hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト胎盤分化成熟機構の解明：分化ステージの異なる細胞を分取し比較するアプローチ

栄養膜細胞は胎盤の主要構成細胞である。従って、栄養膜細胞のエストロゲン合成を伴う分化過程の解明は、胎盤の成熟、及び妊娠の維持に関する重要な知見をもたらすことが期待される。ヒト栄養膜細胞のモデル細胞として知られるJEG3細胞株には、アロマターゼ(エストロゲン合成酵素)の陽性細胞と陰性細胞が混在しており、分化誘導処理により陽性細胞の割合が増加することを我々は確認している。これは、アロマターゼ遺伝子の発現を指標として分化ステージの異なる細胞を、JEG3細胞株集団から分取できる可能性を示している。そこで、CRISPR-Cas9を用いた相同組換えによるノックイン法で、JEG3細胞株のアロマターゼ遺伝子をGFP遺伝子に置換したレポーター細胞株の樹立を試みた。組換えのドナーDNAには、GFP遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をアロマターゼ遺伝子の転写開始点前後に挟んだプラスミドを用いた。PCR法とサンガーシーケンス法により、得られたピューロマイシン耐性株の相同組換えを検定した。その結果、5 ́側は正しい組換えを確認できたが、3 ́側には余分な外来遺伝子を含むものが混在していた。原因として、アロマターゼ遺伝子中の反復配列の影響が考えられた。よって、耐性株をクローニングすることで、正しくノックインされたレポーター細胞株を得る操作を現在行っている。この細胞株の樹立により分化ステージの異なる細胞の分取が可能になり、発現遺伝子の細胞間比較から栄養膜細胞の分化に関連した因子が新たに同定されると考える。CRISPR-Cas9法を用いたレポーター細胞株の樹立に想定外の時間を要した。樹立したレポーター細胞株を分化誘導した後、セルソーターにかけGFP陽性細胞と陰性細胞を分取する。次世代シーケンサーを用いて両細胞集団間の遺伝子発現を比較することで、栄養膜細胞の分化に関連した新規因子の同定を試みる。胎盤の主要構成細胞である栄養膜細胞の分化制御は、胎盤が正常に成熟し機能維持する為に必要である。本研究は、栄養膜細胞の分化に関わる新たな因子の同定を目的としている。我々は、ヒト未分化栄養膜細胞のモデル細胞であるJEG-3細胞株を研究に使用している。これまでの研究で、JEG-3細胞を分化誘導処理すると、アロマターゼ(エストロジェン合成酵素)遺伝子を発現した細胞や、凝集した核を持つ細胞など、分化ステージの異なるヘテロな細胞集団を形成することを確認している。アロマターゼは分化中期、核の凝集は分化後期の栄養膜細胞の特徴である。そこで、アロマターゼの発現と核の形態を指標として、分化初期(アロマターゼ陰性、核正常)、分化中期(アロマターゼ陽性、核正常)、分化後期(アロマターゼ陰性、核凝集)の3つの分化ステージの細胞を分取し、遺伝子発現を比較することで新規の分化関連因子を同定することを計画した。本年度は、分化ステージの異なる細胞を生きた状態で分取する為のレポーター細胞株の作成を目標とした。その為に、アロマターゼの発現、及び核の形態を蛍光により識別可能な細胞株の作成を目指した。まず、核を可視化する為に、クロマチンの主要構成成分であるヒストンH2BのC末端に蛍光タンパクを融合したキメラタンパクをコードするDNA断片をJEG-3細胞に導入した。作成した細胞株を蛍光顕微鏡で観察したところ、正常な形態をした核を持つ細胞と、凝集した核を持つ細胞を確認できた。これにより分化後期の細胞とそれ以外の細胞の識別が可能になった。現在は、アロマターゼ遺伝子を蛍光タンパク遺伝子に組み替えるための条件を検討中である。核を標識した細胞株の作成により、分化後期の細胞とそれ以外の細胞の識別が可能になった。我々の研究目的は、胎盤の主要構成細胞である栄養膜細胞の分化に関わる新たな因子を同定することである。これまでの研究で、栄養膜細胞のモデル細胞(JEG3細胞株)を分化誘導処理すると、アロマターゼ(エストロジェン合成酵素)遺伝子を発現した細胞や、凝集した核を持つ細胞など、分化ステージが異なると思われるヘテロな細胞集団を形成することを確認していた。そこで本研究では、アロマターゼの発現と核の形態を指標として、分化初期(アロマターゼ陰性、核正常)、分化中期(アロマターゼ陽性、核正常)、分化後期(アロマターゼ陰性、核凝集)の3つの分化ステージの細胞を分取し、遺伝子発現を比較することにより、新規分化関連因子の同定を目指している。昨年度は、ヒストンH2B-GFP融合タンパクを発現する細胞株(H2B-GFP株)を樹立した。H2B-GFP株を分化誘導処理した後、蛍光観察したところ、核の形態が正常な細胞以外に、凝集した核を持つ細胞を確認できた。これにより、生きた状態で核の形態を見分けることが可能となった。H2B-GFP株は、アロマターゼ遺伝子をmCherry遺伝子に置き換えたレポーター細胞株の作製に用いる。そこで本年度は、H2B-GFP株が親株のJEG3細胞株と同様の特徴を持っているかを確認した。H2B-GFP株を分化誘導処理し、アロマターゼの発現を免疫染色で調べたところ、JEG3細胞株と同様にアロマターゼ陽性細胞と陰性細胞が確認できた。また、JEG3細胞株や栄養膜細胞で発現が報告されているE-カドヘリンなど複数のタンパクの発現も免疫染色で確認できた。これらの結果より、H2B-GFP株はレポーター細胞株の作製に用いて良いと判断した。H2B-GFP株の特徴の解析に予定より多くの時間を要し、本年度中にレポーター細胞株を作製することが出来なかった。

しかし、レポーター細胞株の樹立に使用するCRISPR/Cas9システムの目処はついているので、今後は速やかに研究が進行すると考えている。栄養膜細胞は胎盤の主要構成細胞である。従って、栄養膜細胞のエストロゲン合成を伴う分化過程の解明は、胎盤の成熟、及び妊娠の維持に関する重要な知見をもたらすことが期待される。ヒト栄養膜細胞のモデル細胞として知られるJEG3細胞株には、アロマターゼ(エストロゲン合成酵素)の陽性細胞と陰性細胞が混在しており、分化誘導処理により陽性細胞の割合が増加することを我々は確認している。これは、アロマターゼ遺伝子の発現を指標として分化ステージの異なる細胞を、JEG3細胞株集団から分取できる可能性を示している。そこで、CRISPR-Cas9を用いた相同組換えによるノックイン法で、JEG3細胞株のアロマターゼ遺伝子をGFP遺伝子に置換したレポーター細胞株の樹立を試みた。組換えのドナーDNAには、GFP遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をアロマターゼ遺伝子の転写開始点前後に挟んだプラスミドを用いた。PCR法とサンガーシーケンス法により、得られたピューロマイシン耐性株の相同組換えを検定した。その結果、5 ́側は正しい組換えを確認できたが、3 ́側には余分な外来遺伝子を含むものが混在していた。原因として、アロマターゼ遺伝子中の反復配列の影響が考えられた。よって、耐性株をクローニングすることで、正しくノックインされたレポーター細胞株を得る操作を現在行っている。この細胞株の樹立により分化ステージの異なる細胞の分取が可能になり、発現遺伝子の細胞間比較から栄養膜細胞の分化に関連した因子が新たに同定されると考える。CRISPR-Cas9法を用いたレポーター細胞株の樹立に想定外の時間を要した。今年度に作成した細胞株のアロマターゼ遺伝子を蛍光遺伝子に組み替え、これをレポーター細胞株とする。レポーター細胞株を分化誘導した後、セルソーターにかけ分化ステージの異なる細胞を分取し、次世代シーケンサーを用いて各細胞集団の遺伝子発現を比較する。H2B-GFP株のアロマターゼ遺伝子をmCherry遺伝子に置き換えた細胞株を樹立する。樹立したレポーター細胞株を分化誘導した後、セルソーターにかけ分化ステージの異なる細胞を分取し、次世代シーケンサーを用いて各細胞集団の遺伝子発現を比較する。樹立したレポーター細胞株を分化誘導した後、セルソーターにかけGFP陽性細胞と陰性細胞を分取する。次世代シーケンサーを用いて両細胞集団間の遺伝子発現を比較することで、栄養膜細胞の分化に関連した新規因子の同定を試みる。本年度使用予定の試薬の購入を次年度に繰り越したことと、キャンペーンの製品を購入するなどして支出が抑えられた。理由;本年度に購入予定だったCRISPR/Cas9システム関連の試薬の購入が次年度に繰り越した。使用計画;本年度購入予定であった試薬の購入や論文投稿の費用に充てる。レポーター細胞株の樹立が遅れたため、その細胞株を用いた解析に要する経費が掛からなかった。本年度購入予定であった試薬の購入や論文投稿の費用に当てる。
児童思春期の学校における自殺関連要因の前方視的研究

本研究では対象は、6歳から18歳の札幌市の小中学高校生に対してに対して本人および保護者から得た上で、1年目の希死念慮が2年目にどのように変化したかを2年連続して回答した小中高校生118名を対象に評価した。同時に、希死念慮と、抑うつ尺度、BCL(子ども行動チェックリスト)、Birleson:自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)、FTTを実施し、児童思春期における自殺行動に関連する、心理、コミュニケーション能力、発達障害の影響について探索的研究を行った。に自殺念慮の変化ならびにそれに関する要因を解析した。従来日本で使用されていた成人用の心理学的剖検アニュアルを基に海外の複数(アメリカ、イギリスのマニュアル)の児童思春期用の心理学的剖検マニュアルを参考にし、本研究のために児童思春期用の半構造化面接用の心理学的剖検マニュアルを作成した。分担研究者とともにそのマニュアルの妥当性について検討し、本研究で得られた質的なデータの解析法について検討を行った。また、アメリカ精神医学会に参加し海外の児童思春期の自殺研究に関わる専門家と児童思春期の自殺に関わる要因に関しての最新の知見に関して意見の交換を行った。札幌市教育員会と自殺予防対策共同研究事業ワーキンググループを立ち上げ札幌市の小学校、中学校、高校の教員並びにスクールカウンセラーと隔月ごとに対象のリクルートについての会議を開催し、対象のリクルートを円滑に行える体制を確立した。また、児童思春期の自殺に関しての講演を札幌市の教員を対象に6回行い本研究の理解と協力を求め、今後の対象のリクルートを推進する試みを行った。今年度は、当初の予定に従って心理学的剖検の児童思春期ようのマニュアルの作成及び対象のリクルートのための体制作りは円滑に行うことができたが、今年度は対象のリクルートは行うことはできなかった。我が国の自殺者数が急増し年間3万人を超えた1998年には全年齢層において自殺者数の増加が認められたが,中高年男性において自殺者数の顕著な増加が認められ,それが1998年以降の我が国の自殺の特徴とされていた。しかし,平成26年版自殺対策白書(内閣府, 2014)によると,近年では中高年層の自殺者数は大きく減少し,特に50代,60代では自殺死亡率が2013年時点で1998年以前の水準に回復している一方で,10代から30代の若年者においては自殺者数の減少が緩徐であり,10代から30代においては2013年時点で1998年と同水準かそれより高い自殺死亡率を示している。また,15歳34歳においては2012年における死因の第1位が自殺となっており,欧米諸国と比較しても極めて高い自殺死亡率となっている。対象は、6歳から18歳の札幌市の小中学生に対して2300名に対して本人および保護者から得たた上で、自殺関連要因を同定し、そのれに伴うCBCL(子ども行動チェックリスト)、Birleson:自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)、インタネット依存尺度:SDQ:FTTを実施し、児童思春期における自殺行動に関連する、心理、コミュニケーション能力、発達障害の影響について探索的研究を行った。札幌市内の小中高校生を対象に約2000名に対してDSRS-C)を実行し、「生きていててもしかたないと思うという項目が小学年(1-2年生)では自己記入式抑うつ評価尺度Cが7.3%、しょうがっこい高学年から小学年にかけては、27.5%、高校生では21.9%と、児童思春期を超えると自殺関連行動が急激に高まり、自殺関連行動の推移は成人の自殺者が減少にある実態とは異なり児童思春期に適切な自殺予防対策ためにも今回の結果をもとにさらに児童思春期の自殺関連行動に寄与する要因を明確にしていく必要がある。6歳から18歳の札幌市の小中学生に対して2300名に対して本人および保護者から得たた上で、自殺関連要因を同定し、そのれに伴うCBCL(子ども行動チェックリスト)、Birleson:自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)、インタネット依存尺度:SDQ:FTTを実施し、児童思春期における自殺行動に関連する、心理、コミュニケーション能力、発達障害の影響について探索的研究を行った。札幌市内の小中高校生を対象に約2000名に対してDSRS-C)を実行し、「生きていててもしかたないと思うという項目が小学年(1-2年生)では自己記入式抑うつ評価尺度Cが7.3%、しょうがっこい高学年から小学年にかけては、27.5%、高校生では21.9%と、児童思春期を超えると自殺関連行動が急激に高まり、自殺関連行動の推移は成人の自殺者が減少にある実態とは異なり児童思春期に自殺予防対策のためにも今回の結果をもとにさらに児童思春期の自殺関連行動に寄与する要因を明確にしていく必要がある。現時点では自殺企図者を同定することが可能とできるようになったが実際に実際に心理的な剖検に基づいた原因の探求には至っていない。

しかし,近年では中高年層の自殺者数は大きく減少し,特に50代,60代では自殺死亡率が2013年時点で1998年以前の水準に回復している一方で,10代から30代の若年者においては自殺者数の減少が緩徐であり,10代から30代においては2016年時点で1998年と同水準かそれより高い自殺死亡率を示している。また,15歳34歳においては2016年における死因の第1位が自殺となっており,欧米諸国と比較しても極めて高い自殺死亡率となっている。本研究では対象は、6歳から18歳の札幌市の小中学高校生に対してに対して本人および保護者から得た上で、自殺関連要因を同定し、それに伴うBCL(子ども行動チェックリスト)、Birleson:自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)、FTTを実施し、児童思春期における自殺行動に関連する、心理、コミュニケーション能力、発達障害の影響について探索的研究を行った。2年連続して回答した小中高校生118名を対象に自殺念慮の変化ならびにそれに関する要因を解析した。児童思春期を超えると自殺関連行動が急激に高まり、自殺関連行動の推移は成人の自殺者が減少にある実態とは異なり児童思春期に適切な自殺予防対策ためにも今回の結果をもとにさらに児童思春期の自殺関連行動に寄与する要因を明確にしていく必要がある。本研究では対象は、6歳から18歳の札幌市の小中学高校生に対してに対して本人および保護者から得た上で、1年目の希死念慮が2年目にどのように変化したかを2年連続して回答した小中高校生118名を対象に評価した。同時に、希死念慮と、抑うつ尺度、BCL(子ども行動チェックリスト)、Birleson:自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)、FTTを実施し、児童思春期における自殺行動に関連する、心理、コミュニケーション能力、発達障害の影響について探索的研究を行った。に自殺念慮の変化ならびにそれに関する要因を解析した。本年度構築した自殺予防対策共同研究事業ワーキンググループとの連携を維持しながら、当初予定した、6歳から18歳の自殺企図を図った男・女(30名)と性別・年齢で合致する健常群(30名)のリクルートを早急に行い。作成した心理的剖検マニュアルに基づき、半構造化面接を本人、家族、学校関係者に行い自殺行動に関連する要因を抽出する。また症状評価尺度を用いて精神症状および臨床的背景を評価し、さらに、対象者の継続した追跡調査を行う。今年度リクルートが困難だったことから、自殺予防対策共同研究事業ワーキンググループとの定期的な連携に加えて児童思春期の自殺に関する啓蒙・対応に関する冊子の作成などを行い本研究の意義と存在を教育者のみならず対象となる児童思春期の自殺未遂者及び家族にも研究への参加を促す試みを食いかしていく予定である。また、国内外の児童思春期の自殺に関する専門家と自殺予防に関する介入法について意見交換を継続していく予定である。児童思春期における自殺に関する研究は本邦では数が少なく、かつ系統だった研究はまれである。児童思春期の自殺を予防するためには、自殺に関わる要因を明らかにすることが不可欠である。本研究では、自殺行動に関連しる要因を明らかにする。ことを目的にする。前方視的に自殺行動の要因を明らかにすることを目的にする。本研究から自殺行動に関わるリスク因子および保護因子を明確にし、本邦における児童思春期の自殺予防策を作成するための基礎的な研究となることが目的である。今年度児童思春期の自殺関連行動者を同定することができたことをもとに、札幌市教委委員会と連携をしながら心理学的剖検を用いた自殺の便探求とともにと、平行継続した児童生徒の自殺関連行動の推移とそれに関連す要因を縦断的に、気分障害、学習障害、インターネット使用など多面的な面からの原因の探索を行う。
リン酸化α-シヌクレインとドパミンの相乗的細胞毒性に関する研究

パーキンソン病は神経変性疾患としてはアルツハイマー病に次いで有病率の高い疾患である。症状の主体である運動症状の本態は黒質におけるドパミン神経細胞の脱落であるが、なぜ選択的に細胞死が生じるかはわかっていない。一方でα-シヌクレインの病的代謝がパーキンソン病の分子病理おいて極めて重要と考えられている。本研究では、ドパミンの存在がα-シヌクレインの細胞毒性を増強する事を実験細胞を用いた手法により明らかにした。SH-SY5YにTet-ONシステム導入し、チロシン水酸化酵素を発現誘導する細胞株を複数樹立。チロシン水酸化酵素の発現は誘導後12時間で安定し、結果として産生されるドパミンは2日間後に定常状態となった。細胞内および細胞外にドパミンが産生・放出されることは細胞溶解液および、培地においてHPLC法によって確認した。チロシン水酸化酵素の過剰発現は細胞内に過量のドパミンを産生するため、ドパミンによってもたらされた酸化的ストレスによって細胞毒性がもたらされると考えた。実際に、チロシン水酸化酵素の過剰発現で、細胞内にROS(reactive oxygen species)の増加が確認されたが、細胞死は生じず、JNK,p38などのシグナル伝達においても変化を認めなかった。細胞外のドパミンが保護的に働く、という報告が多くあり、細胞外のドパミンの作用について検討することとした。実際には、ドパミンはドパミン受容体を介して細胞になんらかの影響を及ぼしていると考えられるため、培地にドパミンD1およびD2アンタゴニストを添加し、ドパミンの受容体への結合をブロックした。チロシン水酸化酵素の過剰発現とD1アンタゴニストの添加では細胞死は生じなかったが、D2アンタゴニストであるエチクロプリドでは細胞死(アポトーシス)が観察された。この結果はドパミンD2受容体刺激が細胞保護的に働いていることを示唆しており、確認のためD2アンタゴニストに加え、D2アゴニストを培地に添加した。D2アゴニストはキンピロールとPD-128907を使用したが、いずれも容量依存性にアポトーシス誘導を抑制した。これらの結果から、D2アンタゴニストの細胞保護効果は,薬剤固有の作用ではなく、D2受容体を介しているものと考えられた。細胞毒性と細胞保護、という相反する側面を持つドパミンであるが、本研究ではその細胞保護という観点からドパミン受容体の持つ重要性を明らかにしている。SH-SY5YにTet-ONシステムを導入し、チロシン水酸化酵素を発現誘導する細胞株を樹立。結果として、細胞内および細胞外にドパミンが産生・放出されることを確認。チロシン水酸化酵素の過剰発現は細胞内に過量のドパミンを産生するため、ドパミンによってもたらされた酸化的ストレスによって細胞毒性が誘導されると考えたが、実際にはチロシン水酸化酵素の過剰発現で細胞死は生じなかった。細胞外のドパミンはドパミン受容体を刺激し、これが細胞保護的に働くとする報告は多い。本実験系では細胞毒性を導く細胞内ドパミンを増加させる一方で、培地に放出されたドパミンによりドパミン受容体が刺激されている可能性を考えた。そこで、培地にドパミンD1およびD2アンタゴニストを添加し、ドパミンの受容体への結合を阻害した。この結果はドパミンD2受容体刺激が細胞保護的に働いていることを示唆しており、確認のためD2アンタゴニストに加え、D2アゴニストを培地に添加すると、D2アゴニストは容量依存性にアポトーシス誘導を抑制した。同様の実験をα-シヌクレイン過剰発現下で行った。チロシン水酸化酵素過剰発現+D2アンタゴニスト添加条件下において、さらにα-シヌクレインを過剰発現させると、より強い細胞毒性が示された。このときに、細胞内にはα-シヌクレインの凝集体が観察され、ウェスタン・ブロットでは不溶画分にα-シヌクレインの蓄積を認めた。
振動援用研磨による研磨条件の最適化と材料除去メカニズムの解明

本研究の目的は、マイクロ光学素子用金型の超平滑表面を高効率に創成するための振動援用研磨法について、その基礎特性を明らかにし、研磨精度、効率および制御性を向上させることである。これを実現するため、研磨中の材料除去メカニズムを解明し、研磨プロセスにおけるパラメータ間の相互関係を定量的に明らかにすることで、最適な研磨条件を求める。具体的な数値目標としては、小径(3 mm以下)の非球面や自由曲面を持つマイクロ光学素子用金型を10分以内に50 nm P-Vの高い形状精度と0.2 nm Ra以下の表面粗さに仕上げるプロセスの確立を目指す。本研究は2年間計画されたが、平成27年10月31日付で退職し、科研費応募資格を失うため、廃止された。従って、この半年に経て、実施した研究の成果は以下のようです。1)振動研磨ツールを直線・円・楕円状の各軌跡で振動させた場合の材料除去率及び表面粗さの違いを比較した。振動研磨ツールの振動周波数と振幅は、アクチュエータ部分の寸法または先端に取り付けるポリッシャ部分の長さによって調整することができる。これを利用して、振動周波数一定の条件で、被加工物の表面性状の振動振幅による違いを調べた。また、同様の実験を振動振幅一定の条件でも行い、周波数による表面状態の変化についても調査した。以上で得られた測定データに基づいて、各研磨パラメータの相互関係について評価を行った。2)研磨のプレストン方程式によれば、研磨圧力と材料除去率は比例の関係となる。申請者のこれまでの経験では、振動援用研磨においてはこの単純な比例関係は適用できず、ある一定の研磨圧力を境に材料除去率が下がる傾向にある。この現象を定量化し、原因を明らかにするため、研磨圧力を変化させた研磨実験を実施し、材料除去率と粗さの変化を調べた。2. Jiang GUO,兵庫県知事賞,中国留日同学会, 2015.
英語の形容詞と副詞の特徴と文構造における役割の研究

3年間にわたる本研究では、英語の形容詞というある意味では類似した性質をもつ2種類の要素の統語的・意味的な特徴を明らかにすることを目的とした。I.形容詞の統語上の特徴としては、名詞の前置修飾語と後位修飾語として用いられる用法と、述部の一部を構成する叙述形容詞としての用法がある。これに加えて、副詞節の省略された形で文頭に付加詞として用いられる用法がある。形容詞の意味上の特徴としては次の二つの点がある。先ず第一に、名詞の前位修飾語としての形容詞は、名詞の内在的特徴を形容し、この点で属性付与と分類という機能をもつと考えられる。第二に、名詞の後位修飾語と叙述形容詞と付加詞としての形容詞は、多くの場合名詞の一時間な特性を記述する機能をもつと考えられる。II.副詞の統語上の特徴としては、連結動詞の補語として用法もあるが、多くの場合は付加詞として用いられる。同一の語が叙述形容詞と単純形容詞として用いられることがあるが、その機能は明らかに異なる。叙述形容詞は名詞の一時的特性を記述し、多くの場合「小節(small clause)」として分析することが可能である。他方、単純形副詞は、形容詞に類似しているが、根本的に副詞としての機能を有しており、名詞の特性を形容するという機能はなく、むしろ名詞の状態・様態を表わす。例えば、John spelled my name wrong.という文における単純形副詞wrongは、My name was wrong.ということではなく、The spelling of my name was wrong.ということを表わしており、副詞的な働きをしていることが明かである。副詞の意味上の特徴は、動作や出来事の様態や状態を形容するという抽象的な修飾機能をもつ点にある。そこで、このような特徴は、指向性(orientation)という概念を認め、一次的指向性と二次的指向性という多重的な修飾機能を仮定して、説明する必要がある。1.形容詞と副詞の用法に関して、形容詞は人・物の属性を表現し、副詞は状態や様態を表現するものである、ということを基本的な仮説として設定し、これらの要素の特徴を明らかにしようと試みた。このような立場に立つと、He is careful.やHe left the room angry.やI like my coffee black.のような文における、careful,angry,blackといった叙述形容詞の用法と、He opened the doorwide.のwideのような単純形副詞やHe drives carefullyのcarefullyのような様態の副詞の用法との違いが明らかになる。さらに、なぜ副詞は形容詞と異なり、名詞の前位修飾語になることが一般に不可能であるか、ということも説明できる。2.副詞の中にも、Reluctantly he was in London alone.におけるreluctantlyのような主語副詞やShe painted thewall beautifully.のbeautifullyのように、一見したところ人や物の属性・特性を表わすようにみえる用法がある。このような副詞の用法も対応する形容詞の用法とは明らかに異なっており、このような副詞の働きは「一時的属性の付与」ということで、基本的には副詞の上で指摘した用法の一部とみなすことができる。3.英語では前置詞句が副詞的要素として用いられることが多いが、しばしば前置詞が省略されて名詞句が単独で副詞として用いられることがある。名詞句が文の中に生ずることにはいろいろな問題があり、どのような場合に、名詞句が前置詞なしで副詞として用いることができるかを検討した。

1.形容詞の〓語上の特徴としては,名詞の前位・後位修飾語として用法と述語の一部を構成する叙述形容詞としての用法がある.これに加えて,副詞節の省略されたものとして,文頭に付加詞的に用いられる場合もある.形容詞の意味上の特徴としては,形容詞の内在的な特徴と被修飾語である名詞の特性を考慮して,より細かな規定を要する点もあるが,一般的には次のように要約できる. (1)名詞の前位修飾語としての形容詞は,名詞の内在的特徴を形容し,この点で,属性付与と分類という機能をもつと考えられる.(2)名詞の後位修飾語と叙述形容詞と付加詞としての形容詞は多くの場合,名詞の一時的特性を記述する機能をもつと考えられる.2.副詞の〓語上の特徴としては,一部の副詞は連結動詞の補語として用いられるものもあるが,多くの場合は付加詞として機能する.英語には同一の語が叙述形容詞と単純形副詞として用いられるが,その機能は明確に異なる.叙述形容詞は連結動詞の補語としての機能に類似し,名詞の一時的特性を記述し,理論的には「小節(small clause)」分析が可能である.他方,単純形副詞は,基本的に副詞である,名詞の特性を形容する機能はなく,状態・様態を表す.例えば,John spelled my name wrong.という文におけるwrongは,The spelling of my name was wrong.ということを表し,叙述形容詞の働きとは異なる.副詞の意味上の特徴は,動作や出来事の様態や状態を形容するという抽象的な修飾機能をもつ.そして,副詞の意味機能を説明するには,指向性という概念を認め,一次的指向性と二次的指向性という多重的な修飾機能を仮定する必要がある.
蛋白質の膜透過と選別輸送の分子機構

細胞内には、その複雑な生命現象を維持するために多くの高分子が存在するが、その中で、蛋白質は最も重要な役割を担うものである。この蛋白質は一部のものを除き、その合成場所から、本来、機能し、生理的役割を果たすべき場所に正確に輸送されなければならない。従って、細胞の機能と動態を分子細胞生物学的に明確にするためには、この蛋白質の選別輸送の分子機構の解明が必須である。そこで平成3年度より重点領域研究「蛋白質の膜透過と選別輸送の分子機構」が発足することとなり、以下に示す会議によって綿密な研究計画が討議された。1)平成2年10月22日、大阪にて。坪井昭三(山形大)、伊藤明夫(九州大)、橋本隆(信州大)、森正敬(熊本大)、米田悦啓(大阪大)、伊藤継昭(京都大)、池原征夫(福岡大)、大西俊一(京都大)、高野達哉(帝京大)、田代裕(関西医科大)、中野明彦(東京大)、吉田匡(山形大)、横田貞記(山梨医科大)、本家孝一(北海道大)、らによって、研究計画申請書作製などについて討議がなされた。2)平成2年12月21日、大阪にて。斧秀勇(山形大)、堀内正公(熊本大)、三輪正直(筑波大)らによって事務手続きの打ち合わせがなされた。3)平成3年1月2829日、山形にて。水島昭二(東京大)、佐藤了(大阪大・名誉教授)、加藤敬太郎(九州大)、田代裕(関西医科大)、勝沼信彦(徳島大)、大西俊一(京都大)、大村恒雄(九州大)、坪井昭三(山形大)、吉田匡(山形大)、斧秀勇(山形大)らによって平成3年度の研究及び会議の計画について討議がなされた。4)平成3年2月28日、文部省にて。水島昭二(東京大)、名取俊二(東京大)加藤敬太郎(九州大)、田代裕(関西医科大)、坪井昭三(山形大)高井義美(神戸大)らによって、重点領域研究公募者の審査が行われた。
高品質・高機能イメージングのためのカラー画像疎表現理論に基づく新画像復元法の開発

研究代表者らがこれまでに開発した「各種のハイブリッドフレーム」と「各種のColor Shrinkage法」とを組み合わせることで,以下に述べる各研究課題に取り組んだ.1.まず,研究代表者らがこれまで開発してきた画像復元法と同一の数学的枠組みで定式化し,最適構成した.2.カメラ内処理によって生じる各種の妨害を個別に取り扱うのではなく,一括して取り扱って除去する画像復元課題を最適構成した.3.暗闇での撮影によって得られた劣化観測データから高画質のカラー画像を復元する問題を,光電変換によって発生した光電子の計数過程のポアソン分布を用いたカラー画像疎表現問題として定式化し最適構成した.1.順次型冗長DCTとSoft Color-Shrinkageを用いたカラー画像雑音除去法:冗長DCTを用いた雑音除去では,DCT係数間に相互相関がある.この相関を利用すると雑音除去性能を改善することができる.本研究では,順次型冗長DCTを用いることで演算量を増加させることなく,雑音除去性能の改善が得られることを示した.2.空間適応型の混合カラーセミノルムを用いたカラー画像雑音除去:空間適応型カラー全変動セミノルムとカラーBesovセミノルムを正則化セミノルムとして用いたカラー画像の雑音除去法を構成し,これにより各セミノルムに由来したアーチファクトの発生を抑制しつつ,画像テクスチャをより鮮明に復元できることを明らかにした.3.混合ガウス分布モデルに基づく適応的Shrinkageを用いたカラー画像雑音除去:劣化信号の混合ガウス分布モデルに基づき,劣化信号から真の信号を推定する問題の解として空間適応的Shrinkageを構成し,これをWavelet雑音除去に適用すると,選択的に雑音が除去され,従来法よりも視覚的に自然なテクスチャが復元されることを明らかにした.4.混合ガウス分布モデルに基づく適応的Shrinkageを用いたカラー画像雑音除去:ポアソンランダム画像の最高水準の復元法であるPIDAL-FA法に分散安定化変換と色刊相関を考慮したカラーBesovセミノルムを導入した方式を構成し,その有効性を実験的に明らかにした.研究代表者らがこれまでに開発した「各種のハイブリッドフレーム」と「各種のColor Shrinkage法」とを組み合わせることで,以下に述べる各研究課題に取り組んだ.1.まず,研究代表者らがこれまで開発してきた画像復元法と同一の数学的枠組みで定式化し,最適構成した.2.カメラ内処理によって生じる各種の妨害を個別に取り扱うのではなく,一括して取り扱って除去する画像復元課題を最適構成した.3.暗闇での撮影によって得られた劣化観測データから高画質のカラー画像を復元する問題を,光電変換によって発生した光電子の計数過程のポアソン分布を用いたカラー画像疎表現問題として定式化し最適構成した.1.カラー画像疎表現理論に基づくカラー画像復元法の開発研究代表者らは,1カラー画像復元に適した新しい各種のハイブリッドフレームや,2三原色信号間の相互依存性を考慮した新しい各種のColor Shrinkage法を開発し,これらを用いて劣化カラー画像から復元カラー画像の疎表現を求めることで,雑音除去,JPEG・MPEG超解像度復号,超解像度画像拡大などの個別のカラー画像復元が効果的に実現され,かつ世界最高水準の性能が達成されることを確認している.これらの画像復元課題に加え,デモザイキング歪やぼけ歪など,カメラ内処理によって生じる各種妨害の除去を行う際に必須となる画像復元法を開発した.2.カメラ内処理による劣化カラー画像の高画質のためのカラー画像復元技術の開発レンズ系・光学LPFなどによる画像ぼけやショット雑音に汚された観測信号に,デモザイキング,色・諧調変換,画像圧縮符号化などの標準的カメラ内処理が適用されて出力された“劣化カラー画像"から,カメラ内処理に関する情報を活用して,より高品質なカラー画像を復元する技術を開発した.上記の“カラー画像疎表現理論に基づくカラー画像復元法"で開発された各種の手法を,統一的な数学的枠組みの中で統合化することによって,カメラ内処理による劣化カラー画像の高画質化のための復元技術を構築した.すなわち,各種の妨害を個別に取り扱うのではなく,一括して取り扱って除去する画像復元課題を,統一的な数学的枠組みで再定式化し,その求解アルゴリズムを研究代表者らが開発した各種のハイブリッドフレームとColor Shrinkage法を組み合わせることで最適な構成法の検討を行った.夜間画像監視のように入射光量が極端に少ない条件下で撮像した場合,撮像した動画像の各画素位置における観測値は,光電変換に由来したポアソン分布に従う確率変数に,電子回路等に由来した白色ガウス性雑音が加わった確率変数として統計的にモデル化できる.これまで,一般的な動画像復元法として,V-BM4D法など,高度な動き解析を伴う動画像復元法が考案されてきたが,ポアソンーガウシアン動画像に対し,このようなタイプの既存の動画像復元法を直接に適用しても,必ずしも良好な復元動画像が得られることを期待できない.本研究ではポアソンーガウシアン動画像に特化した動画像復元法を具体的に構築した.この動画像復元法では,観測値の統計的信頼度を高めるため,処理に先立って画素ビニング(Pixel binning)を行っている.また,破綻することがあらかじめ予想される“高度な動き解析"を避けるため,画像変換として三次元DCT(3D-DCT)を採用した.この動画像復元法によれば,復元対象のポアソンーガウシアン動画像からある程度良好な画像品質の動画像を復元することが可能であり,この復元動画像を用いることで静動判定や動き推定などの動き解析が安定に行えることを示した.

したがって,動画像復元を2パスとすることで,その復元能力をさらに向上させることが可能である.すなわち,本研究では動画像復元を第1ステップとし,その復元動画像に静動判定を適用し,さらに第2ステップの動画像復元において静止領域と動領域とで復元処理パラメータを別々に適応制御することで,その復元性能をさらに改善可能であることを実験的に明らかにした.総合領域本研究で得られた研究成果を学会大会、シンポジウム当で発表している。また、これらの研究成果を4件の論文として学会論文誌に投稿し、掲載されている。当初の予定通り,おおむね順調に研究をおこなっている.得られた研究成果を学会大会,シンポジウム等で発表している.また、これらの成果を学会論文誌に4件の論文として投稿し,掲載されている.これまで静止画像を対象として研究開発を行ってきた画像復元法を、動画像に応用するための研究を行う予定である。具体的には、静止画像で用いていた2次元DCTを動画像処理では3次元DCTを用いる。DCT変換の3次元化により増加する演算量を抑制するためのアルゴリズムを検討する。夜間の監視カメラ等、きわめて低光量下で撮影された動画像画像の復元法を検討する。これまで,主に静止画像を対象としてその復元法・雑音除去法の検討を行ってきた.次年度以降では,静止画像復元法・雑音除去法の更なる性能改善とともに,動画像を対象とした復元法の検討を行って行く予定である。具体的には,画像を時間方向も含めて3次元のデータと見なし,3次元の冗長変換とColor Shrinkageを適用することで,動画像特有の時間方向の相関を活用した画像復元法・雑音除去法の開発を行う予定である.残金が少額となったため、物品等の購入が困難であったため。次年度の使用額が少額なため当初の使用計画の特段の変更は無い。該当なし
岩石の圧電性に関する基礎研究

ある種の結晶構造に応力が加えられると、応力に比例した分極が生じる。また、このような結晶構造に電場を加えることによって、電場の強さに比例した歪みが生じる。この現象は圧電効果と呼ばれている。この圧電効果は、マイクロフォン、スピーカーやピックアップといった音響機器、ソナーや魚群探知機、厚み計といった計測機器、ライターや内燃機関の点火装置、通信機器のフィルターなどに古くから多方面で応用されている。岩石の電気的性質をとらえようとしたとき、岩石は異種類の造岩鉱物の集合体であり、圧電性を持つ結晶も中に含む。このことから、岩石も圧電性を持つと考えられている。また、岩石に荷重を加えた際の電気的性質ついては、そのクラックの発生、進展及び破壊の際に、岩石小片の複雑な移動やこれに伴う界面の変化によって電荷の分配が行われ電気信号が観測されることも知られている。しかし、岩石及び岩盤の組織、構造は極めて複雑であるためその電気的性質には解明すべき点や未知の点が数多く残されている。殊に、岩石の圧電性については、試験片で静的に荷重を加えた際の現象についての研究や、発破による振動を与えた際に石英岩脈近傍で生じる電荷についての研究等が報告されているがその数は少ない。本研究では、花崗岩ブロックにハンマーで衝撃荷重を加えた際に衝撃を加えた点の近傍で生じる電荷と離れたところで生じる電荷及びハンマーに生じる歪みの測定を行い、その結果を述べるとともにその波形を検討し、衝撃荷重を岩石に加えた際の岩石の電気的性質について詳細に検討した。今回の研究の成果としていくつかの興味深い現象が見出された.不明な点もいくつかあり、今後の継続的な研究が是非とも必要であるが、このように荷重を加えた際の岩石の電気的性質を解明することは、岩盤崩壊の検知や圧電鉱物を含む岩石を母岩に持つ鉱脈の探査等多方面に役立つことになると思われる。地震時あるいはその前後に,地電流の異常,電磁波の発生が観察されている.5年ほど前から,室内の圧縮試験において,試験片が破壊する前後になにか電気的な異常(現象)があらわれないかどうかを調べ,岩石の円柱試験片に圧縮応力を加えると電位差が生ずること,また,岩石の棒に衝撃波を加えると電位差が生じ,その電位差は誘電分極により生ずる圧電気では説明できないほど大きいことを見出した.本研究では,上記の予備試験にて観察された,岩石の圧電性について実験的・理論的な検討を加えて下記を明らかにすることを目的とする.(1)電位差の生ずる機構を明らかにする.(2)見出された圧電効果の応用方法をいくつか考え,その内有望と思われるものについてフィージビリティ・スタディ等をおこなった.その概要をまとめると次のようになる.1.試料岩石の収集と現象の分類:圧電現象は岩石ごとにかなり異なる可能性があるが,どんな岩石でどういう現象が観察されるかは現在のところ全く不明である.現象の分類と,各分類に対応する岩石の特徴をまずあきらかにすることが平成9年度の第1目標と考える.そこで,本年度はできる限り多くの岩石を収集した.2.定応力速度ないし定歪速度試験:できる限り多種類の岩石を使用して定応力速度試験ないし定歪速度試験を実施した.なお,試験片を節約するため破壊試験はごく一部おこなった.3.衝撃試験:出来る限り多くの岩石を使用して,衝撃試験を実施した.その際の目標は,衝撃圧電現象の分類と,各分類に対応する岩石を明確に示すことである.4.クリープ試験法の開発:一定応力下での圧電現象を観察する.

この実験は従来の報告が全くなく現在のところ具体的な実験計画を思いつかないが,定応力速度試験ないし定歪速度試験の結果を詳しく検討した後,試験方法を検討した.ある種の結晶構造に応力が加えられると、応力に比例した分極が生じる。また、このような結晶構造に電場を加えることによって、電場の強さに比例した歪みが生じる。この現象は圧電効果と呼ばれている。この圧電効果は、マイクロフォン、スピーカーやピックアップといった音響機器、ソナーや魚群探知機、厚み計といった計測機器、ライターや内燃機関の点火装置、通信機器のフィルターなどに古くから多方面で応用されている。岩石の電気的性質をとらえようとしたとき、岩石は異種類の造岩鉱物の集合体であり、圧電性を持つ結晶も中に含む。このことから、岩石も圧電性を持つと考えられている。また、岩石に荷重を加えた際の電気的性質ついては、そのクランクの発生、進展及び破壊の際に、岩石小片の複雑な移動やこれに伴う界面の変化によって電荷の分配が行われ電気信号が観測されることも知られている。しかし、岩石及び岩盤の組織、構造は極めて複雑であるためその電気的性質には解明すべき点や未知の点が数多く残されている。殊に、岩石の圧電性については、試験片で静的に荷重を加えた際の現象についての研究や、発破による振動を与えた際に石英岩脈近傍で生じる電荷についての研究等が報告されているがその数は少ない。本研究では、花崗岩ブロックにハンマーで衝撃荷重を加えた際に衝撃を加えた点の近傍で生じる電荷と離れたところで生じる電荷及びハンマーに生じる歪みの測定を行い、その結果を述べるとともにその波形を検討し、衝撃荷重を岩石に加えた際の岩石の電気的性質について詳細に検討した。今回の研究の成果としていくつかの興味深い現象が見出された.不明な点もいくつかあり、今後の継続的な研究が是非とも必要であるが、このように荷重を加えた際の岩石の電気的性質を解明することは、岩盤崩壊の検知や圧電鉱物を含む岩石を母岩に持つ鉱脈の探査等多方面に役立つことになると思われる。
ベクトル最適化問題の解析的研究と制御システムへの応用

最適化理論全般に関連する凸解析及び錐解析に現れる解析的な性質を体系化するために、その最近の研究結果を論文の別刷りやコピーとして収集した。これらの資料をもとにして研究を行い、いくつかの新しい知見が得られ、大きく分けて以下の3つの結果が得られた。1.ε-劣微分解析を取り入れたベクトル最適化問題の考察を経て、ベクトル最適化問題の近似解の解析的研究を行い、論文として発表することが出来た。これは、ベクトル最適化問題の近似解の解析的研究に関するユニークな取り組みであり、近似的有効解の存在性やその特徴付けが理論的に与えられた。2.ベクトル値関数に関する性質を凸性・準凸性及び半連続性についていろいろなクラス分けとそれらの間の関係についてさらに解析し、新しい錐鞍点の存在定理を証明した。また、昨年10月に来日したロシアの研究者との意見交換により、これらの結果を応用した共同研究を実現し、その研究を論文としてまとめた。この論文は、平成8年度の国際会議で発表する予定である。3.上の2に関する研究を微分ゲームや制御問題に応用するためには、集合値写像の凸性や半連続性を考慮した集合値解析及び集合値最適化を研究しなければならないことが明らかになった。これに従い、集合値写像の半連続性の非整合性を指摘し、その改良した概念とそれらの関係を明らかにした。これについては、京都大学数理解析研究所講究録に発表した。今後、集合値写像の凸性の理論的な調査研究をし、その結果に基づいて集合値解析及び集合値最適化の研究を行う予定である。
感染などの明確な要因が誘発する癌の罹患率予測を実現する人口学モデルの構築と実装

肺癌と子宮頸癌を対象にして,喫煙率の低下やHPVワクチンの摂取率の増加といった危険因子への暴露の減少と人口動態を考慮した癌の数理モデルを構築し,発癌メカニズムを理解する.肺癌では,喫煙率は減少しているが,高齢化によって肺癌の罹患数が増えており,このようなメカニズムを定量化する.モデルを基に癌の罹患率を定量的に予測するシステムを確立し,禁煙やHPVワクチン接種といった対策の癌抑制効果を明らかにする.肺癌と子宮頸癌を対象にして,喫煙率の低下やHPVワクチンの摂取率の増加といった危険因子への暴露の減少と人口動態を考慮した癌の数理モデルを構築し,発癌メカニズムを理解する.肺癌では,喫煙率は減少しているが,高齢化によって肺癌の罹患数が増えており,このようなメカニズムを定量化する.モデルを基に癌の罹患率を定量的に予測するシステムを確立し,禁煙やHPVワクチン接種といった対策の癌抑制効果を明らかにする.
パターン化脂質二分子膜を利用したタンパク質の濃縮と2次元結晶化

研究代表者は、生体膜の新しいモデル系として、光重合したポリマー脂質二分子膜と流動性脂質二分子膜をハイブリッド化するパターン化モデル生体膜作製手法を世界に先駆けて開発し、光重合条件を制御することでポリマー脂質二分子膜と流動性脂質二分子膜がナノメートルオーダーで混合したコンポジット膜を作製することに成功した。そして、パターン化脂質二分子膜において流動性脂質膜中の脂質成分が秩序液晶相と無秩序液晶相に分離・濃縮されるという新規な現象を発見した。本研究は、この現象を利用することで、膜に結合したタンパク質を基板表面のパターン化区画に濃縮することを目的とした。平成22年度は、パターン化脂質二分子膜に結合した水溶性タンパク質および膜結合型タンパク質の導入および濃縮を検討した。糖脂質(GM1)を含む脂質二分子膜に水溶性のタンパク質であるコレラ毒素(subunit B:CTB)を結合した実験では、CTBがパターン化膜中でポリマー脂質膜のない区画に濃縮される様子を全反射蛍光顕微鏡で観察することに成功した。また、流動性脂質膜にビオチンを持つ脂質を組み込み、ストレプタビジンを膜表面に結合した実験では、パターン化膜の区画中にストレプタビジンの2次元結晶が形成することが観察された。これらの結果から、水溶性タンパク質についてはパターン化基板上での濃縮および2次元結晶化が可能であることが示された。また、膜結合型タンパク質としては、パターン化膜にロドプシンを導入し、活性を計測することに成功した。これらの結果は、今後膜結合型タンパク質の濃縮、結晶化につながるものと期待される。本研究は、この現象を利用することで、膜に結合したタンパク質を基板表面のパターン化区画に濃縮することを目的とする。平成21年度は、(1)パターン化脂質二分子膜内における脂質成分の相分離メカニズム解析、(2)膜に結合した水溶性タンパク質の濃縮、の検討を行った。その結果、パターン化脂質二分子膜において秩序液晶相と無秩序液晶相の相分離が起きるのは、脂質分子が膜内を2次元拡散しながら、秩序液晶相がポリマー脂質膜のない区画に特異的に成長するためあることが示された。また、糖脂質(GM1)を含む脂質二分子膜に水溶性のタンパク質であるコレラ毒素(subunit B : CTB)を結合した実験では、パターン化膜中でCTBがポリマー脂質膜のない区画に濃縮される様子を全反射蛍光顕微鏡で観察することに成功した。この結果から、少なくとも水溶性タンパク質についてはパターン化基板上での濃縮が可能であることが示された。今後は、膜結合型タンパク質を用いた検討を進める予定である。
イネいもち病菌の付着器形成機構の分子遺伝学的研究

1.変異株の取得と解析米国より導入した交配能を持ついもち病菌株を用い、NTG、UV、REMI法により変異処理を行った後、付着器形成欠損の形質を示す変異株を50株程度取得した。それらについてcAMPによる回復を指標とした検定により変異形質の特徴を推定したところ、得られたすべての変異株がcAMPの関与する過程以降の分化誘導後期変異株であることが判明した。また、変異株のうち、既知の現象であるConAによる付着器形成阻害反応と類似の形質を示す株について、交配による遺伝解析を行った。現在さらに詳細な遺伝解析を行っている。2.分化形態形成時に特異的に発現する遺伝子群のディファレンシャルサブトラクション法による取得付着器形成条件下の発芽胞子と、栄養成長時の菌糸からcDNAを用い、サブトラクション法により付着器形成初期に特異的に発現する遺伝子のクローニングを行った。付着器形成条件の発芽胞子からは、極めて微量のmRNAしか得られないことから、従来のドライバー-DNAのビオチンラベルによるケミカルサブトラクションにアダプター配列を利用したPCRによるテスターDNAの増幅濃縮法を組み合わせ、目的の特異的遺伝子群を含むと考えられるディファレンシャルcDNAライブラリーの構築に成功した。このライブラリーよりノーザンハイブリダイゼーション及びRT-PCR法により、分化時特異的に発現していると考えられたcDNAにつき、塩基配列の決定、染色体クローンの取得と解析を行った。現在さらにプロモーター領域の解析、遺伝子の機能解析を行っている。
LIM・PDZ構造を持つLIMK2の機能解析と発生分化及び癌化に於ける役割の解明

我々は蛋白-蛋白結合に関与するLIM・PDZドメインとキナーゼドメインを持つLIMK2遺伝子を単離し、この遺伝子の各種組織の発生分化及び癌化への関与の解明を目指し、種々の検討を行い、以下のような成果を得た。(1) LIMK2a・2b isoformの発現を定量的に解析し、組織特異的・発生段階特異的なisoformの発現制御を確認した。又、一部の腫瘍細胞株でLIMK2の発現制御の異常を見出した。(2) LIMK2a・2b isoformの発現制御機構を解明するため、2種のisororm各々のプロモーター領域を単離し解析を進めた。その結果、各々のプロモーターはともにTATA-lessプロモーターであり、単一の転写開始点を持つことが判明した。又、各々のプロモーターにおいて転写活性化・転写抑制領域を見出した。LIMK2b上流の転写活性化領域には、一部の脳細胞の発生分化に必須な核内レセプターのRORα結合領域が見られ、実際にLIMK2b高発現細胞株においては、RORαの発現が亢進していることが判明し、RORαがLIMK2bの発現制御に関与していることが示唆された。又、MZFlがLIMK2aの発現に関与している可能性も示唆された。(3)ヒトLIMK2のプロモーターを含めた遺伝子構造が、種を越えて保存されていることを明らかにした。(4) Tet-offシステムでLIMK2a・2bが発現誘導される正常気管支上皮細胞株を樹立した。この細胞でLIMK2を発現誘導することで、LIMK2遺伝子が細胞周期・細胞骨格形成・細胞分化等の制御に関与している結果を得た。(5) LIMK2結合分子の候補として新規LIM結合分子ヒトLdb2を単離した。Ldb2はLIMK2と共に他の核内LIM蛋白と結合する結果を得ており、LIMK2の蛋白複合体形成の制御に非常に重要な関与をしていることが示唆された。我々は蛋白-蛋白結合に関与するLIM・PDZドメインを持ち、肺癌細胞株の一部で発現増強が見られるLIMK2遺伝子を単離し、この遺伝子の各種組織の発生分化および癌化への関与について、主として固形腫瘍発症との関連を中心に検討を進めている。本年度の研究に於いては、転写開始点の違いにより生じるLIMK2遺伝子の2種のisoformであるLIMK2a・2bの組織特異的発現制御機構とその生物学的機能の解明を目指して、第一に正常組織及び種々の癌細胞株に於ける2a・2b isoformの発現量を定量的に解析した。その結果組織特異的な発現調節を確認すると共に、一部の癌細胞株で2b isoformの異常な発現増強が見られることを見い出した。又、2a・2b各々の遺伝子構造及び転写開始点の確定・特異的プロモーター領域の単離を終了し、プロモーター活性を解析し発現制御機構の解明を進めた。現在2a・2b isoformの発現比率と、単離した各々のプロモーター活性が相関することを確認し、その転写活性領域の同定を進めており、発現制御機構の解明を目指している。又、テトラサイクリンレプレッサーの系を用いてLIMK2a・2b各々をヒト正常気管支上皮細胞株へ遺伝子導入し、各々を発現誘導し得る細胞株を樹立し、LIMK2遺伝子の細胞生物学的機能の解析を開始した。増殖能の変化・分化誘導等を示唆する初期的結果が得られており、更に解析を進めている。

一方、LIMK2のLIMドメインに結合する遺伝子の候補のひとつとしてヒトLdb2遺伝子を単離し、LIMK2遺伝子の機能との関連を中心に検討を始めている。我々は蛋白-蛋白結合に関与するHM-PDZドメインとキナーゼドメインを持つLIMK2遺伝子を単離し、この遺伝子の各種組織の発生分化及び癌化への関与の解明を目指し、昨年度に続き本年度も検討を進め、以下のような成果を得た。HMK2遺伝子の2種のisoformの組織特異的な発現制御機構とその生物学的機能の解明を目指して、昨年度に単離解析を進めていた2種のisoform各々のプロモーター領域の解析を、本年度は更に進めた。その結果、各々のプロモーターはともにTATA-1essプロモーターであり、単一の転写開始点を持つことが判明した。各々のプロモーターにおいて転写活性化・転写抑制領域を見出した。HMK2bの転写活性化領域には、一部の脳細胞の発生分化に必須と思われる核内レセプターのRORα結合部位が見られ、実際にLIMK2b高発現細胞株においては、RORαの発現が亢進していることが判明し、LIMK2b発現への関与が示唆された。又、LIMK2aの転写活性化領域とLIMK2bの転写抑制領域にMZF1結合部位が見られ、LIMK2a発現への関与が示唆された。この解析に伴い、ヒトLIMK2遺伝子が、LIMK2a特異的なエクソン1・2及びLIMK2b特異的なエクソン2b-1が40kb近い広い範囲に散在するという、マウスLIMK2と酷似した特異な構造をとることが判明し、このような特異な構造に基づく2種のisoformの転写調節の重要性が示唆された。又、LIMK2遺伝子の細胞生物学的機能の解明を目指し、昨年度樹立したTet-offシステムでLIMK2a・2bが発現誘導される正常上皮細胞株を用いて、本年度はLIMK2発現による増殖能・細胞形態・分化マーカー等の変化を検討した。その結果LIMK2遺伝子の細胞周期・細胞骨格形成・細胞分化等における制御機能が示唆される結果を得た。