hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エノール型チミンとグアニン間での塩基対形成の可能性に関する研究

昨年度までの報告書において,これらの互変異性体に相当する安定型イソスターの設計と合成を報告した。さらに,これらイソスターの構造を計算化学的手法により最適化し,親化合物である核酸塩基互変異性体の構造と比較し,それぞれが構造的にも電子的にも近似していることが判明した。今回は,フッ素/水素間の水素結合の有無を調べるために,フルオロベンゼン構造を含むワトソン・クリック型塩基対擬似モデル化合物の合成を試み,1H-NMRを測定した。分子設計は,フルオロベンゼンと,ベンゾイミダゾールあるいは芳香族アミンとを,酸素あるいは炭素で架橋することとした。すなわち,o位にフッ素を持つ化合物(1a:5-(2-Fluoro-phenoxy)-1H-benzoimidazol-4-ylamine;2a:6-(2-Fluoro-phenoxy)-1H-benzoimidazol-5-ylamine;3a:2-(2-Fluoro-phenoxy)-phenylamine;4a:3-(2-Fluoro-phenoxy)-pyridin-2-ylamine;5a:4-Chloro-2-(2-fluoro-benzyl)-phenylamine)と各々に対応するフッ素を含まない化合物1b-5bをモデル化合物とし合成を行った。次に得られた化合物の1H-NMRを測定して水素結合の有無を調べた。まず,DMSO-d6溶媒中で化合物1,2のアミノ水素の化学シフトを観察し,フッ素置換体と非フッ素置換体での差異について調べた。なお,測定は,いずれも0.05mmol/mlの濃度の試料を用い,室温にて行った。その結果,化合物1aのアミノ水素は,非フッ素体1bと比較し,0.148ppm低磁場シフトしていることがわかった。同様の低磁場シフトは化合物2aと2bの場合にも観察された。化合物1と2はCDCl3には不溶であったため,次により単純な化合物3-5を用いて,CDCl3およびDMSO-d6中にて測定を行った。その結果,測定溶媒の種類に関係なく,すべての場合で,フッ素化合物3a-5aのアミノ水素の化学シフトの方が,非フッ素体3b-5bのものより0.078-0.243ppm低磁塲シフトしていることが判明した。突然変異は,核酸塩基の互変異性体(エノール型異性体)が,関与しているといわれている。しかし,互変異性体はごく微量しか存在しないため,合成することはもとより確認することすら難しい。そこで塩基の互変異性体に相当する化合物,すなわち,エノール型イソスターを設計し合成することを試みた。まず,チミンエノール型イソスター分子の合成を行った。分子計算化学的手法を用いた分子設計により,塩基部に5-Fluoro-2-methyl-phenolを組み込んだデオキシリボースがチミンエノール型イソスターになりうることがわかった。合成は以下のように行った。まずフルオロメチルアニリンのアミノ基を水酸基に変換後,臭素化,さらに水酸基をTBDMS基で保護して塩基部を合成した。続いて,2,2-Diisopropyl-tetrahydro-furo[3,2-d][1,3,2]dioxasilin-6-oneと縮合,トリエチルシランによる還元,つづいてシリル基を脱保護して標的のチミンエノール型イソスター,5-(2-Fluoro-4-hydroxy-5-methyl-phenyl)-2-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-3-olを合成することに成功した。続いて,グアニンエノール型イソスターの合成を行った。分子の設計にあたっては,先と同じく,HF-6-31G**を用いて解析した結果,互変異性に関与する窒素原子を炭素原子に置き換え,エノール構造しか取りえないフェノールタイプの化合物を,すなわち,アミノヒドロキシベンズイミダゾールが立体的にも電気的にもアデニンの等価体となることが判明した。そこで,アミノヒドロキシベンズイミダゾールを持つデオキシリボースの合成を行うこととした。まず,トリニトロベンゼンのひとつのニトロ部をメトキシ化した後,さらにニトロ化,2回の還元を経て,ジアミノ体に導いた。蟻酸ナトリウムで環化してベンゾイミダゾール環を合成した後,メトキシ基を臭化水素酸で処理して脱メチル化し,核酸塩基部の合成を完了した。このものと糖クロル体とをカップリングしたのち,脱保護,還元反応を経て目的のグアニンエノール型イソスターの合成に成功した。突然変異は,核酸塩基の互変異性体が,関与しているといわれている。しかし,互変異性体は合成することはもとより確認することすら難しい。そこで塩基の互変異性体に相当するエノール型イソスターを設計し合成することを試みた。計画書に伴い,グアニンのエノール型異性体として,2-Amino-5-trifluoromethyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-olを合成することを計画した。この化合物は,5位にトリフルオロメチルを持ち,フッ素の強い電気陰性度のために,環内の電子が不足している。そのため芳香化して安定化すると予想される。また,フッ素原子は隣接するエノール水素と水素結合を形成する可能性が高いため,エノール型構造を安定化すると考えた。

さらに,この化合物は電気的および立体的な面からグアニンエノール構造にそっくりであることからも,絶好のグアニンエノール型ミミックであるといえる。合成は以下のように行った。まず,1-Chloro-3,3,3-trifluoro-propeneを金属ナトリウムの存在下,メタノールと反応させ,3,3,3-Trifluoro-1-methoxy-propeneを収率良く得た。続いてこの化合物をヘキサン酸中,ジメチルスルホン酸存在下で加水分解を行って,3,3,3-Trifluoro-propionaldehydeに変換した。得られたアルデヒドを酢酸中で臭素を作用させ,2-Bromo-3,3,3-trifluoro-propionaldehydeを収率良く合成した。この臭化アルデヒドをDMFと水の混合溶媒中2,6-Diamino-pyrimidin-4-olと室温で反応させた後,酢酸ナトリウムを加え1昼夜加熱還流することにより,目的とする2-Amino-5-trifluoromethyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-olをごく微量であるが得ることに成功した。この化合物の構造をさらに確認するため,無水酢酸およびピリジン中で加熱撹拌してアセチル化を施し,アセチル体として構造を決定した。また,これとは別に包水フロラールをDMFと水の混合溶媒中にて,2,6-Diamino-pyrimidin-4-olと室温で反応させた後,酢酸ナトリウムを加え1昼夜加熱還流すると,7-Amino-2,4-bis-trifluoromethyl-1,4-dihydro-2H-pyrimido[4,5-d][1,3]oxazin-5-olが一挙に得られることがわかった。この化合物の環骨格は,5/6システムではなく6/6システムであるが,電気陰性度の高い2つのトリフルオロメチル基で置換されているため環内が電子不足状態となったエノール構造をとる化合物であり,興味深いイソスターになりうると考えている。昨年度までの報告書において,これらの互変異性体に相当する安定型イソスターの設計と合成を報告した。さらに,これらイソスターの構造を計算化学的手法により最適化し,親化合物である核酸塩基互変異性体の構造と比較し,それぞれが構造的にも電子的にも近似していることが判明した。今回は,フッ素/水素間の水素結合の有無を調べるために,フルオロベンゼン構造を含むワトソン・クリック型塩基対擬似モデル化合物の合成を試み,1H-NMRを測定した。分子設計は,フルオロベンゼンと,ベンゾイミダゾールあるいは芳香族アミンとを,酸素あるいは炭素で架橋することとした。すなわち,o位にフッ素を持つ化合物(1a:5-(2-Fluoro-phenoxy)-1H-benzoimidazol-4-ylamine;2a:6-(2-Fluoro-phenoxy)-1H-benzoimidazol-5-ylamine;3a:2-(2-Fluoro-phenoxy)-phenylamine;4a:3-(2-Fluoro-phenoxy
ポスト・デモクラシー状況下のウェストミンスター・モデル憲法の理論的・実証的研究

2010年総選挙後の連立政権下でのイギリスの憲法変動を、民主主義の「劣化」というポスト・デモクラシー状況を踏まえて検討し、研究組織メンバーに課題を分担して成果を上げるとともに、各年度の春秋の研究会や夏季の合宿研究会等による共同研究として「ウェストミンスター・モデル」憲法の最近の変化を明らかにする成果をあげた。また、2012年春にはイギリスから憲法研究者を招聘し、13年秋にはロンドン大学で、2回の「日英憲法セミナー」を開催し、研究交流で成果を上げ、国際的共同研究の基盤を築いた。共同研究の成果の概要はすでに冊子にまとめられ、さらに科研の出版助成をえて論文集を上梓する予定である。本科研初年度の研究計画は、本科研の研究課題の達成に向けて、研究分担者および連携研究者それぞれの研究担当課題について研究を開始するとともに、現時点での研究の達成状況を研究会を通して発表、交流し、その成果を共有することにあった。そのために、春期学会に合わせて5月13日に研究分担者の報告による研究会をもち(関西学院大学東京丸の内キャンパス)、8月31日から9月2日にかけては、松本市において、合宿研究会を開催した。この合宿研究会では、研究分担者・連携研究者のほか、若手の研究協力者からも最近のイギリス憲法の各分野の最新の動向等を中心に計9件の報告とそれに基づく議論を行った。また、その場では、各分担者の研究の進捗状況と、本科研共同研究の今後の進め方についての議論と意思統一を行った。また、若手研究分担者・研究協力者を含むのべ8人によるイギリスおよびニュージーランドへの実地調査を行った。これらを通して、本科研初年度においては、研究課題であるウェストミンスター・モデルの変動について、イギリスを中心とした最近の憲法動向(2010年総選挙による政権交代後の選挙制度改革レファレンダム(2011年5月)を中心とした統治制度改革、人権法を中心とした人権保障制度のほか、地方議会、移民、平等、表現の自由等の個別分野での動向)を把握し、また、イギリス・モデルを出発点としながらも変容を進めているオーストラリアとニュージーランドの動向(人権保障、成典憲法かなど)についての情報の収集と分析を行い、ウェストミンスター・モデルというイギリスを中心とした憲法モデル(また、それは、日本の政治改革にも大きな影響を与えている)の変容についての重要な論点についての出発点となる研究成果を得ることができた。最終年度として研究組織メンバーの研究を前進させ、共同研究としての研究課題達成のための研究を着実に進展させるとともに、次のような活動を行い成果を得た。まず、春季と秋季の学会に合わせて新潟(2013年5月。報告者:倉持孝司[研究分担者])及び龍谷大学(同10月。テーマ:日英憲法セミナーの成果と今後の課題について等)で研究会と研究の進め方の検討を行い、8月には長野県諏訪市で2泊3日の合宿研究会を持ち(報告者:松井幸夫、小松浩、成澤孝人、岩切大地、佐藤潤一[以上、研究代表者、研究分担者]、植村勝慶[連携研究者]、榊原秀訓、杉山有沙、村上玲[以上研究協力者])、研究成果や情報の交換、進捗状況の確認と以後の研究の進め方や課題を議論した。また、前年4月に龍谷大学で開催した国際セミナーを発展させ、2013年9月13-14日にロンドン大学キングスカレッジで2回目の国際セミナーを開催した(日本側の報告者:松井幸夫、柳井健一、倉持孝司、元山健[以上研究代表者、研究分担者]、愛敬浩二[連携研究者]。イギリス側の報告者7人)。これらを通して、イギリス憲法および憲法理論を中心にウェストミンスター・モデル憲法についての研究を大きく進展させることができた。また、前年度に続いて国際セミナーを開催したことによって、イギリス憲法学の理論状況と共に、私たちの問題・課題意識および成果とイギリス憲法学との接点・異同等について大きな収穫を得、今後の国際的共同研究の足がかりを築くことができた。研究の成果の概要は、冊子『イギリス憲法の「現代化」と憲法学』(2014年4月)でまとめ、本格的な成果の公表は秋には科研費(出版助成)を申請して出版する予定である。初年度の成果を踏まえて研究組織メンバーの研究を前進させ、共同研究としての研究課題達成のための研究を着実に進展させることができた。まず、ロンドン大学・キングスカレッジのキース・ユーイング教授を招いて、4月21日に龍谷大学深草キャンパスで研究セミナーを開催した(使用言語は英語)。同セミナーでは、ユーイング教授の報告(同報告の邦訳は『法と政治』63巻4号に掲載)と、これに対する日本側の報告4本(元山、柳井、江島ー以上研究分担者、愛敬ー連携研究者)に基づいて議論を行った。司会は松井が担当。

セミナーには本科研研究組織外のイギリス憲法研究者およびイギリス行政法研究会のメンバーも参加した。このセミナーによってイギリス憲法学の理論状況と共に、私たちの問題・課題意識および成果とイギリス憲法学との接点・異同等について大きな収穫を得、次年度ロンドン大学での日英の憲法学者による共同シンポジウム開催の足がかりを築くことができた。また、春期学会に合わせて研究会をもち(5月11日龍谷大学深草キャンパス、報告者:松原ー研究分担者)8月28日から30日にかけて、岡山県津山市で合宿研究会を開催し(報告者:元山、柳井、小松、佐藤ー研究分担者、愛敬ー連携研究者)、秋期学会時には外部報告者による研究会(10月5日明治大学)をもって、最近のイギリスの憲法状況を議論した。同時に、これらの場では、本研究課題に関する情報に交換と、今後の共同研究の進め方や課題を話し合った。さらに、のべ5人によるイギリスおよびニュージーランドへの実地調査を行い、当地でのインタビュー・意見交換を行うと共に、在外研究中の松井を交えてイギリスでの日英合同シンポジウム等今後の研究方向についての打ち合わせを行った。これらを通して、イギリス憲法および憲法理論を中心にウェストミンスター・モデル憲法についての研究を大きく進展させることができた。研究分担者の役割分担についてはそれぞれが研究に着手し、個々的には遅れもみられるものの、すでにそのいくつかについては上記研究会で報告がなされ、また、下記の研究成果にも示されている。研究課題全体についても、合宿研究会等においてその意義等について意見交流し、今後の展開の基礎を築くことができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究成果では、ロンドン大学のK.ユーイング教授を招いて行った研究セミナーであり、とりわけ同教授の報告と議論によって、本科研の研究課題であるウェストミンスター・モデル憲法の近年における変動と理解について、イギリス憲法学と同教授の考え方を知り、議論でき、さらに本研究組織の共通認識とできたことは大きな成果であった。また、研究分担者の分担課題については、それぞれが研究をすすめ、すでにそのいくつかについては上記研究会で報告がなされ、また、下記の研究成果にも示されている。また、共同研究としての研究課題全体についても、合宿研究会等においてその意義等について意見交流し、最終年度の研究に反映させ、さらにその成果を交換する目的に向かって前進することができた。このように本科研研究は着実に前進しているが、個々の研究分担者についてはその進捗が他と比べて遅れているものが何人か見られる。24年度については、ロンドン大学キングス・カレッジKeith Ewing教授を招聘して、4月末に本科研の研究課題にかかわるシンポジウムを開催する予定である。このシンポジウムでは、3人の研究分担者も報告を行い、そこでの成果を踏まえて課題達成のために各研究を推進する。また、夏の合宿研究会と秋の全国学会に合わせた研究会において、研究分担者、連携研究者等によるの個別報告と議論によって、研究の進捗状況の確認と成果の共有化を図り、研究を推進したい。これら作業を通して、最終年度に向けての研究成果の集約と公表の準備も進めていく。
わが国の観光産業のインバウンド戦略を支援する会計システムの探究

本研究では、わが国の観光産業がインバウンドの集客力を高め、収益性の劇的な改善を図るうえで、効果的なインバウンド戦略の立案とその実現を支援する情報システムの構築に向けた操作性に優れた方法論の探究を目指した。あわせて、各種の観光産業間の有機的なコラボレーションのあり方についても検討を行った。具体的には、上記の情報システムのベースとなるモデルを提示し、民間企業の協力の下アクションリサーチによっての効果の検証を行った。他方で、後者のコラボレーションに関しては、面接および体験調査により、その促進および阻害要因を明らかにするとともに、ツーリズム研究の新たな方法論に関する検討も行った。過去数年間に渡って、われわれ研究グループはサービス産業における戦略マネジメントシステムの変革(サービス・リエンジニアリング)に関する研究に取り組んできた。本研究は、これをわが国の観光産業、とりわけホテル・旅館等の宿泊産業をターゲットに、当該産業が海外からの集客力を高め、収益性の劇的な改善を図るために不可欠となる優れたインバウンド戦略の立案とその実現を支援する会計システムに関する、具体的かつ操作性に優れた方法論の探究に応用することを目的として企画された。初年度は主に宿泊産業の低収益構造の原因解明のためのフィールドリサーチと、前述のシステムのベースとなるモデルの構築に全力をあげてきた。その結果、後者のモデルそのもののはぼぼ構築することができ、その妥当性の検証を目指すアクションリサーチを待つ段階にこぎつけることができた。他方で、本研究は宿泊業とその周辺産業の有機的なコラボレーションの在り方を探究することも目的の一つとしてきた。すなわち、宿泊業のみの努力によって海外からの観光客を多数呼び込めるわけではない。換言すれば、運輸産業や飲食産業をはじめとする他の関連産業との有機的なコラボレーションが組織されてはじめて、それは可能となる。それゆえ、本研究ではこうしたコラボレーション(ツーリズム・サプライチェーン)のあり方についても検討を行い、そのためのガイドラインを提示するすることも視野においている。残念ながら、初年度においては、前述のモデル構築にフォーカスをおいたことから、後者の目的に資する研究活動には十分な時間を割くことができなかった。そこで、28年度はこの点を埋めるためのリサーチを重視する予定である。初年度の活動は、宿泊産業の低収益構造の原因解明および改善に向けた課題の明確化を目的としたフィールドリサーチと、宿泊産業が海外からの集客力を高め、収益性の劇的な改善につながる優れたインバウンド戦略の立案とその実現を支援する会計システムの核となるモデルの構築を、研究の2つの柱として計画された。もっとも、後者のモデルそのものは28年度中の完成を予定していたものの、初年度中にほぼ完成にこぎつけることができた。くわえて、モデルの有効性の検証と革新を目的とするアクション・リサーチの協力サイトも見つかり、すでに実行の段階に入っている。また、モデルの完成度についての意見聴取を兼ねて、初年度の研究成果を公表するためのフォーラムを日本管理会計研究学会において企画し、28年度はじめ(4月)に開催することができた。このことから、本研究はわれわれの想定を超えたスピードで進行中であるが、その一方で、研究の企画段階では予想していなかった円安傾向によりインバウンド顧客が急増し、戦略的な対応をなんら講ずるまでもなく、宿泊業の業績は向上している。その結果、当該産業の構造的な問題点が見えにくくなっていると研究メンバー一同痛感しており、この点が研究上の大きな懸念要素となっている。本研究では、わが国の観光産業、とりわけホテル・旅館等の宿泊産業が海外から集客力を高め収益性の劇的な改善を企図する優れたインバウンド戦略の立案と実現を支援する会計システムの構築に向けた、具体的かつ操作性に優れた方法論(サービス・リエンジニアリング)の探究を目指して活動を行ってきた。具体的な支援ツールとなる分析モデル(サービスABCD)は初年度に完成し、昨年は山口県のビジネスホテル(ホテルサン防府)の協力を得て、イノベーション・アクションリサーチの実施に挑んだ。当該リサーチは現在も継続中であるが、中間報告の形でその経緯を近々公表する予定である。他方、本研究のもう一つの柱であるツーリズム・サプライチェーンの実施状況とその課題に関する調査に関しては、卓越したケースがなかなか探索できず難航しているのが現状である。ただし、度重なる調査を通じて、その課題はかなり鮮明になったと考えている。そこで、当該課題の根底にある要因をより詳細に分析し、これを解決するための道筋を見極めるべく、総力をあげて検討を行っているところである。そのほか、研究の過程で、従来の常識では説明が難しいインバウンド顧客の行動様式の解明という新たな課題も登場したことから、一部のメンバーが中心となって、体験型リサーチも実施した。これは、エスノグラフィカルなリサーチといえるが、短期的であることに加え、研究結果がリサ-チャーの興味や関心に左右される面も否定できない。それでも、体験を通じてはじめてインバウンド顧客が特定の場所や施設に集中する理由が理解できた部分も多々あった。そのため、こうした結果をさらに積み上げていくためにも、当該リサーチを確固たる方法論に仕立て上げることが有用と考えている。前述のように、インバウンド戦略の立案と実現を支援する会計システムのモデルの構築はすでに最終段階に入っていることが主な理由である。ただし、ツーリズム・サプライチェーンの実施状況とその課題に関する調査に関しては、卓越したケースがなかなか探索できず難航していることを再度付け加えておきたい。

本研究では、わが国の観光産業、とりわけホテル・旅館等の宿泊産業が海外からの集客力を高めるとともに、収益性の劇的な改善に向けた優れたインバウンド戦略を立案し、その実現を図るうえで、これを支援する有効な情報システムの構築に向けた、具体的かつ操作性に優れた方法論を探究すべく努力を重ねてきた。さらに、いかに卓越した戦略を描くことができたとしても、宿泊業のみの努力によって海外からの観光客を多数呼び込めるわけではないことから、運輸産業や飲食産業をはじめとする他の関連産業との有機的なコラボレーション(ツーリズム・サプライチェーン)のあり方についても検討を行ってきた。具体的には、前述の情報システムのベースモデルとなるサービスABCD(attribute-based cost deployment)を提示し、その有効性を確認するためのアクションリサーチを山口県防府市にあるビジネスホテルの協力を得て推進してきた。このアクションリサーチでは、あわせてサービスVE(value engineering)の適用可能性の検証も行った。加えて、ホテル産業におけるアメーバ経営の有効性に関する検討も他のリサーチサイトを対象に実施した。他方で、後者のツーリズム・サプライチェーンに関しては、主にインタビュー調査を通じて、その促進要因および阻害要因を明らかにすべく研究を進め、その成果の一部を提言にまとめてフォーラム等を通じて発信してきた。その他、インタビューおよび訪問調査を実行する際に体現した研究方法論に関する様々な疑問点および障害の解決につながるアプローチのあり方についても検討を重ね、その成果の一部は近々公表する予定である。本研究では、わが国の観光産業がインバウンドの集客力を高め、収益性の劇的な改善を図るうえで、効果的なインバウンド戦略の立案とその実現を支援する情報システムの構築に向けた操作性に優れた方法論の探究を目指した。あわせて、各種の観光産業間の有機的なコラボレーションのあり方についても検討を行った。具体的には、上記の情報システムのベースとなるモデルを提示し、民間企業の協力の下アクションリサーチによっての効果の検証を行った。他方で、後者のコラボレーションに関しては、面接および体験調査により、その促進および阻害要因を明らかにするとともに、ツーリズム研究の新たな方法論に関する検討も行った。今後の活動は、主に(1)初年度に構築した宿泊業のインバウンド戦略の立案およびその実現を支援するツールとなるモデルの妥当性の検証・革新を目的とするアクションリサーチと、(2)宿泊業とその周辺産業の有機的なコラボレーションの在り方の探究を、研究の2つの柱と設定している。(1)については、すでに山口県のビジネスホテルの協力のもと、実施段階に入っているが、他の協力サイトの発見にも注力していきたいと考えている。この点に鑑みて付言するなら、われわれが企図するサポートツールは主に管理会計的な手段をベースとしている。しかしながら、それだけで宿泊業の戦略マネジメントシステムとしての必要十分条件が満たされるわけではない。サービスの多くは人を介して提供されるものであり、戦略の策定もその戦略を実現に導くための活動もすべては組織構成員の努力と力量に委ねられている。
移動の文法獲得に関する理論的・実証的研究

移動の文法特性と言語獲得の問題を中心に1年間、理論的研究と実証的研究を行なった。移動についての理論的な研究として、ChomskyやKayneの提唱する文法論が日本語の関係節の特性についてもつ説明力について分析をすすめ、この研究成果をベルリン大学で開催された関係節についての学会にて(招へい)発表した。この論文は日本語オペレーター移動による関係節が存在しないことに理論的な説明を与える事を主旨とするものである。更に、日本語にみられ、英語にはみれらない「関係節」の特徴的な文法問題として、「半分」などを主要部にもつ複合名詞句の統語的特徴についての分析をおこない、論文に纒めた。また、移動に関して時と場所を示す付加詞が項としてのふるまいを示す分析を執筆した。言語獲得ついては、アルバイトの学生一名とともに、自らの移動に関する実証的研究に加え、過去に発表されている言語獲得データの中から関係節の発話だけをとりだし、構造別に分類する作業をおこなった。その結果、関係節は2才の段階で既に獲得されており、そして、その多くは主格を関係節化するものであるが、他の文法類型についても観察されることを、約80ページのデータ集として纒めた。今後は、この一年の研究成果を礎に、移動全般についての文法特性と言語獲得について、更に研究を進めたい。
Calreticulin陽性膵癌幹細胞の癌幹細胞性および病態生理の解析

平成30年度は我々が癌細胞株(以下Parent cell)から独自な方法で誘導した膵癌幹細胞様細胞豊富な細胞集団(Lm細胞)に含まれるCalreticulin(CRT)を表出した細胞の幹細胞性の解析を目的としていた。RT-PCRにおいては、Parent cellと比較し、CRT陽性細胞とCRT陰性細胞の両方で、Stemness geneであるALDH1A1およびNANOGが高発現し、EMT関連転写因子であるSNAILおよびSLUGの高発現が確認できた。さらにCRT陰性細胞と比較し、CRT陽性細胞ではNANOG, SLUGが高発現していた。RNA seqによる網羅的な解析により、CRT陽性細胞とCRT陰性細胞の性質の違いをさらに明らかにすべく現在解析を行っている。研究計画では、平成30年度はCRT陽性細胞の癌幹細胞性の解析を目的とし、腫瘍原性の確認、Stemness gene, RMT related geneの発現、RNAseqを主に行う予定としていた。「研究実績の概要」に示したように、そのいくつかで癌幹細胞性を示す結果が得られ、一部は解析の準備が整う段階になっている。以上より、計画はおおむね順調に進展している、と判断した。平成31年度はCRT陽性細胞の免疫逃避機構を含めた免疫学的機能の解析と同細胞に高発現した分子および活性化した代謝経路の同定を中心に研究を進める予定としている。使用する物品の効率的な使用により費用削減が可能となった。平成31年度は網羅的解析に多額の予算を要することが予想されるため、次年度使用額を効率的に使用する予定である。
モ-バイル環境への適応を具体例としたオペレーティングシステム発展機構に関する研究

近年、カーネルの発展性(extensibility)に関する要求が高まっている。新しい概念のハードウェアの出現や様々な応用プログラムの需要に応えるためには、発展性のあるカーネルが必要なのである。既存のカーネル発展機構には、マイクロカーネルとカーネルモジュール取込み(lkm:loadable kernel module)とがある。今年度の研究では、前者には発展部実行時の処理効率に、後者には発展部開発時の安全性に、それぞれ問題があることを明らかにした。また、これらの欠点を補った保護付きモジュール取込み(plkm:protected loadable kernel module)の概念を提案した。今後、本研究では、保護付きモジュール取込みの得失および実現法を考察し、最終的にはその実現を試みる。さらに、モ-バイル環境で多用される複製ファイルの間での一貫性を維持するプログラムを対象にして、保護付きモジュール取込みに要求される機能などについても考察する。
septoclastの軟骨吸収における異なる脂肪酸結合タンパク発現の意義

我々は、マウス骨端板の骨軟骨境界において非石灰化軟骨を吸収するseptoclastが、表皮型脂肪酸結合タンパク(E-FABP)を特異的に発現することを見出した。さらに一部のE-FABP陽性septoclastに脂肪細胞型FABP(A-FABP)が発現し、E-FABP欠損マウスでは、septoclastにA-FABP発現細胞数が増加することを見出した。本研究では、「septoclastによる骨端板軟骨吸収に伴い取り込まれた長鎖脂肪酸がE-FABPまたはA-FABPを介する作用により軟骨吸収機能に関与し、FABPサブタイプの発現バランスにより軟骨吸収を調節する」との仮説を検証する。
遺伝子改変動物や培養細胞を用いたコエンザイムQ10結合蛋白質の生理的意義の解明

代表者らはサポシンBがCoQ10結合蛋白質であることを報告してきた.サポシンB前駆体タンパク質プロサポシンのノックアウトマウスでは,CoQ投与食添加後の血漿中や臓器中の外因性CoQ量が低下し,外因性のCoQがミトコンドリアに到達しないことを見出した.ヒト肝がん由来HepG2細胞のプロサポシン発現量改変株解析の結果,高発現株ではCoQ10量が増加し,ノックダウン株では減少することを見出した.以上の知見から,サポシン類は,CoQ10量の維持に必須のタンパク質であると考えられた.代表者らはサポシンBがCoQ10結合蛋白質であることを報告してきた.サポシンB前駆体タンパク質プロサポシンのノックアウトマウスでは,CoQ投与食添加後の血漿中や臓器中の外因性CoQ量が低下し,外因性のCoQがミトコンドリアに到達しないことを見出した.ヒト肝がん由来HepG2細胞のプロサポシン発現量改変株解析の結果,高発現株ではCoQ10量が増加し,ノックダウン株では減少することを見出した.以上の知見から,サポシン類は,CoQ10量の維持に必須のタンパク質であると考えられた.ATP産生に不可欠であり抗酸化物質としても重要であるが,加齢とともに細胞内濃度が減少するコエンザイムQ10(CoQ10)が加齢・老化に伴う機能障害の鍵を握る物質の一つとして注目を集めている.脂溶性であるCoQ10の細胞内外への輸送にはその結合蛋白質が必須であり,代表者らは世界で初めてサポシンBがCoQ10結合蛋白質であることを明らかにした(J.Clin.Biochem.Nutr.(2008)42:167-174).遺伝子工学手法によりCoQ結合蛋白質サポシンBをノックダウンまたは高発現させたマウスや動物細胞を用いて,サポシンBの生理的意義や加齢・老化に対する影響を解明することが本研究の目的である.(1)プロサポシンノックアウトマウスを用いたCoQ10結合蛋白質の生理的意義の解明CoQ10結合蛋白質(サポシンB)の生理的意義を明らかにするために,サポシンBの前駆体であるプロサポシンのノックアウトマウスを解析した.そのヘテロ体の受精卵を入手し,繁殖させ,さらにヘテロ体を交配することによりホモ体が得られることを確認している.ワイルド体,ヘテロ体,ホモ体の各臓器中のCoQ等の濃度を測定し,比較した.さらにはCoQ添加食を投与し,ワイルド体,ヘテロ体,ホモ体の各臓器中のCoQ等の濃度を測定し,比較した.結果,ホモ体においては,CoQ投与食添加後の血漿中および臓器中の外因性CoQ量が有意に低下していることを認めた.(2)プロサポシン遺伝子改変培養細胞を用いたCoQ10結合蛋白質の生理機能の解明すでに樹立したヒト肝癌由来HepG2のプロサポシンの高発現株やノックダウン株を用いて,細胞内CoQ10量を解析した.高発現株ではCoQ10量が増加し,ノックダウン株ではCoQ10量が減少していた.ATP産生に不可欠であり抗酸化物質としても重要であるが,加齢とともに細胞内濃度が減少するコエンザイムQ10(CoQ10)が加齢・老化に伴う機能障害の鍵を握る物質の一つとして注目を集めている.脂溶性であるCoQ10の細胞内外への輸送にはその結合蛋白質が必須であり,代表者らは世界で初めてサポシンBがCoQ10結合蛋白質であることを明らかにした(J.Clin.Biochem.Nutr.(2008)42:167-174).遺伝子工学手法によりCoQ結合蛋白質サポシンBをノックダウンまたは高発現させたマウスや動物細胞を用いて,サポシンBの生理的意義や加齢・老化に対する影響を解明することが本研究の目的である.1,プロサポシンノックアウトマウスを用いたCoQ10結合蛋白質の生理的意義の解明サポシンBの前駆体であるプロサポシンのノックアウトマウスを解析した.本年度は,引き続きCoQ10添加食を投与したときの各種臓器におけるCoQ10量の解析を行った.結果,ホモ体においては,CoQ投与食添加後の血漿中および臓器中の外因性CoQ量が有意に低下していることを確認した.2,プロサポシン遺伝子改変培養細胞を用いたCoQ10結合蛋白質の生理機能の解明すでに樹立したヒト肝癌由来HepG2細胞のプロサポシン高発現株を用いて,細胞内CoQ10量を解析した.高発現株ではCoQ10量が増加していた.シュークロースグラジエント手法を用いて細胞分画をおこない各オルガネラのCoQ10量を比較したところ,ミトコンドリア分画においてCoQ10量の顕著な増加を認めた.ATP産生に不可欠であり抗酸化物質としても重要であるが,加齢とともに細胞内濃度が減少するコエンザイムQ10(CoQ10)が加齢・老化に伴う機能障害の鍵を握る物質の一つとして注目を集めている.脂溶性であるCoQ10の細胞内外への輸送にはその結合蛋白質が必須であり,代表者らは世界で初めてサポシンBがCoQ10結合蛋白質であることを明らかにした.遺伝子工学手法によりCoQ結合蛋白質サポシンBをノックダウンまたは高発現させたマウスや動物細胞を用いて,サポシンBの生理的意義や加齢・老化に対する影響を解明することが本研究の目的である.

1.プロサポシンノックアウトマウスを用いたCoQ10結合蛋白質の生理的意義の解明前年度までの解析により,プロサポシンノックアウトマウスでは,CoQ投与食添加後の血漿中および臓器中の外因性CoQ量が有意に低下していることを認めた.本年度は,さらに肝臓の細胞小器官を分画し,各細胞小器官におけるCoQ量を解析した.結果,プロサポシンノックアウトマウスでは,外因性のCoQがミトコンドリアに到達していないことを見出した.2.プロサポシン遺伝子改変培養細胞を用いたCoQ10結合蛋白質の生理機能の解明前年度までの研究により, HepG2のプロサポシンの高発現株やノックダウン株が樹立されている.高発現株ではCoQ10量が増加し,ノックダウン株ではCoQ10量が減少していた.本年度は各細胞小器官のCoQ10量を解析した.細胞小器官に分画して解析したところ,高発現株ではミトコンドリアCoQ10量が上昇し,ノックダウン株では減少していた.CoQ10はミトコンドリア電子伝達系に必須の因子である.高発現株を解析したところミトコンドリア呼吸活性が上昇していた.また,ノックダウン株では外因性のCoQ10の取り込みが低下することも明らかとなった.交付申請書の研究の目的として(1)プロサポシンノックアウトマウスを用いたCoQ10結合蛋白質の生理的意義の解明と(2)プロサポシン遺伝子改変培養細胞を用いたCoQ10結合蛋白質の生理機能の解明の2点を記載したが,いずれもほぼ計画通りに解析が進捗している.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の予定として,応募書類調書に記載したごとく,ヒト肝癌由来HepG2に加え,ヒト単球由来THP1等のプロサポシンのノックダウン株あるいはプロサポシンを高発現させた細胞株を作製する.さらに,サポシンBに生理作用があることを明らかにするために,サポシンB部位にミュータントを導入した細胞株の作製を試みる.各オルガネラとサイトゾル分画中のCoQ10含量やCoQ10の酸化還元状態の解析も併せて検討したい.24年度が最終年度であるため、記入しない。
臨場感の向上を目的とした視覚感性に基づく超階調表示

本研究では、256階調より多くの階調を大画面で表示することを可能にした。そして、従来の階調数を超える本表示の有効性を示すために、様々な階調数で表示した画像が観賞者にどのような印象を与えるかを主観評価実験により調査した。その結果、ある一定の階調数までは、階調数の増加に伴い画像の印象が向上し、特に肌や空などのグラデーション領域を多く含む画像においては顕著に向上するという、今後の表示装置の開発に有用な知見が得られた。本研究で提案する超階調表示が、どのような印象変化をもたらすかを調査することを目的とした。まず、評価項目として、印象評価に用いる評価語29語を、関連研究などから収集した643語からKJ法により選定した。次に、実験試料として、屋内外で撮影した多種多様なハイダイナミックレンジ画像を用意した。そして、これらの画像を、328階調、256階調、192階調、128階調、64階調、32階調の6種類の階調で表示した。また、実験環境はITU-R BT.710を基に設定した。そして、これらの条件下にて、本研究で提案する超階調表示が、どのような印象変化をもたらすかを、主観評価実験により調査した。被験者は、20代男性13名、女性8名の計21名とし、「そう思う」から「そう思わない」までの5段階の評価尺度を用いて、表示画像に対して各評価語の当てはまり度合を回答してもらった。その結果、実験試料の特徴と実験結果の関係より、表示画像のグラデーション領域が50%以上の画像においては、高階調であるほど画像の印象が向上する傾向が見られた。一方、グラデーション領域が50%未満の表示画像においては、本実験の輝度範囲において高階調化を知覚できない可能性が示された。また、「好ましさ」が「再現性」や総合評価とは異なる傾向を示していたため、高階調化により現実世界の見えに対する「再現性」や総合評価は向上しても、「好ましさ」は同様の傾向を示さないことが示唆された。超階調表示装置が有する従来よりも広い輝度範囲において,人間が認識可能な輝度差を解明し,この輝度差を表示可能な超階調表示に適した応答特性を提案することを目的とした.人の目が認識可能な最小輝度差を上回る輝度差を各階調に与えなければ,階調を認識することができず,階調が増加したことにはならない.そこで,より多くの階調を認識可能な応答特性を求めるために,超階調表示装置おいて,ガンマ値2.2と3.3,および医療用モニタの規格として用いられているグレースケール画像の表示関数であり,人の目が認識可能な最小輝度差に基づいたGSDF(Grayscale Standard Display Function)の3種類の応答特性を実装した.そして,それぞれの応答特性における認識可能な輝度差および階調数を被験者実験により測定した.また,比較のために,従来の表示機器においても,同様に認識可能な輝度差および階調数を測定した.その結果,本超階調表示装置では認識可能な階調数が従来の表示機器よりも増加していることが確認できた.さらに,各応答特性とGSDFの輝度差の比率と,各応答特性における認識可能であった被験者数の関係を解析した結果,本超階調表示装置において人が認識可能な輝度差を表示するためには,GSDFの約3.5倍の輝度差を与える応答特性が適している可能性が示された.超階調表示による印象変化と画像コンテンツの関連性を調査することを目的とした。まず、実験試料として、ハイビジョン・システム評価用標準動画像第2版から選定した画像や屋内外で撮影した多種多様なハイダイナミックレンジ画像から、風景や建物、人物、動物、光沢のある物体などを含めた16種類の画像コンテンツを用意した。ただし、画像コンテンツを選定する際に、画像中心に目を引き付けるものがある画像と目を引くものがない画像が半々になるように選定した。次に、これらの実験試料を、人の目が認識可能な最小輝度差に基づいたGSDF(Grayscale Standard Display Function)の輝度差を近似するように2台のプロジェクタの出力輝度を組み合わせて、530階調、256階調、128階調、64階調、32階調の5種類で表示した。そして、これらの階調表示における画像の印象と画像コンテンツの誘目性を、主観評価実験により調査した。評価語は、前年度の先行研究を参考に「好き」、「滑らかな」、「自然な」、「迫力がある」、「嫌い」、「粗い」の6語とした。被験者は20代男性13名、女性18名の計31名とし、被験者には「そう思わない」から「そう思う」までの7段階の評価尺度により、表示画像に対する各評価語の当てはまり度合を回答してもらった。さらに、全画像を評価した後にアンケートを実施し、評価する際に画像のどこを見て判断したかを印してもらった。

その結果、ある一定の階調数までは、階調数の増加に伴い、画像の印象が向上することがわかった。また、この向上は、画像コンテンツに強く影響されるが、肌や空などグラデーション領域を含む画像で起こりやすいと言えた。ただし、画像中にグラデーション領域が含まれていたとしても、それらが観賞者の目を引く対象でない場合は、印象変化は起こらない可能性が高いことも示された。感性情報処理次年度に計画していた評価画像や評価項目の選定を優先したほうが、研究実施計画全体として効率的であることがわかった。そのため、それらを優先して行ったことにより、今年度の計画に遅れが生じたが、研究実施計画全体としては、おおむね順調に進んでいる。応答特性の実装において,その精度をさらに検証する必要があるが,おおむね順調に進んでいる.実環境において高臨場感を与えるために必要な超階調表示の要素を取り入れた、視覚感性に基づいた超階調表示の応答特性を提案する。そして、視覚感性に基づいた超階調表示が、従来のガンマ値2.2に従う超階調表示よりも高臨場感を実現できるかを、主観評価実験により調査する。さらに、臨場感をどの程度高められたかを統計的な数値で示し、その有効性を評価する。まず,実環境において高臨場感を与えるために必要な超階調表示の要素を解明する.そして,これらの要素を取り入れた,視覚感性に基づいた超階調表示の応答特性を提案する.次に,視覚感性に基づいた超階調表示が高臨場感を実現できることを実証する.本研究に関する成果発表および情報収集のため本研究に使用する消耗品等の購入のため
ナノ細孔制御金属支持体上への新規酸素イオン伝導体のナノ薄膜化と高性能SOFC

イオン伝導におけるナノサイズ効果は、非常に興味ある現象として注目されており、種々のイオン伝導体について検討されている。本研究では混合伝導体におけるナノイオニクス効果を検討するとともに、LaGaO_3系酸化物のナノ薄膜を利用する高出力固体酸化物燃料電池(SOFC)の開発を検討した。Pr_2NiO_4系酸化物は優れた酸素イオン伝導性を有するが、Ptをナノサイズで添加することで、ホール伝導を抑制し、酸素イオン輸率の向上を検討した。その結果、期待したようにPtを1wt%添加した試料ではホールがトラップされ、全伝導度は低下するものの、酸素イオン伝導性は低下しないことがわかった。そこで、Ptナノ粒子の添加は酸素イオン輸率の向上に有効であることが見出された。一方、PLD法によるLaGaO_3系酸化物の薄膜化を検討した。目的とする組成のLaGaO3膜の作成を検討し、ターゲット組成を最適化することで、膜厚4μmの目的組成の薄膜が得られた。作成した薄膜を用いてSOFCを組み立て、発電特性を検討したところ、1.6W/cm^2の出力を700°Cで達成することができた。内部抵抗を測定したところ、カソードの内部抵抗が大きいことから、カソードのS_<0.5>Sr_<0.5>CoO_3をPLD法で作成す重ことを行なった。その結果、膜厚が400nmの場合に最も内部抵抗は小さくなり、大きな出力を得ることが可能となった。以上より、PLD法により膜厚を制御したナノ効果を利用するSOFCでは大きな出力の達成が行なえた。イオン伝導におけるナノサイズ効果は、興味ある現象として注目されている。本研究では(1)薄膜化することで導電率の向上が期待されるランタンゲルマネート系酸化物について、金属アノード基板上へのナノレベルの製膜による高出力SOFCの開発、(2)Pr2Ni04系混合導電体のナノ薄膜化に伴う導電特性の変化の検討を行った。La2GeO5系薄膜を用いたSOFCの試験では、700°Cにおいて約1.1 W/cm^2程度の出力を得ることができた。一方、作製した薄膜は約5μm程度の膜厚を有していることから、期待したようなイオン伝導のサイズ効果が発現していない領域であると思われる。Pr2Ni04系薄膜の作製においては、緻密でクラックのない単相の薄膜が形成できた。約500°Cを境界に高温域では金属的伝導を示し、低温域では半導体的伝導であった。バルクと比較して薄膜化に伴い伝導度が約半桁ほど向上し、特に400°C以下の低温域では温度依存性が小さくなる結果となった。これらの現象は、薄膜化により表面緩和減少に伴う残留応力の低下や新たな欠陥導入、さらには移動度の向上などいったことが要因ではないかと示唆され、現段階では薄膜化に伴う伝導度の向上が観測されたもとと考えている。
末梢血由来の骨芽細胞系細胞の機能解析

関節リウマチは全身性の慢性炎症性疾患であり、心血管疾患(CVD)を合併することが多いことが知られている。主要なCVDの危険因子は血管壁石灰化であり、以前より末梢血中の骨芽細胞系細胞の関与が推定されている。ヒト末梢血単核球を象牙質上で培養し、炎症性サイトカイン(TNFαまたはIL-6)で刺激すると石灰化物質の形成を認めた。この石灰化物質は主にカルシウム、リンが含まれていた。TNFαまたはIL-6で刺激された末梢血単核球は、骨形成マーカーを強く発現し、骨芽細胞様細胞の分化が誘導された。このことは炎症性サイトカインが骨芽細胞様細胞への分化を誘導することで血管石灰化に関与している可能性を示唆する。ヒト健常人由来の末梢血単核球を象牙質上で培養し、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子(TNFα)で刺激すると骨芽細胞系細胞分化の指標である石灰化組織が高頻度に形成されることを見出した。この新知見は、末梢血中に骨芽細胞系細胞が存在を疑わせるものである。本研究では、末梢血中において、骨芽細胞に類似した骨芽細胞系細胞を同定し、その役割を明らかにすることを目的とする。末梢血中の骨芽細胞系細胞の存在が明らかになることで、動脈硬化の特徴の一つである血管壁の石灰化についての新たな制御へ発展していくことが期待される。当該年度に実施した研究の成果は以下の内容である。1末梢血単核球を象牙質上で培養しTNFαで刺激すると、TNFα濃度依存性に骨芽細胞系細胞分化の指標である石灰化組織が形成された。2もう一つの主要な炎症性サイトカインであるIL-6刺激においても、同様に象牙質上に石灰化組織が形成された。3培養末梢血単核球をTNFα刺激により骨芽細胞の分化には必須であるOsterix mRNAの発現が誘導された。また、骨芽細胞マーカーであるAlkaline Phosphatase, Osteoprotegerin, osteocalcin mRNAの発現が誘導された。さらに間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化の際に活性化されるWntシグナルmRNAが誘導された。このことは末梢血単核球中の細胞の一部(間葉系幹細胞)が骨芽細胞へ分化誘導した可能性を示唆する。4末梢血単核球を象牙質上だけでなく、ポリクロロトリフルオロエチレンフィルム上で培養し、TNFαで刺激した際にも石灰化組織が形成されることが明らかになった。このことは末梢血単核球由来の骨芽細胞系細胞が象牙質上だけでなくても、他の部位においても石灰化組織を形成する可能性を示唆する。[目的]関節リウマチ(RA)は全身性慢性炎症疾患であり炎症性サイトカインが強く関連すると共に、心血管疾患(CVD)を合併することが多いことが知られている。主要なCVDの危険因子は、血管壁石灰化が挙げられる。最近、末梢血中を循環している骨芽細胞系細胞が血管壁の石灰化に関与していることが報告されている。そこで、ヒト末梢血単核球を用いて、炎症性サイトカインTNFα刺激による骨芽細胞様細胞への分化誘導・機能を検索した。[方法]末梢血は健常人より採取し、比重遠心法にて単核球へ分離した。得られた単核球を象牙質上で21日間、TNFαまたはRANKLで刺激・培養した。形成された石灰化物質を電子顕微鏡で観察し、構成元素と濃度をエネルギー分散型X線分析(EDX)で調べた。培養単核球細胞の特性を調べるためにosteoprotegerin (OPG)、RANKL、ALP、osteocalcin、Runx2、osterix mRNAの発現レベルをreal-time PCR法で解析した。[成果]末梢血単核球を象牙質上で培養し、TNFαで刺激すると濃度依存性に石灰化物質の形成を認めた。同様にマウス骨芽細胞前駆細胞であるMC3T3も石灰化物質を形成した。この石灰化物質はEDXによる解析で、主にカルシウムとリンであった。一方、TNFαで刺激した末梢血単核球のreal-time PCR法による解析の結果、OPG、ALP、osteocalcin、Runx2、osterix mRNAの発現量が無刺激・RANKL刺激と比較して有意に増加していた。[意義・重要性]ヒト末梢血単核球をTNFαで刺激すると石灰化物質の形成能を有する骨芽細胞様細胞が分化誘導された。このことはTNFαが組織の石灰化に関与していることを示し、RAにおけるTNF阻害療法はTNFαの低下を介して、血管の石灰化を抑制する可能性を示唆するものである。

このことは炎症性サイトカインが骨芽細胞様細胞への分化を誘導することで血管石灰化に関与している可能性を示唆する。本研究は末梢血中の骨芽細胞系細胞の研究を行っているが、一般的に骨芽細胞、骨芽細胞系細胞は骨髄内に存在し、末梢血中に存在するという概念はほとんど知られていない。そのため、末梢血中に骨芽細胞系細胞が存在するか確認することが必要不可欠であった。そこで培養末梢血単核球において、TNFα刺激により骨芽細胞の発現分子(Osterix, Alkaline Phosphatase, Osteoprotegerin, osteocalcin) mRNA発現レベルを確認したところ、いずれも発現分子mRNAが有意に誘導されていた。また、末梢血単核球中の細胞の一部から骨芽細胞系細胞が分化誘導する機序を明らかにするために、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導の際に活性化されるWntシグナルmRNAの発現レベルを解析した。その結果、培養末梢血単核球をTNFαで刺激することによりWntシグナルmRNAの発現が誘導されることが明らかになり、末梢血単核球中の細胞の一部が骨芽細胞系細胞に分化誘導する機序を確認した。リウマチ学引き続き、以下の4つの計画・方法で研究を継続していく。1末梢血単核球から磁気細胞分離装置を用いて、骨芽細胞系細胞(抗オステオカルシン陽性細胞、またはCD34陽性細胞)を分離する。2分離されたそれぞれの細胞を象牙質上で培養し、TNF, IL-6でのそれぞれの刺激によって、石灰化組織の形成されるか、電子顕微鏡で確認する。3分離されたそれぞれの細胞をTNFでの刺激によって、骨芽細胞分化に必須な転写因子(Runx2, Osterix) mRNAの発現レベルが増加するか、real-time PCRで解析する。4生体内で誘導できるか確認するため、分離されたそれぞれの細胞をTNF, IL-6で刺激後、回収し、マウス腹腔内に移入し、石灰化組織が形成されるか、レントゲン撮影により評価する。末梢血単核球より抗オステオカルシン抗体、抗CD34抗体を用い、磁気細胞分離装置でそれぞれの細胞を分離する予定であった。しかし、予備実験による末梢血単核球のオステオカルシン、CD34 mRNA発現の確認が不可欠であった。この確認実験の再現性の確認のために、抗オステオカルシン抗体、抗CD34抗体の購入が遅れてしまい、次年度使用額が生じた。上記の確認実験は終了しており、次年度に上記の実験を行うための抗体を購入する予定である。これにより次年度使用額は使い切ることが出来る。