hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＮＬＲＰ３インフラマゾーム活性制御機構におけるミトコンドリア動態の意義

また、ミトコンドリア分裂因子Drp1を阻害した際、ATP刺激後のNLRP3インフラマゾーム活性が亢進し、インフルエンザウイルス感染後のそれが低下する理由についても理解が進んだと考えている。一方、ニゲリシン刺激では、ミトコンドリア形態制御因子OPA1がプロセシングされるという知見を得たものの、そのNLRP3インフラマゾームとの関連性は不明で、Drp1阻害によってNLRP3インフラマゾーム活性が低下する理由と併せて今後の課題と考える。また、NLRP3インフラマゾームの活性化機構においてその重要性が示唆されている「NLRP3のミトコンドリアへの移行」や「ミトコンドリアゲノムDNAの細胞質への放出」といった現象も解析する計画であったが、当該年度では実験系の確立に留まっている。本研究は、ミトコンドリアダイナミクスに焦点を当てた解析を出発点に、「ミトコンドリアを介したNLRP3インフラマゾーム活性制御機構」の解明を目指して進めてきた。昨年度までに、NLRP3インフラマゾーム活性制御に対するミトコンドリアの寄与度が刺激の種類によって異なる可能性を見出していた。当該年度は、ミトコンドリア分裂因子Drp1やミトコンドリア由来活性酸素種(mtROS)といったミトコンドリア関連因子の役割を刺激ごとにさらに明確にすべく、詳細な解析を実施した。その結果、細胞外ATP刺激がmtROSの産生を誘導し、mtROS並びにミトコンドリア膜電位に依存してインフラマゾームを活性化する一方、ニゲリシン刺激やRNAウイルス感染はmtROSやミトコンドリア膜電位に依存することなくインフラマゾームを活性化することが立証された。また、一部の先行研究では損傷ミトコンドリアの蓄積がNLRP3の活性化に重要と示唆されているが、本研究における解析では、細胞外ATP及びニゲリシン刺激後の損傷ミトコンドリアの蓄積はむしろ活性化したNLRP3により惹起されていた。さらに、ミトコンドリアの分裂は、細胞外ATP刺激後のインフラマゾーム形成をmtROSの抑制を介して負に制御する一方、詳細な分子機構は未解明なものの、ニゲリシン刺激後のインフラマゾーム形成を正に制御することが示唆された。ミトコンドリアダイナミクスに着目して開始した本研究は、「NLRP3インフラマゾーム活性制御機構におけるミトコンドリアの役割が刺激の性質により異なる」ことを明確に示し、ミトコンドリアの重要性が既成事実化されつつある当該分野に一石を投じるとともに、その発展に貢献するものと考えられる。ミトコンドリアの形態変化がNLRP3インフラマゾームの活性化あるいは活性制御に寄与することを強く示唆し、刺激の種類によってNLRP3インフラマゾームの活性化経路や活性制御経路が異なる可能性を見出すことができた。また、研究を進める中で、マクロファージにて特定のタンパク質の発現を一過的に抑制する系を確立したが、これは本課題研究を推進していく上で強力なツールになることが期待される。新たな知見と共に、今後の研究を進展させていくための基盤を得ることができたものと考えている。
ヒト関節疾患と性ホルモン受容体遺伝子多型

我々は変形性関節症や慢性関節リウマチなどの関節疾患が女性に多いことから,その病態における性ホルモンの関与に注目した.そして性ホルモン受容体遺伝子など性ホルモンに関連する遺伝子の多型が疾患の発症や重症度に関与しているのではないかという仮説を立て,変形性関節症や慢性関節リウマチ患者の遺伝子解析を行い,以下の結果を得た.変形性関節症のサブタイプである全身性骨関節症について,エストロジェン受容体遺伝子多型が遺伝子マーカーとなることを報告した(J Rheumatol,1998).同時に解析したビタミンD受容体遺伝子多型は変形性関節症とは関連しなかった(Rheumatology,2000).慢性関節リウマチ患者では女性で発症年齢とエストロジェン受容体遺伝子多型との間に関連があること(Ann Rheum Dis,1999),男性患者ではアンドロジェン受容体の遺伝子多型(CAG反復)が関連していること(Ann Rheum Dis,2000)を見い出した.また男性強直性脊椎炎患者でもアンドロジェン受容体遺伝子多型(CAG反復)が関与していた(Rheumatology,2000).さらに性ホルモンの合成酵素であるCYP17の遺伝子多型も女性慢性関節リウマチ患者の発症と関連していた(Clin Exp Rheumatol,1999).一方,ヒト関節軟骨細胞にエストロジェン受容体αおよびβの遺伝子が発現しており,これらの発現に性差があることを報告した(Osteoarthritis Cart 1999).慢性関節リウマチと性ホルモン関連遺伝子多型1)エストロゲン受容体遺伝子エストロゲン受容体遺伝子多型のPxハプロタイプが女性慢性関節リウマチ患者の発症年齢に関連していることを明らかにした。(文献)2)アンドロゲン受容体遺伝子アンドロゲン受容体遺伝子のCAGマイクロサテライと反復数を調べた結果、CAG反復数が少ないこと、つまりtransactivationの機能が高いことが若年で発症する一部の男性慢性関節リウマチ患者に有意に関連していることを明らかにした。(投稿中)3)チトクロームP450c17α遺伝子チトクロームP450c17α遺伝子多型は血清性ホルモン濃度と関連することが報告されているが、遺伝子型A2/-は女性の老年発症の慢性関節リウマチに抑制的に働くことを明らかにした。(投稿中)変形性関節症と性ホルモン関連遺伝子多型1)チトクロームP450c17α遺伝子チトクロームP450c17α遺伝子型は変形性股関節症を合併した全身性骨関節症に関連していた。これは全身性骨関節症が血清ホルモン濃度に関連してさらにサブタイプに分類される可能性を示した。(投稿中)ヒト関節軟骨におけるエストロゲン受容体遺伝子の発現ヒト関節軟骨細胞におけるエストロゲン受容体αおよびエストロゲン受容体βの2種類の遺伝子発現を初めて明らかにした。(投稿中)我々は変形性関節症や慢性関節リウマチなどの関節疾患が女性に多いことから,その病態における性ホルモンの関与に注目した.そして性ホルモン受容体遺伝子など性ホルモンに関連する遺伝子の多型が疾患の発症や重症度に関与しているのではないかという仮説を立て,変形性関節症や慢性関節リウマチ患者の遺伝子解析を行い,以下の結果を得た.変形性関節症のサブタイプである全身性骨関節症について,エストロジェン受容体遺伝子多型が遺伝子マーカーとなることを報告した(J Rheumatol,1998).同時に解析したビタミンD受容体遺伝子多型は変形性関節症とは関連しなかった(Rheumatology,2000).慢性関節リウマチ患者では女性で発症年齢とエストロジェン受容体遺伝子多型との間に関連があること(Ann Rheum Dis,1999),男性患者ではアンドロジェン受容体の遺伝子多型(CAG反復)が関連していること(Ann Rheum Dis,2000)を見い出した.また男性強直性脊椎炎患者でもアンドロジェン受容体遺伝子多型(CAG反復)が関与していた(Rheumatology,2000).さらに性ホルモンの合成酵素であるCYP17の遺伝子多型も女性慢性関節リウマチ患者の発症と関連していた(Clin Exp Rheumatol,1999).一方,ヒト関節軟骨細胞にエストロジェン受容体αおよびβの遺伝子が発現しており,これらの発現に性差があることを報告した(Osteoarthritis Cart 1999).1)慢性関節リウマチと性ホルモン関連遺伝子慢性関節リウマチ(RA)における遺伝要因および性ホルモンの関与より、RA患者の性ホルモン関連遺伝子の遺伝子多型について調べた。エストロゲン受容体遺伝子型は女性RA患者の発症年齢と関連していた(Ushiyama,1999)。アンドロゲン受容体遺伝子のCAG反復はそのtransactivationの機能と関連しているが、この反復数は若年で発症する男性RA患者で少なかった(Kawasaki,1999)。また、エストロゲンやアンドロゲンの合成酵素であるCYP17遺伝子には上流に遺伝子多型があり、転写機能を介して最終的に血清性ホルモン濃度に影響を与える。CYP17遺伝子のA2アレルは老年発症のRAを抑制した(Huang,1999)。2)強直性脊椎炎とアンドロゲン受容体遺伝子のCAG反復強直性脊椎炎には性差があるが、男性強直性脊椎炎患者においてアンドロゲン受容体遺伝子のCAG反復数は有意に少なかった(Mori,in press)。3)変形性関節症における性ホルモンの関与と遺伝要因

変形性関節症のサブタイブである全身性骨関節症にエストロゲン受容体遺伝子多型が関与することは既に明らかにしているが(Ushiyama,1998)、今回ヒト関節軟骨細胞にエストロゲン受容体αとβの両者が発現していること、すなわちエストロゲンが関節軟骨細胞に直接作用することを明らかにした(Ushiyama,1999)。一方、海外ではビタミンD受容体遺伝子多型が変形性膝関節症に関連していると報告されている。これについて日本人で追試を行なった。その結果、日本人においては手指、股関節、膝関節あるいは多関節羅患の変形性関節症とビタミンD受容体遺伝子多型との関連は認めなかった(Huang,in press)。我々は変形性関節症や慢性関節リウマチなどの関節疾患が女性に多いことから,その病態における性ホルモンの関与に注目した.そして性ホルモン受容体遺伝子など性ホルモンに関連する遺伝子の多型が疾患の発症や重症度に関与しているのではないかという仮説を立て,変形性関節症や慢性関節リウマチ患者の遺伝子解析を行い,以下の結果を得た.変形性関節症のサブタイプである全身性骨関節症について,エストロジェン受容体遺伝子多型が遺伝子マーカーとなることを報告した(J Rheumatol,1998).同時に解析したビタミンD受容体遺伝子多型は変形性関節症とは関連しなかった(Rheumatology,2000).慢性関節リウマチ患者では女性で発症年齢とエストロジェン受容体遺伝子多型との間に関連があること(Ann Rheum Dis,1999),男性患者ではアンドロジェン受容体の遺伝子多型(CAG反復)が関連していること(Ann Rheum Dis,2000)を見い出した.また男性強直性脊椎炎患者でもアンドロジェン受容体遺伝子多型(CAG反復)が関与していた(Rheumatology,2000).さらに性ホルモンの合成酵素であるCYP17の遺伝子多型も女性慢性関節リウマチ患者の発症と関連していた(Clin Exp Rheumatol,1999).一方,ヒト関節軟骨細胞にエストロジェン受容体αおよびβの遺伝子が発現しており,これらの発現に性差があることを報告した(Osteoarthritis Cart 1999).
把握運動における道具使用の有無と課題難易度の観点からみた利き手形成機序の解明

本研究では、なぜ、利き手が存在するのか?なぜ、ヒトには右利きが多いのか?といった疑問の解明を目指しています。1道具使用の有無(箸vs指)、2使い慣れた道具とそうでない道具(箸vs医療用止血鉗子)、3正確性を要する課題とそうでない課題(ターゲット小vsターゲット大)の異なる条件で、4右利き者と左利き者を対象に把握運動課題を実施します。そして、手指の3次元動作解析と把握物体に対して発揮される3軸方向の作用力の分析、さらには筋電図解析を行い、異なる条件下で手の左右差がどのように変化するのかを調べます。
グローバリゼーション下のディアスポラー在日インド人のネットワークとコミュニティー

本研究の目的は、エスニック集団と地域との相互関係を、グローバリゼーション下の在日インド人社会を対象に考察するものである。在日インド人ディアスポラに焦点を合わせ、1990年以降の経済・文化のグローバル化のもと、越境するネットワークとコミュニティとの再帰的関係をみた。特に対象としたのは、阪神地区(特に貿易港・神戸)の在日インド人社会(開国以降のオールドカマー)と「世界都市・東京」のインド人社会(増加しているIT労働者を中心としたニューカマー)である。これらの作業を通じて、エスニック集団と場所との生産・再生産の過程を分析した。(1)エスニック集団・ディアスポラ・グローバリゼーションの関係についての理論構築エスニツクな集団が彼らの場所を生産し、その場所が彼らをエスニックなアイデンティティをもつ存在としていかに生産するのか、その再帰的関係を都市論・構造化理論・現象学のアプローチを援用しながら論点を整理し、人文地理学に新たな視角を提起した。(2)ミロスケールにおける基礎統計の収集・個人史の聞き取り分析--在日インド人ディアスポラの動向在日インド人に関する統計や情報をもとにローカルレベルにおけるコミュニティとの関係を考察した。1)ミクロスケールにおける在日インド人の居住地・就業地分布,就業構造及びその変化に関して、インド人社会組織などの資料を用いて分析を行う。彼らの集住地区の形成と変化を把握し,セグリゲーションの要因を労働市場と住宅市場,さらにサービス供給(消費財・教育・宗教)・社会組織の点から考察した。2)東京地区および阪神地区の在日インド人の社会組織への聞き取り調査により、その形成のメカニズムとその変化を解明する。また在日インド人の個人史の聞き取り調査により、ネットワークの空間的広がりとアイデンティティの再生産との関煙を分析した。本研究の目的は、人間(ここではエスニック集団)と地域との相互関係を、グローバリゼーション下の在日インド人社会(在日インド人ディアスポラ)を対象に考察するものである。在日インド人ディアスポラに焦点を合わせることにより、経済・文化のグローバル化のもと、越境するネットワークとコミュニティとの再帰的関係をみる。特に対象とするのは、阪神地区の在日インド人社会(開国以降のオールドカマー)と「世界都市・東京」周辺のインド人社会(下請け工場の単純労働者や近年増加しているIT労働者を中心としたニューカマー)である。これらの作業を通じて、エスニック集団と地域との生産・再生産の過程を明らかにしたい考えている。そこで平成13年度に行った研究の成果は、以下の通りである。(1)南埜「インド系移民統計に関する一考察」(兵庫教育大学研究紀要、平成14年3月)の論文発表を行った。この論文では、統計分析の基礎資料である移民統計の基準・移民の定義について考察を行った。(2)澤「在日インド人と神戸」(兵庫地理学協会、平成13年5月、神戸市立外国語大学)の口頭発表を行った。(3)澤・南埜「在日インド人の「場所」とアイデンティティ-エスニシティに関する方法論の地平-」(日本地理学会、平成14年3月、日本大学)の口頭発表を行った。これら2つの口頭発表では、エスニックアイデンティティの形成と再生産において、「場所」の果たす役割が不可欠であることを実証的に示した。本研究の目的は、エスニック集団と地域との相互関係を、グローバリゼーション下の在日インド人社会(在日インド人ディアスポラ)を対象に考察するものである。在日インド人ディアスポラに焦点を合わせることにより、1990年以降の経済・文化のグローバル化のもと、越境するネットワークとコミュニティーとの再帰的関係をみた。

特に対象とするのは、阪神地区(特に貿易港・神戸)の在日インド人社会(開国以降のオールドカマー)と「世界都市・東京」周辺のインド人社会(下請け工場の単純労働者や近年増加しているIT労働者を中心としたニューカマー)である。これらの作業を通じて、エスニック集団と場所との生産・再生産の過程を分析している。平成14年度は、特にグローバリゼーションと場所との関係を理論的に整理するとともに、場所の生成に関するフィールドワークを行った。そこで平成14年度に行った研究の成果は、以下の通りである。(1)グローバリゼーション下の在日インド人社会--エスニック集団と「場所」との再帰的関係、秋田茂・水島司編『現代南アジア第6巻世界システムとネットワーク』東京大学出版会、pp.347-367、2003年3月出版.ここでは、同じ在日インド人であっても、「貿易港・神戸」のインド人社会と「世界都市・東京」周辺のインド人社会では、コミュニティーのあり方が大きく異なり、これはそこでの場所の生成と大きく関わっていることが要因として考えられることを示した。本研究の目的は、エスニック集団と地域との相互関係を、グローバリゼーション下の在日インド人社会を対象に考察するものである。在日インド人ディアスポラに焦点を合わせ、1990年以降の経済・文化のグローバル化のもと、越境するネットワークとコミュニティとの再帰的関係をみた。特に対象としたのは、阪神地区(特に貿易港・神戸)の在日インド人社会(開国以降のオールドカマー)と「世界都市・東京」のインド人社会(増加しているIT労働者を中心としたニューカマー)である。これらの作業を通じて、エスニック集団と場所との生産・再生産の過程を分析した。平成15年度は、特に以下の点の調査研究を行った。(1)エスニック集団・ディアスポラ・グローバリゼーションの関係についての理論構築エスニックな集団が彼らの場所を生産し、その場所が彼らをエスニックなアイデンティティをもつ存在としていかに生産するのか、その再帰的関係を都市論・構造化理論・現象学のアプローチを援用しながら論点を整理し、人文地理学に新たな視角を提起した。(2)ミロスケールにおける基礎統計の収集・個人史の聞き取り分析-在日インド人ディアスポラの動向在日インド人に関する統計や情報をもとに、ローカルレベルにおけるコミュニティとの関係を考察した。1)ミクロスケールにおける在日インド人の居住地・就業地分布,就業構造及びその変化に関して、インド人社会組織などの資料を用いて分析を行う。彼らの集住地区の形成と変化を把握し,セグリゲーションの要因を労働市場と住宅市場,さらにサービス供給(消費財・教育・宗教)・社会組織の点から考察した。2)東京地区および阪神地区の在日インド人の社会組織への聞き取り調査により、その形成のメカニズムとその変化を解明する。また在日インド人の個人史の聞き取り調査により、ネットワークの空間的広がりとアイデンティティの再生産との関連を分析した。
細径マッキベン型空気圧人工筋肉を用いた前腕欠損児のための動力義手の開発

本研究の目的は,アクチュエータに細径マッキベン型空気圧人工筋肉を用いることで,小型かつ軽量で高い安全性と機能性を有する小児用前腕動力義手を開発することである.そして,欠損児に試作した義手を使ってもらい,日常生活を想定したモデルケースにおいて,動力義手の操作性や耐久性などを総合的に評価し,その結果を踏まえて義手の改良を行う.これらの内容により,提案する義手の有用性を実証し,実用化への基盤を構築する.2018年度は,動力義手の試作と機械的な基本性能を評価した.すなわち,小児用動力義手の手部,手首,前腕を試作し,肘から先を補う前腕動力義手を試作した.5指は,屈曲および伸展動作を可能とし,アクチュエータの駆動により指の屈曲動作を行う.アクチュエータを停止すると,指関節に配置されているゴム部品の弾性力を利用して伸展を行う.前腕部には,アクチュエータおよびマニフォールドを格納した.空圧源には,小型ポンプとディスポーサブルボンベのどちらも用いることができるように構築した.また,アクチュエータへの空圧供給制御は,小型電磁弁にて行い,電磁弁の駆動制御にはマイコンを用いた.そして,筋電情報を動作の入力信号に利用して義手をコントロールする入力インターフェースを試作した.試作した義手に,シリコンゴム製の装飾用グローブを着用して,物体の把持実験を行った.把持する物体は,日常的に把持する可能性があり,かつ大きさや形に差がある物体とし,チョコレート,ボール,ホッチキス,ミニカー,霧吹き,メガネケースとした.実験の結果,複数種類の物体を把持可能であることが明らかとなった.これは,柔軟な関節構造を採用したことにより,形状の異なる物体に適応できるような把持動作が可能となったためであると考えられる.しかしながら,床においた薄い物体や細い物体は把持することが出来なかった.当初の計画では,2018年度の目標は,小児用動力義手の試作と機械的な基本特性評価であった.義手の試作では,指の構造を改善し,様々な物体が把持できることを確認した.そして,筋電システムを構築し,本システムによる駆動を実現した.また,試作した義手を前腕欠損児に使用してもらう機会を設け,義手に関する意見交換を実施した.これは,2019年度前半に予定していた実施内容であり,2018年度の段階で実施できたことにより,さらに改善すべき点が明らかとなった.これらのことから,当初の計画以上に進展していると判断している.2019年度は,2018年度の評価結果に基づき,義手の改良を進め,広島国際大学森永浩介氏(研究分担者)の協力のもと,前腕欠損児の切断部に試作した動力義手を取り付けて,簡易上肢機能評価テストキットSTEFおよびSHAPによる動作評価試験を行う.STEF・SHAPは,各種ブロックのつまみ動作,移動作業により義手の機能を定量的に評価することができる.次に,STEF・SHAPによる動作評価試験の結果を踏まえ,より実用に耐えうるための改良を施す.そして,日常生活を想定したモデルケースにおいて,動力義手の操作性や耐久性などを総合的に評価する.モデルケースとして,コップを掴んで飲む,ボールを掴んで投げる,机に義手をついて起き上がるなどを想定している.本研究の目的は,アクチュエータに細径マッキベン型空気圧人工筋肉を用いることで,小型かつ軽量で高い安全性と機能性を有する小児用前腕動力義手を開発することである.そして,欠損児に試作した義手を使ってもらい,日常生活を想定したモデルケースにおいて,動力義手の操作性や耐久性などを総合的に評価し,その結果を踏まえて義手の改良を行う.これらの内容により,提案する義手の有用性を実証し,実用化への基盤を構築する.2018年度は,動力義手の試作と機械的な基本性能を評価した.すなわち,小児用動力義手の手部,手首,前腕を試作し,肘から先を補う前腕動力義手を試作した.5指は,屈曲および伸展動作を可能とし,アクチュエータの駆動により指の屈曲動作を行う.アクチュエータを停止すると,指関節に配置されているゴム部品の弾性力を利用して伸展を行う.前腕部には,アクチュエータおよびマニフォールドを格納した.空圧源には,小型ポンプとディスポーサブルボンベのどちらも用いることができるように構築した.また,アクチュエータへの空圧供給制御は,小型電磁弁にて行い,電磁弁の駆動制御にはマイコンを用いた.そして,筋電情報を動作の入力信号に利用して義手をコントロールする入力インターフェースを試作した.試作した義手に,シリコンゴム製の装飾用グローブを着用して,物体の把持実験を行った.把持する物体は,日常的に把持する可能性があり,かつ大きさや形に差がある物体とし,チョコレート,ボール,ホッチキス,ミニカー,霧吹き,メガネケースとした.実験の結果,複数種類の物体を把持可能であることが明らかとなった.これは,柔軟な関節構造を採用したことにより,形状の異なる物体に適応できるような把持動作が可能となったためであると考えられる.しかしながら,床においた薄い物体や細い物体は把持することが出来なかった.当初の計画では,2018年度の目標は,小児用動力義手の試作と機械的な基本特性評価であった.義手の試作では,指の構造を改善し,様々な物体が把持できることを確認した.そして,筋電システムを構築し,本システムによる駆動を実現した.また,試作した義手を前腕欠損児に使用してもらう機会を設け,義手に関する意見交換を実施した.

これは,2019年度前半に予定していた実施内容であり,2018年度の段階で実施できたことにより,さらに改善すべき点が明らかとなった.これらのことから,当初の計画以上に進展していると判断している.2019年度は,2018年度の評価結果に基づき,義手の改良を進め,広島国際大学森永浩介氏(研究分担者)の協力のもと,前腕欠損児の切断部に試作した動力義手を取り付けて,簡易上肢機能評価テストキットSTEFおよびSHAPによる動作評価試験を行う.STEF・SHAPは,各種ブロックのつまみ動作,移動作業により義手の機能を定量的に評価することができる.次に,STEF・SHAPによる動作評価試験の結果を踏まえ,より実用に耐えうるための改良を施す.そして,日常生活を想定したモデルケースにおいて,動力義手の操作性や耐久性などを総合的に評価する.モデルケースとして,コップを掴んで飲む,ボールを掴んで投げる,机に義手をついて起き上がるなどを想定している.当初計画では、設備備品として3Dプリンタを計上していたが、科研費以外の予算にて導入できた。このことが、次年度使用額が生じた理由である。2019年度分の予算と合わせて、研究成果発表の旅費および義手改良に伴う消耗品費に使用する予定である。
クラリスロマイシン耐性肺MAC症に対する新たな治療薬の開発

非結核性抗酸菌、特にMycobacterium avium complex (MAC)に属するM. aviumとMycobacterium intracellulareによる肺MAC症患者が本邦で急増しているが、クラリスロマイシン(CAM)以外の治療薬は効果が限定されており、またCAM耐性肺MAC症患者の予後は多剤耐性結核患者のそれに匹敵して悪いことが示されていることから、新たに有効な治療薬を開発することが切望されている。これらのMACに有効な新規薬剤を開発するため、まずMAC臨床分離株の薬剤耐性獲得状況を調べた。4医療機関から合計44菌株のCAM耐性M. aviumの供与を受け、23S rRNA遺伝子上のDomain Vにおける変異の保有状況を調べた。23S rRNA遺伝子ホットスポット領域をPCR増幅し、ダイレクトシークエンシングにより塩基配列を決定すると、22% (10/44)では野生型と変異型の配列が混在していることがその波形から示唆された。このことは、マクロライド耐性集団と感受性集団が臨床試料中に共存していることを示唆している。一方、44検体中9株(20%)では、CAM耐性であるにもかかわらず変異が見られなかったことから、これらの菌株ではホットスポットとは異なる未知の部分に変異が生じている可能性が示唆された。次に、新規合成マクロライド化合物(avermectin誘導体)22種についてCAM高度耐性M. avium 24株に対する抗菌効果を調べるため、MIC測定を行った。4種の化合物においてMICが8μg/ml以下と効果が認められた。これら化合物には構造上の類似性が見られたことから、共通する構造を基に新たな化合物の検討を行っている。M. aviumにおけるCAM耐性機序としては23S rRNA遺伝子上のDomain Vにおける変異が知られている。Domain V上の2058番、あるいは2059番の位置に点突然変異が生ずるとその立体構造に変化が生じ、CAMはリボゾームに結合できなくなり耐性化するが、収集したCAM耐性臨床分離株は、当該領域に変異を持つものと持たないものが混在しており、これは新規薬剤の効果を評価する上で大変都合が良い。これらの菌株にCAM感受性の菌株を加えて、新規合成した様々なマクロライド系薬物・アベルメクチン系薬物に対する感受性をin vitroのMIC測定法を用いて検証しており、多様な臨床株に対する効果が検証できている。さらに、ある程度の抗菌効果が認められる化合物が複数見つかっており、これらの化合物に構造の共通性を見出せることから、今後の改良に関しても期待が持てる。抗菌効果が見られた新規化合物に共通する構造を踏まえ、新たに多数の類似化合物の試験を行う予定である。また既に効果の認められた4種類の化合物に関しては、THP-1細胞を使用した培養細胞系を使用し、これに菌が感染した場合にも有効に作用するかどうかを検討する。培養細胞を用いた感染系においても効果が認められた化合物については、動物実験での有効性を調べ、新規治療薬としての可能性を検討する予定である。また、CAM耐性で23S rRNA遺伝子のDomain Vに変異の見られなかった菌株についてはゲノムシーケンシングにより、耐性の原因となっている因子の解析を行う予定である。研究協力者が所属する臨床施設の肺MAC症患者から分離されたクラリスロマイシン(CAM)耐性とされる抗酸菌51株について、23SリボゾームRNAの塩基配列を決定することにより菌種を同定した結果、46株がMycobacterium aviumであることがわかり、これら46株についてあらためてCAM感受性試験を行った結果、40株が64μg以上のMICを示した。これら46株と、以前から保管している7株について、クラリスロマイシン耐性を引き起こすとされる23SrRNA遺伝子の2058、及び2059番の塩基を調べたところ、少なくとも6株でこの部位に変異が見られないことが分かった。また、変異が検出された株のうち、10株ではそのシークエンス解析での波形から菌株集団が均一ではなく、変異をもつものと持たないものの混合であることがわかり、必ずしも変異をもつ集団が大部分を占めるわけではないことが判明した。一方、CAMに対して高度に耐性を示した1株にこれまでに報告がない2057番の変異が検出された。これらのCAM耐性M. aviumに対して有効な薬剤を見出すため、ソリスロマイシン、14-OHCAM、及び新規に化学合成したマクロライド9種の有効性をin vitro薬剤感受性試験を行って検討した。ソリスロマイシン、14OHCAMではCAM耐性M. aviumに対する効果は認められず、試験した新規合成マクロライド9種のうち、8種では同様に効果が見られなかったが、残りの1種の化合物SPM574が全ての菌株で4μg以下のMICを示し、有効な薬剤であることが判明した。肺MAC症から分離され、臨床現場でCAM耐性とされたM. aviumは、あらためて行った薬剤感受性試験でもCAM耐性であることが確認された。これらの菌株の23SrRNA遺伝子は、変異を持つものと持たないものの両者を含み、それぞれ耐性のメカニズムが異なることが推測されることから、CAM耐性M. aviumに有効な新規薬剤を幅広くスクリーニングするために適していると考えれる。これまでに試験した新規化合物では1種の化合物が少なくともin vitroで有効であることが判明したことから、この化合物の化学構造を基にしてさらなる有効な化合物の探索が可能となると考えられる。

非結核性抗酸菌、特にMycobacterium avium complex (MAC)に属するM. aviumとMycobacterium intracellulareによる肺MAC症患者が本邦で急増しているが、クラリスロマイシン(CAM)以外の治療薬は効果が限定されており、またCAM耐性肺MAC症患者の予後は多剤耐性結核患者のそれに匹敵して悪いことが示されていることから、新たに有効な治療薬を開発することが切望されている。これらのMACに有効な新規薬剤を開発するため、まずMAC臨床分離株の薬剤耐性獲得状況を調べた。4医療機関から合計44菌株のCAM耐性M. aviumの供与を受け、23S rRNA遺伝子上のDomain Vにおける変異の保有状況を調べた。23S rRNA遺伝子ホットスポット領域をPCR増幅し、ダイレクトシークエンシングにより塩基配列を決定すると、22% (10/44)では野生型と変異型の配列が混在していることがその波形から示唆された。このことは、マクロライド耐性集団と感受性集団が臨床試料中に共存していることを示唆している。一方、44検体中9株(20%)では、CAM耐性であるにもかかわらず変異が見られなかったことから、これらの菌株ではホットスポットとは異なる未知の部分に変異が生じている可能性が示唆された。次に、新規合成マクロライド化合物(avermectin誘導体)22種についてCAM高度耐性M. avium 24株に対する抗菌効果を調べるため、MIC測定を行った。4種の化合物においてMICが8μg/ml以下と効果が認められた。これら化合物には構造上の類似性が見られたことから、共通する構造を基に新たな化合物の検討を行っている。M. aviumにおけるCAM耐性機序としては23S rRNA遺伝子上のDomain Vにおける変異が知られている。Domain V上の2058番、あるいは2059番の位置に点突然変異が生ずるとその立体構造に変化が生じ、CAMはリボゾームに結合できなくなり耐性化するが、収集したCAM耐性臨床分離株は、当該領域に変異を持つものと持たないものが混在しており、これは新規薬剤の効果を評価する上で大変都合が良い。これらの菌株にCAM感受性の菌株を加えて、新規合成した様々なマクロライド系薬物・アベルメクチン系薬物に対する感受性をin vitroのMIC測定法を用いて検証しており、多様な臨床株に対する効果が検証できている。さらに、ある程度の抗菌効果が認められる化合物が複数見つかっており、これらの化合物に構造の共通性を見出せることから、今後の改良に関しても期待が持てる。in vitroの感受性試験で効果が見られた化合物SPM574について、マウスを使用した感染実験での効果を測定する。in vitro試験で有効である化合物が必ずしも動物実験で有効とは限らないため、より多くの有効な化合物候補を得るために研究協力者に依頼してさらに新規化合物の合成を行い試験する。より有効な薬剤の開発のために、in vitro薬剤感受性試験で有効性が示された化合物に関して、その作用機序と耐性菌出現頻度の解析を行う。
免疫プロテアソームを標的とする自己免疫疾患治療薬の天然資源からの探索

哺乳類の全ての細胞に存在する構成型プロテアソームに対して、適応免疫において重要な役割を果たしているのが免疫プロテアソームである。そして、免疫プロテアソームに特異的な薬剤は、自己免疫疾患に有効であるため注目を集めている。そこで本研究では自己免疫疾患の治療薬の開発を目指し、免疫プロテアソームに対する特異的な新規阻害物質を天然資源から探索することを計画した。構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害する天然資源抽出物をスクリーニングで選び、阻害物質の精製を行った。新規プロテアソーム阻害物質の発見には成功したが、現在のところ免疫プロテアソームに特異的な阻害物質は得られていない。本研究では、免疫プロテアソームのβ5iサブユニットに対する特異的阻害物質を探索するために、新たにアッセイ系を構築し、薬用海洋資源ライブラリーから新規阻害物質を単離することを目標とした。さらに、これまでに構築したアッセイ系を用いて、E1、E2、E3、脱ユビキチン化酵素及びポリユビキチン化されたp53のリクルートに対する阻害物質を探索し、p53の作用を増強するがん治療薬の開発を目指す。構成型プロテアソームは、以前、ラットの肝臓から調製した。今回、同様の方法を用いて、ラットの脾臓から免疫プロテアソームを調製した。2種類のプロテアソームにおいて、キモトリプシン様活性を評価するため発蛍光性基質を反応させ、天然資源の抽出物をスクリーニングした。今後、構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害した抽出物から阻害物質を単離・構造決定する予定である。一方、p53の作用を増強するがん治療薬の探索のため、引続き、既に確立したアッセイ系(E1、E2、E3、脱ユビキチン化、リクルート過程)を用いて阻害物質の探索を行った。そして、海綿Stylissa massaの抽出物が脱ユビキチン化酵素USP7の作用を阻害したので化合物の精製を行い、spongiacidin Cを天然物として初めてのUSP7阻害物質として単離することができた(Bioorg. Med. Chem. Lett.)。USP7は、がん抑制遺伝子産物p53のプロテアソームによる分解を促進するHdm2(ヒトMdm2)に結合し、自己ユビキチン化したHdm2からユビキチンを除去する働きをする。したがって、USP7に対する阻害物質はp53を安定化させ、がん抑制効果を示すと考えられる。本研究では免疫プロテアソームのβ5iサブユニットに対する特異的阻害物質を探索するために、新たにアッセイ系を構築し薬用海洋資源ライブラリーから新規阻害物質を単離することを目標とした。さらに、これまでに構築したアッセイ系を用いて、E1、E2、E3、脱ユビキチン化酵素USP7に対する阻害物質を探索し、p53の作用を増強するがん治療薬の開発を目ざし研究した。構成型プロテアソームは、ラットの肝臓から調製し用いている。そこで、本研究では同様の方法を用いてラットの脾臓から免疫プロテアソームを調製しスクリーニングした。そして、構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害した抽出物から阻害物質を単離・構造決定した。本研究では免疫プロテアソームのβ5iサブユニットに対する特異的阻害物質を探索するため、新たにアッセイ系を構築し当研究室で保有する薬用海洋資源抽出物のライブラリーから新規阻害物質を単離することを目標とした。さらに、これまでに構築したアッセイ系を用いてE1、E2、E3、脱ユビキチン化酵素USP7に対する阻害物質を探索し、p53の作用を増強するがん治療薬の開発を目指し研究した。構成型プロテアソームはラットの肝臓から調製し用いている。そこで、本研究では同様の方法を用いてラットの脾臓から調製した免疫プロテアソームを用いてスクリーニングし、構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害した抽出物から阻害物質の単離を試みた。当初、免疫プロテアソームに対する特異的阻害物質を単離したと思われたが、精製された免疫プロテアソームを購入し阻害活性を確認したが、特異的ではないことが明らかとなった。そこで現在では、購入した精製免疫プロテアソームを用いて探索を継続している。一方、p53の作用を増強するがん治療薬の探索のため、引続き既に確立したアッセイ系(E1、E2、E3、脱ユビキチン化酵素)を用いて阻害物質の探索を行った。そして平成27年度の研究成果は、4報の原著論文と14件の学会発表により報告した(「13.「研究発表」参照」)。

まだ、免疫プロテアソームに特異的な阻害物質の発見には至っていないが、新規構成型プロテアソーム阻害物質は発見することができたので、今後も、天然資源からの探索を精力的に進めることにより、天然資源から初めてとなる免疫プロテアソーム阻害物質の発見につながると期待している。27年度が最終年度であるため、記入しない。天然物化学構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害した薬用資源から阻害物質を単離・構造決定する。さらに、p53の作用を増強するがん治療薬の探索のため、引続き、既に確立したアッセイ系(E1、E2、E3、脱ユビキチン化酵素)を用いて阻害物質の探索を継続する。当初予定していた免疫プロテアソーム調製とスクリーニングだけでなく、天然物として初めてのUSP7阻害物質として海綿からspongiacidin Cを単離することができたので、当初の計画以上に進展していると判断した。免疫プロテアソームに特異的な阻害物質が発見された際に、構成型プロテアソームに対する阻害との違いを明らかにする研究を予定していたが、特異的阻害物質を発見できなかった。その研究に必要な試薬を購入しなかったので、次年度使用額が生じた。構成型プロテアソームよりも免疫プロテアソームをより強く阻害した抽出物から阻害物質を単離・構造決定する。さらに、p53の作用を増強するがん治療薬の探索のため、引続き、既に確立したアッセイ系(E1、E2、E3、脱ユビキチン化、リクルート過程)を用いて阻害物質の探索を継続する。平成27年度に特異的阻害物質を発見し、阻害機構の違いを研究する試薬を購入する予定である。3月に抗体を注文したが国内在庫がなかったので、納品が4月になることになった。そのため、次年度使用額が生じた。4月に納品になる抗体を用いて、予定の実験を行う。
マス高等教育段階における新しい教育接続の研究-教育スタンダードと大学入試の国際比較分析-

本研究の目的は大衆化高等教育の時代にふさわしい大学進学の在り方を検討することである。高等教育が数少ないエリートのためのものであった時代には大学進学は厳しい選抜の機会であった。だが、今日のように年齢人口の半分が大学・短大に入学していく時代には、多様な高等教育の目標を達成するための新しい高大接続のシステムが求められる。この問題意識にもとづき、日本、アメリカ、イギリス、ドイツ、韓国、タイなどの大学進学事情を中心に調査研究を進めた。とくに、大学大衆化の先進国であるアメリカについては、独自の実験的な試みを進めている複数の州をとりあげ、重点的な調査を行った。これらの調査研究により得られた知見はおよそ下記の4点にまとめられる。1.進学準備のための初等中等教育改革アメリカでは1990年代に国家的な規模で教育スタンダードの導入に踏み切り、進学準備教育の徹底を図った。そのことが地方分権制を旨としてきたアメリカ教育の様相を大きく変えている。イギリスでも1988年にナショナル・カリキュラムの導入を法制化した後、中等教育修了資格の改革にも着手し共通基礎の充実を図っている。2.義務教育から大学までを一貫させるシームレスな学校システムの構築アメリカのオレゴン州では、高校までの教育(K-12)と大学をつなげ、K-16の学習を一貫した体制に変える教育改革を進めている。すべての学校段階を進級によって結ぶ構想である。ただ、この実現のためにはいかに生徒、学生の学習意欲を維持させるかが大きな課題になっている。3.教育評価システムの改革選抜中心の評価から教育中心の評価システムへの転換が進んでいる。パフォーマンス評価と呼ばれる評価方法がアメリカでは最近注目されているが、この方法はできるだけ多元的な評価を用いる方法だが、利用のしかたによってはできる子どもとできない子どもを却って際だたせてしまうという欠点がある。教員の負担も従来よりも遙かに大きい。これらの問題点を含め取り組むべき課題は多い。4.高大のダブル登録制や転学システムを活用した接続システムコミュニティカレッジを仲介とする高校から大学への編入学システムはよく知られている。これもいわゆる選抜入試とは違う高大の接続システムの一種である。アメリカのノースカロライナ州をはじめとするいくつかの州では、従来の編入学に加えて、高校教育とコミュニティカレッジを並行学習させるダブル登録制や、受け入れカリキュラムの充実など新しい試みが進められており、今後の動向が注目される。1.月例研究会での活動月例研究会では、参加者全員が自己の研究テーマを発表し、相互に議論して問題意識を深めるという作業を続けた。第2段階では、高校(後期中等教育)、大学の量的規模、就学該当年齢人口の時系列的な推移を調べ、対象国間で比較できるよう、整理を行った。対象国は、アメリカ、イギリス、ドイツ、フランス、日本、韓国、タイ、バングラディッシュ、オーストラリア等の諸国である。さらに第3の作業として、大学入試に関連する教育法制の調査に着手した、これについては池田のアメリカ研究、木戸(研究協力者)のドイツ研究が進んでいるが、大学入試の理解を深め、問題意識を共有化するうえで、たいへん役に立った。2.外国調査の実施当初、予定していた計画を多少変更し、外国調査を前倒しして実行に移した。

研究分担者の河野はバングラディッシュの教育省へ、尾中はタイの高校調査を実施し、新しい情報、資料の収集に努めた。また、荒井、池田、橋本、木村、藤井、腰越は、今回の研究の主要な対象となるアメリカについて、第1回めの調査を実施した。訪問地はサンフランシスコ市とシアトル市。主な訪問先はスタンフォード大学、サンフランシスコ州立大学、ワシントン州教育庁、ワシントン大学である。1.今年度は平成11年度に調査したアメリカ合衆国の調査資料をもとに、各州の教育スタンダードとその評価法の検討を進め、月例研究会、夏季合宿等を通して知識の共有化を図るとともに、分担者各自の問題意識を先鋭化させた。2.フルブライト記念基金により、6月と11月に訪日したアメリカ合衆国の教育関係者(教師及び教育長等)に対して、インタビュー及びアンケートの調査を実施した。(1)インタビュー:6月、11月の2回にわたって、合計20人の教育関係者(フロリダ州、ワシントン州等10州)に主にパフォーマンス評価に関する質疑を行った。(2)アンケート調査:6月に訪日した200人の教員に対して教育スタンダード、出口試験、パフォーマンス評価に関する調査を実施した。3.米国訪問調査今年度はアメリカ合衆国に訪問地を集中させ、複数のチームにより、カリフォルニア州、オレゴン州、ニューヨーク州、ミシガン州等の大学、教育委員会、高校等を尋ね、高校と大学の新しい接続に関して調査を行った。1.外国調査平成11年度、12年度に引き続き、平成13年9月と平成14年3月にアメリカ調査及ぴ韓国調査を行った。アメリカ調査ではNAEP(全米学力調査)の動向、オレゴン州の再調査、ノースカロライナ州のコミュニティ・カレッジの調査に重点を置き、新しい接続形態の進展を確認した。(1)オレゴン州:教育庁、公立高校、オレゴン大学(2)ワシントンDC、ニューヨーク、プリンストン:教育省、カレッジボード、ETS(3)韓国:大学、高校2.教育制度学会の課題研究当科研費研究の代表及び分担者7名により、日本教育制度学会(2001.11.18)の課題研究「高校と大学の接続」の分科会を担当し、本共同研究の成果を発表した。研究報告4本と討論者、司会は下記のとおりである。課題研究:大学ユニバーサル化時代の新しい教育接続-アメリカの事例を中心として-池田輝政アメリカにおける教育接続の枠組み藤井佐知子新アドミッションシステム導入の政策的背景橋本昭彦・河野銀子オレゴン州高校教育の動向とPASSによる接続の開始尾中文哉コミュニティ・カレッジを活用した接続改革討論者;木村元司会;荒井克弘平成14年度今年度は研究計画の最終年度にあたり、情報・資料のさらなる調査、収集に従事するとともに、これまで収集した資料、データ類の分析を深めた。
クロマチン構成因子DEKによるクロマチン構造制御機構の解明

本研究では、クロマチン構成因子DEKによるクロマチン構造制御機構の解析を行う。DEKは、癌化やリウマチ関節炎に関与することが知られており、細胞核内に大量かつユビキタスに存在する因子であるにもかかわらず、クロマチンに及ぼす影響についてはほとんど不明である。本研究では、構造生物学的、生化学的手法を中心に、DEKとクロマチンの相互作用解析を行うことで、DEKによるクロマチン構造制御機構を解明する。さらに、DEKと他のクロマチン構造形成因子との比較を行うことで、真核生物におけるクロマチン構造形成の多様性の解明を試みる。ヒトをはじめとする真核生物のゲノムDNAは、クロマチン構造を形成して細胞核内に収納されている。クロマチンは様々な因子が結合することで、緩んだ構造や、凝縮した構造にダイナミックに変化する。この構造変化によって、ゲノムDNAとDNAの機能発現を担う因子との相互作用が調節されることで、遺伝子の発現、DNAの修復、複製などが制御されている。そのため、クロマチンの構造を規定する因子が、細胞の複雑かつ多様な生理機能を実現する上で非常に重要である。本研究では、クロマチンの構成因子DEKによるクロマチン構造制御機構の解明を目的としている。DEKは、癌やリウマチ関節炎に関与することが知られており、細胞核内にユビキタスに存在してヘテロクロマチンの形成に関与することがわかっているが、クロマチン構造に与える影響については不明である。そこで、本研究では、DEKとクロマチンの相互作用解析を行っている。まず、DEKをリコンビナントタンパク質として精製する系を確立した。DEKにより形成されるクロマチン構造の解明のため、精製したDEKとクロマチンとの複合体を形成させ、電子顕微鏡観察によりその立体構造解析を進めた。具体的には、クライオ電子顕微鏡による解析のために、凍結試料の作製条件を詳細に検討した結果、良質な凍結グリッドを作製することに成功した。クライオ電子顕微鏡により、単粒子解析を行った結果、DEKとクロマチン複合体の立体構造を決定することに成功し、DEKの特徴的なクロマチン結合機構が明らかになった。昨年度は、研究計画に基づき、DEKとクロマチンの複合体の立体構造解析を推進した。まず、DEKとクロマチンの複合体の再構成に成功した。複合体の立体構造をクライオ電子顕微鏡解析によって解析するために、スクロースと架橋剤の密度勾配遠心分離による精製法GraFixを用いて複合体を安定化して精製する系を確立した。試料の濃度、架橋剤の濃度や、複合体の凍結条件(Blot timeやBlotforceなど)を詳細に検討した結果、良質な凍結試料を作製することに成功した。この凍結試料について、クライオ電子顕微鏡Titan Kriosを用いて3000枚程度の顕微鏡写真を収集し、単粒子解析を行った結果、DEKとクロマチンの立体構造を決定することに成功した。その結果、DEKの特徴的なクロマチン結合機構が明らかになり、DEKによるクロマチン構造制御に関する重要な知見が得られた。DEKとクロマチンの立体構造決定は、本研究を進める上で非常に大きな進展であったと言える。しかし同時に、構造解析の結果から、クロマチンに結合したDEKの構造はフレキシブルなものであり、複合体中でDEKの構造の分解能が低いことが明らかになった。その結果として、DEKとクロマチンの複合体の原子モデルの構築にはさらなる詳細な構造情報と、生化学的解析が必要であると考えられた。そのため、DEKのクロマチン結合ドメインをリコンビナントタンパク質として精製し、X線結晶構造解析を試みている。現在までに、タンパク質の精製に成功し、結晶化条件のスクリーニングをロボットを用いて大規模に行っている。平成31年度は、まずDEKとクロマチン複合体の原子モデルの構築を行う。そのために、DEKのクロマチン結合ドメインの立体構造を、X線結晶構造解析により高分解能で決定する。そのために、引き続き結晶化条件のスクリーニングを行う。良質な結晶が得られた際には、大型放射光施設SPring-8や、Photon FactoryにてX線結晶構造解析を行う予定である。さらに、DEKのクロマチン結合機構を生化学的に解析するため、架橋を用いた質量分析により相互作用解析を行う。これらの構造、生化学的情報からDEKとクロマチン複合体の原子モデルを構築する。さらに、DEKのクロマチン結合に重要なアミノ酸について変異体を作製し、クロマチンとの相互作用解析を行うことで、モデルのバリデーションも行う。次に、DEKがクロマチンの高次構造に与える影響を解析するため、より巨大なクロマチンを再構成し、DEKと複合体を形成させ、電子顕微鏡により立体構造解析を行う。そのために、まず複合体の調製法を確立する。具体的には、GraFix法に用いるスクロース濃度や架橋剤の濃度、種類などを検討する。複合体が凍結試料作製の際に崩壊してしまう可能性を考え、クライオ電子顕微鏡による解析がうまく進行しない場合には、ネガティブ染色法による構造解析を行う。電子顕微鏡解析は、東京大学に設置されている顕微鏡を用いる予定である。

ヒトをはじめとする真核生物のゲノムDNAは、クロマチン構造を形成して細胞核内に収納されている。クロマチンは様々な因子が結合することで、緩んだ構造や、凝縮した構造にダイナミックに変化する。この構造変化によって、ゲノムDNAとDNAの機能発現を担う因子との相互作用が調節されることで、遺伝子の発現、DNAの修復、複製などが制御されている。そのため、クロマチンの構造を規定する因子が、細胞の複雑かつ多様な生理機能を実現する上で非常に重要である。本研究では、クロマチンの構成因子DEKによるクロマチン構造制御機構の解明を目的としている。DEKは、癌やリウマチ関節炎に関与することが知られており、細胞核内にユビキタスに存在してヘテロクロマチンの形成に関与することがわかっているが、クロマチン構造に与える影響については不明である。そこで、本研究では、DEKとクロマチンの相互作用解析を行っている。まず、DEKをリコンビナントタンパク質として精製する系を確立した。DEKにより形成されるクロマチン構造の解明のため、精製したDEKとクロマチンとの複合体を形成させ、電子顕微鏡観察によりその立体構造解析を進めた。具体的には、クライオ電子顕微鏡による解析のために、凍結試料の作製条件を詳細に検討した結果、良質な凍結グリッドを作製することに成功した。クライオ電子顕微鏡により、単粒子解析を行った結果、DEKとクロマチン複合体の立体構造を決定することに成功し、DEKの特徴的なクロマチン結合機構が明らかになった。昨年度は、研究計画に基づき、DEKとクロマチンの複合体の立体構造解析を推進した。まず、DEKとクロマチンの複合体の再構成に成功した。複合体の立体構造をクライオ電子顕微鏡解析によって解析するために、スクロースと架橋剤の密度勾配遠心分離による精製法GraFixを用いて複合体を安定化して精製する系を確立した。試料の濃度、架橋剤の濃度や、複合体の凍結条件(Blot timeやBlotforceなど)を詳細に検討した結果、良質な凍結試料を作製することに成功した。この凍結試料について、クライオ電子顕微鏡Titan Kriosを用いて3000枚程度の顕微鏡写真を収集し、単粒子解析を行った結果、DEKとクロマチンの立体構造を決定することに成功した。その結果、DEKの特徴的なクロマチン結合機構が明らかになり、DEKによるクロマチン構造制御に関する重要な知見が得られた。DEKとクロマチンの立体構造決定は、本研究を進める上で非常に大きな進展であったと言える。しかし同時に、構造解析の結果から、クロマチンに結合したDEKの構造はフレキシブルなものであり、複合体中でDEKの構造の分解能が低いことが明らかになった。その結果として、DEKとクロマチンの複合体の原子モデルの構築にはさらなる詳細な構造情報と、生化学的解析が必要であると考えられた。