hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト臍帯血幹細胞を標的にした遺伝子導入および選択的増幅技術の基礎検討

1.iBMTとSAGによる遺伝子治療技術慢性肉芽腫症などの遺伝性疾患に対し造血幹細胞遺伝子治療を臨床応用するためには、放射線照射や抗癌剤を使用する前処置はできる限り省くことが望まれる。そこで、前処置なしで造血幹細胞治療を可能にさせる基盤技術開発をカニクイザルの系で行った。まず、前処置なしで移植細胞を生着させる手段として骨髄内移植法(iBMT)をカニクイザルで検討した。まず、レトロウイルスベクターで標識遺伝子をCD34細胞に遺伝子導入し、この細胞をiBMTで前処置なしで移植した。移植後、コロニー形成細胞(CFU)全体の2-30%が遺伝子導入陽性細胞であったが、末梢血の遺伝子標識細胞は0.1%以下にとどまった。上記の問題を解決するために、移植後の遺伝子導入細胞を生体内で選択的増幅させる目的で選択的増幅遺伝子(SAG)を応用したシステムをiBMT系に組み合わせて検討した。これらの結果より前処置なしに生着した遺伝子導入細胞を、分子スイッチ(EPO)依存性に生体内で増幅させることに成功し、このレベルは臨床応用可能域にまで到達した。また、LAM-PCR法でクローナル解析を行い、増幅された細胞はポリクローン性増幅であることを確認した。2.臍帯血を標的にする検討ヒト臍帯血にSAG遺伝子をレトロウイルスベクターで遺伝子導入し、in vitroで増幅することは既に成功している。そこで現在これが生体内で可能かどうか、X-SCIDマウスに前処置なしでかつiBMT法で移植し、効果を解析しているところである。我々が開発した選択的増幅遺伝子(SAG)が、in vivoで作用(造血幹細施の増幅)するかどうかを検討するため、ヒトに極めて近いNon-human Primate(カニクイザル)をモデルとして遺伝子導入実験を行った。まずサルより採取した骨髄細胞を標的に、SAG遺伝子を搭載したレトロウイルスベクターで遺伝子導入を行った。次に致死的放射線量の照射を受けたレシピエントサルに対し、SAGを遺伝子導入した骨髄細胞を移植し、生着後経時的にSAGの分子スイッチであるエストロゲンを投与したところ。エストロジェン刺激に応じて速やかに遺伝子導入細胞が増幅されることを確認した。このことより、SAGシステムがin vivoで働くことを実証した。さらにSAGが造血幹細胞に確実に遺伝子導入されているかどうかを確認するため、レトロウイルスベクターのインテグレーションサイト解析をInverse-PCR法を用いて検討した。この話果、遺伝子導入を受けた血液細胞は、長期的に存在し骨髄再構築をしていることを確認できた。これは造血幹細胞にSAGを遺伝子導入できたことを示唆した。(Hanazono Y. etal. Gene Ther 9(16):1055-64,2002.)サルはヒトの結果を極めて精度よく予測できるモデルと考えられており、今回我々はこの実験系で、SAGシステムが造血幹細胞をin vivo選択的増幅できることを確認した。今後はヒト臍帯血細胞を標的に検討を加える予定である。
加速器制御用基本ソフトウエアの標準の確立

加速器の巨大化と複雑化にともない、加速器制御用のソフトウエアの作成に要するマンパワーは数百人年を越えることがあたりまえとなってきている。数十人のソフトウエア技術者が10年近く働き続けてやっと出来上がるる規模である。CERNで建設中のLHCに代表される次世代の加速器では、ソフトウエアに要するマンパワーが1000人年に達すると予想されている。この10年の計算機技術とネットワーク技術の進展により、加速器制御システムを構成する標準的な手法が次第に確立してきた。これを加速器制御標準モデルという。標準モデルに基づく制御システムは、マン・マシンインターフェースを司る第1層と分散された加速器の機器の現地での制御を行う第2層、そしてプロセス入出力からなる第3層からなる。第1層においては、高機能のワークステーションが、第2層には、ボード型の制御マイクロコンプータが用いられ、これらが高速ネットワークによって接続されることになる。なお、標準モデルという名前は、ネットワーク、計算機のオペレーティングシステム、プログラミング言語、プロセス入出力などが国際標準または事実上の国際標準にのっとることを含意している。それぞれの加速器はそれぞれ独自の制御ソフトウエアを持っているように一見えるのであるが、詳しく分析してみると、(1)共通の基本機能を持ち、そして(2)この共通部分は加速制御ソフトウェアの70-80%に達することがわかる。この事実が加速器制御の分野で共通理解となったことにより、(1)国際的な共同作業により、(1)加速器制御の基本機能を明確に定義し、(2)この定義に基づく基本ソフトウエアを作成し、(3)この基本ソフトウエアを実際の加速器に適応し、さらに(4)実地の経験に基づいて改良を続けていくことを目指す、加速器制御用の標準的な基本ソフトウエアを国際標準として確立することを目指す活動がヨーロッパおよび米国を中心として始まった。。標準モデルが確立したことによ、さらに一歩進んで、本国際学術調査は、ヨーロッパを中心とする加速器制御スフトウェアの標準化活動の調査を行うことを目的とした。本活動の成果として、以下の点をあげることができる。(1)加速器制御システムの基本ソフトウエアの国際標準は、残念ながら現時点では確立していない。(2)しかし、国際標準に準ずるものとして、EPICSが存在している。(3)EPICSは、1980年代の後半に米国ロス・アラモス研究所が中心となってす進めたGATとよばれる加速器の制御システムを発展させたものである。現在、超伝導電子線形加速器CEBAFとアルゴンヌ国立研究所の放射光加速器APSという2つの巨大加速器の制御に用いられいる他、数十の加速器の制御に採用されている。(4)EPICSは一種のフリーウエアであり、EPICS連合体に参加すれば、どの研究所でも自由に使用することができる。連合体への参加機関は、EPICSに何らかの変更や追加を行ったときには、そのむねを連合体に知らせる義務がある。世界各地で行われるEPICS改良の努力は、連合体全員に役立つものとするためである。(5)高エネルギー物理学研究所で現在建設中のBファクトリー加速器(KEKB)の制御システムの基本ソフトウエアシステムとしてEPICSを採用することに決定した。EPICSはKEKBの制御に必要なすべての機能を持ち、また最新の計算機を用いることにより、KEKBの制御に必要な性能を発揮することが調査の結果あきらかである。(6)EPICSはこれまで米国およびヨーロッパの加速器にのみ採用されていた。高エネルギー物理学研究所がEPICSを採用することにより、EPICSは始めて全世界的なものとなり、国際標準にさらに一歩近づくことになる。(7)高エネルギー物理学研究所の貢献としてEPICSにダイナミック登録削除機能を付け加えるものとする。EPICSに機器制御のドライバーソフトウエアを登録または削除する際には、EPICSシステム全体の再コンパイルが必要であるが、この改良により不要となる。

この事実が加速器制御の分野で共通理解となったことにより、(1)国際的な共同作業により、(1)加速器制御の基本機能を明確に定義し、(2)この定義に基づく基本ソフトウエアを作成し、(3)この基本ソフトウエアを実際の加速器に適応し、さらに(4)実地の経験に基づいて改良を続けていくことを目指す、加速器制御用の標準的な基本ソフトウエアを国際標準として確立することを目指す活動がヨーロッパおよび米国を中心として始まった。。標準モデルが確立したことによ、さらに一歩進んで、本国際学術調査は、ヨーロッパを中心とする加速器制御スフトウェアの標準化活動の調査を行うことを目的とした。本活動の成果として、以下の点をあげることができる。(1)加速器制御システムの基本ソフトウエアの国際標準は、残念ながら現時点では確立していない。(2)しかし、国際標準に準ずるものとして、EPICSが存在している。(3)EPICSは、1980年代の後半に米国ロス・アラモス研究所が中心となってす進めたGATとよばれる加速器の制御システムを発展させたものである。現在、超伝導電子線形加速器CEBAFとアルゴンヌ国立研究所の放射光加速器APSという2つの巨大加速器の制御に用いられいる他、数十の加速器の制御に採用されている。(4)EPICSは一種のフリーウエアであり、EPICS連合体に参加すれば、どの研究所でも自由に使用することができる。連合体への参加機関は、EPICSに何らかの変更や追加を行ったときには、そのむねを連合体に知らせる義務がある。世界各地で行われるEPICS改良の努力は、連合体全員に役立つものとするためである。(5)高エネルギー物理学研究所で現在建設中のBファクトリー加速器(KEKB)の制御システムの基本ソフトウエアシステムとしてEPICSを採用することに決定した。EPICSはKEKBの制御に必要なすべての機能を持ち、また最新の計算機を用いることにより、KEKBの制御に必要な性能を発揮することが調査の結果あきらかである。(6)EPICSはこれまで米国およびヨーロッパの加速器にのみ採用されていた。高エネルギー物理学研究所がEPICSを採用することにより、EPICSは始めて全世界的なものとなり、国際標準にさらに一歩近づくことになる。(7)高エネルギー物理学研究所の貢献としてEPICSにダイナミック登録削除機能を付け加えるものとする。EPICSに機器制御のドライバーソフトウエアを登録または削除する際には、EPICSシステム全体の再コンパイルが必要であるが、この改良により不要となる。加速器が巨大となり複雑化するにしたがい、加速器制御用のソフトウエア作成に要するマンパワーが数百人年を越えることがあたりまえとなり、次世代の巨大加速器の制御には1000人年のマンパワーが必要であると予想されている。加速器制御用ソフトウエア作成に要するマンパワーを大幅に削減することを可能とするために、どのような加速器にたいしても適用できる一般的な加速器制御用基本ソフトウエアを国際的な協同によって造りあげることが重要である。1993年秋にベルリンにて開催された制御に関する国際会議において、このような標準化のための国際的なワーキンググループが結成された。
有機触媒によるエステル不斉加水分解および固体触媒との協同触媒の開発

加水分解反応、特にカルボン酸エステルの加水分解反応は非常に基本的な反応である。生体触媒によるエステルの不斉加水分解は実用化例も多いが、一般的に酵素はその安定性が低く、また、単位重量当たりの活性も低いといった問題がある。我々はこれまでに、シンコナアルカロイド由来不斉四級アンモニウム塩を用いたエステル類の不斉加水分解反応を進めてきた。これまでに、エノールエステルおよびジエニルエステルの不斉加水分解反応を行ってきた。最高で95% eeを達成している。この反応は加水分解後にエノラートが生成し、その不斉プロトン化として反応が進行するため、エノラートを経由する可能性のないラセミ基質に対する反応を行った。その結果、アミノ酸エステル類で最高91% eeで反応が進行することがわかった。反応は基質のラセミ化を伴う動的速度論分割として進行する。これまでのアミノ酸誘導体基質では、窒素上の置換基をベンゾイル基やピバロイル基として検討してきた。保護基として機能するようなBoc基やFmoc基では高い選択性が得られない問題があった。最近、フェニルグリシンの誘導体であればN-Boc保護基質の不斉加水分解反応で、75% eeと比較的高い選択性が発現することがわかってきた。現在、さらなる最適化を進めている。フェニルグリシンは非天然型のアミノ酸であり、また不斉アルキル化や不斉水素化で合成するのが難しく、価値があると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。当研究室では、シンコナアルカロイド由来の塩四級アンモニウムをキラル相間移動触媒として用いたアルケニルエステル類の加水分解的不斉プロトン化反応を高収率、高エナンチオ選択的に進行させることに成功している。また、N-保護アミノ酸エステル類にも応用し、キニジン由来の触媒を用いて77% eeの選択性で不斉塩基加水分解を行うことに成功している。しかし、得られるアミノ酸誘導体が非天然型である点と、選択性が十分でない問題点があった。今回の研究では、より活性が高く、また天然型のアミノ酸を得るためにキニン由来の四級アンモニウムの合成を試みた。ハロゲン化アリールとボロン酸とのカップリングで合成した様々な臭化ベンジル誘導体を用いて、新規の四級アンモニウム塩、約30種類を合成した。アミノ酸エステルの不斉加水分解において、最高で86% eeで天然型アミノ酸を得ることに成功した。また、一方、四級アンモニウム塩以外の新規触媒の開発にも取り組んだ。特に、不斉三級ホスフィンが入手容易であることに着目し、不斉四級ホスホニウムの合成と開発に取り組んだ。さらに、ここにチオウレア構造を組み込むことによって触媒の機能の拡張にとりくんだ。今回、約20種類の不斉四級ホスホニウム塩を合成し、エノールエステル類の不斉加水分解反応を行ったところ、83% eeの選択性をだすことに成功した。今後、反応機構、反応遷移状態、選択性発現機構などを明らかにすることによって、選択性、触媒活性の向上を達成する予定である。これまで問題となっていたアミノ酸エステルの不斉加水分解で非天然型の生成物した得られない点や、四級アンモニウム以外に四級ホスホニウムで新たな触媒が開発できた点は計画通りに進んでいる。アミノ酸エステルの不斉加水分解や、四級ホスホニウム塩を用いた反応のさらなる展開のほかに、2-アリールプロパン酸エステルでの反応を進めたい。2-アリールプロパン酸エステルの不斉加水分解では、NSAIDS関連の生成物が得られるが、生成物は有用なものと逆のエナンチオマーである問題点があった。さらに、固体触媒とのハイブリッド型触媒の開発も進める。
シンク機能に基づく物質集積

植物の物質集積機能の分子的基礎を明らかにするため、突然変異株を利用する方向、cDNAまたは遺伝子をクロ-ニングしその構造などを解析する方向、細胞オルガネラの構造と機能を解析する方向の3つの方向で研究した。1.イネを化学変異原物質で処理し、種子の貯臓タンパク質の集積に変異が起きた株やアミロプラスが変形している株を得ることができた。また粒大を支配する遺伝子の一つLKーfは極めて変異しやすいこと、この遺伝子の作用によってもみ殻が大きくなっても物質集積能力は必ずしも大きくならないことがわかった。2.イネ種子の2種のプロティナ-ゼインヒビタ-(オリザインとオリザシスタチンII)と分子マスが16キロダルトンのプロラミン、ジャガイモ塊茎のUDPーグルコ-スピロホスホリラ-ゼと2種のホスホリラ-ゼ、サツマイモ塊根のF_1ATPaseのγサブユニットなどのcDNAをクロ-ニングし、これらタンパク質の一次構造を推定した。そして、他の生物種の対応するタンパク質と対比し、機能との関連や進化について解析した。また、ダイズグリシニンとジャガイモホスホリラ-ゼについては、cDNAを大腸菌や酵母で発現させ、大量にこれらのタンパク質を得て高次構造を調べ、大量集積とタンパク質の構造との関連を解析した。さらに、サツマイモF_1ATPaseのδサブユニット、シロイヌナズナのCF_1のγサブユニット、ヒマの2種のカタラ-ゼサブユニットなどの遺伝子をクロ-ニングし、その構造を明らかにすると共に、これらの遺伝子の発現調節様相を解析した。3.イネ種子の2種のプロティンボディやカボチャ種子のプロティンボディなど物質集積にかかわっている細胞オルガネラの形成について研究し、プロティンボディへのタンパク質輸送のシグナル配列やプロティンボディ膜タンパク質の生合成の構造などを部分的ながら明らかにした。
学習支援のためのオンライン文字図形認識法の研究

本研究では、タブレット上に筆記される文字や図形を、オンライン型のパターン認識技術を用いて自動的にコード情報に変換するとともに、筆記された解答の正誤を自動的に判定し、利用者の学習を支援する「高精度なオンライン文字図形認識技術」を確立する。また、具体的な活用例として、数学の学習を支援する学習支援システムを試作し、オンライン文字図形認識技術を用いた「学習支援システムの構築技術」を確立する。本期間で明らかにした技術項目を以下に示す。(1)オンライン文字図形認識の高精度化:オンライン文字図形認識の識別部として、パターン間の類似性の評価尺度にDP(ダイナミックプログラミング)による距離算出法を採用し、学習パターンの使用方法としてCAP(カテゴリカル平均パターン)によって基準辞書を求める文字図形識別法を用いることによって、数字の高精度な識別が可能なことを明らかにした。(2)学習支援システムにおける後処理技術の開発:算数の学習を支援する学習支援システムについては、問題とその解答とをデータベースとして準備することができるので、この既知情報を利用して利用者が解答する筆記数字をある程度推定できる。この推定値を利用して、認識精度を向上させる方法を考案し、実験によりその効果を明らかにした。(3)個人辞書の自動更新による識別性能の向上:利用者が算数の問題を解いていくうちに、自動的に識別辞書を更新し、認識精度を向上させる個人辞書作成技術を考案し、実験によりその効果を明らかにした。(4)認識型学習支援ソフトウェアの試作:算数の問題を解くような学習において、(1)問題の提示、(2)利用者の筆記による解答、(3)パターン認識による正誤判定、(4)(1)(3)の繰り返し、(5)採点と集計、などの一連の学習行動を支援する「認識型学習支援ソフトウェア(算数)」を試作し、オンライン文字図形認識技術が自学習の支援に有効なことを確認した。本研究では、子供や高齢者が筆記する変形の大きな文字や図形に対して、タブレットを用いたオンライン形のパターン認識手法によって、自動的にコード化するオンライン文字図形認識技術を確立する。また、具体的な活用例として、数学の学習を支援する学習支援システムを構築し、オンライン文字図形認識のシステム化技術を確立する。本期間で明らかにした技術項目の中から、以下の2項目について報告する。(1)自由筆記文字のデータ収集:タブレットとパソコンとを組み合わせたデータ収集実験システムを構築し、数式学習支援情報とその認識に関するデータ:小学3年生(9人)と小学6年生(13人)に対し、数字、記号、および誤記入時の訂正情報など:を収集した。また、高齢者の筆記した日本語データを入手した。今後は、これらのデータから一文字づつ切り出して正解等の情報を付与し、認識実験に使えるデータベースを作成する。(2)変形を許容する認識アルゴリズムの研究:数字や数式記号、ジェスチャーコマンドなどの数式情報を、高精度で認識する文字図形認識手法として、「動的学習パターンの選択による文字図形認識法」を開発した。この手法は、学習パターンの中から入力パターンに近いk個を選び(すなわちk個の学習パターンの平均パターンと入力パターンとの距離が最も近くなるパターン群を選択し)、それらのパターン群が形成する部分空間を求めて入力パターンとの距離を求める。この方法は、文字図形の変形や品質の劣化に対して、強い認識能力を発揮する手法である[特願2006-11291:文字識別装置及び文字識別方法]。本研究では、タブレット上に筆記される文字や図形を、オンライン型のパターン認識技術を用いて自動的にコード情報に変換して、筆記された解答の正誤を自動的に判定し、利用者の学習を支援する「高精度なオンライン文字図形認識技術」を確立する。

また、具体的な活用例として、数学の学習を支援する学習支援システムを試作し、オンライン文字図形認識技術を用いた「学習支援システムの構築技術」を確立する。本期間で明らかにした技術項目を以下に示す。(1)オンライン文字図形認識の高精度化:オンライン文字図形認識の識別部として、パターン間の類似性の評価基準にDP(ダイナミックプログラミング)による距離算出法を採用し、学習パターンの使用方法としてCAP(カテゴリカル平均パターン)によって基準辞書を求める文字図形識別を用いることによって、数字の高精度な識別が可能なことを明らかにした。(2)学習支援システムにおける後処理技術の開発:算数の学習を支援する学習支援システムについては、問題とその解答がデータベースの中にあるので、この既知情報を利用して利用者が解答する筆記数字がある程度推測できる。この推測値を利用あいて、認識精度を向上させる方法を考案し、実験によりその効果を明らかにした。(3)個人辞書の自動更新による識別性能の向上:利用者が算数の問題を解いているうちに、自動的に識別辞書を更新し、認識精度が向上する個人辞書作成技術を考案し、実験によりその効果を明らかにした。(4)認識型学習支援ソフトウェアの試作:算数の問題を解くような学習において、(1)問題の提示、(2)利用者の筆記による解答、(3)パターン認識による正誤判定、(4)(1)(3)の繰り返し、(5)採点と集計、などの一連の学習行動を支援する「認識型学習支援ソフトウェア」を試作し、オンライン文字図形認識技術が自学習の支援に有効なことを確認した。
交通計画における態度・行動変容マネジメント研究

本研究は,従前までに実施してきた社会実験的MMを継続的に実施するとともに,現地ヒアリング調査等を通じて,これらのMMの長期的効果を含む,様々な効果を測定した.そして,そこで得られた知見を踏まえて,今後,本格的な大規模MMを,我が国の実際の行政で行っていくことを目指して,これまでよりもより大規模(数千1万世帯程度)な世帯を対象とした社会実験的MMを実際に推進し,本格的なMMの実務的展開に向けての課題やMM施策の効果を検証した.その結果,MM施策実施後,渋滞緩和効果や態度変容効果が確認されたいくつかの事例において,その効果が継続的に持続していることが示され,MMの長期的効果が認められた.また,複数の手法を同時に用いた本格的MMを実施し,公共交通の利用者数増加や道路交通の変化などの効果を定量的に検証したところ,対象地域においてMM実施による集計的な効果が確認された.そして,複数種類のMM施策の効果を比較分析することによって,それぞれの施策の相対的な効果や特質を把握することができ,MMの実務的展開に資する知見を得ることが出来た.また,大規模MMの効果を検証するため,50万世帯に配布されている地域新聞を活用し,読者に「かしこいクルマの使い方」を呼びかけると共に,TFPへの参加を呼びかける大規模なMMを実施した.その結果,メディアを通じたコミュニケーションのみでも,読者の態度・行動変容を見込めることが示された.さらに,本取り組みの費用対効果について検討したところ,一定の費用対効果が見込めることが示された.本研究は,従前までに実施してきた社会実験的MMを継続的に実施するとともに,現地ヒアリング調査等を通じて,これらのMMの長期的効果を含む,様々な効果を測定した.そして,そこで得られた知見を踏まえて,今後,本格的な大規模MMを,我が国の実際の行政で行っていくことを目指して,これまでよりもより大規模(数千1万世帯程度)な世帯を対象とした社会実験的MMを実際に推進し,本格的なMMの実務的展開に向けての課題やMM施策の効果を検証した.その結果,MM施策実施後,渋滞緩和効果や態度変容効果が確認されたいくつかの事例において,その効果が継続的に持続していることが示され,MMの長期的効果が認められた.また,複数の手法を同時に用いた本格的MMを実施し,公共交通の利用者数増加や道路交通の変化などの効果を定量的に検証したところ,対象地域においてMM実施による集計的な効果が確認された.そして,複数種類のMM施策の効果を比較分析することによって,それぞれの施策の相対的な効果や特質を把握することができ,MMの実務的展開に資する知見を得ることが出来た.また,大規模MMの効果を検証するため,50万世帯に配布されている地域新聞を活用し,読者に「かしこいクルマの使い方」を呼びかけると共に,TFPへの参加を呼びかける大規模なMMを実施した.その結果,メディアを通じたコミュニケーションのみでも,読者の態度・行動変容を見込めることが示された.さらに,本取り組みの費用対効果について検討したところ,一定の費用対効果が見込めることが示された.もしも,ひとり一人の"移動"(モビリティ)が変わるのなら,つまり,交通行動における「行動変容」が生じるのなら,それら諸問題は,抜本的に解消することが期待される.この様な期待のもとで実施する交通施策として,人々の移動(モビリティ)に関する"行動変容"を促すマネジメント施策である「モビリティ・マネジメント」(mobility management;略称,MM)が近年提案されている.ここに,MMは次のように定義されている(藤井,2004).「一人一人のモビリティ(移動)が,社会にも個人にも望ましい方向注)に自発的に変化することを促す,コミュニケーションを中心とした交通施策」(注:例えば,過度な自動車利用から公共交通・自転車等を適切に利用する方向).この交通施策は,社会心理学の知見に基づいて構築された複数のコミュニケーション技術を基本として,人々の行動変容をもたらすことを目指す施策である.ソフト的交通施策という意味でTDMと類似するが,コミュニケーションや各種マネジメント施策を通じて,「自発的な行動変容」を促すことを目指している点が大きな相違点である.ただし,MMは,その基本的かつ理論的な概要は提案されているものの,実務的に大規模展開を図るには,検討すべき技術的な課題(どのような人々に対しては,どのようなコミュニケーションが適切か?どのように人々に接触していくのが効率的か?等)が数多く残されている.本科研研究では,これまでに蓄積された「心理学的知見」をベースに(藤井,2003),これまでよりもより大規模(数千1万世帯程度)な世帯を対象としたMMを実施することを通じて,本格的・実務的にMMを進めるために必要となる実践的知見を得ることを目指す.そして,日本の実交通行政に直接的に貢献できるマネジメント施策のあり方を,現実的な形で提案することを究極的目的とする.本年度は,前年度までのパイロット的モビリティ・マネジメント(MM)施策によって得られた知見を基にして,MMの実務的な展開に向けての課題やMM施策の効果を明らかにすることを目的として,居住世帯,職場,学校において,社会実験的MMを実際に推進した.その際,本格的MMの実施に資する実務的知見を得るために,数千一万の中規模程度の被験者数を確保した.その結果,居住世帯,職場,学校のそれぞれで進めたMM施策において,従来よりも施策規模を拡大した場合においても,自動車利用の減少効果,及び,公共交通利用の促進効果が存在することが確認された.

さらに,MM実施後の継続的な調査によって,MM施策において長期的効果が存在することも示された.また,全国各地において,MMの実験的な取り組み事例が蓄積される中,これらの事例を収集し,体系的に整理するとともに,英国や豪州における先進的事例との比較検証を実施した.その結果,今後,我が国において大規模なMM施策を展開する上では,MMの効果計測手法を共通化することが重要な課題であることが示唆された.そこで,MM施策の包括的モニタリングならびに施策の横断的・総合的な評価を目的として,我が国におけるMM事例をとりまとめたデータベースを構築した.そして,MMの中でも特にトラベル・フィードバック・プログラム(TFP)に着目し,2005年までに国内で実施された31事例を対象として,TFPの効果の客観的な定量評価を行った.これら複数事例の統一的評価にあたっては,新たに「自動車利用変化指標」「公共交通利用変化指標」を提案することによって,人々の交通行動変容を測る効果計測指標を一元化した.その結果,TFPの実務的効果の平均は,自動車利用が約19%の削減,公共交通利用が約32%の増加であることが分かった.本年度は,これまでに実施してきた社会実験的MMを継続的に実施するとともに,現地ヒアリング調査等を通じて,これらのMMの長期的効果を含む,様々な効果を測定した.そして,そこで得られた知見を踏まえて,今後,本格的な大規模MMを,我が国の実際の行政で行っていくことを目指して,これまでよりもより大規模(数千1万世帯程度)な世帯を対象とした社会実験的MMを実際に推進し,本格的なMMの実務的展開に向けての課題やMM施策の効果を検証した.その結果,MM施策実施後,渋滞緩和効果や態度変容効果が確認されたいくつかの事例において,その効果が継続的に持続していることが示され,MMの長期的効果が認められた.また,複数の手法を同時に用いた本格的MMを実施し,公共交通の利用者数増加や道路交通の変化などの効果を定量的に検証したところ,対象地域においてMM実施による集計的な効果が確認された.そして,複数種類のMM施策の効果を比較分析することによって,それぞれの施策の相対的な効果や特質を把握することができ,MMの実務的展開に資する知見を得ることが出来た.また,大規模MMの効果を検証するため,50万世帯に配布されている地域新聞を活用し,読者に「かしこいクルマの使い方」を呼びかけると共に,TFPへの参加を呼びかける大規模なMMを実施した.その結果,メディアを通じたコミュニケーションのみでも,読者の態度・行動変容を見込めることが示された.さらに,本取り組みの費用対効果について検討したところ,一定の費用対効果が見込めることが示された.
力学的ストレスが骨端軟骨の組織構造と骨化形態に及ぼす作用に関する研究

【目的】力学的ストレスが骨端軟骨の増殖と骨化形態に及ぼす影響を明らかにするため、家兎の近位脛骨骨端部を用い、人為的に骨端部にかかる力学的ストレスを変更し、骨端部軟骨の柱状構造の変化と骨化形態の変化を観察した。【材料と方法】妊娠ニュージーランド白色家兎を管理出産させ子家兎を用いた。生後2週で麻酔下に片側の大腿伸展筋群を切除した脱牽引群と、6羽の生後3週子家兎の片側大腿骨に小創外固定器をとりつけ脚延長を行ない過剰牽引群を作成した。脱牽引群は術後2・4・6・8週に各6羽ずつ安楽死させ、両脛骨を摘出し標本固定した。過剰牽引群は術後3週間、1日1mm延長し、延長終了後安楽死させ、両脛骨を摘出し標本固定した。両標本とも軟X線撮影ののち脱灰し正中矢状面の作成し、HE染色、サフラニンO染色により観察した。【結果】過剰牽引側では膝蓋靱帯停止部の副骨化核の後方に縦走するbipolar physis面の骨梁は幅広く成熟していたが、健側では辺縁粗造でbipolar physisの幅も広く比較的未熟であった。脛骨近位骨端軟骨板は、健側では前方にほど遠位に傾斜していたが、過剰牽引側では比較的水平化していた。脛骨結節の副骨化核の遠位は脛骨前方骨膜に移行しているが、過剰牽引側では骨膜骨化が進んでいた。脱牽引群では副骨化核は健側より更に未熟で、骨端軟骨板は更に前方傾斜し、副骨化核遠位の骨膜性骨化は更に遅れていた。【結論】両群の結果よりこれらの変化は脛骨結節部に負荷した持続的な牽引力の大きさにより発症したことは明らかであり、本動物モデルは、力学的ストレスが生体の形態形成に与える影響を組織学的に検討するための良い実験系になると考えた。
協同的一妻多夫魚や血縁型共同繁殖魚の高度な社会の維持機構とその行動基盤の解明

本研究では、社会的認知性魚類を対象に、自己鏡像認知、顔認知、雌による♂個体の父性認識操作、推移的推察などを、いずれも実験的に検出することに成功し、高次認知システムが魚類に存在することを強く示すことができた。いずれの成果も魚類では始めての検証事例であり、その成果の意義は極めて高い。これらの成果は、従来考えられてきた、高次認知機能は大きな終脳サイズや大脳新皮質が不可欠であるとの常識を覆すものであり、脊椎動物の認知様式の見方の見直しをせまるものである。この高次認知機能の存在は、脳神経回路の多くは、硬骨魚類のうち条鰭類と鳥類やほ乳類との神経回路の類似性あるいは保存性の良さと一致するものと捉えられる。平成24年度は、タンガニイカ湖産カワスズメ,ブリチャージ、トランスクリプタス、サンゴ礁魚のホンソメワケベラを用いて室内実験を実施した.ブリチャージでは顔認識による個体識別についての追加実験、顔認識がいかになされているのかを確認する実験を行い、本種は個体変異のある顔の模様だけで、瞬時にして個体識別が出来る事がほぼ明らかにされた.この顔認識は、霊長類やヒツジ等の社会性ほ乳類での顔認識とよく似ており、今後は「注視」について調べて行く.トランスでは、社会認識の記憶時間に付いて検討した.これは魚類での社会的事象の認識についてはじめての検証例になる.まず、Winner-Loser効果が無い事を確認した上で、本種が5ー7日間、勝者の対戦相手を覚えている事が示された.これは相手個体変化に対応している訳ではない.今後、相手そのものを忘れるのか、相手は覚えていても負けた事を忘れるのか、更なる検討を行う.ホンソメワケベラでは、自己鏡像認知能力を検証すべく、一連の実験を行った.まず鏡提示後数日間は攻撃的に振る舞うが、3ー5日以降は鏡像に対する敵対行動はほぼ無くなること(チンパン時の場合と類似している)、2ー5日に鏡像が自己像である事を確認するかのような行動が見られる事が、確認された.さらに、喉あるいは目の後ろに(本人には直接は見えない)茶色いマーク(本種の餌である外部寄生虫に似せてある)を施した所、その箇所を覗く頻度が増える事が確認され、さらにその場所を底の砂で擦る行動が見られた.この覗きや擦り行動は、透明マークを施したときや、本番の茶色マークをしているが、鏡を見せていない時には見られなかった.この事実は、本種が自己鏡像認知をしている事を強く示唆している.共同的一妻多夫魚であるJ. transcriptusを用いた実験からトリオ(2♂との)産卵の場合多く見られた擬似産卵の効果が確認された。すなわち、擬似産卵でも♂は産卵時と差異のない量の精子を放出していた。このことは、♂が産卵と擬似産卵の区別がつかないことを示しており、放精行動の多さと保護行動が強く相関することは、♂が放精行動に基づいて父性認識をしていることを示している。また、雌はこのため擬似産卵を多用することで、♂の父性認識を操作していることが考えられる。さらに興味深いことに、産卵時に小型のβ♂と多く産卵と疑似産卵ができた雌は、産卵直後βを排除しないが、そうでないβ♂は激しく排除した。このことは、雌は♂がどのくらい放精したのかを把握していることを示している。区別をすることはできないが、雌は産卵後♂がどのように父性を認識しているのかを「理解」している可能性がある。これは、単なる刺激にたいする反応ではなく、様々な産卵のイベント全体を総合的に把握し、多くの情報を自発的に取り込んで総合判断していると考えられ、操作や騙しの問題を考える上で興味深い材料であることが明らかになってきた。また、共同繁殖魚プルチャーの親敵効果が「tit for tat」仮説に基づくのかどうかその可能性を探った。隣人が本来の場所から出た場合、縄張り個体は激しく攻撃すること、しかしその際でも隣人と認識した上で攻撃しているとみなすことなどから、相手の「裏切り」に対し罰を与えていると捉えることができ、本種の親敵効果ではtit for tatが行動基盤として作用している可能性が示された。このような行動基盤の解明は魚類で始めてである。また、共同的一妻多夫魚のオルナータスで、社会的記憶時間についても実証研究を行い、社会的認識はほぼ一週間で消失することが示された。23年度は,大阪市立大学での実験室で予定していたすべての実験を実施した。推移的推察については,カワスズメ科魚トランスを用いて行ったところ,本種が推移的推察を行えることが確認された。

これは魚類では始めての事例であり,魚類での高い認知能力が示された。この他に,優劣関係を各個体がどの程度記憶しているのかという,「短期記憶」実験も行った。その結果,ほぼ5日間は相手と優劣関係を記憶している事が示された。動物の記憶に関する研究は,これまでほとんどなく,特に魚類ではまったくなく,その研究の意義は大きい。また,ブリシャージを用いた個体認識の行動基盤についてもほぼ明らかになった。本種をはじめ協同繁殖魚には顔面に変異のある色彩模様が発達している種が多い。デジタル映像とそれを加工映像を提示した実験から,本種は,顔の模様を認識し,それにより他個体を個体識別していることが示された。これは魚類の個体識別での始めての事例である。また,独自に作製した装置を使い,実験魚がモデルの顔に注目している事も示された。ほ乳類や鳥類での視覚による個体認識は顔を用いていることが知られており,この傾向は脊椎動物の祖先から生じたのか,高い社会性に応じて独立に進化したのか,今後の検討が待たれる。ホンソメワケベラを用いた鏡像認知実験では,きわめて興味深い結果が得られた。鏡を見せられた個体は1ー3日間他個体と見なすが,同時に各個体独特な「探索行動」を示す。それが2ー4日目に見られた後,個体は鏡像をまったく無視するようになる。この段階でマークテストを実施すると,個体はマークを確認しやすい姿勢を鏡の前で有意に頻繁にとるようになった。さらに,マークの位置を水槽の底の砂にこすりつける行動が観察された。これはマークテスト以前には殆ど見られない行動であり,本種は鏡像認知ができる事を強く示唆している。この発見は,驚愕すべき成果といえる。当初の予定ではホンソメワケベラは、これまでの状況証拠から自己鏡像認知をすることを予想してはいたものの実際に検証研究まで出来るかどうかははっきりしていなかった.初年、H23年度の実験において、本種が鏡像認知できる事が強く示唆され、さらにH24年度の実験からこのことが事実上実証されたと言える.動物の自己鏡像認知は脊椎動物で類人猿、ゾウ、イルカ、カササギでしか確認されておらず、今回鏡像認知が魚類でも出来る事が実証された訳で、この研究結果だけでも、当初の目的を遥かに超える成果である.このことを踏まえ、ホンソメワケベラを用いた「戦術的騙し(意図的騙し)」の検証研究に取り組み始めている.もし、このことが実験的に検証できれば、魚類ではじめてである事はもとより、類人猿以外では事実上はじめての研究となり、脊椎動物の認知研究の常識をひっくり返す程の巨大なインパクトになる.その他の認知研究においてもほぼ予定通りの成果が得られている.本研究では,水槽で飼育した魚類を用い,カワスズメ科魚類をはじめ高い社会性の魚類の知性や認知能力に関する行動実験を行う事を目標としている。テーマとして,協同繁殖魚の雌による雄の父性認識の操作,順位制の発達した魚類での推移的推察,個体識別様式,記憶,さらには魚類での鏡像認知にかんする研究である。父性操作に関する研究では,まず雄が産卵時の放精行動の頻度に依存して父性を認識しているらしい事,ペアの雌に比べ一妻多夫の雌は「擬似産卵」を多く行位,その際も雄は放精行動を行う事が明らかになった。このことから,擬似産卵によって雌は雄の父性認識をしている可能性が強く示唆された。また,個体がA>BかつB>CからA>Cを導くような推移的推察の能力を魚が持つ事も示された。
電気二重層キャパシタにおけるアノマリー容量効果の解明と積極的活用

キャパシタ電極として活性炭電極を採用し,イオン性液体であるイミダゾール塩にリチウム塩を添加したところ,粘度は増大したにもかかわらず容量増大効果が見られた。しかも興味深いことに,アニオンは共通イオンのままでカチオンのみをリチウムイオンとして加えたにもかかわらず,実際に容量増大効果が見られたのは,カチオン吸着極(負極)ではなく,アニオン吸着極(正極)のほうであった。このことより,単純にヘルムホルツ型の二重層モデルが容量を決定するのではなく,より高次の,あるいは長距離のイオン構造が容量を支配するアノマリーな容量発現メカニズムの存在が示された。さらにこのようなアノマリー効果が発現する状況がより広範囲に存在する可能性も考慮し,イオン性液体系にとどまらず,ゲル電解質系,水系についても精査を行った。2年度目は新規なキャパシタ電極における特異な容量増大効果を検討した。すなわち,活性炭とDNAを混合させることで,速度論的のみならず熱力学的にもキャパシタンス増大効果が認められた。詳細な解析により,二重層形成領域を支配するミリ秒単位以下の時定数にも短縮効果が認められた。DNA高分子の分子サイズは,活性炭のミクロ孔レベルよりはるかに大きく,通常の理論では非速度論的な容量増大効果は予想できないため,長距離構造におけるアノマリーな容量発現機構が存在していると考えられた(特許出願中)。また,イオン性液体にリチウム塩,あるいは微量溶媒を添加した系の二重層容量発現についてさらに解析した。その結果,電極表面に本来二重層を形成しない,対イオンが容量挙動に大きく影響を与えることがわかった。このようにイオン性液体の場合は長距離イオン構造が二重層容量に影響を与えていることが明確になり,単純な拡散二重層構造を超えたアノマリー容量発現が明らかになった。キャパシタ電極として活性炭電極を採用し,通常の電解質であるアルキルアンモニウムテトラフルオロボレート,また,イオン性液体であるイミダゾール塩を用いて二重層容量測定を行った。これにリチウム塩を添加したところ,アルキルアンモニウム塩に対しては容量がほぼ同じ,あるいはかえって減少し,通常理論で予想できる挙動であった。しかしながら,上記イオン性液体にリチウム塩を添加したところ,容量増大効果が見られた。しかも興味深いことに,アニオンは共通イオンのままでカチオンのみをリチウムカチオンとして加えたにもかかわらず,実際に容量増大効果が見られたのは,カチオン吸着極(負極)ではなく,アニオン吸着極(正極)のほうであった。このことは,単純にヘルムホルツ型の二重層モデルが容量を決定するのではなく,本研究のようにより高次の,あるいは長距離のイオン構造が容量を支配するアノマリーな容量発現メカニズムが存在していることが示されたといえる。この結果を積極的に活用すれば,現在限界とされている容量限界を打破し,高エネルギー密度のキャパシタデバイスが作成できる可能性がある。さらにこのようなアノマリー効果が発現する状況がより広範囲に存在する可能性も考慮し,イオン性液体系にとどまらず,ゲル電解質系,水系,また二次電池系についても精査を行った。このなかで熱力学的な因子,速度論的な因子についての情報を交流インピーダンス法や直流充放電法などから得た。この精査によりアノマリー容量効果の機構解明を次年度も進める。機構解明についてはまだ完全とはいえないので,次年度も継続して行う見込みであるが,本年度においては,特定の系においては上記のように,基本的な発現条件については把握できた。前年度に引き続き,キャパシタ電極における特異な容量増大効果を検討した。その結果,まず,活性炭とDNAを混合させることで,速度論的のみならず熱力学的にもキャパシタンス増大効果が認められた。

拡散係数などの解析によると,長距離移動におけるバルク拡散係数が増大していることが明らかになったが,これ以外に二重層形成領域を支配するミリ秒単位以下の時定数にも短縮効果が認められた。DNA高分子の分子サイズは,活性炭の二重層形成場であるメソ孔からミクロ孔レベルの規模よりはるかに大きく,通常の理論では非速度論的な容量増大効果は予想できないため,長距離構造におけるアノマリーな容量発現機構が存在していると考えられた。このDNAによる容量増大効果については新規性が非常に高いため,特許出願を進めている。また,イオン性液体にリチウム塩,あるいは微量溶媒を添加した系の二重層容量発現について解析した。その結果,電極表面に本来二重層を形成しない,対イオンが容量挙動に大きく影響を与えることがわかった。機構の詳細はさらに研究を継続する必要はあるものの,イオン性液体の場合は長距離イオン構造が二重層容量に影響を与えていることが明確になり,単純な拡散二重層構造を超えたアノマリー容量発現が明らかになった。このような二重層構造の特異性を活かし,リチウムイオン電池の電極界面制御も試みた。その結果,金属リチウムの界面構造に対しても添加剤が特異的な容量発現性をもたらすことが明らかになった。
奄美地域の中世城郭の実態調査

奄美地域には,中世域郭とみなせるもので, 45個ある.これらについて地形図・地字図・空中写真を集め,また刊行された報告書類を収集した.その検討結果により,次の15か城について現地で実測調査を行い,関連する事項について調査を行った.与論城・内城・後蘭孫八城・海城・根瀬部城・小宿城・朝戸城・円城・戸口城・平家盛・七城・国直城・今城・ファームテ城・坂元城.これらの中世城郭は, 17世紀初頭まではその機能を果していたが,その後は当地域独特の信仰であるノロ信仰と深く結びついていた.したがって,現在まで,旧態を良く残してきた.一方,現在何ら中世城郭の痕跡のない地域を,「城」と呼びならわしている場合が,相当数になっている.その数は,集落の3割以上となっており,調査がすすめば,現存する集落のうち半数以上の所より見い出せるものと思われる.この「城」を,グスクと呼んでいるが,グスクは琉球文化圏に特徴的な存在であり,奄美地域の中世城郭の調査は,同文化圏の中に位置づけられなければならない.今回の調査の限りでは,奄美地域のグスクは,沖縄の先島地域のグスクと共通点が多い.このようにグスクの研究は,ようやく分布実態調査が始まったばかりであり,史料の少いこの地域の歴史研究の有力な資料であるにもかかわらず,現在では,急速に消滅しつつあり,また特に若い人達の関知しないものとなりつつある.できる限り,地元の郷土史研究者等と協力体制を作り,改めて伝承としてしか残っていないグスクについて聴き取り調査をすべきであるというのが,現時点での主要な課題である.奄美地域には,中世域郭とみなせるもので, 45個ある.これらについて地形図・地字図・空中写真を集め,また刊行された報告書類を収集した.その検討結果により,次の15か城について現地で実測調査を行い,関連する事項について調査を行った.与論城・内城・後蘭孫八城・海城・根瀬部城・小宿城・朝戸城・円城・戸口城・平家盛・七城・国直城・今城・ファームテ城・坂元城.これらの中世城郭は, 17世紀初頭まではその機能を果していたが,その後は当地域独特の信仰であるノロ信仰と深く結びついていた.したがって,現在まで,旧態を良く残してきた.一方,現在何ら中世城郭の痕跡のない地域を,「城」と呼びならわしている場合が,相当数になっている.その数は,集落の3割以上となっており,調査がすすめば,現存する集落のうち半数以上の所より見い出せるものと思われる.この「城」を,グスクと呼んでいるが,グスクは琉球文化圏に特徴的な存在であり,奄美地域の中世城郭の調査は,同文化圏の中に位置づけられなければならない.今回の調査の限りでは,奄美地域のグスクは,沖縄の先島地域のグスクと共通点が多い.このようにグスクの研究は,ようやく分布実態調査が始まったばかりであり,史料の少いこの地域の歴史研究の有力な資料であるにもかかわらず,現在では,急速に消滅しつつあり,また特に若い人達の関知しないものとなりつつある.できる限り,地元の郷土史研究者等と協力体制を作り,改めて伝承としてしか残っていないグスクについて聴き取り調査をすべきであるというのが,現時点での主要な課題である.
宿主内で活性化する細菌遺伝子発現制御系と食細胞を介する感染調節

宿主に侵入した細菌は,宿主環境にさらされる。細菌はこれを環境変化として感知して,宿主免疫に抵抗するとともに感染維持や毒性に働く物質の産生を調節する。本研究は,大腸菌の情報伝達経路である二成分制御系と,RNA合成酵素のシグマサブユニットによる感染調節の仕組みを明らかにすることを目的として進められている。本年度は,初年度の成果に基づき,二成分制御系EnvZ-OmpRによる宿主毒性調節に働く物質の同定を目指した。膜型ヒスチジンキナーゼEnvZが活性化すると,転写調節因子OmpRの活性を変化させ, OmpRが制御下遺伝子群の発現を調節する。このうち正に制御される遺伝子群の中から,ショウジョウバエ宿主感染系を利用して,膜タンパク質をコードするompC遺伝子がハエへの毒性を抑制することを見出してきた。ompC遺伝子欠損菌株の破砕液を出発材料として,遠心分離により細胞質画分,外膜画分,内膜画分を得て活性を調べると,外膜画分に活性が存在した。そこで,外膜画分を界面活性剤で可溶化してクロマトグラフィーにより連続分取を行い,全画分の毒性活性をハエ感染系により調べた。活性の高い画分に含まれるタンパク質をMS解析すると,ompC欠損により存在レベルが高い種類が数十種類見出された。これらのタンパク質をコードする遺伝子群をスクリーニングし,ompC欠損による毒性亢進を担うタンパク質の候補群が得られた。その多くは外膜に局在する機能未知のタンパク質であり,これらの中に,毒性物質が含まれると考えられた。2年度目は,初年度の成果に基づき,EnvZ-OmpRに制御されるOmpCタンパク質により抑制されている毒性物質の同定を目指した。研究代表者は,2018年度途中に所属が変わり,新たに研究室の立ち上げを行ない,実験室整備は,実験台や実験機器をいちから準備また調達する時間が必要であった。また,震災停電の影響を受け,試薬類や実験材料の再調製を行なった。そのため,実験の進行が当初予定よりやや遅れている。ただし,OmpC欠損菌株に含まれる毒性成分を,クロマトグラフィーにより分離した全画分の活性を,同じ手順で分離した親菌株の該当画分と比較することで,OmpC介在性の毒性活性画分を追跡できた。また,両菌株由来画分に含まれるタンパク質の比較により,目的タンパク質の候補を効率よく絞り込むことができたことから,来年度の研究で研究進行を推進することが期待できる。今後は,これまでの解析で得られた成果に基づき,OmpCにより抑制される毒性物質の同定を目指す。候補タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれについて,遺伝子変異菌株を準備する。また,それぞれの候補タンパク質の強制発現を誘導するプラスミドを準備し,これを導入した発現誘導株も作成し,効率よく目的タンパク質を発現する培養条件を整える。発現誘導株は誘導条件や発現効率がそれぞれ違うと考えられるため,まず,遺伝子欠損菌株群の抽出液を調製し,ハエを用いて宿主毒性が減弱する種類をスクリーニングする。ここで選ばれた遺伝子について,続いて,強制発現株の抽出液を用いたスクリーニングを行い,注入実験発現なしと高発現時の宿主毒性の変化をハエ感染系で調べ,候補を絞り込む。続いて,毒性画分を分離精製した手順を利用して,候補分子を分離精製し,これらについてハエへの毒性を調べて大腸菌の宿主傷害物質を同定する。一方,シグマ因子による感染調節については,その転写後調節に働く分子を,低分子RNAやRNA結合タンパク質の中から見出し,RNA合成酵素による感染調節機構を明らかにすることを目指す。細菌には環境変化を感知して遺伝子発現を変化させ,新たな環境に適応して生育する仕組みがあり,これは,宿主に感染した細菌についてもあてはまる。宿主因子の情報を受け取ることで,細菌は宿主への感染維持や毒性発揮に働く物質の産生を変化させる。本研究では,大腸菌の情報伝達経路と,RNA合成酵素のシグマサブユニットに着目し,感染調節機構を明らかにすることを目的として行われている。初年度は,細菌の情報経路のひとつである二成分制御系EnvZ-OmpRによる環境感知と毒性調節を扱った。膜型ヒスチジンキナーゼEnvZと転写調節因子OmpRはセットで働き,自己リン酸化により活性化したEnvZはリン酸基をOmpRに転移し,リン酸化されたOmpRが,制御下遺伝子群の発現を調節する。これまでに,EnvZ-OmpRに調節されるompC遺伝子が細菌の宿主調節に働くことを,大腸菌とショウジョウバエのモデル系から見出している。ショウジョウバエより回収した体液成分を大腸菌に混ぜて共培養すると,EnvZおよびOmpRがリン酸化されるとわかり,体液成分を加熱もしくはエタノール処理してもその程度に変化はなかった。本経路の活性化因子を探索するため,EnvZ-OmpRにより正に制御される遺伝子群のプロモーター活性化程度を利用した解析を進め,EnvZ-OmpRを活性化する宿主因子は,加熱処理に耐性で親水性の小型分子と考えられた。一方,OmpCは外膜タンパク質であり,宿主の免疫系がこれに作用すると考えられる。宿主免疫系のうち,液性応答を担うImd経路,細胞性応答の中心である食細胞の貪食受容体Draper, Integrinの寄与をショウジョウバエ変異体を用いて調べると,いずれの宿主因子もOmpCによる感染調節作用に必要ないと考えられた。初年度に計画された実験が実施され,期待する成果が得られたことより,順調に進展していると判断した。

まず,宿主体液中に,大腸菌の二成分制御系のEnvZとOmpRを活性化し,下流遺伝子の発現を制御する活性成分が含まれているとわかり,活性は小型の親水性の分子が有すると考えられた。EnvZ-OmpRは多くのグラム陰性細菌が共通して有する細菌の情報経路であるが,浸透圧変化による物理的刺激により活性化されると報告されていた。今回の解析により,宿主体液中に,細菌情報経路の活性化因子が含まれるとわかり,物理的刺激以外のリガンドの存在が示された。一方,EnvZ-OmpRによる感染調節作用について,グラム陰性細菌に対する主要な液性経路であるImdに関わる因子や,食細胞であるヘモサイトの貪食受容体群の働きは必要ないと考えられる結果が得られた。このことは,感染調節に働く新たな宿主ー細菌応答の仕組みが存在することを示唆している。宿主に侵入した細菌は,宿主環境にさらされる。細菌はこれを環境変化として感知して,宿主免疫に抵抗するとともに感染維持や毒性に働く物質の産生を調節する。本研究は,大腸菌の情報伝達経路である二成分制御系と,RNA合成酵素のシグマサブユニットによる感染調節の仕組みを明らかにすることを目的として進められている。本年度は,初年度の成果に基づき,二成分制御系EnvZ-OmpRによる宿主毒性調節に働く物質の同定を目指した。膜型ヒスチジンキナーゼEnvZが活性化すると,転写調節因子OmpRの活性を変化させ, OmpRが制御下遺伝子群の発現を調節する。このうち正に制御される遺伝子群の中から,ショウジョウバエ宿主感染系を利用して,膜タンパク質をコードするompC遺伝子がハエへの毒性を抑制することを見出してきた。ompC遺伝子欠損菌株の破砕液を出発材料として,遠心分離により細胞質画分,外膜画分,内膜画分を得て活性を調べると,外膜画分に活性が存在した。そこで,外膜画分を界面活性剤で可溶化してクロマトグラフィーにより連続分取を行い,全画分の毒性活性をハエ感染系により調べた。活性の高い画分に含まれるタンパク質をMS解析すると,ompC欠損により存在レベルが高い種類が数十種類見出された。これらのタンパク質をコードする遺伝子群をスクリーニングし,ompC欠損による毒性亢進を担うタンパク質の候補群が得られた。その多くは外膜に局在する機能未知のタンパク質であり,これらの中に,毒性物質が含まれると考えられた。2年度目は,初年度の成果に基づき,EnvZ-OmpRに制御されるOmpCタンパク質により抑制されている毒性物質の同定を目指した。研究代表者は,2018年度途中に所属が変わり,新たに研究室の立ち上げを行ない,実験室整備は,実験台や実験機器をいちから準備また調達する時間が必要であった。また,震災停電の影響を受け,試薬類や実験材料の再調製を行なった。そのため,実験の進行が当初予定よりやや遅れている。ただし,OmpC欠損菌株に含まれる毒性成分を,クロマトグラフィーにより分離した全画分の活性を,同じ手順で分離した親菌株の該当画分と比較することで,OmpC介在性の毒性活性画分を追跡できた。また,両菌株由来画分に含まれるタンパク質の比較により,目的タンパク質の候補を効率よく絞り込むことができたことから,来年度の研究で研究進行を推進することが期待できる。