hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チベット高原における温暖化にともなう有機物分解促進メカニズムの解明

当初の計画では、研究代表者および分担者が昇温処理を実施中の調査地(青海チベット高原の海北高山草原)に行って現地調査を実施する予定だったが、中国当局の指導があり、日本人の我々が現地へ入ることが認められず、平成29年度は現地調査が実施できなかった。そのため、北京大学の研究協力者と相談のうえ、現地での調査は次年度以降に延期するとともに、土壌温度、土壌水分、温室等の気象観測だけは研究協力者の指導学生に依頼して継続することにした。また、北京大学の研究協力者2名を日本に招聘し筑波大学にて研究集会を開催し、本研究に関するこれまでの成果と今後の研究計画について相談を行った。平成28年度に引き続き今年度も中国当局の方針により、急きょ本研究計画の根幹をなす青海・チベット高原の海北高山草原での野外実験を中断せざるを得なくなった。そのため、現地調査をいったん中断し、研究成果発表に重きを置かざるを得なくなった。本研究の目的は、チベット高原における温暖化にともなう有機物分解促進メカニズムの解明であり、そのため、これまで申請者が継続して調査を行ってきたチベット高原北東端部に位置する青海省海北草原の高山帯で昇温実験を開始するとともに、有機物分解実験の準備に着手していた。しかし2016年に入り、研究代表者および分担者を含む日本人の現地への入境が中国当局により禁止され、それ以降は許可が下りない状況が続いており、2018年度も現地入りすることができなかった。そのため、青海省海北草原の現地調査に関しては、気象データのみ、研究協力者(北京大学:唐艶鴻教授)の協力を得て、中国人研究者に委託して気象観測を継続して行った。一方、日本国内の高標高域にある尾瀬ヶ原を本研究の代替地に選定し、2018年は本研究テーマを実施するための予備調査および準備を行った。尾瀬ヶ原には、標高1650m前後に広がる湿原と周辺には2300mを超える二つの山がある。特に尾瀬ヶ原は、土壌水分が高い高層湿原が広がっており、海北草原に広がるalpine meadowに似通った植生もみられる。本年は尾瀬ヶ原の上田代の牛首付近で植生および土壌の詳細な調査を行った。尾瀬ヶ原では約20年前に同様の調査が行われており、現状把握およびこの20年間での変化を明らかにするために、20年前と同様の調査を行った。その結果、植生はほとんど変化していない一方で、土壌堆積物表層には、尾瀬ヶ原湿原内の草本やミズゴケ以外の木本層の植物遺体(リター)が多くみられることがわかった。これは、この20年間の地球温暖化に起因する局所的な極端現象(洪水の激甚化など)が増え、その結果、尾瀬ヶ原湿原への有機物蓄積パターンが変化している可能性を示唆している。当該地域の温度上昇区と対照区において、2016年から2018年の夏期に、植生調査(種数yと植物量)、群落レベルのCO2交換量(光合成速度、生態系呼吸速度、土壌呼吸速度)、土壌窒素無機化速度、土壌有機物量と質の調査、フェノロジーに関する現地調査を行う。尚、当該地域での現地調査は、中国側の共同研究者の指導学生も加わって共同で実施する予定である。また、2015年夏の予備調査の植生とCO2動態に関しては、国際専門誌に学術論文として投稿すべく準備を進めている。尚、当該地域は調査のみならず入境自体に制限がかかる地域であり、政治等の情勢によっては日本人による現地調査ができない可能性もありうる。そこで、国内の高山帯(中央アルプス木曽駒ヶ岳頂上付近)でも同様の温暖化実験を行う予定である。今年度(2017年)に入り、中国当局から中国科学院を介して、当該地域への外国人入境不許可の連絡が入り、今年度は私を含めて日本人が入境出来ない、即ち我々が直接調査出来ない状況になった。
脳腫瘍におけるホルモン細胞増殖因子およびサイトカイン受容体の研究

1 3Hラベルしたリガンドを用いたドパミン(D1&D2)受容体の定量測定D1受容体はSCH23390、D2受容体はspiperoneをリガンドとして定量測定した。(1)下垂体腺腫下垂体腺腫に対して、D1及びD2受容体それぞれに高いaffinityを有するリガンドを用いた定量測定は今まで報告がない。細胞活性を抑制的に作用するD2受容体の発現頻度は各腺腫間で差がなかったが、その検出量は明らかにPRL産生腺腫で高値を示した。一方、D1受容体はPRL産生腺腫やGH産生腺腫に比べて、非機能性腺腫に高く発現している傾向が見られた。bromocriptineは、親和性は低いがD1受容体にも結合して腫瘍細胞のadenylate cyclaseを刺激して増殖を促す可能性もある。つまり、bromocriptine耐性あるいは無効となる要因の一つとして、D2受容体の発現量や細胞内伝達系の異常の他にD1受容体の発現も考えられた。(2)髄膜腫最近、いくつか報告がなされているが、D1受容体の発現に高値を示すものがあった。D2受容体については、陽性例はなかった。今後、他の腫瘍(神経鞘腫、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、転移性脳腫瘍など)に対しても検索測定を進める。2経過中に組織学的悪性変化を示した髄膜腫に対するPCNA,Ki-67を用いた増殖能の検討悪性変化に伴いPCNA,Ki-67の陽性細胞が多くなる傾向がみられている。
北東アフリカ諸国における経済自由化と民主化の比較考察

この研究プロジェクトは、研究計画調書および交付申請書提出段階では、民主化・経済自由化を軸に、1.スーダン・アフリカの角(エチオピア、エリトリア、ソマリア、ジブーティ)と2.エジプトの比較を行おうとした。研究分担として、1.を英国レッディング大学政治学科教授、ピーター・ウッドワード氏、2.を私が担当することになっていた。しかし、研究を開始して1年後の平成10年度交付申請書提出段階において、本務校の事務担当者より、研究組織上外国人を含めることはできず、また実際研究代表者1名による個人研究であるので、そのような形で研究を遂行してほしいとの指摘を受けた。そこで、日本学術振興会担当課に、交付申諸書記載事項の変更を届け出るべきか照会したが、その必要はないとの返答を得た。こうした経緯を踏まえ、平成10、11年度には、エジプトの民主化と経済自由化の研究に集中した。分担地域1.については、ウッドワード教授との研究レビューに止めた。研究成果報告書第1部は、エジプト革命以降サーダート政権までを中心に、従来発表した研究に加筆修正を施した。また第1部、「終りに」において、新たに、7月23日革命以後1990年代半ばに至るエジプトの政治過程を概観している。第2部は、研究計画調書で問題提起した、1960年代エジプトにおける経済自由化の萌芽に関する研究である。第8章を除く全ての論稿は、このプロジェクト期間中に調査あるいは執筆を行ったものである。第11章では、60年代前半のソ連・東欧における経済改革の影響がエジプトに及んだ経緯をある程度分析することができた。今後、エジプトにおける経済自由化の萌芽の問題を軸に、1960年代後半の出来事を追跡して、日本におけるエジプト研究の中で、一つのまとまりとオリジナリティを持った研究に仕上げるつもりである。本年度の研究はほぼ交付申請書記載の実施計画に沿って進められたが、12月に予定していたイギリスおよびエジプト(あるいはスーダン)での研究レビュー・資料収集は、埃でのイスラーム主義武闘派の動き、スーダン内戦激化のため取り止め、日本での研究に切り替え、e-mailでイギリスと研究打ち合わせを行った。このため研究費の内当初外国旅費に予定した予算を他の費目へ配分した。研究は、1.エジプトの経済自由化(富田広士)と2.アフリカの角諸国の民主化(Peter Woodward)に関して行われた。1.研究代表者が明らかにしようとした点は、1964年66年に一部表面化した経済自由化構想の由来と埃の開発戦略の展開の中でそれが持つ意味である。米ケネディ政権の開発援助やIMF融資が埃開発戦略に与えた影響を考察した。1962年段階では工業化戦略自体の見直しは表れず、従来型の開発計画の遂行を、対外財政援助の獲得と貿易自由化の促進とによって支えようとしていた。2.ウッド、ワードは、アフリカでは1990年代に入って表面的には民主化が広範囲にわたり達成されたかに見えるが、実際には、制度化の未熟な側面をスーダン、ソマリア、エチオピア、エリトリアについて考察した。その要因として、民主化と平行して弱体化した国家の再建に取り組むといった国内要因が大きいとし、それに加え、周辺諸国の介入など地域的・国際的要因もまた民主制を抑制する方向で作用しているとした。来年度は、以上の基礎的枠組みの中で両者の研究を共同研究として展開させるために、主要な研究対象国をエジプトに絞り、上記1.に関しては開発戦略の歴史的推移を他の中東諸国(例えばトルコ)やインドとの比較を含めて考察を進め、上記2.についてはアフリカの角諸国との比較を軸に、歴史的推移と国内・地域・国際要因を探る。

平成10年度交付申請書提出時に当局より修正を求められた点は、平成9年度研究計画および遂行において、実質的には英国レツディング大学政治学科教授、ピーター・ウッドワード氏との共同研究としたことであった。そこで、本科研費プロジェクトでは同氏との研究レビューに基づきエジプトの経済自由化と民主化に限定して研究を進め、ウッドワード氏が専攻するアフリカの角諸国の諸問題については、並行して続行中の別の共同研究プロジェクトの中で取り上げることになった。本年度は「現代エジプトの経済自由かと民主化-1952年81年-」をテーマに、これまでに発表したものの加筆修正と新たな論文執筆を並行して行った。1.経済自由化については、「開発戦略の転換と政府主導性」(11.研究発表参照)で、1964年に埃指導部が打ち出した開発政策の変更とIMFからのスタンド・バイ融資第二回トランシュの関連性に焦点を当て、経済自由化における外圧の役割とその内実の解明を試みた。2.民主化については、ナーセル政権が採用した「単一政党制」がサーダート政権へ移行する過程でどのように変化したのかという視覚から考察している。「エジプト〔政治〕」(11.研交発表参照)では、サーダート期以降の内政外交の流れを概観した。私の関心は経済自由化、民主化双方について、その内発的要因と対外的要因のバランスを考量する点にある。また12月に実施した短期出張では、次の三か所で研究レビューを受けた。1.エジプト・カイロ、(1)アメリカン大学人文・社会科学部政治学科、Nigel Harrisから経済自由化の背景となった開発論の世界的潮流について、(2)新市民フォーラム、Said El-Naggarから1960年代埃経済自由かの限界について、2.英国レッディング大学政治学科、Peterwoodwardから民主化、アフリカの角諸国との比較の二点について。本年度も昨年度と同様に、エジプト(以下「埃」と略記)の経済自由化と民主化に限定して研究を進めた。自由化全般に関する埃とアフリカの角(以下HofAと略記)諸国との比較については、HofA諸国の政治を専攻するPeter Woodward氏(Prof.,Dept.of Politics,Univ.of Readi.UK)との研究レビューを通して行った。1.経済自由化については、「『アラブ社会主義』の再検討」(11.研究発表参照)で、1960年代埃の開発戦略の変容に関して、日本における研究状況を検討し、今後明らかにされなくてはならない問題点として、(1)開発論の世界的潮流変化とどのように関連づけられるべきか、(2)60年代前半以後ソ連・東欧において唱えられた経済改革構想-一部北欧を経由した-が埃にいかなるインパクトを与えたか、を指摘した。2.民主化については、『新訂増補・アフリカを知る事典』(11.研究発表参照)で、サーダート期以降の内政外交の流れ、とりわけ80年代後半から90年代初頭にかけてIMF融資導入・経済改革着手をめぐり、ムバーラク政権が民主化(議会政治)とどのように連結させたか、を考察した。
矛盾した感情表出に対する認知の発達的検討

送り手の感情表出に矛盾がある場合、受け手は主に表情を重視して全体的印象を決めていることが、感情認知に関するこれまでの欧米研究において示されている。一方、日本人大学生を用いた研究では、表情が否定的な場合には、表情以外の声の調子や話の内容などに注意を向けようとすることが認められている。また、日常的な経験からは、発達段階によっても、これらの矛盾するような感情の表出と認知には違いがあると思われる。すなわち、幼い子どもは母親の音調や表情をみて母親の要求を理解しようとしているし、ある年齢の子どもたちに冗談を言っても言語内容のみが重視され冗談が通じないことは、日常的によく経験することである。そこで、これらの研究および日常的経験に基づき、冗談や皮肉などの矛盾するような感情表出に対する認知について、発達な検討を行った。具体的には、言語以外の表情や音調などを重視する発達段階から言語内容、そして表情への重視と変化する過程について、言語能力・ソーシャルスキル能力の観点から検討を加えた。実験方法は、まず、教師を表出者として、表情・音調・言語内容が矛盾するビデオ刺激を作成した。続いて、上記の各刺激について、冗談、皮肉、からかいなどの表出の程度について成人の評価を行った。さらに、幼稚園児、小学生、大学生に刺激を呈示し、各刺激についての印象を測定した。同時に各被験者について言語性能力・ソーシャルスキル能力を測定し、これらの能力と上記の刺激との関連性について検討した。その結果、次のような点が明らかになった。1つは、否定的表情に対する評価が幼稚園児と、大学生では有意に異なる。一方、小学三年生と、大学生では差はあるものの、その差は有意ではなかった。2つめは、幼稚園児においては、言語性能力とソーシャルスキル能力には、相関が認められた。また、ソーシャルスキル能力の高い園児は、低い園児よりも表情認知力においても大学生の評定値との相関が高かった。
試験管ES細胞分化システムを用いた間葉系幹細胞の分化メカニズムの解明と医療応用

ES細胞から間葉系幹細胞を誘導しえたこと、この間葉系幹細胞は神経上皮細胞由来であることから、試験管内のES細胞の分化メカニズムと生体内の発生過程が同じであるのかを明らかにすることを目的として研究を行った。神経上皮特異的に発現している遺伝子であるSox1遺伝子にCreリコンビネースをノックインしたマウスを作成した。このマウスと、Rosa-stop-YFPマウスと交配することで、Creが発現すると、YFPが発現し、ひとたびCreが発現した細胞は、理論上Creを発現し続けることができるマウスを作成することに成功できた。このマウスを解析したところ、胎生期においては、YFP陽性すなわち神経上皮細胞由来のPDGFRα陽性の細胞が存在し、その細胞は多分化能および増殖能力を有しES細胞由来の間葉系幹細胞と同じ能力および形態の細胞であった。以上のことから、少なくとも胎生期において、神経上皮由来の間葉系幹細胞が生体内で存在することを証明しえた。次に出生後のマウスにて神経上皮由来の細胞が存在するのかを解析することにした。同様にSox1CreマウスとRosa-stop-YFPマウスを交配した。まず、間葉系幹細胞の存在が報告されている骨髄で解析をすることにした。出生直後のマウスを用いた解析からは、骨髄内にわずかではあるが、間葉系幹細胞が存在する、という所見を得た。この発生過程が、神経から直接関間葉系に分化するのか、Neural crestを経るのか、という問題に関して、PO-Creマウスを用いて、同様に行った。このとき、Sox1-Creマウスと同様にNeural Crestからも同様にできることがわかり、少なくともNeural Crestも神経上皮と同様の能力を持つということが分かった。ES細胞から間葉系幹細胞を誘導しえたこと、この間葉系幹細胞は神経上皮細胞由来であることから、試験管内のES細胞の分化メカニズムと生体内の発生過程が同じであるかを明らかにすることを目的として研究を行った。まず、長腕側8kb、短腕側3kbでターゲッティングベクターを作成した。TT2ES細胞にエレクトロポレーションしたところ、数個のホモロガスリコンビーネーションをしたES細胞を得ることができた。このES細胞のうち、2ラインからキメラマウスが生まれ、F1を得ることができた。Rosa-stop-YFPマウスと交配することで、Creが発現すると、YFPが発現し、ひとたびCreが発現した細胞は、理論上Creを発現し続けることができるマウスを作成することに成功できた。ヒトES細胞を用いて、マウスと同じ条件で間葉系幹細胞を得るために、分化誘導を行った。ひとES細胞は京都大学で樹立されたES細胞を用いた。
興奮性アミノ酸による選択的神経細胞障害の発現機序に関する研究

アクロメリン酸を全身投与すると脊髄介在ニュ-ロンの選択的変性による持続性の痙性対麻痺がラットに引き起こされる。このようなアクロメリン酸に特異的な神経障害作用のメカニズムを明らかにする目的で、1)受容体結合実験によりアクロメリン酸の作用する容受体を検索した。2)脊髄クモ膜下腔に興奮性アミノ酸を直接に投与することにより生ずる脊髄ニュ-ロンの変性の特徴を検索した。1)受容体結合実験は、ラット脊髄シナプトゾ-ム分画に対する[ ^3H]カイニン酸および[ ^3H]AMPA結合能をフィルタ-法を用いて測定した。脊髄の[ ^3H]カイニン酸および[ ^3H]AMPA結合部位は共に単一であった(Kd値:各6.2±0.35、7.6±1.5nM、Bmax値:52±1.6、70±5.6fmol/mg protein)。[ ^3H]カイニン酸結合能に対するアクロメリン酸の阻害作用はカイニン酸の1/30に過ぎず、[ ^3H]AMPA結合能に対するアクロメリン酸の阻害作用はキスカル酸の1/30であった。アクロメリン酸はラット後根神経をカイニン酸よりも強力に脱分極させるが、これはアクロメリン酸が[ ^3H]カイニン酸、[ ^3H]AMPA結合部位とは異なった受容体に作用して高い脱分極作用を発揮していることを示唆する。2)興奮性アミノ酸をラット脊髄クモ膜下腔に注入し、脊髄ニュ-ロンに対する興奮作用を比較すると、アクロメリン酸は、AMPAに比べて数十倍、カイニン酸に比べて100倍以上強力であること、半永続的な痙性対麻痺と、脊髄介在ニュ-ロンに特異的な神経細胞障害を引き起こすことが明らかになった。これは脊髄性の痙性対麻痺を研究するうえで極めて有用なモデルであると考えられる。興奮性アミノ酸の種類による違い、拮抗物質、神経変性のメカニズム、慢性投与による影響などを検討中である。
低温度差で熱音響現象を発生させる方法の基礎検討 -低温廃熱の有効利用に向けて-

低温度廃熱の有効利用を目指して,低温度で熱音響現象を発生,維持するための基礎研究を行った.粒子速度分布を調整するためにフェイズアジャスターを提案した.システム内に発生する音波の音圧と粒子速度の位相を調整し,低温度での発振に成功した.(2)音圧分布を調整するためにトリガーチューブ,(3)変位を調整するためにメンブレンを提案.3つの提案ともに効果を確認した.フェイズアジャスターを設置した条件においては300°C程度での発振に成功した.今後は更なる低温度差による発振条件を詳細に検討する必要があると考える.低温度廃熱の有効利用を目指して,低温度で熱音響現象を発生,維持するための基礎研究を行った.粒子速度分布を調整するためにフェイズアジャスターを提案した.システム内に発生する音波の音圧と粒子速度の位相を調整し,低温度での発振に成功した.(2)音圧分布を調整するためにトリガーチューブ,(3)変位を調整するためにメンブレンを提案.3つの提案ともに効果を確認した.フェイズアジャスターを設置した条件においては300°C程度での発振に成功した.今後は更なる低温度差による発振条件を詳細に検討する必要があると考える.熱音響冷却システムの冷却特性向上に向けて3つの提案を行い,その影響について検討した.1.粒子速度分布を調整するためにフェイズアジャスターを提案する。システムの断面積を狭くするデバイスで、システム内の粒子速度を調整する。PAはシステム内に発生する音波の音圧と粒子速度の位相を調整する役割を果たし,低い周波数である1波長共鳴とさせ,冷却特性を大幅に向上させることが確認された.3種類の内径の違うフェイズアジャスターを製作し、その効果を確認した。2波長共鳴を1波長共鳴にすることが可能となり、冷却効果の大幅な向上を確認した。また、熱エネルギーから音エネルギーへのエネルギー変換効率の大幅な向上を確認した。内径変化によって、変換効率も変化することを確認した。2.音圧分布を調整するためにトリガーチューブを提案する。システムの一部を分岐するデバイスで、システム内の音圧を調整する。トリガーチューブを3種類作製し、試作機に取り付けて、その効果の検証を行った。そのうちの1つにおいてのみ、熱エネルギーから音エネルギーへの変換効率の上昇を確認した。残りの2つにおいては変換効率を低下させていることがわかった。3.変位を調整するためにメンブレンを提案する。システムの断面を塞ぐ薄膜状のデバイスで、システム内の変位を調整する。数種類の薄膜を用いて、熱音響冷却システムに適用した。薄膜を導入することによって、熱エネルギーから音エネルギーへの変換効率の上昇を確認した。しかしながら、設置位置においては悪影響となる場合もあることが確認された。3つの提案ともに効率の向上を確認したが、条件(形状、位置など)を選ぶ必要があることが確認された。昨年度に続き,熱音響冷却システムの冷却特性向上に向けて3つの提案を行い,その影響にういて検討した.1.粒子速度分布を調整するためにフェイズアジャスターを提案した.断面積を狭くするデバイスでシステム内の粒子速度を調整する.フェイズアジャスターはシステム内に発生する音波の音圧と粒子速度の位相を調整する役割を果たし,低い周波数である1波長共鳴とさせ,冷却特性を大幅に向上させることが確認された,数種類の長さの違うフェイズアジャスターを製作し,その効果を確認した,低温度での発振,冷却効果の大幅な向上を確認した.2.音圧分布を調整するためにトリガーチューブを提案した.システムの一部を分岐するデバイスで、システム内の音圧を調整する.トリガーチューブをさらに数種類試作し,試作機に取り付けて,その効果の検証を行った.トリガーチューブについては形状において大きなばらつきがあり,継続して性能の評価をする必要があると考える.3.変位を調整するためにメンブレンを提案した,システムの断面を塞ぐ薄膜状のデバイスで,システム内の変位を調整した.薄膜を導入することによって,低温度発振ならびに熱エネルギーから音エネルギーへの変換効率の上昇を確認した.3つの提案ともに効率の向上を確認したが,条件(形状,位置など)を選ぶ必要があることが確認され,低温度差での発振に成功した.今後は更なる低温温度による発振条件を詳細に検討する必要があると考える.
乳腺上皮の増殖調節に関する分子生物学的研究

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。乳腺上皮細胞の分裂増殖は、多数のホルモンにより制御される複雑な現象である。これらホルモンの相互作用を解明するためには、in vitroにおける個々のホルモンの作用機序を調べるとともに、成長因子の細胞内情報伝達における相互作用を明らかにすることが必要である。本研究は、このような目的のもとに計画されたものである。乳腺上皮の増殖は、生体ではエストロゲン、プロゲスタゲン、成長ホルモン、プロラクチンなどによって調節されているが、培養条件下では、これらのホルモンには直接の分裂誘導作用がなく、間接作用と考えられる。乳腺には成長ホルモンのレセプターが存在せず、成長ホルモンの作用は、肝臓よる分泌されるインシュリン様成長因子を介するものと考えられる。本研究では、コラーゲンゲル細胞培養法により、インシュリン、インシュリン様成長因子、上皮成長因子などの乳腺上皮細胞に対する増殖作用を調べるとともに、これら成長因子の細胞内情報伝達に関与するMAPキナーゼ、細胞分裂のG1/S期、G2/M期を制御する酵素であるcdk2キナーゼ、cdc2キナーゼなどの酵素蛋白質の存在をイムノブロット法により検出することを試みた。その結果、細胞培養では乳腺上皮細胞はインシュリン、インシュリン様成長因子、上皮成長因子の単独、または組合せにより増殖し、これらの1つが必須である。エストロゲンは効果がなく、プロラクチンとプロゲステロンの組合せは上記3種類の成長因子の1つが存在する場合にのみ有効であった。MAPキナーゼ、cdk2キナーゼ、cdc2キナーゼは、同期中、妊娠、泌乳の各時期に同様に存在し、成長因子のレセプターからのシグナルによって常に活性化される状態にある。今後は、これら蛋白質の酵素活性を測り、活性型か非活性型かを検討するとともに、これら成長因子のレセプターがどのように調節されているかを明らかにすることが重要である。細胞培養系では、乳腺上皮細胞は基本的にはインシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子により増殖する。

プロラクチンとプロゲステロンはこれらをさらに促進する。インシュリン、IGF-I、EGFのシグナル伝達においては、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、ほとんど増殖のない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、その時期にかかわらず、MAPキナーゼは存在し、レセプターからのシグナルがあり次第伝達される状態であると考えられる。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することを試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより増殖が特異的に刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により特に変化は見られず、また、酵素活性にも変化はなく、MAPキナーゼの経路が使用されていない可能性が示唆された。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されるので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。ところで、乳腺は、周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。
クロロフィル窒素同位体比による海洋窒素循環の解析

植物プランクトンの光合成に伴う無機態窒素利用に関する知見の獲得を目的として、西部太平洋の亜寒帯・亜熱帯の2地点(K2, S1)の2012年から2015年の夏季ブルーム期間に、表層域のクロロフィル色素の窒素同位体比、一次生産者の光合成基質となる無機態窒素の濃度と窒素同位体比を測定した。得られたデータを分担者が開発した安定同位体海洋窒素循環モデルを用いて解析した結果、西部北太平洋における植物プランクトンによる栄養塩窒素利用バランスが定量的に復元された。研究成果の一部は査読論文および国際学会・国内学会にて発表され、他の成果も早期に論文および学会として発表するよう準備中である。本年度は研究計画初年度のため、特に海水中から採取される懸濁粒子試料中からクロロフィルを抽出および単離・精製するための手法の最適化を行い、本応募研究の実施に必要な技術的基盤を確立することに専念した。申請者らがこれまで実施してきた堆積物試料中のクロロフィルと比べて、懸濁粒子中に含まれるクロロフィルは量が相対的に少なく、また分解生成物や夾雑物の組成も異なるものとなるため、特に精製法に関しては、注意深い吟味も必要となる。これらを踏まえて、平成25年度は、1.海水試料濾過による懸濁態試料の捕集作業の簡便化、2.懸濁態試料からのクロロフィルの抽出手法の改良、3.単離精製クロロフィル試料の元素分析計/同位体質量分析計測定における試料導入システムの高効率化を実施した。試料として東京湾・相模湾の沿岸域海水試料を中心に用い、主たる研究試料としては、平成24年度7月に採取した西部北太平洋海洋試料、同海域にて平成25年度年度7月に追加採取した試料を用いた。この結果、2.に関しては酸素雰囲気との暴露を少なくすることで試料抽出中のクロロフィル損失を縮小することが可能となった。また、3.に関しては現在装置の改良による改善が認められた。これらに関しては今後より詳細な検証を継続する。現時点までの手法最適化の結果、外洋域の有光層POM試料の一部に於いて、抽出したクロロフィルaの窒素同位体比分析が可能となり、得られた懸濁態粒子、硝酸態窒素、クロロフィルa窒素のそれぞれの窒素同位体比の関係性については、初期的な解析も実施された。得られた成果の一部は、国内外の学会・会議等において報告し公表された。平成26年度における試料採取はほぼ予定通り完了し、硝酸態窒素とクロロフィルの安定同位体比測定が実施された。懸濁粒子中のクロロフィル色素についても、概ね順調に試料処理と安定同位体比分析のプロセスが進行中である。本年度採取した試料についての硝酸態窒素同位体比測定は全て完了し、濃度・安定同位体比の双方に於いて、詳細な鉛直プロファイルが得られた。硝酸態窒素を含む無機態窒素の情報は、植物プランクトンにおける光合成の基質情報となり、クロロフィル色素の窒素同位体比情報と共に、定量的な海洋窒素循環モデルのための主要情報となる。平成26年度は海洋中のピコプランクトンの単離分析技術についての技術開発試験も実施された。貧栄養海域にて光合成を担うシアノバクテリアは、ガラス繊維ろ紙を用いた従来手法では捕捉が困難であり、ピコプランクトン類の捕集と単離の手法確立は、貧栄養海域の窒素循環研究において特に重要性を増す。一方、いわゆる微生物研究を目的に開発された既存の手法は、試薬等に窒素や炭素を含むことが多く、安定同位体比を用いた研究には適さない。平成26年度は特に「安定同位体比分析に干渉せず、本来の作業性や有効性を阻害の少ない代替試薬類」の選定を目的に、凍結・濃縮・試料単離の各前処理手法等において検討が重ねられた。検討結果を経て、S1地点の海水試料について実施された試験分析では、セルソーターを用いて分離された真核生物と原核生物のそれぞれについて同位体比測定を行い、炭素安定同位体比データを得ることが出来た。このような微細試料採取の新技術は、超微量安定同位体比技術とを合わせることでより深い情報となることが予想され、化合物レベルでの安定同位体比情報と共に、物質循環や生態環境の分野だけでなく、生化学分野にも新しい可能性を生み出す礎になることが期待される。平成27年度は調査対象としていた西部太平洋の亜寒帯・亜熱帯の2地点のうち、亜寒帯域のK2地点において表層域(200m以浅)の懸濁態全窒素同位体・クロロフィル窒素同位体比、一次生産者の光合成基質となる無機態窒素濃度測定、硝酸態窒素同位体比測定用の試料の採取を行い、これまでに本研究で採取された試料と共に各項目についての分析を行った。最終年度である平成27年度は、より明確な「植物プランクトンによる光合成とそれに伴う無機態窒素利用」に関する知見の獲得を目的として、亜寒帯域のサイトにおいて、無機態窒素量が変化しているタイミングで複数回の試料採取を行い、光合成における窒素利用の変化に関する解析を実施した。外洋域におけるより簡便かつ効率的な試料採取手法として、試料採取において大型現場ろ過装置を用いた大容量サンプリング手法を新たに導入した。またクロロフィル色素の窒素動態比分析は本研究課題において平成26年度までに検討・開発を実施した手法を適用した。

平成27年度および本研究でこれまでに採取された試料について得られた栄養塩濃度、硝酸態窒素およびクロロフィル色素の分子レベル窒素同位体測定結果は、分担者がYoshikawa et al.(2005)をもとに本研究海域にあわせて再構築した海洋窒素循環モデルを用いて解析され、これにより西部北太平洋における植物プランクトンによる栄養塩窒素利用バランスが計算された。これらの結果の一部は国内・国際での学会等で発表され論文として執筆中である。植物プランクトンの光合成に伴う無機態窒素利用に関する知見の獲得を目的として、西部太平洋の亜寒帯・亜熱帯の2地点(K2, S1)の2012年から2015年の夏季ブルーム期間に、表層域のクロロフィル色素の窒素同位体比、一次生産者の光合成基質となる無機態窒素の濃度と窒素同位体比を測定した。得られたデータを分担者が開発した安定同位体海洋窒素循環モデルを用いて解析した結果、西部北太平洋における植物プランクトンによる栄養塩窒素利用バランスが定量的に復元された。研究成果の一部は査読論文および国際学会・国内学会にて発表され、他の成果も早期に論文および学会として発表するよう準備中である。予定していた試料は順調に採取が完了し、クロロフィルおよび硝酸態窒素同位体比等の分析も順調に進行している。微小サイズの光合成生物に関する試料採取技術の試験も実施され、安定同位体データを得るために必要な前処理条件等について、一定の成果が得られた。以上より、平成26年度までの研究の進展はおおむね順調であると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物地球化学これまでの研究結果に沿い、平成26年度までに採取された試料および平成27年度に追加で入手予定の西部北大西洋試料について、クロロフィル窒素および、無機態窒素の安定同位体測定を実施し、窒素同位体モデルの進化を図る。平成27年度の西部北太平洋での試料採取においては、本年度試験を行った2種類の海水中微小光合成生物分画手法の、現場実験を実施する。ここでは近年進化の著しい海洋水中からの微小光合成生物の採取および単離の新技術と超微量安定同位体比技術とを合わせた研究を念頭に、新しいタイプの安定同位体試料の獲得と、これによる新たな安定同位体知見を得ることを予定している。海洋光合成生物に関する研究手法の開発は、生元素同位体比を用いた物質循環や生態環境はもとより、微生物を用いた生化学分野の研究にも新しい可能性を生み出すことが期待される。基本的な研究体制に変更はない。平成27年度も、海洋試料の採取は分担者が、有機態窒素の同位体比測定と解析は代表者、無機態窒素測定と物質循環モデルの構築は分担者が、それぞれ実施する。得られたデータの全体での検討と解析・解釈は、逐次、代表者と分担者とで議論しつつ行う。得られた成果は順次、学会や論文の形で公表予定である。研究目的については、一部に於いて若干の遅れが認められるものの、概ね計画通りに進行している。試料採取の簡便化手法について、当初期待した通りの成果が得られなかったため、使用予定であった機器装置をの変更を余儀なくされて、この点で若干遅れが出ている。一方で、同位体質量分析装置における試料導入手法等の改善により、初年度に検証と並行してえる予定であった、西部北太平洋での試料測定データは期待通りに得ることが出来たため、全体としての遅れは小さく、概ね順調に進行していると判断した。研究の進展過程で予測と異なる結果が得られたことから、一部の試薬・実験器具について購入の是非を判断するための追加の検証実験を実施した。
コンクリート構造物用基準の新たな体系に関する企画調査

コンクリート構造物用基準の新たな体系の構築を目的として,土木学会コンクリート標準示方書に対して全体の合意事項としての提言と各研究分担者の提言とを行った.合意事項としての提言は以下のとおりである.1.2部構成の導入いわゆる示方書(原則と性能照査法)とマニュアルの2部構成とする.前者はコードライター用で,後者が現場技術者用である.マニュアルの性格は,各編で異なる.例えば,(構造)設計編では,設計例のようなものである.2.共通編(原則編)の導入共通編(原則編)のように,各編に共通的に必要な,もしくは,原則的な内容を記した編を新たに導入する.共通編はダム編,舗装編も対象とする.3.各編の構成(構造)設計編、材料施工編,維持管理編,ダム編,舗装編,規準編とする.ただし,これらの名称は仮称である.4.作用に関する記述の拡充他の分野の成果を待つのではなく,他の分野との連携を積極的に視野に入れながら,作用に関する,特に作用の決め方に関する記述の拡充を図る.他の分野の人には,コンクリート構造物側として何が必要なのかを示す.5.改定作業工程の改善原稿完成後,一定期間社会から公に意見を求める期間を置くとともに,その間に設計例を作成する.全ての編を同時に発刊するのではなく,例えば,毎年1編ずつなどのように,発刊時期をずらす.コンクリート構造物用基準の新たな体系の構築を目的として,土木学会コンクリート標準示方書に対して全体の合意事項としての提言と各研究分担者の提言とを行った.合意事項としての提言は以下のとおりである.1.2部構成の導入いわゆる示方書(原則と性能照査法)とマニュアルの2部構成とする.前者はコードライター用で,後者が現場技術者用である.マニュアルの性格は,各編で異なる.例えば,(構造)設計編では,設計例のようなものである.2.共通編(原則編)の導入共通編(原則編)のように,各編に共通的に必要な,もしくは,原則的な内容を記した編を新たに導入する.共通編はダム編,舗装編も対象とする.3.各編の構成(構造)設計編、材料施工編,維持管理編,ダム編,舗装編,規準編とする.ただし,これらの名称は仮称である.4.作用に関する記述の拡充他の分野の成果を待つのではなく,他の分野との連携を積極的に視野に入れながら,作用に関する,特に作用の決め方に関する記述の拡充を図る.他の分野の人には,コンクリート構造物側として何が必要なのかを示す.5.改定作業工程の改善原稿完成後,一定期間社会から公に意見を求める期間を置くとともに,その間に設計例を作成する.全ての編を同時に発刊するのではなく,例えば,毎年1編ずつなどのように,発刊時期をずらす.
パンコムギの冠水耐性に働く核・細胞質ゲノム間相互作用の解析

水田転作畑でのパンコムギ栽培は,排水性に難のある水田転作畑においても斉一で良好な幼苗生育を保証する,冠水耐性を備えたパンコムギ品種の育成が求められている。申請者らはこれまでに冠水ストレス応答性が異なるパンコムギ核細胞質置換系統を見つけ出した。本研究では,これらの系統を対象に網羅的な遺伝子発現解析を行い,核ゲノムとの情報交換を通じた細胞質ゲノムの冠水ストレス耐性への寄与を明らかにすることを目指す。
メチルメルカプタン高産生能を示すP.gingivalisの特性

【研究目的】:歯周病原細菌は、脱落上皮細胞、白血球、歯肉溝滲出液等をタンパク分解することで得られたメチオニンやシステインの代謝・合成から、硫化水素(H_2S)、メチルメルカプタン(CH_3SH)、ジメチルサルファイド((CH_3)_2S)といった口臭関連ガスである揮発性硫黄化合物(Volatile Sulfur Compounds、以下VSCs)を産生し、口臭症に関与している。歯周病原細菌の中でPorphyromonas gingivalis(P.g)はメチルメルカプタンの産生能が高いと報告されているが、同じP.gであっても臨床分離株においては、菌株レベルでVSCs産生能に違いがあると予想される。一般的に歯周病原細菌も垂直感染が主と考えられ、P.gingivalisのメチルメルカプタン高産生能株の検出・特性を解明することは口臭治療に多大な影響を与えると考える。本研究はP.gのVSCs産生能に関わる因子を明らかにするため、硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイドについて口臭症患者から分離したP.g臨床分離株および標準菌株を用いて、VSCsガス産生能の違いを菌株レベルで検討を行った。【研究方法】:1.P.g臨床分離株の分離と同定方法患者の5分間刺激唾液の10^5倍希釈したものをCDCバクテロイデス選択培地に播種し嫌気培養後黒色コロニーから染色体DNAを抽出し、PCR法を用いて16srRNAを増幅して確認した。2.P.g臨床分離株および標準菌株を用いて、L-メチオニン90分作用時のVSCsガス産生能の違いを菌株レベルで分析した。【研究成果】:標準菌株間でVSCs産生能を比較すると、硫化水素(H_2S)についてはW83,W50,11が高く、メチルメルカプタン(CH_3SH)についてはS-2,GT-6が高く、ジメチルサルファイド((CH_3)_2S)についてはW50,S-2が高い値を示した。臨床分離株においても3種それぞれのガスが優位に高い値を示す菌株が存在した。本実験から、P.gはメチルメルカプタンの産生能が高いと言われているが、P.g標準株及び臨床分離株へのL-メチオニン添加によるメチルメルカプタンの産生能は菌株間で違いがあることが明らかとなった。一方で、3種ガスの内、2種において高濃度のガス産生を示す菌株も存在した。これは産生経路に係わる酵素活性の違いなどによるものと考えられる。今後、これらの酵素活性に関して、産生能の高い菌株および低い菌株について遺伝子レベルでの検討が必要と考える。
ワルファリン投与初期の治療に対するCYP2C9、VKOR遺伝子型の影響

背景および目的Vitamin K oxide reductase(VKOR)-1639G>A、cytochrome P450(CYP)2C9*2および*3の遺伝子多型はワルファリンの維持投与量に大きな影響を及ぼす。近年、これらの遺伝子型に基づいてワルファリンの適正投与量を設定し、患者ごとに個別化された抗凝固療法が注目されている。そこで、VKORおよびCYP2C9遺伝子多型がワルファリン用量決定へ与える影響を明らかにし、遺伝子型に基づく初期投与量設定の最適化に関する検討を本研究の目的とする。方法文書による同意を得たワルファリン服用患者73名から採血し、VKORおよびCYP2C9の遺伝子型をSMart Amplification Process (SMAP)法により判定した。これらの患者について、服用開始から維持投与壁決定までに要した日数を調査し、遺伝子型ごとに比較した。結果VKOR-1639AAおよび-1639GAの遺伝子型を有する患者のワルファリン維持投与量はそれぞれ3.0±1.2mg/dayおよび4.0±1.2mg/day、CYP2C9*1/*1および*1/*3の患者ではそれぞれ3.2±1.3mg/dayおよび2.5±1.3mg/dayであった。維持投与量決定までに要した日数は、VKOR-1639AA、-1639GAの患者でそれぞれ20.4±22.6 dayおよび29.8±28.2 day、CYP2C9*1/*1およびCYP2C9*1/*3の患者ではそれぞれ22.0±24.1 dayおよび22.3±19.1 dayであった。考察日本人で低頻度の、VKOR-1639GAの遺伝子型を有する患者で、維持投与量決定までに要する日数が長くなる傾向がみられた。したがって、遺伝子型に基づいた初期投与量設定は、ワルファリンによる抗凝固療法の最適化に寄与すると考えられる。
H. suis感染胃MALTリンパ腫形成に関わるCXCL13発現メカニズムの解明

Helicobacter suis (H. suis)は、ヒト胃MALTリンパ腫発症に関与しているグラム陰性細菌であり、感染マウスにおいては、その100%の確率で胃にMALTリンパ腫を発症することが知られている。近年、申請者は、H. suisをマウスに感染すると、H. suis感染後に誘導されるIFN-γならびにCXCL13の発現上昇が胃MALTリンパ腫を発症させる重要な遺伝子であることを明らかにしたが、それら2つの遺伝子発現と胃MALTリンパ腫発症との関連性を示す詳細なメカニズムは明らかにされていない。申請者は、H. suis感染後の胃MALTリンパ腫内に存在する各々の細胞のCXCL13の発現について解析したところFDCに高い発現を認めた。また、同様に胃粘膜に浸潤した細胞上の遺伝子発現について網羅的に解析した結果、他の細胞に比べてFDC上でIFNGRの発現が亢進していることが明らかとなった。さらに、IFN-γの産生を介したFDCからのCXCL13産生と胃MALTリンパ腫発症との関連性を明らかにするためにCXCL13欠損マウスを用いてFDCならびに組換えIFN-γを投与しH. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成を評価した。結果としてCXCL13欠損マウスではH. suis感染後の胃MALTリンパ腫が有意に抑制されていたが、FDCならびに組換えIFN-γを同時投与した群では胃MALTリンパ腫形成が回復されていた。一方で、胃MALTリンパ腫を構成する各々の細胞を精製し組換えIFN-γで刺激したところFDCにおいてCXCL13が産生されることが明らかとなった。これらのことからH. suis感染においては感染後に誘導されるIFN-γによるFDC上のIFNGRを刺激する結果、CXCL13産生を促進し、胃MALTリンパ腫の形成維持に機能していることが示唆された。Helicobacter suis (H. suis)は、グラム陰性細菌で、ヒトを含む多くの動物種の胃に感染し、人畜共通感染症の原因菌として想定されている。この菌をマウスに経口感染させると、その100%の確率で胃にMALTリンパ腫を発症することが知られている。しかしながら、これまでにH. suis感染後に誘導される胃MALTリンパ腫の詳細な形成メカニズムは明らかにされていない。近年、申請者は、H. suisをマウス胃粘膜に感染すると、胃粘膜B細胞から産生されるIFN-γが胃MALTリンパ腫形成に関連していること、また、感染胃粘膜では、B細胞の走化性に関与するケモカインCXCL13が高発現しており、抗CXCL13抗体を用いたH. suis感染マウスへの投与は、胃MALTリンパ腫発症を有意に抑制させることが明らかとなっている。これにより、H. suis感染後に誘導されるIFN-γ、ならびに、CXCL13の発現上昇が胃MALTリンパ腫を発症させる重要な遺伝子であると考えられる。本申請では、IFN-γの刺激による濾胞樹上細胞からのCXCL13産生を介したH. suis感染後の胃MALTリンパ腫発症との関連性を評価するために、H.suis感染CXCL13欠損マウスに精製した濾胞樹上細胞を移入する。その後、組換えIFN-γをマウスに投与し、感染後の胃MALTリンパ腫形成を評価する。また、IFN-γ刺激後の濾胞樹上細胞から産生せれるCXCL13を評価するために、組換えIFN-γを用いてマウスから精製した濾胞樹状細胞に刺激させ、CXCL13産生をin vitroで評価する。さらに、IFN-γ刺激後の濾胞樹状細胞から誘導されるCXCL13産生の分子メカニズムを詳細に検討するために、組換えIFN-γを用いてた細胞刺激実験を行い、その産生機序を明らかにする。平成29年度は以下の項目について検証を行った。1) H. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成と濾胞樹上細胞(FDCs)から産生されるCXCL13との役割CXCL13欠損マウスにH. suisを経口感染させ、さらに、野生型マウス由来FDCsをフローサイトメトリーを用いて精製し、H.suis感染CXCL13欠損マウスに移入した。その後、感染2週間後に組換えIFN-γをマウスに投与し、感染マウスにおける胃MALTリンパ腫形成を評価する予定する。本研究に使用予定であったCXCL13欠損マウスの作成に時間がかかってしまい現在進行中である。2) H. suis感染胃粘膜に浸潤した細胞上の遺伝子発現解析H. suis感染マウスの胃を摘出し、酵素処理後、感染胃粘膜に浸潤した各々の細胞上IFNGRの発現をフローサイトメトリーにて評価した。結果、感染胃粘膜に浸潤しているB細胞、T細胞、DCs、ならびに、FDCsにおいてFDCs上で高いIFNGRの発現が認められた。3)IFN-γの刺激によるFDCsからのCXCL13産生メカニズム野生型マウス脾臓を摘出し、B細胞、T細胞、DCs、ならびに、FDCsをセルソーターで精製した。

精製後の細胞を培養皿にまき、コントロール群、組換えIFN-γ、抗IFNGR抗体処理群、ならびに、組換えIFN-γと抗IFNGR抗体処理群で刺激実験を行い、刺激細胞のCXCL13を定量的PCR法で、さらに、培養上清中に産生されるCXCL13をELISA法で検出した。結果、組換えIFN-γの刺激により、FDCsからCXCL13が産生されることを明らかにした。今年度予定していた上記1)の実験が期間内に終了できなかったが、次年度予定していた3)の実験を行い、予想通りの結果が得られたことから、おおむね順調に進展しているものと判断している。Helicobacter suis (H. suis)は、ヒト胃MALTリンパ腫発症に関与しているグラム陰性細菌であり、感染マウスにおいては、その100%の確率で胃にMALTリンパ腫を発症することが知られている。近年、申請者は、H. suisをマウスに感染すると、H. suis感染後に誘導されるIFN-γならびにCXCL13の発現上昇が胃MALTリンパ腫を発症させる重要な遺伝子であることを明らかにしたが、それら2つの遺伝子発現と胃MALTリンパ腫発症との関連性を示す詳細なメカニズムは明らかにされていない。申請者は、H. suis感染後の胃MALTリンパ腫内に存在する各々の細胞のCXCL13の発現について解析したところFDCに高い発現を認めた。また、同様に胃粘膜に浸潤した細胞上の遺伝子発現について網羅的に解析した結果、他の細胞に比べてFDC上でIFNGRの発現が亢進していることが明らかとなった。さらに、IFN-γの産生を介したFDCからのCXCL13産生と胃MALTリンパ腫発症との関連性を明らかにするためにCXCL13欠損マウスを用いてFDCならびに組換えIFN-γを投与しH. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成を評価した。結果としてCXCL13欠損マウスではH. suis感染後の胃MALTリンパ腫が有意に抑制されていたが、FDCならびに組換えIFN-γを同時投与した群では胃MALTリンパ腫形成が回復されていた。一方で、胃MALTリンパ腫を構成する各々の細胞を精製し組換えIFN-γで刺激したところFDCにおいてCXCL13が産生されることが明らかとなった。これらのことからH. suis感染においては感染後に誘導されるIFN-γによるFDC上のIFNGRを刺激する結果、CXCL13産生を促進し、胃MALTリンパ腫の形成維持に機能していることが示唆された。平成30年度は以下の項目について検証を行う。1) H. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成と濾胞樹上細胞(FDCs)から産生されるCXCL13との役割について検証する。方法:CXCL13欠損マウスH. suisを経口感染させ、さらに、野生型マウス由来FDCsをフローサイトメトリーを用いて精製し、H.suis感染CXCL13欠損マウスに移入した。その後、感染2週間後に組換えIFN-γをマウスに投与し、感染マウスにおける胃MALTリンパ腫形成を評価する予定である。2)IFN-γ刺激後のFDCsから産生されるCXCL13の分子メカニズムの解明を行う。方法:野生型マウス脾臓を摘出し、0.83%の塩化アンモニウムを用いて赤血球を除去する。その後、B細胞特異的抗体、T細胞
ランチビオティックnukacin ISK-1の作用機作の分子機構の解析

1.菌株特異的作用機作の解明昨年度の研究成果から、ランチビオティックnukacin ISK-1は菌株により作用機作(静菌あるいは殺菌的)が異なるというこれまでの概念を超えた結果を得た。今年度は、殺菌作用をさらに詳細に解析した。nukacin ISK-1が検定菌からのATP漏出や検定菌の細胞膜を用いて調製したリポソームからの低分子蛍光物質の漏出を引き起こさなかったが、カリウムイオンのような低分子の溶出が確認され、nukacin ISK-1が小さなサイズの孔あるいはカリウムイオンに特異的な孔を形成することが示された。我々は他のランチビオティックであるmersacidin、lacticin3147のLtn A1、plantaricin Cに見られるようなlipid IIに結合する保存モチーフ(TxS/TxD/EC)をnukacin ISK-1のリングA領域にも見出した。また、これまでに等温滴定型熱量計を用いてnukacin ISK-1と標的分子である細胞壁前駆体lipid IIとの結合を認めた。しかし、lipid IIとnukacin ISK-1のどの部分が結合に関与するのか、nukacin ISK-1のどの領域が関与するのか、結合することで構造変化がみられるのか、など分子情報は不明であったので、核磁気共鳴(NMR)を用いてnukacin ISK-1-lipid II複合体の構造を分子レベルで解析することを試みた。大腸菌でのランチビオティック生産系を用いて、^15N,^13Cラベル化nukacin ISK-1を調製した。また、lipid IIの水溶性アナログを合成して、nukacin ISK-1との相互作用や複合体の高次構造を解析している。(抄録なし)ランチビオティックが一般の抗生物質と異なり選択的な抗菌活性を示す要因は何に依存するのか検証する必要がある。なぜならランチビオティックの構造に基づく作用機作の分子機構解明は、新規で優れた諸性質を兼ね備えたランチビオティックの合成にとって必要不可欠であるからである。我々はランチビオティックnukacin ISK-1がBacillus subtilisやStaphylococcus aureusに対して静菌的に作用することを報告している。ところが、最近、nukacin ISK-1がMicrococcus luteusやStaphylococcus simulansに対しては殺菌的に作用し、菌株により作用機作が異なるというこれまでの概念を超えた結果を得た。本研究では、nukacin ISK-1が菌株により殺菌作用または静菌作用を示す要因を多面的に解析した。殺菌的に作用することで知られているランチビオティックnisin Aをコントロールとして用いた。nukacin ISK-1を最小生育阻止濃度の5倍量添加すると、M.luteusやS.simulansは菌体濃度や生菌数が大きく低下したが、その程度はnisin Aに比べて若干劣っていた。また、これらの菌株の膜電位の崩壊の程度はnukacin ISK-1とnisin Aで同程度であった(約40-50%)。また、透過型電子顕微鏡を用いた細菌の形態観察から、nukacin ISK-1の添加によってM.luteusは細胞死に至っていることがわかったが、死菌体の数はnisinAに比べて少なかった。さらに、nukacin ISK-1が検定菌からのATP漏出や検定菌の細胞膜を用いて調製したリボソームからの低分子蛍光物質の漏出を引き起こさなかったことから、nukacin ISK-1が検定菌の細胞膜に孔を形成する可能性は低いことが示唆された。計画書の作成段階で、予想される問題点を明確にしていたことと、数値目標を定め多方面からの検討を柔軟に行ったことが順調に進展する結果となった。また、研究代表者と分担者が互いの専門領域で柔軟に対処したことも大きな要因と言える。