hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電位依存性ホスファターゼに基づく膜タンパク質電位作動性のスクリーニング

電位感受性ホスファターゼVSPの細胞内の局所の構造変化によって酵素活性が制御されるという特性を生かし多様な膜タンパクの膜電位感受性を検出する分子ツールを開発することを目指した。膜タンパクの電位依存性スクリーニングに適するホスファターゼ構造を明らかにした。アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて各キメラ分子の解析を電気生理学的に行い、C2ドメインに電位依存的活性をチューニングする部位が存在することを見出した。この部分の改変により酵素活性を正常の酵素より増加させることに成功した。酵素領域を他のVSPの電位センサー領域に融合させた蛋白を作成し電位センサー特性で規定される膜電位依存的酵素活性を得た。本研究の実施中に、他のグループによってCi-VSPの細胞内領域のX線結晶構造解析により基質結合ポケットの大きさが異なる2つの構造が解かれた。基質結合部位の構造を規定する部分を含むgating loopと呼ばれる構造が、電位センサーと酵素間のリンカー部分PBMと相互作用して変化するモデルが提唱された。この場合、PBMと酵素ドメイン内が特定の構造を形成することで、酵素領域が電位センサーの構造変化によって制御される。もしそうであればVSPに固有のS4直下での構造変化でのみ酵素活性の調節が行われることとなる。どのような電位センサーの構造変化が酵素活性の活性化をもたらすのかを明らかにするため、魚類VSPの様々な電位センサーの変異体を作成した。その結果、S4に2点の変異を導入した分子が二段階で電位センサーが動き、中間状態を示すことを見出した。今後、電位センサーが中間状態をとるVSPにおいて様々な膜電位において酵素活性を定量することによって、酵素活性をOnにできる電位センサーの構造が一定であるのか、自由度があるのかを判定できる。普遍的な膜タンパクの電位依存性スクリーニングに適するホスファターゼ構造を明らかにするため、電位センサーのC末端側に、ヒトPTEN様ホスファターゼ領域を融合させたキメラを作成し、酵素活性を膜電位依存的に変化されられるかを検討した。発現系細胞においてPLC-delta-PHドメイン-GFP融合分子またはOSBP-1-PHドメイン-GFP融合分子と共発現させたところ、脱分極に伴う変化を認めたものの、その変化は微弱であった。PTENとVSPの基質結合ポケットの異なるアミノ酸配列を変更し、PTENがPI(4,5)P2を脱リン酸化できるように変更することを試みたところ、この特性は変化しなかった。これらのことから、電位依存的な活性を酵素変化として検出するには、現在明らかになっているVSPの細胞内領域を用いることが最適であることが確認された。更に、VSPの酵素領域のどの領域に、電位依存的調節を仲介する構造が存在するかを明らかにすることでプローブモジュールを最適化できることを期待し、PTENとVSPとのキメラ分子を作成し、電位依存的な活性の比較を行った。これには、昨年度ターゲットタンパク研究プロジェクトで蛋白質研究所中川研究室と共同で解明した細胞内領域のX線結晶構造を元にして、PTENと構造が異なる部位に注目することで解析を行った。蛋白質研究所中川研究室と共同で、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて各キメラ分子の解析を電気生理学的に行い、C2ドメインに、電位依存的活性をチューニングする部位が存在することを見出した。更に、C2ドメインに様々な部位の変異導入を行った結果、C2ドメインのループ構造を構築する部位の基部においてアミノ酸変異させることにより酵素活性を正常の酵素よりも増加させることに成功した。電位センサーの可動量と、酵素活性の関係を、イメージング実験と数値計算を組み合わせて解析した。普遍的な膜タンパクの電位依存性を定量的に探索するためのホスホイノシチド・ホスファターゼとして、これまで明らかになっているVSPの細胞内領域が最適であることが確認された。PTENとVSPとのキメラ分子を作成し、電位依存的な活性を検出することに成功した。また阪大蛋白質研究所中川敦史教授との共同研究により得られた細胞内領域のX線結晶構造を元にして、アミノ酸の変異導入を行い、基質特異性を改変したり、酵素活性を向上させることに成功した。膜電位刺激時の酵素活性を、イメージング実験と数値計算を組み合わせることで定量することに成功した。今回得られた知見は今後電位依存性を検出する手法へ発展する上で重要な基盤となる知見であり、本研究の目標に向けて順調に進んでいると判断した。VSPの動作原理に基づくデザインに向けて、VSPの細胞内領域、リンカー部分に変異を導入し、最適化を行う。とくにC2ドメインの知見に基づいた変異導入などを試みる。VSP以外の膜タンパクとの融合蛋白を作成し、膜電位依存性の検出が可能かを検討していく。膜貫通セグメントS1のN末端側の細胞内領域が膜電位センサーの構造変化に伴って動きを生じるかどうかを、蛍光蛋白との融合蛋白を作成し、検討する。

また、膜電位のレベルに応じて、基質特異性が変化することを示唆する知見が得られており、その分子機構に着目した解析も行っていく。分子改変実験と発現系細胞での機能解析を行うため、分子生物学試薬、生理実験試薬、抗生物質、プラスチックチューブ、アフリカツメガエル、飼料などを購入する。データを解析するためのDVDなどの消耗品や、パソコン関係の部品を購入する。また、学会参加や、情報を入手するための旅費として使う予定である。
肝再生過程にみられる抗腫瘍免疫の活性化とその機序

大量に肝切除を行うと肝は活発な再生を示すが、この肝再生を制御する機構については未知な点が多い。肝再生制御機構に免疫機構が関与していることを示唆する幾つかの報告が存在する。我々も肝切除後の肝再生過程において、NK活性、LAK活性などのキラーリンパ球の活性が増強されることを見出した。このキラー活性は再生肝細胞に対しても発揮されることから、これらのリンパ球が肝再生の抑制を行っている可能性を検討するため、マウスに70%部分肝切除(肝切)を行い、経時的に脾および肝より細胞を採取し以下のとおり検討した。LAK細胞の再生肝細胞に対する細胞障害活性は肝切後1日目より認められ、このcytotoxicityに対する再生肝細胞の感受性は6日目を頂点としてその後は減衰する。このin vitroで示される活性が実際にin vivoで働き肝再生を抑制することができるか否か、次に検討した。70%肝切の12時間後にLAK細胞510×10^7コを静脈内投与し、36時間後の肝再生におよぼす影響をBrdU標識法により検討した。LAK細胞の肝集積性を高めるためにLAK細胞をあらかじめノイラミニダーゼで処理したものを用いるとBrdU標識でみた肝再生の阻害率は5256%程度認められた。IL-2の腹腔内投与は肝内のNK/LAK活性を増強し、肝切後IL-2を投与するとLAK細胞投与の場合と同様に肝再生の抑制がみられた。肝切後の脾細胞のIL-2再生産は高まるので、肝内のNK/LAK細胞はこのIL-2の刺激を受けて活性化され肝再生を制御しているものと考えられる、そこでIL-2産生阻害剤であるcyclosporineA510mg/kgを肝切の前後に投与したところ肝再生の促進が159226%観察された。FK506にも同様の効果が認められた。以上の結果から肝再生の制御にNK/LAK細胞が関与しており、肝切後活性化されるNK/LAK細胞活性を抑制することにより肝再生を促進することが可能であると考えられた。正常マウスに部分肝切除(HEP)を加えると脾細胞のADCC活性、NK活性の増強がみられ、またin vitroでのLAK活性誘導も増強される。またHEP後に同系のMH134肝癌を接種するといったん生着、増殖するが、1週頃より退縮、2週頃には拒絶され、特異的免疫が成立する。HEP後の非特異的キラーの活性化と肝癌に対する特異的免疫の誘導の現象の間に如何なる因果関係があるのか不明である。そこでこの二つの現象の関連を解析する目的で、HEP後の脾細胞をin vitroで種々の腫瘍細胞、あるいは再生肝細胞と混合培養し、誘導されるキラー細胞の活性を検討した。HEP後7日目の【C_3】Hマウス脾細胞をresponderとし、各種腫瘍細胞をstimulaterとする5日間のMLTRを行った。同系肝癌細胞であるMH134、MH129を、stimulatorとして用いた場合には、いずれの肝癌細胞に対しても障害性を有する、しかし他の腫瘍細胞には障害性を示さない特異的なキラー細胞が誘導された。また同系のX5563をstimulatorとして用いるとX5563に特異的なキラー細胞が誘導された。

しかし単に開腹しただけの対照群の脾細胞からはMH134に対するキラー活性は誘導されなかった。次にHEP後7日目の脾細胞を肝切除2日目の同系再生肝細胞あるいは受精後10日頃の同系胎児肝細胞で刺激するMLLRを行うと、MH134,X5563などの同系腫瘍,JTC,MethAの同種腫瘍,Walker256,K562の異種腫瘍のすべての腫瘍細胞に対し細胞障害活性を示し、さらに同系再生肝細胞,胎児肝細胞などの正常細胞に対しても活性がみとめられた。MLLR,MLTRによって誘導されるエフェクター細胞の活性は抗Thy1,抗Lyt2抗体と補体によってほぼ完全に消失し、抗Lyt1,抗ASGM1抗体と補体によって半減したことより、Thy【1^+】,Lyt【2^+】,一部Lyt【1^+】,ASGM【1^+】の細胞群から成立っているものと推定された。1.肝部分切除後の肝再生過程において移植同系肝癌の退縮が認められた.2.同過程において細胞障害活性をもつkiller細胞の活性化が観察された.3.このkiller細胞はNK細胞の標的細胞であるYACー1細胞とともに再生肝細胞を障害した.4.このkiller細胞はin vitroにおいてILー2によりさらに活性化され, in vitro抗腫瘍活性スペクトラムが拡大した.5.このkiller細胞はin vitroILー2投与によりさらに活性化され, in vitro抗腫瘍活性スペクトラムが拡大した.6.同過程においてILー2産生能の亢進が認められた.7.同過程における脾細胞はin vitroにおいて, ILー2刺激により細胞増殖抑制因子を産生した.8.同卸程における脾細胞をin vitroにおいて再生肝細胞で再刺激し,特異的killer細胞の誘導を試したが,これを観察できなかった.9.腫瘍移植実験における同過程に抗腫瘍活性の肝癌選択性は特異的killer細胞の関与を示唆する.現在,再生肝細胞刺激による特異的サイトカイン産生の実験中であり,さらに同過程において腫瘍に対する免疫学的無反応性が解除さる得るかどうかの実験を計画している.
新規間質性肺炎治療薬ニンテダニブの血中濃度測定法の確立と投薬支援

【目的】難治性疾患の間質性肺炎において新規機序の分子標的薬のニンテダニブが登場し、画期的な治療薬として注目さている。一方、下痢や肝機能障害の発生頻度は高く、安全な治療をする上では副作用管理が重要である。多くの分子標的薬では血中濃度と効果や副作用と相関があることが知られており、ニンテダニブにおいても同様に血中濃度測定は、その効果や副作用のモニタリングに有効である。そこで本研究では、ニンテダニブの副作用との血中濃度、遺伝子多型の関連性を解析し、ニンテダニブの個別化投与設計方法を開発することを目的とした。【方法】ニンテダニブおよびその主代謝物であるBIBF1202の同時測定法の確立:既報(Lin D., et al, J Pharm Biomed Anal, 117 2016)の測定条件を参考に、液体クロマトグラフ/タンデム質量分析法(UPLC/MS/MS法)を用い、血漿中ニンテダニブおよびその主代謝物であるBIBF1202の測定方法を検討した。ニンテダニブおよび、BIBF1202を含む血漿125μLにアセトニトリル400μL加え除タンパクを行い、遠心後の上清をUPLC/MS/MSに注入した。カラムはBEH C18(2.1mm*50mm, 17μm)を用い、移動相として、0.1%ギ酸、アセトニトリルを使用した。【成果】ニンテダニブおよびその主代謝物であるBIBF1202の検量線は5-250ng/mLの範囲で両薬剤ともに直線性を示した。ニンテダニブおよびその主代謝物であるBIBF1202の同時測定法を確立することができた。また、患者検体を用いたニンテダニブおよびその主代謝物であるBIBF120の血漿中濃度薬物濃度測定方法の遺伝子多型解析の確立を継続している。
肺がん患者の血漿中細胞外遊離DNA/RNAを用いた融合および耐性遺伝子の定量

当グループでは血漿中のcell-free DNA(cfDNA)を用いた肺がん細胞の遺伝子変異・融合遺伝子の解析によるゲノムDNA上の変異・融合好発部位を報告している。この解析技術と情報を応用し、ゲノムDNAからの検出が困難とされているEML4-ALK融合遺伝子変異につき、次世代シークエンサーを用いた血漿中のcell-free DNA(cfDNA)解析での定量的解析を試みる。さらに検証が終了した段階でEML4-ALK遺伝子融合陽性の肺腺がん患者の血漿検体を用いて、確立したシークエンシングを行うことにより、血漿からの融合変異/耐性変異の同定・定量と耐性機構判定法の確立を目指す。
赤色光の光形態形成作用におけるフィトクロムRfrとは異なる細胞内信号

ホウキモロコシの暗黒芽生えのアントシアニン形成で赤色光によってフィトクロムPfrとPfrを増幅する因子σが生成されることが生理学的証拠によってわかっている。我々はσの化学的本体の解明を目指しているが、本申請期間中に次のことを明らかにした。1.ホウキモロコシ種子を24°Cで浸漬し、は種後19°Cで培養した芽生えは、常温(24°C)で培養した芽生えに比べσによるPfr増幅効果が顕著であることを確認した。したがってσ生成の機構とその機能の解析には、上記条件で育てた芽生えを用いるのが最適であることがわかった。2.σは赤色光量に依存して生成されるが、660nmの単色光照射の場合約8,000μmolm^<-2>、620nm光の場合約12,000μmolm^<-2>の光量によってその生成が飽和することがわかった。3.σ生成の作用スペクトルおよび光量応答曲線を解析した結果、σ生成の光受容体はフィトクロムである可能性が示唆された。しかし遠赤色光照射による打ち消しを受けにくいこと、フィトクロムPfrを飽和に導く赤色光量は通常1,000μmolm^<-2>程度であるのに比べ、2の結果からもわかるようにσ生成を飽和するにはかなり高い光量が必要であることなどから、フィトクロム以外の未知の光受容体の関与の可能性も考えられた。この点について更に検討をしていくことになった。4.今後1-3で得られた知見をもとに、σ候補物質を検索していく予定である。
溶接部材のマイクロパターン自動計測装置の開発

本研究の目的である「座標格子法」を溶接部材に応用するための、マイクロパターン自動計測装置は、初期の計画通り完成させることが出来た。交付申請書に基づき、その経過及実績を述べれば以下のようである。マイクロパターン自動計測装置の主要ハード部分およびコントロールソフトウェアを含むシステム全体は、昭和59年度中に完成させている。昭和60年度は、まず座標格子法にもとづくひずみ解析とひずみ分布のグラフィックのためのソフトウェアを開発している。これにより、当初予定していたマイクロパターン自動計測システムを完成させることが出来た。引続いて、開発したシステムにより、異材溶接継手部の高温変形の解析を試みたが、座標格子法のためのマイクロパターンに当初予想していなかった欠点のあることが判明した。従来マイクロパターンとしては、2つの直線が直行するモアレ法のためのパターンを用いていたが、このパターンであると測定精度は当初の目標(±1μm)は達成できるものの、測定時間が長くデータ処理の迅速化という点で不完全であることがわかった。そこで、データ処理の迅速化を達成させかつ測定精度もさらに向上させるため、直径5μmの微小円形ドットの規則的配列から成る新しいマイクロパターンを試作している。以上のマイクロパターンおよび自動計測システムにより、HK鋼、インコネルおよびCr-Mo鋼から成る異材溶接継手部の高温クリープ変形を測定した結果、幾つかの新しい知見を得ることが出来た。とくに、クリープき裂発生との関連において興味あることは、クリープき裂の発生個所が変形拘束の大きい見掛け上変形の小さい個所と一致することである。このことは、変形の小さい個所では拘束応力が著しく上昇することを意味しており、異材継手の安全性確保の上で重要な知見である。
金属ナノギャップにおける少数分子の光応答その場追跡

光-分子強結合反応場となる、可視から近赤外の波長領域の光励起に応答性を有する二次元金属微小配列構造の構築に成功した。金属微小構造体近傍に少数分子を担持することにより、局在化した光増強電場に起因した高効率な異方的分極励起による光励起選択則の変調や局所化学反応が発現する実験的知見が得られた。これらの結果から、光-分子強結合反応場の局所特性や光化学反応性に関する特徴を明らかにした。(1)可視から近赤外の波長領域の光励起に応答性を有する二次元金属微小配列構造を構築し、さらに光化学的・電気化学的な金属の選択的析出・溶解反応制御に基づいた微小構造制御を行う。(2)これにより得られた金属微小構造体近傍に局在化する増強電場を利用し、分子の吸着構造・励起状態に関する情報を取得する。(3)ターゲット分子の光散乱、発光、温度(振動励起状態)、化学的反応性を単一分子レベルで制御し、位置選択的重合、酸化還元反応、置換反応の反応速度制御など光-分子強結合反応場の構成基本単位を構築する。(4)さらにそれら単位構造におけるイベントを二次元空間にて相互に相関を持たせることを試み多色照射光への応答性を有する場を形成する。自己集合配列させたポリスチレンビーズを蒸着テンプレートとして利用して金属ナノトライアングル構造の構築に成功した。本手法において、ビーズの直径、蒸着角度により構造体のサイズ・周期性・形状異方性の制御が可能であることを明らかとした。また、本構造体構築基板を出発構造として、光化学的・光電気化学的変形法によりその構造のサイズ、間隔をナノメートルオーダーにて制御するための条件を決定した。本構造体の光学吸収スペクトル測定より、可視から近赤外領域の広い波長領域にわたってプラズモン共鳴吸収バンドの波長領域を制御することが可能となることが明らかとなった。これらの基板上に種々のサイズ、光学特性を有する分子を担持し、金属構造表面における分子吸着構造を顕微ラマン測定により評価を行なった。その結果、二つの金属構造体が非常に近接して配列されたナノダイマー構造において、著しく強いラマン散乱スペクトルが得られることが明らかとなり、本結果はダイマー間隙における局所電場増強効果に由来するものであると理論計算から予測された。また、ダイマー間隙における顕著な電場勾配の形成の結果、特定の分子に対する光トラップエネルギーが熱揺らぎエネルギーを超え、ダイマー間に集積・配列する挙動が観測され、本基板が高感度な分子トラップならびに検出システムとして有用である事を明確化した。さらに、増強ラマン散乱スペクトルを精査した結果、金属ナノダイマーにおいては特異的な分子配向特性が発現しうることが示唆された。可視から近赤外の波長領域の光励起に応答性を有する二次元金属微小配列構造を構築し、さらに光化学的・電気化学的な金属の選択的析出・溶解反応制御に基づいた微小構造制御を行った。これにより得られた金属微小構造体近傍に局在化する増強電場を利用し、分子の吸着構造・励起状態に関する情報を取得した。ビピリジンなどのモデル分子を用いて金属微小構造体近傍における表面増強ラマンスペクトルを測定し、スペクトルの散乱強度、ピーク波数、相対強度などついてストークス散乱とアンチストークス散乱領域にて検討を行った。その結果、電場強度や分子濃度に依存した吸着配向特性の変調が観測された。本結果は、異方性電場中における分子のラマンスペクトルを計算にてシミュレートした結果からも定性的に説明が可能であり、本実験により、ダイナミックな吸着配向変化の単一分子レベル検出に成功したと言える。さらに、単層単一カーボンナノチューブに対する同様の実験を行った所、金属微小構造体近傍においてナノチューブの欠陥成分に帰属されるDバンドの強度が段階的に増加する現象を見出した。本現象は、局所的な電場増強場における化学反応性が増幅されたことを示唆するものである。以上の様に、ターゲット分子の光散乱、温度(振動励起状態)、化学的反応性を単一分子レベルで制御し、位置選択的重合、酸化還元反応、置換反応の反応速度制御など光一分子強結合反応場の構成基本単位を構築するための基礎的な知見を得た。さらにそれら単位構造におけるイベントを二次元空間にて相互に相関を持たせることを試み、多色照射光への応答性を有する場を形成可能性が提案された。可視近赤外領域の波長の光に応答性を有する金属微小配列構造体を二次元規則的に構築し、その近傍における少数分子の光化学的あるいは物理的な挙動を評価した。その解析に基づき、金属微小構造体近傍に局在化して形成する光増強電場の特性の理解を深め、光増強電場内における分子の特異的挙動発現メカニズムを検討した。まず、単一単層カーボンナノチューブを用いて金属微小構造体近傍における表面増強ラマンスペクトルを測定し、スペクトルの散乱強度、ピーク波数、相対強度などついてRBMモード、Dバンド、Gバンド領域にて検討を行った。

その結果、入射電場の偏向方位に応じた種々の変化が観測された。直線偏光においては、偏光方位に依存して各バンドの散乱強度が変調され、その角度依存性の解析により、この散乱強度変化は光増強電場の形成効率に対する入射電場方位依存性が反映されたものであることが明らかとなった。さらに、円偏光を用いた場合、その偏光方位によりDバンドとGバンドの強度比においても強い依存性が現れた。光増強電場に関する電磁気学的計算を行った結果、入射光の円偏光方位により光増強電場の形成位置がシフトすることが示唆され、そのシフト量はシングルナノメートルの分解能にて制御可能であることも明らかとなった。つまり、本研究にて観測されたDバンドとGバンドの強度比の円偏光方位依存性は、単一単層カーボンナノチューブにおいて数ナノメートル程度離れた異なる部位を検出していたことになる。従来の通常光を用いた場合では、光の解説限界により数百ナノメートル以下の空間分解能を持って分光することは原理的に不可能であったのに対し、本研究では光増強電場を用いることで光励起場を数ナノメートルに閉じ込め、さらに、その照射エリアを数ナノメートルの分解能にて制御することで、従来の分光法とは全く異なる新奇な高分解分光システムを構築することに成功した。可視から近赤外の波長領域の光励起に応答性を有する二次元金属微小配列構造を構築・制御し、その構造体近傍に局在化する増強電場を利用して、分子の吸着構造・励起状態に関する情報を取得する。また、ターゲット分子の光散乱、発光、温度(振動励起状態)、化学的反応性を単一分子レベルで制御し、位置選択的重合、酸化還元反応、置換反応の反応速度制御など光-分子強結合反応場の構成基本単位を構築することを目的とする。平成22年度では、モデル分子に単層カーボンナノチューブを適応し、金属微小構造体近傍における表面増強ラマンスペクトルのRBMモード、Dバンド、Gバンド領域にて検討を行った。その結果、従来の共鳴ラマン散乱測定では測定困難であった中間周波数モードを高感度測定可能であること、また、観察された一部の中間周波数モードが、欠陥成分に帰属されるDバンドと同期して変化することを明らかにした。また、ある条件下においてナノチューブの欠陥成分由来のDバンドの強度が段階的に増加する現象が観察され、局所光増強電場により欠陥導入反応を人為的に誘起すること、すなわち、局所光化学反応制御に成功した。局所光増強電場による光励起選択則について検証を行うため、グラフィティック構造の振動モード由来のGバンドスペクトルの評価を行った。その結果、光増強場を用いて単一SWNTの異方的な分極励起を効率よく誘起する実験的知見が得られ、光選択則制御に向けた基礎的知見が得られた。
リボソーマルRNAの抗生物質耐性変異の網羅的解析

環境ゲノム由来16S rRNA遺伝子を大腸菌欠損株に導入し、生育を相補する16S rRNAをライブラリー化した。この際、PCRプライマーにより19番目の塩基と916番目の塩基との間でミスマッチが生じる場合、ミスマッチの種類や16S rRNA配列全体によってはスペクチノマイシン耐性が現れることが判明した。また、ミスマッチを含まないように設計したPCRプライマーを用いて得た16S rRNA遺伝子置換大腸菌ライブラリーを種々の抗生物質存在下でスクリーニングしたところ、スペクチノマイシン(4)、G418(10)、テトラサイクリン(2)、アプラマイシン(1)に対して耐性を示す株が得られた。大腸菌内で機能する異種生物由来16S rRNAのうち、抗生物質耐性を示す遺伝子を獲得する目的で、まず、種々の環境より調製した環境ゲノムを鋳型に16S rRNA遺伝子をPCR法により増幅した。この際、増幅プライマーとしては、遺伝子開始直後に位置する系統群ごとに特徴的な部位を含むもの、含まないものの2種類を用い、ミスマッチの影響を合わせて解析した。ゲノムデータベースに登録されている遺伝子情報からは、大腸菌の属するγープロテオバクテリア細菌は、19番目の塩基としてAを有するものが多く、その他の系統群ではCを有するものが多い。この塩基は916番目の塩基と対合しているが(19A-916Uまたは19C-916G)、本来の組み合わせと異なる場合、機能に影響が出る恐れがある。そこで、19A-916Gまたは19C-916Uとなる人工的な16S rRNAの機能を配列既知の微生物由来の16S rRNAを用いて評価した。その結果、塩基対の組み合わせによってはリボソーム活性をほぼ失うものや、温度感受性の変化するものなどが出現した。さらに興味深いことに、リボソーム攻撃性の抗生物質に対して耐性を示すものが出現した。上記検討とは別に、ミスマッチを含まないように設計したプライマーを用いて得た16S rRNA遺伝子のうち、大腸菌欠損株内での機能相補性、引き続いて様々な抗生物質存在下で耐性スクリーニングを行ったところ、新規変異を見いだすことができた。取得したクローンにつて塩基配列解析を行った結果、微生物の起源としては、γープロテオバクテリアのものや門レベルで異なるものが含まれていた。抗生物質の種類としては、同一ライブラリーをスクリーニングした場合にも、スペクチノマイシンとG418耐性を示すものが最も多く、さらにいくつかの薬剤に対して多重耐性を示すものも存在した。抗生物質耐性機構の解明は、細菌感染症の予防・治療にとって極めて重要な研究課題であり、最近では耐性遺伝子の網羅的解析(レジストーム解析)が盛んに行われている。しかし従来の研究では、解析対象が分解酵素や排出ポンプ等に限定されており、抗生物質の標的分子の代表格であるリボソームなどは解析対象となっていない。これはリボソームの機能解析が本質的に困難なことが一因である。とくに、rRNA遺伝子の変異による耐性の場合、rRNAオペロンがゲノム内に複数コピー存在する(例えば大腸菌では7コピー)ため、1コピーの変異では耐性(表現型)が現れないことが多く、潜在的な耐性変異があっても知られていないと推察される。こうした状況の中、我々は、rRNAの機能解析技術として、大腸菌のrRNAオペロン欠損株(Δ7株)を用いる方法を開発した。本研究では、大腸菌のrRNAオペロン欠損株(Δ7株)を用いた単一rRNAオペロン機能解析技術に基づき、異種微生物由来の16S rRNA遺伝子の機能を生育相補性、さらに薬剤耐性に関するスクリーニングを行った。まず、種々の細菌由来の16S rRNAの機能解析を行うにあたり、環境ゲノムを鋳型に16S rRNA遺伝子をPCR増幅するが、その際に用いるプライマーを再設計した。改良したプライマーを用いてライブラリーを構築し、Δ7株相補株を獲得した。数万規模の16S rRNA遺伝子欠損の相補株を抗生物質耐性に基づきスクリーニングした結果、アプラマイシン(1株)、スペクチノマイシン(4株)、テトラサイクリン(2株)、G418(10株)について耐性株が得られた。耐性クローンが有する16S rRNA遺伝子の配列解析、耐性に寄与すると思われる塩基の大腸菌16S rRNAへの導入などを行い、耐性の実態を明らかにしている。本課題では、天然に存在する新規な変異点、変異パターンを網羅的にスクリーニングすることを主眼としている。これに対し、環境ゲノムからの16S rRNA遺伝子増幅効率のさらなる拡大を意図して行ったプライマーの検討を通じ、人工的に発生した変異(ミスマッチ)による耐性の出現という当初想定していない結果を得ることができた。

これは従来知られていない変異点、変異パターンであり、当初計画を超えた発見をすることができた。また、ミスマッチを含まないように設計したプライマーを用いて環境ゲノムをスクリーニングしたところ、まず機能相補可能な微生物期限として、大腸菌(プロテオバクテリア門)とは門レベルで異なるバクテリア由来の16S rRNAで機能相補可能なことを発見した。さらに、薬剤耐性の観点でスクリーニングした結果、新規な耐性変異や変異パターン、従来よりも耐性の高い遺伝子などが見出された。また、別々の耐性変異と思われるものが組み換えにより一つの遺伝子に組み合わさったと推定される多重耐性遺伝子も見出された。酵素などをコードする薬剤耐性遺伝子などでは、遺伝子変異による薬剤スペクトルの拡張や、耐性レベルの向上などがよく知られており、また一つのプラスミド上に複数の耐性遺伝子がコードされることによる多剤耐性化なども知られているが、組み換えが起きると思われていない16S rRNA遺伝子において、一つの遺伝子が組み換えにより多機能化するということが真実であれば、耐性発現の新たなメカニズムとして16S rRNAの進化についての学術的な新発見とともに医学的な見地からも多重耐性についての新たな視点を与えるという点で意義深いと思われる。微生物学すでに獲得したクローンについて、耐性を与える変異点を絞り込む。既知変異と類似のものであれば一塩基置換などで容易に確定することも可能であるが、16S rRNAの置換という大きな摂動を与えているため、新たなメカニズムに基づく耐性の出現も考えられる。Site-directed mutagenesis以外にドメインレベルでの組み換えやDNAシャッフリングなどの手法により可能な限り耐性に関わる領域を絞り込みたい。獲得された16S rRNAとその変異体について、薬剤耐性の程度や薬剤スペクトルを解析する。基本的には生育に基づく耐性の確認を行うが、リボソーム活性の観点から、in vitro systemやo-ribosomeなどを用いて、タンパク質合成に対しての効果も検討する。上記研究を進めると同時に、新規なスクリーニングも継続する。とくに、生物密度の濃い環境から得た場合、生物感相互作用が活発なため、薬剤耐性などが見つかる頻度も高いと思われる。こうした観点から環境を選択する予定である。
混合導電性ペロブスカイト型酸化物中の遷移金属イオンの状態解析

イオン導電性と電子導電性を併せ持つ混合導電性希土類遷移金属系ペロブスカイト型酸化物結晶を、酸素分圧、温度及び共存元素を種々変化させて作製し、その結晶構造を粉末線X回折を用いたリ-トベルト解析により構造を精密に求め、遷移金属イオンの原子価並びに配位等の状態変化と電気的性質等の物性との関係を理論的に明らかにした。La:Mn=1:1およびランタンの一部をストロンチウムあるいはマンガンの一部をマグネシウムで置き換えた組成のLa-Sr-Mn-OあるいはLa-Mn-Mg-O系ペロブスカイト型酸化物を種々の酸素分圧下で焼成し、化学分析によるマンガンの原子価分析及びリ-トベルト法を用いた結晶構造解析を行い、マンガンの原子価と結晶構造の関係を明らかにした。マンガンの平均原子値が小さいとき、立方晶に近い新規の斜方晶ペロブスカイト相が生成した。この結晶相は2価のマンガンイオンを多く含むとともに、3価のマンガンイオンによるヤーンテラー効果が互いに打ち消し合うような構造をとる。対称性を保つため、マンガンイオン間の電子交換が阻害され、電気伝導度が減少する。La:Co=1:1及びランタンの一部をストロンチウムで置き換えた組成のペロブスカイト型La_<1-X>Sr_XCoO_3を焼成し、化学分析によるコバルトの原子価分析、リ-トベルト結晶構造解析及び電気伝導度測定を行い、コバルトの原子価と結晶構造、並びに電気的性質の関係を明らかにした。コバルトの原子価は、ストロンチウム量が少ないときは、ほぼ化学量論的に変化するのに対し、ストロンチウム量の増加に従い、次第に一定値へと近づいた。結晶構造解析の結果、格子定数並びにCo-O間距離に不連続な変化が観測され、また電気伝導度にも半導体から金属への転移が示された。O-2pバンドとCo-dバンドの間に生ずる電荷移動ギャップが、構造変化に伴い閉じることによると解釈される。La:Mn=1:1及びランタンの一部をストロンチウムあるいはマンガンの一部をマグネシウムで置き換えた組成のLa-Sr-Mn-OあるいはLa-Mn-Mg-O系ペロブスカイト型複合酸化物を種々の酸素分圧下で焼成し、化学分析によるマンガンの原子価分析及びリ-トベルト法を用いた結晶構造解析を行い、マンガンの原子価と結晶構造の関係を明らかにした。マンガンの平均原子価が小さい時、立方対称に近い新規の斜方晶ペロブスカイト相が生成した。この結晶相は、2価のマンガンイオンを多く含むと共に、3価のマンガンイオンによるマイクロヤーン・テラー効果が互いに打ち消し合うような構造をとる。La:Co=1:1及びランタンの一部をストロンチウムで置き換えた組成のLa-Sr-Co-O系ペロブスカイト型複合酸化物を焼成し、化学分析によるコバルトの原子価分析及びリ-トベルト法を用いた結晶構造解析を行い、コバルトの原子価と結晶構造の関係を明らかにした。結晶構造解析の結果、格子定数並びにCo-O間距離に不連続な変化が観測され、また電気伝導度にも、半導体から金属への転移が示された。O-2pバンドとCo-3dバンドの間に生ずる電荷移動ギャップが、構造変化にともない、閉じることによると解釈される。焼成原料作製のために、スターラー付き恒温槽及びインキュベータ-を使用した。また焼成のための試料成形には、ジャッキを使用した。精密な試料作製のため、雰囲気の酸素分圧を制御することができる電気炉を使用した。

結晶構造解析には、遷移金属に対して吸収や異常分散の小さいモリブデンの特性X線を使用することが必要であった。リ-トベルト解析のプログラムを作製し、良好な信頼度因子を示す精密な解析を行い、新規且つ興味ある現象を詳細に明らかにすることができた。La_<1-x>Sr_xCoO_3は高い電子導電率とイオン導電率とを合わせ持つ混合導電性セラミックスであり、高温固体型燃料電池(SOFC)のカソード材料や、酸素透過膜としての応用が期待される。また近年、金属-絶縁体(M-I)転移を示す系としても注目されている。La_2O_3、SrCO_3、CoCO_3を用いてLa_<1-x>Sr_xCoO_3を焼成した。Mo-Kα線により粉末X線回折を測定し、リ-トベルト結晶構造解析を行った。試料中のCoの平均原子価、および酸素空孔濃度はヨードメトリーによって求めた。試料の直流導電率は急冷サンプルを直方体状に切りだし、4端子法で測定した。測定は大気中、室温から1473Kの温度範囲で行った。xが0.55まではSrのドープ量が増す毎にほぼ酸素ストイキオメトリックに増加するが、xが0.55を超えると直線からはずれて一定値へと近付き、徐々に酸素ノンストイキオメトリックへと移行する様子が観測された。xが0.55の時結晶構造が菱面体晶から立方晶へ転移した。x<0.25においては低温域で半導体的な挙動を示し、温度上昇とともに導電率は増加するが、極大点を経た後に導電率は次第に減少し、金属への転移を示した。結晶解析により、La_<1-x>Sr_xCoO_3のM-I転移のおこるx0.25で、Co-O距離の減少とCo-O-Co結合角の増加が認められた。Co-O結合のこのような変化はバンド幅を増加させるので、この変化がホールの準位とO-2pバンドの重なり、つまり金属への転移と対応していると考えることができる。また0.2<x<0.3におけるCo-O間距離の減少のために、a軸が縮み、それによってc軸も縮んだと説明できる。つまり、格子定数や原子間パラメータの特異な挙動は、M-I転移に起因するものであり、結晶構造、バンド構造の変化がLa_<1-x>Sr_xCoO_3の電子導電率を決定する最大要因であると結論づけることができる。
可聴下波動伝播特性による南極域の多圏融合物理現象解明と温暖化影響評価

極域における可聴下周波数帯域の波動伝播特性による多圏システム間の物理相互作用解明に向けて、平成30年度は以下の内容を実施した。氷河地震関連では、昭和基地及び沿岸露岩域で記録された波形・周波数変動の特徴から、氷震微動を3グループに分類し、季節変化と周辺環境、特に海氷変動との関連性を調べた(Tanaka et al., 2019)。またリュツォ・ホルム湾域の氷山・海氷・氷河変動に伴う高周波共鳴を伴う地震微動を衛星による海氷分布と対比し、定着氷と氷山の衝突等、発生原因について考察した(Kanao et al., 2018)。さらに昭和基地の地震検知率の統計解析により、季節依存性と気温・海氷・風速との相関を調べた(岩田, 2018)。また雪氷圏地震学研究について国内外の最近の成果の取りまとめを行った(Kanao et al., 2018)。インフラサウンド解析では、昭和基地及び周辺域の微気圧計アレイデータから各周波数帯の波動の到来方向推定を行い、リュツォ・ホルム湾の波浪や海氷を起源とするイベント検知を行った。特に2016年4月の海氷流出と音源位置とに明瞭な相関が得られた(Murayama et al., 2018)。昭和基地の10年間の時系列解析では、微気圧計の2008-2017年の連続データのスペクトルから脈動と微気圧擾乱の短時間変動、日周・季節変化、並びに長期間の経年変化を求め、気象データと良い相関が示された(石原・他、2018)。北極域では、グリーンランドの氷床底部の氷の温度状態を、地震波干渉法による波形解析から推定した。グリーンランド氷床底部に感度を持つ表面波を抽出し、その位相速度の季節・経年変化を調べたところ、隣り合う地域でも速度変化のパターンが逆転する現象が見いだされた。これは氷床底部が融解・凍結状態を反映している(Toyokuni et al., 2018)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。極域における可聴下周波数帯域の波動伝播特性による多圏システム間の物理相互作用解明のため、今年度は以下内容を実施した。時系列解析では、昭和基地の微気圧変動データ(2008-2010)のスペクトル解析から、脈動と微気圧擾乱の短時間変動、日周・季節変化、及び経年変化を求めた(Ishihara et al., 2015)。特に海洋波浪の大陸棚起源のモードが顕著に観測され、その振幅と周波数の変動を議論した。氷河地震関連では、昭和基地の地震検知率の統計解析から、季節依存性と気温との相関を調べた(岩田、研究分担者)。また過去半世紀に国際地震センターへ報告したイベント数の長期変動と季節変化を検討した(金尾、研究代表者)。さらに海洋潮汐をトリガーとする氷河地震の定量的検討(古本、連携研究者)、震源分布や発生機構、周波数・波動伝播特性等、「雪氷圏地震学」の動向をまとめた(金尾)。広域解析としては、昭和基地の微気圧変動アレイ観測データから、南大洋起源の波浪をはじめ各周波数帯の波動の到来方向推定を行った(村山、研究協力者)。また、南大洋上の大気・海面擾乱による南極大陸の地殻及び表層大気への広範囲な影響を精査するため、砕氷船「しらせ」の走行観測により、オーストラリア南極に至る南大洋を通過する測線上で微気圧データを取得し、スペクトル解析により波浪モードの検知を行った(柿並、研究協力者)。波動伝播モデリングでは、多圏間の物理相互作用メカニズムを推定し、観測による脈動・微気圧擾乱の振幅強度の経年変化と比較し温暖化の影響を評価するため、大気-海洋のマルチスケール・カップリングのモデリングを行った(松村、研究協力者)。また、氷床中を伝搬する地震波形計算により、氷床の厚さや基盤深度情報も加味して,氷床中を伝わる実体波(ice waves)の生成様式を理論的に予測した(豊国、研究分担者)。極域における可聴下周波数帯域の波動伝播特性による多圏システム間の物理相互作用解明に向けて、今年度は以下内容を実施した。氷河地震関連では、昭和基地の地震検知率の統計解析から、季節依存性と気温との相関を詳細に調べた(Iwata and Kanao, 2015)。また国際地震センター(ISC)へ報告した地震数の長期変動と季節変化を検討した(Storchak et al., 2015)。さらにグリーンランドやシベリアを含む、北極全域の地震活動と地殻構造・テクトニクスについて最新成果をレビューした(Kanao et al., 2015)。広域解析では昭和基地の微気圧変動アレイ観測データから、南大洋起源の波浪をはじめ各周波数帯の波動の到来方向推定を行った(Murayama et al., 2015)。また昭和基地を含む両極域の広帯域地震計データのスペクトル解析から、巨大地震で励起される地球中心核の低周波固有モードの励起状態の緯度分布を推定した(Shimizu et al., 2015)。さらに南極プレートの上部マントル3次元温度構造モデルを、国際極年で展開した地震計データのトモグラフィー解析より推定した(An et al., 2015)。

波動伝播モデリングでは、南大洋脈動による微気圧擾乱の励起様式と、大気-海洋-固体地球間のカップリングを、有限要素法による精密なモデリング計算で行った(松村、科研費雇用研究員)。また氷床中を伝搬する地震波形計算により、氷床厚や基盤深度情報も加味して、氷床中の実体波の生成様式を推定した(Toyokuni et al., 2015)。本研究による成果を含め、国際極年における極域地震学的研究成果をエルゼビア社のPolar Science特集号として編集・出版した(2015, Vol. 9, Issue 1, ELSEVIER社、計15編)。時系列解析では、昭和基地の微気圧計の2008-2014年の連続データのスペクトル解析から、脈動と微気圧擾乱の短時間変動、日周・季節変化、並びに長期間の経年変化が得られ、順調に行われている(石原、研究分担者)。氷河地震関連では、昭和基地の地震検知率の統計解析から季節依存性と気温との相関が詳細に調べられ、また検知地震数の長期変動と季節変化について検討された。さらに氷河地震を含む北極全域の地震活動とテクトニクスの最新成果がまとめられた。広域解析では昭和基地の微気圧変動データから、南大洋波浪の到来方向推定がアレイ解析で行われ、また昭和基地を含む両極域の地震計スペクトル解析から、巨大地震で励起される中心核の低周波固有モードの励起状態の緯度分布が推定された。さらに南極プレート全域の上部マントル3次元不均質速度及び温度構造の微細モデルが、国際極年IPYで得られた南極域の広域データのトモグラフィー解析により、これまで以上の高い空間分解能で求められた。波動伝播計算では、多圏間の物理相互作用メカニズム推定のため、大気-海洋のマルチスケール・カップリングのモデリングが行われ、また氷床中を伝搬する地震波形モデリングにより、氷床中の実体波(ice waves)の生成様式が示された。本研究による成果は、エルゼビア社Polar Scienceや海洋出版の月刊地球等に、特集号として編集・出版されている。極域における可聴下周波数帯域の波動伝播特性による多圏システム間の物理相互作用解明に向けて、平成28年度は以下の内容を実施した。氷河地震関連では、昭和基地の地震検知率の統計解析を継続し、検知率の季節依存性と気温・海氷・風速データとの相関を詳細に調べた(岩田、他)。南極・昭和基地で2014年に記録された氷震微動について波形・周波数変動の特徴を詳細に分類し(平松、他)、基地の位置する東オングル島での地震アレイデータ解析より、周辺のタイドクラックを起源とするイベント検知を行った(中元、山本、他)。さらに、リュツォ・ホルム湾域の氷山・海氷・氷河変動に伴う高周波共鳴地震微動を衛星データと対比して、定着氷と氷山の衝突等、発生原因について考察した(Kanao, 2017)。広域解析では昭和基地及び周辺氷床上の微気圧変動アレイ観測データからは、各周波数帯の波動の到来方向推定を行い、リュツォ・ホルム湾の波浪や海氷振動を起源とするイベント検知を行った(Murayama et al., 2017)。その結果、2015年4月の海氷流出時期と震源位置との明瞭な相関が得られた。また、同地域でのインフラサウンドおよび可聴音の比較観測から、氷河崩落に伴うと考えられるイベント検出を行った(山本、石原、他)。波動伝播モデリングでは、南大洋の脈動による微気圧擾乱の励起様式と、大気-海洋-固体地球間カップリングの、有限要素法による精密モデリングを継続した(松村、他)。また、グリーンランド氷床観測点のノイズ相関解析により、地震表面波の速度変化を元に氷床下部の底面溶解や圧雪状態について、4年半の期間の経年及び季節変化を調べた(豊国、他)。
ジャガイモシスト線虫のふ化促進物質の単離・構造決定

1.ジャガイモシスト線虫のふ化促進物質の抽出・分離・精製.活性物質の原料として,ジャガイモ根圏抽出液(標準ふ化液),トマト水耕液,トマト乾燥根の3種類を検討した.大量入手可能で,その中でも比較的安定な活性を示すトマト乾根を,粗原料として選択した.トマトの根を7月末採集し,冬期10°C以下で水抽出を行った.水抽出液にアンバーライトXAD-2樹脂を投入し,ドライアイスで撹拌と酸性化(pH5)を行いながら吸着させた.樹脂を口別後アセトンにて脱着,次いで濃縮し,黒褐色のオイルを得た(活性値10^<-4-5>g/ml).これを水-酢酸エチルにて分配し,水層を凍結乾燥して,粗抽出物を得た(活性値10^<-5>g/ml).続いて順に,水を用いたカラムクロマトグラフィー, 1)XAD-2, 2)セファデックスG-15, 3)セファデックスG-10,トヨパールHW-40c,トヨパールHW-40sに付して分離し次にHPLC分離を行い,最活性部を約100μgを得た(活性値10^<-9>g/ml).この分画と前後の弱活性を示す分画を400MHz-NMR測定を行ったところ,それまで多量に含まれていたオリゴ糖が除かれ,テルペノイド類に属すると考えられるスペクトルを与えた.2.活性物質の化学的性質.分離精製途中で,活性物質の化学的性質を明らかにするため,水素添加反応,セロファンチューブによる透析実験,ゲルロカクマトグラフィーによる分子量測定を行った.水添では失活し,透析実験では分子量3000以下であること,さらにシアノコバラミンをマーカーとして用いることにより,分子量1000以下であることがわかった.1.ジャガイモシスト線虫のふ化促進物質の抽出・分離・精製.活性物質の原料として,ジャガイモ根圏抽出液(標準ふ化液),トマト水耕液,トマト乾燥根の3種類を検討した.大量入手可能で,その中でも比較的安定な活性を示すトマト乾根を,粗原料として選択した.トマトの根を7月末採集し,冬期10°C以下で水抽出を行った.水抽出液にアンバーライトXAD-2樹脂を投入し,ドライアイスで撹拌と酸性化(pH5)を行いながら吸着させた.樹脂を口別後アセトンにて脱着,次いで濃縮し,黒褐色のオイルを得た(活性値10^<-4-5>g/ml).これを水-酢酸エチルにて分配し,水層を凍結乾燥して,粗抽出物を得た(活性値10^<-5>g/ml).続いて順に,水を用いたカラムクロマトグラフィー, 1)XAD-2, 2)セファデックスG-15, 3)セファデックスG-10,トヨパールHW-40c,トヨパールHW-40sに付して分離し次にHPLC分離を行い,最活性部を約100μgを得た(活性値10^<-9>g/ml).この分画と前後の弱活性を示す分画を400MHz-NMR測定を行ったところ,それまで多量に含まれていたオリゴ糖が除かれ,テルペノイド類に属すると考えられるスペクトルを与えた.2.活性物質の化学的性質.分離精製途中で,活性物質の化学的性質を明らかにするため,水素添加反応,セロファンチューブによる透析実験,ゲルロカクマトグラフィーによる分子量測定を行った.水添では失活し,透析実験では分子量3000以下であること,さらにシアノコバラミンをマーカーとして用いることにより,分子量1000以下であることがわかった.
歯周炎における歯肉溝上皮の細胞間接着装置を介した情報伝達機構の解析

細胞接着は、細胞の形態形成・極性・増殖・運動等において様々な重要な役割を果たしている。本研究では、歯周炎において細菌の刺激を受けた歯肉上皮細胞の動態について、細胞間接着装置に着目して解析を行った。歯周治療時に炎症歯肉を採取し、4%パラホルムアルデヒドにて固定後、通法に従ってパラフィンに包埋した。試料は薄切してシランコートスライドガラスに貼付し、細胞接着装置の1種であるアドヘレンスジャンクションの構成分子、E-カドヘリンとβ-カテニンについて、mRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて検索した。プローブはFITCで標識し、発色基質にはアルカリホスファターゼを用いた。検索の結果、E-カドヘリン、β-カテニンともに炎症部と非炎症部においてその発現に差は認められなかった。先に行った免疫組織化学染色において、タイトジャンクションの構成分子であるオクルディンの発現が弱かったことから、歯周炎における上皮細胞の反応には、アドヘレンスジャンクション以外の細胞接着装置がより関与している可能性も考えられる。今回は歯周治療時に得た歯肉を試料とし、同一切片上で炎症性細胞の浸潤の程度を目安としてmRNAやタンパクの発現の比較を行った。炎症歯肉という試料の性質上、炎症性細胞がほとんど見られない部位であっても、すでに上皮細胞が細菌に感作されている可能性も十分考えられ、炎症部と非炎症部においてその発現に差は認められなかった今回の結果につながったことも考えられる。歯周治療時に得た炎症歯肉をパラホルムアルデヒドにて固定後パラフィン包埋し、連続切片を作製した。これらの切片にE-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、γ-カテニン、オクルディンの抗体を用いて免疫染色を行った。E-カドヘリンは、基底細胞層かち顆粒細胞層にかけて上皮細胞の辺縁部および細胞突起に特異的な発現が認められた。結合組織内の炎症性細胞浸潤の多寡によるE-カドヘリンの発現に明らかな差は認められなかった。強度の炎症部位においては、上皮組織の剥離や上皮細胞間への炎症性細胞の浸潤、上皮細胞間の間隙の増大や細胞間橋の消失・断裂が認められた。β-カテニン・γ-カテニンについてもE-カドヘリンと同様、基底細胞層から顆粒細胞層にかけての上皮細胞の辺縁および細胞突起に発現が認められたが、α-カテニン、オクルディンについては弱い発現であった。α-、β-、γ-カテニンはいずれもE-カドヘリンの細胞膜裏打ちタンパクであるが、α-カテニンとβ-およびγ-カテニンの発現は一致していなかった。これらの結果をもとに、まずE-カドヘリンについてin situハイブリダイゼーション法を用いて炎症歯肉におけるmRNAの発現について検索を行っている。また、in vitroの系については、埋伏歯の抜歯時に正常歯肉を採取し、結合組織と上皮組織を分離してそれぞれ培養し、正常ヒト線維芽細胞および上皮細胞を得た。コラーゲンゲル中で線維芽細胞を培養した上に上皮細胞を重層させて3次元培養を行い、歯周炎モデルを作製中である。