hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
性判別精液・受精卵利用は酪農経営の収益性を向上させるか？

子牛市場価格の高騰を背景に、酪農経営では後継牛を外部導入する経営体が増え、初妊牛価格は上昇している。一方、性判別技術は着実に深化しているものの、利用実態や受容性は明らかではない。そこで本研究は当該技術の受容性把握を行うことにより課題へのアプローチを試みた。その結果、1性判別技術は着実に浸透・利用されていること、2本技術は大規模飼養階層および牛群能力が高い階層に多用されていること、3北海道が本技術を積極的に導入することにより、安定的に後継牛を確保していること、しかし4北海道の都府県への後継牛供給基地としての機能は消失しつつあり、都府県は自らの力で確保する必要性があることが明らかになった。昨今の肥育素牛価格上昇の傾向を受けて、都府県の酪農家では積極的に搾乳牛に和牛精液もしくは和牛受精卵を受胎させて、副産物販売による収入確保に務めている。しかし、この収益確保策は、いわば「両刃の剣」であるとも言える。すなわち、本来であれば搾乳後継牛を確保するためには、ホルスタイン種を作出すべきであるが、それを行わず、後継牛は外部購入に依存する傾向にある。一方、乳用初妊牛(後継牛)価格は上昇の一途をたどっていることから、自家育成を行わない農家の経営負担は増すばかりである。この状況に対して、行政及び生産者団体では助成金を措置することにより、9割の確立でメスが産まれるとされる「性選別精液」およびこの付加価値を高めた技術である「性判別受精卵移植」の普及を図っているところである。しかしこれら技術、とりわけ「性判別受精卵移植」普及に係る農家意識および利用に伴う収益性向上に関しての研究は行われていないのが、現状である。これら性判別技術に係る技術的課題は日々克服されているのに対して、その普及が図られていないことが課題であるとも言える。そこで本研究では、初年度事業として、酪農家における性判別技術の受容度を判断するために、栃木県下の酪農家749戸および北海道足寄町、浜中町および猿払村の酪農家300戸を対象として、アンケートを実施した。このうち、栃木県より261戸(35%)、北海道より98戸(33%)の有効回答を得た。現在、集計中でありその詳細については明らかになってはいないが、これら先端技術を「既に用いている」階層、「使ってみたい」階層、「使いたくない」階層および「よく理解できない」階層の4つに類型化が可能であるように思慮される。今後はこれら数値を精査するとともに、フィールド調査により、より具体的な課題にアプローチしたい。酪農経営の持続的発展を図るには、その基礎となる後継牛確保が不可欠である。その要望に応えうる技術の一つが、繁殖における性別のコントロールである。現在、営農現場で主に利用されている方法は「性判別精液」の利用であり、これに伴う経営研究は盛んに行われている。その一方で、「性判別受精卵」利用に関しては技術作出に関する成果は多いものの、個別経営を対象とした事例研究は極めて少ない。そこで本年度の研究では、過年度に集積した北海道浜中町(n=56)と、都府県酪農主産地である栃木県(n=255)データを解析し、それぞれの地域において、酪農家の性判別受精卵の利用意向を明らかにした。その結果、北海道においては、性判別受精卵への関心は高く、「興味がある」とした回答割合は6割と高かった。また「興味がある」「興味がない」の回答間には、総飼養頭数との間に1%水準で有意差が認められた。栃木県においては、性判別受精卵への関心は「興味がある」が4割であった。しかし、受容性に関しては、「利用したくない・利用したいかわからない」という利用に消極的な回答が7割を占めた。「利用したい」「利用したくない・利用したいかわからない」の階層間で総飼養頭数において、5%水準で有意差が認められた。利用したいと回答した酪農家は、北海道においても都府県においても、共に約3割であることから、経営立地に関わらず一定の割合で利用を希望する酪農家が存在していることが分かった。また北海道では性判別受精卵を既に利用している酪農家は全体の約15%を占めていた反面、都府県では3%であった。利用意向と経営立地との間には、北海道と都府県の間で、既に利用していると回答した酪農家と、利用したいかわからないと答えた酪農家の割合には差が見られたが、その背景については明らかにすることはできなかった。以上に加えて熊本県における先進事例調査を実施した。全国的に夏期の天候が不安定であり農作業に支障を来し、酪農家および農協が多忙であったために、酪農家を対象としたセミナー開催には至らなかった。さらに研究代表者負傷のために夏期休暇中に入院治療を余儀なくされたため、ニュージーランドへの調査事業を実施できなかった。山梨県下の後継牛確保と性選別技術の利用,および乳牛の供給先である北海道の初妊牛生産の現状を性選別技術利用の視点から明らかにした。平成28年7月に山梨県下のJAクレインおよびJA梨北等に所属する酪農家31戸から「酪農経営に関するアンケート」回答を得た。集計データは後継牛確保比率を基に,1自家育成型,2育成預託型,3乳牛導入型に類型化した。また,8月に北海道JA釧路丹頂農協管内の酪農家からは124戸の有効回答数を得た。

この結果、山梨県では初妊牛外部導入が主流である反面、育成預託型の未経産/経産牛比率は38%と高く,性選別精液の利用率および受精卵移植率も高値を示すことから,効率的に後継牛を確保している。また,自家育成型の飼養頭数規模は最も大きく,粗飼料自給率も高い。性選別精液を利用している階層は,していない階層と比較して,全ての経営・技術指標において有意に上位にあった。一方、北海道の性選別技術の利用者は,1担い手確保率が高く,今後の経営展開において拡大志向にあり、2飼養頭数規模が大きく,3労働力当たり出荷乳量が高いことから労働生産性が高い経営体である。また,性判別受精卵利用者は飼養頭数規模の大きい,いわゆるメガファームと呼ばれる経営階層であった。初妊牛供給源の北海道では,まず自らの経営に必要な後継牛を優先的に確保し,それ以外は好調な肉牛相場の影響により産子に黒毛和種を用いているため、初妊牛増産に直接は繋がっていない。つまり北海道における性選別技術は,効率的に後継牛を確保するには有効な技術であるが,都府県の乳牛不足を解消していない。都府県酪農の経営基盤を強化するためには,経営内で後継牛を確保し,自家育成ができない場合は預託を活用する方法が有用であろう。研究報告の場として平成28年度末に日本畜産学会大会が神戸大学において開催された。そのデータ分析に時間を要したこと、北海道の草地酪農地帯における調査分析数が不足していることがあげられる。本研究の集大成として、典型的な北海道の草地・放牧酪農地帯である浜中町において、JA浜中町傘下の全酪農家を対象としてアンケート調査およびヒヤリングを実施した。その結果99戸からの有効回答を得ることができた。注目すべき点として、ホルスタイン種を交配させている農家と黒毛和種精液を交配させている農家が半々を占めていた。この結果は前年とほぼ同等であることから、北海道の酪農経営は、まず自らの経営に必要な後継牛を確保したうえで、「余剰」相当分の育成牛に黒毛和種を交配させている。聞き取り調査結果からも、肉用牛売却所得課税特例措置があることで、初妊牛生産よりも、むしろ短期間で所得につながりやすい肉用素牛生産を増進させていることが明らかになった。換言すれば、北海道の酪農経営は、都府県酪農の後継牛不足事情を斟酌した初妊牛生産をしている訳ではなく、性選別技術の活用により、まず自分の後継牛を確保したうえで、F1子牛販売による収益確保という経営が浸透している。また、今後のF1子牛価格が不透明ななかで、優秀な後継牛を確保したい都府県酪農家による「ホルスタイン性選別精液または受精卵を受胎させた初妊牛」のニーズが高まることが期待されるが、北海道における初妊牛販売に使われるホルスタイン性選別精液は僅か3%であることから、都府県酪農自らが性選別技術を駆使した優良牛群を創出し、収益性を向上させる必要性があることが示唆された。以上、4年間に亘る研究により1性選別技術は着実に浸透していること、2当該技術は大規模飼養階層および牛群能力が高い階層に用いられていること、3北海道が当該技術を援用することにより、着実に後継牛を確保していること、同時に4北海道が後継牛供給基地としての機能は失いつつあり、都府県酪農は自らの力で確保する必要性があることが明らかになった。子牛市場価格の高騰を背景に、酪農経営では後継牛を外部導入する経営体が増え、初妊牛価格は上昇している。一方、性判別技術は着実に深化しているものの、利用実態や受容性は明らかではない。そこで本研究は当該技術の受容性把握を行うことにより課題へのアプローチを試みた。
ロボット聴覚の実環境理解に向けた多面的展開

音は画像と比べ拡散性が強いので,ロボット聴覚による音環境理解は,画像だけでは捉えきれない環境でも理解できる一方,広域から得られる情報の活用方法が課題となる.本研究課題では,既開発のロボット聴覚を基に,実環境音環境理解が可能な安全安心のためのロボット聴覚技術の多面的展開を目的とする.具体的には,WP1:多様なマイクロフォンコンフィグレーションへの展開,HARK-16の性能向上や分散設置された複数のマイクロホンアレイの同期方法,WP2:室内から屋外への展開,室内での音響マップ作成から無人飛行機による空中からの音の取得と音源定位,WP3:音声から楽音・環境音を含めた音一般への展開,特にノンパラメトリックベイズ信号処理,音光変換による動物音響学,楽器演奏音からの楽器音実時間分離,環境音の擬音語認識,に取り組むことになっていた.研究開始から辞退までの2ヶ月間で,実験装置の準備と,無人ヘリコプタの使用の詳細化,無人ヘリコプタ搭載用のマルチチャネルAD装置の設計,特に,非同期分散マイクの処理を高性能化するための時間情報付き音響データ転送方式の設計を行った.また,HARK-Binauralの洗練化,移動音源を対象とした音源定位のベイズ手法の開発,ベイズ手法による突発音や反射音を抑制したMUSIC(Multiple Signal Classification)法の開発,音源の活動状況と音源分離とを同時に推定するノンパラメトリックベイズ手法によるIVA法の開発,楽器音の音モデルのゆらぎを許容する多重演奏曲の楽器音分離法の開発,バンドパスフィルタを用いたカエルホタルの高機能化などに取り組んだ.音は画像と比べ拡散性が強いので,ロボット聴覚による音環境理解は,画像だけでは捉えきれない環境でも理解できる一方,広域から得られる情報の活用方法が課題となる.本研究課題では,既開発のロボット聴覚を基に,実環境音環境理解が可能な安全安心のためのロボット聴覚技術の多面的展開を目的とする.具体的には,WP1:多様なマイクロフォンコンフィグレーションへの展開,HARK-16の性能向上や分散設置された複数のマイクロホンアレイの同期方法,WP2:室内から屋外への展開,室内での音響マップ作成から無人飛行機による空中からの音の取得と音源定位,WP3:音声から楽音・環境音を含めた音一般への展開,特にノンパラメトリックベイズ信号処理,音光変換による動物音響学,楽器演奏音からの楽器音実時間分離,環境音の擬音語認識,に取り組むことになっていた.研究開始から辞退までの2ヶ月間で,実験装置の準備と,無人ヘリコプタの使用の詳細化,無人ヘリコプタ搭載用のマルチチャネルAD装置の設計,特に,非同期分散マイクの処理を高性能化するための時間情報付き音響データ転送方式の設計を行った.また,HARK-Binauralの洗練化,移動音源を対象とした音源定位のベイズ手法の開発,ベイズ手法による突発音や反射音を抑制したMUSIC(Multiple Signal Classification)法の開発,音源の活動状況と音源分離とを同時に推定するノンパラメトリックベイズ手法によるIVA法の開発,楽器音の音モデルのゆらぎを許容する多重演奏曲の楽器音分離法の開発,バンドパスフィルタを用いたカエルホタルの高機能化などに取り組んだ.
高効率酸素酸化反応を鍵とした集積合成のための高機能ナノ触媒の開発

酸素酸化反応に有効な金属ナノクラスター触媒をはじめ複数の触媒を,ナノマイクロサイズの高度に制御された微小反応場を形成する固相担体に集積化した高機能触媒の開発を行った.複数の触媒が同一反応場に存在することにより反応中間体の拡散時間が短縮されるため,反応の加速や不安定中間体が速やかに次の触媒反応に消費され,分解反応や副反応が抑制されるため選択性の向上が期待される.1)酸素酸化反応と不斉CーC結合形成反応の集積化に有効な固相触媒の開発高分子固定化Jorgensen-Hayashi(JH)触媒をAu-Pdナノクラスターを含有するポリマーで被覆することで,二機能性層状固相触媒を調製した.本触媒はアリルアルコールの酸素酸化反応と不斉Michael反応の同一時空間反応集積化に高活性,高選択性をもって機能した.本触媒中では二種類の触媒が異なるレイヤーに適切な配置をもって固定化されているため,ナノクラスターとJH触媒の望ましくない相互作用による失活を抑制することができた.2)NHC「活性」架橋構造を有する金属ナノ粒子触媒の開発と反応集積化への展望高分子担体中にNiナノ粒子とNiナノ粒子への配位子としてのNHCを同時に固定化した,NHC「活性」架橋構造含有高分子内包型Ni触媒を開発した.本触媒はイミダゾール含有高分子,アルキルハライド含有高分子およびNiナノ粒子の自己組織化により調製され,Corriu-Kumada-Tamao反応において,高い活性,幅広い基質一般性を示した.固体1H NMR解析により,固体触媒中でのNHC構造を確認した.今後,NHC部位を,担持した金属ナノクラスターへの配位子としてのみならず,有機分子触媒,もしくは他の均一系金属種と錯体を形成させることにより,金属ナノクラスターとこれらの触媒種による反応集積化への展開も大いに期待できる.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。酸素酸化反応に有効な金属ナノクラスター触媒をはじめ複数の触媒を,ナノマイクロサイズの高度に制御された微小反応場を形成する固相担体に集積化した高機能触媒の開発を行った.複数の触媒が同一反応場に存在することにより反応中間体の拡散時間が短縮されるため,反応の加速や不安定中間体が速やかに次の触媒反応に消費され,分解反応や副反応が抑制されるため選択性の向上が期待される.1)酸素酸化反応と不斉CーC結合形成反応の集積化に有効な固相触媒の開発高分子固定化Jorgensen-Hayashi(JH)触媒をAu-Pdナノクラスターを含有するポリマーで被覆することで,二機能性層状固相触媒を調製した.本触媒はアリルアルコールの酸素酸化反応と不斉Michael反応の同一時空間反応集積化に高活性,高選択性をもって機能した.本触媒中では二種類の触媒が異なるレイヤーに適切な配置をもって固定化されているため,ナノクラスターとJH触媒の望ましくない相互作用による失活を抑制することができた.2)NHC「活性」架橋構造を有する金属ナノ粒子触媒の開発と反応集積化への展望高分子担体中にNiナノ粒子とNiナノ粒子への配位子としてのNHCを同時に固定化した,NHC「活性」架橋構造含有高分子内包型Ni触媒を開発した.本触媒はイミダゾール含有高分子,アルキルハライド含有高分子およびNiナノ粒子の自己組織化により調製され,Corriu-Kumada-Tamao反応において,高い活性,幅広い基質一般性を示した.固体1H NMR解析により,固体触媒中でのNHC構造を確認した.今後,NHC部位を,担持した金属ナノクラスターへの配位子としてのみならず,有機分子触媒,もしくは他の均一系金属種と錯体を形成させることにより,金属ナノクラスターとこれらの触媒種による反応集積化への展開も大いに期待できる.前年度までに高分子内包型ロジウム触媒(PI-Rh)を開発しており、本触媒と外部添加したBINAPによりアリールボロン酸のα,βー不飽和ケトンへの1,4付加反応が高い収率、高い光学選択性を持って進行たが、本反応系では顕著なRhの流出がおこることが問題となっていた。そこで、リガンドおよび触媒構造の検討を行ったところ、RhとAgの合金クラスターを担持した触媒PI/CB-Rh/Agおよびキラルジエンリガンドを用いることで、高い収率、高い光学選択性を維持したまま、Rhの流出を完全に抑制することができた。また、触媒の回収、再利用の検討を行ったところ、複数回の回収、再利用が可能で、例え触媒が失活しても回収した触媒を無溶媒条件下、加熱することで、賦活化することができた。一方、高分子内包型金ナノクラスター触媒でのアリルアルコールの酸素酸化反応を行った後に、アリールボロン酸とRh/Ag触媒を加え反応温度を100 °Cまで上昇させる時間的反応集積化を行ったところ、高い収率、高い光学選択性で目的物を得ることができた。これまでにPI-Pt触媒を用いたヒドロキノン類のキノン類への酸素酸化反応を開発してきた。そこで、同一時空間反応集積化によってカテコールとアミンから酸化的にベンゾオキサゾールが合成できないか検討を行った。その結果、予想外の結果として目的とするベンゾオキサゾールの代わりにアミンが酸化的にカップリングしたイミンが得られた。種々の反応最適化の結果、tBuカテコールとPt/Ir合金ナノクラスター触媒を用いることで様々なアミンのイミンへの酸素酸化反応に有効に機能することを見出した。

反応機構研究から、カテコール類とPt/Irナノクラスターが協調的に作用していることがわかり、これは金属ナノクラスターと有機分子触媒による協調触媒系の初めての例である。さらに、本反応を酸化的キナゾリン合成反応へと展開した。当初の計画通り、高分子内包型金属触媒による不斉炭素ー炭素結合形成反応をRh/Agナノクラスター触媒とキラルジエンリガンドを用いることで達成した。さらに、本反応と、既に開発されていた高分子内包型金ナノクラスター触媒によるアリルアルコールの酸素酸化反応と集積化することにより、回収、再利用可能な固相触媒による酸素酸化反応と不斉炭素ー炭素結合形成反応の集積化を実現できた。さらに、白金ナノクラスター触媒を用いたカテコールとアミンからの反応集積化によるベンゾオキサゾール合成法の開発の過程において、予想外にもPt/IrナノクラスターとtBuカテコールが協調して働き、アミンのイミンへの酸素酸化反応が温和な条件下進行することを見出した。これは、世界で初めての金属ナノクラスターと有機分子触媒による金属含有酵素協調触媒系の発見であり、その反応機構は生体内の金属含有酵素であるアミンオキシダーゼの触媒サイクルと類似しており、その学術的意義は大きい。さらに、本触媒反応系を様々な医薬品や生理活性物質に見出される有用なヘテロ芳香環であるキナゾリンの効率的な合成法の開発へと展開し、これまで達成されていなかった興味深い構造を有するキナゾリン誘導体を合成することができた。高分子内包型金ナノクラスター触媒によるアリルアルコールの酸素酸化とキラルRh/Agナノクラスター触媒による、生成したエノンへのアリールボロン酸の1,4付加による不斉炭素ー炭素結合形成反応の時間的反応集積化を達成することができた。しかしながら、本反応を同一時空間反応集積化によって行うと、金ナノクラスター触媒と酸素によるアリールボロン酸のホモカップリング反応と、Rh/Ag触媒によるアリルアルコールのケトンへの異性化反応が進行してしまい、目的の反応を効率的に行うことができなかった。そこで、空間的反応集積化への適用を行い、より効率的な反応系の構築を行う。一方、Pt/Irナノクラスターとカテコールによる協調触媒系を用いた酸化的キナゾリン誘導体合成反応と、これまでに開発したPtナノクラスター触媒による、分子状酸素を酸化剤として用いたベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール合成反応を集積化することにより様々なヘテロ芳香環ダイマーやオリゴマー、ポリマーの合成反応を開発し、これらの化合物のライブラリーの構築を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
水ストレスが樹幹木部の通水機能と葉の蒸散抑制に与える影響についての研究

多くの樹木において、水ストレスを受けた場合に樹冠の頂端部が枯死する先枯れ現象が認められている。先枯れの起こりやすさを木部の構造と通導性から解析するために、ヒノキとカイヅカイブキの2年生挿し木苗を3段階の水ストレス条件で生育させた。両樹種とも乾燥ストレスを受けると日中の蒸散速度、水ポテンシャル、葉の含水率が低下した。また、比断面水分通導度は尖端部ほど低くなり、辺材部面積当たりの通導性が低下した。カイズカイブキの比葉面積通導度は主軸の下部から先端までほぼ同じ値を示したが、ヒノキは最先端部分で通導性が高くなる傾向を示した。この違いは先枯れの起こりやすさと強く関連していることが示唆された。ヒノキ科の多くの樹木では針葉と鱗片葉を1個体の中に同時に発生させる。こうした異形葉性がストレス耐性に果たす役割を明らかにするために、中国内蒙古毛烏素沙地に自生する臭柏稚樹の生育環境と異形葉性の関係を調べた。暗い環境では大きな比葉面積を持つ針葉の割合を高めることで葉面積が増加した。っまり、臭柏稚樹は針葉と鱗片葉の割合を生育段階で変化させることで、定着初期に必要な耐陰性と後期に必要な耐乾性を獲得し、半乾燥地の厳しい環境下での更新が可能になると考えられた。アラカシとヒサカキの苗木を用いて、光条件が木部の通導性に与える影響を調べた。量樹種とも明るい環境では木部の水ポテンシャルの低下にともなる水分通導度の低下が少なかった。アラカシは明るい環境ほど蒸散量が多くなるので、キャビテーションが起こるリスクを減らすために、小径の道管を用いるとともに、気孔調節によって失水を制御していた。暗い環境では蒸散量が少ないので、大径の道管を用いることで光環境に順応していた。一方、ヒサカキは明るいと、気孔調節に加え、個体の葉量を減らして失水を抑えた。供試木としてヒノキ(Chamaecyparis obtusa)、カイヅカイブキ(Juniperus chinensis 1.var. kaizuka)の2年生挿し木苗およびサウジビャクシン(Juniperus procera)の4年生実生苗をもちいた。いずれも3月にポットに植栽し、6月25日から重量法によって土壌の水分条件をpF1.8(対照区)、pF3.2(弱ストレス区)、pF4.2(強ストレス区)に調整した。対照区は毎日潅水し、水ストレス処理区は所定の土壌水分条件になるまで待ってから、灌水を行った。植栽直後から主軸長、地際直径を毎月1回測定した。9月から10月に日中の蒸散速度と夜明け前の葉の水ポテンシャルを測定し、生育期間の終了した12月に木部断面積や葉面積などを測定し、比通導面積や比断面積水分通導度、比葉面積水分通導度を求めた。乾燥ストレスを受けるとヒノキとカイズカイブキは日中の蒸散速度は低下した。しかし、サウジビャクシンは有意な低下を示さなかった。水ポテンシャルと葉の含水率は3樹種とも乾燥ストレスで低下したが、カイズカイブキの場合、強ストレス区で水ポテンシャルの低下が著しかった。ヒノキとカイズカイブキとも比断面水分通導度は尖端部ほど低くなり、辺材部面積当たりの通導性が低下していた。

しかし、比葉面積通導度は、カイズカイブキの場合、主軸の下部から先端までほぼ一定の値を維持した。ヒノキも、最先端部分を除いて、ほぼ一定の値を示したが、頂端では通導性が高くなる傾向を示した。したがって、カイズカイブキと比べて、ヒノキの方が先枯れは起こりにくいと考えられた。水ストレスを調整して生育させる室内実験と、中国内蒙古毛烏素沙地での調査測定で、臭柏(Sabina vulgaris)の木部の通水性と蒸散活動に対する水ストレスの影響を調べた。室内実験の結果、固定砂丘上の水分条件に匹敵する比較的弱い乾燥ストレスを受ける環境に生育した臭柏は、夏期の蒸散速度を制限するとともに、水ポテンシャルを低く維持する水分生理的な反応により、失水、吸水の面で乾燥ストレスに順応した。このことによって、乾燥ストレスを受けない場合と同程度の個体サイズを実現できた。一方、半固定砂丘上に匹敵するような極度の乾燥ストレスを受ける環境に生育した臭柏は、蒸散速度、水ポテンシャルとも乾燥条件に順応できる限度を超えており、乾燥ストレスを受けない場合と同程度の個体サイズを維持することはできなかった。臭柏は発育段階により針葉と鱗片葉を持つ異型葉性を示す。臭柏稚樹の異型葉性と資源配分特性の関係を調べた。地際直径と相対照度には正の相関が見られ、明るい環境ほど個体が大きかった。一方、全葉重に占める鱗片葉重の割合(鱗片葉率)は、相対照度との間で相関が見られなかったが、地際直径、個体重など個体サイズと正の相関が見られた。また、T/R比は小個体で大きく、定着初期の根への資源配分量が大きかった。個体重あたりの葉重は個体重で変化しないが、個体重あたりの葉面積は小個体で大きく、実生が定着する低照度環境での耐陰性を高めると考えられた。この個体重当たりの葉面積の増加は、大きな比葉面積を持つ針葉の割合を高めることで調節されていた。高照度環境で生育する大きな稚樹は耐乾性の高い鱗片葉の割合が多かった。つまり、臭柏稚樹は針葉と鱗片葉の割合を生育段階で変化させることで、定着初期に必要な耐陰性と後期に必要な耐乾性を獲得し、半乾燥地の厳しい環境下での更新が可能になると考えられた。光条件を相対照度100%区、10%区および3%区で約2年間育てたアラカシとヒサカキの苗木を用いて、異なる光条件に対していかにして樹木が順応しているのかを、木部構造や通水特性、さらに気孔の開閉調節の面から解析した。両樹種ともに明るい処理区ほど木部の水ポテンシャルの低下に伴う水分通導度の低下の程度が低い傾向が認められた。このキャビテーションに対する感受性の違いを木部構造より検討した結果、アラカシでは全ての道管のサイズには差が認められなかった。しかし、機能している道管と閉塞している道管を分けた頻度分布から、100%区と10%区では小径の道管を使用し、キャビテーション発生のリスクを低く抑える傾向が見られた。一方、3%区ではより大径の道管を使用していた。また、100%区のアラカシでは日中に気孔コンダクタンスを低下させており、1日あたりの蒸散量が暗い処理区と同程度に低かった。ヒサカキの100%区においては気孔を終日閉じ気味にしており、1日あたりの蒸散量は暗い処理区と同程度に低い値を示した。10%区および3%区においては、両樹種ともに午前中に気孔を最大に開き、日没にかけて低下させることで日中の乾燥を回避し、失水を抑えていた。また、アラカシは処理区間で個体あたりの総葉面積に差が見られなかったが、ヒサカキにおいては100%区において総葉面積が他の処理区よりも有意に小さい傾向があった。以上より、アラカシは明るい光条件下では蒸散要求性が大きいことから、キャビテーションリスクの小さな小径の道管を用いるとともに日中の気孔調節を行い失水を制御していた。
肥満細胞における小胞体ストレスを介した腸炎発症および腸管線維化メカニズムの解析

本研究では、腸管小胞体ストレスと、クローン病に特徴的な病態である腸管狭窄との関連を明らかとするべく、腸炎発症及び腸管線維性狭窄における小胞体ストレスと肥満細胞の役割を検討する。研究には肥満細胞株であるLUVA細胞、肥満細胞特異的腫瘍壊死因子(TNF)欠損マウス、肥満細胞特異的Xbp1欠損マウスを用いて、腸炎関連分子や線維化関連分子の発現を評価する。さらに、肥満細胞における、IL-12/23阻害の炎症・線維化抑制作用についても検討する。
Chern-Simons積分,スーパーフィールド,停留位相法の研究

研究代表者はドイツのアルベベリオ氏達のチャーンサイモンズ積分を3次の項を無視して飛田のホワイトノイズ解析の超関数として捉える立場とは別に,無限レベルではファインマン積分をウィナー積分で置き換えてもいいだろうという思想の下にウィナー空間上の変数変換(停留位相法)を用いる方法でウィルソンラインのチャーン-サイモンズ積分を定義し,無限レベルにおいて積分の3次の項がどのようになって消滅して2次までの積分に帰着されるかを考察して,それを「Wiener space approach to a perturbative Chern-Simons Integral」と題する論文にまとめ平成10年8月にドイツのボン大学で行われたディリクレ形式に関するワークショップで招待講演した.今後の課題はいかにして積分の局所化の議論を数学的に厳密にするかであり,さまざまに計算されている種々の位相不変量との関連を見ながらウィナー測度を変更せざるを得ないかも知れないし,物理の言うようにスーパーフィールドの方法が避けられないものなのかも知れない.研究代表者はドイツのアルベベリオ氏達のチャーンサイモンズ積分を3次の項を無視して飛田のホワイトノイズ解析の超関数として捉える立場とは別に,無限レベルではファインマン積分をウィナー積分で置き換えてもいいだろうという思想の下にウィナー空間上の変数変換(停留位相法)を用いる方法でウィルソンラインのチャーン-サイモンズ積分を定義し,無限レベルにおいて積分の3次の項がどのようになって消滅して2次までの積分に帰着されるかを考察して,それを「Wiener space approach to a perturbative Chern-Simons Integral」と題する論文にまとめ平成10年8月にドイツのボン大学で行われたディリクレ形式に関するワークショップで招待講演した.今後の課題はいかにして積分の局所化の議論を数学的に厳密にするかであり,さまざまに計算されている種々の位相不変量との関連を見ながらウィナー測度を変更せざるを得ないかも知れないし,物理の言うようにスーパーフィールドの方法が避けられないものなのかも知れない.研究代表者はアルベベリオ達のチャーン-サイモンズ積分を3次以上の項を無視して飛田のホワイトノイズ解析の超関数として捉える立場とは別にウイナ-空間上の変数変換(停留位相法)を用いる方法でウイルソンループのチャーン-サイモンズ積分を数学的に定式化しようとしている.今年度はそのために必要なスーパーフィールドの方法を東工大の井上氏にレビューに佐賀大学に来ていただいた.その時の内容は井上氏がこの科研費でブリズベインで発表したものとほぼ同じである.市川氏はこの積分の計算に共形場理論を用いる接近する立場から無限種数のリーマン面の研究をし成果をドイツの整数論の雑誌に発表した.研究代表者は積分の3次の項がどのようなからくりで消滅して2次までの積分に帰着されるかを考え新しいリノーマリゼイションの構想に到達し現在,その発表を目指して整理している段階である.他の研究分担者も夫々の分担に鋭意努力されておられるので科研費の完了年までには多くの成果が期待できると確信している.研究代表者はウィナー空間上の変数変換(停留位相法)を用いる方法でウィルソンラインのチャーン-サイモンズ積分が無限レベルにおいて積分の3次の項がどのようになって消滅して2次までの積分に帰着されるかを考察して,それをと題する論文にまとめ平成10年8月にドイツのボン大学で行われたディリクレ形式に関するワークショップで招待講演した.研究分担者の市川は代数曲線のショトキー及びマンフォード一意化理論を基礎環が整係数形式巾級数環の場合に拡張した.分担者の久保は千葉大学の剣持教授と共同である種の相転移モデルの解が定義する無限次元力学系のGlobal Attractorの存在を証明した.学外分担者の東工大の井上氏は野村氏との共同研究で氏のスーパー解析の方法によってランダム行列にたいするウィグナーの半円則の精密化を研究した.
疾患および老化研究に必要不可欠なストレス可視化マウスの開発

生きている状態そのままで生命現象を捉えることは生命科学研究において大切なことであり、そのための生体イメージング技術は近年になり急速に進んでいる。その技術を上手く活用することで、ある種の疾患については原因究明や治療法開発に役立ちつつある。この技術を支えるものに光レポーターを導入したモデルマウスがあるが、より広い分野で深く貢献するには現在でも種類が不足している。そこで本研究では特に私たちの健康問題と密接に結びつく3種類のストレスを可視化する新たな生体イメージング用モデルマウスの開発を目指している。これらのマウスはいずれも医学・薬学研究の場で高いニーズが期待され、大きく貢献するはずである。初年度にあたる本年度は特に「統合ストレス」を対象にモデルマウス開発を進めてきた。詳細は後述するが、年度の前半に培養細胞レベルでストレス特異的な挙動変化を生じる分子の調査と選定を行い、続いて選定した分子のストレス特異的挙動変化を利用した光レポーター遺伝子の考案と機能確認を行った。年度の後半では予定通り熊本大学と共同で機能確認できた光レポーター遺伝子をもつトランスジェニックマウスの作出にあたり、現在は作出したトランスジェニックマウスの性能評価を行いながら系統確立に向けた実験を進めている。まだ全てのトランスジェニックマウス系統の評価は済んでいないが、少なくとも複数の系統が目的の性能に達しており、今後は高性能なマウス系統を選び出す段階に進む。私たちのカラダを構成する細胞はストレスに曝されると、自身を守るために様々な応答反応を示す。その1つに統合ストレス応答と呼ばれるものが知られている。この応答はストレスによりeIF2αがリン酸化を受けることから始まる。そのeIF2αはタンパク質の翻訳を調整する分子であるが、それがリン酸化されるとATF4タンパク質の翻訳は活性化されるようになる。活性化されたATF4は転写因子として機能して、ストレス時における特定遺伝子の転写誘導を担っている。これらeIF2αおよびATF4による機能は、生体の恒常性維持に必要なため、幾つかの疾患にも関連することが報告されている。これらの報告を受けて、私たちは統合ストレス応答を生体マウスレベルで可視化できるマウスモデル(UMAIマウス)を開発した。このマウスはeIF2αのリン酸化に由来するATF4の活性化をルシフェラーゼの発現に変換できる仕組みを備えており、私たちは統合ストレス応答を発光シグナルで捉えることができるようになった。ただルシフェラーゼ発光では高価な発光基質を必要とする点が欠点の1つであるため、蛍光タンパク質の発現に変換できる仕組みを備えた改良型UMAIマウスの開発が求められた。本研究では2種類の赤色蛍光タンパク質(AzaleaB5とtdTomato)を利用して新たな遺伝子コンストラクトを構築した。これら2種類の遺伝子コンストラクトを導入されたトランスジェニックマウスが昨年12月までに全体で25匹誕生している。現在は導入した遺伝子の発現レベルや蛍光シグナルのストレス応答性などの面から誕生したトランスジェニックマウス系統の性能評価を行っており、すでに期待しているレベルのマウスが存在することを確認している。懸命にトランスジェニックマウス系統の性能評価にあたったが、年度内に終了することができなかった。ただ、これはネガティブな理由よるのではなく、得られたマウス系統が予想より多かったせいである。良いモデルマウスを得るためには多くの中から選ぶ方が良いので、時間がかかっても全ての系統を評価して系統確立まで持って行きたい。これとは別に計画では次年度にミトコンドリアストレス可視化マウス開発を行うことになっているので、それを進めたい。その進め方としては本年度と同じく年度の前半に培養細胞レベルでストレス特異的な挙動変化を生じる分子の調査と選定を行い、続いて選定した分子のストレス特異的挙動変化を利用した光レポーター遺伝子の考案と機能確認を行う。年度の後半では熊本大学と共同で機能確認できた光レポーター遺伝子をもつトランスジェニックマウスの作出にあたり、作出されるであろうトランスジェニックマウスの性能評価を行いながら系統確立に向けた実験を進める。現時点で候補に挙がっている分子標的としてはATFS-1であり、この厳密に制御されたATFS-1のミトコンドリア移行や分解反応を生体イメージング技術に利用することを目指している。

まだ全てのトランスジェニックマウス系統の評価は済んでいないが、少なくとも複数の系統が目的の性能に達しており、今後は高性能なマウス系統を選び出す段階に進む。私たちのカラダを構成する細胞はストレスに曝されると、自身を守るために様々な応答反応を示す。その1つに統合ストレス応答と呼ばれるものが知られている。この応答はストレスによりeIF2αがリン酸化を受けることから始まる。そのeIF2αはタンパク質の翻訳を調整する分子であるが、それがリン酸化されるとATF4タンパク質の翻訳は活性化されるようになる。活性化されたATF4は転写因子として機能して、ストレス時における特定遺伝子の転写誘導を担っている。これらeIF2αおよびATF4による機能は、生体の恒常性維持に必要なため、幾つかの疾患にも関連することが報告されている。これらの報告を受けて、私たちは統合ストレス応答を生体マウスレベルで可視化できるマウスモデル(UMAIマウス)を開発した。このマウスはeIF2αのリン酸化に由来するATF4の活性化をルシフェラーゼの発現に変換できる仕組みを備えており、私たちは統合ストレス応答を発光シグナルで捉えることができるようになった。ただルシフェラーゼ発光では高価な発光基質を必要とする点が欠点の1つであるため、蛍光タンパク質の発現に変換できる仕組みを備えた改良型UMAIマウスの開発が求められた。本研究では2種類の赤色蛍光タンパク質(AzaleaB5とtdTomato)を利用して新たな遺伝子コンストラクトを構築した。これら2種類の遺伝子コンストラクトを導入されたトランスジェニックマウスが昨年12月までに全体で25匹誕生している。現在は導入した遺伝子の発現レベルや蛍光シグナルのストレス応答性などの面から誕生したトランスジェニックマウス系統の性能評価を行っており、すでに期待しているレベルのマウスが存在することを確認している。懸命にトランスジェニックマウス系統の性能評価にあたったが、年度内に終了することができなかった。ただ、これはネガティブな理由よるのではなく、得られたマウス系統が予想より多かったせいである。良いモデルマウスを得るためには多くの中から選ぶ方が良いので、時間がかかっても全ての系統を評価して系統確立まで持って行きたい。これとは別に計画では次年度にミトコンドリアストレス可視化マウス開発を行うことになっているので、それを進めたい。その進め方としては本年度と同じく年度の前半に培養細胞レベルでストレス特異的な挙動変化を生じる分子の調査と選定を行い、続いて選定した分子のストレス特異的挙動変化を利用した光レポーター遺伝子の考案と機能確認を行う。年度の後半では熊本大学と共同で機能確認できた光レポーター遺伝子をもつトランスジェニックマウスの作出にあたり、作出されるであろうトランスジェニックマウスの性能評価を行いながら系統確立に向けた実験を進める。
細胞界面のナノ構造制御による機能性ハイブリッド組織の創製

本年度は、マイクロセンサー粒子を配置したハイブリッド血管組織モデルの構築とシグナル伝達解析を目的とした。血管壁は、血管内皮細胞が産出した一酸化窒素(NO)を平滑筋細胞が受け取ることで弛緩し、血圧が下がる。そのため、内皮細胞からのNOの産生と血管の弛緩を評価することは、降圧剤や心筋梗塞などの治療薬の開発に重要であるが、これまでは動物実験でしか評価ができなかった。本研究では、生体外で動物実験と同様にNOの産出量と拡散距離を評価できるハイブリッド血管組織の構築を目的とした。粒径1.6μmのメソポーラスシリカにNO感受性の蛍光プローブ、DAF-2を担持させることで、センサー粒子を作製した。細胞積層法により血管モデル構造を作製する際に各層にセンサー粒子を吸着させることで、ハイブリッド血管モデルを構築した。NO産生を促進するホルモン剤であるブラジキニンを加えた後の各層におけるセンサー粒子の蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡で三次元的に解析した結果、NO分子が60μm拡散していることを見出した。この拡散距離は、これまでの動物実験と同等であり、生体外の組織モデルで初めて動物実験と同様の評価が可能であることを明らかにした。以上より、本年度も極めて順調に計画を推進することができた。本研究の成果より、細胞界面を制御して得られたハイブリッド組織が医療・創薬分野に有効であることを証明することが可能であり、幅広い応用が期待される。本研究は、細胞表面のマイクロ環境を支配している細胞外マトリックス(ECM)に着目し、細胞表面に人工ECMとしてナノメートルレベルの様々なナノ薄膜を形成することで細胞界面の構造と細胞機能を制御し、再生医療分野への応用を目的とした生体組織に近い構造と機能を有するマテリアルー細胞ハイブリッド組織の構築を目的としている。本年度は、細胞表面への様々なナノ薄膜の形成と形態観察、またナノ薄膜と細胞の相互作用の解明を目標に設定した。マウス線維芽細胞の表面へ、合成高分子や天然由来高分子、多糖類、タンパク質の様々なナノ薄膜を調製した結果、静電的相互作用を駆動力とする薄膜の場合は膜厚依存的な細胞毒性が観察されたが、フィプロネクチンの結合ドメインを介した相互作用の場合、100nm以上の膜厚においても細胞毒性は観察されなかった。また、後者の薄膜の場合、細胞表面でフィプロネクチンの重合に伴う線維化挙動が観察され、天然のECM様のナノファイバーの形成が細胞表面にて確認された。さらに、透過型電子顕微鏡観察の結果、ヒト平滑筋細胞とヒト血管内皮細胞を積層して作製した血管モデル構造内部において、細胞表面のナノファイバーが細胞内のアクチン線維と結合している様子が確認された。細胞内骨格と密接に連結する人工ナノファイバーの構築はこれまで例が無く、世界で初めての成果である。以上より、本年度は極めて順調に計画を推進することができた。人工的に作製したナノファイバーを足場とた細胞のハイブリッド組織は、様々な医療分野への応用が期待される。
非侵襲卵巣機能診断を実現する光干渉断層撮影システムの開発

本研究では、光干渉断層画像化法(オプティカル・コヒーレント・トモグラフィ:OCT)技術を応用し、無侵襲的に卵胞サイズと位置情報をイメージングできる高感度計測システムの開発を目的とした。高分解能OCTプローブと超高速画像処理技術を開発し、生物学的解析によるOCTシステムの有効性を評価した。その結果、従来のOCTシステムではイメージングができなった一次卵胞を検出できるドップラーOCT技術を開発することができた。本研究で開発したドップラーOCTシステムは、高輝度シグナルを指標に卵巣内に存在する卵母細胞の定量化とクオリティー評価を可能とするシステムであることが示された。低コヒーレンス光干渉を利用した光干渉断層画像化法(オプティカル・コヒーレント・トモグラフィ:OCT)は、弱い近赤外光を生体に照射し、生体試料内部からの後方散乱光を高感度に検出することにより、生体試料の断層画像を撮影する技術である。本研究では、OCTを基盤とするドップラーOCT技術により卵巣内の卵胞を無侵襲的に画像撮影し、卵胞サイズと位置情報をイメージングできる高感度計測システムの開発を目的とする。平成26年度は、(1)高分解能OCTプローブと超高速画像処理技術の開発と(2)生物学的解析によるOCTシステムの有効性の評価を行った。(1)では、SLD光源(中心波長λ0=841.1 nm、半値全幅Δλ=40.2 nm)から出射した光を水平ビニングにより1024画素でスペクトルを検出した結果、深さ方向7.8 μm、横方向21.4 μmの分解能を得ることができた。このシステムを用いてマウス卵巣組織を解析した結果、胞状卵胞の構造が明確に観察できるとともに、これまでOCTシステムではイメージングができなった高輝度シグナルが一次及び二次卵胞内に存在することがわかった。(2)の組織学的解析の結果、高輝度シグナルを示す構造は卵母細胞であることが示唆された。低コヒーレンス光干渉を利用した光干渉断層画像化法(オプティカル・コヒーレント・トモグラフィ:OCT)は、弱い近赤外光を生体に照射し、生体試料内部からの後方散乱光を高度に検出することで生体試料の断層画像を可能とする技術である。本研究では、OCTを基盤とするドップラーOCT技術によりマウス卵巣内の卵胞を非侵襲的に画像撮影し、卵胞サイズと位置情報をイメージングできる高感度OCTシステムの開発を目的とした。平成27年度は、ドップラーOCTによる3次元断層画像化計測技術の開発と生物学的解析によるドップラーOCTの有用性の評価を行った。OCT技術では、測定対象への光照射サイズは10um程度とかなり小さいため、2次元の断層画像だけでは詳細な測定位置や卵胞のサイズを正しく判別するのは困難である。そこで本研究では、昨年度明らかになった卵母細胞の細胞質に観察される散乱光のドップラー効果を位相差計測することで卵胞の3次元断層画像計測を試みた。従来よりも高速画像処理可能なラインカメラを導入した結果、2秒以内で3次元断層画像構築のためのデータ取得が可能となり、マウス卵巣内に多数の光散乱像がイメージングすることができた。この方法を用いて生後512週齢マウスの卵巣を画像化した後、同一の卵巣を組織学的に観察した。その結果、発生初期の一次卵胞及び二次卵胞、大きく成長した胞状卵胞において卵母細胞内に光散乱像が観察された。以上の結果から、ドップラーOCT技術は、卵巣内での卵胞の定量化及び立体的局在の解析に有効であることが示された。ドップラーOCT技術を用いることで、マウス卵巣内に存在する種々の発生ステージの卵胞のイメージングに成功した。本研究は、当初の計画通り順調に進んでいると判断される。本研究では、OCT技術により卵巣内に存在する卵胞を無侵襲的に画像撮影し、卵胞サイズと位置情報をイメージングできる高感度計測システムの開発を目的とした。平成28年度は、前年度までに開発したドップラーOCT技術の有用性を評価するための生物学的解析実験を行った。具体的には、卵母細胞の細胞質で検出される光散乱像と生物活性との関連を調べた。マウスの新鮮卵巣とホルマリン固定した卵巣のドップラーOCT観察を行った結果、固定した卵巣では光散乱像は全く観察されなかった。次に、長時間保存した卵巣のOCTイメージングを行った結果、保存時間の延長に伴い光散乱像は減衰することがわかった。これらの結果から、ドップラーOCTシステムにより観察された高輝度シグナルは、卵母細胞の生命現象に伴って発生するものであることがわかった。さらに、2年齢マウスから採取した卵巣を観察した結果、光散乱像がほとんど認められず、卵巣内には卵母細胞がほとんど存在していないことがわかった。以上の結果から、本研究で開発したドップラーOCTシステムは、高輝度シグナルを指標に卵巣内に存在する卵母細胞の定量化とクオリティーの評価に有効であることが示された。

高分解能OCTプローブと超高速画像処理技術を開発し、生物学的解析によるOCTシステムの有効性を評価した。その結果、従来のOCTシステムではイメージングができなった一次卵胞を検出できるドップラーOCT技術を開発することができた。本研究で開発したドップラーOCTシステムは、高輝度シグナルを指標に卵巣内に存在する卵母細胞の定量化とクオリティー評価を可能とするシステムであることが示された。ドップラーOCT技術を応用することで、従来のOCTシステムでは検出できなかった卵母細胞の画像化に初めて成功した。本研究は、当初の計画通り順調に進んでいると考える。ドップラーOCT技術により卵巣内に存在する卵胞の定量化を行い、組織学的解析により有用性を検証する。卵母細胞の検出マーカーとなっている高輝度シグナルの実体を明らかにするために、若齢マウス及び加齢マウスの卵巣や新鮮卵巣及び固定卵巣における高輝度シグナルの変化を比較検討し、卵母細胞の生物活性と高輝度シグナルの関係を明らかにする。生殖生物学ドップラーOCT技術の有効性をより確実にするために、組織学解析により各発生ステージの卵胞数を定量化し、OCTで検出された卵胞数と比較検討する。生きた卵巣組織と固定処理した卵巣組織を比較し、高輝度シグナルの発生原因を解析する。加齢マウス卵巣やウシ卵巣など異なる生物学的条件の卵巣における卵胞イメージングを試みる。新規に導入した計測装置の設置とデータ収集及び実験動物の準備に想定以上の時間を要したため。マウス等の実験動物の購入費及び飼料購入費が予定より少なかったため、次年度への繰越が生じた。加齢マウスの繁殖及び維持及びデータ収集に関連する経費に使用する。マウス等の実験動物の購入費、ウシ卵巣の採材費用、組織学的解析を行うための試薬等、OCT計測に必要な部材の購入に充てる。
肝芽腫の発生・進展過程におけるDNAメチル化異常の解明

肝芽腫11症例の検体に対してメチル化ビーズアレイ解析をおこなった。更には、肝芽腫細胞株よりシスプラチン(CDDP)耐性細胞株を作成し、耐性獲得前後のmRNA発現アレイ解析をおこなった。これらを掛け合わせ、CDDP抵抗性関連遺伝子の候補となりうる5遺伝子を抽出した。この5遺伝子に対し、55例の患者検体を用いてバイサルファイトパイロシークエンス解析をおこない、3遺伝子において高メチル化群では予後が有意に低下していた。今後これまでに集積した肝芽腫特異的な分子プロファイルを統合解析することで、肝芽腫の予後予測マーカーおよび新規治療法の確立につながると考えている。肝芽腫は胎児肝の発生過程におけるepigenetic異常、特にDNAメチル化異常が発癌および進展における主要なmodulatorとなっている。本研究では、同一患者から得られた正常肝、原発巣の各組織型、転移巣より個別に抽出した核酸(DNA・RNA)を用いて、肝芽腫のheterogeneity(腫瘍内不均一性)および転移へと進展する過程におけるDNAメチル化プロファイルおよびmRNA発現プロファイルをゲノムワイドに解析する。先行研究によって判明した肝芽腫における癌特異的なメチル化異常と照合し選別することによって、DNAメチル化異常に基づく腫瘍内不均一性と分岐進化の観点から、肝芽腫の新規分子生物学的マーカーを確立し、個別化治療を開発することを目的としている。平成27年度の研究計画どおり、肝芽腫7症例において、同一患者から採取された肝芽腫検体パラフィン包埋(FFPE)切片から、正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによって核酸(DNA,RNA)を分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析(Infinium 450K)をおこなった。正常肝→原発巣→転移巣へと癌化・進展するにつれて、DNAメチル化プロファイルがどの様に変化するかを各患者間で解析中である。プレリミナリーなデータではあるが、有意にβ-value(=メチル化率に同等)が変化したプローブを抽出してクラスター解析を行うと、正常肝から原発巣へと進化する過程においては高メチル化を示すCpGが圧倒的に多いことに対し、原発巣から転移巣へ進展する際にはグローバルに低メチル化傾向がみられることが示唆されている。今後統計解析手法による候補遺伝子の抽出を進め、既存のdatabase(ENCODE等)にて明らかにされているヒストンコード情報を照らし合わせることによって、より効率的に洩れなく選別する計画である。当初の研究計画どおり同一患者から正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによって核酸(DNA)を分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析(Infinium 450K)をおこなった。解析サンプルは品質良好であり、解析結果は十分信頼のできるデータが得られた。網羅的解析であるため解析結果のデータ量はぼう大であり、現在統計解析手法を駆使して目下責任遺伝子の同定に向けて解析施行中である。当初計画していた発現アレイ解析はFFPE検体から解析に値する十分なmRNA採取が困難であることが判明した。現在microRNA解析(より塩基数が少ないため核酸抽出が可能である公算が高い)が可能であるかを検討中である。なお遺伝子発現に関しては、先行研究によって得られた脱メチル化細胞株の発現変化データや既知のENCODE情報などを用いることを計画している。同一患者から得られた正常肝、原発巣の各組織型、転移巣より個別に抽出した核酸(DNA・RNA)を用いて、肝芽腫のheterogeneity(腫瘍内不均一性)および転移へと進展する過程におけるDNAメチル化プロファイルおよびmRNA発現プロファイルをゲノムワイドに解析する。平成27年度に肝芽腫7症例のパラフィン包埋(FFPE)切片から、正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによってDNAを分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析をおこなったのと同じ検体を用いてRNAを抽出し、miRNA発現アレイ解析をおこなった。更には、平成28年度研究計画通り、肝芽腫細胞株(HuH6)よりシスプラチン耐性細胞株を作成し、耐性獲得前後のmRNA発現アレイ解析をおこなった。それによって有意に発現が減少した遺伝子を104個同定した。H29年度はこれまでの研究にて同定した進展に関わるメチル化異常およびシスプラチン耐性に関わるメチル化異常、さらには肝芽腫特異的なmiRNA発現異常との照合、選別をおこなう予定である。また臨床腫瘍検体を用いて絞り込んだ候補がん抑制遺伝子のメチル化率を測定する。当初の研究計画通りシスプラチン耐性株を用いた発現アレイ解析を行い、肝芽腫のシスプラチン耐性に関わるDNAメチル化異常を同定する試みが順調に進んでいる。臨床腫瘍検体40例を用いて候補遺伝子のバイサルトパイロシークエンシング解析を実施中であり、絞り込んだ候補遺伝子の中から臨床情報(化学療法抵抗性および予後)との相関を統計解析を用いて検討している。更には当初の研究計画には盛り込んでいなかったmiRNA発現アレイ解析を実施した(FFPE切片からのmRNA発現解析は核酸のクオリティーに問題がみられたため)。

肝芽腫のエピジェネティック異常を解き明かす上でDNAメチル化異常とmiRNA発現異常とを組み合わせることは新たな知見を得られる可能性があり、網羅的解析データを目下統合・照合しているところである。肝芽腫は胎児肝の発生過程におけるepigenetic異常、特にDNAメチル化異常が発癌および進展における主要なmodulatorとなっている。同一患者から得られた正常肝、原発巣の各組織型、転移巣より個別に抽出した核酸(DNA・RNA)を用いて、肝芽腫のheterogeneity(腫瘍内不均一性)および転移へと進展する過程におけるDNAメチル化プロファイルおよびRNA発現プロファイルをゲノムワイドに解析する。それによって、DNAメチル化異常に基づく腫瘍内不均一性と分岐進化の観点から、肝芽腫の新規分子生物学的マーカーを確立し、個別化治療を開発することを目的としている。平成27年度に肝芽腫7症例のパラフィン包埋(FFPE)切片から、正常肝組織、原発巣、転移巣よりそれぞれmacrodissectionによってDNAを分別回収し、メチル化ビーズアレイ解析をおこなった。更には、平成28年度研究計画通り、肝芽腫細胞株(HuH6)よりシスプラチン耐性細胞株を作成し、耐性獲得前後のmRNA発現アレイ解析をおこなった。それによって有意に発現が減少した遺伝子を104個同定した。H29年度はこれらを掛け合わせ、CDDP抵抗性関連遺伝子の候補となりうる5遺伝子を抽出した。この5遺伝子に対し、33例の患者検体を用いてバイサルファイトパイロシークエンス解析をおこない、CDDP感受性群に対し抵抗性群で有意に高メチル化を示したのは1遺伝子のみであったが、残りの4遺伝子中3遺伝子で、正常部と比較し癌部で有意に高メチル化を認め、またメチル化別で群別化すると、高メチル化群ではOSやEFSが有意に低下していた。更に、平行しておこなったmiRNA発現アレイ解析データを上記メチル化ビーズアレイ解析結果と統合解析することによって、miRNA発現異常をもたらすDNAメチル化異常の関りについて検討をおこなった。肝芽腫11症例の検体に対してメチル化ビーズアレイ解析をおこなった。更には、肝芽腫細胞株よりシスプラチン(CDDP)耐性細胞株を作成し、耐性獲得前後のmRNA発現アレイ解析をおこなった。これらを掛け合わせ、CDDP抵抗性関連遺伝子の候補となりうる5遺伝子を抽出した。この5遺伝子に対し、55例の患者検体を用いてバイサルファイトパイロシークエンス解析をおこない、3遺伝子において高メチル化群では予後が有意に低下していた。今後これまでに集積した肝芽腫特異的な分子プロファイルを統合解析することで、肝芽腫の予後予測マーカーおよび新規治療法の確立につながると考えている。平成28年度研究計画どおりに、肝芽腫細胞株のシスプラチン耐性株を作成し、発現アレイ解析をおこなってシスプラチン抵抗性に関わるDNAメチル化異常(先行研究及び上記in vitro解析の統合)を解析する。