hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人のグルクロン酸転移酵素(UGT1A9)の多型と薬剤副作用の研究

研究目的UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT1A9)の日本人での多型の存在の有無を検討し、薬物代謝における多型の役割を検討した。研究の成果1.100名の健常ボランティァでUGT1A9の遺伝子を調べたところ、遺伝子頻度0.005のD256N変異が見いだされた。この変異は日本人のガン患者で報告されているものと同じであった。2.麻酔薬プロポホールはUGT1A9によってのみ代謝され、副作用が知られている。変異酵素ではプロポフォールのKmとVmaxが正常酵素の40%および8%に低下していた。この結果から変異のホモ接合体では、プロポフォール投与により副作用を示す可能性が示唆された。3.免疫抑制剤マイコフェノリック酸は主にUGT1A9によって代謝される。マイコフェノリック酸にたいするVmaxはD256Nによって正常の10%に低下した。4.UGT1遺伝子の共通エキソンに、日本人で遺伝子頻度0.006で存在する変異Y483D変異がUGT1A9に与える影響をプロポフォールとマイコフェノリック酸を基質として検討した。Y483Dは両基質の抱合活性を正常の約3分の1に低下させ、D256NはY483DよりもUGT1A9のこれらの活性をより強く低下させることが分かった研究目的UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT1A9)の日本人での多型の存在の有無を検討し、薬物代謝における多型の役割を検討した。Y483Dは両基質の抱合活性を正常の約3分の1に低下させ、D256NはY483DよりもUGT1A9のこれらの活性をより強く低下させることが分かったグルクロン酸転移酵素遺伝子(UGT1)は、スプライシングの違いにより1つの遺伝子から複数の基質特異性の異なるアイソフォームを発現する。この遺伝子は人種により変異の種類や頻度が大きく異なる。本酵素はビリルビン、ホルモンなど内在性物質だけでなく、臨床上重要な多数の薬剤をグルクロン酸抱合して、解毒排泄する。本研究の目的は、日本人におけるグルクロン酸転移酵素の遺伝子多型と変異の種類・頻度を明らかにし、変異酵素と薬物副作用・発ガンとの関連を明らかにすることである。本年度の研究では(1)日本人のUGTIA9遺伝子多型と変異の種類・頻度を明らかにする。(2)グルクロン酸転移酵素遺伝子異常Y486Dは日本人固有の変異でUGTIの共通エキソン上に存在するため、UGTIから発現するすべてのアイソフオームの活性を欠損もしくは著しく低下させる。Acetaminophenについて、UGTIA9でY486Dが酵素活性にどのような影響をあたえるか検討するという2つの課題について明らかにする計画であった。(1)については100名の健常者でUGTIA9遺伝子の解析を行った。その結果D256N変異のヘテロ接合体が見いだされた。(2)に関してはAcetaminophenの代わりにpropofolを用いて活性の測定を行った。詳細については、現在、論文を投稿中である。研究目的UDP-グルクロン酸転移酵素(UGTIA9)の日本人での多型の存在の有無を検討し,薬物代謝における多型の役割を検討した。研究の成果(1)100名の健常ボランティアでUGT1A9の遺伝子を調べたところ,遺伝子頻度0.005のD256N変異が見いだされた。(2)麻酔薬プロポホールはUGT1A9によってのみ代謝され,副作用が知られている。この結果から変異のホモ接合体では,プロポフォール投与により副作用を示す可能性が示唆された。(3)免疫抑制剤マイコフェノリック酸は主にUGT1A9によって代謝される。(4)UGT1遺伝子の共通エキソンに,日本人で遺伝子頻度0.006で存在する変異Y483D変異がUGT1A9に与える影響をプロポフォールとマイコフェノリック酸を基質として検討した。Y483Dは両基質の抱合活性を正常の約3分の1に低下させ、D256NはY483DよりもUGT1A9のこれらの活性をより強く低下させることが分かった
前臨床試験を目指した病理学的に正確な脳腫瘍マウスモデルの開発

悪性脳腫瘍の治療成績は悪く、新たな治療法の開発には正確な動物モデルの使用が必要である。RCAS/tv-aシステムと呼ばれるマウスモデルは、RCASウイルスを用いて癌遺伝子をtv-aマウスの脳細胞へ導入し、マウスの脳から直接腫瘍を発生させることができ、腫瘍の病理組織や微小環境を正確に再現できる特徴がある。本研究により、このマウスモデルを日本に初めて導入し、種々の脳腫瘍モデルの作成と薬物治療効果の確認、脳腫瘍発生機構の解明を行うことができ、今後のさらなる脳腫瘍の病態解明と治療開発へ繋がる結果となった。遺伝子改変マウス(Gtv-a、Gtv-ap53-/-)と癌遺伝子を組込んだレトロウイルスベクター(RCAS-c-Myc、RCAS-PDGFB)が完成し、RCAS/tv-aシステムによりマウスの脳に髄芽腫と悪性神経膠腫を発生させることができるようになった。発生した脳腫瘍やマウス脳細胞の初代培養細胞から、培養実験系にて遺伝子導入の確認と蛋白発現の確認を行った。また、H&E染色による組織解析と免疫染色による蛋白発現解析も行い、腫瘍の特性を調べた。髄芽腫のマウスモデルについては、3種類のc-Myc蛋白のアイソフォームのうち、どの蛋白が腫瘍化に関わっているのかを培養実験系とマウスを用いた腫瘍発生の実験系にて解明し、ヒト髄芽腫組織での免疫染色結果も加えて発表した。また、RFPやluciferaseを組み込んだRCAS-PDGFB改変ベクターを作成し、PDGFBが遺伝子導入された腫瘍細胞が赤色蛍光またはluciferinにより発光するマウスを開発した。この新たなマウスモデルは、腫瘍の発光により腫瘍細胞を正確に同定でき、生体イメージング機器の使用により、マウスが生きたまま脳腫瘍を観察できるようになった。薬剤投与実験も開始し、脳腫瘍治療薬のテモゾロミドを腹腔内投与したマウスの脳腫瘍変化を、生体イメージングによって経時的に測定した。これらの研究成果とマウスモデル作成につき、現在論文発表を準備している。既にアメリカから輸入してあった遺伝子改変マウス(Gtv-aマウス)にp53ノックアウトマウスを交配し、Gtv-ap53-/-マウスを作成した。次に、癌遺伝子を組込んだレトロウイルスベクター(RCAS-c-Myc、RCAS-PDGFB)をウイルス産生細胞(ニワトリ線維芽細胞:DF-1)に導入した。RCAS-PDGFBを産生するDF-1細胞をGtv-ap53-/-マウスの脳に打ち込むと、90%以上の確立で悪性神経膠腫を発生させることができた。RCAS-c-Myc産生のDF-1をGtv-ap53-/-マウスの小脳に打つと30%程の確立で髄芽腫が発生した。これらの腫瘍ホルマリン固定し、パラフィン埋包して、H&E染色にて観察した。これらの結果の大部分は、海外で行われた実験結果の再現であるが、c-Mycを用いた髄芽腫は研究者のオリジナルの腫瘍であり、日本国内ではRCAS/tv-aシステムを用いた最初の脳腫瘍モデルであるため意義深い。tv-a受容体を脳細胞に発現した遺伝子改変マウス(Gtv-a、Gtv-ap53-/-)と、癌遺伝子を組込んだレトロウイルスベクター(RCAS-c-Myc、RCAS-PDGFB等)を用いて(RCAS/tv-aシステム)、マウスの脳に髄芽腫と悪性神経膠腫を発生させることができるようになった。発生した脳腫瘍やマウス脳細胞の初代培養細胞を用いて、ガングリオシドGD3が脳腫瘍発生に関わることを解明した(論文投稿中)。また、RFPやGFP、luciferaseを付加したRCASベクターを作成することで、癌遺伝子を遺伝子導入した腫瘍細胞が標識可能となり、腫瘍細胞を蛍光または発光イメージングにてモニターできるようになった(論文作成中)。一方で、新たに作成した3種類のc-Myc蛋白のアイソフォームの塩基配列が間違っていたため、新たにコンストラクトを作成し直した。薬剤投与実験については、生体イメージング可能な脳腫瘍マウスモデルを用い、テモゾロミド他数種類の抗癌薬を試験的に投与し、腫瘍の発光減弱を確認した。最終的な研究目標である脳腫瘍マウスモデルを用いた薬剤投与試験に向け、マウスモデルと腫瘍のモニタリングシステムが整いつつある。本脳腫瘍マウスモデルは、国内では研究者がほぼ独占的に使用・開発しているものであり、脳腫瘍発生機構の解明から薬剤効果の判定まで幅広い用途に応用できるシステムの構築に寄与できている。癌遺伝子を組込んだレトロウイルスベクター(RCAS)と、RCAS受容体(tv-a)を脳細胞に発現した遺伝子改変マウス(tv-aマウス)を用いて、マウスの脳に神経膠腫と髄芽腫を発生させた。tv-aマウスは、GFAPプロモーター調節下にtv-aを発現するGtv-aマウスを使用し、p53欠損マウスと交配することにより、腫瘍の発生率と悪性度を高めた。癌遺伝子には神経膠腫用にPDGFB、髄芽腫用にSHHとMYCを用いた。癌遺伝子にRFPやGFP、luciferase等のレポーターを付加したRCASベクターを作成することで、遺伝子導入した腫瘍細胞が標識可能となり、腫瘍細胞を蛍光または発光イメージングにてモニターできるようになった。また、マウスの正常脳細胞から培養細胞株を作成し、RCASにて腫瘍化させることで、脳腫瘍発生機構の解明を行った。

これらの実験系から、MYCアイソフォームやガングリオシドGD3の脳腫瘍発生への関わりを解明し、発表した。脳腫瘍に対する薬剤投与試験は、脳腫瘍細胞株や生体イメージング可能な脳腫瘍マウスモデルを用いて、テモゾロミド等の数種類の抗癌薬で腫瘍縮小効果を確認した。薬剤の効果について、現在結果の解析と追加実験中である。RCAS/tv-aシステムによる脳腫瘍マウスモデルは、脳腫瘍発生機構の解明から薬剤効果の判定まで幅広い用途に応用でき、研究代表者が国内では優先的に使用・開発を行っている。本研究により、目的としたRCAS/tv-aシステムの構築と使用の成果がほぼ達成され、さらなる脳腫瘍の病態解明と治療開発へ繋がる結果となった。悪性脳腫瘍の治療成績は悪く、新たな治療法の開発には正確な動物モデルの使用が必要である。RCAS/tv-aシステムと呼ばれるマウスモデルは、RCASウイルスを用いて癌遺伝子をtv-aマウスの脳細胞へ導入し、マウスの脳から直接腫瘍を発生させることができ、腫瘍の病理組織や微小環境を正確に再現できる特徴がある。本研究により、このマウスモデルを日本に初めて導入し、種々の脳腫瘍モデルの作成と薬物治療効果の確認、脳腫瘍発生機構の解明を行うことができ、今後のさらなる脳腫瘍の病態解明と治療開発へ繋がる結果となった。作成したc-Myc蛋白のアイソフォームの塩基配列が間違っていることが判明し、遺伝子導入ベクターを作成し直した。また、研究者の異動に伴い、研究の中断を余儀なくされたため、研究にやや遅れが生じた。研究者は2015年1月に名古屋大学医学部から東京大学医科学研究所へ異動したが、これに伴い、遺伝子改変マウスを用いた実験の申請(組換えDNA実験機関承認、大臣確認)を再提出する必要があり、実験の許可が得られるまで数ヶ月間の研究中断を要する見込みである。脳腫瘍今後の研究の推進方策:異動先の東京大学医科学研究所で実験を継続できるよう、機関承認や大臣確認の申請作業を進め、新たな研究室での実験環境を整備する。また、3種類のc-Myc蛋白のアイソフォームを組込んだRCASベクターが完成したので、研究体制が整い次第、c-Myc導入による腫瘍発生機構の違いを調べ直す。さらに、種々の脳腫瘍に対する有効な薬剤を見つけるため、培養細胞やマウスを用いて薬剤のスクリーニングを行う。新たなマウスモデルを開発するため、新たな癌遺伝子の導入や、新たな遺伝子改変マウスの作成にも取り組む。必要な遺伝子改変マウスとレトロウイルスベクターの準備が終わり、生体イメージング用に改変したベクターも開発できたため。前年度までに科学研究費を用いて行ったマウス脳腫瘍モデルの研究により、必要なマウスやベクターの準備がある程度整っていた。また、研究者は脳腫瘍作成のための手技に習熟しており、実験をサポートしてくれる人材と環境にも恵まれていたため、RCAS/tv-aシステムによる脳腫瘍の作成をスムーズに行うことができた。最終的な年度末の物品購入額が予算と合わずに1円余った。今後の研究の推進方策: PDGFB導入により作成した膠芽腫と、c-Myc導入により作成した髄芽腫に対し、有効な薬剤を見つけるため、培養細胞やマウスを用いて薬剤のスクリーニングを行う。また、新たなマウスモデルを開発するため、新たな癌遺伝子の導入や、新たな遺伝子改変マウスの作成にも着手する。
アダプティブアレーアンテナに基づく空間・時間領域の通信理論に関する研究

アダプティブアレーアンテナの実用化が期待される移動通信、衛星通信などのシステムで解決すべき問題ならびに、国内外の研究機関が行なっているアダプティブアレーアンテナの構成法、制御法、解析法などに関する研究動向を調査し、その対策技術を検討した。具体的には、1.理論解析:(1)通信路の空間伝搬特性も考慮した空間・時間領域のモデル化:アダプティブアレーアンテナを用いることを前提とした場合、従来の時間(周波数)領域での通信路モデルでは不十分であり、空間・時間領域での通信路モデルを導出した。(2)アダプティブアレーアンテナを含む通信路に関する通信路容量の解析:情報理論の観点から、アダプティブアレーアンテナを含む通信路の空間伝搬特性を考慮した場合の通信路容量を導出し、従来の理論との比較検討を行なった。(3)アダプティブアレーアンテナの空間・時間信号処理能力の解析:アレーアンテナの等価ディジタルフィルタ表現などを用いて、アダプティブアレーアンテナの空間フィルタおよび時間フィルタとしての処理能力とその限界を解析した。(4)アダプティブアレーアンテナを用いた空間・時間領域のマッチドフィルタ、最適受信機の導出:通信路における種々の外乱を考慮し、アダプティブアレーアンテナの空間・時間信号処理能力を考慮したマッチドフィルタなどの検波法や理論的な最適受信機を導出した。2.方式検討:(1)アダプティブアレーアンテナを用いた空間・時間領域の通信路符号化の考案:情報理論の観点から、アダプティブアレーアンテナを空間領域におけるアナログ符号器と見なした場合、通信路誤りを低減する符号化法と復号法を考案した。(2)空間・時間領域の適応フィルタとしてのアダプティブアレーアンテナの適応制御アルゴリズムの考案:アレーアンテナの空間信号サンプリング機構に基づく信号の到来方向推定能力を利用し、通信路変動に対して高速かつ安定に適応できるアルゴリズムを考案した。(3)アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化による空間・時間領域における等化方式の考案:アレーアンテナにディジタルフィルタを組み合わせることにより、空間・時間領域の信号処理能力を改善し、従来の波形等化を空間領域も含む等化理論へ拡張し、最適等化方式を考案した。(4)アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化による空間・時間フィルタリングのための適応アルゴリズムの考案:アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化に伴うアンテナ重み係数とフィルタ係数の更新に必要な評価基準を導出し、安定かつ高速な収束性を実現する適応アルゴリズムを考案した。(5)移動通信におけるマルチパス・フェージングの抑圧とダイバーシティ合成への応用:上述の理論解析や各種の考案方式を移動通信、衛星通信、放送におけるフェージング対策に応用する場合の各種パラメータの最適化を検討し、実用技術として確立した。(6)スペクトル拡散多元接続(CDMA)通信における他局間干渉の除去への応用:陸上移動通信、無線LANなどに採用されているスペクトル拡散通信システムにおけるCDMAの他局間干渉を抑圧・除去するために、上述の各種方式の応用を検討した。3.実験的解析:考案する各種方式の性能評価と理論的解析の確認のために、計算機上に時間(周波数)領域ばかりでなく、空間(周波数)領域の特性も表現できる通信路シミュレータをワークステーション上で構築し、アダプティブアレーアンテナを含む空間・時間領域の信号処理を記述できる実験系を構築・解析を行なった。4.総合評価と研究発表:上述の理論解析、実験的解析に基づき、各種提案方式の特長と問題点を明確にし、以後の研究課題として整理した。また、本研究を通じて得られた成果をまとめ、学会において報告した。(3)アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化による空間・時間領域における等化方式の考案:

アレーアンテナにディジタルフィルタを組み合わせることにより、空間・時間領域の信号処理能力を改善し、従来の波形等化を空間領域も含む等化理論へ拡張し、最適等化方式を考案した。(4)アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化による空間・時間フィルタリングのための適応アルゴリズムの考案:アレーアンテナとディジタルフィルタの一体化に伴うアンテナ重み係数とフィルタ係数の更新に必要な評価基準を導出し、安定かつ高速な収束性を実現する適応アルゴリズムを考案した。(5)移動通信におけるマルチパス・フェージングの抑圧とダイバーシティ合成への応用:上述の理論解析や各種の考案方式を移動通信、衛星通信、放送におけるフェージング対策に応用する場合の各種パラメータの最適化を検討し、実用技術として確立した。(6)スペクトル拡散多元接続(CDMA)通信における他局間干渉の除去への応用:陸上移動通信、無線LANなどに採用されているスペクトル拡散通信システムにおけるCDMAの他局間干渉を抑圧・除去するために、上述の各種方式の応用を検討した。3.実験的解析:考案する各種方式の性能評価と理論的解析の確認のために、計算機上に時間(周波数)領域ばかりでなく、空間(周波数)領域の特性も表現できる通信路シミュレータをワークステーション上で構築し、アダプティブアレーアンテナを含む空間・時間領域の信号処理を記述できる実験系を構築・解析を行なった。4.総合評価と研究発表:上述の理論解析、実験的解析に基づき、各種提案方式の特長と問題点を明確にし、以後の研究課題として整理した。また、本研究を通じて得られた成果をまとめ、学会において報告した。
放射線照射後のレドックスステータスの変化は脳腫瘍幹細胞の放射線抵抗性に寄与するか

研究当初、放射線被ばく後のレドックス状態の変化に着目したが、本研究で用いた実験系ではレドックスの変化は認められなかった。また、放射線照射後に投与することで細胞の生存率をレスキューできる抗酸化物質を見出すには至らなかった。一方で、脳腫瘍幹細胞様細胞が特殊なエネルギー代謝機構を有しており、これが放射線抵抗性に関与することが示唆された。放射線が短時間に直接的、またはラジカル等を介して間接的に、生命にとって致死的なDNA二重鎖切断を引き起こすことは良く知られている。一方でこれとは別に、放射線照射数時間後から起こるミトコンドリアからの活性酸素種(ROS)の産生や細胞内抗酸化物質の誘導が細胞の生存率に関与する可能性が指摘されている。がん幹細胞においても低いROS産生や抗酸化能の亢進が報告されているが、放射線照射後に細胞内でROS産生量や抗酸化能がどのように変化し、どのような生物学的意義があるかはあまり分かっていない。本研究では放射線照射後の脳腫瘍幹細胞にどのようなredox statusの変化が起きるか明らかにし、放射線抵抗性への寄与を解析する。本年度は本研究に利用可能な放射線抵抗性脳腫瘍幹細胞モデルの作成を行った。放射線抵抗性を持つ、実験に利用可能な細胞数まで安定的に増殖させることができる脳腫瘍幹細胞モデルをA172細胞およびC6細胞から樹立した。また、細胞のレドックスバランスと放射線抵抗性の関係を明らかにするため、薬剤の投与により細胞のレドックスバランスを変化させた際の放射線応答を解析した。また、細胞の抗酸化活性の長時間解析を可能とするため、ESR装置を改造した。1)以前に樹立したものを含めると、4種類の放射線抵抗性脳腫瘍幹細胞様細胞株とそのコントロール株を樹立しており、本研究に利用できる。2)細胞のレドックスバランスと放射線抵抗性の関係を明らかにできたため、論文投稿準備中である。3) ESR装置改造により、再現性よく、細胞の抗酸化活性を評価できるようになった。まず、これまでに樹立したがん幹細胞様ONSーF8の系を用いて、がん幹細胞様細胞と親株(ONSー76)のredox statusを評価したところ、ONSーF8ではROSの産生が低下していた。しかし、グルタチオンの量は変わらなかった。OCRの結果からも、ONSーF8ではミトコンドリア呼吸が抑制されていることが示唆された。一方で、ミトコンドリア賦活剤として知られているDCAを投与すると、OCRの上昇と活性酸素が上昇し、それに伴い、幹細胞性の低下と放射線感受性の増加が観察された。しかしながら、これは一般的に言われているような、ミトコンドリア呼吸の賦活化によるものではなく、複合的な代謝経路のalterationによるものであった。また、Tempol法により還元能を解析したが、ONSー76とONSーF8を比較するとF8の方が、Tempol還元速度が低かった。放射線照射後に測定したが、ONSー76とONSーF8共に、非照射時とほとんど変わらなかった。また、ONSー76に放射線照射後に抗酸化物質(6種類)を投与して生存率が変化するか解析したが、少なくとも、毒性が全く出ないレベルにおいては、生存率の増加も減少も認められなかった。一部の先行研究では、生存率が増加するという報告があったが、本研究で使った細胞では再現性が取れなかったということになる。これらの結果を総合的に判断すると、ミトコンドリア呼吸を始めとしたエネルギー代謝のあり方はstemnessや放射線抵抗性に非常に重要である一方、放射線照射後のredox statusは少なくとも我々が使用した細胞に関しては放射線抵抗性に関して有意義な影響を与えるということはなかった。H28年度はこれまでに樹立した細胞の放射線照射後のレドックスバランスをESR装置を用いて解析する。さらに、放射線照射後のレドックスバランスの変化を分子レベルで明らかにすることを目標とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経外科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
腎機能保護を目的とするアンギオテンシンII受容体拮抗薬のTh1抑制作用の解明

目的:アンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)のTh1作用抑制効果の有無を検討するため、ループス腎炎のモデルマウスであるMRL/lprマウスにARBを投与し、BUN、尿蛋白とリンパ球のTh1/Th2バランスの変化を検討した。背景:SLE患者ではTh1/2サイトカインバランスの変化が疾患の活動性に関与している。特に、Th1優位の状態となると疾患の活動性が増す傾向となる。一方、アンギオテンシンIIを実験動物に投与するとSLE患者と同様のバランスの変化が見られ、これにARBを投与するとTh1/Th2バランスが逆転し病態の改善が見られるとされる。方法:ループス腎炎のモデルマウスであるMRL/lprマウスに9週齢から28週齢にわたってolmesartan活性体(olmesartan medoxomil換算で10mg/kg/day)を連日飲水投与した(n=10)。コントロールとして、Vehicle投与群(n=16)、hydralazine投与群(n=10)をおいた。また、Balb/cマウスをWild typeのコントロールとした(n=10)。BUN、尿蛋白を測定した。各個体から脾臓細胞由来のT細胞を分離培養し、培養液上清からThサイトカインであるIFN-γ、IL-4を測定した。結果:尿タンパク、BUNについては明らかな改善傾向は見られなかった。サイトカインバランスについても、ARB投与でvehicle群に比べてTh1/Th2サイトカインのバランスに変化は見られなかった。しかし、生命表分析ではolmesartan投与群の生存率が明らかに改善していた。まとめ:ARBの腎保護効果については本実験では明らかでなかったが、生存率の明かな改善効果が見られた。ARBの他臓器への効果が生存率を改善したと考えられた。今回の検討では、ARBの一種であるolmesartanにSLE自然発症マウスにおけるTh1抑制効果は認められなかった。目的:ループス腎炎のモデルマウスであるMRL/lprマウスにARBを投与することによって、リンパ球のThバランスの変化を検討した。背景:ARBの投与は、脾臓におけるリンパ球増殖を促す。またヒトのループス腎炎(ClasslVV)において、Th1サイトカインの発現が上昇する。IFN-γは増殖性糸球体腎炎の組織新生に寄与している。またアンギオテンシンII投与モデルラットにおいて、同様のThバランスの不均衡とARB投与によるThバランスは逆転する。結果:11週齢におけるマウスの血圧を測定した。t検定の結果、olmesartan投与群はvehicle投与群に対して有意に低い血圧を示した(P<0.05)。またolmesartan投与群、telmisartan投与群は共に、hydralazine投与群に対して有意に低い血圧を示した(P<0.005)。BUNは14週齢で測定した。t検定の結果、olmesartan投与群はvehicle投与群(P<0.01)、telmisartan投与群(P<0.05)、hydralazine投与群(P<0.05)に対して有意に低いBUN値を示した。目的:アンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)のTh1作用抑制効果の有無を検討するため、ループス腎炎のモデルマウスであるMRL/lprマウスにARBを投与し、リンパ球のTh1/Th2バランスの変化を検討した。

一方、アンギオテンシンIIを実験動物に投与するとSLE患者と同様のバランスの変化が見られ、これにARBを投与するとTh1/Th2バランスが逆転し病態の改善が見られるとされる。方法:ループス腎炎のモデルマウスであるMRL/lprマウスに9週齢から28週齢にわたってolmesartan活性体(olmesartan medoxomil換算で10mg/kg/day)を連日飲水投与した(n=10)。コントロールとして、Vehicle投与群(n=16)、hydralazine投与群(n=10)をおいた。また、Balb/cマウスをWild typeのコントロールとした(n=10)。BUN、尿蛋白を測定した。各個体から脾臓細胞由来のT細胞を分離培養し、培養液上清からThサイトカインであるIFN-γ、IL-4を測定した。結果:尿タンパク、BUNについては明らかな改善傾向は見られなかった。サイトカインバランスについても、ARB投与でvehicle群に比べてTh1/Th2サイトカインのバランスに変化は見られなかった。しかし、生命表分析ではolmesartan投与群の生存率が明らかに改善していた。まとめ:ARBの腎保護効果については本実験では明らかでなかったが、生存率の明らかな改善効果が見られた。ARBの他臓器への効果が生存率を改善したと考えられた。今回の検討では、ARBの一種であるolmesartanにSLE自然発症マウスにおけるTh1抑制効果は認められなかった。
ATP結合蛋白質のラウエ法による動的結晶解析のための実験法の開発

生体反応の担い手である酵素のなかにはATPを補酵素として利用するものが数多くある。これらの酵素反応機構を理解するうえで時分割ラウエ法による動的結晶解析は有力な方法である。しかし、この方法を一般化するためには実験するうえで解決しなければならない問題が幾つかある。そこでX線結晶解析により既に2A分解能で立体構造を決定した大腸菌由来グルタチオン合成酵素を用いてラウエ実験法の開発を行った。まず動的構造解析するためには静的構造を精度良く解析して酵素の構造のみならず基質の結合位置および結合時の構造変化を明らかにしておく必要がある。本酵素の基質であるATPとγ-Glu-Cysを結合した複合体酵素の結晶を調製し、放射光を用いて収集した回折強度データを用いて立体構造を決定した。その構造と酵素自身の構造とを比較して基質の結合場所および結合時の構造変化を明らかにした。酵素中に含まれるフレキシブルループは、基質が結合しても固定された構造を採らないことが判った。次にラウエ実験に適する反応速度を実現するために変異酵素を調製した。ATP結合に関与すると思われるアルギニンをリジンに変えた変異酵素R210Kの反応速度は野生型酵素の1/500で、反応速度をもう一桁遅くするとラウエ実験に適することが判った。従って、低温で実験すればよいと思われる。ラウエ実験には高品質の結晶が必要である。本酵素の場合、種々の沈澱剤で結晶化したが、質は殆ど変わらなかった。むしろ、同じバッチの結晶でも質が異なり、一般に少し小さめの結晶の方が質が良いことが判った。flash photolysisによる反応トリガー法は、光の強さや結晶の大きさに依存するので条件を一定にするのが難しかった。更に追求する必要がある。以上の結果は一般的に適用できるものであると思われる。今後、Zn-プロテアーゼの反応機構解析にも適用してみる予定である。
バイオオーグメンテーション有効化に向けた環境浄化細菌の生残性向上に関する基盤確立

バイオオーグメンテーションの有効化に向けて、自然環境下でも生残性を持つ環境浄化細菌の育種を試みた。具体的には高いトリクロロエチレン(TCE)分解能を有する細菌への抗原生動物活性を有するビオラセインの産生能の付与を検討した。トランスポゾンを利用して、ビオラセイン合成遺伝子群を、対象の細菌の染色体上に導入した。ビオラセイン合成遺伝子群が導入された形質転換体は、ビオラセインの産生により、青紫色を呈した。得られた形質転換体を使って、鞭毛虫による捕食実験を行った結果、捕食回避能を有することが明らかとなった。また、TCE分解能を測定した結果、親株のTCE分解能は維持された。本研究では、原生動物による捕食の機構を明らかにすると共に、その回避法を確立し、浄化現場での有効活用を目的としている。本年度は、研究実施計画に挙げた、捕食を低減できる分解細菌の育種の一環として、ビオラセインを合成する遺伝子を取得し、大腸菌内での発現を試みた。ビオラセインは細菌によって生産される青紫色の天然色素で、抗原生動物活性を有することが知られている。2種類のChromobacterium violaceum、および2種類のJanthinobacterium lividum、それぞれから合計4種類のビオラセイン合成遺伝子群,vioABCDE,をPCR合成し、クローンを取得した。取得の際は,trpプロモーターによって発現するpBR322系のプラスミドpKNA94を利用した。目的のクローンがプラスミド中に組込まれた場合は、宿主である大腸菌の形質転換体のコロニーは生産されたビオラセインによって青紫色を呈した。4種類中で、非常に濃い青紫色を示した、C. violaceum JCM1249由来の遺伝子により形質転換した大腸菌を使って、6株の単離原生動物による捕食実験を行った。河川水から、鞭毛虫に分類される6株の細菌捕食性原生動物を単離した。それらの内、3株の18S rRNA遺伝子は,環境中で優占的に活動する実績を持つものと同一であった.捕食は著しく阻害され、合成されたビオラセインに強い抗原生動物活性があることが明らかとなった。原生動物の捕食挙動解析のため、細菌への蛍光タンパク質遺伝子の導入を検討した。対象細菌はトリクロロエチレン汚染土壌の浄化に利用された実績のあるCupriavidus necator KT1(以下、KT1株)とし、捕食実験では水環境に広く生息するSpumella属の鞭毛虫を捕食者として利用した。導入遺伝子は、緑色および赤色蛍光タンパク質遺伝子で、トランスポゾンによって、プロモーターと共にKT1株の染色体上に組込んだ。その結果、Cellレベルでの検出が可能となった。一方、蛍光タンパク質遺伝子の導入によるKT1株の性状変化や、捕食挙動への著しい影響は観察されなかった。また、形質転換体の中から捕食されにくい変異株が選出でき、2色の蛍光を利用した比較実験により、高い残存性が示された。これらの成果から、トランスポゾンによって捕食回避能を有する変異体を取得できる手法に目処が付いた。また、蛍光タンパク質の利用によって、Cellレベルでの観察が可能となり、その利用基準についても明確となった。また、捕食回避の1手法として検討しているビオラセイン合成遺伝子の適用についても検討を進めた。ビオラセインはアミノ酸のトリプトファンから合成されるため、どの様な種類の細菌に導入されても発現され、ビオラセイン合成が起きると考えていた。しかしながら、これまでに大腸菌で発現が確認されたものの、上記のKT1株では、ビオラセイン生産は確認できなかった。そこで、トリプトファンの合成量に問題があると考え、大腸菌からトリプトファン合成遺伝子群を取得し、利用を検討した。その結果、ビオラセイン合成遺伝子群とトリプトファン合成遺伝子群の2種類の遺伝子群の同時導入によって、本問題は解決でき、KT1株でもビオラセインの合成が可能となった。本年度は捕食挙動を解析するため、トランスポゾンベクターを利用した変異株取得法と、捕食回避法としてのビオラセイン合成遺伝子群の対象被食細菌への導入・発現を検討した。両手法ともに、その利用が可能となり、予定通りの成果を得ることが出来た。本年度は、バイオオーグメンテーション有効化に向け、環境浄化細菌の生残性向上に関する基盤の確立を目指した。環境浄化細菌としては、トリクロロエチレン分解細菌を対象とした。これまでに、我々は高いTCE分解能を有するCupriavidus属の組換え体2株を開発している。これらの菌株へのビオラセイン合成遺伝子群導入を検討し,菌体内でのビオラセイン合成を試みた。ビオラセインはアミノ酸であるL-トリプトファンから産生されるが、研究対象のCupriavidus属細菌は、栄養要求性はなく、全アミノ酸を合成できると考えられ、ビオラセイン産生は原理的には可能である。作製された新たなTCE分解細菌については、その捕食回避能、およびTCE分解能を評価した。これまでに、この様な捕食回避能が付与された環境浄化細菌の開発に関しては報告例がない。それゆえ、TCE分解能と捕食回避能を合わせ持つ分解細菌が育種できれば、将来的には、その様な細菌の利用を前提とした、新しい浄化プロセスの構築も可能となる。具体的には、2種類のTCE分解細菌、Cupriavidus sp. KN1-TAC、

およびCupriavidus sp. TW2-Pにビオラセイン合成遺伝子を導入し、その発現に成功した。作製されたビオラセインを産生するCupriavidus sp.KN1-TACVおよびCupriavidus sp. TW2-PVの培養菌体は青紫色を呈し、環境中の代表的な細菌捕食者であるSpumellaの捕食を回避した。また、ビオラセインの産生が行われても、元来のTCE分解能は保たれ、1週間の捕食試験後もTCE解能の低下は観察されず、安定したTCE分解能を保持した。さらに、本研究で捕食回避が確認できた条件を、過去の知見と比較検討した結果、想定される地下水汚染現場の環境下でも、作製菌株の適用が可能であることが示された。バイオオーグメンテーションの有効化に向けて、自然環境下でも生残性を持つ環境浄化細菌の育種を試みた。具体的には高いトリクロロエチレン(TCE)分解能を有する細菌への抗原生動物活性を有するビオラセインの産生能の付与を検討した。トランスポゾンを利用して、ビオラセイン合成遺伝子群を、対象の細菌の染色体上に導入した。ビオラセイン合成遺伝子群が導入された形質転換体は、ビオラセインの産生により、青紫色を呈した。得られた形質転換体を使って、鞭毛虫による捕食実験を行った結果、捕食回避能を有することが明らかとなった。また、TCE分解能を測定した結果、親株のTCE分解能は維持された。平成26年度の研究計画では以下の3項目を挙げた。1)「自然界からの原生動物の単離」、2)分子生物学的な解析手法の開発、3)捕食を低減できる分解細菌の探索・育種。これらの項目については、成果を上げて、論文発表を行なった。加えて、平成27年度の研究計画である、1)捕食を低減できる分解細菌のモニタリング法の確立についても平成26年度の後半には着手し、成果が出始めている。このことから、当初の計画以上に進展していると判断した。次年度は、最終年度にあたり、最終的な目標である捕食回避の有効性を示す実証実験を行う。具体的には、これまでに得られている捕食回避のエンジニアリング的手法(ビオラセイン合成や捕食回避能を有する変異)を、対象の特定細菌に適用し、室内規模の実験によって検証を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。環境保全工学今後は、当初の研究計画に沿って、捕食回避能を備えた分解細菌を育種して、回分実験および連続実験により、バイオオーグメンテーションの有効化に向けた、汚染物質(トリクロロエチレン等)の分解試験による検討を進めたい。その上で、工学的な課題を整理して、色々なケースに活用できる、より一般性を持った工学的手法を確立していきたい。年度末に購入した物品が、計画より安い値段で購入できたため生じた。次年度の研究費と合わせて、計画に沿って、速やかに物品購入に利用する。
収縮性の保持された心不全と血管内皮機能の関連についての検討

目的:以前より心不全の原因は収縮機能傷害と考えられていたが,近年収縮性の保持された心不全(HEART FAILURE WITH PRESERVED EF ; HFpEF)が半数近くあることが明らかになった.更にHFpEFの生命予後も収縮不全の心不全とそれほど変わらないことが明らかになった. HFpEFの発症機序は十分解明されておらず,予後改善に有効な治療は確立されていない.一方で糖尿病患者ではHFpEFが多い事が知られている.さらに糖尿病患者ではサルコペニアも多い事が知られている.今回私は, HFpEF,血管内皮機能,およびサルコペニアの関係を検討するため,市立奈良病院に入院した糖尿病患者を対象に,血管内皮機能,心エコー,および血液検査を行い,拡張障害の指標の1つであるE/E'との関係を検討した.方法: 2012年9月から2015年3月までの期間に糖尿病治療目的で当院に入院した患者143名を対象とした.拡張障害と血管内皮機能との関係を検討するため,各対象に心エコー,血管内皮機能検査,および血液検査を行い, 24ヶ月追跡調査を行った.尚,サルコペニアは欧州ワーキンググループの定義を用いた.成果:対象を非サルコペニア群(119名)とサルコペニア群(24名)の2群に分けた.サルコペニア群では非サルコペニア群と比較し,血管内皮機能(Flow-mediated dilatation : FMD)が有意に低く(4.1±0.6 vs. 6.2±0.3, P=0.0021), E/E' (13.9±0.6 vs. 11.7±0.3, P=0.0028)が高値であり,さらに尿中アルブミン量も有意に高い事が明らかになった(93.1±16.8 vs. 40.8±7.6, P=0.0051). 2年間の追跡により,サルコペニア群のみE/E'の有意な増悪を認めた(13.9±0.6 vs. 14.8±0.8, P=0.029).さらに, E/E'は,尿中アルブミン量, FMD,および握力と関連がある事が明らかになった.これらの結果より,糖尿病患者ではサルコペニア群と非サルコペニア群で拡張障害の増悪に差が生じる事が予想され,更にその予測因子として尿中アルブミン量, FMD,さらに容易に測定できる握力が有用である事が示唆された.目的:以前より心不全の原因は収縮機能傷害と考えられていたが,近年収縮性の保持された心不全(HEART FAILURE WITH PRESERVED EF ; HFpEF)が半数近くあることが明らかになった.更にHFpEFの生命予後も収縮不全の心不全とそれほど変わらないことが明らかになった. HFpEFの発症機序は十分解明されておらず,予後改善に有効な治療は確立されていない.一方で糖尿病患者ではHFpEFが多い事が知られている.さらに糖尿病患者ではサルコペニアも多い事が知られている.今回私は, HFpEF,血管内皮機能,およびサルコペニアの関係を検討するため,市立奈良病院に入院した糖尿病患者を対象に,血管内皮機能,心エコー,および血液検査を行い,拡張障害の指標の1つであるE/E'との関係を検討した.方法: 2012年9月から2015年3月までの期間に糖尿病治療目的で当院に入院した患者143名を対象とした.拡張障害と血管内皮機能との関係を検討するため,各対象に心エコー,血管内皮機能検査,および血液検査を行い, 24ヶ月追跡調査を行った.尚,サルコペニアは欧州ワーキンググループの定義を用いた.成果:対象を非サルコペニア群(119名)とサルコペニア群(24名)の2群に分けた.サルコペニア群では非サルコペニア群と比較し,血管内皮機能(Flow-mediated dilatation : FMD)が有意に低く(4.1±0.6 vs. 6.2±0.3, P=0.0021), E/E' (13.9±0.6 vs. 11.7±0.3, P=0.0028)が高値であり,さらに尿中アルブミン量も有意に高い事が明らかになった(93.1±16.8 vs. 40.8±7.6, P=0.0051). 2年間の追跡により,サルコペニア群のみE/E'の有意な増悪を認めた(13.9±0.6 vs. 14.8±0.8, P=0.029).さらに, E/E'は,尿中アルブミン量, FMD,および握力と関連がある事が明らかになった.これらの結果より,糖尿病患者ではサルコペニア群と非サルコペニア群で拡張障害の増悪に差が生じる事が予想され,更にその予測因子として尿中アルブミン量, FMD,さらに容易に測定できる握力が有用である事が示唆された.
細胞膜微小領域ラフトの構築と機能の分子解析

1.ラフトの細分画と質量分析により脳由来細胞膜ラフトの構築因子の解析を行った。膜の主要ATPaseであるNa/K-ATPaseの一部がラフト局在を示すことを見いだし、更にこのATPaseの阻害剤であるウアバインによってラフトへの局在量がアイソフォーム特異的に変化することを見いだした。2.NAP-22結合因子を免疫沈降法で見いだし、これをprotein N-myristoyl transferase 1,及び2と同定した。すなわち、ラフトにおいてタンパク質の脂質修飾が行われている可能性を見いだした。3.神経細胞膜の成熟に伴い、NAP-22が膜中でオリゴマーを形成することを見いだした。コレステロール除去により、このオリゴマーが解離する知見より、この集合化にコレステロールとの結合が重要であることを見いだした。4.neurocalcinα結合因子との結合機構を解析する目的でneurocalcinαのC-末にmyc-tagを付けたneurocalcin-mycの発現プラスミドを構築した。現在west-western法によりneurocalcinα結合因子との結合機構の解析を行っている。またneurocalcinα結合因子の1っとして側索硬化症の原因遺伝子産物の1つである、アルシンを見いだし、アルシン中のneurocalcin結合部位、アルシンの結合因子の検索を大腸菌での発現タンパク質を用いて解析中である。5.NAP-22の脂質結合解析の過程でphospholipase Cβ1,β3,β4のラフト局在を発見し、ラフトよりのphospholipase Cβ1の精製と酵素学的解析を行った。NAP-22の添加により酵素活性の阻害が観察されたが、これはNAP-22のPIP2への結合によると考えられる。これらの知見はラフトにおけるNAP-22の脂質動態への関与を裏付ける知見である。1.NAP-22改変体の機能解析NAP-22のN末60残基に焦点をあて、この領域内に欠失部位を導入し、変異タンパク質を大腸菌で発現し、精製の後、リポソームとの結合実験を行った。41-50、51-60残基の欠失体の脂質結合能は全長タンパク質と大きな差異を示さなかったが、32-40残基の欠失ではファスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸以外への脂質結合が消失し、20-25残基の欠失ではコレステロールに対する結合性が特異的に減少した。2.改変体の神経細胞発現GFPとNAP-22の融合体を神経細胞に発現させ、シナプス部への移行、コレステロールとの共局在等を観察した。GFP以外にCFPとの融合体発現プラスミドを作成し、PC12細胞を用いて、NAP-22のオリゴマー形成に伴う蛍光エネルギー移動の解析に着手している。4.ラフトの細分画Blue-Native-PAGEと細胞分画によりシナプス小胞ラフトの主要成分をv-ATPaseと同定した。さらにこの輸送体の機能が膜コレステロール濃度と関連することを見い出した。また膜クロライドポンプ活性がNAP-22免沈物中に回収されることを見い出した。グリア細胞由来のラフトを解析し、ミエリン由来ラフトの局在因子がアクチン系細胞骨格と結合することを見い出した。培養神経細胞を用い、低温化でのTriton X-100による脂質、タンパク質の可溶化を行い、生化学的に分画したラフト領域との比較検討を行い、シナプス部においてラフト構築脂質が可溶化されづらいことを見い出した。1.NAP-22結合因子の解析抗NAP-22抗体を用いた免疫沈降によりN-ミリストイル転移酵素(NMT)の存在を質量分析により見出した.

特異抗体作成のため,NMTのcDNA cloningを行い,GST融合タンパク質の発現ベクターを構築した.2.脳由来ラフト画分の脂質ラフト画分中のフォスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)量をGST-PHdamainを用いて定量化する系を立ち上げ,シナプス細胞膜,ミエリン膜中のPIP2のラフト画分への回収を定量化した.またメチルーβ-シクロデキストリン(MCD)処理によりコレステロールのみでなくPIP2も可溶化されることを見出した.In vitroの実験よりNAP-22はコレステロールのみならずPIP2とも結合することが知られているが,神経細胞膜においてもPIP2動態を制御している可能性をこの結果は示唆している.3.ラフト構成因子の1つとしてNa/K-ATPaseを同定し,シナプトソームのラフト局在Na/K-ATPase量がウアバイン処理により変動することを見い出し,これに関与する膜動態について解析を進めている.4.カルシウム依存的にラフト局在を示す諸因子をさらに解析し,annexin VII,annexin XI,copin5,copin6等を新たに見出した.またカルシウム依存的な重合-脱重合サイクルによりannexin VIを中心とする構造体を調製することに成功し,構築因子の同定を進めつつある.5.Neurocalcin αに対する抗体を用いた免疫沈降物中にnNOSを同定した.NNOSとneurocalcinαの相互作用についての検討を進めつつある.1.ラフトの細分画と質量分析により脳由来細胞膜ラフトの構築因子の解析を行った。膜の主要ATPaseであるNa/K-ATPaseの一部がラフト局在を示すことを見いだし、更にこのATPaseの阻害剤であるウアバインによってラフトへの局在量がアイソフォーム特異的に変化することを見いだした。2.NAP-22結合因子を免疫沈降法で見いだし、これをprotein N-myristoyl transferase 1,及び2と同定した。すなわち、ラフトにおいてタンパク質の脂質修飾が行われている可能性を見いだした。3.神経細胞膜の成熟に伴い、NAP-22が膜中でオリゴマーを形成することを見いだした。コレステロール除去により、このオリゴマーが解離する知見より、この集合化にコレステロールとの結合が重要であることを見いだした。4.neurocalcin α結合因子との結合機構を解析する目的でneurocalcin αのC-末にmyc-tagを付けたneurocalcin-mycの発現プラスミドを構築した。現在west-western法によりneurocalcin α結合因子との結合機構の解析を行っている。またneurocalcin α結合因子の1つとして側索硬化症の原因遺伝子産物の1つである、アルシンを見いだし、アルシン中のneurocalcin結合部位、アルシンの結合因子の検索を大腸菌での発現タンパク質を用いて解析中である。5.NAP-22の脂質結合解析の過程でphospholipase C β1,β3,β4のラフト局在を発見し、ラフトよりのphospholipase C β1の精製と酵素学的解析を行った。
SPARC を標的分子としたスキルス胃癌に対する診断、治療法の開発

新規腫瘍関連抗原SPARCのHLA-A24(A*2402)拘束性CTLエピトープを同定した。さらに、健常人および癌患者の末梢血から、このペプチドを用いて誘導したSPARC特異的CTLは、in vitroおよびin vivoにおいて、抗原特異的な細胞傷害活性を示した。また、マウスを用いた動物実験にて、抗腫瘍効果を発現した。以上より、SPARCを標的とした抗腫瘍免疫療法の有用性が示された。スキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析により同定した腫瘍関連抗原SPARCは、膵癌やメラノーマなど多くの癌で高発現することが報告されている。本研究では、SPARCの機能解析を行い、癌の診断および法抗体療法、免疫療法などの分子標的治療への応用の可能性を探ることを目的とする。1.スキルス胃癌の診断における血清SPARC蛋白測定の意義についての検討ELISA法により、血清SPARC値の測定に様々な癌の診断的意義があるか否かについて検討を行うため、スキルス胃癌、通常型胃癌をはじめとした各種癌患者の血清サンプルを収集中である。現在までの少数例の検討では、スキルス癌患者血清での優位な血清SPARC値の上昇は認めていない。2.スキルス胃癌の切除組織における間質および癌細胞のSPARC蛋白の発現の検討し。免疫組織学的染色を用いてSPARC蛋白の発現を検討中。症例が集まり次第、癌細胞および間質におけるSPARCの発現の程度と、癌の進行度、生存率、無再発率や治療効果との相関を検討予定である。3. SPARCペプチドを用いたがん免疫療法についての検討。BALB/cマウスにおいて、自己免疫現象を伴うことなく、H2-K^d拘束性にSPARC陽性細胞株を傷害するSPARCペプチド特異的CTLを誘導できた。さらに、同様のペプチド負荷骨髄由来樹状細胞を投与した後に、SPARCを高発現するマウス乳癌細胞株N2Cを移植し、抗腫瘍効果を検討した。その結果、有意な腫瘍の増殖抑制効果と生存期間の有意な延長を誘導することができた。現在、癌患者および健常人の末梢血より誘導したHLA-A24拘束性SPARC特異的CTLを用いて、抗腫瘍効果について検討中である。スキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析により同定した腫瘍関連抗原SPARCは腫瘍のみならず、腫瘍G間質にも高発現している。また、多くの癌で高発現することが報告されている。SPARCによるヒト細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を検討し、免疫療法等の治療法への応用の可能性を探ることを目的とした。1.ヒト癌の切除組織における間質、癌細胞および正常組織のSPARC蛋白の発現の検討胃癌、大腸癌、膵癌および正常組織について、SPARCの発現をRT-PCRおよび免疫組織化学的解析により検討した。その結果、高頻度に、癌細胞の細胞質および間質細胞を中心としてSPARC蛋白の発現を認めた。正常組織においては、精巣にてSPARC蛋白の発現を認めたが、その他の組織においては脊髄、肺等においても、SPARC蛋白の発現は認められなかった。2. SPARCペプチドを用いたがん免疫療法についての検討。前年度の研究により、BALB/cマウスにおいて、自己免疫現象を伴うことなく、K^d拘束性にSPARC陽性細胞株を傷害するSPARCペプチド特異的CTLを誘導でき、in vivo実験において、抗腫瘍免疫を誘導できることを証明した。これらの研究成果をもとに、実際に健常人および癌患者の末梢血から、HLA-A24に結合性SPARCペプチドを用いて、抗原特異的なHLA-A24拘束性CTLを誘導した。これらのCTLは、in vitroで抗原特異的かつHLA-A24拘束性の細胞傷害活性を示すのみでなく、SPARCを発現するヒト腫瘍細胞株を接種したNOD/SCIDマウスに、SPARC特異的ヒトCTLを静注することにより抗腫瘍効果が観察された。またNOGマウスを用いてSPARCペプチドを負荷したヒトDCを、ヒトCD8陽性細胞と共にマウスの腹腔内に移入することにより、マウス体内でSPARC特異的CTLが誘導された。
多元合金の規則・不規則構造研究のためのX線(放射光)異常散乱法の開発

不規則構造および規則構造の研究に関し以下の作業を進め有意義な結果を得た。2.多元合金の規則構造は一般的に副格子上で異種原子の混合的な占有が存在する。また、多種類の原子の混合状態が発生するために、2元合金の場合のように、各原子に対してどの副格子を正しい格子として割り振るかという方法には限界がある。そこで、長範囲規則構造解析法としてそうした前提なしに実行できる方法を検討をした。これに関しては、"Effective Order Parameters in Long-range Ordered Multi-component Alloys"と題してActa Cryst.Aに投稿する準備をしている。3. Cu_2NiZn合金(fcc)を500°Cで熱処理した試料からのX線回折測定(CuKa)をした結果、110点に規則格子(長範囲規則性)反射が見つかった。これを放射光を使って、各吸収端近傍の5種類の波長に対して積分強度測定を行った結果、Cu-Ni対の部分強度が負の値を取り、CuとNiが副格子を混合占有することが明らかになった。しかし、現段階では上記の2.の長範聞規則度の精密な解析はできないでいる。実験上の誤差よるものであろうと判断し、99年4月に再実験を計画している。