hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
迅速骨置換型炭酸アパタイトブロックの創製

さらに、骨芽細胞による培養実験では骨伝導性のマーカーとしたオステオカルシン値は15日目で11ng/mLであり細胞培養用シャーレの3ng/mLより著明に大きい値を示したことから骨伝導性を有することが示唆された。前年度の研究で,水酸化カルシウム圧粉体を炭酸ガス中で炭酸化することにより炭酸カルシウムとし、さらにリン酸塩水溶液処理により炭酸アパタイトに転化させて炭酸アパタイトブロックの調製を行った。今年度は、炭酸化速度を高めるためドライアイスを用い超臨界条件下でのCO_2中での炭酸化を行った。また、リン酸塩処理では当初、アンモニウム塩を使用する予定であったが、残存するアンモニウムイオンが骨芽細胞の増殖等に影響しやすいことがわかったのでナトリウム塩を用いた。調製条件と生成する炭酸アパタイトブロックの物理・化学的性質の関連を検討し、さらに、炭酸アパタイトフォームの創製条件も検討した。超臨界条件での炭酸化によるカルサイトへの転化はほぼ2日で終了し、常圧の炭酸ガス流通下での条件よりも炭酸化は促進されることがわかった。一方、反応温度を100°Cとしリン酸3ナトリウム水溶液中で処理を行ったところ2日以内でほぼ純粋な炭酸アパタイトが得られることがわかった。炭酸アパタイトフォームを作製するために以下の操作を行った。酸化カルシウム粉末懸濁液にポリウレタンフォームを浸漬、乾燥し、ポリウレタンフォームの骨梁に酸化カルシウムを付着させる。電気炉にて焼成し、ポリウレタンフォームの焼却と酸化カルシウムの焼結を同時に行う。酸化カルシウムのフォームは得られたが、これをガス流通型反応器内で二酸化炭素と反応させると反応による体積膨張が著しくフォームが一部崩壊することがわかった。反応条件等をもっと詳細に検討する必要があると考えられる。硬組織代替材料としての評価のために,骨芽細胞を用い接着性および増殖能の評価を行った。焼結体アパタイトより劣るものの良好な接着性増殖能を示した。また、破骨細胞による吸収を示すハウシップ窩が表面に認められた。酸化カルシウムを出発原料としてポリウレタンフォーム法により調製したフオームは、空気中の湿気や炭酸ガスの吸収によるフォームの崩壊を避けられなかった。そこで、出発原料としてリン酸四カルシウムを用いてフオームを調製し、炭酸塩水溶液で水熱処理することによる炭酸アパタイトフォームの調製を試みた。しかし、炭酸塩単独処理ではアパタイト相へ転化しなかったので、まず、リン酸塩水溶液処理によりアパタイトへの転化過程を検討した。アパタイトへの転化はリン酸塩濃度に大きく影響され、薄い程転化率が大きかった。また、単に蒸留水中での水熱処理によりアパタイトへの転化は進行するが、水酸化カルシウムが副生した。一方、ウレタンフォーム焼却法による炭酸アパタイトフオームの調製に代わる方法として、水酸化カルシウムに一定量の塩化ナトリウムを添加し炭酸化後に塩化ナトリウムを熱水中で溶かし出すことによりカルサイト多孔体を調製しさらにリン酸塩水溶液中での水熱処理により炭酸アパタイト多孔体とする方法について検討した。その結果、塩化ナトリウムの添加量調節することによりを気孔率が最大で約90%の炭酸カルシウムおよび炭酸アパタイト多孔体を調製できることがわかった。生成した炭酸アパタイトの分析結果から、使用する塩の種類によりA,B両タイプの生成比が異なることがわかった。
過去の海水の酸化還元変動を知る～クロム同位体を用いた新しい挑戦～

本研究では,炭酸塩堆積物からクロム分離手法を確立してその同位体比を測定し酸化還元指標としての可能性を評価した.白亜紀アプチアンに太平洋の海山で堆積した浅海性石灰岩の主要元素,微量元素およびクロム同位体比を測定した.アプチアンには,世界各地で有機質黒色頁岩が形成する海洋無酸素事変(OAE)-1aが起こっており,海水の酸化還元電位が大きく変動している.クロム同位体比の最も重い値は黒色頁岩の堆積が始まる直前のアプチアン最初期に認められ,OAE-1aが始まる前に海水の酸化還元状態がすでに変化を始めていたことを示している.本課題は,クロム同位体組成を古環境変動の解明に応用することを目的とした研究である.クロム同位体は海水が還元的になり始める時期を知るのに有用な指標となることが指摘されてきた.海水中で6価クロムが3価に還元される時に軽い核種が選択的に還元され,delta-53Cr/52Crに最大6‰の同位体分別が起こる.クロムの還元は,現在のように海洋が酸化的である状態から,やや還元的な状態になる時に進み,軽い核種が海水中から除去されて残った溶存クロムの同位体比が重くなることが予想される.6価クロムがクロム酸イオンの形で炭酸塩鉱物の炭酸イオンを置換して取り込まれることが室内実験で明らかになっている.本研究では,炭酸塩鉱物中のクロムを抽出し,その同位体比の深度分布を知ることで過去の海水の溶存クロムの同位体比の時系列変動を復元する方法の確立と,そのデータから過去の環境変動を知ることが目的である.本研究では,平成23年度に研究環境の整備と構築を行い,平成24年度に白亜紀試料への応用を計画していた.具体的には,白亜紀アプチアンの海洋無酸素事変OAE-1aに注目し,海洋の還元化が急激に進んだのか,徐々に貧酸素化が進んだのかに注目した.もし後者であれば,黒色頁岩の堆積が始まる前に前兆現象がクロム同位体比の変化として記録されるはずである.本研究では,中央太平洋海台とイタリア中部からOAE-1aを含む中期白亜紀の石灰岩を採取し,クロム同位体比を測定してOAE-1a前後の太平洋とテチス海のクロム同位体比の時間変化を復元した.その結果,太平洋Resolution Guyotの浅海石灰岩で,OAE-1aの直前にクロム同位体比が高くなる現象が認められた.これは,海洋が還元的になる初期段階でクロムの還元が始まり,OAEが始まる数10万年前から海水の溶存クロム同位体比が重くなり始めたことを示す,画期的な成果であった.クロムは酸化還元変化に敏感な元素であり,酸化還元反応で同位体分別が起こることが知られている.一方,海水はやや重い値を持つ.海水の溶存クロムのほとんどは6価として存在し,還元されると3価になる.還元の際に同位体分別が起こり,軽い同位体が選択的に還元されるため,海水には重い同位体が残る.バハマバンクのアラレ石のクロム同位体比は海水の値に近い値を持つ.このことから,炭酸塩中のクロム同位体比は,海水の溶存クロムに由来すると考えられる.つまり,炭酸塩中のクロム同位体比から,地質時代の海水のクロム同位体比変動が復元できる可能性がある.6価から3価への還元は,比較的高い酸化還元電位で起こるため,酸化的な海洋環境から還元的になる過程の初期段階で大規模な海水のクロム同位体比の変化が起こると予想される.私は炭酸塩堆積物のクロム同位体比の酸化還元指標としての可能性に注目し,地質時代の海水の酸化還元変動を堆積物から復元することを試みた.1年目には石灰質堆積物から効率よくCrを分離・抽出する方法を構築した.23年目にはその同位体比を測定した.白亜紀アプチアンに太平洋のMid-Pacific Mountainsに堆積したチョークと,Resolutionギョーに堆積した浅海性石灰岩,テチス海西部の陸棚遠洋域に堆積したイタリア・マルケ州のチョークの炭酸塩相のクロム同位体比を測定した.アプチアンには,世界各地で有機質黒色頁岩が形成する海洋無酸素事変(OAE)-1aが起こっており,海水の酸化還元電位がドラスティックに変動している.太平洋の浅海性石灰岩のクロム同位体比は重い値を持ち,最も重い値は黒色頁岩の堆積が始まる直前のアプチアン最初期に認められた.一方,遠洋性チョークでは地殻と同じ値となった.このことから,浅海性石灰岩は海水のクロム同位体比を反映し,遠洋性チョークのクロム同位体比は堆積後の続成の影響を強く受けることが分かった.本研究では,炭酸塩堆積物からクロム分離手法を確立してその同位体比を測定し酸化還元指標としての可能性を評価した.白亜紀アプチアンに太平洋の海山で堆積した浅海性石灰岩の主要元素,微量元素およびクロム同位体比を測定した.アプチアンには,世界各地で有機質黒色頁岩が形成する海洋無酸素事変(OAE)-1aが起こっており,海水の酸化還元電位が大きく変動している.クロム同位体比の最も重い値は黒色頁岩の堆積が始まる直前のアプチアン最初期に認められ,OAE-1aが始まる前に海水の酸化還元状態がすでに変化を始めていたことを示している.

本研究課題は、白亜紀海洋無酸素事変におけるクロム同位体変動から海洋の還元化プロセスを明らかにするという研究である。申請期間内の研究計画は以下の3段階からなる。第1段階は実験環境の整備と分析技術の向上、第2段階は試料採取と実際の分析、第3段階はデータにもとづく古海洋学的検討である。平成23年度の前半は、第1段階(実験環境の整備と分析技術の向上)に努めた。具体的には、クリーンルームでのクロム分離環境の整備、クロム抽出のための試薬類の調整と品質評価、マルチコレクター型誘導結合プラズマ質量分析計(MC-ICP-MS)感度・精度向上のための調整である。平成23年度の後半は、第2段階(試料入手,評価,同位体分析)をスタートさせた。掘削試料の入手、試料の記載(岩相記載と顕微鏡観察)、分析試料の選出、前処理、四重極型誘導結合プラズマ質量分析計(ICP-QMS)を用いた主要元素・微量元素測定、クリーンルームでのクロム抽出・分離、MC-ICP-MSを用いたクロム同位体測定とデータ解析を行い、データを取得することができた。この成果の一部を、日本地球化学会で発表した。特筆すべき最大の成果は、分析感度の向上とブランク低下により必要試料量を低下させた点である。従来の方法では、1回の分析につき約250 ngのクロムが必要であった。炭酸塩相中のクロム濃度は0.20.3 ppmであるので、1回の分析で試料約1 gが必要であった。これに対し、1回のカラム分離で処理できる炭酸カルシウム量は100 mgである。つまり,1試料につき10回のカラム分離が必要で、時間の浪費が著しく大きかった。平成23年度の取り組みで、質量分析計の精度を保ったまま感度を上げ、ブランクも下げることができ、最終的に100 ngの試料量で分析できることがわかり、作業効率が向上した。さらに、平成24年度にも引き続き分析技術の向上に努める。本課題は,申請時に以下のように計画していた.1)平成23年度に研究環境の整備と構築を行う,2)平成24年度に実際の地質試料に応用し,白亜紀の石灰岩試料を分析する.研究手法の確立は平成23年度におおむね確立することができた.また,実際に分析する前期白亜紀石灰岩試料(中央太平洋海台MidーPacific Mountainsの遠洋性石灰岩,Resolution Guyotの浅海性石灰岩,イタリア中部アペニン山地の遠洋性石灰岩)を採取し,主要元素,微量元素,希土類元素組成およびクロム同位体比を測定してOAE-1a前後の太平洋とテチス海の溶存クロム同位体比の時間変化を復元することを試みた.遠洋性石灰岩では,クロム同位体比は海水と異なる値を示した.これは,鉄マンガン酸化物によるケイ酸塩鉱物由来のクロムの再酸化を示す.つまり,海水の情報が保存されていないことが判明した.一方,Resolution Guyotの浅海石灰岩では,海水に特徴的なクロム同位体比が得られ,鉄マンガン酸化物によるクロム同位体組成の変質は起こっていないことが分かった.過去のクロム同位体比を復元するためには,浅海性石灰岩が適しているという結論に達した.特筆すべきは,OAE-1aの直前にクロム同位体比が高くなる現象が認められた.これは,海洋が還元的になる初期段階でクロムの還元が始まり,OAEが始まる数10万年前から海水の溶存クロム同位体比が重くなり始めたことを示す,非常に画期的な成果であった.現在までに,当初目的の達成度に対し,おおむね順調に進んだ.しかし,この画期的な成果を公表するためには,Resolution Guyotの試料の分析数がやや不十分で,さらに分析を進めてデータの信頼性を高める必要がある.
移民コミュニティの言語に関する総合的研究：言語接触の実態と言語政策の影響

移民コミュニティの言語実態を調査した結果、在日コリアンでは来日時期や民族学校の種類によって言語使用状況に違いがあること、同時に共通点も多くあることが明らかになった。在独トルコ系コミュニティでは、一世か否かのほか性別も言語使用に大きな影響を与えていること、移住後数十年が経過してもなお、本国の言語と移民の言語の間には細部に亘り共通性が見られること、などが明らかになった。これらの調査結果から、「移民言語」というのは、従来考えられていた複数の言語の混合体というよりは、複数の言語の要素を保持しつつ、それらを能動的に選択するという、言語使用のありかたであることが明らかになりつつある。1.フィールド調査によるデータ収集ドイツのトルコ系コミュニティについては,ベルリンにおいて,トルコ語・ドイツ語二言語使用者であるトルコ系住民を対象に談話データの収集をおこなうとともに,これまで収集したアンケート調査のデータに基づき,トルコ語とドイツ語の間の干渉,言語選択の要因について研究を進めた(林)。それと同時に,トルコ系・イタリア系移民のドイツ語習得との類似性を調べるため,ベルリンの日本語母語話者のドイツ語談話を収録した。その調査において,事前にドイツ語を学習しなかったり,ドイツ滞在後しばらくドイツ語学校に行かなかったにもかかわらず,かなりの高度なレベルのドイツ語を駆使している日本語母語話者も少なくないこと,そのようないわゆるGood Learnerの特徴も探ることができた(平高)。在日コリアンの言語については,いわゆる総連系の民族学校での授業参観とビデオ収録によるデータ収集を行った。特に1年生の生徒の朝鮮語習得過程について分析を進めている。また,韓国系の民族学校での言語に関するアンケート調査を行った(生越)。日系カナダ人の言語に関しては,これまで収集した自然談話録音資料の再分析に着手するとともに,カナダの研究者と分析の枠組み等について協議を行った(日比谷)。さらに,アイルランドにおける母語意識については,母語(Mother tongue)の定義およびそれに対する態度について,現地の高校で調査を行った。比較のために,東京の大学においても同様の調査を行い,その結果を分析している(マーハ)。2.研究会の開催と研究打ち合わせ今年度は以前から続けてきた「移民コミュニティ言語研究会」を4回開催し,当該分野で成果を上げている研究者の発表とそれに関する討論を行った。さらに,分担者間で頻繁に連絡を取りながら,研究の方向について議論を行った。1.フィールド調査によるデータ収集日本のコリアンコミュニティについては、総連系民族学校で参与観察を継続的に行うとともに、東京の韓国系民族学校で言語使用に関するアンケート調査を行った(生越)。日本のベトナム系移民の調査は、大和市などでの談話データ収集を行った(林、平高)。ドイツの移民コミュニティについては、トルコ語・ドイツ語二言語使用者の言語使用に関して行ったアンケート調査の結果をまとめ、国際学会において報告した(林)。さらに、周辺諸国からのいわゆる移民のドイツ語習得との比較を行うため、ドイツ滞在日本語母語話者で渡独前にドイツ語未習得の人のドイツ語についてインタビューを実施した(平高)。カナダの日系コミュニティについては、トロント在住の日系カナダ人の英語による自然談話録音資料の分析を進めると同時に、ヴァンクーヴァーで収集した日本語による自然談話録音資料を、一世同士の方言接触の観点から検討した(日比谷)。アイルランドの移民コミュニティについては、マスメディアや学問的ジャーナルで取り上げられるアイルランドの言語状況について情報収集を行いつつ、ヨーロッパの言語史や文学のなかで"母語"(Mother Tongue)が果たす役割について考察を進め、その成果を発表した(マーハ)。また、ロンドンにおける多言語使用状況について、現地で聞き取り調査および資料収集を行い、現代言語教育との関係から英語をめぐる言語政策について検討を行った(嶋田)。2.言語政策資料の収集各地域での言語政策資料の収集に努めた。3.公開の研究会と研究打ち合わせ会議の開催第1回国際シンポジウムを2011年5月に開催し、研究発表およびカナダから招聘した2名の研究者(James Walker,Naomi Nagy)の講演を行った。また、移民コミュニティ言語研究会を発展させた「東京移民言語フォーラム」を発足させ、4回の研究発表会を行った。1.フィールド調査によるデータ収集日本のコリアン・コミュニティについては、総連系民族学校(神奈川・群馬)での参与観察を継続するとともに、東京の民族学校で行ったアンケート調査の結果分析を進め、論文として発表した(生越)。日本のベトナム系移民の調査は、神奈川県大和市、横浜市において、引き続き談話データ収集を行った。(林、平高)ドイツの移民コミュニティに関しては、モノリンガルとバイリンガルのトルコ語話者の間の、トルコ語指示詞の用法の違いを明らかにするために、2010年度に実施した実験データの書き起こし、およびアノテーション付けの作業を行った。また、指示詞の用法に関するアンケートデータを分析し、その結果について研究発表を行った。(林、平高)

さらに、ドイツで日本語母語話者のドイツ語による談話データを収集し、他の言語を母語とする移民の言語との比較対照作業を引き続き行った。(平高)アイルランド・イングランドの移民コミュニティに関しては、アイルランド南西部において、伝統的な方言話者の言語使用に関する調査を行うとともに、言語接触による言語の動態をアイルランド英語を手がかりに考察し、その成果を国際シンポジウムで発表した(嶋田)。また、日本の大学生を対象に母語に関する意識調査を行った(マーハ)。カナダの日系コミュニティに関しては、トロント大学、ヨーク大学の研究協力者がトロントで従事している中国系カナダ人、イタリア系カナダ人の英語を対象とした分析結果と、日系カナダ人の英語を比較し、言語接触・言語変容の個別性と普遍性を考察した。(日比谷)2.言語政策資料の収集分析国家・コミュニティにおける英語の機能と言語政策における英語の位置づけに関する文献・資料収集(嶋田)、ヨーロッパにおける「母語」「母国語」「多言語/多文化主義」という概念に関する言語意識調査の結果や歴史的文献(文学、精神分析論、哲学など)の収集・分析(マーハ)を行った。3.国際シンポジウム・研究会の開催と研究打ち合わせ会議の開催1.フィールド調査によるデータ収集・分析日本のコリアン・コミュニティについては,総連系民族学校(群馬)での参与観察を継続するとともに、初級学校1年生の朝鮮語習得過程を分析し、研究会で発表した(生越)。ドイツの移民コミュニティに関しては、トルコ語・ドイツ語バイリンガル話者を対象に、指示詞を指標としてトルコ語へのドイツ語の影響について調査したほか、比較のために、モノリンガルの小学生の指示詞の使用についても調査した。さらに、日本語母語話者にドイツ語によるインタビューを実施し、ドイツにおける移民のドイツ語習得との共通点・相違点を探った(林、平高)。また、ドイツの統合コースの最近の動きをとらえるため、統合コース実施機関や学校を訪問し、移民やその子弟に対するドイツ語教育の実態を調査した(平高)。アイルランド・イングランドの移民コミュニティに関しては、アイルランド英語の接触言語的性質に関してフィールド調査を行い、特に当該言語とクレオールとの連続性について考察をまとめ、研究発表を行った(嶋田)。カナダの日系コミュニティに関しては、ヴァンクーヴァー、トロントなどのコミュニティにおける日本語・英語の言語接触とそれによる言語変容の諸相を、同地域の他の移民コミュニティ(中国系、イタリア系等)の状況と比較しつつ明らかにした(日比谷)。2.言語政策資料の収集分析イギリスとヨーロッパにおける多言語状態や市民権についての研究を、主に言語とアイデンティティーに焦点を合わせて継続的に行うとともに、「母語」概念について再検討し、新しい定義を構築した(マーハ)。
全身性エリテマトーデス患者Tリンパ球の機能異常と蛋白リン酸化との関連

SLE患者T細胞はphorbol myristateacetate(PMA)に対する増殖反応が低いことがわかっていたが、この際T細胞の80kDaや64kDaの蛋白のリン酸化が著明に低下していることが明らかになり、このことがSLE患者T細胞の活性化の欠陥に関連していることが示唆された。さらに蛋白脱リン酸化阻害剤であるオカダ酸を加えると、80kDa蛋白のリン酸化が増強され、T細胞の増殖反応も促進されたが、SLE患者T細胞ではこれらの反応が極めて弱いことを証明した。このSLE患者T細胞の活性化障害とは裏腹に、抗CD3抗体でT細胞を刺激すると、B細胞へのシグナルは効率よく伝達され、B細胞によるIg産生が増加する傾向を示した。また、最近T-B細胞相互作用においてT細胞上の膜型TNF-αが注目されるようになった。われわれは健常者T細胞にHTLV-1を感染させると細胞表面に26kDaの膜型TNF-αが発現することを明らかにした。この感染T細胞と自己B細胞を培養すると、B細胞によるIgM産生が有意に増加し、抗TNF-α抗体により抑制された。このように膜型TNF-αはB細胞に刺激を送るaccessory moleculeと考えられ、しかもそれがHTLV-1感染によってもたらされるという重要な知見を得た。さらに、膜型TNF-αを発現したT細胞に抗TNF-α抗体を作用させると、細胞内Ca^<2+>の上昇が起こり、IL-2やIFN-γの産生が増加することも確かめられた。このように、T細胞に発現されるTNF-αは新しい機能分子であることが示唆され、SLEなど自己免疫疾患における意義について検討中である。全身性エリテマトーデス(SLE)患者のTリンパ球にはいくつかの機能異常があることが知られている。我々はまずSLE患者末梢血Tリンパ球をin vitroでphorbol myristate acetate(PMA)で刺激し、プロテインキナーゼC(PKC)の酵素活性を測定した。その結果、SLE患者Tリンパ球では健常者のそれに比べPKC活性は明らかに低下していた。PMA刺激による細胞内蛋白のリン酸化を^<32>Pを用い、SDS-PAGE、オートラジオグラフィーにより検討したところ、健常者Tリンパ球においては、PMAの濃度依存的に80kDa、及び64kDaの蛋白がリン酸化を受けていることが明らかになった。ところが、SLE患者Tリンパ球では、これらの蛋白のリン酸化が著明に低下していた。このことがSLE患者Tリンパ球活性化の欠陥に関連していることが示唆された。さらに、蛋白脱リン酸化阻害剤であるオカダ酸をPMA刺激に加えると、Tリンパ球の増殖反応は促進され、前述の80kDa蛋白のリン酸化も増強された。しかし、SLE患者Tリンパ球においては、このような反応が極めて弱く、CD3分子のgamma鎖のリン酸化も減弱していた。このように、Tリンパ球は蛋白脱リン酸化抑制によっても増殖反応が促進されることがわかったが、SLE患者Tリンパ球ではこの作用も弱いことが明らかとなった。Tリンパ球の増殖反応とは別に、活性化Tリンパ球によるBリンパ球の免疫グロブリン(Ig)産生補助能を検討した。抗CD3抗体でSLE患者Tリンパ球を刺激すると、Bリンパ球へのシグナルは健常者に比べ、より効率よく伝達され、Bリンパ球によるIg産生が増加する傾向がみられた。このように、SLE患者Tリンパ球は現在のところ、刺激に対する増殖とヘルパー活性が解離することが考えられる。

その1つの原因として、phorbol myristate acetate(PMA)刺激に対するプロテインキナーゼC(PKC)の活性低下が考えられることを我々はすでに明らかにした。このPMA刺激に対する細胞内蛋白のリン酸化をSDS-PAGEにより検討したところ、健常者Tリンパ球においては、PMAの濃度依存的に80kDa、及び64kDaの蛋白がリン酸化を受けていることが明らかになった。ところが、SLE患者Tリンパ球では、これらの蛋白のリン酸化が著明に低下していた。さらに、蛋白脱リン酸化阻害剤であるオカダ酸をPMAとともに加えると、Tリンパ球の増殖反応は促進され、上記の80kDa蛋白のリン酸化も増強された。しかし、SLE患者Tリンパ球はこのような反応が極めて弱く、膜のCD3分子のγ鎖のリン酸化も低下していた。このように、Tリンパ球は蛋白の脱リン酸化抑制によっても増殖反応が促進されることが明らかとなったが、SLE患者Tリンパ球ではこの反応も弱いことが証明された。活性化Tリンパ球によるBリンパ球の免疫グロブリン(Ig)産生補助能を検討するために、抗CD3抗体でSLE患者Tリンパ球を刺激したところ、健常者のそれに比べBリンパ球によるIg産生の高い補助能を示した。このように、SLE患者Tリンパ球はその増殖活性とヘルパー活性が解離することが示唆された。また、HAM患者由来のHTLV-1感染細胞により、健常者のCD4^+細胞にHTLV-1を感染させたところ、膜上にTNFαの発現が誘導され、しかもこのことがB細胞を活性化させることが認められた。現在、SLEやSjogren症候群などの自己免疫疾患Tリンパ球について、その作用が強いのか否かを検討しているところである。活性化Tリンパ球上の膜型TNF-αはBリンパ球による免疫グロブリン(Ig)産生を促進させることが最近明らかになった。われわれは高Ig血症を呈することで知られる全身性エリテマトーデス(SLE)やシェ-グレン症候群(SjS)の発症病理における膜型TNF-αの役割に注目している。HAM/TSP患者由来のHTLV-1感染株化Tリンパ球(H/T)と健常者Tリンパ球とを10日間共培養すると、HTLV-1の感染が成立し、かつ細胞表面に26kDの膜型TNF-αが発現することがWestern-blot法により確認された。この新しく感染したTリンパ球と自己Bリンパ球を10日間培養すると、Bリンパ球によるIgM産生が有意に増加し、しかも抗TNF-α抗体処理により部分的ながらIgM産生が抑制された。これに対し、Bリンパ球によるIgG産生の増強はみられなかった。これは感染Tリンパ球表面にCD40Lが発現されていなかったためであろうと考えられた。このように膜型TNF-αはBリンパ球にシグナルを送るaccessory moleculeと考えられ、しかもそれがHTLV-1感染によってもたらされるという重要な知見を得た。次にこの膜型TNF-αがTリンパ球内で何らかのシグナルを伝達する機能があるか否かを検討した。膜型TNF-αを発現しているTリンパ球に抗TNF-α抗体を加えると、細胞内Ca^<2+>の上昇が起こり、一方、培養液中にIL-2とIFN-γの産生が増加することが見いだされた。このように、Tリンパ球に発現される膜型TNF-αは新しい機能分子であることが示唆され、かつHTLV-
医療用医薬品を素材とする多機能性ナノデバイスを用いた革新的遺伝子医薬品の開発

医療用医薬品を用いた遺伝子ベクター開発を行った。医薬品はプロタミン硫酸塩静注(PRT)、コンドロイチン硫酸注射液(CS)、強力ネオミノファーゲンC、ヒアルロン酸点眼液を用いた。pDNAと医薬品の組み合わせを検討した結果、混合比と調製手順を最適化することでpDNA-PRT複合体(PRT複合体)、pDNA-PRT-CS複合体(CS複合体)を構築できた。両複合体はともに高い遺伝子発現を示した。PRT複合体は細胞毒性を示したが、CS複合体では毒性が見られなかった。PRT複合体は血清存在下で遺伝子発現が低下したが、CS複合体は影響を受けなかった。CS複合体は静脈内投与後、脾臓で高い遺伝子発現を示した。医療用医薬品を構成成分とするナノデバイスの開発を目的とした。ホタルルシフェラーゼをコードしたpDNA (pCMV-Luc)と様々なカチオン性医薬品を混合することで、医療用医薬品ベクターの調製を試みた。スクリーニングの結果、pDNAと硫酸プロタミン静注用(PRT)の混合比と調製プロセスを最適化することで、安定なナノサイズのpDNA-PRT複合体(PRT複合体)を構築することに成功した。作製したPRT複合体はin vitroにおいて、1×108 (RLU/mg protein)を超える高い遺伝子発現を示した。また、各種エンドサイトーシス阻害剤(クロルプロマジン、ゲニステイン、アミロライド)と共存させた結果、ゲニステインと共存させた場合に遺伝子発現効果が有意に低下した。これらの結果より、PRT複合体はカベオラ介在性のエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれることが示唆された。一方、PRT複合体は低用量では細胞毒性を示さなかったが、高用量ではわずかな細胞毒性を示した。そこで、PRT複合体にアニオン性医薬品を被膜した三重複合体の調製を試みた。アニオン性医薬品として、コンドロイチン硫酸ナトリウム注射液(CS)、ヒアルロン酸点眼液(HA)、および強力ネオミノファーゲンC(GL)を用いて、三重複合体を調製した結果、GLでは凝集して複合体を構築できなかったが、CSおよびHAでは三重複合体を構築できた。また、予備的検討ではあるが、三重複合体は高用量でも細胞毒性を示さなかった。以上のように、我々は本年度の研究によって、硫酸プロタミン静注用を構成成分とする遺伝子ベクターの開発に成功した。来年度は、CSおよびHAを被膜した三重複合体の有効性や安全性を詳細に評価する予定である。昨年度までに硫酸プロタミン静注用(PRT)を構成成分とする遺伝子ベクター(pDNA-PRT複合体:PRT複合体)の開発に成功し、in vitroにおける有効性を確認した。本年度は高用量でわずかに認められたPRT複合体の細胞毒性を軽減するために、アニオン性医薬品であるコンドロイチン硫酸ナトリウム注射液(CS)でPRT複合体を被膜した三重複合体(pDNA-PRT-CS複合体:CS複合体)を調製し、有効性および安全性を評価した。作製したCS複合体はin vitroにおいて、PRT複合体にはやや劣るものの1×107 (RLU/mg protein)を超える高い遺伝子発現を示した。また、各種エンドサイトーシス阻害剤(クロルプロマジン、ゲニステイン、アミロライド)と共存させた結果、クロルプロマジンおよびゲニステインと共存させた場合に遺伝子発現効果が低下する傾向にあった。これらの結果より、CS複合体はクラスリン介在性およびカベオラ介在性のエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれることが示唆された。また、血清存在下での遺伝子発現を検討した結果、PRT複合体では遺伝子発現の低下が認められたが、CS複合体では高い遺伝子発現を維持した。さらに、CS複合体はPRT複合体で細胞毒性が認められた用量においても、毒性を示さず、高い安全性が示された。以上のように、我々は本年度の研究によって、硫酸プロタミン静注用およびコンドロイチン硫酸ナトリウム注射液を構成成分とする遺伝子ベクターの開発に成功した。来年度は、in vivoにおける有効性および安全性評価、およびsmall interfering RNA (siRNA)への応用を試みる予定である。当初予定していた平成27年度の研究実施計画をほぼ達成しているため、概ね順調に進展していると評価した。昨年度までに硫酸プロタミン静注用(PRT)およびコンドロイチン硫酸ナトリウム注射液(CS)を構成成分とする遺伝子ベクター(pDNA-PRT-CS複合体:CS複合体)の開発に成功し、in vitroにおける有効性を確認した。本年度はCS複合体のin vivoにおける有効性および安全性評価、およびsmall interfering RNA (siRNA)への応用を試みた。モデル核酸としてホタルルシフェラーゼをコードしたpCMV-Lucよりもルシフェラーゼの発現が高いpDNAであるNanoLucを用いた。NanoLucと硫酸プロタミン静注用で構築したPRT複合体をマウスに静脈内投与した結果、肝臓、脾臓、肺で高い遺伝子発現を示した。一方、CS複合体を静脈内投与後は、脾臓において選択的に高い遺伝子発現を示した。また、PRT複合体、CS複合体を赤血球と混和させた結果、PRT複合体は凝集を引き起こしたが、CS複合体は凝集しなかった。ルシフェラーゼを抑制するsiRNAに硫酸プロタミン静注用を様々な比率で添加し、siRNA-PRT複合体を構築した。

さらに、siRNA-PRT複合体にコンドロイチン硫酸ナトリウム注射液を加えて、siRNA-PRT-CS複合体を調製した。これらの複合体は100 nm程度の安定なアニオン性微粒子を形成した。これらの複合体を、ルシフェラーゼを恒常発現させたメラノーマ細胞株B16-F10/Luc細胞に添加し、遺伝子抑制効果を評価したが、十分な抑制効果が得られなかった。現在、複合体の改良を行っているところである。医療用医薬品を用いた遺伝子ベクター開発を行った。医薬品はプロタミン硫酸塩静注(PRT)、コンドロイチン硫酸注射液(CS)、強力ネオミノファーゲンC、ヒアルロン酸点眼液を用いた。pDNAと医薬品の組み合わせを検討した結果、混合比と調製手順を最適化することでpDNA-PRT複合体(PRT複合体)、pDNA-PRT-CS複合体(CS複合体)を構築できた。両複合体はともに高い遺伝子発現を示した。PRT複合体は細胞毒性を示したが、CS複合体では毒性が見られなかった。PRT複合体は血清存在下で遺伝子発現が低下したが、CS複合体は影響を受けなかった。CS複合体は静脈内投与後、脾臓で高い遺伝子発現を示した。当初予定していた平成26年度の研究実施計画をほぼ達成しているため、概ね順調に進展していると評価した。平成28年度も当初予定していた研究計画に従い研究を推進する。医療薬剤学平成27年度も当初予定していた研究計画に従い研究を推進する。キャンペーン期間に購入するなどして研究費を効率的に使用した。平成28年度に配分される研究費については、消耗品および旅費として使用する予定である。また、平成27年度の繰越は消耗品に補填する。平成27年度に配分される研究費については、消耗品および旅費として使用する予定である。また、平成26年度の繰越は消耗品費に補填する。
都市縮減社会における住居系市街地のリスケーリング型整備手法の適用に関する研究

本研究の目的は人口や経済の規模が縮小する「都市縮減社会」の住居系市街地で生じる遊休空間(低未利用の土地・建物)、ならびに既存の地域自治組織を合わせて再編する「リスケーリング型整備手法」の制度設計と適用可能性検討を行うことにある。三つ設定した各年度の研究課題の内、平成30年度は「研究課題(3)地域自治組織を市街地整備の主体とする組織的再構築(リストラクチャリング)」を扱い、六つあるステップの5・6の研究を実施した。ステップ5:都市縮減社会におけるリスケーリング型整備手法の制度設計...リスケーリング型整備手法の制度設計、制度の適用可能性検討を行うための事例研究を進めた。具体的には1市街化区域縁辺部を念頭に、埼玉県の「旧暫定逆線引き地区」の現状を知ることから、低未利用の土地・建物を漸進的に市街地整備の俎上に載せる際の課題検討を進めた。2空洞化する都市中心部に近接する住居系市街地として、東京都の「不燃化特区」を事例に宅地の交換・分合による市街地整備の可能性を考察した。3郊外住宅団地である福島市蓬莱団地を事例とした遊休空間としての空き家問題の発生に関する調査を行い、その解決に望まれる地域自治組織のあり方を検討した。ステップ6:都市縮減社会におけるリスケーリング型整備手法の適用可能性検討...一連の研究結果をまとめた。旧暫定逆線引き地区では区画整理に替わる地区計画による権利操作が進まず、低未利用地の活用に至っていない。不燃化特区では公的住宅の導入など行政の介入が相当必要であり、公費負担などの改善の仕組みが必要である。郊外住宅団地では高齢化による地域自治組織の機能低下が進み、再編自体、困難になっている。本研究では特に旧暫定逆線引き地区を中心事例とし、追加の自治体調査や所沢市における事例研究を進め、宅地の交換・分合を図る手法、それを支える地域自治組織のあり方を検討した。本研究の目的は、人口や経済の規模が縮小する「都市縮減社会」の住居系市街地で生じる遊休空間(低未利用の土地・建物)、ならびに、既存の地域自治組織(町内会、自治会、まちづくり協議会等)を合わせて再編する「リスケーリング型整備手法」の制度設計と適用可能性検討を行うことである。この目的に対し、本研究は三つの研究課題を設定し、各年度一つずつ検討する。さらに各年度を半期(ステップ)に分け6段階で研究を行う。平成28年度は「研究課題(1)遊休空間の交換・分合による地区・街区の適正規模化(シュリンク)」を扱い、以下に示すステップ1・2の研究を実施した。ステップ1:都市縮減社会におけるリスケーリング型整備手法の基本設計と研究のフレームの確定...本研究の背景となる人口や経済の規模縮小という状況に関する既存の研究や統計を収集・検討した。そして、収集した文献や資料の読み込み、統計の整理や加工を実施した。ステップ2:遊休空間の交換・分合による地区・街区の再編事例の収集・検討...大きく以下の4点の研究を進めた。まず住居系市街地における空間の動態把握のため、1埼玉県を事例に都市圏分類を行い、まず20km圏内に位置する川口市芝地区における土地区画整理事業未着手の実態把握とそれに替わる地区・街区再編の可能性検討を実施した。2次に人口減少局面の境界にある埼玉県3040km圏に位置する上尾市上平第二地区における、まちづくり条例を活用した地区・街区再編の可能性検討を実施した。3関連して福島市医王寺前駅周辺地区を事例に、遊休空間が粗放化する実態について検討を進めた。4並行して、既存の地域自治組織の再編状況を把握するため、全国136自治体を対象とした調査票調査を実施、130件(95.6%)から有効回答を得た。5具体的な地域自治組織の活動状況・課題を把握するため、福島市蓬莱団地を事例とした現地調査を行った。研究実績の概要に示したとおり、平成28年度はステップ1・2の研究を実施した。ステップ1に関しては当期のみで完結する内容ではなく、引き続き既存の研究や統計を収集・検討し、熟考を重ねていく必要がある。したがって継続課題であり、現状において可能な情報収集はなされているという観点から、「おおむね順調に進展している」と評価した。ステップ2に関してはシュリンク+ブリッジ両面での遊休空間の交換・分合事例の収集・検討を行うとともに、その過程で地域自治組織が果たした役割に関する検討を行うことが主たる内容であった。この内容に対して、前者については人口や経済の規模の変動を把握するため、首都圏からの距離による都市圏分類の実施を試みることとし、埼玉県を対象とした検討を進めた。これにより川口市と上尾市での事例研究を進めることができた。また、所属研究機関の近隣にあって詳細な検討が行いやすいことから、福島市での遊休空間の粗放化に関する実態の検討も進めることができた。後者については地域自治組織の再編をめぐって全国規模での調査票調査を実施することができた。そして、同様に近隣にある事例として福島市での現地調査、実態把握を進めることもできた。以上のように特にステップ2に関しては研究発表も含めて、進捗を図ることができたことから「おおむね順調に進展している」と評価した。しかし、ステップ2で設定していた二つの検討内容の融合は今後の課題である。

また、遊休空間の交換・分合事例の検討に関して川口市及び福島市での事例研究は研究発表を行ったが、上尾市での事例研究は平成29年度に持ち越した課題である。また、地域自治組織の再編に関する検討についても福島市での事例研究は研究発表を行ったが、全国規模での調査については平成29年度に発表の機会を設けたいと考えている。本研究の目的は人口や経済の規模が縮小する「都市縮減社会」の住居系市街地で生じる遊休空間(低未利用の土地・建物)、ならびに既存の地域自治組織を合わせて再編する「リスケーリング型整備手法」の制度設計と適用可能性検討を行うことにある。このため三つの研究課題を設定し、各年度一つずつ検討する。各年度は半期(ステップ)に分け6段階で研究を行う。平成29年度は「研究課題(2)地区・街区を架橋する土地・建物の交換・分合の可能性検討(ブリッジ)」を扱い、ステップ3・4の研究を実施した。ステップ3:遊休空間の交換・分合による地区・街区の適正規模化の事例検討...遊休空間を再編することから、地区・街区の適正規模化ないし機能更新にとりくむ事例を抽出、検討した。具体的には1人口減少局面の境界にある首都圏3040km圏に位置する上尾市上平第二地区におけるまちづくり条例を活用した地区・街区再編の可能性検討、2全国の地域自治組織の再編状況をふまえ、合併により生活課題の解決を図る長野市若槻団地の事例検討、3福島市蓬莱団地を事例とした地域自治組織再編の検討や遊休空間の把握、を進めた。ステップ4:地区・街区を架橋する土地・建物の交換・分合の事例検討...地区・街区を架橋して行われた遊休空間の交換・分合をめぐり、その制度上の課題や整備上の効果について検討した。具体的にはステップ31の事例検討とともに、4同じ埼玉県における「暫定逆線引き地区」の現状を知ることから、低未利用の土地・建物を漸進的に市街地整備の俎上に載せる際の課題検討を進めた。また、5として東京都の「不燃化特区」を事例に、既成市街地の遊休空間や宅地の交換・分合による市街地整備の可能性について検討を進めた。以上の他、土地・建物の交換・分合の手法である土地区画整理事業や市街地再開発事業に関して猪苗代町、仙台市、広島市、板橋区等で情報収集を行った。研究実績の概要に示したとおり、平成29年度はステップ3・4の研究を実施した。ステップ1・2の研究から内容を継続し、発展的に進めることができたと考えている。まずステップ3・4に共通して、都市縮減社会という人口や経済の規模が縮小する状況を意識して研究を進めることができた。具体的には上尾市上平第二地区の事例検討を進めたが、人口減少局面の境界を特定するとともに、そこでの土地利用転換、特に相続を契機とした低未利用の土地・建物の変動をつぶさに観察することができた。並行して、まちづくり条例に基づくまちづくり協議会が主体となって地区・街区の課題を改善していく様子を検討することもできた。その成果は日本都市計画学会編集・発行『都市計画報告集』に論文として発表できた。また、ステップ4に入って同じ埼玉県の暫定逆線引き地区について調査を開始することができた。ただし、その自治体を横断した調査や詳細な事例検討は平成30年度に引き続き行っていく予定である。そして、既存の地域自治組織の再編に関しては、ステップ2で実施した全国136自治体を対象として130自治体から有効回答を得た調査票調査に基づいて研究を進行できた。
18～19世紀エクフラシスの歴史的・理論的考察

エクフラシスとは、芸術作品などの言葉による「鮮やかな描写」のことである。ギリシャ・ローマに端を発するこのジャンルに属する作品を歴史的に辿り、イギリス・ロマン主義時代のエクフラシス作品を具体的に分析した。作品描写に与える王立美術院(1768)等の政治的影響も考察した。考察対象をさらに拡げ、ロバート・フック著『ミクログラフィア』(1665)の顕微鏡的表象とくに顕微鏡観察記録というテクストは、エクフラシスとして捉えなおすことができると示唆した。平成19年度は以下の作業を行った。(1)姉妹芸術およびエクフラシス関連の文献を読んだ。(b)上記エクフラシスの対象となった絵画作品や彫刻などの画像を可能な限り入手した。他の図像・図版(銅版画ほか)も可能なかぎり入手し、エクフラシスとの関係を解読した。(c)王立美術院、芸術家協会、芸術/技術振興協会、ディレッタント協会関連の文献、とくに王立美術院批判、1819世紀の美術制度、当時のイングランドの芸術の現状、パトロン、政治と美術制度などに関わる文献を幅広く渉猟し、姉妹芸術、エクフラシスの観点から読み解く作業を続けた。(d)王立美術院、芸術家協会、芸術/技術振興協会等、18世紀19世紀の美術に関わる協会の展示美術カタログを可能な限り収集し、また絵画評などは、当時の新聞・雑誌やパンフレットに博捜しこれを収集し解読した。(e)イギリスへ資料収集に出かけ文献の充実を計り、また関連学会に出席することで知見を広めまた情報交換をした。(2)エクフラシス関連の研究書や論文、関連ジャーナルを数多く入手し精読した。(3)入手したデータや分析した結果を主題・項目ごとにまとめ、必要に応じてコンピュータ入力した。平成20年度も昨年度に引き続き、以下の作業を行った。(b)王立美術院、芸術家協会、芸術/技術振興協会,ディレッタント協会関連の文献、王立美術院批判、1819世紀の美術制度、イングランドの芸術の現状、パトロン、政治と美術制度、美術館(博物館)などに関わる文献を幅広く渉猟し、姉妹芸術、エクフラシスの観点から読み解いた。(2)エクフラシス関連の研究書や論文、関連ジャーナルを数多く入手し精読する。(4)本研究課題に関連する論文を書いた。エクフラシスの対象となった絵画作品や彫刻などを可能な限り多数の画像を入手した。王立美術院、芸術家協会、芸術/技術振興協会,ディレッタント協会(Dilettanti Society)関連の文献、とくに王立美術院批判、1819世紀の美術制度、イングランドの芸術の現状、パトロン、政治と美術制度などに関わる文献を幅広く渉猟し、姉妹芸術、エクフラシスの観点から読み解いた。
翻訳後修飾を基盤とする新規の時計振動体の探索

転写・翻訳を介した概日時計の分子発振が約24時間という長い周期を安定に維持するためには、時計タンパク質のリン酸化などによる翻訳後制御が重要な役割を担うことが知られている。本研究においては、1)細胞への物理化学ストレスや2)セカンド・メッセンジャーとしての活性酸素種シグナルがキナーゼシグナルに変換される過程を経て、概日時計を制御する機構の解明を目指す。1)昨年度までに、培養細胞への高浸透圧刺激が時計遺伝子Dec1, Dec2およびE4bp4を急速に転写誘導して細胞時計をリセットすることを見出した。本年度はこのリセットシグナリング経路の全貌に迫るために、時計機構とストレス応答の間を共役する因子としてストレス応答性MAPKKKであるASK (Apoptosis Signal-regulating Kinase)ファミリーに着目した。培養細胞におけるASKシグナルを活性化させると細胞の転写リズムの振幅が顕著に減弱した。また、ASKシグナル活性を阻害した場合、時計の発振速度にはほぼ影響がみられないが、ストレス刺激により細胞時計の位相シフト幅が減弱した。2)レドックス環境に応答する新規の蛍光プローブセンサーを培養細胞に発現させると、その蛍光強度(FRET)を測定することにより細胞内レドックス環境を可視化できる。昨年度に確立したこの実験系により、カタラーゼ阻害剤の投与が細胞内環境を酸化的に傾けることを確認した。続いて、細胞時計の同調後、様々な時刻にFRET ratioを解析することによりレドックス環境が日周変動する傾向を見出した。さらに、このプローブを培養細胞だけでなく生体組織に対して導入するため、アデノ随伴ウイルス発現ベクターを用いた遺伝子導入法を採用し、哺乳類の時計中枢であるマウス視交叉上核の組織切片に対してプローブセンサーを発現させることに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究においては、細胞への物理化学ストレスやセカンド・メッセンジャーとしての活性酸素種(ROS)シグナルがキナーゼシグナルへと変換され、概日時計を制御する機構の解明を目指す。細胞外ストレスの一つである高浸透圧刺激を培養細胞に与えると、細胞時計がリセットする。そこで、浸透圧刺激による時計リセットの入力作用点を探るべく、高浸透圧刺激に対する一群の時計遺伝子の応答プロファイルをqRT-PCR法によって解析した。その結果、培養細胞への高浸透圧刺激に応答して時計遺伝子Dec1/2およびE4bp4が30分以内に転写誘導されることを見出した。ここで刺激時間を60分、120分と延ばした場合、高浸透圧中ではこれらの遺伝子応答は観察されなかったが、浸透圧を元に戻すと30分以内には転写誘導が観察された。つまり、時計のリセットは高浸透圧刺激というよりもむしろ浸透圧の変化が引金となる可能性が示唆された。一方、細胎内のレドックス環境の変化が概日時計に与える影響についても研究を進めた。マウス組織や培養細胞を非還元SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析に供することにより、検出されるバンド易動度の違いからPrxの酸化状態を検出する実験条件を決定した。この条件において様々な時刻に回収したマウス肝臓および培養細胞由来のPrxを検出したところ、その酸化還元状態が時刻依存的に変動する様子が観察された。さらに、細胞内の総和的・生理的なレドックスステータスに応答するFRETプローブセンサーを一過的にマウス培養細胞に発現させ、FRET ratioを測定することにより、細胞内レドックスステータスを検出する実験系を確立した。

交付申請書に記載したとおり、浸透圧ストレス刺激が細胞時計をリセットすること、またその際に転写誘導される一群の時計遺伝子を同定した。また、細胞内ストレス環境を測定する実験系を複数構築した。浸透圧刺激によって転写誘導される種々の時計遺伝子についてノックダウン・ノックアウトを行い、高浸透圧刺激時の時計リセットの有無を検証する。また、浸透圧刺激によって活性化する生理的なキナーゼシグナルの同定を通して、新規の時計入力経路を探索する。細胞内レドックス環境を測定する実験系を応用することにより、細胞内レドックスステータスの日周変動の有無を調べる。また、網羅的RNAi実験と組み合わせることにより、レドックスの変動リズムと転写リズムの間の共役メカニズムや、共役を媒介する分子を探索する。
植物の「香り受容体」の同定とその膜トポロジー解析

花(植物)も鼻(『香り受容体』)があって,においを嗅いでいる。われわれは,プロテオミクスの手法を駆使することによって,『香り受容体』に関わっている蛋白質の相互作用の可能性をすべて網羅的に洗い出し,それを基に蛋白質ネットワークを解析した。われわれは『香り受容体』と相互作用する蛋白質群のネットワークを網羅的に解析し,現象を蛋白質ネットワークとして理解することで,発見した『香り受容体』の真の生理的・生化学的意義を明らかにした。次に,植物の細胞膜を透過した香りの成分がどのように変換されて行くのかを,プレゴンを例に解析した。その結果,プレゴン還元酵素の立体特異性はその酵素だけで決まっているわけではなく,細胞内の他のタンパク質との相互作用によって決定することが明らかになった。さらに,香り受容体などの中には,細胞膜とα-ヘリックスで結合しているものがあり,その結合様式に関して検討した。細胞膜へもぐりこんでいるペプチドを切り出し,膜とのトポロジーを質量分析と化学修飾法を用いて決定した結果,1)このようなペプチドは膜を貫通していること,2)ペプチドは膜内で上下にゆらいでいること,が明らかになった。この上下にゆらいでいる速度は分オーダーの速度であり,その活性化エネルギーはリポソーム膜からリン脂質1分子が引き抜かれるときの活性化エネルギー(約70kJ/mol)に近い値であった。植物は香る。一般にその香りは、昆虫など動物に対するシグナルであると考えられてきた。しかし植物は自らの香りによって、アポトーシスを引き起こす。この事実は植物自身が香りの受容体(鼻)を持っていることに他ならない。本研究では,植物の香りのうちモノテルペノイドを取り上げ、その受容機構を1)『香り受容体』を単離・同定し、2)『香り受容体』の生体膜上のトポロジー解析を行う。また、3)『香り受容体』から香りが細胞内ヘシグナルとなって伝達する機構を解明し、4)もし、植物の『香り受容体』が働かない(植物の『鼻』がつまったら)植物にとってどのような不都合が生じるかについて調べる。1)および2)については『香り受容体』を植物の細胞膜から単離・精製し,これをMALDI-TOF型の質量分析装置により構造解析を行なった。その結果,『香り受容体』はABCトランスポータータンパク質である可能性が高いことが明らかになった。3)については、『香り受容体』と相互作用する蛋白質をクロスリンカーを用いて共有結合させた後、結合蛋白質をプロテオームの手法を用いて網羅的に解析した。その結果,5種類の『香り受容体』と結合するタンパク質が得られた。現在,クロスリンカーの濃度を変えて,『香り受容体』との結合が特異的であるのかどうかを明らかにしている。シロイヌナズナ培養細胞よりプロトプラストを調製し,これにカルボキシル基のグリシンアミド化およびアミノ基のアセチル化を行った。化学修飾の後,プロトプラストから蛋白質画分を調製する。これを(1)で作成した抗体を結合させた抗体カラムに通し,化学修飾を受けた受容体をアフィニティー精製した。抗体カラムはあらかじめ担体の表面をp-トルエンスルフォニルクロライドで活性化したビーズに(1)で調製した抗体を結合させることにより作成した。得られた修飾受容体をトリプシン消化の後,MALDI-TOF MSで測定した。受容体は一般に細胞内でも原形質液と接触している。この領域を明らかにするために,プロトプラスト化させた細胞の細胞膜に(ペプチド)試薬(特許との関係により非公開)で穴を開け,これを低温下,超音波処理をすることによって,細胞膜のクラスタ構造を壊さないように「ソフトに」展開した。

これを上記と同様な方法で化学修飾すると,細胞膜の内と外で水系に露出している部分の情報を得ることができる。この結果と上記の膜処理していない細胞で得られた結果とを比較することによって,受容体が細胞内で原形質液内に露出している部分の情報を得た。