hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波造影剤の微小気泡が生じる径振動の高速度観察によるシェルの機械的特性の計測

○高速度顕微観察システムの改良時間・空間分解能の向上を目指し,微弱光増幅装置の利用や照明用アーク放電型光源の集光光学系の改良に関して検討した.その結果,対物倍率40倍では最小露光時間は200nsから20nsに向上し,最大撮影速度は毎秒400万コマから1,600万コマに向上した.○減衰特性計測装置の開発我々が以前生体組織の減衰特性の測定で開発した技術を基に,微小気泡懸濁液の減衰特性を高精度に計測する装置を開発した.中心周波数10MHzの広帯域パルスを用いることにより3から14MHz程度の帯域で微小気泡懸濁液の減衰の周波数特性が計測でき,計測の半自動化により精度向上を図った.○微小気泡のふるまいの高速度観察によるシェルの機械的特性の検討1つの微小気泡に音圧が増加する超音波パルス列を照射して気泡の径振動を高速度観察し,超音波の音圧と径振動振幅の変化の関連からシェルの機械的特性を調べた.観察対象としては,7種類の超音波造影剤と1種類のサブミクロン気泡,1種類のプラスチック気泡を用いた.観察の結果,リン脂質系のシェルでは,低音圧から音圧に応じて膨張・収縮が増強する様子が,バルミチン酸やアルブミンシェルの気泡では,ある音圧閾値を越えて初めて振動を始める特性が確認され,その違いは臨床で用いられている超音波照射条件の違いに対応していた.○気泡懸濁液の音圧依存性減衰の計測によるシェルの機械的特性の検討上記9種類の微小気泡懸濁液の減衰特性を,印加する超音波の音圧を変化させて計測した.その結果,それぞれの気泡の減衰係数の周波数特性には,減衰の最大値やその周波数に特徴ある音圧依存性が確認された.この特性は,高速度観察で捉えた各気泡の膨張・収縮運動の違いを反映していたことから,音圧依存性減衰の測定は,微小気泡のシェル特性の推定に有用であることが確認された.○高速度顕微観察システムの改良時間・空間分解能の向上を目指し,微弱光増幅装置の利用や照明用アーク放電型光源の集光光学系の改良に関して検討した.その結果,対物倍率40倍では最小露光時間は200nsから20nsに向上し,最大撮影速度は毎秒400万コマから1,600万コマに向上した.○減衰特性計測装置の開発我々が以前生体組織の減衰特性の測定で開発した技術を基に,微小気泡懸濁液の減衰特性を高精度に計測する装置を開発した.中心周波数10MHzの広帯域パルスを用いることにより3から14MHz程度の帯域で微小気泡懸濁液の減衰の周波数特性が計測でき,計測の半自動化により精度向上を図った.○微小気泡のふるまいの高速度観察によるシェルの機械的特性の検討1つの微小気泡に音圧が増加する超音波パルス列を照射して気泡の径振動を高速度観察し,超音波の音圧と径振動振幅の変化の関連からシェルの機械的特性を調べた.観察対象としては,7種類の超音波造影剤と1種類のサブミクロン気泡,1種類のプラスチック気泡を用いた.観察の結果,リン脂質系のシェルでは,低音圧から音圧に応じて膨張・収縮が増強する様子が,バルミチン酸やアルブミンシェルの気泡では,ある音圧閾値を越えて初めて振動を始める特性が確認され,その違いは臨床で用いられている超音波照射条件の違いに対応していた.○気泡懸濁液の音圧依存性減衰の計測によるシェルの機械的特性の検討上記9種類の微小気泡懸濁液の減衰特性を,印加する超音波の音圧を変化させて計測した.その結果,それぞれの気泡の減衰係数の周波数特性には,減衰の最大値やその周波数に特徴ある音圧依存性が確認された.この特性は,高速度観察で捉えた各気泡の膨張・収縮運動の違いを反映していたことから,音圧依存性減衰の測定は,微小気泡のシェル特性の推定に有用であることが確認された.○超音波造影剤の収集本研究の目的の1つは,超音波造影剤のシェルの機械的特性を調べる手法の確立であり,より多くの造影剤を入手し評価することは重要な意味を持つが日本で認可された造影剤は1種類しかない.そこで本年度は薬剤メーカへのサンプル提供依頼および購入を行い,7種類の超音波造影剤を入手した.○超音波照射システムの改良計算機で制御できる任意波形発生装置を用いて高い自由度でパルス超音波列を発生できる超音波照射システムを開発し,超音波波形の実測を行った.○高速度顕微観察システムの空間・時間分解能の改良高速度顕微観察システム(既存設備)と本研究費補助金で購入した微弱光増幅装置を組み合わせ,観察倍率の拡大による空間分解能の向上と,露光時間の短縮による時間分解能の向上が可能であることを確認した.○シェルの影響を考慮した気泡の径振動シミュレーションFerraraらの検討を参考に,シェルの特性を考慮してRayleigh-Plesset方程式を解くシミュレーションプログラムを作成した.○造影剤の減衰特性の高精度計測システムの開発我々の既存技術を基に5-10 MHz帯における造影剤懸濁液の減衰特性を高精度に計測できるシステムを開発し,異なるシェル特性が予想される

2種類の造影剤について透過法による減衰係数計測を行った.減衰特性を音圧を変化させて測定したところそれぞれの造影剤の音圧依存性に大きな違いが見られたことから,減衰特性の計測がシェルの特性評価に有用であることが確認できた.○高速度顕微観察システムの空間・時間分解能の改良(継続)昨年度に引き続き,本研究補助金で購入した微弱光増幅装置の性能確認を行った.その結果,光増幅装置の機能の一部(最高フレームレートにおける光増幅率)に不十分な点があったことから,その改善を行った.また,照明用アーク放電型光源の集光光学系について検討を開始した.○微小気泡のふるまいの観察入手した7種類の超音波造影剤のうち4種類(シェル材質としては3種類:パルミチン酸,アルブミン,リン脂質)について,音圧が徐々に増加するパルス列を加えて気泡のふるまいの変化を調べた.その結果,リン脂質のシェルを持つ気泡では,低い音圧から音圧に応じた径変化生じるのに対し,バルミチン酸やアルブミンのシェルを持つ気泡では,ある音圧を超えて初めて振動を開始する閾値的な特性があることを確認した.○減衰係数の高精度計測昨年度開発した高精度減衰係数計測システムを用いて,上記検討でシェルの特性に違いが見られた超音波造影剤2種類(シェル材質:パルミチン酸,リン脂質)の音圧依存性減衰を測定した.その結果,両気泡とも音圧の増加に伴い減衰係数が増加する傾向が見られたが,振動開始に音圧閾値があったパルミチン酸気泡では,減衰が増加し始める音圧にも閾値が存在することが確認され,気泡のシェルの違いを減衰特性の違いとして計測できることを確認した.○細胞と気泡の相互作用の観察高速度撮影システムの高感度化により,従来不可能であった位相差観察が可能となる.その有用性を確認するために,細胞と気泡の相互作用の高速度撮影を行った.画像のコントラストが改善された結果,気泡のふるまいにより細胞に生じる微細な変化が捉えることが可能となり,気泡のふるまいの機械的な作用が細胞に損傷を与えることが示された.○高速度顕微観察システムの空間・時間分解能の改良購入したイメージインテンシファイヤの利用や照明光学系の改良に関する検討を行った結果,最終的に観察視野の光量を10倍弱増強することができた.これにより,これまでと同倍率の観察では最大撮影速度が4倍向上し,最大毎秒1600万コマでの撮影が可能になった.○微小気泡のふるまいの観察改良した高速度観察システムを用いて,これまでに入手した7種類の超音波造影剤と1種類のサブミクロン気泡の高速度観察を行った.その結果,シェルの柔軟性が高く,低い音圧から音圧に応じて膨張・収縮する気泡と,ある音圧閾値を越えて初めて動き始める気泡の2種類に大きく分類されることが示され,その分類は臨床経験を基に推定されたものと良く一致した.○減衰特性測定装置の高精度化以前開発した気泡懸濁液の減衰特性測定装置の精度と安定性の向上を目的として,計測の自動化を進めた.その結果,ほとんど人手を使わずに,6段階の音圧における減衰の周波数特性を数分のうちに取得できるようになった.○気泡懸濁液の減衰特性測定上記の計測装置を用いて,8種類の微小気泡懸濁液の音圧依存性減衰を測定した.その結果,それぞれの気泡の減衰特性には特徴ある音圧依存性が確認され,本測定結果から微小気泡の物理的特性の推定が可能と考えられた.また,高速度撮影において振動開始に音圧閾値が見られた気泡では,これを裏付ける減衰特性が得られたことから,減衰特性から気泡ダイナミクスを推定することの有用性が確認された.減衰が最大となる周波数は,測定パルスの周波数特性(中心周波数10MHz)の影響を受けて気泡径で決まる共振周波数よりも高くなるが,音圧によって変化する様子も観察された.この周波数と実際の気泡振動周波数の関連について,今後さらに検討を行なっていく.
wavelet解析におけるアルゴリズム論的定式化

平成12年度及び13年度に於ける研究内容は、以下の2つに大別される。(1).Hilbertの第13間題に伴う未解決問題への解答。1900年に国際数学者会議で、D.Hilbertが行った総合講演の中で「今後の数学の発展を方向付ける23の問題」として発表したもののうち、第13問題、即ち「他変数連続関数をより少ない個数の連続関数の重ねあわせで表現できるか」という問題は、約50年後にKolmogorovとArnoldにより解決されたが、上記問題に付随する「連続性」という条件を「解析性」に置き換えた場合や「無限回連続微分可能性」に置き換えた場合は、依然として未解決であることが知られていた。平成13年度は、多次元Wavelet解析的手法を応用することにより、「Hilbertの第13問題の解析関教版」を解決することに成功した。(2).上記研究成果のデータ圧縮問題(特に計算図表問題)への応用。以下では、特に3変数解析関数空間と2変数解析関教空間に限定して実績報告を行う。双方の空間とも、通常のsup-normを導入することによりBanach空間となることが知られているが、両空間の変数の個数の相違を、双方の位相構造に反映することが可能であるような特性量を、イプシロンエントロピーを用いて作製した。さらに、2変数解析関数の重ね合わせ表現により新しく構成される3変数解析関数の部分空間が、全体空間の中で位相空間論的にどのように特徴付けられるかをBaireのカテゴリー定理に基づいて調べ、「重ね合わせ表現で記述できる3変数関数はごく限られたものである」という結果を得た。なお、この問題は、計算機科学の分野では、「計算図表問題」として知られ、上記問題が肯定的に解決されるならば、即ち「重ね合わせ表現可能」であることが示されるならば、新たなるデータ圧縮の原理を形成することになったのであるが、この結果は、「計算図表問題」に対するある意味での実用不可能性示したともいえる。上記一連の結果を得るに際して、Wavletスペクトル解析の手法を導入した。Fourierスペクトルが有界であるようなLebesugue-2乗可積分関数族が,再生核Hilbert空間としての構造を有するのと同様に,ある種のwaveletスペクトルの大域幅が有界領域に含まれるLebesgue-2乗可積分関数族が再生核Hilbert空間としての構造を有するという結果を用いて,wavelet解折における標本化定理を構成する.また,Fourierスペクトル解析における時間と周波数に関する不確定性原理のwavelet解析版についても検討する.wavelet変換を与える積分核作用素は,Lebesgue-2乗可積分関数族上のコンパクト作用素となるため,コンパクト作用素族に対するε-エントロピー理論を適用することが可能である.このことは,ε-エントロピー理論に基づく分類法が.wavelet変換族もしくは対応するwavelet積分核族に対する情報理論的分類を可能することを意味している.更にある種のwavelet変換族から構成される作用素環に対する作用素環論的分類法についても検討する.Fourier変換と同様に,wavelet変換においても逆変換公式を適用する際,入力データとして必要とするwaveletスペクトルの台を有界閉区間に限定しなければならない.従って,ここに入力スペクトル区間の打ち切りという操作に伴う再生信号の誤羞評価を検討することが問題として生ずる.

ここでは,打ち切り区間幅を逐次拡張することにより得られる再生信号列の平均収束状況や概収束状況について調査する.上記研究成果に基づき.離散wavelet変換の数学的定式化を行い,有界なwaveletスペクトルを持つLebesgue-2乗可積分関数族から構成される再生核Hilbert空間を張る正規直交基底を構成する.一方,高速Fourier変換プログラムは,統計学における因子分析プログラムに端を発するが,このプログラム原理は極めて不変性を有するものであり,これらの結果は高速wavelet変換プログラム作製にも応用され得るものである.1900年に国際数学者会議で、D.Hilbertが行った総合講演の中で「今後の数学の発展を方向付ける23の問題」として発表したもののうち、第13問題、即ち「他変数連続関数をより少ない個数の連続関数の重ねあわせで表現できるか」という問題は、約50年後にKolmogorovとArnoldにより解決されたが、上記問題に付随する「連続性」という条件を「解析性」に置き換えた場合や「無限回連続微分可能性」に置き換えた場合は、依然として未解決であることが知られていた。平成13年度は、多次元Wavelet解析的手法を応用することにより、「Hilbertの第13問題の解析関数版」を解決することに成功した。以下では、特に3変数解析関数空間と2変数解析関数空間に限定して実績報告を行う。双方の空間とも、通常のsup-rormを導入することによりBanach空間となることが知られているが、両空間の変数の個数の相違を、双方の位相構造に反映することが可能であるような特性量を、イプシロンエントロピーを用いて作製した。さらに、2変数解析関数の重ね合わせ表現により新しく構成される3変数解析関数の部分空間が、全体空間の中で位相空間論的にどのように特徴付けられるかをBaireのカテゴリー定理に基づいて調べ、「重ね合わせ表現で記述できる3変数関数はごく限られたものである」という結果を得た。なお、この問題は、計算機科学の分野では、「計算図表問題」として知られ、上記問題が肯定的に解決されるならば、即ち「重ね合わせ表現可能」であることが示されるならば、新たなるデータ圧縮の原理を形成することになったのであるが、この結果は、「計算図表問題」に対するある意味での実用不可能性示したともいえる。上記一連の結果を得るに際して、Waveletスペクトル解析の手法を導入した。
近代日本にける都市開発の研究－神戸湊川新開地を事例に－

本年度は、従来の研究のなかで具体的に明らかにされることのなかった都市開発の過程を、主に19101920年代の神戸湊川新開地を事例に、申請者のこれまでの研究を基礎としながら、土地所有・利用の局面から、当該地域が映画館を中核とした娯楽空間へと開発されていく過程明らかにしていくことを目的とした。具体的には、湊川新開地の開発を担った会社の経営史料(神戸市文書館所蔵)のほか、当該地域で発生した土地利用をめぐる裁判記録(国立公文書館つくば分館所蔵、民事裁判資料)の調査を進めたことで、開発過程における土地利用の構造を明らかにすることができた。また当該期の神戸市の統計資料(神戸市文書館所蔵)や、神戸で発行されていた映画雑誌(東京国立近代美術館フィルムセンター所蔵)を調査し、当該期の映画興行の実態や、行政による規制、映画受容のあり方といった論点を深めることができた。さらに、映画従業員組合をはじめとした映画館の労働関係資料(国立国会図書館所蔵)の調査も進めたことで、労働の現場としての映画館をめぐる社会関係への視座を獲得することができた。以上、開発を契機とした社会関係の変容、映画興行の形態、それらに対する都市行政の施策を具体的に捉え、映画という戦前を代表する都市文化の受容形態や、それをめぐる社会的諸関係の解明が進んだ。また、これまでの研究の一部を、「湊川神社境内の店舗営業ー1901年境内建物立ち退き問題を手がかりにー」として『歴史と神戸』297号への掲載が決定した。本年度は、従来の研究のなかで具体的に明らかにされることのなかった都市開発の過程を、主に19101920年代の神戸湊川新開地を事例に、土地所有・利用の局面から当該地域が映画館を中核とする娯楽空間へと開発されていく過程を解明する作業に取り組んだ。具体的には、19101920年代における湊川の開発過程を具体的に明らかにするため、『神戸又新日報』や『神戸新聞』といった、当該期に神戸で発行されていた新聞史料のほか、湊川の開発を担った会社の経営史料(神戸市文書館所蔵)に関する調査を進めた。同時に開発過程で生じた土地利用をめぐる対立について明らかにするため、神戸地方法務局が所蔵する戦前の土地台帳を用い、当該地域の土地所有状況を明らかにすることに努めた。この作業を通じて、湊川付け替え跡地が、映画館やカフェーなどを中核とする娯楽空間へと開発されていく過程において、当該地域において取り結ばれていた露店営業をはじめとする社会的諸関係が変容していくことを明らかにすることができた。これによって、従来の研究のなかで具体的に明らかにされることのなかった都市開発の過程を、主に19101920年代の神戸湊川新開地を事例に、土地所有・利用の局面から迫ることが可能となり、都市開発の具体的過程と、映画をはじめとする都市文化の受容という問題との関係性を解明するという本研究の課題を解決するための基本的視座を獲得することができた。また、以上のような成果をもとにして本年度12月には、神戸大学大学院人文学研究科に博士論文「近代日本の都市開発と娯楽空間-神戸新開地形成史の研究-」を提出し、3月に学位を取得した。本年度は、本研究がフィールドとする神戸に所在する史料を中心に調査した結果、初見の史料から新たな論点を見出すことができ、その成果を博士論文としてまとめることで、おおむね順調に研究が進展した。本研究の課題である、都市開発の具体的過程と、映画をはじめとする都市文化の受容という問題との関係性を明らかにするため、本年度にまとめた博士論文の成果をもとにしながら、さらなる史料調査を進める。神戸に所在する史料には、残存・利用状況の関係から限界があるため、東京を中心とした資料保存利用機関が所蔵する史料についても、積極的に調査を進める必要がある。
蛍光ATPプローブ遺伝子ノックインマウスを用いた膵島細胞糖代謝異常の解析

これまで我々はATP濃度によってOFP/GFP比が変化するFRETであるGO-ATeam1ノックインマウスおよびCa2+インジケータであるfura-2を併用して、膵β細胞内ATP濃度およびCa2+濃度動態同時測定を行い、同一β細胞内および隣接する膵島細胞間での代謝(ATP)・イオン(Ca2+)動態の変化を検討してきた。その過程で、同一膵島内のβ細胞間であっても、代謝やイオン動態が不均一であることを示唆する観察結果を得た。この同一膵島細胞間での代謝動態不均一性のメカニズムを検討するため、膵島細胞に対してシングルセル・レベルでトランスクリプトーム解析をおこない、膵β細胞が少なくとも4つの亜集団にわかれることを見出した。特に増殖膵β細胞と考えられる亜集団では、細胞周期関連の遺伝子群の発現が亢進するのに対し、酸化的リン酸化やATP産生に関する遺伝子群やホルモン分泌に関連する遺伝子群の発現が、他の3つの亜集団と比して、低下していることを確認した(International Symposium of Epigenome(ISE)2019;Feb.3-4, 2019で発表)。引き続き、今回得られた上記結果をもとに、各群における遺伝子発現と細胞機能との関連性に関して解析を進め、遺伝子発現的にも機能的にも不均一であるβ細胞群が混在する膵島に関して、不均一であることの合目的性について検討を進めていく予定である。研究代表者の主たる所属が、昨年度(2017年度)以降、大学から一般病院に変わり、研究環境および研究体制が変わったことによる。膵島細胞を用いたシングルセル・レベルでのトランスクリプトーム解析により今回得られた結果(膵β細胞が幾つかの亜集団に分類できる可能性)をもとに、各群における遺伝子発現と細胞機能との関連性に関して解析を進め、これら遺伝子発現的にも機能的にも不均一であるβ細胞群が混在する膵島に関して、不均一であることの妥当性・合目的性について、さらには膵島の正常機能発現および維持のためには均一でなく不均一であることが重要である可能性について検討を進めていきたいと考えている。生理的条件下における膵β細胞代謝調節メカニズムの理解には、生細胞における刺激前後の細胞内シグナルの動態観察が必要であるが、従来、細胞内ATP動態を生細胞のまま簡便に、経時的かつリアルタイムで測定できる手法はなかった。本研究は、蛍光ATPプローブ遺伝子ノックインマウス、さらには肥満・糖尿病モデルマウスを用いて生細胞のまま、生理的条件下で、直接的、経時的かつリアルタイムに解析し、様々な摂餌条件および耐糖能状態における細胞内糖代謝と糖代謝異常の病態形成機序との関わりの実際を検証・解明することを目的とする。ATP濃度によってOFP/GFP比が変化するFRETであるGO-ATeam1ノックインマウスを作成し、野生型マウスと比べて耐糖能、膵β細胞機能に差がないことを確認した後、ノックインマウスより単離したβ細胞において、糖負荷時のOFP/GFP比の上昇を確認した。またCa2+インジケータであるfura-2を導入し、細胞内Ca2+とATP濃度動態の同時測定を行ったところ、先行するOFP/GFP比、すなわち細胞内ATP濃度の上昇とそれより1分程度遅れて細胞内Ca2+濃度の上昇を確認した。近年生体内の膵島においてβ細胞機能の不均一性(heterogeneity)が注目されており、単離したβ細胞と生体内の膵島状態でのβ細胞では異なるATP動態を示す可能性がある。そこで我々はマウス生体内β細胞のATP濃度動態を観察するため、β細胞特異的GO-ATeam1ノックインマウスを作成し、まもなく2光子顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡で糖負荷時の膵島における各β細胞のATP濃度動体を観察予定となっている。当初の研究計画に沿って、蛍光ATPプローブ遺伝子ノックインマウスを用いて、これまで詳細不明であった膵島細胞内ATP濃度変化および細胞内Ca2+濃度変化との経時的連関等についての実験結果が得られている。さらに膵島細胞(α細胞、β細胞、δ細胞、等々)の中のβ細胞特異的に蛍光ATPプローブを発現するマウスを作成し、膵島細胞における細胞種別の細胞内代謝(ATP)動態の評価へと研究が進展しているため。細胞内ATP濃度変化を、生理的状態のまま、リアルタイムに測定することは、細胞の代謝動態を評価する上で非常に重要であるが、これまで細胞内ATP濃度変化を生理学的条件化下で測定する際の適したツールがなかった。我々は、ATP濃度によってOFP/GFP比が変化するFRETであるGO-ATeam1を導入したノックインマウスを用いて、野生型マウスとの比較で耐糖能およびβ細胞機能に差がないことを確認した上で、単離β細胞にCaインジケータであるfura-2を導入し、細胞内CaとATP濃度動態の同時測定を行い、先行するOFP/GFP比、すなわち細胞内ATP濃度の上昇とそれより遅れて細胞内Ca濃度上昇することを確認。さらに生体内の膵島におけるβ細胞およびα細胞機能の不均一性に着目し、細胞内ATP動態および細胞内Ca動態、さらには酸素分圧プローブを用いて野生型β細胞およびα細胞の細胞内酸素分圧変化を測定した。さらに、各細胞内ATP動態変化を精密に測定するため、2光子顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡で糖負荷時の変化を検討中である。上記検討過程で得られた結果;Ateam発現マウス由来の単離

膵島を用いて細胞内代謝に関するβ細胞の不均一性に関して学会発表を行った(Asian Association for the Study of Diabetes Scientific Meeting; AASD Investigator Award受賞:Usui R et al. Nagoya,2017)研究代表者の所属が変わり、研究環境および研究体制が変わったことによる。これまで我々はATP濃度によってOFP/GFP比が変化するFRETであるGO-ATeam1ノックインマウスおよびCa2+インジケータであるfura-2を併用して、膵β細胞内ATP濃度およびCa2+濃度動態同時測定を行い、同一β細胞内および隣接する膵島細胞間での代謝(ATP)・イオン(Ca2+)動態の変化を検討してきた。その過程で、同一膵島内のβ細胞間であっても、代謝やイオン動態が不均一であることを示唆する観察結果を得た。この同一膵島細胞間での代謝動態不均一性のメカニズムを検討するため、膵島細胞に対してシングルセル・レベルでトランスクリプトーム解析をおこない、膵β細胞が少なくとも4つの亜集団にわかれることを見出した。特に増殖膵β細胞と考えられる亜集団では、細胞周期関連の遺伝子群の発現が亢進するのに対し、酸化的リン酸化やATP産生に関する遺伝子群やホルモン分泌に関連する遺伝子群の発現が、他の3つの亜集団と比して、低下していることを確認した(International Symposium of Epigenome(ISE)2019;Feb.3-4, 2019で発表)。引き続き、今回得られた上記結果をもとに、各群における遺伝子発現と細胞機能との関連性に関して解析を進め、遺伝子発現的にも機能的にも不均一であるβ細胞群が混在する膵島に関して、不均一であることの合目的性について検討を進めていく予定である。研究代表者の主たる所属が、昨年度(2017年度)以降、大学から一般病院に変わり、研究環境および研究体制が変わったことによる。近年生体内の膵島においてβ細胞機能の不均一性(heterogeneity)が注目されており、単離したβ細胞と生体内の膵島状態でのβ細胞では異なるATP動態を示す可能性がある。今回作成したβ細胞特異的GO-ATeam1ノックインマウスを用いて、膵島細胞内の細胞種(β細胞およびnon-β細部など)個々の細胞内代謝(ATP)動態を評価することと並行して、単離された状態の細胞ではなく、マウス生体内膵島状態でのβ細胞ATP濃度動態を観察する予定である。2光子励起顕微鏡を用いて、in vivoにおける膵β細胞代謝変化の測定を検討する。生体内の膵島におけるβ細胞およびα細胞機能の不均一性の検証を進める。膵島におけるβ細胞およびα細胞機能の不均一性が、適正な膵島機能維持に関与するか否か、関与するとすればそのメカニズムについての検討を進める。膵島細胞を用いたシングルセル・レベルでのトランスクリプトーム解析により今回得られた結果(膵β細胞が幾つかの亜集団に分類できる可能性)をもとに、各群における遺伝子発現と細胞機能との関連性に関して解析を進め、これら遺伝子発現的にも機能的にも不均一であるβ細胞群が混在する膵島に関して、不均一であることの妥当性・合目的性について、さらには膵島の正常機能発現および維持のためには均一でなく不均一であることが重要である可能性について検討を進めていきたいと考えている。
アポトーシス細胞を模倣した抗炎症スマート粒子の設計と新たな急性疾患治療法の開発

本研究では、炎症部位(心筋梗塞部位)での微妙な環境変化(熱やpHなど)に応答してフォスファチジルセリン(PS)を“on-off"で提示するアポトーシス細胞模倣型スマート粒子の開発を行った。まず、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの合成を行った。次にPSモノマーと温度応答性ポリマーとの共重合体(PSポリマー)を合成した。合成したポリマーは抗炎症性を示すことが明らかとなった。本研究課題では、炎症部位での微妙な環境変化(熱やpHなど)に応答してフォスファチジルセリン(PS)を“on-off"で提示するアポトーシス細胞模倣型スマート粒子の開発を目的とする。通常、PSは正常細胞では細胞膜の内側に局在するのに対し(OFF状態)、アポトーシスを起こすと細胞膜の外へと局在を変え(ON状態)、マクロファージなどによる炎症を回避することが知られており、急性期の生体の炎症反応に対して、アポトーシスを起こした細胞が、細胞膜表面に露出するPSを介して免疫反応を制御するシグナルを出すという報告がなされている。平成23年度までに合成したPSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーを用いて、平成24年度には温度応答性のN-isopropylacrylamide (NIPAAm)およびその誘導体との共重合体(PSポリマー)を合成した。高分子の相転移温度は3740°C付近になるように様々な組成のポリマーを合成した。また、正常な生体組織と類似した弾性率を有する生分解性粒子を作製するため、Pentaerythritolを開始剤としてCaprolactone(CL)とD, L-Lactide (LA)を共重合させた。このポリマーを用いてエマルジョン法によって粒子を作製した。粒子の硬さはCLとLAの比によって制御可能であった。また、コントロールとしてPSを有する脂質を用いてリポソームを作製し、マクロファージの活性化実験を行ったところ、PSリポソームがアポトーシス細胞と同との抗炎症性作用を有することが明らかとなった。以上のことより、今回合成したPSポリマーを用いてナノ・マイクロ粒子を作製することで、抗炎症作用を有する粒子の作製が期待できる。細胞はアポトーシスを起こすと、細胞膜に内在するホスファチジルセリンというリン脂質を細胞外部へ露出し、免疫細胞に速やかに貪食、処理されることが知られている。従来、ホスファチジルセリンを認識した免疫細胞はアポトーシス細胞を貪食するのみであるとされてきたが、ホスファチジルセリンを認識した免疫細胞がサイトカイン産生パターンを変更し、周囲の炎症的な環境を抑制することが近年明らかとなってきた。そこで本研究では、アポトーシス細胞の特異的な膜表面構造を模倣した抗炎症活性を有する材料の創出を目的として、ホスファチジルセリンの機能性部位であるホスホリルセリン基(PS基)を有する高分子材料の作製を試みた。合成した高分子の物性評価を行ったところ、相転移温度は3740°C付近に有することがわかった。この高分子をマクロファージに添加したところ、炎症性サイトカインの産生を抑制できることが明らかとなった。本申請課題では、炎症部位(心筋梗塞部位)での微妙な環境変化(熱やpHなど)に応答してフォスファチジルセリン(PS)を"on-off"で提示するアポトーシス細胞模倣型スマート粒子の開発を目的とする。平成23年度には、PSの活性部位を側鎖に有する新規PS誘導体モノマーの分子設計を行った。合成スキームとしては、まず2-Hydroxyethylmethacrylate(HEMA)と2-Chloro-2-oxo-1,3,2- dioxaphospholane (COP)と反応させた。次に、1,8-Diazobicycloundec-7-ene (DUB)存在下でフォスファチジルセリン基を反応させ、PS活性部を有するモノマー(PSモノマー)を合成した。次にPSモノマーと温度応答性のN-isopropylacrylamide (NIPAAm)およびその誘導体との共重合体(PSポリマー)を合成した。フォスファチジルセリン(PS)の活性部位を側鎖に有する新規PSモノマーの合成に関してはおおむね予定通りに進んでいる。これは、申請者のこれまでの経験と実績により重合条件などがスムーズに決まったためである。

また、生分解性粒子の設計に関しても、予定通りの弾性率を有する粒子の合成が達成できた。これは、高分子の結晶性の制御の制御が予定通り進行したためである。一方で、その粒子サイズに関しては予定より少し大きめのものができており、今後界面活性剤の種類を検討することによってス百ナノメートルサイズの粒子の合成を達成する。また粒子の形に関しても、球状の粒子は簡単に作製できるが、今後は楕円など様々な形のものを作製し、マクロファージへの取り込みなども検討していきたいと思っている。そのためには、リソグラフィーなどを用いることも検討している。フォスファチジルセリン(PS)の活性部位を側鎖に有する新規PSモノマーの合成に関してはおおむね予定通りに進んでいる。これは、申請者のこれまでの経験と実績により重合条件などがスムーズに決まったためである。一方で、モノマーの純度に関してはまだ十分とは言い切れないため、今後モノマーの精製方法を検討していく。これまでに作製したPS粒子表面のPS基の活性の評価を行う。また同時にPSポリマーが修飾された表面の作製も行う。これにより簡便に炎症評価の実験が行えるものと考える。その際、表面ポリマー密度やPS密度、ポリマーの運動性などを調節する。PSと認識結合するたんぱく質(アネキシンV etc.)を用いて、37°C(OFF状態)と40°C(ON状態)におけるPSの表面密度を調べる。PS粒子が炎症細胞の抗炎症作用に与える影響について調べる。肺胞マクロファージを用い、炎症性サイトカイン(TNF-alpha, IL-6, IL-1beta etc.)および抗炎症性サイトカイン(IL-10,TGF-beta etc.)のレベルをEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)により測定する。コントロールとして、筋芽細胞およびアポトーシス筋芽細胞においても同様の評価を行う。PS粒子が、目的細胞表面のPSレセプターを介したシグナルによって、炎症に関わる転写因子を制御しているかについてウエスタンブロッティングにより確認する。具体的には、炎症性サイトカインの転写因子であるNF-kBの活性化に関与するIkBのリン酸化について検討を行う。
反応性ECRプラズマ中電子速度分布関数尾部に関する研究

研究の目的:本研究はプロセシングプラズマ用のコンパクト高効率ECRプラズマ装置を開発する事を目的とし、プラズマ中の反応に重要な電子速度分布関数中特に高エネルギー尾部の形を制御することにある。設計と装置:永久磁石(SmCo)を多極カスプ型に配置した円筒型ECRプラズマ源を設計、製作。円形導波管TE_<11>モードのマイクロ波2.45GH_2を導入。径方向はカスプ磁場、軸方向は端部の逆電界で閉じ込める。基本波、第二高調波共鳴領域は閉じた同軸面になる。電子のbounce運動は隣接磁石列間で行われれ周期はミラー型に比べ短くドリフト不安定性はない。16cmΦ×30cmの寸法で実験したが導波管を遮断波長限界に近付けると内径7.5cmΦ迄小型に出来る。実験:H_2、H_2/CH_4で放電させ速度分布関数の監視、生成分子、イオンとの相関を調べた。永久磁石列の配置を16極よりも8極にする方がプラズマは点火し易く、多極カスプ形状を反映した形が形成された。カスプ領域および軸上でプラズマ密度は1.5×10^<10>、2.5×10^<10>cm^<-3>、等価電子温度(2/3×平均エネルギー)は4、16eVである。電子速度分布係数はプローブによりドリベステン法で測定、特に尾部の測定の為に100、750メッシュのグリッドを用いた静電アナライザを製作した。速度分布はマクスウェル分布からずれ中間エネルギー帯の密度が大で尾部は同一等価電子温度のマクスウエル分布に比較的良く載る。圧力の低い程分布関数尾部が延びる。マイクロ波パワーに対する尾部の延長は緩やかであるがパワーと共にイオン生成率は上昇する。結論:DC放電に比べ低圧で高い等価電子温度を有し密度が1桁以上高いプラズマが生成出来、基板表面の処理、中性ビーム、イオン源として有用である。速度分布制御法として陽極バーに異なる電圧を与え速度分布を制御出来る事、端部のグリッドも密度制御に有効な事が分った。
虚血性神経細胞死におけるカルパイン-カルパスタチン系の役割の解析

虚血によって誘導される神経細胞死におけるカルパイン・カルパスタチン系の役割について以下の点を明らかにした。[1]動物モデルにおいて、虚血時間を変化させることによって生じる神経細胞死の臨界点に着目し、これとカルパイン活性化の初期相および後期相との関連について調べた。その結果、虚血直後のカルパイン活性化ではなく、約24時間後の後期相が細胞死に連動していることが明らかになった。このことは、カルパイン活性化の阻害が、虚血後であっても、比較的早い時間であれば、神経細胞死の予防として有効であることを示唆する。[2]カルパイン特異的阻害蛋白質であるカルパスタチンに対する特異抗体を調整し、虚血後の動態を調べた。その結果、虚血後、一過的にカルパスタチンレベルが上昇するが、その後、カルパインによる分解を受けて、断片化されることが判明した。さらに、虚血に対する耐性の強いCA2錘体細胞においては、カルパスタチンレベルが高いままで維持されることが明らかになった。カルパスタチンの神経細胞防御効果が示唆された。[3]カルパイン活性化を阻害する薬剤としてALLNalやカルペプチンを、リポソームをキャリアとして脳に投与する系を確立した。その結果、カルパイン活性化を阻害することによって、神経細胞死を有効に抑制することに成功した。本研究の臨床応用可能性が大きく広がったと言える。
オロモ語の歯茎入破音の音響音声学的特徴について

平成7年9月にエチオピア人民民主共和国で言語調査をした際、オロモ語ウォレガ方言話者Luboo Tafarii氏に協力してもらい、本研究のテーマである歯茎入破音の音響音声学的特徴を調べるために、歯茎入破音を含む単語をデジタルオ-ディオテープレコーダ及び8ミリビデオテープに収録した。8ミリビデオテープは歯茎入破音の調音時の接触状態を調べるために利用し、デジタルオ-ディオテープは音声分析ソフトに入力するために利用した。以下に現時点で判明した分析結果を記す。1調音状態は舌尖が後部歯茎に接し、舌の裏側が接するようなそり舌化はしていない。なお第2フォルマントと第3フォルマントは閉鎖の前に若干下降することが窺知される。2収録した単語を音声分析ソフト(サウンドスコープ)で分析したところ、オロモ語の母音間にある入破音が閉鎖の開放の直前まで、声帯振動が始まらないので、典型的な有声の入破音と違って、ハウサ語などに報告されているきしり声(creaky voice)の入破音と同質のものであることが分かる。3オロモ語では語頭の位置に入破音がある単語が入破音をなくした母音のみの単語と交替可能であることから、形態音韻論的解釈にこの音響的特徴が利用できる。
地球にダストプラズマリング?-可能性とその実証観測-

本研究では、放射線帯内帯の高エネルギー電子の「ダンベル分布」を理解することに端を発して、大胆な仮説、「地球の周辺には未発見のダストプラズマリングが存在する」、を提唱し、その検証を理論と観測から試みる研究を行っている。1.チリ・アタカマ砂漠における地球ダスト散乱光成分検出観測データの解析ダストの光学観測(観測サイト:チリ・アタカマ砂漠,期間:2003年7月27日より8月1日,対象:日没直後、日出直前の天の赤道方向の黄道光)データから、微弱な地球ダスト光を検出する解析が進められた.詳細な解析の結果,現在のところ,一様帯状に広がる黄道光の中から、磁気赤道に沿って含まれているであろう地球ダスト微弱光の空間分布は検出されていない.この結果をもとに黄道光可視域地上観測では光量が不足することから今後の研究方針が検討され,人工衛星による赤外域の黄道光観測データ(米国COBE衛星,目本あかり衛星)の解析が有望であるとの結論が得られた。2.惑星における微粒子散逸・分布過程の研究木星の衛星イオから放出される火山性ガスが木星の磁気圏に分布していく様相は,本研究がもくろむ地球ダストリングの検出にきわめて有用な情報をもたらす.イオ衛星を起源とするナトリウム分子の散逸過程が観測とシミュレーションによる解析から究明された.これらの結果は,今後の地球ダストリング検出の研究に応用される.本研究では,放射線帯内帯の高エネルギー電子の「ダンベル分布」を理解することに端を発して、大胆な仮説、「地球の周辺には未発見のダストプラズマリングが存在する」、を提唱し、その検証を理論と観測から試みる研究を開始した。(1)チリ・アタカマ砂漠における地球ダスト散乱光成分の検出観測本グループのこれまでの木星プラズマ・大気放射光観測の実績を生かして、高感度・低雑音CCDカメラを用いて、視野角50°、空間分解能10秒角、を満たしかつ長時間露出を可能とする地球ダストプラズマリング撮像装置を完成させ,観測を行った。装置は、フラットフィールド較正,絶対値較正等を行いダスト散乱光観測に必要な性能を確認した後、試験観測を行った。観測地は、光学観測条件(人工光がなく、大気が薄く、かつ連続晴夜)を満たすサイトとしてチリ・アタカマ砂漠が選定された。観測は2003年7月27日より8月1日までの期間にわたり、日没直後、日出直前の天の赤道方向を対称とし、連続観測がおこなわれた。(2)解析手法の開発・改良およびそれに基づく観測データの解析撮像した観測データには、我々がねらいとする地球ダスト光に加えて、大気発(夜光)、星夜光、黄道光が、重畳している。更に観測条件や光学系に起因する大気減光、周辺減光が存在する。これら成分を含むデータから、微弱な地球ダスト光を検出するアルゴリズムの開発が進められ,現在,一様帯状に広がる黄道光の中から、磁気赤道に沿って含まれているであろう地球ダスト微弱光の空間分布抽出が進められている。(1)チリ・アタカマ砂漠における地球ダスト散乱光成分検出観測データの解析ダストの光学観測地として、光学観測条件(人工光がなく、大気が薄く、かつ連続晴夜)を満たすサイトであるチリ・アタカマ砂漠が選定され,2003年7月27日より8月1日までの期間にわたり、日没直後、日出直前の天の赤道方向を対称とし、連続観測がおこなわれた。撮像した観測データには、我々がねらいとする地球ダスト光に加えて、大気発(夜光)、星夜光、黄道光が、重畳している。(2)放射線帯粒子分布の異方性とダスト存在可能性の解析あけぼの衛星で観測される放射線帯高エネルギー電子のピッチ角分布を詳細に調査し,磁気緯度に対する異方性分布,及びその磁気活動度依存性の解析を行った。さらに,衛星へのダストの衝突時に出現すると思われる低周波ノイズの存在およびその分布の解析を行った。これらの解析から,高エネルギー電子ピッチ角異常は,地磁気活動,特に磁気嵐に依存することが示された。1.チリ・アタカマ砂漠における地球ダスト散乱光成分検出観測データの解析ダストの光学観測(観測サイト:チリ・アタカマ砂漠,期間:2003年7月27日より8月1日,対象:日没直後、日出直前の天の赤道方向の黄道光)データから、微弱な地球ダスト光を検出する解析が進められた.詳細な解析の結果,現在のところ,一様帯状に広がる黄道光の中から、磁気赤道に沿って含まれているであろう地球ダスト微弱光の空間分布は検出されていない.

この結果をもとに黄道光可視域地上観測では光量が不足することから今後の研究方針が検討され,人工衛星による赤外域の黄道光観測データ(米国COBE衛星,目本あかり衛星)の解析が有望であるとの結論が得られた。2.惑星における微粒子散逸・分布過程の研究木星の衛星イオから放出される火山性ガスが木星の磁気圏に分布していく様相は,本研究がもくろむ地球ダストリングの検出にきわめて有用な情報をもたらす.イオ衛星を起源とするナトリウム分子の散逸過程が観測とシミュレーションによる解析から究明された.これらの結果は,今後の地球ダストリング検出の研究に応用される.
多連装計数系をもつ放射光粉末回折計を用いた鉱物の高分解能構造解析

平板試料・反射型に基づいた光学系として、世界で初めての多連装計数装置を備えた放射光用粉末回折計を製作し、迅速な高分解能粉末回折データの収集を可能にした。本計画は、平成6年度の装置の設計・製作に始まり、平成7年度初めの高エネ研放射光実験施設への完成した回折計の導入、予備的実験の開始、平成7年度のビームライン改築を経て、平成8年度の粉末回折ステーション共用運転の開始に至るものである。平成8年度においては以下の実験を中心に行った。1)ビームラインモノクロメータ下流におけるミラーの使用により、ピーク頂点強度において1012万counts/sという、極めて高い計数を記録し、高分解能と高強度を同時に実現できることが示された。2)種々のアナライザー結晶による分解能への影響に関する研究を行った。その結果、観測された分解能曲線の変化は、使用したモノクロメータ結晶およびアナライザー結晶に基づいて計算された理論曲線と良い一致を示した。3)種々の鉱物結晶の構造をリ-トベルト法を用いて構造の精密化を行った結果、単結晶法によって求められた構造パラメータと極めてよい一致を示し、粉末法によって単結晶法と同レベルの構造解析ができることが示された。4)運用の習熟とともに各種装置・実験パラメータの最適化が行われた結果、通常、1日に3本の高分解能データを測定できることが示された。以上により、高分解能粉末回折データの収集として、極めて高効率の実現がなされた。1)計画初年度において多連装計数系を備えた放射光用粉末回折装置を設計・製作した。回折装置は入射スリット部、入射強度モニター部、ゴニオメータ部、計数部、計数回路部、コントロール部からなる。入射スリット部およびゴニオメータ部は、架台の上において、それぞれ独立に、あるいは連動してパルスモータにより外部から上下動できる。計数部は25°おきに扇状に5本設置された多連装計数部、および種々のアナライザーを設置できる多目的アームからなる。計数はシンティレーションカウンターを用いる。2)平成7年度以後は、次のような研究の展開を行う予定である。製作した粉末回折装置の試験運用を筑波高エネルギー物理学研究所・放射光実験施設にて行う。そこにおいては、まず装置の調整として計数系の調整、標準試料を用いたプロファイルの測定、多連装計数管同志の調整最適化を行う。次に、構造既知の試験用試料を用いて構造解析を行い、解析精度の評価、複雑な結晶の鉱物結晶の構造解析を行う。本研究は、平板試料・反射型としては世界で初めての多連装計数系を備えた放射光用粉末回折装置を設計・製作し、それを用いて高分解能粉末回折データを収集し、鉱物をはじめ、多くの無機結晶の構造を明らかにすることを目的としている。平成6年度よりスタートした本研究の初年度において、回折計の基本設計、詳細設計を行い、装置の製作を行った。平成7年度においては、まず、4月につくばの高エネルギー物理学研究所・放射光実験施設に装置を搬入・据え付けを行った。ついで、5月、6月に最初の放射光を用いた実験を行い、分解能・強度に関する基本データを収集した。その結果、分解能は半値幅で0.022°、強度は40,000counts/sと、この高分解能において極めて高強度を記録し、しかも従来の1/5の時間で測定できることが実証された。その後、夏の期間においてビームラインの改修がなされ、秋の実験期間中においては、11月、12月にそれぞれ新しくミラーを備えた光学系を用いて実験を行った。そ結果、集光のために分解能が若干下がったものの、強度では100,000120,000counts/sと、従来にない高強度が得られることが示された。また、装置の実用性を示すため、リ-トベルト法を用いた鉱物結晶の構造解析を行った。

平板試料・反射型に基づいた光学系として、世界で初めての多連装計数装置を備えた放射光用粉末回折計を製作し、迅速な高分解能粉末回折データの収集を可能にした。本計画は、平成6年度の装置の設計・製作に始まり、平成7年度初めの高エネ研放射光実験施設への完成した回折計の導入、予備的実験の開始、平成7年度のビームライン改築を経て、平成8年度の粉末回折ステーション共用運転の開始に至るものである。平成8年度においては以下の実験を中心に行った。1)ビームラインモノクロメータ下流におけるミラーの使用により、ピーク頂点強度において1012万counts/sという、極めて高い計数を記録し、高分解能と高強度を同時に実現できることが示された。2)種々のアナライザー結晶による分解能への影響に関する研究を行った。その結果、観測された分解能曲線の変化は、使用したモノクロメータ結晶およびアナライザー結晶に基づいて計算された理論曲線と良い一致を示した。3)種々の鉱物結晶の構造をリ-トベルト法を用いて構造の精密化を行った結果、単結晶法によって求められた製造パラメータと極めてよい一致を示し、粉末法によって単結晶法と同レベルの構造解析ができることが示された、4)運用の習熟とともに各種装置・実験パラメータの最適化が行われた結果、通常、1日に3本の高分解能データを測定できることが示された。これは高分解能粉末回折データの収集として、極めて高効率の実現である。
神経細胞死を制御する14-3-3タンパクの分子調節機構の解明

本研究課題の目的は、細胞内タンパク質である14-3-3proteinの神経細胞における機能的役割を解明し、また小児神経疾患におけるその診断と治療への応用性を明らかにすることである。分子生物学的側面としては、細胞内における14-3-3proteinとASK1の相互作用、および14-3-3proteinがApoptosis Signal-regulating Kinase 1(ASK1)の酵素基質かどうかを検討した。ASK1および14-3-3proteinのrecombinant proteinを用いたin vitro kinase assayで基質になることを確認した。この際ASK1のauto-phosphorylationが阻害されることから両タンパクの相互作用がリン酸化に影響していることが判明した。臨床医学的側面からは、ヒト髄液中に含まれる14-3-3proteinの疾患関連性およびその検出意義について解析を行った。中でも小児の小脳疾患における検出意義の解析を中心に進め、小脳炎、小脳失調症、遺伝性小脳性疾患で髄液中に14-3-3proteinが検出された。さらに黄色ブドウ球菌を原因菌とするToxic shock syndromeでも小脳症状が出現し髄液中から14-3-3proteinが検出された。この時頭部MRIでは病変部を描出できず、14-3-3proteinが小脳疾患の急性期疾患マーカーとして有用であることが示唆された。14-3-3proteinには7つのisoformが存在するが、その特異的抗体が数社から発売されている。それらの比較検討を行い、isoformごとの有用性を検討し、髄液中14-3-3proteinの測定が臨床上有用な疾患マーカーになることが本研究で示された。(764字)。(764字)。本研究課題の目的は、細胞内タンパク質である14-3-3 proteinの神経細胞における機能的役割を解明し、また小児神経疾患におけるその診断と治療への応用性を明らかにすることである。本年度の研究実施計画と達成状況について報告する。(1)分子生物学的側面としては、細胞内における14-3-3 proteinとASK1の相互作用、および14-3-3 proteinがASK1の酵素基質かどうかの検討を行っている。ASK1および14-3-3 proteinのrecombinant proteinを作成し、それを用いたinvitrokinaseassayを今後行ってゆく。現在のpreliminary dataでは、大腸菌で作成したrecombinant ASK1でもキナーゼ活性はよく保たれており、その機能維持性から種問で高度に保存されたタンパク質であることも推定された。(2)臨床医学的側面からは、ヒト髄液中に含まれる14-3-3 proteinの疾患関連性およびその検出意義について解析を行っている。髄液中には様々なタンパク質が含まれるが、14-3-3 proteinは脳神経細胞重量の1%を占めるため、その検出は脳神経細胞の破壊を反映するとされる。また14-3-3 proteinには7つのisoformがあり、その検出パターンは罹患障害部位を反映することが知られている本年度もヒト髄液中の14-3-3 proteinの解析を継続した。特筆すべき成果は小脳疾患における陽性率の高さを証明したことである。小児における小脳疾患はまれでありその疾患マーカーは存在しない。従って診断は臨床症状と頭部MRIにより原因不明のことも多い。我々は小児の小脳疾患7例(小脳炎2名、小脳失調症2名、小脳萎縮3名)についてその髄液中14-3-3 proteinを解析し6例で陽性であった。

陽性例全例で頭部MRI画像上単独の小脳病変を認め、その由来が小脳であることを確かめた。中でも慢性進行性小脳疾患である乳児神経軸索ジストロフィー症では、疾患の進行に平行して髄液中14-3-3 proteinが検出され、高度の萎縮が完成した段階で検出されなくなったため、小脳疾患マーカーとして有用であることが推定された。また14-3-3 proteinのisofom解析では14-3-3 epsilonのみが検出され、罹患部位の推定に有用であることが示唆された(787字)。本研究課題の目的は,細胞内タンパク質である14-3-3proteinの神経細胞における機能的役割を解明し,また小児神経疾患におけるその診断と治療への応用性を明らかにすることである。分子生物学的側面としては,細胞内における14-3-3proteinとASKLの相互作用,および14-3-3proteinがApoptosis Signal-regulating Kinase 1(ASKl)の酵素基質かどうかを検討した。ASK1および14-3-3proteinのrecombinant proteinを用いたin vitro kinase assayで基質になることを確認した。この際ASK1のauto-phosphorylationが阻害されることから両タンパクの相互作用がリン酸化に影響していることが判明した。臨床医学的側面からは,ヒト髄液中に含まれる14-3-3proteinの疾患関連性およびその検出意義について解析を行った。中でも小児の小脳疾患における検出意義の解析を中心に進め,小脳炎,小脳失調症,遺伝性小脳性疾患で髄液中に14-3-3proteinが検出された。さらに黄色ブドウ球菌を原因菌とするToxic shock syndromeでも小脳症状が出現し髄液中から14-3-3 proteinが検出された。この時頭部MRIでは病変部を描出できず,14-3-3 proteinが小脳疾患の急性期疾患マーカーとして有用であることが示唆された。14-3-3proteinには7つのisoformが存在するが,その特異的抗体が数社から発売されている。それらの比較検討を行い,isoformごとの有用性を検討した。これらにより今後より効率的に髄液中14-3-3proteinを検出することが可能になった。このように髄液中14-3-3proteinの測定が臨床上有用な疾患マーカーになることが本研究で示された。(794字)。