hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
出生率変動の経済分析

平成2年度には、初年度の調査と研究を基礎にして経済理論モデルを作成し、その分析を行った。途中経過は、4月から5月にかけてオ-ストラリア国立大学で発表し、8月にはスペインのバルセロナにおける世界計量経済学会で発表した。この過程でまとめられてきた研究成果は、10月の理論計量経済学会で発表し、更に、12月には米国で、南カリフォルニア大学のイ-スタリン教授,ニュ-ヨ-ク大学のベンハビブ教授、コロラド大学のシャオ教授、ロチェスタ-大学のマッケンジ-教授、そしてカナダのウェスタンオンタリオ大学のザン教授との研究交換を通じて英文論文としてまとめあげることができた。イ-スタリン仮説を理論的に証明し、出生率逓減傾向の原因を検討するという当初の目的は十分に達成された。また派生的に、出生率と社会保障や年金負担の関係についても研究の必要性がでてきた。これは海外の研究者との意見交換の中で指摘された点である。もう一点は、経済モデルを開放モデルとした場合の問題である。これまで一般には、出生率の経済分析は貿易を無視した閉鎖モデルにおいてのみ研究されてきた。しかし現実には、国際資本移動や海外労働力の流入は無視し得ない。そのような要因を明示的に考慮したモデルにおいて、あらためて出生率の変動が経済に及ぼす影響を考慮することは重要なことである。これらは将来の研究につながる問題であり、本研究計画の中では扱い得なかった。従って今回は、閉鎖体係の経済モデルに限定した成果を報告することになる。
中山間地域において１６年間継続してきた高齢者水中運動講座の効果の縦断的検証

20年目に入る高齢者水中運動講座の実施を継続するとともに、学内の様々な分野の教員が講座の運営のみならず研究の土台となる体制の構築を更に進めた。この為の1つとして、研究者らが運営・研究を実施するために必要な知見を学会に参加するなどして各研究者が積極的に推進した。毎年実施している体力測定会も継続して開催するとともに、この諸データをパソコンへ入力する作業を進めた。この大会の運営には、昨年度と同様に看護師出身の研究者の継続的な従事者を確保するなどして、多くの研究者らの視点が加味される大会に成長させた。これにより更に充実した研究フィールドの樹立を勧めた。この際、被験者である参加者への負担の軽減を図るよう配慮して実施した。これらの実績の結果、研究の遂行に必要な基礎データを年に1度は収集する仕組みとして十分に樹立するに至った。年間を通した水中運動教室の運営における参加者の観察で、本年度も数か月の間に認知機能の低下が疑われるようなケースも見受けられた。このようなケースの把握のために、運営にあたるスタッフ間での情報共有するシステムが必要でこの試みの模索を進めたが、システムの構築までには至らなかった。参加者の第一目的が自身の運動機能的な健康のプロモーションのためであることなどから、短期的な認知機能の変化をトレースする仕組みや環境の構築に本年度もいたらず、この方法について更に検討していくことが課題として検討を続けている。このほか、体力測定会で蓄積されたデータについて、認知機能などのいくつかに焦点を絞った解析の必要が考えられた。初期に測定したデータの中に機器が異なる点などが問題点が依然として遅れの原因となっている。この中には、機器が異なっていても縦断的な研究のデータとして使用できる項目もあるが、この項目の検討に時間がかかった。毎回の講座(水中運動教室)での問診では、時間と人員的な制約がある中で比較的効率的に運営する体制が進んだ。この際、簡単な問診による認知機能のチェックを問診者の主観的なレベルでは行えるようにはなった。しかし、多くの参加者が自身の身体機能維持への関心の高さと自信があることが原因となって、問診時などに「短期的に認知機能の変化を追跡する客観的なシステムの構築」までは進まなかった。上記の課題点を研究チームで検討を進めた上で、一部は計画通りに「縦断的な効果を詳細に評価する為の項目の追加」について補填していくことを試みる。また、毎回の教室で実施している問診で、研究者の観察データをより簡単に蓄積できるシステムの構築を進める。この際、日常生活での変化を尋ねた結果を自由記述だけでなく、選択的に入力していけるように改築を進める。これに加え、短期的な参加者の変化を捉えるためのデータ収集方法などの検討をさらに継続する。18年目に入る高齢者水中運動講座の実施を継続するとともに学内の様々な分野の教員が講座の運営に関与する体制の構築をはかった。また、近年の諸データの蓄積について体力測定会を中心にパソコンへの入力を進めた。また、機能測定大会では参加者の測定結果を研究に用いるに十分なものとなるように機器の更新を進めるとともに、測定項目を追加し認知機能などの測定を行った。また、機能測定大会の運営方法について改良し、参加者への負担の軽減を図るよう配慮して実施した。これらの結果、研究の遂行に必要な基礎データを年に1度は収集する、よりよい仕組みを樹立するに至った。年間を通した参加者の観察から、数か月の間に認知機能の低下が疑われるようなケースも見受けられた。このようなケースの把握のためには、短期的な認知機能等の変化を把握するスクリーニングシステムが必要と考えられた。しかし定期的な参加者がいる状況ではあるものの、参加者の第一目的が自身の運動機能的な健康のプロモーションのためであることなどから、短期的な認知機能の変化をトレースする仕組みや環境の構築にはいたらず、この方法について検討していくことが今後の課題として明らかになった。初期のデータは紙媒体であることや、測定した機器が異なる点などが問題点としてあげられ、入力作業に入る前に十分な縦断的研究としての価値のあるデータの検討が必要であることが問題点となった。また、収集するデータに認知機能検査などの必要性もあると考えられた。しかし毎回の講座での問診では、時間と人員的な制約があり、加え参加者の身体機能維持への関心の高さ等から、短期的に認知機能の変化を追跡する仕組みへの検討が進まなかった。19年目に入る高齢者水中運動講座の実施を継続するとともに、学内の様々な分野の教員が講座の運営のみならず研究の土台となる体制の構築をはかった。例年おこなっている体力測定会も実施するとともに、この諸データをパソコンへ入力する作業を進めた。この大会の運営には、昨年度よりも看護師出身の研究者の増員や継続的な従事者を確保するなどして、多くの研究者らの視点が加味される大会に成長させたことでより充実した研究フィールドの樹立を勧めた。これと同時に参加者への負担の軽減を図るよう配慮して実施した。これらの実績の結果、研究の遂行に必要な基礎データを年に1度は収集する、よりよい仕組みとして十分に樹立されていることを確認するに至った。年間を通した水中運動運営における参加者の観察で、本年度も数か月の間に認知機能の低下が疑われるようなケースも見受けられた。

このようなケースの把握のために、昨年度かた、短期的な認知機能等の変化を把握するスクリーニングシステムが必要と考えられた。いくつかの方法にスクリーニングを実施する模索をしたがシステムの構築までには至らなかった。参加者の第一目的が自身の運動機能的な健康のプロモーションのためであることなどから、短期的な認知機能の変化をトレースする仕組みや環境の構築に本年度もいたらず、この方法について更に検討していくことが今後の課題として明らかになった。このほか、体力測定会の蓄積されたデータについて、認知機能に焦点を絞った解析の必要も考えられた。初期に測定したデータの中には機器が異なる点などが問題点としてあげられていたものの、機器が異なっていても縦断的な研究のデータとして使用できる項目もあった。今後、測定機器の入れ替えの際には、過去のデータと同等の扱いをしてよいのかの模索も、必要ということが課題として挙げられた(骨密度測定器など)。また、収集するデータにより認知機能を判定できるものの必要性もあると考えられた。しかし毎回の講座での問診では、時間と人員的な制約が依然としてあり、加えて参加者の身体機能維持への関心の高さ等から、短期的に認知機能の変化を追跡する仕組みへの検討は本年度も進まなかった。ただし、研究者間でのこの問題に関する意識共有は進んだ。20年目に入る高齢者水中運動講座の実施を継続するとともに、学内の様々な分野の教員が講座の運営のみならず研究の土台となる体制の構築を更に進めた。この為の1つとして、研究者らが運営・研究を実施するために必要な知見を学会に参加するなどして各研究者が積極的に推進した。毎年実施している体力測定会も継続して開催するとともに、この諸データをパソコンへ入力する作業を進めた。この大会の運営には、昨年度と同様に看護師出身の研究者の継続的な従事者を確保するなどして、多くの研究者らの視点が加味される大会に成長させた。これにより更に充実した研究フィールドの樹立を勧めた。この際、被験者である参加者への負担の軽減を図るよう配慮して実施した。これらの実績の結果、研究の遂行に必要な基礎データを年に1度は収集する仕組みとして十分に樹立するに至った。年間を通した水中運動教室の運営における参加者の観察で、本年度も数か月の間に認知機能の低下が疑われるようなケースも見受けられた。このようなケースの把握のために、運営にあたるスタッフ間での情報共有するシステムが必要でこの試みの模索を進めたが、システムの構築までには至らなかった。参加者の第一目的が自身の運動機能的な健康のプロモーションのためであることなどから、短期的な認知機能の変化をトレースする仕組みや環境の構築に本年度もいたらず、この方法について更に検討していくことが課題として検討を続けている。このほか、体力測定会で蓄積されたデータについて、認知機能などのいくつかに焦点を絞った解析の必要が考えられた。初期に測定したデータの中に機器が異なる点などが問題点が依然として遅れの原因となっている。この中には、機器が異なっていても縦断的な研究のデータとして使用できる項目もあるが、この項目の検討に時間がかかった。
発生工学的手法による自己免疫病発症機構の解析

正常マウス末梢CD4T細胞の約10%を占めるCD25(IL-2α鎖)発現T細胞を除去すると、ヒトの自己免疫病と免疫病理学的に酷似した様々な病変(胃炎、甲状腺炎、副腎炎、糖尿病、卵巣炎等)が高率に発症し、CD25+細胞を一定期間内に補えば病変発症は阻止される。これは、末梢における自己反応性T細胞の活性化・増殖が、他のT細胞による制御を受けており、その制御機構の破綻は様々な自己免疫病の直接的原因と成りうることを意味する。CD25+T細胞による自己寛容維持の分子的機序を解明するため、本年度はCD25+T細胞による抑制能を定量的に測定できる試験管内実験系を確立した。その結果、CD25+T細胞はT細胞レセプターに対する特異的、非特異的刺激に対して増殖反応を示さずアナ-ジックであった。さらにCD25-T細胞の増殖を細胞数依存的に抑制した。この抑制能はさまざまなサイトカインに対する中和抗体の添加、あるいはCD25+T細胞の培養上清の添加で解除できなかった。また低分子物質は通過させるが細胞を通過させない半透過性膜で仕切っても抑制はみられず、細胞間の接触が必要と考えられた。一方、CD25+T細胞のアナジー/抑制は高濃度のIL-2あるいは抗CD28抗体の添加で破ることができた。さらに抗原非特異的刺激と高濃度IL-2によって末梢T細胞を処理すれば自己反応性T細胞の活性化・増殖を促し、CD25+T細胞を除去しなくても自己免疫病を誘導できることがわかった。以上の結果は正常免疫系に自然状態でアナ-ジ-状態のT細胞が存在し、しかもそれらは抑制能を発揮することにより、免疫的自己寛容の維持に能動的に関与していることを示している。CD25+T細胞による自己寛容維持の分子的機序を解明するため、CD25+T細胞を条件的に一定期間除去でき、その結果自己免疫病を自然発症するトランスジェニックマウスの作製を計画し、現在遺伝子コンストラクトをマウス卵に導入中である。一方、自己免疫病発症阻止能を持つCD25+T細胞について、それらが発現するT細胞抗原レセプターVα/Vβ群に偏りがなく、IL-2β鎖、NK1.1分子を発現しておらず、NKT細胞とは異なるとの結果を得た。またCD25+T細胞の自己免疫阻止能について、FACSで調整したCD25+T細胞が構成的に産生しているサイトカインをRT-PCRで検索し、IL-4,IL-10,TGF-βがこの範疇に入ることを見い出した。それらについて、特異的中和抗体のin vivo投与がCD25+T細胞除去の代わりとなるか、またこれらの遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを筋注し血中濃度を上げた場合自己免疫病の発症が阻止されるか検討している。CD25+制御細胞の抗原特異性については、正常T細胞のコンカナヴァリンA刺激により作製した活性化T細胞の移入によって自己免疫病の発症を阻止できたが、卵白アルブミン特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウス由来T細胞を抗原特異的に活性化しても阻止できなかった。制御T細胞の抗原特異性についてさらに検討中である。

以上の結果は正常免疫系に自然状態でアナ-ジ-状態のT細胞が存在し、しかもそれらは抑制能を発揮することにより、免疫的自己寛容の維持に能動的に関与していることを示している。
ヒト乳頭腫ウイルス型特異的細胞変性効果に関する分子病理学的研究

16型ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)を用いて、E1ウイルス蛋白質が初期複製・後期複製に必須であるが維持複製には必須でないことを示した。抗ウイルス薬としてE1阻害剤の開発が試みられているが、E1阻害剤の効果は限定的である可能性がある。この過程で開発した実験系を用いて、HPVの任意の蛋白質の機能を生活環の中で検討することが可能となった。組織学的に細胞内封入体をもつ、特異な「型特異的細胞変性効果」を示す扁平疣贅より新型HPV126を発見しゲノム全長をクローニングし報告した。正常皮膚不死化細胞株(HDK1K4DT)を用い野生型および変異型組み換えヒトパピローマウイルス(HPV)ゲノムを保持する細胞の樹立に成功した。HDK1K4DTは、これまで用いてきた子宮頚部上皮不死化細胞株と比較して、分化誘導能をもち、3次元分化誘導培養で角層形成まで分化誘導が可能である。それを用いてE1蛋白質の3つの異なるphaseにおけるウイルスゲノム複製機構の解明を行い、E1蛋白質が初期複製・後期複製に必須であるが維持複製には必要ないことを示し発表した。ウイルス蛋白を必要としない複製機構は宿主側の免疫機構刺激しにくく、持続感染に有利に働いている可能性がある。また、E1は抗ウイルス薬の標的として期待されE1阻害剤の開発が試みられているが、E1阻害剤は維持複製を阻害しない可能性が示され、E1阻害剤の効果は限定的である可能性がある。この過程で開発したFLP-FRT系を用いた外来遺伝子の発現制御系と変異型組換えHPVを用いることで、HPVの任意の蛋白質の機能を生活環の中で検討することが可能となった。加えて、L2領域を薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子と置き換えたウイルスゲノムを作製し、ウイルス粒子の作製、感染実験・初期複製・維持複製のモニターや複製阻害剤のスクリーニングに応用を検討し予備実験を行った。我々の発見したHPV126型は扁平疣贅様臨床形態をもつが、病理組織学的には細胞内封入体をもち表皮肥厚は顕著ではないが,Ki-67染色で角層直下まで陽性であるなど、特異な「HPV型特異的細胞変性効果(CPE)」を示していた。このHPV126ゲノム全長をクローニングし、HPV126として、病理組織学的特徴と共に発表した。近年新型HPVの報告の多くはDNA配列のみで、臨床像などのCPEの記載がなく、シークエンスから臨床像、組織学的特徴まで記載されたHPV126の報告は意義深いと考えられる。正常皮膚不死化細胞株(HDK1K4DT)を用いて野生型および変異型組み換えヒトパピローマウイルス(HPV)ゲノムを保持する細胞の樹立に成功した。HDK1K4DT細胞株は、これまでの子宮頚部上皮不死化細胞株と比較して、分化誘導能をもち、3次元分化誘導培養では角層形成まで分化誘導が可能である。それを用いてE1蛋白質の3つの異なるphaseにおけるウイルスゲノム複製機構の解明を行い、E1蛋白質が初期複製・複製に必須であるが維持複製には必要でないことを示し、発表した。このことは、ウイルスがその生活環において、2つの機構を使い分けていることを示している。また、E1は抗ウイルス薬の標的として期待されておりE1阻害剤の開発が試みられている。しかし、我々の結果から示されるように、E1を阻害しても維持複製が阻害されないことは、E1阻害剤の効果は限定的なものになることが考えられる。加えて、この過程で開発したFLP-FRT系を用いた外来遺伝子の発現制御系と変異型組換えHPVを用いることで、HPVの任意の蛋白質の機能を生活環の中で検討することが可能となった。今後E1にとどまらず、E6、E7、E2の検討へと応用が可能である。また、我々の発見したHPV126型は扁平疣贅様臨床形態をもつが、病理組織学的には細胞内封入体をもち表皮肥厚は顕著ではないが,Ki-67染色で角層直下まで陽性であるなど、特異な「HPV型特異的細胞変性効果(CPE)」を示していた。このHPV126ゲノム全長をクローニングし、病理組織学的特徴と共に発表した。当初の予定であった、Cre/loxP系を使ったHPV16ゲノム保持上皮正常細胞株の樹立に子宮頚部上皮不死化細胞(HCK1T)および正常皮膚不死化細胞株(HDK1K4DT)を用いて成功した。

特に、HDK1K4DTを用いた場合、3次元分化誘導培養ではHCK1Tとは違い角層までを含む過形成が再現された。それを用いてE1蛋白質の3つの異なるphaseにおけるウイルスゲノム複製機構の解明を行い、E1蛋白質が初期複製・複製に必須であるが維持複製には必要でないことを示し、第27回国際パピローマウイルス会議で発表し、論文として発表した。この過程で開発したFLP-FRT系を用いた外来遺伝子の発現制御系と変異型組換えHPVを用いることで、HPVの任意の蛋白質の機能を生活環の中で検討することが可能になり、以後の研究を促進すると考えられる。また、ウイルス粒子産生に関しては予備実験段階である。E1E2をexogenousに発現させるとHPVゲノムを10倍以上に増幅されることを確認した。また、Caを添加しての平皿上で分化誘導を行い、ゲノムからウイルスカプシド蛋白質の誘導を確認した。現在、分化誘導後細胞株よりのウイルス粒子回収を試みているところである。また、ウイルスゲノム維持をモニターする系として、L2L1領域にレポーター遺伝子を挿入したHPV16ゲノムを作製し、そのウイルスゲノムを持つウイルス粒子を産生することに成功した。これらを、293T細胞に感染させたところ、レポーター遺伝子の発現を確認した。これらを用いて、ウイルス粒子の感染から初期複製、維持複製等、生活環を通しての研究を行える環境が整った。また、特異的なHPV型特異的細胞変性効果(CPE)を持つHPV126を発見し、ゲノム全長をクローニングし、病理組織学的特徴と共に論文として発表した。FLP-FRT系を用いた外来遺伝子の発現制御系と変異型組換えHPVを用いることで、HPVの任意の蛋白質の機能を生活環の中で検討することが可能となり、実際、ウイルス初期遺伝子に変異を入れたウイルスゲノムの作製およびFLP-FRT系でそれらのウイルス遺伝子の発現制御系を作製中である。作製後は、それぞれのウイルス蛋白質の、生活環での機能を検討する予定である。ウイルスゲノム維持をモニターする系として、L2L1領域にレポーター遺伝子を挿入したHPV16ゲノムを作製した。レポーター遺伝子はGFPと分泌型ルシフェレースを選択しており、それぞれ、HPVゲノム保持細胞がGFP蛍光を呈する細胞として観察できる、HPVゲノムの平均量を培養上清を用いて簡便に定量できる等の利点があると考えられる。現在、293T細胞に導入したところ、レポーター遺伝子の発現は確認できるが、初期複製を行っていないことを示唆するデータが得られている。初期複製時のE1E2の供給がウイルスゲノムからの新規合成なのか、ウイルス粒子から蛋白質として供給されるのか検討中である。また、分泌型ルシフェレースをレポーターとして用いた系で、正常皮膚不死化細胞株(HDK1K4DT)に導入した細胞株の樹立を試みており、ゲノム量とルシフェレース活性の関係やどの程度長期にわたって維持複製をモニターできるか評価中であり、最適なコンストラクトが同定できれば報告し、維持複製阻害剤のスクリーニング系として応用を考えている。ウイルス粒子作製では293T細胞を用いて他研究室と同様安定したウイルス粒子を作製することに成功したが、報告通りウイルスゲノムのパッケージング効率は低い。今後、ウイルスゲノムを保持する正常上皮細胞株を用いてE1E2の誘導によるゲノムの増幅、分化誘導を用いてのカプシド蛋白質の誘導、ウイルス粒子の作製を試み、高収量のウイルス粒子作製を試みる。培養関連消耗品:正常上皮不死化細胞株を主に用いる。正常上皮細胞株の培養には無血清の専用培地を用いており、一般的な培地と比べて10倍程度高価である。
植物細胞における染色体分配機構の解明

本研究は、植物細胞における分裂装置の構築機構とそれを反映する染色体分配様式が、進化の過程においてどのように変化してきたのかを明らかにすることを目的としています。細胞周期M期後期にみられる紡錘体伸長は、染色体を分配するための重要な機構です。紡錘体伸長は、動物細胞では一般的な機構ですが、植物細胞では分裂組織における紡錘体伸長の有無とその染色体分配への寄与が明らかではありませんでした。そこで、本研究では材料に3種類のモデル細胞系、タバコ培養細胞BY-2(以下BY-2細胞)、シロイヌナズナ根端細胞、ヒメツリガネゴケ原糸体を選び、これらモデル細胞系における細胞周期のM期後期の紡錘体伸長を測定し、比較しました。昨年度までに、BY-2細胞、シロイヌナズナ根端細胞、ヒメツリガネゴケ原糸体細胞においてM期後期に紡錘体伸長が起こることを示し、後期紡錘体の伸長率は同程度であることが示されました。本年度は昨年度の結果をふまえ、ヒメツリガネゴケ原糸体における紡錘体形態の詳細な解析を行いました。観察数を増やすため蛍光抗体染色法を用い、M期後期における染色体間の距離に対する紡錘体長を測定しました。その結果、ヒメツリガネゴケ原糸体では染色体間の距離がある一定の長さを越えると紡錘体長に大きな変化がみられました。この結果から、ヒメツリガネゴケ原糸体では、紡錘体伸長が染色体分配へ寄与する割合は、M期後期の後半に大きくなることが示唆されました。この結果はBY-2細胞でみられる紡錘体の動態と同様であり、シロイヌナズナ根端細胞とは異なると考えられます。これまでに報告されている様々な生物の研究から、紡錘体の伸長率と伸長開始時期について考えると、進化的にも形態学的にも大きく異なる動物細胞と植物細胞で紡錘体伸長が染色体の分配に同程度寄与しており、紡錘体伸張が染色体の分配に果たす役割をより一層明確に出来たと考えています。本年度は、遺伝学的解析も可能なシロイヌナズナ植物体内で染色体と微小管を二重に可視化した細胞株と共焦点レーザー顕微鏡システムを用いた高時空間分解能をもつ実験観察系を確立しました。この実験観察系の確立により、これまで困難であった、分裂頻度の高い組織である根の先端の細胞におけるリアルタイムでの分裂の観察が容易になりました。シロイヌナズナの根端細胞における分裂後期の紡錘体伸長を測定したところ、BY-2細胞と同様の染色体分配様式であることが示されました。進化的な面からのアプローチとして用いたヒメツリガネゴケでは、紡錘体微小管の伸長過程に着目しました。後期の紡錘体長の推移を調べると、ヒメツリガネゴケでも後期に紡錘体が伸長することが明らかとなり、ヒメツリガネゴケにおいても後期Bが存在することが示唆されました。この結果をふまえ、BY-2細胞、シロイヌナズナ根端細胞、ヒメツリガネゴケ原糸体細胞において算出した後期紡錘体の伸長率を比較しました。その結果3種類のモデル細胞系では同程度の伸長率であることが示され、陸上植物の細胞分裂において、後期Bは一般的に起こることが示唆されました。陸上植物の細胞は、中心体を持たず、星状体微小管に依らない紡錘体伸長機構を発達させ、細胞形態と紡錘体構造の双方に依存した染色体分配様式を持つと考えられます。本年度の結果とこれまでに報告されている他生物の研究の結果から、細胞形態と紡錘体の相対的な体積に着目し、植物細胞の染色体分配における後期Aと後期Bのバランスを決定する機構のモデルを提案しました。この結果から、ヒメツリガネゴケ原糸

体では、紡錘体伸長が染色体分配へ寄与する割合は、M期後期の後半に大きくなることが示唆されました。この結果はBY-2細胞でみられる紡錘体の動態と同様であり、シロイヌナズナ根端細胞とは異なると考えられます。これまでに報告されている様々な生物の研究から、紡錘体の伸長率と伸長開始時期について考えると、進化的にも形態学的にも大きく異なる動物細胞と植物細胞で紡錘体伸長が染色体の分配に同程度寄与しており、紡錘体伸張が染色体の分配に果たす役割をより一層明確に出来たと考えています。
講式に関するデータベース作成を可能にする為の研究と設備の具備、及び実際の作成

講式は十世紀後半に成立した日本の独特な仏教儀式の一つで、日本語で語られたという点に於いて、他の儀式と異なっているし、音楽(管弦や声明)、舞踊、演劇、絵画等の要素を含む一つの独特な総合的文化体系であるといってよいものである。この点で、講式は仏教のみならず、日本の芸能や文化を研究する為の貴重な資料である。約十年間にわたって集めてきた資料のデータを基に、今回のプロジェクトでは、講式の写本、古刊本や近代以降の翻刻のデータをオンライン目録で収録することを目指した。これによって、国内外の研究者にとって従来研究対象になりにくかった資料が、比較的簡単にアクセスできるようになった。これらの文献データの数は1000点以上に上り、新井弘順・福島和夫両氏(上野学園大学日本音楽資料室)が提案した分類方法では、約320種類の講式作品を分類したことになる。文献データの中で、講式の成立・展開・影響上特に重要と思われる作品は、講式全文のテキストファイルとリンクし、これによって初めて活字に起こしたものも少なくない。データベースはSGML-言語のアプリケーションとしてHTML 3.2をベースにして(後にHTML4.0に改めた)開発されたので、利用者が自分の都合で改造し拡大することもできる(例えば写本の画像ファイルを加える等など)。講式の場合、前近代のテキストが殆どなので、JISコードに入っていない所謂外字が特殊なソフトを使わずに表示できる為に、(一)外字に当たる漢音を仮名で表記し、(二)外字に該当する諸橋大漢和辞典の漢字番号を付けて、(三)外字を単純なIMGファイル(GIFファイル)として製作し、それをテキストファイルにリンクした。尚、データベースのアドレスは下記のとおりである。申請したのは、「『花園大学国際禅学研究所一字索引叢書』の開発ソフトに合うデータベースの作成」という計画であった。しかし、その後このソフトの普及性、応用性を詳しく検討した結果、次の結論を得た。花園大学データベースはSGML-言語をベースにして開発されており、外字管理の面では非常に優れた解決方法をとっているという長所の反面、このソフトを購入しないとアクセスできないという短所がある。できるだけ広範囲の研究者からのアクセスを可能にするという点を優先するなら、前者の長所をいくらか犠牲にしても、同じSGML-言語系のHTMLベースが望ましいと思う。HTML言語は、今のところは外字使用は不可能であるが、インターネットの一般ブラウザ-で利用できるという大きな利点がある。具体的には、講式に頻出する外字を次の様に処理した。即ち、(1)表記統一によって、出来る限りJISコードに入っている漢字に置き換えた。(2)JISコードに入っていない外字を単純なIMGファイル(GIFファイル)として製作し、それをテキストファイルにリンクした。(3)IMGファイル(GIFファイル)を処理できないブラウザ-の為に、外字に該当する諸橋大漢和辞典の漢字番号も付けた。このように、外字問題は取り敢えず解決したので、次にHTML言語でデータベースを作製した。全体の構造は既にできあがっているが、検索できる科目が少ないので、未だ公開には踏み切っていない。データベースは複数のレベルに分けられ、各レベルの文書は一段上のレベルによって繋げられて検索できるようになっている。データ通信時間を短縮する為に、グラフィック要素を最小限にして、長いファイルは分けた。HTML言語としてはHTML3.2を選んだが、特殊なブラウザ-でしか利用できない要素を使用しないように注意を払った(殆どのファイルはHTML2.0応用のブラウザ-でも利用できるはず)。試験段階のデータベースは、日本で主に使用されているブラウザ-(2種類)でチェックした。データ入力も順調に進んでおり、計画した講式索引のうち、永観作講式の索引一冊(約120頁)が完成した。

昨年度と同様に、今年度も七月に、現地調査のため関西に出かけた。今回は京都市の高山寺のほか、和歌山県の高野山大学も訪ねた。この頃ちょうど取りかかっていた講式の作品研究に関して、現地で複数の写本が閲覧できたことは、今年度の調査の大きな収穫であった。そこから得られた新しい成果を、調査から間もない八月後半に開かれた学術会議で口頭発表し、更に詳しい研究を続けて、二つの論文を纏めた。二つの論文とも、目下今印刷中である。今回の調査から得られた最も大きな発見は、複数作者の事実の解明であるが、これは、緻密な伝本調査によらなければ発見不可能であった。講式の中でもかなり流布している作品に『光明真言講式』という作品があって、これは古くから知道上人作か、もしくは明恵上人作とされてきた。明恵作説は、明恵が長らく暮らしていた高山寺に伝わっていた説だったが、作品の内容そのものに明恵とは思えない部分が沢山含まれていた為に、こちらの説は、これまで積極的に取り上げらることはなかった。データベースに入れる為に調査したところ、様々な形で伝わってきた『光明真言講式』は、主に五段式と三段式に分けられることが判った。あまり流布していない三段式は、これまでは五段式の略本であると考えられてきた。しかし今回の綿密な伝本調査によって、三段式は逆に五段式の元になっていたことが判り、しかもこの三段式の作者は、やはり明恵であることを証明することができた。データベース化の作業は急ピッチで進めているが、試験段階としてこの四月から公開に踏み切るつもりである。今回はまだデータの三分の一程度しか利用できないが、利用者の反応を参考にして改善作業に入りたい。(現在は公開に向けてデータベース以外のメニュ作り一人門編・ヘルプ等一をしている。)尚、データベースのアドレスは下記のとおりである。http://faculty.web.waseda.ac.jp/guelberg/koshiki/datenb-j.htm三年という研究期間の最後の年となったので、今年度は主にデータベース作製や公開に向けて作業を進めてきた。出来上がったファイルをサーバーに送り込む作業は、リンク等の有効性やソースの誤りを小まめにチェックする必要がある為に、非常に時間のかかる作業である。この作業を開始したのは昨年八月であるが、それ以来二月二十日の現時点までに、講式データ(313作品の、各講式に関する書誌学的データ、即ち伝本、翻刻、参考文献等)の全てを登録し終わり、伽陀データは、約750点の中の159点を、本文データは57点の異なる作品を、登録した。特に講式データの全てを公開したことによって、データベース作製の主な目的を果たし、これによって今後の講式研究全体に非常な便宜を与えることができたと思う。伽陀データは、例えば同じ伽陀がどの講式にあるかを細かく調べる際等、データベースの検索機能には欠かせないものであるが、まだ全てを作製し終わっていないのは、次の理由による。伽陀データは数が多い為に、いずれにせよ非常に時間がかかるが、データファイル作製には伽陀本文等が必要となるので、伽陀本文も含まれる講式本文入力後に作製した方が、伽陀データの作業過程を簡略にすることができる。
口腔内における実験的病巣感染の成立機序

動物実験においては、根尖病巣が原病巣である菌血症の発症が報告されている。一方、菌血症によって炎症歯髄に血行性感染が生じることは“アナコレーシス"として知られている。昨年度、私は実験動物の歯髄に熱刺激あるいはリーマー挿入によって機械的な損傷を与え、同時に細菌培養液を伏在静脈に注入して菌血症を誘発すると、損傷程度が大きい歯髄に血行性由来の細菌が定着し、その定着率は細菌の種類によっても大きく異なることを報告した。“病巣感染"の原病巣として口腔内感染症が多いことは以前から指摘されていたが、同一口腔内に第2疾患が生じる可能性については明らかでなかった。そこで本年度は根管内に細菌を接種して根尖病巣を作成し、それが同一口腔内の損傷歯髄に及ぼす影響を検討することを目的とした。実験はまだ継続中であるが、現在までネコ5匹を用いて予備実験を行った。感染根管(根尖病巣)は抜髄・根管拡大後、細菌培養液(S.aureus単独、Enterococcus単独、あるいはS.aureus+Enterococcus)を接種して作成した。1週間後、残りの被験歯にリーマーを挿入して損傷を与え、二重仮封した。4週間後に損傷を与えた被験歯の根管内細菌検査を行ったが、いずれも陰性であった。また、実験終了時までに菌血症の発症は確認できなかった。今後は菌血症を生じうる病態や起炎菌について詳細に検討し、根尖病巣の作成に用いる菌種および損傷歯髄の作成方法による差異について検討を加えていく予定である。今年度は、血行性感染の発生頻度に対する歯髄組織の損傷程度および菌血症を引き起こしている細菌種の影響を検討するため、ネコ14匹を用いて動物実験を行った。被験歯は歯髄の損傷程度の影響を調べるため、未処置群、熱刺激群およびリ-マ-挿入群の3群に分けた。そして歯髄刺激終了後30分以内にE. coli、Str. sanguis、S. aureus、group D EnterococcusあるいはP. aeruginosaのうち、いずれか1種類の細菌を2.5ml伏在静脈に注入した。その1週間後に各被験歯の根管内容物を採取して、静注した細菌の定着率を検討した。また熱刺激およびリ-マ-挿入による歯髄の損傷程度を観察するため、2匹のネコを歯髄刺激直後に屠殺して、病理組織標本を作成した。得られた結果は以下の通りである。1.未処置群すなわち正常歯髄にはいずれの菌種もまったく定着しなかった。熱刺激あるいはリ-マ-挿入によって損傷を与えた歯髄(根管)には静注した細菌が定着し、その頻度は菌種および歯髄の損傷程度によって異なっていた。2.損傷歯髄に対して、S. aureus EnterococcusおよびP. aeruginosaは44.488.2%と高い頻度で定着したが、E. coliおよびStr. sanguisの定着率はいずれも10%以下であった。3.歯髄全体に損傷が加えられたリ-マ-挿入群における各細菌の定着率は平均46.1%(7.788.2%)であった。また冠部歯髄が壊死に陥っているものの根部歯髄がほぼ正常である熱刺激群は、リ-マ-挿入群よりも定着率が低い傾向が見られ、平均35.4% (060.0%)であった。Enterococcusでは危険率5%で両群間に有意差が認められた。以上の結果より、歯髄の損傷程度が大きいほど血行性由来の細菌が定着しやすく、また菌血症の細菌の種類も重要な因子であることが示された。
新しいムチン関連癌抗原コア蛋白の遺伝子クロ-ニングと臨床応用への基礎

ムチンは巨大糖蛋白分子として知られており、これまでに多くの研究が展開されてきた。しかしその分子の本態に関する理解は十分ではなかった。一方、この10数年間に癌抗原に対する無数のモノクロ-ナル抗体が作製されてきたが、その中でも臨床応用上有用とされるモノクロ-ナル抗体の多くが、ムチン分子上のエピト-プを認識していることが明らかとなってきた。注目すべきことにムチン分子は現時点でも最低4種の分子種に分けられており、これらはMUCー1,2,3,4geneと命名されるようになった。それぞれ20個前後のアミノ酸がタンデム・リピ-トしているユニ-クな構造を有している。我々は胃癌患者腹水から得た高分子画分を免疫原としてモノクロ-ナル抗体MUSE11を確立したが、最近この抗体がMUCー1遺伝子産物と反応していることが判明した。さらに合成ペプチドを用いてエピト-プマッピングを行ったところ、MUSE11はMUCー1コア蛋白の特定の領域に反応していた。興味深いことに、この抗体は癌部組織と強い反応性を示し、非癌部ではコア蛋白上の糖鎖によりエピト-プがかくされている可能性が示唆された。逆に癌部においては糖鎖の変化によりエピト-プが露出しており、その部位にモノクロ-ナル抗体MUSE11がアクセスしやすい可能性がある。次にMUCー1遺伝子cDNAをクロ-ニングして、リコンビナント蛋白を産生させ、これを用いて第二世代のモノクロ-ナル抗体の作製を試みた。これまでにいくつかの抗体を得ているので、その性状について引き続き検索中である。
ヒューム・ロザリー則の機構解明とそれを応用したAl-基熱電材料の創製

本研究はHume-Rothery則の理論的解釈を第一原理バンド計算で明らかにし、Hume-Rothery合金群がフェルミ準位に擬ギャップを持つ特徴を活かして準結晶・近似結晶、Fe_2VAl系における熱電特性を評価した。得られた成果を以下に示す。(1)Al-Li-cu近似結晶の電子構造をLMTO-ASA及びNFE近似で計算し、擬ギャップが(631),(543),(710),(550)zoneとフェルミ面の相互作用で生じていることを証明し、Hume-Rothery則の物理的解釈を与えた。(3)Fe_2VAl系ではAlのSi置換及びVのTi、Mo置換でゼーベック係数を正から負(-140μV/K)へと大きく変化させることに成功した。Fe_2VAlではVサイトに入ったFeが作り出すスピン揺らぎが比抵抗を増大させ熱電特性の劣化を生んでいる。そこで、FeをRuで置換した系において磁化が激減するのに伴い、低温の比抵抗及び磁気抵抗ともに急激に減少することを示した。これより熱電特性の劣化はVサイト上のFe原子による磁気欠陥が原因と結論した。(2)Al-Re-Si,Al-Mn-Si,Al-Pd-Mn-Re-Si,Al-Mn-Re-Si系近似結晶を合成し電子比熱係数とゼーベック係数、比抵抗、熱伝導度の温度依存性を詳細に解析し、フェルミ準位における擬ギャップ構造と熱電特性の関係を明らかにした。特定の電子濃度において特定の相が安定化することを指摘したHume-Rothery則は70年以上にわたって冶金学の黄金則として合金設計に利用されてきた。本研究はこの経験則が何故成り立つかを理解し、この機構で安定化する物質がフェルミ準位に擬ギャップを形成することを活用して新しい熱電材料の創製を図ることが目的としている。本年度の研究実績を以下に示す。(1)Al-Li-Cu近似結晶の電子構造をLMTO-ASA法及びNearly Free Electron近似で計算し、系を安定化させるフェルミ準位に生成する擬ギャップが(631), (543),(710), (550) zoneとフェルミ面の相互作用で生じていることを実証し、これまで経験則として使われて来たHume-Rothery則の物理的解釈を与えることに成功した(佐藤、竹内、水谷)。(2)Al-Re-Si近似結晶を作成しその擬ギャップ構造をバンド計算と高分解能光電子分光法で精査し、同時にゼーベック係数を測定しフェルミ準位における擬ギャップ構造と熱電特性の関係を明らかにした(竹内、生田、水谷)。(3)Fe_2VAl系では擬ギャップ内のフェルミ準位をAlのSi置換及びVのTi、Mo置換で移動させゼーベック係数を正から負(-140μV/K)へと大きく変化させることに成功した(西野、水谷)。(1)Al-Li-Cu近似結晶の電子構造をLMTO-ASA及びNFE近似で計算し、擬ギャップが(631),(543),(710),(550)zoneとフェルミ面の相互作用で生じていることを証明し、Hume-Rothery則の物理的解釈を与えた。(2)Al-Re-Si,Al-Mn-Si,Al-Pd-Mm-Re-Si,Al-Mn-Re-Si系近似結晶を合成し電子比熱係数とゼーベック係数、比抵抗、熱伝導度の温度依存性を詳細に解析し、フェルミ準位における擬ギャップ構造と熱電特性の関係を明らかにした。
口腔癌切除後の言語機能に関する研究

今回の研究は、舌・口底・下顎骨の切除を受けることの多い口底癌切除後の構音機能について検討し、これからの手術法や術後のリハビリテーションに役立てることを目的に行った。対象および方法:1985年4月より1997年12月までに、当科で手術を行い言語機能を評価することのできた口底扁平上皮癌16例について、100音節語音発語明瞭度検査、原発巣の切除範囲、/ka/構音時のエコー所見、/i/および/ata/構音のパントグラム所見について検討し、以下の結果を得た。1)口底部の切除面積が大きい症例ほど、発語明瞭度が低くなっており負の相関関係が認められたが、下顎骨の切除面積は、発語明瞭度に影響は少なかった。2)口底部のpull-through症例は、切除面積が少なくても発語明瞭度が低くなる傾向があった。3)/ka/構音時のエコーによる舌運動所見では、舌最大運動量、舌運動左右差と発語句明瞭度との関連は認められなかったが、舌運動時間と発語明瞭度で負の相関関係が認められた。4)/i/構音時のパラトグラム所見では、再建方法が同様であれば、口底部の切除面積が大きい症例ほど形態が非対称になり、接触面積の減少が認められた。5)/ata/構音時の経時的変化におけるパラトグラム所見では、再建方法が同様であれば、口底部の切除面積が大きくなるにつれて、接触点数の最大接触時から開放までの時間が長かった。以上の結果より、口底癌の術後構音機能は、構音時の舌の形態および運動時間に障害を及ぼすため、手術または、術後補綴に際しては、舌の少ない動きで構音ができるような固有口腔の狭小化を図るべきと考えられた。
視覚障害者のための画像処理方式の研究開発および3次元グラフイックス処理の基礎研究

全盲者へのグラフィックスと画像の提示システムをそれぞれ完成した。具体的なシステムと今年度行った内容は以下の通りである。1.パソコン画面の凸点画ハードコピーシステム全盲者が自らパソコンカラーグラフィックスを行うことをサポートするためのシステムである。すなわち、カラー画面の忠実な凸点画ハードコピーをCOPYキ-操作でいつでも取得できるため、全盲者自らがC言語のグラフィック機能を使ってCRT画面上にカラー図形を作成することができるようになる。これは前年度(平成6年度)に完成し、今年度はプログラムのデバッグや微修正を加えて稼働テストを行い、学会発表や論文発表を行ってきた。2.カラー画像の点画像変換編集システム(UNIXワークステーション版)本システムは今年度には入ってから取り組んだものである。これは写真や風景などのイメージ構想を全盲者にできるだけ正確に提示することを目的に試作したシステムである。したがってこれは晴眼者が操作することを前提としている。イメージスキャナーやビデオカメラなどから読み込んだ原画像を全盲者にも触察できるような特徴抽出イメージに変換後凸点画像として点字プリンタに出力する。できるだけオリジナル画像の正確さを失わずかつデフォルメされていない画像を抽出提示するために画像処理技術を適用する。このために画像反転、グレースケール変換、エッジ検出、しきい値処理(2値画像処理)、回転、スケール、凸点変換出力を中心とした機能を作成利用した。最後にまとめとして、それらの研究発表および論文作成を行った。政治情勢および納入業者の選定等の事情により主要設備備品の導入予定(8月末)が大幅に遅れて、11月になった。これにより必要設備(Indy他)の稼動は11月以降にずれ込んだ。したがってこの時点までに手元のパソコン画面を利用した容易なカラーグラフィックスクリーンの点画変換プログラムの作成から始めた。これは今後行う、より複雑なカラー画像解析のための技術的基礎とするものである。画像解析に点字プリンタプロッタがどの程度有効か、およびカラーの扱いはどのように行うべきか、といった基本的な手法の可能性を調べた。そしてパソコングラフィック画面の点画ハードコピー常駐型プログラムとして完成、フリーソフトとして一般公開した。さらにIndyシステム(OS:UNIX)を利用しての画像処理システムの構築に取り掛かり、現在までに基本調査と基本設計を行った。処理の流れは以下の通りである。(入力)→(処理)→(出力)(入力)カラーイメージスキャナーおよびビデオカメラ(処理)各種画像解析処理、画像-凸点変換処理(出力)点字プリンタプロッタ、レーザプリンタ+立体コピー機またビデオカメラからの入力画像の精度と分解能などの性質、ウインドウシステム上でのプログラミング手法、点字プリンタプロッタとのインタフェースの整合性とプログラミング、イメージスキャナーとのインタフェースの整合性とプログラミング、画像解析手法の調査と獲得を行った。グラフィックスと画像の提示システムをそれぞれ完成した。(1)パソコン版画面の点画ハードコピーシステム全盲者が自らパソコンカラーグラフィックスを行うことをサポートするためのシステムである。すなわち、カラー画面の忠実な凸点画ハードコピーをCOPYキ-操作でいつでも取得できるため、全盲者自らがC言語のグラフィック機能を使ってCRT画面上にカラー図形を作成することができることを可能とする。これは前年度(平成6年度)に完成し、今年度はプログラムのデバッグや微修正を加えながら稼動テストを行い、学会発表や論文発表にも力を注いだ。(2)カラー画像の点画像変換編集システム(UNIXワークステーション版)本システムは今年度に入ってから取り組んだものである。これは写真や風景などのイメージ構造を全盲者にできるだけ正確に提示することを目的に試作したシステムである。これは晴眼者が操作することを前提としている。イメージスキャナーやビデオカメラなどから読み込んだ原画像を全盲者にも触察できるような特徴抽出イメージに変換後、凸点画像を点字プリンタで作成する。できるだけオリジナル画像の正確さを失わずかつデフォルメされていない画像を抽出提示するためには画像処理技術を適用する。

このために画像反転、グレースケール変換、エッジ検出、しきい値処理(2値化処理)、回転、スケール、凸点変換出力を中心とした機能を作成利用した。最後にまとめとしてそれらの研究発表および論文作成を行ってきた。
Transgenic mouseを用いた発癌の組織特異性に関する研究

リンパ球系の腫瘍発生に関与しうる遺伝的背景が存在するのかどうかを解析するため、免疫グロブリンH鎖エンハンサー(Emu)によって活性化されたmyc遺伝子(Emuーmyc)を2つの異なった近交系マウス、すなわちC57BL/6マウスとC3Hマウスに導入しトランスジェニックマウスを作製した。用いたEmuーmyc遺伝子も、完全なmyc遺伝子を含むもの(Emuーmyc)とプロモーターと第1エクソンを欠いているEmuーDELTAmycを準備した。作製したトランスジェニックマウスの解析から、発症年令はどちらの遺伝子を用いても生後48週であり、従って近交系では発症が早く、交雑系やクローズドコロニーでは発症が遅くなることが分かった。また、C57BL/6マウスではBリンパ腫が、C3HマウスではTリンパ腫が多発することを明らかにしていたが、これは導入した遺伝子発現の違いによるのではなく、リンパ球の育つ環境によって決定されることが分かった。即ちC57BL/6由来のリンパ球であってもC3Hマウスの個体内で育つとTリンパ腫が発生しやすくなることが分かった。昨年度迄に、B型肝炎ウイルス(HBV)による肝炎・肝癌の発症機構を明らかにするため、HBVを肝で複製しうるトランスジェニックマウスの作製に成功していた。このマウスにおいてウイルス粒子が形成されマウス血中に分泌されているかどうかを電顕的に解析したところ、約42nmのDane粒子が血中に存在することが分かった。更に、この粒子がヒト胎児肝細胞に感染しうるかどうかを解析したところ、感染しHBs抗原を作り出すことが分かった。ウイルスを産生しているマウスにおいて、肝炎等が生じるかどうかを生後2年近くまで解析しているが、全く肝細胞には障害がおこっていないことが明らかとなった。このことは、肝炎が免疫学的機序に基づいておこっていることを示唆している。
初期胚において多繊毛細胞の分化・成熟・機能を制御する新規シグナル伝達経路の同定

多繊毛細胞は脊椎動物の様々な器官の上皮に存在し、数百本の運動性繊毛により上皮表面に沿った液流を引き起こす。我々は、Rasシグナル経路によって転写抑制を受ける分子として以前同定していたmab21-l3が、多繊毛細胞分化とイオノサイト分化の初期段階に必須の因子であることを示した。また、MAPKキナーゼファミリー分子ERK7がアクチン制御分子CapZIPのリン酸化を介して繊毛形成を制御することを示した。mab21ファミリー分子であるmab21-l3は、脊椎動物で保存された機能不明のタンパク質である。これまで我々は、アフリカツメガエルのmab21-l3が、初期胚表皮において多繊毛細胞とイオノサイトに発現していること、mab21-l3の機能を阻害すると、多繊毛細胞とイオノサイトの形成が阻害されることを見出していた。そこで、mab21-l3の機能阻害が多繊毛細胞やイオノサイトの初期の分化過程を阻害するかどうか検討したところ、原腸胚中期において両方の初期分化マーカーの発現が低下していることがわかった。さらに、イオノサイトが含まれないマウス気道上皮細胞の初代培養系において、mab21-l3の機能阻害によって多繊毛細胞の数が減少するが基底細胞の数は殆ど変化しないこと、mab21-l3の発現がNotchシグナルによって負に制御されることを見出した。加えて我々は、アフリカツメガエルのMAPKファミリー分子ERK7の機能を阻害すると、多繊毛細胞に存在する繊毛の形態が異常になることをこれまで見出していた。そこで、繊毛形成に必須であることが知られていたアクチン制御分子CapZIPに着目して解析を進め、ERK7の機能阻害胚における多繊毛の形態異常が、CapZIPのリン酸化模倣変異体の過剰発現によって部分的にレスキューされることを見出した。従って、ERK7が少なくても部分的にはCapZIPのリン酸化を介して、多繊毛の形成を制御することが示唆された。MAPKファミリー分子であるERK7は、無脊椎動物から脊椎動物まで進化的に保存されているにも関わらず、その生理的機能は長らく不明であった。これまで我々は、アフリカツメガエルのERK7ホモログが初期胚表皮多繊毛細胞などの繊毛細胞に特異的に発現すること、ERK7が多繊毛の形成を制御することを示し、その分子機構の一端として、ERK7がWntシグナルの細胞内中継分子Dishevelledを介してアクチン制御因子CapZIPのリン酸化を促進することを見出した。そこで、ERK7による多繊毛形成の分子機構をさらに詳細に明らかにするため、酵母ツーハイブリッド法によって同定していたERK7結合候補分子およびその近縁分子の解析を行なった。ERK7結合候補近縁分子のアフリカツメガエル初期胚における発現パターンをホールマウントin situ hybridizationによって調べたところ、表皮や体節等の様々な組織において発現が観察された。さらに、ERK7結合候補近縁分子に対するモルフォリノオリゴをアフリカツメガエル初期胚にインジェクションすると、繊毛の形成が阻害されたことを示す表現型が得られた。さらに、ERK7とは別の機能不明キナーゼ分子のモルフォリノオリゴをアフリカツメガエル初期胚の腹側割球にインジェクションし、尾芽胚期まで培養すると、表皮形成不全が観察された。この表現型は、以前我々が多繊毛細胞やイオノサイト形成の必須因子として同定したmab21-l3のノックダウンによる表現型と類似していた。昨年度までの主な研究対象であったmab21ファミリー分子mab21-l3およびMAPKファミリー分子ERK7以外の分子の機能解析に着手することができた。これまで我々は、アフリカツメガエルのmab21ファミリー分子mab21-l3が、初期胚表皮において多繊毛細胞とイオノサイトに発現し、これらの細胞の分化に必要であることを見出していた。そこで、mab21-l3が機能する時期について詳細に検討したところ、遅くても原腸胚中期にはmab21-l3がこれらの細胞の分化に必須となることがわかった。さらに、マウス気道上皮細胞の初代培養系において、mab21-l3の機能阻害によって多繊毛細胞の数が減少するが基底細胞の数は殆ど変化しないことを見出した。加えて我々は、アフリカツメガエルのMAPKファミリー分子ERK7の機能を阻害すると、多繊毛の形態が異常になることをこれまで見出していた。そこで、繊毛形成に必須であることが報告されていたアクチン制御分子CapZIPに着目して解析を進め、ERK7が少なくても部分的にはCapZIPのリン酸化を介して機能することを見出した。さらに、酵母ツーハイブリッド法によって同定したERK7結合候補分子およびその近縁分子の解析を行なった。ERK7結合候補近縁分子に対するモルフォリノオリゴをアフリカツメガエル初期胚にインジェクションすると、繊毛の形成が阻害された。このようなモルフォリノオリゴによるノックダウンの表現型が特異的であることを示すために、CRISPR/Cas9によるゲノム編集の実験系の立ち上げに着手した。さらに、ERK7とは別の機能不明キナーゼ分子のモルフォリノオリゴをアフリカツメガエル初期胚にインジェクションすると、表皮形成不全が観察された。この表現型はmab21-l3のノックダウンによる表現型と類似していたが、詳細に検討したところ表皮の細胞接着に異常が見られることが判った。さらにマイクロアレイおよびプロモーター解析によって、キナーゼの下流で働くと予想される転写因子を同定した。

多繊毛細胞は脊椎動物の様々な器官の上皮に存在し、数百本の運動性繊毛により上皮表面に沿った液流を引き起こす。我々は、Rasシグナル経路によって転写抑制を受ける分子として以前同定していたmab21-l3が、多繊毛細胞分化とイオノサイト分化の初期段階に必須の因子であることを示した。また、MAPKキナーゼファミリー分子ERK7がアクチン制御分子CapZIPのリン酸化を介して繊毛形成を制御することを示した。当初の研究目的であった、mab21ファミリー分子mab21-l3およびMAPKファミリー分子ERK7の機能解析を進め、それぞれ論文として発表することができた。ERK7結合候補分子およびその近縁分子が繊毛形成を制御する分子機構を詳細に調べる。機能不明キナーゼ分子のノックダウンによる表皮形成不全と多繊毛細胞形成等の関連について検討する。生物科学mab21-l3が多繊毛細胞分化を制御する分子機構、およびERK7が繊毛の形態を制御する分子機構を、より詳細に解析する。mab21-l3やERK7以外で多繊毛細胞に発現する可能性がある遺伝子の機能解析を行なう。アフリカツメガエル胚の多繊毛が外部に露出していることを利用して、繊毛の形態を制御する細胞外刺激の探索を検討する。予定通り研究が進み、試薬等の消耗品の購入が少なかった。また、情報収集等のために学会出張を予定していたが、日帰り可能な神戸市で学会が開催されたため宿泊費等が不要となり、旅費が少額で済んだ。当初の予定よりも効率よく研究が進み、投稿した論文の受理に至ったため、試薬等の消耗品の購入が少なかった。また、情報収集のために学会出張を予定していたが、情報収集なしで研究を進めることが出来たため、旅費を使用しなかった。次年度は、プラスミド抽出試薬、RNA抽出試薬、qPCR関連試薬、in situ hybridization関連試薬、モルフォリノオリゴ、実験動物(アフリカツメガエル)などの購入に使用する。研究の進行状況に応じて、学会などにおける情報収集や発表のための旅費、論文の出版費用等に使用する。次年度は主に、プラスミド抽出試薬、RNA抽出試薬、qPCR関連試薬、in situ hybridization関連試薬、モルフォリノオリゴ、実験動物(アフリカツメガエル)などの購入に使用する。研究の進行状況に応じて、学会などにおける情報収集や発表のための旅費に使用する。