hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上層木の管理は植生の被食耐性を高めるか？資源分配理論からの検証

<シカ不嗜好性植物の防御戦略の特定>前年度に採取した植物種の葉について,サポニン及びアルカロイドの含有量を定量し,不嗜好性植物で高い値を得た。昨年度までの化学分析の結果と総合すると,本調査地のシカ不嗜好性種ではアルカロイド類,サポニンもしくは棘による防御を行うものが多く,縮合タンニン等の量的防御物質の利用は限定的と考えられた。アルカロイドとサポニンの葉中含有率に柵の内外で有意差がなかったことから,シカ不嗜好性植物は,誘導防御ではなく恒常的防御としてこれらの物質を生産すると考えられた。なお,閉鎖林冠下の柵内ではこれらの物質の含有量が他の実験区よりやや低下する傾向がみられ(有意差はなし),資源制限下で採食圧がないと防御投資が減少する可能性が示された。<二次林管理による植生回復の可能性>調査個体のサイズを再測定した結果から成長量を計算し,成長量と防御物質量のバランスに実験処理が与える影響を,主成分分析により検討した。閉鎖林冠下では成長量と防御物質量の両方が制限されていたが,光環境の好転した伐採跡地では,成長量と防御物質量がともに閉鎖林冠下より大きく,改善がみられた。この結果から,シカによって下層植生が消失した放棄二次林において,上層木管理により光環境を改善し,植生回復を補助できることが示された。また伐採跡地では,柵内での優占種(主に高木)は柵外で成長量が小さく,柵外での優占種(草本,低木,小高木)は柵外で成長量が小さかった。この結果は,柵の内外で種間競争と採食圧による成長制限の強度が逆転し,異なる優占種が選択されるという当初の予想に合致した。このため,強度採食圧下にある柵外では採食に強い草本,低木,小高木等が優占し,高木林の再生はみられなかった。従って,伐採と遷移によって森林の再生を図る際には,柵等を用いたシカの密度管理も不可欠と考えられる。シカの影響で下層植生が消失した二次林において,上層木伐採と防鹿柵の設置による植生回復への効果を検討した。上層木を伐採すると林床の光環境が改善され,採食耐性の高い植物群落が形成されることにより,処理後10年以内で下層植被が45-98%まで増加した。上層木を伐採すると成長・光合成・防御などの形質値に大きな種間差,種内差が見られるようになり,群集内の機能形質値の多様化が生じた。林床の光環境が悪化している林分では,間伐や更新補助伐を通して,採食防御機能を有する多くの植物種の出現を促し,かつ元々生息していた植物個体の成長速度や防御物質含有量を増大させて,植生全体の採食耐性が高まる効果が期待される。予定通り調査対象種の成長,光合成,防御形質の測定を遂行し,所期の仮説を検証する。また,遅れている丹沢山地での植生調査を実施し,すでに実施した植生調査データと合わせて分析結果をとりまとめ,学術誌に発表する。イズセンリョウ以外の対象樹種についての化学分析を完了し,それらの種についても上述のイズセンリョウと同様に統計解析を実施する。ここまでの結果は9月のIUFRO(国際森林学会)で発表する。並行して8月に,昨年度マークしたサンプル個体のサイズを再測して,各個体の成長速度を計算する。成長速度のデータと化学分析の結果を統合して統計解析を行い,研究課題2および3を完了する。イズセンリョウの摘葉実験については,4月中に山取り稚樹の植栽と被陰処理を完了した。根の活着を見計らって5月末に摘葉処理,8月末頃に刈り取りとサンプリングを実施予定である。その後,冬期にかけ化学物質の定量を行い,今年度中に結果を取りまとめる予定である。森林生態学分担者の変更に伴い,元々予定していた高額消耗品(粉砕機)の購入が必要なくなった。
脳腱黄色腫におけるコレステロール代謝異常の生化学的研究

脳腱黄色腫(CTX)は常染色体劣性の遺伝疾患でコレステロールの代謝異常である。コレステロールの代謝産物であるコレスタノールや胆汁アルコールの蓄積が報告され、胆汁や血清中の胆汁酸の異常がみられる。病気の本態はまだわかっていないが、近年ケノデオキシコール酸(CDC)の経口投与により症状が改善されることが報告され治療法としての可能性が注目されるようになってきた。〔目的〕この疾患では血清コレスタノール値も低下するといわれ治療効果を判定するモニターとして利用できることが示唆されている。そこで本研究において血清コレスタノールの迅速で簡便な定量法の確立を企て、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析法を開発した。〔方法〕血清100μlに一定量の内部標準物質を加え、鹸化してステロール画分を得る。塩化ベンゾイルを加えてベンゾイル誘導体に変え、アセトニトリル:ジクロルエタン(2:1)溶液としてHPLC分析に供した。HPLCは逆相ODS系カラムを用いて、0.1%酢酸を含むアセトニトリルを溶媒として分析した。UVモニター(228nm)を用いた。〔結果〕前処理に要する時間は70分、HPLC分析は40分で2時間以内に定量値を得ることができる。定量の安定性・再現性は大変良好で、従来のGC/MS法に比べて格段に改善された。我々はこれまでに42例の分析を行ってきたが最近の5例は本法によって定量を行った。〔考察〕CTXの診断において血清コレスタノールの定量が有効であることは過去10年間の実績から明らかである。HPLCにより2時間以内に定量できる方法が確立されたことにより、ベッドサイドでの分析も可能になって最近各医療機関で開始されたCDC投与による治療に際して、その効果の判定手段として有効に利用できるものと期待される。実際に3人の患者についてモニターが開始され投薬量決定の判断に用いられている。
ヒト脳内に存在するニューロメラニン色素の構造とその生成過程の解明

褐色で不溶性のメラニン様色素(ニューロメラニン、NM)が、ヒトやほ乳類の中枢神経系(中脳の黒質および青斑核のカテコール作動性ニューロン)に存在している。さらに最近、我々は脳内被殻、前運動野皮質、小脳などにNM様色素が存在することを発見した。しかしながら、その構造や機能は単離の困難さや適切な生化学的モデル化合物がないため不明な点が多い。また、この色素がパーキンソン病の病因に重要な役割をしていると関連づけられているが、詳細は不明である。我々は、NMの生合成過程ならびに加齢現象を調べる目的で、ドーパミン(DA)とシステイン(Cys)をさまざまな比率でチロシナーゼ酸化し、得られた合成NM色素を経時的に化学的分解法を使って分析し、分解生成物を定量解析した。その結果、神経毒性を示す物質がNMの生成過程でNMに捕捉されることがわかった。また、加齢過程を模倣した実験から、天然のNMは、DAとCysを2 : 1で酸化して得られた合成NMを37°Cで40日間加熱したものに近いことがわかった。この研究から天然NMの構造を模倣した合成NMの調製法を確立することができ、NMの生理学的役割を解明する研究に利用できることが期待される。脳黒質に存在するニューロメラニン(NM)は皮膚のメラニンとは対照的にその構造や機能の複雑さ、単離の困難さ、適切な生化学的モデル化合物がないなど不明な点が多い。我々は、DOPAとCysから生成するフェオメラニンの初期生成過程の解析を昨年度報告した(Wakamatsuら,PCMR,22,474-486,2009)。それによると、最初に生成するシステイニルドーパは、さらに酸化されてジヒドロ-1,4,-ベンゾチアジン-3-カルボン酸(DHBTCA)を生成し、その後、o-キノンイミン体を経て、ベンゾチアジン骨格を有するフェオメラニンになり、徐々にベンゾチアゾール骨格に変換することが示されている。本年度は、NMの生合成経路を解明するためドーパミン(DA)とシステイン(Cys)の酸化から生成するNMの中間体を合成し、この合成品を用いてNMの生合成経路を考察した。1)5-S-CysDAの合成:pH6.8の緩衝液中、DAとCysをチロシナーゼ酸化し、陽イオン交換樹脂で精製した。2)DHBT-1の合成:5-S-CysDAに2M-NaOHを加え、pH9で10分反応後、陽イオン交換樹脂で精製した。3)ODHBT-1の合成:5-S-CysDAに0.1M-NaOHを加え、1時間反応後、陽イオン交換樹脂で精製した。4)TTCAとTDCAの合成:DAとCysから合成したCysDAメラニンに1M-NaOHを加え、4日間H_2O_2酸化し、陽イオン交換樹脂、つづいてHPLC分取により精製した。5)Bz-1の合成:pH6.8の緩衝液中、5-S-CysDAにFeNH_4(SO_4)_2、(NH_4)_2S_2O_8を加え、室温で3時間反応後、陽イオン交換樹脂で精製した。6)DAとCysを1:0.5の比率で生理的条件下(pH7.4、37°C)チロシナーゼ酸化し、反応時間1分、3分、5分、15分、30分、1時間で反応液を分取し、HPLCへの直接注入による中間体の確認および反応溶液の化学反応により、生成物の解析を行った。反応は極めて早く進行した。最初に生成するCysDAは3分で消滅し、それに伴ってODHBT-1、Bz-1が徐々に生成した。反応が早いために当初予想していたDHIBT-1は検出されなかった。H_2O_2/K_2CO_3酸化およびHI水解により、メラニン分解産物のPDCA、TDCA、TTCA、Bz-1が徐々に増加した。一方、Cys-DA由来の4-AHPEAは減少した。一方、TTCA/PDCA比は徐々に増加し、4-AHPEA/PDCAは減少した。

以上の結果は、NMは、最初にCys-DAメラニンが生成し、Cysの枯渇後、Cys-DAメラニンの顆粒上にDAメラニンが沈着するcasing modelを指示する結果であり、反応の進行とともにベンゾチアジン骨格を持つNMからベンゾチアゾール骨格を持つNMに変換されることがわかった。黒褐色で不溶性のメラニン様色素ニューロメラニン(NM)の生成は高い酸化ストレスに対する神経細胞の防御機構の結果であると仮定されている。一方で、NMがフリーラジカルや細胞毒性を有する化合物の供給源になり、酸化ストレスや神経細胞損失のサイクルを永続化させるという報告もある。このようにNMの生理的機能には複雑な二面性があると考えられている。また、この色素がパーキンソン病(PD)の病因に重要な役割を果たしていると関連づけられているが、詳細は不明である。したがって、NMの化学構造とその生成機序の解明は、神経化学の進歩に貢献するのみならず、臨床医学的にもPD発症機序の解明、さらにはその予防への足がかりになると期待されている。平成22年度の研究は、NMの生合成経路の解明とagingによる構造変化を詳細に調べる目的で実験を行った。平成21年度に化学合成したシスティニルドーパミン(CDA)、ジヒドロベンゾチアジンカルボン酸-1(DHBT-1)、オキソジヒドロベンゾチアジン-1(ODHBT-1)およびベンゾチアゾールアミン-1(BZ-1)を標準物質として用いて、ドーパミン(DA)とシステイン(Cys)のチロシナーゼ酸化の反応経路を追跡するために経時的に反応を停止して中間体の分析をするとともに、その反応混合物をアルカリ性H_2O_2酸化と還元的HI水解を行い、生成する分解産物をHPLCで定量した。また、吸光度法により全メラニン量の測定も行った。その結果、最初にDAがCysと反応してCDAとなり、さらにDHBT-1を経て不溶性のPMが生成し、Cysの枯渇後、残存するDAが酸化され不溶性のEMが生成することがわかった。さらに、NMのagingによる構造変化の影響を調べるために、合成NMを100°Cまたは60°Cで加熱することにより経時的に合成NMの構造変化を追跡したところ、合成NMの構成単位であるベンゾチアジン構造単位がベンゾチアゾール構造単位に変換されることがわかり、agingによるNMの構造変化を確認できた。また、HPLC分析による合成NMの分解生成物を比較から、NMは合成NM(DA:Cys=1:0.5)を加熱処理した構造に近いことが示唆された。ニューロメラニン(NM)の生合成および構造については、まだ未知の部分が多い。今回、DAとCysをさまざまな比率で生理的条件下チロシナーゼ酸化して得られた合成品を用いて、NM生成への酸化の時間経過、およびさまざまな加熱条件下でのNMの生分解を検討した。その結果、NMのベンゾチアジン骨格からベンゾチアゾール骨格への骨格変化が加齢過程(agingprocess)の条件下で生じることを化学分解反応で生成する4-AHPEAとTTCAをHPLC分析することにより証明した。4-AHPEA/PDCA比とTTCA/PDCA比から天然のNMは、DAとCysを2:1比で合成したNMの100°C、8時間加熱したものに近いことがわかった。この研究から得られたメラニン含量は、比色法から11.9%、化学分解法からは3.1-3.5%であり、これらの結果からまだ矛盾することが判明した。比色法の結果は、天然のNM中に加齢を反映するメラニン構造以外にまだ未知の色素が存在することを示唆していた。つづいて、ヒト脳の異なった部位(小脳、脳梁、尾状核、前運動皮質、淡蒼球、青斑核、黒質)から得られた9個のNMを分析したところ、今回初めてNM色素が不溶部分に加えて、1.4-52kDaの分子量でDMSOに可溶な色素が含まれていることを発見した。
中世イエメンにおけるザイド派イマーム勢力の展開と部族統治政策に関する研究

今年度は特別研究員奨励費支給の最終年度にあたるため、私は「中世イエメンにおけるザイド派イマーム勢力の展開と部族統治政策に関する研究」というテーマで実施してきた本研究を、以下の論文の形でまとめることとした。論文は、第一部「イエメンにおけるザイド派イマーム政権の成立と拡大の過程」、第二部「ザイド派イマーム政権の対外関係」、第三部「ザイド派イマーム政権の租税制度」、そして第四部「ザイド派イマーム政権と中世イエメン社会」の四部から構成されている。以下、その概要をのべる。第一部では、9世紀末から12世紀後半までのイエメンにおけるザイド派イマーム政権による支配の成立と拡大について論じた。第二部では、ザイド派イマーム政権と、イエメン支配をめぐって政治的・社会的に衝突した諸勢力(カルマト派)・政権(アイユーブ朝)との対外関係について分析した。第三部では、ザイド派イマーム政権の経済・財政的側面に関して、同政権がどのようにして租税を課税し、そして徴税していたのかを考察した。第四部では、ザイド派イマーム政権下のイエメン社会に関して、その社会を構成する様々な階層に属する人びとをそれぞれ検討した。以上の考察は、ザイド派関連のアラビア語原典史料が近年になってようやく発見・出版されるようになったことから、世界的にもいまだ十分に研究されていない分野のひとつである。それゆえ、今後のイエメンあるいは南アラビアに関する歴史学研究の進展において、きわめて重要な成果であると思われる。
遠距離海洋レーダを用いた対馬暖流の流路観測と流路分岐メカニズムの解明

本研究では、対馬海峡西水道を通過した後に200m等深線に沿って北上するとされる対馬暖流第二分枝流の存在とその季節変化を観測により明らかにするため、海洋レーダによる海面流速の連続観測を実施した。また、電波の有効利用を目的とした新たな海洋レーダシステムの開発を行った。海洋レーダ観測結果から、山陰沖日本海の100m等深線に沿って流れる対馬暖流第一分枝流と第二分枝流と思われる200m等深線付近の東向きの流れを観測することに成功した。従来の海洋レーダとは異なり、1局から送信し2局で受信するバイスタテック海洋レーダの開発に成功した。山陰沖を流れる対馬暖流の第一分枝流と第二分枝流の変動を調べるため、設置場所から約200kmの範囲の海面流速を30分の時間間隔で測定できる遠距離海洋レーダのレーダサイトを整備した。レーダサイトは長崎県対馬市上対馬町と山口県萩市相島の2カ所とし、目的の海域を観測できるアンテナの配置と設置準備のため、現地での測量を行った。さらに、設置場所の伐採を行いサイト構築に必要な作業を行った。同時に、観測に必要な電力と通信設備の準備と、レーダの送受信アンテナの設計を検討しアンテナを作成した。アンテナ設置場所の準備はH25年11月までに完了したが、アンテナの設計、送受信機の準備のためレーダサイト構築はH26年2月および3月に行った。それぞれのレーダサイトには、約200mの敷地に受信アンテナ30本(対馬)、28本(相島)と送信アンテナ3本、無線機や制御PCを入れるコンテナを設置した。また、レーダを動かし、リアルタイムで監視できるよう電力と通信を整備した。電気工事の遅延のためレーダの稼働は5月となった。レーダ稼働後の初期データを調べたところ、当初予定していたより観測範囲は狭くなっていたが、目的としている対馬暖流第一及び第二分枝流が流れているとされる海域を観測できることがわかった。山陰沖日本海の対馬暖流の流路変動を観測するため、海面流速を30分毎に観測可能な短波海洋レーダを長崎県対馬北端の舌崎と、山口県萩市の相島北部に設置した。電気工事の遅延のため、H25年度は敷地の整備とアンテナの設営まで行い、H26年度の初めに無線機等をサイトに搬入し稼働させた。レーダはH26年の5月より稼働させたが、送信アンテナの設計ミスにより安定した送信ができず、アンテナの改良が完了した6月より正常なデータが取得できるようになった。データは9月上旬までほぼ連続で取得することができた。また、この期間、海洋レーダの精度検証と、対馬暖流の鉛直構造を把握するため、6月と7月の2回、海洋レーダ観測海域において漂流ブイ観測をJAMSTECの新青丸により実施した。さらに、5測点に海底設置式流速計を1ヶ月半係留し、海洋レーダ観測海域の流速の鉛直分布データを取得することに成功した。船舶観測と係留観測により得られた流速データと海洋レーダデータを比較した結果、海洋レーダのビームが設計より少しずれていることが分かった。この問題を解決するためデータ処理プログラムを修正した。9月以降は、対馬局から送信、対馬局と相島局で受信するバイスタティックモードでの観測実験を開始した。この実験では、何度か正常なデータが得られたが、外来ノイズが多いことと、相島局が海から少し離れた場所にあるため欠測になることが多かった。この問題を解決するため、ハード・ソフトの両面からシステムの改良を行った。通常の2つの局からそれぞれ送受信し表層流を観測するシステムから、1局のみ送信、2局で受信する新たな海洋レーダシステムの開発を行った。このシステムを作成するため、新たな受信機を作成すると同時に、他局から発信された送信波を受信し受信機内で送信波の疑似信号を作り出すシステムを開発した。この新たな受信システムを山口県相島局に導入し観測を開始した。しかし、相島局では海岸からの距離が遠いためか、送信信号を受信し疑似信号を発生させることはできたが、海から反射してくる電波を受信することができなかった。そのため、新しい受信システムを長崎県対馬局へ移動させ、相島局から送信、対馬局で受信させた。その結果、ノイズが大きいものの海面から散乱された電波を受信することに成功した。ノイズの影響を除去するため新たなフィルターの導入等を試みたが劇的な改善がないことから、受信システム内で疑似信号をデジタルとして発生させるのではなく、相島局からの送信電波の情報から、全く同じタイミングで対馬局内で送信信号を発生させる装置の開発を開始した。対馬局の送信アンテナを相島局からの送信波の受信アンテナとして使うための改良、相島局からの送信波を受信し全く同じタイミングで送信波を発生させるソフトウェアーおよびハードウェアーの開発を行い、それが正常に稼働し2ヶ月は連続で動くことを確認した。また、これまで各局で送受信したデータの再処理を行い流速データの高精度化をおこなった。1局送信、2局で受信する新たな海洋レーダシステムのハードウェアー、ソフトウェアーの開発は、受信波に想定していた以上のノイズが含まれてこれへの対応により少し遅れ気味であったが年度内に完成させ観測を開始できた。一方、この新たな海洋レーダシステムの精度検証のために予定していた漂流ブイとの比較検証は、海洋観測を実施する時期に送信する無線機の故障により比較データを取得することができなかった。以上のことから本研究は当初の予定よりやや遅れている。

1局送信、2局で受信する新たな海洋レーダシステムを完成させ、対馬暖流が分岐するとされている海域の海面流速を連続的に観測した。今年度は、昨年度末に完成させた混合信号除去システムを受信システムに組み込み、ノイズの大きい観測海域において海面から散乱された微弱な電波を受信できるようにした。本システムは、受信局と180km程度離れた送信局からの直達波を受信し、その直達波と全く同じタイミングで受信機内に送信波を発生させ海面からの散乱波とビートをとり、狭い帯域のバンドパスフィルターを通すことで前述のことを実現させた。この新たなシステムにより、長崎県対馬局から170km離れた海域からの散乱波も十分な精度を持って受信できることが確認された。対馬海峡西水道を通り日本海に流入後、200m等深線に沿って東へ流れるとされる対馬暖流第二分枝は、長崎県対馬局から150km程度に位置するとされていることから、本システムにより目的としていた対馬暖流の分枝流をとらえることができた。途中、落雷などによりシステムの故障があったが、6ヶ月程度のデータを蓄積することができた。平成26年度に行った各局で送受信を行ったデータと合わせると、各季節の対馬暖流第二分枝の状況を観測したことになり、当初予定していた、対馬暖流第二分枝流の季節変化の把握は達成できた。得られたデータから、海洋物理的な解析と、電波科学としての解析を行いそれぞれ論文としてまとめている。また、このようなデータは今後取得することが難しいと思われることから、データのクオリティーチェックを行い、データセットとしてまとめる作業を行っている。本研究では、対馬海峡西水道を通過した後に200m等深線に沿って北上するとされる対馬暖流第二分枝流の存在とその季節変化を観測により明らかにするため、海洋レーダによる海面流速の連続観測を実施した。また、電波の有効利用を目的とした新たな海洋レーダシステムの開発を行った。海洋レーダ観測結果から、山陰沖日本海の100m等深線に沿って流れる対馬暖流第一分枝流と第二分枝流と思われる200m等深線付近の東向きの流れを観測することに成功した。従来の海洋レーダとは異なり、1局から送信し2局で受信するバイスタテック海洋レーダの開発に成功した。レーダサイトに電力を供給するため、電力会社と調整をしていたが、当初予定していたより大がかりな作業が必要となったことと、送電線の一部が電力会社のものでなかったため、他の機関との調整に時間がかかり電気工事が遅延した。そのため、H25年度内にレーダサイトを完成し、送受信テストを行うことができなかった。当初予定した2つの無線局からの送受信実験は問題なく行うことができたが、1局送信、2局受信を行う新たな実験を行ったところ、予想以上の外来ノイズと無線機の故障により、予定より少し遅れた。対馬暖流の分岐流である対馬暖流第二分枝が存在するのは、対馬局から約150km沖合とされている。ノイズレベルが高い状態では距離の離れた場所からの電波を受信することが難しいことから混信電波除去を効果的に行うシステムの改良を進め、対馬局から150km以上沖合のデータを連続的に蓄積できるようにする。また、新たなシステムによるデータの精度検証を行うため、漂流ブイを海洋レーダ観測域に流し現場の流速と海洋レーダにより観測された流速の比較を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ウエルシュ菌β毒素の細胞膜ラフトを介する情報伝達系活性化の分子機構の解析

ウエルシュ菌のβ毒素は、血液系の細胞であるTHP-l細胞の細胞膜脂質ラフトの結合してオリゴマーを形成後、内因性ホスフォリパーゼCを活性化して、生じたIP_3が、細胞内Ca^2+濃度を上昇させ、カルモジュリンーカルシニューリンシグナル伝達系が活性化し、細胞傷害作用を示すことを明にした。さらに、本毒素により、PIの取り込みや細胞のSwellingが認められることから、細胞に対してネクローシスを誘導することが判明した。β毒素の免疫系細胞に対する作用を解析するため、セルライン化された血液系の細胞であるHL-60細胞、THP-1細胞、U937細胞、BALL-1細胞、MOLT-4細胞にβ毒素を作用させたところ、いずれも細胞の膨化が観察され、本毒素は血液系細胞に作用することが初めて明らかになった。この中で、THP-1細胞とU937細胞にβ毒素は感受性がもっとも強いことが判明した。さらに、本毒素の細胞毒性は、ラフトを破壊するMbCD処理で阻害されることが判明した。そこで、毒素感受性の差を明らかにするため、各細胞のマイクロドメインへの結合を、[^<32>P]ラベルβ毒素と各細胞をインキュベーション後、ショ糖不連続超遠心法でラフト画分を単離し検討した。その結果、β毒素は感受性が強いTHP-1細胞とU937細胞のラフトに、オリゴマーを形成して強く結合することが判明し、本毒素に対する感受性は、毒素のラフトでのオリゴマー形成量の差によることが明らかとなった。そこで、免疫系細胞に対する本毒素の結合を検討するためβ毒素に対する抗体と蛍光ラベル2次抗体を用いて細胞に結合した毒素を染色すると、本毒素は、細胞膜表面に結合し、細胞内には侵入せず、細胞表面で働き、細胞の膨化を誘導することが明らかとなった。一方、β毒素によるTHP-1細胞の膨化は、内因性ホスホリパーゼC活性を阻害するU73122処理で、有意に抑制された。すなわち、本毒素は、血液系細胞膜のラフトでオリゴマーを形成後、細胞膜のホスホリパーゼCを活性化して、何らかのシグナル伝達を活性化して、細胞毒性を示すことが考えられる。我々は、β毒素は、免疫細胞に作用させると、形態が大きく変化して膨れあがることを報告している。本毒素が作用するラフトにはG-アクチンなどの細胞骨格が存在し、細胞骨格の安定化に深く関与していることが知られている。本毒素が細胞形態を変化させることから、β毒素がこれら細胞骨格蛋白質(Fアクチンやチューブリン)にどのような変化を示すのかを、ローダミン-ファロイジンや抗チューブリン抗体で蛍光染色して解析したところ、毒素作用により少しのアクチンとチューブリンの少しの減少が認められた。次に、in vivoにおけるβ毒素の作用を解析するため、β毒素をマウスに投与して、脾臓、および、末梢血由来の免疫系細胞の変化をフローサイトメーターで測定すると、CD4陽性のTh細胞や、CD19陽性のB細胞が低下し、細胞毒性を示した。すなわち、本毒素は、in vivoでも免疫系に影響を与えることが判明した。そこで、本毒素による、血中サイトカイン量の変化を測定した。その結果、毒素投与後、約1時間後から、血中TNGα、IL-4、IL-10量の増加が認められ、3時間以上、増加していた。一方、IL-2、IL-5、IFNγの各サイトカインは、毒素投与でも変化はなかった。以上の結果から、β毒素は、免疫系細胞の形態は変化させるが、細胞骨格タンパクの変化ではないことが明らかとなった。さらに、in vivoにおいて本毒素は、特定の免疫系細胞に作用して、サイトカイン遊離を誘導し、これらの作用は本毒素の毒性に密接に関与することが明となった。β毒素は、血液系の細胞であるTHP-1細胞に対して内因性ホスフォリパーゼC(PLC)を活性化して、生じたIP_3が、細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、さらに、CaMやCNの阻害剤で本毒素の細胞毒性が阻害されることから、本毒素により、カルモジュリン(CaM)-カルシニューリン(CN)シグナル伝達系が活性化されることを明らかにした。本年度は、これまでの結果をふまえ、β毒素をマウスに投与した時、いずれの血球系やリンパ球系細胞に障害を与えているかを検討した。種々のCD抗原に対する抗体を使用してフローサイトメーターを用いて詳細に解析すると、Th細胞やマクロファージの血中量が低下した。一方、THP-1細胞に対する細胞死を検討すると、本毒素により、細胞の核の断片化は認められず、PIの取り込みや細胞のSwellingが認められることから、細胞に対してネクローシスを誘導していることが判明した。さらに、本毒素を投与したマウスin vivoでのサイトカイン遊離量を検討するとTNFαやIL-1βなどの炎症性サイトカインの遊離が認められた。これらの結果より本毒素は免疫系の細胞に障害を与え、それが引き金となり致死活性を発現する可能性が推察された。

β毒素の構造解析については、結晶解析を行うにあたり、β毒素遺伝子を使用して、大腸菌で組換え体の発現と精製法を確立して、大量精製を行った。毒素タンパク質を種々のスクリーニングbufferを用いて結晶化を行っている過程である。これにより、X線解析が可能な毒素の結晶を作製する。
高温超伝導/強磁性多層薄膜の作成と可変マイクロ波フィルター

最近、強磁性/高温超伝導の積層薄膜がボルテックスのピン止めやスピン偏極キャリアー注入などの基礎科学分野で注目されている。一方、このような2層膜は携帯電話中継基地局で使用される可変マイクロ波フィルター・デバイスとしての応用が期待できる。磁場を印加すると、強磁性層の透磁率が変調され、超伝導層を伝播するマイクロ波の伝播モードが変調でき、定在波共鳴周波数がシフトできる。つまり、このような積層膜の作成と単層薄膜の電気的・磁気的性質、高温超伝導層の磁場下でのマイクロ波吸収が重要な研究課題となる。さらに、積層膜作成中の下層膜(強磁性層と高温超伝導層)の劣化の問題と、応用上その経時劣化が大きな問題となる。YBCO薄膜のa-c配向成長メカニズムを調べるために、基板表面に酸素プラズマを照射して表面粗さを制御し、その上にYBCO薄膜を成長して、<表面マイグレーション機構>の重要性を証明した。強磁性LBMO単層薄膜を作成し、磁気的性質を調べた。金属-絶縁体転移温度はキュリー温度よりもかなり低いので、2相分離モデルを適応した。負の磁気抵抗を強磁性粒の二重交換相互作用で、正の磁気抵抗をその磁気伸縮モデルで説明できた。あるデバイス温度では強磁性で絶縁性であるので、可変マイクロ波フィルターの強磁性層として適用可能である。高品質のYBCO薄膜をLBMO薄膜上に積層できた。積層中にLBMO層の結晶性は劣化しないが、2層膜の表面粗れが増強した。LCMO/YBCO超格子薄膜のマイクロ波吸収を測定し、重要な結果を得た。磁場を膜面に垂直に印加すると大きなマイクロ波吸収を示すが、平行に印加するとそれはほとんどゼロであった。つまり可変マイクロ波フィルターに適用するときに、磁場を平行に掛ければマイクロ波の損失を小さく抑えることができる。最近、強磁性/高温超伝導・積層薄膜がボルテックスのピン止めやスピン偏極キャリアー注入などの基礎科学分野で注目されている。一方、このような2層膜は携帯電話中継基地局で使用される可変マイクロ波フィルター・デバイスとしての応用が期待されている。磁場を印加すると、強磁性層の透磁率が変調され、超伝導層を伝播するマイクロ波の伝播モード(速度)が変調できる。したがって定在波共鳴周波数がシフトできる。つまり、このような積層膜の作成と高温超伝導体の磁場下でのマイクロ波吸収が重要な研究課題となる。本研究では、強磁性(LSMO,LBMO)単層膜の作成および積層膜LSMO/YBCOとLBMO/YBCO(高温超伝導層)の作成と劣化について研究した。またYBCO超伝導薄膜の磁場下でのマイクロ波吸収を調べた。LSMO(La(Sr)MnO)単層薄膜およびLSMO/YBCO(YBaCuO)積層薄膜をイオンビームスパッタ法でLAOとMgO基板上に作成した。LSMO薄膜は500度Cの低温までエピタキシャル成長した。これは酸素プラズマの供給によって促進できた。LAO基板では格子整合のために明瞭なステップ・テラス成長したが、MgO基板では格子不整合のために粒状成長した。LSMO上層膜はa配向およびc配向YBCO下層膜上にエピタキシャル成長できた。しかし下層YBCO膜が少し劣化したので、今度さらに低い温度で作成しなければならない。LBMO(La(Ba)MnO)薄膜をMgOとLAO基板およびa/c配向YBCO下層膜上に同時に堆積した。下層YBCO膜の結晶性は積層中に若干劣化した。上層LBMOの結晶性は単層LBMOのものより劣っていたが、その原因は積層中の下層YBCOの結晶性劣化だと思われる。a/c配向YBCO薄膜の77Kでのマイクロ波吸収測定を種々の磁場配置で磁場を掃引して行った。両サンプル共に低磁場に大きなピークを示し、これは表面マイスナー遮蔽電流に基づくものである。磁場が超伝導面に垂直の場合、吸収強度は掃引速度の増加につれて増大した。これはボルテックスの粘性によって生じるボルテックスの侵入遅れに基づく過渡的遮蔽電流の増大に起因する。a配向YBCOでは異方的ボルテックス・ダイナミクスを明らかにした。強磁性LBMO

単層薄膜を作成し、磁気的性質を調べた。金属-絶縁体転移温度はキュリー温度よりもかなり低いので、2相分離モデルを適応した。負の磁気抵抗を強磁性粒の二重交換相互作用で、正の磁気抵抗をその磁気伸縮モデルで説明できた。あるデバイス温度では強磁性で絶縁性であるので、可変マイクロ波フィルターの強磁性層として適用可能である。高品質のYBCO薄膜をLBMO薄膜上に積層できた。積層中にLBMO層の結晶性は劣化しないが、2層膜の表面粗れが増強した。LCMO/YBCO超格子薄膜のマイクロ波吸収を測定し、重要な結果を得た。磁場を膜面に垂直に印加すると大きなマイクロ波吸収を示すが、平行に印加するとそれはほとんどゼロであった。つまり可変マイクロ波フィルターに適用するときに、磁場を平行に掛ければマイクロ波の損失を小さく抑えることができる。
PPARα活性化抑制を標的としたC型肝炎関連肝癌の予防法の開発

C型肝炎ウイルス(HCV)トランスジェニックマウスでは加齢に伴い、脂肪肝・肝細胞癌を高率に合併する。本マウスでは耐糖能異常、肝臓での酸化ストレス増加も観察され、C型慢性肝炎患者の病態を比較的忠実に反映している動物モデルと見なされている。これらの病態に中枢的に作用しているのがPPARα活性化である。よってそれを促進させる物質(飽和脂肪酸など)、あるいはその抑制剤(エイコサペンタエン酸(EPA)やベザフィブラート)の長期投与により、肝細胞癌の発症率が変化するのではないかと考えた。本研究の目的は、HCVトランスジェニックマウスに対し、臨床投与相当量のEPAやベザフィブラート、あるいは飽和脂肪酸食の長期投与(約18ヶ月)にて発癌率が変化するかを解析することである。本年度での主な研究内容は、マウスの調製と薬物・特別食投与の開始であった。6月までにオスのトランスジェニックマウスを約60匹調製できたので、これを4群(各15匹ずつ)に分類し、通常食投与、通常食+EPA投与、通常食+ベザフィブラート投与、飽和脂肪酸食投与を開始した。全てのマウスは生存しており、幸い大きなトラブルはない。飽和脂肪酸食投与群ではコントロールに比し体重が増える傾向にあり、脂肪肝の増悪が予想される。現在の実験を継続すると共に、今後さらに多くのマウスが用意できれば、高コレステロール食投与、通常食+ピオグリタゾン投与の2群を新たに設定し、研究を発展させる予定である。自身の留学に伴いマウスの管理を当該教室の青山俊文教授にお願いしたが、データ解析・報告は研究代表者が責任を持って遂行する。
神経芽腫におけるsurvivin geneの発現に関する研究

小児固形腫瘍のなかで最も発生頻度が高く、その予後は今だ予後不良である神経芽腫におけるinhibitor of apoptosis proteinの1つであるsurvineのm-RNAの発現をN-myc増幅との比較してsurvivinの意義を明らかにすることを目的にした。それらの発現と予後およびN-myc増幅との関連を検討した。その結果、予後不良群である進行症例、再発症例は全例にsurvivineの発現が増強していた。FasおよびTRAIL-R1は予後良好群に発現が認められる傾向であった。N-mycは予後不良症例の7例中4例のみ増幅が認められた。以上の結果よりsurvivin発現はN-myc増幅よりその予後を強く反映していることが明らかになった。更にヒト神経芽腫細胞株を用いて、神経芽腫におけるsurvivin発現とその機能、特に抗癌剤またはTRAILを中心としたサイトカインを用いたapoptosis導入への関与について検討した。その結果、survivinの発現が大きい細胞ほど高い増殖率とetoposideに対する高抵抗性、細胞周期におけるG2/M期に高い分布を示し、TRAILによるapoptosis導入に対しても抵抗性を示した。これらの研究によりSurvivin発現は治療抵抗性にも関与している可能性があり今後の遺伝子治療の標的分子となる可能性がある。Survivin発現は治療抵抗性にも関与している可能性があり今後の遺伝子治療の標的分子となる可能性がある。平成14年度はヒト神経芽腫細胞株を用いて、神経芽腫におけるsurvivin発現とその機能、特に抗癌剤またはTRAILを中心としたサイトカインを用いたapoptosis導入への関与について検討する予定である。これらの研究によりsurvivinの発現をコントロールする遺伝子治療に発展する可能性がある。
流域の仮想集水域指標の開発と環境コミュニケーション機能の分析

流域での水利用に関する環境負荷を総合的に分かりやすく表すことを目的として,「仮想集水域」指標を開発した。仮想集水域とは,人々が暮らしている地理的な集水域とは異なり,域内の水利用と域外に依存する水利用とを含めた仮想的な水資源へのインパクトを表現する概念的な指標で,水利用が水資源賦存量の範囲内に収まっているか,あるいは,使い過ぎはどの程度か,などの評価が可能となる。具体的に,阿武隈川の支流域で適用した結果,水資源賦存量よりも仮想水使用量が多いと推計され,使い過ぎの状況が明らかとなった。(1)研究目的近年、その重要性が認識されている「流域」を単位とした水資源管理に役立てることを目的として、新たな指標の開発と、それがもつ環境情報の伝達機能を分析しようとするものである。ここで「仮想集水域」とは、人々が暮らしを送っている地理的な集水域ではなく、流域内と流域外に依存する水利用とを含めた実際の人工的な水利用全体のインパクトを表現する概念的な指標として、新たに考案したものである。この指標により、流域での水利用状況が、地理的な流域の水資源量の範囲内に収まっているかどうかや、逆に使いすぎ(オーバーシュート)がどの程度であるかといった評価が可能になる。さらに、地理的な集水域と仮想集水域との乖離具合を表現できるため、日常生活でイメージすることが困難になってきている「流域」に対する人々の認識を促進する効果が期待できる。(2)具体的な研究目的具体的な研究目的は,主に以下の二つである。(1)仮想集水域指標を開発し,実際の流域に適用する。(2)指標の環境コミュニケーション特性について分析する。本年度は,研究計画にのっとって,1)具体的な流域を対象とした仮想集水域の推計と、2)世界における指標の開発動向に関する情報収集を行った。1)については,福島県の阿武隈川流域において,域外からの取水を行っている点で特徴的な「安積疏水」の関連流域を取り上げ,水資源へのインパクトを総合的に表す仮想集水域指標を適用した。水資源賦存量と仮想水使用量を推計した結果,安積疏水関連流域における水使用量のインパクトは水資源賦存量を上回っており,約2.3倍の仮想集水域から水を使っている状況と評価された。また,猪苗代湖から取水している量は,水道用水の52%,農業用水の47%に相当していること,米の消費量の観点からは,安積疏水によって流域内の人口とほぼ同じ人口を別の地域で支えるだけの稲作が可能となっていること,などの特徴が明らかとなった。このような特徴は,仮想集水域指標の考え方によって明示的に示されるものであり,従来の水に関する環境指標では表現できないものである。疏水による域外からの取水は,歴史的な偉業として位置づけられることが多いが,環境的には他地域への依存度を増すことになるものであり,その依存状況を表すことができる点で,仮想集水域指標は意義があると考えている。2)については、イギリスで開催された,ウォーター・フットプリントをメインテーマとした初めての国際会議である「ウォーター・フットプリント・サミット(Water Footprint Summit)2008」に参加し,推計の枠組みや事例について最新の動向を把握した。この指標は,仮想集水域指標を着想するヒントの一つとなった指標であるが,(踏みつけ面積(footprint)という名前にも関わらず)単位が「水量」であり,水質についても明示的に計上されないという点で,仮想集水域指標とは異なる。その違いや長所・短所等の特徴について,新たな知見を得た。本年度は,流域の仮想集水域指標の分析に必要となる,研究設備の更新とデータの収集・分析を行った。研究設備の更新については,当初の予算執行計画にはなかったが,地理情報システム(GIS)で扱うデータ量が増大し,また,衛星データも分析対象として扱えるように研究環境を整備する必要が生じたことから,計画を変更して,高性能のワークステーションを導入した。これにより,森林GISや衛星データの分析を行った。流域を対象とした具体的な分析として,福島県の会津地域にある,只見川流域を対象に,地理データや衛星データの収集・分析を行った。流域における水資源の涵養には,森林の分布や活性状況が関係していることから,それらの評価を行った。民有林については,森林GISのデータを収集し,小班ごとの成長量に基づいて炭素蓄積量を推計した。国有林についてはデータが入手できなかったため,原単位を用いた推計とした。只見川流域における炭素蓄積量は,森林経営(FM)率を考慮した場合,平成18年時点で年間約6万4千12万6千炭素トン程度と見積もられた。

只見川流域では,植生自然度9の自然林が4割程度を占めており,その多くは国有林で,国有林における炭素蓄積量は全体の68割程度を占めているなどの結果が得られた。一方,衛星データとしては,流域における森林の活性度を見るため,Terra/MODISの衛星データを入手し,現在分析を進めているところである。本年度は,1)指標の環境コミュニケーション機能に関する指標の設計要素と,提示による効果についての研究,2)仮想集水域指標の研究内容に関する書籍の執筆,を行った。指標の設計要素と提示による効果については,幅広い年齢層を考慮して,小学生を対象とした環境教育の場で環境指標を取り上げた。小学生にとって身近な通学路を対象とし,どのような指標を用いれば良い点や悪い点を評価できるのか,その指標は妥当か,指標による評価を実感するためにどのような工夫が考えられるか,などの点を検討した。通学路の指標には主に「便利さ」「気持ちよさ」の軸があり,触れる樹木の数やゴミの数などで評価可能なこと,指標の規準化によって比較した異なる通学路の評価結果はメンバーの意見と合致すること,指標を実感するための工夫(例:ゴミを減らすための掃除機の電力量を自転車発電で賄う)によってコミュニケーション性が高まること,などの結果が得られた。これらの結果を含む活動の内容について,日本環境教育学会で報告した。仮想集水域指標の研究内容に関する書籍の執筆については,阿武隈川流域を対象に,福島大学の教員を中心として実施した研究成果をまとめた書籍『阿武隈川流域の環境学』の刊行において,「流域の水資源管理のための環境指標」(p.255270)を分担執筆した。仮想集水域指標に関するこれまでの研究成果とともに,流域や水資源管理の分野で開発されている新しい環境指標の動向を踏まえて内容を構成した。本年度は、最終年度として、環境コミュニケーション機能の分析を行って、研究のとりまとめを行う予定であったが、2011年3月11日に発生した東日本大震災と福島第一原発の事故を踏まえて、研究の内容を修正した。当初予定していた、福島県内の流域とその地域住民を対象とした、仮想集水域指標についての質問紙調査は、現実的には、原発災害に苦しむ福島県民を対象に、実施すべき状況にはなかった。福島県全体の社会経済活動に関する総合的な環境指標として、「物質フロー」に関する指標を取り上げて、その改善状況を把握するとともに、その問題点を指摘して、論文にまとめた。物質フローに関する環境指標は改善傾向にあるものの、火力発電の増加などにより物質量が増えているものがあることが明らかになった。同時に、原発のウラン燃料や放射性廃棄物など、物質量は小さいが質的に危険な物質をそのまま計上することの問題点に言及した。環境指標の活用については、持続可能な消費に関する国際会議(2011年11月68日、ドイツ・ハンブルク)へ参加し,エコロジカル・フットプリント指標等の役割に関する議論を行った。福島第一原発の事故を踏まえて、従来の環境指標で評価できていた側面とそうでなかった側面を再確認した。また、日本環境教育学会では、原子力発電の教育および広報において、二酸化炭素の排出量という環境指標における優位性が、放射性廃棄物量という環境指標における劣位性に比して強調されていた側面を指摘し、公平性を追求することの重要性を問うた。
CLL希少地域である日本からの挑戦～確実な鑑別診断法の確立と分子病態の解明～

本邦における慢性リンパ性白血病(CLL)の実態を明らかにするため国内多施設共同前方視登録研究(CLLRSG-01:UMIN000004915 )を行い登録症例の解析結果を報告してきた。自然乾燥標本を用いた形態的Typical CLLは75%、Atypical CLLは25%であり、欧米で約10%と報告されるAtypical CLLの頻度より多いことが明らかになった。また、免疫表現型でAtypi cal CLLはMatutesスコアがTypical CLLに比して有意に低値であった。CLLRSG-01登録症例について前年度に引き続き2018年度も解析を行った。近年、病理組織を用いた免疫組織化学によりCLL/SLLにlymphoid-enhancer-binding factor 1 (LEF1)が高頻度かつ特異的に陽性となることが報告されている。CLLRSG-01登録症例の中で、骨髄組織標本が得られた症例を対象に、免疫組織化学によりLEF1発現について検討した。WHO分類でCLLと診断された症例の中で、FCM解析によるMatutesスコア4または5の28例は全例LEF1陽性であった。しかし、スコア3は37例中20例(55%)のみがLEF1陽性であり、45%はCLLでない可能性が考えられた。また、CD5かCD23の少なくとも一方が陰性で定義上CLLにならず、他の類縁疾患の診断に当てはまらないLGBCL,NOS 16例中5例(31%)はLEF1陽性であった。CLLRSG-01登録100症例における解析結果を2019年iwCLLで報告する予定である。本邦における慢性リンパ性白血病(CLL)実態を明らかにするため国内多施設と共同で前方視登録研究(CLLRSG-01:UMIN000004915)を行い登録症例について中央診断を完了した。WHO分類に基づきMatutesスコア3点以上であるCLLは109例であった。FAB分類で定義される形態的Typical CLLは82例(75%)、Atypical CLLは27例(25%)であり、欧米で約10%と報告されるAtypical CLLの頻度より多いことが明らかにされた。Typical CLLとAtypical CLLについて臨床的背景を比較したが有意差は認められなかった。免疫表現型ではAtypical CLLはMatutesスコアがTypical CLLに比して有意に低値であった。FISH解析で13q欠失、17p13欠失、11q22欠失、trisomy 12の頻度を確認したが両群に有意差は認められなかった。MYD88 L265P変異は全体の7%に確認され、IGHV遺伝子変異は全体の81%に確認されたが、やはり両群に有意差は認められなかった。使用されるIGHV遺伝子は1-69が欧米で高頻度(11-18%)であることが知られているが、本邦における今回の検討症例では1.2%であり低頻度であった。これらの結果は2017年5月12日にニューヨークで開催されるiwCLL2017で発表する予定である。CLLRSG-01登録例において、OthersとなるCLL以外の類縁疾患と、形態上はCLLであるがMatutesスコア低値で表面形質的にCLLと診断できないB細胞腫瘍が予想以上に多く、診断と解析に時間を要している。本邦における慢性リンパ性白血病(CLL)の実態を明らかにするため国内多施設共同前方視登録研究(CLLRSG-01:UMIN000004915 )を行い登録症例について解析した。WHO分類に基づくCLLは109例であった。自然乾燥標本を用いた形態的Typical CLLは82例(75%)、Atypical CLLは27例(25%)であり、欧米で約10%と報告されるAtypical CLLの頻度より多いことが明らかになった。免疫表現型でAtypi cal CLLはMatutesスコアがTypical CLLに比して有意に低値であった。IGHV遺伝子V領域変異は全体の81%に確認されたが、やはり両群に有意差は認められなかった。使用されるIGHV遺伝子は1-69が欧米で高頻度(11-18%)であることが知られているが、今回の検討症例では1.2%であり低頻度であった。これらの結果は2017年5月12日にニューヨークで開催されたiwCLL2017で発表した。CLLRSG-01登録症例を検討したところ、他のリンパ増殖性疾患の診断に合致せず形態的にはCLLの範疇であるが、免疫形質がCLLに典型的でない(Matutes' score 3以下)症例が多数認められることが判明した(CLL-like LPD)。Matutes' score 4または5のCLL 57例(43%)とCLL-like LPD 75例(57%)を比較検討した。CLL-like LPDは形態的atypical CLLが多く、表面形質はCD13発現頻度が高くCD69とZAP-70発現頻度が低かった。これらの結果は2017年10月に開催された第79回日本血液学会学術集会で発表した。

CLLRSG-01登録例からCLL典型例(Matutes' score 4および5)の確定は容易であったが、Matutes' score 3以下のCLL-like LPD症例は他のリンパ増殖性疾患との鑑別が困難であったため、確定に時間を要した。また、新しい倫理指針に基づく研究計画改訂が遅れ、施設における遺伝子倫理審査承認が遅延している。本邦における慢性リンパ性白血病(CLL)の実態を明らかにするため国内多施設共同前方視登録研究(CLLRSG-01:UMIN000004915 )を行い登録症例の解析結果を報告してきた。自然乾燥標本を用いた形態的Typical CLLは75%、Atypical CLLは25%であり、欧米で約10%と報告されるAtypical CLLの頻度より多いことが明らかになった。また、免疫表現型でAtypi cal CLLはMatutesスコアがTypical CLLに比して有意に低値であった。CLLRSG-01登録症例について前年度に引き続き2018年度も解析を行った。近年、病理組織を用いた免疫組織化学によりCLL/SLLにlymphoid-enhancer-binding factor 1 (LEF1)が高頻度かつ特異的に陽性となることが報告されている。CLLRSG-01登録症例の中で、骨髄組織標本が得られた症例を対象に、免疫組織化学によりLEF1発現について検討した。WHO分類でCLLと診断された症例の中で、FCM解析によるMatutesスコア4または5の28例は全例LEF1陽性であった。しかし、スコア3は37例中20例(55%)のみがLEF1陽性であり、45%はCLLでない可能性が考えられた。また、CD5かCD23の少なくとも一方が陰性で定義上CLLにならず、他の類縁疾患の診断に当てはまらないLGBCL,NOS 16例中5例(31%)はLEF1陽性であった。CLLRSG-01登録100症例における解析結果を2019年iwCLLで報告する予定である。形態上はCLLであるがMatutesスコア3以下で表面形質的にCLLと診断できないB細胞腫瘍に関しては、スコア4以上のCLLと比較検討を行っている。Othersの解析も病組織学的検討を含めて進んでいる。これらが整理された後に、予定通り全ゲノム解析にとりかかる予定である。CLLと類縁疾患の鑑別を容易にするため、新しいスコアシステムを確立する。また、遺伝子倫理審査委員会の承認を得た後に、CLLとCLL-like LPDの分子遺伝学的相違を明確にするため、全ゲノム解析にとりかかる予定である。研究成果が十分にまとまらず、予定していた国際学会(ASH)に参加できなかった。遺伝子解析が予定より遅れて、消耗品の使用が予定より少なかった。第一段階の研究成果がまとまったため、国際学会(iwCLL2017)に演題が採用されたため、出席のため旅費として使用する。遺伝子解析も加速的に進んでおり、次年度に消耗品費が予定より多く必要となることが見込まれる。
大型動物脊髄損傷モデルを用いたiPS細胞由来神経幹細胞移植による再生治療研究

我々はこれまでに神経幹細胞移植とヒストン脱アセチル化酵素阻害活性をもつバルプロ酸を併用することで、脊髄損傷に対して高い治療効果を発揮する新規治療法を開発した。しかし、今回我々が開発したこの新規治療法を安全に臨床応用するためには、ヒトに近い霊長類で治療効果を詳細に検討することが必要である。我々はこれまでにラット・マウス脊髄損傷モデルを用いた研究を展開してきたため、その技術を応用し、カニクイザル専用の圧挫損傷モデル作製装置を開発した。その後、軽度・中程度・重度の3つの異なる損傷エネルギーにて脊髄を圧挫損傷し、後肢機能を評価したところ、損傷エネルギーの大きさに応じて段階的な機能障害がみられた。損傷した脊髄内では著明な炎症反応が起こり炎症性サイトカインの影響により損傷部には著明なグリア瘢痕が形成されることが報告されている。損傷部に神経幹細胞を移植する手法がこれまでに試されているが、炎症性サイトカインの影響でほとんどがアストロサイトへと分化し、僅かな治療効果しか発揮されない。そのような問題点を克服するために、我々は神経幹細胞を移植するとともに、バルプロ酸を投与することにより移植神経幹細胞のグリア細胞への分化を抑制しつつニューロン分化を促進させ、損傷した神経回路網を再建するというこれまでにないアイデアに基づいた治療法を開発した。実際に脊髄損傷モデルマウスに治療してみたところ、著明な運動機能の回復が得られることが分かった。移植細胞の分化傾向を免疫染色で観察すると、バルプロ酸投与群においてニューロン分化が著明に促進され、そのニューロンの長く伸びた突起は頭側・尾側の後索(錐体路が存在する領域)や脊髄前角細胞近傍まで伸長していることが分かった。さらに、移植細胞を免疫染色した組織切片を電子顕微鏡で観察すると、GFP陽性の移植細胞由来ニューロンが宿主ニューロン軸索の投射を受け、かつ脊髄前角細胞に投射し、そこにシナプスを形成している様子が観察された(JCI 2010)。これらの結果は我々が予測していたコンセプトに合致するものであった。しかし、今回我々が開発したこの新規治療法を安全に臨床応用するためには、この治療の作用メカニズムをさらに明らかにするとともに、ヒトに近い動物種で治療効果を多面的に検討することが必要である。今回我々が開発したこの新規治療法を安全に臨床応用するためには、ヒトに近い霊長類で治療効果を詳細に検討することが必要である。当研究では、霊長類脊髄損傷モデルに対するiPS細胞由来神経幹細胞移植治療の効果を検討する事が目的である。我々はこれまでにウサギ・ラット・マウス脊髄損傷モデルを用いた研究を展開してきたため、その技術を応用し、カニクイザル専用の圧挫損傷モデル作製装置を開発した。その後、パイロット実験として脊髄損傷モデルを作製した。カニクイザル(3年齢オス)に全身麻酔をかけ、腹臥位で手術を行った。第10胸椎レベルに後方から正中縦切開し、椎弓を露出させた後、椎弓切除を行い脊髄を露出させた。その後脊椎を固定し、Impactorにて脊髄損傷を作製した。損傷4週間後潅流固定した後に、脊髄を採取し、固定後切片を作成し、免疫染色や髄鞘特異的な染色法によりグリア瘢痕の形態や脊髄内ニューロンの生存、脱髄の程度を評価している。