hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In situ ナノチューブ生成・観測用の電気炉レーザー蒸発質量分析装置の開発

本実験で観測対象にする"短い"SWNTsは炭素原子数が千1万前後(質量数10万程度まで)のチューブである。これらのサイズ領域(高質量域)のSWNTsを質量分析装置で観測するために、本装置では以下の工夫がなされている:(i)30万程度の質量数の物質を効率良く、脱離・イオン化することが知られているMALDIを用いる、(ii)高質量のイオンを高分解能で分離・検出できる、直線型イオン反射鏡を内蔵した飛行時間型(TOF)質量分析計を用いる、(iii)質量数10万程度までのイオンを効率良く検出できる後段加速を内蔵したタンデム・チャンネルプレートを検出器に用いる。本研究では、SWNTsの生成のための"高温電気炉レーザー蒸発装置"と、生成したSWNTsのサイズ分布をin situで検出・観測するための"高質量TOF質量分析計"を組み合わせた新しいタイプの「In situナノチューブ生成・観測用の電気炉レーザー蒸発・質量分析装置」の設計・開発を行った。また、カーボンナノチューブ研究の急激な進展に対処するために、専門のメーカー(真空冶金株式会社)と協力して、本装置の実用化に向けての開発を推進した。本高温電気炉レーザー蒸発装置部は、(i)1,200°Cまで昇温可能な特殊な電気炉を用いた、(ii)高精度のマスフロー制御装置でバッファーガス(通常、アルゴン)の流速を精密に制御する、(iii)新たに金属を内包したSWNTs(ナノワイヤ)の生成を行うために、Fe(Co,Ni)含有の炭素ロッドと純金属ターゲットロッドの二つを同時にレーザー蒸発させる、(iv)生成したSWNTsを質量分析装置部でin situに観測するためのトランスポーターを内蔵する、などの大きな特徴を有する。また、高質量域質量分析装置部はMALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)リフレクトロン飛行時間型質量分析計である。本研究により、ナノチューブの生成には、触媒金属・炭素の前駆体が存在し、これらはアルゴン雰囲気かでは、秒オーダーの寿命をもつことが世界に先駆けて、初めて実験的に確認された。
経口投与可能な粘膜免疫誘導型エイズDNAワクチン開発の基礎研究

経口感染するE型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス用中空粒子(VLP)をエイズDNAワクチンのデリバリーに用いて、経口投与可能な粘膜免疫誘導型エイズDNAワクチンの開発を目指した。その結果、HEV-VLPの表面に別の抗原エピトープを発現させることで、これに対する免疫応答も同時に粘膜面に誘導できることが明らかとなった。多くの病原体は粘膜面を介して感染することから、粘膜免疫を強く誘導するワクチンの開発が望まれている。特にウイルス排除に重要な細胞障害性リンパ球の誘導に優れたDNAワクチンを経口的に粘膜面に送り込む手法はいまだ確立されていない。本研究では、粘膜感染を起こすエイズウイルス(HTV-1)に対するワクチン開発の基礎研究として、経口感染するE型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス用中空粒子(VLP)を用いて、経口投与により粘膜免疫を誘導するエイズDNAワクチンの開発を行った。まず、細胞性免疫を誘導するHIV-1Gag DNAワクチンの調整とその免疫誘導能の評価系を確立した。免疫マウスの脾臓細胞を採取し,Gag抗原特異的なT細胞増殖試験、抗原特異的なサイトカイン産生細胞数の測定を行い,DNAワクチンの免疫誘導能について検討した。次に、DNAワクチンを経口的に粘膜に送り込むための立体構造物としてHEVのVLPを調整した。VLPにはHIV-1Envの抗原エピトープを表出するキメラVLPを用い、VLP表面のEnvとVLP内部に封入したGag DNAワクチンによりEnv・Gag両者の免疫応答を誘導できるワクチンを調整した。このワクチンをマウスに2週間隔で3回投与したところ、腸間膜リンパ節、バイエル板などの粘膜関連リンパ組織および脾臓においてEnvおよびGag特異的な免疫応答の誘導が認められた。一方、Gag DNAワクチンを通常のワクチン投与ルートである筋肉内接種した場合では脾臓のみで免疫応答が認められた。今回の研究により、HEV-VLPに抗原エピトープを表出させ、さらにDNAワクチンを封入することで、通常では誘導困難な粘膜面の細胞性免疫応答を経口的に誘導できる事が明らかとなった。この手法を用いることで粘膜感染に対するワクチン開発や粘膜面への遺伝子治療の可能性が示された。実験動物学ワクチン学
感情経験と自己-「合理性」対「感情性」という矛盾した構造が自己構成に与える影響

本年度の研究実績は、看護職の「感情労働」に関する実証研究から、感情経験と自己像構成のあり方との関係性をさらに考察し、それを纏め上げたものと、現代社会分析のために感情社会学の新たな展開を目指した理論的考察とに大別出来る。前者については、従来の感情労働研究における「感情管理」を強制される事に伴う自己像構成の困難というテーゼに関して反駁を試みた。その中では、看護職が患者との関わりの中で、「感情管理」を支える感情規則を読み替えていく技法が明らかにされた。またさらに、こうした考察を通して、既存の「感情管理」の方法の脱慣習化を図っていく方法が明らかにされた。この点については、拙稿「感情規則の相対化のプロセス」、並びに論文「感情経験と自己」に纏められている。また、後者についてはエリアスの文明化論や、その影響を受けたインフォーマル学派が示す、現代社会における「感情管理化」に関する楽観論と、ホクシールドに代表される「感情管理化」に関する疎外論との対置を通した理論的考察を試みた。その中では、文明化・インフォーマル化がもたらす「感情管理」の進展とその高度化こそが、「感情管理化」の進展に伴う感情経験からの自己疎外をもたらす、という関連性があることから、両者の共犯関係こそが考察されるべきであることが示された。さらに、文明化・インフォーマル化の進展に伴う、文化産業における感情経験の合理化・商品化の進展が、個々人の感情経験を馴致する中で、既存の「感情管理」への同調要因となることが示された。この点についての考察は、拙稿「感情管理化社会の様態」に纏められている。
テーラーメイド医療を目指した生体吸収性複合材料の材料設計法の開発

疾患の部位・程度に応じたテイラーメイド医療を実現するため,ポリL乳酸(PLA)とリン酸三カルシウムからなる複合材料に対して,配合比が力学的特性と分解特性に与える影響を実験的および解析的側面から検討した.力学的特性についてはマイクロメカニックスにより予測する手法を開発した.分解特性として,分子量変化を自己触媒効果を用いて解析的に予測する手法を開発した.分解に伴う力学的特性の変化については,分解はTCP/PLLA界面領域で優先して発生することが確認されたことから,界面はく離を損傷変数として導入した損傷力学解析により予測可能となった.また界面処理により複合材料を高強度化する手法を開発した.疾患の部位・程度に応じたテイラーメイド医療を実現するため,ポリL乳酸(PLA)とリン酸三カルシウムからなる複合材料に対して,配合比が力学的特性と分解特性に与える影響を実験的および解析的側面から検討した.力学的特性についてはマイクロメカニックスにより予測する手法を開発した.分解特性として,分子量変化を自己触媒効果を用いて解析的に予測する手法を開発した.分解に伴う力学的特性の変化については,分解はTCP/PLLA界面領域で優先して発生することが確認されたことから,界面はく離を損傷変数として導入した損傷力学解析により予測可能となった.また界面処理により複合材料を高強度化する手法を開発した.生体吸収性プラスチック複合材料を骨治療材料としてより広範囲に適用するため,強度・剛性の向上か不可欠であり,本年度はフィラー(リン酸三カルシウム,TCP)とマトリックス(ポリL乳酸,PLLA)の界面強度向上及び押出鍛造成形による分子配向の制御を試みた.界面強度向上のため,乳酸モノマー水溶液を用いてTCP表面を処理し,その後熱混練と溶液分散法によるフィラーの分散を行った.乳酸モノマー濃度がある程度までは強度が向上し,その後は劇的に低下することが明らかとなり,これはTCPと結合していない乳酸モノマーがマトリックスであるPLLAと結合するためであることを明らかとした.また,界面処理を施していないTCPについては熱混練よりも溶液分散により分散性がよくなるが,界面処理を施すと,撹拌中にTCP同士が凝集してしまうことも明らかとなった.押出延伸法については新たに押出部のテーパー角度を変更することにより,押出時に与えるひずみ量を調整することを可能としている一軸押出用の治具を設計・作製し,これを用いてガラス転移温度以上の温度で行った.潤滑することなく押出加工が可能であったのは,100°C以上の場合であったので,押出時の分子配向の緩和も考慮し,100°Cと120°Cにてテーパー角度及び保持時間の影響を調査した.120°Cで成形したスクリューは緩和と結晶化による脆化のため,100°Cで成形したものよりも引抜・せん断・ねじり弓強度が低かった.100°Cで成形したものに関しては引抜強度は強ひずみ加工したものが高かったが,せん断・ねじり強度については強ひずみ加工したもののほうが低かった.これは分子の配向方向に依存していると考えられ,用途に応じた高次構造制御をする必要性が示唆された.また,同時に,ゲル浸透クロマトグラフィー装置により,加水分解を受けたPLLAの分子量変化についても先行して調査を開始した.PLLA単体では結晶化した試験片が,また複合材料ではフィラー含有率の高いもののほうが分子量低下が早いことが実験的に明らかとなった.生体吸収性プラスチック複合材料を骨治療材料としてより広範囲に適用するため,強度・剛性の向上が不可欠であり,昨年まではフィラー(リン酸三カルシウム,TCP)とマトリックス(ポリL乳酸,PLLA)間の界面強度向上及び押出鍛造成形による分子配向の制御を試みている.本年度は界面処理により界面強度が向上するメカニズムを明らかにするため,実際に界面上に付着している処理剤であるL乳酸の量を熱重量測定およびpH測定により測定した.さらに,TCP粒子表面のカルシウム原子に付着可能なL乳酸の量を分子軌道計算により求めた.その結果,過度にL乳酸処理をすると,TCP表面に吸着していないL乳酸と母材であるPLLAが結合し,結果的に界面強度が低下することを解析的に明らかとした.また,界面処理に用いたL乳酸の量の最適値は実験結果と解析結果において定量的に良い一致を示した.分子配向の制御については,押出延伸を施した後にねじり延伸を施すことにより,PLLA円筒試験片に45°方向に傾いた分子配向を付与することに成功している.このねじり延伸を施したのちに作製したPLLAスクリューにおいては延伸方向と同方向へのねじり強度が,ねじり延伸を施さないものと比較して,約1.5倍となることが明らかとなった.ただし,ねじり延伸方向と逆方向のねじりに対しては強度が80%程度となってしまい,きわめて顕著な異方性を付与することが可能となった.また同時に,ゲル浸透クロマトグラフィー装置により,加水分解を受けたPLLAの分子量変化についても調査した.PLLA単体では結晶化した試験片が,また複合材料ではフィラー含有率の高いもののほうが分子量低下が早いことが昨年度の結果から明らかとなっているが,本現象を解析的に明らかとするため,自己触媒効果を導入した分解予測式とFickの拡散則を用いて,水の拡散に伴い変化する試験片内における水分濃度の変化を考慮した分解予測式を構築してきている.

その結果,PLLAの結晶・非晶領域およびTCP領域において拡散係数および水分飽和濃度が異なることを考慮しても説明がつかず,PLLA/TCP界面領域を通った水分の拡散を考慮する必要性が示唆された.本年度は,生体吸収性プラスチック及び複合材料の高強度化のため,分子配向制御と強化材であるリン酸三カルシウム(TCP)の表面改質に関して調査を行った.分子配向制御に関しては,本材料を用いた骨接合材料を産業化した際に低コストで作製することを考慮し,連続成形が可能な押出法を採用している.これまでの研究で延伸比が2以上の場合,せん断・ねじり強度に及ぼす延伸比の影響が少ないことがわかっている.この現象を考察するため,試料の配向関数を一回全反射フーリエ変換赤外線分光法を用いて算出した.この結果,配向関数の傾向は延伸比と相関があり,延伸比を大きくしても十分な延伸が行われていないことが示唆された.このため,有限要素解析により,押出延伸中の変形状態を検討することとした.このために,高温における圧縮試験を行い,使用しているポリL乳酸(PLLA)の真応力ー真ひずみ線図を温度の関数として取得し,材料物性として用いた.結果として,押出延伸中の分子の配向は試料の外表面近傍のみにおいて行われていることが明らかとなった.TCPの表面処理によりTCP/PLLA複合材料の強度を向上させることが可能であることは前年度までの研究で明らかとなってきているが,その向上のメカニズムが未解明であった.このため,まず,もっとも脆弱であるTCP/PLLA界面がいつ破壊しているのかを明らかにするため,アコースティックエミッション測定を行った.得られた実験結果から,界面相破壊と試験片の最終破壊には相関があることが確認され,界面破壊が複合材料の破壊の起点となっていることが明らかとなった.界面破壊をさらに考察するため,有限要素法計算によりTCP周りでの応力分布を計算した.この結果,界面相厚さがある程度までであれば,複合材料としての弾性率を損なうことなく,界面における応力を低下させることが可能であることが明らかとなった.実際に医療用接合材料として用いられるバルク状リン酸三カルシウム(TCP)/ポリL乳酸(PLLA)複合材料の分解を予測するため,まず,実験結果に基づき,吸水量を予測するモデルを構築した.具体的にはPLLA単体の吸水量の結果を用い,任意のTCP含有率を有する複合材料のPLLAとTCPの吸水量を分離して計算した.その結果,吸水初期において,複合材料の吸水量はPLLA及びTCP単体の吸水量とTCP含有率にのみ依存するが,吸水後期においては,特にTCP含有率の高い複合材料において,界面における吸水量が無視できなくなることが明らかとなった.以上の結果より,実際の複合材料中の吸水量の差異が分解に及ぼす影響は大きいことが予想されたことから,分解の数値モデルとして,複合材料をTCP・PLLA・それらの界面からなる3相材と仮定し,これまでは一定と仮定することの多かった,それぞれの相の吸水量を考慮したモデルを構築した.本予測モデルによる解析結果と実験結果を比較したところ良好な一致を示した.本モデルは界面領域での加速分解を適切に表すことができ,さらにモデル中の界面領域の厚さはTCP含有率によらない材料定数であることが明らかとなった.力学的特性の予測として,分解に伴う,TCP/PLLA界面での応力伝達の低下を解析的に予測するため,これまで開発してきたマイクロダメージメカニックスを用いて分解後の複合材料の応力-ひずみ線図のフィッティングを行った.
東アジアにおける陸域生態系炭素循環シミュレーションモデルのデータ同化手法の開発

東アジアの炭素循環を陸域生態系モデルによってより現実に近く再現するため、パラメータ調整の際に観測データを取り込むデータ同化手法を利用し、実際に1979-2003年の陸域炭素循環を推定した。得られた炭素フラックスは、妥当な分布を示し、さらに、CO_2上昇による施肥効果を考慮した場合、しなかった場合よりも、誤差が小さく、データ同化によって、東アジア地域で、モデルの推定精度が向上する可能性が示唆された。1)データ同化手法の開発において,対象としている東アジア生態系の基礎的な情報を得るために,すでに論文や学会発表要旨として出版さた渦相関法による炭素循環研究の成果をレビューし,初歩的な統合解析を行った。その結果,年間べスにおいて,ほとんどのサイトで陸域生態系側の炭素吸収を示しており,その大きさは年平均気温。降水量こよって制御されていることを明らカにした。2)本研究で利用する東アジアの炭素動態のデータを得るために,東アジアの3大観測ネットワークであるJapanFlux(日本),Koflux(韓国),ChinaFLUX(中国)の責任研究者が集まる会合に出席し,デ-タの提供を受ける可能性について調査した。その結果,日本が管理するサイトを中心とした10-20箇所の観測サイトからデ-タの提供を受けることが可能であるとの判断し,今後,具体的な働きかけを行う予定を立てた。3)データ同化手法の開発を行うに当たって,当該技術で世界をリードしている英国ブリストル大学Prof.ICPrenticeの研究室を訪問し,本研究について議論を行った。その結果,当初予定していたさまざまな同化手法のうち,MCMC法とアジョイント法を利用して研究を進めることが妥当であるとの結論に達した,さらに今後,本課題たついて,共同研究を行うことにした。4)2)において,共同研究で利用するアジョイント法の数値計算プログラムを編集し、操作方法の確立や,適用可能性の検討を行い,本研究の対象としている生態系炭素循環モデルSim-CYCLEへの適用の準備を行った。1)データ同化手法の開発において、対象としている東アジア生態系の基礎的な情報を得るために、すでに論文や学会発表要旨として出版された渦相関法による炭素循環研究の成果をレビューし、初歩的な統合解析を行った。その結果、年間ベースにおいて、ほとんどのサイトで陸域生態系側の炭素吸収を示しており、その大きさは年平均気温、光合成有効放射、降水量によって制御されていることを明らかにし、投稿論文として発表した。2)データ同化手法の開発において、協力関係にある英国ブリストル大学のProf.IC Prenticeの研究室との議論を行った。その結果、本研究において、同研究室が開発しているアジョイント法を利用した炭素循環におけるデータ同化システム(CCDAS)を利用することを決定した。しかしながら、それらは、地上観測点のCO_2濃度データを同化するシステムであるため、本研究の目的を達成するために、それらを地表面のフラックスデータを同化するように変更することが必要とされた。3)2)において、本課題では、着実な進捗を得るために、まず全球を対象とした粗い地表解像度による実行を行うべく、コードの変更を開始した。その初期段階として、炭素循環における陸域生態系モデルの働きを知るために、1979-2003年を対象とした全球スケールのCO_2施肥効果を、CCDASを用いて調べた。しかしながら一方で、本課題策定時の想定よりもコードが複雑であり、多くの時間をコードの改良と試行に費やしたため、東アジアに特化した同化手法の完成には至らなかった。そのため、本課題以降も継続して開発を行う予定である。
ストレス環境下でも翻訳されるmRNAのゲノムスケールでの探索

植物が環境ストレス(熱、塩、乾燥等)にさらされると、mRNAからの翻訳が抑制される。その機構についてはまだ不明な点が多いが、環境ストレスにより、すべてのmRNAからの翻訳が抑制されるわけではなく、翻訳が維持される、つまり選択的に翻訳されるmRNAも存在する。しかし、動植物を問わず、制御を規定する5'UTR内の因子を含め、制御機構に関する知見は乏しいのが現状である。そこで、本研究は、シロイヌナズナ培養細胞を用いてストレス環境下(熱および塩ストレス)において選択的に翻訳されるmRNAに関して、ポリソームプロファイルおよびマイクロアレイを用いてゲノムスケールで解析するとともに、翻訳状態の変化を2種のストレス間で比較・検証した。塩及び塩のいずれのストレス下においても、全体的にはポリソーム形成が阻害されるが、維持されるmRNA種から極端に阻害されるmRNA種まで様々であった。また、極端に翻訳が阻害されるあるいは維持される傾向にある機能集団の存在から、翻訳段階の制御が、植物のストレスに応答した遺伝子発現制御過程において重要な意味を持って存在している可能性が示唆された。加えて、植物のストレスに応答した翻訳制御には、ストレス間で共通した大部分のmRNAに対する制御とストレス特異的な制御が存在している可能性も示された。植物が環境ストレスに応答して遺伝子発現を制御する過程の中で、翻訳段階においても幅広いmRNAに対するダイナミックな制御がなされており、そうした制御は、これまで考えられてきた以上に、植物のストレス応答において重要な役割を担っていると考えられる。本研究は、ストレス環境下において選択的に翻訳される血RNAを、マイクロアレイを用いてゲノムスケールで探索し、共通性という観点から制御を規定するコンセンサス配列を同定することを目的としている。1.ポリソームプロファイル解析とDNAマイクロアレイ解析(1)ストレス条件の検討(ポリソームプロファイル解析)既に決定している熱ストレス条件に加え、塩・栄養飢餓ストレスに関してもシロイヌナズナ培養細胞(T87株)を様々なストレス条件にさらし、ポリソームプロファィル解析を行った。ハウスキーピング遺伝子mRNAの翻訳抑制(非ポリソーム画分への移行)状態を各画分から調製したmRNAを用いたRT-PCRによってモニターすることにより、最適なストレス条件(塩;NaCl 200mM 30min,飢餓;ショ糖を除いて5時間)を決定した。(2)DNAマイクロアレイ解析(熱ストレス)非ストレスおよび熱ストレス条件からポリソーム分画を行い、それぞれポリソームおよび非ポリソーム画分から独立に計4種類のmRNAを調製した。これらをセットで蛍光ラベルし、シロイヌナズナDNAマイクロアレイを用いてアレイ解析を行い、ポリソームと非ポリソーム画分に存在するmRNAの量比を、ストレスを与えたことによる変化という観点から定量し、複数の候補mRNAを得た。2.候補mRNAのストレスにおける翻訳状態候補mRNAの中には、熱ストレス条件下でも翻訳が抑制されないHsp90 mRNAに加えて、アルコール脱水素酵素をコードするADH mRNAがあった。予備実験のレベルであるが、塩ストレス時のこれらmRNAの翻訳状態を各画分から調製したmRNAを用いたRT-PCRによってモニターしたところ、これらmRNAは熱に加え塩ストレス条件下でも翻訳は抑制されなかった。本研究は、ストレス環境下において選択的に翻訳されるmRNAを、マイクロアレイを用いてゲノムスケールで探索し、ストレス間での挙動を比較するとともに、共通性という観点から制御を規定するコンセンサス配列を同定することを目的としている。1.ポリソームプロファイル解析とDNAマイクロアレイ解析昨年度決定した塩ストレス条件に基づき、非ストレスおよび塩ストレス条件からポリソーム分画を行い、それぞれポリソームおよび非ポリソーム画分から独立に計4種類のmRNAを調製した。

2.候補mRNAのストレスにおける翻訳状態複数の候補mRNAについて、ストレス時の翻訳状態を各画分から調製したmRNAを用いたRT-PCRによってモニターしたところ、アレイの結果を完全に反映した。3.ストレス間での共通性と特殊昨年度実施した熱ストレスでのアレイ解析の結果と塩ストレスでの結果を比較したところ、全体としての挙動は両ストレス間で非常に類似していたが、一部遺伝子については、ストレス間で挙動が異なった。このことは、ストレス下での翻訳が共通の制御で行われているとともに、ストレス特異的な制御も存在することを示唆している。今後、in silico解析等を通じて、制御を規定するコンセンサス配列が同定されることが期待される。
虚血誘導性神経幹細胞を用いた共培養法の検討

方法;再現性の良いCB17マウスの脳梗塞モデル(J Exp Stroke Transl Med 2010;3:28)を用い、脳梗塞後の組織からiNSPCを抽出し、(1)ニューロスフィア法で浮遊系培養を、(2)Poly-D-Lysineコーティングで接着培養を行い、細胞増殖を検討した。さらに接着系培養では血管内皮細胞との共培養を行った。iNSPCは高濃度の血清存在下ではGFAP陽性のグリア細胞に分化するため、また共培養細胞によっては血清非存在下では生存できないため、iNSPCが幹細胞としての特性を保ち、かつ神経細胞に分化できる至適な培養液の条件を探索する目的で、成長因子や血清の濃度を検討した。さらに、培養神経幹細胞の幹細胞関連遺伝子発現をGene tipやPCR、免疫組織化学、Western blotなどにより検討を行った。結果:虚血負荷をかけた大脳皮質の梗塞組織を浮遊系、接着系に培養したところ、浮遊系に比べ接着系のほうがiNSPCの増殖が見られた。さらにフィーダー細胞との共培養では、血管内皮細胞と共培養により増殖が確認されたが、共培養の条件としては、2%血清添加がiNSPCと血管内皮細胞相方の維持に至適条件と考えられた。共培養下でのiNSPCと単独培養下での神経幹細胞の発現蛋白をGene tipとPCRで観察したが、血管内皮細胞との共培養により、iNSPCの接着分子が高発現していることを確認した。考察:本実験により、虚血負荷による神経幹細胞の増殖・維持に血管内皮細胞との共培養が有効で、その増殖には接着系分子が関与することが示唆された。今後、血管内皮細胞によるiNSPC増殖に関与する因子の同定を行いたいと考えている。
陰陽ガウス分布に基づくパターン認識手法の開発と大規模データへの適用

本課題では,あるサンプル集合(陽サンプル)と,その原点対象となる鏡像サンプル(陰サンプル)を一つのガウス分布で表現する分布を提案し,これらから導かれる統計的パターン認識手法を開発し,これまで発見的に拡張されてきた相互部分空間法や複数サンプルの同時クラス分類を効率的に行う手法を統計的に導くことを可能とした.これらの手法を画像認識,音声認識,動画像認識などの大規模データに適用して,その有効性を確認した.平成25年度では,陰陽ガウス分布を複合決定問題へ適用することで,連続して観測された複数のサンプルに対するクラスラベルを,統計的独立性を仮定しないで決定するアルゴリズムの開発に関する研究を行う.複合決定問題とは,複数のサンプルを観測した後,それぞれのクラスラベルを同時に決定する問題である.このような問題は,ビデオを構成する複数のショットのクラスラベル推定等に応用可能であり,大規模データ解析には必要な要素技術である.平成25年度では,この問題に対して確率密度関数として陰陽ガウス分布を用いることにより,圧縮を伴った複数サンプルの同時クラス分類を実現するためのアルゴリズムを開発した.具体的には,統計的独立性を仮定し,さらに確率密度関数として陰陽ガウス分布を用いることで,少ない記憶容量と計算量で同じクラスに由来する複数の未知サンプルを分類したり,異なる複数の特徴量に基づいて未知サンプルを分類したりするための認識アルゴリズムを導き,TRECVIDや位置推定問題のような公開ベンチマークデータセットに対して分類実験を行い,従来手法よりも高い識別性能を達成できることをしめした.本課題では,あるサンプル集合(陽サンプル)と,その原点対象となる鏡像サンプル(陰サンプル)を一つのガウス分布で表現する分布を提案し,これらから導かれる統計的パターン認識手法を開発し,これまで発見的に拡張されてきた相互部分空間法や複数サンプルの同時クラス分類を効率的に行う手法を統計的に導くことを可能とした.これらの手法を画像認識,音声認識,動画像認識などの大規模データに適用して,その有効性を確認した.本課題では,あるサンプル集合(陽サンプル)と,その原点対称となる鏡像サンプル(陰サンプル)を一つのガウス分布で表現する陰陽ガウス分布を提案し,これから導かれる統計的パターン認識手法を大規模データ解析に応用することを目的とする.具体的には,陰陽ガウス分布をカルバック・ライブラー情報量や複合決定問題(ベイズの定理の拡張)に適用することにより,これまで発見的に開発されてきた相互部分空間法や複数サンプルの同時クラス分類を効率的に行う手法を統計的に導くことを可能とする.さらに,本研究によって開発した新しいパターン認識手法を数千万,数億オーダー規模のデータに適用することで,大量データ時代のパターン認識問題に対する一つのアプローチを確立する.平成24年度では,複合決定問題への陰陽ガウス分布の適用を行った.複合決定問題とは,ベイズ決定則を複数のサンプルの同時クラス分類問題に拡張したものであり(Hannan & Robbins, 1955),連続して観測された複数のサンプルに対応する連続したクラスラベルを,統計的独立性を仮定しないで決定する問題である.この問題に陰陽ガウス分布を適用すれば,少ない記憶容量と計算量で複数のサンプルに対し同時にクラスラベルを付与できるアルゴリズムを導くことができると期待できる.本年度では,この考えに基づき,統計的独立性を仮定することで,異なる複数の特徴量に基づいて未知サンプルを分類するための識別器を導いた.本課題では,前年度までに,あるサンプル集合(陽サンプル)と,その原点対称となる鏡像サンプル(陰サンプル)を一つのガウス分布で表現する陰陽ガウス分布を提案し,これから導かれる統計的パターン認識手法を開発した.具体的には,陰陽ガウス分布をカルバック・ライブラー情報量や複合決定問題(ベイズの定理の拡張)に適用することにより,これまで発見的に開発されてきた相互部分空間法や複数サンプルの同時クラス分類を効率的に行う手法を統計的に導くことを可能としてきた.平成26年度ではこれらを画像認識,音声認識,動画認識などの大規模データに適用して,その有効性の検証を行った.その結果,少ない記憶容量と計算時間で,従来法と同程度の認識率を達成できることを実験的に示し,大量データ時代に対する一つのアプローチを提示することができた.情報科学当初の予定通りに進捗があり,実験結果も良好なことから,おおむね順調に進展していると判断した.平成24年度では,陰陽ガウス分布を複合決定問題へ適用することで,連続して観測された複数のサンプルに対するクラスラベルを,統計的独立性を仮定しないで決定するアルゴリズムの開発に関する研究を行なった.複合決定問題とは,複数のサンプルを観測した後,それぞれのクラスラベルを同時に決定する問題である.このような問題は,ビデオを構成する複数のショットのクラスラベル推定等に応用可能であり,大規模データ解析には必要な要素技術である.本年度では,この問題に対して確率密度関数として陰陽ガウス分布を用いることにより,圧縮を伴った複数サンプルの同時クラス分類を実現するためのアルゴリズムの開発を行った.ただし,複合決定問題では複数のクラスラベルの組み合わせ(context)ごとに事前確率とサンプルに関する確率密度関数が必要であり,その組み合わせの個数は,クラス数をC,観測するサンプル数をnとすると,Cのn乗個も存在してしまう.そこで,統計的独立性を仮定し,さらに確率密度関数として陰陽ガウス分布を用いることで,少ない記憶容量と計算量で同じクラスに由来する複数の未知サンプルを分類したり,異なる複数の特徴量に基づいて未知サンプルを分類したりするための認識アルゴリズムを導いた.

平成26年度では,これまで通りの研究ペースを保ちつつ,本研究で開発したアルゴリズムを大規模データに適用して,その有効性を検証することを目的とする.今後の予定としては,同一クラスに由来する複数の未知サンプル集合が得られた場合を想定し,未知サンプル集合も陰陽ガウス分布で表現した場合のカルバック・ライブラー情報量に関する研究を行う.具体的には,未知サンプルの分布を表す陰陽ガウス分布と,クラスごとの訓練サンプルの分布を表す陰陽ガウス分布とのカルバック・ライブラー情報量を求めることにより,相互部分空間法に類似したアルゴリズムを導く.ただし,この方法で求めたアルゴリズムと相互部分空間法のアルゴリズムは完全に一致するわけではないので,その相違点に関して理論的な研究と実験を行い,相互部分空間法を統計的に拡張可能とすることをこの年度の主たる研究目的とする.また,Hadoopを導入し,大量のデータを並列分散的に管理・運用できるようにする.残額が少額なため,無理に使用しないこととしたため次年度の消耗品購入の際に利用する本研究課題では,理論面の研究の大凡の見通しは立っていたので,平成24年度ではその研究に注力した.そのため,大規模データに対する実験を行わなかったため,次年度使用額が生じた.本年度では,Hadoopを導入することと,本研究室の大学院生を雇用してシステム構築と運用チェックのために予算を使用する予定である.
DSAにおけるハイブリッドサブトラクション法の基礎的および臨床的研究

DSAの欠点の1つである軟部、カズによる障害陰影を除去するために、エネルギーサブトラクション法(HS)をDSAへ応用し、画質を左右する因子の検討と画質改善を試みた。実験的研究においてI.I.面における線量を測定したが、HSの高電圧,低電圧一組あたりの線量は2.48mRであったのに対し、通常のDSAの4枚加算では8.38mRであった。HSにおける一画像を形成させるに要した曝射線量では、通常のDSAの30%程度であった。HSの信号雑音比(SNR)は通常のDSAの約1/2であり、HS画質は、フレームの4枚加算を行うことによってわずかに向上が認められた。I.I.面での線量を増加させることによってもSNRの軽度の改善が認められた。臨床床的研究ではIA DSA,IV DSAともにHSでは極めて良好なガス,及び軟部によるアーチファクトの消去がが可能であった。ガス,アーチファクトはDSAよりもよく除去された。しかし、少数例においては、アーチファクトの除去は殆ど差がなかった。HSの血管抽出能は、通常のDSAに比して劣っていた。HSの診断能は通常のDSAに比べて多くの症例で劣っていたが、2例ではHSの診断能が優れていた。HSの血管抽出能は、IA DSAよりもIV DSAで劣っている印象であった。HSのmetched filter,加算法,及び加算なしで画質を比較すると、matchedfilterを応用したHSの画質が最もよく、続いて加算法,加算なし,の順番になった。加算法を加えたHSでは、時に血管壁の不明瞭化がみられた。後処理を加えないHSでは、他の方法に比べてしばしば画質の低下がみられた。今後、HSの画質を向上させるためにはI.I.面のX線量増加,及び適切な後処理プログラムの開発が必要である。
エネルギ供給率のマッチングと非線形接続に基づく複雑システムの解析設計理論の構築

最終の本年度は、過去2年間の研究で具体的化に成功した「供給率の非線形接続」と「供給率のマッチング」という本課題が提案する着想の有効性を探究し、個別のテクニックから統一的理論体系へ脱却・進化させることに専念した。本年度は主に、(1)システムの部分要素が大域的にゲインを持たなくても小ゲイン的条件から結合システムの大域的安定性とロバスト性を導出可能にすること、(2)固定したたった1つの小ゲイン条件から異なる供給率を持つ複数のシステムの安定性を保証できる理論を確立すること、(3)漸近安定性よりも利用範囲の広いロバスト外乱抑制特性へと理論を拡張すること、(4)複雑非線形システムに対するリアプノフ関数を陽に導き出す手段を開発すること、の4つに力を注いだ。それぞれ具体的には、積分入力状態安定なシステムに対する小ゲイン定理の確立、供給率のパラメトリゼーションの提唱、ロバスト消散性条件の導出、状態依存スケーリング問題へ解析解の明示、という前例のない理論として成果を得ることに成功した。これにより、複雑非線形システムの解析・設計において多種多様に強い非線形性を「広く取り扱いながらも肯定的な答えを導き出す能力を持つ」新しい理論体系を誕生させるという目標を達成した。そもそも国内ではそういった発想に基づく研究者はいないため、本研究が提唱から実現を通して与えた日本の制御理論への貢献は大きい。国際的にも本件研究のテーマと着想は独創性が非常に強く、初めてで他に類がない研究成果となった。そのため昨年まで本研究に対し数理・抽象的印象や実問題と距離感を持つ研究者・技術者が多かった。そこで本年度は、理論をわかりやすく接続して体系化すること、ツール公式集のように整理すること、具体例を通して有効性を示すことにも努力した。こうして得た全ての研究成果は、速報として国内および国外の研究集会・会議で発表し、さらに外国論文誌へ投稿した。本課題最初の本年度は、エネルギ供給率のマッチングと非線形接続をアイディアとする複雑システムの解析と設計の新たな理論の構築を目指し、まず基礎理論の創出に専念することから始めた。「供給率の非線形接続」と「供給率のマッチング」という着想それぞれが如何に複雑非線形なシステムの解析に有効活用できるのかを、過去から代表的、あるいは、よりアドバンスな供給率やモデルの例を具体的に使いながら突き詰め、それを整理して一般定式化することで基礎的アイディアをまとめ上げた。研究代表者が現在までの研究の過程でバラバラに生み出してきたいくつかの理論的部品を、統一的に新たな表現の観点から見直すことからはじめた。融合の過程には新たな多くの発想を要したが、その結果、様々な非線形性を持つダイナミック要素について状態依存のスケーリングを用いた供給率の非線形接続により、結合システムの安定性が統一的に導けることがわかった。これまでの研究代表者の研究により、スタティック要素やスタティックな結合については、状態依存のスケーリングを施したL2ゲイン条件から結合システムの安定性が導けることがわっていたが、ダイナミック要素やダイナミックな結合の場合にも、ふさわしく選んだ集合に属する状態依存スケーリング関数を利用することで、動的ゲインの意味を持つ供給率から結合システムの安定性が導けることが明らかになった。さらに、L2ゲインの有界性は複雑非線形システムに課すには厳しすぎることにも注目し、L2ゲインを脱する表現として入力状態安定(ISS)の理論を吸収かつ発展させる方向から供給率の一般化へ取り組んだ。これにより、ISS理論が強い非線形性に有効である仕組みをうまく継承した、さらに広いクラスの供給率に基づく解析理論の骨組みが一部出来上がった。研究代表者の予想通り、「供給率の非線形接続」には、非線形ゲインや状態依存型スケーリングの概念が研究に非常に有効であり、これらを拡張利用して供給率を自由変数でパラメトライズすることもできた。この自由変数は「供給率のマッチング」に大いに役立つことが期待できる。このようにして得られた研究初段階の成果を、速報として国内および国外の研究集会・会議で発表、投稿した。本課題二年目の本年度は、初年度に創った基礎アイディアを統一的に整理して発展させ、複雑システムの解析や設計の理論枠組みを形作る研究に主に専念した。初年度に個別ケースごとに有効性を発見した「エネルギ供給率の非線形接続」を一般化させた統一的理論を確立するだけでなく、自由な関数変数を供給率にアフィンな形で導入し、理論のシステムや非線形性への適用範囲を拡大させることを行った。こうして出来あがった定式化のアフィン性を活用してコンピュータパワーを利用した数値計算すれば、「供給率のマッチング」をするだけで結合システムの安定性を判別することが可能になり、複雑システムの安定性解析や制御設計への新しい道を開くことができた。「供給率の接続」は三角構造を持つシステムに関する研究代表者の過去の研究成果から発したアイディアであるが、本年度の研究の大きな貢献点は三角構造から脱したことである。それは、供給率の接続に「非線形性の活用」の有効性を発見したことから始まった。接続を線形に限ってしまうと、対処できる非三角構造は本質的に線形的なシステムや結合に限られるという理に適った結論に達した。従来の理論との関係の明確化にも力を注ぎ、提案する理論に従来理論の自然な拡張としての解釈を与え、従来法と比較した利点を整理することに成功した。本年度は、一部の理論について計算機シミュレーションにより有効性を検証した。以上により、「供給率の非線形接続」と「供給率のマッチング」という2つの着想に基づいた結合システムの解析設計の理論の基礎がほぼ確立できた。

今後この成果を発展させ、小さなシステム一つ一つの供給率を非線形接続しながらシステムを拡大していく手段を構築すれば、真に複雑な非線形システムやネットワークを取り扱う魅力的なアプローチになると考えられる。得られた研究中間段階の成果を、国内および国外の研究集会・会議で発表、投稿した。最終の本年度は、過去2年間の研究で具体的化に成功した「供給率の非線形接続」と「供給率のマッチング」という本課題が提案する着想の有効性を探究し、個別のテクニックから統一的理論体系へ脱却・進化させることに専念した。本年度は主に、(1)システムの部分要素が大域的にゲインを持たなくても小ゲイン的条件から結合システムの大域的安定性とロバスト性を導出可能にすること、(2)固定したたった1つの小ゲイン条件から異なる供給率を持つ複数のシステムの安定性を保証できる理論を確立すること、(3)漸近安定性よりも利用範囲の広いロバスト外乱抑制特性へと理論を拡張すること、(4)複雑非線形システムに対するリアプノフ関数を陽に導き出す手段を開発すること、の4つに力を注いだ。それぞれ具体的には、積分入力状態安定なシステムに対する小ゲイン定理の確立、供給率のパラメトリゼーションの提唱、ロバスト消散性条件の導出、状態依存スケーリング問題へ解析解の明示、という前例のない理論として成果を得ることに成功した。これにより、複雑非線形システムの解析・設計において多種多様に強い非線形性を「広く取り扱いながらも肯定的な答えを導き出す能力を持つ」新しい理論体系を誕生させるという目標を達成した。そもそも国内ではそういった発想に基づく研究者はいないため、本研究が提唱から実現を通して与えた日本の制御理論への貢献は大きい。国際的にも本件研究のテーマと着想は独創性が非常に強く、初めてで他に類がない研究成果となった。そのため昨年まで本研究に対し数理・抽象的印象や実問題と距離感を持つ研究者・技術者が多かった。そこで本年度は、理論をわかりやすく接続して体系化すること、ツール公式集のように整理すること、具体例を通して有効性を示すことにも努力した。こうして得た全ての研究成果は、速報として国内および国外の研究集会・会議で発表し、さらに外国論文誌へ投稿した。
断層粘土の形成に伴う微量元素の挙動について

私は中部日本の10箇所の代表的な断層のTh-Pb年代測定および断層帯のラドン濃縮による過剰鉛-206からの過去の活動度推定を試みている。ただしこれらの考察には断層粘土とその母岩との鉛、ウラン、トリウムの含有量が断層粘土形成から現在まで変化していないという前提が必要である。断層粘土の形成に伴う微量元素の挙動については不明な点が多く、国内外でも類似の研究は見あたらない。母岩が花崗岩の場合の断層粘土形成時の化学組成の変化を知るために、六甲花崗岩、跡津川断層北東部の船津花崗岩、阿寺断層中央部の苗木一上松花崗岩、中央構造線の両家花崗岩のような地域における、近畿・中部日本の断層の母岩と断層破砕物質について文献調査をおこない、その一部についての試料を入手した。中性子放射化法などの微量元素分析や粉末X線回折装置を併用して鉱物分析および状態分析を併用して母岩と断層破砕物質との化学組成の違い、同一母岩から生成したと考えられる断層破砕物質内での鉱物組成と化学組成の関係、酸化還元状態による鉱物組成と化学組成の差、採取地点の断層からの距離による断層破砕物質、母岩の種類、断層の種類による相違点などについて検討している。平成7年10月1日付けで東京大学・大学院理学系研究科から北海道大学・大学院地球環境科学研究科へ転出したために東京大学での研究は不可能になり、北大での放射線取り扱いの認可が遅れたためにデータの提出が遅れていたが、現在北海道大学において研究事業を再開することが可能になり、本研究の目的である(1)断層粘土形成時の化学組成の変化、(2)断層粘土の閉鎖性の問題、(3)断層粘土のキャラクタリゼーション、について考察を進めている。
悪性神経膠腫における腫瘍幹細胞を標的とした間葉系幹細胞療法の試み

平成22年度は、悪性神経膠腫における腫瘍幹細胞制御のための標的遺伝子を検索することに費やした。悪性神経膠腫摘出標本から得た細胞塊から、腫瘍幹細胞の分離同定を行った。neurosphere法に加えフローサイトメトリー(FACS)を用いた方法にて腫瘍幹細胞を濃縮する方法を確立した。CD133陽性細胞に高発現する分子を同定するため、signal sequence trap法やmicroarray法にて、候補遺伝子を選択した。FACSを用いて候補分子の発現とCD133の発現との関係を解析し、CD133陽性細胞に高発現かつsphere形成能が高いBTSC4(特許申請予定のため仮名)を見出した。さらに、悪性神経膠腫におけるBTSC4機能的役割を検討するため、siRNA、shRNAによるノックダウンを行った。機能解析方法としては1)Transwellを用いたmigration、2)細胞増殖能の評価、3)Zymographyを用いたMMP-2/9活性の測定、4)免疫不全マウス胎児脳への移植による造腫瘍活性、増殖、浸潤能の評価を行った。その結果、BTSC4は細胞増殖には関係はないが、浸潤の抑制に影響を及ぼす分子であることを明らかにした。さらにBTSC4のsoluble isoformの機能的役割についても同様の検討を行い、soluble isoformBTSC4は浸潤を促進する分子であり、soluble BTSC4を発現させたグリオーマ細胞株は免疫不全マウス脳内で腫瘍形成が促進されていることを確認した。平成23年度は、悪性神経膠腫の治療ターゲットとなりうる分子としてsoluble isoform BTSC4が考えられる。悪性神経膠腫におけるBTSC4 isoformの阻害効果については現在確認中である。来年度はこの標的遺伝子を導入した間葉性幹細胞の作成と抗腫瘍効果について検討を行うこととする。悪性神経膠腫手術例から得た臨床検体計21例を対象とした。腫瘍幹細胞の分離・同定は、neurosphere法に加え、当院の癌幹細胞制御学講座とともに確立したFACSを用いた方法にて腫瘍幹細胞を濃縮する方法を用いた。得られたCD133陽性分画の細胞表面に存在する分子をsignal sequence trap法や採取したmRNAを使用しmicroarray法にてCD133陰性分画との遺伝子発現比較により候補遺伝子を選択し、CD133陽性分画に発現する分子の同定を試みた。さらに、フローサイトメトリーを用いて膠芽腫検体で候補分子の発現とCD133の発現との関係を蛋白レベルで検討し、CD133+細胞に高発現する分子を同定を試みた。その結果CD166/ALCAM(Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule)が上記の条件を満たす分子であることを見出した。さらに我々はCD166/ALCAMの悪性神経膠腫における機能的役割を検討した。具体的にはsiRNA、shRNAによるノックダウンを行い、その後機能の解析方法としては1)Transwellを用いたmigration、2)細胞増殖能の評価、3)Zymographyを用いたMMP-2/9活性の測定、4)免疫不全マウス胎児脳への移植による造腫瘍活性、増殖、浸潤能の評価を行った。その結果CDI66/ALCAMは細胞増殖には関係はないが、浸潤の抑制に関連している分子であることを見出した。さらにCD166/ALCAMはsoluble isoformがあることが知られており、soluble CD166/ALCAMの機能的役割についても同様の検討を行ったところ、soluble isoform CD166/ALCAMは浸潤を促進する分子であることを見出し、さらにこのsoluble CD166/ALCAMを発現させたU87MGグリオーマ細胞株は免疫不全マウスへの投与では明らかに腫瘍形成が促進されていることを見出した。これらの結果より悪性神経膠腫の治療ターゲットとなりうる分子としてsoluble isoform CD166/ALCAMが考えられる。現在この標的遺伝子を導入した間葉性幹細胞療法の可能性について検討中である。
shape理論の研究

Approximate Shape理論のフラクタル幾何学への応用が目標である。今年度の研究では、時にフラクタル次元に焦点を当ている。フラクタル次元は未だに数学的定義が与えられて無い。便宜的な定義は多くの研究者によっりいろいろ提唱されているが、確定したものにはなっていない。この現状を打開するために数学的に定義されているハウスドルフ次元を解析することから始めた。(1)X上の測度とX_i上の測度との相互関係を考察する。(2)上の(1)での考察より、展開(X,U)にたいして或数値x(X,U)を定義する。(3)特に(K,V)に対しては、w(K,V)はハウスドルフ次元と一致することを示す。今年度は(1)の問題に着手した。ハウスドルフ測度を一様位相より定義すると見る(によりX上の一様位相とX_iの一様位相との関係と同様の関係を見いだすことが出来た。これにより、(2)と(3)への足掛りを手にいれたことになる。これから、順次研究を続けるが、完成迄に2・3年は必要であろう。出来た結果から順次まとめて発表します。
ヒト大腸癌に特異的に蓄積するユビキチン化蛋白質の同定

大腸癌手術切除材料および内視鏡下切除材料より蛋白質を抽出し、2次元電気泳動により解析した。抗Ubモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより、癌部の不溶性分画に優位(特異的)な分子量45dkDaと42kDaのスポット群が認められ、特に42kDaのスポットは癌部に特異的であることが判明した。この蛋白質を2次元電気泳動を用いて単離精製、アミノ酸シークエンスを行った結果、これはヒトサイトケラチン8(CK8)と同一のホモロジーを含むことが示された。このことは、抗CKモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにても確認され、この蛋白質はUb化CK8フラグメントであることが示された。以上より、大腸癌において特異的に蓄積するUb蛋白質として、分子量42kDaのUb化CK8フラグメントを同定した。また、これはCK8のUbシステムによる分解の中間代謝物であることが示唆された。また、この42KDaUb化CK8フラグメントの蓄積は、正常部、腺腫には1例も認められず、癌部には35例中25、71.4%と有意に高率だった。さらに、癌において臨床病理学的因子別にみると、統計学的に有意な相関は認められなかったが、組織型では低分化なほど、深達度、リンパ節転移、肝転移、Dukes stageでは進行度が高くなるほどその発現率が高くなる傾向が認められた。以上より、この42KDaUb化CK8フラグメントは大腸癌において発癌早期から蓄積し、大腸早期癌のマーカーとしての可能性が示唆された。
多振動体時計の統合:時計遺伝子のinvivo-exvivoイメージング

本研究は、多振動体階層構造をもつ中枢時計、視交叉上核(SCN)における振動細胞カップリングによる概日周期発振メカニズムの解明を目的とし、培養SCN発光イメージング、細胞内カルシウム網羅的解析、時計遺伝子発現と膜電位の同時計測などのexvivoの長期連続計測と無麻酔無拘束動物における時計遺伝子発現invivo計測システムを開発し、同調因子の入力から生理機能出力に至る過程を検討した。その結果、日長変化に応じて行動開始、終了位相を制御するSCN内の3振動体の局在、すべてのSCN細胞における部位特異的細胞内Ca++リズムの存在、神経性連絡による背側-腹側間リズム結合を明らかにした。さらに、中枢時計内振動細胞ネットワークが離乳頃に成獣型に移行し、その形成に時計遺伝子Cryが必須であることを明らかにした。多数の時計細胞により構成され多振動体階層構造をもつ視交叉上核(SCN)では、個体が環境周期に適応して適切なリズムを示すために、細胞間リズムカップリングや部位特異的振動体間の位相調節が重要な鍵となる。平成21年度では、階層構造の各レベルのリズム発振に注目し、以下の成果を上げた。1)SCN培養系による部位特異的多振動の位相調節機構:長日および短日に同調させたPer1-lucマウスのSCN水平断培養を行い、点灯に同調し行動終了を制御する振動体と、消灯に同調し行動開始を制御する振動体部位を細胞レベルで同定し、前SCNにみられた第三の振動体の部位を明らかにした。2)SCN内各振動体の出力経路と末梢時計:光ファイバーをSCN直上に挿入し、照明と連動したファイバー測光と自発行動の同時計測システムを完成された。本システムを用い、SCN内に光による行動リズム変位と一致した位相反応を示す振動細胞群があることを見出した。3)概日リズム発振と同期に関わる分子機構の検討:恒常暗で行動リズムが消失するため無周期変異とされていたCry1/2ノックアウトマウスを用い、個々の視交叉上核細胞が脱同期したPer1発現リズムを示すこと、神経発火リズムは同期しているが周囲が不安定であることを明らかにし、Cryがリズム発振ではなく振動細胞間同期とSCNからのリズム出力に関わる遺伝子であることを示した。4)SCNによる末梢時計調節機構の検討:中枢-末梢時計相関を明らかにするため、自発行動と同時に皮膚や大脳皮質の時計遺伝子発現をリアルタイム定量計測するシステムを立ち上げた。21年度は、体表からの発光計測機器をセットアップし、2種の基質の定速長期持続注入法を比較検討した。哺乳動物の生物時計が局在する視床下部視交叉上核(SCN)は、多数の概日振動細胞により構成されるが、システムとしての生物時計機能は未だ不明である。本研究は、時計遺伝子Per1,Pert2発現を生物発光にてin vivo,ex vivoで計測し、SCN内の部位特異的振動体の局在と機能と出力を含めたシステムとしての生物時計のシステムを明らかにすることを目的とする。平成22年度は以下の研究を行い、所定の成果を得た。SCNをスライス培養し、Per1およびPer2発現リズムを一細胞レベルの発光解析にて、細胞内Ca2+レベルをCa2+センサープローブを用いたFRET解析にて、膜電位を多電極ディッシュ法にて計測することに成功した。さらに、日長をコードする2振動体は、Per1発現と一致することから、時計遺伝子間でPer1が関与する振動機構とPer2が関与する機構とが異なることを示唆した。2.光ファイバーを用いたSCNにおけるin vivo遺伝子発現解析SCNの中枢振動体が行動リズムを駆動する時計機構を検討する目的で、光ファイバーシステムを構築し、SCNからの発光リズムを約30日にわたり連続計測することに成功した。また、光パルスによる行動リズムと同様に移行期をもつ発光リズムの変位を、SCNから直接計測し、SCN内にも移行期を示すサブ振動体が存在することが明らかとなった。3.SCN内各振動体の出力経路と各振動体が支配する末梢時計2台のCCDカメラのステレオ撮像により、覚醒動物から連続的に生物発光を記録するシステムを構築し、無麻酔で発光リズムを体表から計測することに成功した。今後、光パルスによる中枢時計と、脳内各部位の時計の変位を同一マウスで連続的に解析することが可能となった。本研究はin vivoとex vivoメージングを駆使して、多振動体階層構造をもつ哺乳動物の生物時計、視交叉上核(SCN)における組織レベルでのリズム統合メカニズムを総合的に検討した。実験には、各種時計遺伝子レポーターマウスの培養系での発光イメージング、多電極ディッシュ計測とin vivo計測を行った。