hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AMPKのERストレス応答に対して非受容体型チロシンキナーゼFynが果たす役割

AMPキナーゼが肥満治療の標的分子として注目されているが、我々は非受容体型チロシンキナーゼFynがAMPKαサブユニットを直接チロシンリン酸化することで、その分子内活性を調節することを報告してきた。今回更に検討を行い1長期TNFαでAICAR依存性のAMPKの活性化の減弱を認めた。2長期TNFαでFynの活性の上昇を認めた。3siRNAを用いてFynをノックダウンすると長期TNFα下でのAICAR依存性のAMPK活性の減弱が起こらなかった。これらの成果はメタボリック症候群に深く関与する炎症性サイトカインTNFαがFynの活性調節を介してAMPK活性を調節することを示唆している。AMPKが肥満治療の標的分子として注目されているが、近年我々はその上流のLKB1がFynによって直接制御されていることを報告した。さらにFynがLKB1を介さずとも、AMPKを直接チロシンリン酸化することで、その活性を調節する可能性に関して様々な検討を行っている。今回更に検討を行い、下記結果を得た。1FynによるAMPKの直接のリン酸化をin vitroの系で確認した。2変異体(AMPK-Y432F)を作成し、内因性のAMPKをノックダウンした細胞にてAMPK-WT,Y432Fを発現したところ、変異体を発現した細胞にてAMPK活性の上昇を認めた。またAMPKはα,β,γサブユニット(α,β,γ)からなるため、更に検討し下記結果を得た。3Fynによるリン酸化部位を変異させたGST融合変異体GST-AMPKα-Y432FとGST-AMPKα-WTを293細胞で発現し共免疫沈降法を行ったところ、これらαと結合するβ,γは変化がなかった4GST-AMPKα-WT/Y432Fと結合するβ,γをpull downで確認したところ変化がなかった53と逆も同様だった6変異体を発現した細胞でAMPK基質のraptor,ulk1のリン酸化が上昇した74の細胞でαの活性を確認したところ、変異体を発現した細胞にて上昇を認めた。これら結果はFynによるAMPKの活性調節がαの分子内の構造変化によって生じる可能性を示唆している。メタボリックシンドロームは世界で急激に増加傾向であり、日本でも社会問題となっているが、これらは細胞、個体レベルにおけるエネルギー状態の破綻によって起こるとされている。細胞内エネルギー代謝調節に重要な蛋白質であるAMPキナーゼ(AMPK)はα,β,γのサブユニットからなり、その活性調節はAMP/ATP比によってなされるとされているが、これによるAMPKのアロステリックな変化による活性上昇は数倍程度にとどまり、αサブユニットの172番目のスレオニンのリン酸化が重要とされている。このリン酸化を行うキナーゼとしてはLKB1、CAMKKβ, TAK1が知られているが、近年、我々はLKB1が非受容体型チロシンキナーゼの一つであるFynによって直接リン酸化されており、このリン酸化によって、その活性が抑制されることを報告した。さらに近年、FynがこのLKB1を介さずとも、AMPKαサブユニットの432番目のチロシン残基を直接リン酸化することで、その分子内活性の調節が可能であることを確認した。また更に検討を行い、1HEK293細胞にて長期TNFαでAICAR依存性のAMPKのαの172番目のスレオニンのリン酸化とその基質であるアセチルCoAカルボキシラーゼのリン酸化の減弱を認めた。3HEK293細胞でsiRNAを用いてFynをノックダウンし、長期TNFα下でのAICAR依存性のAMPKのリン酸化の減弱が起こらないことを確認した。これらの結果はメタボリック症候群に深く関与する炎症性サイトカインTNFαがFynの活性を上げる事、さらにそれによりAMPK活性調節が生じる可能性を示唆している。これら一連の発見によってメタボリック症候群においてAMPKを抑制する新たなメカニズムが判明したこととなり、肥満治療に大きく貢献することができると考えられる。代謝学preliminaryのデーターが揺るぎないものであるためこの研究の最終段階である、ER stressとこの機構の関係について最終チェックしていく。さらにER stressとの関連が明らかとなった際には最近になり疾患との関連性が明らかになりつつあり、ER stressとの関連が強いオートファジー機構に関しても検討していきたいと考えている。1年目に多く実験する予定であった細胞、siRNAを使用した機能解析を実験の都合上2年目に行うことした。つまり単純に研究、実験の順序によるバランスの偏りが原因。当初の最終目的に合わせて、研究を行うことが可能
色素幹細胞の抗原性に着目したメラノーマに対する免疫療法の開発

悪性黒色腫(メラノーマ)は増殖および転移能が高く治療に最も苦渋する皮膚がんの代表である。メラノーマの免疫療法の大きな特徴として、腫瘍退縮と皮膚の白斑出現に相関が認められ、腫瘍退縮に関与している免疫応答は色素細胞系譜に特異的な抗原を標的としていることが示唆されている。またメラノーマ細胞の分化状態に関わらず、ほとんどのメラノーマ細胞が腫瘍形成能力を持ち合わせていることが最近指摘されている。そこで本研究では、色素幹細胞とその子孫細胞(分化細胞)の両方を標的とした自己免疫応答を誘導することにより、メラノーマに対する新たな免疫療法を開発することを目的として実施した。免疫源としてアポトーシスさせた正常ヒト表皮メラノサイト(NHEM)および色素幹細胞のマーカーとして用いられているドパクロムトートメラーゼ(Dct)由来のエピトープペプチドを、骨髄由来樹状細胞(BMDC)に取り込ませてB6マウスに免疫して色素細胞が標的となることで白毛化が誘導されるかを調べた。その結果、NHEMで免疫した場合には白毛化は見られなかったが、Dct由来のペプチドで免疫した場合は白毛化し、免疫を止めた後の毛周期で生えてくる毛も白いまま維持され、色素幹細胞が免疫応答の標的となっていることを示唆する結果が得られた。また本研究では、組織学的にヒトメラノーマに近づけるためヒト型の皮膚をもつマウス(:K14-SCF tg)にヒトメラノーマと同様の変異BRAF遺伝子発現をタモキシフェン投与により色素細胞系譜において特定の時期に制御可能な遺伝子、およびヒトのメラノーマで変異が確認されているPTEN遺伝子の欠損が導入され、さらに色素幹細胞系譜を可視化できる遺伝子が導入されたメラノーマ自然発症モデルマウスを作製し、自然発症かつヒトのメラノーマに酷似する像が得られるのかどうかを詳細に解析中である。正常な色素細胞、色素幹細胞を標的とした自己免疫応答を誘導し、マウスの毛を白毛化させることに成功した。またメラノーマ自然発症モデルマウスとして、合計6つの遺伝子をtransgeneしたマウスを作製することができ、現在このマウスから発生してくる病理像がヒトメラノーマの病理像と同じであるかを詳細に解析している。自己免疫応答が誘導できる方法を利用し、自己免疫応答の異常により引き起こされる尋常性白斑のモデルを作製していく。また色素幹細胞系譜を可視化できる遺伝子が導入されたマウスを免疫して白毛化させ、色素細胞や色素幹細胞の組織学的な解析を行っていく。さらに当研究室で作製したメラノーマ自然発症モデルマウスから発症してくるメラノーマの病理像の解析が終了し、ヒトのメラノーマに酷似していることが確認されたら、このマウスを用いて免疫療法の効果を確認していく。
歩行から走運動への運動パターン変化に関与する身体運動情報の解明

知覚・学習・運動システムである身体システムが,身体内部・外部環境の変化に柔軟に対応する典型的な方策として運動パターンの変化がある.特に,もっとも基本的な移動運動である歩行は,その移動速度を上げていくとある速度以上ではその運動形態を維持できなくなり無意識で走運動へと変化する.この移動運動パターン変化は,筋収縮エネルギーの最適な状態が自己組織的に選択されることから生じると考えられているが,実際の実験データに基づく検証は十分に行われていない.本研究は,歩行から走運動への移行に関与する運動とともに生じる身体内部情報を実験的に解明することであった.実験は,外踵上部に加速度計を装着した10名の被験者に,一速度を徐々に増加させるトレッドミル上で,歩行から走運動へ移行するまで衝撃力が異なる2つの条件(裸足とシューズ)で移動運動を行わせた.その結果,シューズ条件と裸足条件両者とも歩行から走運動への移行により内力が減少するが,衝撃力は依然として増加する傾向が見られた.よって,身体に加わる衝撃力の増加ではなく,下腿を前方にスイングする筋収縮力の増加がある臨界点に達することが,歩行から走運動への運動パターンの情報になっていると考えられた.またさらに,この状態で移動速度を増加させていくと,踵着地から前足部着地への着地動作の変化が生じた.そしてこの変化は,変化衝撃力が大きな裸足試技が,それが小さなシューズ試技より低い速度で生じ,さらにこの着地動作の変化によって衝撃力が減少した.以上のことから,人間の移動運動は大きく,歩行,踵着地走行,前足部着地走行の3つのパターンに分けられ,歩行から踵着地走行への変化は内力増加に対応するため,そして踵着地走行から前足部着地走行への変化は着地衝撃増加に対応するために生じていると考えられた.知覚・学習・運動システムである身体システムが,身体内部・外部環境の変化に柔軟に対応する典型的な方策として運動パターンの変化がある.特に,もっとも基本的な移動運動である歩行は,その移動速度を上げていくとある速度以上ではその運動形態を維持できなくなり無意識で走運動へと変化する.この移動運動パターン変化は,筋収縮エネルギーの最適な状態が自己組織的に選択されることから生じると考えられているが,実際の実験データに基づく検証は十分に行われていない.本研究は,歩行から走運動への移行に関与する運動とともに生じる身体内部情報を実験的に解明することであった.実験は,外踵上部に加速度計を装着した10名の被験者に,一速度を徐々に増加させるトレッドミル上で,歩行から走運動へ移行するまで衝撃力が異なる2つの条件(裸足とシューズ)で移動運動を行わせた.その結果,シューズ条件と裸足条件両者とも歩行から走運動への移行により内力が減少するが,衝撃力は依然として増加する傾向が見られた.よって,身体に加わる衝撃力の増加ではなく,下腿を前方にスイングする筋収縮力の増加がある臨界点に達することが,歩行から走運動への運動パターンの情報になっていると考えられた.またさらに,この状態で移動速度を増加させていくと,踵着地から前足部着地への着地動作の変化が生じた.そしてこの変化は,変化衝撃力が大きな裸足試技が,それが小さなシューズ試技より低い速度で生じ,さらにこの着地動作の変化によって衝撃力が減少した.以上のことから,人間の移動運動は大きく,歩行,踵着地走行,前足部着地走行の3つのパターンに分けられ,歩行から踵着地走行への変化は内力増加に対応するため,そして踵着地走行から前足部着地走行への変化は着地衝撃増加に対応するために生じていると考えられた.知覚・学習・運動システムである身体システムが,身体内部・外部環境の変化に柔軟に対応する典型的な方策として運動パターンの変化がある.特に,もっとも基本的な移動運動である歩行は,その移動速度を上げていくとある速度以上ではその運動形態を維持できなくなり無意識で走運動へと変化する.この移動運動パターン変化は,筋収縮エネルギーの最適な状態が自己組織的に選択されることから生じると考えられているが,実際の実験データに基づく検証は十分に行われていない.本研究は,歩行から走運動への移行に関与する運動とともに生じる身体内部情報を実験的に解明すること,そしてその明らかにした情報を用いて新たな移動運動パターン変化のモデルを提案することを目的とする.その第1年目として,以下の実験を行い,モデル化の基礎資料を得た.(本年度の実験)外踵上部に加速度計を装着した10名の被験者に,速度を徐々に増加させるトレッドミル上で,歩行から走運動へ移行するまで移動運動を行わせた.なおこの試技は,衝撃力が緩衝されるシューズ装着試技と衝撃力がダイレクトに身体に加わる裸足試技の2種類を行い,側方から高速カメラで撮影した.高速カメラから得られた画像データからスイング中の股関節トルクと膝関節トルクを算出し,身体に加わる衝撃力と供に,移動速度と伴いどのように変化するかを検討した.その結果,シューズ試技と裸足試技両者とも歩行から走運動への移行により内力が減少するが,衝撃力は依然として増加する傾向が見られた.よって,身体に加わる衝撃力の増加ではなく,下腿を前方にスイングする筋収縮力の増加がある臨界点に達することが,歩行から走運動への運動パターンの情報になっていると考えられた.知覚・学習・運動システムである身体システムが,身体内部・外部環境の変化に柔軟に対応する典型的な方策として運動パターンの変化がある.

特に,もっとも基本的な移動運動である歩行は,その移動速度を上げていくとある速度以上ではその運動形態を維持できなくなり無意識で走運動へと変化する.この移動運動パターン変化は,筋収縮エネルギーの最適な状態が自己組織的に選択されることから生じると考えられているが,実際の実験データに基づく検証は十分に行われていない.本研究は,歩行から走運動への移行に関与する運動とともに生じる身体内部情報を実験的に解明することであった.実験は,外踵上部に加速度計を装着した10名の被験者に,速度を徐々に増加させるトレッドミル上で,歩行から走運動へ移行するまで衝撃力が異なる2つの条件(裸足とシューズ)で移動運動を行わせた.その結果,シューズ条件と裸足条件両者とも歩行から走運動への移行により内力が減少するが,衝撃力は依然として増加する傾向が見られた.よって,身体に加わる衝撃力の増加ではなく,下腿を前方にスイングする筋収縮力の増加がある臨界点に達することが,歩行から走運動への運動パターンの情報になっていると考えられた.またさらに,この状態で移動速度を増加させていくと,踵着地から前足部着地への着地動作の変化が生じた.そしてこの変化は,変化衝撃力が大きな裸足試技が,それが小さなシューズ試技より低い速度で生じ,さらにこの着地動作の変化によって衝撃力が減少した.以上のことから,人間の移動運動は大きく,歩行,踵着地走行,前足部着地走行の3つのパターンに分けられ,歩行から踵着地走行への変化は内力増加に対応するため,そして踵着地走行から前足部着地走行への変化は着地衝撃増加に対応するために生じていると考えられた.
4端子メムリスタを用いた信号伝達相関型シナプス素子の創製

本研究では、SrTiO3およびTiO2単結晶中の酸素空孔の挙動場と素子構造の精密なデザインに基づき、生体系シナプスの高次機能を模倣する信号伝達相関型シナプス素子を創製し、その基本動作を実証した。貼り合せ原子接合によって形成した高配向2次元螺旋転位網を酸素空孔のドリフト場として機能させることで、高い安定性を持つ低/高抵抗状態と急峻な抵抗スイッチング特性を実現した。また、平面型4端子メムリスタ素子を開発し、修飾電界印加による酸素空孔分布を基に、素子抵抗を可塑的かつ可逆的に変化させることに成功した。これによって、多入力で信号伝達挙動を制御できる金属酸化物シナプス素子の実現への可能性が示された。本研究では、酸化物結晶中の転位ネットワーク構造と素子構造を精密にデザインし、信号伝達の相互作用を実現するメムリスタで構成されるシナプス素子を作製し、その基本動作特性と機能を実証することを目的としている。具体的には、1駆動電極、修飾電極を介して各入力状態に応答する電気伝導特性を計測し、抵抗遷移の制御性と可塑性を検討する、2集束イオンビーム(FIB)加工を駆使し、サブミクロンスケールの改良型クロスバーアーキテクチャを構築する、3駆動電極と修飾電極を連合させたデュアルシナプス回路を作製し、シナプス間における抵抗遷移の相関特性を観測する、ことである。当該年度は、SrTiO3(STO)基板結晶に着目し、電気伝導特性の計測を基に抵抗遷移の制御性と可塑性を検討した。ノンドープSTO基板結晶は、結晶中に生成された酸素空孔によって抵抗スイッチング特性を発現することが確認されており、それは主に転位に沿う酸素空孔の電界ドリフトが関与していると示唆されている。今回、報告者らがこれまでに立ち上げた、貼り合わせ・原子接合プロセスをノンドープSTO(001)基板結晶に適用し、接合界面に高配向らせん転位ネットワークを有する直接接合STO基板を作製した。この基板を超高真空下で還元熱処理することによって、当初の透明色が黒色に変化し、ホール測定による電子濃度が3E18 cm-3であったことから、結晶内に酸素空孔が形成されたことを確認した。接合界面を含む状態のショットキー金属/STO/オーミック金属からなる2端子素子を形成し、電流-電圧特性を計測した結果、高抵抗状態と低抵抗状態の二つの安定状態からなるバイポーラ型のヒステリシス特性が確認された。これは、ショットキー電極側を正電圧印加した状態で、低抵抗から高抵抗に遷移するヒステリシスであり、抵抗遷移を誘発する媒体が酸素空孔であることを示唆している。当該年度は、メムリスタ材料であるTiO2の単結晶に着目し、フォーミング現象に寄与するフィラメントの結晶構造を明らかにした。4端子制御へ向けての適用が容易な平面型の2端子素子をTiO2(100)面上に試作し、フォーミングに係る電流-電圧特性を測定した。測定後のTiO2単結晶には複数のフィラメントが形成されており、それらの形態は光学顕微鏡によって明瞭に観察することができた。また、集束イオンビーム加工装置を駆使してフィラメント部から局所的に透過電子顕微鏡(TEM)観察用試料を抽出し、TEM観察によりその構造を決定した。電子線回折パターンには、フィラメント以外の領域には見られない回折ストリークが明瞭に観測され、TEM像を併用した解析により、それらは酸素空孔によって形成される剪断面が周期的な原子面配列を乱すことにより形成された構造であることが明らかになった。なお、形成されたフィラメントはすべて[001]方向に伸びており、電界の印加方向に依存しないことが判明した。この結果は、フィラメントが伸びる[001]方向を駆動電界、それに垂直な方向(例えば[010]、[100]方向)を修飾電界とする、信号伝達相関型の4端子デバイスの設計指針を与えており、今後の素子作製において重要な示唆を与えている。一方、同TiO2系2端子デバイスで発現する抵抗スイッチングの抵抗比を向上させるために、素子の更なる微細化を検討した。電子線リソグラフィーを用いた作製プロセスを構築することによって電極間距離が5 um以下の平面型2端子デバイスを作製した。当該年度は、前年度に確認された還元TiO2単結晶の電気伝導特性に着目し、結晶内の酸素空孔分布と素子抵抗変化機構との相関を明らかにした。具体的には、還元熱処理を施した(100)面方位TiO2単結晶基板の表面に、電気伝導に係る駆動電界を与える電極と、その電界方向に垂直な電界を与える修飾電極を設けた4端子平面型素子を作製し、修飾電界印加に伴う駆動電界方向の電流変化を計測した。また、光学顕微鏡を用いて、電界印加の各段階における酸素空孔集積による電気着色現象を観察した。その結果、[001]方向に優先的に伸びるフィラメントおよびその周囲の暗コントラストの形態が修飾電界によって可逆的に変化する様子が観察された。また、このコントラスト形態に依存して、素子抵抗が不揮発・可逆的に変化することから、結晶内の酸素空孔分布変化が抵抗遷移に直接影響していることが明らかになった。本研究では、酸化物結晶中の酸素空孔の反応場と素子構造の精密なデザインに基づき、生体系シナプスの高次機能を模倣する信号伝達相関型シナプス素子を創製し、その基本動作を実証することを目的としている。研究期間全体を通して、SrTiO3およびTiO2の還元単結晶を用いて当該素子の開発にあたった。

前者においては直接基板接合により人工的に形成した二次元転位網を、後者においては[001]結晶方位に優先的に形成される導電性フィラメントを酸素空孔の挙動場とする抵抗変化素子を作製し、両素子において、低抵抗状態と高抵抗状態の高い安定性と制御性を確認した。特にTiO2結晶に対しては、修飾電界印加により、素子抵抗を可塑的かつ可逆的に変化させることに成功し、これによって、酸素空孔分布の制御に基づき、多入力で信号伝達挙動をコントロールできるシナプス素子の実現への可能性が示された。本研究では、SrTiO3およびTiO2単結晶中の酸素空孔の挙動場と素子構造の精密なデザインに基づき、生体系シナプスの高次機能を模倣する信号伝達相関型シナプス素子を創製し、その基本動作を実証した。貼り合せ原子接合によって形成した高配向2次元螺旋転位網を酸素空孔のドリフト場として機能させることで、高い安定性を持つ低/高抵抗状態と急峻な抵抗スイッチング特性を実現した。また、平面型4端子メムリスタ素子を開発し、修飾電界印加による酸素空孔分布を基に、素子抵抗を可塑的かつ可逆的に変化させることに成功した。これによって、多入力で信号伝達挙動を制御できる金属酸化物シナプス素子の実現への可能性が示された。当該年度は、TiO2単結晶を対象にして、メムリスタ(抵抗スイッチング)特性の発現において重要な役割を果たす結晶内のフィラメントの構造に着目した。本研究が目的とする、信号伝達の相互作用を可能とするメムリスタで構成されるシナプス素子の実現には、電気伝導の駆動と修飾の両機能が必須であり、電気伝導を担うフィラメントの電気的制御と構造的制御が不可欠となる。今年度は、フィラメントの電気的特性と結晶学的特性の直接的相関が解明されており、全体の研究目的に照らし合わせて、研究は順調に進展しているといえる。材料物性工学当該年度においては、新たなメムリスタ材料としてTiO2単結晶に着手した。本材料ではこれまでのSrTiO3(STO)単結晶とは異なり、結晶の対称性に依存した電気伝導が発現し、結晶内には、それを担う特有のフィラメント構造が観察された。この結果は、電気伝導の駆動電圧を加える2端子とその電気伝導機構を修飾する2端子からなる4端子デバイスを試作するうえで、非常に有効な成果である。今後は従来のSTOとともに、TiO2系での研究も進め、両者を比較実験することで、信号伝達相関機能を発現させるべく、材料・デバイス構造の最適化を図る。また、今年度から開始した電子線リソグラフィーのみならず、TEM試料作製ツールとして使用していた集束イオンビーム加工装置(FIB)も併用することで、多様な素子構造を設計・作製していく予定である。当該年度は、ノンドープSrTiO3基板結晶を対象に、結晶中に高配向転位ネットワークを形成する貼り合わせ原子接合プロセス、結晶中に酸素空孔を導入する超高真空還元熱処理プロセス、ショットキー/オーミック電極形成技術、接合界面を含む金属/STO/金属2端子素子作製技術、およびその素子の電気的特性計測技術等、プロセス、素子作製、測定評価の立ち上げに注力した。それぞれの技術は今後の研究展開に向けて拡充できる段階にあるため、全体の研究目的に照らし合わせて、研究は順調に進展しているといえる。当初外注する予定であった試料分析や微細加工に関わる費用が、学内施設・設備の活用によって賄うことができたため、大幅な支出削減が達成され、その分も含めて当該助成金が生じた。
確率過程に対する統計的推測理論の構築と数理ファイナンスへの応用

高次漸近展開は,複雑な統計モデルにおける統計量の分布の近似公式を系統的に導き,また漸近有効性などの高次漸近理論にとって不可欠であるばかりか,情報幾何などの新しい数理的視点を誘導することが,独立標本モデルや時系列モデルにおいてはよく知られている.連続時間径数をもつ確率過程に対しても,小さな拡散モデルなどの一部のモデルについて,漸近展開をもちいた高次漸近理論が展開されているが,本研究では,統計量がミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,高次漸近展開を導出し,その典型的で最も有用な例として,M推定量の3次の漸近展開を求めた.また,M推定量が最小コントラスト推定量である場合,いわゆるバートレットの関係式が成り立てば,漸近展開の係数は,情報幾何的な定数で与えられることも明らかにした.これらの結果は,時系列のような離散時間径数を持つ確率過程やジャンプを持つ拡散過程などに応用可能であるが,本研究では連続な拡散過程に対するM推定量の漸近展開を導いた.その結果は,モデルの特定に失敗した場合も含んでいる.さらに,M推定量の漸近展開を導くのと同様な方法で,局所対立仮説に対する対数尤度比が,ミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,その高次漸近展開を求め,ある正則条件のもので最尤推定量の2次有効性を証明した.この結果ほ,連続時間径数,離散時間径数を問わず,多くの確率過程に応用可能であるが,特に連続な拡散過程に対してそのことを証明した.このように,確率過程を含む多くのモデルに対して,高次漸近理論のための基本的な道具の導出に成功したが,その結果が含まない数少ないモデルとして,線形な係数を持っ拡散過程がある.このような例外的なモデルに対して,漸近展開の正当性についてグローバルアプローチとローカルアプローチを併用することで証明に成功した.これにより,応用上重要なほとんどすべての拡散過程に対する統計量の漸近展開が求められたことになる.高次漸近展開は,複雑な統計モデルにおける統計量の分布の近似公式を系統的に導き,また漸近有効性などの高次漸近理論にとって不可欠であるばかりか,情報幾何などの新しい数理的視点を誘導することが,独立標本モデルや時系列モデルにおいてはよく知られている.連続時間径数をもつ確率過程に対しても,小さな拡散モデルなどの一部のモデルについて,漸近展開をもちいた高次漸近理論が展開されているが,本研究では,統計量がミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,高次漸近展開を導出し,その典型的で最も有用な例として,M推定量の3次の漸近展開を求めた.また,M推定量が最小コントラスト推定量である場合,いわゆるバートレットの関係式が成り立てば,漸近展開の係数は,情報幾何的な定数で与えられることも明らかにした.これらの結果は,時系列のような離散時間径数を持つ確率過程やジャンプを持つ拡散過程などに応用可能であるが,本研究では連続な拡散過程に対するM推定量の漸近展開を導いた.その結果は,モデルの特定に失敗した場合も含んでいる.さらに,M推定量の漸近展開を導くのと同様な方法で,局所対立仮説に対する対数尤度比が,ミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,その高次漸近展開を求め,ある正則条件のもので最尤推定量の2次有効性を証明した.この結果ほ,連続時間径数,離散時間径数を問わず,多くの確率過程に応用可能であるが,特に連続な拡散過程に対してそのことを証明した.このように,確率過程を含む多くのモデルに対して,高次漸近理論のための基本的な道具の導出に成功したが,その結果が含まない数少ないモデルとして,線形な係数を持っ拡散過程がある.このような例外的なモデルに対して,漸近展開の正当性についてグローバルアプローチとローカルアプローチを併用することで証明に成功した.これにより,応用上重要なほとんどすべての拡散過程に対する統計量の漸近展開が求められたことになる.高次漸近展開は,複雑な統計モデルにおける統計量の分布の近似公式を系統的に導き,また漸近有効性などの高次漸近理論にとって不可欠であるばかりか,情報幾何などの新しい数理的視点を誘導することが,独立標本モデルや時系列モデルにおいてはよく知られている.連続時間径数をもつ確率過程に対しても,小さな拡散モデルなどの一部のモデルについて,漸近展開をもちいた高次漸近理論が展開されているが,本研究では,統計量がミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,高次漸近展開を導出し,その典型的で最も有用な例として,M推定量の3次の漸近展開を求めた.また,M推定量が最小コントラスト推定量である場合,いわゆるバートレットの関係式が成り立てば,漸近展開の係数は,情報幾何的な定数で与えられることも明らかにした.これらの結果は,時系列のような離散時間径数を持つ確率過程やジャンプを持つ拡散過程などに応用可能であるが,本研究では連続な拡散過程に対するM推定量の漸近展開を導いた.その結果は,モデルの特定に失敗した場合も含んでいる.さらに,M推定量の漸近展開を導くのと同様な方法で,局所対立仮説に対する対数尤度比が,ミキシング性を持つマルコフ過程の汎関数で近似できる場合について,その高次漸近展開を求め,ある正則条件のもので最尤推定量の2次有効性を証明した.この結果は,連続時間径数,離散時間径数を問わず,多くの確率過程に応用可能であるが,特に連続な拡散過程に対してそのことを証明した.

このように,確率過程を含む多くのモデルに対して,高次漸近理論のための基本的な道具の導出に成功したが,その結果が含まない数少ないモデルとして,線形な係数を持つ拡散過程がある.このような例外的なモデルに対して,漸近展開の正当性についてグローバルアプローチとローカルアプローチを併用することで証明に成功した.これにより,応用上重要なほとんどすべての拡散過程に対する統計量の漸近展開が求められたことになる.Sakamoto-Yoshida(1996)によるウィナー汎関数の展開公式を応用して,縮小推定量を中心とする信頼領域や予測領域の被服確率に対する展開公式を求めた.この結果から,通常の信頼領域や予測領域と縮小推定量によるものの比較が可能となり,点推定と同様に,次元が3以上のときは通常のものが許容的でないことが証明できた.これらの結果は,Sakamoto-Takada-Yoshida(2004)に出版された.また,混合性を持つマルコフ過程の汎関数に対する展開公式を導いた.この結果は,漸近正規性を持つ様々な統計量に応用でき,しかも,飛躍を持つ拡散過程や非線形時系列を含む多くの統計モデルに対応するため,今後幾多の応用が可能であると期待される.その応用として,M推定量の分布の漸近展開を一般的な統計モデルに対して求めた.これらの結果は,Sakamoto-Yoshida(2004)において発表された.これらの結果は,拡散過程に応用できるため,真のモデルを含まない統計モデルを用いた場合のM推定量の漸近展開,特に,拡散モデルに対するそれを求め,現在投稿中である.上記の結果は,拡散過程などの多くの確率過程に対する統計的推測において基本となる道具を提供するものであり,特に,M推定量の漸近展開は数理ファイナンスにおける統計的推測にとって基礎となる結果を与えた.連続観測に基づく拡散過程の判別分析に対する評価方法を導いた.拡散過程に対する様々な判別関数は,一般にその分布形が明らかではなく,リスク,または,誤判別確率を評価するとき,何らかの近似法が必要となる.それの有力なアプローチは漸近近似であるが,様々な漸近特性が考えられるため,漸近特性ごとに近似公式を開発する必要がある.今年度は,(1)学習標本と観測標本が全て大きい場合,(2)学習標本と観測標本のイノベーションが全て小さい場合,(3)学習標本が大きいが観測標本は大きくない場合の3つの場合について,ベイズ判別ルール,ワルド型プラグイン判別ルール,尤度比検定型Z判別ルール,それぞれの誤判別確率の漸近展開を求めた.(1)と(2)の場合については,オルンシュタイン=ウーレンベック過程や,CIR過程などの具体的なモデルについて,漸近展開の近似精度を数値的に評価した.また,バイアス修正法と漸近展開を用いた簡便な近似法を提案し,その近似精度を数値的に評価した.さらに,(3)の場合は,1次の漸近特性がベイズ判別ルールで決まる,通常のエッジワース型の漸近展開でないことが明らかになり,しかも,3つの判別ルールの誤判別確率は漸近オーダーが2次まで一致することが明らかになった.
メタンハイドレート鉱床の分解・流動シミュレーションに関する研究

最近、日本近海におけるメタンハイドレートは非在来型のガス資源として期待されている。第2章に"メタンハイドレート層の探査分布と資源量"として報告したようにメタンハイドレート鉱床は旧ソ連、アメリカ、カナダの陸上、主に大西洋、太平洋の大陸棚に沿ってアメリカの北部と中央部および日本周辺部に確認されている。この報告書はメタンハイドレート資源の最近のデータについてまとめた。全世界における最も確からしいメタンハイドレート原始資源量は2,100兆m^3(これは地球上の在来型天然ガスの原始地表量の倍の規模である)と見積もられる。次に、将来の資源開発を目指して、メタンハイドレート分解に伴う一次元でのガスおよび水の挙動推定するための数値モデルを開発した。このモデルはメタンと水の2成分からなる。これは多孔質媒体内でのガスと水の流れ、ハイドレートの分解および熱の収支を考慮した。ここで開発したシミュレータはメタンハイドレート分解によるメタンガス生産量予測に役立つ。最後に、ハイドレートの飽和した多孔質媒体内の浸透率について実験的研究を行った。この実験では初歩的段階として擬似ハイドレートとして氷を用いた。結果は第4章に示すように、固体の増加に従って急激に浸透率の減少が起こるメカニズムが判明した。本研究で構築したシミュレータのFortranプログラムおよびこの研究に関連した主な発表文献については報告書の付録に収めた。21世紀の新しいクリーンエネルギー資源として注目されているメタンハイドレート鉱床からメタンを回収する際のハイドレートの分解・流動に関する研究は外国においても基礎調査、研究の段階である。ここでは諸外国におけるハイドレートの生成分解過程の実験・理論に関する文献収集とメタンハイドレートの鉱床の調査研究を行い研究手法の確定した。ハイドレート分解過程シミュレーションを行うにはハイドレート相の相平衡計算と多孔体内でのガス、水および熱の流れを計算する。すでにメタンと水でハイドレートの3相平衡状態に関する熱力学的相平衡計算プログラムの作成を行い、流体の流れはガスと水の2相流についてはLBLで開発したTOUGH2VOCプログラムを利用して一次元シミュレータを開発した。このプログラムを用いてハイドレート分解過程の挙動特性を調査している。さらに既存設備と多点計測スキャンニングシステム装置を使用して、岩石の孔隙空間内に擬似ハイドレートとして氷をつくり孔隙内の飽和率変化と浸透率に関連した実験的準備を完了し、実験を続けている。次に、既存のハイドレートの分解実験データと比較することによりハイドレートの分解挙動を解明する。本研究の最終目的はメタンハイドレート層内の生産井回りのハイドレートの分解相挙動を解析するシミュレーションモデルの開発とメタンハイドレート鉱床からのメタンガス生産能力予測である。21世紀の新しいクリーンエネルギー資源として注目されているメタンハイドレート鉱床からメタンを回収する際のハイドレートの分解・流動挙動に関する研究は外国においても基礎調査、研究の段階である。メタンハイドレートはシャーベット状の固体であるが分解に伴いメタンガスと液体である水になり、固体は消滅する。この固体は多孔体内の孔隙率を変化させるだけでなく形状が変わるので流体の浸透率に影響する。理論的にハイドレート分解過程は相平衡論と分解速度論の2つの方法が考えられている。本年度は相平衡論を用いたメタンと水でハイドレートの3相平衡状態に関する熱力学的相平衡計算プログラムの作成を行い、多孔体内でのガス、水および熱の流れの計算にはLBLで開発したTOUGH2VOCプログラムを利用して一次元シミュレータを開発し、このプログラムを用いてハイドレート分解過程の多孔体内での流体と熱に関する挙動特性を攻究している。さらに既存設備、多点計測スキャンニングシステム装置、コアー試験装置を使用して、岩石の孔隙空間内に擬似ハイドレートとして氷をつくり孔隙内の飽和率変化と浸透率に関連した実験的準備を完了し、基礎的な実験を続けている。本研究の最終目的はメタンハイドレート層内の生産井廻りのハイドレート分解・相挙動を解析するシミュレーションモデルの開発とメタンハイドレート鉱床からのメタンガス生産能力予測であるので、坑井近傍のハイドレート分解過程の挙動特性を研究するため、分解速度論による2次元シミュレータを開発し、生産に伴うハイドレートの分解挙動を解明する。本年度は分解速度論に基づいたメタンハイドレートの分解モデルに関する計算プログラムの開発を行った。

ここでは多孔体内でのガス、水、熱の流れおよびハイドレート相の式を解くのに最初に圧力の式を解き、続いて飽和率を計算するIMPES法を用いた。このプログラムを用いてハイドレート分解過程の多孔体内での流体と熱に関する挙動特性について研究した。実験的研究としては、恒温槽等の既存設備、多点計測スキャンニングシステム装置、コア試験装置を使用して、岩石の孔隙空間内に擬似ハイドレートとして氷をつくり孔隙内の飽和率変化と浸透率に関連した実験的準備を完了し、基礎的な実験を続けた。本研究ではコアの孔隙空間内に擬似ハイドレートとして氷を作り、氷の生成が原因で起こる浸透率変化を考察した。この実験ではコア内飽和率を均一になるように氷を作り、氷の生成による浸透率変化を計測した。その結果コア内に氷が存在するとき、コアの浸透率は孔隙容積に占める氷の飽和率に対して2次関数的に減少していくことがわかった。また、孔隙内がコアの構成粒子で埋められていく場合と氷で埋められていく場合とを比べたら、明らかに後者のほうが空隙の減り方に対しての浸透率の減少が大きくなることもわかった。今後、メタンハイドレートについてはハイドレートの飽和率変化を考慮した研究が必要となる。さらに実フィールドに適用するためにはメタンハイドレート層内の生産井廻りのハイドレート分解・相挙動を解析するシミュレーションモデルの開発し、メタンガス生産を予測することが重要である。この研究では坑井近傍のハイドレート分解過程の挙動特性を研究するため、分解速度論による1次元シミュレータを開発し、生産に伴うハイドレートの分解挙動に必要な基礎的研究を行った。
19世紀末遣独フランス大学人の調査・研修報告(1878-1900年)に関する研究-人間諸科学におけるアカデミック・キャリアーの成立の観点から-

第三共和政初期のフランス大学改革におけるドイツ大学モデルの「転移」を、(1)フランス政府派遣少壮エリート大学人執筆の各学問分野に関する調査・研修報告(「高等教育協会」機関誌および『国際教育評論』誌所載、1878-1900年)、(2)M.collignon,Ch.Seignobos他10余名の上記報告執筆者のプロゾポグラフィーおよびフランス大学人の「界」への定位、に基づいて超領域的に考察することにより、以下の点について新たな知見が得られた。1報告に見られるドイツ大学観(1)普仏戦争以前にドイツ大学に学んだ世代とは異なり、ドイツ大学の盲目的模倣の限界を示そうとする考慮、つまり、「転移」可能なものは大学を構成する個々の要素の域を越ええないという共通の認識が見られること、(2)講義、学生、教授、インスティトゥートおよびゼミナール等ドイツ大学における具体的な教育・研究の関しては、肯定的評価と否定的評価が相半ばして両義的であり、唯一共通に評価されているのは科学の工房としてのゼミナール、教授間における競争という側面のみであること。2フランス大学人の「界」における報告執筆者彼らは執筆の時点において、年令的にはいうまでもなく、学問的にも職業的にも、フランスの大学人の「界」の周縁に位置するが、しかし、彼らの軌跡および将来における軌道から見ると、フランスの教育システムが生み出した最も正統的・エリート的な革新的「相続人」であること。3人間諸科学のアカデミック・キャリアー化ドイツ大学モデルの部分的「転移」の具体例を視野に入れつつ、執筆者の集合的心性の観点から報告の言説を考察すると、この時期におけるドイツ・モデルの「転移」は、フランス大学人の「界」に同化可能な限りにおいて、しかも、新たに勃興しつつあった人間諸科学の諸領域をアカデミック・キャリアーとして確立するのに裨益する限りにおいて行なわれたこと。
子どもの物理的認識に関する定量的・系統的分析法の開発と授業評価・改善への活用

1.研究の目的子どもが素朴概念・誤概念を持っていることはよく知られているが,小学校理科物理分野においては,これらを定量的に調査・分析し,授業評価・改善に役立てる方法は確立されていない。本研究はその開発を目的とする。2.研究の方法前年度S小学校第6学年児童を対象に物理概念予備調査を2回実施したが,今年度はその分析から始めた。第1次調査は力と運動(N=37),電気と磁石(N=37),物の性質(N=37)という具合に,学級毎に別問題で実施し,多肢選択方式による定量的調査と回答理由記述による定性的調査を併用した。第2次調査は,これらを統合し,多肢選択方式で実施した(N=74)が,分析に限界が生じ,追跡調査も兼ねて,同校児童が多数進学するS中学校第1学年生徒(N=150)を対象に第3次調査を実施した。分析は第2次調査を中心に項目特性図を作成して行い,児童を総点により概ね同人数の5群に分け,グラフの横軸に群,縦軸に選択率を表した。グラフから回答傾向や識別力を検討し,記述式回答から偽正答・偽誤答についての検討を加え問題を改良した。特に,てこの支点に関する素朴概念は根強く,選択肢や図を何度も修正した。こうして力と運動,電気と磁石の2種類の調査問題を完成させ,第5学年「電流の働き」,第6学年「てこの規則性」「電気の利用」のプレーポストテストとして実施した。3.研究の成果「てこの規則性」を中心に分析を行い,規格化ゲインを求め,授業評価・改善の検討材料とした。教科書程度の問題では, 0.240.58のゲイン(問6問8)が得られたが,他事象に適用する問題は正答率の変化は小さかった。授業は基礎・基本の定着に一定の効果があったが,規則性の他事象への適用に課題があることが明らかになった。力と運動の調査は,中学生に対しても実施したが,てこの支点についての素朴概念は,あまり改善されないことが分かった。以上の内容について,論文1本投稿査読中。2本投稿予定。2本投稿予定。
糖鎖シグナルによる口腔硬組織形成の分子制御機構の解明

本研究では、歯の発生から脱落に至るまでの、糖鎖機能を解明することを目的としてきた。O型糖鎖結合蛋白であるアメロブラスチンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合領域を有し、そのドメインを利用して細胞接着活性をもつマトリックス蛋白として機能し、その結果、エナメル芽細胞の分化及び、エナメル質形成に必須の分子であることが、ノックアウトマウスの解析から明らかとなった。具体的には、アメロブラスチンはP27の発現誘導を行うことで、エナメル芽細胞の細胞増殖を停止、一方でMsx2などの転写因子発現を制御することで、直接的にアメロジェニンなどのエナメルマトリックスの発現制御をおこなっている可能性が示唆された。従ってアメロブラスチンノックアウトマウスでは、エナメル芽細胞の異常増殖と、アメロジェニンの発現減少、およびこれらに伴うエナメル質の完全欠失が認められた。また、本ノックアウトマウスでは、加齢とともに歯原性腫瘍の生じることから、アメロブラスチンは単にエナメル形成にもならず、口腔硬組織内の歯原性上皮腫瘍形成にも重要な分子であることが明らかとなった。細胞表面に存在する糖脂質は、様々な増殖因子受容体などの細胞表面局在や、そのシグナル制御に重要であることを明らかにしてきた。歯の発生過程において、この糖脂質の糖鎖構造を修飾するGD3合成酵素の発現に関して解析を進めてきた。その結果、GD3合成酵素遺伝子は、歯胚発生の初期過程において歯原性上皮細胞に強く発現し、その分化とともに発現が減少することが明らかになった。また、GD3合成酵素遺伝子を過剰発現させた歯原性上皮細胞では、細胞増殖因子によって誘導される細胞増殖が亢進することから、GD3合成酵素によって合成される糖鎖構造が、細胞の増殖・分化に重要な役割を演じていることが明らかになった。以上の結果から、糖鎖シグナルは、歯及び口腔硬組織形成過程において、必須のメカニズムであり、今まで未知の領域であった分野の開拓に貢献できたものと考えられる。その中で、まず歯の発生過程における糖鎖分子の発現パターンを決定する目的で、歯原性上皮細胞より糖脂質分子を精製し、その糖鎖構造の解析を行なった。その結果、中性糖脂質ではGb4、LacCerが、また酸性糖脂質ではGM3,GM1がその主要構成成分であることが判明した。また、歯の発生段階において、発現量に変化の認められる分子群のスクリーニングから、GD3合成酵素であるシアル酸転移酵素の発現が、歯原性上皮細胞に認められた。この遺伝子は、発生初期に高い発現を示すが、分化とともに徐々に減少していくことが明らかになった。本遺伝子を歯原性上皮細胞に過剰発現させることで、その細胞増殖能の亢進が認められたとこから、シアル酸転移酵素遺伝子の発現が、何らかの増殖因子シグナルを制御していることが示唆された。一方、糖鎖修飾された細胞外マトリックスの歯の発生における機能の解明も同時に行なってきた。その中で、O型糖鎖結合蛋白であるアメロブラスチンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合領域を有し、そのドメインを利用して細胞接着活性をもつマトリックス蛋白として機能し、その結果、エナメル芽細胞の分化及び、エナメル質形成に必須の分子であることが、ノックアウトマウスの解析から明らかとなった。また、本ノックアウトマウスでは、加齢とともに歯原性腫瘍の生じることから、アメロブラスチンは単にエナメル形成にもならず、口腔硬組織内の主要形成にも重要な分子であることが明らかとなった。また基底膜糖蛋白分子であるラミニンのうち、alpha2鎖を有するラミニンが、象牙質形成に重要であることを発見した。ラミニンalpha2鎖欠損マウスでは、象牙質形成に重要である象牙質シアロ蛋白の発現の減少を認めた。その結果、象牙質形成過程におけるプロテオグリカン分子群の除去を十分行なえないことから、象牙質形成の抑制が認められ、さらには象牙芽細胞自体の分化抑制にも異常を生じていることが明らかとなった。現在、歯の発生過程に重要な新規糖鎖分子群のスクリーニングと、個々の糖鎖機能について詳細な解析を進めている。

その結果、GD3合成酵素遺伝子は、歯胚発生の初期過程において歯原性上皮細胞に強く発現し、その分化とともに発現が減少することが明らかになった。また、GD3合成酵素遺伝子を過剰発現させた歯原性上皮細胞では、細胞増殖因子によって誘導される細胞増殖が亢進することから、GD3合成酵素によって合成される糖鎖構造が、細胞の増殖・分化に重要な役割を演じていることが明らかになった。以上の結果から、糖鎖シグナルは、歯及び口腔硬組織形成過程において、必須のメカニズムであり、今まで未知の領域であった分野の開拓に貢献できたものと考えられる。
蛋白質凝集体モデル結晶の水和構造とゆらぎ―理論と実験のコラボレーション

アミロイド線維に代表される蛋白質凝集体は,アルツハイマー病をはじめとする種々の疾患の原因となる。これまでの実験により,凝集体は生体中で対らせん状線維(Paired Helical Filaments, PHF)と呼ばれる構造を形成しており,凝集体形成に特に重要な役割を果たす残基の配列(部分鎖)が存在することが分かっている。Eisenbergらのグループは,凝集体形成に最も重要な働きをすると考えられる部分鎖ポリペプチドの単結晶30数種類について構造を決定しており,いくつかの特徴的な構造を見出している。本研究では,蛋白質凝集体を一次元あるいは二次元に広がった"結晶"としてモデル化し,凝集体表面の水和構造とゆらぎを分子動力学(MD)シミュレーションにより解明し,凝集体形成のメカニズムや生理活性物質との相互作用との関連性を明らかにする。本年度は,アルツハイマー病の原因となるタウ蛋白質のアミノ酸配列のうち,PHF形成に最も寄与するとされる6残基のみからなる部分ペプチド(VAL-GLN-ILE-VAL-TYR-LYS,以降VQIVYKと表記)を対象として,凝集体のモデルとなる各種結晶構造を構築し,その水和構造をMDシミュレーションにより解析した。水素結合数や水の配向緩和時間などを計算し,凝集体が水和構造や水のダイナミックスに及ぼす影響について考察した。PHFによる水分子の自由度の制限が緩和時間およびその分布の増大を招き,細胞内の生化学反応に影響を及ぼしている可能性が示唆された。凝集体形成のメカニズムや生理活性物質との相互作用を解明するためには,分子理論に基づいた物理化学的な観点からの研究が欠かせない。本研究では,蛋白質凝集体を一次元あるいは二次元に広がった"結晶"としてモデル化し,凝集体表面の水和構造とゆらぎを分子動力学(MD)シミュレーションにより解明する。折から,実験化学の立場からも,アミロイド線維をモデル結晶の観点から解析する試みが始まっている。この好機をとらえ,理論と実験のコラボレーションとして本研究を実施する。アルツハイマー病の原因となるタウ蛋白をはじめとする各種蛋白質について,部分鎖結晶モデルを構築し,表面の水和構造とゆらぎを水素結合ネットワークの構造とダイナミックスの観点から詳細に検討する。理論と実験の立場を超えた共通認識のもとに,凝集体表面の水和構造とゆらぎの一般的概念を確立する。本年度は,アルツハイマー病の原因となるタウ蛋白質の部分鎖モデル結晶を,研究の対象とした。部分鎖モデル結晶と水との界面モデルについて,分子シミュレーションを行い,結晶表面の水和構造とゆらぎを水素結合ネットワークの観点から解析した。水素結合数分布,水素結合相関関数,水分子の配向緩和時間などを精度良く計算し,蛋白質凝集体の水和現象をエントロピーなどの要素に分けて解析した。また,分担者により分子生理学的実験を並行して進め,シミュレーションと実験の両面から,モデル結晶の水和構造とダイナミックスに関して考察を進めた。種々の結晶モデルについて検討したところ, 2枚の結晶に挟まれた領域で,水分子の運動性が大きく抑制されていることが明らかになった。
マウス生体内における肝臓細胞からインスリン産生細胞への転換法の確立

本研究では糖尿病に対するβ細胞補充療法確立のため、in vivoにおいて肝細胞をインスリン産生細胞へ直接分化誘導するために導入すべきβ細胞関連転写因子の検討を目的とした。肝細胞をインスリン産生細胞へ転換することが報告されているPdx-1,NeuroD,MafAの3遺伝子を、均一かつ効率的に肝細胞へ導入するため、これら3遺伝子をコードするポリシストロニックアデノウイルスベクター(Ad-PDA)を作製した。昨年度、このAd-PDAを導入したマウス肝細胞を用いてin silico解析を行い、新たに加える因子として転写因子Xを同定した。今年度、転写因子Xのインスリン産生の増強効果を確認するため、転写因子Xのアデノウイルスベクター(Ad-X)を作製し、Ad-PDAと組み合わせてマウスに導入して解析を行なった。その結果、Ins1-Lucマウスを用いたインスリンの転写活性の誘導で、明らかな増強効果が認められた。今後グルコース応答性が確認できれば、β細胞として使用できる可能性に大きく近づくと期待される。また、Ad-PDAにより3遺伝子の肝細胞への導入効率は上がったが、インスリン産生細胞への転換は不完全であった。この要因のひとつとして、アデノウイルスによる遺伝子導入が一過性であることが考えられた。そこで3遺伝子を肝細胞で持続的に発現させた際のインスリン産生細胞の転換について解析するため、Creにより誘導的にPdx-1,NeuroD,MafA,tdDsRedを生体内組織で発現できるノックインマウスの作製を行った。2つのTgマウスラインを樹立し、それぞれ全身でCreを発現するマウスと交配することで3因子を活性化させたが、インスリンタンパク質の発現は確認できなかった。それぞれのマウスラインでは、肝臓での発現は弱かったため、肝臓での発現を増強するため、アルブミンプロモーターの利用を検討したい。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、糖尿病に対するβ細胞補充療法の確立のため、in vivoにおいて肝細胞をインスリン産生細胞へ直接分化誘導するために導入すべきβ細胞関連転写因子の検討を目的とした。まず、肝細胞をインスリン産生細胞へ転換することが報告されているPdx1, Neurod, Mafaの3遺伝子を効率的かつ均一に肝細胞に導入させ、肝細胞をインスリン産生細胞への転換させる効率を上げる手法確立のため、これら3遺伝子をコードするポリシストロニックアデノウイルスベクター(Ad-PDA)を作製した。Ad-PDAを野生型マウスに導入し、肝臓を免疫染色法で観察したところ、肝細胞が高い割合でインスリンを発現しており、さらにそれらの細胞では導入した遺伝子由来のタンパク質も共発現していた。また、qRT-PCRにより肝臓の遺伝子発現を解析すると、導入されたPdx1、NeurodおよびMafaに加え、β細胞特異的遺伝子であるSur1やKir6.2が発現しており、これらの発現レベルは3種類の組換え体アデノウイルスを導入したマウスよりも有意に高かった。さらにAd-PDAを導入したマウス生体内におけるインスリンプロモーターの活性を観察したところ、肝臓において、3種類の組換え体アデノウイルスを個々に導入したマウスよりも高いインスリンプロモーター活性が観察された。以上より、Ad-PDAによって遺伝子の導入効率および肝細胞の転換効率が上がったことが示唆された。しかし、Ad-PDAによって誘導されたインスリン産生細胞がグルコースに応答してインスリンを分泌するか、in situ liver perfusionによって検討したところ、グルコース応答性を持たないことがわかった。これにより、Pdx1、NeurodおよびMafaの3遺伝子だけでは肝細胞をインスリン産生細胞へ転換するには不十分であるということが明らかとなった。本研究では糖尿病に対するβ細胞補充療法の確立のため、in vivoにおいて肝細胞をインスリン産生細胞へ直接分化誘導するために導入すべきβ細胞関連転写因子の検討を目的とした。昨年度、肝細胞をインスリン産生細胞へと転換することが報告されているPdx1, Neurod, Mafaの3遺伝子を効率的かつ均一に肝細胞に導入させ、肝細胞をインスリン産生細胞へと転換させる効率をあげるため、3遺伝子をコードするポリスシトロニックアデノウイルスベクター(Ad-PDA)を作製した。しかし、Ad-PDAのみでは肝細胞をインスリン産生細胞へ転換させるには不十分であることが示唆された。そこで今年度、肝細胞特異的遺伝子の発現を抑制することで、遺伝子導入によって転換されたインスリン産生細胞が肝細胞へ復元するのが阻害され、インスリン産生細胞への転換が促進されるとの仮説を立てた。そこで先行研究により候補と考えられた転写因子、HNF4α、CEBPβ遺伝子の発現抑制アデノウイルスベクターを作製し、Ad-PDAと組み合わせてマウスに導入したが、インスリン産生細胞転換効率に変化はなかった。次に、Ad-PDAだけではインスリン産生細胞転換が不十分となる可能性があるため、Ad-PDAに新たな因子を追加する検討を行うこととした。まず、新たな因子の探索のため、Ad-PDAを導入した肝細胞を用いてマイクロアレイ解析を行った。結果、転写因子Xが同定された。そこで3遺伝子を肝細胞で持続的に発現させた際のインスリン産生細胞の転換について解析するため、アデノウイルス特異的Pdx-1,NeuroD,MafAノックインマウスの作製を行った。