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岩手の伝統野菜‘琴畑かぶ’の栄養特性および抗酸化力の評価

○研究目的我が国には、全国各地にその土地の気候・風土や歴史、食文化に根ざした地方伝統野菜が古くから存在するが、それら伝統野菜はその文化と共に消滅の危機にある。岩手県にも様々な伝統野菜が存在するが、その中でも遠野地方で古くから栽培されてきた`琴畑(ことはた)かぶ'は、栽培農家の減少から一時は途絶えたとされていた幻の野菜である。伝統野菜が恒常的に注目されるためには、単に「珍しい野菜」という希少価値だけではなく、その栄養成分や機能性成分を明らかにすることが重要である。そこで本研究では、岩手県の伝統野菜`琴畑かぶ'の一般成分、機能性成分に関する調査・分析を行い、その詳細について明らかにすることを目的とした。○研究方法供試材料は`琴畑かぶ'の他に、比較対象として一般的な小カブを用いた。5月と9月にそれぞれ播種し、生育調査をしたみちに一般成分と機能性成分の分析を行った。なお一般成分については外部委託とした。具体的な調査項目について、生育調査は「葉長、葉数、根長、根径、全重、根重」、一般成分は「エネルギー量、水分量、タンパク質、脂質、炭水化物、灰分、食塩相当量」、機能性成分は「抗酸化活性」とし、抗酸化活性は生の状態と茄でた状態で、DPPHラジカル消去活性の測定により分析した。○研究成果`琴畑かぶ'と小カブを比較して、一般成分に関してはナトリウム含量が`琴畑かぶ'でやや高い傾向にあった。その他の成分に関してはほぼ同程度であった。DPPHラジカル消去能は小カブに比べて`琴畑かぶ'では個体間で差が大きかった。「5月播種(生、茄で)」、「9月播種(生、茄で)」、いずれも小カブの方が高い値が得られたが、「9月播種(茄で)」を除いて`琴畑かぶ'との差は小さかった。`琴畑かぶ'の皮について生の状態で分析した結果、皮を剥いた部位の平均値と比べて「5月播種」で約7.3倍、「9月播種」で約5.6倍の値が得られた。
混合配位子錯体の生成に基づく新しいフッ化物イオンの吸光光度分析用試薬の開発

数種の有機試薬のジルコニウム(IV)錯体についてフッ化物イオンとの反応を検討した結果,セミキシレノ-ルオレンジを用いた系で有望な反応を見いだした.実際の定量に即して,条件(緩衝液の種類,pH,試薬濃度)の最適化を行った.この系の感度は現在広く用いられているランタンーアリザリンコンプレキソン系と同程度であるが,試薬ブランクが比較的低く,また瞬時に完結するという利点をもっている.フロ-インジェクション分析法を適用することによって,簡単で迅速なフッ化物イオンの分析法を確立することができた.この反応系およびすでにフッ化物イオンの蛍光定量法として定着しているジルコニウム(IV)ーカルセインブル-系についてイオン選択性電極を用いて溶液内の平衡を解析した.その結果,呈色反応はいずれも部分的に加水分解した親錯体がフッ化物イオンと反応してフッ化物イオンとの混合配位子錯体を生成する際に,発色団の金属イオンへの配位状況が変化するという,今までに知られていない機構によっていることを明らかにした.両配位子は実質的に同一の官能基を持っており,今後更に優れた有機試薬を開発していく上での指針をえた.多座の配位子の側鎖が混合配位子錯体の安定性に大きな影響をおよぼすことが判明したので,構造の簡単なアミノポリカルボン酸のZr(IV)錯体について詳しい検討を行った.DTPAおよびDPTAの場合には,Zr(IV)と最もよく適合し混合配位子錯体は生成しない.一方,配位数の多いTTHAでは,MLはほとんどフッ化物と反応しないが,プロトン化したMHLはかなり高い親和性を示し,EDTAなどのML錯体に近い配位状態にある.3ーの電荷を持つHEDTAとの錯体MLは4ーのEDTAのML錯体よりかなり大きい生成定数を持っているが,アルコ-ル性水酸基が脱プロトンして生ずるMH_<ー1>LではEDTAなどのML錯体と同じ電荷にも関わらず著しく親和性が低い.数種の有機試薬のジルコニウム(IV)錯体についてフッ化物イオンとの反応を検討した結果,セミキシレノ-ルオレンジを用いた系で有望な反応を見いだした.実際の定量に即して,条件(緩衝液の種類,pH,試薬濃度)の最適化を行った.この系の感度は現在広く用いられているランタンーアリザリンコンプレキソン系と同程度であるが,試薬ブランクが比較的低く,また瞬時に完結するという利点をもっている.フロ-インジェクション分析法を適用することによって,簡単で迅速なフッ化物イオンの分析法を確立することができた.この反応系およびすでにフッ化物イオンの蛍光定量法として定着しているジルコニウム(IV)ーカルセインブル-系についてイオン選択性電極を用いて溶液内の平衡を解析した.その結果,呈色反応はいずれも部分的に加水分解した親錯体がフッ化物イオンと反応してフッ化物イオンとの混合配位子錯体を生成する際に,発色団の金属イオンへの配位状況が変化するという,今までに知られていない機構によっていることを明らかにした.両配位子は実質的に同一の官能基を持っており,今後更に優れた有機試薬を開発していく上での指針をえた.多座の配位子の側鎖が混合配位子錯体の安定性に大きな影響をおよぼすことが判明したので,構造の簡単なアミノポリカルボン酸のZr(IV)錯体について詳しい検討を行った.DTPAおよびDPTAの場合には,Zr(IV)と最もよく適合し混合配位子錯体は生成しない.一方,配位数の多いTTHAでは,MLはほとんどフッ化物と反応しないが,プロトン化したMHLはかなり高い親和性を示し,EDTAなどのML錯体に近い配位状態にある.3ーの電荷を持つHEDTAとの錯体MLは4ーのEDTAのML錯体よりかなり大きい生成定数を持っているが,アルコ-ル性水酸基が脱プロトンして生ずるMH_<ー1>LではEDTAなどのML錯体と同じ電荷にも関わらず著しく親和性が低い.ジルコニウム(IV)の各種有機試薬およびフッ化物イオンとの混合配位子錯体の生成について、イオン選択性電極を用いる電位差滴定法によって系統的な検討を行った。アミノポリカルボン酸の中で供与原子の数が8であるDTPAの場合に混合配位子錯体の生成が起こりにくいことを見い出したので、これを用いてZr(IV)共存下でのイオン選択電極によるF^ーの定量法を確立することができた(Analyst,1991)。一方、HEDTAのように共存原子の数が少ない配位子の場合、かなり安定存混合配位子錯体の生成することがわかった。そこで、イミノニ酢酸ユニットを有する発色試薬であるキシレノ-ルオレンジとのZr(IV)錯体を選びフッ化物イオンの比色定量試薬としての可能性を検討した。この過程で、Zr(IV)ーXO二元系で生成する錯体に関する10以上のすべての報告に、実験上およびデ-タ解析上の誤りがあることを見出した。Zr(IV)ストック溶液の加水分解・反応速度・広いpHおよび金属:配位子比率等に留意して測定を行った結果、この系では1:1および1:2錯体が生成する・反応速度が非常に遅い・pHが低い場合には1:1錯体は定量的には生成しない・1:2錯体の安定性は更に低きそのモル吸光係数は1:1錯体の2倍より小さい等の点を明らかにした。

これらの知見に基づいてフッ化物イオンとの反応を検討し、10^<ー4>moldm^<ー3>レベルのフッ化物イオンを定量できる条件を見出した(Anal.Chem,発表予定)。この系では混合配位子錯体の安定性が低いために高い感度を得ることができなかった。そこで一つの配位子で二つのZr(IV)と反応し、フッ化物イオンがその両金属中心と相互作用できるような試薬を合成し、その二元系・三元系での反応・比色定量への応用について現在検討している。数種の有機試薬のジルコニウム(IV)錯体についてフッ化物イオンとの反応を検討した結果,セミキシレノ-ルオレンジを用いた系で有望な反応を見いだした.実際の定量に即して,条件(緩衝液の種類,pH,試薬濃度)の最適化を行った.この系の感度は現在広く用いられているランタンーアリザリンコンプレキソン系と同程度であるが,試薬ブランクが比較的低く,また瞬時に完結するという利点をもっている.フロ-インジェクション分析法を適用することによって,簡単で迅速なフッ化物イオンの分析法を確立することができた.この反応系およびすでにフッ化物イオンの蛍光定量法として定着しているジルコニウム(IV)ーカルセインブル-系についてイオン選択性電極を用いて溶液内の平衡を解析した.その結果,呈色反応はいずれも部分的に加水分解した親錯体がフッ化物イオンと反応してフッ化物イオンとの混合配位子錯体を生成する際に,発色団の金属イオンへの配位状況が変化するという,今までに知られていない機構によっていることを明らかにした.両配位子は実質的に同一の官能基を持っており,今後更に優れた有機試薬を開発していく上での指針をえた.多座の配位子の側鎖が混合配位子錯体の安定性に大きな影響をおよぼすことが判明したので,構造の簡単なアミノポリカルボン酸のZr(IV)錯体について詳しい検討を行った.DTPAおよびDPTAの場合には,Zr(IV)と最もよく適合し混合配位子錯体は生成しない.一方,配位数の多いTTHAでは,MLはほとんどフッ化物と反応しないが,プロトン化したMHLはかなり高い親和性を示し,EDTAなどのML錯体に近い配位状態にある.3ーの電荷を持つHEDTAとの錯体MLは4ーのEDTAのML錯体よりかなり大きい生成定数を持っているが,アルコ-ル性水酸基が脱プロトンして生ずるMH_<ー1>LではEDTAなどのML錯体と同じ電荷にも関わらず著しく親和性が低い.
光で内部の静電反発力をオンオフする、高速・異方性ヒドロゲルアクチュエータの創成

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
18歳選挙権を踏まえた主権者教育及び子どもの社会参画促進につなげる国際比較研究

(1)主権者意識を育む教育のあり方の実践検証と評価<スウェーデン視察>スウェーデン総選挙(2018年9月)における学校選挙、政治教育及びシティズンシップ教育の現場を視察するために、スウェーデン・ストックホルムの中学校・高校・ユースセンター・若者市民社会庁・現地NPO等を訪問し意見交換を行った。<研究会の実施>18歳選挙権時代が始まった日本では、高校はもとより、小学校や中学校段階での政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育の取り組みに関心が集まっている。しかし海外では、実際の選挙時に小学校で模擬選挙が普通に行われ、子ども時代からシティズンシップや民主主義について学び、権利主体としての子どもが社会参画する機会が多々ある。そこで、ドイツ(2017年連邦議会議員選挙)、アメリカ(2016年大統領選挙)、スウェーデン(2014年総選挙/2018年総選挙)で取り組まれている政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育・民主主義教育・子どもの社会参画の現場視察を踏まえ、日本におけるこれからの可能性と課題について考える研究会を、2018年12月に実施した。(2)子どもの声を政治・行政に反映する機会の効果検証と評価「「地方自治と子ども施策」全国自治体シンポジウム2018宗像」(2018年10月実施予定だったが、台風接近のため2019年2月に延期実施)を通じて、実際に自治体における子ども会議に参加している子どもおよび自治体職員から、その効果と評価について意見を伺った。また、模擬選挙や研究会などを通じて、中高生世代の声を把握した。模擬選挙に関する報告書を作成し、ウェブサイトを通じて情報発信を行うとともに、論文や書籍などで政治教育・主権者教育が抱えている課題や展望についてまとめた。(1)主権者意識を育む教育のあり方の実践検証と評価<研究会の実施>2016年6月19日から「18歳選挙権」が始まり、同年7月の参院選では、模擬選挙の参加者が1万人を超え、中学校や高校での模擬選挙に注目が集まった。その一方で、「政治的中立性」との兼ね合いもあり、政治教育・主権者教育のこれからについて模索が続いている。そこで、7月の参院選で模擬選挙に取り組まれた中学校・高校の先生方からの報告、学校と連携している民間団体の工夫、メディアの立場からの提言、当事者である高校生とともに、これからの政治教育・主権者教育についての意見交換を行った。<アメリカ視察>大統領選挙(2016年10月)における模擬選挙、政治教育及びシティズンシップ教育の現場を視察するために、高校教員、NPOスタッフとともにアリゾナ州フェニックスの小学校・中学校・高校・大学・州教育局・現地NPO等を訪問し意見交換を行った。(2)子どもの声を政治・行政に反映する機会の効果検証と評価「「地方自治と子ども施策」全国自治体シンポジウム2016宝塚」を通じて、実際に自治体における子ども会議に参加している子どもおよび自治体職員から、その効果と評価について意見を伺った。また、模擬選挙やセミナーなどを通じて、中高生世代の声を把握した。検証のための研究チームの立ち上げにはいたらなかったが、10月に行った研究会において報告いただいた先生方から中学・高校の学校現場が抱えている課題が多数出され、今後の改善点を見出すことができた。また、初の18歳選挙権による国政選挙となった7月の参院選を踏まえて、各地からも課題が届いている。学生団体、NPOなどが各地で活躍していたこともあり、それらの団体からも課題やこれからの展望が寄せられている。特に「政治的中立性」に対しては、自民党がいわゆる“密告サイト"を開設したことによって、必要以上に意識していることが把握できた。海外での取り組みについては、アメリカでの調査についてまとめるとともに、アメリカで模擬選挙を推進しているMock Election USAと連携をとることとなった。なお、子どもの声は必要に応じて把握してきているが、初の18歳選挙ということで学校現場も慎重になったため、意識調査を行うことはできなかった。(1)主権者意識を育む教育のあり方の実践検証と評価<海外視察>ドイツ連邦議会議員選挙(2017年9月)における模擬選挙、政治教育及びシティズンシップ教育の現場を視察するために、ドイツ・ベルリンの政治教育センター・中学校・高校・ユースセンター・現地NPO等を訪問し意見交換を行った。コスタリカ大統領選挙(2018年2月)における模擬選挙、民主主義教育及び平和教育の現場を視察するために、コスタリカ・サンホセの憲法最高裁判所・公教育省・投票所・模擬選挙の投票所(子ども博物館、チャンネル7)・憲法法廷・国会議事堂等を訪問し意見交換を行った。<研究会の実施>18歳選挙権時代が始まった日本では、学校での政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育の取り組みに関心が集まっている。そこで、ドイツ、アメリカ、スウェーデンで取り組まれている政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育・民主主義教育・子どもの社会参画の現場視察を踏まえ、日本におけるこれからの可能性と課題について考える研究会を、2017年12月に実施した。(2)子どもの声を政治・行政に反映する機会の効果検証と評価「「地方自治と子ども施策」全国自治体シンポジウム2017えちぜん」を通じて、実際に自治体における子ども会議に参加している子どもおよび自治体職員から、その効果と評価について意見を伺った。

また、模擬選挙や研究会などを通じて、中高生世代の声を把握した。模擬選挙に関する報告書を作成し、ウェブサイトを通じて情報発信を行うとともに、論文や書籍などで政治教育・主権者教育が抱えている課題や展望についてまとめた。検証のための研究チームの立ち上げにはいたらなかったが、12月に行った研究会において日本の学校現場が抱えている課題が浮き彫りとなり、今後の改善点を見出すことができた。また、18歳選挙権による国政選挙がすでに2回(2016年7月の参院選、2017年10月の衆議院総選挙)行われ、かつ、地方選挙でも18歳選挙権が普通に行われる中、各地からも課題が届いている。学生団体、NPOなどが各地で活躍していたこともあり、それらの団体からも課題やこれからの展望が寄せられている。海外での取り組みについては、12月の研究会の実施によって、アメリカおよびドイツの実践についてまとめることができ、コスタリカについても調査結果をまとめているところである。特に、海外の模擬選挙を含めた政治教育の実態について実際に視察をしたことに対する需要は高く、各地から報告に招かれている。なお、子どもの声は必要に応じて把握してきているが、18歳選挙が始まってまだ2年が経過した段階でもあり、学校現場が慎重で、十分に取り組めていない。(1)主権者意識を育む教育のあり方の実践検証と評価<スウェーデン視察>スウェーデン総選挙(2018年9月)における学校選挙、政治教育及びシティズンシップ教育の現場を視察するために、スウェーデン・ストックホルムの中学校・高校・ユースセンター・若者市民社会庁・現地NPO等を訪問し意見交換を行った。<研究会の実施>18歳選挙権時代が始まった日本では、高校はもとより、小学校や中学校段階での政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育の取り組みに関心が集まっている。しかし海外では、実際の選挙時に小学校で模擬選挙が普通に行われ、子ども時代からシティズンシップや民主主義について学び、権利主体としての子どもが社会参画する機会が多々ある。そこで、ドイツ(2017年連邦議会議員選挙)、アメリカ(2016年大統領選挙)、スウェーデン(2014年総選挙/2018年総選挙)で取り組まれている政治教育・主権者教育・シティズンシップ教育・民主主義教育・子どもの社会参画の現場視察を踏まえ、日本におけるこれからの可能性と課題について考える研究会を、2018年12月に実施した。(2)子どもの声を政治・行政に反映する機会の効果検証と評価「「地方自治と子ども施策」全国自治体シンポジウム2018宗像」(2018年10月実施予定だったが、台風接近のため2019年2月に延期実施)を通じて、実際に自治体における子ども会議に参加している子どもおよび自治体職員から、その効果と評価について意見を伺った。
グレリン受容体発現細胞の免疫による立体構造認識抗体および機能性抗体の作出

グレリンは、胃から発見されたペプチドホルモンである。グレリンは、Gタンパク質共役型受容体のひとつであるグレリン受容体に結合することによって成長ホルモンの分泌促進や摂食亢進などの生理作用を示す。グレリンが受容体に結合するためには、3番目のセリン残基のオクタン酸修飾が必須であるがその分子機構は未だ明らかになっていない。そこで、X線結晶構造解析を用いたグレリン受容体のオクタン酸修飾グレリン認識機構の解明を目的として、抗グレリン受容体抗体の作出を試み、グレリン受容体の熱安定性を向上させる抗体を作出することができた。本研究は、グレリン受容体のX線結晶構造解析に資するグレリン受容体立体構造認識抗体を取得することを目的としている。平成28年度は研究計画に基づき、1抗原の作製、2免疫および3スクリーニングを行い、23株のグレリン受容体の立体構造認識抗体を作出することに成功した。1抗原の作製:CHO細胞を発現宿主として、リポフェクション法でグレリン受容体を遺伝子導入し、グレリン受容体高発現株を作製した。また同時に、別の抗原作製方法として精製グレリン受容体をリポソームに再構築するプロテオリポソーム法も検討し、グレリン受容体のプロテオリポソームを作製した。2免疫:グレリン受容体ノックアウトマウスと自己免疫疾患マウスの2系統のマウスに対して、免疫を行った。1014日ごとに3回免疫を行い、ELISA法によって血清中の抗体価が十分に上昇していることを確認した。脾臓摘出後、脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させることでハイブリドーマ細胞を作製した。3スクリーニング:ハイブリドーマ細胞の細胞上清を用いて、各種ELISA法およびゲル濾過クロマトグラフィーによってグレリン受容体立体構造認識抗体株をスクリーニングした。その結果、23株がグレリン受容体立体構造認識抗体であることが示唆された。さらにFACS解析によって、うち1株が細胞外認識抗体であることが示唆された。本研究によってグレリン受容体のX線結晶構造解析に資する抗体を取得し、立体構造を決定することができれば、生命活動に重要なホルモンであるグレリンの認識機構を明らかにすることができ、グレリン研究において長年の課題であった、グレリンの脂肪酸修飾の生理学的な意義を明らかにすることができると考える。1抗原の作製:グレリン受容体の発現宿主細胞を、当初の計画にあったBa/F3細胞からCHO細胞に変更した。これは、Ba/F3細胞にリポフェクション法で遺伝子導入することが困難であったためである。検討の結果、エレクトロポレーション法であれば遺伝子導入が可能であったが、当研究室に機器がなく、恒常的な実験が不可能であったため断念した。一方でCHO細胞は、リポフェクション法での遺伝子導入が可能であり、比較的容易にグレリン受容体高発現株を作製することができた。2免疫:研究計画にあったグレリン受容体ノックアウトマウスへの免疫に加えて、自己免疫疾患マウスへの免疫を行った。3回の免疫によって血清中の抗体価が十分に上昇していることを確認し、ハイブリドーマ法によって抗体産生細胞を作製した。3スクリーニング:スクリーニングの結果、23株のグレリン受容体立体構造認識抗体であることを取得した。いくつかの点で研究計画を見直す必要があったが、各ステップにおいて問題点を解決し、現段階までに当初の見込みを上回る立体構造認識抗体および細胞外認識抗体を取得することができた。平成29年度は、前年度に作出した23株の抗グレリン受容体抗体産生細胞株の1モノクローン化および2抗体の大量発現と精製を行い、3抗体がグレリン受容体の安定化に寄与するか検討した。さらに4熱安定性に寄与した抗体のシークエンス解析を行った。123株の抗体産生細胞株のモノクローン化を行った。細胞を96ウェルに限界希釈することでシングルコロニーを得た。これらのシングルコロニーが、目的とする抗グレリン受容体抗体を産生しているか、ELISA法によって確認した。その結果、23株のうち10株の抗体産生細胞株のモノクローン化に成功した。2抗体の大量発現と精製を行った。抗体産生細胞株を135 mLで培養し、Protein Aカラムを用いて、IgG精製した。精製したIgGは、パパイン処理することによって断片化した。その後、ゲル濾過クロマトグラフィーによってFab断片とFc断片を分離した。3精製した抗体Fab断片がグレリン受容体の安定性に寄与するか検討した。グレリン受容体を精製し、作出した抗体Fab断片と混和して複合体形成させた。その後、CPM assayによって熱安定性を測定した。その結果、10株の抗体株のうち、2種類がグレリン受容体の熱安定性を3度程度向上させた。4熱安定性に寄与した2株の抗体のシークエンス解析を行った。細胞株からRNAを抽出して逆転写反応によってcDNAを作製した。

このcDNAを用いて、抗体のL鎖およびH鎖特異的なプライマーでPCRを行い、サブクローニング後、シークエンス解析を行った。その結果、これら2株は、同一クローンであることを確認した。本研究によって、グレリン受容体のX線結晶構造解析に資するグレリン受容体立体構造認識抗体を1株取得することができた。グレリンは、胃から発見されたペプチドホルモンである。グレリンは、Gタンパク質共役型受容体のひとつであるグレリン受容体に結合することによって成長ホルモンの分泌促進や摂食亢進などの生理作用を示す。グレリンが受容体に結合するためには、3番目のセリン残基のオクタン酸修飾が必須であるがその分子機構は未だ明らかになっていない。そこで、X線結晶構造解析を用いたグレリン受容体のオクタン酸修飾グレリン認識機構の解明を目的として、抗グレリン受容体抗体の作出を試み、グレリン受容体の熱安定性を向上させる抗体を作出することができた。平成29年度は、作出した抗体がグレリン受容体の熱安定性に寄与するか、さらに細胞外認識抗体については細胞内シグナルに影響を及ぼすか検討する。作出した抗グレリン受容体抗体産生細胞株は、100 mLで拡大培養して培養上清からIgGを精製する。さらに、精製したIgGをパパイン処理することによってFabを作製する。作製したFabと精製グレリン受容体を混和してCPM assayによって複合体の熱安定性(Tm値)を検討する。グレリン受容体単体と比較してTm値を向上させたFabが複数ある場合は、抗体産生細胞株からRNA抽出を行い、逆転写後、シークエンスをチェックする。Tm値を向上させることが確認されれば、グレリン受容体と複合体を形成させて、結晶化を行い、結晶形成を促進させるか検討する。細胞外認識抗体は、FACSによってグレリン受容体細胞外ループのどの領域を認識しているかさらに詳細に検討する。グレリン受容体は7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体(GPCR)に属しており、3つの細胞外ループを形成している。この細胞外ループをそれぞれ独立して別GPCRのループに置換することで、抗体がどのループを認識しているか明らかにする。さらに、Ca2+フラックスアッセイまたはレポーターアッセイによって細胞内シグナルに影響を及ぼすか検討する。内分泌28年度は、免疫原の調整と抗体作製を中心に研究を進めた。遺伝子導入方法が、当初予定していたエレクトロポレーション法からリポフェクション法に変更になったが、おおまかな実験条件の検討がすでに十分に行えていたこともあり、順調に研究を進めることができた。そのため追加の実験の必要が少なく、結果として今年度の執行額が減少した。28年度は実験が順調に進んだ。また期待されていた以上の抗体クローンを作出することができた。29年度は、これらの抗体の機能解析および論文作製を行う。機能解析に十分量の抗体を精製するために培地や精製のための試薬やカラムが総じて増加することが考えられるため、次年度使用額は、これらに充てる予定である。
生体膜機能性複合糖脂質の合成

近年、生体膜機能性物質に関する研究は世界各国で多角的に進められ、それらの生化学的性質が徐々に明らかになってきている。しかしながら、複合脂質(スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質、グリセロン脂質等)の細胞膜における生理的機能については未だ不明な点が多い。また、複合脂質は、通常その脂肪酸組成は単一でなく、かつ脂肪酸の種類の異なる類縁体の分離が極めて困難であることから、それらを効率的に合成し、その生理的機能解明に資することは重要な研究課題である。本研究は、共通の光学活性合成素子を経由して、脂肪酸組成の単一なスフィンゴ糖脂質およびグリセロ糖脂質の一般性の高い合成法の開発を目的としている。平成2年度に以下に示す研究成果を得た。(1)2ーブテンー1、4ージオ-ルから数行程で誘導される数種のアリルアルコ-ル体を基質とした不斉エポキシ化反応を詳細に検討した結果、複合脂質合成の素子として有用な光学活性C4ーエポキシドを合成することができた。(2)光学活性C4ーエポキシドを出発原料として、スフィンゴ糖脂質の構成アミノアルコ-ルであるC18ースフィンゴシンの4種の光学異性(Dーエリスロ、Lーエリスロ、Dースレオ、Lースレオ)体を合成した。(3)天然型のDーエリスローC18ースフィンゴシンを用いて、ゴ-シェ-病患者の脾臓から分離されるスフィンゴ糖脂質のパルミトイル類縁体の合成に成功した。(4)光学活性Cー4エポキシドを出発原料として、グリセロリン脂質の一つC16型血小板活性化因子(C16ーPAF)の合成に成功した。(5)光学活性C4ーエポキシドを出発原料として、沖縄産海綿から分離されている抗炎症活性グリセロ糖脂質Mー5のパルミチン酸アナログの合成に成功した。(6)複合脂質と生体膜機能の関連性の検討に有用な人工液膜およびヒト赤血球膜を用いる3種にイオノフォア活性試験法を開発した。
スーパー繊維と先進複合材料の圧縮挙動に関する研究

今世紀に入り、炭素、アラミド等の各種高性能繊維が開発、製造されている。これらは航空宇宙分野等における構造部材、スポーツ用品、その他数多くの目的に使用されている高分子系複合材料の強化材としての用途が見出されている。これら高性能繊維の繊維方向の引張特性は近年大幅に向上してきているが、その反面、圧縮特性に関しては引張特性と比較すると貧弱であり、座屈現象等複雑な要因が絡み合って、あまり明白にされていないのが現状である。これらの繊維を強化材とする複合材料においても同様の指摘がなされており、構造部材等として圧縮荷重下において適用されることを考えると、不可避な問題とせざるを得ない。このような背景を考慮し、本研究では先進高性能繊維とそれらを用いた高分子系複合材料の圧縮挙動について詳細に検討してきた。本年度ではまず強化繊維そのものの圧縮挙動を、引張リコイル試験法により検討した。本試験法は単繊維の圧縮強度を簡便に、かつ直接的に得ることができる方法として知られている。対象としたのは主にPAN系炭素繊維であり、しかも高弾性率型のものである。引張弾性率が異なる数種類の炭素繊維について試験し、軸方向圧縮強度と繊維の剛性の関係を明らかにすることを試みた。その結果、各繊維の圧縮強度が定量的に評価され、しかも繊維の剛性が増せば圧縮強度は低下するという知見が得られた。さらに圧縮破壊後の炭素繊維の破断面を走査電子顕微鏡により観察した結果、繊維の剛性が増すほど破壊モードが曲げ破壊モードからせん断破壊モードへと移行したことがわかった。圧縮荷重下においてせん断破壊を呈するのはPitch系炭素繊維の特徴の一つであることから、炭素繊維の剛性を増すことは微細構造の変化に密接に関連し、PAN系よりむしろPitch系の構造に近づいてゆくことなどの推察がなされた。他にアラミド繊維、ガラス繊維についても同様のアプローチを試み、主に圧縮強度に及ぼす表面処理の影響を明らかにした。複合材料全体の特性に重大な影響を及ぼすとされている繊維/樹脂間の界面について、その圧縮荷重下における特性の評価も行った。これについては確立された試験法が存在しないため、まず試験法の検討から開始した。具体的には単繊維を樹脂中に埋蔵させた試験片を作製し、軸方向に圧縮して繊維および界面の変化を観察した。さらに界面伝達効率なる概念を適用して実験結果を取り扱うことにより、圧縮荷重下における界面特性を定量的に評価することに成功した。リコイル試験法による強化繊維の圧縮挙動および単繊維埋蔵圧縮試験法による界面の圧縮挙動についての知見は、次の複合材料全体の圧縮挙動についての議論において有用な役割を果たした。複合材料の圧縮試験では、主に一方向炭素繊維強化プラスチックス(CFRP)を実験対象とし、静的な試験を行った。まずリコイル試験において対象としたものと同一の、異なる剛性を有する炭素繊維を強化材として選択し、これら強化繊維特性がCFRPの圧縮挙動に及ぼす影響について検討した。その結果、強化繊維の剛性が低いと繊維の微小座屈がCFRP中において生じ易くなり、せん断破壊モードを誘起する形で材料全体の圧縮強度が低下することがわかった。また界面特性の見地から考察すると、界面の接着性が悪いと繊維の微小座屈が生じ、同様に圧縮強度向上の妨げとなることが判明した。次に異なるマトリックス樹脂から成るCFRPの圧縮試験も行ったところ、樹脂の剛性が低い場合繊維の微小座屈現象が生じる傾向となり、圧縮強度が低下することが明らかとなった。これらの結果から、圧縮荷重下におけるCFRPの力学的特性を向上させるには、繊維および樹脂の剛性を増し、さらに接着性の高い界面を有する系を選択することが必要であることがわかった。しかし先のリコイル試験における結果において、炭素繊維の剛性を高くし過ぎると繊維の圧縮強度がかなり低下したことを考慮すると、強化材としての炭素繊維には、中間の弾性率を有するものを選択すべきであるという結論を得た。このように、高分子系複合材料の圧縮挙動に対して、その強化繊維、マトリックス樹脂および界面といった各々の構成要素の圧縮強度の寄与を考慮してアプローチを行うことにより、圧縮荷重下においてより優れた特性を有する複合材料の設計指針を得ることができた。

さらに圧縮破壊後の炭素繊維の破断面を走査電子顕微鏡により観察した結果、繊維の剛性が増すほど破壊モードが曲げ破壊モードからせん断破壊モードへと移行したことがわかった。圧縮荷重下においてせん断破壊を呈するのはPitch系炭素繊維の特徴の一つであることから、炭素繊維の剛性を増すことは微細構造の変化に密接に関連し、PAN系よりむしろPitch系の構造に近づいてゆくことなどの推察がなされた。他にアラミド繊維、ガラス繊維についても同様のアプローチを試み、主に圧縮強度に及ぼす表面処理の影響を明らかにした。複合材料全体の特性に重大な影響を及ぼすとされている繊維/樹脂間の界面について、その圧縮荷重下における特性の評価も行った。これについては確立された試験法が存在しないため、まず試験法の検討から開始した。具体的には単繊維を樹脂中に埋蔵させた試験片を作製し、軸方向に圧縮して繊維および界面の変化を観察した。さらに界面伝達効率なる概念を適用して実験結果を取り扱うことにより、圧縮荷重下における界面特性を定量的に評価することに成功した。リコイル試験法による強化繊維の圧縮挙動および単繊維埋蔵圧縮試験法による界面の圧縮挙動についての知見は、次の複合材料全体の圧縮挙動についての議論において有用な役割を果たした。複合材料の圧縮試験では、主に一方向炭素繊維強化プラスチックス(CFRP)を実験対象とし、静的な試験を行った。まずリコイル試験において対象としたものと同一の、異なる剛性を有する炭素繊維を強化材として選択し、これら強化繊維特性がCFRPの圧縮挙動に及ぼす影響について検討した。その結果、強化繊維の剛性が低いと繊維の微小座屈がCFRP中において生じ易くなり、せん断破壊モードを誘起する形で材料全体の圧縮強度が低下することがわかった。また界面特性の見地から考察すると、界面の接着性が悪いと繊維の微小座屈が生じ、同様に圧縮強度向上の妨げとなることが判明した。次に異なるマトリックス樹脂から成るCFRPの圧縮試験も行ったところ、樹脂の剛性が低い場合繊維の微小座屈現象が生じる傾向となり、圧縮強度が低下することが明らかとなった。これらの結果から、圧縮荷重下におけるCFRPの力学的特性を向上させるには、繊維および樹脂の剛性を増し、さらに接着性の高い界面を有する系を選択することが必要であることがわかった。しかし先のリコイル試験における結果において、炭素繊維の剛性を高くし過ぎると繊維の圧縮強度がかなり低下したことを考慮すると、強化材としての炭素繊維には、中間の弾性率を有するものを選択すべきであるという結論を得た。このように、高分子系複合材料の圧縮挙動に対して、その強化繊維、マトリックス樹脂および界面といった各々の構成要素の圧縮強度の寄与を考慮してアプローチを行うことにより、圧縮荷重下においてより優れた特性を有する複合材料の設計指針を得ることができた。炭素繊維強化熱硬化性樹脂複合材料を成形し、その圧縮試験を実施した。その際、ASTMに準拠したジグと、我々が独自に作製したジグを使用することにより、2種類の圧縮試験方法について検討した。
視床CM核―線条体系による行動選択の学習と制御の神経回路基盤

今年度の研究によって2つの成果を挙げた。第一に、電気生理学の手法によって背測線条体に投射する視床CM核細胞を同定した。感覚刺激に長い潜時で応答し、刺激と運動を連結する役割を持っていた。第二に、感覚刺激に短潜時で応答する細胞は、文脈(行動と報酬の連合)や報酬を得るまでの手続きが変更されてSurprise“びっくり"が起こった時に、特異的に活動をすることを見出した。木村と共同研究者は視床髄版内核と大脳基底核の機能連関に関する研究を継続的に行ってきた。これらの成果に基づいて、平成26年度には仮説『基底核出力を受ける視床CM/PF核が、価値の高い選択肢にバイアスをかけると共に、バイアスのミスマッチを知らせる刺激を検出し、線条体に投射することでバイアスを切り替える』を検証するための実験研究を行った。研究代表者と共同研究者の分類によるサルの視床CM核のSLF、LLF細胞が、報酬に基づく特定の行動へのバイアス信号と、バイアス行動Aから非バイアス行動Bへのバイアスの切り替え信号が表現されるかに注目して詳細に検討した。その結果、CM核には感覚刺激に興奮応答をせず、従来報告されてこなかったNSF細胞が多数存在し、この細胞が特定の行動へのバイアス信号を担っていることが判明した。更に、GO-NOGO課題を用いてCM核細胞の活動を調べたところ、LLF細胞は小さな報酬と連合した行動を教示する視覚刺激によって特に強く活性化されることが判明した。この結果は、LLF細胞が行動バイアスと行動の教示のミスマッチがある場合に、バイアスを打ち消す働きを担うことを示唆している(発表論文1)。ラットを対象とするシステム神経科学研究に遺伝子工学と光遺伝学を用いた先端技術を導入する実験系を立ち上げた。大脳基底核線条体の間接路を特徴づけるドーパミンD2受容体を含有する細胞特異的にD2-Creを発現するトランスジェニックラットを共同研究者から供給願った。D2受容体を含有する細胞特異的に蛍光(GFP)とチャネルロドプシンを発現させるウイルスをこのラットの線条体に注入することによって、間接路細胞の同定と活動記録、選択的な光刺激が可能になる点で大きなメリットがある。現在、ウイルスを注入して線条体でのD2受容体含有細胞特異性と、チャネルロドプシンの発現を詳細に検討中である。本研究課題の目的は、視床線条体投射による行動学習と行動選択の神経回路メカニズムを明らかにすることである。26年度の研究によって、CM核にはLLF、SLF細胞の他に、感覚刺激には応答しないNSF細胞が多数存在することが確認された。本年度は、特定の行動へのバイアス信号、動機づけや注意による認知的バイアス信号を担っているかどうかを検討した。視覚の指示によって、右ボタンと左ボタンのいずれかを押さえるHOLDーGO課題を日本ザルに行わせた。50ー90試行(1ブロック)の間、指示される行動と報酬量の大小の関係が、右ボタン大報酬ー左ボタン小報酬のように一定であるので、サルは報酬量が多い行動の指示が現れることを期待させた。この点は大報酬行動の反応時間が小報酬行動よりも短いことで確認された。予測できない時点で次のブロックに移行し、行動ー報酬関係を逆転させた。NSF細胞は、ボタン押し行動を指示する視覚刺激(GO)が現れる直前に、持続的に放電を増大させた。この活動は、現在の行動ブロックで大報酬に連合した行動に選択的に生じたので、大報酬に連合した行動を素早く、確実に実行できるように予めバイアスをかけることに作用することが示唆された。LLF細胞は、GO刺激で指示される行動が、予めバイアスがはたらいている大報酬行動と同じ場合には、異なる時よりも短い潜時で応答した。この結果は、行動バイアスをGO刺激で支持される行動に反映させるはたらきを持つことを示す。これらの成果は、報酬に基づく意志決定と行動選択に関する視床CM核の役割の理解への重要な示唆を与えた。大脳基底核の直接路・間接路機能に視床CM核から線条体への投射の役割を知るために、ラットを対象とするシステム神経科学研究、遺伝子工学、光遺伝学を導入し、検討を開始した。大脳基底核の機能は、頭頂葉、前頭葉皮質を中心に広範囲の大脳皮質から線条体へ部位特異的に運動、感覚信号、更に選択肢の価値に関わる情報が投射され、中脳ドーパミン細胞由来の動機づけや報酬予測誤差情報によって学習、意志決定と行動選択における役割が次第に明らかになってきている。一方、視床から線条体への強力な投射の機能については、研究代表者らの従来の研究を中心に、顕著な感覚手がかりに対する注意の喚起や行動選択への関与が示唆されている段階であり、神経回路メカニズムの理解が求められている。27年度から現在までの研究によって、1.NSF細胞は、行動の文脈に基づいて報酬に連合した行動に対して予めバイアスをかけることに作用し、報酬に連合した行動を素早く、確実に実行できるように貢献することが示唆された。2.LLF細胞は、外部からの指示でおこなう行動が、予めバイアスがはたらいている行動と同じ場合に、外部からの指示でおこなう行動に対して行動バイアスを反映させるはたらきを持つことを示唆する成果を得た。

3.SLF細胞は、刺激と報酬の連合関係や、報酬獲得までの手続きなどが予測に範囲して変化し、“Surprise、びっくり"した時に、特異的に活動し、新しい行動文脈の検出と学習に関わることが示唆された。これらの成果によって、報酬に基づく意志決定と行動選択に関する視床CM核、そして大脳基底核の役割の理解への重要な1歩となった。本研究課題の目的は、行動学習と行動選択の大脳基底核の神経回路メカニズムを明らかにすることである。27年度までの研究によって、1.視床CM核にはLLF、SLF細胞の他に、感覚刺激には応答しないNSF細胞が多数存在すること、2.NSF細胞は行動文脈の中から報酬に連合した選択肢を予測し、報酬に連合した選択肢を素早く、確実に実行できるように予めバイアスをかけること、3.LLF細胞はこのバイアスを外界から求められる行動に反映させるはたらきを持つことを明らかにした。27年度の成果は2点である。1.LLF、SLF、NSFの中いずれの細胞が線条体に投射するかを調べた。線条体(被殻)に刺入している電極から電流パルスを流すことによって、視床CM細胞が逆行性活動電位を発生させるかどうかを調べた。逆行性活動電位かどうかは、CM細胞の自発放電と被殻刺激に由来する活動電位が衝突することで確認できる。9個のNSF細胞と13個のLLF細胞についてこのテストを行い、4個のLLF細胞の活動電位が被殻の刺激によって逆行性に伝道する活動電位と衝突することを確認し、視床線条体投射細胞であることを明らかにした。SLF、NSF細胞が線条体に投射するかどうかについては、今回の研究でテストした細胞数が少ないために結論することができず、今後の課題として残された。2.SLF細胞について、GO/NOGO課題、HOLDーGO課題、HOLDーCUEーGO課題で放電活動を調べた結果、文脈(行動と報酬の連合)や報酬を得るまでの手続きが変更されてSurprise“びっくり"が起こった時に、特異的に活動をすることを見出した。この活動が線条体に投射されて、刺激ー行動ー報酬の連合学習に導くことを示唆する。Journal of Neural Transmission誌にReview論文として発表した。今年度の研究によって2つの成果を挙げた。第一に、電気生理学の手法によって背測線条体に投射する視床CM核細胞を同定した。感覚刺激に長い潜時で応答し、刺激と運動を連結する役割を持っていた。第二に、感覚刺激に短潜時で応答する細胞は、文脈(行動と報酬の連合)や報酬を得るまでの手続きが変更されてSurprise“びっくり"が起こった時に、特異的に活動をすることを見出した。大脳基底核の機能は、大脳皮質から線条体への運動、感覚信号、更に選択肢の価値に関わる情報が投射され、中脳ドーパミン細胞由来の報酬予測誤差情報と動機づけ情報によって学習、意志決定と行動選択における役割が次第に明らかになってきている。一方、視床から線条体への強力な投射の機能については、研究代表者らの従来の研究を中心に、顕著な感覚手がかりに対する注意の喚起や行動選択への関与が示唆されている段階であり、神経回路メカニズムの理解が求められている。
遠心力場散水シミュレーションによる土構造物の降雨時安定性に関する研究

本研究では,豪雨時の土構造物の変形・崩壊挙動を調べるために,盛土斜面および多数アンカー式補強土壁を対象にした遠心力場散水シミュレーションを実施した.その結果,飽和領域が表層部から拡大していく盛土斜面では,土の内部摩擦角よりも法面勾配が大きい場合は,見掛けの粘着力が消失して不安定化して崩壊に至ることが分った.また,補強土構造物においては,適切に排水機能を維持することの重要性と,豪雨時の不安定化の進展の様子を捉えることができた.本研究では,豪雨時の土構造物の変形・崩壊挙動を調べるために,盛土斜面および多数アンカー式補強土壁を対象にした遠心力場散水シミュレーションを実施した.その結果,飽和領域が表層部から拡大していく盛土斜面では,土の内部摩擦角よりも法面勾配が大きい場合は,見掛けの粘着力が消失して不安定化して崩壊に至ることが分った.また,補強土構造物においては,適切に排水機能を維持することの重要性と,豪雨時の不安定化の進展の様子を捉えることができた.本研究においては,豪雨時の斜面崩壊メカニズムを明らかにすることを目的として,遠心力場散水実験を実施した.ところで,遠心模型実験においては,実在する地盤材料を用いて模型地盤を作製すると,間隙流体の粘性を調節しなければ浸透現象に関する相似則が満たされなくなる.さらに,散水する流体をできるだけ微粒化させ,散水実験中の盛土表面の水食を防ぐことにも留意しなければ,適切な豪雨散水シミュレーションは成立しない.そこで,先ず遠心力場において適切に散水実験を行うための降雨装置の開発に着手した.散水ノズルには,噴霧孔付近で液体に圧搾空気を当てて微霧を発生さたる2流体ノズルを採用し,模型地盤表面に均一に散水することのできるシステムを構築した.このようなシステムを用いて,雨量強度および盛土締固め時の飽和度の影響を調べるための模型実験を実施した.盛土材料にはまさ土を用いて,締固め度が80%になるように模型盛土を作製した.また,雨量強度は,大雨警報が発今される程度の40mm/Hr程度と70mm/Hrの豪雨に設定した.その結果,豪雨時には,降雨強度の違いに拘わらず,盛土表層部の雨水浸透に伴う土塊重量の増加と飽和度の上昇によるせん断抵抗力の低下によって,極めて表層部の崩壊が順次繰り返されていくことが観察された.一方,盛土造成の際の飽和度が高い地盤においては,含水比調整時に土質材料が団粒化したために,地盤の随所に局所的に間隙の大きな領域が形成された.これによって,雨水の浸透能力が向上し,40mm/Hr程度の雨量においては,雨水は地盤内へ浸透していくことが観察された.さらに,降雨の進行に伴って盛土内に浸透流が発生し,盛土全体の大きな変形が見られた.このように,同一地盤材料においても締固め施工時の飽和度が異なれば,浸透能力が変わってくるために,崩壊・変形挙動には違いが生じることが分った.本研究においては,豪雨時の斜面崩壊メカニズムを明らかにすることを目的として,遠心力場散水実験を実施した.遠心力場において浸透現象を扱う場合は,浸透時間に関する相似則を考慮する必要がある.本研究では,間隙流体の粘性を調節してこの問題を解消した.遠心力場散水実験において,平成20年8月末に東海地方を襲った豪雨を想定し,時間雨量150mm程度の豪雨を1時間与えた場合の盛土斜面の崩壊機構を調べたところ,降雨開始から早い段階で表層が崩壊することが分った.また,時間雨量30mmに設定し,これを5時間与えて総雨量を150mmにしたケースと前述の豪雨を比較したところ,総雨量が同程度であっても,豪雨時においては短時間で規模の大きな崩壊に至ることから,災害規模は降雨強度に依存することを明らかにした.また,法面勾配30度の盛土斜面において,時間雨量30mm,総雨量450mmになるまで降雨を与えたところ,崩壊土砂は観察されずに,他のケースのような表層崩壊と比較して深い部分でのせん断変形と盛土全体の沈下が確認された.これは,雨水が地盤内に浸透していったことに起因するものと考えられる.ここで,本研究で用いた地盤材料の強度特性を調べるために一面せん断試験を実施したどころ,乾燥密度ρ_d=1.4g/cm^3においては,内部摩擦角がφ'=40度であることが分っている.盛土の法面勾配が土の内部摩擦角以上である場合,雨水浸透による極めて表層部分での飽和によって見掛けの粘着力が消失すると崩壊が発生することを示唆している.一方で,法面勾配が緩く表層崩壊に対する安定性を保持している場合は,雨水は地盤内に浸透していき,盛土全体の飽和度を上昇させる.さらに,土塊重量の増加により不安定化していくと,大きな円弧に沿ったすべりに対する安定性が低下すると考えられる.本研究においては,豪雨時の土構造物の変形・崩壊メカニズムを明らかにすることを目的として,遠心力場散水実験を実施した.遠心力場において浸透現象を扱う場合は,浸透時間に関する相似則を考慮する必要がある.盛土斜面を対象にした散水実験では,この種の相似則がしばしば問題になるため,間隙流体の粘性を調節して解消した.発生頻度が稀な降雨現象として,時間雨量150mm程度の豪雨を1時間与えた場合の盛土斜面の崩壊機構を調べたところ,降雨開始から早い段階で表層が崩壊することが分った.

また,法面勾配30度の盛土斜面において,時間雨量30mm,総雨量450mmになるまで降雨を与えたところ,崩壊土砂は観察されずに,他のケースのような表層崩壊と比較して深い部分でのせん断変形と盛土全体の沈下が確認された.これは,雨水が地盤内に浸透していったことに起因するものと考えられる.本研究で用いた地盤材料の内部摩擦角がφ^'=40度であることが分っており,盛土の法面勾配が土の内部摩擦角以上である場合,雨水浸透による極めて表層部分での飽和によって見掛けの粘着力が消失すると崩壊が発生することを示唆している.一方で,法面勾配が緩く表層崩壊に対する安定性を保持している場合は,雨水は地盤内に浸透していき,盛土全体の飽和度を上昇させる.さらに,土塊重量の増加により不安定化していくと,大きな円弧に沿ったすべりに対する安定性が低下すると考えられる.多数アンカー式補強土壁の豪雨時安定性を評価するための遠心力場散水実験においては,飽和領域が上部から拡大していく場合は,崩壊しようとするくさび状の土塊が小さく,これを負担する補強体が有効応力の減少によって十分な引抜き抵抗力を発揮できなければ,壁面パネルの移動は上部から進行していくことが分った.
スズ及びその周辺元素化合物の異常原子価と新反応性

有機スズ化合物は,安定な炭素一スズ結合のおかげで,通常の有機金属より取り扱いが容易で,複雑な有機構造の中にも組み込んでいける利便さがある。しかし,ラジカル,遷移金属触媒,ルイス酸等での活性化により高い反応性を示すため,有機合成上有用に用いることができる。今回は反応の中間体で生じると考えられる異常原子価状態の有機アリスズがどのような反応性の特徴を示すかを,6員環環状エーテル合成と,その際の立体化学制御を観察する事で調べた。さらに周辺の異なる金属種であるケイ素,ゲルマニウムなどとの比較を行い,この反応を有用な生理性天然物合成への応用性について最適化の検討を行った。反応する相手の分子内のアセタールを,2,4-ジメチルプロパン-1,5-ジオールを用いてC2対称性なキラル構造を導入し,その立体化学,及び分子内にある別の不斉炭素からの立体化学をどう反映するか調べた。その結果有機スズ化合物では,2,4-ジメチルプロパン-1,5-ジオールの不斉炭素からの不斉誘起が起こり,その高い求核性が観察できたのに対し,有機ゲルマニウム,有機ケイ素誘導体では,SP2型のカルボニウム,あるいはオキソニウムイオンが生成してから,炭素一炭素結合生成を起こした結果を示すデータが得られ,各金属種により大きく結果が異なるを見いだした。またこの結果を基盤に,7員環の合成も試み,高収率,高選択的な結果を得ることができた。これにより,4つに縮環した環状エーテルの合成を行い,6-7-7-6員環型ポリエーテルの高立体選択的合成に成功した。
内向き整流性カリウムチャネルの単一伝導度を規定する分子構造の解析

本年は昨年の研究に引き続き、まずはラットの心筋からKir2.2型の内向き整流性カリウムチャネル遺伝子の全長のクローニングを試みた。方法はKir2.1型の時と同様に、RT-PCR法を用いて行った。その結果、心筋からクローニングされたKir2.2のシークエンスは、既に報告のあるラットの脳よりクローニングされたものとidenticalであることが判明した。同様にこの遺伝子を挿入したプラスミドDNAをテンプレートとして、in vitroでmRNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、二本刺電位固定法により全電流を測定したところ、その電流はラット心筋のKir2.1型を発現させた時に得られたものと有意な差異は認められなかった。これらのことから、ラットの心筋にはKir2.1型とKir2.2型のチャネル両方が共存する可能性が考えられた。Kir2.2型の内向き整流性カリウムチャネルの単一伝導度は既に34pSと報告されており、ラット心筋には比較的低い単一伝導度(25pS)と高い単一伝導度(34pS)を持つ2種類の内向き整流性カリウムチャネルが共存することが示唆された。ここで、nativeのラット心筋では、発生過程において、胎生初期は単一伝導の低いチャネルのみであるのに、胎生後期には単一伝導度の高いチャネルが多く出現してくるという過去の報告に着目した。即ち、もし、そうだとすれば、分子生物学的には胎生早期と後期では、Kir2.1型とKir2.2型のチャネルに発現量の違いが見られるのではないかと考えた。そこで、実験計画を少し変更し、まずはKir2.1型とKir2.2型のmRNAの発現量が胎生時期により異なっているかどうかを、RT-PCR定量法を用いて検討した。予備実験においては、nativeチャネルでの胎生期の変化をmRNAの発現量の変化により説明できるような結果が得られている。今後はこの実験の再現性を確かめるとともに、引き続き単一伝導度と分子構造の関係を追求していきたい。研究初年度である本年はまず、nativeの細胞において明らかにウサギの心室筋の内向き整流性カリウムチャネルと単一伝導度が異なっているラットの内向き整流性カリウムチャネル遺伝子の全長のクローニングを試みた。方法はウサギ心室筋からクローニングした内向き整流性カリウムチャネル遺伝子(RBHIK1)との相同性に着目し、RT-PCR法(3'RACE法,5'RACE法)を用いた。その全長をクローニングした後、シークエンスをダイデオキシ法を用いて行った。その遺伝子はカリウムチャネルの分類ではKir2.1に属し、アミノ酸配列はRBHIK1と比べるとM1からM2領域の間で2箇所、それよりC末で7箇所の差異が認められ、C末の変異の一つは負電荷を持つアミノ酸から中性電荷のアミノ酸への変化であった。この遺伝子を挿入したプラスミドDNAをテンプレートとして、in vitroでmRNAを作成し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させた。まずは二本刺電位固定法により全電流を測定したところ、その電流はRBHIK1を発現させた時に得られたものと有意な差異は認められなかった。次にパッチクランプ法を用いて単一チャネル電流を測定したところ、単一チャネル伝導度は約25pSであり、RBHIK1の単一伝導度より、5pSほど大きな値を示したが、nativeのラット心筋細胞の内向き整流性カリウムチャネルの単一伝導度の半分くらいであり、nativeとクローンの解離が認められた。5pSの伝導度の差異は、構造と単一伝導度の関係を解析するには、やや小さな値であり、研究方法の変更を迫られた。現在はクローンチャネルの中で単一伝導度が、Kir2.1の約2倍あるとされているKir2.2型チャネルのクローニングを試みており、今後はKir2.1型チャネルとKir2.2型チャネルのキメラ作成などを通じて構造と単一伝導度の関係にアプローチしたいと考えている。補助金により購入したPCRサーマルサイクラ-は、当然のことながらPCRクローニングの遂行に多大な貢献をしている。

そこで、実験計画を少し変更し、まずはKir2.1型とKir2.2型のmRNAの発現量が胎生時期により異なっているかどうかを、RT-PCR定量法を用いて検討した。予備実験においては、nativeチャネルでの胎生期の変化をmRNAの発現量の変化により説明できるような結果が得られている。今後はこの実験の再現性を確かめるとともに、引き続き単一伝導度と分子構造の関係を追求していきたい。