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生物学の哲学における還元主義的思考と非還元主義的思考との相補的関係についての研究

自然選択の単位の問題と、社会生物学/進化心理学の論証構造の吟味という二つのテーマを柱として、生物学の哲学における還元主義的思考に対する批判的な検討を行った。前者においては、対立遺伝子を選択の単位と見るウィリアムズやドーキンスの立場は、「帳簿的な意味」においては正しいが内容空虚であり、「因果的な意味」において端的に誤りであるという結論に達した。後者においては特に、「進化的機能分析」という進化心理学に特有の方法論における論理的循環の問題を指摘した。本年度の前半は、交付申請書で平成19年度の研究目的として挙げた「集団選択理論再考」まで踏み込むことはできなかったが、自然選択の単位問題に関する遺伝子選択主義の妥当性の検討に関する、等しく重要なケーススタディとして、ヘテロ接合子優越(超優性)の事例を研究し、「単一対立遺伝子の視点からの記述は2倍体遺伝子型の視点からの記述と少なくとも等価である」という遺伝子選択主義者(Sterelny, Kitcher, Watersなど)のテーゼが、因果性の記述の観点からは成立しえないものであることを示した。その成果は、ISHPSSB2007(7月、英国Exeter)での一般発表、日本進化学会(8月、京都大)でのワークショップ報告という形で、国内外で公表した。現在その成果を一部として盛り込んだ博士論文を執筆中である。本年度の後半は一転、交付申請書では平成20年度のテーマとして挙げておいた「社会生物学/進化心理学における人間行動の適応主義的説明の妥当性の吟味」に重点を移した。その結果として、両理論における論証構造は、根本的に重要なところで、論証されない推測的前提に依存していることを示し、その成果を、科学基礎論学会秋の研究集会(10月、慶応大)におけるワークショップ報告、そしてそれを基に執筆した基礎論学会の欧文誌(Annals)寄稿論文として、公表した。特に寄稿論文の方では、進化心理学における「進化的機能分析」と呼ばれる手法(Barkow, Cosmides, Tooby)を取り上げ、そこに見られる進化的適応環境(EEA)における適応的問題の同定、ならびに現代人の心は太古の時代の適応的産物であるという作業仮説に内在している固有の方法論的困難を指摘した。なお、本年度の4月に、昨年の10月に北大で開催された科学哲学会大会におけるワークショップ「生物学の哲学の現状と展望」のオーガナイザーとしての報告論文が、『科学哲学40-1』に掲載された。8月の世界哲学会議(ソウル大学)にて、本助成研究の一方の柱である「人間行動の適応主義的説明」の問題のための基礎研究として、「The Nature of Adaptationism」と題する、進化生物学における適応主義的方法論の問題に関する報告を英語で行った。同じく8月に日本進化学会の年次大会(東京大学)における「哲学はなぜ進化学の問題となるのか」というテーマのワークショップの報告者として、「進化心理学の論理の批判的考察」と題する報告を行ない、日本の進化学のプロフェッショナルな研究者を前にして、進化心理学の方法論(進化的機能分析)に関する原理的な問題提起を行った。11月には、私が準備組織委員会の一員としてその開催準備に取り組んできた国際生物学の歴史・哲学・社会学会のワークショップ(神戸大学)が開催された。私は「東アジアにおいて勃興しつつある生物学の哲学」というセッションのオーガナイザーを務め、かつ報告者として「Critical Examination of the Logic of Evolutionary Psychology」と題する(基本的に8月の進化学会の報告と同趣旨の)報告を行った。原著論文としては、東海大学文明研究所で発行している機関誌『文明』に、「『新優生学』をどう考えるか」と題する論文を発表した。これは本助成研究の研究計画に直接関連するものではないが、2003年のヒトゲノムの解読完了以降浮上してきた社会的・倫理的諸問題について、生物学の哲学の観点から検討を行ったものである。さらに、本助成研究のもう一方の柱である自然選択の単位の問題に関して、『生物科学』誌に「遺伝子選択主義をめぐる概念的問題」と題する論文を3月に提出したが、発刊は4月以降になるものと思われる。さらには、「応募内容ファイル」にも書いた、慶応大学に提出する英文の博士論文をほぼ完成させた。4月中には提出する見込みである。
ジャークコストによる不正咬合とその治療結果についての機能的評価

(1)正常咬合を有する成人および骨格性下顎前突症を有する成人について、ガム咀嚼時における下顎の3次元運動の制御特性を定量的に評価した。咀嚼サイクルの閉口相において、骨格性下顎前突症患者の咀嚼運動は、正常咬合者と比べて、高い正規化ジャークコスト、運動時間の延長およびピーク速度の減少が認められた。これにより正常咬合者の咀嚼運動は骨格性下顎前突症患者と比べて、効率よく円滑に行われていることが示された。(2)咀嚼運動軌跡の99%は、各サイクルについて任意の平面上の2次元成分で説明できることが明らかとなった。前歯部に交叉咬合を有する症例の治療前後について、この平面の傾きの分散と、運動軌跡の曲率の分散を比較したところ、治療後有意に減少したことから、交叉咬合を治療することで、咀嚼運動がパターン化することが示唆された。最小分散理論より、矯正治療による運動の変動の減少は運動円滑性が向上した結果であることが示唆できた。(3)日本語文音読時の下顎運動の正規化ジャークコストを計算することができる解析方法を新たに考案し、本ジャークコスト計算アルゴリズムの妥当性を示した。(4)顎関節症を有する患者の咀嚼運動軌跡について、最小ジャークモデルを適用して解析的なシミュレーションを行ったところ、モデルの予測精度は、正常咬合者の行う咀嚼運動に対して行ったシミュレーションの予測精度よりも有意に低いことが分かった。従って、顎関節症を有する患者の咀嚼運動は、正常咬合者が行う咀嚼運動と比べて円滑ではないことが示唆された。またこれらの相違は咀嚼運動の開口相にて明らかであることが分かった。(5)骨格性下顎前突症の1症例や前歯部の咬合干渉を有する前歯部叢生の1症例について、治療の前後で咀嚼運動の正規化ジャークコストや、最小ジャークモデルにてシミュレーションを行った時のモデルの予測精度を比較した結果、予測誤差や正規化ジャークコストは、治療前には正常咬合者よりも有意に高い値を示していたが、治療後には正常咬合者についての値とほぼ一致するまでに低下した。以上の結果から正規化ジャークコストや最小ジャークモデルによる運動軌跡の予測誤差は、矯正治療善後における咀嚼運動効率の向上を客観的に評価できる指数として用いることが十分可能であることが明らかとなった(1)正常咬合を有する成人および骨格性下顎前突症を有する成人について、ガム咀嚼時における下顎の3次元運動の制御特性を定量的に評価した。以上の結果から正規化ジャークコストや最小ジャークモデルによる運動軌跡の予測誤差は、矯正治療善後における咀嚼運動効率の向上を客観的に評価できる指数として用いることが十分可能であることが明らかとなったI:正常咬合を有する成人10名を被験者として人工的な咬合干渉を付与し、ガム咀嚼時における下顎の3次元運動奇跡を定量的に評価した。咀嚼サイクルの閉口相において、運動の円滑性を示すことができるジャークコストの値は上昇(円滑性は低下)し運動時間は延長するとともにピーク速度は減少していることが明らかとなった。

またその変化の程度は、大臼歯部よりも犬歯の方が大きくなることおよび咬合干渉装着後の経過時間に従って装着前に近づくことも明らかとなった。つまり、歯の早期接触の動態特性を定量的に評価することが可能であると判明した。II:正常咬合を有する成人40名および骨格性下顎前突症を有する成人40名のガム咀嚼時における下顎の3次元運動軌跡を定量的に評価した。咀嚼サイクルの閉口相において、骨格性下顎前突症患者は正常咬合者と比べて、(1)高いジャークコスト(円滑性に欠く)(2)下顎の運動時間の延長(3)ピーク速度の減少が認められた。これにより正常咬合者の方は骨格性下顎前突症患者と比べて、有意に円滑な咀嚼運動が行われているということが示された。III:外科的矯正治療を行った骨格性下顎前突症患者10名の治療前後における下顎の3次元運動軌跡を定量的に評価した。外科的矯正治療後には咀嚼サイクルの閉口相において、(1)ジャークコストの減少(円滑性の向上)(2)運動時間の短縮(3)ピーク速度の上昇が認めたれた。これらの動態特性の変化は、外科的矯正治療の有効性・存在理由を証明する本質的な答えとなるものである。以上に記したように、急性および慢性に作られる咬合干渉の存在による動態特性の変化について運動制御学的観点から本研究を遂行し、その成果が得られた。第一に、咀嚼運動軌跡の99%は、各サイクルについて決定される任意の平面上の2次元成分で説明できることが明らかとなった。前歯部に交叉咬合を有する症例について交叉咬合の治療前後について、この平面の傾きの分散と、運動軌跡の曲率の分散を比較したところ、治療後有意に減少したことから、不正咬合を治療することで、咀嚼運動がよりパターン化することが示唆された。第二に、骨格性下顎前突症の一例についてジャークコストを用いて、治療前後において咀嚼運動の円滑性を比較した結果、治療後、有意に運動の円滑性は上昇した。また、治療前後において、ミニマムジャークモデルを用いて、運動軌跡を予測した結果を比較したところ、治療後には、モデルはより正確に運動を予測した。以上の結果から、外科的矯正治療による咬合の改善は、咀嚼運動の円滑性を向上させることが示唆された。第三に、前歯部に交叉咬合を伴う叢生の一症例についてジャークコストを用いて、治療前後において咀嚼運動の円滑性を比較した結果、治療後、有意に運動の円滑性は上昇した。以上の結果から、矯正治療による咬合の改善は、咀嚼運動の円滑性を向上させることが示唆された。第四に、170字からなる日本語文の音読時の下顎運動のジャークコストを計算することができる解析方法を新たに考案した。3名について正規化ジャークコストの変動係数を求めたところ、2.8%であり、運動距離や運動時間の変動係数よりも小さかった。発音時の下顎運動は高度にパターン化されていることから、この結果は、本ジャークコスト計算アルゴリズムの妥当性を示唆した。(1)顎関節症を有する患者の咀嚼運動軌跡について、最小ジャークモデルを適用して解析的なシミュレーションを行ったところ、モデルの予測精度は、正常咬合者の行う咀嚼運動に対して行ったシミュレーションが示した予測精度よりも有意に低いことが分かった。従って、顎関節症を有する患者の咀嚼運動は、正常咬合者が行う咀嚼運動と比べて円滑ではないことが示唆された。またこれらの相違はは咀嚼運動の開口相にてより明らかであることが分かった。また最小ジャークモデルによる予測精度は、顎関節症状の客観的評価とほぼ一致していた。すなわち最小ジャークモデルによる予測誤差は、顎関節の症状が明らかであるほど大きい値を示した。
非被覆性コケムシの群体形態多様化の解明および環境評価への応用に向けた研究

1.スナツブコケムシ科の系統分類本年度は,得られた塩基配列情報に基づいてスナツブコケムシ科の唇口目内における系統的位置を探るとともに,砂泥底に生息するLanceoporidae科Lanceopora属の2種について遺伝的距離を求め,個虫形態が酷似したこれら2種の分類に関する検討を行なった.スナツブコケムシ科2属4種の18SrDNAおよび16SrDNAの塩基配列を決定し,他の唇口目コケムシ類の塩基配列と併せて系統解析を行なった結果,スナツブコケムシ科は単系統群となったが,Lepraliomorpha(下目)については先行研究と同様に単系統群とはならなかった.Lanceopora属2種については18SrDNA,16SrDNA,COIの塩基配列を決定し,前述の系統解析に加えた.その結果,これら2種間に明瞭な遺伝的差異がみられた.そのため,この2種については群体の外見と生活様式の違いが分類形質となり得ることが示された,本年度はこのほかに南西諸島海域およびこれまで調査されてこなかった山陰沖(隠岐)での追加標本の採集も行ない,山陰沖の日本海における本科の棲息をはじめて確認した.2.安定同位体を用いた大型起立性コケムシ群体の成長率の推定本年度は,昨年の分析で速度論的効果がみられた南西諸島海域のニセツノコケムシ群体を対象に,試料採取方法を改変して新たに同位体比分析を行なった,分析に用いる枝について,枝の中心部と表面に分けてサンプリングを行なった結果,枝の中心部における炭素同位体比はほぼ同位体平衡下で形成された値を示したのに対し,枝の表面ではその値が大きく外れ,生物学的要因による同位体効果がはたらいている可能性が示唆された.このことから,ニセツノコケムシ群体においては,枝の中心部は同位体平衡下で形成されている可能性が高く,今後の分析にも有用であると考えられる.また,枝の表面では中心部に比べて酸素同位体比がわずかに軽い傾向もみられたことから,ニセツノコケムシ群体の枝の表面では中心部に比べて炭酸カルシウム骨格の成長速度が速い可能性も考えられる.1.スナツブコケムシ科の系統分類本年度は,スナツブコケムシをはじめとした砂泥底に生息する唇口目コケムシの調査採集を行うとともに,これらのDNAを抽出して各塩基配列の決定を行なった.南西諸島海域,相模灘,日本海での調査採集により,これまでに5属16種のスナツブコケムシ科標本およそ850群体が得られた.日本海で本科の群体の棲息がはじめて確認されるなど,日本近海の砂泥底に生息するコケムシ相の知見を大幅に更新する成果が得られている.分子実験については,本年度は国立科学博物館が新宿からつくばへと移転する時期と重なったため,共通機器の移転後に試薬等を新調して分子実験を開始する環境を整えた.その後,スナツブコケムシ科およびLanceopora属の群体からDNAの抽出を行ない,現在までに10種のコケムシから配列を得ている.2.安定同位体を用いた大型起立性コケムシ群体の成長率の推定本年度は,過去に採集した起立性コケムシ群体を対象として成長方向に沿ってマイクロサンプリングを行い,安定した同位体分析法の確立を目指した.岩手県大槌湾で得たコブコケムシ科群体では酸素同位体比に周期的な変動がみられたことから,これが季節消長を表している可能性が示唆された.南西諸島海域で得たニセツノコケムシの分析結果では酸素同位体比が炭素同位体比と連動していたため,反応速度論的同位体効果が危惧された.そこで,群体の枝に穴をあけるサンプリング方法を変更し,枝の表面および枝の中心部に分けて各々サンプリングを行なった.これとは別に,コケムシを用いたMART解析の研究を進めている研究グループと意見交換を行なった.本研究で確立したマイクロサンプリング法は,今後,起立性コケムシ群体を用いたMART解析にも有効であると期待される.1.スナツブコケムシ科の系統分類本年度は,得られた塩基配列情報に基づいてスナツブコケムシ科の唇口目内における系統的位置を探るとともに,砂泥底に生息するLanceoporidae科Lanceopora属の2種について遺伝的距離を求め,個虫形態が酷似したこれら2種の分類に関する検討を行なった.スナツブコケムシ科2属4種の18SrDNAおよび16SrDNAの塩基配列を決定し,他の唇口目コケムシ類の塩基配列と併せて系統解析を行なった結果,スナツブコケムシ科は単系統群となったが,Lepraliomorpha(下目)については先行研究と同様に単系統群とはならなかった.Lanceopora属2種については18SrDNA,16SrDNA,COIの塩基配列を決定し,前述の系統解析に加えた.その結果,これら2種間に明瞭な遺伝的差異がみられた.そのため,この2種については群体の外見と生活様式の違いが分類形質となり得ることが示された,本年度はこのほかに南西諸島海域およびこれまで調査されてこなかった山陰沖(隠岐)での追加標本の採集も行ない,山陰沖の日本海における本科の棲息をはじめて確認した.

2.安定同位体を用いた大型起立性コケムシ群体の成長率の推定本年度は,昨年の分析で速度論的効果がみられた南西諸島海域のニセツノコケムシ群体を対象に,試料採取方法を改変して新たに同位体比分析を行なった,分析に用いる枝について,枝の中心部と表面に分けてサンプリングを行なった結果,枝の中心部における炭素同位体比はほぼ同位体平衡下で形成された値を示したのに対し,枝の表面ではその値が大きく外れ,生物学的要因による同位体効果がはたらいている可能性が示唆された.このことから,ニセツノコケムシ群体においては,枝の中心部は同位体平衡下で形成されている可能性が高く,今後の分析にも有用であると考えられる.また,枝の表面では中心部に比べて酸素同位体比がわずかに軽い傾向もみられたことから,ニセツノコケムシ群体の枝の表面では中心部に比べて炭酸カルシウム骨格の成長速度が速い可能性も考えられる.南西諸島海域や日本海における調査で砂泥底に生息するコケムシの生きた群体が多数得られたほか,それらのDNA抽出および塩基配列決定が成功していること,さらに起立性群体における同位体比分析においても酸素同位体比の変動がみられていることやサンプリング手法の改善が試みられている点から,本研究の目的を達成する上で十分な進展がみられたと評価できる.系統分類では第一に追加採集を行なうとともに,これまでに得られているスナツブコケムシ科標本を走査型電子顕微鏡で観察し,種分類を完了して記載論文を執筆する,また,新たに得られた標本からもDNA抽出を行い,これらについても各塩基配列を決定して系統関係を推定する.塩基配列の増幅がうまくいかなかったものについては,新たにプライマーを設計して配列決定を試みる.これと同時に,Lanceopora属コケムシの飼育実験を行ない,この結果と野外データとを照らし合わせて,唇口目コケムシの砂泥環境における生活様式の多様性解明を試みる.同位体比分析では,まずは大槌湾で採水した海水の酸素および炭素同位体比を分析し,同海域のコブコケムシ科群体における同位体平衡部位を特定して,大槌湾におけるコブコケムシ科群体の成長速度と成長パターンを推定する.また,ニセツノコケムシを対象として行った2通りのマイクロサンプリングで得られた粉末についても同位体比分析を行い,今後の分析に有用な部位を特定して,ニセツノコケムシ群体の成長速度の推定を行なっていく.
自家骨髄幹細胞・脂肪組織由来幹細胞を利用した細胞シートを用いた下部尿路再生療法

われわれは、ラビットの大腿骨骨髄より骨髄由来幹細胞、もしくは皮下脂肪組織から脂肪幹細胞を採取し、シート状に培養し増殖することを可能とした。そのシートを、放射線によって障害を与えた膀胱、もしくは凍結傷害を与えた尿道括約筋に移植し、その再生を免疫染色および機能的検査にて確認することができた。このことは、単なる細胞注入法での移植よりも、シート状にした幹細胞移植は、下部尿路再生により効果的であることを示すこととなった。今年度は骨髄幹細胞および脂肪幹細胞の遊離および培養に重点をおいた。1ラット、ラビットの大腿骨骨髄より注射針で骨髄由来幹細胞を採取し15%fetal bovine血清および抗生剤附加のDulberco Modified Eagle Mediumの中に入れた。2これらの細胞を遠心分離した後に、TypeIcollagenでコートした培養皿で7日間初代培養した。培養によって接着伸展した骨髄由来幹細胞を温度感受性培養皿(37°Cでは疎水性、20°Cでは親水性の性質をもつ)で継代培養し、単層の骨髄幹細胞シートを作製した。3また、これらの実験動物の腹腔内の脂肪細胞からも同様な手法を用いて、脂肪幹細胞の分離培養を行い、脂肪幹細胞由来の細胞シートを作製することができた。骨髄幹細胞由来の細胞シート脂肪幹細胞由来シートと比較を行ったが、シート作製にかかる時間、コスト、作業効率では、ほぼ同等と思われた。4それぞれのシートにおいて再生能力としての有用性も、パイロット研究として放射線照射を行った膀胱に対しても行った。免疫組織学的および膀胱内圧検査にて膀胱機能として検証を行ったが、ほぼ同等の結果を得ることができた。4また、Nerve Growth Factorなどの成長因子の添加で、培養効率をあげる今後の研究展開も視野に入れるため、まず、それらの因子の濃度測定も行った。その結果、いずれの成長因子の増加も確認できたが、特に線維芽細胞成長因子が高いことを発見した。昨年度までに骨髄幹細胞および脂肪幹細胞の採取と培養が確立したため、以下の研究を遂行した。2.膀胱・尿道括約筋障害ラットの膀胱、尿道括約筋、尿道、尿管への移植:漿膜側より-80°Cのアイスバーで障害を受けた膀胱モデルへ、30G注射針を使用して膀胱壁に骨髄幹培養細胞、もしくは脂肪培養細胞を移植した。コントロールとしては細胞の入っていない培地のみを注入した。また、同様に膀胱内側より、-80°Cのアイスバーで内尿道括約筋の障害を受けた腹圧性尿失禁モデル、放射線障害により尿道括約筋収縮力の低下した尿失禁モデル、尿道もしくは尿管を途中から断裂させた尿道・尿管損傷モデルに対しても同様な細胞移植を行った。3.組織学的な再生の確認:移植後3日目、14日目に膀胱および尿道括約筋を取り出した。Monoclonal anti-GFP抗体、平滑筋特異抗体を使用して免疫二重染色を行い、レーザー蛍光顕微鏡で移植した細胞の分化、つまり、筋層をはじめとする膀胱および尿道括約筋の再生を観察した。また、14日目においては、Acta2 primerを使用してalpha smooth muscle actinを、Myh11 primerを使用してsmooth muscle myosin heavy chainを、Real time RT-PCR法にて定量測定し、骨髄幹細胞もしくは脂肪細胞の膀胱平滑筋、内尿道括約筋への分化、尿道、尿管の再生についての評価も定量的に行った。いずれの実験においても膀胱、尿道活躍筋が再生されていることが確認できた。骨髄幹細胞シートを作製し、放射線による障害を受けたラットの膀胱へ移植、膀胱機能を再生することができた。この研究成果は、再生の領域では評価の高い国際誌であるTissue Engineering誌に発表することができた。ラット、ラビットの大腿骨骨髄より注射針で骨髄由来幹細胞を採取し遠心分離した後に、TypeIcollagenでコートした培養皿で7日間初代培養した。培養によって接着伸展した骨髄由来幹細胞を温度感受性培養皿で継代培養し、細胞シートを作製した。また、これらの実験動物の皮下脂肪細胞からも同様な細胞採取を行い、脂肪幹細胞由来の細胞シートも作成できることを確認した。培養途中の5日目の時点で、GFP(Green fluorescence protein)発現遺伝子を培養細胞内にトランスフェクションしてマーキングした。膀胱の漿膜側より-80°Cのアイスバーで障害を受けた膀胱へ、骨髄幹培養細胞、もしくは脂肪培養細胞で作成したシートを貼付移植した。また、同様に膀胱内側より、-80°Cのアイスバーで内尿道括約筋の障害を受けた腹圧性尿失禁モデルに対しても同様な貼付もしくは巻き付け法で細胞シート移植を行った。移植後3日目、14日目に膀胱および尿道括約筋を取り出した。Monoclonal anti-GFP抗体、平滑筋特異抗体を使用して免疫二重染色を行い、レーザー蛍光顕微鏡で移植した細胞の分化、つまり、筋層をはじめとする膀胱および尿道括約筋の再生を確認した。また、14日目においては、Acta2 primerを使用してalpha smooth muscle actinを、Myh11 primerを使用してsmooth muscle myosin heavy chainを、Real time RT-PCR法にて定量測定し、骨髄幹細胞もしくは脂肪細胞の膀胱平滑筋、内尿道括約筋への分化の再生についての評価も定量的に行い、組織学的な再生が確認できた。また、14日目に覚醒下無拘束状態下での膀胱内圧検査を行うことによって、膀胱としての機能の再生を確認、また、腹圧時尿漏出時圧測定を行うことによって尿道括約筋としての収縮機能が再生されたことを確認した。

われわれは、ラビットの大腿骨骨髄より骨髄由来幹細胞、もしくは皮下脂肪組織から脂肪幹細胞を採取し、シート状に培養し増殖することを可能とした。そのシートを、放射線によって障害を与えた膀胱、もしくは凍結傷害を与えた尿道括約筋に移植し、その再生を免疫染色および機能的検査にて確認することができた。このことは、単なる細胞注入法での移植よりも、シート状にした幹細胞移植は、下部尿路再生により効果的であることを示すこととなった。当初の研究予定に従い、一連の排尿器官としての機能的再生の確認を行う予定である。手法としては、移植の14日目に膀胱および尿道括約筋を摘出しなかった別の移植ラット群(ラビット群)においては、覚醒下無拘束状態下での膀胱内圧検査を行うことによって、膀胱としての機能の再生の確認、また、腹圧時尿漏出時圧測定を行うことによって尿道括約筋としての収縮機能が再生したかを、コントロールと比較して検証する。また、尿道、尿管については造影剤を入れることによって、管腔臓器としての機能が回復したかを形態的に検証する。泌尿器科学1幹細胞培養途中の5日目の時点で、Lipofectamine 2000 Reagentを使用し、GFP(Green fluorescence protein)発現遺伝子を培養細胞内にトランスフェクションしてマーキングする、もしくは、蛍光時間の長いQtrackercell labeling kits1重染色によるマーキングを行う。2膀胱・尿道括約筋障害ラットの膀胱、尿道括約筋の再生を検討するため、漿膜側より-80°Cのアイスバーで障害を受けた膀胱モデル(Imamura T., Tissue Eng. 2009)、もしくは下部尿路閉塞のために二次的に障害を受けた膀胱モデル、糖尿病による神経障害のために二次的に生じた排尿筋収縮障害をもつ膀胱へ、30G注射針を使用して膀胱壁に骨髄幹培養細胞、もしくは脂肪培養細胞を移植する。また、同様に膀胱内側より、-80°Cのアイスバーで内尿道括約筋の障害を受けた腹圧性尿失禁モ尿道括約筋の再生を検討するため、放射線障害により尿道括約筋収縮力の低下した尿失禁モデル(Imamura T.et al, Tissue Eng., 2012)、尿道もしくは尿管を途中から断裂させた尿道・尿管損傷モデルに対しても同様な細胞移植を行う。3移植後3日目、14日目に膀胱および尿道括約筋を取り出し、Monoclonal anti-GFP抗体、平滑筋特異抗体を使用して免疫二重染色を行い、レーザー蛍光顕微鏡で移植した細胞の分化、つまり、筋層をはじめとする膀胱および尿道括約筋、尿道、尿管の再生を観察する(Imamura T. et al., Tissue Eng. 2009, 2012, 2013)。また、14日目においては、Acta2 primerを使用してalpha smooth muscle actinを、Myh11 primerを使用してsmooth muscle myosinheavy
プルースト草稿資料における固有名の調査および索引作成

マルセル・プルーストの草稿帳全75冊の固有名調査を行い、人名、地名、作品名から成る総合索引(Index general des Cahiers de brouillon de Marcel Proust)をフランス語により作成した。実在の固有名に対して補助情報を記載したのみならず、架空名に関しては、その変遷の過程を記し、『失われた時を求めて』の生成研究に資する索引とした。マイクロリーダーおよびパソコンを購入し、大学院生の補助を受けて、市販ソフトAccessを使用することによりデータベースを作成。このデータベースにおいてはアクセスからエクセル、さらにワードへと変換するシステムが構築されており、最終的な段階の索引作成を念頭においている。文学研究科フランス文学研究室に所蔵しているマイクロフィルム化されたプルーストの草稿帳(カイエ)を解読しつつ、固有名の索引データの入力を開始した。テクストの生成を探求する上で極めて重要であり、かつ執筆順の確定のための指標ともなる名前の変化は送り記号、矢印などによって指示し、草稿の持つ時間的性格を浮き彫りにするよう工夫している。固有名を人名・地名・作品名の3種に分類しているが、「人名」としては固有名以外に、父、母、祖母、叔父など家族の呼称、および医師、画家、司祭などのような普通名詞も特定の人物を指す場合には収拾している。また実在人物の場合には職名、生没年などを補助情報として記入することにより、事典としての機能も併せ持つようにしている。「地名」には国名、地方名、町名、街路名など以外に、建物、施設、モニュメント、組織等も含めている。「作品名」には文学、音楽、美術などの作品名ばかりでなく、新聞・雑誌のタイトルも収録している。さらには固有名が現れている場所を特定しやすいように、行間の加筆、あるいは余白の加筆などの場合はその旨を記入している。最終的には全草稿帳75冊の索引作成をめざしているが、フランス国立図書館による草稿番号に従って、カイエ1から始め、今年度はカイエ25までの入力を完成した。全体の3分の1にあたる25冊分を入力したことになる。現段階で入力項目数約1700、頻度数約6000に及ぶ。解読の困難な固有名、特定が難しい固有名、また同時期に並存する架空名の扱いなど未解決の問題に関して今後調査を深めてゆく。平成20年3月23日30日にフランスへ出張し、フランス国立図書館において、草稿のオリジナルを調べるとともに、固有名についての調査を行った。またフランス人研究者と面談および共同作業を行い、本研究についても意見交換をした。最終年度である平成20年度は、プルーストの草稿帳カイエ46からカイエ75までの固有名の入力をし、3年間で草稿帳全75冊の固有名調査および索引作成を完了した。人名3044件、地名1124件、作品名406件、合計4574件の項目数となった。平成20年5月のフランス語フランス文学会全国大会でのプルースト研究会に参加し、本研究に関する意見交換を行った。序論、注記、解説、統計表、索引(人名、地名、作品名)から成るプルーストの草稿帳総合索引(Index general des Cahiers de brouillon de Marcel Proust)を100部印刷した。フランスをはじめ、世界各国のプルースト専門家が使用できるように、すべてフランス語で執筆した。世界最初となるこの索引集により、マイクロフィルムを所有する大学にて、プルーストの草稿調査が進展すると思われる。
超弦理論における時空の創発とダイナミクス

本研究の目的はゲージ理論で実現されると期待される時空の創発を系統的に理解し、その本質を解明することであった。本年度は、超弦理論を記述すると考えられているゲージ理論であるBMN行列模型の数値計算と、数値計算で現れる符号問題を解決する手法の様々な物理系への適用において特に進展があった。この行列模型は、Mブレーンと呼ばれる空間的に広がりを持ったオブジェクトを実現する真空を複数持っていると考えられており、様々な証拠が挙がっている。有限温度系ではそれらの真空のうちの1つが支配的になると考えられ、温度などの理論のパラメータが変化していくごとにどの真空が実現されるかが変わってくる。本研究の数値計算により、これが相転移的な振る舞いをすることが明らかになり、相図の概略を求めることができた。本成果により、時空の創発の一種であるブレーンの創発の理解が大きく進展した。以上までは時間依存性が出ない有限温度系での計算であったが、時間も含めた時空間の創発を明らかにするには、時間を実とするLorentz型計量で扱う必要がある。そのようなゲージ理論の数値計算には符号問題と呼ばれる困難が現れるが、近年開発され発展している複素Langevin法やLefschetz thimble法により解決できる場合がある。これらの方法を比較的簡単な系に適用し、ゲージ理論の数値計算への足がかりを得た。適用した系は調和振動子・非調和振動子の時間発展のような非常に単純化された系から始め、原子核殻模型のような現実の物理を記述する系まで及んだ。特に、Lefschetz thimble法により振動子系の波動関数の時間発展が正しく計算できることや、殻模型に複素Langevin法が適用できる領域が見つかるなどの結果を得た。当初の計画では符号問題の現れない数値計算を遂行する予定であったが、それだけでなく、符号問題のために今まで計算されてこなかった物理系についても数値計算をして成果を上げることができた。時空の創発が議論できるような数値計算をするには符号問題は避けて通れない問題であるため、この方向性での成功は期待以上のものと言える。殻模型については、特に魔法数が大きい場合に複素Langevin法が適用できる条件を満たしやすいことが分かってきたが、愚直に数値計算すると激しい揺らぎが観測されるため、正しい値を得るのが容易でないことも同時に判明した。これに対して、物理量の求め方を工夫した数値シミュレーションを実行することで予想される値の再現を試みる。
J-PARCパルス中性子ビームを用いた鉄鋼材料や植物中のホウ素の可視化の研究

昨年度までにJ-PARC/MLF/BL04にてパルス中性子ビームとGeガンマ線スペクトロメータを用いて、微量ホウ素を含んだ植物および鉄鋼模擬試料での定量評価実験研究や、ホウ素濃度に分布をつけた鉄鋼模擬試料においてその分布のイメージング実験研究を行ってきた。定量評価実験では、少なくとも数ppmレベルまで定量できることを明らかにした。また、ピンホールで直径3mmに単純に絞ったパルス中性子ビームで試料をスキャンすることで、ホウ素分布のイメージングに成功した。以上のようにホウ素の定量イメージングを実証した訳であるが、今年度は本手法に関し、より高い統計やより高い空間分解能の画像を得るための発展研究として、パルス中性子ビームの集光デバイスの開発を行った。この集光デバイスは、平行に近い中性子ビームを一点に集光する中性子集光ミラーであり、中性子ビーム方向の長さが200mmの回転放物面の3.5Qcスーパーミラーとなっている。中性子入射側が直径約20mm、回転方向は120度分というプロトタイプである。ミラーの基板はアルミニウム合金であるが、荒く放物面にしたアルミニウム基板にニッケル-リンを蒸着し、このニッケル-リンを精密に加工することで高精度の回転放物面を実現している。この集光デバイスを製作し、実際にパルス中性子ビームを用いて集光実験を行った。実験は北海道大学中性子源HUNSにおいて、J-PARC/MLF/BL04を模擬した条件で行った。中性子源から約4mの位置に集光ミラーを、さらにそのすぐ下流に中性子2次元検出器を設置した。集光ミラーのほぼ設計通りの位置で集光している事を確認した。集光ビームは半値幅約2mmで、集光による単位面積あたりの中性子強度は、0.6nm以上の波長域で約10倍が得られた。この装置開発により、今後のホウ素イメージングの高精度化、イメージの高精細化の見通しを得た。平成27年度は、鉄鋼および植物の模擬試料を作成し、本研究で用いるJ-PARC/MLF/ANNRIにてパルス中性子ビームを照射し、微量ホウ素検出の予備実験を行った。鉄鋼の模擬試料は20×20mm,厚さ5mmの純鉄、植物のそれは17.5×15.5mm,厚さ1.3mmの水とそれを保持するアルミニウム製容器である。模擬試料には、純鉄や水の質量に対して0,5,10,50,100,500ppmのホウ素を含ませた。異なるホウ素濃度の試料それぞれについて0.55時間、直径約7mmのパルス中性子ビームを照射した。中性子とB-10の反応で発生した478keVガンマ線を、試料の上下に配したGeガンマ線スペクトロメータにて検出した。この結果、鉄鋼、植物の模擬試料ともに、ホウ素濃度に比例した強度で478keVガンマ線を検出することができた。植物模擬試料では試料の不具合で5,10ppmのデータが得られなかったものの、鉄鋼模擬試料では、最もホウ素濃度の少ない5ppmでも有意にホウ素が検出できることを確認することができた。さらに、この実験結果を予測計算値と比較した。中性子フラックス、中性子ビームの広がり、試料中での中性子の反応率、478keVガンマ線の試料中での減衰、Geスペクトロメータのガンマ線検出効率を考慮して予測計算値を導出した。両方の試料において、実験と予測計算値はほぼ整合することがわかった。この比較から、試料中での中性子の散乱による影響の考慮が重要であることがわかった。以上の成果は、今後正確にホウ素濃度を測定すること、また中性子ビームを絞ってイメージングを実現するための装置製作とデータ分析に大いに役立つと考える。今年度J-PARCにて鉄鋼材料と植物を模擬した試料を使った予備実験を行うことができた。これにより、ホウ素がppmオーダーで検出できることが確認でき、予測計算とのおよその一致が得られたことは大きな進捗であった。またこれは、“ぼやけ"の小さなビームスポットを作るためのコリメータや試料上下左右に動かす装置の設計・製作に役立つ。本研究では、高強度パルス中性子を用いて、鉄鋼材料や植物中のppmレベルの微量ホウ素を定量イメージングすることを目的としている。平成27年度は比較的大きな面積のホウ素含有試験試料(鉄鋼や植物を模擬したもの)においてホウ素の定量評価の初期実験を行い、ppmレベルでホウ素が検出できることを得たが、平成28年度以降では更なる定量化実証やイメージングの実証を行うことを目標とした。中性子コリメータにより細く絞ったパルス中性子で試料をスキャンして試料面方向のホウ素の空間分布をイメージングするために、試料を面方向に駆動する機構が必要である。この試料駆動機構の仕組みを検討した。このためにJ-PARC/MLF/BL04ビームラインのGeスペクトロメータの試料位置付近のダクトや構造体を現地調査し、必要な図面などを入手した。ppmレベルの微量ホウ素を定量評価するためには、ホウ素10が中性子と反応して発生する478keVガンマ線を良いS/Nで計測することが必要であり、バックグラウンドを極力低下させる必要がある。このために、試料付近の物質量を減らす構造の工夫をした。また、必要な精細さでイメージングを行うためにはサブミリの位置精度で試料を駆動する必要がある。また、リチウム6濃縮された炭酸リチウムで作られるコリメータの構造も検討した。J-PARCでの実験実施のため課題申請したが、平成28年度はマシンタイムが少なく不採用であった。

しかし、平成29年度のマシンタイムに応募し、採択された。試料を面方向に駆動する機構の構造を決定するために、その製作が遅れている。また、今年度はJ-PARCのマシンタイムが極端に少なかったため、実験を行うことができなかった。今年度は、ホウ素の2次元イメージングを実現するため、試料を中性子ビームに対して直交する平面内で水平と鉛直方向に駆動する装置を開発し、この装置を用いた実験をJ-PARCにて行った。実験はJ-PARC/MLF/BL04にて行った。実験体系は、パルス中性子ビーム上流から、中性子源、21.5m下流に実験試料、実験試料の直上流に直径3mmの中性子コリメータ、試料の上下に計14個のGeガンマ線検出器であった。試料として、厚さ1mm、20mm×20mmの面積の純鉄板5枚を重ねたものに、ホウ素を含むアモルファス合金箔を試料の位置ごとに枚数を変えたもの(すなわちホウ素濃度分布をつけたもの)を用いた。この装置の先端に試料を取り付け、試料を水平、鉛直方向ともに3mmピッチで移動させ、水平7×鉛直7の計49点に中性子ビームを照射し、スキャニングを行った。コリメータで整形された中性子ビームのプロファイルを金箔照射とイメージングプレート転写で評価したところ、直径3mmの中性子ビームであることが確認できた。実験データを分析した結果、B-10と中性子との核反応に起因する478keVガンマ線を検出することができた。さらに、このガンマ線の収量を49点毎に導出した。この結果、試料位置に依存したホウ素の分布を画像化することができた。鉄試料におけるアモルファス合金の分布と、実験で得たホウ素分布とを水平・鉛直方向で射影して定量的に評価したところ、両者の形状はほぼ一致していることが分かった。以上のように、ホウ素の2次元イメージングに成功した。試料を駆動する装置の設計に際して、設置する場所の空間的制限を考慮して必要な2次元スキャンの範囲を確保できるように設計するのに時間を要した。昨年度までにJ-PARC/MLF/BL04にてパルス中性子ビームとGeガンマ線スペクトロメータを用いて、微量ホウ素を含んだ植物および鉄鋼模擬試料での定量評価実験研究や、ホウ素濃度に分布をつけた鉄鋼模擬試料においてその分布のイメージング実験研究を行ってきた。定量評価実験では、少なくとも数ppmレベルまで定量できることを明らかにした。また、ピンホールで直径3mmに単純に絞ったパルス中性子ビームで試料をスキャンすることで、ホウ素分布のイメージングに成功した。以上のようにホウ素の定量イメージングを実証した訳であるが、今年度は本手法に関し、より高い統計やより高い空間分解能の画像を得るための発展研究として、パルス中性子ビームの集光デバイスの開発を行った。この集光デバイスは、平行に近い中性子ビームを一点に集光する中性子集光ミラーであり、中性子ビーム方向の長さが200mmの回転放物面の3.5Qcスーパーミラーとなっている。中性子入射側が直径約20mm、回転方向は120度分というプロトタイプである。ミラーの基板はアルミニウム合金であるが、荒く放物面にしたアルミニウム基板にニッケル-リンを蒸着し、このニッケル-リンを精密に加工することで高精度の回転放物面を実現している。この集光デバイスを製作し、実際にパルス中性子ビームを用いて集光実験を行った。
口腔内細菌による動脈瘤形成機序の解明および新たな予防法の開発戦略

口腔内細菌が大動脈瘤の発生および病態の進行に深く関わっていることが強く示唆されている。口腔内細菌による直接的な大動脈瘤壁への感染とそれに引き続く炎症がその本質であると考えられているが、これまでの報告は大動脈瘤壁に歯周病菌が存在していることをPCR法や免疫染色法にて確認しているのみであった。この方法では血行性に動脈瘤に流れ着いた歯周病菌の残骸を検出している可能性が否定できない。我々は心臓血管外科との共同研究をおこない、大動脈瘤手術時に摘出された大動脈瘤壁を直接培養することで口腔内細菌が「生きた」状態で存在しているか検証した。その結果、大動脈瘤およびその他大動脈疾患から歯周病菌は検出されず、体表や口腔の常在菌として知られているstaphylococcus属やPropionibacterium acnesの検出率が高かった。そこで、大動脈瘤壁を直接培養することで得られた細菌が大動脈瘤壁サンプルを用いたPCR法にて検出されるか検証した。その結果、PCR法では検出率が悪く、検出したサンプルもDNAバンドが薄かった。このことは培養法がPCR法と比べて大動脈瘤中の細菌を検出することに適していることを示している。また、これらの細菌が口腔内に存在していたかを示すために、手術時のサンプル採取に前もって採取しておいたデンタルプラークを用いて、PCR法にて検証した。その結果、培養法にて検出された細菌は口腔内においても検出されることがわかった。さらに、動脈瘤およびデンタルプラークから検出された細菌の16S rDNA領域の配列を比較した。その結果、患者間では配列が異なる細菌が検出される割合が高く、またサンプル間では一致する割合が高かかった。このことから、動脈瘤サンプルで培養された細菌は、口腔内由来である可能性が示唆されたが、これら細菌は常在菌であることも考慮し断定には至っていない。本研究は培養法を用いて細菌を同定する研究であるため、手技操作における細菌のコンタミネーションについての議論が常に必要になる。加えて、歯周病菌だけではなく口腔内に存在する常在菌をターゲットにしているため、徹底した細菌コンタミネーションの議論が必要となる。これまでのところ培養サンプルを次亜塩素酸洗浄することで、培養前の常在菌コンタミネーション防止策をおこなってきた。今回、動脈瘤壁からの検出菌とデンタルプラークのマッチングを実施することで、生きた口腔内由来の細菌が動脈瘤壁に存在する可能性についての検証が概ね終了した。動脈瘤壁からの検出菌とデンタルプラークのマッチングをDNAシークエンスを用いて実施することで、生きた口腔内細菌が動脈瘤壁に存在する可能性についての検証が概ね終了した。今後は、動脈瘤形成モデルマウスに対して生きた歯周病菌などの口腔内細菌を静脈内に投与し、動脈瘤形成が進行すること、および投与した口腔内細菌が生きた状態で動脈瘤内に存在することを明らかにする。さらに、生きた口腔内細菌に感染した大動脈瘤壁に発現の亢進している遺伝子についてマイクロアレイを用いて探索し、口腔内細菌が動脈瘤形成に直接的に、かつ深く関係していることを明らかにする。最終的には口腔内細菌による動脈瘤壁血管内皮細胞内シグナル伝達経路への影響を解明する。将来的には、口腔ケアや抗生剤投与による細菌学的な動脈瘤発症・拡大予防だけではなく、血管内皮細胞を標的としたシグナル伝達阻害剤などにも応用が期待される。

加えて、歯周病菌だけではなく口腔内に存在する常在菌をターゲットにしているため、徹底した細菌コンタミネーションの議論が必要となる。これまでのところ培養サンプルを次亜塩素酸洗浄することで、培養前の常在菌コンタミネーション防止策をおこなってきた。今回、動脈瘤壁からの検出菌とデンタルプラークのマッチングを実施することで、生きた口腔内由来の細菌が動脈瘤壁に存在する可能性についての検証が概ね終了した。動脈瘤壁からの検出菌とデンタルプラークのマッチングをDNAシークエンスを用いて実施することで、生きた口腔内細菌が動脈瘤壁に存在する可能性についての検証が概ね終了した。今後は、動脈瘤形成モデルマウスに対して生きた歯周病菌などの口腔内細菌を静脈内に投与し、動脈瘤形成が進行すること、および投与した口腔内細菌が生きた状態で動脈瘤内に存在することを明らかにする。さらに、生きた口腔内細菌に感染した大動脈瘤壁に発現の亢進している遺伝子についてマイクロアレイを用いて探索し、口腔内細菌が動脈瘤形成に直接的に、かつ深く関係していることを明らかにする。最終的には口腔内細菌による動脈瘤壁血管内皮細胞内シグナル伝達経路への影響を解明する。将来的には、口腔ケアや抗生剤投与による細菌学的な動脈瘤発症・拡大予防だけではなく、血管内皮細胞を標的としたシグナル伝達阻害剤などにも応用が期待される。当初計画では、平成30年度にマウスを用いた実験および物品使用を実施する予定であったが、実際には大動脈瘤サンプルおよび口腔内サンプル間の検出細菌のマッチングするための検証や実験に予想よりも時間がかかってしまった。そのため、次年度使用額がわずかながら生じてしまった。次年度計画については、当初予定どおり実施する予定である。
グリオブラストーマ幹細胞が腫瘍形成能を維持するメカニズムの解明

本研究では膠芽腫形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定を目的として、検体由来膠芽腫細胞を用いた網羅的RNAiスクリーニングを行った。平成24年度は、スクリーニングの結果得られた遺伝子のうち、ヌードマウスへの移植実験においてノックダウンによる有意な延命効果が得られた遺伝子について、その遺伝子産物に対する阻害剤を作製し、投与試験を行った。この結果、検体由来膠芽腫細胞をマウス頭蓋内へ移植したマウスに対して腹腔投与により延命効果のある2種類の阻害剤を得た。今後、既存の治療薬との組み合わせ投与試験など、ヒトへの投与試験に向けた実験を行っていく予定である。またRNAiスクリーニングで得られた遺伝子のうち、膜タンパク質であるNE10(仮称)について詳細な解析を行った。NE10のノックダウンにより膠芽腫細胞の増殖が抑制されることを複数の検体由来細胞を用いて確認した。またノックダウン細胞に対してマイクロアレイ解析を行った結果、NE10ノックダウンによってオリゴデンドロサイトへの分化が示唆された。今後、この膜タンパク質に対する阻害剤を作製し、膠芽腫幹細胞を分化させるというコンセプトでの抗がん剤の開発を行っていく予定である。平成23年度に酵母two-hybrid法によりNE10の相互作用因子としてKLHL20を同定し、KLHL20によってNE10がユビキチン化されることを明らかにした。本年度は、MS解析によりNE10のユビキチン化候補リジン残基を同定し変異体を作製して解析を行った。NE10はアクチン骨格制御によって細胞運動に関与することが報告されており、細胞内で局所的にKLHL20がNE10を制御することによって細胞運動にどのような影響があるのか解明していく予定である。本研究では細胞増殖、運動、分化をターゲットとして複数の抗がん剤の分子標的候補を同定した。これは膠芽腫に対する抗がん剤開発への重要な貢献であると考える。膠芽腫に対して腫瘍細胞の増殖を抑制し得る阻害剤を開発したことは非常に重要な進展であるといえる。また、検体由来細胞を用いた投与試験や薬物動態試験など一連の創薬試験に対する実験手法を確立した点も非常に重要な成果である。取得した薬剤について、ヒトに対する臨床試験に向けた実験を行う。RNAiで取得した他の遺伝子について、引き続きその遺伝子産物に対する阻害剤の開発を行う。本研究では、膠芽腫検体由来の細胞(GB-S)を用いて、CD133を指標とした網羅的RNAiスクリーニングを行うことにより、膠芽腫幹細胞の腫瘍形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定を目的として実験を行っている。平成22年度は、RNAiスクリーニングによってCD133の発現調節因子として同定された機能未知の膜蛋白質、PCDH7,8,9,10,17に着目して実験を行った。各遺伝子をノックダウンしたGB-S細胞を免疫不全マウス脳内に移植し、移植後の生存日数を観察した結果、各PCDHのノックダウンによってマウスの生存期間が有意に延びることが明らかとなった。このことから、PCDHの発現を抑制することにより、グリオブラストーマ幹細胞の腫瘍形成能が有意に低下したと考えられる。さらに、マウス脳内での移植細胞の挙動を観察するため、移植後死亡したマウスの脳切片を作成し、移植細胞特異的マーカー(GFP)に対する抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、PCDH10のノックダウンにより、GB-S細胞のマウス脳組織への浸潤能が著しく低下することが明らかとなった。PCDHは機能未知の膜蛋白であり、下流のシグナルは明らかになっていない。そのため、まずPCDHの細胞内相互作用因子を同定することを目的として、PCDH10の細胞内ドメインをベイトとした酵母two-hybridスクリーニングを行った。その結果、PCDH10の細胞内ドメイン結合因子として、KLHL20、TBCBを新規に同定した。今後,これらPCDH下流の因子の膠芽腫幹細胞における機能を明らかにすることにより、膠芽腫幹細胞に腫瘍形成能を付与する新たなメカニズムを明らかにしていきたいと考えている。本研究では膠芽腫形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定を目的として、検体由来膠芽腫細胞を用いた網羅的RNAiスクリーニングを行っている。平成23年度は、スクリーニングの結果得られた遺伝子のうち、ヌードマウスへの移植実験においてノックダウンによる有意な延命効果が得られた遺伝子に着目して実験を行った。平成22年度のマウス脳への移植実験の結果では、コントロール細胞がマウス脳内で非常に浸潤性の高い腫瘍を形成するのに対し、膜蛋白質であるPCDH10のノックダウン細胞は正常組織との境界が明瞭である浸潤性の低い腫瘍を形成した。そこで、PCDH10が膠芽腫細胞の運動や浸潤に重要な役割を果たすと考え、詳細な実験を行った。まず、膠芽腫細胞の運動能への影響を調べるため、ライブセルイメージングの手法を用い、シングルセルマイグレーションアッセイを行った結果、PCDH10のノックダウンにより、膠芽腫検体由来細胞の運動能が顕著に低下することが明らかとなった。今後は移植した膠芽腫細胞のマウス脳内での挙動に着目し、PCDH10ノックダウンによる浸潤能への影響を定量的に解析していく予定である。本研究ではPCHDIOの下流のシグナルを明らかにするため、酵母two-hybridスクリーニングによってPCDH10の細胞内ドメインに結合する新規因子の探索を行っている。本年度はPCDH10の細胞内結合因子として新規に同定したKLHL20について、in vitro、in vivoでの結合を再確認した。KLHL

20は腫瘍の浸潤に関与するという報告のある遺伝子でため、KLHL20との相互作用を解明することにより、PCDH10を介した浸潤能の制御に関する分子メカニズムを解明できるのではないかと期待している。膠芽腫の予後が悪い原因の一つとして高い浸潤性が挙げられるため、膠芽腫の浸潤に関わる新たな因子を同定したことは非常に重要な成果であると考える。本研究では膠芽腫形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定を目的として、検体由来膠芽腫細胞を用いた網羅的RNAiスクリーニングを行った。平成24年度は、スクリーニングの結果得られた遺伝子のうち、ヌードマウスへの移植実験においてノックダウンによる有意な延命効果が得られた遺伝子について、その遺伝子産物に対する阻害剤を作製し、投与試験を行った。この結果、検体由来膠芽腫細胞をマウス頭蓋内へ移植したマウスに対して腹腔投与により延命効果のある2種類の阻害剤を得た。今後、既存の治療薬との組み合わせ投与試験など、ヒトへの投与試験に向けた実験を行っていく予定である。またRNAiスクリーニングで得られた遺伝子のうち、膜タンパク質であるNE10(仮称)について詳細な解析を行った。NE10のノックダウンにより膠芽腫細胞の増殖が抑制されることを複数の検体由来細胞を用いて確認した。またノックダウン細胞に対してマイクロアレイ解析を行った結果、NE10ノックダウンによってオリゴデンドロサイトへの分化が示唆された。今後、この膜タンパク質に対する阻害剤を作製し、膠芽腫幹細胞を分化させるというコンセプトでの抗がん剤の開発を行っていく予定である。平成23年度に酵母two-hybrid法によりNE10の相互作用因子としてKLHL20を同定し、KLHL20によってNE10がユビキチン化されることを明らかにした。本年度は、MS解析によりNE10のユビキチン化候補リジン残基を同定し変異体を作製して解析を行った。NE10はアクチン骨格制御によって細胞運動に関与することが報告されており、細胞内で局所的にKLHL20がNE10を制御することによって細胞運動にどのような影響があるのか解明していく予定である。本研究では細胞増殖、運動、分化をターゲットとして複数の抗がん剤の分子標的候補を同定した。これは膠芽腫に対する抗がん剤開発への重要な貢献であると考える。RNAiを用いた網羅的スクリーニングによって、膠芽腫に対する抗癌剤の新規ターゲットとなり得る遺伝子を複数個同定したことは非常に重要な成果であると考える。また、膠芽腫は非常に浸潤性が高い癌であるが、その浸潤能に関わる分子を同定したことにより、今後、膠芽腫の浸潤を抑制するという新たな治療法開発へとつながる可能性が高まったと考える。膠芽腫に対して腫瘍細胞の増殖を抑制し得る阻害剤を開発したことは非常に重要な進展であるといえる。また、検体由来細胞を用いた投与試験や薬物動態試験など一連の創薬試験に対する実験手法を確立した点も非常に重要な成果である。現在実験を行っているPCDH10について、膠芽腫細胞の運動能と浸潤能に着目した詳しい実験を行う。