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教育実践場面における生理指標を用いた重度・重複障害児の興味・関心の評価

肢体不自由特別支援学校では、近年、障害の重度・重複化や多様化が進んでいる。重度・重複障害児(者)は、重い知的障害に運動障害や感覚障害を併せ持ち、周囲の働きかけに対する応答が微弱である。発話による意思表示が非常に困難で、行動観察から働きかけに対する応答を確認することも難しい。教員は、残存すると思われる感覚機能を中心として重度・重複障害児への支援やコミュニケーションを行うが、その残存機能の実態把握が難しく、効果的な教育実践の模索や教育実践効果の評価が非常に困難であった。これらの問題を解決するため、申請者は重篤な運動障害と視覚障害を併存すると医師に診断されていた重度・重複障害のある肢体不自由特別支援学校中学部の生徒2名(A, B)を対象に、計測に負担が少ない軽量ワイヤレス心拍計を用いて感覚機能評価を行った。その結果、いずれの生徒も、色や光の視覚刺激呈示にともなって、心拍数が一過性に減少する定位反応が再現性高く認められ、視覚刺激を知覚していることが示唆された。また、生徒Aにおいては、見知らぬ他者が顔を見せたときにも定位反応と思われる一過性の心拍数減少が認められた。一方、前担任や父母が顔を見せたときには、心拍数が一過性に増加する期待反応がみられ、とりわけ前担任よりも父母の顔のときの方が心拍数増大は顕著であった。これらのことから、生徒Aの心拍数増加は顔の親和性と関連し、見知った顔に対して能動的に注意を向けていたものと考えられ、心拍で重度・重複障害児(者)の興味・関心をとらえられる可能性が示唆された。
細胞接着の物理の解明に向けた糖脂質膜と幹細胞の力学的相互作用の精密測定

本申請では胚発生の過程で重要な糖鎖SSEAに着目し、これらの糖鎖分子が膜の力学的特性と膜間の界面相互作用に与える影響を解明する。実空間と波数空間の実験手法を駆使し、膜の時空間揺らぎをマルチスケールに測定する。具体的には、(1)中性子非鏡面散乱法を用いた糖脂質多層膜の曲げ剛性率と圧縮弾性率の測定と、(2)反射干渉コントラスト顕微鏡(RICM)を用いた接着エネルギーの定量を通じて研究を進めてきた。(1)については、中性子実験施設ILL(仏・グルノーブル)でSSEA3およびSSEA4の多層膜構造からの非鏡面散乱プロファイルを測定した。糖脂質のモル分率またカルシウムイオン濃度を系統的に変化させたときに膜間平衡距離が変わることを見出し、膜間の垂直方向相互作用が変調されることが明らかになった。(2)については、糖鎖で修飾したsupported membraneの上に播種したヒトiPS細胞の接着面をRICMにより可視化し、糖鎖の種類および分子間距離をナノメートルオーダーで制御したときの細胞接着面積を系統的に取得した。細胞遊走やコロニー形成におけるシングルセルの変形と運動を取得し、その自発変形のダイナミクスを解析した。また、本研究の推進の中で得られた実験手法と結果に着想を得て、以下の成果を国際誌に発表した:(A)ヒト角膜内皮再生医療に用いられる培養角膜内皮細胞の接着力の評価と、「培養している移植用細胞の品質」及び「移植してからの組織予後」の両方を統合的に評価する物理指標の開発(Yamamoto et al., Nature Biomedical Engineering, accepted)。(B)フッ化炭素-炭化水素テトラブロック分子が気液界面に自発形成するドメイン構造の形状および相関長の測定(Abuillan et al., ChemPhysChem (2019))。(A)中性子非鏡面散乱については、前年度に計画されていたILLでの実験が設備導入計画のために延期となっていたが、当該年度に実験期間が振り替えられていたため、SSEA3およびSSEA4糖鎖分子に関する実験を行うことができた。現在これらの結果から、膜の力学物性である曲げ弾性率及び圧縮剛性率の定量的な解析を進めている。(B)RICMを用いた細胞接着の定量については、ジャイアントベシクルおよびヒトiPS細胞を用いた実験を当初の計画のとおり進められた。また、新たにピコ秒パルスレーザーに誘起された圧力波を用いて細胞接着力を測定する手法も加えることで、複数の物理学的リードアウトを用いて細胞接着を多角的に評価することができた。また上述のとおり、本研究を進める中で当初計画していなかったいくつかの成果を得ることも出来た。(A)中性子表面散乱法を用いた実験では、ILLでの実験計画が1年遅れたのを受け、現在実験結果の解析を進めている。これまでに取得した実験結果からは、糖鎖の分子構造、リン脂質分子との混合比、溶液中のカルシウムイオン濃度といった変数が膜の力学物性に影響を及ぼすことが分かっている。そこで今後これらの結果を定量的に評価し、膜の曲げ弾性率および圧縮剛性率の変化を系統的に明らかにする。この結果と(B)RICMを用いた実験による結果を合わせて、「膜の時空間揺らぎ」「膜間の力学的相互作用」という指標を用いて糖脂質膜の接着力を統合的に明らかにする。糖鎖分子の弱い相互作用に起因する膜の力学的相互作用を物理的な指標を用いて記述し、膜面の分子修飾が膜接着に及ぼす影響を、膜の構造揺らぎという指標から評価する。さらにこれまでの研究を推進する中で得られた着想から、中性子非鏡面散乱法を用いてフッ化ポリマーの多層構造の力学特性のフッ素鎖長依存性に関する実験も行い、温度・湿度による液晶相転移を含めた興味深い結果を多数得ることが出来た。これらの結果も今後まとめ論文として発表することを計画している。本研究では幹細胞表面に特異的に発現する糖鎖SSEA(stage specific antigen marker)分子に着目し、糖鎖の同種・異種分子間の相互作用による膜の力学特性と界面相互作用を定量的に測定することで、細胞接着における表面糖鎖の役割を解明する方法論と解析法の確立を目指している。本年度はまず、ヒトおよびマウスの幹細胞で特異発現する3種類のSSEA糖鎖を合成し、更にそれを(1)重水素化した脂質分子の親水基、(2)ビオチン分子、へと結合した分子の合成を行った。(1)の糖脂質を用いては、糖脂質二分子膜の曲げ弾性率と圧縮弾性率を測定するために、フランスの中性子散乱実験施設ILLにおいて中性子非鏡面散乱法の実験を行った。その結果、脂質膜中の糖脂質分子濃度を高くしていくと膜間距離が広がっていくが、水和水中にカルシウムイオンが存在するときには糖脂質分子によって膜間距離が短くなるという結果が得られ、膜間相互作用に大きな影響を与えることが分かった。この結果について解析を始めており、糖脂質分子モル分率やカルシウムイオン濃度の系統的変化による糖脂質膜の力学特性および膜間相互作用の強さを定量評価している。(2)のビオチンタグ付けされた脂質分子を用いては、精密に機能化された細胞膜モデルであるSupported Membranesにビオチンタグを介して糖鎖を結合し、その上にヒトiPS細胞を播種して接着面の時間発展を反射干渉顕微鏡を用いてラベルフリーで長時間観察することに成功した。本年度ではSupported membranes上の糖鎖密度と細胞培養液中の成分の最適化を行い、実際にデータ測定を開始した。

(1)の糖脂質を用いた実験は当初平成29年度に計画していたが、本年度において既にILLでのビームタイムを獲得することができたので、当初の計画を大幅に超えて研究を進展させることができた。(2)のビオチンタグ付けされた糖鎖を用いた実験はほぼ当初の計画に沿って進めることができた。さらに反射干渉顕微鏡の手法を水平展開することで当初の予定を超えた成果を収めた。本申請では胚発生の過程で重要な糖鎖SSEAに着目し、膜の時空間揺らぎを測定することで、膜の力学的特性と膜間の界面相互作用に与える影響を解明する。具体的には、(1)中性子非鏡面散乱法と用いた糖脂質多層膜の曲げ剛性率と圧縮弾性率の測定と、(2)反射干渉コントラスト顕微鏡(RICM)を用いた糖脂質ベシクルと幹細胞の接着エネルギーの定量を通じて研究を進めてきた。(1)については、フランス中性子実験施設ILLにおいて昨年度までに取得したデータの解析を進めた。その結果、糖脂質分子のモル分率とカルシウムイオン濃度に依存した多層膜の力学物性(曲げ剛性率と圧縮弾性率)の変化を定量した。(2)については、糖鎖で修飾したsupported membraneの上に播種したヒトiPS細胞の接着をRICMにより可視化し、糖鎖の種類および分子間距離をnmオーダーで変化させたときの細胞接着面積を系統的に測定した。一方、本研究を推進する中で得られた結果に着想を得て、以下の成果を国際誌に発表した:(A)コヒーレントX線を用いて細胞の表面構造と細胞内電子密度を数十nmオーダーの空間分解能で測定する実験・解析手法を、マラリア感染性ヒト赤血球を用いて確立した(Frank, et al., Scientific Reports (2017))。(B)ヤング率を可逆的に動的変化できる水和ゲル材料を開発し、この基板に接着する筋芽細胞C2C12の接着と細胞骨格構造秩序の変化を定量した(Hoerning, et al., Scientific Reports (2017))。(C)フッ化炭素直鎖分子が気液界面単分子膜において自発的に形成する直径数10nmオーダーのドメイン構造とその空間相関を、微小角入射X線散乱法を用いて解明した(Veshgini, et al., ChemPhysChem (2017))。(A)中性子非鏡面散乱については、該当年度にILLで1週間にわたり実験を行うことを計画していたが、ILL全体の設備導入計画の遅れのために延期となった。しかしながら、研究期間最終年度に振り替えて実験期間が保障されていること、当該年度以前に当初の計画を超えて結果が得られていることを踏まえて、計画全体としては順調に進捗している。(B)RICMを用いた細胞接着の定量については、ジャイアントベシクルおよびヒトiPS細胞を用いた実験を当初の計画のとおり進められている。また上述のとおり、本研究を進める中で着想を得ることで、当初計画していなかったいくつかの成果を得ることも出来た。本申請では胚発生の過程で重要な糖鎖SSEAに着目し、これらの糖鎖分子が膜の力学的特性と膜間の界面相互作用に与える影響を解明する。実空間と波数空間の実験手法を駆使し、膜の時空間揺らぎをマルチスケールに測定する。
急性炎症での細胞浸潤と血管透過を制御するサイトカインネットワークに関する研究

急性炎症での細胞浸潤と血管透過の機構を知るために、ウサギのMCP-1(rrMCP-1)とGRO(rrGRO)の遺伝子組換体、特異抗体を作成し、免疫測定系を確立した。ウサギ関節炎モデルにて、MCP-1の産生動態、産生制御機構、単球浸潤における意義を検討した。MCP-1は炎症早期に滑膜細胞で産生され、TNFαとIL-1により制御されていた。抗MCP-1抗体の投与で単球浸潤は抑制されたが、好中球の浸潤、TNFα、IL-1β、IL-8の産生量に変化はなかった。更に、rrMCP-1の投与で単球浸潤を起こすことが出来たが、TNFα、IL-1β、IL-8は検出されず、軟骨破壊も認めなかった。これらの結果からMCP-1による単核球の浸潤は急性炎症の増幅系には働いていないと考えられる。更に、炎症初期に浸潤する好中球がMCP-1による単球の浸潤に重要であることが判明した。次にGROの関節炎で果たす役割を検討した。GROの産生は、2時間目に主なピークをもって主に滑膜細胞で産生されていた。このGROの産生はIL-1で制御され、TNFα、IL-8とは独立していた。このrrGROの関節内投与で、好中球浸潤を起こすことができ、IL-8と共に重要な好中球の遊走因子であること、浸潤した好中球がIL-1β、IL-8を産生することが明らかとなった。これらから、炎症初期に産生されるIL-1がGROの産生を誘導し、GROにより浸潤した好中球が更にIL-1とIL-8の産生を行うが、このIL-1産生はTNFαにより制御されていることが判明した。また、GROはTNFαの産生を誘導し、血管透過に関与していることが明らかになった。以前から炎症局所でのサイトカイン、特にTNFα、IL-1β、IL-8、IL-1Raの役割を解析してきているが、MCP-1、GROの検索結果を追加することにより、これらの機構の解明がより進んだ。遺伝子組換体を作成していたMCP-1(rrMCP-1)については、特異抗体を作成し、ELISA系を確立した。この測定系により、LPS誘導関節炎でのMCP-1の産生動態をみると、起炎後4時間目にピークを持つ単峰性の産生が見られた。この産生は抗TNFα抗体で57%が、IL-1Raで41%が抑制され、両者の同時投与で90%が抑制された。抗IL-8抗体では抑制は見られなかった。これらの結果から、LPS炎症でのMCP-1の産生は主にTNFαとIL-1により制御されていることが明らかとなった。このMCP-1の産生細胞は滑膜細胞であった。更に、rrMCP-1をウサギの膝関節に注射すると、24時間目にピークを有する単峰性の炎症細胞(ほとんどが単核球)の浸潤を起こすことが出来た。

この時の他のサイトカインについて検討すると、IL-1Raのみが18時間目前後をピークとする産生が見られたが、TNFα、IL-1β、IL-8はいずれの時間帯でも検出されず、また、軟骨破壊も認めなかった。これらの結果はMCP-1による単核球の浸潤は急性炎症の増幅系には働かず、IL-1raを介して抑制に働いている可能性を示しており、その役割については検討中である。GROについても、遺伝子組換体(rrGRO)及び特異抗体の作成、ELISA系の確立を完了した。この測定系によりLPS誘導関節炎でのGROの産生動態をみると、2時間目に主なピークがあり、9時間目に小ピークが見られる。IL-1Raにより、2時間目と9時間目の産生はそれぞれ39%、67%が抑制され、GROの産生は主にIL-1により制御されていることが明らかになった。このrrGROを関節内に投与すると6時間目と12時間目にピークを有する炎症細胞(ほとんどが好中球)浸潤を起こすことができた。今後、他のサイトカインとの関連について検討を行う予定である。単球浸潤に重要なケモカインのMCP-1産生の制御機構の検索の過程で、LPS関節炎において、好中球の浸潤に重要なケモカインのIL-8を抗IL-8抗体で中和するとMCP-1の産生の抑制がないにも関わらず、好中球の浸潤の抑制と共に単球の浸潤が抑制されることが判明した。好中球枯渇ウサギのLPS関節炎では、好中球のみでなく単球の浸潤も極めてわずかになったが、MCP-1産生の抑制は見られなかった。また、好中球の浸潤を極めて強く抑制する処置(抗TNFα抗体+抗IL-8抗体+IL-1Raの投与、または好中球枯渇)をしておくと、MCP-1投与による単球の浸潤が抑制された。逆に、MCP-1と共にIL-8を投与すると、単球の浸潤が増加した。これらから、単球のケモカインではないIL-8が好中球の浸潤を介して単球の浸潤に強く関与しているという意外な結論が得られた。好中球浸潤に重要なケモカインのGROについても、引き続き検討を加えた。LPS関節炎でのGROの産生はIL-1Raで抑制され、抗TNFα抗体、抗IL-8抗体では抑制されず、抗GRO抗体ではTNFαとIL-8の産生には影響がなかった。これらから、LPS関節炎では、GROの産生はIL-1で制御され、TNFα、IL-8とは各々独立的に産生されることが判明した。更に、GROの投与での他のサイトカインの産生を調べた。TNFα産生は2時間目にピークを持ち、好中球枯渇での減少は認めなかった。IL-8産生は2時間目と12時間目にピークを持ち、好中球枯渇では12時間目が抑制を受けた。IL-1β産生は6時間目にピークを持ち、抗TNFα抗体あるいは好中球枯渇ではほとんど抑制された。これらから、GROはTNFα、IL-8の産生を起こし、浸潤した好中球が更にIL-1とIL-8の産生を行うが、このIL-1産生はTNFαにより制御されていることが判明した。
回転系振動格子乱流における乱流拡散と渦構造に及ぼす回転効果の解明

実験および数値計算を用いて回転系振動格子乱流を調べた。実験は回転テーブル上に置かれた矩形タンク内で実施された。実験装置に対しては、装置固有の二次流れ抑制のためいくつかの工夫がなされている。数値計算では、ALEタイプの移動格子に対する自乗量保存形差分スキームを用いてナビエ・ストークス方程式が解かれている。回転系では振動格子から離れた領域で準2次元的な渦構造が確認された。振動格子近傍では、静止系および回転系ともに、3次元的な渦構造が支配的である。標準的な乱流統計量と併せ、乱流減衰および回転によるその抑制も示された.回転系における準2次元的な渦構造の発達過程において,慣性波の伝播が特定された.回転系振動格子乱流について,近年構築した大型実験装置を用いた実験,および回転系ナビエ・ストークス方程式による直接数値計算(DNS),を実施した.回転系振動格子乱流の実験は,近年構築した大型実験装置を用い,回転系からx-z断面(回転軸を含む断面)でのPIV計測を実施し乱流統計量を算出した.PIV計測には本年度の研究費で購入した高速度カメラを用いた.回転タンク内の振動格子乱流の実験では乱流生成格子の振動に伴う二次流れが問題となるが,メッシュ幅M = 30 mmでは二次流の影響がみられるものの,M = 50 mmではその影響がほとんど見られずより理想的な実験となる事を確認した.さらに,メッシュサイズM=50 mmで,格子振動ストロークS = 40mm,格子振動周波数fg = 2.0 Hz,タンク回転数Ω= 0, 15 rpmの条件で実験を実施し,流れ構造,乱流強度,乱流エネルギー収支,等に対する回転の効果を調べた.これらの結果については日本機械学会東海支部第64期総会・講演会で講演発表を行っている.回転系振動格子乱流のDNSは,ALEタイプの移動変形格子に拡張された自乗量保存形の差分スキームを使用し,乱流生成格子を差分格子で正確に表現し実施した.計算領域は水平方向(回転と直交する方向)に4M ×4M、回転軸方向に20Mとし,水平方向に周期境界条件,回転軸方向の上下面はすべり無し壁面境界条件とした.乱流生成格子の1片の長さはd = M/5,乱流生成格子の振動ストロークはS = 4M/3とし,レイノルズ数ReM = fgMM/ν=2700,ロスビー数Ro = fg/(2Ω) = 1.43, 0.716, 0.258, 0.239の4例のDNSを実施した.計算結果を用いて流れ場の可視化を行い,振動格子乱流に対するDNSとしては初めて,慣性波の存在が確認された.また,各種乱流統計量に及ぼす回転の効果についても定量的に示した.これらの結果については,第28回数値流体力学シンポジウムで講演発表を行っている.回転系振動格子乱流について,平成26年度に引き続き,近年構築した大型実験装置を用いた実験,および回転系ナビエ・ストークス方程式による直接数値計算(DNS),を実施した.回転系振動格子乱流の実験は,平成26年度に実施した回転系からx-z断面(回転軸を含む断面)でのPIV計測に加え,回転系からx-y断面(回転軸と直交する断面)でのPIV計測も実施し乱流統計量を算出した.まず,x-z断面およびx-y断面でのPIV計測結果の比較を通して計測結果の信頼性の確認を行った.乱流統計量については,二次流れの影響が少ないメッシュサイズM = 50 mmに対して,格子振動ストロークS = 40 mm,格子振動周波数fg = 2.0 Hzと設定し,タンク回転数Ω= 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 rpmの条件で詳細な実験を実施し,乱流強度,乱流エネルギー収支,長さスケール,渦度の確率密度分布等に対する回転の効果を調べた.これらの結果については日本機械学会東海支部第65期総会・講演会で講演発表を行っている.回転系振動格子乱流のDNSは,平成26年度に引き続き,ALEタイプの移動変形格子に拡張された自乗量保存形の差分スキームを使用し,乱流生成格子を差分格子で正確に表現し実施した.計算領域は水平方向(回転と直交する方向)に4M ×4M、回転軸方向に20Mとし,水平方向に周期境界条件,回転軸方向の上下面はすべり無し壁面境界条件とした.使用している計算手法においては圧力ポアソン方程式の解法の計算負荷が高いため,より大規模なDNSを実施するため,特に今年度は圧力ポアソン方程式の解法の高速化の検討を行った.交付申請書に記載した平成27年度の研究実施計画に記載した2点,つまり大型装置を用いた回転系振動格子乱流の実験,および自乗量保存形の差分スキームを用いた回転系振動格子乱流のDNS,について研究を実施した.また,日本機械学会東海支部第65期総会・講演会にて研究成果を発表している.今年度は最終年度であるため,まず平成27年度までに得られた回転系振動格子乱流の実験データを検討した.その結果,特に静止系において乱流統計量の分布に2次流れの影響が無視できない程度に現れている事が判った.

そこで,当初の予定を変更し,まず静止系における2次流れの抑制に注力する事とした.乱流統計量の分布および流れ場の可視化観察から,2次流れは乱流生成格子末端とタンク側壁とのすき間から生じている事が判った.また,溶接により作成された乱流生成格子面にわずかではあるが歪みが生じ,これによる平面性の欠如が2次流れを促進している事が判った.そこでまず,乱流生成格子末端とタンク側壁とのすき間をこれまでの55 mmから5 mmへと減らす事とした.さらに乱流生成格子面の平面性を確保するため,ウオータージェット加工でアルミ材に穴を開けて乱流生成格子を作成した.新たに作成した乱流生成格子で生成された乱流場は,振動格子乱流として理想に近いものとなった事を確認した.また,この格子により回転系振動格子乱流の実験も実施し,回転によるエネルギー減衰の抑制効果も確認する事ができた.回転系振動格子乱流のDNSは実験と同条件で実施した.これまの実験データには2次流れの影響が現れていたので正確な比較ができなかったが,より理想的な状態の実験データと比較する事により,格子解像度を上げるとDNSデータが実験データに近づく事が確認された.しかし,現在使用している格子解像度では小スケール乱流構造を解像するには不十分である事も判った.そこで,非圧縮性流体解析の律速である圧力のポアソン方程式の解法を検討し,この流れ場に対しては内部反復解法にBiCGStab法を用いる多重格子法が有効である事がわかった.また,このDNSによる乱流構造の考察,回転の効果について,日本機械学会東海支部第66期総会講演会において,講演発表を行っている.実験および数値計算を用いて回転系振動格子乱流を調べた。実験は回転テーブル上に置かれた矩形タンク内で実施された。実験装置に対しては、装置固有の二次流れ抑制のためいくつかの工夫がなされている。数値計算では、ALEタイプの移動格子に対する自乗量保存形差分スキームを用いてナビエ・ストークス方程式が解かれている。回転系では振動格子から離れた領域で準2次元的な渦構造が確認された。振動格子近傍では、静止系および回転系ともに、3次元的な渦構造が支配的である。標準的な乱流統計量と併せ、乱流減衰および回転によるその抑制も示された.回転系における準2次元的な渦構造の発達過程において,慣性波の伝播が特定された.交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画に記載した2点,つまり大型装置を用いた回転系振動格子乱流の実験,および自乗量保存形の差分スキームを用いた回転系振動格子乱流のDNS,についてほぼ予定どおりに研究を実施した.またそれぞれについて,日本機械学会東海支部第64期総会・講演会,および第28回数値流体力学シンポジウム,にて研究成果を発表している.回転系振動格子乱流の実験については,平成26年度と平成27年度に実施した実験結果を一旦整理する.そして,現象をより適切に議論するために必要な追加実験を実施し,研究成果をまとめる.回転系振動格子乱流のDNSについて,平成27年度に検討した圧力ポアソン方程式の高速解法を導入した計算コードを用い,乱れの大きな条件(格子の振動ストロークSと振動周波数fgが大きな条件)に対する大規模数値計算を実施し,乱流統計量を算出する.さらに,これまでに実施した計算結果と併せて実験結果との比較検討を行い,必要に応じて実験では算出が困難な諸量の算出も行い,回転系振動格子乱流の乱流拡散に及ぼす回転の効果を解明する.28年度が最終年度であるため、記入しない。流体工学回転系振動格子乱流の実験については,平成26年度に引き続き,タンク回転角速度Ω,格子のメッシュ幅M,振動ストロークS,振動周波数fg ,を変化させた実験を実施する.
迅速PET脳血流・酸素代謝検査における非侵襲化のための非観血法の確立

PET脳酸素代謝検査において、撮像した画像データから入力関数を推定し検査を非侵襲化することを目的とした。本方法ではモデル関数を導入し、水と酸素を短時間投与したPET検査で得た画像データから複数の脳組織曲線を抽出し、これらの脳組織曲線を同時にフィットし入力関数を推定した。脳血流と酸素代謝量を計算し、13%の推定が可能であることが示唆された。また、シミュレーションにより脳血流と酸素代謝量の再現性は10%であることが分かった。以上から本方法により非侵襲検査が可能であることが示唆された。本研究では、PET脳酸素代謝検査において、撮像した画像データから抽出した脳組織の時系列曲線から入力関数を推定する方法を開発し、検査を非侵襲にすることを目的とした。今年度の研究では、検査で用いる標識酸素および標識水の2種の薬剤に対する全身での動態に基づいたモデルを記述し、モデル入力関数を構築した。またこのモデル入力関数からこれらの薬剤に対する脳組織動態モデルに基づき組織モデル関数を計算した。また計算したモデル入力関数を、水および酸素を短時間投与した検査で得た血中放射能濃度曲線を最適化法を用いて直接フィッテングし、モデル関数を構成するパラメーターに対する初期値と制限値を得た。健常者による迅速脳血流・酸素代謝検査で得られたPETダイナミック画像データから複数の脳組織曲線を抽出し、得られたそ組織モデル関数を用いてこれらの複数の脳組織曲線を同時にフィッティングし入力関数を推定した。現状では、15%程度での再現性が確認されている。これらに加え、本方法の有効性、限界を明らかにするためシミュレーションにより再現性を検討する計算を行っている。具体的には、PETで測定される組織曲線には常に少なからずノイズを伴うため、シミュレーションで組織放射能濃度曲線を作り、ノイズを加えた上で入力関数の再現性について計算している。また本計算では水の分配定数(血液と水に含まれる水の割合)を0.8ml/gと仮定しているが、この仮定に対する影響についてシミュレーションにより検討している。先ず、計算したモデル入力関数を、水および酸素を短時間投与した検査で得た血中放射能濃度曲線を直接フィッテングし、モデル関数を構成するパラメーターに対する初期値と制限値を得た。この初期値と制限値にもとづき、健常者および患者による迅速脳血流・酸素代謝検査で得られたPETダイナミック画像データから複数の脳組織曲線を抽出し、得られた組織モデル関数を用いてこれらの複数の脳組織曲線を同時にフィッティングし入力関数を推定した。推定した入力関数により、脳血流と酸素代謝量を計算し、13%の推定が可能であることが示唆された。これらに加え、本方法の有効性、限界を明らかにするためシミュレーションにより再現性を検討する計算を行った。PETにより得られる組織曲線上のノイズの影響は、10パーセント程度であることが分かった。また本計算で水の分配定数(血液と水に含まれる水の割合)を0.8ml/gと仮定している影響は、この値10パーセントの変動に対して10パーセントの影響であることが分かった。以上から本方法は臨床検査に適用し検査を非侵襲化することが可能であることが示唆された。
海馬ＣＡ３錐体細胞の樹状突起における情報処理メカニズムの解明

申請研究では、海馬CA3の錐体細胞は、シナプス入力の時空間パターンを情報として読み取り、さらに情報演算を行っていると考えている。特に、海馬CA3の機能は、樹状突起の領域ごとにシナプス入力の時空間的なまとまりの程度を変えることで実行されるという仮説を立て検証している。申請研究では、上記仮説検証のため機能的多スパインカルシウム画像法の高速化を実現した。その結果、海馬CA3錐体細胞の樹状突起は受け取ったシナプス入力の内一部だけを細胞体へ伝えていることを発見した。すなわち、大部分のシナプス入力が樹状突起上で無効化されているのである。また、シナプス入力の無効化にはGABA性のシナプス入力が関わっていることも明らかにした。さらに、GABA性入力によるシナプス入力の無効化は樹状突起の局所で行われていることがわかった。シナプス入力の時空間パターンとシナプス入力の無効化との関係を検証した。樹状突起は、同期シナプス入力を情報の単位としている。そのため、抑制性シナプス入力は特定の同期シナプス入力を無効化することで、一部の情報だけを細胞体へ伝えているのではないかと考えた。この可能性を検証するために、クラスタリング解析とロジスティック回帰分析を用いた。その結果、樹状突起上にはシナプス入力が細胞体に伝わる同期シナプス集団と細胞体に伝わらない同期シナプス集団が存在することがわかった。本結果は、神経細胞が樹状突起で情報の選別をしていることを意味している。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請研究では、海馬CA3では、シナプス入力の時空間パターンにもとづいて、樹状突起が多様な情報を処理していると考えている。そこで、海馬CA3錐体細胞は、樹状突起の領域ごとにシナプス入力の時空間的なまとまりの程度を変えることで、多様な情報処理を可能にしているという仮説を立て、申請研究において検証しようと試みている。本年度においては、シナプス入力の時空間パターンを従来よりも精密に捉えるため、実験手法の開発・改良を行った。申請研究で用いる機能的多スパインカルシウム画像法は、高い時空間解像度を有している。本手法をさらに改良することで、最大で313個という膨大な数のスパインから、最速で2msという短い露光時間の画像取得を可能とした。現在、取得したデータの予備解析段階だが、シナプ入力が必ずしも細胞体に伝わるわけではないことを示す結果が得られた。この現象は、樹状突起がシナプス入力パターンに基づいて情報処理を行った結果ではないかと考え、今後さらに解析を行っていく予定である。特に、樹状突起による情報処理に重要なシナプス入力の時空間的なまとまりの程度との関連に着目していく。また、樹状突起の領域によってこの現象に差異があれば、樹状突起の領域ごとに情報処理が行われていることを示すものであり、樹状突起領域間の違いにも注目し併せて解析を行う。本研究において、昨年度に確立した高速機能的多スパインカルシウム画像法とパッチクランプ記録法を組み合わせることで、海馬CA3錐体細胞樹状突起におけるシナプス入力パターンと興奮性シナプス後電流(EPSC)との関係を調べたところ、全てのシナプス入力が細胞体でEPSCとして記録されるわけではないことを発見している。本年度では、同手法を用いてデータ取得・解析を行い、本現象のメカニズムの解明を目指した。申請研究で注目したのは、シナプス入力時の樹状突起スパインヘのカルシウム流入量やスパインの構造、細胞体との距離である。その結果、これらのパラメータと本現象との間に関連はないことがわかった。そのため、本現象がより高次のシナプス入力パターンに依存している可能性があり、次年度において検証する。

昨年度確立した高速機能的多スパインカルシウム画像法を用いて、データ取得と解析が進展したため。また、その結果から次年度の研究指針を立てることができたから。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はより複雑なシナプス入力の時空間パターンとして申請時に仮説を立てた時空間的なまとまりの違いに注目する。また、本現象と抑制性シナプス入力との関係についても検証する予定である。機能的多スパインカルシウム画像法の改良により、従来よりも優れた時空間解像度を実現した。これにより、申請研究に追いて、重要なシナプス入力の時空間パターンをこれまでよりも精密に知ることが可能となった。機能的多スパインカルシウム画像法の改良の結果、データの取得段階に研究が今後は移行させる。本手法を用いて、シナプス入力の時空間パターンを樹状突起がどのように情報処理しているのかを明らかにしていく。特に、そのメカニズムの解明には薬理学的検討も視野に入れる必要があると考えている。
ヒトの終夜睡眠構造を規定する生理・心理的要因の同定

6夜連続の睡眠ポリグラフの記録をおこない,睡眠中の目覚めに対する自覚反応を被験者からのボタン押し反応(SA)によって検出し,睡眠段階,睡眠経過および体動, α活動の出現様との関連から睡眠中の自発的目覚を中心として,ヒトの終夜睡眠構造を分析した.その結果は次のようにまとめることができる.1)各睡眠段階におけるSA出現頻度は,段階REMと段階2で高かった.2)睡眠経過に伴うSA出現頻度は,睡眠初期で最も低く,時刻への依存性は認められなかった.また出現頻度は睡眠周期第3周期で最も高く,周期間に有意な差が認められた.3)段階REMにおけるSAの42.4%がその時点で他の段階に移行した.SAの出現潜時は段階REMでは927分区間での頻度が高く,段階2では018分区間と3645分区間での頻度が高かった.段階に2について1つ前の睡眠段階別にSA出現潜時をみると, 1つ前の段階が段階REMの場合は, 018分区間と3645分区間での頻度が高く,段階4, 3, 1の場合は09分区間での出現は認められなかった.4)SAの出現頻度は女子に比べ男子の方が高い傾向が認められた. 5)翌朝の自発覚醒についての主観的評価で,ボタン押し反応数は,ポリグラフ記録上の客観的評価で認められたSA数に比べ,過大評価された.以上の結果から,睡眠中の自発的目覚は睡眠段階REMと段階2でおこりやすく,特に段階REMと密接な関係があると考えられる.また,自発的目覚の時間的出現位置は,睡眠経過に伴う睡眠の質的変化によって規定されると推察され,睡眠周期第3周期で自発的目覚めがおこりやすいと結論できる.自発的目覚の個人差として,目覚め直前の睡眠段階で決定される個人の「目覚めのスタイル」の存在が示唆されたのは非常に興味深く,今後の研究がこのような個人差を中心に展開されることが望まれる.6夜連続の睡眠ポリグラフの記録をおこない,睡眠中の目覚めに対する自覚反応を被験者からのボタン押し反応(SA)によって検出し,睡眠段階,睡眠経過および体動, α活動の出現様との関連から睡眠中の自発的目覚を中心として,ヒトの終夜睡眠構造を分析した.その結果は次のようにまとめることができる.1)各睡眠段階におけるSA出現頻度は,段階REMと段階2で高かった.2)睡眠経過に伴うSA出現頻度は,睡眠初期で最も低く,時刻への依存性は認められなかった.また出現頻度は睡眠周期第3周期で最も高く,周期間に有意な差が認められた.3)段階REMにおけるSAの42.4%がその時点で他の段階に移行した.SAの出現潜時は段階REMでは927分区間での頻度が高く,段階2では018分区間と3645分区間での頻度が高かった.段階に2について1つ前の睡眠段階別にSA出現潜時をみると, 1つ前の段階が段階REMの場合は, 018分区間と3645分区間での頻度が高く,段階4, 3, 1の場合は09分区間での出現は認められなかった.4)SAの出現頻度は女子に比べ男子の方が高い傾向が認められた. 5)翌朝の自発覚醒についての主観的評価で,ボタン押し反応数は,ポリグラフ記録上の客観的評価で認められたSA数に比べ,過大評価された.以上の結果から,睡眠中の自発的目覚は睡眠段階REMと段階2でおこりやすく,特に段階REMと密接な関係があると考えられる.また,自発的目覚の時間的出現位置は,睡眠経過に伴う睡眠の質的変化によって規定されると推察され,睡眠周期第3周期で自発的目覚めがおこりやすいと結論できる.自発的目覚の個人差として,目覚め直前の睡眠段階で決定される個人の「目覚めのスタイル」の存在が示唆されたのは非常に興味深く,今後の研究がこのような個人差を中心に展開されることが望まれる.終夜睡眠中にみられる中途覚醒の分析をおこなった。健常な成人被験者7名に対して連続3夜にわたる睡眠実験を実施し、EEG,EOG,EMGを記録するとともに、中途覚醒を被験者に手につけられているボタンスイッチをおすことによって実験者に報告させた。その結果、一夜当り平均2.4回の中途覚醒が観察され、睡眠段階別にみるとStage-2,REMにおいて中途覚醒がみられた。しかし、日を経るにしたがって中途覚醒がREM期に集中する傾向があった。中途覚醒を予測しえる前駆症状について更に分析を進めている。
免疫学的不妊症に対する抑制性T細胞因子療法の基礎的研究

現在、ヒトの免疫学的男性不妊症に対する有効な治療法はほとんど未解決のままである。本研究は、過去10年来私達が得てきた、モルモットの実験的自己免疫性精巣炎(EAO)の発症阻止と治療に係わるサプレッサ-T細胞やT細胞因子の作用に関する研究成果を基礎にして、免疫学的男性不妊症に対する抑制性T細胞因子療法の開発を、より詳細な解析が可能なマウスを用いて企図したものである。免疫学的不応答が誘導された生体内に生成する、抗原共異的サプレッサ-T細胞によって産生される抑制性因子を用いる免疫療法は、それが免疫系に内在する細胞性因子であるが故に、通常の免疫抑制剤のような造精機能障害をひき起こす危険がないと思われる。本研究によって得られた成果の主なものは、1.EAO発症阻止能力をもつサプレッサ-T細胞を誘導するマウスの実験系の確立(日本病理学会誌79:219-219,1990)。2.サプレッサ-T細胞株の樹立(未発表)。3.抑制性T細胞因子の効果を確認するためのin vivo検考系の確立:(1)発症率のきわめて高いマウスEAOモデルの確立(日本免疫学会記録16:547-547,1989:投稿中)。(2)EAO受身伝達能をもつエフェクタ-細胞株の樹立(抑制性因子による効果期EAOの抑制の検定に用いられる)(Japan Society for Basic Reproductive Immunology Proceedings of the 3rd Annual Meeting:33-41,1988)。(3)再現性と感度において優れたマウス抗精子抗体価測定のためのELISA法の確立(Am.J.Reprod.Immunol.21:9-15,1989)。本研究は目下、抑制性T細胞因子生産能力をもつT細胞ハイブリド-マの確立、サプレッサ-T細胞からの因子の抽出・精製および効果検定を主題としており、さらに最終目標である抑制性T細胞因子の遺伝子クロ-ニングに向けて進行中である。1.精巣抗原特異的サプレッサーT細胞の誘導:超遠心(100,000xg, 1hr)により凝集物を除いた寛容原化精巣抗原10mg/500g体重をstrain13モルモットに3日おきに3回静注することにより,精巣抗原/CFA感作による精巣炎の発症を抑制する抗原特異的サプレッサーT(Ts)細胞を得た.このTs細胞はサイクロフォスファミド(CY)感受性で,細胞性免疫反応を抑制するが,抗精子抗体の産生を抑制しない.マウスでも同様の処置を行ないTs細胞を誘導した.これらのTs細胞から,超音波破砕または凍結融解によりTs因子を抽出した.2.抑制活性検定系の確立:(1)in vivo検定系としてマウスで発症率の高い精巣炎誘導系が必須である.我々は,同種精巣ホモジネートまたは精製抗原(脱脂・硫安沈降・酸抽出)をCFAとの混合乳剤として用いる感作のみでは発症率が1/7を越えないため, pertussigen,CY前処理,生後3日の胸腺摘出, γ-インターフェロンなどの併用を試みたが,発症率の目立った向上に至らなかった.現時点ではCY前処置-同系精巣細胞注射による精巣炎モデルが,軽症ではあるが病変形成率が高く,検定系として有用であることがわかった.

(2)in vitro検定系として,精巣抗原反応性T細胞核を樹立した. BALB/cマウス精巣細胞の皮下注射11日目の脾・リンパ節細胞を精巣抗原と共に培養し, feeder細胞とIL-2の存在下で継代した.この細胞を用い足蹠反応, in vitro増殖性反応,精巣白膜下注射による局所受身伝達精巣炎など,細胞性免疫のエフェクター細胞活性の検定を行っている.(3)マウス抗精子抗体ELISA法を確立した.これにより抗体の微量測定が可能となった.3.抗原特異的サプレッサーT細胞の株化:1の方法により免疫学的不応答を誘導したマウスの脾・リンパ節細胞からLyt-2^+細胞を選択し, IL-2と精巣抗原の存在下で継代培養し,細胞性免疫応答を特異的に抑制するサプレッサーT細胞株の樹立に努力中である.1.精巣抗原特異的サプレッサーT(Ts)細胞株の誘導:精巣自己免疫に対して抑制的に働く特異的Ts細胞株の確立へ向けての努力が現在も続いている。我々のモルモットにおける研究成果に基づき、初年度来凝集物を除去した寛容原化マウス精巣抗原(nTA)の静注によって免疫不応答を誘導し、脾・リンパ節からCB8^+リンパ球を選別し、in vitroでmTAとIL-2の存在下で継代培養を行なう方法によりTs細胞の確立を試みてきた。しかし、現時点では目的は達成されていない。その理由として、Ts細胞をCD8^+細胞に限定した点に問題があったと反省しており、実権的脳脊髄炎のTs細胞株がCD4^+であった事実を考慮し、Ts細胞株誘導方法を変更して研究続行中である。2.精巣自己免疫に対するtS細胞因子活性の検定系の確立:(1)in vivo検定系として必須の実験的自己免疫性精巣炎(EAO)モデルを確立した。従来のマウスEAO誘導法では、発症率が低く病変も軽度であったため、サプレッサー活性の評価ができなかった。我々はEAO誘導につき考え得る限りの試行の末、発症率がきわめて高く、しかもアジュバントやシクロフォスファミド前処置を必要としない、同系精巣細胞注射によるEAOモデルの開発に成功した。(2)精巣自己免疫のエフェクター期抑制の検定に有用な、精巣炎受身伝達能力をもつエフェクターT細胞株の確率に成功した。同系精巣細胞の腹腔内注射後に採取した脾・リンパ節細胞を、まずシクロスポリン存在下でmTAと共に培養した後、"eed phase"と"Starve"phaseとを交互に反復して細胞株を樹立した。この細胞株は局所性および全身性の精巣炎受身伝達能を有しており、精巣白膜下に移入すると5日後に、また、腹腔内注射により40日後に無精子症、精巣炎を発生した。本細胞株の表現系はThy1.2^+、CD4^+CD8^-、I-A^+で、mTA刺激により増殖性反応とMIF産生を示すが、細胞障害活性はない。国内外を通じてこのようなT細胞株の報告はまだない。1.発症阻止能力のあるサプレッサ-T細胞誘導系の確立:C3H/Heマウスにおいて可溶性マウス精巣抗原(部分精製精子抗原を超遠心によりdeaggregateしたもの)り1mg/匹5回静注により、EAOの発症と特異的細胞性免疫応答とを著しく抑制する実験系を確立した。
高密度電子部品接続部の信頼性評価を実現する任意曲線損傷変数法の開発

高密度電子部品はんだ接続部が受ける疲労・クリープ損傷について詳細に調べるために、昨年度、パルスステージを応用した高精度疲労試験装置を開発した。本年度は、この試験装置を用いて、各種表面実装型はんだ接続部(主に鉛フリーはんだ材)の疲労試験を強制変位量±550μm、繰返し周波数0.0015.0Hz、雰囲気温度303333Kの条件下で行い、各種はんだ接続部の疲労き裂発生・進展挙動を明らかにした。また、はんだ材が受ける疲労・クリープ損傷を定量的に表現できる損傷モデルを確立するため、はんだバルク材用疲労試験装置を新たに作製し、上記と同じ条件で実験を行うことにより、損傷課程における表面状態や組織の変化をレプリカ法や顕微鏡により連続観察した。そしてこれらの実験結果を基にはんだ材の損傷(寿命)を予測するための評価式を提案した。さらに、この評価式と任意曲線法あるいは有限要素法解析とを組み合わせることにより、表面実装はんだ接続部の疲労き裂発生寿命の予測を行った。また、はんだバルク材の疲労試験より得られた構成式と損傷発展式を用いて、表面実装はんだ接続部のき裂進展解析を行った。これらの解析結果と実験結果とを比較することにより、表面実装はんだ接続部の疲労き裂発生寿命、き裂進展経路およびき裂進展寿命が本解析法によりほぼ予測できることを確認した。高密度電子部品はんだ接続部が受ける疲労・クリープ損傷について詳細に調べるために、電子部品と回路基板との間の線膨脹差に相当する微小繰り返し強制変位を与えることができる簡易型疲労試験装置を作製した。そして、プリント基板表面実装形はんだ接続部の中で代表的なButt型およびGullwing型実物大模型試験片を用いて、強制変位量±550μm、繰り返し周波数0.0015.0Hz、雰囲気温度303333Kで疲労試験を行い、疲労き裂発生・進展挙動を明らかにした。さらに、著者らが提案したはんだバルク材に対する寿命評価式と非弾性有限要素法解析とを組み合わせる事により、微細はんだ接続部の疲労寿命をある程度予測できることを示した。これらの研究成果はButt型についてはKey Engineering Materialsの1月号に既に掲載され、Gullwing型については日本学会論文集の4月号に掲載される予定である。現在は疲労寿命予測の精度をさらに高めるため、常微分方程式の境界値問題に帰着させて解くことを念頭に置いた新しい連続体損傷モデルを基に定式化した任意曲線損傷変数法のプログラムを作製しているところである。
糖鎖が構造形成におよぼす要因の解析と膜タンパク質結晶化への応用

1.修飾糖鎖の解析について4ヶ所糖鎖の修飾を受けるリンゴ銀葉病菌由来エンドポリガラクツロナーゼのうち、2ヶ所(Ash92,Asn161)が修飾されているIaとその脱糖鎖型deIaについて超高分解能精密結晶構造解析を行った。また、オリゴガラクツロン酸との複合体を結晶化させることに成功し、サブサイト構造について明らかにすることができた。ついで、分解能を向上させることにより、水素の構造についても明らかにすることに成功した。さらに、中性子線解析によって、水素構造の確認を行うため、中性子線解析に必要となる巨大結晶(数ミリ立方メートル大)の作成を試みた。2.ABCトランスポーターについてガンの多剤耐性の原因となるMDR1と糖尿病薬スルホニルウレア剤のレセプターであるSUR1について、ヒトおよびマウス由来の遺伝子を用いてバキュロウイルスをベクターにした昆虫培養細胞(Sf-9)による発現系を構築し、得られた発現系を用いて活性型のタンパク質を大量生産(3リットルの液体培養)できる培養条件を確立した。また、細胞からミクロソーム画分を調製する方法を改良することにより収量を改良することができた。さらに、結晶化を補助するため、モノクロナール抗体から調製したFabフラグメントとの複合体を調製することを試みた。その結果、特定の界面活性剤を用いたときだけ複合体ができていることが判明した。1.修飾糖鎖の解析についてリンゴ銀葉病菌由来エンドポリガラクツロナーゼは4ケ所糖鎖の修飾を受けるが、そのうち、2ケ所(Asn92, Asn161)が修飾されているlaとその脱糖鎖型delaについて超高分解能精密結晶構造解析を行った。さらに、laについては、生成物モノガラクツロン酸との複合体結晶の結晶構造解析を行い、初めてエンドポリガラクツロナーゼの活性中心の位置を同定した。その結果、触媒残基は、Asp173,Asp153,Asp174によって構成されていると考えられた。また、Lys228,Arg226が基質の有するカルボキシル基の認識に重要な役割をすることが示唆された。修飾糖鎖と基質結合部位は離れており、修飾糖鎖が基質結合に与える影響は、ほとんどないことが示唆された。2.ABCトランスポーターについてガンの多剤耐性の原因となるMDR1と糖尿病薬スルホニルウレア剤のレセプターであるSUR1について、ヒトおよびマウス由来の遺伝子を用いてバキュロウイルスをベクターにした昆虫培養細胞(Sf-9)による発現系を構築した。そこで、得られた発現系を用いて活性型のタンパク質を大量生産(3リットルの液体培養)できる培養条件を確立した。さらに、カラムクロマトグラフィーにより、電気泳動的に単一な精製標品を得ることに成功した。得られた精製標品をリポソームに再構成したところ、MDRの有するATPase活性を検出することができた。
再生医療的アプローチを用いた新しい横隔膜修復術の開発

先天性横隔膜ヘルニア(以下CDH)治療における人工膜縫着後の胸郭変形の防止などQuality of lifeの向上をはかるべく、CDHラットモデルを開発した。横隔膜欠損孔にはPLGA-collagen hybrid meshを縫着するが、Sheet縫着の際に、血管系を有茎に残した大網を間置し、「新横隔膜」への栄養血管とする事により筋再生を図ることができるかを検討すべく、新たな横隔膜ヘルニア修復術を開発した。小児外科領域の先天性疾患特に横隔膜ヘルニア(以下CDH)治療における人工膜縫着後の胸郭変形の防止などQuality of lifeの向上をはかるべく、我々は、CDHラットモデルを開発し、再生医学的アプローチにより新しい欠損孔の補填材料の可能性を研究し、臨床応用へつながる一定の成果を得てきた。片側横隔膜全欠損やそれに準じる巨大横隔膜欠損を有するCDHの究極の治療は筋としての横隔膜の再生であるが、これには血管・神経の再生という大きなハードルが立ちふさがっている。現在、再生医学的手法はかつてのようなin vitroにおいて一から臓器を再生する試みから、失った臓器の機能をin vivoで再生させる方向へとシフトしてきているが、現存する臓器・機能を有効利用して、欠損した臓器の再生をin vivoにおいて図るための新しい手法の開発が本研究の第一の目的である。このなかで、GFPラット由来の筋芽細胞を用いて筋再生の可能性を探る。また、本研究にて用いるPLGA mesh-collagen spongehybrid scaffoldに大網を間置する手法は、たとえ筋再生が得られないとしてもscaffold担体を用いる手法に比してより強度が得られることが証明されれば、現在ある人工素材を置き換えるものとして臨床の場にすぐに還元しうる技術である。本研究は早期に臨床応用可能な技術の開発の側面があり、これが第二の目的である。これまでの研究では、巨大欠損孔の横隔膜ヘルニアに対してパッチ閉鎖を行う際に、自己由来の組織と置き換わるscaffoldを開発し、臨床応用可能であることが明らかになったが、人体に使用するにはより強度が必要となる。よって、いかに強度を上げられるかを追求する。欠損した臓器の再生をin vivoにおいて図るための新しい手法の開発が本研究の第一の目的である。本研究にて用いるPLGA mesh-collagen spongehybrid scaffoldに大網を間置する手法は、たとえ筋再生が得られないとしてもscaffold担体を用いる手法に比してより強度が得られることが証明されれば、現在ある人工素材を置き換えるものとして臨床の場にすぐに還元しうる技術である。我々はPLGA mesh-collagen sponge hybrid scaffoldによる欠損孔の再生を研究してきたがそれが大網間置によってより強固なものになるか、また血管系を有する再生横隔膜として有効に機能するかを明らかにする。このため、まず、重層させたPLGA mesh-collagen spongehybridscaffoldに血管系を有茎に残した大網を間置させて欠損孔に縫着する技術を確立すべく、PLGA-collagen hybrid meshを制作。ラット横隔膜ヘルニアモデルを作成し、そこにPLGA-collagen hybrid meshを縫着するが、Sheet縫着の際は、血管系を有茎に残した大網を間置し、「新横隔膜」への栄養血管とする事により筋再生を図ることができるかを検討した。これまでの研究では、巨大欠損孔の横隔膜ヘルニアに対してパッチ閉鎖を行う際に、自己由来の組織と置き換わるscaffoldを開発し、臨床応用可能であることが明らかとなったが、人体に使用するにはより強度が必要となる。本研究にて用いるPLGA mesh-collagen spongehybrid scaffoldに大網を間置する手法は、たとえ筋再生が得られないとしてもscaffold担体を用いる手法に比してより強度があることが証明されれば、現在ある人工素材を置き換えるものとして臨床の場にすぐに還元しうる技術である。

本研究は早期に臨床応用可能な技術の開発の側面があり、これが第二の目的である。我々はPLGA mesh-collagen sponge hybrid scaffoldによる欠損孔の再生を研究してきたが、それが大網間置によってより強固なものになるか、また血管系を有する再生横隔膜として有効に機能するかを明らかにする。このため、まず、重層させたPLGA mesh-collagen spongehybridscaffoldに血管系を有茎に残した大網を間置させて、欠損孔に縫着する技術を確立すべく、PLGA mesh-collagen meshを制作。ラット横隔膜ヘルニアモデルを作成し、そこにPLGA mesh-collagen meshを縫着するが、sheet縫着の際は、血管系を有茎に残した大網を間置し、「新横隔膜」への栄養血管とすることにより筋再生を図ることができるかを検討した。先天性横隔膜ヘルニア(以下CDH)治療における人工膜縫着後の胸郭変形の防止などQuality of lifeの向上をはかるべく、CDHラットモデルを開発した。横隔膜欠損孔にはPLGA-collagen hybrid meshを縫着するが、Sheet縫着の際に、血管系を有茎に残した大網を間置し、「新横隔膜」への栄養血管とする事により筋再生を図ることができるかを検討すべく、新たな横隔膜ヘルニア修復術を開発した。横隔膜ヘルニアラットモデルの作成自体に難渋し、大網を間置したラットの産生が困難であり評価に十分な検体作成に遅れが生じている。よってそれ以降の組織学的・免疫学的検討に関しても遅れが生じている。小児外科昨年度後半にかけて作成技術の見直しを行い、モデル作成が充分可能となる見込みである。本年度前半にモデル作成が軌道にのることが出来れば後半に検体作成と解析を行うことが出来る。筋芽細胞の誘導に関しては時間的な余裕がない場合は未誘導モデルの解析を優先して行い、一定の結果を達成する予定である。PLGA-collagen hybrid meshの制作を、連携研究者である物質・材料研究機構陳国平氏の協力を得、制作を行っている。ラットの大網における血管走行パターンから、いくつかの手術法を検討しているが、実際のラットモデルの作成が確立していない現況である。連携研究者である物質・材料研究機構陳国平氏の協力を得、PLGA-collagen hybrid meshの制作をおこなった。手術法については机上では候補となる方法があり、ラットの大網の走行についてのパターンを得ることができた。それを実証すべくラットモデルへの導入を試みたが、実際のラットモデルを確立するまでには至らず、当初の予定より遅れているのが現状である。本年度に予定していた研究内容に遅れが生じたため、使用予定であった予算の使用が困難となった。