hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Phenotype・Genotypeによる超早期COPD検診法の研究開発

慢性閉塞性肺疾患(COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease)は死亡数の多い疾患であり,2030年に世界の死因第3位になると報告されている.COPDを早期発見することが重要である.本研究は世界に類のない長期経年低線量CT画像(700例(2002年から2015年,14年間,9,048検診)・臨床情報(年齢,性別,Pack-year,禁煙歴,スパイロメトリー検査結果)を数理統計解析してCOPDの発症から増悪の過程を体系的に明らかにし,Phenotype(表現型)・Genotype(遺伝子型)による超早期COPD検診システムを研究開発する.1.長期経年低線量CT画像・臨床・ゲノム情報データベースの構築,2.長期経年低線量CT画像・臨床情報を用いたCOPD罹患・増悪の高リスク群の層別化,3.経年ゲノム情報を用いたCOPDの原因遺伝子・遺伝子変異の発掘,4.Phenotype・Genotypeによる超早期COPD検診システムの研究開発からなる.本年度は徳島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会の承認を得てヒトゲノム・遺伝子解析研究体制を整備し,1,2,3に注力した.非造影低線量CT画像の大動脈・肺動静脈の高精度な自動抽出法の開発,血管形態とCOPD罹患・増悪の高リスク群の関連性の調査,COPDの罹患・増悪に関連するSNP(Single Nucleotide Polymorphism)の選別を実施した.本研究は2年計画であり,本年度の研究計画は1.長期経年低線量CT画像・臨床・ゲノム情報データベースの構築,2.長期経年低線量CT画像・臨床情報を用いたCOPD罹患・増悪の高リスク群の層別化法の開発,3.経年ゲノム情報を用いたCOPDの原因遺伝子・遺伝子変異の発掘からなる.本研究計画を国立がん研究センター・東京都予防医学協会の肺がん・COPDの専門医,徳島大学の人類遺伝学の専門医と連携して推進した.1.長期経年低線量CT画像,臨床情報,ゲノム情報を統合して数理統計解析するためのデータベースの構築,唾液の採取(平成29年5月開始)からゲノム解析に至る環境の整備を実施した.2.CT画像から臓器形態(肺実質・肺血管樹・気管支樹の構造)と病態(病変の発生部位・最大径・体積・形状)を定量化してCOPD罹患・増悪の高リスク群の層別化に関連するイメージングバイオマーカーを探索した.3.人類遺伝学の専門医と連携し,アジア人を中心として肺がん・COPDに関連するSNPを調査し,12個のSNPを解析候補として選別した.本研究に関する平成28年度の研究成果は国際会議論文1件,国内研究発表7件である.申請時の計画通り概ね順調に進展している.慢性閉塞性肺疾患(COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease)は死亡数の多い疾患であり,2030年に世界の死因第3位になると報告されている.COPDを早期発見することが重要である.本研究は世界に類のない長期経年低線量CT画像(700例(2002年から2015年,14年間,9,048検診)・臨床情報(年齢,性別,Pack-year,禁煙歴,スパイロメトリー検査結果)を数理統計解析してCOPDの発症から増悪の過程を体系的に明らかにし,Phenotype(表現型)・Genotype(遺伝子型)による超早期COPD検診システムを研究開発する.(1)長期経年低線量CT画像・臨床・ゲノム情報データベースの構築,(2)長期経年低線量CT画像・臨床情報を用いたCOPD罹患・増悪の高リスク群の層別化,(3)経年ゲノム情報を用いたCOPDの原因遺伝子・遺伝子変異の発掘,(4)Phenotype・Genotypeによる超早期COPD検診システムの研究開発からなる.本年度は徳島大学大学院医歯薬学研究部の協力を得て(3),(4)に注力した.非造影低線量CT画像の大動脈・肺動静脈の高精度な自動抽出法の開発,血管形態とCOPD罹患・増悪の高リスク群の関連性の調査,COPDの罹患・増悪に関連するSNP(Single Nucleotide Polymorphism)の発掘を実施した.本年度に実施した1,2,3の研究課題を継続し,4.Phenotype・Genotypeによる超早期COPD検診システムの研究開発に取り組む.平成29年度に検診を予定している受診者の唾液を採取し,ゲノム情報抽出/タイピング解析を実施する.長期経年低線量CT画像を用いて臓器形態と病態の経年変化を定量化する手法を開発し, CT画像・臨床情報・ゲノム情報を統合した多元空間を数理統計解析してCOPD罹患・増悪の高リスク群の層別化に有効なイメージングバイオマーカー・SNPを発掘する.これらの成果に基づいてPhenotype・Genotypeによる超早期COPD検診システムを目指す.システム化のために長期経年低線量CT画像・臨床情報・ゲノム情報の大規模データのハンドリング技術,臓器形態・病態の時空間情報の可視化技術の研究開発を推進する.協力研究機関における臨床評価によってシステムの有用性を検証する.これらの課題について国立がん研究センター・東京都予防医学協会の肺がん・COPDの専門医,徳島大学の人類遺伝学の専門医,研究支援者1名の連携によって推進する.医用画像処理研究支援者の謝金が3月に発生しており,また,CT画像・臨床情報のバックアップ用物品が3月に納品となり,支払いが完了していないため.4月に支払いが完了する予定である.
微生物型情報伝達機構・二成分制御系の普遍的体系化

(A)サイトカイニン初発情報伝達分子機構の解明と維管束分化統御機構:シロイヌナズナの対象としてこの数年間における研究を集大成することで、サイトカイニンの受容体を含む初発情報伝達分子機構のフレームワークを構築することができた(図参照)。AHK2/3/5→AHP1/2/3/5/→ARRI/10/12が根幹となる経路であることが主に遺伝学的な解析から未唆された。同時に根におけるこのサイトカイニン応答情報伝達系は前形成層の原生木部への分化制御(サイトカイニンによる抑制的制御)に深く関わっていることが示唆された。(B)時計分子機講の解明と植物の光環境応答制御機構:シロイヌナズナを対象とした最近の研究から植物のもつ概日時計の分子機構の本質にせまる知見が蓄積しつつあり、時計分子モデルの構築も可能な段階に迫りつつある。我々も時計関連因子擬似レスポンスレギュレターPRR因子群の発見とその機能解析を介して、この間の研究の進展に大きく貢献してきた。本年度は我々独自の時計分子モデルを提唱し、その分子基盤を遺伝学的に精査すると同時に光り環境応答と関連したオルガネラ(クロロプラスト)や植物器官(花芽)の分化統御に関わる時計機能の重要性を示唆する知見を蓄積した。(C)糸状菌におけるリン酸リレー情報伝達機構:最近になり、糸状菌(カビ)の全ゲノム配列が病原菌や有用カビの何種類かに関して決定された。そこで、麹カビに近縁のモデルカビであるA. nidlunsに関して、そのゲノムに見いだされる二成分制御系関連遺伝子群に関するバイオインフォーマティクス的解析を行った。その結果、本糸状菌の二成分制御系関連遺伝子群の俯瞰的リストを作成することができた。また、これら遺伝子(SskA, SrrA, SrrB, SrrCと命名)を欠損した変異株を作成し、その生理的表現型を解析した。その結果、SskA, SrrAともに酸化ストレス応答に密接に関わっていることが示唆された。本研究計画に関して、本年度は大腸菌の情報伝達機構を中心に解析した。浸透圧応答に関わる二成分制御因子(OmpR)、嫌気応答に関わるリン酸リレー制御因子(SixA)、鉄の利用に関与する二成分系(BasSR)に関してそれぞれ詳細な解析を行い興味ある成果を得た。また、高等植物(シロイヌナズナ)の時計分子機構に関して詳細な研究を行った。我々は既に時計の中心振動体を形成する一連の遺伝子群(PRR1/PRR3/PRR5/PRR7/PRR9)を発見し、その機能解析を主に遺伝学的に方法で行ってきた。本年度は、PRR7/PRR5、PRR9/PRR7、PRR9/PRR5、及びPRR9/PRR7/PRR5からなる二重及び三重遺伝子欠損植物体を作出して時計関連の表現型を詳細に解析した。その結果、PRR9/PRR7二重遺伝子欠損植物体は長周期(時計が一日30時間で動く)、一方、PRR7/PRR5二重遺伝子欠損植物体は単周期(時計が一日19時間で動く)という両極端の性質を示すことが明らかになった。次いで、PRR9/PRR7/PRR5の三重遺伝子欠損体を作成したところ、この植物がもつ時計はほぼ動かなくなってしまった。このことは、これらの遺伝子か時計の進行スピードを制御する中心振動体の一部(部品)をコードしていることを強く示唆している。

これらの結果をもとに、我々は高等植物の生物時計の分子機構に関して新しいモデルを提唱した。また、これらの時計欠損植物体では、開花時期(どの季節に花が咲くか)の制御にも欠陥が生じ、開花時期が大幅に遅延した。また、一般に高等植物は赤色の光に敏感に反応して自らの背丈の伸張や形態を変化させるが(環境への適応)、変異体植物では赤色の光に対する感受性が大きく損なわれていた。このようなことから、本研究計画で我々が解析を進めてきたPRR遺伝子群は、高等植物の高次機能の一つである生物時計(花時計)やそれと関連した開花・結実時期の制御(花時計)、及び光形態形成に深く関わっていることが明らかとなった。以上の解析から、実に多様な生物の多様な環境応答系に二成分制御系・情報伝達機構が関与していることが明らかになりつつあり、今後の成果が大いに期待できる段階到達した。(1)大腸菌の環境応答リン酸リレー系のネットワーク解析:(水野が担当)申請者らは、長年にわたり大腸菌の環境応答・遺伝子発現制御に関してリン酸リレー系を中心に多くの研究を積み重ねてきた。この間、「センサーHis-キナーゼの発見」や「新規HPt因子と多段階リン酸リレー系の発見」など、この分野の発展に貢献してきた。また、ゲノム情報に基づき、大腸菌が30系統以上に及ぶリン酸リレー情報伝達網を装備していることを明らかにしてきた。本年度は、これら個別の研究を統合してバクテリアの細胞生理学の観点から体系化を試みた。(2)真核微生物におけるリン酸リレー系と環境応答機構の解析:(水野が担当)申請者らは、既に分裂酵母における多段階リン酸リレー系が減数分裂(胞子形成)制御に深く関わっていることを示唆する結果を得ている。事実、制御RR因子の欠損株は不稔性である。一方、減数分裂が真核生物型情報伝達系で制御されていることはよく解析されている。そこで、(原核生物型リン酸リレー系→真核生物型リン酸カスケード)間のクロストークに関する一般的概念を確立するのに分裂酵母の系は最適と思われる。従って、このリン酸リレー系を主に分子遺伝学的アプローチで解析した、加えて同じ真核微生物である糸状菌(カビ)に関する研究も開始した。(3)シロイヌナズナの植物ホルモン応答におけるリン酸リレー系の重要性の解析:(山篠が担当)リン酸リレー系により制御されるサイトカイニン(植物ホルモン)応答系に焦点を絞り、特にマイクロアレイを用いた遺伝子発現に関する網羅的な解析を行った。その結果、リン酸リレー情報伝達系により支配される多くの下流遺伝子を同定することができた。最近になり、糸状菌(カビ)の全ゲノム配列が病原菌や有用カビの何種類かに関して決定された。その結果、糸状菌においても二成分制御・リン酸リレー情報伝達系関連遺伝子が数多く保存されていることが明らかとなった。そこで、麹カビに近縁のモデルカビであるA.nidlunsに関して、そのゲノムに見いだされる二成分制御系関連遺伝子群に関するバイオインフォーマティクス的解析を行った。その結果、本糸状菌の二成分制御系関連遺伝子群の俯瞰的リストを作成することができた。その結果を、他の糸状菌(アカパンカビなど)を比較したところ、20種類近くのHisキナーゼ遣伝子が広く保存されていることが明らかになった。これは、同じ真核微生物である酵母(13種類)などに比較してはるかに多い数であった。従って、糸状菌では多様な環境応答機構に二成分制御機構が関与していることが示唆された。
崩壊する風波気液界面での物質輸送に及ぼすリップルと気泡と液滴と汚れの効果

約10m/s以上の高速の乱流状態で水面上を気体が流れる場合、液側では気流による強いせん断力により波状の気液界面がリップル状の渦を形成しながら激しく崩壊する。また、この波状の気液界面の崩壊に伴い液側には多数の気泡が巻き込まれ、気側には液滴が放散される。本研究では、強いせん断力により気液界面(波)が崩壊する場合の気液界面を通しての物質輸送機構を波の崩壊とそれに伴う気泡および界面の汚れと関連づけて明らかにすることを目的とした。具体的には、室内実験と数値計算を併用して、波の崩壊および気泡が物質輸送に及ぼす影響を正確に評価し、物質輸送を支配する主要因子を明らかにすることをめざした。実験としては、水槽の上に気流を発生させる風波乱流水槽を用いて、その中で炭酸ガスの放散実験を行うことにより物質輸送速度を計測した。気泡に関しては、径、速度および数密度の実測地と乱流場での気泡と液滴周りの流れの直接数値計算(DNS)により気泡と液滴の物質輸送への貢献度を評価した。さらに、気液界面上に重油を投入した場合の物質輸送速度を計測することにより、気液界面の汚れが物質輸送に及ぼす影響を明らかにした。その結果、波の崩壊時に巻き込まれる気泡が物質輸送に貢献する割合は最大でも7%程度にしかすぎないことがわかった。この結果は、波の崩壊時に気液界面を通しての物質輸送量が急激に増大する原因が気泡の巻き込みによるものだとする従来の通説を大きく覆すものである。また、重油による表面汚れが物質輸送に及ぼす影響に関しては、風速が小さく波が崩壊しない場合は表面汚れによって物質移動速度が大幅に減少するものの、風速が大きく波が崩壊する場合は物質移動速度は重油汚れがない場合と等しいことがわかった。これは、界面の崩壊により内部の汚れていないフレッシュな流体が表面を更新するため、表面汚れの影響がなくなるためであると考えられる。これらの結果は、工学的には気液接触型の工業装置の最適設計の問題、環境工学的には炭酸ガス等による地球の温暖化やエルニーヨ現象等に起因する局所的な異常気象の予測の問題を解決する上で極めて重要な知見となるものと考えられる。本年度は、強いせん断力により気液界面(波)が崩壊する場合の気液界面を通しての物質輸送機構を波の崩壊に伴う気泡の巻き込み、および界面の汚れと関連づけて明らかにすることを目的として実験を行った。水槽の上に気流を発生させる風波水槽を用いて、その中で炭酸ガスの放散実験を行うことにより物質輸送速度を計測した。気泡に関しては、径、速度および数密度の実測値と乱流場での気泡と気泡まわりの流れの直接数値計算(DNS)により気泡の物質輸送への貢献度を評価した。さらに、別の小型振動格子乱流水槽を用いて、気液界面上に種々の濃度をもつ重油を投入した場合の物質輸送速度を計測することにより、気液界面の汚れが物質輸送に及ぼす影響を明らかにした。

また、重油による表面汚れが物質輸送に及ぼす影響に関しては、風速が小さく波が崩壊しない場合は表面汚れによって物質移動速度が大幅に減少するものの、風速が大きく波が崩壊する場合は物質移動速度は重油汚れがない場合と等しいことがわかった。これは、界面の崩壊により内部の汚れていないフレッシュな流体が表面を更新するため、表面汚れの影響がなくなるためであると考えられる。本年度は、強いせん断力により風波気液界面(波)が崩壊する際に気流側に放散される飛沫状の液滴が気液界面を通しての物質輸送にどの程度貢献するのかを明らかにするための実験の第一段階として、液滴のレイノルズ数と物質輸送に関するシャーウッド数との関係を室内実験により評価した。高さ2mの矩形ダクト内に純度99%の二酸化炭素を大気圧(1atm)で充てんさせ、上部から注射針を用いて純水液滴を自由落下させた。異なる内径の注射針を用いることにより液滴径を変化させて実験を行った。落下する液滴をハイスピードビデオカメラで撮影することにより液滴の径と速度を評価し、液滴が吸収した二酸化炭素量を有機全炭素濃度計を用いて測定した。得られた液滴の速度、液滴径、液滴の二酸化炭素濃度から、液滴のレイノルズ数とシャーウッド数を評価した。その結果、液滴のレイノルズ数とシャーウッド数の関係が明らかになり、液滴のレイノルズ数の増加に伴い、シャーウッド数が指数関数的に増加することがわかった。本年度の研究で得られたレイノルズ数とシャーウッド数の評価式を用いることにより、風波乱流場で発生する液滴の飛散速度と液滴径分布を測定すれば、気流側に放散される液滴が気液界面を通しての物質輸送機構にどの程度貢献するのかを明らかにすることが可能である。そこで、来年度は、実際に風波乱流場で波が崩壊する場合に気流側に放散される液滴の飛散速度と液滴径分布を粒子画像流速計(PIV)および位相ドップラ流速計(PDA)を用いた測定により明らかにし、液滴が気液界面を通しての物質移動にどの程度貢献するのかを総合的に評価する予定である。1)風波気液界面の崩壊に伴う液滴の発生および飛散機構風波気液界面の崩壊に伴い発生する液滴の径・数密度・速度を位相ドップラ流速計(PDA)を用いて測定した。その結果、粒子(液滴)レイノルズ数、液滴の飛散個数に関する実験相関式を得た。この関係式を用いて飛散液滴による物質移動量を総液滴に対して求めることにより、崩壊する風波気液界面を通しての物質移動に対する液滴の寄与を評価することが可能となった。2)風波気液界面を通しての物質移動に及ぼす温度成層の効果安定および不安定温度成層が存在する風波乱流場でレーザドップラ流速計(LDV)を用いた瞬間速度の測定を行い、液側の乱流構造に及ぼす温度成層の効果を明らかにした。また、抵抗線温度計を用いて乱流熱フラックスを測定することにより、風波気液界面を通してのスカラ(熱)の輸送に及ぼす温度成層の効果について検討を行った。その結果、風波気液界面を通してのスカラの輸送に対しては、液側に存在する安定および不安定温度成層の影響はないことが明らかとなった。本研究課題による3年間の研究により、強いせん断力による風波の崩壊に伴う気泡の巻き込み、および液滴の飛散が風波気液界面を通しての物質移動に及ぼす影響を明らかにし、さらに、重油による界面汚れ、液側の安定および不安定温度成層が物質輸送に及ぼす影響も明らかにした。
緑内障に対する濾過手術後の癒着の予防を目的とした特殊な医療材料の眼科手術への応用

現在、緑内障に対する濾過手術後の濾過胞部癒着予防を目的として、一般的に代謝拮抗阻害薬(Mytomycin C:MMC)が用いられているが、同薬の併用に伴い、房水漏出、濾過胞感染などの術後晩期合併症の頻度は増加している。この現在の手術法の改良を目的として、婦人科腹腔鏡手術領域ですでにヒトへの使用が認可されている癒着防止シート(Gynecare Interceed TM:Interceed)を使用し、安全で長期的に良好な濾過胞を維持することが可能かを検証する実験を開始している。まず第一段階として、家兎の結膜下にInterseedを留置し、3ヶ月の経過観察を行い家兎眼に対する有害性がないことを確認した。またInterceed留置群と非留置群を比較し、非留置群では術後早期より結膜強膜間に強い癒着を生じたのに対し、Interceed留置群では強膜結膜間の癒着が抑制されていることを確認した。次に家兎の結膜下にInterceedを留置した群とMMCで処置した群を作成し、両群ともに結膜の癒着が防止されていることを確認した。また両群において術後結膜の脱落、壊死等の有害事象は認められなかった。続いて、第二段階として、本来の目的である線維柱帯切除術後の濾過胞維持に有用か否かの判定のための実験に移った。具体的には、9羽の家兎の片眼にそれぞれ無処置の繊維柱帯切除術、Interceed留置を併用した繊維柱帯切除術、MMC塗布を併用した繊維柱帯切除術を行い、濾過胞の維持期間を比較評価する計画であり、現在3羽の手術実験を終え、経過観察中である。手術実験開始後、術後癒着確認動画記録のために顕微鏡にスマートフォンを取り付け動画撮影を行うこととした。しかし、スマートフォンを取り付けた状態では癒着の確認の記録はできるものの、切開・縫合等の手術操作は顕微鏡での立体視ができず困難であるため、途中から顕微鏡に直接取り付け画像を抽出するためのカメラを導入した。その都合上、計画よりもやや遅れている状況である。現在、手術実験第二段階の濾過胞維持の有用性の検討を行っている。引き続き家兎に対し無処置の繊維柱帯切除術、Interceed留置を併用した繊維柱帯切除術、MMC塗布を併用した繊維柱帯切除術を行い、濾過胞の維持期間を比較評価してゆく。Interceed群で結膜と強膜の間に癒着が発生せず癒着防止の目的が達成されるか否かを確認するため、最大3か月にわたり濾過胞の状態を観察する。本実験はヒトの使用が認可されている手術材料を用いた実験であり、将来的には眼科領域での臨床応用を早めることも本研究の独自性であると考えている。手術実験が計画よりやや遅れており、本年度の学会発表も行っていないため、当該助成金が生じたと考える。
腎癌における次世代CA9ペプチドワクチンの開発とテーラーメイド型癌ワクチン療法

腎細胞癌に強発現する癌関連抗原CA9のHLA-A24拘束性ペプチドワクチン3種類(CA9p219、p288、p323)を開発し、第1相臨床研究から得られた免疫学的結果をもとに、より迅速に特異的CTL細胞が誘導できるペプチドワクチン療法の開発が望まれると考えられ、新しい次世代CA9ペプチドワクチンの開発に取り組んだ。臨床試験に使用したペプチドのMHCクラス1分子に対する親和性を調べたところ、最もCTL誘導能があったCA9p219がコンピュータを用いて予想した高い親和性に反し非常に低いものであった。そこで我々は、より優れたペプチドワクチン開発を目的に、既存のペプチドワクチンの改変型ペプチドワクチンやコンピュータ解析で高親和性が予想されるペプチドをさらに25種類作製し、HLA-A24に対する親和性をMHC stabilization assayにて検討した。結果はRD6128,9M15,16,17,20,9M8Yの6ペプチドが高親和性を示し、これらのペプチドの癌ワクチンとしての有用性を検討するために、腎細胞癌担癌患者の末梢血より得られた有核細胞を用いて各ペプチドに対するCTLアッセイを行った。結果は、これまでに使用してきたオリジナルペプチドワクチン(CA9P219,CA9p288)に比較し、高いCTL誘導能を示すペプチドが存在した。また、親和性にかかわらず、より高いCTL誘導能を有するペプチドも存在すると思われ、他のペプチドも含め、次世代テーラーメイド型CA9ペプチド癌ワクチンとしての有用性に関して、CIR細胞を用いたペプチド特異的なCTL誘導能とCA9陽性HLA-A24陽性癌細胞SW620に対する殺細胞効果(51Crrelease assay)について検討した。我々は腎細胞癌で高頻度に発現している癌関連抗原MN/CA9より、HLA-A24拘束性9merペプチドワクチン3種類(CA9 p219、P288、P323)を開発し、2002年7月より第I相臨床試験を既存の治療に抵抗を示す進行性腎癌患者12名に施行した。その結果、ワクチン投与による重篤な有害事象を認めず安全と考えられ、臨床的には、幸運にも転移巣の縮小を示した2例のresponderを認め、本ワクチン療法が有効であると思われた。免疫学的にはp219およびp288の2ペプチドに対する特異的CTL誘導を認めるものの、p323に対するCTL誘導は認めなかった。また、ワクチン投与開始からCTL誘導までに3-6ヵ月と少し時間を要することが分かった。これらの結果を鑑み、各ペプチドのMHCクラスI分子に対する親和性を調べたところ、p219、p288は比較的高いもののp323はコンピュータを用いて予想した親和性に反し非常に低いものであった。そこで我々は、既存のペプチドワクチンの9個のアミノ酸のうち2、9番目を改変させた改変型ワクチンやコンピュータで高親和性が予想されるペプチドをさらに10種類作成し調べたところ、2種類のペプチドにおいて非常に高い親和性を示した。次に、癌ワクチンとしての有用性を検討するために、腎細胞癌担癌患者の末梢血より得られた有核細胞を用いて各ペプチドに対するCTLアッセイを行ったところ、これまでに使用してきたオリジナルの3ペプチドワクチンに比較し、高いCTL誘導能を有すると思われた。現在、癌ワクチンとしての有用性についてpre-clinicalな検討をしている。すなわち、テトラマーを用いた患者リンパ球CTL前駆細胞の検出、各ペプチド刺激樹状細胞を用いたペプチド特異的なCTL誘導能とCA9陽性HLA-A24陽性癌細胞に対する殺細胞効果などについて検討中である。我々は腎細胞癌で高頻度に発現している癌関連抗原CA9のHLA-A24

拘束性ペプチドワクチン3種類(CA9p219、p288、p323)を開発し、臨床試験を難治性進行性腎癌患者23名に施行したところ、ワクチン投与による重篤な有害事象を認めず、臨床的にも転移巣の縮小を示したresponderを認め、本ワクチン療法が安全かつ有効であることを示した(Clin Cancer Res,2006)。その際得られた免疫学的結果から、より迅速に特異的キラー細胞が誘導できるペプチドワクチン療法の開発が望まれると考えられた。臨床試験に使用した各ペプチドのMHCクラスI分子に対する親和性を調べたところ、p219、p288は比較的高いもののp323はコンピュータを用いて予想した親和性に反し非常に低いものであった。そこで我々は、既存のペプチドワクチンの9個のアミノ酸のうち改変させた改変型ワクチンやコンピュータで高親和性が予想されるペプチドをさらに25種類(RD6124-32,9M11-20,9M2M,9M2F,9M3M,9M3F,9M8Y,9M10Y)作成し、より優れたペプチドワクチン開発を目的に、まずHLA-A24に対する親和性をMHC stabilization assayにて検討した。結果はRD6128,9M15,16,17,20,9M8Yの6ペプチドで親和性が高かった。次に、癌ワクチンとしての有用性を検討するために、腎細胞癌担癌患者の末梢血より得られた有核細胞を用いて各ペプチドに対するCTLアッセイを行ったところ、これまでに使用してきたオリジナルペプチドワクチン(CA9p219,CA9p288)に比較し、高いCTL誘導能を示すペプチドが存在した。現在、これら新しいペプチドの癌ワクチンとしての有用性について、テトラマーを用いた患者リンパ球CTL前駆細胞の検出、各ペプチド刺激樹状細胞を用いたペプチド特異的なCTL誘導能とCA9陽性HLA-A24陽性癌細胞に対する殺細胞効果(^<51>Cr release assay)について検討中である。我々は腎癌で高頻度に発現しているCA9抗原のHLA-A24拘束性ペプチドワクチン3種類(CA9 p219、p288、p323)を開発し、難治性腎癌患者23名に対し臨床研究を施行したところ、特異的CTL誘導と共に転移巣の縮小を示したresponderを認め、本ワクチン療法が安全かつ有効であることを示した(Clin Cancer Res,2006)。その際得られた免疫学的結果から、特異的免疫誘導までに3ヵ月以上要し、臨床効果は6ヵ月以上必要であることから、より迅速に特異的キラー細胞が誘導できるペプチドワクチンの開発が望まれると考えられた。既存の各ペプチドのMHCクラスI分子に対する親和性を調べたところ、p288、p323は比較的高いもののp219は予想した親和性に反し非常に低いものであった。そこで我々は、既存のペプチドワクチンに加え新規ペプチドおよびCA9p219,p288の改変型ペプチドをさらに25種類作製し、より優れたペプチドワクチン開発を目的に、まずMHCクラスIに対する親和性をMHC stabilization assayにて検討した。結果は6ペプチドで親和性が高く、次に、癌ワクチンとしての有用性を検討するために、腎癌担癌患者の末梢血より得られたserumと有核細胞を用いて各ペプチドに対する抗IgG抗体の定量とCTLアッセイを行ったところ、オリジナルペプチドワクチンに比較し、高いCTL誘導能を示すペプチドを同定することができた。
動物のアレルギー性疾患に対するDNAワクチン療法の開発

本研究においては、DNAワクチンによるアレルギー性疾患の根治的治療法を確立するため、アレルギー性疾患の自然発症犬および実験的感作犬を用いて、in vitroにおけるアレルギー反応の基礎的解析、さらにそれを応用してin vivoにおける臨床有効性の検討を行なった。最初に、スギ花粉抗原に感作されたアトピー性皮膚炎のイヌを対象としてスギ花粉抗原に対するアレルギー反応を解析した。すなわち、スギ花粉主要抗原のひとつであるCry j 1に感作された症例が多いことを明らかとし、それら症例においてはCry j 1に対するIgE産生がスギ花粉飛散時期と一致していることを解明した。さらに、これら症例においてCry j 1のオーバーラッピングペプチドを用いてT細胞エピトーブ部分を同定した。また、Cry j 1DNAワクチンの治療試験を4頭の症例を用いて実施し、治療群においてはいずれの症例もアトピー性皮層炎症状の改善とともに、スギ花粉粗抗原を用いた皮内反応の陰性化およびスギ花粉に対する末梢血リンパ球の芽球化反応の低下を認めた。一方、スギ花粉を実験的に感作した犬において、スギ花粉抗原気道内曝露によってスギ花粉特異的な気道過敏性を誘導することが可能であった。これを用いてCry j 1DNAワクチンによる治療試験を行なったところ、治療群においては、IgE値やリンパ球の芽球化反応においては顕著な変化は認められなかったが、スギ花粉抗原に対するin vivo反応性においては皮内反応の陽性閾値の上昇、気道過敏性反応の閾値の上昇が認められた。さらに、肺の組織においても、対照群と比較して肥満細胞の数が有意に低下していた。以上のことから、DNAワクチンはアレルギー性疾患の臨床症状をコントロールすることができる根治的治療法であることがわかった。動物のアレルギー性疾患の新規治療法として、減感作を有効に誘導することが可能なDNAワクチンによる治療法確立を最終目的とし、応用的研究の基盤としての基礎的研究の成果を集積した。スギ花粉症と診断された犬において、スギ花粉抗原に対して末梢血リンパ球の増殖反応を検討し、さらに末梢血中好塩基球を利用したヒスタミン放出を測定した結果、スギ花粉抗原に対するリンパ球芽球化反応を認め、スギ花粉抗原特異的なヒスタミン放出を認めたことから、イヌのスギ花粉症においてもヒトと同様なアレルギー反応がその病態に関与していることがわかった。また、イヌにおいてアラムアジュバントを用いて実験的にスギ花粉感作を誘導することに成功した。これら実験的感作犬を用いて合成オーバーラッピングペプチドによるT細胞エピトープのマッピングを行った結果、スギ花粉主要抗原の一つであるCry j1において2種類のペプチドに反応性が確認され、ダニ主要抗原のDer f2においても1種類のペプチドに高い反応性を有することがわかった。さらに、これらのペプチドに対するリンパ球のサイトカイン産生パターンにおいても、明らかにIL-4の産生が増加していることがわかった。これらのことから、犬においてもこれらT細胞エピトープがアレルギー発症機序に関与しており、これらに対するDNAワクチン療法が有効であることが示唆された。また、季節性鼻炎のネコにおいてもスギ花粉抗原に対して皮内反応陽性、P-Kテスト陽性、リンパ球芽球化反応を検出し、ネコにおいてもスギ花粉症が存在し、ヒトの自然発症モデルとして今後の根治治療法の対象となることがわかった。応用的研究においては、T細胞エピトープの経口投与によるペプチド療法およびスギ主要抗原Cryj1遺伝子によるDNAワクチンによる遺伝子治療の臨床的有効性について検証するため、実験的にスギ花粉感作犬を作成することに成功し、それら実験感作犬のリンパ球芽球化反応におけるサイトカイン産生パターンを解析した結果、IL-4が優位であることがわかった。本研究では各種腫瘍マーカーを小動物の臨床例に応用し、獣医臨床における腫瘍マーカーの有用性を明らかにすることを最終目的として実験を行ってきた。

研究年度内には(1)血清(漿)中腫瘍マーカー,(2)細胞内テロメラーゼおよびテロメラーゼ逆転写酵素,(3)細胞内P53蛋白・MDM2蛋白の発現およびp53遺伝子の変異、(4)細胞クローナリティー、(5)染色体分析、(6)多剤耐性に関与するP糖蛋白(P-9gp)の6項目についておいて腫瘍マーカーとしての有用性を検討してきた。主な研究成果は以下の通りである。1.染色体末端に存在するテロメアの長さと細胞内テロメラーゼ酵素の活性について犬の乳腺腫瘍症例を用いた研究を行い,獣医学領域においても、我々は、テロメラーゼが犬の腫瘍マーカーとして利用できる可能性を見い出した。2.犬および猫の自然発生腫瘍症例を用いてp53遺伝子について検討を行い、とくに犬においてはヒトと同様に約半数の腫瘍症例でp53遺伝子の異常が検出されることを見い出し、動物における腫瘍マーカーとして利用可能であると考えられた。またp53を不活化するMDM2についても解析を進め,特定の腫瘍においては過剰発現があることを明らかにしており,p53と同様腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。3.猫白血病ウィルス(FeLV)に感染した猫の末梢血または腫瘍、骨髄、リンパ節の生検材料から抽出したDNAについて、外来性FeLVプローブを用いたサザンブロット解析を行い、腫瘍性疾患(白血病および骨髄異形成症候群:MDS)ではモノクローナル/オリゴクローナルなバンドとして検出され,FeLV感染猫における新たな腫瘍マーカーとなりうることが確認された。4.犬および猫のP糖蛋白質(P-gp)をコードするmdr(multi-drug resistance)遺伝子の塩基配列を決定し,これをもとに作製したプライマーを用いたRT-PCR,およびP-gpに対するモノクローナル抗体(C219)を用いた免疫組織(細胞)化学染色によって腫瘍症例とくにリンパ腫におけるmdr/P-gp遺伝子の発現を検出した。また実際にP-gpのを過剰発現して薬剤耐性となった症例に対して多剤耐性克服薬剤を併用して抗癌剤を使用することによって化学療法による治療成績の向上が確認された。
消化腺導管系の構造と機能に関する免疫組織化学的研究

(1)唾液腺の導管系におけるカリクレイン分泌細胞の確定とその機能的意義免疫組織化学法で、ラット顎下腺、耳下腺の線条部導管細胞の管腔側に存在する小顆粒内にカリクレインが陽性で、この顆粒がアドレナリンαおよびアセチルコリン刺激により外分泌されることを検証した。(2)導管系構成細胞の分裂能の調査成体ラット膵臓でBRdU法によりDNA合成能を持つ細胞の頻度を検討し、腺房中心細胞とその近傍の介在部細胞が再生能が高いことを結論した。(3)発生期耳下腺における細胞の分裂能とアポトーシス生後発生におけるラット耳下腺で、細胞分裂と細胞死の動態をPCNA法とTunel法により調査し、外分泌腺では常に先端に向けて細胞分裂が進行して全体の構造を形成するが、導管の予備能力は予想されたより小さいこと、その間、アポトーシスによる細胞死はほとんど認められないことを明らかにした。また分裂に伴うゴルジ装置の三次元的形状変化を連続切片電顕法とコンピュータグラフィックスにより示した。(4)再生膵における細胞増殖の動態ラット膵臓を胆管葉のみを残して外科的に約90%を部分切除し、以後の再生の動態を経時的に調査し、切除3目目からブロモデオキシウリジン(BrdU)で標識される細胞が残存部の腺房細胞と腺房中心細胞に高度に出現するようになり、それが2週目まで継続し、次いで標識細胞は急速に減少するという結果を得た。再生にあたり腺房部とそれに直接する腺房中心細胞が増殖の中心的機能を持つものと結論された。(5)腺管構造の分枝形態形成におけるEGFの受容細胞とその作用胎生期マウス顎下腺の分枝形態形成に対するEGFの作用を調査し、EGFが分枝形態形成が促進するがその阻害剤により形態形成が停止することを確認した。また、特異抗体を用いた免疫組織化学法によりEGF受容体は胎生13日目から導管系上皮細胞の細胞膜に発現し始め、その活性は次第に増強し胎生15,16日目に最も強い反応が導管上皮細胞の基底側細胞膜に限局することが判明した。このようなEGF受容体の分布動態よりEGFが形態形成の調節に重要な関与を営むものと推断した。(6)顎下腺基底膜の超微細構造ラット顎下腺をモデルに基底膜の構造を各種の固定法により高解像度電顕法で比較検討した。それにより基底膜は上皮細胞直下に拡がる厚さ40-100nmの均質な細網構造を基本とし、それに直行する方向に100nmの細線維が走行し、この細線維が直下の膠原線維に結合するというジェーマが描かれ、従来の記載にある明帯は固定や染色による人工産物である可能性が示唆された。

それにより基底膜は上皮細胞直下に拡がる厚さ40-100nmの均質な細網構造を基本とし、それに直行する方向に100nmの細線維が走行し、この細線維が直下の膠原線維に結合するというジェーマが描かれ、従来の記載にある明帯は固定や染色による人工産物である可能性が示唆された。(1)顎下腺分枝形態形成におけるEGFの作用胎生期マウス顎下腺の分枝形態形成に対するEGFの作用を調査した。その結果、EGFの作用により分枝形態形成が促進するがその阻害剤により形態形成が停止すること、導管上皮にEGF受容体を保有する細胞が存在することを免疫組織化学的に検証された。(2)発生期耳下腺における細胞の分裂能とアポトーシス生下時直後から成体に至るまでのラット耳下腺について、細胞分裂と細胞死の動態をみるため、分裂細胞の分布をPCNA法により、またアポトーシスをTunel法により標識して調査した。その結果、(1)生後3週までは終末部の先端部に分裂細胞が密に存在するが、(2)近位部では次第に分裂細胞が減少する傾向にあること、(3)3週以降は急速に分裂細胞の頻度が減少すること、(4)この経過にアポトーシスはほとんど認められないことが判明した。この結果より、外分泌腺では常に先端に向けて細胞分裂が進行して全体の構造ができあがり、その一方で、導管の予備能力は予想されたより小さいものと推定された。(3)膵臓を再生膵臓を部分切除した成体ラットにおいて、膵臓の再生過程を研究するためのシステムが確立した。今後これを利用して再生における細胞動態を研究する。1.導管系構成細胞の分裂能の調査生体ラットの膵臓をモデルに、ブロモデオキシウリジン(BRdU)法によりDNA合成能を持つ細胞の出現頻度を腺房部及び導管各領域で比較検討した。その結果、腺房中心細胞を含めた腺房部が約3%という最も高いの標識率を示し、次いで介在部導管領域が約2%、小葉内導管と小葉間導管は1%以下という結果を得た。定性的には、腺房領域にあっても腺房中心細胞の方が腺房細胞より標識されるものが多いこと、介在部導管では腺房に近い領域の細胞が標識される確率が高いことが確認されている。現在この所見を定量化するための処理を行っている。この結果より、膵臓では導管系細胞の内、腺房中心細胞とその近傍の介在部細胞が再生能が高いことが結論された。2.再生膵における増殖細胞の動態ラット膵臓に部分切除を施し、組織の再生の動態とそれに関わる細胞を調査した。それにより、切除後3日目より腺房中心細胞と腺房細胞の標識率が高まり、約2週後にはそれが低下してきた。この結果より再生に関与するのは腺房中心細胞と腺房細胞で、逆に一般の導管系の増殖能は低いものと推定した。3.腺管構造の発生におけるEGFの作用分枝形態形成におけるEGFの作用を見るため胎生期マウス顎下腺について、EGF受容体の分布を特異抗体を用いた免疫組織化学法により調査した。それにより、EGF受容体は胎生13日目から導管系上皮細胞の細胞膜に発現し始め、その活性は次第に増強し胎生15,16日目には最も強い反応が導管上皮債細胞の基底側細胞膜に限局していた。しかしそれ以降は次第に減弱し、生後1日目には完全に消失していた。分枝形態形成の進行と平行したかかるEGF受容体の分布動態よりEGFが形態形成の調節に重要な関与を営むことが推定された。
免疫不全症への遺伝子治療に向けたFVベクターによる長期造血幹細胞への遺伝子導入

Foamy virus(FV)ベクターによるX連鎖重症複合免役不全症(X-SCID)に対するより安全な造血幹細胞遺伝治療の確立を行った。A2UCOE配列をプロモーターとしてγc鎖cDNAを組み込んだFVベクターによりX-SCIDマウスの骨髄細胞に遺伝子導入を行い、その後NOD/SCID-γc nullマウスに移植した。移植後のマウスでは、T細胞(CD3抗体による増殖とIL-2の産生)、B細胞(血清免疫グロブリンの上昇)の機能回復を認め、免疫系の再構築を認めた。ベクター挿入部位解析では、レトロウイルスベクターに比べて、よりランダムな挿入パターンであり、FVベクターの安全性が示唆された。本年度はX連鎖重症複合免疫不全症(X-SCID)に対する、フォーミーウイルス(FV)ベクターによる遺伝子治療の効果を、X-SCIDマウスを用いて検証した。安定した発現を目標としてA2UCOE配列をプロモーターとして、その下流にγc鎖cDNAを組み込んだFVベクタープラスミドを作製した。これをヘルパープラスミド(gag, pol, env)と共に293T細胞にトランスフェクションし、ウイルスを作製、回収した。作製したウイルスにより、γc鎖欠損ヒトT細胞株であるED40515(-)に遺伝子導入を行なったところ、フローサイトメトリーにて細胞表面上にγc鎖の発現を認めた。またIL-2の刺激によりシグナル下流のSTAT5のリン酸化を認め、導入γc鎖の機能も確認した。遺伝子導入後のED40515(-)におけるベクター挿入部位解析では、コントロールであるレトロウイルス(RV)ベクターに比べて、転写開始部位近傍への集積は有意に低く、また、遺伝子外への挿入が多いことから、FVベクターの安全性が示唆された。次に、X-SCIDマウスから採取した骨髄細胞に、上述のFVベクターにより遺伝子導入を行い、その後NOGマウス(NOD/SCID-γc knock out )に移植した。移植後のマウスでは、T(CD4, CD8)リンパ球、B(B220)リンパ球の出現と、ベクターによるγc鎖の発現を認めた。脾臓より採取したTリンパ球をCD3抗体で刺激したところ、増殖とIL-2産生の回復を認めた。また、移植後のマウスでは、血清の免疫グロブリン(IgM, IgA, IgG)レベルの上昇を認め、B細胞の機能的回復も確認した。以上の成果を学術誌(PLos One. 8:e71594, 2013)に発表した。安定した発現のためプロモーターにはA2UCOE配列を使用し、下流にγc鎖cDNAを組み込んだFVベクタープラスミドを作製した。遺伝子導入T細胞株において、γc鎖の発現とIL-2刺激後のSTAT5のリン酸化により機能の確認を行った。ベクター挿入部位解析では、レトロウイルスベクターに比べて、よりランダムな挿入パターンが認められ、FVベクターの安全性が示唆された。次に、X-SCIDマウスから採取した骨髄細胞に、FVベクターにより遺伝子導入を行い、NOGマウス(NOD/SCID-γc knock out )に移植した。移植後のマウスでは、T、Bリンパ球が出現し、またCD3抗体刺激による脾臓Tリンパ球の増殖とIL-2の産生、血清のIgM, IgA, IgGの上昇により、T、B細胞の機能的回復を確認した。以上の成果を学術誌に発表した(H25年度)。遺伝子治療効果の更なる向上を目指し、細胞内アダプター蛋白であるLnkのドミナントネガティブフォーム(dNLnk)によるTPOシグナルの増強とそれに伴う造血幹細胞の増殖や生着効率の改善を試みた。PCRによってマウスLnk cDNAの増幅を行い、R364E変異を入れることでdNLnkを作製した。安全なdNLnkの導入を目指し、C末端にオクタアルギニン(R8)を付加し、蛋白としてのマウス造血幹細胞への導入を試みたが、非導入細胞との違いは認められなかった。そのため、インテグラーゼに変異(D64V)を導入したインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターを作製しdNLnkを導入した。現在dNLnkによるFVベクターの遺伝子導入効果への影響をX-SCIDマウスを用いて検討中である。遺伝子治療、血液、免疫本年度は、FVベクターのシステム作製に時間を要した。FVベクターシステムにおいては、申請者の経験よりそのセットアップに時間がかかるため、その条件設定を重点的に行なった。その中で、対象であるX-SCIDへのFVベクターの効果を、in vitro, in vivoともに確認することができ、その結果を学術誌に発表した。FVベクターによる動物モデルへの遺伝子治療は、いまだその報告は少なく、X-SCIDへの適応は初である。しかし本研究では、FVベクターシステムの効果を全体的に改善することを目的としており、現在も研究の継続中である。安全性の向上および遺伝子導入効率の上昇に重点を置き、以下の研究を継続する。

1これまでの遺伝子治療では、特定の疾患(X-SCIDやWiskott-Aldrich症候群)において、導入遺伝子の発現パターンも発がんに関与すると考えられている。そのため、より生理的な発現を目標とし、プロモーター領域も含めたヒトγc鎖ゲノムを組み込んだベクターを作成中である。2遺伝子導入時の幹細胞の性質(自己複製能、多分化能、生着能)の維持を目指して、細胞内アダプタータンパクであるLnkのdominant negativeフォーム(dNLnk)を導入する。申請者は既にマウスおよびヒトdNLnKを作製しており、これらをゲノムへの影響を与えずに導入する方法として、オクタアルギニン( R8)付加dNLnkをタンパクとして導入する方法とインテグラーゼ欠損非挿入型レンチウイルスベクターによる導入を検討している。3FVウイルスベクターの遺伝子導入効率の低さには、力価の低さと高倍率の濃縮に伴うエンベロープの毒性の増強などが考えられ、これらを克服するためにウイルス産生細胞株の作製を現在行なっている。4その他に、発現効率に影響を与える要因として、染色体へのベクターの挿入部位が考えられる(位置効果)。レトロウイルスの発現の強さには、遺伝子の転写開始部位近傍に挿入されるということも大きく、逆にレンチウイルスでは、転写開始部位より下流の遺伝子内に挿入されることから、実際の遺伝子治療においても、発現効率が低い場合がある。これは治療効率に直接影響することであり、FVベクターにおいても詳細な挿入パターンを検討する必要がある。具体的には、染色体での挿入部位におけるH3K4me1(転写開始部位)、H3K36me4(coding領域)、H2AZ(エンハンサー/プロモーター領域)などの解析を行なう予定である。初年度はFVベクターのシステム構築とX-SCIDマウスモデルを使用した研究を行い、かつ、研究成果を学会、および論文として発表した。しかし、dNLnkのタンパクとしての精製や、次世代シークエンサーによる遺伝子導入部位解析など、使用額が大きい項目の一部が、次年度へ回ってしまった。dNLnkのタンパクとしての精製や、次世代シークエンサーによる遺伝子導入部位解析、ヒト造血幹細胞培養のためのサイトカインの不足分に使用する予定である。
ネプツニウム酸化物における新奇な八極子秩序の微視的研究

ネプツニウム酸化物NpO_2の低温秩序相は、転移点において比熱に大きな跳びが観測されるにも関わらず、明確な磁気双極子モーメントが存在しないという異常な物性を示す。そのためf電子系特有の磁気八極子による全く新しい秩序の可能性が指摘されていた。本研究は微視的プローブであるNMRの特徴を生かし、磁気八極子秩序という新しい物理現象の探索とそのメカニズムの解明を行った。通常は観測が難しい酸素核でのNMR測定を成功させるため、東北大学金属材料研究所大洗施設においてNMR観測が可能な17O同位体核を高濃縮した特別な単結晶試料を準備した。またネプツニウムの強い放射能の問題を克服するため、同じ施設内に超ウラン化合物専用のNMR測定装置を立ち上げた。さらに高精度での磁場角度依存性の測定を行うため新たに磁場中試料回転機構を開発した。その結果、17O核のNMRスペクトル測定からネプツニウム酸化物の低温の相転移が5f電子の磁気八極子自由度によるものであることを微視的に明らかにすることに成功した。また核スピン-格子緩和時間の測定から、Np核とO核の強い結合に起因する特異な核磁気緩和の機構の存在を示した。さらにNpO_2との比較のため5f電子数のひとつ多いPuO_2のNMR実験も実施し、磁気基底状態の違いを明らかにした。これらの研究成果をまとめたものを国内外の主要な国際的な学術誌に発表し、招待講演を行うなど国際的にも高い評価を受けた。f電子系化合物の示す複雑で豊かな物性の背後には、f電子が持つ多極子の自由度が隠されている。この多極子の自由度が最も顕著に現れるのが多極子秩序とよばれ現象である。本研究の目的は、NpO_2において世界で初めてとなる核磁気共鳴(NMR)による研究を行い、f電子の高次の磁気多極子のひとつである磁気八極子に起因する全く新しい秩序状態を微視的観点から明らかにすることである。研究初年度である平成18年度は、常圧下でのNpO_2単結晶を用いたNMR研究を行い、NMRスペクトルの磁場角度依存性の測定から、磁場中での酸素核における超微細相互作用の起源が、磁場誘起された磁気双極子および八極子モーメントにあることを示すことができた。この結果は八極子秩序状態がNpO_2で実現していることを微視的観点から強く支持する結果となった。本年度はさらに核スピン-格子緩和時間の測定も実施し、Np核とO核の強い結合に起因する特異な核磁気緩和の機構の存在を明らかにすることに成功した。本研究成果は国際的な学術誌に掲載されるとともに、国際会議における招待講演として報告され、国際的にも高い評価を受けた。
制御ラジカル重合の手法を利用した成長ラジカルの鎖長や共重合系の成長末端の研究

これまで、実際のラジカル重合系に近い条件下で成長ラジカルのESRスペクトルを観測してきた。そのスペクトルをもとに定常状態が成立していることを確認し、定常ラジカル濃度をもとに成長速度定数の見積りも行ってきた。その際問題になったのは観測している成長ラジカルの鎖長であった。成長速度定数を見積るには十分に長鎖の成長ラジカルのスペクトルが観測されている必要がある。しかし、鎖長に関する実験的な証拠はなく、一般に長鎖のラジカルよりは短鎖のラジカルのほうがESR測定をしやすいということもあって、本当に成長速度定数を見積ることができるだけの長鎖の成長ラジカルが観測されているかどうかは疑問であった。重合系を観測しているだけでは鎖長の変化はなかなかわからない。モデル系を構築して調べる必要があった。近年、原子移動ラジカル重合(Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP)やニトロキシドなど安定なラジカルによる安定ラジカル媒介重合(Stable Free-radical Mediated Radical Polymerization, SFRP)、可逆的付加開裂連鎖移動重合(Reversible Addition-fragmentation Chain Transfer Radical Polymerization, RAFT)など制御ラジカル重合の手法がいろいろと開発され、研究が進んできた。なかでもATRP法では分子量を制御できる上、分子量分布の狭いポリマーを合成することができ、そのポリマーの末端には炭素-ハロゲン結合が存在する。ATRP法により種々の鎖長のポリマーを合成し、それぞれの末端の炭素-ハロゲン結合を有機スズ化合物との反応により開裂させると種々の鎖長を持つ成長ラジカルのモデルラジカルを発生させることができる。そのラジカルをESRで観測するとスペクトルと鎖長との関係についての情報を得ることができるはずであると考えた。また、2種のモノマーの組み合わせによる2量体のモデルラジカルをESRで観測すると共重合系における前末端基効果を直接的に観測できる可能性があるとも考えた。以上のような観点からATRP法によりモデルラジカル前駆体としての種々の鎖長のポリマーやオリゴマーを合成し、そこから発生させたラジカルをESRで観測することにより、メタクリル酸tertブチルの成長ラジカルのESRスペクトルの鎖長依存性や、メタクリレート/アクリレート2量体モデルラジカルを用いた前末端基効果のESRによる観測などを行った。近年、制御ラジカル重合法の発展により、末端の炭素-ハロゲン結合を切断して任意の鎖長のモデルラジカルを発生させることが可能となってきたため、スペクトルの鎖長依存性を調べることができるようになってきた。本研究では、主としてメタクリル酸エステル類の成長ラジカルの鎖長依存性とESRスペクトルとの関係を明らかにすることを目指している。1)成長ラジカルの鎖長や分岐構造を調べる研究MMAをはじめ、種々のメタクリル酸エステルのいろいろな鎖長をもつポリマーをATRP法で合成し、それらをラジカル前駆体として成長ラジカルのモデルラジカルを発生させ、鎖長とESRスペクトルとの関係を明らかにした。この成果はMacromolecules誌に発表したほか、アメリカ化学会の講演をまとめた本の一章としても発表した。メタクリル酸エステル類の成長ラジカルのESRスペクトルは顕著な温度依存性を示すことも知られており、種々の温度で測定したスペクトルを分子運動を考慮したシミュレーションプログラムで解析し、成長末端の回転運動の活性化エネルギーや頻度因子なども求めた。

これらの成果は国内の高分子学会で発表したほか、論文を投稿準備中である。アクリル酸エステルについては2量体、3量体などオリゴマーを合成し、ラジカルの連鎖移動に基づくmid-chain radicalの生成について検討し、結果として出来るポリマーの分岐構造とmid-chain radicalの生成との関連について調べている。一部の成果は前述のアメリカ化学会の本に発表した。2)ラジカル共重合系の成長ラジカルについて調べる研究ATRP法を応用して、種々のアクリル酸エステルとメタクリル酸エステルを組み合わせた2量体モデルラジカル前駆体を合成し、そこから発生させたラジカルをESRで観測することにより、共重合系における前末端基効果を直接観測した。成果はMacromolecules誌に発表した。近年、制御ラジカル重合法の発展により、末端の炭素-ハロゲン結合を切断して任意の鎖長のモデルラジカルを発生させることが可能となってきたため、スペクトルの鎖長依存性を調べることができるようになってきた。本研究では、主としてアクリル酸エステル類やメタクリル酸エステル類の成長ラジカルの鎖長依存性とESRスペクトルとの関係を明らかにすることを目指している。1)成長ラジカルの鎖長や分岐構造を調べる研究MMAのオリゴマーをATRP法で合成し、2量体、3量体、4量体、5量体を単離、精製した。それぞれから発生させたラジカルをESRで観測することにより、成長ラジカルモデルとしての構造の明確なラジカルのコンホメーションや末端の回転の活性化エネルギーなどについて検討した。アクリル酸エステルについては2量体、3量体などオリゴマーを合成、単離し、ラジカルの連鎖移動に基づくmid-chain radicalの生成について検討し、結果として出来るポリマーの分岐構造とmid-chain radicalの生成との関連について調べた。2量体では水素移動は起らず、3量体から起り始めることを明確にした。連鎖移動反応が分子内の1,5水素移動反応であることも明らかとなった。また、RAFT重合系に生じる安定中間体ラジカルをESRで観測し、重水素化モノマーを用いた研究などで何が起こっているのかについて、検討した。