hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トゲネズミ三種の比較解析によるY染色体消失過程の推定

トゲネズミ属3種のうち、アマミトゲネズミとトクノシマトゲネズミは、XO/XO型の性染色体構成をもち、Y染色体だけでなく性決定遺伝子SRYを消失した極めてめずらしい哺乳類である。一方、オキナワトゲネズミ(以下オキナワ)は、一般的なXX/XY型の性染色体をもつが、その性染色体は一対の常染色体の転座により大型化し、SRYは特異的なアミノ酸置換と重複により独自の進化を遂げている。トゲネズミ属のY染色体の進化過程を明らかにすることを目的とし、平成22年度はオキナワにおいて、性染色体のさらなる構造変化の有無の検出、祖先Y染色体領域の同定、SRYの機能性予測をおこなった。29のマウスのcDNAクローンを用いたFISH解析の結果、オキナワの祖先X染色体領域(Xq)および性染色体に転座した常染色体領域(Xp、Yp)は他のネズミ類の遺伝子オーダーと一致し、構造変化はみられなかった。ただし、アマミトゲネズミの性決定候補遺伝子であるCBX2が、オキナワにおいて常染色体の転座に伴い、性染色体に連鎖し、さらに他の染色体に重複していた。また、CGH解析の結果、オキナワのY染色体に性特異的な領域は検出されなかったが、単一のY連鎖遺伝子と同定されたDDX3YとUTYのcDNAクローンを用いたFISHの結果、両遺伝子はYpの動原体付近に存在し、祖先Y染色体領域がYp動原体付近に保持されていることをつきとめた。さらに、SOX9の精巣特異的エンハンサー領域にあるSRY結合配列の保存性を、マウス、ラット、ヒト、オキナワにおいて比較した結果、結合サイトの一つにオキナワ特異的な置換がみられ、保存性が失われていた。今回の結果から、トゲネズミ共通祖先はY染色体にいくつかのY連鎖遺伝子を保持していたことが明らかとなったが、SRYの機能はトゲネズミ共通祖先において、すでに低下もしくは消失していた可能性が考えられた。トゲネズミ属のY染色体進化を解明するために、オキナワは鍵となる重要な種であることが本研究によって強く示された。トゲネズミ3種のうち、アマミトゲネズミとトクノシマトゲネズミは、それぞれ2n=25、2n=45で、XO/XO型の性染色体構成をもち、Y染色体だけでなく性決定遺伝子SRYを消失した極めてめずらしい哺乳類である。一方、オキナワトゲネズミ(以下オキナワ)は2n=44、XX/XY型で唯一Y染色体をもつ。分子細胞遺伝学的な手法を用いた3種の比較解析により、XO型トゲネズミのY染色体の消失過程を明らかにすることを目的とし、平成21年度は、研究実施計画にある3種の系統関係の解明と、オキナワにおけるSRYの存在有無の確認、機能性予測、染色体上の位置の確認をおこなった。分子系統解析の結果、オキナワが共通祖先から先に分かれ、XO型2種の共通祖先でY染色体が消失したことが示された。PCR法とサザンブロット解析、FISH法の結果、一般的な哺乳類では単一のSRYを、オキナワはY染色体上に複数コピーもつことがわかった。オキナワには少なくとも24種類のSRY配列が存在し、3配列はORFが保存されていたが、残り21配列には中途ストップコドンが存在した。全コピーにおいて、他種では保存されたDNA結合表面のひとつにアミノ酸置換がみられたことから、3種の共通祖先に生じた変異であることが示唆された。オキナワのSRYの機能性は今後、詳細に調べる予定である。また、オキナワの性染色体の特徴を明らかにするために染色体解析をおこなった結果、オキナワのX、Y染色体は一対の常染色体の融合により、大きなユークロマチン領域を獲得したことが明らかとなった。この構造変化により、オキナワは唯一Y染色体の消失を免れた可能性がある。SRYの消失は、Y染色体の消失において鍵となるイベントであるが、オキナワのSRYおよびY染色体に特異的な変異がみられたことから、Y染色体の運命に関わる変異が、XO型2種だけでなく、オキナワを含む3種の共通祖先に生じたという新たな可能性が、本研究によりはじめて示された。

また、CGH解析の結果、オキナワのY染色体に性特異的な領域は検出されなかったが、単一のY連鎖遺伝子と同定されたDDX3YとUTYのcDNAクローンを用いたFISHの結果、両遺伝子はYpの動原体付近に存在し、祖先Y染色体領域がYp動原体付近に保持されていることをつきとめた。さらに、SOX9の精巣特異的エンハンサー領域にあるSRY結合配列の保存性を、マウス、ラット、ヒト、オキナワにおいて比較した結果、結合サイトの一つにオキナワ特異的な置換がみられ、保存性が失われていた。今回の結果から、トゲネズミ共通祖先はY染色体にいくつかのY連鎖遺伝子を保持していたことが明らかとなったが、SRYの機能はトゲネズミ共通祖先において、すでに低下もしくは消失していた可能性が考えられた。トゲネズミ属のY染色体進化を解明するために、オキナワは鍵となる重要な種であることが本研究によって強く示された。
ミナミヤモリ種群における核型変異と性染色体の分化

本研究は、九州の南端から琉球列島、台湾に産するミナミヤモリ種群と、大陸中国南東部に産するGekko hokouensisおよび本邦に産するGekko属をGバンド法を主とした染色体分染法を用いて比較解析したものである。本研究で分析された核型の染色体数はすべて2n=38であり、大別して6種類に分類され、うち2つの核型に性染色体(ZZ/ZW型)が分化していることが判明した。核型Aは大陸中国産の核型であり、大型中部動原体型染色体が2対(1-2番)、大型から小型端部動原体型染色体が10対(3-12番)、大型から中型の次端部動原体型染色体3対(13-15番)、小型両腕染色体4対(16-19番)により構成されていた。それぞれの染色体対はG-バンド法で識別可能であった。核型Bは台湾産2種の核型で、核型Aの6番染色体が腕間逆位を起こして次端部動原体型染色体になったもの、核型C1は、先島諸島産の核型で、核型Bの4番染色体に雌特異的な腕内逆位が生じ、G-バンド法でのみ認識可能な異形対となっているもの、核型C2は、北琉球諸島と沖縄島産の核型で、核型Bの4番染色体に雌特異的な腕間逆位を生じ、次端部動原体型染色体となって異形対となったものである。核型Dは、オキナワヤモリの核型で、核型Bに5番染色体の短腕獲得、16番染色体の長腕伸張他を伴ったものであり、核型Eは、ニホンヤモリの核型で、核型Aの11番染色体が短腕を得たものである。その他の種では、ニシヤモリは核型A、タワヤモリ、ヤクヤモリ、タカラヤモリは核型B、アマミヤモリは核型Dであることが判明した。核型C1、C2ではZW型の性染色体が分化していた。一方、本研究で核型Eとしたニホンヤモリの核型については、先行研究によりXY型性染色体の存在が報告されていた。しかし少なくとも今回調べた5地点のサンプルにおいては、性染色体は分化していなかった。研究課題「ミナミヤモリ種群における核型変異と性染色体の分化」を遂行すべく、以下のことを行った。1.細胞遺伝学的手法による解析:ギムザ染色法に加えてGバンド法、Cバンド法、AgNOR法などの染色体バンド法を用い、基準標本産地である河口産のミナミヤモリ(Gekko hokouensis)をはじめ各地に産するミナミヤモリの核型解析を展開している。現段階では、この種群の核型は、(1)中国本土型、(2)台湾・西表島型、(3)沖縄本島・トカラ列島型、(4)沖縄本島隠蔽種型と4つの核型に大別できる。ちなみに、台湾隠蔽種は現在のところ(2)の範疇にある。異型対となった性染色体は(3)沖縄本島・トカラ列島型のみに見られ、(1)中国本土型と

(2)台湾・西表島型の4番染色体対が異型対になったものとGバンド法によって明らかにされた。常染色体の変異については、(1)中国本土型の6番染色体対は端部動原体型であるが、(2)台湾・西表島型、(3)沖縄本島・トカラ列島型では短腕を獲得して次端部動原体型となっていることが明らかとなった。(4)沖縄本島隠蔽種型の解析はその途上にあるが、前述の6番染色体の短腕獲得に加えて、さらなる常染色体の変異が付加的に起こっていることが判明している。以上の事実から、現時点では、(1)→(2)→(3)の核型変異が起こったものと推測し、(4)については、性染色体が分化していないことから、(2)→(4)へと変異したものと推測している。2.In situ hybridizationによるrDNAのマッピング:プライマーとなるオリゴヌクレオチドの合成とゲノムDNAの抽出・精製を行った。現在このプライマーを用いてのPCR産物のTAクローニング行っている。3.ミナミヤモリとその近縁種の採集:先島諸島の石垣島、宮古島、黒島、竹富島よりミナミヤモリを採集し、台湾並びに沖縄本島隠蔽種と近縁種としてヤクヤモリ(G.yakuensis)を採集し、培養に供した。これまでの成果を、2005年6月1418日にスペイン・グラナダで開催されたInternational Cytogenetics and Genome SocietyのFirst Congresにおいて「Chromosomal differentiation in the Gekko hokouensis species complex (Gekkonidae, Squamata)」のタイトルで発表した。著者は、Kohno et al.である。細胞遺伝学的手法による解析(河野担当)については、これまでに西表島産雌で観察された4番染色体(性染色体)の腕内逆位が、新たに石垣島産のミナミヤモリ種群の雌1頭のGバンド分析により観察され、性染色体対異型化の中間的存在(相同対→腕内逆位→腕間逆位による異型対化)である可能性が強く浮上してきた。FISH解析他(久保田担当)については、18S rDNAの座が19番染色体の二次狭窄部であることを確認し、精巣の分化に関与するDMRT1遺伝子については、slot blot hybridizationを行ったが、明確な雌雄の差は認めなかった。この結果は、「ミナミヤモリ(Gekko hokouensis)における性染色体関連遺伝子の検索」(芝池ら)とし、染色体学会2005年度(第56回)年会(弘前)において報告した。新たに、西表島産の4個体(♀3、♂1)を11月に、また、ミナミヤモリの近縁種であるタワヤモリ(G.tawaensis)を12月中旬岡山県北木島にて4頭を採集し、うち雄1頭を培養に供した。採集は、いずれも太田が行った。これまでの成果を、2006年11月23,24日に千葉大学で開催された染色体学会2006年度年会において「ナミヤモリ(Gekko hokouensis)種群における染色体変異(第3報)」のタイトルで発表した。著者(発表者)は、芝池由樹他である。細胞遺伝学的手法により(河野担当)、先島諸島に生息するこの種群の雌の動物が第4染色体対に腕内逆位を持ち、Gバンド分析により異形性(ZZ/ZW型性染色体対)が観察されることが明らかになった。沖縄島、北琉球に生息する個体群の短腕を持って異形対となった性染色体(ZZ/ZW)とは別の性染色体が南琉球に分化していることが明らかになった。また、タワヤモリ、ヤクヤモリ並びにタカラヤモリの核型は台湾産のミナミヤモリの核型と、ニシヤモリの核型は中国大陸産のG.hokouensisのそれと同じであり、アマミヤモリの核型はオキナワヤモリのそれと同じで、本邦並びに近隣のGekko属が大別して6種の核型よりなることが判明した。FISH解析他(久保田担当)については、18S rDNAのマッピングに続いて、5S rDNAの座が8番染色体(端部動原体型染色体)にあることを確認した。新たに、ミナミヤモリ種群の近縁種である長崎県平戸産のニシヤモリ(♀3、♂3)、岡山県北木島産のタワヤモリ(♀3、♂2)、トカラ列島小宝島産のアマミヤモリ(♀2、♂2)、宝島産タカラヤモリ(♀2)を採集し、培養に供した。これらの採集は、いずれも太田により行われた。
口腔粘膜重層培養系を用いたmTOR阻害剤による口内炎発症機序の解明

本研究の目的は、重層培養系を用いて、mTOR阻害剤の長期的影響を調べ、口内炎発症機序を解明することである。本研究の重層培養系は、下からコラーゲンコートしたメンブレンを基底膜に模しており、その上に有棘層、顆粒層、重層扁平上皮表層が形成される。単相培養系を用いた基礎検討では180日以上の長期培養が可能であった。この重層培養系での長期培養を試み、従来報告がなかったシロリムス存在下での長期的構造的変化を捉える。それにより扁平上皮層の形成が抑制され、アフタ性口内炎をinvitroでmimicし、さらに長期培養により、表層の扁平上皮化が起こるかどうかを観る。
機能性分子による共役ポリマーの超階層構造の構築

共役ポリマーは光学的、電気化学的に共役系特有の性質を示すことから有機半導体、有機EL素子、ディスプレー、太陽電池、化学センサなど多方面にわたり研究されている。これらの応用には共役高分子の鎖間、鎖内の光学的、電気化学的な性質をチューニングすることが重要な課題の一つだと考えられる。そのためには、主鎖を規則的に配列させることはもちろんのこと、鎖間を様々な距離に制御することが必要である。現在では、液晶や結晶化を用いた手法が報告されているが、主鎖を一方方向に配列させることは可能でも鎖間を様々な距離にチューニングするまでには至っていない。そのため、新たな一般的な手法の開発が待たれているのが現状である。そのような背景のもと、我々は細胞中におけるアクチンフィラメント(1次元高分子)の配列に注目した。そのコンセプトは、複数のアクチンフィラメント認識部位を有する架橋タンパク質がアクチンフィラメント間を架橋するという非常にシンプルなものである。これにより形成される構造は、認識部位間のスペーサーの距離、配向および自由度に大きく依存するため、鎖問の狭い強固な構造や鎖間の広い柔軟な構造となる。以上の知見から、共役ポリマーを規則的に配列させるためには、共役ポリマーを認識する部位を複数有する架橋分子を用いれば可能であると考え検討を行った結果、共役ポリマーを2次元シート、環状、グリッド状の集合体へと変換することに成功した。今後3次元の結晶性配列へと展開することが必要となる。
自然免疫の記憶機構のゲノム解析

生物が、1度感染した病原菌を記憶し、2度目の感染に素早く応答し菌を排除することは、蔓延する病原菌に対抗し生き残るために重要な適応戦略である。従来、原始的な免疫機構である自然免疫には、このような記憶のメカニズムはないと考えられてきたが、近年、記憶を示唆する研究例が蓄積している。例えば、ショウジョウバエに低濃度の菌を感染させ事前に訓練しておくと、その後の高濃度の感染に抵抗性をもつことが示されている。しかし、そのメカニズムは不明な点が多く、議論が続いているのが現状である。重要な問題点の1つは、訓練による免疫増強は、本当に記憶というメカニズムが寄与しているのか、通常の免疫シグナルが残存しているだけなのか、明確ではないことである。本研究は、ショウジョウバエのゲノム科学を用いて、この問題にアプローチし、「自然免疫の記憶」のメカニズムを明らかにすることを目的とする。研究の成果は、新しい免疫機構を解明するだけではなく、ゲノム科学の手法の新しい応用例を提案できる可能性をもつ。具体的には、ショウジョウバエのゲノムワイド関連解析を用いて、通常の免疫反応と訓練による免疫増強に関連する遺伝子座を同定する。2つの遺伝子座を比較することによって、訓練による免疫増強が通常の免疫シグナルとは異なるメカニズムで制御されているのか、検証する。自然免疫の記憶機構が示唆された場合、それに関与する遺伝子群を網羅的に同定する。個々の遺伝子の役割は、ゲノム編集技術を用いて実証する。さらに、トランスクリプトーム解析から、免疫記憶における遺伝子発現の変化を調べる。これらの解析から、自然免疫の記憶のメカニズムと、それに関与する遺伝子ネットワークの全体像を明らかにする。ショウジョウバエの免疫記憶を検出するために、injectionによる全身性の感染モデルにおいて様々な菌種を用いて訓練効果の検出を試みた。その結果、いくつかの菌種の組み合わせで高い訓練効果が検出された。その条件は、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)で訓練を行い、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)で本感染を行うものと、マイクロコッカス属菌(Micrococcus luteus)で訓練を行い、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)で本感染を行うものであった。興味深いことに、この組み合わせを入れ替えると訓練効果が検出されなかったことから、訓練効果にはある程度の特異性があることが示唆された。トランスクリプトーム解析を行なうために、上記2種の組み合わせで、訓練の有無、本感染の有無の計7条件のショウジョウバエを準備し、各条件3レプリカ(計21サンプル)の成虫オスの個体全身からRNAを抽出し、RNA-Seq解析を行なった。HiSeq2000によるシーケンス解析から各サンプルで平均19,400,000リード(各リード100 bases)の配列を取得した。現在、データを解析中であり、今後、訓練による発現変動遺伝子を同定する。さらに、免疫訓練のゲノムワイド関連解析を行なうために、ゲノム配列が決定されている系統ライブラリーであるDSPR系統(King, Genetics 2012)の一部を用いて、条件検討を行なっている。マイクロコッカス属菌で訓練を行い、黄色ブドウ球菌で本感染を行う条件がより安定的に定量的に訓練効果を検出できることから、この条件でさらに詳細な実験条件(菌の濃度や訓練から本感染までの時間など)を検討している。実験条件が決まり次第、DSPR系統群を用いて、ゲノムワイド関連解析を行なう。トランスクリプトーム解析から、免疫訓練によって発現変動する遺伝子を同定する。今回、訓練と本感染について2種類の組み合わせ(1ネズミチフス菌の訓練で緑膿菌の本感染、2マイクロコッカス属菌の訓練で黄色ブドウ球菌の本感染)で実験を行なった。それぞれの組み合わせで発現変動遺伝子を同定するとともに、両者を比較し、共通して変動する遺伝子を同定する。訓練菌と本感染菌の組み合わせを入れ替えると訓練効果が検出されなかったことから、訓練効果にはある程度の特異性が存在することが示された。したがって、各組み合わせで特異的に変動する遺伝子は特異的な訓練効果に関与する可能性があり、両条件で共通して変動する遺伝子は訓練効果に共通して関与する遺伝子であると予想される。ゲノムワイド関連解析から、訓練前の通常の免疫応答に関わる遺伝子座と、訓練後の免疫増強に関連する遺伝子座を同定する。2つの遺伝子座を比較することによって、訓練効果に特異的に関与する遺伝子座を同定する。さらに、トランスクリプトーム解析との統合的な解析から、自然免疫の記憶機構に関与する遺伝子群を網羅的に同定する。近年、「自然免疫の記憶」に関する論文が続々と発表されている(総説として、Netea, Cell Metab 2019など)が、これらの研究は主に哺乳類の培養細胞を用いており、自然免疫の記憶において個体レベルで何が起きているのか、など不明な点も多い。さらに、多様な病原菌がどの程度特異的に記憶されるのか、免疫記憶が次世代に継承されるのか、など重要な問題点も解決していない。本研究は、これらの問題にアプローチすることによって、「自然免疫の記憶」の研究に新たなパラダイムシフトを起こすことを目指していきたい。生物が、1度感染した病原菌を記憶し、2度目の感染に素早く応答し菌を排除することは、蔓延する病原菌に対抗し生き残るための重要な適応戦略である。

例えば、ショウジョウバエに低濃度の菌を感染させ事前に訓練しておくと、その後の高濃度の感染に抵抗性をもつことが示されている。しかし、そのメカニズムは不明な点が多く、議論が続いているのが現状である。重要な問題点の1つは、訓練による免疫増強は、本当に記憶というメカニズムが寄与しているのか、通常の免疫シグナルが残存しているだけなのか、明確ではないことである。本研究は、ショウジョウバエのゲノム科学を用いて、この問題にアプローチし、「自然免疫の記憶」のメカニズムを明らかにすることを目的とする。研究の成果は、新しい免疫機構を解明するだけではなく、ゲノム科学の手法の新しい応用例を提案できる可能性をもつ。具体的には、ショウジョウバエのゲノムワイド関連解析を用いて、通常の免疫反応と訓練による免疫増強に関連する遺伝子座を同定する。2つの遺伝子座を比較することによって、訓練による免疫増強が通常の免疫シグナルとは異なるメカニズムで制御されているのか、検証する。自然免疫の記憶機構が示唆された場合、それに関与する遺伝子群を網羅的に同定する。個々の遺伝子の役割は、ゲノム編集技術を用いて実証する。さらに、トランスクリプトーム解析から、免疫記憶における遺伝子発現の変化を調べる。これらの解析から、自然免疫の記憶のメカニズムと、それに関与する遺伝子ネットワークの全体像を明らかにする。ゲノムワイド関連解析を行うためには、生物の形質を定量化する必要がある。ショウジョウバエの免疫記憶を検出する実験条件を検討した。過去の報告と同様に、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の死菌をinjectionして訓練した成虫は、その後の緑膿菌のinjectionに対する抵抗性が上昇した。また、エントモフィラ菌(Pseudomonas entomophila)の経口摂取による免疫応答について調べたところ、死菌を用いた訓練によって、その後の感染における抵抗性が上昇することがわかった。これらのことから、injectionによる全身性の感染においても、経口摂取による局所的な腸管の感染においても、事前の訓練によって免疫増強が誘導されることが示された。さらに、ゲノム配列が決定されている純系統ライブラリーであるDSPR系統(Long, Trend Genet 2014)の一部を用いて、エントモフィラ菌の経口感染における訓練効果を調べたところ、訓練効果の強さ(生存率の上昇幅)は系統間で共通していたが、訓練の感受性(免疫増強を示す菌の濃度)が系統間で異なることがわかった。このことから、訓練の感受性を指標にすることによって、免疫記憶に関連する遺伝子をゲノムワイドに探索できる可能性が示唆された。生物が、1度感染した病原菌を記憶し、2度目の感染に素早く応答し菌を排除することは、蔓延する病原菌に対抗し生き残るために重要な適応戦略である。従来、原始的な免疫機構である自然免疫には、このような記憶のメカニズムはないと考えられてきたが、近年、記憶を示唆する研究例が蓄積している。
マイクロ流路内気泡の挙動制御の最適化

本研究はCPU等の各種電子機器の冷却のための熱交換器やマイクロリアクタ等の気液二相を利用したデバイスを対象とし,マイクロ流路(500∝m以下)での気泡挙動を制御することを目的としている.そこで,流路形状や液物性値(表面張力,粘度等)がマイクロ流露内の二相流動に及ぼす影響を調べた.円形と矩形のマイクロ流路,物性値の異なる各種液を用い,流動様式,気泡速度,気泡長さ,ボイド率と圧力損失を測定した.そして,それらのデータを記述するモデルを得た.本研究はCPU等の各種電子機器の冷却のための熱交換器やマイクロリアクタ等の気液二相を利用したデバイスを対象とし,マイクロ流路(500∝m以下)での気泡挙動を制御することを目的としている.そこで,流路形状や液物性値(表面張力,粘度等)がマイクロ流露内の二相流動に及ぼす影響を調べた.円形と矩形のマイクロ流路,物性値の異なる各種液を用い,流動様式,気泡速度,気泡長さ,ボイド率と圧力損失を測定した.そして,それらのデータを記述するモデルを得た.本研究はCPU等の各種電子機器の冷却のための熱交換器や気-液間の反応を行うマイクロリアクタ等の気液二相を利用したデバイスを対象とし、マイクロ流路(500μm以下)における気泡挙動を制御することを目的としている。そこで、今年度の研究では気液混合法および液物性値(表面張力、粘度等)がマイクロチャンネル内の二相流動に及ぼす影響を調べた。具体的には供試管として内径100と250μmの溶融シリカ製の円形マイクロチャンネル、作動液体に重量濃度の異なるエタノール水溶液を用い、ボイド率と圧力損失を測定した。気液混合部には内径が250と500μmのマイクロティを使用した。さらに、それらのデータを使って二流体モデルによるボイド率の解析で必要となる壁面摩擦力および気液界面摩擦力の実験値を求めた。その結果、次のことが分かった。供試液体の違いによらず、擬似均質流と擬似分離流の二つのタイプの流れが観察された。・二つの流れに対応して、ボイド率αの実験値は均質流モデルによる式あるいはKawaharaらの式に近い値を示した。・液体の粘度が高くなると気泡の速度が増加し、ボイド率が低下することが分かった。・壁面摩擦力F_<WL>は擬似均質流の場合が擬似分離流のそれより大きくなることが分かった。また、擬似均質流と擬似分離流の中間領域のF_<WL>が存在した。・気液界面摩擦力は擬似均質流の場合が擬似分離流のそれより大きくなることが分かった。さらに、F_Iはボイド率に対して線形的に増加し、その傾きは流動様式に依存することが分かった。本研究はCPU等の各種電子機器の冷却のための熱交換器や気-液間の反応を行うマイクロリアクタ等の気液二相を利用したデバイスを対象とし,マイクロ流路(500μm以下)における気泡挙動を制御することを目的としている.そこで,今年度の研究では流路形状,流路段差および液物性値(表面張力,粘度等)がマイクロチャンネル内の二相流動に及ぼす影響を調べた.具体的には供試流路としてPDMS製の水力学相当直径が250μmの矩形マイクロチャンネル,作動液体に蒸留水,エタノールおよびHFE(ハイドロフルオロエーテル)を用い,流動様式,気泡速度,気泡長さ,ボイド率と圧力損失を測定した.そして,それらのデータを記述するモデルの検討を行った.以下に得られた主な知見を要約する.・擬似均質流,擬似分離流およびレイヤー流の三つの流動様式を観察した.それらの流動様式を記述する新たな流動様式線図を得た.・気泡の速度は物性値に大きく依存することが分かった.また,流路形状(矩形と円形)にも影響を受けることが分かった.新規に開発した分布定数を組み込んだドリフトフラックスモデルで気泡速度を予測できる.・ボイド率は液物性値に依存することが分かった.・擬似分離流における気泡長さはGarsteckiらのモデルで記述できることが分かった.一方,擬似分離流の気泡長さは彼らのモデルより非常に長くなり,新たな式の開発が必要である.・摩擦圧力損失は新たに開発したCモデルを組み込んだLockhart-Marinelli法で予測可能であった.・新規に開発した壁面摩擦力および気液界面摩擦力の構成式を組み込んだ二流体モデルは,ボイド率および摩擦圧力損失を精度良く予測できた.
BC級戦犯横浜法廷で下された死刑判決の減刑基準に関する判例分析

本研究の目的はBC級戦犯浜法廷(1945年1949年)の軍事委員会が下した死刑宣告に関して、刑の宣告・執行に際してその是非の判断基準となった法理論の分析を試みるものである。本研究は平成29年度を以て研究期間の最終年度としていたが、報告者の私的事情及び想定を超える膨大な資料の分析により時間を要し、当初予定より1年間の期間延長を行った。横浜法廷での死刑制度は、軍事委員会が下した死刑宣告に対する1被告人側からの再審請求と、2刑を執行する際のGHQによる事前承認手続きがあり、これらが「再審」的な役割を果たしている。実際、横浜法廷ではこの手続きによって123名の被告人に対して死刑宣告が下され、53名が処刑、そして70名が減刑処分となっている。本研究の調査目的はこの死刑宣告の是非を問う判断基準の分析で、同法廷の刑の宣告文またはGHQの事前承認書を分析したところ、1被告人の犯罪行為に上官からの強制性があったのか(逆説的に被告人の犯罪行為に関与する「自発性」があったのか)、2加えて被告人がその犯罪行為に対して違法性の認識(事前承認書の表記は“moral choice(人道的選択権)"があったのかが問われている。ただしこの基準の運用は単純なものでなく、例えば捕虜を死亡させた場合、被告人が捕虜収容所の所長かスタッフかで顕著な違いを見せており、さらには東西の冷戦対立が生じると対日感情の緩和もあってか、再審請求で減刑措置が多発するなど、この判断基準の運用実態は前半期の場合と比べて大きく異なっている。現在、この判断基準の運用法について、福岡県北九州市で発生した捕虜殺害ケースを事例を基に論文執筆をしており、加えてこの事件の日本人弁護人(柴田次郎弁護士)が遺した資料と米国立公文書館所蔵の資料の比較分析も行い、それを研究ノートとしてまとめている状況にある本件研究の目的は、BC級戦犯横浜法廷で審理された『BC級(アメリカ裁判関係)横浜裁判・第168号事件』、通称「折尾事件」を通して、死刑宣告やその執行に際して用いられた法理論の分析を試みるものである。横浜法廷で下された死刑の執行に対しては、戦争犯罪被告人裁判規程5条h項により、連合国軍総司令官のマッカーサーの事前承認が必要であったが、これが死刑宣告に対する「再審」的な効果をもたらすようになり、多くの死刑宣告者が終身刑等に減刑されている。そこで本研究では、死刑宣告を受けた被告人らがどのような理由で減刑されたかについての、法的分析を試みるものである。特に本件調査では、研究報告者がこれまでの調査活動で発見した『柴田次郎BC級戦犯横浜法廷資料』に含まれている、上述の「折尾事件」をケーススタディーにして、他の事実概要の類似する事件(上官の命令による捕虜殺害処分)との比較を行いながら、国立国会図書館が所蔵するReviews of the Yokohama Class B and Class C War Crimes Trials by the U.S. Eighth Army Judge Advocate 1946-1949や、国立公文書館が保管する横浜法廷の関連資料を調査・分析し、その刑罰の適用実態について明らかにする。本年度(27年度)の研究実績としては、国内で閲覧を可能とする関連資料の調査・収集活動に努め、現在、上述の『柴田次郎BC級戦犯横浜法廷資料』の所有者であった柴田次郎氏の経歴と、氏の横浜法廷における弁護活動の調査が終了し、次年度(28年度)に論文発表する予定である。また『柴田次郎BC級戦犯横浜法廷資料』の経年劣化が著しかったため、本助成金を用いて(株)資料保存器材に申請通りに修繕依頼を行い、28年3月にその作業が完了した。申請書に基づく本件研究計画によれば、本年度(27年度)は、アメリカ国立公文書館に保管されているBC級戦犯横浜法廷資料の調査を行う予定であったが、これを次年度(28年度)に延期した。当初の計画では、日本側の法廷資料を把握して、その裏付けとなるアメリカ第8軍の資料を米国立公文書館で調査する予定であったが、その基礎資料となる日本側の資料の収集に手間取ったことが、今回、アメリカでの調査を延期した理由である。日本側の資料は、その多くが日本の国立公文書館に保管されており、戦犯関係者のプライバシー上、本件研究で必要とする資料の多くが公文書館の事前審査を要するもので、現時点(28年4月10日)でもなお審査中のものがある。米公文書館での調査活動には、本件研究責任者にとっては初めての訪問であり、またアメリカでの調査期間も限られているため、本件研究の資料調査を行うにあたっては、日本側資料を十分に把握し、万全な態勢で実施する方が得策と考え、当初予定していた本年度の渡米調査を次年度に延期することとした。ただしこの遅滞状況は本研究活動にとって致命的なものでなく、次年度の夏期または春期休暇に集中して調査を行えば、その遅滞は挽回し得るものと考えている。以上が本件研究課題の進捗状況に、遅滞を来してしまった理由である。本研究の目的はBC級戦犯横浜法廷で審理された『BC級(アメリカ裁判関係)横浜裁判・第168号事件』、通称「折尾事件」を通して、死刑宣告やその執行に際して再審手続きで用いられた法理論の分析を試みるものである。横浜法廷で宣告された死刑の執行にあたっては、同法廷の適用法規である戦争犯罪被告人裁判規程5条h項により連合国軍総司令官のマッカーサーの事前承認が必要とされ、この承認手続きが死刑宣告に対する「再審」となる。

実際、横浜法廷で死刑宣告を受けた被告人のなかには、この承認手続きで終身刑などに減刑された者もいる。本研究ではこの死刑宣告の減刑措置に関して、どのような理由に基づいて行われたかを法的に分析するものである。特に本研究では、報告者が所持している『柴田次郎BC級戦犯横浜法廷資料』のうち、死刑宣告からの減刑措置がとられた「折尾事件」をリーディングケースにして、他の類似事件(特に上官命令による捕虜殺害処分)との比較を行いながら、国立国会図書館が所蔵するReviews of the Yokohama Class B and C Class War Crimes Trials by the U. S. Eight Army Advocate 1946-1949や、国立公文書館が保管する横浜法廷の関連資料、さらにはアメリカ国立公文書館の資料を調査・分析し、同法廷の審理や刑罰の運用実態について明らかにする。本年度(28年度)は本研究の中間成果報告として、横浜法廷における初期の日本側弁護態勢に関する調査結果を執筆した(髙澤弘明「BC級戦犯横浜法廷における日本人弁護人の費用負担問題について」日本情報ディレクトリ学会誌15号・掲載予定)。また、資料収集のため、平成29年3月11日から25日にかけて米国に出張し、アメリカ国立公文書館での資料調査を行った。27年度は本研究資料を所蔵する国内の施設(国立公文書館、国立国会図書館、外務省史料館)を回り、本研究に必要とする多くの資料の収集を行うことができた。なお、当初の予想と比べて資料が膨大であることが判明し、現時点においても資料の収集活動は随時行っている。本年度(28年度)は、本研究の中間報告としての論文執筆を行い、一応の成果をあげることができた(髙澤弘明「BC級戦犯横浜法廷における日本人弁護人の費用負担問題について」日本情報ディレクトリ学会誌15号・掲載予定)。そして本研究にとっての要というべきアメリカ国立公文書館での資料調査を平成29年3月11日から25日にかけて行い、多くの文書資料や画像資料の収集を行うことが出来た。ただし、現在、これら収集資料の整理と分析作業を行っているが、重要資料の発見などもあり、当初の予想に反して分析作業に時間がかかっている。加えて発見した重要資料は、日本の国立国会図書館に所蔵していないアメリカ第8軍関係の資料で、今回のアメリカ滞在中に全て複写することが出来ず、本年度もアメリカ国立公文書館での再調査をする必要性が出てきた。そのため本研究の進捗状況は「やや遅れている」状態であると判断したが、まずは収集済みの資料を29年度の夏期休暇までに分析作業と資料整理を終え、同時にアメリカ国立公文書館での調査を行うことによって、29年度内に論文発表ができるよう鋭意努力する。本件研究の目的は、BC級戦犯浜法廷(1945年1949年)で下された死刑宣告に関し、その際に適用された法理論の分析を試みるものである。死刑宣告に基づく執行を行う場合、GHQの事前承認が必要で、それが死刑宣告の「再審」的な役割を担っていた。その過程で減刑された事例が多数ある。本研究はその事前承認書に記された刑の執行を認める理由を分析することにより、死刑と減刑との境を探るものである。本年度も前年度に引き続き、国立公文書館、国会図書館、外務省史料館での史料収集を行っており、現在も継続中である。
咳による感染症リスクを低減させる建築・設備に関する研究

新型インフルエンザをはじめとした感染症の流行の際には、患者を診察する医療従事者への感染が大きな問題となる。本研究では、医療福祉施設において、感染症患者の咳による医療従事者に対する感染リスクを低減する建築・設備の提案に向け、模擬咳気流発生装置開発、感染対策手法の感染リスク低減評価、CFDによる気流解析、診察・診療行為の動作範囲測定、医療福祉施設における感染リスクの評価方法の提案を行った。医療従事者は、診察・治療のため患者付近の汚染濃度の高い領域に曝露される。特に患者の咳やくしゃみによるウイルスの飛散は医療従事者にとって大きな脅威である。また、このような場合には、診療体制にも支障が出ることが予想されており、安全性が確保された感染対策診療施設を必要数確保するためにも、感染への対策が急務となっている。本研究では、医療福祉施設における感染症リスクを低減する建築・設備を提案することを目的としている。昨年度は模擬咳気流発生装置を用いて咳気流を発生させ、トレーサーガス濃度測定による感染リスク評価実験を実施した。今年度は、主に、診察室や病室において感染対策のための環境制御を効果的に行うため、診療中の医療従事者や患者の動作範囲を測定し、感染リスクとなる汚染物質の発生場所と対策の必要な場所の測定を行った。医師、看護師の協力のもと、着衣にマーカーをつけて診療行為をし、その様子をビデオカメラで撮影した。患者役として被験者を用い、重症度の異なる症状(軽度:熱は無い。体調が良くないので心配、中度:微熱、重度:高熱)を想定し、順に演じさせた。医師・看護師は、通常行っている外来での診察と同様の診察・診療行為を行った。これらの録画画像を用いて3次元ビデオ動作解析を行った。患者を座らせて診察を行う場合と寝かせて診察する場合に分けて、診療行為中の医療従事者と患者の動作範囲を明確にした。以上のような社会的背景を受け、医学分野のみならず、建築・設備の観点からの感染症対策が重要であると考えられる。本研究では、医療福祉施設における感染症リスクを低減する建築・設備を提案することを目的とし、科学的根拠に基づいた感染リスク評価手法の提案を行う。昨年度までの研究で、模擬咳気流発生装置を用いて咳気流を発生させた感染リスク評価実験を行った。また、診察室や病室における診療中の医療従事者や患者の動作範囲を測定を行い、診察室での汚染物質の発生状況及び対策が必要な場所を明確にした。今年度は、感染症患者から発生した汚染物質(ウイルスなど)を含む咳気流の空間性状の詳細な把握、他条件検証が可能な再現モデルの作成を目的とし、前年までに実施した実験を再現する気流流体解析(CFD)を行った。境界条件として、模擬咳気流発生装置開発時に測定した咳データ(咳流量、気流速度など)を入力した。また、医療福祉施設における感染症リスクを評価する評価式を提案した。この式に上記の実験、実測、解析などで得られた結果を代入することで、患者の咳による汚染物質(ウイルス)濃度と、診察室内での人の動きを考慮した感染リスク評価を行うことが可能になった。本研究を遂行するにあたり、既往研究の調査や社会情勢などの調査を行い、本研究の位置づけ、研究の方向性を確認した。実際の患者の咳によるウイルスの飛散・感染を再現性を持って模擬するため、模擬咳気流発生装置を開発した。測定精度の確認のため、咳流量・気流形状などについて人間の咳との比較を行った。診察室を想定した実験室において、開発した模擬咳気流発生装置を用いて咳気流を発生させ、トレーサーガス濃度測定による感染リスク評価実験を実施した。

本実験は、患者の咳を模擬して模擬咳気流発生装置から放出したトレーサーガスの濃度を、医療従事者(医師、看護師)にみたてた呼吸機能を設置したサーマルマネキン(ブリージングサーマルマネキン)の呼吸域で測定する。トレーサーガスとして二酸化炭素を用いた。室内環境条件として、プッシュプル装置などの局所気流発生装置を用いて異なる気流制御を行った条件、人体位置を変更した条件、隔壁やマスクを使用した条件を設定した。人体配置を直接咳気流に当たらないようにすることや、プッシュプル装置のような局所換気の有効性、その中でも特に間に障害物がなく気流が形成できる横方向と斜め方向のプッシュプル気流によって大きな効果が得られることがわかった。おおむね順調に進展している。研究成果は学会などで発表する予定である。おおむね計画通り進捗している。これまでの実験、実測などで得られた結果より、医療福祉施設における感染症リスクの評価方法の提案などを行う。病室のような広い空間における咳気流の伝搬特性を把握する必要がある。このため、模擬咳気流発生装置の改良を行い、トレーサーとしてパーティクルを用いることができる、人間の口腔形状を模擬できるものにする必要がある。改良の際には、人間の咳との比較を行い、測定精度の確認を行う。また、診察室や病室において感染対策のための環境制御を効果的に行うため、診療中の医療従事者や患者の動作範囲を測定し、感染リスクとなる汚染物質の発生場所と対策の必要な場所を明確にする。重症度の異なる症状を想定し、通常行っている外来での診察と同様の診察・診療行為を行う。これらの録画画像より、3次元ビデオ動作解析を行い、診療行為中の医療従事者と患者の動作範囲を明確にする。次年度の研究費は、主に感染リスク評価のための測定費用、研究成果の発表などに使用する予定である。模擬咳気流発生装置の精度測定を行うための実験費用、医療従事者・患者の動作解析測定実験費用、これまでの研究成果発表費用。
魚卵・稚仔の大量標識法の開発

本研究で予定した計画はほぼ完遂し、最終目的とした魚卵・稚仔の耳石標識法の確立を果すことができた。その成果の概要は以下の通り。(1)塩酸テトラサイクリン(TC)、アリザリン・コンプレクソン(ALC)およびカルセイン(CAL)が耳石標識剤として使えることがわかった。それぞれ黄色、鮮紅色、緑黄色の蛍光を呈するマークを作った。至適当処理法は魚種・発育段階により異なるが、おおむね100300mg/lで24時間浸漬するのが良かった。複数の標識剤で多回処理することにより多重標識が得られた。(2)本法をアユ・ニジマス・サクラマス・シロウオ・マダイ・ヒラメ・ニシン等淡水魚・海産魚計24種に試してみた所、いずれも標識可能であった。(3)標識処理によって耳石に23日分に相当するチェックリングができることもあるが、その後通常の輪絞形成が再開された。標識魚と対照魚の成長生残に差はなかった。骨・鱗・鰭条等耳石意外の硬組織には標識処理後約1ケ月経過すると全く標識蛍光は見あたらず、標識剤は耳石を除き全て外へ排出されてしまうものと考えられた。これらのことより、本法が魚に与える悪影響はほとんどなく、また標識残存期間もその個体のほぼ一生に亘るものと予想された。(4)ゴム引きのキャンバス水槽(6角形・直径約6m、水深50cm)を考案したことにより、安全且つ廉価に大量の稚仔魚を標識することが可能となった。(5)実際の天然海域でALC標識したマダイとTC処理のアユ仔魚を放流して追跡調査したところ、本標識法がこれらの野外調査で極めて有効であることが確認された。また2群の稚仔魚に全く同一の環境条件を与えて飼育する際にも本法は有効であることが確認された。(6)本研究の成果の一部は10編に分けて公表された。本年度予定した研究計画はほぼ完遂することができた。(1)大量処理法約30万尾のマダイ稚魚(全長1020cm)を同時に標識処理する方法を開発した。ゴム引きのキャンバス水槽(六角形、直径約6m、水深50cm)を考案したことにより、一時に大量の稚魚を処理することが可能となり、廉価で且つ安全な大量処理法が確立された。(2)標識魚の野外放流実験大分県蒲江町入津湾においてアリザリン・コンプレクソン(ALC)で耳石標識を施したマダイ稚魚約70万尾を放流し、本標識法が実際の放流調査の実用に供せるか否かを検討した。大量標識処理とそれに続く輸送、放流、再捕、標識検出と各作業とも順調に進み、本法の野外調査における実用性が検証された。なおこの間、捕食魚の消化管内容物中にも標識耳石が発見され、本法は天然水域における被捕食調査にも利用できることがわかった。(3)標識処理の影響本法の処理時には耳石上に23日分に相当するチェックリングが形成されたが、その後は通常の輪絞形成が再開された。なお本法は仔稚魚の成長・生残に全く影響しないことをアユ・マダイで確認した。(4)標識検出法

耳石の凹部の成長率は低いため、この面を上にして観察すると、12才魚の高齢マダイでも研磨することなく螢光標識を確認できることがわかった。(5)成果の公表本研究の成果の一部は6報にわけて公表した。
遺伝子工学・細胞生物学的アプローチによる配偶子形成過程における分子基盤の解明

TEX101は、Ly6-like prorein superfamilyに属すGPIアンカー型タンパク質であり、生殖細胞特異抗原である。本研究ではこの分子と精巣内で共役するLy6k及びdipeptidase3の分子性状を詳細に検討した。その結果、Ly6kの精巣内における胎生期から性成熟期に至る詳細な発現動態、及びTEX101とdipeptidase 3が精巣内生殖細胞膜上で分子複合体を形成することを明らかにした。生殖細胞(配偶子)形成は正常な受精・発生を保証する上で重要かつ本質的な過程である。従って、その過程に関連する分子の機能不全があれば配偶子の機能不全に繋がり、結果として不妊症になる。生殖細胞形成過程には形成段階に特異的な様々な分子群が関与しているが、それらの分子群のうち我々は生殖細胞マーカー分子TEX101分子に焦点を当て研究を進めてきた。TEX101は、近年癌細胞の転移・接着に関与する重要分子群として注目されているウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体(uPAR)/Ly6ファミリーに属すGPIアンカー型タンパク質であることを我々は明らかにしている。このことは、接着・移動等の細胞生物学的機能を介して配偶子形成過程においても本分子特有はユニークな生理活性を有することが推測される。本年度は、まずこの分子と精巣内で共役することをこれまでの研究で明らかにしたLy6k分子(GPIアンカー型タンパク質)との相互作用・分子発現動態を時系列で確認することを試み、免疫組織化学・分子生物学的にこれらの分子および遺伝子発現を解析した。その結果、Ly6kは生殖細胞特異的な発現は示さなかったが、精巣内においては時間的・空間的にTEX101と密にリンクした挙動を示すことが明らかになった。平行して試みている遺伝子相同組換えを用いたTEX101遺伝子欠損ES細胞は、その樹立を目指して、現在、TEX101遺伝子エクソンをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを構築し、マウスES細胞にエレクトロポレーション法で遺伝子導入を試みている。生殖細胞形成は正常な受精・発生を遂行する上で本質的な過程であり、その過程に関連する分子の機能不全があれば配偶子の機能不全に繋がる。従ってこの機構の解明は不妊症の病態生理の理解する上で重要である。生殖細胞形成過程にはその段階に特異的な様々な分子群が関与しているが、それらの分子群のうち、我々は生殖細胞マーカー分子TEX101に焦点を当て研究を進めている。TEX101は、Ly6-like proreinスーパーファミリーに属すGPIアンカー型タンパク質である。精巣内においては精母細胞、精子細胞、成熟精子に発現しており、また、卵巣においては出生直前の卵巣内卵原細胞に一時的限局発現することを我々は明らかにしてきた。その発現動態の特徴から生殖細胞形成過程において重要な生理活性を持つことが推定される分子である。本年度は、この分子と精巣内で共役するLy6kの分子性状を更に詳細に検討し、その1)精巣内におけるTEX101との発現相互作用の解析を行い、胎生期から性成熟期に至る詳細な発現動態及び2)多クローン抗体と単クローン抗体の異反応性を詳細に検討した結果、膜結合型Ly6k 17kDa form及び可溶型12kDa formの存在の2点を生化学的・形態学的な手法を用いて明らかにした。平行してTEX101プロモーターを利用したTex101-iCreトランスジェニックマウスの作製を行いCre recombinaseの精巣内生殖細胞限局発現を確認した。正常な受精・発生を遂行する上で生殖細胞形成は本質的な過程である。生殖細胞は二倍体生物個体において、「次世代にその形質を伝える」という他の体細胞と全くその機能として一線を画しており、減数分裂による遺伝子セット(ゲノム)の一倍体化を始め様々なユニークな特徴を有している。その形成段階においては、これまでの研究によりさまざまな分子の機能が明らかにされてきた。生殖細胞形成においては、他の体細胞と共通の分子機構も存在するが、その一方で、多種多様な特異的な分子群の関与も示されている。それらの分子群のうち、我々はLy6-like proteinスーパープァミリーであるTEX101(GPIアンカー型タンパク質)の生殖細胞上での生理活性の解明を目標に研究を進めている。TEX101はN結合型糖鎖を持つ糖タンパク質であることをこれまでの研究で明らかにしてきたが、本年度は、この糖鎖分子を認識する単クローン抗体Ts4を用いて、精巣内におけるTEX101の関連分子について検討した。その結果、1)精巣内のTs4が認識する糖鎖を有すTEX101分子とdipeptisase3が精巣内生殖細胞膜上で分子複合体を形成すること2)dipeptidase3の精巣内及び精巣上体内における発生過程を含めた発現動態を明らかにした。平行して現在TEX101欠損マウスの生殖能の解析を細胞生物学的に進めている。
オートファジーの化学生物学研究

ケジカルゲノミクスの手法でオートファジー制御活性を定量的に測定した.その結果を階層的クラスタリングによって解析することで,がんと神経細胞におけるオートファジーの制御機構の違いを明らかにした.オートファジーを促進することで,たんぱく質凝集を阻害するSO286はSOBP1と結合し,SOBPをノックダウンすることでSO286の作用が阻害された.このことから,SOBP1がSO286の作用に関与していることが示唆された.オートファジー細胞死誘導物質の探索をおこなった結果,放線菌2142A-36株を大量培養し,単離精製,構造解析した結果, Cholest-5-ene-3b,7a-diolを取得した.蛍光タンパク質EGFPとmCherryをN末端側に融合したLC3B (tf-LC3)を細胞に発現させることでオートファジーが定量的に検出できる.そこでtf-LC3遺伝子を発現できる高力価のレトロウイルスを作製し,HeLa, PC12D細胞に感染させることでtf-LC3を一過的かつ安定的に発現させることに成功した.ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にMPP+を処理すると細胞内にα-Synucleinを含む凝集物が蓄積し,MPP+とSO286を共処理するとα-Synuclein凝集物の蓄積は抑制された.これまでにSO286の結合タンパク質(SOBP)を同定している.SOBPwoノックダウンすることでα-Synucleinの凝集が観察されること,またこのSOBPのノックダウン細胞にSO286を添加してもMPP+によるα-Synuclein凝集物の蓄積が抑制されなかったことから,SO286の凝集物蓄積阻害作用にSOBPが関与していることが示唆された.レトロウイルスベクターに,short hairpin RNA (shRNA) -Atg7を発現するプラスミドを作製した.このプラスミドを用いてHEK293T細胞培養上清中にレトロウイルスを産生させた.このレトロウイルスを標的細胞であるA549, PC3細胞に感染させることで,細胞内でAtg7をノックダウンするshRNAを恒常的に発現する安定細胞株の樹立に成功し,オートファジー細胞死を簡易に評価可能な実験系の構築を実現した.mCherry-EGFP-LC3B発現細胞の安定発現細胞を用いてオートファジーの評価を試みたが,細胞の継代を重ねるたびにm-Cherryの赤いドットが蓄積し,正確なオートファジーの定量が困難であった.そこで,レトロウイルスによる発現方法に変更した.このことにより当初予定より若干の計画の遅れが生じた.SO286の標的分子についてはほぼ特定することができた.オートファジー細胞死誘導物質のスクリーニング系も予定通り確立できた..オートファジー制御機構の解析のために,東京大学水島昇教授より供与されたpMRX-IP/GFP-LC3-RFPを鋳型にpGCDNsamMCSV/GFP-LC3-RFPプラスミドを作製した.このプラスミドとpVSV-Gプラスミドを293 GP-2細胞へトランスフェクションして得たレトロウイルスを,293 GP-G細胞に感染させ,FACSによるソーティングを行って293 GP-G/GFP-LC3-RFPレトロウイルスパッケージング細胞を樹立した.RAで分化させたSH-SY5Y細胞に0.5 mMMPP+を24時間処理して一度αシヌクレイン凝集物を形成させてから,10マイクロg/ml SO286と30 nM Bafilomycin A1(BMA :オートファジー阻害剤)と0.1 nM MG132(プロテアソーム阻害剤)をそれぞれ共処理した.その結果,MG132とSO286を共処理した時,SO286による凝集物クリアランス効果は見られたが,BMAと共処理した時,SO286の作用は見られず凝集物の蓄積が見られた.以上のことから,SO286はオートファジーを介して凝集物をクリアランスしていることが分かった.当研究室の保有する放線菌培養液1160サンプル、化合物ライブラリ320サンプルについてスクリーニングを行った。その結果、放線菌2142A-36株培養液に、コントロール細胞にのみ細胞死を誘導する目的の活性を見出した。そこで、放線菌2142A-36株培養液から活性物質の単離精製を試みた。放線菌2142A-36株を大量培養して頂き、培養液から抽出物1.9172 gを得た。ヘキサンによる脱脂後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて化合物の極性による分離を試みた。さらに、Sephadex LH-20 Lab Packsを用いて単離精製を実施し、目的の活性を有する活性画分を得た。オートファジー制御機構解析研究においては,測定方法を変更したことで遅れが生じたかに見えたが,高タイターのウイルスを用いることで,その遅れを解消できたと考えられる.また,SO286化合物を用いたパーキンソン治療薬シードの開発については,神経細胞やモデル細胞系の種類を増やし,当初用いていた細胞(PC12D)における特異的現象ではないことが明らかにできた.また,SO286の標的タンパク質ファミリーの遺伝子をクローニングでき,順調に進行している.オートファジー細胞死誘導物質については,放線菌の生産量が低いことが予想され大量培養を行う必要が生じたが,精製は順調に進行している.オートファジー誘導機構の制御:東京大学・水島教授より頂いたGFP-LC3-RFP