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防御応答メカニズムを利用して成立したマメ科植物ー根粒菌共生の進化プロセスの検証

微生物と共生する植物は病原菌を排除しながら共生菌を受け入れなければならない。我々は以前に、マメ科植物において根粒菌との共生プログラムを起動する役割を果たすNFR1が、糸状菌のキチンを認識して防御応答を起動するCERK1から進化したことを明らかにした。本研究で我々は多くの非マメ科植物が持つCERK1が、防御応答だけではなく菌根菌共生にも関わっていることを明らかにした。菌根菌共生およびキチン防御応答は、最初の陸上植物であるコケ植物でも観察されるので、CERK1の二面的機能は陸上植物の進化の過程で共生と防御が密接に関わっていたことを示唆している。マメ科植物は根粒菌と共生を行うことで、窒素栄養を獲得することができる。一方で植物は多種多様な病原菌の脅威にさらされており、これに対抗するために高度な防御応答メカニズムを備えている。植物が病原菌を排除しながら、根粒菌を受け入れているメカニズムはほとんど研究が進んでいない。マメ科植物は根粒菌の分泌するNodファクターを認識することで、根粒菌を受け入れるためのプログラムを開始する。共生の開始に必須である植物のNodファクター受容体NFR1は、防御応答を担うことが知られているCERK1受容体から進化したことを我々は明らかにしている。本研究ではCERK1のどのような変化が防御から共生への変化をもたらしたのかについて調べることを目的とする。シロイヌナズナのキチン受容体AtCERK1の細胞内ドメインには、共生応答を誘導する能力が無い。しかしNFR1が持つ3アミノ酸のYAQ配列を導入すると、AtCERK1は共生応答誘導能力を獲得する。今年度の研究で同定したトマトやトウゴマなどの非マメ科植物CERK1ホモログはYAQ配列を持つことが明らかとなった。またイネやソルガムなどはYARの配列を持つが、シロイヌナズナと同じアブラナ科のハクサイ、ブロッコリーではYAQ/YAR配列が欠失していた。検証の結果、これらのYAQ/YAR配列を持つ非マメ科CERK1ホモログは全て共生応答誘導能力を持つことを明らかになった。根粒菌共生はマメ科植物に限定されているが、そのメカニズムの一部は陸上植物の80%が共生する菌根菌共生にも使われている。NFR1はこの菌根菌共生にも必須の経路を活性化する役割を持つが、菌根菌共生においてNFR1に相当する受容体はこれまで知られていない。我々はCERK1が菌根菌共生においてNFR1と同等の役割を果たしていると考え、次年度検証する予定である。また防御から共生への転換は、陸上植物-菌根菌共生時に起こった可能性がある。これを検証するために、陸上植物で最も古いコケ植物におけるCERK1の役割を調べる予定である。CERK1が防御応答だけではなく共生応答にも必須である可能性について、菌根菌が共生するイネのCERK1遺伝子破壊株を用いて解析を行った。その結果、oscerk1変異体においては、菌根菌共生が表皮で停止することが明らかとなった。その一方でOsCERK1と受容体複合体を形成することでキチン防御応答を起動することが知られているCEBiPの遺伝子破壊株oscebipでは正常な菌根菌共生が観察された。したがってキチン応答ではなくCERK1が菌根菌共生に必須であり、CERK1は防御と共生の二面的機能を持つことが判明した。我々の以前の解析結果から、マメ科植物で根粒菌共生応答を起動するNFR1は、非マメ科植物で防御応答を担うCERK1から進化したことが示唆されていた。共生菌を受け入れるためのプログラムを起動するNFR1が、なぜ正反対の病原菌を排除する役割を持つCERK1から進化したのかは謎であったが、今回の我々の結果から、そもそも非マメ科植物のCERK1自体が共生機能を持ち、それがNFR1への分子進化につながった可能性が示唆された。その一方でなぜCERK1が正反対の二面的な機能を持つのか?という新たな疑問が生じた。菌根菌共生は最初の陸上植物であるコケ植物で成立したと考えられている。我々は菌根菌共生の原点であるコケ植物でキチン防御応答および菌根菌共生のメカニズムを解析することで、CERK1の二面的機能の意義について明らかにできると考えている。これまでに整備されているコケのモデル植物であるゼニゴケおよびヒメツリガネゴケは、菌根菌共生をしない例外的な種である。そこで我々は現在、菌根菌共生を行うフタバネゼニゴケを用いて解析基盤の整備を開始した。現在までにフタバネゼニゴケにおいてもCERK1が1コピーのみ保持されていることや、キチン防御応答と菌根菌共生が観察できることを確認している。

マメ科植物は根粒菌と共生を行うことで、窒素栄養を獲得することができる。一方で植物は多種多様な病原菌の脅威にさらされており、これに対抗するために高度な防御応答メカニズムを備えている。植物が病原菌を排除しながら、根粒菌を受け入れているメカニズムはほとんど研究が進んでいない。マメ科植物は根粒菌の分泌するNodファクターを認識することで、根粒菌を受け入れるためのプログラムを開始する。共生の開始に必須である植物のNodファクター受容体NFR1は、防御応答を担うことが知られているCERK1受容体から進化したことを我々は明らかにしている。本研究ではCERK1のどのような変化が防御から共生への変化をもたらしたのかについて調べることを目的とする。シロイヌナズナのキチン受容体AtCERK1の細胞内ドメインには、共生応答を誘導する能力が無い。しかしNFR1が持つ3アミノ酸のYAQ配列を導入すると、AtCERK1は共生応答誘導能力を獲得する。しかし昨年度の研究から、トマトやトウゴマなどの非マメ科植物CERK1ホモログはYAQ配列を保持しており、さらにマメ科のNFR1と同様に共生応答誘導能力を持つことが明らかとなっている。根粒菌共生はマメ科植物に限定されているが、そのメカニズムの一部は陸上植物の80%が共生する菌根菌共生にも使われている。NFR1はこの菌根菌共生にも必須の経路を活性化する役割を持つが、菌根菌共生においてNFR1に相当する受容体はこれまで知られていない。我々はCERK1が菌根菌共生においてNFR1と同等の役割を果たしていると考え、菌根菌共生を行うイネにおいてCERK1遺伝子の破壊株を作製して解析を行っている。予想外の結果であるが、本年度得られた成果は当初の予想よりも重要で興味深いシステムの存在を示唆しており、当初の計画以上に進展していると評価している。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の想定とは異なる予想外の展開となっているが共生と防御の関係について、より重要な発見ができている。NFR1の先祖遺伝子でありキチン防御応答に関わるCERK1は最近の研究で糸状菌だけではなく細菌に対する防御応答にも関与することが報告されており、防御応答の中心的な役割を果たすことが明らかになっている。本研究で作製したイネのcerk1変異体の予備的な解析結果では、CERK1が共生に関与することを示す結果を得ており、非常に大きなインパクトをもたらす研究になる見込みである。今年度の研究で、防御応答を担うCERK1が菌根菌共生に関与する可能性が示唆されている。これを検証するために、イネのCERK1破壊株を作出して菌根菌共生への影響を調べる。また防御から共生への転換がどのように行われたのかを調べるために、菌根機共生を行うコケ植物でCERK1や共生遺伝子の機能を調べる予定である。本研究の主要な解析結果はそろいつつあり、最終年度である本年度はこの結果をまとめて論文投稿を行う。またインパクトの高い結果が得られているので、これを国内外に積極的に発信していく予定である。
稠密構造探査によるプレート境界浅部の断層構造・流体分布とスロー地震活動の関係解明

巨大地震の発生域の周囲では,スロー地震と呼ばれるゆっくりとした断層すべりが起こる.最近の研究で,こうした現象がプレートが沈み込み始める海溝に近いプレート境界浅部で多く見つかってきたが,そこでの岩石の物性や摩擦の特性はよくわかっていない.本研究はプレート境界浅部でスロー地震が頻発するニュージーランドヒクランギ沈み込み帯を対象として,海底地震計を用いた大規模探査のデータと波形インバージョン解析という先端的な解析手法を用いてプレート境界浅部の詳細な構造を解明する.巨大地震の発生域の周囲では,スロー地震と呼ばれるゆっくりとした断層すべりが起こる.最近の研究で,こうした現象がプレートが沈み込み始める海溝に近いプレート境界浅部で多く見つかってきたが,そこでの岩石の物性や摩擦の特性はよくわかっていない.本研究はプレート境界浅部でスロー地震が頻発するニュージーランドヒクランギ沈み込み帯を対象として,海底地震計を用いた大規模探査のデータと波形インバージョン解析という先端的な解析手法を用いてプレート境界浅部の詳細な構造を解明する.
リガンド結合型光触媒を用いた生体内標的タンパクノックダウン法の開発

26年度の研究成果において、生体環境調和性の高い光触媒、Ru(bpy)3で一電子酸化反応を誘起することによってペプチドやタンパク質が分解すること、ペプチド分解にはアミノ酸配列に依存性があることを見出した。そこで、平成27年度にかけて、細胞内に送達されて機能するタンパク質分解光触媒を開発すべく、標的へのリガンドを連結した触媒の合成、細胞内標的タンパク質の発現量変化の解析を行った。標的タンパク質として、上皮細胞増殖因子チロシンキナーゼ(EGFR-TK)を選択し、そのリガンドとしてアニリノキナゾリン骨格を有するイレッサを選択し、イレッサにRu(boy)3を結合させたリガンド結合型光触媒を分子設計し、その合成に成功した。この光触媒を用いて、EGFR-TKに対する標的タンパク質ノックダウン実験を行った。N,N-dimethylamino-N'-acyl phenylenediamine(TRT)の非存在下では、リガンド連結型のRu(bpy)3光触媒は一重項酸素の生成による酸化的なタンパク質ノックダウンを誘導することを見出した。一方で、同化合物存在下では、その反応は抑制されつつ、チロシン残基上でのタンパク質ラベル化反応が進行した。また、細胞内のタンパク質を標的にした実験系においても、標的のタンパク質ノックダウンとラベル化反応を外部刺激により制御できることが分かった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本課題は光触媒とタンパク質への親和性リガンドを連結させた低分子化合物と可視光刺激という二つの細胞外刺激によって、細胞内の任意のタンパク質を選択的に分解に導く新規方法論の確立を目的としている。26年度は、タンパク質親和性リガンドを連結させたRu(bpy)3光触媒を用いることで、タンパク質混在系の中でも任意の標的タンパク質上にチロシン残基のラジカル種を発生させる技術の確立を目的として研究を遂行した。まず、本手法の“標的タンパク質選択的にその表面に高活性なラジカル種を発生させることができる"といった新規な点に着目し、光刺激応答によって発生するペプチド鎖アミノ残基上のラジカル種の挙動を精査した。その結果、Ru(bpy)3錯体はチロシン残基以外のアミノ酸残基(Cys, Trp, Met, His)も一電子酸化的にラジカル化しており、中でもヒスチジン残基上のラジカル種生成がペプチド鎖の分解に関与すること、N,N-dimethylamino-N'-acyl phenylenediamine構造(Tyrosyl Radical Trapper: TRT)の添加によって光分解反応を抑制しつつチロシン残基のラベル化反応に誘導できることを見出した。このことから、Ru(bpy)3光触媒に標的タンパク質に特異的に作用するリガンド分子を導入することで、細胞内で標的タンパク質を選択的に不活性化させる可能性が示唆された。27年度は、炭酸脱水素酵素等を標的タンパク質に選定し、実際に細胞内で不活性化が可能かどうか検証する。Ru(bpy)3錯体はチロシン残基以外のアミノ酸残基(Cys, Trp, Met, His)も一電子酸化的にラジカル化しており、中でもヒスチジン残基上のラジカル種生成がペプチド鎖の分解に関与することを明らかにした。このことは、他の光感受性化合物によるタンパク質分解反応とは明らかに異なる機構で進行していることをしめすものであり、本手法はタンパク質不活性化(ノックダウン)の新しい手法を提案することに繋がり、学術的にも非常に意義がある。タンパク質親和性リガンドを連結させたRu(bpy)3光触媒を細胞内標的分子のノックダウンに応用展開する。具体的には、A431細胞における上皮成長因子受容体(EGFR)を標的にそのリガンドであるgefitinibを連結したRu (bpy)3錯体を新たに開発して、可視光刺激によってEGFRを選択的に分解させ、細胞レベルでも本手法が適応できることを証明する。
ヒト腎尿細管に特有なエンドテリン・一酸化窒素の作用と調節機構の意義

我々はAngIIが単離したヒト近位尿細管(PT)において野生型マウス(低濃度で刺激,高濃度で抑制)と違い濃度依存的にNa輸送を刺激することを見出した。マウスでの刺激はMEK/ERK,抑制はNO/cGMP/cGKIIを介すること,ヒトでの刺激はNO/cGMP/ERKを介することも示唆された。AngIIのPT作用における細胞内Caの関与はマウスではないが,ヒトではCa濃度依存性にPT輸送亢進が認められた。エンドセリン(ET)もマウスではごく僅かにAngIIと同様の二相性反応,一方ヒトでは濃度依存性に強い刺激が見られた。ヒト腎での血圧上昇におけるAngII,NO,Ca,ETの意義が示唆された。アンジオテンシンII(AngII)は血管収縮作用に加えて強力な腎尿細管Na再吸収亢進作用を有し,高血圧発症,慢性腎臓病進行に大きく関与している。最近,AngIIの血圧上昇作用には近位尿細管(PT)でのNa輸送亢進が不可欠であることが示された。一方,一酸化窒素(NO)やエンドテリン(ET)はNa利尿作用を有し,AngIIの尿細管作用と拮抗する。ここで興味深いことに,筆者らはAngIIが単離したヒトPTにおいて他種と違い一相性の濃度依存性刺激作用のみを有することを確認した。この詳細な機序と意義について,主にヒトとマウスPTの反応を比較しつつ解析を行った。ヒトにおいては,AngIIは濃度依存的かつ一相性にPTのNa-HCO3共輸送体(NBCe1)活性を亢進させた。この作用は,アンジオテンシン受容体(AT1)阻害剤の存在下では大半が阻害され,またMEK/ERK阻害剤の存在下では殆ど阻害された。ERKのリン酸化もAngIIにより濃度依存的に刺激された。これらより,ヒトではAngIIが濃度依存的に近位尿細管Na輸送を総じて亢進させることが示唆された。これまでの知見より,マウスではAngIIのPT作用は二相性(低濃度で刺激,高濃度で抑制)であり,ヒトとマウスのAngIIに対するPTの反応性の違いが明らかになった。次いでNO及びその経路の関与について調べたところ,マウスPTではNO合成酵素阻害薬L-NAMEの存在下でAngIIの抑制作用が消失し,NBCe1活性亢進とERKリン酸化が認められ,NO経路がマウスPTに対するAngII抑制作用に関与する可能性が示唆された。一方ヒトでは,L-NAMEによりAngIIの一相性刺激作用が消失し,AngIIの刺激作用がNO経路を介することが示唆された。アンジオテンシンII(AngII)は血管収縮作用,強力な腎尿細管Na再吸収亢進作用を有し,高血圧発症,慢性腎臓病進行に深く関与している。昨年度に引き続き,ヒトとマウスPTの反応性を比較検討した。昨年度の研究で,マウスではNO経路がAngII抑制作用に関与する一方,ヒトではNO経路がAngII刺激作用に関与することが示唆されており,AngII作用の種差の由来を検討した。蛍光色素DAF-FMによりPT細胞内でのAngII反応性NO増加反応を調べたところ,ヒト,マウスともにAngIIは濃度依存性にPT細胞内NOを増加させた。このことから,AngIIのNBCe1に対する作用の種差がNO産生経路には依らないと推察された。次いでエンドセリン(ET1)のNBCe1に対する作用について検討した。マウスPTに各々10 -12 M,10 -10 M,10 -8 MのET1を添加したところ,以前の報告(JCI 1994 Jun;93(6):2572)と同様にごく僅かに低濃度で刺激,高濃度で抑制の二相性反応が見られた。一方ヒトでは濃度依存的に極めて強くNBCe1活性を増強させた。昨年度に引き続いてPTでの血圧調節物質の調節に関する種差について詳細に検討を行った。

蛍光色素DAFによる細胞内NOの量のAngIIによる変化に関し追試を行い,マウスではAngII 10-6Mの添加により細胞内NOは16%増加した。ヒトではAngII 10-8Mにより3.4%,10-6Mにより2.4%の増加を認めた。AngIIのNBCe1作用の種差はNO産生経路には依らないことが推察されたが,産生されるNOの増加量についてはさらに検討の余地があると考えらえた。また今年度はAngIIのPT作用における細胞内Caの意義について検討を行った。細胞内Caのキレート剤(BAPTA/AM)をloadingしたヒトPTではAngIIのNBCe1増強作用がほぼ消失した。またCa-ionophoreであるionomycinはヒトPTのNBCe1活性を増強したが、マウスPTのNBCe1活性は変化させなかった。この結果は以前当研究室にてウサギPTの検討を行い得られた結果(Am J Physiol 1996;271:F1068)と同等であった。AngIIのPT作用は,ヒトでは細胞内Caに依存するが,マウスでは依存しないことが考えられた。我々はAngIIが単離したヒト近位尿細管(PT)において野生型マウス(低濃度で刺激,高濃度で抑制)と違い濃度依存的にNa輸送を刺激することを見出した。マウスでの刺激はMEK/ERK,抑制はNO/cGMP/cGKIIを介すること,ヒトでの刺激はNO/cGMP/ERKを介することも示唆された。AngIIのPT作用における細胞内Caの関与はマウスではないが,ヒトではCa濃度依存性にPT輸送亢進が認められた。エンドセリン(ET)もマウスではごく僅かにAngIIと同様の二相性反応,一方ヒトでは濃度依存性に強い刺激が見られた。ヒト腎での血圧上昇におけるAngII,NO,Ca,ETの意義が示唆された。ヒトと他種のPTにおけるAngIIに対する反応性の比較については,NO作用,ET1作用について解析が進んでおり,概ね順調といえる。腎臓内科学1.AngIIのNBCe1に対する作用における細胞内Caの意義について検討を行う。具体的には,Caキレート剤を添加した状態でAngII作用を検討し,また逆にCa-ionophoreを添加し細胞内Ca濃度を上昇させ同様の検討を行う。2.ET1に関しては,NBCe1に対してマウスで二相性,ヒトで強力な濃度依存的刺激作用と興味深い結果が得られており,申請者らが開発した単離PT培養系(Kidney Int 2015)を用いてET1作用を媒介する受容体(ETA/ETB)の同定を試みるとともに,同様に申請者らが開発した新規管腔側輸送体解析法を用いて管腔側NHE活性に対する作用を検討する。3.前年度に引き続き,AngIIに対する近位尿細管反応の種差におけるNOS/NO/sGC/cGMP経路の意義について,単離した尿細管を用いた生理実験やERKリン酸化の解析,各種阻害薬に対する反応などにより検討する。野生型マウスに加えてcGKII欠損マウスも用いて同様の実験を行い、cGMP以下の経路についても検討する。ヒトと他種の近位尿細管におけるAngIIに対する反応性の比較については,NOを中心とした情報伝達の経路の詳細の解析が進んでおり,順調に進捗していると考えている。AngIIに対する近位尿細管反応の種差におけるNOS/NO/sGC/cGMP経路の意義について,単離した尿細管を用いた生理実験やERKリン酸化の解析,各種阻害薬に対する反応などにより検討する。また,PTのNBCe1以外のNa輸送体(NHEなど)に対するAngII作用についても検討する。物品費の支出が予想より少なかったため。
乳腺外来患者(がん患者)の遺伝に対する意識と心理的ストレスに係る臨床心理学的研究

乳腺外来を受診する患者に対して、不安や心配、考え、気持ちについて自由に話してもらったところ、遺伝に関する意識を自発的に表出した患者は、初診時(確定診断前)には233名中39名(16.7%)、確定診断後には133名中9名(6.9%)であった。また、乳がん家族歴や遺伝に関する意識は、確定診断前の患者にとって心理的ストレスとは関連がなかった。しかしながら、面接内容の質的分析より、遺伝に対する意識は肯定的なものから否定的なものまで多様であり、個別のとらえ方を踏まえた対応が医療職者には望まれることが明らかとなった。乳腺外来愚者が抱く遺伝に対する意識に関する特徴を明らかとするため、乳腺外来を初診にて受診した患者(確定診断前)233名に対して実施した面接調査から、遺伝に関する意識を自発的に表出した患者を抽出したところ、39人(16.7%)の患者が臨床心理士との面接において自発的に遺伝に関する内容を語っていた。乳がん家族歴があり遺伝に関する意識を表出した患者、乳がん家族歴がなく遺伝に関する意識を表出した患者、乳がん家族歴があり遺伝に関する意識を表出しなかった患者、および乳がん家族歴がなく遺伝に関する意識を表出しなかった患者の4群における心理的ストレス(質問紙:Profile of Mood Statesにて測定)を比較したところ、これらの患者間に有意な心理的ストレスの差は見いだせなかった。すなわち、乳がん家族歴や遺伝に関する意識は、確定診断前の患者にとって心理的ストレスとは関連がないことが明らかとなった。しかしながら、面接内容の質的分析より、家族歴があるものの中でもそれを肯定的にとらえている患者・否定的にとらえている患者がおり、個別のとらえ方を踏まえた対応が医療職者には望まれることが明らかとなった。本研究成果は、実際の臨床現場に還元される有用な知見であり、現在学術論文としてまとめ、Familial Cancer誌に投稿中(査読中)である。臨床研究として「遺伝カウンセリング研究」に取り組む意義は大きいにも関わらず、日本国内において遺伝カウンセリング研究を科学的に実施する研究者は少なく、研究指導体制そのものが脆弱な現状がある。この状況に関して専門家内での討論を実施する場として、日本人類遺伝学会第55回大会シンポジウム「サイエンスとしての遺伝カウンセリング研究」が企画された。報告者は本シンポジウムの座長および講演者を務め、本研究課題の結果を例示しながら、研究の有用性について討論を行った。乳腺外来患者が抱く遺伝に対する意識の特徴を明らかとするため、乳腺外来を初診にて受診した患者(確定診断前)233名に対して、確定診断前、確定診断時、初期治療(入院治療)を終え退院2週間後から1年後に渡り、縦断的に面接調査を実施した。参加者233名は、確定診断において74名が乳がんと診断され、159名は良性腫瘤/乳腺症といった乳腺における良性の疾患と診断された。確定診断前(初診時)における乳腺外来患者が抱く遺伝に対する意識については、昨年度解析を実施し、本年度、Familial Cancerに投稿し、受理・出版された。確定診断前(初診時)に面接調査を実施し、さらに確定診断後に面接調査を実施できた131名(乳がん患者34名、良性疾患患者97名)のうち、9名(6.9%)が確定診断後の臨床心理士との面接において自発的に遺伝に関する内容を語っていた。一方、131名中確定診断前(初診時)に遺伝に関する意識を自発的に表出した患者は25名(19.1%)であった。確定診断前後における遺伝に関する意識表出の頻度に関してFisherの直接確率検定を行ったところ、確定診断後には遺伝に関する意識を表出しなくなる傾向があった(x^2(1)=4.025,p=0.067)。面接内容の質的分析から、乳がんと診断された患者は今後の治療や自身の生活に対する懸念や不安を述べることが多く、良性(乳腺症や良性腫瘤など)と診断された患者は安堵感を述べることが多いことが、その理由として考えられた。また、乳がんと診断された患者のうち継続面接が可能であった28名に対して、初期治療を終えた2週間後から約1年後までの期間に実施された138面接においても遺伝に関する意識表出頻度は2.9%(4/138)と低かった。面接内容の質的検討から、治療期間においては、実施している治療に関して述べられることが多いことがわかった。本研究における知見は、遺伝に関する情報の患者への伝達時期/遺伝カウンセリング導入時期に対する患者のレディネスに関する検討の一助となるものであり、臨床活動に還元できるものであった。
摩擦誘導超低摩擦ナノ構造層によるスマートトライボシステムの開発

摩擦誘導ナノ構造層による超低摩擦の安定指針を得るため2つの装置を試作し、超低摩擦発現モデルを提案した。「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」により、カーボン系硬質膜の無潤滑時の超低摩擦は摩擦で形成するナノ構造変化層の厚さ、硬さ及び表面粗さが重要で、それらのパラメータを用いた「薄膜固体潤滑理論」が超低摩擦モデルとして妥当であることを定量的に明らかにした。また、「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」により、摩耗痕の表面エネルギーの低減が摩擦低減に有効であることを定量的に明らかにし、超低摩擦が発現した際はナノ構造層の内部で摩擦する超低摩擦メカニズムを提案した。平成25年度は,ピンオンディスク型摩擦装置と反射分光分析装置を複合した「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」を試作し、摩擦力とナノ構造変化層の光学特性を同時に計測し、超低摩擦発現の必要条件を検討した。具体的内容を以下に示す.1.「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」の試作とその場計測の可能性の実証カーボン系硬質膜が摩擦係数0.01以下の超低摩擦を発現する際は、その構造変化層厚さ,合成表面あらさの標準偏差の比がある値以上となることが必要である。しかし、これらのパラメータが摩擦に伴いどのように変化するか不明であり、その変化により早期に安定した超低摩擦状態となるか、それとも長期間必要か、またその原因は構造変化なのか表面あらさなのか不明となる。そこで、本研究では、ピンオンディスク型摩擦装置及び反射分光分析装置を複合した「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」を環境制御チャンバー内に試作し、摩擦初期からのナノ構造変化層の厚さと摩擦力を計測した。2.超低摩擦発現ナノ構造変化層の誘電関数から硬さの推定(光学特性からの硬さの非接触推定)本研究で試作する「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」により構造変化層の厚さだけでなく,極表面のナノ構造変化層の誘電関数を求めることが可能である.そこで,本研究では,「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」で摩擦面のナノ構造変化層の誘電関数からsp3/sp2の割合に及ぼすすべり距離の影響を摩擦時その場計測した。種々のモデル試験片で校正をとり、得られた結果が妥当であることを明らかにした。また、更にESRのデータと会わせることで、ダングリングボンド密度のその場計測も可能であることが明らかにされた。1.「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」による超低摩擦発現条件の実証試作した「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」により市販の水素含有DLCにおいて、乾燥窒素吹付け下で、摩擦力、ナノ構造変化層厚さ及び硬さを同時に計測する手法を提案し、摩擦時その場で評価した。その結果、摩擦の減少とともに、水素含有率が高い軟質なグラファイト層が生成し、それに伴い摩擦が減少することが明らかになった。水素含有DLC膜は元来消衰係数が大きく構造変化層の形成が確認できるか不明であったが、本研究成果により本手法が適応可能であることが明らかになった。その結果、水素含有DLC膜においても超低摩擦発現に構造変化層が重要であることが明らかになった。2.「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」の試作と実証「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」を試作し,CNx膜において窒素雰囲気下での、窒素中摩擦、直後の表面エネルギー測定を、繰り返し行えるようになり、摩擦によるカーボン系硬質膜の表面エネルギーの変化の測定を可能にした。3.負バイアスを印加した表面波励起マイクロ波プラズマによる水素,窒素及びシリコン含有の異なるカーボン系硬質膜の成膜とそれらのナノ構造変化層と摩擦特性に及ぼす影響「表面波励起マイクロ波高密度プラズマ」を用いて,原料ガスである,メタン,アルゴン及びTMS(テトラメチルシラン)の流量比により,水素、窒素及びシリコン等の含有率を徐々に変化させたカーボン系硬質膜を成膜した。ベース油中で摩擦試験を行い,ラマン分光分析、X線分光分析による摩擦前後のカーボン系硬質膜の構造の変化を明らかにした。1.「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」の試作と実証H27年度には、水素含有DLC膜(a-C:H膜)において、同様の乾燥窒素吹き付け中の摩擦におけるナノ構造変化層の各パラメータの摩擦に影響を明らかにした。その結果、誘電関数の変化から水素の離脱が摩擦に大きな影響を及ぼす可能性が示された。2.「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」の試作と実証環境制御型走査電子顕微鏡ESEMの観測用チャンバー内に小型の往復型摩擦装置を組み込んだ、「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」において、繰り返し摩擦に伴う表面エネルギーの分散力成分と水素結合力成分の変化を検出可能である事が明らかになった。3.「バイアスを印加した表面波励起マイクロ波プラズマによるCVDカーボン系硬質膜」と「イオンビームミキシング・フィルタードアーク成膜法による超低摩擦カーボン系硬質膜の成膜」フィルタードアーク成膜法(FCVA法)に窒素イオンビームを同時照射する、イオンビームミキシング・フィルタードアーク成膜法(EBA-FCVA法)を提案、試作した。得られたテトラゴナル窒化炭素膜(ta-CNx)のXPSによるsp

3/sp2比の評価及びベース油中摩擦実験を行い超低摩擦の可能性を検討した。その結果、窒素の含有率と共に摩擦係数と耐摩耗性が著しく減少することが明らかとなった。1.「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」の試作と実証カーボン系硬質膜の数nmの構造変化層の光学特性を誘電関数で評価することで、構造変化層の膜厚と構造及び表面粗さを非接触でその場分析が可能であり、H25年に窒化炭素膜(CNx膜)、H26年に水素含有DLC膜(a-C:H膜)において、摩擦係数を支配するパラメータの取得に成功しており、予定通りである。2.「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」の試作と実証H26年にESEMチャンバー内での冷却ステージ上で繰り返し摩擦する「表面エネルギーのその場評価装置」の開発には成功した。しかし、摩擦係数の評価のためには高精度で摩擦係数を計測する必要があるが、現状の摩擦装置では、電気ノイズや機械振動が発生し、安定した摩擦力の評価に至っていない。今後、発生電磁波の抑制や摩擦計測装置のコンプライアンスを最適化することで摩擦力のその場計測が可能となり、当初の目的である摩擦力と表面エネルギーの関係を明らかにする事が可能となる。問題点が明確でありH28年度には予定通りに、摩擦係数と表面エネルギーの関係が明らかになる予定である。3.「バイアスを印加した表面波励起マイクロ波プラズマによるCVDカーボン系硬質膜」と「イオンビームミキシング・フィルタードアーク成膜法による超低摩擦カーボン系硬質膜の成膜」H26年に試作された両成膜装置による水素,窒素及びシリコン等の含有率を自在に変化させsp3/sp2比の制御により硬さを制御し、かつ多層膜の制御も可能なため、上記で述べた2種類の「摩擦時その場評価装置」により評価分析する事で摩擦誘導超低摩擦ナノ構造層によるスマートトライボシステムの材料の設計指針の提案が可能となる。本年度は「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」と「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」による摩擦誘導ナノ構造層による超低摩擦の安定実現の実証を行った。具体的に行った内容を以下に示す。1.「超低摩擦発現ナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置」による種々のスマートトライボ膜の評価窒化炭素膜(CNx膜)にベース油中摩擦におけるナノ構造変化層の摩擦時その場計測装置を行い、構造変化層、油膜厚さと超低摩擦の関係を明らかにした。その結果、潤滑状態が境界潤滑よりは流体潤滑へ移行するだけではなく、油性に影響を及ぼすと思われるCNx表面の構造変化層の分極率と近傍の油膜の分極率が増加した,CNx膜と潤滑油間のファンデルワールス力が増加し,油分子が構造変化層極表面に吸着し,吸着分子膜を形成することで,境界潤滑部の摩擦係数が減少し,低摩擦を発現することが示唆された.2.「超低摩擦摩擦面の表面エネルギーのESEM内その場評価装置」による種々のスマートトライボ膜の評価表面エネルギーのESEM内その場評価装置を用いて未だ未解明であるカーボン系硬質膜の表面エネルギーと超低摩擦の関係を明らかにした。その結果、表面エネルギーが減少するに従って摩擦係数が減少し,表面エネルギーが最も低い値を示した試験片で摩擦係数μ=0.05の低摩擦を発現することが明らかになった.
原子層成長法による超均一・低抵抗ZnO薄膜の開発

本研究では、プラズマ耐性が高く、また150°C程度の低温度において形成が可能であるなど優れた特徴を有するZnO膜に着目し、均一で低抵抗なZnO膜を得るために新しく原子層成長法(ALD)による製膜を提案し、その成長条件を明らかにした。その結果、ALD法で作製した膜は従来の有機金属化学気相堆積法(MOCVD)で作製した膜より導電率及ぴ透過率が高く、また面内均一性に優れていることが明らかとなった。次に、導電性が高いZnO膜を得るために、H_2希釈B_2H_6を用いてボロンドービングを行った。その結果、膜厚400nmにおいて抵抗率5x10^<-4>Ωcm、シート抵抗12Ωの低抵抗ZnO膜の作製に成功した。この値は、MOCVD法による作製した厚さが同程度のZnO膜より1桁以上低い。さらに、得られた低抵抗ZnO膜の安定性について検討を行った。スパッタ法あるいはMOCVD法などにより作製したZnO薄膜は、熱アニール等に対して不安定であることが知られている。そこで、ALD-ZnO膜が同様な不安定性を有するかどうかについて検討を加えた。その結果、ALD法で作製したZnO膜は長期間大気中に放置したい場合でも、安定であることが明らかとなった。特に、n型ドーピングを行った膜においては、放置から2年間が経過しても、抵抗率はほとんど変化せず、非常に良好な安定性を示すことが明らかとなった。また、MOCVD法により作製した膜の抵抗率の変化は、電子移動度の低下が主であることが明らかとなった。さらに、MOCVD法により凹凸構造を有するZnO薄膜を作製し、その表面を安定性に優れるALD-ZnO膜を用いて被覆する二段階成長法を新たに提案した。この手法を用いることにより、安定性に優れた低抵抗かつ凹凸構造を有するZnO薄膜を作製することに成功した。最後に、得られた均一・低抵抗ZnO膜をa-Si太陽電池の透明導電膜へと応用した。その結果、p層成長時の条件等を最適化することにより、安定化効率8.2%のa-Si太陽電池を実現した。透明導電膜(TCO)は、アモルファスシリコン(a-Si)太陽電池の変換効率を向上する上で非常に重要な役割を果たしている。これまでa-Si太陽電池の透明導電膜としては、化学気相堆積法(CVD)により作製したSnO_2が用いられてきた。しかしながらその製膜温度は約600°Cと高く、また水素プラズマによる膜特性の劣化があり、これらがSnO_2の太陽電池への応用を制限してきた。そこで本研究は、プラズマ耐性が高く、また150°C程度の低温度において形成が可能であるなど優れた特徴を有するZnO膜に着目し、均一で低抵抗なZnO膜を得るために新しく原子層成長法(ALD)による製膜を提案し、その成長条件を明らかにした。

成長時の原料ガスにはジエルチル亜鉛(DEZn)およびH_2Oを、キヤリアガスにはアルゴン(Ar)を用いた。これらの原料ガスを交互供給することにより、Corning7059ガラス基板上にZnOの製膜を行った。その結果、膜の成長速度は基板温度105°Cから165°Cまで変化せず、1サイクルあたりの平均膜厚がZnO(100)の面間隔とほぼ等しくなり、ALD法による成長の自己停止機構を初めて確認した。更に、得られた膜の電気的特性を評価したところ、従来のMOCVD法で作製したZnO膜より移動度が高く、均一性に優れていることが明らかとなった。次に、導電性が高いZnO膜を得るために、H_2希釈B_2H_6を用いてボロンドービングを行った。その結果、膜厚400nmにおいて抵抗率5x10^<-4>Ωcm、シート抵抗12Ωの低抵抗なZnO膜の作製に成功した。この値は、MOCVD法による作製した厚さが同程度のZnO膜より1桁以上低い値である。昨年度までに本研究では、ALD法によるZnO薄膜の作製を行ってきた。その結果、均一性に優れたZnO薄膜をALD法により作製可能であることを明らかした。本年度は、新たにB_2H_6を用いたn型ドーピング技術の開発を行った。はじめに、B_2H_6の均一ドーピングを試みた。しかしながら、ALD成長時にボロンを均一にドーピングすると、過剰のボロンが膜内に取り込まれてしまい、良好な特性を有する低抵抗ZnO膜が作製できないことが明らかとなった。そこで次に、ボロンを導入する間隔を調整することにより、キャリア濃度の制御を試み、抵抗率6.4×10^<-4>Ωcmの低抵抗Zn○薄膜の作製に成功した。本年度はさらに、得られた低抵抗ZnO膜の安定性について検討を行った。スパッタ法あるいはMOCVD法などにより作製したZnO薄膜は、熱アニール等に対して不安定であることが知られている。そこで、ALD-ZnO膜が同様な不安定性を有するかどうかについて検討を加えた。その結果、ALD法で作製したZnO膜は長期間大気中に放置したい場合でも、安定であることが明らかとなった。特に、n型ドーピングを行った膜においては、放置から2年間が経過したも、抵抗率はほとんど変化せず、非常に良好な安定性を示すことが明らかとなった。また、MOCVD法により作製した膜の抵抗率の変化は、電子移動度の低下が主であることが明らかとなった。さらに、MOCVD法により凹凸構造を有するZnO薄膜を作製し、その表面を安定性に優れるALD-ZnO膜を用いて被覆する二段階成長法を新たに提案した。この手法を用いることにより、安定性に優れた低抵抗かつ凹凸構造を有するZnO薄膜を作製することに成功した。最後に、得られた均一・低抵抗ZnO膜をa-Si太陽電池の透明導電膜へと応用した。その結果、p層成長時の条件等を最適化することにより、安定化効率8.2%のa-Si太陽電池を実現した。
超好熱生物の遺伝情報はどのように守られ、伝達されるのか？

kodakarensisには3種のMcmと2種のPCNAが存在する生理的意味を解明すべく、これらのタンパク質の生化学的性質解析とこれらをコードする遺伝子破壊株の性質を調べる遺伝学的解析の双方から研究を進めた。またDNAの塩基に損傷が入った場合の修復機構を解析した結果、P. furiosusから、全く新規のDNA切断酵素を発見し、Endonuclease Qと名付けて、国際特許出願した。昨年度にクローニングした、Thermococcus kodakaraensisの3種のmcm遺伝子のうち、mcm3遺伝子は破壊株が得られず、生存に必須の遺伝子であることが推定された。他の二つは必須ではないものの、細胞内では産生されていることを確認した。従って、Mcm1, Mcm2タンパク質の細胞内での機能は何なのか大変興味が持たれる。DNA修復のどこかの過程で機能していることを考えて研究を進めている。発現させたMcm蛋白質は高純度に精製して、in vitroにおける活性を測定した。3種のMcmは、どれもそれら自身でヘリカーゼ活性を示した。また、GINSタンパク質との相互作用も示すので、Mcm1, Mxm2はMcm3とともにDNA代謝の何か重要な機能を担っていることが予想され、その解明を目指している。また、T. kodakarensisの近縁種であるPyrococcus furiosus由来のタンパク質について、これまでに、PCNA-DNA-DNAリガーゼ複合体やPCNA-DNA-DNAポリメラーゼ複合体、さらに、ウラシルグリコシラーゼ-DNA-APエンドヌクラーゼ-PCNAという塩基除去修復に関わる複合体について、機能と構造の関係を解明して来た。さらに本課題では、T. kodakaraensis,P. furiosusを用いて複製ヘリカーゼ複合体の解明を目指しているが、MCM-GINSに、RecJ様のタンパク質が安定に結合することを見出した。GINSは、RecJ様タンパク質の有するエキソヌクレアーゼ活性を促進することも発見した。この促進作用の生理的な意味を明らかにするとともに、このMCM-GINS-Cdc45複合体が複製ヘリカーゼとして重要であることを予想して、その構造解析を進めている。複合体を高純度に調製して、結晶化、電子顕微鏡観察などへ進めている。DNA複製開始やフォークの進行にとって重要なGINS複合体をThermococcus kodakaraensis由来のものと、Thermoplasma acidophilum由来のものについて比較解析した。これらのGINSはMcmヘリカーゼと相互作用をすることが分かったが、さらにRecJ様の配列を有するタンパク質が安定に複合体を形成することも発見した。また、T. acidohilumはCdc6を二つ有しており、そのうちCdc6-2がMCMヘリカーゼを促進すること、そしてその促進効果はGINSとの間で相乗的であることと、DNA上でMCM-GINS-Cdc6-2複合体が、少なくとも一時的に構築されることを合わせて論文原稿を作成した。さらに、超好熱性アーキアのゲノムDNAの安定性を維持するための新規ヌクレアーゼを発見し、PfuExoI, EndoQというように命名しが、特許出願する(EndoQは国際出願)とともに、基礎的性質解析と遺伝子工学的試薬としての応用開発研究へ進めた。この酵素の性質をさらに詳細に調べて論文原稿にまとめた。PfuExoI遺伝子の破壊株は比較的容易に単離できたが、endoQは困難を極めた結果、部分破壊株単離に成功したので、その影響を調べる実験を進めている。また、PfuExoI, EndoQ両酵素とも結晶構造解析に成功し、立体構造情報をえることができた。今後のさらなる発展が期待される。T.kodakarensisゲノム上に存在する2種のpcna遺伝子の産物の機能解析を進めた。また分担者によりこれらの遺伝子破壊株の単離が試みられたが、PCNA2に対する破壊株は得られ、PCNA1は得られなかったので、PCNA1は生育に必須であると予想された。PCNA2の破壊株の表現形を詳細に調べた。PCNA2が欠失した変異体はDNA修復異常が観察されるかと予想されたが、これまでの実験結果は、紫外線や変異原化学物質に対する感受性において野生株と比較して差が観察されていない。PCNA1, PCNA2と特異的に結合するタンパク質をスクリーニングした結果、PCNA1とは異なるタンパク質が結合することがわかり、今後の研究が期待できる。DNA複製開始やフォークの進行にとって重要なGINS複合体をT. kodakaraensis由来のものと、Thermoplasma acidophilum由来のものについて比較解析した。また、T. acidohilumはCdc6を二つ有しており、そのうちCdc6-2がMCMヘリカーゼを促進すること、そしてその促進効果はGINSとの間で相乗的であることを発見した。アーキア細胞の中でもDNA複製機構は多様性を示すことが証明された。

さらに、ゲノムDNAの安定性を維持するためのDNA修復機構には多くのヌクレアーゼが関与することが想像されるが、超好熱性アーキア由来の新規ヌクレアーゼを発見し、PfuExoI, EndoQというように命名した。これらの酵素は特許出願するとともに、基礎的性質解析と遺伝子工学的試薬としての応用開発研究へ進めた。本研究では多くのDNA関連酵素の活性測定を行う必要があるが、その際にはDNA基質の純度が悪いと、結果の正確な判定がむずかしくなる。そのために、昨年度の予算を繰り越して、DNAを精製するための装置を購入した。その結果、常時高純度のDNAが得られるようになり、研究の進展に大変役立った。研究内容は、二種類のPCNA,三種類のMCMの役割分担を解明すること、さらに、それらとの特異的相互作用因子を調べ、分子機構解析を発展させること、また、修復にかかわる種々の酵素の性質解析とその機能的役割について、進展させた。25年度が最終年度であるため、記入しない。超好熱性アーキアのDNA複製、修復に関与するタンパク質因子、酵素に関して、生化学手法とと遺伝学的手法を取り入れた、きっちりした研究の進行が実現できている。これまでに実績のあるテーマについて、さらに進展させる共に、新規酵素の発見など新たな展開もできている。新規酵素については特許も出願できている。新規な発見に関しては、出願まで対外発表を控えた。アーキアの遺伝情報が如何に守られているかを解明するための方向として、アーキアの持つDNA修復機構の解析は大変重要なので、新規に発見した3種の酵素の高純度精製法の確立、生化学的性質解析、結晶化、X線構造解析、遺伝子破壊株作成と変異体の解析について、精力的に進めていく。新たに発見したヌクレアーゼであるPfuExo I, Endo Q, NucSの3種について、その構造と機能を詳細に解明するとともに、細胞内での具体的な役割を突き止めるべく、研究を展開したい。これらの酵素について、高度精製法の確立、結晶化、X線構造解析、生化学的酵素解析、遺伝子破壊による変異体解析等を精力的に進める計画を実行する。これらの研究を通して、アーキアのあらたなDNA修復系の発見につながり、またその成果を応用した新技術開発が期待でかる。
色光刺激を用いた新しい瞳孔視野計による他覚的視野測定

本研究は局所刺激に対する対光反射の瞳孔反応量を視感度として捉え,視野を他覚的に評価するものである。従来にない特徴は網膜神経節細胞の機能特性に応じた色光刺激を用い,視野をこれまでとは違った角度から多角的かつ他覚的に測定する点である。新しい瞳孔視野計の開発については,色光刺激に適したディスプレイを選定,赤外線CCDとマクロレンズの組み合わせを試用し,撮影画角や画質、サンプリングレートなどを確認した。瞳孔視野測定用の専用プログラムを開発し,今後の臨床評価に向けて必要な分析ならびに基礎的な検討が完了した。2015年度は当初の計画通り,色光刺激が可能な新しい瞳孔視野計の開発に着手した。色光刺激に適したディスプレイとその機能を評価するための輝度計を購入し,刺激系の構築を進めている。記録系としては当初予定していた赤外線CCDより高性能なものが発売された。レンズと組み合わせて試用し,撮影画角や画質,サンプリングレートなどを確認した。2016年の2月には本研究の研究協力施設であるTuebingen大学(ドイツ)の研究室を訪問し,研究の進捗状況および今後の方向性について協議した。また瞳孔視野の測定および分析のための専用プログラムの提供を受け,当方のシステムに組み込んでいる。試作した瞳孔視野計を用いた予備実験は順調に進行してる。メラノプシン含有網膜神経節細胞の反応をより効果的に抽出できる刺激法とそれに応じた分析法の考案に取り組み,それらを一連のシステムに組み込んでいる。2015年度は色光刺激が可能な新しい瞳孔視野計の開発に着手した。色光刺激に適したディスプレイとその機能を評価するための輝度計を購入し,ディスプレイの性能を確認した。記録系としては赤外線CCDとマクロレンズの組み合わせを試用し,撮影画角や画質,サンプリングレートなどを確認した。2016年度は新しい瞳孔視野計を用いて正常データのデータ収集を行った。今後の臨床評価に向けて必要な分析ならびに基礎的な検討が完了した。関連研究として,国内外の大学と共同で取り組んだ対光反射に関係する内容が海外の雑誌に掲載された。色光刺激を用いた対光反射の記録については,新しい機能評価として注目され,いくつかの新知見を得ることが出来た。これらの研究成果をもとに,開発した瞳孔視野計に新機能を追加した。今後は臨床応用を計画しており,視野異常の他覚的検出に取り組む予定である。2016年度は色光刺激を用いた瞳孔視野の測定と評価の方法を確立し,正常データベースを構築する。システムの細かな調整を行い,健常人を対象としたデータ採取を開始する。蓄積した研究成果は国内外の学会および雑誌に広く発表する。神経眼科学当該年度に研究討議のための海外渡航費を計上していた。実際に渡航し研究討議を行ったが,別の助成が確保できたので今回はその予算で支出することとなった。研究討議のための海外渡航費として使用する予定である。また国内外の学会および雑誌投稿の費用として使用する。
急性膵炎におけるカルシウム結合蛋白の役割ー新たな創薬を目指して

S100gは主に十二指腸に発現しているタンパクである。mRNAレベルでは膵臓にも発現しているが、蛋白レベルでは免疫染色においてもウエスタンブロットにおいても膵臓に発現はみられなかった。コレシストキニンのアナログであるセルレインを複数回投与して実験的膵炎を惹起すると膵臓における発現が増加し、蛋白レベルでも同定できるようになった。つまり、急性膵炎反応によって膵臓に発現が誘導された。そして、コントロールマウス、S100gノックアウト(KO)マウスを比較すると、膵炎反応はS100g KOマウスで軽減していた。血清アミラーゼの上昇に差はなかったが、膵組織中のトリプシン異所性活性化はS100g KOマウスで抑制された。ラット膵腺房細胞癌由来のAR42J細胞は膵外分泌モデルとして使用されている。この細胞にS100gを過剰発現させた細胞(AR42J-S100g)を樹立した。コレシストキニン(CCK-8)刺激によるアミラーゼ分泌の変化、fura-2を用いた細胞内カルシウム濃度[Ca2+]iの変化をコントロール細胞(AR42J-GFP)と比較検討した。100pM CCK-8による分泌刺激において、AR42J-S100gではアミラーゼ分泌が抑制され、[Ca2+]iの上昇も著明に抑制された。これらの結果から、過剰なCCK-8刺激においてS100gは[Ca2+]iの上昇にブレーキをかける働きをしているが、S100g KOマウスではその上昇にブレーキがかからず、外分泌が亢進したままの状態となる。そのため、細胞内のトリプシノーゲン量が少なくなり、細胞内での異所性活性化が抑制され、S100g KOマウスでは膵炎反応が軽減したものと考えられる。但し、これは仮説であり、検証が必要である。マウスの生体内でのCa2+シグナルのモニタリングは難しく、年度内に証明することが出来なかったのが残念である。1.野生型マウスにおけるS100g, Anxa10の挙動の確認過剰量のセルレインを7-12回腹腔内に投与し、浮腫性膵炎を惹起させるとS100gはmRNAレベル、蛋白レベル両者において発現の亢進がみられ、Anxa10はmRNA、蛋白の無からの発現を認めた。免疫染色では、S100gは側方基底膜寄りの細胞質が染まった細胞がまだらに出現し、膵炎の進展と共に膵臓全体に広がっていったのに対し、Anxa10は細胞質全体の染色性が亢進していった。原因か結果かは不明であるが、これらの分子は膵炎発症に関与している可能性が高いと考えられる。2.ラット膵腺房細胞株を用いたin vitroでの検討ラット膵腺房細胞癌由来のAR42J細胞にS100gを過剰発現させた細胞(AR42J-S100g)、Anxa10を過剰発現させた細胞(AR42J-Anxa10)を樹立した。コレシストキニン(CCK-8)刺激によるアミラーゼ分泌、fura-2を用いた[Ca2+]iの変化をコントロール細胞(AR42J-GFP)と比較検討した。100pM CCK-8による分泌刺激では、AR42J-S100gではアミラーゼ分泌が著明に抑制されたのに対し、AR42J-Anxa10ではごくわずかに抑制されたのみであった。AR42J-S100g細胞では、CCK-8刺激による細胞内Ca濃度の上昇が著明に抑制されたが、AR42J-Anxa10ではその抑制はわずかであった。S100g過剰発現AR42J細胞では細胞内Ca濃度の上昇、アミラーゼ分泌が顕著に抑制された。Anxa10も同様の傾向であるが、その作用は弱かった。急性膵炎発症初期にみられる外分泌不全にS100gが関与している可能性が示唆された。siRNAを用いてS100gの発現をノックダウンし、上記と逆の結果が見られるかを検討したが、AR42J細胞ではうまくノックダウンが出来なかった。韓国Chungbuk National UniversityのEui-Bae Jeung教授からS100g KOマウスを供与してもらった。秋田大学からさいたま医療センターへ移送するに際しての書類の整備に時間を要し、2016.10月に到着した。現在交配によって使用可能なマウスが増えてきたところである。既報通り、生理条件下では異常を呈さず、繁殖にも問題は見られない。今後このマウスを利用して解析を進めていく予定である。上述のように、AR42J細胞ではsiRNAによるノックダウン効率が低く、実験を遂行することができなかった。レトロウイルスやレンチウイルスを用いてshRNAを恒常的に産生する細胞を樹立して検討する必要があると思われる。S100gノックアウト(KO)マウスは韓国Chungbuk National UniversityのEui-Bae Jeung教授から供与して頂き、秋田大学から移送して解析を行った。既報の如く、生理条件下では生育に異常を呈さず、繁殖にも問題はみられなかった。mRNAレベルでは膵臓にも発現しているが、免疫組織化学では生理条件下において膵臓に発現はみられなかったが、実験的急性膵炎を惹起すると発現が認められるようになった。