hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線CTデータを活用したモデル生物の高精細3DCGアトラス作成の試み

【研究目的】近年、生物学分野の研究においてもX線CT装置が広く活用されるようになった。しかしながら、それらCTデータから得られる断面像を正確に理解するためには、生物種ごとの形態学的知識や画像解析ソフトウェア操作の習得などが不可欠で研究活用への大きな障壁となっている。この解析面での問題を解決するために、当研究所が生物遺伝資源事業で提供するモデル生物(マウス、ゼブラフィッシュ、イネ)について、X線CTの性能を最大限に引き出した高精細な画像を取得し、それらのデータから煩雑な画像解析ソフトウェアを使用することなく観察可能な断面動画や、構造物を直感的に理解しやすい3DCGモデルを作成し、構造名を付記して公開する「3D画像アトラス」作成プロジェクトを計画している。今年度はその基盤となるCGソフトウェアの導入と、それらを用いた3Dモデルデータの作成およびネット上への公開方法を検討した。【研究方法】マウス胎児(10.518.5日齢)のCTスキャンデータを使用し、断面動画の作成にはOsiriXを、全身や内部臓器の3Dモデル作成にはImarisを使用した。3Dモデル作成の第1段階としてImarisによる臓器抽出法を検討し高精細な3Dモデルを得た。第2段階としてそのモデルを高性能CGソフトウェア「CINEMA4D」に読み込み、3D空間内に臓器観察しやすいようにモデルを配置し、次いでポリゴン削除などの編集を行った後、Web公開用の3Dモデルデータを作成した。第3段階としてそのデータを3Dモデル共有サイト「Sketchfab」に投稿し、臓器名の付記など各種設定を行って公開した。【研究成果】OsiriXによる効果的な断面動画作成法や、Imarisによる高精細3Dモデル作成法を見出した。これらの手法はマウス胎児を中心にゼブラフィッシュやトウモロコシなどの実際の研究支援に活用され複数の論文発表に貢献した。またCINEMA4Dについてはセットアップと並行して講習会等に参加して基本的な操作法を習得し、実際にSketchfab上に合計30個の3Dモデル(マウス胎児全身10、マウス胎児の脳2、マウス胎児内臓4、ゼブラフィッシュ8、棘皮動物6)を公開した。これらのモデルは様々な角度から自由に観察可能であり「3D画像アトラス」として十分に機能することを確認した。
違法ドラッグ及びその代謝物の一斉構造決定を可能にする新システムの開発

近年、薬物成分を配合した違法ドラッグは大きな社会問題となっている。本研究では、違法ドラッグ成分の正確かつ迅速な分析システムの開発、および分解物・代謝物の簡便な探索・同定方法の検討を行った。350種類以上の指定薬物アナログについてGC-MS、LC-PDAおよびLC-QTOF/MSで測定可能な分析条件を設定した。実際のドラッグ製品を当該条件で分析したところ、分解物や合成副生成物と考えられる化合物が検出されたため、その構造同定を行い、生成機構を推察した。近年、指定薬物等を配合した違法ドラッグが大きな社会問題となっている。指定薬物と類似の構造を持つ指定薬物アナログは無数に合成されており、取締りに際しては化学構造の差異を正確に捕捉可能な分析法が不可欠である。また、それらの化合物が人体に摂取されたのち、どのような構造の代謝物として排出されるかはほとんど知られていない。本研究課題では、違法ドラッグ成分である指定薬物と指定薬物アナログの正確かつ迅速な分析システムの開発、および簡便な指定薬物アナログ代謝物の探索・同定方法の検討を行う。今年度は、違法ドラッグ成分である指定薬物アナログを対象とした一斉分析法の開発準備と、ヒト薬物代謝酵素による代謝物生成の調査を行った。1)多数の標準品を整備しLC/PDA、GC-MSおよびLC/QTOF-MSの分析条件を設定した。また、実際に府下で流通している違法ドラッグ検体を用いて、溶媒の種類や抽出時間、抽出方法の違いによる成分抽出効率の検討を行った。加えて、市販されていない指定薬物アナログの化学合成を行い、10種類の新規化合物を合成した。その結果、分析対象化合物を250種類以上とした。2)違法ドラッグ成分であるカチノン系化合物33種類について、LC/QTOF-MSによる各化合物の分析を行った。このうち、同一分子量を有する14の化合物について、一斉分析法の開発を試みた。構造が非常に類似した化合物においては、LC/QTOF-MSでは分離不十分な化合物も存在したが、GC/MS・LC/ PDAを併用することで、区別可能であることを確認した。3)指定薬物にヒト薬物代謝酵素を加えてインキュベートし代謝物の生成の有無を調査したところ、代謝物の生成が認められた。今年度は、違法ドラッグ成分である指定薬物アナログを対象とした分析法の開発と、LC-NMR分析条件検討を行った。さらに製品より検出された薬物成分の分解物の構造決定を行った。1)70種類以上の標準品を配備し、LC-PDA、GC-MSおよびLC-QTOF/MSの分析条件を設定した。加えて、市販されていない指定薬物アナログの化学合成を行い、7種類の新規化合物を合成した。その結果、分析対象化合物を300種類以上とした。2)実際の違法ドラッグ検体を用いて分析条件検討を行い、LC-PDAでの酸や界面活性剤を含まない系での分離条件を設定した。またこの分析条件を用いてLC-NMRによる分析を行い、違法ドラッグ検体に含まれる成分の構造決定を達成した。3)違法ドラッグ製品より検出された薬物成分の分解物について、NMRとX線結晶構造解析を利用して構造決定を行った。また薬物成分より分解物が生成する条件を調査し、その生成機構を推定した。近年、指定薬物等を配合した違法ドラッグ(危険ドラッグ)が大きな社会問題となっている。今年度は、類似構造を有する指定薬物アナログについてヒト代謝酵素による代謝実験を行い、生成物を分析した。さらに製品より検出された薬物の合成副生成物の構造決定を行った。1)新たに配備した約50種類の違法ドラッグ標準品について、LC-PDA、GC-MSおよびLC-QTOF/MSの分析条件の設定を行うとともに、スペクトルライブラリを作成した。加えて、市販されていない指定薬物アナログの化学合成を行い、8種類の新規化合物を合成した。その結果、分析対象化合物を350種類以上とした。2)類似した構造を持つ指定薬物アナログについて、肝ミクロソームを用いたin vitroの系で代謝実験を行った。その結果、指定薬物アナログの含窒素骨格の違いが代謝されやすさに影響する傾向があることを明らかにした。3)違法ドラッグ製品より検出された薬物の合成副生成物について構造決定を行った。また副生成物が生成する条件を調査し、その生成機構を推定した。

本研究では、違法ドラッグ成分の正確かつ迅速な分析システムの開発、および分解物・代謝物の簡便な探索・同定方法の検討を行った。350種類以上の指定薬物アナログについてGC-MS、LC-PDAおよびLC-QTOF/MSで測定可能な分析条件を設定した。実際のドラッグ製品を当該条件で分析したところ、分解物や合成副生成物と考えられる化合物が検出されたため、その構造同定を行い、生成機構を推察した。違法ドラッグ成分の代謝物分析法の開発に向けて、必要な準備を整えることができた。また、LC-NMR分析の条件検討を行い、実際の検体に適用できることを確認した。しかし、条件検討の際に多くの労力を必要とすることが判明したため、この点については今後検討が必要と考えられる。分析化学構造の類似した指定薬物アナログを対象に、代謝物のLC/QTOF-MSによる一斉分析法を開発する。また、LC-NMR分析で対象薬物の1H-NMRデータを取得できることを確認したが、用いる試料溶液の濃度や条件設定等、分析前に検討するべき事項が多かったため今後は異なる分析機器の使用も検討する。違法ドラッグ成分分析法の開発に向けて、必要な準備を整えることができた。また、代謝物の分析についても検討した。購入を予定していた指定薬物アナログ標準品が、納期や輸入先の法規制等の関係で購入不可となる事例があったため、次年度使用額が生じた。1)構造の類似した指定薬物アナログを対象に、LC/QTOF-MSによる一斉分析法を開発する。2)ヒト薬物代謝酵素による指定薬物代謝物の生成について、詳細な条件検討を行う。また、生成した代謝物の構造決定を行う。次年度使用額については、指定薬物アナログ標準品の購入に充てることを計画している。輸入不可の化合物については合成を検討し、合成原料を購入する。
電磁力により軌道追従・運動をする多剛体システムの汎用解析プログラムの開発

48字×17行=816字(11ポイントフォントの時)電磁力を用いて物体を浮上・案内・推進するシステムは、リニアモータカ-をはじめ、工場内搬送、電磁プロセシング、自動化機器などの広い分野で使用されている。このようなシステムでは駆動される物体が軌道と接していない上に、加えられる電磁力が能動的にまたは受動的にその軌道に対する配置に関係して与えられるために、その運動の解析が理論的には困難かつ複雑で、シミュレーションによらざるをえない。本研究では多数の軌道に沿って動く移動座標枠を使って制御された多剛体の運動をフレキシブルかつ相互作用が明確な形でモデル化するとともに、(1)多剛体の機械運動(2)運動の場に生ずる電磁現象(3)自由運動する物体の制御の三つの解析計算要素を連成させる構成のワークステーション上で働く汎用プログラムを開発した。このプログラムはアニメーションとも連成可能で、使用者に物体の運動の様子を理解させたり、電磁コイルの配置の影響を把握するのを容易にしている。さらに、これを用いて超電導磁気浮上鉄道車輌および常電導磁気浮上鉄道車輌の走行特性を解析し、曲線部走行時の振舞いや振動・動揺のダンピング機構の解明とそれらを改善するダンピング手法の効果の算定などその設計に役立つ知見を得た。このプログラムでは軌道に沿ったコイルの幾何学的な配置を入力する部分が労力を要し、軌道系上の変更をした解析を繰り返すのは容易ではない。そこで、このようなソフトウェアの利用者からみた見通しをよくしてプログラムの負担を軽減するように、超並列計算機の機能を模擬したPIM-Parallel Inference Machineを用いたシミュレーション手法をも研究し、その多重化されたセル構造のプログラミングの特徴を活かす方法について検討し、その将来性をも明らかにしている。今年度は研究の初年度として基本的要素のモデリングを行った。本研究の特徴を磁気浮上車輌や電磁気アクチュエータを利用したアクティブ制御車輌の取り扱いにおいているので、これらの車輌の構成、構成要素の電気・機械システムとしての表現を明らかにし、新しい応用対象と考えられる能動制御形の振り子車輌についても調査を行った。このようなシステムでは電磁気特性が移動体と固定部との相対的な位置の影響を受けるので、固定部(軌道系)の振動特性の表現が重要である。またうず電流の影響や磁気回路の等価的な表現法についても検討を加え、走行特性の計算精度に相応するモデル化の手法を求めた。磁気浮上車輌を例として軌道振動のモデル化の手法と運動の正確な表現の関係をも明らかにし、簡略化されたモデルの適用例を示した。一方、運動表現の手段としてのアニメーションのために超電導浮上を例として予備的な研究を行った。実際の寸法上の現象と、設計や解析の立場からの要求を明確にする表現法を検討している。数学的な表現手法のまとめについては順調に進んでいる。一方、経費の削減の影響と並列計算技術の進歩から、より簡単なソフトウェア制作の可能性を求めて、125個の並列CPUを模擬的に実現する計算システム(PIM-cell)を使用する方法について基礎的な検討を進めている。この方式はハードウェアが完成したばかりで、他に例を見ないものであり、ソフトウェアの汎用部分と個々のシステムに固有の部分を容易にPOLで結合できるので、MEDINAのような既存のソフトウェアより利用者の使い易さをいち著しく向上できる見通しである。その具体的な性能を高めるための数値積分の方法を検討し、プログラム構成についての方針を決定した。モデル化手法の応用は超電導形及び常伝導形の磁気浮上の特性解析に適用して成果を上げている。

本年度はシミュレーション対象として電磁誘導式の超電導磁気浮上台車および吸引制御式の常電導磁気浮上車軸を取り上げて,具体的な走行シミュレーションプログラムの作成の過程で,並進3自由度、回転3自由度の合計6自由度の3次元運動を行う多剛体系運動のモデル化を行った。また、電磁界系においては超電導コイルの磁束保存性や導体中に誘導される渦電流なども取り入れ、システムのより詳細な記述が可能となった。軌道形状としては直線軌道だけでなく、直線部と曲線部を緩和曲線を介して接続することも可能になり、走行シミュレータとして汎用性が向上した。6自由度の運動を視覚的に表現することは容易ではないが、その一つの方法はアニメーションである。本年度はその第一歩として、そのような台車の運動を視覚的に表現するプログラムをX-Windows上で作成し、横風を受けたとき、曲線部に突入した場合、超電導コイルにクエンチが発生した場合などの台車運動の描写が容易となった。また、常電導磁気浮上車軸の高速走行シミュレーションのために、浮上用電磁石部分の構造を拡張し、スタガ配置磁石も取り入れた。それによって、200km/h程度の高速車輌走行における電磁石構造による性能比較が可能となり、特に曲線部での車輌運動に着目してシミュレーションを行った。一方、電磁力による軌道追従における重要な要素である制御面から詳細な検討を行うために、常電導磁気浮上制御のモデル化を汎用ソフトウエアであるMATLABによって行い、磁気浮上車輌走行の解析モデル、鋼板の磁気浮上、高温超電導バルク材を用いたハイブリッドマグネット浮上などの解析モデルなどを作成し、評価を行った。電磁力を用いて物体を浮上・案内・推進するシステムは、リニアモータカ-をはじめ、工場内搬送、電磁プロセシング、自動化機器などの広い分野で使用されている。このようなシステムでは駆動される物体が軌道と接していない上に、加えられる電磁力が能動的にまたは受動的にその軌道に対する配置に関係して与えられるために、その運動の解析が理論的には困難かつ複雑で、シミュレーションによらざるをえない。本研究では多数の軌道に沿って動く移動座標枠を使って制御された多剛体の運動をフレキシブルかつ相互作用が明確な形でモデル化するとともに、(1)多剛体の機械運動(2)運動の場に生ずる電磁現象(3)自由運動する物体の制御の三つの解析計算要素を連成させる構成のワークステーション上で働く汎用プログラムを開発した。このプログラムはアニメーションとも連成可能で、使用者に物体の運動の様子を理解させたり、電磁コイルの配置の影響を把握するのを容易にしている。さらに、これを用いて超電導磁気浮上鉄道車輌および常電導磁気浮上鉄道車輌の走行特性を解析し、曲線部走行時の振舞いや振動・動揺のダンピング機構の解明とそれらを改善するダンピング手法の効果の算定などその設計に役立つ知見を得た。このプログラムでは軌道に沿ったコイルの幾何学的な配置を入力する部分が労力を要し、軌道系上の変更をした解析を繰り返すのは容易ではない。
人工飼育魚の捕食者認識・防衛行動における学習効果：放流技術に繋がる基礎的研究

2018年度は2017年度に引き続き、ヒラメ人工飼育稚魚を供試魚として実験を行った。まず、ヒラメ稚魚に、同種他個体がカサゴまたはイシガニに捕食される様子を観察させた。これらの処理を施した「カサゴ経験個体」、「イシガニ経験個体」と「未経験個体」を捕食者がいない水槽に移し、摂餌時の離底行動を測定し、処理区間で比較を行った。カサゴ経験個体はイシガニ経験個体および未経験個体に比べて離底回数が少なく、離底時間が短く、一離底あたりに複数回アタックする割合が小さくなった。カサゴは海底で身を潜め、近くに来た餌生物を捕食するため、ヒラメ人工種苗は離底行動を控えるとともに俊敏な離底行動をとる方が生残しやすいのかもしれない。よって、ヒラメ稚魚は、カサゴの捕食圧を経験することにより、カサゴに捕食されにくいように離底行動を変化させたと考えられる。一方で、イシガニ経験個体では、多くの行動要素が未経験個体と大きく変わらず、着底時の姿勢においてのみ、カサゴ経験個体および未経験個体より頭を上に向けながら着底する頻度が高くなった。イシガニは、底周辺の餌生物をにおいで探索するため、ヒラメ人工種苗は底周辺にいると被食の危険が高まるため、上方へ離底していた方が生残しやすいのかもしれない。これが、多くの行動要素が未経験個体と変わらないことと、上方を向き続けながら着底するという行動に結びついたのかもしれない。以上より、異なる捕食者を経験することにより、異なる方向に離底行動が変化することが分かった。放流後のヒラメ人工種苗は独自の捕食様式を持つ複数の捕食者に直面する。そのため、放流前に一種のみの捕食者を経験させるだけでは放流後の生残率を上げる施策としては不十分であると考えられる。事前に放流海域に存在する複数の捕食者を特定し、それらを経験させる施策が必要かもしれない。本研究の目的は、人工飼育魚への1種の捕食者の学習処理が、同種および異種捕食者への対捕食者行動に及ぼす効果を明らかにすることである。2017年度は、ヒラメ人工飼育稚魚を供試魚として実験を行った。まず、ヒラメ稚魚に、同種他個体がイシガニに食べられる様子を観察させた(観察学習)。続いて、「別種捕食者であるカサゴを提示」、「同種捕食者であるイシガニを提示」、「捕食者を提示しない」の3つの条件下で、学習個体と非学習個体の離底行動(底を離れて遊泳する行動)を測定し、捕食者間・学習処理区間で比較を行った。学習個体、非学習個体ともに、「別種捕食者であるカサゴを提示」では、「同種捕食者であるイシガニを提示」、「捕食者を提示しない」に比べて離底回数および高く離底する割合が低かった。底に居る餌生物を捕食するカニなどの捕食者に対しては高く頻繁に泳ぎ上がることが有利だと考えられるが、遊泳している餌を捕食するカサゴに対しては底に留まることが有利だと考えられる。よって、ヒラメ稚魚は先天的にある程度、捕食者に応じて離底行動を変化させると考えられた。一方で、イシガニを学習させると、ヒラメ稚魚はより頻繁に、より高く離底することが分かった。この結果は、別種捕食者であるカサゴを提示した場合や捕食者を提示しない場合でも同様であった。ヒラメ人工種苗にアナハゼを観察学習させた先行研究では、学習により離底回数が減少し、低い離底の割合が増加することが報告されている。よって、底に居る餌生物を捕食するカニなどの捕食者を学習した場合には、その捕食者を避けるように頻繁にかつ高い離底行動を示し、遊泳している餌を捕食するアナハゼやカサゴなどの捕食者を学習した場合には、その捕食者に見つからないように離底頻度を低下させるとともに低い離底を行うようになる可能性が考えられる。ヒラメ稚魚への1種の捕食者(イシガニ)の学習処理が、同種(イシガニ)および異種捕食者(カサゴ)へのヒラメ稚魚の対捕食者行動にどのような効果をもたらすかが明らかになったため。

これが、多くの行動要素が未経験個体と変わらないことと、上方を向き続けながら着底するという行動に結びついたのかもしれない。以上より、異なる捕食者を経験することにより、異なる方向に離底行動が変化することが分かった。放流後のヒラメ人工種苗は独自の捕食様式を持つ複数の捕食者に直面する。そのため、放流前に一種のみの捕食者を経験させるだけでは放流後の生残率を上げる施策としては不十分であると考えられる。事前に放流海域に存在する複数の捕食者を特定し、それらを経験させる施策が必要かもしれない。人工飼育魚にカサゴを学習させて、上記と同様の実験を行う。また、捕食者と人工飼育魚の対面実験により、捕食者回避に関わる人工飼育魚の行動・運動特性を特定する。学会発表で旅費を計上する予定であったが、発表予定の研究協力者(大学院生)が発表助成を得たため、旅費を計上する必要がなくなった。また、知り合いの研究者より飼育装置(水槽、濾過装置、消耗品)を譲り受けたため、当初の想定よりも水槽設備の設置に予算がかからなかった。以上から、予算を次年度に繰り越して、旅費・消耗品費・英文校閲・論文投稿料等に使用することとした。
地域性と構法差を考慮した木造住宅の耐雪性能と屋根雪下ろし時期の簡便判定方式開発

(1)北陸地方を中心に、多雪地域の木造住宅について、耐雪性能に関わる構法の地域的特徴と年代的変遷を調査し,その属性を典型化し分類表示できるようにして、各分類毎に木造住宅の構造解析モデルを提案した。(2)地上及び屋根上の積雪観測資料を収集調査し、屋根面上の積雪荷重モデルを提案した。(3)こうして典型化された荷重と木造骨組モデルに対して、パラメトリックな構造解析と耐力計算を行い、耐雪性能判定の為の基礎データを集積した。(4)鉛直荷重に対する詳細な木構造計算規準と雪害の事例を基に、木造建物の耐力評価を工夫して、雪下ろしが間に合わなかったときに多発する被害発生箇所「軒部の耐雪性能」が、屋根の積雪特性に応じて簡便に評価できる判定法を具体的に提案した。(5)「主要構造体の耐雪性能」が簡便に評価できる判定法の基本構想を同様に提案した。(6)以上を総合して、構法の特徴と屋根雪の特性に応じて、構造体や軒部の耐雪性能と被害発生を未然に防ぐ屋根雪下ろし時期の目安を手軽に得られる『パソコン利用の判定システム』と、その集積データの要点を抽出した簡便な『判定早見表』を設計し製作した。
脊柱靱帯骨化症における脊柱靱帯および皮膚由来細胞の骨化機序の解明

ヒト脊柱靱帯を細胞培養し、骨・軟骨・脂肪への分化能を確認し、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーの発現を呈する細胞の単離に成功し、間葉系幹細胞の存在を証明した。また幹細胞は血管周皮細胞領域、靱帯実質部、骨化前線周囲に局在していた。皮膚についても間葉系幹細胞の存在を確認し、脊柱靱帯および皮膚の細胞について、両組織から得られた間葉系幹細胞は高い骨分化能を有していた。また骨化症患者では非骨化症患者と比較し、骨関連遺伝子発現が有意に高かった。以上より、脊柱靱帯骨化症患者では幹細胞レベルで骨形成能が高く、骨化傾向が高いことが証明され、これらが本疾患の発症に強く影響を与えていることが考えられた。平成24年度は靱帯および皮膚から細胞の単離培養実験を行い、靱帯細胞で間葉系幹細胞のminimal criteriaを満たすことが証明できた。骨化巣における間葉系幹細胞の局在をを明らかにするために、骨化靱帯および非骨化靱帯に対して免疫組織学的な検討を行った。初代培養細胞のフローサイトメトリー解析により、CD73,CD90,CD105が陽性かつCD34, CD45, CD14, CD19, HLA-DR陰性である間葉系幹細胞と同様の細胞表面マーカー発現を認めた。また均一な細胞間での性質比較のため、CD34陰性かつCD105陽性細胞をセルソーティングで抽出して培養を行った。培養では靱帯および皮膚細胞の両者で線維芽細胞様細胞の増殖とコロニー形成を認めた。単細胞培養によるコロニー形成能の評価では骨化症患者と非骨化症患者間に有意差を認めなかった。骨分化誘導培地による培養で、BMP-2, Runx2, ALPの発現比較をしたところ、骨化症患者では靱帯細胞、皮膚細胞ともに発現量が多く、骨分化能が高いことが証明された。3次元培養では軟骨基質形成をAlcian Blue染色で証明し、骨化症患者の靱帯細胞で形成されたペレットから軟骨基質形成能が高いことが証明された。靱帯細胞における間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの局在について二重免疫蛍光染色を行った。骨化靱帯では多数の血管新生を認め、血管周囲にマーカーの局在を認めた。また靱帯実質部にもマーカーの局在を認め、その発現率は骨化靱帯で高くなっていた。また骨化前線周辺では、マーカーを発現する軟骨芽細胞様細胞が観察された。皮膚においても靱帯細胞と同様に血管周囲にマーカーが発現しているか現在確認中である。患者遺伝子サンプルについては、画像と遺伝子型との関連について解析中であり、さらに靱帯および皮膚細胞の性質との関連性について調べているところである。平成25年度は脊柱靱帯由来細胞の性質評価として酵素処理法にて細胞を単離した。Fluorescence-activated cell sorterを用いて、間葉系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーであるCD34陰性、CD105陽性を満たす細胞を選別した。各群での細胞のコロニー形成能、骨分化能、脂肪分化能、軟骨分化能および各分化関連遺伝子の発現を検討し、コロニー形成能は単細胞培養にて評価を行った。コロニー形成能は対照群と骨化症群で両群間に有意差を認めなかった。骨分化誘導培養後のAlizarin Red S染色の吸光度を計測すると、対照群に比較し、骨化症群は有意に骨分化能が高かった。ALP活性は誘導開始時には両群間に差を認めないが、通常培養14日と誘導培養7、14日では骨化症群で有意に高値であった。脂肪分化誘導では、吸光度は対照群と骨化症群で有意差を認めなかった。軟骨分化誘導では、形成された軟骨ペレットの重量および最大径は対照群と骨化症群で有意差を認めなかった。BMP2とALPが誘導後7日において骨化症群で有意に高値であり、またRunx2が誘導後14日と21日において骨化症群で有意に高値であった。PPARγ2とLPL、Sox9、COL2A1、COL10A1の発現には有意差を認めなかった。骨化症群の画像上の骨化形態と脊柱靱帯由来間葉系幹細胞の骨分化能との関連では、頚椎の骨化範囲の指標であるOssification indexが高い症例と胸椎に脊柱靱帯骨化を合併する症例で細胞の骨分化能が有意に高かった。皮膚由来細胞の骨分化誘導培養後のAlizarin Red S染色の吸光度は対照群に比較し骨化症群で有意に高かった。ALP活性は両群とも経時的に増加したが、群間に有意差を認めなかった。骨分化関連遺伝子発現は、BMP2、Runx2、ALPとも骨化症群で発現が高い傾向を認めたが群間に有意差を認めるには至らなかった。

以上より、脊柱靱帯骨化症患者では幹細胞レベルで骨形成能が高く、骨化傾向が高いことが証明され、これらが本疾患の発症に強く影響を与えていることが考えられた。平成23年度は頚椎後縦靭帯骨化症患者、頚椎症性脊髄症患者、さらに胸椎黄色靭帯骨化症患者より手術時に黄色靱帯並びに皮膚を採取し、骨化誘導培地により靱帯細胞ならびに皮膚細胞の培養実験を行った。培養では靱帯細胞並びに皮膚細胞の両者において、ともに線維芽細胞様細胞の増殖を認めた。後縦靱帯骨化症患者では培養細胞の増殖能が高いことを確認し、またreal time定量PCRにより骨化関連遺伝子マーカーであるアルカリフォスファターゼやオステオポンチンの発現量が、頚椎後縦靱帯骨化症患者では頚椎症性脊髄症より靱帯および皮膚のどちらの細胞でも優位に高いことが判明した。さらに間葉系幹細胞の存在を突き止めるために幹細胞培養を行い、Alizarin Red染色、Oil Red O染色、Toruidine Blue染色を行い、骨、脂肪、軟骨細胞へ分化しうることを確認した。さらにフローサイトメトリーでCD73,CD90,CD105が陽性であることを確認し、靱帯細胞での間葉系幹細胞の存在を同定した。現在二重免疫蛍光染色により間葉系幹細胞の局在を同定中であり、また皮膚細胞についても靱帯細胞と同様に間葉系幹細胞の存在を確認中である。患者遺伝子サンプルについては、60歳未満の頚椎後縦靱帯骨化症のうち、2椎体以上に連続して骨化が認められた連続型症例の血液サンプルを収集中であり、すでに20例からDNAを抽出した。また患者データのうちXpおよびCTを用いた画像と血液生化学データと遺伝子型との関連について現在解析中である。平成24年度は分子生物学的研究では、後縦靱帯骨化症患者においては靱帯細胞、皮膚細胞の骨分化能が高いことを証明した。免疫組織学的検討により、骨化および非骨化脊柱靱帯における間葉系幹細胞の局在を同定した。遺伝子学的研究ではSNP解析を行ったが、過去に報告されている結果と異なること、全体としては患者およびコントロール間に差異を認めず、患者ごとの画像や細胞情報と照らし合わせて検討している段階である。平成23年度は分子生物学的研究では、患者サンプルの収集と培養系の確立を目指し、靱帯細胞と皮膚細胞の骨化誘導培地における培養系を確立することができた。また靱帯細胞においては間葉系幹細胞の存在を証することができた。遺伝子学的研究では、患者遺伝子サンプルの収集と遺伝子抽出までは行うことが出来たが、解析については患者検体収集に時間を要し、SNP解析を行うところまでには至っていない。分子生物学的アプローチでは、培養実験で靱帯細胞および皮膚細胞を骨化誘導し、カルシウム沈着と骨化関連遺伝子発現のより詳細な特徴を明らかにする。免疫組織学的アプローチでは、骨化黄色靱帯におけるサイトカイン局在を明らかにし、間葉系幹細胞との相互作用について関連があるか証明する。またこれら基礎研究で得られた結果と骨化形態、骨化範囲などの臨床データとの関連性を見つけ出す。分子生物学的研究では、靱帯細胞および皮膚細胞の培養細胞における骨化関連遺伝子の発現をさらに比較し、その特徴を明らかにする。また両細胞における間葉系幹細胞の局在を明らかにし、異所性骨化との関連性をみつけだしていく。遺伝子研究については、過去に報告されている骨化関連遺伝子でのSNPを用いた遺伝子多型解析を行う。また画像上の骨化形態との関連性についても検討を行う間葉系幹細胞、サイトカインの抗体染色、誘導培養に使用する成長因子に関わる材料費用に使用する予定である。
ａＰＫＣλ／ιの発現・局在異常は口腔がんの新たな診断基準となり得るか？

aPKCλ/ιは細胞極性の制御に必須の極性タンパク質であり,その過剰発現や局在異常が腫瘍の進展に関与することがこれまでの研究から判明している。そこでわれわれは,口腔扁平上皮癌におけるaPKCλ/ιの発現を免疫組織化学染色法を用いて評価した。その結果,低分化型の口腔扁平上皮癌においてaPKCλ/ιの過剰発現を認めた。また,60歳未満の症例においてaPKCλ/ιの過剰発現を認めた。このことにより,aPKCλ/ιの発現が口腔扁平上皮癌の悪性度診断の基準や化学療法の標的になり得ることが示唆された。前年度までにピックアップした56症例に加え,新たに20症例を加えて再評価を行った。その結果,口腔扁平上皮癌の組織分化度とaPKCλ/ιの過剰発現の間に高い有意差を得ることができた。この結果から、aPKCλ/ιの過剰発現が口腔扁平上皮癌の悪性度診断の基準になり得る可能性がさらに高くなった。現在,ここまでの結果をまとめ、英文雑誌に投稿する論文を執筆中である。次いで,癌の増殖・進展に関与すると考えられているIL-6について着目し,IL-6発現とaPKCλ/ι発現の相関について検討した。口腔扁平上皮癌に対するIL-6免疫組織学的染色法のプロトコールの確立を行った。抗体の濃度調整などで試行錯誤を繰り返したのち、プロトコールが確立された段階で全76症例についてIL-6免疫組織学的染色を行った。しかしながらIL-6発現とaPKCλ/ι発現の間に有意差は見られなかった。そこで,新たに同様のタンパクであるALDHに着目し,現在までに口腔扁平上皮癌に対するALDH免疫組織学的染色法のプロトコールはほぼ確立されている。前年度までに使用した横浜市立大学附属病院口腔外科で採取した76症例のサンプルで,口腔扁平上皮癌の組織分化度とaPKCλ/ιの過剰発現の間に高い有意差を示す結果を得ている。そのことからも,aPKCλ/ιの過剰発現が口腔扁平上皮癌の悪性度の診断基準となり得る可能性が示唆されている。現在,その結果を英語論文としてとりまとめて英文雑誌に投稿中である。前年度までに確立していたアセトアルデヒド脱水素酵素(Aldehyde dehydrogenase:ALDH)免疫組織学的染色法を用い,がんの増殖・進展に関与すると考えられているALDH発現とaPKCλ/ι発現との相関について検討をおこなった。しかしながら,ALDH発現とaPKCλ/ι発現との間に統計学的な有意差を認めることはできなかった。次に,癌増殖遺伝子である上皮成長因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)に着目してEGFR発現とaPKCλ/ι発現との間の相関について,免疫組織学的染色法を用いた検証を現在おこなっている。それと同時に,aPKCλ/ι発現と細胞浸潤能に関するin vitro研究を行うために,aPKCλ/ιノックダウン細胞株の樹立を目標とした研究をヒト由来扁平上皮癌細胞株を用いて進行させている。しかし,現時点では樹立にはいたっておらず,研究期間の終了を迎えてしまった。今後も引き続き,ヒト由来扁平上皮癌細胞株を用いてのaPKCλ/ιノックダウン細胞株の樹立を進め,aPKCλ/ι発現と細胞浸潤能に関するin vitro研究を進めていく予定である。平成19年から平成22年までに横浜市立大学附属病院歯科・口腔外科で加療した口腔扁平上皮癌患者のうち、本研究の対象となったのは56症例であった。これらの症例について、臨床病理学的因子(年齢、性別、UICC分類、腫瘍サイズ、リンパ節転移の有無、病理組織分化度、喫煙歴など)を取りまとめた。症例のまとめと並行して、口腔扁平上皮癌に対するaPKCλ/ι免疫組織学的染色法のプロトコールの確立を行った。抗体の濃度調整などで試行錯誤を繰り返したのち、プロトコールが確立された段階で56症例についてaPKCλ/ι免疫組織学的染色を行った。その結果、46症例(82.1%)においてaPKCλ/ιの発現を示し、23症例(41.1%)においてaPKCλ/ιの過剰発現を示した。次に臨床病理学的因子とaPKCλ/ιの発現の相関をPearsonのχ2検定を用いて検討した。その結果、低分化型の口腔扁平上皮癌において有意にaPKCλ/ιの過剰発現を認めた(p=0.030)。また、60歳未満の症例において有意にaPKCλ/ιの過剰発現を認めた(p=0.032)。さらに、aPKCλ/ιの過剰発現を認めた症例ではaPKCλ/ιが細胞核優位に発現していた(p=0.047)。

この結果から、aPKCλ/ιの過剰発現が口腔扁平上皮癌の悪性度診断の基準になり得る可能性が示唆された。ここまでの結果をまとめ、日本頭頸部癌学会、日本口腔外科学会総会において研究報告を行った。予定通り20症例の追加研究を行い,昨年までのデータをより磨き上げることに成功した。一方で,口腔扁平上皮癌に対するIL-6免疫組織学的染色のプロトコール確立は成功したものの,統計学的に有意なデータを得られなかったことは誤算であった。現在,ALDHなどほかのがん発生関連タンパクとの相関の検討を進めている。口腔扁平上皮癌に対するaPKCλ/ι免疫組織学的染色のプロトコール確立は容易ではなかったが、ここまでに安定して染色を行えるようになった。その後、これまでの解析結果で、統計学的に有意なデータを得ることができており、幸先よく研究をスタートすることができた。とりわけ、がんの進展や転移に関与しているaPKCλ/ιが口腔扁平上皮癌において過剰発現していることが判明し、かつ病理組織分類が低分化型の症例や若年者の症例といった、より悪性度の高いとされる症例において有意にaPKCλ/ι過剰発現を示していることは、口腔扁平上皮癌においてaPKCλ/ιががん悪性度の指標となりうると考えられた。この結果を踏まえて研究を継続していくことで、本研究の目的である新たな診断方法への応用が期待できた。しかし、当初の予定より少ない症例数しか集まらなかったのは誤算であった。そのため、まずは対象期間を延ばして症例数を増やさなければならない。すでに20症例が研究対象として新たにピックアップされており、これらの症例についてこれから改めて臨床病理学的因子を取りまとめたり、aPKCλ/ι免疫組織学的染色を行って統計学的解析を行う必要がある。ただし、ここまでのプロトコールはすでに確立しており、症例数の追加が研究を遅らせることはほとんどないと考えている。昨年追加した20症例を加え,全76症例としてデータを収取し,口腔扁平上皮癌の組織分化度とaPKCλ/ιの過剰発現の間に高い有意差を得ることができた。この結果を現在英語論文として執筆中であり,年内に投稿する予定である。昨年IL-6との相関を検討したが,失敗に終わった。今年度は新たに癌の進展・転移に関与しているとされるALDHとaPKCλ/ιとの相関性を検討する。本来であれば細胞実験の準備を行っている予定であったが,上記のためスタートできずに研究費の残金が生じたが,本年度に流用する予定である。昨年度は平成19年から平成22年までに横浜市立大学附属病院歯科・口腔外科で加療した口腔扁平上皮癌患者56症例を対象に研究を行ってきた。しかし、56症例は口腔扁平上皮癌を用いた類似研究と比較するとやや少ない。そこで、研究対象期間を平成23年前半までの症例とし、20症例を追加して合計76症例とした。この結果、類似研究と比較して遜色のない症例数を得ることができた。まずは追加した20症例についてaPKCλ/ι免疫組織学的染色を行い、合計76症例として再度統計解析を行う。解析が終了したのちは、癌の進展・転移に関与しているとされるIL-6やALDHとaPKCλ/ιとの相関性を検討する。具体的には、これまでに用いた76症例の標本をIL-6ならびにALDH免疫組織染色を行い、それぞれの発現を調査する。
学生の思考力とその教育実践の評価のあり方に関する実践的・総合的研究

学生の「思考力(自分で考える力)」とその育成に焦点を当て、(A)「育成対象(思考力自体と学生の発達意識)」と(B)「育成主体(大学教員とその教育実践)」両面の文献調査・言説分析・質問紙調査の量的質的分析・ナラティヴ調査・実践事例研究等の各種調査分析を通して、「大学教育が担うべき思考力育成とその教育実践と教育の評価のあり方」の総合的研究を行い、批判的に思考する「態度」育成の重要性やその教育実践事例分類、学生の発達意識や教員の意識における思考力育成の可能性や重要性の認識分析、カリキュラムと教育の評価のあり方分析等を行い、批判的に思考する能力や態度の育成のあり方の方向性と可能性を考察した。本研究は、学生の「思考力(自分で考える力)」とその育成に焦点を当て、(A)「育成対象(思考力自体と学生の発達意識)」と(B)「育成主体(大学教員とその教育実践)」両面に関する研究を通して、「大学教育が担うべき思考力育成とその評価のあり方」の総合的研究を行い、一定の方向性や可能性の明確化を目指すものである。初年度の今年度は、以下、1)5)の研究を進めた。1)思考力育成自体の研究では、米国やOECD、産業界等の考え方も踏まえつつ、21世紀に求められる能力や学習成果の考察を深め今後育成が重要となる思考力の分析を進めた。「大学生にとっての大学教育の意味」という観点から、大学教育のあり方や成果についてどのような研究が必要であるかについて検討も行った。2)学生の発達意識の分析では、調査項目および測定方法について検討した。その結果、学生の学習成果という観点からは、思考力獲得度合いの自覚および未熟さの自覚双方に意義があるにもかかわらず、一般的な量的尺度を用いた場合、後者を正確に測定・抽出できないことが明らかになった。3)教員の意識の研究では、平成23年度以降に実施予定の教員の教育に関する意識調査本調査のための予備調査を実施し、カリキュラムの体系化や教育実践上の課題・学生の学習成果の把握等に関する考え方について調査した。4)教育実践の現状分析では、総合大学の各学部の初年次段階の教育の方針とカリキュラムの実態について聞き取り調査を行った。5)教育実践・FDのあり方研究では、自らの教育実践における思考力育成のあり方の研究を進めるとともに、米国AAC&Uの年次大会に参加し米国を中心とする海外のリベラル教育(教養教育)や思考力育成のあり方・FDのあり方に関する研究や実践の情報収集と交換を行った。フンボルト理念の現代的解釈の可能性を探りながら大学教員の教育と研究のあり方の考察も深めた。2年目の今年度は、以下、1)5)の研究を進めた。1)思考力育成自体の研究では、21世紀に求められる能力や学習成果の考察を深め今後育成が重要となる思考力の分析を一層進めた。また、初年次教育と教養教育を中心にどのような力(思考力)の育成が行われようとしているのかという観点から、カリキュラム調査を実施した。2)学生の発達意識の分析では、引き続き調査項目および測定方法について検討し、2方向からの学習成果測定の妥当性を検証するとともに、学生がどのような場面において自らの思考力発達を自覚するかに関する分析を進めた。3)大学教員の意識の研究では、昨年度に実施した教員の教育・FDに関する意識調査の予備調査結果を分析し、その結果を踏まえて、教育実践上の工夫や課題・学生の学習成果の把握やカリキュラムの体系化等に関する考え方についてより詳しく調査する本調査を設計・実施した。4)教育実践の現状分析では、総合大学の各学部の初年次段階の教育の方針とカリキュラムの実態について昨年度に聞き取り調査を行った結果を分析するとともに、学士課程教育のあり方に関する聞き取り調査を実施した。5)教育実践・FDのあり方研究では、自らの教育実践における思考力育成のあり方の研究を進めるとともに、思考力育成のあり方・FDのあり方に関する先行研究や実践の情報収集を継続した。本研究は、学生の「思考力(自分で考える力)」とその育成に焦点を当て、(A)「育成対象(思考力自体と学生の発達意識)」と(B)「育成主体(大学教員とその教育実践)」両面に関する研究を通して、「大学教育が担うべき思考力育成とその評価のあり方」の総合的研究を行い、一定の方向性や可能性の明確化を目指した。最終年度の今年度は、以下1)5)の研究を進めた。

1)思考力育成自体の研究では、先行研究や海外団体意見、産業界ニーズ等から、今後育成が重要な思考力の考察結果をまとめた。思考力自体の評価可能性の程度については、大学生にとっての大学教育の意味を先行研究成果等も検討しながら明らかにし、初年次教育と教養教育に関するカリキュラム調査の分析・考察を行った。2)学生の発達意識の分析では、今年度はナラティブワークと発達課題達成度分析を行い、学生が自覚する発達課題達成度が時間の経過とともに上昇している可能性と、自分が大事にしていること(価値)を自覚し語れる学生がより高い学修成果を出している可能性を示した。3)大学教員の意識の研究では、昨年度に入力と基礎分析を行った調査結果の思考力育成の教育実践上の工夫や教育目標等に関する考え方の分析を実施した結果、思考力育成の多様な実践は10の取り組みとさらに5つの取り組みに整理出来ることがわかった。4)教育実践の現状分析では、総合大学の各学部の初年次段階の教育の方針とカリキュラムの実態について一昨年度に聞き取り調査を行った結果を分析するとともに、昨年度行った学士課程教育のあり方に関する聞き取り調査結果を分析した。5)教育実践・FDのあり方研究では、自らの教育実践における批判的に思考する態度育成の動機付け教育の実践とその効果の検討や主体的学習・思考に成績評価が与える影響の研究を進めた。1)5)の研究各々で総合的分析も行い、その結果も含めて最終成果報告書にまとめた。本研究は、学生の「思考力(自分で考える力)」とその育成に焦点を当て、(A)「育成対象(思考力自体と学生の発達意識)」と(B)「育成主体(大学教員とその教育実践)」両面に関する研究を通して、「大学教育が担うべき思考力育成とその評価のあり方」の総合的研究を行い、一定の方向性や可能性の明確化を目指すものである。3年目の今年度は、以下、1)5)の研究を進めた。1)思考力育成自体の研究では、21世紀に求められる能力(新たに必要な能力と20世紀から通して必要な能力両面)や学習成果の考察を深め今後育成が重要となる思考力の分析を引き続き進めた。また、初年次教育と教養教育を中心にどのような力(思考力)の育成が行われようとしているのかという観点から、カリキュラム調査を実施した。2)学生の発達意識の分析では、引き続き調査項目および測定方法について検討し、2方向からの学習成果測定方法について一定の実用性と効果を確認した。あわせて、学生本人の「自覚的な」学修経験の有無が思考力発達と関連している可能性が示唆された。3)大学教員の意識の研究では、一昨年度に実施した教員の教育・FDに関する意識調査の予備調査結果を踏まえて昨年度に実施した本調査の教育実践上の工夫や課題・学生の学習成果の把握やカリキュラムの体系化等に関する考え方についての数値部分を中心とする分析を実施した。5)教育実践・FDのあり方研究では、自らの教育実践における思考力育成のあり方の研究を進めるとともに、思考力育成のあり方・FDのあり方に関する先行研究や実践の情報収集と分析を継続した。学生の「思考力(自分で考える力)」とその育成における、(A)
CD47-SIRPシグナル制御による移植抗原反応性T細胞・B細胞性免疫応答の抑制

我々はCD47-SIRPシグナル誘導により異種反応性マクロファージ応答が抑制されることをin vitroで解明してきた。本研究では、CD47-SIRPシグナル誘導により異種反応性CD4^+T細胞応答は間接認識経路を介した応答は抑制されるが、直接認識経路を介した応答には影響を及ぼさないことをin vitroで解明した。またCD47-SIRPシグナル伝達誘導により、マクロファージ性異種細胞拒絶反応が抑制できることをin vivoモデルにおいて証明した。我々は、異種間でのCD47-SIRPαシグナルの不応答がマクロファージによる自然免疫応答を引き起こし異種移植臓器の拒絶反応を誘発すること、またブタ細胞へのヒトCD47遺伝子の導入によりマクロファージ性拒絶機構が回避し得ることをこれまでの研究で解明した。ヒトCD47トランスジェニック(Tg)ブタからの組織・臓器移植を想定する揚合、自然免疫応答に引き続き起こる獲得免疫応答のうち、抗原提示細胞とT細胞、B細胞の細胞間コミュニケーションにおけるCD47-SIRP抑制シグナルの機能解析と、CD47遺伝子の修飾による異種間免疫応答の影響を解明する必要がある。本研究では、ブタ抗原提示細胞へのヒトCD47遺伝子導入が直接認識経路によるanti-xenoヒトCD4^+T細胞応答に与える影響を解析した。ブタ肺胞マクロファージ細胞株をIFN-γおよびTNFαで刺激することによりclassII分子を発現すること、ヒトT細胞上にはSIRPαが発現していないことがフローサイトメーターで確認し得た。さらにヒト末梢血リンパ球とヒトCD47遺伝子導入あるいは非導入のブタマクロファージの混合培養系でヒトT細砲分裂効果を解析したところ、少なくともヒトCD47遺伝子導入により過剰なT細胞応答が惹起されることはなかった。一方では、より強力な抗原提示能をもつヒト樹状細胞がブタ細胞を貧食する際に受けるCD47-SIRPαシグナルが、その貧食能に及ぼす影響を解析した。ヒト末梢血リンパ球からGM-CSFとIL-4の存在下で培養し得られたヒト未成熟樹状細胞と、ヒトCD47遺伝子導入あるいは非導入のブタリンパ芽球様細胞株(標的細胞)を混合培養した。標的細胞はあらかじめ蛍光色素(CFSE)で染色しフローサイトメーターで定量的に貧食能を評価したところ、ヒトCD47遺伝子導入したブタ細胞に対しては非導入のブタ細胞と比べ、少なくとも過剰な貧食反応は示さなかった。我々は、ブタ細胞へのヒトCD47遺伝子の導入により、CD47-SIRPα抑制シグナルを介して異種マクロファージ性拒絶機構が回避し得ることをこれまでの研究で解明した。ヒトCD47トランスジェニック(Tg)ブタからの異種組織・臓器移植を想定する場合、自然免疫応答に引き続き起こる獲得免疫応答のうち、抗原提示細胞とT細胞の細胞間コミュニケーションにおけるCD47-SIRP抑制シグナルの機能解析を解明する必要がある。本年度の研究では、異種性T細胞応答におけるCD47-SIRPシグナル伝達を解析した。ヒトT細胞上にはマクロファージや樹状細胞に存在するSIRPαは発現せず、CD47と相互作用して抗原特異的T細胞増殖に関わるSIRPγを発現していた。ブターヒト間CD47相同性の相違が、CD47-SIRPαおよびCD47-SIRPγシグナル伝達を介した異種性ヒトT細胞応答に対してどのように影響しているのか、リンパ球混合試験(MLR)により解析を進めた。まず、反応系に可溶性ヒトCD47-Fc融合蛋白を添加すると、異種反応性ヒトCD4陽性T細胞のStimulation Index(SI)は有意に低値となり、CD47ないしSIRPαブロッキング抗体をさらに添加するとその差は認めなくなった。また、異種間CD47-SIRPγの相互作用を解析するため、responderから抗原提示細胞を除去しT細胞のみとした条件下でCD47-Fc添加MLRを行った。CD47-Fcを添加しても非添加群とSI値に有意差を認めなかった。以上より、CD47-Fc添加によるヒト異種性T細胞応答は、間接認識経路を介した反応は抑制されるが、直接認識経路を介した反応には影響を及ぼさないことが示された。つまり、ブタ-ヒト間CD47相同性の相違により、間接認識経路を介したCD47-SIRPα抑制性シグナルが伝達されず、強力な異種性CD^4+T細胞応答を引き起こしている可能性がある。我々はブタ細胞へヒトCD47を遺伝子導入することにより、自然免疫応答であるマクロファージ性拒絶機構がCD47-SIRPαシグナルを介して回避されることをin vitroで解明した。ヒトCD47トランスジェニックブタからの異種組織・臓器移植を想定する場合、自然免疫応答に引き続いて起こる獲得免疫応答、すなわち抗原提示細胞とT細胞の細胞間コミュニケーションにおけるCD47-SIRP抑制シグナルの機能解析を解明する必要がある。本研究ではまず異種性T細胞応答におけるCD47-SIRPシグナル伝達をin vitroで解析した。その結果、ヒト異種性T細胞応答は間接認識経路を介した反応は抑制されるが、直接認識経路を介した反応には影響を及ぼさないことを解明した。

本年度はin vitro解明した現象をin vivoで再現されるか否かを解析し得るモデル作製を行った。NOD/SCIDマウスのSIRPαはヒトCD47と交差反応性があるため、まずNOD/SCIDマウスの腎被膜下にヒトCD47発現ブタリンパ芽球様細胞を移植するモデルを用いた。ヒトCD47を高発現したブタリンパ芽球様細胞と無処置のブタリンパ芽球様細胞を1:1に混合し、NOD/SCIDマウスの腎被膜下に移植、2週間後に腎臓を摘出しフローサイトメトリーで腫瘍細胞を確認したところ、ヒトCD47を高発現した細胞集団のみを確認した。またラット・マウス間モデルでマクロファージ性拒絶機構が回避できるか否か解析を行った。ストレプトゾトシンで糖尿病化したRAG2/γcダブルノックアウトマウス(T,B,NK細胞が存在せず、マクロファージ機能は正常)にマウスCD47を発現したラットインスリノーマもしくはコントロールベクターを遺伝子導入したインスリノーマを腹腔内投与したところ、マウスCD47発現ラットインスリノーマではコントロールと比べ有意に血糖降下を認めた。以上よりin vivo疾患モデルにおけるレシピエント種CD47遺伝子導入による自然免疫応答の抑制を証明した。今後は獲得免疫応答の抑制効果をin vivo疾患モデルで証明する。
沖縄における内分泌疾患とGAD抗体、21−OH抗体、β3−AR、mtDNAの解析

欧米人と日本人さらにアジア人のインスリン依存性糖尿病患者(IDDM)におけるGAD抗体陽性者の頻度は各々6384%,3050%,550%と相違があることが報告されており、人種差によると考えられている。今回我々は^<125>-Iでラベルした遺伝子組み替えhumanGADを使用した新しい免疫沈降法アッセイを用いて沖縄県人における抗体陽性率を測定した。この測定系は我々がイギリス、ウエールズ大学医学部と共同で開発したものであり、感受性、特異性とも従来のブタの脳より抽出したGADを用いた測定法より優れていると考えられる。沖縄における発症1年以内の患者(18人)では83.3%にGAD抗体陽性であり、欧米人における報告と同等の陽性率であった。発症23年(患者36人)で66.7%となり、発症3年以上(患者46人)では54.3%に下降したが、これらの陽性率はアジア人における従来の報告よりは、高いものであった。長期観察し得た14人のIDDMのうち1人の患者を除いて、高抗体価が12年間持続した。IDDM患者で自己免疫性甲状腺疾患合併の有無では、GAD抗体の陽性率に差はなかった。発症1年以内のIDDM患者では、IA-2抗体は64.7%に検出されたが、GAD抗体の陽性率に比べると低かった。今までのアジア人における報告ではGAD抗体陽性率が低かったが、これは測定方法に問題があり、感受性が低かったからではないかと推測される。我々の研究により、沖縄県人のGAD抗体陽性率はヨーロッパでの報告と同等であると考えられることがわかった。沖縄県人のIDDMにおいても自己免疫機序がその原因として最も重要と考えられることが判明した。