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表現する組織：イノベーションの実現における芸術・人文学的知識の役割についての研究

本研究では、イノベーションの実現における芸術・人文学の役割として、英国の芸術・人文学研究評議会(AHRC)等が助成する、イノベーションに資する芸術・人文学研究・教育事業の調査、芸術・人文学の知見を導入した、イノベーションに関する観察や研究の可能性の探求を行った。その結果、次の三点が明らかになった。第一に、イノベーション研究は、経済的、技術的な観点で進められてきたが、文化的、哲学的な視点を導入することによって、より創造的な議論へと進むことができる。第二に、このような議論を進めるには、芸術・人文学から社会科学を横断し、人とその仕事の社会とのつながりの性質(ビジネス、コミュニケーション、デザイン)や、その質的階層(実践的、知的、創造的)による類型化が必要である。第三に、このように時空間と人の活動の関係性を中心にイノベーションを再考してみることによって、情報技術の高度化に伴う新しい社会科学の役割として、イノベーションを促進する研究実践についての議論も行うことができる。最終年度に当たる2018年度は、研究成果の取りまとめとして、工業化が進んでいた時代とは異なる、インターネットの普及、デジタル技術の進歩、メディアのパーソナル化による、表現の時代のイノベーションについての概念的枠組みを検討した。さらに、本研究を応用し、複雑とされ、学際研究が要請されるような社会的課題に取り組む、情報技術の高度化に見合った社会調査や質的研究の手法について検討した。この手法を通じて、「大学文化(と社会との関係)を変える」ことを目的としたパブリックエンゲージメント事業など、多様な人や組織が関与する、クリエイティブ経済特有の事業に関わる組織や戦略の研究に向けた議論も開始することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は、1)イギリスのクリエイティブ産業政策の成功要因を、政府の「外」、すなわち、産業、企業、大学、地域の4つの観点から再考した。また、2)平成28年度の課題である、この政策の基本方針を踏まえた概念的枠組みを構築するための予備調査を行った。さらに、3)この枠組みを構築するために必要となる日本企業の事例に関する共同研究を実施した。まず、1)については、文献資料調査およおび現地調査に基づいて、イギリスのクリエイティブ産業政策にかかわる企業や大学、研究者、専門家などにインタビュー調査を行った。具体的には(1)UKTI (英国貿易産業省)が主催したINNOVATE 2015に参加し、政府と企業、産業の関係についてのインタビュー調査を実施した。また、(2)芸術人文学評議会の支援を受けて行われている、知識交流4拠点(大学)の研究者らと議論を重ねた。さらに、(3)文化・メディア・スポーツ省、Nestaにおけるクリエイティブ産業政策をめぐる統計、および実証分析の専門家と意見交換を行った。2)については、クリエイティブ産業政策の基本方針を枠組みとする理論を構築するため、その基礎となる歴史的背景の整理を行った。具体的には、イギリスのアーツ&クラフツ運動およびドイツ表現主義のデザイン界、製造業への波及についての調査を行った。表現主義運動は、イギリスで起きたアーツ&クラフツ運動からの影響も受けているが、ドイツはイギリス以上にその影響が製造業に強く見られる点で注目に値する。3)クリエイティブ産業政策の基本的な方針を踏まえた概念的枠組みを日本企業に示唆を与えうるものとするため、マツダの事例研究を行った。具体的には、マツダにおける魂動デザインをめぐるリーダーシップやデザイナーの思考と実践に関して、インタビュー調査を広島本社およびカリフォルニアのデザインスタジオで実施した。1)イギリスのクリエイティブ産業政策の成功要因を、政府の「外」、すなわち、産業、企業、大学、地域の4つの観点から再考し、その成果の一部を、平成27年度10月に行われた研究・技術計画学会年次大会において発表した。平成28年度中には、論文として投稿する予定である。なお、この政策は、政権の変化によっていまだ変化もあるため、平成28年度以降も調査を重ねる予定である。2)イギリスのクリエイティブ産業政策は、芸術や文化産業の振興策だと思われる事が多いが、実際には、科学、技術、経済を中心とするイノベーション論に対する、アート、文化、芸術の視点を取り入れた考え方であり、芸術人文学の視野と科学的な視点を融合した概念的枠組みが必要である。平成27年6月に行われた組織学会の研究発表大会(一橋大学)にて発表を行い、芸術人文学的な視点と科学的な視点の違いを体感することができ、重要な示唆を得ることもできた。また、イギリスで開催されたINNOVATE UKにおいて、C.P.スノーの「二つの文化」(1959)を解決することがこの政策の目的であることがはっきりと明示されたため、この概念を踏まえた上で、これまでの創造性研究・理論を踏まえた、芸術人文学的な視点に基づく概念的枠組みを構築することがふさわしいことがわかった。二つの文化とは、日本で言えば、文系、理系の違いによって生じる問題であり、最近では、日本企業の問題として指摘されることも増えてきている。3)平成28年3月に発行された一橋ビジネスレビューのケーススタディとして「マツダデザイン“CAR as ART"」を発表することができた。本研究は、デザインに焦点を当てたため、今後の課題としては、デザインとクリエイティブ産業ならびに創造性との関係性を整理する点にあると考えている。平成28年度は、芸術・人文学的知識が製造業など、他産業のイノベーションにもたらす効果・役割に関する概念枠組みを構築することを目的に研究を進めた。

具体的には、Throsby (2001)の「文化的価値」の構成要素(美的価値/精神的価値/社会的価値/歴史的価値/象徴的価値/本物の価値)と研究方法(図式化/厚い記述/態度分析/内容分析/専門的鑑定)を中心に、延岡(2011)の意味的価値など、技術経営の文脈における同様の議論との接点を探求することによって、芸術・人文学的知識の役割を整理・検討した。方法としては、マツダ等の企業でのインタビュー調査から、多様な研究分野における人の視点・思考・実践の違いとその要因を探求した。また、(A)科学、テクノロジー、経済および、(B)技芸、芸術、文化領域の研究者や企業、その従業者、フリーランスへの聞き取り調査を重ねた。(A)と(B)に属する人々に対する調査及び定量的調査を行うことも予定していたが、研究の進捗状況を鑑み、断念した。結果として、当初計画していた内容では、「二つの文化」つまり、(A)科学、テクノロジー、経済、(B)技芸、芸術、文化領域の違いを整理するにとどまり、本質的な議論を行うことが難しいと判断した。そのため、新たに、「二つの文化」を超えた概念として表現という行為を位置付け、(1)人や組織に知識を創造させる意識と、(2)意識と知識を共創させる知性と感性についての資源とプロセスについての概念的枠組みとして提示することにした。言語、知識、イメージに関する先行研究を整理し、それぞれの構造と創造プロセスについての議論を援用した。そうすることによって、知識創造企業論では論点になっていなかった、知識の内容や質についての議論が可能になることがわかった。平成28年度までに、芸術・人文学的知識が製造業など、他産業のイノベーションにもたらす効果・役割に関する概念枠組みとして、質の高い知識を創造し、イノベーションを実現して、競争優位を確立できる人や組織の意識と、意識と知識を共創させる知性と感性についての内容とプロセスに関する分析単位を明らかにすることができた。既存の創造性研究に対して、英国の「クリエイティブ産業」政策が求める創造性の違いも整理することができた。したがって、芸術人文学並びに社会科学の違いの整理と、その融合による新しい議論が可能な基盤は整備できたと考えている。平成28年までの課題は、概念的枠組みを構築することであったが、その過程において、事例分析と定量調査の可能性についても検討していたため、、平成29年度以降の研究の準備も進めることができた。ただし、研究成果の公表は十分には出来ていないため、平成29年度以降は、積極的に成果の公表も行う。平成29年度は、これまでの研究に限界と矛盾を発見したため、研究の方針の変更を行なった。しかし、年度終了までに、この問題を解決し、これまでのイノベーションの議論を場所中心に考える概念的枠組みを構築し、ブレア政権以降の英国の政府、産業、大学における変化を歴史的、社会的に検討した。これまでは、英国における芸術・人文学の研究や教育が解決しようとしている問題が、自然科学、社会科学、芸術人文学といった学問分野の違いにあると考えていたが、実際には、進歩した技術の性質の変化に対応する人材を育成する方法であることがわかった。
戦略的情報システムに支援された在庫管理システムの理論的および実証的研究

本年度の研究計画に基ずき、国内主要3社と米国系4航空会社の実態調査と資料収集を行った.その分析を進め、統計資料の分析とデータベース化を行った.統計ソフトを利用して基本統計量の解析をほぼ終えている.これによって得た新たな知見は、1.1980年代後半より消費者が航空チケット価格にたいへん敏感になってきている.これは主に、米国系航空会社の戦略の影響が大きいことを確認した.2.企業外秘であり計算はできなかったが、格安航空チケットの販売比率が伸びていることを示すデータが得られた.3.利益を最大化するための座席の各種チケットの配分方法(例.Economyクラスでも、金額により数種類に別れる.)は需要予測の精度を上げることにより改善の余地がある.言い替えると、その予測こそ、利益最大化のkeyとなる.4.日本の航空行政の規制緩和は、消費者の利益を増大させる.この実態調査とともに、戦略的情報システムのモデルの理論的研究を進めた.数種類ある座席のクラスを一種の資産のクラスととらえ、この資産運用の目標収益率を下回る座席管理の運用パフォーマンスをリスクと定義し、リスク発生に罰金を課すような資産運用モデルを提案し、この最適配分を求めるための計算アルゴリズムを提案した.また、予約のキャンセルがある場合を不確実な選択と考え、最適停止・最適制御としてモデル化し、最適な販売方法を分析した.このモデルによると、キャンセルの確率が収益に及ぼす影響のきわめて大きいことがわかり、上記データ分析による知見3を支持するが、モデルを建てるときの仮定を緩和する方向でより実態にあったモデルを提案する方向で研究を継続している.本年度の研究計画に基ずき、国内主要3社と米国系4航空会社の実態調査と資料収集を行った.その分析を進め、統計資料の分析とデータベース化を行った.統計ソフトを利用して基本統計量の解析をほぼ終えている.これによって得た新たな知見は、1.1980年代後半より消費者が航空チケット価格にたいへん敏感になってきている.これは主に、米国系航空会社の戦略の影響が大きいことを確認した.2.企業外秘であり計算はできなかったが、格安航空チケットの販売比率が伸びていることを示すデータが得られた.3.利益を最大化するための座席の各種チケットの配分方法(例.Economyクラスでも、金額により数種類に別れる.)は需要予測の精度を上げることにより改善の余地がある.言い替えると、その予測こそ、利益最大化のkeyとなる.4.日本の航空行政の規制緩和は、消費者の利益を増大させる.この実態調査とともに、戦略的情報システムのモデルの理論的研究を進めた.数種類ある座席のクラスを一種の資産のクラスととらえ、この資産運用の目標収益率を下回る座席管理の運用パフォーマンスをリスクと定義し、リスク発生に罰金を課すような資産運用モデルを提案し、この最適配分を求めるための計算アルゴリズムを提案した.また、予約のキャンセルがある場合を不確実な選択と考え、最適停止・最適制御としてモデル化し、最適な販売方法を分析した.このモデルによると、キャンセルの確率が収益に及ぼす影響のきわめて大きいことがわかり、上記データ分析による知見3を支持するが、モデルを建てるときの仮定を緩和する方向でより実態にあったモデルを提案する方向で研究を継続している.
骨・軟骨形成における低分子量Gタンパク質Cdc42の機能解析

本研究の目的は、骨・軟骨形成における低分子量Gタンパク質Cdc42の機能を明らかにすることで、骨軟骨形成不全などの先天性疾患の原因解明とその予防・治療方法の可能性を探ることである。我々は、軟骨特異的Cdc42遺伝子コンディショナルノックアウトマウスを用い、大腿骨成長板においてCdc42が軟骨細胞の増殖、分化の制御に重要な役割を担っていることを明らかにした。また、Cdc42の欠損が軟骨形成遺伝子の発現を抑制し、結果として軟骨内骨化に影響を及ぼし、海綿骨の形成不全を引き起こすことを明らかにした。Cdc42遺伝子コンディショナルノックアウトマウスがコントロールマウスと比較して低身長で四肢が短縮していたこと、また大腿骨成長板において増殖軟骨層が短縮、肥大軟骨層が肥厚していた原因について解明するために、生後1日齢Cdc42fl/fl;Col2-Creマウスの大腿骨成長板における表現型の組織学解析を行った。具体的には、組織切片作製後、PCNAやpH3などの増殖マーカーの抗体を用いた免疫染色や、BrdUの取り込みにより、増殖軟骨層における細胞増殖について検討を行った。PCNAによる免疫染色の結果、Cdc42遺伝子コンディショナルノックアウトマウスではコントロールマウスと比較して増殖軟骨細胞の増加が認められたが、pH3の免疫染色では変化が認められなかった。また、同様に組織切片を用いて、後期肥大軟骨細胞における細胞死をTUNEL染色によって解析を行ったところ、Cdc42遺伝子コンディショナルノックアウトマウスではコントロールマウスと比較して、増殖軟骨細胞層におけるTUNEL陽性細胞の増加が認められた。次に、Cdc42fl/fl;Col2-Creマウスの大腿骨成長板から軟骨細胞を採取し、軟骨分化・成熟に関与する遺伝子(Sox9、アグリカン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼなど)の発現様式を定量的PCR法により解析した。PCRの結果、Sox9、アグリカン、II型コラーゲン、X型コラーゲンの発現はコントロールマウスと比較して低下しており、マトリックスメタロプロテアーゼ13の発言は増加していた。全てまた、海綿骨における破骨細胞の局在を確認するためにTRAP染色を行ったところ、破骨細胞数の低下が認められた。昨年度までの研究では、Cdc42fl/fl ; Col2-Creマウスの肋軟骨から軟骨細胞を採取し、軟骨分化・成熟に関与する遺伝子(Sox9、アグリカン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼなど)の発現様式を定量的PCR法によって解析を行ってきた。しかし、Cdc42を欠損させていることから、in vitroの実験系において培養した細胞が、正しく軟骨細胞に分化、成熟しているかは不明瞭である。そこで、今年度の研究では、軟骨細胞をGFPによって標識した新たなコンディショナルノックアウトマウスを作製することで、軟骨細胞を視覚的に確認可能な系の確立を目指した。軟骨でCre遺伝子を発現するトランスジェニックマウス(Col2-Cre Tg)と、mT/mG二重蛍光Creレポーターマウスとを交配し、Cdc42fl/fl ; Col2-Cre ;mTmGマウスを作製し、大腿骨成長板から軟骨細胞を採取し培養を行ったところ、GFP陽性の軟骨細胞を確認できた。この結果をもとに、Sox9、II型コラーゲン、X型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)13などの遺伝子発現解析を定量的PCR法によって解析を行ったところ、コントロールマウスと比較してCdc42fl/fl ; Col2-Cre ;mTmGマウスでは、各遺伝子の発現が低下していることが明らかになった。この結果により、昨年度までの研究で得られた結果の整合性を得ることができた。Cdc42コンディショナルノックアウトマウスで得られた表現型の原因について解明するために予定していたPCNAやpH3などの増殖マーカーのを用いた実験、アポトーシスの確認のためのTUNEL染色を用いた解析、定量的PCR法による各軟骨分化・成熟遺伝子の発現解析は行えており、破骨細胞数の検討も行えた。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨・軟骨形成おおむね順調に遂行出来ているので継続していく。
メカノストレスに対する糖尿病骨格筋のカルシウムイオン動態

糖尿病の予防やその進行を抑制するためには,骨格筋の糖代謝能を正常に保つことが重要である.本研究は糖尿病モデル動物を用いて,筋収縮を繰り返すと疲労の原因となる細胞質のカルシウムイオンが蓄積しやすいことを明らかにした.とくに,カルシウム恒常性と関連する微小血管の血流や酸素運搬に考慮し,それらの細胞内環境が維持されたin vivo実験(生体内モデル)によってこの知見を得ることに成功した.糖尿病が誘発する骨格筋の脆弱性はカルシウムの恒常性が深く関与する.糖尿病の予防やその進行を抑制するためには,骨格筋の糖代謝能を正常に保つことが重要である.本研究は糖尿病モデル動物を用いて,筋収縮を繰り返すと疲労の原因となる細胞質のカルシウムイオンが蓄積しやすいことを明らかにした.とくに,カルシウム恒常性と関連する微小血管の血流や酸素運搬に考慮し,それらの細胞内環境が維持されたin vivo実験(生体内モデル)によってこの知見を得ることに成功した.糖尿病が誘発する骨格筋の脆弱性はカルシウムの恒常性が深く関与する.筋収縮に対する筋細胞内のカルシウム恒常性は,筋疲労や筋損傷と関連している.ところが,糖尿病状態での筋収縮と筋細胞内カルシウム恒常性の関係は明らかではない.【目的】平成22年度は,課題1として,糖尿病ラットは正常ラットと比較してアイソメトリック(ISO)とエキセントリック(ECC)に対する細胞内カルシウム濃度[Ca^<2+>i]の蓄積パターンが異なるという仮説を検証した.【方法】実験はラットの骨格筋観察モデルによるin vivoバイオイメージングによって実施した.糖尿病ラット(DIA, streptozotocin, i.p.)と正常ラット(Cont)の脊柱僧帽筋を対象にカルシウムイメージング(Fura-2AM)によって,電気刺激(100Hz)による50回を1セットとする連続的なISOとECCを5分間の間隔をおいて10セット反復した.各セットの筋収縮後に取得した蛍光画像(340/380nm ratio image)の強度変化から[Ca^<2+>i]蓄積動態を経時的に評価した.【結果と考察】Contにおいて,安静時(収縮前)と比較して有意な[Ca^<2+>i]増加はISOでは収縮負荷6セット,ECCでは1セットから観察され,ECCがISOよりも[Ca^<2+>i]蓄積が有意に高かった.DIAのISO条件は1セットから有意な蓄積が生じ,Contよりも蓄積動態が大きかった.一方,ECC条件ではContよりも蓄積が低いことが観察された.細胞内の[Ca^<2+>i]蓄積には筋小胞体とStretch-activated channelsを介した細胞外からの流入が関与していると考えられる.したがって,本研究結果で示された[Ca^<2+>i]蓄積パターンの違いは,糖尿病の骨格筋では細胞外カルシウム流入量や筋小胞体のカルシウム取り込み能力の変化が生じている可能性を示唆している.【結論】糖尿病はISOおよびECCに対する[Ca^<2+>i]蓄積が正常モデルと異なることが明らかになった.以上のような細胞内カルシウムの恒常性の違いは,糖尿病での筋疲労,筋損傷の特徴を考える際に重要であると考えられる.細胞内に蓄積したカルシウムイオン(Ca^<2+>)は筋の損傷や再生の誘導因子として関与することが考序られる.これまで筋細胞内への流入経路が異なることが示されている伸張性収縮(ECC)負荷ならびに薬理学的作用によって上昇した細胞内Ca^<2+>の経時変化については明らかになっていない.そこで,本年度は,バイオイメージングによりECC終了時から60分間後までの細胞内Ca^<2+>動態とブビカバイン(BVC)付加後のCa^<2+>動態の蓄積パターンを明らかにすることを目的とした.実験にはWistar系雄性ラットを用いた.麻酔下で外科的に露出した脊柱僧帽筋に,Ca^<2+>蛍光指示薬であるFura2-Amを付加し,電気刺激による50回のECC収縮を5分の安静期間をおいて10セット負荷した.筋線維毎に任意の複数箇所の細胞内Ca^<2+>膿度の変化を,ECC収縮負荷後またはBVC付加後から60分間観察した.その結果,ECC後のCa^<2+>蓄積動態は筋線維間で異なり,細胞内Ca^<2+>が有意に上昇した部分では,少なくとも観察した60分間は増加した値が継続された.また,この蓄積は細胞膜伸展に伴って開口するSACチャンネルのプロッカーによって抑制されることを明らかにした.BVC付加後においても有意な一過性のCa^<2+>濃度上昇が観察されたが,60分間で安静値レベルへと回復した.以上のことより,運動誘発性によるCa^<2+>蓄積と薬理的な作用によるCa^<2+>蓄積パターンが異なるごとが明らかにされた.骨格筋サイズはタンパク質の合成・分解比によって調節されている.インスリンの分泌が極度に低下している1型糖尿病は,糖代謝の恒常性破綻を招くと同時にタンパク質合成を抑制し筋萎縮の合併症を引き起こす.これまで,レジスタンス運動が糖尿病性筋萎縮の抑制に対して有効であるということが明らかになっている.近年,レジスタンス運動に筋血流の制限を伴うことによって,筋肥大シグナルが顕著に亢進し効果的な筋肥大が起きるという現象が注目されている.

平成25年度は,筋萎縮の亢進が著しい1型糖尿病ラットモデルを作成し,血流制限を伴った運動が筋肥大シグナルに及ぼす影響を明らかにすることを目的として実験を遂行した.ラットにストレプトゾトシン(45mg/kg)を腹腔内注射し薬理学的投与による1型糖尿病モデルラットを作成した.大腿部にカフを装着して血流制限(カフ圧力: 80 mmHg)を加え,1分後に前脛骨筋に電気刺激によるアイソメトリック収縮(低強度:最大発揮張力の50%)を1分間隔で4セット(20,15,15,15回)負荷した.前脛骨筋を3時間後に摘出し,mTORシグナル経路のリン酸化応答(mTOR,S6K1,S6)をWestern Blottingにより調べた.その結果,血流制限によって,S6のリン酸化が有意に亢進していることが示された(+317%:p < 0.05).一方,運動条件では,血流制限よりもS6のリン酸化の強い亢進が認められた(+520%:p < 0.01).また,血流制限と運動を組み合わせた負荷条件では,運動条件と比較し,そのリン酸化レベルは同程度であった(+560%:p < 0.01).血流制限は,1型糖尿病モデルにおける筋萎縮の抑制に対して有効な処方となる可能性を示した.一方,運動条件では,健常モデルに与えるほどの血流制限の効果は期待されないことを示唆した.糖尿病は様々な代謝疾患を併発する.これには,骨格筋の形態的,機能的な脆弱性が関係しており,筋萎縮やミトコンドリアの機能障害が報告されている.さらに,小胞体やミトコンドリアにおけるカルシウムイオン(Ca2+)放出,取り込みの低下などといった筋細胞内Ca2+恒常性の障害が示唆されている.しかしながら,in vivo環境下において,筋細胞内Ca2+の緩衝能力(Ca2+恒常性機構)に関しての知見は得られていない.24年度では,糖尿病状態の筋細胞は,細胞外から流入するCa2+に対して,細胞内のCa2+放出,緩衝能力が低下しているという仮説を立て,マイクロインジェクションによるCa2+負荷後の筋細胞内Ca2+動態を明らかにした.実験には1012週齢のWistar系雄性ラットを用い,ストレプトゾトシン誘発による1型糖尿病群(DIA)と正常群(CONT)に区分した.測定項目は形態・組織化学的評価,緩衝能力評価とした.形態・組織化学的評価は,組織化学染色法を用いて,筋横断面積,酸化系能力(SDH:コハク酸脱水素酵素)を測定した.緩衝能力評価は,麻酔下で外科的に露出した脊柱僧帽筋に,Ca2+蛍光指示薬であるFura-2を負荷し,単一筋線維にCa2+溶液をマイクロインジェクションによって注入し,注入前30秒,注入後60秒のCa2+経時変化を画像解析によって評価した.インジェクションによるCa2+の上昇率の最大値から90秒時の相対的な差を緩衝率とした.その結果,DIAは,CONTよりも筋横断面積,SDH活性の有意な低値を示し,糖尿病群の筋の萎縮,酸化系能力の低下が示唆された.また,DIAは,CONTよりもインジェクションによるCa2+の上昇率,緩衝率の有意な低値を示した.以上の結果から,in vivo下の糖尿病骨格筋において,細胞内Ca2+の放出,緩衝能力の低下が示唆された.細胞内へのカルシウムイオンの流入経路と消去経路の解明に取り組む予定であった.本研究の観察モデルは数時間までは可能であるものの,伸張性収縮(ECC)負荷モデルの消去経路の解明には,さらに長時間の経時的なプロトコールが必要であることが判明した.そのため,消去経路の解明を目的とした実験を実施することができなかった.25年度が最終年度であるため、記入しない。
小児白血病におけるメルカプトプリンによる治療のDNA中代謝物濃度による個別化

小児白血病の治療において、主要な治療薬の1つである6-メルカプトプリン(6-MP)は、細胞内に取り込まれた後に、複数の代謝酵素によって代謝を受け、活性代謝物である6-thioguanine nucleotides (6-TGNs)となる。6-TGNsはDNAやRNAに取り込まれ、細胞障害を現す。これまでに、細胞内の6-TGNs濃度の測定について、欧米人の患者において報告があるが、日本人では報告が少ない。さらに、6-MPの代謝物が効果を発現するDNAやRNAへの取り込み量と作用発現については、日本人では報告がない。そのため、DNAに取り込まれたTGNsの濃度を測定する方法を確立することとした。確立したDNA-dTG濃度測定法で、実際に臨床で6-MPを服用した患者から採取したDNAを用い、DNA-dTG濃度の測定を行った。これまでに報告があったDNA-dTG濃度範囲と同様の測定結果が得られた。DNAに取り込まれたTGNsの濃度測定を行う測定系を確立し、Cell lineおよび実際の患者検体で測定可能であることを確認できている。治療効果については、Cell lineを用い、IC50等とDNA-dTGの関連があるかについて、検討する予定である。副作用との関連性については、実際に6-MPにより治療を行なっている患者において、骨髄抑制等の副作用が発現した際の血液よりDNAを採取し、副作用発現の指標となるDNA-dTG濃度を検討する。LC-MS/MSでは、0.1pg/μL-20ng/μLの濃度を測定することが可能な検量線を作成した。89株の培養細胞のDNA-dTGを測定し、測定精度は十分であった。必要とした物品を購入するためには今年度使用額では不足していたため、次年度の使用額と併せて、当該物品を購入することに充当する予定である。
衝撃波と干渉する遷音速せん断流れの三次元構造

衝撃波を含む遷音速せん断流れ場の三次元構造および非定常挙動を測定できるレーザ計測法を開発し,衝撃波と干渉する遷音速せん断流れ場として衝撃波-境界層,ならびに衝撃波-自由せん断層の三次元干渉問題に本レーザ計測法を適用して,それらの干渉場における三次元流れ構造および非定常挙動に関する詳細なデータを取得した.その計測データおよび数値シミュレーションから衝撃波を伴う遷音速せん断流れ場の非定常三次元構造を解析し,以下の結果が得られた.レーザ誘起蛍光法による三次元流れ計測システムを用いてスイ-プバンプ付きダクト内遷音速流れ場の三次元温度分布を測定した結果,バンプにより誘起された衝撃波の三次元形状,ダクト壁面における衝撃波の反射形態,境界層のはく離など,遷音速ダクト内での衝撃波と境界層の三次元干渉場における極めて複雑な流れ構造を定量的に明らかにすることができた.本三次元流れ計測システムは,衝撃波と干渉する複雑な遷音速せん断流れ場の有力な三次元診断法であることが分かった.超音速キャビティ流れ場の衝撃波と自由せん断層の干渉開題に,レーザー誘起蛍光法を用いた非定常三次元流れ計測システムを適用して,流れ場の温度の時間平均三次元分布および時間変動を測定した.その結果,キャビティ前縁から生じるはく離せん断層,キャビティ後縁から発生する離脱衝撃波,キゃビティ内の渦など,流れ場の三次元的構造を明らかにすることができた.また,キャビティ内の流れ場には発生原因が異なる三種類の自励振動形態が存在することが明らかになった.衝撃波を含む遷音速せん断流れ場の三次元構造および非定常挙動を測定できるレーザ計測法を開発し,衝撃波と干渉する遷音速せん断流れ場として衝撃波-境界層,ならびに衝撃波-自由せん断層の三次元干渉問題に本レーザ計測法を適用して,それらの干渉場における三次元流れ構造および非定常挙動に関する詳細なデータを取得した.その計測データおよび数値シミュレーションから衝撃波を伴う遷音速せん断流れ場の非定常三次元構造を解析し,以下の結果が得られた.レーザ誘起蛍光法による三次元流れ計測システムを用いてスイ-プバンプ付きダクト内遷音速流れ場の三次元温度分布を測定した結果,バンプにより誘起された衝撃波の三次元形状,ダクト壁面における衝撃波の反射形態,境界層のはく離など,遷音速ダクト内での衝撃波と境界層の三次元干渉場における極めて複雑な流れ構造を定量的に明らかにすることができた.本三次元流れ計測システムは,衝撃波と干渉する複雑な遷音速せん断流れ場の有力な三次元診断法であることが分かった.超音速キャビティ流れ場の衝撃波と自由せん断層の干渉開題に,レーザー誘起蛍光法を用いた非定常三次元流れ計測システムを適用して,流れ場の温度の時間平均三次元分布および時間変動を測定した.その結果,キャビティ前縁から生じるはく離せん断層,キャビティ後縁から発生する離脱衝撃波,キゃビティ内の渦など,流れ場の三次元的構造を明らかにすることができた.また,キャビティ内の流れ場には発生原因が異なる三種類の自励振動形態が存在することが明らかになった.本研究は、衝撃波を含む遷音速せん断流れ場の三次元構造および乱れの状態を明らかにできるレーザ計測法を確立し、工学的に重要な遷音速流れ場の診断法を提供するとともに、圧縮性乱流モデルの構築に資することを目的とする。このため、アルゴンフッ素エキシマレーザを使用し、遷音速流れ場計測法の多角的開発を行うこととした。本年度は主として同レーザにおける紫外ビーム伝送技術習得と蛍光の基礎データ蓄積および可変密度遷音速風洞における供試ダクトの特性調査を行うとともに、数値解析の基礎ソフトウェア作成を行った。本研究において、現在までに得られた結果を以下に述べる。(1)遷音速流れ場の高時間分析能紫外レーザ計測法を確立するため、既設の小形間欠吹出し式風洞用紫外レーザビーム伝送系を設計製作するとともに、可変密度型気体セルを製作し紫外光受光試験を行った。蛍光検出には光電子増倍管を用いたが、流れ場の乱れを測定する場合、光子統計による増倍管出力の揺らぎと流れ場の揺らぎを区別する必要がある。このため、従来よく分かっていなかった紫外用光電子増倍管の光子統計揺らぎのデータ蓄積を行った。(2)衝撃波-境界層の三次元干渉の詳細な構造を調べる目的で、大形の傾斜バンプ付きダクトを製作し、可変密度遷音速風洞内に設置した。本年度は、中心線上の圧力分布と、シュリーレン法による流れ場の可視化を行い、大形ダクト内流れ場の概略を明らかにした。(3)有限体積型陰的緩和法による非定常粘性流れ場の数値解析法を開発した。本年度は、差分格子点数を少なくし、エンジニアリング・ワーク・ステーションによる予備解析を行ったが、従来、本研究グループが行ったアルゴンレーザ蛍光法による傾斜バンプ付き流れ場の様相を、数値解析でほぼ再現できることが確認できた。本研究は、衝撃波を含む遷音せん断流れ場の三次元構造および乱れの状態を明らかにできるレーザ計測法を確立し、工学的に重要な遷音速流れ場の診断法を提供するとともに、圧縮性乱流モデルの構築に資することを目的とする。本年度は主として酸素セルに同レーザを入射した際に得られる蛍光と散乱光のスペクトル解析およびレーザ蛍光法による遷音速循環流計測法開発を行うとともに、数値解析の基礎ソフトウェアを作成中である。

本研究の経過と、現在までに得られた結果を以下に述べる。(1)遷音速流れ場の高時間分解能紫外レーザ計測法を確立するため、可変密度型気体セルを製作し紫外光受光試験を行った。とくに本年度は気体セルを用いた迷光除去技術の確立に重点を置き、バッフルプレートと特殊処理したフィルターを開発して、迷光レベルを蛍光および散乱光強度と比較して無視できる程度まで下げることができた。また、紫外分光器による測定を行い、酸素からのスペクトルを分析して、蛍光、レーリー散乱光とラマン散乱光計測し、それらの強度と気体圧力との関係を明らかにした。(2)壁面にキャビティを有する遷音速ダクト内の流れ場をターゲットとし、レーザで誘起された蛍光の時間揺らぎを測定するための技術を開発した。従来、蛍光はCCDカメラで捕らえられていたが、時間分解能を向上させるため、検出器に光電子増倍管を適用したところ、本方法で20kHzまでの振動が計測可能なことが実証された。(3)上記の遷音速ダクト内流れ場が解析できる有限体積型陰的緩和法を用いた非定常粘性流れ場の数値解析法を現在開発中である。前年度までに開発したレーザー誘起蛍光法による三次元流れ計測システムおよび非定常流れ計測システムを用いて,超音速キャビティ内の自由せん断流れ場における温度の時間平均三次元分布および時間変動を測定した.また,LES(Large Eddy Simulation)による非定常三次元数値計算を併せて行い,レーザによる計測結果と数値計算結果から,衝撃波を伴う遷音速自由せん断流れの三次元構造および非定常挙動を解析した.その結果,以下のことが明らかになった.超音速キャビティ前縁から生じるはく離せん断層やキャビティ後縁から発生する離脱衝撃波,キャビティ内の渦など,流れ場の三次元構造を捕らえることができた.また,キャビティ内の流れ場には発生原因が異なる三種類の自励振動が存在することが明らかにされ,本実験の場合,これらの振動の周波数はそれぞれ7kHz,13kHzおよび20kHzであった.20kHzはせん断層内の渦がキャビティ後面に衝突する際に発生する圧力波によってキャビティ内に形成される定在波に起因している.7kHzの振動はキャビティ底面の前面コーナー側に形成される渦構造の発生から消滅までの周期と対応している.13kHzの振動はキャビティ内の後面側および前面側に形成される二つの渦構造の干渉に関連している.さらに,キャビティ前縁からの放出渦を伴うせん断層とキャビティ後面角部が干渉することにより,後面角部で発生する負および正の圧力波がキャビティ内の亜音速部を上流へと伝播し,キャビティ前面角部に到達してせん断層と干渉し,新たな放出渦の形成を促す過程がキャビティ内の20kHzの自励振動メカニズムであること,キャビティ底面の前面コーナー側に形成される渦構造に強い三次元性があり,これがキャビティ流れの渦構造および自励振動過程に大きな影響を及ぼしていることがわかった.
ペスチウイルスの病原性発現の分子機構に関する研究

本研究は、ペスチウイルスの病原性発現の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。平成27年度は以下の研究を実施した。I.ウイルスの複製に関与するウイルス蛋白と宿主因子の検索および同定豚コレラウイルスの病原性発現に関与する非構造蛋白NS4BのN末端領域に認めた両親媒性ヘリックスのゲノム複製における役割を調べた。まず、非構造蛋白NS4BのN末端領域の二次構造をコンピュータソフトを用いて予測した。その成績を基に細胞内膜への親和性を膜分画アッセイおよび共焦点レーザー顕微鏡にて解析し、非構造蛋白NS4Bの細胞内膜への親和性に関与するアミノ酸部位を同定した。さらに、リバースジェネティクス法にて作出したレプリコンおよびウイルスを用いて両親媒性のヘリックス構造のウイルス感染環における役割を解析した。その結果、NS4BのN末端領域に認めた両親媒性のヘリックスはウイルスのゲノム複製およびその増殖に必須の構造であることがわかった。次に、非構造蛋白NS4Bと相互作用する蛋白質を哺乳動物ツーハイブリッド法にて検索した。その結果、NS4B蛋白のC末端領域とNS5A蛋白は相互作用することが明らかになった。II.ウイルスの宿主指向性に関与する宿主因子の検索および同定これまでに同じペスチウイルス属の牛ウイルス性下痢ウイルスは、宿主細胞のCD46およびLDLをレセプターとして細胞への侵入の際に利用することが明らかにされている。ブタのCD46と結合すると考えられる領域の近傍に、これまでに同定した豚コレラウイルスの病原性発現に関与するE2分子上のアミノ酸部位が存在した。本年度は、CD46が豚コレラウイルスの宿主指向性を規定する因子であるかを検するため、CRISPR-Cas9システムを用いてCD46を欠損した細胞を樹立することとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は以下の研究を実施した。1.表面糖蛋白E2分子上のウイルスの吸着と侵入に関与する部位の同定豚コレラウイルス弱毒株のE2の分子モデルを生物情報科学の手法を用いて作製し、ウイルスの吸着と侵入に関与する部位を推定した。その結果、これまでに同定した病原性発現に関与するアミノ酸部位は、宿主細胞のウイルスレセプター候補因子と結合する構造の近傍に位置することがわかった。弱毒株のそのアミノ酸部位を強毒株のそれに置換したウイルスを人工的に作出し、ブタの細胞における吸着および侵入効率を解析した。その結果、これらのアミノ酸部位はブタの細胞でのウイルスの吸着と侵入に関与することがわかった。2.ウイルスの「複製複合体」の機能解析および病原性発現に関与する機能領域の同定ウイルスの「複製複合体」の基盤である非構造蛋白NS4Bを認識する抗体を、ウサギにその組換え蛋白を免疫することで作出した。さらに、NS4Bを哺乳動物の細胞で過剰に発現する実験系を確立し、抗体を用いてその局在と経時変化を解析した。その結果、NS4Bは細胞内膜に強い親和性を持つことがわかった。また、ウイルスの「複製複合体」の機能を生物情報科学の手法を用いて推定した結果、新たにNS4BのN末端領域が病原性に関与することが示唆された。そのため、動物接種試験を実施してその領域の病原性への関与を調べたところ、ウイルスの病原性発現に関与することがわかった。3.非構造蛋白Nproの自然免疫抑制能が生体における免疫応答および病原性に及ぼす影響の解析Nproが、局所感染臓器においてI型インターフェロンの産生を抑制することでウイルスの増殖効率を向上させ、病原性発現に関与することを明らかにした。この研究は、目的達成のため当初の計画に加えて実施した。平成26年度は以下の研究を実施した。1.ウイルスの複製に関与するウイルス蛋白と宿主因子の同定およびその機能解析まずウイルスゲノムの複製効率を評価するために、豚コレラウイルス弱毒株のRNAレプリコンを構築した。RNAレプリコンを用いて、昨年度同定したウイルスの病原性発現に関与する非構造蛋白NS4BのN末端領域のアミノ酸部位がゲノムの複製効率に及ぼす影響を調べた。その結果、NS4BのN末端領域はウイルスゲノムの複製に関与することが分かった。次に、ブタ由来株化細胞をその密度に応じて分画する実験系を確立し、NS4BのN末端領域が局在する膜分画を調べた。その結果、それは膜蛋白に分画された。さらにNS4Bの大部分は小胞体と共局在することから、ペスチウイルスの遺伝子は小胞体で複製されることが示唆された。2.ウイルスの宿主指向性に関与する宿主因子の同定に向けた研究表面糖蛋白E2はウイルスの吸着と侵入に関与すると共に、ウイルスの粒子形成にも関与すると考えられている。そこで、昨年度作出したE2分子上の吸着と侵入に関与する部位のアミノ酸を置換した変異ウイルスを用いて、それらのアミノ酸部位がブタ由来株化細胞におけるウイルスの粒子形成に及ぼす影響を評価した。その結果、それらのすべてはウイルスの粒子形成効率には影響を及ぼさないことが分かった。現在、宿主細胞のウイルスレセプター候補因子を欠損した細胞を作製している。3.ブタから分離されたヒツジのボーダー病ウイルスの性状解析日本で初めてボーダー病ウイルスが分離された。

本来の宿主であるヒツジに対する分離ウイルスの病原性を調べた結果、ブタに対する病原性よりもそれは高いことが分かった。この研究は、目的達成のため当初の計画に加えて実施した。本研究は、ペスチウイルスの病原性発現の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。平成27年度は以下の研究を実施した。I.ウイルスの複製に関与するウイルス蛋白と宿主因子の検索および同定豚コレラウイルスの病原性発現に関与する非構造蛋白NS4BのN末端領域に認めた両親媒性ヘリックスのゲノム複製における役割を調べた。まず、非構造蛋白NS4BのN末端領域の二次構造をコンピュータソフトを用いて予測した。その成績を基に細胞内膜への親和性を膜分画アッセイおよび共焦点レーザー顕微鏡にて解析し、非構造蛋白NS4Bの細胞内膜への親和性に関与するアミノ酸部位を同定した。さらに、リバースジェネティクス法にて作出したレプリコンおよびウイルスを用いて両親媒性のヘリックス構造のウイルス感染環における役割を解析した。その結果、NS4BのN末端領域に認めた両親媒性のヘリックスはウイルスのゲノム複製およびその増殖に必須の構造であることがわかった。次に、非構造蛋白NS4Bと相互作用する蛋白質を哺乳動物ツーハイブリッド法にて検索した。その結果、NS4B蛋白のC末端領域とNS5A蛋白は相互作用することが明らかになった。II.ウイルスの宿主指向性に関与する宿主因子の検索および同定これまでに同じペスチウイルス属の牛ウイルス性下痢ウイルスは、宿主細胞のCD46およびLDLをレセプターとして細胞への侵入の際に利用することが明らかにされている。ブタのCD46と結合すると考えられる領域の近傍に、これまでに同定した豚コレラウイルスの病原性発現に関与するE2分子上のアミノ酸部位が存在した。本年度は、CD46が豚コレラウイルスの宿主指向性を規定する因子であるかを検するため、CRISPR-Cas9システムを用いてCD46を欠損した細胞を樹立することとした。ウイルス蛋白の機能を解析した結果、当初の計画に加えて動物への接種試験を行う必要が生じたため計画を変更したが、おおむね順調に進展している。本年度は、病原性発現に関与するウイルス蛋白の機能を新たに同定し相互作用する宿主因子の一つを同定した。以上から、本研究はおおむね順調に進展している。また得られた成績を国内外の学術集会にて発表し、学術雑誌に投稿している。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、計画通り病原性発現に関与するウイルス蛋白と相互作用する因子を同定する研究を進める。さらに、新たに同定した機能領域については詳細な解析を実施する。今後は、計画通り病原性発現に関与するウイルス蛋白と相互作用する宿主因子をさらに検索し、同定する研究を進める。
海馬顆粒細胞前駆細胞の胎生型から生後型ニューロン新生への転換機構の解析

脳の大部分では、成体になるとニューロンは新生されないが、海馬では成体になってもニューロンの新生が続いている。この成体ニューロン新生という現象は、傷害された脳組織も再生できるという希望を抱かせる。このいつまでも続くニューロン産生を解明するために、胎生期生後の海馬ニューロン新生の移行期について研究した。我々は胎生期と生後初期で神経前駆細胞の性質が異なることを見出した。その上、ニューロン新生部位周囲の細胞が重要な働きをすることを明らかにした。これらの結果は、海馬の継続的なニューロン新生には、神経前駆細胞の性質の変化や周囲の細胞から分泌されるシグナル分子が関係していることを示している。大脳新皮質など脳の大部分のニューロンは、胎生期に産生され、生後になるとその産生が止まる。しかし、海馬の顆粒細胞は、生後になっても産生が止まらず、成体になるまで産生され続けている。現在、成体海馬のニューロン新生は、再生医療、記憶・学習機構、精神疾患など様々な分野で注目され、精力的に研究されている。本研究では、このニューロン新生の連続性に着目し、胎生期から成体期の海馬で起こるニューロン新生を包括的に理解することを目的とする。今回、胎生後期から生後の各増殖部位における神経幹細胞/前駆細胞の性質を調べたところ、生後0日から1日目の間に、Brain lipd-binding protein (BLBP)+/Glia fibrillary acidic protein (GFAP)-からGFAP+/BLBP+に変化することを見出した。この結果は、顆粒細胞を産生する神経幹細胞/前駆細胞の性質が出生直後に胎生型から成体型に急速に変化することを示している。また、胎生期の大脳新皮質と歯状回に発現する遺伝子を、DNAマイクロアレイにより網羅的に解析した。現在までに、海馬特異的に発現する分子をいくつか同定している。その中で2-3個の遺伝子に注目し、その遺伝子の強制発現ベクターを作製し、それを大脳皮質側に遺伝子導入した。その結果、未熟な神経前駆細胞の維持に働くと思われる分子を見出した。現在、その分子の抗体を用いて胎生期におけるその分子の発現分布を調べている。海馬歯状回の顆粒細胞層では、成体になってもニューロンの新生が例外的に続いている。本研究では、海馬のニューロン新生の連続性に着目し、胎生型から生後型へのニューン新生様式の転換機構を解析している。GFAP-GFPマウスの免疫組織化学的な解析結果から、胎生期のGFAP-GFP陽性神経前駆細胞のほとんどはBLBP(Brain lipid biding protein)陰性であり、生後のGFAP-GFP陽性神経前駆細胞はBLBP陽性であることを明らかにした。このことから、胎生期と生後では、神経幹細胞/前駆細胞の性質や、それらの調節する微小環境が異なると推測した。現在神経幹細胞の起源を知るためにBLBP-CreERマウスを使って解析している。胎生期の海馬歯状回には、ごく少数存在するBLPBP陽性細胞と多数のBLBP陰性細胞(GFAP陽性細胞)が存在する。胎生期と生後初期のBLBP陽性細胞のその後の発生運命を知るために、BLBP-CreERT2マウスとレポーターマウス(Ai9)を掛け合わせ、胎生14-18日目および生後6日目にタモキシフェンを投与し、生後1ヶ月目のBLBP陽性細胞を解析している。現在のところ、一部のマウスの解析しか終わっていないが、傾向として胎生14日目のBLBP発現細胞は顆粒細胞に分化しないが、胎生16日目以降のBLBP発現細胞は顆粒細胞に分化するとの予備的な結果が得られている。これは最初予想した結果とは異なり、胎生期のBLBP発現細胞も、胎生16日以降では顆粒細胞に分化しうることを示している。今後は、さらに解析を続けると共に、胎生16日目のBLBP発現細胞のニューロン分化過程をタイムラプス観察なども含めてさらに観察する予定である。本研究では、海馬のニューロン新生の連続性に着目し、胎生期から生後初期のニューン新生機構を解析している。以前の研究で、我々は、顆粒細胞は、胎生期成体期まで、GFAP陽性神経前駆細胞によって産生されることを明らかにした。また、胎生期のGFAP陽性神経前駆細胞はBLBP(Brain lipid biding protein)を発現していないが、生後になるとBLBPを発現することを明らかにした。このことから、胎生期と生後では、神経幹細胞/前駆細胞の性質や、それらの産生を調節する微小環境が異なると推測した。そのため、BLBP陽性神経幹細胞の発生運命を知るためにBLBP-CreERマウスを使って解析してきたが、結果を詳しく検討したところ、このマウスのBLBPプロモータが正しく作動していないことが明らかになった。この結果から、残念ではあるが、このマウスの使用を停止した。そこで、胎生期生後初期の神経幹細胞/神経前駆細胞の解析は、Tol2システム-RFPとCAX-GFPを用いた解析に切り替えた。このシステムでは、増殖活性の高い前駆細胞と低い前駆細胞を区別して解析できる。また、微小環境因子として、CXCR4/CXCL12分子に注目することにした。

その結果、分裂活性の高い細胞が生後顆粒細胞層内側に位置することが明らかになった。この位置には神経前駆細胞も存在することから、現在分裂活性のある程度高い細胞が、生後のBLBP陽性神経幹細胞になる可能性を検討している。また、CXCR4分子が、神経前駆細胞の移動や分化に関与することを明らかにした。脳の大部分では、成体になるとニューロンは新生されないが、海馬では成体になってもニューロンの新生が続いている。この成体ニューロン新生という現象は、傷害された脳組織も再生できるという希望を抱かせる。このいつまでも続くニューロン産生を解明するために、胎生期生後の海馬ニューロン新生の移行期について研究した。我々は胎生期と生後初期で神経前駆細胞の性質が異なることを見出した。その上、ニューロン新生部位周囲の細胞が重要な働きをすることを明らかにした。これらの結果は、海馬の継続的なニューロン新生には、神経前駆細胞の性質の変化や周囲の細胞から分泌されるシグナル分子が関係していることを示している。神経幹細胞の起源については、BLBP発現細胞の解析を中心に進んでいるが、その調節因子については、マイクロアレイ解析に係わる共同研究者の都合により遅れている。神経発生学今後はBLBP-CreER;Ai9を中心に胎生期のBLBP発現細胞の発生運命を解析する予定である。できればタイムラプス観察を行いその動態を詳しく解析したい。海馬歯状回の顆粒細胞の神経前駆細胞に関して、胎生期と成体期で性質が異なることを発見したのは一歩前進である。胎生期の海馬と大脳新皮質に発現する分子をマイクロアレイで比較した実験から、海馬の発生に関与すると思われる分子の候補を同定したが、これについては、その分子の機能を十分には解析していない。これは今後の課題である。動物、抗体、試薬などが予想していた量よりも少なくて済んだため。しかし、現在残量が少なく次年度の初めに購入する。生前と生後の神経前駆細胞ではBLBPの発現に違いがあることが明らかになったので、今後は、BLBP-CreERマウスとレポーターマウスを用いて、生前と生後のBLBP発現細胞がそれぞれ将来どのような細胞になるのかを解析する。また、マイクロアレイで同定した候補分子の胎生期における発現分布を詳細に検討するとともに、機能をsiRNAなどを用いて解析する予定である。次年度は最終年度であり、抗体、試薬、培養器具などが次年度の最初に新たに購入するものが多数あるので、その費用として用いる。共焦点レーザー顕微鏡のコンピュータの修理のために使用する予定であったが、修理が遅れたため(ドイツに送られた)、年度内に請求が来なかった。修理金額についてははっきりしなかったが、おおよそ20-50万円ぐらいだとの話だった。現在修理が終わり、56月に修理代が請求されるので、その支払いに使用する。
骨髄内酸素環境が担う骨代謝制御の役割の解明

「骨と腎臓」の機能連関は、生体の低酸素応答の要となる制御基盤である。両臓器を結びつけるホルモンの一つに、エリスロポエチン(Epo)があり、その作用は、単に赤血球の産生亢進だけでなく、造血の場を司る骨の代謝にも関与する。Epoによる骨代謝制御は、破骨細胞による骨破壊の促進を伴う。しかしながら、破骨細胞自身は、Epoの受容体を発現しておらず、その作用は間接的と不明な点が多い。そこで、本研究では、Epoによる骨髄内酸素環境の調節を介した破骨細胞制御の是非を検証する。本年度では、Epoによる破骨細胞形成への影響を生体レベルで明らかにするために、Epo投与マウスを用いたgain of function並びにISAMによるloss of function解析に従事した。その結果、Epo投与マウスは破骨細胞数の増加とともに骨量減少を、一方ISAMは破骨細胞数の減少並びに骨量増加を呈することを見出した。また、Epo投与による骨髄内酸素濃度がどのように変化するかを捉える方法として、イリジウム錯体の酸素プローブBTPDM1を用いた酸素イメージングの実験系を立ち上げた。実際に、マウスが吸入する酸素濃度を20%から95%へ変動させた場合、骨髄内の赤血球系列細胞からのリン光強度が顕著に低下することを観察した。一方、免疫組織化学による方法として、pimoを投与したマウスから骨を単離し、whole mount免疫染色と組織の透明化を併用することで、骨髄内低酸素領域を評価する実験系を立ち上げた。Epo投与マウスでは、骨髄内の低酸素領域が減少することが判明した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度では、破骨細胞分化に好気的代謝がかかわることを明らかにした。さらに、好気的代謝に伴って産生亢進されるS-アデノシルメチオニンが破骨細胞制御の重要なregulatorとなることを実証した。研究計画通り遂行し、破骨細胞制御における好気的代謝の重要性を明らかにしたため。今後は、引き続き研究計画通り取り組み、骨髄内酸素環境の実体解明、並びに骨髄内酸素環境と破骨細胞制御との関係性の解明に取り組む。