hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家計行動の多様化による公的負担の世代間及び世代内格差への影響

近年、社会大きな関心事となっている出生率の低下の要因は女性の高学歴化、賃金率の上昇等によってもたらされた晩婚・非婚化である。また、出生率の低下は単に1家計当たりの子供数が低下したわけではなく、子供のいない家計が増えたり、共稼ぎの家計が増加したりという家計の属性の多様化に起因している。そこで本研究では、このことが公的負担に与える影響に焦点を当て、多様な属性を持つ家計の存在を前提としたとき、世代間負担及び世代内負担の差にどのような変化が生じるかを分析する。これにより、これからの社会保障制度や税制のあり方について考察する。属性の異なる複数の家計が存在すると仮定し、税金、社会保険料の制度が家計の属性にも影響を与えるものとして、オーバーラッピング・ジェネレーション(OG)モデルを用い、公的負担に関する分析を行った。そして、片稼ぎで子供のいる家計を前提としている社会保障制度や税制、特に配偶者控除(あるいは配偶者特別控除)、国民年金の3号被保険者問題を取り上げ、家計の属性の多様化によって、世代間負担の差及び世代内(属性の異なる家計間)負担の差が大きくなることを示した。さらにシミュレーションを行い、世代間及び世代内負担の差を縮小するためには、現行のように配偶者に所得控除や年金保険料の免除を認めるのではなく、子供の保育者に認めることが一つの有効な方策であることを示した。近年、家計の直面する様々な選択とそれに関連する構造変化の中でも、急速な出生率の低下と高齢化の展開は、マクロ的にも賦課方式の年金制度の行き詰まりや若年層の租税負担の上昇、さらには貯蓄率の減少や労働力不足による経済成長の抑制などをもたらす危惧がある。そこで、数々の問題をもたらす出生率低下の要因について、女性の結婚行動の変化と出生率の関係に着目して、検証を行うこととした。Beckerに代表される新古典派の理論によれば、家計の持つ子供の人数は、所得を所与とし、母親の機会費用を含めた育児費用と子供から得られる効用を比較して決定される。そこでは、女性の高学歴化や賃金の上昇は、母親の機会費用を増加をもたらすため、家計の最適な子供数は減少することが指摘されている。他方、現在の出生率の低下は女性の晩婚化が原因であり、単に出産時期の遅れをもたらすものであって、一人の女性が生涯において産む子供の数(完結出生児数)には影響しないわけであるから、何れ出生率は上昇するという議論もなされている。その何れが成立しているかを平均初婚年齢、未婚率、就業や育児支援政策に関する変数等を説明変数に加えた出生率関数を推定することによって検証した。その結果、結婚しない女性(晩婚、非婚の女性)が単に出産時期を遅らせているわけではない、言い換えれば生涯において生む子供数が少ないことが、出生率の低下の要因であることを示した。
在宅療養の質向上を目指した高齢がん患者のための経口抗がん剤導入プログラムの評価

【当該年度の目標・方法】本研究では高齢がん患者に対する経口抗がん剤指導ツールの運用と評価を目指しているが、当該年度では実態調査(副作用・アドヒアランスへの対処)を踏まえ具体的コンテンツの開発を目標とした。これは、高齢がん患者が現在の自分の対処行動の状況に対する気づきを促し、マネジメント能力を高めることを目指している。当該年度では、文献検討や既存の冊子の内容、専門家の意見を踏まえて教育支援に関するコンテンツ開発を進めた。【結果】「経口抗がん剤を導入する高齢がん患者が治療とうまくつきあうための教育支援ツール」は副作用症状、アドヒアランスの向上、生活上の困難感、治療継続の悩み、療養生活上の対処の内容から成る。内容妥当性の結果では、表現の不備が指摘されたが概ね適切性が高いと評価された。高齢者に見やすくわかりやすいかどうかは、さらに情報リテラシー等の専門家との連携を図っていく必要がある。これらを踏まえ、高齢がん患者に対する本ツールの表面妥当性の調査を行っているところである。【考察・今後の課題】自己管理能力の向上に向けたこれらのコンテンツはほぼ順調に開発が進められ、次年度は、コンテンツの完成が課題である。更に、これらのツールの運用と評価に向けて、外来支援の現状を把握し実現可能性の高い実施方法を探索することも必要である。外来看護のあり方を検討し、本ツールの運用が継続的に質を担保するための方策に関して検討を重ねる予定である。経口抗がん剤指導用ツールの開発やケアコンテンツ開発は順調に進んでいる。次年度は、ケアコンテンツの完成と運用に向けた取り組みを完了できる見込みができており、研究の目標として設定した内容に、ほぼ到達できると予測されるため。指導コンテンツの完成に向けて、専門的意識や先端研究の把握が不十分と考えられ、高齢者看護、在宅看護、情報リテラシーの専門家との連携を深めるようにした。教育支援ツールは外来診療の中で展開する予定であるが、現在の医療事情として外来診療や外来看護の充実化をはかることは、人的資源、物的資源の確保などの問題、経済的問題がある。しかし、在宅療養の推進を考えれば、外来看護の発展は社会的要望の高い課題である。今後は対象施設において、外来支援事業の一環として本研究を実施できないかを検討していく予定である。前倒しし多額の残額で運用可能であると考えられるため、予定通りの計画を実施していく。昨年度の予定より進捗が早かったため、運用に必要な金額を前倒しした。
マルチオミクス統合解析アノテーションに基づく分子標的強化門脈塞栓術と肝肥大効率化

マウスの全肝容積の約60%を占める左内側及び外側葉へ流入する門脈血行路を結紮遮断するモデルを作製、Nrf2^<-/->、Keap1^<f/f-Alb>、Wild typeマウスで行い非結紮葉の肥大の程度、mRNA発現、タンパク質発現につき比較検討した。Nrf2^<-/->、Wild typeマウスに対して解析を行ったところ、PBL施行群の非結紮葉においてWild typeではNrf2^<-/->に比べ有意な肥大を認めた。またNrf2の核での蓄積は認められなかったが、PBL施行後のWild typeにおいて、非結紮葉では結紮葉に比べNrf2の標的遺伝子Nqo1のmRNA、タンパク質量ともに有意に増加し、術後7病日では門脈結紮に対する反応が終息しつつある事が示唆された。肝切除の適応拡大と術後肝不全の予防のための術前処置として定着してきた門脈側戦術における切除予定肝萎縮と温存予定肝の代償性肥大という現象に着目し、動物モデルの確立と経時的なサンプル採取・tyouseiを今年度の目標とした。実診療で最も施行される肝右葉内の門脈塞栓を想定し、雄性SDラットの全肝容積の70%を占める左内側葉と外側葉へ流入する門脈枝を結紮するモデルを作成、コントロールとして単開腹モデルも同時に作成し、その手技を安定化させた。小動物用CT装置にて経時的に撮影し、そのBoxel情報から得たDICOMデータをワークステーション上で肝容積計算を行った。また、各撮影時の血液生化学データを測定し、同時に塞栓肝と非塞栓肝の組織を採取し、未固定凍結組織、OCTコンパウンド包埋組織、ホルマリン固定パラフィン包埋組織として収集した。これらの組織から、レーザーマイクロダイゼクションにて肝細胞を特異的に採取してtotal RNAを抽出して間接標識法によるマイクロアレイを行った。また、タンパク質ペプチド消化物をLC-MSを用いたショットガン解析による網羅的プロテオーム解析を施行中である。また、外注によるメタボローム解析も同時並行中であり、来年度はこれらの体系的・網羅的な各データの抽出・統合を行い、生物学的結果を俯瞰した分子機構を探る予定である。肝胆膵外科における拡大肝葉切除の際、最も重篤な合併症である肝不全を予防する術前処置としての門脈塞栓術(Portal vein Embolization; PE)導入以降、術後肝不全は減少したが、その有効性が明瞭なエビデンスとして確立しているわけではない。PE前後の肝再生等の形態的検討・機能的検討の報告はあるが、その詳細な分子機構は未だ明らかではなく、当初各種オミクス解析により関連する分子機構を明らかにしようとした。しかしながら、近年、転写因子Nrf2の肝胆道系における増殖、再生、また各種の癌におけるその発癌、進行への関与が示唆されてきた。またNrf2は分化、増殖シグナルであるNotch1を介して肝切除後の肝再生に寄与している事が報告され(Wakabayashi et al. 2010)、細胞増殖におけるNrf2の役割が明らかになりつつある。そこでKeap1-Nrf2システムがPE後の肝増殖に関与するのではないかと考えた。マウスの全肝容積の約60%を占める左内側葉および左外側葉へ流入する門脈血行路を結紮遮断するモデル(Portal vein Branch Ligation; PBL)を作製し、コントロールとして単開腹モデル(sham)も同時に作製、上記手技をNrf2^<-/->マウス(Nrf2ノックアウトマウス)、Keap1^<f/f->Albマウス(肝特異的Keap1ノックアウトマウス)、Wild typeマウスで行い非結紮葉の肥大の程度、mRNA発現、タンパク質発現につき比較検討した。個体数を確保できたNrf2^<-/->マウス、Wild typeマウスに対して解析を行ったところ、PBL施行群の非結紮葉においてWildtypeマウスではNrf2^<-/->マウスに比べ有意な肥大を認めた。またNrf2の核での蓄積は認められなかったが、PBL施行後のWild typeマウスにおいて、非結紮葉では結紮葉に比べNrf2の標的遺伝子Nqo1のmRNAの発現、タンパク質量ともに有意に増加し、術後7病日の段階では門脈結紮に対する反応が終息しつつある事が示唆された。
一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いた呼吸器疾患に伴う肺高血圧症の病態解明

本研究では、合計5種類のマウス(野生型、n,i,eNOSノックアウトマウス、NOS完全欠損マウス: n/i/eNOSノックアウトマウス)を用いて、低酸素性肺高血圧における一酸化窒素(NO)や一酸化窒素合成酵素(NOS)の役割の解明を試みた。NOS完全欠損マウスでは、WTマウスやシングルノックアウトと比較して優位に肺高血圧が増悪していた。さらに、NO donorによるNO補充療法などを行うことにより、それが改善することが明らかとなった。さらに骨髄由来のNOS系に注目し、骨髄移植実験を行ったところ、骨髄NOS系のみの欠損でも肺高血圧は有意に増悪していた。呼吸器疾患に伴う肺高血圧症(低酸素性肺高血圧症)は、未だ病態は不明な点が多く確立した治療法もない。しかし一方で肺高血圧症においては一酸化窒素(nitric oxide; NO)、NO合成酵素(NO synthase; NOS)の役割に関して不明な点は多いが、重要な役割を果たしていることが示唆されている。本研究では、低酸素性肺高血圧におけるNOやNOSの役割の解明のため、合計5種類のマウス(野生型、n,i,eNOSシングルノックアウトマウス、NOS完全欠損マウス: n/i/eNOSトリプルノックアウトマウス)を用いて、低酸素性肺高血圧症の詳細な病態機序を解明することを目的とした実験を行っている。これまでに上記5種類のマウスを用いて低酸素性肺高血圧モデルを作成し、NOおよびNOSの役割についての比較検討を行った。結果は、NOS完全欠損マウスでは、野生型マウスや3種類のシングルノックアウトマウスと比較して肺高血圧の病態は有意に増悪しており、内因性NOS系が低酸素性肺高血圧に保護的に作用していることが明らかとなった。今後はさらなるNOの詳細な機序解明を骨髄由来の細胞系などに注目し継続していく予定である。本研究では、低酸素性肺高血圧における一酸化窒素(NO)や一酸化窒素合成酵素(NOS)の役割の解明のため、合計5種類のマウス(野生型、n,i,eNOSシングルノックアウトマウス、NOS完全欠損マウス: n/i/eNOSノックアウトマウス)を用いて、低酸素性肺高血圧におけるNOおよびNOSの役割を明らかにすることを目的としている。これまでに上記5種類のマウスを用いて低酸素性肺高血圧モデルを作成し、NOおよびNOSの役割についての検討を行った。結果として、NOS完全欠損マウス(triple NOSノックアウトマウス)では、WTマウスやシングルノックアウトと比較して優位に肺高血圧が増悪していた。今後、さらに骨髄NOS系における肺高血圧の機序に注目し研究を行う予定である。上述したように、これまでに肺高血圧におけるNOおよび各種NOSの役割についての検討を行い、病理学的評価及び右心カテーテルを用いた肺高血圧の評価についてはほぼ終了した。今後はその詳細な機序について今後検討を行う予定である。背景:低酸素性肺高血圧症は慢性肺疾患の進行期に合併し,しばしば予後不良とされることから詳細な病態解明が求められている。その中で一酸化窒素(NO)は肺高血圧症において重要な役割を果たすとされるが,生体内におけるNOの詳細な役割については十分に解明されていない。方法及び結果:8週齢の野生型マウス(WT),3種のNOSシングルノックアウトマウス, NOS完全欠損マウスをそれぞれ低酸素環境下で3週間飼育後に比較し,その機序について検討した。(i)低酸素暴露を行ったところ5種類全てのマウスで肺高血圧を示唆する所見を認め,NOS完全欠損マウスははるかに重度であった。(ii)この機序を解明する目的で血中の骨髄由来平滑筋前駆細胞数を調べたところ,NOS完全欠損マウスではWTマウスと比較し増加していた。さらに緑色蛍光蛋白質(GFP)を過剰発現させたマウス由来の骨髄細胞をNOS完全欠損マウスに移植したところ低酸素暴露後の肺血管リモデリング部位にGFP蛍光が多く認められ,骨髄由来細胞が肺血管リモデリングに関与していることが示唆された。(iii)次にNOS完全欠損マウスとWTマウスを用いて骨髄置換実験を行い骨髄NOS系の役割を検討した。WTマウス由来の骨髄細胞を移植したNOS完全欠損マウスはNOS完全欠損マウス由来の骨髄細胞を移植したマウスと比較し肺高血圧は軽減し,逆にNOS完全欠損マウス由来の骨髄細胞を移植したWTマウスではWTマウス由来の骨髄細胞を移植したマウスと比較して増悪していた。結論:NO/NOSは低酸素性肺高血圧症の成因に中心的役割を果たしていることが示唆され,特に骨髄由来平滑筋前駆細胞や骨髄NOS系はその成因に関与していることが考えられた。

上述したように、これまでに肺高血圧におけるNOおよび各種NOSの役割についての検討を行い、病理学的評価及び右心カテーテルを用いた肺高血圧の評価についてはほぼ終了した。今後はその詳細な機序について検討を行う予定である。次年度の研究費は昨年同様に、マウスの飼育費用、各種免疫染色用の抗体や試薬、および、ELISA、Taqman probeなどの血清や組織におけるサイトカインなどの定量的評価を行う上での試薬、その他消耗品などの購入に使用予定である。肺高血圧次年度の研究費は昨年同様に、マウスの飼育費用、低酸素曝露装置維持費用、各種免疫染色用の抗体や試薬、および、ELISA、Taqman probeなどの血清や組織におけるサイトカインなどの定量的評価を行う上での試薬、その他消耗品などの購入に使用予定である。実験が予想以上に順調に進み、試薬の購入が抑えられたため。実験が予想以上に順調に進んだため。生じた次年度使用額については、当初計画よりも踏み込んだ機序解明を行うために実験費用として使用する予定である。生じた次年度使用額については、当初の計画より踏み込んだ機序解明を行うための実験費用として使用する予定である。
急性無石胆嚢炎の発生機序の研究ー特に微小循環障害とフリ-ラジカル並びにプロスタグランディの関与についてー

既にわれわれは雑種成犬を用いて,中肝動脈および上腸間膜静脈を虚血ー再潅流させることにより急性無石胆嚢炎を作成することに成功しており,このモデルを用いて,虚血および再潅流時間をそれぞれ一定として,虚血ならびに再潅流による胆嚢粘膜障害の程度を経時的に肉眼的および組織学的に検索するとともに,生化学的に検索した.これによると45分虚血以上かつ90分以上再潅流を行った群では胆嚢炎は全例に発生し,肉眼的炎症面積は虚血時間の延長により増大し,組織学的な炎症の深度は再潅流時間の延長により進行した.また胆嚢粘膜中の生化学では,再潅流時間を90分と一定にすると,虚血時間の延長に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量は漸増し,虚血時間を45分と一定にすると,再潅流時間の延長(24時間まで)に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量,SODが漸増した.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CATを持続注入することにより,炎症面積は対照群に比し45%軽減され,胆嚢粘膜中のPLA_2活性,過酸化脂質量も軽減した.またプロスタグランディンの役割をみると,胆嚢内に漏出してくるPGE_2,PGF_2α,6KF,TXB_2は虚血ー再潅流することにより上昇し,特にPGE_2は胆嚢の炎症面積と正の相関が認められた.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CAT+キナクリンを持続注入すると,炎症面積は対照群に比し50%軽減し,胆嚢内に漏出してくる6KF,TXB_2変動は認められなかったが,PGE_2とPGF_2αは著明に低下した.また本実験の派生結果として,1時間虚血後再潅流を行うと,コレステロ-ジスが高率に発生し,虚血ー再潅流を繰り返すことにより,その発生頻度はさらに高率となった.生化学的にみても虚血ー再潅流により,胆嚢内胆汁のpHは低下し,胆汁酸やレシチン濃度が低下し,コレステロ-ル飽和指数は上昇していた.既にわれわれは雑種成犬を用いて,中肝動脈および上腸間膜静脈を虚血ー再潅流させることにより急性無石胆嚢炎を作成することに成功しており,このモデルを用いて,虚血および再潅流時間をそれぞれ一定として,虚血ならびに再潅流による胆嚢粘膜障害の程度を経時的に肉眼的および組織学的に検索するとともに,生化学的に検索した.これによると45分虚血以上かつ90分以上再潅流を行った群では胆嚢炎は全例に発生し,肉眼的炎症面積は虚血時間の延長により増大し,組織学的な炎症の深度は再潅流時間の延長により進行した.また胆嚢粘膜中の生化学では,再潅流時間を90分と一定にすると,虚血時間の延長に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量は漸増し,虚血時間を45分と一定にすると,再潅流時間の延長(24時間まで)に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量,SODが漸増した.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CATを持続注入することにより,炎症面積は対照群に比し45%軽減され,胆嚢粘膜中のPLA_2活性,過酸化脂質量も軽減した.またプロスタグランディンの役割をみると,胆嚢内に漏出してくるPGE_2,PGF_2α,6KF,TXB_2は虚血ー再潅流することにより上昇し,特にPGE_2は胆嚢の炎症面積と正の相関が認められた.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CAT+キナクリンを持続注入すると,炎症面積は対照群に比し50%軽減し,胆嚢内に漏出してくる6KF,TXB_2変動は認められなかったが,PGE_2とPGF_2αは著明に低下した.また本実験の派生結果として,1時間虚血後再潅流を行うと,コレステロ-ジスが高率に発生し,虚血ー再潅流を繰り返すことにより,その発生頻度はさらに高率となった.生化学的にみても虚血ー再潅流により,胆嚢内胆汁のpHは低下し,胆汁酸やレシチン濃度が低下し,コレステロ-ル飽和指数は上昇していた.

既に,われわれは雑種成犬を用いて,中肝動脈及び上腸間膜静脈を45分以上虚血,90分再還流させることにより,急性無石胆嚢炎を作成することに成功しているので,本年度は虚血及び再還流時間のいずれか一方を一定とし,他方を変化させて,虚血並びに再還流による胆嚢粘膜障害の程度を経時的に肉眼的及び組織学的に検索するとともに,生化学的にも検索した.即ち,実験群として,I群:中肝動脈(MA)及び上腸間膜静脈(SMV)遮断のみ,II群:MAとSMVの遮断時間は一定として,その後の再還流時間を変化させる,III群:MAとSMVの遮断時間を変化させ,再還流時間を一定とする.これら3実験群の実験終了後,直ちに犠牲剖検して,胆嚢の肉眼的,組織学的検索を行うとともに,各群における胆嚢粘膜中のPLA_2活性や過酸化脂質量及びSOD活性を測定した.虚血のみでは胆嚢炎の発生はなく,虚血時間の延長に伴ってPLA_2活性や過酸化脂質量は増加したが,SOD活性は24時間以降は低下した.虚血ー再還流では,再還流時間を90分とし虚血時間を変化させると,虚血時間が延長するに従って,炎症面積は増大し,PLA_2活性や過酸化脂質量は増加したが,SOD活性は虚血時間30分で最も高値を示した後,45分では一旦低下し,さらに虚血時間を延長すると再び増加した.虚血時間を45分とし,再還流時間を変化させると,炎症の深部への波及が増強し,PLA_2活性や過酸化脂質量およびSOD活性はいずれも増加傾向を示した.以上,本年度の研究では雑種成犬に45分虚血ー90分再還流を行うことにより,最も効率的に急性無石胆嚢炎が作成されることを明らかにした.また,虚血ー再還流により惹起される微小循環障害の病態の上で,膜結合性PLA_2やfree radicalsあるいは過酸化脂質の重要性が指摘された.従って,次年度には45分虚血ー90分再還流の基本モデルを用いて,種々のradical scavengerやPLA_2阻害剤の投与を行って,胆嚢粘膜障害に対する抑制効果を検索する予定である.既にわれわれは雑種成犬を用いて,中肝動脈および上腸間膜静脈を虚血ー再潅流させることにより急性無石胆嚢炎を作成することに成功しており,このモデルを用いて,虚血および再潅流時間をそれぞれ一定として,虚血ならびに再潅流による胆嚢粘膜障害の程度を経時的に肉眼的および組織学的に検索するとともに,生化学的に検索した.これによると45分虚血以上かつ90分以上再潅流を行った群では胆嚢炎は全例に発生し,肉眼的炎症面積は虚血時間の延長により増大し,組織学的な炎症の深度は再潅流時間の延長により進行した.また胆嚢粘膜中の生化学では,再潅流時間を90分と一定にすると,虚血時間の延長に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量は漸増し,虚血時間を45分と一定にすると,再潅流時間の延長(24時間まで)に伴いPLA_2活性,過酸化脂質量,SODが漸増した.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CATを持続注入することにより,炎症面積は対照群に比し45%軽減され,胆嚢粘膜中のPLA_2活性,過酸化脂質量も軽減した.またプロスタグランディンの役割をみると,胆嚢内に漏出してくるPGE_2,PGF_2α,6KF,TXB_2は虚血ー再潅流することにより上昇し,特にPGE_2は胆嚢の炎症面積と正の相関が認められた.さらに虚血45分ー再潅流90分の実験モデルを用いて再潅流時間中に,胆嚢動脈内にSOD+CAT+キナクリンを持続注入すると,炎症面積は対照群に比し50%軽減し,胆嚢内に漏出してくる6KF,TXB_2に変動は認められなかったが,PGE_2とPGF_2αは著明に低下した.また本実験の派生結果として,1時間虚血後再潅流を行うと,コレステロ-ジスが高率に発生し,虚血ー再潅流を繰り返すことにより,その発生頻度はさらに高率となった.生化学的にみても虚血ー再潅流により,胆嚢内胆汁のpHは低下し,胆汁酸やレシチン濃度が低下し,コレステロ-ル飽和指数は上昇していた.
造血器腫瘍に対するHSV-1ウイルス療法の開発

造血器腫瘍に対するHSV-1ウイルス療法の臨床応用を目指し、造血器腫瘍細胞株を対象に、G47Δと同様の遺伝子改変を施したHSV-1であるT-01の感染と殺細胞効果の有無を調べたところ、14種類の造血器腫瘍細胞株中10細胞株で直接的な殺細胞効果を示した。感受性細胞と抵抗性細胞の違いを明らかにするために、細胞株上のHSV-1レセプターの発現レベル、GFP導入T-01のエントリー量、殺細胞効果の三者の相関を調べたところ、nectin-1の発現レベル、T-01のエントリー量、殺細胞効果の三者に定量的な正の相関関係がみられた。これに一致して、nectin-1のノックダウン細胞においてT-01のエントリー量が減少し、nectin-1陰性細胞へのnectin-1強制発現によって殺細胞効果が付与された。一方、HSV-1レセプターHVEMの発現レベルとT-01のエントリー量に相関はみられなかった。また、cGAS-STING経路、PKR-eIF2 alpha経路の発現やIFN-beta産生能と殺細胞効果にも相関はみられなかった。Nectin-1を発現しないヒトバーキットリンパ腫細胞株Ramosにヒストン脱アセチル化酵素阻害薬panobinostatを加えるとnectin-1の発現が誘導された。以上より、造血器腫瘍におけるHSV-1の殺細胞効果は、nectin-1を介したエントリーに強く規定され、nectin-1の発現が有効性のバイオマーカーになると考えられた。一方、腫瘍細胞自体の抗ウイルス免疫機構は殺細胞効果に大きな影響を与えないと考えられた。さらに、エピジェネティックな遺伝子発現制御によりnectin-1の発現を誘導し、HSV-1ウイルス療法の適応症例を拡大できる可能性が示唆された。がん治療用ウイルス(oncolytic virus: OV)療法は、新たな癌治療法として活発に開発が進められている。OV療法では、腫瘍細胞に対する直接的な殺細胞効果に加え、OVが腫瘍細胞にimmunogenic cell death (ICD)を誘導することにより、免疫学的な抗腫瘍効果が発揮される。遺伝子組換えherpes simplex virus (HSV)-1であるG47Δによるウイルス療法が造血器腫瘍に適用できるかどうかを明らかにするために、造血器腫瘍の細胞株と臨床検体を対象に、in vitroにおけるG47Δ感染と細胞死の有無を検討した。その結果、細胞株では様々な造血器腫瘍由来の11細胞株中6細胞株で、臨床検体では10例中6例で、G47Δの感染かつ細胞死を認め、G47Δによる直接的な殺細胞効果が示された。HSV-1のエントリーレセプターnectin-1, HVEM, non-muscle myosinの発現と感染との相関を検討したところ、nectin-1の発現と感染の有無に相関がみられた。さらにG47Δの感染が確認された細胞株を用いて、ICDのマーカーである培養上清中のHMGB-1及びATPの放出量を測定したところ、G47Δが殺細胞効果を示す細胞株において,感染後HMGB-1及びATPの放出を認めた。以上より、G47Δは造血器腫瘍に対するウイルス療法の手段として有用である可能性が示された。また、感染にはnectin-1の発現が重要であることが示唆された。今後、ICDを来した腫瘍細胞が樹状細胞に及ぼす影響と抗原のクロスプレゼンテーション、さらにマウスモデルによるin vivoでの抗腫瘍効果の検討を行い、造血器腫瘍に対するG47Δの臨床応用を目指す。平成27年4月に研究代表者が京都大学から香川大学に異動し、27年度は大学院生が帯同しなかったため、当初の計画より進捗が若干遅れている。G47Δが造血器腫瘍に応用可能であることを示す現象はデータとして得られたが、当初予定していたG47Δが免疫細胞を活性化する際の分子メカニズム、G47Δで死滅した腫瘍細胞由来の抗原が樹状細胞によって提示されるかどうかの解析を手がけるに至っていない。造血器腫瘍に対するHSV-1ウイルス療法の臨床応用を目指し、造血器腫瘍細胞株を対象に、G47Δと同様の遺伝子改変を施したHSV-1であるT-01の感染と殺細胞効果の有無を調べた。14種類の造血器腫瘍細胞株中、骨髄系、リンパ系を含む10細胞株でT-01の感染かつ細胞死を認め、直接的な殺細胞効果が示された。感受性細胞と抵抗性細胞の違いを検討したところ、HSV-1のエントリーレセプターnectin-1, HVEM, PILR-α, non-muscle myosinのうち、T-01に感受性のあるすべての細胞株でnectin-1の発現がみられた。一方、DNAウイルスゲノムを認識しI型インターフェロン産生を誘導する細胞質内核酸センサーであるcGASとSTINGの発現は、殺細胞効果と相関しなかった。T-01が感染し死滅した腫瘍細胞は、共存する樹状細胞の活性化・成熟を誘導した。T-01がin vitroでさまざまな系列の造血器腫瘍細胞に対し殺細胞効果を示したことから、G47Δが広汎な造血器腫瘍に応用できる可能性が示された。また、HSV-1レセプターとして働くnectin-1の発現が有効性のバイオマーカーになり得ることが示唆された。このことは、将来的にHSV-1ウイルス療法の有効例を絞る上で臨床的に有用である可能性がある。

平成28年4月に京都大学から香川大学に大学院生が合流したので、当初予定していたT-01による樹状細胞の活性化を示す結果が得られるとともに、T-01に対する腫瘍細胞の感受性を規定する因子の同定が進み、全体として当初の予定に近づきつつある。造血器腫瘍に対するHSV-1ウイルス療法の臨床応用を目指し、造血器腫瘍細胞株を対象に、G47Δと同様の遺伝子改変を施したHSV-1であるT-01の感染と殺細胞効果の有無を調べたところ、14種類の造血器腫瘍細胞株中10細胞株で直接的な殺細胞効果を示し、T-01が感染し死滅した腫瘍細胞が、共存する樹状細胞の活性化・成熟を誘導した。さらに、感受性細胞と抵抗性細胞の違いを明らかにするために、細胞株上のHSV-1レセプターの発現レベル、GFP導入HSV-1のエントリー量、殺細胞効果の三者の定量的相関、およびHSV-1レセプターnectin-1のノックダウン細胞におけるHSV-1のエントリー量を調べた。感染後の複製を左右する因子として、細胞内抗ウイルス分子cGAS-STING経路、PKR-eIF2 alpha経路の発現や、IFN-beta産生能と殺細胞効果の相関を検討した。また、臨床検体を対象にしたT-01の殺細胞効果の有無を調べた。その結果、nectin-1の発現レベル、HSV-1のエントリー量、殺細胞効果の三者に定量的な正の相関関係がみられ、これに一致してnectin-1のノックダウン細胞においてHSV-1のエントリー量が減少した。一方、HSV-1レセプターHVEMの発現レベルとHSV-1のエントリー量に相関はみられなかった。また、cGAS-STING経路、PKR-eIF2 alpha経路の発現やIFN-beta産生能と殺細胞効果にも相関はみられなかった。以上より、造血器腫瘍におけるHSV-1の殺細胞効果は、nectin-1を介したエントリーに強く規定されると考えられ、nectin-1の発現が有効性のバイオマーカーになることが示唆された。一方、腫瘍細胞自体の抗ウイルス免疫機構は殺細胞効果に大きな影響を与えないと考えられた。平成27年4月に研究代表者が京都大学から香川大学に異動し、27年度は大学院生が香川大学に帯同しなかったため、研究の進捗が当初の予定より遅れたが、28年度に合流した大学院生の頑張りによりその後研究が進み、当初の予定の8割方終了している。造血器腫瘍に対するHSV-1ウイルス療法の臨床応用を目指し、造血器腫瘍細胞株を対象に、G47Δと同様の遺伝子改変を施したHSV-1であるT-01の感染と殺細胞効果の有無を調べたところ、14種類の造血器腫瘍細胞株中10細胞株で直接的な殺細胞効果を示した。感受性細胞と抵抗性細胞の違いを明らかにするために、細胞株上のHSV-1レセプターの発現レベル、GFP導入T-01のエントリー量、殺細胞効果の三者の相関を調べたところ、nectin-1の発現レベル、T-01のエントリー量、殺細胞効果の三者に定量的な正の相関関係がみられた。これに一致して、nectin-1のノックダウン細胞においてT-01のエントリー量が減少し、nectin-1陰性細胞へのnectin-1強制発現によって殺細胞効果が付与された。一方、HSV-1レセプターHVEMの発現レベルとT-01のエントリー量に相関はみられなかった。
ラジカル活性種を経由した三員環開裂反応による新規骨格合成法の開発

既に不斉合成に成功している三員環化合物(1)の反応性および潜在的な利用価値を調べるため、三員環上に存在するスルフィド基を一電子酸化剤を用いてラジカルカチオン体とし、この三員環alpha位のラジカルがどのような反応性を示すかについて調べた。まず、硫黄原子の一電子酸化を種々の検討した結果、1aの化合物に対しメタノール中、四価のセリウム金属塩を作用させることにより、三員環の'a'の結合がメタノールの攻撃を伴って位置選択的に開裂し、7員環化合物(2a)が得られることを見い出した。興味深いことに、この反応を無水アセトニトリル中で行うと開環体は全く得られずスルホキシド体(3)のみが得られる。そこで、分子内に水酸基を有する三員環化合物(1b)に対して同様の酸化反応を行うと、分子内での工一テル環形成が優先して起こり、1-オキサスピロ[4.6]ウンデカン体(2b)が生成した。次に、三員環開裂反応を伴った分子内炭素一炭素結合形成反応を試みた。側鎖に求核種として種々のオレフィン体を導入した化合物(4)を合成しそれぞれを酸化反応に付したところ、電子豊富なオレフィン体(4a-b)については閉環反応が進行し目的とするスピロ[4.6]ウンデカン体(5a-b)が生成したが、他のオレフィン体(4c-e)については溶媒であるメタノールが反応し2a類縁体のみを与えた。以上のことより、この三員環開裂反応には電子密度の豊富な求核種の存在が必須であること、続く閉環反応が単なるラジカル機構で進行しているのではないことがわった。
画像表示による乳管腺葉糸が3次元的再構築からみた乳癌乳管内進展に関する研究

乳房温存手術における切除断端癌遺残の主因である乳癌の広範な乳管内進展について病理学的な基礎資料を得るため、乳癌手術材料の厚切り全割標本から乳管内癌進展の特徴について2次元および3次元的に検索した。材料と方法:当科で乳房四分円切除術を施行した単腫瘤性の原発性乳癌20例(乳頭腺管癌8例、充実腺管癌5例、硬癌6例、粘液癌1例)を用いた。切除標本は2mm厚に全割してWellingsらの厚切り標本法に準じ実体顕微鏡下に観察した。2次元的検討では癌分布図から乳管内癌の進展距離および角度を計測した。3次元的検討では画像処理装置により乳管腺葉系の3次元再構築を行った。結果:1.対象20例中16例に主腫瘍から連続する乳管内進展を認めた。2.18例は進展距離が20mm以内で、19例は進展角度が35度以内だった。3.49歳以下の若年齢層が、高年齢層に比して進展範囲の広い傾向があった。4.マンモグラフィーで微細石灰化を認めた例ではこれのない例に比して有意に進展距離が大きかった。5.乳頭腺管癌が他型に比して有意に進展距離、角度とも大きかった。6.主腫瘍巣の乳管内成分の比率は有意に進展距離の大きさを反映した。7.面疱型の乳管内進展巣は非面疱型に比して有意に進展距離が大きかった。8.16例の進展様式は、【.encircled1.】浸潤癌巣から乳頭側に連続する中枢型(11例)、【.encircled2.】末梢、側方に連続する末梢型(3例)、【.encircled3.】広範囲に連続する混合型(2例)に分類され、【.encircled2.】【.encircled3.】は乳頭腺管癌、面疱型の乳管内進展巣に多かった。9.乳管腺葉糸の様々な部位に乳管吻合が存在し、一つの腺葉系を越えた広範な乳管内進展形成に関与していた。考察:本研究により乳管腺葉系間に多数の乳管吻合が確認されたが、こうした乳管吻合は広範な乳管内進展形成における乳腺組織構築上の新たな危険因子と思われた。今後さらに症例を積み重ねて乳癌の乳管内進展の特徴を一層明らかにし、進展の範囲と方向性を意識した過不足ない切除範囲の決定に応用していきたい。
巨大基数を指向しないＰκλ上のイデアル論

Pκλ上のイデアルの構造理論の土台となるP-point, Q-point, selectiveイデアルの概念を定式化し、いくつかの定理を証明した。それらには、κ上のイデアルと同じく成り立つものと、大きく異なるものがある。また、κ上の場合が、λ=κという特殊事情によるものだったことを示唆する事実も得られた。κが超コンパクト基数のとき、Pκλのstationary setはreflectすることが知られていたが、κが強コンパクトでreflectしないstationary setが存在する強制モデルを構成した。研究目的ごとに述べる。[1]強正規イデアルと正規イデアル:κがalmostλineffable(強正規性)でもκがsubtle(正規性)とは限らない。[2]イデアルの構造理論:(1) P-point、Q-point、selectivityの妥当な定義を確定した。(2)弱正規イデアルへの拡張可能性の組み合わせ論的特徴づけを行った。(3) Pκλの濃度より小さい非有界集合の生成するイデアルはboundedイデアルの局所化では得られない。[3]非有界集合の組み合わせ論的性質:(1) ineffable及びcompletely ineffableな集合は、分割の性質をもつ。(2) stationaryな集合の局所反映原理は巨大基数的性質ではないが、同時反映原理は巨大基数的性質である。Pκλ上のイデアルについて、構造理論の核となるP-point、Q-point、selectiveイデアルの概念を定義した。κ上と同じく成り立つのは、(1)正規イデアルはP-pointである。(2)Boundedイデアルはweak P-pointだがnowhere Q-pointである。κ上と異なる事実は(1){X:fによるXの逆像がboundedイデアルに属する}が、BoundedイデアルのfによるPκλの像f[Pκλ]への制限{X:Xとf[Pκλ]の共通部分がIに属する}にならないものが存在する。(2)正規イデアルでselectiveではないものが存在する。また、κ上が特殊な場合であったことが明らかになった事実として、「弱正規イデアルIと{X:fによるXの逆像がIに属する}がイデアルになるfに対しては,補集合がIに属し、その上でf(x)=f(y)ならばsup(x)=sup(y)になっている集合が存在する」がある。Pκλのunbounded setに関しては、「強コンパクト基数κに対し、Pκλのstationaryな部分集合Sで、どんなPκλの元xに対してもSと{y|yはxの部分集合でyの濃度はxとκの共通部分の濃度より小さい}の共通部分はstationaryではない」強制モデルを構成した。これは、κが超コンパクトの場合と異なる事実である。研究課題と関連する巨大基数に関しては、次のような結果を得た:(1) Pκλ上の3個組の分割の性質をalmost ineffabilityで特徴づけた。(2)超強基数やextendible基数などは、超コンパクト基数と異なり、強い閉性をもつ強制法では保存されない。(3)弱コンパクトイデアルなどの、多くの定義可能なイデアルを飽和させる強制法が存在する。研究目的ごとに得られた結果を箇条書きで述べる。[1]強正規イデアルと正規イデアル:(1)Pκλの標準的埋め込みによる像は、κが強到達不能基数のときに限り非有界であり、κがMahlo基数のときに限りstationaryである。(2)最小の強正規イデアルに属さない集合の像は強stationaryで、有界集合の像は有界であるようなPκλの埋め込みは、標準的なものしかない。[2]Pκλ上のイデアルの構造理論:(1)κ上では、有界集合の像は有界であるため、有界イデアルの像は、κの像へ有界イデアルを制限したものである。PκλからPκλへの関数fで、有界イデアルの像が、Pκλの像への有界イデアルの制限にならないものを構成した。(2) fによる非有界集合Aの逆像Bが有界イデアルの双対フィルターに属し、Bの任意の部分集合Xに対し、Xが有界なこととXの像が有界なことが同値ならば、fによる有界イデアルの像は、Aへの有界イデアルの制限である。(3)弱正規イデアルIの双対フィルターF上で上限関数が1対1で、fが有界イデアルを保存ずるならば、fはF上で1対1である。[3]非有界集合の組み合わせ論的性質:(1)λが正則で、濃度λの非有界部分集合が存在するならば、ある非有界な集合上で上限関数は1対1である。

(2)非有界集合Xの濃度のcofinalityがκより大きいならば、Xの有界部分集合でXと等濃度なものが存在する。(3)κが強到達不能基数でPκλの濃度がλならば、非有界部分集合Xで、Xの任意の2元x, yに対し、xがyの部分集合ならばxの濃度はyとκの共通部分の濃度より小さいものが存在する。イデアルの構造理論に関しては、基本概念を確定させたので、この1年である程度の枠組みを構成できると思われる。非有界集合の性質の究明は、昨年度と同様に散発的な結果を得ているにすぎない。何らかの契機で、それらが結び合わされることを期待する。本研究の波及効果として、分担者は位相空間論に関する強制法でいくつかの知見を得ているし、代表者はPκλにおける新たな視点を得ている。以上から、全体的には若干の遅れをきたしていると思われる。イデアルの構造理論に関しては着実に成果を積み上げてきており、残り2年間である程度整った理論を構築できると踏んでいる。一方、非有界集合の性質の究明は困難を極めている。正規性を仮定しないと、あまりにも多くの可能性があって、まとまった結果とならない。しかし、これはある程度予期していたことで、多くの成果が得られない可能性は申請書にも述べていた。本研究の波及効果として、分担者は組み合わせ論に関する多くの結果を示しているし、Pκλに関する新しい知見を代表者もいくつか得てている。以上を総合すると、順調な進展とは言い難いが、若干遅れている程度と思われる。各研究目的ごとに、次の事項を重点的に研究する。[1]:(1)正規性を保つPκλの埋め込みを発見する。(2)強正規イデアルへの拡張可能性の組み合わせ論的特徴づけを行う。[3]:上記の研究上で現れる組み合わせ論的性質をもつ、nonstationaryな非有界集合の存在を、強制法も絡めて考察する。加茂静夫(大阪府立大名誉教授)と塩谷真弘(筑波大)を連携研究者とする。アジア論理学会議(中国)等、複数の国際学会で発表し、併せて情報の収集にも努める。8月と翌3月に若手研究者を神奈川大に招いてセミナーを行う。日本数学会の定例会(9月、3月)、9月のRIMS研究集会等で全メンバーによる研究打ち合わせを行うほか、可能な限り多くの直接ディスカッションをし、研究を遂行する。各研究目的に対して、次の点を重点的に研究する。[1]:(1)Pκλの標準的埋め込みは強正規性を保つので、強正規でない正規イデアルの振る舞いを研究する。(2)イデアルが正規イデアルに拡張できるという性質と、強正規イデアルへの拡張可能性の間に差異があるかを調べる。[2]:有界イデアルを保存する関数f:Pκλ→Pκλのみを対象にした構造理論を構築する。κ上のP-ポイント、Q-ポイント等は、この理論の枠組みに含まれるので、扱う関数を制限したからといって無意味なものではない。[3]:研究目的[1]、[2]の遂行上で浮かび上がってくる組み合わせ論的性質を満たす、stationaryではない非有界集合が存在するか調べる。Logic Colloquium 2012 (マンチェスター)等、海外での成果発表を2回以上行い、情報の収集に努める。9月と2013年3月に若手研究者(分担者も含む)を神奈川大学に招いてセミナーを行う。
インフルエンザBウイルスヌクレオカプシドの細胞質内輸送に関与するBM2蛋白の機能

インフルエンザBウイルスの第7分節RNAによってコードされるBM2は、B型ウイルスのみに存在するユニークな蛋白である。我々は11年度の研究成果から、BM2はウイルス粒子中に存在する構成蛋白であることを証明した。さらに、その後の解析からは、COS-1細胞は感染性のないB型ウイルスを産生し、その粒子中にはヌクレオカプシド(vRNP)およびBM2蛋白が殆ど含まれていないことを明らかにした。このことから、BM2蛋白は感染細胞内でvRNPと複合体を形成していること、さらに、COS-1細胞内では、BM2蛋白もvRNPもウイルス粒子出芽部位まで正常に輸送されない可能性などを推定した。12年度においては、これらの点を証明するために、1.Mammalian two-hybrid系およびvRNP分画法を用いて、BM2と結合するウイルス蛋白の同定、2.COS-1細胞内および感染性ウイルスを産生するMDCK細胞内でのvRNPとBM2蛋白の局在、などについて検討した。これらの解析から、BM2はvRNPの主構成蛋白であるNPとは結合せず、vRNPに結合しているM1蛋白と結合することを解明した。このことは、BM2はM1蛋白との結合をとおしてvRNP複合体に含まれることを示している。一方、MDCK細胞ではBM2もvRNPも感染後期には細胞質全体に広がり、最終的には粒子出芽部位まで輸送されるのに対して、COS-1細胞ではBM2は核膜周辺に蓄積して、細胞質内での拡散は全く見られなかった。これに対応して、vRNPの細胞質内輸送も見られなかった。このことから、vRNPの細胞質内輸送にとってBM2が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。今後は、これらの点に焦点を絞って研究を進展させていきたい。インフルエンザBウイルスの7分節RNAによってコードされているBM2蛋白は、B型ウイルスのみに存在するユニークな蛋白で、その性状や機能は殆ど分かっていない。我々は既に、BM2蛋白の性状を抗BM2抗体を用いて解析し、BM2は感染性ウイルス粒子の産生にとって不可欠な蛋白であることを報告した。本研究ではBM2蛋白の機能解析を行い、以下の成績を得た。1 BM2蛋白が結合するウイルス蛋白の同定。界面活性剤で分解した感染性ウイルス粒子を各ウイルス蛋白に対する抗体で免疫沈降したところ、BM2蛋白はM1蛋白と結合していることが示された。そこで、感染細胞内で既にBM2-M1複合体を形成しているのか否かを動物細胞内two-hybrid系を用いて解析した。その結果、BM2はM1およびヌクレオカプシド(vRNP)核外輸送蛋白NS2と結合することが分かった。M1、NS2蛋白はvRNP複合体を形成することから、BM2もこれらと結合することでvRNP複合体を形成していると考えられた。2 COS-1細胞から産生されるウイルスの性状。B型ウイルスをCOS-1細胞で増殖させると、感染性のない粒子が産生された。この粒子にはvRNPとBM2蛋白が含まれていなかった。3感染細胞内におけるBM2蛋白の局在。感染性粒子を産生するMDCK細胞では、感染後期にBM2蛋白は粒子出芽部位の細胞膜へ移動した。その結果、BM2はvRNPとともにウイルス粒子に取り込まれた。一方、非感染性粒子を産生するCOS-1細胞では、BM2蛋白は核膜外周に局在して存在し、細胞質内での移動は見られなかった。このことから、COS-1細胞内では、BM2-vRNPと結合して、vRNPの細胞質内輸送およびウイルス粒子への取り込みに関与する蛋白であることが示唆された。インフルエンザB

ウイルスの第7分節RNAによってコードされるBM2は、B型ウイルスのみに存在するユニークな蛋白である。我々は11年度の研究成果から、BM2はウイルス粒子中に存在する構成蛋白であることを証明した。さらに、その後の解析からは、COS-1細胞は感染性のないB型ウイルスを産生し、その粒子中にはヌクレオカプシド(vRNP)およびBM2蛋白が殆ど含まれていないことを明らかにした。このことから、BM2蛋白は感染細胞内でvRNPと複合体を形成していること、さらに、COS-1細胞内では、BM2蛋白もvRNPもウイルス粒子出芽部位まで正常に輸送されない可能性などを推定した。12年度においては、これらの点を証明するために、1.Mammalian two-hybrid系およびvRNP分画法を用いて、BM2と結合するウイルス蛋白の同定、2.COS-1細胞内および感染性ウイルスを産生するMDCK細胞内でのvRNPとBM2蛋白の局在、などについて検討した。これらの解析から、BM2はvRNPの主構成蛋白であるNPとは結合せず、vRNPに結合しているM1蛋白と結合することを解明した。このことは、BM2はM1蛋白との結合をとおしてvRNP複合体に含まれることを示している。一方、MDCK細胞ではBM2もvRNPも感染後期には細胞質全体に広がり、最終的には粒子出芽部位まで輸送されるのに対して、COS-1細胞ではBM2は核膜周辺に蓄積して、細胞質内での拡散は全く見られなかった。これに対応して、vRNPの細胞質内輸送も見られなかった。このことから、vRNPの細胞質内輸送にとってBM2が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。今後は、これらの点に焦点を絞って研究を進展させていきたい。
メタボローム解析による環境汚染物質のヒト健康リスク評価法確立

本研究では高速液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)を用いたハイスループットかつ定量性に優れた血清・尿中メタボローム分析法を検討し、コホート調査など、大規模調査に適用可能な分析手法を確立した。手法確立後、コホート試料測定と並行し、臭素系難燃剤を投与したマウスの血清中メタボロームについて解析を行った。これらの結果、化学物質の曝露を反映するマーカー候補物質を複数見出した。これらはいずれもエネルギー代謝に関連するマーカーであり、難燃剤の曝露がエネルギー代謝系のかく乱に関与している可能性が示唆された。本研究「メタボローム解析による環境汚染物質のヒト健康リスク評価法確立」の構想は、細胞内に数千種類存在する低分子代謝物(メタボローム)の解析を通して有機ハロゲン化合物の曝露を反映するバイオマーカーを特定し、環境疫学・環境毒性学の端緒開拓を目指すものである。メタボローム解析は体液、生体組織中のアミノ酸、アミン、核酸、糖類、脂質、ホルモン類などを包括的に測定することで、主に医学・薬学の分野で疾病マーカーの探索や薬効のメカニズム解明、副作用の検索などに適用されている研究手法であるが、メタボローム解析をコホート調査などの疫学的手法と組み合わせ、汚染物質の曝露に起因するバイオマーカーを特定することは化学物質曝露による未知のリスク解明や毒性機序を明らかにする上で有用な手法と考えられるが、過去にそのようなアプローチで研究を試みた例は乏しいのが現状である。このような背景から、申請者はヒト血液・尿中のメタボロームを分析し、汚染物質との相互作用を明らかにすることで化学物質の曝露に関わるバイオマーカーを解明できると考えた。さらにコホート調査の項目に特定したバイオマーカーの分析をくわえ、化学物質の曝露リスク評価に適用することで、極めて社会学的にも重要な知見を得ることが期待できる。以上の点から、本申請の学術的・社会学的波及効果は極めて大きいと考え、着想に至った。本年度、申請者は高速液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)を用いた血清・尿中のメタボロームの一斉分析法の開発に取り組み、コホート調査に適用可能なハイスループットかつ定量性に優れた分析手法の確立を試みた。初年度の研究の結果、前処理として限外濾過フィルタによるろ過を組み込むこと、適切な内部標準物質を設定することで、既存分析手法に比べ、より定量性に優れた尿中メタボロームの分析法を確立することができた。本年度は前年度確立した分析手法を用い、まず臭素系難燃剤であるPBDEsを投与した、仔マウス血清中におけるメタボロームの変動を解析した。HILIC-MS/MSにより血清中メタボロームを測定した後、得られたデータを直交部分最小二乗法判別分析(OPLS-DA)を用いて解析した。判別モデルを作成した結果、曝露群、コントロール群の血清中メタボロームの組成から、2群を完全に判別することができた。この結果から、PBDEsの曝露により、代謝のかく乱が起きることが示唆された。続けて、変動したマーカー群が生体内機構のどの部分に関与しているか、パスウェイ解析を用いて検討した。解析の結果、クエン酸回路、アミノ酸代謝、脂質代謝に関わるマーカーの変動が認められ、PBDEsがエネルギー代謝系のかく乱に関与している可能性が示唆された。これまでの結果を踏まえ、現在コホート試料についてもメタボロームの測定を開始し、現在測定値と化学物質曝露の量の関係について解析を進めている。コホート研究の実験計画についてはprotocol paperとして国際誌に投稿、受理された。難燃剤投与マウスおよびコホート研究におけるメタボローム解析の結果は今後詳細な解析を進め、国際誌に投稿予定である。さらに、本分析手法を有機ハロゲン化合物の毒性解明を目的とした共同研究結果も得られ始めており、今後の研究成果拡大が期待できる結果となった。初年度の研究計画は、高速液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)を用いた血清・尿中のメタボロームの一斉分析法の開発に取り組み、コホート調査に適用可能なハイスループットかつ定量性に優れた分析手法の確立を目指すことであった。初年度の研究の結果、既存分析手法に比べ、より定量性に優れた尿中メタボローム分析法を確立することができた。既存手法では同一検体の繰り返し測定(n = 5)における検出された目的物質200種のうち、130種が変動係数30%を超過したが、前処理として限外濾過フィルタによるろ過を組み込むこと、適切な内部標準物質を設定することで、変動係数が30%を上回る物質を60種にまで抑えることに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境分析化学本分析法における測定値の日間変動等の詳細な条件について求めておく必要があるため、これらの条件を求めた後、分析法については国際誌に投稿予定である。

これらの詳細条件を確立した後、千葉コホート調査として採取したヒト血清・尿サンプルを分析、汚染物質の曝露を反映するメタボロームを探索することで、化学物質の曝露を反映するメタボロームの特定を試みる。サンプル採取時に実施したアンケート調査の結果から男女差、年齢などの個体差要因や、食習慣、職業、居住地や喫煙・飲酒の有無などの生活習慣など、パラメータに影響をおよぼす可能性を持つ要因については、多変量解析を用いてメタボローム発現に関わる交絡要因を取り除き、PCBsを始めとする汚染物質の曝露とメタボロームの関係を解明することで、バイオマーカーの検索を試みる。統計解析により抽出されたメタボロームの機能はKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Human metabolome databaseなどのオンラインデータベースを用いて検索・同定し、生体内の機能を解析することで毒性発現機序について解析する。特定のバイオマーカーを抽出する過程の解析において、さまざまな交絡因子の影響により、解析・データ解釈に問題が生じる可能性がある。そのため、化学物質、中でも本申請で対象とするPCBsの曝露リスクに関する疫学的解析の実績があり、疫学・医学・生化学などの専門家と共同して千葉大学予防医学センターを主催されている、森千里教授から支援と協力の確約を得ている。27年度が最終年度であるため、記入しない。