hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮細胞の糖蛋白質の局在化機構に関する糖鎖の役割

細胞の極性化は細胞の組織構築及び機能発現に重要な特性である。この極性化における糖蛋白質N-結合糖鎖の役割を明らかにするため、膜上で極性化させたイヌ腎上皮由来のMDCK細胞の糖蛋白質を解析した。まず^<35>S-Met標識した細胞から頂端側及び側底面側へ分泌される蛋白質のレクチン親和性を調べた結果、Con AとAAL結合性に大きな差が認められ両者の糖蛋白質糖鎖に構造上の違いがあることが示された。次に両膜面の糖蛋白質糖鎖を解析するため、膜上で極性化させたMDCK細胞を^3H-マンノース標識し、各膜面をビオチン化してTriton X-100で可溶化した後、アビジンゲルカラムで精製した。これらをヒドラジン分解、N-アセチル化後、高圧ろ紙電気泳動、及びシアリダーゼ消化、メタノリシスで分析した結果、両者の糖鎖とも中性糖鎖:シアル酸結合糖鎖:硫酸化糖鎖の割合が約20:3:1であった。これらをBio-Gel P-4クロマトグラフィーで分析したところ、中性糖鎖は主に高マンノース型糖鎖、酸性糖鎖は繰り返し構造を含む複合型糖鎖であった。また頂端側糖蛋白質糖鎖は側底面側に比べて、高いフコシル化が認められた。一方、マメ科レクチンと高い相同性を持ち、頂端側輸送に関与していると考えられている蛋白質VIP36の機能を解析した。VIP36の細胞外ドメイン("Vip36"とする)をコードするcDNAをMDCK細胞の総RNAよりRT-PCR法で得た。このcDNAをpGEXベクター内のグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子の下流につなげ、E.coliに導入し、発現させた融合蛋白質GST/Vip36をグルタチオン-セファロースで精製した。これをゲルに固定化したカラムに詰め、S-Met標識した頂端側分泌蛋白質を通したところ、pH5.5で結合しpH7.4で溶出された。現在、Vip36と頂端側フコシル化糖鎖との関連を検討中である。ヒトやラット、マウスなどの腎臓糖蛋白質N-結合型糖鎖の構造はγ-GTPややジペプチジルペプチダーゼ-IVなどを用いて、申請者らのグループが既に明らかにしているが、イヌ腎臓由来のMDCK細胞の糖鎖の研究はほとんど行われていない。そこでどの様な糖鎖の特徴があるか、[^3H]-グルコサミンでメタボリックラベルし、それから可溶化した糖蛋白質をヒドラジン分解・N-アセチル化の後、高圧ろ紙電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー、各種レクチンクロマトグラフィー、グリコシダーゼ消化などの方法により分析した。その結果、約1/4が高マンノース型糖鎖、残りが24本鎖複合型糖鎖でアセチルラクトサミン繰り返し構造にフコースや2→6結合したシアル酸の結合した構造であることが明らかになった。現在さらにこれらの糖鎖の局在性について検討中である。一方VIP36のうち、レクチン様活性が存在すると思われる疎水性部分約800個のアミノ酸に対するcDNAをMDCK細胞よりRT-PCR法でクローニングした(Vip800)。

Vip800のcDNAをpQE-9の発現ベクターに導入し、大腸菌で大量発現を試みたが発現量が低く、Vip800を充分量精製することができなかった。そこでpGEX-2TKベクターにおいてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)のcDNA下流につなげ、GSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現したところVip800の大量発現に成功した。GSTは抗原として働かないことが明らかにされているため、現在グルタチオンセファロースカラムを用いて精製した融合タンパク質をVip800の抗原としてVip800に対するポリクローナル抗体を作製中である。細胞の極性化は細胞の組織構築及び機能発現に重要な特性である。この極性化における糖蛋白質N-結合糖鎖の役割を明らかにするため、膜上で極性化させたイヌ腎上皮由来のMDCK細胞の糖蛋白質を解析した。まず^<35>S-Met標識した細胞から頂端側及び側底面側へ分泌される蛋白質のレクチン親和性を調べた結果、Con AとAAL結合性に大きな差が認められ両者の糖蛋白質糖鎖に構造上の違いがあることが示された。次に両膜面の糖蛋白質糖鎖を解析するため、膜上で極性化させたMDCK細胞を^3H-マンノース標識し、各膜面をビオチン化してTritonX-100で可溶化した後、アビジンゲルカラムで精製した。これらをヒドラジン分解、N-アセチル化後、高圧ろ紙電気泳動、及びシアリダーゼ消化、メタノリシスで分析した結果、両者の糖鎖とも中性糖鎖:シアル酸結合糖鎖:硫酸化糖鎖の割合が約20:3:1であった。これらをBio-GelP-4クロマトグラフィーで分析したところ、中性糖鎖は主に高マンノース型糖鎖、酸性糖鎖は繰り返し構造を含む複合型糖鎖であった。また頂端側糖蛋白質糖鎖は側底面側に比べて、高いフコシル化が認められた。一方、マメ科レクチンと高い相同性を持ち、頂端側輸送に関与していると考えられている蛋白質VIP36の機能を解析した。VIP36の細胞外ドメイン(′′Vip36′′とする)をコードするcDNAをMDCK細胞の総RNAよりRT-PCR法で得た。このcDNAをpGEXベクター内のグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子の下流につなげ、E.coliに導入し、発現させた融合蛋白質GST/Vip36をグルタチオン-セファロースで精製した。これをゲルに固定化してカラムに詰め、^<35>S-Met標識した頂端側分泌蛋白質を通したところ、pH5.5で結合しpH7.4で溶出された。現在、Vip36と頂端側フコシル化糖鎖との関連を検討中である。
酸化物ナノアイランドを用いた新規光電変換素子の研究

●研究の目的●〈交付申請書に記載した内容〉・測定系の確立:イオンビームスパッタ装置を修理して再稼働させる。1光触媒の材料であるアモルファス酸化ニオブについて,短期周期構造を解明する等の研究を続ける.3パーティクル状の市販粉末を導電性樹脂と組み合わせて幅広い素子構造を試作する.〈本年度に行った研究の成果〉・イオンビームスパッタの修理費用が50万を超えたため,修理を断念して外部機関に製膜してもらった。1外部機関を利用してUPS測定を行い,このUPS価電子帯バンドに相当するクラスターモデルを求めることに成功した. (この発表は第74回応用物理学会秋季学術講演会プログラム編集委員の推薦によりPosterAwardの「ノミネート候補」になりました.)今後,このクラスターモデルを用いて下地金属とのフロンティア軌道を求めることによって最適な金属を導きだすことができる.2新たな酸化物を蒸着しても発電アップとはならなかった。しかしながら, ZnO/Al/glassを蒸着させた場合,電気化学的特性に非常に興味ある考察が行えた.NbOx/Al/glass|KNO_3. aq|Alの場合は何も溶出が無いのに対して, ZnO/Al/glass|KNO_3. aq|AlではAlやZnの溶出があることは前回にも報告している.この現象が電位-pH図を用いて説明することができた. (第61回応用物理学会春季学術講演会)3バインダー・トルエン・光触媒・黒鉛粉末を混入することで新たな光電変換基板を作製することに成功した.まだ,試作数が少ないため,来年度の奨励研究として申請している.●研究実施計画●〈交付申請書に記載した内容と,本年度に行った研究の成果〉1測定系の確立→上記より不可能.2光触媒の評価→上記3種類を試したが,有益な成果は得られなかったが, ZnOの場合に興味ある電気化学的特性の考察が行えた.3新構造の評価→評価までにはいたっていないが,新構造を考案することができた.1秋季2春季応用物理学会発表→上述の通り2件発表した.●研究の目的●〈交付申請書に記載した内容〉・測定系の確立:イオンビームスパッタ装置を修理して再稼働させる。しかしながら, ZnO/Al/glassを蒸着させた場合,電気化学的特性に非常に興味ある考察が行えた.NbOx/Al/glass|KNO_3. aq|Alの場合は何も溶出が無いのに対して, ZnO/Al/glass|KNO_3. aq|AlではAlやZnの溶出があることは前回にも報告している.この現象が電位-pH図を用いて説明することができた. (第61回応用物理学会春季学術講演会)3バインダー・トルエン・光触媒・黒鉛粉末を混入することで新たな光電変換基板を作製することに成功した.まだ,試作数が少ないため,来年度の奨励研究として申請している.●研究実施計画●〈交付申請書に記載した内容と,本年度に行った研究の成果〉1測定系の確立→上記より不可能.2光触媒の評価→上記3種類を試したが,有益な成果は得られなかったが, ZnOの場合に興味ある電気化学的特性の考察が行えた.3新構造の評価→評価までにはいたっていないが,新構造を考案することができた.1秋季2春季応用物理学会発表→上述の通り2件発表した.
動脈管の収縮特性に関する研究

平均体重50gの胎生28日のウサギ(満期30日)の動脈管(外径1.2mm、長さ1.2mm)を摘出して、98%酸素で平衡化した溶液または低酸素高カリウム溶液(K=65mEq)にて収縮状態を作成し、ウサギ胎児動脈管を動脈管の収縮モデルとして使用することに成功した。高カリウム溶液による収縮動脈管に対し、ステップ状長さ変化を与えて張力過度応答を見るステップ応答法と、サイン状の長さ変化(0.005-20Hz)を与えて張力応答を測定しスティッフネスと位相差を計測する周波数応答法による結果を得た。その結果は、我々が以前報告した心筋の硬直筋(rigor)の所見と同様に、クロスブリッジの動きのない収縮をしていることが推測された。98%酸素による収縮は高K収縮とは異なり、1540分周期を中心とした不規則な収縮弛緩を繰り返す。酸素による収縮下では20μのステップ状長さ変化によりサイン状の張力振動が誘発された。この張力振動を1分毎に512時間経時的に計測して最大エントロピー法によるスペクトル解析をおこなった。最大パワーを呈する周波数は8.78×10^<-4>±1.55×10^<-4>Hz(n=6)であり、この逆数の周期は19.7±4.2分であった。灌流液の温度を35度から27度に低下させて温度依存性を検討したが、主周期は温度低下とともに減少し、Q10値は約3で、この振動がエネルギーの関与した減少であることが示唆された。血管内皮を破壊しても、NO合成酵素阻害薬(NMMA)存在下でも張力振動は存在し、血管内皮分泌のNOの関与は否定された。平滑筋細胞内のカルシウムの増減によるゆらぎの可能性は否定されてないが、アクチンとミオシンという収縮系のみの反応による収縮振動の可能性が高い。血管平滑筋の収縮は、クロスブリッジが動かないlatched state(Murphyら)ではなく、緩やかな収縮弛緩を繰り返す収縮と思われる。また、高K溶液では張力振動が存在しないことより、高酸素による収縮とは異なる収縮状態であることが推測された。平成5年度のまとめ出生後、正常児においては動脈管が収縮・閉鎖して胎盤循環から肺循環への劇的な血行動態の変化が起こる。未熟児動脈管の薬物による閉鎖やチヤノーゼ性先天性心疾患の動脈管の薬物による開存は、収縮・開存の反応性が一律ではない。生理的または病的条件下で、動脈管の収縮状態の差を収縮特性解明の点より研究することを本研究の目的とした。本年度の成果としては、まず、1)平均体重50gの胎生28日のウサギの動脈管(外径1.2mm、長さ1.2mm)を摘出して98%酸素または低酸素高カリウム溶液(K=65mEq)にて収縮状態を作成することに成功した。2)収縮状態の動脈管に対してステップ状の長さ変化(3040mu)を与えて張力過渡応答を見るステップ応答法により張力過渡応答を記録した。3)サイン状の長さ変化を与えて張力応答を測定しスティッフネス・スペクトラムと位相差を計測した(周波数応答法)。

ステップ応答法、周波数応答法の実験では、我々が以前、ウサギ心室乳頭筋を用いて行った実験で観察された硬直筋(rigor)における所見と同様の結果が得られた。このことは、収縮中の動脈管平滑筋内部ではクロスブリッジが結合・離解の周期的動きを示さず、長い間結合したままの収縮をしていることが推測された。血管平滑筋における他の実験方法による報告でも、クロスブリッジが長い間結合したままの収縮をしていることが示唆されている。動脈管におけるこのような収縮状態に関する知見は今までに報告がない。
閉鎖・開放浸透と水稲生育および窒素の動態に関する研究

研究は、現実の水田の閉鎖・開放浸透という土層環境の違いが土層内の科学的成分および水稲生育に及ぼす影響について解明することを目的とした。実験は、実際の水田の酸化還元環境を大型円筒(径30cm、高さ75cm)を用いて再現し、円筒内に稲を栽培し行った。円筒内の土層は3層構成(作土:12.5cm、スキ床:10cm、心土:35cm)とし、心土層の浸透形態を開放と閉鎖に切り替え模型を作製した。供試模型は作土およびスキ床に黒ボク土、心土を礫としたものと黒ボク土としたものの2種類とした。土層は、作土、スキ床層は閉鎖浸透で還元層となった。心土層は、黒ボク土を用いた場合も礫を用いた場合も閉鎖浸透条件では還元層、開放浸透は酸化層となった。降下浸透水の硝酸態窒素は、還元層では低濃度であったが、酸化層には著しく上昇した。同じようにな濃度増加は亜硝酸態窒素でも認められた。このような濃度の高まりは、実験開始し約60日目まで認められた。肥料として施したカリは、作土層で約50日間スキ床層、心土層の濃度に比べ高まる傾向が確認された。降下浸透水中の鉄およびマンガン濃度は、作士スキ床層で検出されたが、下層が開放浸透で酸化層である場合には検出濃度が著しく低下した。水の生育収量への影響は、全層黒ボク土水田の心土層の根活性が閉鎖浸透層に比べ開放浸透層で高い傾向が確認された。また、黒ボク土水田では心土層が開放浸透層の水田の草丈が高くなる傾向が認められた。礫水田では草丈に差は認められなかった。この結果より、浸透型の違いは水稲根圏環境を変え、生育収量およびその養分環境に大きな影響をもたらしていると判断された。砂礫水田のモデル土柱を作製し、心土層の浸透形態(閉鎖浸透と解放浸透の両者を指す)の相違が層内の化学的成分動態及び作物の生育収量へ及ぼす影響を調査した。モデルは作土(12.5cm)、スキ床(10cm)、心土(35cm)の3層構成とした。浸透形態の制御は、心土層を対象とし、排水位の高低でその制御を行った。このような環境下で水稲(つがるおとめ)を栽培し浸透形態との対応関係を検討した。調査は、降下浸透水の深度別水質の変動(鉄、マンガン、カリ、窒素、燐等)、稲の生育収量調査(草丈、葉齢、茎数、穂数、穂長、籾数、玄米千粒重)、根の活性及び根量である。これらの調査は、毎週1回の目安で実施した。ただし、根の調査は稲刈り後の1回のみとした。その結果、心土層が開放浸透時には層内は酸化状態を、閉鎖浸透時には還元状態を示した。降下浸透水の鉄、マンガンイオン濃度は、作土スキ床層の還元層で高く、心土層が酸化層の場合には著しくその濃度を低下させる傾向となった。しかし、両イオン濃度は心土層が還元層の場合には開放浸透に比べ高い濃度ではあるが、検出される濃度は下方に行くにしたがい低下する傾向となった。窒素濃度は、心土層が酸化層の場合には観測初期に硝酸態の窒素濃度が還元層の値に比べ高まる傾向(40日目頃まで)であったが、時間の経過と共にその増加傾向は認められなくなった。燐及びカリイオン濃度では、浸透形態の相違による差異は明瞭とは判断し難かった。生育収量調査の結果、統計的に有意差のはっきりした調査項目はなかった。しかし根の活性は、酸化層の根が還元層のそれに比べ2倍以上の値となった。さらに、根量も開放浸透層が閉鎖浸透層より多くなった。このことより、根の環境としては酸化層(=開放浸透層)が好ましい条件であると判断された。また根の色は、還元層では赤く、酸化層では白くなる特性が認められた。

水の生育収量への影響は、全層黒ボク土水田の心土層の根活性が閉鎖浸透層に比べ開放浸透層で高い傾向が確認された。また、黒ボク土水田では心土層が開放浸透層の水田の草丈が高くなる傾向が認められた。礫水田では草丈に差は認められなかった。この結果より、浸透型の違いは水稲根圏環境を変え、生育収量およびその養分環境に大きな影響をもたらしていると判断された。
分裂酵母のDNA二重鎖切断修復機構を形成する遺伝子ネットワークの解析

本研究は,分裂酵母におけるDNAの二重鎖切断修復にかかわる遺伝子を総括的に同定し,二重鎖切断修復システムの全体像を解明することを目的としている.今年度は以下の研究実績をあげた.Rhp51依存的且つRhp57非依存的な新規組換え修復経路を解析した.この経路で機能する新規遺伝子sw5とsfr1を同定し,解析した.その結果,Sfr1タンパク質は,Rhp51タンパク質及びSwi5複合体を形成すること明らかにした.一方,接合型変換においては,Swi5-Swi2-Rhp51複合体が形成されることを示した.また,Swi2とSwi6が物理的相互作用をすることを示した,Sfr1とSwi2は,共通の保存領域を有し,この保存領域を介して,Swi5とRhp51と物理的相互作用をすることを明らかにした。Swi5-GFPタンパク質は,核内に局在し,一部の分子は,ヘテロクロマチン領域に濃縮されていることを明らかにした.核の存在は,Sfr1に依存して,ヘテロクロマチンに局在するのは,Swi2に依存していることを明らかにした.本研究は,分裂酵母におけるDNAの二重鎖切断修復にかかわる遺伝子を総括的に同定し,二重鎖切断修復システムの全体像を解明することを目的としている.今年度は以下の研究実績をあげた.Rhp51依存的且つRhp57非依存的な新規組換え修復経路を解析した.この経路で機能する新規遺伝子sw5とsfr1を同定し,解析した.その結果,Sfr1タンパク質は,Rhp51タンパク質及びSwi5複合体を形成すること明らかにした.一方,接合型変換においては,Swi5-Swi2-Rhp51複合体が形成されることを示した.また,Swi2とSwi6が物理的相互作用をすることを示した,Sfr1とSwi2は,共通の保存領域を有し,この保存領域を介して,Swi5とRhp51と物理的相互作用をすることを明らかにした。Swi5-GFPタンパク質は,核内に局在し,一部の分子は,ヘテロクロマチン領域に濃縮されていることを明らかにした.核の存在は,Sfr1に依存して,ヘテロクロマチンに局在するのは,Swi2に依存していることを明らかにした.
マルチ量子ビーム照射によるディウェッティング現象その場観察とその機構解明

本研究では、北海道大学の複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡を利用し量子ビーム照射誘起Dewetting現象についてその場観察し画像解析からその機構を解明することを目的とし、100keVのArイオンと波長532nmの短パルスレーザーの複合照射下及びそれぞれ単独での照射下におけるDewetting現象のその場観察を行った。その結果、貴金属が矩形から球形へ変化するレイリー不安定時の挙動を直接観察することに成功すると共に、貴金属薄膜厚が薄いほどDewetting後のナノ粒子の平均粒径は小さくなり、可視光の吸収波長も短波長側へブルーシフトする量子効果が発現することを確認した。最近、局在型表面プラズモンを利用した環境中の微量有害物質や生体内の微量代謝物質を捉えるバイオセンサーの研究・開発が進められている。従来、誘電体基板表面に有機物を利用して貴金属ナノ粒子を担持するため結合強度やそれらが光学特性に影響を与えるなど課題があったが、これまでの研究でイオンやレーザー等の量子ビーム照射により基板表面にナノ粒子を1層だけ分散させる表面改質法を見出した。しかしながら、量子ビーム照射により誘起される基板表面の貴金属薄膜のDewetting現象の詳細は未解明で特に貴金属が矩形から球形へ変化するレイリー不安定時の挙動が不明である。そこで、本研究では、北海道大学が有するマルチビーム超高圧電子顕微鏡を利用し量子ビーム照射誘起Dewetting現象のその場観察を行いその機構解明を目的とした。平成26年度は、金薄膜を蒸着したSiO2ガラス基板に複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡を用いてナノ秒パルスレーザー照射下のDewetting現象のその場観察を行った。得られた成果の概略は以下の通りである。1.精密イオンシニング装置を(PIPS)を用いて金薄膜を真空蒸着したSiO2ガラス基板の背面からのみArイオンを照射するバックシニング法により、複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡によるその場観察実験に最適なTEM薄膜試料を作製できる条件を見出した。2.532nmのナノ秒パルスレーザーを照射すると、照射前は明瞭だった金薄膜の回折コントラストが不明瞭になり、ベンドコンターのような不定形な濃淡を呈した後、金薄膜の粒界と思われる領域が裂けて下地のSiO2基板が露出し、ホールが形成する様子を初めて捉えることに成功した。その後、ホールは成長し、ホール間の金薄膜が裂断し、網の目状の組織を経て粒子状になる一連のDewetting現象の過程を始めてその場観察することに成功した。誘電体基板上に貴金属ナノ粒子を分散し、表面プラズモン共鳴を応用した光学デバイス等の開発が進められている。これまでの研究で、イオンやレーザーなどの量子ビーム照射により誘電体基板表面にナノ粒子を1層だけ分散させて形成することに成功しており、本研究では超高圧電子顕微鏡を利用したその場観察からその機構を解明し任意に分散状態を制御して量子ドットの製作を目指している。平成27年度は、平成26年度に得られた知見を基に誘電体基板の結晶性や表面の極性など材料科学的な要素がディウエッティングに及ぼす効果について検討することとし、先ずβ-SiC多結晶基板を用いて実験を行った。その結果、非晶質のSiO2ガラス基板で行った実験の時と同様に、ナノ秒パルスレーザーをβ-SiC多結晶基板表面に真空蒸着した金薄膜に照射すると、結晶粒界の三重点や膜厚の薄い領域ホールが形成した後、ホールが大きく成長して基板の露出面積が増加すると共に金薄膜が細い線状のネットワーク組織を形成する様子がその場観察できた。その後、パルス数が増加すると共に金の細線が一様ではなくなり不安定な様子を示し、基板が露出したホール間の金薄膜が細くなったところから千切れて粒子化する様子をその場観察することができた。これまでの実験条件の範囲では、基板の結晶性の有無については明確な違いが観察できず、基板とのエピタキシャルな関係もはっきりしていなかったことから引き続き平成28年度も実験を進める予定である。また、金薄膜の厚さやナノ秒パルスレーザーの強度等をパラメーターとして実験を行い、引き続きデータの解析を平成28年度も行う予定である。更に、非晶質のSiN基板や、半導体プロセスを応用して作製したTEM用の均一な誘電体薄膜を利用して、基板表面のナノ秒パルスレーザーの波長以下の凹凸がナノ粒子形成に及ぼす効果などを引き続き検討する予定である。科研費によらない研究環境整備として、平成24年の概算要求で整備された複合量子ビーム照射装置が順調に稼動しており、従来のデジタルビデオから、CCDカメラから直接ビデオレートを設定してハードディスクに記録できることになったことから、その場観察ビデオのDA-AD変換による画質の劣化等はなくなり、より高精度の画像解析が行える環境が整備されている。そのため、科研費でその場観察画像記録系の改良や更新等を検討しなくて良くなったことから、当初計画していた物品購入を取りやめて、学術研究員の雇用費とすることにした。これは、以下の理由からである。今年度は、一昨年に生じた当初予期していなかったマルチビーム超高圧電位顕微鏡の高圧タンクの故障による実験の遅れを取り戻す必要が生じために、本年度限りで学術研究員を雇用して当初の計画していた実験+遅れていた実験を遂行することを計画した。その結果、その場観察実験では、予想していなかった現象も観察され追実験等を行う必要も生じたが、量子ドット形成の実験条件を見出すことが出来た。今後、更に実験条件の探索を行うことによって最適化を進めたい。更に、誘電体ガラス基板薄膜の表面と厚さを厳密に制御することによって、最適な条件が得られつつある。

これまでの成果報告として、国際会議4件(国内開催2件、国外開催2件)、国内会議1件の口頭発表を行うと共に、1件の査読つき英文論文が採択され、現在招待レビュー論文を投稿し、投稿準備中のが1報ある。この様な現在の状況から総合的に判断して概ね順調に進展していると自己点検評価した。本研究では、北海道大学の複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡を利用し量子ビーム照射誘起Dewetting現象についてその場観察し画像解析からその機構を解明することを目的とし、100keVのArイオンと波長532nmの短パルスレーザーの複合照射下及びそれぞれ単独での照射下におけるDewetting現象のその場観察を行った。その結果、貴金属が矩形から球形へ変化するレイリー不安定時の挙動を直接観察することに成功すると共に、貴金属薄膜厚が薄いほどDewetting後のナノ粒子の平均粒径は小さくなり、可視光の吸収波長も短波長側へブルーシフトする量子効果が発現することを確認した。最近、局在表面プラズモンを利用した環境中の微量有害物質や生体内の微量代謝物質を捉えるバイオセンサーの研究・開発が進められている。従来、誘電体基板表面に有機物を利用して貴金属ナノ粒子を担持するため結合強度やそれらが光学特性に影響を与えるなど課題があったが、イオンやレーザー等の量子ビーム照射により基板表面にナノ粒子を1層だけ分散させる表面改質法を見出した。しかしながら、量子ビーム照射により誘起される基板表面の貴金属薄膜のDewetting現象の詳細は未解明で特に貴金属が矩形から球形へ変化するレイリー不安定時の挙動が不明である。そこで、本研究では、北海道大学が有する複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡を利用し量子ビーム照射誘起Dewetting現象についてその場観察しその機構解明を目的とした。石英ガラス基板だけでなく、高温作動型の局在表面プラズモンデバイスを着想するに至ったことから非常勤の学術研究員を2年目に雇用しCVD法で作製した柱状晶のβ-SiC基板上の金薄膜のDewetting現象についても詳細に検討した。試料は、現有のイオン研磨装置を利用して基板側からバックシニングを行い、TEM観察が可能な薄膜とした後、現有の蒸着装置を利用し石英ガラス基板あるいはCVD法で作製した柱状晶のβ-SiC基板に金あるいは金-銀の薄膜を5nm20nmで蒸着した。その後、複合量子ビーム超高圧電子顕微鏡を利用して、Ar+イオン照射下あるいは532nmの短パルスレーザー照射下などの量子ビーム照射下におけるDewetting現象のその場観察を行った。貴金属の量子ビーム照射下におけるレイリー不安定性について照射量や膜厚との関係を検討した結果、当初の貴金属薄膜厚が薄いほどDewetting後のナノ粒子の平均粒径は小さくなり、可視光の吸収波長も短波長側へブルーシフトする量子効果が発現することを確認した。平成26年の4月に本研究で使用する北海道大学に設置してあるマルチビーム超高圧電子顕微鏡の高圧電源部が不安定になり、その後高圧タンク内の電子部品の故障が原因であることが判明したことから、修理に数ヶ月要し当初の実験が遅れた。その間、Ex-situ実験を進めて最適な条件を探索したことから、後半のマシンタイムを有効に活用することが出来、当初の計画通りの成果を得ることが出来た。
適応進化の分子的検証および復元

生物の示す多様性の神秘は我々を魅惑し止まない。このような多様性は祖先のもつ遺伝子に様々な変異がつけ加えられることにより生み出されたと考えられる。もしそうならば「進化過程における変異を元に戻し祖先型遺伝子を回復させれば祖先生物の特徴を復元することができるのではないだろうか?」本研究の先行研究ではこの考えに基づき、バクテリアからタバコ属野生植物ゲノムに水平移行したNgrol遺伝子群による祖先復元解析について解析した。本研究ではこの"祖先遺伝子復元実験"に"分子進化速度加速推定"を加えることにより可能となる「適応進化の分子的実証の試み」についてさらなる解析法を開発した。ここでは花器官の運命をきめるMADS遺伝子群分子進化における正の淘汰を理論的に推定し分子機能の進化の実験的復元を試みた。MADS遺伝子群は花器官homeotic変異の原因遺伝子として発見された。蛋白質機能としてはこの遺伝子群の仲間同士で多量体をつくり転写因子として働くことが知られている。MADS遺伝子群は花器官誘導に必須な役割を果たすため花形態の進化に関わった可能性を考えまず系統樹を作成、解析を行った。(この結果を論文として発表した)。この系統樹の枝の中に他より顕著に長くなる枝が見つかった。この枝は"裸子植物と被子植物の共通祖先における分岐点"と"被子植物の多様化における分岐点"を結ぶ花の初期進化の時期に当たる枝であることが示された。そこで両分岐点における祖先遺伝子の配列を理論的に推定し復元合成した。機能実験に関するpreliminaryな結果によるとこの推定祖先遺伝子は多量体の組み合わせに関わる蛋白質相互作用の進化的変遷を説明することがた。近年の分子遺伝学やEvoDevoにおける成果は形態形成遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群の重複や変異による分子機能進化の中には表現型進化と関わったものがある可能性を示唆している。一方、分子進化学は生物学的な機能変化を伴う突然変異が起こる際、多様性を高めるような選択が働くか機能的制約の緩和により進化速度が加速する可能性のあることを理論的に示している。形態形成遺伝子の機能進化は、重複の後、機能的制約から解放された片方の遺伝子だけにより高い自由度で突然変異が蓄積し新しい機能を獲得した結果引き起こされた、と考えられる。このような過去の分子変異を分子進化学や系統学により推測し、再現実験して調べれば人類の想像の中に描いてきた生物進化の歴史を実際に調べることが可能と考えられる。そこで本研究では「適応的表現型進化を分子的に実証すること」を目標に(A)計算による系統樹上の分子進化速度加速の検定、(B)実験による祖先DNA配列の合成および機能の復元の2つの解析を行った。具体的にはまず形態形成遺伝子群による分子系統樹の作成を行い、系統樹上で問題となる形質が進化した時代の枝を推定した。そして(A)により「この枝のみに見られる遺伝子突然変異の特異性」を解析し、(B)により「この枝における遺伝子突然変異で遺伝子機能および表現型変化が起こること」を示す解析を行った。現在、分子レベルでの機能の解析に取り組み、推定していたタンパク質相互作用における祖先形質が復元することを確認した。そこで生物への遺伝子導入を行うことにより形態変化への影響について現在詳しい解析を行っている。
簡便で信頼性が高い脊髄機能モニター法の開発

大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による運動誘発電位のモニタリングが広く用いられているが、安定性が低いため偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。本研究は、食道電極を用いて脊髄を電気刺激することにより、感受性・特異性共に高いモニタリング法を確立することを目的として実施した。まず、自作した刺激電極を用いて実現可能性と安全性を確認し、経頭蓋刺激に比して電位の安定性が優れることを発見した。次いで、下行大動脈バルーン閉塞モデルを用いて脊髄虚血に対する反応性を検討し、経食道刺激は経頭蓋刺激に比して、脊髄虚血に対する応答が早いこと、予後との相関が良好であることを見出した。大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による筋電図である運動誘発電位motor evoked potential(MEP)のモニタリングが広く用いられているが、麻酔薬の影響や下肢虚血の影響を受け偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。より有用性が高いモニタリング法に、脊髄直接刺激・導出による脊髄誘発電位evoked spinal cord potential(ESCP)があるが、硬膜外電極を要するため、ヘパリン使用環境での応用には難点がある上、電極の位置不良によりモニター出来ない場合がある。本研究は、食道電極を用いて脊髄を電気刺激することにより、硬膜外電極を用いずにESCPと同等の有用性を持つモニタリング法を確立することを目的として実施している。当該年度においては、前年度に実現可能性を確認した方法(シリコン製エアウェイと硬膜外電極を用いて自作した食道電極と頸部皮下電極を用いたtrain of five刺激)を用い、安全性の確認と、麻酔薬等への安定性を確認した。安全性としては、心臓のリズムに対する悪影響がないことを8匹の保存心電図波形から確認した。また麻酔薬過量により犠牲死させた3匹のイヌの摘出食道標本から、食道粘膜への影響がないことも確認した。さらに、生存させた5匹のイヌの神経機能に問題がないことを確認し、脊髄への悪影響がないことも確認した。麻酔深度に対する安定性試験では、プロポフォルとアルフェンタニルの投与速度を様々に変更し、経頭蓋電気刺激と比較検討した。臨床例で見られる経頭蓋刺激の不安定性を実験では再現できなかったため、差を確認するにはいたらなかったが、経食道刺激の安定性は確認できた。さらに、経食道刺激は経頭蓋刺激とは異なり、電極の位置がアバウトでも導出が容易であることを見出した。大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による筋電図である運動誘発電位motor evoked potential(MEP)のモニタリングが広く用いられているが、麻酔薬の影響や下肢虚血の影響を受け、偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。当該年度においては、経食道脊髄刺激の実現可能性と安全性の証明実験を実施した。まず電極の食道粘膜への密着性の確保のために、シリコン製エアウェイと硬膜外電極(いずれも市販品)を用いて食道電極を自作した。次いで体重20kg前後のイヌを用い、レミフェンタニルとプロポフォルによるTIVAで麻酔を導入・維持のうえ、自作した食道電極で脊髄刺激実験を行った。導出には、上下肢筋電図ならびに直腸電極による肛門括約筋電図を用いた。結果。対極としてX線透視下に頚部皮下・棘突起付近に刺入した硬膜外電極を用いることで、加算刺激、train刺激ともに脊髄刺激が可能であることを証明した。現在は、麻酔深度に対する安定性をMEPと比較検討することと同時に、交感神経機能や心臓のリズムに対する悪影響がないことを刺激中の心電図波形を保存して解析中である。また麻酔薬過量により犠牲死させたイヌの食道を摘出保存しており、食道粘膜への影響を今後検討する予定である。大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による筋電図である運動誘発電位motor evoked potential(MEP)のモニタリングが広く用いられているが、安定性が低いため偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。他のモニタリング法には脊髄誘発電位evoked spinal cord potential(ESCP)や体性感覚誘発電位somatosensory evoked potential(SSEP)があるが、前者は特異性は高いものの脊髄虚血に対する反応が遅く、かつ硬膜外電極を要するためヘパリン使用環境下での使用に難点があり、後者は感覚神経のモニタリングであるため、反応も遅く、特異性も低い。本研究は、食道電極を用いて脊髄を電気刺激することにより、硬膜外電極を用いずに感受性・特異性共に高いモニタリング法を確立することを目的として実施してきた。初年度に、自作した刺激電極を用いて実現可能性を確認した後、次年度には、本法の安全性を確認し、また、経頭蓋刺激に比して麻酔薬への耐性には差を認めないものの、電位の安定性は優れることを発見した。当該年度においては、初年度と次年度において得られた成果を国内外の学会で発表し、欧州心臓胸部外科学会でawardを取得するなど、高い評価を得た。

同時に、下行大動脈バルーン閉塞モデルを用いて脊髄虚血に対する反応性の実験を進め、経食道刺激は経頭蓋刺激に比して、脊髄虚血に対する応答が早いこと、予後との相関が良好であることを見出した。大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による筋電図である運動誘発電位motor evoked potential(MEP)のモニタリングが広く用いられているが、安定性が低いため偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。他のモニタリング法には脊髄誘発電位evoked spinal cord potential(ESCP)や体性感覚誘発電位somatosensory evoked potential(SSEP)があるが、前者は特異性は高いものの脊髄虚血に対する反応が遅く、かつ硬膜外電極を要するためヘパリン使用環境下での使用に難点があり、後者は感覚神経のモニタリングであるため、反応も遅く、特異性も低い。本研究は、食道電極を用いて脊髄を電気刺激することにより、硬膜外電極を用いずに感受性・特異性共に高いモニタリング法を確立することを目的として実施した。まず、自作した刺激電極を用いて実現可能性と安全性を確認し、経頭蓋刺激に比して麻酔薬への耐性には差を認めないものの、電位の安定性が優れることを発見した。本成果は国内外の学会で発表し、欧州心臓胸部外科学会でawardを取得し、発表論文は当該年度のeditor' choiceに選ばれるなど、高い評価を得た。次いで、下行大動脈バルーン閉塞モデルを用いて脊髄虚血に対する反応性を検討し、経食道刺激は経頭蓋刺激に比して、脊髄虚血に対する応答が早いこと、予後との相関が良好であることを見出した。本成果は、米国胸部外科学会で発表し、発表論文にはeditorial commentをいただくなど高い評価を得た。最終年度には、最終実験と米国胸部外科学会での発表、ならびに論文化を実施した。大動脈外科手術に伴う脊髄虚血障害を防止するため、経頭蓋脳刺激による運動誘発電位のモニタリングが広く用いられているが、安定性が低いため偽陽性率が高く、予後との相関も乏しい。本研究は、食道電極を用いて脊髄を電気刺激することにより、感受性・特異性共に高いモニタリング法を確立することを目的として実施した。まず、自作した刺激電極を用いて実現可能性と安全性を確認し、経頭蓋刺激に比して電位の安定性が優れることを発見した。本研究の主目的である、経食道刺激運動誘発電位モニタリング法を確立し、脊髄虚血検出に関する制度が経頭蓋刺激より優れていることを見出すことが出来たため。心臓血管外科学当該年度に得られた成果を、海外の学会で発表することが決まっている。また、上肢の過大な運動を回避する刺激方法を実験中であり、もう数例の追加実験を行う予定である。第2年度の最大の目的であった、経食道脊髄刺激の麻酔薬への安定性試験を実施することが出来、ここまでの研究成果を今年度中に学会等で発表予定であるため。
四光波混合による二光子電子遷移測定法の開発と長鎖ポリエン分子のS_1状態

まず近赤外域の広帯域波長可変レーザー光源を,再生増幅Nd : YLFレーザーの2倍波をポンプ光としたパラメトリック光発生を用いて開発した。我々の再生増幅器の2倍波は50psのパルス幅,1kHzの繰り返し率で約1mJの出力があるが,これに長さ4cmのLiNbO3結晶を2個使用する事で,ほぼ我々の目的に使用可能と思われる程度の光源を得ることができた。つぎにこの光源と再生増幅器の基本波を用いた光学的ヘテロダイン検出二光子吸収誘起カー効果分光法(OHD-TIKES)の開発を行った。現時点までの実験では,ポンプ光に上記光源による波長可変光を,プローブ光に再生増幅器の基本波を用い,プローブ光は本予算で購入した近赤外分光器を通した後PbSe検出器で検出してパルス成分を取り出す方法で,β-カロテンをサンプルとしてOHD-TIKESの測定を試みたが,未だ信号の検出に成功していない。今後試みるべき条件として,一つにはポンプ光とプローブ光を逆にする事が考えられる。プローブ光は偏光の純度が高い必要があると考えたため,方解石プリズムを用いる都合上,長波長となる可能性のある波長可変光はプローブ光としてでなく,ポンプ光として用いた。しかし,OHD法では通常のカー効果分光法におけるほどの偏光純度は要しない可能性があり,適切な工夫によってレーザーの偏光が乱れないように注意さえすれば,この組み合わせの方が測定に適している可能性がある。また,サンプルとして,近赤外域の光によって二光子遷移を起こすと予測される物質を,テストには用いるべきであったかも知れない。この2点を中心に,二光子吸収スペクトルの測定が可能となるよう観測の試みを続ける予定である。
広帯域誘電分光による食品中の過冷却水の観測手法の確立と応用

本研究では低含水量の穀物など,固い表面を有する食品の高周波誘電分光を行うため,測定試料・電極周りの設計・製作を新たに行った。特に穀物の粒状試料を固定化するためのシリコンゴム製サンプルホルダーやその粉体試料測定のための同軸円筒型電極をセットアップした。低含水量食品である穀物を意識し,まずPoly(vinylpyrrolidone)[PVP]水溶液の高濃度域(含水量8wt%以下)での広帯域誘電分光(BDS)測定を行い,得られた緩和曲線に各緩和過程の緩和関数をモデリングしたフィッティング解析を適用して緩和パラメータを決定したところ,50°Cでは10Hzから1mHzにかけて二つ以上の緩和が観測された。このような低含水量試料の測定は従来ほとんど行われていない。poly(vinyl acetate)のbenzene溶液の場合,誘電分光で得られた分子鎖運動は示差走査型熱量(DSC)測定で観測されるガラス転移に対応していることから,これを利用して上述の緩和過程の同定が可能であろう。次に食品として米や肉類のBDS測定によって,食品中の水構造を調べた。米粒は13%ほどの含水量で小さく固いために,表面を削って前述のホルダーにセットした後に同軸平面型の電極を接触させて測定し,十分な再現性を得た。さらに米粉や炊飯米の誘電分光を併せて行うことで,広い含水量範囲での水構造を観測し,得られた緩和時間と緩和時間分布のダイアグラムによるオリジナルなフラクタル解析を行ったところ,米の水構造が各種水溶液系よりも水分散系の水構造に近いことを示した。炊飯米の水構造が変性の特徴を示すかどうか,今後の詳細な精密測定の結果が期待される。これらの研究成果を,2005年度に開催された水観測の国際会議(ISEMA2005)やスローダイナミクスの国際会議などで発表し,さらに米物理学協会,米化学会などの学術誌に発表した。誘電分光測定では,測定対象が水系の場合には誘電率・導電率や誘電緩和時間が大きな変化を示すため,多様な電極や測定・解析手法を適切に選択する必要がある。GHz領域を含む周波数帯でこれらの測定を遂行するため,別途新たに導入した精密インピーダンスアナライザーを含む広帯域誘電分光のセットアップを行った。これらの電極の設計・製作や,測定・解析アルゴリズム・プログラムの開発に加え,水系の誘電的性質が温度に強く依存することから,恒温槽,温度コントローラ,クオーツ温度計等を測定システムに組み込み,より詳細な温度調整を可能にし,さらに凍結用ジャケット,クライオスタットの製作を行って低温域測定で用いた。セットアップの妥当性を確認するための標準データとして,まず従来から誘電分光データを集積しているpoly(vihylpyrrolidone)の水溶液について,様々な濃度で緩和パラメータを決定し,さらに広範囲な標準データの集積ができた。食品系で重要な高分子ゲルとしてPAAm/水系の体積相転移に伴う拘束水のダイナミクスを観測した。従来のデータに加えて,加水分解処理によってアクリル酸側鎖を導入したゲルについてもさらに正確な体積測定を行った誘電分光測定を行い,収縮ゲル内拘束系でのデータを得た。また,水をジオキサンに置き換えた測定によって,収縮相での溶媒分子ダイナミクスに水系と異なる挙動を見出した。ゲル系の物性における疎水/親水性相互作用の影響を検討する上で興味深く,今後の測定が期待される。さらにいくつかの多糖類高分子水溶液について,放射線架橋によってゲル分率を変化させた場合の水,分子鎖ダイナミクスを検討した。現在放射線によるラジカル化からのゲル構築を整理し,これらのダイナミクスについての知見をまとめている。また,これらを凍結温度以下まで冷却して不凍水のダイナミクスを観測し,緩和強度から不凍水量,緩和時間とその分布から拘束の様子を調べ,誘電分光で得られたガラス転移の挙動を熱分析と比較することが可能になってきた。食品系で重要な高分子ゲルとしてPAAm/水系の体積相転移に伴う拘束水のダイナミクスについては既に観測・解析を行ったが,高分子鎖ダイナミクスの観測については,直流伝導成分の影響が誘電緩和過程を隠してしまうため,現在でも困難が大きい。そのため,水をジオキサンに置き換えた測定で分子鎖ダイナミクスの観測を目指したが,まだその観測は難しく,新たな平行平板電極製作が急務である。一方収縮相でのジオキサン溶媒分子ダイナミクスの水系と異なる挙動については,スケーリング解析による規格化によって水と同様な挙動を見出した。ゲル拘束系のスケーリング解析による疎水/親水性相互作用の影響を検討する手法として,今後さらなる測定・解析が期待される。多糖類高分子であるヒドロキシメチルセルロース系水溶液について,放射線架橋によって架橋密度やゲル分率を変化させ,水と分子鎖ダイナミクスの再測定を行ったところ,水の分子ダイナミクスは照射量に対して複雑な挙動をとることが判った。架橋度の増加による高分子構造の弾性的強化や自由体積減少だけでなく,架橋に伴う高分子と相互作用している水分子数の減少や分子鎖切断に伴う新たな高分子-水相互作用の増加など互いに打ち消し合う作用が共存している様子を解析した。凍結実験は少し遅れながらも,今後これらの温度依存性を調べていく。

特に凍結温度以下での拘束系で不凍水のダイナミクスを観測し,緩和強度から不凍水量,緩和時間とその分布から拘束の様子を調べ,不凍水量の温度依存性や熱分析から調べたガラス転移点との比較を行う。これらの基礎研究の結果から得られた解析手法を今後様々な食品に適用していく。また食品として米粒内の水構造についての予備データをとったところ,米粒中で拘束されている水がとる動的挙動にはゲル形成物質中の水との類似性があるようで,さらに詳細な観測・解析による検討が期待される。本研究では低含水量の穀物など,固い表面を有する食品の高周波誘電分光を行うため,測定試料・電極周りの設計・製作を新たに行った。特に穀物の粒状試料を固定化するためのシリコンゴム製サンプルホルダーやその粉体試料測定のための同軸円筒型電極をセットアップした。低含水量食品である穀物を意識し,まずPoly(vinylpyrrolidone)[PVP]水溶液の高濃度域(含水量8wt%以下)での広帯域誘電分光(BDS)測定を行い,得られた緩和曲線に各緩和過程の緩和関数をモデリングしたフィッティング解析を適用して緩和パラメータを決定したところ,50°Cでは10Hzから1mHzにかけて二つ以上の緩和が観測された。このような低含水量試料の測定は従来ほとんど行われていない。poly(vinyl acetate)のbenzene溶液の場合,誘電分光で得られた分子鎖運動は示差走査型熱量(DSC)測定で観測されるガラス転移に対応していることから,これを利用して上述の緩和過程の同定が可能であろう。次に食品として米や肉類のBDS測定によって,食品中の水構造を調べた。米粒は13%ほどの含水量で小さく固いために,表面を削って前述のホルダーにセットした後に同軸平面型の電極を接触させて測定し,十分な再現性を得た。さらに米粉や炊飯米の誘電分光を併せて行うことで,広い含水量範囲での水構造を観測し,得られた緩和時間と緩和時間分布のダイアグラムによるオリジナルなフラクタル解析を行ったところ,米の水構造が各種水溶液系よりも水分散系の水構造に近いことを示した。炊飯米の水構造が変性の特徴を示すかどうか,今後の詳細な精密測定の結果が期待される。これらの研究成果を,2005年度に開催された水観測の国際会議(ISEMA2005)やスローダイナミクスの国際会議などで発表し,さらに米物理学協会,米化学会などの学術誌に発表した。
膜性腎症の病因・病態に関与する新規自己抗原の同定と臨床応用に向けた発展的研究

特発性MN症例での抗PLA2R抗体の陽性率は、諸外国では約70-80%と高頻度であるが、本邦症例では我々の検討も含め約35-50%と低頻度である。従って、本邦の特発性MN症例では未知の抗原・抗体系の関与が推定される。本研究の目的は、本邦の特発性MNの病因・病態に関与する新規自己免疫異常を明らかにすることである。更に、自己抗体測定系を確立し、その臨床的意義についての検討も行う。新たな血清診断法を確立できれば、特に腎生検が困難な高齢者MN症例の診療に寄与できる。また、新たな治療法の開発に繋げることもでき、関連分野への波及効果は大きい。
胃がんでのDNAメチル化異常ゲノム網羅的解析によるがん抑制遺伝子の同定と機能解析

DNAメチル化異常誘発の分子機構及びその誘発因子には不明な点が多い。CpGアイランド(CGI)内の散在性CpGメチル化が誘発される頻度が異なる胃がん細胞株各2系統を用い、散在性メチル化はCGI全体の高密度なメチル化につながること、高転写の遺伝子のメチル化も誘発することを示した。Helicobacter pylori(H.pylori)感染によるメチル化異常誘発には遺伝子特異性が存在し、遺伝子の低転写がその特異性に重要であることを明らかにした。スナネズミモデルを用いた解析から、メチル化異常の誘発には炎症の種類が重要であることを示した。ヒト胃がんのゲノム網羅的なDNAメチル化異常の検索により、これまでに、Lysyl oxidase (LOX)を新たな胃がん抑制遺伝子として同定した。その過程で、(a)一部のヒト胃がん細胞株では、CpGアイランド内の幾つかのCpG部位に散在性のメチル化が持続的に誘発されること(「メチル化の種」の産生増加)、(b)メチル化の種の産生増加は、一定の頻度で、CpGアイランド全体の高密度メチル化を誘発することを見出した。本年度は、メチル化の種の産生増加が、高度に転写されている遺伝子にもサイレンシングを誘発するか否かを明らかにするために、産生増加を示す胃がん細胞株2系統(AGS,KATO-III)と、示さない胃がん細胞株2系統(HSC39,HSC57)について、サイレンシングされる遺伝子数を計測した。これら細胞株を、脱メチル化剤5-aza-2'-deoxycitidine (5-aza-dC)により処理、発現回復する遺伝子をオリゴヌクレオチドマイクロアレイにより解析した。5-Aza-dCの処理濃度として、それぞれの胃がん細胞株について、DNAメチル基転移酵素を高度に低下させ、かつ、細胞増殖抑制が軽度な濃度を設定した。処理前は発現がほとんどなく、処理後に発現が16倍以上上昇する遺伝子について、処理前のプロモーター領域CpGアイランドの高密度メチル化を検討した。その結果、サイレンシングされる遺伝子数は、AGSおよびKATO-IIIでは、24個および41個であったのに対し、HSC39およびHSC57では、4個および1個であった。従って、メチル化の種の産生増加は、遺伝子が転写されていても、プロモーター領域CpGアイランドの高密度メチル化を誘発し、発現を抑制することが示唆された。CpGアイランド(CGI)メチル化形質は、様々な分子機構により誘発されると考えられる。これまで、CGI内の散在性のCpG部位にde novoメチル化(メチル化の種)が誘発される頻度が増加している細胞株が存在すること、また、メチル化の種の増加は遺伝子サイレンシングの原因となるCGI全体の高密度メチル化も誘発することを示してきた。一般的に、遺伝子サイレンシングは転写が少ない遺伝子に起こりやすいとされる。そこで、今年度は、メチル化の種の増加が転写量の多い遺伝子にも起こるか否かを明らかにすることを目的とした。種の増加を示す胃がん細胞株2系統(AGS, KATO-III)と、示さない胃がん細胞株2系統(HSC39, HSC57)を、脱メチル化剤5-aza-2'-deoxycitidine(5-aza-dC)により処理、発現回復する遺伝子をオリゴヌクレオチドマイクロアレイにより解析した。5-Aza-dCの処理濃度として、それぞれの胃がん細胞株において、DNAメチル基転移酵素を高度に低下させ、かつ、細胞増殖抑制が軽微な濃度を設定した。処理前は発現がほとんどなく、処理後に16倍以上上昇した遺伝子数は、AGS, KATO-III, HSC39, HSC57で、それぞれ44,97,21,9個であった。プロモーター領域CGIのメチル化状態を解析したところ、メチル化によりサイレンシングされる遺伝子数は、それぞれ24,41,4,1個と推計された。これら遺伝子のうち13個にっいて、正常な胃での転写量を検討したところ、転写量が多い遺伝子8個は種の増加を示す細胞株でのみメチル化されていたのに対し、転写量が少ない遺伝子5個は何れの細胞株でもメチル化されていた。従って、種の増加は、プロモーター領域CGIにおいて、転写によるメチル化からの防御に打ち勝って、高密度メチル化を誘発することが示唆された。DNAメチル化異常は様々なヒト腫瘍に関与するにも関わらず,その誘発要因はほとんど明らかになっていない。内在性の要因として,これまで,CpGアイランド内のCpG部位に散在性DNAメチル化が誘発されると,CpGアイランド全体の高密度なメチル化(遺伝子サイレンシングを誘発する)につながることを示してきた。