hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質分子膜を用いるイオン選択性電極の開発

申請書記載の実施計画に基づいた研究により以下の成果を得た.特に(3)については,本研究経費により購入した電気信号取得・解析装置を用いて得られたものである.1.貼り合わせ法により作製した脂質二分子膜中に種々の人工カチオンレセプタ-(ビス(12ークラウンー4)),ビス(15ークラウンー5),長鎖ビピリジル誘導体,ETH(001等)を包埋した電極を作製し,電位応答を調べた.検討条件下で(i)Nernst応答を生起する場合(ビス(12ークラウンー4))及び(ii)電位応答を引き起こさない場合(その他のレセプタ-)に分類できることが見出された.このような挙動は従来の液膜系とは明らかに異なり,脂質二分子膜の特性が反映されている(日本分析化学会北海道支部1991年冬季研究発表会講演要旨集,p.84).2.バリノマイシンを包埋した人工脂質単分子膜界面におけるホストーゲスト相互作用を表面圧ー面積曲線から観察し,K^+イオンとバリノマイシンとの錯形成は膜表面電荷によって制御され,錯形成には負の電荷をもつ脂質が必要であることを初めて明らかにした(Langmuir,投稿中).この成果は分子膜界面での物質認識システムを設計する上で重要な指針を与える.3.電荷をもつ人工脂質単分子膜が気/液界面で示す表面電位を実測し表面電位に及ぼす脂質双極子と表面電荷により構成される電気二重層の寄与を分離することに成功した.さらに,中性分子によって引き起こされる脂質単分子膜の表面電位変化の機構を明らかにした.この成果は,中性分子に応答する分子膜電極を開発する上で重要な知見である.申請書記載の実施計画に基づいた研究により以下の成果を得た.特に(3)については,本研究経費により購入した電気信号取得・解析装置を用いて得られたものである.1.貼り合わせ法により作製した脂質二分子膜中に種々の人工カチオンレセプタ-(ビス(12ークラウンー4)),ビス(15ークラウンー5),長鎖ビピリジル誘導体,ETH(001等)を包埋した電極を作製し,電位応答を調べた.検討条件下で(i)Nernst応答を生起する場合(ビス(12ークラウンー4))及び(ii)電位応答を引き起こさない場合(その他のレセプタ-)に分類できることが見出された.このような挙動は従来の液膜系とは明らかに異なり,脂質二分子膜の特性が反映されている(日本分析化学会北海道支部1991年冬季研究発表会講演要旨集,p.84).2.バリノマイシンを包埋した人工脂質単分子膜界面におけるホストーゲスト相互作用を表面圧ー面積曲線から観察し,K^+イオンとバリノマイシンとの錯形成は膜表面電荷によって制御され,錯形成には負の電荷をもつ脂質が必要であることを初めて明らかにした(Langmuir,投稿中).この成果は分子膜界面での物質認識システムを設計する上で重要な指針を与える.3.電荷をもつ人工脂質単分子膜が気/液界面で示す表面電位を実測し表面電位に及ぼす脂質双極子と表面電荷により構成される電気二重層の寄与を分離することに成功した.さらに,中性分子によって引き起こされる脂質単分子膜の表面電位変化の機構を明らかにした.この成果は,中性分子に応答する分子膜電極を開発する上で重要な知見である.
少年団－中学校運動部活動－地方競技団体の連携システム構築

平成30年度に実施した調査は、次の6点である。1)茨城県バスケットボールスクール参加者へのアンケート調査:茨城県バスケットボール協会主催のバスケットボールスクールにおいて、参加者および保護者へのアンケート調査を実施した。中学校における運動部活動の制限の影響で、地域クラブでの活動を指向する声が出ており、調査内容の見直しを行うこととした。2)運動部活動適正化モデル校実践事例集:茨城県教育庁学校教育部保健体育課主催の「運動部活動適正化モデル校美野里中学校スーパーバイザー」として、これまでの研究成果を踏まえた指導実践の援助を行い、その成果を公表した(茨城県教育委員会>学校体育>運動部活動>運動部活動適正化モデル校の実践事例集)。3)コロラド州ならびにニューメキシコ州の育成システムの調査:アメリカ合衆国コロラド州デュランゴにあるFort Lewis Collegeを拠点に地域のスポーツ活動を調査した。また、ニューメキシコ州で開催されたネイティブアメリカン居住地での子どものスポーツ活動支援団体主催のコーチ研修会に参加し、地域コミュニティ作りに果たすスポーツ活動の役割を調査することができた。4)茨城大学社会連携センター主催の「プロスポーツとの連携による茨城・水戸の地域活性化」において、これまでの研究成果をふまえたテーマでシンポジウムを開催し、進行役として議論を深めることができた。シンポジウムの内容を公開する予定である。5)昨年度に引き続き平成24・25年度のバスケットボールスクール参加者への追跡調査を実施するための基本データ収集を行った。急激に変化する運動部活動をとりまく状況を踏まえて、調査内容の見直しを図った。6)日本バスケットボール協会指導者養成部門、茨城県バスケットボール育成部の活動を調査し、急激に変化する地域スポーツへの対応について聞き取りを行った。少年団をめぐる状況、中学校運動部活動の在り方が問われる社会状況の変化、地方競技団体における一般社団法人化など、本研究に取り組みはじめたときからこの2年間で著しく変化している。特に、指導者のインテグリティが問われ、働き方改革が進行し、中央競技団体、地方競技団体や都道府県教育委員会に求められている社会的要請が高まる中で、従来のようなボランティアを中心としたスポーツ指導者の限界が見えつつある。本研究課題を申請した時点と現在の状況があまりにも変化していることから、研究フレームを修正しつつ、調査を実施してきたが、本質に迫る調査には至っていない。そうした状況の中で、今年度実施したネイティブアメリカン居住区での研修会参加は、あらためて地域のコミュニティづくりにこどもたちのスポーツ活動が欠かせないことを実感させられる出来事であり、スペインをはじめとするこれまでの海外調査を総括し、激変する日本の地域スポーツ活動の在り方を見つめなおす契機となった。来年度の総まとめに向けて、その方向性を定められたことは、当初の予定を上回る収穫であった。来年度は、これまでの調査や研究成果を取りまとめる。当初の研究課題設定時の仮説とは、大幅に異なる研究成果を発表することになるが、研究課題の現代性を鑑みると、おおむね順調に進展していると判断することができる。昨年度のスペイン現地調査の結果やバスケットボールスクールの指導内容を踏まえて、運動部活動適正化モデル事業に着手し、一定の成果を得ることができたことは、県教育庁学校教育部でも評価され、さらなる事業展開を依頼されている。本研究課題との整合性について担当者の理解も得られていることから、中学校運動部活動を支えている行政との連携をこれまで以上に深めることができる。一昨年度実施した中学校運動部活動顧問教員に対する調査結果を踏まえた上で、あらたな調査を実施する方策である。過去に実施した茨城県バスケットボールスクール参加者に対する追跡調査を実施する体制が7割ほど整ったので、新たなフレームワークでの調査を実施し、早急に結果をとりまとめる方策である。プロスポーツチームのユースとしてのクラブチームと少年団の延長としてのクラブチームと従来からある一般のクラブチームが育成年代を取り込みはじめた状況を鑑み、それぞれの実態を把握し、その問題点を明らかにしたうえで、少年団と中学校運動部活動と地方競技団体がどのように連携しながら地域スポーツクラブを支えたらよいのかについて、その指針を提案する予定である。その指針に沿って、地方競技団体の施策を講じることによる効果や成果については、本研究課題をとりまとめた上で、次期研究課題として検証していきたい。平成29年度に実施した調査は以下のとおりである。1)茨城県バスケットボールスクール参加者への調査:茨城県バスケットボール協会主催のバスケットボールスクールにおいて参加者および保護者へのアンケート、ならびにスクール担当指導者への聞き取り調査を実施した。過去のデータとの比較検討を行ない発表する予定である。2)中学校運動部活動顧問教員への調査:「運動部活動の在り方に関する総合的なガイドライン」がスポーツ庁から示されるとの情報を受けて、茨城県教育委員会と連携して、ICCEが提唱する新しいコーチングフレームワークを参考に作成したアンケートを中学校運動部活動顧問教員300人に実施した。有意差検定の結果、担当する運動種目の経験の有無、性別、保健体育教科担当であるかないかが、新たなコーチングフレームワークに則ったコーチングへの可能性に影響することが明らかになった。今後は、因子分析を行い全容を明らかにする。3)スペインの育成システムの調査:スペインマドリッド州内の複数のクラブチームにおいて、育成年代のバスケットボール指導の実地調査、ならびに関係者へのインタビュー、スペインバスケットボール協会指導者養成担当者、マドリッド州バスケットボール協会競技運営担当者、審判養成担当者への聞き取り調査を行った。シーズン(10月6月)中、10歳17歳までのすべてのカテゴリーで最低30試合のリーグ戦をバスケットボール協会主催で毎週行うことによって、コーチも審判もプレイヤーも成長するようなシステムを構築していることが明らかになった。

これは、スペインバスケットボール協会がその方針を決定し、各州にその運営を依頼していた。4)平成24・25年度に茨城県バスケットボールスクールに参加したことのある高校生への調査を実施するため、その基本データ(進学先、部活動への参加の有無やその活動実績)の収集の準備に取り掛かった。過去の茨城県バスケットボールスクール参加者への追跡調査は、個人情報保護の観点から慎重に行う必要性があり、手続きを重視しているためデータ収集にまで至らず、その準備段階にとどまった。しかしながら、茨城県教育委員会の協力を得て、運動部活動顧問教員に対してアンケート調査を実施することができたことは、予想以上の成果であった。茨城県バスケットボールスクール参加者及びその保護者へのアンケートを実施することができたことやスペインバスケットボール協会とマドリッド州バスケットボール協会の協力を得て担当者へのインタビュー調査ができたことやマドリッド市内及び周辺のクラブチームの育成内容について詳細に現地調査をすることができたことは、当初の予定を上回る収穫であった。なお、当初予定していたリトアニアの現地調査は、通訳の都合が日程的に合わなかったため断念し、スペイン調査に専念した。平成30年度に実施した調査は、次の6点である。1)茨城県バスケットボールスクール参加者へのアンケート調査:茨城県バスケットボール協会主催のバスケットボールスクールにおいて、参加者および保護者へのアンケート調査を実施した。中学校における運動部活動の制限の影響で、地域クラブでの活動を指向する声が出ており、調査内容の見直しを行うこととした。2)運動部活動適正化モデル校実践事例集:茨城県教育庁学校教育部保健体育課主催の「運動部活動適正化モデル校美野里中学校スーパーバイザー」として、これまでの研究成果を踏まえた指導実践の援助を行い、その成果を公表した(茨城県教育委員会>学校体育>運動部活動>運動部活動適正化モデル校の実践事例集)。3)コロラド州ならびにニューメキシコ州の育成システムの調査:アメリカ合衆国コロラド州デュランゴにあるFort Lewis Collegeを拠点に地域のスポーツ活動を調査した。また、ニューメキシコ州で開催されたネイティブアメリカン居住地での子どものスポーツ活動支援団体主催のコーチ研修会に参加し、地域コミュニティ作りに果たすスポーツ活動の役割を調査することができた。4)茨城大学社会連携センター主催の「プロスポーツとの連携による茨城・水戸の地域活性化」において、これまでの研究成果をふまえたテーマでシンポジウムを開催し、進行役として議論を深めることができた。シンポジウムの内容を公開する予定である。
Yb系重い電子化合物における新しい量子臨界性と超伝導

近年、"量子臨界点近傍に形成される新しい量子相"としての異方的超伝導と非フェルミ液体に大きな関心が集まっている。強相関電子系において、典型例としてこれまでCe系の重い電子系が主に研究されてきたが、本研究では我々のグループにより発見された新物質のYb系の重い電子超伝導体β-YbAlB_4およびその類縁物質を対象とし、この系の示す量子臨界性と超伝導の研究を行った。まず、β-YbAlB_4の純良試料に対し常圧下の精密磁化測定を行い、零磁場近傍における磁化の発散的挙動を詳細に調べた。その結果、磁化がT/Bスケーリングを示し、実験精度(数G)の範囲内で実質的に零磁場量子臨界点が実現していることが分かった。このようなコントロールパラメータのチューニングを必要としない、いわば、自発的な量子臨界現象の発現は、金属において初めての現象であり、量子臨界相の可能性を強く示唆する興味深い結果である。また、β-YbAlB_4および類縁物質のα-YbAlB_4はともに価数揺動系であるが、価数揺動の温度スケール約200K以下でも整数価数の近藤格子の様に振舞うことが分かった。この振舞いの起源を明らかにするため、Lu希釈系α-,β-Yb_<1-x>Lu_xAlB_4を作成し、Ybのサイト間相関の効果を明らかにする実験を行った。その結果、希釈によってα型、β型共に、低温の近藤格子的な磁化の寄与および比熱が減少し、x0.6程度で近藤格子的な振舞いが消失することを明らかにした。さらに、α-YbAlB_4の電気伝導度の異方性からこの系でc-f混成が異方的である可能性を明らかにした。α-YbAlB_4のAlサイトにFeをドープした場合、磁気転移が出現する。このとき、わずか1%程度ドープした系では磁気転移が抑えられ、β型の常圧零磁場と良く似た量子臨界性を示す等、ドーピングにより量子臨界点が実現することが分かってきた。強相関電子系において、典型例としてこれまでCc系の重い電子系が主に研究されてきたが、本研究では我々のグループにより発見された新物質のYb系の重い電子超伝導体β-YbAlB_4およびその類縁物質を対象とし、この系の示す量子臨界性と超伝導の研究を行う。初年度はまず、常圧下の精密磁化測定から、この系が零磁場近傍で示す磁化の発散的挙動の詳細を調べ、磁化(の温度微分)がT/Bスケーリングを示すことを明らかにした。この結果から、この系の量子臨界性が、スピン揺らぎの理論で説明のできない非従来型であり、さらに、実験精度の範囲内で実質的に零磁場量子臨界点が実現していることが分かった。現在進行中の圧力下の電気伝導度、交流帯磁率測定と合わせて、量子臨界相の実現の可能性等を検証したい。また、類縁物質のα-YbAlB_4について、その純良化に成功し、低温でSdH振動の観測にも成功した。この純良試料を用いて常圧下の低温物性測定を行った結果、零磁場での基底状態がβ-YbAlB_4と異なりフェルミ液体であること、さらに3T程度の磁場下でメタ磁性を示すこと等が明らかになった。さらにα-YbAlB_4のAlサイトにFeをドープした場合、磁気転移が出現する。このとき、わずか1%程度ドープした系では磁気転移が抑えられ、顕著な非フェルミ液体性を示すなど、ドーピングにより量子臨界点が実現することが分かってきた。今後、この量子臨界点の起源と、β-YbAlB_4における零磁場量子臨界点との関係について明らかにしたい。

その結果、希釈によってα型、β型共に、低温の近藤格子的な磁化の寄与および比熱が減少し、x0.6程度で近藤格子的な振舞いが消失することを明らかにした。さらに、α-YbAlB_4の電気伝導度の異方性からこの系でc-f混成が異方的である可能性を明らかにした。α-YbAlB_4のAlサイトにFeをドープした場合、磁気転移が出現する。このとき、わずか1%程度ドープした系では磁気転移が抑えられ、β型の常圧零磁場と良く似た量子臨界性を示す等、ドーピングにより量子臨界点が実現することが分かってきた。
染色体ストレス応答におけるクロマチンリモデリング因子の役割

ファンコニ貧血(FA)の原因遺伝子群の構成するFA経路は、DNAクロスリンク(ICL)修復と染色体ストレス応答に必須の役割を果たす。本研究課題では、FA経路とクロマチン制御因子がカップリングする可能性を想定し、以下の研究を行った。1)FA経路の中心タンパク質FANCD2のヒストンシャペロン活性の検討。詳細な表現型解析により、昨年度同定した点突然変異体(RK変異体)を含め、これまで分離したFANCD2 C末端領域のヒストンシャペロン変異体は、いずれも同時にFANCD2のモノユビキチン化が抑制されることが判明した。このため、FANCD2の機能分離変異体の単離を試みた。検討の結果、FANCD2が正常にモノユビキチン化され、ヒストンシャペロン活性が著減するヒトFA患者由来のFANCD2 R302W(トリではR305W)変異体を見いだした。その解析から、FANCD2のヒストンシャペロン活性は、クロマチン上で働くFANCD2の機能であること、また、この活性は直接クロマチンの動的変化を制御することが結論され、これらの成果を論文として発表した。2)FA経路とクロマチンリモデリング複合体Swi/Snfとの機能連携の検討。ヒトHeLa細胞を用い、Swi/Snf複合体のBrg1, Brm, SNF5のsiRNAによるノックダウンを行い、細胞の表現型解析により直接的にFA経路との機能連携を検討した。いずれの細胞も、DNAダメージによるFANCD2モノユビキチン化は正常であり、ICL薬剤に対する感受性にも顕著な差はなかった。従ってICL修復においては、FA経路分子とSwi/Snf複合体の機能連携の寄与は大きくないと結論される。加えて、Brg1欠損細胞であるH1299細胞にBrg1を再発現させた細胞を構築し、両者を比較したが、優位な差は見られず、上のノックダウン実験の結論を支持する結果が得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請者が研究してきた遺伝病「ファンコニ貧血(FA)」の原因遺伝子群の構成するFA経路は、DNAクロスリンク(ICL)修復と染色体ストレス応答に必須の役割を果たし、発がんや早期老化、幹細胞不全などの重篤な疾患状態の原因となるため、医学的に重要な研究課題である。ICL修復には、FA経路のみならず、DNA組換え修復、損傷乗越え複製、ヌクレオチド除去修復、チェックポイント応答機構などの分子機構が密接かつ機能的にカップリングする必要がある。我々は、FA経路を中心としたICL修復とクロマチン制御因子のカップリングの可能性を想定した。本研究では、以下の2つの課題を設定した。1)FA経路の中心タンパク質FANCD2のヒストンシャペロン活性変異体の作製を行い、その活性の本質的役割を明らかにする。2)従来FAとの関連が指摘されているクロマチンリモデリング複合体Swi/SnfとFA経路との機能連携の可能性ついて解析する。1)の研究課題では、FANCD2のヒストンシャペロン活性について、欠失変異体を用いた解析から、ヒストン結合領域をFANCD2のC末端付近に同定した。さらに、このC末端部分の中、に種を超えて保存された領域を見いだした。加えて、その中でも特に保存性の高いアミノ酸残基に着目し、複数の置換変異体を作製、解析した。その中の1つは、ヒストン結合能やin vitroのヌクレオソーム・アセンブリー活性が著減しており、現在、その変異体についてさらに解析中である。次に2)の課題では、FA経路分子FANCAとSwi/Snf複合体のATP分解サブユニットの1つBrg1との会合が報告されており、また我々自身,FANCD2の会合分子候補としてコアサブユニットであるSNF5を見いだしたことから、FA経路とSwi/Snf複合体に関連性について解析した。Brg1とは異なるSwi/SnfのATP分解サブユニットであるBlmを加え、yeast two-hybrid法を用いて、Brg1,BlmSNF5とFA経路分子との相互作用を網羅的に検討した。既存の分子間の相互作用に加え、新規の相互作用を複数見いだしており、さらに詳細に解析している。ヒト

HeLa細胞を用い、Swi/Snf複合体のBrg1, Brm, SNF5のsiRNAによるノックダウンを行い、細胞の表現型解析により直接的にFA経路との機能連携を検討した。いずれの細胞も、DNAダメージによるFANCD2モノユビキチン化は正常であり、ICL薬剤に対する感受性にも顕著な差はなかった。従ってICL修復においては、FA経路分子とSwi/Snf複合体の機能連携の寄与は大きくないと結論される。加えて、Brg1欠損細胞であるH1299細胞にBrg1を再発現させた細胞を構築し、両者を比較したが、優位な差は見られず、上のノックダウン実験の結論を支持する結果が得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した平成23年度の研究計画のうち、1)FANCD2のヒストンシャペロン活性については、首尾よく狙い通りの置換変異体の分離に成功した。当初の計画以上に進展していると言ってよい状況である。計画2)については交付申請書の研究計画では、Swi/Snf複合体の欠損細胞の作製・解析としていたが、その前提となるSwi/Snf複合体とFA経路の相互作用の全貌を把握する実験が未実施だったため、研究内容を上のように変更した。申請書の「研究目的」に照らすと達成度は、おおむね順調に進展していると言える。以上を総合的に考え、(2)と評価した。上の研究課題1)については、現在の方策を継続することで目的は達成されると予想される。本年度の研究で同定した変異体の解析をさらに進めるとともに、同様の手法で新たな変異体の探索を行っていく。2)の課題についても、本年度の研究計画の修正により新たな知見が得られおり、この方策でさらに解析を進める。
シリコン基板上に成長した金属ナノクラスターアレイの量子サイズ効果と電子状態の研究

(1)独自に設計した「Al蒸着源」の改良を繰り返し,難しいとされた安定的な蒸着に成功した。また,所属受け入れ先を今年度4月から変更し,真空部品を取り扱う道具が不足していたため,表面ナノ構造作成と解析を行えるように整備した.(2)Al/Si(111)系表面構造の蒸着温度・Al膜厚依存性をSTM観測により詳細に調べ,これまで確認されていない半単位格子ナノクラスター発見し,このナノ構造体がAl原子15個,Si原子6個から構成されることが判明した.さらには,このナノ構造体がAlナノクラスターからγ相へ変化する中間状態として存在し,これまで明瞭な報告例のないγ相の表面構造をも明らかにすることができた,これらの研究成果を雑誌論文(Physical Review B)にも投稿し,受理された.(3)Alナノクラスターの表面電子状態をSTM/STS観測によって,高い表面絶縁性を示し,極性の異なるSi(n・p型)表面上のAlナノクラスターが異なる表面電子状態を発見した,その理由が,探針誘導バンドベンディング効果を考慮した計算シミュレーションからキャリア濃度の変化と表面状態密度の減少が起因していることを明らかにした,これらの研究成果を雑誌論文(Physical Review B)に投稿予定である.(4)Alナノクラスター表面相上にCoを蒸着させることにより,さらにサイズが均一なCo金属クラスターの作成に成功した.この表面電子状態をSTM/STS観測したところ,Alナノクラスターより金属的な性質を示し,さらには特徴的なトンネルスペクトルを観測できた.また,このCoクラスターがAlナノクラスターを形成させずにSi基板に直接Coを蒸着させた場合に形成されるCoSi2クラスターとは異なり2×2表面相を示さない形成プロセスを確認し,STSスペクトルからも全く異なるスペクトルを検出した.このCoクラスターとCoSi2クラスターの構造的な違いを知るために,高エネルギー加速器研究機構(KEK)のフォトンファクトリービームライン18A(PFBL-18A)の高輝度放射光源を用いた内殻光電子スペクトルから両クラスターとSi基板間の界面構造が異なることを示唆するスペクトルを得ることができた.今後は,これらの内殻光電子スペクトル結果から得られたスペクトルを元に光電子回折実験を行い,Coクラスターの原子構造を明らかにして雑誌論文に投稿する予定である.(5)Coクラスターはこれまでの研究から低温40K以下で強磁性体を示すことが明らかになっていることから,この表面で強磁場中本年度はSi表面上のナノ構造体の表面構造・電子状態を解明する目的で以下のとおり実施した.(1)独自に設計した「STM探針加熱ホルダー」でSTM探針のクリーニングを行い,STM測定時の高安定・高信頼性・高分解能を実現でき,また,不純物ガスの発生を抑えた「Al蒸着源」を作成し,その有用性を確かめた.さらには,STMと光電子分光アナライザーを接続した複合測定システムを構築し,信頼性の高い表面電子構造の測定に成功した.尚,「試料輸送用マニュピレータ」は試料準備槽を金銭面の問題から準備することができず,購入を見送った.(2)Al/Si(111)系表面構造の蒸着温度・Al膜厚依存性をSTM観測により詳細に調べ,これまで確認されていない半単位格子ナノクラスター発見し,このナノ構造体がAl原子15個,Si原子6個から構成されることが分かった.さらには,.このナノ構造体がAlナノクラスターからγ相へ変化する中間状態として存在し,これまで明瞭な報告例のないγ相の表面構造をも明らかにすることができた.これらの研究成果は国内学会(1件)で発表し,雑誌論文にも投稿している.(現在査読中).(3)Alナノクラスターの表面電子状態をSTM/STS観測によって,高い表面絶縁性を示すことが分かった.また,極性の異なるSi(n・p型)表面上のAlナノクラスターが異なる電子状態を示し,その理由を探針誘導パンドベンディング効果を考慮した計算シミュレーショシから,キャリア濃度の変化と表面状態密度の減少が起因していることを明らかにした.これらの研究成果は国際・個内学会(計4件)で発表し,雑誌論文を執筆中である.これまでの成果報告を元に,来年度は絶縁体Alナノクラスター上に磁性体金属ナノクラスターを新なに作成し,クラスター間の電気磁気特性を測定することによって,ナノデバイス今野での有益な応用技術となるような研究成果を生み出したい.(1)独自に設計した「Al蒸着源」の改良を繰り返し,難しいとされた安定的な蒸着に成功した。また,所属受け入れ先を今年度4月から変更し,真空部品を取り扱う道具が不足していたため,表面ナノ構造作成と解析を行えるように整備した.(2)Al/Si(111)系表面構造の蒸着温度・Al膜厚依存性をSTM観測により詳細に調べ,これまで確認されていない半単位格子ナノクラスター発見し,このナノ構造体がAl原子15個,Si原子6個から構成されることが判明した.

さらには,このナノ構造体がAlナノクラスターからγ相へ変化する中間状態として存在し,これまで明瞭な報告例のないγ相の表面構造をも明らかにすることができた,これらの研究成果を雑誌論文(Physical Review B)にも投稿し,受理された.(3)Alナノクラスターの表面電子状態をSTM/STS観測によって,高い表面絶縁性を示し,極性の異なるSi(n・p型)表面上のAlナノクラスターが異なる表面電子状態を発見した,その理由が,探針誘導バンドベンディング効果を考慮した計算シミュレーションからキャリア濃度の変化と表面状態密度の減少が起因していることを明らかにした,これらの研究成果を雑誌論文(Physical Review B)に投稿予定である.(4)Alナノクラスター表面相上にCoを蒸着させることにより,さらにサイズが均一なCo金属クラスターの作成に成功した.この表面電子状態をSTM/STS観測したところ,Alナノクラスターより金属的な性質を示し,さらには特徴的なトンネルスペクトルを観測できた.また,このCoクラスターがAlナノクラスターを形成させずにSi基板に直接Coを蒸着させた場合に形成されるCoSi2クラスターとは異なり2×2表面相を示さない形成プロセスを確認し,STSスペクトルからも全く異なるスペクトルを検出した.このCoクラスターとCoSi2クラスターの構造的な違いを知るために,高エネルギー加速器研究機構(KEK)のフォトンファクトリービームライン18A(PFBL-18A)の高輝度放射光源を用いた内殻光電子スペクトルから両クラスターとSi基板間の界面構造が異なることを示唆するスペクトルを得ることができた.今後は,これらの内殻光電子スペクトル結果から得られたスペクトルを元に光電子回折実験を行い,Coクラスターの原子構造を明らかにして雑誌論文に投稿する予定である.(5)Coクラスターはこれまでの研究から低温40K以下で強磁性体を示すことが明らかになっていることから,この表面で強磁場中
組織培養汚染マイコプラズマ検出用の合成オリゴヌクレオチドプロ-ブの開発と応用

組織培養にはさまざまなマイコプラズマが重度に汚染するとがあるため、憂慮すべき事態となっている。たとえば、(1)マイコプラズマに汚染された組織培養養においては培養細胞1個に10^210^3個のマイコプラズマが付着するために、培養細胞のDNAを組換えDNA実験のDNA源とした場合には、その2.525%がマイコプラズマ由来となるため、「実験指針」に低触するような過ちを犯すことがあること、(2)マイコプラズマはヌクレオシドホスホリラ-ゼ活性を有するため、ミエロ-マ細胞に汚染するとハイブリド-マ作出時のHAT培地での選択効率が著しく低下するなど、重大な問題を生起する。本研究ではこのように組織(細胞)培養を汚染するマイコプラズマを合成オリゴヌクレオチドプロ-ブを用いて検出することを目的としている。そこでマイコプラズマ・カプリコラムの5Sリボソ-ムRNAの中からル-プ構造の領域に相補的な24塩基(5'-CTAACTTCTGTGTTCGGCATGGGA-3')から成るオリゴヌクレオチドを化学合成し、これをビオチンにより標識してドット・ブロット法によるDNA-RNAハイブリダイゼ-ションを行ったところ、ビオチンが培養細胞由来のタンパク質と反応するため非特異現象が認められ、実用に適さないことが判明した。次いでアルカリホスファタ-ゼによる酵素標識を行ったところ、酵素分子が合成オリゴヌクレオチドに比較して大き過ぎるため立体障害を起こし、核酸間のハイブリット形成率が低下することが明らかになった。これまでの研究ではアイソト-プ標識によるプロ-ブの検出感度が最も高いという結果が得られているが、放射性物質であるため取り扱いが不便であるので、今後は検出方法をポリメラ-ゼ連鎖反応(PCR)に変更して実用化を計る必要があろうと思われた。組織培養にはさまざまなマイコプラズマが重度に汚染するため、憂盧すべき事態となっている。たとえば(1)マイコプラズマに汚染された組織培養では培養細胞1個に10^210^3個のマイコプラズマが付着するために、培養細胞のDNAを組換えDNA実験のDNA源とした場合には、その2.525%がマイコプラズマ由来となるため、「実験指針」に抵触するような過ちを犯すことがあること、(2)マイコプラズマはヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有するため、ミエローマ細胞に汚染するとハイブリドーマ作出時のHAT培地での選択効率が著しく低するなど、重大な問題を生起する。本研究はこのように組織培養を汚染するマイコプラズマを菌種レベルで同定するために、各菌種のリボゾームRNAの塩基配列の中でその菌種に固有の領域を選択し、それに相補的な約25塩基からなるオリゴヌクレオチドを化学合成し、ビオチンもしくはハプテン等による非放射性標識を施し、プローブを作成することを初年度の目的とした。最初に化学合成したヌクレオチドはM.capricolumの5SRNAの中からループ領域に相当する25塩基に相補的な配列から成る。これをビオチン標識してプローブを作成し、ドット・ブロット法によるDNA-RNA交雑試験を行ったところ、ビオチンが細胞由来のタンパク質と反応するため非特異反応が認められ、実用性に乏しいことが判明した。そこで、アルカリホスファターゼによる酵素標識に切り代えて、DNA-RNA交雑試験を行ったところ、良好な成績が得られた。アルカリホスファクターゼ標識プローブはアイソトープ標識プローブに比べて1001000倍感度が低いが、安全性が高く、長期間保存できるなどの利点を有しており、しかも、最近開発されたPCR(polymerase chain reaction)法による標的DNAの増幅技術を応用することで、実用化可能と判断された。次年度はPCR法も含めて検討する予定である。

組織培養にはさまざまなマイコプラズマが重度に汚染することがあるため,憂慮すべき事態となっている。たとえば,(1)マイコプラズマに汚染された組織培養においては培養細胞1個に10^210^3個のマイコプラズマが付着するために,培養細胞のDNAを組換えDNA実験のDNA源とした場合には,その2.525%がマイコプラズマ由来となるため,「実験指針」に抵触するような過ちを犯すことがあること,(2)マイコプラズマはヌクレオシドホスホリラ-ゼ活性を有するため,ミエロ-マ細胞に汚染するとハイブリド-マ作出時のHAT培地での選択効率が著しく低下するなど,重大な問題を生起する。本研究はこのように組織(細胞)培養を汚染するマイコプラズマを合成オリゴヌクレオチドプロ-ブを用いて検出することを目的としている。そこでマイコプラズマ・カプリコラムの5Sリボソ-ムRNAの中からル-プ構造の領域に相補的な24塩基(5′-CTAACTTCTGTGTTCGGCATGGGA-3′)から成るオリゴヌクレオチドを化学合成し,これをビオチンにより標識してドット・ブロット法によるDNA-RNAハイブリダイゼ-ションを行ったところ,ビオチンが培養細胞由来のタンパク質と反応するため非特異現象が認められ,実用に適さないことが判明した。次いでアルカリホスファタ-ゼによる酵素標識を行ったところ,酵素分子が合成オリゴヌクレオチドに比較して大き過ぎるため立体障害を起こし,核酸間のハイブリット形成率が低下することが明らかになった。これまでの研究ではアイソト-プ標識によるプロ-ブの検出感度が最も高いという結果が得られているが,放射性物質であるため取り扱いが不便であるので,今後は検出方法をポリメラ-ゼ連鎖反応(PCR)に変更して実用化を計る必要があろうと思われた。
複数波長を放射するフレキシブル光源を用いた皮膚がん向けALA-PDTの研究

皮膚がん治療には、手術・冷凍・外用療法があるが、超高齢化社会をむかえ、身体的負担の低い光線力学的治療(PDT)が注目をあびている。PDTとは、単独では細胞毒性を有しない光増感剤を投与することにより、がん腫瘍組織に選択的に蓄積させ、特定波長の光を照射し組織内部での光化学反応によって生成する活性酸素種を腫瘍組織のみに誘導し、殺細胞する方法である。皮膚がんに対するPDTは、本邦では薬剤も医療機器も現在未承認であり実施されていない。本研究において、薬剤の吸収スペクトラムを応用した複数波長を用いた全く新規の皮膚がんPDTの基盤技術確立に向けた研究を進める。
KRAS変異に制御される遺伝子の機能解析と革新的治療薬の開発

KRAS遺伝子変異は、がんドライバー遺伝子として多くのがん組織で検出され、特に大腸がんでは頻度が高い。したがってKRASを標的にした分子標的薬が開発されれば、その恩恵を受ける患者さんは膨大な数に上る。大腸がんでは、抗EGFR抗体薬が分子標的薬として承認されているが、KRAS野生型症例、という条件が付く。したがって大腸がん患者の約半数を占めるKRAS変異を持つ患者には、利益(延命効果や縮小効果、等)が得られない。KRAS遺伝子は細胞内シグナルネットワークの中心分子で、KRASを直接標的とする薬剤は体内で他のタンパク質と予期せぬ反応を示し、がん細胞の増殖に有利な条件を獲得する可能性も指摘されていることから、KRAS変異の下流で機能するシグナル経路に的を絞って治療薬開発を進める。しかしながら、日本人がん患者におけるRASシグナル経路の遺伝子変異や遺伝子発現の異常を同時に網羅的に解析した体系的な研究が不足している。2018年度においては、大腸がん906例について、全エクソン領域のシークエンシング(WES)およびがん関連409遺伝子を対象としたディープシークエンシング(CCP)を行い、同時に網羅的遺伝子発現解析を行った。KRAS変異は、大腸がんの41.0%(372/906)に認め、WESとCCPの一致率は91.4%であった。コドン12の変異は64.5%と最も高く、次いでコドン13(20.2%)、146(8.1%)、61(2.7%)、117(2.7%)、59(1.1%)、22(0.8%)の順であった。KRAS野生型大腸がん534症例では、変異型症例に比較してBRAF、PIK3CG、PIK3CDやNRAS変異の頻度が高かった。既報のRASシグナル経路に含まれる遺伝子を含む体細胞変異および網羅的遺伝子発現解析結果を基盤として、KRAS変異大腸がんに対する有効な治療薬を開発する意義は高い。大腸がんにおける網羅的体細胞変異および遺伝子発現解析によって、約半数の症例においてKRAS変異が認められ、KRAS変異症例においてはPIK3CA変異の頻度が最も高かった(23.1%)。一方、KRAS野生型では、KRAS変異型に比較してBRAF、PIK3CG、PIK3CDおよびNRAS変異の頻度が高く、RALGDSの変異は野生型のみに認められた。KRAS変異型では、RAS遺伝子シグナル伝達経路関連遺伝子の内、CCND1、DUSP2、DUSP4、RAC2、RAC3、SPRY4、RALGDS、RASAL1および転写因子ETS2、JUN、ELK1の発現上昇を認め、これらの遺伝子がKRAS変異大腸がんの創薬の標的となる可能性を示した(第77回日本癌学会発表-2018年)。次に、大腸がんにおいて最も頻度の高いKRASコドン12変異によって制御される新規のより特異的な創薬ターゲットを同定する目的で、KRAS G12変異症例(n=240)とKRAS野生型症例(n=390)を対象として、両者の間で最も発現差を示す遺伝子を探索した。KRAS野生型は、RASシグナル伝達経路に影響を与えると考えられるPIK3CA、PIK3CD、PIK3CGG、RALGDS、RGL1-3、BRAF、ARAF、RAF1およびHRAS、NRASに変異を有する症例は解析から除外した。野生型と比較してG12変異型において2倍以上(かつBenjamini-Hochberg P=1E-07>)の発現差を示す遺伝子は53遺伝子であった。53遺伝子のうち4遺伝子(RASAL1、RHOBTB3、DUSP4、DUSP6)は、既知のKRASシグナル伝達経路の下流遺伝子であった。新たに形質転換や細胞増殖、浸潤に関わるがん遺伝子様の機能を持つ12の候補遺伝子を同定し、KRAS変異を有する大腸がんに対する治療薬の開発を順調に進めている。大腸がんにおけるKRASコドン12の変異は、G12Dが最も頻度が高く、次いでG12V, G12C, G12A, G12S, G12Rの順であった。これら6種類のKRAS変異体蛋白質発現プラスミドを作成した。これらの変異体を正常ヒト細胞株や大腸がん細胞株に遺伝子導入し、前年度に同定したKRAS変異によって制御されている可能性のある12の候補遺伝子について、KRASコドン12変異体の種類により、その遺伝子発現や細胞増殖の促進能に差異があるのか否か明らかにし、KRAS変異をもつ大腸がんの創薬ターゲットの標的遺伝子を絞り込む。一方、KRASコドン12変異体蛋白質発現プラスミドに加え、コドン13、61、117、146、22、59の変異体蛋白質発現プラスミドを作成し、コドン12変異体導入細胞株の遺伝子発現との差異について調べる。特に、大腸がんにおいて頻度の低いコドン22と59の変異については、その形質転換や増殖、浸潤能を中心に網羅的に調べる。以上の結果を基盤として、KRAS変異有無の大腸がん細胞株に、最終的に選択された候補遺伝子のcDNAを組み込んだ蛋白質発現プラスミドを個別に過剰発現、あるいは翻訳制御等の方法でその機能的意義を明らかにする。これらのインビトロの成果をもとに、大腸発がん動物モデルで検証しKRAS変異を有する大腸がんに対する治療薬の開発を目指すが、動物モデルに対する検証は資金不足の可能性があり、その際には新たな研究費を確保した時点で実施する。

したがってKRASを標的にした分子標的薬が開発されれば、その恩恵を受ける患者さんは膨大な数に上る。大腸がんでは、抗EGFR抗体薬が分子標的薬として承認されているが、KRAS野生型症例、という条件が付く。したがって大腸がん患者の約半数を占めるKRAS変異を持つ患者には、利益(延命効果や縮小効果、等)が得られない。KRAS遺伝子は細胞内シグナルネットワークの中心分子で、KRASを直接標的とする薬剤は体内で他のタンパク質と予期せぬ反応を示し、がん細胞の増殖に有利な条件を獲得する可能性も指摘されていることから、KRAS変異の下流で機能するシグナル経路に的を絞って治療薬開発を進める。しかしながら、日本人がん患者におけるRASシグナル経路の遺伝子変異や遺伝子発現の異常を同時に網羅的に解析した体系的な研究が不足している。2018年度においては、大腸がん906例について、全エクソン領域のシークエンシング(WES)およびがん関連409遺伝子を対象としたディープシークエンシング(CCP)を行い、同時に網羅的遺伝子発現解析を行った。KRAS変異は、大腸がんの41.0%(372/906)に認め、WESとCCPの一致率は91.4%であった。コドン12の変異は64.5%と最も高く、次いでコドン13(20.2%)、146(8.1%)、61(2.7%)、117(2.7%)、59(1.1%)、22(0.8%)の順であった。KRAS野生型大腸がん534症例では、変異型症例に比較してBRAF、PIK3CG、PIK3CDやNRAS変異の頻度が高かった。既報のRASシグナル経路に含まれる遺伝子を含む体細胞変異および網羅的遺伝子発現解析結果を基盤として、KRAS変異大腸がんに対する有効な治療薬を開発する意義は高い。大腸がんにおける網羅的体細胞変異および遺伝子発現解析によって、約半数の症例においてKRAS変異が認められ、KRAS変異症例においてはPIK3CA変異の頻度が最も高かった(23.1%)。一方、KRAS野生型では、KRAS変異型に比較してBRAF、PIK3CG、PIK3CDおよびNRAS変異の頻度が高く、RALGDSの変異は野生型のみに認められた。KRAS変異型では、RAS遺伝子シグナル伝達経路関連遺伝子の内、CCND1、DUSP2、DUSP4、RAC2、RAC3、SPRY4、RALGDS、RASAL1および転写因子ETS2、JUN、ELK1の発現上昇を認め、これらの遺伝子がKRAS変異大腸がんの創薬の標的となる可能性を示した(第77回日本癌学会発表-2018年)。次に、大腸がんにおいて最も頻度の高いKRASコドン12変異によって制御される新規のより特異的な創薬ターゲットを同定する目的で、KRAS G12変異症例(n=240)とKRAS野生型症例(n=390)を対象として、両者の間で最も発現差を示す遺伝子を探索した。KRAS野生型は、RASシグナル伝達経路に影響を与えると考えられるPIK3CA、PIK3CD、PIK3CGG、RALGDS、RGL1-3、BRAF、ARAF、RAF1およびHRAS、NRASに変異を有する症例は解析から除外した。野生型と比較してG12変異型において2倍以上(かつBenjamini-Hochberg P=1E-07>)の発現差を示す遺伝子は53遺伝子であった。
クリスタルエンジニアリングに基づく新規光学分割剤の開発

分割剤の芳香環、水酸基およびアミノ基の相対的な位置関係が、結晶構造および分割能に与える影響について検討することを目的として、トランス-1-アミノ-2-インダノ-ル(1)およびトランス-2-アミノ-1-インダノ-ル(2)を用いた2-アリ-ルアルカン酸の光学分割について検討を行った。その結果、1は芳香環にベンゼン環を含む酸に対してはほとんど分割能を示さなかったが、ナフタレン環を含む酸に対し比較的高い分割能を有していた。この場合、難溶性塩結晶中では、1のアミノ基、水酸基と酸のカルボキシレート基により強固なカラム状の水素結合ネットワークが形成されていた。さらに、カルボン酸のナフタレン環間に働くCH・・・π相互作用が難溶性塩を安定化させる上で重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、2は2-アリールアルカン酸のうちアルファ位の置換基がメチル基のものに対し比較的高い分割能を有していた。この場合、難溶性塩結晶中では共通して、2のアミノ基と酸のカルボキシレート基により強固なカラム状の水素結合ネットワークが形成されていた。さらに、結晶中には水分子が取り込まれ、2の水酸基、水分子、酸のカルボキシレート酸素の間に水素結合が形成されることにより、結果的に強固な平面状水素結合ネットワークが形成されていた。このように、分割剤の芳香環および水素結合性置換基の相対的位置関係が、晶出するジアステレオマー塩中で形成される水素結合ネットワークの形状に大きく影響し、結果的に分割成績に大きな影響を与えることがわかった。塩基性分割剤として光学活性シス-2-アミノ-1-インダノールを用い,2-アリールアルカン酸の光学分割を系統的に行なった。その結果,この光学活性アミノアルコールは広範な2-アリールアルカン酸に対して優れた分割能を有することが分かった。続いて,X線結晶構造解析により,高い分割効率を与えた場合に優先的に晶出した難溶性塩の結晶構造を詳細に検討した。その結果,いずれの難溶性塩結晶中でも,極めて特徴的なカラム状水素結合ネットワークが形成されていることを見出した。このカラム状水素結合ネットワーク中ではカルボキシレート酸素,アンモニウム水素およびアミノアルコールの水酸基により,強固な水素結合が形成されていることが分かった。また,カラム状水素結合ネットワーク間のパッキングは,主としてCH・・・π結合により安定化されていた。次に、易溶性塩結晶について安定性を検討した結果,易溶性塩結晶は、水素結合およびCH・・・π結合いずれの点からも、対応する難溶性塩と比較して安定性に劣るということが分かった。これらの結果から,シス-2-アミノ-1-インダノールによる2-アリールアルカン酸の不斉識別においては,カラム状水素結合ネットワークの形成が本質的に重要であり,難溶性塩/易溶性塩の安定性の差は水素結合およびCH・・・π結合の強弱により生じていることが分かった。今後は,分割剤の芳香環,水酸基およびアミノ基の相対的な位置関係が,結晶構造および分割能に与える影響について検討することを目的として,トランス-2-アミノ-1-インダノールおよびトランス-1-アミノ-2-インダノールを用いた2-アリールアルカン酸の光学分割について検討を行なう予定である。
癌幹細胞に発現するTRPV2チャネルを標的とした食道癌新規治療法の開発

平成30年度は、TRPV2が高発現することを既に確認済みである、ヒト食道癌細胞株:TE15、KYSE170を用いて、TRPV2 siRNAのトランスフェクションを行い、細胞増殖抑制効果・アポトーシス増強効果、細胞遊走・浸潤能抑制効果を確認した。また、TRPV2のノックダウンにより、EMT関連蛋白であるSnailの低下と、Apoptosis関連蛋白であるCleaved Caspase3の増加が確認された。更に、TRPV2 siRNAを導入したTE15細胞株の遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析した。Ingenuity Pathway Analysisの結果では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達系に遺伝子発現変化を認めた。現在、TRPV2とWnt pathwayの相互作用機序を解明するため、更なる関連遺伝子発現解析を進めている。また、食道扁平上皮癌細胞株TE4、TE8、膵癌細胞株PK59から癌幹細胞を抽出・培養することに成功し、その遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析した。何れの癌幹細胞株においてもTRPV2の高発現が確認された。また、TE-4、TE-8由来癌幹細胞株に共通して、ATP2A1、ATP2A3、ORAI3などの、他のカルシウムイオンチャネルやトランスポーターが高発現することを見出し、現在、癌幹細胞とカルシウムイオン輸送に関する更なる機能解析を進めている。当初の研究計画のうち、ヒト食道癌組織におけるTRPV2の発現解析、癌細胞におけるTRPV2を介する細胞周期・アポトーシス・細胞浸潤制御機構の解明、Wnt/β-カテニンシグナル伝達系の関与の解明、癌細胞株TE4、TE8からの癌幹細胞抽出・培養と、共通し発現変化する遺伝子の解析は、ほぼ終了している。また、消化器癌における種々のイオン輸送体・pH制御因子の機能解析も進展しており、研究成果は既に国内外の学会で発表し、英文雑誌にも投稿・掲載されている。現在、TRPV2とWnt pathwayの相互作用機序を解明するたの、更なる関連遺伝子発現解析も進行しており、研究目的・研究計画はおおむね順調に進展していると考える。次年度以降は、術前化学療法施行症例を中心に食道組織内TRPV2・癌幹細胞マーカー発現を同様に解析し、化学療法の組織学的効果との相関について検討する。また、TE-4、TE-8由来癌幹細胞株に共通して高発現していることが明らかとなった、ATP2A1, ATP2A3, ORAI3などのカルシウムイオンチャネルやトランスポーターについても、研究を進める。更に、各種抗癌剤(5FU、シスプラチン、ドセタキセル)による抗腫瘍効果が、TRPV2阻害剤トラニラストの併用により増強されるか否かを解析する。また、in vivoにおけるTRPV2制御による皮下腫瘍成長抑制効果、及び抗癌剤併用効果について検討する予定である。平成29年度は、まずヒト食道癌組織におけるTRPV2の発現レベルを解析した。扁平上皮癌組織において、細胞膜・細胞質にTRPV2発現が確認された。TRPV2発現をスコア化し、臨床症例を二群化して比較したところ、TRPV2高発現群の予後が有意に不良であった。次に、種々のヒト食道癌細胞株におけるTRPV2発現を解析し、TE15、KYSE170におけるTRPV2の高発現を確認した。両細胞株において、TRPV2 siRNAをトランスフェクションしたところ、細胞増殖抑制・アポトーシス増強効果を認めた。また、TRPV2 siRNAの導入により、細胞遊走・浸潤能が抑制されることを確認した。現在、TRPV2 siRNAを導入した細胞株の遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析している。また、癌細胞株TE8から癌幹細胞を抽出培養し、網羅的遺伝子発現解析からTRPV2の高発現を見出し、その阻害剤トラニラストの癌幹細胞増殖抑制効果についてまとめ、英文論文として報告した(J Gastroenterol. 2018)。同様の現象を他の細胞株でも再確認するため、TE4からの癌幹細胞抽出・培養に成功し、その遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析している。一方で、食道癌におけるAE1(Oncotarget.2017)、NHE1(Oncotarget.2017)、TRPM7 (Anticancer Res.2017)などのイオン輸送体の機能解析・臨床病理学的意義を解明した。同時に、ヒト胃癌細胞株における低浸透圧殺細胞効果が、カリウムチャネル阻害剤により調節性容積減少(RVD)の抑制を介して増強されることを解明した(Oncotarget.2017)。また、肝細胞癌において、温度刺激が水チャネルAQP5の発現局在・細胞内代謝に与える影響を解明した(Int J Oncol.2017)。当初の研究計画のうち、ヒト食道癌組織におけるCa2+透過性陽イオンチャネルTRPV2の発現解析、癌細胞におけるTRPV2を介する細胞周期・アポトーシス・細胞浸潤制御機構の解明、TE8由来癌幹細胞におけるTRPV2を介する癌幹細胞特異的な増殖抑制効果の検討、新たな癌細胞株TE4からの癌幹細胞抽出・培養などの基礎実験は、ほぼ終了している。現在、TRPV2 siRNAを導入した細胞株や、新たに樹立したTE4由来癌幹細胞株の遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析しており、研究目的・研究計画はおおむね順調に進展していると考える。

平成30年度は、TRPV2が高発現することを既に確認済みである、ヒト食道癌細胞株:TE15、KYSE170を用いて、TRPV2 siRNAのトランスフェクションを行い、細胞増殖抑制効果・アポトーシス増強効果、細胞遊走・浸潤能抑制効果を確認した。また、TRPV2のノックダウンにより、EMT関連蛋白であるSnailの低下と、Apoptosis関連蛋白であるCleaved Caspase3の増加が確認された。更に、TRPV2 siRNAを導入したTE15細胞株の遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析した。Ingenuity Pathway Analysisの結果では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達系に遺伝子発現変化を認めた。現在、TRPV2とWnt pathwayの相互作用機序を解明するため、更なる関連遺伝子発現解析を進めている。また、食道扁平上皮癌細胞株TE4、TE8、膵癌細胞株PK59から癌幹細胞を抽出・培養することに成功し、その遺伝子発現変化をmicroarrayにより網羅的に解析した。何れの癌幹細胞株においてもTRPV2の高発現が確認された。また、TE-4、TE-8由来癌幹細胞株に共通して、ATP2A1、ATP2A3、ORAI3などの、他のカルシウムイオンチャネルやトランスポーターが高発現することを見出し、現在、癌幹細胞とカルシウムイオン輸送に関する更なる機能解析を進めている。当初の研究計画のうち、ヒト食道癌組織におけるTRPV2の発現解析、癌細胞におけるTRPV2を介する細胞周期・アポトーシス・細胞浸潤制御機構の解明、Wnt/β-カテニンシグナル伝達系の関与の解明、癌細胞株TE4、TE8からの癌幹細胞抽出・培養と、共通し発現変化する遺伝子の解析は、ほぼ終了している。また、消化器癌における種々のイオン輸送体・pH制御因子の機能解析も進展しており、研究成果は既に国内外の学会で発表し、英文雑誌にも投稿・掲載されている。現在、TRPV2とWnt pathwayの相互作用機序を解明するたの、更なる関連遺伝子発現解析も進行しており、研究目的・研究計画はおおむね順調に進展していると考える。次年度以降は、術前化学療法施行症例を中心に食道組織内TRPV2・癌幹細胞マーカー発現を同様に解析し、化学療法の組織学的効果との相関について検討する。また、新たに作製した癌幹細胞を解析し、特異的に発現するイオン輸送体を同定する。更に、各種抗癌剤(5FU、シスプラチン、ドセタキセル)による抗腫瘍効果が、TRPV2阻害剤トラニラストの併用により増強されるか否かを解析する。また、癌幹細胞におけるTRPV2・イオン動態を介する細胞周期・アポトーシス制御機構解明を進めるとともに、in vivoにおけるTRPV2制御による皮下腫瘍成長抑制効果、及び抗癌剤併用効果について検討する予定である。