hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体への埋め込みを目指したグルコース/酸素型バイオマイクロ燃料電池の開発

生体埋め込みを目指した安全で小型なバイオ燃料電池の開発を目的とし,本年度は(1)電極構成物質の完全固定化,(2)電圧向上のためのセル設計,(3)出力電力の安定化システムの開発,(4)体内への埋め込みを指向した小型針電極の作製と生体内での性能評価を行った.1.補酵素NAD(H)(ニコチンアミドアデュンジヌクレオチド)をポリマー化することで電極反応に関与する構成物質の全固定化を行った,安定性は十分でないものの,1mAcm^<-2>程度のグルコース酸化電流を得られる電極を作製することができた.2.電池の出力電圧向上のためのセル設計を行った,超撥水表面を組み込んだマイクロ流路セルを作製することで,3つのバイオ燃料電池をほぼ自動で直列化することに成功し,1V以上の電圧を獲得することができた.3.電池出力の安定化を,発電方式により行うことを目指した時差発電システムについて,基礎試験を行った.生分解性の高分子(PLGA:Poly(lactic-co-glyiolic)acid)を用いたシステムを作製することで原理の実証を行い,時差発電システムにより,安定した出力が可能であることを示した.4.バイオ燃料電池の皮下埋め込みを想定した,小型・針型バイオ燃料電池の検討を行った,小型で皮下への挿入操作が可能であることや,電極表面の生体適合性に配慮した電極を作製し,生体内での試験を行った.その結果と,電極表面の観察,体外での実験結果を考察したところ,生体内での不安定な出力挙動は,電極表面への吸着物質によるものと推測した.我々はこれまで,安全で体内埋め込み可能な小型電源を開発するために酵素を触媒としたグルコース/酸素型のバイオ燃料電池の研究を行ってきた.ここで特徴的なのは,グルコースの酸化極であるアノードの電子メディエータに有機物であるビタミンK3を用いていることで安全性を高めている点である.本年度は更なる電極性能の向上のため,新規にビタミンK3ポリマーの合成を行うことで,飛躍的な性能の向上を達成することに成功した.さらにカーボンブラックの利用によりグルコースの酸化電流密度は2mAcm^<-2>にまで達した.次に微細加工によってマイクロ流路型のバイオ燃料電池を作製することで,このグルコース酸化極のバイオ燃料電池のアノードとしての性能を評価した.マイクロ流路型バイオ燃料電池の利点としては,このまま小型電源として使用できることのみならず,燃料溶液の送液状態をコントロールできるため,電極の性能のみを様々な条件において定量評価できるという点にある.これにより,バイオ燃料電池の出力の流速依存性,耐久性を評価した.さらなるマイクロ流路型バイオ燃料電池の研究を進めており,電池の構造といった面においての,バイオ燃料電池性能に与える影響などの検討も行っている.これまで我々が研究してきたバイオ燃料電池の酸素極(カソード)は白金電極であり,反応選択性,また酸素還元能といった点からも,カソードに酵素電極を用いることが望ましい.そこで,中性において酸素の4電子還元が可能であるビリルビンオキシダーゼという酵素を用いた酵素カソードの研究も行い始め,これを用いることで,電池の電圧,電力を上昇させることができた.体内で発電するバイオ燃料電池を目的とし,本年度は(1)カソードの酵素化や,(2)流路中に配置した電極の位置や流路構造の違いによる発電量の検討を中心とした研究を行った.1.酵素カソード(+極,酸素還元極)は電極にカーボンブラック電極を利用し,そこに酸素還元活性を有す酵素であるビリルビンオキシダーゼを吸着させることにより作製した.作製した酵素カソードの性能を流路型のセルで評価したところ,白金電極に比べて,より高い電位からの酸素還元が観測され,電池のカソードとして用いた場合に0.2V程度大きな電圧を得られることがわかった.2.電極構造や流路高さを変えたマイクロ流路型バイオ燃料電池の出力比較を行った.カソードとアノードの位置関係については,カソードをアノードの上流に配置することで,アノード近傍での酸素濃度を減少させることができ,10%程度大きな出力が得られることがわかった.また,流路高さが低い場合には流路内の酸素の欠乏により電池出力が減少することもわかった.これらの現象はシミュレーションや計算結果からもある程度推測できるものであった.高性能な酵素カソードを作製できたことにより,電池出力の向上のみならず,反応選択性も付与させることができたため,体内のような燃料以外に様々な物質を含む環境下での発電が可能となってきた.血管内を模擬したマイクロ流路中において,電極の配置や,流路高さつまり流路径といったものが電池性能に影響することがわかったことから,埋め込み部位の血管径への配慮が必要であり,その際シミュレーションによる,ある程度の推測が有効であると考えられる.生体埋め込みを目指した安全で小型なバイオ燃料電池の開発を目的とし,本年度は(1)電極構成物質の完全固定化,(2)電圧向上のためのセル設計,(3)出力電力の安定化システムの開発,(4)体内への埋め込みを指向した小型針電極の作製と生体内での性能評価を行った.1.補酵素NAD(H)(ニコチンアミドアデュンジヌクレオチド)をポリマー化することで電極反応に関与する構成物質の全固定化を行った,安定性は十分でないものの,1mAcm^<-2>程度のグルコース酸化電流を得られる電極を作製することができた.

2.電池の出力電圧向上のためのセル設計を行った,超撥水表面を組み込んだマイクロ流路セルを作製することで,3つのバイオ燃料電池をほぼ自動で直列化することに成功し,1V以上の電圧を獲得することができた.3.電池出力の安定化を,発電方式により行うことを目指した時差発電システムについて,基礎試験を行った.生分解性の高分子(PLGA:Poly(lactic-co-glyiolic)acid)を用いたシステムを作製することで原理の実証を行い,時差発電システムにより,安定した出力が可能であることを示した.4.バイオ燃料電池の皮下埋め込みを想定した,小型・針型バイオ燃料電池の検討を行った,小型で皮下への挿入操作が可能であることや,電極表面の生体適合性に配慮した電極を作製し,生体内での試験を行った.その結果と,電極表面の観察,体外での実験結果を考察したところ,生体内での不安定な出力挙動は,電極表面への吸着物質によるものと推測した.
ペプチド化合物のリボソームとNRPSによる協同的新規生成機構の解明

放線菌が生産するペプチド系抗生物質、フェガノマイシン(PM)は、N-末のフェニルグリシン誘導体(PheGly)に長さと配列の異なるペプチド(NVKDRとNVKDGPT)が結合している2種類が知られている。その生合成研究を行った結果、2つのペプチド部分がリボソームにより、38アミノ酸からなるプレカーサーペプチドとして供給されること、さらにATP-graspモチーフを持つPGM1がPheGlyをATP依存的にリン酸化し、次いで、2つのペプチドが求核剤として働くことを明らかにした。本酵素は幅広い基質特異性を有したことから結晶構造解析も行った。放線菌が生産するフェガノマイシン(PM)は、N-末のフェニルグリシン誘導体に長さと配列の異なるペプチド(NVKDRとNVKDGPT)が結合している2種類が知られている。その生合成を予測すると、非タンパク性のアミノ酸をN-末に持つことからNon Ribosomal Peptide Synthase(NRPS)により生合成されると推定されるが、NRPSは基質であるアミノ酸を活性化するアデニレーション(A)ドメインの認識は厳密であることから、どのような機構でこの多様性が導かれるか興味が持たれた。そこで、その生合成遺伝子クラスターの同定を試みた。ドラフトゲノム配列中にフェニルグリシン誘導体の生合成遺伝子オルソログを探索し目的クラスターを見出した。しかし、最長8つのアミノ酸を活性化できる巨大なNRPSは存在しなかった。そこで、ペプチド部分がリボソーム関与で合成される可能性を考え塩基配列を精査した結果、両ペプチド配列を含む38アミノ酸からなる遺伝子を見出した。本遺伝子の関与は、遺伝子破壊によるPM生産性の消失により確認した。次いで、フェニルグリシン誘導体とペプチド(NVKDRとNVKDGPT)のペプチド結合を触媒する酵素をクラスターに探索した。これまでペプチド結合を触媒する酵素の多くはATPを要求する。そこでATP結合モチーフを持つ遺伝子を探索した結果、前駆体ペプチドをコードする遺伝子上流に機能未知の候補遺伝子を見出した。本遺伝子を破壊した結果、PMの生産性が消失したことから、組換え酵素を用いて実証実験を行った結果、両基質のペプチド結合を触媒することが分かった。本酵素は、ペプチドを求核剤とする初めての例であるとともに、リボソームとペプチドライゲースという機構の異なるマシナリーによるペプチド生成の初めての例でもある。放線菌が生産するペプチド系抗生物質、フェガノマイシン(PM)は、N-末のフェニルグリシン誘導体に、長さと配列の異なるペプチド(NVKDRとNVKDGPT)が結合している2種類が知られている。昨年度筆者は、その生合成研究を行い、2つのペプチド部分がリボソームにより、38アミノ酸からなるプレカーサーペプチドとして供給されること、さらにATP-graspモチーフを持つPGM1がフェニルグリシン誘導体をATP依存的にリン酸化し、次いで、NVKDRとNVKDGPTが求核剤として働きPMを生成することを明らかにした。今年度、組換え酵素を用いて詳細な酵素学的諸性質を解析した。その結果、本酵素は幅広い基質特異性を有することが分かった。N-末として、D-amidino phenylglycine、2-guanidinoacetic acid、creatineも基質となった。さらに求核剤として、NVKDGPTの任意のアミノ酸を他に置換した種々のペプチドやC-末からアミノ酸を順次欠失させたジペプチドまでの各種ペプチド、さらにはPGMとは全く関連が無い、アスパルテームや昆虫由来の18アミノ酸から成る抗菌ペプチドapidaecinも基質となることが分かった。本酵素が示す幅広い基質特異性を理解するため、結晶構造解析も行った。種々の基質との結晶化を試みた結果、AMPとの複合体として結晶を得ることが出来た。解析の結果、配列相同性が18%と低いが、同じくATP-grasp superfamilyに属する、Glycinamide ribonucleotidesynthase(PurD)と構造的に類似していることが解った。また、N-末のグアニジノ基の認識や求核剤として働くペプチドの認識に関わるアミノ酸残基をドッキングシュミレーションにより推定し、変異導入実験により確認した。生合成工学当初、フェニルグリシン誘導体とリボソームで合成された前駆体ペプチドが、生合成遺伝子クラスター上流に見いだされたNRPSで生合成されると仮定し実証を試みたが予想に反する結果となった。しかし、クラスターの遺伝子を精査した結果、ペプチドを求核剤として用いる新規ペプチドライゲースを見出した。この新規ペプチドライゲースについて、基質特性など詳細な酵素学的諸性質を調べる。また、ゲノム解析された他の放線菌にも本遺伝子のオルソログが存在することから合わせて機能解明を行う。3月納品分の支払が4月にずれ込んだため。3月に納品済
マイクロ流路長期培養系を用いた大腸菌の細胞伸長における表現型可塑性の解析

一細胞培養系を用いて、大腸菌の細胞伸長に関わる3要因を解析した。(仮説A)「捕食回避説」、(仮説B)「低密度良好説」、(仮説C)「環境ストレス説」である。細胞密度・増殖環境変化に伴う細胞伸長作用とrecA遺伝子発現の関連性を調べた。その結果、一部細胞でrecA遺伝子プロモーター活性が高くなり、recAを強く発現する細胞("高recA発現細胞")は細胞サイズの大きい伸長細胞であった。また、細胞密度が高まると伸長細胞頻度や高recA発現細胞数が増加した。細胞密度の増加は、老廃物の蓄積や栄養塩の枯渇をもたらし、環境ストレスが増加することで、細胞伸長とrecA遺伝子発現をもたらしている。代表的な単細胞生物である大腸菌は、さまざまな環境要因によって細胞が伸長する表現型可塑性の現象が知られている。例えば、貧栄養条件で細胞が伸長する報告、逆に富栄養条件に置くと細胞が伸長するとの報告、さらには、捕食者の原生生物(テトラヒメナ)を培養してカイロモンが混じっている培養液で飼育すると捕食防衛のために細胞が伸長する報告など、いまだに結論が出ていない。よって、1細胞培養計測系を用いて体系だった実験デザインで、大腸菌をさまざまな栄養条件に置くことで、どのような遺伝子が発現するのかを、精密に測定することを試みた。大腸菌内でのプロモーター活性を蛍光シグナルを利用して調べた結果、増殖に伴い、一部の細胞において、SOS応答とDNAの組み替えに関わるrecA遺伝子が強く発現することを確認した。またrecAを強く発現する細胞の多くは細胞サイズの大きい伸長細胞であることも確認した。この結果から、細胞の密度増加とともにrecA高発現細胞が増える「密度依存仮説」をたて、培養開始後4時間後、6時間後、8時間後、11時間後のクローン細胞を捕集し、細胞伸長とrecA発現量の解析を行っている。今後1細胞長期培養系を用い、強いrecA発現が世代をまたいで娘細胞に引き継がれるかを検証するとともに、伸長細胞を分取してDNA配列変化の有無を精査し、表現型可塑性に伴う遺伝情報の変化(進化)が起きているか検証する予定である。嶋田と大林夏湖(嶋田研特任研究員)は、連携研究者・若本の開発した1細胞培養計測系での大腸菌内でのプロモーター活性を、蛍光シグナルを利用して調べた。その結果、一部細胞で、増殖に伴いSOS応答とDNAの組替えに関わるrecA遺伝子(以下recA)が強く発現し、recAを強く発現する細胞(以下「高recA発現細胞」)は細胞サイズの大きい伸長細胞であることを確認した。この結果から、細胞の密度増加とともに高recA発現細胞が増える「密度依存仮説」をたて、バッチ培養系で特定時間培養後のクローン細胞を捕集し、recA発現量(レポーター遺伝子GFPの輝度)と細胞伸長(細胞分裂に関わる別のレポーター遺伝子の輝度)の解析を行った。液体培地での4時間、6時間、8時間、11時間培養後の高recA発現細胞は、それぞれ、3/217, 1/202, 5/233, 27/212(高recA発現細胞数/全細胞数)であった。また伸長細胞は10/217, 2/202, 47/233, 35/212(伸長細胞数/全細胞数)であった。伸長かつ高recA発現した細胞は8時間後で2細胞、11時間後で3細胞であり、4時間、6時間後には観察されなかった。以上の結果から、(1)伸長細胞頻度は培養時間とともに増加、(2)高recA発現細胞頻度も培養時間とともに増加したことから「密度依存仮説」が支持された。一方、(3)伸長かつ高recA発現の細胞数はわずかであり、必ずしも両者の相関は強くなかった。この結果は伸長状態と高recA発現の相関が1細胞計測系とバッチ培養系で異なる可能性を示唆している。寒天培地を用いた1細胞計測系では、細胞内で高いrecA発現が持続する間は細胞分裂が抑制されて伸長が続き、細胞内のrecA発現が弱まると分裂を再開する様子が観察され、高recA発現と細胞伸長の間には関連性があることが推測された。生物学平成25年度(2年目)には、単細胞生物シアノバクテリアの実験を経験している特任研究員を雇用することができたので、1細胞培養計測系を使ったデータ測定が飛躍的に進行した。初年度

平成24年度に雇用していたRAの院生が自分本来のテーマに集中したいとのことで実験を離れて業務に穴が開いてしまい、それを補うべく嶋田研で博士学位を取得した特任研究員を雇用して研究が再スタートしたが、この特任研究員も新たな大型プロジェクトの特任研究員に使用されたために、この研究課題に対して決まった院生または特任研究員が不在の状態が生じてしまった。しかし、H25年5月に別の独立行政研究機関から特任研究員を雇用することができたので、ようやく研究体制が整備されたのである。これにより、ストレス環境下におけるrecA遺伝子の発現の解析が大いに進み、recAを強く発現する細胞は、細胞サイズの大きな伸長細胞であることを確認した。形質転換体を作製し、細胞伸長とストレス応答遺伝子発現をGFPで観測することで、クローン内の細胞に異質性があることを把握できた。また、これが分裂後の娘細胞に継承されることが示唆される結果を得たのは、初年度としては重要な結果である。また、1細胞培養計測系の技術を珪藻の性比調節に適用して、単細胞生物での進化のゲーム理論に適合する世界初の結果を報告している。変動環境下での大腸菌内で発現するSOS遺伝子について、プロモーター活性を蛍光シグナルを利用して調べた結果、増殖に伴い、一部の細胞において、SOS応答とDNAの組み替えに関わるrecA遺伝子が強く発現することを確認した。またrecAを強く発現する細胞の多くは細胞サイズの大きい伸長細胞であることも確認した。これらの結果から、細胞の密度増加とともにrecA高発現細胞が増えることに着目し、培養開始後からの時間経過に従ったクローン細胞を捕集し、細胞伸長とrecA発現量の解析を行っている。今後は、1細胞長期培養系を用い、recA発現の強さが世代をまたいで娘細胞に引き継がれるかを検証するとともに、伸長細胞を分取してDNA配列変化の有無を精査し、表現型可塑性に伴う遺伝情報の変化(進化)が起きているか検証する。また、栄養条件について環境に揺らぎを与えて、変動する栄養条件においての大腸菌のrecA遺伝子の発現パターンを観測したい。通常栄養条件とストレス環境条件(貧栄養+抗生物質の混合)を周期的に交互に変えることで、SOSレスポンス関与遺伝子を組み込んだ形質転換株による変動環境での細胞伸長と貧栄養+抗生物質への反応基準を、1細胞培養計測系で調べる計画である。3月に発注した消耗品の納品が3月中に行われず、4月以降になってしまったため。注文した消耗品を購入し、研究に活用する。該当なし
運動開始時の呼吸応答と循環応答の類似性・独自性に関する研究

運動を開始すると同時に換気と心拍は急増する。本研究では運動開始20秒以内の呼吸応答と循環応答の関連性を明らかにするために、1)顔面冷却法を用いて副交感神経系を亢進させて循環系の出力を変化させた時の運動開始直後の呼吸・循環応答を明らかにすることで、呼吸応答と循環応答の類似性・独自性を検討すること、2)これまで蓄積してきた男性被検者群のデータ(高齢者、こども、一般成人)に加え、女性、鍛錬者(特に短距離選手)の運動開始直後の換気、心拍、血圧応答を測定し、それらのデータを総合して各応答間の相関を求め、換気応答と循環応答の関連性を検討することを目的として2種類の実験を行った。その結果、1)の実験から、顔面冷却によって運動開始時の心拍応答が抑制されると換気応答も抑制されるが、その抑制の程度は両者で相関がないことが明らかとなった。これは呼吸応答と循環応答の出力システムがかなり異なっていることが原因と考えられる。また、2)の実験から、運動開始時の換気応答と心拍応答の大きさは相関が高いことから、両者は類似した変化を示すことが明らかとなった。これは換気応答、心拍応答を引き起こす中枢への神経入力経路が同一であることが主要因と考えられる。しかし、同じ循環機能の血圧は換気や心拍とは異なった応答を示すが、これは血圧が脳への血流維持といった生命維持が重要な役割であり、換気や心拍とは異なったメカニズムで調節されているからと考えられる。以上のことから、運動開始直後の呼吸機能と循環機能は、同じ入力系によって互いに協調し合って運動時の酸素摂取システムを維持・亢進するために類似した変化を示すが、一方で、生命維持のために異なる出力系を持ち、互いに独立して応答していることが明らかとなった。このように、呼吸と循環は、運動開始時にはお互い「類似性」を持ちながらも「独自性」を持って変化しているというのが本研究の結論である。【目的】潜水時に心拍数が低下する"diving reflex"は、顔面の三叉神経への冷却刺激による副交感神経亢進がその原因の一つとされている。一方、動的な運動開始直後は副交感神経が急速に抑制されて心拍数が急増するが、気道も反射的に拡張して換気亢進を促進する可能性が示唆されている。本研究では顔面冷却によって自律神経系を変化させた場合の、運動開始直後の循環動態と換気動態の関連性について明らかにすることを目的とした。【方法】健康な成人男子8名に、30秒の椅座位安静の後、氷水の入った氷枕(表面温度:35°C)を前額部と瞼、左右の頬上部に置き、そのまま安静状態を100秒間保つFC(Face Cool)条件、安静状態を90秒保った後に両脚交互の伸展-屈曲運動を20秒間実施するEX(Exercise)条件、安静30秒後にFC条件と同様に氷枕を置き、その60秒後にEX条件と同じ20秒間の運動を実施するCM(Combine)条件の3つの条件を各4回ランダムに実施した。心拍数、毎分換気量、平均血圧を連続的に測定し、3条件で比較した。【結果】顔面冷却を開始後60秒で安静時心拍数が3拍程度有意に低下するが、安静時毎分換気量には有意な変化は認められなかった。運動開始とともに心拍数及び毎分換気量は急増するが、その増加の程度は顔面冷却しない時(EX)に比べ冷却時(CM)に有意に低値を示した。

平均血圧は運動中に一過性の減少が見られるが、安静、運動とも冷却による影響は認められなかった。【結論】副交感神経を活性化させて運動させると、運動開始直後の換気と心拍応答は抑制されることが明らかとなった。このことから、循環系を人為的に通常と異なる状況にした場合、安静時の換気と心拍応答は独自性があるが、運動開始直後の換気と心拍応答には類似性があることが示唆された。【目的】生体は運動開始直後に酸素需要量に合わせて、できるだけ早く正確に呼吸機能と循環機能を亢進させる必要があるが、酸素摂取システム全体としてアンバランスが生じないように、両者は協調して変化していると考えられる。先行研究では日頃トレーニングを積んでいない様々な年齢の男性で、運動開始直後の換気応答と心拍応答の大きさとの間に有意な正の相関関係があることを見いだしたが、今回は被検者の幅を広げ、女性、鍛錬者(特に短距離選手)を含めてそのような関係が成立するのか明らかにしようとした。【方法】女性群として健康な成人女性7名、短距離群として優秀な大学短距離選手10名、対照群としてそれぞれ日頃トレーニングを積んでいない成人男性7名と10名を被検者とし、安静状態から両脚交互の脚伸展-屈曲運動(負荷;体重の2.5%)を20秒間だけ5、6セット行わせ、その時の毎分換気量、心拍数、平均血圧を測定した。さらに同じ運動を3分間継続した時の定常値を100%、安静値を0%として運動開始15秒目の相対的変化率を応答の大きさ(Gain)とした。【結果と考察】男女間、そして短距離選手群と非鍛錬者群間で毎分換気量、心拍数、平均血圧に有意差は認められず、運動開始直後の換気、心拍、血圧応答に性差、トレーニングの影響はないことが明らかとなった。また、個人の換気のGainと心拍のGainをプロットすると、それぞれの実験においてr=0.5程度の有意な正の相関が認められ、これまでのデータを含めた82名のデータを合わせても、換気応答と心拍応答のGainはr=0.52、P<0.001と高くて有意な正の相関関係が認められた。これは換気と心拍応答の入力システムが同じ神経経路であることが原因と考えられる。しかし、換気と血圧、心拍と血圧に有意な相関関係は認められなかった。【結論】運動開始直後には換気と心拍は類似した変化を示す。
カヤツリグサ科水陸両生植物種の生育環境によるC_3、C_4炭酸固定経路変動の要因

カヤツリグサ科の水陸両生植物Eleocharis viviparaでは水生型はC_3、陸生型はC_4光合成経路を持つと報告された(上野ら1988)。この研究発展のため、本研究ではE.viviparaと生化学的研究の少ないE.retroflexaを用い、水生の自然状態で付着繁殖する微細藻類の影響を排除し、環境条件を厳密に規定するためにin vitro植物生育システムを作り、光合成・光呼吸炭素代謝経路の酵素活性が環境条件によりどの様に変動するかを調べた。陸生→水生型移行に伴う光合成経路の酵素活性の変動を調べたところ、E.viviparaではPEPカルボキシラーゼ、NADマリックエンザイムなどC_4経路の酵素活性が減少するが、RuBPカルボキシラーゼ、NADPトリオースリン酸デヒドロゲナーゼなどカルビン回路の酵素活性は変動しないことが確認できた。しかし、E.re-troflexaでは陸生型のみならず水生型でもC_4経路の酵素活性が高いままであることが明らかになった。これに対し、グリコール酸オキシダーゼ、カタラーゼ、セリン-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼなど光呼吸経路の酵素活性は、両Eleocharis種共に、水生型でも陸生型と同程度の低い活性のままであった。したがって、E.retroflexaは水生でもC_4経路を保持しているが、E.viviparaの水生型は通常の陸生C_3植物とは異なり、光呼吸の少ない水生C_3植物(SAM)に似た特徴を持つと思われる。なお、水生植物のCO_2利用に関係するカーボニック・アンヒドラーゼ活性の変動を詳細に検討したが、両植物種の水生/陸生型で大きな差は認められなかった。さらに、陸生型E.viviparaを1%高CO_2下で生育させたところ、空気中生育の陸生型に比べ、C_4光合成経路の酵素活性が低下する傾向が見られたので、カタラーゼなど光呼吸経路の酵素活性やカーボニック・アンヒドラーゼの活性変動について、目下継続して検討中である。1.Eleocharisを自然状態で水中に生育させると、微細藻類が付着して繁殖するので、光合成系の研究結果が曖昧になるおそれがある。また、環境条件を厳密に規定するためにも、無菌状態の植物体を得ることが大切である。陸生型植物体の桿先端に生じた分けつ芽を滅菌して大型試験管の寒天無機培地に移植し、発根定着させることにより、陸生型と水生型の無菌植植物体を繁植させるin vitro生育システムを作ることができた。2.温室で生育させた植物体を用い、陸生から水生型への移行に伴うC_4/C_3光合成経路の酵素活性の変動を調べた。E.viviparaではPEPカルボキシラーゼ、NADマリックエンザイムなどC_4経路の酵素活性が減少するが、RuBPカルボキシラーゼ、NADPトリオースリン酸デヒドロゲナーゼなどカルビン回路の酵素活性は変動しないこと(上野らの報告)を確認した。また、E.retroflexaは炭素代謝経路が殆ど研究されていないが、本研究により、陸生型のみならず水生型でもC_4経路の酵素活性が高いままであることが明らかになった。

3.これに対し、グリコール酸オキシダーゼ、カタラーゼ、セリン-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼなど光呼吸経路の酵素活性はElocharis両種の陸生C_4型が低いのは予期した結果であったが、両種の水生型でもこれらの酵素活性が低いままであったのは意外な発見である。4.E.viviparaが陸生から水生型に移行する過程でC_4からC_3型への炭素代謝変換を促進する主環境要因は何かを探るため、陸生型を1%CO_2下で生育させたところ、空気中の陸生型に比べ、C_4光合成経路の酵素活性が低下する傾向が見られた。この結果や他の環境因子の影響を調べるためには、無菌状態の生育個体を用いて検討する必要がある。カヤツリグサ科の水陸両生植物Eleocharis viviparaでは水生型はC_3、陸生型はC_4光合成経路を持つと報告された(上野ら1988)。この研究発展のため、本研究ではE.viviparaと生化学的研究の少ないE.retroflexaを用い、水生の自然状態で付着繁殖する微細藻類の影響を排除し、環境条件を厳密に規定するためにin vitro植物生育システムを作り、光合成・光呼吸炭素代謝経路の酵素活性が環境条件によりどの様に変動するかを調べた。陸生→水生型移行に伴う光合成経路の酵素活性の変動を調べたところ、E.viviparaではPEPカルボキシラーゼ、NADマリックエンザイムなどC_4経路の酵素活性が減少するが、RuBPカルボキシラーゼ、NADPトリオースリン酸デヒドロゲナーゼなどカルビン回路の酵素活性は変動しないことが確認できた。しかし、E.retroflexaでは陸生型のみならず水生型でもC_4経路の酵素活性が高いままであることが明らかになった。これに対し、グリコール酸オキシダーゼ、カタラーゼ、セリン-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼなど光呼吸経路の酵素活性は、両Eleocharis種共に、水生型でも陸生型と同程度の低い活性のままであった。したがって、E.retroflexaは水生でもC_4経路を保持しているが、E.viviparaの水生型は通常の陸生C_3植物とは異なり、光呼吸の少ない水生C_3植物(SAM)に似た特徴を持つと思われる。なお、水生植物のCO_2利用に関係するカーボニック・アンヒドラーゼ活性の変動を詳細に検討したが、両植物種の水生/陸生型で大きな差は認められなかった。さらに、陸生型E.viviparaを1%高CO_2下で生育させたところ、空気中生育の陸生型に比べ、C_4光合成経路の酵素活性が低下する傾向が見られたので、カタラーゼなど光呼吸経路の酵素活性ゃカーボニック・アンヒドラーゼの活性変動について、目下継続して検討中である。
死後組織由来iPS細胞を活用した新たな剖検診断スキーム基盤体制の確立

突然死の死因を解明することは医学的社会的に重要事項である。しかし、法医解剖においては、死後の解析であるが故、死後変化という壁によって正しい解析が困難になっている。このため、死後であっても、死後変化を受けない生前の状態を再現する手段が求められている。近年iPS細胞という、あらゆる細胞に分化できる手法が確立しており、これを死後にも応用することは革新的なことである。原因不明のてんかんの既往があり、死後に遺伝子解析を行ったところSTXBP1遺伝子に変異が検出された小児突然死症例の解剖例に対し、解剖時に線維芽細胞を培養したのち、iPS細胞を樹立した。今回樹立したiPS細胞は、オリジナルの線維芽細胞と同じSTXBP1遺伝子変異を有しており、STR解析によっても同一性が確認された。さらに、蛍光染色でTRA-1-60、TRA-1-813マーカー陽性、フローサイトメトリーでSSEA4の発現を確認、qPCRでOCT4、NANOG発現を確認したことで、多分化能を確認した。死後にiPS細胞を樹立した報告はこれまでにも複数発表されているが、いずれもアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経疾患の病態解明のために、予め計画された段取りによって樹立されたものばかりで、予期せぬ突然死症例に対して、突然死の診断・原因究明目的で行われているものはなく、今回の樹立が初めてである。本成果は死後に生前を再現するという、これまで法医学領域にはなかった新しい試みと言える。今後は、iPS細胞から神経細胞や心筋細胞へ分化させ機能解析を行っていきたい。また、他に多く残された、遺伝子変異は検出されたもののその意義が不明なままの突然死症例についても、同様にiPS細胞の樹立をすすめたい。一年目はまずは一例の樹立および論文化を目指してきた。初めての事例であったことで予定通り進まないところもあったが、論文投稿までは進むことができた。本事例が報告できた後には、新たに数例のiPS細胞樹立を検討している。本研究グループで初めての試みであり、当初予定していた計画通りに進まず、一例目の確立に時間がかかった。反面、複数例を樹立できなかったことで費用は翌年以降に持ち越すこととなり、二年目以降は安定した樹立体制を構築できると考える。
災害用折り畳みトラス橋の展開機構と耐荷力に関する研究

災害時の緊急仮設橋として、折り畳んで運搬し現地で展開する新たな橋梁を開発する。架設時間が従来より大幅に短縮でき、短時間のうちに通行可能にできるため、災害時の人命救助や物資輸送に役立てることができる。平成30年度は折り畳み動作をシザーズ(マジックハンドのように、ヒンジ節点を設けた棒部材から成る)の伸び縮みにより実現させるため、シザーズの形状やヒンジ部の構造詳細を検討した。棒部材は幅90mm、板厚12mmのスギ材を使用し、ヒンジ部はアルミパイプ、セットカラーを用いてスムーズな回転を生じせしめた。このシザーズと橋梁本体との結合方法として、シザーズ端部のヒンジ部に直径11mmの穴を設け、当初のヒンジ機能(回転できる機能)に加えて、M10のボルトを貫通させられるようにし、このボルトと橋梁本体が連結できる構造とした。橋梁本体のトラス下弦材には連結補強材として、鋼製アングル材を用いることとし、このアングル材とシザーズ端部がM10のボルトによるボルト接合がなされる。このような構造を採用することにより、シザーズが伸び縮みする機能に加えて、橋梁本体を補強する機能も保持する。シザーズの伸び縮み動作の確認とトラス橋のシザーズによる補強効果の確認のため、載荷実験を実施した。実験の第1段階は死荷重作用時の片持ち梁条件による伸び縮み、第2段階は両端支持条件による支間中央橋軸直角方向載荷を計画した。実験の結果、第1段階において、死荷重たわみが非常に大きくなり、片持ち状態を維持できなくなったため、実験を中止した。これを改善するため、折り畳み状態からの展開方法に検討を加えることとした。実験供試体の製作、改良等は予定通り実施できている。また、実験に必要な固定端フレームや重り等も予定より短期間で製作でき、実験も短時間で実施できた。しかしながら、実験において、当初予期していなかったこととして、片持ち状態での展開中に、トラス先端部が床に接し、片持ち状態が維持できなる事態が生じた。よって、実験の一部が完了できなかったが、展開方法を改良することで、当初の目的である短時間架設が可能となる。よって、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。今後は展開時におけるトラス本体の支持方法に改良を加える。片持ち状態ではたわみが非常に大きくなることが明らかとなったため、下記の支持方法を検討することとする。(1)クレーンで折り畳みトラス橋を吊り下げた状態で展開する:この方法は、空中に浮いた状態で展開させるため、人力による小さな力で十分である。クレーンで吊った状態であるため、地面に接する不具合は生じない。展開させた後、地面に下し、連結部ボルト締め、床版設置を行う。(2)地面に架設台を設置し、その上に折り畳み橋を載せ、展開する:この方法は、架設台上で展開させる際、トラス橋の下面と台の上面で摩擦があると展開に支障を来す。摩擦を減少させる工夫が必要となる。展開は人力で安定した状態で遂行できると考えられる。以上は、当初計画には無かった検討項目であるが、安全性を損ねず短時間架設も可能なため、より望ましい成果が期待できると考えている。

よって、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。今後は展開時におけるトラス本体の支持方法に改良を加える。片持ち状態ではたわみが非常に大きくなることが明らかとなったため、下記の支持方法を検討することとする。(1)クレーンで折り畳みトラス橋を吊り下げた状態で展開する:この方法は、空中に浮いた状態で展開させるため、人力による小さな力で十分である。クレーンで吊った状態であるため、地面に接する不具合は生じない。展開させた後、地面に下し、連結部ボルト締め、床版設置を行う。(2)地面に架設台を設置し、その上に折り畳み橋を載せ、展開する:この方法は、架設台上で展開させる際、トラス橋の下面と台の上面で摩擦があると展開に支障を来す。摩擦を減少させる工夫が必要となる。展開は人力で安定した状態で遂行できると考えられる。以上は、当初計画には無かった検討項目であるが、安全性を損ねず短時間架設も可能なため、より望ましい成果が期待できると考えている。
ゼロエミッション風力推進船に向けた多帆装船の空力性能向上に関する研究

本研究では、ゼロエミッション風力推進船の実現に向け、翼型の硬帆を多数配置した船舶の空力性能について調査し、その性能向上技術を開発した。複数の翼帆を列状に並べた翼帆列を対象に数値解析と風洞模型試験を実施し、翼帆同士の相互作用による風力推進性能の低下特性を明らかにした。また、その相互作用を抑制し推力を向上する手法を提案した。加えて、船舶の所要エネルギ推定プログラムを構築し、航行状態における風力推進性能の向上についても評価した。本年度は、ゼロエミッション風力推進船に求められる空力性能向上技術構築のための基礎的検討として、単独翼型硬帆ならびに23枚の同翼帆列を対象とした数値解析と風洞模型試験を実施し、以下に述べる知見を得た。1.境界要素法を用いた3次元非粘性流動解析:各翼帆の迎角を一様に変化させた解析に加え、翼帆列に対する見かけの風向角を変化させて解析を実施した。その結果、翼帆列内の翼帆間の空力干渉により各翼帆が生じる空気力の大小関係に変化を生じることが示された。また、見かけの風向角の変化は風に対する各翼帆の相対的な位置の変化を生じ、それに伴って翼帆間干渉の生じ方が変化することが示された。2.有限体積法による3次元乱流流動解析:翼帆列に加え、船体を模擬した台座を考慮した解析を行い、翼帆列-船体間の干渉影響について検討した。その結果、船体側端からの流れの剥離や船体による風向の変化などによって、甲板上の翼帆に作用する風速分布が非一様となり、翼帆列の空力特性が変化することが確認された。上記2手法による解析結果を低迎角条件において比較すると、両者は定性的な一致を示した。従って、各翼帆が低迎角条件にある場合、各翼帆が生じる循環の干渉が翼帆間の空力干渉における支配的要素であると考えられた。3.風洞模型試験:1/100スケール模型による風洞試験を実施した。各翼帆に作用する空気力の計測とともに、熱線流速計による風速計測手法を導入、確立して、数値解析の妥当性検証に利用可能なデータを取得した。低迎角条件下の翼帆列では、各翼帆の相対的な揚力が数値解析結果と定性的に一致し、数値解析の妥当性が確認された。また、翼帆列中の一部の翼帆を単独翼帆の失速角を超える高迎角とした場合、条件によっては同翼帆が単独時の最大揚力を上回る揚力を生じることが確認され、相互干渉を失速抑制と翼列の揚力性能向上に利用できる可能性が示された。本年度は、ゼロエミッション風力推進船に求められる空力性能向上技術構築のための検討として、昨年度に引き続き複数枚の翼型硬帆列を対象とした数値解析と風洞模型試験を実施した。さらに翼帆による空気力を入力とする所要エネルギ推定プログラム(EPP)を構築し、翼帆列による風力推進性能の評価を実施した。これらの手法により、以下に述べる知見を得た。1.風洞模型試験:3枚の1/100スケール翼帆模型による風洞試験を実施した。この結果、昨年度2枚翼帆列で示されていた各翼帆迎角の個別設定による空力性能向上法が、翼帆枚数を増加させた場合にも有効であることが示された。特に、斜め向い風および斜め追い風条件では、翼帆枚数増大に伴って揚力が増大する翼帆枚数が増え、翼帆列の揚力の増加率が向上した。また、斜め追い風時については抗力を推力の主成分とする迎角設定について検討し、これまでの迎角設定と比べて推力が向上することを確認した。さらに、そのような抗力主体の迎角設定でも、各翼帆迎角の個別設定により推力が向上することを示した。2.境界要素法を用いた3次元非粘性流動解析と風力推進性能評価:最大9枚の翼帆列モデルに対して迎角を一様に変化させた解析ならびに迎角を個別に変化させた解析を実施し、実際に想定される帆装枚数において空力特性の検討を加えた。その結果をEPPに入力し、翼帆列による風力推進性能を評価した。3.有限体積法による3次元乱流流動解析:最大9枚の翼帆列について迎角一様条件での解析を行い、翼枚数の増大に伴う空力特性の変化を調査した。また、追い風条件において抗力を推力の主成分とする翼帆迎角配置での空力解析を行い、翼帆間の空力干渉影響についても検討した。特に完全な追い風時には船尾側翼帆の後流中に含まれることによって抗力を生ずる翼帆も存在した。このため、一部翼帆を縮帆によって間引いた状態の解析も行い、干渉影響低減を検討した。昨年度までの研究に引き続き,相互干渉する翼帆周り流れの解明のため,周囲流れとその相互干渉問題を実験計測と数値解析を組合せた検証を実施した.

1.風洞試験計測:広島大学所有の吹出し型風洞試験装置を用いて新たな翼型模型を用いて検力実験を行い,これまでのNACA翼型模型で得られた計測結果との比較から,翼帆形状を変更した際の翼帆間干渉特性の変化について知見を得た.2.乱流場の数値解析:翼帆列周囲の乱流場の解析では,これまでのLES法に比べて計算負荷の低いRANS(Reynolds Averaged Navier-Stokes Simulation)法を適用し,平均乱流場の予測を行った.これにより,乱流と粘性の影響を考慮した解析によるパラメータスタディを行い,各種パラメータが翼帆間の空力干渉に与える影響を明らかにした.また,それらのデータを基に,帆走性能評価の入力データとしてより高精度な翼帆空力特性データとなる翼帆列空力特性モデルを構築した.3.帆走性能評価:上記RANS法による解析から得られた翼帆列の空力特性を入力とし,昨年度までに構築したEPP(Energy Prediction Program)による帆走性能評価を再度実施し,風力推進による燃費削減率の推定とその向上に向けた翼帆列空力特性の検討を行った.特に,高推力翼型による改良翼帆列では,推力とともに横力とヨーモーメントも増大するため,条件によっては斜航抵抗や舵抵抗の影響が無視できなくなることを示した.多数の翼帆列の空力干渉影響の解明が進んだこと、迎角個別設定によって翼帆列としての性能向上を示したこと、さらにEPPツールの構築による船体運動への影響評価が実現可能になったことなどから、着実に目的に向けた進展が得られていると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、主に以下の項目について検討を加えることで、空気力学的な観点からゼロエミッションを目標とした帆主機従型風力推進船を実現するための船舶帆装技術の提案構築を目指す。・翼帆形状の改良による風力推進性能の向上・翼帆形状の変化に伴う、翼帆間空力干渉影響の変化の検討・風圧力の入力による船体構造への影響の検討・洋上の大気境界層影響を考慮した翼帆列空力性能の検討、翼帆列-船体間空力干渉の検討24年度が最終年度であるため、記入しない。
層状高温超伝導酸化物のインタ-カレ-ション・化学反応性の解析と超伝導制御

層状を有する高温酸化物超伝導体YBa_2Cu_3O(YBCO)とBiSrCaCu_2Oについて、インタ-カレ-トし得ると考えられるNO,CO等の小分子との反応性を検討した。酸化物超伝導体の化学反応性、安定性は実用上の問題であるだけでなく、Tc向上、超伝導機構解明のための知見ともなり得る。調製後しばらく保存したYBCOを触媒としてNO-CO反応を行うと、まず大量のNOを速やかに吸収し、ついでCOを吸収し、その後NO+CO-->N_2+O_2反応が高速で進行する。吸収NO量は酸化物に対しモル比で0.6に達し表面だけでの反応では説明できない。吸収NOは500°CですべてNOとして脱離し可逆的にまた吸収する。XPSIRの結果はNO_2^-として存在することを示した。XRDによると晶系は斜方から正方へ変化しc軸がやや伸びている。ところが、新しく調製したYBCOは、酸素不定比性(y)を6.2から6.9まで変えてもNOをわずかしか吸収せずNO-CO反応に対する触媒活性も低いことが解った。またBaCuO_4の影響を調べるためY_<1-x>Ba_<2+x>Cu_3O_UのNO吸収を測定したところ、吸収量はyとともに大幅に増加したが速度は極めて小さかった。そこで、新しく調製したYBCOを水蒸気に長時間室温で接触させたところ、大量のNOを速やかにかつ可逆的に吸収するようになった。この水蒸気処理の際の表面積変化が小さいことは確認した。したがって、YBCOは水蒸気との反応により表面に活性相が生成し、この活性相の存在によりNO吸収、NO-CO反応に高い反応性を示すものと推論した。
受容体（Ｇｂ３）非発現細胞に対し志賀毒素はＬＤＬ受容体依存性に毒性を発現する

志賀毒素(Stx:Shiga toxin)産生大腸菌(STEC)が産生したStxは、腸組織の中性スフィンゴ糖脂質(GSL)と複合体を形成する。Gb3Cerを含む各種GSLとStx2で合成したGSL-Stx2 liposomeは、LDL、VLDLへの高い結合能を有し、Gb3非発現、或は低発現の培養細胞において、LDL受容体を介して細胞内に高率に取り込まれた。以上の結果から、腸管内産生志賀毒素は、Gb3Cerを含むGSLに結合し、血漿中でVDL、LDLとの複合体を形成し、LDL受容体を介してGb3非発現細胞に取り込まれる可能性が考えられた。本年度は、まず1)リポ蛋白(LDL)へのGSL-Stx2 liposomeの結合能を解析した。liposomeは、TLC immunoblottingにおいて、LDL, VLDLへの高い結合能をしめしたが、HDLへの結合は検出レベル以下であった。さらに、LDL, VLDL両分画に結合したliposomeは、Stx2を保持していることも確認された。TLC immunoblottingにおいて、結合バンドが複数みられたことから、TLCで展開した標品から該当するバンドを抽出し、各抽出標品中のGb3Cer moietyをGC/MS解析した。その結果、C24:0/C24:1が主要な脂肪酸であること、さらにlipidceramide anchor中の遊離脂肪酸のheterogeneityはLc2Cer, GalCer, GlcCerが関与しており、中でもGalCerが主体であることが認められた。次に、2)LDL結合GSL-Stx2 liposomeの血管内皮細胞内での動態を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。Sx2単独投与に比して、Gb3発現量の少ない血管内皮細胞に対して、効率的に細胞内に取り込まれ、顕著なラフト構造の変化を誘導し、ゴルジ装置内を逆行性に輸送されることが確認された。TNF-alphaやIL-1beta刺激血管内皮細胞では、この効果は一層顕著であり、現在定量化を試みている。論文投稿(Matsumura Y, et al. Microb. Pathog. 2012年投稿)したが、腸組織中のGb3Cer量がGb4Cerよりはるかに少ないにもかかわらず、1Stx2結合Gb3Cerが検出される理由が、結合能の差異のみで説明できるのか、また2血管内皮細胞や脳神経細胞は培養株だけでなく、新鮮分離細胞で確認したか等のクレームがあり、当初計画はおおむね順調に進んでいたが、これらのクレームに対応するため研究に遅れがでた。1については問題なく解答し得たが、2については、培養株と新鮮分離株での差異を定量化で明確にすること、更にサイトカイン刺激によるGSL-Stx2 liposomeの取り込み及び細胞内でのretrograde transportの差異について「定量化」での違いを明確にすることを求められ、現在実施中である。このため、当初予定の動物実験等において、遅れが生じている。組織、血漿中のGSL解析、GSL-Stx2 liposome作製と毒性比較が順調に実施でき、当初計画はおおむね順調に進んでいる。しかし、これらのデータを論文投稿(Matsumura Y, et al. Microb. Pathog. 2012年投稿)したが、腸組織中のGb3Cer量がGb4Cerよりはるかに少ないにもかかわらず、Stx2結合Gb3Cerが検出される理由が、結合能の差異のみで説明できるのか、また血管内皮細胞や脳神経細胞は培養株だけでなく、新鮮分離細胞で確認したか、感染マウスの腸管組織内Gb3CerへのStx2結合は確認しえるか、等のクレームがあり、当初計画はおおむね順調に進んでいるが、これらのクレームに対応するため現在実験準備に取り掛かっており、若干の遅れを生じている。血管内皮細胞、脳神経細胞におけるLDL受容体発現に、どの様なサイトカインが関与しているかを、培養系での免疫染色、フローサイトメトリーで解析し、GSL-Stx2 liposome投与マウス組織での発現は免疫染色で確認する。STEC経口感染後のStx2の腸管内から脳への輸送経路解析:放射標識GSL-Stx2 liposome投与後のマウスをもちいて、オートラジオグラフィーでトレースする。LDL受容体欠損マウスにおけるSTEC感染感受性とStx2の動態解析:LDL受容体欠損マウスへのSTEC感染、及びGSL-Stx2 liposome投与後の感受性(生死)比較と、放射標識GSL-Stx2 liposome投与後のStx2動態をオートラジオグラフィーでトレース比較する。1)リポ蛋白(LDL)受容体(LOX-1)へのGSL-Stx2 liposomeの結合解析:LOX-

1発現を抗LOX-1抗体で確認したヒト由来樹立神経細胞株(グリア細胞、アストロサイト:JCRB譲渡)を用いて、GSL-Stx2 liposomeの結合を、標識LDL存在下での競合的結合解析法で測定。2)リポ蛋白(LDL)受容体(LOX-1)へのGSL-Stx2 liposome結合後のStx2受容体の細胞内動態関連解析:蛍光標識Stx2を用いてGSL-Stx2 liposomeを作製し、ヒト由来樹立神経細胞株LDL受容体(LOX-1)結合GSL-Stx2 liposomeの、ラフトを介したエンドソームからゴルジ体への輸送、ゴルジ体から小胞体への輸送を、共焦点レーザー顕微鏡下で解析。3)TNF-alpha、IL-1betaなどサイトカイン刺激によるLDL受容体発現解析:ヒト由来樹立神経細胞株でのサイトカイン刺激によるLOX-1発現を、RT-PCR、及びsurface biotin labeling法により解析。発現亢進細胞におけるGSL-Stx2 liposomeの毒性を非刺激細胞との比較定量。4)GSL-Stx2 liposomeのマウス毒性解析:静脈内投与、経口投与及び開腹マウス大腸内への直接投与におけるGSL-Stx2 liposomeとStx2の毒性を致死活性濃度で比較。さらに、HE染色・各種免疫染色による死亡マウス病態の多角的解析。5)LDL受容体欠損マウスにおけるSTEC感染感受性とStx2の動態解析(25年度実施に向けて、本年度遺伝子改変動物実験の申請)。6)STEC経口感染後のStx2の腸管内から脳への輸送経路解析(25年度実施計画)。本年度の研究経費(総計108万円)は、GSL-Stx2 liposomeのリポ蛋白(LDL)受容体への結合と結合物の細胞内動態解析の試薬・消耗品購入(41万円)、及びSTEC経口感染後のStx2の腸管内から脳への輸送経路解析の試薬・消耗品購入(32万円)及び動物関連(10万円)、及びLDL受容体欠損マウスにおけるSTEC感染感受性とStx2の動態解析の試薬・消耗品購入(10万円)に主眼を置いて配分し、論文投稿・学会旅費などに関する費用(15万円)にも配分する。当初計画に組み入れていなかった1)新鮮分離細胞で確認、2)感染マウス腸管組織内Gb3CerへのStx2結合確認等の追加実験のため、動物及び必要な試薬購入に、23年度の研究経費残額(69万円)から65万円を本年度の研究経費に組み込む。4万円は現在投稿・修正中論文の別刷り購入に使用する。本年度の研究経費(総計100万円)は、GSL-Stx2 liposomeのリポ蛋白(LDL)受容体への結合と結合物の細胞内動態解析、及びLDL受容体発現とStx2毒性との関連解析に主眼を置いて配分する。これらの解析に関する研究費は、試薬・抗体・細胞培養関連試薬を主とする消耗品代(46万円)、又、毒性比較解析については、マウス購入を主体とする消耗品、及び試薬品代(39万円)、及び論文投稿・学会旅費などに関する費用(15万円)に配分する。
3種類のPNPLA3遺伝子改変マウスを用いたNASH発症病態の解明

非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の発症病態における小胞体(ER)ストレスにPNPLA3遺伝子が重要な役割を果たすことを報告されているが、NASHにおけるERストレスと脂質代謝、NASH発症病態におけるPNPLA3遺伝子や遺伝子多型との関わりについては明らかではない。更に、KOmiceに対してヒトPNPLA3正常および変異遺伝子(I148M)をアルブミンプロモータにて肝臓特異的に過剰発現させた2種類のPNPLA3遺伝子改変マウスをさらに追加作成した。3種類のPNPLA3遺伝子改変マウス(欠損、ヒト正常遺伝子・変異遺伝子導入)を用いて様々な飼料を用いて飼育をするとともに、様々なタイミングでERストレス負荷を行い解析を行った。現在その検証した条件下における遺伝子改変マウスの表現型の違いから、PNPLA3遺伝子の働き・役割について研究を進めている。更に、KO miceに対してヒトPNPLA3正常および変異遺伝子(I148M)をアルブミンプロモータにて肝臓特異的に過剰発現させた2種類のPNPLA3遺伝子改変マウスをさらに追加作成した。現在、3種類のPNPLA3遺伝子改変マウス(欠損、ヒト正常遺伝子・変異遺伝子導入)を用いて様々な飼料を用いて飼育をするとともに、様々なタイミングでERストレス負荷を行い解析を行っている。以上のように、研究助成により研究を順調に継続できている。本研究から順調に多くの研究データが出ており、実験結果に関する学会と論文発表を予定している。そこで、NASH発症に関与するERストレスに注目し、作成したPNPLA3欠損マウス(KO mice)に対しツニカマイシン(TM)投与によるERストレスを負荷し肝臓の組織学的変化とERストレス応答についてC57BL/6マウス(WT mice)との相違点について比較検討を行った結果、PNPLA3遺伝子はERストレス応答においてXBP-1遺伝子の制御を介して肝臓の脂肪酸やTG代謝に関与することでNASH発症に重要な役割を果たしている可能性が高いことを報告した(Hepatol Res. 2016 May;46(6):584-92. EASL 2016; ILC2016-RS-2079)。本研究から多くの研究データが出ており、実験結果に関する学会と論文発表を予定している。PNPLA3正常遺伝子および変異遺伝子によるERストレス応答およびシャペロン蛋白発現への役割についてXBP-1遺伝子制御への観点を中心に解析を進めていく予定である。更には、高脂肪食や高スクロース食負荷など様々な食事負荷によるERストレスの惹起、肝内脂肪酸組成変化、apoptosis増悪の観点から、肝臓の壊死、炎症の発症、風船様腫大の出現、さらには肝星細胞の活性化を介した肝線維化進展の増悪メカニズムについても解析を行う予定である。3種類のPNPLA3遺伝子改変マウスおよびC57BL/6マウス(コントロール(WT))を用いて、肝の脂肪化を始めとしたphonotype発現の違いについて検討を行う予定である。各遺伝子改変マウスを高脂肪食および高スクロース食を用いて飼育し各マウスにおける肝臓phenotypeの違いについて解析を行う。また、肝内の脂肪酸・脂質合成系因子の発現の違いや炎症性マーカー、ERストレス応答、apoptosisの評価、さらには線維化関連マーカーについても解析を行う予定である。各遺伝子改変マウスを経時的に観察することで、肝の脂肪酸・脂質合成系因子や、炎症性マーカーおよびERストレス応答、apoptosisの評価や肝線維化関連マーカーの発現の時期による違いについても解析を行い、PNPLA3遺伝子の変異によるNASH発症における関与と重要性について解析を行う。また解糖系、TCAサイクルにおける因子の変化と、長鎖、中鎖、短鎖脂肪酸の各組成の変化を検討する目的でmetabolome解析を行い、脂肪酸代謝および糖代謝についてのPNPLA

3遺伝子の変異により影響を受けている新たな因子の探索を行いたいと考えている。次年度活用予定があるため、予定した海外出張をとりやめた。次年度研究および発表にて活用予定があるため、予定していた海外出張など一部取りやめた。来年度に研究発表のため国内外へ学会発表及び出席を積極的に行い、研究に必要な物品購入で使用予定である。