hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチド作動性血管拡張性神経伝達におよぼす抗高血圧薬の作用

本態性高血圧の優れた動物モデルの高血圧自然発生ラット(SHR)では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有血管拡張性神経の活動が加齢によって減弱することから、高血圧成因には血管拡張性神経の活動減弱が関与していると考えられる。CGRP神経活動を改善する薬物は本態性高血圧の根本的な治療薬になり得る可能性があると考え、平成3年度の研究において、現在高血圧の治療に用いられている抗高血圧薬がSHRにおいて減弱した血管拡張性神経伝達を改善するものがあるかどうか検討した。高血圧進展時期の8週齢SHRに抗高血圧薬としてβ-受容体遮断薬(Pindolol)、アンギオテンシン変換酵素阻害薬(Captopril)、Ca拮抗薬(Nicardipine)および血管拡張薬(Hydralazine)を飲料水あるいは固形飼料として7週間長期投与した結果、Captopril投与群でのみCGRP神経性反応が大きく促進することを明らかにした。平成4年度では、高血圧が固定した15週齢SHRを用い、Pindolol、Captopril、Hydralazineを飲料水として与え7週間飼育した。22週齢時に麻酔下に頚動脈圧を多用途プリアンプ装置(RMP-6008)および圧トランスデュサー(P23XL)にて測定した結果、いずれの抗高血圧薬慢性投与したSHRの血圧は同週齢無処置SHRに比較して有意に低値を示した。各抗高血圧薬投与SHR群および同週齢の無処置SHR群において腸間膜潅流標本における経壁電気刺激(経壁電気刺激装置SEN-3301)による神経性血管拡張反応を検討した結果、Pindolol投与SHR群の神経性拡張反応の大きさは無処置SHR群と同程度であった。一方Captopril投与SHR群の拡張反応は無処理SHR群の反応よりも有意に大きかった。現在、Hydralazineの実験が終了し、その結果を集計中であるが、CGRP神経性血管拡張反応は対照SHRと差がない結果がでている。以上のように抗高血圧薬の慢性投与は高血圧が固定したSHRの血圧を低下させたが、CaptoprilのみがCGRP含有血管拡張性神経機能を改善させるという新たな知見がえられた。この結果はCaptoprilの降圧作用機序を解明するの貴重なdataと思われる。全身血圧の調節維持に重要な役割を果たしている内臓血管の抵抗血管にはカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)を伝達物質とするペプチド作動性の血管拡張性神経が分布し、抵抗血管の機能調節に寄与している。本態性高血圧の優れた動物モデルの高血圧自然発生ラット(SHR)では、CGRP含有血管拡張性神経の活動が加齢によって減弱することから、高血圧成因には血管拡張性神経の活動減弱が関与していると考えられる。従って、拡張性神経活動を改善する薬物は本態性高血圧の根本的な治療薬になり得る可能性があると考え、平成3年度の研究において、現在高血圧の治療に用いられている抗高血圧薬がSHRにおいて減弱した血管拡張性神経伝達を改善するものがあるかどうか検討した。抗高血圧薬としてβー受容体遮断薬(PindololとPropranolol)、アンギオテンシン変換酵素阻害薬(Captopril)、Ca拮抗薬(Nicardine)および血管拡張薬(Hydralazine)を用いた。これらの抗高血圧薬を飲料水(0.05%Pindolol,0.1%Propranolol,0.1%Captopril,0.005%Hydralazine)あるいは固形飼料(0.05%Nicardipine)として8週齢SHRに与え、15週齢まで7週間飼育した。15週齢時に麻酔下に頚動脈圧を多用途プリアンプ装置(RMPー6008)および圧トランスデュサ-(P23XL)にて測定した結果、いずれの抗高血圧薬慢性投与したSHRの血圧は対照SHRに比較して有意に低値を示した。各抗高血圧薬投与SHR群、無処置SHR群および無処置正常血圧WKY群において腸間膜潅流標本における経壁電気刺激(経壁電気刺激装置SENー3301)による神経性血管拡張反応を検討した結果,Pindolol,PropranololおよびHydralazine投与SHR群の神経性拡張反応の大きさは無処置SHR群と同程度である、WKY群の反応に比較して有意に小さかった。Nicardipine投与SHR群の反応は無処置SHR群の反応よりも有意に小さかった。一方、Captopril投与SHR群の拡張反応は無処置SHR群の反応よりも有意に大きく、WKY群の反応とほぼ同程度であった。以上のように抗高血圧薬の慢性投与はSHRの血圧を低下させたが、CaptoprilのみがCGRP含有血管拡張性神経機能を改善させるという新たな知見がえられた。この結果はCaptoprilの降圧作用機序を解明するのは重要なdataと思われる。平成4年度では、高血圧が固定した15週齢SHRを用い、Pindolol、Captopril、Hydralazineを飲料水として与え

7週間飼育した。22週齢時に麻酔下に頚動脈圧を多用途プリアンプ装置(RMP-6008)および圧トランスデュサー(P23XL)にて測定した結果、いずれの抗高血圧薬慢性投与したSHRの血圧は同週齢無処置SHRに比較して有意に低値を示した。各抗高血圧薬投与SHR群および同週齢の無処置SHR群において腸間膜潅流標本における経壁電気刺激(経壁電気刺激装置SEN-3301)による神経性血管拡張反応を検討した結果、Pindolol投与SHR群の神経性拡張反応の大きさは無処置SHR群と同程度であった。一方Captopril投与SHR群の拡張反応は無処理SHR群の反応よりも有意に大きかった。現在、Hydralazineの実験が終了し、その結果を集計中であるが、CGRP神経性血管拡張反応は対照SHRと差がない結果がでている。以上のように抗高血圧薬の慢性投与は高血圧が固定したSHRの血圧を低下させたが、CaptoprilのみがCGRP含有血管拡張性神経機能を改善させるという新たな知見がえられた。この結果はCaptoprilの降圧作用機序を解明するの貴重なdataと思われる。
子宮由来シグナル因子により誘導される胚盤胞活性化の機序に関する研究

本研究は、子宮由来シグナル因子による胚盤胞活性化機序の解明を目的とした。着床の成立には胚盤胞活性化と子宮の胚受容能獲得が同時に進行する必要があるが、この胚・子宮間の同調に介在する機序は未だ明らかでない。マウスの着床期子宮はエストロゲンの一時的な血中濃度上昇により胚受容能を獲得する。そこで本研究では、エストロゲン依存的に子宮より分泌され、胚盤胞活性化を誘導する因子の同定を試み、オステオポンチンとフィブロネクチンを同定した。これら細胞外基質タンパク質は胚盤胞のインテグリンを受容体として着床期の胚発生に重要な役割を有していると考えられる。胚着床は、胚盤胞の活性化と子宮の胚受容脳獲得の高度な調節を伴う真獣類にとって重要な生命現象であるが、この胚・子宮間の同庁に介在する機序は不明である。本研究は胚盤胞活性化を誘導する子宮由来因子の同定を試みるものであり、H27年度は、遺伝子発現データベースのバイオインフォマティックス解析と、胚盤胞活性化に介在する細胞内シグナリングの同定を行った。Gene Expression Omnibusから着床期マウス子宮における遺伝子発現データセットを入手し、1.エストロゲン(E2)依存的に子宮内膜上皮において発現が上昇し、2.その翻訳産物が分泌型タンパクであり、3.細胞外シグナルとして標的細胞のMAPKもしくはAKTシグナリング経路を活性化する可能性がある遺伝子を抽出し、さらにその受容体が胚盤胞において発現しているものを抽出することで、胚盤胞の活性化を誘導する子宮由来因子候補として20遺伝子のリストを得た。胚盤胞の接着性を誘導する子宮由来因子であるオステオポンチン(OPN)は上記インフォマティックス解析により得られた遺伝子リストに含まれており、E2依存的な発現上昇が最も高いことからその役割の重要性が示唆された。我々は体外培養モデルを用いてOPNにより活性化が誘導される胚盤胞の細胞内シグナリングの同定を行い、OPNはfocal adhesion kinaseを介してその下流シグナリングを活性化していることを明らかにした。In vivoでの胚盤胞活性化過程においても、オステオポンチンにより誘導される細胞内シグナリングと同様の活性化パターンが見られ、オステオポンチンが胚盤胞活性化誘導因子である可能性を強く示唆するとともに、これら細胞内シグナリングの活性化が胚盤胞活性化の指標として有効であることが示された。本研究は、E2の血中濃度依存的に胚着床が進行するマウスをモデルに用い、着床期特異的な胚盤胞の活性化を誘導する子宮由来シグナル因子の同定と、胚盤胞の外殻をなす栄養外胚葉の細胞増殖・分化制御機序の解明を行うもので、H27年度は当初計画に従い、遺伝子発現データベースのバイオインフォマティックス解析による子宮由来シグナル因子候補群の抽出とその検証、および胚盤胞活性化に介在する細胞内シグナリングの同定に取り組んだ。子宮由来シグナル因子の抽出においては、当初想定していた候補数よりもはるかに少ない20遺伝子まで絞り込むことができ、その検証作業はやや遅れてはいるものの本研究のアプローチの有効性が示されたと言える。また、胚盤胞活性化に介在する細胞内シグナリングの同定については、E2受容体阻害モデルと体外培養系によるOPN刺激モデルで一致した結果が得られ、順調に推移している。一部の子宮由来シグナル因子については体外培養系を用いた胚盤胞への影響の検証を開始しており、総じて順調に進捗していると言える。胚着床は、胚盤胞の活性化と子宮の胚受容能獲得の高度な調節を伴う真獣類にとって重要な生命現象であるが、この胚・子宮間の同調に介在する機序は不明である。本研究はマウスを用いて胚盤胞の活性化を誘導する子宮由来因子を同定することを目的としている。我々はH27年度に遺伝子発現データベースのバイオインフォマティックス解析と胚盤胞の体外培養系を用いた胚盤胞接着能活性化モデルの解析を行い、胚盤胞の活性化を誘導し得る着床期特異的子宮由来シグナル因子候補として20遺伝子を抽出するとともに、エストロゲン依存的に着床期子宮内膜腺より分泌されるオステオポンチン(osteopontin, OPN)が胚盤胞のfocal adhesionkinase (FAK)を介してその下流シグナリング、すなわちMAPKおよびPI3K/AKTシグナリング経路を活性化することを明らかにした。平成28年度は、バイオインフォマティックス解析により得た着床期特異的な胚盤胞活性化の子宮由来シグナル因子候補の子宮における発現を、妊娠3.5および4.5日齢ならびにエストロゲン受容体を阻害した妊娠4.5日齢の子宮を用いて定量的RT-PCR法と免疫組織化学法により検証し、現在までにCXCL14がエストロゲン依存的に子宮内膜腺上皮において発現していることを明らかにした。また、胚盤胞の体外培養モデルの解析により、胚盤胞の内部細胞塊より産生されるFGF4は、OPNにより活性化するFAK下流シグナリングのうちAKTのリン酸化を阻害することが明らかになった。一方で、胚盤胞の栄養外胚葉細胞の増殖は時間の経過とともに減少し、胚盤胞の接着能を誘導するOPNは栄養外胚葉細胞の増殖には影響しなかった。平成28年度は、バイオインフォマティックス解析により得られた胚盤胞活性化を誘導する子宮由来シグナル因子候補をマウス子宮から抽出したmRNAを用いて検証した。

しかし、バイオインフォマティックス解析により得られた候補因子にはその発現がユビキタスであるもの、例えば血球細胞からの発現が知られているものなどが多く含まれており、子宮の組織片から抽出したmRNAの解析ではその発現の時期特異性やエストロゲン依存性を検証することが困難であり、組織切片を用いたin situでの解析法を導入する必要が生じた。また、これまでに得られたデータからは、胚盤胞栄養外胚葉細胞の増殖・分化には複数の子宮由来因子が強調して作用していることが示唆され、計画よりも多くの実験条件を設定する必要がある。これらの理由により計画よりもやや遅れて進捗している。胚着床は、胚盤胞の活性化と子宮の胚受容能獲得の高度な調節を伴う。本研究ではマウスを用いて胚盤胞の活性化を誘導する子宮由来因子を同定することを目的とし、着床期子宮内膜上皮においてエストロゲン依存的に発現し胚盤胞活性化に作用する因子の探索と、子宮由来因子からの刺激を受けて胚盤胞の接着性を活性化する細胞内シグナリング経路の同定を試みた。本研究では胚盤胞の体外培養モデルを用い、OPNが胚盤胞のFAKおよびその下流のMAPKおよびPI3K/AKTを活性化することを明らかにした。これらシグナル伝達物質の活性化は胚盤胞活性化の指標として有用であると考えられる。さらに、胚盤胞の接着性が壁側栄養外胚葉でのみ活性化する機序を検証し、国際学会にて発表した。現在さらなる詳細の解明に取り組んでいる。一方、胚盤胞の活性化を誘導する子宮由来シグナル因子候補を探索するため、我々はまず遺伝子発現データベースのバイオインフォマティックス解析により20遺伝子を抽出した。この20遺伝子のなかにはOPNも含まれており、我々が過去に報告した知見と一致する結果が得られた。OPNはRGD配列を含んだ細胞外マトリックス(ICM)のひとつで胚盤胞の接着能活性化を誘導する。抽出した20遺伝子の中には、OPNと同様にRGD配列を有するICMであるフィブロネクチン(Fn1)も含まれており、現在、Fn1の発現のエストロゲン依存性と子宮管腔への分泌の有無を調査中である。20遺伝子のなかには他にもサイトカインなどが含まれており、うちいくつかは子宮内膜上皮での発現とエストロゲン依存性が見られた。しかしながら、明確に管腔中に分泌されている根拠は得られず、これらの因子は胚盤胞ではなく子宮内膜を標的としている可能性が考えられたため、着床期子宮内膜の白血球分布動体を検証し、その成果を現在論文としてまとめている最中である。本研究は、子宮由来シグナル因子による胚盤胞活性化機序の解明を目的とした。着床の成立には胚盤胞活性化と子宮の胚受容能獲得が同時に進行する必要があるが、この胚・子宮間の同調に介在する機序は未だ明らかでない。マウスの着床期子宮はエストロゲンの一時的な血中濃度上昇により胚受容能を獲得する。そこで本研究では、エストロゲン依存的に子宮より分泌され、胚盤胞活性化を誘導する因子の同定を試み、オステオポンチンとフィブロネクチンを同定した。これら細胞外基質タンパク質は胚盤胞のインテグリンを受容体として着床期の胚発生に重要な役割を有していると考えられる。胚盤胞活性化に介在する細胞内シグナリングの同定は、これまでにE2受容体阻害モデルとOPN刺激体外培養モデルで検証したが、これらに加えて卵巣除去による着床遅延モデルの検証を加えることで得られた知見をより確かなものにする。
農作業機械の自動化が運転者の人的特性に及ぼす影響

自動化・高性能化された農作業機械は、高能率と低コスト化を目指して高速度作業を行う。これら高性能システムと言えども運転者を要するばかりか、その運転者はパネルや作業のできばえを眼で見て、頭で最適操作法を判断し、その判断結果により手や足を用いて運転をせねばならない。すなわち、機械化によって運転作業は軽労作に変わったが、高速で走るシステムの一部に組み込まれて追われるように注視と判断を繰り返している。最初は、運転者の注視点の挙動を追求して操作の頻度、ひいては精神・神経的疲労に連なる根源を明らかにする実験をした。自動車のように頭部を動かさず眼を動かす運転操作では、アイマークレコーダによる試験が有益であった。しかし、同器は視点の検出に赤外線を使っていて白日晴天下の農作業では使えないことが分かった。一方、農業機械の運転は至近距離を見ていて、視野内には注視すべき対象がほぼ一つに限られ、小型ビデオカメラで計測できることを知った。その結果、良好な作業条件下では、自動化作業機の運転者に周囲を見回すような動作が現れて心の余裕が確認されたが、不良な条件では、自動化されない場合以上に視点が集中させられ、問題点があることが分かった。次に、農作業を請負うコントラクタの運転者は、超高性能作業機による超高速度作業を長期間にわたって行い、厳しい振動条件によって健康問題が発生しかねないことが分かった。また、平成9年から始まった大特車の軽自動車化という規正緩和は、道路走行時に新たな問題点が起こる危険性が推定される。これらを総括し、前述の視点・振動問題と道路走行の法制度のすべてにおいて、新しい時代に応じたマンマシンシステムの研究と機構的対応が不可欠であると結論する。本研究は、急速に増大する農作業機械の自動化機構を使った時に、運転者にどのような影響を及ぼすかを追求して,ハードウェアと人間の調和及び安全性の確立をしようとする研究であり,初年度の本年は次の成果を上げた。1,有人・無人トラクタの製作次年度に発展させる人工知能制御の主体となるトラクタとして4輪操舵4輪駆動の極小型トラクタを設計製作した。当機は12kWのエンジンでHSTを駆動し,出力側を4輪それぞれを駆動する油圧モータにつないで任意の速度が無段に得られ,操舵は車輪毎に1本の電気式シリンダーを装着して,多様な走行軌跡となる運転が可能である。これらには全てトランスデューサを装備して操舵走行制御・出力経過がコンピュータに記録される。本年は有人運転が出来るまで完成した。2,農作業コントラクタの運転者が受ける振動・騒音被曝に関する調査機械化農作業で運転者が受ける振動・騒音は、防震対策の改善と短期間作業などのため問題視されなかったが,突如出現した「農作業コントラクタ」では、超高性能作業機にいる超高速度作業が長期間にわたって行われ、厳しい振動・騒音条件による新たな労働問題が顕在化させた。S農協の育成牧場でサイレ-ジ切り込み作業について振動・騒音を計測したところ,いずれも防震を施したキャビン装着車なのに大きな振動を受け、1日の作業時間は許容時間を超え,かつ,この条件で作業期間日数も長くて健康上大きな問題が出ることを突き止めた。これら成果は、本年4月の日本農作業学会春季大会(於:農工大)で「コントラクタ運転者の振動被曝」と題して講演発表をする。なお,本研究は次年の対象であったが,偶然に協力が得られる機会を得て本年に繰り上げたものである。

本研究は,急速に増大する農作業機械の自動化機構を使った時に,運転者にどのような影響を及ぼすかを追求して,ハードウェアと人間の調和及び安全性の確立をしようとする研究であり、初年度の本年は次の成果を上げた。1.有人・無人トラクタの製作初年度に設計した4輪操蛇4輪駆動の小型トラクタにワンボードコンピュータを用いた運転制御装置を取り付けた。当機は12kWのエンジンを動力に2個のHSTを用いて前後輪を個別に駆動するものであり,出力側を4輪の油圧モータにつないで任意の速度が無段に得られる。また、操舵は前後輪毎に操舵シリンダーを装着して,多様な走行軌跡となる運転が可能である。ワンボードCPUによって2WD走行が可能となったが、機構が複雑で充分な演算が不可能なため、これにパソコンを前置した制御方法に切り換えた。2,農作業コントラクタの運転者が受ける振動・騒音被曝に関する調査初年度の研究で「農作業コントラクタ」は、超高性能作業機による超高速度作業が長期間にわたって行われ、厳しい振動・騒音条件による新たな労働問題が顕在化したことを指摘した。本年も継続して追加調査を行い、近隣の一般農家も加えて牧草収穫・畑収穫作業について振動・騒音を計測したところ,高能率な作業をするところではいずれも大きな振動および騒音を受け、1日の作業時間は許容時間を超え,かつ,この条件で作業期間日数も長くて健康上大きな問題が出ることを突き止めた。また、3年間にわたる作業日報を入手し、運転者の勤務状況、連続作業時間の日数の実態を把握した。3,運転者の操作挙動の調査振動や騒音の環境条件のほかに運転者に大きな影響を及ぼすものは、運転者の手腕と足を用いた操作があるため、模擬運転台を製作して動作分析を行った。次年は目の挙動も追加して全貌を明らかにする。本研究は、急速に増大する農作業機械の自動化・高性能化機械を使った時に、運転者にどのような影響を及ぼすかを追求して、ハードウエアと人間の調和及び安全性の確立をしようとする研究であり、最終年度の本年は次の成果を上げた。1,農作業コントラクタの運転者が受ける振動被曝に関する調査の総括初年度から3年間続けたコントラクタの労働問題は、いずれの年も超高性能作業機による超高速度作業が長期間にわたって行われ、厳しい振動条件によって健康問題が発生しかねない新たな問題が顕在化していることを確認した。なお、溝を跳び越えるなどの瞬時の超強度な振動についての把握と評価法が懸案として残った。2,運転者の注視点に関する調査の実施と総括農作業機械の自動化・高性能化機械システムと言えども運転者を要するばかりか、その運転者は機械や作業のできばえを眼で見てから、頭で最適操作法を判断し、その判断結果を手や足を用いて最適な運転をせねばならない。すなわち、機械化によって人力労働のようなRMRの高い作業から軽労作に変わったが、運転者はは高速で走るシステムの一部に組み込まれて追われるように注視と判断を繰り返している。そこで操作の基となる注視点の挙動を追及して操作の頻度、ひいては精神・神経的疲労に連なる根源を明らかにする実験をした。A)アイマークレコーダーによる試験結果注視点の計測には視野画像と視点が一度に掌握できるアイマークレコーダーが不可欠である。先ず自動車の運転について調査と解析を行い、高速走行(農業機械との対比)時の注視点の特性を把握した。これは前方視野の中で眼を動かして監視する視点移動監視法として整理できた。しかし、同器は視点の検出に赤外線を使って白日
化学物質およびエネルギー同時生産のための固体酸化物燃料電池型反応器の開発

固体酸化物を電解質として用いた燃料電池型反応器において、合成ガス(CO+H_2)と電力の同時生産をおこなう電力化学物質同時生産システムの構築を目的とし、燃料極について研究を行った。メタンの部分酸化反応条件では、電極上に炭素が析出し、電極性能劣化を引き起こすため、炭素析出を抑制する燃料極の開発が重要である。FeをドープしたCaTiO_3(以下FCT)を新規燃料極材料として検討し、化学的安定性をX線回折により評価し、また電極微構造の電子顕微鏡観察を行い、電極作製条件の最適化を行った。この材料はプロトンおよび酸素イオン導電性を示し、導電性が高いため、燃料極のNi量を低減し炭素析出をおさえられる可能性がある。これまでにNi-FCTとYSZ電解質との焼成温度は1300°Cがもっとも良いことを報告しているが、この温度での熱処理前後では、X線回折パターンに変化は見られず、高温処理後も化学的に安定であることが分かった。焼成温度を1400°Cにしても同様に安定であることが示唆された。NiとFCTの重量比が、NiO:FCT=1:1もしくは4:1において、電極表面観察および発電試験を行ってきたが、さらにNiO:FCT=7:3、6:4、4:6、3:7において電極を調製した。このうちNiO:FCT=4:6がもっとも微細な電極構造をとった。開回路電圧はNiO:FCT=1:1の場合と同様の値が得られ、メタンの部分酸化反応に対応する開回路電圧となったが、電流値は1/10程度となり、著しく性能は低くかった。したがって、NiO:FCT=1:1、1300°C焼成試料が最適条件であると分かった。SOFCモデルにより、燃料の電極上での直接内部改質と、外部燃料改質との熱効率の比較をした。内部改質では熱エネルギーが余剰になる傾向があり、部分的に燃料を外部改質し、のこりの燃料を直接電極上で改質する方が、発電効率が向上することがわかった。本研究では、FeをドープしたCaTiO_3(以下FCT)を検討した。この材料はペロブスカイト型構造を取り、プロトンおよび酸素イオン導電性を示す。高い導電性を示すため、燃料極のNi量を低減し、Niを活性サイトとした炭素析出をおさえられる可能性がある。まず、Ni-FCT燃料極調製の最適条件を探るため、NiとFCT重量比および電極焼成温度と発電特性の関連について調べた。NiとFCTの重量比は、NiO : FCT=4:1がもっとも高い発電性能を示し、また焼成温度は1300°Cが最適であることが分かつた。この最適条件で調製したNi-FCT燃料極は、燃料としてH_2およびCH_4を用いた場合に、従来のNi-YSZ燃料極とほぼ同等の発電性能を示した。200mA/cm^2の電流負荷をかけ、メタン/水蒸気=1.5という条件で、1000°Cにおける発電実験を行ったところ、Ni-YSZ燃料極は約5時間で端子電圧が半分に低下したのに対し、Ni-FCT燃料極は20時間にわたって安定した発電特性を示し、炭素析出を抑えられる可能性が十分あることが分かつた。SOFCの反応モデルを作製し、電極上で直接燃料改質をおこなうシステムと、外部で燃料改質をおこなうシステムの熱効率の比較を行った。直接燃料改質をおこなうシステムが発電効率が高くなり、これは発電にともない発生する熱を電極上で改質反応により吸熱することにより、低レベルの熱として系外に排出されるエネルギーの量を低減することができるためであることが明らかとなった。昨年度に引き続き、FeをドープしたCaTiO_3(以下FCT)を検討し、電極微構造の電子顕微鏡観察を行い、電極作製条件の最適化を行った。Ni-FCT燃料極調製の最適条件を探るため、NiとFCT重量比をかえて電極を作製し、微構造を観察した。NiとFCTの重量比が、NiO : FCT=1:1、1300°C焼成がもっとも微細な構造を取り、発電性能の向上を期待したが、NiO : FCT=4:1、1300°C焼成条件が、発電性能の面からは最適であることが分かった。しかし、Nio:FcT=1:1、1300°C焼成試料は性能は低いものの、CH_4を低S/C=1.2で燃料に用いた場合は、開回路電圧が向上し、メタンの部分酸化反応に対応する開回路電圧となった。ガス分析による反応機構の推定が必要である。

またNiO : FCT=1:1、1300°C焼成試料はCH_4を低S/C=1.2で供給し、200mA/cm^2の電流負荷をかけ、1000°Cにおける発電実験を行ったところ、端子電圧が徐々に上昇し、発電性能が向上することがわかった。SOFCモデルにより、燃料の電極上での直接内部改質と、外部燃料改質との熱効率の比較を行った。いずれもS/Cの値が小さくなるにつれて発電効率が向上した。直接改質がより効率が高いが、S/Cの値が小さくなるにつれて、その差は小さくなった。固体酸化物を電解質として用いた燃料電池型反応器において、合成ガス(CO+H_2)と電力の同時生産をおこなう電力化学物質同時生産システムの構築を目的とし、燃料極について研究を行った。メタンの部分酸化反応条件では、電極上に炭素が析出し、電極性能劣化を引き起こすため、炭素析出を抑制する燃料極の開発が重要である。FeをドープしたCaTiO_3(以下FCT)を新規燃料極材料として検討し、化学的安定性をX線回折により評価し、また電極微構造の電子顕微鏡観察を行い、電極作製条件の最適化を行った。この材料はプロトンおよび酸素イオン導電性を示し、導電性が高いため、燃料極のNi量を低減し炭素析出をおさえられる可能性がある。これまでにNi-FCTとYSZ電解質との焼成温度は1300°Cがもっとも良いことを報告しているが、この温度での熱処理前後では、X線回折パターンに変化は見られず、高温処理後も化学的に安定であることが分かった。焼成温度を1400°Cにしても同様に安定であることが示唆された。NiとFCTの重量比が、NiO:FCT=1:1もしくは4:1において、電極表面観察および発電試験を行ってきたが、さらにNiO:FCT=7:3、6:4、4:6、3:7において電極を調製した。このうちNiO:FCT=4:6がもっとも微細な電極構造をとった。開回路電圧はNiO:FCT=1:1の場合と同様の値が得られ、メタンの部分酸化反応に対応する開回路電圧となったが、電流値は1/10程度となり、著しく性能は低くかった。したがって、NiO:FCT=1:1、1300°C焼成試料が最適条件であると分かった。SOFCモデルにより、燃料の電極上での直接内部改質と、外部燃料改質との熱効率の比較をした。内部改質では熱エネルギーが余剰になる傾向があり、部分的に燃料を外部改質し、のこりの燃料を直接電極上で改質する方が、発電効率が向上することがわかった。
レトロウイルス逆転写酵素阻害剤によるHAM新治療法開発に関する研究

逆転写酵素阻害剤投与例の増大とともにその有効例、無効例の出現が観察された。有効例においてはHTLV-Iプロウイルス量の軽減と臨床症状の改善が認められたが、無効例ではウイルス量に変化はなく、症状の改善も見られなかった。この原因の特定を特定するためにそれぞれの群でHTLV-Iウイルス増殖様式の差があるのかの検討を行った。即ちHAMは末梢血リンパ球中のHTLV-Iプロウイルス量が増加しているわけであるが、感染リンパ球が増殖しているのか、HTLV-Iウイルスそのものが増殖してリンパ球への感染を拡大しているのか宿主の応答の面から検討を加えたわけである。HTLV-I感染後に体内でHTLV-Iウイルスが増加しやすい環境を許してしまう個体では、逆転写酵素阻害剤での治療が有効でない可能性を示唆していると考えている。まずHAMとキャリアを区別できる可能性のあるHTLV-Iウイルス量について解決するために、0.5%ごとにHAM発症数、HTLV-Iキャリア数を算出し、ROC曲線を描画後に、cut off値を算出した。ROC曲線からは、HTLV-Iウイルス量2%で、感度80%以上、特異度80%以上でHAM群とキャリア群を区別できることが明らかとなった。この値で、HTLV-Iウイルス量と宿主因子のHAM発症への関連を解析したところ、HLA-DRB1^*0101は、HAM群でキャリア群より高頻度に見られた(χ^2=4.45、Odds ratio 1.80 95%C.I. 1.04-3.11、p=0.03)が、この傾向は、HTLV-Iウイルス量2%以下のHAM群で強く見られ(χ^2=4.18、Odds ratio 2.495%C.I. 1.02-5.67、p=0.04)、2%以上群では認められなかった。HLA-A^*02は、HAM群でキャリア群より有意に頻度が低く(χ^2=17.12、Odds ratio O.4495%C.I. 0.29-0.65、p=3x10^<-5>)、これはHTLV-Iウイルス量2%以下群で顕著であった(χ^2=6.73、Odds ratio O.39 95%C.I. 0.19-0.81、p=0.008)。2%以上群ではこの関係は認められなかった。HLA-B^*54では、HAM群で有意に頻度が高く(χ^2=12.46、Odds ratio2.43 95%C.I. 1.47-2.00、p=0.0004)、この傾向は、HTLV-Iウイルス量2%以上のHAM群で強く見られ(χ^2=8.45、Odds ratio 7.5 95%C.I. 1.74-32.30、p=0.003)、2%以下群では認められなかった。この情報を逆転写酵素阻害剤の有効例、無効例に応用して、有効性の予測が可能かの解析を加えた。残念ながらこの検討では、有効例、無効例の投与前の予測は症例数の問題があり、可能ではなかった。我々は蛍光強度解析システムにて定量を行う方法を導入、HTLV-Iプロウイルス定量用に改良し、増幅効率の良いPCR用プライマー部位を設定、簡便で再現性の高いPCR定量法の開発に成功している。この定量法を用いHAM患者ではHTLV-Iプロウイルス量が著しく増大していること、即ちHAM患者ではHTLV-Iキャリアに比しウイルス量が平均7倍高いことを証明したわけであるが、このことは治療法開発においても極めて有用な判定方法を得たことを意味している。本研究には、現在までにHIVで有効性、安全性の確立されている逆転写酵素阻害剤(HTLV-1感染者並びにHAM患者では十分に安全性が確立されているとは言えない)を使用し、十分なインフォームドコンセントの上治療法の開発研究を行った。今回は逆転写酵素阻害剤(3TC/AZT)のHAM治療における有効性を検討した。HAM患者9例(男性2例、女性7例)に3TC単剤または3TC/AZT両剤を投与し、HAM症状(運動障害度、10m歩行時間)の推移、HTLV-Iプロウイルス量の変化、副作用発現について観察した。前記のごとくHTLV-Iプロウイルス量はABIPrism7700^<TM>にて定量的PCR法により計測した。5例は治験終了(うち1例は3TC単独投与)、4例は副作用のため投与中止した。運動障害度は大きな変化はなかったが、9例中6例においては10m歩行に要する時間の短縮と歩数の減少が認められ、3TC単独または3TC/AZT併用療法が効果を示した症例は67%(6/9)であった。有効群と無効群で臨床背景、治療前のプロウイルス量に特に有意な差はみられなかった。治療後のウイルス量は臨床症状の改善が見られた症例で低下する例があったが、一定の傾向は見られなかった。

この定量法を用いHAM患者ではHTLV-Iプロウイルス量が著しく増大していること、即ちHAM患者ではHTLV-Iキャリアに比しウイルス量が平均7倍高いことを証明したわけであるが、このことは治療法開発においても極めて有用な判定方法を得たことを意味している。本研究では、昨年度までにHIVで有効性、安全性の確立されている逆転写酵素阻害剤を使用し、十分なインフォームドコンセントの上治療法の開発研究を行った。HAM患者9例(男性2例、女性7例)に3TC単剤または3TC/AZT両剤を投与し、HAM症状(運動障害度、10m歩行時間)の推移、HTLV-Iプロウイルス量の変化、副作用発現について観察した。HTLV-Iプロウイルス量は前記のごとくABI Prism7700^<TM>にて定量的PCR法により計測した。5例は治験終了(うち1例は3TC単独投与)、4例は副作用のため投与中止した。運動障害度は大きな変化はなかったが、9例中6例においては10m歩行に要する時間の短縮と歩数の減少が認められ、3TC単独または3TC/AZT併用療法が効果を示した症例は67%(6/9)であった。有効群と無効群で臨床背景、治療前のプロウイルス量に特に有意な差はみられなかった。治療後のウイルス量は臨床症状の改善が見られた症例で低下する例があったが、一定の傾向は見られなかった。本年度は、3TC/AZTとプラセーボを用いた二重盲検試験を、インフォームドコンセントの得られたHAM患者において開始するための準備を行い、条件の整った患者において治験を開始した。半年間の二重盲検期間の後に、半年間の実薬を用いるプログラムであり、現在経過観察中である。逆転写酵素阻害剤投与例の増大とともにその有効例、無効例の出現が観察された。有効例においてはHTLV-Iプロウイルス量の軽減と臨床症状の改善が認められたが、無効例ではウイルス量に変化はなく、症状の改善も見られなかった。この原因の特定を特定するためにそれぞれの群でHTLV-Iウイルス増殖様式の差があるのかの検討を行った。即ちHAMは末梢血リンパ球中のHTLV-Iプロウイルス量が増加しているわけであるが、感染リンパ球が増殖しているのか、HTLV-Iウイルスそのものが増殖してリンパ球への感染を拡大しているのか宿主の応答の面から検討を加えたわけである。HTLV-I感染後に体内でHTLV-Iウイルスが増加しやすい環境を許してしまう個体では、逆転写酵素阻害剤での治療が有効でない可能性を示唆していると考えている。まずHAMとキャリアを区別できる可能性のあるHTLV-Iウイルス量について解決するために、0.5%ごとにHAM発症数、HTLV-Iキャリア数を算出し、ROC曲線を描画後に、cut off値を算出した。ROC曲線からは、HTLV-Iウイルス量2%で、感度80%以上、特異度80%以上でHAM群とキャリア群を区別できることが明らかとなった。この値で、HTLV-Iウイルス量と宿主因子のHAM発症への関連を解析したところ、HLA-DRB1^*0101は、HAM群でキャリア群より高頻度に見られた(χ^2=4.45、Odds ratio 1.80 95%C.I. 1.04-3.11、p=0.03)が、この傾向は、HTLV-Iウイルス量2%以下のHAM群で強く見られ(χ^2=4.18、Odds ratio 2.495%C.I. 1.02-5.67、p=0.04)、2%以上群では認められなかった。HLA-A^*02は、HAM群でキャリア群より有意に頻度が低く(χ^2=17.12、Odds ratio O.4495%C.I. 0.29-0.65、p=3x10^<-5>)、これはHTLV-Iウイルス量2%以下群で顕著であった(χ^2=6.73、Odds ratio O.39 95%C.I. 0.19-0.81、p=0.008)。2%以上群ではこの関係は認められなかった。
非線形有限要素法による粘弾性体の減衰マトリックスの定式化とプログラム開発

非線形有限要素法による粘弾性体の減衰マトリックスの定式化とプログラム開発を目指して2年間研究を行った。初年度は粘弾性材料の線形特性と非線形特性をそれぞれ明らかにする実験である。線形実験から粘弾性体の周波数依存性を明らかにして分数階微分モデルを確立した。非線形実験では周波数およびひずみ依存性を明らかにして、減衰効果を周波数およびひずみ依存性の効果に対して求めた。2年目では、ほぼ確立していた非線形有限要素運動方程式の定式化と減衰マトリックスの導出を見直し、運動方程式の定式化と非線形減衰マトリックスの導出を完成した。これと平行して分数階微分方程式の高性能数値積分アルゴリズムを開発して、有限要素運動方程式に使用する準備をした。以上を基に非線形有限要素解析の数値計算アルゴリズムを作成し、プログラミングを行った。理論検討に予想以上の時間を要し、プログラムの作成は最近であり、現在数値解析中である。したがって数値解析例を本報告に含めることはできなかった。しかし非線形有限要素運動方程式の定式化と非線形減衰マトリックスを導出したことは大きな成果である。これは防振器の設計に大いに役立つ。理論的にも実際的にも、今後、さらに非線形減衰マトリックスの性質を明らかにしていくことが大切である。高分子材料の粘弾性挙動を分数階微分則を用いて記述する方法を材料が大きな動的な変形を受ける非線形特性下で調査することが目的であり、その最も重要な特性の一つが減衰マトリックスの定式化である。粘弾性材料は高周波、高応力下で大きな減衰能を有する。粘弾性材料から成る製品や構造体の減衰特性を明らかにするには非線形有限要素法の定式化が重要で、本研究ではその定式化を行なった。粘弾性材料の構成方程式をFractional Voigtモデルで記述できる場合に、これまで粘弾性体の非線形問題の定式化に対して確立されている方法を拡張して、非線形有限要素法の新たな定式化を行い、非線形減衰マトリックスも併せて定式化した。次にこの解析に重要な数値積分法の開発を行ない論文として日本機械学会に投稿した(研究成果に示す3編の論文)。これらの論文はいずれも非線形分数階微分方程式の応答解を求めるための数値積分法の開発であるが、第3番目の論文に示すように、これまでにない、まったく新しい着想の基にベキ時間を導入した数値積分法を開発した。これは今後、多くの人達に利用されていく可能性を秘めたユニークな効率の良い解法である。粘弾性の動的挙動を研究するFractional Dynamics(フラクショナル動力学)の情報交流のために「Fractional Differentiationとその応用に関する研究会」を2006年8月17日と18日の2日間、いわき明星大学で行なった。これには海外から1名、国内から10名の研究者が参加し、有意義な情報交流が図れた。
腎糸球体荒廃過程での成長因子・細胞外マトリックスの解析

1.FGF2と糸球体上皮細胞障害糸球体上皮細胞が障害された後、Bowman嚢上皮細胞の増殖反応が観察され癒着病変が形成される。この病的反応にFGF2が関与することを明らかにし、糸球体上皮細胞をPuromycin(PAN)にて障害後FGF2を投与により蛋白尿の増加、糸球体上皮細胞障害の増強、Bowman嚢上皮細胞の増殖が観察され、中和抗体投与により蛋白尿の減少、癒着病変形成の抑制が観察された。2.Dominant Negative(DN)FGF受容体発現によるメサンギウム細胞増殖の抑制培養メサンギウム細胞増殖は、FGF2添加により増殖が観察される。FGF受容体1、2のKinase domainを取り除いたcDNAを作成し、培養メサンギウム細胞に発現させた。その発現をRT-PCRで確認した後、FGF2添加による増殖作用への影響を観察した。DNFGF受容体では増殖作用の抑制が観察された。3.半月体形成とFGF2の役割抗GBM抗体腎炎モデルにおいて、半月体形成細胞や、その周囲細胞の(Bowman嚢周囲)に、FGF2やその受容体のmRNAの発現が観察された。主に発現している細胞は、αSmooth mscule actin陽性の細胞であった。4.糸球体上皮細胞障害とWT1蛋白の関連正常糸球体上皮細胞は、核内にWT1蛋白の発現が観察される。糸球体上皮細胞をPuromycin(PAN)にて障害すると、多核上皮細胞が観察され、その細胞ではWT1蛋白の発現の減少が観察された。この背景には、WT1蛋白の細胞周期調節への関与を示唆している。5.糸球体管外病変とOsteopontin(OP)の発現半月体形成腎炎モデル、巣状糸球体硬化モデル、メサンギウム細胞増殖腎炎モデルにおいて、管外病変部に接着蛋白OSmRNAが観察され、その周辺部にマクロファージや単球の浸潤が観察され、OSの糸球体荒廃過程細胞浸潤への関与が示唆された。
好酸球特異的な分子群の網羅的解析研究

好酸球数は臨床的にアレルギー性炎症の最も良い指標とされているが、好酸球のアレルギー病態における役割については不明な点が多く残されている。私達はマイクロアレイを用いて好酸球特異的な機能の網羅的な探索を試みた。その結果、末梢血から純化した好酸球をin vitroで各種の刺激を加えたところ、定常状態の他の血液細胞には発現していない遺伝子群が見いだされた。それらの中にはAREGやCCL23などの他の細胞の活性化や遊走を惹起する因子が含まれていた。以上の結果から、好酸球は効果細胞としての脱顆粒などによる直接的な作用だけでなく、制御細胞としてもアレルギー性炎症反応に関与する可能性が示唆された。初年度である本年度は培養の至適濃度およびRNA回収の至適時間を検索するための予備実験を行い、その後、活性化好酸球の網羅的な遺伝子発現解析(Microarray解析)の本実験を行った。1.好酸球は活性化に伴い細胞毒性の強い顆粒蛋白を放出するため、脱顆粒に伴い細胞死が誘導される。また、好酸球顆粒蛋白自体に強いRNAse活性が存在するため、短時間の刺激では活性化による遺伝子発現誘導が不十分となり、一方長時間の刺激では細胞死やRNA収量の低下が認められる。これらのことから、好酸球を活性化する刺激としてGM-CSF、IL-5、IFN-γ、secretory IgA、などの刺激を行いその後の生存率とRNAの収量などから刺激6時間後にTotal RNAを回収することとし、また刺激の指摘条件を確定した。2.複数のドナーから400ml以下の採血を行い、抗CD16抗体結合immunomagnetic beadsによって99%の純度で好酸球を単離し、活性化後に好酸球の網羅的な遺伝子発現解析(Microarray解析)の本実験を行った。3.その結果をClustering解析などによって候補遺伝子群の絞り込みを行い、刺激によって好酸球に発現誘導され、かつ他の血球細胞に発現していない分子群を抽出した。4.これらの分子群の遺伝子情報やOntology情報を元に機能的にアレルギー性炎症病態に関与していることが推察される分子として、まずAmphiregulin(AREG)に着目し、各種サイトカインの刺激後に誘導されるAREGのmRNA発現を測定し、上清中の蛋白をELISAで定量した。その結果、GM-CSF刺激によって好酸球が有意にAmphiregulinを産生放出することが明らかとなった。初年度である昨年度は、予備実験での至適濃度や至適時間の検索後、活性化好酸球の網羅的な遺伝子発現解析(Microarray解析)の本実験を行い、刺激によって好酸球に発現誘導され、かつ他の血球細胞に発現していない分子群を抽出した。また、そうした好酸球活性化分子の中から好酸球特異的に発現しており、かつ機能的にアレルギー性炎症病態に関与していることが推察される分子として、Amphiregulin(AREG)に着目し、詳細な解析を行った。その結果、GM-CSF刺激によって好酸球が有意にAREGを産生放出することが明らかとなった。また、この好酸球活性化分子の中から好酸球特異的に発現しており、かつ機能的にアレルギー性炎症病態に関与していることが推察される分子として、CCL23に着目し詳細な検討を行った。その結果、好酸球をGM-CSF、IL-5で活性化することによってCCL23蛋白が培養上清中に産生放出されることが明らかとなった。最終年度である平成22年度は上記分子群の詳細な検討を更に進める予定である。好酸球数はアレルギー性炎症の最も良い指標とされているが、好酸球のアレルギー病態における役割については不明な点が多く残されている。私達はMicroarrayを用いて好酸球特異的な機能の網羅的な探索を試みた。その結果、軽症のアレルギー患者末梢血から純化した好酸球を100ng/ml IFN-γ、10ng/ml IL-5もしくは固相化した100μg/ml secretory IgA (sIgA)刺激6時間後に、vehicle刺激と比較してそれぞれ839、197および117遺伝子の発現が2倍以上増強した。それらにはなどが含まれていた。これらの遺伝子のうち、49、111および8遺伝子は他の血液細胞にはconstitutiveには発現していない遺伝子であった。特にアレルギー性炎症病態に好酸球特異的に関与すると考えられるAREG、CCL23に関してはすでに詳細な分泌制御を検討し、論文化した。M-CSFについては、現在、臨床検体における発現上昇を確認している。
疎水性物質との相互作用に関わる環境汚染物質分解菌表層分子機構の解明とその応用

昨年度までの成果で、トルエン分解細菌Acinetobacter sp.Tol 5株は、アンカーというこれまでに報告例のない細胞外付属器によって、固体表面につながっていることが明らかになった。本年度は、Tol 5株の固体付着メカニズムをさらに詳細に検討した。燐タングステン酸によりネガティブ染色した細胞をTEMで観察したところ、Tol 5株はアンカー以外にも無数の付属器を周毛状に有していることが明らかと成った。TEM像の統計処理の結果、アンカーとピリの長さはそれぞれ378nm、286nm、太さはそれぞれ37nm、10nmであり、両者の形態上の相違は統計的に有意なものであった。一方、表面に付着している細胞の立体像を観察するために、我々はこれまでFE-SEMを用い、その結果アンカーの発見に至ったわけであるが、前処理、特に脱水の段階で生じ得るアーキファクトの可能性を排除することは困難であった。そこで今回は、前処理操作が無用の環境型-FESEMによる観察を行った。低真空下で含水の生体試料を観察するE-SEMはこれまでも報告があったが、解像度が低く、細菌細胞について満足のいく観察像を示したものは存在しなかった。我々は、E-SEMとFE-SEMの技術を融合し、また二次電子像の検出システムも刷新された新型のVP-FESEMを、初めて細菌細胞の表層観察に適用し、生のままの立体像を得ることに成功した。その結果、ピリは前処理の過程で形態が変化しているが、アンカーの長い直線構造と先端で表面に付着している様子は、本来の形態であることを立証することができた。さらに、Tol 5の野生株と付着性低下変異株T1について付着性のイオン強度依存を調べた結果、T1は、細菌細胞の付着について従来より提唱されているDLVO理論に従うが、野生株は従わず、新たなメカニズムで表面付着を達成することが明らかとなった。Acinetobacter genospecies Tol5株の付着メカニズムを明らかにするために、トランスポゾン挿入法による変異株の取得を行った。その結果得られた7種の変異株のうち、付着性をほとんど完全に失ったT1株と、部分的に失ったT6株について、検討を進めた。各株がポリウレタン表面に付着した様子をSEMで観察したところ、野生株は細胞が密にかつ多層になって付着しているのに対し、T1株は単一の細胞が非常にまばらに付着していた。また、T6株は、単層または小さな細胞凝集体として付着していた。以上より、Tol5株の高い付着性は、固体表面に付着した細胞にさらに別の細胞が次々と付着していく共付着によるものであることが示された。ポリウレタン表面への付着の様子を、FE-SEMにより詳細に観察した結果、野生株はアンカー状の細胞付属器によって、固体表面上につながっていることが明らかとなった。このアンカーは枝分かれせず、固体表面に向かって真っ直ぐに伸びており、その先端で表面と相互作用していた。アンカーは菌体と固体表面だけでなく、菌体細胞同士の長距離結合にも関与していた。また、密な凝集体上では、アンカーとは形態上異なる付属器が、比較的大量に観察された。これらは、非直線型であり、枝分かれや屈曲した形状をしていた。アンカーは概ね500nm以上であるのに対し、非直線型付属器は300nm程度であった。このような細胞表層の付属器はT1株では欠損していたことから、これらが、Tol5株の固体付着には必要であることが明らかとなった。また、T6株細胞表面には、付属器が観察されたが、野生株のアンカーとは形態が異なっており、むしろそれらは、屈曲タイプの付属器に類似していた。固体表面との相互作用は付属器先端ではなく、付属器全体に及んでいた。したがって、T6株は野生株のように離れた距離から表面に固定されるのは不可能であると思われる。野生株をトリプシンで処理したところ、付属器が消化され、自己凝集体が分離したことより、付属器は蛋白質を主成分とするピリに近いものであることが判明した。

その結果、ピリは前処理の過程で形態が変化しているが、アンカーの長い直線構造と先端で表面に付着している様子は、本来の形態であることを立証することができた。さらに、Tol 5の野生株と付着性低下変異株T1について付着性のイオン強度依存を調べた結果、T1は、細菌細胞の付着について従来より提唱されているDLVO理論に従うが、野生株は従わず、新たなメカニズムで表面付着を達成することが明らかとなった。
オートファジー始動複合体の作動状態の活写

オートファジーの進行に必要な多数のAtgタンパク質群は,飢餓条件下PASに局在し,分解対象を包む膜である隔離膜の形成に働く.Atg1,Atg13, Atg17, Atg29, Atg31からなるタンパク質複合体であるAtg1複合体は,数十コピーからなる高次の多量体を形成することでPASの足場を形成し,オートファジーの始動に働くと考えられているが,その構築基盤は未だ不明である.本研究では,実際にPASの中核として機能する状態のAtg1複合体の動的構造を明らかにすることで,PASの実体および形成メカニズムを明らかにする.近年,液-液相分離という原理で形成される膜のないオルガネラ(membraneless organelles)が注目を集めている.これら膜のないオルガネラには,核酸や天然変性領域を持つタンパク質が多く含まれる.我々はPASの性質や構成因子の分子間相互作用様式が,液-液相分離を介した膜のないオルガネラに酷似していることを見出した.そこで本年度は光褪色後蛍光回復法や蛍光相関分光法などの定量的な解析により、PASが細胞質との間でAtg因子を活発にやり取りしていること,PAS内のAtg因子は細胞質内と同等の高い運動性を保持していることを示した.さらにPASが形成される過程においてAtg1複合体液滴同士の融合やオストヴァルト熟成が見られることを示し,PASが液-液相分離により形成された液滴であることを証明した.また,PASの中核を担うAtg1複合体について,試験管内で液-液相分離することを示し,Atg13が相分離に必須の役割を持つことを示した.高速AFM像と蛍光顕微鏡像を同時観察可能な装置を用いて、液-液相分離状態のAtg13-Atg17-Atg29-Atg31複合体の微細構造観察を行ない,その規則性のない動的内部構造を明らかにした.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。オートファジーの進行には多数のAtgタンパク質群が必要だが,それらの殆どは飢餓条件下,PAS(pre-autophagosomal structure)に局在し,分解対象を包む膜である隔離膜の形成に働く.Atg1,Atg13, Atg17, Atg29, Atg31からなるタンパク質複合体であるAtg1複合体は,数十コピーからなる高次の多量体を形成することでPASの足場を形成し,オートファジーの始動に働くと考えられているが,その構築基盤は未だ不明である.本研究では,実際にPASの中核として機能する状態のAtg1複合体の動的構造を明らかにすることで,PASの実体および形成メカニズムを明らかにする.Atg1複合体の構成因子は天然変性領域を多く含み,さらに高次多量体を形成することから,従来型の構造生物学の枠を超え,高速AFMの手法を最大限活用する.本年度はAtg1複合体を構成する個々のタンパク質について,高速AFM像を取得した.まずAtg17の立体構造については,Atg17-Atg29-Atg31複合体,Atg17-Atg31(Atg17との結合領域のみ),Atg17単独の3種類の高速AFM像を高精度で取得した.Atg29の天然変性領域がAtg17と弱い相互作用をすることによって,Atg17-Atg29-Atg31複合体の特徴的なS字構造が維持されていることを明らかにした.またAtg1の立体構造については,その自己リン酸化によって,天然変性領域中に微小な構造が出現することを明らかにした.さらに,高速AFMによって推定した微小な構造が出現する領域について,NMRを用いて構造変化を検出することを試みたが,これまでのところ立体構造の誘起を検出できていない.引き続き実験条件の検討を続ける.上記の通り,本年度はAtg1複合体を構成するタンパク質の,個々の高速AFM像の取得を行った.測定条件の検討を繰り返すことにより,以前に取得した像よりも精度の高い像が得られ,X線結晶構造解析では知ることのできない天然変性領域の情報を得ることに成功している.特に,Atg29の天然変性領域に関する情報や,Atg1の天然変性領域内微小構造の情報は,高速AFMの長所を最大限に生かした情報であり,今後のin vivo, in vitroでの実験で,その重要性を検討していきたい.オートファジーの進行に必要な多数のAtgタンパク質群は,飢餓条件下PASに局在し,分解対象を包む膜である隔離膜の形成に働く.Atg1,Atg13, Atg17, Atg29, Atg31からなるタンパク質複合体であるAtg1複合体は,数十コピーからなる高次の多量体を形成することでPASの足場を形成し,オートファジーの始動に働くと考えられているが,その構築基盤は未だ不明である.本研究では,実際にPASの中核として機能する状態のAtg1複合体の動的構造を明らかにすることで,PASの実体および形成メカニズムを明らかにする.近年,液-液相分離という原理で形成される膜のないオルガネラ(membraneless organelles)が注目を集めている.これら膜のないオルガネラには,核酸や天然変性領域を持つタンパク質が多く含まれる.我々はPASの性質や構成因子の分子間相互作用様式が,液-液相分離を介した膜のないオルガネラに酷似していることを見出した.