hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経栄養因子を模倣する食品成分の探索研究

先に当研究グループによって,ラット胎仔海馬の初代培養神経細胞において神経突起伸展促進作用を有することを報告しているカテキン類について,経口摂取後,実際に脳内に活性成分が移行するかを検討した。Catechinをラットに経口投与後,脳ではCatechinそのものは検出されなかったが,その代謝物である3'-O-Methylcatechinが検出された。このことから, Catechinは生体内で代謝変換されて活性を示す可能性が示唆された。脳神経賦活作用については,従来からPC12細胞を使用したスクリーニング法がよく知られており,PC12細胞はNGFなどの神経栄養因子により神経細胞様に分化し,神経分化,突起伸展のモデルとしてよく使用されている.しかし本研究では脳内で記憶を司る領域として重要な海馬の神経細胞を培養し,被験サンプルを添加した後,神経細胞の突起伸展の比較を行い,脳神経賦活作用物質探索のスクリーニング試験を行うことを特徴としている.先行研究において,in vitro実験系による海馬神経細胞の神経突起伸展活性試験を行った結果,コーヒーやリンゴなどに主成分であるChlorogenic acidやその代謝物のm-Coumaric acidなどのポリフェノール類に神経突起伸展活性を有することを見出している.本研究では,さらに食品成分を中心として広く当研究室保有の化合物ライブラリーから海馬神経突起伸展活性成分探索を行った.その結果,3,6'-Di-0-sinapoylsucroseおよび2-C-[β-D-Apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-1,3,6-trihydroxy-7-methoxyxanthoneにコントロールと比較して有意な突起伸展活性が認められた.さらに関連化合物として,4-Methoxycinnamic acidにも顕著な突起伸展活性が見られ,その活性は先行研究により見出した活性成分のChlorogenic acidよりも顕著なものであった.今回見出した活性化合物の中でも,2-0-[β-D-Apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-1,3,6-trihydroxy-7-methoxyxanthoneのようなキサントン誘導体は,サプリメントのセントジョーンズワートやマンゴスチンなどの果実が属するオトギリソウ科植物,血糖値の上昇を穏やかにする健康茶として飲用されているサラシア属植物などに含まれることから,これら食品素材の機能性開発に期待できる基礎データが提供できた.さらに既に神経突起伸展作用を有することを見出しているCatechinをラットに経口投与し,Catechinの最高血中濃度に達する1時間後に,脳を摘出,メタノールでホモジナイズを行い,その抽出液について,各種HPLC分析法により,Catechinおよびその代謝物であるMono-O-methylcatechin類の脳内移行率の算出を検討している.近年,高齢化社会が急速に進むに伴い,アルツハイマー病をはじめとする認知症の脳神経疾患の罹患者も増加の一途を辿っているが,現在その治療法又は予防法の開発が待たれている.先に,脳神経賦活作用を有する天然物の探索研究の一環として,ポリフェノール成分のカテキン類やキサントン類,さらにはChlorogenic acidおよびその生体内代謝産物のm-Coumaric acidなどが,ラット胎仔海馬の初代培養神経細胞を用いた神経突起伸展作用を有することを見出し,報告している.本年度は,神経突起伸展作用を示したポリフェノール類が,経口投与後に脳内に移行するかを評価するために,活性成分の中でもCatgchin投与後の脳内移行に関する基礎的検討を行った.SD系雄性ラットにCatechinを経口投与し,1,3,6,12時間後に全採血を行い,続いて全脳を摘出した.摘出した脳はメタノールでホモジナイズを行い,β-glucuronidaseおよびsulfatase処理後,酢酸エチルにより抽出し,分析サンプルとした.得られた血漿および脳サンプルは,HPLC-ESI-MS/MSにより分析を行った.その結果,投与後1時間から,血漿中にはCatechinおよびその生体内代謝産物である3'-0-Methylcatechinが検出され,ラットにおいてCatechinは,経口投与後,吸収されて,その生体内代謝物産物の3'-0-Methylcatechinと共に血中に存在することが明らかとなった.一方,脳ではいずれの時間においてもCatechinの存在は確認できなかったが,投与後1時間において,3'-0-Methyl-catechinが検出されたことから,Catechinの脳神経賦活作用においては,その生体内代謝産物も含めた活性評価を行う必要性が示された.さらにキサントン誘導体高含有のマンゴスチンに着目し,脳神経賦活作用を有する更なる天然物を探索する目的で成分研究を行った.マンゴスチンのメタノールエキスを各種カラムクロマトグラフィーにより分離,精製を行い,2種の化合物を単離し,それぞれNMRおよびMSスペクトルの解析結果からα-Mangostinおよびγ-Mangostinと同定した.脳神経賦活作用などの各種活性試験に供試できるキサントン化合物を得ることができた.

脳神経賦活作用を有する天然物の探索研究の一環として,先にポリフェノール成分のカテキン類やキサントン類などが,ラット胎仔海馬の初代培養神経細胞を用いた神経突起伸展作用を有することを見出し,報告している。さらに本研究では,神経突起伸展作用を示したカテキン類が,経口投与後に脳内に移行するかを評価するために,活性成分の中でもCatechin投与後の脳内移行に関する基礎的検討を行い,脳内に3'-0-Methylcatechinが存在することを示唆するデータを得た。さらの摘出脳の抽出方法について再検討した結果,従来の固相抽出法よりも溶媒抽出法の方が,感度良く分析できることが判明したため,Catechinの経口投与後の脳内移行について,後者の抽出法によるHPLC-ESI-MS/MS法の再検討を行った。その結果,経口摂取されたCatechinは,血中では未変化体のCatechinとともに,3'-0-Methylcatechinが血中に存在することが明らかとなった。さらに脳内においては3'-0-Methylcatechinのみが検出された。従って,Catechin経口摂取後に,代謝物のみが脳内に移行することが明らかになったことから,脳神経賦活作用においては,その生体内代謝産物も含めた活性評価を行う必要性が示された。一方,脳神経突起伸展作用を示したキサントン誘導体を多く含むマンゴスチンのキサントン誘導体について活性評価を行うために,昨年度に続き,マンゴスチンのメタノールエキスについて各種カラムクロマトグラフィーにより分離,精製を行い,さらに3種の既知キサントン誘導体などを単離し,それぞれNMRおよびMSスペクトルの解析結果から同定した。単離した化合物については,今後脳神経賦活作用などの各種活性試験を行う予定である。
デザイン型超強酸の開発とその触媒的応用および新規機能性材料への展開

当研究室ではすでに新規ブレンステッド超強酸、ペンタフルオロフェニルビス(トリフリル)メタン(C_6F_5CHTf_2)の開発に成功している。また、このブレンステッド超強酸が様々な求核剤に対してパラ位特異的に求核置換反応することを見い出し、それを利用して固体担持型ブレンステッド酸や、フルオラス超強酸触媒の開発に成功した。さらに、求核剤としてジオールから容易に調製できるジアルコキシアニオンやアリールジブロミドから調製できるアリールジアニオンを用いることによって、1分子中に活性プロトンを2つ持つ二塩基酸が合成できた。さらには、ペンタフルオロフェニルビス(トリフリル)メタンの合成法は様々なアリールビス(トリフリル)メタンの一般的かつ有用な合成法であることが分かった。また、アリールビス(トリフリル)メタンだけでなくアルキルビス(トリフリル)メタンの合成も可能である。この合成法を利用してキラルブレンステッド酸の合成とその触媒としての評価を試みた。キラルテンプレートにはビナフチル骨格を選択し、出発原料に市販の(R)-ビナフトールを用いて2位にビストリフリルメチル基を持ち、2'位に水酸基、メトキシ基、メチル基をもつ3種類の新規キラルブレンステッド酸を合成した。これらを触媒に用いてベンズアルデヒドから誘導されるアルジミンとケテンシリルアセタールとの不斉マンニッヒ反応を試した。その結果、触媒の2'位の置換基によって反応性に差が見られ水酸基の場合に最も高い活性を示した。これは、ビストリフリルメチル基の酸性プロトンと水酸基の相互作用により酸性度が高められた結果であると考えられる。アルジミンの窒素上の置換基を検討した結果、ジフェニルメチル基の場合に中程度のエナンチオ選択性を与えた。しかし、化学収率が低かった。そこで、様々な添加剤を検討した結果、t-ブタノールを加えることによりエナンチオ選択性を損なうことなく良好な化学収率で目的の生成物を得ることができた。以上、アリールビス(トリフリル)メタンの一般的な合成法を開発したことによりブレンステッド酸の精密設計が可能になった。
スポーツ選手における椎間板変性と遺伝的要因との関連性

我々は大学スポーツ選手を対象として椎間板変性の原因遺伝子を調査するとともに、腰部器質的変化と腰痛との関連性を検討した。その結果、特に大学体操競技選手においてCOL11A1遺伝子は腰部器質的変化の一つである隅角解離の原因遺伝子となりうること、およびこの隅角解離を起点として椎間板変性を誘発する可能性を見出した。さらに体操競技選手において椎間板変性と腰痛発生との有意な関係を見出した。以上から遺伝的背景を起点とし、腰部器質的変化を介した腰痛発生のモデルを提示することができた。我々は500名以上のスポーツ選手を対象としてCILPおよびアスポリンの遺伝子多型が椎間板変性の発生に対する有意なリスクファクターであることを明らかにしてきた.特にこれらの遺伝子多型と椎間板変性の関係には性差が存在するということが特徴である.CILPおよびアスポリンはTGFbeta結合性の細胞外マトリクスであり,TGFbetaのシグナル伝達に関わるタンパク質は同様の傾向を示す可能性は高い.そこで我々は,TGFbeta signaling Pathwayに関わるタンパク質のSNPを中心に椎間板変性との関係を解析する,具体的には潜在型TGFβ結合タンパク質,デコリン,TGFbeta,TGFbeta受容体,SMADなどの中から,椎間板において発現の高いタンパク質およびすでに疾患などとの関連性の検討がなされているいくつかのSNPなどに焦点をあて解析を行う.解析を行う上では特に性差に着目する.本年度は大学スポーツ選手541名(男子358名,女子183名)を対象として,TGFbetaシグナル伝達経路において報告されている106箇所のSNP(Watanabe et al.J Hum Genet.2002)の中でTGFbeta1-5G/T(rs2241715)と椎間板変性発生との関連性の解析を行った,椎間板変性の有無はMRI画像によりPfillman分類によって判定した,ロジスティック回帰によりオッズ比を算出した.その結果,全対象者においてTGFbetal-5G/Tに関してGアレル保有者が椎間板変性発生のリスクが高い傾向が得られた(オッズ比1.27,1.0-1.6,P=0.056).ただし性差は確認されなかった.これらの結果はTGFbetaシグナル伝達経路が性差によらず椎間板変性に対して何らかの有意な相関関係を有することを示唆している.この結果を受けて今年度はさらにTGFbetaシグナル伝達の下流に位置するsmadタンパク質のSNP解析を行う予定である.本研究は腰痛の発生原因となりうる椎間板変性の発生に関して、その誘因となる遺伝的要因や身体特性を横断的に検討し、さらには腰部器質的変化と腰痛との関連性を明らかにすることを最終的な目標としている。X1型コラーゲンは軟骨組織特異的に存在するコラーゲンである。StickIer症候群は腰部軟骨など様々な部位に変異が観察されるが、X1型コラーゲンの変異がその主な原因とされている。本年度は特に体操競技選手において、腰部器質的変化とXI型コラーゲンα1鎖の遺伝子多型との関連性を検討した。対象は大学体操競技選手103名であった。MRIにより腰部器質的変化を同定した。口腔粘膜より採取した細胞を用いてDNAを抽出し、Taqmanプローブ法にてCOUIA1のSNP(rs167648)の有無を検出した。年齢、体重、BMI、性別、競技体操の経験年数、COUlA1遺伝子型などを独立変数とし、腰部器質的変化を従属変数としてロジスティック回帰をおこなった。その際腰部器質的変化を詳細に分類し、発生頻度の高かった椎間板変性、隅角解離、シュモール結節などを従属変数として解析を行った。椎間板変性、シュモール結節に関しては単回帰あるいはロジスティック回帰のいずれにおいても有意な独立変数を見出すことはできなかった。一方隅角解離においてCOLIlA1のSNPおよび年齢と競技年数が有意な独立変数として選択された。特に年齢と競技年数が有意な独立変数として選択されたことから、隅角解離の発生に関しては若年期における腰部へのストレスが原因として考えられた。それに加えて遺伝的な素地が加わることにより隅角解離発生を惹起する可能性が示唆された。本研究は腰痛の発生原因となりうる椎間板変性の発生に関して、その誘因となる遺伝的要因や身体特性を横断的に検討し、さらには腰部器質的変化と腰痛との関連性を明らかにすることを最終的な目標としている。我々はこれまでに椎間板変性と関連性の高い遺伝子多型としてCILP,ASPN遺伝子を報告し、特に体操選手における腰部器質的変化の一つである隅角解離とCOL11A1遺伝子多型との関連性を報告してきた。腰痛の発生要因としては環境要因,心理的要因,遺伝的要因など様々な因子が挙げられている.中嶋,中里(連携研究者)らのグループはこれまで大学柔道選手を対象として腰痛と椎間板変性の発生に関する検討を行ってきた.

その結果,大学柔道選手において椎間板変性は腰痛のリスクファクターでないことを報告した(J Orthop Sports Phys Ther, 2007).しかしながら我々は,大学体操競技選手104名を対象とし,。横断的研究にて椎間板変性を含む腰部器質的変化(8項目)と腰痛の関係を検討した.その結果,体操競技選手の約半数は腰痛を有していること,さらに椎間板変性以外にも多くの腰部器質的変化を有していることを確認した.そこでロジスティック回帰分析を行った結果,椎間板変性は腰痛の有意なリスクファクター(オッズ比=2.70,95%CI:1.10-6.66)であることを見出した(Int J Sports Med, 2013).以上の結果は各競技スポーツ種目によって腰痛の原因となる腰部の器質的変化(椎間板変性を含む)が異なる可能性を示唆しているこれまでに競技選手の腰部器質的変化に関するいくつかの原因遺伝子を抽出することができてり、おおむね予定通りの進行であると考えられる。また得られた成果は国際学術誌に受理されており、学術的な水準も保たれている。今年度はこれまで通り被験者の人数及び競技の種類を増やしてさらに多角的に腰部器質的疾患の原因を探っていく。これに加えて、腰部器質的変化と腰痛に関しても検討を進めていきたいと考えている。
家族形成過程と女性の就業中断に関する研究

家族の形成過程(結婚・出産)のありようは、妻・母親である女性個人の職業経歴の展開の規定要因として作用している。いわゆるM字型就業といわれる「中断再就職」パターンの職業経歴は、女性固有のものであり、また高度経済成長と呼応して一般化してきた。一方で近年わが国では「結婚退職」から「出産退職」へと職業経歴の中断スタイルに変化が生じていることも指摘されている。本研究は、ライフコースの視点から、家族の形成過程と女性の職業経歴の展開の過程を実証的に考察するものである。家族役割と職業役割の移行にみられる共時性に着目し、確率論的にそのメカニズムを説明することを目的とする。4種の調査研究データ(「昭和期を生きた人びと」データ、「成人前期の役割移行調査」データ、「がらだ・こころ・つながりの発達研究」データ、「サラリーマンの仕事と家庭」データ)から1914-71年出生コーホート女性のイベントヒストリーデータを再構成し、イベントヒストリー分析を行った。具体的には、(1)移行の共時性は高度経済成長期以降、強化した(出生コーホート間比較)、(2)移行の共時性の方向性は、家族役割移行から職業役割移行へと作用する(家族役割の経過時間と職業中断の発生率の関連性-半マルコフ仮説)、(3)移行の共時性は、それ以前の個人の属性(状態)からの規定を受ける(マルコフ仮説)を検証した。研究成果は、研究成果報告書「家族形成過程と女性の就業中断に関する研究」において、(1)1914-71出生女性の職業キャリア・パターンのコーホート比較、(2)就業中断タイミングに関するイベントヒストリー分析の2部構成でまとめ、平成11年4月末刊行の予定である。本研究は、家族の形成過程(結婚・出産)のありようが、妻・母親である女性個人の職業経歴の展開の規定要因として、いかに作用しているかに関心がある。一方で近年わが国では、「結婚退職」から「出産退職」へと職業経歴の中断のスタイルに変化が生じていることも指摘されている。本研究は、ライフコース論の視点から、家族の形成過程と女性の職業経歴の展開の過程を実証的に考察するものである。家族役割と職業役割の移行にみられる共時性に着目し、確率論的にそのメカニズムを説明することを目的としている。本年度は出来事史データの作成作業を行った。4つのコ-ホ-ト調査研究データから、1914-71年出生コ-ホ-ト女性の出来事史データを作成したが、その際に、(1)調査研究間の変数の統制、(2)データ打ち切り処理、(3)出来事史(人一年)データの作成という手順を踏んだ。研究協力者ならびに業者への委託を経て、本年度中に完成の予定である。来年度はこの出来事史データをもとに、生存時間分析を中心とした確率論モデルの構築作業へ着手する予定である。
導波路型光ゲートを用いる超高速光信号処理

開発しようとするものは,タンタル酸リチウム(LiTaO_3:LT)基板上に集積された複数の導波路スイッチを中心とする光回路によって10ピコ秒を単位とするレーザパルスの波形観測を行うシステムである.その特徴は,対象とする波形が繰り返し波形でなく,孤立波形でもかまわない点にある.昭和61年度では, LT基板上に2次元導波路を形成する化学プロセスの開発に力を注ぎ,それを受けて昭和62年度には, LN基板上に線状の導波路を形成し,またそのパターンを制御すること,および制御電極の形成を試みた.この導波路はLT基板に銅を熱拡散して作成した.その利点は拡散温度が約600°CとLTのキュリー点より低く,全体の工程数が省けることにある.しかし実験の結果,単に表面から浸み込ませる形でCuを熱拡散しただけでは,出来上った導波路の屈折率分布が数週間のうちに変化し,使用に耐えなくなることが判明した.各種の試行の後,熱拡散の直前にガラス膜で保護すればこの現象があらわれないことを確認した.製作した導波路スイッチは全反射型のものであるが,動作試験の結果,一応のスイッチ機能は呈するものの,明瞭ではなかった.これは,導波路および制御電極のパターンの「きれ」が悪いこと,および端面の荒れに起因するものと想像され,フォトリソグラフィの空間分解能の向上が必要となった.開発しようとするものは,タンタル酸リチウム(LiTaO_3:LT)基板上に集積された複数の導波路スイッチを中心とする光回路によって10ピコ秒を単位とするレーザパルスの波形観測を行うシステムである.その特徴は,対象とする波形が繰り返し波形でなく,孤立波形でもかまわない点にある.昭和61年度では, LT基板上に2次元導波路を形成する化学プロセスの開発に力を注ぎ,それを受けて昭和62年度には, LN基板上に線状の導波路を形成し,またそのパターンを制御すること,および制御電極の形成を試みた.この導波路はLT基板に銅を熱拡散して作成した.その利点は拡散温度が約600°CとLTのキュリー点より低く,全体の工程数が省けることにある.しかし実験の結果,単に表面から浸み込ませる形でCuを熱拡散しただけでは,出来上った導波路の屈折率分布が数週間のうちに変化し,使用に耐えなくなることが判明した.各種の試行の後,熱拡散の直前にガラス膜で保護すればこの現象があらわれないことを確認した.製作した導波路スイッチは全反射型のものであるが,動作試験の結果,一応のスイッチ機能は呈するものの,明瞭ではなかった.これは,導波路および制御電極のパターンの「きれ」が悪いこと,および端面の荒れに起因するものと想像され,フォトリソグラフィの空間分解能の向上が必要となった.
有機溶媒可溶化と組み換え体を用いた酵素による有機化合物合成

L-乳酸脱水素酵素(LDH)は細胞内でピルビン酸をNADHにより還元して立体選択的にL-乳酸を生じる反応を触媒する。大腸菌にクローニングされたBifidobacterium longumと高度好熱菌Thermus aquaticus YT-1およびT.caldophilus GK-24のLDHの基質特性を調べ、B.longumのLDHがピルビン酸に対して特異性が高く、この基質のメチル基が他のアルキル基に置換している基質への触媒活性が低いこと、Thermus LDHは前者のLDHより長鎖2-ケト酸に対する活性が高いことを確かめた。次に、既に結晶解析により立体構造の明らかにされているB.longum LDHの基質結合部位に関係するアミノ酸残基をタンパク質モデリングプログラムを用いたコンピュータシュミレーションにより特定し、これらアミノ酸残基を組換えDNA技術を用いて置換した各種変異酵素を作成した。ピルビン酸および各種長鎖2-ケト酸に対するこれら酵素の活性を測定した。酵素の総合的活性指数としては触媒活性と親和性パラメーターの積であるK_<cat>/S_<0.5>を用いた2-ケトカプロン酸に対する活性を比較すると野生型酵素に較べて100ないし500倍高い活性を持つ変異酵素をえることが出来た。各種2-ケト酸の水に対する溶解度が低いため、有機溶媒での反応が可能なようにB.longum LDHを脂質修飾して有機溶媒に可溶化することを試みたが、この酵素の分子量が大きいことなどの理由で成功できなかった。そこで水と混和性のある各種有機溶媒中でのLDHの活性を調べたところ、有機溶媒の濃度を高めると活性が低下する場合もあるが、逆に数倍に増加することもあることを見出し、有機溶媒中での反応触媒が可能であることを示した。申請書に記載した11年度の計画のうち下記の成果が得られたA.L-乳酸脱水素酵素(LDH)による2ケト酸の2ヒドロキシ酸への立体選択的還元A-2.LDHの基質特異性の改変:我々がすでに立体構造を明らかにしたB.longumのLDHについては活性部位の構造の解析に基づき残基置換を行い、ピルビン酸よりも大きい基質に特異的な変異酵素を得ることが出来た。上記Thermus LDHの基質特異性と構造との関係を解析し、さらにより酵素を得ることが出来る見通しが得られた。A-3.LDHの有機溶媒耐性の検討:有機溶媒を加えた混合溶媒での各酵素の安定性を調べた結果、Thermus LDHは安定度が高く、低濃度の有機溶媒添加において活性のかなりの上昇が見られた。B.アクアライシンIおよび関連酵素を用いたペプチド合成アクアライシンIの同族酵素である脂質修飾ズブチリシンを用いて水を含まない有機溶媒中でのペプチド合成を行い、側鎖を保護せずにペプチド合成が行えることを確かめた。申請書に記載した12年度の計画のうち下記の成果が得られたA.L-乳酸脱水素酵素(LDH)による2ケト酸の2ヒドロキシ酸への立体選択的還元さらに、B.longumおよびのLDHのアロステリック性を軽減し、活性化物質フルクトース1,6-二リン酸無添加でも活性を示す変異酵素の取得に成功した。LDHを利用して連続的に2ケト酸から立体選択的に2ヒドロキシ酸を製造するバイオリアクターの構築へ向けての基礎的検討を試み、LDHをアミノセルロースに固定化した固定化酵素とアルコール脱水素酵素をアルデヒドセルロースに固定化した固定化酵素を用いて、補酵素を約400回転利用してピルビン酸を全てL-乳酸に還元する系の構築に成功した。
ニュートン法の重根に二次収束する初期値の構造とその応用

本研究の主題は、高次元ニュートン法における重根を、固定不定点として力学系の観点から調べることである。重根であるから、十分近い初期値を与えれば重根への収束が期待されるが、一方、不定点であるから、分母が消えるため、無限遠への爆発があるはずである。本研究によって、階数1の重根の近傍が3種類の部分集合に分かれ、重根に安定して収束する集合A,無限遠に爆発する集合B,重根に2次収束する集合Cが存在すること、そしてそれらの幾何学的構造が部分的に明らかとなった。今年度は、緩和パラメータつき2次元ニュートン法の重根のまわりの局所収束性について、とくに、重根に速く収束する初期値の集合の幾何学的構造に着目して研究した。緩和パラメータの設定は、力学系の摂動である。緩和パラメータを持たない場合、重根が階数1のニュートン法の力学系は超安定の方向を持ち、重根に2次収束する初期値の集合Cは、複素曲線とカントール集合との直積を原点でpinchしたものとして記述できる。緩和パラメータを持つ場合は、重根への2次収束は得られないが、1次収束ながら重根への収束が速い初期値の集合Cが存在する。緩和パラメータの設定により不定点が重根の近傍に存在するため、集合Cは多数のpinching pointを持つことがわかった。一般の2次元複素力学系の周期的不定点の場合についても、力学系を摂動した場合、安定多様体のカントール族の摂動が見られたが、今回の研究はその類似である。最後に、ジョージア工科大学K.Mischaikow教授を訪れて、成果発表を行い、今後の研究の発展の方向について議論した。二変数関数Fにおいて点(x,y)が重根であるとは、.まずF(x,y)=(0,0)であり、(x,y)におけるFの微分係数DFの階数が2よりも小さいときをいう。いま原点(x,y)=(0,0)が重根であって、階数が1の場合を考える。このときFの前後に線形写像を合成した関数のニュートン法は、もとのFのニュートン法と線形共役である。そこで線形な座標変換を施すことによりF(x,y)=(x+...,p(x,y)+...)としてよい。ただしP(x,y)はm次斉次式、m【greater than or equal】2である。さてこのニュートン法に緩和パラメータλをつけた場合を考える。このとき一定の条件の下で、緩和パラメータをつけない場合と同様に、重根に近い初期値は(A)ゆっくり安定に一次収束する初期値、(B)無限遠の近くにうつる初期値、(C)重根に比較的速い一次収束をする初期値、の3種類に分かれることを示した。(A)の初期値の収束の速さ(一次収束の係数)は1-λ/mであり、(C)の初顛値の収束の速さは1-入である。(C)の初期値は、重根とひとつの不定点を通るような曲線のカントール族である。(C)の初期値は緩和パラメータλについて連続に動き、λ=1の場合は、二次収束する初期値の集合と一致する。今年度は、高次元ニュートン法の具体例として全根同時反復解法を考え、その中で最も基本的な解法であるDurand-Kerner法について、従来知られている基本的な性質を、いわゆる収束解析の手法を使わずに数学解析および力学系の見地から再整理した。さらに、それらと同様の性質が、高次元チェビシェフ法の全根同時反復解法である田辺法についても成立つことを示した。すなわち、Durand-Kerner法が、根と係数の関係を表す連立方程式にNewton法を適用したものであるという認識から出発し、多変数の重根に対するNewton法の基本的な性質を整理することを通して、反復で不変なDochevの超平面の存在、重根に対する近似値のバランス収束ならびに近似値の重心の高次収束、Aberthの初期値の安定性を導いた。また、田辺法が連立方程式に対するChebyshev法であることを利用して、同様の議論を田辺法にも適用した。次に、バランス収束を持つ固定不定点として重根を力学的に特徴づけし、Durand-Kerner法(または田辺法)のアフィン共役性から多項式のアフィン同値が導かれることを示す。

緩和パラメータを持つ場合は、重根への2次収束は得られないが、1次収束ながら重根への収束が速い初期値の集合Cが存在する。緩和パラメータの設定により不定点が重根の近傍に存在するため、集合Cは多数のpinching pointを持つことがわかった。一般の2次元複素力学系の周期的不定点の場合についても、力学系を摂動した場合、安定多様体のカントール族の摂動が見られたが、今回の研究はその類似である。最後に、ジョージア工科大学K.Mischaikow教授を訪れて、成果発表を行い、今後の研究の発展の方向について議論した。
細胞治療を併用した新しい免疫寛容誘導法に関する基礎的研究

免疫抑制性細胞を誘導し、これを用いた新しい免疫抑制法を探求するための基礎的研究を行った。NF-κBやMAPKsを抑制しドナー抗原を添加して樹状細胞(DC)を体外誘導すると制御性DCが作成され、このDC投与により有効な免疫抑制作用が得られることが判明した。ドナーリンパ球輸注とNF-κB、MAPKsやAP-1/mTOR/p70S6Kの活性化阻害剤を併用すると強力な免疫抑制が得られ、生体内での制御性T細胞誘導作用も明らかとなった。ヒト末梢血単核球をCD80/86やCD40副刺激経路遮断下にアロ抗原と共培養すると、比較的抗原特異的な制御性T細胞が高率に誘導でき、その臨床応用が期待された。本研究では、自己由来のリンパ球をex vivoにて免疫抑制能を有する細胞へと誘導し、これを用いた細胞治療による新しい免疫抑制法を探求するため基礎的研究を遂行し、本年度は以下の成果が得られた。制御性樹状細胞(tDC)の誘導:マウス骨髄細胞よりGM-CSF下にアロ抗原ペプチドを添加してDCを誘導した。DCのex vivo誘導に際し、培地にNF-κB阻害剤DHMEQまたはMAPKs抑制剤NK026680を添加してDH-tDC、NK-tDCを誘導した。DH-tDCおよびNK-tDCは共に、コントロールDCに比し、TNFα刺激に対する表面抗原CD40, CD80, CD86, I-Ad発現やIL-12産生を有意に抑制し、直接及び間接認識でのT細胞増殖をともに有意に抑制した。更にマウスアロ心移植モデルにおいてコントロールDCを心移植1週間前にレシピエントマウスに投与するとグラフト生着期間が無治療より短縮したが、DH-tDCまたはNK-tDC投与によりグラフトは長期間生着し、これらtDCの有効性が示された。制御性T細胞(Treg)の誘導:マウス脾細胞をアロ抗原刺激し、DHMEQ、NK026680やAP-1/mTOR/p70S6K阻害剤DTCM-gultamideを添加したところ、CD4+CD25+ T細胞は抑制された。ヒト末梢血単核球をアロ抗原で刺激し抗CD80抗体+CD86抗体下に培養すると、CD4+CD25+Foxp3+, CD4+CD25+CTLA4+, CD4+CD127loFoxp3+などの制御性T細胞が高率に誘導され、これら誘導細胞を添加することにより、アロ抗原で刺激したT細胞増殖は細胞数依存性に抑制された。これは抗CD40抗体下に培養した場合にも同様の結果が得られ、これらの手法によりヒトリンパ球を用いて制御性T細胞が高率に誘導されることが判明した。本研究では、リンパ球を用いた細胞治療による新しい免疫抑制法を探求するための基礎的研究を遂行し、本年度は以下の成果が得られた。マウスにドナー由来のリンパ球を用いた細胞治療を行い、MAPKs阻害剤を同時期に投与することで、抗原特異的なCD4+CD25+Foxp3+ T細胞が生体内で高率に誘導され、移植心アログラフトの生着期間は著明に延長し、強力な免疫抑制作用が得られることが判明した。また、マウス心移植モデルにおいて既存免疫抑制剤の細胞治療に対する影響を検討した。ドナー由来リンパ球による細胞治療にNF-κB阻害を併用すると免疫寛容が誘導され移植心は長期生着したが、カルシニューリン阻害剤を細胞治療と同時に投与開始すると制御性T細胞の増殖は阻害され免疫寛容は誘導されなかった。一方、カルシニューリン阻害剤を心移植後に開始するとエフェクター細胞が有効に抑制され、より免疫寛容が効率に誘導されることが分かった。昨年度の研究で、ヒト末梢血単核球をアロ抗原で刺激し抗CD80抗体+CD86抗体下に培養すると、抗原に対し比較的特異的な抑制性リンパ球が誘導されることを示したが、本年度は、これら誘導細胞の中で免疫抑制作用を発揮している細胞を同定すべく研究を実施した。誘導リンパ球からCD3+ T細胞を除去すると免疫抑制能は完全に失われ、CD3+ T細胞の再添加で抑制能は復した。B細胞、単球、NK細胞や樹状細胞の除去では免疫抑制能は保たれた。T細胞の中でCD4+CD25+Foxp3+やCD127loFoxp3+細胞等のCTLA4を発現する制御性T細胞の他、IL-10産生性CD4+CD8+ T細胞が著増していた。これにより、抗CD 80抗体/抗CD

86抗体を用い誘導される免疫寛容誘導細胞はT細胞であり、機能分子としてCTLA4及びIL-10が関与している可能性が示された。臓器移植本年度は、マウス細胞を用いた免疫抑制性細胞の探索的な基礎研究を行った。主にDCやT細胞で免疫抑制能を有する細胞の誘導を試み、上述の研究成果が得られた。B細胞やマクロファージについては未着手だが、次年度開始を予定していたヒトリンパ球を用いた制御性細胞の誘導実験は開始し、一定の成果が既に得られた。また、平成26年度に使用を予定しているヒト化マウスモデル確立の為の基礎実験にも既に着手しており、総合的に判断し、研究目的を達成するにあたり概ね順調に進展しているものと考える。基本的には研究計画に従って研究を推進してゆく。即ち、昨年度は主にマウス細胞を用いた探索的基礎研究が中心であったが、平成26年度はヒト細胞を用いた基礎研究を行い、制御性細胞の誘導および本細胞を用いたin vivoでの検討、特にヒト化マウスを用いた検討を中心に研究を進める。B細胞やマクロファージについての検討を次年度に行うこととし、代わりに次年度開始を予定していたヒトリンパ球を用いた実験に着手したことから、約10万円の研究費の次年度使用額が生じた。繰越研究費は、予定していた実験を平成26年度初頭に行うために使用する。
チクングニア熱関節炎におけるC型レクチンの関与

チクングニアウイルス(CHIKV)は蚊によって媒介され、感染患者は関節炎を特徴とした発熱症状を示す。本研究では、CHIKVが細胞への吸着にC型レクチンを使用することを明らかにし、CHIKVは蚊と哺乳類との間でまわる感染の過程でウイルス膜蛋白質上に纏う糖鎖構造を変え、複数のレクチン発現細胞に効率よく感染する可能性を示した。また、CHIIKV感染により関節炎を発症するマウスモデルを確立し、炎症部位ではレクチン関連分子の遺伝子発現量が上昇することを明らかにした。この結果より、発現が増加したレクチン関連分子を介して炎症部位ではCHIKVの細胞への吸着効率が増加する可能性が考えられた。本研究では、チクングニアウイルス感染による関節炎の発症・増悪にC型レクチン介在性細胞侵入機構が関与するかどうかを明らかにする。2014年までに申請者らは39例のチクングニア熱輸入症例を確定診断し、9株のウイルス分離に成功した。複数の臨床分離株を用いて、樹状細胞、マクロファージに発現するC型レクチンであるDC-SIGN、肝臓、リンパ節の血管内皮細胞に発現するC型レクチンであるDC-SIGNR、LSECtinを発現させたJurkat細胞への感染効率を比較解析した。その結果、我々の保有する臨床分離株のうち、2004年以降にインド洋諸国を中心に流行した病原性が高いと考えられているウイルス株と系統学的に最も近縁な株がC型レクチンを介した細胞での侵入・増殖効率が高いことが示された。以上の点からC型レクチン介在性細胞侵入・増殖効率はチクングニアウイルスの病原性に関与する因子の1つである可能性が示唆された。レクチン介在性細胞侵入に関与するウイルス側の要因を明らかにするために、シンドビスウイルスベクターを利用した組換えチクングニアウイルス作出の系を構築に着手した。レクチン介在性細胞侵入に関与する宿主側の要因を明らかにするために、野生型およびIFNAR1ノックアウトマウスを用いたチクングニアウイルスの感染実験に着手した。チクングニアウイルス感染により起こる関節炎と類似の症状を呈す関節リウマチ患者の関節組織では、C型レクチンの発現量が増加し、病態形成にレクチンの発現が関与していることが報告されている。本研究では、チクングニアウイルス感染による関節炎とC型レクチンの関連について明らかにすることを目的に研究を実施している。今年度は野生型マウスを用いたチクングニアウイルス感染による関節炎発症マウスモデルの構築を試みた。しかし、我々の保有するウイルス株の下腿への皮下接種ではマウスは関節炎を発症しなかった。そこで、チクングニアウイルスに易感染性の免疫不全マウス(チクングニアウイルス感染により致死的症状を示すため、関節炎発症モデルとしては使用できない)または乳のみマウスでウイルスを継代することによりマウス順化チクングニアウイルスの作出を試みた。しかし、10継代後もマウス組織へのウイルスの順化は起こらなかった。また、複数の異なる系統のマウスを使用してチクングニアウイルス感染への感受性を調べたが、いずれのマウスにおいても関節炎を発症しなかった。そこで、チクングニアウイルスの関節炎発症マウスモデルを確立したオーストラリアQIMR Bergfuher Medical Research InstituteのAndreas Suhrbier博士指導の下、マウス感染実験に関する手技を習得した。学んだ手技によりマウスに関節炎を発症させることが可能となり、現在、症状を呈したマウスより経時的に採材したサンプルの解析を進めている。本年度はチクングニアウイルス感染による関節炎発症マウスモデル構築を目的に研究を実施した。先行研究に習い、野生型マウスにチクングニアウイルスを皮下接種することで関節炎を発症させることが可能と考えていたが、ウイルスの増殖法、接種部位の検討等に時間を要したため、当初の予定よりも遅れている。本研究はチクングニアウイルス(CHIKV)感染により発症する関節炎にC型レクチン(糖鎖に結合活性を示す蛋白質)が関与するかどうかを明らかにすることを目的に実施した。認識する糖鎖パターンや生体内での分布が異なる3種のC型レクチン(DC-SIGN、L-SIGN、LSECtin)発現細胞では、非発現細胞と比較してCHIKVの感染性が上昇することを確認した。次に、CHIKVを増殖させた細胞種により各レクチン発現細胞への感染効率が異なることを明らかにした。蚊細胞で増殖させたCHIKVはDC-SIGN発現細胞への感染性が高く、哺乳類細胞で増殖させたCHIKVはLSECtin発現細胞への感染性が高かった。この結果より以下のことが考えられた。蚊の体内で増殖したCHIKVは蚊の吸血時にヒトの皮内に侵入し、DC-SIGNを発現する単球系細胞に感染する。ヒトの単球系細胞で増殖したウイルスは血流に乗り、LSECtinを発現する内皮細胞に感染する。蚊と哺乳類で付加される糖鎖構造の違いがCHIKVの宿主内での動態に影響を与えている可能性が考えられた。CHIKV感染による関節炎と類似の病態を示す関節リウマチでは、関節炎発症部位でC型レクチンの発現量が増加する。CHIKV感染においても関節炎発症部位でレクチンの発現量が増加するかどうかを調べるため、CHIKV感染により関節炎を発症するマウスモデルを構築した。次世代シークエンサーにより、関節炎を発症したマウスの後肢より採取した遺伝子の発現量解析を実施した結果、5種類のC型レクチン関連遺伝子の発現が増加することが分かった。この結果より、CHIKV感染による関節炎の病態形成にレクチン関連分子が関与している可能性が考えられた。

チクングニアウイルス(CHIKV)は蚊によって媒介され、感染患者は関節炎を特徴とした発熱症状を示す。本研究では、CHIKVが細胞への吸着にC型レクチンを使用することを明らかにし、CHIKVは蚊と哺乳類との間でまわる感染の過程でウイルス膜蛋白質上に纏う糖鎖構造を変え、複数のレクチン発現細胞に効率よく感染する可能性を示した。また、CHIIKV感染により関節炎を発症するマウスモデルを確立し、炎症部位ではレクチン関連分子の遺伝子発現量が上昇することを明らかにした。この結果より、発現が増加したレクチン関連分子を介して炎症部位ではCHIKVの細胞への吸着効率が増加する可能性が考えられた。シンドビスベクターを用いた組換えチクングニアウイルス作出に関する遺伝子組換え実験大臣確認申請が承認されたのが2014年11月であり、申請開始から承認までに1年以上を要したため、実験の開始が大幅に遅れた。また、シンドビスウイルスベクターを用いて作成した組換えチクングニアウイルスは野生型のウイルスと比較して感染効率が著しく低く、以降の実験に使用することが困難であった。そのため、平成26年度に予定していたC型レクチン介在性細胞侵入効率に関与するチクングニアウイルスの膜蛋白質領域を特定することができなかった。関節炎を発症したマウスより経時的に採材したサンプルについて解析を行う。当初の計画では異なるウイルス株を接種し、関節炎を発症したマウスの組織標本を使用して、レクチン発現細胞の分布、発現量を比較解析する予定であった。しかし、組織染色に適した抗マウスレクチン抗体が入手できないことから、計画を変更し、炎症部位より採取した遺伝子を用いて次世代シークエンサーによるレクチン遺伝子の発現量解析を行う予定である。ウイルス学(1)シンドビスウイルスベクターの非構造蛋白質領域をチクングアウイルスのものに入れ替え、より野生型のチクングニアウイルスに近い組換えウイルスを作成する。(2)我々が保有するチクングニアウイルス臨床分離株は野生型マウスに関節炎を起こさないため、野生型マウスでウイルスを継代し、マウスに順化したウイルスを作成する予定である。また、当初の研究計画に追加して、野生型マウスと比較して易感染性であるIFNAR1ノックアウトマウスにおいてもウイルスを感染・継代する予定である。年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成27年度分についてはほぼ使用済みである。シンドビスベクターを用いた組換えチクングニアウイルス作出に関する遺伝子組み換え実験大臣確認申請が承認されたのが2014年11月であり、申請開始から承認までに1年以上を要したため、実験の開始が大幅に遅れた。そのため、平成26年度に予定していた全ての実験計画を実行することができなかったため。上記のとおり。平成26年度に達成できなかった実験および平成27年度に予定している実験内容達成のため、遺伝子関連試薬、蛋白質関連試薬、細胞培養関連試薬、プラスチック類、動物実験関連品の購入に使用する。
水分移動組織特異的新規蛋白質parchorinの病態生理学的解析

申請者はウサギ脳脈絡叢から新規蛋白質をクローニングし,parchorinと名付けた.この蛋白質は当初,ウサギ胃底腺の刺激時に壁細胞において細胞質から分泌側膜上へ移動してくるリン酸化蛋白質として見い出されたものである.以後の研究によって,parchorinは,壁細胞ばかりでなく,脳脈絡叢choroid plexusをはじめとする水分移動に関わっている細胞特異的に発現していることが明らかとなった。parchorinのC末端部分には細胞内小胞の塩素イオンチャネルと考えられているCLICファミリーと相同性を持つ部分が存在することから、塩素イオンの透過性の制御を介して,水輸送を制御していることが予測された.そこで、parchorinのノックアウトマウス(CLICファミリーのノックアウトマウスとして世界で初めての例)を作成したところ、予想に反して、明瞭なフェノタイプが発現しなかった。特に、最大の発現が見られる壁細胞の機能である酸分泌に全く変化が見られなかった。これは、発生過程においてparchorinの生理機能を補償する他の蛋白質の発現が増加した可能性と、全く予想外の生理機能をもつ可能性を示唆する。そこで、野生型・ノックアウトマウスの胃粘膜及び脈絡叢をGeneChipにより網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、胃粘膜では酸分泌に関与すると思われるいくつかの遺伝子に変化が認められ、脈絡叢においては、種々のイオンチャネルの発現変動が認められた。更に、脈絡叢において、予想外のスプライシングバリアントが存在する可能性が示唆された。また、parchorinが細胞内で相互作用する分子の候補として、PDZドメインをもつ細胞内トラフィック関連蛋白質synteninを同定した。本研究の目的は,新規蛋白質parchorinの機能の解明を通じて,parchorinを創薬のターゲットとして提案することである。そのためにparchorinノックアウトマウスの作成とその解析を通じて、ヒトにおける遺伝性疾患の可能性、およびparchorinの機能修飾による創薬の可能性を探る。前年度までに作成したキメラマウスから,FLP-Frtにより薬剤選択に使用したNeomycin耐性遺伝子,及びCre-loxPによりparchorinのexon1をそれぞれ掛け合わせにより除き,得られたヘテロマウスを掛け合わせることにより,parchorinのホモノックアウトマウスを作製した.誕生したのは本年度7月であるが,ジェノタイピングの結果,ホモ体が誕生していた.従って,parchorinの欠損はembryonic lethalではなく,生存に必須ではないことが判明した.現在のところ,ノックアウトマウスの性比は極端に雌に偏っているが,parchorinが雄の発生・成長に必須であるかどうかを判定するにはもっと例数を重ねる必要があろう.バッククロスを行わない状態では,成長曲線を単純には比較できないが,ノックアウトマウスは極端な障害を示さず成長し,かつ雌雄とも生殖能力があり,雌の哺乳能力も損なわれてはいなかった.現在はバッククロスを重ねつつ繁殖させ,加齢による障害発生の可能性を検討する計画である.それは,陰イオンチャネルやトランスポーターの欠損により加齢による視力・聴力・生殖障害を発症する例があるからである.現在の予定では,1年以上飼育したホモマウスの視覚・聴覚検査を行った後,剖検し,水輸送組織を中心に組織学的精査を行う.また,繁殖させたノックアウトマウスを用い,in vitroで胃酸分泌,唾液分泌などの分泌機能を検査することにしている.前年度までに作成したキメラマウスから,FLP-Frtにより薬剤選択に使用したNeomycin耐性遺伝子,及びCre-loxPによりparchorinのexon 1をそれぞれ掛け合わせにより除き,得られたヘテロマウスを掛け合わせることによりparchorinのホモノックアウトマウスが得られた.

従って,parchorinの欠損はembryonic lethalではなく,生存に必須ではないことが判明した.現在ノックアウトマウスの性比は極端に雌に偏っているが,parchorinが雄の発生・成長に必須であるかどうかを判定するにはバッククロスを重ねつつ繁殖させ,加齢による障害発生の可能性を検討する必要がある.しかしながら,17年度から主任研究者の所属が現在のものに変更された.それに従い,ノックアウトマウスを新設なった同志社女子大学薬学部動物施設に移送する必要があった.遺伝子改変動物の移動,飼育には法律に従った手続き等が必須のため,17年度の秋までの準備期間が必要であった.その後,新しい施設においてマウスの繁殖を開始した.従って,ノックアウトマウスのフェノタイプ観測は不可能であった.その間,バッククロスを重ねたマウスが誕生した場合に行うべき実験の準備を行った.まず,塩素イオン移動能が深く関与する系として酸分泌,唾液分泌を摘出器官を用いて測定する系を確立した.また,脳脈絡層,破骨細胞の培養系を確立し,これらを用いて精密なフェノタイプ観測を可能とした.また,マウスparchorinを特異的に認識するポリクローナル抗体を作成し,ノックアウトマウスでは蛋白質の発現も完全に無くなっており,類似機能を持つスプライシングバリアントの存在も無いことを確認した.更に,parchorin機能を補償するために代償的に発現上昇をする遺伝子を見いだすためAffymetrixGeneChipを用いたトランスクリプトーム解析の系を確立した前年度までに作成したparchorinのホモノックアウトマウスを,当機関でバッククロスを行い,繁殖維持した.これまでにparchorinノックアウトはマウスの発生・生存・成長・繁殖には必須ではないことが示唆されていたが,これが徐々に確認された.また,消化機能にも著変がないことは,全身状態の観察から明らかであったが,摘出胃を用いた胃酸分泌能を測定したところ,基礎分泌,刺激分泌とも野生型と全く変化がなかった.そこで,parchorinが重要な生理学的機能を果たしているとしても,他の蛋白の発現誘導によって補償されていると考え,Affymetrix GeneChipを用いたトランスクリプトーム解析を行った.胃粘膜においては,ある種のトランスポーターを含む幾つかの蛋白が過剰発現していた.最も注目されたのは脳の脈絡叢において,parchorinの3'非翻訳領域がノックアウトマウスにおいても高発現していたことである.これは,組織特異的な,予期せぬスプライシングバリアントの存在を示唆しているため,現在その実体を検討中である.また,parchorinの生理的役割を解析するために,yeast two-hybrid法を用いて,parchorinと結合する蛋白質を検索した.その結果,C末端側にPDZドメインを2つ持つ蛋白質であるsynteninを同定した.synteninは膜トラフィックに関与していることが推定されている蛋白であり,N末を介してparchorinと結合していた.
磁気泳動による生体物質の物性測定・運動制御に関する研究

本研究は生体へ及ぼす磁場の作用機構を明らかにし、強磁場の医用工学的応用を目指して磁場の新しい利用の可能性を見いだすことを目的とした。勾配磁場下において各々の物質の磁化率の差による磁気力の差が生じ、濃度変化等が生じる現象、すなわち磁気泳動効果について様々な生体物質を対象に研究を行った。本年度の研究では、静止液体中での磁気泳動による生体高分子の濃度変化を光学的に測定した。これまでに、常磁性物質の濃度変化の光学的測定は報告されていたが、本年度の研究により、たとえ反磁性物質でも、分子量が数十万オーダの蛋白質や糖鎖高分子の場合、高分子を取り囲む水との磁化率の差による磁気泳動が生じるこが示唆された。ヘモグロビンやカタラーゼ、デキストラン等を用いた磁気泳動の光学的測定を行った。特に、ヘモグロビンの磁気泳動に関して再現実験を繰り返し行った。一方、タンパク質コロイド溶液の光散乱が、磁気泳動実験で観測される光強度に与える影響も検討した。均一磁場中におかれた3ml溶液のレーリー散乱光測定を行った。08テスラの磁場では、タンパク質コロイド溶液中の磁力線に並行な入射光によるファラデー効果の結果、入射光に垂直な方向のレーリー散乱光は顕著な偏光面回転を見せ、光検出系の偏光強度に明確な磁場影響が認められた。しかし、磁力線に垂直な入射光の場合は顕著な磁場効果が見られなかった。以上より、磁気泳動測定における光散乱磁場効果の影響は無視できると結論した。また、フィブリン重合過程におけるフィブリン磁気泳動について過去に報告したが、フィブリン重合に伴う濁度変化が、磁気泳動時の光学的寄与分をどのくらい持つかを明らかにするため、フィブリン重合時の光吸収特性の時間変化を調べた。本年度の研究では、強磁場中クロマトグラフィーによる生体物質の分離・機能測定法の開発を検討するため、クロマトグラフィーにおける溶出パターンを解析した。グリシン(アミノ酸)、アルブミンやカタラーゼ(蛋白質)、デキストラン(糖類)、およびDNA(核酸)などの水中での輸送速度が勾配磁場下にて加速/減速する現象や、クロマトグラフィーカラムからの物質溶出パターンへの磁場効果を明らかにした。次に、静止液体中での磁気泳動による生体高分子の濃度変化や光学的に測定した。これまでに、常磁性物質の濃度変化の光学的測定は報告されていたが、本年度の研究により、反磁性物質同士でもヘモグロビンや糖鎖高分子のように分子量がある程度大きい場合には、高分子を取り囲む水との磁化率の差による磁気泳動を観測できた。さらに、生体中に存在する物質に非侵襲的に磁気力を作用させることによる巨大分子および生体組織の運動制御法の開発のため、循環モデル系を用いた全血の凝固溶解過程への14T磁場曝露の効果を調べた結果、磁場中で形成された血栓の重量が磁場外の場合よりも減少し、血液粘性にも磁場効果が見られた。