hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クイア仏教学の構築

研究初年度にあたる2018年度は、クイア仏教学の構築をめざして「クイア」という言葉の理解に力を注いだ。「クイア」とはかつて侮蔑的な意味でセクシュアル・マイノリティ当事者に浴びせられていた言葉を、当事者が逆手にとり、差異をのりこえて連帯することで差別状況を転換する運動という意味がある。それともう一つ、男/女や異性愛/同性愛などの二項対立で規定されてきた様々な概念を否定的に捉え、性に関する現実の問題を契機としながら、既成の概念規定を脱却し克服していく論理を再構築していく学問という意味もある。こうした「クイア」な課題の克服を目的とした実践的な学問としてクイア・スタディーズが形成されつつあるということが理解できた。こうした「クイア」的視点を仏教研究と融合させていくにあたり、現実的なクイア的疑問を想定することにした。なぜなら、クイアに代表される差別などの具体的な問題を考える場合、「仏教は無分別を説き差別を超越した宗教だから、教えとしては解決している」という意見や「仏教とは超越概念なので、現実の問題にはかかわらない」という意見をしばしば耳にするからである。そうした意見に対して、クイア・スタディーズからはこのような問いが返されるはずである。「教えとしては解決している問題であるにもかかわらず、なぜ具体的な教団のなかで差別現象が存在し続けているのですか?」とか「具体的に差別が解消できていないのであれば、差別の解消にむけて仏教を再構築する必要があるのではないですか?」と。現実的な課題を前提とし、その解決のための論理の再構築を模索するクイア・スタディーズだからこそだされる貴重な問いだといえる。今年度は以上のようにクイアという言葉の定義と、クイアスタディーズという分野について知ることができた。残された2年間で、さらに課題への理解を深めていきたいと思う。サンフランシスコに行きアメリカ仏教会でのLGBTへの取り組みを視察することができた。ただし、アメリカのサンフランシスコでは物価が高騰しており2018年度の渡米機関が短期間に終わった。本来であれば、もう少し長期で滞在し、サンフアンシスコ仏教会でのLGBTに関する議論の様子を多く知ることが必要だったが、それができなかったことは反省点である。日本におけるクイア研究に関しては、資料を集めることができつつある。2018年度は日本におけるクイア研究者の先人の方々と多く知り合うことができたことはことのほかの収穫であった。クイアに関しての研究は様々な分野で少しづつは始まってきているが、やはりそれぞれが所属する学会で孤軍奮闘しながら研究が進められているという話を伺った。挑戦的研究であるが故の宿命であるが、そうであるが故に研究の意義は大きいということを再確認させられた年度でもあった。資料収集に関してはまだ完全ではないので、今年度以降も継続的に収集していきたい。研究者のネットワーク作りも進捗した。せっかくつながることができた研究者とともに、研究会を開催してクイア仏教学の意義を確立したい。仏教を研究する方のなかで、なかなか同一テーマに興味を持たれていらっしゃる方が少ないことも分かった。そうしたなか、龍谷大学で研究発表をさせていただいたのは大変貴重な経験となった。現時点での私自身の概念理解を明確化させ、今後の展望を整理しながら考える機会を作っていただいた。また、LGBT支援コミュニティーを名古屋、大阪、東京で尋ねることができたのも収穫であった。当事者の方々の置かれている現状を、具体的に知り、仏教学者としていかにその現状に研究をもって関わるかを考えさせられた。今後も継続的に関係を持っていきたい。2018年度に多くの研究者と知り合うことができた。2019年度はせっかく知り合えた研究者の方々と研究会を開催することで、情報を共有しながら自らの研究を進めていきたい。クイア研究の全身になるものが、ジェンダー研究であり、フェミニズム研究である。こうした研究所も多く仕入れることも今後の目標としたい。さらに九州でクイア研究を行っている研究者が少ないので、クイア研究者によるシンポジウムを行い、九州での認識の拡大を図りたい。名古屋、大阪、東京のLGBTコミュニティーの方々とつながることができたので、今後とも継続的に訪問して新たな情報を収集する努力を重ねたい。2018年度は国会議員による、LGBT差別発言がおこり当事者のなかでも非常におおくの悲痛な声を聴くこととなった。こうした具体的に悲しいという声は、研究室に閉じこもっていても聞くことができない者だったと思うので、今後とも明日を運んでいきたい。トランス女性への差別の顕在化も大きな課題である。人がなぜ、バイオロジカルなジェンダーにばかりとらわれるのかなど、解決すべき疑問は多くあるので取り組みたい。なにより、仏教教団のなかでLGBTへの差別が存在している事実を知ったことは大きな収穫であった。今後は、こうした仏教教団のなかでの差別に焦点を合わせながらクイア理論を活用することで、いかに事態を解決することができるかを考察してきたい。

それともう一つ、男/女や異性愛/同性愛などの二項対立で規定されてきた様々な概念を否定的に捉え、性に関する現実の問題を契機としながら、既成の概念規定を脱却し克服していく論理を再構築していく学問という意味もある。こうした「クイア」な課題の克服を目的とした実践的な学問としてクイア・スタディーズが形成されつつあるということが理解できた。こうした「クイア」的視点を仏教研究と融合させていくにあたり、現実的なクイア的疑問を想定することにした。なぜなら、クイアに代表される差別などの具体的な問題を考える場合、「仏教は無分別を説き差別を超越した宗教だから、教えとしては解決している」という意見や「仏教とは超越概念なので、現実の問題にはかかわらない」という意見をしばしば耳にするからである。そうした意見に対して、クイア・スタディーズからはこのような問いが返されるはずである。「教えとしては解決している問題であるにもかかわらず、なぜ具体的な教団のなかで差別現象が存在し続けているのですか?」とか「具体的に差別が解消できていないのであれば、差別の解消にむけて仏教を再構築する必要があるのではないですか?」と。現実的な課題を前提とし、その解決のための論理の再構築を模索するクイア・スタディーズだからこそだされる貴重な問いだといえる。今年度は以上のようにクイアという言葉の定義と、クイアスタディーズという分野について知ることができた。残された2年間で、さらに課題への理解を深めていきたいと思う。サンフランシスコに行きアメリカ仏教会でのLGBTへの取り組みを視察することができた。ただし、アメリカのサンフランシスコでは物価が高騰しており2018年度の渡米機関が短期間に終わった。本来であれば、もう少し長期で滞在し、サンフアンシスコ仏教会でのLGBTに関する議論の様子を多く知ることが必要だったが、それができなかったことは反省点である。日本におけるクイア研究に関しては、資料を集めることができつつある。2018年度は日本におけるクイア研究者の先人の方々と多く知り合うことができたことはことのほかの収穫であった。クイアに関しての研究は様々な分野で少しづつは始まってきているが、やはりそれぞれが所属する学会で孤軍奮闘しながら研究が進められているという話を伺った。挑戦的研究であるが故の宿命であるが、そうであるが故に研究の意義は大きいということを再確認させられた年度でもあった。資料収集に関してはまだ完全ではないので、今年度以降も継続的に収集していきたい。研究者のネットワーク作りも進捗した。せっかくつながることができた研究者とともに、研究会を開催してクイア仏教学の意義を確立したい。仏教を研究する方のなかで、なかなか同一テーマに興味を持たれていらっしゃる方が少ないことも分かった。そうしたなか、龍谷大学で研究発表をさせていただいたのは大変貴重な経験となった。現時点での私自身の概念理解を明確化させ、今後の展望を整理しながら考える機会を作っていただいた。また、LGBT支援コミュニティーを名古屋、大阪、東京で尋ねることができたのも収穫であった。当事者の方々の置かれている現状を、具体的に知り、仏教学者としていかにその現状に研究をもって関わるかを考えさせられた。今後も継続的に関係を持っていきたい。2018年度に多くの研究者と知り合うことができた。
腸管出血性大腸菌の3型分泌装置依存的炎症性サイトカイン産生抑制機構の解析

腸管出血性大腸菌感染症の臨床症状では、炎症反応が低いという特徴を有する。しかしながら、その機構は全く明らかにされいない。これまでの解析結果により、この炎症抑制作用は3型分泌装置(Type III secretion system; TTSS)依存的であり、さらに未知のエフェクターが寄与している可能性が示唆されている。本研究では、3型分泌装置依存的サイトカイン産生抑制機構に寄与するエフェクターの同定を試みた。これまでの解析結果により、この炎症抑制作用は3型分泌装置(Type IIIsecretion system;TTSS)依存的であり、さらに未知のエフェクターが寄与している可能性が示唆されている。そこで、まずエフェクター同定のためのアッセイ系を確立した。本研究では、EHECを宿主細胞に感染させるのではなく、EHECの培養上清をprotein transfection(つまり培養上精に分泌されたエフェクターを人工的に細胞内に注入する)し、その細胞のTNF刺激に対する反応性を解析するというアッセイ系を考案した。種々のEHEC変異株およびprotein transfection試薬を検討した結果、DsepL株およびChariotprotein transfection regent(ACTIVE MOTIF)を用いたときにもっとも良好な結果が得られた。さらに培養条件は、DMEM、37°C、5時間振とう培養がもっとも至適であった。次に、このアッセイ系においても、野生株EHEC感染細胞で認められる、TNF刺激によるIL-6誘導過程におけるIkB-αのリン酸化およびプロテオソームによる分解過程の阻害が、同様に認められることを確認した。現在、得られた条件で、EHEC培養上清の分画を行っている。これらの知見により、今回確立したアッセイ系は、野生株EHEC感染細胞で認められる炎症性サイトカイン産生抑制作用に寄与するエフェクターと同様もしくは類似の分子(エフェクター)を同定する上で好ましい系であることが示唆された。これまでの解析結果により、この炎症抑制作用は3型分泌装置(Type III secfetion system ; TTSS)依存的であり、さらに未知のエフェクターが寄与している可能性が示唆されている。これまでにsepL遺伝子欠損およびChariot protein transfection regent (ACTIVE MOTIF)を用いたときにもっとも良好な結果が得られたが、さらにhfq遺伝子欠損によってTTSSエフェクターの分泌量がさらに亢進することを見出した。また、インドール添加およびpchA遺伝子発現によってもTTSSの発現量が上昇することも明らかになった(Hirakawa et.al. Microbiology. (2009)155, 541-540)。現在、これまで得られた条件の組み合わせで、最良な条件を検討している。これらの知見をもとにEHEC培養上清の分画を行う予定である。
住民と国保保健婦が協働した戦後健康づくり活動の過程と展開に関する歴史社会学的研究

本研究は、日本の戦中期から戦後に至る公衆衛生政策と、政策の変化がもたらした保健師の役割、及び政策によって変化させられた中にも存在した地域住民と保健婦との協働関係を、歴史社会学の手法にて解明するものである。初年度である平成30年度は、第一の課題である「日本の戦中戦後期における保健師の活動に焦点を当て、地域住民と保健師との協働関係」、及び第二の課題である「戦中戦後期における住民と保健師との関係と変化を明らかにする」ために、特に戦中期を中心とした史料の収集と分析を行った。保健師の身分が法的に定められたのは昭和16年制定の「保健婦規則」による。保健師の制度や教育に関する先行研究は多くみられるが、実際の活動状況に関する分析は途上であるといえる。本研究ではまず戦後期に保健師が行なった健康づくり活動との比較のため、戦中期の保健師活動の実態を明らかにすることとした。具体的には戦中期の保健師の現任教育に関して国立国会図書館所蔵の史料を用いて分析を進めた。この結果、「保健婦規則」制定前に行われていた保健師活動は家庭訪問による個別の事例への支援が中心であったが、「保健婦規則」制定後はこれらに加え、集団指導や地区組織活動を利用した活動に広がりをみせていた。戦中期に保健師に課せられた役割のひとつは人口増加であるが、人口増加に対しては国民全体の死亡率を低下させることが重要である。当時は疾病に加えて衛生状態の悪化、貧困、医療を受けることが困難な環境等が高い死亡率に影響していたことが確認されたと共に、これは現代の保健師活動にも関連する重要な事項であった。平成30年度は国保保健婦と地域住民との協働関係に焦点を絞り、史料収集と分析を行った。ほぼ予定通り進んでいるが、分析を進める中で、当時の現任教育のために用いられた教本の中にこの時代の保健師活動における重要な部分を発見したため、現在はここに中心を据えて分析を進めている。また、歴史社会学の手法による分析方法に関しては、医学史研究会に定期的に参加し、知識及び技術を得ている。本研究は戦後期に保健師が行なった健康づくり活動の内容と住民との関係を明らかにすることより、市井の人々の公衆衛生史を再構築することを目的としている。今後の推進は下記のとおりである。1戦後戦中期の保健師活動に関する分析を進める。2保健師や公衆衛生に関する歴史社会学を専門とする研究協力者との検討会を開催し助言を得る。3令和2年度には国保保健婦へのインタビューを予定している。令和元年度中に対象者の選定を行う予定である。平成30年度は国立国会図書館の蔵書中心に分析を進め、前述した重要な記述に行き着いた。そのため当初予定していた保健婦資料館等での史資料収集は次年度以降に繰越すことになったことによる残額が生じた。

次年度に関しては、引き続き資料の収集と整理、分析を行うことを予定している。そのための人件費を計上した。また、歴史社会学的な研究手法を用いているため、研究協力者との検討会を開催し助言を得ることとしている。
再生医療を支援する間葉系幹細胞工学の展開

急展開している幹細胞学は、多分化能を持つ体性幹細胞を体内随所に発見して、「胚性幹細胞だけが重要である」としてきた古典発生学のドグマを破壊し続けている。増殖しないと信じられてきた中枢神経系に幹細胞が発見され、骨髄液に血球系、間葉系や内皮系だけでなく、神経系にさえ分化する幹細胞が発見されて、再生医療という新領域が開花している。このような体性幹細胞の最たる例は、体内随所の脂肪組織に多分化性幹細胞が大量に存在するという最近の発見である。その量は脂肪組織細胞の20%にも及ぶとも言われている。我々は、脂肪細胞集団を天井培養することによって間葉系幹細胞を得る方法を開発して特許出願した。本研究では、この成果を発展させてより効率的で簡便な体性幹細胞の分離・増殖法を開発し、再生医療を幹細胞工学の側面から支援することを目指した。初年度には、脂肪より採取・分離した体性脈管性分に含まれる自家幹細胞が本質的に旺盛な増殖能力を持つ細胞集団であることを発見し、多様な増殖因子を含む血清を高濃度で培養系に加えることは、幹細胞の多方向への分化を促進するために返って不利であり、高血清培地では不特定に分化した細胞集団が年齢依存的に増殖するものの幹細胞の含量が次第に低下することを発見した。この成果を「低血清培養で選択的に増殖する動物組織遍在性の分化多能性細胞」として特許出願し、臨床応用を想定して培養系を完全にヒト化することにも成功した。次年度以降には、このように体内随所に存在する体性幹細胞が正常な体内では暴走せず、組織再生が必要な事態でのみ増殖・分化する機構を支えていると想定される「体性幹細胞保育因子(機構)」を提出して実体解明に努めた。未だ分子レベルでの解明には至っていないが、脂肪組織に内在する体性幹細胞が端末分化を遂げた成熟脂肪細胞と強く相互作用しており、その影響下で正常時には増殖と分化が抑制されていることを明らかにした。骨、軟骨、骨格筋、心筋や脂肪に分化できる間葉系幹細胞が成人の骨髄液中に発見されて、これを分離・増殖させて自家移植することによって、失われた組織を再生させる医療が進んでいる。我々は、同様の幹細胞が脂肪組織にも存在することを発見して、2歳男児から採取した0.5グラムの皮下脂肪片から10^<14>個にまで拡大培養できる幹細胞を得る方法を開発した。また、「脂肪に分化しやすい幹細胞」と「骨芽細胞に分化しやすい幹細胞」を個別に拡大培養することにも成功した。本研究では、これらの基礎技術を発展させて、脂肪だけではなく、各種末梢組織から同様の幹細胞を採取する方法を開発し、病原体フリー条件下で拡大培養して、再生医療を支援する幹細胞工学に発展させることを目標とした。その結果、1)2歳から57歳の患者の皮下脂肪組織から、性別や採取部位に関わらず、高い再現性で上記の2種類の間葉幹細胞を分離することに成功した。2)皮下脂肪に加えて、内臓脂肪である大網からも幹細胞を分離することに成功した。3)従来は20%のウシ胎児血清の存在下でしか増殖しなかった幹細胞を、5%のウシ胎児血清添加で増殖させる方法を確立した。この低血清化は、ウシ胎児血清に代えて、患者血清を用いる病原体フリーの増殖培養系の開発に道を開いた。さらに、4)得られたヒト脂肪

由来幹細胞を実験動物の筋肉内に移植することによって、レントゲン撮影で検出可能な骨様構造を形成させることにも成功した。幹細胞が発見されて、組織移植に依存してきた移植外科術は大きく変貌しようとしている。しかし、骨髄液中の間葉系幹細胞含量は微量であり、組織再建に必要となる間葉系幹細胞を準備するには大量の骨髄液の採取が必要であり、患者に大きな負担を与える。我々は、脂肪細胞集団を天井培養することによって間葉系幹細胞を得る「天井培養」と称する方法を開発して特許出願した。本研究ではこの成果を発展させて、より効率的で簡便な方法を開発すると共に、皮下間質などの脂肪以外の末梢組織から間葉系幹細胞を取得する方法の開発をめざした。本年度の本研究の成果は、脂肪より採取した分離した幹細胞をマウスに移植し、軟骨、骨、脂肪組織を作ることを確認し、間葉系幹細胞が本質的に旺盛な増殖能力を持つ細胞集団であることを確認した。そして多様な増殖因子を含んである血清は多方向への幹細胞の分化を促進するために、幹細胞を幹細胞として増殖させるためには害毒であり、高血清培地では不特定に分化した細胞集団が増殖するものの、幹細胞の含量が次第に低下することを発見した。この成果を「低血清培養で選択的に増殖する動物組織遍在性の分化多能性細胞」として特許出願した。そして、このような幹細胞の暴走を抑えるために機能している「成体幹細胞保育因子」なる概念を提唱し、末梢組織の細胞外マトリックスに多量に含まれているラミニンの構成鎖であるα4鎖G領域が保育因子として機能していることをしめす実験結果を蓄積した。これらの成果はがんなどの再建手術を行う形成外科手術にとって、今後有力な治療法への足がかりとなりうる。急展開している幹細胞学は、多分化能を持つ体性幹細胞を体内随所に発見して、「胚性幹細胞だけが重要である」としてきた古典発生学のドグマを破壊し続けている。増殖しないと信じられてきた中枢神経系に幹細胞が発見され、骨髄液に血球系、間葉系や内皮系だけでなく、神経系にさえ分化する幹細胞が発見されて、再生医療という新領域が開花している。このような体性幹細胞の最たる例は、体内随所の脂肪組織に多分化性幹細胞が大量に存在するという最近の発見である。その量は脂肪組織細胞の20%にも及ぶとも言われている。我々は、脂肪細胞集団を天井培養することによって間葉系幹細胞を得る方法を開発して特許出願した。本研究では、この成果を発展させてより効率的で簡便な体性幹細胞の分離・増殖法を開発し、再生医療を幹細胞工学の側面から支援することを目指した。昨年度には、脂肪より採取・分離した幹細胞が本質的に旺盛な増殖能力を持つ細胞集団であることを発見し、多様な増殖因子を含む血清を培養系に加えることは、幹細胞の多方向への分化を促進するために返って不利であり、高血清培地では不特定に分化した細胞集団が増殖するものの幹細胞の含量が次第に低下することを発見した。最終年度になる本年度には、このように体内随所に存在する体性幹細胞が正常な体内では暴走せず、組織再生が必要な事態でのみ増殖・分化する機構を支えていると想定される「体性幹細胞保育因子(機構)」を提出して実体解明に努めた。未だ分子レベルでの解明には至っていないが、脂肪組織に内在する体性幹細胞が端末分化を遂げた成熟脂肪細胞と強く相互作用しており、その影響下で正常時には増殖と分化が抑制されていることを明らかにした。
新たな中枢性神経障害性疼痛モデルの作成

神経障害性疼痛には、末梢神経の障害による末梢性神経障害性疼痛と中枢神経の障害による中枢性神経障害性疼痛の2種類に分類されます。特に中枢性神経障害性疼痛は難治性であることが知られています。中枢性神経障害性疼痛は、視床などへの出血により発症するもの(視床痛)、脊髄損傷によるものなど、神経障害の部位は様々です。これらの神経障害により痛みが発症するメカニズムは不明です。この原因は良い動物実験モデルが存在しないことにあると考えています。今回の研究では、新たなモデルを開発するために、視床などへ血液などを選択的に投与しましたが、臨床に即した動物モデルを作成することは出来ませんでした本研究では、脳卒中後中枢性疼痛の動物実験モデルを作成することである。脳卒中後中枢性疼痛は、視床、視床ー頭頂葉間、脳幹への出血を契機として発症するものである。脳卒中後中枢性疼痛は、出血部位により痛みを生じる場合と生じない場合がある。従って、動物実験を行うに当たっては、正確にラットの視床、視床ー頭頂葉間、脳幹などに直接血液を投与したり、フェノール・フェノールグリセリンなどの神経破壊薬を投与する必要がある。このため、平成23年度平成24年度にかけて、ラットステレオ手術の方法を用いて、適切な部位にカニュラ先端を留置技術の習得に時間がかかった。さらに、痛みモデルを作成した後に、マイクロダイアリシス法を用いて脳内の神経核からのグルタミン酸・ノルアドレナリンなどの神経伝達物質の放出の検討を目標とした。マイクロダイアリシス用のカニュラの挿入を、ステレオ手術の技術を用いて目的とする神経核へ留置する技術の確立を行った。さらに、マイクロダイアリシスの技術確立とともに、高速液体クロマトグラフィーを用いてのグルタミン酸・ノルアドレナリンなど濃度測定技術の確立を行った。平成23年度平成24年度を通じて上記の技術確立に時間がかかり、実際に血液・フェノール・フェノールグリセリンなどを直接投与しての脳卒中後中枢性疼痛モデルを確立するところまでは至らなかった。平成25年度以降に、血液・フェノール・フェノールグリセリンなどを直接投与しての脳卒中後中枢性疼痛モデルの確立を目指していきたい。今回の研究では、新たなモデルを開発するために、視床などへ血液などを選択的に投与しましたが、臨床に即した動物モデルを作成することは出来ませんでした本研究は、ラットに脳定位手術の手法を用いて、視床を中心とした侵害刺激伝達の経路に沿って様々な部位に神経障害を与え、中枢性神経障害性疼痛の発症を観察することを目的としたものである。本年度は、ラットの脳定位手術の技術を用いて、目的とする部位に正確にカニュラを挿入することが可能となる様に手技の向上を目指した。ラットをハロセン麻酔下に固定器に装着し、George Paxinos and Charles WatsonによるTHE RAT BRAINの図譜を用いて挿入する位置を決めた。カニュラは、視床以外にpreiaqueductal gray (PAG)、rostral ventromedial medulla (RVM)等にも挿入を試みた。挿入後のカニュラの位置は、当初はCTを撮影することにより確認する予定であった。しかしながら、正確な位置の確認(様々な核との関係など)が難しかったため、挿入後にラットを灌流固定し、ビブラトームにて切片を作成し、ニッスル染色を行った後に、解剖学的に位置の確認を行った。カニュラを予定した部位に確実に挿入することは難しく、本年度の実績としては技術の向上のみとなってしまい、実際に血液・化学物質(フェノール、アルコールを用いる。フェノール、アルコールの濃度は、共に70%から10%ずつ上げていき、100%まで)を入れる予定であったが、これらの物質による効果を検討することは出来なかった。平成24年度に、これらの物質以外に熱刺激などを行い、触刺激などに対する反応性を検討していく予定としている。本年度の計画では、カニュラの挿入手技の確立と、刺激物質である血液などの注入までが目標であった。しかしながら、カニュラ挿入手技の確立に時間を要したため、本年度はカニュラ挿入手技の確立のみしか達成できなかった。本年度に、カニュラ挿入技術の確立は達成できたため、24年度にはフェノール、アルコールなどの化学物質、血液、熱などによる神経損傷を作成し、知覚の低下、アロディニアの発症によりを検討していく予定である。これらの神経症状は、神経障害を与えた後、1日、3日、1週間、2週間、4週間後に評価する予定である。熱による神経損傷のためのラジオ波熱凝固の器械を購入の予定である。また、使用するラット、麻酔薬、固定用のホルマリンなどの消耗品の購入に研究費を充てる予定である。
硫黄サイクル、鉄サイクルおよびANAMMOXを活用した酪農排水の新規処理法の開発

酪農排水は有機物と窒素濃度が高い排水である.多くは活性汚泥法を用いて処理されているが,エネルギー消費量が多く,窒素が残存するため周辺環境への影響が大きい.本研究では,硫酸塩濃度が高い酪農排水を対象として,硫黄サイクル,ANAMMOX,鉄サイクルを活用した,新規の省エネルギーな生物膜処理法の開発を目的としている.提案するプロセスは,嫌気-無酸素-好気槽を組み合わせた硫酸塩還元/脱窒・ANAMMOX/部分硝化プロセス(SRDAPNプロセス)である.本処理法の有効性を検討するために,模擬酪農排水を用いた連続処理実験と微生物叢の解析を行う.酪農排水を模擬した人工排水を用いて,嫌気無酸素生物ろ床装置の連続運転を行った結果,嫌気槽ではメタン生成と硫酸塩還元反応の両者が進行していたと推定された.無酸素槽では,従属栄養脱窒と硫黄脱窒反応に加え,アンモニア濃度が減少したことから,ANAMMOX反応が同時に進行していたと考えられる.16S rRNA遺伝子を標的として次世代シークエンサーを用いた微生物解析結果より,嫌気槽では硫酸塩還元菌とメタン生成古細菌,無酸素槽では脱窒菌とANAMMOX菌が確認された.人工の酪農排水を用いた嫌気無酸素生物ろ床装置の連続運転はおおむね順調であり,嫌気槽と無酸素槽内の水質結果と菌叢解析より良好な結果を得られている.嫌気無酸素生物ろ床装置の連続試験を段階的に行い,硫酸塩還元細菌,鉄還元細菌,硫黄脱窒細菌,ANAMMOX菌をそれぞれ槽内に保持するための条件を明らかにする.各槽内の微生物を用いて活性試験,次世代シークエンサーを用いた16S rRNA遺伝子の菌叢解析により,微生物の共存関係を明らかにする.さらに,嫌気無酸素生物ろ床装置の後段に好気槽を接続して循環することにより,本プロセス全体を評価する予定である.酪農排水は有機物と窒素濃度が高い排水である.多くは活性汚泥法を用いて処理されているが,エネルギー消費量が多く,窒素が残存するため周辺環境への影響が大きい.本研究では,硫酸塩濃度が高い酪農排水を対象として,硫黄サイクル,ANAMMOX,鉄サイクルを活用した,新規の省エネルギーな生物膜処理法の開発を目的としている.提案するプロセスは,嫌気-無酸素-好気槽を組み合わせた硫酸塩還元/脱窒・ANAMMOX/部分硝化プロセス(SRDAPNプロセス)である.本処理法の有効性を検討するために,模擬酪農排水を用いた連続処理実験と微生物叢の解析を行う.酪農排水を模擬した人工排水を用いて,嫌気無酸素生物ろ床装置の連続運転を行った結果,嫌気槽ではメタン生成と硫酸塩還元反応の両者が進行していたと推定された.無酸素槽では,従属栄養脱窒と硫黄脱窒反応に加え,アンモニア濃度が減少したことから,ANAMMOX反応が同時に進行していたと考えられる.16S rRNA遺伝子を標的として次世代シークエンサーを用いた微生物解析結果より,嫌気槽では硫酸塩還元菌とメタン生成古細菌,無酸素槽では脱窒菌とANAMMOX菌が確認された.人工の酪農排水を用いた嫌気無酸素生物ろ床装置の連続運転はおおむね順調であり,嫌気槽と無酸素槽内の水質結果と菌叢解析より良好な結果を得られている.嫌気無酸素生物ろ床装置の連続試験を段階的に行い,硫酸塩還元細菌,鉄還元細菌,硫黄脱窒細菌,ANAMMOX菌をそれぞれ槽内に保持するための条件を明らかにする.各槽内の微生物を用いて活性試験,次世代シークエンサーを用いた16S rRNA遺伝子の菌叢解析により,微生物の共存関係を明らかにする.さらに,嫌気無酸素生物ろ床装置の後段に好気槽を接続して循環することにより,本プロセス全体を評価する予定である.購入価格に差額が生じたためであり,次年度の実験用消耗品等に振り替える予定.
３次元空間イメージングによる肺静脈心筋自発活動の発生および伝播機序の解明

組織の立体構造を保持した肺静脈標本に高速3次元共焦点顕微鏡法および微小電極法を適用し、細胞から組織レベルまでの総合的視点から、自発活動の発生および伝播機序を解明することを目指した。摘出肺静脈組織標本では自発活動が観察され、その発火頻度はnoradrenalineによって増大し、acetylcholineによって減少した。自発活動が見られない標本にnoradrenalineを作用させると静止膜電位の変化および局所的な細胞内カルシウムオシレーションに続いて自発活動が誘発された。以上の結果より、肺静脈心筋の自発活動は自律神経伝達物質により影響を受けることが明らかになった。肺静脈心筋は電気的に不安定であり自発活動を示すことが知られている。肺静脈での異常な電気的興奮が心臓に伝わると心房細動などの不整脈になることが示されており、肺静脈の性質を明らかにすることは重要である。本研究の目的は、この肺静脈の電気的自発活動に焦点を当て、組織の立体構造を保持した肺静脈標本に高速3次元共焦点顕微鏡法を適用し、細胞から組織レベルまでの総合的視点から、自発活動の発生および伝播機序を解明することである。今年度は肺静脈標本の2次元空間イメージング法を確立し、自発活動を捉えるため、本実験で使用する動物種の検討を行った。マウス肺静脈摘出標本を組織染色した結果、肺静脈自体の厚さが100ミクロン程度、さらに心筋層はおよそ30ミクロン程度であることがわかり、顕微鏡観察に適している可能性が示唆された。マウス肺静脈摘出組織標本の心筋層にガラス微小電極を刺入し、電気活動を記録した。約半分の標本で自発的電気活動が見られ、連続発火、バースト状の間欠的な発火の両方が見られた。発火頻度をnoradrenalineは増大させ、acetylcholineは減少させた。自発的電気活動が見られない標本に1Hzの電気刺激を加えると、活動電位が発生した。肺静脈心筋の静止膜電位は心房筋に比べて浅いものであった。自発的電気活動が見られない標本にnoradrenalineを作用させると静止膜電位の脱分極方向あるいは過分極方向へのシフトが見られ、続いて自発活動が誘発された。この自発活動に対してacetylcholineおよびadenosineは抑制効果を示した。これらの結果から、マウス肺静脈心筋では多様な自発活動が見られること、それが自律神経伝達物質により影響を受けることが明らかになった。今年度はこれまでの研究で顕微鏡観察に適していることを見出したマウス肺静脈摘出組織標本の電気生理学的特徴についてさらなる検討を行った。特にバースト状の間欠的な発火は、多種では報告例の少ないものであり、マウス肺静脈心筋特有の現象である可能性が考えられた。次に肺静脈心筋の自発活動の発生機序を検討するため、細胞膜上に存在するカルシウムイオンチャネル、トランスポーターおよび筋小胞体の阻害薬を処置した。その結果、マウス肺静脈心筋の自発活動はナトリウム・カルシウム交換機構阻害薬のSEA0400およびL型カルシウムチャネル遮断薬のnifedipineによって頻度の低下や停止が観察された。しかし、T型カルシウムチャネル遮断薬R(-)-efonidipineによって頻度の低下や停止は観察されなかった。一方、自発活動はRyanodine受容体遮断薬のRyanodineおよびIP3受容体遮断薬の2-Aminoethoxydiphenyl borateによって自発活動の頻度の低下および停止が観察された。以上の結果より、マウス肺静脈心筋の自発活動には筋小胞体からのカルシウムの放出と細胞膜を介したカルシウム流入が関与していることが示唆された。育児休業(平成27年2月3日から平成28年3月31日まで)に伴い、平成27年度は研究を中断した。本研究は心房細動の発生源として重要視されている肺静脈の電気的自発活動に焦点を当て、組織の立体構造を保持した肺静脈組織標本に高速3次元共焦点顕微鏡を適用し、細胞から組織レベルまでの総合的視点から、自発活動の発生および伝播機序を解明することを目的としている。これまでの研究から、マウス摘出肺静脈心筋標本が顕微鏡観察に適していること、そして肺静脈自発活動に関与するカルシウムチャネルやトランスポーターの存在を明らかにすることができた。今後は高速スキャン顕微鏡の導入によって、ミリ秒単位で変化する心筋細胞の膜電位やカルシウムオシレーションを捉えることを目指す。

本研究の目的は、この肺静脈の電気的自発活動に焦点を当て、組織の立体構造を保持した肺静脈標本に高速3次元共焦点顕微鏡法を適用し、細胞から組織レベルまでの総合的視点から、自発活動の発生および伝播機序を解明することである。今年度は細胞内カルシウム動態や循環器疾患の発症と深く関連すると予想される交感神経伝達物質noradrenalineの肺静脈自発活動の発生機序について検討した。モルモット肺静脈心筋摘出筋標本において、ノルアドレナリンは肺静脈心筋の自発活動を濃度依存的に誘発した。その際、細胞内カルシウム濃度の上昇も観察された。アドレナリンα受容体刺激薬メトキサミンも自発活動を誘発し、その興奮頻度は低値であったが、β受容体刺激薬イソプレナリンの追加により頻度が著明に上昇した。一方、イソプレナリン単独では自発活動は誘発されなかった。ノルアドレナリン誘発肺静脈心筋自発活動に対し各種アドレナリン受容体選択的遮断薬を処置したところ、α1受容体選択的遮断薬プラゾシンおよびβ1受容体選択的遮断薬アテノロールが自発活動を停止、あるいは頻度を減弱させた。α2受容体選択的遮断薬ヨヒンビン、β2受容体選択的遮断薬ICI118551およびβ3受容体選択的遮断薬SR59230は抑制効果を示さなかった。以上の結果から肺静脈心筋において、ノルアドレナリンはアドレナリンα1受容体およびβ1受容体の両方を介し自発活動を発生させることが示唆された。組織の立体構造を保持した肺静脈標本に高速3次元共焦点顕微鏡法および微小電極法を適用し、細胞から組織レベルまでの総合的視点から、自発活動の発生および伝播機序を解明することを目指した。摘出肺静脈組織標本では自発活動が観察され、その発火頻度はnoradrenalineによって増大し、acetylcholineによって減少した。自発活動が見られない標本にnoradrenalineを作用させると静止膜電位の変化および局所的な細胞内カルシウムオシレーションに続いて自発活動が誘発された。以上の結果より、肺静脈心筋の自発活動は自律神経伝達物質により影響を受けることが明らかになった。前年度までに、マウスの肺静脈心筋標本が、顕微鏡観察に適していることを見出した。今年度は、各種阻害薬を投与することによって自発活動に関与するカルシウムイオンチャネルやカルシウムのトランスポーターを明らかにすることができた。今後は、高速スキャン顕微鏡の導入によって、ミリ秒単位で変動する心筋細胞の膜電位やカルシウムオシレーションを捉えることを目指す。1組織レベルでの膜電位やカルシウムオシレーションの伝播を、ミリ秒単位の高速スキャンによって2次元および3次元空間的に捉える。2神経伝達物質・ホルモンの影響により自発活動の発生機序や伝播様式が変化するか否かを、細胞内カルシウム動態や循環器疾患の発症と深く関連すると予想される交感神経伝達物質noradrenaline、副交感神経伝達物質acetylcholine、angiotensin II、aldosteroneなどの影響下で検討を行う。3免疫組織学的手法を加え、自発活動に関与する分子の存在部位や比率を3次元空間的に解析し、自発活動の発生頻度との相関を取る事で、自発活動の易発生部位とその機序を明らかにすることを目指す。循環薬理学組織レベルでの膜電位やカルシウムのオシレーションの伝播を高速スキャンよって2次元および3次元空間的にミリ秒単位で捉えることを目指す。
元素の性質に基づいた合理的設計と偶然を狙った無差別型反応による新しい創薬

有機化合物へフッ素原子を導入するための試薬や方法論は多数開発されているが,現在知られている含フッ素医薬品は,ベンゼン環や複素環などの芳香族上の水素原子をフッ素に置換した例ばかりが目立ち,含フッ素ステロイド医薬品に代表されるような不斉中心にフッ素原子を有する医薬品や農薬品は少ない。これは,不斉中心にフッ素を選択的に導入する実用的な不斉フッ素化試薬やフッ素化反応がないことにも起因する。我々はこの問題に取り組み,これまでの研究例から完全に脱却した,キナアルカロイド/Selectfluor試薬を開発することに成功した。この試薬は,2種の市販試薬を有機溶媒中で混合するだけで簡単に調整出来るキラルフルオロアンモニウム塩である。簡便に反応を実施でき,適応範囲が広く,しかも不斉収率は従来法に比べ格段に高いなど,これまでにはない優れた性能を備えていた。本方法は,試薬という性格上,キナアルカロイドを化学量論量使用する必要がある。我々がこの研究を発表した直後に,Togniらによって初めての触媒的不斉フッ素化反応が報告された。彼らはβ-ケトエステルのフッ素化反応において,チタン/酒石酸を触媒に用いることにより,二点配位型の錯体を経由し,高エナンチオ選択性でフッ素化体が得られることを見出した。選択性については,まだ改善の余地が残されていたが,その後このアプローチは袖岡らのPd錯体を用いる方法により劇的に改善された。鎖状構造から環状構造までバリエーションに富んだβ-ケトエステル類の不斉フッ素化反応を,すべて90%ee以上の選択性で実現した袖岡らの方法は,この分野を一挙に完成にまで近づけた。この研究成果に刺激され,我々は,もう一歩踏み込んだ新しいフッ素化反応が出来ないものかと模索し始めていた。アミノ酸より簡便に合成できるビスオキサゾリン型触媒は,世界中で汎用されるキラル触媒の一つで,その不斉合成への実績は大きい。そこで,この触媒を活用した新しいフッ素化反応の開発を目指すこととした。着手して数ヶ月後,β-ケトエステル類の触媒的不斉フッ素化反応において,金政らの開発したDBFOX触媒とニッケル触媒が最適であることを見っけた。その不斉収率はこれまでに一度も達成されなかったことのなかった99%eeを記録しただけでなく,オキシインドール類の不斉フッ素化まで可能にすることとなった。分子内にトリフルオロメチル基をもつフッ素化合物は,フッ素の特異的性質により生理活性の向上が期待できることから,創薬研究においてトリフルオロメチル化反応の開発は重要な位置を占める。一般にカルボニル化合物のトリフルオロメチル化は,トリフルオロメチルトリメチルシランを用い,触媒としてはフッ素アニオン種を存在させて行うがフルオロトリメチルシランの発生を伴うため触媒サイクルのターンオーバーが絶たれる問題があり不斉反応への展開は難しい。そこで我々はルイス塩基類を触媒としたトリフルオロメチル化反応の開発に着手した。2-ナフトアルデヒドのトリフルオロメチル化に対してルイス塩基,溶媒等の検討を行ったところトリ-tert-ブチルホスフィンが有効な触媒となることを見出した。

即ち,DMF中で触媒量のトリ-tert-ブチルホスフィン存在下,トリフルオロメチル化反応は様々なカルボニル化合物に対し高い反応性を示しトリフルオロメチル化体を高収率で得られた。次にルイス酸を用いた方法の開発研究に着手した。先に述べたようにトリフルオロメチル基を直接導入する方法はフッ素アニオンを触媒とする求核的トリフルオロメチル化反応が数多くある一方で,ルイス酸を用いた報告例はこれまでにほとんどない。そこで様々なルイス酸とトリフルオロメチルトリメチルシランを用い,2-ナフトアルデヒドに対するトリフルオロメチル化反応を検討した。その結果四フッ化チタンでは配位性の非プロトン溶媒であるDMF中で,また,酢酸銅ではリガンドに1,2-bis(diphenylphosphino)ethaneを用いることでトルエン中0°Cでも反応が進行することを見出し,ルイス酸を触媒とした触媒的トリフルオロメチル化反応の開発に成功した。含フッ素化合物の合理的設計は,医薬品や農薬の開発において重要である。しかし,フッ素の有する特異的な性質のため,開発が遅れていた。特にエナンチオ選択的モノフルオロメチル化はまったく報告例がなく,未開拓の分野であった。我々はこの課題を克服するため,フッ素という元素の特異な性質を利用したモノフルオロメチル化試薬の開発が本文野での突破口となると考え,モノフルオロメチル化試薬,フルオロビス(フェニルスルホニル)メタンを創出した。この試薬はフェニルスルホニル基の除去が可能なため,調整が困難なモノフルオロメチルアニオン等価体として使用でき,様々な反応に適応可能である。モノフルオロメチル化試薬は,ビス(フェニルスルホニル)メタンからセレクトフロアーをフッ素化試薬に用いて,簡便に合成できる。このモノフルオロメチル化試薬をパラジウム触媒によるアリル位の置換反応において使用した。反応条件を検討した結果,アリルアセテートに対し,不斉触媒として(S)-PHOX(5mol%)と[Pd(C3H5)Cl]2(2.5mol%)を用い,塩基として炭酸セシウムを使用して,塩化メチレン中で反応させると,対応するフッ素化体が高収率,高エナンチオ選択的に得られることがわかった。モノフルオロメチル化試薬の代わりに,フッ素を持たないビス(フェニルスルホニル)メタンを用いると,反応はほとんど進行しないことからも,我々の新型試薬の有用性は明白である。次に本法を創薬分野への活用を展開した。イブプロフェンは広く市販されている医薬品であり,近年では新たな薬理活性も見つかっており,新型誘導体の開発が注目されている。先の反応を鍵反応に用い,先に得られたフッ素化体をオゾン酸化,それに続く還元反応,マグネシウムを用いた脱フェニルスルホニル化反応,Jones酸化の4工程を経て,新規化合物である,フルオロメチルイブプロフェンの両エナンチオマーの合成を達成した。さらにフルオロメチルナプロキセン,エイズ治療薬であるフルオロカルバリボフラノース,フルオロアバカビルの合成も達成した。
人工エキソ／エンドサイトーシス系の界面解析と標的特異的分泌／取り込み系への展開

私たちは、巨大リポソーム内に微小リポソームを含有させ、GUV内にCa2+を流入させることで、微小リポソーム内の物質を外部に分泌できる人工エキソサイトーシス系を構築した。本研究では、構築した人工系を用いて、巨大リポソーム内外の浸透圧差や、リポソームの脂質組成がエキソサイトーシス活性に及ぼす影響を明らかにした。またアミロイドβに対して特異的な人工エキソサイトーシス系の開発に向けて、アミロイドβ刺激によって巨大リポソーム内部にCa2+流入が引き起こされることを確認した。これらの研究成果は、アミロイドβを認識して、これに対してアミロイドβの分解酵素を分泌・分解する系の開発に繋がるものと考えられる。我々は、細胞サイズの巨大リポソーム内に微小リポソームを含有させ、Caイオンを流入させることで微小リポソーム内の物質を外部に分泌できる人工エキソサイトーシス系を構築した。また同様に、巨大リポソームを用いて外部のナノ粒子を内部に取り込む人工エンドサイトーシス系の構築にも成功した。本研究では、これらの人工系を用いて、脂質組成や系の物理化学的性質とエキソ/エンドサイトーシス活性との相関を明らかにして、より高効率な系へと改良する。さらに特定の環境下で分泌あるいは特定の標的を取り込むエキソ/エンドサイトーシス系へと発展させることを目的とする。初年度は、構築した人工系の脂質組成やGUV内外の浸透圧差とエキソサイトーシス活性との相関について検討を行った。GUV内外の浸透圧比(GUV外液の浸透圧/GUV内液の浸透圧)として、2.8、3.2、3.6、4.0で検討を行ったところ、4.0の時に最も融合効率が高く、2.8と3.2の時には膜融合が引き起こされなかった。次に、巨大リポソーム側と微小リポソーム側で、どちらのホスファチジルセリン(PS)がエキソサイトーシス活性に重要であるか検討を行った。膜の成分としてPSを含む巨大リポソームを用いた時には、微小リポソーム側のPSの有無に関わらず、エキソサイトーシス様の膜融合が観察された。その一方で、膜の成分としてPSを含まない巨大リポソームを用いた時には観察されなかった。これらの結果は、エキソサイトーシス様の膜融合において、巨大リポソーム側のPSが重要な役割を果たしていることを示唆するものである。これらの結果は、エキソサイトーシスの分子機構解明に寄与するものと考えられる。今後は、標的特異的な人工エキソ/エンドサイトーシス系の開発に取り組む予定である。申請者はこれまでに、細胞サイズの巨大リポソーム内に微小リポソームを内包させ、外液からCaイオンを流入させることで、微小リポソーム内の物質を外部に分泌できる人工エキソサイトーシス系を構築した。本研究では、これらの人工系を用いて、脂質組成や系の物理化学的性質とエキソ/エンドサイトーシス活性との相関を明らかにして、さらに特定の標的を取り込むエキソ/エンドサイトーシス系へと発展させることを目的とする。構築した人工エキソサイトーシス系を用いて、GUV内外の浸透圧差とエキソサイトーシス活性との相関について検討を行った。その結果、GUV内外の浸透圧比(GUV外液の浸透圧/GUV内液の浸透圧)が4.0の時に最もエキソサイトーシス活性が高いことが明らかとなった。その結果、巨大リポソーム側のPSが重要な役割を果たしていることが示唆された。上述の結果をふまえて、標的特異的な人工エキソサイトーシス系の構築を試みた。申請者らが開発した人工エキソサイトーシス系は、外液からCaイオンを流入させることでエキソサイトーシス活性を示す。アミロイドβは、Ca透過性のチャネルを形成することが報告されている。そこでGUVにCa感受性の蛍光色素であるfluo-3を内包させて、アミロイドβ刺激を行うことで、GUV内にCaイオンを流入させることができるかどうか検討を行った。その結果、10uMのアミロイドβで刺激を行うことで、GUV内にCaイオンが流入することを確認できた。今後は、SUVを内包するGUVに対してアミロイドβ刺激を行うことで、エキソサイトーシス活性を確認する予定である。

生物物理学脂質組成や系の物理化学的な性質とエキソサイトーシス活性との相関については、予定通り検討を行うことができた。その一方で、脂質組成や系の性質とエンドサイトーシス活性との相関については、検討を行うことができなかった。したがって、現在までの達成度としては、やや遅れていると判断した。平成26年度は、これまでに構築した人工エンドサイトーシス系を用いて、脂質組成や系の物理化学的性質とエンドサイトーシス活性との相関を明らかにする。また、人工エキソ/エンドサイトーシス系に特異的な分子認識能を付加して、特定の環境下で分泌、あるいは特定の標的を取り込む系へと発展させる予定である。具体的には、アルツハイマー症の原因となるアミロイドβを認識して分泌・分解するエキソサイトーシス系の開発、および動脈硬化の原因となるコレステロール複合体を取り込むエンドサイトーシス系の開発を行う予定である。
胚性幹細胞分化系におけるジーントラップ法を用いた血液系細胞分化関連遺伝子の単離

ジーントラップに用いるトラップベクターはEn-2イントロンの下流にスプライシングの受容シグナル、翻訳活性を上げるためのIRESシグナル、およびLacZをマーカー遺伝子として配置、下流にはアクチンプロモーター下にネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、その有効性は確認済みである。このベクターをES細胞株であるD3およびE14-1細胞に導入して数千個のES細胞クローンを樹立した。これらのクローンをプールしてop/opマウス由来の骨髄繊維芽細胞株OP-9上で培養し、8日目にX-gal染色を行う方法でスクリーニングした。LacZを発現する陽性細胞は非常に少なく同定は困難であったが、陽性と思われる細胞を選別後、cDNAライブラリーを作成し、クローンを同定した。10種類あまりのcDNAの塩基配列を決定後、未知と思われるものをプローブにして成熟マウスの各組織での発現をノザン法にて解析した。多くはubiquitousな発現が見られたが、クローンによりある程度の組織特異性はみられるものの、造血系組織で特異的に発現しているクローンは得られなかった。ES細胞はin vitroで種々な組織・細胞に分化しうるがheterogeneousであり、ジーントラップで血球系細胞特異的な発現が見られるクローンを同定するには特定の系列の細胞に分化する系を確立する、あるいはFACSを用いて特定のlineageの細胞をソートしてくる必要があると考えられ、現在も両方面からの系の確立を試みている。将来的にはマウス以外のES細胞を用いることも視野に入れて研究を続ける。造血系細胞分化にはサイトカイン、増殖因子やその受容体、接着分子や転写因子など多くの分子が深く関わっている。種々な系を用いてその分化過程が解析されているが、lineageコミットメントや幹細胞の自己増殖に関する因子等、不明な点も多い。本研究ではジーントラップ法を組み合わせ、in vitro、in vivoにおいて造血系細胞に分化することが知られているES細胞を用いて、造血系細胞への分化増殖に関連する遺伝子を単離、解析することを目的とする。本年度は構築されたジーントラップベクターを用いて基礎的な条件を検討した。ジーントラップベクターは、En-2イントロンの下流にスプライシング受容シグナル及びIRESシグナル断片を接続し、第2cis-tronであるマーカー遺伝子を効率よく発現させるという構築である。これにより、トラップ後その遺伝子上流のプロモーターの働きでマーカー遺伝子が転写、翻訳されることになり、トラップ後ポリAシグナルをその3'下流に持つ転写活性部位に入ったベクターのみがネオマイシン耐性を獲得することが予想される。実際にb-galをマーカーに、レチノイン酸に反応するいくつかのES細胞クローンを得、このベクターがワークすることが確認できた。しかし、ES細胞の分化はheterogeneousで分化した細胞の一部でマーカー遺伝子が発現したとしてもその細胞がどういう分化段階の細胞であるのかの同定は非常に困難である。実際にいくつかのin vitroでのES細胞文化系を用いて検討したがマーカー遺伝子の発現する陽性細胞の頻度はきわめて低かった。従ってES細胞をある特定のlineageに分化させる方向、あるいはFACSなどを用いて特定の分化段階の細胞をsortingする必要があると思われ、今後これらの点について検討が必要である。このベクターをES細胞株であるD3およひE14-1細胞に導入して数千個のES細胞クローンを樹立した。

多くはubiquitousな発現が見られたが、クローンによりある程度の組織特異性はみられるものの、造血系組織で特異的に発現しているクローンは得られなかった。ES細胞はin vitroで種々な組織・細胞に分化しうるがheterogenousであり、ジーントラップで血球系細胞特異的な発現が見られるクローンを同定するには特定の系列の細胞に分化する系を確立する、あるいはFACSを用いて特定のlineageの細胞をソートしてくる必要があると考えられ、現在も両方面からの系の確立を試みている。将来的にはマウス以外のES細胞を用いることも視野に入れて研究を続ける。