hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内耳治療に向けてのウロキナーゼ抗アポトーシス作用の検討

ウロキナーゼは血栓溶解薬として臨床応用されている薬剤であるが、近年その抗アポトーシス効果が報告されるようになってきた。今回我々は、ウロキナーゼの内耳アポトーシス予防効果を検討した。内耳有毛細胞培養系にてアミノ配糖体によるアポトーシスをウロキナーゼが予防することを示した。同時にウロキナーゼ投与がアポトーシス経路のP38を活性化することを示しメカニズムの一部を示した。らせん神経節培養系を用い、グルタミン酸投与によるアポトーシスも抑制することも証明した。以上の結果は今後の内耳治療の一つの選択肢として期待できると考える。本年度は昨年度に引き続きウロキナーゼのアポトーシス抑制効果・そのアポトーシス抑制経路の検索を行った。ラット蝸牛培養細胞を用い、障害因子として硫酸カナマイシン(KM)を投与した。これまでにKM投与下でウロキナーゼ投与を行うと優位に細胞障害が抑制されることを示したが、ここへウロキナーゼインヒビターを投与を行い変化を観察したところ、細胞障害の予防効果は消失し、KMによる蝸牛有毛細胞障害にウロキナーゼが関与していることが、示唆された。ウロキナーゼによるアポトーシス抑制経路としてこれまでにERK1/2およびP38の活性化による経路が報告されているが、ERK1/2については明らかな発現は認められなかったものの、KM投与6時間後においてウロキナーゼ投与群でP38の発現が認められた。このことからウロキナーゼによるP38経路の活性化がアポトーシスを抑制することが示唆された。また、in vivoの系で、白色モルモットに対してKMおよびエタクリン酸による難聴モデル動物を作成し、ウロキナーゼを蝸牛窓に留置難聴の予防効果を検討したが、残念ながら有意な効果は認められず今後継続して実験を行う必要があると考えている。ウロキナーゼは血栓溶解剤として臨床応用されている薬剤であるが、近年ウロキナーゼレセプターに作用後、MAPK/ERK経路に作用してアポトーシスを抑制することが示されている。この薬剤の内耳への応用を検討した。ラット内耳の培養系を用い、内耳アポトーシスをきたす硫酸カナマイシン投与下におけるウロキナーゼのアポトーシス効果を検討した。この際、ウロキナーゼに加えてウロキナーゼインヒビターも投与した場合を同時に検討した。その結果、ウロキナーゼを投与した群では有意に内耳有毛細胞の障害率が軽減されていたのに対して、ウロキナーゼインヒビター同時投与群では内耳有毛障害は軽減しなかった。続いて内耳硫酸カナマイシン投与下でMAPKの一種P38の発現を検討したところKMに加えてウロキナーゼを投与した群においてP38の強い発言を認めた。ウロキナーゼ投与に伴うP38の役割を検討するため硫酸カナマイシン/ウロキナーゼ投与下にP38インヒビターを投与し有毛細胞に対する影響を検討した。その結果P38インヒビターを投与した群で有意に有毛細胞の障害が増加した。上記結果からはウロキナーゼはP38の発現を通じて有毛細胞のアポトーシスを抑制する可能性が示唆された。最終年度には、ウロキナーゼのらせん神経節細胞に対するアポトーシス抑制効果を検討した。グルタミン酸によるらせん神経節細胞培養系障害系においてウロキナーゼを投与した群では非投与群に比べて障害率が有意に低下しおり、ウロキナーゼによるらせん神経節細胞障害予防効果が示唆された。この結果はウロキナーゼの内耳治療への可能性を示唆するものであり、今後の内耳治療戦略野一つの手段として臨床応用への期待ができるものと考えられる。本年度はウロキナーゼのアポトーシス抑制経路の検討を行った。ラット蝸牛培養細胞を用い、障害因子としてカナマイシンを投与した。カナマイシン(KM)投与培養細胞に対して、Caspase9の染色を行うと10時間後にCaspase9の発現が見られることがわかった。ここへ、ウロキナーゼの投与によりKMによる障害が濃度依存的に軽減した。以上からミトコンドリアを介したアポトーシス経路の抑制が推測された。他の研究にてウロキナーゼのアポトーシス抑制効果としてはMAPKの発現を調節することが岩ており、今回同様の実験系においてERK1/2、P38の発現に変化があるかを検討した。これまでKM投与1時間10時間まで条件を検討していったが、現時点では残念ながらいずれのMAPKの発現の変化は確認できていない。今後の戦略として、MAPK阻害剤を同時投与することによりウロキナーゼのKM障害に対するアポトーシス抑制効果の変化をみることで間接的にMAPKへのウロキナーゼの影響を検討するとともに、Western BlotによるMAPKの発現を検討してゆく予定である。また、ラット蝸牛螺旋神経節細胞の培養細胞においても現在ウロキナーゼの効果を検討している。

神経栄養因子の非存在下でのアポトーシスやグルタミン酸投与によるアポトーシスの抑制効果さらには、MAPK発現の変化について現在検討を加えているところである。本年度はウロキナーゼのアポトーシス抑制機構の一部が解明された。またウロキナーゼインヒビターによる実験を追加することで、ウロキナーゼの有毛細胞障害予防効果がより確実なものであることが証明でき、今後実験をin vitroからin vivoへと発展させていくための基礎が形成されたと考えられる。本年度はMAPKを含む蝸牛におけるウロキナーゼのアポトーシス抑制メカニズムを解明する予定であったが、現時点ではまだ完全に解明が達成できていない。来年度に引き続き検討を加えていく予定である。今後は、蝸牛有毛細胞のみならずらせん神経節神経節細胞や前庭細胞などにおいてもアポトーシス障害予防孔効果があるかどうかを検討してゆく。また、P38によるアポトーシス抑制を確認するためにP38インヒビターを用いてその効果が消失するか確認する予定である。また、有毛細胞以外の組織でもP38の活性化が起こるかどうかも検討する。また、臨床により近いin vitroの実験系においてウロキナーゼの効果を聴力測定、アポトーシスシグナル検出などを通じて確認する。障害因子としてはアミノ配糖体投与以外にも騒音暴露・加齢性変化などの要因も含めて検討する予定である。まずは、昨年度に引き続きウロキナーゼのアポトーシス作用機序について検討を加えてゆく。具体的には免疫染色によるMAPKの検出に加えてWestern Blottingなどの手法で証明する方法や、MAPK阻害剤によるウロキナーゼの効果の変化をみる方法など行う予定である。また、蝸牛有毛細胞のみならず螺旋神経節細胞・血管条・前庭有毛細胞など他の機関においても検討を加えてゆく予定である。また、臨床応用により近い形でのin vivoにおけるウロキナーゼの効果確認、アポトーシスシグナルの検出も行う予定である。in vivoでは障害因子としてアミノ配糖体に加えて臨床上でよく問題となる騒音暴露、加齢性変化なども追加して行っていく予定である。その際は、蝸牛有毛細胞のみならず、前庭細胞・螺旋神経節細胞なども含めて検討を行っていく予定である。細胞の組織学的な障害度に加えABRによる聴力の変化、平衡機能検査(カロリックテスト)など前庭機能の検査なども併せて行っていく。各種抗体、阻害剤などの薬剤および培養器具、動物代など消耗品30万円程度予定している。海外での発表・情報収集などに20万、成果発表関連20万円程度予定する。各種抗体、阻害剤など薬剤および培養器具、動物代など消耗品に60万程度予定している。海外での発表、情報収集の旅費として20万程度必要と考えている。さらに成果の発表に関連した費用その他雑費として20万円程度使用する予定である。
超小型半導体光センサーと新型シンチレータによる次世代ＳＰＥＣＴ

放射線源を体内に投与し,外からその放射線を検出する方法は心筋や脳の血流診断にとって非常に有用である.単一光子放射断層撮影法(SPECT)は投与放射線源の取り扱いが容易などの利点をもつが,位置分解能に改善の余地がある.そこで本法では1 mm (半値幅2.4 mm)の分解能を目指した.従来は数mmの位置分解能である.従来法では大きなシンチレータに放射線が入射して発する複数光子を、複数の光電子増倍管で測定し,光子数重心より位置を求める.本法では,1 mm x 1mm断面積に区切ったシンチレータにこれと同サイズの光検出器を一対一対応で装着し,目的の位置分解能を達成した.従来のSPECTではコリメータの穴より大きなシンチレータをコリメータ直後に配し,それに放射線が当たって発光する光をやはりコリメータより大きなサイズの光電子増倍管で検出し,エネルギー重心により,入射放射線の位置を求めるものである.本法では,コリメータの穴に同サイズの断面積をもつシンチレータを挿入し,これをシンチレータの径と同サイズのピクセル化光子検出器(PPD)で読み出すことにより.高位置分解能を達成する.研究ではシンチレータ長以上に伸ばしたコリメータ(一穴1x1x50mm^3,この穴が10 x 10 = 100穴)を作成し,20 mm長のシンチレータ結晶(LSOもしくはYSO)を挿入して実験した.各シンチレータ後端に感度面1mm x mmのPPDを装着し,コリメータから入ってくる放射線の測定位置分解能を確かめた.実験の前にモンテカルロシミュレーションを行い,標準偏差としての分解能1 mmを得ることができる条件を予測し,その条件で実験した.この時に決めたパラメータは,コリメータの長さ,コリメータの壁厚,シンチレータの長さであり,コリメータ長30 mm以上のとき壁厚0.12 mmであればよいことと,シンチレータの長さはLSO 4 mm以上,YSO 20 mm以上である事がわかった.実験ではコリメータ長条件を可変とするために,シンチレータとPPDの間に光ファイバを用い,コリメータへのシンチレータの挿入位置を調整できるようにした.バックグラウンドの研究をした後に,3行3列のシンチレータ-PPD読み出しマトリックスを作成し1 mmの分解能を得るに至った.放射線源を体内に投与し,外からその放射線を検出する方法は心筋や脳の血流診断にとって非常に有用である.単一光子放射断層撮影法(SPECT)は投与放射線源の取り扱いが容易などの利点をもつが,位置分解能に改善の余地がある.そこで本法では1 mm (半値幅2.4 mm)の分解能を目指した.従来は数mmの位置分解能である.従来法では大きなシンチレータに放射線が入射して発する複数光子を、複数の光電子増倍管で測定し,光子数重心より位置を求める.本法では,1 mm x 1mm断面積に区切ったシンチレータにこれと同サイズの光検出器を一対一対応で装着し,目的の位置分解能を達成した.シンチレータをコリメータの中に直接挿入し,装置の位置分解能を改善する理論的根拠を確立した.また,コリメータの厚みと径,長さによる空間分解能を予測計算し,コリメータのデザインを行った.予定ではこれらの計算にはGeant4による詳細なシミュレーションを用いる予定であったが,時間的制約から,解析的な計算で概算するにとどまった.シンチレータ結晶の密度と,使用放射線源からシンチレータの必要長さも同様に決定した.その必要なシンチレータの一部を購入し,単チャンネルからの読み出し技術を確立した.その後バックグラウンドを考慮したシンチレータの選択を行い,そのシンチレータを購入し,基本感度測定を開始している.多チャンネル読み出しシステムの構築にとりかかっているが,完成には達していない.シンチレータをいかに読むかの基本方針は固まり,デザインも確立した.しかし単チャンネルの読み出しのシステム確立,ノイズ除去に予想外の時間をとった.このことに手を取られ,シミュレーションシステムに手が回らなかった.前期中に多チャンネル読み出しシステムを確立し,性能評価を実施する.性能としては時間分解能と空間分解能である.特に空間分解能は改善が予測できている.シミュレーションシステムの構築がおくれたが,性能評価を進めると同時にその開発を進める.ここまで,放射線源は当研究所所蔵の22Naを用いてきたが,57Coを購入する.(200,000円)当初予定の3x3 channelでは空間分解能の評価が困難であると判断されたため,6x6多チャンネルを予定している.そのため,シンチレータを50 (200,000円),コリメータ(500,000円),ASICとそれを採用した読み出し回路を(400,000円),そのコントロールモジュール(400,000円)を購入する.成果発表のため国内外の学会参加を予定しており,その旅費を必要とする(600,000円).図書等の雑日を(70,000円)見積もっている.本年度,コリメータの購入が遅れたため,また,成果発表をほとんどしなかったため,旅費とコリメータの費用として570,000円が,次年度繰越となった.上記はそれを含んでいる.
がん幹細胞運命決定の糖代謝レオスタット仮説実証を通じて膠芽腫根治モデル創出に挑む

がんでしばしば認められる糖代謝亢進ががん細胞にとってどのような意義があるかについてはいまだ不明な点が多い。本研究課題では糖代謝ががん幹細胞状態の調節器としてグリオブラストーマ幹細胞の維持に重要な役割を果たしているという作業仮説の検証を試みた。グリオブラストーマ幹細胞の糖代謝を調節する目的でグルコーストランスポータの一つGLUT1の機能を抑制したところ、糖代謝抑制とともに細胞内活性酸素レベルの上昇が観察され、同時に幹細胞性の喪失が認められた。これらの結果は糖代謝が細胞内活性酸素レベルの調節を通じてグリオブラストーマ幹細胞のがん幹細胞状態維持に寄与している可能性を示唆しているものと考えられた。自己複製能・腫瘍創始能といったがん幹細胞を特徴付ける形質を喪失させる手法の開発はがん根治実現のカギを握ると考えられるが、こういったがん幹細胞に特徴的な形質が如何なる機序で維持されているかはいまだ不明な点が多い。これに対して我々は「がん幹細胞の糖代謝活性が幹細胞形質維持調節に重要な役割を担っている」という新たな仮説を着想した。本課題はこの仮説を膠芽腫をモデルに実証する傍ら、がん幹細胞糖代謝標的治療を、膠芽腫幹細胞分化誘導法やbulk tumor control(非幹細胞制御)法等と理論的に組み合わせることによって膠芽腫根治の前臨床モデルを創出することを最終的な目標として行った。具体的にはまず最初にin vitroにおける解糖経路阻害が膠芽腫がん幹細胞の諸特性に与える影響を検討するとともに、in vivoにおける解糖経路阻害が実際に膠芽腫がん幹細胞による腫瘍形成を抑制しうるか検討した。その結果、解糖経路阻害がin vitroで膠芽腫がん幹細胞の諸特性を抑制するとともに、in vivoでも膠芽腫がん幹細胞による腫瘍形成を抑制することが明らかとなった。さらに我々は、このような解糖経路阻害により幹細胞性が失われる機序について検討を行ったところ、解糖経路阻害により細胞内ROSレベルの上昇が誘導され、これが幹細胞性を抑制している可能性を示唆する結果が得られた。研究課題の根幹/大前提をなすコア仮説「グリオーマ幹細胞維持における糖代謝の重要性」を実証することができたため。脳神経外科学、脳腫瘍学新たに得られた新知見を踏まえつつ、糖代謝阻害単独あるいは他のがん幹細胞分化誘導法との組み合わせが膠芽腫がん幹細胞に与える影響を、基本的には当初計画どおりの実験手法を用いることで検討を試みる。研究過程において申請時には予見できなかった新知見が得られ、この新知見に関する検討を十分に行うことにより得られると期待される情報に基づいて当初予定の研究を実施するほうが、当初予定の研究を拙速に実施するよりも遥かに研究費の有効活用が可能であり、有意義な知見が得られると考えられたため。と同時に、科研費の効率的かつ有効利用を最大化するため、研究課題で行う予定の実験のうち、研究室に既存のマテリアルを使用することで推進可能なものは極力既存のマテリアルを使用することで実施する努力をしたため。新知見に基づいて今後得られるであろうと期待される新情報を踏まえつつも方法論的には当初計画どおりに研究を進める予定であり、そこで必要とされる一連の実験を実施するために研究費を使用する。
骨代謝因子OPG/RANKLが明示する血管内皮細胞の新しい炎症制御機構

【目的】骨代謝因子であるOsteoprotegerin(OPG)の局所濃度は感染による歯槽骨の吸収や抜歯治癒など多くの口腔内疾患に影響を及ぼす。OPGの大きな供給源の一つとして血管内皮細胞があるが、動脈硬化や糖尿病などによる血管内皮の障害の際にOPGの産生量が上昇すること、過度のOPG濃度の上昇は血管内皮細胞の機能障害を引き起こすことが知られている。本研究の目的は口腔の感染症が血中や感染局所のOPG濃度に影響を与えるか、感染により増加もしくは減少したOPGが病態に関与するか否かを明らかにすることである。平成30年度では、前年度に確立した深在性カンジダ症マウスモデルを用い、カンジダ症発症における血中と感染した舌組織中のOPG濃度増減について検討した。【方法】5週齢メスICRマウスに塩酸クロルテトラサイクリン含有水道水(4mg/ml)を飲水させプレドニゾロンを感染4日前と1日前に100mg/kg投与した。C. albicans臨床分離株OH-1株を舌に接種した後、経時的に舌、脾臓および腎臓の感染量と、舌組織および血清中のOPG濃度を測定した。【結果と考察】感染後4日目と5日目において、感染群は非感染群に比較して有意に血清OPG濃度の上昇が認められた。しかし、舌組織では明らかなOPG濃度上昇は認められなかった。また、感染群の30%で脾臓と腎臓へのC. albicansのトランスロケーションが認められた。これらの結果より口腔を感染源とする深存性カンジダ症はOPG血中濃度を上昇させる可能性が示唆された。【結果と考察】本研究結果は、口腔で比較的頻繁に見られる感染症の一つであるC. albicans感染が全身のOPG血中濃度に関与し、血管内皮細胞などの機能に影響することを示唆するものである。本研究の目的は、慢性感染症による血中の骨吸収抑制因子Osteoprotegerin (OPG)濃度の上昇が、感染症の増悪に関与しているか否かを明らかにすることである。そこで平成28年度はin vivoにおける全身感染症のマウスモデルの構築とその臓器別の感染、および組織におけるサイトカインの定量法の確立を行った。ICRマウスにテトラサイクリンを飲水させ、免疫抑制剤であるプレドニゾロンを投与したのち、口腔内よりCandida albicansを感染させ、舌、胃、小腸、盲腸および糞からの生菌数を指標に各臓器の感染量を測定した。プレドニゾロン投与群では舌、胃、小腸、盲腸共にプレドニゾロン非投与群よりも有意に高い感染量が認められた。また、プレドニゾロン投与群では高い確率で腎臓と脾臓におけるトランスロケーションが認められた。さらにプレドニゾロン投与群の臓器において、非投与群に比較してIFNγ、IL-17などのC. albicansの感染防御に関わるサイトカインの低下が認められた。また、舌に接種したC. albicansがプレドニゾロン投与群、非投与群ともに胃に定着していること、プレドニゾロン非投与群では、小腸でほとんどC. albicansが認められなかったが、投与群では高い量のC. albicansが認められたことから、プレドニゾロン投与による小腸の粘膜バリアの破綻がトランスロケーションに関与している可能性が示唆された。今後、このマウスモデルを用い各種臓器の感染量と血中のOPG値の変化を調べていく予定である。ICRマウスにおいて、C. aclbicansを口腔内に感染させ、テトラサイクリンとプレドニゾロンを用い、全身感染症である深在性カンジダを再現性よく引きおこす条件を確立した。これは人が易感染時に口腔カンジダ症から深在性カンジダを引き起こす良いモデルとなると考えられる。また、胃や小腸などの酵素活性が高い消化器官をホモジネートして再現よくサイトカイン定量する方法を確立した。以上よりC. albicans感染によるOPGおよびRANKLの作用を評価・研究する基盤が確立された。次年度からリコンビナントRANKLを投与したICRマウスの各臓器C. albicans感染量の検討を行い、全身感染症である深存性カンジタにおけるOPGとRANKLの作用について研究を行っていく予定である。そこで平成29年度は前年度に確立した深在性カンジダ症マウスモデルを用い、血清中のOPGとサイトカイン濃度を検討した。ICRマウス(5週齢)に塩酸クロルテトラサイクリン含有水道水(4mg/ml)を飲水させプレドニゾロンを感染4日前と1日前に100mg/kg投与し、ヒト口腔内から単離したC. albicans OH-1株を舌に接種(108CFU/匹)した。その後、血清中のサイトカイン量を測定した。舌に接種したC. albicansは24時間以内に舌や腸管に定着し、3日後には40%で腎臓への感染の移行が認められた。血清中のIL-6、IL-12およびIL-10は非感染群では全て低い値であったが、感染群では一部にサイトカインの上昇が認められた。そのことから、血清中のこれらサイトカイン上昇とC. albicansの深部臓器への感染との関与が示唆された。

また、血清中のOPGは非感染群とは異なった値を示した。今後、これらのサイトカイン濃度と血中のOPG値、および各種臓器の感染量の相関性を検討していく予定である。ICRマウスにおいて、C. aclbicansを口腔内に感染させ、テトラサイクリンとプレドニゾロンを用い、全身感染症である深在性カンジダ症を再現性よく引きおこす条件を確立した。これは、C. albicansが易感染時に口腔から深部臓器へ感染を広げるメカニズムの解明の良いモデルとなると考えられる。また、胃や小腸などの酵素活性が高い消化器官をホモジネートして再現よくサイトカイン定量する方法を確立した。さらにC. albicans感染によりOPGの血清濃度が非感染群と異なる値を示すことを見出した。以上より、血清OPG濃度とC. albicansの深部臓器感染との関与についての研究基盤が確立できた。【目的】骨代謝因子であるOsteoprotegerin(OPG)の局所濃度は感染による歯槽骨の吸収や抜歯治癒など多くの口腔内疾患に影響を及ぼす。OPGの大きな供給源の一つとして血管内皮細胞があるが、動脈硬化や糖尿病などによる血管内皮の障害の際にOPGの産生量が上昇すること、過度のOPG濃度の上昇は血管内皮細胞の機能障害を引き起こすことが知られている。本研究の目的は口腔の感染症が血中や感染局所のOPG濃度に影響を与えるか、感染により増加もしくは減少したOPGが病態に関与するか否かを明らかにすることである。平成30年度では、前年度に確立した深在性カンジダ症マウスモデルを用い、カンジダ症発症における血中と感染した舌組織中のOPG濃度増減について検討した。【方法】5週齢メスICRマウスに塩酸クロルテトラサイクリン含有水道水(4mg/ml)を飲水させプレドニゾロンを感染4日前と1日前に100mg/kg投与した。C. albicans臨床分離株OH-1株を舌に接種した後、経時的に舌、脾臓および腎臓の感染量と、舌組織および血清中のOPG濃度を測定した。【結果と考察】感染後4日目と5日目において、感染群は非感染群に比較して有意に血清OPG濃度の上昇が認められた。しかし、舌組織では明らかなOPG濃度上昇は認められなかった。また、感染群の30%で脾臓と腎臓へのC. albicansのトランスロケーションが認められた。これらの結果より口腔を感染源とする深存性カンジダ症はOPG血中濃度を上昇させる可能性が示唆された。【結果と考察】本研究結果は、口腔で比較的頻繁に見られる感染症の一つであるC. albicans感染が全身のOPG血中濃度に関与し、血管内皮細胞などの機能に影響することを示唆するものである。平成29年度は以下の研究を進めていく予定である。1)リコンビナントRANKLをICRマウスの腹腔内に投与し、その後C. albicansを口腔内より感染させ、舌、胃、小腸におけるC. albicansの感染量へのRANKLの影響を検討する。2)RANKL投与マウスの各種臓器のサイトカイン量を検討する。特にOPGに関わる炎症性サイトカインおよびIFNγ、IL-17などのC. albicansの感染防御に関わるサイトカイン、さらにディフェンシンなどの抗菌ペプチドの産生状態を検討する。3)C. albicans
コレステリック液晶ガラスの創製とそのらせん構造に基づく光位相制御機能の応用

本研究は、省資源、省エネルギーを目指し、これら生体関連高分子をキラル高分子素材として利用し、それが形成するコレステリック液晶の螺旋構造を固化し、様々な光位相マニュピレーション機能を持つフィルムの作成を試みたものである。本研究で得た主要な結果を以下に記す。1.高分子コレステリック液晶素材として,天然由来の蛋白質,合成ポリペプチド,セルロース,キチンなどの多糖類がある。これらは,もちろん,棒状でかつ光学活性であるため,コレステリック液晶を形成する能力を持ち合わせているが,我々は,これらの液晶素材を,サーモトロピック液晶を示す系-すなわち溶媒を必要とせず温度を上げるだけで,液晶としての流動性が現れる系-に変換できることを示すことができた。2.これらの生体系高分子のコレステリック液晶では、剛直分子がフィルム面内に面配向するため、螺旋がフィルム面に均一かつ垂直に成長すること、螺旋ピッチの温度依存性が著しく高いため、処理温度の選択によりいかなるピッチの螺旋でも調整できること、また側鎖種の変化により、複屈折値を多様に変えることができるなどの特徴を認めることができた。3.コレステリックの螺旋構造は、サーモトロピック液晶を急冷ガラス化する手法と、重合溶剤を2030%含ませ、それを重合する方法で定量的に固化することができることが判明し、所望の螺旋ピッチを持ち、かつモノドメインの螺旋構造のフィルムを定常的に調製できることが判明した。4.光学素材としては、微細構造の書き込み、すなわち場所によっては螺旋ピッチが異なったり、螺旋軸の配向様式が変わったりした試料、が必要であるが、サーマルヘッド、あるいは紫外、赤外光照射による書き込み操作で、最低十ミクロンの線幅での書き込み操作が可能であることが判明した。5.以上の手法で作成したフィルムが、プリントカラー素材、イレーザブル記録材料、円偏光分光フィルター、赤外、紫外カットフィルター、光位相差板、直線偏光子、光拡散材などの光位相マニュウピレーション材料として幅広く有用に活用できるものであることを示すことができた。本年度は、主にコレステリック液晶素材の開発を行い、下記に示すように、ポリペプチド、セルロース、ポリエステル、ポリシランにおいて、良好なコレステリック液晶を調製できることを明らかにした。1)ポリグルタミン酸エステル、ヒドロキシセルロースを基盤に、側鎖の化学修飾により、サーモトロピック液晶を作成することができ、また多種、多様な溶媒に可溶なリオトロピック液晶を作成できることが判明した。さらにこれらコレステリック液晶では、らせんピッチの温度依存性が高く、一つの試料で数百ナノメーターから数千ナノメーターのらせんピッチのコレステリック液晶を作成し得ること、また急冷固化あるいは溶媒重合により、良好なコレステリック固体フィルムを作成できることを明らかにした。2)主鎖型ポリエステルでは、屈曲鎖部に、ポリシラン系では側鎖にキラルドーパントを導入する手法で、サーモトロピック・コレステリック液晶を作成し得ることを明らかにに、また液晶のガラス化により、らせん構造の固定化が可能であることを示した。次年度は、これら多種のコレステリック素材を用い、らせん構造を詳細に解析し、光学材料としての資質を評価する。本研究は、省資源、省エネルギーを目指し、生体関連高分子をキラル高分子素材として利用し、それが形成するコレステリック液晶の螺旋構造を固化し、様々な光位相マニュピレーション機能を持つフィルムの作成を試みたものであり、以下のような成果を得るに至った。

1.コレステリック液晶素材として、キラル生体高分子であるタンパク質、セルロース、キチン質を化学修飾し、サーモトロピック液晶高分子に変換したものが、安価でかつ有用な素材であることを明らかにした。2.これらの生体系高分子のコレステリック液晶では、剛直分子がフィルム面内に面配向するため、螺旋がフィルム面に均一かつ垂直に成長すること、螺旋ピッチの温度依存性が著しく高いため、処理温度の選択によりいかなるピッチの螺旋でも調整できること、また側鎖種の変化により、複屈折値を多様に変えることができるなどの特徴が認められた。3.コレステリックの螺旋構造は、サーモトロピック液晶を急冷ガラス化する手法と、重合溶剤を2030%含ませ、それを重合する方法で定量的に固化す名ことができることが判明し、所望の螺旋ピッチを持ち、かつモノドメインの螺旋構造のフィルムを定常的に調製できることが判明した。4.光学素材としては、微細構造の書き込み、すなわち場所によっては螺旋ピッチが異なったり、また螺旋軸の配向様式が変わったりした試料、が必要であるが、サーマルヘッド、あるいは紫外、赤外光照射による書き込み操作で、最低十ミクロンの線幅での書き込み操作が可能であることが判明した。5.以上の手法で作成したフィルムが、プリントカラー素材、イレーザブル記録材料、円偏光分光フィルター、赤外、紫外カットフィルター、光位相差板、直線偏光子などの光位相マニュウピレーション材料として幅広く有用に活用できるものであることを示すことができた。
骨軟部腫瘍幹細胞を標的とした新規治療法の開発

強い幹細胞性を有する骨軟部腫瘍の3次元増殖に、血管内皮増殖因子(VEGF)が重要な役割を演じている。滑膜肉腫では原因融合遺伝子を抑制すると、VEGFが3次元増殖より管腔構造を有した内皮細胞への分化を誘導する事から、滑膜肉腫は内皮細胞への分化可能な多機能幹細胞を起源とし、融合遺伝子により、VEGFが3次元増殖を制御している事が示唆された。VEGF signalが強く抑制されるとchemokineであるSDF-1alphaとreceptorであるCXCR4-axisが活性化される。CXCR4阻害薬をVEGF阻害薬と併用する事で極めて効率的に骨軟部腫瘍の増殖を抑制出来る事を見いだした。現在、既に倫理委員会で承認されているprotocolに従い、患者検体より種々の骨軟部腫瘍細胞株を樹立し、幹細胞としての性質を調べている。現在までnude miceに移植可能な骨軟部腫瘍細胞株を8種樹立しており、さらに樹立をめざす。樹立した細胞株には幹細胞性を有するものが多く、幹細胞に特異的に発現する遺伝子(Oct3/4,Nanog,SOX2,KLF4)、融合遺伝子(滑膜肉腫の場合SS18-SSX)、以前より悪性化(浸潤・転移)に関与する標的分子として研究を行っている。SSXの幹細胞性や分化等に与える影響に関して、siRNA-basedのin vitro,in vivoの抑制実験を行い、検討する。得られた結果より、骨軟部腫瘍幹細胞の標的として、最適な分子の絞り込みを行い、低分子、抗体、siRNA-liposome等を用いた分子標的治療の開発を(製薬企業と共同で)行う。下記のメンバーに阪大整形外科大学院生2名(田中、若松)を加えたチームで研究を遂行しており、定期的に毎月全体meetingを行っている。連携研究者吉川秀樹(大阪大学医学部整形外科教授)-全体のまとめ、臨床応用、大学院生数名の派遣研究協力者笹川覚(当部門研究員)-生物学的な解析中紀文(大阪大学医学部整形外科講師、当部門特別研究員)-細胞株の樹立城山晋(病院整形外科医長)-臨床情報、細胞株の樹立荒木信人(病院整形外科部長)-臨床情報、細胞株の樹立上田孝文(大阪医療センター整形外科部長)-臨床情報、細胞株の樹立既に倫理委員会で承認されているprotocolに従い、患者検体より現在までにnude miceに移植可能な骨軟部腫瘍細胞株を11例樹立、樹立した細胞株には幹細胞性を有するものが多く、幹細胞に特異的に発現する遺伝子(Oct3/4, Nanog,SOX2, KLF4)、融合遺伝子(滑膜肉腫の場合SS18-SSX)等の腫瘍悪性化(浸潤・転移)に関与する研究を行っている。H23-25年度の研究結果より、血管新生因子(VEGF)がdriverとして機能し、標的分子として有効なことが判明。腫瘍細胞自身に対する機能を生物学的に明らかにすると共に、製薬企業とともに現在臨床に既に用いられている抗VEGFR抗体(Avastin)や低分子化合物(Pazopanib)を用いた動物実験を行っている。さらにVEGF以外にCXCL12-CXCR4のchemokine signalが3次元増殖に重要である事が判明し特異的阻害薬(AMD3100)を用いた動物実験を施行し両者の併用が非常に効果的な肉腫増殖抑制作用を有する事を見いだした。研究成果は、米国癌学会、国際骨軟部腫瘍学会等で発表すると共に、論文を投稿、現在revise中である。下記メンバーに阪大整形外科大学院生2名(田中、若松)を加えたチームで研究を遂行しており、定期的に毎月全体meetingを行っている。連携研究者吉川秀樹(大阪大学医学部整形外科教授)ー全体のまとめ、臨床応用、大学院生数名の派遣:研究協力者笹川覚(当部門研究員)ー生物学的な解析:中紀文(大阪大学医学部整形外科講師、当部門特別研究員)ー細胞株の樹立:城山晋(病院整形外科副部長)ー臨床情報、細胞株の樹立:荒木信人(病院整形外科部長)ー臨床情報、細胞株の樹立:上田孝文(大阪医療センター整形外科部長)ー臨床情報、細胞株の樹立現在、既に倫理委員会で承認されているprotocolに従い、患者検体より現在までnude miceに移植可能な骨軟部腫瘍細胞株を10例樹立、さらに樹立をめざしている。樹立した細胞株には幹細胞性を有するものが多く、幹細胞に特異的に発現する遺伝子(Oct3/4, Nanog, SOX2, KLF4)、融合遺伝子(滑膜肉腫の場合SS18-SSX)等の腫瘍悪性化(浸潤・転移)に関与する研究を行っている。得られた結果より、骨軟部腫瘍

幹細胞の標的として、最適な分子の絞り込みを行い、低分子、抗体、siRNA-liposome等を用いた分子標的治療の開発を(製薬企業と共同で)行う。H23-24年度の研究結果より、血管新生因子(VEGF)がdriverとして機能し、標的分子として有効なことが判明。腫瘍細胞自身に対する機能を生物学的に明らかにすると共に、製薬企業とともに現在臨床に既に用いられている抗VEGFR抗体(Avastin)や低分子化合物(Pazopanib)を用いた動物実験を行っている。さらにVEGF以外にCXCL12-CXCR4のchemokine signalが3次元増殖に重要である事が判明し特異的阻害薬(AMD3100)を用いた動物実験を施行中。下記メンバーに阪大整形外科大学院生2名(田中、若松)を加えたチームで研究を遂行しており、定期的に毎月全体meetingを行っている。連携研究者吉川秀樹(大阪大学医学部整形外科教授)ー全体のまとめ、臨床応用、大学院生数名の派遣:研究協力者笹川覚(当部門研究員)ー生物学的な解析:中紀文(大阪大学医学部整形外科講師、当部門特別研究員)ー細胞株の樹立:城山晋(病院整形外科医長)ー臨床情報、細胞株の樹立:荒木信人(病院整形外科部長)ー臨床情報、細胞株の樹立:上田孝文(大阪医療センター整形外科部長)ー臨床情報、細胞株の樹立病院整形外科からの臨床材料からの細胞株の培養は順調に行っており、免疫不全マウス(ヌードマウス)へ移植可能な細胞株が複数樹立されてきている。従って材料は十分揃ってきた。これらの細胞株は融合遺伝子を有していると共に、非常に幹細胞性が強く、幹細胞性の維持に関与する種々の遺伝子・蛋白の発現を示すと共に、多種類の成長因子を発現、分泌している。今年度の実験結果より、とりわけその中で血管新生因子(VEGF)の分泌が、sarcosphereと呼ばれるspheroid形成と3次元増殖に重要であることが判明した。VEGF阻害作用を有する低分子化合物(Pazopanib)はヌードマウス移植種腫瘍の増殖抑制と共に、3次元培養下での腫瘍増大を効果的に抑制した。25年度が最終年度であるため、記入しない。既に承認されて開始している倫理委員会のprotocolに従い、現在までnude miceに移植可能な骨軟部腫瘍細胞株を10例樹立しており、さらに樹立をめざす。樹立した細胞株には幹細胞性を有するものが多く、幹細胞に特異的に発現する遺伝子(Oct3/4, Nanog, SOX2, KLF4)、融合遺伝子(滑膜肉腫の場合SS18-SSX)、悪性化(浸潤・転移)に関与する標的分子として研究しているSSXの幹細胞性や分化に与える影響に関して、siRNA-basedのin vitro, in vivoの抑制実験を行い検討。さらにVEGF以外にCXCL12-CXCR4のchemokine signalが3次元増殖に重要である事が判明し特異的阻害薬(AMD3100)を用いた動物実験を施行中、前臨床として有効な結果が出ており、現在論文作成中である。
幼児期におけるプロジェクト活動の展開可能性と評価方法に関する研究

本年度の研究はフィールドワークを中心に行い、プロジェクト活動を展開していく際のスーパーバイザーとして保育活動に参与するとともに、評価方法に関するアンケート調査を行った。まず、35歳児の保護者らに、子どもたちの家庭生活での姿をたずねるアンケート調査を行った。その結果、(1)身辺自立に関する定量分析では4歳児-5歳児クラス間には有意な差がなく、3歳児-4歳児クラス間の差が大きい項目が多いこと、(2)自由記述の分析からは、3歳児の場合、「自分でやる時とやらない時の差がはげしい」、5歳児に関しては、「一人でやるが手抜きする」という点で保護者が問題を感じていることがわかった。そこで、各クラスにおいて「からだ」に関するトピックをプロジェクト活動として展開させることを試みた。3歳児クラスでは、他者と比べて差異に敏感になるという発達的特徴をふまえて、友だちどうしで身体のさまざまな部分を比べ合い、大きさや皮膚の色、男女の違いなどを言葉や描画、粘土を使って表現していった。現実吟味の力がそなわってくる5歳児は、「見えないけれどもある」もの、身体内部の臓器や「ばい菌」の実際を調べる方向へと展開し、普段食べている魚と人間との共通性(背骨など)や、しっかり手を洗うことの重要性などに気づいていった。次いで、"A Process-Oriented Child Monitoring System for Young Children"(Experimential Education Series, no.2)に基づいて、保育場面で観察されるwell-being及びinvolvementのレベルを一人ひとりについてスクリーニングすることを試みた。日常的にinvolvementの程度が低かった子どもの中に、プロジェクト活動の展開過程においてそれが高まったケースがあったことは特記すべき結果であったが、well-beingの指標はやはり家庭環境との関連が強く短期的な変動はみられなかった。また、保育者の経験年数が少ないほど、involvementの指標よりも「できるかできないか」に観察が焦点化される傾向がみられた。※平成15年6月12月まで体調不良で「絶対安静」の診断を受け、2か月間の入院、及び、自宅での静養を余儀なくされたため、今年度の計画のうちフィールド・ワークを遂行することができませんでした。ご了承いただきますようお願い申し上げます。本研究は、i)プロジェクト活動の展開過程を規定する発達的な要因を明らかにすること、ii)子どもの"involvement"の程度を測る視点、及び、自己発達を診断する方法の手がかりを得ることを目的としている。今年度は、第1に、国内外のプロジェクト実践に関する資料収集を継続し、プロジェクト活動におけるテーマ設定と展開方法を分析した。荒れた姿を見せていた5歳児クラスの実践について、「発生的カリキュラム」、及び、「子どもの主体性」の観点から保育計画立案を見直し、前期の「探検あそび」と後期のプロジェクト活動の展開過程との関連を明らかにした(来年度発行予定の書籍に収録)。第2に、幼稚園教諭や音楽家らと協働してプロジェクト活動に取り組み、子どもの"involvement"の程度を測る準備として、ベルギーのCentre for Experiential Education刊行のA Process-Oriented Child Monitoring System for Young Children, Experimential Education Series, no.2(全240頁)を日本詩に完訳した。この邦訳冊子によって研究協力者らへの周知をはかり、利用する際の留意点や改善点について検討していただいた。研究a 4月当初「荒れた」姿をみせていた5歳児クラス、及び、軽度発達障害と診断され、高機能広汎性発達障害(HFPPD)やADHD(注意欠陥多動性障害)が疑われる5歳児男児3名を対象とした小集団保育の一年間を追い、共同あそびが可能になる条件と対象児らの発達変化について検討を行った。保育計画の立案に際して、5歳児クラスでは近くの山を探検するごっこ遊びの仕掛けを工夫し、小集団保育では、「買い物に行って-おやつを作る」「大根を掘りにいって-皮を剥いて・・・」など、生活体験と遊びとを有機的に結びつけ、活動の流れが必然的になるように工夫した。身近な社会を体感する、「したらする」「したらになる」といった関係を理解する、ごっこ遊びのイメージをつくる、保育活動に保護者も巻き込み、体験を「お手伝い」として活かすといった点はレッジョ・エミリア保育学校のプロジェクト活動の中で重視されていることとも共通し、こうした取り組みの中で、荒れた姿をみせたり、コミュニケーションの難しさをもつ子どもたちも、他者を必要とし、共感して認め合う関係を築いていけることがわかった。(『自己信頼感の育ちに着目した「ことばの教室」における保育の評価-共同あそびに至るまでの保育の工夫と対象児らの発達変化についての考察』岐阜東幼稚園研究紀要,2004、『保育計画のつくり方・いかし方』ひとなる書房、2004)研究b音楽家らと協働し、幼児を対象とした「音あそびプロジェクト」を行い、自分の身体と"対話"する方法や、イメージをふくらませて他の遊びに発展させる方法について検討した。「シュー」「くすくす」などの擬音語から、3歳児クラスではごっこ遊びに発展し、4歳児クラスでは言葉あそびにつながるなど、対話や表現活動としての音あそびの可能性が示唆された。(『園児とつくった音楽あそび40「音・リズム・からだ」』民衆社、2005)本年度の研究はフィールドワークを中心に行い、プロジェクト活動を展開していく際のスーパーバイザーとして保育活動に参与するとともに、評価方法に関するアンケート調査を行った。

その結果、(1)身辺自立に関する定量分析では4歳児-5歳児クラス間には有意な差がなく、3歳児-4歳児クラス間の差が大きい項目が多いこと、(2)自由記述の分析からは、3歳児の場合、「自分でやる時とやらない時の差がはげしい」、5歳児に関しては、「一人でやるが手抜きする」という点で保護者が問題を感じていることがわかった。そこで、各クラスにおいて「からだ」に関するトピックをプロジェクト活動として展開させることを試みた。3歳児クラスでは、他者と比べて差異に敏感になるという発達的特徴をふまえて、友だちどうしで身体のさまざまな部分を比べ合い、大きさや皮膚の色、男女の違いなどを言葉や描画、粘土を使って表現していった。現実吟味の力がそなわってくる5歳児は、「見えないけれどもある」もの、身体内部の臓器や「ばい菌」の実際を調べる方向へと展開し、普段食べている魚と人間との共通性(背骨など)や、しっかり手を洗うことの重要性などに気づいていった。次いで、"A Process-Oriented Child Monitoring System for Young Children"(Experimential Education Series, no.2)に基づいて、保育場面で観察されるwell-being及びinvolvementのレベルを一人ひとりについてスクリーニングすることを試みた。日常的にinvolvementの程度が低かった子どもの中に、プロジェクト活動の展開過程においてそれが高まったケースがあったことは特記すべき結果であったが、well-beingの指標はやはり家庭環境との関連が強く短期的な変動はみられなかった。また、保育者の経験年数が少ないほど、involvementの指標よりも「できるかできないか」に観察が焦点化される傾向がみられた。
微小電極による微生物凝集増殖体(生物膜・グラニュール汚泥)の生態学的構造解析

これまでの生物膜型水処理装置の開発研究では,反応器をブラックボックス的に取り扱う経験工学的な方法論に多分に頼ってきた.しかしながら,生物膜プロセスの信頼性,安定性,融通性を拡大するためには,このブラックボックスを開いて、生物膜やグラニュールなどのアグリゲート体の微生物生態学的構造を明らかにし、その構成フローラのダイナミックスをより精確に把握したうえで,その能力をより効果的に発揮させうるような生息環境をつくり出すことが必要である.そこで本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性と微生物生態学的構造を直接的に把握するために,先端径が1020μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)セサ-を開発し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度検出を行った.さらに,基質の消長,生産物蓄積やその結果として生起するpH勾配の様相などを記述する生態学的構造モデルを構築し,別途回分実験より求めた動力学的パラメーター値を用いたシミレーションによってモデルの検証を行った.開発した微小電極は,pHセンサー,硫化イオンセンサー,アンモニア性窒素センサー,硝酸性窒素センサー,グルコースセンサー,溶存酸素センサーの7種類で,UASBグラニュール汚泥,人口生物膜,回転円板生物膜に適用した.測定した基質濃度プロファイルは構築した生態学的構造モデルによるシミレーションとほぼ一致しており,生物膜やグラニュールなどのアグリゲート体の微生物生態系の機構が明らかになった.これまでの生物膜型水処理装置の開発研究では,反応器をブラックボックス的に取り扱う経験工学的な方法論に多分に頼ってきた.しかしながら,生物膜プロセスの信頼性,安定性,融通性を拡大するためには,このブラックボックスを開いて、生物膜やグラニュールなどのアグリゲート体の微生物生態学的構造を明らかにし、その構成フローラのダイナミックスをより精確に把握したうえで,その能力をより効果的に発揮させうるような生息環境をつくり出すことが必要である.そこで本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性と微生物生態学的構造を直接的に把握するために,先端径が1020μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)セサ-を開発し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度検出を行った.さらに,基質の消長,生産物蓄積やその結果として生起するpH勾配の様相などを記述する生態学的構造モデルを構築し,別途回分実験より求めた動力学的パラメーター値を用いたシミレーションによってモデルの検証を行った.開発した微小電極は,pHセンサー,硫化イオンセンサー,アンモニア性窒素センサー,硝酸性窒素センサー,グルコースセンサー,溶存酸素センサーの7種類で,UASBグラニュール汚泥,人口生物膜,回転円板生物膜に適用した.測定した基質濃度プロファイルは構築した生態学的構造モデルによるシミレーションとほぼ一致しており,生物膜やグラニュールなどのアグリゲート体の微生物生態系の機構が明らかになった.
新規視床下部デルタ神経核の生理機能解析

脳の視床下部は、生命維持活動に重要な本能行動、摂食、飲水、睡眠、性行動ならびに自律神経の調節を担う。視床下部は、その組織学的・化学的特徴から更に10個以上の小区域に分けられている。本研究は、最近我々が発見した新規な視床下部領域、仮称「デルタ神経核」の、1構成ニューロンの種類、2神経回路、3生理機能の3点の解明を目指し研究を行った。その結果、デルタ神経核ニューロンは、神経ペプチドの一種であるエンケファリンを産生し、情動制御に関わる外側中隔と双方向性の神経連絡を有することが明らかとなった。また、これらニューロンは心理的なストレスに応答し、不安の制御に関与する可能性が示唆された。本研究は、申請者らが最近発見したマウス視床下部の新規領域(仮称デルタ神経核)における神経ネットワークと生理機能を明らかとすることを目的としている。本領域は、視床下部室傍核と脳弓の狭間、視床下部前核の背側に位置し、ペリニューロナルネットと呼ばれる特殊な細胞外マトリクスに覆われたニューロン集団を含んでいる。H25年度は、以下のような研究成果が得られた。【デルタ神経核の遺伝子発現と神経細胞種同定】本領域に発現する神経伝達物質合成の関連遺伝子についてDNAマイクロアレイを用いてスクリーニングを行い、また各種神経細胞マーカーを用いて免疫組織化学による確認を行った。その結果、デルタ神経核には少なくとも、GABA陰性のエンケファリン陽性ニューロンとカルレチニン陽性ニューロン、GABA陽性(抑制性)ニューロンの3種が存在することがわかった。【神経ネットワーク】神経ネットワーク解析の結果、本領域は外側中隔、視床下部腹内側核、背側乳頭体前核と相互に線維連絡を有することが明らかとなった。また、本領域に存在するエンケファリン陽性神経細胞は外側中隔に投射し、逆に外側中隔のGABA作動性カルビンディン陽性ニューロンが本領域に投射していることも確認された。【生理機能】c-Fosタンパク質の発現を指標として様々な生理的刺激やストレスに対する神経細胞の応答性を調べた結果、本領域の神経細胞は新規環境暴露や拘束、攻撃行動といった心理的ストレスを伴うような刺激に対しては応答するが、絶食、摂食、絶水、飲水、血中ナトリウム濃度の上昇による高浸透圧刺激のような恒常性維持に影響する刺激に対しては応答を示さなかった。これらの結果から、本領域は、視床下部内の特定領域と神経連絡を持つ他、辺縁系である外側中隔とも相互に繋がりがあり、ストレスや情動に関与する可能性が示唆された。申請者らは最近、マウスの視床下部にこれまで同定されていない新たな領域を発見した。本研究では、仮称「デルタ神経核」と名付けた本領域の、1神経化学的特性、2神経回路、3生理機能について明らかにする。組織学的解析とDNAマイクロアレイ解析により、デルタ神経核を構成する神経細胞種の同定を行った。その結果、デルタ神経核はクラスター化した大細胞性のエンケファリン陽性ニューロンから成ることが明らかとなった。また、近傍には多くのカルレチニン陽性ニューロンも存在していた。両者は共にGABA陰性であった。神経回路について順行性および逆行性ニューロントレーサーを用いて調べた結果、エンケファリン陽性ニューロンは外側中隔へ豊富に投射していた。また本領域は外側中隔のカルビンディン陽性ニューロンからの入力を受けることも示された。次に、c-Fosタンパク質の発現を指標として神経活動解析を行った結果、本領域のニューロンは、新規環境ストレス、拘束ストレス、攻撃行動等の心理的ストレスに応答する一方で、絶食や絶水といった恒常性に関わるストレスには応答が認められなかった。更に、イボテン酸を用いてデルタ神経核損傷マウスを作製し、それらの血中グルココルチコイド濃度と不安様行動を測定した結果、グルココルチコイド濃度に有意な差は認められなかったが、オープンフィールド試験では不安様行動の上昇が示唆された。デルタ神経核の構成ニューロンならびにそれらの投射先に関する結果から、本領域はラット脳で同定された脳弓周囲核と相同であると考えられた。これまで脳弓周囲核の機能についてはほとんど明らかとされていないが、本研究により、心理的ストレスや不安に関与する可能性が示唆された。本研究の成果は、視床下部神経解剖の基礎となる重要な知見であると共に、視床下部ー辺縁系神経回路の理解に大きく役立つと考えられる。神経解剖現段階において、デルタ神経核を構成する神経細胞の種類と神経伝達物質についての情報はは概ね得られたと考えている。また本領域と神経線維連絡がある脳部位についても同定済みである。

また、生理機能に関しては、c-Fos発現を指標とした結果ではあるが、デルタ神経核ニューロンは、情動変化を伴うような刺激(心理的ストレス)に対して顕著な応答性を示すことがわかってきた。現在得られているこのような情報は、本研究目的の達成にあたって重要な基礎的データであり、今後の方策を決定するにあたって重要な手がかりとなっている。このような理由から、今年度の研究計画はおおむね予定通り実行できたと判断した。H26年度は、デルタ神経核の機能解明に向けて、まずは本領域と情動との関連性を明らかとしていく。申請当初は、本視床下部領域が摂食と関連している可能性を想定していたが、その後の実験結果により不安等の情動との関わりが示唆された。よって、まずは本領域のニューロンをイボテン酸等の局所注入によって破壊したマウスを用いて、不安様行動への影響について種々の行動試験(オープンフィールドテスト・明暗箱テスト・高架式十字迷路)により調べる。また、Cre recombinase依存的にchannel rhodopsin 2を発現するTgマウスを用いて、オプトジェネティクスによりデルタ神経核ニューロンを刺激し行動を観察する。さらに、シナプス形成・維持におけるデルタ神経核ペリニューロナルネットの役割解明に向けて、コンドロイチナーゼABCの局所注入によるペリニューロナルネット破壊実験を行い、上述の行動試験に加え、興奮性および抑制性シナプスマーカータンパク質の発現変化についてウエスタンブロッティングと免疫組織化学により解析を行う。
受精現象における精子内卵活性化タンパク質の同定とその機能解明

まず最初の目的である卵細胞への定量的マイクロインジェクションはマイクロインジェクターの導入により可能となった。これによりいろいろな物質を正確にダメ-ジなく注入することができた。しかしながら当初の目的である卵を活性化する精子細胞質因子の分離精製は、この因子が単一成分でないことがわかり、現在、各成分について検討中である。一方それに伴っておこなった研究で、精子の卵活性化における卵細胞内情報伝達因子をいくつか同定できた。まず受精時に精子の融合によって誘導される細胞内カルシウムの上昇とカルシウムに依存した表層顆粒のエキソサイトーシスをそれぞれに特異的な蛍光色素を用いて定量化する方法を確立した。特に後者は膜蛍光色素TMA-DPHを用いた新しい方法で我々が独自に開発した。次に表層顆粒エキソサイトーシスをひきおこす卵細胞内情報伝達因子をいろいろな既知のインヒビターやアクチベータでスクリーニングしたところ、低分子量GTP結合タンパクとマイクロフィラメントが重要な役割をえんじていることがわかった。受精前のマイクロフィラメントは表層顆粒の分布部位に一致して存在し、受精によってその分布が変動する。この変動と表層顆粒エキソサイトーシスはともにマイクロフィラメントインヒビターで抑制された。このことは表層顆粒エキソサイトーシスにマイクロフィラメントが関与する可能性を示唆している。またGTP結合タンパクをそのアクチベータで活性化すると表層顆粒エキソサイトーシスがおこり、それが細胞内カルシウムに依存しないことがわかった。さらにこれが低分子量GTP結合タンパクのRabファミリーに属することを明らかにした。今後これらの機能を詳細に検討していく予定である。まず受精時に精子の融合によって誘導される細胞内カルシウムの上昇とカルシウムに依存した表層顆粒のエキソサイトーシスをそれぞれ特異的な蛍光色素を用いて定量化する方法を確立した。