hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SCIDマウスにおけるATL細胞の増殖と制御

この腫瘤はHTLV-I陽性ではあったが、T、B細胞のキメラであり、単クローン増殖を認めなかったため、ATL細胞の直接の増殖を確定できなかった。またキャリアー1名の末梢血液単核球を8匹に接種した結果では、1匹のみが、肺、その他の臓器においてHTLV-I陽性であったが、腫瘤の形成は認めなかった。上記の結果より、AAGM処理はHTLV-I感染細胞のSCIDマウスにおける移植実験に有用であり、ATL発症にNK活性の低下が重要である可能性を示した。
擬微分作用素と時間周波数解析

擬微分作用素および多重線形フーリエマルチプライヤー作用素の有界性について研究を行った.特に有界性を保証するためにはいったいどれだけの滑らかさの条件をシンボルが持っていればよいのかを考え,これまでに知られていた滑らかさの条件を弱めることに成功した.擬微分作用素および多重線形フーリエマルチプライヤー作用素の有界性について研究を行った.特に有界性を保証するためにはいったいどれだけの滑らかさの条件をシンボルが持っていればよいのかを考え,これまでに知られていた滑らかさの条件を弱めることに成功した.A.Boulkhemair(J.Funct.Anal. 1999)はある不等式を用いることにより,モジュレーション空間を用いるSjostrand(Math.Res.Lett. 1994)のL^2-有界性に関する結果と,ベソフ空間を用いるM.Sugimoto(J.Math.Soc.Japan 1988)のL^2-有界性に関する結果をそれぞれ導いた.注目すべき点は,SjostrandとSugimotoの結果は互いに独立な関係にあるにもかかわらず,ある同じ不等式から導かれるのである.ここで,SjostrandとSugimotoの結果は,擬微分作用素論における基本定理であるCalderon-Vaillancourtの定理を含む興味深いものであることに注意しておく.本年度は,BoulkhemairのL^2-有界性の結果をL^p-有界性に拡張することができた.Boulkhemair型の不等式をL^2からL^pに拡張することにより,例えばA.Miyachi(Math.Nachr. 1987)やM.Sugimoto(J.Fac.Soc.Univ.Tokyo Sect.IA.Math. 1988)のS_{0,0}にシンボルを持つ擬微分作用素のL^p-有界性に関する結果を改良することに成功した.きらに,このBoulkhemair型の不等式を用いることにより,モジュレーション空間にシンボルを持つ擬微分作用素のL^p-有界性を得ることができた.これは,SjostrandのL^2-有界性に関する結果を,L^p-有界性に拡張できたことを意味する.また,本年度は双線形フーリエマルチプライヤーの有界性に関する結果を得ることができた.具体的には,有界性を保証するために必要な双線形フーリエマルチプライヤーの滑らかさに関する仮定を弱めることに成功した.これまでの双線形の理論で用いられていた積分核の各点評価のかわりに積分評価を用いることが重要である.双綿形フーリエマルチプライヤーに対する重み付き不等式や双線形擬微分作用素を扱い,本年度の研究をさらに発展させたい.フーリエマルチプライヤーは,偏微分方程式の研究において非常に重要な役割を果たす.例えば,熱方程式,波動方程式などの基本的な方程式から,非線形偏微分方程式まで,現在の偏微分方程式論の研究には必要不可欠な道具である.調和解析の分野において,フーリエマルチプライヤーに対してどれだけの滑らかさを要求すれば作用素として有界になるのか.という問題は基本的である.そして,多くの研究者がこの問題を考え,線形の場合の重要な結果の一つとしてHormanderの定理がよく知られている.これは,弱い滑らかさの仮定の下での作用素の有界性を保証する定理である.現在この分野では,これまでに知られている線形の理論を多重線形の場合に拡張する研究が盛んである.単なる一般化ではなく,多重線形の理論により初めて与えられる偏微分方程式への応用も知られており,多重線形の場合への拡張は非常に重要である.多重線形のフーリエマルチプライヤーの有界性の結果として,Coifman-Meyerの定理は基本的である.しかし.彼らの結果を線形の立場から眺めた場合,有界性を保証するためにマルチプライヤーに対して要求する滑らかさの仮定が強すぎる.この滑らかさの仮定を弱めるために,本年度は研究成果欄で述べた多重線形フーリエマルチプライヤーに対するHormander型の定理の研究を推し進めた.具体的には,宮地晶彦教授(東京女子大学)と共に,より少ない滑らかさの仮定の下での多重線形フーリエマルチプライヤー作用素のHardy空閲上での有界性について研究した.特別な場合には最適な滑らかさの仮定を見つけることに成功したので,今後も引き続き本年度の研究をさらに発展させたい.偏微分方程式論において,フーリエマルチプライヤー作用素の有界性が重要な役割を果たすことはよく知られている.実際,熱方程式,波動方程式などの基本的な方程式から,非線形偏微分方程式まで,現在の偏微分方程式論の研究において,フーリエマルチプライヤーは必要不可欠な道具である.昨年度に引き続き,今年度も多重線形作用素の有界性について研究を行った.多重線形のフーリエマルチプライヤー作用素の有界性に関する結果として,Coifman-Meyerの定理は基本的である.しかし,彼らの結果を線形の立場から眺めた場合,有界性を保証するためにマルチプライヤーに対して要求する滑らかさの条件が強すぎる.この滑らかさの条件を弱めようというのが,研究のテーマである.昨年度までに,ルベーグ空間の指数が1より大きい場合に,Hormander型の定理を得ることができていた.

本年度は,宮地晶彦教授(東京女子大学)との共同研究において,双線形の場合にはすべてのルベーグ空間の指数の下で,双線形フーリエマルチプライヤー作用素が有界になるための最小の滑らかさの条件をソボレフ空間の意味で決定することに成功した.指数が1より小さい場合には,ルベーグ空間をハーディー空間に置き換えるわけだが,双線形の場合には1つのアトムに対する一様な評価を得るだけでは不十分である.これは,線形の場合とは大きく異なる点である.そして,この困難を乗り越えるため,双線形作用素にアトムを作用させた関数を分離して評価するL. Grafakos - N. Kalton (2001)の考え方を,非常に少ない滑らかさの条件の下で適切に修正した.
単結晶内部の延性損傷進展挙動に関する放射光白色Ｘ線による研究

延性損傷の進展と結晶方位の関係を実験的に検証するためには単結晶を用いたX線回折法が有効である。本研究では、大型放射光施設SPring-8において、白色X線を用いたアルミニウム単結晶の延性破壊進展挙動の検証を行った。その結果、延性損傷進展に伴い発生した転位セルの回転は水平面内に比べ垂直面内で大きいことがわかり、引張負荷によるAl(111)面のすべり活動が転位セルの生成と回転に大きな影響を及ぼしていることが考えられた。また、転位密度は材料の延性損傷が進むことで全体に増加したが、ノッチ近傍では相対的に低かった。延性損傷進展によるひずみエネルギーの解放の影響が考えられた。結晶方位とき裂進展の関係を明らかにするためには単結晶レベルでの延性損傷進展に関する基礎的検証が有効である。平成24年度には大型放射光施設SPring-8に設置された共用ビームラインBL28B2において、引張負荷下で単一すべり系が優先的に活動するアルミニウム単結晶試験片の延性損傷進展と結晶方位の関係を明らかにすることができた。平成25年度は、111すべり面が負荷方向に対し直交あるいは平行となるアルミニウム単結晶試験片を作製して引張試験を行い、き裂の進展挙動を検証した。試験片には平行部中央に片側ノッチ、両側ノッチをそれぞれ施した。111すべり面が負荷方向に平行な片側ノッチ試験片では、ノッチの部分から荷重方向に対してV字方向にすべり帯が発生し、せん断帯も同じ方向に進展することが確認できた。両側ノッチ試験片では、両側のノッチ部分からすべり帯が発生し、せん断帯がひし形状に全体に広がっていくことが確認できた。そして、引張方向に対して垂直にき裂が発生し進展した。111すべり面が負荷方向に直交する片側ノッチ試験片では、すべり帯がノッチ部ではなくチャック部に発生した。すべり面が直交している方が平行の時と比べ二次すべりの挙動が制限され、チャック部分の応力集中が優先したと考えられる。両側ノッチ試験片では、両側のノッチ部分から荷重方向に対して45°の方向にすべり帯が発生し、せん断帯も同方向へ進展した。アルミニウム単結晶の延性破壊の進展はすべり帯の発生、き裂の進展方向など結晶方位によって違いが顕著に見られた。一連の実験により、結晶方位と延性破壊の進展に依存性があることを確認できた。しかし、今年度は放射光白色X線を用いた実験課題を申請したが採択されなかったため転位密度の変化などは確認できなかった。き裂の急激な進展は材料の破壊をもたらすため、その発生・進展を非破壊で高精度に推定・評価する手法の開発が産業界から強く望まれている。多結晶材料内部のき裂先端は局所的には1つの結晶粒に達したのち、その結晶粒内部に進展するか結晶粒界を伝播するかは、き裂先端近傍の応力場と結晶方位との関係も決定要因の1つとなることが推測される。したがって、結晶方位とき裂進展の関係を明らかにすることが重要であり、そのためには単結晶レベルでの延性損傷進展に関する基礎的検証が重要となる。そこで本研究では、平成24年度に大型放射光施設SPring-8に設置された共用ビームラインBL28B2において、白色X線を用いたアルミニウム単結晶の延性破壊進展挙動の検証を行った。負荷方向に対して[110]方位が45°の傾きを有するアルミニウム単結晶(純度約99.9999%)を用いて片側ノッチを有する試験片を作製し、引張り試験により塑性変形させながらノッチ中心から斜め45°の方向に沿って白色X線で測定した。塑性変形が進むにつれて亜結晶粒の生成とその微小な回転が推測された。そこで、2次元検出器であるフラットパネルを用いて亜結晶粒の回転を測定点ごとに追跡し、結晶方位を定めたのち0次元検出器である半導体検出器SSDで透過回折X線を測定した。回折X線プロファイルから延性損傷の進展を検討するためVoigt関数でプロファイルフィッティングを行った。プロファイル解析で得られた積分幅ガウス成分から不均一ひずみや転位密度を算出し延性損傷進展挙動を検討した。その際、真の積分幅ガウス成分を得るために、装置関数の影響を除去する新たな方法を提案した。解析の結果、転位密度は材料の延性損傷が進むことで全体に増加したが、ノッチ近傍では相対的に低いことが明らかとなった。白色X線を用いた単結晶に対する回折X線プロファイル延性損傷解析システムの構築を目的として、平成25年度までに0次元検出器として半導体検出器SSDを利用した単結晶の弾塑性域における透過回折白色X線の測定およびプロファイル解析についてはほぼ確立することができた。

単結晶の測定では回折X線が単一となる場合が多いが、そのような回折X線プロファイルから装置関数成分を除去するための放射光白色X線法における新しい手法を提案した。また、測定ごとに結晶方位をフラットパネルセンサで定めることで測定精度の安定した延性損傷解析を可能とした。平成26年度は負荷方向に対して[110]方位が45°の傾きを有するアルミニウム単結晶を用いて平行部の両側にノッチを有する試験片を作製し、引張り試験により塑性変形させながらノッチ近傍を高エネルギー白色X線で測定した。負荷方向に対し45°の方向に現れる(222)面と(220)面のピークをそれぞれ測定した。数値解析結果から予測されていた延性損傷の進展方向であるノッチ底から斜め45°の方向に沿って回折X線を測定した。X線回折プロファイルから得られる積分幅ガウス成分から不均一ひずみや転位密度を算出し、塑性ひずみの増加に伴いそれらの値も変化することを確認した。プロファイル解析に必要な装置関数の決定では,エネルギー分散法特有の応答関数などを考慮した方法を用いた。その結果、延性損傷進展に伴い発生した転位セルの回転は、水平面内に比べ垂直面内で大きく、特に負荷ひずみ5%のときの[111]方位に沿った方向の角度変化が大きくなることがわかった。引張負荷によるAl(111)面のすべり活動が転位セルの生成と回転に大きな影響を及ぼしていることが考えられた。本研究により結晶方位と延性破壊の進展挙動に関連があることを確認できた。材料強度学白色X線を用いた単結晶回折X線プロファイル延性損傷解析システムの構築を目的として、平成25年度までに0次元検出器として半導体検出器SSDを利用した塑性域における単結晶透過回折白色X線の測定およびプロファイル解析についてはほぼ確立することができた。特に、単結晶のプロファイル解析で問題となる装置関数の除去について、放射光白色X線を用いる場合の新しい手法を提案した。また、2次元検出器のフラットパネルセンサが転位セルの回転の追跡には極めて有効であり、測定ごとに結晶方位をフラットパネルセンサで定め回折X線プロファイルをSSDで測定することで精度の安定した延性損傷解析が可能となった。結晶方位についてはこれまでに、引張負荷下で面内4すべり系と単一すべり系が優先的に活動する試験片について測定ができており、平成25年度までの目標としてはほぼ達成できている。平成25年度では111すべり面が負荷方向に対し直交あるいは平行となるアルミニウム単結晶試験片を作製して引張試験を行いき裂の進展挙動を観察したが、放射光白色X線を用いた転位密度評価については実験課題が採択されなかったため実施できていない。この実験に関しては次年度に再度申請し行う予定である。平成24年度は白色X線を用いた単結晶回折X線プロファイル延性損傷解析システムの構築を目的とした。0次元検出器として半導体検出器SSDを利用した弾性域および塑性域における単結晶透過回折白色X線の測定およびプロファイル解析についてはほぼ構築することができた。2次元検出器としてフラットパネルセンサを用いた塑性域における単結晶透過回折白色X線の測定についても実施できた。しかし、2次元検出器による延性損傷解析については、得られた透過回折X線プロファイルの分解能がSSDに比べて低く、プロファイル解析による転位密度、不均一ひずみなどの正確な評価は難しいと判断した。
高効率輸送用リニア誘導モータに関する研究

1.端効果補償器付リニア誘導モータの特性リニアモータ一次側の長さが短く制限される場合,効率を向上させるための唯一残された手段は端効果の補償である。その具体的な方法としては,永久磁石回転型補償器を利用するのが最も有効と考えられ,以下にその効果と利用法について述べる。(1)永久磁石回転型補償器を利用することにより,本体のリニアモータを含めた総合効率で少なくとも5%程度の増加し,76%程度に向上させることができる。また,そのとき総合推力は40%程度増加しており,高効率で高密度推力をもつリニアモータを実現できる。(2)補償器において4極機に比べて補償器円柱の直径が約半分で断面積が4分の1の2極機でも,4極機とほぼ同等の端効果補償効果が得られる。2極機の場合,リニア誘導モータの一次側長さ2.5mに対し,リニアモータ前方のわずか0.2m長程度の空間に設置できる。(3)補償器の製作に際しては,複数個の永久磁石を配列して1磁極を形成する場合,磁石本来の特性を発揮させるために,できるだけ一磁極をまとめて磁化することが望ましい。2.高効率を目的とした実車両用の長い車上一次型リニア誘導モータの特性(1)安全性のために12mm程度の長いエアギャップが必要であり,一方で,二次導体の幅が400mm程度に制限される条件の下では,無限長と等価な非常に長いリニアモータでポールピッチを400-500mm以上にしても,縁効果のために効率はほとんど向上しなくなる。なお,二次側関しては効率向上のための改善の余地は少ない。(2)極数を増加させると,端効果の影響が小さくなり効率向上に必要な小さな滑りを動作点に選定することが可能になる。しかしながら,力率も考慮すると時速40kmでの運転滑りは0.07以上の条件となる。効率80%を目標とする場合,リニアモータ一次側には現在の8極・2.5m長に対して20極・約6m長が必要になる。1.補償器付リニア誘導モータに関する検討1-1.磁気車輪方式端効果補償器の実験的検討試験装置を用いて,本補償器がリニアモータに供給する電流と磁束を実測した。本モデルの解析は非常に困難であるが,市販の特殊ソフトELFによる解析値の結果は実測値とよく一致することを確認した。また,本方式ではリニアモータによる駆動によって補償器自体の動力がない(補償器駆動のための損失がない)状態でも回転させることが可能であり,その場合でもリニアモータに補償電流を供給できることを明らかにした。1-2.単相集中巻線方式・静止型補償器の場合の全体特性比較的解析が容易な本方式での検討の結果,補償器によってリニアモータ部に供給される電流に対して,補償器部下の二次導体中における銅損が非常に大きいことが明らかになった。この銅損は総合効率に支配的な影響を与えるものであること,また,補償器方式によってこの値は大きく変化することが明らかになった。2.効率を重視した長い車上一次型リニア誘導モータに関する検討2-1.安全性のために12mm程度の長いエアギャップが必要であり,効率向上に不利なこの条件はポールピッチを長くすることで緩和される。しかしながら,一方で,二次導体の幅が400mm程度に制限されるために,導体縁付近で渦電流の流れが抑制され,二次導体の抵抗が等価的に増加する。

いわゆるこの縁効果のためにポールピッチを400-500mm以上にしても効率はほとんど向上しなくなる。またこの縁効果のために低滑りにおいて力率の向上が小さい。2-2.極数を増加させると,端効果の影響を受けない極部の数が増えるために端効果の影響が小さくなり特に小さな滑りで効率の向上が大きくなる。しかしながら,力率も考慮すると時速40kmでの運転滑りは0.07以上の条件となる。この条件において,20極・約6m長以上では効率の増加割合は非常に少なくなる。1.補償器部の損失低減方法について補償器も含めたリニア誘導モータ(LIM)の総合効率を高くするためには,リニアモータ内に流入させる補償電流の大きさに対して,補償器部分での二次導体中銅損の割合をできるだけ少なくすることが必要である。そのためには補償器部分で移動磁界を印加する方法が有効であることを確認した。さらに補償器の出口端端効果での電流発生とブレーキ力との関係について調べ,より効果的な方法・方式について検討する必要がある。2.永久磁石回転型補償器付リニア誘導モータ(LIM)の総合効率についてこの方式の直接的な特性算定および実験による確認は非常に困難であるため,単純な構成での実験結果を電磁界数値法に利用する手法について検討した。数値解析法には積分要素法と呼ばれるエアギャップの要素分割が不要な解析ツールと種々の分野で利用されている有限要素法の2種類を使用した。前者は三次元専用の動磁場解析であり,実際の形状を考慮できるもの,計算精度が保証される要素数に制限があるために長いLIMとを組み合わせた解析には使用が困難である。一方,現段階での有限要素法は永久磁石が導体板上を回転しながら直線移動するようなモデルの渦電流問題には利用できない。したがって,永久磁石回転型補償器付LIMの解析では,まず,実験結果や積分要素法を用いて補償器を機械的には回転しない多相の等価電流に置き換え,回転磁界をもつ補償器とLIMとの組み合わせモデルで有限要素法解析を行い,その総合効率を算定する手法を開発した。わが国の地下鉄で利用されているLIMに関して,まだ最適化されていない補償器定数で総合効率を算定した結果,効率は4.9-5.3%の割合で向上することが明らかになった。これは本補償器に要する寸法分を延長した単一LIMの効率よりも2-3%高い。設計を最適化することにより,さらに高い効率が期待できる。1.永久磁石回転型端効果補償器付リニア誘導モータの総合特性(1)現在のリニア地下鉄電車用の設計定数をそのまま利用する場合,本永久磁石回転型補償器を利用することにより,リニアモータ単体での効率69.5%を補償器とリニアモータを含めた総合効率で少なくとも75%に増加させることができる。(2)4極機に比べて補償器円柱の直径が約半分,断面積が4分の1の2極機で4極機とほぼ同等の端効果補償効果が得られることを明らかにした。この2極機の場合,リニア地下鉄電車用のリニア誘導モータの一次側長さ2.5mに対し,わずか0.2m長程度の補償器をリニアモータ前方に付加すればよい。(3)補償器の製作に際しては,複数個の永久磁石を配列して1磁極を形成する場合,これらの磁化方向は半径方向に厳密に磁化しないと発生磁束密度が著しく不均一になりまたその強度に大きな低下を招く。したがって,磁化に際しては細心の注意が必要であり,できるだけ一磁極をまとめて磁化することが望ましい。2.高効率を目的とした実車両用の長い車上一次型リニア誘導モータの設計
白血病細胞における転写因子GATA-2発現の役割とインターフェロンの効果

転写因子による遺伝子発現制御機構の解明は細胞分化や発癌の機構を理解する上で重要であり、特に、転写因子GATA-2は造血前駆細胞の分化や増殖に密接に関わる大切な調節因子の一つである。GATA-2遺伝子の発現制御機構を明らかにするため、マウスのGATA-2遺伝子を単離し、この遺伝子は2つの第1エキソン/プロモーターの選択により制御されていること、すなわち、近位のIG(general)プロモーターはほとんど全てのGATA-2発現細胞で機能しており、遠位のIS(specific)プロモーターは造血系細胞で用いられていることを最近報告した。本年度は,GATA-2遺伝子座で働く調節活性について、遺伝子導入マウスを用いてin vivoで検討した。導入遺伝子はISおよびIGの両プロモーターとその上流に想定される調節領域を含み、AGM(aorta-gonads-mesonephros)領域および肝原基、さらに成体骨髄の系列特異マーカー陰性細胞画分でレポーター遺伝子を特異的に発現させた。しかし、この再構成遺伝子導入によるレポーター遺伝子発現は内在性GATA-2遺伝子の発現状況の一部のみを再現するものであった。特に重要な知見は、1)ISプロモーターと6kbp上流領域のみでは、AGM領域と神経組織でのレポーター遺伝子発現は見られるが、肝原基での発現は見られないこと、2)導入遺伝子からISプロモーターの上流領域を削除すると、これによってDNアーゼI高感受性部位の1つが除かれ、レポーター遺伝子発現が完全に消失することなどである。解析の結果、造血性エンハンサー活性はISエキソンの上流3.52.5kbpの間に、神経組織性エンハンサーは0.65kbp以内に局在することが知られた。これらの結果はGATA-2遺伝子の発現が複数の異なる要素により時間的および空間的な調節を受けていることを示している。
夾雑を制御するための細胞融合デバイス開発

昨年度に引き続き、PUERシステムを使ったオスモライトによるタンパク質合成活性への影響を調べた。これは、融合細胞を作成した際、そのタンパク質合成活性などが大幅に低下する現象を明らかにし、対策するために実施している。本年度の成果として、上記以外に融合細胞の作成に関する論文と、大腸菌の巨大化による分裂能の報告を行った。PUREを用いた研究では、4種類のタンパク質に対して、ベタインとTMAOのそれぞれのオスモライトの効果を調べた。3種類のタンパク質において合成活性が向上し、1種類のタンパク質において合成速度の向上が見られた。DNAからのタンパク合成とRNAからのタンパク合成を比較することによって、これらの活性向上はタンパク質翻訳のステップを加速していることがわかった。これらのことから、オスモライトという低分子化合物でも分子夾雑効果を発揮し、タンパク質合成という細胞機能を活性化していることが示唆された。また、融合細胞の作成においては、脂質二重膜を張ったマイクロチャンバーデバイスと大腸菌プロトプラストを融合する方法を確立し、融合するプロトプラストのサイズから融合細胞内の細胞質濃度の希釈割合を求めて細胞内夾雑環境がタンパク質合成に与える影響を調べた。その結果、希釈倍率が大きいデータが多くないため断定はできないが、希釈倍率が少ない方が活性が高い可能性が示唆された。さらに、巨大化大腸菌を作成し、その巨大化の過程から体積が1000増えたあたりが内部代謝の限界であることが見られ、分裂においては400倍程度が限界であることが見いだされた。これらは、大腸菌のような単純な生命システムがどの程度の大きさまでその機能を維持できるかを示している。これらの成果はすべて論文として報告している。当初計画と異なる部分も出てきたが、これまでの成果を論文として報告できるなど計画は順調と考える。今後は、細胞内システムを単純化したPURE systemを用いて、微小空間における夾雑環境の影響や、非特異的吸着に関する影響を調査する。そのため、バルクで見いだされた条件を用いて、マイクロチャンバー内にタンパク質をコードしたDNAとPURE systemを閉じ込め、発現の確認を行う。この実験結果とバルクでの結果を比較することで、微小空間に閉じ込めることの影響を評価する。また、チャンバー内壁の修飾に関しても検討を行い、PURE systemを用いた実験で、そのタンパク質発現効率の検討を行うことで評価することで、最適な条件の探索を実施する。また、オスモライトも加えて夾雑環境を再現し、細胞レベルの微小空間内での効果を検証する。さらに、脂質二重膜作成に使う脂質の検討も実施し、浸透圧などでチャンバー内部体積を変えられる実験系の確立を目指す。これは、チャンバー内部と外部の浸透圧差による水の移動を利用して脂質二重膜を膨らませたり、へこませることでチャンバー内部の体積を変える実験系である。この実験系により、実験途中でチャンバー内部の物質濃度を変更することが可能となり、夾雑環境をリアルタイムに変更することが可能になる。また、融合細胞での実験も実施する。これまでの研究では、PURE systemなどの限られたコンポーネントで研究を進め、問題点の洗い出しを行っている。それを解決し、再度融合細胞の実験にフィードバックすることで細胞内夾雑環境を制御するデバイスの完成を目指す。できあがった融合細胞を用いて、浸透圧差を利用して融合細胞の体積を変更することで細胞内夾雑環境を変化させたときのタンパク質発現などの細胞機能に与える影響も評価する。

この実験結果とバルクでの結果を比較することで、微小空間に閉じ込めることの影響を評価する。また、チャンバー内壁の修飾に関しても検討を行い、PURE systemを用いた実験で、そのタンパク質発現効率の検討を行うことで評価することで、最適な条件の探索を実施する。また、オスモライトも加えて夾雑環境を再現し、細胞レベルの微小空間内での効果を検証する。さらに、脂質二重膜作成に使う脂質の検討も実施し、浸透圧などでチャンバー内部体積を変えられる実験系の確立を目指す。これは、チャンバー内部と外部の浸透圧差による水の移動を利用して脂質二重膜を膨らませたり、へこませることでチャンバー内部の体積を変える実験系である。この実験系により、実験途中でチャンバー内部の物質濃度を変更することが可能となり、夾雑環境をリアルタイムに変更することが可能になる。また、融合細胞での実験も実施する。これまでの研究では、PURE systemなどの限られたコンポーネントで研究を進め、問題点の洗い出しを行っている。それを解決し、再度融合細胞の実験にフィードバックすることで細胞内夾雑環境を制御するデバイスの完成を目指す。できあがった融合細胞を用いて、浸透圧差を利用して融合細胞の体積を変更することで細胞内夾雑環境を変化させたときのタンパク質発現などの細胞機能に与える影響も評価する。
ＴＬＲ３リガンドによる分泌型ＩｇＡ抗体誘導メカニズムの解明

経鼻インフルエンザワクチンにおいて、合成二本鎖RNAには、分泌型IgA抗体を誘導する高い粘膜アジュバント活性があることが知られている。インフルエンザウイルスの感染時にはウイルスゲノムがTLR7に認識されることから、TLR7リガンドも粘膜アジュバントになりうると考えた。しかしながら、TLR7リガンドの粘膜アジュバント活性は、合成二本鎖RNAの活性に満たないことが明らかになった。合成二本鎖RNAによる分泌型IgA抗体誘導機構を明らかにすることを目的として、研究を継続中である。経鼻インフルエンザワクチンにおいて、合成二本鎖RNAに高い粘膜アジュバント活性を示すことが明らかになっている。合成二本鎖RNAが示す粘膜アジュバント活性の作用機序を明らかにすることを目的としたが、当初計画していた通りの実験を進行することが出来なかった。インフルエンザウイルスの感染時にはウイルスゲノムがTLR7に認識されることから、TLR7も良い粘膜アジュバントになりうると考えられる。TLR7のリガンドとなるImiquimodには粘膜アジュバント活性が認められなかったが、今回改めてその他のTLR7リガンドに関して経鼻インフルエンザワクチンにおける粘膜アジュバント活性を検討した。この結果、Imiquimod同様に、合成二本鎖RNAと比較して高い粘膜アジュバント活性は認められなかった。合成二本鎖RNAの受容体となるTLR3を発現するCD8陽性樹状細胞の評価を行うため、脾臓に存在するCD4あるいはCD8陽性樹状細胞それぞれの単離を試みた。昨年度の検討から細胞数が非常に少ないことが明らかになっていたので、複数匹のマウス脾臓からMACSを用いて標的樹状細胞の精製を試みた。FACS解析の結果CD4陽性樹状細胞の存在は認められず単離精製できなかったが、CD8陽性樹状細胞は少ないながらも単離精製でき、合成二本鎖RNA刺激に対してIFN-λを産生することが示された。鼻腔粘膜領域に存在する細胞に対する合成二本鎖RNAの効果を明らかにする必要があるが、脾臓と異なり細胞数が少ないため標的細胞の調製法が課題として残された。今後、明らかになった課題を克服する手段を考えつつ,研究を継続したい。本研究課題において、平成24年度は主に「合成二本鎖RNA Poly(I:C)とviral dsRNAによるCD8陽性樹状細胞のTLR3を介したIFN λ産生の比較検討」を行うことを計画した。マウスの骨髄細胞をFlt3-ligand存在下で培養すると、試験管内においてCD8陽性ならびに陰性の樹状細胞および形質細胞様樹状細胞(pDC)を誘導することが可能であるとの文献をもとに、CD8陽性樹状細胞の誘導を試みた。Flt3-ligandによる誘導ではCD8陽性樹状細胞の誘導効率が低いことが明らかとなり、当初計画した実験は諦めざるを得ない結果となった。そこで、マウスの臓器からCD8陽性樹状細胞を精製し、試験管内で合成二本鎖RNA刺激による応答を検討することに予定を変更した。本研究で標的とするのは、上気道領域に存在するCD8陽性樹状細胞ではあるが、鼻腔粘膜領域、鼻咽頭粘膜関連リンパ組織(NALT)、頸部リンパ節あるいは脾臓におけるCD8陽性樹状細胞の存在比率を、文献等をもとに単離・精製法と共に検討した。この結果、ナイーブなマウスでは脾臓においてCD8陽性の樹状細胞が少ないながらも存在することが明らかになった。現在、脾臓から単離・精製したCD8陽性樹状細胞に関して、試験管内においてTLR3のリガンドである合成二本鎖RNA、TLR7やTLR9のリガンド、インフルエンザウイルスによる1型IFN(IFN-α、β、λ)の発現・産生を解析中である。当初、参考文献をもとに骨髄細胞から樹状細胞の誘導を行うことで、試験管内でのCD8陽性樹状細胞を用いた解析が可能なものと考えていた。しかしながら、CD8陽性樹状細胞の誘導効率は実際には低いことが判明した。これに伴い、マウス骨髄細胞に対するFlt3-ligandの添加量あるいは誘導時間等の検討、もう一つの樹状細胞誘導サイトカインであるGM-CSFの添加によるCD8陽性樹状細胞の誘導効率の検討を行った。また、ナイーブマウスの各組織からCD8陽性樹状細胞を直接単離・精製する手段を検討した。上述の理由により、当初計画した計画から大きく遅れることとなった。平成25年度は、ナイーブマウスの脾臓から単離・精製したCD8陽性樹状細胞を用いて、試験管内でTLR3のリガンドである合成二本鎖RNA刺激、あるいはインフルエンザウイルス添加によるIFN-λをはじめとする1型IFN応答を解析する(現在進行中)。さらに、BALB/cマウスおよびBALB/cバックグラウンドTLR3 KOマウスを用いて、Poly(I:C)を粘膜アジュバントとした経鼻インフルエンザワクチン接種ならびにインフルエンザウイルス上気道感染実験を行う。

この実験において、平成24年度の検討により確立・習得した各組織における樹状細胞の解析法を用いて、経鼻ワクチン接種あるいは感染による各樹状細胞サブセットの割合の変動を解析すると同時に、in vivoでのIFN-λをはじめとする1型IFN応答を検討する。また、上気道粘膜上皮自体がIFN-λの産生源となることを示唆する論文が発表されたため、マウス上気道粘膜上皮細胞の初代培養系を導入することで、粘膜上皮細胞による合成二本鎖RNA刺激(経鼻ワクチン接種)あるいはインフルエンザウイルス添加によるIFN-λ等サイトカインの産生能を解析する。上述の実験から得られる結果は、合成二本鎖RNAを粘膜アジュバントとする経鼻インフルエンザワクチン接種による分泌型IgA抗体の誘導機構を明らかにする知見となり得ると考える。上述の実験において必要となる、マウスの購入(KOマウスに関しては、繁殖・維持費用を含む)、CD8陽性樹状細胞を精製するための試薬、フローサイトメーターに用いる抗体各種、1型IFNを含む各種サイトカイン定量用のELISAキット等を購入のために使用する予定である。さらに、平成25年度に新たに導入する予定であるマウス上気道粘膜上皮細胞の初代培養に必要な培地ならびに試薬等を購入する予定である。
サクセスフル・エイジングとシチズンシップの観点からみた「農」のあり方に関する研究

本研究は,都市における「農」を活かしたライフスタイルのあり方やそれを支えるアクターの役割について考察することを目的とした。名古屋大都市圏の中心都市(名古屋市・岐阜市・豊橋市)では,食や農に係るアクターは多様であり,様々な実践やそこから派生した活動により,ファーマーズマーケットや直売所,観光農園,アンテナショップなどは新たな役割を果たすようになっていた。また,それは,生産者や消費者に対して,地域課題の解消や解決に向けて主体的に活動する「市民」としての意識を高めることを促し,そのことが,都市における農業の存続や「食」に関連する諸活動の社会的な意義を高めていることが明らかとなった。平成26年度は,主に岐阜市を事例に現地調査を進めた.まず,岐阜市健康ふれあい農園を取り上げ,その利用実績について調査を行った.また,JAぎふ長良支店で行っているブドウの援農プロジェクト参加者の意識について調査を実施した.両結果から,市民の「農」に対するニーズは一定程度,存在しており,市民農園や直売所などの利用は増加基調にあることがわかった.その他,学生と市民が企画・実践したブドウを利用した集客イベントについても実態把握を行った.一方,担い手である生産者への調査も併せて実施した.市内の花きやブドウ,イチゴを栽培する農家・農業機関に対し,聞き取りを行い,市街化区域内に農地の多い岐阜市において生産者の抱える営農環境悪化の影響や周辺住民との関係性について把握した.さらに,名古屋大都市圏における都市農業の実態を把握するための基礎作業として,農業や観光・レクリエーション等に係る各種統計を用いて東海3県の市町村別の農業・農村地域の特性を分析・整理した.以上の結果,都市住民のなかでも,農作業や土に触れることに興味を示す市民層と新鮮で安全・安心な農産物を手に入れたいといった食(収穫物)にのみ関心を示す層,食や農に積極的に関わりをもつ市民層,無関心層といったように,いくつかのタイプが存在し,今後は宣伝・広報の方法や参加可能な企画の内容にバリエーションをもたせるといった工夫を行い,多様な市民層を巻き込む活動や意識付けの充実が必要なことが伺えた.こうした実態を把握することは.都市における「食と農の乖離」を緩和するといった,実践的な効果を考えるという意味でも重要であり,また,多様な価値観をもつ住民の集まる都市における「農」のあり方やそれを支える市民の役割を考察していくための基盤になる作業でもあり,そこに研究上の意義があると考える.平成27年度は,名古屋市と岐阜市を対象に調査を行った.まず,名古屋市栄の商業・交通ターミナル「オアシス21」内に店舗を構える岐阜県アンテナショップ「g.i. Foods」における野菜市の取り組みについて運営側と消費者の双方に対し,聞き取り調査を行った。さらに,岐阜市内の朝市や夜間市場に参加する生産者,直売所・観光農園を経営する生産者,市農林部・岐阜県庁へのインタビューとJAぎふ長良支店管内のブドウ栽培農家を対象にアンケート調査を実施した.前者の調査では,名古屋の都心に岐阜県のアンテナショップがあることの意味として,愛知県内の住民に岐阜の情報や特産物を発信し,認識してもらうことに加え,岐阜県で生まれ育ち,進学・就職・結婚を機に愛知県内に転出した元岐阜県民に対し,具体的な商品を通じて「ふるさと」を想起してもらうといった効果を有している側面がみられた.後者の調査では,朝市や夜間市場を利用する都市部の住民の高いニーズと評価の存在が明らかとなった.また,ブドウ狩りの観光農園・直売所に対する調査では,ブドウを活かしたアグリ・ツーリズムの集客圏は主に岐阜市およびその周辺(県境を跨いで一宮・名古屋までのエリア)の消費者や観光レクリエーション需要によって成立していること,そのニーズは衰えることなく,安定基調もしくは幾分,需要過多の状態にあることから,担い手の不足・生産者の高齢化といった当該地域の農業の抱える現実と正反対の状況にあることがわかった.都市の「農」に携わる担い手や活動の場は多様であり,上記のような現地調査を重ねるなかで,生産者や消費者(市民)の食や農への関わり合いや意識の一端を理解することができた点は,都市における農のあり方を考察する際に不可欠な作業であり,最終年(平成28年度)に向けて有用な資料やデータを入手・作成することができたと考えている.今年度は,現地調査(聞き取り・アンケート調査)を積極的に行うとともに,資料・データの収集に努めた。また,学会発表や本研究の成果を含む論文等を執筆した。1年目(平成26年度)に調査を十分に行うことの出来なかった地産地消に関わる店舗や都市内部の消費者への聞き取り調査の充実を図ることができたものの,そちらに力点を置きすぎたため,「農」的な活動に積極的に参加する高齢者への調査を十分に行うことが出来なかった。この点は,最終年である次年度(平成28年度)の早い段階で調査を進めていくつもりである。平成28年度は,名古屋大都市圏の中核市(岐阜市と豊橋市)において現地調査を行うとともに,まとめの作業を行った。まず,岐阜市では市街地において開催されているファーマーズマーケットに着目し,運営側と来訪者への聞き取り・アンケート調査を行った。その結果,朝市は生産者と消費者の交流のみならず,生産者や消費者同士の繋がりを深化させる機能を有していることがわかった。また,朝市は周辺住民(主に高齢な交通弱者)の食を支えるという役割を担っていることも明らかとなった。こうした生産者による,地域の課題解決に資する市民的な活動は,ファーマーズマーケットの極めて現代的な役割の一端を示しているといえる。

また,豊橋市の調査では,東三河最大の産直施設(JAあぐりパーク食彩村)を対象に聞き取り調査と資料・データ収集を行った。食彩村は地産地消の推進・管内生産者の出荷先として重要な位置を占めており,日常的に食彩村を利用する近隣住民にとってはスーパーのような位置付けになりつつあることが明らかとなった。他方,開店前から並ぶような市外からの訪問者も多く,こうした利用者の存在は,高い知名度と集客力を有する直売施設としての性格を併せもっていることを示している。その他にも全国各地の直売所との連携(農産物・加工品の供給・調達)も行っており,食彩村はきわめて多様な役割を担っていることも明らかとなった。3年間の調査・研究を通じ,都市における食や農の担い手は多様であり,ファーマーズマーケットや直売所,観光農園,アンテナショップなどは,食や農にまつわる様々な機能や役割を果たしていた。また,それは,生産者や消費者に対して,地域課題の解消や解決に向けて主体的に活動する「市民」としての意識を高めることを促し,そのことが,都市における農業の存続や「食」に関連する諸活動の社会的な意義を高めていることが明らかとなった。本研究は,都市における「農」を活かしたライフスタイルのあり方やそれを支えるアクターの役割について考察することを目的とした。名古屋大都市圏の中心都市(名古屋市・岐阜市・豊橋市)では,食や農に係るアクターは多様であり,様々な実践やそこから派生した活動により,ファーマーズマーケットや直売所,観光農園,アンテナショップなどは新たな役割を果たすようになっていた。現地調査・資料収集と並行して,学会発表や関連する内容を含む論文の執筆を行うことができた.ただし,調査内容について,消費者や地産地消に関わる店舗への調査は不十分となってしまった.この点は次年度に補足したいと考えている.次年度は,当該研究の最終年度となる.このため,1・2年目に調査した内容の分析・考察を深めていくとともに,2年目の研究において調査の進んでいない,都心に居住し「農」的な活動に参加する高齢者の実態や意識についても調査を進め,シチズンシップやサクセスフル・エイジングといった観点から,都市の農のあり方を整理し,まとめていきたいと考えている.人文地理学
DNA複製起点の無い超好熱性アーキアの生命維持機構解明

本研究主題はoriCやorc1/cdc6遺伝子欠損の超好熱性アーキアのDNAが複製するための分子機構を解明する。太古の地球は高熱嫌気環境であったこと、知られている超好熱性生物のほとんどがアーキアであること、遺伝子の分子進化系統解析から超好熱性アーキアがもっとも生命の起源近くに位置することから、超好熱性アーキアの生命維持機構には、地球上の多くの生物が獲得してきた機能の原始的なものが残っている可能性が高い。遺伝情報が正しく親細胞から娘細胞へ引き継がれるために、oriCやイニシエータの無い超好熱性アーキアがどのような制御機構を有しているかを解明することによって分子生物学の新たなパラダイムを提供する。
イオン周囲のミクロ環境制御による高機能イオン会合試薬の設計・合成と分析化学的応用

水溶液内の疎水構造型イオン会合の普遍的重要性に着目し,イオンの周りのミクロ環境及び水構造制御による高機能発現を活用した高機能イオン会合試薬の設計・合成・開発を行った。これらの合成試薬を用いる新しい分離法,分析法を開発した。更に,申請者の提唱した水溶液内イオン会合論の実証的研究を進めた。1.イオン周囲のミクロ環境を制御した新規イオン会合試薬の設計と合成:イオン会合性,ソルバトクロミズム発現,水への溶解性,イオン会合体の疎水性場への親和性等,分離・分析上重要な機能を備えた試薬として,メチルオレンジ系長鎖アルキルアミノ誘導体,トリフェニルメタン系誘導体,アルキルアミノフェニルアゾアニリニウムイオン及びシアニン系陽イオン等の誘導体を合成・開発した。アルキル基のメチレン基数を増すにつれて,有機陽イオンと有機陰イオンのイオン会合性は増大し,新イオン会合論を裏付ける結果を得た。また,アルキル基が長くなるにつれて,陽イオン色素の発色団の近傍におけるミクロ環境が親水性から疎水性に変わり,ソルバトクロミズムが発現し,吸収波長のシフトが起こった。本ソルバトクロミズム現象を利用することにより,10^<-7>Mオーダーの陰イオン界面活性剤の水溶液一層系での吸光光度定量等が可能となった.更に,イオン会合体の疎水性場への分配特性も大幅に向上し,新規開発のイオン会合試薬の分離・分析試薬としての有用性が実証された。2.イオンの周りのミクロ環境と水構造の相関研究:キャピラリー電気泳動法による精密イオン移動度測定法を開発し,電荷,イオン半径の異なる各種無機,有機イオンのストークス半径及び比較的弱いイオン会合定数を正確に求めることに成功した。これらの結果から,イオン周囲の水構造を推定することに成功した。ストークス半径とイオン会合性(イオン会合定数)における良好な相関も発見した。これらの結果は,新イオン会合論を直接的に支持するもので,新しい分離・分析試薬開発の大きな指針となった。3.高感度分析法の開発:染料陽イオンとのイオン会合に基づくリン,ケイ素の高感度定量法の開発に成功し,超純水分析へ応用した。キャピラリー電気泳動法によるアルキルアミン類の誘導体化/分離・定量にも成功した。「イオンの回りのミクロ環境及び水構造制御による高機能発現」を活用した「高機能イオン会合性試薬の設計・合成と新規合成試薬を用いる分離・分析法の開発」を目的に研究した.1.イオン会合試薬周囲の親水性・疎水性・電子密度のコンピューター評価と試薬設計:モデルイオン会合試薬について,イオン回りの電子密度,電荷密度の計算,それらの結果に基づく溶媒和の予測とイオン移動度の相関に関する情報を初めて得た.2.イオン周囲のミクロ環境制御型イオン会合試薬の設計・合成:イオンの回りの電子密度・電荷密度の計算結果に基づき,イオン会合に及ぼす疎水性相互作用とソルバトクロミズム発現の両機能を有する試薬として,陽イオン性のフェニルアゾジアルキルアニリン系試薬の合成に成功し、疎水性陰イオンとイオン会合し,可視部に鋭敏な発色を示すことを確認した.3.精密移動度測定によるイオンのストークス半径,疎水性尺度,置換基寄与の決定:

精密電気泳動移動度測定により求めたイオン移動度を用いてこれらの値を決定した.得られた値から計算結果を評価し,より精密な試薬設計・合成指針にフィードバックし,新たな試薬の設計・合成に活用した.4.HPLC及び電気クロマトグラフイーによるイオン会合反応解析法の開発:UV吸収を示さないイオンのイオン会合反応解析法を新たに開発し,イオン会合定数,イオンの回りの水構造,イオン会合体の回りの水構造に関する新しい知見を得た.これらめ知見は,今後の高機能試薬設計指針に活用できる.水溶液内の疎水構造型イオン会合の普遍的重要性に着目し,イオンの周りのミクロ環境及び水構造制御による高機能発現を活用した高機能イオン会合試薬の設計と合成を行い,合成試薬を用いる新しい分離法,分析法を開発することを目的に研究を進めた。更に,研究者の提唱した新イオン会合論の実証的研究を進めた。1.イオンの周りのミクロ環境を制御した新規イオン会合試薬の合成:イオン会合性,ソルバトクロミズム発現,水への溶解性,イオン会合体の疎水性場への親和性等の分離・分析上重要な機能を備えた試薬として,4-(N',N'-ジアルキルアミノメチルフェニルアゾ)-N,N-ジアルキルアミノベンゼンの誘導体を合成した。アルキル基のメチレン基数を増すにつれて,プロトン付加体と有機陰イオンLS^-との反応性は増大し,新イオン会合論からの予測と一致した。また,アルキル基が長くなるにつれて,イオン会合体のアゾ基の周りのミクロ環境が親水性から疎水性に変わり,ソルバトクロミズムが発現し,アゾ化合物の吸収が短波長シフトした。イオン会合体の疎水性場への分配特性も大幅に向上し,分離・分析試薬としての有用性が実証された。2.イオンの周りのミクロ環境と水構造の相関研究:キャピラリー電気泳動法によるイオンの移動度測定の結果から,各種の無機・有機イオンのストークス半径を求め,イオン周囲の水構造を推定する新しい手法を開発し,水構造及びストークス半径とイオン会合性(イオン会合定数)における良好な相関を発見した。これらの結果は,新イオン会合論を直接的に支持するもので,新しい分離・分析試薬開発の大きな指針となった。3.イオン会合論に基づくCE分離分析法,FIA分析法を開発した。水溶液内の疎水構造型イオン会合の普遍的重要性に着目し,イオンの周りのミクロ環境及び水構造制御による高機能発現を活用した高機能イオン会合試薬の設計と合成を行った。これらの合成試薬を用いる新しい分離法,分析法を開発した。更に,申請者の提唱した水溶液内イオン会合論の実証的研究を進めた。1.イオン周囲のミクロ環境を制御した新規イオン会合試薬の設計と合成:イオン会合性,ソルバトクロミズム発現,水への溶解性,イオン会合体の疎水性場への親和性等の分離・分析上重要な機能を備えた試薬として,アルキルアミノフェニルアゾアニリニウムイオン及びシアニン系陽イオンの誘導体を合成した。アルキル基のメチレン基数を増すにつれて,これら陽イオンと有機陰イオンのアルキルベンゼンスルフォネートイオン(ABS^-)との反応性は増大し,新イオン会合論を裏付ける結果を得た。また,アルキル基が長くなるにつれて,陽イオン色素の発色団の近傍におけるミクロ環境が親水性から疎水性に変わり,ソルバトクロミズムが発現し,吸収波長のシフトが起こった。
矯正力負荷は破骨細胞前駆細胞のオートファジーを誘導するか？

矯正力が誘導する骨改造において、破骨細胞は中心的役割を担うが、誘導機構の詳細は不明である。我々は破骨細胞の誘導研究において、破骨細胞への分化が決定した前駆細胞(quiescent osteoclast precursors, qOP)を同定した(J Cell Biol, 2008)。本研究では、矯正力によるqOPのAutophagy誘導機構を解明する。Autophagyはプロテアソーム系と並ぶ細胞内の主要分解系で、細胞の恒常性維持に重要な役割を担っている。近年、細胞の分化、活性の過程においてAutophagyが関与することが報告されている。しかし、破骨細胞分化過程においてAutophagyがどのような役割を担っているかについてはいまだ不明な点が多い。そこで我々は破骨細胞分化におけるAutophagyの役割について解析をおこなった。昨年までの解析により、Autophagy関連遺伝子Beclin 1の発現もRANKL刺激により上昇した。またBeclin 1の過剰発現は破骨細胞分化を亢進した。さらに、RANKL刺激によるBeclin 1の発現誘導メカニズムの解析を行った結果、1RANKL刺激によりBeclin 1へのubiqutinチェーンの結合が増加、2Beclin 1へのubiqutinチェーンの結合はTRAF6を介するメカニズムであることが考えられた。平成30年度はBeclin 1を破骨細胞特異的にノックアウトしたコンディショナルノックアウトマウスが完成し、解析を行った。破骨細胞分化に影響はみられなかったが、皮質骨の肥厚が認められ骨形成に影響を及ぼしていることが示唆された。これらのことより、RANKLにより刺激されたAutophagyの活性化は、破骨細胞の分化誘導因子の一つであることが示唆された。矯正力が誘導する骨改造において、破骨細胞は中心的役割を担うが、破骨細胞の誘導機構の詳細は不明である。我々は破骨細胞の誘導研究において、破骨細胞への分化が決定した前駆細胞(quiescent osteoclast precursors, qOP)を同定した(J Cell Biol 184: 541, 2009)。本研究は、矯正力によるqOPのオートファジー誘導機構を解明する。Autophagyは細胞成分を代謝する主要分解機構であり、細胞の恒常性維持において重要な役割を担っている。破骨細胞においても、Autophagy関連遺伝子が欠損することで破骨細胞の骨吸収機能不全が起こることが明らかになった。1野生型マウス由来の骨髄マクロファージ(M)へのRANKL刺激は、オートファゴソームの主要成分の一つであるLC3Bの発現を増加させた。2Autophagy活性の初期段階に必要とされるBeclin 1の発現についても解析したところ、RANKL刺激によりその発現が上昇した。さらにMの細胞株であるRaw264.7細胞にBeclin 1を過剰発現させ、破骨細胞分化能について調べた結果、通常の細胞と比較し破骨細胞数は増加した。これまでの結果より、RANKL刺激によるAutophagyの活性化は、Beclin 1により生じることが示唆された。破骨細胞分化におけるAutophagyの役割について解析をおこなった結果、in vitroにおいて、オートファゴソームの主要成分の一つであるLC3Bの発現をWestern Blottingにて解析をおこない経時的に発現量が増加していることを確認できた。マクロファージの細胞株であるRaw264.7細胞にGFP-LC3Bベクターをインフェクションし、コンフォーカル顕微鏡を用い細胞内のLC3Bの発現を観察したところ、RANKL添加によりGFP陽性のLC3Bの発現上昇が確認できた。次に、Autophagy活性の初期段階に必要とされるBeclin 1の発現についてもin vitro解析をおこなったところ、RANKL刺激によりその発現が上昇していた。そのため、Raw264.7細胞にBeclin 1を過剰発現させ、破骨細胞分化能の解析をおこなった結果、コントロール細胞と比較し破骨細胞数は増加していることを確認した。これら骨髄マクロファージおよび細胞株Raw264.7細胞を用いたin vitro解析はおおむね順調に進展していると考える。昨年までの解析により、野生型マウス由来の骨髄マクロファージ(M)へのRANKL刺激は、オートファゴソームの主要成分LC3Bの発現を増加させた。さらにAutophagy関連遺伝子Beclin 1の発現もRANKL刺激により上昇した。

またBeclin 1の過剰発現は破骨細胞分化を亢進した。本年度は新たに、RANKL刺激によるBeclin1の発現誘導メカニズムの解析を行った結果、1RANKL刺激によりBeclin1へのubiqutinチェーンの結合が増加、2Beclin1へのubiqutinチェーンの結合はTRAF6を介するメカニズムであることが考えられた。これまでの結果より、RANKL刺激によるAutophagyの活性化は、Beclin 1により生じることが示唆された。破骨細胞分化におけるAutophagyの役割について解析をおこなった結果、in vitroにおいて、オートファゴソームの主要成分の一つであるLC3Bの発現をWestern Blottingにて解析をおこない経時的に発現量が増加していることを確認できた。マクロファージの細胞株であるRaw264.7細胞にGFP-LC3Bベクターをインフェクションし、コンフォーカル顕微鏡を用い細胞内のLC3Bの発現を観察したところ、RANKL添加によりGFP陽性のLC3Bの発現上昇が確認できた。次に、Autophagy活性の初期段階に必要とされるBeclin 1の発現についてもin vitro解析をおこなったところ、RANKL刺激によりその発現が上昇していた。そのため、Raw264.7細胞にBeclin 1を過剰発現させ、破骨細胞分化能の解析をおこなった結果、コントロール細胞と比較し破骨細胞数は増加していることを確認した。さらに、RANKL刺激によるBeclin 1の発現上昇のメカニズムについての解析をおこなった。LPS-TLR4シグナルによって、TRAF6が活性化することでBeclin1へUbiquitinチェーンが結合しAutophagyが活性化されることが報告されていることから(Shi C et al Science Signaling, 3, 42 2010)、RANK-RANKLシグナルによっても同様な現象が起こる可能性があると考え、RANKL刺激によるBeclin 1へのUbiquitinチェーンの結合の有無を解析した。その結果、RANKL刺激によりBeclin1へのubiqutinチェーンの結合が増加したことを確認した。これらのことより、骨髄マクロファージおよび細胞株Raw264.7細胞を用いたin vitro解析はおおむね順調に進展していると考える。矯正力が誘導する骨改造において、破骨細胞は中心的役割を担うが、誘導機構の詳細は不明である。我々は破骨細胞の誘導研究において、破骨細胞への分化が決定した前駆細胞(quiescent osteoclast precursors, qOP)を同定した(J Cell Biol, 2008)。本研究では、矯正力によるqOPのAutophagy誘導機構を解明する。