hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨形成因子BMP2による半月板の恒常性の分子機構の解析

半月板は関節機能の維持に必須の組織であるにも関わらず、その形成、成熟、恒常性の分子機序はほとんど解析されていない。私たちのこれまでの研究から、骨形成因子(BMP, Bone Morphogenetic Protein)ファミリーに属する分子BMP2を半月板形成期に欠失させると半月板形成に異常をきたすことを明らかとしている(Tsuji et al, Nature Genetics, 2006)。そこで本研究では、半月板におけるBMP2の情報伝達経路を詳細に解析し、その形態形成、成熟、恒常性及び損傷後修復のプロセスにおける分子機能を明らかとすることを目的とする。私たちは、発生過程における関節形成初期に、四肢の間葉組織特異的に骨形成因子BMP2を欠損させる(Bmp2c/c;Prx1::cre)と、100%の確率でヒトの円板状半月板に類似した形態異常が観察されることを示した。今回、詳細にBMP2欠損マウスにおける半月板組織の形成過程を組織学的に観察したところ、軟骨分化(成熟)のプロセスがほぼ完全に阻害されることを発見した。すなわち、これら欠損マウスでは胎生17日前後に半月板の予定領域に細胞の集積が観察されるが、それらは軟骨細胞への分化が観察されず、細胞外基質へのプロテオグリカンの蓄積も観察されなかった。また、半月板組織における軟骨細胞分化、骨髄腔の形成(齧歯類はヒトと異なり、成熟半月板の前節部に骨髄腔が形成される)、軟骨基質の蓄積は、15週齢においても観察されなかった。以上の結果は、一時的にせよ軟骨分化が観察される関節軟骨領域とは完全に異なった表原型を示している。以上の結果は、半月板形成過程においてBMP2が必須の生理機能を有すること、形態的にはヒトの円板状半月と類似しているが、ヒトの病態とは異なることを示唆している。前年度において、四肢の間葉組織特異的に骨形成因子BMP2を欠損させたマウス(Bmp2c/c;Prx1::cre)の半月板形成過程を、継時的に、組織学的に観察を行なった。その結果、半月板の予定領域への細胞の集積は正常に起こるが、半月板組織への分化過程にBMP2活性が重要であることを示すことができた。生後15週においても半月板領域への軟骨基質の蓄積は観察されなかったことからこの過程においてBMP2活性は必要不可欠であると考えられる。以上の進捗より、上記の区分とした。本年度は主に以下の2点に関して検討を行う。(1)半月板形成過程におけるBMP2及びその受容体分子(Alk3, Alk6, BmpRII, ActRIIa, ActRIIb)の時空間的発現解析。BMP2欠損マウスにおいて観察された半月板の形態異常の機序を解析するにあたって、半月板形成過程においてどの時期にどの場所でBMP2及びその受容体が発現しており、どの細胞がシグナルを受け取っているかを同定することは非常に重要である。この考えから、野生型マウスの膝関節を用いて、胎生15.5, 16.5, 18.5,生後0, 1, 2, 3, 4週の半月板領域におけるこれらリガンド、受容体分子の発現をIn Situ Hybridization法を用いて解析を行う。また、BMP2シグナルを受け取っている細胞の同定はSmad1分子のリン酸化抗体を用いた免疫組織染色法を用いる。(2)半月板形成(成熟)過程においてBMP2により制御される標的遺伝子の同定。BMP2による半月板形成の分子機序を解析するため、胎生15.5, 16.5, 18.5,生後0,1, 2, 3, 4週の野生型及びBMP2欠損マウスの半月板からLaserCapture Microdissection法を用いて組織を回収し、そこからRNAの採取を行う。Microarray法を用いて、野生型とBMP2マウスの間で発現量の異なる遺伝子の同定を行う。さらにその中から重要と思われる遺伝子のピックアップを行い、項目1と同様の実験を行なって、半月板の形成過程における遺伝子発現のカスケードの解析を行う。

また、半月板組織における軟骨細胞分化、骨髄腔の形成(齧歯類はヒトと異なり、成熟半月板の前節部に骨髄腔が形成される)、軟骨基質の蓄積は、15週齢においても観察されなかった。以上の結果は、一時的にせよ軟骨分化が観察される関節軟骨領域とは完全に異なった表原型を示している。以上の結果は、半月板形成過程においてBMP2が必須の生理機能を有すること、形態的にはヒトの円板状半月と類似しているが、ヒトの病態とは異なることを示唆している。前年度において、四肢の間葉組織特異的に骨形成因子BMP2を欠損させたマウス(Bmp2c/c;Prx1::cre)の半月板形成過程を、継時的に、組織学的に観察を行なった。その結果、半月板の予定領域への細胞の集積は正常に起こるが、半月板組織への分化過程にBMP2活性が重要であることを示すことができた。生後15週においても半月板領域への軟骨基質の蓄積は観察されなかったことからこの過程においてBMP2活性は必要不可欠であると考えられる。以上の進捗より、上記の区分とした。本年度は主に以下の2点に関して検討を行う。(1)半月板形成過程におけるBMP2及びその受容体分子(Alk3, Alk6, BmpRII, ActRIIa, ActRIIb)の時空間的発現解析。BMP2欠損マウスにおいて観察された半月板の形態異常の機序を解析するにあたって、半月板形成過程においてどの時期にどの場所でBMP2及びその受容体が発現しており、どの細胞がシグナルを受け取っているかを同定することは非常に重要である。この考えから、野生型マウスの膝関節を用いて、胎生15.5, 16.5, 18.5,生後0, 1, 2, 3, 4週の半月板領域におけるこれらリガンド、受容体分子の発現をIn Situ Hybridization法を用いて解析を行う。また、BMP2シグナルを受け取っている細胞の同定はSmad1分子のリン酸化抗体を用いた免疫組織染色法を用いる。(2)半月板形成(成熟)過程においてBMP2により制御される標的遺伝子の同定。BMP2による半月板形成の分子機序を解析するため、胎生15.5, 16.5, 18.5,生後0,1, 2, 3, 4週の野生型及びBMP2欠損マウスの半月板からLaserCapture Microdissection法を用いて組織を回収し、そこからRNAの採取を行う。Microarray法を用いて、野生型とBMP2マウスの間で発現量の異なる遺伝子の同定を行う。さらにその中から重要と思われる遺伝子のピックアップを行い、項目1と同様の実験を行なって、半月板の形成過程における遺伝子発現のカスケードの解析を行う。トランスジェニックマウスの維持にかかる費用が見込みよりも少額になったことが理由の一つである。交配がうまく行かずマウス頭数が伸び悩んだため、ケージ維持費用が比較的抑えられた。本年度は、マウスコロニーを増やし、よりスピーディーに解析できるように心がける。
動的環境下における知的エージェント集団の創発的知能の開発

本研究は,「動的環境下における知的エージェント集団の創発的知能の開発」というテーマのもと,理論構築から応用展開まで,シミュレーション検証から実機検討までをそれぞれ網羅する4つの研究領域を相補的に進めることにより,包括的かつ実践的な研究成果を得ることができた。まず,本研究の中心的成果である知的車椅子の開発研究では,市販の電動車椅子をベースにした試作機を開発した。この試作機の仕様のもとで実現可能な知的振る舞いとして自律・協調・協同行動に注目し,それぞれの行動システムの実現に至った。次に,群としての振る舞いに注目した本研究は,知的エージェント群によるマクロ行動についても基礎的検討を進めた。マルチエージェントによる群行動の創発シミュレーションでは,群集の複雑な振る舞いや交通システムを事例に,その制御方法の検討を進めた。実機・シミュレーションの検討のいずれにおいても,知的エージェント集団が動的環境で適切な振る舞いを得るためには,適応的な学習,進化的なアプローチが必要である。本研究では,動的環境下における強化学習法,進化手法の開発をすすめることで,知的車椅子や,マルチエージェントシミュレーションに応用可能な基礎技術の開発を行った。さらに,近年注目されている進化型ハードウェアを,故障時におけるエージェントの自律的修復機能として利用するために動的再構成システムの検討を行い,ロボットの迷路巡航問題にてその効果を確認するに至った。以上の成果から,近未来の知能社会システムを支える基盤技術を開発し,その応用例を示すという研究目的が達成された。初年度にあたる今期は,以下の3点について取り組んだ。(1)知的エージェント集団の創発的知能に関する基礎理論の確立自律行動の基礎技術である強化学習について,実環境に近い部分マルコフ過程タスクに効果的な、新しい手法を開発した。また,モジュール構造型のエージェントにおける効率的な学習方法と,創発的な形態形成メカニズムに関して,基礎理論上での新たな展開を得た。(2)知的エージェント集団理論を応用した「知的車椅子群システム」の概念・システム仕様,及びハードウェア設計知的車椅子が具備すべき諸機能を「自律」「協調」「協同」という個別の役割に分解し,これらが独立に動作するとともに,互い調停し合うシステムアーキテクチャを仕様に取り込んだ。一方ハードウェアの設計として,電動車椅子を改造し,専用のドライバを開発することで.後述のシミュレータシステムとのシームレスな結合が可能な研究環境の構築に成功した。(3)知的車椅子群システムにおける進化・学習・創発実験に利用するシミュレータシステムの開発実機での学習・進化・創発実験に伴う負荷を軽減するためのコンピュータシミュレーションシステムを開発した。クライアントに相当するエージェントの設計を容易にするために,専用フレームワークを別途開発した。これらの実装により,効率的な実験環境の構築に成功した.以上3点の研究により,今年度は,論文4件,国際会議3件,講演発表1件,図書1件の成果を上げることができた。2年度目にあたる今年度は,特に以下の3点の研究に集中的に取り組み,それぞれ成果を上げることができた(1)知的エージェント集団の創発的知能に関する応用研究知的エージェント集団の学習機構の1つである強化学習において,多次元空間の学習を効率的に行うための状態空間の動的構成法と,離散センサ入力の正規化による空間次元の圧縮法を提案し,知的車椅子における知的エージェントの自律行動機構に応用した。(2)「知的車椅子」における知的エージェントシステムの実装知的車椅子の「自律」「協調」「協同」機能同士の連携をはかるサブサンプションアーキテクチャを用いた行動統括機構を実装した。特に協調行動については,不完全な環境情報から効率的な協調行動を創発するフラストレーションコストを用いた手法を提案し,隘路におけるデッドロック回避行動の獲得に成功した。また、タッチパネルと単眼カメラを用いた指差による簡易な方向指示インタフェースや,RFIDによる位置決め機構などを実装し,様々な環境で利用可能なプロトタイプ機を完成させた。本プロトタイプ機を用いて実環境での実験を重ねた結果,目標とするいくつかの機能において,知的エージェント集団による創発的知能の創発を確認するに至った。(3)実応用を目指した進化型高精度シミュレータの開発

知的エージェントが動作する実環境と学習環境であるシミュレータ上での誤差を縮めるために,シミュレータ自身が知的エージェント集団の学習と共に進化する手法を提案した。本進化型シミュレータの実現により,実環境における様々な誤差や外乱の影響を含めた知的エージェント集団の学習・進化が可能となり,効率的な創発的知能の開発が可能となった。以上3点の取り組みから,雑誌論文6件,レター1件,国際会議2件,講演発表6件の成果を上げることができた。最終年度にあたる16年度は,昨年度までに実施した知的エージェントの自律性と協調性の獲得機構を,さらに動的環境化で利用できるよう拡張をはかり,本研究課題の目標であった知的エージェント集団による実環境での知的創発機構の実現をはかった。具体的には,以下の3つの点について成果をあげた。(1)動的環境化における知的エージェント自律システムの発展知的車椅子の「自律」機能について,様々な外乱のある環境化でも安定した障害物回避を行うことをめざし,隠れマルコフモデル(HMM)を自律行動制御に利用することを提案した。動作コンテクストをモデル化しておくことで,外乱による行動伸縮にロバストな制御が可能になる。様々な環境でのシミュレーションと実機による実験の結果,所望の動作が確認されたことから,実環境での実用性が評価できた。(2)動的環境化における知的エージェント協議システムの発展本研究の中心となる群内での協調行動獲得について,より深い検討を行った。フラストレーションコストと呼ぶ大域環境情報を媒介として,集団が情報をやり取りするstigmergyの応用をはかった。遺伝的プログラミング(GP)と強化学習(RL)の比較を行った結果,非マルコフ過程のである実環境上では,集団行動を獲得する上でGPが有利であることを確認した。(3)基礎技術の発展的応用一連の研究成果から生まれた新たな技術,手法をもとに交通の効率化をめざす発展的な応用研究に着手した。特にマルチカーエレベータ制御における群知能の創発応用について成果を上げた。以上3点の取り組みから,今年度は雑誌論文2件,国際会議・シンポジウム2件,講演発表7件の成果を上げることができた。
今日のアフリカにおける身体芸術と社会-モーションキャプチャを利用した学際研究-

無文字社会であったアフリカにおける身体芸術(特にダンス)の研究は、舞踊の原点を知る上で重要である。またジャズやブルースの誕生に深くかかわっているため、現在の芸術を知る上でも必要である。そこで本研究は、アフリカの身体芸術とアフリカの今日の社会に焦点をあてて以下を行った。I研究目的:I・1.アフリカ(特にナイジェリアとケニア)における身体芸術と文化社会の現状I・2.身体芸術をモーションキャプチャによる記録・解析I・3.2の動作特性と文化・社会との関連性とその意味・構造を明らかにする。II研究方法:II・1.アフリカに関する文献研究II・2.アフリカにおける文化人類学的フィールドワークII・3.アフリカ人ダンサー(日本へ招聘)によるダンスのデジタル記録・解析である。IVモーションキャプチャの記録プロセス:立命館大学アート・リサーチセンターにおける光学式モーションキャプチャを利用してIV・1.カメラ設置IV・2.キャリブレーションIV・3.被験者にマーカー付着IV・4.計測IV・5.データ編集を行った。V研究結果の主な点:V・1.トルソー(肩と腰)の動かし方に特徴が見られるV・2.ダンスの熟練と非熟練者の違いは、トルソーの動かし方にみられる等。本研究は、現地のダンサーやダンス関係者にコンピュータ解析によって新しい見方を可能するなど、有益であると思われる。研究実績は、以下の通りである。1.ケニアの舞踊動作に関して。ケニアの典型的と考えられる舞踊の計測を行い、その計測した動作データに関して編集作業を行った。動作計測は、立命館大学アート・リサーチセンターで光学式モーションキャプチャを利用した。ケニア人男性1名、女性6名ダンサーの身体に42個のマーカを付着させた。これは、身体の骨格構造に基づいた位置に付着させている。ダンス演目は、6演目である:1ゴンダGonda(ギルヤマ族の結婚式の舞踊:バンツ語系)、2オルトOrutu(弦楽器の一種であるがルオ族の結婚式の舞踊:ナイル語系)、3スクティSukuti(ルヤ族の葬式の舞踊:バンツ語系)、4サンブルSamburu(サンブル族の戦争の舞踊:ナイル語系)、5センゲンヤSengenya(ディゴ族の結婚式及び葬式の舞踊:バンツ語系)、6キクユKikuyu(キクユ族の割礼の舞踊:バンツ語系)である。計測した動作データより、動作の周期性や動作パターンの確認が出来ている。今後は、これらの動作パターンにおける各関節部の動作分析を行っていきたいと考えている。また、ドラムなどの管楽器や弦楽器で演奏した音楽情報と動作における関係についてもナイル語系とバンツ語系で比較を行い,動作解析をしていきたい。2、論文執筆。アフリカの文献とフィールドワークによって、アフリカの舞踊人類学の研究動向を論文としてまとめた(別紙参照)。3、ナイジェリア国立舞踊団のアーティスト・イン・レジデンスの一員として調査が可能になった。4、研究成果の公開。2004年7月25日サンフランシスコクラリオンミュージックセンターにおいて『日本とケニアの舞踊』と題し、モーションキャプチャのデモンストレーションを交えて講演を行ってきた。(講演の報告は、日本体育学会編『体育学研究』第50巻第1号、2005年p.159を参照)研究実績は、以下の通りである。1.ナイジェリアの舞踊動作のデジタルアーカイブ化。ナイジェリアの典型的と考えられる舞踊の計測を行い、その計測した動作データに関して編集作業を行った。動作計測は、次の手順で行った。(1)立命館大学アート・リサーチセンターで光学式モーションキャプチャシステム(カメラ21台)を準備する。(2)ナイジェリ国立舞踊団団員:男性2名、女性2名の身体(身体の骨格構造に基づいた位置)にマーカーを49個装着させる。(3)ダンス6演目を記録する:1カヌリのMaliki(エレガントさとロイヤリティを表現しているダンス)2ティブのSwange(農作物の豊穣と子孫繁栄を願うダンス)3ハウサのKabulu(農作物の収穫を祝うダンス)4ヨルバのBata(雷の神シャンゴ神に祈りを込めて踊るダンス)5イボのIri-Agha(戦士のダンス)6エフィクのEkombi(海の女神をたたえるダンス)。これらのデータをもとに各関節部の動作分析を行う予定である。2.論文執筆。

アフリカの文献とフィールドワークによって、ケニアの舞踊に関する論文をまとめた(別紙参照)。3.フィールドワーク。ナイジェリア国立舞踊団アーティスト・イン・レジデンスの一員として現地調査を継続させた。4.研究成果の公開。ナイジェリア国立劇場とベニン大学で、上記1のモーションキャプチャデータに関する研究結果を報告し、新聞、テレビで大きく報道された。1.ケニアの舞踊動作解析。特に熟達度の異なる2人の男性ダンサー:1.イディ・アジズ・クンヤ、2.オウイノ・チャールズ・オブヤに着目して、3つのダンス演目:1.ゴンダ(ギリヤマ人の結婚式のダンス:バントゥー語系)2.オルトゥ(ルオ人の結婚式のダンス:ナイル語系)3.ボラナ(ボラナ人の結婚式のダンス:クシ語系)対象に次の3点から解析を行った:1.正面、肩と腰の角度変化2.側面、肩と腰を結ぶラインの左右の角度変化3.頭上、肩と腰の角度変化。その結果は次のようになった。イディのダンス特性は、1.ゴンダ:小刻みに速く動き、胴体の動きのぶれが少ない。2.オルトゥ:胴体の動きのぶれが少ない。3.ボラナ:肩と腰が同時に動いているが、腰の動きが遅い。正面から見た場合、肩は動いているが、腰が動いていない時もある。肩と腰の角度の変化は少ない。オウイノのダンス特性は、1.ゴンダ:イディに比べると動きが遅く、胴体の動きがぶれている。2.オルトゥ:胴体の動きがぶれている。3.ボラナ:イディに比べると、動きの速度が遅い。正面から見た場合、イディに比べると肩と腰の動きの角度が大きい。このような結果から舞踊の熟達度は、胴体の動きに現れやすいことなどが明らかになった。2.論文&学会。1.日本スポーツ人類学会編『スポーツ人類学』において「ケニアの舞踊-ボーマス・オブ・ケニアを中心として」を執筆、2.2006年5月29日韓国スポーツ人類学会第2回大会一般研究「アフリカの舞踊に関するデジタルアーカイブ化の試み-ナイジェリアの舞踊を事例として-」於:韓国国立江原大学三陟キャンパス図書館4階学術会議場で発表、3.2007年3月30日日本スポーツ人類学会第8回大会口頭発表「モーションキャプチャを利用した舞踊動作のデジタルアーカイブ化研究於:九州国立博物館ミュージアムホールで発表した。3.研究継続。ナイジェリア国立舞踊団のアーティスト・イン・レジデンスの一員として調査を継続した。I.研究活動1.8月、アフリカにおいてデジタル化された舞踊データに関して現地の研究者や舞踊家と共同討議を行った。また、そのデータから読み取れる舞踊の特性と社会・文化に関する考察を行った。2.デジタル記録した舞踊データをもとにCGなどを用いて身体動作データベース化を行った。
がん悪液質による食欲不振・倦怠感に対する薬物療法の複合的研究

進行がんの悪液質により生じる食欲不振・倦怠感への薬物療法については現在に至るまでも信頼に足るエビデンスが乏しい状況が続いており、本研究課題のような前向き研究による質の高いエビデンスが求められている。本研究では、平成29年度目標にした「異なる用法用量のステロイド療法を比較する前向き介入研究の実施」について、予定どおり研究計画書の作成と各施設においける倫理委員会承認を経て、従来進行肺がん研究領域で豊富な実績のある多施設共同研究グループにおける臨床試験が現在進行中である。症例集積に遅れが生じているが、今年度中の目標症例数到達を目指し、データ解析後には各種学会での報告を経て論文化を目指す。他方、食欲不振・倦怠感に悩む進行がん患者における「食べられなくなるまでの期間」「歩けなくなるまでの期間」を予測できることは、患者の現状に即した適切な緩和ケアを提供するうえで非常に重要であるが、申請者らが中心的に関わっている全国的な進行がん患者の大規模レジストリ研究のなかで上記予測因子を解析する計画が順調に進捗し、平成30年度中に1600例を超える患者が登録され、現在はデータクリーニング中である。上記予測因子についても平成31年度中に解析され、結果が得られると予定している。前向き臨床研究は予定どおり症例集積が進んでおり、レジストリ研究も予定どおり症例集積は終了している。患者遺族への調査研究はやや進捗が遅れているが、挽回は十分可能である。前向き臨床研究については、引き続き多施設共同研究グループへの呼びかけを積極的に行い順調な症例登録を目指す。レジストリ研究のデータを用いた予測因子解析は、今年度中の解析終了を予定しており、その後は学会発表、論文化を目指す。患者遺族への調査研究については主担当者の宮下教授との連携を密にし、早めの研究計画立案と研究遂行を目指す。症例集積も順調に進んでおり、今年度中の目標症例数到達を目指す。その後は、速やかにデータ解析を行い、各種学会での報告を経て論文化を目指す。他方、食欲不振・倦怠感に悩む進行がん患者における「食べられなくなるまでの期間」「歩けなくなるまでの期間」を予測できることは、患者の現状に即した適切な緩和ケアを提供するうえで非常に重要であるが、申請者らが中心的に関わっている全国的な進行がん患者の大規模レジストリ研究のなかで上記予測因子を解析する計画も順調に進捗している(昨年末までに1600例を超える患者が登録され、現在はデータクリーニング中である)。上記予測因子についても平成30年度中の解析が予定されている。食欲不振・倦怠感を有する患者の介護者に対する調査研究については、主担当者の宮下教授が平成29年後半に海外留学をされたことから、平成30年度から具体的な計画案を検討し、実施を目指す。
ゲル内結晶化法を応用した新しい作用機序のプロテアソーム調節薬剤の開発

本研究では、プロテアソーム機能調節薬剤の開発を目指し、初年度は難水溶性化合物との複合体構造決定を可能にするゲル内結晶化法の開発に取り組んだ。まず、プロテアソームのゲル内結晶化条件の検討(pH,ゲル濃度、沈殿剤濃度、サンプル:リザーバー比)を行い、物理的強度が向上したゲル内結晶を得た。プロテアソームの機能を調節する化合物のDMSO溶液にこの結晶を浸漬した結果、既存の化合物(MG132)ではプロテアソームとの複合体構造解析が可能であった。このことから、DMSOを含んだバッファでの浸漬に耐えうる結晶が作製できたといえる。しかし、高濃度のDMSO溶液にしか溶解しない化合物の浸漬による構造解析では、結晶構造は決定されたものの化合物との複合体構造は得られなかった。化合物の濃度が不十分であり複合体形成が行われなかったと考えられる。ゲル内結晶化条件の検討をする上でプロテアソームは大量調整が困難であるため、高収量の代用サンプルを使用して、簡便に条件検討可能なタンパク質の検討を行った。プロテアソームの形成に関与するシャペロン分子はプロテアソームの複合体形成に影響し結果として細胞内のプロテアソームの活性に関与する。このためプロテアソームシャペロンは本研究の目的に合致していることから、ゲル内結晶化を目指し、まずゲルを含まない溶液状態での結晶化条件検討を行った。条件検討の結果、構造決定が可能な結晶は得られたが、浸漬実験可能な大きさの結晶は得られていない。既存の化合物を用いた、プロテアソームゲル内結晶化及び化合物との複合体構造決定に成功した。また、より広範なゲル内結晶化条件検討を可能にするための代替サンプルの結晶化条件の決定及び構造解析に成功した。当初の研究計画通り、より難水溶性な化合物との複合体構造解析が可能なゲル内結晶化条件の検討を進めるとともに、当初目的としていた難水溶性化合物を用い、別の構造解析方法(電子顕微鏡法など)による複合体構造解析にも取り組む予定である。使用計画作成時にはゲル内結晶化方法の検討を広範に行う予定であったが、化合物を含んだ結晶構造が得られたため、条件検討のために計上していた予算が残った。次年度は高いDMSO濃度でしか溶解しない化合物での検討を、実験条件を広げて行う予定であり、また研究代表者の異動により、年度内に行っていた実験と同等の実験を次年度も進めていく必要があるため、当初の計画通り(初年度の残額+次年度予定していた額を合わせた額)の使用額を計上した。
懸垂式水中線状構造物を対象とした制振機構の開発

海底熱水鉱床の揚鉱等の海底資源の開発への導入が見込まれる、下端が海底面に直接接続されず、懸垂状態で運用されるライザーシステムおよび洋上天然ガス液化生産設備に用いられるプラント冷却水取水管を対象として、建築物の免震部材に用いられる機構を応用した制振機構を試設計し、これらを組み込んだ多節構造型ライザーシステムの有効性の検討を実施した。その結果、浮体動揺によるライザーの振動および曲げモーメントを制振機構を取り付けた位置だけでなく、管全体に亘って低減した。さらに上端のモーメントを逃がす機構を持つシステムに対しても多節構造型ライザーシステムが管全体の曲げモーメントを低減すること確認した。製品・技術の調査として、揚鉱ライザーに関する調査を行い、類似の研究に関して文献調査を実施した。また、フェアリング、ストレーキ等の既存のVIV制振デバイスについても調査した。上述の技術調査結果を基に、揚鉱ライザー模型ならびに制振機構模型の試設計を行った。揚鉱ライザーは石油天然ガスの掘削、生産にも用いられるリジットライザーを基に想定実機を検討した。具体的には想定実機と同じくフランジで接続するタイプの鋼管をスケールダウンした樹脂模型をライザー管模型とし、これを複数本連結して1本のライザー模型とする。また、制振機構については当初予定した下記の1.に加えて2.3.についても試設計を行った。1.フランジ部のボルトに通常よりも長いものを用いて、出来た隙間に合成ゴム等の弾力性のある素材を挟むことで制振機構とする。制振機構は建築物の免震装置に用いられる鋼板と積層ゴムを重ねた荷重による変形の小さい機構を計画している。2.上下のライザー管模型の間をチェーン吊りにして管の重量を支持し、加えて流体ダンパーを取り付けることで船体動揺やVIVによる管の動揺を減衰させる。3.2.と同様にチェーン吊りにして管の重量を支持し、比較的剛性の低い金属線を両端のフランジに取り付けることで、金属線の塑性変形によるエネルギー消費を用いてダンパーとする。平成27年度の研究実施計画に沿って水槽試験と数値計算を実施した。具体的には平成26年度に検討した制振機構モデルを基に水槽試験向けに縮尺部分模型を作成し、併せて懸垂式水中線状構造物の模型を作成した。さらにこれら模型を用いて水槽試験を実施た。水槽試験では水中線状構造物が上端で接続する上部浮体の波浪中船体動揺を模擬して上端部を強制加振し、その際の管の動揺を計測した。加えて潮流中のVIV(渦励振:Vortex Induced Vibration)挙動を計測するために、潮流発生装置を用いて管に流れを当て、そのときの挙動を計測した。数値計算では水槽試験で用いた模型を基にしたシミュレーションモデルを作成し、水槽試験結果と比較・検証した。また、制振機構を取り付けた場合と取り付けていない場合で管の挙動および管に生じる曲げモーメントを比較・検討し、制振機構の有効性を検証した。計画当初は平成26年度中に制振機構およびライザー管模型の試作を行い、水槽試験まで実施する予定であったが、他業務に忙殺され技術調査および制振機構およびライザー管模型の試設計までしか実施する事ができなかった。海中海底工学平成26年度に実施できなかった制振機構およびライザー管模型の試作および水槽試験については平成27年度の始めに実施を予定している。また、制振機構模型を当初、1つの設計・試作から3つに増やしたため、水槽試験における計測ケースの大幅な増加が見込まれる。そのため、研究計画時に予定していた船体動揺に起因する疲労被害度の評価は規模を縮小し、制振機構の基礎的な性能評価に重点を置いた水槽試験計画を立てる予定。なお、VIVに起因する疲労被害度の評価についても同様の方針で検討している。制振機構模型およびライザー管模型の試作および水槽試験が他業務の遂行に忙殺されたため実施できなかったため。制振機構模型およびライザー管模型の試作および水槽試験の実施によって、研究計画時に予定していた平成26年度予算および平成27年度予算の大半を費やす予定であり、過不足は生じないと考えている。
血管再構築ならびに粥状動脈硬化における骨髄多機能細胞の役割と解析

かねてより研究代表者らは、血管生物学における受容体型チロシンキナーゼを介する情報伝達に注目し、その機能遮断抗体をモデル動物に投与することによって、in vivoで動的な組織形成・再構築反応の解析を精力的に続けてきた。本研究期間においては、まず血管新生の場として腎糸球体の発生に着目し、マウス新生仔にPDGFβ受容体に対する拮抗抗体を投与すると、メサンギウム細胞や周皮細胞を介して糸球体血管内皮細胞のアポトーシスが惹起され、さらに糸球体の形成が阻害されることを発見した。次に、血管傷害後の再構築病変における骨髄由来細胞の挙動を調べるため、GFPマウスの骨髄を移植したマウスの大腿動脈にポリエチレンカフを装着し、2週間後に組織を観察した。この病変には骨髄由来のマクロファージ・平滑筋細胞・血管内皮細胞が多数存在した。さらにこの実験系で抗体投与によりM-CSFとその受容体c-fmsの情報伝達を遮断すると、病変へのマクロファージの集簇は抑えられたが平滑筋細胞は増加した。他方PDGFとβ受容体のシグナル遮断では、血管再構築部位の平滑筋細胞が減少する一方でマクロファージが増加した。以上より、血管再構築過程では、1)骨髄由来細胞の動員と関与が顕著であること、さらに2)マクロファージと平滑筋細胞に分化運命を辿りうる少なくとも2種類の血管前駆細胞が相互に干渉しながら進行すること、が示された。また、免疫反応としての粥状動脈硬化を追究するため、高脂肪食を負荷したアポリポ蛋白欠失マウスにヒト免疫グロブリンを大量に投与すると粥腫形成とマクロファージの集簇が抑制されるが、F(ab')2投与ではこの効果はないことから、免疫グロブリンはFc部位とTリンパ球を介して動脈硬化を抑制することを明らかにした。虚血性心疾患・脳血管障害に代表される粥状動脈硬化性病変の成立機構を探究するため、申請者は粥状動脈硬化が炎症類似の機序を伴う臓器再構築過程にあると位置付け、特に骨髄幹細胞の役割についてモデル動物を用いた解析を行なってきた。今年度はこの目的で、正脂血症マウスにGFP遺伝子発現トランスジェニック(Tr)マウス骨髄を移植したのち、4週間後に右股動脈にポリエチレンカフを装着し血管再構築モデルを作成した。2週間後に屠殺し血管平滑筋細胞ならびにマクロファージ系細胞に特異的な抗体を用いて組織学的検索を行なったところ、カフ装着部に多数のGFP陽性の骨髄細胞集簇を認めるとともに、平滑筋細胞系細胞、マクロファージ系細胞およびいずれにも属さない未分類の細胞への分化を認めた。この成績は、カフ装着による血管再構築病変において、骨髄由来多機能幹細胞が深く関わることを明瞭に示し得たものと考えられた。さらにその分子機構を詳細に検討するために、カフ装着後に単球・マクロファージの分化・増殖に関わるM-CSF受容体である。c-fmsならびに血管平滑筋細胞の増殖に関わるPDGF受容体βからのシグナル伝達をそれぞれに対するモノクローナル抗体を投与することにより遮断したところ、遮断した細胞とは反対の細胞系である平滑筋細胞、マクロファージ系細胞数の著明な増加を認め、これら二系統の細胞分化に関する情報が、互いに拮抗する様式をとりうることが示唆された。以上の成績より、【1】血管再構築における骨髄幹細胞の関与が明らかになると共に、【2】骨髄幹細胞の動員・分化・増殖様式の分子機構に関する基盤成績をあげたと考えた。

申請者は粥状動脈硬化モデルマウスであるアポEノックアウトマウスにおいて単球・マクロファージ分化誘導因子であるM-CSF、平滑筋細胞増殖因子であるPDGF受容体β各々のシグナル遮断をおこない、粥状動脈硬化病変ではマクロファージが他の細胞系に先行して関与する細胞階層の存在を示してきた。本申請では再構築巣での骨髄由来細胞の分化様式の解析のために、GFP発現トランスジェニックマウスの骨髄細胞をC57/B16マウスに対して亜致死線量のガンマ線照射後に移植した。4週後血球細胞のFACS解析でドナー由来骨髄細胞の定着を確認し、右側大腿動脈周囲にポリエチレンカフ(長径2mm)を装着し血管再構築病巣を形成させたところ、術後2週目には血管再構築病変部は内膜、中膜、外膜の全層にわたりGFP陽性細胞で占められ、血管内腔の狭小化を伴った。また病変への平滑筋細胞の集簇はカフ装着後2週目から顕著となった。シャム手術をおこなった左側大腿動脈には上記のような変化は認めなかった。M-CSFシグナル遮断モノクローナル抗体投与マウスでは病変へのマクロファージ系細胞の集簇は抑えられたが平滑筋細胞は増加した。他方PDGF受容体βのシグナル遮断では血管再構築部位の平滑筋細胞が減少する一方でマクロファージ系細胞数が増加した。以上より、血管再構築課程では骨髄細胞の動員と関与が顕著であること、さらにその細胞階層は自然発生粥状動脈硬化と異なり、マクロファージが平滑筋細胞に先行するのではなく、マクロファージと平滑筋細胞に分化運命をたどると考えられる少なくとも2種類の細胞系統が相互に干渉しながら進行することが示された。
シリルケテンの効率的合成法の開発とその有機合成への応用

ケテン(CH_2=C=0)は古くから有機合成に用いられている重要な反応剤であるが,室温では気体で強い刺激臭が有る上に毒性が強く,しかも容易に二量化する取り扱いにくい反応剤である。一方シリルケテン(R_3SiCH=C=0)は蒸留可能な液体で,二量化することもなく長期保存可能な安定かつ安全な化合物である。我々はこのシリルケテンの効率的合成法を検討すると同時に,複素環化合物の構築剤として応用すべく研究を行ってきた。効率的な合成法の開発については,種々検討したが,残念ながら未だ大量合成に向く方法を見出していない。しかし複素環化合物の合成への応用は,大いに発展し,ユーピラノン,イソクロメン,ユーピリドン類の新規合成法の開発に成功した。更にシリルケテンとニトロンおよびN-アリールイミノトロポンとの反応を検討した結果、オキシインドールの新規合成法ならびに,1-アザアズレン-2(IH)-オン誘導体の新規合成法を,それぞれ開発することに成功した。
Arabidopsisの分化過程および光反応性欠損変異の分離と解析

1.シロイヌナズナ(Arabidopsis)の種子をエチルメタンスルフォネートで処理し,その種子(M1)の次代(M2)の中から種々の突然変異体(1)花の発生,形態に異常を示すもの(2)葉や茎に形態の異常を示すもの(3)根の重力屈性反応に異常を示すもの(4)各種薬剤に耐性を持つものなどを分離した.このうち, (1)と(3)について,外部形態など表現型の解析と遺伝解析を行った.花の形態形成異常の変異体(約160株)の中には,花弁,がく,おしべ等の器官原基が欠失しているもの,原基の数が増減するもの,原器が成長して成熟した器官になる途中の段階で構造的異常が生じるもの等に加えて,本来がくになるべき原基がめしべに分化するなどのホメオティック変異を示すものが多数得られた.これらの変異体は,そのほとんどが, 1個の単純劣性突然変異を核ゲノム上に持っていることが明らかになった.また根の重力屈性反応異常を示す変異体10株は, 3グループに分別分類された.少なくとも3個の遺伝子が,根の重力屈性を支配していると考えられる.2.-λファージベクターを用いてシロイヌナズナのジェノミックライブラリーを製作し,ラットのカルモジュリン遺伝子をプローブとして,シロイヌナズナのカルモジュリン遺伝子をクローニングした.現在2個の異なる遺伝子を同定して塩基配列を決定している.3.Tiプラスミドベクターを用いてシロイヌナズナの葉片または茎の一部の細胞にトランスフォーメイションを行い,形質転換細胞を得る系を作っている.得られた形質転換細胞からトランスジェニック植物体を再生させることができる.この系を用いて,上に述べたシロイヌナズナの花の形態形成や根の重力屈性反応に異常を示す突然変異体から変異遺伝子を同定分離することを試みている.1.シロイヌナズナ(Arabidopsis)の種子をエチルメタンスルフォネートで処理し,その種子(M1)の次代(M2)の中から種々の突然変異体(1)花の発生,形態に異常を示すもの(2)葉や茎に形態の異常を示すもの(3)根の重力屈性反応に異常を示すもの(4)各種薬剤に耐性を持つものなどを分離した.このうち, (1)と(3)について,外部形態など表現型の解析と遺伝解析を行った.花の形態形成異常の変異体(約160株)の中には,花弁,がく,おしべ等の器官原基が欠失しているもの,原基の数が増減するもの,原器が成長して成熟した器官になる途中の段階で構造的異常が生じるもの等に加えて,本来がくになるべき原基がめしべに分化するなどのホメオティック変異を示すものが多数得られた.これらの変異体は,そのほとんどが, 1個の単純劣性突然変異を核ゲノム上に持っていることが明らかになった.また根の重力屈性反応異常を示す変異体10株は, 3グループに分別分類された.少なくとも3個の遺伝子が,根の重力屈性を支配していると考えられる.2.-λファージベクターを用いてシロイヌナズナのジェノミックライブラリーを製作し,ラットのカルモジュリン遺伝子をプローブとして,シロイヌナズナのカルモジュリン遺伝子をクローニングした.現在2個の異なる遺伝子を同定して塩基配列を決定している.3.Tiプラスミドベクターを用いてシロイヌナズナの葉片または茎の一部の細胞にトランスフォーメイションを行い,形質転換細胞を得る系を作っている.得られた形質転換細胞からトランスジェニック植物体を再生させることができる.この系を用いて,上に述べたシロイヌナズナの花の形態形成や根の重力屈性反応に異常を示す突然変異体から変異遺伝子を同定分離することを試みている.
分泌因子を介した１細胞間相互作用の定量的理解

個々の免疫細胞の分泌動態は、不均一かつ時間的に変動するものが多い。そこで本研究計画では、1細胞リアルタイム分泌計測を用いて、1細胞が分泌を介して相互作用し、細胞集団として機能する原理を定量的に解明する。そのために、11細胞の分泌シグナル入出力関係の定量的解析、2多細胞からの分泌の1細胞粒度同時計測、31細胞と多細胞の階層間を繋ぐ数理モデル構築の三つのアプローチを融合した手法を開発して用いる。具体的には、2型自然リンパ球(ILC2)を中心とする免疫システムを研究対象とする。
総合学科高校における環境リテラシーの育成を目指した実感型環境学習の実践的研究

本研究では、勤務校である総合学科高校の福祉科目の授業において、「環境倫理」の観点を導入し、環境リテラシーの育成を目指した環境学習プログラムの開発、試行、評価を行った。導入した「環境倫理」の観点は、欧米において広まりつつあるディープ・エコロジー思想をもとにしたものであり、「自然との一体化による自己実現への到達」、「生態系における生物多様性と共生の原理の実感」、「原則としての生命圏平等主義的な自然観の獲得」、「レクリエーションの手法の実感的理解」を目標とし、野外体験学習プログラムを開発し、平成22年11月に試行した。本プログラムは、ディープ・エコロジー思想を導入したワークをアレンジした「身近な植物との一体化体験」を中心とし、ネイチャーゲームと組み合わせて構成し、校庭の草地において、勤務校の「福祉と人間を学ぶ系列」の生徒3年生19名を対象に実施した。プログラム実施後の質問紙調査の結果、参加した84%の生徒が草地の植物との一体感を感じ、63%の生徒が一体化体験に心地よさを感じ、74%の生徒が一体化の対象とした植物に対してプログラム実施前より親しみを感じ、95%の生徒が本プログラムのように自然との一体感を感じる機会は大人になってからも日常生活の中で必要であると感じ、84%の生徒が、将来子どもと遊ぶときや高齢者との交流に本プログラムのような活動を生かせると感じていることが明らかになった。短時間のプログラムであり、実施高校の種々の条件に規定された事例的実践ではあるが、ディープ・エコロジー思想をもとにした「環境倫理」の観点を導入した環境学習プログラムの目的が一定程度達成された。
象徴天皇制の思想的基盤に関する研究-知識人を中心として-

本研究は、第一次世界大戦後から1950年代後半までを対象時期として設定し、象徴天皇制の思想的基盤の解明を試みようとしたものである。第一次世界大戦後の世界的君主制の危機を踏まえ、日本でも近代天皇制の再編に関する構想が提起された。昭和戦前期にももちろん断絶した部分もあるが、構想が継続し、敗戦後へと繋がった。それは、大衆化・現代化といった問題への対応だったと考える。2008年度は、象徴天皇制の思想的基盤について、戦前の問題を中心に史料収集と分析を進めた。以下が成果である。(1)大正デモクラシー期の代表的知識人である吉野作造の天皇制・国体に関する構想を考察した。これについては、論文の執筆を行い、学術雑誌に投稿中である。(2)大正デモクラシー期の様々な天皇制論の収集に努めた。特に、ジャーナリストの長谷川如是閑の皇太子教育論を発掘し、その論の前提となる彼の国家論についての再検討を試みた。その過程で収集した史料を元に、彼の「大学自治」論に関する論文を『京都大学大学文書館研究紀要』に執筆した。(3)戦時期から敗戦直後の天皇制に関する研究の分析を、国立公文書館蔵史料、外務省外交史料館蔵史料、『矢部貞治日記』や『高木惣吉日記と情報』、『木戸幸一日記』から進めた。これについては現在、論文の執筆を進めている。この他戦後についても、史料収集と論文執筆に取り組んだ。(4)戦後の退位論を、国立国会図書館憲政資料室蔵「プランゲ文庫」などから網羅的に収集した。来年度、この史料の詳細な分析と論文の執筆を予定している。(5)ミッチー・ブームについて、知識人の言説なども含め、その前提と反応を分析し、論文「象徴天皇制・天皇像の定着-ミッチー・ブームの前提と歴史的意義」として『同時代史研究』に公表した。2009年度は、象徴天皇制の思想的基盤について、戦後の問題を中心に史料収集と分析を進めた。以下が成果である。(1)大正デモクラシー期の「国体論」について検討を深めた。特に、東京市長であった永田秀次郎について中心に検討し、日本史研究会近現代史部会で報告した。(2)天皇制と帝国大学についての関係性について検討した。その成果は、『東京大学史史料室ニュース』に発表した。また関連書の書評を『京都大学大学文書館研究紀要』に発表した。(3)戦時期から敗戦直後の天皇制に関する研究の分析を、国立公文書館・外務省外交史料館蔵の史料、『矢部貞治日記』や『高木惣吉日記と情報』から進めた。これについては現在、学会報告および論文の執筆を進めている。(4)戦後天皇制に関しては、一般雑誌へ積極的に寄稿し、研究成果を発表した。また、著書『「象徴天皇」の戦後史』を刊行し、戦後天皇制に関する知識人・マスコミなどの思想について体系的にまとめる作業を行った。2010年度は、象徴天皇制の思想史的基盤について、研究をまとめるための史料収集と分析を進めた。以下が成果である。(1)第一次世界大戦後の1910年代から、大正デモクラシー・総力戦体制・敗戦、そして高度経済成長までの天皇制・天皇像の連続性/非連続性について検討し、日本史研究会大会近現代史部会で報告した(準備報告は3回)。また、それを論文化し、『日本史研究』に掲載した。この論文は本研究の集大成としての意義を持つ。大正デモクラシーの潮流を踏まえ、デモクラシーを主張する側からも、国体論を展開する側からも天皇制の再編が試みられたのである。昭和戦前期にももちろん断絶した部分はあるが、この構想が継続して展開された。戦争に国民一人一人が主体的に参画する総力戦体制下にあっては、天皇の下に国民それぞれは平等でなければならなかった。そのため、天皇との直接的な結びつきが強調されていく。そしてそれは、敗戦後の象徴天皇制へと繋がった部分もある。象徴天皇制は敗戦というインパクトによって形成された制度・構想であるが、それは、近現代を通しての大衆化・現代化といった問題への一貫した対応への結果だったと考える。(2)昨年度に引き続き、天皇制と帝国大学の関係性についての検討を行った。具体的には、京都大学文書館が所蔵している「皇室関係文書」を調査するとともに、当該期の新聞史料の収集を行った。この成果は、来年度以降に公表したい。(3)戦後天皇制に関しては、一般雑誌へ積極的な寄稿を行った。また、これに関する研究書の書評を執筆した(公表は来年度)。
咳嗽の発現機構と治療の研究:気道炎症におけるタキキニンの役割

今回の研究では、免疫反応でタキキニンが気管支組織から遊離されていることをより正確に証明するために、タキキニンの拮抗薬を使用し、生理学的に、また、薬理学的に、その収縮反応が抑制されることを確認した。また、ヒトの気管支組織では、カプサイシンによる気管支の収縮が、ニュートラルエンドペプチダーゼの阻害剤で亢進し、この反応はタキキニンの拮抗薬で抑制されることを認めた。これらの結果からヒトの気管支でもタキキニンが存在し、生理的な役割を担っていると考えられる。プロスタグランディンF_<2α>によるモルモットの気管支の収縮もニュートラルエンドペプチダーゼの阻害剤で亢進し、この反応はタキキニンの拮抗薬で抑制されることを認めた。よって、プロスタグランディンF_<2α>もタキキニンを遊離する作用があることを確認した。これらの反応は、神経の伝導を阻止するテトロドトキシンによって影響を受けないことより、種々の刺激にて遊離された化学伝達物質が神経伝導を介さずにタキキニンを神経末端から遊離していることを示唆する。また、食道の刺激により咳が誘発されることが知られているが、その原因として気道におけるタキキニンの遊離が関与している可能性がある。そこで、モルモットの気道を塩酸で刺激して気道での血管透過性を調べたところタキキニンの遊離されていることが示唆された。この一連の研究の目的は、「咳嗽の発症機構として、ヒト気管支の刺激によって遊離されたタキキニンが咳嗽の刺激になっているであろう」、という仮説を実証するためのものである。これまでの研究では、モルモットとヒトの気管支でタキキニンが遊離されていることを確認したことになる。以前の研究のデータと組み合わせると、炎症反応によって誘発される咳嗽もタキキニンを介していると予測される。現在、乾性咳嗽が長期に続いている患者の気管支組織の集積をしている。また、気道のサブスタンスPの染色を進めている。サブスタンスPの染色が不十分なので、他の物質、ニューロキニンA、あるいは、接着分子ICAM-1、VCAM-1を染色してその技術と抗体の再検討をしているところである。また、神経と肥満細胞の接点の検討を課題にしているが、肥満細胞の染色は成功している。今後、乾性咳嗽患者の喀痰の細胞分画、気道組織の細胞分画、接着分子、好酸球からの分泌される蛋白について検討していく予定である。現在、接着分子については染色に成功しているので、その技術を拡大していきたい。動物モデルの研究は、免疫反応による気道の炎症で、現在サブスタンス遊離の促進が引き起こされているか否か、の検討中である。現在、乾性咳嗽の患者の気道の組織票本の集積が順調に進行中である。気道のサブスタンスPの染色が、まだ、成功していないので抗体の再検討をしなくてはならない。しかし、接着分子については成功しているので、今後、接着分子、炎症細胞とサブスタンスPとの関連を発展させていきたい。肥満細胞の染色は成功した。動物モデルの研究は、免疫反応による気道の炎症で、現在サブスタンスP遊離の促進が引き起こされているか否か、の進行中である。

また、ヒトの気管支組織では、カプサイシンによる気管支の収縮が、ニュートラルエンドペプチダーゼの阻害剤で亢進し、この反応はタキキニンの拮抗薬で抑制されることを認めた。これらの結果からヒトの気管支でもタキキニンが存在し、生理的な役割を担っていると考えられる。プロスタグランディンF_<2α>によるモルモットの気管支の収縮もニュートラルエンドペプチダーゼの阻害剤で亢進し、この反応はタキキニンの拮抗薬で抑制されることを認めた。よって、プロスタグランディンF_<2α>もタキキニンを遊離する作用があることを確認した。これらの反応は、神経の伝導を阻止するテトロドトキシンによって影響を受けないことより、種々の刺激にて遊離された化学伝達物質が神経伝導を介さずにタキキニンを神経末端から遊離していることを示唆する。また、食道の刺激により咳が誘発されることが知られているが、その原因として気道におけるタキキニンの遊離が関与している可能性がある。そこで、モルモットの気道を塩酸で刺激して気道での血管透過性を調べたところタキキニンの遊離されていることが示唆された。この一連の研究の目的は、「咳嗽の発症機構として、ヒト気管支の刺激によって遊離されたタキキニンが咳嗽の刺激になっているであろう」という仮説を実証するためのものである。これまでの研究では、モルモットとヒトの気管支でタキキニンが遊離されていることを確認したことになる。以前の研究のデータと組み合わせると、炎症反応によって誘発される咳嗽もタキキニンを介していると予測される。
輸送基質による酵母アミノ酸輸送体の動的構造変化と自己分解シグナルの伝達

本研究では、細胞内アミノ酸濃度の恒常性を維持する機構の解明を目的とし、特に出芽酵母のトリプトファン輸送体Tat2に着目して研究を行った。Tat2は芳香族アミノ酸を基質とする高親和性の輸送体であり、高濃度(40 ug/mL)トリプトファンの存在下では不要となるため、合成後、細胞膜に到達する前に液胞で分解される。一方、低濃度(4 ug/mL)トリプトファンの存在下では効率良く細胞膜へと運ばれる。しかしながら、既に細胞膜上に存在するTat2が、培地のトリプトファン濃度に応じて分解が促進されるのか否かは不明だった。そこで今年度は、ガラクトース誘導性プロモーターの下流にTAT2を連結し、グルコース投与で転写抑制すると同時にトリプトファンを投与し、Tat2の分解を追跡した。このとき、Tat2に様々な変異を導入することで、基質誘導による分解に必要なアミノ酸残基を特定した。その結果、高濃度トリプトファン投与によってTat2は3060分で分解されることがわかった。100種以上の変異型Tat2の分解を調べたところ、D74R(細胞質末端変異)のように輸送活性はあるが分解遅延するもの、E286A(TMD6内の変異)のように輸送活性を欠き分解遅延するもの、そしてV326L(TMD7内の変異)のように輸送活性を欠き、低濃度トリプトファン条件下でも恒常的に分解促進されるものに分類された。興味深いことにD74R-V326L二重変異型Tat2では輸送活性が回復したことから、V326L変異による何らかの構造異常がTat2に生じ、ユビキチン分解の標的になったものと考えられる。一方、I285TやI285V変異によりTat2は超高活性型に転じ、1 ug/mL程度のトリプトファン存在下でも良好に増殖した。生化学的解析によって、これは変異によるKm値の低下とVmaxの増大による相乗効果であることがわかった。Tat2の100種類以上の変異型について分解パターンを全て調べ、輸送活性との関連性を示唆することができた。今後Tat2の構造転移と分解との関連を解明する前提となる十分な材料が得られたことから、研究は概ね順調に進展していると言える。各種変異型Tat2には何らかの構造異常が生じており、結果としてRsp5ユビキチンリガーゼの標的となったものと考えられる。しかしながら、遺伝学的解析ではこうした構造的実体を解明することはできない。そこで、細胞膜から可溶化したTat2を非変性ゲル電気泳動で分離し、野生型と比較する。予備的な実験から、野生型Tat2は単量体または二量体として細胞膜上で存在し、非変性ゲル電気泳動では2本のバンドとして検出されている。変異による構造異常が、非変性ゲルを用いたTat2の電気泳動パターンに違いをもたらすものと期待しこれを解析する。また、高濃度トリプトファンが細胞に投与されたとき、Rsp5アダプタータンパク質であるBul1が野生型Tat2を認識し、Rsp5依存的な分解を誘導する。そこで、低トリプトファン培地で恒常的に分解される変異型Tat2の分解も、やはりBul1に依存するのかどうかについて解析を行う。

各種変異型Tat2には何らかの構造異常が生じており、結果としてRsp5ユビキチンリガーゼの標的となったものと考えられる。しかしながら、遺伝学的解析ではこうした構造的実体を解明することはできない。そこで、細胞膜から可溶化したTat2を非変性ゲル電気泳動で分離し、野生型と比較する。予備的な実験から、野生型Tat2は単量体または二量体として細胞膜上で存在し、非変性ゲル電気泳動では2本のバンドとして検出されている。変異による構造異常が、非変性ゲルを用いたTat2の電気泳動パターンに違いをもたらすものと期待しこれを解析する。また、高濃度トリプトファンが細胞に投与されたとき、Rsp5アダプタータンパク質であるBul1が野生型Tat2を認識し、Rsp5依存的な分解を誘導する。そこで、低トリプトファン培地で恒常的に分解される変異型Tat2の分解も、やはりBul1に依存するのかどうかについて解析を行う。バイオシェーカーBR-42FLの購入を当初予定していたが、培養のスケールダウンをはかったため、今年度は現有するシェイカーでまかなうことができた。一方、次年度はDNAのシークエンスが多数見込まれることから、繰り越し予算によってこれをまかなう方針である。