hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超塑性発泡法を用いた新規機能性セラミックスの創製と特性向上

報告者の提案した超塑性発泡法を用い、セラミック中に導入した気孔の圧力による形状変化を利用したセンサの開発を行なった。400°Cまでの温度範囲であればZnO発泡体は加圧・除圧における抵抗変化を示し,センサ素子としての応用が可能であることを示した。更に、異種元素(Ag,Li)のドーピングによって母体の抵抗値を変化させることで,センサ感度の向上や動作温度を500°Cまで高めることに成功した。電子回路の集積化に伴い信号線の間の浮遊容量が問題となる。高速スイッチングや高周波用途での伝送遅延を防ぐためには、絶縁基板の誘電率を下げることが有効である。空気の比誘電率は1に近いため基板に気孔を導入することにより全体の誘電率を小さくすることは可能であるが、従来の多孔化方法では開気孔が形成されるため、水分吸着による電気容量変化や機械的強度低下が問題となっていた。報告者の提案・開発してきた超塑性発泡法は緻密なマトリックス中に、閉気孔を高体積分立で導入できるため、誘電率の低減と機械強度の維持および雰囲気湿度への安定性が両立しうるものと期待される。超塑性発泡法において、気孔を拡張させるためには、マトリックスの超塑性変形特性を高めるため、添加物を用いる。機械特性制御に最適な添加物をそのまま用いても、機能材料では特性に悪影響をおよぼす恐れがある。テーマでは、電気特性を損なうことなく超塑性変形能を高める添加物を探索したところ、アルミナ基板に、マグネシア、スピネルを添加すると、低誘電率を維持したまま超塑性能を向上させることができ、緻密な気孔壁を有する気孔率50%近い多孔体を作製することができた。この多孔体の誘電率が雰囲気湿度に影響されないことを確認した。また、研究実施者の研究室では、超塑性変形速度や変形限界の向上にマイクロ波(ミリ波含む)の利用が有効であるとの知見を得ている。このため、本年度はミリ波加熱容器・制御機を導入し、超塑性発泡体作製への適用の可能性を探った。ジルコニア基板にシリカを添加したときは赤外加熱と同等の塑性変形であったが、チタニア、酸化スズを共添加するとミリ波中での塑性変形能力が向上することがわかった。圧力センサーは,気体,液体,固体など,あらゆる物質間に作用する力量検出素子であり,通常歪みに依存した抵抗変化を示す材料が用いられる.圧力センサーのうち,金属製の歪ゲージは約800°Cまで使用可能であるが精度がシリコン製に劣る.シリコン製のものは精度の面で金属製よりも優れているが,シリコンが約300°Cで塑性変形するため耐熱限界温度が300°C程度となっている.そこで,300°C以上の耐熱性を有し,高精度な圧力センサーの開発が求められている.当研究室では,セラミック中に導入した気孔の圧力による形状変化を利用したセンサーの開発を行なっている.この気孔導入には当研究室で開発した超塑性発泡法を用いている.この方法では母体が緻密化した後超塑性変形を用いて,気孔を拡張させる.このセンサーは材料がセラミックであるため耐久性,耐食性,耐熱性に優れ,またシンプルな構造のため量産しやすいメリットがある.試料の高温(300°C)での測定したところ、常温での場合と同様に,試料の抵抗は圧力の増加に伴って減少した.また感度についても1.25×10-08(Pa-1)と,従来のシリコン製センサーよりも高感度を示している.従来のシリコン製センサーが塑性変形を起こす温度においても,高感度のセンサー特性が確認されたことから,今回の試料が高温条件下で使用可能な圧力センサー材料になり得るということが示された.圧力センサーは,気体,液体,固体など,あらゆる物質間に作用する力量検出素子であり,通常歪みに依存した抵抗変化を示す材料が用いられる。圧力センサーのうち,金属製の歪ゲージは約800°Cまで使用可能であるが精度がシリコン製に劣る。シリコン製のものは精度の面で金属製よりも優れているが,シリコンが約300°Cで塑性変形するため耐熱限界温度が300°C程度となっている。そこで,300°C以上の耐熱性を有し,高精度な圧力センサーの開発が求められている。報告者は,セラミック中に導入した気孔の圧力による形状変化を利用したセンサーの開発を行なっている。このセンサーは材料がセラミックであるため耐久性,耐食性,耐熱性に優れ,またシンプルな構造のため量産しやすいメリットがある。昨年度までの研究において,400°Cまでの温度範囲であればZnO発泡体は加圧・除圧における抵抗変化を示し,センサー素子としての応用が可能であることを示した。本年度は,異種元素(Ag,Li)のドーピングによって母体の抵抗値を変化させることで,センサー感度の向上や500°C以上での高温測定が可能な試料の作製を目的とした。Li添加試料での高温測定(500°C)における加圧時の抵抗変化を測定したところ、無添加試料と比較して,加圧・除圧に対する抵抗変化がはっきりと表れるようになった。これはLi添加によってZnO母体の抵抗が増加し,高温においても試料内部の気孔周辺を電流が流れるようになったためであると考えている。本研究での常温・高温におけるセンサー感度はともに,既存材料の約10倍以上の値を示しており,高温条件下でも使用可能な圧力センサー素子になり得るということが示された。

報告者の提案した超塑性発泡法を用い、セラミック中に導入した気孔の圧力による形状変化を利用したセンサの開発を行なった。400°Cまでの温度範囲であればZnO発泡体は加圧・除圧における抵抗変化を示し,センサ素子としての応用が可能であることを示した。更に、異種元素(Ag,Li)のドーピングによって母体の抵抗値を変化させることで,センサ感度の向上や動作温度を500°Cまで高めることに成功した。低誘電率基板以外に圧力センサーについても着手できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。無機材料科学圧力センサーについてさらに研究を深め、他の機能材料をも模索する。誘電率を低下することなく、マトリックスの塑性変形能力を向上させる添加物を見出すことができた27年度が最終年度であるため、記入しない。圧力センサーへの適用を前倒しして行いたい。
マクロリド抗生物質の生合成過程の生物有機化学的研究と有用類縁体合成への応用

本研究は,オレアンドマイシン(1__)を対象物質として選び,従来の生合成中間体を培養液中に見いだす方法とは異なり,生合成中間体と予想される種々のアグリコンを合成した後,変異菌により目的の天然マクロリド抗生物質1__に変換できるか否かを調べることにより生成過程を生物有機化学的に明らかにしていくことを第一の目的とし,平成2年度,変異菌の育成と同時にその目的を達成した。平成3年度は,非天然型のアグリコンを合成した後,変異菌により表換し,有用な非天然型マクロリド抗生物質を得ることを目的とした。まず、1__から(8R)ー8,8aーデオキシオレアンドライド(2__),(8R,9S)ー9ージヒドロー8,8aーデオキシオレアンドライト(3__),(9R)ー9ージヒドロー8,8aーデヒドロー8,8aーデオキシオレアンドライド(4__),8,8aーデヒドロー8,8aーデオキシンオレアンドライド(5__)オレアンドライド(6__)などを合成した。変異菌はアグリコンまでの生産能力は欠損しているが適当なアグリコンを与えると,1__に変換できるので,1__の生産菌から人工的に育成した。上述のアグリコンを取り込ませた結果,すべての1__に変換され,その生産量から生合成過程の最終工程は2__→3__→4__→5__→6__→1__→の順であることが初めて示唆された。1__のエポキシ環は構成糖が導入される前に形成されていることが示された。同様にして,非天然型アグルコンである(8S)ー8ーヒドロキシー8ーヨ-ドメチルオレアンドライド,8ーフルオロメチルオレアンドライド,9ーブロモオレアンドライド,9ーアミノオレアンドライドなどを合成し,変異菌による取り込み実験を行ったが,相当する新現マクロリド抗生物質を与えなかった。さらに基質特異性の低い変異菌の育成が今後の課題であるが,この手法により,抗生物質の生合成過程を生物有機化学的に明らかにすることができることを例証した。マクロリド抗生物質としてオレアンドマイシン(1__)を対象物質として選び以下の研究成果を得た。1.医薬品として実用されているオレアンドマイシンから導いたアグリコン部分,8ーメチルオレアンドライドを原料にして,8ーエキソメチレンオレアンドライド,オレアンドライドそのものなど8種のアグリコン類縁物質を有機化学的に合成した。2.オレアンドマイシン生産菌を人工的に変化させ,それ自身はアグリコン部分までの生産能を欠損しているが,適当なアグリコンの添加によりオレアンドマイシンを与える変異菌を1300株の中から8株発見し,単離,育成した。3.上述の合成したアグリコン部分を変異菌とそれぞれ培養した。その結果,9ージヒドロー8ーメチルオレアンドライド(2__),8ーメチルオレアンドライド(3__),9ージヒドロー8ーエキソメチレンオレアンドライド(4__)およびオレアンドライド(5__)が生産菌に取り込まれ,天然のオレアンドマイシン(1__)を与えるが,9ージヒドローオレアンドライドはオレアンドマイシンに変換されないことが判明した。これらのことより,オレアンドマイシンの生合成の最終工程において,エポキシ環が構築されて後,2種の糖部分が導入されることが明らかになった。

また,これらのアグリコン類縁体が生産菌に取り込まれ生産されるオレアンドマイシンの量から,その生合成過程は,2__→3__→4__→5__→1__の順に変換されていくと推定された。4.天然物と立体化学および置換基の異なる非天然型アグリコンの取り込み実験の準備として,Cー8位あるいはCー9位などに奥素原子あるいはアミノ基を有するアグリコン類縁体を合成した。本研究はオレアンドマイシン(1)を対象物質として選び,従来の生合成中間体を培養液中に見いだす方法とは異なり,まず,生合成中間体と予想される種々のアグリコン部分を合成した後,微生物(変異菌)により目的の天然マクロリド抗生物質1に変換できるか否かを調べることにより生合成過程を生物有機化学的に明らかにしていくことを第一の目的とし,昨年度,変異菌の育成と同時にその目的を達成した。今年度は,非天然型のアグリコン部分を合成した後,変異菌により変換し非天然型マクロリド抗生物質を得ることを目的とした。すなわち,1を原料として,本研究者らの方法により5行程で(9R)ー9ージヒドロー8ーメチレンオレアンドライドライド(2)を合成し,また8ーヒドロキシー8ーヨ-ドメチルオレアンドライド(3)を合成した。この3はトリエチルアミンの作用により,オレアンドライド(4)に導かれた。これらのアグリコン2,3および4を原料にハロゲンやアミノ基の導入が試みられた。2より7行程を経て8ーフルオロメチルオレアンドライド(5)を合成し,3より7行程を経て,9ーアミノオレアンドライド(6)を合成した。また別に,3より9ーアミノー8ーヒドロキンー8ーメチルオレアンドライド(7)を合成した。9ーブロモオレアンドライド(8)も同様に合成された。これらの合成アグリコン3,5,6,7および8を,1の生産菌の変異菌(アグリコンまでの生産能力が欠損している菌)と培養し,菌に取り込まれ,1の新規類縁体を生産するか否かを検討した。アグリコン3はオレアンドマイシン(1)そのものを与えたが,58は効率よく取り込まれず抗生物質を与えなかった。さらに基質特異性の低い変異菌の育成が今後の課題となる。
マウスとヒトにおける抗癌剤の比較薬理学的解析

マウス腫瘍を用いる抗癌剤スクリーニング系の臨床効果予見性を改善するには、マウスの糸と臨床の系との間でしばしばみられる抗腫瘍効果のギャップが何に起因するかを解析しておくことがまず重要である。本研究は次の二つの側面からこの問題に検討を加えた。第一に、マウス腫瘍とヒト腫瘍の薬剤感受性の間に大きな違いがあるか否かを、共通の宿主としてヌードマウスを用いたIn Vivo実験、培養細胞を用いたIn Vitro実験により比較検討した。その結果、両腫瘍群とも、一つの抗関剤に対する感受性には大きな広がりがあるが、その範囲は、全体としてほぼ重なり合っているという意味で、両者間には大きな薬剤感受性の差異はないと結論した。第二に、マウスとヒトにおける抗癌剤の投与量および体内動態の違いに基づき、それぞれの体内で「腫瘍がさらされる薬剤濃度」に違いがあるか否かを検討した。まず、速度論的解析から、この違いは血中で非結合状態で存在する薬剤の濃度により比較できることを明らかにした。また、比較の方法としては、抗癌剤の殺細胞効果が濃度-時間曲線下面積(AUC)と相関する場合は、これによる比較が最も適切であると考えられた。今回比較を行った4剤の中でこれに属するのはmitomycin(MMC)とadriamycin(ADR)であり、cisplatin(DDP)も、あるいは比較的短時間の範囲では5-fluorouracil(5FU)もこれに属するものと推定し得るがそれを証明する実験がまだない。ここでは仮に4剤ともその血中AUCより、各治療量を投与されたときの「腫瘍がさらされる薬剤濃度」を比較すると、MMCでは5倍もマウスで高く、ADR,DDPでは多少マウスで低く、5FUの場合には1/5もマウスで低くなっている。この事実は、腫瘍自体に対する作用には差がない場合でも、ヒトに比してマウスで過大にまたは過小にその抗腫瘍効果を評価する可能性のあることを強く示唆している、マウス腫瘍を用いる抗癌剤スクリーニング系の臨床効果予見性を改善するには、マウスの糸と臨床の系との間でしばしばみられる抗腫瘍効果のギャップが何に起因するかを解析しておくことがまず重要である。この事実は、腫瘍自体に対する作用には差がない場合でも、ヒトに比してマウスで過大にまたは過小にその抗腫瘍効果を評価する可能性のあることを強く示唆している、
葉酸の生体内機能の再評価に関する体系的研究

生体内での葉酸の機能をより明らかにするために、葉酸欠乏食を与えたラットを用いて、その欠乏過程における各組織中のホモシステイン濃度を検討するとともに、ラットのメチル基代謝に及ぼす影響と過酸化および抗酸化物質の動態を検討した。葉酸欠乏群のホモシステインは、血漿,肝臓,心臓において有意に上昇したが、腎臓および脳では対照群と有意差が認められなかった。血漿ホモシステインの上昇が、動脈硬化症の一因になることから、その診断マーカーとして使用されている血漿中のコレステロール,遊離コレステロール,HDL-コレステロール,リン脂質,トリグリセリドの各濃度を測定したところ、リン脂質のみ葉酸欠乏群で有意に低い値を示した。メチル基代謝に関与するS-アデノシルホモシステイン(SAH)量、SAH-hydrolaseおよびL-メチオニン-S-アデノシル(MA)transferaseの活性は、肝臓において有意に上昇し、SAM量,SAM/SAH比は、有意に減少した。しかしながら、脳においてはこれらの値に有意な変化は見られなかった。過酸化物であるTBARS量は、肝臓,心臓,腎臓において、欠乏6週目に有意に上昇した。抗酸化系で作用する物質の動態を検討したところ、ビタミンC量は肝臓,心臓,血漿において、ビタミンE量は肝臓と血漿において、有意に減少した。グルタチオン量は、肝臓において有意に減少したが、グルタチオンペルオキシダーゼ活性は、有意な変化は示さなかった。以上の結果より、肝臓においては葉酸欠乏によりメチル基代謝が変化したが、脳においては影響をうけないことが判明した。また、肝臓,腎臓,心臓では、葉酸の欠乏によって酸化が亢進していたが、脳においては葉酸欠乏による酸化ストレスをうけないことが明らかになった。申請者は、生体内での葉酸の機能を、化学的に正確な量を基礎として解明するための研究を推進している。葉酸は、古くから抗貧血因子として知られているが、生体内では大部分が還元型として存在していることから、抗酸化物質として機能している可能性が考えられる。そこで本年度は、葉酸の生体内における抗酸化ビタミンとしての機能を評価することを目的に、葉酸欠乏過程において、生体内に存在する葉酸誘導体の動態に対応して、生体内で抗酸化系で作用する物質がどのように変化するか検討した。ラットに葉酸欠乏食を与えて飼育したところ、5週目より体重、ヘマトクリット値、ヘモグロビン濃度が減少して、貧血の症状が認められた。肝臓中の葉酸誘導体は、還元的条件で肝臓より抽出した後、HPLCにて分離し、電気化学的に検出する方法により特異的に定量した。その結果、貧血の症状が認められる以前の2週目より、テトラヒドロ葉酸(THF)、5-メチルTHF、5-ホルミルTHFが有意に減少した。次に、抗酸系で作用する物質として、ビタミンC、E、グルタチオン量を測定した。血漿および肝臓中のビタミンC量を特異的に定量したところ、欠乏食開始5、6週目においてコントロールに対して有意に減少した。本研究で用いたWistar系のラットは、体内でビタミンCを合成することができるにも関わらず、ビタミンC量の減少が認められたことから、葉酸の欠乏によって体内でのビタミンCの消費が増大した可能性が考えられた。ビタミンE量は、血漿では2週目から、肝臓では4週目からコントロールに対して有意に減少した。肝中のグルタチオン量も、5週目から有意に減少した。以上の結果から、葉酸欠乏によってこれらの抗酸化物質が減少し、生体内の酸化が亢進している可能性が示唆された。葉酸の欠乏によりメチル期転移反応が阻害されると、血漿中のホモシステイン濃度が上昇して、血管内皮などに酸化的傷害を引き起こし、動脈硬化等疾患の一因になることが最近注目されている。

しかしながら、葉酸の主要な貯蔵臓器である肝臓をはじめとした血漿以外の組織中でのホモシステインの動態については、ほとんど明らかにされていない。そこで、本年度は葉酸欠乏過程における各組織中のホモシステイン濃度の変化を検討するとともに、過酸化および抗酸化物質の動態を明らかにし、葉酸欠乏によってもたらされる生体内の酸化ストレス亢進の可能性を検討した。離乳直後のラットに葉酸欠乏食を与えて飼育したところ、5週目より貧血の症状が認められた。肝臓、腎臓、脳の葉酸誘導体は、還元条件下で抽出し、電気化学的に検出する方法により、特異的に定量した。その結果、肝臓ではテトラヒドロ葉酸(THF)、5-メチルTHF,5-ホルミルTHFが、腎臓ではTHFが、各々2週目から有意に減少したが、脳では主要な葉酸誘導体であるTHFが、欠乏期間を通してほぼ一定の値を示した。次に、葉酸欠乏過程におけるホモシステイン濃度の動態を検討した結果、血漿中では2週目から、肝臓、心臓では4週目から対照群に対して有意に上昇したが、脳のホモシステイン濃度は対照群との差がみられなかった。過酸化の指標であるTBARSは、肝臓,腎臓,心臓において有意に上昇した。抗酸化系で作用するビタミンCとグルタチオン量を測定したところ、ビタミンC量は血漿,肝臓,腎臓,心臓において、グルタチオン量は肝臓において、有意に減少した。一方、脳のTBARSとビタミンC量は、ホモシステイン濃度と同様に、対照群との差がみられなかった。以上より、葉酸の欠乏によって、脳以外の組織中のホモシステイン濃度が上昇し、その結果酸化ストレスが亢進していると考えられた。
野外教育の体験活動によるコミュニケーションスキル獲得と日常生活への汎化の検討

コミュニケーションスキルの獲得と日常生活への汎化という視点から、野外教育における教育プログラム、研究方法、研究成果を再検討し、野外教育の体験学習によるコミュニケーション獲得に関する研究を推進することを意図し、研究プロジェクトを立ち上げるために企画調査を行った。まず、三回の企画推進会議および一回の研究成果報告会を実施した。ここでは、野外教育における体験学習プログラムにおける理論的構築について、野外教育学および心理学の両側面から検討した。また、体験学習プログラムについて、海洋スポーツにおけるコミュニケーション促進プログラムのレビューを行った。さらに、コミュニケーションスキル獲得として、野外教育における心理社会的効果レビューおよび障害児・者を対象とした野外・体験教育におけるコミュニケーション効果のレビューを行った。さらに、研究方法論として、日常生活への汎化の質的側面・量的側面からの検証方法について検討した。最後に、企画推進会議および国外・国内の研究動向の調査を踏まえ、野外教育の体験学習によるコミュニケーションスキル獲得に関する大型研究プロジェクトを策定した。本研究プロジェクトは、学際的視点に基づき、体系的に研究を遂行するところに大きな特徴がある。
ファンコニ貧血症細胞の形質転換と感受性支配遺伝子のクローニング

Fanconi貧血症(FA)細胞がマイトマイシンC(MMC)に超高感受性で、クロスリンク修復を特異的に欠損することを明らかにしている。本研究では正常ゲノムDNA導入によるFA細胞の形質転換と全cDNAを作成し、その導入による形質転換の研究を行い、FA細胞のMMC高感受性を支配する修復遺伝子をクローニングすることを目的とした。2ケ年の研究成果は次の通りである。1.HeLaDNA導入と形質転換,FA14JTO線維芽細胞にゲノムDNAを導入し、一次MMC選択で【10^(-5)】/μg頻度の生存コロニーを得、二次選択で正常感受性クローン多数を得た。非導入では復帰変異を認めなかった。増殖のよい選択8クローンの中、7株は老化し、安定な1株FA14t【II】3を得た。この細胞は正常細胞と同じMMC感受性とクロスリンク修復能を示した。この転換ゲノムDNAをクローニングするために、40kbSal【I】断片をneo遺伝子と連結導入し、neo-MMCの2回選択を行ったが両形質をもつ転換クローンは得らなかった。2.cDNAライブラリーの作成と導入による形質転換,正常細胞のpoly【A^+】mRNAに相補なcDNAライブラリーを岡山・バーグ法でpcDベクターを用いて作成した(pcDHF)。大量のFA細胞GM6914にpcDHF DNAを導入し、2回MMCで選択し多数の転換クローンを得た。pcDベクーターを組込んだ安定転換クローン4株を最終的に獲得した。その中、最良のFApcD5102-8クローンのゲノムDNAの20kbSau3A【I】断片をEMBL4ライブラリーとし、スクリーニングとGM6914への導入によってMMC抵抗性を与える1ファージクローンを単離した。したがって、FAのMMC感受性を支配するcDNA遺伝子をクローニングすることができた。今後、このcDNA遺伝子の塩基配列の決定と遺伝子産物の同定、この遺伝子をプローブとしてゲノムDNAの探索と染色体局在の解明、さらには遺伝子突然変異の内容等に関するより進んだ研究が展望できるようになった。
急性骨髄性白血病の再発における遺伝子異常の解析

急性骨髄性白血病症例の初発時と再発時における遺伝子異常の解析を行った。AMLにおいて遺伝子変異の頻度が高いNPM1、FLT3、CEBPA、IDH1、IDH2、DNMT3A、WT1およびTP53などの遺伝子変異の有無を検索した。NPM1変異例ではDNMT3A、FLT3、IDH1あるいはIDH2変異との共存を認めることが多かった。初発時と再発時のペア検体において、これらの共存する遺伝子変異が再発時に消失したり、新たに出現する場合が数例に認められた。再発時に新たに獲得した遺伝子変異が初発時に微少なサブクローンとして存在したかどうか、全エクソンシーケンスおよび単一細胞PCR法により解析中である。本年度は主に急性骨髄性白血病症例の初発時と再発時における遺伝子異常の解析を行った。既知の遺伝子変異として染色体転座由来のAML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARAおよびMLL転座などのキメラ遺伝子のPCRによる同定を行った。また、AMLにおいて遺伝子変異の頻度が高い異常として、NPM1、FLT3、CEBPA、IDH1、IDH2、DNMT3A、WT1およびTP53などの遺伝子変異の有無を検索した。初発時と再発時のペア検体において、これらの共存する遺伝子変異が消失したり、新たに出現する場合が数例に認められた。これらの再発時に新たに獲得した遺伝子変異が初発時に微少なサブクローンとして存在したか、解析中である。また、本年度は急性リンパ性白血病症例において数度の再発を繰り返すうちに急性骨髄性白血病へ転化した症例の遺伝子解析を行った。5回目の再発時にt(6;11)染色体転座を認め、MLL-MLLT4融合遺伝子が同定された。急性骨髄性白血病への転化時にもMLL-MLLT4キメラ遺伝子が確認され、同一クローンによる転化であることが示された。さらに、初発時にも同融合遺伝子を同定し、染色体検査では同定できなかったが、初発時にすでにMLL-MLLT4キメラ遺伝子クローンが存在したことを明らかにした。本例の急性リンパ性白血病から急性骨髄性白血病への形質転化に関わるその他の遺伝子変異について検索中である。既知の遺伝子変異として、AMLにおいて遺伝子変異の頻度が高いNPM1、FLT3、CEBPA、IDH1、IDH2、DNMT3A、WT1およびTP53などの遺伝子変異の有無を検索した。また、本年度は家族性の急性骨髄性白血病の原因となるCEBPA遺伝子変異の解析を英国のグループとの共同研究によって行った。自施設症例を含む10家系24例の解析において、N端の胚細胞変異に加えてC端の体細胞変異を有する例がほとんどであった。全エクソン解析により、共存する遺伝子変異として、通常の急性骨髄性白血病とは異なり、GATA2およびWT1遺伝子変異が多いという特徴を認めた。比較的再発の頻度は高いが、家族性CEBPA変異例の予後は散発例と比較して有意に良好であった。診断時と再発時の検体の解析により、多くの例で再発時には異なる体細胞変異を認め、診断時のクローンの再発ではなく胚細胞変異に伴う2回目の急性骨髄性白血病の新規発症であることが証明された。これらの特徴は急性骨髄性白血病の約10%を占める散発のCEBPA変異例の解析にも有用と考えられ、再発の分子モデルとなりうることが示唆された。研究計画に沿って、急性骨髄性白血病の初発および再発検体を用いて既知の遺伝子異常を解析した。再発時に新たに獲得した遺伝子変異は初発時に微少なサブクローンとして存在していたか、解析中である。また、再発時に消失した遺伝子変異についても初発時にメインクローンとは別のサブクローンではなかったか検討中である。これらの点に関して、実施計画の目的をほぼ予定通り達成していると考える。しかし、診断時、再発時のペア検体の解析が可能な症例は限られているためまだ十分な検討ができていない。計画では比較的大きな遺伝子異常をSNPアレイを用いて検討する予定であったが、準備している全エクソンシーケンスにより網羅的に解析可能と考え、SNPアレイを用いた解析の変更を予定している。本年度も引き続き、急性骨髄性白血病症例の初発時と再発時における遺伝子異常の解析を行った。TP53変異はこれらの遺伝子変異と共存が少なかった。診断時と再発時のペア検体の解析により、多くの例で再発時には初診時のメインクローンと思われる遺伝子変異に加えて、新たな異なる体細胞変異を認めた。

急性骨髄性白血病の再発時の遺伝子変異が初発時にも微少なサブクローンとして存在したか、あるいは新しく獲得したものであったか、また、再発時に消失した遺伝子変異についても初発時にメインクローンとは別のサブクローンではなかったか、初発時検体における単一細胞PCR解析を行い、結果の解析中である。これらの再発時に新たに認めた遺伝子変異の多くは、再発時に新たに獲得した変異であったが、一部の症例においては初診時からマイナーなサブクローンとして存在していた可能性が示唆され、現在複数例で検証中である。とくに、共存しやすいNPM1、DNMT3A、FLT3、IDH1、IDH2遺伝子変異例では微少なサブクローンの存在する可能性が高いと推定された。これらの特徴は急性骨髄性白血病再発の分子モデルとなりうると考えられ、初診時検体の詳細な解析により、再発の予測を行いうる可能性が示唆された。急性骨髄性白血病症例の初発時と再発時における遺伝子異常の解析を行った。AMLにおいて遺伝子変異の頻度が高いNPM1、FLT3、CEBPA、IDH1、IDH2、DNMT3A、WT1およびTP53などの遺伝子変異の有無を検索した。NPM1変異例ではDNMT3A、FLT3、IDH1あるいはIDH2変異との共存を認めることが多かった。初発時と再発時のペア検体において、これらの共存する遺伝子変異が再発時に消失したり、新たに出現する場合が数例に認められた。再発時に新たに獲得した遺伝子変異が初発時に微少なサブクローンとして存在したかどうか、全エクソンシーケンスおよび単一細胞PCR法により解析中である。計画に沿って、急性骨髄性白血病の初発および再発検体を用いて既知の遺伝子異常を解析した。再発時に新たに獲得した遺伝子変異は初発時に微少なサブクローンとして存在していたか、解析中である。また、再発時に消失した遺伝子変異についても初発時にメインクローンとは別のサブクローンではなかったか検討中である。これらの点に関して、実施計画の目的をほぼ予定通り達成していると考える。計画ではもうひとつ比較的大きな遺伝子異常をSNPアレイを用いて検討する予定であったが、こちらはあまり進んでいない。既知および未知の遺伝子異常に関して、次期に計画している全エクソンシーケンスにより網羅的に解析可能と考え、SNPアレイを用いた解析の一部変更を検討している。急性骨髄性白血病の再発時の遺伝子変異が初発時にも微少なサブクローンとして存在したか、あるいは新しく獲得したものであったかについて解析中である。初発時および再発時のペア検体における全エクソンシーケンスによる網羅的解析および単一細胞解析の予備実験中である。これらの解析により急性骨髄性白血病における臨床上の最大の課題である再発の分子病態を明らかにし、予後予測としての臨床応用を検討する予定である。また、急性骨髄性白血病の発症や進展に関与する遺伝子変異は年々新たに報告されているので学会報告などにおける情報収集にも努めて、研究計画の推進に資す予定である。さらに、初発および再発のペア検体の症例数を増やすために他施設との共同研究を計画している。血液内科学急性骨髄性白血病の再発時の遺伝子変異が初発時にも微少なサブクローンとして存在したか、あるいは新しく獲得したものであったかについて単一細胞PCRを用いて解析中である。
骨髄由来胸腺前駆細胞の胸腺への生着離脱機構に関する研究

ウサギ腹腔内に酢酸コルチゾンを投与(48時間後の胸腺組織を解析すると胸腺皮質細胞の著明な消失が特徴的に観察された。同様の変化は500ラドのX線を全身照射した場合にも観察された。しかし免疫抑制剤サイクロスポリンAXFK506の投与では観察されなかった。後者の免疫抑制剤FK-506はむしろ髄質リンパ球の消失を促進する傾向が強かった。これらの処理前後の細胞膜糖脂質抗原の変化を調べると,酢酸コルチゾンでは皮質リンパ球のマーカー分子VI^3NeuGc-nLc_6CerとIV^3NeuGc-nLc_4Cerが約1/8の濃度にまで減少しており,X線照射でも同程度の減少が観察された。従って膜抗原から判断できる皮質細胞の消失率はほぼ1/8に達すると言える。一方,胸腺マトリックスに主として分布しているII^3NeuAc-LacCerは酢酸コルチゾン投与によって逆に約3倍に増加しており,X線や他の免疫抑制剤では変化しなかった。酢酸コルチゾン処理後の胸腺をほぐし,^<14>C-MauNAc又はCMP-^<14>C-ManNAcと反応させると^<14>CManNAcはもっぱらII^3NeuAc-LacCerの合成に用いられ,酢酸コルチゾン処理の有無にかかわらず合成活性に違いは見られなかった。しかし,CMP-^<14>C-NeuAcを前駆体にするとII^3NeuAc-LacCerの合成は酢酸コルチゾン処理胸腺にのみ認められることから,酢酸コルチゾン処理によって増加するII^3NeuAc-LacCerの合成は胸腺マトリックス細胞の膜表面に存在するシアル酸転移酵素によって行なわれている可能性が示唆された。次に酢酸コルチゾン処理と未処理胸腺のマトリックス細胞を培養に移し胸腺皮質細胞の結合を調べると,処理胸腺マトリックス細胞には全く結合できず,未処理細胞には結合できることが明らかになった。しかし,脾やリンパ節のリンパ球はほとんど結合できず,胸腺リンパ球には胸腺マトリックス細胞と結合するための特異的分子が存在していることが予想された。細胞のシアル酸転移酵素の高い活性は,培養後3日間は維持されていた。ウサギ腹腔内に酢酸コルチゾンを投与し48時間後の胸腺組織を解析すると胸腺皮質細胞の著明な消失が特徴的に観察された。同様の変化は500ラドのX線を全身照射した場合にも観察されたが、免疫抑制剤サイクロスポリンAxFK506の投与では観察されなかった。後者の免疫抑制剤FK506はむしろ髄質リンパ球の消失を促進する傾向が強かった。これらの処理前後の細胞膜糖脂質抗原の変化を調べると酢酸コルチゾン処理では先に報告した皮質リンパ球のマ-カ-分子VI^3NeuGcーnLc_6CerとIV^3NeuGcーnLc_4Cerが約1/8の濃度までに減少しており、X線照射でも同程度の減少が観察された。

一方、胸腺マトリックスに主として分布しているII^3NeuAcーLacCerは酢酸コルチゾン投与によって逆に約3倍に増加しており、X線や他の免疫抑制剤では変化しなかった。酢酸コルチゾン処理後の胸腺をほぐし、^<14>CーManNAc、又はCMPー^<14>CーNeuAcと反応させると^<14>CーManNAcはもっぱらII^3NeuAcーLacCerの合成に用いられ、酢酸コルチゾン処理未処理にかかわらず合成活性に違いは見られなかった。しかし、CMPー^<14>CーNenAcを前駆体にするとII^3NeuAcーLacCerの合成は酢酸コルチゾン処理胸腺にのみ認められることから、酢酸コルチゾン処理によって増加するII^3NeuAcーLacCerの合成は胸腺マトリックス細胞の膜表面に存在するシアル酸転移酵素によって行なわれている可能性が示唆された。次に酢酸コルチゾン処理と未処理胸腺のマトリックス細胞を培養に移し、胸腺皮質細胞の結合を調べると処理胸腺マトリックス細胞には全く結合できず、未処理細胞には結合できることが明らかになった。しかし、脾やリンパ節のリンパ球はほとんど結合できず、胸腺リンパ球には胸腺マトリックス細胞と結合するための特異的分子が存在していることが予想された。細胞のシアル酸転移酵素活性の高いレベルは、少なくとも培養3日間は維持されていた。ウサギ腹腔内に酢酸コルチゾンを投与し48時間後の胸腺組織を解析すると胸腺皮質細胞の著明な消失が特徴的に観察された。同様の変化は500ラドのX線を全身照射した場合にも観察された。しかし、免疲抑制剤サイクロスポリンAやFK506の投与では観察されなかった。後者の免疲抑制剤FK506はむしろ髄質リンパ球の消失を促進する傾向が強かった。これらの処理前後の細胞膜糖脂質抗原の変化を調べると、酢酸コルチゾンでは皮質リンパ球のマーカー分子6^3NeuGc-nLC_6Cerと4^3NeuGc-nLc_4Cerが約1/8の濃度にまで減少しており、X線照射でも同程度の減少が観察された。従って、膜抗原の濃度から判断できる皮質細胞の消失率はほぼ1/8に達すると言える。一方、胸腺マトリックスに主として分布しているII^3NeuAc-LacCerは酢酸コルチゾン投与によって逆に約3倍に増加しており、X線や他の免疲抑制剤では変化しなかった。酢酸コルチゾン処理後の胸腺をほぐし^<14>C-ManNAc又はCMP-^<14>C-ManNAcと反応させると^<14>CManNAcはもっぱらII^3NeuAc-LacCerの合成に用いられ、酢酸コルチゾン処理の有無にかかわらず合成活性に違いは見られなかった。しかし、CMP-^<14>C-NeuAcを前駆体にするとII^3NeuAc-LacCerの合成は酢酸コルチゾン処理胸腺にのみ認められることから、酢酸コルチゾン処理によって増加するII^3NeuAc-LacCerの合成は胸腺マトリックス細胞の膜表面に存在するシアル酸転移酵素によって行なわれている可能性が示唆された。次に酢酸コルチゾン処理と未処理胸腺のマトリックス細胞を培養に移し、胸腺皮質細胞の結合を調べると、処理胸腺マトリックス細胞には全く結合できず、未処理細胞には結合できることが明らかになった。細胞のシアル酸転移酵素の高い活性は、培養後3日間は維持されていた。
中世後期英文学に見られる王権と正義の概念に関する考察

本年度は、主に15世紀前半のイングランドで詩作を行ったジョン・ガウアー、トマス・ホックリーヴ、ジョン・リドゲイトの詩作品(Vox Clamantis, Cronica Tripertita, In Praise of Peaxe, Regiment of Princes, Fall of Princes, Troy Book)に焦点を絞り、1)各々のテクストが王権と正義の問題をどのような角度から論じているか、2)そうした見解が政治哲学に関する過去の文献や「君主の鑑」の伝統にどの程度依拠しているか、3)リチャード二世の在位中に書かれた同種の英詩との間にいかなる類似性や相違点が存在するのか、4)同時代の年代記や政治的著作(ジョン・フォーテスキューの著作であるOn the Laws and Governance of England等)との間にどのような共通点が見られるのかについて考察した。15世紀前半は、ヘンリー四世による王位簒奪に始まり、ヘンリー四世治下にイングランド各地で多発した一揆や反乱、ヘンリー四世と皇太子との間の政治的対立、ヘンリー五世率いる英軍の対仏戦争における劇的な勝利、ヘンリー五世の急逝、幼年であったヘンリー六世即位後の内政の混乱、バラ戦争の勃発と、イングランドにとってはまさに激動の時代であり、国王の権威の源泉は何か、王権を支え、維持するものは何か、国王権力はいかに行使されるべきかについて種々の見解が表明された時代である。本研究では、上記の三詩人が各々の社会的立場を投影するような形で詩作を行い(ガウアーは中小地主層に属する法律家、ホックリーヴは王宮に仕える下級役人、リドゲイトは王家と関わりの深い修道士)、時にはランカスター家の王たちに直接語りかけ助言を与えるような形式で自論を展開し、また時には不穏な政情を内面化するかのように自らを病人や亡命者に譬えながら己の複雑な心情を吐露し、当時の社会的・政治的状況に敏感に反応しつつ王権の意義に対する深い洞察を個々のテクストにおいて表明していることを明らかにした。本年度までの研究の成果の一部は"Principis Umbra : Kingship, Justice, and Pity in John Gower's Poetry,""The Voice of an Exile : From Ovidian Lament to Prophecy in Book 1 of John Gower's Vox Clamantis"と題する論文として、平成18年中に米国の出版社から発表される予定である。本年度はリチャード二世在位中に詩人ジョン・ガウアーによって書かれた三作品(Mirour de l'Omme, Vox Clamantis, Confessio Amantis)に焦点を絞り、その中で国王権力と法の関係がどのように論じられているかを考察した。これらの作品は各々異なる言語・文学様式を用いて書かれているが、「君主の鑑」の伝統に基づいて国王の権利と義務を詳細に論じた一節を共通して含んでおり、その中で国王がいかに法的権力を行使すべきか、より具体的に言うならば、法に従って正義を守り、犯罪人を裁くという国王の負うべき社会的な義務と、神から授かった慈悲(mercy)の力によって刑罰を軽減することのできる法を超えた国王の特権との間にいかにして折り合いをつけるべきかという問題を一貫して探究している。三作品に含まれた君主論を綿密に分析した結果、それらすべてがトマス・アクィナスやローマのアエギディウス等による神学的・哲学的論考、王権の法的解釈をコモンローやローマ法との関連で論じたブラクトンの著作、および俗語を用いることによって幅広い読者層に君主論を普及させたブルネット・ラティーニのLivre dou TresorやSecretum Secretorumの英訳書に多くを負っていることが証明されたが、にもかかわらず、リチャード二世即位直後の時期に国王権力の弱体化によって生じた社会秩序の乱れ、1381年の農民一揆の原因とその鎮圧の経緯をめぐる議会内の論争、国王による恩赦の多用とそれに起因する犯罪の増加に対する臣民の不満等、その時々の社会的・政治的情勢を反映して、ガウアーの見解が微妙に変化と揺らぎを見せていることが同時期の議会議事録・年代記との比較対照によって明らかになった。分析は、2003年5月8日にアメリカのミシガン州カラマズー市で開催された38th International Congeress on Medieval Studiesにおいて試論として口頭発表した後(題目"Principis Umbra : Kingship, Justice, and Pity in John Gower's Vox Clamantis")、その原稿を敷衍し発展させる形で論文("Principis Umbra : Kingship, Justice, and Pity in John Gower's Poetry")にまとめた。これは2004年度中にMedieval Institute Publicationsから刊行されるガウアー論文集に収録される予定である(Robert F.Yeager編、書名・刊行日は未定)。本年度は14世紀後半のイングランドで創作された詩作品(William Langland著Piers Plowman, Geoffrey Chaucer著Troilus and Criseyde, Tale of Melibee, Lak of Stedfastnesse, John Gower著Vox Clamantis, Confessio Amantis,作者不詳のRichard the Redeless)をおもな研究対象とし、各々のテクストが王権と正義の問題をいかなる政治的・社会的立場から論じているか、そうした見解が過去の哲学的文献(聖アウグスティヌス、ソールズベリのヨハネス、トマス・アクィナス、ローマのアエギディウス等の著作)からどの程度思想的影響を受けているか、また同時代に書かれた歴史的資料との間にいかなる見解の類似、相違が見られるかを考察した。

これらの作品が書かれた時期は、対仏戦争の長期化に伴って生じた戦争の正義をめぐる種々の論争、反逆罪の意味とその適用法をめぐって激化したリチャード二世と諸侯との対立、1390年代に入って次第に暴君化したリチャード二世の国王としての適性を論じた多様な論議、1399年のリチャード廃位とその法的な正当化など、正義の守護者であるべき国王の権力と法の関係が深刻な問題として度々浮上した時代である。上記の詩作品の詳細な分析により、1)各々が過去の思想的著作に含まれる抽象的な議論を反復し敷衍する一方で、同時代の政治的混乱に敏感に反応して書かれたものであること、2)そうした反応を言語化する際の表現方法が、国王に対する助言や忠告といった直接的な形を取ったものから、社会の弱者(特に女性)が圧制の犠牲となった姿に焦点を絞って王権と法の間題を比喩的に描いたものまで多岐にわたることが明らかとなった。これらの研究成果の一部は、平成16年7月の国際チョーサー学会(グラスゴー大学で開催)で"Female Subjectivity and space in the Criseyde Story"という題で口頭発表された。本年度は、主に15世紀前半のイングランドで詩作を行ったジョン・ガウアー、トマス・ホックリーヴ、ジョン・リドゲイトの詩作品(Vox Clamantis, Cronica Tripertita, In Praise of Peaxe, Regiment of Princes, Fall of Princes, Troy Book)に焦点を絞り、1)各々のテクストが王権と正義の問題をどのような角度から論じているか、2)そうした見解が政治哲学に関する過去の文献や「君主の鑑」の伝統にどの程度依拠しているか、3)リチャード二世の在位中に書かれた同種の英詩との間にいかなる類似性や相違点が存在するのか、4)同時代の年代記や政治的著作(ジョン・フォーテスキューの著作であるOn the Laws and Governance of England等)との間にどのような共通点が見られるのかについて考察した。15世紀前半は、ヘンリー四世による王位簒奪に始まり、ヘンリー四世治下にイングランド各地で多発した一揆や反乱、ヘンリー四世と皇太子との間の政治的対立、ヘンリー五世率いる英軍の対仏戦争における劇的な勝利、ヘンリー五世の急逝、幼年であったヘンリー六世即位後の内政の混乱、バラ戦争の勃発と、イングランドにとってはまさに激動の時代であり、国王の権威の源泉は何か、王権を支え、維持するものは何か、国王権力はいかに行使されるべきかについて種々の見解が表明された時代である。
ボリビア産リスザルを用いたマラリア感染動物モデルの開発

ヒト熱帯熱マラリアに対して感受性を持つリスザルを使用してマラリア研究に有用な動物実験モデルを確立すること、さらにリスザルに対して感受性を持つ麻疹ウイルス(MV)をワクチンベクターとして、マラリア抗原を挿入した組換えウイルス(rMV)を作製し、このrMVの感染防御効果を検討し、ワクチンを開発することを目標とした。平成15年度は、マラリア原虫感染血液ストックとマラリア抗原組換えMV(rMV(PfEMP-1))の作製を行った。平成16年度は、感染実験によるリスザルの免疫反応の解析は重要であるが、解析系がリスザルではまだ確立されていないため、リスザルの免疫担当細胞表面抗原を認識する抗体の探索とインターロイキン4(IL-4)の塩基配列の決定を試みた。抗体の探索には、ヒト用の抗体を用いて、リスザルの細胞との交叉性を調べた。ヒトの15種類のCD抗原に対して開発された41個のモノクローナル抗体の交叉性を調べた結果123個のモノクローナル抗体で交叉性が見られた。CD3(T細胞),CD4(ヘルパーT細胞),CD8(細胞障害性T細胞),CD20(B細胞)といった細胞表面抗原に対して反応する抗体の発見は、免疫応答に対してリンパ球サブセットの変化を解析する上で重要であると考えられた。また免疫応答に対してサイトカインが関わっていることが知られているが、リスザルでは、IL-1β,2,5,6,10の塩基配列が報告されている。IL-4も多機能サイトカインとして重要と思われるので、塩基配列の決定を試みた。RT-PCRと3'RACE法によりヒトや他のサルのIL-4塩基配列と相同性が高い393塩基をクローニング出来たが、5'RACE法により5'末端部分をクローニングすることが出来なかった。プライマーを変更して5'RACEを行ってみたがクローニングすることは出来なかった。最終目的であるリスザル、マラリア原虫、組換え麻疹ウイルスを使ったワクチン実験までは到達することが出来なかった。ヒト熱帯熱マラリアに対して感受性を持つボリビアリスザルを使用してマラリア研究に有用な優れた動物実験モデルを確立すること、さらにリスザルに対して感受性を持つ麻疹ウイルス(MV)をワクチンベクターとして、マラリア抗原を挿入した組換えウイルス(rMV)を作製し、このrMVの感染防御効果を検討し、ワクチンを開発することを目標とした。現在までに次の3項目の実験を行った。(1)マラリア原虫感染血液ストックの作製。米国・CDCと仏・Pasteur Instituteより分与されたマラリア原虫株をリスザル体内で増殖させ感染率上昇後、感染血液を採取して凍結保存した。この感染血液は、rMVで免疫したリスザルに対して接種する予定である。(2)マラリア抗原組換えMVの作製。接種によって強い液性・細胞性免疫を誘導し終生免疫が得られることが知られているMVを使用して、マラリアワクチンを作製した。新リバースジェネティクス法を使用して、マラリア抗原(マラリア原虫赤内型発育期に感染赤血球表面に発現するPfEMP-1)の遺伝子がMVに挿入された組換えMV(rMV(PfEMP-1))を作製した。rMV(PfEMP-1)の性状解析は現在進行中である。(3)リスザルの免疫担当細胞表面抗原を認識する抗体の探索。

rMV(PfEMP-1)の接種やマラリアの接種によるリスザルの免疫反応の解析は重要であるが、この免疫反応の解析系がリスザルではまだ確立されていないため、免疫動態を観察するため道具として、リスザルCD4,CD8細胞、B細胞等と反応する抗体の検索を行った結果、CD3,CD4細胞を認識する抗ヒトCD3またはCD4抗体を発見した。現在CD8,B細胞を認識する抗体を検索中である。以上が平成15年度の研究の概要である。今後もサイトカイン定量法の確立など、リスザルの免疫動態を観察する方法を確立することを中心に研究を進める予定である。ヒト熱帯熟マラリアに対して感受性を持つリスザルを使用してマラリア研究に有用な動物実験モデルを確立すること、さらにリスザルに対して感受性を持つ麻疹ウイルス(MV)をワクチンベクターとして、マラリア抗原を挿入した組換えウイルス(rMV)を作製し、このrMVの感染防御効果を検討し、ワクチンを開発することを目標とした。平成15年度は、マラリア原虫感染血液ストックとマラリア抗原組換えMV(rMV(PfEMP-1))の作製を行った。平成16年度は、感染実験によるリスザルの免疫反応の解析は重要であるが、解析系がリスザルではまだ確立されていないため、リスザルの免疫担当細胞表面抗原を認識する抗体の探索とインターロイキン4(IL-4)の塩基配列の決定を試みた。抗体の探索には、ヒト用の抗体を用いて、リスザルの細胞との交叉性を調べた。ヒトの15種類のCD抗原に対して開発された41個のモノクローナル抗体の交叉性を調べた結果、23個のモノクローナル抗体で交叉性が見られた。CD3(T細胞),CD4(ヘルパーT細胞),CD8(細胞障害性T細胞),CD20(B細胞)といった細胞表面抗原に対して反応する抗体の発見は、免疫応答に対してリンパ球サブセットの変化を解析する上で重要であると考えられた。また免疫応答に対してサイトカインが関わっていることが知られているが、リスザルでは、IL-1β,2,5,6,10の塩基配列が報告されている。IL-4も多機能サイトカインとして重要と思われるので、塩基配列の決定を試みた。RT-PCRと3'RACE法によりヒトや他のサルのIL-4塩基配列と相同性が高い393塩基をクローニング出来たが、5'RACE法により5'末端部分をクローニングすることが出来なかった。プライマーを変更して5'RACEを行ってみたがクローニングすることは出来なかった。最終目的であるリスザル、マラリア原虫、組換え麻疹ウイルスを使ったワクチン実験までは到達することが出来なかった。
ナイルグラスラットを用いた昼夜行動選択の機構解明

動物飼育施設に設置されたナイルグラスラット(Arvicanthis niloticus)専用の飼育室において、系統維持を開始した。また、赤外線センサーを用いた行動リズムの解析を行い、昼行性行動リズムを確認している。動物飼育に関しては、4種微生物検査を外注で行い、今までのところ病原体の検出はない。急性脳スライスを用いたCa2+イメージング実験のために、新たにリニアスライサーを導入し、ナイルグラスラットの急性視床下部スライス実験を開始した。また、こうした実験のためには、脳座標(ブレインマップ)の作製が不可欠であることから、凍結脳から連続切片を作成し、ニッスル染色を行い、連続写真を取り込んだ後に、コンピューター内でのグラフィック処理により、汎用性の高いブレインマップを作製した。さらにゲノミックDNAの抽出と、時計遺伝子ホモログの配列決定に取り組んでおり、Bmal1、Per1などいくつかの時計遺伝子ホモログの配列決定を行った。一方で、脳組織から視交叉上核や室傍核を数時間おきに単離し、これらから抽出したRNAをリアルタイムPCRで解析したが、まだ時計遺伝子の転写レベルにおいて、明瞭な概日リズムが検出できていない。これらは、単離の精度の問題や、プライマー設計の問題など、様々な問題が考えられるが、今後、脳マップの完成とともに、実験精度を改善していく予定である。これらの研究の進捗については、別系統のナイルグラスラット(Arvicanthis ansorgei)を維持するストラスブール大学INCI・エチエンヌシャレ博士らと情報交換会(2018年11月15日・ストラスブール大学・フランス)を開催し、意見交換を行っている。現在、行動パターンが明瞭なグラスラットの掛け合わせを行っており、モデルに適した系統の樹立を目指し、実験を継続中である。ゲノミックDNAの抽出と、時計遺伝子ホモログの配列決定については、Bmal1、Per1などいくつかの時計遺伝子ホモログの配列決定が完了した。一方で、脳組織から視交叉上核や室傍核を数時間おきに単離し、これらのリアルタイムPCR解析を行ったが、まだ時計遺伝子の転写レベルにおいて、明瞭な概日リズムが検出できていない。吸光度計の故障があり抽出RNAの定量が不正確であった可能性があったため、吸光度計を更新し、再実験しているところである。この他、プライマー設計の問題など、様々な問題が考えられるが、今後、脳マップの完成とともに、実験精度を改善していく予定である。本研究と並行して、外注にてナイルグラスラットの全ゲノム解読を進めており、時計遺伝子ホモログの配列のみならず、昼行性行動に直接かかわるイオンチャネル、イオントランスポーターなどについても遺伝子配列を決定して行く予定である。ブレインマップについては、George Paxinosの「The Rat Brain」を参考に、ニッスル染色に加えて、ChAT免疫染色による座標の可視化も行い、精度の高いものとする予定である。これらを通して、定位固定したラットの第三脳室に正確にアクセスできるようにしていく。また、脳スライス実験については、Ca2+イメージング実験と合わせて、電気生理学的に視交叉上核ニューロンの自発発火頻度についても解析していく予定である。

本研究と並行して、外注にてナイルグラスラットの全ゲノム解読を進めており、時計遺伝子ホモログの配列のみならず、昼行性行動に直接かかわるイオンチャネル、イオントランスポーターなどについても遺伝子配列を決定して行く予定である。ブレインマップについては、George Paxinosの「The Rat Brain」を参考に、ニッスル染色に加えて、ChAT免疫染色による座標の可視化も行い、精度の高いものとする予定である。これらを通して、定位固定したラットの第三脳室に正確にアクセスできるようにしていく。また、脳スライス実験については、Ca2+イメージング実験と合わせて、電気生理学的に視交叉上核ニューロンの自発発火頻度についても解析していく予定である。