で働く因子と協調的に働くことによりシールド形成をつかさどることが示唆された。我々はマウスの体軸形成機構解明のため、転写因子HNF3βのノード特異的遺伝子発現制御機構を解析してきた。これまでにHNF3βエンハンサーの活性に必須な配列CS3を発見し、そこに結合する転写因子TEFを同定した。TEFは広く発現しているが、CS3は活性化は体軸形成領域(ノードと原条)に限られていたので、まず、その機構を培養細胞で解析した。その結果、体軸形成シグナルWnt/β-catenin依存的に、TEFが未同定の転写因子とCS3上に転写因子複合体を形成する機構が示唆された。一方、ハエでは、TEFが作用するためにはコファクターのVestigialが必要なので、マウスにおいてTEFの機能を総合的に理解するために、マウスVestigialのクローニングを行った。これまでに3つのVestigialのcDNAをクローニングし、それら遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーション法により調べたところ、8.5日以降において特徴的な発現パターンを認めたものの、それ以前のノード形成期では発現が弱くはっきりしなかった。現在、TEFとVestigialについて、その体軸形成における機能を遺伝学的に解析するために、遺伝子ノックアウトマウスの作成を進めている。RT-PCRの結果、ノード形成期には4つのTEFと2つのVestigialとが発現していることがわかった。それらは、ファミリー内で機能的な重複が予想されるので、それらすべての遺伝子について遺伝子破壊マウスの作成を行っている。また、いくつかの遺伝子は、発現レベルが低くin situ hybridizationによる発現部位の特定が困難であったので、レポーターとしてlacZ遺伝子を導入することにより検出感度を上げ、ヘテロ変異マウスにおいて、これら遺伝子の発現部位を特定することを考えている。
プラズマ乱流による電流異常拡散とそれに伴う異常輸送に関する理論的研究

カオティックな磁場構造に関する基礎的研究を行った。ポアンカレ-の定理によって示されたように、少なくとも一つ対称性を持つ磁場は磁気面を持つ。軸対称プラズマではポロイダル磁束関数のレベルセットがトロイダル状の磁気面を与えるが、テアリング不安定性等によって軸対称性が破られると、磁気カオスが発生し得る。KAM理論によって知られているように、磁気カオスは異なるヘリシティーを持つ磁気島のオーバーラッピングによって発生する。磁気島同士の非線形相互作用をモデル化することによって、非線形連立常微分方程式系を導出し、その数値実験によって実際のトカマクプラズマを模擬したパラメータで磁気カオスが発生するプロセスをシミュレートできた。このモデル方程式系はベナ-ル対流のロレンツモデルに類似した構造を持つ。しかし方程式の導出は、ヘリシティー輸送理論(本研究計画平成3年度成果)に基づくプラズマ物理独特の理論的方法によっている。第二の研究テーマとして、乱れた磁場中を伝播するアルフベン波のスペクトルを研究した。極めて単純でありながら厳密かつ物理的本質を保つ定式化を行ない、準周期摂動が連続スペクトルを点スペクトルに変化させる事を証明した。この様なアルフベン波スペクトルの変化は、近年核燃焼プラズマに於いて重要な不安定性モードになるとして注目されるTAEモードに関連している。本研究は、TAE的なモードは磁場のカオティックな乱れに起因するアンダーソン局在によってピン止めされたアルフベン波の固有モードと考えて良いことを示した。電流駆動モ-ドの乱流化による異常輸送、異常加熱について基礎的な理論モデルを構築した。電流駆動不安定性は磁気自由エネルギ-の自発的な開放を意味し、非線型発展を介し、磁気エネルギ-的に緩和した構造を自己形成する。この間、プラズマで電流分布の自発的な変化が生じる。この電流分布変化は、古典的な抵抗拡散と本質的に異り、プラズマの運動による誘導電場が支配している。本研究では電流密度の輸送がヘリシティ-密度の輸送に相等することを示し、テアリングモ-ドの乱流が引き起こす、所謂超抵抗効果をヘリシティ-フラックスによって表現した。ヘリシティ-の輸送は非線型平行電流及び非線型偏極電流を伴い、従って前者が電子の熱流束を、後者が粒子束を引き起こす。この関係を具体的に計算した。ここで示した熱、粒子束は電流密度の勾配を駆動力としていると言う意味で、通常の温度、密度勾配による輸送とは異る原理による、極めて興味深い異常輸送過程である。一方磁気エネルギ-の緩和に於いて放出された自由エネルギ-は散逸過程によって熱化される。不安定性を駆動するモ-ドのが大きい場合、乱れのエネルギ-の散逸はイオンの粘性によって支配されることを示した。粘性による散逸は、低抗による散逸と異り、ヘリシティ-の散逸を引き起こさない。従ってMHD緩和モデル仮説と合致する。ヘリシティ-保存と電場のバランスの関係を解析することによって、乱流プラズマの異常抵抗モデルを導いた。その結果はULQプラズマで実験のデ-タを説明し得る。ポアンカレーの定理によって示されたように、少なくとも一つ対称性を持つ磁場は磁気面を持つ。このモデル方程式系はベナール対流のロレンツモデルに類以した構造を持つ。

極めて単純でありながら厳密かつ物理的本質を保つ定式化を行ない、準周期摂動が連続スペクトルを点スペクトルに変化させる事を証明した。この様なアルフベン波スペクトルの変化は、近年核燃焼プラズマに於いて重要な不安定性モードになるとして注目されるTAEモードに関連している。本研究は、TAE的なモードは磁場のカオティックな乱れに起因するアンダーソン局在によってピン止めされたアルフベン波の固有モードと考えて良いことを示した。
糸状菌をモデルとした極性生長におけるアクチンケーブルの役割

糸状菌の菌糸の生長速度が一定ではなく、早い遅いを繰り返していることが判明した。細胞内カルシウムイオン濃度の変化を蛍光によりライブイメージングすることに成功し、周期的なパルスを発見した。カルシウムイオンチャンネルがそのパルスに必要であることから、細胞外からのカルシウムイオンの一時的な流入が起きることが示された。そして、菌糸先端のアクチンの重合、エキソサイトーシス、カルシウムの流入が周期的に起きること、それらが同調していることが示され、論文として公表した(Takeshita et al PNAS 2017)。当初の予定通り、糸状菌Aspergillus nidulansにおいてアクチンケーブルを可視化するため、GFP付加したトロポマイオシン(以下、TpmAと呼ぶ)またはアクチン結合タンパク質由来の17アミノ酸であるLifeactを発現する株を作成した。それぞれの表現型、菌糸先端におけるアクチンケーブルの挙動(長さ、重合速度、脱重合速度、重合頻度)を初めて定量化することに成功した。その結果、GFP-TpmAは正常なアクチンケーブルを可視化していること、GFP-Lifeactはその発現量によりアクチンケーブルを安定化することが示された。アクチンケーブルを重合するフォーミと呼ばれるタンパク質の局在を制御する因子として、cell end markerが知られていた。GFPとmCherryの組み合わせにより、cell end markerとアクチンケーブルの重合端が共局在することが示され、cell end markerがアクチンケーブルの局在を制御するという従来のモデルが支持された。アクチンケーブルと微小管の相互作用とそれぞれの重合化制御の関係を解析した。GFPとmCherryの組み合わせにより、アクチンケーブルと微小管を可視化し、超解像顕微鏡を用いてそれぞれの相互作用を可視化した。その結果、菌糸先端に向かって伸長する微小管の重合端と菌糸先端から重合するアクチンケーブルの脱重合端の短い距離(1マイクロメーター以下)のオーバーラップが見られた。さらにスピニングディスク型共焦点顕微鏡を用いて高速イメージングを行い、それぞれのダイナミックな重合-脱重合の様子を観察した。その結果、微小管が菌糸先端に向かって伸長する際、アクチンケーブルが脱重合を起こし、逆に微小管が菌糸先端から脱重合を起こす際、アクチンケーブルが菌糸先端から重合化することが示された。この結果は、微小管とアクチンケーブルのそれぞれの重合-脱重合の制御が協調的に行われていることを示唆している。当初の予定通り、アクチンケーブルのダイナミクスを定量化することに成功した。また、アクチンケーブルの重合端とcell end markerとの共局在を示した。さらに、アクチンケーブルと微小管の相互作用、重合制御の関係を明らかにした。これらの結果をまとめた論文を作成し、Fontiers in Microbiologyに受理された。まだ達成できていない点として、分泌小胞がアクチンケーブル上を輸送されるかという点が明らかにされていない。アクチンケーブルを脱重合する薬剤を使用した実験で、アクチンケーブルが分泌小胞の輸送に関わることは知られているが、それぞれを可視化し、分泌小胞がアクチンケーブル上を輸送される様子を示す予定であるが、まだ成功に至っていない。当初の予定通り、糸状菌Aspergillus nidulansにおいてアクチンケーブルを可視化するため、GFP付加したトロポマイオシン(TpmA)またはアクチン結合タンパク質由来の17アミノ酸であるLifeactを発現する株を作成した。それぞれの表現型を解析し、菌糸先端におけるアクチンケーブルの挙動(長さ、重合速度、脱重合速度、重合頻度)を糸状菌で初めて定量化することに成功した。その結果、GFP-TpmAが正常なアクチンケーブルを可視化していること、GFP-Lifeactが発現量に依存してアクチンケーブルを安定化することが示された。GFPとmCherryの組み合わせで、超解像顕微鏡を含む蛍光顕微鏡により解析し、アクチンケーブルと微小管の相互作用を明らかにした。高速スピニングディスク型共焦点顕微鏡を用いて、それぞれの重合と脱重合が協調的に制御されている機構を明らかにした。これらの結果をまとめcorresponding authorとして論文を作成し、Frontiers in Microbiologyに受理された。さらに、アクチンケーブルの重合が周期的であること、カルシウムの流入に依存して制御されることなど、新しい現象を明らかにした。アクチンケーブルと微小管の相互作用、協調的重合制御機構を明らかにした。これらの結果をまとめ論文を作成し、Frontiers in Microbiologyに受理された。さらに、超解像イメージング技術により、これまで検出できなかった高速・長距離移動の分泌小胞の輸送を発見した(Zhou et al Sci Adv 2018)。これらの研究は、糸状菌の菌糸先端生長がどのようにしてなされるかという、基礎研究のみならず応用研究にも重要な影響を与える疑問に対する明確な回答を与えるものである。

そして、超解像顕微鏡を含む最先端イメージング技術を、初めて糸状菌に応用したものであるため、独創性と先駆性が大きい。また、動物の神経細胞や植物の花粉管などを含む細胞一般の極性生長の理解に貢献し、再生医療を視野に入れた細胞・組織工学にも応用可能であることから、生物学への貢献と波及効果は重大である。加えて、糸状菌が関わる醸造・発酵、有用酵素生産、動植物への病原性など、医薬・農薬開発上また産業上への応用にも大きく貢献する可能性を秘めた根元的な研究である。糸状菌の菌糸の生長速度が一定ではなく、早い遅いを繰り返していることが判明した。細胞内カルシウムイオン濃度の変化を蛍光によりライブイメージングすることに成功し、周期的なパルスを発見した。カルシウムイオンチャンネルがそのパルスに必要であることから、細胞外からのカルシウムイオンの一時的な流入が起きることが示された。そして、菌糸先端のアクチンの重合、エキソサイトーシス、カルシウムの流入が周期的に起きること、それらが同調していることが示され、論文として公表した(Takeshita et al PNAS 2017)。引き続き、GFPとmCherryの組み合わせにより、分泌小胞とアクチンケーブルを可視化し、分泌小胞がアクチンケーブル上を輸送される様子をイメージングすることを目指す。スピニングディスク型共焦点顕微鏡を用いた高速イメージングにより、達成を目指す。問題は、菌糸先端付近における分泌小胞の蛍光のバックグラウンドが高いことである。そのため、蛍光の色が変化する蛍光タンパク質mEosを分泌小胞の可視化に用いて、菌糸の一部分だけに蛍光を変化させる波長のレーザーを当て、その変化した蛍光を追跡することで、バックグラウンドが低い中で分泌小胞の輸送を明らかにする予定である。その実験系とアクチンケーブルの可視化を組み合わせることで、分泌小胞がアクチンケーブル上を輸送される様子をイメージングすることを目指す。アクチンケーブルと微小管の重合-脱重合の制御が協調的に行われていることなどから、菌糸の先端生長のいくつかのプロセスが協調的に行われているというモデルを提唱した。Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Title: Coordinated process of polarized growthin filamentous fungiそのモデルにおける各プロセスとして、微小管の菌糸先端への到達、極性部位の確立、微小管の脱重合、アクチンケーブルの重合、分泌小胞の微小管からアクチンケーブルへの乗り換え、分泌小胞の極性部位でのエキソサイトーシス、菌糸の伸長、小胞膜の形質膜への挿入による極性部位の消失があり、次の微小管の菌糸先端への到達により次のサイクルへ進行する。