hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ERKの時間パターンによる細胞運命決定機構の解明

シグナル伝達経路を構成する分子の時系列データに情報が含まれており、その情報が下流にどのように処理され伝わっていくかを理解すること、すなわち分子ネットワークのシステム特性を理解することで生命システムの本質的な理解に繋がると考えられます。申請者は、シグナル分子の活性や下流の遺伝子発現量を定量的かつハイスループットに取得可能な自動分注ロボットによる定量的イメージサイトメトリーを用いて、シグナル伝達経路の中心的な因子であるERKをはじめとするMAPKs,および転写因子CREBによるIEGs(c-FOS, EGR1, c-JUN, FOSB, JUNB)の時間パターンに基づく発現誘導機構を非線形ARXモデルにより解析しました。結果、EGR1は、c-FOSに比べてERKの一過性の時間パターンに強く応答することが予測され、実験で検証されました。加えて、EGR1はNGFパルス状刺激の間隔を短くすることでステップ刺激に比べて強く誘導できることを実験的に導きました。今までのシステム生物学では、既知の分子ネットワーク(経路)に基づき常微分方程式によりモデルを作成する手法が一般的でした。しかしながら、分子ネットワークが詳細に分かっている経路は限られており適用範囲が狭いという問題点がありました。この問題の解決には経路が未知の場合でも入出力関係をデータから記述する統計的手法が適していると考えられますが、これまでの測定手法ではこのような解析を行うには精度・データ数が十分ではなく限界がありました。申請者は大量の時系列データを計測する手法および、統計的な解析手法を組み合わせることで、経路が未知な場合であっても、精度の良いモデルを作り、経路のシステムの特性を明らかにできることを世界で初めて示しました。本研究により、実験データに基づくシステム生物学研究の新たな方向性を提示することが出来たと考えています。本研究の最終目的では、一過性のERKの活性に選択的に応答する初期応答遺伝子を探し、そのメカニズムを解析することでした。本研究により、EGR1は、c-FOSに比べてERKの一過性の時間パターンに強く応答することが予測され、実験で検証されそのメカニズムに迫ることができました。本研究により、細胞の分化を誘導するデコーダーの候補としてcFOSが選定され、細胞の増殖を誘導するデコーダーの候補としてEGR1が選定されました。今後はsiRNAの実験により、それぞれの初期応答遺伝子が表現型にどのような影響を与えるか解析していく予定です。また、初期応答遺伝子の発現制御機構に関して、どのようなネットワーク構造・制御関係によって一過性の時間パターンを抽出しているのかモデルの解析を進めていくことを考えています。細胞外刺激の情報は、細胞内においてシグナル伝達分子の活性化の強さや時間パターンに変換され、下流の遺伝子発現および増殖・分化・アポトーシスなどの表現型を制御します。申請者は、シグナル分子の活性や下流の遺伝子発現量を定量的かつハイスループットに取得可能な自動分注ロボットによる定量的イメージサイトメトリーを用いて、シグナル伝達経路の中心的な因子であるERKをはじめとするMAPKs,および転写因子CREBによるIEGs(c-FOS,EGR1,c-IUN,FOSB,JUNB)の時間パターンに基づく発現誘導機構をARXモデルにより解析することを試みました。23年度はまず、定量的イメージサイトメトリーを用いて、ARXモデルで解析するための実験データを取得した。シグナル伝達経路の中心的な因子であるERKをはじめとするMAPKs,および転写因子CREBによるIEGs(c-FOS,EGR1,c-JUN,FOSB,JUNB)の時間パターンを3分間隔で180分間計測し、計10000点にも及ぶ時系列データを計測することに成功しました。続いて、線形のARXモデルを構築しシミュレーションした。しかしながら、線形のARXモデルでは、実験データを再現することができませんでした。そこで申請者は、生化学反応を模したヒル式を組み合わせた非線形ARXモデルを構築することにしました。結果、ヒル式による非線形ARXモデルは実験データをうまく再現することができました。

この問題の解決には経路が未知の場合でも入出力関係をデータから記述する統計的手法が適していると考えられますが、これまでの測定手法ではこのような解析を行うには精度・データ数が十分ではなく限界がありました。申請者は大量の時系列データを計測する手法および、統計的な解析手法を組み合わせることで、経路が未知な場合であっても、精度の良いモデルを作り、経路のシステムの特性を明らかにできることを世界で初めて示しました。本研究により、実験データに基づくシステム生物学研究の新たな方向性を提示することが出来たと考えています。本研究では、当初線形ARXモデルの解析を予定していました。しかしながら、線形のARXモデルでは実験データを再現できませんでした。そこで、急遽モデルの解析手法を改良し、ヒル式による非線形ARXモデルを思いつき実験データを再現することができました。ヒル式は生化学反応を組み込んだ手法であるため、この手法はより生体に近い挙動を再現するモデルであると考えられ、研究が飛躍的に進展したと考えられます。本研究の最終目的では、一過性のERKの活性に選択的に応答する初期応答遺伝子を探し、そのメカニズムを解析することでした。本研究により、EGR1は、c-FOSに比べてERKの一過性の時間パターンに強く応答することが予測され、実験で検証されそのメカニズムに迫ることができました。本研究で構築したヒル式による非線形ARXモデルにより、シグナル伝達経路による初期応答遺伝子の制御機構について、その特徴を解析することを考えています。続いてその特徴を引き出すような外挿刺激を考え、モデルで検証していくことで、細胞運命決定機構の解明に迫りたいと考えています。本研究により、細胞の分化を誘導するデコーダーの候補としてcFOSが選定され、細胞の増殖を誘導するデコーダーの候補としてEGR1が選定されました。今後はsiRNAの実験により、それぞれの初期応答遺伝子が表現型にどのような影響を与えるか解析していく予定です。また、初期応答遺伝子の発現制御機構に関して、どのようなネットワーク構造・制御関係によって一過性の時間パターンを抽出しているのかモデルの解析を進めていくことを考えています。
記憶Ｔ細胞によるマラリア肝細胞期感染防御全貌の蛍光生体イメージング

マラリア肝細胞期は、ヒトで1週間、マウスではわずか2日間程度で終了し赤内型に移行する。この間無症状であるが、この期間の感染防御にはマラリア原虫特異的CD8+T細胞による免疫応答が有効であり、マラリアワクチンの有力な標的となっている。我々は、モデル抗原OVAを発現する組換えマラリア原虫とOVA特異的CD8+T細胞を用いて、肝細胞期防御の生体イメージングを行っている。これまでの研究で、感染肝細胞周囲に抗原特異的CD8+T細胞がクラスターを形成し、原虫排除に導くことを解明した。今回、このCD8+T細胞の抗原特異性について検討した。特異的T細胞としてOVA特異的T細胞受容体(TCR)トランスジェニックT細胞OT-I、非特異的T細胞としてアロ抗原特異的TCRトランスジェニックT細胞2Cを用いた。各々試験管内で活性化後、マウスに受けに移入し、GFPとOVAの融合蛋白を発現する組換えマラリア原虫スポロゾイトを感染させた。約40時間後肝臓の生体イメージングを行ったところ、OT-Iと2C細胞が共にクラスター形成に参画していた。その数は若干OT-Iが多く、OT-I細胞が抗原シグナルを受けている可能性が示唆された。また、2C細胞のクラスター参画は単独移入マウスでは観察されず、OT-I細胞が抗原特異的に活性化されて標的細胞に集まり、その後抗原非特異的に2C細胞がクラスターに参画することが示唆された。OT-Iや2C細胞のクラスター形成は、百日咳毒素で阻止されることから、ケモカインの関与が示唆されている。樹状細胞やクッパー細胞の関与を含め、肝細胞期原虫排除におけるT細胞のクラスター形成の分子機構は、今後解決すべき課題である。また、クラスターに参画した原虫抗原非特異的T細胞が、マラリア原虫の排除に何らかの役割を担うのかについても今後明らかにしていきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。マラリア原虫のスポロゾイトはまず肝細胞に感染する。このステージでは特異的CD8+T細胞が感染防御に有効である。これまでの研究で、特異的CD8+T細胞が感染肝細胞周囲にクラスターを形成し、原虫排除に至ることを、モデル原虫抗原卵白アルブミンOVAを用いた生体イメージングの系で示してきた。本研究ではこの実験系をさらに進め、肝臓内の樹状細胞、クッパー細胞、NK細胞などが肝細胞期防御にどのように関わるか、さらに記憶CD8+T細胞の動態とナイーブT細胞の動態の比較について、多光子レーザー顕微鏡を用いた生体イメージングにより解明することを主な目的としている。多種類の細胞を観察するため、多色同時解析が可能なように顕微鏡の設定条件を改善すると共に、マラリア原虫は従来のgfp発現原虫に加えて、赤系の蛍光色素tdTomatoとOVAを発現する原虫を作成した。この原虫を用いることにより、組織特異的にegfpを発現するマウスを使用することが可能になり、T細胞と原虫に加えて、様々な肝臓内の細胞を同時にイメージングすることが可能となる。免疫記憶細胞については、当初DsRed発現OVA特異的T細胞をマウスに受け身移入し、OVAを免疫することにより記憶細胞樹立の試みを行ったが、宿主側にDsRedタンパクに対する免疫応答が誘導されて、長期間の内には移入したT細胞が拒絶されてしまった。現在は、egfpを発現するT細胞を用いて免疫記憶細胞を作ることに計画変更し、実験を進めている。

また、クラスターに参画した原虫抗原非特異的T細胞が、マラリア原虫の排除に何らかの役割を担うのかについても今後明らかにしていきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。この一年間は、研究準備期間ともいえる期間で、機器設定や必要な原虫の作成、マウスの収集をを行った。またイメージングの人材育成も行った。準備はおおむね整ったので、二年目には予定した実験を順次行いデータを集める予定である。実験計画はおおむね順調に進んでいる。マラリア肝細胞期の研究は、蚊を飼育してスポロゾイトを集めるなど実験準備に時間がかかる。この実験サイクルを確実に回すことにより、効率良く実験を行うことができるようにする。
心理社会的ストレスによる喘息増悪の分子病態の解析

本研究の目的は、喘息病態形成に重要な神経ペプチドと気道上皮細胞のバリア機能に着目し、ストレスが、どのように気道局所に作用し、喘息の病態形成に関与しているのかを明らかにし、診断、治療につながる臨床的意義を見出すことである。平成30年度は、下記にあげた研究項目1.2.3.について研究を実施し、以下の研究計画の進展を得た。研究項目1:(神経ペプチドによる気道上皮バリア機能への影響)ヒト気道上皮細胞株に神経ペプチド(PACAP:ストレス耐性遺伝子PAC1のリガンド)を刺激後、上皮バリア機能を測定したところ、バリア機能への影響は認められなかった。しかし、PAC1遺伝子のノックダウンは、アデノシン三リン酸(ATP)による気道上皮バリア機能形成促進を抑制した。以上よりPACAPの上皮バリア機能への影響は確認できていないが、PAC1がバリア機能形成促進に関与する可能性が示唆された。研究項目2:(心理社会的ストレス、喘息のマウスモデルと神経ペプチド)1ストレス負荷(母子分離ストレス、拘束ストレス)マウスモデルを作製し、血清、肺胞洗浄液、肺組織などの検体を回収した。2予備実験としておこなったダニアレルゲン負荷喘息モデルマウスでは、母子分離ストレスで、アレルギー性気道炎症(肺胞洗浄液中の好酸球浸潤)が増悪した。3蛍光標識デキストランを経気道的に投与し、血清中にリークするデキストラン量を測定することで、生体における上皮バリア機能を評価する。マウスを用いてこのバリア機能の測定系を構築することができた。研究項目3:(神経ペプチドの臨床的意義)臨床研究を申請する上で基盤となる喘息患者の臨床情報を研究分担者とともに収集し、検討した。研究課題1((神経ペプチドによる気道上皮バリア機能への影響)については、PACAPの受容体であるPAC1は上皮バリア機能形成促進に関与する結果が得られたが、PACAPによる上皮バリア機能への影響が、現行の条件では有意な変化を認めなかった。神経ペプチドによる直接的な気道上皮バリアへの影響を確認できておらず、やや遅れている状況である。研究課題2(心理社会的ストレス、喘息のマウスモデルと神経ペプチド)については、細胞実験と並行してすすめることができたため、ダニアレルゲンモデルによる予備実験でも有意な結果がでており、おおむね順調に進められている。研究課題3(神経ペプチドの臨床的意義)については、現在、心身相関を背景に持つ喘息患者について臨床情報を収集、集約し、神経ペプチドの臨床的意義を検証できうる臨床研究申請のための準備をすすめている段階である。やや遅れている状況である。研究課題1(神経ペプチドによる気道上皮バリア機能への影響)については、PACAPの性状や刺激条件を検討し、気道上皮バリア機能への直接的な影響を検証する予定である。また、そのほかの神経ペプチド(NMUなど)についても随時、検証する。確認が取れた時点で網羅的遺伝子発現解析を行う予定である。研究課題2(心理社会的ストレス、喘息のマウスモデルと神経ペプチド)については、ストレスによる喘息増悪モデルを卵白アルブミン(Ovalbumin:OVA)および細胞構造物質で作成する予定である。ストレスモデル(母子分離ストレス、拘束ストレス)およびストレスによる喘息増悪モデルにおける肺組織の網羅的遺伝子発現解析を行う予定である。母子分離+拘束ストレスによるモデルは、上記刺激におけるアレルギー性気道炎症の結果を踏まえて検証する予定である。また、前年度に確立したマウスにおける気道上皮バリア機能測定系を用いて、神経ペプチドによるバリア機能への影響を検証する予定である。研究課題3(神経ペプチドの臨床的意義)については、臨床研究を申請し、患者からの検体採取に着手する予定である。

研究課題1((神経ペプチドによる気道上皮バリア機能への影響)については、PACAPの受容体であるPAC1は上皮バリア機能形成促進に関与する結果が得られたが、PACAPによる上皮バリア機能への影響が、現行の条件では有意な変化を認めなかった。神経ペプチドによる直接的な気道上皮バリアへの影響を確認できておらず、やや遅れている状況である。研究課題2(心理社会的ストレス、喘息のマウスモデルと神経ペプチド)については、細胞実験と並行してすすめることができたため、ダニアレルゲンモデルによる予備実験でも有意な結果がでており、おおむね順調に進められている。研究課題3(神経ペプチドの臨床的意義)については、現在、心身相関を背景に持つ喘息患者について臨床情報を収集、集約し、神経ペプチドの臨床的意義を検証できうる臨床研究申請のための準備をすすめている段階である。やや遅れている状況である。研究課題1(神経ペプチドによる気道上皮バリア機能への影響)については、PACAPの性状や刺激条件を検討し、気道上皮バリア機能への直接的な影響を検証する予定である。また、そのほかの神経ペプチド(NMUなど)についても随時、検証する。確認が取れた時点で網羅的遺伝子発現解析を行う予定である。研究課題2(心理社会的ストレス、喘息のマウスモデルと神経ペプチド)については、ストレスによる喘息増悪モデルを卵白アルブミン(Ovalbumin:OVA)および細胞構造物質で作成する予定である。ストレスモデル(母子分離ストレス、拘束ストレス)およびストレスによる喘息増悪モデルにおける肺組織の網羅的遺伝子発現解析を行う予定である。母子分離+拘束ストレスによるモデルは、上記刺激におけるアレルギー性気道炎症の結果を踏まえて検証する予定である。また、前年度に確立したマウスにおける気道上皮バリア機能測定系を用いて、神経ペプチドによるバリア機能への影響を検証する予定である。研究課題3(神経ペプチドの臨床的意義)については、臨床研究を申請し、患者からの検体採取に着手する予定である。
有機化合物を選択的に吸着する無機・有機層間化合物の合成

本研究では層間化合物への有害有機化合物の吸着を利用した環境浄化材料の設計を目指している。その一つの方法として層状複水酸化物の層間にデオキシコール酸を挿入した層間化合物の調製を試みた。デオキシコール酸はコレステルール類似の構造から生体物質の分離、吸着、または担持材料への展開を期待している。デオキシコール酸自身は溶解性が低く、層間化合物の合成は極めて困難であり、従来行われている層状複水酸化物層間へのゲストの導入方法は適用できなかった。そこで出発物質に水酸化マグネシウムと水酸化アルミニウムを用い、水熱反応を行うことにより層間化合物の合成を試みた。その結果層間にデオキシコール酸が挿入された層間化合物の合成が可能となった。現在この層間化合物の吸着特性について検討を行っているところである。また層間にシラノール基を有する層状ポリケイ酸塩等をホストに用い、多様なミクロ構造の層間化合物を合成し、その吸着特性を検討している。今年度は層状ポリケイ酸塩層間のシラノール基とシリル化剤との反応によって有機基を導入した層間化合物(昨年度までにその合成には成功し、論文も発表済み)の吸着特性の評価を中心に研究を行った。特にオクチルシリル基を固定したものについて直鎖アルコールの吸着を検討した。その結果、表面に固定する官能基の空間的分布を制御することにより吸着特性を定量的に制御できることが明らかとなった。官能基の固定量が小さければ、吸着容量が大きくなる。新しいタイプの材料としてさらに多様な化合物の吸着特性の検討を行っている。その一つの方法として層間にシラノール基を有する層状ポリケイ酸塩等をホストに用い、多様なミクロ構造の層間化合物を合成し、その吸着特性を検討する。今年度は層状ポリケイ酸塩層間のシラノール基とシリル化剤との反応によって有機基を導入した層間化合物の合成を中心に研究を行った。層状ポリケイ酸塩としてマガディアイトを水熱合成により調製しホストとして用いた。マガディアイトの層間に直接インターカレートするゲスト種は限られているため、以下に示すような合成法を用いた。予め層間にインターカレートしやすい界面活性剤陽イオンを導入したものを中間体として用い、多段階の反応で直接の反応では合成できない層間化合物を合成する。この反応によりアルキル基、ビニル基、チオール基などを層間に固定することに成功した。この反応はX線回折分析、赤外吸収スペクトル、組成分析などにより確認した。この際層間の有機官能基の密度を制御し、さらに多様な特性の付与を試みている。またケイ酸塩としてマガディアイト以外の物質についても上記反応を試みている。また層間に有機化合物を挿入する新しい合成法として環状化合物を用いた反応を検討した。これはある種の環状化合物が特定のイオンと極めて選択的、かつ強固に錯体を形成することに着目したもので、イオン交換反応を行うホスト層間に存在するイオンが溶液相にある環状化合物と錯体を形成し、生じる電荷の不足を補うために溶液相に添加した有機陽イオンが層間に侵入するものと考えた。新しい合成法として有望であり、現在他の物質系への展開を検討中である。
粗骨材粒を含む多孔質耐火れんがの構造モデル化と非線形変形挙動解析に関する研究

粗骨材粒を含むレンガ全体と粗骨材粒の弾性率を測定するため,レンガから大型の曲げ試験片と,骨材粒原料のMgOとスピネルの粒状焼結体から厚さ5mm程度の平板をそれぞれ作製した.ついで,共鳴振動法によりレンガ全体の動弾性率を測定した結果,縦振動から求めた動ヤング率は38GPaであった.一方,縦波と横波の各振動子を用いて超音波パルス法によりMgOとスピネルの粗骨材平板を熱乾燥させて動弾性率を測定した結果,動ヤング率は275GPaと295GPaとなり,粗骨材粒の気孔率が7%と5%であることがわかった.また,レンガ全体が2種類の粗骨材粒と中粒以下を焼き固めた多孔質母材から構成されると考えて,多孔質母材の初期ヤング率を複合則から導いた結果,24GPaであることがわかった.次に,曲げ試験片の引張側と圧縮側の各表面に長さ30mmと1mmのひずみゲージを貼り付け,曲げ荷重に対するレンガ全体のマクロひずみとMgOとスピネルの粗骨材粒の局所ひずみの変化挙動をその場測定した.その結果,曲げ試験片の荷重ひずみ線図は,すぐに上に凸の非線形挙動を示し,引張側のひずみが常に圧縮側よりひずむ傾向があること,ある荷重レベルまでは,負荷/除荷を繰り返しても荷重ひずみ関係はほぼ可逆的であることがわかった.その一方で,レンガ全体のマクロひずみに対するMgOとスピネルの粗骨材粒の局所ひずみの比は,曲げ試験の開始時は引張側と圧縮側でほぼ一定値を示すが,荷重が増すにつれて,引張側では単調減少する傾向があるのに対し,圧縮側では単調減少した後,ある荷重レベル以上に達すると一定値を示す傾向があり,引張荷重下と圧縮荷重下での非線形変形挙動に明らかな差があることを実験的に明らかにすることができた.初年度に予定していた曲げ試験片と2種類の粗骨材平板を作製し,縦波振動子と横波振動子やレンズ,真空炉を導入して,研究内容1の初期弾性率を実測することができ,複合則により,実測が難しいと考えていた多孔質母材の初期弾性率を見積もることができた.また,非線形挙動を発現する構造モデルを模索するのに必要な基礎データを取得することができた点で研究は概ね順調に進展していると判断している.2年目は,非線形変形挙動を示すレンガの力学特性を表現する複合モデル化にチャレンジする.そのために,まず,曲げ試験の荷重速度を変化させて,荷重ひずみ線図の速度依存性の有無を実験的に明らかにする.また,供試れんがは,非線形な変形挙動を示すが,素材そのものは多孔質セラミックスであり,レンガ全体の弾性率は約40GPaと非常に低いが,マクロひずみも100με以下と非常に小さく,短軸引張試験は物理的に不可能であるため,曲げ試験を主体とした研究計画を立案しているが,初年度の研究結果から曲げ時の引張面と圧縮面の非線形挙動を把握することができたが,ひずみ変化が圧縮と引張で明らかに挙動が異なることから,引張と曲げの応力場が共存する曲げ試験結果のみからは,レンガの構造モデル化に必要なデータが不足しているといえる.そこで,供試れんがの圧縮試験片を作製し,新たに短軸圧縮試験を行うことで,構造モデル化に必要なデータを取得し,短軸圧縮場での非線形変形挙動の構造モデル化から行う.粗骨材粒を含むレンガ全体と粗骨材粒の弾性率を測定するため,レンガから大型の曲げ試験片と,骨材粒原料のMgOとスピネルの粒状焼結体から厚さ5mm程度の平板をそれぞれ作製した.ついで,共鳴振動法によりレンガ全体の動弾性率を測定した結果,縦振動から求めた動ヤング率は38GPaであった.一方,縦波と横波の各振動子を用いて超音波パルス法によりMgOとスピネルの粗骨材平板を熱乾燥させて動弾性率を測定した結果,動ヤング率は275GPaと295GPaとなり,粗骨材粒の気孔率が7%と5%であることがわかった.また,レンガ全体が2種類の粗骨材粒と中粒以下を焼き固めた多孔質母材から構成されると考えて,多孔質母材の初期ヤング率を複合則から導いた結果,24GPaであることがわかった.次に,曲げ試験片の引張側と圧縮側の各表面に長さ30mmと1mmのひずみゲージを貼り付け,曲げ荷重に対するレンガ全体のマクロひずみとMgOとスピネルの粗骨材粒の局所ひずみの変化挙動をその場測定した.その結果,曲げ試験片の荷重ひずみ線図は,すぐに上に凸の非線形挙動を示し,引張側のひずみが常に圧縮側よりひずむ傾向があること,ある荷重レベルまでは,負荷/除荷を繰り返しても荷重ひずみ関係はほぼ可逆的であることがわかった.その一方で,レンガ全体のマクロひずみに対するMgOとスピネルの粗骨材粒の局所ひずみの比は,曲げ試験の開始時は引張側と圧縮側でほぼ一定値を示すが,荷重が増すにつれて,引張側では単調減少する傾向があるのに対し,圧縮側では単調減少した後,ある荷重レベル以上に達すると一定値を示す傾向があり,引張荷重下と圧縮荷重下での非線形変形挙動に明らかな差があることを実験的に明らかにすることができた.初年度に予定していた曲げ試験片と2種類の粗骨材平板を作製し,縦波振動子と横波振動子やレンズ,真空炉を導入して,研究内容

1の初期弾性率を実測することができ,複合則により,実測が難しいと考えていた多孔質母材の初期弾性率を見積もることができた.また,非線形挙動を発現する構造モデルを模索するのに必要な基礎データを取得することができた点で研究は概ね順調に進展していると判断している.2年目は,非線形変形挙動を示すレンガの力学特性を表現する複合モデル化にチャレンジする.そのために,まず,曲げ試験の荷重速度を変化させて,荷重ひずみ線図の速度依存性の有無を実験的に明らかにする.また,供試れんがは,非線形な変形挙動を示すが,素材そのものは多孔質セラミックスであり,レンガ全体の弾性率は約40GPaと非常に低いが,マクロひずみも100με以下と非常に小さく,短軸引張試験は物理的に不可能であるため,曲げ試験を主体とした研究計画を立案しているが,初年度の研究結果から曲げ時の引張面と圧縮面の非線形挙動を把握することができたが,ひずみ変化が圧縮と引張で明らかに挙動が異なることから,引張と曲げの応力場が共存する曲げ試験結果のみからは,レンガの構造モデル化に必要なデータが不足しているといえる.そこで,供試れんがの圧縮試験片を作製し,新たに短軸圧縮試験を行うことで,構造モデル化に必要なデータを取得し,短軸圧縮場での非線形変形挙動の構造モデル化から行う.
化学指標の地理的パターンから復元する中生代温室期の異様な海洋・炭素循環

中生代中期の炭素循環の記録は,これまで古太平洋海域から示されてこなかった.そこで本研究では,同時期の古太平洋地域の石灰岩(日本の鳥巣式石灰岩)に注目し,体系的な炭素同位体比の記録を示した.その結果,古太平洋海域の炭素同位体比の記録はテチス海と地域間対比が可能であることが判明した.両海域の炭素同位体比はジュラ紀後期に収束していくことから,大陸移動に関連した海洋循環の変動が想定される.また本研究では,この時期の石灰岩から産出する厚歯二枚貝という特殊な二枚貝の研究も行った.本研究の結果,原始的な巻貝型厚歯二枚貝は波浪の及ばない静穏な環境に生息していたことが判明した.平成25年度の上半期には鳥巣式石灰岩(日本)に関係する作業をすすめた。鳥巣式石灰岩のデータはある程度揃っていたため,これまでの研究内容に不足しているデータを補うかたちで作業を進めた.具体的には、石灰岩から全岩の炭素・酸素同位体比の測定を行った。これらの分析作業に必要な機材、機器は研究代表者が所属していた研究室にほぼ揃っていたため、速やかに取りかかることができた。これらの研究成果を集約すると以下の通りである.1.古太平洋地域からははじめてとなるジュラ紀後期から白亜紀初期にかけての体系的な炭素同位体(δ13C)層序プロファイルを示した.2.鳥巣式石灰岩のδ13Cプロファイルは同位体異常にもとづき,同時期のテチス海のプロファイルとの地域間対比が可能である.3.キンメリッジアン期後期の鳥巣式石灰岩のδ13C値はテチス海に比べて1‰ほど低く,その地域差はチトニアン後期に消失する.4.同位体比の地域差が収束するのはジュラ紀後期に大陸移動に伴って海洋循環に大きな変化が生じたことを示唆する.この研究成果をもとに論文を執筆し,2014年3月に日本地質学会で発行している国際誌"Island Arc"にて論文を公表することができた.7月には海外調査地域の一つである、ボルネオ島北西部のバウ石灰岩にて野外調査を行うことができた。この時期の調査地の気候は雨期にあたり、頻繁にスコールが発生するものの,比較的気候が温和で、野外調査に適している季節である。バウ石灰岩からは石灰岩試料と厚歯二枚貝を中心とした大型化石を採取した。石灰岩試料からは薄片を作成し、詳細な岩相記載を行った.その結果は2013年9月の日本地質学会,2014年3月の炭酸塩コロキウムにて報告した.中生代中期(ジュラ紀後期白亜紀前期)には,大気中の高い二酸化炭素濃度によって温室効果が働き,地球表層では異常な炭素循環が機能した.本研究は,日本・マレーシアなどの古太平洋地域の化石・石灰岩試料をもとに,堆積学,古生物学,同位体層序学(炭素・ストロンチウム)などの研究手法を活用して,当時の古海洋環境の復元に取り組む.さらに,テチス海のデータとの比較を行い,最終的には当時の海洋循環と炭素循環を復元することを目的とする.今年度は昨年度から継続して,日本国内の鳥巣式石灰岩(ジュラ紀後期)の岩相と化石相の記載に取り組んだ.研究対象としたのは,大分県四浦半島に分布する津井層に含まれる鳥巣式石灰岩である.調査の結果,厚歯二枚貝が貧栄養の静穏な極浅海域でサンゴとともにバイオストローム(地層状に殻が密集した構造)を形成していたことが判明した.この産状はメガロドン類(厚歯二枚貝の祖先)や白亜紀のレクイエニア類(津井層の厚歯二枚貝の直系の子孫)のものと類似する.一方,他の鳥巣式石灰岩から報告された厚歯二枚貝の産状とは大きく異なっている.このことは,厚歯二枚貝は出現してから比較的早い時期にすでに生態を多様化させていたことを示唆する.この研究成果は1)厚歯二枚貝がジュラ紀後期の段階ですでに様々な生息環境で適応放散していたこと,2)厚歯二枚貝の生息に適した温暖な海洋環境がすでにジュラ紀後期の段階で成立していたことを示唆している.この示唆はジュラ紀後期の海洋環境を考える上で重要な情報である.この研究成果は2014年9月に開催された日本地質学会,および2015年1月に発行された地質学雑誌において公表された.昨年度は明治大学の研究員としての業務が多忙であったため,本研究計画を進めることができなかった.そのため,昨年度に計画していた研究内容はそのまま今年度に繰り越し,本研究計画を継続する予定である.研究員としての業務が多忙であり,本研究計画を進める時間的余裕があまりなかったため.中生代中期(ジュラ紀後期白亜紀前期)の異常な地球表層での炭素循環は,主にテチス海から提示されてきたが,地中海であったテチス海のデータは地域的シグナルにすぎない可能性があった.

そこで本研究では,その時期に古太平洋地域で堆積した石灰岩(日本の鳥巣式石灰岩とマレーシアのバウ石灰岩)に注目した.鳥巣式石灰岩では代表的な2セクションから炭素同位体比を測定し,体系的な炭素同位体比(δ13C値)の層序プロファイルを示した.先行研究で判明しているストロンチウム年代と生層序の年代を元に同時期のテチス海のδ13Cプロファイルと対比した.その結果,地域間対比が可能な3つの同位体異常が確認された.また両地域のδ13Cプロファイルを比較したところ,Kimmeridgian後期の鳥巣式石灰岩のδ13C値は同時期のテチス海のδ13C値に比べて1‰ほど低いが,Tithonian後期にはこの地域差は収束していくことが判明した.この同位体比の均質化は海洋循環の変動に関係しているのかもしれない.また中生代中期には,古海洋環境に適応した,「厚歯二枚貝」という特異な二枚貝が出現した.本研究では同位体層序学的研究と平行して,鳥巣式石灰岩とバウ石灰岩から産出した厚歯二枚貝(Epidiceras)の古生物学的な研究も行った.その結果, Epidicerasは波浪の及ばない静穏な環境に生息していたことが判明した.鳥巣式石灰岩からは波浪の強い環境にも厚歯二枚貝(Valletia auris)が生息していたことが知られており,本研究結果は厚歯二枚貝の生態はジュラ紀後期の時点ですでに多様化しつつあったことを示している.現在はイオンクロマトグラフィー装置を使用して,石灰岩中に含まれる金属イオンの定量を行い,石灰岩の堆積環境・生成条件についてより詳細な議論に取り組んでいる.中生代中期の炭素循環の記録は,これまで古太平洋海域から示されてこなかった.そこで本研究では,同時期の古太平洋地域の石灰岩(日本の鳥巣式石灰岩)に注目し,体系的な炭素同位体比の記録を示した.その結果,古太平洋海域の炭素同位体比の記録はテチス海と地域間対比が可能であることが判明した.両海域の炭素同位体比はジュラ紀後期に収束していくことから,大陸移動に関連した海洋循環の変動が想定される.また本研究では,この時期の石灰岩から産出する厚歯二枚貝という特殊な二枚貝の研究も行った.本研究の結果,原始的な巻貝型厚歯二枚貝は波浪の及ばない静穏な環境に生息していたことが判明した.本研究計画の一部として進めていた石灰岩の岩相・化石相の記載に関連して,大分県内の鳥巣式石灰岩から産出する厚歯二枚貝の産状記載の論文を2015年1月に上梓することができた.この論文が公表されたことで,出現最初期の厚歯二枚貝の古生態について広く議論することが可能になった.厚歯二枚貝の進化史は当時の海洋環境の変遷と大きく関わっており,本研究を遂行する上で重要な示唆を含んでいる.現在,もう一つの調査地であるバウ石灰岩の厚歯二枚貝の産状についての論文も現在執筆中である.本研究計画のうち「石灰岩の岩相・化石相の記載」については,当初の見込み以上の成果が得られつつある.一方,今年度に予定していたバウ石灰岩の厚歯二枚貝の同位体比の測定は未着手のままである.しかし,予備的な調査(薄片観察・化石試料の保存状態の確認)はほぼ完了しており,同位体比測定に向けた準備は着実に進行している.以上のことから,本年度終了時点での達成度は「おおむね順調に進展している」と言える.昨年度の研究計画を繰り越し,今年度も本研究内容を継続する予定である.具体的には,鳥巣式石灰岩やバウ石灰岩から採取された試料から化学指標の分析を進める.また,これまでの研究成果を地質学会などで公表する予定である.学会では他学の研究者との議論・意見交換に努める.本研究課題の成果の一部を報告した地質学平成25年度の野外調査によって,バウ石灰岩から厚歯二枚貝の化石と大量の石灰岩試料が得られている.薄片観察の結果,これら厚歯二枚貝化石の保存状態が良好であることが判明している.来年度はこれら化石・岩石試料の分析に専念する.また前述のように,バウ石灰岩の厚歯二枚貝化石の産状を堆積学的・古生物学的に記載した論文を作成中である.
岩石変形実験による地殻の力学物性の解明：流体の影響

断層強度と下部地殻・マントルの非弾性変形を明らかにするために、以下の研究を行なった。(1)熱水条件下で含水鉱物の摩擦特性を調べた。スメクタイトの安定領域(150°C)における摩擦係数は0.050.09、緑泥石の大変位摩擦試験では600°Cまでの広い領域にわたって0.3程度であった。中央構造線の断層ガウジについて摩擦実験を高温・高圧条件で実施した。浅部の低温ガウジはスメクタイトの影響で摩擦強度が極端に低いが、250°C以上の条件では含水鉱物の影響が小さく、中部地殻が差応力を支えていた推察される。断層の運動方向は広域応力場の変化に伴って逆転し得る.模擬断層物質を用いた摩擦実験では,剪断方向の反転による粒子の噛み合いで強度が過渡的に上昇した。(2)断層帯における岩石-流体相互作用における塩水の影響についての予察的な解析を行った結果,静水圧下で地温勾配に沿って温度が降下する場合は,400300°Cにかけて相互作用が活性化することを明らかにした。(3)沈み込み帯の地震発生帯深部における変形摩擦物性を調べるために、内圧500 MPa、温度300°Cでの使用に耐える圧力容器を設計開発した。イタリア・Balmuccia岩体の断層構造と温度圧力解析から、マントル岩の脆性ー延性遷移温度を700°Cに拘束した。(4)ガス圧式高温高圧試験機の断熱性能を改善して実験条件を高温領域に広げるとともに、ねじり変形機構を搭載することで、回転剪断変形実験の実施を可能とした。下部地殻を構成する斜長石のレオロジーを精密に求めるため、人工斜長石多結晶体を用いて変形実験を封圧や含水量を変えて行ない、含水下での強度が含水量に反比例することを明らかにした。野外地質調査で得られた断層岩試料を室内で実験し、中央構造線の断層摩擦特性を調べる研究を中心に、地殻強度について目標としていた成果が得られた。新規に開発している熱水摩擦試験機についても、圧力容器の設計開発が完了した。下部地殻の変形実験でも予察的な成果が得られた。成果のとりまとめと論文発表が遅れている。基本的に研究計画通りに実験を進めていく。最終年度にあたり、海外の研究協力者との連携も深めつつ、成果を国際誌等に公表していく。(1)内陸地殻の断層強度を知るために、中央構造線の断層構成物質の摩擦実験を行なった。予察的結果によると、最新滑り面の摩擦係数は0.1未満の低い値を示したが、より古い構造では摩擦係数は0.60.7程度で速度強化を示す。粘土鉱物の摩擦実験により,中高速強度低下における断層帯の水理特性の重要性を明らかにした。また室内摩擦実験で得られた組織発達パラメータを用いて,天然の断層における長期的な強度変遷を見積もった。断層流体の化学的特徴を解明するため,チリのアタカマ断層系の調査及び試料採集を行った。炭質物断層温度計を開発するために泥岩の加熱実験を行なった。実験後の炭質物の反射率測定とラマン分光分析から,短時間被熱履歴の解析が可能な速度則を導出した。(2)沈み込み帯深部の熱水条件下における断層強度を評価するために、かんらん石/斜方輝石の粉末試料をもちいて変形実験を行った。剪断応力はピークに達した後、顕著な歪軟化を示し、回収試料には剪断面に沿って選択的に滑石が生成していた。速度状態依存(RSF)摩擦則と摩擦面接触状態の比較から、従来の枠組みと矛盾する状態遷移挙動を発見した。高温高圧の熱水条件下で大変位摩擦試験を行なうために、新たな熱水式回転摩擦試験機の開発に着手し、圧力容器の熱応力解析を行なうとともにシステムの剛性を検討した。(3)下部地殻・マントルの変形特性解明のための技術開発を行なった。ガス圧変形試験機の温度範囲を1000°C以上まで拡大できるように、熱計算に基づいてヒーター・断熱材、温調回路、圧力容器等の改良を行なった。固体圧試験機における差応力決定精度を向上させるため試料アセンブリを改良し、応力校正則を構築した。斜長石のレオロジーにおける水の効果を定量化するために、下部地殻条件で人工多結晶体をもちいた変形実験を行なった。無水の人工試料に水を加える事で流動応力が20分の1程度まで低くなった。断層強度と下部地殻・マントルの非弾性変形を明らかにするために、以下の研究を進めた。(1)B01班の採取した中央構造線試料のうち、比較的新しい断層ガウジ2試料について地下の温度圧力条件で摩擦実験を実施した。摩擦係数は膨潤性粘土の含有量に応じた低い値(0.150.27)を示し、高間隙水圧下でより低くなる傾向がみられた。A02班とともに跡津川断層系周辺地域を踏査し,活断層の存在が知られていない地域において多数の中・小規模断層を見出した。応力インバージョンの結果は現在の応力配置に調和的な向きを示す。炭質物の熱熟成度を示す空中反射率を用いた断層温度計を開発した。(2)アタカマ断層系(チリ)の調査および採集試料の分析と熱力学データを用いたシミュレーションにより,断層末端に分布する裂罅先端の進展方向と裂罅中の溶液の移動方向と流量を解析した。

(3)沈み込み帯の地震発生帯深部における変形摩擦物性を調べるために、高温高圧の熱水条件下(300 MPa, 700°C)で大変位摩擦試験を行なうための回転式摩擦試験機の設計を進めた。また超低速での試験を高精度で行うための技術的検討を行なった。沈み込み帯深部での岩石・流体相互作用がプレート境界強度に与える影響を評価するため、カンラン岩ガウジの熱水摩擦すべり実験を行温度500°C封圧1GPaで行ない、加水反応の進行に伴なう顕著な歪軟化を見いだした。EBSD法によって高圧変成岩中の石英の結晶粒径の変化を精密に解析し、過去の沈み込み帯プレート境界断層深部の差応力を見積もった。(4)下部地殻・マントルの変形特性を解明するため、ガス圧式高温高圧試験機の高温化を目的として、ヒーター・音調回路の改良を行なった。固体圧試験機の応力の較正則を構築した。斜長石のレオロジーにおける水の効果を定量するために、無水の人工アノーサイト多結晶体をもちいて軸圧縮実験を行った。計画通り、天然断層の摩擦実験を開始し、予察的データを取得することができた。また下部地殻物質の高温高圧変形実験も開始した。新規の回転摩擦実験装置については、本体フレームの設計がほぼ終了した。一方、目標としたガス圧式変形試験機の改良による1000°C以上の高温領域にはまだ達しておらず、油圧式変形試験機や内燃式ガス圧装置(HIP)による実験は十分行えなかった。断層強度と下部地殻・マントルの非弾性変形を明らかにするために、以下の研究を進めた。(1)中央構造線の断層露頭で最も古い時代に形成されたと考えられるガウジについて、形成時の温度圧力条件で剪断実験を行ない、前度に実施したスメクタイトに富むガウジとは異なる摩擦係数(0.42)と摩擦特性を見い出した。スメクタイトで熱水摩擦すべり実験を行ない、全条件下で0.060.12と著しく低い摩擦係数を得た。グラファイトと石英の模擬断層ガウジを用いた摩擦試験では、滑り方向の逆転時に強度回復が見られた.跡津川断層周辺の断層群に応力逆解法を適用し,小中規模の断層群が現在の応力場における非弾性変形の要因となっていると推定した。(2)断層帯における岩石-流体相互作用では、塩水の有効誘電率が主要なパラメータとなる。そこで温度500°C、圧力200 MPaまでの溶解度測定データをもとに有効誘電率の暫定的な定式化を行った。四川大地震の地表断層試料中の炭質物のラマンスペクトルを解析し、断層運動が炭質物の結晶度に与える影響を評価した。(3)高温高圧・熱水条件下で大変位摩擦試験を行なうために、回転式摩擦試験機を設計し、本体フレームと駆動部を完成させた。マントルウェッジ下に存在するカンラン石・斜方輝石の粉末試料を用い、熱水摩擦すべり実験を行った結果、滑石の生成に伴う顕著な歪軟化を見出した。三波川変成帯中の石英の再結晶粒径から沈み込み帯プレート境界断層深部の差応力を推定した。(4)下部地殻・マントルの変形特性を解明するため、ガス圧試験機のヒーターと試料アセンブリを改良し、1000°Cまでの試運転を行った。熊澤型変形試験機のセットアップと校正試験を行なった。下部地殻のレオロジーを知るため、斜長石の圧縮試験を行なったところ、含水条件下で高圧下での保持時間が長くなるほど、試料の含水量が増加し強度が低下した。既存の実験装置を使った変形試験は概ね順調に進んでおり、ガス圧試験機による高温(1000 °C)目標も達成した。しかし、新規に開発中の回転式摩擦試験機については、圧力容器および高温ヒーターなどの設計が遅れているため、断層深部条件の摩擦試験が遅れている。
消化器系抗原とその遺伝子に関する免疫学的・分子生物学的研究ならびに新しい応用

分子生物学的手法により、CEA遺伝子ファミリーの解析に大きな進展がみられた。上皮組織では1種類と考えられていたNCAmRNAが、顆粒球において複数のサブファミリーを有することが明らかにされつつある。またBGP1についても少くとも4種のisoformが存在し、それらの組織あるいは腫瘍特異的発現の有無を今後検討する必要がある。一方ムチン抗原に関しても、免疫化学的解析に加え、コア蛋白の構造が明らかになりつつあり、糖鎖、タンパクおよびmRNAのそれぞれのレベルでの検討が可能になってきた。腫瘍におけるこのような検討は、ムチン抗原分子の腫瘍マーカーとしての新しい意義を明らかにする可能性がある。AFPについてもリコンビナントAFPを用いてその生化学的機能の解析が可能となった。診断面への応用として、ras癌遺伝子が肝硬変および肝癌への進展に重要な役割を担うことが示唆され、前癌病変としての肝硬変症において、癌化のポテンシャルを予測するマーカーとなり得る可能性も考えられる。また、トランスフェリンの解析を通じて、各種臓器癌に特異的あるいは普遍的に出現増大する糖タンパク質の糖鎖を感度良く定量できることが示され、臨床応用が試みられつつある。治療への応用として、PST1のvariantあるいはモノクローナル抗体の作製が可能となれば、モデル実験を通して具体的な検討が開始されよう。リコンビナント・ヒトーマウスキメラ抗体やリコンビナント・ヒト型モノクローナル抗体の作製が容易になり、いくつかの消化器癌関連抗原に対するものが確立された。これらの中にはADCC等の強い生物活性を示すものが認められ、今後治療への応用が可能となると思われる。
ストレスによる持続性ドーパミン変化における外側手綱核の役割

外側手綱核はストレスや意欲に関連するドーパミン変化に深く関係していることが予想される。本研究では外側手綱核などの神経核からなる神経ネットワークがどのようにドーパミン放出を制御しているのかを明らかにし、ストレスやストレス対処行動の神経機構を理解するために、外側手綱核をチャネルロドプシンと光ファイバを用いた光刺激し、電気化学的手法を用いてドーパミンの放出先である側坐核でのドーパミン濃度を測定した。また外側手綱核からドーパミン細胞を有する腹側被蓋野までの経路であると考えられる反屈束および吻側内側被蓋核も同様に光刺激を行い、そのドーパミン応答を計測した。またこの結果をもとに計算機シミュレーションを用いてそのネットワーク機構を調べた。シミュレーションには神経回路シミュレーションに特化したNEST simulatorを用いて単純なニューロンモデルで外側手綱核から腹側被蓋野に至る神経ネットワークをモデル化した。その結果、刺激周波数によってドーパミン変化が変化した。外側手綱核の低頻度刺激では側坐核ドーパミン濃度は増加したが、高頻度刺激ではドーパミン濃度は減少した。外側手綱核から腹側被蓋野などへの伝達経路である反屈束や外側手綱核から興奮性投射を受ける吻側内側被蓋核でも同様に光刺激を行ったところ、低頻度刺激ではドーパミン濃度の増加が見られ、高頻度刺激ではドーパミン濃度の低下が見られた。次に、外側手綱核によるドーパミン制御の神経ネットワーク機構を調べるために計算機シミュレーションを行った。その結果、外側手綱核への強い入力ではドーパミン細胞の活動が高まったが、外側手綱核への弱い入力ではドーパミン細胞の活動が弱まり、実験と同じ結果をシミュレーションでも得ることができた。本研究では、ストレス環境下における側坐核の持続性ドーパミン変化を定量的に測定し、ストレスや意欲に関連した行動と持続性ドーパミン変化の関係、およびそのときの外側手綱核の役割を明らかにすることを目標とする。平成29年度はfast-scan cyclic voltammetry (FSCV)を応用した手法を用いて持続性ドーパミン変化の定量的測定法の確立を行った。当初計画にあった高速電位走査吸着走査ボルタンメトリー(FSCAV)の他に、近年提案されたcharge-balancingmultiple waveform FSCV(CBM-FSCV)法を用いて持続性ドーパミン変化をマウス生体脳内から測定し、その測定能力を検証した。具体的には、腹腔内へのノミフェンシン投与もしくはmedialforebrain bundle (MFB)の電気刺激、さらに外側手綱核の電気刺激によって生じる線条体側坐核における持続性ドーパミン変化をFSCAVもしくはCBM-FSCVによって測定した。その際にマイクロダイアリシスと同時記録することにより定量的にFSCAV・CBM-FSCVの両手法を評価した。その結果、CBM-FSCVではin vitroでは安定してドーパミン計測が行えたが、in vivoでは感度および精度が悪く安定した測定ができなかった。それに対してFSCAVではin vivoだと多少感度が下がるもののin vitroでもin vivoでも持続性ドーパミンが定量的に計測できていることが確認できた。したがってFSCAVの方がストレス環境下における行動中の持続性ドーパミン量変化の測定に適していることがわかった。当初計画していた持続性ドーパミン量変化の測定法を確立することができた。しかし研究代表者の所属機関異動による研究環境の変化のため研究計画の見直しを行った。そのため進捗状況としてはやや遅れている。研究代表者の所属機関異動にともないさらなる動物実験を行うことが困難になったため、当初の計画を変更し、これまでの実験で得られた外側手綱核活性とドーパミンの放出データをもとに、計算神経科学的にドーパミンおよび外側手綱核の研究を行う。研究代表者の所属機関異動にともない研究計画に変更が生じたため。
細胞分裂時のゲノム分配における１分子性のモデル研究

細胞内におけるゲノムの「数」は,真核細胞であれば有糸分裂において様々なモータータンパク質等の協同的作業により制御されている.大腸菌などの原核細胞では,高度な制御機構がないものの,成長・分裂過程において1細胞あたり1ゲノムDNAがうまく入るようになっている.JunとMulderは,大腸菌の細胞膜・壁内の非常に小さな領域に押し込められたゲノムDNAのモンテカルロシミュレーションを行い,DNAがエントロピー的に自己排除する効果でDNAの分配が遂行されるという説を提唱した.また,Erringtonの研究グループは,細胞壁や分裂に必要とされるタンパク質を持たないバクテリア(枯草菌)でも,増加した膜がちぎれるように分裂し,増殖することが可能なことを示した.これらの報告は,原始的な細胞またはモデル細胞が成長して分裂する際に,特別な機構を持たずとも倍加したDNAが均等に分配され得ることを示唆している.本研究では,モデル細胞膜としてジャイアントユニラメラリポソーム(GUV)を用い,それが細胞分裂様に変形する際に,中に封入したゲノムサイズのDNAがどのように分配されるかを検証した.具体的には,長さが約1.6×10^5塩基対,回転半径が約1μmであるT4ファージ由来のgDNAを直径520μm程度のGUVに封入し,浸透圧ショックを加えることで分裂様の変形を誘起した.また,細胞内の混雑環境を模擬するため,分子量20k Daのポリエチレングリコール(PEG)を08wt%の濃度で共封入し,その影響を調べた.その結果,DNAが変形した娘細胞膜に比較的均一に分配されるには,膜変形の速度が影響すること,また,GUV内が混雑環境にある場合,速い膜変形においてもDNAの分配が実現されることを明らかにした.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。真核細胞では,細胞分裂において多様な特殊化したタンパク質が複雑巧妙かつシームレスに働き,複製したゲノムを正確に娘細胞に分配する.大腸菌などの細菌では,これほど精巧な機構を持たないものの,複製されたゲノムはほぼ正確に二つの娘細胞に分配される.本研究では,ゲノムの少数性を維持するメカニズムが,モータータンパク質に代表される精巧な制御がなくとも実現される条件を明らかにすることを目指した.申請者は過去の研究において,モデル細胞膜であるジャイアントリポソームにゲノム分子を模擬した巨大分子(直径1μm程度)を封入し,膜が細胞分裂様の変形をする際に,2個の巨大分子が娘リポソームに分配される様子を調べた.その結果,娘リポソームのサイズが小さいほど,巨大分子が1:1に分配される確率が顕著に上昇することを示した.本研究では,この内容を継続・発展させ,モデル細胞形成の再現性を飛躍的に改善する工学的工夫を行い,模擬ゲノム分子の娘細胞への均等分配が可能となる条件を定量的に調べている.検討項目は,1模擬ゲノム分子と分裂後の娘細胞のサイズ比の依存性,2細胞質を模擬したバックグラウンド混雑高分子の効果(排除体積効果,拡散係数の減少)の検討を掲げた.平成26年度は,1を実現する実験方法の改良を行い,一定の進展を得た.具体的には,インクジェットノズルを用いた均一容積を持つリポソーム形成法の開発を行い,実際に利用可能な系が完成しつつある.また,人工細胞膜としてのジャイアントリポソームにたいして高効率で分裂を誘発する条件を見出した.現在,ゲノム分配の確率性を統計的に評価するために,均質なゲノムDNAを調製するための条件検討に取り組んでいる.以上の項目がそれぞれ完結すれば,目標に掲げた,モデル系によるゲノムDNA分配の物理的な評価が可能になる.細胞内におけるゲノムの「数」は,真核細胞であれば有糸分裂において様々なモータータンパク質等の協同的作業により制御されている.大腸菌などの原核細胞では,高度な制御機構がないものの,成長・分裂過程において1細胞あたり1ゲノムDNAがうまく入るようになっている.JunとMulderは,大腸菌の細胞膜・壁内の非常に小さな領域に押し込められたゲノムDNAのモンテカルロシミュレーションを行い,DNAがエントロピー的に自己排除する効果でDNAの分配が遂行されるという説を提唱した.また,Erringtonの研究グループは,細胞壁や分裂に必要とされるタンパク質を持たないバクテリア(枯草菌)でも,増加した膜がちぎれるように分裂し,増殖することが可能なことを示した.これらの報告は,原始的な細胞またはモデル細胞が成長して分裂する際に,特別な機構を持たずとも倍加したDNAが均等に分配され得ることを示唆している.本研究では,モデル細胞膜としてジャイアントユニラメラリポソーム(GUV)を用い,それが細胞分裂様に変形する際に,中に封入したゲノムサイズのDNAがどのように分配されるかを検証した.具体的には,長さが約1.6×10^5塩基対,回転半径が約1μmであるT4ファージ由来のgDNAを直径520μm程度のGUVに封入し,浸透圧ショックを加えることで分裂様の変形を誘起した.また,細胞内の混雑環境を模擬するため,分子量20k Daのポリエチレングリコール(PEG)を08wt%の濃度で共封入し,その影響を調べた.