hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪蓄積調節遺伝子をマーカーにした家畜用抗肥満ワクチンの開発 -低脂肪食肉生産-

脂肪蓄積調節遺伝子をマーカーとして、脂肪細胞の増殖を抑制する作用を持つ機能性栄養素・抗体をスクリーニングし、鶏脂肪蓄積抑制因子を同定して、家畜用抗肥満ワクチンと安全な低脂肪食肉生産システムの開発を目指した応用研究を行なった。・鶏前駆脂肪細胞を分化誘導させるには、哺乳動物における前駆脂肪細胞を分化誘導するホルモン(Ins, DEX, IMX)に外因性の脂肪酸の添加が必須であることがはじめて明らかにした。・鶏前駆脂肪細胞の分化マスターレギュレーターはPPARγであることを証明した。・insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthin, dexamethasonのホルモンと脂肪酸を混合し、トリオレインでエマルジョン化した混合物を、細胞増殖が盛んな1日齢のヒナの腹腔内にin vivo投与すると、3週齢時あるいは5週齢時における鶏脂肪組織重量を低下させることができることを明らかにした。また、この作用は、脂肪細胞を分化させることによる細胞増殖抑制に起因することを実証した。以上の結果から、現時点ではわずかな量で、一時的な操作ではあるもののホルモンを使用する点で、消費者に受け入れられる実用的な制御技術の確立には至らなかったものの、脂肪細胞分化誘導因子の投与がin vivoにおける脂肪蓄積量を約2/3に減少することができるなどの、鶏脂肪蓄積制御法の極めて有効な手段を明示することができた。脂肪蓄積調節遺伝子をマーカーとして、脂肪細胞の増殖を抑制する作用を持つ機能性栄養素・抗体をスクリーニングし、鶏脂肪蓄積抑制因子を同定して、家畜用抗肥満ワクチンと安全な低脂肪食肉生産システムの開発を目指した応用研究を行なう。本年度は、脂肪蓄積調節遺伝子の同定と家畜用抗肥満因子のスクリーニング、およびその毒性試験を行なった。(1)鶏前駆脂肪細胞の分化制御遺伝子および分化マーカー遺伝子の同定哺乳動物における脂肪細胞分化制御因子として同定されている転写因子および分化マーカーのmRNA発現を、分化を開始した鶏培養脂肪細胞で経時的に観察した。鶏脂肪細胞の分化過程において、PPARγのmRNA発現は余り変動しなかったのに対して、C/EBPαの発現変動が特異的であった。また、リポプロテインリパーゼ、aP2およびVLDLreceptorのmRNAが鶏脂肪細胞の分化マーカーとして使用できることが確認された。(2)鶏前駆脂肪細胞の分化誘導因子の検索鶏前駆脂肪細胞の増殖を抑制し、分化を進行させる因子を検索した。鶏前駆脂肪細胞培養系では、哺乳動物では必須ではない脂肪酸(FA)を添加しなければ増殖を抑制することができなかった。また、Insulin(Ins)、Dexamethason(DX)および3-isobutyl-l-methylxanthine(IMX)が鶏前駆脂肪細胞の増殖を抑制するために有効であることが示された。現在も、さらに有効な因子を検索中である。(3)鶏前駆脂肪細胞増殖抑制因子(分化誘導因子)の安全性の確認(2)で有効であると推測された各因子(FA, Ins, Dx,およびIMX)および分化の進行を活性化すると推測されたbiotinを孵化直後のヒナの腹腔内に投与して、その毒性試験を行なった。その結果、各因子0.5mg/birdの量までであれば、体重低下などの顕著なストレス応答を引き起こさないことが明らかとなった。本年度は、前年度においてin vitro条件下で選出した分化誘導因子を、鶏にin vivo投与して、鶏の脂肪蓄積抑制が可能かを推察した。(1)鶏前駆脂肪細胞の増殖抑制因子の同定前年度に選出したオレイン酸、Insulin(Ins)、Dexamethason(DX)および3-isobutyl-1-methylxanthine(IMX)以外の鶏前駆脂肪細胞増殖抑制因子をスクリーニングした。脂肪酸としてパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、CLAを供試したところ、若干、リノール酸、アラキドン酸で増殖が抑制される傾向が認められたものの、大きな差異は認められなかった。

(2)鶏前駆脂肪細胞増殖抑制因子(分化誘導因子)のin vivo投与孵化直後のヒナ(Ross)にオレイン酸、Ins、DX、IMXを腹腔内に投与すると、脂肪蓄積が減少する傾向が認められた。しかし、体重も減少することから、各種因子を様々な濃度で投与して検討したところ、各因子それぞれ10μg/birdの混合物で体重の減少は認められないことが明らかとなった。そこで、次の試験で適切な投与形態を検討した。(3)脂肪過剰蓄積抑制因子の投与形態の検討初生ヒナ(Ross)の腹腔内に上記因子の混合物をトリオレインでミセル化して投与した。その結果、4週齢時の体重に有意な差異は認められないものの、腹腔内脂肪重量を約2/3に低下させることができた。すなわち、実用化が可能な投与形態が確立できたものと推測された。一方、Cobb種ヒナに投与しても、その腹腔内脂肪に変動は認めらず、様々な因子を検討したが、同様な結果を得た。すなわち、現時点ではRoss種のみの脂肪蓄積を制御できるワクチンの開発が可能であることが推察された。脂肪蓄積調節遺伝子をマーカーとして、脂肪細胞の増殖を抑制する作用を持つ機能性栄養素・抗体をスクリーニングし、鶏脂肪蓄積抑制因子を同定して、家畜用抗肥満ワクチンと安全な低脂肪食肉生産システムの開発を目指した応用研究を行なう。最終年度である本年度は、前年度において確立した脂肪細胞分化誘導因子による鶏の脂肪蓄積抑制法が実用化可能であるかを検討した。(1)肥満抑制ワクチンの完成・ワクチン投与後の鶏脂肪組織のPPARγおよびC/EBPαの発現は、生理食塩水を投与した対照区に比べ大きく亢進し、脂肪細胞分化誘導因子が脂肪蓄積制御ワクチンとして有効であることが再確認された。・抗肥満ワクチンの効果に、性差、種差があるかを検討したところ、本研究で作製したワクチンは、Ross種のメスで最も効果が高く、逆にCobb種のオスで効果が低かった。すなわち、脂肪細胞の分化条件に品種間差および性差がある可能性が示唆された。・本試験で確立した分化誘導因子はInsulin(Ins)、Dexamethason(DX)および3-isobutyl-1-methylxanthine(IMX)などのホルモンを含んでいる。そこで、ホルモンを添加しないワクチンが製作可能であるかを検討した。様々な脂肪酸、ビタミンをホルモンの変わりとして検討したものの、ホルモンと同程度の抗肥満作用は得られなかった。また、PPARγ誘導剤であるtroglitazoneをホルモンの変わりに添加しても、大きな抗肥満作用は示さなかった。(2)肥満抑制ワクチンを用いた脂肪過剰蓄積抑制・低脂肪食肉システムの確立・ワクチンの投与は、脂肪過剰蓄積抑制作用を持つものの、飼料効率に大きな差異は認められなかった。一方、飼料摂取量は若干低下する傾向を示した。すなわち、本ワクチン投与はエネルギー摂取量を節約できる可能性が推察され、家畜の抗肥満抑制に有効に使用可能である可能性が示唆された。
日本語における助数詞の歴史的研究

当該研究期間の研究成果は次の通りである。1各時代、各文章ジャンル、各資料などにおける助数詞表現の検討と用例の収集を、時間の許す限り行った。それらは、(1)古文書、(2)古記録、(3)訓点資料、(4)表白集、(5)古往来、(6)文学作品、(7)教科書、(8)辞書、の広い分野に渡っている。それぞれにおける実態調査は、共時的研究・通時的研究のいずれにおいても基礎となるものである。2日本語助数詞の歴史的展開の把握、また、その展開の必然性についての考察:この代表的な事例として、日本の鷹狩り文化に関する「鷹」の助数詞について歴史的考察を行った。今後には、衣類、魚介類、等々、分野ごとに、また、対象ごとに、細かく検討していきたい。3中世から近世における故実書・書札礼・節用集の検討過程において、これらの時期には、助数詞は文書類(簿籍、証書、手紙、その他)の作成には不可欠の存在であることが判明した。その用法の習得こそは、文章作成者に必須とされた教養でもあり技術でもあったのである。4日本語の助数詞と、中国・その他における助数詞相当語(類別語・量詞)との比較研究:漢代前後から唐代にかけての、西北辺境遺跡出土の簡牘類、墓葬出土の簡牘類を調査し、多くの量詞(助数詞相当)の用例を得た。また、タイ語、ラオス語、マレーシア語、カンボジア語、ベトナム語、インドネシア語など東南アジアにおける類別語(助数詞相当)を調査し、その根底にある類別の原理について考察中である。5現代の新聞における助数詞を調査した。ここでは伝統的な助数詞表現の豊かさは斟酌されず、簡易化され過ぎている憾みがある。6島根県における方言生活の中の助数詞について考察した。本研究の調査課題とする資料ジャンルの内、最も用例の多く拾われるのは、イ:文書類、ロ:記録類、の二方面である。これらについては、目下、次のような点(分野、資料)を集中的に調査・分析中である。イ:文書類上代新出の平城宮跡出土木簡、特に、長屋王邸宅跡出土木簡ロ:記録類(1)吏部王記(2)泰重卿記(3)兼見卿記(4)実隆公記(5)山科家礼記前者は、日本における助数詞の用法の内、その初期の様相を探ろうとするものである。後者は、これらのみにおいても多くの実際例を得ようとするものであるが、もう一つ、先に行った「中世、また、近世の辞書類における助数詞の調査」の不備を補おうとするものである。辞書類には、多くの助数詞が収録されている。しかし、その実際の用法ははっきりしないことがあり、時には、それが助数詞であるか否かの決め手を欠くことさえある。記録類の内、(4)『山科家礼記』は、一家司の手になる日記であるが、大部なものであり、これによって、「当時における、一個人の使用し得る助数詞(異なり語)」についての考察が可能ではないかと思う。カード採取は終わったので、これから分類・考察を行いたい。以上のほか、現今、次のような調査を終え、または、調査中であり、(a)日本書紀・北野本(訓点) (b)今昔物語集(c)近世の料理書さらに、「韓国語」「タイ語」「マレーシア語」「カンボジア語」における助数詞「類別語」のあり方について検討中である。

日本語の助数詞を真に理解するには、「中国語(古代現代)」はもとより、こうした近隣諸語における助数詞(類別語)の検討も不可欠であろう。以下のそれぞれのテーマにおける今年度の研究実績は次の通りである。1各時代、各文章ジャンル、各資料などにおける助数詞表現の検討と用例の収集を、時間の許すかぎり行った(前年度に続く)。中でも「山科家礼記」や近世従来物関係における収穫は大きい。用例の収集については、終了ということはない。共時的研究・通時的研究のいずれにおいても用例が基礎となるので、今後も弛まずその収集に努めたい。2日本語助数詞の実態と歴史的展開の把握、また、その展開の必然性についての考察:この代表的な事例として、日本の鷹狩り文化に関する「鷹」の助数詞について歴史的考察を行った。今後には、衣類、魚介類、等々、分野ごとに細かく検討していかねばならない。3中世から近世における「助数詞教育」の意味についての考察:助数詞の用例・用法等を追求していく課程において、おのずから中世から近世における「文書作成教育」の在り方を考察することにもなった。即ち、助数詞は、文書類(薄籍、証書、手紙、その他)の作成には不可欠の存在であり、その用法の習得こそは、文章作成者に必須とされた教養でもあり技術でもあったらしい。4日本語の助数詞と、中国・その他における助数詞相当語(類別語・量詞)との比較研究:漢代前後から唐代にかけての、西北辺境遺跡出土の簡牘類、墓葬出土の簡牘類を調査し、多くの量詞(助数詞相当)の用例を得た。また、タイ語、ラオス語、マレーシア語、カンボジア語、ベトナム語など東南アジアにおける類別語(助数詞相当)を調査し、その根底にある類別の原理について考察中である。5現代の新聞における助数詞の調査:現代の朝日新聞により調査した。6方言生活における助数詞の考察:島根県全域について調査した。
関節リウマチの手指関節破壊におけるレントゲン画像の半自動的定量評価システムの開発

関節リウマチの特に手指に認められる関節の破壊を詳細に把握するための評価方法の開発として演算による画像解像度の改善を得る超解像手法をレントゲン画像に応用し、解像度の向上の得られた関節のレントゲン画像を用いてカーブフィッティング法という関節の隙間の距離を測定のばらつきを少なくする新しい手法で関節の計測を試みた。これらの一連の手法は特許出願をしている。関節の隙間の測定の精度は良好で実測する値が正確に得られたことを実験において確認した。この手法を用いることで微小な関節の破壊の変化を検出し、早期に適切なタイミングで治療介入できる可能性が期待される。関節リウマチにおける治療は生物学的製剤により劇的に変化し関節破壊が良好に抑制されている。これまで抑止しきれなかった関節破壊の進行は容易にレントゲン画像により確認が可能であったが、現在の治療下ではその検出が困難である。Sharpscoreを代表とするレントゲン画像の評価方法を用いればその変化を検出は可能であるが、読影に要する時間が日常診療において確保が困難である。この問題を解決する方法としてより定量的且つ省労力であるコンピューターによる自動解析システムの開発をしている。関節リウマチにおける関節破壊の形態は関節裂隙の狭小化と骨びらんに大別される。骨びらんは3次元的に広がる骨侵食を投影像であるレントゲン画像で評価する複雑さと、どこまでを骨びらんとするか既存の目視による判断も困難な面があり、現時点では骨びらんと関節裂隙の狭小化では後者のほうが関節リウマチ患者の日常生活動作の障害に直結するという報告もあり、関節裂隙間距離の測定より着手している。罹病歴の短い関節リウマチ患者の手指のレントゲン画像のDICOMデータを用いて関節裂隙間距離の計測をするアルゴリズムを開発中であるが、問題点としてDICOMデータにおける1ピクセルの距離は0.15mm、中手指節(MCP)関節の距離は1.5mm程度であり、10ピクセルという低解像度が挙げられ、Total Variation正則化手法とShock Filterを用いた超解像手法により理論上34倍の解像度を獲得し、高解像度となった画像に対し関節面の輪郭を任意の点を数点選択することで任意の時数関数で表現するカーブフィッティング法により算出し、関節の近位側と遠位側の距離を関節面の曲線となる頂点同士からの法線を用いて関節裂隙間距離を算出する方法と、カーブフィッティングで得られた2曲線間の関数を積分して算出する方法で関節裂隙間距離の測定を達成した。関節リウマチにおける治療の戦略は生物学的製剤の登場により劇的に変化した。その中で最も注目するべき点は関節破壊の抑制である。これまで抑止しきれなかった関節破壊の進行は容易にレントゲン画像により確認が可能であったが、現在の治療下においてはその検出が困難となっている。Sharpscoreを代表とするレントゲン画像の評価方法を用いればその変化を検出は可能であるが、読影技術の習得の問題と読影者間の差が問題となり、さらに読影に要する時間が日常診療において確保が困難である。この問題を解決する方法としてより定量的且つ省労力であるコンピューターによる自動解析システムの開発をすすめ、骨びらんと関節裂隙の狭小化とに大別される関節リウマチの骨破壊について関節裂隙の狭小化の計測を超解像画像に変換し開発したアルゴリズムを用いて計測する方法を確立させた。研究の成果は発明の名称:「骨間距離測定装置、骨間距離測定方法、コンピュータを骨間距離測定装置として機能させるためのプログラム及び該プログラムを記憶した記録媒体」として特許出願した[出願番号:特願2015-022533]。また、映像情報メディア学会年次大会、映像メディア処理シンポジウム、コンシューマエレクトロニクス研究会でその成果を発表した。また実際の関節リウマチ患者の関節画像を利用して検者間信頼性などの妥当性の検証や複数回の計測を行い測定精度の確認を現在行っている。この問題を解決する方法としてより定量的且つ省労力であるコンピューターによる自動解析システムの開発をすすめ、骨びらんと関節裂劇の狭小化に大別される関節リウマチの骨破壊について関節裂劇の狭小化の計測を超解像画像に変換し計測する方法を確立した。超解像画像処理はToral Variation正則化手法により演算上の解像度の向上、Shock filter処理によりエッジの協調を行う。得られた画像に対し関節の境界面を主導で複数点選択することにより関節曲面を演算により2次曲線を作成(カーブフィッティング法)、その曲線を基準に関節裂隙間距離を算出する方法を開発、平成26年度に「骨間距離測定装置、骨間距離測定方法、コンピュータを骨間距離測定装置として機能させるためのプログラム及び該プログラムを記憶した記憶媒体)として特許出願[出願番号:特願2015-22533]をした。平成27年度は第59回日本リウマチ学会と第27回中部リウマチ学会にて超解像処理画像で得られた測定値が通常解像画像で得られた測定値と比較して統計学的優位にばらつきが少ないことを報告した。測定値の信頼性を検証するために関節裂隙間を表現するファントムモデルを作成し、それをレントゲン撮影した。

そのレントゲン画像に超解像画像処理を施し測定を行いその良好な測定精度を確認した。関節リウマチの特に手指に認められる関節の破壊を詳細に把握するための評価方法の開発として演算による画像解像度の改善を得る超解像手法をレントゲン画像に応用し、解像度の向上の得られた関節のレントゲン画像を用いてカーブフィッティング法という関節の隙間の距離を測定のばらつきを少なくする新しい手法で関節の計測を試みた。これらの一連の手法は特許出願をしている。関節の隙間の測定の精度は良好で実測する値が正確に得られたことを実験において確認した。この手法を用いることで微小な関節の破壊の変化を検出し、早期に適切なタイミングで治療介入できる可能性が期待される。半自動的に行われる定量的レントゲン画像の読影システムの構築に関してはTotal Variation正則化手法とShock Filterを用いた超解像手法によりより精度の高い状況で関節裂隙間の距離の測定を行える環境が整備された。この一年間で処理条件の変更を行い、骨輪郭をより明瞭に描出できる様に改良を加えた。関節裂隙間距離の測定は関節表面を人的に数点選択することでカーブフィッティング法を利用する点において大きな変更はなく。法線法と面積法のよる二つの測定方法を用いて実際の計測が進行中であり両者の測定法における観察者内変動や観察者間変動について半自動的システムであることも含め、検証を現在行っている。また現時点では人的操作で行われている行程を自動化できる余地があり、さらなる省力化・測定の短時間化を図っていく。前述の如く関節表面の認識に関しては任意の点を人的に選択する必要があり、画像情報の認識手法についての改善点を模索し、さらなる自動化、それによる観察者内変動や観察者間変動の減少を目指していく。画像情報の認識手法の向上は骨びらんの識別にも応用が期待され、予定通り今年度より骨びらんの測定に関しても研究を進めていく予定である。整形外科現時点ではMCP関節のみを対象としているが、昨年末より近位指節間(PIP)関節の計測アルゴリズムの開発に着手し計測とその妥当性を検証中である。今後更に他の関節への応用を進めていく予定である。現時点では半自動的計測方法としながらも人的操作が多く煩雑な行程が残っており、省力化という点において改善の余地があり、プログラミングの修正を行い省力化を現在図っている。またもうひとつの関節破壊の形態である骨びらんについては画像認識の方法以前に、3次元的に広がる骨侵食を投影像であるレントゲン画像で評価をする複雑さと、どこまでを骨びらんとするか既存の目視による判断も困難であるという問題点があり、画像認識の手法の継続的な改善と併せて基準の策定とその妥当性の検証も進めていきたい。
核融合プラズマにおけるアルヴェン固有モードの中性子放出スペクトルへの影響

本研究の目的は、磁場閉じ込め核融合プラズマにおいて不安定化されたアルヴェン固有モードのイオン速度分布関数、核融合反応率係数、及び核融合反応で生成される中性子の放出スペクトルへの影響を明らかにすることである。今年度は、アルヴェン固有モードによる磁場揺動を考慮しイオン分布関数及び中性子放出スペクトルを評価する数値解析モデルを構築し、ITER級重水素-三重水素プラズマを想定した解析を行った。不安定化されたモードが存在する領域で、イオン速度分布関数はMaxwell分布から歪み、磁力線と同方向及び逆方向に非Maxwell成分を形成することを示した。分布関数の変化によって、局所的に核融合反応率係数が増加し、条件によっては核融合出力が全体として数パーセント程度上昇し得ることを指摘した。本解析では単一のモードを想定したが実際のプラズマには複数のモードが存在しているため、核融合出力の上昇は更に大きくなる可能性がある。核融合炉の運転に先立ち、今後アルヴェン固有モードが不安定化された場合の核融合出力への影響を明らかにすることが重要である。燃料イオン分布関数に非等方的な非Maxwell成分が形成されることによって、中性子放出スペクトルも非等方的になり、トーラスの接線方向に放出される中性子が特徴的なエネルギースペクトルを持つことを示した。この特徴的な中性子スペクトルはイオン分布関数の形状を反映したものであり、磁場揺動と同時に計測することで、数値解析によって示したイオン分布関数のアルヴェン固有モードによる変化を実験によって確認できる可能性がある。数値解析コードの開発及び整備、ITERを想定したイオン分布関数、核融合反応率係数及び中性子放出スペクトルの評価を当初の計画として掲げた。その目的は、アルヴェン固有モードによってイオン分布関数と中性子放出スペクトルがどのように変化するのかを定性的に明らかにすることであり、この目的の達成に必要な数値解析コードを開発した。開発したコードを用いてイオン分布関数及び中性子放出スペクトルを評価し、分布関数の磁力線方向と逆方向に非Maxwellテイルが形成され、中性子放出スペクトルはトーラスの接線方向に特徴的なエネルギー成分が形成されること、また、それらの磁場揺動振幅と周波数依存性を明らかにした。これらに加え、開発したコードの妥当性の検証を目的とした実験データとの比較についても検討を始めており、順調に進展している。これまでに開発した数値解析コードには、いくつかの仮定や近似が含まれている。これらはイオン分布関数と中性子放出スペクトルの定性的な変化を示すには十分だが、実験の予測や解析を行うためには、より実際に近い解析が行えるように改良する必要がある。来年度は、複数のモードの時間発展、及び任意の速度分布関数に従う粒子とのCoulomb散乱による着目粒子の速度変化を考慮できるように改良を行う。また、開発したコードの妥当性を検証するために、数値解析結果と実験データとの比較を行う。まずは実験を行いやすい、中性粒子ビーム入射加熱によって形成される分布関数と中性子放出スペクトルを対象とするのが良いと考えられる。核融合科学研究所の大型ヘリカル装置において、中性粒子ビーム入射加熱に起因した中性子放出の非等方性が観測されており、その実験データを開発したコードを用いて解析し、妥当性を検証する。

来年度は、複数のモードの時間発展、及び任意の速度分布関数に従う粒子とのCoulomb散乱による着目粒子の速度変化を考慮できるように改良を行う。また、開発したコードの妥当性を検証するために、数値解析結果と実験データとの比較を行う。まずは実験を行いやすい、中性粒子ビーム入射加熱によって形成される分布関数と中性子放出スペクトルを対象とするのが良いと考えられる。核融合科学研究所の大型ヘリカル装置において、中性粒子ビーム入射加熱に起因した中性子放出の非等方性が観測されており、その実験データを開発したコードを用いて解析し、妥当性を検証する。
NADPHオキシダーゼ阻害剤によるNASHの抗酸化療法の開発研究

酪酸は,AMPKの活性化とHDAC阻害作用を併せもち脂肪酸β酸化経路を活性化させることにより肝臓の脂質代謝を改善する可能性が示唆された.Salacia reticulataは血清中adiponectinを上昇させ脂肪分解を亢進することで抗肥満効果を示すことが示唆された.葛花抽出物は肝臓および褐色脂肪に作用して抗肥満効果を示すことが示唆された.これらの結果は,非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態解明と治療法の確立に寄与する重要な知見と考えられた.酪酸は,AMPKの活性化とHDAC阻害作用を併せもち脂肪酸β酸化経路を活性化させることにより肝臓の脂質代謝を改善する可能性が示唆された.Salacia reticulataは血清中adiponectinを上昇させ脂肪分解を亢進することで抗肥満効果を示すことが示唆された.葛花抽出物は肝臓および褐色脂肪に作用して抗肥満効果を示すことが示唆された.これらの結果は,非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態解明と治療法の確立に寄与する重要な知見と考えられた.近年,生活習慣病としてのメタボリックシンドロームの1病態として非アルコール性脂肪肝(NASH)が注目されている.特に、脂肪肝炎の病態解明と治療法の確立が急務である.申請者らは,脂肪肝炎の病態では注目されていなかったNADPHオキシダーゼ(NOX)複合体由来の活性酸素種(ROS)が脂肪肝炎を進展させる可能性があることを報告した.そこで,本研究では,肝臓への脂肪蓄積時のROS産生に対するNOX複合体の役割を明らかにすると共に,NOX阻害剤による脂肪肝炎の治療の可能性を検討することとした.マウスに脂肪肝炎を誘導する高脂肪・高コレステロール食にNOX阻害剤を混合し,その効果を検討している.開始後,24週後に一部のマウスを屠殺し,臓器を回収した.現在,組織像をヘマトキシリン-エオジン染色,およびアザン染色により評価している最中である.今後は,採取した血液サンプルを用いて肝障害マーカー,脂質,酸化ストレスマーカー,炎症性サイトカインの測定を行うとともに,肝臓での脂肪化・炎症・線維形成関連遺伝子の発現レベル,肝臓内脂肪含量(トリグリセリド・コレステロール・遊離脂肪酸),ならびに肝臓内酸化ストレス(TBARS,プロテインカルボニル等)も評価する予定である.また,LPSを暴露させ活性化させたRAW264.7細胞にNOX阻害剤を処置し,マクロファージ活性化の指標であるTNF-α発現量(mRNAレベル-リアルタイムPCR法),TNF-α産生量(培養上清中-ELISA法),一酸化窒素(NO)産生量(培養上清中)を測定している最中である.これまでに申請者は,脂肪肝炎の病態では注目されていなかったNADPHオキシダーゼ(NOX)複合体由来の活性酸素種が脂肪肝炎を進展させる可能性があることを報告した.NOX複合体は,肝細胞自身に加えて,肝臓に存在するマクロファージ(クッパー細胞)に多く発現している.これまでに,マクロファージが脂肪酸やリポポリサッカライド(LPS)によって異常に活性化され,活性酸素種を大量に産生することが報告されており,NASHの病態進展にも寄与している可能性がある.そこで,本研究では,マクロファージの活性化に及ぼすNOX阻害剤,および抗酸化剤の効果を検討することとした.LPSにより活性化させたマウスマクロファージ細胞株RAW264.7にNOX阻害剤(apocynine),および抗酸化剤(alpha-tocopherol, N-acetyl-L-cysteine, hypotaurine,およびtaurine)をそれぞれ処置し,マクロファージ活性化の指標であるiNOS,IL-6,TNF-αmRNA発現量をリアルタイムPCR法で測定した.その結果,apocynineは,LPSによるiNOS,IL-6のmRNA発現増加を抑制した.また,抗酸化剤のうち,N-acetyl-L-cysteine,hypotaurine,およびtaurineもapocynineと同様の抑制効果を示した.これらの結果から,NOX阻害剤および抗酸化剤によって,マクロファージの活性化を抑制出来る可能性が明らかとなった.さらに,初代培養幹細胞とマクロファージの共培養培養上清中の活性酸素種を定量する予定である.本研究は、近年生活習慣病としてのメタボリックシンドロームの一病態として注目されている非アルコール性脂肪肝(NASH)について、脂肪肝炎の病態解明と治療法確立に寄与することを目標としている。本年度は、自然発症肥満2型糖尿病モデル動物マウス(TSODマウス)とその対照マウス(TSNOマウス)を通常食および高脂肪食で飼育し、Salacia reticulata抽出物(SRE)および葛の花抽出物(PTE)をそれぞれ12ヶ月間投与後の体重および各組織重量、リアルタイムPCRやウエスタンブロットによる各組織の遺伝子発現の評価と血液検査を行った。また成熟脂肪細胞である3T3-L1細胞を用いたin vitro実験を行った。SREは、TSODマウスの腸管膜脂肪においてTGの加水分解を担うホルモン感性リパーゼHSLとadiponectinの遺伝子発現を有意に増加させ、血清中adiponectin濃度も有意に増加させた。PTEは、高脂肪食接種群と比較し体重増加抑制作用、内臓脂肪蓄積抑制作用、肝肥大抑制作用、耐糖能異常改善作用を示し、脂肪肝を顕著に抑制した。また、褐色脂肪組織の活性化も認められた。さらに3T3-L1細胞では、細胞内TG蓄積量が、SREの濃度依存的に減少し、100μg/mLでは無処置群に比して約30%低下した。

この時、脂肪細胞分化を制御する転写因子PPARγのmRNA、およびタンパク発現量は共に約60%低下した。更に、PPARγの標的遺伝子のmRNA発現量も有意に低下していた。一方、上清中グリセロール量は約40%増加しており、HSL mRNA、およびタンパク発現量も有意に増加していたことから、加水分解の亢進が示唆された。以上より、SREは血清中adiponectinを上昇させ加水分解を亢進することで肥満治療効果を示すことが示唆された。PTEは、肝臓および褐色脂肪に作用して抗肥満効果を示すことが示唆された。これらの結果は、脂肪肝炎の治療法確立に寄与する重要な知見と考えられる。
無症候期のCD-8陽性T細胞によるエイズウイルス増殖抑制とその破壊のメカニズム

無症候HIV-1キャリア末梢血CD8陽性T細胞には、HIV増殖を抑制する機能がある。この現象はAIDS発症後は減少しており、明かなCD4陽性細胞数の低下を伴わないことから、無症候期維持に重要な因子介在性の生体防御機構であると考えられている。本研究の目的は、この無症候期に存在するウイルス増殖抑制CD8陽性T細胞の作用機序を明らかにし、AIDS発症時の抑制機構破綻のメカニズムを探ることである。本年度はCD8陽性T細胞による抑制作用のMHC-I拘束性と、標的細胞感受性の関係を解析し、複数あると思われる抑制のメカニズムの個別化を試みた。無症候HIV感染者末梢血リンパ球に試験管内HIV感染を加えると非感染者の末梢血リンパ球に比べウイルス産生量が著しく低かった。試験管内感染を加えた非感染者由来のCD4陽性リンパ球に無症候感染者のCD8陽性細胞を加えるとウイルス産生を抑制することができた。PCR法を用いたHIV複製サイクルの解析では、子孫ウイルスの感染性の低下による再感染の抑制が示唆された。CD8陽性T細胞とCD4陽性細胞を半透膜で隔てるとこの抑制は消失したが、一部の症例では弱い抑制が認められた。更に、標的細胞として細胞株を用いた場合、抑制はクラスI組織適合性抗原(MHC-I)による拘束性を受けるが、標的が末梢血リンパ球である場合、拘束は不完全であった。即ち、CD8陽性T細胞はプライマリ-のリンパ球にのみ作用でき、細胞接触を必要とするメカニズムでMHC-I非拘束性にウイルス増殖をおさえていることが分かった。
冠動脈疾患の危険因子としての抗クラミジアニューモニエ抗体価の臨床的意義に関する研究-内皮細胞由来血管作動性物質と凝固系分子マーカーからの基礎的検討-

昨年度に引き続いて症例数を増し、冠動脈疾患(心筋梗塞症、狭心症)で入院した患者から採血し、抗Chlamydia.Pneumoniae、および抗Helicobactor Pylori特異的IgA,IgG抗体価を市販検出キットを用いて測定した。また健常対照として検診受診者、病的対照群として有意狭窄を認めない異型狭心症症例を用いた。高抗体価を認めた症例については1・3カ月毎に採血し、経過中の変動を調査した。また、抗体価とともに高感度C-反応性蛋白などの炎症マーカーを改良ラテックス凝集法(高感度法)により測定した。その結果、全体として解析するとIgG抗体価は加齢とともに有意に上昇し、IgA抗体価は逆に加齢に伴って低下した。これを病態別に分類して解析する〓〓健常対象、異型狭心症、労作性狭心症、陳旧性心筋梗塞などの群ではいずれも全体での解析結果とほぼ同様〓あったが、急性心筋梗塞症患者群ではIgA抗体価が加齢とともに上昇した。このような現象がクラミジアに特有であるか否かを検証するためにヘリコバクターでも同様の検討を行ったところ、IgG抗体価は各群間で有意差がないのに反し、IgA抗体価は急性心筋梗塞群でのみ著明に高値を示した。以上から、急性期の感染と持続感染(細菌寄生)を示唆するIgA抗体価の高値は動脈硬化症の増悪要因としてクラミジアやヘリコバクター感染が現実に機能していることを明確に示していると言える。そこで、次に急性心筋梗塞患者血液から単球を分離し、そのDNAを抽出して、PCR法で増幅して測定すると、検討した14例中で6例にクラミジアのDNAが存在することを明らかにした。したがって、日本人において、クラミジアの感染は、感染局所から単球に寄生したクラミジアが流血中を移動し、動脈硬化の初期病変であるプラークに滲入し、そこで感染を拡大して病変を急成長させて急性心筋梗塞を発症させるものと考えられる。同様の現象がヘリコバクターでも起こるものと思われる。さらに、この現象を裏付けるように炎症マーカーである高感度CRPが、冠動脈疾患患者で高値であることを明らかにした。冠動脈疾患(心筋梗塞傷、狭心症)で入院時に採血し、抗Chlamydia.pneumoniae特異的IgA,IgG抗体価を市販検出キットを用いて測定した。また、抗体価とともに高感度C-反応性蛋白などの炎症マーカーをラテックス凝集法により測定した。これを病態別に分類して解析すると、健常対象、異型狭心症、労作性狭心症、陳旧性心筋梗塞などの群ではいずれも全体での解析結果とほぼ同様であったが、急性心筋梗塞症患者群ではIgA抗体価が加齢とともに上昇した。病態を判別するためにカットオフ値を設定して陽性率を検討すると、IgG抗体価については各群間で有意差はなかったがIgA抗体価は急性心筋梗塞群で他の群に比較して明らかに高く、約50%にも達した。抗体価の絶対値を比較すると、IgG抗体価では陳旧性心筋梗塞群で高値傾向を示した。IgA抗体価では明らかに急性心筋梗塞群で高値であった。クラミジアの慢性感染の指標と考えられるIgGおよびIgA抗体価がいずれも陽性になる率を比較したところ急性心筋梗塞群で他群と比較して有意に高値を示した。以上のように、冠動脈疾患が感染症によりもたらされることが示唆されたため、高感度CRP測定を行った。その結果、健常者では400ng/mlであったが、急性心筋梗塞群ではバラツキがあるが著明に高値を示し、他の冠動脈疾患群でも80012000ng/mlに分布し、健常者と比較して有意の高値を呈した。しかし、血中硝酸イオン濃度については変動が大きく有意差は得られなかった。

以上から、急性期の感染と持続感染(細菌寄生)を示唆するIgA抗体価の高値は動脈硬化症の増悪要因としてクラミジアやヘリコバクター感染が現実に機能していることを明確に示していると言える。そこで、次に急性心筋梗塞患者血液から単球を分離し、そのDNAを抽出して、PCR法で増幅して測定すると、検討した14例中で6例にクラミジアのDNAが存在することを明らかにした。したがって、日本人において、クラミジアの感染は、感染局所から単球に寄生したクラミジアが流血中を移動し、動脈硬化の初期病変であるプラークに滲入し、そこで感染を拡大して病変を急成長させて急性心筋梗塞を発症させるものと考えられる。同様の現象がヘリコバクターでも起こるものと思われる。さらに、この現象を裏付けるように炎症マーカーである高感度CRPが、冠動脈疾患患者で高値であることを明らかにした。
最新の空間情報科学技術を用いた土地利用分析法の確立

地域研究者が土地利用図を作成するために必要な空間情報科学の最新技術について、その有用性と限界を検討した。具体的には、正規化法による地形補正、オブジェクトベースの分類法による土地被覆分類、数値表層モデルの分析による地理的変数の生成が、小地域を対象にした土地利用図の作成に有用であることが明らかになった。さらに、アジア・オセアニア地域における土地利用・土地被覆の変化にかかわるメカニズムの個別性と普遍性を整理した。本研究の目的は、めざましい発展を遂げつつある空間情報科学の最新技術を応用することによって、地域研究に適した土地被覆・土地利用・資源利用分析の方法論を確立するとともに、アジア・オセアニアのさまざまな地域における土地利用・土地被覆・資源利用の動態とそこにかかわる政治・社会・生態要因の整理をおこなうことである。本研究課題で対象とする6地域を対象に、土地利用の経年変化データベース、および村落レベルを対象にした詳細な土地被覆・土地利用データベースを完成させることが最終的な目標である。本年度は6月にスタートアップ会議をおこない代表者・分担者のこれまでの業績を互いに紹介した上で、研究目標と計画を確認した。その後、本研究費の経費をもちいたフィールド調査を、中国・海南島およびインドネシア・ジャワ島、パプアニューギニアの対象地域で実施した。そこで得られたデータを分析した結果、(1)地域研究で用いる衛星データの大気補正・地形補正の方法として「正規化法」が有用であること、(2)オブジェクトベース分類ソフトウェアであるDEFINIENSにより地域研究に有効な高解像度衛星データの土地被覆分析精度が向上することが明らかになった。年度末(3月)には当該分野を専門とする外国人研究者、当該分野を研究する他機関の研究グループと合同でワークショップを開催し、地域研究に寄与する空間情報科学の活用について方法論の整理をおこなった。本申請課題の目的は、めざましい発展を遂げつつある空間情報科学の最新技術を応用することによって、地域研究に適した土地被覆・土地利用・資源利用分析の方法論を確立するとともに、アジア・オセアニアのさまざまな地域における土地利用・土地被覆・資源利用の動態とそこにかかわる政治・社会・生態要因の整理をおこなうことである。この目的を達成するために、代表者のグループ(梅崎:パプアニューギニア)に加えて、複数の分担者のグループ(河野:タイ・ベトナム、西谷:中国雲南省、大久保:インドネシア、富田:ラオス)、研究協力者(蒋:海南島)が実績をもつ地域を対象にした比較研究をおこなう。本申請課題で対象とする6地域においては、代表者ならびに分担者が地域研究の実績を有しており、地域レベルを対象にした、コロナ衛星・航空写真・ランドサット衛星をもちいた土地利用の経年変化データベース、あるいは村落レベルを対象にした詳細な土地被覆・土地利用データベースが構築されている。本研究課題においては、新たな現地調査によってこのデータベースを更新するとともに、新しい空間情報科学の技術(オブジェクトベースの土地利用分類、SRTM標高データ、空間統計学)を適用した再分析をおこなうことで、地域研究者にとって利便性のたかい方法論を確立する。さらに、6地域を対象にした分析結果を比較検討することにより、アジア・オセアニア地域の多様な社会自然環境条件における土地利用・土地被覆あるいはそれを生み出した人間活動の多様性を説明する要因を探索する。平成22年度は、バングラデシュにおいて共同の調査を実施したほか、最終的なとりまとめにむけて、パプアニューギニア、中国、ラオス、ベトナム、タイ、インドネシアのそれぞれの調査地における土地利用パタンおよびその変化についてのケーススタディー集を編集し、さらにそれぞれの地域において撮影された衛星データ(ランドサット、クイックバードなど)に対して、オブジェクトベースの土地利用分類法を適用し、既に作成してあった土地利用図との比較評価をおこなった。さらにそのプロセスを、マニュアルとしてまとめた。さらに、ディシジョンツリーを用いた土地利用分類法、簡便な画像の地形効果補正法など、本プロジェクトで検討してきたいくつかの空間情報科学技術について、その適用結果に基づく成果発表の準備をすすめた。
鉄欠乏状況下において身体運動能力の低下を惹起する骨格筋内の分子機序の解明

鉄欠乏による貧血状態下において確認される一般的な身体運動能力の低下は、活動筋である骨格筋への酸素の供給低下が主因であると考えられている。一方本研究では、その主因を骨格筋自体に求め、酸素の供給に非依存的な解糖系における代謝障害を根本要因とする仮説を検討する。また、筋疲労との関わりにおいて骨格筋における鉄代謝と糖代謝とのクロストークを明らかにし、代謝障害を引き起こす分子機序の解明を試みる。骨格筋のインスリン作用はグリコーゲンの貯蔵量やグリコーゲン枯渇からの回復速度を決定する重要な因子であり、身体運動能力の発揮に強く関与する。昨年度までの研究において、鉄欠乏状況下では血糖値が有意に上昇することから全身性のインスリン抵抗性が生じていると仮定し、骨格筋のインスリン作用を単離骨格筋において評価してきた。しかしながら、これまでに鉄欠乏食の摂取において骨格筋のインスリン作用の減弱を確認できていない。2018年度の研究においては、鉄欠乏食の摂取によって、安静時のグリコーゲン量の増加傾向やミトンドリアの増加傾向など、むしろ身体能力の向上を目的とする上で有益と思われる代謝適応が認められた。興味深いことに、鉄欠乏食の摂取により、肝臓から分泌される生理活性物質の発現量が低下することを確認した。この分子は骨格筋のインスリン作用を負に調節し、骨格筋のトレーニング効果を低下させる分子である。よって、鉄欠乏食の摂取によるこの分子の低下は、骨格筋に影響を及ぼし、貧血状態下による身体能力の低下を補填する働き、もしくは、運動の種類の違いによればトレーニング効果を増強する働きを担う可能性も示唆された。予定していた研究期間は2019年3月末までであったが、学科のカリキュラム変更にともない、最終年度における大学業務に対するeffortが著しく増加してしまった。このことが起因となり研究計画に大幅な遅れが生じてしまった。また、仮説と反した結論につながり得る結果が集積しつつある。そのため、研究計画に示した実験の条件を追加するなど、より深い検討が必要になっている。以上の理由により、研究計画の遂行とその成果をより高めるため1年間の研究機関の延長を希望し、承諾を得るに至った。最終年度の実験計画通り、トレーナビリティーに関する研究を継続する。これまでに自発運動による実験モデルにおいてトレーニングを負荷していたが、鉄欠乏状況下では運動量が有意に低下を示しており、トレーニング効果の比較に難があった。2019年度では、運動負荷を同一化する目的で8日間の水泳運動を負荷し、同一のトレーニング量において鉄欠乏食の摂取によるトレーニング効果への影響を比較・検討する。また、その際に肝臓での生理活性物質の発現解析に加え、血液中濃度の測定を進める。鉄欠乏による骨格筋の代謝応答に、肝臓由来の生理活性物質が影響を与えている可能性が予想される。生体内において骨格筋のインスリン作用を測定し、単離骨格筋による解析結果と比較・検討することによって肝臓由来の生理活性物質の関与を見積もる。以上の結果をまとめ、2020年に学会および学術雑誌での発表を予定している。本研究では、主題にある通り、鉄欠乏状況が身体パフォーマンスへ影響を与え得る代謝変化の分子機序の他、生活習慣病の発症機序など、鉄代謝と糖代謝のクロストークを解析する上で一定の見解が得られるよう、努める予定である。一般的に鉄欠乏による貧血状態下において確認される身体運動能力の低下は、活動筋である骨格筋への酸素の供給低下が主因であると考えられている。ラットに鉄欠乏食を摂取させると、2週間でヘモグロビンや赤血球数の低下が確認でき、その状況は4週間の摂取時においても維持された。この間、ラットの行動量を測定してみると、鉄欠乏による顕著な変化は確認できなかった。一方、自発運動をしながら同鉄欠乏食を摂取させてみたところ、2週間目から4週間目にかけて顕著な行動量の低下を確認できた。このことは、鉄欠乏による貧血状態下において、身体運動に特異的な適応が身体に生じている可能性を示唆している。そこで、骨格筋における代謝適応を明らかにするため、鉄欠乏食を2週間摂取させ、単離骨格筋の糖取り込みを測定してみた。この条件下では骨格筋への血流等の影響を排除することができる。その結果、インスリン刺激による糖取り込みは変化していなかった。一方、身体運動による骨格筋の糖取り込みは有意に低下をしていた。この結果は、鉄欠乏食による貧血状態下では、骨格筋の糖取り込み機構に身体運動に特異的な障害が生じていることを示している。以上の結果は、研究仮説を支持するものであり、今後、同実験モデルを用い、さらなる検討を加える予定である。28年度における研究目的の1つは、鉄欠乏による貧血状態の進行にともなう代謝変化を包括的に明らかにすることであった。現在までに、鉄欠乏食の摂取期間と貧血の程度、行動量、糖取り込みとの関係を明らかにした。また、摂食量や内臓脂肪量の変化から、今後検討を重ねるべき実験モデルを確立した。これらはおおむね実験計画書に沿って行われている。一方、28年度はもう一つの研究目的であった、代謝変化と筋疲労との関係を明らかにすることは十分に行なえていない。この点、研究計画から遅れている点である。

しかしながら、身体運動に対する骨格筋の糖取り込みが、血流等の変化とは関係なく低下していることを28年度に確認できた。また、この低下は内臓脂肪量の変化とは無関係に生じることがわかった。身体運動によって骨格筋に取り込まれる糖質は、骨格筋内の筋グリコーゲンの利用量に影響を与える。よって、貧血状態下における糖取り込みの低下は、筋グリコーゲンの利用を促進し、筋グリコーゲンの枯渇を導く可能性がある。この点、身体運動、および単離骨格筋での筋収縮モデルを並列しながら、その作用機序の分子メカニズムも合わせて今後検討をさらに進めていく予定である。一般的に鉄欠乏による貧血状態下において確認される身体運動能力の低下は、活動筋である骨格筋への酸素の供給低下が主因であると考えられている。一方本研究では、その主因を骨格筋自体に求め、酸素の供給に非依存的な解糖系における代謝障害を根本要因とする仮説を検討する。また、筋疲労との関わりにおいて骨格筋における鉄代謝と糖代謝とのクロストークを明らかにし、代謝障害を引き起こす分子機序の解明を試みる。ラットに鉄欠乏食を摂取させると、2週間目の時点において、鉄欠乏食を摂取したラットの血糖値は上昇を示し、全身性のインスリン抵抗性を呈していることが推察される。インスリン抵抗性は身体運動による骨格筋の反応や適応において重要な調節因子の1つである。しかしながら、鉄欠乏食を摂取したラットの骨格筋を単離して試験管内で培養してみると、インスリン刺激による糖取り込み能は低下していなかった。同様に、試験管内において解糖系を最大に活性化しえる身体運動刺激を模した低酸素刺激を負荷してみても糖取り込み能は減弱していなかった。これらの結果は、2週間目の時点で確認できる全身性のインスリン抵抗性は骨格筋自体に由来しておらず、低酸素刺激後の筋グリコーゲン量に鉄欠乏食の影響がないことからも、骨格筋の解糖系に障害が存在しない可能性が高いと解釈できる。そこでインスリン感受性組織である肝臓の解析を試みた。肝臓の筋グリコーゲン量は鉄欠乏状態で低下をしており、肝臓の糖放出が促進していると思われる。また、グリコーゲン枯渇の状態から糖質摂取による回復速度を測定してみると、骨格筋では鉄欠乏食の影響を確認できなかったが、肝臓では有意な回復速度の遅延が確認できた。以上のことから、鉄欠乏状況下では骨格筋に先んじて肝臓でインスリン抵抗性が生じること、肝グリコーゲン量の低下や回復速度の減弱は主に持久運動時の疲労要因になり得る可能性が示唆された。平成29年度における研究目的の1つは、鉄欠乏による貧血状態における骨格筋の代謝変化を、液性・神経因子を排除できる試験管内で評価することであった。試験管内における筋収縮実験が未実施であるが、概ね実験計画通りに進んでいる。しかしながら、鉄欠乏食摂取の2週間目の時点において、試験管内で低酸素刺激やインスリン刺激を用いて評価をする限りでは骨格筋自体に解糖系における代謝障害を確認できていない。これは比較的長期的な鉄欠乏状況や顕著な貧血状況に至った場合であっても骨格筋の代謝調節が維持されていることを示唆している。今後、さらに長期間摂取した場合の影響を検討していく必要がある。
新規酵素探索による未利用資源を利用したグリコール酸の微生物合成系構築

有用なグリコール酸(GA)の環境調和型生合成プロセスを構築するため、本研究では、未利用資源のエチレングリコールを原料としたGAの微生物合成を目指した。GA合成に関与するグリコールアルデヒド酸化酵素産生微生物の探索を行い、見出した酵素は、基質への活性が高くGA合成に適した新規酵素であった。さらに、GA合成経路にGA酸化酵素を組み合わせ有用なグリオキシル酸も合成可能なことから、GA酸化酵素産生微生物も探索し、グリオキシル酸合成に適した基質特異性を有する新規酵素を発見した。本酵素の遺伝子を取得し組換え大腸菌発現系を構築後、アミノ酸変異を導入し、粗酵素の比活性が約1.2倍向上した変異体作成に成功した。本研究では、細胞内でグリコール酸(GA)を合成するために、エチレングリコールからのGA合成に関与する酵素のうち、これまでに報告のないグリコールアルデヒド酸化酵素(GAO)を産生する微生物のスクリーニングを行った。具体的には、エチレングリコール、2ーメトキシエタノール、プロピレングリコールを単一炭素源とした最少培地で自然界のサンプルより集積培養を行い、培養液を希釈してプレート培地上で培養した。目的酵素を産生している候補菌株を赤色に呈色するアッセイ系を用いてスクリーニングを行った結果、数株の候補菌株を選出した。さらに、選抜菌から粗酵素液を調製し、最も高いグリコールアルデヒド酸化酵素活性を示した菌株を1菌株選抜し、GAOを最も産生する培養条件を検討した。また、上記手法を用いてスクリーニングを行った過程で、GAをさらに酸化する系での有用物質合成に寄与する酵素の産生微生物も見出すことができた。本菌株よりGA酸化能を有する酵素を精製し、その諸性質を明らかとした。具体的には、精製酵素の基質特異性、各基質に対する酵素活性反応動力定数、最適pH、最適温度、pH安定性、温度安定性、サブユニット構造、補酵素などについて明らかとした。結果、本研究で見出された酵素は、アルコール酸化酵素に属するものと考えられるが、これまでに報告されたアルコール酸化酵素に加え、植物由来グリコール酸酸化酵素とも異なる性質であり、新規のアルコール酸化酵素であることを示すことができた。本研究では、エチレングリコールを原料として、グリコール酸(GA)を合成することを目指し、新規なグリコールアルデヒド酸化酵素(GAO)の取得を試みた。前年度までに、GAO産生微生物を見出しGAO産生量の最も高い培養条件を見出したため、まず本年度は、目的酵素の精製系構築および精製したGAOの性質解明を目指した。目的酵素は、6段階のクロマトグラフィーを用いることで、電気泳動的に単一に精製することができた。得られて精製酵素の分子質量を調査した結果、本酵素は、76 kDa、36 kDa、14 kDaのサブユニットから成るヘテロ三量体であることを明らかとした。基質特異性に関しては、本酵素はグリコールアルデヒドに加えて、αアルデヒド、芳香族アルデヒド、グリオキサールには反応するが、グリコール酸やアルコールには反応しないことが分かった。また、本酵素の最適pHおよび温度はpH6.0で50oCであった。さらに、各サブユニットのN末端アミノ酸配列は、キサンチンデヒドロゲナーゼのサブユニットと高い相同性を示した。上記の性質より、本酵素は、これまでに報告されているアルデヒド酸化酵素とは異なる新規のアルデヒド酸化酵素に分類されることが示された。最後に、精製酵素を用いて、グリコールアルデヒドに反応させた結果、反応生成物として目的のグリコール酸が合成されていることを確認し、本研究で見出したGAOがグリコール酸合成に適していることが示された。本研究では、エチレングリコールを原料としグリコール酸(GA)を合成することを目指して、グリコールアルデヒド酸化酵素(GAO)の取得を試みた。昨年度までに、GAOを産生するBurkholderia sp. AIU 129を見出し、本菌株が産生するGAOが、目的とするグリコールアルデヒドからグリコール酸への酸化反応を効率よく触媒し、新規な性質を有する酵素であることを明らかとした。本年度は、精製GAOのN末端アミノ酸情報を基に縮退プライマーを設計し、GAO遺伝子のクローニングを試みた。ゲノムDNAを鋳型として縮退プライマーを用い、PCRによる目的遺伝子の増幅を試みたが、様々な条件検討を行っても目的遺伝子の増幅は確認されなかった。また、本研究では、これまでにGAOを産生する微生物のスクリーニング過程において、GAをさらに酸化し有用物質であるグリオキシル酸を合成する新規アルコール酸化酵素を産生する微生物も得られており、その酵素の精製および諸性質もすでに明らかとしてきた。本酵素に関しても遺伝子クローニングおよび組換え大腸菌における発現系の構築を試み、原株の約20倍の酵素を産生することを明らかとした。本年度も目的であったグリコールアルデヒド酸化酵素遺伝子のクローニングを達成していないため。本研究では、廃不凍液由来のエチレングリコールを原料として、高収率にグリコール酸(GA)を合成することを目指し、グリコールアルデヒド酸化酵素(GAO)の取得を試みてきた。GAOを産生する微生物を見出し、昨年度は精製酵素のN末端アミノ酸配列情報等をもとに、ゲノムDNAからGAO遺伝子クローニングを試みたが達成できなかった。本年度は、GAO遺伝子のクローニングと並行して、研究室保有菌由来のアルデヒド酸化酵が、GAOと同じくグリコール酸を合成可能ではないかと考え、本酵素を用いた反応生成物の分析を行った。結果、GAO遺伝子クローニングは本年度も達成できなかった。