hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動錯覚と運動イメージを同期させたニューロリハビリテーションデバイスの開発

本研究の目的は、運動錯覚生成メカニズムに及ぼす運動イメージ能力の影響を解明し、ニューロリハビリテーション介入時に運動イメージ能力を高めながら、感覚運動機能を改善させる効果的な脳内神経機能再編成システムを構築することであった。振動刺激時の脳内神経活動についてMicrostate法解析を行った結果、錯覚誘起には運動イメージ能力が影響を及ぼすことが明らかとなった。また、脳卒中片麻痺患者に対して、我々が開発した脳波周波数パターン認識型システムを用いた介入を実施した結果、感覚運動関連脳領域の神経活動性に向上を認め運動主体感も改善を認めた。以上より、本システムの介入手法としての有用性が示唆された。これまで,振動刺激によって生成される運動錯覚は,健常者の脳内感覚運動皮質領野の神経活動性を高めることを見出した。しかし,その生成に影響を及ぼすとされる運動イメージ能力との関連性は未だ明らかではなく,脳血管障害患者にみられるような脳機能障害を呈する状態とのメカニズムに関する機能的差異は解明されていない。これらの点が明らかとなれば,振動刺激を用いた治療介入時に,同期的に運動イメージをシミュレートさせることで,より強力に感覚運動機能の再編へ向けた神経基盤の構築が可能になる。本研究は,運動錯覚生成過程における感覚運動領野を中心とした脳内関連領野の神経活動性および脳機能ネットワークを解明し,さらにそれらの結果を応用することで,ニューロリハビリテーションツールとしての多感覚刺激装置を開発するための基礎研究である。平成27年度は,装置の基本システムの実証と運動錯覚生成メカニズムに及ぼす運動イメージ能力の影響および機能解明を目的に取り組んだ。まず,装置開発の基本的なシステムとなるニューロフィードバックの介入効果について検討した。難治性疼痛患者に対して脳波信号のフィードバック介入を実施した結果,疼痛や不安傾向に減少が認められ,かつ脳波周波数解析から脳神経活動も変化することを報告した。さらに,脳血管障害患者に対する振動刺激によって,脳内に惹起される運動錯覚が脳神経活動へ及ぼす影響を検討した。その結果,運動イメージ誘起に関与するとされる感覚運動領野の有意な神経活動性を認めた。運動障害をもつ脳血管障害患者においても,運動錯覚が感覚運動領野の神経活動性を高める可能性を報告した。これらのことから,運動錯覚と運動イメージ能力の関係性や基本システムの有用性は明らかとなったが,装置開発に向けて,脳の半球間の活動特性や機能的関連性についての詳細な検証は,現在も研究を継続中である。平成27年度,多感覚刺激装置開発へ向けたシステム構築において重要となる,脳機能障害患者における運動錯覚の影響とニューロフィードバックの有用性に関しては,検討し報告した。中でも,運動の実行へ向けた脳内神経活動に関して,その事前の活動として必要不可欠となる運動イメージ能力を誘起する脳領野が,運動錯覚の影響を受けることを明らかにした点は大きな進展であると考える。本年度は,ニューロリハビリテーションツールとしての多感覚刺激装置を開発するための基礎研究に取り組んだ。まず,脳血管障害患者においても健常者と同様に振動刺激による運動錯覚が脳内に誘起されるかどうかについて検証した。その結果,運動イメージ創出に関連する感覚運動領野の神経活動性を認め,その手法の有用性を報告した。しかし,半球間の機能バランスの回復が優先となる重度の麻痺を有する患者などへの介入手段とするためには,障害のない脳機能状態において,運動イメージ中の両側同期的に活動する領域の存在やそれらの機能的な連関性について検証しておくことが重要となる。そのため,健常者における左右の運動イメージ時の脳活動領域で出現する周波数パターンの様相について,検討を行った。方法は,運動イメージに関連する電位は運動準備電位(MP)を分析した。運動イメージ時の脳領域として左右のSMC,PMCおよびM1を関心領域として設定し,MP出現時における本領域の神経活動性および神経相関について脳機能イメージング法sLORETA解析を用いて検証した。その結果,MPでは左右関心領域の神経活動性を認め,各課題時における運動指令側の周波数パターンは半球間に神経相関を認めた。以上より,左右一側ずつの手指運動イメージを別々に行っても同一個体では同様の周波数パターンを呈することが明らかとなった。本結果を踏まえ,非損傷脳のイメージ中の脳機能パターンをセンシングし損傷脳へティーチングするシステム(特許申請中)を考案し,現在も研究を継続中である。平成28年度,多感覚刺激装置開発へ向けたシステム構築において,脳機能障害者においても,運動錯覚により創出される運動イメージが脳内神経活動を賦活させることを報告した。また,健常脳における運動準備時の脳活動において,補足運動野が両側同期的に活動する可能性も見出されたが,脳活動時の周波数パターンの同定を現在実施しているため「おおむね順調に進展している。」と判断した。平成27および28年度を通じて、ニューロリハビリテーションツールとしての多感覚刺激装置を開発するための基礎研究の実施と、脳卒中片麻痺患者の非損傷脳のイメージ中脳機能パターンをセンシングし損傷脳へティーチングするシステム(特開2017-102504)を考案した。本年度は、本システムの臨床応用を目標に、脳卒中患者への介入を実施した。感覚運動障害を呈する延髄梗塞の患者に対してトレーニングを行った。方法は、まず健側手指運動イメージ時の脳神経活動パターンが、非障害側脳からセンシングされた脳波周波数パターンと一致した際、患側手指の上に設置したモニター上の自身の手指画像が伸展方向へ動くようにシステムを設定した。

結果、開始時所見に比較し最終時所見では、Fugl-Meyer Assessment上肢(FMA)、運動主体感に関する質問(麻痺している手指を動かした際、自分自身が動かしたという感覚はどれくらいありますか?)のNRS(0-10点)、精神症状を評価するHospital Anxiety and Depression scale(HADS)不安項目、身体認知の評価であるThe Bath CRPS Body Perception Disturbance Scale(BPDS)において改善を認めた。また、最終週のトレーニング成功回数は、1週目の平均回数9.8回から、59.7回と向上した。脳波イメージングでは、開始時に比べ最終時の方が両側補足運動野を中心とした感覚運動関連領域の高い神経活動性を認めた。これらの結果から脳波解析手法を基盤とした本システム介入手法が有用である可能性が示唆された(第10回日本運動器疼痛学会および第22回日本ペインリハビリテーション学会学術大会にて報告)。本研究の目的は、運動錯覚生成メカニズムに及ぼす運動イメージ能力の影響を解明し、ニューロリハビリテーション介入時に運動イメージ能力を高めながら、感覚運動機能を改善させる効果的な脳内神経機能再編成システムを構築することであった。振動刺激時の脳内神経活動についてMicrostate法解析を行った結果、錯覚誘起には運動イメージ能力が影響を及ぼすことが明らかとなった。また、脳卒中片麻痺患者に対して、我々が開発した脳波周波数パターン認識型システムを用いた介入を実施した結果、感覚運動関連脳領域の神経活動性に向上を認め運動主体感も改善を認めた。以上より、本システムの介入手法としての有用性が示唆された。平成27年度に引き続き,当初計画していた通りに研究を遂行する。脳血管障害患者における解析は,運動錯覚と運動イメージの関連性については検証することができ順調である。平成28年度は,本患者のように脳の左右に機能的差異を有する状態において,運動イメージ能力が運動錯覚生成過程へどのような影響を及ぼし誘掖しているのか,健常者との違いを明らかにし,さらにイメージを創出した際の機能側性を詳細に検討する。これらを進めることで,運動錯覚に相乗的に運動イメージを付加できるような装置の開発を目指す。平成28年度に引き続き,計画通りに研究を遂行する。感覚運動障害を有する脳血管障害患者に対して介入を実施し,本周波数パターンセンシングシステムを基盤としたBCIシステムの有用性を検証していく。これらを進めることで,脳機能障害患者などに対する神経機能再編成を具現化できるようツールの確立を目指す。リハビリテーション科学・福祉工学研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため,当初の見込み額と執行額が異なった。しかし,研究計画に変更はなく,当初予定通りの計画を進めていく。プロトタイプでの機器を使用した臨床介入がやや遅れたことが理由として挙げられる。解析機器の購入および対象者への謝礼がなかったため残額が生じた。
イヌでの消炎ステロイド療法における動態学的薬物間相互作用の可能性

本研究ではイヌにおいて汎用される消炎ステロイドが薬物間相互作用を引き起こす可能性について検討した。その結果、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾンやトリアムシノロンでイヌを治療中した際には薬物の酸化的代謝能や組織移行性を支配する血漿タンパク結合に影響する可能性が示された。このため、これらステロイドを一部の薬物と併用した場合、それら薬物の代謝速度や組織への移行性に影響し、その薬物の副作用を招く可能性が示唆された。1.消炎ステロイドのCYP代謝への影響のin vitro試験での評価トリアムシノロンの臨床用量でイヌを1週間処置し、肝マイクロソーム中のエトキシレゾルフィン脱エチル化(CYP1A活性)、トルブタミド水酸化(CYP2C活性)、ブフラロール水酸化(CYP2D活性)およびミダゾラム水酸化(CYP3A活性)を測定し、ミカエリス・メンテン動態を解析した。得られた最大速度に基づくと、CYP1A活性は有意な影響を受けなかったが、CYP2C、2Dおよび3A活性は有意に増加した。したがって、トリアムシノロンは臨床用量でCYP2C,2Dおとび3Aを誘導するものと考えられた。ラットにプレドニゾロン、トリアムシノロンおよびヒドロコルチゾンを1週間処置した結果、トリアムシノロンがCYP2C活性を増加させた以外は、いずれのCY活性も有意に低下した。このため、阻害実験を行った。その結果、いずれの消炎ステロイドも可逆的あるいは非可逆的にCYP活性を阻害したが、各反応に対して得られた阻害定数は比較的大きく、75μM5600μMであった。したがって、得られたCYP活性の低下は酵素がダウンレグレーションされたためと考えられた。このため、消炎ステロイドのCYP活性への影響には種差があることが示された。2.血漿中α_1酸性糖タンパク(AGP)濃度への影響の評価トリアムシノロンで処置中のイヌにおける血漿中AGP濃度は、経日的に低下し、投与後5日以降で有意な低下を示した。一方、ラットではいずれの消炎ステロイドでも増加の傾向を示した。1.消炎ステロイドCYP活性への影響のIn vitro試験での評価プレドニゾロン(PDSL)およびヒドロコルチゾン(HCZ)の臨床用量をイヌに1週間投与し、肝マイクロソーム中のCYP活性およびα_1酸性糖タンパク(AGP)濃度血漿中への影響を検討した。いずれもCYP2Dおよび3Aの活性を低かさせ、down regulationの可能性を示唆した。しかし、トリアムシノロン(TAN)で認められた血漿中α_1酸性糖タンパク濃度(AGP)の低下は認められなかった。2.消炎ステロイドのCYP活性に対する阻害作用の評価PDSL、HCZおよびTANのCYP1A、2C、2Dおよび3A活性に対する阻害作用を、肝マイクロソームを用いて検討した。いずれのステロイドもCYP1A、2Cおよび2D活性に対しては比較的弱い阻害作用を示し、CYP3A活性に対して比較的強い阻害作用を示した。特にHCZでは、臨床においてCYP3Aの基質となる薬物と有意な薬物間相互作用を引き起こす可能性が示唆された。3.イヌに汎用される塩基性薬物のin vitro試験での結合動態の評価イヌでの血漿を用い、リドカイン、プロプラノロール、キニジン、リンコマイシン、クリンダマイシンの結合動態を検討した。いずれも低濃度で高い結合率を示し、算出された解離定数は数μM以下(0.233.84μM)であった。イヌのAGP溶液とアルブミン溶液を用い、これら薬物の結合を検討した結果、いずれもがAGPにだけ結合することが示された。プレドニゾロン(PDSL)およびヒドロコルチゾン(HCZ)を頸動・静脈にカテーテルを装着したSDラットにイヌの抗炎症の目的で用いる用量を1週間経口投与した。その後、イソフルランの全身麻酔下でCYP3Aの基質であるキニジンを静注し、キニジンの体内動態に対するステロイド処置の影響を検討した。その結果、いずれのステロイド処置群においてもキニジンの全身クリアランスは対照群と比較して有意に低く、AUCは高かった。消失半減期は対照群よりも長い傾向を示した。以上の結果から、PDSLおよびHCZはイヌの臨床用量の経口投与でCYP3Aを阻害し、CYP3Aの基質となる薬物を併用した場合には代謝に起因する薬物間相互作用の原因となる可能性が示唆された。ビーグル犬にPDSLを4週間にわたって抗炎症用量で経口投与した。投与2週間前、投与開始2日後、2週間後および4週間後にキニジンを静注し、キニジンの体内動態に対するPDSL処置の影響を検討した。その結果、PDSL処置開始後、2週間及び4週間では、全身クリアランスが増加する傾向を示したが、定常状態分布容積も有意に増加した。

分布容積の増加はキニジンの血漿タンパク結合の低下に起因するものと考えられるので、キニジンに対する血漿中の主要な結合タンパクであるα_1-酸性糖タンパク(AGP)濃度が低下し、このため、分布容積は増加したものと推察された。また、血漿タンパク結合率の増加は全身クリアランスの増加を導くので、血漿中AGP濃度の低下によって全身クリアランスが増加したものと考えられた。消失半減期には有意な変化が認められなかったことから、PDSL処置のCYP3Aへの影響はさほどないものと予想された。以上の試験結果から、イヌにおいては、PDSL処置はAGPへの影響を介した血漿タンパク結合に起因する薬物間相互作用をもたらす可能性が示唆された。
社会資本の役割と負債残高の影響に焦点をあてた発展途上国における国及び地域経済システムの分析

目的は発展途上国における国内・国外負債残高がその国の発展にどのような影響を及ぼすかを定量的に分析し、経済発展のための有効な政策を提言することである。そのためのマクロ計量経済モデルの中核部分は、新たな負債(借入)額の決定と、負債残高が為替市場に影響を与え、それが国際貿易に影響を与える相互依存関係を定式化することである。特に国外への負債(external debt)は、貿易収支の赤字分が自動的に借入に結びつく面と、国の経済発展を目的とする大型プロジェクトのために戦略的に借入を行う面がある。しかし一方、負債残高を無制限に増加することも、貸手側の信用評価を低下させるのでできない。19702002年のパキスタンのデータを用いて、新規外部負債・GDP比率を非説明変数としたモデルでは、パキスタン通貨(ルビー)建て為替レートの変化率は有意に正であり、借り入れを行うとすれば将来よりも現在すべきであるということを示唆している。また為替レート水準そのものの係数は有意に負であり、負債の返済条件の悪化が借入れを抑制している、負債残高・GDP比率は有意に負で貸手側の信用評価が働いていることを示唆している。また、財政赤字・GDP比率は有意に正で、戦略的開発プロジェクトのための大型公共投資は外部負債に依存することを示している。貿易赤字・GDP比率は有意に負で、貸手から見た返済条件の悪化を意味する。このモデルの適合度は0.62でそれほど高くないが、第一段階の検定としては、経済的仮説を支持している。一方、為替レートを説明するモデルの推定では、外部負債残高は有意に正であり仮説を裏付けている。新規借入額も有意ではなかったが正の係数をもつ。貿易収支は期待通り有意に負の符号をもつ。今後、それらを含むマクロモデルを構築する。発展途上国経済における公的資本の役割を分析するために、パキスタンを対象とした地域計量経済モデルを構築した。まず、セクターレベルでの地域生産関数を推定し、公的資本と私的生産要素の生産効率性が分析された。地域人口、地域労働雇用関数も推定され、国全体としての効率性と地域間格差について分析がなされた。主要な結果は以下の通りである。1.パキスタンの4地域間の一人当り生産額で測定した格差は恒常的に存在し、労働生産性や雇用率の格差は1982年以降拡大している。2.推定によれば民間資本の90%近くは先進地域に配分されており、そのような先進地域では公的資本は効率的に使用されているが、民間資本が少ない後進地域では公的資本の役割が小さい。すなわち、公的資本と民間資本の補完性が強くある。3.民間資本の配分はその地域の技術水準にも有意な影響を与え、それが地域間格差を更に拡大している。4.地域間人口移動の多くは、雇用機会の地域間差異によって引き起こされる。5.シミュレーション分析によれば公的、民間資本の地域間配分が、国レベルでの効率性と地域間格差に大きな影響を与える。一国の効率性と地域間格差の間には逆U字型の関係が得られる。
鉱物・融体中におけるコヒーレントな拡散係数の測定と拡散-結晶構造の相関原理の研究

ある鉱物中における各含有元素間の拡散係数の従来の報告はバラツキが大きく、鉱物内の色々な現象の解析のための基礎データとして使用に耐えない。本研究では各元素の拡散係数についての相対性(コヒーレント性)を重視して測定し、拡散を支配する原理を実験的に求めることである。今年度はペロブスカイトCaTi【O_3】を測定試料として選び、拡散係数測定を行なった。試料のペロブスカイトはFZ法によって合成し、6mm【◯!/】×20mmの単結晶を得た。拡散実験のため、これを3mm角に定方位に切出して研磨し、その研磨面上に標準岩石試料JB-2を真空蒸着し、約50nm厚の多成分系酸化物薄膜を形成させた。その試料を酸素雰囲気中1000-1500度°Cの温度域で5-20時間アニールさせて薄膜中の全元素をペロブスカイト中に同時に拡散させた。微量元素を含む多数の元素を同時に測定するために、筑波大学分析センターのCamaca IMS-3f型二次イオン質量分析計(SIMS)での深さ方向分析法を用いた。この手法は数nmのプロフィル分解能を有する。一次イオンビームはビーム径約50umの【O^-】を用い、試料上の約150×150umの領域をラスターし、その領域の中心部約10μmφからの2次イオンビームのみを質量分析した。その結果、Si,Al,Fe,Mg,Mn,Na,K,Liの8元素の拡散プロフィルを得た。解析は今回開発したプログラム(DIFFUS)によって行ない、拡散係数(D),活性化エネルギー(Q)と拡散係数(Do)を計算した。経験的にQとlogDoとの間に正の相関があることが知られている(Compensation law)が、ペロブスカイトにおいてもこの関係が非常によく成り立っていることが判明した。今年度の実験によって、多成分同時拡散と多成分深さ方向分析法の組合わせによるコヒーレントな拡散係数を求める手法がほぼ確立した。より測定精度を上げるためには、ビームのスパッタ速度を上げることと、薄膜中の元素の数と含有量を増やすことが重要である。
分泌蛋白質mRNAの神経突起伸長点への蓄積機序の解明

神経細胞内でのmRNAは一般に神経細胞の細胞体周囲のみに限局して存在すると考えられている。しかし、最近になって神経細胞において特定の種類のmRNAが細胞体外から樹状突起および軸索などへ輸送されることが報告されている。本研究課題では、神経突起伸長因子Amphoterinの細胞体外mRNAの局在機構について解析を行った。(平成14年度研究実績)Amphoterinは細胞外へ分泌されることにより、そのレセプターであるRAGEと結合し、神経突起伸長を促す。しかし、Amphoterinは典型的な分泌シグナルを保持していない。このため、神経細胞からのAmphoterinの分泌には突起伸長点におけるAmphoterinの局在が深く関与している可能性が示唆されている。in situ hybridization法を用いた解析結果より、神経突起伸長点におけるAmphoterin mRNAの蓄積が明らかに認められた。Amphoterin mRNAはその領域内に長い3'非翻訳領域(UTR)を含んでいる。さらに、この3'-UTRにはβ-アクチンで同定されたzipcodeと呼ばれる領域に相同性の高い領域を含んでいた。このため、Amphoterin mRNAの突起伸長点への局在には3'-UTRが深く関与している可能性が示唆された。一般にmRNAの突起伸長点への輸送には細胞骨格成分が重要な役割を担っていることが知られている。また、我々はAmphoterinの突起伸長点への局在能がボルナ病ウイルス(BDV)感染細胞では低下していることを既に報告している。そこで、BDV感染細胞における細胞骨格形成能について検討した結果、BDV感染細胞では細胞骨格形成能が明らかに低下していた。以上の結果より、Amphoterin mRNAの突起伸長点への局在には細胞骨格に依存する輸送経路が深く関与していることが示唆された。
回転体上の三次元境界層の乱流構造の解明

本研究は軸流中の回転円筒上のねじれた速度分布の乱流境界層の乱流構造を実験的に解明しようとするものである。このためにまず平均速度とレイノルズ応力6成分をプローブ回転法により測定し,その変化の特徴,および平均流エネルギと乱れエネルギの収支を明らかにした。次に微小V型熱線プローブを用いて瞬時のu,v変動の時系列データを収録し,これより平均と変動の成分エネルギの収支,u,v変動のパワースペクトル,u,vのクロススペクトルを調べ,以下のような成果を得た。層外主流速度と円筒周速度の合成速度U_<RO>を代表速度として,これにより無次元化したu,w変動の実効値u',w'は速度比によらずほぼ相似になるが,v'は円筒回転時の方が静止時より大きくなること,-uw/U_<RO>^2は速度比とともにやや減少し,-uv/U_<RO>^2は円筒回転時に壁近傍で非常に大きくなることを明らかにした。さらに,円筒回転時には渦動粘度が大きくなり,しかも等方的渦粘性の仮定は成立しないこと,混合距離が非常に増大することを明らかにした。次に,平均流エネルギの対流項と拡散項は,境界層の外層部でほぼ釣り合い,速度比の増加とともに絶対値が減少すること,乱れエネルギの生成項と散逸項は,境界層全域にわたって支配的でほぼ釣り合っており,平衡境界層となっていることを確認した。また,u,v変動のパワーペクトル分布から、壁近くに大規模渦構造が存在することが示唆された。さらに,平均流の成分エネルギの収支から,境界層の内層部では,Uエネルギに対しては生成,粘性散逸,粘性輸送項が損失,拡散項が利得であり,Vエネルギに対しては生成,粘性散逸,拡散項が損失,粘性輸送項が利得となること,外層部ではUエネルギに対する対流と拡散項,Vエネルギに対する生成と拡散項がそれぞれほぼ釣り合うを明らかにした。また,u,v変動のクロススペクトルから,内層部にはスペクトルの低波数域にuとvの強い相関があり,大規模渦構造と関連していることが示唆された。
ツメガエル発生過程におけるNek2の機能解析

私はこれまでに、初期発生におけるNek2Bの機能解析を行い、Nek2Bが中心体の成熟に関与する事を明らかにしてきた。今年度は、後期発生過程で発現するNek2Aの機能解析を行った。Nek2AとNek2Bはスプライスバリアントであるため、Nek2Aのみを特異的に阻害するためにツメガエル受精卵にNek2Aの配列に特異的なモルフォリノオリゴおよびsiRNAを導入した。その結果、モルフォリノオリゴを導入した胚ではNek2A蛋白質の発現量が微減したに留まり、形態的な変化はほとんど見られず、siRNAを導入した胚ではRT-PCRでNek2AのmRNA量の減少が認められなかった。このため、Nek2A特異的中和抗体を作成し、現在機能阻害実験を遂行中である。また、初期胚発生特異的に発現するCdc25Aフォスファターゼの活性制御機構の解析を同時に行っている。Cdc25Aは中期胞胚期にChk1によってリン酸化され、分解される。私はCdc25Aが分解のみならず、Chk1により抑制される必要があることを見出し、この抑制にCdc25AのC末端領域のリン酸化が関与していること、C末端領域をリン酸化されたCdc25AはCdk-サイクリン複合体から解離することを見出した。また、このC末端のChk1によるリン酸化配列はCdc25Aのみならず全てのCdc25ファミリーに存在し、同様のChk1による制御を受けている事を明らかにした。私はツメガエルNek2キナーゼの単離及び機能解析を行ってきた。これまでに、Nek2が中心体に局在し細胞周期のG2期における中心体の成熟・構造の維持に必要であることを明らかにしてきた。今年度は以下の点で進展が見られた。Nek2Aの分解機構解析:Nek2Aは分裂期(M期)の前中期に分解されはじめ、その分解はG1期まで持続する。私はNek2Aタンパクの一次配列内にある2つの分解シグナル(KENボックス及びMR配列)を同定した。Nek2AはAnaphase-promoting complex (APC)と呼ばれる複合体型ユビキチンリガーゼによってユビキチン化され分解される。APCは2つの基質認識サブユニットを用いて基質と結合するが、分裂期前中期から後期にかけてはFZYサブユニットを用い、分裂期終期からG1期にかけてはFZRサブユニットを用いている。FZYは基質のDボックス(RXXL配列)を認識して結合するとされるが、Nek2AはDボックスを持たず、FZYとの結合にはMR配列が必要であった。FZRは基質のKENボックスを認識するとされるが、Nek2AとFZRとの結合にはKENボックスとMR配列が同様に重要であった。これらの結果は、MR配列が新規のAPCによる認識配列であることを強く示唆している。このほかにも、私はツメガエルの卵割期から典型的体細胞分裂期へ移行する中期胞胚遷移(MBT)における細胞周期の伸長に、DNA複製チェックポイント機構が用いられており、そのエフェクターとしてChk1キナーゼが必須であることを明らかにした。また、MBTで分解される卵割期特異的なCdc25AフォスファターゼがChk1キナーゼにより直接的にリン酸化され、このリン酸化が分解に必須であることを明らかにした。
ウニ胚におけるDNA複製速度の発生レベルでの調節

動物の発生初期胚は細胞当り、大腸菌の数千倍、一般の真核生物の数百倍と現存の細胞中最高のDNA複製速度を持つが、発生後期ではその十分の一から百分の一に低下する。これは胚発生特有のDNA複製の調節が働いていることを示唆する。本研究ではこの胚発生におけるDNA複製速度の発生レベルでの調節について主にウニ胚を用いて染色体DNA上のDNA複製開始部位とDNA複製装置の観点から解析した。また、発生レベルでのDNA複製調節の意義を他の細胞増殖系(哺乳動物のホルモン依存の細胞増殖、同調増殖している細胞性粘菌細胞)と比較することにより検討した。発生の各時期にあるウニ胚よりDNAを単離し電子顕微鏡によりDNA複製を解析した結果、DNA複製単位はいわゆる"複製目(replication eyes)"として、また、DNA複製開始部位は"複製目"の中点として観察された。発生初期胚では"複製目"は12キロ塩基長へだてて4-5個の群として染色体DNAに存在するのに対して、発生後期では単一の"複製目"が30キロ塩基長以上離れて散在することを思いだした。このことより、ウニ胚では発生の時期に依存して染色体上のDNA複製開始部位数が変動することが判明し、この複製開始点退かずによりDNA複製速度が調節されていることを解明した。また、DNA複製に参加しているDNA複製装置の数が発生初期胚では後期胚に比べかなり多く、この数が発生の時期に依在して変動することを見いだした。しかし、このDNA複製に参加するDNA複製装置の数は単に細胞中に存在する装置の数ではなく、この装置を"始動"にする因子が存在し、この因子の数によりDNA複製速度が発生レベルで調節されている可能性を明らかにした。動物の発生初期胚は大腸菌や一般の真核細胞に比べ細胞当り数百数十倍のDNA複製速度を持つが,発生後期ではその数十分の一に低下する.本研究ではこの現象を発生中のウニ胚よりDNAを単離し,電子顕微鏡によりDNA上の複製領域を観察することに解析した.その結果,単離したDNA上にDNA複製部位は複製フォーク(replication fork)として,複製単位(replicon)は複製目(repliction eye)としてそれぞれ観察された.複製目ではその60%に内部にトランス位に配位した岡崎断片(Okazaki fragment)合成の場と思われる約100-200塩基長の一本鎖DNA部分がフォーク部に存在するのが判明した.このことよりDNA複製は複製開始点より二方向に等速に半不連続(semi-discontinuous)に進行することが証明された.複製フォークの構造は発生の時期にかかわりなく一定であった.しかし,複製単位の長さや頻度は発生の時期に依存して大きく変わっていた.すなわち,初期胚(桑実胚)より単離したDNA(10-30キロ塩基長)の29%に複製目が存在したのに対して,後期胚(プルテウス胚)では1%以上であった.さらに,初期胚で複製目は平均1.2キロ塩基長へだてて4-5個が群がって存在した.このことより,初期胚では1.2キロ塩基長へだてて群になった複製開始点が多数のDNA上に存在しDNA複製に関与するのに対して,後期胚では少なくとも10-30キロ塩基長以上離れた複製開始点よりDNA複製が開始されることが判明した.以上より,本研究により動物(ウニ)初期胚のDNA複製速度は発生に依存して出現するDNA複製開始点の数により調節されていることが解明された.また,本研究ではこの調節がウニ胚の核に特異的に行われているものか,否かを調べる目的でウニのミトコンドリア,細胞性粘菌の核,ラットの核のDNA複製に関しても生化学的側面から並行して研究した.

DNA複製装置(DNA複製複合体)の観点よりDNA複製速度の調節についてウニ胚及び他の細胞増殖系(同調増殖時の細胞性粘菌、哺乳動物細胞等)を用いて比較検討した。その結果、(1)ホルモン依存性の哺乳動物細胞増殖系ではDNA複製速度はホルモンによって誘導されるDNA複製酵素(装置)の数に関係するが、その数のみによってDNA複製速度が調節されているのではないこと、(2)細胞性粘菌の細胞周期でのDNA複製では核マトリックス上のDNA複製装置の一定数以上の存在とこの装置を"始動"にする因子によりDNA複製速度が調節されていること等を解明した。さらに、(3)DNA複製装置を"始動"にする因子としてDNA合成期に細胞質から核へ移動する微小管会合蛋白質(MAP2)がDNA複製速度の調節に関与していることを解明した。以上の結果をもとにウニ胚でのDNA複製速度の発生レベルでの調節を検討した結果、ウニ胚でも細胞内に存在するDNA複製装置の数とその複製装置を"始動"にする因子がDNA複製速度の調節に関与していることを明らかにした。ウニ胚より単離した核(DNA複製装置を含む)でのDNA合成を先述の微小管会合蛋白質は促進し、促進のメカニズムは粘菌細胞の場合と同じ(DNAの基質であるデオキシボヌクレオチドのDNA複製装置への親和性を高めると同時にDNA合成速度を高める)であった。このことより微小管会合蛋白質がウニ胚でもDNA複製の調節に関与していることが示唆された。また、DNA複製装置に結合している微小管会合蛋白質の数は発生初期で多く発生後期で減少することを明らかにした。これらの結果より微小管会合蛋白質のDNA複製装置へ結合する数によってウニ胚のDNA複製速度の発生レベルでの調節が行われていることが解明された。
水中考古遺物の保存に関する研究(海中保存環境の経年変化の調査研究と処理後遺物の追調査)

2年にわたる研究で海底温の変化、海水の科学的、微生物学的調査を通して、海底保存されている開陽丸の現状の一部が以下のように明らかとなった。海底温については一年を通して見ると22°C4°C迄大きく変動している。これに加えて、低気圧の通過時、冬型の気圧配置を取ったとき一時的に急激な温度変化を示す。これは江差港内水の交替によるもので、港内粒子の流出がこの際起きると推測される。このことは銅イオンと、堆積物で還元環境を作り防虫効果を一年中求めることは難しいことを意味している。溶存酸素は季節変化のみで経年変化は認められなかった。銅イオンは銅網の直上水で溶解が確認されたが、中間水、表面水には見られないため周囲の汚染は現時点では問題にならないようである。銅網は海水のよくあたる箇所の消耗が一番激しく、当初懸念されていたヘドロの成分による消耗はあまり心配ないようである。一般細菌はいずれの資料からも10^210^3オーダーで検出された。この付近の海底は5m前後であることから中低層海水に差異が認められず好気的な海域と考えられるが、これは硫酸還元菌の有無からも裏付けられた。現場は低温海域に属するため微生物による腐食は問題ないと思われるが、地方の港としては驚愕に値する濁りは、これに起因するヘドロと微生物で腐食が加速的に進むと考えられる。以上の結果から総合的に判断すると、早期に引き揚げを行うべきとの結論に達する。収蔵遺物は、仮収蔵庫の湿度が7月後半から9月前半にかけて80%台になるなど大変劣悪な状態である。その影響を一番受けているのは金属製品で、ことに鉄製品に著しい。これも早期に再処理を行い、設備の整った収蔵庫に収めるべきと思われる。海底環境については以下の如く調査を行ないそれぞれの知見を得た。海底水温の時間変化は1991年8月7日から1992年2月28日迄2時間毎に測定した。9月中旬迄は2023°Cでほぼ安定しているが、その後徐々に下がり2月には25°Cが卓越する。11月から1月の間は温度変動が大きく急激な変化を示すこともあった。これは潮汐よりも季節風の強弱によっていると思われ、港内の海底堆積物を港外に運び出すことに関与していると思われる。8月の観測時に見られた懸濁物質や海底堆積物が2月に海底に見られないという目視観測の結果を裏付けるものである。化学分析の為の海水は1991年8月7日と1992年2月28日にダイバ-より港内中層、海底付近、堆積物中から採取された。8月の溶存酸素は海底付近で表層に比べて少なく、堆積物中では表層付近から還元環境になっている。しかし冬期には海水混合が激しく、2月の海底付近と表層水の間で酸素濃度に差がないことから堆積物中でもかなりの深さまで酸化環境であると思われる。尚8月の間隙水においても硫化水素臭は無かった。2月に銅網内から得た間隙水は直上水より化学物質が高濃度になっている。銅網からの溶出と堆積物内での輸送によると思われ、銅網が遺物保存に一役かっている可能性が見い出された。海水中の微生物については堆積ヘドロ及び海水中の一般細菌、産生菌、硫酸還元菌等の菌相に有為な差は認められない。しかし菌数的には嫌気的条件下で生育する酸生菌並びに還元菌が堆積ヘドロ中では多かった。不蝕生成物については顕微鏡下で観察分析していった。

腐蝕がかなり進んでいるものもあり、防錆処理の見直して収蔵庫の改善に資するようにしたい。昨年度に引き続き海底温の測定、海水の化学的、徴生物学的調査を行なった。海底温については1992年2月29日から7月迄のデータが得られ、過去一年間の変化を得ることができた。これによると海底温の上昇は気温上昇より遅れ、5、6月に始まり7月初めではまだ最高温度に達していない。10月後半から92年7月迄短い周期の温度変化が急激に起っている。これは低気圧の通過、冬型の気圧配置になった時期と一致し港内水が急激に入れ替わると推測される。これにより湾内底層に堆積した粒子がこの流れにのり港外に運び出され、夏期に見られた生物生産で作られた粒子が2月の観測で見られないことが裏付けられた。堆積物で遺物を覆い還元環境を作り木部を虫害から守るという当初の目的は夏期の港内水の滞留時期を除き、あまり期待するのは難しい事を意味する。溶存酸素は去年と同様の値を示している。即ち海底付近と表層水の間では差が無く、堆積物の中でもかなりの深さ迄酸化環境と思われる。このことは徴生物学的調査からも裏付けられ、硫酸還元菌が今年度の夏の資料からも検出できず、僅かに低層海水及びヘドロから検出されたにすぎず、冬の資料からは全く検出されなかった。銅イオンは銅網付近で高濃度が得られたが、その他のサンプルでは見られない。また銅網を状況別にサンプリングし消耗具合、腐食生成物の調査を行なった。その結果ヘドロによる消耗破損は現段階ではあまり心配無いと思われる。収蔵環境調査のため仮収蔵庫と復元開陽丸に温湿度計を6月から設置し収蔵環境を測定したが、仮収蔵庫が高湿度の劣悪な状態であることが判明した。これにより特に夏期に腐食が促進するのが観察された。
時間軸を持つ3Dデータ及び映像・音響データを用いたアーカイブシステムの開発

メディアアート作品の保存・修復過程への寄与を目的として、作品の展示空間と鑑賞行動双方の変化を時間的3Dデータとして記録・閲覧するシステムの開発を行う。本研究では、これまでの研究成果を踏まえ、課題となっていた作品向け点群スキャナの精度向上、スキャニング範囲の拡張を前提とした新たな3Dスキャニングシステムの開発を行い、時間軸を持つ作品点群データ、鑑賞者ボーンデータ、映像・音響データを同期して閲覧可能な「タイムベーストデータビューワー」を開発する。
日中の筋電図バイオフィードバックが夜間ブラキシズム抑制に及ぼす効果の多施設検証

覚醒時ブラキシズム(AB)に対するバイオフィードバック訓練(EMG-BF)が睡眠時ブラキシズム(SB)に及ぼす抑制効果を検証した.ブラキシズムを有する男性被験者14名(26.3±2.7歳)を実験群(BF群)と対照群(CO群)に7名ずつ振り分け,3週間の覚醒時および睡眠時のEMG測定を行った.2週目に,BF群ではEMG-BF訓練を行い,CO群ではEMG測定のみ行い,各週のABおよびSB平均イベント数を比較した.BF群において,2週目および3週目のABおよびSB平均イベント数が,1週目に対し有意に減少し(Tukey),ABに対するEMG-Bが,SB抑制効果を示すことが示唆された.日中のクレンチングに対してEMG-BF訓練を行うことによる夜間のブラキシズム抑制に対する効果を検証することを目的として本研究を行った【方法】智歯を除いて歯列に欠損のない健常な男性3名(2329歳)を被験者として以下の実験を行った.昼食をはさむ日中と夜間睡眠時のそれぞれ5時間にEMGを記録した.EMG記録およびBF訓練には携帯型EMG-F装置を使用した.EMG記録開始蒔に,3秒間の最大咬みしめを30秒のインターバルで3回行うよう指示し,その平均を100%咬みしめ(100%MVC)とした.実験スケジュールとして,1日目にBF時の閾値設定に必要となるベースラインデータを記録し.2日目および3日目に電子音を用いた聴覚BFを日中に行い,夜間はEMG測定のみ行った.その後,専用の解析ソフトを用いて,記録されたEMGを機能運動と非機能運動に識別し,筋活動量10,20,30%MVCと筋活動持続時間19秒の組合せによる27通りの閾値におけるイベント数と算出した.その後3名から得られたイベント数の平均を算出し,BF訓練前を基準としてBF訓練後の変化をWilcoxonの符号付順位検定により統計解析を行った.【結果と考察】閾値を20%MVC,持続時間2秒とした場合の夜間のイベント数を比較したところ,被験者1では,訓練前におけるイベント数が11回,BF訓練後の2日目と3日目ではそれぞれ0回と3回であった.被験者2では,訓練前におけるイベント数が4回,BF訓練後の2日目と3日目では1回と0回であった被験者3では,訓練前におけるイベント数が6回,BF訓練後の2日目と3日目では5回と0回であった.3名全員にBF訓練後のイベント数の減少が見られたが有意差は生じなかった(p>0.05).今回の実験では,被験者が3名と少ないことに加え,長期にわたる効果についての実験を行っていないことから,被験者を追加し今後の検討課題としたい日中のクレンチングに対するバイオフィードバック訓練(BF訓練)が夜間睡眠時のブラキシズムに及ぼす抑制効果を調べることを目的として実験を行った.日中のくいしばりの自覚,夜間の歯ぎしりの指摘がある男性被験者10名(27.8±2.4歳)をバイオフィードバック群(BF群)とコントロール群(CO群)にそれぞれ5名ランダムに分け,連続した3週間の日中および夜間睡眠時のEMG測定を各5時間行った.EMG測定部位として主咀嚼側側頭筋部を選択した.BF群では,クレンチング時にBF信号が発生し,その行動を本人に認識させるBF訓練を2週目に行った.CO群はいずれの週にもEMG-BF訓練を行わず,EMG測定のみ実施した.その後,ベースラインデータとなる1週目の測定で得られたEMG記録から,個人ごとに設定した一定の閾値を超えたEMGイベント数を算出した.個人ごとに算出したEMGイベント数から各週のブラキシズム平均イベント数を求めた.統計処理にはtwo-way repeated measures ANOVAと,その後の多重比較にTukeyのHSD検定をおこなった.日中では,BF群において2週目および3週目の平均イベント数が有意に減少した.夜間睡眠時でも,BF群において2週目および3週目の平均イベント数が,1週目に対して有意に減少した.また,夜間睡眠時の3週目のBF群のイベント数はCO群に対し有意に減少した.CO群においては日中及び夜間睡眠時いずれにおいても,イベント数に有意な変化を認めなかった.日中のクレンチングと夜間睡眠時のブラキシズムのイベント数に相関を認めたとの報告もあり,日中のBF効果が夜間睡眠時にも影響を及ぼしたものと考えられる.また,3週目においてもベースラインデータに比較してイベント数の減少が保たれていたことから,訓練1週後において学習効果が得られたことが示された.方法:日中のくいしばりの自覚,ないしは夜間の歯ぎしり指摘のある男性被験者10名(27.8±2.4歳)をバイオフィードバック(BF)群とコントロール(CO)群に5名ずつランダムに分け,3週間の日中および夜間睡眠時のEMG測定を各5時間行った.EMG測定部位として主咀嚼側側頭筋部を選択した.BF群ではクレンチング時にBF信号が発生し,その行動を本人に認識させるBF訓練を2週目に行った.CO群はいずれの週にもEMG測定のみ実施した.その後,ベースラインデータとなる1週目の測定で得られたEMG記録から,Watanabeらの報告に準じて,個人ごとに設定した一定の閾値を超えたEMGイベント数を算出した.個人ごとに算出したEMGイベント数から各週のブラキシズム平均イベント数を求めた.

統計処理にはSPSS ver17.0を使用し、two-way repeated measuresANOVAと,その後の多重比較にTukeyのHSD検定をおこなった.結果:日中では,BF群において2週目および3週目の平均イベント数が,1週目に対して有意に減少した.また,3週目のBF群の平均イベント数はCO群に対して有意に減少した.夜間睡眠時でも,BF群において2週目および3週目の平均イベント数が,1週目に対して有意に減少した.また,夜間睡眠時の3週目のBF群のイベント数はCO群に対し有意に減少した.CO群においては日中及び夜間睡眠時いずれにおいても,1,2,3週の間でイベント数に有意な変化を認めなかった.日中のクレンチングと夜間睡眠時のブラキシズムのイベント数に相関を認めたとの報告2)もあり,日中のBF効果が夜間睡眠時にも影響を及ぼしたものと考えられる.また,3週目においてもベースラインデータに比較してイベント数の減少が保たれていたことから,訓練1週後において学習効果が得られたことが示された.覚醒時ブラキシズムに対するバイオフィードバック訓練(BF訓練)が夜間のブラキシズムに及ぼす影響を検証した.日中の食いしばりと夜間の歯ぎしりを自覚する健常な成人男性10名を対象として3週間の実験を行った.BF群において,1日目に対して3日目のイベント数は有意な減少を認めた.3週目ではCO群のイベント数に比較しBF群のイベント数が有意に減少した. BF訓練が,夜間のブラキシズム抑制に効果をもたらす事が示唆された.また,携帯型筋電計のブラキシズムイベント測定精度を検証した.携帯型筋電計で測定した筋電図の検出能を検証することを目的とし,夜間にポリソムノグラム(PSG)との同時測定を行い,サンプリングレートの違いがブラキシズムイベントの検出に及ぼす影響について検討した. Tonic型のイベント数は携帯型筋電計とポリソムノグラムの両者ともほぼ同様の値を示しており,検出率は94.1%であり,サンプリングレートの違いはTonic型イベントの検出には大きく影響しないことが示された.覚醒時ブラキシズム(AB)に対するバイオフィードバック訓練(EMG-BF)が睡眠時ブラキシズム(SB)に及ぼす抑制効果を検証した.ブラキシズムを有する男性被験者14名(26.3±2.7歳)を実験群(BF群)と対照群(CO群)に7名ずつ振り分け,3週間の覚醒時および睡眠時のEMG測定を行った.2週目に,BF群ではEMG-BF訓練を行い,CO群ではEMG測定のみ行い,各週のABおよびSB平均イベント数を比較した.BF群において,2週目および3週目のABおよびSB平均イベント数が,1週目に対し有意に減少し(Tukey),ABに対するEMG-Bが,SB抑制効果を示すことが示唆された.26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学26年度が最終年度であるため、記入しない。分担研究者との打合せを行い、先行している明海大学と共通のフォーマットで日中と夜間の筋電図を無拘束で測定できる環境を設定できた。また、明海大学では7名の被験者で日中と夜間のブラキシズムの相関を調べ、ブラキシズムの自覚がある被験者で相関が高い(r=0.662,p<0.001)ことを検証した。当初の目的である覚醒時ブラキシズムに対する咀嚼筋筋電図バイオフィードバックが日中のブラキシズムのみならず、睡眠時のブラキシズムに対しても抑制効果があることが判明した。
細胞間コミュニケーションのライブイメージング

NanoLanternの原理を利用した発光を利用した新規バイオセンサーの開発を行い、論文として発表した。このプローブは、RLuc発光タンパク質を既存のFRETバイオセンサー中のCFP蛍光タンパク質のC末端に融合させたもので、RLucからCFPへのエネルギー移動によりドナー蛍光タンパク質CFPを励起するものである。このHyBRET型と名づけたバイオセンサーは蛍光顕微鏡下にFRETを観察することも、Coelenterazine存在かにBRETを観察することもできるものである。これまでFRETバイオセンサーを使った薬剤効果のスクリーニングは顕微鏡を用いてしかできなかったが、このHyBRET型バイオセンサーの発光モードを用いれば、96 well plateでも十分に薬剤の効果を判定できることがわかった。この成果はScientific Report誌に発表した。また、FRETバイオセンサーの高度化を行った。当初Scarlet、iRFP、Neptune、Cardinalなどの赤ー近赤外波長域蛍光タンパク質を使ったプローブを開発したが、多数の試行錯誤の結果にも関わらずシグナルノイズ比の高いプローブを作成することはできなかった。そこで、あらたにmKO2とmKate2の組み合わせを導入し、その結果、既存のFRETバイオセンサーに匹敵する高感度のProtein Kinase Aのプローブを作ることに成功した。現在、論文投稿準備中である。さらに、ROSA26領域にFRETバイオセンサーを組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、その解析も行った。これにより、これまで困難であったT細胞での活性化イメージングが可能となった。その結果、胸腺で分化したT細胞の運動にはERKマップキナーゼの活性が重要であることがわかった。この成果はiScience誌に発表した。HyBRET型プローブと第二世代FRETバイオセンサーの開発は予定通りに進捗したが、近赤外領域を使うバイオセンサーの開発が想定より遅れた。近赤外FRETバイオセンサーのプローブは作成できたので、論文として近く発表する。FRETバイオセンサーはカルシウムやATPなどの低分子、Gタンパク質やタンパク質リン酸化酵素等の情報伝達分子など多様な分子活性や環境情報を可視化することができる。研究室においてはFRETバイオセンサーを培養細胞やトランスジェニックマウス(FRETマウスと呼んでいる)に安定して発現させる技術を開発した。このFRETマウスの表皮基底細胞を多光子顕微鏡で観察したところ、約直径100ミクロンの領域に30分かけてERK活性が打ち上げ花火のように伝搬される様子が観察された。Spatial propagationof radial ERK activity distribution (SPREAD)と命名したこの現象の発見は、FRETマウスの観察がこれまでの培養細胞を用いた研究からは想像もできないような発見をもたらすことの証拠である。神経や免疫細胞以外での細胞間情報伝達を可視化した研究はほとんど知られていないので、これまでの研究を継続し、新しい発見を目指している。さらに、新しい画像処理技術や摂動実験のツールを導入することで、これまでになかった“生きたマウスを使った細胞社会のシステム的研究"を創生しようとしている。現在、単層培養細胞から器官培養へ、そして生体へと情報伝達研究は大きく変化しつつあるので、FRETマウスを用いた研究はこの新しい潮流の駆動力とすべく研究を続けている。FRETバイオセンサーの高度化については、高感度化、長波長化、多色化を進めている。今年度はクサビラオレンジやクサビラグリーンを用いるFRETバイオセンサーの作成を行った。しかし、これまでのシアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質のFRETペア以上のものは作成できなかった。また、第二世代FRETマウスの開発と多様な臓器でのイメージング技術の開発を目指して、BACクローントランスジェニックマウスを作製した。現在、繁殖してどの組織で発現しているかを解析している。3次元画像タイムラプスデータから、細胞間コミュニケーション情報を抽出するプログラムを開発している。2次元では良い結果が得られるものの3次元では細胞の同定が難しく改良が必要である。FRETバイオセンサーを発現する培養細胞やトランスジェニックマウスを蛍光顕微鏡あるいは多光子顕微鏡で観察することで、細胞間コミュニケーションを可視化し、そのメカニズムを解析した。1.RhoファミリーGタンパク質により活性化されるセリンスレオニンリン酸化酵素ROCKの活性を測定するFRETバイオセンサーを作成した。ROCK阻害剤で低下し、Rhoを活性化することで確かにFRET効率が変化することを確認できたので、トランスジェニックマウスの作成を開始した。2.ERKマップキナーゼのFRETバイオセンサーを発現する培養細胞を用いて癌遺伝子の恒常的発現がどのようにERKを制御しているかを解析した。その結果、RasやRafといったERKの上流因子の恒常的活性化においても、細胞密度が高いとERK活性化が抑制されていることがわかった。これは、ERKの活性化に必要なスレオニン残基が脱リン酸化されていることを明らかにした。阻害剤を用いた実験により、PPPサブファミリーのセリンスレオニン脱リン酸化酵素がこの細胞密度依存性ERK抑制に寄与している可能性が示唆された。3.AキナーゼのFRETバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスに腫瘍細胞を接種し、その腫瘍内血管でのPKA活性を測定した。その結果、腫瘍内血管では皮下正常血管と比較するとPKA活性が低く、これが血管透過性の亢進をもたらしていることが示唆された。そこで、PKAの活性をcAMPアナログで上昇させたところ血管透過性が低下した。さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤を投与したところPKA活性が上昇し、血管透過性が低下した。

これらの結果は、血管内皮細胞増殖因子による血管透過性の少なくとも一部はPKA活性の抑制によることを示している。おおむね順調に進んでいるが、トランスジェニックマウスを作成する実験において、発現量が十分でないものがあり、その計画は若干遅れている。NanoLanternの原理を利用した発光を利用した新規バイオセンサーの開発を行い、論文として発表した。このプローブは、RLuc発光タンパク質を既存のFRETバイオセンサー中のCFP蛍光タンパク質のC末端に融合させたもので、RLucからCFPへのエネルギー移動によりドナー蛍光タンパク質CFPを励起するものである。このHyBRET型と名づけたバイオセンサーは蛍光顕微鏡下にFRETを観察することも、Coelenterazine存在かにBRETを観察することもできるものである。これまでFRETバイオセンサーを使った薬剤効果のスクリーニングは顕微鏡を用いてしかできなかったが、このHyBRET型バイオセンサーの発光モードを用いれば、96 well plateでも十分に薬剤の効果を判定できることがわかった。この成果はScientific Report誌に発表した。また、FRETバイオセンサーの高度化を行った。当初Scarlet、iRFP、Neptune、Cardinalなどの赤ー近赤外波長域蛍光タンパク質を使ったプローブを開発したが、多数の試行錯誤の結果にも関わらずシグナルノイズ比の高いプローブを作成することはできなかった。そこで、あらたにmKO2とmKate2の組み合わせを導入し、その結果、既存のFRETバイオセンサーに匹敵する高感度のProtein Kinase Aのプローブを作ることに成功した。現在、論文投稿準備中である。さらに、ROSA26領域にFRETバイオセンサーを組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、その解析も行った。これにより、これまで困難であったT細胞での活性化イメージングが可能となった。その結果、胸腺で分化したT細胞の運動にはERKマップキナーゼの活性が重要であることがわかった。この成果はiScience誌に発表した。HyBRET型プローブと第二世代FRETバイオセンサーの開発は予定通りに進捗したが、近赤外領域を使うバイオセンサーの開発が想定より遅れた。バイオセンサーについては、より多くの蛍光タンパク質について試していく。トランスジェニックマウスについては作成できたものから順次解析を進めていく画像解析プログラムについては、今後、理研の画像解析チームとも協力しながらより性能の向上を目指す。今後も、トランスジェニックマウスの生体観察と中心に進めていく予定である。近赤外