hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エクソゾームを利用した膵癌幹細胞標的療法の開発

近年エクソゾームに関する研究が進み、この膜小胞に含まれる様々の分子が体内において安定であること、また、膵癌などKRASが活性化した細胞ではエクソゾームの取り込みが亢進していること、が報告されている。さらに、エクソゾーム(ならびにこれに含まれる生体分子)がバイオマーカーとして有用であることが、広く知られるようになってきた。本研究では、これらに着目して、i)膵癌幹細胞の生成するエクソゾームの特徴を明らかにするとともに、ii)エクソゾームの運搬体としての有用性を検討し、膵癌幹細胞制御の新たな方法を探る。具体的な方法としては、我々の樹立した癌幹細胞モデルであるCD133陽性膵癌細胞を用い、この細胞にCD133shRNAを安定発現させて得たノックダウン細胞と比較することによって実験をおこなう。今年度は、まずこれらの細胞が細胞外の環境にどのように作用するかを調べるために、免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓に同所移植し、腫瘍を形成させる実験をおこなった(in vivoの系)。両者から得られた腫瘍の切片を作製し組織化学的に検討をおこなった結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進され、また、マクロファージの浸潤が亢進することがわかった。すなわち、CD133の発現は細胞外の組織や細胞に作用を及ぼすことが確認された。そこで、その機序を明らかにするためin vitroの系を用いた解析に着手した。また、エクソゾームを運搬体とした短鎖RNA導入によって膵癌幹細胞の抑制を行う際に標的となる遺伝子を調べる目的で阻害剤を使った実験をおこない、mTOR複合体1と同時にmTOR複合体2を阻害することが、幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。mTOR複合体2は、KRASの下流でAktの活性化に関与し、Akt- mTOR複合体1の経路に寄与するものと考えられた。今年度は、1)CD133陽性モデル細胞(膵癌幹細胞様細胞)とCD133ノックアウト細胞の産生するエクソゾームの比較解析、2)これらの細胞が周辺組織に及ばす影響、および、3)膵癌幹細胞の抑制に効果的な標的シグナルの解明、4)膵癌幹細胞の抑制に効果的なmiRNA配列の検索を計画した。2)については、両方の細胞を免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓に同所移植し、腫瘍を形成させて組織化学的に検討した結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進されることがわかった。したがって、CD133の発現は膵癌細胞の状態を変化させ、周辺の細胞に異なった作用を及ぼすと判断される。このしくみを明らかにするために、次にin vitroの細胞培養系を用いて繊維芽細胞やマクロファージに対する作用の違いをみているが、現在まだ結果が得られていない。両者の放出するエクソゾームに違いがあり、これが周辺組織の線維化に関与している可能性が考えられるので、1)の結果が待たれるがこれについても方法の確認をおこなっている段階である。膵癌ではほとんどの症例でKRASの活性化突然変異があることが知られており、また、KRASに対するsiRNAの投与が治療に有効であることが報告されている(マウスモデル)。いっぽうで、KRAS活性の抑制は、標的療法に用いるエクソゾーム(短鎖RNAのベクター)の取り込みを抑制する可能性があり、新たな標的遺伝子の検討をおこなっている。我々は、RAS下流のAkt⇒mTOR経路に注目しているが、阻害剤を用いた実験からmTOR複合体1および2を同時に阻害することが幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。これを含めて候補となる短鎖RNA(siRNA、miRNA)のリストを作成し、実際にモデル細胞に導入し検討しようとしているが、現在導入効率に問題があり進行が遅れている。CD133陽性膵癌細胞とCD133ノックアウト細胞の周辺細胞への作用については、今後もin vitroの細胞培養系を中心に、細胞学的手法(生理活性の検討)と分子生物学生化学的手法(成分の比較解析)の両面から検討する。現在の方法論的問題については、この方面の実験に実績のあるグループに指導を受ける。短鎖RNA(siRNA、miRNA)の導入効率の問題については、導入効率を可視化できるレポーター系を用いて、導入条件の最適化をはかる。KRAS以外に有効と判断される標的遺伝子がみつかれば、これの発現ベクターを作製し、エクソーム発現用細胞に組み込む。

両者から得られた腫瘍の切片を作製し組織化学的に検討をおこなった結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進され、また、マクロファージの浸潤が亢進することがわかった。すなわち、CD133の発現は細胞外の組織や細胞に作用を及ぼすことが確認された。そこで、その機序を明らかにするためin vitroの系を用いた解析に着手した。また、エクソゾームを運搬体とした短鎖RNA導入によって膵癌幹細胞の抑制を行う際に標的となる遺伝子を調べる目的で阻害剤を使った実験をおこない、mTOR複合体1と同時にmTOR複合体2を阻害することが、幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。mTOR複合体2は、KRASの下流でAktの活性化に関与し、Akt- mTOR複合体1の経路に寄与するものと考えられた。今年度は、1)CD133陽性モデル細胞(膵癌幹細胞様細胞)とCD133ノックアウト細胞の産生するエクソゾームの比較解析、2)これらの細胞が周辺組織に及ばす影響、および、3)膵癌幹細胞の抑制に効果的な標的シグナルの解明、4)膵癌幹細胞の抑制に効果的なmiRNA配列の検索を計画した。2)については、両方の細胞を免疫不全マウス(ヌードマウス)の膵臓に同所移植し、腫瘍を形成させて組織化学的に検討した結果、CD133陽性細胞の腫瘍では腫瘍周辺組織の線維化が促進されることがわかった。したがって、CD133の発現は膵癌細胞の状態を変化させ、周辺の細胞に異なった作用を及ぼすと判断される。このしくみを明らかにするために、次にin vitroの細胞培養系を用いて繊維芽細胞やマクロファージに対する作用の違いをみているが、現在まだ結果が得られていない。両者の放出するエクソゾームに違いがあり、これが周辺組織の線維化に関与している可能性が考えられるので、1)の結果が待たれるがこれについても方法の確認をおこなっている段階である。膵癌ではほとんどの症例でKRASの活性化突然変異があることが知られており、また、KRASに対するsiRNAの投与が治療に有効であることが報告されている(マウスモデル)。いっぽうで、KRAS活性の抑制は、標的療法に用いるエクソゾーム(短鎖RNAのベクター)の取り込みを抑制する可能性があり、新たな標的遺伝子の検討をおこなっている。我々は、RAS下流のAkt⇒mTOR経路に注目しているが、阻害剤を用いた実験からmTOR複合体1および2を同時に阻害することが幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。これを含めて候補となる短鎖RNA(siRNA、miRNA)のリストを作成し、実際にモデル細胞に導入し検討しようとしているが、現在導入効率に問題があり進行が遅れている。CD133陽性膵癌細胞とCD133ノックアウト細胞の周辺細胞への作用については、今後もin vitroの細胞培養系を中心に、細胞学的手法(生理活性の検討)と分子生物学生化学的手法(成分の比較解析)の両面から検討する。現在の方法論的問題については、この方面の実験に実績のあるグループに指導を受ける。短鎖RNA(siRNA、miRNA)の導入効率の問題については、導入効率を可視化できるレポーター系を用いて、導入条件の最適化をはかる。KRAS以外に有効と判断される標的遺伝子がみつかれば、これの発現ベクターを作製し、エクソーム発現用細胞に組み込む。CD133陽性細胞とCD133ノックアウト細胞の産生するエクソゾームの解析と単鎖RNAの導入法に技術的問題があり、計画にやや遅れが生じている。
都市水害の予測とそのハザードマップへの応用に関する研究

陸生の洪水や内水、あるいは海性の高潮などに対する都市の耐水性について,街路,建造物,地下空間などの都市特性を重点的に取り入れて研究し、その成果のハバ-ドマップ化を考察してきた.とくに本年度に得られた主な成果は以下のようである.1.都市内の建造物や街路網を取り入れた氾濫解析法を開発した.従来の2次元平面流れとしてデカルト座標系で解析するときの問題点を整理するとともに、氾濫水の伝播経路となる街路をそのまま取り入れられるように,一般曲線座標系モデルおよび1次元街路ネットワークモデルを構成した.街路網が発達した都市においては,街路ネットワークモデルによれば建造物による遮蔽の効果や街路に沿う流れなどを考慮することができ,このモデルが広い汎用性と実用性を有することが分かった.2.多層構造をなしている地下空間を1の成果を取り入れ,また天井によって水深が限定されているため開水路状態と管路状態が混在し遷移するという水理的特徴があることを考慮に入れて、モデル化した.解析例によれば,氾濫の規模によっては,一部の地下街では満流状態が現れるとともに,それが上部の層の浸水深を増大させるという地下空間での複雑な挙動が明らかになった.3.氾濫被害の算定法について,従来より用いられている治水経済要網による手法に加えて,浸水による営業停止損失の算定法などを改良した方法,およびGIS利用を念頭において町丁ごとの地域属性に応じて算定する方法を提案した.従来の方法では被害額が若干大きく評価される傾向があるが,本研究で提案した方法でもほぼ妥当な結果が得られ,簡便化が期待できるGIS利用の方法の将来性が知られた.陸生の洪水や内水、あるいは海性の高潮などに対する都市の耐水性について,街路,建造物,地下空間などの都市特性を重点的に取り入れて研究し、その成果のハバ-ドマップ化を考察してきた.とくに本年度に得られた主な成果は以下のようである.1.都市内の建造物や街路網を取り入れた氾濫解析法を開発した.従来の2次元平面流れとしてデカルト座標系で解析するときの問題点を整理するとともに、氾濫水の伝播経路となる街路をそのまま取り入れられるように,一般曲線座標系モデルおよび1次元街路ネットワークモデルを構成した.街路網が発達した都市においては,街路ネットワークモデルによれば建造物による遮蔽の効果や街路に沿う流れなどを考慮することができ,このモデルが広い汎用性と実用性を有することが分かった.2.多層構造をなしている地下空間を1の成果を取り入れ,また天井によって水深が限定されているため開水路状態と管路状態が混在し遷移するという水理的特徴があることを考慮に入れて、モデル化した.解析例によれば,氾濫の規模によっては,一部の地下街では満流状態が現れるとともに,それが上部の層の浸水深を増大させるという地下空間での複雑な挙動が明らかになった.3.氾濫被害の算定法について,従来より用いられている治水経済要網による手法に加えて,浸水による営業停止損失の算定法などを改良した方法,およびGIS利用を念頭において町丁ごとの地域属性に応じて算定する方法を提案した.従来の方法では被害額が若干大きく評価される傾向があるが,本研究で提案した方法でもほぼ妥当な結果が得られ,簡便化が期待できるGIS利用の方法の将来性が知られた.大阪湾沿岸都市をモデル・ケースとして取り上げ,沿岸都市特有の構造(建造物,都市内道路,下水道網,地下河川など)を考慮した氾濫流の解析法や避難モデルを構築するとともに,氾濫,被害予測,避難解析などのGIS的表紙を考察している.1.沿岸都市の水災害学的特性と被害予測:陸性の洪水および海性の高潮などに関して,既往の事例,河道計画,内水排除計画および防潮計画などの分析をするとともに,洪水・高潮の重畳時の氾濫の特性を考慮し,大阪市内においては洪水計画と高潮計画の遷移部が治水対策的にさらに検討を要する点であることを指摘した.2.都市氾濫の解析モデルや,地下流入モデルにのよって検討した.建物粗度は氾濫流には大きな影響はなく,遮蔽率の増加が浸水深を上昇させること,下水道は治水施設ではないものの浸水深の減少にかなり効果を有することがわかった.3.地下空間における氾濫解析:地下河川などの地下空間への呑み口地点における流量算定のモデル化を図る.とくに,導水条を有する螺旋式ドロップシャフトについて,既往の水理実験結果をまとめるとともに,連行空気量を抑制するための下部憩流室の効果を明らかにし,無次元量を用いた実験式を導いた.4.避難シミョレーション・モデルの構築:氾濫解析の結果と,避難モデルを組み合わせ,実時間的な避難シミュレーションを実施した.氾濫が生じた場合あるいはその危機が迫った場合,避難命令に従って強制的な避難が行われることが重要であって,任意の避難ではかなりの避難失敗が生ずることが知られた.陸生の洪水や内水,あるいは海性の高潮などに対する都市の耐水性について,街路,建造物,地下空間などの都市特性を重点的に取り入れて研究し,その成果のハザードマップ化を考察してきた.とくに本年度に得られた主な成果は以下のようである.1.都市内の建造物や街路網を取り入れた氾濫解析法を開発した.従来の2次元平面流れとしてデカルト座標系で解析するときの問題点を整理するとともに,氾濫水の伝播経路となる街路をそのまま取り入れられるように,一般曲線座標系モデルおよび1次元街路ネットワークモデルを構成した.街路網が発達した都市においては,街路ネットワークモデルによれば建造物による遮蔽の効果や街路に沿う流れなどを考慮することができ,このモデルが広い汎用性と実用性を有することが分かった.

2.多層構造をなしている地下空間を1の成果を取り入れ,また天井によって水深が限定されているため開水路状態と管路状態が混在し遷移するという水理的特徴があることを考慮に入れて,モデル化した.解析例によれば,氾濫の規模によっては,一部の地下街では満流状態が現れるとともに,それが上部の層の浸水深を増大させるという地下空間での複雑な挙動が明らかになった.3.氾濫被害の算定法について,従来より用いられている治水経済要綱による手法に加えて,浸水による営業停止損失の算定法などを改良した方法,およびGIS利用を念頭において町丁ごとの地域属性に応じて算定する方法を提案した.従来の方法では被害額が若干大きく評価される傾向があるが,本研究で提案した方法でもほぼ妥当な結果が得られ,簡便化が期待できるGIS利用の方法の将来性が知られた.
アニサキスアレルゲンの同定および性状解明に関する研究

アニサキス第III期幼虫より構築したcDNA発現ライブラリーに対して患者血清を用いた抗体スクリーニングを行い、陽性クローンのコードする塩基配列、演繹アミノ酸一次構造を決定することにより4種の新規アレルゲンを特定した。相同性検索の結果、これらのうちの3種は線虫のSXP/RAL-2 protein familyに属するタンパク質およびセリンプロテアーゼインヒビター、およびブタ回虫Ascaris suumの抗原AS14様タンパク質であった。残りの1種はデーターベース上に相同性を示すもののないタンパク質であった。さらに、これらの組換えタンパク質の患者血中IgEに対する反応性を調べたところ、それぞれ35、14、44、31%の患者の血中IgEが陽性反応を示した。主要アレルゲンAni s 1のアミノ酸配列を基に、15または16残基のオーバーラップペプチドを合成した。これらに対する患者血中IgEとのEHSAにおける反応性を指標に、IgE結合エピトープを含むペプチドを特定した。さらに反応性の高かった3つのペプチドについて、アミノ酸残基数を減らしたペプチドや配列の一部をAlaに置換したアナログペプチドも合成し、IgEとの結合に重要なアミノ酸を決定した。抗Ani s 1抗体を用いたアフィニティーカラムによる天然Ani s 1(nAni s 1)の簡易精製法を確立した。虫体1gあたり25μgの天然Ani s 1を精製できた。従来の精製法に比べると、2段階のクロマトグラフィー操作だけでAnis1精製できることから簡便性が増したのに加え、収量も約15倍に向上した。また、このクロマトグラフィーによって精製したnAni s 1と組換えAni s 1(rAni s 1)のアレルゲン性をELISAによって比較した。その結果、rAni s 1は天然品の約80%のアレルゲン性を保持しており、rAni s 1は確定診断用ツールとして利用できると判断した。我々の研究によって全アミノ酸配列を明らかにした主要アレルゲンAni s 1を基に,N末端から5残基ずつずらした15および16残基からなるペプチドを32種合成した。これらのペプチドとAni s 1を認識する11名のIgE保有患者血中IgEとの反応性を調べたところ,ある1種のペプチドに対する顕著な陽性反応を見出した。また,その他にもいくつかのペプチドに対する陽性反応を認めたが,陽性を示したペプチドは11名間でほぼ共通しており,Ani s 1のIgE結合エピトープ領域をほぼ絞り込めた。さらに,最も高い陽性反応を示したペプチドのN末端側またはC末端側から1残基ずつ減らしたペプチド,およびアミノ酸残基の一部を改変したペプチドを合成し,それらのペプチドとIgEの反応性を調べ,反応に重要なアミノ酸を特定しつつある。一方,アニサキス第III期幼虫から構築したcDNAライブラリーに対して,数名のアニサキスアレルギー患者血中IgEの反応性を指標とした抗体スクリーニングを行い,アレルゲンをコードしていたクローンを単離して塩基配列および演繹アミノ酸配列を決定した。相同性検索の結果,2種の新規アレルゲンを同定した。ひとつはC.elegansや数種の昆虫などのトリプシンインヒビターと相同性の高いタンパク質,もうひとつは線虫の中間径線維タンパク質と相同性の高いものであることが判明した。次いでこれらの成熟タンパク質領域を発現ベクターに挿入し,大腸菌に導入して発現誘導を行い,組換えアレルゲンを大腸菌抽出液から精製して患者血中IgEとの反応性を確認している。

両者の組換えタンパク質ともに得られ,前者では患者31名中5名(16%)の血中IgEに対する反応性を確認した。後者については現在研究中である。さらに,二次元電気泳動を用いるアニサキスアレルゲンの確定法の確立に向け,その分析条件の検討も行っているところである。1.アニサキス新規アレルゲンのアミノ酸配列の決定および患者血中IgEに対する反応性の評価前年度に引き続き、アニサキスcDNAライブラリーに対して患者血中IgEとの反応性を指標とした抗体スクリーニングを行い、アレルゲンをコードすると予想されたクローンを単離して塩基配列およびアミノ酸配列を決定した。次いで成熟タンパク質に相当する領域を発言ベクターに挿入後、大腸菌に形質転換して発現誘導を行った。組換えアレルゲンを大腸菌粗抽出液から精製し、IgE反応性をELISAで調べた。得られた2つの陽性クローンA、Bは、それぞれ295残基、147残基のアミノ酸をコードしていた。Aは既報のアレルゲンとは異なる新規アレルゲンで患者36名中16名に対して陽性を示した。一方、BはAscaris suumや他の線虫の抗原As14と40-60%の相同性をもつアレルゲンで36名中11名に対して反応陽性であった。2.アニサキス主要アレルゲンAni s 1の簡易精製法の確立ウサギを免役して作製したポリクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび逆相HPLCにより、アニサキス抽出液からAni s 1を精製した。その結果、虫体1gあたり25μgのAni s 1を精製され、従来よりも収量は17倍に増加した。さらに、上記と同様に発現ベクターと大腸菌を利用して組換えAni s 1を得、患者血中IgEとのELISAにおける反応性を天然品と比較した。その結果、組換えAni s 1の反応性は天然Ani s 1の80%であったが、組換えAni s 1もアレルギーの診断に有用であると判断された。3.その他二次元電気泳動を用いたアニサキスアレルゲンの帰属および新規アレルゲンの探索、およびAni s 1の主要IgEエピトープの絞り込みなどについては、平成19年3月現在も進行中である。
我が国の流通に関するパネル分析

零細過多であると指摘されてきた我が国の小売店舗の数は、1982年の172万店をピークにそれ以降減少している。本研究ではまずはじめに、1979年から1997年までの都道府県別のパネルデータを用いた実証分析を行い、店舗密度(または店舗数)がいかなる要因に規定されているかを検討した。主要な結論は、小売店舗数の時系列的な減少傾向は、乗用車の普及と住戸あたり床面積の拡大という2つの要因によって説明されるということである。これらの要因が消費者の買い物・在庫費用を低め、社会的物流費用を最小にするという意味での「効率性」の観点から必要とされる店舗数が減少したのである。また、小売店舗密度は都市部の方が低いことが一般的に知られているが、消費者・小売店の流通コストを表す諸変数でコントロールすると、むしろ都心部ほど実質的な小売店舗密度が高くなっていることが明らかとなった。第2に、1970年代以降の30年間にわたる日本の消費財のパネルデータを用いて、卸売段階数の規定因に関する実証分析を行った。ここでは、流通の各段階で発生する情報の伝達が制約を受けるため、情報を獲得した主体がそれを利益に転換するために流通に介入する結果、流通経路が長くなるという仮説を立てている。主要な結論は、流通経路の長さが消費地卸の比重と系列化の進展に規定されているということである。また、消費地卸の比重を規定する要因として、地域の需要変動の独立性、下流における広告宣伝活動の重要性および小売店舗数を挙げることができる。これらが消費地卸の情報の価値を左右すると考えられる。さらに、その他卸の比重を規定する要因として、系列化の進展(と同じ市場環境要因)、地域の需要変動の独立性および広告による製品差別化の程度がある。今年度は小売部門の検討を集中的に行った。4-6月は、データの収集と並行して理論的検討を行い、「空間的数量競争と上限価格規制」を作成した。この論文は、6月の日本経済学会・春季大会で報告した後に「流通研究」に投稿し、2003年春に発行される第6巻第1号に掲載される予定である。また、次年度に予定している卸売部門の研究の準備として作成した「繊維・アパレルの流通」が「日本経済研究」No.45に掲載された。11月以降は、同じ分析枠組みを用いて中国の都市別店舗密度に関する実証研究を行い、「中国の小売店舗密度」を作成し、「アジア経済」への投稿を準備している。また、「空間的数量競争と上限価格規制」を理論的に発展させた「建値制と経済厚生」を作成した(この論文は「国民経済雑誌」に掲載予定である)。本研究では、20-30年間の我が国における流通(卸および小売)の変化をパネルデータを用いて実証的に検討した。小売部門:零細過多であると指摘されてきた我が国の小売店舗数は、1982年の172万店をピークに、1997年には142万店まで減少している。本研究では、1979-97年の都道府県別パネルデータおよび同時期の京都府の市区別パネルデータを用いた実証分析を行い、店舗密度(または店舗数)がいかなる要因に規定されているかを検討した。主要な結論は、この時期の小売店舗数の減少は、乗用車の普及(2,554万台から4,861万台)および住戸あたり面積の拡大(96m^2から106m^2)という2つの要因によって説明されるというものである。これら要因によって効率上必要な店舗数が減少したのである。その意味で、この時期の店舗数の減少は、変化する社会経済環境への適応の結果として捉えることができる。

このような変化の中で、店舗あたりの来店客数が減少していることを後継者が認識した結果、後継者不足が生じていると思われる。卸売部門:「長くて非効率」と形容されてきた我が国の流通経路が1970年代以降どのように変化したかを、同時期の業種別パネルデータを用いて検討した。具体的には、各業種の流通経路の長さが、チャネル運営に必要な情報の種類と各段階で発生する情報伝達の制約によって、いかに規定されるかを実証的に検討した。主要な結論は、メーカーによる系列化の進展にもかかわらず、衣服・身の回り品を除けば、流通経路は必ずしも短くなってはいないというものである。その理由として、流通段階で要求されるサービスがより高度になっており、それを適切に供給するために、多くの流通業者が必要とされているということが考えられる。
カーボンナノチューブの一次元性を用いたナノレベル反応制御〜新規ナノ反応場の構築〜

欠陥フラーレン(C_1-C_<59>)とナノチューブ内壁との共有結合生成が、どのようにナノチューブ構造の変形に寄与するかを密度汎関数法計算により検討した。その結果、ゲストとホストとの間に共有結合を生成することにより、結合部位近傍のナノチューブ表面にブタジエン型およびキノノイド型の変形が生じることが分かった。これらの結果は、内包分子の構造変形を用いて、ナノチューブ表面にsp^2骨格を保った状態で局所変形を生成させることを示した例である。また、ナノチューブ内壁と内包分子との結合生成において、ナノチューブ内部の制限された空間がどのように影響するかを検討した。実際には、内包分子として、ナノチューブ内部空間に対して比較的サイズの大きいC_1-C_<59>欠陥フラーレンと比較的サイズの小さいカルベン分子(CH_2)を選択し、アームチェアチューブに対する内包分子の位置選択性を検討した。その結果、欠陥フラーレンC_1-C_<59>がアームチェアチューブ内壁に結合する場合、ナノチューブ軸に対して垂直なC-C結合に結合しやすいものの、カルベン分子の場合、位置選択性を示さないことが分かった。これらの違いは、ナノチューブと欠陥フラーレンの弱い相互作用に由来する。さらに、ナノチューブ表面の局所変形が化学修飾分子カルベンの結合部位に影響を及ぼすかについても検討した。その結果、カルベン分子は、二重結合性の増加したC-C結合に結合した場合、他のC-C結合に結合する場合よりもエネルギー的に有利であることが分かった。二重結合性の増加するC-C結合は、内包カルベン分子とナノチューブ内壁との結合部位近傍のみに存在する。従って、カルベン分子によるナノチューブ化学修飾における結合部位は、ナノチューブの局所変形を用いて制御可能であることを見いだした。カーボンナノチューブ内部でのフラーレン融合反応における反応中間体及び反応過程の詳細を密度汎関数法を用い理論的に考察した。上記反応過程における反応中間体として、端がフラーレンキャップで終端された有限長チューブ状物質アームチェア(5,5)チューブおよびジグザグ(9,0)チューブが考えられる。これら有限長チューブ状物質の電子的特性は、端のキャップ構造に大きく変化するものと考えられる。従って電子特性における端の効果を考察するため、端を水素終端したチューブ状物質についても同様の考察を行った。その結果、アームチェア型ナノチューブの円筒部分の構造は,含有するポリイン鎖の数に関して3の周期性で変化した.さらにそのHOMO-LUMOギャップは無限長チューブのものよりも大きく、チューブが長くなるにつれ周期的に減少することが明らかとなった。これら特異な現象は量子サイズ効果によるものと考えられる。また端にキャップがあることによって有限長チューブ状物質の構造、電子特性が大きく変化することも明らかとなった。さらに上記の結果を透過型電子顕微鏡および共鳴ラマン分光法により得られる実験的結果とあわせることによりフラーレン融合反応における知見を得た。実際、透過型電子顕微鏡から得られるチューブ状物質のチューブ長は、理論的に得られるジグザグ型チューブのそれに相当することが明らかとなり、共鳴ラマン分光法においてもそれを裏付ける実験結果を得ている。従って量子化学計算及び実験的結果を併せることにより,フラーレン融合反応はジグザグ型構造を有するチューブ状物質を経由して進行することが明らかとなった。この結果は、ナノカーボン材料中の分子の挙動を実験と理論の両側面から検証した最初の例であり基礎科学的にも工業的応用の見地からも重要な意義をもつ。本研究課題における実績は以下のとおりである.(I)チューブ状物質の振動構造カーボンナノチューブ内部のC_<60>分子は,真空加熱によりチューブ状物質に転換することが知られている.このチューブ状物質は,カーボンナノチューブ内部でのみ生成する特異な物質であり,その振動構造の知見を得ることは有益である.そこで,本研究ではチューブ状物質の分子振動を理論的に解析した.その結果,有限長チューブは,中間振動数領域(750-800cm^<-1>)に,C_<60>半球に由来した振動モードを有することが明らかになった.アームチェア(ジグザグ)型チューブにおける,これらの振動モードは,C_<60>分子におけるH_g(G_g)の対称性を有する振動モードに対応することから,アームチェア型及びジグザグ型チューブを判別する有益な情報を与えるものと期待される.(II)金属内包フラーレンTi_2C_<80>の構造金属内包フラーレンTi_2C_<80>は,二つの遷移金属原子をフラーレンケージに取り込んだ特異な構造を有している.この分子構造に関して,今までに,二つのTi原子がC_<80>フラーレンケージに内包されたTi_2@C_<80>構造をとることが提案されている.しかし,この提案については,近年再検討が行われており,特に,フラーレン内部でのクラスター構造に関する詳細な知見は得られていない.そこで,本研究ではTi_2C_<80>の構造異性体のエネルギー論を,密度汎関数法を用いて議論した.その結果,Ti_2C_<80>の構造異性体のうち,C_<78>フラーレンケージにTi_2C_2クラスターが内包されたTi_2C_2@C_<78>構造が最安定構造であることが明らかになった.

さらに内包されるTi_2C_2クラスターには,フラーレン内部でのTi原子の配位サイトの違いにより,少なくとも二種類の結合様式が存在することが分かった.以上の結果はすべて公表済みである.欠陥フラーレン(C_1-C_<59>)とナノチューブ内壁との共有結合生成が、どのようにナノチューブ構造の変形に寄与するかを密度汎関数法計算により検討した。その結果、ゲストとホストとの間に共有結合を生成することにより、結合部位近傍のナノチューブ表面にブタジエン型およびキノノイド型の変形が生じることが分かった。これらの結果は、内包分子の構造変形を用いて、ナノチューブ表面にsp^2骨格を保った状態で局所変形を生成させることを示した例である。また、ナノチューブ内壁と内包分子との結合生成において、ナノチューブ内部の制限された空間がどのように影響するかを検討した。実際には、内包分子として、ナノチューブ内部空間に対して比較的サイズの大きいC_1-C_<59>欠陥フラーレンと比較的サイズの小さいカルベン分子(CH_2)を選択し、アームチェアチューブに対する内包分子の位置選択性を検討した。その結果、欠陥フラーレンC_1-C_<59>がアームチェアチューブ内壁に結合する場合、ナノチューブ軸に対して垂直なC-C結合に結合しやすいものの、カルベン分子の場合、位置選択性を示さないことが分かった。これらの違いは、ナノチューブと欠陥フラーレンの弱い相互作用に由来する。さらに、ナノチューブ表面の局所変形が化学修飾分子カルベンの結合部位に影響を及ぼすかについても検討した。その結果、カルベン分子は、二重結合性の増加したC-C結合に結合した場合、他のC-C結合に結合する場合よりもエネルギー的に有利であることが分かった。二重結合性の増加するC-C結合は、内包カルベン分子とナノチューブ内壁との結合部位近傍のみに存在する。従って、カルベン分子によるナノチューブ化学修飾における結合部位は、ナノチューブの局所変形を用いて制御可能であることを見いだした。
障害の視点から見る北アイルランドの社会包摂

初年度である2018年度は、まず(1)障害者人口の基礎データの収集、(2)障害者を取り巻く政治社会環境の考察に注力した。その上で、(3)教育分野に焦点を絞り、障害児の学校教育に関する包摂課題を掘り下げた。具体的な活動内容と成果は下記の通りである。(1)政府統計でカバーされていない障害者人口の詳細について、様々な二次資料を統合して描出を行った。イギリスの他地域との類似性を確認できた一方で、紛争を背景にした地域的特徴も把握できた。(2)障害者に関する法律について、地域条例・国内法・国際法の3レベルで整理し、北アイルランドの現行法制度を取り出すとともに、イギリス(特にイングランド)および国際的動向の歴史的影響を考察した。また、新社会保障制度(Universal Credit,UC)に関して、これまでの段階的導入の過程のなかで浮かび上がってきた課題のうち、障害者に関するものを整理した。さらに、障害者が日常生活で直面している諸問題を分野別にまとめ、それらに対する具体的な支援内容を把握した。(3)宗派によって二分された学校教育制度を検証し、教育的包摂の試みを分析した。特別支援教育とインクルーシブ教育の並存という、今日の国際的な一般傾向が確認できたと同時に、その制度的本質に依拠した北アイルランド独自の課題が、理論と実践の両側面において存在することも見えてきた。この点をさらに追究する必要がある。上記の研究活動は、資料および文献に基づく調査と、現地でのインタビュー調査の両方を以って行われた。2017年1月に停止した自治政府がいまなお機能回復しておらず、政策決定が滞っていることから、市民社会に重きを置き、フィールドワークでは支援団体やモニタリング組織、市民活動家とのネットワーキングに力を入れた。障害者人口の基本情報の取得や法的枠組みの把握など、今後の基礎固めを行うことができ、また学校教育を主要領域のひとつと定めて研究を進め、論文の形で発表できたことを踏まえ、おおむね順調に進展していると判断した。他方、当初の研究計画のなかで、再考すべき事項も出てきた:(1)当初予定していた障害当事者のインタビューについて、協力者の確保が難航している。障害者の家族や支援者、ソーシャルワーカー等に対象を広げて、聞き取りを実施することを検討しつつ、二次データの収集にも注力していきたい。(2)近年の政策分析や政府関係者のインタビューも計画に入っているが、ストーモント政府・議会の停止の長期化を受けて、保留になっている。政情を見守りつつ、機会を待ちたい。2019度も引き続き、学校教育の場における包摂の実態について検証していく。困難に直面しているものの、ここでのインタビューによる一次データの収集も、粘り強く試みる予定である。そして、並行して教育以外の領域も定め、調査を展開していきたい。また、UCの浸透具合やブレグジットの成り行きといった環境的要因も観察しながら、丁寧に研究を進めていきたい。2019年度は中間年にあたり、メインのフィールドワーク実施も重要な位置づけにある。今年度の後半に予定されている2回目のフィールドワークでは、自立生活センターや障害者団体への訪問を試み、当事者の経験や声に接することも目指す。さらには、最終年度(2020年度)におけるフィールドワーク実施も視野に入ってきている。本プロジェクトは北アイルランドの単一事例研究であるものの、周辺地域とのつながりや国際的潮流の影響を見ていく必要性もより顕著になりつつある。特に、初年度はイギリスの他地域との間接的比較を念頭に置いていたが、次第に欧州といった枠組みの重要性や、地続きであるアイルランド共和国との連携も明らかになってきた。こうした側面も考慮に入れながら、リサーチを続けていきたい。

障害者人口の基本情報の取得や法的枠組みの把握など、今後の基礎固めを行うことができ、また学校教育を主要領域のひとつと定めて研究を進め、論文の形で発表できたことを踏まえ、おおむね順調に進展していると判断した。他方、当初の研究計画のなかで、再考すべき事項も出てきた:(1)当初予定していた障害当事者のインタビューについて、協力者の確保が難航している。障害者の家族や支援者、ソーシャルワーカー等に対象を広げて、聞き取りを実施することを検討しつつ、二次データの収集にも注力していきたい。(2)近年の政策分析や政府関係者のインタビューも計画に入っているが、ストーモント政府・議会の停止の長期化を受けて、保留になっている。政情を見守りつつ、機会を待ちたい。2019度も引き続き、学校教育の場における包摂の実態について検証していく。困難に直面しているものの、ここでのインタビューによる一次データの収集も、粘り強く試みる予定である。そして、並行して教育以外の領域も定め、調査を展開していきたい。また、UCの浸透具合やブレグジットの成り行きといった環境的要因も観察しながら、丁寧に研究を進めていきたい。2019年度は中間年にあたり、メインのフィールドワーク実施も重要な位置づけにある。今年度の後半に予定されている2回目のフィールドワークでは、自立生活センターや障害者団体への訪問を試み、当事者の経験や声に接することも目指す。さらには、最終年度(2020年度)におけるフィールドワーク実施も視野に入ってきている。本プロジェクトは北アイルランドの単一事例研究であるものの、周辺地域とのつながりや国際的潮流の影響を見ていく必要性もより顕著になりつつある。特に、初年度はイギリスの他地域との間接的比較を念頭に置いていたが、次第に欧州といった枠組みの重要性や、地続きであるアイルランド共和国との連携も明らかになってきた。こうした側面も考慮に入れながら、リサーチを続けていきたい。2018年度のフィールドワークの実施期間が当初の予定より短くなったこと等の理由で、次年度使用額が生じた。2019年度のフィールドワークのために使用予定である。
サリドマイド結合分子の同定と耐性化克服のための創薬研究

難治性造血器腫瘍である多発性骨髄腫の克服を目指し、(1)治療薬サリドマイドの分子機構の解明、(2)血管新生増殖因子の分子標的、(3)新規化合物による骨病変の改善効果ついて検討した。その結果、我々は新規サリドマイド誘導体を合成し、その結合分子として細胞分裂に必須の蛋白質を同定した。可溶性線維芽細胞増殖因子受容体1を用いて骨髄腫細胞の分子標的を行ったところ、in vitroにおいて増殖抑制傾向が観察された。また、上記の新規サリドマイド誘導体は、マウス破骨細胞の分化や機能を抑制し、骨病変改善効果が期待された。本年度試みた研究成果は下記の通りである。1、サリドマイド結合蛋白質の同定:サリドマイド自体の生物活性は低く、その代謝産物が抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。そこで、それ自体が骨髄腫細胞増殖抑制作用を有する活性型サリドマイド誘導体を合成し、in vitro virus法を駆使して骨髄腫細胞株mRNA-蛋白質ライブラリーよりその結合分子の同定を試みた。候補結合蛋白質が数種同定され、この中には細胞分裂に重要な分子も含まれており来年度以降絞り込みを行う。2、可溶性受容体を用いたハイリスク骨髄腫の克服:t(4;14)染色体転座を有しFGFR3の過剰発現示す患者は、治療抵抗性で予後が悪くハイリスク症例と呼ばれる。KMS11および34細胞はt(4;4)を有しているが、これらに対して可溶性受容体(sFGFRlb-IIIc)を用いた分子標的を行い、ハイリスク骨髄腫の克服をめざす。本年度はまず、FGFおよび受容体群の発現を検討した。その結果、FGF-1,2およびFGFR1,2,4はいずれの細胞株においても遺伝子発現を認めた。特にKMS28細胞は培養上清中に多量のFGF-2を分泌する。FGFR3は、t(4;14)を有するKMS11,26,28,34細胞にのみ遺伝子産物の発現を認めた。また可溶性受容体は、代表的なFGFファミリーであるFGF-1(acidic FGF)、FGF-2(basic FGF)の増殖刺激を用量依存的に阻害した。これらの事実に基づき、可溶性受容体がin vitroにおいてKMS34細胞の増殖を抑制することを見出した。3、分子標的薬による骨病変治療効果:本年度は、マウス破骨細胞および骨芽細胞の分化誘導の系を習得し確立した。次年度は、骨切片を用いた培養系も確立し、可溶性受容体や新規薬剤による直接の破骨細胞分化抑制および骨芽細胞活性化ついても検討を進める。(1)サリドマイド結合分子の同定:サリドマイド自体は生物学的活性が乏しく、その代謝産物が重要とされる。そこで、柳川、服部は、これまでにin vitroにおいてもt(4;14)陽性かつTP53遺伝子を欠失するハイリスク骨髄腫細胞KMS34に対して、強い抗腫瘍活性を有する新たなサリドマイド誘導体を見出している。これを用いて、柳川らが開発した結合蛋白質のcDNAクローニング法であるIn Vitro Virus法(IVV法)により、その結合する分子群を追求した。その中には、細胞分裂期に重要な分子が含まれていた。さらにこの分子をRNA干渉によってノックダウンすると、骨髄腫細胞の分裂が障害されアポトーシス誘導に陥ることが観察された。昨年サリドマイドの催奇形性にかかわる標的分子としてCereblonが分離されたが、抗腫瘍効果は別の分子を介して引き起こされると推測される。(2)可溶性受容体を用いたハイリスク骨髄腫の克服:t(4;14)陽性のハイリスク骨髄腫株に可溶性FGF受容体蛋白(sFGFR1b-IIIc)を添加して培養を行ったところ、統計学的有意差には至らなかったが増殖抑制が観察された。さらに、アデノウィルスベクターを用いてKMS34細胞他にsFGFR1を遺伝子導入したところ有意な増殖抑制が認められた。KMS34坦癌マウスへのsFGFR1遺伝子導入を開始した。(3)骨病変治療効果の検討:M-CSF,RANKL存在下でのマウス破骨細胞の培養系において、上述の我々が見出した新たなサリドマイド誘導体を添加すると、抗腫瘍効果を示すよりも低い濃度(0.5μM)にて分化抑制が認められた。さらに、骨基質吸収系においても抗腫瘍効果を示す濃度(3μM)にて、破骨細胞の活性が抑制されることがわかった。すなわち、同化合物は抗腫瘍効果と共に骨病変配膳効果を有することが期待され、破骨細胞における結合分子の解析が今後重要となる。(1)サリドマイド結合分子の同定:サリドマイド自体の生物活性が低いことから、それ自体が強い抗腫瘍効果を有する新規誘導体を作成し、その結合分子を同定した。

その結合分子について昨年度より各種癌細胞株を用いて、RNA干渉により遺伝子ノックダウンを行い、細胞形体やアポトーシス誘導について検討を継続している。HeLa細胞においては、細胞分裂時に核の多極化を来し最終的にはアポトーシスが誘導されることが確認された。骨髄腫細胞についても同様の変化が起きうるかについて検討が進行中である。さらに、この新規誘導体は、高齢者に多く難治性造血器腫瘍である骨髄異形成症候群(MDS)細胞に対してもlenalidomideよりも低い濃度で細胞増殖抑制とアポトーシス誘導を来たし、このような濃度では正常のマウス骨髄細胞によるコロニー形成能を阻害しない。以上の検討より、骨髄腫や(20)Sといった難治性造血器腫瘍の新しい治療標的分子が明らかとなり、さらにその分子標的化合物も開発することができた。(2)FGFおよびその受容体の発現機能解析を進めた。興味深いことに、骨髄腫細胞では上皮特異的に発現するK-sam-II遺伝子の発現を認めた。そこで、骨髄腫細胞における上皮特異的遺伝子群の発現を検討し、それらの発現を確認した。このことは骨髄腫が固形癌の形質を獲得し、化学療法への抵抗性や固形癌の遠隔転移に相当する髄外病変の形成に関連することを示唆するものと推測された。(3)昨年までに、新規サリドマイド誘導体による破骨細胞の分化・機能抑制を観察しているが、本年度はこれらの確認実験を行うと共に、破骨細胞の分化に関与する遺伝子発現についても検討を加えた。その結果。RANKL,M-CSF存在下で破骨細胞を分化させる際に、新規誘導体が存在すると分化のマスター遺伝子であるNFATc1遺伝子の発現が抑制され、分化マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色性やアクチンリング形成も抑制されることを見出し、分子機構についても考察を加えることが出来た。
ギリシャ数学文献における演繹・論証パターンの分析とデータベース化

当初の計画通り、パッポス『数学集成』第7巻の240個余の全命題について、その証明の各段階に利用されるすべての公理・定理・暗黙の前提等を調査した。この作業には学生・大学院生の研究補助による助力を得た。この結果得られた「パッポスにおける議論のパターンのデータベース」はギリシャの数学者が定理や問題の探求において用いたテクニックの集大成であり、いわば「ギリシャ数学者の道具箱」を再生させたものといえる。このデータベースは現在,最終的に整理中で、テクストの版権者の同意が得られれば、適切な方法で公開する予定である(コンピュータ上で利用できる形での公開を考えている)。このデータベースによる成果の一端をここで報告する。19世紀のパッポスの校訂者Hultschは、命題68(Pappi Alexandrini Collectio、Vol.2,p.776)において、パッポスの議論をエウクレイデス『原論』第5巻命題14に従わせるために、2つの項の順序を、何の資料的根拠もなく入れ替えている。本研究の底本とした今世紀のJonesの版もこれに従っている。しかし、パッポスの他の箇所の議論などから判断すると、Hultschの改訂を受け入れる根拠はなく、パッポスは『原論』第5巻命題14とは異なる命題を彼の議論の根拠として利用していたと考えられる。Hultschの校訂版はしたがって訂正されるべきである。一般に、テクストの校訂はギリシャ数学においては既に今世紀初頭に完了した作業と考えられている。しかし、本研究で得られたデータベースはこのような基本的な問題にも再度光を当てることとなった。このことからも、このデータベースの今後の利用価値はきわめて大きいことが期待される。
誘電泳動による選択的細胞分離技術の新展開

高効率・高精度の細胞分離を行うための誘電泳動(DEP)デバイスの開発を継続して行っている。最終目標とするDEPデバイスの性能として、1細胞試料に微量(<0.01%)に含まれる特定の細胞を分離可能であること、2電界・Joule発熱による細胞のダメージを極力抑えるため、負荷する交流電圧は可能な限り小さく、デバイスの大きさはこれら因子への細胞の暴露時間を最小限にするため可能な限り小さいこと、3分離後の細胞の回収が無菌的に容易に行える、などがある。平成30年度の目標としては、平成29年度の成果を踏まえ、正常細胞と癌細胞の分離をさらに高効率で行うために必要な条件を明確にし、それら条件の絞り込みを行うことである。平成29年度の研究では櫛形電極を用いた平行平板型デバイスを作成し、細胞試料にヒト乳腺正常細胞(MCF10A)と癌細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いた細胞分離実験を行い、MCF10AとMDA-MB-231の組み合わせでは最大約92%の分離効率を示した。この分離効率の値をさらに高めて行くためには、交流周波数に対する細胞の正確な誘電泳動特性の把握が必要である。そのため平成30年度では、細胞の誘電泳動特性を直接測定可能なデバイスを作成し、正常細胞、癌細胞それぞれについて誘電泳動特性の測定と、測定結果の妥当性を検証するための理論解析を行った。細胞の誘電泳動特性を特徴付けるのはClausius-Mossotti因子βの実数部Re(β)である。そのため、Re(β)を直接実験的に測定可能なCreek-gap電極を設計・製作し、ヒト乳腺正常細胞と癌細胞のRe(β)の測定を幅広い交流周波数について行った。さらにRe(β)の測定値をSingle-shellモデルを用いた理論解析値と比較することで、Creek-gap電極による細胞のRe(β)を高い精度で測定できることが判明した。当初の目標である正常細胞と癌細胞を効率よく分離する方法と条件を見出すため、平成29年度では櫛形電極を用いた平行平板型デバイスを作成し、細胞試料にヒト乳腺正常細胞(MCF10A)と癌細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いた細胞分離実験を行った。その結果、MCF10AとMDA-MB-231の組み合わせでは最大約92%の分離効率を達成した。また、細胞の種類によっては分離率が低下することも確認出来たが、このことに関しては平成30年度の研究課題とした。従って、概ね平成29年度の研究では目標とする細胞分離のために必要な負荷電圧・細胞試料の流速条件などの絞り込みが出来た。平成30年度では、正常細胞と癌細胞の分離をさらに高効率で行うため、細胞の誘電泳動特性を直接測定可能なデバイスを作成し、正常細胞、癌細胞それぞれについて誘電泳動特性の測定と、測定結果の妥当性を検証するための理論解析を行った。その結果、細胞種の組み合わせに応じて、高効率分離に必要な交流周波数の最適値の絞り込みが可能となった。これまで高効率・高精度の細胞分離を行うために、櫛形電極を用いた平行平板型デバイスを作成し、細胞試料にヒト乳腺正常細胞(MCF10A)と癌細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いた細胞分離実験を行い、MCF10AとMDA-MB-231の組み合わせで最大約92%の分離効率を得た。また、分離効率のさらなる向上を目指し、細胞のClausius-Mossotti因子βの実数部Re(β)を直接実験的に測定可能なCreek-gap電極を設計・製作し、ヒト乳腺正常細胞と癌細胞のRe(β)の測定を幅広い交流周波数について行った。これまでの研究で、高精度細胞分離に必要な負荷交流電圧、細胞試料の流速、交流周波数が明確になったため、残りのデバイスパラメーターである櫛形電極の幾何学的形状(電極幅・間隔)と、電場強度が細胞に与える影響について明らかにする。実験は櫛形電極の幅・間隔を何通りかに変えて正常細胞と癌細胞の分離を幅広い周波数で行い、櫛型電極の幾何形状と細胞の種類、大きさとの関係が分離効率に及ぼす影響について詳細に調べる。さらに、電極近傍での溶液の温度上昇率の測定をLIF法により、細胞分離後の目標細胞の細胞増殖率をフローサイトメーターを用いた細胞解析により調べ、電場強度が細胞に与える影響を明らかにする。高効率・高精度の細胞分離を行うための誘電泳動(DEP)デバイスの開発を行った。最終目標とするDEPデバイスの性能として、1細胞試料に微量(0.01%以下)に含まれる特定の細胞を分離可能であること、2電界・Joule発熱による細胞のダメージを極力抑えるため、負荷電圧は可能な限り小さく、デバイスの大きさはこれら因子への細胞の暴露時間を最小限にするため可能な限り小さいこと、3分離後の細胞の回収が無菌的に容易に行える、などがある。平成29年度の目標としては、まず正常細胞と癌細胞の分離を高効率で行うこと、そのために必要な実験条件を明確にすることであり、主に上の項目1について検討した。作成したデバイスの流路上面には平板ITO電極、底面には細胞直径を参考に、長さ約40mm、幅50 μmの短冊形電極を50μmの等間隔に配置し、1本おきに接続した対向型の櫛型電極を用いた。細胞試料にはヒト乳腺上皮正常細胞(MCF10A)とヒト乳癌細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いた。

細胞試料中の正常細胞と癌細胞の混合比は1:1とし、溶液には300mMのマンニトール等張溶液を用いた。実験は、DEPデバイスを共焦点レーザー顕微鏡のステージに設置し、細胞試料を流路上流から導入する。流路内に試料が十分に分散した後、波形発生装置で流路に一定電圧の交流電圧を負荷し、様々な周波数に対し細胞の分離率を調べた。正常細胞は正のDEP力により高電圧側電極の縁に吸着する一方で、癌細胞は負のDEP力により電極へは吸着しない。しかし、この傾向は周波数の値で大きく変化し、MCF10AとMDA-MB-231の組み合わせでは周波数20kHzで最大約92%の分離効率を示し、MCF10AとMCF7の組み合わせでは周波数60kHzに対し約76%と、癌細胞の種類によっても分離率と最適周波数が大きく変化することが分かった。当初の目標である正常細胞と癌細胞を効率よく分離する方法と条件を見出すため、まず櫛形電極の幅・間隔を決め、次に交流電圧の周波数を変化させ、分離率の変化を調べてゆく方法を採用した。また、分離率の細胞種による影響も見るため、癌細胞には2種類の細胞種を用いた。その結果、高い効率で分離出来る周波数を絞り込むことが出来、実験を試みることが出来た。また、細胞の種類によっては分離率が低下することも確認出来た。一方、電極間隔および電極幅が分離率に及ぼす影響については時間の関係で調べることが出来ず、平成30年度に引き続き実施することとした。高効率・高精度の細胞分離を行うための誘電泳動(DEP)デバイスの開発を継続して行っている。最終目標とするDEPデバイスの性能として、1細胞試料に微量(<0.01%)に含まれる特定の細胞を分離可能であること、2電界・Joule発熱による細胞のダメージを極力抑えるため、負荷する交流電圧は可能な限り小さく、デバイスの大きさはこれら因子への細胞の暴露時間を最小限にするため可能な限り小さいこと、3分離後の細胞の回収が無菌的に容易に行える、などがある。平成30年度の目標としては、平成29年度の成果を踏まえ、正常細胞と癌細胞の分離をさらに高効率で行うために必要な条件を明確にし、それら条件の絞り込みを行うことである。平成29年度の研究では櫛形電極を用いた平行平板型デバイスを作成し、細胞試料にヒト乳腺正常細胞(MCF10A)と癌細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いた細胞分離実験を行い、MCF10AとMDA-MB-231の組み合わせでは最大約92%の分離効率を示した。この分離効率の値をさらに高めて行くためには、交流周波数に対する細胞の正確な誘電泳動特性の把握が必要である。そのため平成30年度では、細胞の誘電泳動特性を直接測定可能なデバイスを作成し、正常細胞、癌細胞それぞれについて誘電泳動特性の測定と、測定結果の妥当性を検証するための理論解析を行った。細胞の誘電泳動特性を特徴付けるのはClausius-Mossotti因子βの実数部Re(β)である。そのため、Re(β)を直接実験的に測定可能なCreek-gap電極を設計・製作し、ヒト乳腺正常細胞と癌細胞のRe(β)の測定を幅広い交流周波数について行った。さらにRe(β)の測定値をSingle-shellモデルを用いた理論解析値と比較することで、Creek-gap電極による細胞のRe(β)を高い精度で測定できることが判明した。