hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵ランゲルハンス島（膵島）移植における持続冷却潅流装置による膵臓保存に関する研究

本研究は、条件の悪いマージナルドナーから提供された膵臓を従来の冷却浸漬保存でなく持続冷却灌流装置(LifePort)にて保存し、分離膵島の収量を上げ、膵島機能を保持させ、I型糖尿病に対する膵島移植に寄与させるためのものである。ビーグル犬を用いた実験により、分離膵島の収量・機能とも、従来法より優れていることが明らかとなった。さらなる保存条件の改善や工夫が必要ではあるが、近い将来の臨床応用が期待できると考えられた。本研究は、改正臓器移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される条件の悪いいわゆるマージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、携帯型持続冷却潅流装置LifePortによる新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。昨年度までに、LifePortによる灌流保存の条件、UW保存の条件、KPS-1灌流液の条件等を決定し、実験デザインを作成した。また、それに沿った膵臓保存移植実験では、LifePort群では移植後1週間で血糖値が正常化したのに対して、UW群においては効果がなく、LifePortの有効性が確認された。さらに、この結果を参考に、分離膵島においてもLifePort保存群とUW保存群の移植後の効果の比較実験をすすめる予定であった。しかし、分離装置COBE1994の故障や膵島分離条件の見直し等があり、十分な実験をすすめることができなかった。以上、昨年度までに完了した、温阻血時間、還流量、灌流圧、保存温度などの実験デザインの設定をもとに、今年度は、設定された条件で障害膵臓の保存、実際に遅れている実験を行い(二群間における膵島の分離状態・分離効率(収量評価)と分離膵島の機能評価(内分泌機能評価、病理学的解析))、データの解析を行った上で、LifePortを用いた新たな持続冷却灌流保存法の有効性の有無を確かめてゆく予定である。本研究は、改正臓器移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される条件の悪いいわゆるマージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePortTMによる新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。昨年度までに、LifePortTMによる灌流保存の条件、UW保存の条件、KPS-1灌流液の条件等を決定し、実験デザインを作成した。分離装置COBE1994の故障も改善したため、温阻血時間、還流量、灌流圧、保存温度などの実験デザインの設定をもとに設定された条件で障害膵臓の保存を二群間(LifePortTM保存群とUW保存群)で行った。平成26年度は、実際に遅れている実験を行い(二群間における膵島の分離状態・分離効率(収量評価)と分離膵島の機能評価(内分泌機能評価、病理学的解析))、データの解析を行った上で、LifePortTMを用いた新たな持続冷却灌流保存法の有効性の有無、臨床応用する上でのプロトコール等の作成を行う予定である。本研究の初年度にあたる平成23年度は実験モデルの作成に重点をおいた。まず、障害膵の作成モデルとして、ビーグル犬に30分の温阻血時間を加えた後、In situ machine wash out法にて膵体尾部を摘出するイヌ部分膵移植モデル(浅野ら)を採用した。実験デザインは、LifePortTMを用い24時間灌流保存したものをLifePort群、摘出膵をUW液にて24時間単純冷却保存したものをUW群とし、二群間の比較対照実験とした。LifePortの灌流条件は、灌流液として細胞外液組成であるKPS-1液を使用し、灌流圧は10mmHg、灌流温度は4°C、灌流時間は24時間と設定した。また、UW群の保存条件は、UW液を用いた4°C・24時間単純浸漬保存とした。実際の同種膵臓保存実験では、LifePort群において移植後1週間後に血糖値が正常に戻ったのに対して、UW群では血糖値が高値のままであり、LifePortTMの有効性が確認された。以上、今年度は、温阻血時間、還流量、灌流圧、保存温度などの実験デザインの設定が完了した。

次年度からは実際に設定された条件で障害膵臓の保存を行い、二群間における膵島の分離状態・分離効率(収量評価)と分離膵島の機能評価(内分泌機能評価、病理学的解析)を行い、LifePortTMを用いた新たな持続冷却灌流保存法の有効性の有無を確かめてゆく予定である。本研究は、改正臓器移植法の施行による脳死膵臓移植の増加に伴い、増加が予想される条件の悪いいわゆるマージナルドナーよりの膵ランゲルハンス島(膵島)移植を想定して、LifePort(LP)による新たな持続冷却潅流保存法の有効性を評価し、これを膵島移植に臨床応用し、より安全で効果的な膵島移植を実現することを目的としたものである。本研究の最終年度までに、ビーグル犬から30分の温阻血時間を加えて摘出した傷害膵をLPにて24時間灌流保存したLP群、UW液にて24時間単純冷却保存したUW群をそれぞれ5例ずつ終了し、それぞれの保存膵から膵島を分離・純化し、二群間の比較対照実験を行った。分離膵島の収量は、純化前後においてLP群が平均で34倍程度多く、分離膵島の大きさや形態もLP群で良好であった。また、分離膵島の機能についてもインスリンの分泌能においてLP群がUW群に比べて良好であった。しかし、分離膵島の病理組織学検討においては、両群において形態の差はなく、インスリンの免疫学染色やアポトーシスを検索するタネル染色においても差はなかった。さらに分離膵島の自家移植においては、十分な膵島量が確保できなかったためか、両群で移植後の血糖値の変移に差は認められなかった。以上、心停止下膵島移植に向けた持続冷却灌流保存の有効性を検討した本研究においてLPによる保存法はUW液による保存法に比べて、膵島分離における有効性が確認されたが、臨床応用するためには、さらなる膵島収量を上げる工夫が必要であると考えられた。移植平成24年度の研究計画の主なものは、23年度に作成された実験モデルに沿って、実験を遂行することである。温阻血膵の摘出とLifePortによる灌流保存は可能となったが、COBE1994による膵島の分離が十分にできていない状態が続いている。現在、膵島の分離方法の見直しを行っているところであり、研究の進行が遅れていると評価した。平成25年度までの研究計画であったが、COBE1994の故障により研究が遅れていた。しかし、故障が改善したため、二群間(LifePortTM保存群とUW保存群)の比較検討であったが、それぞれ1例の実験を行ったのみであった。そのため、今年度までの延長申請をし、残りのそれぞれ4例の実験を行う予定である。以上、研究の進行は遅れているが、平成26年度内には、実験を終了して、データの解析も行う予定となっている。平成23年度の研究計画の主なものは、実験モデルの作成である。温阻血膵の摘出と実験群の作成である。実験モデルのプロトコールは作成され、温阻血障害膵の摘出はできる状態であり、LifePortによる灌流保存、UWによる浸漬保存の準備も完了しているが、膵島分離装置であるCOBE1994の故障があり、両群からの膵島分離ができていない。以上の研究進行の状態より、研究の進行が遅れていると判断した。ビーグル犬よりの膵臓摘出やLifePortによる灌流保存、UWによる浸漬保存などの実験プロトコールほぼ完了している状態である。今後は、実験プロトコールに沿った、障害膵の摘出、LifePortによる灌流保存群、UWによる浸漬保存群にわけた膵臓保存、分離などの実験の遂行が重要な課題であり、実験が進めば本研究を十分に完了することができると考えます。延長した期間を使って、ビーグル犬よりの膵臓摘出やLifePortによる灌流保存、UWによる浸漬保存などの実験プロトコールに沿って、ビーグル犬を使用した二群間の実験を遂行していくのみである。
繊毛性腫瘍における発癌機構に関する研究

本研究は絨毛癌の発生に関与する癌遺伝子の同定を目的とした.このため5種類の絨毛癌細胞からONAを抽出し, transfection実験を行った.受容細胞としてNIH3T3細胞及び4CY-4-3細胞(ヒト活性型C-H-ras遺伝子により完全形質変換をおこすアデノウィルス4型誘発ラット不完全トランスホーム細胞)を用いた.その結果3種類についてフォーカスの形成を認めたが,二次transfection後Alu配列を失い癌遺伝子の同定にはいたらなかった.このため既知の癌遺伝子プロニブを用い, Southern及びNorthern blottingを行ったが,絨毛癌細胞では1113種類に及ぶ癌遺伝子表現の増大が認められ,絨毛細胞におけるゲノム不安定が絨毛癌化の一因となりうるのではないかという推測をえた.1精子受精・雄性発生奇胎培養細胞で観察される高いSCEの発生及び染色体構造異常もこの推測を支持した.さらに染色体構造異常の切断点を調べたところ,絨毛癌細胞で表現の増大していたN-myc癌遺伝子座等に好発することが判明し,受精形態の異常により導かれる奇胎細胞のゲノム不安定と絨毛発癌の因果関係が示唆された.細胞融合法(マウスNIH3T3細胞書ける絨毛癌細胞)を行うため, 8-Aza-guanine抵抗性細胞株を作成することを試みたが不成功に終わったため, Neo遺伝子導入細胞株を先ず作成した.これを選択マーカーとして現在細胞融合を施行中である.絨毛不死化細胞株を作成し,絨毛癌化のIn vitroモデルとするために,正常胎盤絨毛細胞へアデノウィルスEla遺伝子を導入した.その結果非形質転換細胞の限界を越えて,細胞増殖が継続中であるため,次にN-myc, Vsis等の既知の癌遺伝子トランスフェクションを考慮中である.本研究は絨毛癌の発生に関与する癌遺伝子の同定を目的とした.このため5種類の絨毛癌細胞からONAを抽出し, transfection実験を行った.受容細胞としてNIH3T3細胞及び4CY-4-3細胞(ヒト活性型C-H-ras遺伝子により完全形質変換をおこすアデノウィルス4型誘発ラット不完全トランスホーム細胞)を用いた.その結果3種類についてフォーカスの形成を認めたが,二次transfection後Alu配列を失い癌遺伝子の同定にはいたらなかった.このため既知の癌遺伝子プロニブを用い, Southern及びNorthern blottingを行ったが,絨毛癌細胞では1113種類に及ぶ癌遺伝子表現の増大が認められ,絨毛細胞におけるゲノム不安定が絨毛癌化の一因となりうるのではないかという推測をえた.1精子受精・雄性発生奇胎培養細胞で観察される高いSCEの発生及び染色体構造異常もこの推測を支持した.さらに染色体構造異常の切断点を調べたところ,絨毛癌細胞で表現の増大していたN-myc癌遺伝子座等に好発することが判明し,受精形態の異常により導かれる奇胎細胞のゲノム不安定と絨毛発癌の因果関係が示唆された.細胞融合法(マウスNIH3T3細胞書ける絨毛癌細胞)を行うため, 8-Aza-guanine抵抗性細胞株を作成することを試みたが不成功に終わったため, Neo遺伝子導入細胞株を先ず作成した.これを選択マーカーとして現在細胞融合を施行中である.絨毛不死化細胞株を作成し,絨毛癌化のIn vitroモデルとするために,正常胎盤絨毛細胞へアデノウィルスEla遺伝子を導入した.その結果非形質転換細胞の限界を越えて,細胞増殖が継続中であるため,次にN-myc, Vsis等の既知の癌遺伝子トランスフェクションを考慮中である.1.5種類の絨毛癌細胞株(HCCM,ENAMI,CH1,CC1,CC2)を材料に分子生物学的手法をもちいて絨毛癌発生機構とがん遺伝子の関係を検討した。C-onc遺伝子の構造変化を既知の16種類の癌遺伝子プローブを用いSouthern blot hybridizationによって調べるとENAMI株にC-mycの遺伝子増幅とC-fms遺伝子の組み換えが観察された。これらの変化は5株に共通したものではないため、絨毛癌化との直接の因果関係は考え難いものの、腫瘍の進展や株化などのいずれかの段階で何らかの役割を果したものと推測された。さらにC-onc遺伝子の発現をNorthern blot hybridizationにより調べた。その結果少なくとも11種類から13種類にも及ぶC-onc遺伝子がさまざまなレベルで発現していることが観察された。H-ras,K-ras,N-ras,C-myc,N-myc,fos,src,yes,fms,erbB,rafは全株において、またab1,sis,fpsは株により発現していることが判明した。とくにfosとN-mycは正常線維芽細胞と比べ著しく発現が増大していた。このような多くのC-onc遺伝子の発現例はこれまでに報告されていない。さらにC-onc遺伝子に発癌活性をもたらすような特定の変異の存否を検討するため、マウスNIH3T3細胞、アデノウィルス4型誘発不完全トランスホーム細胞(4CY-4-3に絨毛癌細胞DNAをトランスフェクション法により導入した。しかしNIH3T3細胞の形質転換は検出されなかった。また4CY-4-3細胞ではfocusの形成を認めたが、二次transfection後ヒト固有配列Aluが消失したため、現在、Genomic Libraryを作成し、発癌活性を示す癌遺伝子の同定を試みている。2.絨毛癌細胞株から6-チオグアニン抵抗性細胞の作成を試みたが、低抗性細胞の作成に成功していない。
超強磁場下のミュオン物理

本研究内容は3年にわたって行うように計画が分割されており本年度は最初の年であるため主として実験を行うための装置の開発設計テストに努力がはらわれた。強磁場発生の方法には大きくわけて水冷式定常磁場とパルス磁場の二つがある。前者の方法で20T30Tの磁場を得ることは可能であるが装置自体が非常に大きなものとなり我々の考えている予算で建設することは不可能である。パルス磁場はコンデンサーに蓄えられたエネルギーを瞬間的にコイルに放電して大電流を流し強磁場を出す方法で、水冷式に比べ経済的でありまた出し得る最高磁場も高い。本研究ではミユオンビームがパルス的に来ることを考慮し、そのパルスに同期して発生するパルス磁場を用いることにする。しかし今までに開発され利用されてきた単発のパルス磁場とな異り、周期的に飛来するビームパルスと同じくくり返しを必要とするので定常磁場のように冷却についても考察しなければならない。しかし実際に設計を行ってみるとコイルの冷却よりも電源の方に問題があることがわかった。即ち限られた予算で電源をつくるために電源側の内部損失による発熱をできるだけへらす必要があり、そのためにくり返しの周波数を低くしなければならない。したがって50ミリ秒間隔でくるビームパルスすべてに同期することはできなく2秒に一度のパルス磁場発生となる。コインの内径は約20mmで約10【cm^3】の空間に30Tの磁場を発生させ、デユワーを使うことによりヘリウム温度での実験も可能になるようにする。本年はこの電源に必要なコンデンサーバンクを購入したが充電器等は次年度の予定である。したがって現有の小型のバンクを用いて単発でコイルの発燃テスト等を行った。
フッ化炭素鎖をもつデンドリティック多糖ポリマーによるバイオマテリアル創製

本研究では、高い機能をもつバイオマテリアルの創製を目指して、分子のサイズが制御可能なデンドリティックポリマーに着目し、その末端アミノ官能基を糖鎖で修飾し、水中で自己会合させるためにフッ化炭素鎖または炭化水素鎖を1本導入した両親媒性デンドリティックポリマーおよびその多糖ポリマーの開発を行った。これらの物理化学的性質は、デンドリティックポリマーの世代数および水溶液のpHに大きく依存することがわかった。本研究では、高い機能をもつバイオマテリアルの創製を目指して、分子のサイズが制御可能なデンドリティックポリマーに着目し、その末端アミノ官能基を細胞認識を有する糖鎖で修飾し、水中で自己会合させるためにフッ化炭素鎖または炭化水素鎖を1本導入した両親媒性デンドリティック多糖ポリマーの開発を行うことを目的とする。1本の炭化水素鎖をもつデンドリティックポリマーは、Divergent法に従い合成した。すなわち、ドデシルアミンまたはヘキサデシルアミンをコアとし、アクリル酸メチルによるMichael付加反応と生成したメチルエステルと大過剰のエチレンジアミンの反応を繰り返すことにより、ドデシルまたはヘキサデシル鎖を有する末端アミノ基のデンドリマーを得た。2本鎖のデンドリティックポリマーも、ジドデシルアミンをコアとして同様の方法で合成した。また、フッ化炭素鎖をもつデンドリティックポリマーは、エチレンジアミンに3-(ペルフルオロアルキル)プロピレンオキシドまたは3-(ペルフルオロアルキル)プロピルブロミドを作用させた後、アクリル酸メチルとエチレンジアミンを用いたDivergent法に従い合成した。いずれも世代数は1、2、3とした。さらに、各種デンドリティックポリマーの末端アミノ基に糖鎖であるラクトビオン酸を作用させて、デンドリティック多糖ポリマーに誘導した。これらの構造は、^1HNMRおよびESI-MSにより確認した。デンドリティックポリマーならびに多糖ポリマーの溶液物性は、平衡および動的表面張力、動的光散乱の測定により検討を行った。デンドリティックポリマーおよび多糖ポリマー水溶液の濃度の増加とともに表面張力は低下し、臨界ミセル濃度を示す明瞭な屈曲点が見られ、その濃度以上で会合体の形成が確認された。この会合体の見かけの流体力学的半径は数ナノメートルのサイズであることがわかった。本研究では、高い機能をもつバイオマテリアルの創製を目指して、分子のサイズが制御可能なデンドリティックポリマーに着目し、その末端アミノ官能基を糖鎖で修飾し、水中で自己会合させるためにフッ化炭素鎖または炭化水素鎖を1本導入した両親媒性デンドリティックポリマーおよびその多糖ポリマーの開発を行うことを目的とする。フッ化炭素鎖をもつデンドリティックポリマーは、エチレンジアミンと3-(ペルフルオロアルキル)プロピルブロミドの反応により得られたN-(3-(ペルフルオロアルキル)プロピル)エチレンジアミンを出発のコアに用い、アクリル酸メチルによるMichael付加反応と生成したメチルエステルと大過剰のエチレンジアミンの反応を繰り返すDivergent法に従い合成した。世代数は13とした。また、炭化水素鎖をもつデンドリティックポリマーは、ヘキサデシルアミンまたはエチレンジアミンとヘキサデシルブロミドの反応により得られたN-ヘキサデシルエチレンジアミンを出発のコアに用い、アクリル酸メチルによるMichael付加反応と生成したメチルエステルと大過剰のエチレンジアミンの反応を繰り返すDivergent法に従い、同様に合成した。世代数は15とした。さらに、ジドデシルアミンをコアとして、Divergent法により、2本鎖のデンドリティックポリマーを合成した。各種デンドリティックポリマーの末端アミノ基に糖鎖であるラクトビオン酸を作用させて、デンドリティック多糖ポリマーに誘導した。構造は^1H NMRおよびESI-MSにより確認した。これらの両親媒性デンドリティックポリマーは、従来の界面活性剤と同様に低い臨界ミセル濃度および表面張力などの高い界面活性を発揮し、水溶液中での会合体のナノ構造はデンドリマーの数ならびに世代数に大きく依存することが明らかとなった。また、合成した炭化水素系デンドリティックポリマーを保護剤として、数nmのサイズの揃った金ナノ粒子が調製できることがわかった。
ナチスドイツの建築に関する研究ー社会・経済的背景の分析ー

本年度の実施結果は以下の通りである。1.記録文書の翻訳2.上記記録文書及び記録映像資料の整理3.これらに関するナチスドイツの都市計画組織設立の流れにそった再編集作業4.分析建築家ペーター・ベーレンスが主任デザイナーをつとめていたA.E.G.社新社屋の設計にナチスドイツの建設総監アルバート・シュペーアが大きく関っていたことが記録文書より明らかとなった。ここでは当時のドイツの大企業とナチスドイツの関わりという解釈をおこなうよりも、きわめて先進的なC.I.(コーポレート・アイデンティティ)計画を展開していたA、E、G、社の核となるベーレンスと、一方国家そのものにひとつのデザイン・アイデンティティを与えようとしていたナチスドイツのシュペーアという組み合せ、すなわち非常に保守的で古い世界(ドイツ大企業,右翼政権ナチスドイツ)とその中の新しい世界(ベーレンス、シュペーア)という組合せの一致に注目すべきである。このことはナチスドイツが常に古いものと新しいものの組合せ、例えば新しい機能に古い形態の組合せを大衆の目にふれるプロパガンダ技術としてもっていたことを分析するためには、きわめて参考にされるべきものであると考えられる。
寄生性真核生物に見られる原核生物型転移RNAスプライシング関連酵素の解析

遺伝子中の介在配列であるイントロンを取り除くRNAスプライシングの過程は、遺伝子から機能する分子を生み出すのに必須の過程である。アミノ酸をタンパク質合成の場であるリボソームに運ぶ転移RNA(transfer RNA, tRNA)にはその遺伝子にイントロンを持つものがある。真核生物のtRNA前駆体のスプライシングに関わる酵素は、ごく一部の生物種でのみ解析されており、その全貌は明らかでない。私は寄生性真核生物であるトリパノソーマ類に注目し、そのRNA連結酵素の解析を行った。その結果、トリパノソーマ類の持つRNA連結酵素は細菌から遺伝子の水平伝播によって獲得されたものであることが明らかになった。tRNA前駆体のスプライシングは、他のRNAスプライシングがRNA前駆体自身の酵素反応、あるいはトランスで働くRNA-タンパク質複合体の中のRNA部分の触媒反応によって進行するのに対し、タンパク質のみからなる酵素の触媒反応により進行する。tRNA前駆体を切断するヌクレアーゼは共通の祖先から進化しているものの、生物種によりそのサブユニット構造が大きく変化している。また、エキソン断片を連結するRNAリガーゼも、その反応機構から大きく二つのグループに分かれる。本研究では、真核生物におけるtRNAスプライシング関連酵素の多様性を明らかにするため、寄生性真核生物であるトリパノソーマ目原虫のtRNAスプライシング関連酵素の解析を進める。他の真核生物には通常2種類以上のヌクレアーゼサブユニット遺伝子が見つかるが、これらの原虫では、ヌクレアーゼ候補の遺伝子が一つしか見つからない。これは原核生物であるアーキアの一部で用いられる酵素と類似した特徴である。一方、これらのトリパノソーマ目原虫は反応機構の異なる二つのRNAリガーゼの両方の遺伝子を持っている。その一方の、アーキア、バクテリア、真核生物に広く保存されているRtcB型RNAリガーゼは、原虫ではバクテリア型酵素の配列上の特徴を持つ。この事は、トリパノソーマ目原虫が真核生物型ではなく、バクテリア型酵素を使用している可能性を示唆する。本研究の成果は、真核生物における原核生物型tRNAスプライシング関連酵素の利用の初めての例を示す可能性がある。本年度はまず、原虫のRtcB型RNAリガーゼについて解析を行った。この原虫は反応機構の異なる別のグループのRNAリガーゼ遺伝子を併せ持つ事から、原虫のRtcB型酵素が機能していない可能性もある。そこで、RT-PCRによりRtcB型酵素の転写解析を行った結果、この遺伝子が転写されており、そのmRNAは、原虫において機能するmRNAの目印である5'末端のスプライスリーダー配列を持つ事が分かった。この結果は、原虫のRtcB型RNAリガーゼ遺伝子が、機能するタンパク質をコードしている事を示唆する。現在、RtcB型RNAリガーゼの機能解析のため、タグ付き酵素を発現する組換え原虫を作成している。本年度は、まず、ヌクレアーゼサブユニット遺伝子の解析を進めた。RT-PCR法により、同遺伝子のmRNAの5'末端をスプライスリーダー配列を利用して決定した。さらに、ヌクレアーゼに対する抗体作成用の抗原および酵素学的解析を目的として、同遺伝子を大腸菌に導入し、ヌクレアーゼの大量発現と精製を試みた。その結果、ヌクレアーゼの大量発現は確認できたものの、精製を進める段階で、沈殿してしまうことが分かった。一方、同遺伝子にアフィニティ精製用配列を付加した融合タンパク質の遺伝子を、原虫に導入し、その発現を試みたところ、タグ特異的抗体によりその発現が認められた。また、RtcB型RNAリガーゼ遺伝子についても、同様な原虫発現系を構築し、その発現を確認した。転移RNA(tRNA)遺伝子にイントロンがある場合、tRNA前駆体からのイントロンのスプライシングは、タンパク質合成に必要な全てのtRNAを合成するのに必須の課程となりうる。

一方、真核生物の核コードのtRNA前駆体スプライシングは、古細菌のtRNA前駆体スプライシングの装置と共通点が多いが、まだ、その情報は一部の真核生物についてのものに限られており、特に寄生性原虫からの情報は少ない。そこで我々は、真核生物における、tRNA前駆体スプライシング装置の多様性を明らかにする目的で、ゲノム情報から、原核生物型(古細菌型あるいは細菌型)酵素を使用していると考えられるキネトプラスチダ原虫のtRNA前駆体スプライシングに関わる酵素の解析を試みた。キネトプラスチダ原虫であるLeishmania tarentolaeに、エピトープタグをコードする配列を付加した、tRNA前駆体スプライシング関連酵素の遺伝子を導入し、相同組換えによりこの配列をゲノムに挿入した。その後、組換え原虫を導入した遺伝子の発現を誘導する薬剤存在下で培養し、培養後の原虫から、エピトープタグに対する特異的相互作用を利用して粗酵素画分を調製した。その結果、キネトプラスチダ原虫で、3'-ライゲーションを行うRtcB型RNAリガーゼは真核生物型ではなく、細菌から水平伝播により獲得された遺伝子にコードされているいこと、L. tarentolaeにおけるこの酵素は人工的に作成したtRNAエクソン断片を連結する活性を持つこと、この酵素のN末端側が翻訳後プロセスされている可能性が示唆された。遺伝子中の介在配列であるイントロンを取り除くRNAスプライシングの過程は、遺伝子から機能する分子を生み出すのに必須の過程である。アミノ酸をタンパク質合成の場であるリボソームに運ぶ転移RNA(transfer RNA, tRNA)にはその遺伝子にイントロンを持つものがある。真核生物のtRNA前駆体のスプライシングに関わる酵素は、ごく一部の生物種でのみ解析されており、その全貌は明らかでない。私は寄生性真核生物であるトリパノソーマ類に注目し、そのRNA連結酵素の解析を行った。その結果、トリパノソーマ類の持つRNA連結酵素は細菌から遺伝子の水平伝播によって獲得されたものであることが明らかになった。RtcB型RNAリガーゼの機能解析を進めるとともに、反応機構の異なる別のグループのRNAリガーゼおよびヌクレアーゼについても、発現、機能解析を進める。原虫内で発現が認められたヌクレアーゼサブユニットおよびRtcB型RNAリガーゼを、アフィニティタグを利用して精製する。精製した画分について酵素活性を測定する。また、これらの画分に共存する因子について、ヌクレアーゼおよびリガーゼとの相互作用の可能性を検討する。分子寄生虫学当該年度の研究は、同じ教室の主任教授の研究費によりすすめた。計画の初年度に、教室の関連経費によって当該研究を推進することができ、当該補助金を節約することが出来た。このため、余剰の補助金を3年目に執行することになったため。次年度使用額は人件費(学術支援職員の雇用)に用い、他は、およそ当初計画通りである。物品費として標的タンパク質に対する特異抗体の作成のため約20万円、人件費として研究員雇用のため約100万円を充てる予定である。
構造効果の数理解析

わたしはかって数学者J.G.ケメニーとJ.L.スネルのアイディアに依拠して、社会移動データにみられる離農のプロセスを、吸収マルコフ連鎖モデルによって表現してみたことがある(小林1992)。それ以来、吸収マルコフ連鎖モデルは、社会学にとってきわめて有力なツールとなることを確信するようになった。そして本研究の主題である構造効果に対しても、吸収マルコフ連鎖モデルを適用したことがある(小林1995;1997)。しかしそれは、かならずしも満足できるものではなかった。そこで本研究においては、構造効果の数理解析の基礎として、吸収マルコフ連鎖モデルを社会学的現象の記述・説明に使用する際に、意外と見落としがちな論点を明確にするように努めた。その結果、平均訪問回数の概念を明確化するとともに、吸収マルコフ連鎖の基本特性量として、「平均推移数」という新たなものを提示することができた。そして下記の1997年の論文において展開された相対的剥奪の数理モデルに対し、平均推移数を計算し、相対的剥奪が構造効果として存在する場合の特徴をみてみた。これで構造効果に関する数理モデルの構築作業が確実に一歩前進したものと確信する。文献1992「記述的階層研究からの前進」『理論と方法』7(1):57-65頁1995「構造効果の数理モデル」『福岡大学・人文論叢』第27巻3号1105-1121頁1997「構造効果の数理モデル最訪」岩木健良編『社会構造と社会過程のフォーマライゼーション』(科研成果報告書)75-83頁わたしはかって数学者J.G.ケメニーとJ.L.スネルのアイディアに依拠して、社会移動データにみられる離農のプロセスを、吸収マルコフ連鎖モデルによって表現してみたことがある(小林1992)。文献1992「記述的階層研究からの前進」『理論と方法』7(1):57-65頁1995「構造効果の数理モデル」『福岡大学・人文論叢』第27巻3号1105-1121頁1997「構造効果の数理モデル最訪」岩木健良編『社会構造と社会過程のフォーマライゼーション』(科研成果報告書)75-83頁本年度は、構造効果にかんする先行研究のレヴューを中心に作業をおこなった。構造効果については、統計的・計量的研究は数多いが(たとえばBoyd,L H.And G.R.Ivcrson1979 Contextual Analysis:Concepts and Statistical Techniques.などがある)、数理的研究は少ない。しかし「構造効果」とうたわれていない研究でも、構造効果のモデルを展開するのに大いに参考となるものがある。つまり、集団の特性が個人の行動や意識に影響を及ぼすことのできる「社会的なプロセス」ないしは「メカニズム」を理解するのに有用な研究であれば、参考となるのである。その1つに、J・S・コールマンが1964年に出版されたIntroduction to Hathematical Sociologyのなかの第7章がある。それはコールマンがサーベイ・リサーチの伝統を受け継いで、「多水準にわたる関係のシステム」をとり扱ったものである。具体的には、信念と活動にかんする個人水準の命題から小集団における信念の一致度と活動度合いにかんする集団水準での命題を導出している。コールマンが依拠しているのは連続時間を前提とするマルコフ過程モデルであるが、これを社会学でお馴染みのマルコフ連鎖モデルに転換することは簡単である。またコールマンの関心は、個人水準の命題を組み合わせて、集団水準の命題を演繹的に導出することであった。これを構造効果という問題設定にのせるためには、個人水準ではなく相互行為の水準の命題を組み合わせて、集団の特性が個人に影響を与えるメカニズムにかんする命題を導出するようにしてやればいい。次年度の課題も、そこにある。

そこで本研究においては、構造効果の数理解析の基礎として、吸収マルコフ連鎖モデルを社会学的現象の記述・説明に使用する際に、意外と見落としがちな論点を明確にするように努めた。その結果、平均訪問回数の概念を明確化するとともに、吸収マルコフ連鎖の基本特性量として、「平均推移数」という新たなものを提示することができた。これで構造効果に関する数理モデルの構築作業が確実に一歩前進したものと確信する。文献1992「記述的階層研究からの前進」『理論と方法』7(1):57-65頁1995「構造効果の数理モデル」『福岡大学・人文論叢』第27巻3号1105-1121頁1997「構造効果の数理モデル最訪」岩木健良編『社会構造と社会過程のフォーマライゼーション』(科研成果報告書)75-83頁
アジア・太平洋地域「スポーツのグローバル化研究」相互支援ネットワークの構築

本研究では、各研究者がそれぞれの分担テーマの国・地域でのフィールド調査や学会出席を通して,資料収集と聞き取り調査などを実施すると同時に、現地のスポーツ研究者と将来の相互支援ネットワーク作りに向けて情報交換を行ってきた。初年度と第2年度は、各研究者がそれぞれの分担テーマの国・地域でフィールド調査を行い,資料収集と聞き取り調査などを実施した。同時に、現地のスポーツ研究者と将来の相互支援ネットワーク作りに向けて情報交換を行った。インターネット上の情報交換に加えて,各研究分担者が現地で集めた情報をもとに,この問題に関するグループ全体としての理解を深めるために,研究会を開催した。研究の最終年度は、これまでの研究調査活動をまとめ、今後の発展につなげるような形で公開することを最大の目標とした。具体的には、アジア太平洋スポーツ研究フォーラムの開催に向けた準備、9月のフォーラムの開催、その後のフォーラムの成果をまとめる作業が中心となった。アジア太平洋スポーツ研究フォーラム「スポーツを通して読むアジア・オセアニア(Reading Asia and Oceania through Sport)」は、この地域の身体文化、学校スポーツ、グローバル化をキーワードに、9月20日から22日にかけて滋賀大学で開催された。10か国(オーストラリア、ニュージーランド、フィジー、韓国、中国、台湾、フィリピン、マレーシア、タイ、日本)から約40名の研究者・大学院生が参加して、21本の研究報告と3本のシンポジウム、2本のパフォーマンスが行われた。報告や質疑応答を通して、アジア太平洋地域のスポーツの社会科学的研究の発展のために、研究者間ネットワークの構築、具体的には、この地域の研究者が広く使える教科書や論文集、視聴覚教材の開発やデータベース化に向けて努力すること、共同研究プロジェクトの推進が必要であることが再確認された。本年度は「個別の地域研究」に関して,各自がサブテーマをそれぞれひとつずつ担当して,研究調査を行うことに重点を置いた.各研究者が,それぞれの分担テーマとなっている国・地域に出向きフィールド調査を行い,資料収集と聞き取り調査などを実施すると同時に、現地のスポーツ研究者と将来の相互支援ネットワーク作りに向けて情報交換を行った。インターネット上の情報交換に加えて,各研究分担者が現地で集めた情報をもとに,この問題に関するグループ全体としての理解を深めるために,研究会を開催した.おもな研究活動は、以下の通りである。1.松田恵示2002年12月12-17日タイ・チュラロンコーン大学およびタマサート大学を訪問し、現地の研究者と主にタイ国におけるサッカー文化の変容について情報収集を行ってきた。2.矢崎弥2002年12月17日22日中華民国・台湾大学、台湾師範大学等を訪問し、現地の研究者と主に台湾のスポーツ体制とナショナリズムについて情報収集を行ってきた。3.天野郡寿・高畑幸2003年1月26日30日フィリピン・デラサール大学、フィリピン国立大学、アテネオ大学を訪問し、フィリピンの伝統スポーツの現状やボクシング選手の海外移住の現状について情報収集を行った。4.平井肇2003年2月3日15日フィジー諸島共和国・南太平洋大学を訪問し、現地の研究者と主にフィジーにおけるラグビーの伝播・普及や選手の海外移住の現状について情報収集を行った。5.2003年2月12日に、奈良女子大学で研究を実施し、各分担者の研究報告を行うとともに、次年度以降の研究計画について討議した。本年度も前年度に引き続き「個別の地域研究」に関して,各自がサブテーマをそれぞれひとつずつ担当して,研究調査を行うことに重点を置いた.各研究者が,それぞれの分担テーマとなっている国・地域でのフィールド調査や学会出席を通して,資料収集と聞き取り調査などを実施すると同時に、現地のスポーツ研究者と将来の相互支援ネットワーク作りに向けて情報交換を行った。この問題に関するグループ全体としての理解を深めるために,研究会を開催した.また、本プロジェクトのまとめとして16年度に開催を予定している国際フォーラムの実施に向けて準備を始めた。

なお、SARSや鳥インフルエンザの影響のため、計画していた海外調査旅行のいくつかが中止になった。そのため、年度当初の研究計画や予算執行が途中で変更になった。おもな研究活動は、以下の通りである。1.松田恵示スポーツのグローバル化について、日本とタイの比較を通して、主に資料を中心に、「オカマ文化」にみられるスポーツとジェンダーに関して調査を行い、研究者との交流を行った2.深澤宏アジアのスポーツ産業に関する資料収集および研究者との意見交換を行った(10月29日11月5日米・カナダ)。マレーシアにおけるスポーツの現状について調査を行い、研究者との交流を行った(2月8日12日マレーシア)。3.矢崎弥台湾におけるスポーツ、特にスポーツの産業化の現状を視察し、現地の研究者と意見交換、資料収集を行った(3月1日6日台湾)4平井肇フィリピンとタイを中心に大学スポーツについて調査を行い、スポーツのグローバル化が及ぼす影響とその課題について研究を進めた(9月10日13日)。5.2003年6月1415日、04年1月2425日に、滋賀大学で研究を実施し、各分担者の研究報告を行うとともに、今後の活動について討議した。本研究では、各研究者がそれぞれの分担テーマとなっている国・地域でのフィールド調査や学会出席を通して,資料収集と聞き取り調査などを実施すると同時に、現地のスポーツ研究者と将来の相互支援ネットワーク作りに向けて情報交換を行ってきた。研究の最終年度である本年度は、これまでの研究調査活動をまとめ、今後の発展につなげるような形で公開することを最大の目標とした。具体的には、アジア太平洋スポーツ研究フォーラムの開催に向けた準備、9月のフォーラムの開催、その後のフォーラムの成果をまとめる作業が中心となった。6月12・13日研究会(お茶の水女子大学)-フォーラム開催の準備6月9月アジア太平洋スポーツ研究フォーラムに向けて、各自が研究成果のまとめ9月2022日アジア太平洋スポーツ研究フォーラムの開催10月2月アジア太平洋スポーツ研究フォーラムの、グループとしての成果のまとめアジア太平洋スポーツ研究フォーラムは、この地域の身体文化、学校スポーツ、グローバル化をキーワードに、9月20日から22日にかけて滋賀大学で開催された。10か国(オーストラリア、ニュージーランド、フィジー、韓国、中国、台湾、フィリピン、マレーシア、タイ、日本)から約40名の研究者・大学院生が参加して、21本の研究報告と3本のシンポジウム、2本のパフォーマンスが行われた。
ディリクレ形式に基づく確率解析の研究―空間構造と特異性の解明―

本研究は,ディリクレ形式に付随するマルコフ過程の微視的挙動に着目した理論の深化を図り,特異な状況の解析や,確率過程から派生する空間構造を解明することによって,ディリクレ形式の基礎理論を展開することを目的とする.特に,以下のテーマに沿った研究を行う:強局所ディリクレ形式から定まる可測リーマン構造に基づく確率解析の研究,飛躍型ディリクレ形式から定まる空間構造の研究,ラフパス解析とディリクレ形式の融合的研究,無限次元空間上の確率解析の研究,測度距離空間における確率解析の研究.ディリクレ形式の理論を発展させることで、対象となる空間構造と特異性を解明し、確率解析の研究に新たな展開を促すという趣旨の研究である。可測リーマン構造に基づく解析、飛躍型確率過程を用いた空間構造の研究、ラフパス理論とディリクレ形式の融合、無限次元空間の解析など、壮大な研究計画になっている。ディリクレ形式に付随するマルコフ過程の微視的挙動に着目した理論の深化を通じて、確率過程から派生する空間構造や特異性を解明しようとする点に本研究の独創性がある。研究代表者の高い研究実績、しっかりした研究組織,具体的な国際研究集会の開催計画などから、現在世界的に活発に研究されている確率解析の様々なテーマに関わる成果が期待される。本研究は,ディリクレ形式に付随するマルコフ過程の微視的挙動に着目した理論の深化を図り,特異な状況の解析や,確率過程から派生する空間構造を解明することによって,ディリクレ形式の基礎理論を展開することを目的とする.特に,以下のテーマに沿った研究を行う:強局所ディリクレ形式から定まる可測リーマン構造に基づく確率解析の研究,飛躍型ディリクレ形式から定まる空間構造の研究,ラフパス解析とディリクレ形式の融合的研究,無限次元空間上の確率解析の研究,測度距離空間における確率解析の研究.
活性酸素のエフェクター分子の同定とその生物学的意義の追究

酸化ストレスの形態学的評価にはフリーラジカル反応によるcovalentな修復を受けた分子に対する抗体を作製するストラテジーが適切と考え、生体内においてどのような修飾分子の増加率が高いかを検討した。鉄ニトリロ三酢酸による腎尿細管傷害・腎発がんのモデルでは、腎近位尿細管でFenton-like reactionが発生する。上記モデルにおいて、DNA修飾塩基として8-hydroxy-2^'-deoxyguanosine(8-OHdG)、アルデヒド化合物として4-hydroxy-2-nanenal(HNE)の増加率が最も高いことを見いだした。アルデヒド化合物はフリーの状態では疎水性があり、パラフィン包埋の過程で流出し失われる。アルデヒド化合物が蛋白のアミノ酸残基と反応しマイケル反応産物を形成するという化学反応の解明が、抗体作成の過程で重要であった。上記のエピトープに対するポリクロナール。モノクロナール抗体を作製・評価を行った。これらの抗体を通常のパラフィン包埋に適応する方法を開発した。この方法により、糖尿病、虚血、再灌流モデル(肺、肝、皮弁)、砒素中毒症、大腸癌、C型肝炎、アルコール性肝炎などにおいて酸化ストレスが関与していることを証明した。酸化ストレス発がんに標的となる遺伝子が存在するかどうかという問題に対して、candidate gene apprach、活性酸素代謝に関与する遺伝子の探索を行ってきたが、大きな成果は上がらなかった。しかし、F_1純系動物を使用したLOH解析により糸口をつかみ、p15/p16癌抑制遺伝子の異常が半数近い腫瘍で認められることを見いだした。少なくとも最終的なゲノムの異常に関しては標的となる遺伝子が存在することを初めて明らかにした。1)鉄ニトリロ三酢酸の腎発癌系における酸化ストレス応答遺伝子の同定を目的としてDifferential display法を行った。従来、この方法にはラジオアイソトープを用いることが多かったが、研究効率を上げるために蛍光プライマーを使用する方法を開発した。蛍光はロ-ダミンを使用し、遺伝子確定の過程に必要なサブクローニングを確実にするためにアンカープライマーに制限酵素部位を設けた。まず、スクリーニングが比較的簡単である腫瘍と非腫瘍部の比較から開始し、現在までに予想されるメッセンジャーRNA(10万種類)のほぼ半数のスクリーニングを終え、300のDNA断片を保存し、そのうち60についてサブクローニング・塩基配列を決定したが、その半数は既知の遺伝子であった。これらの遺伝子として、酸化的傷害の修復酵素など酸化ストレスとの関連があらかじめ予想されるもの以外に細胞内情報伝達、細胞間接着、腎尿細管細胞の固有機能に関連したものなどが得られつつある。2)次の実験においては4-hydroxy-2-nonenal-modified keyhole limpet hemocyaninを抗原として、BALB/cマウスを免疫してその脾細胞とマウスミエローマ細胞の融合をおこない、ELISAによるスクリーニングにより求めるクローンを検索した。今回の検討で、ヒスチジン、リエン、システウン残基とほぼ同等に反応するクローンを見いだしたが、システインに特異的なクローンはまだ得られていない。現在までに得られた抗体で4-hydroxy-2-nonenalの標的蛋白質を特に消化器癌を使用して検討中である。3)また、8-hydroxy-2'-deoxyguanosineに対するモノクローナル抗体を開発、その特異性を評価して、免疫染色法とその低量化法を確立した。平成10年度には、1)私たちの研究グループが開発した「鉄を介した酸化ストレスによるラット腎発癌系」を使用し、蛍光を用いたdifferential display法を用いて酸化ストレス応答遺伝子の探索を行った。約8万5千種類のmRNAをスクリーニングすることにより、発現に変化のある遺伝子を多数見いだした。ノザンブロットで再現性のある既知の遺伝子は現在25クローンある。また、未知のものについては一つずつライブラリースクリーニングにより全長を確定しつつある。

特に何度もスクリーニングに引っかかってきたannexin IIについて培養細胞レベルで、トランスフェクションやアンチセンスを使用することにより詳細な検討を加えている。平成11年度はこの研究を更に推進することにより、酸化ストレス遺伝子のパネルを作製を試みる予定である。2)これまでに開発したモノクローナル抗体を使用して、ヒトの種々の疾患やその動物モデルにおいて、その病態に酸化ストレスが関与しているかどうかの検討を行った。すると、糖尿病の動物モデル(ランゲルハンス島)、ヒトの膠原病(尿)、大腸癌で酸化ストレスが亢進しているという新しい知見を得た。。また、特に8-OHdGに対する抗体(N45.1)については、細胞診への応用技術を完成させ、その核内分布を初めて明らかにした。平成11年度も更にヒトの種々の疾患やその動物モデルについて検討を重ねていく。鉄ニトリロ三酢酸による腎尿細管傷害・腎発がんのモデルは1982年に当教室で開発されたモデルであり、腎近位尿細管でFenton-like reactionを引き起こす。酸化ストレスの形態学的評価のためには、フリーラジカル反応によるcovalentな修飾を受けた分子に対する抗体を作製するというストラテジーが適切と考え、まず、生体内においてはどのような修飾分子の増加率が高いかを検討した。上記モデルにおいては、DNA修飾塩基として8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)、アルデヒド化合物として4-hydroxy-2-nonenal(HNE)の増加率が最も高いことを見いだした。アルデヒド化合物はフリーの状態でいると、疎水性でありパラフィン包埋の過程で流出し失われてしまう。アルデヒド化合物が蛋白のアミノ酸残基と反応しマイケル反応産物を形成するという化学反応の解明が、抗体作成の過程で重要であった。名古屋大学大学院生命農学研究科、日本老化制御研究所と共同で、上記のエピトープに対するポリクローナル・モノクローナル抗体を作製あるいは評価を行った。そして、幸運にもこれらの抗体は通常のパラフィン包埋の病理標本で使用可能であることが判明した。上記鉄ニトリロ三酢酸のモデルだけではなく、糖尿病(Goto-Kakizakiラット)、虚血・再灌流モデル(肺、肝、皮弁)、砒素中毒症、大腸癌、C型肝炎、アルコール性肝炎などにおいて酸化ストレスが関与していることを証明した。特に、糖尿病の膵ランゲルハンス島における酸化ストレスの評価は本手法により初めて可能となったものであり意義深い。
仔マウスの行動に対する雄生殖細胞の次世代継承エピゲノム変化に関する研究

Pax6遺伝子変異ヘテロ接合(Sey)雄マウスより得られた精子と、若齢の野生型雌マウス卵子を人工授精して得られた仔マウスにおいて、精子の由来が若齢か高齢かによって、リスク因子を受け継いだSeyマウスの行動の表現型が異なることを明らかにした。また、野生型マウスの若齢および高齢の精子のメチル化について全ゲノム解析を行うことにより、高齢精子において若齢精子と異なるDNAのメチル化領域(DMRs)を同定した。DMRsの近傍には神経機能や神経細胞に関与する遺伝子が濃縮されていることがわかり、父加齢によるDMRsの成立が子孫の発達障害のリスクとなる可能性が示唆された。受精の際に生殖細胞から次世代に伝達される情報には、ゲノム情報に加え、DNAメチル化、ヒストンタンパク質の化学修飾、転写されたnon-coding RNAなどの多数のエピゲノム情報がある。我々は、父マウスの加齢により仔マウスの行動に変化が現れることを出発点として、その背景となるエピゲノム機構の探求を試みている。本年度は、「ゲノム支援」によって得られた精子メチロームについての解析を行った。若齢および高齢由来の精子ゲノム(2個体分)をWGBSにより、それぞれ2,548,898,494および2,539,963,474リードずつシークエンスを実施し、解析ソフトBismarkを用いて、UCSC genome browseのリファレンスゲノム配列(mm9)にマッピングした。若齢および高齢由来精子ゲノムのマッピング効率は比較的低く、それぞれ3537%および2943%であった。マッピングデータをもとに、Integrative genome viewerを用いてDNAメチル化を可視化した。また、若齢および高齢由来の精子におけるDNAメチル化の比較解析を実施し、高齢由来の精子において5,610脱メチル化CpG(4561遺伝子)と1,574メチル化CpG(1467遺伝子)を同定した。さらに、DNAメチル化の比較解析における染色体ごとの分布について検討したところ、その分布は一様ではなく、DNA高メチル化CpGについては、第2, 4, 5, 7, 11番染色体において多く、また、DNA低メチル化CpGについては、上記の染色体に加えて、第17番染色体においても多いことが明らかとなった。「ゲノム支援」により得られた精子DNAメチロームデータについての解析を行うことができた。これまでの先行研究より、仔マウスのUSVに関連する27遺伝子をリストアップし、その遺伝子領域におけるDNAメチル化について検討した結果、Foxp2遺伝子領域におけるCpGの高メチル化およびNeuroligin2、Neuroligin3、Oxytocin受容体遺伝子領域におけるCpGの低メチル化が確認された。親の世代のエピゲノム変化がどのように次世代に伝わるのかは、きわめてホットな研究領域となりつつある。我々はこれまでに、父の加齢が仔マウスの行動に影響を与えることを見出しており、例えば神経発生に重要な遺伝子であるPax6の変異を父から受け継いだ場合、父が若齢か高齢化によって、表現型が異なることを報告した。このような次世代に継承されるエピゲノム変化の分子メカニズムを探索するため、野生型マウス雄生殖細胞、すなわちDNAのメチル化に着目して研究を行った。研究昨年度に実施した精子DNAメチル化の全ゲノム解析(WGBS)により得られた結果では、精子ゲノムのマッピング効率が4割程度にとどまることが明らかとなり、以後の解析の信頼性に問題があった。そこで本年度は、精子ゲノムのCpG領域を選択的に濃縮した後に包括的なDNAメチル化解析を行うことにより、高齢由来の精子において変化するDNAメチル化領域を効率的に検出する手法を試みた。その結果、従来法の100分の1の総リードで、1x以上のカバレッジでは8割程度、10x以上のカバレッジでは5割程度のマッピング効率となり、大幅な改善が認められた。精子ゲノム全体でのメチル化レベルは若齢精子(4検体)では33.3%-34.6%、高齢精子(9検体)では27.7%-36.2%となり両群間で同等であった。MOABSを用いて高齢精子において有意に変化しているDANメチル化領域(differentially methylated regions; DMRs)を探索したところ、約100のゲノム領域がDMRsとして検出された。興味深いことに、これらのDMRsの近傍に存在する遺伝子のGOを解析したところ、学習や神経機能に関与するものが有意に濃縮されていることが明らかとなった。また、モチーフ解析によりDMRsにはREST結合配列が濃縮していることが見出されたことに加え、ChIP-seqデータベース(ChIP-Atlas)を用いた検索からもDMRsに結合する候補分子としてRESTが最上位にリストされた。

DNAメチル化状態が異なるゲノム領域(DMRs)に関わると考えられる遺伝子について、仔マウスの各種脳領域における発現状態についてqPCR等の方法により明らかにすることにより、実際に加齢精子に認められるエピゲノム変化が次世代個体の遺伝子発現に影響を与えるかどうかについて明らかにする予定である。神経発生学
音声知覚における時間錯覚現象の多チャネル脳波計測による検討

聴覚情報処理過程では、周波数情報と時間情報との相互作用によって時間順序の失認や未提示音の補完という「時間錯覚現象」が生じる。これは感覚記憶を用いた情報処理の過程で生じるものであると考えられる。本研究では、ミスマッチ陰性電位(MMN)の計測によって、感覚記憶における時系列の記憶特性を検討した。本年度はまず、時系列情報を保持するために短期間の履歴情報をあるひとまとめの情報として扱う「時間統合」の機能と注意の関係を詳細に検討した。昨年度の本研究の結果から、時間統合の最大時間幅は300ms400ms程度であり、この時間幅を超える長さの音列を短期保持する際には注意が必要となることが示唆されていたが、今回5名の被験者に対して確認実験を行うことにより、それを支持する結果が得られた。また注意条件によるMMNでは、無視条件でのMMNに比べて前頭部に複雑な頭皮上電位分布が生じることが、多チャンネル脳波計測実験から示唆された。これらの結果は、注意下での時系列の短期保持には、作業記憶などより高次な部位が関与している可能性を示すものである。次に、聴覚情報処理過程で生じる群化現象とMMNとの関連を検討した。群化は周波数が近かったり、時間的に近接したりする複数の聴覚刺激をグループとして扱う概念のことである。200msの間隔をおいて提示される二音の間に挿入音を加えたものを単一の刺激とし、最終音の周波数を変化させるオドボール系列によってMMNを誘導する実験を行った。挿入音の個数や週波h数を変えて群化とMMNの関係を検討した結果、群化の有無によってMMNの相対的な振幅が変化し、これから周波数と時間との相互作用(競合や協調)によって群化が生じていることが示唆された。この結果は、時間錯覚現象を説明する上で必要となる聴覚信号の時間情報と周波数情報の競合作用、さらには、聴覚計算論における拘束条件を生理学的な解明につながる結果だと思われる。聴覚情報処理過程では,周波数と時間との相互作用(音系列の知覚時に周波数情報の連続性と時間の連続性との競合)によって時間順序の失認や未提示音の補完という「時間錯覚現象」が生じる.この現象は聴覚情報処理過程を特徴づける重要な知見だと思われる.このような錯覚現象は,持続時間数秒程度の感覚記憶を用いた情報処理の過程で生じるものであると考えられ,この感覚記憶における時間情報の保持特性を調べる必要が生じる.そこで本研究ではまず,聴覚情報の短期保持を求められるする際に,どの程度の時間履歴を保持する能力を持つのかについて検討した.ヒト健常被験者に対する事象関連電位計測を行ない,感覚記憶に関連するミスマッチ陰性電位(MMN)から,ヒトの感覚記憶の能力を調べた.その結果感覚記憶では,時系列情報を保持するために,短期間の履歴情報をあるひとまとめの情報として扱う「時間統合」の機能が存在し,その最大時間幅は300ms400ms程度であること,これは無視条件でも認められることからこのシステムが注意前のものであることが明らかになった.また,この時間幅を越える長さの音列を短期保持する際には注意が必要となることも示された.さらに,保持すべき音列の長さではなく構成を変えた場合についての実験を行ない,時系列の質的側面がどのように保持特性に影響するかを調べた.その結果,音列の構成音の個数が増えるなどにより構成が複雑になるにつれて保持能力が低下すること,現在から遡って時間的に近傍の情報の方がよく記銘されているという結果が得られた.これらの結果は聴覚情報の階層処理,注意による装飾などの特性の一端を明らかにするもので,時間錯覚現象を説明する上で必要となる聴覚信号の時間情報と周波数情報の競合作用の解明につながる結果だと思われる.聴覚情報処理過程では、周波数情報と時間情報との相互作用によって時間順序の失認や未提示音の補完という「時間錯覚現象」が生じる。