hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃がんでのDNAメチル化異常ゲノム網羅的解析によるがん抑制遺伝子の同定と機能解析

平成19年度は,散在性メチル化が増加した胃がん細胞株2系統と増加していない細胞株2系統を用いて,脱メチル化剤処理後マイクロアレイ解析を行い,前者では後者に比べて多数の遺伝子がサイレンシングされていること,また,高転写レベルの遺伝子でもサイレンシングされることを示した。また,各種DNAメチル化酵素(DNMTs)の発現量を解析し,散在性DNAメチル化が増加した細胞株ではDNMT3Bの過剰発現があることを認めた。DNMT3BをMKN28胃がん細胞株で過剰発現させると,散在性メチル化が増加し,高密度メチル化も出現することも認めた。現在,siRNAによるDNMT3Bの発現抑制により,散在性メチル化が減少するか否かを検討している。一方,外来性のDNAメチル化異常誘発要因として,ヒト胃がんの強力な誘発因子であるHelicobacter pylori(H.pylori)感染は,強力なDNAメチル化異常誘発因子であることを明らかにしてきた。しかしH.pylori憾染がどのような遺伝子にDNAメチル化異常を誘発するのか明らかになっていなかった。そこで,H.pyloriの感染がある人とない人の胃粘膜で48個の遺伝子についてDNAメチル化を解析し,明確な特異性があることを明らかにした。ヒト胃がん細胞株でメチル化されうる遺伝子48個について、H.pylori感染者及び非感染者の胃粘膜でのメチル化の有無をMSP法による検索した。その結果、H.pylori感染により容易にメチル化される遺伝子と、ほとんどメチル化されない遺伝子とがあり、H.pylori感染によるDNAメチル化異常誘発には、遺伝子特異性が存在することが明らかになった。メチル化感受性及び抵抗性を決定している因子として遺伝子転写量が考えられたので、定量的RT-PCR法により解析を行い、抵抗性遺伝子の方が有意に高い転写レベルを示すことを見出した。さらに、H.pylori感染によりDNAメチル基転移酵素の発現上昇が誘導されるか否かを、定量的RT-PCR法とWestern blot法により解析したが、発現上昇は認められなかった。DNAメチル化異常誘発要因により、特異的な遺伝子のDNAメチル化異常が誘発されることを示した初めての報告である。(2)新規胃がん抑制遺伝子候補の同定新規胃がん抑制遺伝子を同定するために、AGS胃がん細胞株をDNA脱メチル化剤で処理、発現上昇を示した遺伝子の中から、正常胃粘膜で十分な量の発現を示す遺伝子を探索した。特に、もともと活性なコピーが1つしかなく、不活化される危険が高い遺伝子として、X染色体上の遺伝子について、上記の条件を満たすものを探索したところ、4個の遺伝子が該当した。それらのうち1遺伝子については、プロモーター領域CpGアイランドが胃がん細胞株でメチル化され、発現が消失していること、胃がん手術材料50個中17個でメチル化されていることを確認した。現在、siRNAによるノックダウンを行い、胃がん細胞株の増殖にどのような影響を示すか、解析中である。DNAメチル化異常の誘発機構には不明の点が多い。これまで、CpGアイランド内のCpG部位の散在性DNAメチル化はCpGアイランド全体の高密度なメチル化につながること、散在性メチル化が増加した細胞株では高転写レベルの遺伝子でさえもメチル化されることを示してきた。また、散在性メチル化増加の原因として、DNMT3Bの過剰発現が関与している可能性を示した。
腸管からの生理活性物質の吸収に及ぼす中鎖脂肪酸の影響

本研究では、中鎖脂肪酸化合物の透過促進機構の解明を目的として研究を行い、以下の実験結果が明らかになった。1-1.透過促進検討時の中鎖脂肪酸自身の透過挙動中鎖脂肪酸及びそのモノアシルグリセロール自身の透過促進の際の振舞を拡散チャンバーにセットしたCaco-2細胞培養系を用いて検証した。その結果、(1)カプリン酸ナトリウム塩(C10FANa)は腸管側の濃度差が血管側に出現する透過係数に反映された、(2)細胞内のC10FANaは実験開始後30分ほどで約3500mMに到達するが、腸管側濃度に依存しなかった、(3)小胞輸送阻害剤により阻害される、細胞内からC10FANaを放出する機構の存在が示唆された。カプリン酸モノアシルグルセロール(C10MG)を用いた実験では、C10MGにより透過を促進された親水性生理活性物質の見かけの透過係数と、C10MG自身の透過に相関が観察された。1-2.細胞内pHの変動についての検討フルオレセインデキストランを用いて、中鎖脂肪酸(C10FANa)の接触によりリソソームのpHがどのような影響を受けるかを検討した。文献より細胞内pHに影響を与えるとされるNH4Clへの反応は実験によりばらつきが見られたが、C10FANaを用いた実験では細胞内pHに変化は見られなかった。1-3.中鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸の混合による透過促進効果の検討中鎖脂肪酸を食品に添加した際の透過促進効果に対する影響を検討するため、食品中に多く含まれる長鎖脂肪酸との混合が中鎖脂肪酸の透過促進に与える影響を検討した。その結果、中鎖脂肪酸どうしを混合した際と同様の傾向が観察され、同種の親水基をもつ脂質(C10FANaとオレイン酸など)を混合すると透過が促進され、異種の親水基を持つ脂質(C10MGとオレイン酸など)を混合すると透過が抑制される傾向が観察された。本研究では、中鎖脂肪酸化合物の透過促進機構の解明を目的として研究を行なってきた。その結果、これまでの本研究の知見より、以下のことが明らかになった。1-1.中鎖脂肪酸の細胞内小器官の機能への影響中鎖脂肪酸による透過促進およびそこからの回復過程を細胞層透過電気抵抗を透過促進の指標として用いたモデル系として定義し、実験に用いた。中鎖脂肪酸化合物による透過促進及びそこからの回復過程において、細胞質に存在する乳酸脱水素酵素(LDH)のアピカル側、バソラテラル側それぞれの放出を観察し、細胞の形質膜への影響を考察した。その結果、形質膜は中鎖脂肪酸存在下で傷害を受けるが、中鎖脂肪酸が消滅すると直ちにその放出を停止することが示唆された。また、調べたカプロン酸モノアシルグリセロール、カプリン酸モノアシルグリセロール、カプリン酸ナトリウム塩(C10FANa)、SDS及びタウロコール酸ナトリウム塩では、ほとんどの物質がアピカル側にのみLDHを放出したのに対して、C10FANaのみは、バソラテラル側からのLDHの放出が見られた。この結果よりC10FANaの特殊性が示唆された。1-2.ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性への影響前述の実験系においてMTT法を用いて、細胞内小器官であるミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性(MTT活性)への影響を評価した。その結果、本研究室の以前の研究結果より明らかになっていたように、透過促進と共にMTT活性は減少したが、今回新たに回復過程において、MTT活性も回復してくることが明らかになった。この回復はDNA合成阻害剤aphidico1inを用いて検討した細胞増殖阻害の影響を受けず、中鎖脂肪酸化合物は、ミトコンドリアの機能に影響を与えるが回復不可能ではないことが示唆された。また、この検討よりMTT法による細胞毒性検討において回復の可能性を考慮する必要があることが示唆された。1-3.中鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸の混合による透過促進効果の検討中

鎖脂肪酸を食品に添加した際の透過促進効果に対する影響を検討するため、食品中に多く含まれる長鎖脂肪酸との混合が中鎖脂肪酸の透過促進に与える影響を検討した。その結果、中鎖脂肪酸どうしを混合した際と同様の傾向が観察され、同種の親水基をもつ脂質(C10FANaとオレイン酸など)を混合すると透過が促進され、異種の親水基を持つ脂質(C10MGとオレイン酸など)を混合すると透過が抑制される傾向が観察された。
運動制御系における能動的推論仮説の実験的検証

「自由エネルギー原理」は、脳機能の包括的理解を志向した概念であり、脳科学の広い分野で注目されている。能動的推論は、その自由エネルギー原理の根幹理論の一つであり、感覚運動制御における各脳領域の機能を、「感覚研究」と「運動研究」の壁を超えた共通の枠組みで理解することを可能にする。本研究は、この皮質脊髄路系における能動的推論仮説を、サルを対象とした実験によって検証する。
多核NMR分光法によるフラビン酵素反応機構の研究

Dーアミノ酸酸化酵素(DAOと略)DAOによる基質の酸化の機構を調べるために、基質アナログとして、oー,mー,pーフッ素化安息香酸(それぞれ、OFB,MFB,PFBと略)を用い、これらのアナログのF(19)ーNMR信号を指標にFBとDAOとの結合状態を調べた。その結果、3個のアナログのうち、OFBのF(19)ー信号が他に比べてもっとも大きくシフトし、MFB,PFBの順に小さくなった。このことは、基質Dーアミノ酸がDAOによって酸化される際、アミノ基からフラビンへ電子が移動することを示唆している。NADPHーアドレノドキシン還元酵素(ADRと略)ADRをC(13)で選択的に標識したFADで再構成し、遊離の状態および、NADP結合状態で、C(13)ーNMRを測定した。C(13)標識位置は、フラビン環の2,4,4a,10aー位である。NADP結合状態では、4aーC(13)信号が低磁場シフトしており、NADPHからADRに電子が伝達される時、NADPHがADRに結合することにより、フラビン部分の4aー位の電子密度が下がり、NADPHからフラビンへの電子伝達が促進されていることが示唆された。旧黄色酵素(OYEと略)8ーフルオローFMMで再構成したOYEをキモトリプシンで限定加水分解すると、OYEは特異的に14K断片と、34K断片に切断され、この時に出現した14K断片のNー末端ロイシンのアミノ基が8ーフルオローFMMの8ー位を求核攻撃し、14K断片とフラビン部分が共有結合した。このことによって、OYEの一次構造上、および三次構造上の結合位置と結合様式が推定できた。1.本課題に必要な多核(^<13>C、^<15>N、^<19>F)標識フラビン調製することができた。多核リボフラビンを化学合成し、オキシ塩化リンによるリン酸化を経て、FMNに導いた。多核標識リボフラビンを細菌から精製したFAD合成酵素によってFADに導いた。このFAD合成酵素精製のための細菌(Brevibacterium ammoniagenes)大量培養に、本補助金によって購入された温冷風循環式旋回培養器が有効に利用された。得られたFMN、FADの標識位置は2、4、4a、10a^<-13>C、1、3、5^<-15>N、8^<-19>Fである。2.ウシ副腎皮質のアドレノドキシン環元酵素に^<13>Cー標識FADを再構成させ、種々の条件下に^<13>CーNMRを測定し、それぞれの^<13>Cー信号を観測することができた。その結果、NADPHから本酵素に電子が移動する際、NADPHのピリジン部分がフラビンの4aー位に接近することが示唆され、この電子伝達についての貴重な知見を得た。3.8^<-19>FーFMNを旧黄色酵素に再構成させ、種々の条件下に^<19>FーNMRを測定した結果、本酵素とフェノ-ル化合物との電荷移動複合体形成によって、^<19>Fー信号が大きく高磁場シフトすることがわかった。このシフトは、電荷移動相互作用の結果フラビン部分の電子密度が上昇することを示し、電荷移動相互作用の機構についての重要な知見を得た。4.Dーアミノ酸酸化酵素と拮抗阻害剤o-、m-、p-フルオロ安息香酸との複合体の^<19>FーNMR

スペクトルの^<19>Fー信号の解析から安息香酸のoー位がフラビンに近接していることが示唆され、筆者らが提出した本酵素の電子移動機構を支持することができた。1.昨年度に調製した多核( ^<13>C, ^<15>N, ^<19>F)標識リボフラビンから、オキシ塩化リンによるリン酸化を経てFMNに導き、細菌から精製したFAD合成酵素によってFADに導いた。このFAD合成酵素標品や、多核標識フラビンの保存には本補助金によって購入された超低音フリ-ザ-が有効に利用された。得られたリボフラビン、FMN、FADの標識位置は2,4,4a,10aー^<13>C,1,3,5ー^<15>N,8ー^<19>Fである。2. ^<13>Cー標識FADで再構成したウシ副腎皮質のアドレノドキシン還元酵素と拮抗阻害剤2′,5′ーADPとの相互作用を、標識^<13>Cの^<13>Cー信号および、2',5'ーADPのリン酸基の^<31>PーNMR信号をてがかりに調べた。その結果、2',5'ーADPのアドレノドキシン還元酵素における結合部位は、NADPHのADPー部分のそれと共通であることがわかった。さらに、NADPHとアドレノドキシン還元酵素の結合において、ADPー部分の結合の占める役割が重要であることも判明した。3.8ー^<19>FーFMNを再構成させた旧黄色酵素をキモトリプシン処理することによって、蛋白質部分とフラビン部分を共有結合させることができた。この共有結合は、キモトリプシン処理によって出現したアミノ基が8ー^<19>FーFMNの8ー位を求核攻撃することによって形成された。このフラビン部分が結合したアミノ酸残基付近のアミノ酸配列から、旧黄色酵素におけるFMN結合都位を特定することができた。さらに、旧黄色酵素の14K、34Kの2つのドメインのうち、14KードメインがFMN結合ドメインであることもわかった。D・アミノ酸酸化酵素(DAOと略)DAOによる基質の酸化の機構を調べるために、基質アナログとして、oー,mー,Pーフッ素化安息香酸(それぞれ、OFB,MFB,PFBと略)を用い、これらのアナログのF(19)ーNMR信号を指標にFBとDAOとの結合状態を調べた。その結果、3個のアナログのうち、OFBのF(19)ー信号が他に比べてもっとも大きくシフトし、MFB,PFBの順に小さくなった。このことは、基質Dーアミノ酸がDAOによって酸化される際、アミノ基からフラビンへ電子が移動することを示唆している。NADPHーアドレノドキシン還元酵素(ADRと略)ADRをC(13)で選択的に標識したFADで再構成し、遊離の状態および、NADP結合状態でC(13)ーNMRを測定した。C(13)標識位置は、フランビン環の2,4,4a,10aー位である。NADP結合状態では、4aーC(13)信号が低磁場シフトしており、NADPHからADRに電子が伝達される時、NADPHがADRに結合することにより、フラビン部分の4aー位の電子密度が下り、NADPHからフラビンへの電子伝達が促進されていることが示唆された。旧黄色酵素(OYEと略)8ーフルオローFMM再構成したOYEをキモトリプシンで限定加水分解すると、OYEは特異的に14K断片と、34K断片に切断され、この時に出現した14K断片のNー末端ロイシンのアミノ基が8ーフルオローFMMの8ー位を求核攻撃し、14K断片とフラビン部分が共有結合した。このことによって、OYEの一次構造上、および三次構造上の結合位置と結合様式が推定できた。
高発がん性遺伝病患者由来細胞の放射線損傷DNA部値における異常DNA複製の意味

[目的]本研究は、"紫外線照射されたXP細胞やX線照射されたAT細胞で見られる異常なDNA合成の昂進が、DNA損傷部位におけるトレランスを促進しDNA複製エラーを生ずる"とする作業仮設をたて、その仮設の真ぴょう性を検討し、これらの遺伝病患者の高発がん性と関連づけて解析することを目的として実施した。[結果と考察]XPバリアント細胞(3種),ヒト胎児細胞(3種)およびヒト成人皮膚細胞(3種)の計9種のヒト由来細胞につき紫外線による突然変異(HGPRT遺伝子座)感受性を検討した結果、バリアント細胞はいずれも正常細胞にくらべ3-4倍高い感受性を示した。同時に、不定期DNA合成頻度(UDS)を指標に除去修復能を調べたところ、正常細胞とバリアント細胞で大きく異なり、正常細胞ではUV照射後速やかに行われ照射後1時間以内に終ってしまうが、バリアント細胞では開始が遅れ照射後4時間から8時間にかけてゆっくりと起きることがわかった。一方、UV照射後のDNA複製動態も両細胞で明らかに異なり、UV照射による【^3H】-チミジンの取込みを細胞標識率でみたDNA合成量の減少がバリアント細胞で顕著であるのに、正常細胞では殆どみられない。しかし、照射直後に起きるDNA複製動態をアルカリ溶出法で詳細に観察すると、バリアント細胞ではUV照射により低分子量(8×【10^6】ダルトン以下)から中間分子量サイズ(8-30×【10^6】ダルトン)への伸長が極端に促進されることがわかった。これら一連の結果から、バリアント細胞ではUV照射直後、UV損傷が十分に修復される前に昂進されるDNA複製が誤りを起こし易く、そのためその後のDNA複製を抑制しかつDNA損傷の修復を遅らせる原因になっている可能性を推察できる。今後は、異常昂進したDNA複製が、実際にどのように突然変異や発がんに関わるかを明らかにせねばならない。
NMRデータに基づく配座空間探査による動的糖鎖コードの解読

細胞内の秩序維持に関わる糖タンパク質品質管理機構において、糖鎖は、タンパク質の品質を表示するタグとして機能し、その細胞内運命の決定に寄与している。こうした分子メカニズムを解明することができれば、糖鎖が担う生命情報を解読するための重要な礎となることは間違いない。本研究では、小胞体内において立体構造形成が未完成な糖タンパク質の目印として働く糖鎖を研究対象とし、酵母遺伝子破壊、化学合成、試験管内酵素反応を駆使して本糖鎖の安定同位体標識法を確立した。さらに、常磁性NMR解析法による精密実験と分子シミュレーションを組み合わせた動的構造解析を通して、分子シャペロンによる糖鎖認識の仕組みを解き明かした。平成27年度は、酵母変異株を用いた高マンノース型糖鎖の大量調製法と化学-酵素合成法を組み合わせ、均一または選択的に安定同位体標識を施したモノグルコシル化糖鎖G1M9の調製法を確立し、そのNMR立体構造解析を実施した。糖タンパク質のフォールディングには、G1M9糖鎖が重要であることが見出されている。小胞体内で糖タンパク質のフォールディング状態が不全なタンパク質の存在を感知してそれに糖鎖非還元末端のグルコース残基を付ける酵素であるUDP-グルコース糖タンパク質グルコース転移酵素(UGGT)を活用して、安定同位体標識を施したG1M9糖鎖を作出する方法論を開発した。高マンノース型糖鎖を均一に発現する変異酵母を同位体標識グルコースを炭素源として含む培地で培養することによって、糖タンパク質を均一に標識した。得られた糖タンパク質を基質とし、別途化学合成したUDP-[13C6]グルコースを用いてUGGTによる糖転移反応を行い、モノグルコシル化高マンノース型糖鎖G1M9を調製することに成功した。また、糖タンパク質を分解へと促す酵素グルコシダーゼIIに関して分子運命決定に関わる構造基盤を求めることができた。安定同位体標識を施したシャペロン認識糖鎖を作出する方法論を開発し、詳細なNMR構造解析を行う道筋をつけることができた。得られた研究成果について国際誌に発表している。また、調製した糖鎖について、既に多次元NMR計測と分子動力学シミュレーションによる解析に着手している。新生糖タンパク質が小胞体において立体構造を形成する際や、固有の立体構造獲得後にゴルジ体へと移る際には様々な種類の糖認識タンパク質(レクチン)が関与している。こうした機構において、糖鎖は、分子シャペロンや積荷輸送体など一連のレクチンに認識されることにより、糖タンパク質の品質管理を司り、その運命の決定に関わる目印の役割を果たしている。本研究では、非還元末端グルコース残基を含む12糖からなる高マンノース型糖鎖について、酵母遺伝子破壊、化学合成、試験管内酵素反応を駆使して本糖鎖の安定同位体標識体を作出し、分子動力学シミュレーションと常磁性タグを応用した核磁気共鳴分光(NMR)法とを組み合わせた動的構造解析によって、そのコンフォメーション空間を明らかにすることに成功した。さらに、実験データによって裏付けられた分子シミュレーションにより、多様な構造を形成する糖鎖が分子シャペロンとの相互作用を通じて新たな立体構造を形成する、誘導適合に基づく分子認識の仕組みを理解することができた。これにより、糖タンパク質の立体構造形成、輸送、分解に関与する一連の高マンノース型糖鎖について、水中で揺動する立体構造情報を定量的に得るに至った。さらに、神経幹細胞ではたらく糖鎖を人工分子骨格に結合したハイブリッド分子をデザインし、機能性糖鎖クラスターを創出した。得られた糖鎖クラスターを用いて精密NMR計測を実施することにより、細胞間コミュニケーションに関わる糖鎖ー糖鎖相互作用の構造基盤を明らかにすることができた。引き続き、精密実験データに裏付けられた分子シミュレーションを通じて得られる構造基盤に基づき、糖タンパク質の正しい立体構造形成を促したり、不要となった糖タンパク質を分解するための暗号となる糖鎖動態を描象する。特に、不要となった糖タンパク質を分解するための暗号となる糖鎖動態を描像し、タンパク質の運命決定を司っている糖鎖の作動機構解明を目指す。さらに、一連の酵素およびレクチンとの相互作用解析を実施し、糖鎖上へのタンパク質運命情報をコードし、読み解くメカニズムを明らかにする。生体機能関連化学
ヒトナルコレプシー及び睡眠障害感受性遺伝子の探索

本研究の目的は、ヒトナルコレプシーをはじめとする睡眠障害の新たな感受性・抵抗性遺伝子を見出すことである。昨年度までに約2万3000個のマイクロサテライトマーカーを用いたゲノムワイドな関連解析(1次・2次スクリーニング)を行ない、いくつかの候補マーカーを見出している。本年度はその候補マーカーの内、ヒトナルコレプシーの既知感受性遺伝子であるヒト白血球抗原(HLA)領域(6p21.3)近傍上流に存在するマーカー(MS1)周辺の解析を進めた。まず、pooled DNAを用いた1次,2次スクリーニングによって検出された関連の確認を患者群231名、対照群420名分のゲノムDNAを用いた個別資料タイピングにより行なった。フィッシャーの直接検定法による各アリルに対する2x2分割表を用いた統計解析を行なった結果、MS1の13アリルのうち3アリルが有意差に至り、ナルコレプシーとMS1との関連が示唆された。ほとんどの日本人ナルコレプシー患者はHLA-DRB1*1501アリルを所有することから、HLA-DRB1*1501をヘテロ接合で所有する対照群112名と、先程とは別の患者群170名を用いた関連解析も行なった。その結果、対象検体数が減少したことで検出力は低下したものの、1アリルにおいて依然として有意差に至り、疾患との関連が確認できた。次に、HapMapプロジェクトデータベースに登録されている日本人44人分のSNPs結果を用いてMS1周辺の連鎖不平衡(LD)ブロックを確認し、MS1を含むLDブロック及び両隣のブロック内のTag SNPsを用いた解析を行なった(患者群190名、対照群190名)。その結果、33SNPsが有意差に至り、その中の19SNPsは、HLA-DRB1*1501ヘテロ接合体を用いた解析においても有意差に至った(患者群143名、対照群103名)。これら19SNPsについて最大尤度推定値分析を行なったところ、SNP5とSNP15を持つときに最大尤度を示した(P<0.05)。昨年度までに約2万3000個のマイクロサテライトマーカーを用いたゲノムワイドな関連解析(1次・2次スクリーニング)を行ない、いくつかの候補マーカーを見出した。また、検出されたマイクロサテライトマーカーの周辺に、更に高密度にマイクロサテライトマーカーを設定して関連解析を行なったところ、候補領域を約70-100kb程度に絞り込むことができた。今年度は、70-100kbに絞り込んだ領域内に高密度に1塩基多型(single nucleotide polymorphisms : SNPs)を設定し、それらを用いた関連解析を行ない(5-10kb/1SNP程度の密度)、候補領域をさらに絞り込むことが目標であった。そしてその結果、1つの候補領域(NLC1-A)の絞込みに成功することができた。SNPの選定は、データベース上にSNPとして登録されているものの内、16人の日本人のゲノムを用いた多型解析より日本人集団においても多型性を示すことが確認できたものを選定した。また、HapMapデータベースには45人の日本人のジェノタイプが登録されている。それらのデータを用いて、その領域の連鎖不平衡ブロックがどのように構成されているかをhaploviewソフトウェアを用いてあらかじめ確認し、候補マーカーを含むブロックとその周辺のいくつかのブロックを解析対象とした。その結果80SNPsを解析対象とし、それらのSNPsを用いた関連解析を行った(患者群190名、対照群190名)。関連解析の結果、高密度に設定したマイクロサテライトマーカーを用いた解析よりナルコレプシーとの強い関連が見出されたマーカー(NA3.L)近隣8SNPsが有意差に至り、その中の最も近傍の2SNPs(SNP名:C4、C7)ではNA3.Lと同様に強い関連を示した(p<0.002)。連鎖不平衡解析をおこなったところ、これら3つの多型のナルコレプシーとの強い関連を示したアリルは、強い連鎖不平衡状態であることがわかった。この領域には既知の遺伝子は存在しないが、複数のESTやmRNAにサポートされる測遺伝子が3つ存在する。これらの予測遺伝子のプロモーター領域(上流2kb)、エクソン領域を対象として多型解析を行ったところ、26個の多型が存在したが、C4、C7、NA3.Lよりも強い関連を示す多型は観察されなかった。以上のことより、候補領域NLC1-Aにおいてはこれら3つの多型がナルコレプシー発症・病態に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

フィッシャーの直接検定法による各アリルに対する2x2分割表を用いた統計解析を行なった結果、MS1の13アリルのうち3アリルが有意差に至り、ナルコレプシーとMS1との関連が示唆された。ほとんどの日本人ナルコレプシー患者はHLA-DRB1*1501アリルを所有することから、HLA-DRB1*1501をヘテロ接合で所有する対照群112名と、先程とは別の患者群170名を用いた関連解析も行なった。その結果、対象検体数が減少したことで検出力は低下したものの、1アリルにおいて依然として有意差に至り、疾患との関連が確認できた。次に、HapMapプロジェクトデータベースに登録されている日本人44人分のSNPs結果を用いてMS1周辺の連鎖不平衡(LD)ブロックを確認し、MS1を含むLDブロック及び両隣のブロック内のTag SNPsを用いた解析を行なった(患者群190名、対照群190名)。その結果、33SNPsが有意差に至り、その中の19SNPsは、HLA-DRB1*1501ヘテロ接合体を用いた解析においても有意差に至った(患者群143名、対照群103名)。これら19SNPsについて最大尤度推定値分析を行なったところ、SNP5とSNP15を持つときに最大尤度を示した(P<0.05)。
腎細胞がんにおける新しい分子標的治療およびバイオマーカーの開発

今回は、臨床サンプルを用いた次世代シーケンサーを用いた遺伝子発現解析では、databaseから、がんの進行・転移に関わる遺伝子変化と、治療効果と関連する遺伝子変化の解明に向けて研究を継続している。さらに、腎癌細胞株を用いた次世代シーケンサーを用いた遺伝子発現解析では、グルコース枯渇という比較的シンプルなストレスについて網羅的な解析をおこない、新しいシグナルの解明に繋がった。腎がんの分子標的治療は血管新生阻害剤による治療をおこなっている。今回のグルコース枯渇下での腎がん細胞の遺伝子応答は、これらの治療薬の機序に対する新しい知見を提供し、治療薬及び治療法の進歩に資するものと思っている。腎がん細胞株を用いて、グルコース枯渇状態での遺伝子発現を調べるため、グルコース枯渇条件下での遺伝子発現を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析したところN-GlcNAc2修飾の基質となるUDP-GlcNAc合成経路、小胞体ストレス応答経路の遺伝子発現が上昇し、分裂期キナーゼを含むG2/M細胞周期関連遺伝子の発現が抑制されることがわかった。N-GlcNAc2修飾タンパク質が産生され、G2/M期にアポトーシスを起こすグルコース枯渇に感受性を示す癌細胞株と、N-GlcNAc2修飾タンパク質が産生されずグルコース枯渇に耐性を示す癌細胞株とがある。さらにp53のリン酸化や腎がんの原因のがん抑制遺伝子とされるVHL statusも関連するようである(Isono T et al. PlosOne REVISING)。転移性腎細胞がん262例のdatabaseからは、20例の膵転移症例について注目し、1腎摘後晩期に再発すること、2比較的膵単独転移が多く、外科的切除が有効な症例が多く、分子単独治療の効果も秀逸であること。3したがって、転移後の生存期間も10年以上の長期生存も少なくないこと。などがわかった。(欧州泌尿器科学会で報告予定、論文投稿中)。われわれはこれまでに、腎がんの分子標的治療におけるさまざまな臨床因子・問題点などをあきらかにしてきた。腎がんの分子標的治療は、グルコースをはじめとしたさまざまな物質の細胞内取り込み抑制を行なうmTOR阻害剤やチロシンキナーゼ阻害剤である血管新生阻害剤による治療をおこなっている。今回は、グルコース枯渇という比較的シンプルなストレスによる遺伝子発現について、次世代シーケンサーを用いた網羅的な解析をおこない、新しいシグナルの解明に繋がった。すなわち、腎細胞がん株では、NC65, Caki1, Caki2, ACHNの4種はVHLがwild typeであり、SW839, VMCR-RCW, KMRC-1はVHL遺伝子の変異を認めた。4種のVHLwild typeの腎がん細胞株はグルコース枯渇条件下にてN-GlcNAc2修飾タンパク質群が小胞体に蓄積し、小胞体ストレス応答の亢進を認め、G2/M細胞周期が抑制され、有糸分裂カタストロフィー様の細胞死が観察された。VHL遺伝子の変異のある3種の細胞株では、G1/Sで細胞周期が抑制され、細胞死は認めなかった。これは、VHLがん抑制遺伝子の変異を認める腎細胞がんでは、血管新生阻害剤によるグルコース枯渇において増殖抑制を認めるものの、細胞死に至らないという、腎がん治療の現在の臨床と非常にmimicしており、今後、この耐性機構・メカニズムを明らかにして、臨床での治療耐性を克服するヒントを掴みたいと考えている。現在、腎がん臨床サンプルを用いた次世代シーケンサーによる解析も継続して進めており、すなわち、databaseから、A群腎摘後に長期無再発症例、再発をしたが、B群治療に良く反応し5年以上生存例、C群再発予後不良例。以上の3群にわけて臨床サンプルの解析をすすめ、腎がんの進行・転移に関わる遺伝子変化と、治療効果と関連する遺伝子変化の解明に向けて研究を継続している。泌尿器科腫瘍学当初目的である臨床サンプル解析の前実験として、細胞株を用いてグルコース枯渇という比較的シンプルなストレスによる遺伝子発現について、次世代シーケンサーを用いた網羅的な解析をおこない、新しいシグナルの解明に繋がった。次世代シーケンサーを用いた実験・解析も習得し、臨床サンプルの解析へと進んでいる。databaseから、A群腎摘後に長期無再発症例、再発をしたが、B群治療に良く反応し5年以上生存例、C群再発予後不良例。以上の3群にわけて臨床サンプルの解析をすすめ、腎がんの進行・転移に関わる遺伝子変化と、治療効果と関連する遺伝子変化の解明に向けて調べる。グルコース枯渇下での腎がん細胞の遺伝子応答は、これらの治療薬の機序に対する新しい知見を提供し、治療薬及び治療法の進歩に資することを期待している。今後、腎がん細胞株を用いての腎がんのグルコース枯渇下でのシグナルの解明を継続するとともに、臨床検体での網羅的発現解析をおこなう。次世代シーケンサー関連物品の単価が大きいため、差額は次年度と合わせて使用する予定差額は次年度と合わせて使用する予定である。
EVシフトが進めば,大幅な税収減となり新たな財源の確保が必要となる.一方で,インフラ維持管理費用が深刻な問題となる.走行距離など移動経路に応じて課税する受益者負担の考え方はわかりやすく身の丈にあったインフラ量を誘導する.道路修繕更新費用の一部が走行税で賄われる受益者負担課金を想定し,地方自治体まちづくりに与える影響を分析し,社会最適化などの理論モデルを構築する.EVシフトが進めば,大幅な税収減となり新たな財源の確保が必要となる.一方で,インフラ維持管理費用が深刻な問題となる.走行距離など移動経路に応じて課税する受益者負担の考え方はわかりやすく身の丈にあったインフラ量を誘導する.道路修繕更新費用の一部が走行税で賄われる受益者負担課金を想定し,地方自治体まちづくりに与える影響を分析し,社会最適化などの理論モデルを構築する.
マイクロアレイを用いたHPV関連頭頸部発癌と予後に関わるマイクロRNA異常解析

近年、欧米においてヒトパピローマウイルス(HPV)による中咽頭発癌の罹患率が上昇し、本邦においてもその重要度が増している。これを受けて中咽頭癌をはじめ内反性乳頭腫に合併した鼻副鼻腔癌、原発不明頭頸部癌など、本邦の幅広い頭頸部癌症例を対象にHPVの関与を解明した。また、中咽頭癌パラフィン検体から抽出したRNAを用いてマイクロRNAマイクロアレイを行い、本邦のHPV関連中咽頭癌に特徴的な発現変化を認めるマイクロRNAを明らかにした。東北大学において過去に治療を行った症例(中咽頭癌、乳頭腫の癌化例を含む鼻副鼻腔癌など)を対象に、パラフィン検体を用いてp16免疫染色、high risk型HPV in situ hybridization、更にDNA抽出からのPCR、direct sequencing法等を用いて、各症例のHPV感染statusを明らかにした。特記すべき点として、本邦でも以前から鼻副鼻腔乳頭腫および癌はHPVの研究対象とされてきたが、HPVが細胞に感染した状態を示すepisomal typeと、癌化に特異的と考えられる宿主ゲノムへのウイルスDNAの組込みを伴うintegrated typeが明確に区別されている報告は少なく、主にPCRベースのこれまでの報告で、本邦の癌におけるHPVの関与は12.5-15.7%(Furuta1992,Mineta1998)とされてきた。しかし、今回、integrated typeにターゲットを絞り検討した結果、その関与率は著しく低かった。一方で過去の報告同様にPCRのみではlow risk、high risk型共にepisomal typeと理解される偽陽性を認め、さらにp16免疫染色のみでも偽陽性があるとする報告(Bishop2013)同様に、本邦の症例においても偽陽性があることを確認した。本邦におけるHPV関連頭頸部癌研究の更なる発展に際しては、HPVの検出法の十分な理解と浸透が不可欠と考えた。なお、内反性乳頭腫の癌化症例においてもHPVの関与を認めなかった。確認したHPV感染statusを元に、中咽頭癌パラフィン検体からマイクロRNAを抽出し、定量PCRによるhouse keeping gene発現と電気泳動法によるsmall RNAパターン確認の上で、マイクロRNAマイクロアレイを行った。プロファイリング解析結果を踏まえ、確認実験を予定している。HPV関連頭頸部癌症例の更なる理解のため、これまでに対象としてきた鼻副鼻腔癌や中咽頭癌症例に加えて、臨床的にHPV関与が示唆された重複頭頸部癌症例、喉頭癌症例、原発不明頸腫症例などを対象にHPVの関与を評価した。特記すべき結果として、HPVが複数の癌の発症に関与した症例や、過去に報告を見ない良性型HPVの関与が示された症例など、稀なHPV関連頭頸部癌症例の存在が明らかになった。また、中咽頭癌ホルマリン固定パラフィン包埋検体より抽出したRNAを用いて行ったマイクロRNAマイクロアレイ解析の結果、HPV関連中咽頭癌に強く発現変化を認めたマイクロRNAを抽出し、RT-PCRによりその発現の確認実験を行った。近年、欧州からHPV関連頭頸部癌検体を用いたマイクロRNAマイクロアレイの報告がなされ(Lajer、2012)、本研究と間に認められた多くの共通マイクロRNAはHPV関連癌における普遍的な関与を示唆する一方、本研究のみに発現変化を認めたものについては、HPV関連癌における人種差や地域差を説明しうる可能性が考えられた。同時に、凍結検体由来の報告との高い相関から本研究のパラフィン検体を用いたマイクロRNAアレイの有効性が示された。過去に報告のない新規検出マイクロRNAを中心に、HPV陽性ならびに陰性頭頸部癌細胞株、および同HPV関連腫瘍の子宮頸癌細胞株を用いて、リポフェクション法によるマイクロRNA強制発現/抑制による機能解析実験を行った。腫瘍増殖能アッセイにおいて増殖能亢進への関与が示唆されるマイクロRNAを認めたが、今現在、HPVに特異的かつ有意な結果には至っていない。鼻副鼻腔乳頭腫と扁平上皮癌(SCC)合併例におけるヒトパピローマウイルス(HPV)の関与を検討した。SCCおよび内反性乳頭腫単独症例を比較対象としてパラフィン検体を用いてp16免疫染色、in situ hybridization(ISH)、PCRによるHPV検索などによる検討を重ねた結果、高リスク型HPVであるタイプ16が鼻副鼻腔癌発生に関与する可能性が示唆された。その一方でHPV関連鼻副鼻腔癌のバイオマーカーとしてのp16の役割や、HPV関連癌の放射線化学療法に対する感受性などの臨床的特徴においては、強く関連が証明されている中咽頭癌程の相関が見られなかった。鼻副鼻腔癌症例におけるp16やHPV関連癌の臨床的意義解釈には更なる検討が必要と考えられた。中咽頭癌のパラフィン検体から抽出したマイクロRNAでマイクロアレイを行い、HPV感染有無別等にマイクロRNAプロファイリングを施行した。in vitroで候補マイクロRNAの強制発現並びにRNAiを用いた増殖能や表現形の評価実験を行ったが、有意な機能や形態変化を来しうるマイクロRNAの特定までには至らなかった。また、近年、悪性黒色腫や肺癌等で次々に臨床応用され、各種固形癌における役割解明の需要が急激に高まりつつある時代背景を受けて、免疫チェックポイント分子にも注目し、HPV関連中咽頭癌および非関連癌との間で発現パターンや発現率の差を検討した。その結果、本邦の検体においては欧米からの報告とは異なった傾向が確認され、今後、地域や人種差を考慮した臨床適用判断が必要となる可能性が示唆された。

近年、欧米においてヒトパピローマウイルス(HPV)による中咽頭発癌の罹患率が上昇し、本邦においてもその重要度が増している。これを受けて中咽頭癌をはじめ内反性乳頭腫に合併した鼻副鼻腔癌、原発不明頭頸部癌など、本邦の幅広い頭頸部癌症例を対象にHPVの関与を解明した。また、中咽頭癌パラフィン検体から抽出したRNAを用いてマイクロRNAマイクロアレイを行い、本邦のHPV関連中咽頭癌に特徴的な発現変化を認めるマイクロRNAを明らかにした。頭頸部癌症例におけるHPV関与の評価は、初年度以降も幅広い対象症例にて順調に行われかつ新知見も得られており、順調な進行と考える。一方でマイクロアレイにて得られた候補マイクロRNAをターゲットとしたin vitro機能解析実験においては、HPV関連癌の発癌や予後に関わるマイクロRNAの有意な結果は得られておらず、27年度に跨って引き続き継続する必要がある。耳鼻咽喉科学、頭頸部外科学腫瘍増殖、浸潤能評価といった腫瘍機能評価法に加えて、さまざまな切り口でHPV関連中咽頭癌に関わるマイクロRNAの同定に努める。特に、本研究で得られたHPV関連候補マイクロRNAの中で、ごく最近になって他臓器癌において分子生物学的な特徴との関連が報告されたものがあり、HPV関連癌にも特徴的とされる分子生物的特徴でもあることから、今後のin vitro機能解析実験の評価項目に加えて検討を行う方針である。当初予定していた研究計画に概ね沿った順調な進展であるが、マイクロRNAマイクロアレイの結果解析を、一部、平成26年度に跨って行う方針である。また、中咽頭癌の年代別症例を対象としたHPV感染率評価については、可能な範囲で症例抽出を行ったが、今後、さらに追加抽出が可能なより古い症例があれば随時追加実験を予定している。今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。最近、HPV関連頭頸部癌においては、複数のマイクロRNAが同時に発現変化することで、発癌機序に関与している可能性が報告(Lajer 2012)されてきている。そのため、当初から予定しているHPVの感染有無ならびにタイプ別の他、HPVに関連する分子マーカーなどにも注目したsubgroup別のマイクロアレイ結果解析による候補マイクロRNAの抽出も検討する。次年度に跨って行う実験に用いる他、平成27年度請求額と合わせ、当初計画した平成27年度の研究遂行に使用する予定である。今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額の他、当初計画していた年代の古い検体を対象とするHPV感染評価や、マイクロRNAマイクロアレイの結果解析が、一部、次年度に跨ることに伴い生じたものである。次年度に跨って行う実験に用いる他、平成26年度請求額とあわせ、当初計画した平成26度の研究遂行に使用する予定である。
テレンセファリンのリガンド・ビトロネクチンによるシナプス形成制御機構の解析

細胞接着分子テレンセファリンが細胞外マトリックス蛋白質ビトロネクチンに強く結合することを見出した。ビトロネクチンコートしたビーズを培養海馬神経細胞に撒くと樹状突起に結合し、ビーズ周囲にテレンセファリンの集積を伴う突起構造を形成する。ビトロネクチン欠損マウスの海馬CA1錐体細胞においてスパインヘッドの肥大が観られた。これらのことからテレンセファリンとビトロネクチンとの結合がスパインヘッドの形態を調節していると考えられた。テレンセファリンは終脳特異的に発現する細胞接着分子で、樹状突起フィロポディアの形成やスパインの成熟に深く関わっている。これまで、細胞外でテレンセファリンに結合しフィロポディアやスパインの形成を調節する分子は解っていなかった。新たに細胞外マトリックス蛋白質ビトロネクチンとテレンセファリンが結合することを見出した。ビトロネクチンコートしたビーズを培養海馬神経細胞に撒くと、樹状突起に結合しテレンセファリンの激しい集積を起こす。そして、この集積にはリン酸化ERM蛋白質、F-アクチン、PI(4,5)P2など樹状突起フィロポディアに局在する分子を含んでいた。このことから、神経細胞においてテレンセファリンとビトロネクチンとの結合が重要な働きをすると予想し、以下の実験を行った。1、ビトロネクチン欠損マウスより採取した海馬神経細胞を培養液中にビトロネクチンが有る状態と無い状態で培養した。その結果、ビトロネクチンが無いとHomer1のPSDにおける集積が大きくなった。2、ビトロネクチン欠損マウス海馬CA1錐体細胞におけるスパインの形態をDiIラベルにより明らかにした。その結果、ビトロネクチン欠損マウスにおいてスパインヘッドの肥大化が観察された。また、スパインの密度はビトロネクチン欠損マウスにおいて減少していた。1,2の結果からビトロネクチン欠損状態において、テレンセファリン欠損マウスと同様にスパインの肥大化が観察された。これらのことからビトロネクチンとテレンセファリンとの相互作用がスパインをコンパクトに保っていることが示唆された。3、ビトロネクチンコートしたビーズにテレンセファリンが激しく集積することを利用してビーズに集ってくる分子を精製し網羅的に同定した。その結果から、樹状突起フィロポディア形成からスパイン成熟に重要なアクチン重合分子やこれらを制御するキナーゼやG蛋白質を同定した。テレンセファリンは終脳特異的に発現する細胞接着分子で細胞外マトリックス蛋白質ビトロネクチンと強く結合する。この結合を利用して、ビトロネクチンコートしたビーズを培養海馬神経細胞に撒くとテレンセファリンの激しい集積が観られた。そして、このビーズにテレンセファリンと共に集積してきた蛋白質を精製し網羅的に同定した。これらの蛋白質データからパスウェー解析を行い、シナプス形成とファゴサイトーシスにおいて共通して働くシグナルカスケードを同定した。テレンセファリンはpostsynaptic densityを避けるようにスパインにおいて局在している。これはテレンセファリンとビトロネクチンとの相互作用により局在が制御されていると考えられた。そこで、ビトロネクチンノックアウトマウスと野生型マウスを用いてテレンセファリンのスパインにおける局在を免疫電顕により比較した。その結果、ビトロネクチンノックアウトマウスと野生型の間で差はなく、テレンセファリンの局在にビトロネクチンは影響を及ぼさないことが解った。これまでの実験でビトロネクチンノックアウトマウスではスパインヘッドが大きくなることから、ビトロネクチンはペリサイトより放出され脳全体に広がりシナプス形成の際にテレンセファリンと結合する足場として働いていると考えられた。ビトロネクチンを終脳特異的に高発現させるために、テレンセファリンプロモーター下でテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
パフォーマンス不安の形成メカニズムの解明とその応用

人前での音楽演奏やスポーツ試合など,他者から評価される社会的場面においてパフォーマンス不安が喚起されると,運動スキルが一時的に低下することがあり,演奏者やスポーツ選手を初めとして,多くのパフォーマーを悩ませている。本研究では,パフォーマーの周囲の他者の反応や態度がパフォーマンス不安に与える影響に着目しつつ,パフォーマンス不安による運動スキル低下を防ぐ対処法を提案することを目指している。初年度である平成30年度は,他者の反応・態度がパフォーマンス不安に与える影響を検討するための実験刺激の開発に取り組んだ。音楽演奏やスポーツ試合等の場面において,聴衆・観衆が発する歓声や笑い声等の音声はパフォーマーの心理状態に大きな影響を与えるため,このような感情的音声に着目した。まず,快感情(達成・愉快等)及び不快感情(怒り・恐怖等)を表現した非言語的音声刺激の感情判別データに対して,多変量解析を行った。さらに,日本人の感情的音声の特徴を検討するため,西洋人の感情的音声との比較を行った。日本人及びオランダ人の参加者が,日本人及びオランダ人の感情的音声刺激を用いて感情判別・評定課題を行った実験のデータを分析した結果,オランダ人は,怒りや達成という排他的感情を表現した日本人の音声を判別することが困難であった。日本のような相互依存的文化では,対人関係に関する文化的規範により,排他的感情の音声伝達様式が特異的となっていることが示唆された。こうした感情表現の文化差は,パフォーマンス不安の検討を進める上で考慮すべき要因の一つだと考えられる。本成果は,Emotion誌に原著論文として掲載された。本年度は,他者の感情的反応の影響を検討するための実験刺激の開発に取り組み,刺激の特徴を詳細に検討した。そして,これらの分析結果の一部を原著論文として発表した。以上のように,おおむね順調に成果が得られている。今年度は,他者の感情的反応の影響を検討するための実験刺激の開発に取り組んだ。今後は,こうした刺激を利用した実験系を開発し,他者の反応がパフォーマンス不安に与える影響を検討していきたい。今年度は,他者の感情的反応の影響を検討するための実験刺激の開発やデータ分析に取り組んだため,次年度使用額が生じた。次年度以降,実験系の構築や実験実施に関わる物品費や人件費・謝金に使用する予定である。
固定性補綴装置における長期臨床成績の多変量解析及び生存分析

固定性補綴装置として接着ブリッジとレジン前装冠を選択した.まず,長崎大学病院において装着された金銀パラジウム合金製接着ブリッジについて臨床成績調査を行った.本調査を行う接着ブリッジは,金属被着面を貴金属接着性プライマーで処理後,レジンセメント(スーパーボンドC&B)にて装着した接着嵌合リテーナー使用の金銀パラジウム合金製と限定した.対象となる接着ブリッジを装着した99名のうち,リコールに応じ且つ本研究の目的と合致した77名,81症例を対象として臨床成績調査を行った.生存の状態は(1)完全生存(脱離しなかったもの)及び(2)機能的生存(一旦脱離したが再装着できたもの)に分類した.その結果,81例のうち80例が完全生存に分類されることが分かった.脱離再装着を行った1例は装着157ヶ月後に外傷により脱離したものであった.完全生存の観察期問および生存率は165ヶ月で43.9%,機能的生存は178ヶ月で87.7%であった.更に,接着ブリッジの生存率に寄与する因子について,(1)上顎/下顎の別,(2)前歯部/臼歯部の別,(3)欠損歯数,(4)支台歯数の4項目について検討したが,そのいずれの因子も生存率に有意に寄与しなかった.これらは,金銀パラジウム合金製接着ブリッジの生存率が高いために寄与するに至らなかったと推測された.また、接着嵌合リテーナー(基本型)とコンビネーション型接着ブリッジとの臨床成績をKaplan-Meier法とログランク検定で分析を行った.基本型に関しては「機能的生存」を採用した.その結果,基本型の生存時間の平均値(推定値)は168ヶ月,コンビネーション型は162ヶ月であった.ログランク検定では基本型とコンビネーション型の生存率に差がないことが判明した(p=0.479).同様に臨床評価したレジン前装冠についても,貴金属接着性プライマーと金銀パラジウム合金の臨床的有用性が示唆された.固定性補綴装置として接着ブリッジとレジン前装冠を選択した.まず,長崎大学病院において装着された金銀パラジウム合金製接着ブリッジについて臨床成績調査を行った.本調査を行う接着ブリッジは,金属被着面を貴金属接着性プライマーで処理後,レジンセメント(スーパーボンドC&B)にて装着した接着嵌合リテーナー使用の金銀パラジウム合金製と限定した.対象となる接着ブリッジを装着した99名のうち,リコールに応じ且つ本研究の目的と合致した77名,81症例を対象として臨床成績調査を行った.生存の状態は(1)完全生存(脱離しなかったもの)及び(2)機能的生存(一旦脱離したが再装着できたもの)に分類した.その結果,81例のうち80例が完全生存に分類されることが分かった.脱離再装着を行った1例は装着157ヶ月後に外傷により脱離したものであった.完全生存の観察期問および生存率は165ヶ月で43.9%,機能的生存は178ヶ月で87.7%であった.更に,接着ブリッジの生存率に寄与する因子について,(1)上顎/下顎の別,(2)前歯部/臼歯部の別,(3)欠損歯数,(4)支台歯数の4項目について検討したが,そのいずれの因子も生存率に有意に寄与しなかった.これらは,金銀パラジウム合金製接着ブリッジの生存率が高いために寄与するに至らなかったと推測された.また、接着嵌合リテーナー(基本型)とコンビネーション型接着ブリッジとの臨床成績をKaplan-Meier法とログランク検定で分析を行った.基本型に関しては「機能的生存」を採用した.その結果,基本型の生存時間の平均値(推定値)は168ヶ月,コンビネーション型は162ヶ月であった.ログランク検定では基本型とコンビネーション型の生存率に差がないことが判明した(p=0.479).同様に臨床評価したレジン前装冠についても,貴金属接着性プライマーと金銀パラジウム合金の臨床的有用性が示唆された.本研究課題に対する初年度の研究成果は以下の通りである.初年度においては,固定性補綴装置として接着ブリッジを選択することとし,長崎大学医学部・歯学部附属病院(以下,長崎大学病院と略)において装着された金銀パラジウム合金製接着ブリッジについて臨床成績調査を行った.本調査を行う接着ブリッジは,金属被着面を貴金属接着性プライマー(Vプライマーもしくはメタルタイト)で処理後,レジンセメント(スーパーボンドC&B)にて装着した接着勘合リテーナー使用の金銀パラジウム合金製接着ブリッジと限定した.まず,研究に先立ち,長崎大学歯学系倫理委員会において本臨床調査の承認を受けた.その後,長崎大学病院において金銀パラジウム合金製接着ブリッジを装着した99名のうち,リコールに応じ,且つ本研究の目的と合致した77名,81症例を対象として,臨床成績調査を行った.生存の状態は(1)完全生存(脱離しなかったもの)及び(2)機能的生存(一旦脱離したが再装着できたもの)に分類した.全てのデータは口腔内診査により取得するものとし,診査不能データは最終取得データをもって観察打ち切りとし処理した.その結果,81例のうち80例が完全生存に分類されることが分かった.脱離再装着を行った1例は装着157ヶ月後に外傷により脱離したものであった。完全生存分類の80例のうち,4例が脱離後別の補綴装置を再製作していた.

この4例の脱離は,おそらくリテーナーの一部剥離が起因するもので,完全脱離しなかったために2次ウ蝕を惹起し,これが再装着不能の原因となったことが推測された。接着ブリッジの最長機能期間は165ヶ月であった.本研究によって,プライマー処理とスーパーボンドを併用した金銀パラジウム合金製接着ブリッジの高い信頼性が示唆されたが,接着ブリッジの利点と言われる「再装着」については症例数が非常に少ないことも判明した.本研究課題に対する本年度の研究成果は以下の通り.本年度は,固定性補綴装置における長期臨床成績の追跡を目的とし,研究に先立って研究打ち合わせを行った.打ち合わせの結果,固定性補綴装置としては金銀パラジウム合金製接着ブリッジを選択することとし,長崎大学医学部・歯学部附属病院(以下,長崎大学病院と略)において装着された同ブリッジについて初年度に継続し臨床調査を行い,その生存分析を行って臨床評価を行った.対象となる接着ブリッジは,金属被着面を貴金属接着性プライマーで処理後,レジンセメント(スーパーボンドC&B)にて装着した接着勘合リテーナー使用と限定した.尚,本調査は長崎大学歯学系倫理委員会において承認延長措置を行った.金銀パラジウム合金製接着ブリッジを装着した99名のうち,リコールに応じ,且つ本研究の目的と合致した77名,81症例を対象として,臨床成績調査を行った.生存の状態は(1)完全生存及び(2)機能的生存に分類した.全てのデータは口腔内診査により取得,診査不能データは最終取得データをもって観察打ち切りとし,統計分析した.その結果,81例のうち5症例は脱離したが,1症例については脱離再装着が可能であり機能的生存であった.完全生存の観察期間および生存率は165ヶ月で43.9%,機能的生存は178ヶ月で87.7%であった.更に,接着ブリッジの生存率に寄与する因子について,(1)上顎/下顎の別,(2)前歯部/臼歯部の別,(3)欠損歯数,(4)支台歯数の4項目について検討したが,そのいずれの因子も生存率に有意に寄与しなかった.これらは,金銀パラジウム合金製接着ブリッジの生存率が高いために寄与するに至らなかったと推測された.これらの結果は次頁の通り,論文発表によって公表した.また,上記診査によって確認された希有な症例や上記以外の知見について論文発表を随時行った.次年度は別の補綴装置に対する生存率の比較を行う予定である.本研究課題に対する本年度の研究成果は以下の通り。本年度は、固定性補綴装置における長期臨床成績の追跡を目的とし、研究打ち合わせにより固定性補綴装置として金銀パラジウム合金製接着ブリッジを選択し、長崎大学医学部・歯学部附属病院において装着された同ブリッジについて臨床調査を行い、その生存分析および臨床評価を行った。対象となる接着ブリッジは金属被着面を貴金属接着性プライマーで処理後、レジンセメント(スーパーボンドC&B)にて装着した接着勘合リテーナー(基本型)とし、full coverage typeの支台装置とリテーナーの双方から成るし接着ブリッジ(コンビネーション型)との臨床成績を比較した。支台装置は2歯のみとし、基本型75症例、コンビネーション型41症例について、Kaplan-Meier法とログランク検定で分析を行った。基本型に関しては、脱離後再装着が可能であった症例は生存とする「機能的生存」を採用した。1口腔内に2つ以上の同型接着ブリッジが装着されていた場合は、その平均をとるGEE法を用いて検定を行った。その結果、基本型の生存時間の平均値(推定値)は168ヶ月、コンビネーション型は162ヶ月であった。