hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TRIM-SUMO-プロテアソーム経路：新たな膜蛋白質異常認識・分解機構の実証

ERQC/ERADの仕組みの解明である。平成30年度は、ERのトランスロコンであるDerlin-1、-2とRX AE1の相互作用に焦点をあて、EGFP-RX AE1、RX AE1-EGFP、ΔCD AE1などRX AE1の修飾体についてその構造/ERにおける膜トポロジーとDerlinsによる認識との関連を検討した。その結果、本来の細胞質ドメインをもつRX-AE1とRX AE1-EGFPはいずれもほぼ100%がERに分布し、プロテアソーム分解を阻害しても、その分布に変化は生じなかった。一方、細胞質ドメインのN末端側を修飾したEGFP-RX AE1は50%の細胞でERの複数箇所に大きな集積像を呈した。プロテアソームの阻害によりその割合は80%に増加し、Derlin-1、-2、あるいはその両者の発現を抑制すると、この細胞内分布自体は変化しないものの、細胞内含量に著しい増加がみられた。また、細胞質ドメインを欠くΔCD AE1はERには認められず細胞質に点状の分布を示し、一部の細胞ではアグリソーム様凝集塊を形成した。さらにDerlin-1、-2の発現を抑制すると凝集塊をもつ細胞の大幅な増加、細胞内含量の可溶性/非可溶性画分における著増が認められた。これらの結果から、RX AE1の逆行輸送にはDerlin-1とDerlin-2の両者が不可欠であること、ならびにRX AE1の細胞質ドメインが細胞質への逆行輸送/Ub非依存性のプロテアソーム分解に際して何らかの認識を受けることが判明した。なお、ER膜上での分解の直接的/特異的に実証するため、ER内の逆行輸送/分解中間産物を検出する実験系を新たに構築することとし、現在、必要な分子を安定に発現する細胞を作製している。小胞体(ER)で合成された膜内在性蛋白質のユビキチン(Ub)非依存性の品質管理(ERQC)とプロテアソーム系蛋白質分解(ERAD)の仕組みは未だに謎である。本研究では、AE1アニオン交換輸送体変異体R664X AE1のUb非依存性ERQC/ERADについて、TRIM蛋白質/SUMO蛋白質が関与する分解機構の仮説を検証することを目的とする。平成28年度は、R664X AE1との相互作用が示唆されるTRIM28に加え、ERへの分布やERADとの関連が知られるTRIM13、TRIM59、TRIM21について、HEK293細胞に一過性発現させたR664X AE1に対する影響、相互作用を検討した。R664X AE1含量は、TRIM13の共存下で有意に減少(49%±6%)、TRIM21、TRIM59の共存で有意に増加(各160%±17%、316%±63%)した。TRIM28には明確な影響が認められなかった。一方、Ub依存性ERADで分解されるCFTRは、TRIM59共存下で175%±15%に増加したが、他のTRIMによる量的変動は認められなかった。また、HEK293細胞に発現させたこれらのTRIMSはERへの分布を示すが、同じくERに分布するR664X AE1と共発現させると両者の共在は見られず、免疫沈降反応によるR664X AE1との結合も認められなかった。一方、CLPTM1は一過性発現でR664X AE1含量を約300%に増加させ、siRNAによる発現抑制では約35%に減少させた。また、CLPTM1はR664X AE1と結合を示す一方で、CFTRとの結合は認められなかった。これらの知見は、CLPTM1、TRIM13、TRIM59などが、Ub非依存性ERQC/ERADでERシャペロン分子として機能する可能性を示す新規知見であり、その全貌を解明する端緒となる知見である。
リーマン・ヒルベルト対応のq類似とその周辺

平成29年度中に、ド・ラームコホモロジーやサイクルのホモロジーのアドホックでない定義を得ており、これについて(29年度末の数学会に引き続き)、韓国UNIST、アクセサリーパラメータ研究会にて講演発表を行った。発表及び討論を経て以下の進展があった(特に、1,3,4,5は高次元においてq差分加群の理論を構築する上で大事な視点を獲得したことを意味する):1.(高次元の場合を含め)階数1のホロノミック系の分類はb函数の分類(佐藤)に帰着される(が、別法で同じ結果を得た)。一方、多変数1次函数の冪乗はこのクラスに入らないことが明白となった。(この点は、29年度末の学会発表後に関連の議論をしていた。)2.ド・ラームコホモロジーやサイクルのホモロジーの有限次元性を補償するためには、「q方向爆裂によるコンパクト化」が必要であることが見出された。3.対角線イデアルの冪乗の代わりに、sfhited factorialを考えることが有効であることが見出された。(これは非可換変数での冪乗と捉えられる。)このイデアルによる完備化としてを形式q近傍と呼ぶべきものが得られた。これは、「q方向爆裂」によって付け加えられた例外集合の形式近傍と理解でき自然なものである。4. D加群の理論において、フィルター付けにより非常に重要なデータが得られる。一方q差分加群では、フィルター付けについて、そのままの類似をたどることは難しい。この点について、やや弱い構造で代用し、弱点を補う付加構造(はり合わせ)を見出すことができた。5.私が考案しここまで用いてきた「位相」でも十分機能していたが、より普遍性のある「位相」を見出した。1次元の場合について云えば、論文としての発表が未だなされていないという点で、遅れていると言える。前述「研究実績の概要」でも述べた通り、口頭発表に続く研究討論等を通じ、新たに得られた知見があり、これを踏まえてマイナーチェンジを行う必要が出てきたためである。ただしこの知見により、高次元の場合についての「正しい」方向づけがなされたと考えられる。この意味では、30年度計画の「q差分加群の理論の整備」について難しい局面は超えているのではないか、と思われる。また、31年度計画の「偏屈層のq類似」、「リーマンヒルベルト対応」について、その定式化まではスムーズに進めるであろうと考えられる。1変数についても、前述「研究実績の概要」2,3,5での知見をもとにマイナーチェンジ、書き換えが必要である。この書き換えと並行して論文として取りまとめ発表する。また、30年度中に、q差分加群の理論を整備するための「造成工事」ができている。ここに、q差分加群の理論の整備、併せて、偏屈層のq類似、リーマンヒルベルト対応について令和2年度までかけて行う。具体的には、前述「研究実績の概要」1,3,4,5に応じて、以下の方針で研究を進める:1. n変数1次函数の冪乗のq類似について、階数1であることを放棄(し階数nを許容)すると、その候補を得ることができる。1変数の場合は問題なく、この場合は量子平面の座標環での冪乗を考えている、と理解することが可能である。n変数の場合は、量子平面ではなく、量子群(の部分環)を考えている、と理解できそうである。ここで、D加群の類似を考えるにあたって、q差分作用素を超えるものをも導入して理論を拡げる。3.形式q近傍を用いることで、漸近展開の理論を整備する。これにより、増大度条件を課した函数環を導入することで、環付き空間としての「q方向爆裂」を得る。また、接続問題の「正しい」定式化が得られる。4.この「弱い」フィルター付け+付加構造により、q余接空間、特性多様体、ホロノミー加群等の定義が得られる。5.高次元の場合について、より普遍的な「位相」で書き直す。本年度は、1次元の場合について、twist de Rham理論のq類似を(層係数コホモロジーの文脈で)構築することに成功した。ド・ラームコホモロジーについては研究開始の直前に得られており、これについて口頭発表を行った。また、qサイクルのホモロジーについても構築でき、口頭及び本学紀要で発表した。さらに、1次元の場合のリーマン・ヒルベルト型の主張の一定式化も得られた。qの世界では「接空間」の定義が困難である。そこで、高次のq差分作用素もこめて考える方がすっきりゆく。そこで、q差分加群を導入した。その為にあるsiteを導入した。(但し、それだけではq差分作用素の層はうまく張り合わないため、そのsiteの「被覆」として単体的空間を更に導入した。)ド・ラーム複体は、q差分加群の解複体(の双対)として定義される。この複体は(適当な「特異点の補集合」上で)局所擬定数の層(楕円曲線の構造層の引き戻し)となる。更に、これを楕円曲線上におとしたものがベクトル束となることと、もとのq差分加群が「標準延長」をもつことが等価である、ことがみえてきた。これが、一つのリーマンヒルベルト対応である。qサイクルについては、線分[qa,a]の1次結合では不十分である。原点をまわるループの役割をqの世界で担う対象が必要である。

これは、(古典的な意味での)微分形式が担ってくれることがわかった。(これは、楕円曲線上でのセール双対性の文脈から理解できる。)尚、高次元の場合については、階数1の「ホロノミック」q差分加群の分類を得た。1次元の場合のド・ラーム理論について、完成し発表した。特に、qサイクルのホモロジーについての定式化がほぼ計画通りに得られた。(但し,楕円量子群との関係は未だ調べられていない。)いずれも論文としての発表が未だ為されていない。一方、高次元の場合について、考察はすすんでいるがまだできていない。平成29年度中に、ド・ラームコホモロジーやサイクルのホモロジーのアドホックでない定義を得ており、これについて(29年度末の数学会に引き続き)、韓国UNIST、アクセサリーパラメータ研究会にて講演発表を行った。発表及び討論を経て以下の進展があった(特に、1,3,4,5は高次元においてq差分加群の理論を構築する上で大事な視点を獲得したことを意味する):1.(高次元の場合を含め)階数1のホロノミック系の分類はb函数の分類(佐藤)に帰着される(が、別法で同じ結果を得た)。一方、多変数1次函数の冪乗はこのクラスに入らないことが明白となった。(この点は、29年度末の学会発表後に関連の議論をしていた。)2.ド・ラームコホモロジーやサイクルのホモロジーの有限次元性を補償するためには、「q方向爆裂によるコンパクト化」が必要であることが見出された。3.対角線イデアルの冪乗の代わりに、sfhited factorialを考えることが有効であることが見出された。(これは非可換変数での冪乗と捉えられる。)このイデアルによる完備化としてを形式q近傍と呼ぶべきものが得られた。これは、「q方向爆裂」によって付け加えられた例外集合の形式近傍と理解でき自然なものである。4. D加群の理論において、フィルター付けにより非常に重要なデータが得られる。一方q差分加群では、フィルター付けについて、そのままの類似をたどることは難しい。この点について、やや弱い構造で代用し、弱点を補う付加構造(はり合わせ)を見出すことができた。5.私が考案しここまで用いてきた「位相」でも十分機能していたが、より普遍性のある「位相」を見出した。1次元の場合について云えば、論文としての発表が未だなされていないという点で、遅れていると言える。前述「研究実績の概要」でも述べた通り、口頭発表に続く研究討論等を通じ、新たに得られた知見があり、これを踏まえてマイナーチェンジを行う必要が出てきたためである。ただしこの知見により、高次元の場合についての「正しい」方向づけがなされたと考えられる。この意味では、30年度計画の「q差分加群の理論の整備」について難しい局面は超えているのではないか、と思われる。また、31年度計画の「偏屈層のq類似」、「リーマンヒルベルト対応」について、その定式化まではスムーズに進めるであろうと考えられる。上記で述べたことに関して現在執筆中に論文を早急に完成させる。並行して, qサイクルのホモロジーのより突っ込んだ理解, (遅れている)高次元の場合についてこれまで考察してきたことを、きちんと詰めて行く。1変数についても、前述「研究実績の概要」2,3,5での知見をもとにマイナーチェンジ、書き換えが必要である。この書き換えと並行して論文として取りまとめ発表する。
水産無脊椎動物セルラーゼの酵素工学的活用に関する研究

水産無籍津動物のcDNAクローニング前年度までにアワビ、キタムラサキウニ、ホタテガイの水産無脊椎動物セルラーゼの精製に成功した。そこで本年度はこれらの一次構造を明らかにするためにcDNAクローニングを行った。アワビ・セルラーゼ精製したアワビ・セルラーゼをリジルエンドペプチダーゼで完全消化後、逆相HPLCでペプチド断片を分離・精製した。これらの断片のアミノ酸配列を解析することにより得られた部分アミノ酸配列情報を用いて縮重プライマーを作成した。このプライマーとアワビの肝膵臓から調製したmRNAを逆転写して得られたcDNAを用いてPCRを行った。得られた塩基配列情報をもとに特異プライマーを合成し、5'-、3'-RACEを行うことで、アワビ・セルラーゼmRNAの非翻訳領域を決定した。得られたアワビ・セルラーゼmRNAは全長1898bpで594残基のアミノ酸をコードしていた。キタムラサキウニ・セルラーゼ精製したキタムラサキウニ・セルラーゼをリジルエンドペプチダーゼで部分消化後、電気泳動でペプチド断片を分離した。このプライマーとキタムラサキウニの胃から調製したmRNAを逆転写して得られたcDNAを用いてPCRを行った。得られた塩基配列情報をもとに特異プライマーを合成し、5'-、3'-RACEを行うことで、キタムラサキウニ・セルラーゼmRNAの非翻訳領域を決定した。得られたキタムラサキウニ・セルラーゼmRNAは全長1822bpで444残基のアミノ酸をコードしていた。ホタテ・セルラーゼ精製したホタテ・セルラーゼをリジルエンドペプチダーゼで部分消化後、電気泳動でペプチド断片を分離した。このプライマーとホタテの胃から調製したmRNAを逆転写して得られたcDNAを用いてPCRを行った。得られた塩基配列情報をもとに特異プライマーを合成し、5'-、3'-RACEを行うことで、ホタテ・セルラーゼmRNAの非翻訳領域を解析中である。本研究では、水産無脊椎動物セルラーゼの酵素特性および一次構造、遺伝子構造を解析することを目的としている。各種水産無脊椎動物セルラーゼの精製アワビ、ホタテガイ、キタムラサキウニの水産無脊椎動物セルラーゼの精製方法を確立した。アワビ・セルラーゼアワビの消化液をアワビ内臓より駒込ピペットで採取し、これを緩衝液で透析後、遠心分離を行い上清を得た。この上清を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供しセルラーゼを精製した。ホタテ・セルラーゼアワビ・セルラーゼと同様の方法でセルラーゼを精製した。キタムラサキウニ・セルラーゼアワビやホタテに比べて消化管が小さく、破損しやすいため同様の方法では消化液を採取することはできなかった。そこでキタムラサキウニの内臓組織からアセトンパウダーを調製した。このアセトンパウダーから緩衝液で可溶性成分を調製して、これを陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供しセルラーゼを得た。酵素特性の分析アワビ・セルラーゼの性質アワビ・セルラーゼの至適温度は約40°Cであり、既知の細菌等に由来する酵素よりも低温で高活性を有する酵素であることが示された。また、至適pHは6.3であり酸性域で至適pHを示す既知の酵素とは異なることが示された。キタムラサキウニ・セルラーゼの性質キタムラサキウニ・セルラーゼの至適温度は約35°Cであり、アワビ・セルラーゼとほぼ同様であった。至適pHも約6.5で同様であった。しかしながら、キタムラサキウニ・セルラーゼはpH9.5でも至適pHの60%以上の活性を有し、明らかに一般的なセルラーゼとは異なる性質を有していた。

得られた塩基配列情報をもとに特異プライマーを合成し、5'-、3'-RACEを行うことで、キタムラサキウニ・セルラーゼmRNAの非翻訳領域を決定した。得られたキタムラサキウニ・セルラーゼmRNAは全長1822bpで444残基のアミノ酸をコードしていた。ホタテ・セルラーゼ精製したホタテ・セルラーゼをリジルエンドペプチダーゼで部分消化後、電気泳動でペプチド断片を分離した。これらの断片のアミノ酸配列を解析することにより得られた部分アミノ酸配列情報を用いて縮重プライマーを作成した。このプライマーとホタテの胃から調製したmRNAを逆転写して得られたcDNAを用いてPCRを行った。得られた塩基配列情報をもとに特異プライマーを合成し、5'-、3'-RACEを行うことで、ホタテ・セルラーゼmRNAの非翻訳領域を解析中である。
日欧自動車メーカーの「メガ・プラットフォーム戦略」とサプライチェーンの変容

研究プロジェクトは、2010年代前半に日欧自動車メーカーが業界の話題を集めて推進した「メガ・プラットフォーム戦略」を対象に、各メーカーの取り組みについて比較研究を行い、それぞれの特質を解明した。この戦略は車両の多様化・複雑化・コスト増に対応し、長期商品計画に基づく車台開発、車種・車両セグメントを越えた設計思想の共通化や部品共通化による開発効率化とコスト削減を図る取り組みであった。この新動向が製品開発や生産、サプライチェーンの再編をグローバルベースでもたらし、自動車業界全体の構造を変容させているのかどうかについて、実態を解明した。またこの戦略の背後の論理、部品業界の再編の実態と動因を解明した。【概観】日欧完成車メーカーが推進する「メガ・プラットフォーム戦略」は、車両の多様化・複雑化・コスト増に対応して、長期商品計画に基づく車台開発、車種・車両セグメントを越えた設計思想の共通化や部品共通化による開発効率化とコスト削減を図る取り組みである。この動きが製品開発や生産、サプライチェーンの再編をグローバルベースでもたらし、自動車業界全体の構造を変容させることは、必至である。このもの造りシステムの変化とその背後の論理、部品業界における再編の実態と動因を解明することが研究の目的である。具体的には、本研究の問題意識は、1メガ・プラットフォーム戦略の合理性や経済性の「論理」がどこにあり、各社のアプローチの違いがどのような「要因」により規定されるのか、そして2この新戦略を通じて、完成車メーカーとサプライヤーとの関係がどのように変化し、部品業界がグローバルレベルでどのような再編(集約化・淘汰)を辿るのか、という点にある。【研究計画の進捗状況】6分野で、予定通り、一部予定以上に進捗:上記2つの問題意識⇒《3つの主要課題・6つの分野別課題》課題1「自動車部品産業の構造変化要因の実態解明」:1自動車・部品メーカーの海外シフト、2自動車・部品メーカーのグローバル調達増加。課題2「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略(*)の実態解明」:3新モジュール/新プラットフォーム戦略(含:部品のグローバル標準規格化)、4次世代自動車。課題3「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の部品産業への影響実態の解明」:5自動車部品の新素材増加、6電気・電子部品の増大。【研究組織】「分担型リーダーシップ」方式を採用し、6グループを各分野専門家リーダーが研究推進を指揮し、複数リーダーを中心にエグゼクティブ・チームを編成して研究代表者が調整役を担い、研究全体のバランスを取りながら予定の成果を上げることができた。本研究開始時の平成26年度に設定した、2つの問題意識・3つの課題・6つの分野別課題に基づいて、平成27年度は前年度の実績を踏まえた国内外調査を実施した。但し海外調査計画で予定していた中国調査だけを、ヒアリング先事情に起因して平成28年度に繰越した。また平成27年度の研究成果確認のために、年間4回の研究会議(5月・6月・12月・3月)を開催した。国内調査は、下記3つの課題ごとに分野別課題に応じて、単独調査ないし共同調査の形で、自動車メーカー及び部品サプライヤー、シンクタンク等へのヒアリングを実施した。海外調査は、欧州(9月)、北米・メキシコ(9月)といった調査対象地域ごとに、調査ミッションを組織編成し、各分野別課題の解明のために自動車メーカー(マツダ、日産自動車、トヨタ自動車、VW、AUDI他)、部品サプライヤー(日系及びドイツ系)、自動車関連研究所、コンサルティング企業などを視察・ヒアリング調査し、また情報交換した。課題1「自動車部品産業の構造変化要因の実態解明」については、(1)自動車・部品メーカーの海外シフト、(2)自動車・部品メーカーのグローバル調達増加を、課題2「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の実態解明」については、(1)新モジュール/新プラットフォーム戦略、(2)部品のグローバル標準規格化、(3)次世代自動車の開発・製品化動向を、課題3「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の部品産業への影響実態の解明」については、(1)自動車部品の新素材増加、(2)電気・電子部品の増大や欧米系メガサプライヤーの参入を調査・研究した。その他、海外ワークショップ派遣(ディスブルク大学ワークッショプ、平成27年6月)、公開講演会(「福岡モーターショー2015」と併催、九州経済産業局と共催、平成27年12月)、日韓合同研究会(平成28年2月、九州大学)を行った。(1)課題1「自動車部品産業の構造変化要因の実態解明」(塩次、折橋、李、木村、居城、太田、平山)については、1自動車・部品メーカーの海外シフト、2自動車・部品メーカーのグローバル調達増加を調査した。日本の地場自動車部品サプライヤーの海外生産拠点開設や、系列を離れた国内外取引先開拓や、アセアンにグローバル開発・ロジスティックス拠点を置くTier 1の出現などを確認できた。(2)課題2「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の実態解明」(岩城、目代、古川、李)については、海外サプライチェーンとの関連を調査した。車両セグメントを越えた部品共通化は戦略の合理性や経済性の追求という点で共通であったが、「新車両設計アプローチ」の違いを反映して自動車メーカー・グループごとに異なる形態が見られ、部品共通化に伴うグローバル・サプライチェーンの変容実態が明らかとなった。欧州、アセアン、メキシコ、日本国内での前年度調査成果と併せて検討した結果、温度差はあるが、部品共通化に対応した部品メーカーのグローバル・サプライチェーンの進化を観察できた。目代は、近年の日欧自動車メーカーの新車両開発戦略がモジュール化第2波と位置付けうることを明らかにした。モジュール化

第1波は生産・調達領域での部品複合化であったが、第2波は製品設計における製品システムの切り分けとデザイン・ルールの確立、設計モジュールの組み合わせによる車種バリエーションの創出と部品共通化にあることを示した。この研究成果は、目代により国際学会(ドイツ2件、韓国1件)で報告された。(3)課題3「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の部品産業への影響実態の解明」(竹原、内田、岩城、目代、李)については、自動車部品の新素材増加、6電気・電子部品の増大に注目して調査した。次世代自動車の開発・生産の分野でもモジュール化の部品産業への影響を確認できた。平成28年度は、本科研費基盤研究Aの最終年度であり、研究成果の取り纏めに重点を置いた。ヒアリング先事情に起因する平成27年度中国調査の繰越し実施(平成28年7月)、欧州の自動車開発動向調査(平成29年1月)、2回の研究成果報告会開催(平成28年12月クローズド/29年3月オープン)、2冊の研究成果冊子の編集・公開を行った。計画では年度末に研究報告書(和・英文図書)を刊行する予定であったが、テロ発生に起因する欧州調査時期の繰り下げにより同刊行事業を平成29年度へ繰り越した。これまでの研究成果を、書籍(日本語2冊、英語1冊)に収録し発表することができた。目代(研究分担者)は、日欧の自動車メーカーにおける新製品開発の動向を、モジュール化第2の波と位置づけ、製品バリエーションの創出と部品共通化を両立させる戦略として、モジュラー設計と相似設計の2つがあることを示した。また、モジュール化第2の波が自動車メーカーの部品調達戦略やサプライチェーン全体へ与える影響についても前年度から継続して調査を行っており、日本、ASEAN、メキシコ、欧州については部分的にだが、その影響を明らかにした。(1)課題1「自動車部品産業の構造変化要因の実態解明」については、(2)課題2「新モジュール戦略・新プラットフォーム戦略の実態解明」について、研究成果を和書2冊・英書1冊で発表し、国内外研究者の注目を集めた。平成28年度に予定した欧州調査をテロリスク回避から実施時期を繰り下げたため、同年度に予定していた研究成果の図書公開事業を已むなく29年度に繰り越した。平成29年度一年間をかけて研究成果を取り纏め、平成30年3月に九州大学出版会から学術書を刊行した。即ち、『自動車メガ・プラットフォーム戦略の進化ー競争環境の変容ー』、古川澄明編・JSPS科研プロジェクト著、査読有、2018年、v,348p.。研究プロジェクトは、2010年代前半に日欧自動車メーカーが業界の話題を集めて推進した「メガ・プラットフォーム戦略」を対象に、各メーカーの取り組みについて比較研究を行い、それぞれの特質を解明した。
生検組織より腎細胞癌の予後規定因子を判定し、腎保存手術の適応を決定するための研究

パラフィン包埋された少量の生検標本より核DNA量,AgNORs,PCNAの測定を行うことが可能であるか試みたところ,核DNA量については細胞数の不足によりFlow cytometry(FCM)で判定不能のものが一部あったが,顕微蛍光測光法ではほとんどが判定可能であった.FCMは顕微蛍光側光法に比べ,短時間で客観的に測定できるという点で優れているが,単離できていない細胞集団や細胞片も1個の細胞として測定されてしまう点や,間質細胞の多寡によりヒストグラムが異なってしまう可能性が,短所としてあげられる.特に生検標本では検体量が少ないので,顕微蛍光側光法により検討を行う方がより正確な核DNA量の測定が可能であると考えられる.腎細胞癌でも,一般の癌と同じように組織学的異型度が高くなるほどDNAの腫瘍内hetrogeneityが多くなる傾向が認められた。また,生検と摘出標本で異型度が一致するのは約70%であるが生検でpolyploidかaneuploidであればG2である可能性が非常に高いと考えられる.AgNORs,PCNAについてはまだ十分な検討ができていないが検体量は核DNA量測定より少量で可能であり,薄切切片を得て,染色を行うことについては問題なかった.今後,生検標本において核DNA量,AgNORs,PCNAを測定することが生検診断の精度をどの程度向上させうるのか検討を行ってゆく予定である.パラフィン包埋された少量の生検標本より核DNA量,AgNORs,PCNAの測定を行うことが可能であるか試みたところ,核DNA量については細胞数の不足によりFlow cytometry(FCM)で判定不能のものが一部あったが,顕微蛍光測光法ではほとんどが判定可能であった.FCMは顕微蛍光側光法に比べ,短時間で客観的に測定できるという点で優れているが,単離できていない細胞集団や細胞片も1個の細胞として測定されてしまう点や,間質細胞の多寡によりヒストグラムが異なってしまう可能性が,短所としてあげられる.特に生検標本では検体量が少ないので,顕微蛍光側光法により検討を行う方がより正確な核DNA量の測定が可能であると考えられる.腎細胞癌でも,一般の癌と同じように組織学的異型度が高くなるほどDNAの腫瘍内hetrogeneityが多くなる傾向が認められた。また,生検と摘出標本で異型度が一致するのは約70%であるが生検でpolyploidかaneuploidであればG2である可能性が非常に高いと考えられる.AgNORs,PCNAについてはまだ十分な検討ができていないが検体量は核DNA量測定より少量で可能であり,薄切切片を得て,染色を行うことについては問題なかった.今後,生検標本において核DNA量,AgNORs,PCNAを測定することが生検診断の精度をどの程度向上させうるのか検討を行ってゆく予定である.パラフィン包埋された少量の生検標本より核DNA量,AgNORs, PCNAの測定を行うことが可能であるか試みたところ,核DNA量については細胞数の不足によりFlow cytometry (FCM)で測定不能のものが一部あったが,顕微蛍光測光法ではほとんどが判定可能であった.FCMは顕微蛍光測光法に比べ,短時間で客観的に測定できるという点で優れているが,単離できていない細胞集団や細胞片も1個の細胞として測定されてしまう点や,間質細胞の多寡によりヒストグラムが異なってしまう可能性が,短所としてあげられる.特に生検標本では検体量が少ないので,顕微蛍光測光法により検討を行う方がより正確な核DNA量の測定が可能であると考えられる.腎細胞癌でも,一般の癌と同じように組織学的異型度が高くなるほどDNAの腫瘍内hetrogeneityが多くなる傾向が認められた.また,生検と摘出標本で異型度が一致するのは約70%であるが生検でpolyploidかaneuploidであればG2である可能性が非常に高いと考えられる.AgNORs, PCNAについてはまだ十分な検討ができていないが検体量は核DNA量測定より少量で可能であり,薄切切片を得て,染色を行うことについては問題なかった.今後,生検標本において核DNA量,AgNORs, PCNAを測定することが生検診断の精度をどの程度向上させうるのか検討を行ってゆく予定である。パラフィン包埋された少量の生検標本より核DNA量,AgNORs,PCNAの測定を行うことが可能であるか試みたところ,核DNA量については細胞数の不足によりFlow cytometry(FCM)で判定不能のものが一部あったが,顕微蛍光測光法ではほとんどが判定可能であった.FCMは顕微蛍光測光法に比べ,短時間で客観的に測定できるという点で優れているが,単利できていない細胞集団や細胞片も1個の細胞として測定されてしまう点や,間質細胞の多寡によりヒストグラムが異なってしまう可能性が,短所としてあげられる.特に生検標本では検体量が少ないので,顕微蛍光測光法により検討を行う方がより正確な核DNA量の測定が可能であると考えられる.腎細胞癌でも,一般の癌と同じように組織学的異型度が高くなるほどDNAの腫瘍内hetrogeneityが多くなる傾向がみとめられた.また,生検と摘出標本で異型度が一致するのは約70%であるが生検でpolyploidかaneuploidであればG2である可能性が非常に高いと考えられる.

AgNORs,PCNAについてはまだ十分な検討ができていないが検体量は核DNA量測定より少量で可能であり,薄切切片を得て,染色を行うことについては問題なかった.今後,生検標本において核DNA量,AgNORs,PCNAを測定することが生検診断の精度をどの程度向上させうるのか検討を行ってゆく予定である.
第二言語ライティング研究の現代的課題と解決のための将来構想―東アジアからの発信―

本研究は日本、韓国、台湾、香港という東アジアに位置する4か国がする英語ライティング教育に関して、アンケート調査によって実態を浮き彫りにし、そして互いが一堂に会することで実態を比較しあい、問題点などを共有し、今後の展望などに関して国際シンポジウムとして意見交換ができたことが一番の成果と言える。さらに、学習者コーパスを精査することにより、4か国・地域の学生の書く英語の諸相が明らかにされた。最終成果物として『EFL Writing in East Asia: Practice, Perception and Perspectives』を刊行し、多くの方と共有できたことで、この分野の進展につながった。本研究は、東アジア諸国において共通する「外国語としての英語ライティング教育」の実態と課題を整理し、その課題解決に向けて、日本・香港・台湾・韓国の研究者が国の枠を超えてチームを編成し、互いに研究成果を精査、共有しつつ、広く世界に向け発信することを目的としている。研究の遂行にあったっては、(1)実態調査チームと(2)学習者コーパス班に別れて互いに連携を取りながら協力して行なった。(1)実態調査チームにおいては、ライティング教育の実体を探るために、パイロットスタディとして、学生アンケート(N=350)及び教員アンケート(N=6)を実施し、前者の結果を九州英語教育学会で発表した。このパイロット調査の結果を活かし、本調査の準備をする。また、香港、韓国、台湾を訪問し、各国のライティング研究者と研究協議を行い、多くの知見を得た。更に、(2)学習者コーパス班においては、東アジア諸国の英語学習者から収集した英作文データ(学習者コーパス)を量的・質的に分析し、その結果を海外及び国内の学会で発表した。また、本科研に関連するシンポジウムをアメリカ及び国内の著名な研究者を招き、公開シンポジウムを2回行なった。年度末には、本年度の成果のまとめとして全8章からなる研究成果報告書No.1(平成24年度分)を刊行した。これらの成果により、来年度以降の実態調査の本調査および、更なる学習者コーパスの探求への道筋が開かれた。本研究には2つの柱があり、ひとつはライティング教育に関する実態調査であり、もう一つは学習者コーパス研究である。実態調査に関しては、昨年度行なった実態調査(パイロット版)のまとめを全国英語教育学会(北海道大会)にて発表した。パイロット版の研究の成果を論文化し、学会誌に投稿した(まだ採用には至っていない)。25年度は本科研の中間の時期にあたることから、EFL Writingに関する国際シンポジウムを開催した。"International Symposium in EastAsia: Crossing the Borders"と名をうち、日本から一名、さらに海外から4名の著名な研究者を招きシンポジウムを開催した。本シンポジウムには広く日本各地からの100名ほどの聴衆の参加もあった。ある程度の注目も集め、また、活発な議論の交換もあり、本シンポジウムは成功裏に終了したと考える。このシンポジウムの発表内容をまとめた冊子も作成した。また、本科研のHP上にもアップし、多くの人々に提供している。海外の研究者たちとは今後の国際版実態調査に関する討議も行うことが出来た。実態調査のアンケートの国際版を作成し、海外の研究協力者とすり合わせを行い、最終版を作り上げた。一方学習者コーパスの分野では、これまでの研究成果を国内外のいくつかの学会で発表し、注目も得た。また、それをまとめた論文も2本刊行された。日本語ライティング教育の現状という面からの研究も一定の成果を得つつある。1.本年度実態調査班では3種類のアンケート調査を実施した。1中学校・高等学校英語教員アンケート(国際版)を日本、韓国、台湾において実施し、人数は、日本(129名)、韓国(94名)、台湾(67名)の合計290名であった。このうち、日本と韓国のデータの比較に関しては国際学会にて発表した。その後、台湾のデータも揃ったので、この3国のデータを比較した上での研究発表を来年度行う予定である。2国際版学生アンケートを日本、韓国、香港、台湾の計4か国で実施し、参加者は日本13大学796名、韓国6大学252名、香港1大学127名、台湾2大学198名、合計1373名である。膨大なデータであるため、分析はこれから行うところである。3大学のライティング教員意識調査(国際版)はweb上でデータは収集中である。2.コーパス研究班では、本年度は1ライティング課題文が英語学習者の英作文に及ぼす影響、2英語学習者の英作文におけるライティング課題文の再利用、3英語母語話者の大学生と社会人の英作文におけるライティング課題文の再利用の3つを研究課題とした。1では、全2,000件の英作文データを対象に58の言語項目について個々の使用頻度を算出し、さらに2種類のライティング課題の間でこれらの言語項目の使用にどのような差異があるのかを分析し、各ライティング課題文の英作文に頻出する言語項目の類似性、あるいは各ライティング課題に特徴的な言語項目を特定した。2と3では、本研究のためのn-gram抽出プログラムを開発し個々の英作文データから課題文の単語列全体、あるいは連続する部分的な単語列(3単語連続以上)に完全一致する単語列を、当該の英作文の総単語数に占める割合を算出した。さらに、2は学習者の国別に、3では大学生と社会人それぞれの場合の使用率を算出して比較した。27年度は最終年度として、これまでの研究の集大成の一年であった。

本科研全体として取り組んだものは、第二回国際シンポジウム(2nd International Sympposium on EFL Writing)を11月2日、東京大学駒場キャンパスにおいて開催したことである。このシンポジウムには、海外研究協力者として、香港、台湾、韓国からそれぞれの国のライティング教育の専門家を招聘した。参加者は100人程度あつまり、また、シンポジウム用の資料を盛り込んだ冊子も刊行して、参加者に配布した。これとは別に、実態調査班はこれまで行った1日本、台湾、韓国の中高の教員の英語教育におけるライティング指導に関する意識調査、2日本の大学のライティング教員の意識調査、3日本、台湾、韓国、香港の学生対象の意識調査、それぞれの結果の取りまとめを行い、最終成果物に取り入れた。コーパス班は、1ライティング・プロンプトが英語学習者の言語使用に与える影響、および2ライティング・プロンプトが英語学習者の語彙使用に与える影響につき、ICNALEを活用して調査し、その結果を国際学会等で発表した。本研究は日本、韓国、台湾、香港という東アジアに位置する4か国がする英語ライティング教育に関して、アンケート調査によって実態を浮き彫りにし、そして互いが一堂に会することで実態を比較しあい、問題点などを共有し、今後の展望などに関して国際シンポジウムとして意見交換ができたことが一番の成果と言える。さらに、学習者コーパスを精査することにより、4か国・地域の学生の書く英語の諸相が明らかにされた。最終成果物として『EFL Writing in East Asia: Practice, Perception and Perspectives』を刊行し、多くの方と共有できたことで、この分野の進展につながった。研究発足当初予定していた3種類の国際版アンケートを実施した。また、学習者コーパス班においても着実に成果を上げている。27年度が最終年度であるため、記入しない。英語教育本年度は最終年度として、「東アジアにおけるEFLライティング教育のモデル構築」に向け、これまでの成果を突き合わせてメンバー全員で討議する。また、第二回国際シンポジウムを開催し、東アジアの研究者とともに、本研究で浮かび上がってきた課題を精査したうえで、望ましい「ライティング教育のモデル」を発信できることを目指す。最終成果物を刊行する。本研究を始めるに当たり計画したもののうち、初年度に行うべきことに関してはすべて達成した。学会発表も初年度としては、満足の行ける数のものを発表し、おおむね良い評価を得ている。実態調査班としては、実態調査のパイロット研究を終え、これからの国際調査に向け準備をしているところである。東アジア諸国におけるEFLライティング教育の文献調査および前年度の各国における視察調査結果の知見から、アンケート項目を策定し終わり、それの英語版および各国語版の作成に入ったところである。韓国、台湾、香港、日本の4か国で同時に調査を実施する準備が整った。第一回目の国際シンポジウムの開催により、これらの国々における英語ライティング教育の問題点と課題に対する理解が深まり、今後の分析へとつながる手掛かりを得ている。
脳虚血時神経血管カップリングへのマイクログリアの関与の検討

マイクログリアにGFPを発現させたマウスに慢性閉鎖頭窓を作成し、二光子顕微鏡を用いてマイクログリアと血管網の形状を反復観察したところ、細胞体断面積や密度は一定であり、突起本数は深さによる差異はなく、経日的に有意な変化はなかった。観察期間内に遊走した細胞体、新たな細胞の出現を確認した。8%の慢性低酸素暴露マウスにおいて、マイクログリアが血管新生に深く関与している可能性が示された。アストロサイトまたはニューロンだけに光感受性蛋白チャネルロドプシン2を発現したマウスに光刺激を加えたところ、いずれも強度依存的に脳血流が増大した。薬理学的実験から、それぞれ独立した血流調節機序を有していることが示された。マイクログリアにGFPを発現させた遺伝子組み換えマウス(B6.129P-Cx3cr1<tm1Ltt>/J)の左側頭頭頂葉上に直径3 mmの閉鎖頭窓を作成後、0-21日の間で二光子顕微鏡を用いて、マイクログリアおよび血管網の3次元形状を反復観察した。撮像領域は203×203μm(0.2μm/pixel)とし、脳表から深さ400-950μmまでを1.0μmの間隔で1匹あたり13箇所撮像した。脳血管を観察するために撮像の直前にSulforhodamine 101を腹腔内投与した。解析ソフトMatlabを用いて単一のミクログリア画像を抽出し、撮像平面上における最大値投影画像上において、マイクログリアの細胞体面積および細胞体中心から半径10μmの円周上における足突起の数について評価した。また、脳血管の形状を基に血管に対するマイクログリアの相対的な位置情報を取得し、マイクログリアの遊走量および細胞の新生について評価した。その結果、頭窓作成0-21日において突起を伴ったマイクログリアを脳表から最深950μmまで明瞭に観察し得た。細胞体面積は、頭窓作成後の日数に関係なく一定値が得られた(平均37μm2)。また、突起本数に関しては、1細胞あたり平均15本であり頭窓作成後において有意な変化は認められなかった。さらに、細胞体の遊走量に関しては頭窓作成後7日間で6μm以上移動した細胞が観察領域内で2割程度認められ、新たな細胞の出現を確認した。これらのことから、生体マウス脳内において同一のマイクログリアに関して長期のin vivo反復観察が可能であることを確認した。本件の受領決定が後期に入ってからだったので、着手がやや遅れた。B6.129P-Cx3cr1<tm1Litt>/Jマウスの頭窓を通して実質内マイクログリアの測定条件を模索し、長期的に反復in vivo観察することはできるようになったが、疾患モデルにおける観察まで至っていない。203×203μm(0.2μm/pixel)にて撮像し、脳血管を観察するために撮像の直前にSulforhodamine 101を腹腔内投与したうえで、脳表から深さ400-950μmまでを1.0μmの間隔で1匹あたり13箇所撮像した。解析ソフトMatlabを用いて単一のマイクログリア画像を抽出し、撮像平面上における最大値投影画像上において、マイクログリアの細胞体面積および細胞体中心から半径10μmの円周上における足突起の数について評価した。また、脳血管の形状を基に血管に対するマイクログリアの相対的な位置を求め、マイクログリアの遊走距離および遊走数(率)および細胞の新生について評価した。頭窓作成0-21日において突起を伴ったマイクログリアを脳表から最深950μmまで明瞭に観察し得た。細胞体断面積は、頭窓作成後の日数に関係なく一定値が得られた(平均33μm2)。また、突起本数に関しては、1細胞あたり平均10.3本であり、深さによる変動はなく、頭窓作成後も有意な変化は認められなかった。さらに、細胞体の遊走量に関しては頭窓作成後7日間で6μm以上移動した細胞が観察領域内で認められ、新たな細胞の出現を確認した。さらに、低酸素(8%)灌流装置内で2週間飼育したマウスにおいて同様の撮像を行い、血管新生とマイクログリアの新生、遊走を確認した。B6.129P-Cx3cr1<tm1Litt>/Jマウスの頭窓を通して実質内マイクログリアの測定条件を確定し、長期的に反復in vivo観察することができるようになり、さまざまなモデルマウスにおける観察ができるようになった。マイクログリアにGFPを発現させた遺伝子組換えマウス(B6.129P-Cx3cr1<tmlLtt>/J)の左側頭頭頂葉上にTomita-Seylaz法による慢性閉鎖頭窓を作成し、経日的に3週間まで二光子顕微鏡を用いてマイクログリアおよび血管網の3次元形状を反復観察した。

撮像直前にSulforhodamine 101を腹腔内投与して血管を可視化し、203 x 203 &micro;m (0.2&micro;m/pixel)の領域で脳表から400-950&micro;mまでを1&micro;m毎に撮像した。画像解析ソフトMatlabを用いて単一のマイクログリア細胞を抽出し、撮像平面上における最大値投影画像上においてマイクログリアの細胞体断面積および細胞体中心から半径10&micro;mの円周上における足突起の数および脳血管との相対的な位置からマイクログリアの遊走距離、遊走数(率)について評価した。その結果、頭窓作成から21日目まで、細胞体断面積は頭窓作成後の日数に関係なく平均33&micro;m<2>と一定であり、突起本数は1細胞あたり平均10.3本で深さによる差異はなく、頭窓作成後も有意な変化は認められなかった。観察期間内に6&micro;m以上移動(遊走)した細胞体が一定数認められ、新たな細胞の出現を確認した。以上のことから、マウス脳内において同一のマイクログリア細胞を長期間にわたってin vivo反復観察することが可能であることを明らかにした。さらに、8%の低酸素灌流装置内で2週間飼育した慢性低酸素暴露マウスにおいて、血管新生過程でその周辺にマイクログリアの新生、遊走を認め、レーザー照射によってマイクログリア細胞体を焼灼すると血管新生が停止、あるいは新生過程の血管が消失することから、マイクログリアが血管新生に深く関与している可能性が示唆された。マイクログリアにGFPを発現させたマウスに慢性閉鎖頭窓を作成し、二光子顕微鏡を用いてマイクログリアと血管網の形状を反復観察したところ、細胞体断面積や密度は一定であり、突起本数は深さによる差異はなく、経日的に有意な変化はなかった。観察期間内に遊走した細胞体、新たな細胞の出現を確認した。8%の慢性低酸素暴露マウスにおいて、マイクログリアが血管新生に深く関与している可能性が示された。アストロサイトまたはニューロンだけに光感受性蛋白チャネルロドプシン2を発現したマウスに光刺激を加えたところ、いずれも強度依存的に脳血流が増大した。薬理学的実験から、それぞれ独立した血流調節機序を有していることが示された。頭窓を施したB6.129P-Cx3cr1<tm1Litt>/Jマウスを用い、イソフルラン麻酔下でアストログリア細胞の生体蛍光マーカであるSulforhodamine 101(5-10 mM)を腹腔投与(8μl/g)する。これにより、血管の走行が確認でき、全く同じ部位での反復観察が可能になる。頭窓を通して一次体性感覚野の微小血管内及びアストログリアにおける蛍光強度を二光子顕微鏡法によって5分から30分毎に測定する。血管の構造画像を解像度0.4μm/pixelの条件で深さ方向に800μmまで、またアストログリアを0.2 μm/pixelの解像度で400μmまで、それぞれ5μmのステップ間隔で取得する。同様の実験プロトコルで繰り返し継続観察を行う。これにより脳虚血時の微小血管・神経細胞・アストロサイトと、マイクログリア細胞の動的連携について脳皮質のみならず、さらに深部における変化まで多角的に可能な限り明らかにしていく。頭窓を施したB6.129P-Cx3cr1<tm1Litt>/Jマウスを用い、イソフルラン麻酔下で血管およびアストログリア細胞の生体蛍光マーカであるSulforhodamine 101(5-10 mM)を腹腔投与(8μl/g)する。経
プロテアソームによるポリユビキチン化タンパク質分解過程の過渡的複合体の解析

26Sプロテアソームは、細胞内で迅速かつ選択的にポリユビキチン化タンパク質の分解を行い、様々な細胞機能調節に関与する。本研究はプロテアソームのATP依存的な基質タンパク質の分解過程を高速AFMでの直接観察を目的とし、実験を行った。これまで、酵母プロテアソームの高速AFM観察には成功し、主として分解過程の最初の段階のプロテアソームと基質タンパク質との複合体観察を実施した。AFM観察における良好な画像取得には、サンプルの基板固定条件が重要である。これまでに、26Sの構造を観察するためにはアミノシラン修飾基板が適していることがわかっていたが、この基板では基質の非特異的吸着などの問題が生じ、基質との複合体観察頻度が非常に低く、研究進度が上がらなかった。また、基板上のプロテアソームの活性が保証できておらず、複合体観察に適した基板修飾を検討した。基板表面のプロテアソームの活性評価には、全反射蛍光顕微鏡による1分子観察系を用い、基板表面に固定したプロテアソームへの蛍光標識ATPの結合/解離を評価した。その結果、アビジンを介してPEG修飾基板に固定した基板上のプロテアソームにATPase活性があることを確認できた。さらにそれら解析からプロテアソーム中のAAAサブユニット間の共同的な加水分解反応を示唆するデータが得られた。しかし、PEG修飾基板に固定したプロテアソームの結合強度が低いためか、高速AFMでのプロテアソーム観察には適していないことが判明し、結合強度を高めることを検討する。上記の基板固定方法では、プロテアソームの基質結合部位(19S)を基板が物理的に阻害する可能性があるため、基質結合部位を上向きに固定する方法を検討し、その第一段階となる酵母20Sの基板固定が可能であることを示すことができ、今後基板上の20Sへの19Sの再構築への手がかりを得ることができた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目標は、巨大タンパク質分解装置である26Sプロテアソームの基質タンパク質分解過程を高速AFMで直接可視化することにある。H27ー8年度においては、主として26Sと基質タンパク質複合体の高速AFM観察による構造/ダイナミクス解析と新たな観察基板の構築を目的とし、研究を実施した。これまで、26S単体の高速AFM観察には成功しており、クライオ電験等で構造解析がなされている、26Sに特徴的なダンベル型の構造体が高速AFMで確認できていた。そこで、基板上に固定した26Sに基質タンパク質を添加し、さらに基質が分解してしまわないように、ATPアナログであるATPγS存在下でAFM観察を行った。その結果、頻度は依然として高くはないが、26Sの一方のRPに基質と考えられる構造体が付加した26Sが確認できるようになった。これらの観察を実施したなかで、基質の非特異的吸着が、複合体観察を難しくすることがわかった。そこで基質タンパク質の特異的吸着を低減する新たな基板構築を試みた。その結果、ポリエチレングリコール(PEG)修飾したガラス基板では、AFM観察用の基質タンパク質の非特異的な吸着が極めて低減できることを確認した。さらに、PEG修飾基板上にアビジンを介して26Sを選択的かつ高効率で基板に固定する条件について全反射蛍光顕微鏡を用いて見出した。今後は、PEG修飾基板上の26Sの構造観察と基質存在下における複合体観察および分解過程観察を実施する予定である。真核生物において、細胞内タンパク質の選択的かつ迅速な分解は、様々な細胞機能調節に関与する非常に重要な反応過程である。26Sプロテアソーム(26S)は分子量約250万の超巨大タンパク質分解装置であり、細胞内におけるタンパク質分解システムにおける中心的役割を担う。我々は、26Sによる基質タンパク質分解過程の動的構造変化を捉えるべく、高速AFMを用いて直接的な可視化に挑戦している。本年度は、主として研究代用者が所属する山形大学にて、全反射蛍光顕微鏡を用いて基質タンパク質の非特異的な吸着を低減した、基板条件の検討を行い、熊本大学小椋教授(連携研究者)が保有する高速AFMを用いて複合体等の観察を実施した。昨年度までに、26Sと幾つかの種類の基質タンパク質で分解中間体と思われる複合体を高速AFMで捉えられていたが、複合体として確認できる十分な解像度、観察時間を得ることができていなかった。本年度、添加するヌクレオチド、基板修飾条件、基質/プロテアソーム濃度等の条件を検討した。現時点で、複合体の観察頻度を大きく高くする観察条件は見出せないものの、幾つかの複合体の構造観察に成功した。より高解像度の複合体観察とその複合体の構造の揺らぎなどの動きを継続して観察を進める。上記の複合体観察において、基質タンパク質のAFM観察基板への非特異的吸着が原因で、基質濃度を上げることができず、高速AFMによる複合体観察のボトルネックであることが判明した。そこで、新たにガラス基板上にPEG修飾を施した基板を準備し、基質タンパク質の非特異的な吸着を低減することに成功した。さらに、そのPEG基板にアビジンを介して効率的に26Sを固定する条件を全反射蛍光顕微鏡を用いて確立することに成功した。

これまで、酵母プロテアソームの高速AFM観察には成功し、主として分解過程の最初の段階のプロテアソームと基質タンパク質との複合体観察を実施した。AFM観察における良好な画像取得には、サンプルの基板固定条件が重要である。これまでに、26Sの構造を観察するためにはアミノシラン修飾基板が適していることがわかっていたが、この基板では基質の非特異的吸着などの問題が生じ、基質との複合体観察頻度が非常に低く、研究進度が上がらなかった。また、基板上のプロテアソームの活性が保証できておらず、複合体観察に適した基板修飾を検討した。基板表面のプロテアソームの活性評価には、全反射蛍光顕微鏡による1分子観察系を用い、基板表面に固定したプロテアソームへの蛍光標識ATPの結合/解離を評価した。その結果、アビジンを介してPEG修飾基板に固定した基板上のプロテアソームにATPase活性があることを確認できた。さらにそれら解析からプロテアソーム中のAAAサブユニット間の共同的な加水分解反応を示唆するデータが得られた。しかし、PEG修飾基板に固定したプロテアソームの結合強度が低いためか、高速AFMでのプロテアソーム観察には適していないことが判明し、結合強度を高めることを検討する。上記の基板固定方法では、プロテアソームの基質結合部位(19S)を基板が物理的に阻害する可能性があるため、基質結合部位を上向きに固定する方法を検討し、その第一段階となる酵母20Sの基板固定が可能であることを示すことができ、今後基板上の20Sへの19Sの再構築への手がかりを得ることができた。これまで頻度が低いながらも複合体観察に成功している観察条件を軸として、「基板固定条件の改良」、「反応溶液の組成」および「観察用の基質タンパク質の改良」を行い、まずは、複合体観察を継続し、複合体観察頻度の向上を目指す。また、基質の非特異的吸着を低減したPEG修飾基板上における26Sの観察条件を確立し、基質濃度を飛躍的に高めた観察条件での複合体観察を計画している。また、現在26Sは基板上に横向き、つまりRPが基板と接触した状態で固定/観察している。この方向は、26Sの構造観察には適しているが、RPの“動き"を阻害している可能性があり、今後の分解反応追跡に支障が生じることが危惧される。そこで、RP部分の動きと基質結合を阻害しないように、円筒状の26Sを立てた状態で基板に固定し、高速AFM観察を計画する。28年度が最終年度であるため、記入しない。