hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分割照射の転移に対する影響

細胞はマウス骨肉腫由来高転移株であるLM8を用い、スフェロイドの形成には96ウェルスフェロイドプレート(住友ベークライト社)を用いた。LM8をプレートで7日間培養しスフェロイドを作成した。これに対し1回線量を0.3611.44Gyで変化させ、不均等5分割照射を実施した。具体的には、初回2回高線量群、最後2回高線量群、最初と最後の1回ずつ高線量群及び均等分割群の4群による効果を調べた。スフェロイドに対する細胞致死効果は、スフェロイド制御率(Spheroid Control Probabliity:SCP)で評価し、転移能抑制としてはMatrigel Invasion Assayにて浸潤能の変化を評価した。X線では均等分割群に比べ初回2回高線量群のスフェロイド制御率が顕著に高く、最後2回高線量群が最も低かった。スフェロイドを50%制御するSCD50の値は、均等分割群で15.5Gy、初回2回高線量群で11.9Gy、最後2回高線量群で17.0Gyであった。一方、炭素線では均等分割群で7.8Gy、初回2回高線量群で5.8Gy、最後2回高線量群で8.3Gyと均等分割と不均等分割の間で有意差を示さなかった。浸潤能抑制の点では、X線では最後2回高線量群において低線量域(5Gy以下)での浸潤能亢進が著しく、均等分割群に比べ有意に浸潤能が亢進した。一方で、最初2回高線量群では、低線量域での浸潤能の亢進が小さく、均等分割群より有意に浸潤能を抑制した。以上の結果より、細胞実験だけでなくスフェロイドのような3次元構造を有するモデルにおいても初回高線量群が細胞致死及び転移能抑制の観点から有用であることが示された。放射線腫瘍生物学昨年度の細胞を用いた分割照射実験の結果を受け、今年度前半は移植腫瘍モデルを用いて抗腫瘍効果と転移抑制効果を評価し、炭素線の有用性がin vivo実験でも明らかとすることができ、予定通り均等分割照射による線量依存性及び分割回数依存性についての実験を、細胞・動物両方の実験系で完了することができた。また、今年度の後半では分割照射における線量及び線質の配分を変えた不均等分割による抗腫瘍効果と転移能抑制効果を細胞実験にて検討し、初回高線量照射が均等分割及び2回目高線量照射よりも効果的で有り、その効果は細胞致死よりも転移能抑制の点でより顕著であることを明らかとした。さらに、線量だけでなく、高LETと低LETのように線質の配分を変えた際の効果についても細胞実験で検討し、初回に炭素線を照射する事で、X線同士の組合せに比べより顕著に細胞致死及び転移能抑制を導くことができる事を明らかとしており、予定通りに知見を蓄積できている。最終年度である2014年度は、これまでの成果を踏まえ1)分割回数を増やした場合、及び2)移植腫瘍モデルを用いた不均等分割照射の効果を調べ、当初予定した研究計画を完遂可能であると考え、区分を「おおむね順調に進展している。」とした。当初の予定としては、1年目にX線を用いた均等分割実験を細胞と動物で行う予定だったが、実験の都合上細胞実験と動物実験を分けた方が効率的であると判断し、1年目後半から行う予定であった細胞を用いた炭素線による均等分割実験を1年目に完遂した。合わせて、動物を用いた均等分割照射実験も既に一部遂行しており、当初の予定通り、2年目までで均等分割照射による実験は、細胞・動物実験共に完了できると思われる。エンドポイントについても転移能解析の指標として遊走能と浸潤能の2つのエンドポイントについてデータを得ており、かつ生物効果の基準として細胞致死についてもデータを得ており、予定通り潤滑に進行している。
相互作用を活かした学びを自己に意味づけ,論理的思考力と数学的表現力を育む授業の創造

○研究目的:今,学んでいることが現実世界とどのように関連しているのかを自己に意味づけることで生徒自ら課題を見出し,数学を創造していくことの価値に気づくことができる。そして,他者と多様な見方・考え方を表出しながら数学を創造していくことが,生きてはたらく基礎・基本の確実な定着を図り,論理的に考えていく力,数学的に表現する力を伸長できるという仮説のもと,取り組んだ研究である。○研究方法:協同学習の理念に基づいた小グループを基本とした話し合いを中心に据え,教育課程を編成し授業づくりを行った。ライフスキルトレーニングの手法を取り入れたり,個々の責任を明確にしたり,生徒の学びに機能する話し合い活動が展開できるようなルールづくりをめざした。ここでのルールは現実世界にも転化可能であり,その重要性を実感した。話し合いの中では自分の考えを,言葉,式,図,表,グラフ等を用いて説明する。必然的に数学の表現方法を用い,相手に自分の考えを伝えるために,筋道を立ててわかりやすく説明しようとする姿が見られた。ここに数学的表現力と論理的思考力の育みがみられた。生徒の発話分析をすすめていくと,「例えば」,「次に」,「したがって」など,論理的に自分の考えを伝えるための接続詞が多用されていた。○研究成果:いまだ「教師伝達型」,「反復習得型」の授業が基礎・基本の確実な定着であると考えている教師が多い。また,その授業スタイルから脱却できずに悩んでいる教師も多い。論理的思考力,数学的表現力の育みが基礎・基本の確実な定着と密接に関連しているということ,そのためには学びに機能する話し合い(相互作用)を授業に取り入れることが大切であるということが,授業実践を通して明らかとなった。
Broadhurst-Kreimer予想とその周辺

本研究のゴールは、多重ゼータ値とモジュラー形式の関係を記述する予想である、Broadhurst-Kreimer予想を理解することである。これに対し、低い深さの多重ゼータ値とモジュラー形式の関係に関する研究を行い、両者の明示的な対応を見出した。これはDing Ma(Duke大学)との共同研究である。また、多重ゼータ値とモジュラー形式の共通の一般化である多重アイゼンシュタイン級数に関する興味深い観察も得られている。本研究の目的は,多重ゼータ値とモジュラー形式の間の関係を記述するBroadhurst-Kreimer予想(以下,BK予想と略す)を様々な観点から解析し,部分的な解決を得ることである。BK予想は,提唱されて約20年が経つが,その大部分は未だ解決されておらず,多重ゼータ値とモジュラー形式の周期の間の奇妙な関係を理解するための幾何的な背景の研究と共に発展が期待されている。本年度は,以下の研究を行った。1. Gangl-Kaneko-Zagier (2006)によって得られた周期多項式関係式と呼ばれる2重ゼータ値の間の線形関係式の精密化を行った。具体的には,与えられたカスプ形式に対し,係数がカスプ形式のciritical valueの1次結合となるような2重ゼータ値の明示的な線形関係式を与えた。証明は,Brownにより得られたmotivic多重ゼータ値からある形式的な代数への同型写像を計算すること,および2重ゼータ値が満たす複シャッフル関係式の有理数解(深さ2のrational associator)とカスプ形式とEisenstein級数のPetersson内積を計算することで得られるcritical valueの間の関係式(Kohnen-Zagier関係式)の係数を関係付けることによりなされる。全く異なる二つの対象(深さ2のrational associatorとKohnen-Zagier関係式)が結びついたことは興味深く,今後更なる発展が期待される。2.安田正大氏(阪大)と共同で,BK予想の深さ4の場合の解決に重要な役割を果たす,Brown(2012,2017)により定義された二つの写像cとeの比較を行った。前年度,両者に明示的な関係があることを観察し,安田氏により予想が定式化されていたが,今年度はこの予想の部分的な解決を得た。本研究は,深さ2,3,4に対するBroadhurst-Kreimer予想を様々なアプローチにより解析することで,多重ゼータ値とモジュラー形式の関係を深く理解することにある。今年度は申請書に記載した内容のうち,深さ2と4の場合のBroadhurst-Kreimer予想に対して,いくつか新しい結果を得ることができた。周期多項式関係式の精密化(深さ2の場合)については,その証明において,深さ2のrational associatorとKohnen-Zagier関係式の結びつきを見出すなど,想定外の進展があった。また,Brownの二つの写像を比較する研究(深さ4の場合)においては,予想が確からしいという確信につながるような部分結果が得られた。しかし,同じく申請書に記載した深さ3の場合については,あまり進展が得られなかった。これには,多重Eienstein級数の研究を応用する予定であったが,多重Eisenstein級数の基本的な性質(例えば,微分方程式など)の発展が遅れている。M. Hirose, N. Sato, K. Iwakiとの共同における研究成果を論文にまとめ、投稿した。この論文では、4点抜き射影曲線上の反復積分で定義される正則関数たちの微分公式を発明し、それを応用する形で、これら正則関数たちの線形関係式の研究を行った。実際には、多重ゼータ値の和公式や双対関係式の正則関数での類似を示し、多重ゼータ値のこれらの関係式の比較的初等的な新しい証明を与えた。H. Bachmann, Y. Takeyamaと共同で、有限多重ゼータ値のある種の円分類似の研究を行った。この新しい対象から、アデール的環世界の多重ゼータ値である「有限多重ゼータ値」と多重ゼータ値の対称和として得られる実数である「対称多重ゼータ値」が得られることを示した。両者の間に標準的な代数同型射が存在することを主張するKaneko-Zagier予想に対する新しいアプローチとなりえよう。これらの成果は論文にまとめ投稿中である。兼ねてから取り組んでいるD. Maとの共同研究を完成させ、論文を投稿した。論文では、低い深さの多重ゼータ値とモジュラー形式の間の具体的な関係をまとめている。特に、深さが2の場合に得られた結果は、Gangl-Kaneko-Zagier (2006)の結果の改良版となっており、2重ゼータ値の関係式とカスプ形式との間のある種の標準的な対応を得ることができた。この研究は、深さ3以上の場合への拡張が見つかっていないが、この成果は一般化への一つの足がかりになると考えている。

Brownの二つの写像を比較する研究について,安田氏による予想を解決するためには,これまで行ってきた周期多項式の関係式を用いた具体的な計算による手法では,複雑さも増し,限界があると考えられる。安田氏と議論し,表現論などの手法を用いて新たな解決の糸口を見つける。多重Eisenstein級数の基礎研究を発展させるべく,まずはElliptic多重ゼータ値やElliptic KZB方程式などで使われている手法を学び,多重Eisenstein級数との関係性や類似点などを探る。今年度は,Max Planck研究所(ドイツ)に長期滞在するため,これらに精通する専門家(例えば,N. Matthes氏など)との研究交流が期待出来る。また,多重Eisenstein級数の非可換生成級数が満たす微分方程式の研究を行い,多重Eisenstein級数とB. Enriquezによるelliptic associatorとの関連を見出す。29年度が最終年度であるため、記入しない。整数論29年度が最終年度であるため、記入しない。
高感度同時検出発光酵素イムノアッセイの開発と3種歯周病原因菌の検出への応用

歯周病菌遺伝子のMultiplex PCRの増幅産物を希釈し三成分同時発光検出酵素イムノアッセイにより歯周病菌遺伝子の検出したところ,Pg菌、Aa菌ではPCR増幅産物の12800倍希釈まで,Td菌では3200倍希釈までそれぞれ検出可能であった。今年度はオワンクラゲイクオリンとカルシウムイオンの反応、ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの反応に引き続く、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を化学発光法で測定する三酵素同時検出法の開発を行った。本測定法の原理は以下の通りである。第一段階ではイクオリンをカルシウムイオンで発光検出し、第二段階ではルシフェラーゼをルシフェリン、ATP、Mg2+、O2存在下で発光検出する。第三段階ではHRPをルミノール、過酸化水素を基質として発光検出する。この時、共存するルシフェリンはHRPの発光増強剤として作用する。さらにルシフェラーゼ由来の発光は陽イオン界面活性剤である塩化ベンザルコニウム(BAC)を添加し、ルシフェラーゼ活性を抑制することで排除した。本法における、イクオリンの検量域は1.2x10-194.8x10-16mol/assay、最小検出感度は2.76x10-20mol/assay、同時再現性は2.24.2%であった。また、ルシフェラーゼの検量域は5.3x10-182.2x10-14mol/assay、最小検出感度は6.51x10-19mol/assay、同時再現性は2.64.9%であった。HRPの測定においては、HRPの基質溶液に1.0mMp-Iodophenolの添加を試みたところ、約2倍発光強度が上昇した。0.25%BACを加えルシフェラーゼ活性を抑制し、その後の発光を測定したところ、HRPの検量域は4.9x10-163.1x10-14mol/assay、最小検出感度は1.86x10-17mol/assay、同時再現性は2.47.9%であった。次年度以降これら三酵素を標識とする免疫測定法や遺伝子診断法に本法を応用する。本研究では、歯周病菌の中で代表的なPorphyromonas gingivalis、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Treponema denticolaの3菌の遺伝子をPCR増幅と、イクオリン(Aq)、ビオチン化ルシフェラーゼ(b-Luc)、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)を標識酵素とする三成分同時生物化学発光検出酵素イムノアッセイを組み合わせた方法を検討した。Reverse側にFITC、Forward側にdigoxigenin、biotin、Texas Redで標識した計3対のプライマーを用いて歯周病菌遺伝子のMultiplex PCRを行った。得られた増幅産物を希釈し、抗FITC抗体固相化プレートに添加後、室温で1時間放置した。洗浄後、Aq標識抗digoxigenin Fab抗体結合体、ストレプトアビジン・b-Luc複合体、HRP標識抗Texas Red抗体を各々添加し、1時間反応させた。再洗浄後、カルシウム溶液を加え、Aqの発光を測定した。次にルシフェリン溶液を加え、b-Lucの発光を測定し、最後にルミノール溶液を加え、HRPの発光を測定し、同一ウェル内で3菌の遺伝子のPCR増幅産物の検出を行った。同時発光検出法による各酵素の検出感度はAq : 2.8×10-20、b-Luc : 6.5×10-19、HRP : 1.9×10-17mol/assay、同時再現性は7.9%以下であり、全測定が約13分で可能であった。本発光法を三成分同時発光検出酵素イムノアッセイによる歯周病菌遺伝子の検出に適用した。Multiplex PCR条件は検討の結果から、Pfu Turbo DNAポリメラーゼを用い、サイクル数は20回を至適とした。得られたPCR増幅産物を3成分同時BCLEIAで検出したところ、歯周病菌を迅速かつ高感度に検出することが可能であった。希釈試験では3種の菌全てで10012800倍希釈まで正確かつ高感度な検出が可能であった。この結果は、同時に行なったアガロースゲル電気泳動法と比較し、約936倍高感度であった。これまでの研究によって、増幅効率の悪いTd菌にはAq標識抗digoxigenin Fab抗体を、Aa菌にはSA/b-Luc複合体を、Pg菌にはHRP標識抗TR Fab'抗体をそれぞれ使用することが一番良好な感度で検出できることを明らかにしていた。しかし、HRPを標識する高力価な抗TR抗体を入手することが困難であった。本研究では、新たな高力価の抗TR抗体を調製し、HRP標識抗TR Fab'抗体を用いることで高感度な測定系を構築することを目的とした。今回、家兎2羽より得られた抗TR抗血清約97mLから力価の高い抗TR抗体を約2.8mg得ることができた。得られた抗TR抗体は、ペプシン処理、及び2-メルカプトエタノールで処理することでFab'化した。これをマレイミド化したHRPと反応させ、HRP標識抗TR Fab'抗体を調製した。

これを用いて三成分同時BCLEIAを行った。Pg菌、Aa菌は、それぞれHRP、b-lucの発光によりPCR増幅産物の12800倍希釈まで検出可能であった。Td菌は、Aqの発光によりPCR増幅産物の3200倍希釈まで検出可能であった。同時に行った澤田らの方法、すなわちPg菌に対しAq標識抗TR Fab抗体、Aa菌に対しHRP標識抗digoxigenin Fab抗体、Td菌に対しSA/b-Luc複合体で検出する方法と比較すると、Aa菌ではほぼ同程度の感度が得られ、Pg菌では23倍、Td菌では1.8倍高い感度が得られた。歯周病菌遺伝子の歯肉縁上プラークからの添加回収試験では、溶出操作の繰り返しは5回を最適とし、500μLのDNA溶液を得た。このときの添加回収率は、Pg菌:85%、Aa菌:130%、Td菌:70%となった。以上、新たにHRP標識抗TR Fab'抗体を調製することで、高感度にPg菌、Aa菌、Td菌の同時検出が可能となった。歯肉縁下プラークなどの臨床検体中の菌を添加回収試験同様検出することが可能であれば、本三成分同時BCLEIAは、歯周病菌遺伝子の高感度検出法として歯周病の早期発見と治療に有用な方法になるものと期待される。
シアノバクテリアのゲノムコピー数制御システムの構築

淡水生シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942は細胞あたり複数コピーの染色体を保持している。しかし複数コピーの染色体を持つ生物の増殖機構や、染色体コピー数を規定する要因は不明であった。本研究からS. 7942の染色体コピー数は培地中のリン酸濃度に強く依存し、リン酸濃度の低下と共に染色体コピー数も減少すること、この制御にはリン酸欠乏ストレス応答の制御因子が関与することが示された。またSynechocystis sp. PCC 6803においても同様にコピー数の変動が観察されたことから、淡水性シアノバクテリアに共通した現象であることが明らかとなった。淡水生シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942、Synechocystissp.PCC 6803は細胞あたり複数コピーのゲノムを保持することが知られている。このようなゲノム倍数性は高度好熱菌、放射線耐性菌の他、いくつかの種で報告されており、これらの生物はゲノムのバックアップを常備することでUVや活性酸素によるDNA傷害からゲノム情報を保護し、環境に適応するためのロバストネスを獲得していると考えられる。しかしながらゲノムコピー数を規定するメカニズムや、複数コピーゲノムの複製機構については不明であった。申請者のこれまでの研究からSynechococcus、Synechocystisのゲノムコピー数は培養条件、増殖ステージによって大きく変動することが明らかとなった。本申請ではSynechococcus、Synechocystisのゲノムコピー数制御機構を解明すると共に、これに積極的に働きかけゲノムコピー数の人為的な制御システムの構築を目指す。ゲノムコピー数の変動には遺伝子発現が深く関与することが示唆されていたため、Synechococcusの各増殖ステージにおける遺伝子発現をRNA-seq法により解析した。その結果、ゲノムコピー数の減少する定常期(stationary phase)に強く誘導される遺伝子群を同定した。また、同じタイミングで採取した試料を用いてメタボローム解析を行った。ゲノムコピー数の増加する誘導期(Lag phase)では解糖系、TCA回路中間体、アミノ酸、ATP、GTPが多く蓄積し、その後の対数増殖期(Log phase)ではこれらの代謝産物量は安定化した。この結果より、ゲノムコピー数の増加、つまりゲノム複製は代謝と密接に連動して起こることが示された。ゲノムコピー数の変動には遺伝子発現が関与することが示されていたため、Synechococcusの各増殖ステージにおける遺伝子発現をRNA-seq法により解析した。その結果、ゲノムコピー数の減少する定常期において、リン酸の代謝や取り込みに関わる遺伝子群の発現が大きく変動することを見出した。リン酸を制限した培地に置換するとSynechococcusのゲノムコピー数は減少することから、ゲノムコピー数の変動にはリン酸ストレス応答が深く関与することが示された。これらの遺伝子の中で、定常期に強く誘導された転写因子Xに着目し研究を進めた。転写因子Xの欠損株、過剰発現株を作製しそれらの表現型を解析した結果、Xの過剰発現によってゲノムコピー数の減少が促進された。またコピー数の減少はXの破壊によって抑制された。これらの結果よりSynechococcusにおいて転写因子Xがゲノムコピー数を制御に関わることが示された。またフローサイトメーターを用いてSynechocystisのゲノムコピー数について解析を行った結果、SynechocystisはSynechococcusよりも多くのゲノムを保持することが明らかとなった。また、定常期、リン酸制限培地におけるゲノムコピー数の変動はSynechococcusと同様であることが示された。淡水生シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942、Synechocystissp.PCC 6803は、細胞周期の全てのステージにおいて、細胞あたり複数コピーのゲノムを保持している。しかしながら複数コピーゲノムの複製機構や、ゲノムコピー数を規定するメカニズムは不明であった。平成26年度までの研究結果からSynechococcusのゲノムコピー数は培地中のリン酸濃度に強く依存すること、またその制御にはリン酸飢餓ストレス(以後P-ストレス)に応答する転写因子Xが関与することが示された。平成27年度は以下の項目について研究を実施した。(1)P-ストレスによって引き起こされるゲノムコピー数減少のメカニズムの解明:P-ストレス時のDNA量、複製活性、細胞数を解析した。その結果、P-ストレス下ではDNAの複製開始が特異的に阻害されることが示された。一方、DNA複製の進行、細胞数はコントロールと同程度であった。これらの結果からP-ストレス下では、DNA複製と細胞分裂頻度のバランスが崩れることによって、ゲノムコピー数が減少すると考えられた。(2)P-ストレスの代謝への影響: P-ストレスによる代謝産物量の変化についてメタボローム解析を実施した。その結果P-ストレス下では核酸前駆体の減少が確認された。(3)転写因子Xの機能解析:Xの制御する遺伝子を同定するために、Xの過剰発現株を用いてRNA-seq解析を行った。

その結果、リン酸ストレス応答におけるセンサーキナーゼSphSとレギュレーターSphRに加え、SphS-Rを負に制御するSphUの顕著な誘導発現が確認された。転写因子XがSphS-Rシグナル伝達系とクロストークすると考えられたため、XとsphS遺伝子の二重破壊株を作製した。現在これらの株に関してゲノムコピー数への影響を解析中である。淡水生シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942は細胞あたり複数コピーの染色体を保持している。しかし複数コピーの染色体を持つ生物の増殖機構や、染色体コピー数を規定する要因は不明であった。本研究からS. 7942の染色体コピー数は培地中のリン酸濃度に強く依存し、リン酸濃度の低下と共に染色体コピー数も減少すること、この制御にはリン酸欠乏ストレス応答の制御因子が関与することが示された。またSynechocystis sp. PCC 6803においても同様にコピー数の変動が観察されたことから、淡水性シアノバクテリアに共通した現象であることが明らかとなった。当初計画に沿った研究を進めることができているため。微生物分子遺伝学定常期に強く誘導される転写因子Xについて引き続き機能を解析する。Xを過剰発現させることでゲノムコピー数は減少するが、これがDNA複製の停止によるものか、細胞分裂の促進によるものかを明らかにする。さらにXの制御する下流の遺伝子について、Xの過剰発現株を用いてRNA-seq解析を行う。Xの制御下の遺伝子の内、ゲノムコピー数制御に関わる遺伝子を選別し、これらを欠損、過剰発現させてゲノムコピー数への影響を調べる。当初計画に沿った研究を進めることができている。Synechocystisを材料とした研究に関して新たな展開があり、当初計画以上の成果が期待できる。年度末の予算調整をする上で金額の調整が困難であり、無理に消費するよりも来年度予算に宛てた方が有効に活用できると考えたため。RNA-seqにより同定した定常期に強く誘導される遺伝子群についてその機能を解析する。特に転写制御因子に着目し、これらの欠損株、過剰発現株の表現型、ゲノムコピー数への影響を解析する。一方で培養条件の検討も継続し、コピー数が増減する条件を探す。Synechococcusのゲノムコピー数が4コピーなのに対し、Synechocystisのゲノムコピー数は約200コピーであることが報告されていたが(Griese and Soppa, FEMSmicrobiol. lett., 2011)、論文に用いられている株についてFACS解析を行った結果、Synechococcusの2倍から4倍程度であることが示された。
難治性ぶどう膜炎の細胞生物学的・免疫学的研究

細胞のアポトーシスを制御するアポトーシス関連分子としていくつかの蛋白が知られているが,このうちBcl-2はアポトーシスを抑制すると考えられている.また,Caspase8はFasLやTNFRからのアポトーシスシグナルを伝達する蛋白である.本研究では今年度,ぶとう膜炎患者末梢血単核球(PBMC)のアポトーシス関連分子の発現をmRNA及び蛋白レベルで解析した.その結果,bcl-2,caspase 8のmRNAは,ぶとう膜炎患者も健康成人もいずれも発現がみられた.一方蛋白レベルでの発現を比較すると,活動性ぶとう膜炎患者ではBcl-2とCaspase 8が減少していたが,非活動性ぶとう膜炎患者ではCaspase 8が増加していた.これより非活動性ぶとう膜炎患者におけるPBMCのアポトーシス誘導が示唆される.一方実験的ぶとう膜炎(EAU)に関しては従来Th1優位の自己免疫疾患であるとされている.また近年,ヒトの自己免疫疾患の炎症活動性にTh1及びTh2のバランスが関与していることが報告され注目を集めている.今年度は,非免疫の0日群及び,免疫後3,6,8,10日群から脾臓を摘出し,比重遠心法でリンパ球を分離し細胞表面のCD4および細胞内のIFN-γ,IL-4を染色し,フローサイトメータで解析した.その結果CD4^+細胞におけるIFN-γ産生細胞の割合は,EAU発症前の免疫後3,6,8日群で有意に増加したが,発症後の10日群では減少した.一方,CD4^+細胞におけるIL-4産生細胞の割合は発症直前の8日群で増加したが,10日群では減少し始めた.また,CD4^+IFN-γ産生細胞/CD4^+IL-4産生細胞比は,3日群から上昇し6日群で更に上昇したが8日群では低下した.これより発症過程における脾臓Th細胞は発症以前に最もTh1優位になり,その後はむしろ減少する事が明らかとなった.1.T細胞の活性化活動性ぶどう膜炎を有する患者のCD4陽性細胞のCD69陽性率は正常対照に比べ有意に高く,ヘルパーT細胞が活性化状態にあることが確認された.しかしこのCD69陽性率はOKT-3刺激による培養24時間後から,正常対照では有意に上昇したのに比べて,ベーチェット病患者群では軽度上昇するにとどまり,24時間以降は対照群よりも有意に低値となった.またCD4陽性細胞におけるFas抗原は,OKT-3刺激下の培養により対照群では有意に増加するのに比べ患者群では明らかな増加がみられず,24時間後には対照群のFas抗原陽性率が患者群よりも高くなっていた.即ち,患者T細胞はある程度に活性化された状態にとどまり,リンパ球を活性化するような刺激に対する応答性はむしろ低くなっていると考えられる.Fasリガンドについては,CD4陽性細胞では対照群,患者群いずれも24時間の刺激後に有意に上昇したがCD8陽性細胞では対照群のみ有意に上昇し,患者群では変化がみられなかった.2.アポトーシスの誘導リンパ球をOKT-3により活性化した後アポトーシスを誘導する刺激下で培養すると,対照群と非活動性ぶどう膜炎の患者群では有意にアポトーシス細胞の割合が上昇したが,活動性患者群では有意な上昇はみられなかった.即ち活動性ベーチェット病患者のT細胞はアポトーシス抵抗性であり,AICDを介した消炎が起きにくいことが明らかとなった.以上の結果よりベーチェット病においてはT細胞の活性化とアポトーシス,AICDの機序に異常を生じ,これが慢性炎症病態を形成する原因になりうると考えられた.細胞のアポトーシスを制御するアポトーシス関連分子としていくつかの蛋白が知られているが,このうちBcl-2はアポトーシスを抑制すると考えられている.また,Caspase8はFasLやTNFRからのアポトーシスシグナルを伝達する蛋白である.本研究では今年度,ぶとう膜炎患者末梢血単核球(PBMC)のアポトーシス関連分子の発現をmRNA及び蛋白レベルで解析した.その結果,bcl-2,caspase 8のmRNAは,ぶとう膜炎患者も健康成人もいずれも発現がみられた.一方蛋白レベルでの発現を比較すると,活動性ぶとう膜炎患者ではBcl-2とCaspase 8が減少していたが,非活動性ぶとう膜炎患者ではCaspase 8が増加していた.これより非活動性ぶとう膜炎患者におけるPBMCのアポトーシス誘導が示唆される.一方実験的ぶとう膜炎(EAU)に関しては従来Th1優位の自己免疫疾患であるとされている.また近年,ヒトの自己免疫疾患の炎症活動性にTh1及びTh2のバランスが関与していることが報告され注目を集めている.今年度は,非免疫の0日群及び,免疫後3,6,8,10日群から脾臓を摘出し,比重遠心法でリンパ球を分離し細胞表面のCD4および細胞内のIFN-γ,IL-4を染色し,フローサイトメータで解析した.その結果CD4^+細胞におけるIFN-γ産生細胞の割合は,EAU発症前の免疫後3,6,8日群で有意に増加したが,発症後の10日群では減少した.一方,CD4^+細胞におけるIL-4産生細胞の割合は発症直前の8日群で増加したが,10日群では減少し始めた.また,CD4^+IFN-γ産生細胞/CD4^+IL-4産生細胞比は,3日群から上昇し6日群で更に上昇したが8日群では低下した.
縦波中の船体運動と転覆の関係について

本研究では、1.船舶の初期要因として考えられる積み荷や漁網等の横移動による傾斜状態での転覆現象を明らかにするために、縦波中で横運動と縦運動が連成する傾斜船の連立方程式を導いた。また、模型船を用いた水槽実験で、縦波中で横運動と縦運動が連成する現象を確認し、連立方程式の妥当性を検討したが、説明できるまでには至らなかった。2.縦波中において横揺れを含む横運動と縦運動が連成する場合の連成運動方程式を用いて、縦波中の横運動、特に転覆に関係の深い横揺れと転覆現象をシミュレートするためのコンピュータ・プログラムを作成し、コンピュータ・グラフィック上でのシミュレートを試みたが、検討しなければならない問題はあるものの、可能であることを示した。3.転覆の原因とみられる漁網の移動と転覆の関係について、実船の転覆事故を例に、転覆の原因と機構を明らかにし公表した。4.研究の過程で検討した、転覆の最も大きな要因とされている甲板上への海水打ち込み水量の推定法について実験結果とともに公表した。1.実際に発生した転覆事故の船について、転覆時の積み荷の状態や漁網の荒天準備あるいは操業時の状況について調査し、積み荷や漁網の移動等を考え、模型船を製作し、傾斜状態について水槽実験を行い、実験結果から転覆時の船体運動の状況を正確に把握した。2.転覆の原因とみられる甲板上への海水打ち込みや打ち込み水の甲板上での挙動、あるいは漁網の移動の有無について検討し、それらと復原性との関係から転覆との関わりについて一定の結論を得た。3.船体の運動方程式を用いて、波浪中の船体運動をシミュレートするためのコンピュータ・プログラムを作成し、コンピュータ・グラフィック上でのシミュレートを試み、コンピュータシミュレーションが波浪中の船体運動を知る有効な方法であることが確認できた。4.以上の研究から、傾斜船の縦波中の転覆機構を明らかにするための基礎資料を得ることができた。。1.縦波中おいて横揺れを含む横運動と縦運動が連成する場合の船体動く流体力を求め、それを用いて達成運動方程式を検討し、導いた。2.模型船を用いて水槽実験を実施し、速成運動方程式の妥当性について検討した。その結果、達成運動方程式から得られる数値計算結果と水槽実験結果が定性的には一致しているものの、定量的には差異があることが認められた。3.数値計算結果と水槽実験結果の定量的な差異について現在検討している。平成11年度には主として次のことが明らかになった。1.縦波中において横揺れを含む横運動と縦運動が連成する場合の連成運動方程式を用いて、縦波中の横運動、特に転覆に関係の深い横揺れと転覆現象をシミュレートするためのコンピュータ・プログラムを作成し、コンピュータ・グラフィック上でのシミュレートを試みたが、検討しなければならない問題はあるものの、可能である。2.水槽実験時に録画した縦波中の横運動と縦運動の連成運動とコンピュータ・グラフィック上でシミュレートした縦波中の横運動と縦運動の連成運動を比較、検討したが、転覆現象をシミュレートすることは、甲板上への海水打ち込みやその挙動まで考慮しなければならず、解決しなければならない問題が残っている。
老化シグナル制御による生活習慣病治療法の開発

老化の研究は世界的にもまだ端緒についたばかりであり、その機序はほとんど解明されていない。通常ヒト正常体細胞の分裂回数は有限であり、ある一定期間増殖後、細胞老化とよばれる分裂停止状態となる。その寿命は培養細胞のドナーの年齢に相関すること、また、早老症候群患者より得られた細胞の寿命は有意に短いことも報告されている。そこで我々は、血管の老化研究を「細胞レベルの老化が個体老化の一部の形質、特に病的な形質を担う」という仮説に基づいて進めることにした。我々はこのアプローチによってこれまでテロメアシグナル(Mol Cell Biol.2001;21:3336-3342,Circulation.2002;105:1541)やAngiotensinII/Ras/ERKシグナル(Circulation.2003;108:2264,Circulation in press)、インスリン・Aktシグナル(EMBO J.2004;23:212)が細胞レベルの老化に重要であることを報告し、さらにこれらのシグナルが血管老化・動脈硬化の病態生理に深く関与していることを示唆してきた。本研究ではさらに高齢者に認められる日内リズムの障害に細胞老化シグナルが関与していることを調べるために、細胞レベルの老化が時計遺伝子の発現にどのような影響を及ぼすかについて検討した。初期経代の血管細胞に血清刺激を加えると、時計遺伝子の発現は24時間周期の変化を示すようになる。それに対して老化した細胞では、その振幅が明らかに低下していた。テロメレースの導入によって細胞老化を抑制すると、その障害は解除された。老化したマウスにおいても、末梢臓器の時計遺伝子発現は障害されていた。そこで生体内における細胞老化の関与を調べるために、若年マウスに老化した細胞を含んだマトリゲルを移植、あるいは逆に、初期経代細胞を老化マウスに移植して、時計遺伝子の発現を観察した。その結果、老化マウスに移植された初期経代細胞ではほぼ正常であったのに対し、若年マウスに移植された老化細胞では、著しく時計遺伝子の発現が障害されていた。この障害は、細胞老化を抑制する遺伝子を導入しておくことによって正常化したことから、細胞老化シグナルの制御によって個体老化に伴う時計遺伝子の発現を改善し、高齢者で認められる生理的な日内変動リズムを改善しうることを示唆すると考えられた。ヒトは老化するに従って様々な日内変動リズムが障害されるようになる。例えば、高齢者では睡眠覚醒の日内リズムの障害のため不眠症を発症することが多い。血圧は夜間に低下する日内変動リズムを呈するのが通常であるが、高齢者では夜間の血圧低下が見られないため、臓器障害が進み、脳卒中や急性心筋梗塞などの生活習慣病を発症しやすくなると報告されている。最近、一連の時計遺伝子が発見され、その発現が24時間周期に変動することによって、下流の遺伝子発現を調節し、さらに様々な日内リズムを制御していると考えられるようになった。しかし、老化によって血圧を含めた日内変動リズムの障害が起こる機序については明らかではない。我々は以前より、細胞レベルの老化がヒトの加齢に伴う疾患の病態生理に関与することを示唆してきた。そこで今回は、細胞レベルの老化が時計遺伝子の発現にどのような影響を及ぼすかについて検討した。

初期経代の血管細胞に血清刺激を加えると、時計遺伝子の発現は24時間周期の変化を示すようになる。それに対して老化した細胞では、その振幅が明らかに低下していた。テロメレースの導入によって細胞老化を抑制すると、その障害は解除された。老化細胞における時計遺伝子発現の低下は、CREB転写因子の活性化によって部分的に改善した。一方CREB転写活性を抑制しておくと、初期経代細胞においても時計遺伝子の発現は低下したことから、CREBの活性低下が老化に伴う時計遺伝子発現の低下に重要であると考えられた。老化細胞ではERKの活性が低下していること、初期経代細胞でERKを阻害するとCREBの活性は低下し、時計遺伝子の発現も障害されることから、CREBの上流のシグナルとしてERKの重要性が示唆された。老化したマウスにおいても、末梢臓器の時計遺伝子発現は障害されていた。そこで生体内における細胞老化の関与を調べるために、若年マウスに老化した細胞を含んだマトリゲルを移植、あるいは逆に、初期経代細胞を老化マウスに移植して、時計遺伝子の発現を観察した。その結果、老化マウスに移植された初期経代細胞ではほぼ正常であったのに対し、若年マウスに移植された老化細胞では、著しく時計遺伝子の発現が障害されていた。この障害は、細胞老化を抑制する遺伝子を導入しておくことによって正常化したことから、細胞老化シグナルの制御によって個体老化に伴う時計遺伝子の発現を改善し、高齢者で認められる生理的な日内変動リズムを改善しうることを示唆すると考えられた。心血管系の再生治療の方法として、これまで骨髄細胞が主に用いられてきたが、採取に全身麻酔を必要とすること、骨や脂肪への分化が懸念されることなどから、我々は末梢血単核球を用いた血管再生治療の開発を行なった。基礎実験の結果、骨髄細胞とほぼ同程度の血管再生能力があることがわかった。その後、従来の治療法では下肢切断が免れない重症下肢虚血患者に末梢血単核球を用いた血管再生治療を行ない、救肢率80%以上、疼痛や潰瘍の改善率70-80%など良好な効果を確認した(Lancet 2002)。その高い安全性と有効性から日本で初めて高度先進医療の認定を受けることができた。臨床データの解析から、その有効性は、移植された幹細胞数には相関せず、治療後の血管新生促進性サイトカイン値の上昇と相関することが明らかとなった。当時、移植された細胞から放出されるサイトカインがその効果に重要であると考えられていたが、我々が行なったサイトカインのノックアウトマウスを用いた基礎研究から、単核球移植により、虚血肢の骨格筋細胞が刺激され、骨格筋によるサイトカインの発現が亢進することが明らかとなった。さらに詳細な検討を重ねた結果、単核球によって移植部の骨格筋細胞の再生が誘導され、再生中の細胞から豊富に分泌されるサイトカインが血管の再生を促進することが、本治療の作用メカニズムであることが明らかとなった(Circ Res 2006)。我々は顆粒球コロニー刺激因子による心筋梗塞後のリモデリング抑制効果の作用
貝殻粉砕物の吸水性,中和促進性を活用した強酸性発生土の安定処理策

この研究は,3つの毅階から成り立っている.すなわち,(1)通常の土に比べて黄鉄鉱を多く含む酸性硫酸塩土に,牡蠣殻粉砕物由来の炭酸カルシウムを混ぜ合わせたときのpHの上昇にともなう土中間隙水量の変動メカニズムの解明,(2)牡蠣殻粉砕物を安定材とともに酸性硫酸塩土に混合したときの支持力,強度特性の把握および(3)自然環境下における「酸性硫酸塩土-牡蠣殻粉砕物-安定材混合材料」の長期安定性の確認と剛性の評価である.これらを追究するために実施した室内での化学的,力学的試験および実地での試験施工や追跡調査から,次のような成果が得られた.1.酸性硫酸塩土のように遊離鉄含有量の多い建設発生土を石灰で安定処理すると,種々の水酸化鉄生成による「吸水反応」や鉄酸化物生成による「脱水反応」のほか,貝殻由来炭酸カルシウムの溶解にともなう「炭酸ガスの揮散」に起因して含水比が変化する.2.酸性硫酸塩土に牡蠣殻粉砕物を混入すると,土中間隙水の低減と中和作用の進行とが同時にもたらされ,別途添加する安定材の効用を助長する.したがって,酸性硫酸塩土の改良にあたっては,使用する安定材の量を1/3程度少なく見積もることができる.3.実地に試験的に建設した二層構成路床で1年にわたり計測したインパクト値I_aによれば,当該路床(5工区)の支持力は時間の経過とともに漸次増加し,とりわけ,牡蠣殻粉砕物と安定材との併用によって酸性硫酸塩土を処理した工区では,安定材のみを添加した工区に比べてI_aのみならず動的,静的逆解析で算出した弾性係数も大きくなる。(1)酸性硫酸塩土のように遊離鉄を多く含有する建設発生土を石灰で安定処理する場合には,種々の水酸化鉄生成にともなう「吸水反応」や鉄酸化物生成にともなう「脱水反応」,さらに,貝殻由来炭酸カルシウムの溶解にともなう「炭酸ガスの揮散」などがもたらす含水比の変化を考慮に入れる必要がある.(2)試料土単体のCBRにpHの違いによる顕著な差は認められないものの安定材添加後のCBRにはpHの影響が明確に現れ,酸性硫酸塩土のCBRは非酸性土の1/21/4となる.また,安定処理した酸性硫酸塩土,非酸性土の養生180日目における一軸圧縮強さを比較すると,前者は後者の1/10程度となる.このような結果が得られた原因として,酸性硫酸塩土では添加した安定材の大半が中和作用(硫酸カルシウムの生成)に消費されてアルカリ雰囲気の低下を生じ,珪酸石灰水和物やアルミン酸石灰水和物が生成されにくくなることが考えられる.(3)径2mm未満に粉砕した牡蠣殻を混入した酸性硫酸塩土の締固め特性に殻の径,形状や量はほとんど関与しない.さらに,殻を混ぜてから締固めるまでの時間間隔が異なっても最適含水比,最大乾燥密度の変動は小さい.(4)懸濁液法によるpH測定において,粉砕殻を混入した酸性硫酸塩土における中和の進行速度は殻の径や形状に関連をもち,粉粒であるほどpH=7に達するまでの時間は短くなる.

1.牡蠣殻由来炭酸カルシウムの酸性硫酸塩土(極強酸性:pH=2.6)の中和処理,安定処理への効用を確かめるために,この土と粘土(明酸性:pH=52)に安定材(セメント系固化材,消石灰)のみを28%添加して作製した供試体,さらに,安定材のほかに径0.850.25mmの粉砕殻を土の乾燥質量に対して2割混合して作製した供試体の水浸4日間での吸水膨張量ならびにCBRを比較したところ,吸水膨張量に土の種類や粉砕殻混入の有無による差は認められなかったものの,CBRについてはとくに酸性硫酸塩土で安定材と粉砕殻との併用効果が明確に現れた.昨年度の研究において,試料土に粉砕殻を混ぜると含水比は5ないし10%低下することが判明しており,今回の試験結果と併せて考察すれば,粉砕殻は酸性硫酸塩土の間隙水の低減と中和作用の進行とを同時にもたらし,別途添加する安定材の効用を助長するものといえる.したがって,酸性硫酸塩土の改良にあたっては,使用する安定材の量を少なく見積もることも可能となる.2.上記の室内試験で取り扱った粘土(明酸性:pH=5.2)を埋め立てて造成した地盤の浅層改良工事(全5工区)に併せて1工区だけ酸性硫酸塩土(極強酸性:pH=2.6)を搬入し,2種類の配合条件のもとで安定処理を施した.施工後9ヶ月間の支持力の推移をみると粘土,酸性硫酸塩土ともに径4.750mmの粉砕殻を2割混合した分,セメント系固化材の添加量を1/3減じた工区において衝撃加速度値は漸次大きくなり,かつ,FWDによるたわみ量は小さくなる傾向が示された.注)平成18年度は,空気中養生期間を360日までとした室内一軸圧縮試験ならびに追跡調査期間を施工後1年までとした現地計測を継続して行い,得られた成果を報告するものとする.能登半島七尾湾に面する石川県七尾市中島町の公有水面埋立地の一角約160m_2を1mの深さまで掘削し,自走式土質改良機を用いて掘削土(粘土,pH≒5)にセメント系固化材を6%(乾燥質量比)添加,混合して一旦0.5mの厚さに埋め戻した.続いて,この層の上に「掘削土-セメント系固化材(添加率9%)混合物」,「掘削土-セメント系固化材(添加率6%)-粉砕した牡蠣殻(粉砕殻,混入率20%)混合物」をそれぞれ0.5mの厚さに2工区分ずっ埋め戻した.ここに,1工区あたりの幅および長さは2mおよび10mである.さらに,掘削土に替えて別の工事現場に出現した酸性硫酸塩土(pH<3)を用いた混合物を1/2工区分ずっ埋め戻した.これら5つの工区で,施工後およそ1年にわたって地盤簡易支持力測定器による衝撃加速度値(インパクト値)I_αの計測を定期的に実施するとともに,3ヶ月経過時にはFWDによるたわみ量調査と現場CBR試験とを行った.なお,現場CBRは6ヶ月経過時にも求めてI_αとの整合性を確認した.その結果,明酸性の掘削土も極強酸性の酸性硫酸塩土も,セメント系固化材と粉砕殻との併用によって支持力の大きい,変形の小さい改良地盤を構築できることが明らかとなった.加えて,粉砕殻は中和作用を促進する効果のみならず,セメント系固化材の使用量を1/3程度低減できる効用も合わせ持つことが判明した.一方,現地調査と並行して室内で実施した一軸圧縮試験(最長材齢360日)の結果によれば,一軸圧縮強さq_uとI_α現場CBRとの間には高い相関が認められ,I_αをもとに強度発現の過程や支持力の増加傾向を推測可能であることがわかった.また,動的および静的逆解析によって改良地盤の弾性係数を求める演算プログラムを作成し,粉砕殻の混入は剛性の面からも有益であることを確かめた.
T細胞のヒト胸腺における分化成熟過程とそれに影響する各種因子の性格について

BSA不連続濃度勾配法によりヒト胸腺細胞を分画し、各画分の胸腺細胞の分化レベルの検索を行いその相違について検討した。レクチン刺激によって胸腺細胞に誘導されたインタ-ロイキン・レセプタ-(ILー2R)の解析から胸腺細胞は、反応性の異なる三種類の細胞群に分画されることが示された。つまり、(1)レクチン刺激によってILー2Rを発現し、ILー2を産生して増殖する細胞群(Fr I、II、)、(2)レクチン刺激によってILー2Rを発現するが、ILー2を産生できない細胞群(Fr III)、(3)レクチン刺激によってILー2Rを極めて僅かにしか発現しないかあるいはILー2の細胞内シグナル伝達に欠陥を有する細胞群(Fr IV,V)である。また細胞膜抗原の解析からFr IIIにはCD3・WT31共にhigh intesity positive細胞が多く認められ、この画分の細胞群においてはDNAレベルの再構成がタンパク質レベルでの発現に結び付いている可能性が示唆された。しかしFr IIIにおける主要な細胞群はCD4^+8^+細胞であること、ILー2に対する反応性は認められるもののILー2産生能が低いことなどを総合すると、この画分に存在するCD3・WT31high intensity positive細胞は未成熟な胸腺細胞と考えられた。またILー2Rの発現を認めず、CD3・WT31発現もlow intensity positiveな細胞が主体の画分IV・VにおいてもT細胞抗原レセプタ-(TcR)β鎖の再構成を認めたことは、少なくともDNAレベルにおいては、これらの細胞もTcR遺伝子の再構成をしている可能性を示唆すると考えられた。しかし、側方散乱が低値であること、培養過程における死細胞に出現はこの画分において最も多く認められることなどから、この画分に含まれる細胞では。機能的なTcRαβを発現できない状態の再構成を起こしている可能性が考えられ、現在Nothern blotなどの方法を用いてTcRーmessag RNAに質的・量的な異常の有無についても検討中である。T細胞のヒト胸腺における分化成熟過程とそれに影響する各種因子の性格についての解析1、先天性心疾患児の開胸手術に得られた胸腺から分離した胸腺細胞をBSA不連続濃度勾配法によってIVに画分し、CD3、CD4、CD8に対する抗体とTcRα・β鎖に対する抗体WT31を用いて二重染色し、FACSscanによって解析した。分画IではCD3^-WT31^-に細胞分布のピークがあり、分画IIIではCD3、WT31共にbright positive細胞にも明らかなピークを認め、分画IではCD3、WT31共にdull positive細胞にピークを認めた。CD^+4またはCD8^+細胞は低比重分画に含まれ、doble positive細胞は高比重で大部分を占めた。2、DNAの検索には、各分画の細胞をproteinase K・SDSを添加・培養後phenol/chlorofom抽出を行ない、EtOH沈殿にて高分子DNAを回収した。各分画の細胞から抽出したDNAをEcoR・HindIII・BamHIの各制限酵素を用いて切断し、電気泳動後、Southern blottingとNick translationによってプローベとhybridizationを行ない検討した。TcRβをプローベとしたSouthern blot hybridizationの結果では全分画にTcRβの再編成を認め、一方TcRγをプローベとしたSouthern blot hybridizationでは全分画でTcRγの再編成を認めなかった。

以上より生後のヒト胸腺細胞ではTcRβ鎖の再編成を終了しており、BSAによる分画IIIにはDNAレベルでの再編成が細胞膜での発現に結びついている可能性が示唆された。今後この分画の細胞を主体に各種因子のTcR発現に及ぼす影響を検討する予定である。1.ヒト胸腺細胞よりCD3 dull positive、bright positive細胞を得るため、乳幼児の開胸手術時の胸腺より分離した胸腺細胞を12ー26%のBSA密度勾配法にてIーIV画分に分画した。画分IーIIにはCD3 bright positiveでPHA刺激によりILー2を産生する細胞、画分IIIにはCD3 dull bright positiveでILー2産生能は低いがILー2反応性を有する細胞、画分IVにはCD3 dull positiveでILー2に反応性の極めて低い細胞がそれぞれ濃縮された。ついで画分I、III、IVについてCD3と2H4、4B4発現を検討したところCD3+2H4+細胞は12.0%、4.7%、2.8%と低比重より高比重に次第に減少し、CD4+CD8+細胞は33.3%、53.1%、89.0%と増加傾向を示した。次いでPHA、PMA、Ca ionophore、ILー4をそれぞれ単独もしくは組合せて画分III、IVの細胞と48時間培養し画分に含まれるCD3+2H4+細胞、CD4+CD8+細胞の変化を検討した。CD3+2H4+細胞は画分III、画分IVのいずれにおいても培地のみの2.4%、4.2%から20.8%、21.5%とILー4刺激下においてのみほぼ臍帯血に準じた発現を認めた。またCD4+CD8+はIL-4+PMAの刺激下でのみ89%、53%から26%、12%と著減し、この条件下でCD4-CD8+細胞は2.1%、3.8%から41.3%、72.4%に増加、CD4+CD8-細胞は38%、4.4%から16.4%、0.6%に減少した。これらのことから画分III、IVのいずれの細胞もILー4とPMAの存在下でCD3+2H4+、CD3+CD8+を有意に増加し得ることが示された。2.画分III、IVの細胞より高分子DNAを抽出し、EcoR1、BamH1、HindIIIの制限酵素で切断、T細胞betaレセプタ-遺伝子の再編成を検討したところ両画分由来の細胞にも再編成の可能性が示唆された。PMAとILー4刺激によるT細胞レセプタ-のDNAレベルでの発現調節を検討中である。1.ヒト胸腺細胞は先天性心疾患患児の開胸手術時に得られた胸腺から分離した。胸腺細胞のDNA検索には、各画分の凍結細胞群を融解・再浮遊後phenol/chloroform抽出を行い、EtOH沈澱によって高分子DNAを回収した。