hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘテロクロマチンボディーの構築原理の解明

私たちがヘテロクロマチン因子の一つとして同定したAHDC1を増量することにより、まるいヘテロクロマチンボディーがほどけて太いひも状になることに気がついた。このことは、AHDC1がHP1に結合してその性質を変えることが、ヘテロクロマチンボディーの形態に影響を及ぼしていることを示唆している。本課題では、ヘテロクロマチンボディーの成り立ちを、AHDC1がヘテロクロマチンボディーの形成にどのように働きかけているのかを明らかにしつつ、1)内在する物理化学的な性質や構造、2)核や核小体など核構造との親和性、3)ボディーの外から働きかける力や構造、の3つの要素に還元しながら行う。また、AHDC1や核構造との相互作用に寄与する因子の増減でヘテロクロマチンボディーの形態と核内配置を操作することにより、ヘテロクロマチンボディーの形態や配置と、転写、複製、修復などクロマチン上の制御について議論することを目指す。当該年度は、以下の結果を得た。ヘテロクロマチンボディーの状態を客観的に比較するために、おもにマウスNIH3T3細胞を用いて、クロモセンターに着目して解析することとした。この細胞に、リポフェクションを用いてAHDC1を一過的に発現すると、丸いクロモセンターがひも状に変形する。また、画像解析により、この変化を定量的に測定することに成功した。HP1、SCAIに結合できない点変異、AT-hookの点変異、それらの組み合わせた変異タンパク質の発現系を用いて検証したところ、HP1結合能とC末側に散在する配列の2つの要素が、クロモセンターの形態変化を及ぼす活性に必須であることを見出した。AHDC1のクロモセンターの形態、存在様式への影響を観察するのに適した細胞を見出し、機械学習による画像解析により、客観的に形態、存在様式を計測、評価できる系が確立した。この系を用いて、AHDC1上の、HP1結合能とC末側に散在する配列の2つの要素が、クロモセンターの形態変化を及ぼす活性に必須であることを見出した。このように、ほぼ計画通りに進捗していること、機械学習による定量評価が予想以上に良好であることが判明し、この点においては計画以上に進展した。本年度は、C末端からAHDC1を決失すると、クロモセンターの変形活性を徐々に失うことから、活性に必要な要素が散在していると想定していが、その実態を明らかにすることを目指す。さらに、増量した時の表現型に加えて、減量した時の表現型を観察するために、AHDC1のノックアウト細胞をNIH3T3を用いて作成する。クロモセンターはペリセントロメア領域のメジャーサテライトに形成されるヘテロクロマチンであることから、セントロメア機能やメジャーサテライトからの転写に着目して、AHDC1の機能を洗い出す。
体節時計をモデルとしたマウスとヒトの時間スケール種差を生み出す原理の解明

体節時計はマウス、ヒトともにHes7遺伝子の自己抑制回路による振動という同じ仕組みでできている。しかし、その振動周期はマウスが2時間でヒトが5時間と異なっている。この違いの原因は、Hes7遺伝子自体の違いによるものなのか、Hes7を取り巻く細胞内環境によるのかまったく明らかになっていない。本研究では、マウスES細胞、ヒトiPS細胞から体節時計をもつ未分節中胚葉様の細胞を誘導し、マウス・ヒト間の体節時計時間スケールの違いの原因を明らかにした。まず、マウスとヒトでHes7遺伝子領域の配列の違いが周期の違いを生むとの仮説のもとにHes7遺伝子領域を入れ替えた細胞を作製し周期の長さを調べた。結果は、周期はほとんど変化しなかった。これによりHes7遺伝子領域自体が周期の違いを生むのではないことが分かった。次に、振動周期に影響するどの過程がマウスとヒトで異なるかを測定した。これまでの理論・実験研究から周期の長さには、Hes7合成や抑制の時間遅れ・Hes7の分解速度が重要であるとされている。本研究でそれぞれの過程に必要な時間をマウスとヒトで測定したところ、タンパク合成・イントロンによる時間遅れ、mRNA・タンパク質の分解時間に種差が見られた。また、この違いは2時間と5時間を説明し得る程度の違いであった。このことから、体節時計周期の種間の違いはHes7遺伝子配列ではなく、細胞という反応場の違いがHes7遺伝子の挙動を変え、それが周期の違いにつながることが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。体節時計の周期はマウスでは2時間だがヒトでは6時間である。Hes遺伝子の自己抑制回路という同じ仕組みによりながらも、生物種間で違う時間を持つ。これ違いの原因を理解することが本研究で取り組む課題である。ES,iPS細胞から体節時計を有する未分節中胚葉様細胞を誘導する系を確立する。その系を用いて、2つの仮説1.マウスとヒトではHes遺伝子領域自体が異なるのか、それとも2.遺伝子自体は同じで周りの細胞内環境(場)の違いが遺伝子の振る舞いを変えるのか明らかにする。同時に、遺伝子発現や抑制過程、タンパク分解といったどの素過程の時間に種差があるのか調べる。本年度はES,iPS細胞から未分節中胚葉様細胞を誘導し、体節時計を再現し、観察する方法をマウス、ヒトともに確立した。本年度のもう一つの実績は、種間の時間の違いがHes遺伝子領域自体によるとの仮説のもとに、ヒトとマウス間でHes遺伝子領域を組み替えて時間が変わるか調べたところ、種に固有の時間はほとんど変わらなかった。これはHes遺伝子領域は配列はわずかに異なるが、機能的には相同であることがわかった。これはもう一方の仮説の「遺伝子自体は同じで周りの細胞内環境(場)の違いが遺伝子の振る舞いを変える」を示唆している。今後はその仮説にしたがって解析を行う予定である。本年度は本研究の重要な点である、ES,iPS細胞から体節時計の性質を有している未分節中胚葉様細胞を誘導し、体節時計を再観察する方法をマウス、ヒトともに確立し、2種間の時間を比較することができた。さらに、種間の時間の違いがHes遺伝子領域自体によるとの仮説のもとに、ヒトとマウス間でHes遺伝子領域を組み替えて時間が変わるか調べたところ、種に固有の時間はほとんど変わらなかった。この成果も、本研究の対立する2つの仮説の一方を棄却することができたので、非常に大きな成果と言える。以上のように、ヒトとマウスの時間における種差を解析する系を手にすることができたこと、対立仮説の一方を棄却できたことから本研究課題はおおむね順調に進展しているとした。

本年度は本研究の対立する2つの仮説の一方の「マウスとヒトではHes遺伝子領域自体が異なる」を棄却することができた。そこで今後はもう一方の仮説の「遺伝子自体は同じで周りの細胞内環境(場)の違いが遺伝子の振る舞いを変える」について検証する。具体的には遺伝子発現や抑制過程、タンパク分解といった遺伝子発現振動のどの素過程の時間に種差があるのかを明らかにする。さらには細胞の大きさや代謝、細胞内輸送速度といった細胞環境のどの部分が異なることで時間差が生じるのか、根本原因を同定する。加えて、体節時計をモデルとして、神経発生をはじめとした様々な発生現象の時間スケール種差にも同様の仕組みが存在するかを調べる。あわせて、本研究で得られる知見を活かして、時間を操作する技術の開発を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
発展途上国の農業支援ものづくりを志向したフィールド教育の実施と教育効果の分析

本研究は、バングラデシュを対象に、農業支援を志向したものづくりとフィールド教育によって、グローバル人材を育成することを目的とした。2014年度は手動回転式乾燥機、2015年度は燃焼熱利用の平型乾燥機を考案、現地で製作して実験した。農業の機械化、インフラ整備の着実な進展を考慮して、2016年度からは、農家の子供たちが農業の近代化に取り組んでいけるような知育ものづくりを対象とした。2016年は、テロ発生のため、農村の小学校2校でスカイプによる遠隔授業を実施した。2017年度は、現地小学校3校でものづくり教育を実施した。国内の小学校でも同様な授業を実施し、渡航中は現地児童とスカイプ交流も行った。本研究は、バングラデシュを対象にして、農業支援を志向したものづくりとフィールド教育によって、グローバル人材の育成を実践することを目的としている。毎年新たな学生が、バングラデシュ稲作研究所BRRIの研究者や農民などとの意見交換や実地試験などを行いつつ、継続してチャレンジしていく実践重視の教育・研究である。単なるアイディア出しや生産者目線のものづくりではなく、実際に海外に赴き、現地の人たちと交流しつつ、現地で役立つものを、現地の人が持続して生産し活用できるまでに推し進める。こうした国内外での実践体験を通して、社会に役立つ工学の重要性を実感させるとともに、国際親善・国際協力の大切さ、すばらしさを学ばせ、真のグローバル人材を育成する。2014年度は以下の研究を行った。(1) BRRI、JICAダッカ事務所などとの間で情報収集と意見交換を進めた。(2)渡航前のBRRIとの情報交換で乾燥機の開発・普及の重要性を示唆され、現地で比較的簡単に製作できるものとして、手動の回転式乾燥機を設計した。(3) 9月に学生らと現地を訪問し、事前に送った設計図を基にBRRIで乾燥機を製作して実験を行った。(4)滞在期間の関係で十分な実験が行えなかったところは、後日BRRIから実験結果を送ってもらった。乾燥の目的はほぼ達成できたが、身体への負荷が大きく、容量が限られるなどの課題を指摘された。これを受けて、終盤に、燃焼熱を利用した平型の小型乾燥機を新たに設計・製作した。(5)前年度の学生(修士2年生)に、適宜、授業のミーティングに参加してもらい、前年度の現地調査結果を踏まえて情報・意見交換した。(6) BE専攻が行っているOJE演習受講学生の外部機関による教育効果分析結果も踏まえ、次年度に向けて、教育・研究の進め方について検討した。(7)研究成果は、2015年9月の工学教育協会講演会で発表する。単なるアイデア出しや生産者目線のものづくりではなく、海外に赴き、現地の人たちと交流しつつ、現地で役立つものを、現地の人が継続して生産し活用できるまでに推し進める。こうした国内外での実践体験を通して、社会に役立つ工学の重要性と、国際親善・国際協力の大切さ、すばらしさを学ばせ、真のグローバル人材を育成することをねらっている。2015年度は以下の研究を行った。(1)4月下旬から1週間、研究代表者・大村と研究分担者・小峯が学生2名とともにバングラデシュに赴き、ジェソールの農村において米穀乾燥の現状と現地での乾燥機製作の可否などを調査した。バゲルハットの現地NGO「YES」を訪問して、農家支援活動についての調査した。(2)9月上旬に、大村と小峯が学生6名とともにバングラデシュに赴き、ジェソールの農村においてパーボイル米の乾燥機を製作し実験を行った。現地農民から実用化する上での課題、改良点についてフィードバックをもらった。一連のプロセスにおいて、学生たちは、コーディネーター(バングラデシュ人)の協力を得ながら、現地の農民、鉄工職人、建築職人など、さまざまな人々と協働した。(3)現地活動にあたっては、学生が主体となって、大学において乾燥機のプロトタイプを作成して予備実験を行うとともに、設計図を現地に送って製作を依頼するなど、事前準備にも尽力した。帰国後は、インターネットを通じて現地の人々と情報交換しながら、成果を纏めた。(4)バングラデシュ訪問時には、農村の小学校を3校訪問して子供たちと触れ合い、教師らと意見交換して、初等教育の現状や課題についても調査した。(5)研究成果は、9月の工学教育協会講演会で発表した。バングラデシュに赴き、農村においてパーボイル米の乾燥機を製作し、乾燥実験を行った。現地農民にプレゼンテーションを行い、フィードバックをもらった。この一連のプロセスにおいて、学生たちは、現地の農民、鉄工職人、建築職人など、さまざまな人々と協働する体験をした。現地での活動を実践するにあたり、学生が主体となって、大学において乾燥機のプロトタイプを作成して予備実験を行うとともに、あらかじめ設計図を現地に送って製作を依頼するなど、事前準備にも尽力した。このような活動とその成果によって、学生のフィールド教育を通してのグローバル人材育成という目的は達成できたと思われる。ちなみに、昨年度本研究に参画した学生の一人はJICAに就職した。

こうした国内外での実践体験を通して、社会に役立つ工学の重要性と、国際親善・国際協力の大切さ、素晴らしさを学ばせ、真のグローバル人材を育成することをねらっている。ただ、バングラデシュの農業の機械化、インフラ整備は着実に進んでおり、今後、農具の開発や改善に関わる学生のアイデアや設計・製作だけでは、現地農民の期待に沿うことは難しくなってきた。そこで、本年度は、長期に見て農村が豊かに発展できるように、農業支援を単なる農具の開発や改善に限定せず、将来の農業を担う農家の子供たちの教育に目を向け、子供たちが科学・技術に興味を持ち、農業の近代化に取り組んでいけるような知育教材としてのものづくりを対象として研究を進めた。そのような中、7月に首都ダッカでテロ事件が発生した。そのため帰国した青年海外協力隊員で、現地小学校の教育改革に参画していた人と面談し、バングラデシュの教育が教科書中心の純然たる暗記型教育で、政府は児童中心、実験中心の授業に改善したい意向であるとの情報を得た。この話は、ものづくりを通して、デザインしたり創造力を発揮したりする楽しさ、作り上げたときの喜びなどを体験できる新たな教育を目指そうとする研究方針を支持した。安全を考慮して現地活動は断念したが、ビデオとSkypeによる遠隔授業を立案し、実行した。安全性、実現性、教育効果の観点から、竹とんぼに替わる紙とんぼを教材に選び、画面を通してではあるが、現地の子供たちと交流し、ものづくりの楽しさや喜びを共有することできた。バングラデシュに赴き、現地活動する予定であったが、7月に首都ダッカでテロ事件が発生し治安が悪化したため、渡航を断念せざるを得ない状況となった。そこで、ビデオとSkypeによる遠隔授業を立案し、実行したが、新しい試みであったため、検討すべ課題がいくつか残った。本研究は、バングラデシュを対象にして、農業支援を志向したものづくりとフィールド教育によって、グローバル人材を育成することを目的としている。単なるアイデア出しや生産者目線のものづくりではなく、海外に赴き、現地の人たちと交流しつつ、現地で役立つものを、現地の人が継続して生産し活用できるまでに推し進める。ただバングラデシュの農業の機械化、インフラ整備は着実に進んでおり、農具の開発や改善に関わる学生のアイデアや設計・製作だけでは、現地農民の期待に沿うことが難しくなってきた。そこで昨年度からは、長期に農村が発展できるように、農業支援を単なる農具の開発や改善に限定せず、将来農業を担う農家の子供たちの教育に目を向け、子供たちが科学・技術に興味を持ち、農業の近代化に取り組んでいけるような知育ものづくりを対象とした。2016年7月に首都ダッカで発生したテロ事件を機に帰国した青年海外協力隊員で、現地小学校の教育改革に参画していた人から、バングラデシュの教育が教科書中心の暗記型教育で、政府は児童中心、実験中心の授業に改善したい意向であるとの情報を得た。
木質廃棄物の物質フローの解析と地域林業ゼロエミッションプロセスの構築

本研究の主要な目的は、木質廃棄物のリサイクル利用を対象に、物質およびエネルギーフローを解析することにある。このため、岡山県真庭郡地域をモデルに調査し、地域林業ゼロエミッションプロセスの構築を目指した。すなわち、真庭地域の製材産業の物質フローを解析し、地域で排出される木質未利用資源を用いた小規模単板加工・外構用丸棒加工・木製トレイ製造システムおよび地域林産バイオマス発電システムの構築を考察した。ここでは真庭郡地域の製材不適材・林地残材および樹皮に着目し、小規模単板加工・外構用丸棒加工および地域林産バイオマス発電システムの構築のためのケーススタディをおこなった。調査をもとに、山元の製材不適材の質およぼ量に見合う簡易なベニヤレースを開発した。原木処理量7千m^3/年、原木長さ1m通直、末口平均径24cmの原木丸太の平均単価を8千円/m^3、剥き芯9cm(丸棒として加工利用)など、諸条件を設定して、単板ならびに丸棒加工、木製トレイ製造システムの採算分析を行った。当面未利用のみならず、焼却処理に費用がかかる樹皮を対象にシステムを構築するのが適当である。地域の2原木市場で焼却処理されているバーク量をもとに、採算分析のケーススタディを試みた。発電メリットの予測は、単純焼却年数が46年に及び、余剰電力としての売り電力単価が4.1円/kWh程度では、全くメリットが無いことが判明した。
Theranosticsを目指した水溶性亜鉛含有ポルフィリンの開発

本研究はセラノスティクスの創成を目指し、フッ素ポルフィリン亜鉛錯体(がん診断薬用[65Zn]-P及びがん治療薬用Zn-P)にグルコース(G)鎖とメルカプトエタノール(M)鎖を導入した[65Zn]-PG2M2とZn-PG2M2を合成した。体内動態試験の結果、[65Zn]-PG2M2はGlc鎖のみが結合したPGxに比べ、腫瘍と消化器系臓器との集積率が同程度にまで向上したことが分かった。またZn-PG2M2は、薬剤接触8時間で十分な光細胞毒性効果を示すことが分かった。これらの結果より、今回合成した化合物はセラノスティクス薬剤として期待できる。本研究では、ポルフィリンを用いてガン診断(PET)とガン治療(PDT)を同時に行うことができるセラグノシス薬剤を開発を目指している。本年度は、最適な腫瘍集積性と腫瘍集積時間を有する薬剤開発としてグルコース(Glc)とメルカプトエタノール(mEt)の2つの置換基の置換数を変化させたポルフィリン誘導体((Glc)x(mEt)y)の合成とin vitro評価を行った。比較物質としてGlcが4分子結合したポルフィリン(Glc4)を用いた。合成は、1から3分子のmEt鎖が結合したフッ素ポルフィリン(mEtx)を出発原料に用い、1から3当量のグルコース配糖体(AcGlcSAc)を塩基性条件下で求核置換反応させた後、アセチル基を脱保護することで(Glc)x(mEt)yを60%以上の収率で得た。HeLa細胞株を用いた細胞取り込み試験の結果、Glc4は薬剤接触時間が24時間以降でも取り込み量が増加していた。一方、(Glc)x(mEt)yは薬剤接触8時間以降で取り込み量が飽和した。HeLa細胞株を用いた光毒性試験の結果、薬剤接触8時間の条件では、(Glc)x(mEt)y(EC50<0.2microM)はGlc4(EC 50 > 1.0 microM)よりも高い殺傷効果を示した。また、2つの置換基の置換数の違いが光細胞毒性効果に大きく影響を与えることも見出した。現在、これらの化合物について亜鉛イオンの導入の最適化(溶媒、反応時間、温度)を行っているところである。本研究では、ガン診断(PET)しながらがん治療(PDT)を行うことのできるセラノスティクスの創成とその薬剤開発に取り組んでいる。本研究では、セラノスティクス候補薬剤の合成を行い、担癌マウスを用いた体内動態評価を行った。(合成)フッ素ポルフィリンに腫瘍集積性置換基と腫瘍集積時間促進置換基の2種類を導入したポルフィリン誘導体を出発原料に用いた。実験は、ポルフィリン誘導体溶液(c = 179 microM)に半減期の長い(t1/2= 244 day)RI核種65Zn2+の酢酸溶液(約5 MBq)を加熱反応させたのち、溶媒留去することで[65Zn]-ポルフィリン誘導体を得た。[65Zn]-ポルフィリン誘導体を用いた体内動態の結果、腫瘍と消化器系臓器(肝臓、腎臓、脾臓)との集積率の差は、2倍から同程度の値を示した。また消化器系臓器だけでなく、血液中の[65Zn]-ポルフィリン誘導体量が少ないことから、今回合成した[65Zn]-ポルフィリン誘導体は腫瘍集積性促進置換基を導入することで、クリアランスを促進することができた。今回合成したセラノスティクス候補薬剤であるポルフィリン誘導体は、クリアランスが速く、また腫瘍集積性が高い結果が得られ、がん診断薬としては有望である。今後は、同位体元素であるZnを導入したポルフィリン誘導体の合成と、がん治療薬としての性能を調べていく予定であることから、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。本研究では、がん診断(PET)とがん治療(PDT)が同時に行うことができるセラノスティクスの創成を目指している。一昨年度に開発した、2つの置換基(グルコース(Glc)鎖とメルカプトエタノール(mEt)鎖)を2分子ずつ導入したポルフィリン(TFPP)に放射核種65Znを導入した化合物[65Zn]-TFPP(mEt)2(SGlc)2は、胃ガン(RGK)細胞を移植した担癌マウスを用いた動態試験において、速い腫瘍集積時間と高い腫瘍集積性を示し、がん診断薬としての有用性が示された。そこで昨年度はがん治療薬の開発として、[65Zn]-TFPP(mEt)2(SGlc)2のZnを安定同位体に変更したZnTFPP(mEt)2(SGlc)2を合成し、がん治療薬としての性能を調べた。合成したZnTFPP(mEt)2(SGlc)2について、様々ながん細胞株(HeLa、ラット胃ガン様変異株(RGK)、脳腫瘍株(U87, T98G))を用い光細胞毒性試験を行い、PDT用薬剤としての性能を調べた。また、比較物質として市販PDT薬剤であるレザフィリンについても同様の試験を行った。96穴プレートに細胞株(HeLa、RGK-1、U87およびT98G)を5000cells/ well播種し、37度、5%CO2条件下で8時間培養した。

次に、プレートの各穴に所定濃度(5-0.1 microM)の薬剤溶液(1% DMSO/10% FCS/medium)を添加し8時間接触させた後、ハロゲンランプ(100 W, λ> 500 nm)の光を光量16 J/cm2で照射し、照射24時間後、WST-8アッセイにより細胞生存率を求めた。その結果、どの細胞株においてもZnTFPP(mEt)2(SGlc)2(EC50< 2.5 microM)が、レザフィリン(EC50> 5.0 microM)よりも高い光細胞毒性効果を示され、ZnTFPP(mEt)2(SGlc)2はがん治療薬としても優れていることが示された。本研究で開発したTFPP(mEt)2(SGlc)2亜鉛錯体は、セラノスティクス薬剤として期待できる。本研究はセラノスティクスの創成を目指し、フッ素ポルフィリン亜鉛錯体(がん診断薬用[65Zn]-P及びがん治療薬用Zn-P)にグルコース(G)鎖とメルカプトエタノール(M)鎖を導入した[65Zn]-PG2M2とZn-PG2M2を合成した。体内動態試験の結果、[65Zn]-PG2M2はGlc鎖のみが結合したPGxに比べ、腫瘍と消化器系臓器との集積率が同程度にまで向上したことが分かった。またZn-PG2M2は、薬剤接触8時間で十分な光細胞毒性効果を示すことが分かった。これらの結果より、今回合成した化合物はセラノスティクス薬剤として期待できる。計画では、1年半で最適な腫瘍集積性と腫瘍集積時間を有するセラグノシス薬剤を開発することになっている。これまでに、候補セラグノシス薬剤の前駆体の合成ができ、また現在亜鉛導入の最適化を行っている。これらの理由により、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。今後は、同位体元素であるZnを導入したポルフィリン誘導体の合成と、がん治療薬としての性能をin vitro及びin vivoでのPDT試験を行う。PDT薬剤としても有用性が確認できた後、in vivoでのセラノスティクスの実験を行い、がん診断と治療が同時に行うことができるセラノスティクスを確立する。生体関連これまでに見出した候補セラグノシス薬剤の前駆体に対し亜鉛導入の最適化を行う。その後、この条件を用いてPET核種である62Znを導入したPET薬剤を合成する。このPET薬剤を用いて担癌マウスを用いた体内動態試験を行い性能を調べ、結果を合成にフィードバックさせる予定である。
冷・温阻血傷害肝に産生する一酸化窒素のアンチセンス核酸による抑制

研究助成期間において以下の研究を行った.1.ラットi-NOS mRNA配列の推定2次構造から,標的部位の異なるホスホロチオエート型アンチセンスODN5種AS1AS5を設計した.2.AS1AS5およびマウスiNOS mRNAの開始コドン領域に対するアンチセンス(mAS)を用い,ラット肝実質細胞およびKupffer細胞から産生されるNOの抑制を試みた.実質細胞ではmASが抑制効果を示し,その機構はアンチセンス機構による抑制と非特異的な抑制の両者によるものであると考えられた.一方,Kupffer細胞ではi-NOS mRNAの3′-非翻訳領域に対するAS5が最も強くNO産生を抑制した.しかし何れの細胞においてもNO産生量は低値であり,ラットi-NOS mRNAに対するアンチセンスODNの最適配列に関して明確な結果は得られなかった.3.虚血再灌流後の実質細胞および非実質細胞におけるNO産生動態を検討した.虚血30分,再灌流3時間施したラット肝から調製した非実質細胞において最も強くNO産生およびi-NOS mRNA誘導が観察された.それらに対しAS1AS5の抑制効果を検討したが,NO産生抑制とi-NOS mRNA発現抑制の間に明確な相関は認められなかった.NO産生への内皮型NOSの関与,またはアンチセンスODNの効果が及ばない再灌流早期でのi-NOSタンパク質誘導が考えられた.研究計画調書に従い,本年度は以下の研究を行った.1 NIH genetic sequence databaseに登録されているラットiNOSおよびマウスiNOSのmRNA配列を基にDNASIS(日立ソフトウェアー社)を用いてホモロジー検索を行った.それぞれマウスはRAW264.7細胞に,ラットはSDラット肝臓に由来するiNOSmRNA配列を用い検討したところ,79.15%という高いホモロジーが得られた.また,タンパクレベルでの比較では88.99%のホモロジーが得られた.2 DNASISにより1)で用いたラットiNOSmRNA配列の推定2次構造から,そのループ構造を標的としたホスフォロチオエート型アンチセンスDNA(AS-S-oligo)を5種設計した.AS-S-oligoはそれぞれ,5'非翻訳領域(1種),翻訳領域(3種,うち開始コドン領域に対するもの1種),3'非翻訳領域(1種)に対する20merで,Sugimotoらの最近接塩基対モデルの熱力学的パラメーターから算出したTm値はすべて75°C以上であり,同時に2種類のコントロールS-oligoを設計した.3アンチセンス効果を検討するための予備検討として,Kupffer細胞の調製法および種々の刺激物質に対する応答性を確認した.コラゲナーゼ灌流法および振盪法により調製したKupffer細胞を培養プレートに播種し,LPS,TNF-α,IFN-γおよびIL-1βを単独もしくは併用して作用させ,NO産生をGriess法にて確認した.研究助成期間において以下の研究を行った.1.ラットi-NOS mRNA配列の推定2次構造から,標的部位の異なるホスホロチオエート型アンチセンスODN5種AS1AS5を設計した.2.AS1AS5およびマウスiNOS mRNAの開始コドン領域に対するアンチセンス(mAS)を用い,ラット肝実質細胞およびKupffer細胞から産生されるNOの抑制を試みた.実質細胞ではmASが抑制効果を示し,その機構はアンチセンス機構による抑制と非特異的な抑制の両者によるものであると考えられた.一方,Kupffer細胞ではi-NOS mRNAの3′-非翻訳領域に対するAS5が最も強くNO産生を抑制した.しかし何れの細胞においてもNO産生量は低値であり,ラットi-NOS mRNAに対するアンチセンスODNの最適配列に関して明確な結果は得られなかった.3.虚血再灌流後の実質細胞および非実質細胞におけるNO産生動態を検討した.虚血30分,再灌流3時間施したラット肝から調製した非実質細胞において最も強くNO産生およびi-NOS mRNA誘導が観察された.それらに対しAS1AS5の抑制効果を検討したが,NO産生抑制とi-NOS mRNA発現抑制の間に明確な相関は認められなかった.NO産生への内皮型NOSの関与,またはアンチセンスODNの効果が及ばない再灌流早期でのi-NOSタンパク質誘導が考えられた.研究計画調書に従い,本年度は以下の研究を行った.1.昨年度設計した5種類のホスホロチオエート型アンチセンスDNA(S-oligo)を用い,LPSおよびサイトカイン類によりkupffer細胞から産生されるNOに対する抑制効果を検討し,iNOSmRNAの3'非翻訳領域に対するS-oligoの抑制効果が最も大であることを明かにした.また,何れのS-oligoも細胞に対する毒性は認められなかった.2.前項で抑制効果が最も大きかったS-oligoで4時間前処理後,LPSで誘導されるkupffer細胞内のmRNAレベルをRT-PCR法により測定した.コントロールに比べ,S-oligo処理細胞ではmRNAレベルの有意な減少が確認された.以上の研究から本S-oligoはアンチセンス機構に基づきNO産生を抑制していると考えた.

3.ラット肝の中葉および左外側区の血流を一時的に遮断し,再開通させた後,阻血されていない尾状葉を摘出し,温阻血障害肝モデルを構築した.対照実験ではiNOSmRNAの発現は認められなかったが,1時間の温阻血後,1時間ごとに4時間までの再灌流を行ったラット肝内に,再灌流時間に依存したmRNA発現の増加をRT-PCR法で確認した.本年度は以下の研究を行った.1)昨年度行ったin situ温阻血障害肝モデルの手術手技妥当性を検討するため,虚血および再灌流中の血中LDH量を指標にした.血中LDH量は虚血中および再灌流3時間以降に濃度上昇が観察され,これまで報告されている温阻血傷害肝モデルでの血中LDH濃度の推移と一致した.本実験手技の妥当性が確認された.2)温阻血再灌流時に誘導されるiNOS mRNAの発現強度およびNO産生量を実質・非実質細胞群間で比較したところ,虚血30分後の再灌流を3時間施したラット肝から調製した非実質細胞群においてiNOS mRNA発現およびNO産生量の両方とも最大値を示すことが明らかになった.3)設計した5種類のホスホロチオエート型アンチセンスDNA(AS1AS5)を用い2)の条件で非実質細胞群から産生されるNOに対する抑制効果を検討した.iNOS mRNAの5'非翻訳領域に対するAS1がiNOSmRNA発現ならびにNO産生を抑制した.しかしβ-actin mRNA発現も減弱いるので,本配列が毒性を有することが考えられる.また,翻訳領域を標的とするAS3はNO産生を,3'非翻訳領域に対するAS5はiNOS mRNA発現をそれぞれ抑制したが,共にアンチセンスDNA未処理のControlと有意な差はなかった.加えて,AS3ならびにAS5はβ-actin発現を減弱させる傾向が認められ,障害を増悪する可能性が示唆された.
幼児の生活時間に与える保護者の意識と知恵に関する研究

2017年6月に、東京都の保育園13園に通う06歳児868人(男児438人,女児430人)の保護者に対して、乳幼児とその保護者の生活習慣の実態に関する調査を、無記名自記式質問紙を用いて実施した。その結果、(1)幼児の平均就寝時刻が21時30分前後と遅く、9時間30分を下回る短時間睡眠であった。(2)「園への迎え時刻」や「帰宅時刻」、「入浴時刻」の遅れが、子どもたちの生活を夜型化にしている可能性が懸念された。(3)わが子の就寝時刻を「決めている」保護者は389名(52.6%)、「だいたい決めている」が302名(40.9%)、「あまり決めていない」が30名(4.1%)、「決めていない」が7名(0.9%)であった。(4)わが子の就寝時刻を「21時以前」と早めの時刻に設定している保護者の子どもは、迎え時刻や帰宅時刻、入浴時刻、就寝時刻が有意に早く、睡眠時間が有意に長かった(p<0.001)。(5)20.0%程度の子どもが帰宅後もしくは帰宅途中に外あそびをしていた。これらの結果から、子どもが21時までに就寝できるような環境の設定や保護者の理解の必要性がうかがえたため、保育園乳幼児の家庭では、子どもの規則正しい生活のための知識や理論の普及と、親の意識を高める必要性が求められた。さらに、幼児期の生活を整えるためには、母親自身の生活時間も整える必要があることが考えられた。また、保育園の活動において、午前と午後の外あそびを積極的にとり入れ、身体活動による適度な疲労感を子どもたちにもたせることと、降園後には、各家庭で21時前就寝を目指した生活を呼びかけたい。上記した調査結果の学会発表と合わせて、「規則正しい生活をおくる子どものモデルケースの創出」「家庭でできる早寝のための工夫集の作成」「子どもの生活を乱す注意点や事例をまとめたリーフレットの作成」に向けたデータおよび論文の作成中である。1年目の研究の成果としては、まず、当初予定していた「保育園児の生活習慣の実態と生活の工夫」に関する調査については、その前年度から手掛けてきたために無事に遂行した。具体的には、東京都内の保育園13園に通う1,000名程度の幼児の生活習慣のアンケート調査を実施し、830名程度のデータを得た。これらのアンケートについては、既にエクセルデータとして入力を終了し、図や表にその平均値や標準偏差、人数割合などの結果を算出して可視化し、見やすい形で調査協力園にフィードバックしている。また、同様の内容のアンケート調査を、東京都内の8園の幼稚園についても実施し、1,000名程度の生活実態に関する調査結果を得ている。これらのデータについても、入力を終え、既に図表化して、調査協力園にフィードバックできている。上記の2つの調査で得られた保育園と幼稚園のデータについては分析も進めており、2018年度に開催された6つの学会大会にてその研究成果を発表している。2019年度においても、すでに2つの学会大会にて、研究成果の発表が決定している。2年目に実施すべき内容は、「規則正しい生活をおくる子どものモデルケースの創出」ならびに、「家庭でできる早寝のための工夫集の作成」および、「子どもの生活を乱す注意点や事例をまとめたリーフレットの作成」を進めていくことである。現状、データ入力や図表作成ならびに、2019年度前期の講義や他の業務で多忙を極めているため、予定より3か月程度遅れることが懸念されるが、夏季休暇中に巻き返せるように予定を調査しているため問題はないものと考えている。これらのモデルケース・工夫集・リーフレットをもとにして、2019年度の後半には、介入研究をしようと考えている。本研究課題の今後の推進方策については、まず、当初の予定では昨年度(2018年度)に終了予定の、「規則正しい生活をおくる子どものモデルケースの創出」ならびに、「家庭でできる早寝のための工夫集の作成」および、「子どもの生活を乱す注意点や事例をまとめたリーフレットの作成」を早急に進めていきたいと考えている。具体的なスケジュールとしては、2019年度の9月中旬には作成する予定である。次に、介入研究については、9月10月に準備をし、11月中の実施を目指している。生活のリズムが乱れがちな夏季休業期間ならびにお盆の時期を避け、また、運動会シーズンである10月を避けたいと考えている。さらに、生活のリズムが確立していないことが考えられ、かつ、生活時間を遅らせる誘因となりうるテレビやスマートフォン等に比較的、慣れ、親しみ過ぎていない2歳児未満を対象としようと考えている。2019年度は、前期に講義や業務が集中しているため、前期終了後の8月上旬からは研究に取り組める予定である。それまでに、モデルケースや工夫集、リーフレットの土台となる知見を、1年目で得られたデータから導き、わかりやすい形で示したい。当初の予定より、やや遅れているが、3年目の最終年では、この遅れを取り戻せるように今のうちから努力を重ねていきたい。

その結果、(1)幼児の平均就寝時刻が21時30分前後と遅く、9時間30分を下回る短時間睡眠であった。(2)「園への迎え時刻」や「帰宅時刻」、「入浴時刻」の遅れが、子どもたちの生活を夜型化にしている可能性が懸念された。(3)わが子の就寝時刻を「決めている」保護者は389名(52.6%)、「だいたい決めている」が302名(40.9%)、「あまり決めていない」が30名(4.1%)、「決めていない」が7名(0.9%)であった。(4)わが子の就寝時刻を「21時以前」と早めの時刻に設定している保護者の子どもは、迎え時刻や帰宅時刻、入浴時刻、就寝時刻が有意に早く、睡眠時間が有意に長かった(p<0.001)。(5)20.0%程度の子どもが帰宅後もしくは帰宅途中に外あそびをしていた。これらの結果から、子どもが21時までに就寝できるような環境の設定や保護者の理解の必要性がうかがえたため、保育園乳幼児の家庭では、子どもの規則正しい生活のための知識や理論の普及と、親の意識を高める必要性が求められた。さらに、幼児期の生活を整えるためには、母親自身の生活時間も整える必要があることが考えられた。また、保育園の活動において、午前と午後の外あそびを積極的にとり入れ、身体活動による適度な疲労感を子どもたちにもたせることと、降園後には、各家庭で21時前就寝を目指した生活を呼びかけたい。上記した調査結果の学会発表と合わせて、「規則正しい生活をおくる子どものモデルケースの創出」「家庭でできる早寝のための工夫集の作成」「子どもの生活を乱す注意点や事例をまとめたリーフレットの作成」に向けたデータおよび論文の作成中である。1年目の研究の成果としては、まず、当初予定していた「保育園児の生活習慣の実態と生活の工夫」に関する調査については、その前年度から手掛けてきたために無事に遂行した。具体的には、東京都内の保育園13園に通う1,000名程度の幼児の生活習慣のアンケート調査を実施し、830名程度のデータを得た。これらのアンケートについては、既にエクセルデータとして入力を終了し、図や表にその平均値や標準偏差、人数割合などの結果を算出して可視化し、見やすい形で調査協力園にフィードバックしている。また、同様の内容のアンケート調査を、東京都内の8園の幼稚園についても実施し、1,000名程度の生活実態に関する調査結果を得ている。これらのデータについても、入力を終え、既に図表化して、調査協力園にフィードバックできている。上記の2つの調査で得られた保育園と幼稚園のデータについては分析も進めており、2018年度に開催された6つの学会大会にてその研究成果を発表している。2019年度においても、すでに2つの学会大会にて、研究成果の発表が決定している。2年目に実施すべき内容は、「規則正しい生活をおくる子どものモデルケースの創出」ならびに、「家庭でできる早寝のための工夫集の作成」および、「子どもの生活を乱す注意点や事例をまとめたリーフレットの作成」を進めていくことである。現状、データ入力や図表作成ならびに、2019年度前期の講義や他の業務で多忙を極めているため、予定より3か月程度遅れることが懸念されるが、夏季休暇中に巻き返せるように予定を調査しているため問題はないものと考えている。これらのモデルケース・工夫集・リーフレットをもとにして、2019年度の後半には、介入研究をしようと考えている。
モルヒネの数種薬理効果に及ぼす免疫系の役割

Chediak-Higashi病のモデル動物であり、免疫疾患動物であるBeigeマウスおよびラットを用いて、モルヒネの数種薬理作用を検討した。モルヒネの鎮痛効果は対照のC57BL/6NマウスあるいはDAラットに比較し、Beigeマウスおよびラットともに有意に低い値を示した。また、このBeige動物におけるモルヒネ鎮痛効果の減弱は脾臓摘出により回復した。したがって、脾臓由来の何等かの物質がモルヒネ鎮痛の抑制に関与しているものと考えられる。一方、Beigeマウスにおけるモルヒネ誘発自発運動促進効果はC57BL/6Nマウスに比べ、自発運動促進効果が持続し、総運動量は有意な増加を示した。この自発運動促進効果は脾臓摘出によりさらに増強された。また、モルヒネ混入飼料を3日間処置後のモルヒネ鎮痛耐性は、C57BL/6Nマウスでモルヒネ鎮痛効果の用量反応直線を、2.94倍右にシフトし、Beigeマウスでは5.97倍右にシフトした。したがって、モルヒネ鎮痛耐性の形成はC57BL/6NよりBeigeマウスの方が強く形成されることが明らかになった。Beigeマウスにおけるモルヒネ精神依存はC57BL/6Nマウスと有意差が認められなかった。さらに、モルヒネの身体依存はナロキソン誘発跳躍および身震いにおいてC57BL/6NマウスよりBeigeマウスの方が有意に高い値を示した。したがって、BeigeマウスがC57BL/6Nマウスより身体依存が強く形成されることが示唆できる。また、サトカインの1つであるTNFの活性を測定したところBeigeマウスの方がC57BL/6Nマウスより有意に高かった。これらの結果より、モルヒネの効果はBeigeと対照動物で大きく異なり、この差異の一因としてTNFが関与している可能性が示唆できる。さらに、コカインの精神依存形成に対するリポポリサッカライドの効果を検討したところ、コカインの精神依存形成は著明かつ有意に抑制された。これはリポポリサッカライドがマクロファージを活性化し、TNFやbeta-エンドルフィンを産生した結果として引き起こされたものと考えられる。
むだ時間を含む系の閉ループ同定を用いた統合的制御系設計に関する研究

センサやアクチュエータに時間的な遅れが存在する入力むだ時間系は、予測制御を用いることで、集中系と同じような性能をもたせることができる。しかしながら、実際的な側面においてはまず制御対象を同定することからはじめなければならない。むだ時間の値を正確に同定する研究も必要であるが、入力むだ時間系において、むだ時間の値を必ずしも正確に同定することだけが重要ではない。むしろ制御性能を上げるために適した同定手法を用いる必要がある。以上のことから、入力むだ時間系の同定と制御系設計の統合的制御系設計の研究を行い、以下の実績が得られた。1.入力むだ時間系に対して、集中系で知られているWindsurfer Approach(内部モデル制御)に適した閉ループ同定手法(間接法)を考案し、考案した同定手法から、閉ループ同定と制御系設計の繰り返し制御方法を提案した。(1)上記手法の理論を計測自動制御学会論文集に既発表。(2000年7月)(2)手法を冷却温度制御実験によりその実用性を確かめ国際会議において発表した。(2003年9月)2.状態空間モデルで記述された入力むだ時間系に対して、最適レギュレータを構成するために適した同定手法(入力むだ時間系で閉じているもの)を考案し、考案した同定手法から、同定と制御系設計の繰り返し制御系を構成した。システム制御情報学会誌において発表した。(2002年4月)3.入力むだ時間系に対する古典的な手法であるスミス法と内部モデル制御の関係についてまとめ、国際会議で発表した。(2003年8月)4.離散時間のむだ時間系についての安定性について考察し、発表。(2002年9月)5.むだ時間系の制御手法を電気炉の制御に応用し、発表。(2003年9月)センサやアクチュエータに時間的な遅れが存在する入力むだ時間系は、予測制御を用いることで、集中系と同じような性能をもたせることができる。(2003年9月)本年度は、入力むだ時間系の閉ループ同定問題の理論的考察を進めた。むだ時間系のスペクトル分解が成り立たないことから、むだ時間を含まない系で得られている結果は利用できないことが判り、それを回避するために仮想予測系の閉ループを用いることで、閉ループ同定ならびにLQG最適制御の繰り返し制御が理論的に可能なことを示した。シミュレーションレベルでは実証できたが、仮想予測系はパラメータが正確でなければならず、閉ループ同定の調整が難しく、実プラントへの応用は難しいであろう。すでにわれわれが理論的に示した内部モデル制御と閉ループ同定を用いた統合的制御を、ペルチェ素子を用いた温度制御プラントへ適用した。その実験結果は概ね良好で、従来のPID制御と比べ、はるかに性能の良い制御系設計手法であることが判った。さらに統合的制御は閉ループ同定実験と制御実験を繰り返さなければならず、その過程を自動化することを目指した。制御性能の判断をいかに行うかを検討し、シミュレーションレベルで自動化に成功した。その他、離散時間むだ時間系に関する研究、振動系実験モデルによる状態予測制御実験なども行った。状態予測制御ではむだ時間分の時間長のデータを数値積分するために、コンピュータのプログラムメモリを多く消費し、数値精度を上げるために、制御サンプル時間を短くできず、実装面での改良が必要であることが判明した。

むしろ制御性能を上げるために適した同定手法を用いる必要がある。以上のことから、入力むだ時間系の同定と制御系設計の統合的制御系設計の研究を行い、以下の実績が得られた。1.入力むだ時間系に対して、集中系で知られているWindsurfer Approach(内部モデル制御)に適した閉ループ同定手法(間接法)を考案し、考案した同定手法から、閉ループ同定と制御系設計の繰り返し制御方法を提案した。(1)上記手法の理論を計測自動制御学会論文集に既発表。(2000年7月)(2)手法を冷却温度制御実験によりその実用性を確かめ国際会議において発表した。(2003年9月)(3)上記手法を自動的に行なうアルゴリズムを考案した。シミュレーションレベルでは結果が得られているが、実験結果がまだであるため未発表。2.状態空間モデルで記述された入力むだ時間系に対して、最適レギュレータを構成するために適した同定手法(入力むだ時間系で閉じているもの)を考案し、考案した同定手法から、同定と制御系設計の繰り返し制御系を構成した。システム制御情報学会誌において発表した。(2002年4月)3.入力むだ時間系に対する古典的な手法であるスミス法と内部モデル制御の関係についてまとめ、国際会議で発表した。(2003年8月)4.離散時間のむだ時間系についての安定性について考察し、発表。(2002年9月)5.むだ時間系の制御手法を電気炉の制御に応用し、発表。(2003年9月)
近接場光を用いたチューブリン分子の重合過程の観察と制御

研究法の開発と結果近接場光を応用した高解像度観察と分子反応の制御が最も必要とされる領域の一つに、生体機能分子の観察と制御があげられる。平成9年度の本重点領域研究から、全反射モードの近接場顕微鏡を構成することができた。培養細胞で発現した蛍光シナプトタグミンを、生きた細胞の中で、全反射型近接場光顕微鏡で観察ができることを示すことができた。すなわち、青色のエバネセント光(厚さ200nm)でテュ-ブリンを近接場光のなかで観察することができた。また細胞内の極めて限局した蛍光シナプトタグミンを励起し蛍光観察可能であった。1)これまでの本重点領域の研究(平成9年度)から、テュ-ブリンを近接場光のなかで観察することができた。そのための実験条件を検討した。近接場光のなかで観察されるテュ-ブリンは背景の迷光がないために非常にシャープな映像を得ることができた。この近接場光による分子の映像は通常の蛍光顕微鏡とは異なる分子の状態の情報を持っていると考えられる。近接場光映像から分子の状態を読み取るとこがこれから必要になると考えられる。2)光る蛍光蛋白分子シナプトタグミンを生きた細胞で発現し、近接場光によるイメージングができることがわかった。培養神経細胞PC12(細胞株の名称)に、蛍光を発するように遺伝子改変が行われたシナプトタグミンを遺伝子導入した。この蛍光を発する蛋白分子をもつ細胞を全反射型近接場光顕微鏡にセットして観察を行った。近接場光による細胞の励起では、細胞の膜からわずかに200nm以下の蛋白分子が蛍光励起された。このわずかな光の層にある蛋白質分子、あるいは蛋白質分子の集合が近接場光イメージングした。細胞を興奮するように化学的な刺激を与えると、斑点状に蛍光が変化することが見出された。
NMRを利用した各種レクチンの精密認識機構の解明とその応用

Siaα2→6Ga1とH型あるいはSd型抗原決定基に特異性をもつキカラスウリレクチンTJA-IとTJA-IIの糖結合特異性をさらに^1H-NMRにより詳細に解析した。その結果、TJA-Iとメチル-β-ガラクトシドとの相互作用においては、レクチン活性部位とガラクトースのH-4位が最も近く接していること、またTJA-IIとメチル-β-ガラクトシドではガラクトースのH-2,3,4,5,6位が同程度にレクチン活性部位に接していることが明らかになった。TJA-Iと極めて類似した糖結合特異性を示すカブトムシレクチン(Allo A-II)ではガラクトースの下部平面との相互作用が認められ、^1H-NMRが両者の糖認識様式の微妙な違いを明らかにするために適した方法であることが証明された。^1H-NMRにより、現在さらに複雑な糖鎖とレクチンとの相互作用を解析中である。一方、モンクロシャチホコガレクチン(PFA)の糖結合特異性を種々の糖鎖により解析した結果、Ga1β1→4G1cNAcβ1そのものを強く認識することが明らかになった。しかし、N-アセチルラクトサミン構造にGa1NAc,Ga1,Fucなどが結合すると反応せず、また、マンノースに結合したN-アセチルラクトサミン分岐も結合能がなくなるというユニークな糖結合特異性を示す。このような厳密な結合特異性の明らかになった十数種のレクチンをゲルに固定化し、1ナノモル以下の糖蛋白質から得られた糖鎖をレクチンカラムで系統的に分離することにより、容易に全構造をほぼ解析する方法を確立した。この方法により、肝硬変、肝癌患者血清中のトランスフェリン糖鎖を解析した結果、硬変化によりシアリルルイスX構造を持つ34本鎖が増加し、癌化するとX構造は消失し、単純な34本鎖が増加することが明らかになった。この現象は血清コリンエステラーゼでも確認され、硬変化、癌化に伴う糖鎖の段階的な変化の生物学的意義を検討中である。
ヒトゲノム二次元解析法によるヒト癌に関連する新たな遺伝子群のスクリーニングと同定

癌は遺伝子異常の蓄積の結果生じることがわかってきたが、再発、転移といった予後因子として臨床上有用なマーカーとなる遺伝子異常は、極一部しかわかっていない。われわれは、一枚のゲル上で数千もの遺伝子座位を一度に解析でき、多数例を比較検討することが可能なRLGS法をヒト大腸癌、肝細胞癌に応用し、それぞれの癌組織に特異的な遺伝子異常を同定し、その塩基配列を決定した。さらにその臨床的意義についても検討を行った.1.大腸癌では一症例あたり平均12個のスポット変化が認められた。そのうち共通して高率に変化が認められたスポットをクローニングし、その塩基配列を決定したところ、410塩基対からなる遺伝子断片で、ホモロジー検索を行ったところ、ヒト脂肪酸合成酵素遺伝子とDNAレベルで69%の相同性を有していることが明らかにされた。さらに当スポットから得られたDNA産物をプローブとしたノーザンブロットハイブリダイゼーションを当スポットのみられた検体で施行すると、癌部のみにRNA発現が確認された。2.肝細胞癌では一症例あたり平均16個のスポット変化を認めた。スポット変化数で術後累積生存率を比較検討すると、15個以下の群で優位に良好であった。癌部で共通して著しく増強している4個のスポットについて,クローニングし塩基配列を決定した。1個は染色体8q21に存在している1088個の塩基対からなるhumantandem repeat sequence遺伝子で、もう一つは数個の染色体にわたって存在している1415個の塩基対からなるcentrometricNotI cluster遺伝子であった。これらのスポット輝度と肝細胞癌術後の無再発生存率との間には有意の相関が認められ、これらのスポット輝度の変化を測定することにより肝細胞癌の有用な予後因子となる可能性が示された。本年度の研究により以下の点が明らかにされたので報告する。1。RLGS法にてヒト大腸癌13例中8例で出現したスポットをクローニングしその塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行ったところ長鎖脂肪酸の合成・分解作用を有するhumanfatty acid synthase gene関連遺伝子であることが明らかにされた。2。肝細胞癌においては、RLGS法により検出された遺伝子異常数と再発との間に密接な関連が明らかにされた。すなわち、遺伝子異常数が多い肝細胞癌症例では術後累積健存率が有意に不良であり、予後因子として有用である可能性が示された。3。また、肝細胞癌で高率に出現する高濃度のスポット2個をクローニングし、その塩基配列を決定しホモロジー検索を行ったところ、それぞれ8q21に存在しているrepeating unitとcentrometric Not I clusterであった。4。上記(3)のスポット変化は肝細胞癌あたりの遺伝子異常数と関連が認められ、遺伝子異常数がおおいほどその濃度は濃くなる傾向がみられた。5。上記(3)以外に肝細胞癌で高率に出現するスポットが2個認められたが、これらのスポットについてもクローニングを行い塩基配列を決定したが、ホモロジーのある遺伝子はみつけることが出来ず、未知の遺伝子であると考えられた。6。RLGS法にて食道癌でも特異的かつ高率に異常の認められるスポットが存在していた。さらにその臨床的意義についても検討を行った。1.大腸癌では一症例あたり平均12個のスポット変化が認められた。

そのうち共通して高率に変化が認められたスポットをクローニングし、その塩基配列を決定したところ、410塩基対からなる遺伝子断片で、ホモロジー検索を行ったところ、ヒト脂肪酸合成酵素遺伝子とDNAレベルで69%の相同性を有していることが明らかにされた。さらに当スポットから得られたDNA産物をプローブとしたノーザンプロットハイプリダイゼーションを当スポットのみられた検体で施行すると、癌部のみにRNA発現が確認された。2.肝細胞癌では一症例あたり平均16個のスポット変化を認めた。スポット変化数で術後累積生存率を比較検討すると、15個以下の群で優位に良好であった。癌部で共通して著しく増強している4個のスポットについて、クローニングし塩基配列を決定した。1個は染色体8q21に存在している1088個の塩基対からなるhumantandem repeat sequence遺伝子で、もう一つは数個の染色体にわたって存在している1415個の塩基対からなるcentrometric NotI cluster遺伝子であった。これらのスポット輝度と肝細胞癌術後の無再発生存率との間には有意の相関が認められ、これらのスポット輝度の変化を測定することにより肝細胞癌の有用な予後因子となる可能性が示された。