hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MAPキナーゼカスケードによる植物の細胞板形成の制御機構の解析

植物細胞に特異的な器官である細胞板(細胞壁)形成の分子機構を明らかにするために、細胞板形成に関与する新規分子の同定、機能解析を行った。植物の細胞板形成には、細胞質分裂時に特異的に活性化されるMAPキナーゼカスケードが必要である。本研究により、このカスケードの活性化が上流でサイクリン依存性キナーゼ(CDK)により負に制御されている可能性が示された。また、いくつかの新奇な下流因子の候補を見いだした。MAPキナーゼカスケードによる植物細胞板形成の分子機構を明らかにするために、(1)MAPキナーゼカスケードの下流因子の解析と、(2)MAPキナーゼカスケードの上流の制御因子の同定を行っている。(1)について、生化学的なスクリーニングと質量分析を組み合わせて新規下流因子の同定を進めるとともに、シロイヌナズナのデータベースを用いたin silico解析により、MAPキナーゼによってリン酸化される可能性のあるタンパク質の網羅的な検索を進めた。本年度は、ire silico解析により下流因子の候補として見いだされたAtKinesin l3Bに注目し、生化学的、解析を行った。Atkinesin l3Bは、多くの生物で微小管脱重合活性を持つことが知られているKinesin13ファミリーと相同性を示すキネシン様タンパク質である。Atkinesinl3Bは、in vitroでMAPキナーゼによりリン酸化されることがわかり、主要なリン酸化サイトも明らかとなった。また、GFP融合タンパク質を用いた解析から、このタンパク質は細胞質分裂時に染色体とともに細胞板にも局在することが示された。細胞板に局在することから、このタンパク質が細胞板形成に関与している可能性が示唆された。(2)について、生化学的な解析から、細胞板形成を制御するMAPキナーゼカスケードの最上流因子であるNPKI MAPキナーゼ・キナーゼ・キナーゼ及び、その活性化因子であるNACK1が共にin vitroでCDKによりリン酸化されることが分かった。CDKによるリン酸化は、in vitroで両タンパク質の直接結合を阻害した。NPK1はNACK1との直接結合により活性化されることから、CDKがMAPキナーゼカスケードの活性化及び活性化の時期を制御している可能性が示唆された。本年度は、今回新たに明らかとなった下流因子、上流因子について、in vivoでの機能、リン酸化による機能制御機構の解析を進める予定である。MAPキナーゼカスケードにより制御される植物の細胞板形成の分子機構を明らかにするために、(1)下流標的因子の探索と機能解析、及び(2)上流の制御因子の同定を行っていたが、本年度は(2)について重要な知見が得られたため、特にこちらに研究を集中した。これまでに我々は、キネシン様タンパク質(NACK)とMAPキナーゼカスケードからなるNACK-PQR経路が、植物の細胞質分裂の中心的な制御系であることを示してきた。この経路は、NACKがMAPキナーゼカスケードの最初の酵素であるNPK1 MAPKKKと中期以降に結合することにより細胞質分裂時に特異的に活性化されるが、この特異的な活性を制御するメカニズムについては不明であった。昨年度までに、NPK1及び、その活性化因子NACK1は共にin vitroでCDKによりリン酸化されることを示した。本年度はCDKリン酸化サイトに対するリン酸化抗体を作製し、in vivoにおけるリン酸化タンパク質の解析を行った。その結果、タバコ細胞においてNACK1とNPK1のCDKリン酸化サイトはin vivoで中期以前にリン酸化されていることが明らかとなった。また、このリン酸化はCDKの活性に依存していることも分かった。CDKによるリン酸化はin vitroで両タンパク質の直接結合を阻害することから、CDKは両タンパク質のリン酸化を介して、NACK-PQR経路の活性化、つまり細胞質分裂の開始を抑制しているようだ。CDKは細胞周期の進行をコントロールする主要な制御因子であるが、M期の中期以降にCDKが関わっているかどうかについては知見が少ない。今回、CDKがMAPキナーゼカスケードの上流の制御因子として機能することが示されたことにより、CDKが中期以降の進行を厳密に制御する機能も持つという可能性を一つ提示することができた。本研究結果については現在論文投稿準備中である。
LA／ECRIS-MSの開発による希ガスから金属元素までの連続同位体分析の実現

本研究の目的は、理化学研究所にて開発中の電子サイクロトロン共鳴イオン源質量分析装置(ECRIS-MS)を改良し、元素の種類を選ばず、同位体分析を高感度かつ高精度に実現できるシステムを完成し、惑星物質中の同位体異常の系統的な解析を行い、元素合成や太陽系の起源に関わる研究を行うことである。成果の概要は以下の通りである。1.検出器を複式化を行い、同位体の分析精度を向上させる事が出来た。2.スパッタリングあるいはレーザーアブレーションによる固体試料の直接導入系を整備した。3.Mo等と希ガスについて標準鉱物試料を用いて同位体比の精密分析を実現させた。4.イメージングのための基盤システムを開発した。理化学研究所において開発中の電子サイクロトロン共鳴イオン源質量分析装置(ECRIS-MS)を感度性能や汎用性を活かした同位体分析装置としてカスタマイズし、惑星物質の同位体分析を多元素に対しての同時分析を実現するのが、本研究の目的である。平成26年度においては、平成25年度までに行われた、検出系、イオン源、試料導入系の基本的なカスタマイズおよび、レーザーアブレーションシステムの導入という基盤技術に関する検証を行った。その結果、固体試料の同位体測定に対応することが可能ではあるが、検出系に原因不明のノイズが発生することが判明するとともに、スリットの駆動システムと質量スペクトルの精密同期の再調整や、レーザーアブレーションシステムの光学系において再調整が必要な事が判明した。そこで、さらに、以下の研究を実施した。1.高速移動式のスリットと大型のファラデーカップを組み合わせた疑似複式検出器の駆動システムの改良(ガイドレールの材質の変更や位置センサーの改善など)を行った。また、変更した高速移動式のスリットの形状にあわせて検出器へのイオンの入射系の微調整を行った。2.レーザーアブレーションシステムの光学系の再調整、並びに試料保持システムの改良を行った。3.天然の鉱物試料中の鉛同位体比、モリブデン同位体比を試験的に分析し、質量差別効果が無視できるレベルである事を確認した。シホテアリン隕石を対象とした実用的な分析を開始した。平成27年度初めより、試料駆動ステージの試作、また、レーザーアブレーションシステムと複式検出器を組み合わせた同位体分析の結果を二次元的に展開できるシステムの開発に取りかかり、現在も進行中である。理化学研究所において開発中の電子サイクロトロン共鳴イオン源質量分析装置(ECRIS-MS)をそのイオン源の感度性能や汎用性を活かし、同位体分析装置としてカスタマイズし、惑星物質の同位体分析を多元素に対して、同時分析を実現するのが、本研究課題の目的である。平成27年度においては、平成26年度までに行われた、検出系、イオン源試料導入系の基本的なカスタマイズ及び、レーザーアブレーションシステムの導入という基盤技術の検証を引き続き行った。その結果、固体試料の同位体分析に対応することが可能ではあるが、検出系に、主としてファラデーカップの駆動系に起因するノイズが発生することが判明した。また、検出器前に設置したスリットの駆動系と質量スペクトルの精密同期が取れていないことも問題として明らかになった。そこで、平成27年度において、さらに、以下の実験を実施した。また、レーザーアブレーションシステムで得られたイオンデータを2次元マッピングとして展開するシステムについても開発を行った。1.高速移動式のスリットと大型のファラデーカップを組み合わせた疑似複式検出器の駆動システムを材質を変えて改良したガイドレールを基に位置センサーを改良した物に変更した。2.レーザーアブレーションシステムの光学系の調整と試料保持システムの改良を行った。3.天然のモリブデン鉱石に対して、モリブデン及び周辺元素の同位体分析を実施した。4.同位体データを位置情報と組み合わせた2次元の表データとし、PythonのグラフィックモジュールであるMatplotlibを用いて画像処理するシステムを試作し、動作確認を行った。当初予定した実施項目はほぼすべて行い、平成27年度は標準試料を用いた実証実験的な同位体分析に予定どおり進むことが出来る。気体元素に関しても検出可能である事は実証しており、後は感度性能向上特に、複式化した検出器のノイズ除去達成と、スリット駆動システムと質量スペクトルの精密同期であるが、これに関する対応策は既に出来ており、今後の研究進展の期待は大きい。宇宙地球化学レーザーアブレ-ションによる試料導入と複式化した検出器を組み合わせた同位体分析を行い、イオン光学系の最適化を行いつつ、実試料の局所同位体分析を試みる。気体元素の抽出も既に検証済みであり、これは当初の研究計画に沿ったもので有り、後は試料駆動ステージの製作を平成27年度に行う予定である。検出系の改造後に、駆動システムに起因するとみられるノイズがプリアンプ関連のデータ処理系に発生したこと、また、駆動システムを質量スペクトルに同期させるシステムに若干のタイムラグが生じる事が判明した。

その解決のため平成26年度に予定したレーザーアブレーションシステムの試料駆動ステージの製作を平成27年度に行う事としたため、その分の予算を繰り越すこととした次第である。試料駆動ステージの設計そのものは終了しているので、すぐに発注、製作できる予定であり、研究計画自体の遅延はほとんど無い。試料駆動ステージの製作を行う予定である。設計は既に終了しているため、検出系の改良、駆動システムの質量スペクトルへの同期システムの改造が終了次第、試料駆動システムの製作を行うため、次年度使用額をこれに充てる予定である。
研究開発成果の新たな適用先発見に資する、技術スピンオフの予測に関する研究

本研究の目的は、特定の分野横断的産業で研究開発が行われた技術成果のうち、当初の目的に無かった想定外の用途として花開く技術を膨大な科学技術情報に基づく情報学的手法により、事前に特定することである。技術スピンオフを起こしうる領域の萌芽を事前に特定する手法を提案し、我が国のイノベーション戦略ならびに産業の研究開発戦略への貢献を目的とするものである。平成27年度における実績は次のとおりである。対象となる分野におけるデータ抽出のプロセスとして、炭素繊維材料、ナノ複合材料、薄膜技術等に関する論文データを抽出した。これら抽出した書誌データを元に国際特許分類の共起情報を元にした各年月で共起ネットワークを作成し、複数の時間遷移ネットワークの作成を行った。得られた時間遷移ネットワークのうち、学習用データと評価用データの組み合わせとして、126通りの組み合わせを作成した。リンク予測指標としてCommon Neighbors,Resource Allocaitons, Adamic/Adarおよびそれぞれの重み付けの指標を計算し、合計6指標についてリンク予測の評価指標の計算を行った。各種のリンク予測指標の精度は、データセットによって異なる事を確認した。とくに分野のネットワーク成長構造によって、指標の精度が影響を受けるであろうことが考えられる。また具体的な予測結果として、二輪舎に搭載される内燃機関ののハウジングに初めて炭素繊維が用いられるタイミングを特定することが出来た。本実績は、日本知財学会全国大会企画セッション「知財データ知財情報のサイエンス」で口頭発表を行った。なお、平成27年12月をもって所属機関での雇用条件の変更により雇用経費業務への専従となるため、本研究費の助成を受けた研究は平成27年をもって終了せざるを得ず、従って当該年中の論文化には至っていない。しかしながら今後も当該研究課題については取り組む予定である。
神経芽細胞腫のアポトーシス誘導を制御するカスパーゼ8の解析

ヒトカスパーゼ8の上流でメチル化が生じる部位をシークエンスから検索し、bisulfate処理後その部位をメチル化の有無で認識するプライマーを設定して、神経芽腫196例に行ったところ、予後不良の神経芽腫や進行例でメチル化の頻度が有意に高かった(P<0.05)。その部位のオリゴヌクレオチドでメチル化が起こるシトシンを認識するグアニンと、脱メチル化したシトシンをbisulfate処理にてウラシルに変化させた時に相補的に認識するアデニンとしたオリゴヌクレオチドを作製し、メチル化を同定しうるアレイを作製したが、ハイブリ条件が困難で、オリゴヌクレオチドの長さを40塩基程度に延長して再度アレイを作製して検索中である。さらに神経芽細胞腫において欠失、増幅する1番、2番、14番、17番染色体等の領域をカバーする大腸菌人工染色体クローンを用いたアレイでの遺伝子変化の解析では、メチル化のある腫瘍では有意に1番染色体の欠失、14番染色体の増加などの遺伝子量の変化がみられた。これらの検討を、カスパーゼ8上流にメチル化があり、カスパーゼ8発現が低下している6例を、メチル化のない6例と比較検討し、メチル化と有意に相関する遺伝子変化として、1番染色体1p34領域の欠失、2p領域の増加、11q領域の欠失などがみられ、現在、特異的な部位を同定すべく症例を追加して検討中である。ヒト胎児神経細胞由来のcDNAから作製したアレイで、同様の検体の遺伝子発現を検討したが、メチル化のある腫瘍で有意に発現が亢進していたのはMYCN, CyclinG1やNeuron apoptosis inhibitory factorなどで、細胞接着因子やCaspase 8,9などの発現低下を認め、apoptosisの抑制がみられ、これらのシグナル伝達系の遺伝子の動向について現在検討中である。カスペース8のメチル化の検出可能なアレイの開発は可能であり、また、神経芽腫におけるapoptosis誘導シグナル伝達系の解明は分化誘導療法につながると考えられた。
任意の二重らせんDNAを標的とできる人工リプレッサーの医薬分子設計

【目的】我々は5-ホルミルウリジン(X)のホルミル基が有機溶媒中でリジンの側鎖アミノ基とシッフ塩基を形成することをアミノ酸とヌクレオシドのレベルで確認している。本研究は大腸菌の遺伝子組換え酵素RecAのDNA結合部位にはL-リジン残基が1つだけ存在することに注目し、X含有オリゴヌクレオチドとの水中でのシッフ塩基形成によるクロスリンクの可能性をオリゴマーのレベルで検討することを目的とした。【合成と解析】RecAのDNA結合部位であるloopL2部位に相当する20アミノ酸残基からなるオリゴペプチドとリジンの位置を変えた変異体をFmoc法により固相合成した。X含有オリゴヌクレオチドはジオール体として固相合成した後、過ヨウ素酸酸化によりホルミル体に導いた。Xを7つ含むAと1つだけ含むBの2種類のオリゴヌクレオチドを合成した。各合成ペプチドと天然DNAとの結合をCDスペクトルにより調べたところ、天然の配列をもつペプチド(FECO)とN末端から8番目のグリシンをリジンに置換したペプチド(G8K)だけが、DNAの添加によってそのコンホメーションがランダムコイルからβ-シートに変化し、DNAに結合することが分かった。次いで、各ペプチドとAとの結合をゲル電気泳動法により調べたところ、やはりFECOとG8KのみがAと結合した。リジンに置換してもDNA結合活性を保持できるのは8位のグリシンのみで、さらにリジンはL体に制限され、D体ではDNA結合能が失われることも合わせて明らかになった。オリゴヌクレオチドBでも同様の結果が得られ、生成物が凝集体として水中で沈殿することを見出した。リジンをもたない変異体K6Rを合成し、Bと反応させてもクロスリンクは起こらず、さらにFECOと天然DNAを反応させてもやはりクロスリンクは起こらなかったことからクロスリンクはシッフ塩基形成によることが確認された。【目的】我々はすでに、5-ホルミルウリジン(X)のホルミル基がリジンの側鎖アミノ基とシッフ塩基を形成することをアミノ酸とヌクレオシドのレベルで確認している。今年度は大腸菌の遺伝子組換え酵素RecAのDNA結合部位にはL-リジン残基が1つだけ存在することに注目し、X含有オリゴヌクレオチドとのシッフ塩基形成によるクロスリンクをオリゴマーのレベルで検討した。X含有オリゴヌタレオチド(A,23mer)はジオール体として固相合成した後、過ヨウ素酸酸化によりAに導いた。各合成ペプチドと天然DNA(dT)_<21>との結合をCDスペクトルにより調べたところ、天然の配列をもつペプチド(FECO)とN末端から8番目のグリシンをリジンに置換したペプチド(G8K)だけが、DNAの添加によってそのコンホメーションがランダムコイルからβ-シートに変化し、DNAに結合することが分かった。リジンに置換してもDNA結合活性を保持できるのは8位のグリシンのみで、さらにリジンはL体に制限され、D体ではDNA結合能が失われることも合わせで明らかになった。現在、シッフ塩基形成の有無について詳細に検討しているところである。
骨髄細胞移植を用いた放射線照射皮膚における創傷治癒改善効果の検討

まずratの背部に作成した皮膚欠損創傷に対し、同種骨髄移植を行い骨髄細胞の創傷治癒への関与を検討した。同種rat大腿骨より採取した骨髄から単核細胞(BMMC)を分離し、これを蛍光標識し、control (D-PBS)、BMMC+PBS、BMMC+末梢血、末梢血のみの4群に分け、collagen spongeに浸透させ皮膚欠損創に移植、2週後に創面積測定と試料採取を行い病理組織学的検討を施行した。創面積はBMMC+末梢血群で最も縮小した例が観察されたが、全体としては個体差が大きく有為差を認めなかった。BMMC+PBSおよびBMMC+末梢血群でDiI(+)の血管内皮細胞、筋線維芽細胞と思われるspindle cellが確認され、創傷治癒への関与が証明された。次に難治性潰瘍モデルとして放射線照射皮膚に作成した皮膚欠損創における創傷治癒改善効果に関する検討を行ったが、至適実験条件が得られず、また並行して検討したヒトの難治性潰瘍の病理組織学的検討によりratに同様の病態を作成するのは困難と判断した。一方でわれわれは学内倫理委員会の承認のもと、難治性潰瘍に対する自家骨髄を用いた治療を開始した。治療の際患者の同意のもと難治性潰瘍、骨髄移植後の肉芽を採取し各種免疫組織学的染色を併用し病理組織学的検討を行った。難治性潰瘍ではα-smooth muscle actin (SMA)^+、Factor VIII^-の病的な筋線維芽細胞の増殖による瘢痕化したmatrixを認めた。また潰瘍面の新生血管よりも表層にこの細胞が存在した。骨髄移植後の良好な肉芽ではα-SMA^+、Factor VIII^+の筋線維芽細胞が新生血管を取り囲み、潰瘍表面には筋線維芽細胞の裏打ちのないCD31(+)血管内皮前駆細胞による管腔形成を認めた。また難治性潰瘍の病的筋線維芽細胞が肉芽形成に関与していないことを確認した。骨髄細胞を確立するためにSprague-Dawly ratおよびC57/B6 mouseの骨髄を採取して骨髄単核細胞を比重遠心法にて分離、これを培養して得られたplastic adherent cellsを実験に用いた。また、この他にmesenchymal stem cellとして多分化能を持つ事が知られる脂肪組織由来のpreadypocyte、筋肉由来のmyoblast、脳神経組織由来のneural stem cellも同時に分離・培養した。また、magnetic sortingを用いて骨髄細胞よりCD34(+)cellを分離した。Controlとしては皮膚のfibroblastを分離・培養した。これらの細胞をgreenfluorescent proteinをコードする遺伝子とンエオマイシン耐性遺伝しを有するベクターpQBI 25でトランスフェクシヨンし、G418を用いてトランスフェクタントを選別し、細胞のマーキングを行った。これらの蛍光色素によりマーキングされた細胞をrat、mouse各々の皮膚内に注射し、その細胞の挙動を現在観察中である。これにより各幹細胞のnicheが同定できる可能性がある。また、rat、mouse各々の皮膚に放射線照射を行い(現在至適方法および条件を検討中)、放射線潰瘍が生じる条件において、照射後にこれらの細胞を皮膚内に注射し、放射線潰瘍の形成に与える影響、および移植された細胞がどのような組織に分化し、組織再生に関与しているのかを観察する予定である。
Spin Mechanics

ナノスケール物質において機械的自由度と相互作用する磁気秩序の物理学を記述する為「スピン・メカニクス」という用語を導入した。複雑なフェリ磁性体の磁化ダイナミクスの原子論的シミュレーションや、温度勾配や光パルスなどの摂動に対する応答を計算する為の、マグノン伝導に対するバリスティック領域の理論や半古典理論、有効散逸方程式理論といった、理論模型と研究手法を実際に開発した。特に、スピンホール磁気抵抗、光ポンププローブのマグノンポーラロン、スピンゼーベック輸送実験、スピンペルチェ効果とスピンネルンスト効果の発見に理論的に貢献し、また磁化ダイナミクスによるフォノンポンピングの予測を行なった。29年度が最終年度であるため、記入しない。物性理論29年度が最終年度であるため、記入しない。
紙の燃料電池の創出

DIR-SOFCの信頼性向上とSOFCの用途拡大を目指して提案した“紙の燃料電池"の開発を目的として材料開発を行い、以下の成果を得た。高靭性酸化物フィルムを作製し、当フィルム上にドット電極を適用することで“曲がるSOFC"を開発した。無機繊維からなるフレキシブル触媒上に当セルを適用することで、柔軟性の高い材料のみで構成された改質機能を有するセルを得て、模擬バイオガスを供給して“紙の燃料電池"の実証に成功した。さらに、触媒構成材料の化学的両立性の維持および触媒表面炭素種の改質の促進に取り組み、燃料多様性の向上に資する知見を得た。固体酸化物形燃料電池は、セラミック材料で構成された燃料電池であり、機械的な脆弱性が課題の一つとなっている。本年度は、構成材料の機械的自由度を高めた材料開発に着手し、“紙の燃料電池"の創出に資する設計指針を明らかにした。具体的には、紙の燃料電池の支持体となり得る紙形状触媒構造体の構成について、触媒分析装置を用いて検討すると共に、フレキシブル電解質膜の作製プロセスを確立した。紙の燃料電池のコンセプトは、構造自由度の高い新しいセル構造を追及するものであり、無機繊維からなる紙をシンプルな濾過技術で作製後、触媒機能を付与し、これに柔軟性を高めた固体電解質を組み合わせてセルとするものである。本コンセプトの基盤材料となる無機ペーパーは、燃料改質の反応場となるため、紙を構成する無機繊維(アルミナ/シリカ繊維およびジルコニア繊維)について改質能に影響する繊維表面上酸性サイトの定量評価を行った。特に、強酸点の増加は、炭化水素の改質において炭化水素分子の分解を促進することが報告されおり、繊維表面上の重量当たりの強酸点が表面積の増加とともに単調に増加したことから、低温焼成時に比表面積が向上する上、電解質材料と同じ元素で構成されるジルコニア繊維が紙の燃料電池の創出に有望であることを示した。しかしながら、ジルコニア繊維からなる無機ペーパーの構造安定性を確保するためには、高温焼成により繊維同士の結合を強めなければならず、炭化水素の分解活性が低下することが予想されるため、ジルコニアペーパーの低温焼成プロセスの開発が今後の課題となる。高温作動の固体酸化物形燃料電池(SOFC)では、炭化水素を改質器なしで供給を行う直接内部改質型の作動が原理的に可能であるが、従来のセル構成では、熱応力に対する脆弱性や炭素析出等の問題が生じ、長期耐久性は期待できない為、本研究にて機械的柔軟性および燃料多様性を向上させた、新しいコンセプトの燃料電池の創出を目指す。本年度は、無機繊維ネットワークからなるフレキシブル改質反応場を燃料極側に適用した柔軟性の高い“紙の燃料電池"の作製プロセスの確立を目標とした。ジルコニアおよびセリア、アルミナを固溶させた酸化物粉末をスラリー化後、焼成プロセスにて厚さ約20μmの高靱性電解質シートを作製し、片面に燃料極(Ni-安定化ジルコニアサーメット)ペーストを、反対面には空気極ペーストをドット状に塗布して高温焼成することで機械的柔軟性をもつSOFCとし、さらに無機繊維ネットワーク内にNiを分散させたフレキシブル触媒反応場を積層して内部改質機能を付与し、新しいコンセプトのSOFCとした。上記試作セルにドライ水素および混合ガス(CH4/CO2 = 1)を供給、800 oCにおいて発電試験を行ったところ(セルの柔軟性が失われないよう、セル周囲にシール材を用いないシールレスにて測定)、CH4/CO2供給時に水素と同等かそれを上回る出力が得られた。この結果は、供給したCH4とCO2が、アノード活性層近傍に配置されたフレキシブル改質反応場上で高い転化率でH2およびCOに変換され、純H2供給時に比較して、より効率良く電極反応に寄与するH2およびCOがドット燃料極に供給されたことを示す。発電試験後、アノード活性層及びフレキシブル改質反応場に炭素析出は見られず、電解質の亀裂も観察されず、良好な発電性能を得ることに成功した。以上のように、ジルコニア系酸化物の機械的および電気化学的評価を通して、電解質として機能する柔軟性の高い酸化物シートが得られ、これに柔軟性が損なわないよう燃料極、空気極および改質反応場を適用するセル作製プロセスを確立した。本研究で提案した曲がる固体酸化物形燃料電池(SOFC)のコンセプトは、様々な余剰化学エネルギー発生個所に取り付けられる“発電テープ"としての応用も期待されるため、これを具現化するため、以下の課題に取り組んだ。I. SOFC電解質として適用可能な電気的特性を有する高靭性電解質を得ること。II.セルの機械的自由度を高めるために、新しい構造の電極/電解質界面を構築すること。III.セルが機械的に拘束されないような発電手法を選択すること。I.に関しては、12 mol%のセリアを含有するジルコニアに適度な安定化剤を添加することで、高靭性電解質として知られている3YSZよりも高い破壊靭性値を示し、3YSZに匹敵する曲げ強度およびSOFCに適用可能なイオン伝導性とイオン輸率を有する電解質を得た。II.に対しては、開発した上記高靭性電解質フィルム表面上にドット形状のアノードおよびカソード活性層を適用することで曲がるセルを得ることに成功した。

III.の課題をクリアするためには、セルの機械的自由度が失われないよう、シールレス条件での作動が必要になり、本研究では、曲がるSOFCのコンセプトを実証するために、直径48 mmのアルミナ管の外表面の周方向に沿ってII.で開発したセルを貼り付け、管内に水素あるいは模擬バイオガスを、外側には空気を流し、シールレス条件下で発電特性を評価した。その結果、純水素供給時には、水素リークによる化学エネルギーの損失が大きいのに対して、炭化水素燃料を直接供給し、アノード近傍で水素を作り出す直接内部改質発電がエネルギーロスの軽減に有効であることを明らかにし、紙形状の触媒構造体(PSC)をアノードに隣接して配置することで、模擬バイオガス供給時に従来型SOFCの水素供給時に匹敵する電気化学性能が得られ、機械的柔軟性および燃料多様性を兼ね備えた新コンセプトのSOFCの創出に成功した。DIR-SOFCの信頼性向上とSOFCの用途拡大を目指して提案した“紙の燃料電池"の開発を目的として材料開発を行い、以下の成果を得た。高靭性酸化物フィルムを作製し、当フィルム上にドット電極を適用することで“曲がるSOFC"を開発した。無機繊維からなるフレキシブル触媒上に当セルを適用することで、柔軟性の高い材料のみで構成された改質機能を有するセルを得て、模擬バイオガスを供給して“紙の燃料電池"の実証に成功した。さらに、触媒構成材料の化学的両立性の維持および触媒表面炭素種の改質の促進に取り組み、燃料多様性の向上に資する知見を得た。紙の燃料電池を試作し、その発電試験に成功したが、当コンセプトの導入により、炭化水素直接供給時の燃料電池の長期安定作動が期待できるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。工学今後は、電解質としての機能が低下しないようジルコニアに固溶させるドーパントの種類と濃度の調整を行い、電解質の靱性をさらに高め、得られた高靱性電解質を上記プロセスに適用することにより、セルの柔軟性の向上を目指す。一方、燃料多様性の観点からは以下の取り組みを行う。無機繊維ネットワークからなるフレキシブル改質反応場には、紙抄きプロセスの際に、金属触媒のみならず様々な機能性酸化物を分散させて触媒機能を向上させることができる。分担者と連携して得られた酸化物担体表面上の炭化水素の原子・分子レベルの現象に関する知見をフレキシブル改質反応場の設計に活用するとともに、異なる“紙"の積層化により、炭化水素を直接供給した場合でも発電部にクリーンな合成ガスのみを供給可能な積層型改質反応場を創出し、当反応場を燃料極側に適用することで直接内部改質運転時の安定作動を実証する。紙の燃料電池の基盤材料となる無機繊維の開発指針を明らかにするとともに繊維と組み合わせるフレキシブル電解質の作製プロセスを確立したことから、2年度目からプロトタイプセルの開発に着手できるため。触媒分析用の混合ガスを発注予定であったが、想定よりも消費量が抑えられたため、年度内の購入が必要とならなかった為(白鳥)27年度が最終年度であるため、記入しない。紙の燃料電池の基盤材料となるジルコニアには、様々な元素をドープすることで助触媒効果、焼結性および靱性を向上させることが期待できるため、試作したジルコニア繊維および電解質シートの化学的および機械的分析を進め、フレキシブル材料の開発を進める。これらの材料を組み合わせ、プロトタイプセルの試作を行う。一方、金属触媒/酸化物担体/炭化水素の三相界面での原子・分子レベルの現象解明を目指し、燃料の電気化学的酸化反応を考慮した三相界面での現象を分子論から検討し、燃料極開発に活かす。
腎臓リハビリテーション：有効性の機序解明と臨床応用

長期的運動の腎保護相加・相乗作用およびその機序をラットで検討し、運動療法を腎不全患者に適用して、それらの臨床的有効性を検証した。慢性腎不全ラットにおいて、長期的運動とアンジオテンシンII受容体拮抗薬の併用療法は腎保護効果を示し、カルボニルストレス軽減の関与が示唆された。食塩感受性ラットにおいても長期的運動は腎保護作用を示し、酸化ストレスとNO産生系の改善の関与が示唆された。透析中の運動療法に使用できる、安価・軽量で、負荷量を調整できるエルゴメータを開発・試用し、透析中の血圧過降圧の頻度の減少、身体機能やQOLの向上を認めた。慢性腎不全において、適切な運動は腎保護、運動耐容能の改善など好影響をもたらすことが示唆されている。しかし、その効果はなお完璧なものではなく、効果を増強させる治療法が待たれている。解糖系から産生されるカルボニル物質のMethylglyoxal(MGO)は慢性腎臓病において血中濃度が上昇し病態進展に関わることから、慢性腎不全に対する運動とアンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)であるolmesartanの効果にカルボニルストレスの関与があるかを検討した。7週齢のWistar-Kyotoラットを用いて、5/6腎摘除慢性腎不全モデルを作成し、12週間長期運動(EX)とolmesartanの単独もしくは併用時の糸球体硬化指数(IGS)を検討した。運動はラット用トレッドミル装置を用い、速度20m/minの走行運動を1日1回60分間、1週間に5日間行った。olmesartanは10mg/kg/日の用量で浸透圧ミニポンプを用いて持続投与した。IGSはEXの単独投与により低下したが、olmesartanとの併用はさらに低下した。また、全てのラットデータにおいて血漿MGO濃度は腎障害指標であるIGS、尿蛋白排泄量,及び血清クリアチニン値との間にそれぞれ有意な相関を認めた。以上の結果より5/6腎摘除腎不全モデルにおいてEXは腎保護効果を有するが、olmesartanとの併用により増強した。以上の結果から、慢性腎不全モデルラットにおいて、運動とARBの併用療法は、腎保護効果を発揮しながら運動耐容能を改善させる可能性があり、その腎保護効果にカルボニルストレスの減少を介した機序の関与が示唆された。長期的運動の降圧や腎保護効果の機序を明らかにするため、食塩感受性高血圧ラットにおいて高食塩食負荷(HS)による腎障害に対して長期的な運動が与える影響について検討した。雄性Dahl食塩感受性ラットを0.5%通常食塩食摂取+非運動群、通常食塩食摂取+運動群、8%高食塩食摂取+非運動群、高食塩食摂取+運動群の4群に分け、運動群にはトレッドミル運動を8週間実施した。HSにより血圧は上昇したが、長期的運動は血圧に影響を与えなかった。HSは蛋白尿、糸球体濾過量、糸球体硬化を悪化させ、長期的運動はそれらを抑制した。酸化ストレスはHSにより増加したが、長期的運動により軽減し、NO代謝産物であるNOxの尿中排泄量は長期的運動により増加傾向が認められた。以上の結果から、食塩感受性高血圧ラットにおいて長期的な運動は血圧非依存性に腎保護作用を有し、酸化ストレスの軽減、NO系の改善が関与している可能性が示唆された。透析中の運動療法に関して、電動補助(アシスト)つきエルゴメータは運動負荷としては軽すぎる場合が多いために、安価・軽量で、患者の体力に合わせて軽度中程度の負荷量を調節できるエルゴメータの開発の必要性を感じ、昭和電機が開発・製作を引き受け、「てらすエルゴ」が完成した。研究代表者は試作品の段階からその監修に携わった。「てらすエルゴ」を使用しながら透析中の運動療法を多施設で行ったところ、透析中の血圧過降圧の頻度の減少、身体機能の向上、趣味活動や外出機会が増えるなど活動範囲も拡大することが明らかになり、普及に努めている。また、腎臓リハの有効性や方法をまとめた本邦初の成書である「腎臓リハビリテーション」(医歯薬出版)を2012年に発刊し、2012年2013年にNHK「きょうの健康」、「名医にQ」、「あさイチ」、読売新聞などでも腎臓リハが紹介され、さらに、2013年の国際リハ医学会(ISPRM)での腎臓リハの講演などを行った。慢性腎不全において、適切な運動は腎保護、運動耐容能の改善など好影響をもたらすことが示唆されているが、この腎保護効果の機序は明らかではない。nitric oxide (NO)は血圧、腎機能調節に関与し、腎障害の病態進展に関わることから、慢性腎不全に対する運動の効果にNO産生系の関与があるかを検討した。Wistar-Kyotoラットを用いて、5/6腎摘除慢性腎不全モデルを作成し、運動はラット用トレッドミル装置を用いて8週間の長期運動(EX)を施行した。

コントール群に比較して、慢性腎不全群では収縮期血圧は有意に上昇し、EXにより有意に低下した。しかし、尿蛋白量や血清クレアチニン値にはEXによる有意な改善は認められなかった。NO代謝物のNO2+NO3 (NOx)は、血漿ではコントール群、慢性腎不全群、EX群の間に有意な差はなかったが、尿ではコントール群と慢性腎不全群の間に有意な差はないものの、EX群では有意に増加した。収縮期血圧と尿NOx排泄量には負の相関が認められた。NO合成酵素(NOS)活性は、慢性腎不全群ではコントール群と比較して低下傾向を、EX群では慢性腎不全群と比較して増加傾向を認めた。一方、内皮型NOS (eNOS)蛋白発現は、慢性腎不全群ではコントール群と比較して有意に増加し、EX群では慢性腎不全群と比較して低下傾向を認めた。以上の結果から、慢性腎不全モデルラットにおいて、運動は、尿蛋白量や血清クレアチニン値を改善させる前から血圧を低下させ、腎NO産生を亢進させることが明らかになった。腎NO産生とeNOS蛋白発現の結果には解離があることから、腎不全におけるeNOS蛋白リン酸化、アンカップリング、内因性NOS阻害物質等によるeNOS不活性化が示唆され、長期的運動はこの腎不全におけるeNOS不活性化を改善するものと考えられた。5/6腎摘除慢性腎不全モデルラットを用いた基礎研究については、長期的運動および薬剤併用の有効性を明らかにすることができたが、透析患者を対象とした臨床研究については施設への倫理申請に時間を要し、患者の研究エントリーを開始する段階である。25年度が最終年度であるため、記入しない。5/6腎摘除慢性腎不全モデルラットを用いた基礎研究については、長期的運動および薬剤併用の有効性を明らかにすることができたが、透析患者を対象とした臨床研究については、患者の研究エントリーを開始した段階である。5/6腎摘除慢性腎不全モデルラットを用いた基礎研究については、長期的運動による腎保護効果の機序をさらに明らかにしていく。透析患者を対象とした臨床研究については、患者のエントリー数を増やすと共に、運動療法や骨格筋電気刺激を実施してデータ収集に努めていく。
含ランタン酸化物膜被覆法の開発と表面分析、熱分析による評価

2.酸化チタンと酸化タングステンの混合酸化物薄膜の光電気化学挙動:金属Ti基盤にWを真空蒸着後、1073Kと1173Kで酸化しTiO_2-WO_3混合酸化物薄膜を合成した。光電流は、薄膜のW量の増加と共に、酸化物膜作成時の酸化温度の上昇と共に大きくなった。Wが薄膜の深さ方向に均一に分布しており且つその量が多いことが大きな光電流発生の条件となることが結論された。3. Type430ステンレス鋼の高温酸化反応の初期挙動:ステンレス鋼は、近年、焼却炉材などの高温材料として注目されているが、高温環境下ではブレークアウェーと呼ばれる突発的急速酸化反応が起こることがある。酸化物皮膜の形態、組成、構造をSEM,XPS,XRDにより検討し、ブレークアウェー発生は高温での酸化初期に生成する保護性酸化物皮膜の性質に依存し、その性質は合金組成、酸化雰囲気、高温に至るまでの昇温履歴で決定されることを明らかにした。4.アルミニウムの2段階陽極酸化プロセスによる高耐腐食性薄膜の被覆:アルミニウム表面を、(1)クロム酸-リン酸溶液で処理した後、(2)硫酸中で陽極酸化する。この二つのプロセスにより、3価のクロムと燐酸イオンを含む、多孔性のアルミニウム複合酸化物薄膜が形成され、この薄膜は塩化物イオンを含む系における下地アルミニウムの耐孔食性に優れ、薄膜自身の硬度も大きいことが明らかにした。5.酸化物表面の酸塩基特性:酸化物表面の酸化物イオンは水溶液中では水酸基化し、酸型と塩基型水酸基を生成する。Al_2O_3,Fe_2O_3,Fe_3O_4,TiO_2,MnO_2について、表面水酸基の存在密度の測定方法を確立し、水酸基の解離反応をモデル化し、それに基づき水酸基の解離平行定数を理論計算し、Li,Na,K,Csの1価イオン、Ni,Zn,Co,Mn,Cu,Pbの2価イオンついて実測の交換反応挙動を良く説明できることを明らかにした。1.酸化物表面の酸塩基特性酸化物表面の酸化物イオンは水溶液中では水酸基化し、酸型水酸基と塩基型水酸基を生成する。酸型水酸基は陽イオンと-塩基型水酸基は陰イオンとイオン交換するサイトとなる。二酸化マンガン、ルチル型酸化チタン、マグネタイト、ガンマ型アルミナについて、水酸基の解離反応をモデル化し、それに基づき水酸基の解離平行定数を理論計算し、4種のアルカリ金属イオン(Li、Na、K、Cs)について実測の交換反応挙動を良く説明できることを明らかにした。2.酸化チタンと酸化タングステンの混合酸化物薄膜の光電気化学挙動金属チタン基盤にタングステンを真空蒸着した後、1073Kと1173Kで酸化することにより、TiO_2-WO_3混合酸化物薄膜を合成した。高電流は、薄膜のタングステン両の増加とともに大きくなり、酸化物を作るときの酸化温度が高い程大きくなった。SEM、XPD、XPSによるキャラクタリーゼーションにより、タングステンが薄膜の深さ方向に均一に分布しており且つその量が多いことが大きな光電流発生条件となることが結論された。

3.アルミニウムの2段階陽極酸化プロセスによる高耐腐食性薄膜の皮膜アルミニウム表面を、(1)クロム酸ーリン酸溶液で処理した後、(2)硫酸中で陽極酸化する。この二つのプロセスにより、3価のクロムと燐酸イオンを含む、多孔性のアルミニウム複合酸化物薄膜が形成される。この薄膜は塩化物イオンを含む系における下地アルミニウムの耐孔食性に優れ、薄膜自身の硬度も大きいことが明らかとなった。本方法は他の種類の複合酸化物薄膜の調整にも利用できることが期待できる。1.酸化物表面の酸塩基特性酸化物表面の酸化物イオンは水溶液中では水酸基化し、酸型水酸基と塩基型水酸基を生成する。酸型水酸基は陽イオンと塩基型水酸基は陰イオンとイオン交換するサイトとなる。Al_2O_3,Fe_2O_3,Fe_3O_4,TiO_2,MnO_2の各酸化物について、Ni,Zn,Co,Mn,Cu,Pbの各2価金属イオンは酸化物表面上で1:1及び1:2錯体を形成するとして反応をモデル化し、それに基づき各錯体の安定度定数および反応阻害定数を理諭計算し、実測の交換反応挙動を定量的に説明できることを示した。2.Type430ステンレス鋼の高温酸化反応の初期挙動ステンレス鋼は、近年、焼却炉材なのどの高温材料として注目されているが、高温環境下ではブレークアウェーと呼ばれる突発的急速酸化反応が起こることがある。この反応機構はまだ解明されていない。ブレークアウェー発生は、高温での酸化初期に生成する保護性酸化物皮膜の性質に依存し、その性質は合金組成、酸化雰囲気、高温に至るまでの昇温履歴で決定されると言う新しい視点から、酸化物皮膜の形態、組成、構造をSEM,XPS,XRDにより検討し、以下の機構を提案した。即ち、主にCr_2O_3からなる保護製酸化物皮膜の生成後、皮膜の破壊と下地合金中の鉄の酸化による破壊部分の補修のサイクルの繰り返しにより皮膜成長が進行するが、破壊部分の補修が何らかの理由により不可能になるとブレークアウェー発生となる機構である。スプレーパイロリシス法により、基板上にLa-Ca-Cr-Mn系とLa-Sr-Cr-Mn系ペロブスカイト型複合酸化物薄膜を形成し、その電導性を検討した結果、本方法により酸化物薄膜の厚さと組成を制御でき、Mn置換により電導性の向上があり、Ca置換では粒子間焼結性の向上による電導性の上昇が、Sr置換では粒子成長の促進による電導性低下が確認された。このような表面水酸基サイトの存在密度を測定することは、イオン交換サイトの全量、即ちイオン交換容量を表す尺度となるので重要なパラメーターである。従来、表面水酸基の存在密度を測定方法として6週類の方法が提案されている。Al_2O_3,Fe_2O_3,Fe_3O_4,TiO_2,MnO_2の各酸化物について、各方法の中で申請者らが採用しているGrignard試薬を用いる方法が、最も妥当な値を与えること、酸化物表面の酸化物イオンの細密充填構造からその妥当性を示した。2. Type430ステンレス鋼の高温酸化反応の初期挙動ステンレス鋼は、近年、焼却炉村なのどの高温材料として注目されているが、高温環境下ではプレークアウェーと呼ばれる突発的急速酸化反応が起こることがある。
アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入法による顎関節症の遺伝子治療の試み

1)昨午度マーカー遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ非増殖性アデノウイルスベクターをヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8細胞にin vitroで導入し、X-gal染色にて導入遺伝子が少なくとも3週間持続発現することを確認したが、今年度はまずウサギ膝関節軟骨細胞および顎関節軟骨細胞を初代培養し同様の実験を行った。即ち、両細胞にコンフルエントに達した二日後に上記のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだりコンビナントウィルスをmoi20から50で感染させ遺伝子導入すると、導入遺伝子が少なくとも3週間持続発現することをX-gal染色にて確認した。2)ウサギ膝関節軟骨細胞を用いて、インターロイキン-1が一酸化窒素を介してマトリックスメタロブロテイナーゼおよび線維芽細胞増殖因子を誘導することが関節炎発症の一機序であること見出した。すなわち、これらが遺伝子治療の一標的となる可能性を示唆する知見を得た。3)昨年度は、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ非増殖性アデノウイルスベクターをモルモットの膝関節腔内に注射し、X-gal染色にて滑膜のほとんど全域と一部の変性軟骨表層に遺伝子が導入されていることを明らかにしたが、本年度は同様の方法で、P-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだりコンビナントウィルス4.8x10^7pfuをモルモットの顎関節腔内に26ゲージ針で注射し、導入遺伝子の発現をX-gal染色で調べた。その結果、顎関節では膝関節とは異なり、側頭結節の関節表層と関節円盤の線維軟骨細胞と滑膜に遺伝子が導入され、少なくとも4週間に亘ってβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が発現し続けることがわかった。なお、肝臓や腎等の他の臓器への導入遺伝子の拡散がないことをRT-PCRで確認した。したがって、本法を用いることにより、顎関節症の遺伝子治療が理論的に可能なことが証明された。1)マーカー遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ非増殖性アデノウイルススベクターをヒト軟骨細胞様細胞株HCS-2/8細胞にin vitroで導入し、X-gal染色にて導入遺伝子が少なくとも3週間持続発現することを確認した。ついで、トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)1遺伝子を同様に導入するとII型コラーゲン、アグリカンコアタンパク質のmRNAの発現が亢進し、stromelysinの発現が低下することが判明した。また、熱ショックタンパク質70遺伝子を導入するとアグリカンコアタンパク質のmRNAの発現が亢進することが明らかとなった。2)IGF-IおよびIGF-IIがそれぞれIGF-IRおよびIGF-IIRを介して軟骨細胞のアグリカン合成を促進していること、成長ホルモン(GH)が軟骨細胞に存在するGHレセプターを介してIGFの産生を促進しそのIGFがGHの軟骨成長作用を仲介していることを見出し、これらの因子が顎関節症の遺伝子治療の標的遺伝子となる可能性を明らかにした。3)アンチセンスオリゴヌクレオチドが軟骨細胞の増殖を阻害することから結合組織成長因子(CTGF)は軟骨細胞の増殖因子であるこどが予想されていたが、リコンビナントタンパク質を作製するのに成功し、これを用いてCTGFが軟骨細胞の増殖とアグリカン合成の両方を促進することを見出し、遺伝子治療の標的遺伝子として極めて重要な遺伝子産物であることを明らかにした。4)マーカー遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ非増殖性アデノウイルスベクターをモルモットの膝関節腔内に注射しX-gal染色にて軟骨および滑膜への同遺伝子の導入効率と発現について調べたところ、滑膜のほとんど全域と一部の変性軟骨表層に遺伝子が導入されていることがわかった。なお、肝や腎等の他の臓器への導入遺伝子の拡散がないことをRT-PCRで確認した。さらに、TGF-β1遺伝子を同様に導入すると関節液中にTGF-β1が2週間にわたって産生されることがわかった。
種子発芽の温度反応に関わる遺伝子の単離と機能解析

種子の発芽は、休眠性と環境条件により決定される。温度は発芽の季節を決定する重要な環境要因であり、種子の温度反応性が休眠性の年変化に伴って周期的に変化することが知られている。本研究では、種子発芽の温度による調節機構を分子レベルで解明することを目的とし、発芽の温度反応性を指標とした突然変異体の選抜と解析を行った。20,000系統のT-DNAタグラインから5系統の高温耐性発芽突然変異体の選抜に成功し、これらすべての系統で種子の休眠性が低下していることを明らかにした。TRW124-4を除く4系統はいずれも劣性変異であり、正常な遺伝子は高温条件での発芽および休眠性の低下(後熟)を抑制的に制御する働きを持つと考えられた。TRW71-1は種皮色と高温耐性発芽に母性効果を示し、遺伝的相補性検定からtt7の対立遺伝子であることを明らかにした。本研究により、1)発芽の温度反応性と休眠を繋ぐ遺伝因子の存在を明らかにし、2)温度による発芽調節機構には、胚と種皮の両者が重要な役割を果たすことを示唆した。TRW134-15とTRW187の種子はABA低感受性を示し、TRW187が既知のABA非感受性変異であるabi3の新たな対立遺伝子であることを明らかにした。既知のABA欠損、およびABA非感受性突然変異体種子も高温耐性発芽を示すことから、ABAが発芽の温度反応に深く関与することを示唆した。野生型種子では、34°Cで吸水した種子のABA量が22°Cより多いこと、ABA合成阻害剤により高温阻害が緩和されることから、種子は高温によるABA合成の制御機構を持ち、発芽制御に関与することを示唆した。TRW13-1の変異遺伝子は第1染色体の下腕に座乗することを明らかにし、temperature resistant germination 1(trg1)と命名した。TRG1は未知の遺伝因子であり、マップベースクローニングによる遺伝子の単離と解析により、発芽制御機構の解明に大きな役割を果たすと期待される。1.遺伝様式と発芽:シロイヌナズナのT-DNAタグラインから選抜した高温耐性発芽突然変異系統、TRW13-1とTRW71-1の高温耐性発芽形質は、いずれも1遺伝子の劣性変異によることを明らかにした。両系統とも、T-DNAの挿入は変異形質と連鎖していないことを示した。両変異体の種子は、完熟時に常温(22°C)で97%以上の高い発芽率を示し、休眠性が低下していることを明らかにした。また、両変異体の種子は22°Cから34°Cの間で、いずれの温度においても野生型より高い発芽速度および発芽率を示すことを明らかにした。2.黄土色の種子を生じるTRW71-1について:TRW71-1の高温耐性発芽形質と黄土色の種子色形質は強く連鎖していることを明らかにした。また、F_1種子発芽の温度反応は母親の遺伝型により決定されることから、TRW71-1の高温耐性発芽は種皮によりもたらされることを明らかにした。TRW71-1と同様に黄土色の種子を生じるtt7-1の種子は高温耐性発芽を示した。相補性検定により、TRW71-1はtt7遺伝子座の新たな対立遺伝子であることを明らかにした。

3.発芽の温度反応と種皮:種皮色の変異体、tt2、tt4、tt5、tt6は高温で発芽するが、ttl、tt3、tt9、tt10およびttg1は高温阻害を受けることを見出した。この結果は、フラボノイド合成系の代謝産物が発芽の温度反応に関与する可能性を示唆している。4.新たな高温耐性発芽変異体の単離:未選抜のT-DNAタグライン10,000系統から、高温(32°C)で発芽する突然変異系統を新たに3系統単離した。1.発芽の温度反応性と休眠これまでに20,000系統のT-DNAタグラインから、32°Cでも発芽できる、5系統(TRW13-1,TRW71-1,TRW124-4,TRW134-15,TRW187)の高温耐性発芽変異体を得ている。TRW124-4を除く4系統では、野生型に比べて休眠性が大きく低下しており、種子の温度反応性は休眠と深く関わることが明らかとなった。TRW13-1の高温耐性発芽は劣性1遺伝子の変異によることから、正常な遺伝子は高温条件での発芽抑制とともに、休眠性の低下(後熟)を抑制的に制御する働きを持つと考えられる。2.発芽の温度反応とアブシジン酸発芽におけるアブシジン酸感受性を調べ,TRW187のみがABA低感受性であることを明らかにした。既知のABA欠損変異体であるaba1-1およびABA非感受性変異体であるabi3-1種子の温度反応性を調べたところ、いずれも高温耐性発芽形質を示した。さらに、野生型種子にABA生合成阻害剤であるフルリドンを与えたところ、発芽の高温阻害が緩和された。したがって、温度による種子発芽調節機構にアブシジン酸が重要な役割を持つと考えられる。3.trg1遺伝子座のマッピングTRW13-1とコロンビア生態型との交配により得られたF_2世代を用いた解析から、変異は1番染色体の下腕、SSLPマーカーのnga280とnga111の間に座乗することを明らかにした。この領域には発芽に関わるような遺伝子座がマップされていないことから、変異遺伝子をtrg1(temperature resistant germination1)と名付けた。CAPSマーカーを利用した詳細な解析から、trg1は14G4とKNAT2の間、約1Mbの範囲内に座乗することを明らかにした。1.発芽の温度反応性と休眠TRW124-4では、親株(野生型、Ws)に比べて明確な種子休眠性の低下が認められた。したがって、高温耐性発芽突然変異5系統はすべて休眠性が低下していることとなり、種子の温度反応性と休眠性の強い関連が改めて示された。2.TRW134-15の遺伝・生理解析TRW134-15の高温耐性発芽形質は1遺伝子の劣性変異によること、変異形質とT-DNAは独立に遺伝することを明らかにした。現在、詳細なマッピングを行い、遺伝地図からの遺伝子クローン化を目指している。また、TRW134-15はアブシジン酸(ABA)低感受性であることを明らかにした。3.TRW187の遺伝・生理解析遺伝的相補性検定により、ABA低感受性を示すTRW187はABI3遺伝子座の新たな対立遺伝子であることを明らかにした。ABI3遺伝子座の配列を元にプライマーを作成し、TRW187から同遺伝子座のゲノムクローンを単離した。現在、変異の特定を目的として塩基配列の決定を行っている。4.種子のアブシジン酸定量野生型種子の内性ABA量は、常温(22°C)では吸水に伴って急速に減少するのに対し、高温(34°C)では吸水6時間後までは常温と同様に減少するが、その後増加に転じることを明らかにした。
デキストラン法による脂溶性分子の水溶液中での挙動解析

いくつかの脂溶性分子とデキストランとの複合体を合成した。脂溶性分子としては、(1)DNAと結合する発癌性化合物パイレン、(2)細胞分化誘導物質であるヘミン及びレチノイド(カルコン誘導体ch55)を選択し、当初の予定どうり、デキストラン複合体を合成することができた。デキストラン-パイレン複合体については、その水溶性を利用して各種ジヌクレオチドとの結合選択性を解析することができた。すなわち、パイレン骨格は、GpCやCpG,GpGには(おそらくインターカレーション的に)強く(結合定数が10^6M^<-1>のオーダーで)結合し、ApTやTpA,ApAには弱いながらも結合し、TpTやCpCにはほとんど結合しなかった。このジヌクレオチド結合選択性は、報告されているニトロパイレン単量体のDNA-インターカレーションにおける塩基配列選択性に一致しており、本方法の有用性を示すことができた。デキストラン-ヘミン複合体については、そのDNA切断活性を水溶液中で確認できた。確認したデキストラン-ヘミン複合体のDNA切断活性は、対応するヘミン単量体のそれよりもはるかに強く、デキストラン複合体の抗アグリゲーション特性を示すことができた。デキストラン-カルコン複合体については、その高分子である特性を生かしてレチノイドレセプターとの結合特性を解析することができた。しかし、その結合定数は当初期待したほどに高くはなく、デキストラン-カルコン複合体を用いてのレチノイドレセプター精製への応用研究は断念せざるを得なかった。