hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オープンパス超長光路吸収分光法を用いたエアロゾルおよび雲粒計測装置の開発と応用

本研究では、超長光路吸収分光法であるキャビティリングダウン分光(CRDS)法を用いたオープンパスタイプの消散係数計測装置を新規に開発し、観測試験を実施することにより、開発した装置がエアロゾル粒子の吸湿成長・雲粒生成過程などのリアルタイム直接観測に適用可能であることを実証し、その有用性を示すことを目指した。CRDS法を用いたオープンパスタイプの消散係数計測装置の改造および性能評価を行った。オープンパスCRDS装置では、粒子のあり・なしで、光学キャビティから漏れ出したレーザー光の減衰時定数を測定することで、消散係数を決定する。粒子なしでの計測を実施するために、装置全体を覆う直方体のカバーの中央部分に窓を設置して、開閉を行うように設計を変更し、試験を行った。どの程度の時間間隔で開閉を行う必要があるか調べるため、粒子なしでの計測を数日間に渡り、連続して行った。得られたリングダウン速度の時間変化にアランバリアンス分析を適用し、リングダウン速度の消散係数の計測精度におよぼす影響について調べた。また、小型PM2.5センサをオープンパスタイプの消散係数計測装置内部に設置し、消散係数との同時観測を行い、PM2.5重量濃度と消散係数の比較を行った。さらに、別途開発したセルを有するクローズドパスタイプの消散係数計測装置との同時観測試験を実施し、オープンパスタイプの計測装置による消散係数およびその湿度依存性の計測値の妥当性を評価した。本研究では、超長光路吸収分光法であるキャビティリングダウン分光(CRDS)法を用いたオープンパスタイプの消散係数計測装置を新規に開発し、観測試験を実施することにより、開発した装置がエアロゾル粒子の吸湿成長・雲粒生成過程やフラックスのリアルタイム直接観測に適用可能であることを実証し、その有用性を示すことを目指している。本年度は、CRDS法を用いたオープンパスタイプの消散係数計測装置を設計し、プロトタイプ器の製作を開始した。オープンパスCRDS装置では、粒子の検知部分である光学キャビティを屋外に置く必要があるため、降水など悪天候条件下でも測定が可能な設計にした。また、エアロゾルや風雨による高反射率ミラーの反射率低下などの影響を避けるために、高反射率ミラーの周囲にパージガスを低流量で流せるようにするとともに、高反射率ミラーと周囲の光学系を覆うように雨よけ用のボックスを設置した。また、粒子のない条件下でのバックグラウンド計測を定期的かつ自動的に実施することが可能となるように、自動開閉が可能なセルを設計した。開閉可能なシステムの設置は、次年度に行う予定であるが、現状のプロトタイプ器で、エアロゾル消散係数が高精度かつ高時間分解で測定できるか確認するため、実大気粒子および実験室で発生させた硫酸アンモニウム粒子を用いた性能評価試験を行なった。その結果、6 Hz程度の高い時間分解能で、実大気濃度レベルの粒子の消散係数を高精度に測定できることが確認できた。オープンパスCRDS装置の設計および製作が概ね順調に進んでいる。また、製作の途中段階で性能評価試験を実施し、高い時間分解でエアロゾル消散係数を精度よく測定可能なことが確認できている。CRDS法を用いたオープンパスタイプの消散係数計測装置の製作および性能評価を行った。そこで、粒子のない条件下でのバックグラウンド計測を定期的かつ自動的に実施することが可能となるように、筒状のカバーが移動する自動開閉システムを設計し、機械的な動作試験を実施した。しかしながら、筒状のカバーのひずみや動作時の軸の不安定性の影響が無視できず、結果として、スムーズな開閉が困難であると判断された。そのため、装置全体を覆う直方体のカバーの中央部分に窓を設置して、開閉を行うように設計を変更し、この改良型の装置の製作を実施している。この変更に伴い、光学キャビティを地面に対して垂直方向に設置することとした。この新たな構成で再度、レーザー光源および光学キャビティ、ピンホール、光学フィルター、光検出器の設置位置や光学調整を行い、消散係数の測定を行うことが可能であることを確認した。昨年度に引き続き、オープンパスタイプの消散係数計測装置の製作および性能評価を行った。昨年度設計したバックグラウンド計測用のシステムの動作試験を、今年度に実施したところ、スムーズな開閉が困難であることが判明した。そこで、オープンパスCRDS装置の設計を一部変更し、改良型の装置の製作を行ったことから、全体の計画にやや遅れが生じた。改良型の装置についても製作の途中段階で、光学設計および光学調整を実施し、エアロゾル消散係数が測定可能であることが確認できている。オープンパス

CRDS装置では、粒子のあり・なしで、光学キャビティから漏れ出したレーザー光の減衰時定数を測定することで、消散係数を決定する。粒子なしでの計測を実施するために、装置全体を覆う直方体のカバーの中央部分に窓を設置して、開閉を行うように設計を変更し、試験を行った。どの程度の時間間隔で開閉を行う必要があるか調べるため、粒子なしでの計測を数日間に渡り、連続して行った。得られたリングダウン速度の時間変化にアランバリアンス分析を適用し、リングダウン速度の消散係数の計測精度におよぼす影響について調べた。また、小型PM2.5センサをオープンパスタイプの消散係数計測装置内部に設置し、消散係数との同時観測を行い、PM2.5重量濃度と消散係数の比較を行った。さらに、別途開発したセルを有するクローズドパスタイプの消散係数計測装置との同時観測試験を実施し、オープンパスタイプの計測装置による消散係数およびその湿度依存性の計測値の妥当性を評価した。オープンパスCRDS装置のプロトタイプ器の製作を引き続き行うとともに、製作したプロトタイプ器の性能評価試験を行う。また、開発した装置の有用性を示すために、実大気観測試験を実施し、高湿度環境下でのエアロゾルの吸湿成長過程の観測や、エアロゾルのフラックス計測へ応用可能であるか評価する。前年度に引き続き、オープンパスCRDS装置の製作および動作・性能評価試験を行う。また、実大気観測試験により、高湿度環境下でのエアロゾルの吸湿成長過程の観測などへの応用が可能であるかを評価する。購入予定の消耗品の一部を次年度に購入することにしたため、次年度使用額が生じた。装置開発において、技術的な問題が生じたことにより設計を変更したため、消耗品購入や観測試験のための経費の一部を次年度に使用する必要性が生じた。次年度に、オープンパスCRDS装置の性能評価に必要な消耗品や観測試験のための経費として使用する予定である。オープンパスCRDS装置の性能評価に必要な消耗品の購入費として使用する予定である。
T細胞亜集団の偏りを生むHLA・A/B抗体と内皮細胞応答：抗体陽性移植の新機軸

ドナーHLAに対するレシピエントT細胞のアロ応答後の増殖・分化・成熟は、グラフト細胞が産生する因子によって規定される。移植臓器の長期生着には「移植臓器に対する抗体が存在し、補体活性が認められるにもかかわらず移植臓器が機能を維持しうる状態:免疫順応」の理解と、その誘導法が必要不可欠である。本研究は、内皮細胞HLAにアロ応答するT細胞クローンを同定し、HLA・A/B糖鎖抗体接着による内皮細胞応答が、アロ応答T細胞クローンの増殖・分化に及ぼす影響を明らかとすることを主目的とした研究である。臓器移植においてrecipient T細胞はdirect/indirect recognitionの2種類の反応を介して活性化する。これらの反応は、移植後二次リンパ組織で起こるとされているが、げっ歯類の研究においては、移植後速やかにdonor由来のAPCが処理されるため、Direct recognitionは短命であることが報告されている(Cell report 2016)。内皮細胞のHLA class IIは誘導性たんぱく質分子である。ヒト内皮細胞はげっ歯類と異なり、IFNγで活性化させるとCD4 T細胞を活性化することが報告されている(JCI insight 2017)。つまり内皮細胞HLAを介した移植後のDirect Recognitionの重要性が問われている。本研究では、Direct recognition pathwayに関わるCD4 T細胞の挙動とその重要性、DSAの影響について研究を行う。これらの結果は、免疫順応への理解を深めることにつながり、免疫抑制剤の調節や個別化医療、さらにはABO不適合・DSA陽性臓器移植への理解を深めることへとつながる。されたアロ応答性CD4クローンはCDR3領域に偏りが存在し、HLA class I抗体存在下ではドナー臓器に対するdirect recognitionの制御は、移植直後において非常に重要であると考えられてきた。本研究により移植後慢性期においてもその制御は重要であり、MAPKを介した内皮細胞活性化は、CD4 T細胞応答を亢進させ拒絶反応へと導く可能性が示唆された。今後は更なるメカニズムの解明をめざす.ドナーHLAclass IIに反応するレシピエントCD4 T細胞の直接認識(direct recognition)によるアロ応答は、非常に強いT細胞応答であり、移植臓器に対する拒絶反応の原因となる。移植後、特に慢性期ではグラフト細胞発現HLAがその標的となるが、その反応については必ずしも明らかではない。本研究では内皮細胞HLA-DRに応答するCD4 T-細胞クローンを同定後、anti-HLAclass Iもしくはanti-A/B抗体存在下でのそのクローンの挙動について検討した。内皮細胞HLA-DR反応性CD4 T細胞はメモリー型であり、特にTh17とTfhは強く反応した。このCD4 T細胞増殖は、内皮細胞にanti-HLAclass Iが結合時には亢進し、anit-A抗体結合時には減弱した。シングルCD4 T細胞解析により、TCRβの出現頻度が2%を超えるクローンが10個存在し、その中でも11%と最も高い頻度を示したTCRβは、増殖が最も亢進していた画分で確認された。マイクロアレイ解析により、IFNgamma処理に関わらずanit-A抗体接着時に遺伝子変動を認めた遺伝子として、CD275 (PD-L1)が同定された。PDL-1はanti-A/B抗体接着で内皮細胞での発現上昇がみられ、anti-PD-1使用で、anti-A抗体による細胞増殖抑制効果が消失した。ABO不適合腎移植における組織において、PD-L1は高値であった。内皮細胞HLA-DRに対するCD4 T細胞直接アロ応答は、内皮細胞に結合する抗体の種類で変動することが示唆された。移植においては、肝臓を構築する類洞内皮細胞でPD-L1が高発現であり、このことが肝移植でたびたび見られる免疫寛容誘導に重要であるという報告もある。今回ABO不適合移植患者の腎組織においてPD-L1が高発現であり、anti-PD-1抗体で、anti-A/B抗体接着によるCD4 T-細胞のアロ応答減弱がキャンセルされたことから、ABO不適合腎移植においては、このPD-1-PD-L1の重要性を示唆する結果となった。PD-L1自身は組織においては炎症状態で容易に誘導される。炎症状態の内皮細胞は活性化状態にあるため、anti-A/B抗体接着によるPD-L1の発現制御は、これまでの研究から内皮細胞の活性低下が起因であると推察される。一般的にT細胞におけるPD-1の発現は、定常状態ではそれほど高くはなく、活性化すると誘導し、PD-1とPD-L1との相互作用によりT細胞の活性化は抑制される。また、PD-L1はCD80と相互作用することが可能であり、その結果、T細胞の活性化が抑制されることも報告されている。Tregにも発現が確認されており、免疫抑制メカニズムの一つとされている。これらのことから、anti-A/B抗体接着により内皮細胞内シグナル伝達が制御されることで、PD-L1が誘導され、その結果内皮細胞HLA-DR応答性CD4T細胞のうち、PD-1陽性細胞の活性化が抑制されることが考えられる。

本研究は、内皮細胞HLAにアロ応答するT細胞クローンを同定し、HLA・A/B糖鎖抗体接着による内皮細胞応答が、アロ応答T細胞クローンの増殖・分化に及ぼす影響を明らかとすることを主目的とした研究である。臓器移植においてrecipient T細胞はdirect/indirect recognitionの2種類の反応を介して活性化する。これらの反応は、移植後二次リンパ組織で起こるとされているが、げっ歯類の研究においては、移植後速やかにdonor由来のAPCが処理されるため、Direct recognitionは短命であることが報告されている(Cell report 2016)。内皮細胞のHLA class IIは誘導性たんぱく質分子である。ヒト内皮細胞はげっ歯類と異なり、IFNγで活性化させるとCD4 T細胞を活性化することが報告されている(JCI insight 2017)。つまり内皮細胞HLAを介した移植後のDirect Recognitionの重要性が問われている。本研究では、Direct recognition pathwayに関わるCD4 T細胞の挙動とその重要性、DSAの影響について研究を行う。これらの結果は、免疫順応への理解を深めることにつながり、免疫抑制剤の調節や個別化医療、さらにはABO不適合・DSA陽性臓器移植への理解を深めることへとつながる。されたアロ応答性CD4クローンはCDR3領域に偏りが存在し、HLA class I抗体存在下では臓器移植においてrecipient T細胞はdirect/indirect recognitionの2種類の反応を介して活性化する。内皮細胞のHLA class IIは誘導性たんぱく分子である。本研究では、Direct recognition pathwayに関わるCD4 T細胞の挙動とその重要性、DSAの影響について研究を行った。今後さらなる検討知見を得るためには、実際の移植臓器でのメカニズム解明が必要となる。特に実際の腎組織に浸潤しているT細胞の機能解析が必要になる、つまり、ABO不適合/適合腎移植において、腎組織でのPD-L1の高発現がどの程度の患者で確認できるのか、またその際に浸潤T細胞のサブセットに偏りが生じているのか。またそれらクローンは移植前に同定可能なのかどうかの研究を進めることで、免疫順応のメカニズム解明から治療法へとつながるはずである。ドナー臓器に対するdirect recognitionの制御は、移植直後において非常に重要であると考えられてきた。本研究により移植後慢性期においてもその制御は重要であり、MAPKを介した内皮細胞活性化は、CD4 T細胞応答を亢進させ拒絶反応へと導く可能性が示唆された。
快・不快に基づく強化学習を用いた自己成長型筋電義手に関する研究

本研究は,多自由度筋電義手の実用化に必要な,筋電パターン識別の精度向上に関するものである.研究成果として,筋電パターンの時系列と人の筋骨格系に着目することで,多数の筋電パターンをより正確に識別可能なアルゴリズムを構築した.開発されたアルゴリズムは,過去の筋電パターンの識別結果を参照し2段階目の識別を行うことで,識別率の向上を図る.また識別率が低下した際には,筋電パターンを識別する際に用いる特徴ベクトルを,使用者の不快感を元に自動的に切り替えることにより,識別器の最適化を図る.特徴ベクトルの自動修正は,強化学習をベースに,人の筋骨格系を考慮した内部モデルを保持することで実現されている.これらのアプローチにより,筋電パターンの識別率を飛躍的に向上させることが可能となった.また,筋電パターンを識別器に学習させる際の,ボタン操作の難易度がより簡便となった.これまでは多数の筋電パターンを識別させるために,使用者自身が効果的に筋電パターンを義手に教示する必要があった.しかしながら本研究成果により,より簡便な操作で使用者が筋電パターンを義手に教示することが可能となった.本手法は非常に計算コストの低い処理を行うが,識別率の向上は絶大なものであり,研究途上であった筋電義手を実用に用いるのに十分な性能へと引き上げるものであった.その功績が評価され,様々な機関から講演やメディア露出の依頼が相次いだ.一般との科学技術への理解の隔たりを解消することは今後の科学の発展に非常に重要となるため,これらの活動も積極的に行った.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では,快・不快に反応する脳領域や体動特徴の探索,不快感を用いた強化学習アルゴリズムの開発,という2つの軸で構成されている.前者の快・不快を定量化するための脳波計測法および計測部位の同定は前年度までに行った.現在は快・不快の計測システムを義手と統合するための開発を続けている.具体的には,前年度での手法はオフライン解析によるものであったため,快・不快の計測システムのオンライン解析が可能なシステムの開発を進めている.また,同時にシステム全体の小型化も図っている.現在の開発状況として,不快感計測部分の小型ポータブル化を行い, 10Hzで義手システムへ計測した脳波情報を送信するだけのリアルタイム性を確保した.本研究課題で対象とする快・不快の定量化は,義手のみならず様々な機械の評価やその他様々なアプリケーションに応用が可能なため,システム全体を小型かつ確実簡便に計測ができるよう開発することは非常に重要な要素となる.また,これに並行し不快感を用いた強化学習アルゴリズムの開発を行っている.今年度は前年度までに用いられてきた義手のプロセッサ部分の設計を変更し,よりコンパクトで扱いやすいものとなっている.研究実施計画では学会などのため旅費が多く計上されていたが,様々な国や地域で交流をしたことにより多くの実績に結びついた.11月に視察したアメリカではスタンフォード大学やカルフォルニア大学バークレー校など様々な大学や企業の研究に触れたが,その結果研究成果がSRI(スタンフォード・リサーチ・インスティテユート)の目にとまる結果となり,研究戦略の立て方などに関して多くのアドバイスを得ることができた.また,そのアドバイスをもとに参加したTech Planコンテストにて受賞することができた上,雑誌WIREDでも研究が紹介される運びとなった.この成果により,部品の製作方法や解析方法に至るまで様々な知見や技術を得ることができている.本研究は,多自由度筋電義手の実用化に必要な,筋電パターン識別の精度向上に関するものである.研究成果として,筋電パターンの時系列と人の筋骨格系に着目することで,多数の筋電パターンをより正確に識別可能なアルゴリズムを構築した.開発されたアルゴリズムは,過去の筋電パターンの識別結果を参照し2段階目の識別を行うことで,識別率の向上を図る.また識別率が低下した際には,筋電パターンを識別する際に用いる特徴ベクトルを,使用者の不快感を元に自動的に切り替えることにより,識別器の最適化を図る.特徴ベクトルの自動修正は,強化学習をベースに,人の筋骨格系を考慮した内部モデルを保持することで実現されている.これらのアプローチにより,筋電パターンの識別率を飛躍的に向上させることが可能となった.また,筋電パターンを識別器に学習させる際の,ボタン操作の難易度がより簡便となった.これまでは多数の筋電パターンを識別させるために,使用者自身が効果的に筋電パターンを義手に教示する必要があった.しかしながら本研究成果により,より簡便な操作で使用者が筋電パターンを義手に教示することが可能となった.本手法は非常に計算コストの低い処理を行うが,識別率の向上は絶大なものであり,研究途上であった筋電義手を実用に用いるのに十分な性能へと引き上げるものであった.その功績が評価され,様々な機関から講演やメディア露出の依頼が相次いだ.一般との科学技術への理解の隔たりを解消することは今後の科学の発展に非常に重要となるため,これらの活動も積極的に行った.26年度が最終年度であるため、記入しない。

本研究は脳波信号と筋電信号から,筋電と随意動作の対応関係を快・不快をもとに自動学習するアルゴリズムを開発するものである,不快感を定量化する手法についてはすでに開発し,システムの小型ウェラブル化に取り組んでいるところである.当初の計画では据置型の脳波計を用いて不快感の定量化を行う予定であったが,義手として用いる場合システムの小型化が望ましく,一歩進んで実用を考慮した開発を進行させている.今後,直近では機械学習部分のアルゴリズムを開発していく,具体的には,すでに学習された筋電パターンと義手動作との対応関係を,動的かつ任意に変更可能なシステムを開発する.これが達成されれば,実際に義手を用いて上記不快感の計測が可能になるため,次のステップとして実際に不快感をパラメータ取り入れた強化学習アルゴリズムの開発を行っていく.現在懸念されている事項としては,ポータブル化に際して計測チャンネルを削減しているため,快・不快計測の精度が劣る可能性があることである.ある程度の精度低下であれば許容可能だが,精度低下が大きかった場合,理論の見直しとアルゴリズムのさらなる更新を行い,これに対処する.
映像メディアによるルポルタージュ制作で情報創造力を培う中学校国語科授業の開発研究

本研究の目的は、知識基盤社会を生き抜く力として、「ルポルタージュ制作」の単元授業を開発し、言語を通しての情報創造力、プレゼンテーションカなどの育成をめざすものである。持続可能な社会に向けた課題を意識しながら現場に取材し、生徒一人ひとりが断片的な情報を持ち寄り、他人と協働して統合し作りあげたものを、新たな知識として責任を持たせて発信させ、問題解決に向かわせることが、解のない21世紀の社会には非常に重要だととらえたからである。そこで、「確かな情報発信者/情報受信者」を育てるために、これまでの自身の研究を基盤とし、研究方法として、以下の学習単元を開発した。「同じ素材について、異なる複数の編集の仕方を読み解く」という学習内容である。ルポルタージュ制作に必要な、批判的情報活用能力を身につけさせることをねらいとしている。具体的には、動画テクストである映画の予告編三編を学習材として、生徒が所持している一人一台のタブレットパソコンを活用して比較し、視覚情報、言語情報、聴覚情報の違いを多角的に気付かせ、編集の仕方を読み解いていった。それらの情報量は膨大なため、三編に共通している画像や、一編だけ、或いは二編だけに共通しているシーンや、意図的に挿入された画像に意識的に着目させることによって、戦略的な編集意図を分析し、その予告編は効果的だったかを批判的に論じさせることができたことが成果として挙げられる。また、交流場面で手元のタブレットからIWB(インタラクティブホワイトボード)機能に意見を書き込ませ、電子黒板や授業支援ソフト(xSync)により共有したことで、生徒個々の考えを深化・拡充できた。このような、情報発信者として重要な考えを学ばせた上で、ルポルタージュ制作を通して情報創造力を培うことができた。近々、成果を投稿した学会誌が刊行される。
ポリ(置換メチレン)における多彩な官能基の集積効果を活かした機能性高分子の開発

光機能性官能基としてのBODIPYを、後重合修飾によって、ポリ(置換メチレン)の側鎖として導入する手法の開発に成功した。アントラセンやピレンといった他の光機能性官能基を有するポリ(置換メチレン)にBODIPYを導入することによる、官能基集積効果を活かした光機能性高分子合成への応用が期待される成果である。光学活性な置換基を有するジアゾ酢酸エステルとアキラルなジアゾ酢酸エステルの共重合により得られたポリマーのCDスペクトルにおいて、その鎖中のアキラルなモノマーからなる部分に由来する吸収にコットン効果が観測されることを確認した。これは光学活性な置換基が、アキラルなモノマーからなる部分にキラルならせん構造を誘起したことによるものと考えられる。新たな官能基として、水酸基を保護したグルコースを有するジアゾ酢酸エステルの合成とその重合を行い、脱保護後に主鎖の周囲にグルコースが集積した構造を有するポリマーの合成に成功した。その他にも、各種の長鎖アルキル基、デンドロン骨格等を置換基として有するジアゾ酢酸エステルの合成とその重合にも成功した。これらのポリマーの各種の性質を測定し、それを同じ置換基を有するビニルポリマーと比較することによって、ポリ(置換メチレン)における官能基集積効果の発現の有無を確認していく予定である。ジアゾ酢酸エステルの新たな重合開始剤系として、ナフトキノンを配位子として有するパラジウム錯体を用いる系の開発に成功した。この重合系は、従来の開始剤系に比べて、高分子量体を高収率で得ることができるという特徴を有していることを明らかにした。さらに、用いるナフトキノンの構造を変えることにより、重合の立体選択性を制御できることも明らかにした。各種の置換基を有するジアゾ酢酸エステルの合成とその重合による機能性高分子の開発、そして重合制御を可能とする新たな重合開始剤系の開発という本研究計画の最も重要な目的を、着実に達成しつつあるため。今後も、当初の研究計画どおりに研究を遂行していく予定である。その目的を達成するにあたって、特に問題は発生していない。
不均化反応法による機能性Crセラミックス皮膜の生成に関する研究

窒化処理鋼材料をフッ化クロムと鉄-クロム合金を含有する塩化物系の溶融塩中に浸漬することによって窒化処理鉄鋼材料表面にクロム窒化物のセラミックス皮膜を生成させた。この皮膜生成のメカニズムは溶融塩中に存在するクロムイオンの不均化反応によって進行することが判明した。生成した皮膜はCrNあるいはCr_2Nと鉄とクロムの固溶体合金から構成されていることがわかった。また、この皮膜の厚さは浸漬処理の処理温度と処理時間あるいは溶融塩の化学組成によって影響をうけた。皮膜の表面硬度は1300Hvから3000Hvという高い硬度を示した。この皮膜の常温の塩化物イオンを含む水溶液中における耐食性の評価を行ったところ、高い耐食特性を示した。これは、皮膜表面にクロムの拡散層が形成され,これが耐食性を有するためであると考えられた。さらに、Cr-Siの複合皮膜やCrSi_2が不均化反応を用いて2段階処理によって鉄鋼基板上に生成できた。したがって、母材に存在しない元素でも様々なセラミックス皮膜を不均化反応を用い多段階処理によって基板上に形成することが可能であると考えられる。Cr-N系セラミックス皮膜の作成と、その評価に関して研究を行った。研究経過は以下の通りである。1.ルツボ、金属材料、および処理塩を研究経費によって購入し、表面皮膜生成装置を作成した。2.窒化処理用の塩を作成し、鉄鋼材料表面に窒化処理を施した。3.Cr-N系セラミックス皮膜生成処理用の塩化物塩を作成し、浴組成、処理温度、処理時間を変化させて窒化処理試料表面にCr-N系セラミックス皮膜を生成させた。5.処理材の表面硬度、断面深さ方向の硬度、耐摩耗性、耐食性等について実験を行った。予め窒化した純鉄、極低炭素鋼、炭素工具鋼をクロムをフェロアロイおよびクロム塩を含む塩化カリウムー塩化バリウムーフッ化ナトリウム溶融塩中の7001000°Cにおいてそれぞれ浸漬する実験を行い、次の知見が得られた。1.浸漬処理により試料表面にクロムの窒化物とクロム鉄の固溶体相からなる混合皮膜が生成した。2.処理温度が高く処理時間が長いほど被覆量は増加した。窒化予備処理の増加は、Cr窒化物の被覆量を増加させた。3.溶融塩中のNaF、金属塩、フェロアロイの3成分は被覆を行う上で不可欠であった。このことから皮膜形成には不均化反応が関与しているものと考えられた。4.窒化物層の生成により表面硬度はHv10003000に増加した。それに対応して耐摩耗性も向上した。窒化処理鋼材への溶融塩中不均化反応を用いたCrの溶融塩浸漬法によるCr窒化物皮膜生成に関し以下の結論を得た。1.浸漬法により生成した皮膜は,Cr窒化物/Fe-Cr固溶体複合皮膜であった。窒化物としてはCrN,Cr_2Nの2種類が認められたが,クロム処理温度や鋼材中の窒素濃度によりその存在比が変化した。2.被覆量はクロム処理時間の増加とともに増加した。3.クロム拡散浸透にはNaF,CrF_3,フェロクロムの3者の共存が必要であり,溶融塩不均化反応の支援により進行するものと確認された。4.皮膜硬度は1300Hvを超え,3,000Hv以上を示す場合もあった。5.クロム拡散浸透処理により耐食性も向上した。6.皮膜中の元素,Cr,Siが鋼材試料中には存在しなくても,不均化反応を用いて2段階処理によって基板上にCrSi_2が生成できた。7.主要生成物はCrSi_2であり、SiCもわずか存在する。処理温度と処理時間が増加するにつれて皮膜生成量は増加し,過剰処理ではSiが侵入して皮膜中にFeSiもできる。皮膜は高い表面硬度(2200Hv2500Hv)を示した。耐摩耗性,耐孔食性も良好であった。
イネのRFLPsマ-カ-地図の育種的利用

イネゲノムについて旧来の連鎖地図とRFLP地図との統合を計り、育種的利用に供するため以下の研究を行った。(1)8標識遺伝子の連鎖関係を明らかにし、内外の連鎖デ-タ-を総合して142標識遺伝子座より成る旧来の連鎖地図を作成した。(2)RFLP地図上へPr、Ph、Rcおよびlaの各遺伝子座をマッピングした。また、23種の準同質遺伝子系統(NIL系)を用いて10種の染色体を同定し、第3、10および11染色体について、RRFLP地図では方向が逆になっていることを明らかにした。(3)NIL系統において、第1および10染色体上に位置する半矮性(sdー1)と稔性回復(Rfー1)の各遺伝子座を含むリンレ-ジブロックの大きさを推定し、sdー1を狭むRFLPクロ-ン(CD1083とRZ276)およびRfー1を狭むクロ-ン(RG561とCD094)を同定した。(4)イモチ病低抗については18種の準同質遺伝子系統(国際稲研究所作成)をフィリピン菌系への反応により6群に分け、I群にはPiーk座、II群にはPiーz座、III、IVおよびVI群にはPiーta座またPiーi座の各遺伝子が関与することを明らかにした。(5)プロトプラスト融合により作成した日本型品種「キタアケ」とOryza punctata間の体細胞雑種について、エンドウのrDNA断片をプロ-ブに用いてRFLP分析を行い、雑種におけるバンドの由来を明らかにした。その中には2倍体であって、しかも0.punctata親のバンドの一本の入った2倍体雑種があった。(6)イネのゲノムサイズ(核のDNA含量)を精度の高いFlow cytometerにより0.90pg/2C(IR36の場合)と測定した。さらに日本型イネはインド型よりDNA含量が少ない上にグル-プ内の変異も小さく、日本型×インド型のF_2集団でのDNA含量の分布は連続的で、日本型親に近い0.87pg/2Cにモ-ドを有することを明らかにした。このようにRFLP分析は、今後ますます遺伝育種学への応用場面を拡大し、育種法の改良や効率化へ役立つことを期待できる。RFLPは制限酵素の切断部位の消失や新生により生じるため、DNA塩基配列の置換・欠失や挿入のほかにメチル化といった化学変化も考慮に入れる必要がある。イネにおいてメチル化により生じるRFLPの有無を検討するため、日本型およびインド型の8品種から核DNAを抽出し、CCGGを認識部位とするメチル化感受性のHapIIと非感受性のMspIの2種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動を行った。プロ-ブには「日本晴」の核DNAのHapII切片(12kbp)16種を用い、サザンハイブリッド形成によるRFLPの検出を試みた。16種のプロ-ブのうち、MspIでは2種、HapIIではこれに加えて3種が多型性を示した。したがって、このHapIIにのみ検出された3種のRFLPはメチル化によることがわかった。

RFLP連鎖地図へ従来の標識遺伝子座を挿入するため、NIL(準同質遺伝子系統)法により、NIL、遺伝子提供親および反覆親のRFLPを調査した。各遺伝子プロ-ブについて3者間で多型の検出された割合は平均34%(183%の変異幅)であった。かかる手法で各染色体の両端に近い2ヶ所にある標識遺伝子座のマッピングを試みている。これまでに、第IIIおよび第X連鎖群が旧来の地図とRFLP地図で方向が逆であることが明らかにされた。さらに、RFLPの育種的利用のため、まずプロトプラスト融合により日本型品種「キタアケ」とOryza punctata間で体細胞雑種を作り、エンドウのrDNA断片をプロ-ブに用いて雑種のRFLP分析を行った。その結果、2倍体でしかもO.punctata親にのみ存するバンドの一本が導入された雑種を見出した。また、この雑種の形質は「キタアケ」に似ており、種子を着生した。さらに、4倍体でO.punctata由来のDNA断片を有する雑種をRFLPで選抜し、葯培養を用いて2倍体化を試みている。イネのRFLPマ-カ-を利用して連鎖地図の作成や育種的利用に関する研究を行い、以下の成果を得た。形態並びに生理的マ-カ-による旧来の地図とコ-ネル大学で作成されたRFLP地図の統合を計るために、米国検定系統×北大検定系統の3交雑組合せについて、F_2集団を用いてRFLP地図上における標識遺伝子のマッピングを行った。まず100の遺伝子クロ-ンについてのRFLP多型性の平均が20ー30%であリ、RFLP分析がやや困難であったにもかかわらず、PnーRG462,bcー1ーRG179,PrーRG163,glー1ーRG182,glー1ーRG403,RcーRG30,laーRG118間にそれぞれ9.6,10.4,19.9,15.4,19.7,13.5,41.1のモルガン距離を算出した。イネの連鎖地図はこれまでセントロメアの位置が不明のために両腕が区別できなかったが、RFLP地図と旧来の連鎖地図におけるPnの位置の比較から、第1群の方向は逆転することを明らかにした。また、地図上のマ-カ-の分布も両地図間でかなりの差があるように思われる。このような分析を進めるならば、高度の育種的利用に供し得る精密な統合遺伝地図を作成できる。イモチ病抵抗性遺伝子については、国際稲研究所で作成された同質遺伝子型系統を用いて、Code No.15の遺伝子がPiーz座(第6染色体)の近くに、Code No.18ー22の遺伝子が第12染色体上にあることがわかった。さらに、22種の検定系統についての総当り交配を行ってF_1を作成し、日本におけるイモチ菌系5種による接種試験を行った。その結果、イモチ病抵抗性の反応から、22系統は4群へ分類されたが、その分類が必ずしも従来のフィリピンの菌系による分類とは一致しなかった。そこで次年度は国際イネ研究所において、実際にフィリピンの菌系を用いて同一の材料による接種試験を行って、関与遺伝子の同定を進める予定である。なお、sdー1(半矮性)やRfー1(稔性回復遺伝子)についてもRFLP地図上のマッピングを行った。イネゲノムのRFLP地図と従来の連鎖地図との統合を計り、RFLPマ-カ-の育種的利用を計ることを目的として研究を行い、以下の成果を得た。(1)米国検定系統×北大検定系統の4交雑組合せのF_2集団を用いて、RFLPマ-カ-と標識遺伝子の連鎖関係を調べ、新たにPr、Ph、glー1、Rcおよびlaの各遺伝子座をRFLP地図上へマッピングした。(2)23種の準同質遺伝子系統(NIL系)を用いて、NIL法によるRFLPマッピングを行い、10種の染色体を同定した。
核然料再処理系臨界安全オンライン監視手法の開発

未臨界度の変化を迅速に検出する安価なオンライン臨界安全監視システムの開発が求められている。本研究では、まず未臨界システムが一点炉一群近似動特性方程式で記述できるものとして、中性子検出器出力ゆらぎ時系列データは自己回帰移動平均(ARMA)過程となることを示し、適応フィルターによりこのARMAモデルパラメータをオンライン推定して、モデルの高周波側折れ点周波数(Fc)から未臨界度を推定する方法を提案した。次に、この手法を実用化するのに必要な知見を得るため、計算機シミュレーションと近畿大学炉実験による実データの解析により以下の結果を得た。1.中性子検出器出力ゆらぎのサンプリング周波数(Fs)は20Fc200Fc、2.エリアシング除去フィルタとして1/2Fsに析れ点周波数を持つ4次程度のローパスフィルタ、3.平均値除去フィルタとして0.1Fc0.01Fcに析れ点周波数を持つ6次以上のハイパスフィルタを用いる必要がある。4.パラメータ推定アルゴリズムは初期値を適切に設定したRecursive Extended Least Squares法でARMA(1,1)同定する。5.時間的に変化する未臨界度をより高速に推定する改善法として、残差分散行列活性化法を提案し、この方法を用いることにより、ステップ状未臨界度変化をおよそ1000データで検出できる(サンプリング周波数20KHZに換算すると0.05秒)。以上の結果、オンライン未臨界度推定に本手法が有効であるとの見通しを得た。本手法は原理的に特殊な中性子源や検出器が不用であり、非常に簡単な臨界安全監視システムを構成できるものと期待され、従って臨界安全監視を必要とする場所に容易にこのシステムを設置できる。しかし、結果は一点炉近似動特性の範囲に留まり、実用化のためには、空間依存性の考察と、S/N比の良い信号を得るための中性子源の強化が重要となる。1.計算機による研究:遅発中性子1群1点炉近似動特性に従う未臨界システムは自己回帰移動平均型(ARMA)モデルで記述できることに基づき,計算機シミュレーションにより中性子検出器出力揺らぎを模擬し,このデータを用いて(1)A/D変換サンプリング周波数, (2)カルマンフィルターアルゴリズムとパラメータ推定に要するデータ数,(3)ARMAモデル次数と未臨界度分解能,(4)直流分除去用ハイパスフィルター,(5)観測雑音・中性子信号揺らぎ信号比と推定未臨界度統計精度, (6)推定値の統計的変動,等についての考察を行い以下の結論を得た.カルマンフィルターの逐次計算アルゴリズムとして逐次最小2乗(RLS)法より逐次拡張最小2乗(RELS)法が計算速度・パラメータの収束速度の点で優れている.同定されるモデルパラメータは真値に集束しないが,信号の高周波側パワースペクトル密度は非常によく推定される.即ち中性子検出器信号揺らぎスペクトルの折れ点周波数(Fc)が本手法で推定でき, Fcより未臨界度が算出できる.以下RELS法により解析した結果(1)サンプリング周波数はFcの20200倍に採れば良い.(2)ARMAモデルはARMA(2.2)モデルが最も良い未臨界分解能を持つ.(3)ハイパスフィルターは0.1Fc0.01Fcに折れ点周波数を持つ一次進みでよい.(4)パラメータ推定に要するデータ数は3×10^4で十分である.(5)本手法ではS/N比が2程度の場合5%以下の誤差でFcを推定できる.2.近畿大学炉を用いた実験:上記手法を近畿大学原子炉に設置された中性子検出器(CIC)出力信号揺らぎに適用し,未臨界度7φ82φに対し7φの分解能で未臨界度を推定できることが検証された.本実験は定常未臨界状態に於けるものであり本手法を非定常的な状態には適用できない.従って,本年度は非定常なシステムに適用できるアルゴリズムの研究が最も重要な課題である.未臨界度の変化を迅速に検出する安価なオンライン臨界安全監視システムの開発が求められている。

しかし、結果は一点炉近似動特性の範囲に留まり、実用化のためには、空間依存性の考察と、S/N比の良い信号を得るための中性子源の強化が重要となる。1.原子炉実験による研究:中性子検出器からのアナログ信号をマルチチャンネルフィルタにより処理し、低周波成分、平均値の変動にも着目したデータ収集を行なう予定であったが、近畿大学炉における実験では商用周波数雑音が信号測定系に混入したため、目的に合ったデータの収集を行なうことができなかった。従って、可能な限り深い未臨界度状態で、制御棒操作により時間的に変動する反応度を模擬し、この時の中性子検出器雑音時系列データを用いて、時間的に変動する未臨界度を推定するためのオンライン・パラメータ同定アルゴリズムの検討を行い、従来法によりパラメーチ追従性の良いアルゴリズムを開発した。2.計算機による研究:(1)統計精度のよいパラメータ推定を行なうためには、中性子源強度は、中性子雑音スペクトルが平担となる周波数領域でS/N比が10以上となるようにすることが望ましい。(2)低周波成分除去最適フィルタは、中性子雑音スペクトルの高周波側折点周波数の1/201/100程度に折れ点周波数を持つローカットフィルタで充分である。あまり低い周波数成分を含んだデータは、かえって未臨界度推定精度を悪くする。(3)推定パラノータの収束は、用いるデータセグメント、推定パラメータの初期値、および固定されるシステムに強く依存する。これに対しては、推定パラメータに適当な初期値を与えることにより、パラメータ推定の安定性と収束性が改善される。(4)未臨界度推定に関する限り、最小二乗推定法、最尤推定法にせよアルゴリズ依存性はあまりない。3.今後の研究:現在用いられているパラメータ同定法は対象システム依存性があり、未臨界システムに適したパラメータ同定法を見つけることが重要であり、一方非定常状態に対する追従性の良いアルゴリズムの開発も重要である。そのためには、パラメータ推定アルゴリズム中の残差を非線型評価する手法が有望ではないかと期待される。
器官サイズ制御の分子基盤-補償作用の分子遺伝学的解明

葉原基で細胞分裂脳に異常が生じて細胞数が不足すると、細胞サイズが通常より大型化する現象を、私たちは補償作用と呼んでいる。この補償作用という現象が、細胞分裂能に関する情報の細胞間伝達によって引き起こされていることを、キメラ解析系を樹立して初めて示すことに成功したほか、補償作用の背景となっている遺伝子経路を新たに数多く同定することができた。また葉原基の中での細胞分裂領域と細胞伸長領域の空間配置制御についても明らかにした。器官サイズの制御の理解は基礎生物学的にも、また医学的にも重要な解明課題である。近年の研究の成果から、器官レベルの制御は、細胞レベルの制御の単純な積み重ねではないことが、明らかとなってきた。例えば植物の葉においては、細胞周期の制御に異常を与え、細胞の供給が低下した状態にしても、葉のサイズは、細胞数の減少から計算されるほどには減少しない。これは、原因不明の細胞肥大が異常に亢進して、細胞数の減少を相殺するからである。これは一方向性で、逆の現象は起きない。そこでこれを私たちは補償作用(compensation)と名付けた。本研究計画はこれを重要な視点として、細胞間相互作用に基づく器官レベル制御システムを、分子レベルで解明しようとするものである。そのため5年間の短期集中的解析を進め、以下の各項目について明らかにする計画とした。(1)まず補償作用と呼ばれる現象を支える個々の遺伝子群を同定する。そのことを通じて、補償作用を支える分子基盤とその遺伝ネットワークを解明する。(2)葉原基での細胞の分裂と伸長をリンクさせる分子基盤を明らかにする。(3)同時に、補償作用の惹起を指標として、器官レベルでの細胞数(細胞増殖活性)のモニタリングシステムを解明する。すなわち、器官レベルでの細胞数が、どのようにモニターされているのかを解明する。今年度は、当初計画通り、(1)補償作用を抑圧する遺伝経路の解明と(2)補償作用を誘起する過程の解明を目指して解析を行なった。まず(1)については、葉の細胞のサイズと数とを指標にした大規模スクリーニング(Horiguchi et al.2006a, 2006b)を経て、細胞サイズが特異的に小さくなる変異体群・xsを単離し、それぞれの変異を補償作用を典型的に示すan3変異体に導入した。その結果、補償作用を抑圧する遺伝経路として特定の都遺伝子に制御される細胞伸長制御系が浮き彫りとなった(Fujikura et al. 2007)。この解析の結果、興味深いことに、葉の細胞伸長制御系は、補償作用に関係する経路とそうでない経路との少なくとも2経路があることが明らかになった。しかも補償作用に関係する軽路も、ある特定の段階より下流のみが、補償作用で昂進するということが示された。現在、それぞれの超遺伝子座の精密マッピングを行なっている。一方(2)については、補償作用を誘起する経路の特性を解明するために、新たに補償作用を示す変異体を複数単離し、その細胞サイズと細胞分裂のパターンを経時的に解析した。その結果、補償作用は細胞分裂が終結した後に初めて誘起されるものと、細胞分裂中から誘起されるものの二つがあること、また細胞伸長の昂進の型として、伸長速度が上昇するものと、伸長;期間が長くなるものの二つがあることが明らかとなった(Ferjani et al., in press)。またこれらの型の異なる補償作用を示す変異体を用い、野生株との比較においてマイクロアレイ解析を行なった結果、多数の興味深い遺伝経路が陽性として検出された。現在、これを解析中である。また、上記の新規変異体の大規模スクリーニングで得られた変異体のうち、葉の細胞数に特異的な欠損を示すoli変異体を用いた解析から、補償作用を誘起するための条件として、単純に葉の細胞数だけで決まっているわけではなく、いくつかの鍵となる条件を満たす必要があることも判明した。さらにこの間、倍数性や核内倍加現象との連関を示唆する結果を得て、解析を進めている。本年度の最大のテーマは、「補償作用を誘起するシグナル因子の正体は何か。」である。今年度、初めて葉原基においてキメラ状に特定の遺伝子の発現を誘導する系を確立し、これを使って、補償作用を誘起するシグナルが、細胞自律的に働くのか、細胞非自律的に働くのかという課題(Ferjani et al.2008)について解析し、その現段階での成果について、植物生理学会年大会において発表を行なった。さらに核内倍加の変異体等の解析から、ゲノム倍数化と細胞肥大との間には、未知の制御系が介在している可能性が高いことが判明した(Tsukaya 2008)。また補償作用を誘起する過程と補償作用を実際に引き起こす過程とに関して、これまでに同定した変異体群について原因遺伝子の同定を進めると共に、昨年度から、ベルギーのGerrit Beemster博士およびスペインのJose Luis Micol博士との研究協力の結果、補償作用を示しかつ葉形が変形する変異体の原因遺伝子を多数同定した(投稿準備中)。

さらにマイクロアレイ解析から下流遺伝子候補と考えられた遺伝子群の機能解析を進めた。それらの解析の結果、リボソーム関連遺伝子群のうちの一部が、細胞増殖と細胞伸長の制御の要に位置すること、またひいては背腹性の制御にも関わることを明らかにした(Fujikura et al.,in press)。またこれまで定義してきたタイプの補償作用とは逆に、細胞数が増加して細胞サイズが減少する、「逆補償」タイプの変異体群mscについて原因遺伝子のクローニングをしたところ、いずれも葉位に依存した異型葉性の変異体で、しかもmiR156-SPL系に含まれる遺伝子の変異であった。またこれまでにheteroblastyの制御に関わることが知られているもう一つの経路、tasiR-ARF系についても細胞数と細胞体積を調べたところ、こちらの系の変異体は、外見上の葉の形態で見たときのheteroblastyの変化が明らかに異常であるにもかかわらず、細胞数・細胞体積の変化が見られなかった(Usami et al.,2009)。heteroblastyは従って、複数の制御経路による複合形質であること、また特定の葉位における葉の中の細胞数・細胞体積はmiR156-SPL系によって制御されていることも判明した。本年度の最大のテーマは、「補償作用を誘起するシグナル因子の正体は何か。」である。今年度、初めて葉原基においてキメラ状に特定の遺伝子の発現を誘導する系を確立し、これを使って、補償作用を誘起するシグナルが、細胞自律的に働くのか、細胞非自律的に働くのかという課題(Ferjani et al.2008)について解析し、その現段階での成果について、植物生理学会年大会において発表を行なった。さらに核内倍加の変異体等の解析から、ゲノム倍数化と細胞肥大との間には、未知の制御系が介在している可能性が高いことが判明した(Tsukaya 2008)。また補償作用を誘起する過程と補償作用を実際に引き起こす過程とに関して、これまでに同定した変異体群について原因遺伝子の同定を進めると共に、昨年度から、ベルギーのGerrit Beemster博士およびスペインのJose Luis Micol博士との研究協力の結果、補償作用を示しかつ葉形が変形する変異体の原因遺伝子を多数同定した(投稿準備中)。それらの解析の結果、リボゾーム関連遺伝子群のうちの一部が、細胞増殖と細胞伸長の制御の要に位置すること、またひいては背腹性の制御にも関わることを明らかにした(Fujikura et al., in press)。またこれまでにheteroblastyの制御に関わることが知られているもう一つの経路、tasiR-ARF系についても細胞数と細胞体積を調べたところ、こちらの系の変異体は、外見上の葉の形態で見たときのheteroblastyの変化が明らかに異常であるにもかかわらず、細胞数・細胞体積の変化が見られなかった(Usami et al., 2009)。
ゆらぐ分化誘導情報に対する幹細胞の応答特性

幹細胞は外部シグナルや内因的に生成される情報に基づき、さまざまな細胞タイプへ分化できる。この細胞分化がどのような論理に基づいて起こるのかを正しく理解するには、従来の幹細胞研究で用いられてきた集団計測だけでなく、個々の細胞の時間的な状態変化を実験者側から制御された環境下で調べることのできる新たな計測ツールが必要となる。本研究課題では、このような計測を実現する1細胞計測技術を開発し、それを用いてマウスES細胞の分化応答を1細胞レベルで解析することに成功した。(1)マウスES細胞用オンチップ培養観察デバイスの構築マウスES細胞を顕微鏡上で長期培養するための培養観察デバイスを構築した。ガラスボトムディッシュに、両面テープを介してPDMSのパッドを貼付けるシンプルな構成で、培養液を常に還流しながら細胞を連続観察できるシステムを作った。また、長期観察用に、顕微鏡上でCO2濃度を制御できる簡易インキュベーター装置を作製した。市販の顕微鏡上CO2インキュベーターは定格のため、還流デバイスと組み合わせて用いることはできない。作製した簡易インキュベーターとデバイスを組み合わせることで、マウスES細胞の挙動を少なくとも3日間連続観察できることを確認し、長期1細胞観察の実現へ端緒を開いた。(2) ES細胞無血清培養系のチップへの実装ES細胞の分化誘導条件を厳密に制御するには、実験者側から与えた完全既知の環境条件で細胞を観察する必要がある。そのためには、成分既知の無血清培地を利用すること、そしてES細胞の集塊化を防ぐことの2つが必須である。そこで、無血清培地であるESF7培地(Furue, et al. (2005) In Vitro Cell.Dev.Biol.)を用い、これを、E-cadherin-Fcコートした基板表面でES細胞を分散培養する方法(Nagaoka, et al. (2006) PLoS ONE)と組み合わせた。その結果、ESF7を還流し続けながら、上記(1)のデバイス中で、ES細胞を分散状態においたまま、長期観察できることを確認した。細胞の平均成長速度も、Collagen上の場合とほぼ同程度であり、このシステムでES細胞の培養観察が可能であることを確認した。以上の構成により、培養環境の不確定要因を極力除いた状態で細胞観察を実現できると期待される。本研究課題では、様々なパターンで変動する誘導環境を入力情報としたときの、幹細胞の分化運命決定の情報処理ロジックを明らかにすることを目指している。そこで、(1)変動する分化誘導環境を自在に作り出し、幹細胞の分化応答を1細胞レベルで計測できるシステムを立ち上げること、(2)このシステムを用いて、マウスES細胞をモデルシステムとして、分化応答の入出力応答を定量計測することという2つを実現したい。平成22年度の成果は以下である。1.2つの培養環境を任意の条件で変化させられる灌流システムの構築本研究課題を遂行するには、様々な時間変化パターンを示す分化誘導条件を自由に作ることが必要となる。例えば2つの環境が交互に入れ替わる場合であっても、1時間おきに変化する場合と、10時間おきに変わる場合では、分化応答は大きく変わってくるだろう。2つの環境条件を実験者側から制御した形で入れ替えるために、2つのプログラマブルシリンジポンプとストップバブルを組み合わせた自動送液システムを立ち上げた。これを昨年度までに立ち上げた灌流デバイスと組み合わせることで、周期のことなる環境変動下で、細胞の応答を1細胞レベルで計測できるシステムを構築した。昨年までに構築した灌流デバイスを用い、未分化マーカーNanogのプロモーターからGFPを発現するマウスES細胞株の1細胞計測を進めた。これまでに、未分化状態を維持する培養液を流し続けることで、一定の培養環境下におけるGFP量の細胞内変動を計測している。この計測により、未分化維持環境における分化ポテンシャルの変動や、自発分化をする細胞の割合を明らかにできると期待される。平成23年度の成果は以下である。1.ステップ型の分化誘導環境変化に対するマウスES細胞の応答計測昨年度までに開発した1細胞培養装置を用いて、未分化維持用の培地中で培養されているES細胞に対し分化培地環境条件をステップ型で課し、その応答を1細胞レベルで直接顕微鏡下で観察する実験を行った。データ解析の結果、未分化維持培地、分化培地いずれにおいても、分裂間隔時間や細胞の生死には姉妹細胞間で正の相関があり、1細胞のふるまいにエピジェネティックな要因が働いていることが示唆された。