hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類細胞核内におけるタンパク質品質管理機構

マウスの温度感受性変異体由来のDNAポリメラーゼα、p180を制限温度下で変性させると核内でHSP90に依存して分解されることを見いだした。そこで、HSP90に相互作用する因子の中でE3ユビキチンリガーゼとして最もよく知られているCHIPに着目した。マウスのCHIPの細胞内局在を免疫蛍光抗体染色法により観察した。CHIPは、主に細胞質に局在していた.一方,種々のストレス存在下でCHIPが核内にも検出された.さらにCHIPとHSP90の核内での相互作用をPLA法により検出した。哺乳類細胞の核内タンパク質品質管理はCHIP-HSP90により変性タンパク質が認識され,分解されると示唆された。哺乳類細胞のゲノムの恒常性維持機構の解明を目指し、マウス温度感受性変異体細胞(tsFT20)由来のDNAポリメラーゼαの制限温度下で生じる核内動態を徹底的に解析し、その結果、「核内の複製関連因子の品質は厳格に管理されており、核内への移行阻害と既に核内に存在しているタンパク質の核内での分解という二つの異なるメカニズムにより異常タンパク質を核内から排除する機構が存在する」という核内因子の品質管理機構という概念を提唱した(J. Biol. Chem. 2009)。この核内タンパク質品質管理機構の分子メカニズムのさらなる解明を目指し、NIH3T3細胞へtsFT20由来の変異を持つポリメラーゼα触媒サブユニットp180を一過性過剰発現させ、制限温度にシフトアップする際に種々の阻害剤を加え,分解を阻害する物質を探索した。その結果、HSP90のC末領域のATPaseの阻害剤であるnovobiocinがp180の核内分解を抑制することを見出した。さらにnovobiocin存在下で,核内の内在性HSP90とプロテアソーム活性化因子PA28 gammaが核小体に共局在することを見出した。従って,核内では構造異常を来たしたタンパク質はHSP90によって認識され、refoldされた後、核内プロテアソームへ引き渡され,分解されるのではないかと考えられた。siRNAによるknock down実験により分解系に働く因子を検証している.さらに核小体ストレスに応じた核内分解系の影響に関してポリメラーゼαをモデルとして解析している.光刺激型GFPの融合タンパク質を利用した、哺乳類細胞の核内には小胞体、細胞質,ミトコンドリア等とは異なるタンパク質の認識・分解系が存在すると示唆された。DNAポリメラーゼαの温度感受性変異体細胞株由来のDNAポリメラーゼαの触媒サブユニットp180を培養細胞内において制限温度下で分解するメカニズムの解明を試みている.これまでの結果から、たどり着いた作業仮説は『核内の変性タンパク質の分解系には.構造異常を来したタンパク質を幅広く認識出来るHSP90が検出し、CHIPがユビキチンリガーゼとして働きプロテアソーム活性化因子PA28gammaを介して核内のプロテアソームにおいて分解される』という物である.核内タンパク質品質管理に働く因子がそろったと考えられた.これまでの実験結果を異なるアプローチでも追試出来るかどうかが仮説を検証する上で最も重要になると考えられ、その検証方法として生細胞観察による実験のデザインを考えた.そのために光刺激型GFPであるkikumeとp180の融合プラスミドの構築を試みた.この光刺激型GFPにより、1細胞レベルでの細胞質、細胞核内でのp180変異体の寿命を測定する。さらにsiRNAや阻害剤存在下での観察を行い、上記の作業仮説の検証を終える.そして、上記仮説の中で最も鍵を握る因子としてCHIP(Carboxy terminus of Hsp70-Interacting Protein)に着目した.CHIPの局在は主に細胞質であるが、核内で神経変性疾患原因因子と共局在することも報告されている.そこで、CHIPがNIH3T3細胞において、どのように核に局在するかどのような環境下で核に局在するかを知ることが重要と考え、NIH3T3細胞のCHIPの細胞内局在を解析した.その結果NIH3T3細胞において、マウスCHIPは主に細胞質に局在し、塩化コバルト添加により一部が核に移行することを見いだした.さらに一過性過剰発現させたCHIPもNIH3T3細胞内で塩化コバルト添加により核に移行した.核内で点変異を有するポリメラーゼαが制限温度下でどのように分解されるかを詳細に解析した。核内品質管理機構は不溶性画分への移行と分子シャペロンとの関係が,未解明で重要な論点になっていることから,自前の研究材料と構造変化と分子シャペロンにのみ標的を絞り,堅実な実験データの集積に専心した。昨年の成果を踏まえて,光刺激型GFPであるkikumeとの融合タンパク質を利用した生細胞観察の実験とsiRNAによるCHIPのノックダウンによる実験とを合わせて,仮説を検証した。NIH3T3細胞にp180tsFT20を一過性過剰発現させシフトアップする前に1.5 mMnovobiocinもしくはMG132を添加し33度1時間添加し,その後、39.5度3時間処理し細胞を回収した。可溶性分画と不溶性画分に分け,ウエスタンブロット法により解析した。Noboviocin存在下では不溶性画分にp180tsFT20は検出され,しかもポリユビキチン化はされていなかった。一方プロテアソーム阻害剤MG132では不溶性画分に集積したp180はポリユビキチン化されており,ユビキチン化する前のステップにHSP90の活性が必要であることが分かった。

さらに,novobiocin存在下で可溶性画分に残っているp180の構造変化を検出する為に可溶性画分をグリセロール密度勾配遠心により分画した。p180tsFT20は制限温度下で構造変化を生じて沈降計数が7.1Sから12S以上のボトムに沈降することが分かった。以上の実験により点変異を有するp180は制限温度下で構造変化が生じて,溶解度の低下を来たし,HSP90の分子シャペロンにより溶解度が低下したp180が認識され,ポリユビキチン化することが分かった。ここまでで,核の中の不溶性に変性するタンパク質のポリユビキチン化と分解にはHSP90が関与していることが分かった。核の中と細胞質で起こる現象の区別を明確にするために、光刺激による観察実験を試みており、しかし、原因不明であるが、光刺激型変異体の発現効率が悪く、EGFPとの融合タンパク質の10分の1以下の効率であり、観察が困難である。安定発現細胞株を作成することで解決できる可能性があり、延長後に完成の目処が立っている。哺乳類細胞核内のタンパク質品質管理機構の解明を目指し、DNAポリメラーゼαの温度感受性変異体を研究材料とした。タンパク質分解系のモデル基質として解析を行ってきた。一方で、DNAポリメラーゼαの温度感受性変異体であるtsFT20細胞を半許容温度で数週間培養するとテロメアの一本鎖領域と二本鎖領域が共に伸長することを見出して、報告してき(MCB, Nakamura, M., et al., 2005, 25, 11073-11088)。テロメア領域のラギング鎖合成が滞ることによりテロメアが不安定化されることが示された。ゲノムの恒常性維持のメカニズムを理解する上で重要な現象であると考えられた。そこで、核内タンパク質品質管理機構の生理的意義を理解するための良いモデルとして利用するために、テロメア領域のラギング鎖合成の分子機構の解析を行った。その結果ラギング鎖を合成するDNAポリメラーゼαはテロメア領域に結合するシェルタリン複合体中の唯一の一本鎖DNA結合タンパク質であるPot1と直接相互作用することを見出した。Pot1はDNAポリメラーゼαの触媒サブユニットのp180のN末領域と直接結合することを酵母two-hybrid法、免疫共沈降反応、GST-pull down法により検出した。マウスとラットのPOT1には80%以上のアミノ酸の相同性を有するpot1Bというホモログが存在し、pot1Aとpot1Bは同様にp180のN末に結合し、テロメアに局在することをFISH法、PLA法により検出した。テロメアのラギング鎖合成の維持に働く重要な分子間相互作用の詳細を明らかにできたと考えられた。核内で異常をきたしたDNAポリメラーゼαがどのように検知され、テロメアの不安定化を引き起こすのかを理解することで、細胞老化、ガン化、ゲノムの恒常性維持機構の理解へとつながると期待できる。マウスの温度感受性変異体由来のDNAポリメラーゼα、p180を制限温度下で変性させると核内でHSP90に依存して分解されることを見いだした。そこで、HSP90に相互作用する因子の中でE3ユビキチンリガーゼとして最もよく知られているCHIPに着目した。
脳内アミロイドβ蛋白の検出を目的とした新規分子イメージングプローブの開発

近年、急速な高齢化に伴い、アルツハイマー病(AD)をはじめとする痴呆性疾患の増加が社会問題の一つになっている。しかし、ADの確定診断は患者剖検脳の病理学的所見(老人斑と神経原線維変化)に委ねられており、重篤な脳障害が生じる前の早期段階でADを診断することは困難となっている。AD発症までの最も初期段階の特徴的な脳病変として、老人斑の沈着が知られており、老人斑の早期検出はADの早期診断につながると考えられる。本研究では、老人斑の主要な構成成分であるアミロイドβ蛋白(Aβ)に選択的結合性を有する分子プローブを開発し、PET,SPECT,MRIを利用して、生体の老人斑を体外から画像化・定量評価することを目的とした。本年度は、カルコンおよびフェニルクマリンを基本骨格とするアミロイドイメージングプローブの開発を試みた。カルコンおよびフェニルクマリン骨格に種々の置換基とヨウ素およびフッ素を導入した誘導体を設計・合成し、アミロイド凝集体を用いたインビトロ結合実験、正常マウス体内放射能分布実験による脳移行性とクリアランスについての検討を行った。その結果、インビトロ結合実験において、一部のカルコン誘導体はアミロイド凝集体に高い結合親和性を有すること、正常マウス脳への高い移行性を示すことが明らかとなった。さらに、これらのカルコン誘導体は投与早期に脳へ移行した後、老人斑の存在しない正常マウス脳から速やかな消失が観察され、昨年度に開発したカルコン誘導体より優れた性質を示した。一方、フェニルクマリン誘導体には、顕著なアミロイド結合性が認められず、マウス脳への移行性も低値を示した。今後、本研究で開発したカルコン誘導体のPET,SPECT,MRI用アミロイドプローブとしての応用が期待できる。本年度は、フラボノイド化合物の一種であるカルコンの基本骨格とするアミロイドイメージングプローブの開発を試みた。カルコン骨格に種々の置換基とヨウ素およびフッ素を導入したカルコン誘導体を設計・合成し、アミロイド凝集体を用いたインビトロ結合実験、正常マウス体内放射能分布実験による脳移行性とクリアランスについての検討を行った。さらに、これらのカルコン誘導体は投与早期に脳へ移行した後、老人斑の存在しない正常マウス脳から速やかな消失が観察され、アミロイドイメージングプローブとして優れた性質を示すことを見出した。今後、ADモデルマウスおよびAD患者脳組織切片を用いた検討を行い、カルコン誘導体のPET,SPECT,MRI画像診断用プローブとしての性能を評価する予定である。
ヒトの子育てと前頭前野発達ーチンパンジー、マカク、マーモセットを実験モデルとして

MRI法により霊長類の乳児期から思春期までの前頭前野を中心とする脳構造の発達変化を分析し、前頭前野を中心とする脳構造の発達様式の霊長類共通の特徴、ホミノイド的特徴、母親以外の家族も子育てを行う霊長類の特徴、ヒト固有の特徴を明らかにした。これらの特徴は、脳システムの進化的変化に関連していることが示唆された。主な研究成果として、3本の学術論文(Sakai et al., Neuroscience Research, 2017; Sakai et al., PLOSONE,査読中)、2本の著書を執筆し、4題の招待講演を発表した。さらに、2015年にはプリマーテス研究会で優秀口頭発表賞を受賞した。ヒトの知性や行動およびヒト固有の精神・神経疾患の病態メカニズムを理解するうえで、ヒト以外の霊長類との比較を通して、ヒトの脳の進化・発達機構を明らかにすることは必要不可欠である。本研究では、磁気共鳴画像(MRI)法を用いて、霊長類4種(ヒト、チンパンジー、マカクザル、マーモセット)の乳児期から思春期における前頭前野の脳構造の成長様式を比較することで、ヒト特異的な前頭前野の発達機構の解明を目指す。本年度の計画として、霊長類の発達期の脳画像分析の基盤構築として、(1)マーモセットの3次元脳解剖画像の撮像、(2)霊長類の発達期の標準脳テンプレートの作成法の確立を行った。(1)マーモセットの3次元脳解剖画像の撮像7テスラの高磁場MRI装置により、生後1ヶ月から2歳頃(早期乳仔期から成体期に相当)の正常個体マーモセットを対象に、3次元の脳解剖画像を収集した。(2)霊長類の発達期の標準脳テンプレートの作成法の確立現在に至るまで、ヒト以外の霊長類の発達期の3次元標準脳テンプレートを構築することが困難であった。この原因として、ヒト以外の霊長類を対象とした発達期の脳画像が非常に少ないと同時に、ヒトの脳構造から大きく変形していることがあげられる。そこで、本研究はJohns Hopkins Universityの森・大石研究室からの研究協力を受け、同大学が開発したLarge Deformation Diffeomorphic Metric Mapping (LDDMM)という画像変形アルゴリズムに展開することで、この方法論的問題を解決した。LDDMMをスーパーコンピュータ上で動作することで、幾何学的連続性を保持したまま、画像の非線形的な重ね合わせや非可逆的な変換ができる。これにより、ヒト以外の霊長類においても、解剖学的区分に基づく標準脳テンプレートを年齢ごとに高精度に構築することが可能となった。ヒトの知性・行動および精神・神経疾患の病態機序を理解するには、ヒト固有の脳構造の進化過程を解明することが必須であり、ヒト以外の霊長類の脳構造の研究が欠かせない。本研究では、磁気共鳴画像(MRI)法を用いて、言語、社会性などヒト固有の認知機能で重要な役割を担う前頭前野における、ヒト固有の成長様式を明らかにすることを目指す。現在までのところ、概ね順調に進んでいる。Johns Hopkins Universityの森・大石研究室が開発した計算解剖学的手法を用いて、ヒト以外の霊長類の脳発達アトラスの構築を検討した。また、国内学会での優秀口頭発表賞受賞、国際シンポジウムでの招待講演等、研究成果の発信も十分に実施することができた。(受賞)酒井朋子「優秀口頭発表賞」第60回プリマーテス研究会2016/01/31,(公財)日本モンキーセンター(愛知)(国際シンポジウム・招待講演)本研究は、MRI法によりマーモセット、チンパンジー、ヒトの乳児期から思春期までの脳構造の発達変化を分析し、前頭前野をはじめとする脳構造の発達における霊長類的特徴、ホミノイド的特徴(チンパンジー、ヒトの共通点)、母親以外の家族も子育てを行う霊長類共通の特徴(マーモセット、ヒトの共通点)を理解することにより、ヒト固有の特徴の解明を目指した。今回、全ての霊長類が保持しており、大脳半球を結ぶ最大の白質路である脳梁に注目した。脳梁は感覚、運動、認知などの多様な神経機能の関連している。特筆すべき結果は次とのとおりである。霊長類共通の特徴として、乳児期に脳梁が急速に増加し、子ども期では緩慢な増加が続くことが明らかとなった。母親以外の家族も子育てを行う霊長類共通の特徴として、後期乳児期から子ども期にかけて脳梁の増加が著しかった。マーモセット特異的な特徴として子ども期には脳梁サイズが成体に達していること、チンパンジー特異的な特徴として子ども期にRostrumが急速に発達すること、ヒト特異的な特徴として乳児期にRostralbodyが著しく発達することが明らかとなった。Rostrumは注意に関わる前頭前野の投射を、Rostral bodyは行動制御、言語記憶、数概念に関わる前頭前野と前運動野の投射を受けていると考えられている。よって、これらの種間の発達様式の違いは、人類進化に伴う脳システムの変化と関連することが示唆された。さらに、本年度は、海外特別研究員として、Johns Hopkins Universityにて、霊長類の脳発達アトラスの作成を行った。

主な研究成果として、3本の学術論文(Sakai et al., Neuroscience Research, 2017; Sakai et al., PLOSONE,査読中)、2本の著書を執筆し、4題の招待講演を発表した。さらに、2015年にはプリマーテス研究会で優秀口頭発表賞を受賞した。現在までのところ、研究は概ね順調に進んでいる。当初の研究計画通り、マーモセットの3次元脳解剖画像の収集することができた。さらに、Johns Hopkins Universityの森・大石研究室が独自に開発した計算解剖学的手法を展開することで、ヒト以外の霊長類の発達期の3次元標準脳テンプレートの作成法を確立することに成功した。申請者は平成28年度から、日本学術振興会海外特別研究員として、Johns Hopkins Universityの森・大石研究室で研究活動を行う。これまで収集したヒト以外の霊長類の脳画像をもとに、脳発達アトラスの完成を目指す。さらに、ヒトとヒト以外の霊長類との種間比較と通して、ヒト固有の前頭前野構造の成長様式を明らかにすることを目指す。神経科学、霊長類学、自然人類学今年度取り組むべき課題は、これまでに収集したチンパンジーおよびマーモセットの脳解剖画像を基に、平成26年度に確立した計算解剖学的手法により、解剖学的区分に基づく3次元標準脳テンプレートを年齢ごとに構築することである。さらに、先行研究のヒトやマカクザルの脳データと融合することで、霊長類4種(ヒト、チンパンジー、マカクザル、マーモセット)の乳児期から思春期における前頭前野構造の成長様式の比較を行い、ヒト固有の発達様式の特徴を明らかにすることを目指す。そのうえで、この特徴がヒトの前頭前野構造の形成にどのように寄与するのかを定量的・包括的に検証する。画像解析に必要なパーソナルコンピュータを購入した際、機種の変更により、当初の予算より低額で購入することができたから。平成26年度8月から、申請者の異動により、画像解析を実施する研究機関が、実中研から慶應義塾大学に変更した。これに伴い、当初実中研に設置予定だった画像解析用のパーソナルコンピュターをデスクトップ型からノートブック型に機種変更した。このため、平成26年度の研究費は、このコンピューターの購入費用が余ったかたちとなった。平成28年度における論文校閲に関する経費の一部として使用する予定である。平成27年度から研究代表者の所属機関が実中研から慶應義塾大学に変更するとともに、より本格的な画像解析を実施する予定である。よって、平成27年度に慶應義塾大学に設置する新たなデスクトップ型のパーソナルコンピュターあるいはワークステーションを購入する予定である。
弱熱耐性動物モデルとしてナキウサギ(PiKa)開発の基礎研究

平成4年度は本研究課題の目的を達成すべく、ナキウサギおよびヒトによる高地寒冷順化。弱熱耐性のメカニズムの解明実験を中国および日本の両国において実施した。(1)ナキウサギを用いた中国科学院・上海実験動物中心での実験:現在私共は中国青海省西寧地区の野生のナキウサギ(Ochotona curuzonica)を同地で捕獲後,上記,験動物中心で家畜化するために飼育しており,本年度は,平成4年9月28日,同研究所内で実験・測定を行い,雄雌ナキウサギの直腸温:39.97±0.28°C(n=13),呼吸数:164.5±16.07回/分(n=12),体重:182.46±37.23(n=12)の結果を得た。これらの結果は海抜4000mの高地における野外実験結果と大差なく,海抜0mにおける家畜化の可能性を示唆している。直腸温が約40°C,呼吸数:183回/分は0mにおいて代謝亢進の効果と判定している。室温2022°C,湿度75%(rh)(2)ナキウサギを用いて日本・長崎大学熱帯医学研究所における実験:目下アフガンナキウサギ(Afghan pika:Ochotona rufuscens rufusens)室温20°C,08-20-08の明暗環境で2017匹飼育,生存日数が22.5年の長期も含めて0mでの家畜化が可能である実験結果を確証している。(3)ヒトを用いて高地寒冷順化メカニズムの現地(中国・チベット高原)実験課題A:高所滞在時の夜間酸素不飽和と呼吸パターン。B:高所滞在による順応および脱順応過程の体力医学的考察の口演発表を平成5年4月1-3日の第70回日本生理学会大会(山梨医大)にて発表し,目下学術論文として国際雑誌への投稿準備中である。平成4年度における本研究の課題研究が可能であれば平成5年以降へも継続し,新規テーマとして科研申請をしている。【緒言】生きた化石“ナキウサギ"は約6700万年前から高地一寒冷順化動物としての特性を維持している。私共は1985年以降、ナキウサギの弱熱耐性に注目し、高地・寒冷順化、弱熱耐性の実験動物モデルの確立のために、温熱生理学的手法を駆使して、体温調節・温度順化能を解析し、野外から室内飼育の過程における上記特性の詳細を究明している。【方法】アフガニスタン由来の室内飼育ナキウサギの体温調節能を中国青海省の野性ナキウサギのそれと比較する事によって、高地・寒冷順化能や弱熱耐性を解析するために、直腸温、体熱産生(酸素消費量)熱放散(呼吸数・皮膚温)、行動性体温調節能(巣作り)、循環機能を比較検討した。中国青海省の野生ナキウサギは中国科学院・西北高原生物研究所(西寧)の協力を得た。個体レベル研究と平行して細胞レベルにおける温熱感受性・熱耐性は10%SDSーPAGEによった。【結果】(1)アフガンナキウサギの直腸温は39.6°C(中国野生ナキウサギ:39.6-39.8°C)と高く、高い酸素消費量値20ml/kg・minや弱熱放散能【浅速呼吸の欠落や唾液分泌の減弱、耳介表面積/体温面積比(ナキウサギ7%,家ウサギ17%)】に依存している。(2)循環系の動態は高地・寒冷順化の像を呈し小型赤血球、多赤血球、低ヘマトクリット値(36%)、右心室/左心室比RVW/LVW(ナキウサギ0.25,ラット0.30)、(3)呼吸数の変動が環境温変化に追随しない点は温熱パンティングの欠落や唾液分泌量の不足と深い関係があり、暑熱ストレスによる呼吸中枢の障害が示唆される。(4)10%SDSーPAGEによる熱ショック蛋白(HSPs)誘導がナキウサギで減弱している。ナキウサギの弱熱耐性は個体レベルと細胞レベルにおけるHSPsの熱耐性機能との関連において解明する事が望まれる。【まとめ】室内飼育ナキウサギの平均生存日数56週は実験動物モデルの特徴を備えており、中国野生ナキウサギの導入・室内飼育が望まれる。本研度は前年度に続いて当該課題研究を鋭意遂行し,(1)国内における実験室内でのアフガン・ナキウサギのデ-タ補完及び(2)(中国科学院)上海動物実験中心におけるクチグロナキウサギの体温調節反応dataの収集を実施した。I.アフガン・ナキウサギ(Ochotona rufescens rufescens)の弱熱耐性-温熱性唾液分泌能の検討-:26°C環境温ではナキウサギとラットの間には体重当たりの蒸散量に差を認めず,40°C環境温・加温可能時間はナキウサギで約12分間(ラットでは26分間)で大差であったが,直腸温の上昇は両者とも20°Cであった。ラットでは唾液塗布行動(SS)が顕著に認められ,40°Cでの蒸散量は26°C環境温時の6.5倍であるが,ナキウサギでは(SS)が認められず,蒸散量も約3倍で,かつ体表面は全く濡れなかった。以上の結果はナキウサギで温熱性唾液分泌がなく,弱熱耐性の一因となっていると考えられる。

II.中国科学院,上海実験動物中心におけるDomesticクチグロナキウサギ(Ochotona curuzonicae)の体温調節反応指標収集の結果について:本研究班員の小坂・酒井・斎藤・松崎の4名は,平成3年10月9日,中国科学院・上海実験動物中心を訪問,1991年6月23日,中国青海省,西寧の3600mの高原にて捕獲,1991年10月9日まで上海実験動物中心にてDomestic飼育されたクチグロナキウサギを同センタ-の研究室にて観察し,体温調節反応デ-タを収集した。同センタ-で繁殖用と飼育群に分けて,前繁殖群の平均体重189g(n=6),直腸温39.8°C±0.6(n=6)と高値であり,飼育群の147g,40.1°C±0.4直腸温には有意差なく高値であった。III.今後はクチグロナキウサギのDomestic化,日本への導入・繁殖に努力する一方,アフガンナキウサギの弱熱耐性の細胞レベルの研究を更に推進する所存である。平成4年度は本研究課題の目的を達成すべく、ナキウサギおよびヒトによる高地寒冷順化。弱熱耐性のメカニズムの解明実験を中国および日本の両国において実施した。(1)ナキウサギを用いた中国科学院・上海実験動物中心での実験:現在私共は中国青海省西寧地区の野生のナキウサギ(Ochotona curuzonica)を同地で捕獲後,上記,験動物中心で家畜化するために飼育しており,本年度は,平成4年9月28日,同研究所内で実験・測定を行い,雄雌ナキウサギの直腸温:39.97±0.28°C(n=13),呼吸数:164.5±16.07回/分(n=12),体重:182.46±37.23(n=12)の結果を得た。これらの結果は海抜4000mの高地における野外実験結果と大差なく,海抜0mにおける家畜化の可能性を示唆している。直腸温が約40°C,呼吸数:183回/分は0mにおいて代謝亢進の効果と判定している。室温2022°C,湿度75%(rh)(2)ナキウサギを用いて日本・長崎大学熱帯医学研究所における実験:目下アフガンナキウサギ(Afghan pika:Ochotona rufuscens rufusens)室温20°C,08-20-08の明暗環境で2017匹飼育,生存日数が22.5年の長期も含めて0mでの家畜化が可能である実験結果を確証している。(3)ヒトを用いて高地寒冷順化メカニズムの現地(中国・チベット高原)実験課題A:高所滞在時の夜間酸素不飽和と呼吸パターン。B:高所滞在による順応および脱順応過程の体力医学的考察の口演発表を平成5年4月1-3日の第70回日本生理学会大会(山梨医大)にて発表し,目下学術論文として国際雑誌への投稿準備中である。平成4年度における本研究の課題研究が可能であれば平成5年以降へも継続し,新規テーマとして科研申請をしている。
金属／微小空隙／半導体構造アレイによる生体の電荷・準位分布分析デバイスの研究

金属/微小空隙/絶縁体/半導体構造デバイスの容量-電圧測定によるデオキシリボ核酸ハイブリダイゼーションの電気センシングを実証した。デオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションは、センシングデバイスの容量-電圧曲線のシフトから解析した。金属/微小空隙/絶縁体/半導体構造デバイスは、デオキシリボ核酸ハイブリダイゼーションと非ハイブリダイゼーションを識別できることを実証した。金属/微小空隙/絶縁体/半導体構造アレイの容量-電圧測定による純水の電気センシング動作を実証した。シリコン/シリコン酸化膜/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造センシングデバイスの微小空隙にデオキシリボ核酸溶液を導入し、静電容量-電圧特性を測定することにより、デオキシリボ核酸の負電荷に起因する容量-電圧特性の変化を観測した。さらに、デオキシリボ核酸の濃度が高くなると、電圧が零ボルトのときの容量が減少することを見いだし、デオキシリボ核酸の濃度を測定できることを明らかにした。また、半導体/絶縁体/半導体構造の容量-電圧特性の計算プログラムを作成し、計算結果と実験結果を比較することにより、容量-電圧特性の変化は負電荷によることを明らかにした。シリコン/酸化膜/微小空隙/酸化膜/シリコン構造は、シリコン・オン・インシュレータウェハの微細加工と熱酸化により製作した。シリコン/酸化膜/微小空隙/酸化膜/シリコン構造センシングデバイスは、構造が単純であり、チップに組み込むことが容易にできる意義がある。次に、金/空隙/金構造の空隙に超純水を導入し、交流コンダクタンスを測定することにより、空隙中の超純水の抵抗率の時間変化を測定した。さらに、空隙中超純水のデバイ長を抵抗率から計算し、デバイ長の時間変化を明らかにした。金/空隙/金構造は、金薄膜を形成した石英基板二枚を絶縁膜スペーサを介して向かい合わせて貼り合わせることにより製作した。溶液のデバイ長が長くなると、電荷の検出感度が高くなるため、金/空隙/金構造を用いて、感度を監視できる意義がある。金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造センシングデバイスの静電容量-電圧特性を測定することにより、デオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションを電気的に検出した。センシング表面は、シリコンウェハを微細加工後、微小空隙に面するシリコン酸化膜表面にアミノシラン自己組織化単分子膜を付着させ、プローブとなるデオキシリボ核酸を固定化することにより形成した。デバイスは、プローブとなるデオキシリボ核酸を固定化したシリコンウェハと金薄膜を形成した石英基板をシリコン酸化膜スペーサを介して貼り合わせることにより製作した。微小空隙にターゲットとなるデオキシリボ核酸水溶液を導入後洗浄し、純水を導入してデオキシリボ核酸の負電荷に起因する容量-電圧特性の変化を観測した。プローブと相補的なターゲットデオキシリボ核酸を導入したときは、洗浄後でもセンシング表面の負電荷量が増加し、非相補的なターゲットを導入したときは、洗浄後では負電荷量がほとんど変化しないことを実証した。センシング表面での負電荷増加量から、ハイブリダイゼーションしたデオキシリボ核酸数を明らかにした。ハイブリダイゼーションは、蛍光色素を結合したターゲットデオキシリボ核酸を用いて、蛍光顕微鏡観察により確認した。金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造センシングデバイスは、構造が単純であり、製作工程数を少なくできる意義がある。純水中でのハイブリダイゼーション検出の実証は、純水のデバイ長が長いため、塩基数の多いデオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションを検出できる意義がある。金属/微小空隙/絶縁体/半導体構造の二次元アレイセンシングデバイスを製作し、センシングデバイス動作を明らかにした。半導体部としては、SOI(Silicon on Insulator)ウェハのシリコン層の微細加工により絶縁分離されたライン状シリコン領域を形成した。絶縁体部としては、検出部として用いるシリコン領域表面に極薄シリコン酸化膜を形成した。微小空隙を形成するために、石英基板の微細加工によりスペーサ絶縁部を形成した。金属部としては、微小空隙に面する石英基板表面にライン状の金薄膜を形成した。ライン状金薄膜を形成した石英基板とライン状シリコン領域を形成したSOIウェハの表面を向かい合わせてスペーサ絶縁部を介して貼り合わせ、微小空隙が形成されたデバイスを製作した。アレイデバイスとしては、金ライン8本とシリコンライン12本との交点が96点の金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造を二次元配列したセンシングデバイスを製作した。センシングデバイスの微小空隙に純水を導入し、交点の金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造の静電容量-電圧特性を測定することにより、純水を電気的に検出した。理想静電容量-電圧特性の計算結果と測定結果を比較することにより、交点の金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造がセンシングデバイス動作していることを明らかにした。

金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造二次元アレイセンシングデバイスは、構造が単純であり、製作工程数を少なくできる意義がある。また、多くの検体データの一括取得解析による検出の高精度化を実現できる意義がある。金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造センシングデバイスの静電容量-電圧特性を測定することにより、デオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションを電気的に検出した。センシング表面は、シリコンウェハを微細加工後、微小空隙に面するシリコン酸化膜表面にアミノシラン自己組織化単分子膜を付着させ、プローブとなるデオキシリボ核酸を固定化することにより形成した。デバイスは、プローブとなるデオキシリボ核酸を固定化したシリコンウェハと金薄膜を形成した石英基板をシリコン酸化膜スペーサを介して貼り合わせることにより製作した。微小空隙にターゲットとなるデオキシリボ核酸緩衝溶液を導入してハイブリダイゼーション後、微小空隙を純水で洗浄して純水中のデオキシリボ核酸の負電荷に起因する容量-電圧特性の変化を観測した。ハイブリダイゼーションは、シリコン酸化膜の不安定性の原因となるナトリウムイオンやカリウムイオンを含まない緩衝液を用いて行った。プローブと相補的なターゲットデオキシリボ核酸を導入すると、洗浄後でもセンシング表面の負電荷量が増加することを実証した。センシング表面での負電荷増加量から、ハイブリダイゼーションしたデオキシリボ核酸数を明らかにした。金/微小空隙/シリコン酸化膜/シリコン構造センシングデバイスは、構造が単純であり、製作工程数を少なくできる意義がある。緩衝溶液中でのハイブリダイゼーションは、緩衝液のデバイ長が短いためハイブリダイゼーション効率を向上でき、純水中での電気的検出は、純水のデバイ長が長いため塩基数の多いデオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションを検出できる意義がある。研究計画における生体の高感度センシングの実証、生体適合センシング表面の開発、生体センシングの周波数依存性の解明についておおむね順調に進展している。生体の高感度センシングの実証においては、センシング表面にプローブデオキシリポ核酸を固定化したデバイスの微小空隙にターゲットを導入することにより、デオキシリボ核酸のハイブリダイゼーションを高感度でセンシングできることを実証した。生体適合センシング表面の開発においては、デオキシリボ核酸ハイブリダイゼーション検出のセンシング表面にアミノシラン自己組織化単分子膜付着シリコン酸化膜、または金薄膜が適していることを実証した。生体センシングの周波数依存性の解明においては、低周波数では電極分極効果が大きく、高周波数ではデバイスの寄生抵抗の影響が大きくなり、デオキシリボ核酸センシングには中間周波数が適していることを明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画における生体の高感度センシングの実証、生体適合センシング表面の開発、金属/微小空隙/シリコン構造アレイの製作についておおむね順調に進展している。
ニューロンの受容領域を制御する細胞内シグナル伝達機構の解明

樹状突起は、他の神経細胞もしくは感覚受容器からの情報入力を担っており、外部情報を的確に受容する為には、樹状突起が適切な空間に配置されることにより、受容領域を正確にカバーすることが重要である。申請者は、リン酸化酵素Ndrキナーゼ・ファミリーが、樹状突起の維持・管理機構において中心的な役割を果たしていることを世界に先駆けて示した。さらに、ダウン症原因因子の1つである接着分子Dscam (Down's Syndrome-associated Adhesion Molecule)がNdrキナーゼと協調して機能することを見出した。私達は、ショウジョウバエの感覚神経系をモデルとして、ニューロンの受容領域が形成・維持されるメカニズムを解析し、TrcキナーゼとWtsキナーゼが、それぞれ受容領域の形成と維持において主要な機能を果たしていることを示している。本年度は、Trcキナーゼ・シグナル伝達経路とWtsキナーゼ・シグナル伝達経路において機能する分子群の同定を行った。その結果、Wtsキナーゼ・シグナル伝達経路の構成分子としてポリコーム遺伝子群(PcG)を同定する事に成功した(Parrish et al.,Gene Dev.21:956(2007))。PcGはヒストンのメチル化修飾を介して遺伝子発現を負に制御するエピジェネティック制御因子であり、リン酸化に寄る機能制御を受けていることが示唆されている。私達は、これまでに、受容領域のタイル化前後で、突起伸展速度の低下や、同種突起間における反発運動の減少など、樹状突起の性質が大きく変化する事を示して来たが、このような突起ダイナミズムの変化は、PcGを介したエピジェネティックな転写制御によることが強く示唆された。一方、Trcキナーゼ・シグナル伝達経路の構成分子として接着分子であるDscam(Down's syndome-associated cell adhesion molecule)を同定した。Dscamは主要精神遅滞疾患の1つダウン症候群の原因遺伝子である可能性が指摘されており、今後、受容領域の形成異常と精神遅滞疾患との関連を分子レベルで明らかにできる可能性がある。今年度は、受容領域のタイル化を制御するTrcキナーゼと遺伝的相関をしめす分子群の網羅的スクリーニングを行い、複数の候補分子を同定した。とくに分子量60kDaの分子(p60)は、これまでに報告が無い機能未知の分子であり、C末にPHドメインを有する。免疫沈降法により、p60はTrcキナーゼとN末領域を介して結合していることを明らかにした。またRNAiノックダウン法によりp60の発現を抑制すると、Trcキナーゼの活性が抑制された。したがってp60はTrcキナーゼの膜移行および活性化に必要な分子であると予想される。現在、RNAi法および変異体を用いてp60の詳細な機能解析行っている。加えて、受容領域の維持機構を明らかにする為に、ゲノムワイドRNAi法用いたスクリーニング・システムを確立した。この方法を用いて100遺伝子に関してパイロット解析を行い、樹状突起の維持を制御する遺伝子候補を5つ同定した。中でも、CDK9はmRNAの伸張に関わる因子であるが、分裂後神経細胞では異なる機能を果たしている可能性が示唆されており、今後注目して解析を行う予定である。一方で、ニューロン特異的に脂質結合プローブを発現するトランスジェニック系統の作成に成功し、それを用いて脂質代謝物のライブ・イメージングを開始した。特に、ホスホイノシチド(PIP2、PIP3)、ホスファチジン酸(PA)の時空間的変動に注目して解析を進めている。感覚ニューロン受容領域の形成・維持を司る分子ネットワークを全ゲノムサイズで理解することを目指し、RNAiノックダウン法を用いてショウジョウバエ・ゲノム上にコードされる全1万3千遺伝子の神経機能を簡便に評価出来る解析システムを確立した。確立したシステムを用いて、樹状突起のパターンや空間配置を制御する脂質代謝関連遺伝子群の探索を行い、イノシトールリン脂質代謝酵素PTENが、末端樹状突起の出芽数と出芽位置の双方を制御していること発見した(Kumagai et.al.投稿中)。さらに、マウス初代培養神経系とスライス培養系を用いて、同定した脂質代謝酵素および脂質代謝産物が、高等動物の神経回路形成に与える薬理効果について検討している。また、細胞外マトリックスのリモデリングなど、気管(血管)と神経の突起形成に共通する細胞・分子メカニズムを多数同定した(Yasmaga et.al.投稿中)。一方で、従来は癌抑制遺伝子として考えられていたWtsキナーゼが、構築された樹状突起の維持に必須であることを明らかにした(Nature 2006)。さらに、Wtsキナーゼと遺伝的機能相関を示す因子群の探索を行ない、ポリコーム転写制御因子群を同定した(Genes Dev.2007)。

一方で、ダウン症候群の関連遺伝子であるDscam(Down's Syndrome-associated Cell Adhesion Molecule)が、樹状突起間の相互認識に関与することを示し、Dscamを介する樹状突起の形成・維持メカニズムの異常が、ダウン症の発病に関連する可能性を示した(Neuron 2007)。
サル一次視覚野の色情報処理と視野統合

本研究は視野内の対象の連続性、特に色情報の連続性が、一次視覚野(V1)でどのように表現されているのかを光学計測法(optical recording)ならびに電気生理学的計測法を併用することにより明らかにしようとするものである。本年度は、光学計測実験としてネコおよびラットにおける予備実験を行い、電気刺激に対する神経細胞の活動を可視化することに成功した。現在、光刺激に対する反応の計測を行っている。また電気生理学実験としてニホンザルブロッブニューロンの色選択性を形成する入力メカニズムについての解析を行った。麻酔・非動化したニホンザルV1より記録した21個の色選択性ブロッブニューロンについて、その入力メカニズムを調べるために皮質内抑制系の担い手であるGABAのA型受容体拮抗薬であるbicuculline methiodide(BMI)のイオン泳動投与中の色刺激応答をコントロール時のそれと比較した。その結果、検討した色選択性細胞全てにおいて、複数種類の錐体系入力がオン、オフそれぞれの反応時に与えられており、皮質内抑制が、特定の色刺激に対するチューニングをシャープにする機能を果たしていることが明らかになった。このような色選択性細胞において、受容野のみならず視野の広い範囲に及ぶ色刺激を提示した場合にも上記の観察と同様の結果が得られた。現実の生活における視覚刺激は通常色コントラストのみならず、明るさのコントラストも伴う。また色収差情報も形状認知に寄与していると考えられる。今後は、これらの要素を組み合わせた刺激を用いて光学計測を行い、色情報処理から見た視野統合のありかたを検討したい。
脳室周囲白質軟化の発生に関する細胞生物学的研究

1.軸索に関してAPP、C末端側のA4モノクローナル抗体(Boehringer)は、軸索腫大などの反応性の軸索変化に特異的に発現することを認めた。そこで、PVL形成におけるAPPおよび軸索の意義についてAPP抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。PVL例では、APPは凝固壊死巣あるいは周辺の軸索腫大に特異的に陽性だった。しかし、古い軟化巣には認められなかった。また、正常対照群では、全例、陰性であった。このように、APPは、PVLの初期の軸索変化の早期診断に有用である。早期判定の機序については検討中である。2.グリアに関して発達期脳では髄鞘形成直前のグリアの増加がPVLの素因となる。近年、TNFαは中枢神経系での存在が明らかとなり、脳の発育や発達、脳損傷と回復などに関与しているサイトカインとしてその研究が盛んである。PVLの形成過程におけるTNFαの意義について抗ヒトTNFαモノクローナル抗体(ENDOGEN)を用いて検討した。TNFα陽性細胞はPVL例の壊死巣周辺に高率に認められ、その細胞はミクログリアに一致していた。また、正常対照群に比しPVL例では4週間早い在胎25週より認められた。これは局所的虚血などによって活性化されたミクログリアに産生されたTNFαが、軸索変性に続いて白質軟化形成に関与していると思われた。
植物性エストロゲンを含む大豆食品と内分泌かく乱物質のエストロゲン様相互作用の研究

環境汚染物質、農薬、食品容器の溶出成分などの合成化学物質が内分泌かく乱物質として生体影響する可能性が指摘されている。それらの多くはエストロゲン様作用を示し、大豆などに含まれるイソフラボン類も同様な作用を示すため植物性エストロゲンと呼ばれ同列に扱われている。しかし、実際の生活では大豆食品と合成化学物質は両方摂取されていると考えられ、その影響に注目する必要がある。本研究では、卵巣摘出マウスを用いて、ヒトの摂取量レベルのイソフラボン類を含む大豆食品が、内分泌かく乱作用を疑われる合成化学物質に対し、エストロゲン様作用に関して相加や拮抗など相互作用をもつかどうか検討した。大豆食品として大豆水抽出物の煮汁を作り凍結乾燥物を調製し、それに含まれるダイジン、グリシチン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインをHPLCで分離定量し、総イソフラボン含量を求めた。大豆ミルクからの乳幼児のイソフラボンの摂取量(10mg/kg/day)に相当する量の総イソフラポンを含む煮汁凍結乾燥物の量を算出し、それを投与量とした(1900-6600mg/kg:凍結乾燥物の調製毎の違いによる)。6週齢のICR系雌性マウスの卵巣を摘出した。植物性エストロゲンを含まないAIN-76A精製飼料による飼育下、ヒトの摂取量レベルのイソフラボン類を含む煮汁の14日間経口投与と併用して、ホルモン剤ジエチルスチルベストロール(DES)0.05mg/kgあるいはポリカーボネートの原料ビスフェノールA(BPA)300mg/kg、農薬メトキシクロル(MX)50mg/kgを3日間経口投与した。エストロゲン様作用としての相対子宮重量(体重比)は、煮汁+DESの併用、煮汁+MXの併用では、DES、MXそれぞれの単独に対して増加傾向がみられたが、煮汁+BPAの併用では、BPA単独に対して増加傾向がみられなかった。環境汚染物質、農薬、食品容器の溶出成分などの合成化学物質が内分泌かく乱物質である可能性が指摘されている。その多くはエストロゲン様作用を示す。大豆などに含まれるイソフラボン類も同様な作用を示すため植物性エストロゲンと呼ばれる。本研究は、エストロゲン様作用の検出系の卵巣摘出マウスの子宮肥大試験法を用い、ヒトの摂取量レベルの濃度のイソフラボン類を含む大豆食品が、内分泌かく乱作用を疑われる合成化学物質に対し、エストロゲン様作用に関して相互作用をもつか検討しようとするものである。本年度は、大豆食品と合成化学物質それぞれの投与量の検討を行った。大豆水抽出物の煮汁を作り凍結乾燥物を調製し、それに含まれるダイジン、グリシチン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインをHPLCで分離定量し、総イソフラボン含量を求めた。大豆ミルクからの乳幼児のイソフラボンの摂取量(10mg/kg/day)に相当する量の総イソフラボンを含む煮汁凍結乾燥物の量を算出し、それを投与量とした(3000-6600mg/kg:凍結乾燥物の調製毎の違いによる)。ホルモン剤ジエチルスチルベストロール(DES)、ポリカーボネートの原料ビスフェノールA(BPA)、農薬メトキシクロル(MX)について、DES 0.05mg/kg、BPA 300,600,900mg/kg、MX 50,100mg/kgを投与量とした。植物性エストロゲンを含まないAIN-76A精製飼料によって飼育下、14日間煮汁を、3日間DES、BPA、MXを、それぞれ連続経口投与し、子宮重量を測定した。

相対子宮重量(体重比)は、煮汁の14日間投与、DES 0.05mg/kg、BPA 300mg/kg以上、MX 50mg/kg以上の3日間投与で有意に増加した。環境汚染物質、農薬、食品容器の溶出成分などの合成化学物質が内分泌かく乱物質として生体影響する可能性が指摘されている。それらの多くはエストロゲン様作用を示し、大豆などに含まれるイソフラボン類も同様な作用を示すため植物性エストロゲンと呼ばれ同列に扱われている。しかし、実際の生活では大豆食品と合成化学物質は両方摂取されていると考えられ、その影響に注目する必要がある。本研究では、卵巣摘出マウスを用いて、ヒトの摂取量レベルのイソフラボン類を含む大豆食品が、内分泌かく乱作用を疑われる合成化学物質に対し、エストロゲン様作用に関して相加や拮抗など相互作用をもつかどうか検討した。大豆食品として大豆水抽出物の煮汁を作り凍結乾燥物を調製し、それに含まれるダイジン、グリシチン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインをHPLCで分離定量し、総イソフラボン含量を求めた。大豆ミルクからの乳幼児のイソフラボンの摂取量(10mg/kg/day)に相当する量の総イソフラボンを含む煮汁凍結乾燥物の量を算出し、それを投与量とした(1900-3100mg/kg:凍結乾燥物の調製毎の違いによる)。6週齢のICR系雌性マウスの卵巣を摘出した。植物性エストロゲンを含まないAIN-76A精製飼料による飼育下、ヒトの摂取量レベルのイソフラボン類を含む煮汁の14日間経口投与と併用して、ホルモン剤ジエチルスチルベストロール(DES)0.05mg/kgあるいはポリカーボネートの原料ビスフェノールA(BPA)300mg/kg、農薬メトキシクロル(MX)50mg/kgを3日間経口投与した。エストロゲン様作用としての相対子宮重量(体重比)は、煮汁+DESの併用、煮汁+MXの併用では、DES、MXそれぞれの単独に対して増加傾向が見られたが、煮汁+BPAの併用では、BPA単独に対して増加傾向が見られなかった。
オントロジーの多重化技術による専門分野知識の体系化の研究

本研究全体の成果は以下の通りである。(1)広域ネットワークにおけるオントロジーインターネットには多量の断片的知識が存在している。人間はこのような知識を背景知識を用いて構造化して利用している。また逆にこのような知識から知識の構造を発見している。本研究では、この両者、すなわち、(1-a)オントロジーを用いた情報収集(1-b)ネットワークからのオントロジーの発見について研究を行った。(2)オントロジーの統合複数のオントロジーが存在した場合、それらをどう結び付けるかが問題となる。本研究ではオントロジーを統計的な方法によって統合する方法を開発した。(3)オントロジーの分散開発環境オントロジーをどのように開発していくかという問題に対して、文書における概念構造を利用した開発環境を開発した。この開発環境においては個々の利用者は自らのもつ文書のもつ概念構造を利用してオントロジーを開発する。さらにユーザ同士は移動エージェントによりオントロジーを交換することができる。本研究では、オントロジーの多重化技術を用いて、大規模オントロジーの構築方法論および構築技術の提案およびその実証をすることを目標とする。本年度はまず、多重オントロジー構築方法論の開発について研究を行なった。このためにまず、マルチエージェントのためのオントロジー協調開発環境Dondenを開発した。マルチエージェント系におけるエージェントの知識は全体のオントロジーの中で記述されるべきである。このため、各々のエージェント開発者のもつオントロジーが統合される必要がある。このシステムでは、オントロジーブラウザと呼ばれるオントロジー編集システムが複数と一つのオントロジーサーバからなり、オントロジーサーバでは階層的クラスタリングと多次元尺度構成法により、類似する概念が統合される。つぎにオントロジー利用アプリケーションの作成の研究としては、ネットワーク情報の収集・分類・収集に関してオントロジー利用のシステムを構築した。このシステムの特徴はオントロジーと呼ばれる概念体系を情報の収集・分類・抽出の3つの段階全てを通して利用することである。このシステムの特徴は収集、分類、抽出の3つの段階において、オントロジーというかたちで記述された知識表現を使うことである。情報収集としては、オントロジー上の概念を指定すると、その概念および関連する概念に相当するキーワードでページ上のリンクを評価し、関連があると判定されたリンクをたどるという形でページを収集していく。情報分類としては、収集したぺ-ジに対して、オントロジー上の概念に関連つけられたキーワードを元に、各ページを最も近い概念に配分していく。情報抽出としては、各概念に分類されたページにからその属性概念の属性値を抽出する。本年度は、オントロジー中心型知識組織化アーキテクチャの提案と、そのアーキテクチャに基づくシステムの試作を行なった。オントロジー中心型知識組織化アーキテクチャとは、オントロジーを中心としてモデルレベルとメディアレベル両方を取り扱う知識ベースシステムの枠組みである。このモデルはサーバとユーザ毎のクライアントからなる。サーバには共有されるドキュメントとコミュニケーションメッセージが貯えられており、クライアントは各ユーザ毎に用意される。サーバはサーバは共有オントロジーとユーザの個人オントロジーを用いてドキュメントとコミュニケーションメッセージを組織化して蓄積する。ユーザはオントロジーを用いて、ドキュメントやコミュニケーションメッセージを検索したり、自らのドキュメントを作成する。また、同時にユーザは自分の個人オントロジーを作成していくことができる。個人のオントロジーはサーバに送られ、必要に応じて利用される。また、サーバは必要に応じて外部のネットワークの情報を参照して、これもオントロジーを用いて組織化を行う。この枠組みにもとづき、まず前年度までに開発したネットワークからの情報収集・分類・抽出システムを個人オントロジーを利用できるように拡張した。また、設計など工学的活動を支援する環境としてDesignersAmpliferシステムを試作した。このシステムにおいては、個人が自己のオントロジーを用いて、文書を組織化することができる。本年度は、本研究の最終年度であり、オントロジー構築に関する一般的考察を行なうと共に、研究全体のとりまとめを行った。オントロジーに構築に関する一般的考察では、科学技術知識の体系化とオントロジーとの関わりについて考察した。要約すると、情報化社会の進展に伴い古典的な科学技術知識の体系の維持が困難になり、改めて知識の体系化が問われなければならないこと、そのために知識の背景にあるオントロジーの明示化とオントロジー間の関係を知ることが必須であること、などである。人間にはこのような知識を背景知識を用いて構造化して利用している。

また逆にこのような知識の構造を発見している。本研究では、この両者、すなわち、(1-a)オントロジーを用いた情報収集(1-b)ネットワークからのオントロジーの発見について研究を行った。(2)オントロジーの統合複数のオントロジーが存在した場合、それらをどう結び付けるかが問題となる。本研究ではオントロジーを統計的な方法によって統合する方法を開発した。(3)オントロジーの分散開発環境オントロジーをどのように開発していくかという問題に対して、文書における概念構造を利用した開発環境を開発した。この開発環境においては個々の利用者は自らのもつ文書のもつ概念構造を利用してオントロジーを開発する。さらにユーザ同士は移動エージェントによりオントロジーを交換することができる。