hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗体遺伝子を用いた神経回路形成過程のリアルタイム解析

平成17年度はシナプトタグミンに対する抗体遺伝子をマウス背根神経節ニューロンの成長円錐に発現させ、胎生期の成長円錐小胞に局在するシナプトタグミンの詳細な機能解析を行った。その結果、抗体遺伝子を発現した成長円錐では脱分極刺激依存的なフィロポディアの増大が著しく抑制される事が分かった。しかし、変異型抗体遺伝子を発現する成長円錐ではこの抑制効果は観察されなかった。これは成長円錐に局在するシナプトタグミンが脱分極刺激依存的なフィロポディアの増大を制御していることを示している。現在本研究結果を誌上発表する準備を進めている。また、平成17年度はカルシウム上昇による神経突起伸長の制御メカニズムについても解析を行い、以下の結果を得た。カルシウムストアからのカルシウム放出、あるいは細胞外からのカルシウム流入による細胞内カルシウム上昇は成長円錐細胞膜からのエンドサイトーシスを増強した。このエンドサイトーシスは成長円錐細胞膜に局在し、神経突起伸長を正に制御するシンタキシンの抑制によっても観察された。さらに、シンタキシンの過剰発現により、カルシウム依存的なエンドサイトーシスと神経突起伸長の抑制が解除されることも明かとなった。神経突起伸長には骨格系タンパク質の制御が重要である事は以前から様々な研究から知られていたが、今回の発見はカルシウムが骨格系タンパク質だけでなく、膜動態も制御することによって突起伸長を制御する事を示しており、神経軸索ガイダンスや神経回路形成の研究に重要なインパクトを持つと考えられる。現在、本研究結果の誌上発表の準備中である。シナプトタグミン1/2はシナプス小胞に局在し、シナプス小胞と細胞膜との融合過程を制御する分子である事が既に明らかにされている。申請者らは機能阻害抗体タンパクを用いてシナプトタグミンが神経伝達以外に神経突起伸長を制御する分子である事を明らかにした。シナプトタグミンは成長円錐形質膜の供給源として考えられている成長円錐小胞に局在することから、シナプトタグミンは成長円錐小胞と形質膜の融合過程を制御するものと推測された。神経突起伸長は神経伝達に比ベタイムスケールの長い現象であり、その基盤である成長円錐小胞の膜融合過程も長時間の観察が求められる。そのため膜融合過程の阻害ツールとしては抗体タンパクより長時間の抑制が可能な抗体遺伝子に利点がある。今までに、シナプトタグミンに対する抗体遺伝子を単離し、ニワトリ胚DRGニューロンに導入したところ、著しく突起伸長を阻害する事を明らかにしてきた。この抑制効果は抗体遺伝子の発現により、成長円錐小胞の細胞膜への融合や再取込みが阻害されたことによると仮定している。この仮説を検証する為、今年度は成長円錐小胞のラベリングをFM-dyeやWGAを用いて条件検討した。その結果、FM4-64色素がエンドサイトーシスにより成長円錐に取り込まれ、成長円錐小胞が可視化出来ることが明かとなった。さらにこのFM4-64で可視化されたエンドサィトーシスの性質を調べたところ、興味深いことに細胞外カルシウムには非依存的だが、細胞内カルシウムに依存することが分かった。これは従来から研究されている成熟神経細胞の神経終末におけるシナプス小胞などの性質とは明らかに異なるものである。今後この成長円錐小胞のエンドサイトーシスがシナプトタグミン抗体遺伝子によって阻害されるかを調べる予定である。シナプトタグミンはもともとカルシウム依存的な神経伝達物質の放出過程に関与している事が報告されている。申請者はこのシナプトタグミンの機能阻害抗体の遺伝子をニワトリ背根神経節神経細胞に発現させると神経突起伸長が抑制される事を明らかにした。これは成長円錐小胞に局在しているシナプトタグミンがその膜融合過程を制御している可能性を示唆している。そこで本年度はシナプトタグミンに対するGFP融合抗体遺伝子と成長円錐小胞の膜融合過程を可視化できる蛍光色素を組み合わせることにより、シナプトタグミンがどのように成長円錐小胞の膜融合に関わるかをリアルタイムで観察することを試みた。まず最初にGFP融合抗体遺伝子をマウスDRG神経細胞に発現させ、タイムラプスイメージングを行ったところ、シナプトタグミンに対する抗体遺伝子を発現した成長円錐の脱分極刺激依存的なフィロポディアの形成誘導が抑制されることを発見した。一方、この抑制効果は変異型抗体遺伝子を発現した場合では観察されなかった。このことはシナプトタグミンが成長円錐小胞の融合を介して脱分極刺激依存的なフィロポディアの形成を誘導していることを示唆する。これを検証する為、現在成長円錐小胞の動態を可視化した成長円錐で抗体遺伝子の効果を検討中である。また、フィロポディアは成長円錐の旋回運動に重要な働きをしていることが知られているので、抗体遺伝子の発現による旋回運動に対する効果を観察できる系を現在構築中である。

カルシウムストアからのカルシウム放出、あるいは細胞外からのカルシウム流入による細胞内カルシウム上昇は成長円錐細胞膜からのエンドサイトーシスを増強した。このエンドサイトーシスは成長円錐細胞膜に局在し、神経突起伸長を正に制御するシンタキシンの抑制によっても観察された。さらに、シンタキシンの過剰発現により、カルシウム依存的なエンドサイトーシスと神経突起伸長の抑制が解除されることも明かとなった。神経突起伸長には骨格系タンパク質の制御が重要である事は以前から様々な研究から知られていたが、今回の発見はカルシウムが骨格系タンパク質だけでなく、膜動態も制御することによって突起伸長を制御する事を示しており、神経軸索ガイダンスや神経回路形成の研究に重要なインパクトを持つと考えられる。現在、本研究結果の誌上発表の準備中である。
超音波接合における相対運動の制御と最適化

本研究は,金属材料を加圧し,超音波振動を付加することで接合を行う超音波接合法を対象としている.本接合法では,超音波振動により接合界面を摩擦させることにより,界面密着や酸化被膜の破壊,排出を経て接合が達成される.本研究では,これらを引き起こすための接合材同士,ならびに接合工具と被接合材に生じる相対運動挙動の詳細な理解を図るとともにその制御の可能性を検討した.これにより,接合される材料,および振動を付加する接合工具との間に生じる相対運動と接合界面の組織形成との相関を明らかした.以上の実験により得られた知見を活用し,高信頼化,高性能化を実現した新しい超音波接合技術の可能性を検討した.本研究は,超音波接合プロセスにおける工具および被接合材の動的挙動の評価,および動的挙動と界面組織形成の関係を調べることで,超音波接合メカニズムを明らかにすることを目的としている.この中で,平成26年度は,基礎実験としてアルミニウム,銅などの汎用金属の同種,およびこれらの異種材接合を対象とした接合実験のその場観察を行った.接合部に付与する加圧力,および接合時間を接合因子として,被接合材の塑性流動,接合界面の組織,および継手の接合強度を中心に検討した.申請者は,過去の研究において接合中の超音波ホーンと被接合材の接合中の挙動を高速ビデオカメラで撮影し,撮影画像からデジタル画像相関法により接合中の相対運動挙動を解析する手法を確立している.本年度は,接合中に生じる材料の塑性流動を可視化するため,同手法を接合部全体の領域に拡張し,被接合材中の変位場を可視化するプログラムを新たに作成した.さらに,接合中に生じる凝着核の形成,および接合中の温度上昇に伴う再結晶粒の生成や金属間化合物相の生成を画像解析により得られた相対運動および接合温度計測のデータと対応させながら比較し,接合メカニズムを検討した.その結果,超音波接合においては,特に,接合時間が長くなると,接合に伴う温度上昇により被接合材の巨視的な塑性流動が発生し,接合界面における接合部の成長を促進させること確認された.また,この現象には,接合材と接触する接合工具による摩擦と押し込みが大きく関わっていることがわかった.本研究では,金属材料の固相接合法の一種である超音波接合を対象として,接合現象の動的な運動解析と材料科学的アプローチによる微細組織評価から接合メカニズムの根本的な理解を図ることを目的としている.超音波接合では,その接合方法から接合対象となる材料同士の接合界面,ならびに接合材と接触する工具と接合材の間の界面挙動が接合部の形成に重要な役割を果たしていると考えられる.多くの研究者らによって報告されているように,接合界面に介在する酸化被膜の破壊や排出といった微視的現象は固相接合における重要なプロセスである.また,このような酸化皮膜は工具/接合材界面にも存在し,巨視的な接合過程に影響を与えていると考えられる.さらに,これまでの研究で,接合工具と接合材の相対運動は接合材の塑性流動を引き起こし,撹拌効果よって接合部が形成されることがわかった.接合材と接触する工具の表面形状は塑性流動の発生にかかわる重要な因子であると考えられる.以上の観点から,特に,平成27年度は,2つの界面挙動に密接に関わる接合工具の表面形状,および接合材表面の介在物が接合過程に及ぼす影響を調べた.実験は,平成26年度に開発した解析手法を用いて行った.その結果,超音波接合における継手強度は工具表面に加工された突起形状に大きく依存することが分かった.工具による被接合材の摩擦攪拌を誘発させるため,表面を鋸歯状に加工した工具を用いることで,継手強度が改善されることを明らかとした.また,この原因は,工具と被接合材の相対運動の促進効果によるものであることが示唆された.さらに,被接合同士の界面挙動に関する実験では,接合界面に酸化被膜や潤滑剤を介在させて初期接合部を局在化させることで,被接合材同士の相対運動,および塑性流動による接合部の成長を促進させる効果が得られることを明らかにした.本年度の研究成果は,国内会議,国際会議,さらには投稿論文として発表している.また,次年度の研究も一部開始している.本研究は,固相接合法の一種である超音波接合法を対象に,接合中に生じる材料の動的挙動と接合界面の微細組織の形成との相関を明らかにすることで,接合メカニズムを解明することを目的とした.本接合法では,超音波振動により接合界面を摩擦させることにより,界面密着や酸化被膜の破壊,排出を経て接合が達成される.そこで本研究では,これらを引き起こすための接合材同士,ならびに接合工具と被接合材に生じる相対運動挙動の詳細な理解を図るとともにその制御の可能性を検討した.平成27年度までの研究では,接合部に超音波振動を印加するための接合工具の表面形状に注目し,接合のその場観察ならびに運動解析から,接合工具と接合材の間に生じる相対運動挙動を明らかにした.これにより接合材の塑性流動を誘発して接合を達成する新たな工具形状を提案した.平成28年度の研究では,同様の工具形状による接合プロセス制御のアプローチを発展させて,塑性流動による接合部形成を目的とした工具形状の最適化を図った.同時に,接合界面の酸化皮膜の存在,および界面での接合部形成が相対運動挙動に及ぼす影響を明確化するため,陽極酸化処理皮膜や潤滑剤を界面に介在させた模擬接合実験を行った.その結果,局所的に形成された接合部への応力集中により,接合界面の塑性流動が促進されることが明らかとなった.以上の研究結果を統合し,接合部の形成に関与する相対運動を効果的に発生させるための接合プロセス因子が明らかにされ,これらを制御する接合法開発の指針を得た.

本研究は,金属材料を加圧し,超音波振動を付加することで接合を行う超音波接合法を対象としている.本接合法では,超音波振動により接合界面を摩擦させることにより,界面密着や酸化被膜の破壊,排出を経て接合が達成される.本研究では,これらを引き起こすための接合材同士,ならびに接合工具と被接合材に生じる相対運動挙動の詳細な理解を図るとともにその制御の可能性を検討した.これにより,接合される材料,および振動を付加する接合工具との間に生じる相対運動と接合界面の組織形成との相関を明らかした.以上の実験により得られた知見を活用し,高信頼化,高性能化を実現した新しい超音波接合技術の可能性を検討した.研究成果は既に国内の学会にて発表しており,予定通り研究は進行している.次年度の研究についても一部開始している.引き続き界面運動に着目した,接合メカニズムの解明のための実験を行う.また,平成28年度は最終年度となるため,これまでの研究成果をまとめて投稿論文として発表する予定である.材料接合平成27年度は,工具表面形状に注目した研究を行うとともに,研究成果の発表を積極的に行う.このため,研究費は研究成果発表のための旅費や,論文投稿にかかわる経費が多くなる.残額の約30,000円は,平成26年度の研究成果を英語論文にまとめ投稿するための論文投稿費用,英文校閲費として予定していたが,論文執筆に遅れが生じた.すでに,論文を執筆中であり計画通り投稿費用に充てる.
蛋白尿発症の分子機構の解析 -蛋白尿抑制治療法の開発-

従来、蛋白尿は、糸球体基底膜の障害により発症すると考えられていたが、近年の研究成果から、多くの病態における蛋白尿は、糸球体上皮細胞足突起間に存在するスリット膜の障害により発症することが明らかになってきた。本研究課題の初年度(平成18年度)は新たなスリット膜関連分子の同定を企図した研究を行いsynapticvesicle protein2-B(SV2B)と呼ばれる分子がスリット膜の機能低下、蛋白尿発症に関与していることを明らかにした。次年度(最終年度)の平成19年度は、SV2B並びにその関連分子群の糸球体における発現、病的状態における動態、機能、治療のターゲットとしての有用性についての検討を進めた。SV2B並びにSV2Bと細胞膜分子とのドッキングに関与している膜分子の動態が、ネフローゼ症候群の予後判定の指標になることを明らかにした。siRNA技術を用いた解析で、これらの分子がスリット膜機能維持に重要な役割を果たしていること、これらの分子が新規治療法の開発のためのターゲット分子として有望であることを示した。また、初年度に引き続き、平成19年度も新たな機能分子を同定する作業を続けた。Eph-ephrin系の分子の一つであるephrin-Blという分子がスリット膜近傍に発現しており、スリット膜の機能維持に極めて重要な役割を果たしていることを明らかにした。一連の研究成果は、米国腎臓学会誌(JASN)、国際腎臓学会誌(Kidney Int)、米国病理学会誌(Am J Pathol)などに報告した。従来、蛋白尿は、糸球体基底膜の障害により発症すると考えられていたが、近年の研究成果から、多くの病態における蛋白尿は、糸球体上皮細胞足突起間に存在するスリット膜の障害により発症することが明らかたなってきた。スリット構成分子としてネフリン、ポドシンなどいくつかの分子が同定されているがスリット膜の分子構造の詳細、スリット膜形成機序は明らかになっていない。本研究課題の目的は、糸球体上皮細胞(スリット膜)の新たな機能分子を同定すること、スリット膜の形成機序の解析を行うことである。初年度の平成18年度は、新たなスリット膜関連分子の同定を企図して以下の実験を行った。正常、並びにスリット膜傷害による蛋白尿を呈するモデル動物から糸球体mRNAを調整し、cDNAサブトラクションアッセイ法で、蛋白尿発症時、並びに蛋白尿発症モデルを誘導後早期(蛋白尿発症前)に、そのmRNA発現が低下している分子を同定する作業を行った。これらの分子はその発現低下がスリット膜の機能低下、蛋白尿発症に関与している可能性があると考えられる分子である。この検討でいくつかの酵素、細胞輸送に関する分子などが同定された。その中の1つsynapticvesicle protein 2-B(SV2B)について詳細な解析を行なった。siRNA技術を用いSV2Bをノックダウンした細胞ではスリット膜の機能分子の1つであるCD2APの正常局在が阻害されることを確認した。この結果は、SV2Bはスリット膜の構造形成、維持に関与していることを示す所見である。一連の研究結果は、米国腎臓学会誌(JASN 17:2748-59,2006)に報告した。SV2Bは治療のターゲットとして有望な分子の1つであると考えられる。初年度の平成18年度は新たなスリット膜関連分子の同定を企図した研究を行いsynapticvesicle protein 2-B(SV2B)と呼ばれる分子がスリット膜の機能低下、蛋白尿発症に関与していることを明らかにした。平成19年度は、SV2B並びにその関連分子群の糸球体における発現、病的状態における動態、機能、治療のターゲットとしての有用性についての検討を進めた。

SV2B並びにSV2Bと細胞膜分子とのドッキングに関与している膜分子の動態が、ネフローゼ症候群の予後判定の指標になることを明らかにした。siRNA技術を用いた解析で、これらの分子がスリット膜機能維持に重要な役割を果たしていること、これらの分子が新規治療法の開発のためのターゲット分子として有望であることを示した。また、初年度に引き続き、平成19年度も新たな機能分子を同定する作業を続けた。Eph-ephrin系の分子の一つであるephrin-B1という分子がスリット膜近傍に発現しており、スリット膜の機能維持に極めて重要な役割を果たしていることを明らかにした。一連の研究結果は、国際腎臓学会誌(Kidney Int 17:2748-59,2006)に報告した。
歯髄、脂肪由来MSCｓとアメロゲニン由来新規ペプチドの歯周組織再生への応用

本研究では、エナメル質形成に重要な働きを持つと考えられているエナメル蛋白アメロゲニンの生理活性に着目し、アメロゲニンペプチドが脂肪および歯髄由来の未分化間葉系幹細胞(MSCs)および歯周組織構成細胞に及ぼす影響について明らかにする。また、アメロゲニンペプチドの作用機序の解明および生体内における有効性を検討し、臨床応用に向けて更なるデータの構築をはかる。平成29年度はヒト骨芽細胞株、ヒトセメント芽細胞株などの歯周組織構成細胞およびヒト脂肪由来MSCs、ヒト歯髄由来MSCsなどの間葉系幹細胞に対するアメロゲニンペプチドの影響についての検討を行った。アメロゲニンペプチドの添加によって、歯周組織構成細胞および歯髄、脂肪由来MSCsの細胞増殖や基質産生能などの代謝に影響を及ぼすことが明らかになった。また、アメロゲニンペプチドのシグナル伝達機構について検討を行った結果、アメロゲニンペプチド添加により、脂肪由来MSCsのERK1/2のリン酸化を介してMSCsの代謝に影響を及ぼしていることが示唆された。さらに、アメロゲニンペプチドの固定が各細胞に及ぼす影響について検討するため、カルボジイミド法を用いてアメロゲニンペプチドを金基板に固定し、SPR法を用いてアメロゲニンペプチドを金基板に固定し、SPR法を用いて結合量の定量・測定を行った。その基板上で細胞を培養することによって、MSCsの細胞増殖能や基質産生能は亢進することが明らかとなった。平成29年度はヒト骨芽細胞株、ヒトセメント芽細胞株などの歯周組織細胞およびヒト脂肪由来MSCs、ヒト歯髄由来MSCsなどの間葉系幹細胞に対するアメロゲニンペプチドの影響についての検討を行った。アメロゲニンペプチドの添加によって、歯周組織細胞および歯髄、脂肪由来MSCsの細胞増殖や基質産生能などの代謝に影響を及ぼすことが明らかになった。また、アメロゲニンペプチドのシグナル伝達機構について検討を行った結果、アメロゲニンペプチド添加により脂肪由来MSCsのERK1/2のリン酸化蛋白質発現の増加と、ERK1/2のブロッキングによりこれらの減少が認められたことから、アメロゲニンはMAPK-ERK経路を介してMSCsの代謝に影響を及ぼしていることが示唆された。さらに、アメロゲニンペプチドの固定が各細胞に及ぼす影響について検討するため、カルボジイミド法を用いてアメロゲニンペプチドを金基板に固定し、SPR法を用いて結合量の定量・測定を行った。その基板上で細胞を培養することによって、MSCsの細胞増殖能や基質産生能は亢進することが明らかになった。平成29年度は、アメロゲニンペプチド(AMG-CP)添加が、ヒト骨芽細胞株(Saos-2)、ヒトセメント芽細胞株(HCEM)、ヒト歯根膜細胞株(HPL)、ヒト歯肉上皮細胞株(HOK)、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株(ADS)、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株(BMSCs)および歯髄由来間葉系幹細胞(DPSCs)の増殖能・基質産生能に対する影響について検討を行った。また、生体材料に対するAMG-CPの固定方法の確立の検討を行った。in vitro実験におけるAMG-CPの至適濃度については一定の知見が得られたが、AMG-CPをP(LA/GA)メンブレンへ固定する方法については、まだ検討中である。平成30年度は、AMG-CPを固定した基板上においてMSCsおよび歯周組織構成細胞の増殖能・基質産生能に及ぼす影響について検討を行う。さらに、ラット骨欠損モデルを作製し、欠損部にMSCsを播種したAMG-CP固定メンブレンとMSCsを被覆し、AMG-CPの骨再生効果に及ぼす影響について検証する予定である。

平成29年度の実験により、AMG-CP添加方法の至適濃度を特定したが、動物実験に応用するために、P(LA/GA)メンブレンにAMG-CPを固定する方法については更なる検討を行う予定である。予定している動物実験は、検討する至適条件が決定した段階で可及的早期に開始し、条件修正による再実験に備える。動物実験結果により修正が必要となる可能性がある場合には、動物実験の個体数を増加し、条件修正のためのin vitro実験と並行して行う。実験器具の購入に使用する予定でしたが、金額が不足のため購入できませんでした。翌年度分の助成金と合わせ、実験器具の購入に使用します。
ヒト神経芽腫転移には癌転移抑制遺伝子nm23は関与するか

【研究の目的】癌転移関連遺伝子としてはnm23を用いて、高転移能を有する神経芽腫細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行ない、遺伝子導入前後の転移能をin vivoで確認する。【方法】ヒト神経芽腫細胞株であるNB-1,GOTO,をMEN(10%FCS)(GIBCO)細胞培養液を用いて、CO_2インキュベータ-中で維持する。PUC118プラスミッドに導入したSR_αプロモーターの下流にさらにnm23のcDNAを導入して、EcoR1で切断して、得られたDNAを神経芽腫細胞NB-1,GOTOにそれぞれエレクトロポレーション法によりトランスフェクションする。遺伝導入した1×10^6個の神経芽腫細胞をプロテイナーゼを用いて50°C、12時間で振倒溶解して、10000r.p.mで20分間遠心分離して、上清を採取して、フェノール、クロロホルム処理により除蛋白後、エタノール沈殿法によりDNAを抽出する。このDNAを制限酵素BamH1を用いて切断後、10%アガロースゲルに電気泳動法により分離展開後、ニトロセルロース膜に吸着させて、^<32>pでラベリングしたnm23遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションとして遺伝子導入を確認する。【結果】神経芽腫細胞NB-1,GOTOにnm23のcDNAを導入することに成功した。今後は、遺伝子導入された細胞に転移能の検討を施行したいと考えている。
発生期網膜における血管先端細胞と神経系細胞のクロストーク

網膜の血管網は出生後に形成される。まず網膜の最内側の表面に沿って放射状に成長し、浅部血管叢を完成させる。網膜本体への血管の進入は生後2週目以降に起こり、深部・中間血管叢が段階的に形成される。この特徴的な網膜血管形成のパターンについて、なぜそのようなパターンをとるかは明らかではない。本研究では、あらゆる血管の成長に必須の因子として知られるVEGF(Vascular endothelial growth factor;血管内皮細胞成長因子)が、網膜神経によって取り込み・消化されることで濃度勾配が形成されるという全く新たな機序により、網膜の段階的な血管形成が制御されていることを見出した。血管網形成過程において、血管成長の最前線(vascular front)では血管Tip細胞が旺盛に糸状仮足を伸ばしつつ遊走し、後続の血管網はそのパターニングをもとに形成される。発生期網膜において、神経グリアの1つであるアストロサイトが血管よりも先にネットワーク構造を形成し、それを鋳型としてTip細胞の糸状突起が誘導されるという「血管-神経クロストーク」が存在する。本研究はこのTip細胞とアストロサイトの相互作用に関与する細胞・分子メカニズムを解明することを目的として遂行された。組織酸素応答システムは血管の酸素運搬能という本来の機能からして、血管発生に極めて重要なfactorであると考えられる。我々は、この組織酸素応答のmaster regulatorであるHIF-1αが発生期網膜においては神経網膜、特に未分化神経前駆細胞に発現していることを見出した。神経網膜特異的HIF-1αノックアウトマウスは、アストロサイトの鋳型の形成が疎であり、Tip細胞が糸状仮足を伸ばす足掛かりとなる細胞外マトリックスのネットワークも疎であった。この原因として、神経網膜から放出されるPDGF-Aの発現が低下しているため、アストロサイトの増殖が減少していることが原因と考えられた。そこで神経網膜特異的HIF-1αノックアウトマウスにPDGF-Aを添加したところ、アストロサイト、だけでなく血管の表現型も打ち消された。これらの結果は、血管Tip細胞とアストロサイトの相互作用の上流で、神経網膜の酸素応答システムが作動して、これを制御していることを示唆している。発生期血管成長過程において、神経系組織をはじめとする多くの組織では、血管成長の最前線(vascular front)において血管Tip細胞が旺盛に糸状仮足を伸ばしつつ遊走し、後続の血管網はそのパターニングをもとに形成される。発生期網膜において、アストロサイトが血管よりも先にネットワーク構造を形成し、それを鋳型としてTip細胞の糸状突起が誘導されるという「血管-神経クロストーク」が存在する。我々は、この組織酸素応答のmasterregulatorであるHIF-1αが発生期網膜においては神経網膜、特に未分化神経前駆細胞に発現していることを見出した。そこで神経網膜特異的HIF-1αノックアウトマウスにPDGF-Aを添加したところ、アストロサイトだけでなく血管の表現型も打ち消された。これらの結果は、血管Tip細胞とアストロサイトの相互作用の上流で、神経網膜の酸素応答システムが制御していることを示唆している(Nakamura-Ishizu et al Dev. Biol. 2011)。また、この神経網膜において、驚くべきことに血管内皮特異的VEGF受容体であるVegfr-2が発現しており、神経網膜特異的にVegfr2をノックアウトしたところ、血管網が密になることを見出している。この血管過剰形成のメカニズムとして、soluble formのVegfr2(sVegfr2)の関与が示唆されており、sVegfr2-floxマウスを作成(現在キメラマウス)している。本研究は中枢神経系における血管ー神経クロストークの全容を明らかにする目的で、血管、神経両者の可視化に非常に優れるマウス新生仔網膜をモデルとして、研究は遂行された。VEGFR2は、生体におけるあらゆる血管新生において必須の分子である血管内皮成長因子Vascular encothelial growthfactor(VEGF)のメイン受容体である。本年度は昨年度に引き続き、網膜における神経ー血管相互作用の鍵となる分子として、VEGFR2の網膜神経における発現・機能について解析を行った。

VEGFR2の新規レポーターマウスである、VEGFR2-BAC-EGFP(Ishitobi et al Exp Anim 2009)の各発生過程における発現を詳細に解析した結果、VEGFR2は出生から生後1週間までという、きわめて限定された期間において、網膜神経、および未分化網膜神経前駆細胞に発現することを確認した。遺伝学的に網膜神経特異的にVEGFR2を欠損させたマウスにおいて、血管が神経に向かって異所性に伸びていくという特徴的な血管異常を認め、このメカニズムついて更なる解析を進めている。これに関して、VEGFR2は通常の膜型アイソフォーム(mbVEGFR2)に加えて可溶型アイソフォーム(sVEGFR2)が存在することが近年報告されている(Albuquerque et al. Nat Med 2009)。このsVEGFR2がVEGFをトラップし不活化することで神経への血管の接近を妨げているのではないかという仮説のもと、sVEGFR2を特異的に欠損するマウスを作成することに成功した。本研究は中枢神経系における血管ー神経クロストークの実体を明らかにする上で、視覚受容に特化した中枢神経系の一部である網膜をモデルとし、形態学的・分子生物学的にその全容を解明すべく遂行された。生体内のあらゆる血管新生において、血管内皮成長因子Vascular endothelial growthfactor(VEGF)のシグナルは必須である。本研究は、このVEGFのメイン受容体である2型VEGF受容体(VEGFR2)が、新生仔期網膜においては血管よりむしろ神経に強く発現するという事象を切り口にVEGF/VEGFR2シグナルの神経における発現の意義に焦点を絞り、多面的に解析を行った。遺伝学的に神経においてVEGFR2を欠損させたマウス(Vegfr2Δneuro)では、神経方向に血管が異所性に伸びていくという表現型が得られた。このメカニズムとして、Vegfr2Δneuroでは、神経におけるVEGFR2を介したVEGFの取り込みが起こらないため、神経方向に血管が伸びていくという事象を、複数の遺伝子改変マウスを駆使して突き止めた。VEGFR2は通常の膜型アイソフォーム(mbVEGFR2)に加えて可溶型アイソフォーム(sVEGFR2)が存在することが近年報告されている(Albuquerque et al. Nat Med 2009)。このsVEGFR2がVEGFをトラップし不活化することで神経への血管の接近を妨げているのではないかという、代替となりうる仮説を検証すべく、sVEGFR2を特異的に欠損するマウスを作成することに成功した。しかしながら、このマウスにおいてはVegfr2Δneuroのような異所性の血管新生は見られなかった。これらの結果は、神経は通常、VEGFR2を介して旺盛にVEGFを取り込み・消化しており、血管の進入を排除していることを示している。網膜血管発生において血管-アストロサイト相互作用の上流で未分化網膜前駆細胞がプライマリーの酸素応答システムとして働くことを明らかにした。
42V自動車用リレー接点でのスチッキング故障と転移突起に関する数値評価研究

2台のデジタルマイクロスコープで転移突起の成長過程を2方向から撮影した。リレーに搭載した片持ち梁先端にリベット留めした接点対で発生する転移突起の形状は、円錐形ではなく、背が高くなるに連れてスフィンクス像形となる。突起形状がスフィンクス像に似たことは、アーク柱がローレンツカで片持ち梁先端方向へと押出されるため、多数回のアーク放電で堆積してできた突起の頂点は円錐形状から支持片先端方向へと移動するためであった。転移突起が高くなると閉成時の衝突直前にアーク放電やブリッジの発生を確認できたので、溶融状態の接触面が接触し、静止閉成中に(溶着)スチッキングが発生したと考えられる。転移突起及び消耗クレータの形状の計測に関しては、走査型レーザ顕微鏡を使用して、転移突起と対向する電極上の消耗クレータの3次元イメージの観察、及び形状の数値的評価(深さ・高さ、径の計測、体積の計算)を行った。このうち体積の計算については、新たに「台形近似法」アルゴリズムならびに「区分台形近似法」アルゴリズムを独自に考案した。また、転移突起や消耗クレータの形状を比較するためには、突起高さ又はクレータ深さと突起・クレータの径とを縦軸・横軸としたグラフが有効であることを確認した。低速・定速開離装置を使った開離時アークの姿態を1ms間隔で撮影した結果、この放電の初期及びアーク電圧の大きな変動期間中はアーク輝点の存在場所の変動幅も大きいこと、この放電の後期には輝点の変動幅が狭いこと(ほぼ同じ場所に存在)を突き止めた。本年度は以下の4点で成果を得た。(1)突起の成長過程を観測するため、パソコン駆動で50100倍のズームレンズを着装したディジタルカメラで試料電気接点対の所定開閉回数毎に接点間隙を撮影できる「ディジタルマイクロスコープ装置」を組み立てた。(2)電気接点対の開閉時に起こる電気的な現象を測定する「リレー搭載の電気接点特性測定装置」を創った。測定項目は以下のとおりである。接点対の閉成動作期間においては、(1)動作時間、(2)「第1回目衝突前のアーク継続時間、第1回目衝突接触時間、第1回目跳ね返り期間、第1回目,跳ね返り期間中のアーク放電継続時間、・・・第n回目衝突前のアーク継続時間、第n回目衝突接触時間、第n回目跳ね返り期間、第n回目跳ね返り期間中のアーク放電継続時間(エネルギーも測定)」、次に接触通電期間においては(3)接触電圧と電流(接触抵抗測定と接触安定性の確認)、次に接点対の分離動作期間において(4)復旧時間、(5)開離時アークの継続時間などである。(3)「リレー搭載の電気接点特性測定装置」と「ディジタルマイクロスコープ装置」を組み合わせて、20Aの抵抗性回路において試料リレーで実験した結果、Ag接点対やAg/Cd0接点対においては、大きな突起のできたときにスチッキングが発生した。開発した測定装置によって、スチッキング発生直前のバウンス期間に、衝突直前に1.5V程度の接点間電圧を観測した。この電位は溶融ブリッジの存在を示すものであり、スチッキングの原因は大きな突起の突起先端部で閉成動作中に発生したブリッジの接触中の固溶であると考えた(電子情報通信学会2004年総合大会で発表)。(4)レーザ顕微鏡で転移突起の形状や体積を精密に測定中である。(1)小型リレーの片持ち梁形式の接点支持片に取り付けた接点対で直流抵抗性回路を開閉させ、突起の成長過程を2方向から撮影できる「ディジタルマイクロスコープ装置」によって、開閉動作100回ごとに突起形状を10万回開閉まで撮影した。多数の試料の突起成長過程を分類すると、(1)円錐形突起が成長するに従って円筒型石筍に近づくこと、

(2)正面方向から見た突起形状は石筍形であっても、側面から見た突起の形状は丘状であること、(3)数少ない試料においては側面から見た突起形状が2こぶであり、正面から見た突起形状は1つまたは2つの石筍であること、を見つけた。アーク放電の点弧時に接触面中央で発生したアーク足は支持片の配置で生じた電磁力で、より先端方向に駆動されるために、転移突起はひょろ長くなり丘状となると考えた。(2)「リレー搭載の電気接点特性測定装置」によって閉成時の電圧と電流の波形を測定し、両波形からスチッキング(sticking)発生時には接点対の衝突直前に溶融金属のブリッジが存在することを発見した。この溶融ブリッジは積層した突起が大きくなるほど発生しやすいことも発見した(電子情報通信学会論文誌Cに掲載)。(4)レーザ顕微鏡による転移突起・クレータの形状評価および体積計測を精密に行うため、独自のデータ処理ソフトウエアを開発中である。現在までに、レーザ顕微鏡に付属のソフトウエアでは十分な精度が得られなかった傾斜面上および湾曲面上の突起・クレータの体積を比較的精度良く計測できるソフトウエアを開発し、引き続いてその計測精度の向上および操作性の向上のための改良を続けると共に、これを用いて突起・クレータの計測を実施している。小型電磁継電器(リレー)搭載の2枚の片持ち梁支持片(一方が静止状態で、他方が電磁石とカードで静止支持片側に押付けられる)の先端に取り付けたAg/CdO電気接点対を直流21A回路の閉成責務動作接点対として働かせ、スチッキング(開離不良)発生時の接点間電圧波形を、測定装置を改良することで、観測している。陰極側接点面に積層した転移突起と陽極側接点面の窪みが共に成長し、ある程度の大きさになるとスチッキングが発生した。スチッキング発生過程として、接点対の衝突前後の電圧は計や電流波形を観測することで(分離、アーク放電、接触、ブリッジなどの出現を判定),(1)積層した大きな突起の表面や対応する窪みの表面に存在する微小な凸部の蒸発で衝突直前アーク放電が誘発され、溶融した金属が引き出されて高電位ブリッジが架橋し、その後に接点対はブリッジを押し潰して接触し溶着したと、または(2)接点対は、最後の跳ね返り(およびワイピング中の躍動)の距離が短いので、ブリッジを架橋のまま押し潰して、接触し溶着したと考えている.42V自動車用電気回路を開閉する電気接点対の接触面損傷の一因であるアーク放電の特性を調べるため、低速・定速度開離装置による開離時アーク放電の実験結果では、陰極面と陽極面の近傍の両アーク輝点は(1)アーク継続時間の前半では広範囲に動き、後半になると移動幅が狭くなること、(2)陰極輝点は陽極輝点に比べて、アーク放電前半では輝度が高く・輝く体積も大きいが、アーク放電後半になると逆転すること、(3)接点材料Ag系とCu系とで輝点の運動形態(運動範囲、速度、輝度)に違いがあること、(4)輝点の運動面積が狭いと窪みができることなどを、示している。前年に使用した小型電磁継電器(リレー)搭載の片持ち梁先端に取り付けた接点対に比べて、接点間隙を広くしたAg接点対を使って、直流42V-4.2A回路と42V-10A回路を10万回開閉させて、接触面損傷を比較した。42V-4・2A回路での閉成責務動作接点対と開離責務動作接点対において、陽極面上に突起ができ、陰極面上にくぼみがあり、42V-10A回路での閉成責務動作接点対と開離責務動作接点対において、陰極面上に突起ができ、陽極面上にくぼみがあった。
インスリン様成長因子とその結合蛋白の異常に起因する成長ホルモン不応症の解明

変異遺伝子:発端者と正常身長をしめす父親にIGFALS遺伝子の点変異(p.Arg229His)をヘテロ接合体で見出した。また、発端者およびSGA性低身長を呈した姉と母に、IRSl遺伝子の部分欠失(p.Ser685_Ser686del)をヘテロ結合体で見出した。機能解析:1変異IGFALS遺伝子(p.Arg229His)を有する発端者と父親の血中ALS濃度は健常者に比較して低値を示した。2変異IGFALS遺伝子を導入したHEK293細胞は野生型遺伝子を導入した細胞よりもALS産生量が低かった。3変異IRSl遺伝子(p.Ser685_Ser686del)を導入したL6筋芽細胞では、IRS1発現が野生型導入細胞よりも低く、AKTリン酸化も野生型導入細胞よりも弱い結果を得た。結語:見出した変異IRSl遺伝子はIGF-1R系の異常としてSGA性低身長の原因の可能性が示唆される。一方変異IGFALS遺伝子は機能低下を認めたが、正常身長の父親にも認められており、今後さらなる検討が必要である。目的:新生児低血糖症の要因は、グリコーゲンの蓄積不足や糖新生の未熟性、高インスリン血症の存在などが指摘されているが不明な点が多い。新生児期早期の糖代謝において、インスリン受容体基質(IRS)をはじめとするインスリン/IGFシグナルを評価した文献は少ない。新生児期早期の血糖とインスリン/IGFシグナルの関連を明らかにした。結果:対象となった新生児52例は、平均在胎週数38週で、平均体重はAGA群が2931g、SGA群が1886gであった。血糖値はSGA群が有意に低く、IGF-IはAGA群が有意に高値を示したが、高インスリン血症は無く両者に差を認めなかった。また、SGA群でIRS2、の発現量は有意に増加を認めた。IGF1R、INSR、IRS1、SLC2A2 , 4には2群間に差を認めなかった。考察・結論:IRSはインスリンシグナルにおける重要な因子で、IRS-2の発現は飢餓の際に増加し、インスリン作用によって減少する。本研究では、SGA群の臍帯血中において、IRS2 mRNAの発現増加を初めて明らかにした。一方、過去の報告では、新生児のIGF-I値は体重に応じて増加すると報告されており、本研究でも、IGF-I値はAGA群>SGA群であり、過去の報告と矛盾しない結果であった。IRS2 mRNA発現増加が、SGAにおける血糖低下に寄与している可能性があり、研究を継続する予定である.新生児52例について、AGA群(42例)とSGA群(10例)に分類して,分娩・出生時の臍帯血もしくは児血液から、血糖、インスリン、IGF-Iを測定した。また、同じ検体を用いて,インスリン/IGFシグナルであるIGF1R、INSR、IRS-1、IRS-2、GLUT2、4 (SLC2A2、SLC2A4)遺伝子のmRNA発現量を解析した。その結果、血糖値はSGA群が有意に低く、IRS2の発現量が有意に増加をしていることを明らかにした。IRS2 mRNA発現増加が、SGAにおける血糖低下に寄与している可能性があり、研究を継続する予定である.【症例】在胎40週、出生体重2495 gr (-1.9 SD)、身長42.5 cm (-3.74 SD)のSGAで出生し、6歳時に身長が-2.5 SDのためSGA性低身長症として成長ホルモン(GH)治療を受けた女児。GH治療を行うも13歳の身長が-2.5 SDとGH治療の効果をみとめなかった。母と姉もSGA性低身長症と診断されている。家族歴とGH治療効果が不十分のため、IGF系の異常を疑い遺伝子検索を行った。【遺伝子解析】発端者と正常身長をしめす父親にIGFALS遺伝子に点変異(p.Arg229His)をヘテロ接合体で見出した。また、発端者およびSGA性低身長を呈した姉と母において、IRS1遺伝子に部分欠失(p.Ser685_Ser686del)をヘテロ結合体で見出した。【考察】IGFALS遺伝子異常(p.Arg229His)は、正常身長の父親にも認められており、発端者のSGA性低身長の原因とは考えにくい。IRS1遺伝子異常(p.Ser685_Ser686del)は発端者以外にSGA性低身長を呈した姉と母に見出されており、病因の可能性がある。成長ホルモン治療に対する反応が不良のSGA性低身長児を対象に、IGF系の遺伝子解析を行い、IRS1遺伝子の点突然変異をヘテロ接合体で見いだした。この変異はSGA性低身長をみとめる発端者、姉、母に見いだされており、低身長の原因の可能性が高い。今後機能解析を行う必要があるが、新しいSGA性低身長の原因の可能性がある。機能解析:

1変異IGFALS遺伝子(p.Arg229His)を有する発端者と父親の血中ALS濃度は健常者に比較して低値を示した。2変異IGFALS遺伝子を導入したHEK293細胞は野生型遺伝子を導入した細胞よりもALS産生量が低かった。3変異IRSl遺伝子(p.Ser685_Ser686del)を導入したL6筋芽細胞では、IRS1発現が野生型導入細胞よりも低く、AKTリン酸化も野生型導入細胞よりも弱い結果を得た。結語:見出した変異IRSl遺伝子はIGF-1R系の異常としてSGA性低身長の原因の可能性が示唆される。一方変異IGFALS遺伝子は機能低下を認めたが、正常身長の父親にも認められており、今後さらなる検討が必要である。この研究目標に従い、次年度以降は以下を行う1.臨床対象での検討:原因不明の、特に血中IGF-I血が低値を示す低身長児やSGA性低身長児症例を対象に、IGF-II、IGFBP-3、ALSおよびIGF受容体遺伝子の変異を探索する。2.In vitroでの検討:1)Informed consentを得た後、変異IGFBP-3あるいはALS遺伝子を有する対象者の血清のWestern blotを行い、変異IGFBP-3あるいはALS蛋白とIGF-Iとの結合能を検討する.2)見出された変異IGF-II遺伝子あるいはIGF受容体遺伝子をCHO細胞に発現させ,変異IGF-IIやIGF受容体遺伝子の機能を、細胞増殖能、IGF-Iとの結合能、IGF受容体リン酸化能で評価する。本研究の目的は、1)原因不明の低身長児,特に血中IGF-1値が低値を示す症例,を対象にIGF-2、IGFBP-3、ALSおよびIGF受容体系の遺伝子觧析を行いIGF系の異常に起因する成長障害を明らかにする。2)ln vitroの系を用いて、見出したIGF系の遺伝子異常とその機能異常の関連を検討する。この研究目標に従い次年度は1.臨床での検討:前年度に引き続き、原因不明の、特に血中IGF-1値が低値を示す低身長児あるいはSGA性低身長児を対象に、IGF系遺伝子異常の検索を行う。2.In vitroの検討:1)前年度に見いだしたIGFALS遺伝子およびIRS1遺伝子変異を対象に、それらの導入細胞を作成し、細胞増殖能、IGF受容体以降のリン酸化などの検討を行い、変異遺伝子の機能を評価する。2)今後の検討で見いだされたIGF系遺伝子異常の機能評価を変異遺伝子導入細胞で行う。今年度は原因不明のSGA性低身長児が少なく、年度後半に極めて希なIGF受容体の細胞内情報伝達に関与するIRS1遺伝子異常とIGF結合蛋白ALS(IGFALS)遺伝子異常の両方を有する症例が見いだされた。本来は遺伝子変異の機能解析を年度内に行う予定であったが、次年度にずれ込み、こ予定の物品費が十分に使用できなかった。次年度は本年度見いだした遺伝子変異の機能解析を行う。使用計画:1)見いだされた変異IRS1遺伝子および変異IGFALS遺伝子を導入した細胞を作成する。2)それを用いて細胞増殖能、変異IRS1遺伝子においては細胞内リン酸化を、変異IGFALS遺伝子についてはALS蛋白産生能、あるいは変異ALS蛋白とIGF-1との結合能を評価する。3)更に原因不明のSGA性低身長児のIGF系遺伝子異常の探索を行う。
樹状細胞亜集団特異的抗原デリバリーによる抗腫瘍ワクチンの開発

ワクチン接種部位である皮膚の樹状細胞に発現するレクチンをターゲットすることで、樹状細胞に抗原をデリバリーし、抗腫瘍免疫応答を誘導すること試みた。抗原として、真皮樹状細胞亜集団に発現するマウスマクロファージガラクトース型C型レクチン(MGL)に結合性を有する糖鎖を付加したヒトMUC1タンパク質を作製した。この抗原を免疫し、血清中の抗体応答を調べると、糖鎖修飾のない抗原に比べて、糖鎖修飾のある抗原を用いた場合のほうが有意に高い抗体応答が生じた。さらに、MUC1を強制発現させたマウス大腸癌細胞の増殖及び転移の抑制に成功した。本研究の成果は、ヒトへの抗腫瘍ワクチン開発にも応用できる可能性が高い。癌の治療において、特に転移抑制・再発予防といった点から免疫療法は注目されており、臨床的にも用いられはじめているが、その効果はまだ十分とは言えず、新たな免疫療法の開発が望まれている。免疫応答の制御において重要な役割を担う樹状細胞には、種々の亜集団が存在し、個々の亜集団により異なるタイプの免疫応答が制御される可能性が示されつつある。つまり、抗腫瘍ワクチン応答を誘導するのに適切な樹状細胞亜集団を選択し、抗原を特異的にデリバリーすることは、有効な抗腫瘍ワクチン開発につながると考えられる。そこで、本研究課題では、樹状細胞、特にマクロファージガラクトース型C型レクチン2(MGL2)を発現する皮膚及び皮膚所属リンパ節に存在する樹状細胞亜集団に抗原を特異的にデリバリーする新たな抗腫瘍ワクチンを開発することを最終的な目標としている。本年度は、MGL2を介して真皮樹状細胞亜集団へ抗原を特異的にデリバリー可能なMUC1ワクチンの作製に取り組んだ。その結果、糖鎖を多数結合させる部位であるタンデムリピートを16回含むMUC1-Igキメラタンパク質(糖鎖修飾なし、GalNAc付加、Gal-GalNAc付加の3種類)を、CHO-ldlD強制発現細胞の培養上清から動物実験に用いるのに十分な量を精製する方法を確立した。さらに、精製した糖鎖修飾の異なる3種類のMUC1-Igタンパク質を用いて、in vitroにて骨髄細胞由来樹状細胞を用いることにより、糖鎖修飾のないMUC1-Igに比べ、GalNAc付加MUC1-IgまたはGal-GalNAc付加MUC1-Igは効率的に樹状細胞に結合すること及び取り込まれるが明らかなとなった。この結合と取り込みの効果は、MGL2依存的に生じることを明らかにした。以上より、樹状細胞に発現するMGL2をターゲット可能なMUC1ワクチンの準備が整ったと考えられる。本年度の研究では、モデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を結合させた抗MGL2抗体をアジュバントとしてLPSと共に投与した場合、抗原が皮膚所属リンパ節に存在するMGL2陽性樹状細胞にターゲットされ効率的なIgG1産生が生じるため、皮膚所属リンパ節に存在するMGL2陽性樹状細胞が特徴的な免疫応答を誘導する樹状細胞亜集団であると考えられた。そこで、MGL2陽性樹状細胞の遺伝子発現パターンを網羅的に解析することで、MGL2陽性樹状細胞の特性解析を行った。その結果、皮膚及び皮膚所属リンパ節に存在する別のC型レクチンであるランゲリン陽性の樹状細胞亜集団に比べIL-12の発現レベルが低いことが判明し、MGL2陽性樹状細胞が他の樹状細胞亜集団とは異なる特徴的な亜集団であることが示された。癌の治療において、特に転移抑制・再発予防といった点から免疫療法は注目されているが、その効果はまだ十分とは言えず、新たな免疫療法の開発が望まれている。免疫応答の制御において重要な樹状細胞には、種々の亜集団が存在し、個々の亜集団により異なるタイプの免疫応答が制御されるらしい。つまり、抗腫瘍ワクチン応答を誘導するのに適切な樹状細胞亜集団を選択し、抗原を特異的にデリバリーすることは、有効な抗腫瘍ワクチン開発につながる。そこで、本研究課題では、樹状細胞、特にMGL2を発現する皮膚及び皮膚所属リンパ節に存在する樹状細胞亜集団に抗原を特異的にデリバリーする新たな抗腫瘍ワクチンを開発することを最終的な目標としている。本年度の研究では、異なる糖鎖修飾を持つMUC1-IgGよりMUC1部分のみを切り出す方法の条件検討を行った結果、マウスの免疫に使用可能な十分な量のMUC1を調製することは困難であるとの結論に達し、以後の研究では異なる糖鎖修飾を持つMUC1-IgGをワクチンとして用いることとした。異なる糖鎖修飾を持つMUC

1-IgGをin vitroで骨髄細胞より誘導した樹状細胞に抗原を取り込ませると、Tn抗原あるいはT抗原で修飾されたMUC1-IgGは糖鎖修飾のないMUC1-IgGに比べて樹状細胞により結合し、取り込まれることが明らかになった。この結合および取り込みは、MGL1およびMGL2依存的であった。さらに、MUC1-IgGを取り込ませた樹状細胞をワクチンとして用いたところ、糖鎖修飾の有無にかかわらず、MUC1に対する抗体応答は認められなかったが、Tn抗原で修飾されたMUC1-IgGを取り込ませた樹状細胞で免疫されたMUC1. TgマウスにおけるMUC1発現マウスメラノーマ細胞の実験的肺転移が抑制される傾向が認められた。この効果にはCD4陽性T細胞が関与するらしい。癌の治療において、特に転移抑制・再発予防といった点から、免疫療法は注目されているが、その効果はまだ十分とはいえず、新たな免疫療法の開発が望まれている。免疫応答の制御において重要な樹状細胞には、種々の亜集団が存在し、個々の亜集団により異なるタイプの免疫応答が制御されるらしい。つまり、抗腫瘍ワクチン応答を誘導するのに適切な樹状細胞亜集団を選択し、抗原を特異的にデリバリーすることは、有効な抗腫瘍ワクチン開発につながる。そこで、本研究課題では、樹状細胞、特にMGL2を発現する皮ふ及び皮ふ所属リンパ節に存在する樹状細胞亜集団に抗原を特異的にデリバリーする新たな抗腫瘍ワクチンを開発することを最終的な目標としてきた。今年度は、異なる糖鎖修飾を持つMUC1-IgGをアジュバントとともにマウスに投与した場合、糖鎖修飾のないものに比べて、糖鎖修飾のある場合のほうが、有意に高いIgGクラスの抗MUC1抗体を産生することを明らかにした。また、この抗体応答の初期には、抗原提示細胞に発現することが明らかになっているレクチンであるMGL1およびMGL2が関与することを明らかにした。さらに、MUC1を強制発現させたマウス大腸がん細胞株の脾注肝転移モデルにおいて、糖鎖修飾をもつMUC1-IgGで免疫されたマウスでは糖鎖修飾を持たないMUC1-IgGで免疫されたマウスと比べて、脾臓における癌の増殖及び、肝転移を有意に抑制できることを明らかにした。ワクチン接種部位である皮膚の樹状細胞に発現するレクチンをターゲットすることで、樹状細胞に抗原をデリバリーし、抗腫瘍免疫応答を誘導すること試みた。抗原として、真皮樹状細胞亜集団に発現するマウスマクロファージガラクトース型C型レクチン(MGL)に結合性を有する糖鎖を付加したヒトMUC1タンパク質を作製した。この抗原を免疫し、血清中の抗体応答を調べると、糖鎖修飾のない抗原に比べて、糖鎖修飾のある抗原を用いた場合のほうが有意に高い抗体応答が生じた。さらに、MUC1を強制発現させたマウス大腸癌細胞の増殖及び転移の抑制に成功した。本研究の成果は、ヒトへの抗腫瘍ワクチン開発にも応用できる可能性が高い。当初ワクチンとして用いることを想定していた異なる糖鎖修飾を持つMUC1を大量に調製することができず、ワクチンとして用いる抗原をMUC1-IgGへと変更したが、それ以外についてはおおむね当初の研究実施計画の目的を達成できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
20世紀モンゴル・ウランバートルの都市形成史-仏教中心の遊牧都市から国民国家の定住首都への変容過程

2005年4月から8月の半年間は主に前年度に得られたデータを整理し、文献を読み解き、さらに図面を作成して分析検討した上で論文を執筆した。まず、2005年4月にウズベキスタンのサマルカンドで開催された「北アジア・中央アジア地域における歴史的都市国際シンポジウム」を参加し、モンゴルの都市について発表した。次に、2005年5月に、函館で開催された「第20回満族史研究会大会」でモンゴルにおける満洲城の空間構造について発表した。2005年9月に、大阪で開催された日本建築学会大会でモンゴルのおける貿易都市の形成について発表した。2005年12月にモンゴルにおける都市史、建築史調査に関して、一橋大学で開催された「近現代東北アジア地域史研究会大会」で報告を行った。最後に、2005年8月に英国のケンブリッジ大学で発行されている英語誌「International journal of ASIAN STUDIES」にモンゴルの都市史に関する論文を投稿して採用された。今年の7月に刊行される予定である。農耕文明を基盤に定義されてきた都市の概念では、遊牧社会には都市がないと結論づけられてきた。このような従来の都市概念をそのままモンゴルに当てはめるのではなく、遊牧社会の過去から現在までの社会状況を認知した上で、もうひとつの「都市像」を検証するために、この一年間の研究活動を進めてきた。この一年間は、主に仏教建築及び1920年代以来建設された建築と都市計画の歴史を明らかにした。具体的には、文献収集、フィールドワーク、まとめ及び発表と三段階で研究を進めてきた。まず、日本、中国、モンゴル国でモンゴルの都市、建築、歴史、仏教などに関する史料、文献、書籍を収集し、文献リストを作成した。次に、2004年5月に、モンゴル国ウランバートルで近代建築悉皆調査を行った。具体的には、17世紀から1990年までの全ての建築類型を調査対象とし、900棟の現存する歴史建築を調査表に記録し、その中で200棟を選別し、詳細なデータベースを作成した。最後に、文献及びフィールドワークで得た史料やデータを整理し、国際学会で発表するほか、論文と著書でその成果を公開した。2004年6月には、日本・韓国・中国の建築学会が共同で開催した国際シンポジウムで、「the structural characteristics of Mongolian settled urban space」を発表した。さらに、8月に中国内モンゴル大学で開催された「第4回モンゴル学国際シンポジウム」で「モンゴルのチベット仏教建築に関する研究」を発表した。2004年2月には「モンゴルにおける都市建築史研究」の著書を発行した。