hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
看護職員による禁煙支援活動の促進

健康に及ぼす影響が甚大な「喫煙」について、保険医療職者の最大数を占める看護職者が担う役割が大きいことに注目し、母性・産科看護領域において禁煙支援活動をいかにして促進できるかを探求した。その結果、看護職者は健康影響には無関心ではないものの、喫煙の健康影響や禁煙支援に関わる技術の知識・技術が十分に修得されていない点、近年の産科医療を巡る社会的課題により業務多忙である点があきらかになり、継続的効果的な支援の実現に向けた課題を示すことができた。平成18年度は、以下をリサーチクエスションと定めた研究の1年目であった。1)<保健医療の専門職としての意識の育成にむけて>「なぜ我が国の看護基礎教育・臨床現場では「喫煙するべきではない」という保健医療専門職として望ましい意識が育成されないのか」2)<禁煙支援に関する専門知識・技術の向上と禁煙支援実践の促進にむけて>「何が禁煙支援に関する専門知識の修得を促進し、禁煙支援の実践を促進するのか」我が国の看護基礎教育における現状を客観的に把握するために、禁煙治療先進国であるアメリカ合衆国における禁煙治療・禁煙支援に関わる看護職者の活動状況、基礎教育課程にある看護学生の禁煙治療に対する意識を比較対照とする調査実施に向け実際的に検討した。アメリカ合衆国、カリフォルニア大学ロサンジニルス校のPr.Linda Sarnaと綿密に調整を進めた結果、日米では基礎教育のシステムや個人情報に対する意識の違いが大きく、当初計画での遂行は困難であり調査方法の修正が必要であることが判明し、海外調査は延期とした。現在我が国では健康意識の向上に伴い、受動喫煙防止(健康増進法)の徹底、禁煙治療の診療報AM制度の組み入れ、病院機能評価の喫煙対策項目の強化徹底等が急速に進み、看護職者の専門職者としての意識の形成に対する強い交絡因子と考えられ、因果関係を捉えるための相応の戦略を検討した。次年度は、「禁煙支援」を健康増進・疾病予防介入と定義し、望ましい専門意識形成の促進/阻害要因と介入実践の促進に関する検討を、出産を取り巻く健康の側面に関与することの多い母性・母子保健領域に焦点を当て、実現可能かつ妥当性の高い調査方法に計画を修正して実施する。日ごとに喫煙の健康影響に関するエビデンスが増し健康保持に対する禁煙の重要性が高まるが、保健医療職最大数を占める看護職が行う禁煙介入は芳しくない。しかしながら、喫煙に関する一般住民の意識の高まりや受動喫煙防止対策の厳重化、「禁煙治療」の診療報酬化、病院機能評価の喫煙対策基準の更新などの社会的要請があり、日々対象者の健康を査定し看護を提供する臨床看護職者の役割に意識的・無意識的に変化が生じていることは想像に易しい。従来研究目的と掲げた看護職者による禁煙支援の促進をもたらす要因と考えるべきである。看護職者が喫煙患者の禁煙を支援する役割を担うことは保健医療専門職の職務上前提といえる。その実現のためには、広く禁煙支援を担う医療職者の状況を把握するなかから、看護職者に求められる役割、その独自の専門性ゆえに可能でかつ効果の期待できる独自の禁煙支援戦略を明らかにすることが重要である。このことは、我が国の保健医療の場では従属的立揚になりがちながらも禁煙支援を主体的に担っていくことを促進することにつながると考える。今年度は、海外における調査研究に代わってそこでの喫煙事情とそれに関わる看護職者の活動状況を概観し議論を重ね、国内の禁煙支援実践者との交流を深め意見交換をおこなった。我が国では喫煙に寛容な認識が根強い点もあるが、禁煙治療の周知や独自の保健医療制度が住民の病院へのアクセスを容易にしている点などの効果的な禁煙支援の展開を考える上での利点も見いだせた。さらには、最大保健医療職種という利点をいかした看護職者による効果的な禁煙支援法略を検討することが課題になっている。平成18年度から20年度の3年間にわたる研究活動の最終年度であった。平成20年度は、看護職者が行う禁煙介入の中で特に促進の緊急性が高い妊婦を対象とした禁煙介入の実状を明らかにし、具体的な禁煙支援活動の促進につながる課題を検討することを研究活動の目的として取り組んだ。研究計画に準じ研究活動を進める中で、4-9月に行った複数の妊婦健康診査を実施している施設の実状の調査の結果、明らかに看護職者による喫煙問題や禁煙支援介入への情報の不足と施設環境の未整備が指摘できた。さらに、5-9月に、国内の看護職者による禁煙支援を検討している研究者との情報交換も進め、具体的な介入促進への課題が、看護職者の情報・技術不足が明らかにできた。これらの活動と平行して、このことに関する論文作成を進め、11月に完了、12月に投稿に至った(現在査読者とのやりとり中である)。さらに、これらの成果に基づき、実際に母子保健活動に携わる医療機関従事の看護職者対象として情報提供を行うこととして、3月に実施し、研究が完了となった。
増殖型ウィルスを用いた遺伝子治療ベクターの搬送システム

テトラサイクリン誘導プロモーターを用いた制限増殖型アデノウィルス(AdTRE-E1)を作成した。同ウィルスとテトラサイクリンプロモーター結合蛋白(TREBP)が共存する条件下で、テトラサイクリンを培地中に添加するとプロモーターが活性化され、同ウィルスの増殖を認めた。よって上記のシステムを用いることにより、テトラサイクリン添加の有無でウィルス増殖のタイミングを任意に制御することが可能となった。また、同プロモーターはテトラサイクリン非存在下では活性化されないことからヒト線維芽培養細胞内で安定的に存在した。次のステップとして上記システムに治療用の制限増殖型アデノウィルス、テロメラーゼプロモーター依存性アデノウィルス(AdTERT-E1)を併用し、ヒト線維芽培養細胞をウィルス担体として用いる方法を検討した。同細胞に上記システムを導入した上で、さらにAdTERT-E1を共感染させたところ、テトラサイクリンの非存在下では細胞障害性を認めなかった。しかし、一旦テトラサイクリンを培地中に添加すると、AdTRE-E1ウィルスだけでなく治療用ウィルス、AdTERT-E1も同様に増殖した。添加後72時間の経過で細胞障害性を認め、担体であるヒト線維芽培養細胞を破壊して、ウィルスは培地中に放出された。ウィルスを含む培地の一部をヒト肺癌細胞培養シャーレに添加すると、テトラサイクリン非存在下においても治療用ウィルスの自律的増殖が認められ、肺癌細胞への細胞障害性を発揮した。このシステムはヌードマウス腹腔内に移植した状態でも同様に機能し、飲水内にテトラサイクリンを混入しておくことで、腹腔内におけるAdTRE-E1の増加が観察された。以上の結果から、上記のシステムはin vivoにおいても機能しておりウィルス担体として使用できる可能性が示唆された。薬剤誘導プロモーターを用いた制限増殖型ウィルスの作成とプロモーターフィデリティの検証:E1およびE3領域を除去した非増殖型アデノウィルスにテトラサイクリン誘導プロモーターの制御下にE1A遺伝子を発現するカセットを組み替えて制限増殖型アデノウィルスを作成した(AdTRE-E1)。ヒト線維芽細胞WI38にAdTRE-E1およびTRE結合蛋白発現アデノウィルス(AdTREBP)を共感染させ、培地にテトラサイクリンを添加後に細胞内におけるE1A遺伝子コピー数をTaqman PCR法によって定量化した。その結果、テトラサイクリン非存在下では増加がみられなかったが、添加後72時間で10^4倍の増加を認め、プロモーターの活性化を確認した。AdTRE-E1による細胞障害性の確認WI38細胞にAdTRE-E1およびAdTREBPを共感染させ、テトラサイクリンの添加による殺細胞効果をMTSアッセイおよびクリスタルバイオレットアッセイによって定量化した。その結果、テトラサイクリンの添加のタイミングに依存して殺細胞効果が認められた。また培地中の感染ウィルス粒子数も10^3倍の増加を認めた。癌治療用ウイルスの搬送テロメラーゼプロモーターを利用した癌治療用制限増殖型ウィルス(AdhTERT-E1)をAdTRE-E1およびAdTREBPとWI38細胞に共感染させ、テトラサイクリンを添加したところ3種のウィルスはいずれも増殖し、WI38細胞を破壊して培地中に放出された。培地の一部を肺癌細胞株H157細胞の培地に添加したところ、同細胞に明らかな殺細胞効果が確認された。この殺細胞効果はテトラサイクリンの非存在下でも観察され、AdhTERT-E1の自律的増殖による効果と考えられた。昨年度の研究により、テトラサイクリン誘導プロモーターを使用した制限増殖型アデノウィルスを作成し、in vitro実験系において同プロモーターが機能することを確認した。今年度は同ウィルスがin vivoにおいても同様に機能し、ウィルスの増殖を誘導できるかどうかについて検討を行った。

動物モデルとしてヌードマウス腹腔内にウィルスを感染させたヒト線維芽細胞由来のWI38細胞を移植した。WI38細胞には移植前にAdTRE-E1およびテトラサイクリンプロモーター結合蛋白発現ウィルスを共感染させた。マウスをA、Bの2群にわけ、B群では飲み水内にテトラサイクリンを混入した。移植後1週間の飼育の後に、マウス腹腔をPBSで洗浄し、同洗浄液中のウィルス量を定量化した。テトラサイクリン非投与群(A群)では腹腔内のウィルス量はウィルス非感染コントロールに比べて有意なウィルス量の増加はみられなかった。一方、B群では経時的にウィルス量は増加し、1週間後にはA群に比べて約100倍量のウィルス量の増加が観察された。また、組織学的には移植した線維芽細胞量は減少していた。テトラサイクリン誘導プロモーターを使用した制限増殖型アデノウィルスはin vivoにおいてもテトラサイクリンの投与によって同プロモーターの活性化およびウィルス増殖を制御することが可能であった。ウィルスの増殖はテトラサイクリン投与の時期に依存しており、増殖タイミングについても制御が可能であった。同ウィルスを治療用アデノウィルスと共感染させることで正常細胞をウィルスベクターの担体として使用できる可能性が示唆された。
間葉系幹細胞由来ヒト肝細胞の機能解析とその応用的利用法の検討

脂肪組織由来間葉系幹細胞に増殖因子群を添加することで機能的な肝細胞を得ることに成功した。これまでに、その細胞を四塩化炭素によって肝障害を与えたマウスに移植することで、肝機能の改善が確認された。その際に、実験のコントロールとして使用した未分化な間葉系幹細胞にもアンモニア濃度やGOT・GPTなどの肝障害マーカーの低下といった肝障害・機能の改善効果が確認された。つまり、未分化な脂肪組織由来間葉系幹細胞が肝機能改善に関わる因子を分泌しており、それによって肝機能が改善したと考えられた。そこで、サイトカインアレイを用いて、脂肪組織由来間葉系幹細胞が分泌している因子の同定を試みた。その結果、繊維芽細胞や骨髄組織由来の間葉系幹細胞と比較してIL-1Ralpha,IL-6,IL-8,G-CSF,GM-CSF,MCP-1,NGF,HGFなどのサイトカインや増殖因子の分泌量が多いことが示された。これらの因子は抗炎症作用や肝細胞増殖に関わるものであり、これらによって未分化な間葉系幹細胞を移植した際の肝機能の改善が誘導されることを示した。また、FGF4などの因子で間葉系幹細胞を前処理し、中胚葉系の幹細胞を内胚葉系の細胞へと誘導することで、肝細胞誘導の期間を短縮させた。これによって従来、肝細胞誘導に約5週間かかったところを13日間まで削減することに成功した。この方法を用いて得られた肝細胞は従来の手法によって得られた細胞と同等の機能を有していることを示した。未分化幹細胞の肝機能改善効果の確認や肝細胞分化期間の短縮法の確立によって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の肝障害治療へ応用への可能性が示された。間葉系幹細胞に由来する肝細胞の機能を明らかにするために肝機能の測定を行った。その結果、アンモニア代謝能とグルコース産生能においては確認ができたが、尿素合成能は有していないことが明らかになった。さらに肝臓の機能として重要な薬剤代謝に関与しているシトクロームP450の活性があることを特異的な基質を使用し、検出した。マイクロアレイを用いた解析結果より間葉系幹細胞由来肝細胞と正常ヒト肝細胞の発現プロファイルは酷似しており、肝機能に関わる遺伝子が誘導されてきていることが示された。薬剤など排出に関わる因子や血清中に分泌されるタンパク質、そして肝臓の構造を形成するのに必要な細胞外マトリックスなどをコードする遺伝子の発現が顕著に上昇していることがしめされた。これらの解析により間葉系幹細胞由来の肝細胞の機能と分化を確認した。また、この細胞の安全性を検討するためにマウス移植実験を行った。まず、急性肝炎を起こさせマウスに間葉系幹細胞由来肝細胞の移植をした。その結果、この細胞は障害を受けた肝臓に定着し、アンモニア分解などの肝機能を代替・支援することが確認された。間葉系幹細胞の分化能は若年のドナーからの細胞の方が分裂能及び分化能が優れているが、これを改善する方法として得られた間葉系幹細胞をセルソーターで分離することにより分化・増殖能の高い細胞だけを選別する手法の開発を行った。細胞膜抗原CD105の発現する細胞の割合が年齢などに応じて差があることから、CD105の発現している細胞分画だけを分離した所、均一な細胞形態を示す、分画を得ることに脂肪細胞に由来する間葉系幹細胞において成功した。この細胞を用いて肝細胞分化誘導を行うことで、分離する前と比較して高い割合で肝細胞分化を促すことに成功した。臨床の場において高齢者の方が再生医療による細胞移植治療や再構成された臓器の移植のニーズが高く、今回の分離方法は非常に有益であると考えられる。成体幹細胞における可塑性の特性はほとんど明らかになっていない。これまでに、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞からの肝細胞分化を証明した。そこで、肝細胞分化の原因となる遺伝子を同定するために、マイクロアレイを使用して間葉系幹細胞由来肝細胞の遺伝子発現プロファイルを調べた。発現が変化した遺伝子(1639クローン)の遣伝子セットを用いて間葉系幹細胞由来肝細胞で働いている遺伝子のネットワークの解析を包括的に検討した。クラスターリング解析によって、間葉系幹細胞由来肝細胞とヒト正常肝臓において発現している遺伝子の発現パターンが類似していることが示された。さらに、ジーンオントロジーや遺伝子のシグナルパスウェイの解析を行うことによって、間葉系幹細胞由来肝細胞で発現が上昇している遺伝子では補体の活性化や血液凝固などの代表的な肝機能に関わるカテゴリーの遺伝子が有意に出現していることが示された。興味深いことに、TwistやSnailなどの上皮間葉転換を誘導する遺伝子の発現量は分化が起こると減少することが示され、間葉系幹細胞からの肝細胞分化の過程で間葉上皮転換が引き起こされていることが示唆された。これらのデータは間葉系幹細胞とヒト正常肝臓の類似性を示しており、間葉系幹細胞の可塑性は細胞周辺の環境によって調節されていることを明らかにした。間葉系幹細胞由来肝細胞を使用することで肝機能の基礎生物学を研究するだけでなく、幹細胞を元にした治療への応用も期待できる。

その際に、実験のコントロールとして使用した未分化な間葉系幹細胞にもアンモニア濃度やGOT・GPTなどの肝障害マーカーの低下といった肝障害・機能の改善効果が確認された。つまり、未分化な脂肪組織由来間葉系幹細胞が肝機能改善に関わる因子を分泌しており、それによって肝機能が改善したと考えられた。そこで、サイトカインアレイを用いて、脂肪組織由来間葉系幹細胞が分泌している因子の同定を試みた。その結果、繊維芽細胞や骨髄組織由来の間葉系幹細胞と比較してIL-1Ralpha,IL-6,IL-8,G-CSF,GM-CSF,MCP-1,NGF,HGFなどのサイトカインや増殖因子の分泌量が多いことが示された。これらの因子は抗炎症作用や肝細胞増殖に関わるものであり、これらによって未分化な間葉系幹細胞を移植した際の肝機能の改善が誘導されることを示した。また、FGF4などの因子で間葉系幹細胞を前処理し、中胚葉系の幹細胞を内胚葉系の細胞へと誘導することで、肝細胞誘導の期間を短縮させた。これによって従来、肝細胞誘導に約5週間かかったところを13日間まで削減することに成功した。この方法を用いて得られた肝細胞は従来の手法によって得られた細胞と同等の機能を有していることを示した。未分化幹細胞の肝機能改善効果の確認や肝細胞分化期間の短縮法の確立によって、脂肪組織由来間葉系幹細胞の肝障害治療へ応用への可能性が示された。
蛍光検出高速液体クロマトグラフィーによるアラキドン酸代謝物の解析

アラキドン酸代謝物のリポキシゲナーゼ産物について定量化の検討を行った結果、85%アセトニトリルで溶出することが確認された。またアラキドン酸自身は95%で溶出されることが確認されたので、ステップワイズ溶出を用いてこれらの物質の同時測定を可能にした。この方法でバクトペプトンで浸潤したラット腹腔マクロファージからの刺激に伴って遊離されるアラキドン酸を測定した。刺激薬として発癌プロモーターのひとつであるフォルボールミリステートアセテートを用いた。その結果アラキドン酸代謝物のうちトロンボキサン産生が最も多く、次に6-ケトープロスタグランジンF_<1alpha>の産生が多かった。またアラキドン酸自身も遊離が認められた。またアラキドン酸の遊離は約1時間でほぼプラトーに達するのに対し、アラキドン酸代謝物はさらに産生が続いた。フォルボールミリステートアセテートはプロテインキナーゼCを活性化することが知られているので、プロテインキナーゼCの抑制薬として知られるH-7を用いた結果、有意な抑制を示し、この反応うにはプロテインキナーゼCの作用を介していることが示唆される結果が得られた。フォスホリパーゼA_2の抑制薬としてp-brom ophenacylbromide(BPB)の効果を調べたところ、5muMではアラキドン酸遊離をほとんど抑制せずTX産生を20%抑制した。50muMでは両者共に約40%抑制されたことから、BPBがTX合成酵素も抑制するのか、またはBPBに感受性の異なるフォスホリパーゼA_2が関与しているのかという疑問が生じた。この点については今後の検討課題である。
孤立した低質量原始星における物理・化学構造の診断：化学的多様性の標準を求めて

研究内容1.孤立した星形成領域B335の研究孤立した星形成領域B335の化学組成については、採用までの期間で研究してきた。申請年度にはB335で豊富にみられた飽和有機分子の生成環境を解き明かすため、原始星周りのガスの構造を解き明かす研究を行なった。具体的には、ALMA Cycle4で観測された高解像度観測データの解析を行った。この解析から、B335での回転構造を初めて検出するとともに、回転構造の内側の部分で多くの種類の飽和有機分子が生成されている描像を明らかにした。この成果は論文Astrophysical JournalLetters (2019)で発表するとともに、天文学会年会(2018年秋季年会, 2019年春季年会)や国際学会(NOEMA/30m Workshop,Workshop on Interstellar Matter)などで発表した。また同時に、今回明らかになった回転運動のより内側の構造を明らかにするために、現時点で可能な最高分解能での観測をALMAに提案し、採択された。さらに、B335で明らかになってきた孤立天体での化学組成が普遍的なものであるかを調べるために、別の孤立天体の化学組成を調べる観測をNOEMAに提案し、採択された。研究内容2.原始星誕生後の重水素濃縮度変化の研究原始星誕生後のHNCの重水素濃縮度の変化について、これまでの研究成果を共同研究者と共有し、HNC以外の分子との重水素濃縮度変化の違いや、hot corino/Warm-Carbon-Chain Chemistryの化学組成と重水素濃縮度の関連などについて議論を深めた。採用前までに進めた研究結果と申請年度での議論の内容を取りまとめ、学術論文をAstrophysical Journalに出版した。研究内容1の孤立した星形成領域B335の研究に関しては、観測のデータ解析とその成果の論文出版はほぼ予定通りに進めることができた。また、B335での物理構造をさらに細かく分解するための観測と、孤立天体での化学的特徴をより普遍的にとらえるための観測のいずれも採択されたので、次年度の研究に繋げるための準備も行うことができた。研究内容2の重水素濃縮度に関する研究に関しては、共同研究者との議論や論文出版時の修正に時間がかかり、昨年度から今年度にもちこしとなったが、2018年度内中に出版まで至ることができた。本年度は次の2つの柱で研究を進め、最終年度として研究成果全体をまとめる予定である。1. B335における化学的特徴を他の孤立天体で検証し、一般化する研究B335でみられるHot Corino化学とWCCCを併せもつ化学的特徴が、他の孤立した天体でも普遍的な特徴であるかを検証する。このために、他の孤立天体の化学組成をB335と同じ分解能で調べる観測をNOEMAとALMAに提案し、採択済みである。これらの結果を基に、孤立天体の化学組成の共通点を抽出することによって、B335で確認されたHot Corino化学とWCCCが共存する、「ハイブリッドタイプ」の化学組成が生み出されるメカニズムの解明につなげる予定である。2. B335で飽和有機分子が生成される物理要因を探る研究B335の原始星近傍で豊富に存在する飽和有機分子が、原始星からの輻射加熱やガス降着における衝撃など、どのような物理要因により生成されているかを明らかにする。このために、B335の原始星まわりのガスの構造を最高分解能で調べる観測をALMA Cycle6に提出し、すでに採択済みである。2018年度までの研究で、原始星回りのガスが回転しながら落下する構造の中で飽和有機分子が生成されており、さらに、分子の種類によっても分布が異なる様子が見えてきた。より高分解能で観測し、温度構造などをより精密に調べることで、飽和有機分子生成のための物理要因に制限をつける予定である。さらに、ガスが回転しながら落下する構造の内側では、将来的に惑星が誕生すると考えられる原始惑星系円盤が形成されていると考えられる。このような領域に、どのような飽和有機分子がもたらされているのかを調べることで、原始惑星系円盤での有機分子形成の初期条件を明らかにする研究につなげていく予定である。研究内容2.原始星誕生後の重水素濃縮度変化の研究

原始星誕生後のHNCの重水素濃縮度の変化について、これまでの研究成果を共同研究者と共有し、HNC以外の分子との重水素濃縮度変化の違いや、hot corino/Warm-Carbon-Chain Chemistryの化学組成と重水素濃縮度の関連などについて議論を深めた。採用前までに進めた研究結果と申請年度での議論の内容を取りまとめ、学術論文をAstrophysical Journalに出版した。研究内容1の孤立した星形成領域B335の研究に関しては、観測のデータ解析とその成果の論文出版はほぼ予定通りに進めることができた。また、B335での物理構造をさらに細かく分解するための観測と、孤立天体での化学的特徴をより普遍的にとらえるための観測のいずれも採択されたので、次年度の研究に繋げるための準備も行うことができた。研究内容2の重水素濃縮度に関する研究に関しては、共同研究者との議論や論文出版時の修正に時間がかかり、昨年度から今年度にもちこしとなったが、2018年度内中に出版まで至ることができた。本年度は次の2つの柱で研究を進め、最終年度として研究成果全体をまとめる予定である。1. B335における化学的特徴を他の孤立天体で検証し、一般化する研究B335でみられるHot Corino化学とWCCCを併せもつ化学的特徴が、他の孤立した天体でも普遍的な特徴であるかを検証する。このために、他の孤立天体の化学組成をB335と同じ分解能で調べる観測をNOEMAとALMAに提案し、採択済みである。これらの結果を基に、孤立天体の化学組成の共通点を抽出することによって、B335で確認されたHot Corino化学とWCCCが共存する、「ハイブリッドタイプ」の化学組成が生み出されるメカニズムの解明につなげる予定である。2. B335で飽和有機分子が生成される物理要因を探る研究B335の原始星近傍で豊富に存在する飽和有機分子が、原始星からの輻射加熱やガス降着における衝撃など、どのような物理要因により生成されているかを明らかにする。このために、B335の原始星まわりのガスの構造を最高分解能で調べる観測をALMA Cycle6に提出し、すでに採択済みである。2018年度までの研究で、原始星回りのガスが回転しながら落下する構造の中で飽和有機分子が生成されており、さらに、分子の種類によっても分布が異なる様子が見えてきた。より高分解能で観測し、温度構造などをより精密に調べることで、飽和有機分子生成のための物理要因に制限をつける予定である。さらに、ガスが回転しながら落下する構造の内側では、将来的に惑星が誕生すると考えられる原始惑星系円盤が形成されていると考えられる。このような領域に、どのような飽和有機分子がもたらされているのかを調べることで、原始惑星系円盤での有機分子形成の初期条件を明らかにする研究につなげていく予定である。
Bachファミリーによる細胞の増殖と死の制御

Bach2については,NIH3T3細胞での過剰発現実験を行いBach2は核排出シグナルを持ち通常は細胞質と核をシャトリングしていることを見いだした。酸化ストレスはこの核排出を特異的に抑え,Bach2の核への貯留を増強し,細胞死を誘発する。この際,Bach2はPMLボディー周辺に集積し,同部位での遺伝子発現を選択的に抑えた。したがって,Bach2は何らかの標的遺伝子の発現を抑制することにより細胞死へと細胞を至らしめることが推察された。さらに,Bach2のSUMO化がPMLボディー周辺への集積に関わることを見いだした。Bach2ノックアウトマウスを詳細に解析することにより,Bach2はBリンパ球の分化,特に成熟Bリンパ球から抗体産生形質細胞へ至る段階に必須であることを発見した。この分化段階では細胞死と増殖が極めて活発に起きることから,Bach2はこのような細胞応答にも関わることが予想された。Bach1に関しては,ヘムがBach1に直接結合してそのDNA結合を抑えるとともに核外排出を促進することを見いだした。Bach1は少なくとも4カ所のヘム結合部位を有する。残念なことにDNA結合阻害に関わるヘム結合部位は未だに同定できていない。しかし,核外排出を制御するヘム結合部位を決定することはできた。さらにBach1はストレス防御に重要なヘムオキシゲナーゼ1の発現を制御すること,また,血管平滑筋等では増殖にも重要であることを見いだした。今後は,増殖に関わる下流標的遺伝子を同定しその機能を理解することが重要となる。我々は,JunやFos, Mafといった癌関連転写活性化因子と拮抗し転写抑制を行うBach1およびBach2に着目し,TPA応答配列(TRE),Maf結合配列(MARE),酸化ストレス応答配列(ARE)などを介する遺伝子応答の生理的意義,およびその脱制御を理解することを目指した。本年度の研究から,Bach2は酸化ストレス応答性にアポトーシスを誘導すること,この過程でBach2は核内構造体であるPromyelocytic leukemia(PML)bodyに集積すること,そしてPML bodyにおける転写反応を抑制することを見いだした。一方,Bach1に関しては,同因子がヘムを直接結合すること,ヘムによりそのDNA結合活性が阻害されることを見いだし,ヘムによる遺伝子発現制御の実行分子であることを明らかにした。さらに,Bach1は酸化ストレス防御において重要なheme oxygenase-1(HO-1)の生理的な抑制因子であることをノックアウトマウスの解析から明らかにした。この成果は,酸化ストレス応答においてAP-1系の活性が重要であることを示すとともに,酸化ストレス応答機構の異常が様々な癌化の背景にあることを示唆する。さらに,転写制御とPMLなどが形成する核構造との関連を理解する上でも興味深いものである。我々は,JunやFos, Mafといった癌関連転写活性化因子と拮抗し転写抑制を行うBach1およびBach2に着目し,TPA応答配列(TRE), Maf結合配列(MARE),酸化ストレス応答配列(ARE)などを介する遺伝子応答の生理的意義,およびその脱制御を理解することを目指した。本年度の研究から,Bach2による酸化ストレス応答性アポトーシスの誘導には,核内構造体であるPromyelocytic leukemia (PML) bodyでの部位特異的転写制御が関与すること,そしてこの過程にはBach2のSUMO化が関わることを明らかにした。一方,Bach1に関しては,酸化ストレス防御において重要なheme oxygenase-1 (HO-1)の抑制に加え,細胞周期の進行にも関わることを見い出した。これまでの私たちの一連の研究から,Bach1やBach2は増殖や細胞死の制御に予想外な形で関与することが明らかになりつつあり,しかもBach1とBach2は構造上類似するにも関わらず生理的作用には特性が認められている。これら因子の機能をさらに追求することによりAP-1活性の形成機構とその生理的および病理的意義に関する理解が深まるものと期待される。

我々は,JunやFos, Mafといった癌関連転写活性化因子と拮抗し転写抑制を行うBach1およびBach2に着目し,TPA応答配列(TRE),Maf結合配列(MARE),酸化ストレス応答配列(ARE)などを介する遺伝子応答の生理的意義、およびその脱制御を理解することを目指した。Bach1に関しては,酸化ストレス防御において重要なhemeoxygenase-1(HO-1)のエンハンサー上の複合体形成をクロマチン免疫沈降法などを用いて詳細に検討した。その結果,遺伝子誘導とともにエンハンサーに結合したBach1/Maf抑制複合体からBach1が解離し,代わりにNrf2などの活性化パートナーがリクルートされることを証明した。同様の動態は赤芽球分化過程におけるグロビンエンハンサーでも観察された。Bach1は線維芽細胞の増殖に必須であるが,DNAアレイ解析を行い,線維芽細胞におけるBach1の標的遺伝子候補をいくつか同定した。一連の研究から,Bach1やBach2は増殖や細胞死の制御に予想外な形で関与することが明らかになりつつある。線維芽細胞の解析から,HO-1以外の標的遺伝子候補も見つかった。これら遺伝子の機能は今後の解析を待つしかないが,もしもこれらが増殖制御に関係するのであれば,ヘム-Bach1経路が直接増殖制御にも関わること,換言すれば,ヘムと細胞増殖の関係という全く予想されなかった細胞機能制御システムを解明できる可能性がある。次年度はBach2の解析と平行して,この問題をさらに追求したい。我々は,JunやFos, Mafといった癌関連転写活性化因子と拮抗し転写抑制を行うBach1およびBach2に着目し,TPA応答配列(TRE),Maf結合配列(MARE),酸化ストレス応答配列(ARE)などを介する遺伝子応答の生理的意義,およびその脱制御を理解することを目指した。1.Bach1はストレス防御に重要なヘムオキシゲナーゼ1の発現を制御する。そこで,Bach1ノックアウトマウスを用いて酸素ストレスや低酸素が関与する病態モデル(大動脈カフ巻き障害)を検討した。また,Bach1ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞(MEF)と血管平滑筋(SMC)をそれぞれ調製し,その増殖能や機能などを検討した。そしてBach1は,線維芽細胞や血管平滑筋細胞の増殖に関与し,その欠損マウスでは動脈硬化が軽減することを見いだした。2.野性型およびBach2ノックアウトマウスより得た脾臓Bリンパ球をLPSで刺激し形質細胞を誘導し,培地中に分泌される抗体価を測定した。得られた結果は,Bach2が抗体産生細胞の分化を制御すること,クラススイッチDNA組み換えや体細胞突然変異に必須のAID遺伝子がBach2の下流に位置することを示した。Bach1とBach2は,いずれもMaf関連蛋白質群の中の小Maf因子群とヘテロ二量体を形成し,MAREに結合し,転写を抑制する。本年度の研究から,Bach1は酸化ストレス関連病態に深く関連し,またMEFやSMCの増殖にも関わること,一方,Bach2は液性免疫応答に関わることが理解された。
心筋・平滑筋細胞におけるCa遊離・収縮の細胞内Mgによる制御

フェレット心室乳頭筋標本をサポニン(50μg/ml)処理し、細胞膜の透過性を高めたスキンド標本を作製した。標本を石英キャピラリー中に入れ、筋小胞体からの放出Caを蛍光Ca^<2+>指示薬fluo-3により定量し、筋小胞体のCa^<2+>を取り込み、Ca-induced Ca releaseに対するMg^<2+>、pHの影響を検討した。筋小胞体へのCa^<2+>取り込み速度は、高Mg^<2+>濃度、低pHによって抑制されたが、最大取り込み量は変化がみられなかった。Ca^<2+>濃度が1μM付近でのCa-induced Ca releaseは、低pH(6.6)により抑制されたが、1mM-4mMのMg^<2+>濃度では有意に変化しなかった。10mM Mg^<2+>はCa-induced Ca releaseを抑制した。この結果より、心虚血時には細胞内Mg^<2+>の著明な上昇とアシドーシスが筋小胞体機能に影響を与えていることが示唆された。モルモット盲腸紐縦走筋標本を作製し、蛍光Mg指示薬furaptra/AMを負荷した。標本をイオノフォアで処理し、細胞外液のMg^<2+>濃度を変えて蛍光信号を較正した(in vivo calibration)。標本を低Na^+溶液で灌流すると細胞内Mg^<2+>濃度はゆっくりと上昇し、細胞外Mg^<2+>濃度を戻すと回復した。細胞内Mg^<2+>濃度の増加率と細胞外Na^+濃度の関係は、Hillタイプの式でよく近似でき、Hill係数は約3であった。細胞外高K^+による脱分極はこの関係を高Na^+濃度側に平行移動した。また、ouabainにより細胞内Na^+濃度を高める標本で細胞外Na^+を除去すると細胞内Mg^<2+>濃度は急速に上昇した。これにより、細胞内外のNa^+濃度勾配に依存したMg^<2+>の排出機構の存在が示唆され、この機構は逆向きにも働く可能性が示唆された。
モダニズムの形成に関わるイタリア逓信省の建築デザインについての研究

イタリア逓信省営繕部が192030年代に実現した駅舎デザインの特徴に検討を加えた。同時期のイタリアは、合理主義建築の台頭に代表されるようにモダニズム建築の本格的な導入時期にあたる。逓信省においては、国家戦略として迅速に設計し、確実に施工でき、頑丈な駅舎を設置する実務的な側面から近代主義建築が採用された。それは、プロダクトデザインを含めたトータルデザインを目指すもので、建築デザインの標準化を示唆するものでもあった。さらに国家の顔として、機能性や合理性のみならず敷地の歴史性といった考古学的観点からも意匠が検討されており、逓信省によるモダニズム建築に対する独特なアプローチを指摘することができた。本年度は、イタリア逓信省が1930年代に実現した建築デザインの特徴を明らかにするために、逓信省の設計組織が手がけた建築としてイタリアで最大のローマ・テルミニ駅、ヴェネツィア・サンタ・ルチア駅、トレント駅、ブレンネロ駅についての現地調査を行なった。これらの駅舎について、トレント・ロヴェレート近現代美術館、イタリア国鉄ローマ図書室の協力を得て、計画段階での逓信省の設計図面を収集し、その設計プロセスの調査を進めた。これら資料を分析検討したところ、デザインが決定されるまでの設計手法について、一部分ではあるが把握できるようになった。それは、逓信省が建築設計をすすめて行く際の、敷地の歴史性を読み込んで行く独特なプロセスであり、この手法を詳らかにしていくことは、地縁と切り離されて発展しがちであったモダニズム形成の一つの例外的トピックとして広く知らしめる意義があるだろう。また、平行して、二大戦間に実現された駅舎と郵便局作品についての資料を収集し、これらの作品群の設計に大きく関わった逓信省営繕部の中心人物であった官吏・建築家マッツォーニ、ナルドゥッチについても調査をすすめた。調査の中で、イタリア国鉄OB建築家とコンタクトをとることができ、今後、一次資料をより効率的に収集することができると考えている。これまでの知見については、2012年度のデザイン史学研究会ならびに2012年度の建築学会大会にて発表を行なった。最終年度は、イタリア逓信省営繕部が1930年代に実現した建築デザイン、とりわけ駅舎建築の設計で中心的な役割を果たした官吏・建築家A.マッツォーニの設計手法の特徴を明らかにするために、逓信省の設計組織が手がけた建築としてローマ・テルミニ駅、トレント駅についての現地調査と資料収集を行った。また、トレント・ロヴェレート近現代美術館の協力を得て、逓信省営繕部において、もう一人の中心人物であった官吏・建築家R.ナルドゥッチの駅舎と郵便局図面、写真資料を収集し、整理を進めた。これらの資料は、遺族から寄贈されたばかりで、ナルドゥッチの仕事に関しては、イタリア国内でも必ずしも十分な評価はなされていない。彼の業績についての検証を加え、二大戦間におけるイタリアの近代デザイン潮流の一端を明らかにし、同時代の日本の建築潮流と比較することは、今後の課題である。研究期間全体を通して、逓信省営繕部で指導的役割を果たしたA.マッツォーニ設計による駅舎建築を現地調査し、それらの設計図面の収集し、駅舎のみならず家具やプロダクトまで設計するトータルデザインとしてのユニークな特徴を指摘した。なかでも駅舎建築の集大成となったローマ・テルミニ駅については、古代ローマの遺跡が記されたルネッサンス期以降の敷地図を収集し、設計図と比較検証した結果、設計を進める際に、機能性や合理性のみならず敷地の歴史性を意匠に落とし込む独特な設計手法を確認することができた。このような建築計画の特徴は、近代以前の歴史を否定するものとして理解されがちなモダニズムの理念に対して、新たな視座を与えるものである。これまでに得られた知見については、2012年度のデザイン史学研究会ならびに2012年度の建築学会大会、2013年度の建築学会大会で発表を行なった。2014年度には、建築学会における論文発表と学会発表を予定している。本年度は、イタリア逓信省の建築デザインの全貌を明らかにするために、逓信省の設計組織と、同組織として最大規模の建築となったローマ・テルミニ駅についての調査を行なった。具体的には、二大戦間に逓信省が実現した全ての郵便局・駅舎作品をリストアップし、逓信省における建築家の役割を調査した。リストアップは順調に進んだものの、逓信省内での建築家の役割分担については、資料として確認できるものはなかった。テルミニ駅については、トレント・ロヴェレート近現代美術館、イタリア国鉄ローマ図書室に残る資料を端から調査していった。ここで新たに発見した資料によって、デザインが決定されるまでのプロセスを確認することができ、逓信省の建築デザインの特徴について、新たな知見を得ることができた。

また、逓信省営繕部の特質を明らかにするために、その指導的建築家であるマッツォーニの仕事の概要を把握することに努めているが、本年度は、彼による設計とされるローマ・テルミニ駅の信号所、発電所といった駅舎付属施設、駅舎計画案について資料を収集することができた。さらに、国鉄のOB職員とコンタクトを取ることで、テルミニ駅についての新たな一次資料を確認することができ、逓信省でマッツォーニと共に働いた官吏・建築家ロベルト・ナルドゥッチの資料についても、次回の現地調査での閲覧の手続きを取ることができた。テルミニ駅の設計プロセスと、逓信省よるテルミニ駅のデザイン的特徴について、研究成果をまとめた。それぞれ、2012年度6月と9月に口頭発表の形で報告する予定である。補助事業期間中の平成24年4月に所属研究機関を移動したため、申請時の予定通りに研究調査を進めることができなかった。また、国鉄の民営化による部署内合理化の影響を受け、逓信省時代の多くの資料が散逸してしまっていることが、調査の中で明らかになった。そのため、予測以上に資料の収集が困難になっている。国鉄民営化による合理化の影響を受け、調査のなかで、逓信省時代の多くの資料が散逸してしまっていることが確認された。また、近年急速に進む鉄道高速化工事のため、数年前まで存在していた当時の建築作品が取り壊されていた。このような理由から、予想以上に資料収集が困難になっていたためである。イタリア逓信省が1930年代に実現した建築デザインの特徴を明らかにするために、これまで、まだ十分に検討されてきていない郵便局建築のデザインの特徴について調査を進めていきたい。そして、現地調査で得られた知見を加えて分析を行い、研究報告をまとめて発表する。具体的には、2013年度の建築学会大会で研究成果を発表、建築学会計画系論文集に投稿する予定である。今後は、前年度の引き続き、イタリア逓信省の建築デザインの特徴を明らかにするために、特に同組織の中心的存在であった建築家アンジョロ・マッツォーニと建築家ロヴェルト・ナルドゥッチの仕事に注目していきたい。そのために、現地にて、両建築家についての資料収集と聞取り調査を行う。そして、昨年度までに得られた知見を加えた分析を行ない、年度末に報告を行う。平成24年度に予定していた研究発表と海外調査を翌年度に行なうことにし、未使用額をその経費に充てることにしたい。本年度は、乗客閑散期に海外調査に出られたために旅費に残額が生じた。これを次年度の現地調査のための渡航費としての旅費、資料整理のための設備備品費としての物品費、調査報告のための学会発表費としてのその他費用に活用したいと考えている。
微生物由来金属輸送体の発現制御による次世代型有害金属複合汚染浄化植物の開発

有害金属による複合汚染に対し、低環境負荷で現場での修復が可能な環境浄化法として,植物を用いたファイトレメディエーションが有望視されている。本研究は、微生物由来の有害金属輸送体MerCを植物に発現させ,かつその発現を細胞型および細胞内のレベルで制御することで、有害金属の複合汚染に対応した植物浄化技術の開発を目指した。植物体内での物質輸送に重要ないくつかの細胞型において特異的にMerCを発現する組換え植物系統を確立した。これらの植物のヒ素,カドミウムなど有害金属に対する応答を解析したところ,MerCの発現パターンによって複数の金属の蓄積性や耐性を向上させる効果が示唆された。本研究は、微生物由来の有害金属輸送体であるMer輸送体の能力と、植物の細胞型特異的発現系、細胞内局在因子の基盤を融合し、より効率的な有害金属浄化植物の作出を目指すものである。H27年度は、まず、シロイヌナズナ根あるいは地上部の各細胞型に特異的なプロモーター制御下でMerC-SNARE分子-蛍光タンパクを発現させるためのコンストラクションを完了させた。6種のコンストラククトについてシロイヌナズナへの形質転換を行った。また、多元素同時分析のため、ICP-AESを導入し、CdやAs等15元素について、植物組織・微生物・土壌サンプルから測定する系を確立した。これまでに作成済みのMer過剰発現株を用いて、MS培地に代わる有害金属蓄積・耐性評価のための固形培地の条件を確定させた。計画したコンストラクトの作成およびシロイヌナズナへの導入は順調に実施している。形質転換体を試験するための栽培条件・分析条件も確定している。H28年度は、昨年度に引き続き、シロイヌナズナの細胞型特異的プロモーター制御下で蛍光タンパク-MerC-SNARE分子を発現する組換えシロイヌナズナの確立を進めた。ハイグロマイシン耐性をマーカーとしてT1個体を選抜し、T2世代において3:1分離比の確認後、表皮細胞発現系統、内皮細胞発現系統についてはT3世代において複数のホモ系統を確立した。T2およびT3植物において、蛍光タンパクの発現を指標として顕微鏡観察を行ったところ、それぞれ表皮細胞、内皮細胞特異的な蛍光シグナルを観察した。表皮細胞発現系統の根端について、蛍光タンパクの細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、昨年度に確立した固形培地を用いた栽培系とICP分析を応用し、複合元素汚染を想定した条件での有害元素の蓄積評価系を確立した。計画した形質転換シロイヌナズナのホモ系統の確立は順調に進行している。また、表皮および内皮細胞発現系統について、それぞれ細胞型特異的なタンパク発現を確認している。平成29年度は、先行してホモ系統を確立した表皮細胞特異的プロモーター制御下でMerCを発現するシロイヌナズナについて,共焦点レーザー顕微鏡により発現解析を実施した。複数の形質転換系統を観察したところ,mTRQ2-MerC-SYP121融合タンパク質は,根の表皮細胞および根端の側部根冠に特異的に検出された。細胞内局在についてFM4-64によって細胞膜を染色し共局在を観察したところ,mTRQ2のシグナルは細胞全体で検出され,一部は細胞膜にも局在することがわかった。これらの植物を無機水銀で処理した時の水銀蓄積性を定量したところ,野生型株よりも地上部に水銀を蓄積しやすい傾向が認められ,導入遺伝子の効果が示唆された。さらに,内皮細胞,中心柱,維管束鞘,葉肉細胞にそれぞれ特異的なプロモーターを用いたMerC発現系統について,T3世代にてホモ系統を確立した。共焦点レーザー顕微鏡にて観察したところ,内皮細胞特異的プロモーター系統について,根の内皮細胞特異的にmCherryのシグナルを検出した。葉肉細胞特異的プロモーター系統については,葉の表皮や孔辺細胞では発現していなかったのに対して,葉肉細胞でmT-Sapphireのシグナルを検出した。また,水耕栽培を用いた重金属蓄積・耐性評価系を確立した。この水耕栽培系により,実際の土壌環境を想定した条件として,従来の固形培地を用いた栽培系よりも低濃度・長期間の金属処理の影響を評価できるようになった。形質転換体の選抜をT3まで随時進めて、各系統でホモ個体を得る。同時に、T2あるいはT3植物を用いて、導入したMerの発現の細胞型特異性・細胞内局在・細胞内局性について、蛍光タンパクの顕微鏡観察によって観察する。得られた有望系統について優先的に水銀、カドミウムなどの有害金属耐性・蓄積性について評価を開始する。先行している表皮および内皮細胞発現系統について、細胞型特異性・細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析を進める。

導入遺伝子の発現レベルの系統間差について、リアルタイムPCRによってmRNAレベルを定量比較する。さらに、昨年度までに確立した重金属蓄積評価系を用いて、各系統の有害元素の蓄積能を解析し、導入遺伝子の発現による蓄積能の向上について検証する。表皮および内皮細胞以外の発現系統については、随時T3世代においてホモ系統を確立し次第、顕微鏡観察および遺伝子発現レベルの解析、重金属蓄積性の評価に進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。公衆衛生学29年度が最終年度であるため、記入しない。
金属鉄を唯一のエネルギー源として生育する鉄腐食・酢酸生成菌の代謝機構の解明

本研究では金属鉄を唯一のエネルギー源として二酸化炭素から酢酸を生成し生育する鉄腐食・酢酸生成細菌のエネルギー代謝の分子機構解明を目的とした。鉄腐食・酢酸生成細菌Sporomusasp.GT1株および近縁の酢酸生成菌の鉄腐食能を比較した結果、Sporomusa属の数株は鉄腐食能を示したものの、それ以外の酢酸生成菌は明確な鉄腐食活性を示さなかった。複数種の酢酸生成菌のドラフトゲノムを決定し比較ゲノム解析を行った結果、鉄腐食能を有するSporomusa属細菌のゲノムからはマルチヘム型のc型シトクロムが検出されず、既知のグラム陰性細菌とは異なる細胞外電子伝達機構の存在が示唆された。我々は以前の研究において、固体である金属鉄中の自由電子を唯一のエネルギー源とし、二酸化炭素から酢酸を生成することで生育可能な新規微生物を単離し、この代謝が無酸素環境下での鉄の腐食(いわゆる“さび")を促進することを発見した。しかしこの微生物がいかにして細胞の外にある金属鉄から電子を受け取っているのか、その分子機構は不明である。本研究は我々が単離した鉄腐食・酢酸生成細菌を対象として、近縁種との比較ゲノム解析、網羅的遺伝子発現解析、電気化学的解析、変異株の作製を通して、金属鉄との電子授受に基づくエネルギー代謝の分子機構を解明することを目的とする。次に鉄腐食能を持つ酢酸生成細菌Sporomusa sp. GT1株とSporomusa sphaeroidesについて、ゲノムDNAを調整し、HiSeq法によるホールゲノムシークエンス解析をおこなった。得られたデータから配列のアセンブリ、ORF同定をおこない、総コンティグ数が100前後、カバレージが95%以上のゲノムデータを得ることができた。現在、すでにゲノム解析が完了している鉄腐食能を持たない酢酸生成細菌(Sporomusa ovata、Acetobacterium woodiiなど)のゲノムデータも加え、比較ゲノム解析による鉄腐食関連遺伝子の探索が進行中である。当初の予定では平成28年度中に酢酸生成細菌の比較ゲノム解析を完了し、網羅的遺伝子発現解析を進める予定であった。しかしゲノム解析に予想以上に時間を要したため、多少の遅れが生じている。しかし現在すでに網羅的遺伝子発現解析の準備がすでに整っているため、平成29年度中にその遅れを取り戻すことは可能であると考えている。我々のグループは固体である金属鉄中の自由電子を唯一のエネルギー源とし、二酸化炭素から酢酸を生成することで生育可能な新規微生物を単離し、この代謝が無酸素環境下での鉄の腐食(いわゆる“さび")を促進することを報告した。しかしこの微生物がいかにして細胞の外にある金属鉄から電子を受け取っているのか、その分子機構は不明であった。そこで本研究では申請者らが単離した鉄腐食・酢酸生成細菌、および近縁の酢酸生成菌をを対象とした培養実験および比較ゲノム解析などを通して、金属鉄との電子授受に基づくエネルギー代謝の分子機構を解明することを目的とした。我々のグループで単離した鉄腐食・酢酸生成細菌(Sporomusa sp. GT1株)および近縁の酢酸生成菌の鉄腐食能を比較した結果、Sporomusa属のいくつかの株は鉄腐食能を示したものの、Acetobacterium属やMoorella属の酢酸生成菌では明確な鉄腐食活性がみられなかった。本研究で扱った4種類の菌を含む複数種の酢酸生成菌のドラフトゲノムを決定し、すでに解析されている酢酸生成菌のゲノムも加えた比較ゲノム解析を行った。直接的な細胞外電子伝達に重要であると考えられているマルチヘム型のc-type cytochromeの遺伝子の存在をヘム結合モチーフ(CXXCH)をクエリー配列として検索した結果、本研究で鉄還元能が示された3種のSporomusaゲノムには、複数のヘム結合モチーフがあるタンパク質、例えばc-typecytochromeがいくつか検出されたが、既存のモデル鉄還元菌がもつようなdecaheme型のc-type cytochromeは検出されなかった。以上から、酢酸生成菌における鉄腐食ではdecaheme型のc-type cytochrome非依存的な機構が機能している可能性が示唆された(論文投稿準備中)。今年度は酢酸生成細菌の比較ゲノム解析をさらに進行させ鉄腐食関連遺伝子の候補を絞り込むとともに、網羅的遺伝子発現解析によりその候補遺伝子、ならびにその他の遺伝子について、鉄腐食への関与の推定をおこなう。さらに進行状況に応じ、鉄腐食性/非腐食性の酢酸生成細菌の電気化学的分析、鉄腐食関連遺伝子候補の遺伝子破壊株の作製、などを進めていく予定である。環境微生物学当初の予定通りに研究が進捗せず、予定していた消耗品費、および外注分析費の使用を翌年度に回すことになった。次年度使用額については、網羅的遺伝子発現解析をおこなうのに必要な分子生物学試薬等の消耗品、およびRNAの網羅的配列解析の外注分析費等に使用する予定である。
光合成で駆動する細菌型“リピッドボディー”の創出

本研究では、クロロソームと呼ばれる緑色光合成細菌の光捕集色素タンパク質複合体の機能を改変することで、クロロソーム内部に脂質やカロテノイドといった有用物質を蓄積することのできる、細菌型「リピッドボディー」を創出し、今まで困難であった細菌によるバイオ燃料産生への道筋をつけることを目指した。近年開発された緑色光合成細菌用過剰発現ベクターを用い、プラスミド上で植物(シロイヌナズナ)由来のDGAT遺伝子をクローニングした。このプラスミドを緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに導入することに成功した。本研究では、クロロソームと呼ばれる緑色光合成細菌の光捕集色素タンパク質複合体の形成機能を改変することで、クロロソーム内部に脂質やカロテノイドといった有用物質を蓄積することのできる、細菌型「リピッドボディー」を創出し、今まで困難であった細菌によるバイオ燃料産生への道筋をつけることを目指している。クロロソームは1重の膜で構成され、その中は疎水的環境であり大量のバクテリオクロロフィル分子がその中に蓄積している。このバクテリオクロロフィル分子を、同じく疎水的な分子であるトリアシルグリセロールを蓄積させることが本研究の目標である。クロロソーム膜はモノガラクトシルジアシルグリセロールといった糖脂質で主に構成されている。モノガラクトシルジアシルグリセロール合成の基質はジアシルグリセロールである。そこで同様にジアシルグリセロールを基質としてトリアシルグリセロールを合成する酵素ジアシルグリセロールアシルトランフェラーゼDGATを緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに導入することにした。近年開発された緑色光合成細菌用過剰発現用ベクター(Azai et al. 2013 Plos One)を用い、プラスミド上で植物(シロイヌナズナ)由来のDGAT遺伝子(DGAT1)をクローニングした。このプラスミドを、報告されたプロトコールに従い緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに導入することに成功した。そこで昨年度、ジアシルグリセロールを基質としてトリアシルグリセロールを合成する酵素ジアシルグリセロールアシルトランフェラーゼDGATをシロイヌナズナより単離し、緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに導入することに成功した。得られた株に株は、生育速度が野生型に比して大きく減少したことから、トリアシルグリセロールの蓄積等代謝の異常を来していると考えられた。得られた株の総脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーにより脂質を分離、トリアシルグリセロールの定性分析を行ったが、今までのところその検出には至っていない。現在、より高感度なマス解析による脂質分析を行っている。光生物学本年度は、緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumを材料に、光捕集色素タンパク質複合体クロロソーム内部にバイオエネルギーの原料となる脂質トリアシルグリセロールを蓄積させることを目指している。これまでに、植物由来のトリアシルグリセロール合成酵素DGATのcDNAのクローニングに成功し、その遺伝子を緑色光合成細菌用過剰発現ベクターにクローニングすることに成功した。またこのコンストラクトを緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに実際導入することに成功した。今後得られた株の解析を進めることができる状況にあり、おおむね研究は順調に進行していると言える。昨年度までに、緑色光合成細菌Chlorobaculum tepidumに植物由来のトリアシルグリセロール合成酵素DGATのcDNA過剰発現ベクター導入に成功した。今後得られた株の解析を進める。具体的には、組換え体内のDGAT遺伝子の発現解析、生育条件検討、脂質分析、色素分析を進める。それらの結果を踏まえ、トリアシルグリセロールを更に高蓄積する株の改良を進める。