hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス生体内における肝臓細胞からインスリン産生細胞への転換法の確立

本年度の目的のひとつであった、「肝細胞に導入する遺伝子の組み合わせの探索」を行い、Ad-PDAに加えて新たに導入するべき転写因子Xを候補として同定した。現在、このアデノウイルスベクターを作製、導入し、インスリン産生細胞への転換効率の検討中である。また、もうひとつの目的であった「MafA、MafB遺伝子の膵内分泌細胞における機能解析」についても、昨年度に引き続き解析が進んでいる。さらに、アデノウイルス特異的Pdx-1,NeuroD,MafAノックインマウスの作製が新たに加わり、今後これらを解析することで、3遺伝子のインスリン産生細胞転換効率について詳細な知見が得られると期待できる。よって、課題はおおむね順調に進展していると考えている。本研究では糖尿病に対するβ細胞補充療法確立のため、in vivoにおいて肝細胞をインスリン産生細胞へ直接分化誘導するために導入すべきβ細胞関連転写因子の検討を目的とした。肝細胞をインスリン産生細胞へ転換することが報告されているPdx-1,NeuroD,MafAの3遺伝子を、均一かつ効率的に肝細胞へ導入するため、これら3遺伝子をコードするポリシストロニックアデノウイルスベクター(Ad-PDA)を作製した。昨年度、このAd-PDAを導入したマウス肝細胞を用いてin silico解析を行い、新たに加える因子として転写因子Xを同定した。今年度、転写因子Xのインスリン産生の増強効果を確認するため、転写因子Xのアデノウイルスベクター(Ad-X)を作製し、Ad-PDAと組み合わせてマウスに導入して解析を行なった。その結果、Ins1-Lucマウスを用いたインスリンの転写活性の誘導で、明らかな増強効果が認められた。今後グルコース応答性が確認できれば、β細胞として使用できる可能性に大きく近づくと期待される。また、Ad-PDAにより3遺伝子の肝細胞への導入効率は上がったが、インスリン産生細胞への転換は不完全であった。この要因のひとつとして、アデノウイルスによる遺伝子導入が一過性であることが考えられた。そこで3遺伝子を肝細胞で持続的に発現させた際のインスリン産生細胞の転換について解析するため、Creにより誘導的にPdx-1,NeuroD,MafA,tdDsRedを生体内組織で発現できるノックインマウスの作製を行った。2つのTgマウスラインを樹立し、それぞれ全身でCreを発現するマウスと交配することで3因子を活性化させたが、インスリンタンパク質の発現は確認できなかった。それぞれのマウスラインでは、肝臓での発現は弱かったため、肝臓での発現を増強するため、アルブミンプロモーターの利用を検討したい。本年度の目的のひとつであった、「肝細胞に導入する遺伝子の組み合わせの探索」のために必要である、Pdx1, Neurod, Mafaの3遺伝子をコードするポリシストロニックアデノウイルスベクター、Ad-PDAの作製に成功した。
ミクロゲルを要素とする新規ポリマーアロイの構築に関する基礎的研究

本研究は、ポリマーミクロゲルをもとにして新しい集積材、ポリマーアロイを調製することを主目的とした。このため、まづ基礎的知見を得るための一連の研究を行なった。研究は次の各方法によって実施した。1:4-ビニルピリジンを主成分とする新規ミクロゲルの調製.2:ミクロゲル集合体の構造解析法の研立、3:ミクロゲル混合系において規則的配列構造が発現する条件をコンピューターシミュレーションによって整理すること。以上のような目的、方法によって、以下要約する結果が得られた。1:反応性高分子界面活性材を用いる乳化重合、およびペレポリマーの橋かけ反応によって、従来調製が不可能であった4-ビニルピリジン系ミクロゲル(直径20800nm)を得ることができた。2:走査型電子顕微鏡によって試料の同一場所を角度を変えて観測し、画像を解析することによりミクロゲルの配列を知り集合体の構造を明らかにする方法を開発した。3:4-ビニルピリジンを主成分とするミクロゲルと、表面に水酸基を有するスチレン系ミクロゲルの混合系において、Laves相Mg Cu_2型とNaCl型結晶構造が発現すること、この構造は粒径比によってほぼ決定されることを見出した。特に前者においては、適切な割合で混合すると結晶相が90%以上に達することが判った。さらに、実験とコンピューターシミュレーションの結果との対比から、近距離において異種間に引力が仂く系で規則的な構造が発現し易い結論が得られた。またこれらの構造を、化学的な方法で固定できることを見出した。1.高分子ミクロゲルの合成方法について高分子電解質の橋かけによってミクロゲルが合成できることを発見し,通常はマクロゲル化する濃度において,ポリ(4ービニルピリジン),ポリ(ビニルベンゼンスルホン酸)他を成分とするミクロゲルを合成することに成功した。マクロゲルが生成しない原因は,橋かけ体間の荷電による斥力に起因すると仮定し,生成するミクロゲルの粒径分布が非常に狹くなる事実を合理的に説明した。2.均一なミクロゲルの配列について同一の試料について,走査型電子顕微鏡写眞を角度をかえて撮影し,この写眞から各粒子の座標を算出し,さらに最隣接三粒子のなす角度を決定する方法を案出した。この方法を用いて,スチレン,4ービニルピリジン,メチルメタクリレ-トを主成分とするミクロゲル粒子がどのような配列をしているか決定した。その結果,粒子は面心立方の配列構造をとり,コロイド溶液において認められる体心立方構造は見出されないとの結論に達した。さらにミクロゲル配列体の粒子間の橋かけ反応について検討し,これらの粒子間の空隙を残したまま,あるいは閉塞させて橋かけする条件を見出した。3.ミクロゲル二成分系の粒子配列について二つの成分が相分離しないための混合条件を調べ,さらに均一に混合した系については各々の粒子種がどのように配列しているか検討した結果,混合の均一性には粒子表面の特性が最も強く影響すること,成分の異なる粒子の混合系においてすら各粒子はある程度規則的な配列をしていて,完全にはランダムな配列をしていないなど,重要な結果を得た。本研究は、ポリマーミクロゲルをもとにして新しい集積材,ポリマーアロイを調製することを主目的とした。このためまづ基礎的知見を得る一連の研究を行なった。1:4-ビニルピリジンを主成分とする新規ミクロゲルの調製。2:ミクロゲル集合体の構造解析法の確立。3:ミクロゲル混合系において規則的配列構造が発現する条件をコンピュータシミュレーションによって整理すること。以上のような目的,方法によって以下に要約する結果が得られた。1:反応性ポリマー界面活性剤を用いる乳化重合,およびプレポリマーの橋かけによって從来調製が不可能であった4-ビニルピリジン系ミクロゲル(直径20800nm)得ることができた。2:走査型電子顕微鏡によって試料の同一場所を角度を変えて観測し画像解析することによってミクロゲルの配列を知り構造を明らかにする方法を開発した。

3:4-ビニルピリジンを主成分とするミクロゲルと,表面に水酸基を有するスチレン系ミクロゲルの混合系において,Laves,相MgCu_2型およびNaCl型結晶構造が発現すること,この構造は粒径比によってほぼ決定されることを見出した。特に前者においては適切な割合で混合すると結晶相が90%以上に達することが判った。さらに実験とコンピューターシミュレーション結果の対比から,近距離において異種間に引力が働く系で規則的な構造が発現し易い結論を得た。またこれらの構造は化学的な方法によって固定できることを見出した。
芸術としての文学の思想性・社会性・政治性

今年度は研究成果を発表する機会に恵まれなかった。研究内容は昨年度からの継続であるが、いくつかの方向修正があった。そのなかでも大きなものとして、極端な科学志向が薄れてきたことが挙げられる。わたしのこれまでの立場は、「文学の科学」たる文芸学を重視する立場、誤解を恐れず言い換えれば文学理論を徹底して重視する立場であった。その際、主に二つの視点を取り入れてきた。つまり、一方でマルクス主義的な唯物論に基づく文学についての社会学的研究であり、他方で古典詩学の流れを引き継ぐ文学についての言語学的研究である。前者については主としてサルトルなどフランスの思想家、さらにはイーグルトンなどイギリスの思想家の論考に頼ってきた。後者についてはプラトンやアリストテレスの詩論を踏まえたうえで、ヤコブソンやバルトなど現代の思想家に眼を配ってきた。しかしながら、同じように文学といっても、それぞれの思想家が念頭においている文学概念に関しての相違が大きく、同じ枠組みのなかでとらえることがむずかしくなってきた。現代の思想家の議論を概観し、それを古代ギリシア・ローマの哲学者の議論を引き合いに出しながら補強するというスタイルに、ほころびが目立っようになってきたのである。そこで現在は、理論偏重からの脱却を図るべく、先に挙げた二つの視点のうちの前者を棚上げし、古典期の詩学から現代の言語学的文学研究へと至る流れを考察している。さらに、古代の誌面比較論に端を発する芸術ジャンル論に焦点を絞っている。その際、文学をその表現媒体たる言語によってのみ特徴づけるのではなく、表現される内容をも見るようにしている。つまり、文学とはなにを表現するものであるかという議論を歴史的にたどっているのである。こうしたアプローチこそが、研究課題たる「芸術としての文学の思想性・社会性・政治性」の解明に最も有効であろうという認識に達した。昨年度におこなった口頭発表を整理し、広島芸術学会の年報『藝術研究』第15号に「文学の意味と文学の価値」を発表した。そこでは、文学の意味と文学の価値との関係を、文学作品の一義性(わかりやすさ)と多義性(わかりにくさ)という二面性に基づいて、「意味に同調する価値」および「意味に反発する価値」という新しい独自の観点から考察した。「意味に同調する価値」については主として文学作品の実用的価値(教導的価値・娯楽的価値など)の問題を扱い、「意味に反発する価値」については詩的言語の美的価値の問題を扱った。その際、ホラティウスやサルトルの言説を手がかりにした。また、文学ジャンル間での比較と芸術ジャンル間での比較とをまじえて、これらの問題を論じることになった。どちらもともに大きな概念である意味と価値との関係を論じつくすことはできないにしても、両概念の考察のための新たな枠組みを提示したという点で、今後につながる研究となったように思われる。とはいえ、こうした文学の中心的概念を純粋に科学的に説明しようとすることには限界があることを痛感させられた。われわれが拠って立つ文芸学とは、言うまでもなく、文学の科学であるが、科学だからといってかならずしも概念操作のみに終始しなければならないわけではない。研究課題たる「芸術としての文学の思想性・社会性・政治性」の追求のためには、文学作品の個別性にも配慮した文学ジャンル論こそが有効であろうという認識に達した。
バイオフィルム形成に伴う歯周病原因子の遺伝子発現制御

<バイオフィルム(BF)形成過程の観察> Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa)の野生株では,表面への付着初期では多数の線毛産生が観察されるが,成熟バイオフィルムでは線毛産生が抑制され,菌と菌が密に接着している様子(自己凝集)が観察された。菌体表面には多糖様構造物も観察された。BF形成に伴うミクロな環境変化に応答して,菌体表層物質の産生調節が起こることが示唆された。<BF形成と色素結合性> BF形成株ではコンゴレッド色素に対する結合性を示したが,非形成株では示さなかった。線毛遺伝子破壊株でもこの結合性は保持されており,色素結合性は線毛以外のBF形成因子の存在を示すものと考えられた。この色素結合性は,過ヨウ素酸処理により消失したことから菌体表層多糖の合成を反映していると推察された。ゲノム遺伝子解析から,コンゴレッド結合性多糖合成遺伝子クラスターのホモログが本菌に存在することがわかり,その中の一つの遺伝子破壊株を作製したが,BF形成への明らかな影響は検出できなかった。この遺伝子クラスターとBF形成との関係について,より詳細な検討が必要である。<自己凝集アッセイ>菌体表層多糖と自己凝集との関連性を検討した。過ヨウ素酸処理,DNA分解酵素処理で自己凝集が完全に抑制されたことから,自己凝集には菌体表層の多糖に加え,DNAも関与することが示された。<白血球毒素産生の調節> BF形成と毒素産生へのカタボライト抑制調節タンパク質Crpの影響を調べるために,crp遺伝子破壊株の作製を試みたが分離できなかった。Aaではcrpが必須遺伝子である可能性が示唆された。また,毒素産生は酸性pHにより促進されることから,BF形成過程における局所pHの低下は毒素産生増加に働くことが示唆された。1)線毛以外のバイオフィルム形成因子:Actinobacillusactinomycetenmomitansの線毛はバイオフィルム形成因子であるが,線毛構成タンパク質遺伝子の破壊株(DF株)でも,付着凝集性は低下するもののバイオフィルム形成能を保持している。今回,DF株バイオフィルムは過ヨウ素酸やDNA分解酵素処理により分解するが,プロテアーゼ処理では分解しないことを見出し,菌体表層に存在する糖やDNAがバイオフィルム形成因子である可能性を示した。また,線毛の有無に関わらず,バイオフィルム形成株ではCongo red色素によりコロニーが赤色に染まるが,バイオフィルム非形成変異株のコロニーは白色を示した。他の細菌ではCongo redはN-アセチルグルコサミンからなる菌体表層多糖を染めるという報告があり,本菌でも類似の多糖の存在が示唆された。2)白血球毒素遺伝子の発現調節因子:申請者らは本菌の主要病原因子である白血球毒素の遺伝子発現調節ではカタボライト抑制様機構が関与することを報告した。そこで本年度は,本菌のcAMP receptor protein (crp)遺伝子破壊株の作製を試みた。現在まで分離されていないが,その理由としてcrpの欠損が増殖に与える影響が大きいことが推察される。次年度はcrp以外の種々の発現調節因子の欠損株の作製も試みるとともに,発現ベクターを構築してそれら調節因子の発現誘導を行い,毒素遺伝子発現への影響を検討する。また,毒素遺伝子プロモーター下流にlacZ, gfp等をレポーターとして組み込んだ株を構築し,毒素遺伝子発現レベルを定量化するとともに,新たなregulatory mutantの分離を計画している。なお,バイオフィルムにおける遺伝子発現観察用のフローセルについては現在試作中である。

Actinobacillusactinomycetemcomitans(Aa)のバイオフィルム形成株では、ガラス表面への付着初期において多数の線毛の産生が見られるが、成熟したバイオフィルム表面では線毛産生が抑制され、多糖体様物質の産生が示された。このことから、本菌ではバイオフィルム形成の各段階において、そのミクロな環境変化に応じて菌体間の細胞表層物質の産生が調節を受けていることが示唆された。バイオフィルム形成株ではコンゴレッド色素結合性を示したが、非形成株では示さず、また、この色素結合性は過ヨウ素酸処理により消失した。コンゴレッド色素結合性は成熟したバイオフィルムの菌体表層に観察された多糖の合成を反映し、この多糖体物質がバイオフィルム形成に密接に関わるものと推察された。Aaゲノム遺伝子解析から、コンゴレッド結合性多糖であるN-アセチルヘキソサミン含有多糖の合成遺伝子群が本菌に存在することがわかり、allelic exchange mutagenesisにより、その遺伝子破壊株を作製したが、バイオフィルム形成の明らかなレベル低下は認められなかった。さらに、N-アセチルヘキソサミニダーゼなどの糖分解酵素処理もバイオフィルム分解には至らなかったため、複数の多糖体がバイオフィルム形成に関わっている可能性も推察された。線毛欠損株の自己凝集アッセイでは、過ヨウ素酸およびDNA分解酵素により凝集阻害が見られたことから、多糖体やDNAがバイオフィルム形成における菌体間凝集に関与していることが示唆された。また、本菌の主要病原因子であるロイコトキシンの産生は、カタボライト抑制様機構に加えて、酸性pHにより促進されることが明らかになり、バイオフィルム形成過程における局所pHの低下はトキシン産生増加に働くことが示唆された。
ベトナム戦争はどう記憶され、どう語られるのか その現場(フィールド)心理学的検討

本研究の目的は、ベトナムの人々がベトナム戦争をどのように記憶し、それを現在どのように語るのかを明らかにすることである。ベトナム戦争は、1975年4月30日のサイゴン解放で最終的に終わったと言われる。それから四半世紀以上が経過したが、私たち日本人はかの戦争を、たとえばベトナム戦争を背景としたハリウッド映画を通して、アメリカ側の視点から主に理解してきた。それゆえ、ベトナム側の視点を知るということはとりわけ重要である。4年間にわたる研究期間の間に、ベトナムでの現地調査を7回、アメリカでの現地調査を1回行った。そのたびに様々な立場のベトナム人たち(元北ベトナム兵士、元南ベトナム兵士、元民族解放戦線兵士、一般住民、元反戦運動家、国外へ出た元難民等)と接触し、1975年以前の戦争時代の「語り」に耳を傾けた。途中から、「サイゴン解放の日」に現地にいた人々に焦点を当てたり、ベトナムの中部のフエで1970年前後に巻き起こった仏教徒や学生らによる反戦運動に関わった人々に焦点を当てたりした。報告書の中では、すでに論文発表・学会発表を行ったものを再録し(2.期間の発表論文)、また刊行予定の著書原稿から関連部分を掲載した(3.刊行予定の著書原稿)。また現地調査の記録(4.現地調査の記録)と、3人分の聞きとり調査の結果を収めた(5.インタビューの記録)。それらのなかで、いくつかの新たな視点-「死ぬのは恐くない」とか「自分たちは団結して苦しくも楽しい日々を過ごした」とかといった元北ベトナム兵士のパターン化された語りや、サイゴン解放を経験した人々の語りのバリエーションから構成される「事実」についてなど-を抽出した。本研究のテーマは壮大で、戦火が止まない21世紀の世界状況の問題にも繋がっている。この問題をさらに追究していくことが期待されている。研究計画に基づいて、ベトナムでの現地調査を2回にわたって行った。期間は2000年8月16日9月1日および2000年12月24日30日である。(なお研究分担者として参加している別の科学研究費によって、2001年3月13日20日までベトナムに渡航した際にも、当該の研究の妨げにならない範囲で、当研究の調査を継続して行った。)ベトナムでの在外研究(1998年5月1999年2月)の経験と人脈を活かしながら、元北ベトナムの兵士など10人(女性も含む)に本研究の主旨に同意してもらって、聞き取り調査を行った。なお聞き取りは、日本語に堪能なベトナム人(日本に留学経験のある人)に通訳をしてもらいながら行った。対象者の自宅まで出向き、ができるだけリラックスして自由に語れる雰囲気をつくるよう心掛けた。生まれた年や出生地などはもちろんのこと、入隊した年齢、入隊後の転戦地、その転戦地での生活の様子、病気や怪我、現在の自分や家族にとっての戦争体験の意味づけなどを語ってもらった。1回の聞き取りにかけた時間は、1時間から3時間ほどである。なお2回にわたって聞き取りをお願いできた対象者もいた。重たいテーマであるだけに、最初は本研究の目的などをいぶかる対象者もいたが、いずれの対象者も最終的には、戦争を知らない外国人である研究者に対して、語って聞かせるという調子で話を聞かせてくれた。大変困難で苦しい戦いをしながらも、国の独立と自由を勝ち取る戦いのためにプライド高く闘った様子が窺え、またそのような戦いのなかでの生活が「みなが協力しあい団結していて、楽しかった」と異口同音に語ったのが一番印象的であった。

今回は主に、ベトナムの北側で調査を行ったわけだが、南側で行えば、またかなり違ったベトナム戦争の物語が語られることであろう。戦争は、一方の正義が他方の不正義として映りやすい事象であるからである。北側で同じ対象者に対しても、再び会って話を聞きたいと考えているが、2年目の来年度は、南側での調査に力を入れたいと考えている。また、ベトナム戦争関連の資料(ベトナム語・英語などによる書籍・ビデオなど)を大量に購入した。その内容分析をこれから行うところである。研究計画に基づいて、ベトナムでの現地調査を今年度2回にわたって行った。期間は、2001年8月16日8月31日および2001年12月26日12月31日である。昨年度から通算して4回の現地調査を行ったことになる。ベトナムでの在外研究(1998年5月1999年2月)の経験と人脈も活かしながら、元兵士などを中心に、ハノイおよびホーチミン市(サイゴン)での聞き取り調査を行った。基本的に対象者の自宅まで赴き、できるだけリラックスして自由に語ってもらえる雰囲気を作り出すよう心がけた。生まれた土地や出生地などはもちろん、入隊した年齢、入隊後の点線値、その点線値での生活の様子、病気や怪我、現在の自分や家族にとっての戦争体験の意味づけなどを語ってもらった。2回以上話が聞けた人も含めて、10数名の聞き取りを実施することができた。昨年度はハノイでの調査が中心となったが、今回は南のホーチミン市でも対象者を見つけて話を聞く努力をした。ベトナム国内の事情(現政府に対して不満を抱いている人が大きな声で発言をしにくいなど)から、南側では調査がしづらい面はあったが、少しずつフィールドを広げられつつある。また中部のフエでも次に調査をするべく、フエ市の外報部の協力を取り付けることができた。1年目の成果は「「ベトナム戦争の記憶と語り」ノーツ」という拙論としてまとめた(裏面)。また「女性史学」という雑誌に「ベトナム人女性の戦争の語り」というタイトルの拙論を投稿したところである。3年目も、これまでの成果と基盤を踏まえて調査を継続させていきたいと考えている。研究計画に基づいて、今年度はベトナムでの現地調査を2回(2002年4月28日5月10日:渡航先ハノイ,2002年9月3日9月12日:渡航先ハノイ・ホーチミン市)、アメリカでの現地調査を1回(2002年8月7日8月16日:渡航先:ニューヨーク・ワシントンDC・ホノルル)行った。いわゆるベトナム戦争に直接関わった人々に、その経験を語ってもらうのが本調査の基本であるが、今年度はとくに、1975年4月30日のサイゴン解放の日を現地で迎えた様々な立場の人々にとくに焦点を当てた。また、アメリカに難民として渡った人々にも着目し、現在の居住地で当時のサイゴンを振り返ってもらい、その経験を語ってもらった。サイゴン解放当時の立場の違いによって、語られる内容が異なるわけだが、現在どこに住んでいるのか、ベトナム国内なのか国外なのかという点でも、語られる内容に大きな相違点があることが明らかになってきた。ベトナム戦争当時の南北分断のしこりというのは、ベトナム国外まで目を向ければなおさら、現在でも根強く続いている。アメリカでの現地調査では、2001年9月11日にニューヨーク等で起こったテロ事件の余韻とアメリカの戦争観を知るために、ニューヨークとワシントンDCでは、貿易センタービル跡地やホロコースト博物館にも足を運んだ。
半導体表面における有機金属化合物の共吸着、分解機構の光電子分光法による研究

当初、予定していたターボモレキュラーポンプは取り扱い業者の都合上入手不可能となったため(他業者の同じ性能以上のものは本補助金では購入不可能であった。)、超高真空用高精度リ-クバブルや特別注文の配管等を購入し、2系統の試料溜を試料導入系に配置することにより、共吸着可能な試料導入系を製作した。ガリウム砒素(100)基板の清浄法としてイオンボンバードメント&アニーリング(IBA)を用いていたが、表面の平坦性や、表面化学種がガリウムのみに偏る問題があった。濃塩酸溶液処理後、基板表面が塩化ガリウムで終端され、さらに、水に塩化ガリウムが溶解することにより、砒素で終端される表面構造が得られることを角度分解X線光電子分光法(ARXPS)を用いて確認した。なお、濃塩酸処理後のガリウム砒素(100)基板が原子オーダーで平坦であることは原子間力顕微鏡法(AFM)を用いた他の研究者によりにより確認されている。また、193nm、355nmの波長の紫外線レーザーを、濃塩酸処理後の基板に照射したところ、193nmでは比較的弱いパワーの3mJ/Pで塩素に帰属されるスペクトルに減少が見られるのに対して、355nmでは20mJ/Pまでパワーを上げなければ減少は見られなかった。これは、塩素、又は塩化ガリウムは193nmで光脱離をするのに対して、355nmで熱的に脱離をするためと思われる。今後、さらに塩素の作用によるガリウム砒素基板表面の清浄化機構を理解するため、真空チャンバー内で、塩素、又は塩化水素ガスによるガリウム砒素のエッチング機構について研究することを計画している。室温で放置したSi(100)基板表面(一部Si-Cになっている。)にトリメチルガリウムを20L程度吹き付け、吸着させた後、さらにトリチメルインジウムを20L程度吹き付けたところ、ガリウムのスペクトルに減少傾向が見られた。これがインジウムとガリウムのメチル基交換反応にともなるメチル化ガリウムの脱離によるものか、インジウム吸着によりガリウムの光電子放出阻害によるものかを、追実験を通して、詳しく調べていきたいと考えている。
ホウ素中性子捕捉反応で放出される粒子線の生物効果（DNA損傷・修復）の解析

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)の治療効果向上に資するため、1分割照射、2腫瘍細胞の遺伝的背景、3化学療法剤(テモゾロミド)との併用、4中性子線のエネルギースペクトルの4点が、細胞生存率やDNA二重鎖切断の誘発に及ぼす影響について、培養細胞(ヒトグリオーマ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞)を用いて検討した。その結果、分割照射や腫瘍細胞のp53突然変異で細胞生存率は変動するが、中性子線ではガンマ線ほど顕著でなかった。また、化学療法剤により細胞の生存率は相乗的に低下すること、中性子線のエネルギースペクトルの違いは細胞生存率に大きく影響しないことが分かった。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)はがん細胞に集積させたホウ素に中性子を照射して核反応を誘発し、放出されるアルファ線とリチウム線によって、がん細胞を選択的に死滅させる治療法であり、原子炉だけでなく加速器を用いても治療が可能になってきたことから近年注目されている。本研究は「細胞致死」と「DNA二重鎖切断」を指標とし、BNCTの治療効果の向上に必要な生物学的な知見を提供することを目的としている。実験計画(予定)は、申請書に記載したように、26年度は実験手法の確立と習熟、ならびに、線量率や線質(エネルギー)の影響について、27年度は実際の治療を想定して、分割照射(単一照射、24時間間隔の25回照射)、及び照射の翌日から数回のX線の混合照射による影響について、28年度には化学療法剤や増感剤との併用による影響を明らかにすることとしている。平成26年度は当初計画通り、理化学研究所細胞バンクから、放射線に対する反応に重要な役割を果たすp53遺伝子の状態が異なる2種類のグリオーマ培養細胞を導入し、培養と基本的な特性解析を行うとともに、中性子照射と線量分布等に関する実験条件を確定した。さらに、p53の発現状態の異なるグリオーマ細胞における中性子線やホウ素捕捉反応により放出される粒子線の生物効果の違いについても明らかにして論文(Anticancer Res.35:169-74)に取りまとめた。また、線量率や線質(エネルギー)の影響に関して実験を行い、熱中性子線と高速中性子線の細胞致死とDNA二重鎖切断についての比較実験を完了した(論文投稿中)。学会発表としては、本研究において得られた結果の一部を16thICNCT(国際中性子捕捉療法会議)や国内学会(第57回日本放射線影響学会)で発表した。ホウ素中性子捕捉がん治療(BNCT)は、グリオーマやメラノーマなどの放射線抵抗性の悪性腫瘍に高い効果を有することが知られている。しかしながら、ホウ素中性子捕捉により放出されるアルファ線並びにリチウム線の生物効果については十分な知見がない。本研究は、がん細胞の殺傷の主たる機序であるDNA二重鎖切断とその修復を指標とし、現在、臨床的に実施または計画されている1分割照射、2X線の後照射、3化学療法剤との併用に係わる基礎的な知見を得ることを目的としている。平成26年度は、細胞の調製、照射方法の確認と線量評価、細胞生存率測定などをガンマ線を用いた予備的試験により実施し、完了した。平成27年度は、分割照射や化学療法剤との併用により生物効果(生存率や修復酵素のフォーカス形成)がどのように修飾されるかを明らかにするため、主としてガンマ線を用いた実験を行った。その結果、ガンマ線照射によって誘発される53BP1フォーカスの数は、分割照射によって30%程度低減されることなどが明らかとなった。これらの結果は、国際放射線防護会議(ICRR2015)において発表した。また、線質の違い(中性子線のエネルギープロファイル)の違いについてのデータ解析を完了し論文として発表した。年度当初の研究計画では、これらのガンマ線による実験と並行して、BNCTに利用される熱中性子線、およびホウ素存在下の熱中性子線照射で発生するアルファ線とリチウム線の生物効果についても同様の実験を実施し、ガンマ線との比較を行う予定であったが、中性子源である研究用原子炉(KUR)が安全審査のため停止しており、中性子を用いた実験は行うことができなかった。前述のように、本研究の目的はホウ素中性子捕捉療法の効果の向上を目的として、ホウ素中性子捕捉によって発生するアルファ線やリチウム線が1分割照射、2X線の後照射、3化学療法剤との併用によってどのような修飾を受けるかと明らかにすることである。実験手法の確立は初年度に順調に完了した。第2年度の平成27年度には対照群(未照射)、陽性対照群(ガンマ線照射)、熱中性子の単独照射群、およびホウ素中性子捕捉に伴う粒子線(アルファ線とリチウム線)照射群について実験を進める予定であった。しかしながら、東京電力福島第一原子力発電所の事故を契機に、研究用原子炉にも新しい(より厳しい)規制基準が設定され、これに適合していることが求められたため、本研究に使用を予定していた研究用原子炉(KUR)は平成26年5月から運転を停止している。当初は27年後半から利用できるとのことであったが、審査が長引き27年度は使用できなかった。このため予定していた中性子を用いる実験が実施できていない。そこで、ガンマ線照射についての実験を優先して行ってきた。原子炉実験所共同利用掛からの連絡によれば、本年度(28年)10月から研究用原子炉の中性子線の利用が可能ということであり、それ以降に中性子の実験を集中して実施する。

現在は、陽性対照実験であるガンマ線を用いた実験を中心に研究を進めており、研究炉が停止している影響を出来るだけ小さくなるように工夫をしているが、若干、進捗が遅れていると判断される。ホウ素中性子捕捉療法は、あらかじめホウ素薬剤を投与することで、がん細胞にホウ素を集積させておき、その後に熱中性子を照射して核反応を起こし、生じるリチウム線とアルファ線によりがん細胞を特異的に殺傷する新しいがん治療法である。本研究は、この治療法の効果を向上させ、より効率的な治療プロトコールを確立して行く上で必要な生物学的基礎データを提供することである。特に、分割照射と化学療法剤の併用による生物効果の増強を目指して基礎データの蓄積を図っている。平成28年度は、主としてガンマ線を用い、培養細胞としては一般的な生物効果の実験に多用されているチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞ならびにヒトのグリオーマ由来のA172細胞を用いて分割照射の影響を検討するとともに、ヒトの脳腫瘍の治療に最近多く使用されるようになってきている抗がん剤テモダールの併用について研究を進めた。その結果、27年度に実施した中性子線照射実験の結果と比較すると、ガンマ線は中性子線に比較して分割によって細胞生存率の上昇が大きく、その原因の一部にはDNA二重鎖切断の質または数の違いが関係していることを示唆する知見が得られた。これらの結果の一部は、Anticancer Reseach誌に投稿して受理され第37巻に掲載予定である。また、第59回日本放射線影響学会ならびに第17回国際中性子捕捉療法会議(ICNRT)において口頭発表を行った。さらに、テモダールとガンマ線の併用効果についての研究を進め、CHO細胞においては相乗的な細胞致死効果が観察されるが、ヒトのグリオーマ由来のA172細胞ではその様な効果が明確でないことを見出した(投稿準備中)。今後、テモダールと中性子線の併用、ならびに、テモダールとホウ素捕捉反応により放出される粒子線の併用効果について、研究用原子炉が再稼働次第に実験を行っていく。本研究はホウ素中性子捕捉療法の治療効果向上に資するため、生物学的な基礎データを提供することであるが、現在、研究用原子炉(KUR)は福島原子力発電所事故に伴う新しい規制基準による検査のため停止している。当初は、28年度初頭には再稼働予定であったが、検査が長引き、28年度は中性子が供給されなかった。このため、28年度は対照実験であるガンマ線照射を用いた実験研究のみを実施し、研究計画を一年間延長し、29年度に中性子照射の必要な実験を行い、研究を完了することとしている。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、あらかじめホウ素薬剤を投与してがん細胞にホウ素を集積させておき、その後に熱・熱外中性子を照射して核反応を起こし、生じるリチウム線とアルファ線によりがん細胞を特異的に殺傷する治療法である。本研究は、この治療法の効果を向上させ、より効率的な治療プロトコルを確立していく上で必要な生物学的基礎データを提供することである。特に、分割照射と化学療法の併用による生物効果の解明を目指して平成26年度より3年計画(最終的に1年延長し4年計画)で実施してきた。平成29年度は最終年度にあたり、不足する実験的な研究を実施するとともに、国際会議での発表や学術論文としての発表を進め、研究のとりまとめを行った。
播種ロボット開発のためのデジタル播種機構及びフィ-ドバック回路の研究

本研究は播種ロボットの開発研究として、単年度の補助金を受けて遂行したもので、年度内に、播種のデジタル機構のためのフィ-ドバック回路の開発に重点を於て取り組み、次の知見を得た。1.播種情報フィ-ルドバック回路の開発マルチ播種において、マルチ穴径と播種速度を入力情報として、マルチ穴の中央へ正確に播種するところの位置決め播種が可能なフィ-ルドバック回路を持つ播種用マイクロコンピュ-タ(大きさ:180×140×40)を開発した。本コンピュ-タは、種子導管の前方に取り付けたセンサ-が、穴先端を検知後、種子導管が穴センタ-を通過するまでの時間(待ち時間)を演算し、その時間だけ待って播種させるものである。主に、回路はZ80CPU、2764ROM、6116PRAMを組み込んだCPU回路、8255PPI、8254タイマ-をもつI/0回路からなり、マルチ穴径の情報は光センサ-で、播種速度の情報はエンコ-ダで入力させ、すべてエンコ-ダのパルス数を基準値として、マルチ穴の中央へ播種するための待ち時間を演算する。操作が安易なように、ソフトの構築にあたっては、マルチ穴径計測モ-ドと播種モ-ドの並列型にした。室内での検定試験の結果、種子(落花生、大根)はマルチ穴中央位置に正確に落下し、回路の適用性が確認された。2.アクチュエ-タによるデジタル播種機構の開発人力による播種に近似した作業が可能となると、位置決め播種(デジタル播種、点播もその一例)は容易となるので、多関節型アクチュエ-タを用いて、その可能性を探った。今年は、ビデオによる動作分析だけに留まったが、種子のピックアップ機構も課題として残った。今後は、上記のマイクロコンピュ-タとビデオカメラを組み合わせて、引続きインテリジェント播種可能な播種ロボットの開発研究に取り組んで行く。
液体金属の振動熱対流とその三次元構造

アスペクト比(液層長さ/深さ)Ar=2および4,幅比(液層幅/深さ)Wr=0.54.2の矩形容器の二鉛直壁間に温度差を与え,他壁は断熱条件として,プラントル数Pr=00.027の流体について3次元数値シミュレーションを実行した結果,以下のことが明らかとなった。1.(Ar,Wr)=(2,1),(2,2),(4,1)の場合,振動が起こる臨界グラスホフ数はプラントル数に大きく依存する。2.対流構造は,セル状パターンと縦渦(ロール)により特徴づけられる。一般的には,幅比の増加とともに臨界グラスホフ数は減少する傾向を示すが,狭い幅比域で対流構造の転移による臨界グラスホフ数の急激な増減が見られる。3.Pr=0および0.015では,いずれの幅比に対しても単一セル状対流となる。4.Pr=0.025の場合,Ar=2ではWrが1以下のとき,Ar=4ではWrが1.4以下のときに2セル構造の振動対流が現れ,それら以外の幅比では単一セル構造となる。5.平均熱伝達率に及ぼす振動流の影響は約10%にまで達する。さらに,Ar=2,4,Wr=0.54の条件で溶融ガリウムを用いた実験の結果,以下のことが明らかとなった。1.再現性のある振動流が発生する。温度振動から決定された臨界グラスホフ数はシミュレーション結果と定性的に一致する。2.臨界グラスホフ数は,Ar=2,4ともにWrの増加とともに減少する。大きなWrでは,温度差を徐々に増加させた場合と、減少させた場合とで決定された臨界グラスホフ数にヒステリシスが若干現れる。3.振動周期は幅比が増加するにつれ10秒程度から1分程度まで大きく変化し,特定の幅比を境に跳びが見られる。Ar=4についての測定結果はシミュレーション結果とよく一致する。単純な側壁加熱水平ボートを想定したアスペクト比(液層長さ/液層深さ)2および4,幅比(液層幅/液層深さ)0.54.2の矩形容器の二鉛直壁に温度差を与え,他壁は断熱条件として,プラントル数00.027の流体について3次元数値シミュレーションを実行した結果,1.(アスペクト比,幅比)=(2,1),(2,2),(4,1)の場合,臨界グラスホフ数はプラントル数に大きく依存する。3.プラントル数が0.015以下の場合,いずれの幅比に対しても単一セル状対流となる。4.プラントル数0.025の場合,アスペクト比2では幅比が1以下のとき,アスペクト比4では幅比が1.4以下のときに2セル構造の対流が現れ,他の幅比では単一セルとなる。5.平均熱伝達率に及ぼす振動流の影響は約20%にまで達する。これらの結果は現在,投稿中。さらに,アスペクト比2および4,幅比0.54の条件で,溶融ガリウムを用いた実験を行った結果,1.グラスホフ数(温度差)に依存する,再現性のある振動流が発生する。2.溶融ガリウムの振動流発生に対する臨界グラスホフ数は、アスペクト比2,4ともに幅比の増加とともに減少する。

亜臨界域から温度差を徐々に増加させた場合と、超臨界域から減少させた場合とで決定された臨界グラスホフ数間のヒステリシスは、幅比が大きい場合に若干現れる。3.振動周期は幅比が増加するにつれ10秒程度から1分程度まで大きく変化し、特定の幅比を境に跳びが見られる。4.壁面温度分布は底面付近を除けばほぼ一様であることが確かめられた。側壁加熱水平ボートを想定したアスペクト比(液層長さ/液層深さ)2および4,幅比(液層幅/液層深さ)0.54.2の矩形容器の二鉛直壁に温度差を与え,他壁は断熱条件として,プラントル数0-0.027の流体について3次元数値シミュレーションを,前年度に引き続き実行した結果,1.(アスペクト比,幅比)=(2,1),(2,2)の場合,それぞれプラントル数が0.010.015および0.0180.025の範囲で臨界グラスホフ数が急激に増加することが分かった。2.一般的には,幅比の増加とともに臨界グラスホフ数は減少する傾向を示すが,狭い幅比域で臨界グラスホフ数の急激な増減が見られた。これはセル状あるいはロール状対流構造の転移によることが確かめられた。これらの成果は昨年度の結果とともに,欧文誌に掲載された。さらに,昨年度に引き続いて,アスペクト比2および4,幅比14の条件で,溶融ガリウムによる実験を行った結果,1.アスペクト比2の場合,振動周波数の測定結果はシミュレーション結果ほど幅比に依存して大きく変化せず,よい一致は得られなかった。しかしながら,アスペクト比4では幅比による依存性はあるものの,よく一致する結果が得られた。アスペクト比2の場合,発生する振動振幅が小さく,十分な精度で測定できなかったためと考えられる。2.液晶シートによる融液表面温度場の可視化は溶融ガリウム表面の酸化被膜のために満足な結果は得られなかった。今後さらに検討すべき必要があると考えられる。
DNA塩基配列の多型性を利用した遺伝性腫瘍の研究

NEW2Aの発症機構の解明を目指して、次の研究を行なった。(b)MEN2Aの発症に必要な第2段階以降の遺伝子変異を解明するため、甲状腺髄様癌および副腎褐色細胞腫におけるallele lossと、rasオンコジンの点突然変異を調べた。RBP3よりもさらにMEN2Aに近いプロ-ブMEN203を用いても、両腫瘍合計19例中散発性髄様癌1例にallele lossを認めたに過ぎなかった。またD22S24でloss of heterozygosityが認められた。甲状腺髄様癌および褐色細胞腫から抽出したDNAを用いN-,H-,K-,rasのcodon12ならびにcodon61を含む部分をPCRで増幅して、点突然変異の有無を検討した。甲状腺髄様癌31例中1例でH-ras61に、褐色細胞腫12例中の2例でH-ras12に、それぞれ点突然変異を認めた。(c)その他の遺伝性腫瘍好発家系の収集:MEN1の原因遺伝子は11番染色体の長腕にある。最近MEN1の家系を経験し、この家系について11番染色体を中心に連鎖分析と、腫瘍におけるallele loss目下検討中である。また、副甲状腺腺腫のみが遺伝する1家系を見つけた。これがMEN1または2Aの不全型なのか、別の独立した遺伝性腫瘍なのかは興味深い。この家系については10番ならびに11番染色体上のプロ-ブについて検討中である。
心筋異方向性伝導と心室性不整脈発生機序に関する高密度マッピング法を用いた研究

【目的】心筋組織は心筋線維の配列方向によって興奮伝導速度が異なる異方向性伝導特性を有し,摘出心筋を用いた検討などから,心筋構築の異方向性がリエントリ-性不整脈発生機構に関与する可能性が指摘されているが,未だ十分に解明されてはいない.本研究では,イヌ生体拍動心に高密度マッピング法を用いて急性心筋虚血時における心筋異方向性伝導と心室性不整脈発生の関係を解明することを目的とした.【方法】雑種成熟イヌ8頭(812kg)をpentobarbitalで麻酔後,人工呼吸下で開胸し,心膜を切開して心臓を露出し,左冠状動脈前下行枝(LAD)潅流領域にマッピング電極を留置した.マッピングには極間1mmの双極金球電極96対を1.5mm間隔に8列×12行に配列し,中央に記録用電極とは別に刺激用双極電極を1対配したマット電極を用いた.Base lineの記録終了後LADを近位部で結紮し,経時的に中央刺激電極で基本刺激周期300msの刺激を行い興奮伝播過程を記録した.興奮伝播様式の記録解析にはHPM-7100(フクダ電子社)を用いた.【結果】Base lineにおける心表面心筋線維の長軸方向興奮伝播速度(以下θL)は,θL=0.705±0.067m/s,短軸方向興奮伝播速度(以下θT)は,θT=0.344±0.057m/sであった.LAD結紮510分後には,θL=0.472±0.123m/s,θT=0.255±0.038m/sといずれも有意に低下した.結紮2030分後θL=0.561±0.128m/sと長軸方向の興奮伝播速度が一時改善したが,結紮4050分後には再び興奮伝播速度の低下が認められた(θL=0.441±0.112m/s,θT=0.253±0.073m/s).【総括】イヌ急性心筋虚血モデルにおいて,心表面異方向性伝導の経時的な変化率に差がみられ,この過程が急性心筋虚血時の不整脈発生機序と関連する可能性が示唆された.【目的】心筋組織は心筋線維の配列方向によって興奮伝導速度が異なる異方向性伝導特性を有し,摘出心筋を用いた検討などから,心筋構築の異方向性がリエントリ-性不整脈発生機構に関与する可能性が指摘されているが,未だ十分に解明されてはいない.本研究では,イヌ生体拍動心に高密度マッピング法を用いて急性心筋虚血時における心筋異方向性伝導と心室性不整脈発生の関係を解明することを目的とした.【方法】雑種成熟イヌ8頭(812kg)をpentobarbitalで麻酔後,人工呼吸下で開胸し,心膜を切開して心臓を露出し,左冠状動脈前下行枝(LAD)潅流領域にマッピング電極を留置した.マッピングには極間1mmの双極金球電極96対を1.5mm間隔に8列×12行に配列し,中央に記録用電極とは別に刺激用双極電極を1対配したマット電極を用いた.Base lineの記録終了後LADを近位部で結紮し,経時的に中央刺激電極で基本刺激周期300msの刺激を行い興奮伝播過程を記録した.興奮伝播様式の記録解析にはHPM-7100(フクダ電子社)を用いた.【結果】Base lineにおける心表面心筋線維の長軸方向興奮伝播速度(以下θL)は,θL=0.705±0.067m/s,短軸方向興奮伝播速度(以下θT)は,θT=0.344±0.057m/sであった.LAD結紮510分後には,θL=0.472±0.123m/s,θT=0.255±0.038m/sといずれも有意に低下した.結紮2030分後θL=0.561±0.128m/sと長軸方向の興奮伝播速度が一時改善したが,結紮4050分後には再び興奮伝播速度の低下が認められた(θL=0.441±0.112m/s,θT=0.253±0.073m/s).【総括】イヌ急性心筋虚血モデルにおいて,心表面異方向性伝導の経時的な変化率に差がみられ,この過程が急性心筋虚血時の不整脈発生機序と関連する可能性が示唆された.
Drs癌抑制蛋白の機能をペプチド模倣する新しい抗腫瘍分子標的薬の探索

本研究では、ヒト癌の悪性化過程でしばしば発現消失する癌抑制遺伝子Drsに着目し、その抗腫瘍作用に重要なSushiドメインのループ領域の立体構造をミミック(分子模倣)する低分子化合物(MI化合物)の抗腫瘍活性を解析し、新たな分子標的薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。前年度までのスクリーニングの結果から、MI化合物の中でも強い抗腫瘍活性を示す候補化合物を3種類にまで絞り込んだ(#0925、#0948、#0817)。その後もこれらを中心に候補化合物の選定を行ったものの、これらを超えるものを見つけることはできなかった。またin vitro実験の阻害濃度から、in vivoでのマウス皮下腫瘍形成実験やマウス膵同所性発がん実験では、かなりの高用量を投与する必要があり、必要量の化合物を期間内に確保できないことが予測された。このため、より低用量でも抗腫瘍活性を示す癌細胞株の選定とin vivo実験系の改良とともに、少量でも実施可能なin vitro実験系でのメカニズム解析を優先することにした。この結果、これまでに検討してきた膵臓癌や大腸癌細胞以外に、膀胱癌細胞にもMI化合物が抗腫瘍活性を示すことを新たに見出した。ただし、いずれの癌細胞株に対する効果も同程度で、著効を示す癌細胞株は見出せなかった。また、より実際の病態に近いin vivo実験モデルとして、ヒト膵臓癌細胞株SUIT-2を用いたマウス膵同所性発癌からの転移(播種)能を定量化する実験系を確立した。また、in vitro実験を通じて、MI化合物で処理したときには癌細胞株の培地の酸性化が抑制される傾向を見出した。このことは、我々がすでに報告したDrsによるWarburg効果の調節機構によるものと考えられ、MI化合物の抗腫瘍活性にもこの機構が関与する可能性が示唆された。本研究では、ヒト癌の悪性化過程でしばしば発現消失する癌抑制遺伝子Drsに着目し、そのタンパク立体構造をミミック(分子模倣)する低分子化合物の抗腫瘍作用を解析し、新たな抗腫瘍性分子標的薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。Drsの抗腫瘍活性に重要なSushiモチーフの部分構造をミミックする複数の候補化合物(以下MI化合物)を新規合成し、ヒト癌細胞株を指標にしたin vitro抗腫瘍活性スクリーニングを実施した。まず、第一次スクリーニングでは12種のMI化合物について、大腸癌細胞株DLD-1、ヒト膵臓癌細胞株MIAPaCa-2などの足場非依存性増殖(軟寒天培地中のコロニー形成)抑制作用を検討した結果、いずれの癌細胞株に対しても比較的低濃度(10μM以下)で有効なMI化合物を複数見いだした。そのいくつかの化合物は正常細胞に対する細胞毒性が低く、MIAPaCa-2に顕著な抗腫瘍活性を示したことから、難治性の膵臓癌への有用性が期待される。この結果を踏まえて新たな化合物をデザインし、15種類のMI化合物を用いて第二次スクリーニングを行い、足場非依存性増殖抑制活性を持つ化合物をさらに複数見いだした。ただし第一次スクリーニングと比較して顕著に低濃度でも有効な、高活性の化合物は見られなかった。MI化合物の抗腫瘍作用をさらに解析するため、癌の転移や再発との関係が報告されている癌幹細胞に対する効果を検討した。幹細胞性の指標となる三次元スフェロイド実験系を立ち上げ、スフェロイド形成抑制能を解析したところ、第一次、第二次スクリーニングで見いだしたMI化合物は抑制活性を示した。また幹細胞性の指標となるCD44などマーカー分子発現にも一部に抑制が認められた。また次年度以降の研究に備えて、ヌードマウスを用いた皮下移植腫瘍、同所性膵臓癌移植モデル実験の準備を進めた。本研究課題は10月からの追加採用であったため初年度の研究期間は、計画当初予定より短かったが、第一次・第二次スクリーニングでどちらも抗腫瘍活性を持つ候補化合物を見いだすことに成功した。また新たな実験系として、三次元スフェロイド形成実験技術を研究室内に確立し、計画当初目的としていた内容に近い状況で進捗している。本研究では、ヒト癌の悪性化過程でしばしば発現消失する癌抑制遺伝子Drsに着目し、その抗腫瘍作用に重要なタンパク部分構造であるSushiモチーフの立体構造をミミック(分子模倣)する低分子化合物(MI化合物)の抗腫瘍活性を解析し、新たな分子標的薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。本年度においては、まず初年度の第一次、第二次スクリーリングで抗腫瘍活性を見いだしたMI化合物の構造をもとに、新たな11種のMI化合物をデザインして第三次スクリーニングを行い、これまでの試験で良好な成績だった4種と合わせた15種類のMI化合物を用いてin vitro抗腫瘍活性試験を実施し、活性が高く毒性の少ない候補化合物の絞り込みを行った。大腸癌細胞株DLD-1、ヒト膵臓癌細胞株MIAPaCa-2などの足場非依存性増殖(軟寒天培地中のコロニー形成)抑制試験、ならびに3Dスフェロイド形成抑制試験の結果から、10μM以下の低濃度で抗腫瘍活性を示す化合物7つを見いだした。ただし、最も強い活性を示す化合物は線虫を用いた生物毒性試験において毒性が高いことが示唆されたため候補から除外した。これらの結果を踏まえて、新規合成品を加えた6化合物での第四次(最終)スクリーニングを実施し、#0925、#0948、#0817の3化合物をin vivo抗腫瘍活性試験に向けた候補化合物として選定した。

また、in vivo抗腫瘍活性試験の効率化と定量化のために、マウス同所性膵臓癌モデル実験法の改良を行い、NOD/SCIDマウス膵頭部へのヒト癌細胞移植実験系とhEGFR免疫染色による定量法の確立を行った。当初、in vitro抗腫瘍活性がもっとも強い化合物(MI4232)について、その作用機序を含めた検討を進めていたが、その後、生物毒性試験の結果から毒性が強い可能性が浮上し、in vivoでの投与を見合わせることになった。そのため、活性自体はやや劣るものの毒性の少ない化合物の中から改めて候補を選出するのと並行して、実験系のブラッシュアップを行い、必要な量が合成によって確保でき次第、効率的な実験が可能になるよう準備を整えることができた。なお、MI4232は抗腫瘍剤探索という観点から候補から除外したものの、低濃度で癌細胞株にアポトーシスを誘導することを確認している。もともと、Drs遺伝子自体が高発現するとアポトーシスを誘導することを我々は明らかにしており、Drsの抗腫瘍メカニズムを研究する新しいツールとして利用できる可能性が考えられた。本研究では、ヒト癌の悪性化過程でしばしば発現消失する癌抑制遺伝子Drsに着目し、その抗腫瘍作用に重要なSushiドメインのループ領域の立体構造をミミック(分子模倣)する低分子化合物(MI化合物)の抗腫瘍活性を解析し、新たな分子標的薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。前年度までのスクリーニングの結果から、MI化合物の中でも強い抗腫瘍活性を示す候補化合物を3種類にまで絞り込んだ(#0925、#0948、#0817)。その後もこれらを中心に候補化合物の選定を行ったものの、これらを超えるものを見つけることはできなかった。またin vitro実験の阻害濃度から、in vivoでのマウス皮下腫瘍形成実験やマウス膵同所性発がん実験では、かなりの高用量を投与する必要があり、必要量の化合物を期間内に確保できないことが予測された。このため、より低用量でも抗腫瘍活性を示す癌細胞株の選定とin vivo実験系の改良とともに、少量でも実施可能なin vitro実験系でのメカニズム解析を優先することにした。この結果、これまでに検討してきた膵臓癌や大腸癌細胞以外に、膀胱癌細胞にもMI化合物が抗腫瘍活性を示すことを新たに見出した。ただし、いずれの癌細胞株に対する効果も同程度で、著効を示す癌細胞株は見出せなかった。また、より実際の病態に近いin vivo実験モデルとして、ヒト膵臓癌細胞株SUIT-2を用いたマウス膵同所性発癌からの転移(播種)能を定量化する実験系を確立した。また、in vitro実験を通じて、MI化合物で処理したときには癌細胞株の培地の酸性化が抑制される傾向を見出した。このことは、我々がすでに報告したDrsによるWarburg効果の調節機構によるものと考えられ、MI化合物の抗腫瘍活性にもこの機構が関与する可能性が示唆された。第一次・第二次スクリーニングで抗腫瘍活性を持つMI化合物は得られたが、臨床応用を視野に入れた場合は、現在のものよりもより低濃度かつ低毒性の化合物であることが望ましい。このため三次以降のスクリーニングを進める。ただし、そうした化合物が見つからない可能性も想定し、現在までに得られたMI化合物を用いて、抗腫瘍作用メカニズムを明らかにするための実験と、in vivoでの効果を検討するための動物実験についても、それと並行して進める。