hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
色素細胞と悪性黒色腫の遺伝子発現のSAGE法による解析と基礎・臨床医学への応用

今度、悪性黒色腫や色素細胞の研究や臨床に有用な新規分子の検索を行う予定である。本研究はSeriaI AnaIysis of Gene Expression(SAGE)法と近年充実しつつある遺伝子データベースを駆使して、色素細胞の生物学、色素細胞異常症や悪性黒色腫の診断・治療に有用な、新規色素細胞特異発現遺伝子を同定することを目的とする。前年度は、高色素産生性悪性黒色腫細胞株SKme123の遺伝子発現プロファイルをSAGEにより解析した。本年度は、公開されている各種組織のSAGEデータベースとの比較により、新規色素細胞特異遺伝子候補を選び出し、RT-PCR法とノーザン法により特異発現を確認することにより色素細胞と悪性黒色腫に選択的に発現する遺伝子M172とM182を同定した。全長のcDNAを単離し解析したところ、M172は58アミノ酸からなる機能未知の蛋白をコードしており、M182は既知のメラノソーム蛋白TRP2のスプライシング変異体であった。また、公開されているESTデータベースの相互比較により色素細胞cDNAライブラリー由来のESTデータベースに特異的に検出されるcDNAを80種選択し、その中から実験的に色素細胞特異的に発現する5種の遺伝子を同定し、全長cDNAを単離し解析した。M43は最近、T細胞認識悪性黒色腫抗原として単離され、また、メダカの実験とヒトの白皮症の遺伝解析からメラニン色素産生に関わることが判明したAIM1のスプライシング変異体であった。M125は悪性黒色腫の転移マーカーになりえる,Melastatin1のスプライシング変異体であった。M44は正常色素細胞にのみ発現の見られる機能未知分子であった。M216とM674は5'側に本来の遺伝子のコード領域がある可能性が考えられ解析中である。今後・本研究で同定した分子の色素細胞における役割解析および色素細胞異常症、悪性黒色腫の診断・治療への臨床応用の可能性を追求する。
糸状菌由来のシアン非感受性呼吸系酵素遺伝子を利用した大腸菌の代謝機能改変

Aspergillus niger(クロコウジカビ)のシアン非感受性呼吸系は、シアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す。このような呼吸系を構成する酵素はalternative oxidaseと呼ばれているが、一部の植物と真核微生物のものを除いて当該酵素の性質や遺伝子構成は不明である。本研究においては、A.nigerのシアン非感受性呼吸系酵素の遺伝子レベルでの存在の実証を目的として、alternative oxidaseをコードする相補DNA(以下cDNAと略)を取得し塩基配列を決定した。さらに、当該cDNAを大腸菌で発現させた。シアン非感受性呼吸活性が強く現れるような条件下で培養したA.nigerの菌体よりメッセンジャーRNAを抽出し、これに逆転写酵素を作用させてcDNAライブラリーを作成した。植物で塩基配列が決定されているalternative oxidase遺伝子の保存配列を調べ、相当するDNAプローブを合成してcDNAライブラリーよりA.nigeralternative oxidaseをコードするcDNAを取得した。当該cDNAは1053bpから成り分子量約39kDaのタンパク質をコードすることが判明した。植物のそれとは塩基レベルで約50%、アミノ酸レベルで約70%の相同性を示した。当該cDNAより予想されるタンパク質のN末端付近にはミトコンドリア移行シグナルが存在した。つぎに、IPTGの存在下で発現が誘導される発現ベクターpkk223-3に当該cDNAを組込み、大腸菌DH5αを形質転換した。このキメラプラスミドを有する形質転換体にはIPTGの誘導条件下でシアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す呼吸が出現した。
多元的微細構造評価システムの構築と非自明高次構造の直接観察

本研究では、汎用透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、電子光学レンズ系の制御により、(1)10-2[rad]から10-7[rad]に及ぶ角度分解能を持つ小角電子回折法の実現、(2)同一領域から小角電子回折図形、ローレンツTEM像および構造的暗視野像を取得できる多元的微細構造観察システムの構築を行うことを目的とする。本システムを強相関系物質やマルチフェロイック物質に展開し、磁気渦構造等の非自明な高次構造の形成メカニズムやスピン構造を解明することを目的としている。本年度は、位相差顕微鏡法を用いて、磁気テクスチャでの磁化分布解析を行った。また、磁気偏向や磁気周期の定量分析には逆空間の情報が必須であるため小角電子回折法を用いた。小角電子回折法で実現される長距離のカメラ長を用いることで、一般的に10-210-3 rad程度である結晶格子によるBragg回折角に対し、10-410-6 radの微小偏向角を有する磁気偏向や磁気テクスチャの長周期秩序構造を逆空間で定量的手法に観測・解析できる。こうした実空間および逆空間の磁化分布観測手法を有効に用いることにより、ヘリカル磁性体FeGeや強相関電子系マンガン酸化物における磁気テクスチャの直接観察を行うとともに、磁気テクスチャ磁化分布解析を行った。さらに、バルク単結晶試料合成や物性測定、TEM観察を行い、磁気テクスチャの磁化分布、外部磁場および温度に対する応答、結晶方位依存性などから磁気テクスチャの形成機構を明らかにした。本年度は、無孔位相板を用いた位相差顕微鏡法を磁気スキルミオンの磁化分布解析に応用した。位相差顕微鏡法によって得られる位相像では、弱位相物体近似の成り立つ範囲において、像の強度と試料磁化が誘起する電子波の位相差が線形関係であること示した。この関係から、Aharonov-Bohm効果を利用することで位相像から磁化分布像を取得することができる。小角電子回折法の光学系を参考に、可変磁場下での観察を可能にする光学系を構築した。無孔位相板として用いたカーボン薄膜を制限視野絞りの位置に設置し、コンデンサーレンズを用いて位相板上にクロスオーバーを形成させた。対物レンズは試料への磁場印加装置として用いた。本光学系を用いFeGeにおける磁気スキルミオンを観察したところ、スキルミオンの位相像を取得し、像強度を微分することで磁化分布像を取得することに成功した。位相差顕微鏡法によって得られた磁化分布から、スキルミオンでは正弦波的に面内磁化の大きさが変調することが明らかになった。また、位相差顕微鏡法により、磁気テクスチャの磁化分布を定量的に解析することが可能であることを示唆することができた。これまでに構築してきた小角電子回折法、ローレンツ顕微鏡法および位相差顕微鏡を用いて、ペロブスカイト型マンガン酸化物やZ型ヘキサフェライト(Sr3Co2Fe24O41)での磁気テクスチャ構造について調べていく。具体的には以下の通りである。(1)巨大磁気抵抗物質であるペロブスカイト型マンガン酸化物La1-xSrxMnO3(x=0.175)の斜方晶構造をもつ強磁性金属相においてナノスケールのストライプ磁区構造が形成されており、さらにストライプ磁区に対して垂直磁場を印加することにより、磁気渦構造が出現し、6回対称をもつ格子構造を形成することを見出した。そこで、この磁気渦構造の形成過程の実空間・逆空間観察を行う。また、ホール濃度依存性について調べ、磁気渦構造に関する磁場-温度-組成相図を作製する。・La1-xSrxMnO3(0<x<0.30)における強磁性絶縁体状態(単斜晶構造;0.1<x<0.13)、強磁性金属状態(斜方晶構造;0.15<x<0.18)および強磁性金属状態(菱面体構造;0.18<x)での磁気渦構造等の非自明な高次構造の観察と、磁気渦構造に対する磁場-温度-組成相図の作製。(2)らせん磁性体としては磁気転移点が300 Kよりも高く、電気磁気係数が大きい(2.5×10-10 s/m)Z型ヘキサフェライト(Sr3Co2Fe24O41)を用いて、らせん磁性相と強誘電相の共存する磁場-温度-組成相図の作製を行う。また、らせん磁性相でのローレンツTEM観察および小角電子回折実験により、実空間・逆空間観察を通して、らせん磁性相の磁気的微細構造を明らかにしていく。本研究では、汎用透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、電子光学レンズ系の制御により、(1)10-2[rad]から10-7[rad]に及ぶ角度分解能を持つ小角電子回折法の実現、(2)同一領域から小角電子回折図形、ローレンツTEM像および構造的暗視野像を取得できる多元的微細構造観察システムの構築を行うことを目的とした。平成28年度は、10-2[rad]から10-7[rad]に及ぶ幅広い角度分解能を持つ小角電子回折法の実現を目指して研究を進めた。小角電子回折法は数+百mもの長距離のカメラ長を用いて回折図形を取得する手法である。小角回折スポットを生じさせている領域をフーコー法により可視化するために、対物レンズをオフの状態にしてクロスオーバーを制限視野絞りに形成させた光学系を構築した。本光学系は、対物レンズを用いて磁場印加が可能であり、コンデンサーレンズを用いて照射電子強度を変更できる。

本光学系では、制限視野絞りにクロスオーバーを形成した条件下でカメラ長は約1300 m(対物レンズオフ)、2500 m(対物レンズ0.36 A)であること、外部磁場は約200 mTまで印加可能である。さらに、中間レンズ1を弱励磁で使用し中間レンズ3により焦点合わせを行うことで、0.8 4.5 mまでカメラ長を下げることに成功した。上記光学系により、ペロブスカイト型マンガン酸化物La0.7Sr0.3MnO3 (LSMO)及びNd0.5Sr0.5MnO3の磁区の磁場応答を観察し、LSMOにおいては磁場印加により磁壁がロンボヘドラルの双晶ドメイン壁近傍で大きく変化することを観察した。現在、本光学系を拡張し、同一領域から小角電子回折図形、ローレンツTEM像および構造的暗視野像を取得できる多元的微細構造観察システムの構築を目指して研究を進めている。H28年度において、研究活動に必要な装置の修理や設置、必要な消耗品の購入など研究環境の整備を行い、研究活動を開始した。透過型電子顕微鏡に小角電子回折法を行ううえで必要な対物絞り(φ5μ)を購入した。制限視野絞りにクロスオーバーを形成した条件下でカメラ長は約1300 m(対物レンズオフ)、2500 m(対物レンズ0.36 A)であること、外部磁場は約200 mTまで印加可能であることを示せた。本研究では、汎用透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、電子光学レンズ系の制御により、(1)10-2[rad]から10-7[rad]に及ぶ角度分解能を持つ小角電子回折法の実現、(2)同一領域から小角電子回折図形、ローレンツTEM像および構造的暗視野像を取得できる多元的微細構造観察システムの構築を行うことを目的とした。平成29年度は、10-2[rad]から10-7[rad]に及ぶ幅広い角度分解能を持つ小角電子回折法の実現を目指して研究を進めた。小角回折スポットを生じさせている領域をフーコー法により可視化するために、対物レンズをオフの状態にしてクロスオーバーを制限視野絞りに形成させた光学系を構築した。本光学系は、対物レンズを用いて磁場印加が可能であり、コンデンサーレンズを用いて照射電子強度を変更できる。上記光学系により、バリウムフェライト系磁性酸化物の磁区の磁場応答を観察し、ストライプ磁区構造に磁場印加することにより、磁気渦構造が形成されることを見出した。また、らせん磁性体FeGeの磁区構造に垂直磁場を印加することにより、磁気スキルミオンが形成されるとともに、スキルミオン格子により形成されるドメイン構造の形成プロセスの観察に成功した。現在は、本光学系を拡張し、同一領域から小角電子回折図形、ローレンツTEM像および構造的暗視野像を取得できる多元的微細構造観察システムの構築を目指して研究を進めている。H29年度において、研究活動に必要な装置の修理や設置、必要な消耗品の購入など研究環境の整備を行い、順調に研究は進んでいる。
新規受容体蛋白ファミリーの機能解析

シグナルシークエンストラップ法を用いて新規受容体の同定を行ない、BSRP-A, B, Cと名付けたファミリーを形成する蛋白質群とDNERと名付けたEGFドメインをもつ新規受容体様膜蛋白質群を見い出した。BSRPファミリーはノザンブロット法により全て脳に特異的発現をすることがわかり、さらにin situハイブリダイゼーションにてBSRP-A, Bはほぼ全ての神経細胞に発現しているのに対して、BSRP-Cは特に嗅球、線状体で強く発現しており、小脳での発現が認められなかった。この結果を踏まえて小脳特異的なプロモーターにBSRP-A, B, Cを連結しトランスジェニックマウスの作製を行っている。さらにノックアウトマウスを作製し個体レベルの形態学や行動学的研究により、生理的機能を明らかにする実験を遂行中である。既にBSRP-A, Cのノックアウトマウスはできており、交配によるダブル、トリプルノックアウトマウスの作製も計画している。我々がまず始めに骨格筋で見い出したジャンクトフィリンは、表層膜と結合し筋小胞体膜を貫通することにより結合膜構造の形成に寄与するものと考えられている。その後心臓に特異的な2型、脳に特異的な3型が同定され、ジャンクトフィリンは骨格筋のみならず、興奮性細胞系全般の結合膜構造の形成や機能にかかわっていることが示唆された。脳に特異的な3型ジャンクトフィリンの生理的機能解析をめざしノックアウトマウスを作製した。3型ジャンクトフィリンノックアウトマウスは顕著な表現型の異常は観察されず、脳の解剖学的所見も正常であった。しかし、行動学的実験により運動協調性の低下が観察され、中枢系での3型ジャンクトフィリンの重要性が示唆された。計画調書に記述した実験計画に従い、平成13年度は以下の研究を遂行した。1.新規受容体様分子群に関する研究(未発表)我々の以前の実験で、中枢系に発現する新規受容体様分子群(BSRP-A, B, C)が単離された。細胞内ドメインにチロシン残基が共通の位置に保存されており、ある種のリン酸化酵素によりリン酸化され得ることが示された。従って、チロシンリン酸化によるアダプター分子を仲介した細胞内情報伝達が示唆された。また、ノックアウトマウスの作成に向けた実験を遂行し、数カ月以内に得られる段階にまでに現在進めている。我々の以前の研究で、ノシセプチン受容体を介する興奮性調節が中枢系の様々な神経細胞において見い出されている。脊髄後根神経節細胞において、ノシセプチン受容体の活性化は神経細胞の興奮性低下を導くことがドイツのグループとの共同研究で示された。また、製薬企業との共同研究において、J-113397という低分子薬物は優れたノシセプチン受容体拮抗薬であることが示された。
超高速サブミクロン放電加工に関する研究

本研究は、ますます増加するマイクロ・ナノ製品のニーズに対応するため、微細加工に得意とされる放電加工技術を複雑な微細部品の加工に応用し、高速加工できるマイクロ放電加工技術を確立することを目的とする。具体的には、超高速半導体素子を使用し、従来のRC放電回路の代わりに新たにトランジスタ放電回路とそれに適したサーボ制御回路を開発し、放電加工の弱点である加工速度を従来と比べて約20倍向上した。一方、現状では得られる最小軸径が5μm程度で、マイクロ放電加工技術が微細化の要求に充分に応えているとは言い難い。そこで、本研究では、まず現状で得られる最小軸径を求め、その値以下の軸径が得られない因子として、加工変質層、陽極と陰極に配分されるエネルギーの違い、素材軸自体の製作過程に起因する残留応力、素材軸の材料組織(結晶粒径の大きさ、多結晶体と単結晶体など)について考察した。その結果、超硬合金、超微粒子超硬合金の方がタングステンより微細化に適していることや、タングステン軸を焼鈍することで軸内部の残留応力を除去し、微細軸加工時に現れる軸の屈曲を超硬合金と同程度に抑えられること、工作物を放電エネルギーがより少ない配分される陰極にしたほうが微細化に有利であることが分かった。特に、従来の放電電源を用いて得られる最小の放電痕の径は、本研究で用いた材料に限り、素材によらず一定で約2μmである。従ってサブミクロン加工を目指すにはサブミクロン径の放電痕が得られる放電電源の開発が必要であることが分かった。そこで、回路に生じる浮遊容量により最小限界放電エネルギーが決定される従来型の放電加工機に比べ、微細な加工が可能であり、かつ非接触で給電が可能な静電誘導給電法を開発した。実験の結果、従来型の放電加工機に加工装置を取り付けて加工を行い表面粗さRz0.272μmを達成できることが分かった。ここ数年,三次元構造を持つマイクロ部品の加工には放電加工が利用されるようになったが,現在最も広く使われている市販の微細放電加工機を用いても安定して加工できる最小軸径は5mmにとどまったことがこれまでの実験より判明した。最小軸径の問題を解決するために,筆者らは軸素材の結晶粒径,加工後に生じる加工変質層と放電痕,軸素材自体の製作過程に起因して放電加工前に存在している残留応力,放電加工により新たに生じた残留応力,加工機の位置決め精度や熱変形などの項目について調べ,軸径が5mm以下に加工できない原因を考察した。さらに,細軸加工時に軸の根元近傍側面における放電回数の局所的な増加を避け,軸径細り現象の防止を図るため,切込みごとに軸方向の加工長さをステップ的に短くした加工軌跡を採用した結果,超微粒子超硬合金において直径が約2.3mmの微細軸加工に成功した。なお,マイクロ放電加工における微細化の限界を追求することにより微細化限界の決定因子を解明するため,工作物が多結晶である場合と単結晶である場合の比較を行い,単晶材料の方が多結晶材料より微細加工に適していることや,単結晶材料を加工する際,工作物を陰極とする逆極性での加工の方が正極性の場合より更なる微細化を図れることを確認した。一方,マイクロ放電加工の中仕上げ/仕上げ加工が可能なアイソパルス方式のトランジスタ放電回路を開発し,最短で約30nsのパルス幅での安定な加工を実現した。また,主軸送り機構を定速送りからサーボ送りに変更し,高い放電頻度での加工を実現した。

製作したトランジスタ放電回路でWEDG加工を行い,形状精度をコンデンサ放電回路と比較し,同程度以上の精度が得られると同時に,中仕上げ加工・仕上げ加工とも約20倍と加工速度が上昇することを確認した。本研究は、ますます増加するマイクロ・ナノ製品のニーズに対応するため、微細加工に得意とされる放電加工技術を複雑な微細部品の加工に応用し、高速加工できるマイクロ放電加工技術を確立することを目的とする。具体的には、超高速半導体素子を使用し、従来のRC放電回路の代わりに新たにトランジスタ放電回路とそれに適したサーボ制御回路を開発し、放電加工の弱点である加工速度を従来と比べて約20倍向上した。一方、現状では得られる最小軸径が5μm程度で、マイクロ放電加工技術が微細化の要求に充分に応えているとは言い難い。そこで、本研究では、まず現状で得られる最小軸径を求め、その値以下の軸径が得られない因子として、加工変質層、陽極と陰極に配分されるエネルギーの違い、素材軸自体の製作過程に起因する残留応力、素材軸の材料組織(結晶粒径の大きさ、多結晶体と単結晶体など)について考察した。その結果、超硬合金、超微粒子超硬合金の方がタングステンより微細化に適していることや、タングステン軸を焼鈍することで軸内部の残留応力を除去し、微細軸加工時に現れる軸の屈曲を超硬合金と同程度に抑えられること、工作物を放電エネルギーがより少ない配分される陰極にしたほうが微細化に有利であることが分かった。特に、従来の放電電源を用いて得られる最小の放電痕の径は、本研究で用いた材料に限り、素材によらず一定で約2μmである。従ってサブミクロン加工を目指すにはサブミクロン径の放電痕が得られる放電電源の開発が必要であることが分かった。そこで、回路に生じる浮遊容量により最小限界放電エネルギーが決定される従来型の放電加工機に比べ、微細な加工が可能であり、かつ非接触で給電が可能な静電誘導給電法を開発した。実験の結果、従来型の放電加工機に加工装置を取り付けて加工を行い表面粗さRz0.272μmを達成できることが分かった。
脊髄内タキキニン受容体拮抗作用とオピオイド作用を併せ持つ新規鎮痛薬の創製

1センダイドおよび〔D-Arg^2〕センダイドのサブスタンスP誘発性疼痛関連行動に対する効果サブスタンスP(100pmol)を脊髄クモ膜下腔内(i.t.)へ投与すると、投与直後より疼痛関連行動(scratching biting licking)が認められた。センダイド(0.0625-1.0pmol)のi.t.投与は用量依存的にサブスタンスP誘発性疼痛関連行動を抑制し、そのED_<50>値は0.3pmolであった。〔D-Arg^7〕センダイド(31.25500fmol)のi.t.投与はサブスタンスPによる疼痛関連行動を用量依存的に抑制し、そのED_<50>値は11.55fmolであった。2センダイドおよび〔D-Arg^2〕センダイドの抑制持続時間センダイド40pmolはサブスタンスP(100pmol)による疼痛関連行動を120分間、有意に抑制した。センダイド8.0pmol投与では180分間の有意な抑制効果を示した。〔D-Arg^2〕センダイド0.5pmolはサブスタンスP誘発性疼痛関連行動を60分間有意に抑制した。〔D-Arg^2〕センダイド4.0pmol投与では120分間の有意な抑制効果を示した。3センダイドおよび〔D-Arg^7〕センダイドのサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用に対するナロキソンの効果センダイド1.0pmolによるサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用は、ナロキソン0.5-4.0mg/kg(i.p.)の前処理によって影響をうけることはなかった。一方、〔D-Arg^2〕センダイド0.125pmolのサブスタンスPに対する抑制作用はナロキソン4.0mg/kg(i.p.)の前処置により、有意な拮抗作用を示したが、ナロキソン1.0および2.0mg/kg(i.p.)では無影響であった。しかし、〔D-Arg^2〕センダイド1.0pmolによるサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用はナロキソン低用量(0.5mg/kg.i.p.)の前処置により有意な拮抗作用を示した。4センダイドのマウス脊髄内NK1受容体結合試験マウス脊髄シナプス膜標本と〔^3H〕-サブスタンスPとの結合実験において、未標識のサブスタンスPは〔^3H〕-サブスタンスPとの結合を阻害し、Ki値は3.3±0.7nMであった。センダイドのKi値は0.004±0.001nMであり、未標識サブスタンスPよりも825倍強力な結合能を示した。5センダイドのマウス脊髄内ミューおよびデルタ受容体結合試験マウス脊髄シナプス膜標本と〔^3H〕-DAMGOを用いたミュー受容体結合実験において、未標識のDAMGOは〔^3H〕-DAMGOとの結合を阻害し、そのKi値は0.955±0.08nMであった。センダイドのKi値78.3±14.9nMであり、未標識DAMGOの約1/100の結合力であった。また〔^3H〕-〔D-Ala^2〕-dltorphin IIを用いたデルタ受容体との結合実験において、未標識の〔D-Ala^2〕-deltorphin IIは〔^3H〕-〔D-Ala^2〕-deltorphin IIとの結合を阻害し、そのKi値は13.7nMであった。センダイドのKi値は220.0±45.4nMであり、未標識〔D-Ala^2〕-deltorphin IIの約1/16の結合力であった。以上の結果より、センダイドおよびセンダイド〔D-Arg^2〕センダイドは比較的低用量のi.t.投与によりタキキニンNK_1受容体拮抗作用のみを示し、用量の増加に伴いオピオイド受容体に対するアゴニスト作用を発揮するものと推測される。3センダイドおよび〔D-Arg^7〕センダイドのサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用に対するナロキソンの効果センダイド

1.0pmolによるサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用は、ナロキソン0.5-4.0mg/kg(i.p.)の前処理によって影響をうけることはなかった。一方、〔D-Arg^2〕センダイド0.125pmolのサブスタンスPに対する抑制作用はナロキソン4.0mg/kg(i.p.)の前処置により、有意な拮抗作用を示したが、ナロキソン1.0および2.0mg/kg(i.p.)では無影響であった。しかし、〔D-Arg^2〕センダイド1.0pmolによるサブスタンスP誘発性疼痛関連行動抑制作用はナロキソン低用量(0.5mg/kg.i.p.)の前処置により有意な拮抗作用を示した。4センダイドのマウス脊髄内NK1受容体結合試験マウス脊髄シナプス膜標本と〔^3H〕-サブスタンスPとの結合実験において、未標識のサブスタンスPは〔^3H〕-サブスタンスPとの結合を阻害し、Ki値は3.3±0.7nMであった。センダイドのKi値は0.004±0.001nMであり、未標識サブスタンスPよりも825倍強力な結合能を示した。5センダイドのマウス脊髄内ミューおよびデルタ受容体結合試験マウス脊髄シナプス膜標本と〔^3H〕-DAMGOを用いたミュー受容体結合実験において、未標識のDAMGOは〔^3H〕-DAMGOとの結合を阻害し、そのKi値は0.955±0.08nMであった。センダイドのKi値78.3±14.9nMであり、未標識DAMGOの約1/100の結合力であった。また〔^3H〕-〔D-Ala^2〕-dltorphin IIを用いたデルタ受容体との結合実験において、未標識の〔D-Ala^2〕-deltorphin IIは〔^3H〕-〔D-Ala^2〕-deltorphin IIとの結合を阻害し、そのKi値は13.7nMであった。センダイドのKi値は220.0±45.4nMであり、未標識〔D-Ala^2〕-deltorphin IIの約1/16の結合力であった。以上の結果より、センダイドおよびセンダイド〔D-Arg^2〕センダイドは比較的低用量のi.t.投与によりタキキニンNK_1受容体拮抗作用のみを示し、用量の増加に伴いオピオイド受容体に対するアゴニスト作用を発揮するものと推測される。脊髄内タキキニンNK_1受容体拮抗薬はある程度の鎮痛作用を示すが、単独投与では十分な効果を期待することができない。しかし、オピオイド受容体アゴニスト活性を併せ持つことにより鎮痛作用の増強を見込むことができる。そこで、NK_1受容体拮抗作用とオピオイド活性の両作用を持つ可能性のある化合物について、マウスを用いて行動薬理学的に検討した。サブスタンスP(100pmol)を脊髄クモ膜下腔内(i.t.)へ投与すると、投与直後より疼痛関連行動(scratching,biting,licking)が認められた。センダイド(0.0625-1.0pmol)のi.t.投与は用量依存的にサブスタンスP誘発性疼痛関連行動を抑制し、そのED_<50>値は0.3pmolであった。オピオイド受容体拮抗薬のナロキソン(0.5-4.0mg/kg)はセンダイド1.0pmol投与による抑制効果に対し無影響であった。2)サブスタンスP誘発性疼痛関連行動に対する〔D-Arg^7〕センダイド(Tyr-D-Arg-Phe-D-His-Leu-MetNH_2)の効果〔D-Arg^7〕センダイド(31.25500fmol)のi.t.投与はサブスタンスPによる疼痛関連行動を用量依存的に抑制し、そのED_<50>値は115.5fmolであった。〔D-Arg^7〕センダイド125
ミクロRNAを用いた血管細胞分化増殖制御による新規心血管治療法の開発

虚血性疾患に対する外科的バイパス術後の移植グラフ血管、特に静脈グラフトの劣化やステント治療後の再狭窄などは、平滑筋増殖による内膜肥厚などの血管リモデリングが原因となっている。本研究では、ウサギ頸動脈バイパスモデルを用いて、ミクロRNA-145(miRNA-145)が平滑筋増殖抑制に特異的に作用する性質を応用し、内膜肥厚抑制効果について検討した。コントロール群(遺伝子導入なし)とmiR-145導入群(自家静脈グラフトにエレクトロポレーション法にてmiR-145を導入)の2群に分け、日本白ウサギの頚動脈を自家頚静脈グラフトに置換し、その後の内膜肥厚について評価を行った。4週間後の新生内膜の厚さ及び内膜/中膜面積比は有意にmiR-145群で小さかった。また、平滑筋分化の指標であるSM-1及びSM-2免疫染色においてmiR-145群において増殖型が抑制され、細胞増殖の指標であるKi-67免疫染色でもmiR-145群において内膜肥厚部の細胞増殖が抑制されていた。以上の結果から、血管平滑筋フェノタイプを制御できるmiR-145を自家静脈グラフトへ遺伝子導入することで、新生内膜増殖による移植グラフトの内膜肥厚を抑制できるため、外科的バイパス術後のグラフト開存率が改善されることが期待できる。さらにはウイルスベクターを用いない遺伝子導入法を用いた事で、基礎研究段階から臨床応用への可能性も拡がったと考えられた。虚血性疾患に対する外科的バイパス術後の移植血管の劣化や、ステント治療後の再狭窄などは、平滑筋増殖による内膜肥厚などの血管リモデリングが原因となっている。今回われわれが注目したミクロRNAは標的とするmRNAを阻害することにより遺伝子発現を阻害し、一つのmiRNAで類似する複数の遺伝子発現を阻害できる特徴がある。本研究では、ミクロRNA-145が平滑筋増殖抑制に特異的に作用する性質を利用して、血管リモデリングの制御に有効であることを検証した。まず平成22年4月より培養平滑筋細胞におけるアデノウイルス・プラスミドを用いたミクロRNA-145過剰発現による分化誘導を検証し、その後ウサギ血管移植モデル・ステントモデルによる内膜肥厚抑制実験を行う予定であったが、まず分化誘導に用いる予定であったアデノウイルスでは十分な効率が得られなかったため、ゲノムに組み込まれ、その結果、高発現が期待できるレンチウイルスにて再試験を行う方針とした。しかし、今日の遺伝子導入の臨床応用への流れの中で、制御困難と考えられるウイルスベクターを用いる遺伝子導入法は再検討する必要性ありと判断し、遺伝子導入法自体の手法を再考することとした。同時にウサギ血管移植モデルの作成を行ったが、バイパス閉塞例を認め、当初の手法を再検討することとなったことから、ウサギ血管移植モデルでのmiRNA-145を用いた内膜肥厚抑制実験は未だ行い得ていない。しかし、今日の遺伝子導入の臨床応用への流れの中で、制御困難と考えられるウイルスベクターを用いる遺伝子導入法は再検討する必要性ありと判断し、遺伝子導入法自体の手法を再考した。

その結果、安全性の面からプラスミドを用いたエレクトロポレーション法がより臨床応用へ向けて実用的であると判断し、現在、ウサギ血管移植モデルを作製してエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行っている。具体的にはmiRNA-145を導入した群、antisensemiRNA-145を導入した群、コントロール群を作成して、内皮細胞化、血栓形成、内膜/中膜比の検討を行っている。今後、わたなべウサギを用いた高脂血症病態モデルウサギを用いて、より臨床に近い病態での検討も行っていく方針である。虚血性疾患に対する外科的バイパス術後の移植血管の劣化や、ステント治療後の再狭窄などは、平滑筋増殖による内膜肥厚などの血管リモデリングが原因となっている。今回われわれが注目したミクロRNA(miRNA)は標的とするメッセンジャーRNAを阻害することにより遺伝子発現を阻害し、一つのmiRNAで類似する複数の遺伝子発現を阻害できる特徴がある。本研究では、miRNA-145が平滑筋増殖抑制に特異的に作用する性質を利用して、血管リモデリングの制御に有効であることを検証した。方法として、miRNA-145をエレクトロポレーション法にてウサギ頸動脈バイパスモデルに応用し、グラフト内膜肥厚抑制効果を評価した。日本白ウサギ頸動脈を、下記2群に分けて自家頚静脈グラフトにてバイパス置換し4週間後の内膜/中膜面積比を計測して内膜肥厚抑制効果を比較検討した。コントロール群:遺伝子導入なし、miR-145群:miR-145発現プラスミドをエレクトロポレーション法にて自家静脈グラフトに遺伝子導入した群。また同時にSM-1およびSM-2(平滑筋分化の指標)、Ki-67(細胞増殖の指標)にて免疫染色を行い両群間で比較検討した。4週間後の内膜/中膜面積比は有意にmiR-145群で小さかった(1.129+/-0.233 vs 0.216+/-0.043 p<0.01)。またSM-1およびSM-2免疫染色においてもmiR-145群において増殖型が抑制されていると考えられた。Ki-67を用いた免疫染色でもmiR-145群において内膜肥厚部の細胞増殖が抑制されていた。これらの結果から、血管平滑筋フェノタイプを制御できるmiR-145を自家静脈グラフトへ遺伝子導入することで静脈グラフトの開存率を改善でき、さらにはウイルスを用いない遺伝子導入法により基礎研究段階から臨床応用への可能性も拡がったと考えられた。遺伝子導入の高効率化という点で、ウイルスを用いた遺伝子導入法を当初予定していたが、臨床応用という点で、より実用的な観点から、安全性の高い、プラスミドを用いたエレクトロポレーション法へ遺伝子導入法を変更した。本法は、初期費用が必要ではあるが、制御困難なウイルスより安全であるという大きな利点がある。さらにウサギ血管移植モデルの作成に難渋し、手技の再検討を行うなどを要したため遅延が生じている。結果、ウサギ血管移植モデルによるmiRNA-145による移植血管の内膜肥厚抑制実験は現在進行中であり、ステント内側および肺動脈へのmiRNA-145導入のための技術確立は行い得ていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。ウサギ血管移植モデルによるmiRNA-145による移植血管の内膜肥厚抑制実験に関しては、血管移植バイパスモデルの作成が手技上確立され、現在、遺伝子導入モデルを作成して順次、結果を蓄積している状況である。
フランス絶対王政の統治構造におけるポリス:オート=ノルマンディーのマレショーセ

本研究では、国家権力がどのように臣民・国民を統治しようとし、それに対して臣民・国民がどのように対抗したかという問題を、国家の統治制度が飛躍的に整備されるフランス絶対王政期、とりわけ裁判・警察制度が整備される17世期後半18世期前半において検討するための緒論として、フランス王国の農村部及び幹線道路の治安維持を担った騎馬警察かつ国王特別裁判所マレショーセ(marechaussee)の実像を、18世紀前半期のオート=ノルマンディー地方において検証した。本研究は、18世紀前半のオート=ノルマンディー地方のマレショーセ(プレヴォ裁判所、騎馬警察隊)の活動の実態を明らかにすることによって、アンシァン・レジームの統治構造をポリスの側面から検証するとともに、フランス絶対王政の固有の性格について再検討することを目的とする。平成20年度の研究は、(1)フランスの古文書館における関係史料の収集、(2)史料の読解・分析、(3)論文執筆、(4)論文のフランス語への翻訳作業、フランス語原稿の訂正作業、の4つの作業から計画された。このうち、(4)を除いて、成果が得られた。(1)については、9月に約3週間渡仏し、セーヌ=マリティーム県古文書館、防衛省歴史課古文書館で史料の収集に努めた。その成果の一部は史料紹介として『総合環境研究』(第11巻第2号。平成21年3月)に発表した。(2)については、プレヴォ裁判の管轄・権限と騎馬警察隊の職務内容を明らかにするために、かつて収集していた史料と今回新たに集めた史料(特にプレヴォ裁判文書を補充)の読解・分析を進めている。その成果は一部、平成21年6月の法制史学会近畿支部で報告する予定である。論文は2本書き終えた((3)の作業)。「アンシァン・レジーム期フランスの国王「中級」役人」は6月に書き上げ、全国学会誌に投稿したものの、書き直し・再投稿となった。現在、内容・構成の再検討中であり、平成21年5月末までには再投稿の予定である。「マレショーセと地域住民」は8月末に書き終え、共著書の1つの章として平成21年度に刊行の予定である。「フランス絶対王政期における「警察官」(仮題)」は現在執筆中であり、平成21年初夏までに投稿の予定である。また、上述の論文の一部と既刊の論文を合わせた博士論文『アンシァン・レジーム期フランスの地方警察』をほぼ書き終えており、細部を調整した上で、平成21年7月までに提出するつもりである。平成21年度の研究も、(1)フランスの古文書館における関係史料の収集、(2)史料の読解・分析、(3)論文執筆、(4)論文のフランス語への翻訳作業、「フランス語原稿の訂正作業、の4つの作業から計画された。このうち、(4)を除いて、以下のように成果が得られた。(1)については、2月に約2週間渡仏し、セーヌ=マリティーム県古文書館、防衛省歴史課古文書館、リール市古文書館で史料の収集に努めた。その成果の一部は現在執筆中の博士論文の実証を補強することになるであろう。(2)については、プレヴォ裁判の管轄・権限、騎馬警察隊の職務内容、騎馬警察隊員の親任状の内容を明らかにするために、かつて収集していた史料と今回新たに集めた史料の読解・分析を進めている。(3)については、論文3本(すべて単著、査読付き)を公表した。これらの論文、すなわち「18世紀前半期オート=ノルマンディー地方のマレショーセ隊員-年齢、身長、軍隊経験-」(『西洋史学論集』第47号、2009年)、「オート=ノルマンディー地方のマレショーセ隊員の採用(17201750年)」(『総合環境研究』第12巻第1号、2010年)、「近世フランスの騎馬警察隊員の在職期間-18世紀前半期のオート=ノルマンディー地方の事例-」(『七隈史学』第12号、2010年)はそれぞれ現在執筆中の博士論文の一部である。また、2008年の日本におけるフランス近世・近代史の研究動向を総括・評価した「2008年の回顧と展望近代-フランス」の執筆も付け加えたい(『史学雑誌』第118編第5号、2009年)。なお、昨夏に提出予定であった博士論文は、上述の3本の論文公表との両立が難しく、未だ提出できないままである。しかし、すでにほとんど書き終え、細部を詰める作業にかかっており、本年7月までには提出する予定である。平成22年度の研究も、(1)フランスの古文書館における関係史料の収集、(2)史料の読解・分析、(3)論文執筆、(4)論文のフランス語への翻訳作業、フランス語原稿の訂正作業、の4つの作業から計画された。

(1)については、2月に約3週間渡仏し、セーヌ=マリティーム県古文書館、防衛省歴史課古文書館、ピュイ=ドゥ=ドーム県古文書館で史料の収集に努めた。ここで得られた情報は、現在審査中の博士論文の実証を補強することになるであろう。(2)については、プレヴォ裁判の管轄・権限、訴訟手続、運用の実態、騎馬警察隊の日常的な職務内容、活動の実態、騎馬警察隊員の親任状の内容などを明らかにするために、これまでに収集した史料と今回新たに集めた史料の読解・分析を鋭意進めている。(3)については、まず、学位申請論文「18世紀前半期(17201750年)のオート=ノルマンディー地方のマレショーセ-フランス絶対王政の統治システムにおけるマレショーセ改革(1720年)の意義-』を書き終え、一橋大学大学院に提出した(現在審査中)。その他、論文を1本、史料紹介を1本(いずれも単著、査読無し)公表した。前者は阪口修平編『歴史と軍隊-軍事史の新しい地平を目指して-』(創元社、2010年)所収の「地域住民とマレショーセ隊員-王権の手先?あるいは民衆の保護者?-」(同書54-84頁)であり、後者は「史料紹介王国のマレショーセの職務、統制、規律に関する規則となる王令(1716年7月1日)」(『文化環境研究』No.5、2011年、1221頁)である。いずれも当該研究課題に関連するものであるが、上述の学位申請論文の中には含まれず、それに続く研究、およびそれを補強する研究の成果である。
昆虫の細胞性免疫機構における包囲作用の解明

昆虫類は、体内に侵入した異物が血球より大きな場合は、多くの血球が集合して取り囲み包囲化することで侵入した異物を封じ込める細胞性防御反応を持つが、寄生可能な内部寄生蜂は、寄主体内でその防御反応を回避できる。寄生蜂が寄生時に寄主体内に注入するポリドナウイルスには寄主血球の異物への接着を阻止する働きをもつ遺伝子が存在し、毒液にも存在、さらに寄生蜂が孵化後に漿膜細胞由来のテラトサイトが同様な遺伝子を持つことが明らかになり、寄生直後から脱出まで働いていた。さらには寄主の血球に異物に付着して血球の周りにメラニンを形成し、異物にマークをつける細胞が存在し、寄生蜂が持つ因子で消失していることが明らかになった。新規血球を出来るだけ多く集める方法を考え、集めたサンプルから抽出したタンパクをSDS-PAGE泳動で分離し、一番可能性のあるバンドに対して抗体を作成、P200の抗体を得た。さらにarylphorinも検出されたことから抗体を作成した。蛍光ラベルした抗体で観察したところ確かに周りに沈着していることがわかった。細胞内には検出できなかった。p200は脂肪体細胞の中でも存在するか、またarylphorinが新規細胞から生産されているのかなどを現在切片insituを使って確かめている。もしarylphorinやp200が脂肪体細胞中でも検出されたら、この細胞の由来が脂肪体である可能性が出てきた。さらにimmunlectin2の抗体を作るために発現ベクターに入れて準備を進めているが、あまりうまく進んでいない。さらに寄生バチの持つ毒液でガラス面をコートすると血球が付着しないこともわかってきた。ただ短時間のみで効果が消える。毒液タンパクの中に、細胞の付着のためのintegrinかfocal adhesion complexの形成を阻害するタンパクが含まれている可能性もある。一方で脂肪体細胞から遊出してくる細胞の挙動も観察しメラニン化し多部分への付着も観察した。寄生蜂の毒液は寄生初期に働き、その後をポリドナウイルス(PDV)またはウイルス用粒子(VLP)が、その働きを引き継ぐと考えられることから、毒液とPDVやVLPの遺伝子を鋳型にして同じプライマーでとれてくると予測した。まずはスライドグラスに毒液をコートすることで血球の接着がおこらないことをあきらかにし、現在クローニングを行っている。さらに細胞接着にかかわる因子としてCalreticulinやCofilinがPDVやVLPの注入によりどのように変化するかをRT-PCRを使ってPDVやVLPの影響で抑制されていることを明らかにした。抗calretuculin抗体で血球の識別も行った。さらにアワヨトウの顆粒細胞(Gr)とプラズマ細胞(PL)を分ける方法を検討し、かなりの確率で2種の血球を別々のスライドグラス上にとれることが可能となった。これを使って新奇血球(HSC)を分画するとプラズマ細胞の方に分画され、最初の予想とは異なった。PDVの注入後6時間くらいでHSCガなくなることから、どのようにPDVがこの血球の消失と関連するのかを明らかにしていく。PDVに存在する脱リン酸化酵素(PTP)のクローニングを行い5種類のシークエンスを決定した。これを使ってGrとPLのどちらに多く発現しているのかを明らかにし、血球の接着性との関連性を明らかにする。VLPのMp17は、細胞の接着および細胞が接着した場合それをはがす働きを持つが、その遺伝子がテラトサイトの中にも存在し、ハチの卵期間および幼虫期の異物認識血球の接着を阻害している可能性をPCRおよび抗体を作成し示した。リン翅目幼虫が持つ生体防御反応は、かなり巧妙な仕組みで異物を排除するが、寄生できる寄生蜂は非常に巧妙な仕組みを使ってこれを回避している。寄主が持つ血球は機能に基づく分類がなされていない。我々が見つけた異物表面に付着してメラニンを細胞の周りに形成するhyper spread cell (HSC)は顆粒プラズマ細胞に分類されると考えられ、その性格付けを行った結果、フェノール酸化酵素前駆体(PPO)、フェノール酸化酵素活性化酵素(PPAE)、serine proteinase様酵素(SPH)を持つことがわかった。これら酵素で異物に付着後に細胞の周りにメラニン沈着を形成するものと考えられる。現在これらの抗体を作成し、寄主体内での血球の挙動を明らかにしている。この血球の発見により寄生蜂側のの制御も解析しやすくなった。そこで血球の伸展接着に着目し、解析を行ったところ寄生蜂が持つ寄主制御要因として、今まで毒液はpolydnavirus (PDV)の寄主血球への侵入を助けるだけと考えられていたが、寄主血球の伸展接着に関与する遺伝子とよく似た遺伝子がPDV内にコードされているとともに、毒液にも存在することが明らかになってきた。

これらの遺伝子のRNAの発現はそれに相当する寄主遺伝子の発現と拮抗していること。また寄主血球は寄生後24時間位内にapoptosisが起こり、HSCが消失している可能性が示唆された。またおなじコマユバチ科に属し、同種の寄主に寄生できる寄生蜂でPDVを持たないvirus like particle (VLP)をもつものでも、同じ様な機能を持つ遺伝子を持つことがわかり、PDVの進化の解明にも貢献するものと考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。新規血球が放出しているタンパクを同定するために、レーザーダイセクション法で切り出してRNAの採集を試みてかなりの労力を払ったが、残念ながらいまだに成功していない。そこで別の方法で発現遺伝子を特定しようとしている。異物の周りに付着する血球を回収しそこから発現するRNAを捕らえているために時間がかかっている。新奇血球をレーザーダイセクションでとり、RNA抽出を何回か試みたが殆どRNAが取れてこない。また新奇血球の投稿した論文が受理されずこちらも留まっている。まず論文が受理されなければ、次のこの細胞が寄生された場合に制御されているという論文が投稿できないが、次の論文等の準備を進めて最終年度での決着を付ける。脂肪体のESTデータベースを構築する予定。現在新規血球の周りに付着するタンパクでP200、arylphorinの抗体を作成中、さらにimmunelectin2とPO activating enzymeを発現ベクターに入れて抗体を作成予定1.新奇血球で発現しているフェノール酸化酵素活性化酵素のクローニングを終了し、抗体を作ることで新奇血球の性格付けを進める。2.細胞の接着や細胞分裂を阻止しているのに大きな役目を果たすと思われる脱リン酸化酵素をクローニング、抗体作成などにより、寄生蜂の寄主制御機構を明らかにする。3.カリヤコマユバチは日本に分布する寄生蜂で終齢まで寄生できる特別な機構を持つ寄生蜂である。C.ruficrusは、他の寄生蜂と同様に若齢にしか寄生できない。この違いを明らかにすることで、どのように包囲作用を阻害するのか、またHSCの性格付けもにも貢献する。ギンケハラボソコマユバチ(Mp)は内部寄生バチのPDVの原型になっていると考えられることから、Mpの毒腺をクローニングしてPDVと同様に脂肪体に作用すると思われる遺伝子を特定し、寄生バチのPDVの進化を明らかにする.クローニングからシークエンスのキットを購入する。HSCの収集のために、レーザーダイセクションを使うことが当初の計画であったが、殆どRNAが回収できず、研究が遅れ気味となった。そこで検討を加えるためにSDS-PAGEの泳動結果から、特異的と思われるP200タンパクに着目し、抗体を作成した。作成した抗体で処理しラベルした細胞をセルソータで集めて検討を加えることにする。そのために必要な薬品類などにこの金額を当てる。
ゲノムリプログラミングに関与する初期胚特異的RNA機能分子の同定。

本研究では、マウス未受精卵および2細胞期の初期胚からRNA分画を抽出し、さらにマイクロRNAを含む短鎖長の核酸分子分画を精製した。精製した分画からアダプター分子を付加したのち、アダプター配列をプライマーとして増幅し、クローニングした。クローニングされた最終産物の塩基配列を決定して、その分子の新規性などを検討した。その機能解析の一貫として、マウス受精欄前核への注入などを行い、胚発生への影響などを検討した。最近の発生生物学の動向において、ncRNA分子に代表される非翻訳分子が脚光を浴びている。miRNA分子による、同時に複数の類縁分子の発現抑制する可能性が発生プログラムにおいて1対1のタンパク質間相互作用だけでは説明出来ない現象を補完しうると考えられたからである。そして、最近、受精卵において内因性のsiRNA効果が提示された。これは前述のmiRNAの能力が生理機能として働いていることを示している。卵子内で蓄積されたRNAはがどのように選択的に翻訳され、どんな機能を担っているか、どのような選択的翻訳制御機構が働いているかにすいての核心部分は以前未知なままである。本研究において同定されたncRNAが、選択的な翻訳抑制に機能することが期待され、具体的にどのような分子が関連するかが今後の重要なテーマとなる。本研究は、胚発生の最初の遺伝子発現制御メカニズムにおいてRNA機能分子に着目して研究を進めた。RNA研究基盤がないところからの出発であったが、現在進行中のホットな事象へのアプローチになったため、テクノロジーの進展にも助けられた面も多い。実験プロトコールの取捨選択には十分考慮すべきであるという点も本研究の遂行過程で学んだ点でもあった。得られた成果を受精時のメカニズムの理解に掘り下げるだけでなく、関与することが予想される生体現象についても新しい視点を投げかけたいと考えている。本年度の研究成果として、初期胚および胚性幹(ES)細胞からmiRNA分子群が単離できる実験系の構築が挙げられる。miRNA分子は17-25塩基対ほどの小分子であるため、クローニングが比較的難しいものとされている。本研究では、non-coding RNAのパイオニアの一人であるBartelらの方法を参考にし、初期胚からのmiRNA分子の単離を進めてきた。マウス1細胞後期、およびES細胞からtotal RNAを抽出し、低分子RNA群を分離した後に、逆転写反応、アダプター付加反応をそれぞれ行った。さらにアダプター配列を鋳型プライマーとしてPCRを用いて増幅し、目的分子群のクローニングを行った。その結果、seed配列を含むと考えらえるcDNA断片のクローニングに成功している。一方で、当該領域のテクノロジーの進捗は早く、本研究の遂行と並行して、数種類のクローニングのためのキットが販売されている。クローニングに向けた基本原理は同じであるが、条件がより最適化されていると考えられるため、これらの材料を効率よく取り入れ、本研究の推進を加速させたいと考えている。また、本研究の遂行中に、初期胚におけるmiRNAの報告が続いている(Watanabe T., et al., Genes Dev. 2006, Tang F., et al., Genes Dev., 2007)。とくに後者の報告では、初期発生におけるmiRNAの網羅的探索が行われており、miRNAの生体機能への重要性はますます高まると予想される。本研究では、miRNAのリプログラミングという生命現象への関与を検証することが第一の目的であるため、報告された分子群を含めて、本研究を推進したいと考えている。
胆汁うっ帯性肝障害の胆汁分泌機能(胆汁酸利胆剤の代謝及びその治療効果)

前年度の研究に引き継き,デヒドロコール酸の代謝産物についての測定法を確立し,更に内部標準物質を加える事により, GC-MSを用いて高い精度で定量する事が可能となった. (その一部は, Chem, Pharm, Bul).に速報として発表した.投与されたデヒドロコール酸は,肝において還元,抱合を受け,胆汁中に分泌される.生体に由来する,所謂内因性胆汁酸と区別するため, 24-14Cコール酸を入手し,ジョーンズ酸化により標識デヒドロコール酸の合成を行なった.この標識体を閉塞性黄疸作製ラット及び対照ラットに投与し胆汁を経時的に採取した.投与後3時間で対照ラットにおいて約90%の標識体が回収されたのに対し黄疸ラットでは著しく回収率が低下した.また, 7及び12位のケト基の還元率も黄疸ラットでは低下し,閉塞性黄疸解除後という病態下においてデヒドロコール酸の肝における代謝及び輸送は低下する事が示された.非標識体を用いた実験では,投与量と閉塞の期間を変化させ検討した.胆汁量は黄疸群において対照群より高く,またデヒドロコール酸に対する反応もより大きかった.総胆汁酸分泌量は胆管閉塞により明らかに低下し,閉塞期間が長くなる程低下の度合が強かった.他の胆汁脂質であるコレステロール,リン脂質もほぼ同様の傾向を示した.以上より閉塞性黄疸解除後の病態下ではデヒドロコール酸の代謝,輸送のみならず胆汁成分すなわち,胆汁流量,内因性胆汁酸等の胆汁脂質の分泌も阻害されしかも閉塞期間の長さによってより強くなる事が実験的に確認された.この事は採取された胆汁成分の分析によって肝機能障害の判定を行い得る可能性のある事を示唆している.前年度の研究に引き継き,デヒドロコール酸の代謝産物についての測定法を確立し,更に内部標準物質を加える事により, GC-MSを用いて高い精度で定量する事が可能となった. (その一部は, Chem, Pharm, Bul).に速報として発表した.投与されたデヒドロコール酸は,肝において還元,抱合を受け,胆汁中に分泌される.生体に由来する,所謂内因性胆汁酸と区別するため, 24-14Cコール酸を入手し,ジョーンズ酸化により標識デヒドロコール酸の合成を行なった.この標識体を閉塞性黄疸作製ラット及び対照ラットに投与し胆汁を経時的に採取した.投与後3時間で対照ラットにおいて約90%の標識体が回収されたのに対し黄疸ラットでは著しく回収率が低下した.また, 7及び12位のケト基の還元率も黄疸ラットでは低下し,閉塞性黄疸解除後という病態下においてデヒドロコール酸の肝における代謝及び輸送は低下する事が示された.非標識体を用いた実験では,投与量と閉塞の期間を変化させ検討した.胆汁量は黄疸群において対照群より高く,またデヒドロコール酸に対する反応もより大きかった.総胆汁酸分泌量は胆管閉塞により明らかに低下し,閉塞期間が長くなる程低下の度合が強かった.他の胆汁脂質であるコレステロール,リン脂質もほぼ同様の傾向を示した.以上より閉塞性黄疸解除後の病態下ではデヒドロコール酸の代謝,輸送のみならず胆汁成分すなわち,胆汁流量,内因性胆汁酸等の胆汁脂質の分泌も阻害されしかも閉塞期間の長さによってより強くなる事が実験的に確認された.この事は採取された胆汁成分の分析によって肝機能障害の判定を行い得る可能性のある事を示唆している.本研究は胆汁うっ滞肝に対し、胆汁酸利胆剤(デビドロコール酸)を投与することにより(1)その還元化能から肝機能を評価すること(2)障害肝に対する利胆効果-治療効果の検討を行うことを目的としている。従来の胆汁酸測定法では、投与されたデヒドロコール酸の肝での代謝産物を充分に分離し同定或いは定量することが困難であったが、ステロイド骨格のケト基をハイドロキシムに置換、ジメチルエチルシリルエーテル誘導体化し、ガスクロマトグラフ-質量分析計を用いる分析系を確立した。その結果、従来はその存在が間接的に推測されていたに過ぎない新たな代謝産物を含み6種類の代謝産物を分離同定しえた。また内部標準物質を加えることにより定量も可能となった。ラットを用い実験的に閉塞性黄疸を作製し、閉塞解除後にデヒドロコール酸を投与した場合、正常ラットに比ベ利胆効果が遅延し、これら代謝産物の胆汁中排泄も遷延するが、ケト基の位置により還元化能が正常と異なることも明らかとなり障害肝の機能評価法としての有用性が示唆された。人においても同様の知見が得られつつあり臨床応用も可能と考えられる。一方、胆汁うっ滞患者では異常胆汁酸や胆汁アルコールの尿中排泄が増加することが知られており、著者らは3B-hydroxy-5-cholenic acidのラジオイムノアッセイによる測定法を開発し、この尿中排泄量が胆汁うっ滞をよく反映する事を明らかにした。また尿中胆汁アルコールの分析により、閉塞性黄疸解除後にも、胆汁うっ滞により惹起された胆汁酸代謝異常が遷延することを明らかにした。今後、臨床的に肝機能評価法として或いは治療法としての胆汁酸利胆剤の有用性を検討する際に、還元化能や胆汁分泌能に加え、3B-hydroxy-5-cholenic acidや胆汁アルコールの尿中排泄も指標となる可能性があり、あわせて検討する予定である。