hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
器械出し看護師ロボットにおける中枢神経系と末梢神経系の構築と統合に関する研究

C++で記述したプログラムとUppaalで記述した外科モデルとの交信を可能とするソフトウェア的アダプタであるDTRONの開発によって、SNRの末梢神経系と中枢神経系が統合され、SNRは術中情報および自分自身の行動やその目的を"認識"できるようになった。手術野で使用されている手術器具情報を実時間に取得するシステムはほぼ完成した。RFIDアンテナが隙間無く敷き詰められた手術器具トレイ上の手術器具の認証と位置同定はまだであるが、隣り合うアンテナを2mm離せば同定は可能となった。腹部内臓の実時間同定に関して、種々の波長の光に対するウサギ腹部臓器表面の反射特性に臓器特異的なパターンがあることが判った。1) "外科モデルによる器械出し看護師ロボット(SNR)駆動"および"術中情報取得による外科モデル駆動":Uppaal Timed AutomataとC++言語との間で信号の遣り取りが可能なアプリケーション・プログラム(DTRONと命名)の基本形はでき上がり、デモソフトで動作検証できた。しかし、これを既存のSNRシステムに実装した際にうまく動作できていず、検討中である。2)鏡視下手術の手術野における手術器具使用情報自動取得サブシステムの発展:手術器具のシャフトに貼付した薄いフィルム状のRFIDタグの情報を読み取ることが可能なRFIDアンテナの試作に成功し、手術の邪魔にならないサブシステムの完成に近づいた。3)手術器具の位置情報取得と個別認証が可能な器具トレイ・サブシステムの開発:1cm四方の空間分解能を有する40x80cmのRFID手術器具トレイ(2セットのRFIDユニットで構成)の試作品は完成した。各RFIDユニットは80個のRFIDアンテナ(40個の10x40cmのアンテナと40x10cmのアンテナそれぞれ40個から構成される)、1個のアンテナ切替器、1個のRFID制御ユニットから構成される。アンテナの順次切替、手術器具の個別認証と位置同定が可能なアンチコリジョン対応の制御ソフトウェアも開発できた。4) SNR3号機のハンドの改良:平滑な手術器具トレイ上に置かれた器具を把持できるハンドを試作した。1個のマッキベン・アクチュエータによって駆動可能であるため、軽量でもある。5)内視鏡画像のリアルタイム解析:ニューラルネットワークによる内視鏡カラー動画像のリアルタイム解析をさらに発展させ、リアルタイムに胆嚢などの臓器同定が可能となった。6)器具予測機能と学習機能:SNRの重要な機能である器具予測機能は、平均して70%の的中率が可能なアルゴリズムを完成した。1)"外科モデルによるSNR駆動"および"術中情報取得による外科モデル駆動":Uppaal Timed Automata(UTA)とC++との間で信号の遣り取りが可能なアプリケーション・プログラムであるDTRONを開発・改良するとともに、C++で記述されたSNRサブシステムのアプリケーション・プログラムも改良することによって、本研究課題最大の目標が達成できた。したがって、サブシステムで取得したC++信号がDTRONを介してSNR頭脳内のUTA外科モデルを遷移させ、この遷移がDTRONを介してC++信号を発生させ、これによってSNRのアームを動かし器具提供を行わせるという、SNRの擬似的"随意運動"が可能となった。2)鏡視下手術の手術野における手術器具使用情報自動取得サブシステムの発展:手術器具のシャフトに貼付した薄いフィルム状の市販RFIDタグの情報を読み取ることが可能なRFIDアンテナの試作は成功したが、まだ環境ノイズの影響を受けやすいという弱点がある。3)手術器具の位置情報取得と個別認証が可能な器具トレイ・サブシステムの開発:1cm四方の空間分解能を有するRFID手術器具トレイは2個のRFIDユニットから構成され、各RFIDユニットは80個のRFIDアンテナ、1個のアンテナ切替器、1個のRFID制御ユニットから構成されるが、半導体切替によるアンテナの切替速度向上はまだ成功していない。4)SNR3号機のハンドの改良:平滑な手術器具トレイ上に置かれた器具を確実に把持できるように、エアーチャックを使用したハンドを開発した。5)内視鏡画像のリアルタイム解析:ニューラルネットワークによる内視鏡画像のリアルタイム解析を改良した。6)手術器具予測機能:手術器具予測のアルゴリズムを改良し、対象手術の手順をどのように分割すれば一番的中率が上昇するのか、多数のパターンで比較検討した。1)鏡視下手術の手術野における手術器具使用情報自動取得サブシステムの発展:トロカール・カニューレ(TC)に内蔵させるRFIDアンテナは構造的にTC全周を覆えていず、言わばわずかな“隙間"があり、金属製手術器具シャフトに貼付したフィルム状のRFIDタグがこの“隙間"に正対すると読み取りが不安定になる欠点があった。

そこで、アンテナ導線の線径を0.2 mmから1.0 mmに太くすることによって、前記の読み取りが安定化するかどうか検討した結果、RFIDタグがどのような位置になっても安定的な読み取りが可能となった。2)手術器具の位置情報取得と個別認証が可能な器具トレイ・サブシステムの開発:本手術器具トレイはRFID技術を使用しており、アンテナ部分は10 x 40 cmのアンテナを40個縦に並べ、それらに重ねるように同じアンテナを横に40個並べた構造になっている。問題点は個々のアンテナが隣接しているために発生するクロストークであった。そこで、線径を0.2 mmから0.1 mmに太くすることによってどのような影響が出るのか検討した。その結果、線径0.2 mmの場合は期待通りの読み取りが可能であったのはアンテナ間距離が14 mm以上であったが、線径1.0 mmの場合ではアンテナ間距離が2 mm以上で正確な読み取りが可能となり、アンテナ導線の線径がクロストーク防止に大きな要素を占めることが分かった。3)内視鏡画像のリアルタイム解析:内視鏡画像のリアルタイム解析を可能にすべく、種々の波長の光に対するウサギ腹部臓器表面の反射特性を検討した。反射特性は分光測定と不可視光ビデオカメラ撮影の2つの手法で評価した結果、分光測定結果と不可視光ビデオカメラの画像解析の両方ともに、単独の波長、あるいは複数の波長によって、ウサギの腹部臓器の同定が可能であることが示唆された。1)“外科モデルによる器械出し看護師ロボット(SNR)駆動"および“術中情報取得による外科モデル駆動":昨年度開発に成功したDTRON(Uppaal Timed Automata (TA)とC++言語間の信号の遣り取りを可能にさせるアダプタ的ソフトウェア)をSNRシステム内の種々のC++アプリケーションと外科モデル内の種々のUppaal TAモデル間に組み込み、中枢神経系と末梢神経系の統合が基本的に完成した。2)鏡視下手術の手術野における手術器具使用情報自動取得サブシステムの発展:金属製手術器具シャフトに貼付したフィルム状のRFIDタグの情報を安定的に読み取ることが可能なRFIDアンテナ内蔵トロカール・カニューレの開発に成功した。これは主にインピーダンス整合を図ることで達成できた。また、電気メス使用時の電磁干渉が発生しても誤認識を起こさないための電気メス使用時捕捉システムの改良策として、いかなるサイズの電気メスケーブルにも容易に装脱着可能な“超らせん構造コイル"を考案し、その有用性を実証した。3)手術器具の位置情報取得と個別認証が可能な器具トレイ・サブシステムの開発:半導体素子による複数のRFIDアンテナ切替えに成功した。これまでの電磁リレー切替器では1回の切替時間は10 msであったが、半導体素子の場合は80 nsに短縮されるので、40個のアンテナ(各10×40 cm)の順次切替えが理論上は397 msだけ短縮できることになった。4)SNR3号機のハンドの改良:1個のマッキベン・アクチュエータで駆動するハンドの軽量化に成功した。また、執刀医がその手術器具の柄を把持し少し持ち上げるだけで、SNRが器具を放す機構も考案した。
ヒドロキシカルボン酸の錯形成能を利用した希土類複合酸化物の合成に関する研究

本研究では,ヒロドキシカルボン酸,特にリンゴ酸の金属イオンと錯形成能を利用したヒドロキシカルボン酸前駆体法による高表面積ペロブスカイト型酸化物La_<0.8>Sr_<0.2>MO_3(M=Co,Mn)の合成とその触媒特性について検討した.得られた結果を以下にまとめる.1.金属イオンの混合水溶液とリンゴ酸の混合水溶液のpHはCo系酸化物で1.5,Mn系酸化物で1.8であった.これに塩基を加えてpHを調製していくと,Co系酸化物では3.03.5,Mn系酸化物では4.0付近で,単一相ペロブスカイトの低温合成と高表面積酸化物の合成が同時に達成できた.2.アンモニア水(NH_3),テトラメチルアンモニウムヒドロキサイド((CH_3)_4NOH)何れを用いてpH調製をしても,低温合成と高表面積化が達成できたことから,本合成における金属イオン(Co,Mn)のアンミン錯体形成の寄与はないことを確認した.3.金属ーリンゴ酸前駆体の熱重量分析及び赤外分光法により調べた.pH未調整の溶液から得た前駆体では,リンゴ酸のカルボキシル基が酸型(-COOH)とイオン型(-COO^-)で存在し,それぞれの熱分解に相当する重量減少が認められた.pHが高くなるに従い酸型の割合が減少し,最適pHではすべてイオン型として存在することがわかった.4.以上の結果から,リンゴ酸錯体法によるpH調製の効果は,リンゴ酸のカルボキシル基の解離と金属ーリンゴ酸前駆錯体の形成の促進にあると結論した.5.リンゴ酸錯体法で合成したペロブスカイト型酸化物は,従来の硝酸塩分解法で合成したものよりもメタンの完全酸化活性や過酸化水素イオンの分解反応に高い活性を示し,リンゴ酸錯体法が高活性触媒の合成法として優れていることを明らかにした.本研究では,ヒロドキシカルボン酸,特にリンゴ酸の金属イオンと錯形成能を利用したヒドロキシカルボン酸前駆体法による高表面積ペロブスカイト型酸化物La_<0.8>Sr_<0.2>MO_3(M=Co,Mn)の合成とその触媒特性について検討した.得られた結果を以下にまとめる.1.金属イオンの混合水溶液とリンゴ酸の混合水溶液のpHはCo系酸化物で1.5,Mn系酸化物で1.8であった.これに塩基を加えてpHを調製していくと,Co系酸化物では3.03.5,Mn系酸化物では4.0付近で,単一相ペロブスカイトの低温合成と高表面積酸化物の合成が同時に達成できた.2.アンモニア水(NH_3),テトラメチルアンモニウムヒドロキサイド((CH_3)_4NOH)何れを用いてpH調製をしても,低温合成と高表面積化が達成できたことから,本合成における金属イオン(Co,Mn)のアンミン錯体形成の寄与はないことを確認した.3.金属ーリンゴ酸前駆体の熱重量分析及び赤外分光法により調べた.pH未調整の溶液から得た前駆体では,リンゴ酸のカルボキシル基が酸型(-COOH)とイオン型(-COO^-)で存在し,それぞれの熱分解に相当する重量減少が認められた.pHが高くなるに従い酸型の割合が減少し,最適pHではすべてイオン型として存在することがわかった.4.以上の結果から,リンゴ酸錯体法によるpH調製の効果は,リンゴ酸のカルボキシル基の解離と金属ーリンゴ酸前駆錯体の形成の促進にあると結論した.5.リンゴ酸錯体法で合成したペロブスカイト型酸化物は,従来の硝酸塩分解法で合成したものよりもメタンの完全酸化活性や過酸化水素イオンの分解反応に高い活性を示し,リンゴ酸錯体法が高活性触媒の合成法として優れていることを明らかにした.
形状関数の数理構造を用いた３次元完全メッシュレス法の高性能化

楕円型境界値問題に対してEFG法とX-EFG法による離散化を行うと,それぞれ対称と非対称係数行列をもつ連立1次方程式が得られる.しかしながら, Krylov空間法を得られた連立1次方程式の解法に適用すると,対称版・非対称版を問わず,拘束条件数の増加と共にKrylov空間法の収束特性は著しく劣化する.収束特性の劣化を抑制するために,拘束条件行列の像空間とその直交補空間への射影子を用いて,連立1次方程式からLagrange未定乗数を完全に消去した.さらに,得られた連立1次方程式のソルバーにKrylov空間法を採用した結果,拘束条件数を増加させても収束特性が劣化しないことも数値的に実証した.良く知られているように,軸対称プラズマの電磁流体力学的平衡はGrad-Shafranov方程式を解くことによって決定できる.従来,2重相反境界要素法(DRM)は同方程式の境界値問題に適用され,高精度な結果を残してきた.一方で,近年,境界節点法は積分セルを用いない形で再定式化された.その結果として得られた拡張境界節点法(X-BNM)の精度はDRMと比べて高い精度を示すことが数値的に示されている.さらに,RPIM形状関数を採用すれば,X-BNMの計算スピードも飛躍的に改善できることが判明した.これらの結果は,DRMだけでなくX-BNMもGrad-Shafranov問題に適用できることを示唆している.本年度は,X-BNMをGrad-Shafranov問題に適用し, DRMと比較することによって,その性能を評価した.さらに,部分的メッシュレス法を用いた際に現れる連立1次方程式(X-BNM型連立1次方程式)の高速解法を提案した.本年度の研究で得られた結論を要約すると,次のようになる.1)DRMと比較すると,X-BNMは遥かに高精度である.この意味から,X-BNMは複雑な断面形状をもつ軸対称プラズマの平衡問題を解くための強力なツールとなり得る.2)X-BNM型連立1次方程式のソルバーとしては,LU分解等の直接法よりも,GMRES等のArnoldi原理に基づくKrylov部分空間法の方が遥かに適している.筆者等による先駆的研究によれば,楕円型境界値問題に完全メッシュレス法を適用した場合,現れる連立1次方程式がもつ係数行列の代数的構造は部分的メッシュレス法を適用した場合と酷似している.それ故,完全メッシュレス法を高速化するためには,部分的メッシュレス法を高速化する技術を確立すれば十分である.この意味から,平成27年度は,部分的メッシュレス法を用いた際に現れる連立1次方程式の高速解法を提案した.楕円型境界値問題に部分的メッシュレス法を適用すると,拘束条件付き連立1次方程式が得られる.同連立1次方程式はGMRES, GCR等のKrylov部分空間法を用いて解くことができるが,拘束条件数の増加に伴い,ソルバーの収束特性は著しく劣化する.この問題を解決するため,平成27年度の研究では,拘束条件付き連立1次方程式と等価な方程式を導くことに成功した.具体的には,拘束条件行列CをQR分解した後,部分空間span(Q)とその直交補空間を用いて,拘束条件付き連立1次方程式から拘束条件を完全に消去する.その結果として得られる方程式の変数は,元の方程式と比べて拘束条件の数だけ低減される.提案法を部分的メッシュレス法に適用することにより,その性能を調べた.その結果,従来法と比べて,提案法は少ない反復回数で解が得られることが判明した.さらに,提案法の収束特性は拘束条件数に影響されないことも分かった.当初,本研究課題の平成27年度計画は次のようになっていた.平成26年度の成果を用いて,3次元ポテンシャル問題解析用完全メッシュレス・コードを開発した後,完全メッシュレス法(完全メッシュレスFNMと完全メッシュレスBNM)の高精度化を目指す.具体的には,次の2つを完成させる.1)完全メッシュレスBNMの精度を改善する手法としては,特異積分方程式を支配方程式として解き,超特異積分方程式の残差によって精度を評価するアダプティブ法を拡張する.2)完全メッシュレスFNMを精度向上させる手法としては,アダプティブ法と境界積分の精度改善が行われる.現在までに,2)は完了したのに対して,1)は研究計画とは異なる方向に向かっている.具体的には,完全メッシュレスFNMによる離散化から得られる拘束条件付き連立1次方程式の数値解法を新たに開発することに成功し,その高性能性を数値的に実証した.これまで,拘束条件付き連立1次方程式にKrylov部分空間法を適用する手法として効果的な方法は知られていなかった.この意味では,当初計画通りではないが,本年度に大きな進展を遂げたと言える.Belytcheko等によって開発されたEFG法は構造解析分野に適用され,着実に成果を収めてきた.しかしながら,EFG法は基本境界条件の実装にLagrangeの未定乗数法を用いているため,基本境界条件が厳密には満たされないという欠点をもつ.上記問題を解決するため,著者等はX-EFG法を提唱した.楕円型自己随伴演算子を伴う境界値問題に対して,EFG法とX-EFG法による離散化では,それぞれ対称と非対称係数行列をもつ拘束条件付き連立1次方程式が得られる.しかしながら, Krylov空間法を連立1次方程式に適用すると,対称版・非対称版を問わず,拘束条件数の増加と共にKrylov空間法の収束特性は著しく劣化する.収束特性の劣化を抑制するためには,連立1次方程式からLagrange未定変数を完全に消去する必要がある.

例えば,対称版方程式の場合,先ず,拘束条件行列CをQR分解する.次に, Range(C)とその直交補空間への射影子を用いれば,Lagrange未定変数を含まない連立1次方程式を得る.得られた連立1次方程式を数値的に解くことを,本研究では,変数低減法と呼ぶ.本年度は,変数低減法のソルバーとしてKrylov空間法を採用した結果,拘束条件数を増加させても収束特性が劣化しないことも数値的に実証した.さらに,遮蔽電流密度解析の現れる拘束条件付き連立1次方程式の解法に変数低減法を適用し,さらに,GMRESの行列・ベクトル積にH-行列法を用いれば,遮蔽電流密度解析のスピードを従来法と比べて約19倍まで高速化できることを実証した.楕円型境界値問題に対してEFG法とX-EFG法による離散化を行うと,それぞれ対称と非対称係数行列をもつ連立1次方程式が得られる.しかしながら, Krylov空間法を得られた連立1次方程式の解法に適用すると,対称版・非対称版を問わず,拘束条件数の増加と共にKrylov空間法の収束特性は著しく劣化する.収束特性の劣化を抑制するために,拘束条件行列の像空間とその直交補空間への射影子を用いて,連立1次方程式からLagrange未定乗数を完全に消去した.さらに,得られた連立1次方程式のソルバーにKrylov空間法を採用した結果,拘束条件数を増加させても収束特性が劣化しないことも数値的に実証した.完全メッシュレス法によって得られる現れる連立1次方程式のソルバーとしては,Krylov部分空間法が適していることが判明したが,同法にはGMRES, GCR, Orthomin等の多くの手法が属している.この中で完全メシュレス法型連立1次方程式に最も適した手法を選ぶ基準を提唱する必要がある.平成27年度に引き続いて,今後は,1完全メッシュレス法の高精度化,2完全メッシュレス法の工学的諸問題への応用,というステップを遂行することによって,完全メッシュレス法の高性能化フェーズと工学的実証フェーズを完成させる.1では,完全メッシュレスFNMと完全メッシュレスBNMの高精度化を担当する.特に,完全メッシュレスBNMの精度を改善する手法としては,特異積分方程式を支配方程式として解き,超特異積分方程式の残差によって精度を評価するアダプティブ法を拡張する.2では,これまで有限要素法,境界要素法が重要な役割を演じてきた工学的応用分野に完全メッシュレス法を適用することによって,その有効性を数値的に実証する.それ故,3次元構造解析と3次元電磁界解析の2つのテーマに対する完全メッシュレス・コードを開発し,商用有限要素コードのNASTRANやJ-MAGの解析結果と比較検討することによって,完全メッシュレス・コードの性能評価を行う.シミュレーション科学,計算科学,数値解析平成27年度以降は,前年度の成果を用いて,3次元ポテンシャル問題解析用完全メッシュレス・コードを基礎理論グループと数値実験グループで共同開発した後,1完全メッシュレス法の高精度化,2完全メッシュレス法の工学的諸問題への応用,というステップを遂行することによって,完全メッシュレス法の【高性能化フェーズ】の後半部と【工学的実証フェーズ】を完成させる.1では,基礎理論グループが完全メッシュレスFNMと完全メッシュレスBNMの高精度化を担当する.
腸肝型ヘリコバクター感染と胆道がん・膵がんリスク

腸肝系Helicobacter属細菌の感染が、胆道がんの発癌に関与しているかを明らかにするために患者の胆汁中のHelicobacter属菌の存在をPCR法および培養法で調べるとともに血清中のHelicobacter属細菌に対する抗体の保有状況を調べた。首都圏の協力施設で胆道ドレナージを行った胆道癌37例、膵癌60例、対照28例(胆管炎、胆石、その他の癌など)を対象とした。H. bilisATCC51630株、H. hepaticus ATCC51449株およびH. pyloriTK1402株の可溶性菌体抗原に対する抗体価を測定した。胆汁から精製した全DNAを使ってHelicobacter属細菌特異的PCR増幅およびその塩基配列から菌種同定を行った。胆道癌患者のHelicobacter属細菌抗体保有状況は、H. pylori(Hp)抗体保有者17名、Hp抗体非保有でH. hepaticusまたはH. bilis(Hh, Hb)抗体保有者が3名(8.1%)であった。膵癌患者ではHp抗体保有者21名、Hp抗体非保有でHh, Hb抗体保有者が11名(18.0%)であった。対照では、Hp抗体保有者は13名で、Hp抗体非保有でHh, Hb抗体を保有する例はなかった。胆汁からHelicobacter属細菌が検出されたのは胆道系の癌患者に7例、膵癌8例、対照4例であった。【結語】以上のことから、明確な感染状況の確認にはHelicobacter属細菌感染菌種を判別して抗体の保有状況を明らかにすることが重要であること、対象とした疾患のなかでは、膵癌患者に他の群と比べて有意にHh, Hb抗体保有者が多く含まれることが明らかとなった。検体の収集は順調で、感染と発がんの因果関係について、示唆する有意な結果が得られた。測定方法はほぼ確立されてきたが、未だ精度の評価が十分でない。特に、H. pylori抗体価とH. bilisやH. hepaticusの抗体が相関することが正確な感染診断の妨げになっている。この点を克服するところが未だできていない。1)胆道がんは部位別(胆嚢、肝内・肝外胆管)分析が重要であるので各200例を超えるまで収集を続ける2)良性疾患を含む胆汁ドレナージ症例から同意を得て胆汁と血清のペアを収集する。採取後速やかに凍結して-80°Cで保存し、定期的に杏林大学医学部感染症学(以下杏林大)に移送して-80°Cで保存する。胆管擦過細胞診後の残余検体(胆汁・擦過ブラシ)の収集と細菌培養・メタゲノム解析を行う。対象からは同時に血清も提供してもらう。検体は輸送培地(ヘリコポーター)に入れて杏林大へ1日以内に移送する。このようにして収集する検体を更に20例(10例収集済)を目標として収集する。胆管中に棲息する細菌叢(マイクロバイオーム)を網羅的に解析するとともに、細菌の構成比率を患者間で比較する。全てのメタゲノム解析を杏林大学医学部共同研究施設保有のIon PGM次世代シーケンサーで実施する。本方法により他菌種が混合する胆管組織検体であっても腸肝型Helicobacter属細菌を保有する患者を確実に見出すことができる。1)血清H. hepaticus抗体価をHRII51モノクローナル抗体を用いて測定した。胆道癌症例0.45±0.34(N=388)では対照0.39±0.24 (N=545)より高値(P=0.003)、膵臓癌症例は対照より低値(0.33±0.16)だった。2) Helicobacter属同士の抗体の交差反応の影響を除くため、H. pylori非感染者の血清でH. hepaticus, H. bilis全菌体抗原ELISAを行った。膵臓癌120症例中H. hepaticus抗体保有2例、H. bilis抗体保有9例、胆道癌130例中H. hepaticus抗体保有8例、H. bilis抗体保有19例が示された。非癌患者血清では117例中、H. hepaticus抗体保有1例、H. bilis抗体保有10例であった。胆道癌患者のH. hepaticus抗体、H. bilis抗体保有率が有意に非癌患者より高かった。3)胆道癌、25例、膵臓癌35例、対照者(胆石、胆管炎)の血清で全菌体抗原EIAを行った。胆道癌ではH. hepaticus抗体8例、H. bilis抗体8例、膵臓癌ではH. hepaticus抗体15例、H. bilis抗体17例が陽性であった。5)胆道癌25例、膵臓癌35例、対照者(胆石、胆管炎)の血清で全菌体抗原EIAを実施した。胆道癌ではH. hepaticus抗体保有8例、H. bilis抗体保有8例、膵臓癌ではH. hepaticus抗体保有15例、H. bilis抗体保有17例であった。胆汁からのHelicobacter属細菌の培養を試みているが、未だ成功していない。ブラシを使用した症例の胆汁や、できるだけ新鮮なうちに培地に移すなどの方法を試みている。他の症例収集などは順調であるが、この部分が予定より遅れている。

腸肝系Helicobacter属細菌の感染が、胆道がんの発癌に関与しているかを明らかにするために患者の胆汁中のHelicobacter属菌の存在をPCR法および培養法で調べるとともに血清中のHelicobacter属細菌に対する抗体の保有状況を調べた。首都圏の協力施設で胆道ドレナージを行った胆道癌37例、膵癌60例、対照28例(胆管炎、胆石、その他の癌など)を対象とした。H. bilisATCC51630株、H. hepaticus ATCC51449株およびH. pyloriTK1402株の可溶性菌体抗原に対する抗体価を測定した。胆汁から精製した全DNAを使ってHelicobacter属細菌特異的PCR増幅およびその塩基配列から菌種同定を行った。胆道癌患者のHelicobacter属細菌抗体保有状況は、H. pylori(Hp)抗体保有者17名、Hp抗体非保有でH. hepaticusまたはH. bilis(Hh, Hb)抗体保有者が3名(8.1%)であった。膵癌患者ではHp抗体保有者21名、Hp抗体非保有でHh, Hb抗体保有者が11名(18.0%)であった。対照では、Hp抗体保有者は13名で、Hp抗体非保有でHh, Hb抗体を保有する例はなかった。胆汁からHelicobacter属細菌が検出されたのは胆道系の癌患者に7例、膵癌8例、対照4例であった。【結語】以上のことから、明確な感染状況の確認にはHelicobacter属細菌感染菌種を判別して抗体の保有状況を明らかにすることが重要であること、対象とした疾患のなかでは、膵癌患者に他の群と比べて有意にHh, Hb抗体保有者が多く含まれることが明らかとなった。検体の収集は順調で、感染と発がんの因果関係について、示唆する有意な結果が得られた。測定方法はほぼ確立されてきたが、未だ精度の評価が十分でない。特に、H. pylori抗体価とH. bilisやH. hepaticusの抗体が相関することが正確な感染診断の妨げになっている。この点を克服するところが未だできていない。本研究では検体収集はほぼ計画を達成できたので、検体の測定系の確立を進めてHelicobacter属感染と膵癌、胆道癌との関係を明らかにする。1)一部の患者について胆管擦過細胞診後の残余検体を使って、培養を試みたが、Eikenella corrodens, Lactobacillus sp.などの細菌の他、腸内細菌科の細菌が培養され、Helicobacter属細菌は検出されなかった。今後は胆管擦過細胞診後の残余検体の輸送を翌日から当日中に輸送できるように事前に打ち合わせを行う体制を整え、さらに選択培地を改良して、Lactobacillusの増殖を抑えて、Helicobacter属細菌の分離培養を行う。2) 2015年から2017年に収集した血清についてHRII51モノクローナル抗体を用いたによるサンドイッチELISA法を実施する。3) PCR法により、Helicobacter属細菌DNAが検出され、抗Helicobacter属抗体価およびHRII51抗体価の高い患者の血清を使って、ウエスタンブロッティング解析を行い、患者血清が反応する抗原を探索する。4) PCR法により、Helicobacter属細菌DNAが検出され、抗Helicobacter属抗体価およびHRII51抗体価の高い患者の血清を使って、ウエスタンブロッティング解析を行い、患者血清が反応する抗原を探索する。5)未測定の血清47本、胆汁は6本ある。それらのサンプルについても同様の解析を実施する予定となっている。
予知性の高い歯周病管理システムの構築と口腔および全身のQOLとの関連性

歯周病とメタボリックシンドロームとの関連性とその病態に及ぼすメカニズムを解明することを目的とした。歯の数のリスク因子として,高血糖,低HDLコレステロール,高中性脂肪が有意であった。動脈硬化性疾患のリスク因子として高血圧と歯周病が有意であり、歯周病に罹患しているとある種の炎症性サイトカインや接着因子が高いことを示した。さらに,糖尿病における動脈硬化性疾患に歯周病が関与することが示された。また,酸化ストレスマーカー細胞膜の酸化ストレスの指標である尿8-イソプロスタンが,歯周病罹患者で上昇していた。本年度は口腔状態とその変化の予測に役立つと考えられる生活習慣やメタボリックシンドロームおよびその構成因子との関連性について解析を試みた。国立循環器病センター予防健診部の健康診査を受診した住民3705名を対象とし喫煙,飲酒習慣およびメタボリックシンドローム構成因子と歯数との関連性を調べたところ,男女ともに年齢,血圧,総コレステロール,HDLコレステロール,血糖値およびBMIと歯数に有意の関連性を示し,さらに女性では中性脂肪にも有意の関連性を認めたが,腹囲は男女ともに歯数と有意の関連性は示さなかった。次に,従属変数を歯数20本未満/以上とし,2変量解析で関連性を認めた変数を独立変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った結果,年齢および性別で調整を行っても,歯数は高血糖,低HDLコレステロール,高中性脂肪およびメタボリックシンドロームと有意の関連性を示し,そのオッズ比は1.6,1.3,1.2および1.2であった。喫煙や飲酒および歯磨き習慣といった生活習慣は歯数と関連する傾向を示したが,有意の関連性は示さなかった。しかし,これらの生活習慣は血糖値と独立して有意の関連性を示し,そのオッズ比は1.4,1.5および1.4であった。以上の結果より,全身状態は歯周状態に影響を与えていることが明らかとなり,さらに,喫煙,飲酒および歯磨き習慣といった生活習慣は歯周状態に影響を与えている可能性が示唆され,血糖値のコントロールを介して全身疾患の予防に役立つことで,QOLを向上させている可能性が示唆された。歯周病は,炎症性疾患として全身に影響を与えるだけでなく,歯の喪失原因となり,咀嚼能力の低下が,栄養状態の変化を通じて全身の健康に影響を及ぼしている可能性がある。本年度は咀嚼能力および歯数と全身状態との関連性について調べた。国立循環器病センター予防検診部の健康診査を受診した大阪府吹田市一般住民3503名(男性1588名,女性1915名,平均年齢68.6歳±9.7歳)を対象に,質問票(歯数,性別,年齢,喫煙の有無,飲酒の有無,既往歴)を用いた調査を行った.得られた結果をAdult Treatment Panel IIIの診断基準に基づき,血圧130/85mmHg以上,中性脂肪(TG)150mg/de以上,HDLコレステロール(HDLC)男性40mg/de,女性50mg/de未満,血糖値110mg/de以上,腹囲に関してはアジアの診断基準に基づき男性90cm.女性80cm以上を異常値とし,正常群と異常群に分類した.また3つ以上異常値を保有する者をメタボリックシンドローム群としたところ.年齢,収縮期・拡張期血圧,総コレステロール.HDLC,血糖値において歯数20本以上群と20本未満群との問に有意差が認められた.歯数20本未満の群では,血圧,血糖値,HDLCが異常となり,メタボリックシンドロームと判定されやすい傾向が見られた.歯数が20本未満であることのオッズ比は.高血糖で1.61 (P=0.001).低HDLコレステロール血症で1.34 (P=0.006).高中性脂肪血症で1.27 (P=0.024)およびメタボリックシンドロームで1.22 (P=0.03)であった.以上の結果から.メタポリックシンドローム群では歯数が少ないことがわかり,全身の健康を維持するために歯数と咀嚼能力の維持が重要であることが推察された.歯周病は,生活習慣病であると同時に他の生活習慣病と相互に関連を示している。特に,糖尿病の重要な合併症の一つであるといわれている。歯周病の存在により,糖尿病のコントロールは悪化し,コントロール不良の糖尿病は歯周病を悪化させる。また糖尿病は致死的疾患である動脈硬化性疾患の進展に関わっており,歯周病も重症化により動脈硬化性疾患の進展に関与していると考えられているため.両者が動脈硬化性疾患に及ぼす影響について本研究で調べた。糖尿病患者を動脈硬化性疾患の有無において2群に分類して比較した結果,動脈硬化性疾患有り群は,なし群と比較して男性が多く,腎症が進展しており,高血圧,喫煙,歯周病が有意に高頻度であった。

次に先程比較した臨床背景(年齢,性別,BMI,糖尿病罹病期間,HbAlc,網膜症,腎症,神経障害,高血圧,脂質異常症,喫煙,%CAL≧4mm)を説明変数として動脈硬化性疾患に関与する因子をロジスティック回帰分析により検討した結果,腎症,高血圧,歯周病の診断指標である%CAL≧4mm,HbAlcが有意な説明変数であった。つまり糖尿病における動脈硬化性疾患に歯周病が関与することが示された。どのように歯周病が動脈硬化進展と関係しているかを明らかにする目的で,炎症・酸化ストレスマーカーと歯周病の診断に使用した.%CAL≧4mmとの関係を検討した結果,酸化ストレスマーカー細胞膜の酸化ストレスの指標である尿8-イソプロスタンが%CAL≧4mmと有意な正の相関を認めた。以上の結果から,動脈硬化性疾患を合併した糖尿病患者において歯周病の頻度が高いことが明らかとなった。
児童期の不安障害における認知の変容が不安症状の改善に及ぼす影響

一年目は,児童の不安症状の改善のための,認知の変容プログラムを開発し,実施することを目的とした.まず,47月の間に文献収集等を行い,プログラムの作成を行った.これらは,Kendall(1994)やLowry-Webster et al. (2001)といった先行研究で効果が認められている介入プログラムを参考に作成された.本邦においては,児童の不安症状の改善をターゲットした介入プログラムは存在しないことから,プログラム作成にあたり,World Congress of Behavioral and Cognitive Therapies,11th Congress of the Asian College of Psychosomatic Medicine,38th Annual Convention of the Association for Advancement of Behavior Therapyに参加し,プログラム作成の資料に関する知見を得た.その後,10月より,プログラムを作成した.プログラムは全8回構成となっており,認知の変容を目指した認知行動療法プログラムとなっている.完成したプログラムについて,児童の臨床に携わる臨床心理士にチェックしてもらい,修正点,改善点について議論した.さらに,プログラムのパイロットスタディを実施した.対象者は不安症状を示す児童であり,プログラム実施の結果,認知の変容と不安症状の改善が認められ,認知の変容が不安症状の改善に先行して起こることが示された.以上の結果から,認知の変容が不安症状の改善に影響する可能性が示めされた.一年目は,児童の不安症状の改善のための,認知の変容プログラムを開発し,実施することを目的とした.まず,47月の間に文献収集等を行い,プログラムの作成を行った.これらは,Kendall(1994)やLowry-Webster et al. (2001)といった先行研究で効果が認められている介入プログラムを参考に作成された.本邦においては,児童の不安症状の改善をターゲットした介入プログラムは存在しないことから,プログラム作成にあたり,World Congress of Behavioral and Cognitive Therapies,11th Congress of the Asian College of Psychosomatic Medicine,38th Annual Convention of the Association for Advancement of Behavior Therapyに参加し,プログラム作成の資料に関する知見を得た.その後,10月より,プログラムを作成した.プログラムは全8回構成となっており,認知の変容を目指した認知行動療法プログラムとなっている.完成したプログラムについて,児童の臨床に携わる臨床心理士にチェックしてもらい,修正点,改善点について議論した.さらに,プログラムのパイロットスタディを実施した.対象者は不安症状を示す児童であり,プログラム実施の結果,認知の変容と不安症状の改善が認められ,認知の変容が不安症状の改善に先行して起こることが示された.以上の結果から,認知の変容が不安症状の改善に影響する可能性が示めされた.
バクテリアべん毛輸送装置のエネルギー変換システムの分子基盤

バクテリアべん毛蛋白質輸送装置は6種類の膜蛋白質からなる輸送ゲート複合体と3種類の細胞質性蛋白質からなるATPase複合体から構成される。輸送装置は、ATPおよび細胞膜を横切るプロトン駆動力をエネルギーとして利用し、細胞内からべん毛構成蛋白質を細胞外へ輸送するが、そのエネルギー変換の仕組みは不明であった。本研究では、輸送装置がATPの消費を最小限に抑えつつ、プロトン駆動力を使って高速にかつ高効率にべん毛蛋白質を輸送すること、輸送ゲート蛋白質FlhAがイオンチャネルとして働くことを明らかにした。本研究では、光学顕微ナノ計測装置を活用し、遺伝的および生化学的手法を組み合わせることで、ATPおよび細胞膜を横切るイオン駆動力を動力源とするべん毛蛋白質輸送装置のエネルギー変換の分子機構の解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。1.YFP1分子の蛍光を十分に計測できる高感度の蛍光顕微鏡を用いてべん毛基部に局在しているFliI-YFPの数を見積もった結果、6分子以上のFliI-YFPがべん毛基部体のCリングおよび輸送ゲートプラットフォームに結合していた。FliI-YFPはATPに依存せずに1分間あたり約6回程度離合集散を繰り返していた。2.FliIの触媒部位に存在するGlu-211残基はATPの加水分解反応に直接関与する。E211Q変異体およびE211D変異体を用いて機能解析を行った結果、輸送装置はATPの消費を最小限に押さえながら、プロトン駆動力の膜電位成分のみを使って高速にかつ高効率に動く輸送エンジンであることが示唆された。3.輸送ゲート複合体を構成する膜蛋白質FliO, FliP, FliQ, FliRを同時に大量発現できるプラスミドを作製し、それら4種類の膜蛋白質の大量発現に成功した。現在、可溶化の条件を検討している。4.サルモネラ内でFlhAを大量発現させると、培地中に100 mM NaClが存在すると細胞内Na+濃度が顕著に増加したが、培地中にNaClが存在しない場合には細胞内Na+濃度の上昇は見られなかった。このことから、FlhAがNa+チャネルとして働いていることが示唆された。1.蛍光イメージング法によりべん毛繊維の成長速度を定量的に解析した結果、べん毛繊維が長くなると、べん毛蛋白質の輸送速度が減少することが示唆された。2. fliS欠損株の遺伝学的機能解析から、輸送ゲート複合体によるべん毛蛋白質の解きほぐし過程がべん毛蛋白質輸送の律速になることが示唆された。3. FliH-FliI ATPase複合体のX線結晶構造解析に成功し、FliHはV型ATPaseの外周固定子とそっくりな構造していることが明らかとなった。さらに、結晶構造をベースにした機能解析により、FliHとFliIの相互作用に直接関わる重要な残基を同定した。4. FlhAのC末細胞質ドメイン(FlhAC)がべん毛蛋白質輸送のエネルギーカップリングに重要であること、さらにその効率的なエネルギーカップリングを行う為にはFliH-FliI複合体の助けが必要なことが示唆された。5. FlhACのD2とD4ドメインの間の動的な相互作用がべん毛蛋白質輸送に重要であることが明らかとなった。6. FlhAの膜貫通ドメインとFlhACをつなぐリンカー領域がFlhACの9量体リングの安定化に重要であることが示唆された。7. FlhAの大量発現及び精製方法を確立した。8. FliPが6量体リングを形成することが明らかとなった。さらに、FliOはFliPの6量体リング形成を促進する足場として働くことが示唆された。9. FliP6FliR2複合体の精製に成功した。FlhAの遺伝学的および生化学的解析から、FlhACの開閉運動がべん毛蛋白質の輸送に重要なこと、FlhACがべん毛蛋白質輸送のエネルギー共役に重要であること、などを明らかにした。輸送ゲート複合体構成蛋白質の大量発現系を構築できた。さらに、FlhA, FliO, FliPの精製にも成功した。しかしながら、FlhAのイオンチャンネル活性測定には至れなかった。1.蛍光イメージング法によりべん毛繊維の成長速度を定量的に解析した結果、べん毛繊維の形成初期は1分間に100 nm伸長すること、その後べん毛繊維が長くなるに伴って、べん毛繊維の伸長速度が20 nm/minにまで低下することを見出した。2. pH感受性蛍光蛋白質を輸送装置の近傍に標識して局所pH計測を行った結果、わずか1μmほどのバクテリア細胞内でpH勾配が形成されていること、さらに、べん毛蛋白質輸送装置がATP加水分解とプロトン駆動力をカップルさせて利用することで効率的な蛋白質輸送を行っていることを明らかにした。3.膜電位を上昇させると、水素イオンやナトリウムイオンの濃度勾配が消失しても、べん毛蛋白質が輸送されることが判明した。

4. FlhAのC末細胞質ドメイン(FlhAc)がClosed formからOpen formへと構造変化すること、さらにFlhAの膜貫通ドメインとFlhAcをつなぐリンカー領域がすぐ隣の別のFlhAcサブユニットの構造変化を誘導することを見出した。さらに、このFlhAcサブユニットの協調的な構造変化はATPase複合体に依存することが示唆された。バクテリアべん毛蛋白質輸送装置は6種類の膜蛋白質からなる輸送ゲート複合体と3種類の細胞質性蛋白質からなるATPase複合体から構成される。輸送装置は、ATPおよび細胞膜を横切るプロトン駆動力をエネルギーとして利用し、細胞内からべん毛構成蛋白質を細胞外へ輸送するが、そのエネルギー変換の仕組みは不明であった。本研究では、輸送装置がATPの消費を最小限に抑えつつ、プロトン駆動力を使って高速にかつ高効率にべん毛蛋白質を輸送すること、輸送ゲート蛋白質FlhAがイオンチャネルとして働くことを明らかにした。FlhAがNa+チャネル活性を持つことを示すことができたとともに、他の輸送ゲート構成蛋白質の大量発現系の構築に成功した。さらに一分子蛍光イメージング法により、FliI-YFPのin vivoでのダイナミクスの計測に成功した。一方で、光架橋実験によって輸送基質蛋白質を直接認識している蛋白質の同定を試みたが、未だ成功していない。FliI及びFliHが存在しない条件下でもべん毛を形成できる変異株はNa+イオンを共役イオンに用いてべん毛を形成できる。そこで、輸送装置のエネルギーの入出力関係を明らかにするために、様々なナトリウムイオン濃度下でべん毛の成長速度を計測する。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学・生物物理学FliO/FliP/FliQ/FliR複合体を単離精製してリポソームに再構成して機能構造解析を実施する。さらに、FlhAを単離精製しリポソームに再構成することにより、FlhAのNa+チャネル活性を生化学的に検証する。予定していた海外出張が来年度にかかるものとなった。また、高額な消耗品を今年度は購入する必要がなかったためである。週20時間勤務できる研究協力者1名を雇用する予定であったが、実際雇用できなかったため。海外出張費および高額消耗品の購入に充当する。今年度4月より雇用した特別研究員の謝金の一部にあてる予定である。
動脈硬化におけるチロシンキナーゼＳｙｋを介した自然免疫炎症の解明

(1)動脈硬化におけるチロシンキナーゼsykの関与を検討するために、sykコンディショナルノックアウトマウスを動脈硬化発症ストレインにおいて樹立した。即ち、タモキシフェン感受性Lyz-creトランスジェニックマウスとの交配を樹立し、更にLDL受容体欠失マウスとの交配を確立した。また、apoe欠失マウスとの交配を進めている。これらのマウスにおいて高脂肪食の負荷を開始する予定である。タモキシフェンを投与することによりsykを欠失させ、順次8-16週間の高脂肪食の負荷の後、動脈硬化の程度を大動脈洞と大動脈において病理標本を用いて定量する。(2)善玉コレステロール(HDL)の血清濃度と動脈硬化の進展は逆相関することが観察研究から良く知られているが、その機序としてはHDLのコレステロールの末梢より肝臓への逆輸送によるものと考えられていた。しかし近年のCETP阻害薬の大規模臨床試験の結果からは、HDLの逆輸送効果以外に抗炎症効果が重要であると想定された。我々は、マウスにおけるd-galactosamineとTLRリガンドによる肝障害における検討を通して、apoAI蛋白とフォスファチジルコリンからなるHDLが抗炎症効果を発揮することを確認した。驚くべきことに、この抗炎症効果はヒト血清から純化した、その中に中性脂肪を含むHDLにおいても抗炎症効果が認められ、HDLの脂質逆輸送によるものではないことが明らかとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1) sykコンディショナルノックアウトマウスを導入し、タモキシフェン感受性Lyz-creトランスジェニックマウスとの交配を開始している。このことにより、骨髄球系における選択的sykノックアウトマウスの作成ができる。(2)動脈硬化の成因に血管内皮下におけるコレステロール結晶が惹起する炎症反応が関与している可能性を示しているが、その際にマクロファージはpyroptosisという細胞死に陥る。そしてその細胞死は、近隣にある細胞のTLRなどの自然免疫受容体を介して感知され、さらなる炎症が惹起される可能性が示唆されている。われわれはTLRリガンドとd-Galactosamineを用いたin vivoの肝障害システムを利用し、抗動脈硬化のあるHDLがTLRシグナルを阻害する現象を見いだした。(3) IL-1beta依存性炎症において、Caspase 1が欠失していても炎症が通常通り惹起されることが観察され、in vivoにおけるCaspase 1とCathepsin Cのダブルノックアウトマウスの解析を進めた。この結果、死細胞や無菌的微粒子に対する急性炎症反応は、IL-1bet a依存性であるが、炎症の時間や、炎症惹起物質の種類などによってそれぞれが相加的に、協同的に機能することが明らかとなった。ただし、Caspase 1とCathepsin CダブルノックアウトマウスにおいてもIL-1betaノックアウトマウスとの機能に差異がある状況が観察され、さらに別のIL-1beta成熟分子が働いている可能性が示唆された。sykコンディショナルノックアウトマウスにおいて、その作成が遅れているため。sykコンディショナルノックアウトマウスの作成を進め、invivoにおけるsykの関与について検討する。
蛋白質・情報伝達物質の高感度運動測定による細胞内情報伝達処理機構の研究

(1)副腎皮質細胞に於て、ステロイドホルモン合成反応の各種中間状態におけるPー450の動的存在状態の変化を解析した。牛副腎皮質から精製したadrenodoxin、adrenodoxin reductaseなどを、あらかじめadrenodoxin、adrenodoxin reductaseを取り去った副腎皮質ミトコンドリア内膜に加えて,コレステロ-ル結合型Pー450(SCC)との相互作用を調べた。adrenodoxinを加えるとPー450の運動性が上昇するが、ここにreductaseをくわえるとPー450の運動性は低下する、これはPー450(SCC)がadrenodoxinーadrenodoxin reductaseと短寿命複合体を作った結果である。これは昨年に得た結果とあわせることにより、ミトコンドリアにおいて、コレステロ-ル結合型Pー450(SCC)はPー450(SCC)ーadrenodoxinーadrenodoxin reductase三者複合体を作り電子が伝達され、コレステロ-ルがプレグネノロンに変換されるとこの三者複合体は解離する。これはコレステロ-ル非結合型Pー450(SCC)が他の蛋白と低い接着性しか持たないせいであろう。このようにしてうまく電子伝達のスイッチがONーOFFされている。(2)ラット肝臓ミクロソ-ムから精製したPー450MC、Pー450PB、epoxidehydrase、をPC/PE/PSからなる脂質二層膜に組み込んだ再構成膜を作成して相互作用を調べた。epoxide hydraseの抗体を加えるとPー450MC、Pー450PBの運動性が大きく減少し、両Pー450ともepoxide hydraseと一時的な複合体を作り基質のやり取りをしていることがわかった。(3)牛副腎皮質から精製したPー450(SCC)、Pー450(11β)、Pー450C21、Pー45017α、adrenodoxin、adrenodoxin reductase,NADPHーcytochrome Pー450 reductaeなどをPC/PE/PSやPC/PE/CLからなる脂質二層膜に組み込んだ再構成膜を作成し、各種Pー450の分子運動や上に述べた他の各種蛋白質との相互作用の違いを測定して電子伝達相互作用などのしくみを解析した。Pー450C21はNADPHーcytochrome Pー450 reductaeと短寿命複合体を作ることを見いだした。またPー450(SCC)とPー450(11β)が一時的な複合体を作り、そのほうがadrenodoxinからの電子伝達効率がよいという結果を得た。Pー45017αは他のPー450と比べて最も集合体を作りにくく、単独でよく運動していることがわかった。(4)再構成膜を用いた実験から、Pー450のヘム面が膜面から傾いている角度は各々55度(Pー450PB)、48度あるいは62度(Pー450MC)、38度もしくは78度(Pー450SCC)であることが分かった。副腎皮質のステロイドホルモン合成の第一段階であるcholesterol→pregnenolone変換にともなってadrenodoxin還元酵素+adrenodoxin+P-450sccの電子伝達複合体スイッチがON状態(三者会合体)からOFF状態(三者がばらばら)になることを発見した。このことは、外からadrenodoxin還元酵素とadrenodoxinを加えるとP-450sccの運動性が低下することからの支持された。化学発癌物質エポキサイドを速やかに代謝するepoxidehydraseとP-450b,P-450cを人工再構成膜中できれいに運動させることに成功した。ここにepoxide hydraseの抗体を加えるとP-450の運動性が大きく低下することからepoxide hydraseとP-450b、P-450cが一時的複合体を形成していることを示唆する結果を得た。エオシンでepoxide hydraseをラベルしその運動を再構成膜中で測定する事に成功した。牛副腎皮質ミクロソ-ムのP-450c21とNADPH-cytochrome P-450還元酵素を再構成小胞中で測定して還元酵素が存在するとP-450c21の運動性が上昇することから、両者が複合体を作っていることを発見した。これは昨年に得た結果とあわせることにより、ミトコンドリアにおいて、コレステロ-ル結合型Pー450(SCC)はPー450(SCC)ーadrenodoxinーadrenodoxin reductase三者複合体を作り電子が伝達され、コレステロ-

ルがプレグネノロンに変換されるとこの三者複合体は解離する。これはコレステロ-ル非結合型Pー450(SCC)が他の蛋白と低い接着性しか持たないせいであろう。このようにしてうまく電子伝達のスイッチがONーOFFされている。(2)ラット肝臓ミクロソ-ムから精製したPー450MC、Pー450PB、epoxidehydrase、をPC/PE/PSからなる脂質二層膜に組み込んだ再構成膜を作成して相互作用を調べた。epoxide hydraseの抗体を加えるとPー450MC、Pー450PBの運動性が大きく減少し、両Pー450ともepoxide hydraseと一時的な複合体を作り基質のやり取りをしていることがわかった。(3)牛副腎皮質から精製したPー450(SCC)、Pー450(11β)、Pー450C21、Pー45017α、adrenodoxin、adrenodoxin reductase,NADPHーcytochrome Pー450 reductaeなどをPC/PE/PSやPC/PE/CLからなる脂質二層膜に組み込んだ再構成膜を作成し、各種Pー450の分子運動や上に述べた他の各種蛋白質との相互作用の違いを測定して電子伝達相互作用などのしくみを解析した。Pー450C21はNADPHーcytochrome Pー450 reductaeと短寿命複合体を作ることを見いだした。またPー450(SCC)とPー450(11β)が一時的な複合体を作り、そのほうがadrenodoxinからの電子伝達効率がよいという結果を得た。Pー45017αは他のPー450と比べて最も集合体を作りにくく、単独でよく運動していることがわかった。(4)再構成膜を用いた実験から、Pー450のヘム面が膜面から傾いている角度は各々55度(Pー450PB)、48度あるいは62度(Pー450MC)、38度もしくは78度(Pー450SCC)であることが分かった。
運転コストと余剰汚泥の削減を達成する遊離亜硝酸を用いた新規窒素除去システムの開発

遊離亜硝酸は生物学的窒素除去の初段の反応においてアンモニア酸化の最終生成物、亜硝酸イオンとの平衡反応により生成する。遊離亜硝酸は、省エネで窒素除去を達成するために必須な亜硝酸酸化細菌への阻害効果を発揮したり、細菌細胞の損傷を促進させ、汚泥減容化に寄与したりする特性を有し、排水処理施設内での利用が期待されている。平成29年度は、この遊離亜硝酸が細菌細胞の損傷に及ぼす影響と、亜硝酸酸化細菌への阻害効果に及ぼす影響の評価を行った。従属栄養細菌をモデル細菌として、遊離亜硝酸濃度が細菌細胞の呼吸活性と細胞損傷に及ぼす影響を評価した。高感度に酸素濃度を追跡可能な呼吸活性測定システムを用いることにより、遊離亜硝酸濃度の上昇により細菌の呼吸活性が大幅に削減されることを明らかにした。細菌細胞の静菌効果はわずかなpHや亜硝酸イオン濃度の変化により得られることが示唆された。一方で、嫌気消化の促進に必要な細菌細胞の破砕のためには、静菌作用の遊離亜硝酸濃度よりも1-2オーダー高い遊離亜硝酸濃度が必要になることを明らかにした。活性汚泥を用いた窒素除去バイオリアクターの運転を行い、活性汚泥を高い遊離亜硝酸濃度に曝露させて亜硝酸酸化を抑制し、効率的な窒素除去が行えるかを検証した。遊離亜硝酸による処理を導入する系、導入しない系の2つの半回分式リアクターシステムを構築して評価した。しかしながら、スタートアップに予想以上の時間を要したこと、亜硝酸酸化を担う細菌群の活性が予想を上回ったことから、亜硝酸酸化活性の安定した抑制が達成されなかった。溶存酸素濃度の再設定、もしくは間欠曝気運転等の条件設定が必要であることが示された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。