hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顎骨における微細変化の三次元画像解析の基礎的研究

3)伴により作成されたアパタイトをマイクロCTにて観察した。マイクロCTでの観察に先立ち、電子顕微鏡での撮影をおこない、チタン板に針状のアパタイトの生成を確認した。このアパタイトをマルトー(株)にてチタン板より剥離し1)と同一の形状の試料を作成した。試料内のアパタイトについては顕微鏡での確認、撮影をおこなった。しかし、この形状ではマイクロCTではアパタイトを確認することはできなかった。このため直径数mmの低X線減弱な合成樹脂の円筒に低X線減弱な熱可塑性樹脂でアパタイトを埋没した試料を作成した。この円筒型試料についてはマイクロCT上、アパタイトを検出できた。アパタイトの撮影についてはマイクロCTの特性上、高分解能を求める場合、試料を小型化する必要があることが明らかになった。小照射野CTではピクセルサイズから予想されるようにまったく検出することができなかった。4)歯周病における顎骨の微細な変化を口内法フィルム画像から得る方法については、従来の、岩下、森田、野井倉らのAL当量法に対して、基準参照体を塩化ビニールに置き換えた手法を検討した。塩化ビニール当量法は既に森田により理論計算(コンピュータシュミレーション)が提案されていたが、実際に乾燥下顎骨の撮影をおこない、視覚上も歯槽頂部なと低濃度領域ではAL当量よりも優れていることを確認した。昨年度に続いて、歯科用CTの実験をおこなったが、東京医科歯科大学の歯科用CT、3DX(モリタ社製)を使用した。なお骨標本については昨年度と同じものを使用した。1)基準ファントムについては当初計画した合成HAアパタイトを樹脂に格子状に平面状に配列したファントムを作成した。金属メッシュに析出させたHAを樹脂にHAのみ転写して作成したもので、μCTと歯科用CTの双方において基準となるものである。HAの作成までは鹿児島大学の伴があたりファントムに加工する部分は研究代表者の森田がマルトー(株)と共に行った。ただし、本ファントムは研究開始時点の歯科用CTの性能を評価して作成したものでありやや、HAサイズが小さすぎたたため、現時点では描出されていない。2)歯科用CTの空間分解能については、骨標本の実験から、昨年度の結果では、喧伝されているようには高くないことが明らかになったが、実際の臨床データなどからは理解しがたいことであった。この点について、本年度は特にタングステンワイヤーファントム、人骨ファントム、HAブロックファントム、小型バーカーファントム等をも駆使して解明を試みた。歯科用小照射野CTにおいて、スライス加算効果が重要であることが明らかになった。X線管電流すなわちX被曝量の低減にスライス加算効果は弱い線形に作用し、スキャン回数や雑音特性には線形に作用していた。3)昨年度の結果からの予想に反して、空間分解能の内、高X線減弱物による検出能はタングステンワイヤーにおいて20μm以下であることが判明した。さらに従来のCTのFDA等の性能評価で用いられている100μmのタングステンワイヤーではアーチファクトが大きく、歯科用CTでは新たな標準測定法の確立が急務と思われた。先行しておこなわれた骨梁標本での歯科用CTでの実験においてほとんど同一の骨梁が必ずしも同一画素にならないことが判明した。
P/Q型カルシウムチャネルカルボキシ末端フラグメントの生成機構とその生理機能

遺伝性神経疾患である脊髄小脳変性症6型の発症に関わると考えられるCav2. 1カルボキシ末端フラグメント(CTと略)は、全長Cav2. 1タンパク質から切り出されてできると考えられている。本研究ではそのプロセスに関わるプロテアーゼの同定を試みた。またCav2. 1CTの果たす役割についても検討した。caspase 6, cathepsin L, calpain smallsubunit 1といった分子がCav2. 1CT生成に関わる候補として考えられたが、今後の更なる検討が必要である。また、Cav2. 1CTは多くの細胞に対し毒性を示す事、何らかの遺伝子発現の抑制に関わる可能性が示唆された遺伝性神経疾患である脊髄小脳変性症6型の発症に関わると考えられるCav2. 1カルボキシ末端フラグメント(CTと略)は、全長Cav2. 1タンパク質から切り出されてできると考えられている。また、Cav2. 1CTは多くの細胞に対し毒性を示す事、何らかの遺伝子発現の抑制に関わる可能性が示唆された本年度はまずC末端にFLAG-tagを付加したヒトCav2.1をマウス内在性Cav2.1の代わりに発現するノックインマウスを用いて、Cav2.1C末端の生成に領域特異性があるかどうかを検討した。ノックインヘテロマウスの脳を大脳、小脳その他というように大まかに分画し、それぞれからタンパク質を抽出し、FLAG抗体による免疫沈降およびCav2.1C末端に対する抗体を用いたイムノブロットにより解析した。その結果、分子量約70kDaのCav2.1C末端フラグメントは小脳サンプルにおいてのみ検出された、各部位での発現量の差を補正しなければならないが、Cav2.1C末端の生成機構に領域特異性がある可能性が考えられ、SCA6におけるプルキンエ細胞の選択的脱落の機構との関連で非常に興味深い結果である。しかしこのフラグメントを質量分析等により解析し、切断部位についての情報を得るには膨大な量の出発材料が必要であると推定された。C末端切断部位を同定する別のアプローチとして、データベースの検索からその切断配列の存在が推定されたcaspaselについて実験を進めた。すなわち、培養細胞に発現させたEGFP-Cav2.1融合タンパク質を免疫沈降により精製し、それを実際にin vitroでcaspaselで処理して、イムノブロットにより解析した。しかしC末端切断にcaspaselが関与することについては否定的な結果しか得られなかった。また、Cav2.1C末端の生理機能を明らかにする一環として、Cav2.1C末端をCAGプロモータで発現するトランスジェニックマウスを作製した。現在このトランスジーンの発現量を調べている。多くの細胞で強力な発現を示すことが知られるCAGプロモータ制御下でCav2.1カルボキシ末端(以下単にC末端と略)を発現するトランスジェニックマウスを作製した。導入したCav2.1 C末端は、ポリグルタミン鎖長が13と28の2種類のものを作製した。どちらのトランスジーンからもファウンダーマウスが得られたが、ポリグルタミン28の方が少なかった。また、どちらのトランスジェニックマウスも1系統がライン化されたが、いずれもC末端タンパク質の発現は非常に低いレベルであった。結局当初予定していた上記トランスジェニックマウスと、Cav2.1変異マウスleanerとの交配はできなかったが、上述の事実は、Cav2.1 C末端は多くの細胞に対して何らかの毒性を示し、それを高いレベルで発現すると致死になる可能性を示唆する。そしてポリグルタミン鎖長が13でも28でも毒性を示し、28の方が毒性が強いと推測される。Cav2.1全長をHEK293細胞で発現させると、Cav2.1ノックインマウス小脳で検出されるのと同じサイズのC末端フラグメントが検出される。そこで、HEK293細胞とプルキンエ細胞(小脳内でC末端が多く存在すると考えられる)に共通して発現しているプロテアーゼをデータベースから検索し、それらをRNAiにより阻害した条件でC末端フラグメントの生成が影響されるかどうかを検討することとした。まず解析すべきプロテアーゼ遺伝子として、caspase 6、cathepsin L、calpain small subunit 1を選んだ。これらに対するsiRNAとCav2.1発現ベクターとを同時にHEK293細胞に導入して、その3日後に細胞を回収し、C末端タンパク質をウエスタンプロットにより調べた。しかし、今のところこれらのプロテアーゼがC末端生成に関わるという証拠は得られていない。siRNAの導入時期等の検討すべき点はまだ残るので、今後さらに検討したい。本年度は以下の3点について検討した。1. Cav2.1カルボキシ末端フラグメント(Cav2.1CT)生成機構昨年度に引き続きいくつかのプロテアーゼに着目し、それらのCav2.1CT生成への関与を検討した。caspase6,cathepsin L,calpain small subunit 1を対象とし、これらに対するRNAiをHEK293細胞において行いCav2.1CTの生成が抑制されるかどうかをイムノブロットにより検討した。しかし、siRNAとCav2.1発現ベクターを同時に導入するとチャネルの発現効率自体が低下するといった問題が生じ、明確な結論を得るまでには至らなかった。

2. Cav2.1CTとHSFIとの相互作用GFP-Cav2.1CT融合タンパク質を恒常的に発現するHEK293由来細胞株(S13,L24)は重金属ストレスを与えると、ポリグルタミンの長いCav2.1CTを発現するL24の方が細胞死を起こしやすい(Li et al., 2009)。そして、この脆弱性にはHSF1-HSP70系の活性低下が関与すると考えられているがCav2.1CTがどのようにHSF1-HSP70系に影響するかは明らかではない。そこでCav2.1CTが転写因子HSF1と直接的に相互作用するかどうかを免疫沈降法を用いて検討した。S13,L24細胞の総タンパク質を抽出し、Cav2.1CTをGFP抗体で免疫沈降させ、HSF1抗体によるイムノブロットで解析した。しかしHSF1が検出できる時とできない時があり再現性について問題があった。現時点ではCav2.1C末端フラグメントとHSF1とが直接相互作用する可能性が考えられるが、明確な結論を得るにはさらなる検討を要する。3. Cav2.1CTの転写活性化能、転写抑制能Cav2.1CTが転写活性化能を持つかどうかをGAL4 DNA結合ドメインとCav2.1CTとの融合タンパク質を発現するベクターを作製して検討した(pM3'S13,pM3'L24と名付けた)。レポーターとしてUAS配列下流にアルカリフォスファターゼ(SEAP)遺伝子を持つpG5SEAPをCOS7細胞にコトランスフェクションし、3日後SEAP活性を測定した。しかしCav2.1CT単独ではSEAP活性は検出されなかった。ところが、転写活性化能を有する陽性対照pM3VP16とpM3'S13あるいはpM3'L24を同時に導入すると、pM3VP16単独の場合に比べて著しくSEAP活性が低下した。Cav2.2のC末端を用いた場合にはこれほどの転写抑制は見られなかった。したがってCav2.1C末端は転写抑制活性を有する可能性が考えられる。
生殖過程におけるジベレリンの作用機作の分子基盤

高等植物の生殖期において、ジベレリン(以下GAと略)は花芽誘導・種子発芽過程の鍵となる生理活性物質である。本研究は、ジベレリンによって誘導されることが明確となっているαーアミラ-ゼ遺伝子に注目し、その転写活性を指標として、ジベレリン受容体の検索ならびにその機能について分子レベルの解明を目指すものである。今年度はαーアミラ-ゼ遺伝子の発現制御領域(シス活性化因子)の同定、および転写調節因子(トランス活性化因子)の検索、さらには、これらの準備のもと、トランスジェニック植物を用いた転写活性化因子の解析を行なった。その結果、以下のような知見を得た。(1)RAmylAのプロモ-タ-領域を用いてトランジェント発現の調節に関する研究の結果、約150bpの5'側上流域DNAがこの遺伝子の活性化に必須であることが明かとなった。さらにこれに特異的に結合するタンパク質(RABP1)、またその上流域塩基配列に結合する2種類のタンパク質(RABP2,3)の存在を明かにした。(2)RAmylAプロモ-タ-・GUS融合遺伝子を導入したトランスジェニック・イネを用いた解析の結果、このプロモ-タ-領域にはGAによって活性化されるシス活性化因子が存在することが明かとなった。
スポーツにおける倫理環境の整備に向けた実践的研究

本研究では、セクシュアルハラスメントに関するスポーツ指導者向けの教育映像プログラムを開発した。教育プログラムはスポーツにおける倫理的問題の解決に向けた対策に取り組んでいる3カ国の情報をもとに作成された。作成したプログラムはインターネット上で公開すると同時にDVDにコピーし、日本のスポーツ統括団体ならびに教育委員会、計635団体に配布した。さらには映像プログラムの使用状況を把握するために追跡調査を行った。本研究の目的は、主に海外の先行事例を参考にしながら、日本のスポーツ環境における倫理環境をより良好な状態にするための情報を収集し整理して、さらにはそれらの情報に基づき教育・環境整備プログラムを作製することにある。平成22年度の課題は「諸外国の事例を中心にプログラム内容などについての情報収集と整理、現地調査実施」であった。調査対象国としては、当初から想定していたオーストラリアとカナダに加え韓国も対象国とした。これら三力国における倫理についての取り組み内容について、主にインターネットで情報を収集し、分類、整理した。オーストラリアは高峰が、カナダは熊安が、韓国は両者が担当した。こうした情報を元に、平成23年度は日本における教育プログラムの作成を試みる予定である。さらにこれら三力国については、平成22年23月にかけて現地における聞き取り調査を実施した。韓国は国家人権委員会と体育市民連帯代表者、カナダはスポーツ・カナダと市民活動家、オーストラリアはオーストラリア・スポーツ・コミッションとこのテーマを専門とする大学教員である。調査内容はプログラムが始まった経緯、プログラムの管理・運営方法、運営資金、プログラムの課題や将来性などについてであった。各国においてこうした問題に対する取り組みが始まった経緯や現在直面する課題は異なっており、三力国の聞き取り調査から得られる幅広い多様性のある事例の中には、日本における取り組みで参考にすべき要素が多々含まれていると考えられる。現在、聞き取り調査の内容をまとめており、事例研究論文として発表する予定である。本研究の目的は、主に海外の先行事例を参考にしながら、日本のスポーツ環境における倫理環境をより良好な状態にするための情報を収集し整理して、さらにはそれらの情報に基づき教育・環境整備プログラムを製作することにある。平成23年度の課題は「平成22年度に収集した情報の整理とそれに基づく教育・環境整備プログラムの製作、さらにはそれらプログラムのインターネット上での公開あるいはメディア媒体での配布」であった。平成22年度に韓国、オーストラリア、カナダで収集した情報を整理し、それに基づいて、セクシュアル・ハラスメントに関する指導者向けの教育用映像プログラムを製作した。指導者向けプログラムとした理由は、この問題の解決を視野に入れると指導者に対する情報提供が最も有効であると思われるため、また完成したプログラムを対象者の手元に届けやすいためである。これまで日本では、スポーツの指導者を対象とした倫理に関する教育プログラム、特に映像プログラムは作られておらず、今回製作した映像プログラムを指導者講習会などで用いることによって、この問題に対する指導者の意識と注意を喚起することができると思われる。映像プログラムの内容は概論と事例からなり、時間は20分弱である。この映像プログラムはホームページ上で公開するほか、DVDに記録して各競技団体や都道府県体育協会に酉己布する予定であったが、予算とスケジュールの都合上、こうした公開と配布は平成24年度の作業となる。本研究の目的は、主に海外の先行事例を参考にしながら、日本のスポーツ指導者向けの教育・環境整備プログラムを作成することであった。2010年度はスポーツ場面のセクシュアル・ハラスメントについての問題解決に向けての情報を収集し(Plan)、2011年度はそれらの情報を元にした映像プログラムを作成した(Do)。2012年度はその映像プログラムをスポーツ関連諸団体に配布し、さらには追跡調査を行ってその映像プログラムの使用状況を把握する(See)ことが目的であった。作成したのは「スポーツ環境におけるセクシュアル・ハラスメントの問題ー指導者向けプログラムー」と題する約20分間の映像プログラムである。そのプログラムを記録したDVDを2012年9月に(公財)日本体育協会ならびに62の加盟競技団体、(公財)日本オリンピック委員会、都道府県ならびに法人格を持つ265の市町村体育協会、日本パラリンピック委員会加盟団体(48)、(公財)全国高等学校体育連盟ならびに47都道府県高等学校体育連盟と1専門部、(公財)日本中学校体育連盟ならびに47都道府県中学校体育連盟、(公財)日本高等学校野球連盟ならびに47都道府県高等学校野球連盟、都道府県ならびに政令指定都市の66教育委員会の計588団体に配布した。また映像プログラムはホームページ( http://www.players-first.jp )からも視聴できるようにリンクさせた(2012年11月)。2013年13月にかけて、上記588団体を対象として、配布したDVDの使用状況と、各団体の倫理に関する取組を質問する質問紙調査を実施した。190団体から回答があり、DVDを受け取ったと回答した団体が144団体(75.8%)、そのうち13団体(9.0%)が研修会などで使用しており、79団体(54.9%)が将来的に使用する予定と回答した。上記の研究実績において説明した指導者教育用の映像プログラム製作に予想以上の時間と労力がかかったために、組織向けの倫理規定・ガイドラインのテンプレート作りが遅れている。

このテンプレートは映像プログラムとともに各スポーツ統括組織に配布する必要があるので、早々に完成させる予定である。また専用ドメインを使ったホームページを公開する関係上、平成24年度の予算執行とともにホームページを公開する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。上述の研究作業の遅れは平成24年度明け早々に回復することができる予定であり、全体としての研究計画に大きな変更はない。
アトピー性皮膚炎症状の修飾因子の原因遺伝子同定

アトピー性皮膚炎モデルマウスをランダムミュタジェネシスの中から同定した。このマウスを遺伝子操作したC57BL/6J系の遺伝子背景でライン化して観察したところ、遺伝形式からIgE高値を示す個体と皮膚炎を示す遺伝子変異がそれぞれ別の単一遺伝子で決められていて、常染色体劣性遺伝形式を示す可能性が示された。しがもこれが重なった場合に皮膚炎症状が増悪するために、とれらを両方単離する目的でC3H/HeJ系統と遺伝子マッピングを行った。皮膚炎の原因遺伝子は細胞内信号伝達分子の点突然変異であることがわかった(特許申請準備中)が、IgE高値の原因遺伝子は領域を絞れなかった。C3B6F1のインタークロスと言う遺伝子背景がこの表現型をマスクしてしまうものと考えられた。皮膚炎のマウスにおいては骨髄移植などから血液細胞ではなくて皮膚側に疾患発症の原因があることがわかった。また、このときに皮膚炎の原因遺伝子変異を持つ血液細胞は皮膚炎症状の発症時期を早め、症状を増悪させることもわかった。このことから血液側にアトピー性皮膚炎の修飾因子が存在することがわかった。また、生後8週で発症するが、その時点では免疫学的にはTh2へのシフトを示唆する所見は認められなかった。そこで皮膚での遺伝子発現についてRNAマイクロアレイにより検討した。すると疾患発症前の生後早い時期からミュータント皮膚において、皮膚のバリアの恒常性を維持する酵素分子の幾つかと、ヒトアレルギー性疾患で過剰発現が指摘されている酵素分子が過剰発現していることがわかった(特許申請準備中につき記述しない。)。これらの皮膚の酵素分子がアトピー性皮膚炎発症の修飾因子となる可能性が高いと考えられた。)。本研究ではランダムミュタジェネシスで作成したミュータントマウスプールから確立したアトピー性皮膚炎マウスの疾患発症に関わる修飾因子を検討した。まず、この系統においてはIgE高値を呈する症状とアトピー性皮膚炎発症とが独立した責任遺伝子によってコントロールされていると考えられたために、C3Hマウスとの交配による遺伝子マッピングで皮膚炎発症部位とIgE高値の表現型についてそれぞれ単独、および重複する個体について検討した。総数260匹の検討結果から、皮膚炎については染色体4番のある領域に同定できたが、IgE高値に関しては単一の遺伝子座への同定はできなかった。また、アトピー性皮膚炎が遺伝子因子のみならず、環境因子による影響を強く受けることは人間の疾患においてもマウスアトピー性皮膚炎モデルの検討においても強く示唆されている。環境による影響を検討するためにこれらのマウスをSPF環境からコンベンショナル環境へと移したところ、約3ヶ月後にはSPFでは症状を発現しない多数のマウスでアトピー性皮膚炎発症を確認できた。これらのことから、このアトピー性皮膚炎疾患モデルマウスにおける疾患発症は4番染色体の変異がhomoの場合はSPFで、heteroの場合はそのうち20%がアトピー性皮膚炎様の症状を呈すること、清浄度の落ちるコンベンショナル環境ではheteroもほぼすべてが発症することが明らかとなった。当初の予測である、複数の遺伝子変異による影響の可能性についてはまだ否定されたわけではなく、引き続きIgE高値の表現型の原因遺伝子追及を続けるが、アトピー性皮膚炎が皮膚のバリア機能の破壊と免疫系のアレルギー傾向との複合で起こることが想像されていることから、このマウスが人間のアトピー性皮膚炎疾患モデルとしてより有用であることが明らかとなった。(成果は未発表であり、公表見合わせを希望する。)ENUミュタジェネシスで見出したアトピー性皮膚炎自然発症マウスモデル(常染色体劣性および優性で疾患発症)において、疾患原因である遺伝子変異のメカニズムと、それに対して飼育環境や遺伝子背景の差が疾患発症の時期や程度に及ぼす影響について検討した。

1.疾患発症の基盤となる突然変異はサイトカイン信号伝達にかかわるある遺伝子の点突然変異であり(特許申請中のために遺伝子名は伏せる)、これによって特定のサイトカイン信号伝達系がin vitroの実験系で恒常的に、あるいは刺激によって過剰に活性化することを生化学的に確認した。2.このマウスホモ接合体の場合には飼育環境、遺伝子バックグラウンドにかかわらずアトピー性皮膚炎用疾患が発症したが、ヘテロ接合体にした場合には飼育環境の汚染度が高くないと発症しないこと、オリジナルのC57BL/6Jに比較してC3H/HeNと交配したF1では発症頻度が落ちることなどから、C3H/HeN遺伝子背景でこの疾患の発症の修飾因子となりうる領域について、IgE値を基準に遺伝子マッピングによる追跡をおこなったが、場所は同定できなかった。3つ以上の複数の修飾因子の複合によるものと考えられた。3.骨髄キメラの作成により疾患発症の本態は皮膚環境側にあるが、同一遺伝子変異による血液細胞の活性化が疾患発症と増悪に強く影響することを確認できた。4.この疾患はC57BL/6J遺伝子背景でSPF環境で飼育した場合、生後79週での疾患発症が確認できている。発症前に皮膚で発現するmRNAのマイクロアレイ解析により、皮膚バリアを構成する遺伝子群の発現に大きな変動が確認できた。これらの遺伝子に関してはノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスのコンストラクトを作成した。以上、4項目について新しい知見を得ることができた。
沖縄保守勢力を中心とした戦後沖縄政治の再構築

本研究は関係者への聞き取り調査が中心を占めているが、まず平成30年6月に研究代表者が沖縄に行き、関係者3名にインタビューを実施した。また同年8月には研究代表者と研究分担者が沖縄に行き、研究代表者単独で関係者3名に、研究代表者と研究分担者が共同で関係者2名にインタビューを実施した。インタビュー終了後は二人で研究会を実施し、研究成果の共有に努めた。また同年11月には研究代表者と研究分担者が沖縄に行き、研究代表者単独で関係者4名に、また研究代表者と研究分担者が共同で関係者3名にインタビューを実施した。さらに同年12月には研究代表者と研究分担者が沖縄に行き、研究代表者が単独で4名に、研究分担者が単独で1名にインタビューを実施した。また12月に東京で研究代表者が関係者1名にインタビューを実施した。最後に同年12月末から平成31年1月初頭にかけて研究代表者と研究分担者が沖縄に行き、研究代表者単独で関係者4名に、また研究代表者と研究分担者が共同で関係者3名にインタビューを実施した。インタビュー記録に関しては、業者にテープ起こしを依頼し、12名については終了し、残りは来年度に行う予定である。インタビューの音源データに関しては、パソコンおよびハードディスクに保存し、厳重に保管している。当初の計画では、平成30年度は研究代表者と研究分担者であわせて関係者45名にインタビューを実施する計画であったが、実際には延べ28名にインタビューを実施することができた。理由としては、インタビューの対象となり得る人物が当初想定していたよりも多くいたことや、インタビューに応じてくれた関係者が多かったことなどが挙げられる。令和元年度は、すでに4月に研究代表者が沖縄に行き、関係者2名にインタビューを実施した。また、7月9月にかけて研究代表者と研究分担者が単独で、あるいは共同で沖縄に行き、関係者にインタビューを実施するとともに、その得た知見を共有するために研究会を開催する予定。10月12月にかけても同様に沖縄に行き、インタビューと研究会を実施する予定。インタビューの人数は、前年度と同じぐらいを目標にしたい。研究分担者に次年度使用額が生じたが、その理由は次の通りである。調査・研究の日程上の都合により、若手研究「戦後沖縄の経済界の形成と展開に関する政治経済史的研究:建設業界を主な対象として」(18K12510)の現地調査と重ねて、本課題のインタビューを行うことがあり、旅費の支出が全体として抑えられたため繰越額が発生した。
カレニア・ミキモトイ殺藻性ウイルスKmVによる赤潮衰退への影響評価

有害藻類カレニア・ミキモトイ(Karenia mikimotoi)による赤潮は,規模や分布域を拡大し,日本の水産業に深刻な被害を与えている。申請者は,最近,カレニアを特異的に殺滅するウイルス(KmV)3株を,赤潮衰退期の海水から分離・培養することに成功した。これは,カレニア赤潮の衰退にウイルスが関わっている可能性を示す重要な発見であった。ウイルスは,標的生物のみを殺滅し,爆発的に増えるので,大増殖する赤潮生物を連鎖的に死滅させることが可能であり,赤潮防除技術への利用が大いに期待できる。本課題では, KmVの性質,殺藻力や殺藻範囲,現場におけるカレニア個体群への影響などを詳細に把握するために, KmVの性状解析,定量PCRや抗体法などKmVの高精度モニタリング技術の開発,カレニア細胞内でのKmVの挙動や相互作用を明らかにすることを目的としている。具体的には,今年度は,1)KmVの形態学的特徴および遺伝情報の解明,2)定量PCRなど分子技術に基づいた高精度モニタリング手法の開発を実施した。透過型電子顕微鏡で宿主であるカレニア・ミキモトイ内に存在するウイルス粒子を観察し,形態学的特長を明らかした。また、陰染色によりウイルス自身の形態的特徴を明らかにした。高感度定量PCRについては、遺伝情報を得るために全ゲノム解析を行ったが、DNA抽出に検討を要し、部分配列を得るに至った。現在も、DNA抽出法を検討しているところである。さらに,ウイルス感染時にカレニア生体内で起こるであろう核の形態変化をモニタリングする技術を開発するため,画像解析技術の確立に向けて実験を開始した。有害藻類カレニア・ミキモトイ(Karenia mikimotoi)による赤潮は,規模や分布域を拡大し,日本の水産業に深刻な被害を及ぼしている。本課題では, KmVの性質,殺藻力や殺藻範囲,現場におけるカレニア個体群への影響などを詳細に把握するために,KmVの性状解析,定量PCRや抗体法などKmVの高精度モニタリング技術の開発,カレニア細胞内でのKmVの挙動や相互作用を明らかにすることを目的としている。具体的には、研究機関内に、1)KmVの形態学的特徴および遺伝情報の解明、2)KmV感染時のカレニアの増殖特性の評価、3)定量PCRや抗体法など分子技術に基づいた高精度モニタリング手法の開発、4)モニタリング技術を用いたウイルスがカレニアの増殖や衰退に及ぼす影響の評価,感染機構に関する知見の収集等を実施し、カレニア赤潮の衰退に及ぼすウイルスの影響や生態学的意義を明らかにし,赤潮防除技術の開発に向けた基盤作りを行うことであった。28年度は、1)の形態学的特長を明らかにするため、宿主であるカレニア・ミキモトイ内に存在するウイルス粒子を観察するために、固定法など観察試料作製の技術開発に取り組み、透過型電子顕微鏡で観察することに成功した。また、分子技術による整理生態の把握のために必須である遺伝子の解析を進めた。ウイルスなど天敵生物を利用した防除法技術開発において,ウイルスとプランクトンの相互作用や感染機構の詳細を明らかにすることは必須である。従って、まず、ウイルスKmVがカレニア・ミキモトイに感染している様子を示すために、透過型電子顕微鏡による細胞内観察を行うことにした。一般的に、ウイルスは宿主細胞の膜表面に吸着してから進入し、タンパク質が消失し、核のみになったあと、宿主の機能を用いて自己を複製させる。複製するウイルス個体数は、数百倍数万倍にもなることもあり、このときのみ、細胞内でウイルス粒子が観察される。したがって、細胞内でウイルスを観察できる瞬間は、非常に限られているといえる。また、植物プランクトンは、固定液の種類や濃度によって細胞がこわれることがしばしばあり、固定や試料調製が非常に難しい。そのため、今年度は、観察試料の調製に非常に時間がかかった。最終的に、細胞内で増殖するウイルスの観察に成功したが、成功事例が少ないため、来年度は確立した試料調製法を用いて、感染写真の蓄積に努めたい。また、分子技術導入の基盤となる塩基配列の解読については、DNAを回収し、シークエンスを実施した。現在解析中である。

本課題では, KmVの性質,殺藻力や殺藻範囲,現場におけるカレニア個体群への影響などを詳細に把握するために,KmVの性状解析,定量PCRや抗体法などKmVの高精度モニタリング技術の開発,カレニア細胞内でのKmVの挙動や相互作用を明らかにすることを目的としている。具体的には,研究期間内に,1)KmVの形態学的特徴および遺伝情報の解明,2)KmV感染時のカレニアの増殖特性の評価,3)定量PCRや抗体法など分子技術に基づいた高精度モニタリング手法の開発,4)モニタリング技術を用いたウイルスがカレニアの増殖や衰退に及ぼす影響の評価,感染機構に関する知見の収集等を実施し,カレニア赤潮の衰退に及ぼすウイルスの影響や生態学的意義を明らかにし,赤潮防除技術の開発に向けた基盤作りを行うことであった。29年度までに,透過型電子顕微鏡で宿主であるカレニア・ミキモトイ内に存在するウイルス粒子を観察し,形態学的特長を明らかした。また,分子技術による生理生態の把握のために必須である遺伝子の解析を進めた。さらに,ウイルス感染時にカレニア生体内で起こるであろう核の形態変化をモニタリングする技術を開発するため,画像解析技術の確立に向けて実験を開始した。これまで,カレニア・ミキモトイに感染するウイルスは3個見つかっていたが,いずれも感染の再現率は一定ではなかった。時間のかかる時もあれば,短時間で感染する場合もあった。今年度は,非常に感染力の強いウイルスを新たに分離・精製することに成功したため,このウイルスの解析を進めることとした。従って,まず,ウイルスKmVがカレニア・ミキモトイに感染している様子を示すために,透過型電子顕微鏡による細胞内観察を試みている。細胞内でウイルスを観察できる瞬間は,非常に限られており、植物プランクトンは,固定液の種類や濃度によって細胞がこわれることがしばしばあり,固定や試料調製が非常に難しい。昨年度までに固定法等の条件検討を概ね終えているため,観察に取り掛かっているところである。また,分子技術導入の基盤となる塩基配列の解読については,同様に新規ウイルスのDNAを回収し,現在解析中である。さらに,赤潮藻類衰退へのウイルスの影響について評価することを目的として,ウイルス感染時に起こる宿主の核の形態変化を画像解析し数値化する技術を開発している。2017年度は,対象種をKarenia mikimotoi (以下,カレニア)とそのウイルスKmDNAV5とし,昨年度に検討した条件にて,カレニアにウイルスを感染させて,形態変化を4日間観察した。その結果,ウイルスを感染させた細胞の核は,感染させなかった細胞の核より,明らかにサイズが縮小し,形態の変化が認められた。現在,基礎データを蓄積しているところである。細胞の大きさには個体差があり,さらに,細胞分裂時の核変化も考慮すると,カレニア細胞とウイルスに感染されたカレニア細胞の核の大きさ,形態の違いを画像解析できる程度まで発展させるには,いくつかの条件検討が必要である。有害藻類カレニア・ミキモトイ(Karenia mikimotoi)による赤潮は,規模や分布域を拡大し,日本の水産業に深刻な被害を与えている。申請者は,最近,カレニアを特異的に殺滅するウイルス(KmV)3株を,赤潮衰退期の海水から分離・培養することに成功した。これは,カレニア赤潮の衰退にウイルスが関わっている可能性を示す重要な発見であった。ウイルスは,標的生物のみを殺滅し,爆発的に増えるので,大増殖する赤潮生物を連鎖的に死滅させることが可能であり,赤潮防除技術への利用が大いに期待できる。
肺形態発生に関わる成長因子と先天性横隔膜ヘルニア治療応用への基礎的研究

本研究ではラット胎仔の低形成肺モデルを用いて正常肺と各種遺伝子の発現を比較しCDHにおける低形成肺の病態及び発生機序の一端を解明することを目的として行っているが、本年度は主に予備実験に重点を置き、RT-PCR法、whole mount ISH法と肺器官培養を行ってその手法を検討した。1、妊娠9.5日のSDラットにナイトロフェン100mgを経口投与する方法にて低形成肺胎仔を得た。また胎生1320日の各日の正常肺とモデル低形成肺を摘出し検討した。2、胎仔及び実体顕微鏡下に摘出した胎仔肺を直ちに凍結保存する。13-14日肺は非常に小さく、一度に15体分の肺を集めても抽出出来るmRNAは0.1μgにもはるかに満たず抽出に難渋したが、凍結していた肺より効率良くRNAを抽出する方法を検討し、検体処理法とmRNA抽出キットを決定した。3、続いて、RT-PCR法を用いて次の各成長因子の発現量を比較検討した。KGF、KGF-R、FGF-10、BMP-4、Shh、TGF-β、HGFとそのレセプター等。各種プライマーの特性を掴むためアニーリング温度から伸長反応時間まで様々な予備実験をおこなった。肺に関しては現在のところ良好な条件での結果が得られていない。全身の検索ではナイトロフェン投与胎仔では13日にはKGFの発現がまだ認められないという結果が得られた。また13、14日ではBmp4の発現に差を認めなかった。4、whole mount ISH法をβアクチンとKGFについて施行した。ラット胎仔胎生12、13日にて外観上は肺でのKGF発現は明らかでなく、以後は胎仔のサイズの問題で良好な結果が得られていない。5、肺の培養はほぼ100%で成長が認められるような手法を確立した。基質としてマトリゲルを使用する方法を採択した。本年度の予備実験をもとに来年度は一気に結果を出していく予定である。
Crohn病に対する樹状細胞を用いた抗原特異的な新しい免疫治療法の開発

Crohn病は肉芽腫形成、全層性炎症を特徴とする難治性慢性炎症性腸疾患であり、我々の研究グループではこれまでに腸管粘膜局所における腸管腔内抗原に対するTh1型優位の免疫反応が本症での組織傷害を惹起していることを明らかにしてきた。本研究は自然免疫系および獲得免疫系を制御している樹状細胞に注目し、本症のTh1型免疫反応誘導機構における重要性を明らかとする目的で、腸間膜リンパ節より樹状細胞を単離する方法を確立し、腸管内抗原提示における樹状細胞の機能異常を追究した。まず、ヒト手術検体より腸間膜リンパ節を得、酵素処理、ホモジェナイザー処理により単細胞浮遊液を調整した。比重遠心法により単核球画分を得て、磁気細胞分離装置を用いてCD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56陽性細胞を除去後、CD4陽性MHC classII^<high>の樹状細胞を単離した。腸間膜リンパ節より単離した樹状細胞およびCD4陽性T細胞について解析することにより、Crohn病の腸間膜リンパ節内でimmature DC1樹状細胞の増加とTh1サイトカインプロファイルをもち、転写因子T-betの発現が亢進したCD4陽性T細胞が増加していることが示され、このことはCrohn病の腸間膜リンパ節内でTh1免疫反応が亢進しており、その機序として樹状細胞によるTh1誘導が重要であり、Crohn病の病態において腸間膜リンパ節における免疫反応がトリガーになっている可能性が示唆された。さらに、今後、樹状細胞を標的とした、あるいはNKT細胞などを用いてTh1/Th2サイトカインバランスを是正するCrohn病に対する新しい治療法の開発する上で重要な知見と考えられた。Crohn病ではCD11c陽性のmyeloid DCがCD123陽性のplasmacytoid DCに比して増加していた。allogenic MLR activityは、Crohn病、潰瘍性大腸炎ともに増強していた。一方、同時に腸間膜リンパ節より単離したCD4陽性T細胞は、Crohn病においてIFN-γを、潰瘍性大腸炎においてIL-4を優位に産生しており、腸間膜リンパ節内での樹状細胞による抗原提示が、Crohn病におけるTh1型免疫反応誘導に重要であることが示唆された。今後、NKT細胞などを用いてTh1/Th2バランスを是正する新しい治療法を開発する予定である。

本研究は自然免疫系および獲得免疫系を制御している樹状細胞に注目し、本症のTh1型免疫反応誘導機構における重要性を明らかとする目的で、腸間膜リンパ節より樹状細胞を単離する方法を確立し、腸管内抗原提示における樹状細胞の機能異常を追究した。まず、腸間膜リンパ節より樹状細胞を単離する方法を、磁気細胞分離、フローサイトメトリーを用いて初めて確立した。腸間膜リンパ節より単離した樹状細胞およびCD4陽性T細胞について解析することにより、Crohn病の腸間膜リンパ節内でimmatureDC1樹状細胞の増加とTh1サイトカインプロファイルをもち、転写因子T-betの発現が亢進したCD4陽性T細胞が増加していることが示され、このことはCrohn病の腸間膜リンパ節内でTh1免疫反応が亢進しており、その機序として樹状細胞によるTh1誘導が重要であり、Crohn病の病態において腸間膜リンパ節における免疫反応がトリガーになっている可能性が示唆された。さらに、今後、樹状細胞を標的とした、あるいはNKT細胞などを用いてTh1/Th2サイトカインバランスを是正するCrohn病に対する新しい治療法の開発する上で重要な知見と考えられた。
フラビウイルス科ウイルスの進化と宿主特異性の解明

フラビウイルス科ウイルスの進化と宿主特異性を明らかにするために、以下の研究を前年度に引き続き実施した。1.フラビウイルス科ウイルスの粒子産生における膜結合性タンパク質NS1の役割の解析細胞外に分泌されるフラビウイルスのNS1タンパク質がウイルスの粒子産生に関与するかを解析した。まず、NS1の六量体形成に関与するアミノ酸部位をバイオインフォマティクスの手法にて予測した。次に、昨年度作製したレポーターウイルスを基に、ウイルスのNS1遺伝子にレポーター遺伝子を挿入して、自立複製および増殖能を欠いたウイルスを作出した。予測部位のアミノ酸を異なる種類のアミノ酸に置換した103種類のNS1タンパク質を強制発現する培養細胞を作製し、自立増殖能のないウイルスを用いて、複製と粒子産生能を免疫染色法とレポーター活性にて評価した。その結果、273番目のアミノ酸を置換したNS1を発現させた細胞では、ウイルスゲノムは複製したが、ウイルス粒子は産生されなかった。さらに、この変異NS1タンパク質は培養上清中に分泌されなかった。また、この部位の1アミノ酸を置換したウイルスを作出し、C型肝炎ウイルスとペスチウイルスがそれぞれ粒子産生に利用する宿主のアポリポタンパク質とウイルスタンパク質Ernsにてフラビウイルスの粒子産生を代償できることを明らかにした。以上の成績からフラビウイルス科に属するウイルスの間で、分泌する糖タンパク質が粒子産生において必須であり、それらは共通する機能を持つことが実証された。2.新規レポーター遺伝子を搭載したフラビウイルス科ウイルスの評価タンパク質の構造とその特性を利用し、外来遺伝子の適した挿入部位を選抜する方法を確立した。さらに、この方法で作出したレポーターウイルスは生体で親株と同等の病原性を示し、ルシフェラーゼ活性値にてウイルスの増殖性を評価することが出来ることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、フラビウイルス科ウイルスの進化と宿主特異性を明らかにするために以下の研究を実施した。1.フラビウイルス科ウイルスの粒子産生における膜結合性タンパク質の役割の解析まず、ペスチウイルスのErns遺伝子を欠失させたウイルスRNAを作製した。Erns蛋白、フラビウイルスの分泌性膜結合蛋白NS1およびアポリポタンパク質を培養細胞に強制発現させ、Erns遺伝子を欠失したウイルスRNAを導入し、ウイルスの粒子が産生されるか調べた。その結果、Erns蛋白を発現させた細胞には劣るが、NS1蛋白とアポリポタンパク質を発現させた細胞でウイルスの粒子産生を認めた。次に、ヘパシウイルスが粒子形成に利用するアポリポタンパク質を欠失させたヒト肝臓由来細胞に、宿主タンパク質CAMP、ペスチウイルスのErns蛋白およびフラビウイルスのNS1蛋白を強制発現させ、ウイルスを感染させた。その結果、アポリポタンパク質を回復させた細胞には劣るが、それ以外のタンパク質を強制発現させた細胞で粒子産生は回復した。以上から、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの粒子産生にウイルス性膜結合性分泌タンパク質Erns、NS1および宿主のアポリポタンパク質が共通した役割を持つことがわかった。2.新規レポーター遺伝子を搭載したフラビウイルス科ウイルスの作出ヘパシウイルスの各タンパク質の遺伝子のN末端に、ルシフェラーゼ由来の11アミノ酸を挿入した11つの完全長cDNAクローンを作出し、ウイルスが回収されるか調べた。その結果、非構造蛋白NS2のN末端にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したウイルスが効率よく増殖した。ウイルスを培養細胞で5代連続継代した結果、遺伝子は維持されていた。さらに、臨床現場で使用されている抗ウイルス薬に対してそれは感受性を示すことがわかった。今後は、他のフラビウイルス科のレポーターウイルスを作出する予定である。フラビウイルス科ウイルスに共通した粒子産生様式とそれに関与する宿主およびウイルスタンパク質の機能を同定することでき、順調に研究を推進できている。1.フラビウイルス科ウイルスの粒子産生における膜結合性タンパク質の役割の解析これまでにフラビウイルスの分泌タンパク質NS1は、ウイルスRNAの複製に必須であることがわかっている。そこで、NS1がウイルスの粒子産生に関わっているかを調べることとした。まず、NS1分子上の複製に関与する部位のアミノ酸を置換し、機能を失活させたデングウイルスのcDNAクローンを作製した。この変異によりウイルスが複製できないことを確認し、NS1の変異体をHCVが粒子形成に利用するアポリポタンパク質を欠失させたBE-KO細胞に強制発現させた。野生株のNS1とNS1の変異体を強制発現させた細胞にHCVを感染させ、ウイルス粒子産生に及ぼす影響を調べた。その結果、培養上清中のウイルス感染価はどちらの細胞で同程度だった。同様に、これらNS1をブタ由来株化細胞に強制発現させた。その細胞にErns遺伝子を欠損したペスチウイルスのRNAを導入し、ウイルスの粒子産生量を調べた。その結果、どの細胞でも同程度のウイルス感染価を示した。以上からNS1の粒子産生とウイルスの複製は、フラビウイルスの生活環で独立した作用機序を持つことが示唆された。2.新規レポーター遺伝子を搭載したフラビウイルス科ウイルスの作出とその応用新規レポーター遺伝子を搭載したフラビウイルスとペスチウイルスを作出した。レポーターウイルスは野生株と同様に増殖し、その遺伝子は安定であった。また、レポーター遺伝子を搭載したC型肝炎ウイルスはマウスに野生株と同様の病態を引き起こし、レポーターの活性値でウイルスの増殖性を評価できることがわかった。さらにレポーターウイルスは、薬剤スクリーニングへの応用が可能であることがわかった。

下記の3つの理由から研究を順調に推進できていると考える。・フラビウイルスの粒子産生におけるウイルスタンパク質の新たな機能を見出した。・フラビウイルス科ウイルスの宿主および組織特異性を解析する際に役立つレポーターウイルスを作出することができた。・本研究課題の成果を国内外の学会と学術雑誌に発表した。フラビウイルス科ウイルスの進化と宿主特異性を明らかにするために、以下の研究を前年度に引き続き実施した。1.フラビウイルス科ウイルスの粒子産生における膜結合性タンパク質NS1の役割の解析細胞外に分泌されるフラビウイルスのNS1タンパク質がウイルスの粒子産生に関与するかを解析した。まず、NS1の六量体形成に関与するアミノ酸部位をバイオインフォマティクスの手法にて予測した。次に、昨年度作製したレポーターウイルスを基に、ウイルスのNS1遺伝子にレポーター遺伝子を挿入して、自立複製および増殖能を欠いたウイルスを作出した。予測部位のアミノ酸を異なる種類のアミノ酸に置換した103種類のNS1タンパク質を強制発現する培養細胞を作製し、自立増殖能のないウイルスを用いて、複製と粒子産生能を免疫染色法とレポーター活性にて評価した。その結果、273番目のアミノ酸を置換したNS1を発現させた細胞では、ウイルスゲノムは複製したが、ウイルス粒子は産生されなかった。さらに、この変異NS1タンパク質は培養上清中に分泌されなかった。また、この部位の1アミノ酸を置換したウイルスを作出し、C型肝炎ウイルスとペスチウイルスがそれぞれ粒子産生に利用する宿主のアポリポタンパク質とウイルスタンパク質Ernsにてフラビウイルスの粒子産生を代償できることを明らかにした。以上の成績からフラビウイルス科に属するウイルスの間で、分泌する糖タンパク質が粒子産生において必須であり、それらは共通する機能を持つことが実証された。2.新規レポーター遺伝子を搭載したフラビウイルス科ウイルスの評価タンパク質の構造とその特性を利用し、外来遺伝子の適した挿入部位を選抜する方法を確立した。さらに、この方法で作出したレポーターウイルスは生体で親株と同等の病原性を示し、ルシフェラーゼ活性値にてウイルスの増殖性を評価することが出来ることがわかった。フラビウイルス科ウイルスに共通した粒子産生様式に着目し、種および組織特性が高いヘパシウイルスと類似した遺伝子構造を持つペスチウイルスを用いて、宿主特異性獲得のメカニズムを明らかにする予定である。今後はフラビウイルスのNS1タンパク質に着目し、ウイルスの粒子産生における機能を解析することで、ウイルスの進化および宿主特異性を獲得する際の分泌性タンパク質の意義を検討する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
医療機関における家族――性的指向と性自認を軸とする患者・看護師の相互行為

本研究は、日本の医療機関において性的指向・性自認(SOGI)が典型的ではないとみられる患者(以下いわゆるLGBT)と看護師との家族をめぐる相互行為上の齟齬を明らかにするのを目的とする。SOGIにおいて困難をかかえる人々と看護師間の家族をめぐる相互行為上の齟齬を明らかにするため、本研究では1)一定数の病床を備える医療機関を対象とする質問紙調査、2)LGBTとみられる患者を担当したことのある看護師・関係職へのインタビュー調査、3)医療機関において家族をめぐる困難を経験したLGBTへのインタビュー調査、を実施する。平成29年度は、LGBTと医療にかんする文献の精査、医療関係者とのネットワーキングに務めた。平成30年度は医療系の学会やシンポジウムに参加し、LGBTに関する現状の学会の認識を把握し、先進的取り組みについて学んだ。その上で、石川県、静岡県、東京都の病院に勤務する看護部長を対象とした郵送調査「LGBTの患者対応についての看護部長アンケート」を実施した。郵送時に同封した調査依頼書にて、LGBTの患者を担当したことのある看護師を対象とするインタビュー調査の協力者を募ることができた。学会や研究会、研修会を通して医療機関とのネットワークを順調に構築している。さらに、看護部長を対象とするアンケート調査も実施し、今後予定しているインタビューに協力してくれる協力者(看護師)のリクルートの目処がたっている。当初の計画では1)一定数の病床を備える医療機関を対象とする質問紙調査、2)LGBTとみられる患者を担当したことのある看護師・関係職へのインタビュー調査、3)医療機関において家族をめぐる困難を経験したLGBTへのインタビューを実施することとなっており、すでに2)までの目処がたっている。調査3)は、研究費の不足が予測されることから、新たな科研費への申請を予定している。
細胞核ダイナミクスにおけるゲノムの機能的収納機構の解明

本研究は、ゲノムを細胞核に機能的に折り畳むための遺伝情報を解明することを最終目標にしている。そして、本年度は、計画に沿って3つの解析を行った。以下に成果を報告する。1. DNA高次構造のクロマチン制御能と遺伝子発現制御能の解析:一過的遺伝子発現系を用いた解析で、我々は既に遺伝子発現を活性化できる十字架構造とZ型DNA構造を見出していた。そこで本年度は、両者のクロマチン制御能の解析を中心とした解析計画を立てていた。しかし、再度検討した結果、この計画を実施するためには、まだ両構造の転写活性化能が不十分であることが判明した(実験的に検出できないほど僅かなクロマチン構造の変化でも転写活性に影響することがあるため)。さらに、この点を解決するためには、まずZ型DNA構造に的を絞り、転写活性化能を上昇させた上で次の解析に進むことが賢明であると判断された。そこで、新規のZ型構造の開発を引き続き行うこととし、これまでに転写を約25倍活性化できる構造を作製することに成功した。この他、マウスES細胞に導入した人工ベントDNAT20は、同細胞を肝細胞に分化させても転写を活性化する能力を保持していることを明らかにした。2.各種真核生物ゲノムの柔軟性地図の作成:ヒト、チンパンジー、マウス、ショウジョウバエ、線虫、酵母、シロイヌナズナの各ゲノムの柔軟性を3bpまたは4bp単位で解析し、各ゲノムの全長に渡るDNAの柔軟性地図を完成させた。そして、どのゲノム上にも極めて柔軟な特性をもつ小領域(SPIKEと命名)が分布していることを発見した。3.ヌクレオソームの自己集合能の解析:ニワトリの赤血球から精製したコアヒストンと各種DNAを用いて試験管内でヌクレオソームを再構成した。得られたヌクレオソームの混合溶液を解析した結果、同じDNAをもつヌクレオソーム同士が集合する傾向があることが示唆された。ゲノムの機能的収納機構を解明するために、昨年度に続き二つの視点から研究を進めた。ひとつは、プロモーター領域の機能的収納機構という視点で、もうひとつは、ゲノム全体を折り畳むために使われるDNAの物理的特性という視点である。プロモーター領域の機能的収納機構については、負の超らせんを擬態した180塩基対の合成ベントDNA(T20)を用いた解析に加え、Z型DNAと十字架構造を用いた解析も行った。その結果、次の点が明らかになった。(1)T20は、未分化状態の細胞内でも分化後の細胞内でもプロモーターを活性化できる(マウスES細胞を肝細胞に分化させた実験の結果で、昨年度予備的な結果であったものを確認した)。(2)T20をもつレポーターは細胞核周縁部に存在する(lac0/lacl-GFP法を用いた予備的な実験の結果)。(3)T20は出芽酵母内でも遺伝子発現を活性化できる(明星大学・清水光弘博士との共同研究)。(4)Z型DNAにも、十字架構造にもプロモーターを活性化する構造がある(HeLa細胞を用いた-過的遺伝子発現系での実験結果)。以上のように、今年度は、プロモーター領域の機能的収納における超らせん擬態ベントDNAの効果が確認でき、加えて、他の高次構造にも同様の効果がある可能性を見出すことができた。ゲノム収納とDNAの物理的特性との関係については、ヒトゲノム全域にわたる機械的特性(柔軟性)のマップを完成させた。そして、個々の染色体には機械的特性における特異領域(際立って柔らかい領域)が数Mbおきに存在することを発見した。ゲノムDNAの階層的折り畳みにおいて、30nmファイバーよりも高次の構造の実体は未だに不明である。我々が発見した特異領域は、染色体の構築機構における重要な構造因子である可能性があり、さらに解析を進めている。

3.ヌクレオソームの自己集合能の解析:ニワトリの赤血球から精製したコアヒストンと各種DNAを用いて試験管内でヌクレオソームを再構成した。得られたヌクレオソームの混合溶液を解析した結果、同じDNAをもつヌクレオソーム同士が集合する傾向があることが示唆された。