hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写共役ヌクレオチド除去修復開始反応のin vitro再構成

転写共役ヌクレオチド除去修復機構(TC-NER)は、紫外線などによって生じたDNA損傷を修復するメカニズムの1つである。TC-NERの開始反応は未だ不明な点が多いことから、そのメカニズムの解明に取り組んだ。特に、機能未知のUVSSAとRNAポリメラーゼ(RNA pol IIo)の関係に着目し、TC-NERの開始段階で観察されるRNA pol IIoのユビキチン化修飾反応とUVSSAの機能について、詳細な解析を実施した結果、TC-NER活性に必須かつUVSSA依存的に起こるRNA pol IIoのユビキチン化サイトを複数同定した。本研究では、以下の2課題に取り組んだ。課題1:in vitro転写系と損傷導入プラスミドを用いて、RNA polIIoのDNA損傷個所での停止と、その後のユビキチン化分子反応を解析するシステムを構築した。UVSSAやCS複合体、E3リガーゼ関連因子の各反応ステップにおける要求性について、詳細に調査する。さらに、各因子の機能性ミュータントの解析を実施することで、分子相互の依存関係、作用機序の解明に取り組む。課題2:RNA polIIoをユビキチン化するE3リガーゼ複合体について、リコンビナント蛋白質の共結晶化とX線結晶構造解析を実施中である。RNA polIIoのユビキチン化反応が、UVSSAとE3複合体のどのような作動原理に基づいて生じるのかを構造生物学的に明らかにする。また、構造解析の結果に基づいた機能性ミュータントを作成し、生化学的/細胞生物学的解析を行い、課題1と併せて分子間相互作用機序を明らかにする。初年度は、紫外線誘発型のDNA損傷を導入したプラスミドテンプレートの作成が完了し、in vitro転写系の構築が順調に進んだ。また、DNA修復活性が欠損、あるいはユビキチン化能が欠損したUVSSAのミュータントを追加同定した。今後、これらのミュータントとin vitro転写系を用いて、RNA polIIoユビキチン化反応の詳細を解明していく。さらに、これまで精製困難であったUVSSA蛋白質を、比較的簡単に精製する技術を確立した。ことから、今後、大量精製を進め、結晶構造解析を実施する。UV照射後のPol IIのユビキチン化を詳細に解析するためユビキチン化経路に関わるいくつかの阻害因子で細胞を処理したところ、幾つかの阻害剤によりGG-NERは正常だったがTC-NERが減弱した。またsiRNAによるノックダウンの解析では、ある種のE3リガーゼ複合体がPol IIのユビキチン化に関わることが判明した。UVSSAはpolIIのユビキチン化に関与していると考えられ、幾つかのドメインの変異体を作成し、解析をおこなっている。Pol IIはUVSSA非存在化では迅速に分解されるが、幾つかの変異体ではC32R変異体と同様にPol IIの分解速度の回復はできなかった。一方、UVSSAの機能解明の糸口として、UVSSAタンパク質の結晶構造解析に挑んでいる。UVSSAは非常に不溶性であるため精製が困難であったが、これまでに本研究においてUVSSAの精製に必要な幾つかの条件を決定した。現在、結晶化に向けた全長UVSSAの精製を進めている。UVSSAがPol IIの分解サイクルに重要であるという新たな証拠を同定した。UVSSAタンパク質は本研究を開始した時点では精製すること自体が困難であったが、現在時点では結晶構造解析に向けて大量精製出来る段階にまで進展している。UVSSAは、転写共役ヌクレオチド除去修復(TC-NER)開始時の転写型RNA pol IIoのユビキチン化反応に関与していると考えられる。そこで、UVSSA依存的なRNA pol IIoのユビキチン化部位を決定するため、SILAC代謝標識システムを利用することとした。本解析の結果、UVSSAに依存してUV照射により誘導されるRNA pol IIoのユビキチン化サイトを同定することに成功した。この結果に基づいて、本ユビキチン化サイト特異的にユビキチン化が起こらない変異型RNA pol IIを発現するノックイン細胞を作製し、それぞれのTC-NERの活性や、UV照射前後のRNA pol IIoのユビキチン化状態の詳細およびRNA pol IIoの分解状態とその分解速度等の検討を進めている。また、in vitroユビキチン化反応解析中にUVSSAが自己ユビキチン化されることを見出した。このUVSSAの自己ユビキチン化サイトに関して、変異体を作成し、TC-NERへの影響やRNA pol IIのユビキチン化および分解との関連など細かく解析を行った。一方、UVSSAの機能解明を目的としたUVSSA蛋白質の結晶構造解析では、UVSSAの一部ドメインの結晶化と構造解析に成功した。この結果得られた機能性と予想される部位の情報をもとに、各種変異体の作成を実施し、細胞レベルでの検証を行っている。さらに、全長のUVSSA蛋白質の精製も完了し、現在結晶化スクリーニングを実施している。SILAC代謝標識システムを利用して、UVSSA依存的なRNA pol IIoのユビキチン化部位の同定を試みた。正常細胞とUVSSA欠損細胞をLightとHeavyのアミノ酸で標識し、細胞抽出蛋白質をトリプシン消化後に抗di-Glycine抗体でユビキチン由来のペプチドを濃縮した後、高分解能オービトラップ質量分析装置で同定・解析を行なった。その結果、UVSSAに依存し、かつUV照射により誘導されるRNA pol IIoのユビキチン化サイトを同定した。

このユビキチン化部位のリシンをアルギニンに変異させることで、特定のユビキチン化が制限された変異型RNA pol IIを発現する遺伝子改変細胞を作成し、細胞レベルでの検証を実施している。UVSSAが自己ユビキチン化する部位のアミノ酸変異体は、UVSSA欠損細胞のTC-NER活性を相補することができず、変異体UVSSAを発現する細胞ではUV照射後のRNA pol IIoの分解速度が速くなっていた。UVSSAの結晶構造解析では、一部ドメインの結晶化・構造解析に成功し、全長UVSSA蛋白質は結晶化スクリーニングの段階に入っている。以上のように、これまでUVSSAがRNA pol IIoのユビキチン化およびその分解サイクルに重要であることを示してきたが、その作用機序解明に迫るためのデータが着々と蓄積している。「転写と共役したヌクレオチド除去修復機構(TC-NER)」は、DNA損傷箇所で停止した転写型RNAポリメラーゼを取り除き、DNA修復と転写の再開に必要である。この反応はRNA pol IIoのユビキチン化により開始され、UVSSAが関与していると考えられている。UVSSA欠損細胞では紫外線照射後にRNA pol IIoの分解反応が観察される。UVSSAのRNA pol IIoユビキチン化反応に関する機能を明らかにするため、SILAC代謝標識精密質量分析法により、紫外線照射後にUVSSA依存的に誘導されるRNA pol IIoのユビキチン化サイトを探索し、これらを同定することに成功した。そこで、本ユビキチン化を制限した変異型RNA pol IIを発現する遺伝子改変細胞を作製し、細胞の紫外線感受性、TC-NER活性や、紫外線照射時のRNA pol IIoのユビキチン化状態と分解反応等について詳細に比較検討をおこなった。平行して、RNA pol IIoのin vitroユビキチン化反応系を構築し、UVSSA依存的と考えられるユビキチン化サイトに変異を導入したRNA pol IIの、ユビキチン化修飾や分解反応の変化について生化学的な解析を実施した。また、上記RNA pol IIoのユビキチン化サイトに変異を持つ遺伝子改変動物を作製し、これを用いて個体レベルでの解析を実施することで、細胞生物学・生化学的な実験結果の検証と比較検討をおこなうこととした。遺伝子改変マウスの作製を進め、この系統樹立に成功した。また、UVSSAのX線結晶構造解析に関する共同研究を進め、UVSSAの一部ドメインの結晶化とその構造解析に成功した。全長UVSSAの解析を進めながら、別ドメインの部分結晶構造解析にも合わせて取り組んだ。転写共役ヌクレオチド除去修復機構(TC-NER)は、紫外線などによって生じたDNA損傷を修復するメカニズムの1つである。TC-NERの開始反応は未だ不明な点が多いことから、そのメカニズムの解明に取り組んだ。特に、機能未知のUVSSAとRNAポリメラーゼ(RNA pol IIo)の関係に着目し、TC-NERの開始段階で観察されるRNA pol IIoのユビキチン化修飾反応とUVSSAの機能について、詳細な解析を実施した結果、TC-NER活性に必須かつUVSSA依存的に起こるRNA pol IIoのユビキチン化サイトを複数同定した。
ベイズ統計による環境汚染物質の確率的濃度解析手法の開発

本研究では、汚染物質濃度の離散的かつ低い空間解像度の計測データを出発点として、連続的かつ高い解像度の空間濃度分布を数値的に解析し、同時にその解析データの信頼性を診断する一連のシステム構築を目指している。当該年度においては、特に以下の課題に取り組んだ。1ベイズ推論を中核として、計算流体力学による随伴濃度解析と汚染物質濃度の計測を組み合わせ、汚染物質の発生位置とその強度を確率的に推定する基本モデルを構築した。また、そのモデルを数値的に評価する解析システムを構築した。2随伴濃度解析を時間平均型乱流モデル(Reynolds-averaged Navier-Stokes equations)で解析する際には、乱流シュミット数に代表されるようないくつかの経験的パラメータを与える必要があるが、それらのパラメータ入力値の不確かさが波及し最終的な解析誤差も増大してしまう。そこで、解析上必要となる経験的パラメータ等も未知量として同時に推定するように基本モデルを拡張した。また、既往の実験データを基に同モデルを利用したケーススタディを実施しその有効性を確認した。3今後の更なる解析モデルの拡張に対応するため、都市空間中における風速や汚染物質濃度の分布を検討する風洞実験を実施し、計測データの蓄積を行った。4汚染物質濃度の数値予測手法の精度向上を図るため、都市内気流を対象とした非定常型乱流モデル(Large-eddy simulation)による解析とその精度検証を行った。予定していた基本モデルの構築は完了し、解析モデルやシステムの拡張にも着手している。また、要素技術としてのシミュレーション精度の向上や検証も進め、今後の検討に用いる実験データの取得も進んでいる。これまでは主に単一の点と見なせる発生源から放出される汚染物質の濃度を主な対象としてきた。今後は、発生源の形状や数に任意性がある場合においても解析可能なようにモデルを拡張していく。また、主に随伴濃度解析は乱流モデルを用いた予測が必要となるため、計算コストが大きくなる傾向にある。解析システムの精度を向上させるとともに計算効率を高める手法に関しても検討を行ってく。
ポリ乳酸の光学分割重合法の開発

バイオプラスチックであるポリ乳酸(PLA)はD-乳酸単位が含まれると物性や生分解性に影響するため、D-乳酸単位を制御する必要がある。本研究では、重合結晶化を利用したPLLAの光学分割合重合を検討した。ラクチドは可溶でポリマーは不溶の溶媒を用いてカチオン重合を行い、重合過程でせん断を印加してPLA結晶を析出させた。D-乳酸単位の共重合仕込み比率が減少するにつれて析出したPLA結晶中のD-乳酸単位含有率が重合仕込み比率より著しく低下すること、ならびに、せん断速度の増加によりPLLAの選択性が向上することが分かった。ポリL-乳酸(PLLA)は高価格であり、廉価に提供できる合成法が希求されている。光学純度の低いラクチドの開環重合過程においてPLLAが選択的に調製できれば、乳酸の光学分割工程を省略することができ、上記の問題の解決に繋がると考えられる。このような背景から、重合結晶化を利用したPLAの合成に於いて、重合場にせん断流動を印加することによるPLLAの光学的選択重合を検討した。円筒形撹拌棒を備えた円筒形重合容器にトルエンとn-オクタンの混合溶媒、ならびにL-ラクチドとD-ラクチドを仕込比(L-ラクチド/D-ラクチド=95/5)で濃度0.02 mol/Lとなるように仕込み、撹拌をしながら窒素気流下で80oCまで昇温した。ラクチドが完全に溶解したら、重合開始剤であるトリフルオロメタンスルホン酸を加えた。その後、せん断速度0、147、ならびに489 s-1で撹拌を印加し20時間重合を行った。部分ラセミ体を静置下で重合を行うと、収率42%で高結晶性のポリ乳酸(PLA)の板状結晶が生成した。ベルヌーイ統計に従ってモノマー仕込み比から算出した立体構造の異なる乳酸単位からなるシンジオタクチック連鎖racemo2連子(r)は9.5%であるのに対して、得られたPLAではr=4.7%と低く、光学選択性が発現した。そこで次に、せん断速度147ならびに489 s-1でせん断を印加し、同様に重合を行った結果、せん断速度の増加に伴ってr値は減少し、せん断速度489 s-1ではr=3.2%となった。せん断印加による光学的選択性向上の詳細を検討するため、それぞれの重合における収率とr値の時間変化を調べた。その結果、せん断印加によって重合初期における収率の向上が見られた。せん断を印加すると、重合初期では撹拌による反応速度の増大により重合度の高いコオリゴマーが生成し析出する。重合中期以降ではオリゴマーの溶解性差の効果が顕著になり、コオリゴマーに比べホモオリゴマーが優先的に析出することでr値が減少したと推測された。当初の計画では、L-ラクチドとDL-ラクチドとの重合系を検討することにしていた。しかし、ラクチドの安定性の問題から、より光学分割が難しいと考えられる完全な鏡像関係にあるL-ラクチドとD-ラクチドの共重合系で研究を開始した。その結果、部分ラセミ体からの重合にせん断を印加することで、光学的な選択性が発現し、D-乳酸単位の少ないポリ乳酸を結晶として調製することができた。更には、せん断速度と光学的選択性との間に相関関係があることも見出すことができ、本研究の根幹をなすせん断印加による光学的選択重合の可能性を見出すことができた。また、得られた結晶の固体構造解析も実施し、せん断の印加によらず非常に結晶性の高い板状結晶が得られることも分かった。せん断印加系に於いても、オリゴマーやモノマーが重合と同時に結晶化していることが明らかとなり、次年度の計画に繋がる研究成果を獲得することができている。当初計画であるせん断印加条件を含めた重合条件と生成ポリマーの分子量との関係がまだ完全には把握できておらず、次年度での継続的な検討課題として残っている。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。環境意識の高まりから、バイオプラスチックであるポリ乳酸(PLA)に対する期待は大きいが、高価格であることが課題である。高分子PLAはラクチドの開環重合により合成されており、ラクチドの前駆体である乳酸は微生物合成によるL-乳酸の合成法が主要であることから、商業的に生産されているのはポリ(L-乳酸)(PLLA)である。乳酸にはL-乳酸のほかにエナンチオマーであるD-乳酸が存在し、PLAにおけるD-乳酸単位との共重合組成比は融点、結晶加速度、生分解性に影響するため、光学純度の高いL-ラクチドが必要となる。そのためには微生物合成や化学合成の際に副生するエナンチオマーであるD-ラクチドを取り除く光学分割による精製工程が必要となり、これが高価格の要因の一つとなる。ラクチドの光学純度が低くても、重合過程で光学純度を上げることが可能になると、煩雑な乳酸の精製工程を省略することができ、PLLAの低価格化が可能となる。そこで本研究では、触媒に頼ることなく、重合過程でのオリゴマー結晶化である重合相変化を利用することでD-乳酸単位を含む光学純度の低いラクチドからのPLLAを光学分割合的に合成する方法に加え、重合系へのせん断印加によりPLAの共重合組成比率制御技術を検討した。

ラクチドは可溶でポリマーには不溶の混合溶媒を用いてカチオン溶液重合を行い、重合過程でPLA結晶を析出させた。この重合系にせん断を印加すると、D-乳酸単位の共重合仕込み比率(X)が減少するにつれてPLA結晶の収率が減少したが、析出したPLA結晶中のD-乳酸単位含有率(r)がX値より著しく低下することが分かった。また、せん断速度の増加によりr値がより減少し、X値が95mol%でもr値が1mol%以下とPLLAの選択性が向上することを明らかにすることができた。バイオプラスチックであるポリ乳酸(PLA)はD-乳酸単位が含まれると物性や生分解性に影響するため、D-乳酸単位を制御する必要がある。本研究では、重合結晶化を利用したPLLAの光学分割合重合を検討した。ラクチドは可溶でポリマーは不溶の溶媒を用いてカチオン重合を行い、重合過程でせん断を印加してPLA結晶を析出させた。D-乳酸単位の共重合仕込み比率が減少するにつれて析出したPLA結晶中のD-乳酸単位含有率が重合仕込み比率より著しく低下すること、ならびに、せん断速度の増加によりPLLAの選択性が向上することが分かった。L-ラクチドとDL-ラクチドの開環共重合系において,継続検討課題である重合条件とポリマー分子量の関係を明らかにする。また,せん断速度,印加時間,ならびに印加開始時期によって,オリゴマーの溶解性や結晶化速度が影響を受けると予想される。よって、オリゴマーの溶解度と結晶化速度,ならびに固体構造のせん断依存性を明らかにした後に、せん断印加時間や印加開始のタイミングなどの条件を検討し、更なる光学選択性の向上を図る。得られた知見を基に、L-ラクチドとDL-ラクチドの共重合系におけるせん断印加と光学選択性の関係を明らかにする。更には、開環重合系だけではなく、乳酸の重縮合に於いても重合結晶化を利用したPLAの光学選択的合成を検討し,せん断印加という外力を利用した新しい光学的選択重合を確立する。環境学該当なし
保健所精神衛生活動に対する住民の求助行動過程と保健婦の対処方法に関する研究

保健所において精神保健活動に従事する保健婦との事例検討を重ねた。これらの事例検討から得られた知見をさらに再検討することにあたり、住民の保健所への救助行動の特徴と、保健婦の対処の方法に焦点を当てた。その結果、以下の新たな知見を得ることができた。まず、住民が保健所の精神活動に援助を求める際に、必ずしも自分自身の健康上、あるいは精神的な問題を持ち込むのではないこと、また、それ故、保健所が住民に処遇を求められている問題は相談者とは異なる人物に関するものであることが明らかとなった。つまり、相談者である住民は他者の精神的問題の処遇を保健所に求めていることとなる。このことは、本来セルフケアを行うべき問題を持っている人(あるいは家族)に処遇を求める動機はなく、周辺の関連する人物が相談者となることを意味する。このため精神科的問題解決の動機は多くの場合ないか、あるいは極めて希薄であるか、または、他者にあることとなる。また、他者が純粋に精神科的問題の解決を望むとは限らず、単に精神障害を持つ者に困らされているだけであるという事例も少なくなかった。すなわち、住民は第三者として保健所に精神障害を持つ者の処遇を転嫁するという形式に基づいて相談を持ち込んでこることが多いことが明らかとなった。ただし、いわゆる相談者が解決してもらいたいとする問題は、極めて多様であり、これを類型化することは本年度の枠内では行い得なかった。しかし、この類型化は保健婦の援助方法の確立において、重要な意味を持ち得ることから今後の研究課題とする必要がある。一方保健婦は、住民から転嫁された問題の解決を行う際に、多面的な役割が要請されることが明らかとなった。つまり、住民、精神障害者、及び場合によっては病院等の関連諸機関の固有の立場を理解しつつ、これらを有機的に統合していくという援助を行っていることが明確となった。これらの結果を今後公表していく予定である。
日本語学習者の文章産出過程における読み手との共通の枠組み設定に関する研究

本研究では、日本語学習者の文章産出過程に関して、書き手が読み手との間に想定する共通の枠組み設定に注目し、社会的・文化的文脈を含む広義の読み手意識について、学習者がどのような事柄を意識し文章産出を行っているか、そのことが読み手からの評価にどう影響するかを考察した。韓国語を母語とする中・上級程度の学習者5名をインフォーマントとし、新聞の投書を意識した意見文、目上の人に対する依頼の手紙、近しい間柄の友人にあてた手紙の3種類の課題作文を行い、インタビューにより思考や行動の内省を得た。また、5名の学習者が書いた前述の3種類の課題作文および新聞の投書1編の4種類16編の文章について、プラス・マイナスの評価を文章上にマークし、その理由を記述するという方法で得たデータから読み手としての意識、評価の基準となる項目を分析した。読み手の評価については、5人の学習者に加え、日本語母語話者のデータも収集し、学習者と日本語母語話者との比較を試みた。韓国人学習者の場合、学習者自身、書くことに関して彼らの母文化と日本語文化との距離はかなり近いと意識しており、そのことが文を書く、あるいは評価する際に韓国語文化での判断をそのまま持ち込むという態度となって表れていた。全体としては共通の判断基準が適用されることが多いが、しかしそのことが細かなルールや価値観のずれを見えにくくさせ、書き手の意図や配慮とは異なる評価を読み手から受けることにつながっている事例が見られた。また、母語では当然書かれることが落とされたために(回避ストラテジーの使用)、文全体が単調になるなど、母語話者からは日本語力の問題とは理解されず書き手の思考力や個性の問題として低い評価につながっている事例が見られた。これらを初めとし、従来の作文教育ではほとんど扱われてこなかった側面が評価に影響していることが認められた。
トンネル効果の基礎理論

断熱的あるいは非断熱的なレベルの交差がある場合のトンネル効果および量子コヒーレンスはまだこれからも研究の余地のある興味ある問題と言える.この断熱的なレベル交差がある場合の量子コヒーレンスを研究するために,まず断熱遷移の問題をゲージ理論の技法を用いて再定式化することをおこなった.興味のある点は,このようにしてsu(2)ゲージ変換を用いて断熱的な描像と透熱的な描像をつなぐ定式化を行うと,レベル交差の相互作用の強さという点からは一方の描像では強結合であれば他方の描像では弱結合になることが明快に定式化された.すなわち、二つの描像は互いに双対(dual)であるといえる。この双対性(duality)を用いることにより,よく知られたLandau-Zenerの公式とかレベル交差を伴う系の量子コヒーレンスの本質的な性質が摂動理論で定式化できる.この研究は現在も続行中であり、まだ論文にはまとまっていないが、近日中に論文にまとめるべく急いでいる.上記以外の研究としては、水素原始の問題を経路積分を用いて定式化し、Jacobiの最小作用の原理が基本的な役割を果たしていることを示した.この定式化では、量子力学の経路積分は一般に一次元の量子重力の問題に帰着される。この定式化の一つの応用として,強い電場中のStark効果およびそれに付随したトンネル効果が,不安定な4次の結合を持つ非調和振動子の問題になることを示した.その他では,ゲージ場の量子化におけるGribovの問題と呼ばれるものをゲージ場の配位の大局的な振る舞いに基づいて考察した.断熱的あるいは非断熱的なレベルの交差がある場合のトンネル効果および量子コヒーレンスはまだこれからも研究の余地のある興味ある問題と言える.この断熱的なレベル交差がある場合の量子コヒーレンスを研究するために,まず断熱遷移の問題をゲージ理論の技法を用いて再定式化することをおこなった.興味のある点は,このようにしてsu(2)ゲージ変換を用いて断熱的な描像と透熱的な描像をつなぐ定式化を行うと,レベル交差の相互作用の強さという点からは一方の描像では強結合であれば他方の描像では弱結合になることが明快に定式化された.すなわち、二つの描像は互いに双対(dual)であるといえる。この定式化の一つの応用として,強い電場中のStark効果およびそれに付随したトンネル効果が,不安定な4次の結合を持つ非調和振動子の問題になることを示した.その他では,ゲージ場の量子化におけるGribovの問題と呼ばれるものをゲージ場の配位の大局的な振る舞いに基づいて考察した.
非線形化学反応への高分子電解質添加効果

前年度の研究で、ルテニウム錯体およびセリウム触媒Belousov-Zhabotinsky(BZ)反応系にアニオン性高分子電解質であるポリビニル硫酸カリウム(PVSK)を添加すると振動抑制等の効果が観測され、高分子電解質と触媒との相互作用の機構は触媒によって異なることが示唆された。そこで本年度は、カオス振動を示すセリウム触媒-無撹拌バッチBz反応に添加することで規則振動を発現させることが報告されている非イオン性高分子のポリエチレングリコール(PEG)の添加効果について詳細な検討を行った。バッチBz反応系において無撹拌条件で観測されたカオス振動は、非常に低い撹拌速度において規則振動へと分岐した。またPEGの添加量の増加に伴って振動が抑制され、この傾向は低分子量のPEGほど顕著であった。またセル内の異なる位置で同時に酸化還元電位を測定したところ、PEGの添加により振動周期は等しくなるものの、位相は完全には同期しなかった。PVSKを添加した場合にも、カオス振動から規則振動への分岐が観測された。セリウム触媒BZ反応においては、PVSKの添加により酸化および還元反応の双方の進行が抑制されることを以前報告したが、PEGを添加した場合には、酸化反応の進行速度には変化が見られないものの還元過程の開始が早くなることが見出された。また無触媒のBZタイプの反応においてもカオス振動が観測されたが、PEGを添加しても規則振動は観測されなかった。これらの結果より、無撹伴BZ反応ではセル内の局所領域において位相等の異なる振動が並行して進行しているために、結果として酸化還元電位がカオス振動を示し、PEGの添加によって、これまでに提唱されている溶液の粘性の影響に加え、還元過程の進行が加速されるために、より広い領域で同期して振動が起こり、規則振動が発現するものと考えられる。高分子電解質の電荷選択的な対イオン凝縮という現象を利用し、酸化反応と還元反応が交互に進行する化学振動反応であるBelousov-Zhabotinsky(BZ)反応において酸化型の触媒濃度のみに選択的に摂動を加えることを目的として、Ru(bpy)_3^<2+>およびCe(III)を触媒とするBZ反応系に、アニオン性高分子電解質であるポリビニル硫酸カリウム(PVSK)および電気的に中性なポリビニルアルコール(PVA)を添加し、その効果を検討した。連続流通撹拌反応槽(CSTR)中で振動状態にある系にPVAを添加した場合には、ほとんど影響は見られなかったが、PVSKを添加すると、Ru(bpy)_3^<2+>-触媒の場合には振動周期が長くなり、特に系が酸化状態にとどまる時間が長くなった。さらに添加量を増やすと系は定常状態へと分岐したが、これはPVSKの添加により、高分子イオンと反対荷電の錯体触媒イオンの強い電気的相互作用が起こり、特に酸化型のRu(bpy)_3^<3+>との相互作用が強いために還元過程の進行が抑制されるからであると考えられる。一方、Ce(III)-触媒BZ反応では、PVSKの添加により緩和型の振動から不規則振動を経て短周期の振動へと変化し、最終的には定常状態へと分岐した。この時の振動波形の変化から、PVSKの添加により酸化および還元反応の双方の進行が抑制されているものと思われる。一方、バッチ条件下では、PVAを大量に加えるとPVSK同様の振動抑制効果が観察された。また、この効果は酸濃度や硫酸ナトリウムのような低分子電解質の濃度が高くなると軽減されることが見出された。しかし、高分子電解質の添加による粘度の変化も含め、化学的および物理的な機構の詳細については、さらに検討が必要である。
行為と注意のダイナミクスに基づく個人識別とコミュニケーション

近年,高齢化社会や教育現場において,人間に優しいロボットの導入の期待が高まっており,高度なコミュニケーション能力を持つロボットの開発が行われつつある.しかしながら,現在のロボットのコミュニケーションの研究の多くは,自然言語認識やジェスチャー分類であるが,人間の身振り手振りには,その人固有のダイナミクスが存在し,コミュニケーションでは,ある特定のジェスチャーを伴う受け答えのパターンが存在し,個人間の行為のダイナミクスやパターンの違いは,識別のための不変項として利用できる.身振り手振りを含む人間の行為には,注意を促す動作や表情を作り出す動作など様々な情報が含まれており,本研究ではこれらの情報を効率よく抽出することを目標とし,高い精度のジェスチャー認識機構を実現するために計算的知能を用いた手法を提案した.まず,進化的ロボットビジョンを用いてカメラ画像から人間を抽出する.次に,人間の顔を中心とした注視領域を決定し,注視領域内で人間の手の位置の時間的変化パターンをスパイキングニューラルネットワークにより抽出する.この抽出されたパターンをジェスチャーとして,自己組織化マップを用いて教師無し分類学習を行う.提案手法により,人間の動きにあわせて,注視領域を自動生成するとともに顔の向きから注視方向を抽出し,ジェスチャー認識を効果的に行えることを示した.また,異なる角度から計測した複数のカメラ画像を用いて,効果的にジェスチャー認識を行えることを示した.さらに,複数カメラ画像間の位置関係を自動的に学習することにより,予測的なジェスチャー認識を行えることを示した.これらの提案手法に基づき,複数の人間のジェスチャーの差異により,個人識別が行えることを示すとともに,ジェスチャー認識や注意の方向抽出を用いることにより,円滑なコミュニケーションが行えることを示した.身振り手振りを含む人間の行為には,注意を促す動作や表情を作り出す動作など様々な情報が含まれており,本研究ではこれらの情報を効率よく抽出することを目標とし,高精度のジェスチャー認識機構を実現するために計算的知能を用いた手法を提案する.さらに抽出した人間の行為のダイナミクスには,その人固有のパターンが存在しうるため,パターンの違いに基づく個人識別の手法を提案する.本年度は,個人の行為のダイナミクスを抽出するために以下の3つの研究を行った.まず,人間の動作を表現する代表点の時系列情報を用いて時空的パターンを学習可能であるファジィスパイキングニューラルネットワーク(以下,FSNN)を用いた手法を開発した.次に,自己組織化マップを用いてFSNNの時系列発火パターンから人間の様々な動作パターンをクラスタリングする手法を提案した.最後に,人間の動作系列から動作パターンを分類する予測に基づく知覚システムを提案した.本提案手法は,パターンの入力層,入力パターンの分類層,次の状態を予測する予測層,予測に基づき知覚モジュールを用意する選択層の4層から構成される.予備実験結果では,人間が,ボールを題材にロボットに英語を話し,ホワイトボードに書き説明するという動作を40分間繰り返した.本実験で用いたロボットの知覚モジュールは,差分抽出,人間検出,物体検出,手の動き認識の4つであり,これらが出力する知覚情報を表現するニューロンの発火パターンの時系列から,人間の行為のパターンの分類を行う.実験結果から人間が物体を持たずに発話などをしている状態,人間が発話しながら,物体を見せる動作,ホワイトボードマーカーで文字を書く動作,文字を消す動作等を分類し,その時間的変化のパターンから個人を特定する情報となりうる動作パターンを抽出した.来年度は,これらの提案手法から個人識別を行う手法を提案する予定である.近年,高齢化社会や教育現場において,人間に優しいロボットの導入の期待が高まっており,高度なコミュニケーション能力を持つロボットの開発が行われつつある.しかしながら,現在のロボットのコミュニケーションの研究の多くは,自然言語認識やジェスチャー分類であるが,人間の身振り手振りには,その人固有のダイナミクスが存在し,コミュニケーションでは,ある特定のジェスチャーを伴う受け答えのパターンが存在し,個人間の行為のダイナミクスやパターンの違いは,識別のための不変項として利用できる.身振り手振りを含む人間の行為には,注意を促す動作や表情を作り出す動作など様々な情報が含まれており,本研究ではこれらの情報を効率よく抽出することを目標とし,高い精度のジェスチャー認識機構を実現するために計算的知能を用いた手法を提案した.まず,進化的ロボットビジョンを用いてカメラ画像から人間を抽出する.次に,人間の顔を中心とした注視領域を決定し,注視領域内で人間の手の位置の時間的変化パターンをスパイキングニューラルネットワークにより抽出する.この抽出されたパターンをジェスチャーとして,自己組織化マップを用いて教師無し分類学習を行う.提案手法により,人間の動きにあわせて,注視領域を自動生成するとともに顔の向きから注視方向を抽出し,ジェスチャー認識を効果的に行えることを示した.また,異なる角度から計測した複数のカメラ画像を用いて,効果的にジェスチャー認識を行えることを示した.さらに,複数カメラ画像間の位置関係を自動的に学習することにより,予測的なジェスチャー認識を行えることを示した.これらの提案手法に基づき,複数の人間のジェスチャーの差異により,個人識別が行えることを示すとともに,ジェスチャー認識や注意の方向抽出を用いることにより,円滑なコミュニケーションが行えることを示した.
口腔癌細胞-間質細胞の相互応答による腫瘍間質誘導の分子機構

口腔癌浸潤にともなう間質誘導の分子機構は未解明であったので、間質の主要構造である細胞外基質(ECM)分子を基軸に実質癌細胞と間質線維芽細胞との間での遺伝子発現から蛋白質生合成までを試験管内および生体組織内で比較検討した。ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞系ZK-1およびヒト間質線維芽細胞OF-1との間接および直性共培養法の条件で、それぞれの細胞のECM分子産生レベルをRT-PCR法および蛍光抗体法により、遺伝子ならびに蛋白質レベルで確認した。直接共培養実験では、マイクロディセクション法により二種の細胞を選択的に分離した。その結果、共培養実験では、1)総体的にECM分子産生量が上昇すること、2)ZK-1細胞はOF-1細胞との共培養によりそのECM産生レベルが低下することがしめされた。したがって、癌浸潤によって誘導される腫瘍性間質は間質在住の線維芽細胞により産生されることが明らかとなった。つぎに、生体内で上皮内癌のように浸潤性を獲得していない段階から浸潤癌に変化する過程で、ECMの産生はどのように変化するのかを病理組織標本上で、パールカンほかのECM分子に対する抗体を用いた酵素抗体法、RNAプローブによるin-situハイブリダイゼーションを実施したところ、ECM分子は浸潤前は上皮層内に、浸潤後は間質空間にそれぞれ局在し、その産生担当細胞も浸潤開始の前後で癌細胞から線維芽細胞へと転換することが判明し、試験管内実験の結果に対応していた。そこで、癌の浸潤とは間質誘導と同意語であるという概念を提唱するとともに、実質細胞から間質細胞に間質誘導の役割が転換する現象を間質誘導のスイッチング現象と名付けた。この概念は今後その詳細な遺伝子発現制御機序を解析する作業の仮説となるとともに、病理組織学的診断においても上皮内癌と浸潤癌の鑑別にもきわめて重要となった。(1)細胞培養系による口腔癌細胞と間質細胞の細胞外基質生合成:ヒト唾液腺腺様嚢胞癌由来細胞ACC2、ACC3細胞、ACC2細胞よりクローン化した高転移能を有するACC-M細胞、舌扁平上皮癌由来細胞MK-1、ZK-1およびZK-2細胞と乳児口腔腫瘍由来線維芽細胞の初代培養細胞、そのほか各種ヒト由来株化線維芽細胞について、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)とファイブロネクチン(FN)の細胞外基質分子およびインテグリン(INT)分子の発現を観察するため、現在までに確立した方法で培養維持した。各癌細胞と線維芽細胞系細胞とを共培養して、上記各分子の発現を検討する実験では、両細胞密度の比率を調整して最適な培養条件を決定した。培養は播種後集密化まで約10日間複数系列で継続し、48時間毎に、固定、蛍光抗体法による蛋白質発現とRNA抽出ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子発現とを検討した。その結果、間質細胞の共存下では細胞外基質分子の発現は癌細胞で有意に低下した。すなわち、生体内では間質細胞の産生する細胞外基質を癌細胞が接着遊走すなわち浸潤に利用している可能性がしめされた。(2)ヒト口腔癌組織における細胞外基質産生の担当細胞の決定:当講座に保管している過去の口腔癌手術症例の組織パラフィンブロックから切片を作製し、免疫組織化学(蛋白質)およびハイブリッド組織化学(mRNA)によって、細胞外基質分子の沈着とその生合成を検討した。その結果、間質細胞にくらべて意外にも腫瘍細胞の細胞外

基質分子遺伝子発現レベルは高く、とくに浸潤先端では亢進していた。したがって、間質細胞の産生する細胞外基質のほかに、実質-間質界面では腫瘍実質細胞はみずから細胞外基を産生して、自身の増殖浸潤にふさわしい環境をつくりだしている可能性があることが秋垢となった。(3)レーザ・キャプチャー法による細胞組織の選択的微小切り出し回収:前項のように準備した組織切片ならびに培養細胞を、レーザ・マイクロディセクション装置によって、実質と間質との界面域を中心に、癌細胞と間質細胞とを分離してそれぞれ回収し、遺伝子を抽出する条件を設定した。あわせて、リアルタイムPCR法によってそれらの発現量の比較定量をおこなう条件設定をおこなった。(1)免疫およびハイブリッド組織細胞化学的実験:前年度で作製した組織切片ならびに経時的に固定された培養細胞系列について、HSPG、ラミニンおよびファイブロネクチンの細胞外基質分子に対する抗体を用いた酵素抗体法あるいは蛍光抗体法によって共焦点レーザ顕微鏡上で細胞内外の三次元的局在様式を観察した。同時に、それぞれのRNAプローブによるin-situハイブリダイゼーションを実施した。(2)実質細胞と間質細胞の共培養実験:ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞系ZK-1およびヒト間質線維芽細胞OF-1との共培養を二種類の方法で確立した。第一はトランスウェルを利用するもので、下段にOF-1を播種し、上段ウェルにZK-1をおいて、それぞれ別個に細胞を回収できた。第二は直接混合培養で、対照には各細胞の単独培養をもちいた。(3)RT-PCR法による細胞外基質分子遺伝子発現解析:第一のトランスウェル共培養より、腫瘍細胞と間質細胞とを個別に回収して抽出されたRNAよりcDNAを調製し、上記(1)項の細胞外基質分子について発現量を検索した。その結果、共培養開始後、腫瘍細胞の細胞外基質分子産生は低下し、間質細胞のそれが強調された。(4)マイクロディセクション法による細胞外基質分子遺伝子発現解析:上記(2)項の直接混合培養では、各細胞外基質分子遺伝子発現は経時的に増強した。そこで、フィルムを貼付したスライドグラス上にガラスリングを接着した培養皿に細胞を播種し、これを経時的に固定し、マイクロディセクション法によって腫瘍細胞胞巣と間質とを区別してレザーキャプチャーで回収した。これから、RNAを抽出してRT-PCRをおこなった。現在データの蓄積中である。以上の現在までの結果により、両種細胞の共存下では、間質細胞の細胞外基質生合成がより強調されることが判明したので、腫瘍間質の形成には上皮性腫瘍細胞と間質細胞が相互に関与しているものの、浸潤段階では間質細胞がより主体的な役割を果たすことが示唆された。(1)免疫およびハイブリッド組織細胞化学的実験:癌浸潤にともなう間質誘導が病理組織学的に上皮内癌と浸潤癌の鑑別に利用できるかどうかを目的に、HSPG、テネイシンおよびファイブロネクチンの細胞外基質(ECM)分子に対する抗体を用いた酵素抗体法、それぞれのRNAプローブによるin-situハイブリダイゼーションを実施し、これらのECM分子の局在によって浸潤癌を確定できる可能性をしめすことができた。これらの腫瘍性間質の産生担当は誘導間質線維芽細胞であることを確認した。したがって、癌の浸潤とは間質誘導と同意語であるという概念を提唱した。(2)実質細胞と間質細胞の共培養実験:前年度までに確立したヒト口腔扁平上皮癌
表皮角化細胞の獲得免疫前抗原応答

接触皮膚炎では獲得免疫応答が働いており、表皮角化細胞も役割を果たしていることが分かっているが、免疫反応がどのように始まるのかは明らかでなかった。本研究では、表皮角化細胞が他の細胞の影響なしに、物理的刺激だけで炎症を引き起こしうることを、ナノマテリアルである二酸化チタンの結晶を利用して示した。チクチクしたものが触れた後に痒く赤くなることがあるが、これは皮膚の細胞1つ1つでも起こっている反応である。接触皮膚炎における皮膚での最初の反応を考えるため、表皮角化細胞に対する抗原と細胞障害性物質の影響を比較する。まず化学的に安定しているが、細胞障害性がある物質について調べた。二酸化チタンは、その形状により、細胞への影響の大小があることが知られており、主に気道構成細胞への障害性について検討されている。その中で、化粧品や顔料に含まれている球状のチタンは細胞障害性が少ないが、針状のチタンには毒性があることが分かっている。そこで、今回われわれは、表皮角化細胞に対するチタンの影響を、針状と球状の2種類で比較検討することとした。培養表皮角化細胞に抗原物質を添加培養し、1.表皮角化細胞のinflmmasome関連遺伝子の発現量変化、2.培養上清中に産生された炎症性サイトカイン/ケモカインの産生量変化、3.表皮角化細胞の細胞内カルシウム濃度の変化、を検討した。結果、針状二酸化チタンは、1.Caspase 1のmRNA発現が亢進しており、2.IL-6,IL-8,の産生を亢進させた。つまり、針状二酸化チタンは表皮角化細胞に対して障害性をもち、皮膚においては炎症を惹起する可能性があることが示唆された。これらの分子は、細胞障害性物質に対する自然免疫反応に関連するものであり、二酸化チタンに対する表皮角化細胞の反応には、自然免疫系が発動している可能性がある。なお、3.の細胞内カルシウム濃度の変化は、共焦点レーザー顕微鏡で観察したが、二酸化チタン添加30分後までの観察では、濃度変化が検出されなかった。一方、球状二酸化チタンを添加培養しても、表皮角化細胞にはこれらの変化は見られず、安全性が確認された。接触皮膚炎における皮膚での最初の反応を考えるため、表皮角化細胞に対する抗原と細胞障害性物質の影響を比較することを目的とした。まず、刺激性接触皮膚炎のモデルとして、化学的に安定しているが、細胞障害性がある物質について調べた。平成22年度の研究にて、培養表皮角化細胞に抗原物質を添加培養し、表皮角化細胞のCaspase 1のmRNA発現亢進、IL6,IL8,の産生亢進を見いだした。本年度の研究では、IL-8産生量の変化を指標にして研究を進めた。その結果、1針状結晶の二酸化チタンではIL-8産生亢進が著明であること2球状結晶の二酸化チタンでも、IL-8産生亢進の傾向があること3浮遊細胞と比較し、接着した表皮角化細胞ではIL-8産生量が多い傾向があることが分かった。これらのことから、表皮角化細胞のIL-8産生は恒常的に行われている可能性があること、細胞に対する刺激はチタンそのものの化学的性質より形状が関連している可能性があることを考えた。形状による刺激は、圧力による刺激とも言い換えることができるため、より原始的な刺激が細胞に与える影響を示唆する結果といえる。同時に、培養細胞の炎症モデル作成にあたり、化学物質ではなく物理的刺激で起炎する方法も考えられる。
着衣における水分の移動と蓄積を考慮した人体の熱環境に対する非定常応答

衣服を身につけた人体の熱環境に対する非定常応答を、発汗がある場合にも予測できるモデルの作成を目的として、以下の検討を行った。1.汗をかいた状態の被験者を冷房された環境に一定時間滞在させるという実験を行い、深部温、皮膚温、着衣温の変化性状を計測する。2.皮膚および着衣表面温度分布の経時変化から、皮膚と着衣の接触状況の特性を把握する。3.連続蒸散・発汗測定装置を活用して、発汗過程における発汗量の変動を計測する。4.深部温に相当するものとして測定されている腋下温、鼓膜温、直腸温の特性を把握する。5.汗が蒸発する過程における着衣温変動を十分に再現できるモデルを作成する。上記の各項目に対応する結論は、それぞれ以下の通りである。1.部位により、皮膚温に最大で約4°Cの差が見られ、汗の蒸発過程における変動パターンも異なる。汗の蓄積量が多い部位ほどが、蒸発による温度低下が長く続く。発汗過程の着衣温に関して、水分の吸着による急激な温度の上昇が見られた。本実験の場合、着衣温の最高値は気温より約2°C高い。2.赤外線画像より、着衣含水率が比較的高いと思われる部位において、着衣からの熱損失が比較的長時間続く傾向が確認された。また体表面の凹凸により、胸中央などで皮膚と着衣が離れている、逆に腹部で接触しているなどの傾向が示された。3.発汗過程において皮膚温、深部温、発汗量が単調増加する。4.高温環境から低温環境へ移動する際の温度変化性状は、腋下、鼓膜、直腸それぞれで異なっていた。5.着衣の平衡含水率を測定した。また、湿度が階段状に変化する場合の着衣の温度変化を計測した。着衣の温度変化過程について、熱水分同時移動モデルに基づく数値解析を行ったところ、適切な平衡含水率曲線、湿度伝達率を用いれば、実験値を再現できることが確認された。衣服を身につけた人体の熱環境に対する温熱反応の時間変化を、発汗がある場合にも十分に予測できるモデルを作成することを目的として、以下の検討を行った。1.被験者実験を行った。汗をかくような高温高湿度環境に一定時間被験者を滞在させ、その後、汗が着衣および皮膚面に蓄積した状態で、冷房を想定した低温低湿度環境へと移動させ、その過程での皮膚温、深部温、体重の時間的変動を計測した。2.着衣における熱・水分移動に関する物理モデルと、人体の温熱反応に関する生理モデルであるTwo-nodemodelを組み合わせて、「非定常着衣-人体熱水分収支モデル」を構成した。3.提案したモデルによる数値計算結果と実験結果を比較することにより、モデルの妥当性を検討した。上記の検討により、以下の結果が得られた。1.高温高湿度環境において、周辺空気および皮膚表面からの水分吸着により、着衣は急激な温度上昇を示す。また、実験で得られた値を、解析で大略再現することができた。2.高温高湿度環境における着衣温の上昇が下降に転ずるのは、皮膚の相対湿度が100%に達した時点である。3.発汗の後、低温低湿度環境に移動すると、着衣温、皮膚温ともに急激な温度変化を示す。これを解析モデルで表現するには、皮膚と着衣の間の熱・湿気伝達率を変化させるだけでは不十分であり、着衣における水分移動、蓄積についてさらに詳細な検討を行う必要がある。4.Two-node modelでの皮膚温の計算値は、蓄積された汗が蒸発する過程で、いったん下降した後、再び上昇し、さらにその後下降に転ずるという傾向を生じさせる場合がある。これは、血流調節のモデルと関係していると考えられる。5.皮膚温、着衣温の予測には、発汗量の正確な予測が不可欠である。Two-node modelにおいては、発汗量が皮膚温および深部温の関数で表現されているため、とりわけ深部温が適切に計算されることが重要である。本年度の実験で得られた鼓膜温および腋下温は、深部温の計算値と必ずしもよく一致していないことから、モデルの検討に加え、深部温の計測についてもさらに検討が必要である。

2.赤外線画像より、着衣含水率が比較的高いと思われる部位において、着衣からの熱損失が比較的長時間続く傾向が確認された。また体表面の凹凸により、胸中央などで皮膚と着衣が離れている、逆に腹部で接触しているなどの傾向が示された。3.発汗過程において皮膚温、深部温、発汗量が単調増加する。4.高温環境から低温環境へ移動する際の温度変化性状は、腋下、鼓膜、直腸それぞれで異なっていた。5.着衣の平衡含水率を測定した。また、湿度が階段状に変化する場合の着衣の温度変化を計測した。着衣の温度変化過程について、熱水分同時移動モデルに基づく数値解析を行ったところ、適切な平衡含水率曲線、湿度伝達率を用いれば、実験値を再現できることが確認された。
DNAマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析による新しい口腔癌の診断法の開発

口腔扁平上皮癌(OSCC)の分子診断技術の閉発を目的に、約500種の癌関連遺伝子を載せたマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。癌組織間あるいは計測間の偏りを排除するために、分析した全15腫瘍において正常粘膜に対する発現量比が減少または増加した遺伝子を選定した。遺伝子発現の一様な減少はRetinoic acid receptor gamma、ケラチンfamily分子とdesmosome構成分子群などにみられた。一方で増加はMMPs, uPAなど細胞外基質分解酵素系とTenascin C, Fibronectin1などの細胞外基質(ECM)、MIG、IP-10、STAT1、BIGH3など増殖因子の刺激伝達に関係する遺伝子に見出された。クラスター解析の結果でもこれらの遺伝子産物には発現様式の類似性が見出された。概して、OSCCは上皮構造の喪失、盛んな組織破壊と癌間質形成、細胞刺激伝達系の乱れを示していた。リンパ節転移の有無による群間比較では、転移を有する腫瘍でMMPs、uPA、CD44、Integrin a3、Paxillinの発現増加とCD9、IGFBP2の発現減少がみいだされ、リンパ節転移形成にECM分解酵素群とともに細胞-ECM接着を介した刺激伝達の関与が示唆された。免疫組織学的染色においてMMP1、MMP3、uPAは腫瘍間質内の炎症性細胞、脈管内皮細胞、ECMに局在した。特に炎症性細胞浸潤内のエオジン好性単核紬胞にそれらの強い陽性所見がみられ、その周囲でコラーゲン繊維の破壊像と脈管の新生像が確認された。この組織学的所見は遺伝子発現解析で予想された分子間の共調的発現と機能的共役性を裏付けている。特にMMP1はリンパ節転移形成と強い相関(U=0、p=0.001)を示し、単独でリンパ節転移の鋭敏なマーカーになり得ることが示唆された。今回の雑多な細胞成分からなる、OSCC全組織の遺伝子発現様相を対象にしたが、共通の発現傾向の抽出、クラスター解析、臨床所見と関連性および分子の組織内局在の検討によって、診断学的に有用な遺伝子発現の変化を同定できた。1.研究機関内での腫瘍検体の収集のための組織構築:手術室等での腫瘍組織の切除、組織の切り出し、固定操作、RNA抽出と精製、保存とデータファイルの作成といった一連の作業、計画の組織的実施のための打ち合わせを行い、期間内に新潟大学歯学部附属病院において行われた口腔腫瘍の生検と手術のほとんどに対し計画を実行した。現在は日々腫瘍検体が集まってきている。平成12年度の期間で約40症例の検体を収集した。2.実験操作及び条件の最適化:腫瘍組織からのRNA抽出操作を行った。当初OD260/280値、RNA変性ゲルでの品質検定を行いtotal RNAの抽出条件を検討した。mRNAはoligo dTビーズを用いて精製した。これらの結果を総合してRNA増幅操作なしで行うマイクロアレイ解析に必要な最低組織量とRNA精製法について一定のレジメンを作成した。3.分析委託:12検体の委託分析を実施した。分析は宝酒造株式会社DNA機能解析センターに腫瘍組織mRNAを送付し、同社のHuman Cancer Chip v2.1を使用した。これによって得られた画像データはバックグラウンドのレベルも低く、シグナル強度も十分解析が可能な質であった。

4.データ解析(進行中):コンピュータでの画像データの定量を行い、今のところ一定の所見をまとめるに至っていない。正常粘膜に対する発現比を3倍以上と1/3以下で選定すると1分析あたり十数個の遺伝子が見出されている。今後はその中から共通性のあるもの、あるいは転移などの臨床所見、浸潤様式などの組織型と関連が見出されるものについて検討を進める予定である。5.RNA増幅法の試行:特に生検試料など組織量が少なく増幅なしではマイクロアレイ解析ができなかったものについてRNA増幅法の試行を準備している。口腔扁平上皮癌(OSCC)の分子診断技術の開発を目的に、約500種の癌関連遺伝子を載せたマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。そこでえられた結果から、リンパ節転移に影響を与えることが示唆された遺伝子産物にっいて免疫組織学的染色を行った。MMP1、MMP3、uPA、uPARは腫瘍間質内の炎症性細胞、脈管内皮細胞、ECMに局在した。特に炎症性細胞浸潤内のエオジン好性単核細胞にそれらの強い陽性所見がみられ、その周囲でコラーゲン繊維の破壊像と脈管の新生像が確認された。TenascinCは腫瘍細胞巣の辺縁の基底細胞集団に発現が見られ、腫瘍細胞胞巣周辺の間質内に沈着が確認された。その他のECM分解酵素との分布の一致は厳密には見られなかったことから、腫瘍転移の機序において、両者がことなる機序に関与していることが示唆される。概してこれらの組織学的所見は遺伝子発現解析で予想された分子間の共調的発現と機能的共役性を裏付けている。今回の雑多な細胞成分からなるOSCC全組織の遺伝子発現様相を対象にしたが、従来癌の転移形成において重要だとされてきた多くの遺伝子種の変化が検出されなかったことや、予想とは逆の発現様式を示したことは、腫瘍の組織構成の違いによる影響の結果であるかもしれない。共通の発現傾向の抽出・クラスター解析、臨床所見との関連性および分子の組織内局在の検討によって、このような臨床検体の結果から診断学的に有用な遺伝子発現の変化を同定できた。