hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カロとマニエリスム版画の研究

三年間にわたる「カロとマニエリスム版画」研究の最終年にあたる平成4年度は、これまでの研究をもとに、それぞれの研究分担者が独自の研究テーマにそって研究を進めていった。その一部が公表されたものもあるので、その概要をここで報告しておきたい。雪山は「ベラスケスにおける聖と俗、《マルタとマリアの家のキリスト》をめぐって」において、ベラスケスが図像的に16世紀ネーデルラント絵画から影響を受けていることを指摘した。幸福は「世界地図から世界風景へーネーデルラント絵画における『地誌』と『風景』をめぐって」において、カロの《ブレダの包囲》に典型的に見られるような「地図的風景」とも呼ばれるべき特異な表現形式について16,17世紀のネーデルラント風景画を例にとって論じた。また、高橋はカロをも含む17,18世紀のフランス素描展を企画し、そのカタログが昨秋出版された。越川の論文は西洋美術館に所蔵されるピラネージの版画の来歴などについての詳細な報告である。このように、カロが活動した17世紀前半のヨーロッパ美術に関する様々な研究が公表されたわけであるが、いずれもカロを中心課題としたものではない。しかし、例えば、幸福の論文などは明らかにカロの《ブレダの包囲》を念頭に置いたものであり、幸福は報告書でこの問題を再び取り上げる予定である。昨年、フランスのナンシーでは大規模なカロ展が開催された。この展覧会のカタログなどで公表された新しい事実をも取り入れながら、報告書を作製したい。国立西洋美術館にはカロの版画の大半が所蔵されている。本研究の目的はこの所蔵作品の調査研究を一方の柱とし,他方,カロを1600年頃の国際マニエリスムという汎ヨ-ロッパ的視点からとらえ直そうとするものであるが,所蔵作品の調査については比較的順調に進み,また,各人の研究についてもカロを視野に入れつつより広い視点から1618世紀の各派の美術に関する研究が公表された。調査研究についていえば,リュ-ルのカタログを参照しながら所蔵される個々の作品の刷りの状態やステ-トを確認すると同時に,それぞれのモティ-フの影響関係について検討を加えていった。また,すべての作品の写真をとり,それらは基本デ-タとして国立西洋美術館年報に目録化した。このような作品自体についての研究とは別に,各人は個別に研究を進めた。カロと同時代の画家カラヴァッジオやヴァン・ダイクについての研究が行なわれ(中村,雪山),また,ヴェロ-ネ-ゼ,ティエポロといったイタリアの画家についての作品研究も進められた(越川)。また,これまでカロ芸術の中で必ずしも正当な評価の対象とはならなかった風景表現に関していえば,カロにも少なからぬ影響を与えたネ-デルラントの風景表現についての研究が行なわれた(幸福)。また、平成4年度の自主企画展としてカロの素描を含む「フランス近世素描展」が企画され、その申備のためパリ国立美術学校との交渉も開始された(高橋)。本年は直接カロを論じようとするような研究を公にすることはできなかったものの、作品自体の調査は大きく近展し、カロの研究にとっても指標となるような研究が各研究分担者によってなされたことは意義深いものであったと思われる。前年度に行なわれた西洋美術館の所蔵になるカロ作品の整理分類にもとづきながら、今年度はより広い視点に立って、カロの版画に表現された様々な主題ごとの研究が進められた。雪山はベラスケスについての調査をまとめる一方、特に17世紀スペインの静物画についての調査を進め、その一部を発表した。幸福はネ-デルランドの肖像画背景をなす風景描写の問題を取り上げ、また、カロの《ブレダの攻囲》に典型的にあらわれた地図と風景が結び付いたかのような表現形式についての研究を進めた(但し、これは現在執筆中である)。また、中村はレンブラントにおける工房の役割と彼が弟子たちに与えた影響について詳細な論文を発表した。高橋は来年度(平成4年10月)に開催される予定の『フランス素描展』(これにはカロの素描も数点含まれる)の準備のためパリ国立美術学校との具体的な交渉に入り、すでに、原稿の執筆、翻訳に取りかかっている。また越川もメディチ家の祝祭とカロの版画との関わりについての調査を断続して行なった。このように、今年度もどちらかといえばカロを直接に論ずるというよりは、その周囲の画家や芸術動向に目が向けられたきらいがないわけではないが、すでに何度か研究会ももたれており、来年度の研究成果公表に向けての準備は整備されつつあるといえよう。

越川の論文は西洋美術館に所蔵されるピラネージの版画の来歴などについての詳細な報告である。このように、カロが活動した17世紀前半のヨーロッパ美術に関する様々な研究が公表されたわけであるが、いずれもカロを中心課題としたものではない。しかし、例えば、幸福の論文などは明らかにカロの《ブレダの包囲》を念頭に置いたものであり、幸福は報告書でこの問題を再び取り上げる予定である。昨年、フランスのナンシーでは大規模なカロ展が開催された。この展覧会のカタログなどで公表された新しい事実をも取り入れながら、報告書を作製したい。
明治末東京における周作人と日本文学の出会いとその意義について

明治時期の周作人の活動を知る手掛かりになる資料が少ないため、研究の進展は必ずしも順調とは言えなかったが、問題点のいくつかは明らかになった。1周作人が日本文学に興味をいだくようになったのは、そもそもは、先に日本に来ていた兄魯迅が漱石を愛読していたことが大きな背景としてある。周作人自身日本書を読むのは漱石から始まったと回顧している。「ホトトギス」の「ぼっちゃん」号を周作人はのちのちまで持っていたが、買った当時内容を理解していたとは考えにくい。日本語が読みこなせるようになるのは、留学して三年目つまり1908年あたりからで、漱石の「文学論」(1907年5月)あたりがその最初ではないかと想像される。著名な「文学論」の序文の内容に周作人も深く感じるところがあったようである。というのも、周作人自身もそのころ(1908年)に故国で初めて出版された文学史の著作を批判しつつ展開する文学論を発表しているからである。ただ、漱石のいう漢文学と英文学との決定的差異、そしてその非西洋圏の読者にとっての意味というような問題を、周作人は必ずしも深刻な問題としては受け取っていないもようである。2周作人が日本文学への愛好を深めることと、魯迅の帰国あるいは日本人婦人との結婚という事件との間に、予期していたような、劇的な因果関係を見出すことはできなかった。しかし、日本社会の中での生活に迫られた周作人が、より一層日本の特に平民文学へ近づくことになったのは、当然の結果といえよう。3周作人が自然主義や頽廃派に深い関心を抱かなかったのは確かとしても、決してはじめから無視したのではなく、田山花袋でも、谷崎潤一郎でも、一応目を通していることは確認しておく必要がある。
生体高分子機能を修飾する抗がん化合物の合成と作用解析

本年度の研究で以下のことを明らかにした.昨年度合成した固形がんに優れた活性を示す3'-C-ethynyluridine (EUrd)および-cytidine (ECyd)の構造-活性相関を調べた。核酸塩基部を変換したエチニル体では活性が、cytosine>uracil>adenine>5-F-cytosine=5-Furacil>>thymine=guanineの順になった.一方、糖部置換基はアセチレン体が最も活性が高く、プロピン、ブチンにするに従い活性は減弱し、ビニル、エチル体はほとんど活性を示さなかった.新規ネオカルジノスタチンの10員環アナログの合成に成功した.本化合物はguanine選択的アルキル化を起こし、DNA切断に必須な構造は、単純な交差共役ジエインであることを明らかにした.タキシニンの化学修飾により分化誘導佐用を市示す化合物を得るとともに、光反応生成物がP糖蛋白質の機能阻害活性を有することを見い出した.抗腫瘍性天然物ハリコンドリンBの合成ルートをほぼ完了し、合成中間体のいくつかにcytotoxicな構造を見い出した.サイクリックADPリボース安定等価体であるカーボサイクリックIDPリボースを合成した.細胞分化の特異的調節因子であるレチノイン酸の作用を制御する化合物として、その拮抗物質、作用増強物質を合成し、核内レセプターレベルでの作用であることを明らかにした.PCNDACをリカンドとしたアフィニティークロマトグラフィーより、ATP存在下dCydをリン酸化する酵素を約2000倍に精製した.CNDAC, DMDCおよびaraCはがん遺伝子を導入した形質転換細胞に対しin vitoroとin vivoで異なる抗腫瘍性を示した.特に、CNDACはin vivoでDMDCやaraCに比して優れた活性を示した.これらの化合物に対する腫瘍細胞側の規定因子はdCydkinaseの酵素活性と細胞内蓄積量であることを明らかにした.FUdRによるアポトーシスの誘導過程でプロテアーゼが関与することを明らかにした.本年度の研究で以下のことを明らかにした.昨年度合成した固形がんに優れた活性を示す3'-C-ethynyluridine (EUrd)および-cytidine (ECyd)の構造-活性相関を調べた。核酸塩基部を変換したエチニル体では活性が、cytosine>uracil>adenine>5-F-cytosine=5-Furacil>>thymine=guanineの順になった.一方、糖部置換基はアセチレン体が最も活性が高く、プロピン、ブチンにするに従い活性は減弱し、ビニル、エチル体はほとんど活性を示さなかった.新規ネオカルジノスタチンの10員環アナログの合成に成功した.本化合物はguanine選択的アルキル化を起こし、DNA切断に必須な構造は、単純な交差共役ジエインであることを明らかにした.タキシニンの化学修飾により分化誘導佐用を市示す化合物を得るとともに、光反応生成物がP糖蛋白質の機能阻害活性を有することを見い出した.抗腫瘍性天然物ハリコンドリンBの合成ルートをほぼ完了し、合成中間体のいくつかにcytotoxicな構造を見い出した.サイクリックADPリボース安定等価体であるカーボサイクリックIDPリボースを合成した.細胞分化の特異的調節因子であるレチノイン酸の作用を制御する化合物として、その拮抗物質、作用増強物質を合成し、核内レセプターレベルでの作用であることを明らかにした.PCNDACをリカンドとしたアフィニティークロマトグラフィーより、ATP存在下dCydをリン酸化する酵素を約2000倍に精製した.CNDAC, DMDCおよびaraCはがん遺伝子を導入した形質転換細胞に対しin vitoroとin vivoで異なる抗腫瘍性を示した.特に、CNDACはin vivoでDMDCやaraCに比して優れた活性を示した.これらの化合物に対する腫瘍細胞側の規定因子はdCydkinaseの酵素活性と細胞内蓄積量であることを明らかにした.FUdRによるアポトーシスの誘導過程でプロテアーゼが関与することを明らかにした.
タンパク質修飾による細胞死誘導複合体(DISC)の形成に関する制御機構の解析

腫瘍やガン細胞株にはFas, FADD, Caspase8を発現しているにもかかわらずFasを介する細胞死に対し強い抵抗性を示すものがある。従来、このような細胞ではFLIPがDISCの形成を競合阻害し、結果的に細胞死に対して抵抗性を示すと考えられてきた。Caspase8はDISC内で自己触媒的な活性化により切断さるが、FLIPはCaspase8と競合することによりCaspase8とFADDの会合を阻害することでCaspase8の活性化を抑制する。FLIPは元々アポプトーシスを抑制する分子として報告されたが、近年、FLIPはアポプトーシスを促進する機能も有するという論文も複数報告されている。我々はFas非感受性の腫瘍細胞株に低濃度のCychloheximideを同時に与えると細胞死に強い感受性を示すようになり、細胞死感受性の細胞株では感受性がさらに高まることを見出した。このような細胞株ではFLIPの有意な発現は認められず、感受性の変化とFLIPの発現量にも相関関係は観察されなかった。次にFLIPの切断に注目し、その切断がFLIPの細胞死制御にどのようにかかわっているのか調べた。FLIPの野生型とDN変異型をHeLa細胞に導入し、恒常的に発現する細胞株を樹立して解析を行った。得られた細胞株にFasを介する細胞死を誘導したところ、野生型のFLIPはp10サブユニットの生成が観察されたが、変異型のFLIP DNは全く切断されなかった。さらに変異型のFLIP DNは野生型のFLIPと比べて、僅かな発現量でもFas誘導アポプトーシスを効率よく抑制できることが分かった。このことはFLIPの切断がCaspase8の活性化を促進することを示唆する。我々の実験結果は生理的なレベルの発現量においてもc-FLIPはCaspase8の活性化に関わることを強く示唆する。今後、Caspase8の活性化におけるc-FLIPの機能をさらに解析していきたい。腫瘍やガン細胞株にはFas, FADD,カスパーゼ-8を発現しているにもかかわらずFasを介する細胞死に対し強い抵抗性を示すものがある。このことから、Fasを介するアポトーシスを調節する未知の分子機構の存在が示唆され、さらに解析を試みた。各種造血系の腫瘍由来細胞株のFasの発現を調べ、発現が認められた細胞株において、Fas刺激に対する非感受性細胞株を新たに選択した。それらの細胞において、DISCの形成に必要なCaspase-8, FADDの発現、またDISCにおけるアポトーシス阻害因子であるc-FLIPの発現を調べた。その結果、すべての細胞株においてCaspase-8, FADDの発現が認められた。c-FLIPの発現は、YT細胞においてのみ確認された。また、ML-1細胞においてFADDが異なった分子量として検出され、FADDに未知の分子形態が存在する可能性が示唆された。、一方、YT細胞においてはCaspase-8が切断を受け、活性化される際の中間体中間体が検出されたが、活性化Caspase-8は検出されなかった。

また、FLlPも切断を受けた中間体として検出されることから、この細胞ではc-FLIPがCaspase-8活性化を阻害していることが示唆された。次に、Fas刺激におけるDISCの形成を検証するために、これらの細胞株の細胞溶出液をゲル濾過カラムChromatographyにより解析を行った。その結果、どの細胞株においてもDISCは検出されなかった。また、免疫沈降法によってもDISCを形成する分子間の複合体は認められなかった。この結果は、これらの細胞株はFas刺激によるDISCの検出が難しいと言われている(タイプIIと呼ばれる)細胞群に属することを示唆する。細胞死を誘導してない細胞溶出液においてもFas, Caspase-8, FADDやc-FLIP間の複合体も検出できなかった。さらに、c-FLIPを発現するYT細胞においてもc-FLIPとCaspase-8、FADDとの相互作用は検出されなかった。Caspase-8に比べて極めて少量しか存在しないc-FLIPがどのようにCaspase-8の活性化を効率よく阻害できるのかは不明であり、今後はc-FLIPの阻害機構の解析を明らかにしたい。c-FLIPは元々アポプトーシスを抑制する分子として報告されたが、近年、c-FLIPはアポプトーシスを促進する機能も有するという論文も複数報告されている。Fasはアダプター分子であるFADDを介してCaspase-8を含むタンパク質複合体(DISC)を形成する。このDISC内でCaspase-8が自己触媒的な活性化により切断され、死のシグナルを伝えることになる。c-FLIPはCaspase-8と競合することによりCaspase-8とFADDの会合を阻害する。c-FLIPはCaspase-8によてp10サブユニットには切断されるが、切断配列を持たないためp18サブユニットは生成されない。我々はc-FLIPの切断に注目し、その切断がc-FLIPの細胞死制御にどのようにかかわっているのか調べた。まず、c-FLIPの切断配列に変異を導入し、p10(FLIP)が生成されない変異型(DN)を作製した。c-FLIPの野生型とDN変異型をHeLa細胞に導入し、恒常的に発現する細胞株を樹立して解析を行った。得られた細胞株にFasを介する細胞死を誘導したところ、予想どおり野生型のc-FLIPはp10サブユニットの生成が観察されたが、変異型のc-FLIP DNは全く切断されなかった。さらに変異型のc-FLIP DNは野生型のc-FLIPと比べて、僅かな発現量でもFas誘導アポプトーシスを効率よく抑制できることが分かった。このことはc-FLIPの切断がCaspase-8の活性化を促進することを示唆する。すなわち、c-FLIPはCaspase-8の自己切断的な活性化を促進し、結果的に細胞死を促進する因子として機能することが考えられる。今まではc-FLIPの高発現は細胞死を誘導し、生理的なレベルでの低発現は細胞死を抑制すると考えられたが、我々の実験結果は生理的なレベルの発現量においてもc-
器官培養法を応用したバイオマテリアルの生物学的評価に関する研究

器官培養法を応用して、生体に使用される材料の組織適合性を検討した。使用材料はコバルトクロム合金(【Co^-】Cr)と接着性レジンである。【Co^-】Crとしてはメタキャスト(Metと略,Co62%Cr32%Mo4%その他2%),ドラリアムJD(JD,Co68%Cr26%Mo4その他2%),スマロイコバルト(SM,Co61%Cr26%Mo7%Ti0.5%その他5.5%),サンコリュームハード(SUN,Co57%Cr23%以上Ni5%以上Mo3%W3%その他9%以下),接着性レジンとしてスーパーボンドC&B(SUP),パナビアEX(EX),比較のためクリアフィルF【II】(CL),光重合レジンのデュラフィル(DU),対照として直径0.3mmのガラス棒を用いた。これらの材料を直径0.3mmの線状に調整し、無菌的に摘出した鶏胚大腿骨にこれら試料を挿入し、7日間回転培養した。培養後、長さの成長率や湿重量/乾燥重量比(W/D),組織標本等によって各試料の組織の影響を検討した。その結果、鶏胚骨の長さの成長率では対照に対してMet110.1±13.1%,JD108.6±15.4%,SM96.0±7,5%,SUN98.8±7.3%,SUP106.1±9.0%,EX102.4±5.3%,CL110.5±3.7%,DU94.4±13.5%となり対照と有意な差はなかった。またW/Dは対照に対してMet91.3±5.3%,JD99.8±4.0%,SM101.3±3.8%,SUN101.9±6.5%,SUP98.5±7.9%,EX104.2±4.3%,CL98.5±7.9%,DU102.2±5.8%であり、Metのみが対照に対して小さい値を示しているが、組織像を調べると対照と差はあまりなく、W/Dが大きい場合は問題となるが、組織像より判定して小さい場合は問題ないと思われる。組織像では対照と比較して、【Co^-】Crは試料と隣接した部分に結合組織層の存在を認めるものの大きな差はない。一方、CLは対照よりも組織の細胞に限られてはいるが、影響を与えている。これに対しSUPやEXはCLよりも細胞への影響範囲が少なかった。したがって、【Co^-】Crは組織に大きな影響はなく、接着性レジンはレジン硬化後に関しCLより影響は少ない材料と考えられる。
強力パルス中性子源を活用した超高圧物質科学の開拓

地球深部や惑星内部に存在しうる水、氷、鉱物中の水素などの構造を解析することを目的とした超高圧条件における中性子回折実験を、J-PARCに建設された強力パルス中性子源を活用しながら実現した。体積の小さな超高圧条件の試料に効率よく中性子を集光するスーパーミラー管を新たに製作し、ナノ多結晶ダイヤモンドなどを利用した新規高圧発生装置を開発し、中性子をプローブとする超高圧物質科学の地平を拓くことに成功した。J-PARCに建設されたパルス中性子源を利用し、これまで到達することができなかった高圧力条件で中性子回折を測定する技術を開発し、地球・惑星内部に匹敵する超高圧極限条件における、水素を基調とした物質科学を飛躍的に発展させる。本研究計画では、人類未到の圧力領域における中性子回折実験を実現するため、新しい高圧発生装置の開発と、高圧力下に置かれた微小体積試料に中性子を絞り込むための中性子光学系の開発を並行して行う。特に今年度は、圧力発生に用いるナノ多結晶ダイヤモンドの加工技術の開発に力を入れた。ナノ多結晶ダイヤモンドはもっとも硬度の高い物質で、その加工は困難を極める。我々は種々のパルスレーザーを用いたダイヤモンドの切削、研磨加工を試行した。その結果、ナノ秒ならびにフェムト秒のパルスレーザーを用いて、ナノダイヤモンドの表面を1ミクロン以下の平滑度で加工できることがわかった。加工断面はFIBによって薄膜試料を切り出し、透過電顕を用いて観察を行った。単結晶ダイヤモンドとナノ多結晶ダイヤモンドとではレーザー加工断面に顕著な差がみられた。これらの違いは、ナノ多結晶ダイヤモンドが単結晶ダイヤモンドと比較して一桁近く熱伝導度が低いことによりレーザーパワーが局所的に集中すること、そしてナノ多結晶ダイヤモンドには碧海面が存在しないことなどが起因していると考えられる。また、パルス中性子を1mm程度の空間に集光し、さらに得られる回折パターンの分解能を0/5%以下に維持することができる中性子集光ミラーをシミュレーションによって最適化し、設計を行った。この設計を元に、ミラーの試作品を発注し、一般ユーザーに公開されているJ-PARCのビームラインでミラーの性能をテストし、我々の設計の正当性を評価してゆく。さらに今後はこれらの知見を元に、高圧ビームライン用の長尺中性子ガイドミラーの設計と製作を行う予定である。昨年度に続き、極めて強固な新材料であるナノ多結晶ダイヤモンドを、高圧発生用のアンビルとして応用し、超高圧条件における中性子散乱実験を行うための技術開発を進めた。特に、今年度は近赤外レーザーを用いたナノ多結晶ダイヤモンドの加工法の開発と、表面状態の解析を進めた。その結果、単結晶ダイヤモンドでは結晶内での劈開によって加工表面がミクロンオーダーで粗くなるのに比較して、ナノ多結晶ダイヤモンドをレーザー加工した表面は極めて平滑であることが、電子顕微鏡による観察で明らかになった。また、ナノ多結晶ダイヤモンドの断熱性も、優れた加工特性につながっていることが明らかになった。ナノ多結晶ダイヤモンドを圧力発生材料として応用する場合は、ダイヤモンドを曲面状に加工し、テーパー面で加重を分散させる機構が不可欠である。平滑な曲面加工が可能となることによって、応力の集中を防ぎながら、アンビルの背面圧をサポートすることが可能になる。また、ナノ多結晶ダイヤモンドの内部に蓄積する応力分布を三次元的に可視化する手法も開発した。具体的には、顕微ラマン分光法による三次元イメージングによって、微小な残留応力に起因する振動数のシフトを観測する計測手法を開発した。本測定法を用い、加工前後のナノ多結晶ダイヤモンドの応力の有無を確認することができた。また、本技術の開発による副産物も見逃すことができない。本方法を地質学的な試料に適応したところ、日本列島に産する微小なダイヤモンド結晶の発見につながった。年度の後半には、本研究で確立したナノ多結晶ダイヤモンドの加工技術により、高圧発生用のアンビルを試作することができた。今後は、圧力発生実験を重ねて、中性子散乱測定に適用していく予定である。本研究計画では、超高圧状態での水素関連物質の結晶構造を、パルス中性子源を用いた中性子回折測定によって明らかにするための技術開発を行い、地球・惑星物質科学における新たなサイエンスの開拓を進めることを目標にしている。本年度は、主に以下に述べるような研究成果を原著論文として発表した。本研究計画の柱となっているナノ多結晶ダイヤモンドの精密加工による小型対向アンビルセルの開発では、これまで初年度から積み重ねてきたレーザー加工技術を駆使し、実際に対向型アンビルセルを試作し、高圧発生実験を行った。また、独自の中性子光学設計に基づいたミラーのデザインと製作を行い、パルス中性子源を用いた超高圧下での中性子回折測定技術の開発をさらに発展させた。また、並行して低温・高圧条件での中性子回折測定が可能となる、小型キュービックアンビル高圧発生装置の開発も進め、実際にJ-PARC工学材料回折装置「匠」において、中性子回折測定を行った。以上のような装置開発と並行して、ナノ多結晶ダイヤモンドのレーザー加工表面の精密観察や、加工組織の電子顕微鏡観察を行い、新材料であるナノ多結晶ダイヤモンドのレーザー加工の際の基礎データを科学論文として公表した。

また、中性子回折測定により、氷Ih相の秩序化相であるXI相の生成プロセスを精密に解析することに成功し、氷XIが存在するとは考えられていなかった温度条件においても、微小なXIのドメインが存在しうると言う新たな仮説を提案した。本年度はJ-PARCに完成した高圧中性子ビームラインPLANETに、独自に設計した新規中性子集光ミラーを製作・導入し、小型高圧セルを用いた中性子回折実験を行うため基盤を完成させた。本研究プロジェクトで導入した12メートル級のスパーミラーガイド管、ならびに当該年度に導入した集光ミラーを併用することで、世界最高レベルの強度を誇るパルス中性子源において、高圧下中性子回折実験を行う環境が整ったことになる。また、PLANETビームラインで用いる中性子回折用小型セルも製作し、ナノ多結晶ダイヤモンドを用いて1mm^3程度の試料体積を維持しながら15GPaを超える圧力条件での実験が可能となった。また、これまでParis-Edinburghプレスを用いて低温・高圧下での実験が行われてきたが、低温条件を実現するためにプレス全体を冷却する必要があったため、油圧による細かい圧力制御を行うことができなかった。我々はジルコニアを熱絶縁体として活用した新規対向形高圧発生装置を新たに開発し、高圧におかれたアンビル近傍のみ冷却することを実現させた。本装置を用いることにより、これまで不可能であった低温条件での圧力コントロールが可能となり、あわせて迅速な温度制御も行うことができるようになり、当初の目標を超えた低温条件での高圧下中性子回折実験を行うことができるようになった。当該年度は、金属水酸化物、含水ケイ酸塩鉱物、メタンハイドレート、水素ハイドレート、種々の合金系などを研究対象として、高圧下での構造変化、物性変化を観測することに成功した。
キラル共役ポリラジカルの合成と磁気光学機能

本研究では、らせん選択重合など精密重合により側鎖ラジカルの配置にキラリティを有するキラル共役ポリラジカルを合成し、かつその配置を水素結合により固定・制御することでラジカル配置と磁気的および光学的性質との相関を整理することを研究目的としている。本年度は、次の項目について明らかにした。1.キラル共役ポリラジカルの組織化と磁気的性質水素結合可能な置換基を有するモノマーとしてガルビノキシル骨格を有する4ベンジルオキシカルボニル-3, 5ジヒドロキシフェニルアセチレンのらせん選択重合により得られた光学活性らせんポリマーがm-位のヒドロキシメチル基による分子内水素結合により極めて安定ならせん構造を有していることから、これを化学酸化することで高スピン濃度の光学活性ならせん高分子ポリラジカルが得られることを明らかにした。また、ラセミ体の1-フェニルエチルアミンを用いて重合して得られた、鎖内でらせん方向がラセミ化していると考えられるポリラジカルと比較して、光学活性ならせん高分子ポリラジカルでは、非常に強い反強磁性を示した。分子間でらせん方向をラセミ化させたポリラジカルにおいても比較的強い反強磁性を示したこと、およびESRスペクトルにおいてg=4にΔm_s=±2の禁制遷移が観測されたことより、この強い反強磁性相互作用にらせん構造が大きく関与していることが示唆された。2.キラル共役ポリラジカルの磁気光学効果安定ラジカル構造を有する光学活性なポリ(1, 3-フェニレンエチニレン)について、MCDスペクトルでは300nm付近の主鎖発色団および470nmのガルビノキシルラジカル発色団の吸収に対応してファラデー効果が観測されたが、そのコンフォメーションに依存しなかった。一方、フォルダマー構造を形成することで側鎖ガルビノキシル間に大きな反強磁性的相互作用を誘起することが明らかとなった。この目的を達成するために、以下の項目について実施している。「らせん選択重合により、光学活性ならせん状超階層構造を有する新規な共役ポリラジカル、すなわちキラル共役ポリラジカルを合成する。」、「得られたキラル共役ポリラジカルについて、その片巻らせん構造に起因した磁気的・光学的性質を明らかにする。」本年度は、次の項目について明らかにした。1.水素結合可能な置換基を有するモノマーの設計および合成水素結合可能な置換基を有するモノマーとして4ベンジルオキシカルボニル-3,5-ジヒドロキシフェニルアセチレンおよびαメチル位にTEMPOラジカルを置換した4-(ヒドロキシメチル)フェニルアセチレンを新規に設計・合成した。また、より高スピンのラジカル側鎖を導入するため、ガルビノキシル骨格を有する25量体のオリゴ(9,10-アントリレンエチニレン)誘導体も併せて合成した。2. 3つの方法による光学活性ならせん主鎖ポリラジカルの合成上記、新規合成したモノマーも含め、安定ラジカル構造を有する光学活性ならせんポリ(フェニルアセチレン)およびポリ(1,3-フェニレンエチニレン)について、3つの合成法(すなわち、1)光学活性モノマーとラジカル骨格を有するモノマーとの共重合、2)光学活性触媒によるらせん選択重合、3)光学活性溶媒による光学不活性ポリマーからの片巻らせん誘起と水素結合によるその固定化)を開拓した。
プロテインキナーゼCと結合するLIMタンパク質の機能解析

1996年に酵母Two-Hybrid法によりPKCβ結合タンパク質としてENH1(Enigma homologue1)が見出された。591アミノ酸残基から成るこのENHは、タンパク質間相互作用に関連すると考えられるPDZドメインを1コピー及びLIMドメインを3コピー有しており、これまでに見出されていたPDZ-3LIMタンパク質ファミリーの一つであった。これまでに、申請者を中心として、ENHのLIMドメインがPKCβの制御領域と結合し、そのリン酸化活性を亢進することを示した。さらに、PDZドメインが心筋細胞内でα-actininと直接結合し、サルコメアZ-diskに局在することも明らかにした。また一般に、PKCβの活性亢進が心筋サルコメア構造形成に関与し、特に心肥大の要因となる知見も得られている。ENHと類似の構造を持つEnigmaタンパク質が、チロシンキナーゼ群を統括するアンカリングタンパク質と報告されていることからも、ENHは、心筋発生時、及び、心肥大発生時に同種の役割を担っていると推察される。従って、ENHと結合するタンパク質群を同定することは心筋発生、心肥大とPKCβを介する細胞内情報伝達機構を結ぶ新規な情報伝達経路を解明する上で重要なアプローチとなると考えられる。そこで今年度、申請者は共同研究者らと共に新たなENH結合タンパク質、プロテインキナーゼD(PKD)を酵母Two-Hybrid法により同定した。さらに詳細な実験により、PKDはその全長では無く、キナーゼドメインのみの欠失変異体がENHのLIMドメインと結合することが判明した。この結果、細胞内で活性化型PKDのみがENHと結合することが示唆される。実際、心筋細胞を蛍光抗体法で観察したところ、活性化型PKDのみがENHと共にZ-diskに局在することが判明した。また、心肥大を誘導するいくつかの液性因子(AngiotensinII, norepinephrine, etc.)によってサルコメアを再構成させた心筋細胞では、活性化型PKDがその刺激によりZ-diskに局在移行することを見出した。一方、同様に「心肥大を誘導する液性因子として知られる白血病抑制因子(LIF)による刺激では活性化型PKDはZ-diskに局在移行することは無かった。これらの事実は、心肥大を誘導する様々なエンドサイトーシスから特定の分子から成る情報伝達経路を形成する足場タンパク質としての働きをZ-disk上で担っていることを示唆している。このように、ENHの心筋細胞内での役割を解明することは心肥大発症機構を解明する上でも重要であると考えられる。
児童生徒の反社会的行動に及ぼす非社会性要因の影響について

本研究は、「暴力行為」や「非行」という反社会的行動に対して、非社会性の改善(社会性の向上)に関する研究で培われた視点・手法・教育実践を適用することにより、反社会的行動の減少・抑制が可能であることを実証したものである。これは、現在の児童生徒の反社会的行動の背景には、近年の児童生徒全般に見られる社会性の未熟・未発達の問題が少なからず存在していることをも示したものと言え、「非行少年」等の処遇に対しても示唆を与えるものと言える。本研究の目的は、「暴力行為」や「非行」という反社会的行動に対して、非社会性の研究で培われた視点・手法・教育実践を適用することにより、新たな知見・解釈を得られるかどうかを検証することにある。従来、反社会的行動等の問題に対しては、もっぱら本人や家庭の暴力的要因を主因と見なし、それらを除去したり矯正したりすることで問題の解消を図るといった、いわば「治療的発想」に基づく対応がなされてきたと言える。今回の研究では、そうした反社会的行動の背景に非社会性の問題があると仮定し、そこに「教育的発想」に基づいた対応を行うことで、非社会性のみならず反社会的な問題の未然防止も可能になるかどうかを検証しようとするものである。本年度は、その1年目として、暴力的な問題行動の発生率が相対的に高いA中学校区(A中学校、B小学校、C小学校)に対して、基礎的な質問紙調査を、5回にわたって実施した。内2回は「問題行動測定調査」と呼ばれるもので、6日と11日に実施、残る3回は「社会性測定調査」と呼ばれるもので、5日・10月・2月に実施した。これらのデータは、2年目以降に行うA中学校区の取組の参考にするためのものであると同時に、2年目以降も類似の調査を行うことで、相互の結果を比較対照し、2年目の取組の効果を測定・評価するためのものである。2年目には主として自己有用感に着目した教育実践を行ってもらうことによって児童生徒の社会性を高め、そのことが3年目における児童生徒の反社会的行動の減少に結びつくかどうかを検証していくことになる。なお、本年度は、そのほかに、スウェーデン教育省の関連研究機関の研究者との交流、ニュージーランド教育省の行政官ならびに研究者との交流を行うことにより、非社会性が反社会的行動に結びつく傾向は、日本に顕著な(先進的に顕在化している)傾向であることを確認した。○22年度に執行した研究にかかる実績本年度は、その2年目として、暴力的な問題行動の発生率が相対的に高いA中学校区(A中学校、B小学校、C小学校)に対して、基礎的な質問紙調査を、5回にわたって実施した。初年度(小6時)に社会性育成の取組を行った本年度の中1生は、不登校に関してもいじめに関しても、前年度の中1生の結果と比べて大きく改善したことが明らかになった。すなわち、「教育的発想」に基づいた対応は、非社会性のみならず反社会的な問題に対しても有効であることが確認された。○23年度に執行した研究にかかる実績平成22年11月1日3日に開催予定の第5回校内暴力会議5th World Conference on Violence in Schools(アルゼンチン)に出席して情報交換を行う予定であったが、延期になったため平成23年4月7日9日の同会議に出席した。また、その様子を、調査協力校区にて報告した。○23年度に執行した研究にかかる実績本年度は、その3年目として、暴力的な問題行動の発生率が相対的に高いA

中学校区(A中学校、B小学校、C小学校)に対して、基礎的な質問紙調査を、5回にわたって実施した。初年度(小6時)に社会性育成の取組を行った本年度の中2生は、不登校等に関して前年度の中2生の結果と比べて好ましい結果になっていることが明らかになった。すなわち、「教育的発想」に基づいた小6時の対応は、非社会性のみならず反社会的な問題に対しても有劾であり、それが持続していることが確認された。
B2型金属間化合物を主体とする高温構造用材料の合金設計

これまでにCo-A12元系B2/(Co)2相合金で圧縮塑性歪23%,Co-A1-Ni3元系B2/L1_2(Ni_3A1)2相合金で10%以上の延性改善を行った。B2/L1_2相合金では延性と高温強度を同時に改善できる可能性があり,Co-A1-Ni-Ti4元系内でL1_2 Ni_3A1とCo_3Tiの連続固溶体を利用すると,Co高濃度側までB2/L_2多相領域が拡大でき,広い組成範囲での組織制御が可能であると考えた。本年度は,Tiを2.5および5.0at%添加したCo-A1-Ni-Ti4元系B2/L1_2多相合金の組織形態と機械的性質の関係を調べた。Ti添加量2.5,5.0at%の合金をアーク炉により溶製し,1373K,4h+1173K,24hの均質化熱処理を施した。組織および平衡相を調べるため光学顕微鏡観察,X線回折,示差熱分析を行い,機械的性質を調べるために,硬さ試験,室温から1273Kの温度範囲で圧縮試験を行った。その結果,2.5,5.0at%Ti両合金ともに組織はB2/(Co,Ni)2相,B2/L1_22相,B2/(Co,Ni)/L1_23相と思われる3つのタイプに大別できた。ほぼB2単相のB2/(Co,Ni)2相合金を除く全ての合金で410%の圧縮塑性歪が得られ,L1_22相を含む合金では特に良好な室温延性が達成できた。全ての合金が室温で1000MPa以上の高強度を示し,0.2%変形応力(降伏強度)の温度依存性には,支配的である構成相の特徴が反映されることがわかった。例えば,B2相を多く含む合金では600から800Kの温度域で温度上昇に伴う強度低下が抑制されるB2型特有の温度依存性を示し,また,L1_2相を多量に含む合金ではL1_2相に起因する強度の正の温度依存性の発現によって600から800Kの温度域が最大強度を示した。Ti添加量が強度に与える影響はB2/L1_2相合金で顕著に現れ,Ti添加量を増加させると1073Kまでの温度域で200MPa程度の強度上昇が認められた。すなわち,Co-A1-Ni3元系からCo-A1-Ni-Ti4元系に拡張することでB2/L1_2多相領域がCo高濃度側に拡大でき,良好な延性,高強度を実現できた。本年度はB2型金属間化合物のなかでNiAl,FeAlならびにCoAlを選択しNiAlとFeAlはその擬2元系合金の強さの温度依存性をAl量を一定にしてFeとNiの量比を変えた合金について調べた.またCoAlについては実験的にCoーAl2元状態図の見直しを行い,ついでCoAl単相合金とCoの一次固溶体との2相組織とした合金の強さの温度依存性をそれぞれ系統的に求めた.得られた結果をまとめると次のようになる.1)Al量を一定にし,NiとFeの量を変化させたB2型3元化合物の強度は室温から1273Kのすべての温度においてFe量10at%付近で最小となり,40at%付近で最高となる.Fe約10at%付近で強さが最小となる理由はFeあるいはNiのB2結晶構造における置換挙動と密接な関連があると考えられる.2)Feを約30at%以上含有する(Ni,Fe)Al合金は室尚においても延性を育する.このことと1)の結論をあわせると35at%Feを含む(Ni,Fe)Al合金が高温構造用材料として最も有望であるといえる.3)B2型CoAlは単相では著しく脆いが,これをCoの一次固溶体との2相組織にすることにより,延性の若干の改善に加えて強度も増加する.このときB2相内に分散するCo固溶体は粒界に優先析出するため,2相組織の組織制御を行えばさらなる延性の改善が望めると考えられる.なお,これらの成果の印刷発表は現在投稿準備中であり,近日中に行う予定である.これまでにCo-A12元系B2/(Co)2相合金で圧縮塑性歪23%,Co-A1-Ni3元系B2/L1_2(Ni_3A1)2相合金で10%以上の延性改善を行った。

その結果,2.5,5.0at%Ti両合金ともに組織はB2/(Co,Ni)2相,B2/L1_22相,B2/(Co,Ni)/L1_23相と思われる3つのタイプに大別できた。ほぼB2単相のB2/(Co,Ni)2相合金を除く全ての合金で410%の圧縮塑性歪が得られ,L1_22相を含む合金では特に良好な室温延性が達成できた。全ての合金が室温で1000MPa以上の高強度を示し,0.2%変形応力(降伏強度)の温度依存性には,支配的である構成相の特徴が反映されることがわかった。例えば,B2相を多く含む合金では600から800Kの温度域で温度上昇に伴う強度低下が抑制されるB2型特有の温度依存性を示し,また,L1_2相を多量に含む合金ではL1_2相に起因する強度の正の温度依存性の発現によって600から800Kの温度域が最大強度を示した。Ti添加量が強度に与える影響はB2/L1_2相合金で顕著に現れ,Ti添加量を増加させると1073Kまでの温度域で200MPa程度の強度上昇が認められた。すなわち,Co-A1-Ni3元系からCo-A1-Ni-Ti4元系に拡張することでB2/L1_2多相領域がCo高濃度側に拡大でき,良好な延性,高強度を実現できた。
尿細管糸球体フィードバック機構の解明-糸球体輸入細動脈と尿細管の個別潅流法を用いて-

腎臓における自動性調節機序として尿細管・糸球体フィードバック(TGF)機構が想定されている。本研究の目的は、センサーであるマクラデンサ細胞が感知した情報を、効果器である糸球体輸入細動脈へ伝える伝達物質をin vivoおよびin vitroの系で実証することにある。我々はマクラデンサ細胞に豊富に存在する一酸化窒素(NO)合成酵素に注目して、伝達物質の第1の候補としてNOを、そして第2候補としてイオン再吸収に際し産生されるアデノシンを選び検討を加えた。In vivo実験:ペントバルビタール麻酔イヌの腎動脈に高張食塩水を注入し、尿細管の仕事量(Na再吸収)を増加させると、腎血流量の低下、即ち腎血管の収縮が認められた。申請者等が開発した実質臓器用ミクロダイアリーシス法により腎間質中のアデノシン濃度を測定すると、間質中のアデノシン濃度は45倍増加していた。次いで、アデノシンI受容体拮抗薬の前処置下に、腎動脈内に高張食塩水を注入すると、腎血管の収縮はほぼ完全に抑制された。In vitro実験:効果器である糸球体輸入細動脈を強く収縮させるアンジオテンシンII、バゾプレシンとNOの関係について、単離輸入細動脈を用い検討した。アンジオテンシンIIは、輸出細動脈に比べ輸入細動脈の収縮作用は非常に弱いが、NO合成酵素阻害剤処置後では、非常に強い収縮作用を発揮した。その作用は、プロスタグランジン合成阻害により一層増強された。バゾプレシンもV1受容体を介し輸入細動脈を収縮させるが、V2受容体を介し拡張作用を発揮することを明らかにした。この拡張作用は、NO合成阻害下では抑制されることから、V2受容体-NO合成促進系の存在が示唆された。以上、本研究でアデノシンはTGF機構の主な伝達物質である可能性を示し、またNOは多くの血管作動物質の輸入細動脈への作用を修飾することを明らかにした。In vivo実験:ペントバルビタール麻酔イヌの腎動脈内に高張高塩水を注入し、尿細管の仕事量(Na再吸収)を増加させると、腎血流量の低下、即ち腎血管の収縮が認められた。

この拡張作用は、NO合成阻害下では抑制されることから、V2受容体-NO合成促進系の存在が示唆された。以上、本研究でアデノシンはTGF機構の主な伝達物質である可能性を示し、またNOは多くの血管作動物質の輸入細動脈への作用を修飾することを明らかにした。
超音波血流ドプラ信号の相互相関解析によるメタボリックシンドロームの心血管機能評価

超音波血流ドプラ信号解析を用いて、心不全症状のないメタボリックシンドロームの心機能解析を行った。メタボリックシンドロームでは正常対象群と比較して左室収縮能は保持されているが、左室拡張能の低下が認められることが明らかになった。さらに左室拡張能障害は動脈の硬さ指標と相関することが明らかになり、心室-動脈連関が左室拡張能障害に関与することが示唆された。さらに、ドプラ法を用いた解析では心機能指標ストレインは正常群でも加齢とともに低下するが、高血圧単独、糖尿病単独があればさらに低下し、両者が合併すると最も低下度が大であることを明らかにされた。したがって高血圧・糖尿病が合併するメタボリックシンドロームでは左室長軸方向の心機能が最大に低下しているため、拡張障害による心不全を発症しやすいことが示された。本研究では1)超音波診断法を用いて得られる心臓形態および心機能の指標から心臓年齢を導出する方法を開発すること、2)心臓年齢と血管年齢、筋年齢などの老化の指標との関係を明らかにすること、3)心臓年齢と老化促進因子と考えられる酸化ストレスとの関係を明らかにすること、4)食事療法や運動療法が心臓年齢指標に及ぼす影響について検討することを目的とする。高血圧、糖尿病、高脂血症、メタボリックシンドロームの患者を対象として、我々が提唱しようとする心臓年齢評価指標を計測し、健常者の心臓年齢標準曲線との自動照合を行い、心臓年齢評価を行っている。各心血管病リスクファクターと心臓年齢の関係を検討して心臓年齢に大きく関与する因子を明らかにするため、リスクファクターの重複が心臓年齢に及ぼす影響を検討し、心臓年0歳-100歳の健常者の心臓超音波検査から大動脈、左室形態の記録を行っている。心臓年齢の指標としては簡便に短時間で計測可能であることを条件にするため、左室肥大の指標(左室心筋重量)、S状中隔変形度、左室流入血流速度波形(拡張早期流入血流速度:E、心房収縮期血流速度:A、これらの比:E/A)などの通常の心臓超音波検査で計測する項目を重点的に行った。また、頚動脈エコー検査を併せて行い、頚動脈のintima-media thickness (IMT)、頚動脈プラークスコアなど動脈硬化の定量評価を行っている。さらに動脈硬度の指標として、stiffness parameter β、augmentation index (AI)、arterial compliancd (AC)、局所脈波速度(PWV)を超音波診断装置で計測し、同時に血圧・脈波計測装置(ブクダ電子社製)を用いて上腕-足首間の脈波速度を計測し動脈硬化度を計測している。以上の血管年齢の指標を心臓年齢と比較して、心血管系の老化における心臓と血管の関連性にっいてさらに検討する。各心血管病リスクファクターと心臓年齢の関係を検討して心臓年齢に大きく関与する因子を明らかにするため、リスクファクターの重複が心臓年齢に及ぼす影響を検討し、心臓年0歳-100歳の健常者の心臓超音波検査から大動脈、左室形態の記録を行った。心臓年齢の指標として、左室肥大の指標(左室心筋重量)、S状中隔変形度、左室流入血流速度波形(拡張早期流入血流速度:E、心房収縮期血流速度:A、これらの比:E/A)などの通常の心臓超音波検査で計測する項目を重点的に行った。また、頚動脈エコー検査を併せて行い、頚動脈のintima-media thickness (IMT)、頚動脈プラークスコアなど動脈硬化の定量評価を行った。さらに動脈硬度の指標として、stiffness parameter β、augmentation index (AI)、arterial compliance (AC)、局所脈波速度(PWV)を超音波診断装置で計測し、同時に血圧・脈波計測装置(CAVI)を用いて上腕-足首間の脈波速度を計測し動脈硬化度を計測した。これまでのところ血管年齢の指標を心臓年齢と比較して、心血管系の老化における心臓と血管の関連性について新たな知見が獲得されつつあり、論文発表してきた。

さらに、今回研究課題で得られた成績を基にして、超音波診断法によるメタボリックシンドロームの病態解析における知見を明らかにして行きたい。1.超音波血流ドプラ信号の相互相関係数計測による心機能評価と動脈硬化評価臨床例において超音波血流ドプラ法による左室拡張能指標と網膜動脈などの動脈硬化との関連性について検討した。狭心症、心筋梗塞などの動脈硬化性疾患の心機能と動脈硬化の関連性を高血圧、脂質代謝異常、糖尿病、肥満、喫煙、家族歴などの危険因子とともに検討を行った。動脈硬化指標として確立されたCardio-ankle vascular index (CAVI)や網膜動脈の動脈硬化病変と比較し、超音波血流ドプラ信号の相互相関係数計測による心機能および動脈硬化評価の有用性を検討した。2.メタボリックシンドロームでの心機能評価と動脈硬化評価1)従来の動脈硬化指標と心機能計測対象症例を安静仰臥位にて通常の心臓エコー検査を行い、左室、大動脈形態の記録を行い、特に左室肥大、左室拡張能などの心機能指標の計測を行った。引き続き頚動脈エコー検査を行い、頚動脈のintima-media thickness (IMT)で動脈硬化の定量評価を行った。同時に、Cardio-ankle vascular index (CAVI)を用いて脈波速度を計測し大動脈硬化度を計測した。2)超音波血流ドプラ信号の相互相関係数による心機能評価と動脈硬化評価対象症例に対して我々が開発した超音波血流ドプラ信号の相互相関係数計測装置(日立メディコ社製:HITACH EUB 8000搭載)を用いて左室流入血流の伝播速度計測から左心機能評価を行った。左室流入血流伝播速度を計測し、左室拡張能を評価する。従来の心エコー計測から得られた左室拡張能指標と比較し、本法から得られる心機能指標は偽正常化などの限界が認められず、臨床上有用と考えられた。
新しい分子認識能実現を目指す抗体のタンパク質工学

繊維状ファージのコートタンパク質に異種タンパク質を融合し機能を保持したまま提示するシステムを利用すれば無作為な変異導入により創製されるタンパク質の構造・機能を迅速に選択できる。本研究ではニワトリリゾチームとそのモノクローナル抗体、HyHEL10に着目し、HyHEL10の可変領域(Fv断片)を繊維状ファージ上に提示するための実験系を確立し、相補性決定領域(CDR)を改変することにより抗原性の異なる相同タンパク質を認識しうる抗体の人工的作製を目指した。本研究をまとめると(1)HyHEL10の抗原認識に関与するFv断片を微生物の効率的発現系により作製し、部位特異的アミノ酸置換法並びに熱量測定により抗原抗体反応の詳細な解析を行い、抗原抗体反応のいくつかの基礎的な特徴を明らかにしてきた。(2)HyHEL10の一本鎖Fv断片を汎用のリンカー(GGGGS)_3を用いて調製を試みたが、アミノ末端からVHーリンカー-VLと並べると大腸菌で殆ど発現しないのに対して、VLーリンカー-VHと並べる充分な分泌発現が見られた。精製した一本鎖Fv断片は抗原リゾチームと充分な結合活性を示したが、元のFv断片より半分程度に低下していることを見いだした。そして、この結合定数の低下は結合反応におけるエントロピーの損失によっていることを明らかにした。(3)ファージ由来のプロモーターを利用し、新規なファージ提示系を開発した。この系を利用してHyHEL10一本鎖Fv断片及び重鎖可変領域をファージ表面に安定に提示することができた。(4)新規なファージ提示系を用いて、HyHEL10の重鎖CDR2に無作為な変異を導入したライブラリーを作製し、野生型HyHEL10が結合能を持たないヒトリゾチームに対する特異性を有する新規抗体の創成に成功した。繊維状ファージのコートタンパク質に異種タンパク質を融合し機能を保持したまま提示するシステムを利用すれば無作為な変異導入により創成されるタンパク質の構造・機能を迅速に選択できる。本研究ではリゾチームとそのモノクローナル抗体、HyHEL10に着目し、HyHEL10の可変領域(Fv断片)を繊維状ファージ上に提示するための実験系を確立し、超可変領域を改変することにより抗原性の異なる相同タンパク質を認識しうる抗体の人工的作製を目指している。今年度は一本鎖Fv断片を既に確立したT7-プロモーターとpelB-ジクナルペプチドを利用したFv断片の大腸菌の分泌発現系を改良して作製した。汎用のリンカー(GGGS)_3を用いて一本鎖Fv断片の調製を試みたが、アミノ末端からVH-リンカー-VLと並べると大腸菌で殆ど発現しないのに対して、VL-リンカー-VHと並べる充分な分泌発現が見られた。精製した一本鎖Fv断片は抗原リゾチームと充分な結合活性を示したが、結合定数を酵素活性の阻害、滴定型熱量測定計を用いて測定すると、元のFv断片より半分程度に低下していることを見いだした。通常Fv断片を一本鎖化すると、抗原に対する結合活性は低下するが、その原因としては主にリンカーによる立体障害等のエンタルピー項の低下を招くためと考えられていたが、本研究での詳細な熱力学的解析から得られた結果は、エントロピー項の低下が主たる原因であることを示している。以上のように、一本鎖抗体を作成する上で考慮すべき問題点を明確にすることができた。また、これら一本鎖FvをM13ファージコートタンパク質上に提示すると、やはりVL-リンカー-VHの組み合せのみ抗原リソチームとの結合活性を示すことを明らかにした。

繊維状ファージのコートタンパク質に異種タンパク質を融合し機能を保持したまま提示するシステムを利用すれば無作為な変異導入により創製されるタンパク質の構造・機能を迅速に選択できる。本研究ではリゾチームとそのモノクローナル抗体、HyHEL10に着目し、HyHEL10の可変領域(Fv断片)を繊維状ファージ上に提示するための実験系を確立し、相補性決定領域(CDR)を改変することにより抗原性の異なる相同タンパク質を認識しうる抗体の人工的作製を目指している。既にT7-プロモーターとpe1B-シグナルペプチドを利用し一本鎖Fv断片の大腸菌の分泌発現系を改良して作製した。汎用のリンカーを用いて一本鎖Fv断片の調製を試みたが、アミノ末端からVH-(GGGS)3-VLと並べると大腸菌で殆ど発現しないのに対して、VL-(GGGS)3-VHと並べると充分な分泌発現が見られた。精製した一本鎖Fv断片は抗原リゾチームと充分な結合活性を示したが、結合定数を酵素活性の阻害、滴定型熱量測定計を用いて測定すると、元のFv断片より半分程度に低下していることを見いだした。そして、この結合定数の低下は結合反応におけるエントロピーの損失によっていることを明らかにしている。今年度は、HyHEL10のVL-(GGGS)3-VHの組合せの一本鎖FvをM13ファージコートタンパク質3上に提示しファージ抗体を作製し、このファージ抗体は抗原リゾチームと充分な結合活性を示すことを見いだした。このファージ提示の際、申請者等が最近確立したファージミッドを利用した新しい提示系でのみ安定で確実な提示が可能であった。VHのCDR3に無作為な変異導入し、相同蛋白質であるヒトリゾチームを抗原として選択することにより、ニワトリリゾチームよりヒトリゾチームに高い親和性を有するFv分子種を選択することができた。本研究ではニワトリリゾチームとそのモノクローナル抗体、HyHEL10に着目し、HyHEL10の可変領域(Fv断片)を繊維状ファージ上に提示するための実験系を確立し、相補性決定領域(CDR)を改変することにより抗原性のことなる相同タンパク質を認識しうる抗体の人工的作製を目指している。既に前年度までに、HyHEL10のVL-(GGGGS)3-VHの組合わせの一本鎖FvをM13ファージコートタンパク質(遺伝子III産物)上に提示したファージ抗体は抗原ニワトリリゾチームと充分な結合活性を示すことを見いだしている。今年度はこのファージ抗体の相補性決定領域(CDR)に無作為な変異を導入し、元々認識能のないヒトリゾチームに対する認識能を有する変異抗体分子種をELISAを用いて選別した。特に、重鎖CDR2のTyr53,Ser56,Ser56,Tyr58に無作為な変異を導入し、元々の抗原であるニワトリリゾチームよりヒトリゾチームに有意に結合能を示す変異抗体分子を数個選択する事に成功した。これらの内3種類を初年度に確立した効率的発現系を利用し大量調製し、表面プラズモン共鳴法および滴定型熱量測定により抗原との相互作用を定量的に解析した。