hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体イメージングによる活性化造血幹細胞ニッチの同定

造血幹細胞の細胞周期は、生理学的状況に応じて変動することが知られているが、その正確なメカニズムはわかっていない。本研究では、多光子励起顕微鏡法を用いて、定常状態及び活性化造血幹細胞の生体イメージングを行った。抗腫瘍薬5-FUによる前処置を行ったマウスに移植された造血幹細胞の運動性は、対照マウスに移植されたものと比較して有意に低下しており、その大部分は血管内皮細胞に近接していた。遺伝子発現解析の結果からは、骨髄抑制後の微小環境が造血幹細胞に増殖シグナルを供給し、その細胞周期に影響を及ぼすことが示唆された。造血幹細胞の特徴は自己複製能と多分化能を有することであるが、その維持・調節のためには造血幹細胞を取り巻く造血微小環境が重要な働きをすることが示されている。その中で、造血幹細胞は“造血幹細胞ニッチ"と呼ばれる特有の環境に存在すると考えられている。造血幹細胞の多くは静止状態にあるが、化学療法や放射線照射などによる骨髄抑制を受けた後には、減少した血球を補うべく細胞周期が活性化し、盛んに分裂するようになる。静止状態と自己複製的な増殖および成熟血球への分化のバランスを保つために、造血幹細胞は必要に応じたシグナルを享受する必要がある。そのため、造血幹細胞は状況に応じて、相互作用するニッチの場を移動すると考えられているが、詳細は明らかになっていない。我々は、二光子励起顕微鏡を用いて骨髄内の造血幹細胞の可視化を行った。生きたマウスを麻酔下に頭部の剃毛と皮膚切開をした上で固定台上に固定し、二光子励起顕微鏡を用いて骨髄内を長時間撮影することに成功した。この技術により、造血幹細胞の骨髄内における三次元的な位置や、その動きを捉えることができた。得られた画像を解析ソフトを用いて詳細に解析することにより、環境側の変化によって造血幹細胞自体の動きや局在に変化が生じることが明らかとなった。造血幹細胞は、骨髄環境側からのシグナルにより細胞周期を変化させていると考えられたため、造血幹細胞近傍の環境側の細胞を解析することにより、造血幹細胞を活性化させる候補シグナルを明らかにする。造血幹細胞の生体イメージングに成功し、環境側の変化によって造血幹細胞自体の動きや局在に変化が生じることを明らかにできたため。造血幹細胞はニッチと呼ばれる骨髄微小環境で維持されており、自己複製や分化を精緻に制御しているものと考えられている。一方、抗腫瘍薬投与などによる骨髄抑制後には、造血幹細胞の細胞周期が回転し、活性化することが知られているが、その詳細なメカニズムは明らかになっていない。そこで本研究の目的は、生理的状態と骨髄抑制後の造血幹細胞を解析することにより、造血幹細胞活性化の分子機構を明らかにすることである。そのために、まず二光子励起顕微鏡を用いてマウス骨髄内の造血幹細胞の可視化を行った。生きたマウスを麻酔下に頭部の剃毛と皮膚切開をした上で固定台上に固定し、正立型二光子励起顕微鏡を用いて骨髄内を長時間撮影することに成功した。抗腫瘍薬による前処置を施したレシピエントマウスに移植された造血幹細胞と、前処置を施さないレシピエントマウスに移植された造血幹細胞について、骨髄内における細胞運動や微小環境(ニッチ)との位置関係を継時的に解析した。結果として、前処置施行マウスに移植された造血幹細胞の多くが、骨髄内の血管性ニッチに存在することが示された。更にホーミングした造血幹細胞の遺伝子発現をRNA-Seq法を用いて網羅的に解析したところ、細胞周期関連の遺伝子発現が環境変化に応じて活性化することが明らかとなった。以上の結果より、骨髄抑制後に生じる微小環境変化が、移植造血幹細胞の挙動や細胞周期に影響を与えうることが示された。28年度が最終年度であるため、記入しない。血液内科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
アルコールとの「微弱な相互作用」を利用したポリヒドリドクラスターの反応性の制御

三核ポリヒドリド錯体とフルオロアルコールとの相互作用について定量的に評価した。三核錯体の場合には溶液中では5分子のアルコールとのアダクトが形成され、金属の種類によって平衡定数には大きな差が表れることを明らかにした。アダクトの形成によってクラスター上からの脱水素反応が促進されるなどアルコールアダクトはプロトン化によって生じるカチオン性錯体と類似の性質を示すが、その他にもアルコールの配位によって不安定な中間体が安定化されうることも明らかにした。ポリヒドリドクラスターとアルコールとの"微弱な相互作用"について各種分光装置を用いて定量的に解析し、プロトン性分子の配位による金属中心の電子状態の変化およびヒドリド配位子の性質の変化について明らかにしていく。さらに、このような相互作用を用いることでポリヒドリドクラスターの反応性を連続的に変化させ、水和あるいはアルコールの付加といった形で炭化水素分子への極性分子の付加、すなわち官能基導入反応の開発につなげることを目的とする。三核ルテニウムペンタヒドリド錯体を中心に様々な核数ならびに様々な種類の金属を用いた異種金属クラスターについても同様に調査し、プロトン性分子との相互作用の強弱からクラスターを構成する元素の数・種類が及ぼす反応性への影響についても明らかにしていく。三核ルテニウムペンタヒドリド錯体へのアルコール分子の配位について検討し、アルコールの酸強度が平衡定数に大きく影響を及ぼすことを明らかにした。三核ルテニウムペンタヒドリドクラスターは5分子のアルコールとアダクトを形成するが、pKaが12.4のトリフルオロエタノールを用いた場合には平衡定数Kは110M^<-1>であったが、pKaが9.95のフェノールを用いた場合にはKの値は2100M^<-1>と、酸性度が高まることでアダクトが形成されやすくなることが明らかになった。一方で二核ルテニウムテトラヒドリド錯体とアルコール分子との相互作用は弱く、相互作用に関する情報を得ることは出来なかったが、二核錯体上に塩基部位としてp-ベンゾキノンを導入することで二核錯体への水素結合の影響を影響を定量的に評価することに成功した。二核ルテニウムテトラヒドリド錯体はベンゾキノンと定量的に反応し、ベンゾキノンが2つのルテニウム間でsyn-η^2:η^2-配位した架橋ベンゾキノン錯体を生成する。このキノン配位子へのアルコールの水素結合の強度ならびに金属中心へ及ぼす電子的な影響についてUV-visスペクトル、IR、NMR、サイクリックボルタモグラムによって定量的に評価した。アルコールとしてフェノールを用いた場合にはアダクトの単結晶を得ることができ、単結晶X線構造解析から水素結合の存在を確認することができた。さらに、水素結合によって錯体の反応性が大きく向上することも明らかにした。二核の架橋ベンゾキノン錯体とアセチレンとの反応では、アセチレンが金属-ヒドリド結合に挿入し架橋ビニル錯体を形成するが、ベンゼン中での反応に比べメタノール中では反応速度が3倍になることが明らかになった。これまでに三核ルテニウムペンタヒドリド錯体とアルコールとの相互作用について検討し、過剰のアルコール存在下では5分子のアルコールがヒドリド錯体と弱く結合したアダクトを形成することを明らかにしてきた。本年度は異種金属ヒドリドクラスターについて検討し、アルコールの配位の平衡定数を調べることで、クラスター骨格に導入した異種遷移金属の効果について明らかにすることとした。ヒドリドクラスターとしてイリジウムを含む等電子構造のテトラヒドリド錯体(Cp^*Ru)_2(Cp^*lr)(H)_4(1)を用いたところ、三核ルテニウム錯体と同様にアルコールアダクトの形成が確認された。NMRを用いた滴定実験から三核ルテニウムの系と同様に5分子のアルコールが平衡に関与しているが、平衡定数は3桁程度小さな値を示すことを明らかにした。この結果は、Ru_2Irのクラスターの塩基性度がRu_3クラスターに比べて低いことを示すものであり、またアルコールの配位数は反応場の立体的な大きさによって支配されることを示唆する、ものであった。また、アルコール存在下におけるヒドリドクラスターの反応と非プロトン性の溶媒中での反応とを比較したところ、末端アルキン類との反応について顕著な差が観察された。非プロトン性溶媒中ではビニリデン錯体などを含む様々な中間体の生成に留まるが、トリフルオロエタノール存在下では垂直配位型アルキン錯体の生成が確認された。これはアルコール分子の配位によって中間体からの脱水素反応が速やかに進行したことを示すものであり、アルコールとの相互作用によってヒドリドクラスターの反応性を大きく変えることができることを強く示唆するものであった。これまでに三核ポリヒドリド錯体とアルコールとの相互作用について検討し、過剰のアルコール存在下では5分子のアルコールがヒドリド錯体と弱く結合したアダクトを形成することを明らかにしてきた。ヒドリドクラスターとして骨格内にイリジウムを含む

テトラヒドリド錯体(Cp*Ru)_2(Cp*Ir)(H)_4についても同様なアルコールアダクトの生成を確認したが、イリジウムを含む異種金属錯体のアルコールアダクトはルテニウム錯体の場合とは異なり、高い反応性を示すことをアルキン類との反応を通じて明らかにしてきた。本年度は酸素との反応について検討し、アルコール存在下での酸素錯体の生成を確認することができた。アルコールアダクトが生成した溶液中に酸素を導入したところ新たなヒドリド配位子の生成が^1HNMRスペクトルから確認することができた。まだ酸素が配位した錯体の単離には至っていないが、この錯体はトリフェニルホスフィンを酸化する能力を有することを明らかにした。ホスフィンの酸化反応は触媒的に進行し、アルコール存在下、空気雰囲気下で50倍モルのホスフィンを酸化する。アルコールが存在しない場合には瞬時にビス三重架橋オキソ錯体が生成し、失活することから、配位した酸素に対してプロトンが付加することで中間体を安定化し、ビスオキソ錯体の生成が阻止されたのではないかと考えている。この結果はアルコールとの相互作用を用いることで、熱力学的に安定な生成物を与える反応経路を変化させたことに相当するものであり、アルコールとの相互作用を利用することでポリヒドリドクラスターの反応性が制御できたことを示す結果である。同様な化学種の生成はカチオン性錯体[(Cp*Ru)_2(Cp*Ir)(H)_5]^+と酸素との反応からも得られることを明らかにした。これまでに三核ポリヒドリド錯体とアルコールとの相互作用について検討し、過剰のアルコール存在下では5分子のアルコールがヒドリド錯体と弱く結合したアダクトを形成することを明らかにしてきた。ヒドリドクラスターとして骨格内にイリジウムを含むテトラヒドリド錯体(Cp^*Ru)_2(Cp^*Ir)(H)_4(1)についても同様なアルコールアダクトの生成を確認したが、イリジウムを含む異種金属錯体のアルコールアダクトはルテニウム錯体の場合とは異なり、高い反応性を示すことをフェニルアセチレン、酸素との反応を通じて明らかにしてきた。これまでにアルコールアダクトの反応は中間体としてカチオン性ペンタヒドリド錯体[(Cp^*Ru)_2(Cp^*Ir)(H)_5]^+(2)の生成を経て進行することを明らかにしてきたが、本年度はカチオン性のペンタヒドリド錯体2を合成し、2と不飽和炭化水素類との反応について検討することでクラスター上のプロトンの影響について調べることとした。3-ヘキシンとの反応では垂直配位型アルキン錯体が得られたが、クラスター上で不飽和結合部分の転移が起こり、3-ヘキシン錯体と2-ヘキシン錯体の混合物が得られることを明らかにした。ここで得られた混合物を45°Cに加熱することで全て2-ヘキシン錯体へと異性化することも明らかにした。このような転移反応は中性のアルキン錯体では見られないものである。また、シクロペンタジエンとの反応では、ほぼ定量的に垂直配位型シクロペンチン錯体が生成した。等電子構造の三核ルテニウムペンタヒドリド錯体とシクロペンタジエンとの反応ではC-C結合の切断によってnido型のルテナシクロペンタジエン錯体が得られている。
Fc受容体のシグナル伝達機構の解析

1. EBウイルス感染により膜表面のCD23 (FcεRII)の発現が増強し、膜貫通部欠損型CD23mRNAの発現が減少すること、膜貫通部欠損型CD23が細胞内に分布していることが観察された。既に膜型CD23と結合する蛋白として膜貫通部欠損型CD23をクローニングしており、膜型CD23が膜貫通部欠損型CD23と細胞内で結合し、膜表面への発現を抑制されている可能性を示唆する。(淀井)2. IL-10はCD23 type b mRNAの抑制により単球表面CD23発現とsCD23産生を抑制することが明らかとなった。また、SLEやRA患者においてリンパ球や単球のD23発現異常が認められ、SLE患者のそれはB細胞異常活性化の指標となり、RA患者では炎症の指標となることが示唆された。(熊谷)3.通年性鼻アレルギー患者の鼻粘膜マスト細胞と偏桃のB細胞とを共培養し、ダニ抗原を加えるとIgE産生が誘導されるが、感染性鼻炎患者の鼻粘膜マスト細胞にはこれを支持する活性がないことが明らかとなった。一方、FcεRIβ鎖遺伝子欠失マウスを作成、現在解析中。(羅)4.マウス発現型γ2b鎖遺伝子導入マウス(C line)の脾臓細胞ではLPSとIL-4依存的にγ1鎖及びε鎖trans-mRNA特異的RT-PCR産物が検出された。C lineマウス脾臓細胞で産生されたtrans-mRNAの量は、Sμ領域を持つμ鎖遺伝子導入マウス脾臓細胞が産生するそれと違いがなかった。(清水)5. FcレセプターをT細胞以外の細胞系に導入したところ、FcγIIAはp34cdc2とサイクリンA遺伝子のプロモーターに影響を与えないことが明らかになった。(二階堂)6.培養ヒト単球より調整したRNAを鋳型として、cDNAライブラリーを作成、現在スクリーニング中。一方、γ鎖がFcεRIやFcαRの他に、組織因子とも会合していること見出した。(桝田)1. EBウイルス感染により膜表面のCD23 (FcεRII)の発現が増強し、膜貫通部欠損型CD23mRNAの発現が減少すること、膜貫通部欠損型CD23が細胞内に分布していることが観察された。(桝田)1.膜貫通部を欠失する低親和性IgE受容体(FcεRII/CD23)を、COS細胞に発現させ共焦点レーザー顕微鏡でその局在を検討した。その結果核周囲に斑紋状に集積していることが判明した。また、正常人末梢血中での局在を検討するため、膜貫通部欠失型CD23に特異的なポリクローナル抗体を作成することに成功した。(淀井)2.低親和性IgE受容体(FcεRII/CD23)に対するRT-PCR法を用いた半定量法を確立した。サイトカインによる発現調節を検討し、IL-4によるB細胞でのmRNA誘導が、type aでは約10倍、type bでは数100倍に達することを示した。また、IL-10による単球FcεRII発現調節を検討し、膜型および可溶型ともに抑制されることを発見した。(熊谷)3.ヒト好塩基球性白血病細胞株(KU812)より、SykキナーゼcDNAを単離し、alternative splicingによる二つの型の存在を明らかにした。

69bpを欠失する短いタイプはZAP70と相同であることから、FcεRIを介したシグナル伝達においての役割が注目され、レセプターの再構築の系に導入してその機能を解析中である。また、ヒトFcαRも、シグナル伝達分子としてFcεRIγ鎖を会合していることを明らかにした。(羅)4.trans-mRNAの産生がその産物への結合刺激により抑制されることを示した。trans-mRNAの産生過程は、クラススイッチの可逆的中間過程である可能性が高く、この段階での調節はアレルギー制御に新たな可能性を開くものである。さらに、可溶化FceRIα鎖が肥満細胞へのIgEの結合の阻害のみならず、IgE産生の抑制を通じてアレルギーの制御に効果をあげる可能性を示唆するものとして興味深い。(清水)5.p34cdc2及びサイクリンAのmutation及びdeletionの入ったプロモーターを作り、双方のプロモーターを解析し、正及び負の制御配列の存在を明らかにした。(二階堂)6.培養単球におけるFc γRIIとγ鎖および35-25PDとの会合は、FcγRIIIαとγ鎖との会合と同様に、NP-40によって解離された。細胞種による違いでは血小板、リンパ球、単球系細胞株(U937、THP-1)では検出できなかった。(桝田)1.Two-Hybrid Systemを用いてCD23を解析した。検出された未知のcDNAをプローブとして、ヒトの各臓器に対し解析した。その結果、すべての臓器において発現が検出され、ubiquitousな蛋白であると予想された。ヒト胎盤のライブラリーをスクリーニングしてその全塩基配列を決定した。その結果、127アミノ酸よりなる蛋白で、この配列中には膜貫通部、シグナル配列に相当する疎水性部分はみられず、既知の蛋白との相合性も見出されなかった。(淀井)2.様々な免疫疾患でCD23の異常発現やsCD23の上昇がみられるが、単球でのCD23発現に及ぼすIL-10の影響を検討した。単球上のCD23 type b mRNAはIL-4により誘導されたが、IL-10はこの誘導を抑制した。CD23 type aについては著名な抑制は認められなかった。(熊谷)3.培養ヒト単球から分離したFcγRII複合体には、23kDa(α)と17kDa(β)のhrterodimerが含まれていた。N末端アミノ酸配列分析を行ったところ、それぞれのN末端アミノ酸配列はWIVLTQSPA(α),EVQLYAPGGM(β)であった。FcγRI及びIIIaは、膜貫通部位でγ鎖と会合しているのに対し、FcγRIIの同部位の相同性が低いことから、35-25PDを介してγ鎖と会合している可能性が示唆された。(桝田)4.ヒトFcγIIIBやマウスIIBlがp34cdc2とサイクリンA遺伝子産物や細胞周期調節因子を解析したところ、FcγIIIB陽性T細胞でもp34cdc2とサイクリンA遺伝子のプロモーター活性がFcγIIIA陽性T細胞と同様に抑制された。またサイクリンA遺伝子産物がFcレセプター陽性T細胞では減少していた。Fcレセプターは種類によって違った細胞増殖制御を行うことが明らかにされた。(二階堂)5.ヒト膜型μ鎖遺伝子導入マウスの脾細胞をリコンビナント可溶化CD40 ligandとIL-4で刺激すると、細胞のblast化並びに増殖が観察されたが、その程度はLPSとIL-4の刺激に比べ低かった。
HIV感染者の産生するJCウイルスの遺伝子構造とPML異常発生との相関

AIDS患者には神経系の疾患が多発し深刻な問題となっている。PML(進行性多巣性白質脳症)は、潜伏していたJCウイルス(JCV)が神経系細胞内で増殖することによっておこる脱随疾患である。HIV感染者におけるPMLの発生頻度は極めて高く、またその病像も激しいものとなっている。この原因を明らかにする目的で、PMLで死亡した日本人および米国人AIDS患者脳組織からJCVのDNAを分子クロ-ニングし、その制御領域遺伝子を解析した。その結果、1,PMLから分離されたJCVの制御領域のnt.90(Mad1)より上流の領域が、JCVの神経細胞でのエンハンサ-活性の誘導に重要な働きをしていることがわかった。またnt.60からnt.90(Mad1)の領域にもエンハンサ-エレメントが存在することがわかった。2,末梢血単核細胞、CSF細胞に、JCVDNAが存在していることが明らかになり、血液リンパ系細胞においてJCVが持続または潜伏感染している可能性が示唆された。3,PMLからクロ-ニングされたJCV制御領域は、健康人尿からクロ-ニングされたJCVと比較してDNAの欠失と挿入が起こっており、特にnt.90(Mad1)より上流部域に大きな変異が見られた。AIDSーPML患者脳からは、この領域に異なる変異を持つた複数のクロ-ンがいずれの患者からも得られ、HIV感染にともなって、JCVの制御領域に高率に変異が起こっていることが明らかになった。以上の結果から、HIVの感染増殖によってJCVの制御領域に変異が起こり、神経病原性が変化したウイルスが生じて、PMLが多発するようになる可能性を示したものと考えられ、JCV感染モデル動物を開発して確かめる必要がある。AIDS患者には、脱髄疾患である進行性多巣性白質脳症(PML)が高率に発生してきている。PMLは、JCウィルスが脳内のオリゴデンドログリア細胞で増殖することによって起ることが、明らかになっている。JCウィルスは、成人の70%以上に感染しているにもかかわらず、きわめて限られた宿主域と増殖の特異性を持っている。JCウィルスの遺伝子の転写を調節する遺伝子領域は、JCウィルスが感染増殖できる宿主細胞の種類と増殖の強さに関わっていることを明らかにした。AIDS患者に高率にPMLが発生する要因を明らかにするために、PMLを発症し死亡したAIDS患者脳などから、JCウィルスを分子クロ-ニングして調節領域遺伝子の構造を調査した。日本人およびアメリカ人AIDS患者脳などからクロ-ニングしたJCウィルス調節領域遺伝子には、いずれも変異がおこっており、その変異は、遺伝子の転写を促進するエンハンサ-配列を新たにもたらすものであった。JCウィルスは、成人の70%以上に感染しており、持続または潜伏感染状態にある。体内にひそんでいるウィルスの再活性化と尿中へのウィルスの放出が多くの人で起っており、加令とともにその頻度がこることが明らかとなってきている。尿中に放出されたウィルスとPML患者脳からクロ-ニングしたウィルスの調節領域を比較したところ、PML患者脳からクロ-ニングしたJCウィルスの調節領域は、いずれも特定領域の欠失と挿入が起っており、新たなエンハンサ-配列を生じる変異が起こっていることが明らかとなった。また白血球中にJCウィルス遺伝子を検出できた。これらの結果から、HIV感染によって、JCウィルス調節領域遺伝子に、高頻度に変異が起こり、その結果病原性の変化したJCウィルスが出現してくることが予想された。
重原子結晶の電子分布と静電ポテンシャル

X線回折法で電子密度分布の精密測定・多極子解析法により、物性を電子密度分布から説明することを目的とした。そのため、KMnF_3結晶の186Kでの立方晶から正方晶への相転移に伴う電子密度の温度変化を実測するため、298K、240K、および相転移点直上の190Kで、精密回折強度測定を行った。電子密度の温度変化を測定し相転移機構を研究する試みは、研究代表者の知る限り、本研究が世界で最初である。測定された電子密度を多極子解析法で解析するとともに、電子密度のトポロジー解析を行ったところ、結合の詳細とともに、相転移機構までも明らかになった。KmnF_3結晶はペロブスカイト型構造を持つが、電子密度のトポロジーから、結晶内にはMn-FとK-F間に、結合の形成を示す(3,-1)bond critical pointが存在することが明らかになった。これはKNiF_3等の他のペロブスカイト結晶と同じである。KMnF_3結晶の弱い一次相転移は、MnF_6正八面体の結晶内での協同的回転によって起こることは知られているが、本研究により、298Kでは、(3,+3)cage critical pointであったK-Mn間の中点が、少なくとも相転移前の240K以下では、結合形成を示す(3,-1)型の点に変化することが明らかになった。これに伴うMn-F、K-F結合の変化から、以下の相転移に伴う事実および相転移機構が明らかになった。1.K-F結合の電子密度の傾きのひとつがほとんど0なり、電子密度分布のトポロジーは結合を示す(3,-1)から(3,+1)ring critical pointに変化しかけている。これはMnF_6の回転を阻害していたK-F結合が190Kで非常に弱くなり切れることを示す。2.温度低下とともに非調和熱振動が増加し、Fイオンは4個のポテンシャルの低い点に、統計的に分布する。3.同時にMn-K結合が形成され結晶の崩壊を防ぐ。相転移点よりも50-60°も上から前駆現象が始まっている。一方、Mn-F結合には目立った変化は見られない。これらを総合すると。温度低下に伴い、Fイオンの非調和熱振動が大きくなるが、Mn-K結合の形成により結晶の崩壊を防ぎつつ、相転移点でK-F結合が切れてMnF_6が回転し、F原子はかねてから形成されていた4個のポテンシャルのひとつに共同的に移動する。これらの成果は国際的にも注目され、15年度5月、8月にロシアおよびオーストラリアで開催された、ロシア全国結晶化学会、サガモア会議等で発表された。また、今夏のゴードン会議(米国)にも招待されている。現在、この研究を発展させるものとして、六方晶BaTiO_3のトポロジカル解析を、ロシアに帰国後も継続して行っている。Ivanov博士は、ペルブスカイト構造を持つ、遷移金属化合物結晶KMnF_3の電子密度を、298K,240Kおよび相転移温度直上の180Kで、X線回折法を使用して精密測定し、その回折強度データを多極子解析法で解析する研究を行った。本研究の具体的な目的は相転移に伴う電子密度のトポロジーの変化を、Bader教授の理論に基づき解析し(電子密度のラプラシアンの解析)、相転移機構を明確にすることであるが、本研究は電子密度の多温度精密測定と相転移を結びつけた、私の知る限りでは世界でも初めての試みであり、相転移の研究に新知見をもたらした。Ivanov博士は1昨年10月に来日以来上記の研究に従事した結果、(1)F-K間にも、Mn-F間と同様に、結合の存在を示す(3,-1)結合特異点(Bond critical point)が存在する。一方、(2)F-F間には結合は存在しない。しかし、(3)相転移温度に近づくに従いK-M結合が形成され、(3,-1)結合特異点が現れるとともに、F-K結合特異点は(3,+1)に変化しF-K結合は事実上消滅し、MnF_6八面体の回転が可能になることを明らかにした。(1)(2)の結果はすでに行ったKNiF_3結晶でも発見されているが、(3)の結果は、相転移に伴いKとMn陽イオン間に結合が形成され結晶構造を保つ一方、FとKの陰陽イオン間の結合が切れて、F_6八面体が回転の自由度を得るという、これまで想像もされなかった相転移の機構を示すものである。電子密度分布の微妙な変化から相転移機構を明示した、世界で初めての研究で高く評価される(Acta Cryst.に投稿中)。この成果を確実にするため、非調和熱振動との関係をさらに詳しく調べると同時に、六方晶BaTiO_3のX線解析を行っている。また、トポロジカル解析法のうち、運動エネルギー分布・ポテンシャルエネルギー分布の計算法はわれわれの推進するX線分子軌道解析法でも、将来必要になると判断されるので、その導入に向けた共同研究も行っております。同博士は上記の結果を昨年12月には日本結晶学会で報告した。また、本年5月のロシアでの国際学会でも発表する予定である。本年8月オーストラリアで開催される電子密度解析の専門化のみによる国際会議であるサガモア会議でも発表を許可されております。

X線回折法で電子密度分布の精密測定・多極子解析法により、物性を電子密度分布から説明することを目的とした。そのため、KMnF_3結晶の186Kでの立方晶から正方晶への相転移に伴う電子密度の温度変化を実測するため、298K、240K、および相転移点直上の190Kで、精密回折強度測定を行った。電子密度の温度変化を測定し相転移機構を研究する試みは、研究代表者の知る限り、本研究が世界で最初である。測定された電子密度を多極子解析法で解析するとともに、電子密度のトポロジー解析を行ったところ、結合の詳細とともに、相転移機構までも明らかになった。KmnF_3結晶はペロブスカイト型構造を持つが、電子密度のトポロジーから、結晶内にはMn-FとK-F間に、結合の形成を示す(3,-1)bond critical pointが存在することが明らかになった。これはKNiF_3等の他のペロブスカイト結晶と同じである。KMnF_3結晶の弱い一次相転移は、MnF_6正八面体の結晶内での協同的回転によって起こることは知られているが、本研究により、298Kでは、(3,+3)cage critical pointであったK-Mn間の中点が、少なくとも相転移前の240K以下では、結合形成を示す(3,-1)型の点に変化することが明らかになった。これに伴うMn-F、K-F結合の変化から、以下の相転移に伴う事実および相転移機構が明らかになった。1.K-F結合の電子密度の傾きのひとつがほとんど0なり、電子密度分布のトポロジーは結合を示す(3,-1)から(3,+1)ring critical pointに変化しかけている。これはMnF_6の回転を阻害していたK-F結合が190Kで非常に弱くなり切れることを示す。2.温度低下とともに非調和熱振動が増加し、Fイオンは4個のポテンシャルの低い点に、統計的に分布する。3.同時にMn-K結合が形成され結晶の崩壊を防ぐ。相転移点よりも50-60°も上から前駆現象が始まっている。一方、Mn-F結合には目立った変化は見られない。これらを総合すると。温度低下に伴い、Fイオンの非調和熱振動が大きくなるが、Mn-K結合の形成により結晶の崩壊を防ぎつつ、相転移点でK-F結合が切れてMnF_6が回転し、F原子はかねてから形成されていた4個のポテンシャルのひとつに共同的に移動する。これらの成果は国際的にも注目され、15年度5月、8月にロシアおよびオーストラリアで開催された、ロシア全国結晶化学会、サガモア会議等で発表された。また、今夏のゴードン会議(米国)にも招待されている。現在、この研究を発展させるものとして、六方晶BaTiO_3のトポロジカル解析を、ロシアに帰国後も継続して行っている。
熱ショック蛋白質HSP60の胃MALTリンパ腫発生への関与

1.HSP60に対するヒト免疫系の反応性、とくにMALTリンパ腫患者リンパ球の反応性MALTリンパ腫患者では、HSP60に対する自己抗体ができることを報告しているが,この機序を解明するために、MALTリンパ腫患者リンパ球をGM-CSFとIL-4存在下にHSP60で刺激し,リンパ球の反応性を調べた。抗原刺激により,MALTリンパ腫患者のリンパ球はIL-4を産生するが、健常者や胃炎患者のリンパ球はIFN-γを多く産生した。またB細胞の抗原刺激に際してco-stimulatory signalとして働くCD4T細胞のCD40リガンド(CD40L)の発現が、MALTリンパ腫患者では増強した。H.pylori菌全体を使った抗原刺激では,胃炎患者とMALTリンパ腫患者でCD40Lの発現に差は認められなかった。これらの結果より、MALTリンパ腫患者ではHSP60に対するTh-2の液性免疫反応が強く誘導され、B細胞の増殖が起こることが判明した。2.HSP-60の末梢血並びにリンパ組織単核細胞における発現HSP60は末梢血中ではTリンパ球の一部と単球の大部分に発現し、マイトゲンで刺激すると,T.B.NK細胞における発現率と発現量が著しく増強した。反応性リンパ組織では、芽中心及び濾胞間のマクロファージとリンパ芽球の胞体内に発現していた。3.感染動物実験による宿主因子の解析マウスの系統によって、H.pylori感染後に発症する胃炎の程度が異なることが知られている。あらかじめ感染させたマウスに大腸菌のリコンビナント易熱性毒素をアジュバントとして、rHSP60を鼻腔より免疫した。Th-1優位なC57BL/6でもTh-2優位なBALB/Cマウスでも、HSP60を用いた局所免疫により、感染早期から胃炎が高率に発症することを認めた。またT細胞を活性化しやすいアミノ酸配列を含んだ領域を部分発現させたHSP60を免疫すると,胃炎の発症が強く誘導された。1.胃MALTリンパ腫および胃炎と健常者の末梢血より単核球を分離し、IL-4とGM-CSFを加えた培養液中に各種抗原を加え一週間培養した。抗原にはrHSP60とH.pylori抗原を用い、培養後、FACScanによりCD40陽性細胞におけるCD40Lの発現を比較した。またELISAにより培養上清中のIFN-γとIL-4の濃度を測定した。その結果、rHSP60の抗原刺激で、CD40Lの発現とIL-4の産生はMALTリンパ腫患者のみ、IFN-γの産生は胃炎患者の4/4と健常者の2/4で認められた。このことから、H.pyloriのHSP60抗原刺激下のCD40L発現及びサイトカインに対する反応性の差が、胃MALTリンパ腫発生に関与していることが示唆された。2.H.pylori HSP60に対する単クローン抗体を作製し、その特異性を明らかにした。現在免疫組織学的検索に使用可能かどうか検定中である。3.HSP60は末梢血中ではTリンパ球の一部と単球の大部分に発現し、マイトゲンで刺激すると、T, B, NK細胞における発現率と発現量が著しく増強することを明らかにした。反応性リンパ組織では芽中心及び濾胞間のマクロファージとリンパ芽球の胞体内に発現していた。4.H.pyloriを感染させたマウスにHSP60を粘膜免疫すると、1ヶ月で胃炎が発症し、免疫をしないコントロールマウス群より、明らかに炎症が強く出現した。血中の抗体価を調べると、炎症の強いマウスでは、HSP60や菌体に対するIgG抗体価が上昇していた。また脾臓リンパ球をHSP60で刺激するとIFN-γのmRNA発現が認められた。

Th-1優位なC57BL/6でもTh-2優位なBALB/Cマウスでも、HSP60を用いた局所免疫により、感染早期から胃炎が高率に発症することを認めた。またT細胞を活性化しやすいアミノ酸配列を含んだ領域を部分発現させたHSP60を免疫すると,胃炎の発症が強く誘導された。
非平衡第一原理計算を基盤とした電流密度計算による燃料電池メゾスケールモデリング

固体酸化物形燃料電池の酸化物/燃料/電極の三相界面設計を理論的に行うべく、三相界面を含むメソスケール動的モンテカルロプログラムを開発し、電流密度計算を大規模長時間スケールで実行可能となるシミュレーション体制の基盤を構築した。合わせて、第一原理計算による反応解析を同モデル界面で実行し、メソスケール動的モンテカルロプログラムの実行に必要な速度論的データの取得に成功した。本研究課題の目的は、固体酸化物形燃料電池の代表的燃料極であるNi/YSZを計算対象とし、その電極での燃料酸化反応経路解析を電極の存在をあらわに取り込んだ第一原理非平衡グリーン関数計算で実行し、そこから得られる電気化学反応素過程の速度論的情報を動的モンテカルロ計算に取り込むことで、3次元電極構造を反映した形で、交換電流密度のメソスケールシミュレーションを達成することである。研究実施計画にもとづき、H22年度はNi/YSZ燃料極での燃料酸化反応の素過程解析を行い、Ni表面上での酸素空孔移動障壁とNi/YSZ界面近傍での酸素空孔移動障壁との違いを検討した。なお、第一原理非平衡グリーン関数計算による反応・イオン移動解析の実行は多大な計算コストを要するため、通常の第一原理計算による経路探索を行っておくことが効率のよい研究の進め方であり、H22度はこの"通常の第一原理計算"による反応経路探索を行った。一方、H22年度の計画には含めていなかった動的モンテカルロ計算プログラムの整備も同年度に開始し、三相界面近傍でのイオン移動(拡散)シミュレーションを実行できるように整備した(これにより、空気極の反応探索を次年度以降の開始へと変更した)。本研究で得られた反応過程解析における知見はもとより、構築しつつあるメソスケール動的モンテカルロシミュレーションプログラムの有効性は、燃料電池研究はもちろん、さらに多方面における適用が想定でき、ここでの成果は大変大きいものと言える。本研究課題の目的は、固体酸化物形燃料電池の燃料極であるNi/Yszを研究対象とし、その電極での燃料酸化反応の反応経路解析を電極の存在をあらわに取り込んだ第一原理非平衡グリーン関数計算で実行し、そこから得られる電気化学反応素過程の速度論的情報を動的モンテカルロ計算に取り込むことで、3次元電極実構造を反映した形で、交換電流密度のメソスケールシミュレーションを達成することである。研究実施計画にもとづき、昨年度はNi/YSZ燃料極での燃料酸化反応の素過程解析を行い、水素スピルオーバーメカニズムによる燃料酸化過程の全体像がまぼ見通せる段階にまで到達した。ただし、第一原理非平衡グリーン関数計算による反応解析の実行は多大な計算コストを要するため、通常の第一原理計算による経路探索を行っておくことが効率のよい研究の進め方であり、昨年度はこの"通常の第一原理計算"による反応経路探索を行った(ここで得られた反応経路をもとに第一原理非平衡グリーン関数計算による解析は本年度にて行う)。一方、動的モンテカルロ計算をメソスケールで実行するためのプログラム整備にも着手し、任意のユニット構造データ(複数可)を三次元的に積み上げ、その構造体に対して発生可能な反応・イオン移動イベントをリストアップし、動的モンテカルロ計算が実行できる体制をほぼ構築した。その動的モンテカルロプログラムを用いて三相界面近傍でのイオン移動(拡散)シミュレーションを実行し、界面近傍でイオンの特徴的な動きが発生することを見出した。本研究課題の目的は、固体酸化物形燃料電池のNi/YSZを研究対象とし、燃料酸化反応の反応経路解析を電極の存在を取り込んだ第一原理計算で実行し、そこから得られる電気化学反応素過程の速度論的情報を動的モンテカルロ計算に取り込むことで、3次元電極実構造を反映した形で、交換電流密度のメソスケールシミュレーションを達成することである。研究実施計画にもとづき最終年度である昨年度は動的モンテカルロ計算をメソスケールで実行するための並列化動的モンテカルロプログラム作成に注力し、主にそのコード開発を行ってきた。その成果として、任意のユニット構造体を三次元的に積み上げ、その巨大構造体に対して発生可能な反応・イオン移動イベントをリストアップし動的モンテカルロ計算が実行できるものとして開発することに成功し、さらにはこの計算プログラムが並列化されて実行されるため、通常の動的モンテカルロ計算では到達しえない時間・空間スケールのダイナミクスを行えるという特徴を有するものとなった。ただし、この並列化への取り組みは当初想定していたものより大変困難を極め、特に動的モンテカルロアルゴリズムと並列化アルゴリズムに内在する相反するコンセプトが存在することから、並列化を導入する上でアルゴリズムの変更を検討する必要性が生じた。このため、プログラム開発に今年度の時間のほとんどを割いてしまったため電流密度算出に関してはテストプログラム程度の結果のみが得られたという状況であるが、当初の目的である並列化大規模動的モンテカルロ計算プログラムの開発と実行にまで到達したという点において十分な成果が得られたと言える。このメソスケール動的モンテカルロシミュレーションプログラムの有効性は、燃料電池研究はもちろんさらに多方面における適用が想定できここでの成果は大変大きいものと言える。研究計画書に記載の昨年度予定である反応経路解析、メソスケール動的モンテカルロプログラム整備、ともにほぼ計画通りに進行している。

ただ、空気極解析は、燃料極解析に時間を費やした分多少遅れてはいるが、本年度にて十分対応可能は状態である。24年度が最終年度であるため、記入しない。反応経路解析に関しては、経路の全体像がほぼ得られたので、それらを非平衡グリーン関数法でより現実的状況設定で計算できる段階にある。メソスケール動的モンテカルロプログラム整備に関しては、並列化の整備を残すのみである。
インド版マイクロファイナンスＳＨＧの発展における信用組合の役割に関する研究

経済成長に沸くインドにおいて、農村における貧困問題は依然として深刻である。そこで、農村の貧困問題を解く1つの手がかりとして、近年注目を集めているインド型マイクロファイナンス「SHG(Self Help Groups)」の働きに着目する。ただし、このSHGは農村における普及度が地域により大きな偏りをみせていることから、普及のための方策を考える必要がある。そこで注目したのが、インド農村で大きな普及度をもつ信用組合で、この信用組合に設置されているWomen's Development CellがSHGの普及において重要な役割をになっていることが明らかになった。本研究の中間年度にあたる今年度の課題は、SHG(Self Help Groups)の結成・育成におけるWDC(Women Development Cell)の効果を検討することであった。そのために、平成25年8月に現地調査を行い、関係者への聞き取りや資料の収集を行った。また、先行研究の整理も行った。その結果、NGOによって結成・育成された場合のSHGと、WDCが中心になって信用組合が結成・育成したSHGには、様々な違いがあることが分かった。最終年度には、初年度(昨年度)と本年度の成果を併せ、本研究の最終的な取りまとめを行う予定である。このような状況下、インド農村の貧困問題を解く1つの手がかりとして、近年注目を集めているインド型マイクロファイナンスSHG(Self Help Groups)の働きに着目する。そこで注目するのが、インド農村で大きな普及度をもつ信用組合で、この信用組合を利用したSHG普及のための新たな方策を明らかにすることが、本研究の課題である。より具体的に言えば、SHGの結成・育成に大きな成果を収めてきたマハラシュトラ州の信用組合を事例とし、その信用組合が設置して効果的であったと考えられるSHG専門の部署であるWDC(Women Development Cell)の効果を明らかにすることが課題となる。この課題に取り組むに当たり、今年度の目標は、事例信用組合内部におけるWDCの効果を明らかにすることで、そのために現地調査を行った。この調査は、WDCのスタッフ及び事例信用組合の関係者、全国農業農村開発銀行関係者、SHGのメンバー等を対象とし、聞き取り調査によって進められた。その結果、WDCの組織構造、信用組合内での位置づけや役割などの実態を捉えることができた。また、WDCが設置されることによって、SHGプログラムへの取組に大きな差が生じていることも明らかになった。そこで注目するのが、インド農村で大きな普及度をもつ信用組合で、この信用組合を利用したSHG普及のための新たな方策を提示していくことが、本研究の課題である。この課題に取り組むため、平成24年度には、現地調査の結果を中心に、信用組合内部におけるWomen Development Cellのインパクトに関する分析を行った。平成25年度にも現地調査を行うことで、Women Development CellがSelf Help Groupsに与えるインパクトに関する分析を行った。そして、平成26年度の目的は、以上の2ヵ年における現地調査や文献調査等の結果を踏まえ、成果を総合的に整理することであった。そのために、これまで行った現地調査や文献調査等のデータを整理した上で、データ不足を補うため、平成26年910月に現地での補足調査を実施した。その結果、信用組合独自でSHGを結成・育成する際、Women Development Cellがいくつかの重要な役割を果たしていることが分かった。経済成長に沸くインドであるが、農村における貧困問題は依然として深刻である。そこで、農村の貧困問題を解く1つの手がかりとして、近年注目を集めているインド型マイクロファイナンス「SHG(Self Help Groups」の働きに着目する。ただし、このSHGは農村における普及度が地域による大きな偏りをみせていることから、普及のための方策を考える必要がある。平成25年度にも現地調査を行うことで、Women Development CellがSHGに与えるインパクトに関する分析を行った。そして、平成26年度も現地調査を行い、これまでの現地調査や文献調査等の結果もあわせ、成果を総合的に整理した。その結果、信用組合独自でSHGを結成する際、Women Development Cellがいくつかの重要な役割を果たしていることが分かった。最終年度となる平成27年度には、以上の成果を研究会等で報告し、最終的な成果発表のアウトラインを固めた。

そこで注目したのが、インド農村で大きな普及度をもつ信用組合で、この信用組合に設置されているWomen's Development CellがSHGの普及において重要な役割をになっていることが明らかになった。平成26年度は、本研究の取りまとめを行った上で、学会や研究会で成果を報告し、その結果を踏まえて修正し、最終的な論文・レポートを作成する予定であった。しかし、当初予定していた学会・研究会での報告が若干不足しているため、本研究の達成度はやや遅れていると判断した。農業経済学次年度は、学会・研究会での報告を積極的に行い、そこで受けたコメントを参考にして、最終的に論文・レポートとして完成させる予定である。本研究は、インドでの現地調査を重視して行うものであり、特に調査対象とする信用組合やSHGメンバー等に対して、徹底した聞き取り調査を行うことに重点を置いている。これまでに、調査対象者からの聞き取り調査が進んでおり、そこで収集したデータを分析する段階に進んでいるものの、若干のデータ不足から補足調査が必要な段階にあるため、本研究の達成度はやや遅れていると判断した。本研究は、インドでの現地調査をより重視して行うものである。特に、事例対象とする信用組合やSHGのメンバー、比較対象とする信用組合やSHGのメンバーなどに対して、徹底的に聞き取り調査を行うことが最も重要だと考えている。そこで、初年度の目標として掲げていたのは、事例信用組合内部におけるWDCの効果を把握するためのデータを現地調査により収集することであった。それを行うため、インド西部マハラシュトラ州での現地調査を行い、当初予定していたすべての調査対象に対しての聞き取り調査を完了させ、十分なデータを収集することができた。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。当初は、国内外での学会や研究会で数回の報告を行う予定であったが、取りまとめが遅れたことにより、それができなかった。そのため、旅費等の支出額が予定額を下回っている。本研究では、SHG普及のために事例信用組合に設置されたWDC(Women Development Cell)の効果を明らかにするため、1事例信用組合内部でのWDCの効果を把握するための現地調査、2SHGの結成・育成におけるWDCの効果を把握するための現地調査、以上を行うことを当初から予定していた。1と2はおおむね順調に進んでいるが、ややデータが不足している部分もあるので、それについては最終年度である次年度に補足調査を行い、補いたい。そして、1と2の結果を取りまとめ、DCCB(県協同組合銀行)による直接連結モデルを機能させるためのWDCの役割等について考察を行いたい。
ヒト食道癌に高発現する新たなチロシンキナーゼの検索

【目的】癌細胞の増殖・分化にチロシンキナーゼ(PTK)を介したシグナル伝達機構が重要とされる。食道癌ではどのような種類のPTKが発現しているのか、その全体像を把握する報告はない。今年度、我々は食道癌に発現するPTKをスクリーニングし、その意義を検討した。【方法】食道癌培養細胞に発現するPTKを変性プライマーを用いたRT-PCR法によりクローニングした。さらに、同定された各種PTKのmRNA発現を食道癌手術及び正常食道粘膜においてノザン法により検索した。【結果と考察】食道培養細胞から10種類の受容体型PTK:EGFR、FGFR4、Cak、HEK2、HEK8、Eck、Erk、IGF1R、Axl、Skyと1種類の非受容体型PTK:Tyk2が同定された。これらのPTKは全て、ノザン解析にて培養細胞、正常食道粘膜及び食道癌手術材料での発現が確認された。同一症例の癌部と非癌部を比較すると、ほとんどの例で同等が癌部での発現が増加していた(1.11.75倍)。これらの結果より、同定されたPTKは扁平上皮の増殖に関与すると考えられた。また高発現するPTKの種類や発現量は症例により差があり、それぞれの腫瘍の生物学的態度との関連を検討中である。
密度汎関数法による表面反応の制御と新機能物質の設計に関する研究

水の可視光による分解を達成する上で、バンドギャップが(H+の還元準位とOH-の酸化準位をまたいていることは当然として)、より狭いギャップの無機材料(半導体)を開発することが最も重要であり、ペロブスカイトは、この目的において有望な物質群である。多くの酸化物半導体の電子構造は、その構成元素の多様性にもかかわらず、原子価帯は、酸素の2p軌道、伝導帯は、金属のd軌道と、比較的単純な電子構造をもっている。一方、今までに、実験サイドからの経験的蓄積として、ある種の重元素を骨格に含む物質では、バンドギャップが、狭くなるということが知られている。本研究では、このような興味ある電子構造をもつ化合物群を中心に、系統的にバンド構造を計算することにより、バンドギャップを狭くする元素として、Bi、Pb、Agなどが有効であり、これらの元素の軌道が酸素の2p軌道と混成し、原子価帯のトップ位置に、現れるためであることを示した。これらの知見は、今後の材料開発をする上での指針となりうる。今年度の課題研究では、水素酸素型燃料電池の反応機構と金属イオン置換ゼオライトへのCO分子の吸着構造について調べた。燃料電池は、クリーンなエネルギー源として注目されており、その内部で進行する反応機構については、以下のような素反応に分けて考えることができる。(1)水素は白金電極表面で解離し、(2)原子状で白金層を通過する。(3)酸素分子は他方の白金電極表面で解離する。(4)酸素原子と水素原子とからOHラジカルが生成する。(5)OHラジカルはさらに水素原子と反応して水を生成する。これらの反応へのアプローチとしては、固体触媒表面での反応解析の方法が用いられるが、水素原子の白金層通過や、系の電荷の効果などが、新しい因子として加わる。計算の結果、水素原子がPt層を通過する過程が最も活性化エネルギーが高いことがわかった。2番目は水の生成過程であるが、実際には多数の水分子が存在するので、このエネルギーは低下すると思われる。金属イオン置換ゼオライトは、一時期、環境触媒として盛んに研究され、現在は一段落した感があるが、反応サイトなどの反応機構上、重要な問題は未決着のまま残されている。COをプローブ分子として種々の金属イオン置換ZSM-5に吸着させ、吸着熱と振動スペクトルを測定することにより、金属イオンの吸着サイトとして、2配位と3配位サイトが存在することを報告されている。また、アルカリ金属(Li、Na、K)置換ゼオライトはCuとは違った性質がある事がわかっている。本研究では吸着安定構造を求め、吸着エネルギー、赤外振動数、吸着分子上の電荷などから、金属による相互作用の違いを系統的に調べた。
ドナー骨髄細胞の増殖能と軟骨分化能および関連non-coding RNAの同定

検体数30個体のドナーから分離した骨髄細胞を用い実験を行った。増殖期のbFGF添加の反応性については従来の報告と同様の定性的な結果が得られ、各ドナーにおける定量指標も独自に得られた。実験の妥当性とその後の解析に十分なサンプルサイズが得られた。各ドナーのRNAプロファイリングをmicroarrayシステム(EXIQON社miRCURY LNA miRNA array)で網羅的に解析し、軟骨分化度のマーカー候補となりうるmicroRNAを検証した結果、miR708-5pが軟骨分化に抑制的に関与することが示唆された。しかしサンプル間でのバラつきも大きく、他の因子の関与も示唆された。本研究では、ドナー間で差があると考えられる骨髄細胞の増殖能と軟骨分化能について、その軟骨分化過程でのnon-coding RNAによる様々な遺伝子発現調節の関与を検討し、さらにそれら細胞の性質の指標となるマーカーの探索を目的としている。昨年度の研究実施によって、臨床試験に先立つ前臨床試験から分与された骨髄(一部購入骨髄を含む)が、既に目標とするN=20のサンプルサイズとなった。得られた細胞の増殖能と軟骨分化能についての実験は継続中であるが、目的とする検体もほぼ9割がた得られ、それらの生化学試験・免疫染色についても順次解析中である。増殖期のbFGF添加による効果、および継代を重ねることによる骨髄細胞の変化については、ほぼ従来の報告通りの結果であることを確認したが、ドナー間のばらつきの程度について本研究で十分なサンプルサイズが得られたことにより確認できた。また増殖期のbFGFに対する反応性を含めた軟骨分化能との相関についてドナー数例を抽出し、軟骨分化誘導前の骨髄細胞のRNAプロファイリングをncRNAを中心に最先端microarrayシステムで網羅的に解析した。それらから軟骨分化過程における遺伝子発現調節に関与する可能性が考えられる既知のncRNAを抽出した。更に関連する研究として、本実験で得られた基礎データを素に、scaffold free軟骨様細胞シートを作製し平成25年度日本軟骨代謝学会(Itokazu M, Mera H et al.日本軟骨代謝学会発表;京都2014年,3月)などで報告した。「臨床試験」および購入骨髄からの検体を合わせN=30(目標N=20以上)のドナー骨髄が得られた。計画ではP1、P4、P7の検討を行う予定だったが、現行の培養方法で必要な日数や費用など臨床利用の観点から、P1の解析のみに修正した。我々が今回骨髄細胞用に選定したロットのウシ血清(FBS)を用い、110%FBS, 25%FBS, 35%FBS+10ng/ml bFGFの条件で培養させた場合、P1における倍加指数はそれぞれ10.22±0.08(PD/d), 20.16±0.08(PD/d), 30.35±0.14(PD/d)で、さらに軟骨分化誘導後のペレットの湿重量は10.82±0.67(mg), 20.82±0.72(mg), 33.42±1.06(mg)であった。生化学試験や免疫染色を含めbFGFの反応性については従来の報告と同様の定性的な結果が得られ、各ドナーにおける定量指標も独自に得られた。実験の妥当性とその後の解析に十分なサンプルサイズが得られたと判断した。これを踏まえ、軟骨分化誘導前のRNAプロファイリングをmicroarrayシステム(EXIQON社miRCURY LNA miRNA array)で網羅的に解析し、増殖期のbFGFの反応性を含めた各ドナーの軟骨分化度のマーカー候補となりうるmicroRNAをいくつか抽出した。定量PCRによる検証の結果、条件1の軟骨分化後の湿重量1mgを境にした群間比較でmiR708-5pの発現が1mg以上群で有意に低く、本遺伝子が軟骨分化誘導に抑制的に関与することが示唆された。しかし1mg以下群内でのバラつきは大きく、これらは他遺伝子の関与を示唆した。今後、bFGF処置細胞のmiR708-5pの発現量とともに他遺伝子についても更なる検討を要する。次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqによる解析および臨床成績との比較は現在進行中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。整形外科26年度が最終年度であるため、記入しない。骨髄ドナーに関して、目標としていたサンプルサイズを満たした。増殖および軟骨分化誘導実験は一部継続中であるが、目的としていた検体もほぼ9割がた得られており、それらの生化学試験・免疫染色についても順次解析中である。また軟骨分化誘導前の細胞のRNAプロファイリングをncRNAを中心に最先端microarrayシステムを用いて網羅的に解析し、増殖期のbFGFの反応性を含めた軟骨分化能との相関について、遺伝子発現調節に関与する可能性が考えられる既知のncRNAを抽出し、ほぼ予定通りの進捗と考えられる。

抽出したncRNAについて定量PCRによる検証を行う。また継続して細胞増殖・軟骨分化誘導実験をおこない、得られた検体の生化学試験・免疫染色を行う。さらに、RNAプロファイリングに用いなかった検体に関してもRNA抽出から続くRTおよび定量PCRによる検証を行い、ドナー数を重ねることでより信頼性の高いncRNAの絞り込みが可能になると考えている。