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気相法による化学電池用導電性多孔質体の合成に関する研究

本研究では、化学電池の高速充放電、サイクル特性などの向上を目的に、化学蒸着法の一種である化学気相含浸法(CVI)により、高導電性機能を有した多孔質体を合成し、二次電池の高性能集電フィラーとして適用して、三次元的構造を有する新しい電極構成の構築を行った。各種木質炭化物を基質として用い、CVI法によってTiNを部分充填することにより多孔質体を作製した。脱脂綿、ろ紙、木材炭素化物から得られたTiN多孔質体は、高い空隙率と低い抵抗率を示し、内部に三次元的導電ネットワークをもつ構造を有していた。合成したTiN多孔質体をリチウムイオン二次電池集電体として利用し、内部に活物質を充填することで、良好な電気的接触を保持しながら電極を厚肉化することができた。本電極は、高速放電特性、サイクル特性に優れていることを見出した。本研究では、化学蒸着法の一種である化学気相含浸法により、高導電性機能を有した多孔質体を合成し、二次電池の高性能集電フィラーとして適用、三次元的構造を有する新しい電極構城の構築を目的とする。本年度は、基質に、安価な天然素材(綿布、脱脂綿、木材、紙)の炭素化物を用い、窒化チタンをコーティングすることで高導電性多孔体の合成を試み、合成条件と多孔質体物性、導電性特性との関係について検討した。綿布、脱脂綿、紙解離繊維、木材は、1000°C、アルゴンガス流中で炭素化し基質(プリフォーム)とした。これらプリフォームは、綿布を除きいずれも空隙率80%以上、平均細孔径10から50μm程度を有し、二次電池用集電フィラーへ適用可能と判断した。作製したプリフォームに、圧力パルスCVI法を用いて、本年度は1%TiCl_4-10%N_2-H_2ガス系からの850°CでのTiNの析出を検討した。なお、当該ガス系用の装置を新規自作した。SEM観察から、膜厚0.51μm程度のTINが炭素繊維もしくは炭素壁上に均一に析出していることがわかり、炭素基質とTiN薄膜との問にはクラックなどは観察されず、密着性はよいものと考えられた。本研究で得られた多孔質TiNの空隙率、つまり活物質を充填可能な空間の割合を、従来の金属箔集電体を利用した電極と比較すると、綿布炭化物を用いた場合は同程度であるが、脱脂綿、及び木材炭化物を用いた場合は大きくなることを見出した。この結果は、脱脂綿、及び木材炭化物から得た多孔質TiNを集電体として用いた方が、従来の金属箔集電体より単位体積当たりの容量の増加が期待できることを示している。又、単位体積当たりの幾何学的表面積を比較すると、多孔質TiNでは、いずれも従来電極より大きくなることがわかった。この結果は活物質と集電体の接触面積が大きくなることを示しており、電気的接触の点で有利となり、電池の内部抵抗の低下が期待できる。本研究では、化学蒸着法の一種である化学気相含浸(CVI)法により、高導電性機能を有した多孔質体を合成し、二次電池の高性能集電フィラーとして適用、三次元的構造を有する新しい電極構成の構築を目的とする。本年度は前年度に引き続き、基質に安価な天然素材の炭素化物を用い、TiNをコーティングすることで高導電性多孔体の合成し、合成条件と多孔質体物性、導電性特性との関係について詳細に検討し、多孔質特性と導電特性の間の関係を導いた。綿布、脱脂綿、紙繊維、木材を、1000°C、アルゴンガス流中で炭素化し基質(プリフォーム)とした。これらプリフォームは、綿布を除きいずれも初期空隙率(ε_o)88%以上、平均細孔径10から50μm程度を有し、基質としては脱脂綿、紙繊維、木材が適当とした。作製したプリフォームに、圧力パルスCVI法を用いて、1%TiCl_4-10%N_2-H_2ガス系からの850°CでTiNを析出させた。TiNの充填率F_<TiN>は処理時間(パルス数)に比例して増加した。パルス数10,000の処理で、残存空隙率80%以上を保持しながら、比抵抗10^<-6>Ωm以下を示し、二次電池用集電フィラーへ適用可能と判断した。

モデル計算により、比抵抗はF_<TiN>に反比例的に減少し、析出相の抵抗率に比例して増加することを予想した。計算結果は実験結果によく一致した。F_<TiN>の増加には限界があるため、より抵抗の低い多孔質体を合成するには析出相の抵抗率を下げる必要がある。析出相のTi/N比は化学量論比からずれていることがわかった。TiNの抵抗率は、Ti/N比に強く影響されるため、今後、合成条件をさらに変化させ、Ti/N比の異なる析出物を被膜し導電性の向上を検討する。さらに、リチウムイオン二次電池活物質となる熱分解炭素を、合成した多孔質体に充填し、高速充放電特性の向上の可能性を判断する。本研究では、化学蒸着法の一種である化学気相含浸(CVI)法により、高導電性機能を有した多孔質体を合成し、二次電池の高性能集電フィラーとして適用、三次元的構造を有する新しい電極構成の構築を目的とする。前年度までに、基質に安価な天然素材の炭素化物を用いTiNをコーティングすることで、残存空隙率80%以上を保持しながら、比抵抗10^<-6>Ωm以下を示す導電性多孔質体を合成でき、二次電池用集電フィラーとして適用可能であることを見出した。本年度は、リチウムイオン二次電池活物質となる熱分解炭素を合成した多孔質体に充填し、高速充放電特性(レート特性)の向上の可能性について検討した。紙繊維炭素化物/TiN多孔質体に、パルスCVI法により、30%C_3H_8-H_2ガス系から950°Cで活物質として熱分解炭素を充填した。本プロセスにより、有機バインダーや導電助材のない、三次元的に導電ネットワークを含有した負極を作製することができた。電流密度を変化させ容量を測定したところ、得られた負極は1000mA/gと高い電流密度下でも、25mA/gでの容量の80%以上を維持しており、良好なレート特性を示すことを明らかにした。又、60サイクル後の容量は、初期値の92%を維持しており、良好なサイクル特性を示すことを明らかにした。TiNコーティング膜上に析出した熱分解炭素は、結晶性がやや低く結晶子の配向が乱れ、数nm以下のメソ孔を含有することがわかった。このような微構造を反映し、得られた熱分解炭素は、黒鉛の理論容量(372mAh/g)より高い容量である460mAh/gを有することを見出した。以上の成果より、本研究で合成した導電性多孔質体は、高容量、良好なレート特性、サイクル特性を併せ持つ高性能リチウムイオン二次電池電極を作製するための導電フィラーとして有望であると期待される。
工学における逆問題の適切性の数学的研究とその工学への反映

本研究課題においては広領域にわたる研究組織の下で、数理工学において基礎方程式として現れる流体あるいはラプラス場、振動系における逆問題ならびに材料特性・負荷の決定に関わる逆問題についてその一意性ならびに安定性などの適切性の構造が数理解析的立場から解明された.さらに数理解析的成果から効率的かつ合理的な数値解析手法の開発にむけた研究がなされた。工学とその関連分野における逆問題の研究に関して、数理解析と数値解析的側面の両面にわたる研究者の組織化が本研究課題の大きな特色であるが,それと同時に本研究組織には広い専門分野から分担者が加わっているので、先端工業技術などの支援のためにも機敏に適応し、総合的見地から寄与することが可能であった。数理解析的側面においては、伝統的な数学解析の見地から不適切な問題とされて研究がなおざりにされてきたさまざまな逆問題の適切性の構造が解明された。本課題におけるこのような研究成果としては、カ-レマンによる偏微分方程式に関する古典的な評価による逆問題の解の一意性の成果および制御論によって逆問題の一意性から安定性を導く手法,非適切性成分の数学的研究などをあげることができる.逆問題の一意性に関しては,この分野の第一線にある研究者をアメリカ,ロシア,フランスなどから日本に招せいして集中的に討論・研究連絡を行なった.これらの理論的成果は逆問題の数値解析に結合されるべきものであり、特に前項の非適切成分の研究などは信頼性のある数値解法のために応用されつつある.本研究課題においては広領域にわたる研究組織の下で、数理工学において基礎方程式として現れる流体あるいはラプラス場、振動系における逆問題ならびに材料特性・負荷の決定に関わる逆問題についてその一意性ならびに安定性などの適切性の構造が数理解析的立場から解明された.さらに数理解析的成果から効率的かつ合理的な数値解析手法の開発にむけた研究がなされた。本課題におけるこのような研究成果としては、カ-レマンによる偏微分方程式に関する古典的な評価による逆問題の解の一意性の成果および制御論によって逆問題の一意性から安定性を導く手法,非適切性成分の数学的研究などをあげることができる.逆問題の一意性に関しては,この分野の第一線にある研究者をアメリカ,ロシア,フランスなどから日本に招せいして集中的に討論・研究連絡を行なった.これらの理論的成果は逆問題の数値解析に結合されるべきものであり、特に前項の非適切成分の研究などは信頼性のある数値解法のために応用されつつある.平成6年7月21日から7月25日まで京都大学・理学部において日本・ロシア合同で逆問題に関する研究集会が開催され、本研究課題の研究分担者が参加し、工学における応用逆問題の適切性に関する理論的成果ならびにそれを踏まえた数値解析についての研究を発表した。ロシアからの参加者も交えて、活発な討論がなされた。平成6年7月27日から7月30日まで大阪工業大学において第2回国際会議『数理工学における逆問題』が開かれ、本研究課題の研究分担者が参加し、国際的視野の下で、研究成果の交換、今後の逆問題の理論面からの研究と実践面のための研究の共同体制をどのように進めていくかについても議論がなされた。上記の2つの研究集会の議事録は来年度に出版される予定である。平成7年2月9日から2月11日まで東京大学大学院・数理科学研究科において本研究課題による応用逆問題に関する研究集会を開催した。本研究課題の初年度における集会であることを考慮して、研究分担者の相互の知見の交換を十分に行うため、講演件数をしぼり、実用面からの要請から重要なさまざまな逆問題についての研究成果が発表された。さらにそのような研究に逆問題の適切性の数学からの研究を有効に応用するための議論もなされた。平成7年2月21日から2月23日まで島根大学において不適切問題・逆問題に関する研究集会が本研究課題によって開かれ、重要ではあるが不適切とされて理論的な研究がさかんでなかった多様な問題について分担者によって解説・意見交換が行われた。本研究課題においては広領域にわたる研究組織の下で、数理工学において基礎方程式として現れる流体あるいはラプラス場、時間について非定常な系における逆問題ならびに材料特性・負荷の決定に関わる逆問題についてその適切性の構造が数理解析的立場から解明され、その成果に基づいて効率的かつ合理的な数値解析手法の開発がなされた。工学における逆問題の研究に関して、数理解析と数値解析的側面の両面にわたる研究者の組織化が本研究課題の大きな特色であるが,それと同時に本研究組織には広い専門分野から分担者が加わっているので、先端工業技術などの支援のためにも機敏に適応し、総合的見地から寄与することが可能であった。数理解析的側面においては、従来の考え方では一律に不適切な問題とされて研究が行われなかったさまざまな逆問題の適切性の構造が解明された。本課題においてこのような方向性をもった研究としては、カ-レマンによる偏微分方程式に関する古典的な評価および不適切性が集合論的に稀にしか起こらないことを主張する『一般化された適切性』の研究などを挙げることができる。

これらの理論的成果は逆問題の数値解析に結合されるべきものであり、本研究組織の下で、併せて信頼性のある数値解法が開発された。さらに、数理解析的成果として,逆問題の『一般化された適切性』ならびに『適切成分』の解明がなされ,その数値解析が遂行された.本研究課題においては広領域にわたる研究組織の下で、数理工学において基礎方程式として現れる流体あるいはラプラス場、振動系における逆問題ならびに材料特性・負荷の決定に関わる逆問題についてその一意性ならびに安定性などの適切性の構造が数理解析的立場から解明された.さらに数理解析的成果から効率的かつ合理的な数値解析手法の開発にむけた研究がなされた。工学とその関連分野における逆問題の研究に関して、数理解析と数値解析的側面の両面にわたる研究者の組織化が本研究課題の大きな特色であるが,それと同時に本研究組織には広い専門分野から分担者が加わっているので、先端工業技術などの支援のためにも機敏に適応し、総合的見地から寄与することが可能であった。数理解析的側面においては、伝統的な数学解析の見地から不適切な問題とされて研究がなおざりにされてきたさまざまな逆問題の適切性の構造が解明された。本課題におけるこのような研究成果としては、カ-レマンによる偏微分方程式に関する古典的な評価による逆問題の解の一意性の結果および制御論によって逆問題の一意性から安定性を導く手法,非適切性成分の数学的研究などをあげることができる.逆問題の一意性に関しては,この分野の第一線にある研究者をアメリカ,ロシア,フランスなどから日本に招せいして集中的に討論・研究連絡を行なった.これらの理論的成果は逆問題の数値解析に結合されるべきものであり、特に前項の非適切成分の研究などは信頼性のある数値解法のために応用されつつある.
神経線維腫症1型及び2型遺伝子産物の細胞内腫瘍抑制機構の解析

神経線維腫症1型(NF1)及び2型(NF2)の病態発症予防・治療の基礎的情報を得るため、これらの原因遺伝子産物(NF1蛋白;neurofibromin, NF2蛋白;merlin)の細胞内機能を解析した。NF1においては、SiRNAによるNF1蛋白質のノックダウン法の確立を行い、NF1蛋白質の欠失による細胞内シグナル・細胞骨格の変化を生化学・形態学的に解析するとともに、NF1高変異部位であるC末端部位に対する結合タンパク質をプロテオミクスの手法を用いて解析した。NF1蛋白質ノックダウン細胞においては、特異的Ras-PI3Kシグナルの活性化、それに伴う細胞骨格異常、細胞膜ruffling,細胞運動能の方進が観察された.又、neurofibrominのリン酸化を制御する細胞内結合蛋白質(N-G, N-G-dimethylarginine dimethylamino-hydrolase ; DDAH)(No制御因子)、そのリン酸化を特異的に認識するアダプター蛋白質14-3-3がneurofibromin結合タンパク質として同定された。さらに14-3-3はneurofibrominのC末端部のリン酸化クラスター部位(Ser2576,Ser2578,Ser2580,Ser2813,Thr2556)に結合してGAP活性を抑制することが判明した。neurofibrominは細胞内にてGAP活性を制御することによってRAS活性を調節しており、その過程にはneurofibrominのリン酸化、及びそれを制御する結合蛋白群の相互作用が重要であることが示唆された。一方、Merlinに関してはプロテオミクスの手法によって、DNA修復酵素であるPARPやKu75,Ku80,DNA-Pks含む8つの細胞内結合蛋白質が同定された。これらの相互作用によってpoly ADP-ribosylationを受けること、これらの結合蛋白質と核・細胞質・膜へのシャトルするためのスカフォードとして機能していること、さらには核へ移行したMerlinが、各種遺伝子の転写調節に関わっている可能性があきらかとなった。プロテオミクスによる、細胞内NF1,NF2関連分子の検索はこれらを介した細胞内シグナル解析と新規治療薬の開発に応用できる可能性があり、今後の詳細な解析が期待される。腫瘍抑制遺伝子NF1及びNF2は、多発性神経系良性腫瘍を特徴とする神経線維腫症1型、及び2型(NF1,NF2)の原因遺伝子として同定された。我々はこれまでに患者腫瘍組織における特異的な構造変異パターンや、これらの遺伝子高変異部位に特異的に結合する細胞内蛋白質を検出・同定して機能解析することによって、細胞機能破綻(腫瘍化)との関連性を提唱している。本研究では、NF1,NF2蛋白の特異的細胞内機能を明らかにし、これらの異常によるいかなる機能破綻が細胞を腫瘍化に導くものであるかを解明することを目的として解析し、以下の結果を得た。NF1-/-マウス胎児線維芽細胞(MEF)内においては、EGFやFCS刺激による恒常的なRasの活性化に伴いPI3K及びMAPK-ERKシグナルの過剰な活性化と、細胞膜ruffling,細胞運動能の亢進が観察され、NF1蛋白が細胞骨格系調節に重要であることが判った。

又神経細胞内ではRasの活性を制御して正常な神経細胞の神経突起伸展形成に重要な調節分子であり、これにNF1mRNAの可変スプライシングが関与していることが判明し、この現象とNF1の病態の一つである学習障害が大きく関連している可能性を示唆した。一方、NF2蛋白はDNA傷害性の刺激やLMB処理によって細胞核に局在してDNA修復酵素群と相互作用したが、同時に核移行した接着因子CD44細胞内ドメインと相互作用しTREを介した転写調節に関わっていた。NF2蛋白は結合蛋白質群を介して細胞膜では細胞接着、核内においてはDNA修復と転写調節分子として機能することが示唆された。両NF蛋白質の細胞内機能を解析することは、神経系腫瘍に共通する病態発生機構を明らかにする重要なステップでもあると考えられ、現在、検出された細胞内結合蛋白質との相互佑用機構をさらに詳細に解析している。神経線維腫症1型(NF1)及び2型(NF2)の病態発症予防・治療の基礎的情報を得るため、これらの原因遺伝子産物(NF1蛋白;neurofibromin,NF2蛋白;merlin)の細胞内機能を解析した。NF1においては、SiRNAによるNF1蛋白質のノックダウン法の確立を行い、NF1蛋白質の欠失による細胞内シグナル・細胞骨格の変化を生化学・形態学的に解析するとともに、NF1高変異部位であるC末端部位に対する結合タンパク質をプロテオミクスの手法を用いて解析した。NF1蛋白質ノックダウン細胞においては、特異的Ras-PI3Kシグナルの活性化、それに伴う細胞骨格異常、細胞膜ruffling,細胞運動能の亢進が観察された。又、neurofibrominのリン酸化を制御する細胞内結合蛋白質(N-G, N-G-dimethylarginine dimethylamino-hydrolase ; DDAH)(NO制御因子)、そのリン酸化を特異的に認識するアダプター蛋白質14-3-3がneurofibromin結合タンパク質として同定された。さらに14-3-3はneurofibrominのC末端部のリン酸化クラスター部位(Ser2576,Ser2578,Ser2580,Ser2813,Thr2556)に結合してGAP活性を抑制することが判明した。neurofibrominは細胞内にてGAP活性を制御することによってRAS活性を調節しており、その過程にはneurofibrominのリン酸化、及びそれを制御する結合蛋白群の相互作用が重要であることが示唆された。一方、Merlinに関してはプロテオミクスの手法によって、DNA修復酵素であるPARPやKu75,Ku80,DNA-Pks含む8つの細胞内結合蛋白質が同定された。これらの相互作用によってpoly ADP-ribosylationを受けること、これらの結合蛋白質と核・細胞質・膜へのシャトルするためのスカフォードとして機能していること、さらには核へ移行したMerlinが、各種遺伝子の転写調節に関わっている可能性があきらかとなった。プロテオミクスによる、細胞内NF1,NF2関連分子の検索はこれらを介した細胞内シグナル解析と新規治療薬の開発に応用できる可能性があり、今後の詳細な解析が期待される。
ラット異系間膀胱移植モデルの作成と生着率、組織学的検討

膀胱移植における急性拒絶反応の発現様式を確認するために、ドナーとして250-350gの雄BNラット、レシピエントとして250-350gの雄ルイスラットを用いた膀胱移植を行った。移植後、免疫抑制剤は投与せず、移植後4日、6日、8日、10日、12日、14日目にラットの移植膀胱を摘出し、移植膀胱と固有膀胱の組織変化を観察した。移植後8日目の組織に関しては、tunnel法によりアポトーシスの存在の確認を行った。移植後6日目には全例血流が保たれていたが、移植後8日目には移植膀胱への血流は閉塞していた。移植膀胱の組織学的変化は、まず移植後4日目には上皮および筋層内への炎症細胞浸潤は極く軽度であり、組織構築にも変化はみられなかったが、移植後6日目には、粘膜下層への細胞浸潤が見られ始めた。移植後8日目には粘膜下層への細胞浸潤および出血がみられ上皮内へのリンパ球浸潤がより顕著になり、tunel染色によりアポトーシスが上皮内で起こっていることが確認された。移植後10日目には移行上皮の脱落が見られ始め、粘膜下層では出血が起こり、筋層においては筋構築が崩れ壊死が起こり始め、移植後12日目には、上皮は完全に脱落し粘膜下層筋層共に壊死に陥った。本研究で確認された急性拒絶反応の発現様式を整理すると、まずリンパ球を中心とした炎症細胞浸潤が粘膜下層を中心に起こり始め、粘膜下層は浮腫・繊維化が起こる。上皮にはリンパ球による細胞浸潤が起こり、これによりアポトーシスが誘発される。筋層にも細胞浸潤が起こり筋細胞にも障害が起こり始める。細動脈の内膜肥厚や内皮細胞の腫大の結果動脈は閉塞し粘膜下層には出血梗塞が起こり、この血流障害により移行上皮は脱落し、筋組織は細胞浸潤による組織障害とあいまって壊死に陥っていくものと考えられた。まず、ラットを用い膀胱移植における膀胱の保存実験を行い、保存時間を5時間以内、24時間、48時間の3群にわけ膀胱の保存時間の検討を行い、臓器摘出から移植まで膀胱の場合24時間までは可能であることを確認し報告した。異型間膀胱移植モデルの作成は、ドナー(BNラット)より摘出した膀胱をレシピエント(LEWラット)に移植することにより行い、移植後4日、6日、8日、10日、12日、14日における膀胱の変化を観察し、膀胱の急性拒絶反応の発現の様式の検討を行った。膀胱粘膜下層及び筋層に炎症細胞が浸潤し始め、移植後10日あたりでは、膀胱上皮の脱落が見られ始めた。また、移植後14日目では膀胱の筋構築はくずれ壊死に陥りかけていることが観察された。このように、膀胱の拒絶反応の様式につき組織学的に細かく検討を加えた上、免疫抑制剤の投与によりいかに急性拒絶反応が抑制されていくかを観察し、免疫抑制剤の至適投与量の検討を行う予定である。免疫抑制剤は、サイクロスポリンを用い非投与群、5mg/kg筋注群、10mg/kg筋注群、15mg/kg筋注群に分け、移植後2週間、4週間、8週間、12週間における生着率と組織学的検討を行う予定である。また、腎移植などの急性拒絶反応の初期において、アポトーシスの発現頻度が高まることが報告されていることより、膀胱移植の急性拒絶反応時のアポトーシスの発現や免疫抑制下におけるアポトーシスの発現を観察することにより急性拒絶反応の早期診断や治療の指標の一つとするための検討を行なっている。

前年度に、膀胱移植における急性拒絶反応の発現様式を確認するために、ドナーとして250-350gの雄BNラット、レシピエントとして250-350g雄ルイスラットを用いた膀胱移植を行った。移植後、免疫抑制剤は投与せず、移植後4日、6日、8日、10日、12日、14日目にラットの移植膀胱を摘出し、移植膀胱と固有膀胱の組織変化を観察した。今年度は、急性拒絶反応の発症とその進展様式とアポトーシスの関連性を検討するために、tunnel法によりアポトーシスの存在の確認を行った。移植膀胱の組織学的変化は、まず移植後4日目には上皮および筋層内への炎症細胞浸潤は極く軽度であり、組織構築にも変化はみられなかったが、移植後6日目には、粘膜下層への細胞浸潤が見られ始めた。移植後8日目には粘膜下層への細胞浸潤および出血がみられ上皮内へのリンパ球浸潤がより顕著になり、tunel染色によりアポトーシスが上皮内で起こっていることが確認された。移植後10日目には移行上皮の脱落が見られ始め、粘膜下層では出血が起こり、筋層においては筋構築が崩れ壊死が起こり始め、移植後12日目には、上皮は完全に脱落し粘膜下層筋層共に壊死に陥った。本研究で確認された急性拒絶反応の発現様式を整理すると、まずリンパ球を中心とした炎症細胞浸潤が粘膜下層を中心に起こり始め、粘膜下層は浮腫、繊維化が起こる。上皮にはリンパ球による細胞浸潤が起こり、これによりアポトーシスが誘発される。筋層にも細胞浸潤が起こり筋細胞にも障害が起こり始める。細動脈の内膜肥厚や内皮細胞の腫大の結果動脈は閉塞し粘膜下層には出血梗塞が起こり、この血流障害により移行上皮は脱落し、筋組織は細胞浸潤による組織障害とあいまって壊死に陥っていくものと考えられた。
燃焼風洞における入口化学種の着火・燃焼におよぼす影響

Vitiatedヒ-タ型の燃焼風洞に対し,数値流体力学(CFD)的手法により,実際の超音速燃焼風洞の幾何学形状を与え,風洞内の化学非平衡反応流れを計算して燃焼生成物の影響を調べた結果,以下の知見を得た.・Vitiated airを用いた燃焼風洞では,通常の高温空気を用いる風洞に比して,圧力・温度の変化が緩慢になる.すなわち,衝撃波直後や循環領域など,圧力・温度のあがるべき場所で温度・圧力が高温空気ほど上がりきれず,膨張波領域など温度・圧力の下がるべき場所で,高温空気ほど下がりきれない.・そのオーダーは数パーセントであるが,温度が2000[K]近い流れ場では数100[K]の差となり,燃焼場に多大な影響を与える.・これらの原因は主に,vitiatedヒ-タで生じた水蒸気成分によって混合気の物性が(高温空気に比して)変化しているためであり,vitiatedヒ-タで生じた活性化学種(O,H,OH)の影響は小さい.・強く燃焼している領域にvitiated airが流入すると,H_2Oが解離して活性化学種OH,Hが増加するが,その存在によって反応が加速されることはなく,解離反応が吸熱反応であるため燃焼場の温度が下がって燃焼は抑制される.Vitiatedヒ-タ型の燃焼風洞に対し,数値流体力学(CFD)的手法により,実際の超音速燃焼風洞の幾何学形状を与え,風洞内の化学非平衡反応流れを計算して燃焼生成物の影響を調べた結果,以下の知見を得た.・Vitiated airを用いた燃焼風洞では,通常の高温空気を用いる風洞に比して,圧力・温度の変化が緩慢になる.すなわち,衝撃波直後や循環領域など,圧力・温度のあがるべき場所で温度・圧力が高温空気ほど上がりきれず,膨張波領域など温度・圧力の下がるべき場所で,高温空気ほど下がりきれない.・そのオーダーは数パーセントであるが,温度が2000[K]近い流れ場では数100[K]の差となり,燃焼場に多大な影響を与える.・これらの原因は主に,vitiatedヒ-タで生じた水蒸気成分によって混合気の物性が(高温空気に比して)変化しているためであり,vitiatedヒ-タで生じた活性化学種(O,H,OH)の影響は小さい.・強く燃焼している領域にvitiated airが流入すると,H_2Oが解離して活性化学種OH,Hが増加するが,その存在によって反応が加速されることはなく,解離反応が吸熱反応であるため燃焼場の温度が下がって燃焼は抑制される.
ボツリヌス毒素伝達機構の解明に向けたファージゲノムの解析

c-stファージは、典型的なC型ボツリヌス毒素変換ファージである。以前に、c-stファージのゲノム解析を行ったが、その大部分の遺伝情報は不明であった。本ファージの毒素遺伝子の水平伝播を明らかにするため、c-stファージのコアゲノム領域を調べた。まず最初に、c-stファージの構造タンパク質をコードする遺伝子が98.5-157.5 kbpの領域に存在すると考えられた。次に、同種ファージであるc-468ファージとの比較ゲノム解析を行うと、43-57 kbpと116.5-123 kbpの領域が欠損していた。さらに、c-stファージゲノムの175.5-178.5 kbpの領域の遺伝子産物が、プラスミド分配に関与していることが明らかとなった。これらの結果から、c-stファージゲノムの1-43 kbpと57-116.5 kbp、123-186 kbpの領域がファージ生命維持に必要なコアゲノムであることが分かった。C型ボツリヌス毒素産生菌は、家畜に強力な致死作用を引き起こすため、畜産分野では脅威となっている。C型毒素遺伝子は、バクテリオファージ(ファージ)により伝播される(ファージ変換)。以前に、C型毒素変換ファージc-stの全ゲノム解析を行った。しかしながら、その大部分の遺伝子情報は未知であった。毒素遺伝子のファージ変換防止には、ファージ遺伝情報の解明が必要である。本研究では、ファージコアゲノム領域の特定を行うことを目的とした。今年度は、1)c-stを構成する構造タンパク質をコードする遺伝子群の特定、2)同種ファージC型毒素変換ファージc-468との比較ゲノム解析を行い、ファージの生命維持に必要なコアゲノムの推定を行った。1)c-stの構造タンパク質をコードする遺伝子群の特定...CsCl密度勾配遠心法によりc-stの粒子タンパク質を精製し、N末端アミノ酸分析と質量分析を用いて解析したところ、計10個のOpen Reading Frame (ORF)が同定された。これらのORFは全てc-stゲノム上の99-168 kbp領域に存在することが示唆された。2)c-468との比較ゲノム解析...今年度は、昨年度に続き比較ゲノム解析に使用するc-468ゲノムの全塩基配列の決定を行った。しかしながら、c-468には異なるサイズのゲノム分子が存在したため、新たにゲノム配列を決定する必要があると考えられた。従って、全ゲノム配列の決定は完全ではない。現在、C型有毒株C468の純培養を行い、得られた菌DNAを使用して宿主菌体内に存在するファージゲノム配列決定を次世代シークエンサーにより行っている。今年度の結果から、C型毒素変換ファージの構造タンパク質をコードする遺伝子群を明らかにした。今後、解析を進めファージのコアゲノムを特定し、毒素遺伝子の伝播機構(ファージ変換)の解明を行いたい。ボツリヌス菌は強力なボツリヌス毒素を産生し、ヒトや家畜に強力な致死作用を示す。本菌はその毒素の抗原性の違いにより、AG型に分類される。これらの中で、C型とD型菌のみ宿主特異性バクテリオファージにより、ボツリヌス毒素の産生性が支配されている。以前に、C型有毒株から単離した毒素変換ファージ(c-stファージ)の全塩基配列を決定し、様々な特徴を明らかとした。今回、以下の2つの研究を行った。1)c-stファージゲノム上には、プラスミド分配に関与するタンパク質であるチューブリン/FtsZ様タンパク質(TubZ), TubR, TubS, TubYをコードする遺伝子が存在することから、それぞれの遺伝子を組換えタンパク質として発現・精製した。種々のタンパク質の機能解析を行ったところ、TubYがTubZ-R-S複合体に相互作用し、プラスミド分配を引き起こしていることが明らかとなった(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, In Press)。2)C型とD型毒素変換ファージゲノム構造をc-stファージと比較するため、ファージゲノム全体のPCRスキャニング解析を行ったところ、全体的には非常にバリエーションがあったことから、それぞれのファージ間でゲノム構造が異なっていることが推察された。

そこで、C型毒素変換ファージ(c-468ファージ)の全ゲノム塩基配列の決定を進め、c-468ファージゲノム全体の約90%に相当する領域の配列決定が終了した。現在、残りのギャップについて配列決定を進めている。ボツリヌス毒素遺伝子を伝達するファージにおいては、1種類のゲノム(c-stファージ)情報のみである。C型とD型毒素変換ファージゲノムの配列決定を行い、ゲノム構造を比較しファージゲノムの多様性を解析する。本解析から、毒素遺伝子の伝達機構(ファージ変換)の解明に前進したいと考えている。既に、当研究室では二種病原体を取り扱う機器が備わっていたこと、取扱施設の承認を得ていたことから、即座に計画通りの実験を始めることができた。また、大学内のフロンティアや人獣共通感染症プロジェクトの支援(連携)を受け、研究のサポート体制が非常に整っていたことから、効率よく実験が進められた。従って、進捗状況は良好である。1)ファージのプラスミド分配に関与するタンパク質の機能解析c-stファージゲノム上のTubZ, TubR, TubS, TubYをコードする遺伝子のクローニングすることが困難であった。それぞれの遺伝子をT7プロモーターを有するベクターに構築し、大腸菌にトランスフォームしたが、液体培地では菌の増殖が認められなかった。そこで、遺伝子の発現を抑制するプロモーターを有するベクターに構築したところ、菌の増殖が改善されそれぞれのプラスミドを抽出・精製することができた。遺伝子のクローニングには時間を要したが、本タンパク質の機能解析を順調に進めることができたことから、論文執筆ができProc. Natl. Acad. Sci. USAにアクセプトされた。2)c-468ファージの全ゲノム塩基配列の決定本ファージゲノムは、継代培養を繰り返すとゲノム構造が変化すること、多数の繰り返し配列が存在することから、配列決定が非常に困難と考えていた。しかし、これまでの研究より様々な問題点を解決するノウハウを身につけていたことから、配列決定に大きな支障は生じなかった。<C型毒素変換ファージの全塩基配列の決定> C型毒素変換ファージ, c-468ファージゲノムの残りのギャップ領域については、インバースPCRとプライマーウォーキング法により配列決定を行う。<D型毒素変換ファージの全塩基配列の決定> D型毒素変換ファージ, d-1873の全ゲノム塩基配列の決定については、次世代シーケンサー(イルミナ, Myseq)を用いて配列決定を行う。繰り返し配列が多い場合、配列決定が困難となることが予想されるので、次世代シーケンサー(Roche, 454 FLX Titanium)を用いる。<ファージゲノム上の配列の相同性検索>ゲノムDNA上のそれぞれのPotential protein-coding regions(ORF)を確定する。得られたORFと種々の生物における既知の遺伝子との核酸・アミノ酸配列の相同性を調べる。具体的には、分子生物学・配列解析ソフトウェア(インシリコモレキュラークローニング)を用いて、塩基配列および予測アミノ酸配列を種々のプログラム(BLASTN, BLASTPなど)により、公共のデータベース(DDBJ)に対して配列の相同検索およびモチーフ検索を行う。特に、毒素の伝達および挿入配列に関わる遺伝子を解析する。
有機大気汚染成分の簡易化学計測法の開発

1.パーソナルモニター用サンプラーの試作-前年度試作のものをさらに改良し、市販の熱帯魚飼育用エアポンプ(1,5002,000円)を利用して新たに試作した。本体は小型直流モーターによりダイヤフラム式の吸引ポンプを駆動させ、吸引空気量はモーターに直結したメカニカルカウンターによって読み取った。大きさは高さ80、幅50、厚さ30mmで約180gであった。サンプリング量は昨年度と同様のガラス製、内径約4mm、長さ約100mmのものを用い、充填剤にはTenaxGC,TenaxTAなどを0.0.4g用いた。また電源は本体とは分離し、単1単3乾電池、又は単3型Ni-Cd電池を用い、必要に応じて外部交流電源も使えるようにした。2.試作サンプラーの性能-サンプラーの吸引流速は充填剤(60/80メッシュ)0.2gをつめたサンプリング管をつけたとき、1.5Vで約100、3Vで約170ml/minで、単1マンガン乾電池1個で約25時間作動した。メカニカルカウンターは流速・電圧の変動に殆ど岡右されず、カウントと積算吸引量とは比例した。前述のサンプリング管をつけ常温で吸引捕集した後GCに導入し、回収実験を行ったところ、ヘキサン以上のn・アルカン、ベンゼン、トルエン、スチレンなどは約80100%の回収率であった。3.実際試料の測定-別に検討したイオントラップ式質量分析計にGCを結合し、試作サンプラーを用いて510L採取した各種地点の空気の測定を行った。有機実験室の空気中にはアセトアミドのような含窒素系化合物のほか実験にしばし用いられるヘキサン、ベンゼン及び微量のトルエン、エチルベンゼンなどが検出された。屋外ではベンゼン、トルエン、キシレン、アルキルベンゼンなど自動車排気由来の成分が顕著に検出されその濃度は交通頻繁度に依存していた。また場所によってはクロロエタンやジクロロベンゼンなども見出された。
生体肝臓由来3次元scaffoldを用いた臓器形成と移植グラフトとしての可能性

薬剤によりラット肝臓から細胞を除き、肝臓の臓器骨格を得ることが可能である。これにマウス胎仔肝前駆細胞と成体肝細胞を種々の条件下に注入して至適条件を検証した。解剖学的特徴から肝細胞の注入経路としては門脈よりも胆管が有効であった。さらに、ラット肝臓の類洞内皮細胞を門脈から注入し、有効に生着することを確認した。肝細胞と類洞内皮細胞を共に注入した肝臓に血液を流し、従来よりも血栓形成が抑制されることを確認するとともに、肝細胞障害が軽減されることを確認した。この結果は将来、移植可能な人工肝臓の作製につながる可能性がある。一方、肝硬変肝臓の臓器骨格作製にも成功し、肝硬変肝臓が肝癌細胞へ及ぼす影響も検証した。<細胞の再細胞化>既に我々が確立したプロトコールを用いてマウス胎仔肝前駆細胞を初代培養するとともに、成体肝細胞を初代培養したうえで、それぞれの細胞群をseeding systemを用いて経門脈的に脱細胞化肝臓へ注入した。システムはポンプ、バブルトラップ、脱細胞化肝臓を入れた培養皿から構成した。適切な再細胞化プロトコールを決定するにあたり培養液の組成、循環させる培養液の速度、細胞混濁液の濃度、細胞注入の速度、注入回数、など複数の条件を比較検討し、至適条件を決定した。成熟肝細胞の場合、細胞径が大きく門脈壁を通過させて実質腔へ移動させる際に培養液の流速を上げて物理的な力を加える必要があったが、胎児肝細胞の場合は細胞が小さいため、容易に実質腔に移動させることが出来、成体肝細胞よりも良好な再細胞化結果を獲得した。さらに、経胆管的に再細胞化する方法も検証中であり、新しいプロトコー最適なプロトコールの立案を進めている。<循環培養>再細胞化した肝臓を閉鎖回路循環培養システムに移し、37°Cで3日間培養した。培養液は毎日交換し、培地中のアルブミンを測定することで肝細胞の機能及びviabilityの評価を行った。培養期間を順次延長し、7日間の循環培養に成功した。<最適プロトコール評価>肝臓を10カ所に分割し、各エリアで無作為に門脈を50カ所選び、細胞が血管外へ移動している管空の割合を計算した。また、再細胞化肝臓に対してH&E染色・DAPI・TUNEL染色を施行し、DAPI陽性かつTUNEL陰性細胞をviableと判断することにより実質腔に移動している肝細胞のviabilityを計算した。成体肝細胞よりも胎仔肝細胞による再細胞化のほうが長期培養によるviability低下が少ないことが確認できた。<内皮・間葉系細胞との共培養>ラット類洞内皮の初代培養を行うとともにヒト血管内皮細胞(HUVEC)を培養し、それぞれとの共培養を検証中である。当研究室においてはマウス胎仔肝前駆細胞分離やその特性解析を長年にわたり遂行しており、実験プロトコールが確立していたことやこれまでの再生医科学研究所との共同研究におけるES細胞分化誘導実験の経験から、分化細胞のみならず未分化細胞の取り扱いに十分習熟していたこと、さらにはこれまでの細胞移植研究の経験から、本研究における細胞培養や脱細胞化肝臓への細胞注入(移植)実験を大きな問題なく遂行できたため、上記研究実績の概要で述べた通り、交付申請時に予定していた各研究項目を順調に進行できている。初代培養したマウス胎仔肝前駆細胞と成体肝細胞を用いて脱細胞化肝臓(3D scaffold)への再細胞化プロトコールを種々の条件下に検証し、従来主流であった経門脈的再細胞化より経胆管的再細胞化において優位に高い生着効率(20.1% vs 81.3%)が得られ、かつ生着した細胞のviabilityも高いことを確認した。その上で再細胞化後の低速循環培養プロトコール(3時間静置に引き続き細胞培養液を0.5ml/hの速度で7日間還流培養)を確立し、再細胞化された胎仔肝前駆細胞が増殖活性を保ちつつ、脱細胞化肝臓の中で肝細胞へ成熟化することをアルブミンおよび尿素合成能で確認したほか、胆管細胞への分化も組織学的に確認できたことから、再細胞化肝臓作製における細胞源として胎仔肝前駆細胞の有用性を示した。上記結果を踏まえて、肝細胞は経胆管的に再細胞化するとともに、ラット肝臓から採取・初代培養した類洞内皮細胞(LSEC)を経門脈的に再細胞化することで、より生理的な臓器形成を試みた。再細胞化されたLSECは生着して特異的表面抗原(SE-1)を発現することが免疫組織学的に確認されるとともに、特異的構造であるfenestration形成が電子顕微鏡的に確認された。さらに、経胆管的に肝細胞のみを再細胞化した肝臓と、肝細胞に加えて経門脈的にLSECを再細胞化した肝臓に血液還流すると、LSECを再細胞化させた肝臓において血栓形成が抑制されることをintegrinαIIb発現により定量的に評価しただけでなく、肝細胞障害が軽減されることがTUNEL染色により確認され、移植グラフトとしての可能性を示した。一方、薬剤により誘導したラット硬変肝の脱細胞化に成功し、これに肝癌細胞株を再細胞化することにより肝硬変肝臓の3D scaffoldが肝癌細胞を上皮間葉転換させ、増殖活性を促進させることを示した。。これにマウス胎仔肝前駆細胞と成体

肝細胞を種々の条件下に注入して至適条件を検証した。解剖学的特徴から肝細胞の注入経路としては門脈よりも胆管が有効であった。さらに、ラット肝臓の類洞内皮細胞を門脈から注入し、有効に生着することを確認した。肝細胞と類洞内皮細胞を共に注入した肝臓に血液を流し、従来よりも血栓形成が抑制されることを確認するとともに、肝細胞障害が軽減されることを確認した。この結果は将来、移植可能な人工肝臓の作製につながる可能性がある。一方、肝硬変肝臓の臓器骨格作製にも成功し、肝硬変肝臓が肝癌細胞へ及ぼす影響も検証した。<再細胞化肝臓の移植へ向けた血液灌流と肝細胞機能評価>再細胞化肝臓を生体に移植した場合、ヘパリン化しただけでは血小板凝集にて直ぐに血栓形成が起こり、肝臓内の血流を維持できない。また抗血小板抗体を用いると、出血のコントロールが出来ずに失血死を来すことが報告されている(Basak et al, NatureMedicine 2010)。まずin vitroの実験系で、再細胞化肝臓内部における血栓形成能を評価する。ラット頸動脈あるいは門脈と再細胞化肝臓を体外循環回路で接続して血液還流した後、血栓形成を組織学的に評価する。血栓形成抑制には血管内皮・類洞内皮細胞の被覆が必要と考えられるため、血管内皮細胞株やラット血管内皮・類洞内皮を密度勾配遠心法により分離培養し、これらの再細胞化を検証する。血管内皮・類洞内皮の再細胞化および血栓形成抑制が得られるようなら、肝切除とレトロルシン投与による肝障害ラットに対して再細胞化肝臓を体外循環型人工肝臓として利用できるかどうかを検証する。さらに、レシピエントのラットの右腎臓を摘出してスペースを確保した後、ドナーラット肝臓の門脈をレシピエント門脈本幹に、ドナーラット肝臓の下大静脈をレシピエント下大静脈に接続する生体肝移植モデルを作製する。手技が安定したところで、レシピエントラットに無アルブミンラット(Nagase rat)を用いてコントロール実験のデータを集め、その後再細胞化肝臓を移植し、レシピエントラットの血清アルブミン濃度を測定する。再細胞化肝臓の機能評価は、無アルブミンラットの血清アルブミン濃度を、生体肝臓の移植時と比較することで行う。肝臓外科学
自己認識における感覚統合メカニズム-遅延自己映像を用いた認知神経科学的研究

前年度の成果から、頭頂葉が自己身体の実現に深く関与しており、特に視覚と体性感覚の統合に重要な役割を果たしていることが示された。本年度はこの結果をもとに、自己と他者の身体が癒合した状態から自己と他者の身体が別々のものとして認識される過程のモデルを提案し、国内学会にて報告をした。このモデルでは、視覚的な身体を処理する脳部位(視覚野)からの入力と体性感覚・触覚を処理する脳部位(一次体性感覚野)からの入力が、その時間的整合性をもとに頭頂葉で統合され、自己身体は上頭頂葉において、他者身体は下頭頂葉において処理される過程を示した。また、本研究に深く関連するトピックとして、他者の運動表現と自己の運動表現が脳内でどのように共有されているかについて、成人および乳児を対象として脳機能計測実験を行った。ヒト成人およびサルでは、自分自身が運動するときに活動する脳部位が、他者の運動を観察したときにも活動することが知られているが、乳児でも同様の脳活動が見られるかについてはまだ明らかではない。そこで本研究では近赤外分光法(NIRS)を用いて他者運動を観察しているときの6-7ヶ月乳児の脳活動を計測した。その結果、実際に(生の)他者運動を観察しているときには一次運動野が強く活動するが、おもちゃのみの動きを見ているときにはあまり活動が見られないことが示された。また他者運動を、TVを介して観察したときには、一次運動野の活動はやはり見られたものの生で見た場合とは若干異なる活動パターンを示すことがわかった。成人を対象とした実験でもほぼ同様の結果が得られた。これらの結果から、他者と自己の運動表現はかなり早い時期から共有されていることが示された。実物とTVを介したときとで脳活動に違いが出た点については今後も研究を進めていきたい。本研究では、自己認識における感覚統合メカニズムの時間的特性を明らかにすることを目的とする。ここでは、自己認識を「自己を対象としたバインディング問題」として捉え、行動実験、脳機能計測、モデル構築の3つの手法を有機的に統合するアプローチをとる。具体的には、視覚フィードバックを時空間的に操作することによって、感覚間の矛盾が自己認識に与える影響について実験的に検証し、感覚統合メカニズムの脳内機序を明らかにする。本年度は、まず自己映像を用いた弁別課題の実験系を構築した。被験者はCCDカメラによって撮影された自分の手の映像をモニタを介して見る。このときの手の映像には時間的遅延の処理が施された。また制御用PCによって映像提示のタイミングなどをコントロールした。被験者は提示された映像と自分の手の動きが一致しているかどうかを判定するように指示された。またこのときの脳活動を近赤外分光法(NIRS)を用いて計測した。その結果、被験者は受動的な運動をする自己の腕の映像に関して、200ミリ秒程度を閾値として遅延を弁別できることがわかった。さらに脳活動計測の結果から、時間遅延のほとんどない自己映像を見ているときには上頭頂葉が、逆に時間遅延が大きいときには下頭頂葉が強く活動することがわかった。また判断の難しい200ミリ秒前後の遅延のときに強く活動する部位が頭頂葉の一部に存在することがわかった。以上の結果から、頭頂葉が自己身体の表現に深く関与しており、特に視覚と体性感覚の統合に重要な役割を果たしていることが示された。
膜通気バイオフィルムリアクターによる高濃度窒素排水の効率除去とＮ２Ｏ削減

29年度が最終年度であるため、記入しない。
オルガネライメージングによるネクローシスのシグナル伝達機構の研究

ネクローシスのシグナル伝達機構を調べることを目的とし、シクロフィリンDがミトコンドリアのエネルギー代謝に及ぼす影響、および、ネクローシス誘導時に観察されるミトコンドリアの変化を単一ミトコンドリアで詳細に計測した。その結果、1)シクロフィリンDがピルビン酸代謝に与える影響の検出、2)細胞内での持続的な膜透過性遷移の検出、3)ミトコンドリアの膜透過性遷移と膨潤の同時イメージング、に成功した。これらは、ネクローシスのうち、プログラム細胞死として生じる細胞死の理解に向けて、重要な知見を与えるものである。本年度は、ミトコンドリアに局在するプロリン異性化酵素シクロフィリンD(以下CypDと略す)の活性に着目し、C6グリオーマ細胞に酸化ストレスを加えた際に生じる細胞死の特徴の解明に取り組んだ。まず、C6グリオーマ細胞に野生型のCypDが過剰発現した細胞株(W)、酵素活性欠損型CypD(R97A)を過剰発現させてドミナントネガティブ効果によりCypDの活性が認められなくなった細胞株(R)、およびこれらのベクターコントロール(V)に酸化ストレスを加え、CypDの活性依存的に細胞死が生じる条件を見出した。次に、その条件において酸化ストレス誘導性の細胞死への関与が示唆されている酵素PARPの阻害剤(3AB)を添加し、CypDにより細胞死が誘導された株において細胞死が抑制されることを見出しな、この事実は、PARPが関与する経路とCypDが関与する経路が下流で統合されていることを示している。今までは、PARPが関与する経路とCypDが関与する経路は別々であり、一方を阻害しても、もう一方が原因の細胞死は抑制されないと考えられていたことから、本発見はネクローシスのシグナル伝達経路に新たな知見を加えたという価値がある。また、本研究では、上述のCypDの活性依存的な細胞死の際には、形質膜が損傷を受ける直前までミトコンドリアの膜透過性が明確な上昇を示していないことを見出した。ミトコンドリアの膜透過性の上昇については、細胞死の原因とする考え方と、細胞死が後戻りできなくなるポイントとしての考え方の2通りがあったが、本研究結果は後者であることを明確に示す結果となった。ミトコンドリアで発生する活性酸素種はネクローシスを誘導する要因であり、また、実際にネクローシスが生じるかどうかは細胞のエネルギー状態に大きく影響される。そこで本年度は、ミトコンドリアに局在するプロリン異性化酵素シクロフィリンD(以下CypDと略す)の活性に着目し、CypDがC6グリオーマ細胞のエネルギー代謝や活性酸素種の発生に及ぼす影響を調べた。具体的には、C6グリオーマ細胞に野生型のCypDが過剰発現した細胞株(W)、酵素活性欠損型CypD(R97A)を過剰発現させてドミナントネガティブ効果によりCypDの活性が認められなくなった細胞株(R)、およびこれらのベクターコントロール(V)を対象に、呼吸速度をクラーク型酸素電極で、乳酸生成速度を乳酸脱水素酵素の活性を計測するための市販のキットにより計測した。その結果、呼吸速度はW>V>R、乳酸の生成速度はR>V>WとなりCypDの活性が高いとミトコンドリアの呼吸速度が増大し、乳酸の生成速度が低下することがわかった。この結果は、CypDのプロリン異性化活性がピルビン酸のミトコンドリアでの代謝を促進させることを示している。野生型のCypDを過剰発現させた細胞株にCypDの阻害剤であるcyclosporin Aで阻害した場合も、同様の結果が得られた。ミトコンドリアでは電子伝達系に供給された電子が水中の酸素に漏れ渡ることで発生する。そのため、CypDのプロリン異性化活性がミトコンドリアにおける活性酸素種の発生を増大させ、ネクローシスを誘導する一因になっているのかもしれない。ネクローシスは主要な細胞死の一種であり、その不適切な実行の抑制が期待されていえる。ミトコンドリアに局在するプロリン異性化酵素シクロフィリンD(以下CypDと略す)の活性が高い細胞では、ネクローシスが生じやすいことが知られている。CypDはシクロスポリンAなどで活性阻害が可能なことから創薬のターゲットと期待されているが、CypDがネクローシスを促進するメカニズムは明確にはわかっていない。ミトコンドリアで発生する活性酸素種はネクローシスを誘導する要因であり、また、ミトコンドリアの電子伝達系から電子がリークして水中の酸素分子に渡ることで生じる。そのため、ミトコンドリアの電子伝達系に多くの電子が供給される状態は、活性酸素種の発生が起こりやすいと考えられる。本研究代表者の太田らは、平成23年度までの研究で、ミトコンドリアに局在するプロリン異性化酵素シクロフィリンD(以下CypDと略す)の活性が高い細胞では、ミトコンドリアでの電子伝達が活発になっていることを示していた。

そこで、平成24年度はCypDによって電子伝達が活発になるメカニズムを調べることを目的とした。CypDはプロリン異性化活性を持つため、タンパク質のフォールディングやミトコンドリアへの輸送を助けると考えられたが、CypD活性の増加によるミトコンドリアのタンパク質量の増加は認められなかった。次に、ミトコンドリアへの蛍光色素の輸送をイメージングにより調べたところ、疎水性の高い蛍光色素は、CypD活性の低いミトコンドリアには輸送されにくい傾向が見られた。このことから、CypDの活性によって脂質などの疎水性分子のミトコンドリアへの輸送が大きくなり、結果として電子伝達が活発になっている可能性が考えられる。この2年間の研究により、シクロフィリンDがネクローシスを促進する原因を見出すことに成功した。特に、ネクローシスを誘導する酸化ストレスが加えられたときに、シクロフィリンDがミトコンドリアのダメージを増大させる理由を見出すことができたことは、本研究の目的に大きく貢献するものである。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までの研究により、シクロフィリンDはプロリン異性化活性により、ピルビン酸代謝を細胞質からミトコンドリアにシフトさせていることを見出した。最終年度は、プロリン異性化活性がピルビン酸代謝をシフトさせる秀子メカニズムを明らかにするとともに、代謝のシフトによりミトコンドリアでの活性酸素種の発生が増大していることを示す。また、シクロフィリンDのプロリン異性化活性が、活性酸素種の発生とは無関係にミトコンドリアの損傷を促進するメカニズムを、単一ミトコンドリアイメージングにより引き続き調べる。