hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水平管内空気輸送におけるサルテーション速度に関する研究

空気輸送システムの設計や運転において最も重要な最適輸送流速を単一粒子を輸送した場合の粒子の流動様式から容易に予測できるようにすることを目的としている.管径10mmと管径30mmの実験管路を使用した実験からサルテーション速度の定義を行いその値を求めた.またそれぞれの場合に関して粒子運動の計算を行い以下の結果が得られた.(1)Zenzの定義に従えば,使用した3種類のプラスチック粒子に関しては,管径に対する粒径の直径比がどちらの場合に関してもおおよそ粒子の終末沈降速度から粒子運動が管底部での衝突反発運動から主に浮遊運動へと変化することから,粒子の終末沈降速度をサルテーション速度と定義できることが分かった.ただし,ステンレス粒子の場合は本実験範囲の問題で定義できなかった.(2)全ての粒子は気流速度が粒子の終末沈降速度以下でも十分輸送される,(3)直径比が0.6の場合はステンレス粒子を除いて無次元粒子速度はほぼ終末沈降速度までは気流速度の増加と共に増加するが,それよりも大きくなれば殆ど一定か一定値に漸近する,(4)直径比が0.2の場合は全ての粒子の無次元粒子速度は気流速度とは無関係でほぼ一定である,(5)気流速度が10m/s以上では粒子速度は直径比が大きい方が大きい,(6)どの粒子の回転数にも最大値が存在し,粒子密度が大きいほど最大値での気流速度が大きい,(7)粒子の通過時間間隔は気流速度が小さいほど大きい,(8)本計算によって直径比がある程度小さい場合は粒子運動を定性的にも定量的にも説明できる,(8)粒子運動を計算によって説明するためには特に粒子と管壁との動摩擦係数を正確に測定し見積もる必要があること,が分かった.空気輸送システムの設計や運転において最も重要な最適輸送流速を単一粒子を輸送した場合の粒子の流動様式から容易に予測できるようにすることを目的としている.管径10mmと管径30mmの実験管路を使用した実験からサルテーション速度の定義を行いその値を求めた.またそれぞれの場合に関して粒子運動の計算を行い以下の結果が得られた.(1)Zenzの定義に従えば,使用した3種類のプラスチック粒子に関しては,管径に対する粒径の直径比がどちらの場合に関してもおおよそ粒子の終末沈降速度から粒子運動が管底部での衝突反発運動から主に浮遊運動へと変化することから,粒子の終末沈降速度をサルテーション速度と定義できることが分かった.ただし,ステンレス粒子の場合は本実験範囲の問題で定義できなかった.(2)全ての粒子は気流速度が粒子の終末沈降速度以下でも十分輸送される,(3)直径比が0.6の場合はステンレス粒子を除いて無次元粒子速度はほぼ終末沈降速度までは気流速度の増加と共に増加するが,それよりも大きくなれば殆ど一定か一定値に漸近する,(4)直径比が0.2の場合は全ての粒子の無次元粒子速度は気流速度とは無関係でほぼ一定である,(5)気流速度が10m/s以上では粒子速度は直径比が大きい方が大きい,(6)どの粒子の回転数にも最大値が存在し,粒子密度が大きいほど最大値での気流速度が大きい,(7)粒子の通過時間間隔は気流速度が小さいほど大きい,(8)本計算によって直径比がある程度小さい場合は粒子運動を定性的にも定量的にも説明できる,(8)粒子運動を計算によって説明するためには特に粒子と管壁との動摩擦係数を正確に測定し見積もる必要があること,が分かった.空気輸送システムの設計や運転において最も重要な最適輸送流速を容易に予測できるようにすることを目的とし,単一粒子を輸送した場合の粒子の流動様式から最適輸送流速(本研究でのサルテーション速度)の定義を試みた.実験は管長8.8m,管径10mmの管路において粒径が6mmで密度が異なる4種類の粒子を使用した.均一粒子を一定時間間隔で連続的に空気輸送し,粒子の流動様式の変化を既設の高速ビデオ装置を使用して調べ,以下の結果が得られた.(1)使用した粒子は気流速度が粒子の終末沈降速度よりも小さい場合も十分に輸送できる,(2)3種類のプラスチック球に関する気流速度による無次元粒子速度は気流速度がほぼ粒子の終末沈降速度までは気流速度が増加すると共に増加し,気流速度がほぼその終末沈降速度以上になると一定値になるか,もしくは一定値に漸近している状態になる,(3)ステンレス球の場合は気流速度によらず一定値のままである,(4)3種類のプラスチック球に関してはそれぞれの終末沈降速度前後では粒子の流動様式も変化することから終末沈降速度をサルテーション速度と定義できる,(5)各粒子の回転数にはそれぞれ最大値が存在し,密度が大きい粒子ほど最大値での気流速度が大きい,(6)粒子の通過時間間隔のばらつきは気流速度が小さいほど大きいことが分かった.今後,更に気流速度を大きくした実験を行い(2)の一定値に漸近している状態の粒子やステンレス球の流動状態がどのようになるのかを確認する必要がある.計算は,本実験を一種のカプセル輸送とみなすことができるので特性曲線法を使用し,粒子間衝突,粒子と管壁との衝突や粒子の回転を考慮して行った.結果として,粒子速度の計算結果は密度が小さい2種類のプラスチック球に関しては実験と定性的に一致するが粒子運動の詳細に関しては最も密度が小さい粒子以外はうまく再現できないことが分かった.

空気輸送システムの設計や運転において最も重要な最適輸送流速を単一粒子を輸送した場合の粒子の流動様式から容易に予測できるようにすることを目的としている.平成17年度の実験管路には不具合が生じていたため先ず管路を再整備し測定データ点を増やした再実験を行い改めて以下の結果が得られた.(1)高速ビデオの粒子映像の目視による観察からZenzによる単一粒子のサルテーション速度の予測は本実験には直接的には使用できないこと,(2)3種類のプラスチック球では気流速度による無次元粒子速度は気流速度がほぼ粒子の終末沈降速度までは気流速度の増加と共に増加し気流速度がほぼ終末沈降速度以上になると一定値になるか,一定値に漸近している状態になること,(3)ステンレス球の場合は無次元粒子速度は気流速度によらず一定値のままであること,(4)3種類のプラスチック球に関しては終末沈降速度以上では殆ど全ての粒子が測定範囲内では浮遊もしくは滑空状態で輸送され,その速度以下では回転を伴う管壁との衝突反発を生じ最終的には滑りを伴い管底を転がること,(5)Zenzの定義から3種類のプラスチック球に関しては終末沈降速度をサルテーション速度と定義できるがステンレス球に関しては定義できないこと,(6)各粒子の回転数には最大値が存在し,密度が大きい粒子ほど最大値での気流速度が大きいこと,(7)粒子の通過時間間隔のばらつきは気流速度が小さいほど大きいこと,また計算に関しては,(8)本実験を一種のカプセル輸送とみなし特性曲線法を使用して粒子と管壁との隙間からの気流もれの他に粒子間衝突,粒子と管壁との衝突や粒子の回転を考慮して行った結果,密度が小さい粒子に関しては流動状態を定性的に再現できることが分かった.また単一粒子の輸送において管壁との隙間が大きい場合はOne-way couplingモデルを使用し,粒子群の輸送に関してはTwo-way couplingモデルを使用する計算プログラムは現在作成中である.空気輸送システムの設計や運転において最も重要な最適輸送流速を単一粒子を輸送した場合の粒子の流動様式から容易に予測できるようにすることを目的としている。平成18年度までの管径10mmの実験管路を管径30mmの管路に換えて同様の実験を行いサルテーション速度の定義を行った。また固気間の相互作用を考慮して粒子運動の計算を行い,平成18年度までの管径に対する粒径の直径比が0.6の場合も含めて以下の結果が得られた。(1)Zenzの定義に従えば,使用した3種類のプラスチック粒子に関しては,どちらの直径比の場合に関してもおおよそ粒子の終末沈降速度から粒子運動が管底部での衝突反発運動から主に浮遊運動へと変化することから,粒子の終末沈降速度をサルテーション速度と定義できることが分かった,ただし,ステンレス粒子の場合は本実験範囲の問題で定義できなかった。その他の結果としては,(2)全ての粒子は気流速度が粒子の終末沈降速度以下でも十分輸送されること,(3)直径比が0.6の場合はステンレス粒子を除いて無次元粒子速度はほぼ終末沈降速度までは気流速度の増加と共に増加するが,それよりも大きくなれば殆ど一定か一定値に漸近する,(4)直径比が0.2の場合は全ての粒子の無次元粒子速度は気流速度とは無関係でほぼ一定である,(5)気流速度が10m/s以上では粒子速度は直径比が大きい方が大きい,(6)どの粒子の回転数にも最大値が存在し,粒子密度が大きいほど最大値での気流速度が大きいこと,(7)粒子の通過時間間隔は気流速度が小さいほど大きいこと,
インプラント関連感染症の早期診断と治療の確立

骨髄炎などに代表される整形外科領域の手術部位感染は、しばしば治療に難渋する。過去に骨髄炎の血清バイオマーカーの候補は報告されているが、骨髄炎に特異的なマーカーは明らかでない。本研究ではマウス骨髄炎モデルにおける特異的感染症バイオマーカーを探索した。手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析した。279種類の代謝産物が同定された。コントロールと比較し、手術侵襲後の感染症マウスでは血清スフィンゴシンとスフィンゴニンが有意に上昇し、術後感染症のバイオマーカーとなりうる可能性が示唆された。超高齢社会の到来に伴い、退行変性疾患や外傷による人工関節置換術、脊椎矯正インプラント、人工骨などの生体材料を用いた手術が広く普及している。一方で、開放性骨軟部組織損傷やインプラント設置手術では、治療過程においてインプラント関連感染症を併発する頻度が少なくない。実際の臨床現場においては感染症の発症予防のために術中洗浄や抗生物質投与が実施されるが、これらが十分に奏功しない場合に感染症が成立する。本研究では、感染症予防を目的に発症早期の段階において超音波を用いた生体材料表面の細菌除去と感染症バイオマーカーの探索を実施した。バクテリアル・ルシフェラーゼを発現する黄色ブドウ球菌(S.aureus)(1x108CFU/ml)中にチタン合金を留置し、37°C・24時間培養し金属表面にバイオフィルムを形成させた。続いてLIVE/DEAD(LD)蛍光染色にてバイオフィルムを染色後、1未処理、2乾燥、3生理食塩水洗浄、4高圧洗浄、5精製水洗浄、6セファメジン洗浄、7イソジン洗浄、8オキシドール洗浄の臨床現場で試みられている8つの処置に加え、9超音波照射をすべて3分間の処置を行った。一定の周波数と出力による超音波照射により金属表面のバイオフィルムの除去が達成できた。われわれが過去に作製した再現性の高い定量的マウス骨髄炎モデル(Infect and Immunity, 2011)を用いて、1コントロール群、2手術(外傷)群、3手術(外傷)+細菌注入群の3群の手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析した。上記の1と2と比較し、3で有意な高値あるいは低値を示した代謝産物を感染症バイオマーカーのターゲットとして探索した。現在のところマウスからの血液多量採取が必要であるため、多くのマーカーは同定できていないが、手術(外傷)+細菌注入群で血清スフィンゴシンが上昇していた。本課題では、1超音波照射のよる細菌ならびにバイオフィルム除去in vitro実験と2感染症バイオマーカー探索実験を2つの大きな課題としているが、1年目においてそれぞれである程度の結果を得ることができている。本研究では、感染症予防を目的に発症早期の段階において超音波を用いた生体材料表面の細菌除去と感染症バイオマーカーの探索を実施している。続いてLIVE/DEAD(LD)蛍光染色にてバイオフィルムを染色後、1未処理、2乾燥、3生理食塩水洗浄、4高圧洗浄、5精製水洗浄、6セファメジン洗浄、7イソジン洗浄、8オキシドール洗浄の臨床現場で試みられている8つの処置に加え、9超音波照射をすべて3分間の処置を初年度行った。当該年度は、最も有効な照射条件を検討した。その結果、800kHz・3W/cm2が最も有効な照射条件であった。また、SEMと病理でも同様の所見を呈していた。また、われわれが過去に作製した再現性の高い定量的マウス骨髄炎モデル(Infect and Immunity, 2011)を用いて、1コントロール群、2手術(外傷)群、3手術(外傷)+細菌注入群の3群の手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析した。手術(外傷)+細菌注入群で297の代謝産物が検出された。うちSham群とコントロール群で低値を、感染群で高値を示す骨感染症に特異的な血漿バイオマーカー候補は55物質同定された。多変量解析にて正の相関関係が特に強い物質はSpingosine(p<0.001)とSphinganine(p<0.001)であった。またTCAサイクル関連物質は感染群で有意に低く、特にリンゴ酸(p<0.001)が最も負の相関が強かった。本課題では、1超音波照射のよる細菌ならびにバイオフィルム除去in vitro実験と2感染症バイオマーカー探索実験を2つの大きな課題としているが、初年度においてそれぞれである程度の結果を得ることができ、当該年度ではさらに最適条件と統計学的に有意な差をもつ代謝産物が同定されている。超高齢化社会の到来に伴い、退行変性疾患や外傷による人工関節置換術、脊椎矯正インプラント、人工骨などの生体材料を用いた手術が広く普及している。

実際の臨床現場においては感染症の発症予防のために術中洗浄や抗生物質投与が実施されるが、これらが十分に奏功しない場合に感染症が発症する。本研究では、感染症予防を目的に発症早期の段階において超音波を用いた生体材料表面の細菌除去と感染症バイオマーカーの探索を実施した。バクテリアル・ルシフェラーゼを発現する黄色ブドウ球菌(S.aureus)(1x108CFU/ml)中にチタン合金を留置し、37°C・24時間培養し金属表面にバイオフィルムを形成させた。続いてLIVE/DEAD(LD)蛍光染色にてバイオフィルムを染色後、1未処理、2乾燥、3生理食塩水洗浄、4高圧洗浄、5精製水洗浄、6セファメジン洗浄、7イソジン洗浄、8オキシドール洗浄の臨床現場で試みられている8つの処置に加え、9超音波照射をすべて3分間の処置を行った。一定の周波数と出力による超音波照射により金属表面のバイオフィルムの除去が達成できた。特にわれわれが過去に作製した再現性の高い定量的マウス骨髄炎モデル(Infect and Immunity, 2011)を用いて、1コントロール群、2手術(外傷)群、3手術(外傷)+細菌注入群の3群の手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析した。上記の1と2と比較し、3で有意な高値あるいは低値を示した代謝産物を感染症バイオマーカーのターゲットとして探索した。今年度の詳細な解析により、手術(外傷)+細菌注入群で血清スフィンゴシンとスフィンゴニンが有意に上昇し、再現性を示した。骨髄炎などに代表される整形外科領域の手術部位感染は、しばしば治療に難渋する。過去に骨髄炎の血清バイオマーカーの候補は報告されているが、骨髄炎に特異的なマーカーは明らかでない。本研究ではマウス骨髄炎モデルにおける特異的感染症バイオマーカーを探索した。手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析した。279種類の代謝産物が同定された。コントロールと比較し、手術侵襲後の感染症マウスでは血清スフィンゴシンとスフィンゴニンが有意に上昇し、術後感染症のバイオマーカーとなりうる可能性が示唆された。1では、超音波の出力と周波数の照射条件を詳細に検証し最も生体安全性が高く、より効果的な条件設定の検証を行う。また、処理前後のバイオフィルムは蛍光顕微鏡とSEMにて観察する。In vivoでも初年度同様に未処理と超音波処理(複数条件)後の金属を洗浄液とともに各々成体BALB/cマウスの浅殿筋に埋没し、感染症成立の有無を光イメージングで観察し、同様にSEMと病理組織による検討を行う。2では、初年度に引き続き、感染症バイオマーカー探索実験をマウス骨髄炎モデルを用いて実施する。同様に1コントロール群、2手術(外傷)群、3手術(外傷)+細菌注入群の3群の手術後3日目の末梢血液から血漿を採取し、CEーTOFMSとLCーTOFMSを用いた代謝産物を解析し、最も再現性の高い、バイオマーカー候補を同定する。1では、In vivoにおいて同様に未処理と超音波処理(複数条件)後の金属を洗浄液とともに各々成体BALB/cマウスの浅殿筋に埋没し、感染症成立の有無を光イメージングで観察し、同様にSEMと病理組織による検討を行う。
セラミド含有exosomeを介した新規NASH進展メカニズムの解明

非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態の一つに、脂肪毒性を受けた肝細胞から分泌されるセラミドを豊富に含んだ細胞外小胞(exosome)による関与が報告されている。近年NASHの病因として脂肪毒性のほか、腸内細菌叢のよる影響が注目されており、本研究では脂肪毒性と腸内細菌叢由来のエンドトキシンによる、肝細胞から分泌されるセラミド含有exosomeの変化を解析し、NASH病態進展への関与を明らかにすることを目的としている。本研究によって脂肪毒性によるNASH進展にエンドトキシンがどのように係わるか明らかにし、NASH進展の高リスク群の予測や治療への応用が期待される。
動力学的ガスターゲットダイバータにおける高熱流プラズマ炎の構造と安定性

高熱流プラズマ発生装置NAGDIS-IIの建設変形TPD型直流放電プラズマ源により最大磁場0.25T,テスト領域のガス圧力1mTorr程以下の条件で電子密度10^<19>m^<-3>を越えるヘリウムプラズマの生成に成功した。従来のTPD装置では困難であった水素放電についてはLaB_6陰極を傍熱型とすることによって最大3×10^<18>m^<-3>の密度の水素プラズマの生成を得ている。これらによりプラズマ-ガス相互作用過程、特にPlasma Detachmentについて研究が可能となった。1MHzイオンサイクロトロン高周波加熱については最長パルス長0.2sにて、40KWを投入し、この内4KW程度をプラズマに投入できている。低密度プラズマでは電子とイオンの内のエネルギー総和が不十分のためイオンの荷電方法を通してのエネルギー散逸のチャンネルがなくなり、また電子温度(Te)がある程度下がると非弾性衝突による電子の直接エネルギー損失もなくなるのでTeのさらなる低下はなく、Detachmentが得られないことを明らかにした。Heガス圧力10mTorr前後にて、Detached領域からの可視域の発光分光分析は、320345mmにわたる再結合に伴う連続スペクトルを示し、その光子エネルギー依存性よりプラズマ温度0.10.3eVが求められた。一方Heのバルマ-線ともいうべき一連のスペクトル線でGriem限界以上のn≧6の準位の占有数分布から、部分的局所熱平衡を確認し、上記温度と一致する結果が得られた。プラズマ再結合過程によるプラズマ粒子束の減少の実現放電電流のパルス的に立ち上げ及び立ち下げすると、ゆっくりした密度の増大と減少があるものの、放電への入力が急速に変化するのでTeの変化が伴う。再結合速度係数はTeの-45乗に比例するので、Teに極めて敏感である。ターゲットへのプラズマ粒子束が再結合過程に依存して大きく変化することを明確な形で実現した。高周波加熱による熱パルスの生成50msの高周波パルス(プラズマへの入力4KW程度)を加え、プラズマの電子エネルギーの増加に伴う諸現象が観測される。核融合炉におけるELMなどの熱パルスに伴う現象と同等の動的過程の研究の基礎を確立した。10^<19>m^<-3>を超える高密度プラズマ(電子温度8eV程度)に対して動作ガスを導入してプラズマ-ガス相互作用を増してゆくと、プラズマのエネルギーと運動量が散逸し、プラズマの熱流と粒子束はターゲット板に到達せず、その前面で終端するDetached Plasmaが実現された。放射冷却能力の高いアルゴンガスを導入するとより効果的にDetached Plasmaを得ることが可能である。しかしプラズマ密度が低い場合には電子とイオンの間のエネルギー緩和が十分でないためにイオンの荷電交換を通してのエネルギー散逸のチャンネルがなくなり、また電子温度がある程度下がると電離・励起に基づく電子の直接的エネルギー損失もなくなるので電子温度のさらなる低下はなく、従って低密度プラズマではDetachmentが得られないことを明らかにした。熱パルスの生成とPlasma Detachmentへの影響〈放電電流変調による密度パルス〉:トランジスタを用いた放電電流のパルス変調による密度パルスの生成については、放電電流の変調の立ち上がり・立ち下がり時間を可能なかぎり短く、変化を急峻にして、過渡応答特性が明確に現われるよう努力している。現在、1msの立ち上がり時間を得ているが、さらに早い変化を追求している。〈高周波加熱による熱流パルス〉:イオンサイクロトロン遅

波の磁気ビ-チ加熱を行うことによって熱流パルスを得るためのアンテナ設計を行いその基礎特性を調べた。平成7年度においては、プラズマ密度が閾値以上において動作ガス導入によりDetached Plasmaが得られることを実験的、かつ解析的に示した。今年度はPlasma Detachmentに伴い、ターゲット板への粒子束の減少がプラズマ再結合によってもたらされていることを示した。特に再結合過程を発光分光法により詳細を明らかにした。ヘリウムガス圧力10mTorr程度において、Detached領域からの可視域の発光を分光分析したところ、320345nmにわたって再結合に伴う連続スペクトル線が認められ、その光子エネルギー依存性よりプラズマ温度が求められた。ガス圧力により0.150.3eV程度で変化する。一方ヘリウムのバルマ-線ともいうべき一連のスペクトル線で限界以上のn≧6の準位の占有数を評価し、そのエネルギー依存性からもプラズマの温度が推定された。両者は極めて良く一致している。熱パルスの生成とPlasma Detachmentへの影響<放電電流変調による過渡応答>ジャイアント・トランジスタによる放電電流の分流を用いた、放電電流の変調を立ち上がり80μs、立ち下がり500μsで実現した。この際放電電流の増大に伴い、ゆっくりした密度増大があるもののプラズマへの入力の増大により上流プラズマ電子温度が増加し、逆に、放電電流の立ち下がりにおいては電子温度の低下がみられた。前述のように、プラズマ再結合がターゲット板の粒子束を決め、再結合は電子温度の-4.5乗に比例するため電子温度の変化によりプラズマの消滅し顕著に現れることが実験的に明らかになり、再結合過程の重要性を別の観点から明らかにした。ターゲット板への粒子束の減少の時間スケールが異常に短い点が興味深い。<高周波過熱による熱流パルス>4連の位相ループアンテナに、50ms程度の高周波パルス(プラズマへの入力4KW程度)を加え、プラズマの電子温度の増加に伴うと思われるターゲットの浮遊電位の著しい低下などが観測され、核融合実験炉におけるELMなどの熱パルスに伴う減少と同等の動的過程の研究の基礎が確立された。
ポリフェノールと食品タンパク質とのSHを介した酸化的成分間相互作用の解明

ポリフェノールの酸化物はアミンやチオールのような官能基と反応し共有結合ができることが考えられた。もしタンパク質のアミノ基やチオール基がポリフェノールと反応することにより修飾を受ければ、タンパク質の性質が変わり様々な影響が出ることも考えられる。加工や調理の過程で、ポリフェノールが酸化され、食品成分と成分間反応することは十分に考えられる。まずはポリフェノールとチオール基の成分間反応の解明を行った。研究には、17種のポリフェノールと、チオール基のモデル化合物としてベンゾイルシステインメチルエステルを用いた。それぞれのポリフェノールとベンゾイルシステインメチルエステルを混合した溶液にDPPHラジカルを用いて反応させることにより、ポリフェノールとベンゾイルシステインメチルエステルの反応の解析を行った。その結果、ポリフェノールとチオールが両方とも減少するもの(カフェ酸メチル、ジヒドロカフェ酸メチル、カテキン、ケンフェロールなど9種)のに、成分間反応している可能性が考えられたため、LC-MSを用いてポリフェノールとチオールが成分間反応した生成物の確認を行った。すると、ポリフェノールに対し、1)分子のみのチオールが反応するもの(カフェ酸メチル、ルテオリン、ケンフェロール)と2)複数のチオールが反応するもの(ジヒドロカフェ酸メチル、プロトカテキュ酸メチル、カテキン、ミリセチン、タキシフォリン)に分けられた。フラボノイドのB環、C環部分のモデルと考えられるカフェ酸メチル、ジヒドロカフェ酸メチルに着目し、それぞれのチオールとの成分間反応生成物を単離し、NMRなどを用いて構造解析を行ったところ、カフェ酸メチルはベンゼン環の2位にチオールが反応したモノチオール付加物、ジヒドロカフェ酸メチルは5位に反応したモノチオール付加物と2,5位に反応したジチオール付加物、2,5,6位に反応したトリチオール付加物が得られた。
注入変調半導体レーザーからの倍周期パルス発振の観測とその光スイッチングへの応用

本申請課題では,緩和振動周波数付近で利得変調されたAlGaAs半導体レーザーから発生する倍周期パルス発振(変調周期の倍の周期で一定のパルス波形を繰り返す発振状態)を観測するとともに,この状態にあるレーザーに対して,戻り光を帰還することによって変動するパルス発振状態について詳細に調べている.実験では,半導体レーザーに注入する変調電流の変調周波数と変調振幅をそれぞれ,2GHz,22dBmに固定し,戻り光量と直流バイアス電流値のみ変化させ,発生する光パルス列を分光器とストリークカメラを組み合わせた受光器により、時間分解スペクトルとして観測した.直流バイアス電流を走査したときに得られる光パルス列のピーク値を,横軸にバイアス電流値をとってプロットした,パルスピーク分布図を描くことによって,パルス発振状態を調べた.戻り光のないときは,分布図上の比較的広いバイアス電流範囲で,倍周期発振する領域が存在することを確認した.戻り光を帰還すると,その量が少ないうちは,倍周期発振領域は拡大する傾向を示したが,最大に達したのちは,戻り光量の増加につれて倍周期発振領域が縮小し,やがて消滅した.得られた一連の倍周期発振領域の推移は,同時に観測した周波数スペクトルの変化と対応しており,注入同期による単一モード化や戻り光による利得制限により,領域がそれぞれ拡大,縮小することをレート方程式を用いた数値計算によって確認した.以上の得られた結果から,緩和振動周波数付近で利得変調されたAlGaAs半導体レーザーにおいて,帰還する戻り光量を調整することによって,正規および,倍周期発振の両状態間でレーザーの発振状態を制御できることがわかった.本申請課題では,緩和振動周波数付近で利得変調されたAlGaAs半導体レーザーから発生する倍周期パルス発振(変調周期の倍の周期で一定のパルス波形を繰り返す発振状態)を観測するとともに,この状態にあるレーザーに対して,戻り光を帰還することによって変動するパルス発振状態について詳細に調べている.実験では,半導体レーザーに注入する変調電流の変調周波数と変調振幅をそれぞれ,2GHz,22dBmに固定し,戻り光量と直流バイアス電流値のみ変化させ,発生する光パルス列を分光器とストリークカメラを組み合わせた受光器により、時間分解スペクトルとして観測した.直流バイアス電流を走査したときに得られる光パルス列のピーク値を,横軸にバイアス電流値をとってプロットした,パルスピーク分布図を描くことによって,パルス発振状態を調べた.戻り光のないときは,分布図上の比較的広いバイアス電流範囲で,倍周期発振する領域が存在することを確認した.戻り光を帰還すると,その量が少ないうちは,倍周期発振領域は拡大する傾向を示したが,最大に達したのちは,戻り光量の増加につれて倍周期発振領域が縮小し,やがて消滅した.得られた一連の倍周期発振領域の推移は,同時に観測した周波数スペクトルの変化と対応しており,注入同期による単一モード化や戻り光による利得制限により,領域がそれぞれ拡大,縮小することをレート方程式を用いた数値計算によって確認した.以上の得られた結果から,緩和振動周波数付近で利得変調されたAlGaAs半導体レーザーにおいて,帰還する戻り光量を調整することによって,正規および,倍周期発振の両状態間でレーザーの発振状態を制御できることがわかった.
乱流特性を考慮した底質pickup関数の提案と統一漂砂量モデルの構築

海浜の地形変化予測を高精度化するため,浅海の砕波に伴う砂の巻上げ量を正しく評価できるモデルの開発を行った.実験水槽内に砕波に類似した流れの状態を再現し,底面付近の流れの特性と砂の巻上げ量の関係を調べた.実験にあたっては,底面に作用する力や砂移動を計測するための新しい方法の開発を合わせて行った.実験結果から,表層由来の乱れが巻上げを増大させることが示され,両者の関係が定式化された.海浜の地形変化予測を高精度化するため,浅海の砕波に伴う砂の巻上げ量を正しく評価できるモデルの開発を行った.実験水槽内に砕波に類似した流れの状態を再現し,底面付近の流れの特性と砂の巻上げ量の関係を調べた.実験にあたっては,底面に作用する力や砂移動を計測するための新しい方法の開発を合わせて行った.実験結果から,表層由来の乱れが巻上げを増大させることが示され,両者の関係が定式化された.乱流特性を考慮した底質pickup関数の構築に向けて,当該年度は本実験に向けた水路改造や外的乱れ供給法に関する基礎的検討ならびに底質移動量を定量的に評価するための画像計測手法の開発をおこなった.当初計画では砂面昇降装置によるpickup量の評価を念頭においたが,一様流のみならず非定常性を含んだより広範な流れを対象とするために,画像計測手法およびレーザーによる連続砂面計測をpickup量評価の中心に据えることとした.(1)水路改造底面付近の流速および外的乱れ供給量と底質pickup量を関連付けるには,非常に多くの条件での実験が必要になる.本実験での実験条件を十分に検討した上で,実験の効率化を図るために既存の水路を改造し,一様流や段波を生成可能な専用小型水路の製作を行った.(2)外的乱れ供給法に関する検討乱流格子を用いた底面への乱れ供給に加えて,自然に上層から底面に向かって乱れが供給される段波を用いることを検討に加えた.予備実験として段波による底面付近の流速や底面せん断力、乱れ特性を計測し,移動床において底質移動特性を把握するための実験を行った.(3)画像計測手法の開発これまでに開発したELバックライトによる浮遊砂濃度計測法の信頼性を高めるため,より広範な条件でのキャリブレーションを行った.また,砂粒子をトレーサーとしたPIVによる流速計測を同時に行うことで,底質フラックスを評価する手法を開発した.単純な条件で手法の精度検証を行ったところ,10-20%程度の精度で底質フラックスの定量的評価が可能であることが明らかとなった.乱流特性を考慮した底質pickup関数の構築に向けて,当該年度は段波における乱流特性と底面剪断応力の変化特性について実験を行うと共に,昨年度に引き続き,画像解析を用いた漂砂フラックスの定量的評価についての研究を継続した.さらに,底質移動による地形変化の定量的予測に使用する目的で,数値波動水槽の開発を継続した.1.水路内段波による乱れ特性と底面剪断応力特性の把握水用底面剪断力計の粗底面に対する特性について検証を行った.流水水槽内に段波を発生させ,この剪断力計を用いて,滑面および粗面における底面剪断力の特性を検討した.また,レーザー流速計(LDV)にて計測した底面直上の流速を用いて,段波通過時の乱流特性を計測し,底面剪断応力との関連について検討を行った.2.画像解析による底質移動速度,底質濃度,底質移動フラックス量の評価昨年度に引き続き,異なる粒径において,掃流・浮遊を含めた砂粒子の移動状況を把握するために,高速度ビデオカメラを用いて,PIVによる流速と砂粒子の運動解析を行った.ELバックライトによる透過型濃度計を用いた平面濃度分布を計測し,これらから漂砂フラックスの評価を行い,高い精度でフラックス評価ができることを確認した.3.底質移動シミュレーションに応用可能な数値波動水槽の開発数値波動水槽にpickup関数を組み込み底質移動計算を行う前段階として,砕波下のように気液界面が明確でない場にも適用することを考え,気相と液相の間に明示的な境界を設けずに統一的な計算が行える気液2相流の数値波動水槽の開発を行った.乱流特性を考慮した底質pickup関数の構築に向けて,表層からの乱れを伴う非定常問題として浅海波浪と段波に対象を絞って各種の検討を行った.底質の移動を引き起こす波浪による底面剪断応力について,剪断力計を用いた直接計測を行った.これにより,浅海波浪や段波によって底面に作用する流体力の特性を検討・評価した.また波浪や段波により巻上がる底質量を定量化するため,あるいは前年度までに行ったpickup関数の改良について検証するために,画像計測手法により漂砂量を高精度に算定する手法についての開発を実施した.1.段波下の底面剪断力の特性に関する実験剪断力計を用いた直接計測およびPIVによる流速分布変化に基づく間接計測の二つの方法による実験的な検討を通して,波浪運動や表層由来の乱れの底面剪断力への寄与を明らかにした.特に非線形波浪場の底面剪断力について,剪断力計を用いて直接的に評価を行った実験例は過去に少なく,波浪の非線形性や砕波に伴う底質移動を明らかにする上で重要な知見を得ることができた.

2.画像解析による底質移動フラックス量の評価面光源を用いた透過型濁度計測について,これまでに開発した底質フラックス計測手法に対してより多くの検証実験を実施することで,計測精度の確認と問題点の抽出・改善を行った.これにより,かなりの高濃度下での安定した濁度(底質濃度)の面的評価が行えることが確認され,またPIVを用いた底質移動速度評価を組み合わせることで,極端に濃度が大きくなる条件を除けば,15%以内の誤差で底質フラックスを面的に計測可能であることが示された.
概日リズムのペースメーカーホルモンPDH受容体の発現クローニング

カニの色素拡散ホルモンとして発見された神経ペプチドPigment Dispersing Hormone(色素拡散ホルモン・PDH)は、概日リズムの発現ペースメーカーとして考えられている。本研究の目的は、PDHの受容体を同定し、概日リズム発現の分子機構を明らかとすることである。このため、特有の内在性PDHペプチドを持ち、概日リズムの発現が明らかなショウジョウバエについてPDHペプチドの放射ラベル体を化学合成し、脳のホモジネートに対して結合試験を実施し、受容体存在の有無を検討する。ショウジョウバエ・PDHのアミノ酸配列(AsnSerGluLeuIleAsnSerLeuLeuSer LeuProLysAsnMetAsaAspAla-NH_2)はカニのPDHペプチドと3残基が異なるのみである。本研究ではまず、ショウジョウバエのPDHを化学合成した。この化学合成においては、N末端アスパラギンの導入が非常に困難であった。しかも、β転位し易いジペプチド配列AsnSerが2カ所もあり、これに起因する副反応などのため合成に細心の注意が必要であることが判明した。天然相当のペプチドはHPLCにより精製し、これのN末端に^<125>Iでラベルしたボートハンター基(BH)を導入を試みた。PDHペプチドへのBH基の導入は必ずしも効率的ではなかったが、調製した^<125>1-BH-PDHを用いて、ショウジョウバエ脳ホモジネートに対する結合試験を実施した。その結果、^<125>I-BH-PDHの高濃度領域において特異的結合が観察された。しかしながら、その結合は十分なものではなく、さらに、^<25>I-BH-PDHが半減期、結合親和性の観点から最適なトレーサーではないと判断されたため、4位ロイシンをデヒドロロイシンにし、これを還元的にトリチウムラベルすべく、現在PDH前駆体アナログを合成している。本研究の結果は、ショウジョウバエ脳に、しかもの膜画分にPDHの受容体が存在することを強く示唆した。今後、より適正なトレーサーで受容体の同定できることが強く期待される。
再会合消化法による一塩基多型(SNPs)の新しいハイスループット検出法の開発

Se式血液型は体液を用いた血液型検査結果を検証する上で重要であり、温度勾配ゲル電気泳動法を応用して日本人に多い4種類の対立遺伝子Se1、Se2、sej、seを解析したところ、ヘテロ接合体試料では遺伝子型に特異的な泳動パターンが検出され、型判定が容易であることが判明した。ミスマッチが1塩基の場合はヘテロ二重鎖が1-2本、2塩基の場合は4本のバンドが検出され、未知の対立遺伝子を解析した際にミスマッチ数が泳動パターンから予想できる可能性も示唆された。ホモ接合体試料ではGC含量の差により異なる泳動度を示すが、特定のホモ接合体試料を混和し再会合させることで生じさせたヘテロ接合体の泳動パターンで遺伝子型を判定することが可能だった。この方法をABO式血液型に応用し、主要4対立遺伝子A、B、O^A、O^Gを対象としたところ、エクソン6ではA, O^AとB, O^Gのホモ二重鎖の分離が可能で,2種類の対立遺伝子を混合したヘテロ二重鎖は欠失とミスマッチの有無に応じて異なるバンドパターンを示した。エクソン7ではA, O^A, BとO^Gのホモ二重鎖の分離が可能で,2種類の対立遺伝子を混合するとミスマッチの種類に応じて異なるバンドパターンを示し、遺伝子型の判定が可能だった。さらにミトコンドリアDNAの高度多型性領域1(mtDNA HVI)への応用を検討し、ホモ二重鎖ではGC含量に起因する電気泳動度の相違を示し、2試料を混合して再会合させた場合はヘテロ二重鎖が検出され、試料問での塩基配列の同一性を検出するのに適していた。ヘテロ二重鎖のミスマッチ部位を切断する方法についても検討したが、報告されている方法では不可能で、型判定への応用はできないことが判明した。以上より、今回検討した温度勾配ゲル電気泳動法が型判定や変異体検出に最も適したハイスループット検出法であることが確認され、その標準的な手法を確立することができた。本年はSe式血液型の遺伝子解析に的を絞り、第1に日本人の代表的な対立遺伝子であるSe、sejおよびse^<fus>について比較し、対立遺伝子特異的増幅法では塩基置換の位置により、遺伝子型によっては断片長の大きく異なる増幅産物しか増幅することができなかったが、逆PCR法を応用した塩基置換部位隣接-対立遺伝子特異的増幅法を開発したことにより比較的断片長の近い異なる長さの増幅断片としてより確実に検出・識別することが可能となった。第2に、日本人に見られる対立遺伝子のSe1、Se2、sejおよび欧米人に特異的なseについてシークエンスを比較した。その結果、Se1と比較してSe2では^<357>C→T置換があり、sejでは^<357>C→T置換と^<385>A→T置換があり、seでは^<428>G→A置換があることから、GCクランプをつけたブライマーを用いてこれらの塩基を含む2種類の長さ(426bpと259bp)のDNA断片をPCR増幅し、Melt Map分析を行った。その結果いずれのDNA断片でも異なる融解温度を持つドメインが形成され、温度勾配電気泳動法で識別が可能であることを確認した。

実際に温度勾配電気泳動法を行ったところ、ヘテロ接合体試料では通常のPCR反応を行うだけでヘテロ二重鎖が十分量形成され、塩基置換が1個の場合はヘテロ二重鎖バンドが12本、置換が2個の場合は4本出現し、対立遺伝子の識別が可能であるとともに、塩基置換の個数も推定できた。ホモ接合体試料は1本のバンドのみ検出されたが、異なる対立遺伝子の増幅産物と混合して再会合(95°Cで加熱後50°Cで保温)を行うと、該当するヘテロ二重鎖が出現し、ホモ接合体試料でも遺伝子型判定が可能だった。継続して行っているSe式血液型遺伝子の温度勾配電気泳動法による一塩基多型(SNP)解析について,日本人に代表的な対立遺伝子であるSe1,Se2,sejおよびse^<fus>の分析条件を検討した。ヘテロ接合体試料では通常のPCR反応を行うだけでヘテロ二重鎖が十分量形成され,再会合のための特別の手順を設ける必要がなかった。ヘテロ接合体試料では温度勾配電気泳動法で遺伝子型の識別が可能で,増幅産物中の塩基置換の個数に相関してバンドの数が増えていった。ただしホモ接合体試料の場合には遺伝子型にかかわらず常にバンドは同じ断片長の1本しか検出されないため,特定の対立遺伝子試料と混合して再会合反応(95°Cで加熱後,50°Cで保存)を行う必要があった。以上については英文論文にまとめて投稿中で,3月中に受理される見通しである。次にミスマッチ部分の消化方法について検討した。論文に報告のあるジオキサンを添加したS1 nucleaseによる消化法では,報告と異なりミスマッチ部分で切断されないことが判明した。特にS1 nuclease消化について,温度条件その他を種々検討したが,酵素作用が弱いと切断されず,強くするとバンド全体が消化されて不明瞭となった。さらに化学的消化法として,四酸化オスミウムや過マンガン酸カリウムによる特定のミスマッチ塩基の修飾・切断法について検討したが,良好な結果は得られなかった。ミスマッチ部分消化方法については,これまでに報告されているその他の方法も実施が困難と予想され,新たな方法の開発を検討している。温度勾配電気泳動法自体は遺伝子型判定に適していたため,さらにABO式血液型遺伝子の分析への応用を始めた。エクソン6とエクソン7とを個別に増幅し分析したところ,良好に遺伝子型が判定できた。ただし塩基置換が多いヘテロ二重鎖はバンドが不鮮明になることが判明した。現在学会発表の準備中である。温度勾配電気泳動法は遺伝子型判定に適していたため,さらにABO式血液型遺伝子の分析への応用を始め、エクソン6(全領域216bp)とエクソン7(245bp)とを個別に増幅し代表的な対立遺伝子A,B,O^A,O^Gを分析した。エクソン6では,A,O^AとB,O^Gのホモ二重鎖の分離が可能で(GC含量の差による),2種類の対立
多様なレセプターが関与する芳香族化合物の新規外膜輸送システム

Sphingobium sp. SYK-6株において、5,5'-dehydrodivanillate (DDVA)の外膜輸送体であるTbtAが、複数存在するTonB、ExbB、ExbDの内、どの成分から構成されるTonB複合体と相互作用するかを検討した。開発したDDVA取り込みアッセイ系を用いて、各TonB複合体成分遺伝子の破壊株についてDDVA取り込み能を評価した結果、顕著に取り込み能が低下する破壊株は認められなかった。一方、破壊することができないtonB1をプラスミドによりSYK-6株に導入したところ、DDVA変換能が野生株よりも上昇した。また、tonB1-exbB1-exbD1をSYK-6株に導入した場合、さらなるDDVA変換能の向上が観察された。以上の結果から、TbtAはTonB1と相互作用すること、DDVAの外膜輸送にTonB1-ExbB1-ExbD1が関与することが示唆された。Hisタグを付加したTbtAのN末端領域とTonB C末端ドメインの精製標品を調製し、クロスリンク法による相互作用解析を行った。相互作用は、抗TbtA抗体および抗Hisタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。しかし、精製標品の精製度が低く、明確な相互作用は検出できなかった。抗TbtA抗体を用いて、DDVA存在下または非存在下で培養したSYK-6株から調製した全膜画分に対するウエスタンブロッティングを行った結果、TbtAがDDVA誘導的に発現することが示された。さらに、DDVA代謝系遺伝子の転写制御因子であるDdvRの遺伝子破壊株では、DDVAの有無によらずにTbtAが高発現したことから、DdvRがtbtAの発現を負に制御することが示された。TbtAの細胞内局在性を明らかにするために、SYK-6株細胞を分画し、抗TbtA抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。その結果、TbtAが外膜に存在することが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。SYK-6株におけるリグニン由来化合物の外膜輸送にTonBシステムが関与するかを調べるためにtonB遺伝子について解析を行った。SYK-6株のゲノム中にはtonB1、tonB2、tonB3の3つのtonB遺伝子が存在する。それぞれの遺伝子を破壊し、リグニン由来化合物での生育能を調べた結果、tonB2破壊株においてのみ様々なリグニン由来化合物における生育能の低下が観察された。また、tonB2の相補によって生育能が野生株と同等までに回復したことから、tonB2が様々なリグニン由来化合物の取り込み、あるいはTonBシステムが輸送を担う鉄イオンなどの生育に必須な因子の取り込みに関与することが考えられた。SYK-6株のゲノムを詳細に解析したところ、TonBドメインを有する遺伝子がさらに3つ存在することが示された。DNAマイクロアレイ解析から、ビフェニル化合物である5,5'-dehydrodivanillate (DDVA)の存在下においてTonB-dependent receptor (TBDR)をコードするtbtAが高く転写誘導されることが示された。tbtA破壊株を作製し、DDVAにおける生育能とDDVA変換能を測定した結果、本破壊株はDDVAでの生育能を完全に欠損しており、変換能が大幅に低下していた。それに対してtbtAの破壊によっては他のリグニン由来化合物における生育能又は変換能に影響がなかったことから、tbtAはDDVAに特異的な輸送体であることが示唆された。一方、DDVA以外のリグニン由来化合物の存在下においても10個の異なるTBDR遺伝子が転写誘導されることが明らかとなった。現在、これら遺伝子のうち、9つについて破壊株の作製を終了している。平成27年度に計画した(1)「リグニン由来化合物の外膜輸送に関与するTonB複合体遺伝子と輸送される基質の同定」と(2)「リグニン由来化合物の取り込みに関与するTBDR遺伝子の同定」についてはほぼ計画通りに遂行された。SYK-6株に3つ存在するtonB遺伝子のうち、tonB2がリグニン由来化合物の取り込みに関与することを示唆する結果を得た。またマイクロアレイ解析によって、各リグニン由来化合物の存在下で特異的に誘導されるTBDR遺伝子を11個同定するとともに、そのうちの1つであるtbtAの遺伝子産物がビフェニル化合物であるDDVAの外膜トランスポーターであることを強く示唆する結果を得た。さらに、同定されたTBDR遺伝子のうち、10個の遺伝子破壊株の作製を終えている。Sphingobium sp. SYK-6株は、tonB1、tonB2、tonB3、2つのexbDと1つのexbBに加えて、3つのtonBと、exbBとexbDのホモログであるtolQとtolRを1つずつ有していることが示された。各遺伝子の破壊を行い、全てのtonB、tolQとtolRの破壊株を取得した。各破壊株のリグニン由来ビフェニル化合物である5,5'-デヒドロジバニリン酸(DDVA)の変換能から、少なくともTonB4とTonB6、TolQがDDVAの外膜輸送に関与することが示唆された。様々なリグニン由来化合物で特異的に誘導される9個のTBDR遺伝子と、遺伝子配置から輸送への関与が推定された3個のTBDR遺伝子について破壊株を作製し、各基質の変換能の評価を行った。

その結果、tbtA以外にも破壊によってDDVA変換能が低下する2つのTBDR遺伝子が見出された。現在のところDDVA以外の基質において変換能の顕著な低下は観察されていないが、誘導培養を行うための基質の調製を含めて培養方法を検討する必要がある。リグニン由来二量体化合物については放射性標識化合物が市販されていないことから、各基質の変換能を調べることで間接的に取り込み能を評価してきた。しかし本法では真の基質の取り込み能を評価できていない可能性を否定できない。そこで本研究ではDDVAの転写制御システムを利用した新規のDDVA取り込みアッセイ系を開発した。本アッセイにより、DDVA外膜輸送を担うTBDR遺伝子と同定されたtbtAの破壊株において取り込み活性が有意に低下することが示され、TbtAがDDVAの外膜輸送を担うTBDRであることが強く示唆された。これまでの成果により、リグニン由来ビフェニル化合物であるDDVAの外膜輸送に関与すると考えられるTBDR遺伝子及びTonB複合体の成分遺伝子が明らかとなってきた。また、今年度計画していたTBDRとリグニン由来化合物の結合解析は等温滴定型熱量測定装置の故障により実施することができなかったが、当初の計画にはなかった新規のDDVA取り込みアッセイ系の開発に成功した。今後、開発したアッセイ系を用いることで、各成分のDDVA取り込みへの関与を明確にすることが可能である。本アッセイ系を用いて、これまで同定した各成分のDDVA外膜輸送への関与を明確にした上で、リグニン由来化合物外膜輸送システムの再構成を行うこととした。TonB-dependent receptor (TBDR)であるTbtAによるDDVAの外膜輸送に必要なTonB複合体(TonB-ExbB-ExbD)の同定を行った。SYK-6株は6つのtonB、2つのexbB、3つのexbDを有しており、tonB2-tonB6、exbB2、exbD3の破壊株を取得している。各破壊株のDDVA取り込み能を測定した結果、少なくともTonB5、TonB6およびExbB2の関与が示唆された。TBDRは膜貫通部位であるバレルドメインと、その内部空間を埋めるプラグドメインで構成される。TBDRのプラグドメイン中には、TonBのC末端ドメインとの相互作用部位であるTonBボックスが存在することが知られている。TbtAと相互作用するTonBを明らかにするために、TbtAのプラグドメインおよびTonB1-TonB6のC末端ドメインを大腸菌で発現させた。現在、TbtAのプラグドメインおよびTonB3とTonB4のC末端ドメインの精製標品を取得している。TbtAの推定TonBボックス中のアミノ酸を変異させた発現プラスミドを作製した。各プラスミドをSYK-6株のtbtA破壊株に導入し、DDVAでの生育能とDDVA取り込み能を調べた。その結果、変異tbtA導入株はDDVAでの生育能と取り込み能が顕著に低下し、TonBボックス中のこれらアミノ酸がTonBとの相互作用に重要であることが示唆された。これまでにTbtAがDDVAの外膜輸送体であり、内膜に局在するTonB複合体(TonB-ExbB-ExbD)の成分の内、少なくともTonB5、TonB6およびExbB2がDDVAの外膜輸送に関与することが示唆された。
リアルタイムイメージングを用いたウイルスと植物の移行複合体のクロストークの解明

本研究では、植物ウイルスの細胞間移行と植物移行性タンパク質の共通した性質に着目し、両者の細胞間移行の共通メカニズムとクロストークを明らかにし、新たなウイルス耐性戦略の技術基盤を開発することを目的として研究を実施した。本年度は、タンパク質の局在解析に適した実験系の確立と、各種オルガネラマーカーおよび蛍光標識ウイルスベクターの構築を行った。植物細胞は個々の細胞が細胞壁に囲まれ、細胞どうしが複数重なっているため、展開葉にて蛍光標識タンパク質を発現しても細胞内局在を正確に観察することは困難である。そこで本実験では各種酵素を用いて植物展開葉よりプロトプラストを調製する技術を確立した。様々な比率でセルラーゼ、マセロチームなどを混合したプロトプラスト調製液を作製し、植物展開葉を浸すことでプロトプラストの取得を可能にした。植物細胞内には分化した形態および機能を持つオルガネラと呼ぶ構造があり、細胞内局在解析での指標として用いられている。本実験では、小胞体、ゴルジ体などの各種オルガネラに局在する蛍光タンパク質発現ベクターを構築し、植物細胞内にて発現しプロトプラスト化したのち蛍光顕微鏡にて観察した。植物タンパク質に蛍光タンパク質を融合させた遺伝子発現ベクター、および蛍光標識ウイルスベクターを構築した。蛍光標識した植物タンパク質は植物発現用ベクターを用いて構築しアグロインフィルトレーション法により遺伝子を発現できるようにした。蛍光標識ウイルスベクターは、植物発現用プロモーターの下流に挿入することで、ウイルス接種できるようにした。これらのベクターを植物にそれぞれ導入し蛍光顕微鏡で観察したところ蛍光が観察された。以上をまとめると、植物ウイルスの移行複合体と植物タンパク質の移行複合体の共通メカニズムと相違点を明らかにする上で必要な基盤技術が開発できた。
十二指腸腺腺房細胞からの粘液分泌機構の解明

消化物と共に十二指腸に流入する酸や消化酵素に対する防御機構として、十二指腸粘膜を被うアルカリ粘液層が重要であることはよく知られている。しかし、十二指腸腺を支配する神経伝達物質およびホルモン支配に関しての知見は乏しく、さらにその細胞内機構に関しては検討した報告さえ存在しない。本研究では発達した十二指腸腺を持つブタ由来の分離十二指腸腺腺房を作製し、Fura2を用いた〔Ca^<2+>〕i測定とパッチクランプによるチャネル電流の解析を行い、以下の成績を得た。A十二指腸腺腺房の細胞内Ca^<2+>濃度の画像解析分離十二指腸腺腺房はアセチールコリン(ACh)の濃度依存性(10^<-7>10^<-5>M)に反応して、細胞内Ca^<2+>濃度(〔Ca^<2+>〕i)を増加させた。静止時には〔Ca^<2+>〕iの変動はなく、AChに対する反応も時間経過の早い相性の増加で、その上に乗る微小なCa^<2+>オッシレーションが観察されるに過ぎなかった。AChの反応はpirenzepineやmethoctramideでは影響されず、4-DAMPで消失したことより、M3受容体を介したものであると考えられる。AChによる〔Ca^<2+>〕i上昇は外液からのCa^<2+>除去では殆ど影響を受けず、タプシガルギンの前処置でほぼ消失したことから、細胞内ストアからのCa^<2+>放出が主要なCa^<2+>動員経路であることが示唆される。Ca^<2+>誘発性Ca^<2+>放出(CICR)を刺激するカフェインは全く影響しなかった。B十二指腸腺腺房細胞の膜電流解析パッチクランプ法による全細胞膜記録を行った。その結果、電位依存性Ca^<2+>チャネルや非選択性陽イオンチャネルによる電流は観察されなかった。しかし、保持電位0mVでAChにより外向き電流が観察された。また、同時に与えた傾斜波による外向き電流の若干の増加が生じた。保持電位0mVで、イノシトール3リン酸(IP3)の入ったピペットで全細胞記録を行ったところ、AChと同様の一過性の外向き電流が生じた。これらの成績はブタ十二指腸腺おそらく〔Ca^<2+>〕iにより活性化されるK+チャネルが存在し、AChは細胞内ストアからIP3を介して〔Ca^<2+>〕iを放出させることによりこのチャネルを刺激することが考えられる。