hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重粒子線照射による低侵襲不整脈治療法の開発-心筋梗塞動物モデルを用いた実験研究-

我々は、これまで癌治療にしか注目されなかった放射線(重粒子線)を病態心に照射することで、不整脈基質の原因である電気学的不均一性を改善し、VT/VFの発生を抑制しようとする研究に着手した。我々の研究は、致死性心室性不整脈の予防治療において重粒子線の潜在的有用性を提示した初めての報告である。目的:病態心への照射効果を検討する。対象として24羽のウサギを用い、冠状動脈内へのマイクロスフェアー注入による非貫壁性心筋梗塞(MI)を作成した(MIのない24羽のウサギをcontro1として使用)。MI作成2週間後、千葉放射線医学研究所のHIMAC加速器を用いて、心臓を標的とした重粒子線照射(Targeted heavy ion irradiation:THIR15Gy)を施行した。結果:mRNAおよびタンパク解析において、THIRはMIおよびcontrolの左心室におけるCx43発現を亢進した。免疫染色結果では、MIにおいては梗塞周囲の残存心筋でCx43が減少していたが、THIRによって改善した(細胞側面>介在版)。左室前壁の心外膜マッピング生体実験では、MIにおける興奮伝導の遅延が認められたが、THIRによって興奮伝導の回復が認められた。また、MIにおける活動電位回復時間のばらつき(ARID)は増加していたが、THIRによって縮小した。プログラム刺激によるVT/VF誘発率はMIで増加したが、THIRによって抑制された。なおTHIRによる心機能の低下は認められなかった。以上の実験的検討より、梗塞周囲の残存心筋と壊死心筋が混在した領域で異常構築された心筋細胞の電気的不安定性はTHIRによって修飾され、興奮伝導の改善と再分極のばらつきを均一化することで不整脈の誘発性を低下させることが明らかとなった。我々は、ウサギ心内膜下心筋梗塞(MI)モデルを用いたこれまでの実験で、左心室を標的とした重粒子線照射(HIR)を行なうと、活動電位光学マッピング実験において梗塞後残存心筋で観察される活動電位再分極の不均一性増大が軽減するとともに、早期刺激による心室頻拍・細動誘発が抑制されることを報告した。本研究では、この抗不整脈作用のメカニズムを解明するための第一段階として、ウサギの左室心筋のギャップ結合に対する重粒子線照射の影響を検討した。ウサギの左側胸部から左心室前・側壁に焦点を合わせて15GyのHIRを行い、2週間後に心臓を摘出して膜電位感受性色素を用いた活動電位光学マッピングを行なった。その後、モノクローナル抗体を用いて免疫染色を行いCx43の発現様式を解析した。光学マッピングで計測した左室表面の伝導速度はcontrolに対するHIR群で軽度(12-27%)低下したが有意ではなかった。一方、MIに対するHIR群では伝導速度は変化しなかった。免疫染色結果では、Control+HIR群ではCx43の発現が全体的に増加し、介在板部分(ID)だけでなく細胞側面(LS)にも多くの分布が認められた。Cx43染色のLS/ID+LSはHIR群の方がコントロール群よりも有意に増大した(0.1±0.05vs.0.3±0.09,n=4)。またMI+HIR群でも同様にCx43の発現が全体的に増加した(MIに対して1.8倍)。重粒子線照射はCx43発現様式を変えることで心室の不整脈発生基質を修飾する可能性がある。

目的:病態心への照射効果を検討する。対象として24羽のウサギを用い、冠状動脈内へのマイクロスフェアー往入による非貫壁性心筋梗塞(MI)を作成した(MIのない24羽のウサギをcontrolとして使用)。MI作成2週間後、千葉放射線医学研究所のHIMAC加速器を用いて、心臓を標的とした重粒子線照射(Targeted heavy ion irradiation:THIR 15Gy)を施行した。結果:mRNAおよびタンパク解析において、THIRはMIおよびcontrolの左心室におけるCx43発現を亢進した。免疫染色結果では、MIにおいては梗塞周囲の残存心筋でCx43が減少していたが、THIRによって改善した(細胞側面>介在版)。左室前壁の心外膜マッピング生体実験では、MIにおける興奮伝導の遅延が認められたが、THIRによって興奮伝導の回復が認められた。また、MIにおける活動電位回復時間のばらつき(ARID)は増加していたが、THIRによって縮小した。プログラム刺激によるVT/VF誘発率はMIで増加したが、THIRによって抑制された。なおTHIRによる心機能の低下は認められなかった。以上の実験的検討より、梗塞周囲の残存心筋と壊死心筋が混在した領域で異常構築された心筋細胞の電気的不安定性はTHIRによって修飾され、興奮伝導の改善と再分極のばらつきを均一化することで不整脈の誘発性を低下させることが明らかとなった。
川崎病急性期における血管内皮細胞の病原関連分子パターンの解析

【背景】川崎病は小中動脈を中心とした全身の血管炎であり、特に冠動脈が傷害される。免疫グロブリン大量療法(IVIG)は、最も有効な川崎病の治療法であり、冠動脈病変(CAL)の合併率を減少させたが、冠動脈病変は川崎病を発症した10%に認められ、15%はIVIGに抵抗性の難治の川崎病であり、新たな治療法の確立が望まれている。川崎病急性期には様々なサイトカインの活性化が報告され、なかでも炎症性サイトカインであるTumor necrosis factor-alpha(TNF-α)は発症早期に高値を示し、炎症機転の中心的な役割を果たすと考えられている。一方、川崎病は、自然免疫の爆発的な活動を特徴とし、中でも、Pathogen Associated Molecular Pattern(PAMP)の一つであるMRP8/MRP14やS100A12は、血管内皮細胞のパターン認識受容体により認識され、シグナル経路から、様々な炎症性サイトカインを誘導し、川崎病では、冠動脈病変を含めた血管炎の重要なマーカーであることを我々は明らかにしてきた。インフリキシマブはTNF-αモノクローナル抗体であり、TNF-αを介して引き起こされる慢性関節リウマチやクローン病といった炎症性疾患において、有効な治療薬であることが報告されてきている。近年、川崎病においても、IVIG無効、メチルプレドニンパルス療法(IVMP)の患者に対するインフリキシマブの投与例の報告が散見されてきている。今回、我々は、IVIG無効、IVMP無効の難治川崎病において、インフリキシマブを投与し、炎症性サイトカインとDAMPの動態の解析を行い、インフリキシマブの血管炎に対する作用機序を明らかにした。【方法】【結果】インフリキシマブ投与例11例中8例が、投与後に臨床症状の改善が認められた。3例はインフリキシマブ投与後も臨床症状が改善せず、炎症反応が遷延し、IVMPの再投与およびサイクロフォスファマイドの投与を余儀なくされた。11例中4例において、冠動脈病変を認めたが、インフリキシマブ投与前より冠動脈病変が認められていた。IVIG反応群ではIVIG投与前において、STNFR、IL-6、VEGF、MRP8/MRP14、S100A12は健常群との比較では有意に高値であったが、IVIG投与後に有意に低下した。IVIG不応群ではIVIG投与前後において、STNFR、IL-6、VEGF、MRP8/MRP14、S100A12は有意に高値を示し続けた。インフリキシマブ投与例ではSTNFR、IL-6はインフリキシマブ投与前に有意に高値を示し、投与後に低下したが、MRP8/MRP14およびS100A12はむしろインフリキシマブ投与後に増加し、VEGFは変化なく高値を示し続けた。【総括】本研究により、インフリキシマブは難治川崎病における有効な治療法のひとつであることが示された。またインフリキシマブ治療によりMRP8/MRP14やS100A12といったPAMPおよびVEGFが抑制されなかったことは、全身の炎症機転はインフリキシマブにより抑制されても、局所の血管炎は抑制されないことが示唆され、冠動脈病変の悪化を十分に阻止できない可能性が示された。そのため、難治川崎病においては、インフリキシマブを早期投与することで、単球・マクロファージの活性化を抑え、血管炎の進展を防止することが望ましいと思われた。

11例中4例において、冠動脈病変を認めたが、インフリキシマブ投与前より冠動脈病変が認められていた。IVIG反応群ではIVIG投与前において、STNFR、IL-6、VEGF、MRP8/MRP14、S100A12は健常群との比較では有意に高値であったが、IVIG投与後に有意に低下した。IVIG不応群ではIVIG投与前後において、STNFR、IL-6、VEGF、MRP8/MRP14、S100A12は有意に高値を示し続けた。インフリキシマブ投与例ではSTNFR、IL-6はインフリキシマブ投与前に有意に高値を示し、投与後に低下したが、MRP8/MRP14およびS100A12はむしろインフリキシマブ投与後に増加し、VEGFは変化なく高値を示し続けた。【総括】本研究により、インフリキシマブは難治川崎病における有効な治療法のひとつであることが示された。またインフリキシマブ治療によりMRP8/MRP14やS100A12といったPAMPおよびVEGFが抑制されなかったことは、全身の炎症機転はインフリキシマブにより抑制されても、局所の血管炎は抑制されないことが示唆され、冠動脈病変の悪化を十分に阻止できない可能性が示された。そのため、難治川崎病においては、インフリキシマブを早期投与することで、単球・マクロファージの活性化を抑え、血管炎の進展を防止することが望ましいと思われた。【研究実施計画】対象は、平成15年から平成18年に発症した11人の川崎病患者で、年齢は3ヶ月から7歳5ヶ月(中央値3.8歳)であった。対象の患者は、すべて診断基準を満たし、IVIG療法またはIVMP療法が無効であった。インフリキシマブ投与前後の血液を採取し、ELISA法を用いて、soluble TNF-αreceptor(sTNFR)、IL-6、VEGF、myeloid-related protein (MRP) 8/MRP14、S100A12、sRAGEの動態を検討した。また健常群33例および川崎病IVIG反応群18例とIVIG不応群14例についても動態を解析し、インフリキシマブ投与群と比較検討を行った。【具体的内容】インフリキシマブ投与例11例中8例が、投与後に臨床症状の改善が認められた。3例はインフリキシマブ投与後も臨床症状が改善せず、炎症反応が遷延し、IVMPの再投与およびCyAの投与を余儀なくされた。【意義、重要性】本研究により、インフリキシマブは難治川崎病における有効な治療法のひとつであることが示された。
広告資料による映像コーパスの作成と広告を利用した日本語教授法の開発に関する研究

本研究は広告資料の収集、データベース化と、そこに使われている言語表現の分析を行うものである。ここでいう広告資料とは、新聞や雑誌の広告、新聞の折り込み広告、ポスター、パンフレット、電車の吊り広告、看板等、広い範囲のものを指す。これらは一般に、作られては消えていく運命にあり、それを研究資料として保存し、活用するのが本研究の目的である。本年度は次のような作業を行った。1.広告資料の収集(採集、録画、撮影等)前年度に引き続き、以下のような広告資料を収集する。(1)地下鉄の吊り広告、ステッカー、駅のポスター(2)新聞の折り込み公告、新聞広告、広告年鑑(3)テレビCM(4)街のポスターやパンフレット、看板(5)海外の広告資料(台湾・中国)2.資料のデータベース化(1)スキャナーによる資料の読み取り(2)スキャナーで読み取った資料を年代や企業別に分類整理する3.日本語表現の分析広告の見出しに現れた表現をヒントにして、論文「コーパスを利用した複合動詞「-直る」の意味分析」を執筆した4.教育への応用の試みこれまでに収集した広告資料を使い留学生および日本人学生に対する格助詞の文法教育を実践した。広告画面のイメージが視覚的に格助詞の意味を伝えるため、各格助詞の特徴が認識されやすいことが分かった。上記の1(1)については、名古屋市交通局協力会および名古屋市内の広告代理店等の協力を得た。本研究によって収集した多数の広告資料は、今後の広告を利用した様々な研究に大いに役立つと考えられる。そのための基礎となる貴重なデータを構築した。本研究は広告資料の収集、データベース化と、その広告資料に使われている言語表現の分析を行うものである。ここでいう広告資料とは、新聞や雑誌の広告、新聞の折り込み公告、ポスター、パンフレット、電車の吊り広告、看板等、広い範囲のものを指している。そこで今年度は次のような作業を行った。1.広告資料の収集(採集、録画、撮影等)(1)地下鉄の吊り広告、ステッカー、駅のポスター(2)新聞の折り込み公告、新聞広告(3)テレビのCM、(4)街のポスターやパンフレット、看板(5)中国・台湾における広告資料の収集2.広告資料のデータベース化(1)スキャナーによる資料の読み取り(2)スキャナーで読み取った資料の分類・整理3.広告表現の分析格助詞に特徴的な使い方をするものを集め、その表現機能を分析している。上記1と2に関しては、名古屋市交通局協力会の協力を受け、多くの吊り広告を収集し、データとして登録しているところである。試みに日本語教育の授業で学生に見せて使ってみたところ、視覚的映像で日本語を覚えられるため、記憶に残りやすいと好評であった。今後はさらにこれを学術的に分析し、論文としてまとめていく。また3に関しては、広告を使った認知的な実験をしている段階である。広告の映像と広告に書かれている日本語の表現がどのようにリンクしているのかを分析しており、次年度に論文としてまとめる予定である。1.広告資料の収集(採集、録画、撮影等)(1)地下鉄の吊り広告、(2)新聞の折り込み公告、新聞広告、(3)テレビのCM、(4)街のポスターやパンフレット、(5)台湾、韓国の広告資料2.広告資料のデータベース化(1)スキャナーによる資料の読み取り、(2)スキャナーで読み取った資料の分類・整理3.広告表現の分析広告表現における格助詞の用法と広告画面との相乗効果について分析し、格助詞のイメージを広告画面で効果的に演出している仕組みを追究した。上記1と2については、引き続き名古屋市交通局協力会、および名古屋市内にある広告代理店等の協力により、多くの広告を収集し、データとして登録作業を行っているところである。上記3の論文では、「イメージで教える日本語の格構文」と題して、広告を利用して視覚的に日本語の格助詞や格構文を教える方法について論じた。その結果、「夢をカタチに。」と「夢がカタチに。」の広告に「行為」と「結果」の違いが如実に現れている等、視覚的イメージを使った文法教育が可能であることを論じた。(1)地下鉄の吊り広告、ステッカー、駅のポスター(2)新聞の折り込み公告、新聞広告、広告年鑑

(3)テレビCM(4)街のポスターやパンフレット、看板(5)海外の広告資料(台湾・中国)2.資料のデータベース化(1)スキャナーによる資料の読み取り(2)スキャナーで読み取った資料を年代や企業別に分類整理する3.日本語表現の分析広告の見出しに現れた表現をヒントにして、論文「コーパスを利用した複合動詞「-直る」の意味分析」を執筆した4.教育への応用の試みこれまでに収集した広告資料を使い留学生および日本人学生に対する格助詞の文法教育を実践した。広告画面のイメージが視覚的に格助詞の意味を伝えるため、各格助詞の特徴が認識されやすいことが分かった。上記の1(1)については、名古屋市交通局協力会および名古屋市内の広告代理店等の協力を得た。本研究によって収集した多数の広告資料は、今後の広告を利用した様々な研究に大いに役立つと考えられる。そのための基礎となる貴重なデータを構築した。
都市流域の集中豪雨, 洪水流出, 浸水氾濫に関する統合予測モデルの構築

近年頻発している都市型洪水被害の低減を目的として、洪水流出予測モデルのための高度な地物データGISを構築し,降雨の流出経路を物理的に忠実に表現可能な精緻な都市型洪水流出予測モデルを提案開発し,これを実流域に適用し本モデルの特性について検討を行った.また,都市中小河川における実時間洪水予測に適した集中型概念モデルの精度向上に向けて,合流式下水道の流出特性を考慮した二価関数の貯留関数モデル提案構築し,その適合性について検討を行った近年頻発している都市型洪水被害の低減を目的として、洪水流出予測モデルのための高度な地物データGISを構築し,降雨の流出経路を物理的に忠実に表現可能な精緻な都市型洪水流出予測モデルを提案開発し,これを実流域に適用し本モデルの特性について検討を行った.また,都市中小河川における実時間洪水予測に適した集中型概念モデルの精度向上に向けて,合流式下水道の流出特性を考慮した二価関数の貯留関数モデル提案構築し,その適合性について検討を行った本年度は以下に示す主として2項目の研究を実施した.1.地物データGISモデルを用いた洪水氾濫浸水予測モデルの構築に関する研究対象流域の観測データとして,河川水位,河川への下水道からの流出量,降雨時の道路冠水状況などのデータを収集し,氾濫浸水予測モデルの未知パラメータの同定資料とした.次いで,ベクトル形式の1/2500数値地図データ(国土地理院発行)から雨水流出・洪水氾濫浸水予測に用いるデータを効率よく抽出するためのデータ作成システムを構築した.そして,雨水流出・洪水氾濫浸水予測モデルのデータ構築手法について,水文・水理データ上の観点からその問題点を明らかにした.さらに,本研究課題で提案している雨水流出・洪水氾濫浸水予測モデルを,東京都内の神田川支川である江古田川(流域面積5km^2弱)を対象にプロトタイプのモデルを構築し,過去の豪雨水害の生じたイベントに対して雨水流出・洪水氾濫浸水の再現可能性を確かめた.2.実時間洪水予測モデルの構築に関する研究全国的にも豪雨災害が頻発した2004年を対象に,東京都でも浸水被害の頻発した神田川流域の降雨・河川流量データを,東京都が独自で高密度(約4km間隔)に設置している地上雨量計からの1分間隔降雨観測データとして抽出した.河川流量データに関しても同様に1分間間隔水位データを河川流量に換算した.次に,一般化貯留関数のパラメータとして平均的な値を用いた場合およびパラメータを大域的探索法(GA法やSCE-UA法など)により最適にチューニングした場合の流量予測を行いその予測精度を評価した.さらに,本来の一般化貯留関数法を都市流域の中小河川に精度良く適用できるよう一般化貯留関数法の修正・改良を検討した.本年度は以下に示す主として2項目の研究を実施した.1.地物データGIS用いた新たな地物指向分布型都市洪水流出モデルの構築に関する研究東京都内の神田川支川(流域面積約1km^2)を具体的な対象流域として取り上げ、基礎的地物データGISから高度な地物データGISを構築し,対象都市流域をモデル化する事により,豪雨の流出経路を物理的に忠実に再現する精緻な地物指向分布型都市洪水流出解析モデルの提案した。本洪水流出解析モデルを用いて実際の集中豪雨データを対象に洪水流出解析を行い,河川水位の解析結果と観測値を比較することにより構築したモデルの妥当性について評価を行うと共に,流域内の要素別貯留量変化,河川水位変化,雨水・下水道管路からの流出量変化について考察を行った.さらに,仮想豪雨に対し本モデルを適用し,同様の検討を行うとともに,雨水・下水道管路の排水不良や河川水位上昇に伴う浸水現象の妥当性について検討を行った。2.合流式下水道の流出特性を考慮した都市洪水貯留関数モデルの構築都市中小河川における実時間洪水予測に適した集中型概念モデルの精度向上に向けて,多くの大都市で採用されている合流式下水道の流出特性を考慮した二価関数の貯留関数モデルである都市洪水貯留関数モデルを構築し,これを都市型洪水氾濫被害が頻繁に発生している東京の代表的中小河州である神田川の上流域に適用し,その適合性及び特性について検討を行った.合成合理式,星らの貯留関数モデル及び構築した都市洪水貯留関数モデルの3種類の集中型モデルを3地点の実測洪水流量観測データに適用し5種類の誤差評価関数に対してパラメータ同定を行い,そのハイドログラフを作成して観測値との比較を行った.その結果,都市洪水貯留関数モデルは,ハイドログラフの形状全体を良好に表現でき,特にピーク流出高及び総流出高の双方が精度良く算定されることを確認した.本年度は以下に示す主として3項目の研究を実施した.1.地物データGIS用いた新たな地物指向分布型都市洪水流出モデルの実流域への適用に関する研究東京都内の神田川支川(流域面積約1km^2)および神田川上流域(流域面積約12km^2)を具体的な対象流域として取り上げ、基礎的地物データGISから高度な地物データGISを構築し,対象都市流域をモデル化する事により,豪雨の流出経路を物理的に忠実に再現する精緻な地物指向分布型都市洪水流出解析モデルを構築した。本洪水流出解析モデルを用いて実際の集中豪雨データを対象に洪水流出解析を行い,河川水位の解析結果と観測値を比較することにより構築したモデルの妥当性について評価を行った。河川水位変化,雨水・下水道管路からの流出量変化について考察を行った,また、雨水・下水道管路の排水不良や河川水位上昇に伴う浸水現象の妥当性について検討を行った。

2.合流式下水道の流出特性を考慮した都市洪水貯留関数モデルの構築と実流域への適用都市中小河川における実時間洪水予測に適した集中型概念モデルとして,多くの大都市で採用されている合流式下水道の流出特性を考慮した二価関数の貯留関数モデルである都市洪水貯留関数モデルを構築し,これを都市型洪水氾濫被害が頻繁に発生している東京の代表的中小河川である神田川の上流域に適用し,その適合性及び特性について検討を行った。その結果,都市洪水貯留関数モデルは,従来の貯留関数モデルに比べ,ハイドログラフの形状全体を良好に表現でき,特にピーク流出高及び総流出高の双方が精度良く算定されることを確認した.3.都市流域集中豪雨の時空間分布特性東京都の水防災総合情報システムにおける都内117地点1分間隔の雨量データを用い,東京都内の降水特に集中豪雨の時空間分布特性について解析を行った.
草原棲絶滅危惧鳥類を指標とした水田と耕作放棄地の生態的価値の評価

本研究は、絶滅に瀕した湿性草原棲鳥種であるオオセッカ(絶滅危惧IB類)とコジュリン(絶滅危惧II類)を指標として、水田と耕作放棄地の生態的価値を定量的に評価し、農耕地環境における農業活動(特に水田稲作)と生物多様性の保全との両立を新たな視点から探るものである。特に、その増加が近年の社会問題の1つとなっている耕作放棄地が、単に経済的価値が小さい環境ではなく、生物多様性の保全において大きな価値があることを示すことが本研究の目的である。農耕地としての再利用や土地利用の転換(メガソーラー発電施設建設等)で耕作放棄地が急激に消失した場合、農耕地環境に生息するこれらの絶滅危惧鳥種がどのような影響を受けるかについて予測することが、本研究の最終的な目標である。研究3年目である平成30年度は、引き続いて秋田県大潟村に生息するコジュリンを対象に、彼らの繁殖期(5月8月)において、湿性草原(従来の生息環境)と農耕地(稲作水田・畦・麦畑・牧草地)それぞれの営巣環境利用について野外調査を実施した。2年間の調査の結果、1コジュリンは湿性草原・稲作水田・畦(道端を含む)・麦畑・牧草地のいずれの環境でも営巣していること、2営巣成功率(成功巣/観察巣)は、湿性草原(11/20巣)・稲作水田(3/5巣)・麦畑(4/5巣)は同程度だったが、畦(1/15巣)は著しく低かったことが明らかとなった。即ち、コジュリンにとって稲作水田や麦畑は湿性草原と同程度の大きな生態的価値があり、一方で畦は生態的価値が極めて小さいことが示唆された。また、3コジュリンは下層草本が多い環境・ヨシが多い環境・ススキが多い環境で営巣が観察され、他の草原棲鳥類よりも営巣環境の幅が広いことが明らかとなった。特に下層草本が多い環境で営巣できる形質は、コジュリンが湿性草原(耕作放棄地を含む)だけでなく農耕地でも営巣する理由であると推察された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。特に、その増加が近年の社会問題の1つとなっている耕作放棄地が、単に経済的価値が小さい環境ではなく、生物多様性の保全において大きな価値があることを示すことが、本研究の目的である。研究初年度である平成28年度は、水田と耕作放棄地が混在した農耕地環境(青森県八戸市市川地区)に生息するオオセッカを対象に、彼らの繁殖期(5月8月)において、営巣環境および採餌環境としての水田と耕作放棄地それぞれの利用状況について野外調査を実施した。その結果、1オオセッカは耕作放棄地を営巣環境および採餌環境として利用したが、水田はほとんど利用しなかったこと、2同所的に生息する他の鳥類(ヒバリ・オオヨシキリ・コヨシキリ・ホオアカ・コジュリン等)は水田を採餌場所として利用したことが明らかとなった。即ち、オオセッカにとって耕作放棄地は大きな生態的価値があり、一方で水田は生態的価値がほとんどないことが示唆された。平成29年度と平成30年度は、コジュリンを調査対象とし、オオセッカと同様に、彼らの繁殖期(5月8月)において、営巣環境および採餌環境としての水田と耕作放棄地それぞれの利用状況について野外調査を実施する。野外調査は秋田県大潟村の農耕地を予定している。平成28年度は、環境省により絶滅危惧IB類に指定されているオオセッカを対象に、1彼らの繁殖活動において、水田と耕作放棄地はどのように利用され、2その利用状況の個体差が、それぞれの繁殖活動や繁殖成功にどのように影響するのかを明らかにすることを目的として野外調査を行った。調査地は、青森県八戸市市川地区にある水田および耕作放棄地を含む農耕地とした。彼らの繁殖期(5月8月)に、調査地全域の個体数センサスを週1回程度行い、成鳥雄の個体数と分布を明らかにした。各成鳥雄は捕獲・標識して個体識別し、採血を行って分子生物学的解析用のDNA試料を得た。週2回程度の集中観察を行い、行動と位置を随時記録して、繁殖テリトリーの配置と面積および採餌範囲を推定し、巣の発見に努めた。巣は週3回程度観察して内容(卵数・巣内雛数等)を記録し、巣立ち数・巣立ち日・繁殖失敗要因の特定に努めた。また、巣内雛は巣内育雛期間中に最多3回の捕獲を行い、体サイズを毎回測定して、雛毎の成長率を算出した。育雛期中期には標識と採血も行った。さらに、各巣について、育雛期前期・中期・後期に各1回のビデオ撮影を可能な限り行い、親鳥の給餌内容を特定した。

窒素炭素安定同位体比分析の試料として、巣内雛の羽毛と、餌資源となる無脊椎小動物と、それらの餌資源となる植物体の採取も行った。成鳥雄22個体の計27巣について繁殖活動に関する詳細なデータが得られた。その結果、1オオセッカは耕作放棄地を営巣環境および採餌環境として利用したが、水田はほとんど利用しなかったこと、2同所的に生息する他の鳥類(ヒバリ・オオヨシキリ・コヨシキリ・ホオアカ・コジュリン等)は水田を採餌場所として利用したことが明らかとなった。即ち、オオセッカにとって耕作放棄地は大きな生態的価値があり、一方で水田は生態的価値がほとんどないことが示唆された。本研究は、絶滅に瀕した湿性草原棲鳥種であるオオセッカ(絶滅危惧IB類)とコジュリン(絶滅危惧II類)を指標として、水田と耕作放棄地の生態的価値を定量的に評価し、農耕地環境における農業活動(特に水田稲作)と生物多様性の保全との両立を新たな視点から探るものである。特に、その増加が近年の社会問題の1つとなっている耕作放棄地が、単に経済的価値が小さい環境ではなく、生物多様性の保全において大きな価値があることを示すことが本研究の目的である。農耕地としての再利用や土地利用の転換(メガソーラー発電施設建設等)で耕作放棄地が急激に消失した場合、農耕地環境に生息するこれらの絶滅危惧鳥種がどのような影響を受けるかについて予測することが、本研究の最終的な目標である。研究2年目である平成29年度は、秋田県大潟村に生息するコジュリンを対象に、彼らの繁殖期(5月8月)において、湿性草原(従来の生息環境)と農耕地(稲作水田・畦・麦畑・牧草地)それぞれの営巣環境利用について野外調査を実施した。その結果、1コジュリンは湿性草原・稲作水田・畦(道端を含む)・麦畑・牧草地のいずれの環境でも営巣していること、2営巣成功率(成功巣/観察巣)は、湿性草原(6/10巣)と稲作水田(3/5巣)は同程度だったが、畦(1/9巣)は著しく低かったことが明らかとなった。即ち、コジュリンにとって稲作水田は湿性草原と同程度の大きな生態的価値があり、一方で畦は生態的価値が極めて小さいことが示唆された。平成30年度は、平成29年度と同様に秋田県大潟村にてコジュリンの営巣環境利用を野外調査する予定である。平成29年度は、環境省により絶滅危惧II類に指定されているコジュリンを対象に、1彼らの繁殖活動において農耕地はどのように利用され、2その利用状況の差異が繁殖活動や繁殖成功にどのように影響するのかを明らかにすることを目的として野外調査を行った。調査地は、秋田県大潟村にある湿性草原(従来の生息環境:調査地には耕作放棄地がほとんど無かったので、これを耕作放棄地の同条件の環境と見なした)と農耕地(稲作水田・畦・麦畑・牧草地を含む)とした。彼らの繁殖期(5月8月)に、調査地全域の個体数センサスを週1回程度行い、成鳥雄の個体数と分布を明らかにした。また、週2回程度の集中観察により巣の発見に努めた。巣は週3回程度観察して内容(卵数・巣内雛数等)を記録し、巣立ち数・巣立ち日・繁殖失敗要因を特定した。さらにコジュリンおよび同所的に営巣する他の湿性草原棲・農地棲鳥類の巣について、繁殖終了後に営巣地点の植生環境を計測した。また、湿性草原・稲作水田・畦・麦畑・牧草地の5環境についても植生を広範囲に計測した。コジュリン計24巣について繁殖活動に関する詳細なデータが得られた。
メダカ胚性幹細胞の増殖を促進する因子の同定と魚類胚工学への応用

この研究課題の目的は,メダカ胚より分離した胚性幹細胞を培養する条件を明らかにし,トランスジェニック魚を作成する方法を確立することである.魚類においてこのような方法によるトランスジェニック動物の作成は,試みられてはいるが未だに成功していないのが現状である.将来の水産バイオテクノロジーへの応用を考えると,魚類においてこのような方法を確立する意義は大きいと考えられる.これまでのわれわれの研究では,マウスにおける方法を参考にして,メダカ初期胚より分離培養し長期間継代している数種の細胞株をフィーダー細胞として用いてきた.この方法でマウス胚性幹細胞と形態的によく似た細胞を培養することが可能となっていた.しかし平成9年度に実施した研究によって,この条件で培養した胚性幹細胞を移植しても奇形が数多く生じキメラメダカは作成されないこと,フィーダー細胞を移植すると極めて高い割合で奇形を生じること,また移植時にフィーダー細胞と分離することが困難であること,が明らかとなった.これはフィーダー細胞が正常な発生を乱すような影響を与えるためと考えられる.この結果より,平成10年度において属フィーダー細胞を用いないで胚性幹細胞を培養する試みを行った.数種類の培地について検討したが,その結果培養1日後の細胞を移植することでキメラメダカを作成することが可能になった.培養時間が短いとはいえ,培養した細胞でキメラ魚が作成できたことは,一歩前進であったと考えられる.また,長期間培養した細胞をモデルに,培地の組成等の条件,細胞増殖に対する諸因子の効果などについて検討を重ねており,新しい知見が得られている.これらの結果が胚性幹細胞の培養条件の改善に参考になると考えられる.今後はさらに検討を続け,分化の全能性のある細胞の長期間の培養を目指して研究を継続していきたい.われわれの研究室では,日本産のメダカを材料として,胚性幹細胞を培養する条件を明らかにし,それを応用することで,トランスジェニック魚を作成する方法を確立することを目的として研究を行っている.魚類においては,哺乳類のLIFは効果がなく,また同様の機能をもつ因子は見いだされていない.したがって胚性幹細胞の増殖に必要なフィーダー細胞や増殖因子を見いだし,トランスジェニック動物を作成できるような胚性幹細胞を培養する方法を開発することが重要な課題である.9年度の研究目標は,メダカ胞胚期の胚より分離した胚性幹細胞の増殖を促進する条件を見いだすことにある.このために,現在継代培養している数種のメダカ胚由来の細胞株を材料に用いて,細胞増殖に最も適した条件について検討する研究を行った.これまでに,組成の異なる各種の培地,培養用のフラスコまたはシャーレの容器,培地中に加えるNaHCO_3の濃度とCO_2インキュベータまたは恒温槽の組み合わせ,培養に用いるウシ胎児血清の濃度,等について検討した.そしてこれまで当研究室で用いていた条件が必ずしも最適ではなかったことが明らかになった.また,ここで見いだされた条件下で継代細胞をフィーダー細胞として用い,メダカ胞胚期の胚より取りだした胚性幹細胞を培養し,それを別の胚に移植してキメラ作成能を検討する研究も継続して行っている.フィーダー細胞として用いている細胞のみを移植すると,多くの胚に奇形が発生する事がわかり,新たに解決するべき問題点として胚性幹細胞を移植する際にフィーダー細胞と分離しなければならないことが明らかになった.10年度においても,これらの点を解決しながら,目標の達成に向け研究を継続する.この研究課題の目的は,メダカ胚より分離した胚性幹細胞を培養する条件を明らかにし,トランスジェニック魚を作成する方法を確立することである.魚類においてこのような方法によるトランスジェニック動物の作成は,試みられてはいるが未だに成功していないのが現状である.将来の水産バイオテクノロジーへの応用を考えると,魚類においてこのような方法を確立する意義は大きいと考えられる.これまでのわれわれの研究では,マウスにおける方法を参考にして,メダカ初期胚より分離培養し長期間継代している数種の細胞株をフィーダー細胞として用いてきた.この方法でマウス胚性幹細胞と形態的によく似た細胞を培養することが可能となっていた.しかし平成9年度に実施した研究によって,この条件で培養した胚性幹細胞を移植しても奇形が数多く生じキメラメダカは作成されないこと,フィーダー細胞を移植すると極めて高い割合で奇形を生じること,また移植時にフィーダー細胞と分離することが困難であること,が明らかとなった.これはフィーダー細胞が正常な発生を乱すような影響を与えるためと考えられる.この結果より,平成10年度において属フィーダー細胞を用いないで胚性幹細胞を培養する試みを行った.数種類の培地について検討したが,その結果培養1日後の細胞を移植することでキメラメダカを作成することが可能になった.培養時間が短いとはいえ,培養した細胞でキメラ魚が作成できたことは,一歩前進であったと考えられる.また,長期間培養した細胞をモデルに,培地の組成等の条件,細胞増殖に対する諸因子の効果などについて検討を重ねており,新しい知見が得られている.これらの結果が胚性幹細胞の培養条件の改善に参考になると考えられる.今後はさらに検討を続け,分化の全能性のある細胞の長期間の培養を目指して研究を継続していきたい.
QTLマッピングによる渓流沿い植物ヤシャゼンマイにおける適応と種分化過程の解析

ヤシャゼンマイの細葉形質に関しては相関が強くみられる遺伝子座がみつかり、この適応的形質を支配する遺伝子が含まれるゲノム領域が明らかになった。また、ヤシャゼンマイに自配受精能があるのは、ゼンマイにみられる劣性有害遺伝子が失われていることに起因することが示された。この遺伝子座は連鎖群11上に存在し、野外雑種集団ではヘテロ接合度が高く、このゲノム領域では遺伝子浸透しやすいことなどが示唆された。種分化は生物多様性を作り出す原動力だと考えられる。渓流沿い植物ヤシャゼンマイとその姉妹種ゼンマイでは、それぞれの生育環境において適応的な形質が複数明らかになっており、遺伝地図に基づいた適応的形質の遺伝的背景と自然選択圧のかかり方の解析により、種分化過程に起こるゲノム領域ごとの遺伝的な分化について調べてきた。細葉形質に関しては相関が強くみられる遺伝子座がみつかり、この適応的形質を支配する遺伝子が含まれるゲノム領域が明らかになった。しかし、小羽片の基部の角度や下側最下の脈から分岐する脈の数、葉形指数などは、独立に分離する可能性が示唆され、遺伝地図のマーカー密度を上げて、個体数を増やした上でマッピングする必要がある。分子マーカーを増やすために次世代シークエンス解析を行い、ヤシャゼンマイとゼンマイのゲノム配列を取得し、全コンティグ31545配列から変異のある10830配列が選び出した。現在、この配列に基づいてマーカーを開発している。また、両種間では繁殖様式が分化していて、ヤシャゼンマイの高い自配受精能は、渓流沿いという特殊な生育環境で分布を拡げるために有利だと考えられるが、人工交配集団の解析から、ゼンマイにみられる劣性有害遺伝子が失われていることによる可能性が高いと考えられた。この遺伝子座は連鎖群11上に存在し、解析の結果、野外雑種集団ではヘテロ接合度が高く、ヤシャゼンマイでみられる有害な効果をもたない対立遺伝子はゼンマイ集団に遺伝子浸透しやすいことなどが示唆された。但し、周囲にヤシャゼンマイが生育しない熱海集団では遺伝子浸透が起こっていないことが確認されている。このゲノム領域はゼンマイでは他殖性を維持する役割があることが考えられ、さらに詳細な解析が必要である。ヤシャゼンマイとその姉妹種であるゼンマイの自然推定F1雑種から採取した胞子を用いて作成したDoubled Haploid集団を解析し、120マーカーを含む遺伝地図を作成した。その上で渓流帯に進出する上で適応的であると考えられる形質の遺伝的背景を調べている。細葉形質の関しては、F2集団を作成し、三出複葉になった時点で形態形質を測定し、41マーカーを解析して複数の遺伝子座に支配されていることや、小羽片基部の角度や下側最下の脈から分岐する脈の数と相関の強い遺伝子座を明らかにした。(角川&堤plant morphology 24:51-55)また、ヤシャゼンマイとゼンマイの繁殖様式の違いに関わる遺伝的背景を解析した結果、ゼンマイがもつ有害遺伝子は連鎖群11に存在する可能性が高いことが明らかになった。この連鎖群11には既に12個のマーカーがマッピングされている。これらのマーカーのうち、8個のマーカーにおいて人工交配集団で分離比の歪みが確認された。配偶体集団では分離比の歪みはそれほど大きくないが、胞子体世代でゼンマイがもつ対立遺伝子がホモ接合になると致死率が高くなることがわかった。特にEST_606とEST_157, EST_925では、この傾向が強くみられた。(日本植物学会第75回大会において発表)野外集団(京都市保津峡集団と埼玉県飯能市入間川沿いの雑種集団)を解析したところ、やはりEST_606においてゼンマイの対立遺伝子の頻度が有意に低いことが明らかになり、その近傍の遺伝子座においてもヘテロ接合度が高いことなどが明らかになった。(日本植物学会第75回大会において大学院生の水谷有希氏が発表)さらに、葉柄形態や展葉フェノロジーを観察した結果、ヤシャゼンマイにおいて栄養葉の葉長が短くなっていることが明らかになり(日本植物分類学会第11回大会発表)、適応的形質として解析対象とした。ヤシャゼンマイとゼンマイの間で、適応的形質の遺伝的背景と自然選択圧のかかり方を調べることにより、どのように種としてのまとまりが生じ維持されているのかを明らかにすることが本研究の目的だが、解析対象としている形質によって進展状況に差がある。また、分子マーカーごとの相関解析は比較的順調に進んでいるが、QTLマッピングのためには遺伝地図のマーカー密度を高める必要がある。マーカーを開発するため、次世代シークエンス解析を行ない、86.6Mbpのゲノムシークエンスが得られた。現在までに、細葉形質に関しては相関が強くみられる遺伝子座がみつかったが、小羽片の基部の角度や下側最下の脈から分岐する脈の数、葉形指数などは、独立に分離する可能性が示唆され、遺伝的背景を明らかにするためには、それぞれマッピングする必要があることが明らかになった。

それ以外の適応的な形質としては、ヤシャゼンマイの自配受精能を解析対象とし、自配受精率に関わるゲノム領域の解析を行なった。人工交配集団における分離の解析結果より、ゼンマイにおいて自配受精を妨げる劣性有害遺伝子が含まれるゲノム領域が明らかになった。ヤシャゼンマイとゼンマイの野外集団について集団遺伝学的な解析を行った結果、種間で対立遺伝子を共有している程度に差があり、種間での遺伝子浸透が起こりやすいゲノム領域と起こりにくいゲノム領域があることが明らかになった。今後は、このゲノム領域が実際にゼンマイの集団内で自配受精を妨げ、他殖性を維持する役割があるかどうかを明らかにする必要がある。また、ヤシャゼンマイとゼンマイおよびレガリスゼンマイの展葉フェノロジーや葉柄形態の解析により、栄養葉の葉長など、新たに適応的な形態形質として注目すべき形質がみつかったが、相関解析やQTLマッピングのためには人工交配集団においてどのように量的形質を測定するかを考案する必要がある。推進方策としては、以下の4点が挙げられる。まず、分子マーカーごとに相関解析は比較的順調に進んでいるが、ゼンマイ類におけるQTLマッピングのためには遺伝地図のマーカー密度を高める必要があり、ESTライブラリーと得られた次世代シークエンスデータを用いてマーカー開発を行ない、人工交配集団において解析することにより、遺伝地図にマーカーを追加する。次に、細葉形質に関しては相関が強くみられる遺伝子座がみつかったが、小羽片の基部の角度や下側最下の脈から分岐する脈の数、葉形指数などは独立に分離する可能性が示唆されたので、それぞれ別々に量的形質を評価してマッピングする。また、細葉形質のみでなく、ヤシャゼンマイが渓流沿いの環境に進出する上で獲得した他の適応的な形質も調べる必要がある。それぞれの適応形質について生育中のF2雑種個体で量的形質を正確に測定した上で、マーカーごとの相関解析もしくはQTLマッピングを行い、機能遺伝子を含むゲノム領域を明らかにする。さらに、それぞれの適応形質を支配する遺伝子の位置関係を調べることにより、適応形質が遺伝的に互いにどの程度相関しているかを明らかにする。また、ヤシャゼンマイの自配受精能を解析対象とした結果、ゼンマイにおいて自配受精を妨げる劣性有害遺伝子が含まれるゲノム領域が明らかになったので、実際にこのゲノム領域がゼンマイの集団内での自配受精を妨げ、他殖性を維持する役割があるかどうかを明らかにする。さらに、ヤシャゼンマイとゼンマイの野外集団について集団遺伝学的な解析をゲノム全体について行ない、ヘテロ接合度が高い領域や種間での遺伝子浸透が起こりやすいゲノム領域と起こりにくいゲノム領域を明らかにし、適応形質を支配する遺伝子にどのように自然選択圧がかかっているかを調べる。既にESTライブラリーと次世代シークエンス解析のゲノムシークエンスがあるので、これに基づいて、マーカー開発を行ない、変異探索と遺伝地図上へのマッピングを行なう。また、QTLマッピングのためには現在の60個体程度から200300個体に増やす予定である。そのために、DNA抽出用のキットおよびダイレクトシークエンス用の試薬、CAPSマーカーとSSRsマーカー解析用の試薬として消耗品費の3分の2程度(100万円)を使う。
ピロティ型住宅の社会的成立プロセス及び居意者の住要求に関する研究

沖縄では戸建住宅の1階を全面開放した鉄筋コンクリート造のピロティ型住宅が広く普及し、居住地景観に大きな変化をもたらしている。本研究では、沖縄本島南部と久米島の12市町村を調査対象地として選定し、平成5年度より平成7年度までの建築概要書の全戸建て住宅の平面・立面・断面を縦覧・抽出し追跡調査を行った。結果184件のピロティ型戸建住宅を抽出し、住宅形式と居住者の住要求及び居住実態の調査分析を通してその成立要因と空間特性を検討した。ピロティ型住宅配置・形態・規模やプランを規定する基本的な骨格ではRC造の特性から画一的な形式を生みだしながらも、ピロティ部分は増築対象空間として計画段階から想定されいること、内部空間は伝統型住宅のプランを踏襲したものとなっていること、接地性の欠如を広いバルコニーが補い、庭の補完として機能していること等から、居住者の住要求が反映され、個性的かつ温暖地の地域性を十分に反映したものであることを明らかにした。しかし、計画段階における設計者とのやりとりにおいては、居住者の直裁的な住要求が設計者の建築的提案を阻害していること、明確な増改築計画が提示されずピロティ部分が長期間留保され住宅地景観が損なわれていることなどの問題点が指摘される。また、居住空間内に上下のコアが存在しないため、増築部分には上下間の動線が確保されないという問題がある。さらには周囲が都市化された場合、ピロティ部分への増改築は通風や採光の点で問題が生じることも予想される。将来の増築に関しては、当初計画の建設コスト検討の必要性や、居住者の増改築目的や時期の設定、周辺環境や法規制のクリア等が同時に指摘されるべき問題であることを明らかにした。沖縄においては住宅計画の際に亜熱帯・台風・島嶼地理といった環境的条件に加え、基地による一般宅地面積の狭少性、強力な血縁・地縁関係によるコミュニティ活動、公共輸送機関欠如によるモータリゼーション化、また米軍住宅を規範とした建設技術の継承等々他地域とは異なった独特の社会的条件を抱え住宅の形式は復帰後急激な変容を遂げてきた。これらの想定される条件を背景に、戸建個人住宅において1階を全面開放した鉄筋コンクリート構造の「ピロティ型戸建住宅」(以下RC造ピロティ型住宅)が都市部・都市周縁部・農村部を問わず蔓延し沖縄独特の風景をつくり出している。今年度、本研究ではこの「RC造ピロティ型住宅」を対象として全183件を抽出し、形態分析・空間分析を行った。その結果、構造方式による形態のパターン化、伝統的な平面形態を踏襲したプランのパターン化、接地空間を補完するための4種類のバルコニー空間等を調査結果として得ることができた。特に、構造方式においては100パーセントラーメン構造であり、そのグリッドパターンも7種類に類型化することができる。また、183件の内172件が伝統的社会活動に基盤を置いた和室の続き間を持つ伝統的平面を持つものであった。そのため、玄関が接道に関わらず南側に配されるプランが多くみられる。バルコニー空間においてもアクセスバルコニーや庭的バルコニー、ユ-ティリティ的バルコニー等その用途に応じて役割を果たしている。次年度はこの対象住宅における設計プロセス、居住実態をヒアリングと現地調査によって研究を進める予定である。
有尾両生類の再生原理を用いたニワトリ胚四肢再生の実現

我々は、有尾両生類(イモリ・メキシコサラマンダー)において四肢と言う「器官」の再生反応を誘導する遺伝子(再生誘導物質)の特定に成功した(Makanae et al., Dev. Biol. 2013, 2014)。この再生誘導物質(FGF2+FGF8+BMP7)は、複数の動物種と器官において再生を誘導できることも判明した(Makanae et al., Dev. Biol. 2014, 2016, Satoh et al., 2015, Regeneration)。本研究は、両生類研究で明らかにした再生誘導因子をニワトリ胚に応用し、ニワトリ胚における四肢再生反応を誘導する試みを提案する。加えて、得られる再生体を分子マーカーで評価し、有尾両生類の再生時における発現パターンと比較することによって、哺乳類を含む恒温動物における四肢再生反応誘導への基盤的知見を得ることを目的にした。ニワトリ胚において肢一再生実験を行うに当り、インターカレーションモデルを採用した。インタ化レーションモデルとは中間部再生ともいえる機構であり、両生類の四肢再生機構の中枢をなす概念となる。言い換えればインターカレーションの誘導が可能であることが証明できれば、両生類型の再生を羊膜類で達成したという意に限りなく近いという事になる。暮らしくは研究報告書の方で説明するが、実績としてインターカレーションの誘導に成功した。メカニズムの探求も行い、すべての成果を論文として報告した。本研究成果は、羊膜類で両生類型の再生を引出しうることを証明した世界初の成果と考えることができると自負する。9.研究実績の概要ニワトリ胚の四肢(肢芽)の再生に挑戦する。これまでの研究で、有尾両生類(イモリ・メキシコサラマンダー)において四肢と言う「器官」の再生反応を誘導する遺伝子(再生誘導物質)の特定に成功した(Makanae et al., Dev. Biol. 2013, 2014)。この両生類研究で明らかにした再生誘導因子をニワトリ胚に応用し、ニワトリ胚における再生反応を誘導する試みを提案する。予備的実験結果において、同定した再生誘導因子(FGF+BMP)はニワトリ胚においても損傷・切断部において何らかの構造を誘導できることがわかった。この得られた再生体がどのような意味を持つのかを分子マーカーで評価する。得られた情報を有尾両生類の再生時における発現パターンと比較することによって、哺乳類を含む恒温動物における四肢再生反応誘導への基盤的知見を得ることを目的にする。本年度特に進展した研究内容は、申請書の研究項目2で、「ニワトリ肢芽におけるインターカレーション反応の誘導」に関する項目である。ニワトリの肢芽をおよそ3等分にし中抜きの状況にすると、通常状態では抜かれた中間部構造を決して再生されない。ここにFGF2+8を与えることで中間部構造の再生芽誘導できることを証明した。また、このプロセスにおける遺伝子発現の変遷や細胞系譜を描くことで論文としてまとめ報告した。その他項目についても鋭意解析中であり、予想以上の進展を見せていると言える状況にある。上記のとおり、すでに研究成果を論文としてまとめることができている。その他項目に関しても順調に推移している。研究項目2に関しては終了とする。研究項目1と3に関して誠意研究を展開してゆく。研究項目1に関してはHoxa13の発現を指標とし、その発現を切断後に行かに誘導するかがカギとなる。これまでの研究ではFGFはHoxa13に対してプラスの作用を持ち、BMPシグナリングはマイナスの作用を有することが見えてきた。

したがってFGFシグナリングの活性化を足場に、Hoxa13の再活性化に向けて研究展開を図る。これまでのイモリの研究で明らかになりつつある再生特異的な遺伝子のダイナミクスを参照し、そこからHoxa13の活性化に関するシグナリングカスケードを洗い出すことで、ニワトリでのHoxa13の活性化に大きなヒントが得られるものと確信している。このHoxa13の再活性化とすでに報告済みの中間部構造の再生方式を合わせることでより完全な四肢再生が可能になるものとしんじて、研究に挑戦する。ニワトリの卵の調達先が秋冬季に一時的に数を出せなくなったため実験の都合上遅れが生じたことに起因する。
老化関連骨軟骨疾患におけるklotho遺伝子の関与

本研究の目的は、老化による骨粗鬆化の分子メカニズムを解明することであり、老化抑制全身因子であるklotho、細胞内分子であるPPAR-gamma、局所因子であるインスリン受容体基質(IRS)-1およびIRS-2について、ノックアウトマウス(KO)を用いたreverse genetics、および臨床患者のゲノム解析を用いたforwardgeneticsの手法を用いて検討することである。本年度はまず、ヒトPPAR-gamma,IRS-1,IRS-2各遺伝子におけるSNPsのスクリーニングを行い骨密度との相関解析を行ったが、現在のところ有意な相関は認められていない。今後は年齢別の層別化検討を予定している。また、老化による骨粗鬆症に対する骨形成能を持つ治療薬として注目されているPTHの骨同化シグナルの検討を行った。まず、野生型(WT)マウス頭蓋骨由来の培養骨芽細胞をPTHで刺激したところ、IGF-I mRNAレベルおよびALP活性が上昇することを確認した。そこでIRS-1KOおよびIRS-2KOマウスに対してPTH皮下注射を行い、その効果をWTマウスと比較した。その結果、WTおよびIRS-2KOにおいてPTH投与群では非投与群に比べて大腿骨、脛骨、脊椎(L2-L5)の骨密度が上昇したのに対し、IRS-1KOではPTHの同化効果は見られなかった。以上より、PTHの骨同化作用は、局所で誘導されたIGF-Iがautocrine/paracrineに骨芽細胞に作用して、IRS-2ではなくIRS-1シグナルが活性化されることによるものであることが示された。この結果はEndocrinology誌にて掲載受諾されている。今後は、IRS-1の下流シグナル分子の関与を検討することでPTHの骨同化作用の分子メカニズムが解明されると考えられる。本年度は、ヒトklotho遺伝子の骨軟骨異常疾患における関与について、ゲノム解析を行って検討した。ヒトklotho遺伝子座の最終exonの下流にCAリピートによるマイクロサテライト多型が高齢者における骨量の減少、若年者における変形性腰椎症の重症度に強く関与していることが明らかとなった(投稿中)。しかしながら、上記のマイクロサテライト多型は、最終exonの更に下流に位置するものであり、klotho遺伝子産物であるKL蛋白の産生や機能に直接結びつくものとは言えない。そこで我々は、このヒトklotho遺伝子座においてその遺伝子の機能に直接関連のあるcodingregionにおけるSNPsのスクリーニングを行った。本研究は、民族による遺伝的背景の差を除外するために、日本人(115例)と英国在住白人女性(288例、英国GEMINI社との共同研究)より採取した末梢白血球DNAサンプルを用いて行った。その結果、日本人においては6カ所、英国人においては8カ所のSNPsが同定され、そのうちの3カ所は共通であった。この共通の3カ所のSNPsに関して、日本人閉経後女性364例、英国人女性1,187例においてそれぞれ骨密度(BMD)とのassociation studyを行った。日本人閉経後女性においては、promoter領域(-395G->A)およびexon4(1818C->T)がBMPと有意な相関を示した。一方、英国人においても同様の結果が見られ、1,187例全体では相関がなかったが、加齢とともにその相関は強くなり、65歳以上の高齢群では、1818C->TSNP(p=0.014)と-395G->ASNPにおいてもBMDとの間に有意な相関が認められた(p=0.002)。以上の結果は、ヒトklotho遺伝子が人種差を超えて加齢に伴う骨密度の変化に関与している可能性を示唆するものと言える。1.昨年までのヒトklotho遺伝子のゲノム解析によって、そのプロモーター領域のSNPである-395G->Aが老年女性における骨密度と有意に相関していることを示した。本年度は、この変異がKlotho蛋白の機能に及ぼす影響について検討した。G-395Aサイトを含むoligonucleotide probeとklotho遺伝子の発現を確認しているヒト腎臓由来293細胞からの核抽出蛋白との結合能をゲルシフト法で解析したところ、G->A置換は核蛋白との結合を著明に低下させることが明らかとなった。以上の結果から、全身性因子のひとつと考えられているklotho遺伝子産物が、老化に伴う骨粗鬆化に関与している可能性が示された(J Bone Miner Res投稿中)。2.一方、老化による骨粗鬆化に伴って骨髄内に脂肪髄が増えていく事実、および骨芽細胞と脂肪細胞がともに骨髄未分化間葉系細胞から分化する事実は、骨髄における骨芽細胞と脂肪細胞の分化のスイッチングが老化に伴う骨粗鬆化に関与している可能性を強く示唆するものといえる。我々は、脂肪細胞への分化誘導因子であるPPAR-γの骨粗鬆化への関与を検討する目的で、PPAR-γ欠損マウスの骨組織の解析を行った。PPAR-γホモ欠損マウスは胎生致死であったが、ヘテロ欠損マウスは脂肪分化障害を呈しつつ正常に発育した。ヘテロ欠損マウスでは野生型に比べて皮質骨・海綿骨とも骨量が有意に増加していた。これは骨髄細胞からの骨芽細胞への分化能が亢進しているためで、成熟骨芽細胞および破骨細胞系細胞の機能には何の異常もなかった。以上より、PPAR-γの抑制は生体内において骨髄前駆細胞からの骨芽細胞の分化を促進することによって骨量を増加させることが明らかとなった。