hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
戦前期東アジアにおける観光現象と鉄道事業の相互性に関する総合的研究

平成30年度は当初の計画どおり、「内地班」もしくは「外地班」のいずれかに所属する各研究組織による個別研究の実施を中心に据えて研究活動が進められた。両班とも、各研究組織は平成29年度に得られた知見を十分に活用しながら、各自で史料の収集や分析に従事した。そこで獲得された成果や課題については、当初計画どおり計3回開催された会合において各研究組織間で共有することができた。その結果、各研究組織によって行われた個別研究は一定以上の成果をあげることができ、当初計画以上のペースで、研究課題のテーマとして掲げられている「戦前期東アジアにおける観光現象と鉄道事業の相互性」に言及した研究成果を、雑誌論文、学会発表、図書すべての媒体で公表することができた。上述した研究組織間の会合については、ほぼ当初計画どおりの7月、11月、1月に東京都内で実施することができた。なかでも11月に開催された会合では、韓国の大学に所属する研究者2名を招聘してそれぞれから研究課題と深く関係する研究報告を頂戴することができた。これは次年度に計画されている国際的な学術交流の一環として位置づけることが可能であり、次年度の研究活動を効果的かつ有意義に進めていく上で大変貴重な機会となった。その他、3月には研究代表者ならびに研究分担者3名の計4名が韓国を訪れ、韓国の大学に所属する研究者1名と研究課題に関する意見交換を行うことができた。また、研究課題と深く関係する場所を実際に訪問することで、各研究組織による個別研究をより精緻化するとともに、研究組織全体の問題意識をより明確化する機会を得ることができた。上記「研究実績の概要」で記したとおり、以下の点において当初の計画以上に進展していると考えている。・当初計画以上のペースで研究成果を公表することができた。・次年度に計画されている国際的な学術交流の一部を前倒しして実施することができた。・当初計画では想定されていなかった韓国訪問が実現し、研究課題への大きな知見を獲得することができた。平成31年度は当初計画どおり、研究成果公表のための公開シンポジウム開催を目指した活動が中心となる。シンポジウム開催に先立ち、平成29年度および30年度において「内地班」もしくは「外地班」のいずれかに所属しながら蓄積された各研究組織による個別研究の成果を共有し、研究組織全体の問題意識の下でそれら一連の成果を統合的に整理しなおすことで、「内地」・「外地」・「観光」・「鉄道」といった本研究課題における重要概念の相互性について検討する機会を持つ。公開シンポジウムには海外の大学に所属している研究者を招聘することを計画しており、そのための準備も行う。現時点で研究計画の変更や遂行上の問題点については看取されていないため、従来どおりの「内地班」と「外地班」という枠組みと、研究組織全体による最終的な知見の統合という方向性を維持しつつ、海外の研究者との連携を密にしながら当初の研究計画どおりに研究活動を進め、公開シンポジウムを3年間の研究活動の締めくくりにしたいと考えている。平成29年度は、各研究組織による個別研究の実施を中心に据え、各自が基礎史料の収集および分析を行うとともに、各研究組織間による成果や課題の共有化を図るために計3回の成果・課題共有化の機会を計画した。その結果、各研究組織による個別研究および基礎史料の収集および分析は一定の成果を挙げることができ、計画以上のペースでいくつかの研究成果を雑誌論文、学会発表、図書のいずれにおいても公表することができた。また、成果・課題共有化の機会については5月、9月、12月に計画どおり3回開催することができた。3回とも各研究組織による成果報告が行われる実質的な研究会として実施され、当初計画以上の成果・課題の共有が実現した。なかでも、9月に開催された研究会には、台湾の大学に所属する研究者が来訪して研究報告を行うという、次年度以降に計画されていた企画を前倒しで実現することができた。7月には、研究代表者がコーディネータ、研究分担者3名が報告者となり、日本植民地研究会全国研究大会において「日本植民地における鉄道と観光」という共通論題報告を組織し、研究の目的のひとつである鉄道史と観光史による総合的な研究による成果の一端を示すことができた。3月には、研究代表者および研究分担者4名が台湾の大学を訪問し、台湾の大学に所属する鉄道史/観光史研究者との国際共同研究会を開催することができた。こうした国際的な研究会の開催も次年度以降に計画されていた企画を前倒しして実施したものであり、国境を越えた情報共有ならびに意見交換が達成された。・計画以上のペースで、研究成果を公表することができた。・計画どおりに成果・課題共有化の機会を開催して計画以上の成果が挙げられたとともに、次年度以降に計画されていた海外からの研究者招聘を前倒しで実現することができた。・計画以上のペースで、研究の目的のひとつである鉄道史と観光史の総合的研究を一部達成することができた。・次年度以降に計画されていた国際的な共同研究を前倒しで実現することができた。

そこで獲得された成果や課題については、当初計画どおり計3回開催された会合において各研究組織間で共有することができた。その結果、各研究組織によって行われた個別研究は一定以上の成果をあげることができ、当初計画以上のペースで、研究課題のテーマとして掲げられている「戦前期東アジアにおける観光現象と鉄道事業の相互性」に言及した研究成果を、雑誌論文、学会発表、図書すべての媒体で公表することができた。上述した研究組織間の会合については、ほぼ当初計画どおりの7月、11月、1月に東京都内で実施することができた。なかでも11月に開催された会合では、韓国の大学に所属する研究者2名を招聘してそれぞれから研究課題と深く関係する研究報告を頂戴することができた。これは次年度に計画されている国際的な学術交流の一環として位置づけることが可能であり、次年度の研究活動を効果的かつ有意義に進めていく上で大変貴重な機会となった。その他、3月には研究代表者ならびに研究分担者3名の計4名が韓国を訪れ、韓国の大学に所属する研究者1名と研究課題に関する意見交換を行うことができた。また、研究課題と深く関係する場所を実際に訪問することで、各研究組織による個別研究をより精緻化するとともに、研究組織全体の問題意識をより明確化する機会を得ることができた。上記「研究実績の概要」で記したとおり、以下の点において当初の計画以上に進展していると考えている。・当初計画以上のペースで研究成果を公表することができた。・次年度に計画されている国際的な学術交流の一部を前倒しして実施することができた。・当初計画では想定されていなかった韓国訪問が実現し、研究課題への大きな知見を獲得することができた。今後の研究は、当初の計画以上に成果を挙げることができた平成29年度の実績にもとづき、各研究組織が個別の研究に従事するとともに、各研究組織間でのより一層の情報・成果共有を目指すことで、研究組織全体が取り組むべき課題や方向性をより一層明確にしていきたいと考えている。研究計画上、現時点で変更すべき点や問題点は看取されていないため、想定どおりの研究計画のもと、従来の研究組織を核として研究活動を行っていくとともに、国内外における新規研究者との協力・連携を模索することでより一層の研究の充実をはかりたいと考えている。平成31年度は当初計画どおり、研究成果公表のための公開シンポジウム開催を目指した活動が中心となる。シンポジウム開催に先立ち、平成29年度および30年度において「内地班」もしくは「外地班」のいずれかに所属しながら蓄積された各研究組織による個別研究の成果を共有し、研究組織全体の問題意識の下でそれら一連の成果を統合的に整理しなおすことで、「内地」・「外地」・「観光」・「鉄道」といった本研究課題における重要概念の相互性について検討する機会を持つ。公開シンポジウムには海外の大学に所属している研究者を招聘することを計画しており、そのための準備も行う。現時点で研究計画の変更や遂行上の問題点については看取されていないため、従来どおりの「内地班」と「外地班」という枠組みと、研究組織全体による最終的な知見の統合という方向性を維持しつつ、海外の研究者との連携を密にしながら当初の研究計画どおりに研究活動を進め、公開シンポジウムを3年間の研究活動の締めくくりにしたいと考えている。
大腸癌で高頻度に認められる第18染色体短腕末端付近の特定アレル欠失の意義の解明

正常大腸粘膜とそれに対応する大腸癌組織合計177サンプルから得たcDNAを対象とした。TS遺伝子が存在する第18番染色体短腕(18p)のmicrosatellite markerであるD18S59、D18S476、D18S481、D18S52、D18S452およびD18S57を用いたPCRを施行し、大腸癌組織における18pの欠失範囲を観察した。さらに、TS遺伝子の非翻訳領域に存在する繰返し配列(TRS)を挟むprimersを用いたPCRで、TRS数によるTS遺伝子型を判定した。その結果、172サンプル中正常大腸粘膜のTS遺伝子型が2R/3Rのヘテロであった90サンプルに対応する大腸癌組織のうち58サンプル(64.4%)にTS遺伝子座を含むアレルの欠失が確認された。また、TS遺伝子座を含む内訳は、2R/lossが12サンプル(30%)、3R/Iossが19サンプル(48%)であった。正常大腸粘膜が3R/3Rもしくは2R/2Rのホモである大腸癌組織についても、TS遺伝子座を含むD18S59を用いた解析では、正常大腸粘膜が2R/2Rである大腸癌組織の2/4(50.0%)に、3R/3Rである大腸癌組織の47/78(60.3%)にTS遺伝子座を含むアレルの欠失が認められた、TS遺伝子型はLOHの頻度に影響を及ぼさないものと考えられた。次いで、D18S59以外の6種類の18pマーカーを使用し,18pの欠失範囲の判定を行なった。その結果、107サンプルに認められた18pの欠失はいずれも広観囲に及び、新規発癌責任遺伝子の特定は断念せざるを得なかった。一方、その範囲に関わらず、18pの欠失の有無はTSmRNAとTS蛋白の腫瘍組織内発現量に影響を及ぼさなかった。腫瘍組織内のTS蛋白発現量は、3Rのアレルが存在する組織で有意に高く、3RのmRNAが転写されることによってTS蛋白の翻訳が亢進すると考えられた。金沢大学医学部附属病院心肺・総合外科の管理下にあるヒト大腸癌のDNAライブラリーに13例の進行大腸癌症例を加えたヒト大腸癌由来DNAおよび対応する,cDNA各153サンプルを用いて実験を施行した。正常大腸粘膜と大腸癌組織から得たcDNAサンプルについて、TS遺伝子の非翻訳領域に存在する繰り返し配列を挟んで増幅を行う二つのプライマーを用いてPCRを行なった。その結果、153サンプル中54サンプル(35%)で正常大腸粘膜のTS遺伝子型が2R/3Rのヘテロであった。一方、それら54サンプルについて対応する大腸癌組織のTS遺伝子型をみると、2R/3Rは21サンプル(39%)のみであった。残り33サンプルについて18p11マーカーであるD18S59を用いたLOH analysisを施行した。その結果、2R/lossが13サンプル(24%)、3R/lossが20サンプル(37%)と、TS遺伝子座を含むアレルの欠失が33サンプル全てにみられた。正常大腸粘膜のTS遺伝子型がホモのものについては、2R/2Rが9サンプル(6%)、3R/3Rが90サンプル(59%)であった。正常大腸粘膜がホモのサンプルに対応する大腸癌組織についても、D18S59を用いたLOH analysisを施行した。

その結果、正常大腸粘膜が2R/2Rである大腸癌組織では、5/9(56%)に、3R/3Rである大腸癌組織では、54/90(60%)にTS遺伝子座を含むアレルの欠失が認められた。これらより、正常大腸粘膜のTS遺伝子型に関わらず、大腸癌組織で60%にTS遺伝子座を含む18pの欠失が存在することが明らかになった。現在、D18S59以外に5種類の18p11マーカー(D18S476、D18S481、D18S52、,D18S452、D18S453)と18p12.3のマーカーD18S57を使用し、18pの欠失範囲の判定を行なっている。正常大腸粘膜13サンプルと大腸癌組織140サンプルから得たcDNAについて、TS遺伝子の非翻訳領域に存在する繰り返し配列を挟んで増幅を行うプライマーT7-TS2を用い、T7 RNA polymeraseの存在下でPCRを行なった。153サンプル中正常大腸粘膜のTS遺伝子型が2R/3Rのヘテロであった54サンプル(35%)のうち33サンプルに、サテライトマーカーD18S59を用いたLOH analysisにより、TS遺伝子座を含むアレルの欠失が確認された。内訳は。2R/lossが13サンプル(24%)、3R/lossが20サンプル(37%)であった。正常大腸粘膜が3R/3Rもしくは2R/2Rのホモである大腸癌組織についても、TS遺伝子座を含むLOHの存在を観察した。したがって、TS遺伝子型はLOHの頻度に影響を及ぼさないものと考えられた。次いで、D18S59以外に5種類の18p11マーカーD18S476、D18S481、D18S52、D18S452、D18S453と18p12.3のマーカーD18S57を使用し、18pの欠失範囲の判定を行なった。その結果、92サンプルに認められた18pの欠失はいずれも広範囲に及び、その領域にコードされている蛋白の発現は、LOHの有無と相関しなかった。当該領域に新規癌抑制遺伝子が存在する可能性は低いものと考えられる。
カイラル対称性を持つ2+1フレイバーの動的格子QCDとフレイバー物理への応用

量子色力学(QCD)の持つカイラル対称性は、QCDが記述するクォークの力学において重要な役割を果たす。QCDの近似によらない計算が可能な格子シミュレーションでは、最近になってこのカイラル対称性を厳密に扱えるようになった。本研究では、軽いu, dクォークとやや重いsクォークを含む、2+1フレイバーの厳密なカイラル対称性を持つ格子QCDの大規模シミュレーションを行い、素粒子標準理論の検証に必要な行列要素の計算など、フレイバー物理への応用を行った。本年度は、2+1フレイバーの動的クォーク効果を含むケージ場の配位を生成し、今後のフレイバー物理に関係したハドロン行列要素の計算のための準備を主に行った。シミュレーションを行うためのコードは、すでに動作するものが開発済みであったので、これを用いてゲージ場配位の生成を開始した。空間方向のサイズ16の格子について現在までにほぼ生成を終了し、物理的な観測量の測定に進みつつある。また同時に、シミュレーション速度の向上のためのアルゴリズムの改良を行った。これは4次元空間の演算子を5次元に拡張する方法において、これまで難しかった低い固有値部分の取り扱いを可能にしたことで、最も時間のかかるオーバーラップ演算子の線形解法について数倍の速度向上を達成し、生成プログラム全体でも約2倍の速度向上を得た。このアルゴリズムを上記のゲージ場配位の生成にも使用し、迅速な研究の進展に役立てた。生成された格子の上では静的ポテンシャルの計算を行い、格子間隔の決定を行っている。これらにより、フレイバー物理のためのハドロン行列要素を計算する準備が整いつつある。また、物理量を精度よく決定するには、格子サイズを24に大きくした計算が不可欠であり、そのための準備的研究も行った。b-クォークのような重いクォークを格子上で扱うための有効理論についても研究を行った。この方法ではクォーク質量無限大の極限を考え、そこからのずれを補正として取り入れる。我々は質量無限大の極限において、現象論的に重要な、ベクトルBメソンがBメソンとパイオンに結合する際の結合定数の高精度計算を行った。今年度は他のグループが生成した格子を用いて方法論の確認を行い、その結果十分な精度が達成可能であることを確認した。今後本研究で生成したゲージ場配位でも計算を行う予定である。本年度は2+1フレイバーの動的クォーク効果を含む格子QCDのシミュレーションを、主に16^3×48という格子サイズで行った。昨年度に開始したトポロジカルチャージゼロでのゲージ場の配位の生成を完了し、スケール(格子間隔)の決定やハドロンスペクトルの計算など基本的物理量を決定した。更に非自明なトポロジーを持つ配位の生成を行うことによって、トポロジカルチャージの効果を調べている。また、これまでより大きなサイズである24^3×48の格子での配位の生成を開始した。これによって有限格子サイズによる系統誤差を定量的に見積もることができ、より精密に物理量を計算できるようになる。生成された格子上での物理量の測定も順調に進んでおり、これまでに2フレイバーの配位を用いた核子中のストレンジクォークの効果、カイラル摂動論との精密な比較、Sパラメターの測定、真空偏極による結合定数の測定などが公表されているが、これらを2+1フレイバーに拡張することを進めている。大きな格子サイズでの計算ではこれまでの数倍の時間がかかるため、アルゴリズムの改良やプログラムの高速化のための研究も継続して行っている。その中ではクォーク線形方程式に対する5次元解法の改良について進展があった。これは近似的な4次元の解があった場合に、そこから5次元の近似解を構成する方法で、これを用いて5次元方向のサイズを変えながら解くアダプティブ解法、時間発展中にそれまでの解からの外挿によって近似解を求める手法などが5次元解法に対して応用可能となる。これらがどの程度実際のシミュレーションを高速化できるかについて定量的に見積もることは今後の課題である。本年度は2+1フレイバーの動的クォーク効果を含む格子QCDのシミュレーションについて、24^3×48の格子配位の生成を行いながら、これまでに生成した16^3×48格子配位でさまざまな物理量の測定を行った。また非自明なトポロジーを持つ配位により、トポロジカルチャージの変動による効果の見積もりを行った。これらにより、物理量に影響を与える有限格子サイズ効果の見積もりがより信頼性のあるものとなる。既に存在している2フレイバーでの格子配位での測定も継続した。今年度は真空偏極と結合定数、パイオンの形状因子、フェルミオンの双線形演算子の非摂動繰りこみ、についての成果が公表された。他のフレイバー物理の解析に必要な物理量についても計算が進められている。また、有限温度状態への、厳密なカイラル対称性を持つ作用の適用を開始した。これは相転移の性質がカイラル対称性によって支配されることから、厳密なカイラル対称性が重要な意味を持つと期待される。

これらに加えて、近年標準理論を超えた物理の候補として注目されている、テクニカラー理論を格子シミュレーションで扱うための研究を行った。これはQCDとほぼ同じ手法で調べることができるが、カラー数、フレイバー数、フェルミオンの表現が異なる。我々はカラー数が2の場合について、基本表現と随伴表現でのフェルミオンに対し、厳密なカイラル対称性を持っ作用を適応することを目指した準備研究を行った。このような研究に必要となる、結合定数のスケール依存性を調べる方法についても開発を行った。これらは厳密なカイラル対称性を持つ理論の応用として非常に興味深い課題であり、本研究課題の発展として研究を継続していきたい。
トゥファ堆積物を用いた宇宙線強度変動復元手法の開拓

本研究では、古い年代でも厳密な1年分解能で宇宙線変動を復元できる手法を開拓すべく、炭酸塩堆積物に含まれるベリリウム10の基礎分析を行った。トゥファ堆積物およびトラバーチン堆積物の濃度特性、トラバーチン堆積物の雨季層および乾季層ごとの濃度、また経年変化の分析を行った。あわせて、ベリリウム9および微量金属元素についても分析を行った。研究の結果、堆積速度の補正を行い、さらに微量金属元素による補正を行うことにより、中性子モニターで測定された宇宙線変動と矛盾しない変動が、トラバーチン堆積物の乾季層のベリリウム10から得られる可能性が示唆された。過去の宇宙線変動を復元には、アイスコア中に含まれるベリリウム10や樹木年輪に含まれる炭素14などの宇宙線生成核種を用いることが一般的である。しかし、アイスコアを用いる場合には、古い年代ほど、年層の圧縮により達成できる時間分解能が下がるほか、炭素14を用いる場合には、半減期があ5730年と短いため、約6万年前までの復元が限界である。そこで本研究では、6万年以上前の年代でも1年分解能で宇宙線変動を復元する可能性を模索するため、古い年代でも1cm以上の年層を保持するトゥファ堆積物(トラバーチン堆積物)に含まれるベリリウム10を用いた宇宙線強度変動復元の可能性を検討し、その手法を開拓することを目的としている。本年度は、中国雲南省で採取されたトラバーチン堆積物の基礎分析を行った。また、年層分離の手法の最適化、および化学処理の最適化のため、同一の年層から複数の手法での試料調整を行い加速器質量分析計での測定に向けてターゲット試料の作成を行った。そのほか、ベリリウム10の堆積過程についても詳細に検討するため、一月ごとにサンプリングしたトゥファ堆積物についても前処理を開始した。トラバーチン堆積物の基礎分析およびサンプリングは予定通り遂行できている。本年度は、中国雲南省においてフィールド調査およびトラバーチン堆積物のサンプリングを行った。サンプリングを行った試料の年層についてベリリウム10測定のための試料調製を行い、東京大学総合研究博物館が保有する加速器質量分析計で初期解析を行った。分析結果に基づき、試料調製手法の妥当性の検証を行い、また、高精度を達成するために必要な試料量の検討を行った。フィールド調査およびトラバーチン堆積物の年層の基礎分析は予定通り遂行できている。過去の宇宙線強度の変動は、一般的に、アイスコアに含まれるベリリウム10や、樹木年輪に含まれる炭素14などの宇宙線生成核種の分析によって復元される。しかしながら、アイスコアによって得られる時系列データには、年代誤差が伴うほか、古い年代ほど時間分解能が下がるという問題点がある。一方、樹木年輪を用いる場合は、1年の分解能でのデータの取得が可能だが、炭素14の半減期が5730年であるため、約6万年前までの分析が限界である。そこで本研究では、古い年代でも厳密な1年分解能でデータを取得できる手法を開拓すべく、炭酸塩堆積物(トゥファ堆積物およびトラバーチン堆積物)に含まれるベリリウム10の基礎分析を行った。トラバーチン堆積物は、トゥファ堆積物に比べてベリリウム10含有量が非常に低いが、明確な年層を持っている。本研究では両者の濃度特性、トラバーチン堆積物の雨季層および乾季層ごとの濃度、また経年変化の分析を行った。あわせて、原子吸光によりベリリウム9含有量の分析を行い、炭酸塩の堆積速度の補正の妥当性を検証した。また、微量金属元素の分析を行った。分析の結果、堆積速度の補正を行い、さらに微量金属元素による補正を行うことにより、中性子モニターで測定された宇宙線変動と矛盾しない変動が、トラバーチン堆積物の乾季層のベリリウム10から得られる可能性が示唆された。2016年5月に、研究協力者の協力のもと中国雲南省および青海省にて基礎分析用の堆積物のさらなるサンプリングを行う。今年度は、その試料の化学処理を行い、東京大学の加速器質量分析計を用いて測定を行う。適宜、中性子モニターによる宇宙線強度データとの比較を行う。

2017年6月に、研究協力者の協力のもと、中国雲南省にてトラバーチン堆積物のさらなるサンプリングを行い、高精度分析を達成するために必要な試料量を確保する。化学処理の後、東京大学の加速器質量分析計を用いて、年層ごとにベリリウム10濃度の分析を行う。結果は、中性子モニターによる宇宙線強度データと比較を行う。宇宙線物理学,太陽物理学ごく少額の残金が発生した。一部分析数が予定と異なったため残金が発生した。消耗品代として使用する。次年度の消耗品および測定費として使用する。
糖尿病患者におけるカプサイシン感受性神経の食道運動障害に与える影響についての検討

正常ラットの上部・下部食道及び後根神経節におけるTRPV1、TRPV2、TRPA1のmRNA発現レベルを免疫組織学的および分子生物学的手法を用いて検討した。その結果、後根神経節におけるmRNAの発現レベルは高かったが、上部-下部食道間では違いを認めなかった。一方、慢性逆流性食道炎モデルでは、下部に比し上部においてTRPV1、TRPV2、TRPA1のmRNAの発現レベルは高い傾向を示した。正常人、逆流性食道炎患者でも検討を行っているが、現段階では食道の部位別でmRNAの発現レベルに違いはみられていない。続いて10週齢のラット慢性逆流性食道炎モデルを用いてTRPV1、TRPV2、TRPA1のmRNA発現レベルを検討した。その結果、後根神経節でのmRNA発現レベルはcontrol、sham群および慢性逆流性食道炎モデルの間で有意な違いは認めなかった。食道組織でのmRNA発現レベルは、controlとsham群では食道の部位によって違いは認めなかったが、慢性逆流性食道炎モデルにおいては下部食道に比し上部食道で有意に高い値を示した。昨年、10週齢の正常ラット及び慢性逆流性食道炎ラットモデルを用いてTRPV1、TRPV2、TRPA1のmRNA発現レベルを検討した結果、慢性逆流性食道炎モデルにおいては下部食道に比し上部食道で有意に高い値を示し、慢性逆流性食道炎ラットでは食道上部でTRPファミリーの分布が多いことが予想され、これがヒトにおいての症状発現の一因となっている可能性が考えられた。ただ、慢性逆流性食道炎ラットは術後死亡するものも多く、数例での検討となり十分な例数での検討はできていなかった。ヒトで検証する前にラットモデルでの検討症例を増やし再度同様の結果が得られるか確認が必要と考え症例を追加。その結果、前回と同等の結果が得られたためヒトへの検討を開始。実際に健常者とGERD患者においてTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1の発現・分布に違いが認められるかについての検討を行うため、当院の倫理委員会の承認を得たのち検討に移った。対象者から研究に参加していただく同意を得たのち、下部・中部・上部食道の粘膜を生検し検体を確保。検体の確保をすすめると共に、併せてTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1のmRNA発現レベルの検討を進めている。胃食道逆流(GERD)症状とtransient receptor potential (TRP)イオンチャネルスーパーファミリーを構成する受容体であるTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1との関連を明らかとするため実際に健常者とGERD患者においてTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1の発現・分布に違いが認められるかについての検討を行っている。正常患者10名、GERDのうちNERD症例5名、逆流性食道炎gradeA症例2名、逆流性食道炎gradeB症例2名、逆流性食道炎gradeC症例2名、逆流性食道炎gradeD症例2名の食道・上部・中部・下部からそれぞれ少なくとも1か所ずつ内視鏡下に生検を行いTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1の発現について検討を行った。TRPファミリーの受容体の発現量が少ないことから、すべての症例についての検討ができているわけではないが、検討した範囲では動物実験でみられたような、食道の部位による発現・分布に大きな違いは認められなかった。もともと、TRPファミリーの受容体が後根神経節で作られ軸索輸送で食道粘膜に分布すること、症例数が少ないことも影響しているものと考えられる。酸を食道内に注入し酸を還流した部位で症状に違いが認められるか検討しているが、その結果、食道の上部の感受性が高いことが明らかとなっている。逆流性食道炎患者においては、健常者と比較して感受性がさらに高まっていることが予測され、食道の部位による受容体の分布に違いがあるものと考えられる。更なる症例追加による検討の余地があるものと考える。本来の計画通りであれば、ヒトでのTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1の発現・分布について少なくとも10例以上について検討していなければならないが、前年度のラットモデルでの検討症例数が数例と非常に少なかった。結果は予想されたものであったがヒトで検討する根拠となるデータが不足していたため、追加検討し検証したことによりヒトでの検討が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトでの検討に関しては、当院での倫理委員会の承認も得、正常者、患者を対象にTRPV1、TRPV2、TRPM8、TRPA1の発現・分布を検討するための生検を開始している。

できる限り症例数を確保するため対象者の確保に努めると共に、生検組織から得られたデータの解析を滞りなく進めるよう努力する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
肝細胞スフェロイド3次元形成のためのマイクロ空間プラットフォームの開発

前年度までで肝組織形成プラットフォームの基本構築が達成されていたため,本年度はプラットフォームとしての完成と,そのプラットフォームの応用を行った.具体的には(1)申請書の予定に沿って,前年度までに行った基本プラットフォームの基本構成をもとに長期培養のための還流システムの改善を行った.(2)同様に,プラットフォームの高処理を実現するために,チャンバのアレイ化(並列化)を行った.(3)昨年度までは単一細胞によるスフェロイドの形成方法に関して検討してきた.本年度は更に生体を模擬したスフェロイドである異種複数細胞からなるヘテロスフェロイドの形成を行った.その結果,(1)長期培養のために,従来の還流システムを改善し更に二つのコンポーネントを自作し,培養日数を1週間まで延長した。(2)チャンバのアレイ化を行い,チャンバを15個連結できるようにし,従来に比べ15倍の処理能力を可能にした.(3)異種細胞の接着は困難であったため,コラーゲンゲルを新たに使用することでヘテロスフェロイド形成を可能にした.そのヘテロスフェロイド形成の評価を行い,その結果,サイズ制御が可能であること及び高速(約2分)でスフェロイドが形成できることが判明した.これらの結果から,交付申請書の目的である肝細胞スフェロイド3次元形成のためのマイクロ空間プラットフォームを提案し,具現化した.さらに本プラットフォーム及びバイオマテリアルを利用した新たなヘテロスフェロイド形成手法を提案し,従来数日かかるヘテロスフェロイドの形成を約2分で可能にする高速ヘテロスフェロイド形成を実現した.本研究は、バイオマテリアルとマイクロ流体を利用した新たなプラットフォームを提案するものであり社会に対して十分な貢献を行うことが出来た.シミュレーションをもとにデザインしたチャンバーに細胞懸濁液を還流することで実際にスフェロイドを作成した.その結果,シミュレーション結果を裏付けるようにチャンバー内にマイクロ旋回流が発生し,組織塊(スフェロイド)を形成することに成功した.さらにチャンバー特性に関して検討したところ、このチャンバーはチャンバー径,培養液内細胞濃度を変化させることで,直径130μm430μmのスフェロイドを作成でき,±15%という高精度でスフェロイドサイズを制御できることが判明した.このスフェロイドを形成する時の流体特性を一般化するためにチャンバー内流体の挙動をCCDカメラとmicroPIV法を用いて計測したところ,スフェロイドが滞留している直径1mmの範囲で流速が0になっている閉空間が形成されていた.この閉空間がスフェロイドを形成し滞留させていることをわかり,チャンバー内流体特性を明らかにした.本年度では,このような,シングルチャンバーに関して検討するだけではなく,還流システムの最適化とアレイ化にも挑戦し,本デバイスによる長期培養(80%以上を数日間チャンバー内に培養)と一括大量処理(15倍)を可能にした.さらに,来年度のスフェロイド機能測定(EROD法)と酸素測定法(りん光寿命法)も構築し終わっており.今年度の研究計画も順調に遂行出来るものと考えられる.以上,本年度の結果はプラットフォームの基盤となるものであり,今後システムとして完成させるために必要不可欠な成果である.申請書に記載した実験実施計画では2009年末に機能測定をする計画が記載してあるが,研究を効率化させるためにアレイ化を優先させて行った.そのうえで,確立した計測法を用いてスフェロイドの肝機能測定を来年度の前半に行い実験実施計画に準じて研究を遂行する予定である.前年度までで肝組織形成プラットフォームの基本構築が達成されていたため,本年度はプラットフォームとしての完成と,そのプラットフォームの応用を行った.具体的には(1)申請書の予定に沿って,前年度までに行った基本プラットフォームの基本構成をもとに長期培養のための還流システムの改善を行った.(2)同様に,プラットフォームの高処理を実現するために,チャンバのアレイ化(並列化)を行った.(3)昨年度までは単一細胞によるスフェロイドの形成方法に関して検討してきた.本年度は更に生体を模擬したスフェロイドである異種複数細胞からなるヘテロスフェロイドの形成を行った.その結果,(1)長期培養のために,従来の還流システムを改善し更に二つのコンポーネントを自作し,培養日数を1週間まで延長した。(2)チャンバのアレイ化を行い,チャンバを15個連結できるようにし,従来に比べ15倍の処理能力を可能にした.(3)異種細胞の接着は困難であったため,コラーゲンゲルを新たに使用することでヘテロスフェロイド形成を可能にした.そのヘテロスフェロイド形成の評価を行い,その結果,サイズ制御が可能であること及び高速(約2分)でスフェロイドが形成できることが判明した.これらの結果から,交付申請書の目的である肝細胞スフェロイド3次元形成のためのマイクロ空間プラットフォームを提案し,具現化した.さらに本プラットフォーム及びバイオマテリアルを利用した新たなヘテロスフェロイド形成手法を提案し,従来数日かかるヘテロスフェロイドの形成を約2分で可能にする高速ヘテロスフェロイド形成を実現した.本研究は、バイオマテリアルとマイクロ流体を利用した新たなプラットフォームを提案するものであり社会に対して十分な貢献を行うことが出来た.
ナノ電子状態解析のフロンティア開拓

本研究では、透過型電子顕微鏡を主軸にした各種付随分光法を駆使して固体材料の微小な局所領域の化学状態を分析、可視化する新たな手法を開発し、実用材料への適用にまで止揚することを目的とした。特に細く絞ったナノ電子プローブを試料上で走査、またはロッキングする事によって分光スペクトルを場所または回折条件の関数として多数収集し、得られたいわゆる「ビッグデータ」に機械学習(インフォマティクス)の手法を適用し、異なる化学状態毎に状態解析と同時にその空間分布を可視化する技術を確立するに至った。本研究では,透過電子顕微鏡のナノ電子プローブを用いた分光法(電子エネルギー損失分光(EELS:伝導帯DOS),カソードルミネッセンス(CL:バンド間遷移),軟X線発光分光(SXES:価電子帯DOS))を集約し,動力学的回折条件によるブロッホ波の対称性を利用して,ナノ構造を内包する試料の電子状態・光学的性質・磁性を,「ナノ分解能で,同じ場所から同時に,かつ元素・サイト選択的に」測定する.そして得られたデータを統計処理することで多角的な情報抽出を行い,共通の分光的特徴を持つ領域の空間分布の可視化を通じて「高角度分解能・多元電子分光」という新たな格子特異点の定量分析法を開拓し,さらにこれらを実際の材料解析へ応用することを目指している.本年度の主な成果および進捗状況は以下のとおりである:1超高圧走査透過電子顕微鏡およびEELSによるナノ磁石の磁気モーメントの定量測定に成功した.2電子チャネリングを利用した二次元格子欠陥の局所状態分析法につて以下の二つを達成した:(1)動力学電子回折理論と第一原理電子状態計算の結合による定量測定法の確立.(2)Bethe法およびMulti-slice法による格子欠陥を含む系における非弾性散乱断面積精密予測プログラムの作成.3領域内連携研究による材料設計と創製として以下の二つに着手した:(1)Tiの表面酸化処理による骨伝導性発現機構の解析.(2)フラッシュ焼結によるセラミック多結晶体の急速焼結とその機構解明.4複合酸化物薄膜における陽イオン比制御と新奇機能性薄膜の創成:酸素空孔を制御したSrMnO2.5薄膜のドメイン構造を解明した.1複合電子顕微分光装置については,反射電子検出器を装備し,信号収率の小さい波長分散蛍光X線分析(WDX)及びCLに対して,厚い試料からチャネリング信号を取り出しつつ測定信号強度を稼ぐ改良が完成した.2新たなTEM-CLシステムの,ナノ粒子によるドラッグデリバリーという新たな未解明のテーマへの応用を開始した.STEMを用いた高い空間分解能は画期的だが,ナノ粒子に付与する電子によって効果的に発光する分子の探索を行い,特定の量子ドットが効果的に使用可能であることを突き止めた.次年度から本格的な観察を開始する.2EMCDによる磁性体の磁気モーメントのナノ領域測定では,前年度の成果を更に拡張し,強磁性多層膜を1nm程度の分解能で走査することで磁気モーメントの界面付近の位置依存情報を得ることに成功した.更に国際共同研究によってEMCD信号の試料厚さ依存性を測定し,軌道磁気モーメントとスピン磁気モーメントを分離して測定することを世界に先駆けて成功した.3前年度確立したビームロッキングによる蛍光X線のイオン化チャネリングパターンによるサイト選択的分析法を,実際のフェライト材料,蛍光材料などの微量添加機能元素に適用し,更に一般化した定量測定法を確立した.4人工骨に使われるチタン表面の窒素酸化処理における窒素の化学状態分析結果について,窒素の化学状態を同定するために第一原理電子状態計算を実施し,最終的に生体親和性を持つチタニア表面の電荷分布状態を特定することに成功した.5機械工学専攻のグループと共同で,ダイヤモンドライクカーボンコーティング膜の摩擦試験後の断面についてナノメートル分解能での分析を行い,コーティング膜による低摩擦現象の解明を図り,ナノトライボロジーという新しい分野を切り開きつつある.本年度の主な成果および進捗状況は以下のとおりである:1電子チャネリングを利用した格子欠陥の局所状態分析において、(1)EDX-EELS同時測定によるリチウムイオン二次電池正極のカチオンミキシングの解析(2)「動力学電子回折理論と第一原理電子状態計算の結合による定量」を行った.具体的には:(i)M型フェライトにおける磁気異方性促進添加元素の占有サイトと占有率測定:更に新規W型フェライトの分析へ拡張中.(ii)Y2Ti2O7輻射熱反射コーティング膜の添加Alの占有サイト評価:A03(キ)班との連携.2電子磁気カイラル二色性(EMCD)測定の開発において、(1)Fe/MgO磁気トンネル界面のナノレベル磁気モーメントマッピング.(2)原子面分解能EMCD定量測定法の開発に成功した.3多変量スペクトル分解法の開発では、新学術領域「スパースモデリングの深化と高次元データ駆動科学の創成」及び公募班との連携によって、従来の懸案であった解の唯一性問題と成分数をデータから正しく求める手法を開発した.4領域内連携研究による材料設計と創製において、(1)「Tiの表面酸化処理による骨伝導性発現機構の解析」および、(2)「フラッシュ焼結によるセラミック多結晶体の急速焼結とその機構解明に成果があった.5

さらに複合酸化物結晶最表面構造制御法の開発:「欠陥形成エネルギー差を利用した結晶最表面構造の制御法を開発」、複合酸化物薄膜における陽イオン比制御と新奇機能性薄膜の創製:「陽イオン比制御による高電子移動度SrTiO3薄膜成長」の二つの成果を挙げた.本助成金により,電子エネルギー損失分光(EELS),エネルギー分散型及び波長分散型X線分析(EDX/WDX),カソードルミネッセンス(CL)及び後方散乱電子検出器(BSED)を一台の走査透過型電子顕微鏡(STEM)に統合して配した複合電子顕微分光STEMのプロトタイプが完成した.我々は,現在世界のSTEM分析の主流である原子コラム毎の分析に対し,その弱みである比較的厚い試料における動力学的電子回折現象を積極的に利用する電子チャネリングを利用した新たな分析手法を確立した.特に収束電子ビームを試料上で走査する代わりに平行ビームを試料上の一点でロッキングさせることによって各分光データの回折条件に対する変化として捕らえ,特に機能元素の原子占有サイトを定量的に測定する手法を開発した.これらは現在フェライト磁石材料,次世代航空機タービンの耐環境保護膜,リチウムイオン電池などの分析に応用され,ユニークな成果を挙げつつある.また微細構造制御された磁性材料の分析に重要となる磁気角運動量の測定をナノメートル分解能で可能とする電子磁気カイラル二色性(EMCD)の測定法開発において,世界を主導する成果を挙げつつある.以上の成果は,電子分光測定技術だけでは無く得られたデータの統計情報学に基づく処理技術に追うところが大きい.我々が早期に提唱した多変量スペクトルデータへの統計学の応用によって,近年必然的に膨大なサイズのデータを生むPC制御による網羅的自動測定データからそこに含まれる有為な情報を恣意的な走査無く抽出し,その空間分布を可視化する手法が大きな発展を遂げた.これは今後ナノ材料の分析技法の一つとして不可欠な要素となることが期待されている.当該年度の実績として以下が挙げられる:前年度までに,EELS,EDX,CL検出器の制御システムを統合し,一つのPCプラットフォーム上で同時に上記分光測定を行うシステムが完成した.当システムを利用した具体的な成果として以下の項目が挙げられる:(1)ビームロッキングによる電子チャネリング条件下でのEELS/EDX同時測定の実施によって,リチウム二次電池正極材料の陽イオン配列とその価数変化を定量的に捉えることに成功した.この論文は欧文誌Microscopyに6月掲載され,Editor's Choice論文に選定され表紙を飾った.(2)領域内連携成果として,人工関節に使用するTi合金の表面スケール層のSTEM-EELSスペクトラムイメージ分析を行い,疑似体液中でハイドロキシアパタイトが生成されて生体親和性を生じるための表面状態を明らかにし,この成果を米国材料学会誌に公表した.(3)STEM-EELS法を低摩擦化のための窒素含有非晶質炭素コーティング膜の分析に応用し,新たなナノトライボロジーという分野を切り開きつつある.実際にコーティング材の摺動後の断面を分析することにより表面付近のミクロ構造及び化学状態の変化によって表面が不活性になることが明らかになり,これまでの摩擦の概念を大きく変えつつある.(4)分光スペクトルの情報統計処理法として低ランク行列分解法によるスペクトル分解とその可視化法を開発した.本年度はソフト直交性の導入およびスペクトルデータの新しい前処理法によって従来の問題点であった分解された成分スペクトルの不自然な強度落ち込みを解消し,重なり合うスペクトルを正しく分解することに成功した.
パキスタンにおけるインドーユーラシア衝突境界域の造構発達史

パキスタン西部のインダス河の西域一帯、バルチスタン州のほぼ全域にわたって地質調査を行い、西から東へFlysh Zone,Axial Zone and Calcareous Zoneと分けられている地帯(terrane)区分が、インドーユーラシア両大陸の衝突過程においてもっている意義について、化石層序学的、堆積岩岩石学的、地球化学的、構造地質学的、変動地形学的および古生物学的研究を行い、現在までに次のような結論をえたので要約して記述する。1.Flysh Zoneにはインドーユーラシア両大陸の衝突後、衝突境界域を広く覆って発達し、アジア大陸の前縁海域を埋積したタービダイト優勢相が特徴的に分布している。堆積構造から推測された堆積物の供給方向は、北ないし北西を明瞭に示し、南側の2帯における供給方向とは逆をしめしている。最下位には始新世サンゴ礁石灰岩が局地的に発達し、それを覆って大型有孔虫類(Nummulitesを主体とする)を多量に含むタービダイト層、砂岩優勢の泥岩互層と重なっている。2.Axial ZoneとCalcareous Zoneには、いわゆるAlozai Groupが広く分布している(Hunting Survey Corporation,1960)が、両地帯の構成層は、岩相的にも年代的にも明らかに異なり、構造地質学的にも別の単元とみなされよう。この地層名は後で述べるAxial Zoneのオリストストローム相に限って使用されるべきであって、Calcareou Zoneのジュラ紀Loralai石灰岩、白亜紀のParh石灰岩層とは区別されなくてはならない。3.Axial Zoneには、Muslim Bagh ophioliteやBella ophioliteのように、両大陸が分離していたと考えられる三畳紀初期の両大陸間に位置していたと考えられる"中央海嶺"にその起源がもとめられるようなophiolite-blue schist complexが三畳紀オリストストローム層上に衝上した関係で発達している。4.Axial Zoneのオリストストローム層には2相が認められ、ともに葉層状の泥質岩(papery shale)が主体であるが、狭在層とオリストリスに関しては著しく異なっている。ひとつはGwalの東一帯に典型的に見られるもので、細礫径のものから大きいものでは長径が1km以上に達するオリストリスをともなっている。細ー中礫径のオリストリスは、あたかもpelagic shaleの堆積場に氷河性のdropstoneとしてもたらされたかのような産状を呈している。これらのオリストリスには、ペルム紀の有孔虫類や腕足貝類を含むミクライト質石灰岩、前期三畳紀アンモナイトを含む石灰岩礫岩、おそらく同時期のpelagic oolitic石灰岩、緑色岩類、石英質砂岩などがある。もうひとつは、薄層の極細粒石灰岩、凝灰質ないし珪質泥岩ーチャートをはさむやはり葉層状の泥岩層で、一部には著しい海底地すべり構造がみとめられ、また発泡した玄武岩質岩を含む緑色岩主体のオリストストローム層、上部では数mの厚さの礫岩層を狭在している。5.オリストストローム層の泥岩層および狭在する薄層の珪質岩からは、中期から後期三畳紀を示す放散虫・コノドント化石群が検出され、下部三畳系とされていたWulgai Formation(Alozai Groupの一部)には、岩相・年代層序など、層序学上の基本的内容についての再提議が必要である。主要な放散虫・コノドント化石と産出地点は次の通りである。4.Axial Zoneのオリストストローム

層には2相が認められ、ともに葉層状の泥質岩(papery shale)が主体であるが、狭在層とオリストリスに関しては著しく異なっている。ひとつはGwalの東一帯に典型的に見られるもので、細礫径のものから大きいものでは長径が1km以上に達するオリストリスをともなっている。細ー中礫径のオリストリスは、あたかもpelagic shaleの堆積場に氷河性のdropstoneとしてもたらされたかのような産状を呈している。これらのオリストリスには、ペルム紀の有孔虫類や腕足貝類を含むミクライト質石灰岩、前期三畳紀アンモナイトを含む石灰岩礫岩、おそらく同時期のpelagic oolitic石灰岩、緑色岩類、石英質砂岩などがある。もうひとつは、薄層の極細粒石灰岩、凝灰質ないし珪質泥岩ーチャートをはさむやはり葉層状の泥岩層で、一部には著しい海底地すべり構造がみとめられ、また発泡した玄武岩質岩を含む緑色岩主体のオリストストローム層、上部では数mの厚さの礫岩層を狭在している。5.オリストストローム層の泥岩層および狭在する薄層の珪質岩からは、中期から後期三畳紀を示す放散虫・コノドント化石群が検出され、下部三畳系とされていたWulgai Formation(Alozai Groupの一部)には、岩相・年代層序など、層序学上の基本的内容についての再提議が必要である。主要な放散虫・コノドント化石と産出地点は次の通りである。
PDE1阻害剤による口腔悪性黒色腫の転移抑制機構の解明と新規治療法の開発

今回の研究により、Phosphodiesterase(PDE)の一つであるPDE1の阻害剤が悪性黒色腫細胞の運動能を抑制する機構について解明した。当科で樹立、継代しているヒト口腔悪性黒色腫細胞MAAにsildenafilを作用させると、細胞の先導端においてアクチンの重合が抑制され、lamellipodia(膜状突起)の形成が阻害されていた。MAA細胞はPDE1を発現しPDE5を発現していないことから、sildenafilによるMAAの運動能の抑制には、PDE1の阻害を介した細胞内のcAMP濃度の上昇とlamellipodiaの阻害が関与する可能性が示唆された。Phosphodiesteraseは11種類(PDE1-PDE11)が報告されており、cAMP、cGMP濃度を調整することにより様々な生理作用に関与している。2004年にわれわれはPDE1が、細胞性粘菌が分泌する物質であるDifferentiation-inducing factor (DIF)のターゲット分子であることを世界で初めて発見した。この発見により、PDE1が悪性腫瘍細胞の新しい分子標的であることを初めて導き出した。しかし、PDE1特異的阻害剤等は、現在のところ臨床応用されていない。一方、PDE5阻害剤としてすでに広く臨床で使用されているSildenafilは、PDE1阻害作用を併せ持ち、これを悪性黒色腫の治療に応用できる可能性がある。われわれはこれまでに、SildenafilがPDE1を阻害することで悪性黒色腫細胞の運動能を抑制することを示してきた。細胞の運動は、細胞の先端部でアクチン骨格が重合し細胞膜の形態が変化することによって起きる。そこで、sildenafilが細胞骨格に与える影響について検討した。細胞は、当教室で樹立したヒト口腔悪性黒色腫MAA細胞を使用した。MAA細胞にsildenafilを作用させると、細胞の先導端においてアクチンの重合が抑制され、lamellipodia(膜状突起)の形成が阻害されていた。また、悪性黒色腫では、低分子量Gタンパク質Rho等が、その転移において重要であることから、MAA細胞でRT-PCRを行ったところ、RhoA、RhoB、RhoCのmRNA発現が確認された。現在、研究の実施に問題はなく、概ね順調である。研究成果の一部は、第60回口腔外科学会総会にて発表した。in vivoでの転移実験においては、腫瘍を尾静脈から移植するよりも眼窩静脈叢からの移植の方がより結果が得られやすいとの知見が得られたため、眼窩静脈叢からの移植について予備実験を行っている。悪性黒色腫の接着能について研究を進めているが、条件設定等に予定以上の日数が掛かりやや遅れが生じている。PhosphodiesteraseはPDE1-PDE11が報告されており、cAMP、cGMP濃度を調整することにより様々な生理作用に関与している。われわれはPDE1が、細胞性粘菌が分泌する物質であるDifferentiation-inducing factor (DIF)のターゲット分子であることを世界で初めて発見し、PDE1が悪性腫瘍細胞の新しい分子標的であることを初めて導き出した。しかし、PDE1特異的阻害剤は、現在のところ臨床応用されていない。一方、PDE5阻害剤としてすでに広く臨床で使用されているsildenafilは、PDE1阻害作用を併せ持ち、これを悪性黒色腫の治療に応用できる可能性がある。

われわれはこれまでに、sildenafilがPDE1を阻害することで悪性黒色腫細胞の運動能を抑制することを示してきた。本年度は、sildenafilが、in vivoで転移抑制効果を示すかどうかを確認するための実験を行った。細胞は、肺に高率に転移するマウスB16-F10 melanomacellおよび、ヒト口腔由来melanoma MAA cellを使用した。B16-F10 melanomacellではPDE5が発現しており、PDE5を阻害することによってcGMP経路が活性化すると運動能が促進される(Dhayadeら:Cell Reports)との論文が2016年に掲載されたため、B16-F10は、controlとして使用した。melanoma細胞の移植は、眼窩静脈叢より経静脈的に行った。移植より14日後、肺を摘出し、実体顕微鏡下で転移巣を計数した。PDE1は発現しているが、PDE5を発現していないヒト口腔由来melanoma MAA cellでの実験を開始したが、MAA cellは、眼窩静脈叢からの移植では明らかな肺転移は確認できなかった。sildenafilが、in vivoでの転移抑制効果を示すかどうかを確認するためには、PDE1を発現し、PDE5を発現していない細胞で、マウスに高率に転移する細胞が必要である。MAA cellの移植方法を変更することにより、転移巣が形成される可能性があり、こちらについても検討する必要がある。今回の研究により、Phosphodiesterase(PDE)の一つであるPDE1の阻害剤が悪性黒色腫細胞の運動能を抑制する機構について解明した。当科で樹立、継代しているヒト口腔悪性黒色腫細胞MAAにsildenafilを作用させると、細胞の先導端においてアクチンの重合が抑制され、lamellipodia(膜状突起)の形成が阻害されていた。MAA細胞はPDE1を発現しPDE5を発現していないことから、sildenafilによるMAAの運動能の抑制には、PDE1の阻害を介した細胞内のcAMP濃度の上昇とlamellipodiaの阻害が関与する可能性が示唆された。当初の研究実施計画に従い、研究を進めていく。平成29年度は、動物実験を計画しており、前年度よりその一部を先行して行っている。悪性黒色腫の接着能についての研究と並行して行っていく予定である。口腔外科学消耗品をキャンペーン時に購入する等の工夫で、若干本年度の使用額を抑えることができた。細胞の接着能に関する実験において、条件設定等が困難であり遅れが生じているため。現在、細胞培養に使用する試薬等の価格が上昇しており、来年度、薬剤の使用額が当初の予定を上回ることが予想されるため、これに使用する。条件設定終了後に消耗品を購入し、本実験を行う。平成29年度分と併せて使用する予定である。
胚発生を制御する新規遺伝子の個体レベルでの機能解析

胚発生の制御に関与すると思われる以下の新規遺伝子について、それらの機能を個体レベルで解析した。1)左右非対称に発現するTGFβ関連遺伝子lefty:マウスにおいては二つの保存された遺伝子(lefty-1,lefty-2)が存在し、それぞれ異なった組織で非対称な発現を示す事が判った。これらの遺伝子の左右決定における役割を知るため、lefty-1,lefty-2の各々を欠損する変異マウスを作製した。lefty-1欠損マウスの形質を解析したところ、多くの臓器の位置異常が認められ、少なくともlefty-1は身体の左右の決定に置いて必須の因子であることが判明した。また、lefty-1,lefty-2遺伝子の転写調節領域をトランスジェニックマウスの系を用いて解析し、左右非対称な発現を規定しているcis-elementを同定した。2)レチノイン酸を不活性化する酵素P450RA:P450RAを利用して、胚発生における内在性レチノイン酸の役割を解析した。この酵素をカエル胚に導入すると、種々の発生異常を誘導することにより、内在性レチノイン酸の重要性が示唆された。P450RA遺伝子欠損マウスの作製を開始した。3)神経細胞の分化・成熟に関与する遺伝子:未知の神経栄養因子の受容体を同定し、その発現様式を調べた所、末梢神経に特異的に存在することが判った。この遺伝子の欠損マウスの作製を開始した。