hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内臓型リーシュマニア症の免疫病態

内臓型リーシュマニア症(VL)はリーシュマニア原虫の感染により引き起こされる人獣共通感染症である。本症の化学療法はさまざまな問題点を抱えており、宿主免疫を適切に調節することで効果を発揮する免疫療法は新たなVLの治療法として期待される。一方、発熱、貧血、肝脾腫といったVLの症状が免疫応答に起因することから、不適切な免疫刺激による逆効果も予想される。つまり、VLに対する効果的な免疫療法の確立にはその感染・発症機序を詳細にとらえる必要がある。本研究では、発生工学を駆使したマウスモデルと、ヒト患者やイヌ由来材料を用いた解析を有機的に組み合わせることで、VLにおける病態免疫を明らかにし、症状の改善を促す免疫療法の開発を目指している。2018年度は貧血に注目して、感染マウス脾臓中にみられる赤血球貪食現象のメカニズムに関する研究を行った。感染マウスで見られる赤血球貪食細胞は、原虫に重度に感染した多核巨細胞であるため、in vitroでマクロファージ(Mφ)を感染させ赤血球貪食を誘導する実験モデルを構築した。その結果、細胞膜上に発現して血球貪食を抑制的に制御する因子であるSIRP-αの発現が感染によって低下すること、またその発現制御はmRNAに依らず酵素による切断に依存することが示唆された。感染マウスの脾臓におけるSIRP-αの発現解析を行ったところ、やはり赤血球貪食細胞において発現レベルが低下していることが明らかとなった。これら赤血球貪食が細胞内の原虫に与える影響を解析したところ、赤血球を貪食したMφにおける原虫の生存率は非貪食Mφと比較して有意に高いことが明らかとなった。VLにおける貧血発症のメカニズムにはこれまで不明な点が多かった。我々が開発したマウスVLモデルは、世界で初めてLeishmania donovani感染による貧血をマウスで再現したものである。そのモデルを用いて貧血の発症メカニズムを詳細に解析したところ、血球貪食を抑制的に制御する因子であるSIRP-αの発現が感染によって低下することを初めて明らかにできた。また、赤血球貪食が原虫感染と重なるという点に着目して、赤血球貪食が貧血に与える影響とは別に原虫の生存に与える影響も解析したところ、赤血球を貪食したMφでは原虫の生存が有利になることが明らかとなった。この現象は、原虫感染による淑因子の発現制御が、原虫の生存と症状の発症に影響するという重要な発見である。原虫感染によるSIRP-α切断メカニズムが明らかになれば、原虫のコントロールと症状のコントロールの両方に貢献できると考えられる。上述した研究成果のほかにも、高ガンマグロブリン血症の原因となる抗原虫IgG抗体の産生におけるBAFFの影響に関する研究成果や、抗体の機能に関する研究成果が得られ、これらの成果は学会発表として成果報告をしたとともに、現在論文を投稿中である。よって研究進捗は順調だと言える。2019年度は貧血、脾腫、肝腫について焦点を当てて、VLの病態形成機序解析を行うが、研究の中心はマウスを用いたものであり、その解析にあたっては常に白血球減少、血小板減少についても並行して行う。ただし、以下の各研究項目では、焦点が分かりやすいよう解析の中心となるものについてのみ記載する。1【全般】原虫と宿主のインターラクトーム解析:原虫の感染動態は感染する臓器ごとにより異なり、局所における免疫応答も大きく異なることが考えられる。局所免疫が各臓器での症状と密接に関連することから、各臓器の免疫応答とその臓器内での原虫の抗免疫応答における関係性を理解することが重要である。本年度は脾臓、肝臓などにおける宿主と原虫のトランスクリプトーム解析を同時に行うことにより、局所における宿主ー原虫のインターラクションの理解を目指す。2【貧血】赤血球貪食亢進に関わるSIRP-αの切断メカニズム解明:昨年度中に、感染マウス脾臓中にみられる赤血球貪食に関わる候補因子としてSIRP-αを見つけ、感染によりSIRP-αの切断が誘導されることを明らかにした。本年度は、SIRP-αの切断部位や切断に関わる酵素群の同定を行い、切断抵抗型のSIRP-α変異体を発現するマウスの作出を行い、SIRP-αの切断阻害が研究貪食や貧血に与える影響について検討を行う。3【脾腫】感染によるBAFF産生亢進の機序解明:感染マウスにおける主なBAFF産生組織は脾臓であったため、脾臓におけるBAFF産生細胞の同定を行う。BAFF産生細胞として、Mφや樹状細胞、T細胞が知られており、BAFF発現細胞におけるCD11b、CD11cやCD3の発現を解析する。次に、BAFF産生を誘導する原虫因子の同定を行う。

本研究では、発生工学を駆使したマウスモデルと、ヒト患者やイヌ由来材料を用いた解析を有機的に組み合わせることで、VLにおける病態免疫を明らかにし、症状の改善を促す免疫療法の開発を目指している。2018年度は貧血に注目して、感染マウス脾臓中にみられる赤血球貪食現象のメカニズムに関する研究を行った。感染マウスで見られる赤血球貪食細胞は、原虫に重度に感染した多核巨細胞であるため、in vitroでマクロファージ(Mφ)を感染させ赤血球貪食を誘導する実験モデルを構築した。その結果、細胞膜上に発現して血球貪食を抑制的に制御する因子であるSIRP-αの発現が感染によって低下すること、またその発現制御はmRNAに依らず酵素による切断に依存することが示唆された。感染マウスの脾臓におけるSIRP-αの発現解析を行ったところ、やはり赤血球貪食細胞において発現レベルが低下していることが明らかとなった。これら赤血球貪食が細胞内の原虫に与える影響を解析したところ、赤血球を貪食したMφにおける原虫の生存率は非貪食Mφと比較して有意に高いことが明らかとなった。VLにおける貧血発症のメカニズムにはこれまで不明な点が多かった。我々が開発したマウスVLモデルは、世界で初めてLeishmania donovani感染による貧血をマウスで再現したものである。そのモデルを用いて貧血の発症メカニズムを詳細に解析したところ、血球貪食を抑制的に制御する因子であるSIRP-αの発現が感染によって低下することを初めて明らかにできた。また、赤血球貪食が原虫感染と重なるという点に着目して、赤血球貪食が貧血に与える影響とは別に原虫の生存に与える影響も解析したところ、赤血球を貪食したMφでは原虫の生存が有利になることが明らかとなった。この現象は、原虫感染による淑因子の発現制御が、原虫の生存と症状の発症に影響するという重要な発見である。原虫感染によるSIRP-α切断メカニズムが明らかになれば、原虫のコントロールと症状のコントロールの両方に貢献できると考えられる。上述した研究成果のほかにも、高ガンマグロブリン血症の原因となる抗原虫IgG抗体の産生におけるBAFFの影響に関する研究成果や、抗体の機能に関する研究成果が得られ、これらの成果は学会発表として成果報告をしたとともに、現在論文を投稿中である。よって研究進捗は順調だと言える。2019年度は貧血、脾腫、肝腫について焦点を当てて、VLの病態形成機序解析を行うが、研究の中心はマウスを用いたものであり、その解析にあたっては常に白血球減少、血小板減少についても並行して行う。ただし、以下の各研究項目では、焦点が分かりやすいよう解析の中心となるものについてのみ記載する。1【全般】原虫と宿主のインターラクトーム解析:原虫の感染動態は感染する臓器ごとにより異なり、局所における免疫応答も大きく異なることが考えられる。局所免疫が各臓器での症状と密接に関連することから、各臓器の免疫応答とその臓器内での原虫の抗免疫応答における関係性を理解することが重要である。本年度は脾臓、肝臓などにおける宿主と原虫のトランスクリプトーム解析を同時に行うことにより、局所における宿主ー原虫のインターラクションの理解を目指す。2【貧血】赤血球貪食亢進に関わるSIRP-αの切断メカニズム
エピジェネティック異常の超高精度蛍光イメージングによるがん悪性度診断法開発

DNAやヒストンのエピジェネティック異常の蓄積は、がん抑制遺伝子の転写抑制を引き起こし、発がんを促す。これまで、エピジェネティック異常の検出法は、細胞の形態情報を失っており、細胞個々の情報が平均化されていた。本研究ではヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)の修飾に注目し、蛍光1粒子イメージングによる独自病理染色法を開発した。その結果、従来のDAB染色に比べ幅広いレンジでヒストンの修飾レベルを測定することができた。また本方法によって、細胞個々のヒストンの修飾レベルを高精度に測定することが可能となり、がん細胞間のエピジェネティック異常の不均一性を評価することに寄与できた。がん組織内の環境は多様化しており、エピジェネティック異常の高い細胞(がん悪性度の高い細胞)から低い細胞が混在し、抗がん剤の細胞感受性のばらつきに繋がっている。本研究ではピストン修飾の解析を目的とした蛍光免疫染色法を新規に開発する。ヒトがん組織の「エピジェネティック異常の蓄積度合い」を細胞レベルで計測し、「エピジェネティック異常の蓄積度合い」と「がん悪性度」や「抗がん剤奏効性」の相関性を臨床データを用いて検討する。さらに新規染色法を担がんマウスに応用し、ヒストン治療薬の効果を定量的に評価可能な創薬モデルの構築を目指す。24年度は、ピストン修飾の免疫蛍光染色法の確立のために、ヒト培養細胞を使った実験を行った。様々なメーカーからピストンH3のアセチル化やメチル化を認識する抗体を複数種類購入し、ヒト乳がん培養細胞MCF-7使って、Cy3や蛍光粒子を標識剤とした染色法の確立を試みた。染色条件の検討では、界面活性剤の種類や濃度を色々と試すとともに、タンパク質分解酵素を染色プロセスに応用した。その結果、A社の抗ヒストンH3アセチル化抗体やC社の抗ピストンH3メチル化抗体で、MCF-7のヒストン修飾を特異的に染色することに成功した。またMCF-7の細胞抽出液中のピストン修飾量を、それぞれの抗体を用いてウエスタンブロットで検出することにも成功した。次年度はこれらの方法を用いて、培養細胞腫間のヒストン修飾の違いを定量的に検出することを目指すとともに、ヒトがん組織への応用を行う。本研究ではヒストン修飾の解析を目的とした蛍光免疫染色法を新規に開発する。25年度は、24年度に検討したヒストン修飾の蛍光免疫染色法をさらに改良した。実際には、24年度の反応条件を基盤として、さらに界面活性剤の種類や濃度を検討し、いくつかのタンパク質分解酵素を応用することで、Cy3や蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色法の特異性を向上させた。ヒト乳がん由来の低転移性や高転移性の培養細胞株を複数種類用い、これらの培養細胞株の免疫染色を本年度改良した方法で行った。その結果、細胞株間のヒストン修飾レベルの違いを高精度解析することに成功した。以上により、26年度に計画しているヒト乳がん組織の蛍光免疫染色に向けた準備を整えることができた。本研究ではヒストン修飾の解析を目的とした蛍光免疫染色法を新規に開発し、ヒトがん組織の「エピジェネティック異常の蓄積度合い」を細胞レベルで計測する。細胞計測データと臨床データを統合的に解析し、「エピジェネティック異常の蓄積度合い」と「がん悪性度」や「抗がん剤奏効性」の相関性を検討することを目的としている。25年度に培養細胞株間のヒストン修飾レベルの違いを高精度解析する方法の開発に成功した。

26年度は本方法を応用して、ヒト乳がん組織(30症例)の蛍光免疫染色を行った結果、従来の蛍光染色に比べ幅広いレンジでヒストンの修飾レベルを測定することができた。本方法によって、ヒストンの修飾レベルを高精度に測定することが可能となり、がん細胞同士のエピジェネティック異常の不均一性を評価することにも寄与できたと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。医工学26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書では培養細胞を使ったヒストン修飾の免疫蛍光染色法の確立を目指しており、計画の目的をおおむね達成しているため。交付申請書では性状の異なる培養細胞種を使ったヒストン修飾の免疫蛍光染色法の確立を目指しており、計画の目的をおおむね達成しているため。今後は24年度に達成した蛍光免疫染色法とウエスタンブロット法をさらに改良して、様々な培養細胞腫間のヒストン修飾の違いを定量的に検出することを目指すとともに、ヒトがん組織への応用を行う。また新規染色法を担がんマウスに応用し、ヒストン治療薬の効果を定量的に評価可能な創薬モデルの構築を目指す。26年度は、これまで培養細胞を用いて得られた知見や技術をヒト乳がん組織に応用し、「エピジェネティック異常の蓄積度合い」を1000細胞以上でイメージングすることを目標とする。イメージングの解析データと「がん悪性度」や「抗がん剤奏効性」の相関性を臨床データを用いて検討し、ヒトがん組織でのエピジェネティック異常診断法の確立を目指す。また本蛍光染色法を担がんマウスに応用し、ヒストン治療薬の効果を定量的に評価可能な創薬モデルの構築を目指す。本実験では、多くの細胞の核1個当たりの蛍光体の強度を高精度で評価する必要がある。多くの細胞の観察には電動ステージを用いた画像のタイリング機能が有効となるため、それに必要な備品を計上した。25年度は、開発した蛍光免疫染色法とウエスタンブロット法を応用し、様々な培養細胞腫間のヒストン修飾の違いを定量的に検出することを目指すとともに、ヒトがん組織への応用を目指している。特に蛍光免疫染色では、極めて多くの細胞データを1細胞ずつ扱い、蛍光体の強度を高精度かつ高速で計算する必要がある。高速でのデータ解析には、必要なスペックを備えたPCやソフトが重要となるため、これに要する経費を計上した。また次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
低焼結收縮性材料作成プロセスの基礎研究

トバモライトはトポタクティック反応によって約900°Cでワラストナイトに相変化する。この反応がトポタクティック反応であるため比較的低い。このためトバモライトをマトリックスとした成形体では、この部分のみが焼結に関与する温度で焼成が可能であり、成形体の組織制御を行えば焼成収縮を極めて小さくできる可能性がある。本研究ではこの点に着目し、ワラストナイトからなる焼結体の作製を行い、圧縮強度を調べ、電子顕微鏡観察による微視的検討を加えた。ワラストナイトとトバモライトの比は90:10および95:5とした。それぞれの組成比になるよう秤量し、少量の結合剤を加え、エタノールとトルエンを加えてボールミルにて混合した。乾燥後、直径11mm、高さ15mmとなるよう金型を用いて加圧成形した。加えた圧力は1,000kg/cm^2ある。本試験に入る前に予備的な実験を行い最適な加熱温度範囲を調べた。その結果、1250°C、および1270°Cの2種類で、加熱時間は2時間で焼成すると良いことが判った。1)焼成体のX線分析結果から、混合したトバモライトのほとんどがワラストナイトに変化し、マトリックスのワラストナイトを結合している。2)焼成体の平均圧縮強度は370520kgf/cm^2の範囲にあり、トバモライト10%、1270°Cの焼成条件のものが最も高い強度を示した。3)圧縮強度はワイブル分布で表すことができ、ワイブル係数が1523の範囲に入り、この種のセラミックスとしてはかなり高い価を示すことがわかった。1.本研究の目的:本研究では、従来のコンクリート材料に代わり得る建築材料用大型焼成物を開発し、その生成メカニズムの調査と二三の機械的性質の評価を目的としている。そこで平成4年度は、まず焼成収縮が小さく、しかも建材として十分な強度を有するセラミックス材料の製作プロセスについて検討した。2.建材作製プロセスにつての基本的な考え方:小さな焼成収縮と十分な強度という相反する命題を両立させるために、高温安定性を有するセラミックス骨材を、小量の結合剤で強固に結合させるプロセスの開発が必要である。骨材としてはワラストナイトの粗粒を選択し、これを低温で強固に結合させるための助剤としてトバモライトを使用した。3.建材製作の手順:平均粒度200#に篩別したワラストナイト粗粒に、5あるいは10wt%のトバモライト微粒体と少量の有機バインダーとを添加し、十分に混合後、10φ-14hの円柱形の金型成形した。燒結は別に行った実験を参照に10001200°C、3時間とした。得られた焼成品の二三の機械的性質、吸水率の測定、構成相のX線分析、SEM、TEMによる組織観察を行った。4.実験の経過:燒結後の円柱の圧縮強度、焼成収縮量ともにほぼ当初の設定条件を満足できることが確認できた。焼成収縮が均等でなかった場合に、圧縮強度がばらつくので、成形法、測定法の改良も含めて次年度に一部実験を行う予定である。そして、とくに高強度が得られているトバモライト10wt%添加品について、TEM観察を中心とした手法で、粒界結合相の生成状況について考察を進めつつある。ワラストナイトは高炉スラグの成分の一つであり、比較的安価に大量に入手が可能な物質である。一方、トバモライトはセメントのオートクレープ処理材料の主要構成鉱物であり、両材料を混合して適当な温度でトポタクティク反応を利用して燒結することによって収縮性の非常に少ない材料創製の可能性に着目して本研究を実施した。

天然産のワラストナイトの粉末とトバモライトの重量比を2種類に変化させ、トルエン、エタノールに若干のバインダーを入れてボールミルを使って混合したものを乾式プレスにより1Ton/cm^2の圧力で11PHIx15mmの寸法に成形した。このような成形体をあらかじめ1000°C1300°Cで燒結し、燒結条件として1250,1270°Cの2種類の燒結温度を決めた。また、ワラストナイトに混合するトバモライトの量を5%と10%の2種類とし、燒結条件との組み合わせで4種類の燒結体を作製して圧縮強度特性について調べ、電子顕微鏡観察結果を組み合わせて燒結体の強度特性について考察した。1)燒結体のX線分析結果から、混合したトバモライトのほとんどがワラストナイトに変化していることが明らかになった。また、電子顕微鏡観察結果からもトバモライトがワラストナイトに変化してマトリックスのワラストナイトを結合している。2)燒結体の平均圧縮強度は370520Kgf/cm^2の範囲にあり、トバモライト10%、1270°Cの燒結条件のものが最も高い強度を示した。しかし、強度の標準偏差はこの条件のものが最も大きかった。3)圧縮強度はワイブル分布で表わすことができ、ワイブル係数が1523の範囲に入り、この種のセラミックスとしてはかなり高い値を示すことがわかった。
確率解析と関連の諸問題

1。Wiener空間を基礎にしたMalliavin解析の枠組を用い、本研究の第一の目標であつたWiener積分に対するVan Vleckの公式を古典的なLagrangianに対応する場合のみならず典型的な多重Markov Gauss過程に関する確率面積の場合に池田が示した。後者はある種の非局所的なポテンシャルを持つFeynmanの経路積分に対する場合に相当する。さらにこの公式に現われるVan Vleck行列の構造をJacobi場の概念を用い経路空間の幾何学の立場から解析した。2。これらの成果は量子力学において知られている2次のポテンシャルを持つFeynmanの経路積分が古典力学から導かれる量を用いて表現される事実の類似がWiener積分の場合にも成立する事を示している。これらの事実は色々の方法で証明することが出来るが、例えば2次のポテンシャルを持つFeynmanの経路積分の場合は作用積分を対角化する経路空間上の変換がJacobi場より定まることから示される。これに相当することがWiener積分の場合は測度の変換公式を用いて示されることを明かにした。3。Van Vleckの公式はWiener積分で表される量の族の漸近評価の基礎になる。そのためには確率解析の一層の整備が必要で、池田、山田(俊)で進めている。漸近理論への応用、特に磁場を持つSchrodinger作用素の研究への応用はこれから解明すべき主要な課題として池田が分担者、荒井、山田〔修)の強力を得ながら進めている。4。引き続く課題としてSelbergの跡公式やcompact semisimple Lie群の場合の熱方程式の基本解の表現等の古典力学における古典軌道やJacobi場を用いる解明が望まれる。5。Van Vleckの公式をめぐる話は滑らかなWiener汎関数に関連しているが、滑らかでないWiener汎関数に関するWiener積分の漸近評価の問題については、境界を持つ領域における熱方程式の基本解のshort time asymptoticsに関連する成果を得た。この問題は本研究の目標の一つであったdiffractionの問題の解明に深く関わっている。1。2。3。4。5。
リンゴ酸ポリマーの合成およびその加水分解性

プロテアーゼ・インヒビターとして青かび中より発見されたリンゴ酸ポリマーは側鎖にカルボキシル基を持つポリラクチド型生体内分解吸収性ポリエステルであることからドラッグ・キャリヤーとしての利用の可能性があり、注目すべき高分子材料と言える。リンゴ酸ポリマーは合成可能でポリ(β-リンゴ酸)およびポリ(α、β-リンゴ酸)の合成が報告されている。本研究では、ポリ(α-リンゴ酸)の合成法の確立を計り、その加水分解性を調べることにより、ドラッグ・キャリヤーとして合成ポリ(α-リンゴ酸)を使って行けるか否かをin vitroで検討した。その結果、次のことが明らかとなった。1.L-リンゴ酸のβ-ベンジルエステルの環状ダイマーであるマライドベンジルエステルの開環重合という手法により、分子量10003000の目的ポリ(α-リンゴ酸)を合成することができた。2.今回合成したポリ(α-リンゴ酸)は、in vitroでは長時間かかってランダム分解を受け、ドラッグ・キャリヤとしての利用の可能性が示唆された。3.5-フルオロウラシル(5FU)担持リンゴ酸ポリマーを合成し、P388白血病担がんマウスに腹腔内投与して、無処置群の生存日数に対する投与群の生存日数の比を求めて延命率(T/C)を求めて制がん活性を評価した。その結果、未反応カルボキシル基をアルキル基で一部保護したり、疎水性スペイサーを介して5FUを担持したコンジュゲートに注目すべき延命効果が発現し、高投与量においてもマウスの急激な体重減少は見られなかった。この結果より、ポリ(α-リンゴ酸)をドラッグ・キャリヤーとして利用することが可能であることが示唆された。生体由来のα-ポリリンゴ酸を化学的に合成することが可能であることを申請者は先に報告した。これはβ-ベンジルマレートをDCC法で直接重縮合してポリベンジルマレートとし、この水添により目的のα-ポリリンゴ酸を合成するという試みであったが、分子量と収率の点で必ずしも十分な結果は得られていなかった。そこで、分子量と収率を高めるために、61年度は下記のように、L-リンゴ酸のβ-ベンジルエステルの環状ダイマーを開環重合させるという新しい手法を適用してこのポリマーの合成条件を検討した。1.L-アスパラギン酸あるいはL-リンゴ酸を出発物質として2つの経路でL-リンゴ酸β-ベンジルエステルの合成を行ったが、取り扱いや収率の面で前者を原料とした合成法の方が有利であることを知った。2.酸化亜鉛を触媒としてL-リンゴ酸β-ベンジルエステルより環状ダイマーであるマライドベンジルエステルを合成したが、収率はあまりよくなかった。3.有機スズ系,有機亜鉛系あるいはアンチモン系触媒存在下でマライドジベンジルエステルの開環単独重合を試みた結果、有機スズ系触媒に重合開始能があることがわかったが、現段階では、分子量の高いα-ポリベンジルマレートを高収率で得るには至っていない。4.しかし、マライドジベンジルエステルとラクチドを開環共重合させることにより、分子量を高くすることができることを見い出した。5.パラジウム・カーボン存在下で水素接触還元により、ポリベンジルマレート側鎖の脱保護を行ない、目的とする水溶性のリンゴ酸ホモポリマーおよびコポリマーを得ることができた。6.合成したリンゴ酸ホモポリマーおよびコポリマーは、一部ラセミ化されてはいるが、ほぼ光学活性は保たれていることがわかった。なお、得られたポリエステルの加水分解の予備実験を試みたが、生理食塩水のようなマイルド条件下では分解は起こりにくかった。

リンゴ酸ポリマーの主鎖エステルの生体内での加水分解性については,このものが青かび中より発見されたポリエステルであることより酵素分解を受けるとも考えられるが,ポリラクチドの仲間であることより,ポリグリコール酸やポリ乳酸のように生体内で非酵素的エステル加水分解を優先的に受けることも考えられる.そこで62年度は, 61年度に合成したリンゴ酸ポリマーの主鎖エステルの加水分解性を37°Cの各種水溶液中in vitroで調べ,リンゴ酸ポリマーの医薬および医療用分野への利用の可能性について基礎的な検討を加えた.以下にその結果を示す.1.エステラーゼによる酵素分解について調べたが,通常の酵素分解で見られるような速い分解は受けなかった.2.生理食塩水,模擬体液およびpH7.4の緩衝液中のようなマイルド条件下では,主鎖エステルの加水分解速度は非常に小さかった.3.胃および腸を想定した強酸およびアルカリ水溶液中での加水分解は比較的速く起こった.4.水系GPCで分子量分布の経時変化を追ったところ,この主鎖エステルはランダム分解を受けることがわかった.以上のin vitroでの結果より, in vitroにおいてもリンゴ酸ポリマーは同じような挙動で分解を受けることが推測できる.したがって,このリンゴ酸ポリマーの側鎖カルボキシル基を利用して共有結合で低分子薬剤を結合させることにより,まず低分子薬剤がリリースして,そのあと長時間かかって主鎖エステルが加水分解を受けるようなMacromolecular Prodrugのキャリアーとしてリンゴ酸ポリマーを利用することが可能であるといえる.61年度と62年度における研究で、リンゴ酸ポリマーは合成可能で、in vitroでは長時間かかって主鎖エステルが加水分解を受けることが見い出され、リンゴ酸ポリマーは修飾可能なラクチド型生体内分解性高分子プロドラッグのキャリアーとして利用できる可能性がでてきた。そこで最終年度に当たる63年度においては、このことをin vivoで確かめるために、5-フルオロウラシル(5FU)担持リンゴ酸ポリマーを合成し、マウスを用いてP388白血病細胞に対する制がん活性を評価した。その結果、以下のことが明らかになった。1.高分子反応という手段により、目的とするリンゴ酸ポリマー/5FUコンジュゲートを合成することができた。2.In vitroでの加水分解では、今回合成したコンジュゲートからはまず5FU自身がリリースし、そのあと長時間かかってキャリアーであるリンゴ酸ポリマーの主鎖が分解して行くことがわかった。このことより、コンジュゲートが5FUの高分子プロドラッグとし働くことがin vivoで期待できるようになった。3.制がん活性は、P388白血病細胞をマウスに腹腔内投与(ip)したあとサンプルをip投与し、無処置群の生存日数に対する投与群の生存日数の比を求めて延命率(T/C)より評価した。その結果、未反応カルボキシル基を一部アルキル基で保護したり、疎水性スペイサーを介して5FUを担持したコンジュゲートに注目すべき延命効果が認められることより、高い延命効果の発現には親永性疎水性のバランスが重要であることが示唆された。なお、高投与量においても、マウスの急激な体重減少は見られず、5FUをリンゴ酸ポリマーに担持することにより、5FUの強い副作用がよわまり、高いT/C値が得られたものだと考えられる。
ヒューマンエージェントインタラクションを利用した社会的エージェント設計

本研究は複数の他者(人間orエージェント)との相互作用を通して利用して学習することにより、社会的知能を持つエージェントを構築するための枠組みを設計することを目的としている。社会的エージェントを実現するには、(1)ユーザの特徴を認識、(2)各ユーザとの相互作用から類似点の把握、(3)各状況を考慮したフィルタリングによる適切な類似性の計算、(4)類似性の影響に応じた仮想的学習、(5)適切な行為出力の決定、(6)学習の結果の評価、の6つのステップを必要とする。このように社会的知能をもつエージェントの実現のためには解決すべき多くの技術的課題があるが、本年度は、実環境で自律的に動くシステムを想定し(1)(2)(3)(4)の4つの機能の実現に重点をおいて研究を行った。その主な内容を以下に示す。まず、ユーザとの相互作用の把握として、ユーザの行為における類似性を判定するためにユーザの行為の流行性について調査を行った。インターネット空間を対象にユーザの行為の規則性により、いくつかの典型的パターンを作成できることを検証した。次に、これらの類似性をもとに、社会的学習を行うために、ユーザとのインタラクションを利用するための設計技術、具体的には複数ユーザとの相互作用からの無矛盾な学習技術の開発を行った。ここでは、複数人の教示者から与えられる時系列データからなる教示環境に注目し、DP matching手法とクラスタリング手法により、教示者群からの教示をいくつかの教示指針に統合し、ロボット自身がより良い教示指針を、自身の身体性に基づき評価することを目指すものである。40名の被験者と3種類の実機ロボットを用いた実験により、システムが異なる身体性を持ったロボットに対し、それぞれの身体性に最適な教示指針を選択したことを確認した。さらに、ユーザとのインタラクションを使った社会的機械学習技術、具体的には、強化学習を使った社会的学習技術の開発を行った。ここでは、直接的経験とは別に、ユーザとの相互作用の類似性から代理経験的に学習影響を受けるモデルベースの学習システムM-MULAを開発し、計算機上のマルチタスクシミュレーションにおいて、提案手法野の効果を検証した。社会的学習は、環境に応じたエージェントの柔軟な知能を構築のため、将来的に極めて有効なコントローラの設計方法になり得る。人間からの教示を最大限に活用する本手法は、現在の学習システムが抱える柔軟な学習の困難さを大きく改善することができるため、その汎用性を今後大きく高めることが期待される。本研究は複数の他者(人間orエージェント)との相互作業を通して利用して学習することにより、社会的知能を持つエージェントを構築するための枠組みを設計することを目的としている。このように社会的知能をもつエージェントの実現のためには解決すべき多くの技術的課題があるが、本研究では、実環境で自律的に動くシステムを想定し(2)(3)(4)の3つの機能の実現に重点をおいて研究を行った。その内容は、1.社会的学習を行うために、ユーザとのインタラクションを利用するための設計技術(具体的には各ユーザとの相互作用の情報化と情報フィルタリング技術)2.ユーザとのインタラクションを使った社会的機械学習技術(具体的には、強化学習または進化的学習を使った社会的学習技術の開発)の2つである。本年度は、主にユーザとのインタラクションを使った社会的機械学習技術に注力し、強化学習を用いた社会的学習アルゴリズムMULA-Qの提案とその検証を行なった。また、クラシファイアシステムを用いた社会的学習システムを実装したペットロボットを用いて、実際にユーザとのインタラクション実験によりその効果を検証した。これにより、複数ユーザとのインタラクションを用いた学習の社会的効果を示し、さらに副次的効果として学習の高速化を検証することができた。

ここでは、複数人の教示者から与えられる時系列データからなる教示環境に注目し、DP matching手法とクラスタリング手法により、教示者群からの教示をいくつかの教示指針に統合し、ロボット自身がより良い教示指針を、自身の身体性に基づき評価することを目指すものである。40名の被験者と3種類の実機ロボットを用いた実験により、システムが異なる身体性を持ったロボットに対し、それぞれの身体性に最適な教示指針を選択したことを確認した。さらに、ユーザとのインタラクションを使った社会的機械学習技術、具体的には、強化学習を使った社会的学習技術の開発を行った。ここでは、直接的経験とは別に、ユーザとの相互作用の類似性から代理経験的に学習影響を受けるモデルベースの学習システムM-MULAを開発し、計算機上のマルチタスクシミュレーションにおいて、提案手法野の効果を検証した。社会的学習は、環境に応じたエージェントの柔軟な知能を構築のため、将来的に極めて有効なコントローラの設計方法になり得る。人間からの教示を最大限に活用する本手法は、現在の学習システムが抱える柔軟な学習の困難さを大きく改善することができるため、その汎用性を今後大きく高めることが期待される。
酸素透過性を制御した担体に固定化した脱窒菌による好気的脱窒操作に関する研究

1.固定化脱窒菌の脱窒速度に及ぼす溶存酸素濃度の影響の評価前年度において調製した酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化した場合の脱窒速度を嫌気条件下において評価した.その結果,固定化脱窒菌の脱窒速度は懸濁系における値とほぼ等しく,固定化が脱窒活性に悪影響を及ぼさないことを明らかにした.さらに,アルギン酸バリウムゲル固定化脱窒菌の脱窒速度は,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態における脱窒速度の約90%を維持していることを確認した.また,酸素透過性が高いアルギン酸カルシウムゲル固定化脱窒菌と比較することにより,脱窒菌を酸素透過性を制御した担体に固定化することの有利性を明らかにした.2.固定化脱窒菌の反応速度論的活性評価固定化菌体量,ビーズ径が固定化脱窒菌の好気条件下における脱窒速度に及ぼす影響を検討し,それぞれ最適な固定化条件の範囲を明らかにした.さらに,有機物濃度,温度,pH等の影響を定量的に明らかにし,プロセス設計に必要となる反応速度論的パラメータを取得した.3.排水処理過程における好気的脱窒速度の評価バルクの溶存酸素濃度が固定化脱窒菌の脱窒速度に及ぼす影響を検討した.その結果,固定化菌体量ならびにビーズ径を上記で得られた最適な範囲に設定した場合,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態の脱窒速度の約95%を維持することを明らかにした.これらの結果より,既存の好気的排水処理操作に固定化脱窒菌による脱窒操作を簡易に付与できる可能性を示した.本年度では,酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化し,好気的な条件における脱窒速度に及ぼす酸素濃度,固定化菌体量,ビーズ径,温度などの影響を明らかにするとともに,好気的脱窒操作が可能であることを確認した.すなわち,当初の目的を達成した.1.固定化脱窒菌の脱窒速度に及ぼす溶存酸素濃度の影響の評価前年度において調製した酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化した場合の脱窒速度を嫌気条件下において評価した.その結果,固定化脱窒菌の脱窒速度は懸濁系における値とほぼ等しく,固定化が脱窒活性に悪影響を及ぼさないことを明らかにした.さらに,アルギン酸バリウムゲル固定化脱窒菌の脱窒速度は,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態における脱窒速度の約90%を維持していることを確認した.また,酸素透過性が高いアルギン酸カルシウムゲル固定化脱窒菌と比較することにより,脱窒菌を酸素透過性を制御した担体に固定化することの有利性を明らかにした.2.固定化脱窒菌の反応速度論的活性評価固定化菌体量,ビーズ径が固定化脱窒菌の好気条件下における脱窒速度に及ぼす影響を検討し,それぞれ最適な固定化条件の範囲を明らかにした.さらに,有機物濃度,温度,pH等の影響を定量的に明らかにし,プロセス設計に必要となる反応速度論的パラメータを取得した.3.排水処理過程における好気的脱窒速度の評価バルクの溶存酸素濃度が固定化脱窒菌の脱窒速度に及ぼす影響を検討した.その結果,固定化菌体量ならびにビーズ径を上記で得られた最適な範囲に設定した場合,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態の脱窒速度の約95%を維持することを明らかにした.これらの結果より,既存の好気的排水処理操作に固定化脱窒菌による脱窒操作を簡易に付与できる可能性を示した.本年度では,酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化し,好気的な条件における脱窒速度に及ぼす酸素濃度,固定化菌体量,ビーズ径,温度などの影響を明らかにするとともに,好気的脱窒操作が可能であることを確認した.すなわち,当初の目的を達成した.1.アルギン酸ゲルの酸素拡散特性の評価アルギン酸ゲルの酸素拡散係数に及ぼすゲル化剤、アルギン酸組成(アンヌロン酸/グルロン酸の比、M/G比)等の影響を検討した。その結果、アルギン酸カルシウムゲル中の酸素拡散係数は水中における分子拡散係数とほぼ等しいこと、アルギン酸バリウムゲル中のそれは水中における拡散係数の40%程度であることを明らかにした。一方、脱窒反応に関与する酸化体窒素(硝酸イオン)と有機物(グルコース)の拡散係数についても同様に検討し、アルギン酸バリウムゲル中のこれらの拡散係数は水中における分子拡散係数とほぼ等しいことを明らかにした。ゲル化剤としてバリウムを用いることにより、酸化体窒素や有機物は拡散しやすく酸素が拡散しにくい固定化担体、すなわち、脱窒菌の固定化に適した酸素難透過性担体を調製することができた。2.脱窒菌の集積ならびに嫌気条件下における脱窒活性の評価下水処理場の活性汚泥より脱窒菌を集積した。脱窒菌の脱窒活性の測定を行い、既往の文献値と同程度であること、溶存酸素濃度が0.3mg/L以上では脱窒反応がまったく進行しないことを確認した。3.固定化脱窒菌の調製ならびに嫌気条件下における脱窒活性の評価嫌気条件下におけるアルギン酸バリウムゲル固定化脱窒菌の脱窒活性は、懸濁液における値とほぼ等しかった。

また、酸素飽和(約7.6mg/L)条件下ではカルシウムゲル固定化脱窒菌の脱窒活性はほとんど認められなかったのに対し、バリウムゲル固定化脱窒菌では嫌気条件下の約4割の脱窒活性を有することを明らかにした。本年度では、脱窒菌の固定化に適した酸素難透過性担体を調製し、これに脱窒菌を固定化することにより好気的脱窒操作の可能性を確認し、当初の計画目的を達成した。1.固定化脱窒菌の脱窒速度に及ぼす溶存酸素濃度の影響の評価前年度において調製した酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化した場合の脱窒速度を嫌気条件下において評価した.その結果,固定化脱窒菌の脱窒速度は懸濁系における値とほぼ等しく,固定化が脱窒活性の悪影響を及ぼさないことを明らかにした.さらに,アルギン酸バリウムゲル固定化脱窒菌の脱窒速度は,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態における脱窒速度の約90%を維持していることを確認した.また,酸素透過性が高いアルギン酸カルシウムゲル固定化脱窒菌と比較することにより,脱窒菌を酸素透過性を制御した担体に固定化することの有利性を明らかにした.2.固定化脱窒菌の反応速度論的活性評価固定化菌体量,ビーズ径が固定化脱窒菌の好気条件下における脱窒速度に及ぼす影響を検討し,それぞれ最適な固定化条件の範囲を明らかにした.さらに,有機物濃度,温度,pH等の影響を定量的に明らかにし,プロセス設計に必要となる反応速度論的パラメータを取得した.3.排水処理過程における好気的脱窒速度の評価バルクの溶存酸素濃度が固定化脱窒菌の脱窒速度の及ぼす影響を検討した.その結果,固定化菌体量ならびにビーズ径を上記で得られた最適な範囲に設定した場合,バルクの溶存酸素濃度が3mg/L程度であっても,嫌気状態の脱窒速度の約95%を維持することを明らかにした.これらの結果より,既存の好気的排水処理操作に固定化脱窒菌による脱窒操作を簡易に付与できる可能性を示した.本年度では,酸素透過性を制御した担体に脱窒菌を固定化し,好気的な条件における脱窒速度に及ぼす酸素濃度,固定化菌体量,ビーズ径,温度などの影響を明らかにするとともに,好気的脱窒操作が可能であることを確認した.すなわち,当初の目的を達成した.
声真似による成りすまし攻撃に対する話者照合の耐性向上に関する研究

声による個人認証(話者照合)の実用化のためには,様々な「成りすまし攻撃」に対する対策を講じる必要がある.本研究課題では「声真似による成りすまし攻撃」を取り上げる.まず,声真似に特別なスキルを有していない一般の人の攻撃についての現象の分析とその対処手法の提案を行う.その際,深層学習に基づく話者照合技術の導入も検討する.さらに,声真似に高いスキルがある人物の攻撃についての分析と対処手法の考案を行い,双方の攻撃に対する効果的な対策手法の提案を目指す.声による個人認証(話者照合)の実用化のためには,様々な「成りすまし攻撃」に対する対策を講じる必要がある.本研究課題では「声真似による成りすまし攻撃」を取り上げる.まず,声真似に特別なスキルを有していない一般の人の攻撃についての現象の分析とその対処手法の提案を行う.その際,深層学習に基づく話者照合技術の導入も検討する.さらに,声真似に高いスキルがある人物の攻撃についての分析と対処手法の考案を行い,双方の攻撃に対する効果的な対策手法の提案を目指す.
『ヴィヤヴァハーラ経』を中心とするジャイナ教出家者戒律の総合的研究

ジャイナ教聖典「ヴィヤヴァハーラ経」を複数の註釈を参照にしながら、読解した。これによりジャイナ教僧団においてどのような戒律が規定され、それが実際に僧侶が過失を犯した際に、どのように適用されるか、またその時代的変遷の概略を註釈の記述の違いから明らかにすることが出来た。さらに使用されている重要な用語の訳語の一覧も作製した。また未刊行の註釈文献の写本を入手し、その一部を読解した。これは世界的にも先駆け的な研究であり、今後も展開していきたい。本年度は前年度に続き『ヴィヤヴァハーラスートラ』のバーシャをマラヤギリ注に拠りながら解読した。詩節数は183ー650でおよそ470である。これらの詩節の原文を確定すると共に日本語訳を付することができた。また『ニシーハスートラ』のバーシャおよびチュールニとの関連も明らかにすることができた。一方、未刊行である『ヴィヤヴァハーラスートラ』のチュールニを解読する必要性から、同書の写本を5種類入手することが出来た。本年度は、まずヴィヤヴァハーラ経のピーティカー部分をマラヤギリ注を参照にしながら講読し、バーシャの日本語訳を作製した。続いて第一章の第一経文およびバーシャをマラヤギリ注に従って読み進めることができた。この作業を通じて、概ね次の三点を達成できた。1)バーシャ中に現れる重要用語に対する日本語の選定。2)先行する英語、ヒンディー語など諸訳との比較検討。3)300偈に及ぶバーシャの構造の決定。これらについては次の様な意義と重要性がある。1)本研究はジャイナ教教団戒律に関する日本での初めての試みであり、訳語の選定は最も重要である。仏教と共通する用語もあるが、本研究では可能な限り現代日本語を使用して、今後の本分野での基礎となることを目指した。2)ピーティカー部分に関しては英訳が存在し、本研究でも指針として使用した。しかし、バーシャ理解に関して意見を異にする部分が約三分の一であり、独自の解釈を行った。これは先行研究を尊重しつつも盲従しないという研究の基本にしたがったものである。またヒンディー語訳は直訳的な部分が多く、より深い日本語訳を行うために参照した。なお、バーシャに関しては英訳も可能な限り作製し、将来の完成に備えている。3)経本文を説明するバーシャは複雑な構造をもっていることが講読の過程で明らかとなった。この構造を解明することは経本文自体の深い理解にも繋がり、またピーティカー部分の役割を理解するためにも重要な意味を持つ。最終年度は、主に二つの面で研究を行った。先ず第一に、初年度および前年度に引き続き、「ヴィヤヴァハーラ経」をプラークリットの韻文註およびサンスクリット註を参照にして読解していった。また重要な用語の訳語も決定した。第二に前年度に数種類の写本を入手した、プラークリットとサンスクリット混淆の散文註釈の読解も行った。研究機関全体を通しての本研究の成果は「ヴィヤヴァハーラ経」の解読をその中心内容とし、その際に三種類の註釈を用いた点が重要である。これによって、ジャイナ教出家者の行動規則がどのようなものであるか、概略を把握することが出来、また歴史的変遷も多少ではあるが、明らかになった。行動規則の概要について言えば、過失に対する滅罪儀礼の規定を実際に適用する際に非常に柔軟な態度で行っていることが知られる。それは現代の日本社会にも適用できるのではないかと思われるほどである。また最終年度に行った研究の第二面は、ほとんど前例のない研究であり難渋を極め、全文を解明するには至らなかったが、今後のジャイナ教研究、広くはインド古典学研究にとって重要な一歩となったと確信する。これを手がかりとして、今後はインドの他宗教、特に仏教の戒律との比較も行いたい。また、現在のジャイナ教出家者の行動規則に関しては実態調査を行ったが、これを本研究で行った文献研究と比較し、歴史的変遷や各分派での違いなどを調査して公表する予定である。研究分担者の削除八木綾子日本学術振興会承認年月日平成25年5月27日堀田和義日本学術振興会承認年月日平成26年3月18日ジャイナ教本研究の基本的な目標である「ヴィヤヴァハーラスートラ」の解読が当初の計画とほぼ一致するように実行できた。また本年度の目標であったチュールニの入手も実現できた。マラヤギリ注を参照にしてヴィヤヴァハーラ経を解読するという目標は概ね順調に達成されている。また写本の入手に関してはチュールニ写本に関してほぼ達成された。しかし、実地研究は現地との連絡を取ってはいるものの行うには至っていない。

今後も『ヴィヤヴァハーラスートラ』のバーシャをマラヤギリ注に従って解読していきたい。またチュールニの翻刻も進めたい。基本的にマラヤギリ注を参照にしてヴィヤヴァハーラ経の解読を進める。また入手した写本を文字化する作業を行う。合わせて現地調査を実行する。研究分担者である堀田和義氏は当初25ー26年の2年間で研究を遂行する予定であったが、1年でその任務が終了した。また分担者としての研究が完了したため、残金が生じた。研究代表者である藤永伸が26年度に行う研究に使用する。該当なし
細胞死を伴う好酸球の脱顆粒メカニズムの解明と病態評価への応用

白血球のひとつである好酸球は、アレルギーの起こっている部位で顆粒蛋白を放出(脱顆粒)し、炎症を慢性化させている。このような組織や分泌液中では、好酸球が脱顆粒を伴って細胞死をきたしていることが知られてきたが、この本態は長い間不明であった。研究の結果、好酸球は過剰な活性化によって顆粒を放出するとともに、核のDNAが網状に放出される(DNA traps)、Extracellular trap cell death(ETosis)と呼ばれる特殊な細胞死をきたすことを明らかにした。さらにDNA trapsは好酸球性副鼻腔炎などの分泌液中に大量に存在し、その強い粘性に寄与していることも明らかにした。難治性喘息、Churg-Strauss症候群(好酸球性多発血管炎性肉芽腫症)、好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、好酸球性中耳炎・副鼻腔炎といったステロイド抵抗性の好酸球性炎症は、今なお解決されない問題になっている。好酸球は血流から血管内皮細胞へ接着し、炎症部位に遊走運動により集積し、局所で活性化してエフェクター細胞として機能するとともにその運命(生・死)を決定している。我々は炎症組織で認められる好酸球の脱顆粒を伴う細胞死(lytic degranulation)の本態を明らかにするために、ハーバード大学との共同研究により組織中の好酸球の形状を解析した。この結果、lytic degranulationをきたした細胞は、細胞膜の破綻・核膜とヘテロクロマチンの消失が認められることがわかった。さらに、固相化した免疫グロブリンや血小板活性化因子等により、高純度分離したヒト好酸球を刺激した場合、NADPHオキシダーゼ依存的にlytic degranulationを誘導できることを見いだした。これらのことから、lytic degranulationが、近年Extracellular trap cell death(ETosis)と呼ばれる非アポトーシス細胞死とほぼ同一のものであることを解明し、これまでの知見を論文として報告した。このことは、アレルギー性炎症疾患における長年の謎であったlytic degranulationの形成を明らかにするとともに、診断・治療につながる新しい概念として重要である。また、好酸球におけるケモカイン・サイトカイン・ビタミン誘導体などによる受容体発現変化・細胞の遊走・接着・生存のメカニズムを、ヒト分離好酸球を用いて明らかにし、論文として報告している。難治性喘息、Churg-Strauss症候群(好酸球性多発血管炎性肉芽腫症)、好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、好酸球性中耳炎・副鼻腔炎といった疾患は、強力なステロイド治療を行ってもしばしばその制御が難しい。これらの疾患における治療ターゲットである好酸球は、血流から局所に集積・活性化しその運命(生死)を決定している。我々は一連の研究において、炎症組織で認められる好酸球の脱顆粒を伴う細胞死の本態が、Extracellular trap cell death(ETosis)というプログラムされた非アポトーシス細胞死であることを解明し、論文として報告している(Ueki etal,Blood.2013)。昨年度から推進してきた臨床検討については、ハーバード大学、秋田大学、山形大学、慈恵会医科大学、関西医科大学の医師・研究者と連携をとり、研究を推進している。基礎検討の結果、特に難治性の耳鼻科疾患(好酸球性副鼻腔炎・中耳炎)から得られた分泌物を用いて、ETosisとの関連を明確にしていく方針である。また、本年度はヒト好酸球における細胞表面受容体による生存能への影響、PI3Kの薬理学的阻害薬による基礎検討を進めており、細胞の遊走や接着のシグナルを明らかにし、国際誌へ報告した。白血球のひとつである「好酸球」は血管内から炎症の起こっている部位に移動し、活性化することにより組織を傷害する顆粒蛋白を放出してアレルギー性炎症を慢性化させている。特に好酸球が関与している難治性喘息、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、好酸球性中耳炎・副鼻腔炎といった疾患は、強力な抗炎症薬であるステロイドにもしばしば抵抗性であり、これらの病態の解明は新しい治療戦略を確立する上でも重要である。アレルギー炎症組織や分泌液中では、好酸球が脱顆粒を伴って細胞死をきたしていることが古くから知られていたが、この細胞死の本態は長い間不明であった。病理組織と末梢血から分離した細胞を用いて検討を進めた結果、活性化に伴って特殊な細胞死(Extracellular trap cell death:ETosis)であることを解明した。ETosisのメカニズムはカルシウム流入とNADPHoxidaseを介しており、プログラムされた細胞死であった。ETosisは生体内では脱顆粒の一形態として重要であり、炎症を増強している可能性が示唆される。また、ETosisでは核内のクロマチン線維が網状に放出される(DNA traps)が、特に好酸球性副鼻腔炎や中耳炎における分泌液の粘性に関与していることが明らかになり、J Allergy Clin Immunol誌に報告した。

研究の結果、好酸球は過剰な活性化によって顆粒を放出するとともに、核のDNAが網状に放出される(DNA traps)、Extracellular trap cell death(ETosis)と呼ばれる特殊な細胞死をきたすことを明らかにした。さらにDNA trapsは好酸球性副鼻腔炎などの分泌液中に大量に存在し、その強い粘性に寄与していることも明らかにした。計画は概ね順調に進展している。昨年度の目標であった臨床検体を用いた検討も行うことができている。本年度は、他の細胞死との比較を行うため、アポトーシスとの差異を電子顕微鏡により形態学的に評価し、学会でその成果を報告した。また、ETosisによって生じるDNA trapsの好酸球性炎症疾患における存在や、その性状について検討を加え、学会で報告するとともに、原著論文として国際誌へ投稿し、追加実験の対応を行っている。一方、特異的シグナル・分子マーカーの探索は引き続いて検討中である。臨床検査医学、アレルギー学引き続きヒト末梢血から高純度分離した好酸球による検討を進めることで、病態に直結する知見が得られる。好酸球はプライマリ細胞であることから、マイクロRNAや遺伝子レベルでのノックダウンは行うことがほとんどできない。そのため、基本的にはETosisの薬理学的な阻害とその結果を明らかにし、必要に応じて他の方法で確認し、総合的に進めていくのが最も妥当なアプローチになると考えている。ETosisとアポトーシスという二つの能動的な細胞死に至る経路の差異を明らかにする上でも重要な点である。今後、さらに好酸球がETosisに至る細胞内メカニズムを明らかにしていく。また、生体内では脱顆粒の一形態としてETosisが炎症を増強している可能性について、他の細胞(気道上皮細胞など)との共培養系の確立などの予備実験を行う。結果は随時、国内外の学会(アレルギー学会、臨床検査医学会、国際好酸球研究会など)で報告を行い、今後論文化を目指す。本年度の目標であったlytic degranulationの本態を明らかにしたこと、その分子メカニズムに活性酸素の産生(NADPHオキシダーゼ)が関与していること、遊離した顆粒の特性についても検討を加えることができた。また、好酸球の生存期間の変化や細胞機能調節についても新たな知見を報告することができた。一方で、ETosisにおける活性酸素の産生に伴って引きおこされると考えられるシグナル蛋白のリン酸化やターゲット分子は不明である。これはETosisとアポトーシスという二つの能動的な細胞死に至る経路の差異を明らかにする上でも重要であることから、さらに検討を加えていきたい。本年度はほぼ予定通りだったが、消耗品が若干少なかった。ヒトの好酸球を用いる利点は病態に直結できることであり、引き続きヒト末梢血から高純度分離した好酸球による検討を進める。他の細胞死との比較を行うため、アポトーシスはAnti-Fas抗体を用いて誘導し、ETosisの細胞との違いを形態学的に評価し、シグナルやプロセスにおけるその差異を明確にする。