hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クロストリジウム細菌生産毒素の分子認識機構の解明

Clostridium botulinumの生産する蛋白性神経毒素(以下、BTXとする)と各種糖脂質との相互作用を検証するために、本年度はまず、人工糖脂質リガンドの合成について検討した。次年度以降において、SPR、LSPR、もしくは、QCM等のセンシング法による相互作用解析を行うため、金表面に糖脂質リガンドを固定化できるよう、アンカーにジスルフィド結合を有するリポ酸を選択し、糖還元末端側スフィンゴシン部位にリポ酸を導入した人工糖脂質リガンドを設計した。天然ガングリオシドであるGT1b、GM1、GM3について、酵素SCDaseを作用させ、2本鎖セラミドのアミド結合について選択的加水分解を行い、アミノ基遊離のlysoGT1b、lysoGM1、lysoGM3を合成した。GT1a、GD1b、GD2についても、酵素によるセラミド部位の脱アミド化を検討したが、lyso体への転換率が低く、又、系内に加えた過剰の界面活性剤を除去するため、HPLC ODSカラムによる精製を試みたが、カラムへの吸着が著しく、目的のlyso体を得ることが困難であった。次に、lysoGT1b、lysoGM1について、DMF中、NHS活性化リポ酸と反応させ、ジスルフィド結合を有するアンカーを導入し、GT1b-TOAおよびGM1-TOAを得た(TOAはリポ酸を意味する)。又、天然グロボ糖脂質であるGb3-Cerを塩基性条件下で加水分解を行い、lysoGb3を合成した。続いてNHS活性化リポ酸と反応させ、Gb3-TOAへと変換した。lysoLac、lysoGlcについてもリポ酸を遊離アミノ基に導入し、対応するLac-TOA、Glc-TOAを合成した。現在のところ、GT1b-TOA、GM1-TOA、Gb3-TOA、Lac-TOA、Glc-TOAについて合成が完了した。lysoGM3のアンカー導入については検討中である。初年度の目標である認識素子であるGM3へのアンカー導入が遅れている。又、GT1a、GD1b、GD2の各ガングリオシドについて酵素反応による選択的加水分解とその精製が遅れており、人工糖脂質リガンドの合成法が確立していない。GT1a、GD1b、GD2の酵素による加水分解については、酵素添加量の増量、反応時間の延長、界面活性剤の最小化、ODSカラムの適切な選択について検討を行い、lyso体の高収率化を目指す。続いて、これらのlyso体および合成の完了したlysoGM3へのアンカー導入も早期に実現する。Lyso体リガンド合成に関する検討が遅れており、助成金を翌年度に持ち越した。次年度は、合成途中のlysoGM3へのジスルフィド基の導入、他のガングリオシドのlyso体への変換とアンカー導入を検討し、関連する実験に必要な試薬、精製のためのカラムや溶媒等の消耗品を購入する。
小児急性白血病のPCR法による微小残存病変の検討

当科にてフォロー中の急性リンパ性白血病(ALL)患者13人を対象とした。うち7症例にT細胞レセプター(TCR)δ遺伝子の再構成を認め,1症例にTCRδ(Jδ1)の欠失を認めた。1)寛解のどの時期に微小残存病変(MRD)が消失するか検討した。ほとんどの症例で寛解導入療法25か月でMRDが消失した。寛解導入療法後4か月以内にMRDが消失する症例はその後も寛解を維持して行く可能性が高く,MRDの消失しない症例,一旦検出感度以下になり再び検出される症例はMRDが検出されてから数か月後には骨髄再発する傾向が認められた。2)骨髄移植症例で臨床経過とMRDの検出の程度を比較した。ALLの再発例のMRDを,第1回目の骨髄再発時から骨髄移植後まで経時的に検索した。再寛解導入治療法でもMRDは持続的に陽性で骨髄移植時は顕微鏡的に寛解であったがMRDはやはり陽性であった。強力な前処置を行い骨髄移植を施行した。移植後4か月間はMRD陰性であったが5か月目に陽性となり,その後約1か月後に骨髄再発した。骨髄移植においては,移植前のMRDが陰性であることが非常に重要であると考られた。以上のようにTCRδ鎖遺伝子の再構成を利用したMRDの検討は急性白血病症例の寛解の深度を知るうえで非常に有用であり,患者の予後,治療効果の判定,移植時期の決定,適切な前処置の選択等幅広い領域で役立つものと考える。
転写因子IRF8による細胞分化マスター制御因子活性バランスの調節

血球系特異的転写因子Interferon Regulatory Factor 8(IRF8)は、ミエロイド系前駆細胞からマクロファージへの分化を促進する一方、好中球への分化増殖は抑制する。また、IRF8欠損マウスが慢性骨髄性白血病(CML)様の病態を呈し、多くのヒト骨髄性白血病においてIRF8の発現が失われていることから、IRF8はヒト白血病において重要ながん抑制因子である事が示唆されている。当研究は、IRF8の機能解析を通して自然免疫細胞の分化機構、ひいては細胞分化の基本原理を理解し、ヒト白血病に対し新しい病態理解と治療法を確立するための基盤を築くことを目指している。本年度は、IRF8と顆粒球系のマスター転写制御因子C/EBPαが結合する事を生細胞においてBiFC法(Bifluorescence Complementation Assay)のみならずFRET法(Fluorescence Resonance Energy Transfer)でも確認することができた。また前年度見出した新しい細胞分化制御転写因子であるが、これはIRF4であり、IRF8とIRF4という二つの血球系IRFがミエロイド系細胞分化において似通った活性を持つ事を、in vitro分化系のみならず、IRF8, 4ダブル欠損マウスの作製によって証明することができた。CML患者ではIRF4の発現も低下している事が報告されており、この結果はCML病態や治療を考える上でも興味深い。今後、本挑戦的萌芽研究で得た結果をさらに発展させ、ミエロイド細胞における転写因子複合体の精製等によってより包括的な理解に繋げて行きたい。血球系特異的転写因子Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8)はミエロイド系前駆細胞のマクロファージへの分化を促進する一方、顆粒球への分化を抑制する。IRF8欠損マウスが慢性骨髄性白血病(CML)様の病態を呈し、多くのヒト骨髄性白血病においてIRF8の発現が失われていることから、IRF8はヒト白血病において重要ながん抑制因子である事が示唆されている。平成19年度においては、IRF8と顆粒球系のマスター転写制御因子C/EBPαが結合する事を、一過性強制発現の系で明らかにすることができた。さらに正常マウス骨髄細胞を用いて内因性のIRF8とC/EBPαの結合を検出することを試みているが、おそらく両因子が発現するのが特定の分化段階のみであるためかまだ成功しておらず引き続き条件を検討している。なお、マイクロアレイ解析によってIRF8の標的遺伝子の検索を行ったところ、IRF5が著しく強く誘導されるという予想外の結果を得た。これを受けてIRF8によるミエロイド系細胞の分化やToll様受容体シグナルの調節が、IRF5を介して行われているのではないかと考え解析を進めたが、IRF5単独の遺伝子導入ではIRF8欠損細胞の異常を是正できなかったため、その可能性は否定的と結論した。これと関連して、IRF5欠損マウスにおけるFasによるアポトーシス感受性を調べたところ、肝臓におけるFas誘導性アポトーシスがIRF5依存性である事、さらにはTLR9シグナルによる樹状細胞のFas感受性獲得にもIRF5が必須であるという新知見を得、これを論文発表している(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.,105:2556-2561,2008)。以上のように、研究はおおむね順調に進み、さらに予期しなかった展開も見せ、その成果を発表するに至っている。血球系特異的転写因子Interferon Regulatory Factor 8(IRF8)はミエロイド系前駆細胞のマクロファージへの分化を促進する一方、顆粒球への分化を抑制する。当研究は、IRF8の機能解析を通して自然免疫細胞の分化機構、ひいては細胞分化の基本原理を理解し、ヒト白血病に対し新しい病能理解と治療法を確立するための基盤を築くことを目指している。これまでに、IRF8と顆粒球系のマスター転写制御因子C/EBPαが結合する事を一過性強制発現の系で明らかにすることができ、現在正常マウス骨髄細胞を用いて内因性のIRF8とC/EBPαの結合を検出することを試みている。なお、本年度はin vitro分化系での遺伝子導入実験によって、IRF8の他にもミエロイド系前駆細胞の分化制御を行う因子を同定する事ができた。その因子をミエロイド系前駆細胞に発現させると、IRF8の発現がなくてもマクロファージへの分化を促進した。一方、顆粒球系への分化は著明に制御した。現在、この因子とIRF8の重複した活性ならびに特異的な活性の理解と、生体レベルでの両因子の役割の解明を目指して解析を続けてている。以上のように、研究はおおむね順調に進み、さらに予期しなかった展開を見せている。

また、IRF8欠損マウスが慢性骨髄性白血病(CML)様の病態を呈し、多くのヒト骨髄性白血病においてIRF8の発現が失われていることから、IRF8はヒト白血病において重要ながん抑制因子である事が示唆されている。当研究は、IRF8の機能解析を通して自然免疫細胞の分化機構、ひいては細胞分化の基本原理を理解し、ヒト白血病に対し新しい病態理解と治療法を確立するための基盤を築くことを目指している。本年度は、IRF8と顆粒球系のマスター転写制御因子C/EBPαが結合する事を生細胞においてBiFC法(Bifluorescence Complementation Assay)のみならずFRET法(Fluorescence Resonance Energy Transfer)でも確認することができた。また前年度見出した新しい細胞分化制御転写因子であるが、これはIRF4であり、IRF8とIRF4という二つの血球系IRFがミエロイド系細胞分化において似通った活性を持つ事を、in vitro分化系のみならず、IRF8, 4ダブル欠損マウスの作製によって証明することができた。CML患者ではIRF4の発現も低下している事が報告されており、この結果はCML病態や治療を考える上でも興味深い。今後、本挑戦的萌芽研究で得た結果をさらに発展させ、ミエロイド細胞における転写因子複合体の精製等によってより包括的な理解に繋げて行きたい。
マメ科植物ＤＤＭＰサポニンの生合成とその生理機能の解明

ダイズには栄養価の高い“良質のタンパク質"が含まれているばかりでなく、大豆サポニン、イソフラボン、レシチンなど多数の機能性物質が含まれている。大豆サポニンには、抗がん作用などの健康機能性を有するDDMPサポニンと不快味の原因物質であるグループAサポニンが存在する。このうちグループAサポニンを欠失した変異体が野生ダイズ(ツルマメ)から見出されており、グループAサポニンは必ずしもダイズの生存に必須ではないと考えられる。一方、DDMPサポニンはダイズ以外の植物にも広く分布し、このサポニンを欠失したダイズ遺伝資源はこれまで見つかっていない。そこで、本研究では、共発現解析、相同性検索やダイズ変異体ライブラリーなどを駆使してDDMPサポニン合成酵素遺伝子の単離・同定に取り組む。そして、DDMPサポニン、さらにはダイズサポニンの植物生理機能を明らかにする。当該当年度は、タルウマゴヤシやダイズの共発現データーベースから、既知のサポニン合成遺伝子と共発現している遺伝子を複数見出した。これらの遺伝子の変異体を高解像度融解曲線分析(HRM)法により変異体ライブラリーから探索し、得られた変異体の種子のサポニン組成を調べた結果、遺伝子Xに変異を有するダイズ種子はDDMPサポニンを欠失していることがわかった。また、薄層クロマトグラフィー(TLC)解析で得られたDDMPサポニン欠失変異体について、遺伝子Xの塩基配列を解析したところ、遺伝子Xに変異を有する系統が複数あることがわかった。野生型とDDMPサポニン欠失変異体では、生育に明白な差異は認められなかったことから、DDMPサポニンは生存に必須ではないことが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。1)ダイズの誘発突然変異体集団にサポニン組成、特に2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one(DDMP)サポニンの有無に関わる変異体を薄層クロマトグラフィ(TLC)により探索した。変異体集団のうち、十分に種子がある約900系統について各系統8粒のサポニン組成をTLCにより解析した。その結果、DDMPサポニンを欠失した複数の変異体を見出した。マメ科植物に広く分布するDDMPサポニンの鍵酵素であるDDMPを付加する酵素はこれまで同定されていないことから、これらDDMPサポニン欠失系統はDDMP付加酵素の単離の強力な研究素材となる。2)同時に、C-3位の第2糖やC-22位の第1糖を欠失した変異体を見出した。また、全サポニンを欠失した変異体も複数見出した。DDMPサポニンに加え、C-3位の第2糖やC-22位の第1糖を欠失した変異体など、これまで野生ダイズを含むダイズ遺伝資源からは見出されていない、新たな変異を発見した。これらの変異体はマメ科植物に分布するDDMPサポニンの生合成経路を解析し、植物生理機能を明らかにする上で重要な素材となる。課題担当者らが作出したダイズ変異体集団は様々な遺伝子の機能変異を包含した研究素材であることが明らかとなった。サポニンの合成経路解明に留まらず、遺伝子の機能解析や育種素材として活用できる。1)昨年度見出した大豆サポニン組成変異系統(DDMPサポニン、C-3位の第2糖やC-22位の第1糖などを欠失した変異系統)を圃場で栽培し、後代種子でのサポニン組成を調査した。これらサポニン組成変異は後代に遺伝し、多くの組成変異系統において組成変異が固定した個体を得ることができた。しかし、いくつかの系統では固定系統を得ることができなかった。2)特定のサポニンを欠失した変異体において生育異常が確認された。その理由として、1特定のサポニンの有無が生存に関与、2変異遺伝子がサポニン合成以外にも関与、3サポニン組成に関わる変異の近傍に生じた遺伝子変異の影響、などが考えられる。3)C-22位の第2糖を欠失した系統を7系統見出した。このうち、6系統にはすでに同定したC-22位の第2糖配糖化酵素遺伝子に何らかの変異が確認された。また、全サポニンを欠失した変異系統のいくつかには、大豆サポニン生合成の鍵酵素であるβ-アミリン合成酵素の遺伝子に変異が見出された。4)原因遺伝子の単離のために、見出した変異系統がホモ型である場合は、野生型品種(エンレイ)を交配してF1種子を得た。見出した変異系統が組成変異を分離する(ヘテロ型)である場合は、複数の種子を栽培し、分離集団を養成した。サポニン組成から原因変異遺伝子を予測し、その遺伝子にナンセンス変異やミスセンス変異を確認した。本研究で見出したサポニン組成変異体から、まだ見つかっていないDDMPサポニン合成酵素などを同定できる可能性は高い。一方、特定のサポニンを欠失した変異体において生育異常が確認された。サポニン生合成経路の全貌を明らかにすることにより、サポニンの生理機能に新たな知見を加えることができるものと期待できる。

このうちグループAサポニンを欠失した変異体が野生ダイズ(ツルマメ)から見出されており、グループAサポニンは必ずしもダイズの生存に必須ではないと考えられる。一方、DDMPサポニンはダイズ以外の植物にも広く分布し、このサポニンを欠失したダイズ遺伝資源はこれまで見つかっていない。そこで、本研究では、共発現解析、相同性検索やダイズ変異体ライブラリーなどを駆使してDDMPサポニン合成酵素遺伝子の単離・同定に取り組む。そして、DDMPサポニン、さらにはダイズサポニンの植物生理機能を明らかにする。当該当年度は、タルウマゴヤシやダイズの共発現データーベースから、既知のサポニン合成遺伝子と共発現している遺伝子を複数見出した。これらの遺伝子の変異体を高解像度融解曲線分析(HRM)法により変異体ライブラリーから探索し、得られた変異体の種子のサポニン組成を調べた結果、遺伝子Xに変異を有するダイズ種子はDDMPサポニンを欠失していることがわかった。また、薄層クロマトグラフィー(TLC)解析で得られたDDMPサポニン欠失変異体について、遺伝子Xの塩基配列を解析したところ、遺伝子Xに変異を有する系統が複数あることがわかった。野生型とDDMPサポニン欠失変異体では、生育に明白な差異は認められなかったことから、DDMPサポニンは生存に必須ではないことが明らかになった。1)DDMPサポニン、C-3位の第2糖やC-22位の第1糖を欠失した変異体を栽培し、後代でのサポニン組成変異の安定性を確認する。2)これまでに同定されているサポニン生合成酵素遺伝子の情報に基づいて原因候補遺伝子を抽出し、変異体にそれら候補遺伝子の塩基配列を解析するとともに、野生型品種と交配して遺伝解析用の分離集団を養成する、3)遺伝解析用の分離集団を用いて、次世代シーケンサーを用いたgenotyping-by-sequenicing(GBS)方によりDNA多型情報を取得し、サポニン組成との関係から原因遺伝子の同定を進める。4)DDMPサポニン欠失変異体を含むサポニン組成変異体について、発芽や発育など表現型を調査する。1)分離集団を用いて、サポニン組成と生育異常との関係を明らかにする。2)遺伝解析用の分離集団を用いて、Bulked segregant法によってサポニン組成と関与するDNA多型情報を取得し、原因遺伝子の同定を進める。3)本研究に用いたダイズ組成変異体集団は、様々な遺伝子の機能変異を包含した有用性の高い研究素材であることを論文にまとめて公表する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞内アスパルティックプロテアーゼカテプシンEの細胞内移行過程と分子型の変化

カテプシンEの細胞内輸送機構を明らかにするため、ラット腹腔マクロファージを用いたパルスチェイス実験を行い以下の成果を得た。1.非還元条件下のフルオログラフィーでカテプシンEは、46kDaのプロ型酵素として生合成された後、チェイス2時間までの間に低分子量にバンドがシフトした。また、、2量体より単量体の量が多いことが示唆された。この結果は単量体のプロ型酵素から成熟型酵素へのプロセシングが生じていると考えられ、マウスフレンド細胞、ラット胸腺細胞において2量体のプロ型のままで存在していたことと異なっていた。2.カテプシンEの糖鎖についてEndoH処理により糖鎖が切断されるか否かを観察したところ、パルスラベル後、24時間までEndoH感受性の高マンオース型であることが明らかとなった。この結果はリソゾーム酵素であるカテプシンDと同様であり、また、マウスフレンド細胞やラット胸腺細胞で、高マンノース型糖鎖から、複合型糖鎖へと修飾されることとは異なっており、カテプシンEにおいても糖鎖修飾の違いが細胞内輸送シグナルとして働いている可能性が強く示唆された。3.以上の結果からラット腹腔マクロファージのカテプシンEはリソゾーム酵素であるカテプシンDと類似した生合成後の修飾を受けており、リソゾームへと輸送されている可能性が示されたので、このことを確認するために、液胞型H^+ATPase阻害剤であるbafilomycinA_1共存下でパルスチェイス実験を行った。この処理によってリソゾーム内のpHは上昇することが知られており、チェイス6時間後には殆どのカテプシンDはプロ型のまま細胞外へと分泌されるが、カテプシンEはカテプシンDと同様に殆どが細胞外に分泌されるものの、その一部は成熟型酵素と同じ位置にバンドが観察された。これら2種のプロテアーゼは酸性条件下において、自己触媒的に成熟型酵素へのプロセシングが生じることが知られているので、一部のカテプシンEは液胞型H^+ATPaseの作用によらない酸性化コンパートメント内でプロセシングが生じたと考えられる。すなわち、カテプシンEの輸送シグナルは、マクロファージにおいてもカテプシンDのような高マンノース型糖鎖の付加されたマンノース6リン酸がすべてではないことが示唆された。
スタック型微生物燃料電池による省・創エネルギー排水処理技術の開発

有機性排水の効率的な処理・電気エネルギー回収技術の確立のため、2台の一槽型MFCを直列に接続したスタック型微生物燃料電池(StMFCs)の開発を行った。StMFCsの性能評価は糖系排水(0.5 gCOD/L)の連続処理試験で行った。MFCの直列接続により各槽での有機物濃度・組成が安定し、良好なCOD除去性能(79%)や発電性能(0.55 W/m3-各MFC)をHRT13時間で得た。また各アノード槽で発電微生物(Geobacter属細菌, Rhodobacter属細菌)の優占化を確認した。電気回路の直列接続では装置全体での観測電圧値の上昇が、並列接続では装置全体での観測電流値の増加が観察された。本年度は、2台の一槽型MFCを直列に接続する事で多槽化構造を形成した装置を用いて実排水(糖系排水:500 mgCOD/L)の連続処理試験を行い、MFCの多槽化が排水処理性能に及ぼす影響を評価した。2台のMFCの直列接続により、各槽における有機物濃度や組成が安定化し、その結果、良好な排水処理性能(COD除去率79%)や発電性能(各MFCの出力密度0.53-0.55 W/m3)が得られた。また、運転有機物負荷が高くなると発電よりもメタン発酵によるエネルギー損失が大きくなる事が明らかとなり、容積負荷1.0 kgCOD/m3/day以下での運転が望ましい事が明らかになった。電気回路の直列接続(スタック化)では装置全体での観測電圧値の上昇が、並列接続では装置全体での観測電流値の増加が観察された。各電気回路接続による微生物菌相への影響評価を目的として真正細菌の16S rRNA遺伝子を対象としたPCR-DGGE法による解析を行った。その結果、いずれの電気回路条件においても電極上にはGeobacter属(発電微生物)が高い割合で存在していた。即ち、電気回路的な条件での微生物菌相への影響はほとんど無く、安定した微生物菌相を維持出来る事が分かった。本研究では微生物燃料電池の容積負荷の設定は処理性能だけでなく、その発電性能へも大きな影響を与える事を明らかとした。特に低容積負荷時では後段のMFCは容積負荷不足による発電性能の低下が観察された。また、高容積負荷の場合にはメタン生成によるエネルギー損失も大きくなったため、最適な容積負荷での運転が必要であった。電気回路の接続方法では直列接続、並列接続共に処理性能や微生物菌相への影響は無かったが、回路内電圧値の上昇を見込めた直列接続が特に有効であるといえた。有機性廃水から電気としてエネルギーを回収できる微生物燃料電池の廃水処理に関する技術開発を目的として、実排水組成による微生物燃料電池の連続排水処理特性評価を行った。試験は、それぞれ処理槽の液有効容積120 mlを持つ一槽型微生物燃料電池を2台使用した。2台の装置共にアノード電極にはカーボンフェルト、カソード電極にはエアカソードを使用した。排水には廃糖蜜を使用し、電気伝導度確保等を目的としてリン酸緩衝液等を含む培地に所定濃度(500 mgCOD/L)になるように希釈して供試した。処理は、前段の微生物燃料電池の処理水が後段微生物燃料電池に流入するプラグフロー型で行った。結果として、HRT各13時間(全HRT 26時間)の条件下で、全体での平均COD除去率79.8%、クーロン効率11.6%、出力密度は、前段MFCで0.55 W/m3、後段MFCでは0.53W/m3を発揮する事が可能であった。また、上記の装置でHRT一定(全体で24時間)のもと有機物濃度変化によって容積負荷を変更し、その影響を評価した。低容積負荷では有機物濃度不足によって生じる装置の出力密度の低下が顕著であった。一方で高容積負荷時では、メタン生成による電子の損失の影響が大きくなることを明らかとし、微生物燃料電池における最適な容積負荷条件設定に関する知見を収集した。平成24年度は、スタック型の微生物燃料電池装置を作成し、排水処理試験においてその出力特性、排水処理特性の把握を行う事を主な目的としているが、装置の作製(2槽型、直列処理)とその性能評価が順調に実施できており、当初の計画通り研究が進行している。また排水の装置への流入方式の検討については、容積負荷の違いが処理性能に与える影響評価として、別の実験方法を用いて評価を行った。また、電極に付着した微生物の群集構造についても、解析を実施している。以上の事から、おおむね研究は順調に進行していると判断する。平成25年度は、前年度に得られた知見を元に装置の改良を施すと共に実排水への適用を行い、装置の構成や運転条件の最適化を図る。

具体的には、実排水処理(低中有機物濃度の食品加工産業排水を想定)へのStMFCの適用を行い、発電性能、処理性能等の評価により開発微生物燃料電池システムの有効性を評価する。また、前年度に得られた有機物分解特性等をもとに微生物燃料電池装置の改良を行い、排水処理能力及び発電性能の向上をはかる。研究費の内訳として、水質分析や微生物群集構造の解析に必要な試薬の購入(消耗品)、水質分析に関わるアシスタントスタッフ雇用経費、成果発表旅費などを計画している。
環境環境指標の利用モデルの構築および実用化に関する研究

今年度は計画のうち最も中心のテーマであった環境管理手法と環境マネジメントコントロールシステムの補完関係についての研究に進捗があった。データ分析のためのモデルの選択について共同研究者と合意が取れ,論文の投稿準備を進めている段階にある。本研究ではMaterial Flow Cost Accounting (MFCA)などの資源生産性のための環境管理会計がaction controls, resutls controls, cultural controls, personnel controlsなどによって構成されるEnvironmental Managenemnt Control Systems (EMCS)との間にどのような補完関係があるのかということ,およびMFCAの利用が企業の環境パフォーマンスに与える影響について分析を行っている。これにより資源生産性のための環境管理会計にはマテリアルフローベースの利用とエンドオブパイプでの利用の2つの側面があること,またMFCAなどのマテリアルフローベースの環境管理会計の手法が,廃棄物管理にフォーカスしたエンドオブパイプの環境管理会計よりもEMCSとの間の補完関係が低く,より独立して利用されていることが明らかになった。また環境パフォーマンスの影響についてエンドオブパイプでの環境管理会計の利用の方がより効果があることも明らかになっている。これらに加え,本年度はサステナビリティ報告書における経営者メッセージの分析を行うためのテキストデータのデータベースの構築を行った。4カ年で,第一に,複数の環境管理手法が組織でどのように共存し,どのように経営活動との間に関係性を構築しているのか,第二に外部と内部での環境アカウンタビリティの連続性,整合性の側面がどのように調整されているのか分析を行う。マテリアルフローコスト会計(MFCA)などこれまで様々な環境管理会計の手法が開発されてきたが,単一の計算技術だけでは環境経営の課題を克服できないため,システム間の補完関係,アカウンタビリティの連続性に着目することが必要となる。経験的な研究と同時に,第三にバランスト・スコアカード(BSC)を環境マネジメントの利用のために拡張するために「環境の視点」が他の経営管理指標とどのようにむすびつくのか,因果モデルの構築を試みる。このうち第一の環境管理手法の組織での共存関係については分析が完了し,論文投稿の準備を進める段階にある。また第二の環境アカウンタビリティの連続性,整合性の問題については分析のためのテキストデータをサステナビリティ報告書をもとに収集し,データベースの整備が進んでいる。2019年度は研究計画のうち,環境管理手法の共存関係の課題について論文投稿を行う予定である。そのうえで環境アカウンタビリティの一貫性,整合性についての分析について,2019年度の前半のうちに日経225に登録されている企業のサステナビリティ報告書を対象に経営者メッセージのテキストデータの分析を行い,研究を進める予定をしている。そのうえで環境情報の意思決定への利用については実験アプローチによる分析を進める予定である。サステナビリティ報告書における経営者メッセージのテキストデータに関するデータベースの作成のために,年度をまたいで調査のアシスタントを雇用している。未使用分については2019年度に作業を実施する。
ゲノム・プロテオーム解析を用いた頭頸部癌EGFR過剰発現関連分子の同定

従来、他癌腫で指摘されていたEGFR阻害剤の効果に影響するであろう遺伝子変化から38種類のCommon Mutationを頭頸部癌細胞株35種類の中から同定できた。特にEGFRパスウエイの下流のうち、癌細胞の増殖、浸潤に大きく関与するPI3KCA-AKTパスウエイでの遺伝子変化をいくつかの細胞株で同定できた。当研究では現在サンプル回収を中心に行っている。該当サンプルを用いた検討では、DNA, mRNAおよびタンパク質のサンプル回収にはホルマリン固定後より、その品質において新鮮凍結標本が優れていることが確認された。新鮮凍結切片から組織を取り出す際、当研究ではLasermicrodissection技術の確立によりその切除範囲をさらに細かく設定することが可能となった。一例として単純に癌組織のみを切り出すのではなく、癌組織をさらに分化度によって細分化したもの、Stromal cell,重層扁平上皮基底部など同一サンプルから多種類の組織を採取、さらにここからDNA, RNA,タンパク質がそれぞれ不足なく抽出できることがわかった。Mutationに関してはいまだ今回の目的分子であるEGFRのvIII型の変異をもつものを細胞株以外では確認できていない。しかし組織採取の細分化によって同一症例サンプルにおける治療効果のheterogeneityのメカニズムをDNA, RNA,タンパク質の3つの面から効果に呼応する分子レベルの変化を網羅的に検討することで頭頸部扁平上皮癌の治療効果予測だけでなく、副作用の予測、さらには当該分子を標的とする分子標的治療のターゲット同定までが期待できる。同一症例から多数の部位を分離して採取しているため、多数のサンプルの回収にはさらに時間がかかる見通しとなったが、統計学的に有意な検討を行うためには50症例以上の検討が必要と考えられる。今後はさらに症例数を増加させ、Bioinfomatics分野からの助言を受けながら、多数の症例間で共通する標的分子を同定したい。頭頸部癌組織のMutationを解析したが、今回の目的分子であるEGFRのvIII型の変異をもつものは実際の検体では皆無であった。しかし、EGFRの機能に大きく影響を与えるであろういくつかのmutationを見つけることができた。これらの変異は肺癌や乳癌の研究においてすでに同定されたmutationの種類と相同性があり、タンパク質の構造学的にも影響があることがここ数年の論文に示されている。単純に変異の有無ではなく、その変異の位置によってその下流のシグナル伝達には大きな違いがあることが確認された。また同一症例サンプルにおいても野生型と変異型が混在しているという知見も得ることができた。すでに臨床応用されているEGFR阻害剤を用いて、EGFRの変異型に応じた効果の違いを引き続き検討していく予定である。実際にはいくつかの頭頚部癌細胞株を用いて人為的にいくつかの種類のEGFR変異株を作成して、分子生物学的アプローチにてその効果のメカニズムの解明にあたりたい。またEGFRの下流にあるPI3KCA、k-rasの変異についても検討を始めている。さらにはこれらの阻害剤の治療効果のheterogeneityのメカニズムをDNA,RNA,タンパク質の3つの面から効果に呼応する分子レベルの変化を網羅的に検討することで、頭頸部扁平上皮癌の治療効果予測だけでなく、副作用の予測、さらには当該分子を標的とする分子標的治療のターゲット同定までが期待できる。Bioinfomatics分野からの助言を受けながら、多数の症例間で共通する標的分子を同定したい。本研究の最初の課題である頭頸部癌での遺伝子変化を引き続き頭頸部癌細胞株を用いて解析した。前回の報告通り、今回の目的分子であるEGFRのvIII型の変異をもつものは実際の検体では皆無であった。しかし、EGFRの機能に大きく影響を与えるであろうEGFRパスウエイの分子のシグナル伝達活性化に関与するいくつかのmutationを頭頸部癌細胞株で見つけることができた。従来、他癌腫で指摘されていたEGFR阻害剤の効果に影響するであろう遺伝子変化から38種類のCommon Mutationを頭頸部癌細胞株35種類の中から同定することができた。さらにPI3KCAの変異については、そのタンパク構造の変化に対するも検討を行っている。実際にmutationによりPI3KCAのポケット状構造にあたる部位にアミノ酸変化をおこした口腔癌由来の細胞株ではリガンドの有無によらずに、その下流の活性化が起こることを突き止めている。今後は、これらの変異を認めた頭頸部癌細胞株を用いて、リガンドや阻害剤の有無による下流の活性化の変化を追うことで、その効果のメカニズムの解明にあたりたい。この遺伝子変化はこれまでに非肺小細胞癌でその近位に遺伝子変化があることが分子標的治療の効果に違いが生まれることが報告されており、頭頸部癌でも同様の機構があることが予測される。これによりこの遺伝子変異によって起こるであろう頭頸部扁平上皮癌の治療効果の変化だけでなく副作用の予測マーカーとしても可能性があり、さらには当該分子を標的とする分子標的治療も開発段階である。従来の抗癌剤との併用や放射線治療との併用によるより一層の頭頸部癌治療の予後改善へのブレイクスルーとなることを期待したい。
天然由来の温度感受性ＴＲＰ受容体アゴニストとアンタゴニスト

メントール受容体TRPM8に対する新規のアンタゴニストとして、Voacanga africanaのvoacangineを見い出し、論文として発表した。Voacangineは初めての化学アゴニスト選択的TRPM8アンタゴニストであり、副作用のないTRPM8遮断薬のシード化合物になることが期待される。さらに構造-活性相関研究を行い、化学アゴニスト選択的TRPM8阻害に決定的に重要な構造を明らかにし、論文として発表した。本ワサビ・西洋ワサビ・カラシ類に含まれるisothiocyanete化合物20種を用いた構造-活性相関研究を行い、構造とTRPA1・TRPV1活性の関係について調べた。本研究により、本ワサビの緑の香り・カブ様の香り成分(ω-alkenyl isothiocyanetes・ω-methylthioalkyl isothiocyanetes)は、低辛味でありながら、allyl isothiocyaneteと同等のTRPA1・TRPV1活性を持つことが明らかとなった。TRPA1・TRPV1活性を持つ食品成分は、エネルギー代謝を高めるため、抗肥満効果がある。これまで報告されてきたTRPA1・TRPV1アゴニストは強辛味のものが多いが、低辛味のアゴニストは強辛味のものに比べて摂取し易いと考えられる。本研究結果は、低辛味のTRPA1・TRPV1アゴニストの開発に貢献することが期待される。本結果を論文にまとめて提出し、現在査読を受けている。また研究予定にはなかった、婦人科がん(卵巣・乳・子宮がん)患者の生存期間とTRPチャネルの発現量に関する解析及び、カプサイシン受容体TRPV1の発現量・TRPV1アゴニストが卵巣がんの増殖に与える影響の解析を、米国ミシガン州立大学にて行った。予定にはなかった米国での研究も実施でき、期待以上に研究を進展させることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1TRPA1・TRPV1アゴニストの探索:平成23年度までの研究で、ドリアン中のスルフィド(diethyl disulfide, diethyl trisulfide)にTRPA1・TRPV1活性のあることを見出した。本年度は、上記に示したsulfide以外で、ドリアンに含まれるsulfide化合物6種についてTRPA1-TRPV1活性を測定すると共に、簡易な構造・活性相関研究を行った。またドリアンsulfideのTRPA1・TRPV1以外のTRP (V2, V3, M8)に対する活性・阻害活性を測定し、TRPに対する選択性を調べた。その結果、ドリアンsulfideはTRPV2, V3, M8には作用せず、TRPA1・TRPV1に対してのみアゴニストとして作用することがわかった。2TRPV1アンタゴニストの探索、阻様様式と阻害する刺激の選択性(阻害特性)の解析:カプサイシン受容体TRPV1は、カプサイシン・熱・酸刺激により活性化する受容体である。平成23年度までに、Voacanga africana由来アルカロイドVoacangineがTRPV1において、カプサイシンを競合阻害することを明らかにした。本年度はVbacangineのTRPV1における熱・酸阻害作用を調べた。そのためにまず、TRPVl発現細胞と蛍光プレートリーダーFlex stationを用いて、熱・酸によるTRPV1活性評価系を確立した。確立した測定系を用いてVoacangineの熱・酸に対する阻害作用を調べたところ、Voacangineは熱による活性化のみ阻害し、酸による応答を抑制しないことがわかった。これらの結果からVbacangineは、TRPV1においてカプサイシンと熱を選択的に阻害する特性をもつことが明らかになった。3TRPV2・TRPV3発現細胞株の樹立と活性測定系の確立:TRPV2・TRPV3に対する新規のアゴニスト・アンタゴニストを探索するために、TRPV2・TRPV3受容体発現細胞を用いた活性評価系を確立した。TRPV2については、一過的発現細胞を、TRPV3にっいては安定発現細胞を用い、最適なポジティブコントロール(アゴニスト・アンタゴニスト)と培養条件を決定した。1TRP受容体に対するアゴニストの探索:ワサビ中の辛味成分Allyl isothiocyanateと、その類縁isothiocyanate化合物18種についてTRPA1・TRPV1活性を測定し、構造-活性相関研究を行った。Allyl isothiocyanateは強い辛味を呈するが、低辛味でありながらAllyli sothiocyanateよりも高いTRPA1・TRPV1活性を示すisothiocyanate化合物を、2成分見出した。2TRP受容体に対するアンタゴニストの探索:平成24年度までの研究で、Voacanga africana由来アルカロイドVoacangaが、TRPV1のアンタゴニストであることを明らかにした。本年度は、VoacangineのTRPV1以外のTRP受容体に対する作用を調べた。その結果、VoacangineはTRPM8においてアンタゴニスト、TRPA1においてアゴニストとして作用することが判明した。TRPM8阻害作用について詳細な解析を行い、VoacangineはTRPM8においてmentholを競合的に阻害すること、icihnを非競合的に阻害することを明らかにした。また阻害する刺激の選択性を調べた結果、TRPM8において低温による活性化を阻害せず、化学アゴニストを選択的に阻害することが判明した。3human TRPM8・TRPV4

発現細胞株の樹立と活性測定系の確立: human TRPM8・TRPV4に対する新規のアゴニスト・アンタゴニストを探索するために、TRPM8・TRPV4発現細胞を用いた活性評価系の確立を行った。TRPM8・TRPV4のそれぞれの安定発現細胞を取得し、ポジティブコントロールにTRPM8はmenthol, icilin、TRPV4は4α-PDDを、アンタゴニストにTRPM8はBCTC、TRPV4はruthenium redを用いる測定系を確立した。これにより、全ての主要なhuman温度感受性TRP (V1, V2, V3, V4, A1, M8)について活性評価系をそろえることができ、今後新たに見出したTRP作用成分について、TRPに対する選択性を調べることができるようになった。メントール受容体TRPM8に対する新規のアンタゴニストとして、Voacanga africanaのvoacangineを見い出し、論文として発表した。Voacangineは初めての化学アゴニスト選択的TRPM8アンタゴニストであり、副作用のないTRPM8遮断薬のシード化合物になることが期待される。さらに構造-活性相関研究を行い、化学アゴニスト選択的TRPM8阻害に決定的に重要な構造を明らかにし、論文として発表した。本ワサビ・西洋ワサビ・カラシ類に含まれるisothiocyanete化合物20種を用いた構造-活性相関研究を行い、構造とTRPA1・TRPV1活性の関係について調べた。本研究により、本ワサビの緑の香り・カブ様の香り成分(ω-alkenyl isothiocyanetes・ω-methylthioalkyl isothiocyanetes)は、低辛味でありながら、allyl isothiocyaneteと同等のTRPA1・TRPV1活性を持つことが明らかとなった。TRPA1・TRPV1活性を持つ食品成分は、エネルギー代謝を高めるため、抗肥満効果がある。これまで報告されてきたTRPA1・TRPV1アゴニストは強辛味のものが多いが、低辛味のアゴニストは強辛味のものに比べて摂取し易いと考えられる。本研究結果は、低辛味のTRPA1・TRPV1アゴニストの開発に貢献することが期待される。本結果を論文にまとめて提出し、現在査読を受けている。また研究予定にはなかった、婦人科がん(卵巣・乳・子宮がん)患者の生存期間とTRPチャネルの発現量に関する解析及び、カプサイシン受容体TRPV1の発現量・TRPV1アゴニストが卵巣がんの増殖に与える影響の解析を、米国ミシガン州立大学にて行った。
地方公共団体における生涯教育実施計画の策定方法に関する研究

地方自治体において生涯教育施策を体系的かつ計画的に纏めていく方法および手続きを検討するために、基礎自治体(市町村)の作業実態とそこに孕む問題点を明確にすることに力点をおいた。同時に、比較的新しい行政課題である生涯教育施策の立案には広域自治体(都道府県)の課題解明とそれにもとづく指導・助言のありかたも決定的な影響を有している。比較研究の結果、(1)県の指導・助言の問題としては、(1)市町村を生涯教育施策の(計画・実施)主体として認容し、施策計画の策定の自主性(施策内容の決定の裁量)を受け入れるというより、上位計画(とくに県計画)の実施者・請負者という位置ににとどめ、かつ伝統的な縦割り行政の枠組みで分化的に市町村の活動を方向づける傾向がつよい、(2)生涯教育施策の射程のとらえ方に大きな落差があり、従来の社会教育法にいう社会教育課題のレベルに固執する部分と、自治体の総合振興計画のソフトとしていわば町(村)おこし課題と結合させた生涯教育イメージに立脚している部分とに二極分解する傾向にある、(3)したがて、県レベルでも指導・助言の責任機関として県教育委員会が当たる伝統型と、知事部局(総務部地方課、企画部開発課など)と教育委員会部局との合同型という二分化傾向にあり、全体として確固たる統一性を欠く現状にある。(2)市町村での進捗状況に孕まれている問題としては、(1)生涯教育の今日的理念の把握とそれを具現する政策構想力を有する専任職員の決定的不足、(2)首長はじめ執行部管理者、さらに議会の議員らにおいて生涯教育施策の意味と現実的必要性についての受け入れ意識・認識が脆弱、(3)生涯教育への住民参加(さらにすすんで住民主体)の許容意識水準もくわわって、施策内容がイヴェント中心型(行政主導)と、住民参加促進の地域文化おこし型とに分化の傾向がある。茨城県猿島郡猿島町を対象とするケース・スタデイーを通して、以上の問題点が実証されたといえる。平成2年度の研究実績は、生涯教育について特定自治体の住民・社会諸団体・行政職員の受けとめ方をアンケ-ト調査の方法で把握したところである。農村地域として性格づけられる茨城県猿島郡猿島町(人口1.3万人)の教育委員会の協力を得て実施した調査の結果、生涯学習・生涯教育という言葉自体の認知も行政職員を除いて、一般住民では極めて低いこと、行政職員でも生涯学習・生涯教育の課題の広がり(=行政としての守備範囲)については理解に乏しく、依然として社会教育の関係事業とみなしている傾向がつよいこと、しかし、生涯学習・生涯教育分野の業務に異動・従事を希望する割合が比較的高いというデ-タが得られている。このような諸主体の意識状況から今後の課題としては、(1)即存の社会教育事業の実態と住民の存加水準についての確認、(2)住民の変様ないきがい追求(=学習実践)と結合・関連している行政サ-ビス全体の確認、(3)学習への行政サ-ビスの全体的な統合化(=即存の縦割行政の改変)、(4)住民の学習分野・水準の向上に〓する行政サ-ビス側の計画の体系化、という諸点が折出される。上記の四っの課題について、他自治体の実施策を把握するために、新潟市および亀岡市に調査研究を行なう。新潟市では、教育委員会の「生涯学習課」による全行政部局の統括ー住民の学習に対する行政サ-ビス部門の把握ーと市内周辺部での学校・PTA・地域住民三者による「郷土史学習」の試みの実態を調査し、亀岡市では「既存の社会教育事業の見直し運動」ー住沢による評価システムの導入で社会教育の功罪を明確化ーを調査した。文献を通じても、生涯学習・生涯教育の課題の広がり(地域社会の改革・まちづくり)を論及するものが少なく、いわんや行政の対応および守備領域についての明確化は今後の研究によるところが大である。

(2)市町村での進捗状況に孕まれている問題としては、(1)生涯教育の今日的理念の把握とそれを具現する政策構想力を有する専任職員の決定的不足、(2)首長はじめ執行部管理者、さらに議会の議員らにおいて生涯教育施策の意味と現実的必要性についての受け入れ意識・認識が脆弱、(3)生涯教育への住民参加(さらにすすんで住民主体)の許容意識水準もくわわって、施策内容がイヴェント中心型(行政主導)と、住民参加促進の地域文化おこし型とに分化の傾向がある。茨城県猿島郡猿島町を対象とするケース・スタデイーを通して、以上の問題点が実証されたといえる。生涯教育実施計画の策定にかかわって都道府県レベルでの課題と実態についての比較検討(茨城県,岩手県,新潟県,広島県,岡山県)と、市町村レベルでの実情と課題についての比較検討(茨城県内外の12市町村を対象)とを区分して、前者ではとくに基礎自治体に対する計画策定方法についての指導・助言について、後者では計画策定の過程・組織・方法上の原則(とくに住民参加の有無)および計画実施の諸結果について重点的に調査研究した。県の指導上の課題ー現状分析から得られたものーは、(1)基礎自治体を生涯教育実施主体として位置づけ計画策定の自主性(計画内容の決定の栽量)を承認するか、または、上位計画(多くは県策定)の実施者にとどめて伝統的な縦割行政の枠組内で市町村の活動を制禦しているという相反する傾向があること、(2)生涯教育行政の守備領域の捉え方に相当の格差があるーそれは生涯教育概念の捉え方の相違を反映しているーこと(例えば、従前の社会教育法の範域にとどまっている場合と、町おこし課題に結合させた総合振興計画のソフト部分的捉え方をしている場合など)、(3)したがって、県の指導責任機関も教育委員会内の小部局か、それとも知事部局の総務・企画・厚生等の部局と教育委員会との協議機関か、など県の間で違いがある。市町村での計画策定および計画実施の結果にみられる問題点は、(1)生涯教育の理念と内容,それを具現する政策構総の理解不足、(2)首長はじめ執行部管理者および議会側の姿勢の違いが計画策定と実施に決定的な影響を与えていること、(3)計画策定および実施の過程への住民参加の程度に応じて「イベント型」と「ト-タル・プログレス型」とに区分され、「イベント型」の行政イニシアチブ催しの限界が明らかになっていること、(4)首長部局の参与が弱く教育委員会の単独事業となっている、など。
フッ素置換基によるカチオン環化反応の活性化と位置制御

カチオン環化反応において、フッ素のβ-カチオン不安定化効果及びα-カチオン安定化効果により中間体のカルボカチオン生成時に活性化と位置制御を行い、F^-としての脱離能も併せて利用し、シクロアルケンの選択的構築を目指した。さらに、これらを組み合わせるTandem環化により多環式縮環骨格の構築を試みた。1.含フッ素カルボカチオンを分子内で効率よく捕捉するため、アルケニル基やアリール基を適切に配した含フッ素ビニル=ケトンを基質として選び、安価なトリフルオロエタノール誘導体から調製したジフルオロビニル金属と酸塩化物のカップリングにより、その合成を行った。この過程で、ジルコノセンを用いるジフルオロビニル化合物の新規合成法を開発した。2.得られた含フッ素ジビニル=ケトンに対しTMSOTfを作用させたところ、Nazarov環化後のアリルカチオンにおいて、フッ素の電子的効果により陽電荷の分布を規制し、同時にF^-の脱離で二重結合の位置を制御した。こうして、メチレノマイシンの骨格をはじめ各種含フッ素シクロペンテノンの位置選択的合成に成功した。また、フッ素を含まない基質の環化も行い、カチオン環化おける活性化と位置制御に対するフッ素置換基の有効性を明らかにした。3.上と同様に、含フッ素ビニル=ケトンの分子内Friede1-Crafts反応及びEne反応による環化とF^-の脱離を組み合わせ、シクロヘキセン環の選択的構築を達成した。4.得られたFriede1-Crafts環化生成物について、環上に残るビニル位フッ素を再利用した。Friede1-Crafts環化に加え、既に申請者が確立した含窒素複素環の合成法あるいは上述のNazarov環化を連続して行うことにより、ステロイドに見られる6/6/6/5の多環式縮環骨格やピラゾール環あるいはピリミジン環を含む縮環骨格の効率的な構築に成功した。
抗原特異的T細胞受容体を用いた肝癌治療に関する検討

本研究の目的は、肝癌関連抗原に特異的なTCRを同定し取得し、その中から肝癌治療に有効と考えられるTCRを選択し、ヒト肝癌治療へ応用していくための基礎データを取得することである。本研究で、HLA-A24およびHLA-A2拘束性の肝癌関連抗原特異的TCRを数多く取得することで、今後の我が国での肝癌治療に寄与することができると考える。本研究は次の3段階のステップで行う。3段階の実験は、1)ペプチド特異的CTLのTCRのクローニングと機能解析、2)肝細胞株に対する細胞傷害活性を証明するin vitro実験モデルの構築、3)in vivo TCR遺伝子治療モデルの構築とこれを用いたTCRの機能評価、からなる。まず、本年度は「1)ペプチド特異的CTLのTCRのクローニングと機能解析」について検討した。肝細胞癌患者の末梢血リンパ球をペプチドで刺激し、MHCペプチドテトラマーを用いてペプチド特異的CTLを検出しsingle cellレベルでソーティングする。次にTCRのレパートリー解析し、ベクターを作成するTCRαとβのペアを決定する。ヒト末梢血リンパ球へのTCR遺伝子導入するためのレトロウイルスベクターを構築する。プラスミドベクターをTCR発現用細胞株に導入し、その細胞株上にTCRを発現させ、MHC-ペプチドテトラマーとの結合及び親和性を確認する。上記の方法を用いて、MRP3由来ペプチドやhTERT由来ペプチドに特異的なTCRを同定することができた。今後は、取得したTCRの機能評価を進めていく予定である。交付申請書に記載した「研究計画」のタイムラインに沿って研究を進めている。ペプチド特異的TCRを取得することができ、本年度は概ね予定通り計画を進行することができた。今後も交付申請書に記載した「研究計画」のタイムラインに沿って計画を進めていく。具体的には、2)肝細胞株に対する細胞傷害活性を証明するin vitro実験モデルの構築、3)in vivo TCR遺伝子治療モデルの構築とこれを用いたTCRの機能評価を行う予定である。MRP3やhTERT由来ペプチドからの候補となるTCRの数が多く、そのレパートリー解析と機能解析に時間がかかり、計画していたペプチドの全てて行うことが出来なかった。そのため、他のペプチドのテトラマーの購入をしなかったため次年度使用額が生じた。
ヒト精巣セミノーマにおける血管新生に関連する研究

腫瘍細胞の低酸素状態は血管新生因子等を介して細胞の悪性形質獲得に重要な役割を担っていることが判明している。今回,ヒト精巣セミノーマ細胞株を用い,血管新生因子を中心に,低酸素培養の影響を検討した。実験に供した細胞株には当教室で樹立したヒト精巣セミノーマ細胞株(JKT-1)とその高転移株(JKT-HM)を用い,低酸素培養(HC:1%O_2)での増殖曲線・形態・vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)産生・血管新生因子を含む種々の遺伝子発現・apoptosis・細胞周期について常酸素培養(21%O_2)と比較した。両株ともに,低酸素培養下では増殖が抑制され細胞は大型の紡錘形となった。培地中へのVEGF-A産生はHC下24時間で増加,遺伝子発現では,VEGF-A,-Bならびに-Dが2日目までやや発現の亢進が見られ,その後減弱を示したが,VEGF-Cは発現の亢進が持続した。HIF-1(hypoxia inducible factor-1)はメッセージレベルでは変化を認めなかった。また解糖系酵素と共にstress proteinであるHsp 70(heat shock protein 70),Hsp90,CDKIs(cyclin-dependent kinase in-hibitors)であるp21,p27,p15,接着因子のCD44,Vimentinの発現亢進を認めた。細胞周期のFACSによる解析ではG_1blockを来していたが,apoptosisは認めなかった。結果として他臓器細胞株と同様に,ヒト精巣セミノーマ細胞株においても低酸素培養において血管新生因子の発現亢進が認められ,なかでも培養早期のVEGF-Cの発現亢進は特徴的であり,臨床的なリンパ性転移との関連性が示唆された。