hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「版本狂言記」を主軸に据えた狂言詞章の分析と近世期口語の再構築

今年度第一の目標は、近代語授受動詞体系の成立に関して、近世前期に如何様な変化があったかを考察することであった。近世前期の「版本狂言記」には授受動詞クダサルが多数見られるが、同じ狂言資料でも「版本狂言記」より少し時代が古い大蔵流や和泉流の狂言台本にはクダサルとタマワル(タモル)が半々の割合で使用されていることに注目した。クダサルは室町末期から近世前期にかけて急激に発達したものと思われる。もともとクダサルは平安期から使用されているが、主に古文書での使用であり和文体には見られないという特徴がある。また意味用法も異なり、「院が院宣をクダサレタ」のように「お与えになる」と解釈できる。これが現在のクダサルになった理由としては、テクダサレというテ形が室町末期から依頼表現を発達させ、「私にをしてください」という意味で多用され、その結果、動作主は相手、受け手は自分という人称制約が生じたのではないかと考えた。テ形が先に文法化を起こしたのではないかという仮説は、最近話題の文法化と一見逆行するかのように思われるが、本動詞と補助動詞が併存した場合、先に補助動詞が形式化し文法化する可能性は大きいのではないかと考える。以上の研究を、研究会では平成17年8月5日(大分県九州国立大学九重共同研修所)第203回筑紫国語学談話会にて「テクダサルの用法-クダサルとの対比-」と題し発表を行った。また、平成17年11月11日第229回近代語研究会秋季発表大会(仙台市戦災復興記念館)では「狂言資料を中心にみたクダサルについて」(全国大会)と題し、口頭発表を行った。上記の課題に題し、論文を二本執筆した(一本は現在印刷中)。しかし、クダサルとクレルとの関係や、ヤル、モラウとの関係など、研究すべき課題は残ったままである。また、当初計画していた指示詞に関しての研究や、鷺流『保教本』の翻刻は途中のまま本年度は終了した。まず、第一点目の「基礎資料の収集と鷺流狂言台本『保教本』本文のテキスト化」であるが、近世期の狂言台本資料の収集と論文の整理を行った。コピーのため、国文学研究資料館や法政大学能楽研究所へ赴いたり、写真の紙焼きを注文したりして、当初予定していた分の約八割の資料を手元にそろえることができた。鷺流狂言台本『保教本』のテキスト化は今年度中に終わらなかったので、来年度も引き続き行う予定である。現在は、『保教本』に書かれている注記と「版本狂言記」の詞章との比較を行っている。第二点目の「指示詞の発達状況の調査」に関しては、今年度論文を二本発表した。一本は、「ナタ」系の指示詞に関するものである。「コナタ・ソナタ・アナタ・ドナタ」の「ナタ」系語は、室町末期から江戸時代の中期にかけて、方向を示す指示詞から人を指す人称詞へ用法を変えたことを明らかにした。従来からアナタが二人称化した問題が未解決であったが、本論ではソナタ・コナタが二人称になったあと、指示詞としての連動から二人称化したという新しい説を唱えた。もう一本は不定詞「ドウ」の発達を関してである。従来「ドウ」は当初から疑問詞として存在していたと思われていたが、狂言資料を中心にしてみると「ドウ」の初期の用例には「ドウナリトモ」のような不定用法しかなく、疑問用法は遅れて発達したことを指摘した。その理由として「コー、ソー、アー、ドー」の指示副詞の体系化が「ドウ」を疑問詞として発達させたのではないかと考察した。さらに、第三点目の「研究結果発表」に関しては、上記の論文発表に加え口頭発表を行った。韓国プサンで開催された「第6回東アジア日本語教育・日本文化研究学会」において、不定詞「ドウ」の発達に関する発表を行った。今年度はまず第一に、「版本狂言記」の資料性を調査する一つの手段として『保教本』注記との比較調査を行った。『保教本』は江戸享保頃に書写された鷺流の狂言本であり、本文の横に他流派に関する多数の注記が施されている。「『保教本』注記から見た狂言詞章の考察」として、論文の中では次の三点を指摘した。まず一点目に、「版本狂言記」の中でも素性が分からないとされる曲に注記と一致する詞章があり、初期の二編「正編」「外五十番」には共通する詞章があることを明らかにした。また二点目として、大蔵流についても対比を行った。江戸初期書写の『虎明本』と江戸後期書写の『虎寛本』と注記とを対比させると、現存の大蔵流狂言本には残存していない詞章が存在することを指摘した。さらに鷺流保教家の狂言家元としての意識変化についても言及した。また、当初の計画にはなかったが、語彙の面からみた「版本狂言記」の資料性に関して調査を行い論文にまとめた。お礼のことばである「かたじけない」と「ありがたい」について狂言資料を調査し、さらに江戸時代を通しての両語の盛衰とその盛衰の理由を考察した。計画第二の『保教本』のテキスト化は少しずつではあるが、着実に進めている。また、計画第三の狂言本を通しての指示詞発達については研究の途中である。

指示副詞を調査しているうちに、ソ系の指示副詞は発達が緩やかだったのではないかという感触を得て、指示代名詞と指示副詞は体系化を一にする必然性はなかったのではないかという仮説を持ち現在も研究を行っている。計画第四の研究発表に関しては、論文発表に加え、中国上海復旦大学で開催された「2004年度東アジア日本語教育・日本語文化研究学会」において口頭発表を行った。今年度第一の目標は、近代語授受動詞体系の成立に関して、近世前期に如何様な変化があったかを考察することであった。近世前期の「版本狂言記」には授受動詞クダサルが多数見られるが、同じ狂言資料でも「版本狂言記」より少し時代が古い大蔵流や和泉流の狂言台本にはクダサルとタマワル(タモル)が半々の割合で使用されていることに注目した。クダサルは室町末期から近世前期にかけて急激に発達したものと思われる。もともとクダサルは平安期から使用されているが、主に古文書での使用であり和文体には見られないという特徴がある。また意味用法も異なり、「院が院宣をクダサレタ」のように「お与えになる」と解釈できる。これが現在のクダサルになった理由としては、テクダサレというテ形が室町末期から依頼表現を発達させ、「私にをしてください」という意味で多用され、その結果、動作主は相手、受け手は自分という人称制約が生じたのではないかと考えた。テ形が先に文法化を起こしたのではないかという仮説は、最近話題の文法化と一見逆行するかのように思われるが、本動詞と補助動詞が併存した場合、先に補助動詞が形式化し文法化する可能性は大きいのではないかと考える。以上の研究を、研究会では平成17年8月5日(大分県九州国立大学九重共同研修所)第203回筑紫国語学談話会にて「テクダサルの用法-クダサルとの対比-」と題し発表を行った。また、平成17年11月11日第229回近代語研究会秋季発表大会(仙台市戦災復興記念館)では「狂言資料を中心にみたクダサルについて」(全国大会)と題し、口頭発表を行った。上記の課題に題し、論文を二本執筆した(一本は現在印刷中)。しかし、クダサルとクレルとの関係や、ヤル、モラウとの関係など、研究すべき課題は残ったままである。また、当初計画していた指示詞に関しての研究や、鷺流『保教本』の翻刻は途中のまま本年度は終了した。
英国公文書館所蔵アーネスト・サトウの日本滞在自筆日記(1861-1884)の解読と活字化

平成11年度から平成13年度の三年継続の本研究計画が認可されたとき、サトウ自筆日記の日本滞在に係わる三つの時期(1862-1869;1870-1884;1895-1900;1906)のなかでも、前半部分(1862-1884)に集中することが、私の当面する研究の必要性と、力量の及び範囲と考えていた。実際に三年間という長い呼吸の歳月の進行とともに、研究意欲は膨らむ一方の勢いとなった。結果的に三年間の継続研究の研究実績は、アトウ自筆日記全39冊の解読・活字化を達成して、66年に及んだサトウ日記執筆の全体像を把握できたことである。その成果を纏めるのに更に一年を要したが、2003年3月には研究成果報告書において、幾つかの事項に関して詳細に報告した。第一の事項は、上記全体像に係わる点である。「表1:サトウ日記の自筆原稿(manuscripts)と転写原稿(transcriptions)の概算」(上記報告書p.18)を纏めあげることによって、サトウ日記の総体を眺望する内外で初めての資料となった。具体的な一例を挙げるなら、当初計画の自筆日記分(1862-1884)は、約2537頁となり、全39冊分の総頁数が約9373頁であるのだから、当初計画の約3.7倍の基礎作業を完了したことになり、A4版30行の転写原稿は、約6457枚の総枚数を数えることが一目して分かる。第2報では全自筆日記資料の書誌的纏め方について、を表2に言及しつつ、極めて簡略化した「記入日リスト」の形にした今回のを述べてある。今後の研究実績の予定されている発表について、最後にひとこと触れておきたい。本研究の中核となる仕事は、解読し活字化した転写テキストを書物として発表することにある。本年度は幕末維新(1861-1869)を出版し、向こう5年間に全20巻で逐次出版することで出版社と協議中である。また、来年度には新書版で「アーネスト・サトウの日記」を出版して、本研究の実績報告の内容を一般読者に向けて公表することになっている。初年度の研究実施計画に沿って、平成11年5-7月末にかけて、サトウ自筆日記の第一期分について判読完成に取り組み、外国人と日本人各一名の大学院生による補助作業を受けて、判読ミスを指摘してもらうなど、完成度の高いテキストの作成を達成できた。8月末から9月中旬まで3週間の現地調査をロンドンの英国公文書館で行い、サトウ私的文書の総体を調査したが、膨大な数量の資料であることが分かり、この内、初年度の計画実施に不可欠な資料の中で手元にない自筆日記(PRO/30/16/1-12,17/1-17)の全29冊をマイクロ・フィルム化するように依頼して帰国した。9月末までに入手できたので、初年度後半の計画にある日本滞在第二期・三期と最後の日本訪問部分の判読に取り組み、目下、順調に進行しているので、予定の平成12年6月初旬までに判読を終えられる見込みとなった。

なお、実際に資料を目の前にしてから、初年度の当初計画に一段と拍車がかかる思いであり、判読テキストの作成を大幅に拡張して、サトウ自筆日記全巻の判読に取り組むことに決心した。すでにシャイアム等の他国滞在期間(1878-1895年)について自分の判読テキストを完成できた。私的には所謂50肩の苦痛に悩みながらも、マイクロ・リーダーを追加購入したことで、研究室と書斎に各1台配置によって、時間の無駄のないように日夜効率的に作業を進めている。また、役職上の時間的制約の中にありながら、計画以上のペースで順調に進行している一方で、3月末に予定していた短期英国調査が不可能になったので、国内調査として予定していた鹿児島県立歴史資料センター黎明館に、3月31日から4月12日までの間に二度調査に出向き、サトウと親交した英人医師Wi11iam Willis自筆文書約650点のカタログ作成に補助的に協力するかたわら、サトウに関連する貴重なウィリス自筆書簡20通余りを発見して判読できた。継続2年目の研究実施は、ほぼ計画通りに進行したので、予定していた成果をあげることができた。当初計画との変更点は、渡英の時期に関してだけである。学科長としての募集・実習指導に係わる校務の都合上、英国公文書館における現地調査は、やむなく夏季休暇から年末年始の2週間に変えざるを得なくなったわけである。渡英中はサトウ自筆書簡の膨大な原資料を調査して、選定の上、注文して帰国できたので、7本のマイクロフィルムを2月初旬までに入手した。目下、日本滞在第一期の日記と書簡の照合を急ピッチで進めている。平成13年5月連休明けには、サトウ伝記研究の関連文献との照応も合わせて行っているので、注釈の原稿が完成する予定である。日本滞在第二期三期・日本短期訪問・日本国内旅行に関連する自筆日記相当分は、予定通りに、判読と研究補助者によるタイプミスの訂正を終えた。判読不明の箇所につき、同僚の大学教師とロンドン在住の日本研究家(Jeffrey Somers)の協力を得て、テキストの厳正を期した。また注釈作成の必要から国内調査を行った。特に鹿児島県立黎明館に寄託されているサトウ親友のウィリス医師が残した自筆書簡の調査を完了させ、書簡目録の刊行に協力したことで、珍しい資料を注釈に追加できたのも成果の一つである。上海時代の友人ダラスの足取りを調査するために、酒田市在住のダラス研究専門家から資料提供を受けた。日本滞在以外の自筆日記判読テキストは、2001年3月末の時点で、1904年末までの分につき作業を終えている。全サトウ自筆日記の5/7を判読した概算になる。平成13年夏に予定している現地調査の渡英までに、全自筆日記の判読テキスト作成と、記入日付・頁数・概要に関する書誌的整理をあわせて完成できる進捗状況にある。継続3年目の研究実施は、完成年度ということもあり、(1)1906-1926年間のサトウ自筆日記の判読テキストを作成すること、(2)サトウ日記全46冊の書誌的リストを作成すること、以上の二つの主要な事業に集中的に取り組み、ほぼ計画通りの成果をあげた。当初計画との変更点の一つは、報告書の印刷発表が、2002年8月中旬となったことである。研究対象を全46冊の日記に拡大したための余波である。3年前の研究計画申請時には、約20年分の日本滞在時期だけを研究対象にしていたのが、いったん本研究の補助金を受けて日々に努力するうちに、自然に高揚する意欲は、約65年間にわたるサトウの全ての自筆日記にまで本研究の対象をひろげて、判読テキストと書誌的リストを作成する勢いに発展した。20年分の対象が、65年分という3倍の年数に膨らんでしまい、全46冊のサトウ日記は、頁数にしても1万頁を越え、実際に判読を終え打ち出したタイプ用紙(A4版・80英字x30行)も約8000枚、それを積み重ねていくうちに、腰の高さにまで達する膨大なものとなった。
頭部外傷者の社会適応度評価(CIQ)の日本国内における妥当性の検証と標準化の試み

平成19年度は過去2年間で収集したCIQデータの解析および学会発表を行った。解析の結果より、日本人健常者のCIQ得点結果には年代および性別による特徴が顕著にあらわれ、また婚姻の有無など、ライフステージに応じた個人的生活状況が直接的・間接的に影響することが示唆された。質問項目を因子解析した結果、欧米の先行研究との明らかな相違点が見られたため、日本人独特のライフステージを反映した可能性が考えられ、今後慎重に内容を検討する必要がある。また、松坂中央総合病院に外来通院中の頭部外傷患者のCIQ得点結果との比較では、健常者と比較すると、女性患者において著しい得点低下が見られた。女性の役割変化を反映するものと考えられ、今後の頭部外傷患者の社会参加の度合いを評価するに当たり、参考とすべき知見を得られたと考える。また、今回健常者の得点傾向を把握したことによって、頭部外傷患者だけでなく、他の疾病に対する適応可能であることが示唆された。今後、ほかのQOL評価法との比較も検討し、更なる信頼性と妥当性の検証を行いたい。今回の調査は、現代の日本人のライフステージを反映したものであり、今後時代の変遷と日本人の価値観の変化と共に調査結果にも経時的変化が加わることが予測される。今後も定期的に調査をする必要があると考える。まず,健常者向けのアンケート用紙を作成した.その際,既存の標準化されているQOL評価法(SR-FAI)と組み合わせて回答を得るよう配慮することで,CIQ使用の妥当性を検討できるようにした.アンケート調査は,10月11月の愛知県豊明市・大府市の地域イべント会場にて行った,事前研修を受けた学生アルバイト調査員が,会場内で来場者を対象に直接対面式の調査を行い,データの収集に当たった.回答者からは調査に参加するにあたり同意書を得て,アンケートに回答に対する謝礼を渡した.結果として,780名の有効回答が得られた.マンパワーと時間的制約を考慮し,各年代とも100人以上のデータが集まったことから,当初の目標数(1000名)にはやや満たないものの,これらのデータをもって健常者のデータとして扱い,傾向の分析を開始することとした.得られたデータは,データべースに蓄積し,現在統計処理を行っている.内容的には,欧米での研究報告と合致するところが多いが,日本人のライフスタイルを反映して,年代ごとの特徴があらわれていると考える.来年度の準備として,TBI患者のデータを収集するため,TBI患者用のアンケート用紙の内容を検討している.TBI患者のデータを収集するに当たっては,松阪中央総合病院の協力を得られることになり,現在データ収集の段取りなどの打ち合わせを開始した.昨年度は健常者に対してCommunity Integration Questionnaireの内容を含めたアンケート調査を実施し,790人分のデータを収集したので,今年度は比較対象としてTBI(頭部外傷)患者にほぼ同様のアンケート調査を実施した.データの収集に当たっては,三重県松阪市の松阪中央総合病院リハビリテーション科の協力を得られることになったので,定期的に松阪市へ通い,外来患者データ総数50人を目標としてデータの収集を行った.結果として54名の患者データを集めることができ,順次解析を開始した.昨年度収集した健常者のデータ解析も同時進行で行い,現在は健常者のみのデータを年代別にまとめて標準値を算出して論文を作成中である.CIQのスコアには,年代別の特徴が如実に表れており,興味ある結果を得ることができた.また,今年度の第41回作業療法学術集会(鹿児島)にもエントリーをして演題発表をする予定となっている.データの収集は今年度で全て終了することができたので,今後は健常者データのさらに詳細な解析をすすめ,さまざまな切り口からの考察をして順次発表を行う予定である.またTBI患者のデータと健常者のデータを比較することで,両者の差異について考察を加え,既存の評価法との相関を考慮に入れて日本国内でCIQを使用することの妥当性について検証したい.平成19年度は過去2年間で収集したCIQデータの解析および学会発表を行った。
技術リスクガバナンスのプロトタイプモデル構築

温室効果ガス排出削減の対価として化学物質リスクの増減がどれほど起きるかに関し、事業者はリスクトレードオフの発生を評価することが求められる。そこで本研究では、リスク評価とライフサイクル評価を組み合わせることで、トレードオフの態様を把握する手法を開発した。この手法を都市静脈系設備の更新をとりあげ、下水汚泥・厨芥からのバイオガス・リン回収施策、都市建造物の更新に係る太陽高発電パネル普及施策の評価を通じて、その適用性を検証した。本研究は,二酸化炭素排出量削減と化学物質管理という2種類のリスク管理を同時に達成することを特に評価手法のプロトタイプモデルとして開発することを目的としたH22年度において,まず二酸化炭素排出抑制戦略の検討に焦点をあて,都市計画技法(用途地域の変更)とエネルギー計画技法(新技術の導入)連携させることで実現できる二酸化炭素排出抑制ポテンシャルを推計するプロトタイプモデルの構築をおこなった対象地域として大阪市をとりあげ,自治体による都市計画と連動した街区レベルでの省エネルギー計画の策定を支援する統合マネジメントモデルを開発し,実績データを収集整備してモデルを大阪市に適用した.2050年までを対象に建物の集積度合いが異なる都市構造を3ケース(多極高度集約,多極普通集約,傾向延長)設定し,2ケース(個別電化,マイクログリッド)の省エネルギー機器導入施策と各街区で二酸化炭素削減効果が高い方を選択導入する施策を,エネルギー収支・二酸化炭素排出量で評価した.各ケースの二酸化炭素削減量は現状比で54.857.6%と推計された.傾向延長・選択導入の削減効果が最も大きく,都市の高密化による熱の融通利用効果よりも太陽光発電の導入効果が上回ったことが主要因であると推察された。多極高度集約・選択導入では,商住混在型の建物集積により燃料電池を効率的に利用できる街区が増え,大阪市民生部門のエネルギー供給源に占める都市ガスの比率が78.2%となったH23年度では,構築したモデルを他のリスクの推算目的で適用し,低炭素技術戦略の導入に伴う,別のタイプのリスク(化学物質,廃棄物)の削減等を検討する予定である日本が環境政策の中核として進めている低炭素社会,循環型社会を具現化するにあたり,下水処理場やごみ焼却場に代表される静脈系施設が担う環境保全機能をマルチプルリスク管理技術拠点へと転換していくことが求められる.下水処理場では,汚泥消化槽を設置して地域のバイオエネルギー供給基地化を進めるとともに,今世紀中の枯渇が憂慮されるリンの回収拠点としても更新していくことが必要とされている.こうした下水処理場側の更新施策の動向を考慮すると,下水処理場に設置された汚泥用消化槽で厨芥を受け入れることにより,消化ガス産出量を増加させるとともに,汚泥・厨芥の両方からのリン回収が可能となる.下水処理場による厨芥受入事業は,石川県珠洲市が2007年8月より事業系生ごみの受入事業を,北海道北広島市が2011年4月より家庭系生ごみの受入事業を先駆的に開始しており,事業の広がりが期待されている.本研究では,汚泥処理場における厨芥の消化槽受入施策,勢定枝の汚泥乾燥熱利用施策を,脱水汚泥の増加が焼却・燃料化工程にもたらすマルチプルな影響を,ごみ焼却場側の排熱発電の高効率化も取り込んで評価することを研究の目的とした.神戸市を評価対象とし,現有設備の更新が終了する2030年におけるエネルギー消費量,温室効果ガス排出量,リン回収量,事業コストの評価を行った.更新ケース3-C(厨芥:消化槽受入,脱水汚泥:熱分解ガス化・発電,勢定枝:汚泥乾燥熱利用)は,標準的なケース1-A(厨芥:焼却・排熱発電,脱水汚泥:高温焼却)と比較して,年間でエネルギー供給量436TJの増加,温室効果ガス排出量37kt-CO2eq.の削減,リン回収量93t-Pの増加,事業コスト3.5億円の削減が達成できると推計された.現代の産業社会は、2つの環境目標実現を時間軸上に抱えている。2020年までの化学物質リスク最小化と、2050年までの二酸化炭素排出量の1990年比半減以上である。化学物質リスク評価は枠組みが構築されつつあり、二酸化炭素の排出削減のための新技術開発・導入が進行しているが、両者のトレードオフを考慮しながら、いつまでに、どこに、どれほど導入すべきか、というバックキャスティング的解析の為には技術の普及拡大に伴う排出削減ポテンシャルのきめ細かな情報が必要となる。そこで本研究は、CO2削減と化学物質管理という2種類のリスク管理をどれほど同時に達成しうるかをトレードオフに注意し評価する方法を検討した。二酸化炭素排出抑制につながる対策技術を、ライフサイクル評価やリスク評価・管理の枠組みで統合し、供給側CO2排出抑制技術、需要側消費者の生活様式の中に潜む削減ポテンシャルを評価し、新技術の未知の評価属性にも留意しながらリスクガバナンスモデルを検討した。評価手法開発では、物質単位を対象としたリスク評価手法とライフサイクル評価を組み合わせて、化学物質のリスク評価とCO2排出量の推定を行う方法を構築した。原単位×活動量×排出係数によるサブスタンスフロー解析に基づくマスバランス解析とインパクト評価が基本となる。

実証研究では、供給側技術として都市スタンディングマスの更新および需要側技術(排水処理・廃棄物処理技術の計画的更新)の評価を行い、複数指標間のトレードオフ態様の検討を通じて技術リスクガバナンスのプロトタイプモデルを検討した。技術リスクガバナンスプロトタイプモデルは、対策技術の適用によって得られた正味の削減効果(対策前ー対策後)及び、対策効率(対策前ー対策後)/対策前という2段階の指標で評価することで、削減量と対策効率の2軸で対策技術のモニタンリングを中心機能としたモデルとして提案した。解析評価のためのプロトタイプモデルの構築と、ケーススタディを実施しおえたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。化学物質対策と温暖化対策の双方を評価する方法論のプロトタイプ構築とケーススタディを引き続き実施する。
複雑な花形態が適応的になる生態学的条件の解明: 種間比較・群集間比較を通じた検討

本研究は、複雑な形をした花(複雑花)が、単純な形をした花(単純花)よりも適応的になる(より多く子孫を残せる)生態学的な条件を明らかにすることを目的とする。特に「複雑花は、同じ植物を選択的に訪花する性質(定花性)の強い送粉者へ花粉媒介を依存することで、植物の種多様性が高く、自種の開花密度の低い環境下で同種内送粉(自種の花を繰り返し訪れてもらうこと)を確実にするための適応である」という仮説を、複数の草原群集を詳細に調べ検証する。主に、「複雑花は単純花に比べて、定花性の強い昆虫により多く訪花され、競合する種が開花し、同種の開花密度の低い条件下でも確実に送粉に成功する」という予測を定量的に検証する。
分子ベアリングによる超潤滑ナノマシン

マイクロマシンやナノマシンの実現は、次世代産業創出のための起爆剤になると考えられている。マイクロマシンのようにサイズが小さくなってくると、表面積の増大によって摩擦力はその重量に比べて相対的に増大する。したがって、たとえマイクロマシンやナノマシンの加工が可能になっても、その物体の可動は困難である。現状では、摩擦力を減らす有効な解決手段が得られていない。このようななか、C_<60>単分子層をグラファイト基板間に挟んだ系が、動摩擦がほぼゼロという実用化にとっては、福音ともなるべき実験結果が我々によって得られた。従来の我々の研究では、C_<60>分子はグラファイト表面に炭素原子の6員環がABスタッキングを維持するように配置すること、多層カーボンナノチューブ分子も、C_<60>分子と同様にグラファイト表面に炭素原子の6員環がABスタッキングを維持するように3回対称の配置することが知られていた。これらの分子は、グラファイト上で炭素原子の6員環によるナノギアを形成し、特に多層ナノチューブの場合には、このナノギアを形成によって転がりが起こる。したがって、このような転がりや安定な配向において、炭素原子の6員環の噛み合わせ(ナノギア)が重要な役割をしていること、さらにC_<60>単分子層の上にグラファイト基板を載せた場合、グラファイト基板はC_<60>単層膜がグラファイトの上に成長した場合と同様に積み上がることなどの知見が得られていた。本研究計画ではマイクロマシン、ナノマシンの実現に寄与すべく炭素原子の6員環の噛み合わせ(ナノギア)に注目し、C_<60>分子やナノチューブをグラファイト基板で挟んだ場合に発現する超潤滑機構の解明、さらに新たな超潤滑系の構築を目的にするに至った。研究期間内に明らかにすることとして(1)ナノギア、分子ベアリングによる超潤滑機構の解明、(2)超潤滑機構の理論的解明、(3)新たな分子ベアリングの超潤滑系の探索が研究課題としてあげた。その結果、この3つの研究課題は、ほぼ、2年間の研究期間に達せられた。特に、(3)の新たな超潤滑系の発見として、フラーレンをグラファイト内に内包した化合物発見が特記される。この新しい物質は、今後の固体潤滑のあり方を示すべく新規の超潤滑固体潤滑物質として世界的に注目されつつある。摩擦のない機械システムの実現は、人類の究極の目的になっている。従来の我々の研究では、グラファイト上にC_<60>単層膜を真空蒸着で作成し、その上にグラファイトフレークで挟んだグラファイト/C_<60>単分子層/グラファイト系が、動摩擦ゼロ(時間平均の摩擦力がゼロ)になることを示した。しかしながら、この試料作成法は、真空蒸着でグラファイト上にC_<60>単層膜を作成することに困難が伴うこと、摩擦力を測る際の試料の位置決めなどに手間がかかるなど問題点が存在する。したがって、この作成法は基礎研究の方法としては重要な意味を与えたが、実用に向けた試料作成としては有効とは言えない。

本研究では、C_<60>フラーレン分子を化学処理,熱処理によって簡単にグラファイトの中に封入したフィルムが定常的に摩擦力ゼロを示すことがわかった。この試料は、グラファイト単層膜(グラフェン)と稠密構造をもつC_<60>単層膜が交互に積層した構造をもつ。100nN(GPaの圧力に相当)以下の荷重では、摩擦力はノイズレベルで常にゼロを示す。この場合、定常的に摩擦力がゼロである。荷重100nNでは,グラフェンによる圧縮により、C_<60>フラーレン分子の回転や転がり等の自由度が失われ、C_<60>単層膜を反映した摩擦力像が出現すると同時に有限な摩擦力が発生する。摩擦力ゼロはサイズ2.3mm×2.3mmの広い領域で起こり、どの方向に走査しても摩擦力ゼロで摩擦に異方性がない。この摩擦力ゼロフィルムの実現は、従来の潤滑剤の発展においてブレークスルーになると同時に、ナノマシンやマイクロマシンの実現にとって極めて重要な発見である。2年間の研究期間の最終年度にあたる本年度は、C_<60>単層膜を内在したグラファイトシステムの構築とその超潤滑機構の解明を中心に研究が行われた。膨張化グラファイトを約600°CでC_<60>粉末とともに2週間ほど加熱すると、C_<60>分子を封入したグラファイトフィルムを作成できることを、前年度に報告した。C_<60>分子を内包したグラファイトフィルムは、透過電子顕微鏡観察によるとグラファイトの平面内ではC_<60>分子は最密充てん構造をとる一方、[0001]軸方向にはC_<60>単分子層が約1.3nmの間隔で積層する構造になっていることがわかった。さらに、理論シミュレーションにより、C_<60>分子-グラファイト間に適当な相互作用ポテンシャルを適用して、層間距離dの関数として垂直荷重F_Zと全エネルギーUを計算した。グラフェン単層膜間の距離を圧縮するのに伴い全エネルギーが下がり、間隔が1.3nmのところで極小点が現れ、このとき、垂直荷重F_Zがゼロになり、安定構造となることが示された。摩擦力測定においては、驚くべきことに、水平力曲線をプロットすると100nN以下では0.1nNのノイズレベルで常にゼロを示すことがわかった。これは、静止摩擦力も動摩擦力もほぼゼロになることを示しており、グラファイト/C_<60>/グラファイト系をはるかにしのぐ潤滑性を示している。この超潤滑現象の発現は、まず第一に、グラファイト間は平衡位置1.3nmを保ち、極めて弱い相互作用の状態でC_<60>分子という球が挟まれているという、この特異な構造に起因する。そのことが6員環や5員環という接触部位を通して、C_<60>分子の微小回転・並進運動という自由度を与え、エネルギーのより低い経路を開き、常に小さい摩擦を与えることに通じる。
糖尿病発症要因の栄養学的追求と予防法の究明インスリン抵抗性とナイアシン代謝の関係

糖尿病の発症には、糖質のみならず、脂質など様々な栄養素の摂取量やその代謝が影響している。我が国の糖尿病患者増加の背景として、必ずしも"飽食"のみが原因ではないと考える。近年、糖尿病患者にナイアシン(ニコチン酸及びニコチンアミド)を投与すると、ナイアシンの生体内代謝産物であるメチルニコチンアミドの血中濃度が上昇し、血中のH_2O_2レベルの上昇とともにインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。一方、脂肪細胞によって作り出される、エネルギーの取り込みと消費の制御に重要な役割を果たすレプチンというペプチドホルモンがある。レプチンは食事後2030分後に分泌され、脳に摂食抑制信号が送る役割を果たす。また、脂肪組織自体にも働きかけ、エネルギー代謝の増大の指示を出す。逆に、脂肪が増えるとレプチンも増え、レプチンが脳の容量に対して飽和状態に陥ることでレプチン抵抗性という状態を引き起こす。これが肥満原因の一つになるとも言われている。我々は、脂肪細胞にニコチンアミド(NA)を添加して培養を行い、レプチンの産生にどのような影響を及ぼすのか検討を行った。NAの濃度をそれぞれ変えて1週間および2週間培養を行い、細胞あたりのレプチン産生量を測定した。1週間培養を行った場合は、1mMの濃度まではレプチン産生が約3倍に増加した。2週間培養を行った場合は、0.1mM以上のNA濃度ではレプチン産生が約3分の1に低下していた。これらの実験結果より、NAは短期的には脂肪細胞のレプチン産生を増加させ、レプチン抵抗性を起こす可能性がある。長期的にはレプチンの産生を低下させ、肥満を引き起こす可能性が示された。ナイアシン投与で糖尿病患者にインスリン抵抗性を起こすという報告と今回の実験結果を考え合わせれば、糖尿病患者にナイアシンを投与する治療は慎重に検討されるべきである。
うつ病者を対象とした自己複雑性を高めるプログラムの効果の検討

本年度は,うつ病患者を対象として,自己複雑性と抑うつとの関連を検討するために,横断調査を実施した。その結果,肯定的自己複雑性と抑うつに負の関連が認められ,否定的自己複雑性と抑うつに正の関連が認められた。そこで,調査を元に,うつ病患者を対象とした介入プログラムを実施した。前年度作成した肯定的自己複雑性を高める介入プログラムを改訂・実施し,抑うつや人生への満足感への効果を検討することを目的とした。うつ病患者数名を対象に,5時点(介入プログラム前,2週間後,1ヶ月後,3ヶ月後,6ヶ月後)の調査票による効果評価を行った。また,対象者には,実施についての意見や感想も求めた。その結果,数名の患者は,介入プログラム後に肯定的自己複雑性が高まり,介入プログラム実施後に抑うつが低減し,人生への満足感が増加することが認められた。しかし,対象者の中には,抑うつが低減しない者も認められた。対象者の感想として,肯定的な自己の側面に注目しづらいという報告があった。横断調査結果が示したように,うつ病患者にとって,肯定的自己複雑性のみならず,否定的自己複雑性からの抑うつへの影響を考慮する必要があったと考えられる。そこで,介入プログラムの改善点として,否定的自己複雑性と抑うつの関連に注目し,否定的自己複雑性を低減するような内容に変更することが必要と考えた。そして,今後は,改善した介入プログラムを実施・検討することを計画している。本年度は,大学生を対象として,修士論文で作成した肯定的自己複雑性を高める介入プログラムを改訂・実施し,抑うつや人生への満足感への効果を検討することを目的として介入研究を実施した。介入プログラムの効果を検討するために,対象者を介入群と統制群2群に無作為に割り付け,5時点(介入プログラム前,2週間後,1ヶ月後,3ヶ月後,6ヶ月後)の調査票による効果評価を行った。その結果,介入プログラム後に介入群の肯定的自己複雑性が高まり,3ヶ月後までその効果が維持されること,介入プログラム実施後に抑うつが低減し,人生への満足感が増加することなどが認められた。次に,うつ病患者数名を対象として,うつ病者向けに改訂を加えた肯定的自己複雑性を高める介入プログラムのフィージビリティスタディを実施した。効果を検討するために,3時点(介入プログラム前,2週間後,1ヶ月後)の調査票による効果評価を行った。また,対象者に実施についての意見や感想も求めた。その結果,大学生の場合と同様に,介入プログラム後に肯定的自己複雑性の増加は認められたものの,抑うつが若干増加する可能性も示唆された。また,現在の説明では内容が理解しづらいなどの意見も認められた。そのため,うつ病患者が本介入プログラムに参加する負担を考慮し,さらに介入プログラム内容の改善を行った。次年度は,パイロットスタディとして改善した介入プログラムを数名のうつ病患者に対して実施し,抑うつ等を指標としてその効果を検討する。
幼若期ストレスが惹起する脳サイトカインネットワークの構築異常の解明

生後1日目より7日間母子分離ストレスを与え、マウスの生後7日齢の脳、脾臓等を採取した。生後7日齢で母子分離群のミクログリア細胞はコントロール群とは異なり、F4/80陰性細胞のミクログリアであった。ウェスタンブロッティング法によってミクログリア特異的タンパク質の発現量は母子分離群で有意に低下していた。FACS法を用いてミクログリア細胞の細胞特性を解析した結果、純粋なミクログリア細胞を単離した。単離されたミクログリア細胞はFACS解析からその性質が3種類の亜集団に分離することがわかった。以上の結果から幼若期にストレスを与えられるとミクログリアの由来や質が違うことが示唆された。本年度は母子分離ストレスのモデル動物作成法の確立を行った。これまでマウスの系統の差や結果の差がある事がわかっている。我々は本実験において以下の様にモデル動物を作成する事にした。1)生後1日より他のケージにマウスを紙コップ容器に入れて母子、個々ともに隔離する。2)隔離の時間は1時間(AM10:00AM11:00)3)約1週間分離実験を行う。以上の方法でそれぞれの発達段階における脳、脾臓、胸腺のサンプル採取を行った。まず脳でのグルココルチコイド受容体の発現をウェスタンブロッティング法にて解析した。その結果、ストレス負荷マウスの生後14日齢の脳のグルココルチコイド受容体の発現は低下していた。一方でストレス負荷時である生後7日齢の発現には変化がなかった。その他脾臓のマクロファージの発現量に差はなかった。しかしながら組織化学解析による脳内ミクログリアの形態が活性化型のアメボイド様であった。この事はミクログリアがなんらかの刺激を受けて活性化もしくは未発達の形態である事を示唆している。今後これらの形態と変化について、また各組織との関連性について検討する必要がある。更に胸腺では分化マーカであるCD3の発現量には変化はなかった。本年度研究よりストレスに対する影響は1時間のストレスでも十分に生後の発達に影響がある事が示唆された。更にこの実験から、目があいていないすなわち視覚情報がないストレスで生後の脳機能に影響がある事が示唆され、今後ストレス負荷の状況に応じた発現変化の検討も必要である事が示唆された。幼若期ストレスとして本研究では母子分離を用いた。生後1日齢より1週間、1時間の母親との分離を行い、実験終了後は通常飼育に戻した。生後7日齢、14日齢、21日齢と仔マウスの脳、脾臓、骨髄などのマクロファージ、免疫細胞等をサンプリングした。その結果、ストレス負荷を与えたマウス脳でのミクログリアの数、形態が変化していた。特に生後7日齢では幼若型のミクログリア(アメボイド型)であるが、コントロール群でがその性質が体内マクロファージの性質を持つF4/80陽性であるのに対して、ストレス群は陰性であった。これらの違いから浸潤してくる由来や性質が違う可能性が示唆された。次に、体内の免疫制御機構を調べるために血清中のIgG,IgA,IgM,IgEを測定したところ、IgG,IgMにおいてストレス群が有意に高値であった。そこで、各免疫組織におけるマクロファージ、T細胞、B細胞の分化をFACSにて分離・同定を行った。しかしながら、骨髄、脾臓、胸腺における分化パターンに違いはなかった。一方で骨髄の細胞数の増加がストレス群には見られた。さらに、もう一つの幼若期の免疫細胞の産生組織である肝臓ではストレス群の分化細胞に違いが見られ、幼若型血球細胞が低下していることが示された。この事から、ストレス群の脳内では本来骨髄、肝臓から産生されるミクログリアが骨髄のみで産生され、さらに産生能が亢進しているために脳に浸潤するミクログリアも多いということが示唆された。そこで数だけではなく感受性も違う可能性を見るために、脾臓より作製したT細胞のCD3刺激によるサイトカインの放出量をELASA法で測定した。その結果、ストレス群の脾臓より作製された細胞のIFN-γの放出量が有意に高値であった。この事から数だけではなく刺激に対する感受性も高くなっており、その結果が血清中のイムノグロブリン(Ig)に見られたのだと結論づけることが出来た。上記研究実績よりストレス負荷によって体内免疫細胞の分化のスピードや細胞の刺激に対する感受性、またミクログリア細胞の特性の違いが示唆される結果を得ることができ、当初の研究計画が順調に進展していると考えられる。生後1日目より7日間母子分離ストレスを与えたマウスを生後7日齢、14日齢の各発達ステージで脳、脾臓、肝臓を採取した。形態学的解析において、生後7日齢でミクログリアは脳室内からアメボイド様が浸潤するが、F4/80陽性細胞を持った細胞がコントロール群では確認された。しかし、母子分離群はF4/80陰性細胞のミクログリアであった。F4/80陽性のマクロファージは卵黄嚢由来と考えられるが陰性細胞は骨髄由来と示唆され、ストレスによってミクログリアの由来の違いがあることが示唆された。これらのミクログリアはOX42陰性細胞であるため活性化型ミクログリアではないと推察された。ウェスタンブロッティング法によって各組織のマクロファージ系タンパク質の発現量を測定した結果、生後7日齢の脳でミクログリア特異的タンパク質Iba1,

CD11b/cの発現は母子分離群で有意に低下していた。一方脾臓では両群ともに差がなかった。したがって、脳内免疫システムは他免疫器官のとは別に独自で働いていることを示唆した。一般的に行われているセルストレイナーによる物理的な分離方法では脳組織では血球マーカーであるCD45陽性群においてほとんどが均一なCD11bの発現を示す細胞であった。一方、免疫組織染色の結果からF4/80の染色性が均一ではないことが示された。ミクログリアの表面抗原の染色性が均一ではなく、ヘテロな集団であることが示唆された。そこで、本研究ではFACS(フルオサイトメトリー法)を用いてミクログリア細胞の細胞特性を解析した。その結果、より純粋なミクログリア細胞を単離することに成功し、更に、単離されたミクログリア細胞はFACS解析からその性質が3種類の集合に分けることが可能になった。発達時期によってその細胞集団の割合が変化することからミクログリア細胞の性質や機能が生後の発達や環境で変化することが示唆された。生後1日目より7日間母子分離ストレスを与え、マウスの生後7日齢の脳、脾臓等を採取した。生後7日齢で母子分離群のミクログリア細胞はコントロール群とは異なり、F4/80陰性細胞のミクログリアであった。ウェスタンブロッティング法によってミクログリア特異的タンパク質の発現量は母子分離群で有意に低下していた。FACS法を用いてミクログリア細胞の細胞特性を解析した結果、純粋なミクログリア細胞を単離した。単離されたミクログリア細胞はFACS解析からその性質が3種類の亜集団に分離することがわかった。以上の結果から幼若期にストレスを与えられるとミクログリアの由来や質が違うことが示唆された。上記研究実績より、母子分離モデル動物の作製として短時間の引き離し時間で十分結果が得られる事がわかった。また分離条件(いつから子供を話すか)によって標的の分子の発現に変化がある事も見い出された。これは生後の脳発達や免疫機能にも影響がある事が示唆できた。したがって来年度以降はターゲットとなる分子の発達段階による追跡を行う必要がある。FACS法によって骨髄のマクロファージ、血球細胞の特性とミクログリアの特性の違いを調べる。脳は結合組織が高いので簡単に分離することが困難であるので酵素処理などを検討する。またミクログリアを単離培養し、ストレス負荷を培養系で行う実験系を組んでミクログリアが放出するサイトカイン量をコントロール群とストレス負荷群で測定し、体内の免疫細胞とミクログリアの感受性の違いがあるのかどうか検討をする。神経科学モデル動物のサンプリング時期をそれぞれ各発達段階で採取検討する。脳、脾臓、胸腺の発達の進み具合は個々によって違う事が本年度の解析で分かったため、共通の発達のマーカー分子やサイトカインなどを各発達段階で採取検討する。また、FACSサンプルの調整方法を検討することが必要である。細胞の同定にはFACS解析による細胞種の同定が必要である。これは免疫細胞の分化の過程は複雑で複数のマーカーより細胞種の同定が可能となるためである。サンプリング時に固定するなどの方法にて共同研究者と連携し細胞種の同定に勤める。予定金額より物品費が安く購入できたため239円残額が生じた。
オミクスによるラフィド藻シャトネラ細胞の活力評価と赤潮被害軽減への応用

本課題では、有害赤潮藻シャットネラの増殖能力を予測可能な分子指標の探索を行うとともに、増殖能力評価法の開発を行った。まず、シャットネラ室内培養株の増殖速度と光合成活性(Fv/Fm比)が正の相関を示し、過酸化水素消去酵素(2-cysteine peroxiredoxin,2-Cys Prx)等数種タンパク質も増殖および光合成活性と同調して変動していることを明らかにした。さらに、現場シャットネラ細胞においても増殖速度(採取日から翌日の増殖速度)とFv/Fm比に正の相関があることを確認し、室内実験と同様に2-Cys Prxも増殖速度と発現量が正の相関を示したため、現場細胞においても本酵素がシャットネラの増殖に重要であることが強く示唆された。そこで、シャットネラ2-Cys Prxの全アミノ酸配列を解析するために、mRNAの配列を解析した結果、585bpのopen reading frameを含む1011bpの塩基配列を決定し、195残基のアミノ酸配列が推定した。アミノ酸配列のN末端1残基目のMetから49および170残基目に過酸化水素の還元に関与すると予想されるCysが1残基ずつ存在し、周辺配列も種間で高度に保存されていた。さらに、過酸化水素暴露による誘導性をリアルタイムPCRにより調べた結果、過酸化水素の濃度と本酵素の遺伝子発現に負の有意な相関が観察されたため、本酵素は過酸化水素により一時的に誘導され、その消去に関与し、それらを通じて光合成活性および増殖能力の維持に関与していることが示唆された。以上の結果から、Fv/Fm比によるシャットネラの増殖能力判定が有効なこと、さらに2-Cys Prxがシャットネラの増殖能力評価指標として有用であることが示唆された。さらに同定スポット数を増やして増殖衰退に関与する分子機構の解明と指標化を進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度(H24年度)は、(実験1)先行研究のプロテオーム解析により明らかにしているperoxidoredoxin(2-Cis Prx)のN末端アミノ酸配列情報(20残基)から縮重プライマーを作製し、Rapid Amplification of cDNA End (RACE)法によるmRNAの全塩基配列の解析を行う。得られた塩基配列からアミノ酸配列を決定し、機能の解析を行う。(実験2)次世代シーケンサーにより約500bp×10万リードのEST解析による主要発現遺伝子の解析を行い、タンパク質レベルおよび遺伝子レベルにおける増殖段階特異的に発現変動する分子種およびその配列を解析するという計画で研究を実施した。(実験1)については、シャトネラの過酸化水素消去酵素である2-Cis Prxの塩基配列およびアミノ酸配列解析に成功し、立体構造予測を行った。さらに過酸化水素暴露による発現誘導解析を行った。その結果、シャトネラの2-Cis Prxは他の藻類・植物の同種タンパク質と有意な相同性を有しており、また過酸化水素の暴露によりその遺伝子発現が誘導されたため、光合成の副産物として発生する有毒な過酸化水素の積極的な消去に関与していることが予想されたため、細胞活力の指標としての可能性が示唆された。得られた成果はH24年度3月に開催された日本水産学会春季大会にて報告を行った。(実験2)については次世代シーケンサー用のサンプル調整は行ったが、機器の不具合等の問題で、H24年度中は実施できなかった。交付申請書におけるH25年度研究実施計画に基づき、まず「2-Cys Prxまたはoxygen evolving enhancer等の発現量変動を指標とした、現場赤潮細胞を用いた増殖能力推定に関する実証試験」を行った。本年度、有明海においてシャトネラ赤潮が発生したが、シャトネラの捕食者による影響と推察される急激な細胞数の減少が観察され、調査予定日に十分な細胞数の海水が入手できなかった。そのためH24年度分の有明海赤潮サンプルについて、現場シャトネラの増殖速度、光合成活性とタンパク質発現量との関係を解析した。その結果、2-Cys Prx(前年度までのperoxiredoxinと同タンパク質)の発現量と増殖速度または光合成活性に正の相関が観察されたが、室内実験で増殖速度と有意な関係性が検出されたoxygen evolving enhancerについては現在細胞の増殖速度または光合成活性との間には有意な関係性は検出されなかった。以上の結果から、タンパク質レベルにおいて、2-Cys Prxの発現量がシャトネラの増殖速度評価指標として有望であることが示唆された。また同時に、光合成活性(Fv/Fm比)と増殖速度との間にも有意な正の相関が観察されたため、光合成活性の測定も増殖能力評価指標として、有用であると考えられた。得られた成果についてはH25年度3月に開催された日本水産学会春季大会にて報告を行った。また、もう一つの計画「プロテオーム解析、および次世代シーケンサーによる主要発現遺伝子の解析と他の有用分子指標の網羅的探索」については、現在準備中であり、H26年度の研究期間中に実施する予定である。

さらに、現場シャットネラ細胞においても増殖速度(採取日から翌日の増殖速度)とFv/Fm比に正の相関があることを確認し、室内実験と同様に2-Cys Prxも増殖速度と発現量が正の相関を示したため、現場細胞においても本酵素がシャットネラの増殖に重要であることが強く示唆された。そこで、シャットネラ2-Cys Prxの全アミノ酸配列を解析するために、mRNAの配列を解析した結果、585bpのopen reading frameを含む1011bpの塩基配列を決定し、195残基のアミノ酸配列が推定した。アミノ酸配列のN末端1残基目のMetから49および170残基目に過酸化水素の還元に関与すると予想されるCysが1残基ずつ存在し、周辺配列も種間で高度に保存されていた。さらに、過酸化水素暴露による誘導性をリアルタイムPCRにより調べた結果、過酸化水素の濃度と本酵素の遺伝子発現に負の有意な相関が観察されたため、本酵素は過酸化水素により一時的に誘導され、その消去に関与し、それらを通じて光合成活性および増殖能力の維持に関与していることが示唆された。以上の結果から、Fv/Fm比によるシャットネラの増殖能力判定が有効なこと、さらに2-Cys Prxがシャットネラの増殖能力評価指標として有用であることが示唆された。さらに同定スポット数を増やして増殖衰退に関与する分子機構の解明と指標化を進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。実験1については半年間の間に、当初予定の遺伝子解析だけでなく、H25年度に予定していた過酸化水素暴露による2-Cis Prxの発現誘導解析を行い、2-Cis Prxが過酸化水素により誘導されることが明らかになったため、本酵素の機能として光合成の副産物であり細胞に有害な過酸化水素の積極的な消去に関与していることが強く示唆された。実験2については次世代シーケンサーによる解析実施できなかったが、進捗の大きな遅れにはならないと考えている。以上、おおむね順調に進展していると判断した。これまでに2-Cys Prxの一次構造決定、過酸化水素による遺伝子レベルでの誘導性、室内・現場赤潮細胞を用いたタンパク質量発現解析等、本酵素の分子基盤の確立および赤潮消長予察の現場実証試験が当初の予定通り実施されてきた。また他の課題についてもH26年度の期間中に実施する予定であり、おおむね順調に進展していると判断した。H25年度は、2-Cis Prxの過酸化水素による誘導性をタンパク質レベルで解析する予定である。また、現場海域のシャトネラ細胞を採取して、細胞の増殖能力と光合成活性(Fv/Fm比:光化学系IIの活性指標)、さらに2-Cis Prxおよび他の光合成関連分子の遺伝子・タンパク質発現等を解析していく。H24年度に予定していた次世代シーケンサーによる発現遺伝子の解析は他機関において同様の研究が実施されているため、そのデータの公開の有無により実施の判断を行う予定である。現時点では、課題は概ね順調に進展しており、H26年度においても計画内容の大きな変更なく実施していく予定である。
歯周ポケット形成における細菌内毒素とタンパク分解酵素の複合作用

本研究の目的は,細菌内毒素(LPS)とタンパク分解酵素(酵素)を単独あるいは複合投与して,歯周ポケット形成における細菌由来物質の複合効果を明らかにすることである。平成14年度は,ポケット形成に最適なLPSと酵素の濃度を単独投与で検討し,それぞれ25μg/μl,2.25unit/μlという条件を得た。また,その条件で複合投与を行い,ヘマトキシリン・エオジン染色標本上で評価した。付着上皮の根尖側移動と骨吸収は複合投与群で最大となり,次いでLPS群であった。好中球数と血管数は複合群で最も多く,その次に酵素群であった。これらから,ポケット形成におけるLPSと酵素の相乗作用が示唆された。またポケット形成の初期と思われる付着上皮の亀裂像は複合群の80%の標本で観察された。平成15年度は複合投与群,LPS群,酵素群,対照群の4群に対して,細胞増殖の点から検討を行った。平成14年度に決定した濃度のLPSと酵素を2,4,8週間単独または複合投与した。屠殺後,固定,脱灰,パラフィン包埋し,頬舌的な切片を作製した。切片をproliferating cell nuclear antigen (PCNA)モノクローナル抗体で染色し,4群の比較を組織定量分析により比較した。PCNA陽性付着上皮基底細胞密度は複合投与群,LPS群,酵素群のいずれも2週目から増加し,複合投与群はLPS群と酵素群よりも高い傾向にあった。付着上皮下のPCNA陽性線維芽細胞密度は4群とも変化はなかった。これらの結果から,LPSと酵素のいずれもが接合上皮の増殖を亢進させることが明らかになった。また,歯周ポケットが形成するときには,細菌由来のLPSやタンパク分解酵素が歯肉溝に入り,正常な状態のときよりも接合上皮の増殖活性が上皮下結合組織の線維芽細胞の増殖活性を上回ることが示唆された。本研究の結論により,結合組織の増殖を促す方法を開発するという,効果的な歯周病予防・治療の方向性が示すことができた。今年度は,ポケット形成に最適なLPSと酵素の濃度を単独投与で決定し,その条件で複合投与を行い,ヘマトキシリン・エオジン染色標本上で検討した。LPS単独投与:2.5,5,10μg/μlのE. coliLPS溶液0.9μlを,ラット上顎第一大臼歯の口蓋側歯肉溝に1日1回投与した。2週間後,屠殺し,固定,脱灰,パラフィン包埋後,頬舌方向の連続切片を作成し,染色を行った。10μg/μlにおいて付着上皮中の好中球が最も多かったが,歯周ポケット形成はなかったことから,ほぼ飽和の25μg/μlをLPS濃度とした。酵素単独投与:0.025,0.25,2.25unit/μlのS. griseus由来酵素溶液1.5μlを投与した。2週間後,標本を計測した結果,2.25unit/μlにおいて結合組織中の好中球が最も多かったが,ポケット形成はなかった。これらより,酵素がほぼ飽和となる2.25unit/μlを濃度とした。複合投与:ラットを複合群(LPSと酵素),LPS群(LPSのみ),酵素群(酵素のみ),対照群(溶媒)の4群に分けた。決定した濃度のLPSと酵素を2,4,8週間投与後,標本を計測した。付着上皮の根尖側移動と骨吸収は複合群で最大,次いでLPS群であった。好中球数と血管数は複合群で最多,その次に酵素群であった。平成15年度は上記4群に対して,細胞増殖の点から検討を行う。そしてポケット形成時の上皮細胞と線維芽細胞の増殖活性に及ぼす,LPSと酵素の複合効果を明らかにする。

切片をproliferating cell nuclear antigen (PCNA)モノクローナル抗体で染色し,4群の比較を組織定量分析により比較した。PCNA陽性付着上皮基底細胞密度は複合投与群,LPS群,酵素群のいずれも2週目から増加し,複合投与群はLPS群と酵素群よりも高い傾向にあった。付着上皮下のPCNA陽性線維芽細胞密度は4群とも変化はなかった。これらの結果から,LPSと酵素のいずれもが接合上皮の増殖を亢進させることが明らかになった。また,歯周ポケットが形成するときには,細菌由来のLPSやタンパク分解酵素が歯肉溝に入り,正常な状態のときよりも接合上皮の増殖活性が上皮下結合組織の線維芽細胞の増殖活性を上回ることが示唆された。本研究の結論により,結合組織の増殖を促す方法を開発するという,効果的な歯周病予防・治療の方向性が示すことができた。