hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
衛星観測・大気再解析データの相互比較による堅牢な成層圏大気像の描出

本年度は,本研究にも密接に関わるSPARC Reanalysis Inter-comparison Project (S-RIP;成層圏における大気再解析データの比較プロジェクト)の最終報告書を執筆した(Chapter 11 "上部成層圏ー下部中間圏"の一部を分担執筆).上記の報告書には昨年度公表した論文も引用されている.また,最近になって新たに公開された大気再解析データ(ERA-5)を部分的に習得して予備調査を行い,データ特性の把握と今後の解析方法の検討を行った.本研究で対象としていた成層圏大気の再現性について更なる改善が期待でき,今後本格的な解析を行ってこれまでの結果との比較検討を行う予定である.また日本気象学会等に出席し,今後の課題について共同研究者と打ち合わせを行った.本研究は、多種多様な観測データを統合的に解析し、データ間の差異を精緻化してその要因を特定し、観測・物理過程の両者に裏打ちされた堅牢な成層圏大気像を得ることを目的としている。本年度は当初の計画通り、最新の衛星データ(SABER, MLS, GPS)と再解析データ(JRA55, JRA55C, JRA55AMIP, MERRA2, MERRA, ERA-Interim, CFSR)の日変動成分を抽出・解析し、成層圏大気の日変動成分について相互比較を行った。日変動成分は、(1)一日周期・太陽同期成分、(2)半日周期・太陽同期成分、(3)太陽非同期成分、にわけて比較を行った。まず一日周期・太陽同期成分については、再解析データ間に大きな差異は見られない一方、衛星データ(特にSABER)と再解析データ間で、特にの振幅に有意な差があることが明らかになった。続いてその要因の検討も行った。JRA55-family(JRA55, JRA55C, JRA55AMIP)データを比較解析することにより、再解析データにおけるデータ同化過程の影響を見積もった。その結果、これらの影響は小さく、衛星観測データ側に問題がある可能性が排除できない。一方、半日周期・太陽同期成分や太陽非同期成分についてはデータ間の差は小さかった。これらの結果は、再解析比較プロジェクト(S-RIP)の国際学会で発表した。現在投稿論文を執筆中である。本年度の計画は、最新の観測データ・再解析データを用いて、中層大気領域の様々な変数について詳細な比較を行うことであった。今のところ解析変数は気温に限られているが、当初の計画通り、多数のデータを統合的に用いた解析を実施することで問題点が明らかになりつつある。昨年度からの研究を発展させ、7種類の再解析データ(MERRA-2, MERRA, JRA55, JRA55C, JRA55AMIP, ERA-Interim, CFSR)(期間:2006-2012年の7年間)と衛星観測データ(SABER, MLS)を用いて日周期変動に関する解析を行った。具体的には(a)太陽同期一日潮汐、(b)太陽同期半日潮汐、(c)太陽非同期潮汐、の各成分について詳細なデータ間比較を行った。その結果、(a)についてはSABER衛星とその他(再解析・MLS衛星)で上部成層圏に有意な差が見られることが分かった。はっきりした原因は不明だが、これまで観測値として信頼されてきた衛星観測自身に問題がある可能性がある。一方(b-c)については、データセット間で系統的な差は見られないことが明らかになった。さらに、再解析データの大気潮汐の長期変化(1980年-2010年の30年間)についても調べた。その結果、精度の高い衛星観測が始まる以前(2000年以前)のデータは大気モデルへの依存度が強く(つまり、同化される観測データへの依存度が小さく)、再解析データ間のバラつきが相対的に大きくなっていることが明らかになった。この結果は、再解析データを用いたトレンド解析の結果に注意を促すものである。上記の結果はS-RIP(再解析比較の国際プロジェクト)の国際会議で発表を行い(口頭発表)、現在ジャーナル論文を執筆中である。メインターゲットである大気潮汐に関する比較解析を終えた。また、異なる種類のデータを比較することで、見つかった差異(特に上部成層圏における太陽同期成分の振幅)が観測データ側にある可能性が示唆された。論文も近日中に投稿予定である。また解析の中で、"視太陽時(Apparent solar time)の季節変化"という、従来の研究でほとんど考慮されていない要素の重要性が明らかになり、共著論文にまとめた。以上の進捗状況に鑑みて、研究は順調に進展していると判断した。昨年度からの研究の継続で、7種類の再解析データ(MERRA-2, MERRA, JRA55, JRA55C, JRA55AMIP, ERA-Interim, CFSR)(期間:2006-2012年の7年間)と衛星観測データ(SABER, MLS)を用いた日周期変動に関する解析結果をまとめ,国際ジャーナル論文として公表した(Sakazaki, Fujiwara and Shiotani, 2018).成層圏内の日周期成分について,網羅的に調べた初めての論文である.再解析データにおける日周期成分の再現性は,同化されるデータの多い中部成層圏より下層では非常に良いが,上部成層圏よりも上層ではモデル依存性が強い.また,同化されるデータは均一でないため,長期トレンド解析に向かないことも分かった.また,上記の結果を元に,再解析比較プロジェクト(S-RIP)の最終レポート執筆にも貢献した.

さらに,主に成層圏で励起され,地上に伝播する半日周期潮汐の地上気圧シグナルを調べたところ,その位相の正確な同定には視太陽時(Apparent solar time)の季節変化(つまり、太陽の南中時刻の季節変化)を考慮する必要があることが明らかになった。国際ジャーナル論文として公表した(Hamilton and Sakazaki, 2017a)。下部成層圏に伴う東西風の準二年周期変動(QBO)の位相を,過去の火山噴火後の"特異な"夕焼けの観測記録から推定する研究に参画した.この際,1991年ピナツボ山噴火の際の再解析データを用いて,夕焼けの記録から推定した東西風速が妥当であることを検証することができた(この検証に基づき,近代気象観測以前のQBOの位相を, 1883年(Mt. Krakatau),1901年(St. Vincent & Mt. Pelee)の火山噴火の際の夕焼け観測に基づいて推定した)本研究内容に関する総合的な論文を執筆し,国際ジャーナル論文として公表することができた.またそこから派生して明らかになった新たな問題についても論文として公表することができた.さらに上記論文を通じて,現在の衛星観測に問題がある可能性を指摘し,将来の衛星観測計画にあたって注意すべき点を提示することもできた.以上の観点から,計画は順調に進展している.本年度は,本研究にも密接に関わるSPARC Reanalysis Inter-comparison Project (S-RIP;成層圏における大気再解析データの比較プロジェクト)の最終報告書を執筆した(Chapter 11 "上部成層圏ー下部中間圏"の一部を分担執筆).上記の報告書には昨年度公表した論文も引用されている.また,最近になって新たに公開された大気再解析データ(ERA-5)を部分的に習得して予備調査を行い,データ特性の把握と今後の解析方法の検討を行った.本研究で対象としていた成層圏大気の再現性について更なる改善が期待でき,今後本格的な解析を行ってこれまでの結果との比較検討を行う予定である.また日本気象学会等に出席し,今後の課題について共同研究者と打ち合わせを行った.まずは、本年度得られた成果を国際ジャーナル論文として公表する。続いて、衛星データ-再解析データ間に見られる差異の要因を検討する。本年度の研究により、当初の計画で想定していた「再解析データにおけるデータ同化過程」はそれほど重要でないことが明らかになった。今後は観測データ側に問題がある可能性も視野に入れ、さらに別の種類の観測データを使用するなどして要因の検討を進めたい。現在執筆中の論文を完成させジャーナル誌(Atmospheric Chemistry and Physics誌を予定)に投稿する。現在投稿中の論文についても、査読結果に対応した追加解析・原稿修正などを行う。本成果を踏まえ、地球大気衛星観測に求められる要素・精度などを整理し、今後の観測計画等にも貢献したい。上記論文を執筆後に登場した新しいデータセットを解析し,学会の場などを通じて研究協力者と更なる議論を深める予定である.本年度は、別途科研費(特別研究員奨励費)を所持していたため、パソコン機器や書籍・文房具等の一部をそちらで賄うことができたことによる。
神経終末内メンブレントラフィックの細胞質タンパク質による制御

神経終末内におけるシナプス小胞の開口放出とエンドサイトーシスはサイトゾルタンパク質によって厳密に制御されている。本研究はこれらの過程におけるサイトゾルタンパク質nSec1/Munc18-1、トモシンおよびシナーフィン/コンプレキシンの役割を明らかにする目的で行われ、以下の結果が得られた。(1)伝達物質放出におけるシナーフィンの作用速度を知る目的で、ヤリイカ巨大シナプスのシナプス前末端にシナーフィンのSNARE複合体結合部位のケージド・ペプチドを注入した。UV照射により、このペプチドを瞬間的に活性化すると、SNARE複合体に結合してシナプス小胞の開口放出を阻害する。この阻害速度を測定し、時定数約180ミリ秒を得た。(2)シナーフィン1,2のC末端近くにカゼインキナーゼII(以下CKII)によるリン酸化予想部位(Ser-115)が存在する。このリン酸化の生理的意義を探る実験を開始した。この予想部位を含むリン酸化ペプチドを抗原として、この部位がリン酸化されたシナーフィンに特異的に反応するポリクローン抗体を作製した。CKIIによってリン酸化された組換えシナーフィン1,2のみがこの抗体と反応し、非リン酸化シナーフィン1,2は全く反応しなかった。タンパク質脱リン酸化酵素阻害剤の存在下でラット脳可溶性分画から免疫沈降したシナーフィン1,2のうち、1のみがこの抗体と反応した。したがって脳内にはSer-115がリン酸化されたシナーフィン1が存在する。(3)Cre-LoxP系を用いて、nSec1/Munc18-1およびトモシンの脳部位特異的欠損マウスの作製を行っている。前者についてはヘテロマウスが得られている。1.シナーフィンの作用機構(1)私たちはすでにサイトゾルタンパク質シナーフィン(別名コンプレキシン)が神経伝達物質の放出に重要であることを証明している。本研究ではその作用機序と放出過程における作用のタイミングの解明を目指している。組換えシナーフィンの突然変異体を作製し、SNARE複合体への結合に関与する残基の同定を試みた。結合に重要と考えられるシナーフィン分子中央部分に限定した。グルタチオンーセファローズに固定してこれらの変異体のGST融合タンパク質に脳膜分画抽出物をかけ、結合したSNAREをイムノブロットで検出した。その結果、野性型に比較して、I66T、R67A、K69AおよびY70Sはいずれも結合活性が著しく減少していた。したがってこれらの残基はいずれもSNARE複合体との結合に重要であると考えられる。(2)私たちは以前の研究によって、この部分のペプチドがSNARE間の相互作用には全く影響せず、シナーフィンの特異的アンタゴニストとして働き、神経伝達物質の放出を抑制することを見いだしてる。現在、この部分のcagedペプチドをイカ巨大シナプス前末端に注入後、紫外線のパルス照射によってこのペプチドを活性し、神経伝達物質放出の抑制の時間経過を追究することにより、シナーフィンの作用速度を解析している。2.Munc18-1およびトモシン遺伝子欠損マウスの作製Munc18-1(別名nSec1))およびトモシンはともにサイトゾルタンパク質で、神経伝達物質放出に密接に関与すると考えられるが、その作用機序は未だ確立されていない。本研究では両タンパク質の機能を解明するため、Cre/lox系を使ってこれらタンパク質の遺伝子の脳部位特異的欠損マウスの作製を試みている。現在、相同組換えを起こしたES細胞のスクリーニングを行っている。
審美性に富む歯科矯正用ワイヤーの開発

歯列矯正治療の初期に用いる弾性率が低く、有効たわみ距離の大きな線材料の開発を目的として研究を行った。今回は、従来より行ってきた重合法の他に、ポリメタクリル酸メチルを加温し、引抜成形する手法を用いた線材料を試作し実験検討を加えた。この結果から、物性特性が最も良好であったPMMAをマトリックス材に選択し、ポリマー系線維、アルミナ線維Si02系ガラス繊維、CPSA系ガラス繊維との複合化を試みた。これらの力学特性を調べるために3点曲げ試験を行ったところ、CPSA系ガラス繊維を強化繊維として用いた複合材では、ガラス繊維体積分率を調整することで、様々な強度特性を発揮させられることがわかった。そこでガラス繊維体積分率を小さくし、弾性率を下げたところ現在治療の初期に用いられている金属線材料と同じ様な特性が得られた。これらの線材料は、透明であり、金属線材料と比較して審美的に優れている。現在の問題点として、たわみ量が大きくなるとガラス繊維が破断し、特性が大きく変化することがある。この点に関しては、分子量の異なるPMMAを用い、ガラス繊維の強度への依存を軽減させることで対応できるものと考えている。一方、CPSA系ガラス繊維をリン酸塩溶液で処理することによりリン酸カルシウム質化合物で被膜された生体材料用ガラス繊維となることが分かっている。今後は、この処理を行なうことにより、生体親和性の高い材料を開発する予定である。また、臨床応用のため耐久性、吸水性、耐熱性、生体毒性などについても検討を加える予鈴である。
遺伝子操作による肝マンナン結合タンパク質の構造と機能に関する研究

本研究は代表者らにより初めて見い出された動物レクチンである肝マンナン結合タンパク質(肝MBP)の構造と機能を遺伝子操作技術を用いて解明しようとしたものである。3年間の研究により次の点が明らかとなった。1.ラット肝MBPの全一次構造をcDNA塩基配列を決定することにより明らかにした。分子量32,000の成熟肝MBPはGluをN末端、AspをC末端とする226個のアミノ酸からなり、プレ肝MBPではこのN末端にさらにMetに始まる18個のシグナルペプチドが結合していた。本レクチンのN末端近傍Gly_<20>からSer_<78>まではGlyーXーYの構造が19回繰り返していた。本構造はコラーゲン分子に特徴的な構造であり、本レクチンは分子内にコラーゲン様構造をもつ非常に興味深い構造をもつことが明らかとなった。本レクチンをコラーゲナーゼ消化して得られる分子量約20,000のC末端側ペプチドは糖結合活性を示し、ここに糖結合ドメインが存在することが示された。また、本レクチンをβ-メルカプトエタノールなどで還元すると失活し、空気酸化により活性を回復することから、このC末端近傍に存在するシステインの間にジスルフィド結合が形成され、これが活性発現に必須であることが示された。2.肝MBPの内在性リガンドの同定に成功した。肝マンナン結合タンパク質は肝細胞内でとくに粗面小胞体に局在しており、ここには同時に内在性のリガンドが存在することが示されていた。今回、MBPを固定化したカラムを用いることにより内在性リガンドを単離し、特異的抗体を用いるウエスタンブロットにより検索したところ、これらの内在性リガンドはα_1ー酸性糖タンパク質、α_1マクログロブリン、α_1ーアンチトリプシンなど血清糖タンパク質の生合成中間体およびβーグルクロニダーゼなどのリソソーム酵素を主成分とすることが明らかとなった。ラット肝マンナン結合タンパク質(MBP)はマンノース・N-アセチルグルコサミンに特異的なレクチンであり、分子量32,000のサブユニットの6量体である。本年度はこのMBPの一次構造を遺伝子操作を利用して決定した。まず、発現ベクター入gt11に組み込んだラット肝cDNAライブラリーを、アフィニティー精製した抗ラットMBP抗体によりスクリーニングし、ラット肝MBPcDNAを単離した。この約850塩基より成るcDNAは、タンパク化学的に決定した肝MBPのN末端構造に対する合成cDNAとハイブリダイズし、肝MBPの全ペプチド部分をコードしていた。そこでこの塩基配列をジデオキシ法により決定し、ついて塩基配列をもとに成熟肝MBPおよびプレ肝MBPの全アミノ酸配列を決定した。成熟肝MBPはGluをN末端AspをC末端とする226個のアミノ酸からなり、プレ肝MBPではこのN末端に更にMetに始まる18個の疎水性アミノ酸に富むシグナルペプチドが結合していた。なお、分子内部には膜貫通タンパク質にみられる疎水性領域はみられなかった。肝MBP分子の一次構造上の最大の特色はN末端半分にコラーゲン様構造をもつことである。すなわちGly20からSer78までの間にGly-X-Yの構造が19回繰り返していた。典型的なコラーゲン分子ではX,Yにプロリン,リジンが多く含まれるが、ここでも同様の特色がみられた。このような一次構造をもつペプチド鎖は二次構造としては折り返し構造をもち、また、3本のペプチド鎖が集まり三重ラセン構造を形成し安定化することが知られている。

MBPもこのコラーゲン様部分で三重ラセン構造をとり多量体を形成している可能性が強い。このように分子内にコラーゲン様構造を含むタンパク質は珍らしく、補体成分Clq,アセチルコリンエステラーゼ,コングルチニン,肺の界面活性タンパク質などに知られているのみである。1.昨年度の研究により調製したラット肝マンナン結合タンパク貭(MBP)cDNAをプローグとしてラット肝mRNAのNorthern分析を行なった.その結果,ラット肝MBPのmRNAは3.4kbの主要成分と4.5kbの少量成分からなることが明らかとなった.先に得たラット肝MBPのcDNAは全翻訳領域およびポリA部分を含む874bより成ることから,肝MBPにはalternative splicingにより生じたいく種かのmRNAが存在すること,また,主要成分は非常に長い非翻訳領域をもつことが示された.現在,主要成分の全領域の配列を決定すべく,新たなcDNAを検索している.2.ヒト肝臓より肝MBPを単離し,その性貭を明らかにするとともに,そのアミノ酸配列をcDNA塩基配列より決定した.まず,ヒト肝臓のホモジネートを,ラット肝MBPの調製に用いた方法に従い処理することにより,ヒト肝MBPを均一に精製することができた.本レクチンは分子量290,000で33,000のサブユニットの9量体と推定された.肝臓100gより約0.5mgの精製標品が得られた.次に, λgt11をベクターとするヒト肝臓cDNAライブラリーをラット肝MBPcDNAをプローブとしてスクリーニングすることによりヒト肝MBPcDNAを得,その塩基配列をジデオキシ法により決定した.その結果,このcDNAはポリAで終る1417bより成り, 34bの5′非翻訳領域, 810bの翻訳領域, 537bの3′非翻訳領域から構成されていた.この翻訳領域は270アミノ酸残基をコードしていたが,この21番目から23個のアミノ酸は別にタンパク質化学的に決定した本レクチンのN末端配列と完全に一致していた.また, N末端近傍にはGlyーXーYの繰り返し構造がみられ,ラットの場合同様に分子内コラーゲン様構造をもつことが明らかとなった.なお,ヒト肝MBPはC末端部分に22残基のアミノ酸が余分に存在する特色を示していた.1.ラット肝マンナン結合タンパク質mRNAの多様性昨年度の研究により調製したラット肝マンナン結合タンパク質の全翻訳領域を含むcDNAをプローブとしてラット肝mRNAのノーザン分析を行ったところ、1.0kbの主要成分の他、3.3kbの少量成分の存在が明らかとなった。先に得たcDNAは全翻訳領域およびポリA領域を含む874bより成ることから低分子mRNAに対応するものと考えられる。このmRNAの多様性の意味を探るため、高分子mRNAに対するcDNAの単離を試みた。低分子cDNAをプローブとして別のcDNAライブラリーを検索した結果、全長約3.3kbのcDNA塩基配列を決定することができた。高分子cDNAの翻訳領域732bの配列は低分子cDNAのものと完全に一致していたが、3′側非翻訳領域は長く2403bにも達し、また、5′側非翻訳領域189bの内の5′端90塩基の配列は低分子cDNAのそれと全く異なるものであった。mRNAの多様性を生じる分子機構およびその生理的な意味が注目される。
プロトン・エレクトロン二重共鳴イメージングの研究

0.2テスラPEDRI(Proton Electron Double Resonance Imaging,プロトン・エレクトロン二重共鳴イメージング)用マイクロ波アプリケータを開発するための実験を行った。周波数はNMR 8MHz、EPR 5.6GHzである。NMR RFアプリケータはソレノイドコイル又はバードケージコイルを用いる。EPRマイクロ波アプリケータに要求される性能はCW 5W以上の耐電力があり、約10mm×20mmの平面に均一度の高い磁界を照射し得ることである。本研究では、マイクロ波磁界を上述の平面状試料に集中的に照射するために、アプリケータの基本型はTE_<10>方形導波管とし、(1)切り離し導波管、(2)フランジ付導波管、(3)格子終端TE_<101>空胴共振器、(4)細隙開口導波管の開口部磁界分布を測定した。磁界のピックアップコイルは線径0.3mm、内径1mmの1巻きのコイルで、シュペルトップバランを備えている。実験の結果、次の事柄が明らかになった。(1)切り離し導波管について:導波管開口部中心では磁界強度が最大値の約10分の1程度と低く、導波管壁長辺の中心に磁界が集中し、分布が不均一であることが分かった。磁界の均一度を磁界の最小値/同最大値と定義すると、開口部では0.09、開口部外では0.45である。(2)フランジ付導波管:磁界均一度は、開口部において0.14、開口部外において0.70であり、開口部外、即ち、フランジ面でより均一な分布であることが分かった。(3)格子終端TE_<101>空胴共振器:格子数5本の共振器についての均一度の最良値は0.37である。以上の実験結果からフランジ又は同様な構造の導体に流れるマイクロ波電流によって生じる磁界の利用が望ましいことが明らかになった。活性酸素等の生体フリーラジカル(不対電子を持つ原子または分子)が病気の発症と促進に深く拘わっていることが指摘されている。そのため不対電子の唯一の直接測定法であるESR(Electron Spin Resonance、電子スピン共鳴)法の研究が近年盛んになっている。特に生体のインビボ(生きたままでの)計測の可能なESR法およびその装置の高感度化が、医学、薬学、その他の関連分野から強く要求されている。本研究ではOverhauser効果によるPEDRI(Proton Electron Double Resonance Imaging、プロトン・エレクトロン二重共鳴イメージング)法の高感度化の研究を次の様に行った。(1)電磁波の周波数の変化による感度の違いを正確に把握できるように、これまでに英国アバデイーン大学等で用いられてきた数MHzに替えて、NMR:8MHz、ESR:5.6GHzとした。このことにより、アバデイーン大学の少なくとの10倍の高感度化が達成できる見込みである。これに伴い、パルス成形回路、パルス制御回路、マイクロ波パルス電力増幅器、T/R(送/受信)スイッチ、共振器、低雑音増幅器等に関しての新しい仕様を定めた。(2)中でも特に共振器の性能が研究成果の善し悪しを決定するので、共振器についてはバード・ケージ、ソレノイド、サーフェイス・コイル各共振器に関して理論的、実験的に特性の吟味を行った。その結果、NMRにはバード・ケージ共振器を、ESRにはサーフェイス・コイル共振器を用いることにした。

Proton Electron Double Resonance(プロトン・エレクトロン同時共鳴)はEPR(Electron Paramagnetic Resonance、電子常磁性共鳴)法の高感度化の有力な一方法である。本研究は同方法によるイメージング(Imaging、PEDRI)による生体の高感度化in vivo(生きたままでの)EPR法に関するものである。PEDRIの測定感度はNMR(核磁気共鳴)及びEPR同様に用いる電磁波の周波数が高いほど高くなる。プロトンNMRの周波数を上げることにより高感度化を図ろうとする研究例があるが、本研究は、将来、人体の全身計測を目指しているので、NMR磁束密度は実用的な0.2Tに止め、EPR周波数を上げることによる高感度化を目指している。本研究では直流磁束密度0.2Tの常電導電磁石を用いるので、NMR周波数は8.5MHz、EPR周波数は5.6GHzである。本研究によるPEDRIは電磁波の生体への進入の深さを考慮して腕の皮膚を測定対象としている。現在、NMRパルス出力電力100W、EPRパルス出力電力50Wの小電力PEDRI装置の設計を行っている。装置は、制御及び画像処理部(任意波形synthesyzer、ワークステーション、ラジオ波synthesyzerを含む)、分配器、NMR電力増幅器、T/Rスイッチ・低雑音増幅器、減衰器、EPR電力増幅器、電力計、NMR/EPR共振器、検波増幅器、及び常電導マグネットを用いた繰り返し磁界システムからなっている。共振器は、NMRにはSolenoid coil及びBird cage resonatorを用いる。Solenoid coilの直径及び軸長は各10cmである。Bird cage coilの寸法も直径、軸長共に10cmである。共振尖鋭度Qは約10が得られている。生理食塩水溶液の挿入によりQ値は約30%低下する事が確かめられた。来年度は小電力及び高電力PEDRI装置の実験を行う予定である。0.2テスラPEDRI(Proton Electron Double Resonance Imaging,プロトン・エレクトロン二重共鳴イメージング)用マイクロ波アプリケータを開発するための実験を行った。周波数はNMR 8MHz、EPR 5.6GHzである。NMR RFアプリケータはソレノイドコイル又はバードケージコイルを用いる。EPRマイクロ波アプリケータに要求される性能はCW 5W以上の耐電力があり、約10mm×20mmの平面に均一度の高い磁界を照射し得ることである。本研究では、マイクロ波磁界を上述の平面状試料に集中的に照射するために、アプリケータの基本型はTE_<10>方形導波管とし、(1)切り離し導波管、(2)フランジ付導波管、(3)格子終端TE_<101>空胴共振器、(4)細隙開口導波管の開口部磁界分布を測定した。磁界のピックアップコイルは線径0.3mm、内径1mmの1巻きのコイルで、シュペルトップバランを備えている。実験の結果、次の事柄が明らかになった。(1)切り離し導波管について:導波管開口部中心では磁界強度が最大値の約10分の1程度と低く、導波管壁長辺の中心に磁界が集中し、分布が不均一であることが分かった。磁界の均一度を磁界の最小値/同最大値と定義すると、開口部では0.09、開口部外では0.45である。(2)フランジ付
CD4+CD25+調節性T細胞を用いた実験的自己免疫性ぶどう膜炎の抑制の試み

近年、末梢性免疫寛容の誘導メカニズムとして様々なタイプの制御性T細胞の存在が挙げられる。とくにCD4^+D25^+制御性T細胞は正常個体の末梢に生理的に存在するT細胞集団であり、免疫応答を抑制的に制御し、この細胞集団の機能的異常がマウスやヒトにおける自己免疫疾患の発症に関与することが報告されている。以前、我々は抗CD25抗体を用いてCD25陽性T細胞をマウス生体内から除去すると、ぶどう膜網膜炎が自然発症することを証明し、CD4^+CD25^+制御性T細胞が網膜抗原に対するトレランスの誘導に極めて重要な働きをしていることを示した。そこで、本実験ではナイーブなマウスの脾臓より得られた抗原非特異的な内在性CD4^+CD25^+制御性T細胞を養子移入することでヒト難治性ぶどう膜炎の実験モデルである、実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis : EAU)を抑制できるか否か検討を行った。さらにCD4^+D25^+制御性T細胞を移入された群では、抗原に対する細胞性免疫能の抑制がみられ、また抗原刺激によって活性化された脾臓由来T細胞のリンパ球増殖反応も抑制されていた。このように、移入されたCD4^+D25^+制御性T細胞は全身の細胞性免疫能を抑制することでEAUを制御することが明らかとなった。今後、制御性T細胞の養子移入による細胞療法がぶどう膜炎に対する新たな治療法となりうることが期待される。近年、自己免疫疾患における免疫制御メカニズムについてその解明が進み、CD4^+CD25^+のマーカーを発現したT細胞(CD25^+制御性T細胞)が末梢における免疫寛容機構において自己免疫疾患の発症制御に強く関わっていることが証明されている。今回我々は内因性ぶどう膜炎の動物モデルとして知られる実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(以下EAUと略す)に対してCD25^+制御性T細胞の養子移入による抑制効果について検討を行った。2.CD25^+制御性T細胞によるIRBPペプチド特異的遅延型過敏反応の抑制の検討IRBPペプチド免疫後7日目に正常マウスの脾臓より分離したCD4^+CD25^+細胞およびCD25^-細胞を養子移入し免疫後20日目にIRBPペプチド(20μg/マウス)をマウス耳介皮下に接種、翌21日目に耳介の腫脹を測定したところ、CD25^+制御性細胞Tを移入された群においてIRBPペプチドに対する遅延型過敏反応の有意な低下が認められた。3.CD25^+制御性T細胞によるIRBPペプチド特異的T細胞増殖反応の抑制の検討IRBPペプチド免疫後7-10日目に頚部リンパ節を摘出し、single cell suspensionを作成した後、同様のペプチドを用いて刺激加える際naiveなCD25^+制御性T細胞と共培養し、リンパ節細胞の増殖能を検討したところ、IRBPペプチド特異的T細胞の増殖反応が有意に抑制された。以上の結果よりEAUの発症期に移入されたCD25^+制御性T細胞は所属リンパ節に存在する抗原特異的なeffector T細胞を抑制することでぶどう膜炎の軽症化を誘導していると考えられた。
小型推進機のための低レイノルズ数流れ測定によるノズル効率低下に関する研究

本研究では超小型衛星に搭載される小型推進機の小型ノズル部の内部流れの測定を行う.低レイノルズ数流れによるノズル効率低下に関する研究は内部流れの直接測定の困難さから数値計算を中心に行われてきた.その中で,本研究では可視光によるMTV法と樹脂3D造形ノズルを組み合わせたノズル内部流れ分布測定を提案し,小型ノズル内部流れ現象を解明することが研究目的となる.ノズル内部と下流の流速/密度分布測定によってノズル効率低下の要因それぞれの効果に対して定量的な比較を行う.本研究では超小型衛星に搭載される小型推進機の小型ノズル部の内部流れの測定を行う.低レイノルズ数流れによるノズル効率低下に関する研究は内部流れの直接測定の困難さから数値計算を中心に行われてきた.その中で,本研究では可視光によるMTV法と樹脂3D造形ノズルを組み合わせたノズル内部流れ分布測定を提案し,小型ノズル内部流れ現象を解明することが研究目的となる.ノズル内部と下流の流速/密度分布測定によってノズル効率低下の要因それぞれの効果に対して定量的な比較を行う.
Survivinを標的とした骨髄腫幹細胞に対する新規治療戦略の開発

難治性のがんを治癒させるためには、がんの親玉である、がん幹細胞を根絶させる治療戦略が必要である。申請者は、難治性の血液癌である多発性骨髄腫におけるこれまでの研究結果より、Survivinというたんぱく質を抑制することで、骨髄腫のがん幹細胞である骨髄腫幹細胞を根絶させることができるのではないかという仮説を立てた。この仮説に基づき、survivinをターゲットとした新たな治療戦略が、骨髄腫幹細胞に及ぼす効果とそのメカニズムを明らかにすることが本研究の目的である。これらが明らかとなれば、骨髄腫を治癒へ導く新たな治療法を開発できるだけでなく、ほかのがんへの応用も期待できると考える。
糖尿病予測およびiPS細胞移植基盤の確立

本研究は、糖尿病の早期予測法の開発と重症糖尿病への再生医療の基盤の確立、の2つを主たる目的として研究を行った。糖尿病患者由来のiPS細胞から作成した膵β細胞はインスリン分泌能・分化のレべル・生存細胞数に違いがあった。また、バイオマーカーとしては、発症早期に特徴的なアミノ酸変化(アラニン、マーカーXの上昇)をきたすことを見出した。エネルギーフラックス検査を行った結果、小児糖尿病群では中心エネルギー代謝系(特にミトコンドリア機能)に異常があることがわかった。iPS細胞から誘導したベータ細胞を糖尿病モデルマウスへ移植し、ミトコンドリア保護薬を用いて治療効果期間を延長する可能性が示唆された。本研究は、1増加傾向にある2型糖尿病の早期予測法の開発、2既に糖尿病になっている患者様の中でも重度の症状を呈する重症糖尿病(1型糖尿病および2型療法を含む)への再生医療を応用した細胞移植治療法の基盤の確立、の2つを主たる目的としている。H27年度(初年度)は、1iPS細胞の樹立、2糖尿病モデルマウス、および3小児生活習慣病患者(2型糖尿病予備群並びに2型糖尿病小児群)を用いた発症を予測するバイオマーカーの検索を行った。まず、小児糖尿病(1型および2型)患者5名(1型3名、2型2名)から血液細胞を分離し、iPS細胞を樹立した。更にこれらのiPS細胞を用いて膵β細胞への誘導をおこなった。糖尿病患者由来のiPS細胞から作成した膵β細胞はインスリン分泌能・分化のレベル・生存細胞数に違いがあった(現在、数を増やして確認中)。これらのことは、小児の糖尿病(1型並びに2型)の病態の一因をあらわしている可能性がある。更に、生活習慣病小児のバイオマーカー検索(アミノ酸プロファイル)を実施した。その結果、マウスで認められた変化が起こる発症早期に特徴的なアミノ酸変化をきたすことを見出した。この変化は、既存の糖尿病のバイオマーカーが変化するさらに早期に変動することがわかった。これらの研究を進めることで、1)糖尿病の予防医学への貢献、2)現時点で実際に臨床応用されている膵島移植治療の技術基盤の向上への貢献、3)iPS細胞を用いた細胞移植治療への貢献、が期待できる。・患者由来iPS細胞の樹立に関しては、小児糖尿病(1型および2型)患者5名(1型3名、2型2名)から血液細胞を分離し、iPS細胞を樹立した。H27年度の計画では5クローンを樹立する計画を立てており、これを達成した。・β細胞の誘導法については、まず、既に我々が確立している方法を用いて(再現性のある方法を用いて)クローン毎(病気ごと)のβ細胞の違いを比較検討した。その結果、クローンによって、β細胞が出現する割合が異なり、負荷(カリウム負荷、糖負荷)によるインスリン分泌能も異なっていることがわかった。小児糖尿病では、1型は自己免疫性疾患でβ細胞自体には異常がないと考えられているが、β細胞自体にも脆弱性がある可能性が示唆された。現在、検査の対象を増やして再現性を確認している。・移植モデルの確立:糖尿病モデル動物としてAKITAマウス(C57BL/6-Ins2 AKITA/J)を用いる。AKITAマウス(ヘテロ)は生後6週目までにはほぼ全てのマウスで血糖500以上を示し、多飲多尿、水腎症、糖尿病性腎症を呈する。1年生存率は50%である。移植後の症状、組織病変の変化、生存率についても評価可能である。この糖尿病マウスへの細胞移植を行った。細胞は、既に我々が樹立している体性幹細胞由来の膵β系細胞を用いた。腹膜、門脈、脾臓、腎被膜における移植効果を検証し、腎被膜が安定した評価には優れていることが示された。・生活習慣病患者におけるアミノ酸プロファイルについては、当初H29年度以降の予定で実施する計画を立てたが、H27年度のデータのみで有意な結果が得られた。すなわち、既存の糖尿病のバイオマーカーに異常をきたす前に特徴的なアミノ酸プロファイルを呈することが示唆された。本研究は、1増加傾向にある1型および2型糖尿病の早期予測法の開発、2既に糖尿病になっている患者の中でも重度の症状を呈する重症糖尿病(1型糖尿病および2型療法を含む)への再生医療を応用した細胞移植治療法の基盤の確立、の2つを主たる目的として実施されるものである。H27年度(初年度)は、1iPS細胞の樹立、2糖尿病モデルマウスおよび3小児生活習慣病(2型糖尿病予備軍並びに2型糖尿病小児群)を用いた発症を予測できるバイオマーカーの解析を行ったが、H28年度は昨年に引き続き小児糖尿病(1型および2型)患者5名(1型3名、2型2名)から樹立したiPS細胞を用いてβ細胞への誘導を行い、細胞機能解析を行った。具体的には、疾患由来iPS細胞から誘導したβ細胞と正常β細胞(正常iPS細胞由来β細胞:タカラバイオ社製)を用いてメタボローム解析を行った。その結果、1型糖尿病患者においては、ある種の特徴的な代謝が阻害されており(未発表データのため非公開)、一方で2型糖尿病患者では逆にこの特異的代謝が促進されていることがわかった。In vitroにおける、これらの結果は、1型糖尿病患者においては単に自己免疫性の細胞破壊だけではなく、細胞自体にも何らかの細胞内代謝機能異常が起こっていることを示唆した。

また、正常iPS細胞由来β細胞を用いて糖尿病マウス(AKITAマウス)への細胞移植を行い、ある程度の血糖上昇抑制効果が得られることがわかった。更に、昨年度にマウスで見出したバイオマーカーについて、発症初期の患者においても変動が見出された。これらの結果は、1)糖尿病の予防医学への貢献、2)膵再生医療への技術移転、3)iPS細胞を用いた細胞移植治療への貢献、が期待される結果となった。・患者由来iPS細胞の樹立について:児糖尿病1型(3名)および2型(2名)からiPS細胞を樹立した(H27年度中に達成)。・β細胞の誘導法について:iPS細胞由来β細胞については、市販のβ細胞を比較検討し、タカラバイオ社製のiPS細胞由来β細胞が最も分化レベルが成熟し、かつ均一な細胞であることがわかったことから、タカラバイオ社の協力をえて、これらをコントロール細胞とした。誘導法についても、これらを比較検討材料として、改善した(H27ーH28年度)。・移植モデル法の確立について:糖尿病モデルマウスとしてAKITAマウス(C57BL/6-Ins2 AKITA/J)を用いたバックグラウンドデータをH27年度までに揃えた。H28年度は、新たにタカラバイオ社製の正常iPS細胞由来β細胞を用いて、腎被膜下への細胞移植実験を行った。その結果、移植後に血糖を50%程度軽減することがわかった。一方で、腎被膜下の移植では、糖負荷への反応が弱く、門脈内移植では良好な反応を示すことが明らかとなった。・マウスで見出されたバイオマーカーが、ヒトでも同様に指標となる可能性があることがわかった。・iPS細胞を用いたメタボローム解析から、新たに病気の原因となる細胞内の機能異常の可能性が示唆されるデータを得た。この結果は、創薬のターゲットとなる可能性があり、更に病気の根本的な問題点を解決できる可能性がある。本研究は、1増加傾向にある2型糖尿病の早期予測法の開発、2既に糖尿病になっている患者様の中でも重度の症状を呈する重症糖尿病(1型糖尿病および2型療法を含む)への再生医療を応用した細胞移植治療法の基盤の確立、の2つを主たる目的として研究を行った。H27年度(初年度)は、1iPS細胞の樹立、2糖尿病モデルマウス、および3小児生活習慣病患者(2型糖尿病予備群並びに2型糖尿病小児群)を用いた発症を予測するバイオマーカーの検索を行った。まず、小児糖尿病(1型および2型)患者5名(1型3名、2型2名)から血液細胞を分離し、iPS細胞を樹立した。更にこれらのiPS細胞を用いて膵β細胞への誘導をおこなった。糖尿病患者由来のiPS細胞から作成した膵β細胞はインスリン分泌能・分化のレベル・生存細胞数に違いがあった。これらのことは、小児の糖尿病(1型並びに2型)の病態の一因をあらわしている可能性があった。H28年度は、更に、生活習慣病小児のバイオマーカー検索(アミノ酸プロファイル)を実施した。その結果、マウスで認められた変化が起こる発症早期に特徴的なアミノ酸変化(アラニン、マーカーXの上昇)をきたすことを見出した。この変化は、既存の糖尿病のバイオマーカーが変化するさらに早期に変動することがわかった。H29年度は、これらの変化の原因を検索した。細胞変化および変化するマーカーは、すべてエネルギー代謝系を反映するものであったことから、エネルギーフラックス検査を行った。その結果、小児糖尿病群では中心エネルギー代謝系(特にミトコンドリア機能)に異常があることがわかった。
CAD/CAMポーセレンインレーに応用するレジンセメントに関する研究-セメント層の厚径と辺縁封鎖性および摩耗性との関係-

我々は、CAD/CAMポーセレンインレーの臨床観察を行い、現段階ではインレー体の適合性に問題があり、間隙をうめるレジンセメントの摩耗が早期より認められることを報告した。そこで本研究では、臨床観察を引き続き行い修復物の経時的変化を観察するとともに、実験的に摩耗試験を行い、セメント層の厚みとレジンセメントの耐摩耗性との関係について検討した。実験1.臨床的研究30歯のCAD/CAMポーセレンインレーの1年経過例について臨床観察を行った。セメントラインの摩耗は、咬合関係の緊密な症例において3カ月、6カ月経過時に1例、1年経過時に3例に認められた。また、直接臨床評価Aの症例のレプリカ模型のSEM観察ではほとんどの症例でレジンセメントの摩耗が認められた。実験2.in vitro摩耗試験フィラー含有量のみを変化させた3種の試作レジンセメント(60,70,80wt%)を用いた。牛歯に形成した箱型窩洞に通法に従いCAD/CAMインレーを作製し、レジンセメントで合着し摩耗試験を行った。レジンセメントの摩耗量は、いずれもインレー体、エナメル質より有為に大きな摩耗量を示した。また、セメント間ではフィラー含有量の多いセメントの方がより高い耐摩耗性を示した。またセメント層の幅を50300mumまで変化させ、セメントの摩耗に及ぼす影響について検討した所、すべてのセメントで、セメント層の幅が広くなると摩耗量が増大するという正の相関が得られた。また各セメント間で比較すると、セメント層の幅が狭いと、60、70、80wt%含有セメントとも摩耗量に明瞭な違いは認められなかったが、セメント層の幅が広くなるとフィラー含有量が耐摩耗性に大きく影響した。以上より、レジンセメントの耐摩耗性を改良するためにはフィラー含有量の増加が効果的であり、またインレー体の適合性を向上させることが最重要であるという結論が得られた。
カメラ画像と超音波測距による可搬性を備えた高精度モーションキャプチャシステム

超音波とカメラを用いて、モーションキャプチャのための3次元トラッキングシステムを構築した。超音波により距離、カメラにより距離方向の鉛直面でのターゲット位置を取得する。提案システムは安価なカメラと超音波送受信機で構成され、非常にコンパクトに実装できる。測位性能向上のため、超音波送信機の位相特性補正を行い、位相補正面をBスプライン関数で補完するという方法を取った。実験の結果RMSEが1.20mm(静止時)、1.66mm(毎秒1m)での3次元トラッキングが可能であることが示せた。これは、最新の高価なモーションキャプチャシステムに匹敵する性能である。奥行き方向の計測を超音波で、その鉛直面方向の2次元位置をカメラで計測することによる高精度モーションキャプチャシステムを提案した。これまでの研究で構築した位相一致法と呼ばれる手法は、3mの測距で0.030mmの標準偏差という極めて高精度の測距が可能である。しかし、超音波のみを用いた3辺測量の場合、基線長(ベースライン)の長さと精度が正の相関となる。つまり、高精度の超音波測距であっても基線長が短ければ3次元位置計測の精度は悪化する。長い基線長システムの大型化を意味するため可搬性に乏しくなるという欠点がある。そこで本研究では超音波測距と画像計測の利点を組み合わせることで、この問題を克服した。提案システムは、安価な小型カメラと超音波送受信機のみのコンパクトな構成(カメラと超音波受信機からなるデバイスの大きさは55mm x 44 mm)である。超音波測距の問題として、超音波送信機の指向性が挙げられる。つまり、送信機の方向によって送信される信号の位相が変動するため、計測値の精度は高いが、誤差を含む測距となる。よって、本研究では、サンプリングされた異なる複数位置のターゲットの距離を事前に計測し、それを基に位相補正曲面を作成した。次に、画像計測で得られる2次元位置から補正面上での測距補正量を計算することで、より正確な3次元位置計測値を得られるようにした。評価実験の結果、静止ターゲットおよび移動ターゲット(1.0m/s)の2乗平均誤差(RMSE)はそれぞれ1.20mm, 1.66mmとなり近年のモーションキャプチャシステムとほぼ同等の性能を示すことを確かめた。申請者らのグループで構築した位置認識システムは、高精度測距技術に基づく3辺測量により物体の3次元位置を取得する。これまでの研究を通して、センサ間の基線長を小さくすることで、コンパクトな実装かつ一定レベルの精度を実現できることを示した。しかし、以下の点が問題であった。(1)超音波トランスデューサの位相特性:超音波トランスデューサは指向性を持っており、超音波の入射角によって位相特性が変化する。提案測距手法は位相差を時刻基準点とするため、位相特性の変化は測距の誤差に直結する。(2)poorGDOP (Geometric Dilution of Precision)による3次元位置認識精度の限界:GDOP値が高い場合、測距の小さな誤差が3次元位置認識の大きな誤差に増幅される。特に、距離方向(z方向)と鉛直な面(xy平面)での誤差が極めて大きくなる。そこで本研究では、(a)超音波トランスデューサの位相特性の補償、および(b)単眼カメラと超音波による深さ方向の計測の統合という2つの方法を用いることにより、高精度かつコンパクトな3次元モーションキャプチャシステムを提案した。本研究では、複数の入射角での超音波トランスデューサの位相特性を計測し、スプライン関数によって位相補償平面を構築した。カメラによって得られるターゲットの位置(カメラを原点とするターゲットの方向)により、超音波測距の補正を行うと同時に、それと鉛直な面での誤差を小さくする。超音波トランスデューサに周囲にLEDを配置することでコンパクトな視覚的マーカを構成し、その3次元位置を取得する実験を行った。その結果、最新の位置認識システムとほぼ同等の測位精度を示すことを確認できた。平成24年度の研究計画では、まず単眼カメラと超音波センサを用いることで、既存手法で実現されている3次元位置認識精度を実現できるかどうかを確認することを課題とした。LEDを配置することにより視覚的なマーカを構成し、2次元平面(カメラの撮像面)での測位とそれに鉛直な方向の超音波による高精度測距を組み合わせることで、コンパクトかつ正確な位置認識の実現を目指した。実証実験を通して、高精度の測位が実現できることが確かめられた。また、物体の移動に起因するドップラーシフトによって、周波数遷移が発生した場合でも、その補償を行うことで十分に高精度の3次元測位が可能であることが確かめられた。以上は、当該年度の目標として挙げていた事項である。平成25年度は、以下のような研究を推進する。

(1)周波数分割による測距性能の確認:広帯域送信機の周波数帯域を排他的に分割し、申請者らのグループで開発した位相一致法のバースト波を各々の帯域上で送信するためのハードウェアおよびソフトウェア、さらに受信機で直交検波するためのソフトウェアおよびハードウェアを実装する。現時点では、超音波送受信機の振幅および位相特性が比較的安定している25KHz85KHzを6kHz毎に分割し、最大10個のバースト波を同時に送信する予定である。一方、受信機側では、受信波形をAD変換し、送信波と同じバースト波を用いて直交検波を行う。LOS(Lineof Sight)が確保できれば、狭帯域超音波トランスデューサの場合と同様の測距性能が示せることを確認する。(2)スパートフォン等を対象としたモバイルデバイスでの室内3次元位置認識、モーションキャプチャの実現:研究成果をより分かりやすくデモンストレーションするために、社会に広く普及しているスマートフォンを用いた3次元位置認識、トラッキングシステムを構築する。可聴域と超音波領域をまたぐ周波数帯を利用することで、人間にとって邪魔にならない音響信号での測位を目指す。まずは、スマートフォンのスピーカーおよびマイクロフォンの周波数特性について計測を進める。次に、その特性に応じて適切な周波数帯を決定する。比較的計算パワーが低いデバイスであることを考慮した測位アルゴリズムやそのアプリケーションソフトウェアについて検討と実装を進める。平成24年度は当初予定の通り周波数分割による複数移動体のトラッキングについての検討を進めたが、実装までには至らなかった。そのため、実装に必要な物品を平成25年度に購入することとした。具体的には、広帯域での音響信号を発生させるためのファンクションジェネレータ、アンプ、およびスーパーツィータを購入する。また基板実装のための電子回路素子も併せて購入する。研究協力者の国立情報学研究所橋爪教授との打ち合わせ(東京、札幌)のための旅費、成果発表のための国内外出張のために必要となる旅費を拠出する。また、評価実験補助、データ解析補助のための学生アルバイト謝金、英語論文校正のために予算を執行する。さらには、実験機材搬送等の通信費用を計上する。
化学シナプスによる情報伝達をターゲットとした神経障害性疼痛発症機構の解明

本研究課題では、ボツリヌス毒素(BoNT)の化学シナプスによる情報伝達を抑制する効果を用いて、神経障害性疼痛の発症機序ならびに感覚入力における情報伝達機構を解明することを目的とするものである。平成30年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た。研究項目1)三叉神経節・脊髄神経系・中枢におけるBoNTの膜タンパク質SNAP-25の切断;in vivoの三叉神経節細胞・後根神経節細胞において、SNAP-25の発現を確認することはできた。末梢におけるBoNT投与により、そのSNAP-25の切断を確認するためタンパク質切断認識抗体を用いて様々な条件で検討を行い、末梢に投与されたBoNTによるSNAP-25の切断は、三叉神経節細胞と後根神経節細胞において確認できなかった。研究項目2)神経障害性疼痛モデルにおけるBoNTの侵害受容2次ニューロンへの効果;6週齢ラットの総腓骨神経を結紮し、von Freyfilamentを用いた機械的刺激、およびプランターテストを用いた熱刺激を加え、逃避行動を示す閾値と潜時の測定を行った結果、1次ニューロンと2次ニューロンへBoNTを投与することにより神経障害性疼痛モデルラットにおいて発現する疼痛関連行動を軽減することは認められなかった。またその各投与部位においてBoNTによる興奮伝達の抑制効果を検討するため脊髄における組織学的検討を行った結果、神経障害性疼痛モデルラットにおいて誘発される2次ニューロンの過剰興奮を抑制することは認められなかった。平成28年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た。研究項目1)三叉神経節・脊髄神経系・中枢におけるBoNTの膜タンパク質SNAP-25の切断;in vitroにおいて、SNAP-25の切断を確認するため6週齢ラットから摘出した三叉神経節と後根神経節培養細胞にBoNTを直接投与してwestern解析したところ、BoNTを投与することによりSNAP-25を切断することが示された。in vivoにおいて発現を確認できているSNAP-25がBoNTを投与することによる影響を解析中である。研究項目2)神経障害性疼痛モデルにおけるBoNTの侵害受容2次ニューロンへの効果;6週齢ラットの総腓骨神経を結紮し、von Freyfilamentを用いた機械的刺激、およびプランターテストを用いた熱刺激を加え、逃避行動を示す閾値と潜時の測定を行った結果、後根神経節へBoNTを投与することにより神経障害性疼痛モデルラットにおいて発現する疼痛関連行動を軽減することが示された。末梢機械受容器と1次ニューロンの神経終末、そして1次ニューロンと2次ニューロンへBoNTを投与することによる影響、また脊髄における組織学的検討を解析中である。in vitroにおいて、三叉神経節と後根神経節培養細胞にBoNTを直接投与することによりSNAP-25を切断することが示されたことから、予定通りに研究が進んでいると考えられる。平成29年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た。研究項目1)三叉神経節・脊髄神経系・中枢におけるBoNTの膜タンパク質SNAP-25の切断;in vitroにおいて、三叉神経節と後根神経節培養細胞においてSNAP-25の切断を確認することができた。in vivoにおいて、三叉神経節細胞においてSNAP-25の発現を確認することはできた。BoNT投与による影響を様々な条件で検討を行っているが、詳細については現在解析中である。また末梢機械受容器と1次ニューロンの神経終末へBoNTを投与することにより神経障害性疼痛モデルラットにおいて発現する疼痛関連行動を軽減することが示された。そして現在、1次ニューロンと2次ニューロンへBoNTを投与することによる影響、また脊髄における組織学的検討を解析中である。今年度は実験に使用する神経節細胞の採取・培養・保存に時間を費やした.また,実験条件などの検討を行ったが,結果が不安定であり,実験条件の調整に想定外に時間がかかった.本研究課題では、ボツリヌス毒素(BoNT)の化学シナプスによる情報伝達を抑制する効果を用いて、神経障害性疼痛の発症機序ならびに感覚入力における情報伝達機構を解明することを目的とするものである。

末梢におけるBoNT投与により、そのSNAP-25の切断を確認するためタンパク質切断認識抗体を用いて様々な条件で検討を行い、末梢に投与されたBoNTによるSNAP-25の切断は、三叉神経節細胞と後根神経節細胞において確認できなかった。研究項目2)神経障害性疼痛モデルにおけるBoNTの侵害受容2次ニューロンへの効果;6週齢ラットの総腓骨神経を結紮し、von Freyfilamentを用いた機械的刺激、およびプランターテストを用いた熱刺激を加え、逃避行動を示す閾値と潜時の測定を行った結果、1次ニューロンと2次ニューロンへBoNTを投与することにより神経障害性疼痛モデルラットにおいて発現する疼痛関連行動を軽減することは認められなかった。またその各投与部位においてBoNTによる興奮伝達の抑制効果を検討するため脊髄における組織学的検討を行った結果、神経障害性疼痛モデルラットにおいて誘発される2次ニューロンの過剰興奮を抑制することは認められなかった。平成29年度の研究実施項目に従い、下記のように進めていく。研究項目3):末梢機械受容器と1次ニューロンの神経終末との間、また1次ニューロンと2次ニューロンの間にある化学シナプスによる情報伝達部位へBoNT/A・Eを投与後、侵害受容入力となる強度の機械的刺激および・熱刺激を加え、疼痛関連行動の観察による行動学的検討、ならびに脊髄におけるc-Fos発現を解析する。今年度は、in vivoにおけるSNAP-25の切断を組織学的検討を予定している。また予備実験から明らかとなっている末梢機械受容器と一次ニューロンの神経終末との間にある化学シナプスによる伝達機構と2次ニューロンの変化について免疫組織学的に検討を予定している。次年度使用額が生じた理由について、in vitroにおける行動学的・組織学的検討に重点を置き実験を行ったため、経費使用の節約となった。平成29年度に計画していた分子生物学的実験を次年度に行うこととしたため。今年度、in vitroにおいて明らかとなった情報伝達部位におけるin vivoの実験を行っていくこと、また研究成果の学会発表を行うことで使用を予定している。