hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イタチ導入による島の生物群集の変化

イタチを導入して約10年が経過した三宅島において、かつて豊富にいたオカダトカゲの生息状況を再調査するとともに、オカダトカゲの主な餌である地表徘徊性の無脊椎動物の種類と量的構成を落とし穴トラップによって調査した。さらに、同様の調査をイタチが導入されていない新島と在来のイタチが生息する伊豆諸島でも行った。イタチの食性は野外で採取した糞を分析することで調査した。このようにして得られたオカダトカゲの生息状況、オカダトカゲの餌動物の種構成と量、イタチの食性をイタチ導入直後の1980年はじめの調査資料と比較検討した。その結果、三宅島においてはイタチ導入前に1時間あたり100個体以上のオカダトカゲが観察されていたのが、導入後約10年を経過して、オカダトカゲはほとんど絶滅状態に陥ってしまったことがあらためて確認された。コントロールとしてオカダトカゲの生息状況を調査したな新島、神津島、大島ではこのような個体数の変化は見いだされず、三宅島におけるオカダトカゲの激減がイタチの捕食によるものであることが確実となった。三宅島に導入された直後のイタチの糞には、オカダトカゲが高い確率で含まれていたが、現在では昆虫など節足動物が主流を占め、オカダトカゲはほとんど検出されなかった。地表を徘徊する小動物の種類構成が、イタチ導入前と10年後で劇的に変化したことが明らかにされた。特にミミズ食のオオヒラタシデムシの増加には著しいものがあった。さらに、当初の調査計画に無かったことであるが、小笠原諸島に帰化した爬虫類であるアノールトカゲの生息状況を、これらの島にあらたに定着し始めたモズの生息状況とともに調査した。それによって、帰化後急激に個体数を増加させたアノールトカゲが、モズの定着した場所では局地的に激減したことが明らかにされた。この2点から、捕食者の人為的導入あるいは自然な定着が餌動物の個体数、ひいてはさらにその餌生物へ著しい波及効果をもたらすことが明らかにされた。
新しい負の炎症調節因子ATF3の発現調節機構および作用機構の解明

共同研究者の東京医科歯科大学小川佳宏教授らのグループは、activating transcription factor 3(ATF3)が、飽和脂肪酸により誘導される肥満脂肪組織の炎症性変化を負に調節することを報告した(Circ.Res.105:25-32,2009)。本研究はATF3の発現調節機構および作用機構を解明し、ATF3を中心とした新しい創薬ターゲットの同定を目指し、1、ATF3結合分子の同定と解析、2、マクロファージ特異的ATF3欠損マウス(MacATF3-KO)を用いた解析を行った。1では、昨年度同定したATF3結合分子のうち、今年度は、11の分子について、マクロファージ細胞株で過剰発現および欠失させ、既にATF3との結合との結合が報告されているストレス応答性分子ATF4および未知のクロマチンリモデリングに関わる分子などが、炎症シグナル伝達系Toll-like receptor 4(TLR4)/NF-κB経路において重要なはたらきを担つていることを明らかにした。TLR4/NF-κB経路の転写制御の詳細については未解明な点が多いが、これらの分子は、メタボリックシンドロームや動脈硬化性疾患など慢性炎症性疾患の病態生理に深く関与する可能性が考えられる。2では、昨年度作製したマウスを用いて、今年度は、(1)マクロファージに対するLPS投与実験、(2)高脂肪高ショ糖食負荷実験を行った。(1)では、MacATF3-KOより調整した骨髄マクロファージおよび腹腔内マクロファージにおいてLPS投与による炎症反応の亢進が認められ、ATF3が初代培養マクロファージにおいても炎症性変化を負に調節していることを明らかにした。(2)では、対照とMacATF3-KOとの間で、体重や脂肪組織重量には差がないにも関わらず、糖負荷試験の結果に有意差が認められ、現在そのメカニズムの解明を進めている。activating transcription factor 3(ATF3)は、リポポリサッカライド(LPS)により活性化された炎症シグナル伝達系Toll-like receptor 4(TLR4)/NF-κB経路の負の調節因子として作用することが証明されている転写因子である。一方、共同研究者の東京医科歯科大学難治疾患研究所分子代謝医学分野小川佳宏教授らのグループは、ATF3が飽和脂肪酸により誘導される肥満脂肪組織の炎症性変化を負に調節することを予備的に確認している。本研究は、肥満脂肪組織における負の炎症調節因子ATF3の発現調節機構および作用機構を解明し、ATF3を中心とした新しい創薬ターゲットの同定を目指すものであり、これまでの進捗状況は以下の通りである。1、ATF3結合分子の同定と解析マクロファージのcDNAライブラリーを用いて、yeast two-hybrid法によりATF3結合分子を同定しか。現在、同定しかATF3結合分子を細胞発現系で過剰発現および欠失させて、マクロファージのTLR4シグナルにおける機能的意義を明らかにするための基礎検討を行っている。2、マクロファージ特異的ATF3欠損マウスを用いた解析lysozymeM-Cre TgマウスとATF3 floxedマウスを交配して、マクロファージ特異的ATF3欠損マウスを作製し、マクロファージにおいてATF3の発現が抑えられていることを確認した。
心筋の小胞体とミトコンドリアの単一イオンチャンネル電流の生理活性物質による修飾機構

心筋小胞体イオンチャネル群について、同チャネル活性の細胞内生理活性物質による修飾機構に関して調べた。単一チャネル電流の測定法である人工脂質膜法や、^<45>Ca^<2+>フラックス法やアイソトープ結合実験などの実験手法を駆使した。アラキドン酸以外の形質膜構成脂質の代謝産物についても、小胞体イオンチャネルへの効果の有無を検討し、アラキドン酸カスケード全体としてのイオンチャネルの修飾機構を調べた。プロスタグランディンを初めとする大半の代謝産物はチュネル活性に全く影響を与えなかったのに対し、HPETEのみがアラキドン酸類似の効果を及ぼすことが判明した。低分子量G蛋白質のうち、ras以外のファミリーであるrhoやrabについても、小胞体イオンチャネルが標的蛋白となっているか否かスクリーニング作業を行った。その結果、ras同様rhoやrabも調べた限りでは、小胞体イオンチャネルの標的蛋白にはなっていないと結論された。病態時の心筋ミトコンドリアについて、Ca^<2+>イオンをキャリアとするイオンチャネルを独自に同定した後、心筋症と正常動物間のCa放出能の差異の有無について、単一イオンチャネル電流レベルの検討を行った。然しながら、両者に有意の差は認められなかった。また、生理活性物質として注目されるポリアミン類を選び、心筋小胞体イオンチャネルへの効果を検討した。結果、Ca^<2+>放出チャネルにおいて顕著な抑制機構を認めた。その詳細な結果は、目下、ある論文に投稿し、reviseの段階である。心筋小胞体粗膜標品および精製蛋白標品を調整し、主に人工脂質平面膜法を用いて、人工膜に封入された小胞体のCa放出チャネルやKチャネルから単一チャネル電流を記録した。まず、細胞内生理活性物質として、形質膜を構成する脂質代謝産物のアラキドン酸を選び、チャネル活性への制御機構について酵素論的検討を行った。同酵素論的展開にあたり、RI結合実験を併用した。その結果、アラキドン酸の小胞体Ca放出チャネルに対する抑制機構を見出した。アラキドン酸は、心筋小胞体からのCa動態に関与する重要なセカンドメッセンジャーであることが示唆された。現在、この仕事は論文投稿中である。もうひとつの生理活性物質として、低分子量G蛋白質の3つのファミリーのうち、今回はrasを選び、小胞体Ca放出チャネルおよびKチャネルとの相互作用の有無を調べた。その結果、rasは両チャネル蛋白に対して有意な効果を及ぼさなかった。更に、病態モデルとして心筋症を選び、小胞体イオンチャネル電流の特徴について正常な場合と比較した。この病態および正常小胞体Ca放出チャネル間では、分子そのものの諸性質は変わらないが、小胞体膜の単位面積当たりのチャネル密度に差が認められた。また、ミトコンドリアの外、内膜標品の単離精製に努めた結果、昨年後半、遂に成功を収めた。このミトコンドリア標品を用いて、小胞体同様の研究を次年度以降展開する予定である。平成5年度に引き続き、心筋小胞体イオンチャネル群を対象に、同チャネル活性の細胞内生理活性物質による修飾機構に関する仕事を当初の計画に沿い遂行した。単一チャネル電流の測定法である人工脂質膜法のみならず、^<45>Ca^<2+>フラックス法やアイソトープ結合実験などの実験手法を併用し、多角的な解析に努めた。1.アラキドン酸以外の形質膜構成脂質の代謝産物についても、小胞体イオンチャネルへの効果の有無を検討し、アラキドン酸カスケード全体としてのイオンチャネルの修飾機構を探った。プロスタグランディンを初めとする大半の代謝産物はチャネル活性に全く影響を与えなかったのに対し、HPETEのみがアラキドン酸類似の効果を及ぼすことが判明した。2.低分子量G蛋白質のうち、ras以外のファミリーであるrhoやrabについても、小胞体イオンチャネルが標的蛋白となっているか否かスクリーニング作業を行った。その結果、ras同様rhoゃrabも調べた限りでは、小胞体イオンチャネルの標的蛋白にはなっていないと結論された。

3.病態時の心筋ミトコンドリアについて、Ca^<2+>イオンをキャリアとするイオンチャネルを独自に同定した後、心筋症と正常動物間のCa放出能の差異の有無について、単一イオンチャネル電流レベルの検討を行った。然しながら、両者に有意の差は認められなかった。4.昨今、生理活性物質として注目されるポリアミン類を選び、心筋小胞体イオンチャネルへの効果を検討した。特に、Ca^<2+>放出チャネルにおいて顕著な抑制機構を認めた。その詳細な結果は、目下、論文にまとめている最中である。
腰髄歩行運動出力形成回路におけるグリア細胞の役割

アストロサイトが歩行神経出力形成に関与しているとの仮説を提唱、検証した。新生ラットから摘出脊髄標本を作製し、薬剤で誘発した歩行神経出力を腰髄L5前根から記録しつつ、共焦点顕微鏡を用いたカルシウムイメージングにより腰髄前角の細胞活動を計測した。通常の計測の後、標本にTTXを投与すると、ニューロン活動のみが抑えられ、さらに、灌流液のカリウム濃度を0.2 mMへ低下させるとアストロサイトのみが興奮性を呈したことから、ニューロンとアストロサイトとを分別した。解析の結果、腰髄前角内に、歩行神経出力と同期した活動を呈するアストロサイトが見出され、アストロサイトの歩行リズム形成への関与が示唆された。下肢歩行運動は、腰髄歩行運動神経回路で形成された神経出力が、左右下肢の伸筋と屈筋を交互に収縮させることにより実現される。この歩行運動出力機構は、ニューロン活動を中心に解析が行われてきたが、十分な解明はなされていない。近年、グリア細胞・アストロサイトは、脳脊髄のニューロンの活動を規定していることが明らかにされた。本研究では、歩行運動神経機構におけるアストロサイトの役割を検証することとした。平成26年度は、下肢歩行運動神経出力を形成させた脊髄標本において腰髄L2とL5の前根活動を記録しつつ、腰髄のアストロサイトとニューロンの活動をカルシウムイメージング法により計測する方法論を確立した。実験では、摘出脊髄標本において、L2, L5レベルの左右の前根より神経出力を記録しつつ、L2あるいはL5レベルの横断面でのニューロンおよびアストロサイトの活動をカルシウムイメージング法で計測できるようにした。すなわち、若齢ラットから作成した摘出脊髄標本において、脊髄L1-L2レベルあるいはL4-L5レベルの断面にカルシウム蛍光指示薬を注入し、その断面が上になるよう、標本を固定した。標本を酸素化人工脳脊髄液で灌流することにより、生存性を維持した。この標本でガラス吸引電極により左右のL2, L4前根から神経出力を記録しつつ、薬理学的刺激により歩行運動出力に対応するリズミックな神経活動を誘発、記録できるように、L2あるいはL4レベルの標本断面に青色レーザー光を照射して、細胞内カルシウム動態を反映する緑色蛍光、すなわち歩行運動に伴うアストロサイトとニューロンの活動を共焦点計測システムにより記録できるようにした。また、歩行と同様のリズミックな活動である呼吸リズム形成にも注目し、歩行運動神経出力機構の理解に資すよう、その形成機構についても延髄を対象にイメージング法を応用した基礎的検討を行った。歩行運動(locomotion)を掌る神経出力は、腰髄前角の歩行運動パターン形成神経回路(locomotor central pattern generator; locomotor CPG)のニューロンにより形成されると考えられてきた。近年、脳脊髄では、グリア細胞・アストロサイトは、グリア伝達物質を介して能動的にニューロン活動を支配していることが明らかにされてきたため、locomotor CPGにおいてもアストロサイトは、ニューロンと情報交換を行いつつ、locomotion神経出力形成に能動的に関与していると考えた。そこで、ラット摘出脳幹脊髄標本にグルタミン酸受容体刺激薬(NMDA)とセロトニンを投与してlocomotion神経出力を形成させ、標本尾側L5レベルでの脊髄横断面での細胞活動をカルシウムイメージング法で計測した。また標本の生存性を確認するとともに、呼吸とlocomotionの機能的連関を解析するため、延髄断面の呼吸性細胞活動の計測も行った。カルシウムイメージング法で記録された細胞を、まず、ニューロンとアストロサイトとに分類する必要があり、平成2627年度は、様々な方法を試した。ニューロンは、ナトリウムチャネル阻害薬TTXにより抑制され、また、低カリウム状態に置くと過分極によりさらに抑制されるが、アストロサイトは、TTX存在下でもカリウム低下によりアストロサイトに特異的に発現しているカリウムチャネルKir4.1を介して細胞外陽イオンが非特異的に細胞内へ流入するため活動が増強する特性を利用し、記録したlocomotor CPG細胞をニューロンとアストロサイトとに分類する方法を確立しえた。その結果、locomotionのリズムに同期した活動を呈するニューロンのみでなく、同期してリズミックな活動を示すアストロサイトの存在を世界で初めて発見した。研究実績の概要欄に記載したように、摘出脊髄標本にNMDAとセロトニンを投与することにより、locomotion神経出力を形成させ、標本断面での細胞活動をカルシウムイメージング法で計測する方法は確立しえたが、カルシウムイメージング法で記録された細胞をニューロンとアストロサイトとに分類する方法の確立に時間を要した。しかし、試行錯誤の結果、通常の計測後にTTX存在下で灌流液のカリウム濃度を下げ、それに対する細胞応答を解析することにより、locomotor CPG細胞をニューロンとアストロサイトとに分類する方法を確立しえた。その分類法を用いて、現在、locomotion神経出力の形成にアストロサイトがどのように関わっているかを解析中で、あと1年間の時間が必要となり、期限を延長した。歩行運動は、腰髄前角内の歩行運動神経回路で形成された周期的な神経出力が、左右下肢の伸筋と屈筋を交互に収縮させて実現される。腰髄における歩行運動制御機構は、従来、ニューロンを中心に解析されてきたが、十分な解明はなされていない。一方、従来は神経情報処理で重要な役割は想定されていなかったグリア細胞・アストロサイトは、ニューロンの活動を規定していることが明らかにされつつある。本研究では、腰髄においてアストロサイトがニューロンと協調して歩行神経出力形成に関与しているとの仮説を提唱し、その妥当性を実験的に検証した。

実験では、新生ラットから下部胸髄から下部腰髄までを含む摘出脊髄標本を作製し、腰髄断面から前角腹側領域にカルシウム蛍光色素を注入し、NMDAと5-HTで誘発した歩行神経出力を腰髄L5前根から記録しつつ、共焦点顕微鏡で腰髄前角の細胞活動を計測した。通常の計測の後、標本にTTXを投与すると、ニューロン活動のみが抑えられ、さらに、灌流液のカリウム濃度を0.2 mMへ低下させるとアストロサイトのみが興奮性を呈することから、ニューロンとアストロサイトとを分別した。得られたアストロサイトの活動につき、L5前根歩行神経出力との機能的相関を解析した。その結果、腰髄前角内に、歩行神経出力と同期した活動を呈するアストロサイトが見出された。これらアストロサイトは、TTXでニューロン活動を抑えても活動性を呈し、ニューロンに依存しない自律的な活動能を有していることが示され、アストロサイトの歩行リズム形成への関与が示唆された。これらの成果は、脊髄に病変を有する歩行障害の病態を理解し、将来のiPS細胞を用いた脊髄再生療法を確立するにあたり基礎的知見を提供するものと期待される。この成果は、平成29年3月に第94回日本生理学会大会で報告したが、さらに原著論文として発表すべく準備中である。アストロサイトが歩行神経出力形成に関与しているとの仮説を提唱、検証した。新生ラットから摘出脊髄標本を作製し、薬剤で誘発した歩行神経出力を腰髄L5前根から記録しつつ、共焦点顕微鏡を用いたカルシウムイメージングにより腰髄前角の細胞活動を計測した。通常の計測の後、標本にTTXを投与すると、ニューロン活動のみが抑えられ、さらに、灌流液のカリウム濃度を0.2 mMへ低下させるとアストロサイトのみが興奮性を呈したことから、ニューロンとアストロサイトとを分別した。解析の結果、腰髄前角内に、歩行神経出力と同期した活動を呈するアストロサイトが見出され、アストロサイトの歩行リズム形成への関与が示唆された。平成26年度は、本研究の初年度であり、下肢歩行運動神経出力形成に関わる腰髄のアストロサイトとニューロンの活動をカルシウムイメージング法により計測するための方法論を開発することを目指した。その結果、研究実績の概要欄に記したように、その方法論をほぼ確立することができた。したがって、平成26年度の研究は、おおむね順調に進展していると考えられた。locomotion神経出力の形成にアストロサイトがどのように関わっているかを明らかにするため、引き続きカルシウムイメージング法により、腰髄L2レベル、およびL5レベルでのニューロンとアストロサイトの活動を計測する実験を行う。特に、アストロサイト機能を特異的に抑制する薬剤(arundic acidなど)を投与した際のlocomotion神経出力と、ニューロンとアストロサイトの活動への影響を同時に解析する。さらに呼吸とlocomotionの機能的連関を解析するため、延髄断面の呼吸性細胞活動とlocomotion神経出力の同時記録、腰髄断面のlocomotion細胞活動と呼吸神経出力の同時記録も行う。
多剤耐性がん細胞を克服する新規化合物の創製と新規創薬標的蛋白質の探索

がん細胞が複数の薬剤に対して耐性となる多剤耐性現象の一因は、ABCトランスポーターと呼ばれる薬剤排出ポンプの過剰発現であり、複数のABC蛋白質が知られているがその詳細はまだ詳らかではない。一方、多剤耐性克服物質としてシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤が知られており、臨床使用されているが、長期投与するとCOX阻害由来の問題があったものの、がん細胞MDRとの相関は不明であった。上記背景下、つい最近申請者らはCOX阻害活性を有さない多剤耐性克服物質インドール誘導体A、Bを発見した。本研究では、新規化合物A、Bをリード化合物とし、副作用の少ない新規多剤耐性克服物質の創製を目指した。1、インドール誘導体ライブラリーの合成(担当:有澤)申請者らがつい最近見いだしたインドール誘導体A、BはCOX阻害剤インドメタシンと同等にがん細胞のMDR感受性は低下させるが、COX阻害活性を有さない(IC50 >400)。そこで、A、Bの化学構造を礎に、より活性の強い多剤耐性克服インドール化合物を設計・合成した。2、新規多剤耐性克服物質の活性評価(担当:中村)「1」で合成するインドール化合物のCOX阻害活性、MDR阻害活性だけでなく、各種ABCトランスポーター阻害活性を評価している(継続中)。3、2,3ー二置換インドール新規合成法の開発(担当:有澤)インドール誘導体の合成法は多数報告されているが、望みの位置に望みの置換基を有する2,3ー二置換インドールの合成法は現代でもチャレンジングな研究課題である。申請者はこれまでにインドール誘導体(A、B)をエナミドーエンメタセシスを鍵反応に用いて合成してきたが、より効率の良い合成法の開発が本研究を成功させる為に必要である。本研究では、申請者が見いだした含窒素複素環カルベン錯体を有するルテニウムヒドリド(Angew. Chem. Int. Ed. 2004, J. Org. Chem. 2006)を用い、オレフィン・ジエン・アレーンの反応特性を巧みに利用し、2,3ー二置換インドールの新規合成法を目指した。現在、新反応を見いだしており、現在この詳細を解明中である。申請者らが見いだした「COX阻害活性を有さない多剤耐性克服物質インドール誘導体」を礎に、より活性の高い多剤耐性克服インドール誘導体を創製を目指し、各種誘導体を合成し、生物活性・薬理活性試験に付した。昨年度の結果では、μMレベルの活性を有する化合物の発見に至ってないが、この結果を基に、更に新しい誘導体を設計・合成し、現在評価中である。また、インドール誘導体の合成法は多数報告されているが、望みの位置に望みの置換基を有する2,3ー二置換インドールの合成法は現代でもチャレンジングな研究課題である。申請者はこれまでにインドール誘導体をエナミドーエンメタセシスを鍵反応に用いて合成してきたが、より効率の良い合成法の開発が本研究を成功させる為に必要である。本研究では、申請者が見いだした含窒素複素環カルベン錯体を有するルテニウムヒドリド(Angew. Chem. Int. Ed. 2004, J. Org. Chem. 2006)を用い、エナミド・アルキンの反応特性を巧みに利用し、2,3ー二置換インドールの新規合成法を開発した。従来法と相補的に用いることにより、これまでよりもより多様な多置換インドールライブラリーを簡便且つ迅速に構築することが可能になる。創薬科学交付申請書に記載した「研究の目的」に対する達成度は90%程度である。より活性の高い(現在のμMレベルの活性をnMレベルに引き上げる)多剤耐性克服インドール誘導体を創製する。また、インドール誘導体のバイオプローブを作製し、活性評価(COX阻害活性、MDR感受性、各種ABCトランスポーター阻害活性)する。この中から、「がん細胞のMDR感受性は低下させるが、COX阻害活性を有さない化合物」と「がん細胞のMDR感受性を低下させ、且つ、COX阻害活性も有する化合物(従来型化合物)」を選択し、これらを多剤耐性がん細胞に投与(in vivoとin vitro)することにより、分子イメージング実験を展開する。これらにより、多剤耐性がん細胞を克服する新しい創薬標的を探索すると共に、副作用の少ない新規多剤耐性克服物質を化学的アプローチにより創出する。研究代表者が平成25年8月に北海道大学から大阪大学に移動した為、化合物合成は完了しているものの、その物性データ(化学的及び生物学的)の取得に若干の遅れがあり、その経費が翌年度に繰り越している状況にある。当初の計画通り、新規インドール化合物の物性データ取得を進める。
途上国農家金融排除解消の為の衛星データとモバイルデータによる信用評価算出システム

発展途上国の農村地域では低所得者層である小規模農家が公式の金融サービスにアクセスできない金融廃除が深刻な問題となっている。借用履歴など記入期間が貸付判断をする際に必要な小規模農家の信用情報の欠如が主な要因だが、これまでに構築された金融機関からの貸付を促進するための小規模農家の信用評価モデルは限定的である。そこで本研究では衛星データやモバイルデータ等の地上データを駆使し、情報の信頼性検証方法等を明らかにすることで、借用履歴に代わるデータ駆動型の信用評価モデル構築を目指す。また、小規模農家の金融廃除経験に貢献するため、モデル構築のみならずアプリケーションとしての信用評価モデルの運用方法を構築する。
発達障害児の他者認知と逸脱行動の関連

5歳齢保育園児の逸脱行動とそれに対する保育士の介入行動についてデータの収集および検討を行った結果、幼児の逸脱行動に対し、保育士は児の名前を呼ぶ行動や、児の行動に対し指示、命令を行うことが多く認められた。また、保育士が介入を行った逸脱行動を示した幼児には、性差は認められず、保育士からの介入に対する児の反応にも顕著な違いは認められなかった。幼児の保育士の介入に対する反応について、保育士が介入を示した際に児を見ていた場合や、保育士の介入方略の一つである「質問」の継続時間が長かった場合には幼児の逸脱行動が抑制されることが明らかとなった。5歳齢児の逸脱行動およびそれに対する保育士の介入行動を、3歳齢児を対象とした同様の観察と比較すると、保育士の介入行動は年齢が異なっても同様の方略、例えば「呼称」や「指示・命令」、を用いることが多いことが明らかとなった。これは保育園という環境の中で、幼児の逸脱行動に対する保育士の関わりかけが、比較的一貫していることを示している。一方、幼児の行動については、保育士の「見る」行動に対して、5歳齢児で頻繁に反応しており、他者の視線を認知することにより、自身の逸脱行動を抑制することが示唆された。発達障害を有する児に対しての保育士の介入行動は、健常児に対するそれとは異なり、接触等のより直接的なものであった。上記の研究とあわせて、保育園において、保育士の特別な配慮が必要と思われる幼児の調査を継続して、実施した。4歳齢から6歳齢までにおいて、各年齢において、特別な配慮が必要な幼児が13名程度存在していた。その内容は、「集団場面において逸脱しやすい」、「食事時の偏食が強い」、「他児に対して攻撃的である」等が挙げられ、多くの場合は社会性に関して課題がなお、存在することが認められた。本年度においては、観察対象とした保育園に通園する発達障害児に対して、その行動特性を予備的に調査した。あわせて、逸脱行動の把握のために、健常児がいかなる状況で逸脱行動を示すのか、また、保育士がそれらに対していかなる介入行動を示すのかを検討した。その結果、5歳齢児に対しては、保育士は設定された場面においては児の行動を方向付ける介入行動を頻繁に示す一方で、児が自由に遊んでいる場面においてはそのような傾向はみられず、児自身に判断を求める介入行動が多いこと認められた。また、保育士は児に危険が及ぶような場合以外には介入を補助的に用いており、児が自身の行動に注意を向ける機会が与えられていることが示唆された。保育士による介入が児に与える影響を検討したところ、介入の継続時間が長くなると、その後、児が介入の対象となった行動を再出現させることは少なくなった。しかし、児が行動を再出現させた場合のみに注目すると、介入の継続時間の長さが児の行動に与える影響は認められなかった。これらから、保育士による介入時間の長短だけでなく、介入を受ける側である児による、介入を受けた理由の理解といった要因も介入の効果に影響を与えていると考えられた。また、「禁止」や「説明」といった行動が含まれる介入により、逸脱行動の再出現率が低下した。しかし、これらの介入行動は保育士によって頻繁に用いられるものではなく、保育士の介入は児の行動を必ずしも即座に変化させようとするものではなかった。このことからも、児は望ましい行動を考えたり、自ら気づくという過程を辿るように介入を受けていることが示唆された。本年度においては、昨年度に引き続き、保育園児の逸脱行動とそれに対する保育士の介入行動についてより詳細に検討した。保育士が介入を行った逸脱行動を示した幼児には、性差は認められなかった。すなわち、保育士は男児、女児いずれに対しても、保育士は同程度その逸脱行動に介入していたことが明らかとなった。先行研究により逸脱行動の生起には性差が認められ、男児はより多くの逸脱行動を生起することが示されているが、本研究においては、保育士の介入という視点からはそのような性差は認められなかった。先行研究と本研究の差異には、逸脱行動の生起数に男児、女児による差が認められない可能性と、女児は男児よりも逸脱行動を示すことが少ないものの、保育士がよりそれに介入することが頻繁である可能性があることが挙げられる。児がいかなる逸脱行動を示し、それに対し、保育士が介入するのか否かを検討する必要がある。また、保育士は、効果の高いより直接的な介入行動は頻繁には用いておらず、効果は低いものの幼児の判断に委ねるような介入を、幼児の逸脱行動に対して用いていた。この経験を通じて、幼児は自己制御能力を高めていくものと思われる。上記の研究とあわせて、保育園において、保育士の特別な配慮が必要と思われる幼児の調査を実施した。その内容は、「集団場面において逸脱しやすい」、「食事時の偏食が強い」、「他児に対して攻撃的である」等が挙げられ、多くの場合は社会性に関して課題が存在することが認められた。

幼児の保育士の介入に対する反応について、保育士が介入を示した際に児を見ていた場合や、保育士の介入方略の一つである「質問」の継続時間が長かった場合には幼児の逸脱行動が抑制されることが明らかとなった。5歳齢児の逸脱行動およびそれに対する保育士の介入行動を、3歳齢児を対象とした同様の観察と比較すると、保育士の介入行動は年齢が異なっても同様の方略、例えば「呼称」や「指示・命令」、を用いることが多いことが明らかとなった。これは保育園という環境の中で、幼児の逸脱行動に対する保育士の関わりかけが、比較的一貫していることを示している。一方、幼児の行動については、保育士の「見る」行動に対して、5歳齢児で頻繁に反応しており、他者の視線を認知することにより、自身の逸脱行動を抑制することが示唆された。発達障害を有する児に対しての保育士の介入行動は、健常児に対するそれとは異なり、接触等のより直接的なものであった。上記の研究とあわせて、保育園において、保育士の特別な配慮が必要と思われる幼児の調査を継続して、実施した。4歳齢から6歳齢までにおいて、各年齢において、特別な配慮が必要な幼児が13名程度存在していた。その内容は、「集団場面において逸脱しやすい」、「食事時の偏食が強い」、「他児に対して攻撃的である」等が挙げられ、多くの場合は社会性に関して課題がなお、存在することが認められた。
環境変動に対する組織適応プロセスのミクロ・マクロ統合的理論構築と定量的実証分析

本研究は、生産職場を主な対象として、ミドルに位置するリーダーの行動実態を様々な定量化手法を用いたフィールド調査で明らかにした上で、シミュレーション手法によるモデル化を行い、ミクロ(個人)とマクロ(組織)の統合的視点から新たな組織適応理論を構築した。その結果、1)平時においては、上司や管轄外部署と協働関係を保ちつつ、自らの率いる現場組織をしっかりと構築できるリーダーが望ましいこと、2)緊急時においては、リーダーが自ら現場に飛び込み問題解決を図ることで短期的な対応力を発揮する必要があること、3)こうしたリーダーに支えられた現場組織を持つ生産拠点は競争優位性を有すること、が明らかとなった。本研究は、生産職場を主な対象として、ミドルに位置するリーダーの行動実態をさまざまな定量化手法を用いたフィールド調査で明らかにした上で、シミュレーション手法によるモデル化を行い、ミクロ(個人)とマクロ(組織)の統合的視点から新たな組織適応理論を構築することを目的としている。平成25年度は、自動車企業X社を中心に3つの点からフィールド調査を行った。(1)現場リーダーとチームの生産性について、現場リーダーのビデオ撮影とTime Studyなどで分析、(2)現場リーダーの人的ネットワークが革新にもたらす効果について、現場リーダーの情報伝達ノートをTextMiningなどで分析、(3)組織目標と成果の因果メカニズムについて、各種生産性指標の時系列解析により分析、である。この結果、(1)と(3)について、英文査読誌Journal of Organizational Change Managementに、グループリーダーのビデオ分析および、リーダー行動と生産性パフォーマンスの関係の分析をした研究が採択された。また、EurOMA(European Operations Management Association)の第20回国際会議(於アイルランド・ダブリン)において、グループリーダーの行動分析と、それをコンピューター・シミュレーションによりモデル化・分析した研究が審査・採択され、報告を行った。(2)については、グループリーダーのコミュニケーション・ノートに関するテキスト分析をおこなった研究がEurOMAの第21回国際会議(於イタリア・パレルモ)で審査・採択され、報告する予定となっている。そのほか、グループリーダーを中心とした組織の環境適応プロセスを定量的に把握するための質問紙調査の設計も進めた。プレ調査も終え、今後本格的調査を実施できる段階まで来ている。本研究は、生産職場を主な対象として、ミドルに位置するリーダーの行動実体を様々な定量化手法を用いたフィールド調査で明らかにした上で、シミュレーション手法によるモデル化を行い、ミクロ(個人)とマクロ(組織)の統合的視点から新たな組織適応理論を構築することを目的としている。平成25年度に引き続き、平成26年度においても、自動車企業X社を中心としたフィールド調査とデータ収集、解析を行った。特に、グループリーダーのコミュニケーション・ノートに関するテキスト分析を通じて、リーダーの持つ人的ネットワークが中長期的な生産性の維持に貢献することを明らかにした。この成果は、オペレーションマネジメントの国際学会EurOMAの第21回国際会議(於イタリア・パレルモ)で審査の上採択され、報告を行った。また、グループリーダーを中心とした組織の環境適応プロセスを定量的に把握するための尺度や質問紙を設計し、電機産業を対象とした大規模調査も実施した(電機連合との共同研究プロジェクトを行い、およそ100事業所、300名のグループリーダー、3000名の現場作業者を対象とした)。その結果、環境変動とグローバル競争の中で高い競争力を維持している生産組織の特徴を見出すことに成功した。この成果は、和文(新宅ほか, 2014)・英文(Inamizu, forthcoming)の査読付学術誌に掲載されたほか、国際学会(EurOMAの第22回国際会議於スイス・ヌシャテル)でも審査の上採択され、報告する予定となっている。本研究は、生産職場を主な対象として、ミドルに位置するリーダーの行動実態を様々な定量化手法を用いたフィールド調査で明らかにした上で、シミュレーション手法によるモデル化を行い、ミクロ(個人)とマクロ(組織)の統合的視点から新たな組織適応理論を構築することを目的とするものである。平成25年度は、自動車企業X社を中心に、1)現場リーダーとチームの生産性について、現場リーダーのビデオ撮影によるTime Studyを用いた分析、2)現場リーダーの人的ネットワークが革新にもたらす成果について、現場リーダーの情報伝達ノートのText Miningによる分析、3)組織目標と成果の因果メカニズムについて、各種生産性指標の時系列解析という主に3つの観点から調査を進めた。平成26年度は、東京大学ものづくり経営研究センター及び電機総研との共同による、電機産業を中心とした大規模質問紙調査を実施し、その分析を進めた。最終年度である平成27年度には、これらの調査分析結果のさらなるブラッシュアップと、コンピューター・シミュレーションを用いたモデル化に取り組んだ。その成果は、国際学会(査読あり)での報告の他、英文査読誌への掲載が決まるなどしている。上記の研究により明らかにされたのは次の通りである。1)平時においては、上司や管轄外部署と協働関係を保ちつつ、自らの率いる現場組織をしっかりと構築できるリーダーが望ましいこと、2)緊急時においては、リーダーが自ら現場に飛び込み問題解決を図ることで短期的な対応力を発揮する必要があること(ただし、こうした行動は長期的な組織能力構築に寄与しないためバランスが必要である)、3)こうしたリーダーに支えられた現場組織を持つ生産拠点は、中国等の海外競合拠点に対しても競争優位性を有すること、である。

その結果、1)平時においては、上司や管轄外部署と協働関係を保ちつつ、自らの率いる現場組織をしっかりと構築できるリーダーが望ましいこと、2)緊急時においては、リーダーが自ら現場に飛び込み問題解決を図ることで短期的な対応力を発揮する必要があること、3)こうしたリーダーに支えられた現場組織を持つ生産拠点は競争優位性を有すること、が明らかとなった。自動車企業X社における綿密なフィールド調査から得られた知見を、企業や産業の枠を超えて広く検証することが本年度の1つの目標としていたが、電機産業という自動車産業とは異なる産業を対象に、しかも100近い企業・事業所を対象に大規模な調査を実施することができた。今後は、これらをシミュレーション等を用いてモデル化するなどして、学術・実務の双方において成果を還元することが求められる。特に、国際学会・国際学術誌を中心に成果を問うことが求められるが、国際学会でも高い評価を得ており、順調に進展していると言える。経営学電機産業を中心として行った大規模調査を継続して、質問紙の尺度の信頼性・妥当性を確かめていく必要がある。また、これらの調査から得られた知見を総合し、シミュレーション等によりモデル化して行くことが求められる。さらに、これらの成果及び、既に国際学会に採択された成果を加筆修正し、英文査読誌に投稿・掲載を目指すことも必要である。自動車企業X社における綿密なフィールド調査により、多くの定量的なデータを収集することが出来、なおかつそれらを英文査読誌1編、査読付国際会議1編(報告予定)に採択されるなど、順調に成果を挙げている。また、これらのデータから明らかとなった現実像をもとに、シミュレーション手法を用いてモデル化することが本研究課題の特色だと言えるが、この点に関しても査読付国際会議1編(報告済み)に採択されるなどしており、評価できる。今後は、X社以外の企業での調査を通じて比較分析をする必要があるが、そのための質問紙設計とプレ調査も既に実施することができ、順調に進展していると言える。主な理由としては、大規模な質問紙調査の実施コスト(データ入力も含む)が当初計画よりも少額で済んだためである。また、国際学会応募論文および英文査読投稿論文の英文校閲費として使用予定であったが、論文作成に時間がかかり、次年度の繰越となったためである。そのほか、研究分担者の1名が、国際学会開催と研究機関の異動や家族の看病等の事象が重なってしまい、国際学会報告への参加等が難しくなったという理由が挙げられる(ただし、報告自体は他の共同研究者によって実施した。また、その後は、査読論文執筆やその他の学会応募論文の執筆等に継続的に参加している)。今後は、まず、2つの査読付国際会議での報告内容を加筆・修正し、英文査読誌に投稿することが必要である。
乳癌組織におけるＳＨＡＰ－ＨＡ複合体による酸化ストレス防御機構の解明

乳癌組織間質に存在するSHAP-HA複合体が,癌の微小環境形成に関与する可能性が考えられた.また,腫瘍の伸展と共にその血中濃度が変化する結果もあり,これらよりマーカーとしての活用も可能と示唆された.SHAP-HA複合体とグルタチオンとの関係性は認められず,抗酸化ストレス機構を通しての腫瘍の微小環境形成への関与は否定された.またSHAP-HA複合体の血中濃度は乳癌患者の病期の進行に一致して増加し,健常人では定値であるため,腫瘍マーカーとしての臨床応用も可能と示唆された.乳癌組織間質に存在するSHAP-HA複合体の,微小環境形成に対する役割を解明する.乳癌組織周囲には,HAおよびCD44によって形成された微小環境が見られるが,その裏打ちとしてSHAP-HA複合体が機能していると思われる.本研究においては,癌細胞の酸化ストレスに対抗する機構の要となる細胞内還元型グルタチオンを取り上げた.これらはCD44を介して細胞内に貯留されるものであるが,ヒトの乳癌組織切片での免疫染色で検討した.免疫染色では,細胞内にグルタチオンは明らかに確認できたが,その間質には発現を認めなかった.上記より,細胞内ではなく間質に存在するタンパクを標的とすべきと再考案するが,現在まではヒアルロン酸に関するものが中心である.本年度においては,これらタンパクの同定を中心に行った.乳癌組織間質に存在するSHAP-HA複合体が,癌の微小環境形成に関与する可能性が考えられた.また,腫瘍の伸展と共にその血中濃度が変化する結果もあり,これらよりマーカーとしての活用も可能と示唆された.SHAP-HA複合体とグルタチオンとの関係性は認められず,抗酸化ストレス機構を通しての腫瘍の微小環境形成への関与は否定された.またSHAP-HA複合体の血中濃度は乳癌患者の病期の進行に一致して増加し,健常人では定値であるため,腫瘍マーカーとしての臨床応用も可能と示唆された.乳癌組織間質に存在するSHAP-HA複合体の,微小環境形成に対する役割を解明する.乳癌組織周囲には,HAおよびCD44によって形成された微小環境が見られるが,その裏打ちとしてSHAP-HA複合体が機能していると思われる.本研究においては,癌細胞の酸化ストレスに対抗する機構の要となる細胞内還元型グルタチオンを取り上げた.これらはCD44を介して細胞内に貯留されるものであるが,ヒトの乳癌組織切片での免疫染色で検討した.免疫染色では,細胞内にグルタチオンは明らかに確認できたが,その間質には発現を認めなかった.細胞内の存在は予想されており,間質はその裏打ちとして何らかの役割をしていることが示唆された.間質にもグルタチオンの確認が得られるならば,それ以上の対ストレス反応は考えづらくなるので,次の展開に良い結果とも言える.血中SHAP-HA複合体の濃度と乳癌の組織のsubtypeとの関係性を検討する.これにおいては,さらなる症例の蓄積の段階である.乳癌組織間質に存在するSHAP-HA複合体の,微小環境形成に対する役割を解明する.乳癌組織周囲には,HAおよびCD44によって形成された微小環境が見られるが,その裏打ちとしてSHAP-HA複合体が機能していると思われる.昨年度において,間質での抗酸化ストレス作用の要となるグルタチオンの存在証明を得ることが出来なかった.追加検討として間質での血管造成因子(VEGF)の発現を免疫染色法にて評価行ったが,その存在の発見には至らなかった.当研究は本年度で終了となるが,SHAP-HA複合体が乳癌の進行に合わせて変化する(血清濃度が上昇)ことはin vivoで確認できており,既存の概念では新しい機能の評価は不可能と推測された.何らかのトランスポーターとして働く可能性も示唆されるため,これまでの結果をnegative dataも含めて報告して次に続けたい.乳腺・内分泌外科昨年度のグルタチオンの発現確認は,細胞内における抗ストレス機構として重要と評価できた.しかし,SHAPーHA複合体は間質に存在するため,細胞内だけに存在するグルタチオンとの相互関係は免疫染色では解明困難であった.乳癌組織での免疫染色を,まず進めている状態である.最初予定したグルタチオンの間質内での存在は否定されたが,細胞内での安定性を与えるための役割を,SHAP-HA複合体が成している可能性を考える.一方,Cystathionine-γ-lyaseでの免疫染色はグルタチオンの存在が認められないために,間質での評価は延期とした.血漿中でのSHAP-HA複合体測定に関しては,その手技はほぼ安定したものとなった.実験の進捗状況においては,前回までの蓄積もあり,本年度においてはほぼ順調に進んだものと考える.間質における酸化ストレスに対する反応が,一般的なグルタチオンを直接介するものではないと確認されたことが,当初の計画以上に進められなかった要因と考える.癌細胞の抗ストレス反応構築おける細胞間質の役割をさらに追及することが必須である.これまでのグルタチオン系の反応と間質との相互作用の評価が重要と考え,2者の細胞外での働きを解明したい.ストレス下での血中グルタチオン濃度の変化の報告は散見されるが,その間質での存在を局所にて確認はされていないので,FISH法等にて合成タンパクを確認する.その場合,腫瘍中心部と辺縁においては発現の差が存在する可能性があるので,その検討も行いたい.平成24年度の実験で使用したしたグルタチオン.ペルオキシダーゼ酵素抗体は,アイソザイム1及び2であった.

この2つは,酸化ストレスに対抗するもっとも有力なものであるが,細胞内だけにしかやはり存在せず,SHAP-HA複合体との関係性の解明が必須となる.細胞培養系に対する研究においては,SHAP-HA複合体を添加するか否かのみで,癌細胞周囲の環境を変化させることが可能であるが,in vivoとの状況とは大きな差がでる可能性を危惧する.培養系での反応を各種の株で試行し,ある程度の反応がみられたら,in vivoでの実験系も視野に入れる必要性を思うところである.今後の方向性は,ヌードマウスに株を移植した状態での反応を検討することとなる.次年度使用額として1603円が計上されたが,使用薬剤の購入費が若干さがったためである.論文作成等の経費に計上する.平成25年度においては,細胞株でのストレス反応とSHAP-HA複合体の反応を十分評価することを中心に進めることになる.この時点で,結果を公表するために論文化すろことは必須となるが,次はin vivoでの実験系の確立となる.当初の予定には,ここまでは考慮されていなかったが,将来はSHAP-HA複合体の中和剤あるいは,ヒトに使用できる抗体を作成することを視野に入れて進めていきたい.
細胞周期をリアルタイムで可視化する蛍光プローブFucciを組み込んだブタの開発

本研究では、細胞周期を可視化できる蛍光プローブ(Fucci)を導入した遺伝子改変ブタを体細胞核移植により作出することを目的とした。Fucciとしての機能を有するブタ胎仔線維芽細胞を体細胞核移植の核ドナーとして樹立した。この細胞を核ドナー細胞としてクローン産仔を作出し、さらにその後代産仔を得た。産仔の各組織・臓器の蛍光観察では、皮膚、心臓、骨格筋の一部で蛍光が確認されたが、他の組織では観察されなかった。これら結果は、体細胞核移植に伴う導入遺伝子のサイレンシングによるものと考えられ、DNAメチル化解析によりFucci遺伝子のプロモーター領域が高度にメチル化されていることが確認された本研究では、細胞周期を可視化できる蛍光プローブ(Fucci)を導入した遺伝子改変ブタを体細胞核移植により作出することを目的とした。これら結果は、体細胞核移植に伴う導入遺伝子のサイレンシングによるものと考えられ、DNAメチル化解析によりFucci遺伝子のプロモーター領域が高度にメチル化されていることが確認された本研究では、生細胞で細胞周期を可視化できる蛍光プローブであるFucci (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)を導入した遺伝子改変ブタの作出を目的としている。本年度は、Fucciを発現する核ドナー細胞の樹立、及びその正常性・機能の確認を行った。計画当初、薬剤選択と度重なる継代による遺伝子導入核ドナー細胞の疲弊が予想された。そこで、作出したクローン胎仔より新たに胎仔線維芽細胞を得ること(細胞の若返り)が必要と考えられた。しかし、実際に樹立した核ドナー細胞は良好な増殖性、形態を維持していたので、核ドナー細胞の若返りを行うための体細胞核移植実験、胚移植実験は必要無く、Fucciを導入した遺伝子改変クローンブタの作出までを一気に進めることができた。体細胞クローニングに使用する核ドナー細胞は、Fucciを発現させる2つの遺伝子コンストラクトをブタ胎仔線維芽細胞(PFF)ヘ導入することにより樹立した。樹立した核ドナー細胞のタイムラプスイメージングにより、細胞周期の進行に伴う蛍光色の変化、つまり細胞周期プローブの機能発現を確認した。この細胞を用いて得られたクローン胚盤胞において、Fucciプローブの蛍光発現が観察された。さらに、構築した核移植胚を2頭のレシピエントブタに胚移植した結果、1頭から8頭のクローン胎仔(作出効率: 8.6%, 8/93)を、他の1頭から4頭のクローン産仔(作出効率: 4.3%, 4/93)を得た。このようにFucci遺伝子の導入による発生阻害は見られず、遺伝子改変クローンブタを作出することができた。作出された遺伝子改変ブタ胎仔及び産仔の臓器におけるFucciプローブの蛍光発現については、現在詳細な解析を行っている。本研究では、生細胞で細胞周期を可視化できる蛍光プローブ(Fucci)を導入した遺伝子改変ブタの作出を目的とした。初年度は、Fucciを発現するブタ細胞の樹立に成功し、クローン作出を行った。タイムラプス観察及びフローサイトメトリー解析により、樹立細胞がFucciの機能を有することを確認した。樹立細胞は体細胞核移植のための核ドナー細胞として、良好な増殖性と形態を維持しており、当初計画よりFucciを導入したクローンブタの作出を早く進めることができた。構築した核移植胚をレシピエントブタに胚移植し、4頭のクローン産仔を得ることに成功した。当該年度では、この得られたクローン産仔の解析および後代産仔の作出・解析を行った。クローン産仔の各組織・臓器の蛍光観察では、全身性のFucciの発現は観察されず、皮膚、心臓、骨格筋でのみ蛍光が観察され、さらにその蛍光は部分的であった。体細胞核移植に伴うエピジェネティック異常は有性生殖により解消されることが知られていることから、有性生殖により後代産仔を作出した結果、Fucciの発現はクローン産仔と同様に限定的であった。そこでクローンおよび後代産仔の線維芽細胞を樹立し、導入されたFucci遺伝子のプロモーター領域についてDNAメチル化解析を行ったところ、Fucciを発現する核ドナー細胞に比べ、DNAが高度にメチル化されていることが明らかになった。また、これら細胞をDNA脱メチル化酵素阻害剤存在下で培養した結果、Fucciの発現が確認され、DNAメチル化も解消することが確認された。本研究ではFucciとしての機能を有したブタ細胞の作出に成功し、Fucci遺伝子を導入した個体の作出できた。しかしながら、遺伝子サイレンシングにより全身にFucciを発現する個体は得られず、体細胞核移植に伴う導入遺伝子のサイレンシングは有性生殖を介しても解消されない可能性が示唆された。実験動物学これまでに我々は、Fucci以外の蛍光タンパク発現ベクターを用いて、核ドナー細胞樹立のソースとなる初代培養細胞(ブタ胎仔線維芽細胞)への遺伝子導入条件、薬剤選択条件を決定していた。そのため本研究ではFucciを発現する核ドナー細胞を計画通り樹立することができた。Fucciを導入したマウスやヒト細胞が既に報告されているが、Fucciを発現するブタ細胞は本研究において初めて作出された。

これにより、本年度の研究実施計画である核ドナー細胞の樹立及び細胞周期プローブとしての正常性・機能確認が達成された。また、樹立した核ドナー細胞を用いて得られたクローン胚盤胞でも、Fucciプローブの蛍光が確認された。さらにFucciを導入した遺伝子改変クローンブタの作出にも到達することができた。計画当初、遺伝子導入後の薬剤選択と度重なる継代により核ドナー細胞が疲弊することが懸念されたが、樹立した核ドナー細胞は良好な増殖性、形態を維持していたので、クローン胎仔を作出して新たに胎仔線維芽細胞を得ること(細胞の若返り)は不要であった。これまでの研究の結果、Fucciはブタ細胞においても機能的であることを確認し、樹立した核ドナー細胞は増殖性や形態が良好なことから、当初の計画にあったクローン胎仔より新たに胎仔線維芽細胞を得ること(細胞の若返り)は不要となった。当初の計画より早くFucci遺伝子導入クローンブタの作出することに成功したので、今後は得られたクローンブタの臓器・組織について、分子生物学的、組織化学的解析を重点的に行う。また、得られたクローン胎仔及び産仔から樹立した線維芽細胞についても、Fucciの蛍光発現や機能を確認する。さらに作出したFucci導入ブタを成豚まで飼育後、野生型のブタとの自然交配により後代産仔の作出も行い、導入遺伝子の伝達や後代産仔の臓器・組織における蛍光発現についても調べる。計画当初、遺伝子導入後の薬剤選択と度重なる継代により核ドナー細胞が疲弊することが予想されたが、樹立した核ドナー細胞は良好な増殖性、形態を有していた。そのため、一旦クローン胎仔を作出して新たに胎仔線維芽細胞を得ること(細胞の若返り)の必要性が無くなった。これにより、核ドナー細胞の若返りを行うための体細胞核移植実験及び胚移植実験を実施せず、研究を遂行することができた。次年度の研究費の使用予定は、作出した遺伝子改変ブタの解析する為の物品費用として1,000千円、契約農場への交通費(国内旅費)として50千円、論文校閲費用(謝金など)として200千円、その他の費用(論文投稿費用、屠体処理費用など)として450千円を計画している。次年度へ繰り越した残額は、後代産仔の作出実験とその解析に充てる。研究費の使用予定として、作出する後代産仔を解析する為の物品費用として379千円、契約農場への交通費(国内旅費)として50千円、その他の費用(交配費用、飼育費用、ワクチン代、屠体処理費用など)として400千円を計画している。