hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再発膠芽腫の新規治療法：EUrd-CED法のラット脳幹部腫瘍モデルでの検討

当研究はヒト悪性神経膠腫摘出組織から抽出した脳腫瘍幹細胞をマウス脳に移植し、腫瘍形成後にEUrdを局注し腫瘍成長を制御可能かを検討する研究である。1年目は新潟大学医歯学総合病院脳神経外科で摘出した脳腫瘍幹細胞を安定培養することに成功し数株の細胞株を樹立しえた。In vitroでのEUrdの腫瘍増殖制御を確認した。2年目にはそれらの細胞株や、他研究機関より譲渡を受けた脳幹グリオーマ細胞株のマウス移植モデルを作成することを行った。当研究室樹立細胞株(NGT41、論文未発表)はヌードマウス脳にほぼ確実に腫瘍を形成することが可能であった。またその他の細胞株でも研究に十分に細胞株とマウスモデルを樹立することをなし得た。当初はラットでの治療実験を検討していたが、条件検討も含めマウスモデルの開発を進めた。マウス脳腫瘍モデル作成の移植方法の条件検討などに時間を要したことが要因である。また脳腫瘍からin vitroで培養する細胞株の樹立率は上昇しているが、マウスでの腫瘍型性能を持つ細胞株を樹立することが困難であることが原因である。しかしながら、当研究室で膠芽腫細胞株が樹立でき、また他施設からの細胞株数株をそろえることができ、本年はマウスモデルでの治療実験を行うことができると考えている。当初の予定通りの実験をマウス脳腫瘍モデルでの施行を予定している。すでにヌードマウスにほぼ確実に腫瘍形成能をもつ細胞株が樹立されており実験系は完成している。今後はマウスに個体数を増やして実験を行う予定である。1.当院脳神経外科において手術で摘出した脳腫瘍組織の一部から、脳腫瘍細胞株を樹立する手技を確立できた。2016年に改訂された脳腫瘍のWHO分類に即した遺伝子変異を持った腫瘍細胞株樹立のため、動物実験に使用する細胞株は、患者腫瘍組織で確認された遺伝子変異が、樹立した細胞株でも維持されたものを使用するとした。2.患者腫瘍組織における遺伝子変異に着目した様々なシグナル伝達経路を抑制する薬の効果を検証する目的で、EUrd以外にも既存治療薬、新規治療薬を用いたin vitroでの増殖抑制アッセイを行い、効果を検証した。3.げっ歯類(マウス)の大脳に脳腫瘍細胞を定位的に移植する手技を確立できた。現在は、脳幹部への定位的な移植方法の検討および、植え込み型浸透圧ポンプによるconvection enhanced deliveryの手技を確立する実験を行なっている。1年目でラットの腫瘍モデルを樹立する予定であったが、ヌードラットは高価であるため,先ずは実験手技の確立を含め予備実験としてヌードマウスにおけるヒト由来脳腫瘍細胞株の脳腫瘍モデルを作製した。大脳半球への脳腫瘍形成は問題なく確認できたが、脳幹部脳腫瘍の技術習得および実際の脳腫瘍形成が予想よりも難航している。次年度には,マウスでの予備実験を済ませ、免疫不全ラットを用いた脳幹部腫瘍in vivo modelの実験に着手する予定である。1.脳幹部腫瘍の確立のために、移植するドナー細胞側の要因(移植細胞数,幹細胞性の維持有無等)とともにレシピエント側(マウス、ラット)の要因についても移植週齢,雌雄などを検討し、最適な条件を確認する。2.実際の臨床に即した再発膠芽腫の検討のため、脳腫瘍患者由来の脳腫瘍細胞株からtemozolomide耐性株を樹立する。3.ラットの脳幹部脳腫瘍モデルが確立できた暁には、EUrdを植え込み型浸透圧ポンプによって投与し、temozolomide耐性株に対するEUrdの効果を検討する。In vivo modelの作成が難渋しており、購入予定であった免疫不全ラットを購入しなかったため予定実験が次年度への繰り越しとなった。今年度は細胞株の条件検討などに時間を費やし動物購入が少なかったため。
高速窒素拡散を利用した低温窒化プロセスによる高強度純チタンの創製

本研究は,低温窒化プロセスにより工業用純チタンを高強度化させることを目的としている.低温域の窒化処理によっても多量の窒素をチタンに拡散させるため,予め強加工プロセスによりチタンの結晶粒を微細化させた.その結果,低温窒化材の表面硬さは増加し,従来窒化材と比較して高い疲労強度を示した.これは,チタン結晶粒の粗大化を抑制するとともに,従来窒化を施した場合と比較して低ヤング率な窒素化合物が形成されたためである.純チタンは、耐食性および比強度に優れている反面、摩擦摩耗特性に乏しいため、工業分野では窒化処理を施した後に使用されることが多い。しかしながら、純チタンに窒化を施した場合、窒素の拡散により表面が硬化するにも関わらず、疲労強度が低下するという問題がある。これは、窒化工程時にチタンの結晶粒が粗大化し、脆弱な窒素化合物層が形成するためである。そこで当該年度は、純チタンの微視変化挙動に及ぼす窒化処理温度の影響について系統的な検討を加えた。その結果、窒化処理温度の増加に伴い、純チタンの結晶粒径が増大する傾向が認められた。また、表面窒化層の観察・分析も行い、600°C以上の窒化処理により窒素化合物が形成されること、処理温度によって窒化層の結晶構造が変化することを明らかとした。具体的には、温度が低い場合にはTi2Nが、温度が高い場合にはTiNが形成され、低温で窒化処理を施すことにより純チタンと同程度のヤング率を有する表面層を形成することができた。以上から、純チタンの疲労特性改善が期待される窒化処理温度(600°C)を見出すことができた。次に、純チタンの疲労特性に及ぼす低温窒化プロセスの影響を評価するため、4点曲げ疲労試験(応力比0.1)を実施した。その結果、通常窒化材(850°C)は未窒化材よりも低い疲労限度を示したのに対し、600°C窒化材は未窒化材と比較して高い疲労限度を示した。その要因について表面分析結果を基に考察し、低温度域で行う窒化プロセスの有用性を示すことができた。本研究は,低温窒化プロセスにより工業用純チタンを高強度化させることを目的としている.低温域の窒化処理によっても多量の窒素をチタンに拡散させるため,予め強加工プロセスによりチタンの結晶粒を微細化させた.その結果,低温窒化材の表面硬さは増加し,従来窒化材と比較して高い疲労強度を示した.これは,チタン結晶粒の粗大化を抑制するとともに,従来窒化を施した場合と比較して低ヤング率な窒素化合物が形成されたためである.純チタンは、耐食性および比強度に優れている反面、摩擦摩耗特性に乏しいため、工業分野では表面改質プロセスを施した後に使用されることが多い。なかでも、窒素雰囲気下で900°C程度の加熱を施す窒化処理は生産性に優れるため、純チタンの表面硬化法として広く利用されている。これは、窒化時の熱影響によってチタンの結晶粒が粗大化、また脆弱な窒素化合物層が形成するためである。工業分野や関連研究分野では、窒化後の仕上げ処理により「弱部(窒素化合物層)を取り除く」アプローチが主流であるが、この手法では結晶粒粗大化による疲労強度低下を解決することはできない。そこで本研究では、窒素の高速拡散を利用することにより、耐摩耗性・耐疲労性の双方に優れる純チタンの創製を可能とする「低温プラズマ窒化プロセス」の確立を目的とする。しかしながら、単に窒化処理温度を低下させると窒素の拡散速度は著しく減少するため、窒化層が形成されないことが予想される。そこで本研究では、窒化の前工程に強加工プロセスを施すことにより、純チタンの結晶粒を微細化させ、窒化工程における窒素の拡散を促進させることを想定している。また、最終的には、疲労強度のみならず延性の確保を目的として、強加工プロセス条件を制御することにより粗大結晶粒を含むネットワーク微細結晶組織を形成させ、高疲労強度・高延性チタンの創製を目指す。本研究は、窒素の高速拡散を利用することにより、耐摩耗性・耐疲労性の双方に優れる純チタンの創製できる「低温プラズマ窒化プロセス」の確立を目的として実施したものである。低温度域でも窒素の拡散が生じるよう,窒化の前工程に強加工プロセス(90%冷間圧延)を施すことにより純チタンの結晶粒を微細化した.その結果、窒化工程における窒素の拡散速度は増加し、単独窒化材と比較して厚く硬い窒化層を形成させることが可能となった。なお、このような硬さ上昇は、500°C窒化処理では認めらなかったことから、窒化処理の低温化に関する下限値を見極めることができた。一方で、700°C以上の温度で窒化処理を施した場合には、チタン結晶粒の粗大化が生じ、疲労特性が低下する結果が得られた。以上の結果から、効果的に純チタンの疲労特性改善に寄与する窒化条件(600°C)を見出すことができた。さらに,600°C窒化処理材は、未処理材と比較して良好な摩擦摩耗特性を示した。したがって、600°C窒化処理により耐摩耗性・耐疲労性の双方に優れる純チタンの作製が可能となり、当初の目的を達成できたといえる。

また、延性の確保を目的として、異なる強加工プロセス(メカニカルミリング)を用いて微細結晶粒をネットワーク状に周期配置した「調和組織チタン」を作製し、同様の窒化処理を施した。その結果、調和組織チタンの微細結晶粒は700°C窒化処理を施した場合にも粗大化せず,表面直下には調和組織が残存していた。以上から、メカニカルミリングを利用した低温プラズマ窒化プロセスは、高延性を維持しながら耐摩耗性・耐疲労性を改善できる可能性を有しており、新たな研究課題を抽出することができた。材料強度学当該年度は、純チタンの微視変化挙動および疲労特性に及ぼす窒化処理温度の影響について系統的な検討を加え、低温窒化プロセスによる純チタンの疲労特性改善メカニズムを明らかとした。純チタンの微視組織変化については、窒化の改質効果が発現する処理温度を明確化し、耐摩耗性・耐疲労性の双方を改善可能な「低温プラズマ窒化プロセス」を確立することができた。その際,単に窒化処理温度を低下させると窒素の拡散速度が減少する点を考慮し、結晶粒微細化プロセスと複合化することにより窒素拡散速度を増加させ、窒化層の形成を可能にした。学術的課題の抽出・解決の過程を通して、新しい表面改質プロセスを確立するという当初の目的は達成できたと考えている。また、結晶粒微細化プロセスを導入したことにより,結晶粒径の異なる試験片を複数作製できたため,窒化チタンの疲労特性に及ぼす結晶粒径の影響についても検討を加えることができた。その結果,表面窒化層の組成が同じである場合にも,その直下に存在する結晶粒の大きさに依存して疲労強度が変化する傾向が認められ、新たな検討課題を抽出することができた。さらに、結晶粒微細化プロセスの種類(冷間圧延,メカニカルミリング)によって、窒化工程時における結晶粒の粗大化挙動が異なり、本プロセスの実用化を見据えた工業的指針も得ている。疲労特性の評価については、現在も4点曲げ疲労試験を継続中であり、長寿命域における実験データを取得しつつあることから、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。当該年度は、主に、微細結晶チタンの表面性状に及ぼすプラズマ窒化処理条件および結晶粒径の影響について検討を加えた。まず、冷間圧延およびメカニカルミリングを用いて、微細結晶粒を有する純チタンを作製した。なお、メカニカルミリングは種々の時間(0, 25, 50 ,75, 100時間)で処理を行い、結晶粒の異なる試験片を作製した。このように作製した微細結晶チタンに対して、3種類の窒化温度(500, 600, 700°C)、2種類の窒化時間(5, 20時間)の条件で窒化処理を施した。その結果、結晶粒を微細化することにより窒素化合物層の厚さは増大し、表面硬さが上昇する傾向が得られた。これは、予め結晶粒を微細化することにより、窒素拡散速度が増大したためである。なお、このような硬さの上昇は、500°Cの窒化処理では認められなかったことから、600°C以上の窒化処理が有効であることが明らかとなった。しかしながら、700°Cの窒化処理を施した微細結晶チタン(冷間加工材)の場合には、結晶粒の粗大化が生じた。これに対して600°C窒化を施した純チタンには、依然として微細な結晶粒が存在していたことから、効果的に純チタンの疲労特性改善に寄与する窒化条件(600°C)を見出すことができた。また、次年度に向け、疲労特性を評価するための4点曲げ疲労試験システムの構築も完了しており、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。今後も600°Cの低温窒化プロセスを施した試験片を中心に、4点曲げ疲労試験を実施していく予定である。
脂肪幹細胞を用いた再生組織付加prefabricated flapの基礎的研究

脂肪幹細胞から作製した再生組織を移植したprefabricated flapを作製し、基礎実験を行った。ラット腹部から脂肪を採取し、脂肪幹細胞を抽出した。脂肪幹細胞を人工骨とともに骨分化誘導培地で3週間培養し、骨芽細胞・破骨細胞に分化させた。脂肪幹細胞と共培養した人工骨をラット背部皮下に移植した。有茎皮弁として挙上できることを確認した。人工骨は表層だけではあるが、アルカリフォスファターゼ染色で染色され、骨基質を形成していることが確認された。染色されたのは人工骨表層のみにとどまっていたが、prefabricated flapとして人工骨を使用した再生骨の作製が可能であることが示唆された。初年度は、再生組織付加Prefabricated flapのマウスモデルを確立するために、マウスにおける脂肪幹細胞の基礎データの収集をおこなった。マウス腹側(腹部脂肪および鼠径部脂肪)の6カ所から脂肪塊を採取した。酵素処理により細胞を単離させたのち、CD31,34,45,90をマーカーとしてFCM分析を施行した。このうち、CD34(+)/CD45(-)の、脂肪幹細胞と考えられる細胞群の頻度は、2.85%±3.70%であり、同細胞群のトータル細胞数は1032であった。この結果から、同一個体において脂肪採取し、目的組織(脂肪/骨/軟骨)に分化誘導させたのちに自家移植する手法は侵襲が大きいが、ヌードマウスに他家移植するのであれば、分化誘導後に目的組織を作製するのに必要な脂肪幹細胞を採取しうることが示唆された。前年度に引き続き、脂肪組織由来幹細胞の抽出と分化誘導を行い、皮弁作製のモデルを作製した。作製したprefabricated flapの移植実験を行うことを考え、prefabricated flapを作製すると、マウスでは小さかったため、ラットを使用することに変更した。ラットより採取した脂肪組織由来幹細胞を培養し、脂肪細胞に分化誘導して移植材料を作製した。細胞をそのまま移植することを試みたが、注射のみでは拡散してしまい、細胞を一か所にとどめることができず、うまく移植することができなかった。多血小板血漿と混和し、ゲル化させることで一か所にとどめて移植を行うことが可能であった。しかし、作製した皮弁の評価を行う段階で、移植細胞と自己脂肪の区別をつけることができなかった。臨床の場において、脂肪細胞の採取は比較的容易であり、脂肪細胞をあえて培養して移植する必要性は乏しいが、Prefabricated flapとして作製し、移植脂肪の計量、計数を行うには脂肪は有用であると考えて開始した実験であったが、脂肪によるprefabricated flap作製を中断し、骨への分化誘導モデルを中心に行うことに変更した。ハイドロキシアパタイトへ播種し、骨へ分化誘導を促し、移植することでprefabricated flapを作製することとした。ハイドロキシアパタイト内の骨細胞は全て移植細胞と判定できると考えられる。現在、骨への分化誘導を行い、prefabricated flapのモデルを作製しているところである。近年、幹細胞から再生組織を作製し、移植材料とすることに期待がもたれている。注入による幹細胞の移植では、移植床の状態によって生着率が大きく左右される。そこで、脂肪幹細胞から作製した再生組織を追加した皮弁を健常な部位にprefabricated flapとして作製した。Prefabricated flapを移植することで、条件の悪い部位でも有用に再生組織を移植できるようになると考え、基礎実験を行った。脂肪幹細胞を骨分化誘導培地で3週間培養し、骨芽細胞・破骨細胞に分化させた。アルカリフォスファターゼ染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色により骨芽細胞、破骨細胞への分化の確認をした。同様に脂肪幹細胞を人工骨と共培養した。人工骨は多孔性ハイドロキシアパタイトを使用した。3週間培養後、アルカリフォスファターゼ染色を行い、人工骨上で骨芽細胞が培養されていることを確認した。脂肪幹細胞と共培養した人工骨をラット背部皮下に移植し、移植後2週間目に有茎皮弁を作製した。有茎皮弁作製後2週間目で皮弁を採取し、病理学的に検討した。しかし、現時点では骨細胞は人工骨表層にとどまり、限界がある。分化誘導した骨芽細胞のみでは骨としての強度を期待することができず、移植に適さない。人工骨を足場として三次元に培養し、移植することができるようになるためには課題が多い。また人工骨表層に播種された骨細胞が、移植後長期経過した際に、生体内でどのように挙動するかはこれからの研究課題である。

人工骨は表層だけではあるが、アルカリフォスファターゼ染色で染色され、骨基質を形成していることが確認された。染色されたのは人工骨表層のみにとどまっていたが、prefabricated flapとして人工骨を使用した再生骨の作製が可能であることが示唆された。脂肪への分化誘導を行った群を作製したが、移植組織の計量等ができなかった。新しい実験系に変更を必要としたため。医学脂肪由来幹細胞をハイドロキシアパタイトの足場に播種し、骨へ分化誘導した後に、ラットへ移植し、皮弁を作製する。作製した皮弁の有用性を評価するため、人工骨を露出させる実験を検討している。初年度はマウスから取り出した脂肪塊から脂肪幹細胞を抽出して、これを皮弁に挿入する予定であったが、同一個体で脂肪を取り出してなおかつ皮弁を作成することはマウスに対する侵襲が大きく、生着を確認できるまで生存させることが困難であった。このためprefabricated flapの作成は計画通り進まなかったが、脂肪塊から脂肪幹細胞を取り出して自家移植できる状態をつくることはできたと考えられ、おおむね順調に進展していると考えられる。ラットの脂肪組織由来幹細胞から脂肪細胞に分化誘導して移植材料を作製し、多血小板血漿と混和し、ゲル化させることで一か所にとどめて移植を行ったが、作製した皮弁において移植細胞と自己脂肪の区別をつけて評価することができなかった。このことから脂肪によるprefabricated flap作製ではなく、脂肪組織由来幹細胞から骨への分化誘導モデルを中心に行うことに変更せざるを得なかった。このことからハイドロキシアパタイトの適切な使用量やその後の評価に必要な物品を揃えるまでには至っておらず、次年度に使用額を持ち越す必要が生じたため。次年度はまず脂肪幹細胞から分化誘導させた脂肪、軟骨、骨組織を確認する。これらをヌードマウスに作成した皮弁に移植してこれらの組織がいかに生着するのかについて研究をすすめていく。具体的には再生組織標本からその発現サイトカインやマーカーなどについて検討し、再生組織の生着ボリュームも計測する。これにより再生組織付加prefabricated flapの有効性を検証できるものと考えている。脂肪組織由来幹細胞をハイドロキシアパタイトへ播種し、骨へ分化誘導を促し、移植することでprefabricated flapを作製する。この場合はハイドロキシアパタイト内の骨細胞は全て移植細胞に由来するものと判定できると考えられる。このことから脂肪組織由来幹細胞から骨へのprefabricated flapのモデルを確立し、その後の移植につなげるための方法を検討する。25年度においては脂肪幹細胞を骨あるいは軟骨組織に誘導する実験には至らなかったため、多孔性ハイドロキシアパタイトやポリ乳酸重合体である生分解性ポリマーを使用せず、これらの材料費は次年度に持ち越して使用する予定となった。このため次年度使用額が生じた形となっている。脂肪幹細胞を多孔性ハイドロキシアパタイトに播種して培養することで骨組織への、また生分解性ポリマーに播種して培養することで軟骨組織への分化誘導をはかる。このためこれらの材料費は次年度に使用する予定である。
I-125シードを用いた新規口腔癌小線源治療法の開発

早期口腔癌を切らずに治す治療法として、小線源治療が確立されているが、東日本大震災以来、線源として用いられるAu-198グレインの供給が不十分な状況になっている。そこで、元来前立腺癌の治療に用いられるI-125シードによって代替できないかを、物理的吸収線量シミュレーションとFucciとよばれる細胞周期可視化法を用いた照射後のG2期への蓄積動態の時空間的可視化によって検討した。その結果、義歯にAuグレインを埋め込み、一定期間義歯を装着することで治療を行うモールド療法を想定した場合、Auの10倍の数のIシードを用いることで、同等の反応が得られる可能性が示された。本研究の目的は、物理学的吸収線量シミュレーション、先端的な分子イメージング技術、マウス移植腫瘍の実験的治療、分子標的薬の併用等を総動員して、I-125シードによる口腔癌の治療効果を学術的に検討し、臨床応用するための基盤を構築することにある。本年度は、物理的吸収線量の検討と、I-125シードを用いて、in vitroでの細胞周期動態を検討することであった。まず、直径2cmの標的を想定し、1個185MBqのAuグレイン9個を用いて、6日間モールド療法(義歯にグレインを埋め込み、義歯を装着)を行うことを想定した。この場合、5mm離れた場所での吸収線量は、Patterson-Parker法から71.8Gyと計算された。これと同様な吸収線量を得るためには、日本で汎用されている1個15MBqのI-125シードを用いると、約100個と計算され、Auグレインの約10倍量が必要であると推定された。I-125からのγ線は、27keVと非常に低いため、生物学的効果比(RBE)が大きいことが知られており、この影響についても検討が必要である。また、モンテカルロ法による計算も進行中である。この結果を基に、in vitroで、細胞周期を可視化するFucciと呼ばれる技術を用いて実験を実施する予定であったが、昨年度、ラジオアイソトープセンターが半年以上に渡って閉鎖するという事態に見舞われ、アイソトープ実験をすることができなかった。そこで、既にHeLa-Fucci細胞は利用できる状況にあったが、やはり本研究では口腔癌の放射線治療を想定していることから、Fucciを発現する口腔癌細胞の樹立を試みた。レンチウイルスを用いて、Fucciを発現する異なる舌癌細胞株3種を得た。平成27年度は、これらFucci発現舌癌細胞を用いて研究を進める。本年度の目的は、物理的吸収線量の検討の継続と、昨年度RIセンター閉鎖によって進められなかったI-125シードを用いて、in vitroでの細胞周期動態を検討することであった。BrachyVisionというソフトを用いて、まず、Au-198グレイン1個を厚さ1.3mmのプラスチックシャーレの下面に設置し、シャーレ上に培養した癌細胞への吸収線量をシミュレーションした。一方、昨年度の検討から、6日間でAu-198グレインと同等の線量を得るためには、市販されている15MBq I-125シードを用いると約10倍量必要であることがわかった。そこで、I-125シードを5個ずつ2列に配置して、BrachyVisinによって吸収線量のシュミレーションを実施した。Au-198グレインの分布と比較すると、シードが平面的に広がった分、線量の最大値を示す位置が中央からややずれ、最大値もかなり低くなることが判明した。Au-198グレインの線量分布に近づけるためのI-125シードの配置に関する検討が必要であると思われる。生物実験は、舌癌細胞株SAS、HSC3、HSC4にFucciプローブを発現させた細胞株を用いて行った。先に述べた様にそれぞれの細胞を培養したシャーレの底面にI-125シードを5個ずつ2列に配列して77時間まで培養し、Fucciの蛍光によって、細部周期動態の検討を行った。その結果、いずれの細胞も24時間位までに線源周囲で緑色細胞が蓄積したが、その後は異なる動態を示した。すなわち、SASではその後細胞死が起こり、細胞密度の低下が認められた。HSC4とHSC3では、赤色細胞への移行と緑色細胞の持続的蓄積がそれぞれに認められた。いずれも特色のある動態であり、Au-198グレインでも同様な動態が認められるかを来年度に確認する。昨年度、ラジオアイソトープセンターが半年以上に渡って閉鎖される事態に見舞われたが、本年度はI-125シードを用いたアイソトープ実験はできたものの、Au-198グレインの使用認可がまだおりておらず、Au-198グレインによる実験ができなかった。本研究の目的は、これまで口腔癌の小線源治療に用いられてきたAuグレインによるモールド療法に対し、前立腺癌の小線源治療に用いられるヨードシードによって代替出来ないかを、物理学的吸収線量シュミレーション並びに細胞周期を可視化するFucciとよばれる手法を導入して、物理学的、生物学的に検証しようとするものである。本年度も引き続き、物理学的な線量分布のシミュレーションを行った。これまで、ヨード線源面のXY平面における吸収線量をZ軸に表示できる様な3Dでの表示ができなかったが、それを可能にするソフトの作製を行い、線源面から5mm離れた位置での吸収線量の分布を、ヨードシードと金粒子の両方で求めた。さらに、RBEを考慮した分布についても検討した。

小線源治療で用いられるAuグレインの本学RIセンターでの使用が認可され、これを用いて、SAS-Fucci細胞への影響を検討した。Auグレイン1個をSAS-Fucci細胞を培養したシャーレの底部に固定して、3日目までFucciの蛍光動態を観察した。すると、線源から2mm程の距離までの細胞は、既に24時間後は細胞死を呈し、さらに5mmまでの細胞は、明らかに緑色細胞の割合が高く、すなわちG2アレストが認められた。その後もそのG2アレストは持続したが、3日目にも細胞は生存しており、興味深いことに、ずっと照射は持続しているにもかかわらず、2日目と比べ明らかに赤色細胞の割合は増加していた。このことは、吸収線量はあきらかに蓄積しているのに、G2アレストから解放されるという現象が起きていることを示している。この現象は、口腔癌の小線源治療に用いられるCs針を用いた場合にも同様に認められることがわかった。また、本研究で予定していた新規微小管阻害剤の開発にも成功し、放射線との併用で大きな増感効果が得られることがわかった。早期口腔癌を切らずに治す治療法として、小線源治療が確立されているが、東日本大震災以来、線源として用いられるAu-198グレインの供給が不十分な状況になっている。そこで、元来前立腺癌の治療に用いられるI-125シードによって代替できないかを、物理的吸収線量シミュレーションとFucciとよばれる細胞周期可視化法を用いた照射後のG2期への蓄積動態の時空間的可視化によって検討した。その結果、義歯にAuグレインを埋め込み、一定期間義歯を装着することで治療を行うモールド療法を想定した場合、Auの10倍の数のIシードを用いることで、同等の反応が得られる可能性が示された。ラジオアイソトープセンターが半年以上に渡って閉鎖されるという事態に見舞われたため、I-125シードを用いたアイソトープ実験が実施できなかった。現在、センターは再開しており、遅れを取り戻すべく準備を進めている。平成28年度は、シミュレーションによる線量分布について、さらに検討を加え、腫瘍標的として直径2cm、高さ2-3mmの円柱を想定し、Au-198グレインを9個配置した時のそれにできるだけ近づけられる様なI-125シードの配置を求める。さらに、Au-198グレインによる培養細胞を用いた実験を実施して、今年度に得られたI-125シードによる舌癌細胞株3種の結果と比較検討する。最終的に、ヌードマウス移植腫瘍に対する効果を、FucciによるG2アレスト動態によって両アイソトープの効果を比較し、臨床応用の可能性について考察する。28年度が最終年度であるため、記入しない。放射線腫瘍学平成27年度は、ラジオアイソトープセンターが再開したので、I-125シードを用い、Fucciを発現した舌癌細胞を使用して、G2アレスト動態が受ける影響を研究する。また、Auグレインとの比較が必要になるので、Au-198の施設使用認可を受ける予定である。ラジオアイソトープセンターでのAu-198グレイン使用認可取得が遅れているため、Au-198グレインが使用できなかった。そのため、アイソトープの使用に予定していた額を平成28年度に繰り越している。ラジオアイソトープセンターが利用できなかったため、アイソトープの使用に予定していた額を平成27年度に繰り越している。Au-198
前立腺がん患者におけるドセタキセルの体内動態および薬効・副作用の個人差要因の解明

前立腺がん患者におけるドセタキセルの体内動態の個人差要因を、ドセタキセルの代謝に関与する酵素の遺伝子変異の観点から解明することを目的とした。浜松医科大学病院において、ドセタキセルによる化学療法を受ける前立腺がん患者のうち、文書で同意の得られた4名を対象とした。また、保険適応の対象にならない患者、医師が不適と判断した患者、治療が中止された患者などについては対象外とした。投与前検査などにて試験参加が適切であると判断された患者に対し、ドセタキセルによる治療を開始した。ドセタキセルの投与量は1日1回75mg/m^2(体表面積)を3時間かけて点滴静注された。治療前検査の通常採血を0時間として、ドセタキセル投与終了後から18時間の経時採血(6ポイント)を実施し、得られた検体を用いてドセタキセルの血漿中濃度を測定した。ドセタキセルの薬物動態学的パラメータについては、得られた血漿中濃度推移からノンコンパートメントモデルによって解析を行った。遺伝子解析については、CYP3A5*3、CYP3AP1*3およびCYP3A4*1Gについて、PCR-RFLP法により行った。前立腺がん患者におけるドセタキセルの薬物動態パラメータには個人差がみられた。特に血漿中濃度時間曲線下面積や全身クリアランスでは、最も値が小さい患者と最も大きい患者間において2.8倍の差がみられるなど、個人差が大きかった。また、対象症例が4例ということもあり、ドセタキセルと同じ代謝酵素で代謝される併用薬の影響もあることから、本研究期間からは、ドセタキセルの個人差要因のとして薬物代謝酵素の遺伝子多型の影響の寄与を統計学的に見出すことはできなかった。
ミューオン・電子転換探索で迫る素粒子標準模型を超えた新物理

本年度の研究では、昨年度に引き続いて円筒型ドリフトチェンバー(CDC)実機の宇宙線を用いた性能評価試験を進めた。CDCの性能評価試験は3段階に分けて実施する計画であり、第1段階ではCDCの一区画の約300読出チャンネルのみを使用し、最小限のセットアップで読出し回路とデータ収集系の構築および解析手法の確立を実現した。第2段階では、読出し領域を拡張しCDCの長期安定運転のための基盤システム(電源供給、トリガー信号分配、多チャンネル光読出し)を構築するとともに、CDCの詳細な性能評価を進めることを目的としている。本年度は昨年度に引き続きシステム開発と解析を進め、CDC性能評価の第2段階を完結して最終段階に移行する道筋を示した。特に、多チャンネル読出しに対応するための懸案事項であったトリガー分配回路システムの拡張と電源供給システムの構築に尽力し、現実的なシステムの導入と安定運転を実現した。これによって読出し領域を昨年度の3倍に拡張してデータ収集をおこなうことに成功した。また、CDCの放電による瞬間的過電流のダメージから読出しフロントエンド回路を保護するための保護抵抗の導入も実施した。試作機によってCDCの性能への悪影響がないことを確認している。現在までに位置分解能170 um以下、検出効率95%以上を達成している。今年度はさらにCDCのワイヤー位置のアラインメント解析にも着手した。これまでのところワイヤー位置に大きなミスアラインメントはないことを確認している。また、宇宙線の入射角度やCDCセル形状の依存性の解析も進めているが、現在の読出し領域では入射角度が依然として限定的であり、詳細な評価にはデータが不十分であることもわかっている。来年度は早期にCDCの全領域4986チャンネルを読出し、完全な状態でのデータ収集をおこなえるように準備を進めている。本年度は昨年度に引き続きCOMET実験に用いる円筒型ドリフトチェンバー(CDC)検出器の性能評価試験を実施した。これまでの暫定的な読出しシステムから脱却し、実際の運転に向けた多チャンネルのシステムを構築した事で、フルセットアップでの本格運転に向けて研究を大きく前進させた。トリガー分配回路の拡張においては海外の共同研究者とともに評価試験を主導し、実機への実装にこぎつけた。また、CDCのセットアップをトリガーグループやデータ収集グループの開発のためのテストベンチとして提供するなど、多様なサブグループとの協奏の場も産みだし他研究者への支援を実現している。当初に計画していた研究のみに留まらず、本年度からは来るべきCOMET実験の物理測定を見据えて背景事象についての検討も開始した。特に、将来的に深刻な背景事象になる懸念があるがこれまであまり重視されてこなかった反陽子起因の背景事象に着眼し、問題点を議論した。過去の実験データのない8GeV近傍における反陽子生成断面積を直接測定する実験計画を立案中である。これによって実データに基づいた信頼性の高い見積りを示すことができ、COMET実験の感度向上につながる。この研究は独自の着想に基づき実験計画を提案しているもので強い主体性を発揮して推進している。今年度は国際会議でCDCの開発とCOMET実験について2件の発表をおこなっており、国際的な場での成果発信を強く意識している。今後は引き続き円筒型ドリフトチェンバー(CDC)実機の宇宙線を用いた性能評価試験を進める。この試験は3段階に分けて実施する計画である。これまで第1段階でのデータ収集セットアップの確立と実証試験、第2段階での読出チャンネル数を拡張したCDCの基本性能の評価試験を完了した。検出効率、位置分解能、ドリフト距離と到達時間の関係等の基本特性が要求を満たしていることを確認した。また電圧、電流、温度、圧力などの情報を制御、監視、記録するシステムも構築してきた。読出し回路への電源供給システムやトリガー分配システムもこれまで用いてきた暫定的なシステムから本実験での使用に耐え得る大規模なシステムを構築してきた。本年度は最終段階である第3段階に移行する。第3段階では4986チャンネル全部を読出し、本実験と同様の状態で長期間のデータ収集をおこなう。CDCの全領域の高統計のデータを使うことで、これまで評価が十分ではなかった宇宙線の入射角度やセルの形状依存性についても詳細な研究が可能となる。本実験と同様の状態での長期運転を確立し、J-PARCへの移送と検出器ソレノイド磁石へのインストールへ向けて本格的な準備をおこなう。また、並行して本実験における背景事象の評価についても反陽子起因背景事象を中心に引き続き検討を進める。本研究で得られた研究成果は、実験グループ内のコラボレーションミーティングや国内外の物理学会等で適宜報告をおこなうとともに、開発の集大成として論文への投稿を目指す。本年度の研究では、宇宙線を用いた円筒型ドリフトチェンバー(CDC)実機の性能評価試験を進めた。CDCの読出しチャンネル数は4986チャンネルに上り、104枚の読出し回路基盤を使って信号をデジタル化してデータ収集をおこなう。本年度は第2段階に移行するために必要な実験装置の整備をおこなった。まず、未実装であったフィードスルーから先のケーブル配線を完了し、全領域に渡って高電圧を印加できる体制を整えた。コンディショニングによって全領域において1800 V以上の高電圧が適切に印加できることを確認した一方、3箇所の不良ワイヤーを特定し張り替えをおこなった。

さらに、張り替えたワイヤーの張力を測定するためにCDC架台に回転機構を導入し、ワイヤー修理保守体制を整えた。その他にも、ガス流量を遠隔制御できるマスフローコントローラーシステムの構築、読出し回路にトリガー信号等を分配する回路の試験、電磁ノイズを遮断するためのシールド機構の導入などを実施した。これにより性能評価試験は第2段階に移行することができ、読出チャンネル数を2倍に拡張して広い有効領域を確保してCDCの基本性能評価のためのデータを収集した。現在までに位置分解能170 um以下、検出効率95%以上を達成し、ガス拡散係数や初期電子イオン対生成数も文献値とほぼ一致しており良好な結果が得られている。一方、現在のセットアップでは宇宙線の入射角度が限定的であるために、セルのビーム軸方向位置依存性に関する評価にはデータが不十分であることもわかった。今後はさらに読出し領域を拡張して入射角度やビーム軸方向位置依存性などの詳細な研究を進める。本年度は当初の計画通りCOMET実験に用いる円筒型ドリフトチェンバー(CDC)検出器の性能評価試験を実施した。年度当初は高電圧印加時の放電問題の解決に多くの時間を費やしたが、忍耐強い調査の末に特定のワイヤーに問題があることを突き止め、ワイヤーを張り替えることで根本的解決へと導いた。その後に行われたCDC検出器の試験においては、使用できる電子回路の制限から検出器の全領域を試験することに限界があったが、入念に工程の再検討を行い段階的に信号を読出す領域を拡張して当初の研究計画を堅持した。研究遂行時には共同で研究する複数の大学院生を当該大学の指導教員とともに指導し、装置開発やデータ解析において、時には長時間に及ぶ議論も厭わずに熱心に取り組んだ。こうして指導した大学院生の一人は本年度にCDC検出器の開発研究で修士号を取得している。また、前述のCDC性能評価試験に加え、本年度は12月にJ-PARCにおいて8 GeV加速試験およびビーム純度(エクスティンクション)測定実験をおこなった。COMET実験で用いる8 GeVの陽子ビームを加速し、今回初めてハドロン実験施設に取り出すことに成功した。高エネ研の研究者らと協力して申請者は主にエクスティンクション測定において検出器信号を処理して読出し回路に送り、トリガー信号を生成する回路の構築と調整を担当した。エクスティンクションはビームバンチ内の粒子数に対するバンチ外の粒子数の比で表されるが、今回の試験においてCOMET実験の要求を満たす6×E-11以下の値を得ており、本実験遂行に向けての大きな一歩となった。本年度の研究では、昨年度に引き続いて円筒型ドリフトチェンバー(CDC)実機の宇宙線を用いた性能評価試験を進めた。CDCの性能評価試験は3段階に分けて実施する計画であり、第1段階ではCDCの一区画の約300読出チャンネルのみを使用し、最小限のセットアップで読出し回路とデータ収集系の構築および解析手法の確立を実現した。
日本における『化学工程』概念の形成史

1.戦前日本における「化学工程」概念の形成過程を、化学工学史の一環に位置づけつつ、次の方法で研究した。(1)酸・アルカリ工業にかんする技術書、工業化学書、化学工学書などの関係テキストおける操作、装置、工程概念の変遷を調べる。(2)原料問題は原料の総合利用。すなわち結合生産の発達と密接な関連にあり、工程概念の形成に着目しつつ、原料の調査研究をも対象とする。(3)日本における「化学工程」概念の形成という点では、工場における製造工程の研究が重要な意味をもってくるので、工場内過程にかんする研究の積植に注目する。(4)1930年代に重視される装置の国産化との関連で、装置工学的研究が「二程」概念の形成に与えた彰饗を検討する。2.以上の方法に基づく研究によって次の知見を得ることかできた、(1)明治期には、硫酸、ヨード製造が比較的早期に発達したが、原料過剌から工学的には低い水準に留まり、技術的には主として操作法に留まった。それに対してソータ工業では原料不足から工程的思考が導入された。(2)独自に工程としての理解は「化学装置」設計の必要性をとおして急速に進んだ、しかし、装置、機械、工程の理解は1930年代でも全体的にはなはだ不十分な水準に留まった。(3)アメリカにおける単位操作、ドイツにおけるVerfahren,Aparatに対して日本では「化学機械」,「化学装置」の理解が一つの要をなしていたと思われる。1.大正から昭和10年代にかけて出版された工業化学、化学機械、化学工学関連に出版物、論文をとおして「工程」概念の形成過程の解明を進めた。(1)工場における測定をもとにする化学量論的研究による「工程」把握の可能性とその限界を、松井元太郎による化学量論的研究の事例をとおして解明した。(2)化学機械関係のテキストにおける化学装置、反応、熱、物質の流れの扱いの特徴を把握し、「化学機械」と「化学工学」の概念的把握の推移を検討した。熱解析の重要性が明らかになった。(3)企業内における技術者、技能者養成における各種操作の扱いをとおして、企業内分業体制と工程分割との関連を把握し、技術的知識の集積とその体系化に与えた影響を検討した。とくに、製鉄所(八幡)におけるテキスト類の内容分析をとおして事例研究を行った。2.化学機械協会設立時の「化学機械」、「化学装置」、」化学工学」の概念的理解をめぐる議論の整理を行った。とくに、「装置」の理解の重要性を明らかにした。3.ドイツにおけるApparatwesen→Verfahrenstechnik→ChemieーIngeniure Wissennschaftへの展開過程の資料収集を行った。1.アメリカにおける「単位操作」を基礎概念として成立した化学工学の反応工学への進展過程、ドイツにおけるAparatwesenからChemie-Ingeneurwissennschaftへの進展過程の文献的研究を行い、化学工学成立過程における「工程」概念、労働における協業、技術を対象とする化学研究の進展、その結果としての研究における基礎、応用、開発研究への機能分化、これら相互の関係をけんとうした。その検討をとおして製造過程における技術的諸要素を統合して「工程」として理解が成立する歴史的過程が次の点に依存していることに注目した。(1)化学工業において主要な製造工程の技術の発展段階、たとえば連続性が重視される段階のものであるか否か、(2)製造工程における労働の分割のあり方や機械技術者と化学技術者との協力のあり方、(3)技術を対象とする科学研究の水準、技術学としての工業化学的研究がその社会における技術を対象としてどの程度の蓄積をもっているか。2.製造過程における労働の分割と技術学との関連は技師養成制度のあり方に影響を与えるはずであり、この点を検討するために、企業内において技師養成の学校組織をもっていた八幡製鉄所における技師養成用テキストの調査を行った。3.以上の点をふまえつつ(八幡の資料はまだ活用し得ていないが)、日本における工程成立史をまず化学工学の成立問題としてまとめを行った。
難純化ウイルスに対する複製型二本鎖RNAからの遺伝子のクローニングと抗血清の作製

本研究では、難純化一本鎖RNAウイルス感染植物体から抽出されるウイルス由来の複製型二本鎖RNAから遺伝子のクローニングを行い、病原ウイルスの遺伝子に対応するcDNAを得ることを第一の目的とした。研究材料としてイチゴマイルドイエローエッジウイルス(SMYEV)、カンキツトリステザウイルス(CTV)、キュウリ黄化ウイルス(CYV)を取り上げ、クローニングと塩基配列の決定を行った。いずれのウイルスでも、感染葉からCF-11セルロースカラムを用いてウイルス由来と考えられる二本鎖RNAが得られ、cDNA合成とクローニングを行い、得られたクローンについては塩基配列を順次決定した。その結果、イチゴでは、PCR法でウイルスの検出を可能とした。さらに、大腸菌で融合タンパク質としてSMYEVの外被タンパク質を発現させ、ウイルスを検出するための抗血清を作製した。さらにこの抗血清を用いて,ウエスタンブロット法でSMYEVを簡便に検出できることを明らかにした。CTVでは少量のサンプルから抽出した複製型二本鎖RNAから強毒株と弱毒株の全塩基配列を決定した。CTVの全塩基配列決定は本研究が世界で4番目の快挙である。CYVでも,得られた二本鎖RNAからcDNAクローンが得られ、その塩基配列を決定し、PCR法で検出を可能とした。さらに、得られた塩基配列から、CYVが外国ですでに記載のあるbeet pseudo-yellows virusと同じであることを明らかにした。本研究では難純化一本鎖RNAウイルス感染植物体から抽出されるウイルス由来の複製型二本鎖RNAから遺伝子のクローニングを行い、病原ウイルスの遺伝子に対応するcDNAを得ることを第一の目的にしている。平成9年度は本研究の初年度であり、イチゴマイルドイエロ-エッジウイルス(SMYEV)とカンキツトリステザウイルス(CTV)を取り上げ、とりあえずはクローニングと塩基配列の決定を目指した。なお、SMYEVはいまだにウイルス粒子さえ確定されていない病原である。SMYEVとCTVのいずれも感染葉よりCF-11セルロースカラムを用いてウイルス由来と考えられる二本鎖RNAが得られ、cDNA合成とクローニングを行った。得られたクローンについては塩基配列を順次決定した。その結果、CTVでは少量のサンプルから抽出した複製型二本鎖RNAからPCR法を用いてウイルスの約2万塩素もある全ゲノムRNAのどの部分でもcDNA合成が可能であることが判明した。そこで、得られたクローンからCTVのM15A株の全塩基配列を決定した。CTVの全塩基配列決定は本研究が世界で3番目の快挙である。イチゴでも、得られた二本鎖RNAからcDNAクローンを得られ、その塩基配列を決定し、PCR法で検出を可能とした。次年度は、得られた塩基配列を基に大腸菌で融合タンパク質としてウイルスの外被タンパク質や非構造タンパク質を発現し、ウイルスを検出するための抗血清の作製を目指す。平成10年度は本研究の2年度にあたり,各分担者は弱毒ウイルスに関して以下のような研究を行った。弱毒ウイルスの遺伝子解析では,キュウリ緑斑モザイクウイルス,カンキツトリステザウイルス(CTV),キュウリモザイクウイルス(CMV)の弱毒株について,塩基配列のどこの部分が弱毒性を決定しているか検討し,CTV以外ではほぼ弱毒性決定領域が判明した(夏秋,奥田)。CMVラゲナリア系について,UV処理と低温処理によりメロンとトマトに軽い退緑斑点のみを生じる株を選抜した。これはメロンとトマトで強毒ウイルスに対し強い干渉効果を示した。ヤマノイモモザイクウイルスについて, IC-PCRによる検出法およびPCR-RFLPによる強毒株と弱毒株の判別法を確立した(亀谷)。トマトモザイクウイルスのコートタンパク質の終止コドンの下流の3'端にpseudoknotと呼ばれる領域が存在する。その中のstemIの部分に欠失が及んだ変異体で植物体全身に感染できないものがあり,弱毒となった可能性が示された。この原理がトバモウイルス全般に応用可能かどうかを現在検討している(渡辺)。CMVの弱毒株CM95を接種したNicotiana rusticaにおいて,3,10日後に5種類の強毒株をそれぞれチャレンジ接種し、その接種葉における強毒株のゲノムRNAの有無をPT-PCR法により調べた。

その結果、上葉に強毒株の明瞭な症状が現れた3日後チャレンジ接種個体では、強毒株のRNA1,2及び3が検出されたが、強毒株の症状が現れなかった10日後チャレンジ接種個体では,強毒株のRNA3は検出されなかった。以上から,CMV強毒株の全ゲノムRNAがその接種葉において構成されない場合に,弱毒株の干渉効果が完全に発現することが示唆された。(小坂)。最終年度はこれらの成果を基に,弱毒ウイルスの遺伝子解析と遺伝子保存,干渉効果の早期解析方法の確立を目指す。本研究では、現在までに鈍化が困難なために抗血清が作製されていなかったり遺伝子がクローニングされていない一本鎖RNA植物ウイルスを研究対象とし、感染植物体から抽出されるウイルス由来の複製型二本鎖国RNAから遺伝子のクローニングを行い、病原ウイルスの遺伝子に対応するcDNAを得ることを第一の目的にした。平成11年度は本研究の最終年度であり、カンキツトリステザウイルス(CTV)とキュウリ黄化ウイルス(CYV)を取り上げ、クローニングと塩基配列の決定、および大腸菌で融合タンパク質としてウイルスタンパク質を発現し、ウイルスを検出するための抗血清を作製した。CTVとCYVのいずれも感染葉よりCF-11セルロースカラムを用いてウイルス由来と考えられる二本鎖RNAが得られ、cDNA合成とクローニングを行い、得られたクローンについては塩基配列を順次決定した。その結果、CTVでは少量のサンプルから抽出した複製型二本鎖RNAを用いて強毒株と弱毒株の全塩基配列を決定した。また両分離株を識別するため、大腸菌でCTVの非構造タンパク質を発現し、抗血清を作製したが、残念ながら識別することはできなかった。しかし、すべてのCTV分離株を2系統に識別するプローブの作製に成功し、少量の感染葉からCTVを検出できた。CYVでも、得られた二本鎖RNAからcDNAクローンが得られ、その塩基配列を決定し、PCR法で検出を可能とした。さらに得られた塩基配列から、CYVが外国ですでに記載のあるbeet pseudo-yellows virusと同じであることを明らかにした。
ＮＬＲＰ３モザイクによる疾患発症、炎症波及機序の解明

自己炎症性疾患であるCINCA症候群はNLRP3遺伝子の機能獲得型変異によって発症する。遺伝形式は常染色体優性遺伝であるが、約半数の患者にヘテロNLRP3変異を認めない。ヘテロ変異を認めない患者の7割にNLRP3モザイク変異を認め、疾患発症の原因と考えられる。しかし低頻度モザイクによる疾患発症機序の詳細は未だ不明である。そこで、今回われわれは、疾患機序解明のため、単細胞培養系を用いたサイトカイン測定法を確立した。その系において、CINCA症候群における主要なサイトカインであるIL-1βの放出は、細胞膜の整合性が失われた直後におこることが確認された。自己炎症性疾患であるCINCA症候群は発熱、蕁麻疹様発疹、慢性髄膜炎、感音性難聴などの症状を呈する。NLRP3遺伝子の機能獲得型変異によって発症する。遺伝形式は常染色体優性遺伝であるが、de novoの変異も多い。約半数の患者にヘテロNLRP3変異を認めないが、その7割にNLRP3モザイク変異を認めることを国際共同他施設研究において示した(2011年)。低頻度体細胞モザイクによる疾患発症機序の詳細は未だ不明である。1)単細胞培養系を用いたサイトカイン測定、遺伝子解析、2)変異NLRP3ノックインマウスを用いた骨髄キメラマウスの作製、解析により低頻度モザイクによる疾患発症機序、炎症波及機序を明らかにすることを目指した。自己炎症性疾患であるCINCA症候群は、発熱、蕁麻疹様発疹、慢性髄膜炎、感音難聴などの症状を呈する。NLRP3遺伝子の機能獲得型変異によって産生される過剰なIL-1βが疾患発症に関連していると考えられている。常染色体優性遺伝形式をとるが、de novoの変異もおおい。ヘテロ変異を認めない患者の約7割はモザイク変異により発症するが、その一部は低頻度の体細胞モザイクによって発症すると考えられる。しかしながら、低頻度のモザイクによる疾患発症機序は不明である。そのため、我々は単細胞培養系を用いたサイトカイン測定により、その発症機序を解明することを目指した。まずは健常者の血液から単球を分離し、LPS、ATP刺激を行い単細胞から分泌されるIL-1βをリアルタイムで測定することができた。また単球はLPS、ATP刺激により細胞死を起こしやすいことがしられているが、リアルタイム測定により細胞死(loss of membrane integrity)直後に、IL-1β放出がおこることが確認された("Real-time single-cell imaging of protein secretion" 2014年Scientific Reports)。また健常者、NLRP3ヘテロ患者、NLRP3モザイク患者の単球におけるIL-1βの測定も現在、進行中であるが、体細胞モザイクにおける変異陽性細胞は、変異陰性細胞より、過剰なIL-1βを産生すると考えられる。ノックマウスによる解析を行うことはできなかった。PDMSウェルアレイチップを用いた解析では、NLRP3ヘテロ患者由来の単球は有意にIL-1βを産生することが確認されたが、生細胞を標識するために用いたカルセインにより、IL-1βの産生が阻害される可能性があることが判明し、現在、系の調整を行っている。また、研究者協力者(理化学研究所、横浜研究)が開発したミクロチャンバーを利用した単細胞培養系(Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference, 2011 16th International)においては、単細胞をピックアップする際に、他のゲノムの混入が認められ、単細胞からのシーケンス解析法を調整中である。マウス実験については今後開始を検討しているが、現時点では開始できていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。まずは、上記の問題点を解決する。具体的には、PDMSウェルアレイチップを用いた解析では、生細胞を標識するために用いたカルセインにより、IL-1βの産生が阻害される可能性があることが判明したため、系の調整を行う必要がある。また、研究者協力者(理化学研究所、横浜研究)が開発したミクロチャンバーを利用した単細胞培養系において、単細胞をピックアップする際に、他のゲノムの混入が排除できるシステムを確立する。また、抗IL-1製剤治療前後での細胞の挙動が変化する可能性もあるため、治療前後で同様の実験を行う。単細胞の遺伝子解析においてはNLRP3変異確認のみならず、マイクロアレイ、もしくはRNAseqをもちいた網羅的発現解析を行い、変異陽性細胞、変異陰性細胞における炎症波及の機序の解明、表面マーカーの違いの有無を検討する。