hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インターフェロン誘導遺伝子群（ＩＳＧｓ）に注目した慢性腎臓病の分子機構解明

市販のヒト正常糸球体内皮細胞を購入・培養して以下の実験を行った。ウイルス感染をmimicする試薬であるpoly ICを細胞に添加し、その下流で発現する因子群を調べ、RNA干渉法を用いて、それらの発現に関与する分子の検索を行った。それらの誘導は、RNA干渉法でToll-like receptor 3 (TLR3)、IFN regulatory factor 3 (IRF3)およびNF-kappa B p65をノックダウンすると抑制された。また、IFN-betaをノックダウンすると、CXCL1、IL-6、RIG-I、MDA5の発現は抑制された。さらに、RIG-IおよびMDA5のノックダウンは、IL-6の誘導を抑制した。以上から、糸球体血管内皮細胞において、CXCL1、E-selectin、IL-6、RIG-I、MDA5はIFN-betaに依存して誘導されることが明らかになった。このことは、これらの分子がウイルス感染による糸球体における炎症の悪化の機構に関与していると考えられた。ヒト糸球体内皮細胞において、TLR3シグナリングを介した自然免疫応答があることを確認することができた。そのシグナリングには、RIG-IやMDA5などのISGsが関与していることが明らかになった。糸球体血管内皮細胞における自然免疫応答を効果的に抑制する薬剤を検討していく。ヒトメサンギウム細胞および、ヒト糸球体内皮細胞を培養し、これらの細胞を用いて、自然免疫応答におけるinterferon-inducible genes (ISGs)の意義についての検討を行った。自然免疫応答の活性化には、Toll-like receptor 3 (TLR3)のリガンドの人工二本鎖RNAのpoly ICと、TLR4のリガンドのlipopolysaccharide (LPS)を用いた。mRNAやタンパク質の発現解析には、定量的RT-PCR法、western blotting法、ELISA法などを用いた。また、遺伝子の機能の検索には、RNA干渉法を用いた。その結果、ヒトメサンギウム細胞において、脱ユビキチン化酵素の一つであるCylindromatosis (CYLD)が、TLR3シグナリング経路を抑制することを見出し、報告した。また、培養ヒトメサンギウム細胞において、時計遺伝子の一つであるDEC1が、TLR3シグナリングにより誘導されるケモカインのCXCL10やCCL5の発現を調節していることを見出し、報告した。また、clarithromycinは慢性炎症を抑制することが注目されている抗生剤であるが、メサンギウム細胞において、TLR4シグナリングによるケモカインのCCL2の発現誘導が、clarithromycinにより抑制されることを報告した。これらの知見は、腎臓における慢性炎症性疾患の病態の一部を明らかにしたものと言える。一方、培養ヒト糸球体血管内皮細胞にいて、メサンギウム細胞におけると同様に、TLR3シグナリングの活性化によりISGsの発現が誘導されることを観察し、現在、投稿中である。今後は、その詳細について、検討を進めていく予定である。培養ヒトメサンギウム細胞におけるTLR3シグナリングにおけるISGsに意義について、いくつかの新知見を得た。前年度の検討に引き続き、培養ヒト糸球体血管内皮細胞および培養ヒトメサンギウム細胞を用いた研究を行う。個々のISGsタンパク質の発現や機能の探索を続けると同時に、ISGsタンパク質同士の相互作用の解析を進める。転写調節機構に加え、翻訳やタンパク質の分解といったposttranscriptionalおよびposttranslationalな調節機構の解析も行う。それらの検討に基づき、メサンギウム細胞との共通性や細胞特異性を検討していく予定である。また、免疫蛍光染色による、糸球体におけるISGsの発現やそれらの局在についても検討を進める。培養細胞の購入が予定していた回数より1回少なかったため。実験に用いたヒト糸球体内皮細胞が、想定していたよりも少量で済んだために残額が生じた。次年度の実験消耗品の支出への充当を予定している。
T-ALLをモデルとした白血病幹細胞特異的な代謝制御機構の解明

これまで我々のグループは、造血幹細胞維持と白血病発症抑制に必須であるFbxw7遺伝子の発現と機能について新たな知見を見いだした。3つあるFbxw7遺伝子のアイソフォームのうち、造血幹細胞特異的アイソフォームがFbxw7αであることを見いだし、Fbxw7αを造血幹細胞で過剰発現さると造血幹細胞を体外で維持できることを明らかにした。その検討過程で、Fbxw7αが造血幹細胞の細胞周期を抑制することで静止期を制御することを見いだした。今年度は、研究をT細胞性リンパ系腫瘍のみならず、B細胞性リンパ系腫瘍についても腫瘍特性を進展させ、ヒト化マウス多発性骨髄腫モデルを作成して多発性骨髄腫細胞の骨髄ニッチへ及ぼす影響と、新規抗腫瘍薬であるベンダムスチンの多発性骨髄腫に対する効果及び多発性骨髄腫ニッチに対する効果も検討した。多発性骨髄腫細胞が骨幹端部を好んで生着し、様々なニッチ細胞とcomplexを形成し、細胞外マトリックス構造を破壊するなどといった、多発性骨髄腫における骨髄間質細胞の細胞学的、解剖学的特徴を明らかにした。その中で、多発性腫瘍細胞の中に低酸素誘導性にVE-cadherinを発現する亜集団の存在を見出し、それが内皮様構造を呈することや治療抵抗性であることも示した。また、ベンダムスチンがin vivoにおいて多発性骨髄腫に有効であり、多発性骨髄腫によって誘導された骨髄ニッチの異常も改善している可能性を見出した。このヒト化マウスモデルを用いた多発性骨髄腫の系は、多発性骨髄腫の病態生理の動態や、腫瘍細胞と他のニッチ細胞との相互関係の解析に大変有益であり、今後も、新規多発性骨髄腫治療開発に役立つと考えられた。これまでに我々のグループは、F-box and WD-40 domain protein 7(Fbxw7)コンテイショナルノックアウトマウスから高率にT細胞性急性リンパ球性白血病(T-ALL)が発症することを明らかにしてきた(Genes Dev, 2008)。Fbxw7とはSCF(complex of SKP1, CLL1 and F-box protein)タイプのユビキチンリガーゼのコンポーネントであり、造血幹細胞における細胞分裂、細胞分化増殖に関連する蛋白質群を一括して標的とするE3ユビキチンリガーゼである。我々は、Fbxw7の造血幹細胞に与える影響をより詳細に解析するために、正常造血幹細胞にFbxw7を過剰発現させることを試みた。更に、Fbxw7コンディショナルノックアウトマウスから発症したT-ALLの白血病細胞に、Fbxw7を戻すことで治療に結びつく可能性を検討した。Fbxw7にはFbxw7α、Fbxw7β、Fbxw7γの3つのアイソフォームがあり、まず我々は造血細胞の各分画においてFbxw7αがより未分化な造血幹細胞に高発現していることを見出した。そこでFbxw7αを造血幹細胞にレトロウィルスを用いて過剰発現させたところ、数あるFbxw7の標的蛋白の中でもc-Myc、Notch1が蛋白レベルで幹細胞内における発現が抑制されていることを明らかにし、細胞周期解析においても細胞周期を低下させることを証明した。更に移植実験においてFbxw7αを過剰発現させることで、より幹細胞を高率に維持できることを明らかにした。またT-ALL白血病細胞に戻すことで、細胞死を誘導し、p53関連や細胞周期関連の遺伝子が高発現していることがわかった。今後は、Fbxw7が造血幹細胞や白血病細胞に与える影響を追究していき、将来的な造血幹細胞の体外増幅や白血病治療に結び付けられる知見を得られるよう研究を展開していく。これまでにFbxw7αを正常造血幹細胞に過剰発現させることで、ターゲット蛋白の分解を促進させ、更に細胞周期を低下させることで静止期幹細胞を制御し、培養条件下で幹細胞活性を維持できる可能性を示してきた。以上の結果を踏まえて、本年度は更に造血幹細胞におけるFbxw7αの機能を明らかにするために、他のアイソフォームであるFbxw7β、Fbxw7γを造血幹細胞に過剰発現させ、Ki67を用いて細胞周期を検討した。しかし、Fbxw7β、Fbxw7γを過剰発現させても細胞周期は低下しないことがわかり、Fbxw7αが特異的に造血幹細胞を静止期に維持していることが明らかとなった。また造血幹細胞の静止期に重要とされる、低酸素環境における造血幹細胞維持とFbxw7に関連性があるのではないかと仮説をたてた。その検討のために、造血幹細胞を低酸素下で一晩培養し、Fbxw7の蛋白発現を免疫組織化学染色で評価したところ、低酸素環境によってFbxw7が細胞内、とりわけ核内に蓄積していることが明らかになり、Fbxw7αが低酸素環境で誘導されていることが示唆された。また、低酸素環境ではc-MycがFbxw7依存性に蛋白レベルでも抑制されていることが、Fbxw7コンディショナルノックアウトマウスを用いた実験から見出すことができた。つまり、低酸素環境が造血幹細胞にFbxw7αを誘導し、低酸素依存性のc-Myc抑制に寄与していることも明らかとなった。3つあるFbxw7遺伝子のアイソフォームのうち、造血幹細胞特異的アイソフォームがFbxw7αであることを見いだし、Fbxw7αを造血幹細胞で過剰発現

さると造血幹細胞を体外で維持できることを明らかにした。その検討過程で、Fbxw7αが造血幹細胞の細胞周期を抑制することで静止期を制御することを見いだした。今年度は、研究をT細胞性リンパ系腫瘍のみならず、B細胞性リンパ系腫瘍についても腫瘍特性を進展させ、ヒト化マウス多発性骨髄腫モデルを作成して多発性骨髄腫細胞の骨髄ニッチへ及ぼす影響と、新規抗腫瘍薬であるベンダムスチンの多発性骨髄腫に対する効果及び多発性骨髄腫ニッチに対する効果も検討した。多発性骨髄腫細胞が骨幹端部を好んで生着し、様々なニッチ細胞とcomplexを形成し、細胞外マトリックス構造を破壊するなどといった、多発性骨髄腫における骨髄間質細胞の細胞学的、解剖学的特徴を明らかにした。その中で、多発性腫瘍細胞の中に低酸素誘導性にVE-cadherinを発現する亜集団の存在を見出し、それが内皮様構造を呈することや治療抵抗性であることも示した。また、ベンダムスチンがin vivoにおいて多発性骨髄腫に有効であり、多発性骨髄腫によって誘導された骨髄ニッチの異常も改善している可能性を見出した。このヒト化マウスモデルを用いた多発性骨髄腫の系は、多発性骨髄腫の病態生理の動態や、腫瘍細胞と他のニッチ細胞との相互関係の解析に大変有益であり、今後も、新規多発性骨髄腫治療開発に役立つと考えられた。
ゾル-ゲル転移点近傍における臨界現象の計測法に関する研究

強いゲル化を起こすポリアクリルアミドと弱いゲル化を起こすアガロースを試料とし、系のマクロな性質である力学物性とミクロな分子レベルの性質を反映する光散乱を計測し、ゾル-ゲル転移点近傍における臨界現象の視点から解析を試みた。ゾル-ゲル転移点近傍のポリアクリルアミド・ゾルのクラスター半径分布を求めるために、動的光散乱測定を試みた。散乱光強度の時間変化からゆらぎの自己相関関数が求められ、この相関関数から求められる拡散係数から、Stokes-Einstein式よりクラスター径を算出した。重合反応開始直後クラスター径分布にまず単一のピークが生じ、反応の進行に伴いさらに大きな第二のピークが現れた。第二のピークは反応の進行に伴い大きくなるのに対し、第一のピークは反応が進行しても大きさはそれほど変わらなかった。この結果から、まず一次クラスターが生成し、この一次クラスターが重合して二次クラスターを形成することが示唆された。二次クラスターの大きさは、ゲル化点に近づくにつれ発散する傾向を示した。濃度についてスケーリングすると、ゲル化濃度は粘性率測定から求められた値とほぼ一致し、また臨界指数は0.84となり、パーコレーション・モデルから予想される相関距離の臨界指数(0.9程度の値が予想されている)に近い値が得られた。また、非共有結合でクラスターを形成するアガロースにおいても、動的光散乱法によりゾル中のクラスター半径分布を測定することが可能であった。アガロースは共有結合による架橋点を形成しないため、本来明確なクラスターの定義は困難であるが、クラスターに相当する部分の大きさの分布と考えればパーコレーションの考え方が適用できると考えられた。なお、本研究で用いたアガロースは45°Cのデータからかなり広い分子量分布をもっていることが示唆された。平均クラスター半径は濃度が増しゲル化濃度に近づくにつれて大きくなり発散する傾向を示した。この発散挙動はスケーリング則で良好に記述でき、27°Cのとき平均クラスター半径と濃度のデータからfittingによりゲル化濃度と臨界指数を求めると、ゲル化濃度は4.5×10^<-3>wt%、臨界指数は0.98となり、相関距離の臨界指数の理論値に近い値が得られた。温度に関しても、温度が低くゲル化温度に近づくにつれて、クラスター半径分布は粒径が大きい方へシフトした。また、分布の形も40.0°C以上の温度条件では大粒径側に長く裾を引いているのに対し、さらに温度が低くなると、裾が消えていることがわかった。濃度0.15wt%のときクラスター平均半径と温度のデータからfittingによりゲル化温度と臨界指数を求めると、ゲル化温度は32.7°C、臨界指数は1.36となった。推定された臨界指数は理論値よりもかなり大きな値となった。以上の結果により、弱いゲル化を起こすアガロースに関しては若干の問題点を残してはいるが、ゾル-ゲル転移点近傍での物性変化を記述する理論として、パーコレーション、スケーリングといった考え方が非常に有用であることが、クラスター半径分布を計測することにより明らかとなった。

また、分布の形も40.0°C以上の温度条件では大粒径側に長く裾を引いているのに対し、さらに温度が低くなると、裾が消えていることがわかった。濃度0.15wt%のときクラスター平均半径と温度のデータからfittingによりゲル化温度と臨界指数を求めると、ゲル化温度は32.7°C、臨界指数は1.36となった。推定された臨界指数は理論値よりもかなり大きな値となった。以上の結果により、弱いゲル化を起こすアガロースに関しては若干の問題点を残してはいるが、ゾル-ゲル転移点近傍での物性変化を記述する理論として、パーコレーション、スケーリングといった考え方が非常に有用であることが、クラスター半径分布を計測することにより明らかとなった。強いゲル化を起こすポリアクリルアミドを試料とし、系のマクロな性質である力学物性とミクロな分子レベルの性質を反映する光散乱を計測し、ゾル-ゲル転移点近傍における臨界現象の視点から解析を試みた。ゾル-ゲル転移点近傍の力学物性の変化に関しては、ゲル側の動的弾性率のデ-タのみを用いてゲル化点と臨界指数を決定する方法が一般的であるが、この方法ではゲル化点と臨界指数が同時に、かつ、相互に依存しあって決定されることになる。したがって、厳密に臨界現象を検討するために、ゲル化点と臨界指数を独立に決定する方法を検討した。すなわち、ゲル化点に関してはゾル側の粘性率から決定し、そのゲル化点の値を用いてゲル側の動的弾性率に関して臨界指数を求めた。この方法により得られた動的弾性率に関する臨界指数は1.95となり、パ-コレ-ション・モデルから理論的に予想される値に非常に近い値が得られた。これにより、この方法の有効性が示されたと考えられる。次に、動的光散乱測定から転移点近傍のゾルでのクラスタ-径分布を求めることを試みた。散乱光強度の時間変化からゆらぎの自己相関関数が求められる。この相関関数から求められる拡散係数から、StokesーEinstein式よりクラスタ-径を算出した。重合反応開始直後クラスタ-径分布にまず単一のピ-クが生じ、反応の進行に伴いさらに大きな第二のピ-クが現れた。第二のピ-クは反応の進行に伴い大きくなるのに対し、第一のピ-クは反応が進行しても大きさはそれほど変わらなかった。この結果から、まず一次クラスタ-が生成し、この一次クラスタ-が重合して二次クラスタ-を形成することが示唆された。これはChhabr et al.(“Kinetics of Aggregation and Gelation,"ed.by F.Family and D.P.Landau,NorthーHolland,Amsterdam,1984)が大規模な計算機シミュレ-ションにより示された動的ゲル化モデルの予測を定性的に支持するものであり、ポリアクリルアミドのゲル化は単純なパ-コレ-ションモデルとは異なるゲル化過程であることが明らかとなった。二次クラスタ-の大きさは、ゲル化点に近づくにつれ発散する傾向を示した。濃度についてスケ-リングすると、ゲル化濃度は粘性率測定から求められた値とほぼ一致し、また臨界指数は0.84となり、パ-コレ-ション・モデルから予想される相関長の臨界指数に近い値が得られた。
MR(磁気共鳴)および近赤外同時測定による脳血行動態の定量解析

本研究は、脳の賦活領域を画像化するファンクショナルMRIの発現機序となる様々な脳血行動態を明らかにし脳機能研究をさらに高次化するための基礎研究である。本研究の目的は、動物実験においてMRIに近赤外測定を同時に併用することで、MRI信号強度に関する基礎要因である血流、血管体積、血中酸素飽和度などの変化を定量的に解析することである。動物用MRIに近赤外分光装置を装荷し同時測定を行うシステムを作成し、ラット頭部測定における磁気共鳴および近赤外分光のローブ形状、位置、さらに撮像パラメータの最適化を行った。その測定系においてラットを用い呼気ガスを制御することで脳血行動態を広い範囲に渡り変化させ測定を行い、特に静脈洞のMRI信号強度にも注目した新たな測定法を確立することで動静脈分布のMRI信号強度変化に対する影響を初めて定量的に示した。その結果、例えばラットの皮質及び基底核での動脈と静脈の体積比が1:9であることが明らかになった。また、生理的条件下では近赤外分光から求まる脱酸素化ヘモグロビン量変化が確かに定量的なmodel式に従いMRI信号強度に影響していることを明らかにし、近赤外分光のfMRIとの同時測定への応用の確固たる基礎を確立した。本研究で予定したラットの刺激応答に関連する局在的な脳血行動態の測定までは到らなかったが、今後は本方法を人の脳血行動態測定に早急に応用し、従来のfMRIの単純な発現機序とされているover compensation model(賦活により脳血流が上昇し、それにより静脈中の脱酸素化ヘモグロビン濃度が低下する)では説明できない複雑な脳血行動態を解明して行きたい。
COPD患者におけるUCP2の抗炎症・抗細胞老化機序の解明

本研究では生体内に存在するStanniocalcin-1 (STC-1)と呼ばれる抗酸化物質およびミトコンドリアにおけるSTC-1の作用部位であるUncoupling protein 2 (UCP2)がCOPDの病態に関わる炎症、組織障害、細胞老化などに対してどのような影響を及ぼすかを検討することを目的とし、ヒトの肺組織や培養細胞、動物モデルを用いて検討を行った。肺組織は非喫煙者とCOPD患者の肺組織を用いて検討を行った。まずCOPD患者と非喫煙者の肺組織におけるUCP2の発現を免疫組織化学法で検討を行ったところ、COPD患者肺において、肺胞上皮細胞や肺胞マクロファージでUCP2の陽性細胞が増加していた。一方、肺の構築細胞である気道上皮細胞や肺線維芽細胞の初代培養細胞を用いた検討ではUCP2の発現の増加は見られなかった。たばこ抽出液を用いたin vitroでの実験系でもUCP2の発現の亢進は認めなかった。以上よりUCP2の発現は肺に関しては末梢肺の領域で見られ、病態としても肺胞領域の病変に関与することが示唆された。STC1の効果についても気道上皮細胞や肺線維芽細胞におけるたばこ刺激での炎症や細胞老化反応に対しては抑制的な効果を示さなかった。以上の検討を重ねていく途中で、さらに強力な抗酸化作用を持つ活性硫黄種がミトコンドリアの酵素を介して産生されることが発表され、以後は活性硫黄種や酵素に着目して検討を行うこととした。活性硫黄種は気道上皮細胞や肺線維芽細胞におけるたばこによる細胞老化を抑制し、またブレオマイシン投与もでるでも抗炎症作用を発揮する可能性が示唆された。本研究は当初の計画と合わせて、後半ではさらに抗酸化作用の強い物質のCOPDにおける効果を確認することができた。慢性閉塞性肺疾患(COPD: Chronic obstructive pulmonary disease)における肺の組織障害の機序を検討すべく以下の検討を行った。まず肺の構造破壊と密接に関係している気道の構成細胞である気道上皮細胞と肺線維芽細胞の細胞老化に着目し、ミトコンドリア内膜に存在する、Uncoupling Protein 2(UCP2)の発現と細胞老化の関連についてin vitroで検討した。たばこ煙の抽出液(CSE: cigarette smoke extract)を作成し、気道上皮細胞であるBeas2B cellと肺線維芽細胞にCSEを投与したところ、細胞老化のマーカーであるβ-galactosidase活性の増加がみられた。さらにp21, p53など細胞老化のマーカーについてもWB法で検討し、CSEによりこれらの蛋白が増加することを確認した。さらに細胞増加曲線やフローサイトメトリーによる細胞周期解析も行いCSEによる細胞老化作用を確認した。酸化ストレスはCSEによる細胞老化において重要な役割を果たすと考えられるため、CSE及び酸化ストレスによりUCP2の発現が増加するか否かを検討した。UCP2の発現はミトコンドリア内膜で見られるため、ミトコンドリア機能との強い関連が示唆される。そこで、ミトコンドリア新生及びマイトファジーに着目し以下の検討を行った。CSEを投与するとミトコンドリア新生のマーカーであるTFAMの発現が増加し、マイトファジーのマーカーであるPINK1の発現は減少した。H2O2の投与でもTFAMは増加傾向を示した。以上よりCSE及び酸化ストレスによりミトコンドリアの恒常性維持のメカニズムに変化が生じることが示唆された。次に、CSE及びH2O2をを細胞に投与し、UCP2の発現を検討したところ、上皮細胞ではH2O2投与によりUCP2の発現が増加する傾向がみられたが、有意差は見られなかった。今年度の結果からはCSEや酸化ストレスにより細胞老化やミトコンドリアの機能に影響を与えることが示された。UCP2の発現には酸化ストレスの方がむしろ関与する可能性が示唆された。COPDの病態に重要な役割を果たしている気道上皮細胞及び肺線維芽細胞における細胞老化とUCP2の関連について今年度は検討を行った。おおむね予定通り研究を行った。様々な条件検討を行い、CSEによる細胞老化作用を確認することができた。CSEによるUCP2の発現に関してはまだ一定の傾向が得られていないが、H2O2ではUCP2の増加傾向を見出すことができた。またミトコンドリア新生やマイトファジーなどミトコンドリア機能に新たに着目しCSEやH2O2がミトコンドリア機能に影響を及ぼすことを見出した。今後の検討課題としてはUCP2がミトコンドリアの機能障害と細胞老化の一連の機序に関与しているかどうかを明らかにする必要がある。また、肺胞上皮細胞やマクロファージなどの検討はまだ行えておらずこれらも次年度以降で検討を重ねていきたいと考えている。なお初年度の研究には、当施設の市川朋宏助教が研究協力者として参加し、共に実験を行った。

まずCOPD患者と非喫煙者の肺組織におけるUCP2の発現を免疫組織化学法で検討を行ったところ、COPD患者肺において、肺胞上皮細胞や肺胞マクロファージでUCP2の陽性細胞が増加していた。一方、肺の構築細胞である気道上皮細胞や肺線維芽細胞の初代培養細胞を用いた検討ではUCP2の発現の増加は見られなかった。たばこ抽出液を用いたin vitroでの実験系でもUCP2の発現の亢進は認めなかった。以上よりUCP2の発現は肺に関しては末梢肺の領域で見られ、病態としても肺胞領域の病変に関与することが示唆された。STC1の効果についても気道上皮細胞や肺線維芽細胞におけるたばこ刺激での炎症や細胞老化反応に対しては抑制的な効果を示さなかった。以上の検討を重ねていく途中で、さらに強力な抗酸化作用を持つ活性硫黄種がミトコンドリアの酵素を介して産生されることが発表され、以後は活性硫黄種や酵素に着目して検討を行うこととした。活性硫黄種は気道上皮細胞や肺線維芽細胞におけるたばこによる細胞老化を抑制し、またブレオマイシン投与もでるでも抗炎症作用を発揮する可能性が示唆された。本研究は当初の計画と合わせて、後半ではさらに抗酸化作用の強い物質のCOPDにおける効果を確認することができた。今後は、気道上皮細胞、肺線維芽細胞におけるCSEや活性酸素・活性窒素種による炎症の亢進にUCP2が関与しているかどうかを明らかにしていく。またStanniocalcin-1(STC1)がUCP2を介した細胞老化や炎症誘導作用に対して、防御的な働きを持つかどうかも検討していく。そしていよいよ肺胞上皮細胞や肺胞マクロファージにおいても細胞老化や炎症とUCP2との関連を検討していく。CSEや活性酸素などの刺激によりUCP2の発現が増加するか否か、またUCP2のノックダウンにより抗老化・抗炎症作用がみられるかどうかを検討していく。これらの刺激がミトコンドリアの機能にどう影響を及ぼすか、UCP2の発現の増減と関連するか否か、その動態が細胞腫によって異なるかどうかなどを詳細に検討していく予定である。さらにエラスターゼやたばこ暴露などのCOPDの動物モデルを用いて、COPDでみられる肺構造の改変に,UCP2やSTC1が関与するか否か、特に本研究の特徴であるSTC1の創薬の可能性も踏まえて追及していきたいと考えている。2年目以降も研究協力者として市川朋宏助教が参加し、検討を行う。初年度は既に当研究室で保存している培養細胞を用いての検討が主であったため、研究用の抗体や試薬、物品の購入のため助成金を使用した。A549などの肺胞上皮細胞やTHP-1などの単球系細胞など、複数のcell lineの培養細胞の購入を検討していたが、購入予定額が残額を上回ったため次年度に持ち越すこととし、次年度の研究開始時にこれらの培養細胞も購入予定とした。
切除不能大腸癌に対する抗癌剤感受性予測遺伝子による個別化医療の実践

FOLFOX治療を受けた切除不能大腸がん患者83名をトレーニングセットとテストセットに分け、各がん組織からRNAを抽出したのち発現プロファイルを解析した。ランダムフォレストによる解析ではトレーニングセットを感度81.4%、特異度85.1%でFOLFOXの奏効率を予測し得た。さらにoutlierを除外することにより感度91.5%、特異度95.6%まで予測精度をあげることがあ可能であり、この予測モデルを用いてテストセット29例のFOLFOX感受性を予測したところ、69.2%の精度であった。遺伝子プロファイリングを用いた機械学習アルゴリズムによる薬剤感受性予測は個別化医療に有用と考えられた。切除不能大腸癌に対するFOLFOX療法の奏功率は約50%とされ、臨床病理学的因子による治療前の抗癌剤治療効果予測は依然として困難である。一方で抗癌剤感受性予測については機械学習アルゴリズムが発現プロファイルに応用され感受性予測が試みられ、決定木による予後予測遺伝子の選択をBootstrap Aggregation (Bagging)法により1-100万回シュミレーションを繰り返すランダムフォレスト法は、予測因子が症例数を大幅に上回る発現プロファイルの判定を行う目的で開発された解析法である。今回我々はmFOLFOX6により治療された切除不能大腸癌83例(4コース終了後CTにより判定:有効42例、無効41例、奏効率50.6%)を54例のトレーニングセットと29例のテストセットに分けて遺伝子発現プロファイリングを行い、ランダムフォレストにより薬剤感受性遺伝子セットの選定、及びcross validationによる各症例の効果予測判定を行った。トレーニングセットで構築した14個の予測遺伝子(SMURF2, MBTD1, AP3M2, RNF141, NPEPPS, BPTF, FAM73A,APPBP2,AMZ2P1,SRGAP1,NMT1,CSPP1,EIF1,CEP290)を用いた予測モデルでは感度91.3%、特異度95.6%で効果予測が可能であった。さらにこの予測モデルを用いたテストセットでは感度80.0%、特異度92.8%であった。すなわち治療による奏功率が50.6%であったFOLFOXによる治療効果を発現プロファイルに対するランダムフォレストを用いた解析により、より高い確率で予測することが可能であり、有効な治療法を選択する個別化医療が可能であると考えられた。薬剤投与時に見られる応答性や副作用の個体差はゲノム多型や発現遺伝子の影響を受けると考えられる。特に抗癌剤投与では無効例に対して長期間に渡り投与を行いQOLを著しく低下させる可能性があり、投与前にその有効性を予測することが重要である。発現解析により患者の層別化を行うには薬剤投与の条件を患者間で整え、かつ解析可能な数を揃えることが困難である。本研究では切除不能大腸癌に対するFOLFOX治療開始前の凍結保存している87例よりRNAを抽出し、これらを利用して遺伝子発現解析により抗癌剤感受性を高確率で予測することによる個別化医療の実践を目的とした。まず、抽出したRNAによりGeneChipにより約25000種類の遺伝子発現を包括的に解析し、このデータをランダムフォレスト法によりFOLFOX感受性に関与する遺伝子群を抽出した。さらにこの遺伝子群の正当性を評価するためにout-of-bags法によりトレーニングセットとテストセットにサンプルをわけ、データの再現性を確認し得た。これらの方法は遺伝子発現解析による薬剤感受性を投与前に予測可能であることを示唆するものであり、将来的には種々の薬剤感受性を予測することにより個別化医療実践の可能性を示唆する研究結果である。切除不能大腸癌のFOLFOX療法による感受性については、すでに83例の治療前に得られた検体からRNAを抽出してマイクロアレイを行い、ランダムフォレスト法により良好な予測結果が得られる遺伝子セットの抽出をおこった。これは前半2/3の症例をテストセットとし、後半1/3の症例をバリデーションセットとして予測を行い予測の信頼性について確認し得た。また、この操作についてはテストセットとバリデーションセットをランダムに入れ替えを行い5回同様の解析を行ったが良好なFOLFOXに対する良好な薬剤感受性予測が可能であったことから十分に信頼性の得られた結果となった。この結果についてはすでに学会などでは報告しており、最終年度となる今年度ではこのデータを英文による論文化を行い公表してゆく予定である。以上のように、前半の2年間で実験とデータベースの構築、及びバイオインフォマティクスによる解析をおこない、当初の目的であった薬剤感受性を規定する遺伝子を同定できたため、研究は順調に進行していると考えられる。解析目標症例数が当初の予定より早い時期に到達し発現アレイデータの解析により生存率に有意差が得られたため、当初の計画よりも早期に解析結果を発表することができた。とくに薬剤感受性モデルの構築は近い将来に高額医療である抗癌剤治療、分子標的治療薬の使用にあたり、個別化医療か可能であることを示唆する結果である。

また、マイクロRNA解析により大腸癌の発癌・転移のメカニズムを明らかにした点も本研究の成果の一つであり、p21, p53などの癌抑制遺伝子のmiR-22による制御機構、miR-493による肝転移抑制機構を世界に先駆けて発表した。この大腸癌におけるターゲット遺伝子の同定は新規抗癌剤候補遺伝子でもあり、本研究により新たな大腸癌治療薬の可能性を示すことが可能であった。以上のデータを本研究期間中に癌関連の主要英文誌に報告することが可能であり、さらに、これらのデータを元に新たな薬剤感受性モデル、大腸癌発癌・進展メカニズムの解明、プロモーターメチル化との統合解析へと発展してゆく可能性もあり、当初の計画以上に本研究は進展していると考えられる。遺伝子発現値に加えて包括的にメチル化解析を前年度まで解析したのと同一サンプルについて行っており、これらの発現値とプロモーターメチル化の二つの異なるパラメータを統合的に解析することを最終年度のテーマとする。具体的にはiClusterと呼ばれるバイオインフォマティクスの解析方法を用い、単独の解析のみからは得られないクラスタリングや表現型を抽出することを目的とする。薬剤感受性についてはこのような統合解析はいまだに報告されてなく、今後新しい知見が得られる可能性がある。また、肝転移、リンパ節転移など抗がん剤感受性のみでなく、ほかの臨床情報もリンクさせることが可能であるため、病態生理に関与する遺伝子の発現状態およびプロモーターメチル化状態を同定することが可能であると考えられる。さらに発現解析のみでなく、包括的エピゲノム解析を併せて行い、大腸癌患者の多角的にゲノムの視点から抗癌剤化学療法に対する層別化を行う。解析対象となる症例の予後を引き続き追跡調査し、ランダムフォレストによって分類された2群間での全生存期間についての比較を行い、研究開始後に得られた検体についてはこれまでに得られた予測遺伝子を用いて前向きの効果予測を行い、臨床応用に可能であるかどうかについての検討も行う。一部のサンプルについてはまだプロモーターメチル化解析が未施行のため、今年度は残りのサンプルの解析を行う。ただし、大部分の症例については実験、解析およびバイオインフォマティクス解析まで終了しているため、今後はこのデータの発表を中心に研究費を使用してゆく。具体的には謝金、人件費、英文校正、投稿料、学会発表の旅費などに充てられる予定である。また、その過程で解析用のソフトも必要となると考えられる。前年度の解析により得られた遺伝子発現データに加えてエピゲノム解析データとの遺伝子統合解析を行うためにとしてプロモーターメチル化アレイ(Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip)によるデータの収集を行う。そのための実験用試薬やチップを購入する必要がある。これらの解析結果により研究初年度に得られたデータとの妥当性を検討し、分子生物学的な意義についての検討を行う。
逆ミセルが創り出すイオン液体中のナノ空間を利用した酵素反応

イオン液体は溶媒物性のチューニングが可能な溶媒であり、その化学構造設計により高極性かつ疎水性という極めて特異な溶媒物性を示すことが可能な溶媒である。このようなイオン液体は水、有機溶媒に次ぐ第3の溶媒として捉えられ、生体触媒の反応溶媒としても大変興味深い。本研究では、このような生体分子(タンパク質や酵素)に、イオン液体のナノ空局という新たな機能発現(反応)の場を与えることが目的である。逆ミセルは、非水系にナノオーダーの安定な微水環境を与えることができる。酵素やタンパク質に代表される生体分子は、おおむねナノオーダーの大きさを有しているため、生体分子をその殻の中に安定に可溶化できる。これら分子集合体が作り出す特異環境は、バルクの水中と大きく異なる性質を有しているため、取り込まれた酵素やタンパク質の特異機能発現の場として有効であると考えられる。本研究では、種々のイオン液体中で安定な逆ミセルを設計し、クリーンで高効率な環境調和型の酵素変換反応を検討した。イオン液体中に逆ミセルを形成し、その内水相に酵素を可溶化するというアプローチである。アルキル鎖が長く十分に疎水性の高いイオン液体(C8bmim)を合成し、1-ヘキサノールを補助溶媒として加えると、イオン液体に界面活性剤AOTが溶解した。ここに微量の水を添加するとAOTの自己集合によって水がイオン液体に均一に分散したイオン液体中逆ミセルが形成された。逆ミセルのWo値(Wo=[水]/[界面活性剤])の増加に伴いミセル粒径が増大することを動的光散乱法(DLS)によって確認した。このイオン液体逆ミセルには様々な酵素やタンパク質を可溶化することができ、内水相に封入された酵素が高い触媒機能を発現することを確認した。本研究では、タンパク質や酵素に、イオン液体中でナノ空間を提供し、その酵素反応特性を検討した。これら分子集合体が作り出す特異環境は、バルクの水中と大きく異なる性質を有しているため、取り込まれた酵素やタンパク質の特異機能発現の場として有であると考えた。本研究では、アルキル鎖が長く十分に疎水性の高いイオン液体(C8bmim)を合成し、1-ヘキサノールを補助溶媒として加えると、イオン液体に界面活性剤AOTが溶解することを明らかにした。さらに微量の水を添加するとAOTの自己集合によって水がイオン液体に均一に分散したイオン液体中逆ミセルが形成された。逆ミセルのW_o値(W_o=[水]/[界面活性剤)の増加に伴いミセル粒径が増大することを動的光散乱法(DLS)によって確認した。このイオン液体逆ミセルには様々な酵素やタンパク質を可溶化することができ、内水相に封入された酵素(リパーゼ、プロテアーゼ)が高い触媒機能を発現することを明らかにした。
グラファイトに吸着された低次元ヘリウム3の磁性と超流動

グラフォイル基盤に吸着された数原子層以下のヘリウム3は、非常にきれいで理想的な2次元フェルミ系を形成し、吸着量を変えることにより液相と固相が同じ試料セルで実現出来る。このうち吸着第二層の反強磁性領域の固相は、三角格子であると共に幾つかの多体交換相互作用の競合によるフラストレーションの大きな系で、その基底状態は長距離秩序のないスピン液体ではないかという予想がある。しかしその相互作用は約1mK程度であり、現在の測定温度領域では未だはっきりした結論に至っていない。ところがグラフォイルにHDをプリコートすると、その上に非常に低密度のヘリウム3固相を実現することが出来るので、より低い有効温度までの測定が可能となる。二層および三層のHDをプリコートしたグラフォイル上の単原子膜固体ヘリウム3の磁化測定が、できるだけ低周波のNMRを用いて初めて0.1mKの低温まで行われた。その結果、振舞はどちらの場合もほぼ同じであることが判った。即ち交換相互作用の大きさ(J)がほとんど変わらないこと、面密度を増やすと相互作用が反強磁性から強磁性に変化することなどである。反強磁性領域では、高温部のキューリーワイス則が交換相互作用(J)よりも小さい温度域までも良く成立している。しかしT=0.1mK即ちT/J=0.025においても相転移の兆候はなく磁化はゆるやかな増加を示しており、スピンギャップはあっても非常に小さいと考えられる。さらに磁化の温度依存性は限られた低密度領域では、T/Jのみの関数として表わせることが明らかになった。この原因を探るため、高温部の温度依存性を多体交換モデルの高温展開で解析したところ、二体交換に比べて三体交換が大きいこと、又これらと四体交換相互作用が密度依存性がほとんど同じであることが判明した。このうち吸着第一層の固相はフラストレーションの大きな3角格子であるが、相互作用が非常に小さく約1mK程度までの測定では、その磁性は明らかではなかった。今回、我々は0.2mKまでのNMRによる磁化測定を行った。その結果、整合相の3x3相が強磁性的であり、吸着密度を増やすと狭い反強磁性的な領域を経て不整合相では再び強磁性的でその大きさはピークを持つことが判った。この結果は原子間の直接位置交換による強磁性的な多体交換相互作用と反強磁性的な多体交換相互作用の競合により説明される。原子間のハードコアポテンシャルのため、高密度では強磁性的な3体交換が優勢であるが、密度の低下とともに反強磁性的2体交換が相対的に強くなるのである。一方整合相の3x3相は基盤からの吸着ポテンシャルにより安定化されており、吸着ポテンシャルのサイトによる周期的変化を考慮する必要がある。3x3相のような低密度では、原子間のハードコアポテンシャルの効果は小さくなり吸着ポテンシャルによるトンネル障壁を無視できない。その結果強磁性的な3体交換が容易になると考えられる。こうして吸着第一層の固相の磁性は明らかになったが、最も興味ある反強磁性的な領域は狭く相互作用の大きさも小さい。そこでより大きな反強磁性的な相互作用を得るため、吸着基盤を固体HDで覆った固体ヘリウム3についての準備が行われた。そのためHDガスに微量に含まれるオルソ水素をパラ変換するシステムの製作やガス導入管の改良がなされ測定が始まろうとしている。

グラフォイル基盤に吸着された数原子層以下のヘリウム3は、非常にきれいで理想的な2次元フェルミ系を形成し、吸着量を変えることにより液相と固相が同じ試料セルで実現出来る。このうち吸着第二層の反強磁性領域の固相は、三角格子であると共に幾つかの多体交換相互作用の競合によるフラストレーシヨンの大きな系で、その基底状態は長距離秩序のないスピン液体ではないかという予想がある。しかしその相互作用は約lmK程度であり、現在の測定温度領域では未だはっきりした結論に至っていない。ところがグラフォイルに二層のHDをプリコートすると、その上に非常に低密度のヘリウム3固相を実現することが出来る。従って、その交換相互作用(J)は約4mKと一連の系の中では一番大きく、より低い有効温度までその基底状態を探ることが出来る。その様な単原子膜固体ヘリウム3の磁化測定が、できるだけ低周波のNMRを用いて初めて0.1mKの低温まで行われた。その結果、高温部のキューリワイス則がJよりも小さい温度域までも良く成立していることが判った。しかしT=0.1mKすなわちT/J=0.025においても相転移の兆候はなく磁化はゆるやかな増加を示しており、スピンギャップはあっても非常に小さいと考えられる。さらに磁化の温度依存性は限られた低密度領域では、T/Jのみの関数として表わせることが明らかになった。この原因を探るため、高温部の温度依存性を多体交換モデルの高温展開で解析したところ、二体交換に比べて三体交換が大きいこと、又これらと四体交換相互作用が密度依存性がほとんど同じであることが判明した。このうち吸着第二層の反強磁性領域の固相は、三角格子であると共に幾つかの多体交換相互作用の競合によるフラストレーションの大きな系で、その基底状態は長距離秩序のないスピン液体ではないかという予想がある。しかしその相互作用は約1mK程度であり、現在の測定温度領域では未だはっきりした結論に至っていない。ところがグラフォイルにHDをプリコートすると、その上に非常に低密度のヘリウム3固相を実現することが出来るので、より低い有効温度までの測定が可能となる。今年度は、三層のHDをプリコートしたグラフォイル上の単原子膜固体ヘリウム3の磁化測定が、できるだけ低周波のNMRを用いて初めて0.1mKの低温まで行われた。その結果、振舞は二層のHDをプリコートした場合とほぼ同じであることが判った。即ち交換相互作用の大きさ(J)がほとんど二層の場合と変わらないこと、面密度を増やすと相互作用が反強磁性から強磁性に変化することなどである。反強磁性領域では、高温部のキューリーワイス則が交換相互作用(J)よりも小さい温度域までも良く成立していることが判った。しかしT=0.1mK即ちT/J=0.025においても相転移の兆候はなく磁化はゆるやかな増加を示しており、スピンギャップはあっても非常に小さいと考えられる。
Coチオシアン酸錯体のゲル化を利用した水溶液中Coの高効率濃縮回収プロセスの開発

本研究では新規Co回収プロセスの各工程について、その詳細を定量化してプロセスの成立性を確認し、具体的なプロセス条件を決定するための指針を得ることを目的とした研究を行っている。平成28年度はゲル状化合物の析出によるCo分離条件について、ゲル化剤の濃度条件を明らかにした。平成29年度は、ゲル状化合物回収後の溶媒抽出工程に着目し、ゲル化剤が溶媒抽出工程に与える影響について予備的な調査を行った。平成30年度はこれに引き続き、ゲル再溶解後の水溶液を、溶媒抽出を経てCo電解採取に持ち込む際の、ゲル由来の不純物の影響を調査した。具体的には下記の調査を行った。<溶媒抽出工程>抽出剤としてD2EHPAまたはPC88Aを、希釈剤としてキシレンまたはケロシンを用いて溶媒抽出工程におけるCoとNiの分離性について調査した。PEGおよびチオシアン酸イオンの存在する条件においても抽出実験を行い、CoおよびNiの抽出曲線から各条件において分離係数を算出した。さらに、SCN-およびPEGの有機溶媒相/水溶液相間における分配を調査し、電解工程に混入する不純物濃度を推算した。<Co電解採取工程>SCN-およびPEGがCoの電解採取に与える影響を調査した。分極曲線の取得により、不純物の共存がCoの還元反応に与える影響を調査した。プロセスの最終段階を模擬した条件として、不純物濃度を変化させた電解浴を用いてCoの分極曲線を取得し、得られる金属Coの表面を観察した。研究機関全体を通して、本研究で提案したCoの回収プロセスを実現する際のプロセス条件について基本的な知見を得ることができた。ただし、溶媒抽出工程ではゲル由来のPEGやチオシアン酸イオンを、Co電解に影響しないレベルに抑えることが困難であり、これら不純物の除去プロセスを設ける、または電解採取以外の方法でCoを採取する、などの対策が必要である。平成28年度は、Coゲル状化合物の生成工程に着目し、目的のCoの回収率を達成する上で重要な濃度条件や温度条件の調査を行った。研究計画(a)(c)について、下記の成果を得た。(a) <Coゲルの生成に関する平衡状態図の作成とゲル化条件の決定>水溶液中のCo濃度、チオシアン酸イオン濃度、PEG濃度を変化させたゲル状化合物の生成実験を行い、ゲル状化合物および上澄み水溶液の組成分析によりゲル状化合物の組成をK2[Co(NCS)4] (PEG)0.25と決定した。さらに、5°C50°Cの温度範囲で、Co回収率の温度依存性についても調査を行い、任意のCoの回収率を達成するのに必要なSCN-およびPEGの濃度範囲、温度条件を明らかにした。(c) <ゲルの生成機構に関する考察およびその他のゲル化剤の検討>ゲル状化合物の生成反応式を仮定し、Co回収率の温度依存性より生成反応の見かけのエンタルピーを見積った。また、ゲル化剤としてPEGの代わりにTriton X-100についてもゲル状化合物生成実験を行い、比較した。実用化の観点から、目的のコバルト回収率を得るのに必要な濃度条件および温度条件について評価し、任意のコバルト回収率を得る条件を明らかにすることができた。不純物元素との分離特性、およびTriton X-100をゲル化剤として用いた場合の回収率の変化についても比較した。平成29年度は、ゲル状化合物回収後の溶媒抽出工程に着目し、ゲル化剤がようばい抽出工程に与える影響について予備的な調査を行った。過去に、Coをゲル状化合物として回収する工程において、添加剤としてポリエチレングリコールまたはTriton-Xを用いた検討を行っている。水溶液中からCoを回収する効率は、Triton-Xのほうが優れていたが、後工程の溶媒抽出においては、界面活性を持つTriton-Xが、有機溶媒相と水溶液相の分離の阻害要因としてはたらき、溶媒抽出によるCoとゲル化剤の分離には不適であることが分かった。共存する有機物の種類が、溶媒抽出工程の実施可否に影響することが明らかになった。エフォート率の低下から、PEGを用いて生成したゲル状化合物から溶媒抽出によりCoの水溶液を得る際の詳細については調査を実施できなかった。

さらに、SCN-およびPEGの有機溶媒相/水溶液相間における分配を調査し、電解工程に混入する不純物濃度を推算した。<Co電解採取工程>SCN-およびPEGがCoの電解採取に与える影響を調査した。分極曲線の取得により、不純物の共存がCoの還元反応に与える影響を調査した。プロセスの最終段階を模擬した条件として、不純物濃度を変化させた電解浴を用いてCoの分極曲線を取得し、得られる金属Coの表面を観察した。研究機関全体を通して、本研究で提案したCoの回収プロセスを実現する際のプロセス条件について基本的な知見を得ることができた。ただし、溶媒抽出工程ではゲル由来のPEGやチオシアン酸イオンを、Co電解に影響しないレベルに抑えることが困難であり、これら不純物の除去プロセスを設ける、または電解採取以外の方法でCoを採取する、などの対策が必要である。当初の計画に沿って、以下の後工程に関する調査を進める。<平成29年度> II. (溶媒抽出工程)SCN-およびPEGがCo溶媒抽出に与える影響調査平衡実験による溶媒抽出におけるPEGの種々の有機溶媒相中への溶解量調査を行ったうえで、溶媒抽出工程におけるPEGの分配を調査する。このようにして評価した結果、PEGの分離に有効と考えられる溶媒抽出系において、Coの抽出曲線の作成および、McCabe-Thiele法による解析を行い、Coの抽出・逆抽出条件を決定する。さらに、SCN-およびPEGの共存がCo抽出挙動に与える影響を調査するとともに、SCN-およびPEGの有機溶媒相/水溶液相間における分配を調査し、Coとの分離係数を算出する。SCN-、PEG、および溶媒抽出で用いる有機溶媒などの不純物の酸化還元反応を考慮し、これらの物質が溶存する水溶液中において、電気化学測定を行い、Coの電解採取条件で起こりうる副反応を特定する。さらに、分極曲線の取得より、不純物の共存がCoの還元反応および電流効率に与える影響を調査する。最終的にはプロセスの最終段階を模擬した条件として、不純物濃度を変化させた電解浴を用いて定電圧または定電流密度でCoの電解採取を行い、得られる金属Co中の不純物元素(O, C, N)を分析する。これにより、電解浴中の不純物の許容値を決定する。以下の後工程に関する調査を進める。<溶媒抽出工程>平衡実験による溶媒抽出におけるPEGの種々の有機溶媒相中への溶解量調査を行ったうえで、溶媒抽出工程におけるPEGの分配を調査する。<Co電解採取工程>
虚弱高齢者におけるトレーニング、脱トレーニング、再トレーニングに関する研究

特別養護・養護老人ホームに居住する虚弱高齢者を対象として、軽強度のトレーニングが下肢筋力、筋機能、歩行能力に及ぼす影響を検討した。被検者は6292歳(83.8±7.9歳)にある高齢男女11名(男子は1名)であった。自立歩行が可能な者は3名で、他の者は杖や歩行器を使用していた。旧厚生省の寝たきり度にもとづく判定では、「ランクA(準寝たきり)」に属する者で、脳血管性の痴呆症が2名含まれていた。また、文部科学省の日常生活動作能力(36点満点)は1124点(14.7±4.1点)にあった。東京都老人総合研究所の活動能力指標は08点(3.5±2.7点)にあった。トレーニング、脱トレーニングおよび再トレーニング前後の評価項目として、膝関節伸展力・膝屈曲力、股関節屈曲力・内転力、足関節底屈力、30秒椅子立ち上がりテスト、Timed Up & Goテスト、10秒および30秒のステッピング、通常および最大歩行速度を用いた。トレーニングと再トレーニングは同じ内容とし、簡単な歩行運動、テニスボールや徒手による筋力運動、マッサージとストレッチングからなる運動を週に1回60分間行わせた。負荷はすべて自覚的に感じる運動強度を用い、「楽である」「ややきつい」で行わせた。トレーニング期間は2002年57月、79月を脱トレーニング期間、911月を再トレーニングとした。2ヶ月のトレーニングの結果、膝伸展力、内転力、底屈力、30秒間のステッピング成績は改善傾向を示したが、有意な変化には至らなかった。2ヶ月間のトレーニング休止による影響はすべての項目で認められなかった。再トレーニングではトレーニング前後や脱トレーニング後の値を変化させるには至らなかった。以上のことから、老人ホームに居住する虚弱高齢者に対する軽強度のトレーニングは対象者の身体機能レベルに影響を与えなかった。これらのことは、本研究で用いたトレーニング強度が低すぎたことや、実施した期間が短かったことが考えられる。本年度は,次年度に実施するトレーニングに関する基礎的データを得るために特別養護老人ホームに居住する身体的に虚弱な高齢者男女14名(虚弱高齢者:82.3±7.1歳)と地域在住の健康な高齢者男女18名(自立高齢者:81.1±5.7歳)の下肢筋力,歩行能力,超音波法による踵骨の音響的骨強度を比較検討した.虚弱高齢者は旧厚生省の寝たきり度にもとづき「ランクA(準寝たきり)」の者とし,日常生活動作(ADL)能力は36点を満点として15.24点(平均17.4点)であった.下肢筋力を評価する指標として,虚弱高齢者でも十分実施可能な30秒椅子立ち上がりテストを用いた.その結果,虚弱高齢者の成績は7.2±1.7回で,自立高齢者は14.4±3.4回であり,虚弱高齢者の能力は自立高齢者の半分程度であった.次に,歩行能力については,椅子から立ち上がって目標物をまわり,再び座る時間で評価するテスト(Timed Up and Go)をおこなわせた結果,虚弱高齢者は14.1±3.2秒で,自立高齢者は6.7±1.3秒で自立高齢者の47.5%であった.また,踵骨の音響的骨強度(OSI)は虚弱高齢者が2.077±0.26(*10^6)で,自立高齢者は2.375±0.29(*10^6)と12.5%有意に低い値を示した.以上のことから,虚弱高齢者の踵骨の音響的骨強度には大きな低下は認められないものの,日常生活動作に必要な下肢の筋力や歩行能力の低下が顕著に認められた.これらの結果から,次年度は下肢筋の組織厚と直接的な筋力の評価を加え,虚弱高齢者の対するトレーニング,脱トレーニング,再トレーニングの影響を検討し,神経.筋記憶に関する知見を得る目的である特別養護・養護老人ホームに居住する虚弱高齢者を対象として、軽強度のトレーニングが下肢筋力、筋機能、歩行能力に及ぼす影響を検討した。

2ヶ月のトレーニングの結果、膝伸展力、内転力、底屈力、30秒間のステッピング成績は改善傾向を示したが、有意な変化には至らなかった。2ヶ月間のトレーニング休止による影響はすべての項目で認められなかった。再トレーニングではトレーニング前後や脱トレーニング後の値を変化させるには至らなかった。以上のことから、老人ホームに居住する虚弱高齢者に対する軽強度のトレーニングは対象者の身体機能レベルに影響を与えなかった。これらのことは、本研究で用いたトレーニング強度が低すぎたことや、実施した期間が短かったことが考えられる。