hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チャ-トと泥質岩の成因ならびに堆積環境に関する研究

1.堆積岩中の液体包有物の分析:鉱床などで産する液体包有物は鉱液の性格を知るうえで重要な手掛りとなるので、多くの研究がある。同様に海成の堆積岩中に包有している液体があれば、それは堆積当時の海水組成と関係すると考えられる。そこで堆積岩中に包有されている液体乃至は可溶性な塩類の分析法を開発した。即ち、本プロジェクトにより購入したイオンクロマトグラフを利用する方法であり、鉱物等により検討した結果、この方法の信頼性が明らかにされたので、これを石灰岩とチャ-トに適用した。その結果2.5億年3.5億年前の石灰岩中の塩素濃度の変動は海進、海退の変遷と一致し、地球上の海水量と関係があることが分った。2.チャ-ト中の希ガスの研究:現在の深海底に産する珪質の放散虫軟泥などは希ガスを多量に包有していることが分ってきた。その同類であるチャ-トは希ガスをどの程度含んでいるかを検討した。試料としては12億年前のもの、また地域としては本邦およびアメリカ産のもの約30個を用いた。この結果、放散虫として沈殿したシリカが続成作用の結果、石英に転移してゆくとき、希ガスの大規模な逸脱が起るが、それはHeのように軽い希ガスの方の効果が大きいことが明らかとなった。3.マンガンバンドの成因と堆積環境:前年度で明らかにされたマンガンバンドの生成について、本年度はとくに炭素同位体組成を用いて検討した。その結果、マンガンバンドの炭素は極めて軽く有機物起源であることが分ったが、とくにチャ-ト中に含まれているものは〓^<13>Cが-40〓にも達し、メタン起源であることが結論された。これはチャ-トと泥質岩中におけるマンガンバンドの成因の差という点で注目される。また、これらの環境を美濃帯のものにあてはめると縁海乃至は大陸斜面など、陸に近いものであることが推論される。1マンガンバンドの確認と意義:本邦における中古生界には厚い珪質、泥質の堆積物が発達しており、その生成環境は未だ明確ではない。本プロジェクトにおいては遠洋性の深海堆積物と半遠洋近海における堆積物中のマンガンの垂直分布を比較検討した。その結果、両者に明確な相違があることが分った。そこで陸上の珪質、泥質堆積岩中のマンガンの垂直分布を数ケ所に亘って精査した。そこでは何れも半遠洋近海堆積物のパターン、つまり、全体としてはマンガン含有量が低いが所々でスパイク状にマンガン濃縮層が存在するという分布が発見され、マンガンバンドと名付けた。この存在は一般に泥質、珪質の堆積物の生成環境を推定するのに極めて、有用な指標となり得ることが結論された。2熱水性マンガンマイクロノジュールの研究:海洋堆積物中には熱水の影響下で生成したと考えられる重金属に富む物質が存在することがある。本プロジェクトでは以前からの実績に基づいてその中に含まれるマンガンマイクロノジュールの化学的性質からその物質の起源を推定する研究を行ってきたが、東南太平洋において従来熱水活動の見られなかった場所から熱水性を示すマイクロノジュールの産出を確認した。このことは本方法の有効性を示すものであり、また陸上堆積物への応用も可能であることから、美濃帯の堆積物の研究も行った。3堆積物中のヘロゲン元素の分析法の検討:本プロジェクトにより購入したイオンクロマトグラフを利用して、泥質・珪質の堆積岩中のフッ素、塩素、臭素などハロゲン元素の分析法の検討を行った。試料を炭酸ソーダ溶融して水に抽出される方法と試料を酸化剤と共に1000°Cに熱し、水蒸気蒸溜を行う方法とで、後者の方がすぐれていることが分った。

その結果、マンガンバンドの炭素は極めて軽く有機物起源であることが分ったが、とくにチャ-ト中に含まれているものは〓^<13>Cが-40〓にも達し、メタン起源であることが結論された。これはチャ-トと泥質岩中におけるマンガンバンドの成因の差という点で注目される。また、これらの環境を美濃帯のものにあてはめると縁海乃至は大陸斜面など、陸に近いものであることが推論される。
伊勢商人長井家江戸来状群の整理・保存・公開と研究基盤創出に向けての史料学的研究

未整理状態であった伊勢(松坂)商人長井家の江戸店からの来状群について、(1)整理と保存・公開を目指した処置を施し、(2)来状群の構造分析を行い、今後の研究基盤創出を目指した研究を行った。(1)については、文書を収蔵する津市石水博物館での予備調査2回、本調査10回を実施し、1万2千点を超える量の整理と目録作成を行い、これらの保存・公開措置も同時に進めた。(2)の構造分析の結果、江戸店からの来状群が主ではあるが、松坂本店で作成・授受した多種・多様な文書群も混在していることが判明した。これらから経営に関わる具体的な取引内容や交友関係の把握が可能である貴重な文書群であることが確認できた。初年度であるため、連携研究者・研究協力者の全体会議を6月18日に現地(津市石水博物館)で開催し、本研究の目的と計画について討議と確認を行った。これに基づいて、整理と目録化のためのマニュアルも作成し、その改訂を進めながら実施した。調査は、事前調査(5月18日21日)と予備調査(10月18日21日)を各1回行うと共に、本調査は6月17日21日、8月16日21日、12月16日22日の3回を実施し、延べ65名の参加を得て、江戸来状群の整理と目録化とその構造分析を進めた。目録化は約3,500点で、デジタル撮影は80点、360カットで、これらの内容と構造分析を進めている。本研究の対象である江戸来状群は、江戸中期以降約200年間に亘り江戸店から松坂本店に定期的に送付された文書群で、そのほとんどが書状形式であることが判明した。その内容は、江戸店の経営に関わる様々な案件に関わって、その処理法の本店指示窺いや支払い・帳簿記載方法についての窺いなど多岐に及ぶ内容で、経営帳簿では数値だけであるが、その実態を具体的に裏付けられる内容であることが判明できた。また、節季の挨拶状など日常生活に関わっての儀礼的な文書も多いが、伊勢商人としての人的ネットワークの解明にも寄与する内容である。ただし、江戸店からの来状だけでなく、松阪本店で送受した文書も混在していることも明らかとなった。その一例として、松阪で本居宣長が医家を勤めていたことは周知のことであるが、その活動の実体を示す記録は皆無であったが、本文書群に長井家の当主の診断をした結果報告が自筆の書状として存在しているなど、今後の調査の進展に期するところ大である。本(最終)年度の津市石水博物館蔵長井家文書の調査は、7月10日15日、8月7日11日、10月30日11月4日までの3回実施し、研究協力者の助力を得ながら同家文書の整理と目録作成及び文書群の構造分析を進めた。その結果、総計で約1万4千点の整理を終え、当初計画の1万2千点を超えることができた。さらに本研究の目的でもある研究基盤創出のための保存・公開について、1月22日24日に具体的な処置法の検討と処置を施した。また最終年度に当たることから研究成果を現地に還元する目的で、3月8日に津商工会館丸之内ホールで「科研費調査報告シンポジウム伊勢商人長井家の経営」を開催し(報告者6名)、80名を超える参加者と活発な質疑応答をも行った。研究の主テーマである文書群の構造分析の結果、約200年間に亘る江戸店からの来状が主ではあるが、松坂本店で作成・授受した多種・多様な文書群も混在していることが判明した。江戸からの来状は、松坂本店当主や支配人宛で、経営に関わる具体的な取引内容や帳面の仕立て方法、江戸での出来事をも報告している。最も意義あることは、決算帳簿である「店算用目録」では金額のみしか記載がないが、その具体的取引内容を補完する情報である。一方松坂本店で作成・授受した文書群は、長井家と他家との年始・年末・五節句時の贈答儀礼に関わる文書群が多く、これにより交友関係の把握ができる。さらに長井家の「店則」に関わって、経営会議、営業規定、役職とその業務分担の実態が把握できることも意義があろう。また本居宣長の自筆書状の新発見があり、松坂で医者だった宣長が長井家の当主を診断した結果を、当人ではなく支配人に報告したもので、医者としての実態把握の文書がない状況に一石を投じるものであることを付言しておく。

2年目にあたり、まず連携研究者・研究協力者の全体会議(15名)を6月16日に代表者が所属する国文学研究資料館(立川市)で開催し、本研究の目的と今年度の計画について確認と討議を行った。これに基づいて、整理と目録化のためのマニュアルを作成し、その改訂を進めながら実施した。現地調査は、7月3日7日(13名)、8月21日26日(31名)、12月18日24日(32名)の3回を実施し、研究協力者の参加を得て、江戸来状群の整理と目録化とその構造分析を進めた。目録化は本年度約6,500点で総計1万点を超えるとともに、デジタル撮影は780点、3,060カットで総計860点、3,420カットで、これらの内容と構造分析を進めている。本研究の対象である江戸来状群は、江戸中期以降約200年間に亘り江戸店から松坂本店に定期的に送付された文書群で、そのほとんどが書状形式であり、その内容は、江戸店の経営に関わる様々な案件に関わって、その処理法の本店指示窺いや支払い・帳簿記載方法についての窺いなど多岐に及ぶ内容であることが確認できた。また経営帳簿では数値だけであるが、その実態を具体的に裏付けられる内容であることも判明できた。また、節季の挨拶状など日常生活に関わっての儀礼的な文書も多いが、伊勢商人としての人的ネットワークの解明にも寄与する内容である。ただし、江戸店からの来状だけでなく、松阪本店で送受した文書も混在していることも明らかとなった。3月16日には、文書を収蔵する石水博物館で、川喜田・長井両家の典籍の調査・研究成果として「伊勢商人川喜田家代々の文芸活動の研究ー石水博物館所蔵文献資料を手がかりにー」と題するシンポジウムが開催されたので、本研究とも密接に関係する内容であるので研究代表者が参加した。本年度が初年度であるので、対象の江戸来状群の整理・目録化を最優先したので、内容分析と構造分析は次年度以降本格的に着手することになる。整理・目録化の効率化をも図りながら進めたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は2年目で、対象の江戸来状群の整理・目録化を最優先し、現地で大勢の研究協力者の参加を得ることができたので、初年度の2倍の7,000点の目録化を達成でき、総数1万点を超えている。内容と構造分析も同時に進展している。対象の江戸来状群は、そのほとんどが書状形式であるため、整理・目録化の段階で個々の内容情報の採録に時間を要する状態である。統一的な内容情報の記述などをマニュアル化しながら、さらなる進展が可能な処理を図りたい。また、糊付け部分の剥離が多く、デジタル撮影も時間を要しているので、撮影方法の改善も図りながら進めたい。対象の江戸来状群は、そのほとんどが書状形式であるため、整理・目録化の段階で個々の内容情報の採録に時間を要する状態であったが、統一的な内容情報の記述などをマニュアル化したことにより、現在1万点の目録化を終えている。当初計画段階では、総数1万2千点を想定したが、これは確実に達成できるものと確信できるし、デジタル撮影も改善を図って進展しているので、内容と構造分析も一層の進展を図りたい。また、来年度が最終年度であるので当初から、現地でのシンポジウム開催と成果報告書を刊行する予定に変更はない。
慢性呼吸器疾患患者の免疫機能改善を目的とした運動療法プログラムの確立

本研究は、慢性呼吸器疾患患者における運動療法が免疫機能に与える影響を検証することを目的とした。免疫機能は、呼気凝縮液及び唾液中の分泌型免疫グロブリンA(SIgA)を解析した。その結果、気道におけるSIgA産生量が微量で、呼気凝縮液よりの試料分析は困難であった。また、慢性呼吸器疾患患者に対する運動療法を中心した入院期呼吸リハビリテーションは、運動能力の改善のための至適な運動強度であること、防衛体力の指標としての唾液中SIgAが一過性に低下しないことが明らかとなった。さらに、免疫調整機能としての抗酸化力も低下しないことが明らかとなり、免疫機能からみた有効な呼吸リハビリテーションの方法が解明された。慢性呼吸器疾患の免疫機能を検討する基礎的データを収集する目的で以下のとおり実施した1)健常大学生26名を対象に,サリベットによる唾液採取,トランスファーピペットを使用して,舌下より唾液を吸引して上気道局所免疫機能である唾液中の分泌型免疫グロブリンA(SlgA)を比較検討した.その結果,日差変動に交互作用を認めず,唾液採取法に主効果を認めたことから,スポイト法による唾液採取がサリベッド法と関連する変動があることが示され,唾液を吸引した唾液採取有用性が明らかとなった2)慢性呼吸器疾患で検討する際に,上気道局所免疫機能のみならず,下気道の免疫機能を含めて検討することが可能かどうか,基礎的検証として呼気凝集液(EBC)中の免疫機能関連物質であるSlgAおよびリゾチームの解析を試みた.SlgAELISA kit(測定範囲:22.2-600ng/ml)を使用して解析した結果,EBC中のSlgAは検出限界以下の濃度であり,試料分析が困難であった.また比濁法によりEBC中のリゾチーム解析を試みたところ,同様に試料分析が困難な結果となった.簡便な唾液採取法は,上気道局所免疫機能である唾液中SlgA分析が有用であるが,来年度は,唾液中の免疫物質のみならず,EBC中のSlgAおよびリゾチームの以外の免疫機能を調節している物質の検討をすすめていき,慢性呼吸器疾患患者の上気道および下気道の免疫機能の変動特性,運動の影響について検討を進めていきたい.以上の研究により,EBC中SIgA産生量は微量で,試料分析が困難であると確証され,下気道の免疫機能を検討するためには,他の免疫関連物質の解析が必要であることが明らかとなった.さらに本年度は,EBC中のSIgA以外の免疫機能と関連する物質として,過酸化水素濃度および抗酸化力の運動負荷による動態解析を試みた.健常成人を対象に,無酸素姓運動負荷を実施し,EBCおよび血漿中変化を検討した.その結果,EBC中の過酸化水素濃度と抗酸化力は運動負荷前後に有意な変化を認めなかった.その一方で,血漿中のヒドロペルオキシド濃度と抗酸化力は運動負荷直後および15分後に有意に増加した.このことから,単回高強度運動負荷は気道中の過酸化水素生成および抗酸化反応に影響しないこと,気道中生体反応は,血液中と異なることが明らかとなった.本年度は、慢性呼吸器疾患患者の運動療法プログラムが免疫調節機能に与える影響を検証する目的で以下のとおり実施した。呼吸不全の増悪により入院した慢性呼吸器疾患患者を対象に、運動療法を中心としたリハビリテーションプログラム前後における唾液採取を行った。唾液採取は、サリベット専用綿による咀嚼刺激法によって実施した。運動療法は、「呼吸リハビリテーションマニュアル-運動療法-」に沿った内容とした。得られた唾液検体は、唾液分泌速度を測定し、酵素標識免疫測定法を用いて唾液中分泌型免疫グロブリンA(SIgA : salivary secretory immunoglobulin A)濃度を解析した。さらに、免疫調整機能の関連指標としてBAP (Biological Antioxident Potential)テストを用いて、抗酸化力を解析した。なお、唾液検体の取り扱いは、唾液採取後に遠心し、唾液容量を計測後に分注し、抗酸化能はその日にすみやかに解析した。また、SIgAの解析は-30°Cにて凍結保存して、後日解析した。その結果、唾液分泌速度および唾液中SIgAは、リハビリテーション前後においてそれぞれ有意差を認めなかった。また、抗酸化力においても、リハビリテーションの実施により有意な低下を認めなかった。以上により慢性呼吸器疾患患者の運動療法を中心とした入院期リハビリテーションは、運動能力の向上のための至適運動強度であることのみならず、一貫して局所免疫機能を一過性に低下させることのないプログラムであることが明らかとなった。また、リハビリテーションプログラムは、免疫調整機能として絶対的あるいは相対的欠乏による抗酸化状態に影響しない可能性が示唆された。
ゲノム刷込みによる生殖系列の機能調節と発生制御

マウス7番染色体のIgf2-H19領域および12番染色体のDlk1-Dio3領域における非コードRNA遺伝子を含むインプリント遺伝子群の胚発生および胎盤形成に対する作用機構について新たな知見を提供した。また、雌雄生殖細胞における包括的DNAメチロームデータを作成した。その外、雌雄ゲノムの個体発生への特異的な関与についてクローン胚およびTS細胞において発生工学および分子生物学の手法を用いて示した。哺乳類では、ゲノム刷込みが雌雄生殖細胞ゲノムの機能差を決定づけているために、雌雄ゲノムが受精により次世代へ伝達されることが個体発生に義務づけられている。本特定領域研究では生殖細胞系列において行われるゲノム刷込み、特にDNAメチル化修飾に着目し、それによる胎盤形成を含む個体発生制御機構の全貌解明に向け実験発生学および分子生物学的なアプローチから追究する。1、6番および12番染色体の父性メチル化領域を欠損した新生仔卵母細胞ゲノムを用い作出した二母性ゲノム胚から、正常な産子を再現性高くかつ高率に生産することに成功した。胎盤に焦点を当て、GeneChipマイクロアレイプロファイルを作成して遺伝子発現調節ネットワークの観点から検討した。その結果、6番および12番染色体の父性メチル化インプリント遺伝子、特にIgf2およびD1K1遺伝子の発現が正常化に集約されることが判明した。2、タンパクをコードしていないH19およびGt12がRNAレベルでcis/transの遺伝子発現調節および個体発生そのものに関与する可能性を検証するため、新たに遺伝子欠損マウスを作出して解析した。その結果、Gt12欠損が雌から伝達したときには生後4週までに必ず致死になること、逆に雄から伝達したときには50%が、胎性致死になることを明らかにした。その分子遺伝学的な詳細な解析から、Gt12転写産物から生じるmiRNAが重要な役割を演じていること、およびcis調節による近傍のインプリント遺伝子の発現が変化していることをを示し、致死性との関連を考察した。3、単為発生胚(9.5日齢胎仔)のGeneChipマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析から、マウス1番染色体およびヒト2番染色体で父性発現するインプリント遺伝子Zdbf2を初めて発見した。また、DNAメチル化解析から、父性メチル化インプリント領域を突き止めた。1. Gt12欠損が雌から伝達したときには生後4週までに必ず致死になること、逆に雄から伝達したときには50%が胎性致死になることをすでに明らかにした。そこでこれらの原因究明のため、Gt12母方欠損マウス(D1k1の発現低下)とIG-DMR父方欠損マウス(D1k1の発現を補正させる目的)を交配し二重欠損マウスを作出してその性状を詳細に検討した。その結果、胎性致死は完全に回避されたが、生後の致死を含む成育障害は依然解消されなかった。これらのことから,D1k1の発現低下がGt12母方欠損マウスにおける胎性致死の原因であること、また、生後の致死性には、この領域から発現するSnoRNAおよびmiRNAが関与していることが強く示唆された。2.精子ゲノムを持たない二母性マウスの特性を明らかにするため、寿命についてデータを蓄積した。その結果、平均寿命で対象群より30%の長命性を示した。この結果は、父性ゲノムをもたない二母性マウスが寿命に関して有意な特性をもつ可能性を示唆するものである。ただし、二母性マウスではRasgrf1遺伝子の発現が抑制されており小型化していることから、長命性の直接的原因についてはさらに追究が必要と考えられる。3. Igf2の発現を欠いている二母性胚を活用してマイクロアレイ解析より、Igf2の制御下にある血管新生に係わる遺伝子群の発現を詳細に調べた。その結果、VegfおよびF1t1等の発現異常が認められたことから、Igf2が胎盤および胎児の血管新生に重要な影響を及ぼしているものと考えられた。平成22年度には、以下の研究成果を得た。1.Gt12欠損が雌から伝達したときには生後4週までに必ず致死になること、逆に雄から伝達したときには50%が胎性致死になることをすでに明らかにした。そこでこれらの原因究明のため、Gt12母方欠損マウス(Dlk1の発現低下)とIG-DMR父方欠損マウス(Dlk1の発現を補正させる目的)を交配し二重欠損マウスを作出してその性状を詳細に検討した。これらのことから、Dlk1の発現低下がGt12母方欠損マウスにおける胎性致死の原因であること、また、生後の致死性には、この領域から発現するsnoRNAおよびmiRNAが関与していることが強く示唆された。

この結果は、父性ゲノムをもたない二母性マウスが寿命に関して有意な特性をもつ可能性を示唆するものである。ただし、二母性マウスではRasgrf1遺伝子の発現が抑制されており小型化していることから、長命性の直接的原因についてはさらに追究が必要と考えられる。3.Igf2の発現を欠いている二母性胚を活用したマイクロアレイ解析より、Igf2の制御下にある血管新生に係わる遺伝子群の発現を詳細に調べた。その結果、VegfおよびFlt1等の発現異常が認められたことから、Igf2が胎盤および胎児の血管新生に重要な影響を及ぼしているものと考えられた。本特定領域研究では生殖細胞系列において行われるゲノム刷込みおよびそれによる個体発生制御機構の全貌解明に取り組くんでいる。23年度は、1)マウス12番染色体インプリント領域における非タンパクコードRNA群(miRNAsおよびsnoRNAs)が個体発生に及ぼす影響を実証するために、2種類のBACクローンを用いてmiRNAsおよびsnoRNAsを過剰発現するTGマウスを合計4ライン作出することに成功した。現在、それぞれの系統樹立を目指し交配を継続している。すでに、致死性を伴う表現型が観察されているものもあり、データを集積している。2)マウス12番染色体インプリント領域における非コードRNAsの腫瘍形成抑制機能について検証するため、Gt12欠損マウス胎仔の腎皮下移植を実施して腫瘍形成能を比較検討した。その結果、Gt12欠損マウス群で腫瘍が肥大化する傾向にあることを見出した。病理組織解析により、試験区の腫瘍では外胚葉、中胚葉および内胚葉系組織への分化も顕著なことが分かった。3)次世代シークエンサーを用いた卵子および精子のメチル化マップの作成に成功した。雌雄ゲノム間でメチル化状態の異なる領域を多数検出した。4)雌性生殖細胞形成過程におけるメチル化インプリントの調節システムの解明を進めるため、メチル基転移酵素遺伝子Dnmt3LおよびDnmt3aを非成長期卵母細胞から特異的に発現するTGマウスの作出に成功した。現在、これらの卵子におけるメチル化状態および受精後の発生能について慎重にデータを蓄積している。本特定領域研究では生殖細胞系列において行われるゲノム刷込みおよびそれによる個体発生制御機構の全貌解明に取り組くみ、24年度は、以下の成果を挙げた。1)マウス12番染色体インプリント領域における非コードRNA群が個体発生に及ぼす影響を実証するために作成したmiRNAsおよびsnoRNAsを過剰発現する2種類のBAC-TGマウスの交配試験を進めた。その結果5世代以降においても、母方からBAC領域が伝達された場合には、安定的に周産期致死を含む顕著な表現型が出現することを突き止めた。現在、miRNAアレイ、mRNAアレイ解析を進行中である。2)雌性生殖細胞形成過程でメチル基転移酵素遺伝子Dnmt3LおよびDnmt3aを非成長期卵母細胞から特異的に発現するTGマウス由来の産子の発生解析から、妊娠初期から中期にかけて顕著な分化・発生異常を発症し、致死になることが明らかとなった。3)以前、我々が同定した刷り込み領域GPR1-ZDBF2において、ヒト・マウスで共通する新たな大型非コードRNA(1ncRNA)、GPRIAS/Zdbf21incを同定した。
Pasteurella multocida毒素の細胞内標的分子の検索

Pasteurella multocida毒素(PMT)は培養細胞に対して強い増殖促進因子として働き、細胞周期が静止期にある細胞のDNA合成を誘導する。現在まで、PMTの作用機構に関してはほとんど分かっでいない。本研究ではPMTの細胞内標的分子を明らかにするため、PMTによる細胞DNAの合成誘導を指標にした発現クローニングを試みた。細胞周期がDNA合成期(S期)に移行するためにはサイクリンAの発現が必須である。そこで、サイクリンAプロモーターの下流にEGFPを結合させたプラスミド(pCyc.A-d2EGFP)をレポーター遺伝子として用いた。またEGFPの半減期は24時間以上で、このままではEGFP陽性細胞を分別する事が出来ないため、半減期が2時間となるように分解シグナルを付加したd2EGFPを用いている。レポーター遺伝子を導入するPMT非感受性細胞として、ヒト初代培養細胞をSV40で不死化させたHFI細胞を用いた。この細胞にpCyc.A-d2EGFPからSVoriを除いたものを導入し、安定発現株をFACSにより回収した。スクリーニングのためのcDNAライブラリーは、PMT高感受性細胞であるSwiss3T3細胞からmRNAを調製し、リンカープライマー法により作製した。このSwiss3T3cDNAライブラリーを先程のHFI細胞に導入後PMTを作用させ、EGFP陽性となった細胞をFACSで回収した。得られた細胞群からハート法によりプラスミドを回収した。このスクリーニングを合計3回行い、最終的に得られたクローンについて解析中である.また、PMTは三量体GTP結合タンパク質Gqを介してホスフォリパーゼCを活性化すると考えられている。このシグナル伝達経路はGqと共役する膜受容体(GPCR)の活性化から始まるので、PMTの作用点も細胞膜にあると推測される。そこで、培養細胞、GPCRが多く存在する脳、PMTの作用が観察されたとの報告がある肝臓から膜画分を回収し、PMTを作用させてから2次元電気泳動を行った。様々な条件下で2次元電気泳動を行ったが、コントロールと差異のあるスポットは検出されていないPasteurella multocida毒素(PMT)は培養細胞に対して強い増殖促進因子として働き、細胞周期が静止期にある細胞のDNA合成を誘導する。様々な条件下で2次元電気泳動を行ったが、コントロールと差異のあるスポットは検出されていない
液晶の自己組織化を活用する無水プロトン伝導体の創製

本研究の目的は液晶の自己組織化を活用して連続したナノイオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導体を構築することである。我々は、次に示す革新的イオン伝導体の開発に成功した:(1)双性イオン液晶とスルホン酸との複合化による一次元および三次元イオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導材料、(2)ジオール基を有する液晶分子とイミダゾリウム型プロトン性塩とからなる水素結合性分子集合体による異方的一次元・二次元プロトン伝導体、(3)光重合性ジエン基を有するジオール化合物とイオン液体からなるカラムナー液晶の光重合による異方的イオン伝導性フィルムの開発。本研究の目的は、液晶の自己組織性を生かして、連続したナノプロトンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導体を構築することである。そのために、精密な分子設計、ナノ相分離構造制御、およびマクロ配向制御を行う。酸塩基イオンコンプレックス形成を活用するイオン性液晶の開発:塩基性分子として、ジエタノールアミン構造を有するジアルコキシフェニルアミド誘導体を設計・合成した。この分子は、単独でサーモトロピックヘキサゴナルカラムナー液晶性を発現した。一方、酸性分子としてベンゼンスルホン酸を上記の塩基性分子と混合モル比を変えて複合化した結果、カラムナー液晶相に加えて、3次元に連続したイオンチャンネル構造を形成する双連続キュービック液晶相および層状のスメクチック液晶相を発現させることができた。これらの液晶相におけるプロトン伝導性を櫛形金電極を用いた交流インピーダンス法により測定した。無水条件下で10-4 Scm-1のイオン伝導度を達成した。双性イオン構造を有するイオン性液晶の構築:アンモニウム型スルホベタイン構造を有するトリアルコキシベンジル化合物を設計・合成した。この化合物は単独でサーモトロピックヘキサゴナルカラムナー液晶性を発現した。これにベンゼンスルホン酸を複合化することにより、双連続キュービック液晶性が発現することを見出した。これは、ベンゼンスルホン酸が解離したベンゼンスルホネートアニオンが双性イオン性液晶のアンモニウム部位と対を形成し、プロトンが双性イオン性液晶のスルホネート基と相互作用したためと考えられる。このような双連続キュービック液晶相を発現する複合体は、無水条件下で10-4 Scm-1のプロトン伝導性を示した。本研究の目的は、液晶の自己組織性を活用して連続したナノイオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導体を構築することであり、そのために精密な分子デザイン、ナノ相分離構造の制御およびマクロスコピックスケールでのチャンネル構造の配向制御を行う。光配向性を有するイオン伝導性液晶の創製:光応答性アゾベンゼン基を導入したイミダゾリウム型液晶を設計・合成した。この分子は、単独でサーモトロピック液晶性を示し、ネマチック相およびスメクチックA相を発現した。スメクチック液晶相で紫外光を照射し、アゾベンゼン部位をトランス体からシス体へ異性化させると等方性液体状態となった。さらに直線偏光の可視光を照射してトランス体へと異性化させると基板上で水平一軸配向したスメクチック液晶相のモノドメインを形成させることができた。櫛形金電極を蒸着したガラス基板上で同様に液晶を光配向させ、交流インピーダンス法により、スメクチック液晶の層に平行および垂直方向のイオン伝導度を測定した。約10倍の伝導度の異方性が得られた。本研究では、イオン伝導パスを形成する液晶材料の光配向を達成し、異方的イオン伝導を実証することに成功した。双性イオン構造を有する液晶性イオン伝導体の構築:イミダゾリウムスルホベタインおよびイミダゾリウムジシアノエテノレート部位を有する扇型分子を合成した。これらは、サーモトロピックカラムナー液晶相および双連続キュービック液晶相を発現した。双性イオンは多様な極性分子やイオン種と相互作用することが期待されたため、ベンゼンスルホン酸・リチウム塩・環状カーボネートなどとの複合化を行った。その結果、双性イオン構造に依存して、発現する液晶相やイオン伝導性が大きく変化することを見出した。本研究の目的は、液晶の自己組織化を活用して連続したナノイオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導体を構築することであり、そのために精密な分子デザイン、ナノ相分離構造の制御およびマクロスコピックスケールでのチャンネル構造の配向制御を行う。水酸基を有する扇型液晶分子とイミダゾリウム型プロトン性塩からなる無水プロトン伝導性液晶材料を構築した。イミダゾールと無水ベンゼンスルホン酸の等モル酸塩基対形成により、新規のプロトン性塩が得られた。プロトン性塩と水酸基を有する液晶分子との混合比を変えた複合体を作製した。水酸基をもつ分子は、単独でヘキサゴナルカラムナー液晶相を形成するのに対し、プロトン性塩との複合体は、カラムナー液晶相に加えて、スメクチック液晶相も発現した。X線回折測定の結果、カラムナー液晶相においてプロトン性塩からなる一次元チャンネルが形成していることが示唆された。これらの複合体における分子間相互作用を調べるために、核磁気共鳴スペクトル測定および赤外吸収スペクトル測定を行ったところ、水酸基とイミダゾリウム環および液晶分子のアミド基とベンゼンスルホネートアニオンとが水素結合を形成していることが分かった。プロトン性塩および液晶性分子との複合体のイオン伝導度を交流インピーダンス法により測定した。

プロトン性塩単体では、10-8 S cm-1の極めて低いイオン伝導度を示したが、液晶性複合体は10-4 S cm-1の高イオン伝導性を示した。プロトン性塩を液晶性ナノ構造の水素結合性ネットワーク構造に組織化することにより、飛躍的に伝導性を向上させることができた。本研究の目的は液晶の自己組織化を活用して連続したナノイオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導体を構築することである。我々は、次に示す革新的イオン伝導体の開発に成功した:(1)双性イオン液晶とスルホン酸との複合化による一次元および三次元イオンチャンネル構造を有する無水プロトン伝導材料、(2)ジオール基を有する液晶分子とイミダゾリウム型プロトン性塩とからなる水素結合性分子集合体による異方的一次元・二次元プロトン伝導体、(3)光重合性ジエン基を有するジオール化合物とイオン液体からなるカラムナー液晶の光重合による異方的イオン伝導性フィルムの開発。イオン伝導パスを形成するスメクチック液晶材料の非接触光配向に初めて成功し、異方的イオン伝導を達成した。また、イミダゾリウムスルホベタインなどの双性イオン構造を有する分子において、目的としたカラムナー液晶相および双連続キュービック液晶相を発現させることに成功し、プロトン源としてのスルホン酸やリチウム塩との複合化によりイオン伝導体を構築することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。有機・高分子化学、機能性材料化学光重合性部位を有する双性イオン構造を持つ液晶分子およびヘテロポリ酸との複合体において光架橋高分子フィルムを作製し、プロトン伝導性および燃料電池発電効率の評価に関する研究を進める予定である。研究計画に従って、アンモニウム型スルホベタイン構造を有する双性イオン液晶を開発し、ベンゼンスルホン酸と複合化することで3次元イオンチャンネル構造を形成するプロトン伝導性双連続キュービック液晶を世界で初めて構築することに成功した。また、酸塩基コンプレックス形成を鍵とする新しいプロトン伝導性液晶の開発にも成功し、期待したプロトン伝導度を達成した。プロトン伝導性液晶高分子膜の燃料電池性能評価のための電子負荷装置を購入することを予定していたが、燃料電池に精通している共同研究者との議論の結果、膜の力学強度およびガス遮断性を十分に評価した後に材料に最適な測定治具を有する測定機器を購入した方が効率よく研究が進むと考えたため。研究計画に従って、新規の無水プロトン伝導性液晶を構築することができた。これらの液晶電解質を用いて燃料電池を構築できるかについて研究を進める予定である。プロトン伝導性液晶高分子膜の熱物性評価のための示差走査熱量計および発電効率の評価のための電子負荷装置の購入に充当する予定である。液晶電解質の伝導性を評価するために高額なアナライザを購入することを計画していたが、本年度に購入したより安価なデバイスアナライザと既存の誘電体装置とを組み合わせて使用することでより高度な伝導特性の評価ができることが判明し、購入機器の変更が生じたため。また、想定していた煩雑な有機合成の実験が効率よく行えた結果、合成試薬・溶媒・分離精製用部材費を節約することができたため。
Hybridプラズマ溶射法による高温固体電解質型燃料電池の一貫製造プロセス開発

1.ハイブリッドプラズマの高出力化昨年までの研究結果より、SOFCの電解質であるYSZの更なる密度高上にはプラズマの高出力化が必要であることが判明し、最大出力100kwの電源を新たに導入するとともに、ガス供給系及び電磁気系統を整備し、80kwレベルプラズマを定常的かつ安定に発生することを可能とした。2.電解質溶射80kwレベルAr-O_2系ハイブリッドプラズマによりYSZを250μm/minの堆積速度で溶射し98%の高密度電解質層形成が可能となった。Ni-YSZサーメット基体に溶射した単セルの出力は1A/cm^2において0.5V程度の値を示し、更なる高性能化への展尾を得た。3.空気極溶射空気極としてはLa_<0.5>Sr_<0.5>MnO_3の多孔質溶射を検討した。溶射時の蒸発はされられず、堆積速度は50μm/min程度であったが、多孔度の制御可能性が示され、導電率も96〔S/cm〕と通常のガス溶射層の約50%増の値を示す空気極形成が可能となった。4.燃料極溶射燃料極としてはNiO-YSZの複合多孔体溶射を検討した。NiOとYSZ粉体供抱比及びYSZの粉径調整により、この溶射層を還元して得られるNi-YSZサーメット層内のNi粉子の分散状態を制御し得ることが見出されるとともに、焼結法よりもYSZ比を多くしても導体率が3000〔S/cm〕から余り低下しないという興味ある結果が得られた。5.単セル超電力測定装置開発上記手法により作製した単セルの発電特性を系統的に評価するため、高精度超電力測定装置を開発し、動作確認等を行った。
イオンビ-ムエッチング法による酸化物超伝導薄膜マイクロブリッジの製作

酸化物高温超伝導体を超伝導エレクトロニックスに応用する場合非常に重要なデバイスはジョセフソン素子である。そしてジョセフソン素子の製作に応えられるような良質な超伝導体の薄膜を作成することは、まず第一にクリア-しなければならない課題である。次ぎにこの膜を使ってジョセフソン素子を製作する時に生ずる様々な困難な問題点を解決しなければならない。本研究においては、酸化物高温超伝導体のうち、YBa_2Cu_3O_<7ーδ>超伝導体の薄膜を直流スパッタリング法で成膜し、この膜を使ってマイクロブリッジ型のジョセフソン素子を製作することを目的としている。Y系酸化物超伝導薄膜は現在様々な方法で成膜が試みられているが、次第に高価でかつおおがかりな装置で成膜されつつある。すなわちそれだけ良質な膜を成膜するのが困難を極めていることを示している。ここでは簡単な直流スパッタリング装置に横方向磁界を印加する巧妙な方法でスパッタリングに於いて非常に厄介な問題となっている荷電粒子の基板への突入問題を解決し、種々の表面モロホロジ-の膜を成膜する方法を見いだした。スパッタリングを行う時のガスに使うアルゴンと酸素の混合比を変えると膜の表面モロホロジ-をコントロ-ルすることができる。スパッタ時の酸素分圧が高いほど表面は緻密で平坦な膜になる傾向がある。これらの膜にミクロンオ-ダ-の微細加工を施し、マイクロブリッジを製作する方法を確立した。マイクロブリッジに加工する際には、アルゴンイオンビ-ムエッチング法を用いることによりこの膜が水に対して不安定である問題を回避する事にした。このマイクロブリッジにマイクロ波を照射しながらIーV特性を測定したところ粒界接合によるジョセフソン効果による定電圧ステップを観測することができた。
動静脈奇型の塞栓術モデルによる接着性液体塞栓物質の至適濃度と至適投与速度の解析

本研究は、動静脈奇型の塞栓物質として最も有効な接着性液体塞栓物質n-butyl-cyanoacrylate(NBCA)の至適濃度と至適投与速度を決定するための客観的な方法が確立されていない現状を鑑み、これを確立するための客観的データを収集する目的で行った。複数のポンプを用いた拍動流発生装置に動静脈奇型の人工的モデルを接続し、pHを調整し微小粒子成分を加えた液体を流すという模擬実験モデルを作製した。動静脈奇型モデルの直前と直後の圧、時間当たり流出液量を測定し、高速で血管撮影を行い、造影剤が動静脈奇型モデルを通過する時間を測定した。ついで、複数種類の濃度のNBCA(Lipiodolに溶解)を自動注入機を用いて注入し、これを高速で血管撮影した。NBCAが動静脈奇型モデルを通過する時間を測定し、静脈側への流出の有無、流入動脈近位側への逆流の有無を記録した。この模擬実験モデルでは、ほぼ安定した造影剤の動静脈奇型モデル通過時間が得られた。高濃度NBCAでは静脈側への流出のほとんどない塞栓が得られる場合があった。低濃度のNBCAでは注入速度の遅い方がNBCAの動静脈奇型モデル通過時間が長かった。これらの結果から、臨牀経験に合致する動静脈奇型塞栓術の模擬実験モデルを作製する可能性が示された。今後の課題として、i)実際の動静脈奇型塞栓術の状況により近い流量や圧波形を実現すること、ii)臨床上で簡便に測定できる指標として造影剤の動静脈奇型通過時間があり、使用するNBCAの濃度や投与速度を決めるのに用いられているが、これが流量と動静脈奇型モデルの直前直後の圧較差をどの程度反映するのか検討すること、iii)造影剤の動静脈奇型モデル通過時間とNBCAの至適濃度や至適投与速度との関係がどの程度か検討すること、があげられる。動静脈奇形の塞栓術で恒久的な閉塞を得るためには、接着性液体塞栓物質(n-butyl 2-cyanoacrylate(NBCA))を用いる必要があるが、使用されるNBCAの濃度と投与速度は職人技として弟子に伝授されるか、経験的に学習されるかであり、学派によって異なっているのが現状である。本研究は、人工的な動静脈奇形モデルを拍動流循環回路に接続して塞栓実験を行い、栄養動脈内の流速、NBCAの濃度および投与速度を変化させたときのNBCAの動態と塞栓範囲に関する客観的データを得て、学派間で意見の異なる現状において、至適濃度と至適投与速度に関する統一的見解に達するための基盤を提供することを目的としている。本年は、初年度として、拍動流回路の作製、動静脈奇形の一型である動静脈瘻モデルの作製、同モデル内の流速測定を行った。流速は収縮期40cm/sec、拡張期17cm/sec程度が実現でき、動静脈短絡点の直前の栄養動脈内の流速に近い状況を実現可能と思われた。また、動静脈奇形のもう一つの型であるnidusモデルについては、当初予定ではGolden Pacific社から購入予定だったが、同社から全く返信がなく、購入できなくなったため、独自に試作することにした。幸い、今年度に血管中空モデル作製を行う別途研究を行っており、この技術を用いて試作を開始したところである。来年度は、これら二型のモデルを用いて、目的の情報を得る予定である。

本研究は、動静脈奇形の塞栓物質として最も有効な接着性液体塞栓物質n-butyl-cyanoacrylate(NBCA)の至適濃度と至適投与速度を決定するための客観的な方法が確立されていない現状を鑑み、これを確立するための客観的データを収集する目的で行った。複数のポンプを用いた拍動流発生装置に動静脈奇形の人工的モデルを接続し、pHを調整し微小粒子成分を加えた液体を流すという模擬実験モデルを作製した。動静脈奇形モデルの直前と直後の圧、時間当たり流出液量を測定し、高速で血管撮影を行い、造影剤が動静脈奇形モデルを通過する時間を測定した。ついで、複数種類の濃度のNBCA(Lipiodolに溶解)を自動注入機を用いて注入し、これを高速で血管撮影した。NBCAが動静脈形モデルを通過する時間を測定し、静脈側への流出の有無、流入動脈近位側への逆流の有無を記録した。この模擬実験モデルでは、ほぼ安定した造影剤の動静脈奇形モデル通過時間が得られた。高濃度NBCAでは静脈側への流出のほとんどない塞栓が得られる場合があった。低濃度のNBCAでは注入速度の遅い方がNBCAの動静脈奇形モデル通過時間が長かった。これらの結果から、臨牀経験に合致する動静脈奇形塞栓術の模擬実験モデルを作製する可能性が示された。今後の課題として、i)実際の動静脈奇形塞栓術の状況により近い流量や圧波形を実現すること、ii)臨床上で簡便に測定できる指標として造影剤の動静脈奇形通過時間があり、使用するNBCAの濃度や投与速度を決めるのに用いられているが、これが流量と動静脈奇形モデルの直前直後の圧較差をどの程度反映するのか検討すること、iii)造影剤の動静脈奇形モデル通過時間とNBCAの至適濃度や至適投与速度との関係がどの程度か検討すること、があげられる。
急速破壊性股関節症の発症・進展のメカニズムに関する研究

[研究目的]急速破壊性股関節症(RDC)は1年以内という短期間で股関節の著しい破壊・変形を来し、患者の日常生活を高度に障害する、原因不明の疾患である。RDCは、他の股関節の破壊を来す疾患である変形性股関節症(OA)、関節リウマチ等と比べ、その臨床経過が非常に急速であることが特徴である。一方、破骨細胞は生理的な骨吸収や炎症性疾患における骨破壊に関与すると考えられている。今回RDCの骨関節破壊における破骨細胞の関与を検討する事を目的とした。[方法と結果]1.関節滑膜細胞からの破骨細胞形成系の樹立RDC並びにOA患者より手術時に採取した滑膜組織を用いて酵素処理後に約2週間培養を行い、この培養系における破骨細胞の形成に関与する各種サイトカイン、成長因子を検討できる培養系の確立を目指した。更に改善が必要であるがほぼ培養手技、培養結果は安定して検討できるようになった。2.成熟破骨細胞の単離と機能解析採取した滑膜細胞から成熟破骨細胞の単離を試みた。滑膜細胞培養開始後24時間でのTRAP染色において、特にRDCで成熟破骨細胞の存在が考えられた。破骨細胞形成系よりもこの系の方がRDCの病態の検討に適すると考え、以降この方法で得られた破骨細胞の機能解析(骨吸収能、カテプシンK・カルシトニンレセプターの発現、破骨細胞生存の検討等)を行っている。3.本疾患で破骨細胞形成に影響を与えている因子の検討(1)滑膜細胞中に存在するストローマ細胞、マクロファージの活性を検討するために準備段階としてそれらと共存培養するためのセルラインを入手し、まずその活性を検討した。前者としてUMR106細胞、後者としてRAW、THP-1細胞を用いてRANKL mRNAの検出、破骨細胞への分化能を検討中である。(2)RDC・OAの滑膜細胞培養上清中のRAW細胞の破骨細胞分化に与える影響について検討した。OAにおいてその培養上清が破骨細胞分化を抑制する結果が得られ、そのメカニズムについて検討中である。1.ヒト関節滑膜細胞の分離と初代培養時の条件設定まず、主に変形性股関節症に対する人工関節置換術時に採取した滑膜を用いて、滑膜細胞分離・初代培養のための実験手技の確立を目的とした。これまで報告されている慢性関節リウマチ(RA)における滑膜細胞培養系を参考に行ったが、変形性関節症の滑膜からは十分数の細胞の回収が困難で、確実な手技の設定には今後も試行錯誤が必要であると考えている。手技の確立と並行して滑膜細胞の初代培養における破骨細胞分化誘導のための条件設定を行った。培養開始時に播種する細胞数、培養期間、培養期間中必要な因子などを検討した。2.ヒト関節滑膜細胞からの破骨細胞分化誘導の検討上記試行し回収した培養細胞に対し、破骨細胞の前駆細胞と考えられているマクロファージに特異的なNSE活性、破骨細胞に特異的なTRAP活性を利用した酵素染色を行い、破骨細胞への分化効率を検討した。現在も上記検討を継続中であり、手技が安定したのち、形成される破骨細胞様細胞の破骨細胞としての形質(骨吸収活性など)の評価と、一般的な変形性関節症における滑膜細胞からの破骨細胞分化の特徴を明らかにし、急速破壊性股関節症などの特殊な股関節疾患について検討していく予定である。

[研究目的]急速破壊性股関節症(RDC)は1年以内という短期間で股関節の著しい破壊・変形を来し、患者の日常生活を高度に障害する、原因不明の疾患である。RDCは、他の股関節の破壊を来す疾患である変形性股関節症(OA)、関節リウマチ等と比べ、その臨床経過が非常に急速であることが特徴である。一方、破骨細胞は生理的な骨吸収や炎症性疾患における骨破壊に関与すると考えられている。今回RDCの骨関節破壊における破骨細胞の関与を検討する事を目的とした。[方法と結果]1.関節滑膜細胞からの破骨細胞形成系の樹立RDC並びにOA患者より手術時に採取した滑膜組織を用いて酵素処理後に約2週間培養を行い、この培養系における破骨細胞の形成に関与する各種サイトカイン、成長因子を検討できる培養系の確立を目指した。更に改善が必要であるがほぼ培養手技、培養結果は安定して検討できるようになった。2.成熟破骨細胞の単離と機能解析採取した滑膜細胞から成熟破骨細胞の単離を試みた。滑膜細胞培養開始後24時間でのTRAP染色において、特にRDCで成熟破骨細胞の存在が考えられた。破骨細胞形成系よりもこの系の方がRDCの病態の検討に適すると考え、以降この方法で得られた破骨細胞の機能解析(骨吸収能、カテプシンK・カルシトニンレセプターの発現、破骨細胞生存の検討等)を行っている。3.本疾患で破骨細胞形成に影讐を与えている因子の検討(1)滑膜細胞中に存在するストローマ細胞、マクロファージの活性を検討するために準備段階としてそれらと共存培養するためのセルラインを入手し、まずその活性を検討した。前者としてUMR106細胞、後者としてRAW、THP-1細胞を用いてRANKL mRNAの検出、破骨細胞への分化能を検討中である。(2)RDC・OAの滑膜細胞培養上清中のRAW細胞の破骨細胞分化に与える影響について検討した。OAにおいてその培養上清が破骨細胞分化を抑制する結果が得られ、そのメカニズムについて検討中である。
神経幹細胞のin vitroでの細胞系譜に関する研究

神経幹細胞は細胞増殖因子や細胞分化の調節因子により調節されている事が示唆されている。神経幹細胞の増殖はbFGF或はEGFを含む培地で確認されているが、増殖はこれらのリセプターとの結合により起こる。この両者のリセプターの神経幹細胞での発現時期が、細胞系譜に影響をしていることも示唆されている。本研究では、前脳より比較的迅速に、かつ期待する純度で初代培養系に適応できる細胞分取法を用いて、培養系で細胞系譜について研究することをテーマとした。胎生12日の前脳からの細胞細胞懸濁液をフローサイトメトリーにて解析すると12%がA2B5陽性細胞であった。また、この時期の細胞はnestin陽性細胞が顕著であり、A2B5陽性細胞との二重陽性細胞も認められた。これらの細胞をそれぞれ分取して分化培地にて培養するといずれの系でもneuronが先行して出現し、のちにglia系細胞が認められた。従って、nestin陽性細胞のクラスターは多分化能をもつとともに、その細胞系譜はrandomであるとこが示唆された。これは、glia系前駆細胞はbFGFの影響をある時期まで受けないことを示唆している。一方、EGFは培養8-10日目からneurospheresが認められ、応答していることからbFGFとの差異が明らかであろう。今後、レセプターとの関連から追求していきたい。分取して培養した神経幹細胞は増殖しながらneurospheresを形成するが、培養から6日目頃から激減する条件では、共存する細胞により非接着条件で回復することから、生存に関与する因子が示唆された。現在、検討中である。神経幹細胞およびある程度分化へ制限された細胞である前駆細胞を含めて、分化の阻止の条件が確立されれば、その臨床応用に貢献できると考えられる神経幹細胞は細胞増殖因子や細胞分化の調節因子により調節されている事が示唆されている。現在、検討中である。神経幹細胞およびある程度分化へ制限された細胞である前駆細胞を含めて、分化の阻止の条件が確立されれば、その臨床応用に貢献できると考えられる1、今年度は神経幹細胞と前駆細胞との差別化を目的とした分取法の検討で、散乱光によるフローサイトメトリー(LS-FCM)の応用について実施した。胎生12日目(E12)はNestin陽性細胞が強く発現している。この発生初期の前脳より単一の細胞懸濁液を用いて膜表層分子に対する抗体で染色したところ、平均で12%の陽性細胞が認められた。この抗体の陽性細胞は神経上皮細胞のサブポピュレーション、成熟ニューロン、またOA2細胞に反応することが報告されている。この12%の陽性細胞の細胞特異性はNestih陽性細胞との発現時期からすると神経上皮細胞のサブポピュレーションの可能性が高い。そこで、Nestin陽性細胞との関係、増殖条件、分化条件について検討している。増殖の検討では二次のneuospheresを形成することから自己増殖能を保持している。現在、分化の結果について多能性が認められるかどうか検討している。2、次いで、E12の前脳より分取した単一の神経幹細胞/前駆細胞(NSCNPCs)の細胞懸濁液を用いてbFGF及びEGFの応答性について検討した。高純度での分離条件で得られた神経幹細胞はbFGFの濃度に関わらず培養10日目(10DIV)で形成したneurospheresの生存率は激減した。しかし、EGFでは培養後にneurospheresの形成が認められなかったが、bFGFと全く逆に10DIVでのneurospheresの形成が確認された。このことより、NSCNPCsは培養後期ではFGFに加えて生存因子の要求性が示唆された。これがin vivoで起こりうることか今後検討の予定である。また、EGFで応答したspheresの細胞系譜について検討中である。胎生期および成体の大脳に局在する神経幹細胞の応用は年々具体化されており、臨床応用での期待感はますます強くなっている。

基礎研究においては、神経幹細胞の自己増殖と多分化能の性質についての細胞学的な研究を中心に活発に行なわれている。1.神経幹細胞の増殖維持と分化阻止の条件が確立でき、その機構が明かされる。2.必要なニューロンのみを再生するための条件とその機構が解明される。3.胎生期および成体の神経幹細胞の差異の解明などが焦点となっている。本研究ではいままで確認された自己増殖、多分化能に加えてアポトーシス、生存維持を加えた、神経幹細胞のもつ多面性について、応用性を考慮して基礎研究を行なった。神経管に認められる神経幹細胞は発生初期に種々の外来性因子により後期の発生に影響を及ぼす結果を示唆しており、それ故、組織からの分離技術がin vitroでの神経幹細胞の分化にも影響していることが考えられた。そこで、発生初期の外来性因子の影響を阻止するために迅速な神経幹細胞の分取法を確立して、初代培養系での検討をした。その結果、培養早期(1-2日)に他種細胞による接触性と非接触性の因子がアポトーシスと生存維持に関与していることを示唆する結果を得た。また、発生初期の外来性因子の影響は、神経幹細胞の対称性の分裂から非対称性の分裂への影響を示唆した。これは最終分化の影響までを支配することも考えられる。今後、これらの因子の同定を試みると共に特定のニューロンへの分化誘導の応用について検討する。初代培養系では培養条件を設定することで、特定の細胞の種々の機能を顕現させることが可能であり、脳内の複雑な環境下での動態を、単純な系として置き換えることでその細胞のもつ機能を予測できると考えられる。しかし、この目的のためには異種の細胞を簡便に差別化して、かつ迅速に分離することが必要である。この条件を満たすために、散乱光によるフローサイトメトリー法(Light Scattering Flow Cytometory : LS-FCM)を用いた。発生初期(胎生12日目)の前脳より単一細胞懸濁液を調整してLS-FCMで解析したところ神経幹細胞の領域とは異なる細胞群が認められた。この両者を生細胞のまま分取して初代培養に供したところbasicFGFでの増殖は良好でありこれらの細胞について解析した。一方、幹細胞および前駆細胞の細胞膜表層抗原に対する抗体による解析から、A2B5抗原が発生の早い時期に発現していた。Glia細胞系の前駆細胞はA2B5とnestinと二重染色される陽性細胞であるが、今回認められたのは、A2B5のみに染色の陽性細胞であり、強陽性と弱陽性に区別された。この発生初期の時期はニューロン前駆細胞の陽性率は低いにも関わらずA2B5陽性細胞の出現の意味を検討している。また、LS-FCMで分取した神経幹細胞のアポトーシスについては、蛋白性因子および低分子の両者が関与していることが今回、示唆された。この現象はLS-FCMにより純度の高い細胞を分取したときに惹起されることから、脳由来の共存の細胞が通常はアポトーシスを阻害していることが考えられた。