hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中世台湾、琉球の海上交易品赤の色材（料）に関する研究

本研究では、琉球王朝盛時における赤と台湾の赤の色材(料)の伝来ルートを調査し、中世の色の活用と色材(料)を明らかとすることを目的としている。平成30年度の調査研究において、琉球王朝衣装の中に「桐板」と呼ばれる中国からの素材で製作された衣装の存在が確認できた。「桐板」とは、見た目は苧麻に類似し透明感があって独特の涼やかな質感を持ち、亜熱帯気候の夏用の衣装の素材として適した貴重なものであるとされている。平成30年度実施した台湾調査では、中世台湾の交易の中心とされた台中、台南には、その素材を確認することができなかった。また、中国における「桐板」の実態についても明らかとなっていない。今後更に、「桐板」について調査を進めることで、繊維素材や色材(料)の伝来ルートを明らかにする手がかりを得ることができると考える。現在までの研究から、明の時代にアジアの海を自由に渡航が許されていたのは、琉球王国であったことが明らかとなってきているが、隣接する台湾には、琉球や東南アジアからの海上での華やかな交易の記録が残されていない。その後、16世紀末日本国内での中国製品に対する需要が高まっていたにもかかわらず、日本との直接の貿易が禁止され、日本は台湾で中国商人と取引をしていたとされている。また、江戸幕府の三代将軍家光の頃、台南にも江戸幕府の交易船の寄港地があり、アジアの各国との貿易拠点として発展していたとされる。その後、17世紀誕生した東アジアの英雄といわれている鄭成功によって日本(平戸)と中国(福州)、台湾と海上交流があり、東アジア海域における南北の航路の要として台湾は重要な地となった。しかし、今回の現地調査では、台中では漢方薬が盛んに流通していた様子が残されているものの蘇芳や紅花の存在は見られず、琉球王国が盛んに蘇木の交易品を収集してきた国は、隣国の台湾ではなかったことが明らかとなった。申請者所蔵の「古紅型」試料は、調査を進めていくうちに那覇市歴史博物館収蔵資料(国宝)に最も近いことが明らかとなりつつあることから、当初予定していた手法(破壊分析)による分析を実施することは望ましくないとの判断に至った。そのため、別の手法として同分野研究者に聞き取りを実施し、最も適した分析手法のアドバイスを得ているところである。一方、文献による調査は進んでおり有用な情報の収集が得られている。このことから、所属関連学会(日本家政学会)に論文を投稿する準備を進めている。平成30年度の研究遂行内容の継続として、令和元(申請時平成31)年度の当初の研究計画どおり実施していく。当初研究からの調査から、1)台湾、沖縄の染色文化をまとめ、2)科学的分析調査のまとめ、3)研究成果発表(日本家政学会学会誌)をすすめ、中世の海上での色材(料)の交易品の実態調査研究から、中世における琉球と台湾を取り巻く海上交易と日本の染色文化の一端をあきらかとしていく。本研究では、琉球王朝における赤の色材(料)と台湾の赤の色材(料)の活用状況を調査し、中世の海上交易品としての赤の色材(料)の伝来ルートから、中世の色を明らかとすることを目的に、平成29年度は以下4項目について結果が得られた。(1)赤外線分光分析の実施。当初直ぐに分析データを取得する予定で進めていたが、申請者所蔵の「古紅型」試料が現在までの蛍光X線分析及び年代測定、類似試料からの写真照合による研究分析を進める中で、国宝に近い非常に貴重な試料であると判断にいたったことから、破壊分析の赤外線分光分析を実施することができない状態となった。そのため、分析手法の再調査に取り組み現在新たな手法の導入を進めている。(2)台湾の染色文化の調査。16世紀にオランダの東インド会社の交易拠点として大きく発展し、その時に、オランダからもたらされた植物が台湾全土に根付き栽培され、交易品としても扱われたこと。また、染色の原材料の紅花や蘇芳などについては、台湾での栽培はされておらず、スペインやイスラエルからの輸入で賄われていること。こうした輸入の形態は16世紀以降安定的にもたらされており、アジアでも大きなハブ港としての役割を裏付けるものであったことを明らかとした。(3)沖縄紅型に使用されている色材(料)の調査・分析。紅型に臙脂やプルシアンブルー(ベロ藍)が使用されていたことが明らかとなったことで、プルシアンブルーの開発が1704年にドイツであることから、使用年代を明らかとする新たな調査項目を得ることができた。(4)研究分担者は、色材の候補と考えられる顔料に含まれる元素の一覧作成に取り組み、蛍光X線分析により得られたデータから、使用されている色材の一部を特定することができた。これにより、色材(料)を判断する資料として有効的に活用することができた。平成29年度当初計画の赤外線分光分析の分析に至らなかった。原因は、申請者所蔵の「古紅型」試料が現在までの蛍光X線分析及び年代測定、類似試料からの写真照合による研究分析を進めるうちに、国宝に近い非常に貴重な試料である可能性が高まったことで、破壊分析の赤外線分光分析を実施することができない状態となったことによる。その後、分析手法の再調査に取り組み現在新たな手法の導入を進めている。また、台湾、沖縄の染色文化の究明にも取り組み有用な情報を得ることができている。

本研究では、琉球王朝盛時における赤と台湾の赤の色材(料)の伝来ルートを調査し、中世の色の活用と色材(料)を明らかとすることを目的としている。平成30年度の調査研究において、琉球王朝衣装の中に「桐板」と呼ばれる中国からの素材で製作された衣装の存在が確認できた。「桐板」とは、見た目は苧麻に類似し透明感があって独特の涼やかな質感を持ち、亜熱帯気候の夏用の衣装の素材として適した貴重なものであるとされている。平成30年度実施した台湾調査では、中世台湾の交易の中心とされた台中、台南には、その素材を確認することができなかった。また、中国における「桐板」の実態についても明らかとなっていない。今後更に、「桐板」について調査を進めることで、繊維素材や色材(料)の伝来ルートを明らかにする手がかりを得ることができると考える。現在までの研究から、明の時代にアジアの海を自由に渡航が許されていたのは、琉球王国であったことが明らかとなってきているが、隣接する台湾には、琉球や東南アジアからの海上での華やかな交易の記録が残されていない。その後、16世紀末日本国内での中国製品に対する需要が高まっていたにもかかわらず、日本との直接の貿易が禁止され、日本は台湾で中国商人と取引をしていたとされている。また、江戸幕府の三代将軍家光の頃、台南にも江戸幕府の交易船の寄港地があり、アジアの各国との貿易拠点として発展していたとされる。その後、17世紀誕生した東アジアの英雄といわれている鄭成功によって日本(平戸)と中国(福州)、台湾と海上交流があり、東アジア海域における南北の航路の要として台湾は重要な地となった。しかし、今回の現地調査では、台中では漢方薬が盛んに流通していた様子が残されているものの蘇芳や紅花の存在は見られず、琉球王国が盛んに蘇木の交易品を収集してきた国は、隣国の台湾ではなかったことが明らかとなった。申請者所蔵の「古紅型」試料は、調査を進めていくうちに那覇市歴史博物館収蔵資料(国宝)に最も近いことが明らかとなりつつあることから、当初予定していた手法(破壊分析)による分析を実施することは望ましくないとの判断に至った。そのため、別の手法として同分野研究者に聞き取りを実施し、最も適した分析手法のアドバイスを得ているところである。一方、文献による調査は進んでおり有用な情報の収集が得られている。このことから、所属関連学会(日本家政学会)に論文を投稿する準備を進めている。当初の研究計画通り実施していく。平成30年度は、1)沖縄染色文化の究明、2)台湾海上交易調査(標本の収集)、3)科学的分析手法の導入及び分析、4)研究成果発表、5)オープンアクセス化を目指し、中世海上の交易品に含まれる色材(料)調査から日本の染色文化を明らかとしていく。平成30年度の研究遂行内容の継続として、令和元(申請時平成31)年度の当初の研究計画どおり実施していく。当初研究からの調査から、1)台湾、沖縄の染色文化をまとめ、2)科学的分析調査のまとめ、3)研究成果発表(日本家政学会学会誌)をすすめ、中世の海上での色材(料)の交易品の実態調査研究から、中世における琉球と台湾を取り巻く海上交易と日本の染色文化の一端をあきらかとしていく。(理由)当初予定していた科学的分析手法による分析では、貴重な試料を破壊することになることから、次年度使用額が生じることとなった。すでに新たな分析法に対応しており、平成30年度合算として分析費用に充てる。(使用計画)
動機づけにおける前頭葉内側部の役割

多面的な動機づけの神経機構を明らかにするため、1.達成動機、2.自己効力感、3.自己決定感による内発的動機づけの促進の神経基盤について、機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)で検討してきた。1.行動を動機づける重要な要因の一つに達成目標があるが、ヒトの達成目標は質的に異なる2種類(自分の成績を超える「習得目標」と他者の成績を超える「遂行目標」)に大別される。それぞれの目標を設定して課題を行っている際の脳活動をfMRIで調べた。習得目標で課題を行っている際には動機付けが高く、遂行目標で課題を行っている際には、動機付けは成績と正の相関を示した。さらに、前頭前野外側部、腹側線条体が動機づけの大きさに応じて活動すること、また、側頭頭頂接合部が遂行目標のときよりも習得目標のときに強く活動することが明らかになった(2011年の北米神経科学大会、神経経済学学会において発表)。2.自分の行動によって特定の結果をうまく導くことができるという期待感は自己効力感と呼ばれており、その高低が動機づけに影響することが分かっているが、その神経基盤は不明である。前頭葉内側部-線条体-視床-前頭葉内側部という神経ループに着目し、自己効力感およびその動機づけへの影響の神経基盤を明らかにするため、自己効力感を調べるのに適した課題の検討を行った。3.外的報酬による内発的動機づけの低減効果(アンダーマイニング効果)において、前頭前野と線条体との相互作用が重要であることを2010年に報告したが、逆に内発的動機づけを促進する神経機構については、よく分かっていない。心理学的な先行研究から、この促進には自己決定感の有無が重要な役割を果たすことが示唆されているので、自己決定感の有無を制御した動機づけ課題を考案、課題プログラムの検討を行った。動機づけの神経機構を多面的に明らかにするため、以下の(1)達成動機、(2)内発的動機、(3)誘因価値の意識的変容についての脳の活動を機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)によって検討した。(1)行動を動機づける重要な要因の一つに達成目標があるが、ヒトの達成目標は質的に異なる2種類(習得目標と遂行目標)に大別される。それぞれの目標を設定して課題を行っている際の被験者の脳の活動を調べた結果、帯状皮質前部と腹側線条体が達成動機づけに一般的に重要な貢献をすること、そして島皮質が習得目標達成のために自身の過去の成績を参照することに関与するが他者の成績を参照する遂行目標には関与しないことが明らかになった。(2)動機づけは、外的誘因(お金や食べ物などの報酬)だけでなく内的な達成感(成功体験自体)にも依存する。そこで両者の動機づけを区別してそれぞれの神経機構を明らかにするため、fMRIを行ったところ、前部線条体など報酬関連領域が金銭報酬と成功自体の獲得に関与していることが明らかとなり、金銭報酬を付加された経験をすることにより、成功自体の価値が下がる効果(アンダーマイニング効果)が、それらの領域の脳活動に反映されていることが明らかとなった。(3)動機づけの強さは動因(e.g.空腹の度合いなど)と誘因の価値(e.g.食べ物の好みの度合い)の両方に依存しており、動機づけを自らコントロールする一つの方法として、誘因の価値の高さを意識的に変えることが考えられる。この誘因の価値の意識的変容の脳活動について検討した。その結果前部帯状皮質が、価値を意識的に変容させた度合いに相関した活動を示していること、また、その変容させた結果の価値の高さが前部線条体によって表現されていることが明らかになった。多面的な動機づけの神経機構を明らかにするため、以下の1.達成動機、2.内発的動機、3.誘因価値の意識的変容について、機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)で検討してきた。それぞれの目標を設定して課題を行っている際の脳活動を調べた結果、前頭葉内側部が達成動機づけに一般的に重要な貢献をすること、そして側頭頭頂接合部が、遂行目標のときよりも、習得目標のときに強く活動することが明らかになった。(Neuroeconomics 2011において発表予定)2.動機づけは、外的誘因(お金や食べ物などの報酬)だけでなく内的な達成感(成功体験自体)にも依存する。そこで両者の動機づけの神経機構について検討した結果、前部線条体など報酬関連領域が金銭報酬と成功自体の獲得に関与していること、そして金銭報酬を付加された経験をすることにより、成功自体の価値が下がる効果(アンダーマイニング効果)が、それらの領域の脳活動に反映されていることが明らかになった。(PNAS 107(49):20911-20916, 2010)3.動機づけを自らコントロールする一つの方法として、誘因の価値の高さを意識的に変えることが考えられる。その結果、価値を意識的に変容させた度合いに相関して前部線条体の活動も変化することが明らかになった。(PNAS 107(51):22014-22019,2010)

多面的な動機づけの神経機構を明らかにするため、1.達成動機、2.自己効力感、3.自己決定感による内発的動機づけの促進の神経基盤について、機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)で検討してきた。1.行動を動機づける重要な要因の一つに達成目標があるが、ヒトの達成目標は質的に異なる2種類(自分の成績を超える「習得目標」と他者の成績を超える「遂行目標」)に大別される。それぞれの目標を設定して課題を行っている際の脳活動をfMRIで調べた。習得目標で課題を行っている際には動機付けが高く、遂行目標で課題を行っている際には、動機付けは成績と正の相関を示した。さらに、前頭前野外側部、腹側線条体が動機づけの大きさに応じて活動すること、また、側頭頭頂接合部が遂行目標のときよりも習得目標のときに強く活動することが明らかになった(2011年の北米神経科学大会、神経経済学学会において発表)。2.自分の行動によって特定の結果をうまく導くことができるという期待感は自己効力感と呼ばれており、その高低が動機づけに影響することが分かっているが、その神経基盤は不明である。前頭葉内側部-線条体-視床-前頭葉内側部という神経ループに着目し、自己効力感およびその動機づけへの影響の神経基盤を明らかにするため、自己効力感を調べるのに適した課題の検討を行った。3.外的報酬による内発的動機づけの低減効果(アンダーマイニング効果)において、前頭前野と線条体との相互作用が重要であることを2010年に報告したが、逆に内発的動機づけを促進する神経機構については、よく分かっていない。心理学的な先行研究から、この促進には自己決定感の有無が重要な役割を果たすことが示唆されているので、自己決定感の有無を制御した動機づけ課題を考案、課題プログラムの検討を行った。
国画創作協会の総合的研究

大正7年1月に創立され,10年余の間に都合7回の展覧会を開催して昭和3年7月に解散した京都の作家集団・国画創作協会については,その創立会員であった小野竹喬,榊原紫峰,土田麦僊,野長瀬晩花,村上田弁次,浅野竹二,畦地梅太郎,石川利治,猪原大華,甲斐荘楠音,梶原緋佐子,要樹平,川上澄生,川西英,小松均,酒井三良,吹田草牧,徳力富吉郎,永瀬義郎,平塚運一,福田豊四郎,森谷南人子,山下摩起などについても,それなりの研究はされてきた。しかしながら87名に及んだ作家たちの全容については,従来総合的全体的に研究調査されたことがなかった。それを可能な限り追跡調査し,諸資料を収集すると共に,問題点を考察してみようとしたのが本研究の目的であったが,現存作家や遺族に当るなどした10名余を残して調査を進めることができた。その成果の一部をまとめてみたのが,報告書にみられる「関係作家生地・居住地・没地一覧」であるが,問題点の考察についてはそこ迄進みえなかったので,次の線にそってこれからの問題として考察したいと思っている。(1)国展解散後作家たちは概して苦難の道を進むことになったが,それによってどのようなことが言えるか。(2)作家達の多くは西洋に関心を持っていたようであったが,それは具体的にどのような姿をとるに至ったか。(3)また一方において伝統町な東洋はどのような影響を及ぼすことになったか。(4)一次的と言えるような作家と二次的な作家ができたが,その相違はどこにあり,その関係はどうなるのか。(5)大正・昭和前期の美術史における団体もしくはグループは,どのような意義をもつことになるのか。(5)1874年より1886年迄8回の展覧会を開いた例えばフランスの印象派と較べると,どこが異るのか。そしてこれらを含めて一人作品3点を含んだ総合的な一書を,近年中に上梓したいとも思っている。研究の初年度として、これまでに収集した資料を整理する一方、関係作家87名についての「生地・居住地・没地一覧図」をまず作成し、準備を整えた。そして関連する主要研究者、中でも笠岡市立竹喬美術館の上薗四郎氏、並びに諸研究機関・美術館博物館と連絡をとりつつ、次のような調査研究をおこなった。1、山形、新潟、長野方面を調査し、高山精華、丹野金示、恩田耕作、佐原修一郎、佐藤草白に関する新資料を収集したこと。2、愛媛、福岡、長崎方面を調査し、主として畦地梅太郎、金田和郎、牟田鶴一、粥川伸二などに関する資料を収集したこと。3、東京の日本美術院事務局と連絡をとり、資料交換をおこなったこと。4、現存作家について新見虚舟、要樹平、徳力富吉郎の諸氏を訪ねて意見の交換をおこなったこと。5、池田市で没した樫野南陽について、池田市立歴史民俗資料館と連絡をとりつつ調査を継続したこと。6、石川晴彦の生地近くの京都府立丹後資料館が下絵デッサン類を保管するに当り、それに協力したこと。

7、大正10年、小野竹喬・土田麦僊・長野瀬晩花と共にヨ-ロッパ巡行に出かけた洋画家黒田重太郎の蔵書について、若干の調査をおこなったこと。以上がその成果の概要である。なおこれに関連して【of sun】笠岡市立竹喬美術館に於て平成2年10月に開催された「新樹社の画家たち、国画創作協会の残英」は、上記上薗氏がその成果の一部を発表したものであり、またこの間において【of sun】田中日佐夫氏が『成城大学文学研究科・美学美術史論集第8輯第2部』に発表された吹田草牧に関する研究、並びに【of sun】福島県立美術館で開催された「酒井三良展」目録は、貴重なものと思っている。前年度にひき続き資料の整理をおこなう一方、関連する作家や遺族、或いは主要研究者並びに諸研究機関・美術館博物館と連絡をとりつつ、本年度は主として次のような新たな調査研究をおこなったが、本年度も昨年度に続いて笠岡市立竹喬美術館の上薗四郎氏の協力をうるところが大きかった。1、遺族関係調査を新たにおこない、戸田北遥、半田鶴一の遺族と接触して、情報を収集した。2、京都府下在住現存作家・上田真吾に会って新しい情報を収集した。3、茨城県在住現存作家・大路未黎と接触して新しい情報を収集した。4、岐阜県及び名古屋方面を調査し、主として森林丘関係について多数の資料を収集した。5、また吹田草牧の遺族より、新たに昭和14年10月に設立された山南会関係の記録資料の提供を受け、解読調査をおこなった。なお本年度中にはこの国画創作協会関係者の展覧会が各地でおこなわれたが、これにともなって関係者や遺族と接触し、資料集収につとめたものとしては、次のものがあげられる。(1)「福田豊四郎その人と芸術」山種美術館、8月24日10月20日。(2)「畦地梅太郎版画展」ナビオ美術館、10月17日27日。(3)小松均美術館の開館(平成2年11月2日であるが)。(4)「金田和郎回顧展」京都国立近代美術館、11月2日12月1日。(5)「足立美術館所蔵品による榊原柴峰展」奈良そごう美術館、12月27日平成4年1月26日。(6)「麻田弁自の遺作と所蔵品」展、京都市美術館、平成4年1月28日2月23日。前年度にひき続き笠岡市立竹喬美術館学芸員の上薗四郎氏と連絡をとりつつ関係作家や遺族、或いは諸美術館博物館・研究機関等をたずねて本年度も資料の収集整理をおこなったが、特に本年度は京都国立近代美術館主任研究員の島田康寛氏とも連絡を密にして、これ迄の研究成果を総合した図書『国画創作協会の総合的研究』を原田・島田・上薗の三名によって上梓できる具体案を作成した。これは適当な出版社をみつけ、近い将来に出版にこぎつけたいと思っている。なおまたそれとは別に、本研究の基礎にするために本研究の初年度に作成した87名の「生地・居住地・没地一覧」を補充訂正並びに詳細化をもおこなったが、これについては「研究成果報告書」及び「研究成果報告書概要」を参照していただきたい。このほかに本年度に新たにおこなった主な具体的調査は次の通りである。1.伊藤草白の遺族を鎌倉市にたずね、関係資料を収集したこと。2.吹田草牧の遺族を東京都日野市にたずね、意見交換すると共に関係資料を収集し、合せて関係者を紹介してもらったこと。3.茨城県竜ケ崎市に大路未黎氏を訪ねて意見を聞くと共に多数の関係資料を収集したこと。4.戸田北遥の遺族を仙台市にたずね、関係資料を多数拝見したこと。5.栃木県鹿沼市に平成4年9月8日に開館した鹿沼市立川上澄生美術館と連絡をとって、川上澄生の調査をおこなったこと。6.多くの関係作家と友人関係にあった天野大虹氏(京都市在住)から情報をえたこと。7.西宮市大谷記念美術館が開催した「山下摩起展」(平成5年1月15日2月14日
分子生物学的手法によるGS-Xポンプを指標とした化学物質の健康影響評価

本細胞系を用いてMRP1遺伝子発現を指標とする有害化合物の健康影響評価システムの開発のための基礎的検討を行ってきたが、本細胞系の正当性を検討するため、重金属の毒性発現に対する影響を詳細に検討した。その結果、Cd、Hgの細胞毒性に対して、HL-60/R-CPはHL-60よりも耐性であった。Cdの細胞内蓄積を比較したところ、濃度と時間依存的に蓄積量が増加するが、HL-60/R-CPはHL-60よりも有意に蓄積量が低かった。これにはGS-X pump活性による細胞外排出の関与が示唆された。CdやHgによる遺伝子誘導を検討したところ、メタロチオネインは処理後3時間から顕著にmRNAレベルが上昇したのに対し、MRP1は48時間後でも全く誘導が見られなかった。シスプラチン耐性機構としてMRP1遺伝子の発現誘導が示唆されているが、短時間の応答によるものでなく、持続処理で蛋白質レベルの上昇が起こるであろうと考えられた。GS-X pumpを指標とした生物学的モニタリングシステムの開発のためには、蛋白質レベルもしくは活性を指標とした系での検討が必要と思われた。GS-Xポンプと呼ばれるMRP遺伝子ファミリー産物は、アレルギー性疾患や炎症との関連が示唆されている。化学物質によるアレルギー性疾患発症との関連性を研究するための基礎として、農薬類によるGS-Xポンプ活性への影響の検討を開始した。クロロフェノキシ酢酸化合物(2,4,5-T、2,4-D、4-CPA、MCPA、2,4-DB、CPMP)の、GS-Xポンプを高発現しているヒト白血病細胞株及びその親株に対する細胞毒性(24時間法での細胞障害テスト、及び3日間培養法による細胞増殖阻害テスト)を測定したところ、いずれの化合物も細胞毒性は低く、100μMでもほぼ100%の細胞に影響が見られなかった。また使用した細胞株間で毒性の程度に差が見られなかった。MRP遺伝子ファミリーのmRNAレベルでの発現状況をnonRIノーザンブロット法で検討したところ、両細胞はMRP1、MRP4、MRP5を発現していたが、MRP2及びMRP3の発現は極めて低かった。対象化合物で処理した後、遺伝子発現(MRP1、MRP2、MRP5)が変動するか検討したところ、顕著な増幅や抑制は見られなかった。本培養細胞実験系においては、対象化合物の代謝酵素群が欠損している可能性があり、さらに対象化合物を代謝活性化した場合での検討が必要であると考えられた。また、アレルギー疾患や炎症と関連がある好酸球様分化細胞を用いた系での検討も必要であると考えられた。以上に加えて、別の対象化合物(有機リン化合物、ピレスロイド化合物など)についても検討する予定である。前年度に引き続き、農薬類化合物のGS-Xポンプ遺伝子発現への影響を検討した。まず、nonRIノーザンブロット法によるmRNAレベルの検出感度を上げるため、MRP1遺伝子断片をRT-PCR/TAクローニング法でRNApolymerase promoterを持つベクターにクローニングした。これより得られるnonRI標識アンチセンスRNAプローブを用いた事で、MRP1遺伝子発現の検出感度が数倍程度上がった。この検出系で、クロロフェノキシ酢酸化合物(2,4,5-T、2,4-D、4-CPA、MCPA、2,4-DB、CPMP)で長期間暴露した細胞(高GS-Xポンプ活性型ヒト白血病細胞株HL-60/R-CP及びその親株HL-60)において、MRP1遺伝子発現に変化があるか検討した。2,4,5-T、2,4-DB、MCPA、CPMPによってやや発現が上昇する傾向が見られたが、顕著な変化ではなかった。詳細については、統計学的検討が必要と思われた。また、対象化合物を代謝活性化した場合での影響を検討した。ラット肝臓マイクロソーム画分の存在下で、クロロフェノキシ酢酸化合物の細胞毒性を測定したところ、いずれの化合物でも代謝活性化による細胞毒性の顕著な変化は認められなかったが、HL-60/R-CP細胞では逆にprotectiveな傾向が見られた。同様に、カーバメイト系農薬(殺虫剤NAC、除草剤MCCおよびChloro-IPC)について、細胞毒性を検討した。これらの化合物はやや毒性が高く、3日間培養法でIC50が数10μMであった。この方法では細胞間の差はなかったが、24時間法で代謝活性化の影響を検討した実験では、NACがHL-60のみ毒性が数十倍増加した。この時細胞のviabilityに変化はなかったので、ミトコンドリア酵素の特異的阻害によるであり、HL-60/R-CPでは高レベル細胞内グルタチオンが耐性に関係したものと示唆された。これらに関して詳細な検討が必要と思われた。

CdやHgによる遺伝子誘導を検討したところ、メタロチオネインは処理後3時間から顕著にmRNAレベルが上昇したのに対し、MRP1は48時間後でも全く誘導が見られなかった。シスプラチン耐性機構としてMRP1遺伝子の発現誘導が示唆されているが、短時間の応答によるものでなく、持続処理で蛋白質レベルの上昇が起こるであろうと考えられた。GS-X pumpを指標とした生物学的モニタリングシステムの開発のためには、蛋白質レベルもしくは活性を指標とした系での検討が必要と思われた。
網膜再生に向けた視細胞の分化メカニズムの解析

Crxはotd/Otxホメオボックス遺伝子ファミリーに属する転写因子であり、変異マウスの解析結果からCrxが視細胞分化を決定づける因子であると考えられている。また、ヒトCrxの変異は失明を引き起こすいくつかの網膜疾患の原因であることが明らかとなっている。申請者らは以前Crxの発現が視細胞運命決定因子であるOtx2により制御されていることを明らかにした。CrxとOtx2は共通のDNA配列を認識する転写因子である。我々はCrxとOtx2の協同作用の解析を行う目的で、CrxとOtx2ノックマウスを掛け合わせ、Crx-/-;Otx2+/-マウスを解析することによりOtx2が視細胞の運命決定だけではなく成熟にも関わることを明らかとした。また双極細胞特異的にOtx2を欠損するマウスを作成し、Otx2は網膜双極細胞の成熟にも関わることを明らかとした(Koike,et al,2007)。さらにOtx2の発現は中枢神経系に広範囲であるにもかかわらず、Crxの発現は視細胞、松果体に限局していることから、Otx2以外のCrx発現の制御メカニズム解析を行った。Crxのプロモーター解析より、Otx2結合配列とは異なるCrxの視細胞特異的発現を誘導する14bpの配列(CUE配列)をCrx遺伝子上流近傍より同定した。CUE配列を変異させたCrx変異プロモーターの下流にLacZレポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを解析した結果、完全なCrxプロモーターによる制御下ではLacZの発現が網膜視細胞および松果体に限局しているのに対し、CUE配列変異プロモーターでは網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることが明らかにしている(投稿準備中)。マウスCrxの発現は網膜視細胞の発生パターンと時空間的に一致することが明らかとなっている。申請者らは以前Crxの発現がOtx2により制御されていることを明らかにした。Otx2の発現は中枢神経系に広範囲であるにもかかわらず、Crxの発現は視細胞、松果体に限局している。申請者らはCrxのプロモーター解析より、Crxの視細胞特異的発現を誘導する14bpの配列(CUE配列)をCrx遺伝子上流近傍より同定した。CUE配列を変異させたCrx変異プロモーターの下流にLacZレポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを解析した結果、完全なCrxプロモーターによる制御下ではLacZの発現が網膜視細胞および松果体に限局しているのに対し、CUE配列変異プロモーターでは網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることが明らかとなった。またトランスジェニックマウス解析により、CUE配列変異プロモーター下ではLacZの発現は脳および視細胞以外の網膜の全ての層において検出され、CUE配列がCrxの発現を抑制することにより組織特異性を誘導していることを明らかにしてきた。申請者らはこのCUE配列が、ヒト、チンパンジー、ラット、マウスで保存されていること、胎生期ラットの網膜、脳から粗核抽出画分を精製しゲルシフトアッセイを行った結果、これらの組織にCUE配列特異的に結合するタンパク因子が存在すること、またY79網膜芽腫細胞を用いてCUEがサイレンサー活性を持つことを明らかにした(投稿準備中)。Crxはotd/Otxボメオボックス遺伝子ファミリーに属する転写因子であり、変異マウスの解析結果からCrxが視細胞分化を決定づける因子であると考えられている。

また、ヒトCrxの変異は失明を引き起こすいくつかの網膜疾患の原因であることが明らかとなっている。申請者らは以前Crxの発現が視細胞運命決定因子であるOtx2により制御されていることを明らかにした。CrxとOtx2は共通のDNA配列を認識する転写因子である。我々はCrxとOtx2の協同作用の解析を行う目的で、CrxとOtx2ノックマウスを掛け合わせ、Crx-/-;Otx2+/-マウスを解析することによりOtx2が視細胞の運命決定だけではなく成熟にも関わることを明らかにした。また双極細胞特異的にOtx2を欠損するマウスを作成し、Otx2は網膜双極細胞の成熟にも関わることを明らかにし、報告した。(Koike, et. al.,2007)さらにOtx2の発現は中枢神経系に広範囲であるにもかかわらず、Crxの発現は視細胞、松果体に限局していることから、Otx2以外のCrx発現の制御メカニズム解析を行った。Crxのプロモーター解析より、Otx2結合配列とは異なるCrxの視細胞特異的発現を誘導する14bpの配列(CUE配列)をCrx遺伝子上流近傍より同定した。CUE配列を変異させたCrx変異プロモーターの下流にLacZレポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを解析した結果、完全なCrxプロモーターによる制御下ではLacZの発現が網膜視細胞および松果体に限局しているのに対し、CUE配列変異プロモーターでは網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることを明らかにした(論文投稿準備中)。
溶接固有ひずみの特性評価とそのビードフラッシュ法への適用

溶接構造物には,溶接線近傍に沿って固有ひずみ(熱ひずみ,塑性ひずみ,変態ひずみなど)が残留し,これが溶接残留応力の生成の原因となる.研究代表者は,溶接部の余盛りを除去する際の,弾性解放ひずみを逆問題解析することにより,固有ひずみを推定し,この固有ひずみから溶接残留応力を推定する「ビードフラッシュ法」を提案してきている.この手法の確立のためには,固有ひずみの基本特性が明確になる必要がある.そこで,本研究では,その有効性の検証を目的として,溶接過程のシミュレーションを行い,以下の結果を得た.(1)固有ひずみの基本特性:溶接過程のシミュレーションを行い,溶接条件,材料特性,部材の形状・寸法,などが溶接固有ひずみの分布に及ぼす影響を明らかにするとともに,「ビードフラッシュ法」の逆問題解析過程において,これらが解空間を限定する上において,どのような意味を有するかを明らかにした.(2)逆問題解析アルゴリズム:薄肉平板を厚肉平板に拡張するためには,逆問題解析の過程において,解空間の限定が必要である.そこで,解空間の限定に溶接シミュレーションを用いるアルゴリズムを考案した.(3)固有ひずみ特性のビードフラッシュ法への適用:以上の結果を基に,ビードフラッシュ法の溶接固有ひずみの逆問題解析時において,固有ひずみの解空間をどのように限定することができるかを明らかにした.溶接構造物には,溶接線近傍に沿って固有ひずみ(熱ひずみ,塑性ひずみ,変態ひずみなど)が残留し,これが溶接残留応力の生成の原因となる.研究代表者は,溶接部の余盛りを除去する際の,弾性解放ひずみを逆問題解析することにより,固有ひずみを推定し,この固有ひずみから溶接残留応力を推定する「ビードフラッシュ法」を提案してきている.この手法の確立のためには,固有ひずみの基本特性が明確になる必要がある.そこで,本研究では,その有効性の検証を目的として,溶接過程のシミュレーションを行い,以下の結果を得た.(1)固有ひずみの基本特性:溶接過程のシミュレーションを行い,溶接条件,材料特性,部材の形状・寸法,などが溶接固有ひずみの分布に及ぼす影響を明らかにするとともに,「ビードフラッシュ法」の逆問題解析過程において,これらが解空間を限定する上において,どのような意味を有するかを明らかにした.(2)逆問題解析アルゴリズム:薄肉平板を厚肉平板に拡張するためには,逆問題解析の過程において,解空間の限定が必要である.そこで,解空間の限定に溶接シミュレーションを用いるアルゴリズムを考案した.(3)固有ひずみ特性のビードフラッシュ法への適用:以上の結果を基に,ビードフラッシュ法の溶接固有ひずみの逆問題解析時において,固有ひずみの解空間をどのように限定することができるかを明らかにした.溶接構造物には,溶接線近傍に沿って固有ひずみ(熱ひずみ,塑性ひずみ,変態ひずみなど)が残留し,これが溶接残留応力の生成の原因となる.申請者らは,溶接部の余盛りを除去する際の,弾性解放ひずみを逆問題解析することにより,固有ひずみを推定し,この固有ひずみから溶接残留応力を推定する「ビードフラッシュ法」を提案してきている.この手法の確立のためには,固有ひずみの基本特性が明確になる必要がある.そこで,本研究では,その有効性の検証を目的とする第一段階として,溶接過程のシミュレーションを行い,以下の結果を得た.(1)固有ひずみの基本特は:溶接過程のシミュレーションを行い,溶接条件,材料特性,部材の形状・寸法,などが溶接固有ひずみの分布に及ぼす影響を明らかにするとともに,「ビードフラッシュ法」の逆問題解析過程において,これらが解空間を限定する上において,どのような意味を有するかを明らかにした.(2)固有ひずみと残留応力の相関:「ビードフラッシュ法」では,固有ひずみではなく.残留応力の評価が最終目標となる.そこで,上記(1)の結果を踏まえ,固有ひずみ分布と溶接残留応力の関係を明らかにした.(3)溶接シミュレーションのビードフラッシュ法への適用:「ビードフラッシュ法」では,逆問題解析の解析過程において,解の評価精度向上のために解空間の限定を行う必要がある.そこで,溶接シミュレーションがこの限定に如何に用いることができるかについて考察を加えた.溶接構造物には,溶接線近傍に沿って固有ひずみ(熱ひずみ,塑性ひずみ,変態ひずみなど)が残留し,これが溶接残留応力の生成の原因となる.申請者らは,溶接部の余盛りを除去する際の,弾性解放ひずみを逆問題解析することにより,固有ひずみを推定し,この固有ひずみから溶接残留応力を推定する「ビードフラッシュ法」を提案してきている.この手法の確立のためには,固有ひずみの基本特性が明確になる必要がある.そこで,本研究では,その有効性の検証を目的とすることを目的として,溶接過程のシミュレーションを行い,以下の結果を得た.(1)固有ひずみの基本特性:従来有効性が確認されていた薄肉溶接平板を厚肉溶接平板に拡張するため,厚肉溶接平板について溶接過程のシミュレーションを行い,溶接条件,材料特性,部材の形状・寸法,開先形状などが溶接固有ひずみの分布に及ぼす影響を明らかにするとともに,「ビードフラッシュ法」の逆問題解析過程において,これらが解空間を限定する上において,どのような意味を有するかを明らかにした.(2)逆問題解析アルゴリズム:薄肉平板を厚肉平板に拡張するためには,逆問題解析の過程において,解空間の限定が必要である.そこで,解空間の限定に溶接シミュレーションを用いるアルゴリズムを考案しした.

(3)応答曲面法:薄肉平板を厚肉平板に拡張するためには,非線型方程式を解く必要が生じる.そこで,その解法に応答曲面法を用いる手法を提案した.溶接構造物には,溶接線近傍に沿って固有ひずみ(熱ひずみ,塑性ひずみ,変態ひずみなど)が残留し,これが溶接残留応力の生成の原因となる.申請者らは,溶接部の余盛りを除去する際の,弾性解放ひずみを逆問題解析することにより,固有ひずみを推定し,この固有ひずみから溶接残留応力を推定する「ビードフラッシュ法」を提案してきている.この手法の確立のためには,固有ひずみの基本特性を明確にする必要がある.そこで,本研究では,溶接過程のシミュレーションを行い,その特性評価を行い,以下の結果を得た.(1)溶接の弾塑性解析:実際の溶接に際しては,溶接時の角変形を防止するため,溶接板に拘束を加える.溶接シミュレーションにより,この拘束がビードフラッシュ法の精度に及ぼす影響を評価し,拘束がない場合との比較において考察を加えた.(2)固有ひずみの特性評価:従来のビードフラッシュ法では,溶接線方向に沿って固有ひずみ分布は一定と仮定した.しかし,この仮定は一般には成立しない.そこで,溶接シミュレーションにより,固有ひずみの溶接線方向分布に及ぼす影響因子(入熱量,板厚,板幅,溶接速度,開先形状,溶接パス数)の影響を明らかにした.(3)固有ひずみ特性のビードフラッシュ法への適用:以上の結果を基に,ビードフラッシュ法の溶接固有ひずみの逆問題解析時において,固有ひずみの解空間をどのように限定することができるかを明らかにした.
トリパノソーマ科原虫のピリミジン合成系における第5、6酵素の生化学的解析

核酸前駆体合成系の中でもピリミジンde novo合成経路はほとんどの生物がこれを有し、核酸合成には不可欠な経路である。この経路は、また、プリン合成経路をsalvage経路に頼る原虫にとっても非常に重要であると考えられる。トリパノソーマ科原虫のピリミジンde novo合成経路は、他の生物の場合と同様、VMPまでの6酵素の連続反応から成る。本原虫の場合の特徴の1つとして、第5、第6酵素、それぞれOrotate phosphoribosyltransferase(OPRT)とOrotidine-5′-phosphate decarboxylase(OMP-DC)は、トリパノソーマ科原虫に特異な細胞小器官であるglycosome膜に独立に存在する点が考えられているが、活性の局在などその詳細はまだ明らかではない。glycosomeは一重膜の袋状構造を保ち、内部に解糖系酵素やβ酸化系酵素などが特異的に局在することから化学療法の標的としても注目されている。そこで本研究では、両酵素の特性を明らかにし、glycosome膜との結合性を明確に示す目的で、Trypanosoma cruzi培養虫体を遠心分画し、得られた画分の酵素活性を分光学的に測定し、さらにこれらの電顕観察を行なった。生化学的解析に要求されるT.cruzi培養虫体の大量培養は、ファーメンターまたは2lの三角コルベンにて実施し、効率よく大量の虫体を回収することができた。この虫体より、すでに確立したミトコンドリア画分調製法を応用した細胞分画法に従って、3,800×g沈渣、26,000×g沈渣、225,000×g沈渣および225,000×g上清の各画分を得た。26,000×g沈渣のOPRTおよびOMP-DCの比活性は、それぞれ6.8、16.5nmol/min/mg proteinと最も高く、至適pHは、8.1と6.5であり、Km値はそれぞれ59μM(Orotate)、5μM(OMP)であった。両酵素の活性の大部分は26.000×g沈渣に回収され、強い膜結合性を示すと考えられた。さらに、各画分の電顕観察により、26.000×g沈渣は比較的均一な一重膜袋状構造の顆粒を含むことが明らかとなり、両酵素の膜結合性とともに、glycosome膜との関連性が強く示唆された。
心筋におけるCa^<2+>ホメオスターシスの調節と収縮制御

心筋小胞体は,心筋の興奮-収縮連関において,細胞内Ca^<2+>濃度の増減を直接に調節している細胞内小器官である. Ca^<2+>の心筋小胞体への取り込みはCa^<2+>-ATPaseによって行なわれる.さらに,このCa^<2+>-ATPaseは,調節蛋白質ホスホランバンの燐酸化反応によって制御されている.燐酸化反応を司る酵素は,従来cAMP依存性プロテインキナーゼが知られていたが,最近,心筋小胞体に内在するカルモデュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼ)もまた燐酸化反応に関与することが見出された.本研究では,心筋小胞体の機能に対するCaM系の関与を調べることを目的として,次のような知見を得た.1)心筋細胞上清分画より,ミオシン軽鎖キナーゼ,ホスホリラーゼキナーゼとは異なるCaMキナーゼを均質な状態にまで精製した.ホロ酵素の分子量55万,サブユニットは5.5万であった. Ca^<2+>, CaMに対するKaはにわとり砂のう筋ミオシン軽鎖を基質としてそれぞれ1.1μMと67nMであった.2)心筋小胞体には,内因性にホスホランバンを燐酸化するCaキナーゼが存在した.トリトンX-100,高濃度の塩処理によっても本酵素を可溶化できなかった.3)細胞上清分画から精製したCaMキナーゼを小胞体に添加すると,ホスホランバン燐酸化反応が増強した.4)細胞上清分画酵素の基質特異性を調べると,脳のCaMキナーゼによって利用される基質はいずれも心筋酵素に役立ち,広い特異性を持つことが明らかになった.内因性基質を調べると,トロポニンIが燐酸化された.以上の結果は,心筋細胞上清分画には,ホスホランバンをCaM依存性に燐酸化するCaMキナーゼが存在していること,心筋小胞体にもCaMキナーゼが存在し,両者がホスホランバン燐酸化反応を介し, Ca^<2+>-ATPaseの調節に関与していることを示している.また,心筋上清分画と小胞体に存在するCaMキナーゼは同一であることが示唆された.心筋小胞体は,心筋の興奮-収縮連関において,細胞内Ca^<2+>濃度の増減を直接に調節している細胞内小器官である. Ca^<2+>の心筋小胞体への取り込みはCa^<2+>-ATPaseによって行なわれる.さらに,このCa^<2+>-ATPaseは,調節蛋白質ホスホランバンの燐酸化反応によって制御されている.燐酸化反応を司る酵素は,従来cAMP依存性プロテインキナーゼが知られていたが,最近,心筋小胞体に内在するカルモデュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼ)もまた燐酸化反応に関与することが見出された.本研究では,心筋小胞体の機能に対するCaM系の関与を調べることを目的として,次のような知見を得た.1)心筋細胞上清分画より,ミオシン軽鎖キナーゼ,ホスホリラーゼキナーゼとは異なるCaMキナーゼを均質な状態にまで精製した.ホロ酵素の分子量55万,サブユニットは5.5万であった. Ca^<2+>, CaMに対するKaはにわとり砂のう筋ミオシン軽鎖を基質としてそれぞれ1.1μMと67nMであった.2)心筋小胞体には,内因性にホスホランバンを燐酸化するCaキナーゼが存在した.トリトンX-100,高濃度の塩処理によっても本酵素を可溶化できなかった.3)細胞上清分画から精製したCaMキナーゼを小胞体に添加すると,ホスホランバン燐酸化反応が増強した.4)細胞上清分画酵素の基質特異性を調べると,脳のCaMキナーゼによって利用される基質はいずれも心筋酵素に役立ち,広い特異性を持つことが明らかになった.内因性基質を調べると,トロポニンIが燐酸化された.以上の結果は,心筋細胞上清分画には,ホスホランバンをCaM依存性に燐酸化するCaMキナーゼが存在していること,心筋小胞体にもCaMキナーゼが存在し,両者がホスホランバン燐酸化反応を介し, Ca^<2+>-ATPaseの調節に関与していることを示している.また,心筋上清分画と小胞体に存在するCaMキナーゼは同一であることが示唆された.
Dysfunctional HDLが冠動脈疾患の進展退縮に及ぼす影響の解明

高比重リポ蛋白(HDL)は、コレステロール逆転送、抗炎症、抗酸化など多彩な抗動脈硬化作用を有するが、炎症や糖尿病などの病態では質的変化をきたす(dysfunctional HDL)。血清ミエロペルオキシダーゼ(MPO)/パラオキソナーゼ1(PON1)比が高い患者ではHDLの抗炎症作用が減弱しており、同比がdysfunctional HDLの臨床マーカーとなることを示した。さらにMPO/PON1比が冠動脈形成術後の病変再発と相関することより、HDLの質的変化が冠動脈疾患の発症・進展に関連することが示唆された。一方、スタチン治療によりHDL-C値が増加するが、コレステロール引抜き能や抗酸化能も増強することを証明した。高比重リポ蛋白(HDL)は、コレステロール逆転送、抗炎症、抗酸化など多彩な抗動脈硬化作用を有する。しかし、炎症や糖尿病などの病態では、HDLの構成成分が変化し動脈硬化を促進するdysfunctional HDLが生成される。本研究は、日本人患者でDysfunctional HDLを同定および定量化し、その機能評価を行なった。また、光干渉断層法(OCT)等の冠動脈画像診断法を用いて、冠動脈粥腫病変の進展・退縮とHDLの質的変化との関連について検討した。1) dysfunctional HDLの指標として、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)とパラオキソナーゼ1(PON1)を測定し、患者血清中のHDLの抗炎症作用とMPOおよびPON1との関係を検討した。冠動脈疾患患者では血清MPOが高くPON1活性が低かった。その結果、冠動脈画像診断(冠動脈造影とOCT)を用いて評価した冠動脈形成術後のステント再狭窄や非ステント留置部位に新規病変の進展が認められた患者においてはMPO/PON1比が著明に高値を示し、冠動脈疾患の進展退縮を制御していることが証明された。患者HDLを用いた生化学的検討により、MPO/PON1比が高い患者のHDLは、サイトカインによるVCAM発現抑制作用が減弱していた。すなわち、MPO/PON1比はdysfunctional HDLの臨床マーカーとなることが証明された。2)スタチン治療後にHDL-C値が増加することが知られているが、スタチン治療後のHDL質的変化は不明である。そこで、スタチン投与前後の血清におけるHDL質的評価を行った。ピタバスタチン投与によってHDLは増加したが、増加したHDLの引抜き能や抗酸化能は保たれていた。すなわち、HDLが増加した分に比例してHDL機能も増強しており、スタチンの粥腫抑制作用に関与していることが示された。当院倫理委員会承認後、当院循環器内科入院患者より早朝空腹時採血を行い、血清を回収した。その血清を用いてメタボローム解析を行い、各患者血清における脂肪酸組成の解析を行った。血清中とHDL粒子中のEPA/AA ratioとパルミチン酸濃度は、正の相関を示すことを確認し、血清中のEPA/AA ratioは、血清中LDLコレステロールと負の相関を示した。血清中パルミチン酸濃度は、血清中LDLコレステロールや中性脂肪(TG)量と正相関を示し、HDLコレステロールとの相関はなかったが、HDL-TG含有量と強い正相関を認めた。健常ボランティアのHDLにおいて、HDLコレステロール引き抜き能と、EPA/AA ratioに有意な相関関係はみられていないが、入院患者で高HDL血症患者においては、HDL引き抜き能とEPA/AA ratioに正の相関の傾向が見られている。HDLパルミチン酸濃度は、健常ボランティアにおいて、HDL抗酸化作用と負の相関の傾向が見られている。患者血清のストックは十分量確保できており、メタボローム解析も順調に進んでいる。現状、HDLの質的評価については、少数のサンプルしか行えていないが、平成24年度に、計画的に進めていく予定である。健常ボランティアや入院患者ともに解析を進めていく予定である。血清パルミチン酸濃度が、HDL中の中性脂肪割合と相関し、HDL-TGが、冠動脈疾患患者で有意に増加していたという国内の報告もあることから、動物実験あるいは、実験室において、パルミチン酸含有量の多いHDLを作成し、コレステロール引き抜き能や抗酸化能を調べる。現在は、サンプル集積の途中であるが、冠動脈造影、IVUS、OCTを用いて冠動脈粥腫病変の性状を評価するとともに、高感度の質量分析計を用いてHDL粒子中の脂肪酸組成を分析し、HDLの抗動脈硬化作用との関連を検証する予定である。メタボローム解析用の質量分析装置の消耗品購入に使用予定。今後、細胞や酸化ストレス測定試薬、RIなどを用いて、HDLの質的評価を行う予定のため、その消耗品、試薬の購入費に充てる。
植物と酵母における液胞形態形成及び液胞タンパク質輸送に関与する遺伝子の取得と解析

昨年、分裂酵母の全ゲノム塩基配列が明らかにされた。そこで分裂酵母全ゲノムのデータから以下の遺伝子を同定して機能解析を行った。(1)分裂酵母の全ゲノムから出芽酵母の液胞タンパク質輸送に関与するVPS遺伝子と相同性の高い遺伝子を同定して、これらの遣伝子破壊株を50以上作成した。多くの破壊株で液胞タンパク質が細胞表層へとミスソートしていることを確認出来たが、全く表現型を示さない株も見いだされ、出芽酵母との相違点を明らかにすることが出来た。(2)分裂酵母の液胞局在ATPアーゼの欠損株を取得した。本破壊株は液胞の酸性化に欠損を示し、液胞タンパク質輸送やエンドサイトーシスなどの細胞内タンパク質輸送経路に欠損を示すことを明らかにした。(3)分裂酵母の小胞輸送に関与する16個の全SNAREタンパク質をコードする遺伝子を単離して、機能解析を行った。その結果、出芽酵母のどのSNAREとも高い相同性を示さないSPAC6F12.03C遺伝子破壊株が液胞タンパク質を細胞表層へとミスソートすることを明らかにした。(4)分裂酵母の液胞の融合に関与するタンパク質の同定を試みた。その結果、出芽酵母のVPS16とVPS33と相同性の高い分裂酵母遺伝子破壊株は液胞形態形成に欠損を示すが、VPS11やVPS18ホモログ遺伝子破壊株は液胞形態に欠損を示さないことがわかり、出芽酵母との相違点を明らかにすることが出来た。(5)分裂酵母のエルゴステロール合成に欠損を示す株を単離し、解析を行った。その結果エルゴステロール欠損株は液胞の融合が起こらないことがわかり、ステロールの液胞形態形成への関与が強く示唆された。液胞は酵母及び植物細胞において様々な機能を果たしていることが明らかになりつつある。出芽酵母において液胞へのタンパク質輸送に欠陥を示すvps変異株の解析から40種類以上もの遺伝子が、液胞タンパク質輸送に関与していることが明らかにされている。しかしながら分裂酵母においては液胞へのタンパク質輸送に関する機構は全く知られていない。そこで分裂酵母の液胞タンパク質マーカーとしてカルボキシペプチダーゼY(CPY)遺伝子を単離して、本酵素の液胞への輸送機構について解析を行った。その結果、分裂酵母CPYは出芽酵母など他起源の酵母CPYとは異なり、高等な植物などと同様にヘテロダイマーとして存在することを明らかにした。液胞へのCPYの輸送には高等動物とは異なり糖鎖部分は関与しないが、その糖鎖はERで合成される場合のタンパク質のフォールディングに重要であることがわかった。またCPYへの液胞への輸送シグナルはタンパク質のプロペプチド部分に含まれていることがわかった。さらに分裂酵母CPYが誤って細胞表層へとミスソートされてしまう変異株を多数取得することができた。これらの変異株の中には、既に出芽酵母において液胞へのタンパク質輸送に関与することが知られているVPS34,VPS4,VPS5,VPS11,VPS19,VPS45などが含まれていることがわかり、これらのタンパク質が生物種を越えて広く真核生物のタンパク質輸送に関与することを明らかにすることができた。CPYやインベルターゼなどの分裂酵母における糖タンパク質の分泌に欠陥を示す変異株を取得した。これらの変異株を相補する遺伝子の中には、出芽酵母のERからゴルジ装置のタンパク質の輸送に必須なErd1タンパク質や、ゴルジ間のタンパク質輸送に関与する低分子量G-タンパク質のYpt6などのホモログ遺伝子であることがわかり、分裂酵母のER、ゴルジから液胞または細胞表層へのタンパク質の分泌機構を解析する系を確立することができた。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて液胞タンパク質の液胞への輸送経路が複数存在することが明らかにされつつある。これまでに分裂酵母Schizosaccharomycespombeには複数の液胞へのタンパク質輸送機構が存在するかは全く明らかにされていなかった。我々は分裂酵母の鉄イオンの取り込みに関与する細胞表層局在複数膜貫通タンパク質をコードするpdt1遺伝子を取得し、本タンパク質が分裂酵母内で細胞表層からエンドサイトーシスにより液胞へと輸送されることを見いだした。またアクチン関連遺伝子を破壊した分裂酵母変異株はPdt1タンパクの液胞へのエンドサイトーシスが阻害されていることを見いだした。次に出芽酵母において液胞膜に局在するアルカリホスファターゼ(ALP)と相同性の高い遺伝子を単離し、本タンパク質が分裂酵母においてALP活性を示すこと、動物や出芽酵母で明らかにされているアダプチン(AP-3)複合体を介して液胞へと輸送されていることを明らかにした。さらに分裂酵母において窒素飢餓特異的に発現する遺伝子として取得されていた遺伝子であるisp6遺伝子産物が、分裂酵母の液胞セリンプロテアーゼであることを証明し、その液胞への輸送機構について明らかにした。以上の結果から分裂酵母にも複数の液胞タンパク質輸送経路が存在することを明らかにすることができた。植物の液胞は種々の化合物の蓄積・解毒コンパートメントとして知られているが、我々は抗真菌剤であるナイスタチンに強い感受性を示す出芽酵母変異株を取得して解析を行ったところ、液胞形態形成に関与するVPS16遺伝子に変異が生じたものであることがわかった。さらに解析の結果、出芽酵母の液胞はナイスタチンの耐性に深く関与していることがわかり、酵母液胞が各種薬剤の解毒コンパートメントとして機能していることを明らかにした。