hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコン集積化デバイスの量子輸送特性に関する研究

本研究は,量子補正モンテカルロデバイスシミュレーションという独自のナノデバイス計算手法を完成させるとともに,それを用いて,ポストスケーリング時代におけるシリコン集積化デバイスの量子輸送特性の解明とその極限性能の追及を目的とした。極微細Si MOSFETの量子輸送特性を解析するには,シリコン伝導帯の回転楕円体・多谷バンド構造を正確に考慮することが重要である。本研究では,シリコン伝導帯の回転楕円体・多谷バンド構造を考慮した量子補正モンテカルロデバイスシミュレータを確立した。その結果,超薄膜SOI構造およびダブルゲート構造における反転層量子化サブバンドの制御を利用した高移動度トランジスタの解析が可能になった。さらに,電子電子相互作用のモデル化に取り組み,速度飽和の電子濃度依存性の実験結果を理論的に説明することに初めて成功した。また,3次元MOS構造への適用を可能にするために,量子補正モンテカルロデバイスシミュレータの3次元化にも着手し,MOS反転層移動度のユニバーサル曲線を再現することができた。ナノスケールMOSFETの準バリスティック輸送特性についても検討を行い,微細化限界に関する重要な知見を得た。具体的には,MOSFETのキャリア注入過程は,いわゆる拡散過程が重要な役割を果たしており,このためにボトルネック点において,完全非対称なフェルミディラック分布を仮定する完全注入モデルは正しくないという結果を得た。一方,バリスティック輸送の影響により,チャネル長が20nm以下にまで微細化されると,電流駆動力が大幅に向上するという興味深い結果が得られた。電流駆動力の向上は,サブ10nmの領域まで期待することができることも分かった。将来のMOSFET微細化限界を議論する上で重要な知見である。Si MOSFETの微細化に伴い,チャネル長の縮小化やゲート絶縁膜の薄層化といった寸法スケーリングだけでは,十分な性能向上が難しいことが顕在化してきた。これは,量子力学的効果や寄生抵抗増大等による素子微細化上の物理的限界が見え始めてきたことに起因する。このような状況の中で,更なる高性能化を実現するためには,従来の寸法スケーリングに加え,MOSFETのチャネル構造やソース端構造を見直す必要性が出てきた。本研究では,筆者が提案し開発を行っている量子モンテカルロデバイスシミュレータを用いて,ポストスケーリング時代におけるシリコン集積化デバイスの極限性能の追及を目指し,デバイス構造の最適化と新型構造デバイスの創出に向けた研究を行っている。本年度は,超薄膜SOI-MOSFETのキャリア量子輸送特性とバリスティック輸送特性について研究を行った。まず,シリコン伝導帯の回転楕円体構造及び多バンド構造を考慮した量子モンテカルロデバイスシミュレータを開発し,シュレディンガー・ポアソン法の結果との比較により,その妥当性を実証した。次に,ナノスケールMOSFETのバリスティック輸送特性について検討を行い,チャネル内を無散乱で走行するバリスティックキャリアの割合を定量的に評価することに初めて成功した。その結果,チャネル長が10nm以下の,所謂,サブ10nm MOSFETにおいても,チャネル内の散乱によりドレイン電流が減少するため,現実のデバイスにおいては,完全なバリスティック状態を実現することは極めて困難であることが分かった。次年度以降では,バリスティックキャリアとMOSFETの電流駆動力の関係を系統的に検証し,Si MOSFETの究極性能の追求とその実現方法に関する研究を行う予定である。本研究では,筆者が提案し開発を行っている量子補正モンテカルロ・デバイスシミュレータを用いて,ポストスケーリング時代におけるシリコン集積化デバイスの性能予測と新型構造デバイスの創出に向けた研究を行っている。

本年度は,電子電子散乱過程を考慮した量子補正モンテカルロ・分子動力学(QMC/MD)法に基づくデバイスシミュレータの開発を行った。そして本シミュレータを用いて,ナノスケールMOSFETの電流駆動力に関して詳細な検討を行った。ドレイン電流-ドレイン電圧特性の計算結果より,擬似バリスティック領域では,電子電子散乱が重要な役割を果たすことが分かった。そして,チャネル長がおよそ20nm以下にまで微細化されると,バリスティック電子の効果により電流駆動力が大幅に向上することを見出した。これらの結果は,バリスティック輸送を利用した電流駆動力の向上が,現在実用化研究が進められている歪によるチャネル移動度向上技術に続くテクノロジーブースターとして,サブ10nmの領域まで継続して期待できることを示している。来年度は,MOSFETのデバイス性能をバリスティック極限に近づけるためのデバイス設計指針について研究を行う予定である。Si MOSFETの微細化に伴い,チャネル長の縮小化やゲート絶縁膜の薄層化といった寸法スケーリングだけでは,十分な性能向上が難しいことが顕在化してきた。これは,量子力学的効果や寄生抵抗増大等による素子微細化上の物理的限界が見え始めてきたことに起因する。このような状況の中で,更なる高性能化を実現するためには,従来の寸法スケーリングに加え,MOSFETのチャネル構造やソース端構造を見直す必要が出てきた。本研究では,筆者が提案し開発を行っている量子補正モンテカルロ・デバイスシミュレータを用いて,ポストスケーリング時代におけるシリコン集積化デバイスの性能予測と新型構造デバイスの創出に向けた研究を行っている。本年度は,MOSFETのデバイス性能をバリスティック極限に近づけるためのデバイス設計指針について研究を行った。具体的には,ナノスケールのチャネル長を持つMOSFETに対して,キャリア散乱過程の電流駆動力への影響について評価を行った。その結果,ナノスケールチャネルでは,チャネル内のソース端から中心部で発生した散乱がドレイン電流を大きく低下させることが分かった。しかし同時に,ドレイン付近で発生した散乱の影響も無視することはできないことも分かった。また,長チャネルデバイスでは,音響フォノン散乱が最も大きな影響を与えるが,ナノスケールデバイスでは,バレー間フォノン散乱とプラズモン散乱の影響が支配的になることが示された。詳細な検討により,これらは,ナノスケールチャネルで顕著となる電子エネルギーの増大が原因であることを突き止めた。バリスティック極限に近づけるためには,チャネルをアンドープにすることに加え,電源電圧の低下による電子エネルギーの低減が効果的であるということができる。
ピア・レスポンスにおける日本語母語話者と日本語学習者の差異

本研究の目的は、ピア・レスポンス(以下PR)においてグループメンバーおよびグループ外のクラスメートの作文を検討する際の、日本語母語話者(以下母語話者)と日本語学習者(以下学習者)の発話と行動の違いを探ることである。母語話者の初回のPRの特徴を分析したところ、教員からの意図の示されない指示は、PRの進行にいかされないことが見出された。その結果を踏まえて意図を明示した指示を行ったところ、指示された行動以外にも意図を反映させた行動をすることが示唆された。母語話者の分析をもとに学習者の初回のPRを分析したところ、具体的でかつ意図が示された指示があれば、同様の方法のPR未経験者であっても、PRを進行できることが見出された。PRの利点として感じているのは、母語話者・学習者共に自分では気づかない点への指摘であった。また、母語話者と学習者のPRにおける困難を調査したところ、学習者のほうがよりPRに困難を感じており、母語話者は自己の既有知識の不足、学習者は自分の言いたいことを伝えることに困難を感じていた。学習者が困難を感じている点の結果を受けて、学習者が相手の作文に対してどのように意見を述べているのか分析したところ、多く見られた発話の機能は「1.情報要求・確認、2.称賛、3.提案、4.同意」であった。さらに、母語話者がPRでどのように意見を述べているのか調査したところ、生活における経験を相手の文の内容に関係付けて意見を述べることや、大学の他の授業で得た知識に基づいて話すことが見られた。そのほかには、PRを経験していくことで学習者が作文を高く評価する点が変化するか検討した。その結果、初回では「間違いの少なさ」に代表される言語形式が多く言及されていたが、最終回では言及されていなかった。母語話者においては、教員から説明を受けたレポート執筆で用いられる用語を使用していく過程が明らかとなった。本研究の目的は、グループディスカッションにおいてグループメンバーおよびグループ外のクラスメートの作文を検討する際の、日本語母語話者と日本語学習者の発話と行動の違いを探ることである。平成27年度は、pilot study、プロトコル作成、文献収集を行った。予備調査は10月採択後に中上級の日本語学習者を対象として行うこととし(秋学期には日本語母語話者対象の授業を担当していないため、日本語学習者のみを対象とした)、11月と12月に予備調査を行った。予備調査は12回の授業のうち10回目と12回目、4回のグループディスカッションのうち3回目と4回目で行われた。受講者は5名であり、グループは教員を含めての3名×2グループとした。プロトコル作成と同時進行で行った観察の結果、ディスカッション中発言をほぼしない参加者でも、他の学生の意見にうなずいたり、笑ったり、あるいは作文を揃えてから再度読むなど他のメンバーと同じ行動を取ったりするという方法でディスカッションに参加していることが伺えた。2回のグループディスカッション終了後、グループディスカッションを進める上で困難を感じた点について尋ねたところ、「自分の意見を相手に言うための文型を最初の授業で教えてほしい」というコメントが得られ、日本語学習者の場合は中上級であっても相手にアドバイスをするための文型を再確認しておく必要があることが示唆された。クラスメートとお互いの作文にアドバイスをしたことのメリットは、他人のアドバイスにより自分が気付いていなかったことが分かったという点が複数名からあげられており、この回答は今後行う日本語母語話者でも同様に得られると思われる。年度計画では平成27年度に日本語学習者のpilot study、pilot studyのプロトコル作成と分析、ピア・レスポンスの文献収集・研究情報収集を行う予定であった。pilot studyのプロトコル作成と分析は開始したが終了しておらず、若干の遅れが生じている。本研究の目的は、ピア・レスポンスにおいてグループメンバーおよびグループ外のクラスメートの作文を検討する際の、日本語母語話者と日本語学習者の発話と行動の違いを探ることである。平成28年度は、日本語母語話者と日本語学習者のピア・レスポンスの調査、プロトコル作成、質的分析(ピア・レスポンス時における言語特徴の分析)を行った。日本語母語話者においては47月にかけて24名のグループのピア・レスポンスを16回分、日本語学習者においては47月および9月12月に23名のグループのピア・レスポンスを9回分調査することができた。日本語母語話者の初回のピア・レスポンスの特徴を分析したところ、教員からの具体性がなく目的の示されない指示は、ピア・レスポンスの進行にいかされないことが見出された。具体的にいうと、「初めてグループが一緒になった人に対しては、素朴な感想・印象を伝える(一緒のグループになるまで、直接感想をいう機会がないため)。」という指示がなされていたが、参加者達は「感想」として何を話してよいかわからず、すぐに次の指示の「不明な点を質問する」ことに移行してピア・レスポンスを行っていた。また、初回においてはどのようにグループ内でピア・レスポンスを進行していくかを検討していることも示された。日本語母語話者の分析をもとに日本語学習者の初回のピア・レスポンスを分析したところ、具体的でかつ目的が示された指示があれば、同様の方法のピア・レスポンス未経験者であっても、指示にしたがってピア・レスポンスを進行していけることが見出された。

年度計画では平成28年度に行うのは日本語学習者と日本語母語話者のピア・レスポンスの調査、プロトコル作成、質的分析(ピア・レスポンス時における言語行動の特徴の分析とカテゴリー作成、カテゴリー案の発表と再検討)、量的分析(ピア・レスポンス時における言語行動の特徴のカウント)であった。ピア・レスポンスの調査、プロトコル作成、質的分析(ピア・レスポンス時における言語行動の特徴の分析)は開始したが終えてはおらず、また質的分析のうちカテゴリー作成、カテゴリー案の発表と再検討、および量的分析には取り掛かれていないため、若干の遅れが生じている。本研究の目的は、ピア・レスポンス(以下PR)においてグループメンバーおよびグループ外のクラスメートの作文を検討する際の、日本語母語話者と日本語学習者の発話と行動の違いを探ることである。平成29年度は、日本語母語話者と日本語学習者のPRの調査、プロトコル作成、質的分析、量的分析を行った。日本語母語話者においては47月にかけて24名のグループのPRを15回分、日本語学習者においては47月に2名のグループのPRを5回分調査した。日本語母語話者の初回のPRの特徴を前年と比較して分析した。前年、目的の示されない指示は、PRの進行を促進しないことが見出されたが、今年度は、目的を明示した指示は、指示された行動以外にも目的を反映させた行動を促すことが示唆された。具体的には、前年は「初めてグループが一緒になった人に対しては、素朴な感想・印象を伝える」という指示がなされていたが、目的が述べられていなかったため、参加者達は「感想」として何を話してよいかわからなかった。今年度は、ディスカッションでは批判的な意見をお互いに述べる可能性もあることから、この「ディスカッションに入る前に相手の研究に対する感想を言う」という指示の目的は相手の研究に対する敬意を表し、ラポール形成をするためであると説明した。その結果、目的に沿った、感想を述べる以外の行動も見られた。日本語母語話者においては、PRを経験していくことで学習者が作文を高く評価する点が変化するか検討した。調査は中上級の日本語学習者を対象とした1学期の「作文」の授業で実施された。初回のPRと最終回のPRにおいて学習者が他の学習者の作文を高く評価した理由を抽出し、言語形式・構成・内容・その他に分類し、初回と最終回を比較した。その結果、初回では「間違いの少なさ」に代表される言語形式が多く言及されていたが、最終回では全く言及されていなかった。年度計画では平成29年度に行うのは日本語母語話者のピア・レスポンスの調査、プロトコル作成、質的分析(ピア・レスポンス時における言語行動のカテゴリー案の発表と再検討および日本語母語話者の差異の検討)、量的分析(ピア・レスポンス時における言語行動の特徴および日本語母語話者と日本語学習者に共通する特徴の頻度比較)、日本語母語話者と日本語学習者のピア・レスポンスの差異の発表であった。日本語学習者の調査は28年度で終了予定であったが十分な数が調査できず、29年度に引き続き調査を行った。十分な参加者が確保できていないためにピア・レスポンスの調査、プロトコル作成、質的分析が終わっておらず、および量的分析も十分には行えていないため、若干の遅れが生じている。
うつ病の治癒機転に重要な転写因子が制御するターゲット遺伝子の探索と機能評価

抗うつ薬の作用メカニズムに関連する脳内分子システムを解明にするため、これまでに我々が抗うつ薬関連遺伝子として同定し転写因子Math2が転写を制御するターゲット遺伝子としてPrg1を同定し、転写調節様式を明らかとし、Math2-Prg1による機能を検討した。また、種々の薬物投与におけるラット脳内のMath2及びPrg1の発現を定量した。本研究結果から、「Math2-Prg1-神経可塑的変化」の分子システムを、新たな抗うつ薬の作用メカニズム仮説として提示した。これまで我々は、抗うつ薬の作用メカニズムに関連する脳内分子システムを明らかにするため、網羅的スクリーニングにより抗うつ薬投与後にラット脳内で発現量が特異的に変化する遺伝子を707種同定してきた(ADRG#1-707)。その中でADRG#701は、basic helix-loop-helix構造を有する転写因子であることが明らかとなった。そこで本研究では、ADRG#701が転写を制御するターゲット遺伝子を同定し、その機能を解明することにより、新しい抗うつ薬の作用メカニズム仮説を提示することを目的とした。研究初年度である本年度は、ADRG#701を高発現した大脳皮質初代培養神経細胞を用いて、ADRG#701により制御を受けるターゲット遺伝子の探索を試みた。しかしながら、初代培養神経細胞のトランスフェクション効率は著しく低く、5%未満であった。そこで、トランスフェクションされた細胞のみを選別するため、ADRG#701発現ベクターとともに細胞表面に発現するlow-affinitynerve growthfactor receptor(LNGFR)発現ベクターをトランスフェクションし、24時間後、抗LNGFR抗体を付加した磁気マイクロビーズおよび磁気盤に設置したカラムを用いて発現神経細胞を選別した。その結果、80%以上の細胞において発現が認められた。次年度は、この選別された発現細胞を用いてGene Chip解析を行い、発現プロファィルを解析する。これまで我々は、抗うつ薬の作用メカニズムに関連する脳内分子システムを解明するため、網羅的スクリーニングにより抗うつ薬投与後にラット脳内で発現量が特異的に変化する遺伝子を707種同定してきた(ADRG#1-707)。その中でADRG#701は、basic helix-loop-helix構造を有する転写因子Math2であることが明らかとなった。そこで本研究では、Math2が転写を制御するターゲット遺伝子を同定しその機能を解明することにより、これまでに数多く報告されている「CREB-BDNF-神経可塑的変化」仮説とは異なる新たな抗うつ薬の作用メカニズム仮説を提示することを目的とした。昨年度は、Math2を高発現した大脳皮質初代培養神経細胞を用いて、Math2により制御を受けるターゲット遺伝子の探索をGeneChip解析により試みた。その結果、Math2の過剰発現により発現変化する46遺伝子を下流遺伝子として得た。本年度はそのうち、E boxコンセンサス配列を有するPrg1に着目して検討を進めた。その結果、Math2がPrg1上流のE boxに直接的に結合すること、転写開始部位に最も近いE boxが転写に必要不可欠であることが明らかとなった。また、Math2またはPrg1を過剰発現したPC12細胞では、対照に比べ有意に神経様突起が伸長することが判明した。さらに、Prg1発現をsiRNAにより抑制した実験結果より、Math2過剰発現による神経様突起伸長がPrg1により制御されていることが明らかとなった。最終年度の次年度は、種々の抗うつ薬、他の中枢神経系作動薬等を投与したラット脳におけるMath2及びPrg1の発現を定量する。これまで我々は、抗うつ薬の作用メカニズムに関連する脳内分子システムを解明するため、網羅的スクリーニングにより抗うつ薬投与後にラット脳内で発現量が特異的に変化する遺伝子を707種同定してきた(antidepressant related gene : ADRG#1-707)。これまでに、Math2の過剰発現により発現変化する46遺伝子を下流遺伝子として得た。本研究では、そのうちE boxコンセンサス配列を有するPrg1に着目して検討を進めた。最終年度である21年度は、薬物を投与したラット脳におけるMath2及びPrg1の発現をreal time RT-PCR法により定量した。抗うつ薬のsertraline、fluoxetineによるMath2及びPrg1の発現定量の結果、3週間投与により有意な発現増加が認められたが、1日または1週間投与では変化は認められなかった。このことは、抗うつ薬の臨床効果発現という時間経過との一致からも、抗うつ薬の作用発現メカニズムとの関連が示唆される。
アトピー性白内障と細胞成長因子

アトピー性白内障の成因を明らかにする目的で以下の実験を行った。実験1.アトピー性白内障の摘出前嚢片に対する免疫組織学的検討。慶應義塾大学眼科にて白内障手術を行ない、前嚢下白内障を有し病理組織学的検討の行いえた18例18眼を検討した。白内障の内訳は、加齢性白内障9眼、アトピー性白内障4眼、ぶどう膜炎を伴う併発白内障3眼、外傷性白内障1眼、発達白内障1眼である。前嚢片を採取しアルファ平滑筋線維アクチン(α-SMA)に対するモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。いずれの白内障の前嚢片にも、混濁部に紡錐形の細胞が認められ、α-SMAが陽性であった。混濁部のない正常な部の水晶体上皮細胞にはα-SMAが認められなかった。基礎疾患による差は認められなかった。アトピー性白内障においても、水晶体上皮細胞がα-SMA陽性な細胞に変化することがその病態の一因であると思われた。実験2.房水中のTGF-β2の濃度の測定採取した房水中のTGF-β2濃度をELISA法にて測定し、前嚢下白内障のない老人性白内障患者の房水を対照として比較した。その結果、房水中のTGF-β2濃度には有意な差は認められなかった。以上の実験結果より、アトピー性白内障の病態は、水晶体上皮細胞がα-SMAが陽性な細胞へと変化し、細胞外基質を産生することにあると思われた。その病因としては、TGF-β2濃度に対照と差がみとめられなかったことよりTGF-β2濃度の差ではなく、その局所での活性化のメカニズムやまたは別の因子が関与している可能性が考えられた。
肥満によるTNF-αの産生と2型糖尿病および歯周疾患との関係

1)平成15年度2型糖尿病患者と非糖尿病患者における肥満と歯周疾患について研究を行った。2型糖尿病患者および非糖尿病患者においてBMIとHDLには負の相関が見られ、歯周疾患の症状はBMIが22kg/m^2以上の肥満した被験者およびHDLが60mg/dl以下の被験者に顕著に見られ、肥満と歯周疾患は関連があることが示された。2)平成16年度当歯学部附属病院歯周病外来を受診している2型糖尿病患者において肥満と歯周疾患の進行状態について研究を行った。2型糖尿病患者は血糖のコントロールが良好で、肥満度も非糖尿病患者と類似していた。また、両者において歯周疾患の進行状態は類似していた。この結果から、血糖のコントロールが良好な2型糖尿病患者の歯周疾患の進行状態は、非糖尿病患者と同様であることが示唆された。3)平成17年度2型糖尿病患者に非外科的歯周治療を行った場合の、炎症性メディエーターの変化について研究を行った。2型糖尿病患者では非糖尿病患者に比べてCRPおよびIL-6がより高濃度に産生され、4種の歯周病原性細菌に対する抗体産生は両方のグループで類似しており、抗体産生については同様の反応1が示された。また、非外科的な歯周治療を行った結果、臨床的、細菌学的な効果が得られたことにより、2型糖尿病患者においても非糖尿病患者と同様に歯周組織の炎症が軽減し、肝細胞からのCRP産生を誘導すると考えられているIL-6の減少に伴いCRPの減少が確認されたと考えられる。4)平成18年度2型糖尿病患者に対する歯周外科治療の効果について研究を行った。重度歯周炎を併発した2型糖尿病患者に歯周外科治療(全顎的Flap Operation)を行った結果、歯周組織の炎症は非糖尿病患者と同様に改善し、血清中のCRPおよびIL-6濃度は減少した。2型糖尿病患者の歯周治療開始時のTNF-α濃度は非糖尿病患者に比べて低い状態で、歯周治療後も有意な変化は見られなかった。この症例の血糖のコントロールの改善は主に体重の減少によると考えられるが、歯周組織の炎症の消退は炎症細胞からのTNF-α産生を抑制し、血糖のコントロールの改善に寄与することが示唆された。本年度は、糖尿病患者と非糖尿病患者における肥満と歯周疾患との関係について研究を行った。目的:2型糖尿病患者と非糖尿病患者における肥満と歯周疾患との関係について調べること。被験者と方法:被験者-110名の2型糖尿病患者(女性50名、男性60名、3079歳)、110名の非糖尿病患者(女性82名、28名男性、3059歳)。研究方法-被験者は、糖尿病と歯周疾患についての質問にアンケート形式で解答し、血液検査を受けた。非糖尿病患者については、Community Periodontal Index of Treatment Needs (CPITN)を用いて歯周疾患検診を行った。Body-mass Index (BMI)と血清中のhigh-density cholesterol (HDL)、CPITNを用いた検診結果、アンケート解答結果について分析した。

結果:年令が対照者と一致した2型糖尿病患者28名でBMIが22kg/m^2以下の患者では、HDLは78.8±18.5mg/dlで、BMIが22kg/m^2以上の患者では49.9±12.2mg/dl(p=0.0005)であった。非糖尿病患者では、BMI 22kg/m^2以下の被験者ではHDLは67.3±15.1mg/dlで、BMIが22kg/m^2以上の被験者では57.3±10.6mg/dl(p=0.0005)であった。10歯以上の歯の喪失率は、BMIが22kg/m^2以下の2型糖尿病患者では5.3%で、BMIが22kg/m^2以上の患者では26.3%(p=0.0486)であった。非糖尿病患者のCPITNは、HDLが60 mg/dl以下の被験者では9.4±10.8で、HDLが60mg/dl以上の被験者では5.5±8.7(p=0.0429)であった。BMIが22kg/m^2以下の非糖尿病患者ではCPITNは6.1±9.3でBMIが22kg/m^2以上の被験者では8.7±10.5(p=0.1655)であった。アンケート調査を分析した結果、肥満とプラークコントロールの状態および歯科治療の経験の有無の間に関連が見られた。結論:2型糖尿病患者および非糖尿病患者において、歯周病の症状はBMIが22kg/m^2以上の肥満した被験者およびHDLが60mg/dl以下の被験者に見られ、肥満と歯周疾患は関連があることが示された。本年度は、2型糖尿病と肥満と歯周疾患の進行状態との関係について研究を行った。(目的)歯周疾患の進行と2型糖尿病の関係を知るために、糖尿病患者と非糖尿病患者における歯周疾患の進行状態を評価すること。(被験者と方法)被験者-歯学部附属病院に来院し協力が得られた64人の患者(2型糖尿病患者12人、非糖尿病患者52人)。研究方法-糖尿病の罹患状態として血糖値とHbA1c、肥満度(BMI)を求めた。歯周疾患の進行状態として歯周ポケットの深さ、ポケット測定後の歯肉からの出血および歯の動揺度、残存歯数、歯槽骨の吸収度を評価した。歯周ポケットは03、46、7mm以上の深さに分け、歯の動揺度は0,1,2,3度に分けてそれぞれの比率を計算した。歯槽骨の吸収度は、レントゲン写真上でSheiのscaleを用いて比率を計算した。(結果)糖尿病患者は2型糖尿病で、薬剤による治療を受けていた。糖尿病患者のHbA1cは5.9%から10.7%で、12人中7人は7%以下であった。BMIの平均値は、糖尿病患者では22.3、非糖尿病患者では23.1であり、両者間に統計学的に有意な差は見られなかった。歯周疾患の進行状態では、歯周ポケットの深さが03、46、7mm以上の平均比率は、糖尿病患者では82.1、14.1、2.9%であり、非糖尿病患者では、86.7、11.8、1.6%であった。歯の動揺度を0、1、2、3度で分けた平均比率は、糖尿病患者では52.1、32.5、12.8、2.8%で、非糖尿病患者では55.2、31.2、12.5、0.9%であった。歯槽骨の吸収の平均比率は、糖尿病患者では22.1%であり、非糖尿病患者では19.2%であった。これらの歯周疾患の進行状態に関する結果において、糖尿病患者および非糖尿病患者の間に統計学的に有意な差は認められなかった。(結論)この研究において、糖尿病愚者は血糖値のコントロールが良好であった。肥満度も非糖尿病患者と類似していた。また、両者において、歯周疾患の進行状態は類似していた。
内因性血管作動性物質の気道上皮繊毛運動への影響

気管繊毛上皮細胞の繊毛打周波数(CBF)制御における一酸化窒素(NO)の役割をラット培養気管繊毛上皮細胞を用いて検討した。NOC-12およびGSNO (NOドナー)、L-アルギニン(NO前駆体)、8-BrcGMP (cGMPアナログ)、イソプロテレノール(β受容体刺激薬)、8-BrcAMP (cAMPアナログ)はCBFを増加させた。L-アルギニン、イソプロテレノールおよび8-BrcAMPによるCBF亢進はL-NMMA (NO合成酵素阻害薬)、ODQ (可溶性グアニレートシクラーゼ阻害薬)およびKT5823(PKG阻害薬)により抑制された。L-NMMA、ODQ、KT5823単独投与はCBFに影響しなかった。培養繊毛上皮細胞にDAF (NO感受性蛍光色素)を負荷し、NO産生を画像蛍光強度より解析した。DAF負荷後、繊毛上皮細胞に一致して蛍光が観察された。L-アルギニン投与により蛍光強度およびCBFが増加した。L-アルギニンによるこれらの増加はL-NMMAの同時投与により消失した。L-NMMAの単独投与は蛍光強度およびCBFを増加させなかった。蛍光強度増加とCBF増加の間には有意の正の相関関係が存在した。以上より、気管繊毛上皮細胞はNOを産生すること、産生されたNOはautocrine/paracrineに働くこと、NO-cGMP-PKG系は気管繊毛運動を制御していること、β受容体-cAMP-PKA系による繊毛運動亢進にはNO-cGMP-PKG系が関与することが明らかとなった。静脈麻酔薬であるプロポフォールのCBFへの影響とNOの役割を検討した。プロポフォールはCBFを用量依存性に亢進させた。プロポフォールによるCBF亢進は、L-NMMA、ODQ、KT5823により用量依存性に抑制された。以上より、プロポフォールはNO-cGMP-PKG系を介して繊毛運動を亢進させることが明らかとなった。気管繊毛上皮細胞の繊毛打周波数(Ciliary Beat Frequency,CBF)制御における一酸化窒素(NO)の役割を検討した。ラット気管繊毛上皮細胞を培養し、位相差顕微鏡下に繊毛運動画像をビデオに記録しCBFを解析した。L-アルギニン(NO前駆体)および8-BrcGMPはCBFを用量依存性に増加させた。またCBFはNOC-12およびGSNO(NOドナー)、zaprinast(cGMPフォスフォジエステラーゼ阻害薬)により増加した。L-アルギニンによるCBF亢進は、L-NMMA(NO合成酵素阻害薬)、ODQ(可溶性グアニレートシクラーゼ阻害薬)、KT5823(プロテインキナーゼG(PKG)阻害薬)により用量依存性に抑制された。L-NMMA、ODQ、KT5823単独投与はCBFに影響を与えなかった。続いて、ラット培養気管繊毛上皮細胞にNO感受性蛍光色素diaminofluorescein(DAF)を負荷し、NO産生を画像蛍光強度より解析した。DAFを負荷しなかった細胞には蛍光が観察されなかった。L-

アルギニン投与により蛍光強度およびCBFが増加した。L-アルギニンによるこれらの増加はL-NMMAの同時投与により消失したが、D-NMMAの同時投与には影響されなかった。D-アルギニン、D-NMMA、L-NMMAのそれぞれ単独投与は蛍光強度およびCBFを増加させなかった。蛍光強度増加とCBF増加の間には有意の正の相関関係が存在した(r=0.81)。以上より、気管繊毛上皮細胞はNOを産生すること、産生されたNOはautocrine/paracrineに働くこと、NO-cGMP-PKG系は気管繊毛運動を制御していることが明らかとなった。静脈麻酔薬であるプロポフォールのCBFへの影響とNO-cGMP系の役割を検討した。イントラリピド(プロポフォールの臨床使用上の溶媒)はCBFに影響しなかったが、プロポフォールはCBFを用量依存性に亢進させた。プロポフォールによるCBF亢進は、L-NMMA、ODQ、KT5823により用量依存性に抑制された。以上より、プロポフォールはNO-cGMP-PKG系を介して繊毛運動を亢進させることが明らかとなった。β受容体刺激による気管繊毛運動亢進における一酸化窒素(NO)の役割を検討した。ラット気管繊毛上皮細胞を培養し、位相差顕微鏡下に繊毛運動画像をビデオに記録し繊毛打周波数(Ciliary Beat Frequency, CBF)を解析した。β受容体刺激薬であるイソプロテレノールはCBFを用量依存性に増加させた。またβ受容体の細胞内セカンドメッセンジャーであるcAMPの薬理学的類似体である8-BrcAMPもまたCBFを用量依存性に増加させた。イソプロテレノールおよび8-BrcAMPによるCBF亢進はL-NMMA(NO合成酵素阻害薬)、ODQ(可溶性グアニレートシクラーゼ阻害薬)、KT5823(プロテインキナーゼG(PKG)阻害薬)により用量依存性に抑制された。イソプロテレノールおよび8-BrcAMPによるCBF亢進はKT5720(プロテインキナーゼA(PKA)阻害薬)により用量依存性に抑制された。アムリノン(フォスフォジエステラーゼタイプIII阻害薬)およびロリプラム(cAMPフォスフォジエステラーゼ(タイプIV)阻害薬)はCBFを増加させた。以上より、β受容体-cAMP-PKA系による気管繊毛上皮細胞の繊毛運動亢進にはNO-cGMP-PKG系が関与することが明らかとなった。気管繊毛運動制御にはcAMP-PKA系とcGMP-PKG系の両者が関与することが明らかとなった。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の気管繊毛運動への影響を検討した。ANP-A受容体のリガンドであるα-rANPはCBFを減少させた。ANP-A受容体刺激は細胞内cGMP濃度を亢進させることが知られており、この結果はcGMPが繊毛運動亢進をおこすことと矛盾する。現在、その機構の解明にむけて検討を行っている。
フルクタン合成遺伝子の導入による切花の着色・開花の改善と老化の制御

(1)低照度条件がトルコギキョウの花弁着色に及ぼす影響について調査した。植物体全体あるいは茎葉部のみを遮光すると(1,000 1x)花色が薄くなったが、花のみを遮光した場合には花色に影響は見られなかった。花を花柄部で切り離しスクロース溶液に浸漬させた状態で開花させると、スクロース濃度の上昇とともに花弁の色は濃くなり、さらにカルコン合成酵素、カルコン異性化酵素、ジヒドロフラボノール4-還元酵素の遺伝子の発現量が促進された。以上の結果は、低照度環境下では、花への光合成産物の供給不足により花色が低下することを示した。(2)トルコギキヨウの葉片を、0.05mg/l IBA、1mg/l BA、および0.1mg/l GA3 MS培地で培養すると、葉片あたり8から18本のシュートが発生した。このシュートを、IAAを含むMS培地に7から10日おいた後、0.5mg/IBAを含む1/2倍濃度のMS培地に移植すると約1ヶ月半で発根が確認された。(3)オオムギのフルクタン合成遺伝子(6-SFT)およびBacilus subtilisのもつSacB遺伝子をpBI121とAgrobacterium tumefaciens LBA4404を用いて、トルコギキョウヘ導入を行った。SacB遺伝子にはサツマイモのスポラミンがもつ液胞移行シグナル配列を連結した。6-SFT遺伝子については、選抜の結果組み換え体は得られなかった。一方、SacB遺伝子については、カナマイシン選抜で32個体が残り、そのうちの15個体に対してPCR及びサザンハイプリダイゼーションによる検定を行ったところ、これらすべてから、レバンスクラーゼ遺伝子が検出され、遺伝子が導入されたことが確認された。(4)トルコギキョウ外植体は発根とそれ以降の生育が悪く、組み換え体を開花する植物体にまで生育させることはできなかった。フルクタン合成遺伝子の導入の影響を調べるためには、遺伝子導入後の培養条件、順化条件をさらに検討する必要がある。トルコギキョウの切り花は、ふつう開花した花だけでなく未開花の蕾を持つ。ある程度生長した未開花の蕾は、室内環境でもいずれは開花するが、花色は薄く花弁は非常に貧弱である。このような花の着色と生長を高めることは、切り花の商品価値を高める上で重要である。これまでの研究から、未開花の蕾が室内環境では十分発達しないのは、茎葉部から花へのショ糖の供給が不足するためであることが推定された。そこで、本研究は、トルコギキョウに貯蔵炭水化物であるフルクタンの合成遺伝子であるフルクトシルトランスフェラーゼを遺伝子導入し、それにより蕾の開花着色が弱光下でも十分に達成されるのかを調べることを目的とした。1.培養系の確立。形質転換体を得るためには、無菌の試料が必要である。トルコギキョウは栽培に非常に時間を要するため、in vitroの培養系が確立していることが望ましい。各種培養法の検討の結果、通常のMS倍地上で側芽を茎頂培養することにより効率的に増殖および培養が可能であった。また、in vitroの培養後、バ-ミキュライトを入れたポットに移植し、人工気象室内で順化させた。この植物体は、光源として電球色の蛍光灯を用いることにより人工気象室内でも栽培することが可能であった。

白色および昼白色の蛍光灯を用いると、茎の伸長が抑制されるとともに過剰に分枝するなど植物体の形態に異常がみられた。2.ベクターの作成オオムギをバ-ミキュライトを含むポットに播種し、20°C、16時間日長下で発芽させた。第1葉が10cm程度まで生長したところで、葉を切り取り、脱塩水に挿して24時間日長下に置いた。この処理によりフルクトシルトランスフェラーゼの発現が誘導されることが報告されている。2日後、葉を回収しRNAを抽出した。これを鋳型としてRT-PCRを行い、フルクトシルトランスフェラーゼDNAを単離し、クローニングを行った。これをさらにベクターに組み換え、アグロバクテリウムによる形質転換に用いる計画である。トルコギキョウは主に切り花として用いられるが、収穫時に未開花の蕾はその後開花することはなく、開花途中の花でも十分には開花せず花色は著しく衰える。未開花の蕾が収穫後に十分発達しないのは、茎葉部から花へのショ糖の供給が不足するためであることがこれまでの研究から明らかとなった。そこで、本研究では、トルコギキョウに貯蔵炭水化物であるフルクタンの合成遺伝子を導入することによって茎葉部における貯蔵炭水化物含量を高め、収穫後の花の発達と着色を改善することをこころみた。オオムギとBacillus subtilis Murburgが持つ2種類のフルクタン合成遺伝子を導入した。オオムギの芽生えからフルクトシルトランスフェラーゼを既報にしたがって発現誘導し、PCR法によりこの遺伝子を単離した。また、Bacillus subtilis MurburgのもつレバンスクラーゼをコードするSacB遺伝子をPCR法により単離した。レバンスクラーゼは細胞外で発現するため、単離したSacB遺伝子の上流にサツマイモの貯蔵タンパク質であるスポラミンがもつ液胞移行シグナル配列を結合し、SacB遺伝子が液胞で発現するように改変した。これら2種類の遺伝子をプラスミドpBI121に挿入し、Agrobacterium tumefacience4404を利用してトルコギキョウの葉片に感染させた。感染させた葉片から多数のシュートが得られ、現在これらの選抜を行っている。
内分泌シグナル系と形態形成シグナル系のクロストークを応用した乳癌治療法開発

乳癌では形態形成シグナル系であるHedgehog(Hh)シグナルが再活性化し、治療標的となることを報告したが、本研究において、Estrogen receptorα(ERα)経路活性化によるShh(Hedgehogシグナルのリガンド)の発現誘導が、リガンド依存性のHhシグナル活性化をもたらす機序を初めて報告した。両シグナルの連関は、乳癌組織においても稼動している可能性が示され、両シグナル系の連関を視野に入れた治療法開発の可能性を示した。我々は、乳癌において高率にHedgehog(Hh)シグナル系が活性化し、治療標的となりうる可能性を報告した(Kubo, et. al.Cancer Reg,2004)。本研究においでは、乳癌におけるHhシゲナル系活性化の機序としてのEstrogen receptor(ER)の関与を明らかにし、新たな治療法開発に応用することを目的とした。本年度の研究計画に沿って成果を記載する。1.乳癌におけるERシグナルとHhシグナルの関速解析:1)ER陽性乳癌細胞およびER陰性乳癌細胞を標的細胞として、ER活性化(エストラジオール添加)によるHh系リガンドであるShhの発現誘導、ERシグナル抑制(ICI 182、780、ERa dominant negative)によるShh発現抑制を明らかにし、ER経路の活性化によるShh発現の連関を明らかにした。2)さらに、ER経路の活性によるShh発現を介したリガンド依存性ER陽性乳癌細胞特異的Hh経路活性化を証明し、Hhシグナル経路とER経路間のクロストークを明らかにすることができた。3)これらクロストークが実際の乳癌組織でも存在する可能性を、手術時摘出乳癌組織にて示した。2.ER経路とHhシグナルのクロストークを利用した治療法の検証:1)ER陽性乳癌細胞におけるER経路活性化による増殖促進とER経路阻害による増殖抑制を明らかにし、ER経路とHhシグナル系の連関を視野に入れた治療戦略の可能性を得た。我々は、乳癌において高率にHedgehog(Hh)シグナル系が活性化し、治療標的となりうる可能性を報告した(Kubo et al. Cancer Res,2004)。本研究においては、乳癌におけるHhシグナル系活性化の機序としてのEstrogen receptor(ER)の関与を明らかにし、新たな治療法開発に応用することを目的とした。1)ERシグナルとHhシグナルのcross talkを利用した治療法の検証(19年度の継続)。低重力培養装置を応用し手術時摘出乳癌組織を3日間培養する系において、ERシグナル阻害剤やRhシグナル阻害剤による細胞増殖抑制をKi-67染色の系により確認した。手術摘出乳腺組織(浸潤癌56例、DCIS50例、良性病変34例、計140症例)を用いて、Hh関連分子(Shh,Ptchl,Glil)及びER関連分子(ERa,pS2)発現を免疫組織染色法により解析した。その結果、予想通り、Hhシグナル系活性化と癌化特に浸潤能獲得との関連結果を得た。現在、micro-dissection法より微小浸潤性乳癌における浸潤部と非浸潤部の解析へと進展した(日本外科学会総会などで一部発表)。3)その他の重要な成果。Hh活性化が増殖促進のみではなく浸潤に関与していること(Anticancer Res, in press、Cancer Sci,99:1377,2008)、さらには同様のシグナル系の連関がERa陽性胃癌においても存在することが細胞株および胃癌組織レベルで明らかにされつつあり、本研究の成果が内分泌経路と形体形成シグナル系の連関に焦点を当てた新たな治療法開発の可能性へと進展した(日本外科学会総会などで一部発表)。
変温脊椎動物色素細胞の光受容機構の微細構造的研究

アフリカツメガエル幼生、メダカ(BR)の光感受性色素胞には、構造的に類似した膜状突起が複数存在する。しばしばラメラ状の膜を含むこの構造は、従来記載された光受容器などの感覚受容器と類似しているが、繊毛由来ではない。光感性の海産魚Trematomusの黄色素胞には認められないが、反応性を欠くメダカの変異系(dm、dmー2)の色素胞には存在する。光感性は確認されていない色素胞以外の皮膚細胞にも近似の構造が少数見られる。光に応答するガンガセDiademaの色素胞には、類似する膜突起は全く認められない。抗ウシロドプシンモノクロ-ナル抗体を用いての、アビジン・ビオチン系による視物質の蛍光抗体法検索は、組織包埋切片、培養細胞についておこなわれた。ツメガエルでは、網膜色素上皮細胞の切片標本に強い蛍光が検出されたが、尾部色素胞は切片で陰性、培養細胞で弱陽性であった。金コロイドをマ-カ-としての免疫電顕検索は、Triton処理・抗体ラベル・通常包埋のpre-embeddingと、アルデヒド前固定・低温樹脂包埋・薄切・抗体ラベルのpost-embeddingによって行った。Pre-embedding法ではツメガエル色素胞は陰性であり、post-embedding法では僅かにラベルが認められた。Post-embedding法における固定法の改良によって膜構造、抗原の保存を今後一層向上させる余地があるものと考えられる。メダカおよびすでにロドプシン様物質の存在が報告されているネオンテトラ色素胞では今回の検索はすべて陰性であった。光感受性の高い黒色素胞を多数含むツメガエル幼生尾部のヒレの抽出液のウエスタンブロッテイングでは、幼生の網膜由来のロドプシン(ポルフィロプシン)相当部位(約40K)にバンドが認められたが、その同定には至っていない。今後は試料の蛋白濃度、一次抗体の濃度をあげての検討が必要である。1.細胞突起と特殊膜構造:光感受性のあるアフリカツメガエル幼生黒色素胞およびメダカ成体の黒・黄・白色素胞には,特殊膜構造を含み,ストークによって細胞体と連結された突起が存在する.突起内膜は管状又はラメラ状構造を呈し,この部分には他の細胞質成分は認められない.ストークには,通常固定・薄切標本では不定形の物質の存在がみられるが,微小管の存在は稀である.シーラカンスの黒色素胞,ネオンテトラの紅色素胞で,細胞内部に観察される層状膜構造が光受容膜である可能性が示唆されているが,細胞表面に突起として存在するアフリカツメガエルやメダカ色素胞のものとはあきらかに異なっている.突起は,従来知られている光受容器と類似点を持つが,内膜配列の規則性が梢低い点は,圧力受容ないしそれ以外の機能を持つ可能性を〓示している.微小管末との連絡のないところから,これらの細胞突起は脊椎動物視細胞外節のような繊毛由来とは考えられない.ストークの構造が,アクチンを含むか否かは不明である.上記については第58回日本動物学会大会および日本色素細胞学会第3回大会で報告された.2.明暗適応と膜構造:色素胞の凝集あるいは拡散反応を起させるに足る比較的短時間の明・暗所適応後の比較では,顕著な構造変化は見出されなかった.なお,ウニの光感性包素胞については,固定法の改良を含め現在準備段階にある.3.視物質の細胞内分布:アクションスペクトルからは,特にアフリカツメガエルで視物質の存在が示唆される.

抗ロドプシンモノクローナル抗体を用いての間接蛍光抗体法,金コロイドラベルによる電子顕微鏡レベルの視物質の色素胞内分布の検索をすでに始めている.抗ウシロドプシンモノクローナル抗体を用いて、アフリカツメガエル、メダカ網膜色素上皮細胞および眞皮性色素細胞内の視物質分布の蛍光抗体法、金コロイド粒子をマーカーとする免疫電顕による検索をおこなった。色素上皮細胞においては、視細胞外節に由来すると思われるミエロイド構造のみが蛍光抗体法、免疫電顕法共に強い陽性反応を示したが、色素果粒やその他の細胞内器官には反応はみとめられなかった。当該細胞では、明暗順応の際の色素果粒の凝集・拡散運動はミエロイドボデイ・トランスロケーター間の信号伝達系によって制御されているものと考えられる。眞皮性色素細胞の蛍光抗体検索では、100%の光反応性を示すアフリカツメガエル幼生尾部の黒色素胞に陽性反応がみとめられたが、メダカでは感光性物質の局在は証明されていない。アフリカツメガエルの黒色素胞についても、電顕レベルではin situおよび分離した色素細胞を用いて低温重合樹脂切片上の視物質分布検索をおこなったが、化学固定に起因する微細構造保持の不全から色素細胞表面の特化した膜構造あるいはミエロイド構造と視物質との関連を示すまでには至っていない。固定法、抗原検出感度の改良を目下検討中である。ロドプシンあるいはポルフィロプシンの分離・定性のために、アフリカツメガエル幼生尾部の黒色素標本が現在相当量ストックされている。明暗順応の特殊な例として、夏期の、連続日照下にある高緯度の南極海において採集された2種の硬骨魚の色素細胞の微細構造研究が平行して進行中である。特に、この中の1種Trematomus bernacchiの黄色素胞はあきらかな光感受性を示す。顕著な光感受性を示すウニ色素胞の微細構造、視物質検索に関しては、現在数種の固定法の比較をおこなっている段階である。低温重合樹脂超薄切片についての抗ロドプシンモノクロ-ナ抗体を用いてのストレプトアビジン・金コロイド系による免疫電顕検索では、光感受性のアフリカツメガエル幼生黒色素胞に弱い反応が認められたが、細胞内小器官と対応させるに充分な構造保持条件はまだ発見されていない。膜の保存は完全でないが、網膜色素上皮細胞内のミエロイド構造は強陽性に反応するので、固定法に改良を加えることでより明確な結論が得られるものと期待される。光顕的には、蛍光抗体法によって、ツメガエルの分離黒色素胞に微弱な陽性反応が認められたが、ポリエステル包埋組織切片上では確認されず、メダカ黒色素胞、抗原性物質の存在が報告されているネオンテトラ虹色素胞を用いた場合にも陰性であった。光感受性メダカ色素胞、ツメガエル黒色素胞に共通に存在する細胞表面の膜性突起は、構造的に感覚受容膜に類似するが、同様の構造は光感受性が確認されていない色素胞以外の皮膚細胞にも少数存在している。また、反応性のないメダカ変異株の色素胞に存在している反面、光に反応する南極海産の硬骨魚Trematomusの黄色素胞には存在していない。また、光感受性のガンガセDiadema setosumの色素胞にも類似の構造は全く認められない。但し、メダカ変異株での運動性欠如は、感覚受容器よりも細胞内運動系の欠損とみられる。ツメガエル色素胞におけるロドプシン様物質の分布は、幼性尾部のヒレSDS抽出分画について免疫ブロッティングによって検索された。
エピジェネティック異常を標的とした新規慢性腎臓病治療法の開発

エピジェネティック機構は、遺伝子スイッチとして作用する。臓器障害がおきると、構成細胞の性質が変わり、正常な働きをしなくなる。本研究により、慢性腎臓病でみられる腎臓の線維化反応や炎症にエピジェネティク機構が関わることが示された。腎臓でのエピジェネティク異常を予防、治療することが新たな慢性腎臓病の治療になる可能性が示唆された。エピジェネティック機序は、障害・防御因子の発現調節を介して臓器修復反応に関与している。我々は、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の抑制が腎保護作用を発揮することを報告してきた。本研究では、慢性腎臓病でのヒストン修飾およびDNAメチル化の変化を明らかにし、それを標的とした治療を開発することを目的にしている。本年度は、尿細管間質障害モデルを用いた検討を中心に研究を進めた。尿管を結紮したUUOモデルではHDAC1,HDAC2の発現が上昇することを我々は報告している。本年度は、新たにHDAC阻害作用がその薬理作用として注目されているバルプロ酸が、UUOでみられる腎臓尿細管間質障害に対して有効であるかどうか検討した。バルプロ酸は飲水に混じて投与し、腎臓は組織学的におよび炎症・線維化関連遺伝子発現について検討した。さらに、培養尿細管細胞NRK52E細胞のケモカイン発現に対するバルプロ酸の効果を検討した。その結果、障害腎でのcollagen la,alpha SMAmRNAの増加ならびにマクロファージマーカーF4/80 mRNAの増加はバルプロ酸で有意に低下し、腎組織は改善傾向を示した。一方、障害腎で低下したBMP-7の発現は増加傾向であった。バルプロ酸は培養尿細管細胞のBMP-7の発現を著明に増加させTNF-alphaによるケモカインCSF-1の誘導を抑制した。これらのバルプロ酸の作用は構造の異なるHDAC阻害薬トリコスタチンとほぼ同一であった。以上の検討から、臨床的に用いられているバルプロ酸はHDAC阻害作用を介して腎臓尿細管間質障害に対して有効であることが示唆された。さらに次年度にむけて、ヒストン修飾、DNAメチル化とその修飾酵素の変化の検討を進めている。本年度は、糖尿病性腎症モデルでのエピジェネティック異常についてDNAメチル化を中心に解析をすすめた。とくに腎機能悪化に対する新たな治療ターゲットとなりうる、腎症初期に変化するDNAメチル化を解析した。糖尿病性腎症モデルにはdb/dbマウスを用いた。db/dbマウスは5週令から高血糖と肥満を呈しはじめ、やがてアルブミン尿および腎臓組織変化を生じる。本研究では10週令雄性db/dbマウスを用いて検討をおこなった。db/+を対照に、mRNA発現変化が生じる遺伝子をスクリーニングし、約30個の候補遺伝子を選定し、各遺伝子についてCOBRA法によってDNAメチル化の変化の有無を解析した。さらに腎臓細胞をFACSによって近位尿細管細胞とその他の分画にわけ、各集団での解析も行った。その結果、db/dbマウスでは腎臓全体でnox4遺伝子のbodyおよびpromoterで有意なDNA脱メチル化が生じていることが判明した。ソーティング後の解析ではdb/+、db/dbマウスともに近位尿細管細胞のnox4遺伝子は10%以下と低メチル状態である一方、非近位尿細管分画では50%以上の高メチル状態であり、DNAメチル化が近位尿細管特異的な発現をコントロールしていると考えられた。重要なことに、db/dbマウスでは、db/+に比して非近位尿細管でのnox4 promoter DNAのメチル化が減少していた。さらに、培養尿細管細胞に脱メチル化薬5-aza-cytidineを加えると、TGFbetaによるnox4 mRNA誘導が増強されることが観察された。以上の検討から、糖尿病性腎症でnox4 DNAのメチル化が減少していることが明らかになった。非近位尿細管でのnox4 DNA脱メチル化は、本来発現が低い部位でのnox4 mRNAの増加に関与し、酸化的ストレスの増加を介して腎症進展に関わる可能性が示唆された。昨年度までの検討で、障害をうけた腎臓では、DNAメチル化およびヒストン修飾変化が生じることが明らかになった。本年度は、認められたエピジェネティック異常の原因となる修飾因子について検討を加えた。最近、ストレス応答蛋白gadd45betaがDNAの脱メチル化反応を引き起こすことが報告されている。そこで腎臓障害でのgadd45betaの発現変化と機能について検討した。一側尿管結紮(UUO)および、虚血再還流モデルについて検討を行った。モデル作成には8週令雄性C57Bl6マウスを用いた。また、ヒト近位尿細管細胞を培養し、gadd45beta発現を変化させる因子を探索し、gadd45beta siRNAを用いて機能を検討した。障害腎でgadd45beta mRNA発現はUUOモデルで約4倍に、虚血再還流モデルで2.7倍に上昇した(p<0.01)。

培養尿細管細胞を用いた検討で、TGF-betaがgadd45betaを誘導することが明らかになった。gadd45betaに対するsiRNAを処置すると、collagen 1a mRNAの発現が60-70%増加する(p<0.01)ことから、gadd45betaは抗線維化作用を持つと考えられた。gadd45betaは腎障害の初期に誘導される内因性の抗線維化因子であると思われた。抗線維化作用がどの段階で生じ、そこにDNAメチル化変化が関与しているかどうかについて現在検討を進めている。本研究によって、gadd45betaが腎障害を抑制する因子であることが明らかになった。薬物によって腎臓特異的にgadd45beta誘導することができれば、新たな腎臓病治療法の開発につながると考えられた。本年度の研究により、腎臓構成細胞ごとの解析をすることにより、腎臓内でDNAメチル化によって特異的発現が制御されている遺伝子が複数存在することが新たに明らかになった。さらに、糖尿病性腎症でDNAメチル化異常を呈する遺伝子がnox4をはじめ複数得られ、新たな治療開発へむけた基盤になると考えられた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、DNAメチル化異常に至るまでにヒストン異常が生じているのか、糖尿病のどの因子が原因となっているか解明し、エピジェネティック異常を予防・治療する足がかりを得たいと考えている。さらに、網羅的な解析も用いることによって、より多くの候補遺伝子を得たうえで、病態に意義のある異常を同定する予定である。