hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クモ膜下出血後髄液による脳血管平滑筋細胞への影響

Ratの脳底動脈から得られた単離血管平滑筋細胞に,くも膜下出血(SAH)患者の髄液を作用させ,その形態学的変化とCa^<2+>動態について検討した。SAH発症後3,4日目に採取された髄液を作用させた時,血管平滑筋細胞の収縮が最も顕著であった。臨床上脳血管攣縮の極期は発症後7-10日目であるため,両者の間には相違が認められた。このことは,SAH後の髄液中に存在する収縮物質が,実際の脳血管の中膜平滑筋細胞に作用が及ぶのに数日かかることが考えられた。また,血管平滑筋細胞が収縮する際に細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が確認され,SAH後に発生する脳血管攣縮には,血管平滑筋細胞の収縮が大きな役割を演じており,その収縮には細胞内Ca^<2+>の上昇が関与しているものと考えられた。一方,この血管平滑筋細胞をP_<2x>,P_<2y>prinoceptorsのantagonistであるsuraminで前処置すると,無処置群と比較して有意に収縮が抑制された。このことはSAH後髄液による血管平滑筋細胞の収縮にヌクレオチドが関与していると考えられ,suraminが脳血管攣縮の治療につながる可能性を示唆した。次にprotein tyrosine kinaseとmitogen activatedprotein kinase(MAPK)についてATPによる細胞内カルシウム濃度の変化への関与を検討した。ATPはratの脳底動脈平滑筋の細胞内カルシウム濃度を上昇させ,MAPKのリン酸化を起こした。これはprotein tyrosine kinase(PTK)によって制御された。引き続きdouble hemorrhage modelを使用して、脳底動脈の血管径とMAPKのactivityを比較検討した。血管径はday3,5,7と徐々に減少したが、MAPKのactivityはday3にpeakが認められた。これは先のSAH後3日目の髄液が脳血管平滑筋細胞を最も収縮された結果と一致するものであった。MAPKの阻害薬であるPD98059は血管攣縮もMAPKのactivityも抑制した。MAPKは様々な刺激に対する細胞内のsignal transductionに関与しており、脳血管攣縮においても重要な役割を持っていると考えられた。Ratの脳底動脈から得られた単離平滑筋細胞に,くも膜下出血(SAH)患者より採取した髄液を作用させ,その形態学的変化とCa^<2+>動態について検討した。その結果今回脳血管平滑筋細胞において,発症3日目もしくはその前後のSAH髄液が最大の収縮を示した。臨床上脳血管攣縮のpeakとされる期日は通常発症7-10日目であるため,実験での最大収縮とのあいだにdiscrepancyが認められた。このことは,SAH後の髄液が中膜の平滑筋細胞まで作用が及ぶのに数日かかる可能性が考えられた。またSAH患者の髄液を加熱し作用させても,脳血管平滑筋細胞の収縮率に有意な差は認められなかったことにより,脳血管攣縮にタンパク,ペプチド系以外の物質の関与が示唆された。さらに血管平滑筋細胞が収縮する際に細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が確認されたことにより,SAH後に発生する脳血管攣縮に,血性髄液による脳血管平滑筋細胞の収縮が大きな役割を演じていることが示唆され,またその収縮に細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が関与していると考えられた。また脳血管平滑筋細胞をP_<2X>,P_<2y> prinoceptorsの選択的antagonistであるsuraminで前処置すると,無処置群と比較し,有意に収縮の抑制が認められ,SAH後の髄液による血管平滑筋細胞の収縮にATPをはじめとするヌクレオチドが関与している可能性が示唆された。そこでこれらの髄液中に含まれるATP,ADP,AMP,adenosine,adenineを高速液体クロマトグラフィーを用いて測定しているが,現在のところどのヌクレオチドが発症何日目に上昇しているかという有意な所見は得られていない。今後検体数を増やしてさらに検討する予定である。次にprotein tyrosine kinaseとmitogen activated

protein kinase(MAPK)についてATPによる細胞内カルシウム濃度の変化への関与を検討した。ATPはratの脳底動脈平滑筋の細胞内カルシウム濃度を上昇させ,MAPKのリン酸化を起こした。これはprotein tyrosine kinase(PTK)によって制御された。引き続きdouble hemorrhage modelを使用して、脳底動脈の血管径とMAPKのactivityを比較検討した。血管径はday3,5,7と徐々に減少したが、MAPKのactivityはday3にpeakが認められた。これは先のSAH後3日目の髄液が脳血管平滑筋細胞を最も収縮された結果と一致するものであった。MAPKの阻害薬であるPD98059は血管攣縮もMAPKのactivityも抑制した。MAPKは様々な刺激に対する細胞内のsignal transductionに関与しており、脳血管攣縮においても重要な役割を持っていると考えられた。血管平滑筋の細胞内カルシウム濃度の変化が血管の収縮を制御している。ATPは脳血管攣縮の重要な因子と考えられており,過去の実験よりATPは脳血管平滑筋細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させる。今回このATPによる細胞内calcium濃度の変化において,protein tyrosine kinase(PTK)とmitogen activated protein kinase(MAPK)の関与について検討した。その結果,ATPはratの脳底動脈平滑筋細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させると同時にMAPKのリン酸化を引き起こし,これはPTKによって制御されていた。また犬のdouble hemorrhage modelを使用して脳底動脈の血管径とMAPKのactivityを比較検討した実験では,脳底動脈の血管径はday3,5,7と除々に減少したが、MAPKのactivityはday3にpeakが認められた。これは前年度,くも膜下出血患者から得られた髄液のうち,発症後3日目に採取されたものが脳血管平滑筋細胞に対して最大の収縮が見られたことと一致した。またMAPKの阻害薬であるPD98059は血管の収縮とMAPKのactivityを抑制した。このことは様々な刺激に対する細胞内signal transductionに関与しているとみられているMAPKが,脳血管攣縮にも重要な役割を演じているものと考えられ,PD98059が脳血管攣縮の治療につながる可能性を示唆した。
大腸発癌における細胞極性異常とaPKC/PAR系の役割

大腸癌の前がん病変である腺腫は、その肉眼的形態の特徴からpolypoid type(PT)とlaterally spreading tumor(LST)に分かれる。LSTの形態学的特徴に正常粘膜細胞に置き換わるように腺腫細胞が増殖し、その極性が保たれたまま腺腫化することにある。PTでは腺腫の時期からTypeIV collagenの消失などの極性の消失が始まることが示唆されたが、LSTでは腺腫内癌でも比較的維持されていることが示された。一方aPKC発現はLSTの腺腫、腺腫内癌では弱く、PTでは強く発現することから、極性の変化に伴ってその発現強度を増すことが示唆された。本年は30症例の大腸Lateral Spreading Tulnor(LST)と20症例のPolypoid type tulnor(PT)に関して、aPKCおよびbeta-catenin, cadherin, TypeIV collagenの免疫染色を行い、発現の度合いおよび発現部位に関する検討を行った。内訳はLST adenoma:8, LST cancer in situ:9, LST invasive cancer:13、PT adenoma:11, PT cancer in situ:9であった。するとLSTはPTに比較して、beta-catenin、cadherinの発現が粘膜内癌でも保たれており、同時にaPKCの発現も細胞質のみの弱い発現(染色強度1-2)であった。このような部位ではType IV collagen染色によって明らかとなった基底膜の存在も保たれており、aPKCの発現が弱い部位での腫瘍細胞の極性は保たれていることが確認された。一方PTでは腺腫の段階から極性の乱れが始まっておりaPKC染色も核内まで染色が明らかとなる染色強度3-4のものが多数を占めていた。すなわちaPKC発現は細胞の極性に関わると考えられるbeta-catenin、cad herinの染色と逆相関し、またaPKC強陽性の部位では基底膜の喪失が生じていた。LST typeであっても浸潤癌においてはこれらの極性は喪失しており、aPKCの染色強度は高くなっていた。aPKCの発現とbeta-cateninの発現には共同性が認められ、aPKCの発現強度がgrade1-2ではbeta-cateninの発現部位は細胞膜上に保たれていたが、grade3-4の部位では核内に移行していた。以上からaPKCの発現は大腸腺腫の比較的早い時期から認められる、浸潤癌になるほど強くなっていくことが示唆された。以上の内容を第100回米国癌学会のannual meetingで発表し成果を収めた。本年は前年の症例数に追加分のLST、Polypoid type tumor症例を加えて、極性変化の検討を加えた。即ち極性の基底部を決定するType IV colagenおよび側面を規定するcadherin、また分裂の際に核内移行するbeta-catenin,の免疫染色を行うと同時に、Matrix Metalloproteinase-9 (MMP9)の発現を検討し極性決定因子との関連をみるとともにaPKC発現との相関を検討した。昨年同様LSTはPTに比較して、beta-catenin、cadherinの発現が粘膜内癌でも細胞膜上に保たれており、同時にaPKCの発現も細胞質のみの弱い発現(染色強度1-2)であった。このような部位ではType IV collagen染色によって明らかとなった基底膜の存在も保たれており、この様な細胞が発現するMMP9の量は低値であった。即ちaPKCの発現が弱い部位では腫瘍細胞の極性は保たれMMP9発現が抑制されていることが確認された。一方PTでは腺腫の段階から極性の乱れが始まっており細胞の基底側のtype IV collagen発現は消失し、cadherinは消失または細胞内に染色され、beta-cateninは核内に移行していた。この様な細胞ではaPKC染色も核内まで染色が明らかとなる染色強度3-4のものが多数を占めていた。一方LST typeであっても浸潤癌においてはこれらの極性は喪失しており、細胞基底側のtype IV collagenは消失し、aPKCの染色強度は3-4となっていた。aPKCの発現とtype IV collagenの喪失およびMMP9の過剰発現の間には正の相関があると考えられ、これに伴いcadherinの喪失、beta-cateninの核内移行と腫瘍細胞の分裂が引き起こされるものと考えられた。以上からaPKCの発現は大腸腺腫の形態形成に重要な役割を有するものと考えられた。以上の内容を第101回米国癌学会のannual meetinで発表し成果を収めた。
体節特異的なホルモン応答シグナルの分子機構の解明

開放血管系である昆虫において、ホルモンが体節特異的に作用する機構は不明であった。そこでカイコのベルソン氏腺をモデルとして解明に取り組んだ。後端体節のベルソン氏腺の細胞死はATG8とcaspase-3が作用することで引き起こされることを明らかとし、また体節特異的な遺伝子を多数見出した。一部はホルモンへ応答することから、これらの因子が相互作用することで体節特異的な応答を生み出していると考えられる。昆虫の蛹変態は、幼若ホルモンが消失することで引き金が引かれる。その後エクダイソンをはじめとするホルモンに対して各組織がそれぞれ異なる応答(再構成、新生、細胞死など)をすることで、個体の蛹への変態が完了する。しかし開放血管系である昆虫において、体液中に均一に拡散しているホルモンが、どのような機構で異なる組織に異なる作用を引き起こすのかは不明である。このホルモンによる組織特異的な変態誘導機構を分子レベルで解明することが本申請研究の目的である。そこで各体節に存在し、かつ蛹変態時に体節特異的に細胞死が誘導されるベルソン氏腺を用いてこの命題に取り組んだ。まず体節特異的に発現する遺伝子を調べるために、既に行っていたマイクロアレイに加えて、細胞死を起こす体節と起こさない体節との間でRNAシークエンスを行い、候補遺伝子の探索を行った。現在得られた候補遺伝子のうち約40遺伝子についてreal time PCRによって体節特異性を確認した結果、すべての遺伝子において体節特異的な発現が確認できた。これらの遺伝子に対して、ホルモンの応答性をin vivoにおいて検証した結果、細胞死を起こす体節と起こさない体節のそれぞれにおいて、ホルモンによって発現が誘導される遺伝子と抑制される遺伝子を単離することが出来た。このうち2つの遺伝子に対してRNAiによるノックダウンを行ったところ、弱いながら細胞死への影響が見られた。今後in vitroでの検証を行うために培養系の開発も始めた。現在短期の培養系が確立出来たので、この系を用いて候補遺伝子のホルモンに対する応答の検証を始めたところである。また体節特異的なJHへの応答により細胞死が誘導されると考えられることから、その受容体の体節特異性の確認およびRNAiによる細胞死への影響を検討した。体節特異的な受容体の発現は見られなかったが、受容体が無いとJHによる細胞死抑制効果は見られなくなったことから、受容体を介して、それより下流のシグナル伝達において体節特異性が生み出されることが明らかになった。加えて細胞死の機構を解析するために、caspase-3の関与およびautophagyの関与を免疫組織化学的手法で確認したところ、caspase-3の関与が明らかになった。そこで既知の細胞死関連遺伝子について発現解析を行った結果、まずautophagyによる自己貪食が進み、その後caspae-3の活性化を伴うアポトーシスが起こることが示唆された。平成27年度は、主にJH受容体であるMet遺伝子の体節特異的な細胞死への関与の解明を挙げており、このことについては発現解析およびRNAiによる遺伝子のノックダウンにより証明することができた。一方で、遺伝子間の相互作用についてもRNAi後の発現状況を解析することで、ある程度進めることができている。また細胞死の実行段階での分子実体も明らかになりつつあり、計画が順調に進行していることを物語っている。これまで体節特異的に起こるホルモン応答がどのような分子機構で行われているのかを解明するために、Micro arrayおよびRNA sequenceを用いたgenome-wideな候補遺伝子の探索を行ってきた。そこで、本年度はさらに現象への関与を明確とするために、体節特異的現象の分子レベルでの解析も行った。まず体節特異的に起こるホルモン応答シグナルの解析のために、体節特異的な細胞死の分子機構の解析をさらに進めた。予定細胞死は大きく2つに分類され、ひとつはアポトーシス、もうひとつは自己貪食(オートファジー)を伴う細胞死である。そこでアポトーシスに関わることが知られている因子とオートファジーに関連する因子の発現解析を行ったところ、それぞれの関連遺伝子が時期特異的に発現していることがわかった。またこれらの因子は細胞死を起こす体節でのみ選択的に発現されていた。さらに一部の遺伝子については、ホルモンにより発現が抑制されていた。加えてRNAiによるノックダウンによる検証を行うことにより、これらの因子が細胞死を誘導することが証明できた。

今後これらの因子に対する他の体節特異的な因子の作用機構を解析することで、体節特異的なホルモン応答の解明につながる。一方で、体節特異的に発現する遺伝子の解析を引き続き行った結果、明確な体節特異性を示す遺伝子が20個以上見つかった。そのなかで体節特異的にホルモンへと応答する遺伝子もおよそ40%程度確認された。その一部に対してRNAiによるノックダウンを行ったところ、それぞれの体節に特異的な現象が阻害された。加えて、一つの遺伝子についてはホルモン受容体への効果が認められ、今後さらなる検証を行うことで、新たなホルモン応答のスキームが見出されると期待できる。開放血管系である昆虫において、ホルモンが体節特異的に作用する機構は不明であった。そこでカイコのベルソン氏腺をモデルとして解明に取り組んだ。後端体節のベルソン氏腺の細胞死はATG8とcaspase-3が作用することで引き起こされることを明らかとし、また体節特異的な遺伝子を多数見出した。一部はホルモンへ応答することから、これらの因子が相互作用することで体節特異的な応答を生み出していると考えられる。平成26年度は、体節特異的にホルモンへ応答する遺伝子の探索をすることを目標として行っていた。これまで体節特異性を生み出す候補遺伝子を複数見いだし、さらにホルモンの塗布実験により、発現がホルモンに依存している遺伝子を見いだすことができたことから、申請研究は順調に進行している。さらにこれらの遺伝子のノックダウンも順次行っており、体節特異性へ影響を与える遺伝子も見いだしている。更にこれらの遺伝子のノックダウンによりホルモン応答性への影響も観察されており、この結果は次年度に目標としていたことであり、計画が順調に進行していることを物語っている。1)体節特異的な細胞死誘導遺伝子間の相互作用の解明候補遺伝子の絞り込みを引き続き行うと共に、遺伝子間の相互作用の解明により最終的に全ての情報から体節特異的細胞死に関わるシグナル系を構築する。すでにある程度のアウトラインは解明しつつあるので、さらに詳しい検証を行っていく。2)体節特異性およびJH応答性に関与する遺伝子の上流配列の解析体節特異的な制御領域を探索するため、これまで得られた候補遺伝子群の上流配列を比較し、保存性の高い領域の探索を行う。カイコは既にゲノム情報の整理が十分に行われており、上流配列の探索は円滑に進むと期待できる。またベルソン氏腺を用いるアッセイは、培養細胞を用いたレポーターアッセイとは異なり、解析したい組織で直接行うため、得られる情報は信頼性が高い。そこで上流配列の比較により保存領域を見出し、その配列の直下にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込むことで、ベルソン氏腺の遺伝子導入系を用いたレポーターアッセイを行う。体節特異性については、細胞死を起こす体節および起こさない体節のベルソン氏腺の両方でアッセイを行うことで確認する。一方JH応答性については、培養系でJHを添加し応答を確認する。
自然免疫におけるＣＡＲＤ９のシグナル伝達経路の解明

昨年度、IgSFR2のリガンドは結核菌の細胞壁成分のミコール酸(MA)であり、MAによるマクロファージからのサイトカイン産生はlgSFR2に依存することを明らかにしていた。そこで、本年度は、in vivoでのlgSFR2の役割、およびその他のMA関連物質に対するIgSFR2の反応性を調べた。まず、MAをコーティングしたスチレンビーズをWTマウスに腹腔投与すると、好中球の浸潤が見られた。同様の実験をIgSFR2KOマウスで行うと、その浸潤が見られなくなった。このことから、IgSFR2はIn vivoでもMAの認識に重要であることがわかった。また、結核菌の細胞壁中には、遊離型のMAの他に糖鎖が結合したトレハロースジミコール酸(TDM)やグルコースモノミコール酸(GMM)が存在し、強い免疫原性を持っことが知られている。またグリセロールモノミコール酸(GrOMM)もある種の免疫応答を示すことが知られている。しかし、TDMに関しては、Mincleという受容体が認識することが知られているが、他のMA関連物質の受容体は不明であった。そこで、TDM, GMM, M, A, GrOMMに対する応答をlgSFR2, MincleのNFAT-GFPレポーター細胞、それぞれのKOマウス由来マクロファージを用いて、それぞれのMA関連物質に対する受容体の応答、依存性を調べると、IgSFR2は全てのMA関連物質を認識し、特にMAとGroMMの認識がIgSFR2に依存していることがわかった。一方で、TDMやGMMの糖が付加したMAに関しては、Mincleに依存することも明らかにした。これらのことより、IgSFR2とMincleは区別してMA関連物質を認識し、同じCard9経路を介して自然免疫を活性化していることがわかった。現在、これらの結果を論文にまとめ投稿中である。結核菌感染におけるCard9経路の一端を明らかにできたから。今後は、IgSFR2以外の他の受容体を明らかに、結核感染におけるCard9シグナル伝達経路を明らかにしたい。本年度は、『shRNAを用いたCard9経路に関わる因子のスクリーニング』、『抗体を用いたCard9相互作用分子の精製』、および、『Card9経路上流にある病原体を認識する新規ITAM受容体の探索』を行った。まず、『shRNAを用いたCard9経路に関わる因子のスクリーニング』において、本年度は、これに用いる細胞株の樹立を行った。Card9経路は、Fc受容体やその他のITAM受容体の刺激によって活性化し、下流にある転写因子、NF-kBを活性化する。そこで、Card9活性化の指標として、NF-kBのシスエレメントの下流に蛍光タンパク質遺伝子を導入したレポーター細胞を作製した。続いて、このスクリーニング系が機能するかどうか確認するため、Card9経路中の既知の遺伝子をKDして、ITAM受容体を刺激し、蛍光が減少するかどうかを調べ、現在スクリーニングの条件検討中である。『抗体を用いたCard9相互作用分子の精製』では、今年度、NおよびC末端にFLAGタグを融合させたCard9を発現するAW246.7、U937細胞を作製した。現在、その細胞から抗FLAG抗体でCard9タンパク質を精製するための条件検討を行っている。『Card9経路上流にある病原体を認識する新規ITAM受容体の探索』では、今年度、結核菌を認識するITAM受容体の探索を行った。まず、各種ITAM受容体-Fc融合ンパク質を作製し、結核菌と結合するITAM受容体のスクリーニング行い、2つのITAM受容体が結核と結合することが示唆された。さらに、2つの受容体のうち1つの受容体の結核菌中のリガンドを同定した。もう1つの受容体のリガンドについても、現在NMR解析中であり、ある程度の骨格は同定することができた。現在は、それら受容体のKOマウスを用いて、受容体の機能解析、および、Card9経路との関連を解析している。本研究は、自然免疫活性化において重要なCard9経路のシグナル伝達経路の解明を目指している。Card9の上流には、ITAM関連受容体が存在し、それがSykキナーゼを介して、Card9を活性化し、最終的に、免疫の活性化に不可欠なNF-kBなどを活性化する。しかし、このCard9の全体像はまだ不明な点が多い、そこで、以下の研究を行った。まず、Sykキナーゼを介してどのようにCard9が活性化されるか明らかにするため、shRNAを用いた網羅的なノックダウンを行いCard9経路に関わる因子のスクリーニングの条件検討を行った。また、Card9上流にあるIT烈関連受容体の多くはリガンドや機能が不明であることから、結核菌を認識するITAM関連受容体の機能解析を行った。まず、shRNAを用いたスクリーニングの方は、網羅的に遺伝子をノックダウンさせるための条件検討を行った。しかし、現在のところ、まだ条件が確立しておらず、細胞株やノックダウンではなく、変異原処理によるスクリーニングなど他のスクリーニング方法を検討している。結核菌を認識するITAM関連受容体関しては、前年度、結核を認識する受容体として同定したIgSFR2とIgSFR5のリガンドおよび機能の解析を行った。その結果、IgSFR2は結核菌の細胞壁由来成分のミコール酸を認識することを明らかにし、また、IgSFR2を欠損させたマクロファージでは、ミコール酸によって誘導されるサイトカインの産生が見られなくなることから、IgSFR2は実際に、マクロファージでミコール酸を認識する受容体として機能していることも明らかにした。

一方で、IgSFR5のリガンドは、結核菌の脂溶性画分に2つ含まれていることを突き止め、それらの構造解析を行った。さらに、これらのリガンド認識にもマクロファージにおけるIgSFR5が関与していることも明らかにした。昨年度、IgSFR2のリガンドは結核菌の細胞壁成分のミコール酸(MA)であり、MAによるマクロファージからのサイトカイン産生はlgSFR2に依存することを明らかにしていた。そこで、本年度は、in vivoでのlgSFR2の役割、およびその他のMA関連物質に対するIgSFR2の反応性を調べた。まず、MAをコーティングしたスチレンビーズをWTマウスに腹腔投与すると、好中球の浸潤が見られた。同様の実験をIgSFR2KOマウスで行うと、その浸潤が見られなくなった。このことから、IgSFR2はIn vivoでもMAの認識に重要であることがわかった。また、結核菌の細胞壁中には、遊離型のMAの他に糖鎖が結合したトレハロースジミコール酸(TDM)やグルコースモノミコール酸(GMM)が存在し、強い免疫原性を持っことが知られている。またグリセロールモノミコール酸(GrOMM)もある種の免疫応答を示すことが知られている。しかし、TDMに関しては、Mincleという受容体が認識することが知られているが、他のMA関連物質の受容体は不明であった。そこで、TDM, GMM, M, A, GrOMMに対する応答をlgSFR2, MincleのNFAT-GFPレポーター細胞、それぞれのKOマウス由来マクロファージを用いて、それぞれのMA関連物質に対する受容体の応答、依存性を調べると、IgSFR2は全てのMA関連物質を認識し、特にMAとGroMMの認識がIgSFR2に依存していることがわかった。一方で、TDMやGMMの糖が付加したMAに関しては、Mincleに依存することも明らかにした。これらのことより、IgSFR2とMincleは区別してMA関連物質を認識し、同じCard9経路を介して自然免疫を活性化していることがわかった。現在、これらの結果を論文にまとめ投稿中である。当初は、既知のITAM受容体刺激によるCard9経路の因子の同定を行う予定であり、それは計画通りに進んでいるが、本年度、さらに、結核を認識する新規のITAM受容体とそのリガンドを同定することができたから。shRNAのスクリーニングの方は予定より少し遅れているが、その分、結核菌の認識受容体の研究で、計画以上の進展が見られた。結核菌感染におけるCard9経路の一端を明らかにできたから。本年度の研究により、Card9経路上流に存在するITAM受容体の内、結核を認識するものを2つ同定し、さらにそのリガンドも明らかになりつつある。そこで、従来のCard9経路の因子を同定する研究を進めるとともに、今後は、これらの新規ITAM受容体に関しても、重点的に研究を行っていく。来年度も予定通り、従来のCard9経路の因子を同定する研究を進めるとともに、結核認識ITAM受容体の研究の方を重点的に行っていく。今後は、IgSFR2以外の他の受容体を明らかに、結核感染におけるCard9シグナル伝達経路を明らかにしたい。
知的財産紛争解決の新しいあり方-アジア知的財産判例DBと模擬裁判を通じて

本研究プロジェクトは引き続き次の2つを目的として研究してきた。a早稲田大学21世紀COE《企業法制と法創造》総合研究所のプロジェクトで確立したデータベースに、更にインドの判例を追加し、データベースをより総合的なものにすること。b判例データベースや、「東アジアにおける産業財産権関連紛争の裁判上の処理に関する実態調査」報告書を基に、アジア各国の異なる知的財産権エンフォースメントを比較研究し、知的財産権紛争の解決の新しいあり方について模索すること。上記研究目的を果たすために、平成20年度には次のような研究活動をした。また、2007年5月13日には「IPエンフォースメントin India」というタイトルで、デリー高等裁判所判事Arjan K. Sikri氏やデリー大学法学部教授S.K.Verma氏など、インド知的財産権を代表する有識者を招いて、国際シンポジウムを開催した。(http://www.21coe-win-cls.org/project/activity.php?gid=10096)本研究プロジェクトは引き続き次の2つを目的として研究してきた。(http://www.21coe-win-cls.org/project/activity.php?gid=10096)本研究プロジェクトは次の2つを目的としている。1)早稲田大学21世紀COE《企業法制と法創造》総合研究所のプロジェクトで確立した知的財産英語判例データベースに、更にインド・韓国の判例を追加し、データベースをより総合的なものにし,2)知的財産英語判例データベースや、「東アジアにおける産業財産権関連紛争の裁判上の処理に関する実態謂査」報告書を基に、アジア各国の異なる知的財産権エンフォースメントを比較研究し、知的財産権紛争の解決の新しいあり方について模索する。このような研究目的を果たすために、平成19年度には次のような研究活動をした。1)2007年11月24日に早稲田大学国際会議場井深ホールで、アジア各国(中国・韓国・タイ・インドネシア・日本・ベトナム・台湾)の裁判官や弁護士を招聘し、知的財産権の仮想紛争事例を各国の法律・判例に基づき解決する国際模擬裁判を開催した。各国のエンフォースメントを比較することによって、異なるシステムを再認識し、より普逼性を有する紛争解決の新しい運用方法を模索することができた。この国際シンポジウムの模様は早稲田大学21世紀COE研究所の紀要14号に詳しく掲載している。2)また、知的財産英語判例データベースにインドの知的財産判例を加えるプロジェクト推進のため,インドを訪問し、デリー大学の教授、デリー高等裁判所の裁判官、弁護士らに会って、インドの最新の知的財産事情を伺い、データベース構築体制を固めて,今後も継続的に判例データの提供を受けてつつ,互いの学術交流を諮ることになった。研究出張の1次的成果として、2007年3月28日にインドの判例89件が、アジア知的財産判例データベース(http://ww.21coe-win-cls.org/rclip/db/search_form.php)に追加されて、無料公開されている。本研究プロジェクトは次の2つを目的としている。(1):早稲田大学21世紀COE《企業法制と法創造》総合研究所のプロジェクトで確立したデータベースに、更にインドの判例を追加し、データベースをより総合的なものにすること。(2):判例データベースや、「東アジアにおける産業財産権関連紛争の裁判上の処理に関する実態調査」報告書を基に、アジア各国の異なる知的財産権エンフォースメントを比較研究し、知的財産権紛争の解決の新しいあり方について模索すること。このような研究目的を果たすために、平成20年度には次のような研究活動をした。2)また、2008年10月3日には「IPエンフォースメントin lndia」というタイトルで、デリー高等裁判所判事Arjan K. Sikri氏,デリー大学法学部教授S.K.Verma氏のほか,同じくデリー大のPoonan Dass氏,弁護士のManoj G. Menda, Girija Varma氏など、インド知的財産法分野を代表する有識者を招いて、国際シンポジウムを開催した。この内容はhttp://www.21coe-win-cls.org/project/activity.php?gid=10096で公開されているほか,季刊「企業と法創造」5巻3号(通巻17号)に54頁にわたって登載されている。
学校間連携型授業研究ハンドブックの開発

本科研では、「専門的な学習共同体」(Professional Learning Community,以下,PLCと表記)のネットワーク化に関する理論及び実践的研究を展開している。本年度は、専門的な学習共同体のネットワーク化を図るInstructional Rounds in Education(以下、IRの)授業分析法に,わが国の参加型授業研究と比して,どのような可能性と課題とがあるかを明らかにすることを試みた。鹿児島県や和歌山県においてIRの試行を行い、参加者からデータを収集している。成果としては、以下の2点が挙げられる。1.試行を通して収集したデータから、ネットワーク化に資するIRの要件の導出を試みた。詳細は省略するが、日本の教師にとってもIRの要件が重要であると認識されたことや、その要件を満たすことで学び得られることが示唆された。2.試行が当初計画よりも進展したため、上記の知見を踏まえつつ、わが国の学校現場における利活用を目指した授業研究ハンドブックの開発を進めることができた。初年次において、ハンドブックの簡易版の作成を終えることができた。研究の意義や重要性であるが、それは、本研究が、わが国の社会状況の変化を見通した研究を行っている点にある。具体的には、人口減少社会や学校の小規模化の進展が予想されるわが国において、専門的な学びを生起する学校間ネットワーク形成の必要性が高まりつつあるが、本研究で得られたIRの要件に関する知見は、その展開モデルを示すものである。研究計画当初に予定していた調査の多くを実施することができた。それに加え、2年目に行う予定であった調査も初年次に実施できたことから、研究は、非常に順調に進展していると考えられる。しかし、国外調査については不十分な点が残されており、総合的にはおおむね順調であると評価される。本科研では、IRの試行や調査に基づき、わが国の学校現場において利活用できるハンドブックづくりを進めている。初年度、研究を基にハンドブックの簡易版の開発を行ったが、今年度も試行や調査に基づき簡易版の修正を進めることを通して、ハンドブックの開発を進める。2年目において、国外における情報収集を重ねることとしたい。今年度の旅費について、国内での試行調査が先行実施できることになり、国外における情報収集に修正が生じたためである。次年度は、この点を補充していく。
躯幹部CT画像の非線形レジストレーションによる経時変化検出技術の開発

肺腫瘍では、サイズ変化や消滅の評価が可能であるとともに新たな転移病巣を自動的な画像処理により検出できることがわかった。さらに腹部・骨盤にも適用・評価したところ、日常診療においてその検出が必ずしも容易ではない骨転移に対して非常に有用なことがわかった。肺の形状は吸気状態により大きく異なるため、時系列画像間の変形・変化が大きく剛体として取り扱うことができない。そこで最初に全体的なレジストレーションを行い、その後局所のレジストレーションへと段階的に実施するアルゴリズムを適用して、その妥当性を検討した。その際、高精細のCT元画像のデータ量は非常に大きく、胸部全体の画像をそのまま処理することはコンピュータの処理能力・所要時間の点から困難であることが判明した。そこでLDDMM法を適用する前段階で行うべき処理を検討、実行可能な処理時間に収めることができた。これらの成果を活用して実際に処理を行い、肺野の経時変化は変形量を記述するJacobian mapとして、病変の出現・消失の記述にはレジストレーション前後の差分によるdifferential mapとして検出可能であることがわかった。ただし気管支閉塞による末梢肺炎のように本来の構造が消失する場合には処理に失敗する場合があることも分かった。本年度は研究代表者の指導の元で本研究を行っている大学院生・坂本をアルゴリズム開発者JHU大学Miller教授のもとに派遣してその改良を続けるとともに、これを肺ガン症例に適用してその性能を検証した。結果、気管支分岐部などランドマークを指標として位置合わせの誤差を評価したところ、従来法とLDDMM法とを比較して近位部では3.11±2.47mmに対して0.02±0.16mm、遠位部では3.99±3.05mmに対して0.12±0.60mmといずれも有意に改善されていることが示された。さらに腫瘍のサイズ変化や出現・消失を的確に捉えられていることが確認された(Sakamoto R, et al. PLoSOne. 9:e85580, 2014)。肺ガンをスクリーニングする目的で行われるCT検査では、5mm以下の小結節を有する場合が多く、そのほとんどが良性である。一方でvideo-assisted thoracic surgery対象症例の38%では肺ガンの大きさは1cm以下との報告がある。腫瘍が倍増するのは平均で181日とする報告はあるが個人差が大きく、CT検査が頻回となる場合も多い。本手法は小病変も含めてその変化を客観的に捉えることを可能とするものであり、肺ガン診療に大きく貢献すると考えられる。画像診断学経時的に撮像された肺野CT画像をLDDMM法を用いて非線形レジストレーション可能とし、差分画像により病変の出現・消失を、Jacobian mapによりサイズ変化を客観的に描出可能とした。これにより平成25年度計画をほぼ初期の目的通り達成した。平成26年度には、まず肺野病変を有する複数症例を対象として、その有用性の検討を進める。またLDDMM法によりCT画像の経時変化を評価する対象を他臓器へと広げる方法を検討する。後者については、肺野と同様に組織間コントラストが高い構造としては骨が挙げられる。CTでも骨転移巣は溶骨性もしくは骨形成性病巣として捉えることは不可能ではないが、通常の診療ではCT評価の対象は主として軟部組織濃度を示す実質臓器である。骨の評価には実質臓器とは異なる表示条件に変更の上で、広範囲を再度視覚的に確認し無くてはならない。そのため診療を支援可能なレベルのレジストレーション精度と変化の検出能を目指す。ただしガンの全身骨転移を対象とする場合には、肺野よりも広範囲を対象とした解析が必要となる。現時点では躯幹部を分割して処理する方法が有力であるが、非線形レジストレーションを行うため、分割した領域の境界部分におけるレジストレーションの整合性が問題となる。また肺野では空気と腫瘍や正常組織とのコントラストが高く、レジストレーションが比較的容易であった。骨のコントラストは高いため同様の精度が期待されるが、事前処理やLDDMM法適用の最適化を検討する。実用レベルに達した場合には、当研究施設が有する多数の疾患・症例を対象とした解析を行い臨床の場において評価・検討を行うことで、躯幹部CT画像の経時変化検出能を改善するとともに、適用可能な領域を明確化して病態変化に関する研究を進める。H25年度計画は当初の予定どおり実施出来たため、結果としてLDDMM法を用いたアルゴリズムの詳細な検討のために米国Johns-Hopkins大学(JHU)で研究を実施せずに済ませることができたため。H26年度はこれまでに検討はしていない新たな領域への適用であり、JHU現地でのLDDMM法適用とアルゴリズム改善の研究を行うとともに、より処理能力の高いワークステーションを導入することで遅滞なく研究を遂行する予定である。
咀嚼困難・嚥下困難な高齢者を対象とした食事基準の作成

嚥下障害、咀嚼障害者は激増しているにもかかわらず、臨床における適切な食品物性の研究はほとんど行われていません。そのため臨床現場では、適切でない食事形態のものを患者に提供している事例が数多く見られます。本研究においては、臨床現場に有用な情報を提供することを目的としています。嚥下障害者が非経口摂取から経口摂取に移行する際、最初に口にするのはゼリー食が一般的になりつつあります。そのため、ゼリー食は高いリスクを伴いながらの摂食となることが多く、ゼリーの物性には慎重さが求められます。食品物性を「かたさ」「付着性」「凝集性」の3要素に別け、ゼリー様食品についての研究を行ないました。具体的には嚥下障害者に対して先進的な治療を行っている病院で提供しているゼリー強度(かたさ)を基準として、数十種類のゲル化剤を用い、濃度や温度を変化させた場合の物性変化などについて検討を行ないました。その結果、テストしたゲル化剤の中ではκカラギーナンにて作成したゼリーが温度による影響が少ないことや、高い凝集性を有し、口腔内でばらけることが少ないことなどがわかり、医療機関との連携のもと、κカラギーナンをゲル化剤として作成したゼリーを嚥下障害者に提供したところ、医療関係者には好評でした。さらに、各種ゲル化剤に対しpH、糖、でんぷんが添加された場合の食品物性に及ぼす影響についてや、ゼリー食に適したブレンダー(ミキサー)食の検討などを行ない、これらの結果については、平成1213年度では講演:福島県栄養士会「嚥下障害と栄養管理」(2000.10)他4回、学会:日本摂食嚥下リハビリテーション学会(2000.9)他3回などで順次公開している。近年、高齢化社会になりつつあり、それに伴い摂食・嚥下障害患者数も増加しているが、このような患者に対し栄養士が自信を持って適切な食事を供与している施設は数少ない。この原因は、施設において、摂食・嚥下障害患者に適した食事は、栄養の充足ではなく、個々の患者にとって食べやすい食事、すなわち物性的な因子が重要になってくるためと考えられる。現段階の研究では、食品物性を「かたさ」「付着性」「凝集性」の3要素に分け、重度の摂食嚥下障害患者がチューブ栄養から経口栄養に移行する際、最初に口にするゼリー様食品についての研究を行っている。具体的には、ゼリーを作るための素材として、ゼラチン、寒天、κカラギーナンを各数種類ずつ用いて、実際病院等の施設でゼリー作成時に使用している程度の濃度を基準とし、濃度を変化させた場合、加熱状態を変えた場合、ゼリー作成後の経時的な変化、などについて検討を行った。施設の看護婦や栄養士などの医療従事者は、寒天とゼラチンではどちらが物性的に優れているのかという疑問を持っているが、それ以前の問題点として、同じ増粘剤、例えば寒天を使用した場合、その種類により大きく物性が変わることや、経時的な変化においては、ゼラチンの物性は大きく変わるが、寒天、κカラギーナンではあまり大きな物性変化はおこらないことなどの基礎的な検討を繰り返し行った。上記の結果については、平成11年10月愛知県食品技術センター「高齢者に適した食品開発」平成11年10月青森県栄養士会福祉協議会「嚥下困難者への食事の対応」平成12年1月第8回岐阜県栄養改善学会「摂食嚥下機能障害者の治療における適切な食事についての基礎的な研究」等で講演、学会発表を行った。
肝臓門脈結紮(塞栓)後代償性肝再生を応用した組織特異的幹細胞の単離とその機能解析

門脈塞栓術後の代償性肝再生に着目し,同状態に動員される肝特異的幹細胞の単離とその機能解析を行った.得られた細胞(Portal Branch Ligation-stimulated Hepatic Cells : PBLHCs)は幹細胞の形質を有し,肝及び胆管細胞へ分化する可塑性を有することを確認した.本知見は,門脈塞栓術によって惹起される肝組織特異的幹細胞を再生医学的手法により臨床応用に供しうることを示唆する所見と考えられた.門脈塞栓術後の代償性肝再生に着目し,同状態に動員される肝特異的幹細胞の単離とその機能解析を行った.得られた細胞(Portal Branch Ligation-stimulated Hepatic Cells : PBLHCs)は幹細胞の形質を有し,肝及び胆管細胞へ分化する可塑性を有することを確認した.本知見は,門脈塞栓術によって惹起される肝組織特異的幹細胞を再生医学的手法により臨床応用に供しうることを示唆する所見と考えられた.我々は門脈結紮後に出現する幹細胞の存在に注目し、(1)同細胞を内胚葉特異的抗体を用いて識別・分離、(2)分離された細胞のin vitroにおける増殖性・分化能力の検討、(3)肝細胞以外の内胚葉由来細胞への分化可塑性の検討(特に膵内分泌細胞への分化の可能性の検討)、(4)肝幹細胞移植による肝障害モデルの病態改善に関する検討を行うことを、本研究の趣旨としている。我々はすでにマウス門脈結紮モデルを確立しており、同モデルを用いて門脈結紮(塞栓)後代償性肝再生に導入されている可能性のある未分化細胞(肝組織特異的幹細胞様細胞)を分離し得た。同細胞は種々のファクター(細胞外マトリックス及び液性因子)の変更により肝・胆管細胞へとそれぞれ分化しうるbipotetiallityを有し、特に胆管細胞分化環境においては正常の胆管組織に類似した組織構築を再現しうることを見出した。本内容は種々の学会にて報告したほか、現在論文として投稿中である。現在この未分化細胞を用いて、内胚葉由来非肝臓細胞への分可能、特に膵臓β細胞への分化能を有するか否かの検討(Plasticityの確認)を施行中である。この解析系においては、膵臓発生特異的遺伝子の導入により、この可塑性の効率化が得られるか否かについても、併せて検討していく。またこの細胞を効率的に分離するため、マウスES細胞を用いた肝組織誘導系を用いて、内胚葉への分化に際して特異的に発現する蛋白質の同定及び門脈結紮術後肝組織での発現解析を進めている。我々は門脈結紮後に出現する幹細胞の存在に注目し、1.内胚葉特異的抗体を用いて,同細胞を識別・分離、2.分離された細胞のin vitroにおける増殖性・分化能力の検討、3.肝細胞以外の内胚葉由来細胞への分化可塑性の検討(特に膵内分泌細胞への分化の可能性の検討)、4.肝幹細胞移植による肝障害モデルの病態改善に関する検討を行うことを、本研究の趣旨としている。我々はすでにマウス門脈結紮モデルを確立しており、同モデルを用いて門脈結紮(塞栓)後代償性肝再生に導入されている可能性のある未分化細胞(portal branch ligation-stimulated hepatic cells:PBL HCs)を分離し得た。PBLHCsは幹細胞のself-renewalに関与するとされるHMGA2を発現しており,種々のファクター(細胞外マトリックス及び液性因子)の変更により肝・胆管細胞へとそれぞれ分化しうるbipotetiallityを有し、特に胆管細胞分化環境においては正常の胆管組織に類似した組織構築を再現しうることを見出した。本内容は論文として発表した(Biochem Biophys Res Commun.2010 Dec 17;403:298-304)。現在PBLHCsを用いて、内胚葉由来非肝臓細胞への分可能、特に膵臓β細胞への分化能を有するか否かに関し,膵臓発生特異的遺伝子の導入により検討している(Plasticityの確認)。我々は門脈結紮後に出現する幹細胞の存在に注目し、(1)内胚葉特異的抗体を用いて、同細胞を識別・分離、(2)分離された細胞のin vitroにおける増殖性・分化能力の検討、(3)肝細胞以外の内胚葉由来細胞への分化可塑性の検討(特に膵内分泌細胞への分化の可能性の検討)、(4)肝幹細胞移植による肝障害モデルの病態改善に関する検討を行うことを、本研究の趣旨とし計画した。我々は独自に開発したマウス門脈結紮モデルを用いて門脈結紮(塞栓)後代償性肝再生に寄与する未分化細胞(portal branch ligation-stimulated hepatic cells : PBLHCs)を分離し得た。PBLHCsは幹細胞のsellrenewalに関与するとされるHMGA2を発現しており、種々のファクター(細胞外マトリックス及び液性因子)の変更により肝・胆管細胞へとそれぞれ分化しうるbipotetiallityを有し、特に胆管細胞分化環境においては正常の胆管組織に類似した組織構築を再現しうることを見出した。

本内容は論文として発表した(Biochem Biophys Res Commun.2010 Dec 17 ; 403 : 298-304)。当初の研究計画ではこの細胞が内胚葉特異的抗体を用いて分離可能と思われたが、PBLHCsは内胚葉特異的に発現する転写因子Soxl7を発現しておらず、肝へのlineageへと誘導された肝幹細胞と考え得る未分化細胞であった。可塑性検討においては従来のliver-to-pancreas reptogrammingにおいて報告されているような異所性遺伝子発現手法を用い、予備実験としてマウス肝組織中に膵臓発生特異的転写因子を複数導入して検討を行い、Pdx1、Ngn3、MafAの3因子を共発現させ肝における異所性インスリン遺伝子の転写促進を得ることを確認し、同遺伝子群を導入したPBLHCsの解析を進めている。
水圏生物の放出型生理活性物質-モデル水槽水からの単離と構造研究-

主に300、450リットルの水槽を用い以下に示す生物について検討を行った。1.甲殻類オオミジンコ(Daphnia magna)の飼育と植物プランクトン形態変化誘発物質:Scenedesmus属やActinastrum属の植物プランクトンは捕食者であるミジンコ類との共存により形態を変え大きな群体を形成する。これはミジンコに由来する何らかの物質(カイロモン)を感知し捕食されにくく形態を変えた結果であると考えられる。そこでこれら藻類のミジンコ飼育水に対する形態変化について調べたところ濃度依存性を持って大きな群体が誘発されることが確認され、しかも活性物質は吸着樹脂で回収が可能であることも分かった。活性物質を大量に取り出すためオオミジンコの大量飼育を行い活性物質を回収し各種クロマトグラフィーにより分離を行った。活性分画は極めて低濃度(数ppb)で活性を示した。物性、構造についてさらに検討中である。2.緑藻スジアオノリ(Enteromorpha prolifera)の培養と遊走子走光性逆転物質:スジアオノリの遊走子は通常負の走行性を示すが藻体が浸かっていた海水中や藻体の抽出物を添加した海水中では正の走行性を示すことが確認された。これは自然界において藻体より放出された遊走子が既にあるスジアオノリ群落の中ではなくその周辺部にテリトリーを広げるための適応と考えられる。ペトリ皿を用いる走行性検定法を確立しスジアオノリ培養海水や抽出物より分離分画を進行中である。3.その他:アジサイイソギンチャク(Antheppsis cookei)、シマオウギ(Zonaria diesingiana)などの培養・飼育を行い水槽水の樹脂吸着成分について検討を行った。300、450リットルの水槽を用い以下に示す生物について検討を行った。1.褐藻シマオウギ(Zonaria diesingiana)の培養とエイコサペンタエン酸(EPA)関連物質:シマオウギには高脂血症に有効なEPAに容易に変換可能なフロログルシノール誘導体が多量に含有されている。シマオウギ成体の培養を試みたところ4ヵ月程度は藻体を維持でき、水槽水を吸着樹脂に通過させところこれら化合物の存在が確認できた。藻体の短寿命は光量不足が原因と考えられ光源を換えさらに培養を継続しており藻体の回復、新たな採集により再検討を行う予定である。2.甲殻類オオミジンコ(Dapnia magna)の飼育と植物プランクトン形態変化誘発物質:Scenedesmus属やActinastrum属の植物プランクトンは捕食者であるミジンコ類との共存により形態を変え大きな群体を形成する。そこでこれら藻類のミジンコ飼育水に対する形態変化について調べたところ濃度依存性を持って大きな群体が誘発されることが確認され、しかも活性物質は吸着樹脂で回収が可能であり、極めて低濃度で活性を持つことも分かった。活性物質を大量に取り出すため大型水槽でオオミジンコの飼育を行い定期的に活性物質を回収しており分離について検討中である。3.緑藻スジアオノリ(Enteromorpha prolifera)の培養と遊走子走光性逆転物質:培養中、生物検定中、4.ウニ類ガンガゼ(Diadima setsum)の飼育と警報物質および魚類プテラポゴンとの共生物質:飼育中、生物検定検討中、5.腔腸動物アジサイイソギンチャク(Antheppsis cookei)の飼育と生理活性物質:予備飼育中、平成11年度本格的飼育予定。