hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食物アレルギーの消化管粘膜の免疫応答に関する研究:便中TNF値および便中IgE値

【目的】即時型アレルギー症状のある食物アレルギー患児では、食物抗原摂取後の便中IgE値が摂取前に比べ高値を示すことから、便中IgE値の上昇は食物抗原刺激に対する消化管粘膜でのI型アレルギーによる免疫応答を反映すると考えられる。また最近、サイトカインのTNFは肥満細胞からも産生されることや、クローン病などの炎症性腸疾患では便中TNF値が高いことなどが報告されている。本研究では、食物アレルギー児に食物抗源の経口負荷を行い、抗原摂取前後の便中TNF値を測定し、便中TNF値と誘発症状や便中IgE値との関連性を検討する。食物アレルギーの抗原の侵入部位である消化管粘膜の免疫応答を直接反映すると考えられる便中のTNF値やIgE値を測定し、肥満細胞に着目してこれらの点を明らかにする。【対象および方法】食物アレルギー患児10例に食物抗原の経口負荷試験を行い抗原摂取前とその後3日間、排便毎に採便し、便中のTNF値およびIgE値を測定する。対照は同年齢の健康小児5例である。採取した便は、リン酸バッファーに溶解し遠心分離後の上清を被検検体とする。TNF値は酵素抗体免疫蛍光法で、またIgE値はデルフィアシステムを用いて時間分解免疫蛍光法で測定した。便中TNF値およびIgE値の経時的変動、誘発症状との関連を検討する。【結果】1)食物アレルギー患児10例では、抗原摂取後30分以内に発疹、喘鳴などの即時型アレルギー症状が誘発された。対照の5例では、抗原摂取後3日間に誘発症状は認められなかった。2)食物アレルギー患児の便中IgE値は、抗原摂取前に比べ抗原摂取後24時間以内で有意に高値で、48時間後は低下した。対照例の便中IgE値は、抗原摂取前後で明かな変動は認められなかった。3)食物アレルギー患児および対照例の抗原摂取前後の便中TNF値は、抗原摂取後72時間以内まで経時的に測定したがでいずれも検出感度以下で、抗原摂取前後で明かな変動は認められなかった。以上、抗原摂取前後の便中TNF値には明かな変動は認められず、臨床症状やIgE値との関連性などを明かにできなかった。便中IgE値と同様に便中TNF値は微量であり、本研究の結果では、測定感度の点での検討が必要と考えられた。
大智度論における大乗仏教教理体系の形成とその展開に関する文献学的研究

『大智度論』は、『大品般若経』の註釈書という形式をとりながら、初期大乗仏教における空思想の体系的研究を意図した浩瀚かつ詳細な一大論書である。本研究においては、本論書の前後に位置すると推察される部派および初期大栗教典類の文献学的研究を通して大乗仏教教理体系の形成過程を解明することを目的としている。当面の課題としては前年に続いて本文解読と詳細な註記の作成を中心にした。各研究分担者は、それぞれの分担課題の詳細な資料の検討を加えつつ和訳原稿の作成を行った。本年度は、昨年に続いて本文(『大正蔵』第25巻)P.79b以下P.94aを和訳して、すでに「愛知学院大学禅研究所紀要」第16巻に発表した。本文和訳に付した註記を作成する段階で次第に明らかになったことは、本論中の引用や教学的背景が原始経典中の律蔵や部派教学の婆沙論の中に多く源をもつということであった。今後の課題としてこれらの資料の検討に重点をおく必要が確認されたことは大きい収穫であった。なお、反省材料としては和訳の文体の不整合を修正することが課題として残った。次年度以降の研究において検討することにしたい。Grassman graph,Johnson Graphの局所的性質による分類は一応の完成を見た.この局所的性質をさらに一般化することについて研究をしている.有限体K上のr×S形の行列全体の集合に対し,行列AとBとの差A-Bの階数が1となるときAとBとを結ぶGraphを考えると,上記のGraphと良くにた局所的性質をもつことに気付いた.この行列の作るGraphを特徴付ける研究を進めている.またHammingスキームにおけるCovercingの問題について,特別な場合であるがある結果を得ている.Atkinsonの公式のcrotical line以外への拡張は昨年度以来の研究が完成され,論文にまとめた.また近年のKloosterman和の研究について,松本の以前の研究との関連で,代数学シンポジウムで総合報告の依頼を受け, Kuznetsovの跡公式や高次元Kloosterman和の研究の現状を整理し論説を行った.擬球上の作用については報告すべき結果を得られなかった.
成長ホルモンにより発生するインスリン抵抗性の原因分子同定のための新しい試み

成長ホルモン(GH)は、インスリン様成長因子の産生を介した成長促進活性を有するが、同時にインスリン抵抗性をはじめとした種々の代謝制御活性を示し、GHの長期連用は糖尿病を誘発する可能性があるなど、臨床上問題となっている。しかし、GHによるインスリン抵抗性の発生機構は、全く明らかとなっていない。本年度、本研究では、3T3-L1脂肪細胞をGHで長時間処理後インスリン処理し、インスリンの細胞内シグナルを詳細に検討した。その結果、GH前処理により、インスリン受容体のチロシンキナーゼ活性や基質のひとつであるIRS-1のチロシンリン酸化は変化しないにも関わらず、もうひとつの受容体キナーゼ基質IRS-2のインスリン依存性チロシンリン酸化が抑制され、更に下流シグナル分子Aktのインスリン依存性活性化も抑制されることを見出した。そこで、恒常的に活性化しているAktを3T3-L1脂肪細胞に強制発現させたところ、GH前処理によるインスリン依存性糖取り込みの抑制が解除され、他の結果も併せると、GH前処理によりIRS-2を介したシグナルが抑制され、GLUT4は細胞膜に移行するのに関わらず、その糖輸送活性が阻害されていると結論された。そこで、GH前処理後のインスリン処理に応答してGLUT4に何らかの分子内修飾が起こっているか、二次元電気泳動を用いて検討したところ、GLUT4の分子内修飾は認められなかった。現在、GLUT4に結合し、GLUT4の糖輸送活性を修飾するような分子の同定を進めている。一方、ヒトGHを高発現するトランスジェニックラットより調製した脂肪細胞では、3T3-L1脂肪細胞と同様に、インスリン依存性糖取り込みの抑制が観察されたが、この糖取り込み抑制は、肝臓でのインスリンシグナルが強められ、インスリン依存性脂肪・グリコーゲン合成が増強されることで補償されることも明らかとなった。しかし、GHによるインスリン抵抗性の発生機構は、全く明らかとなっていない現状である。本研究では、まず、3T3-L1脂肪細胞を長時間GH処理すると、インスリンの細胞内シグナルやインスリン依存的な糖取り込み増加を担っているグルコーストランスポーター4(GLUT4)の細胞内プールから細胞膜への移行に影響しないにも関わらず、インスリン依存性糖取り込みを抑制することを確認した。続いて、GHシグナル伝達に重要と考えられているJAK2あるいはP13-kinaseの阻害剤をGH前処理時に添加したところ、どちらの阻害剤を添加しても、GHによるインスリン依存性糖取り込みの抑制が大きく回復することを見出した。これは、JAK2あるいはP13-kinaseを阻害したことにより、GHによるインスリン依存性糖取り込みの抑制効果が大部分解除されたことを示している。GLUT4は、リン酸化や糖鎖付加などの分子修飾を受けるという報告があり、その糖輸送活性には分子修飾が重要であると考えられている。そこで、GH前処理後、インスリン処理をした3T3-L1脂肪細胞から回収した細胞膜画分を二次元電気泳動に供し、抗GLUT4抗体でイムノブロットした。その結果、GH前処理により、分子質量55kDa付近のGLUT4の等電点に大きな変動は見られなかったが、90100kDaの高分子質量GLUT4がGH前処理により顕著に減少していた。最近、GLUT4とSUMO-1(small ubiquitin-like modifier protein)が結合し、sumolationされたGLUT4が増加すると糖取り込みが増加するという報告がある。これらの結果より、GHがSUMO-1のGLUT4への結合を阻害、糖取り込み能を抑制するという新しい作業仮説が考えられる。
キャビテーションの弱非線形効果を利用した水中高速音響ソリトンの実現と応用

ポンプに代表される水力機器の内部流れにおいて,キャビテーションの発生,そして衝撃波の形成は,しばしば機器の損傷を招く。だからといって,キャビテーションの全てを悪者扱いするのではなく,キャビテーションのメリットのみを有効に利用することは叶わないだろうか。キャビテーションの「弱非線形効果」に着目するとき,衝撃波の音響ソリトンへの変換が可能となる。その波を,機器から高速で放出させることを狙う。本研究の目的は,この革新的技術の実現に向けた理論的基盤の創成にある。キャビテーション気泡振動の弱い非線形性を積極活用することで,波の散逸性の抑制と波の分散性の卓越が両立できて,音響ソリトンの形成が可能となる。そのために,気泡流中を水中音速1,500 m/s超という超高速で伝播する「高速波」なる斬新な波に着目し,その伝播特性を理論的に予測する。高速音響ソリトンの形成において,本質となるのは,波の散逸性・分散性・非線形性それぞれの大きさの見積もりに他ならない。したがって,非線形波動方程式の導出およびその求解を通して,「高速音響ソリトンはいかなる条件下で形成されるのか?」なる疑問への回答が可能となる。初年度の成果は以下のように要約される:1.水中音速を超えて伝播する,超高速・超高周波数の圧力波の弱非線形伝播過程が,非線形Schrodinger方程式で記述されることを示し,その係数を確定させた。2.高速領域の周波数の大小に応じて,2種類の異なる非線形Schrodinger型の方程式が導出される見通しを得た。概ね初年度計画のとおりに研究を遂行できた。一定の困難が予想された非線形波動方程式のうち,1本の導出に成功し,査読付雑誌論文としての公表にも至ったことは,次年度以降の研究遂行のための十分な布石である。さらには,異種の非線形Schrodinger方程式が導かれる見通しも立っている。また,当初計画には含まれておらず,異なる研究として並行に進めていた,気泡流中の非線形波動に熱の効果と流速の効果が及ぼす影響に関する理論解析結果が,本研究に還元可能な見通しも立った。これらの効果を取り入れるための具体的な解析は次年度に譲るが,理論の適用範囲を拡張することができる見込みである。次年度は,初年度の成果を受けて,最終年度における総括を意識しながら,以下のとおりに進める予定である:1.初年度に導いた非線形Schrodinger方程式の理論解および数値解を求める。2.異種の非線形Schrodinger方程式の導出を完了し,上記1との差異を明らかにする。3.粘性・熱伝導の効果を取り入れ,衝撃波面における散逸が及ぼす影響を調べる。4.流速の効果が波に及ぼす影響を調べる。

初年度,想定以上に理論解析が進展したため,数値解析用ワークステーションの購入を先送りとした。次年度使用額は,当該ワークステーション購入および初年度の成果公表に充てる予定である。
ＩＶＲの有効性・安全性向上にむけた拡張現実および三次元モデルの相互活用環境の構築

拡張現実(AR; Augumented Reality)および三次元印刷(3DP; 3D Printing)の技術を、相互活用的に画像下治療(IVR; Interventional Radiology)の領域に応用し、画像下治療の有効性および安全性向上につなげるシステムを構築するにあたり、通常のモニターおよびビデオシースルー型のヘッドマントディスプレイによる仮想現実(Augumented Reality)システムを目標として、段階的にシステムを構築し、3Dプリンターによる三次元印刷(3D Printng)モデルなどにてテストし、実際の使用における評価を目指している。仮想現実(Augumented Reality)システムとしては、通常のモニターにおいて、固定および移動したカメラより撮像した画像に、コンピュータ断層画像(CT; Computed Tomography)や核磁気共鳴画像(MRI; Magnetic Resonance Imaging)などによる三次元画像を投影し、テストを繰り返しながら、実際の生検などに使用可能なシステムの構築を進めている。また、3Dプリンターによる三次元印刷(3D Printng)モデルの血管内治療などといった、術前シミュレーションへの応用としては、引き続き、腹部動脈瘤や門脈、肝静脈狭窄などの血管疾患を対象として、血管内治療の術前シミュレーションに使用可能なモデルを作成し、評価を行うとともに、三次元印刷(3D Printng)モデルを鋳型とした中腔モデルの作成についての検討を行い、実際にカテーテル等を用いた血管内治療の術前シミュレーションへの使用の可能性について、検討を続けている。コンピュータ断層画像(CT; Computed Tomography)や核磁気共鳴画像(MRI; Magnetic Resonance Imaging)による三次元画像をカメラより撮像した画面に投影するシステムの構築は段階的に進められており、また、3Dプリンターによる三次元印刷(3D Printng)モデルの作成および評価を行い、術前シミュレーションでの使用が可能となっており、おおよそ計画に沿って進められていると考えられる。引き続き、コンピュータ断層画像(CT; Computed Tomography)や核磁気共鳴画像(MRI; Magnetic Resonance Imaging)による三次元画像を直視画像に投影する仮想現実システムについて段階的な構築をすすめるとともに、血管を対象の中心として、3Dプリンターによる三次元モデルの作成法を確立し、相互活用可能な環境を構築していく。また、得られた結果に関しては、随時、とりまとめを行い、学会および論文にて、迅速に、成果の発表を行っていく。拡張現実および三次元モデル作成の技術を相互活用的にIVRの分野に応用し、IVRの有用性および安全性の向上、被ばくの低減につなげる環境を構築するにあたり、仮想現実システムの段階的な構築、および、3Dプリンターによる三次元モデルの作成法の確立を進めている。仮想現実システムとしては、まず、固定したカメラより撮像した画像にCTやMRIなどの三次元画像を投影するシステムの構築を進めており、簡易的にマーカー型による拡張現実システムを実現することとし、テストを繰り返しながら、実際の生検などのシミュレーションに使用可能なシステムの構築を進めている。また、3Dプリンターによる三次元モデルの作成としては、3Dプリンターによる造形のメカニズム上、中腔などといった、実際には構築が難しい構造が存在するため、まず、動脈や門脈などの脈管系をはじめとして、モデルの作成法の確立を進めており、血管内治療の術前および術中の評価に使用可能なモデルの作成を行っている。また、中腔の血管モデルの作成法を確立することにより、造影CTのデータに基づき、実際にカテーテル等を用いて、血管内治療の術前シミュレーションが可能となるようなモデルの作成を進めている。中腔の血管モデルに関しては、動脈瘤や狭窄病変に対して、実際の造影CTのデータから複数のモデルを作成することにより、モデルの正確性および再現性の評価を行っており、学会発表および論文化の準備を進めている。おおよそ計画に沿って進められていると考えらえる。拡張現実(AR;Augmented Reality)および三次元印刷(3D Printing)の技術を、相互活用的に画像化手技(IVR;Interventional Radiology)の分野に応用し、IVRの有用性および安全性の向上(術者および被験者の被ばく低減を含め)につなげる環境を構築し、最終的にビデオシースルー型のヘッドマントディスプレイによる仮性現実システムを実現することを目標とし、段階的に仮想現実システムを構築しており、また、3Dプリンターによる三次元モデル等による評価、実際の臨床使用による評価を目指している。仮想現実システムとしては、引き続き、固定および移動したカメラより撮像した画像に、CT(Computed Tomography)やMRI(Magnetic Resonance Imaging)などの三次元画像を投影するシステムの構築を進めており、マーカー型による拡張現実システムをまずは実現することとし、テストを繰り返しながら、実際の生検などに使用可能なシステムの構築を進めている。また、3Dプリンターによる三次元モデルの作成としては、3Dプリンターによる造形のメカニズム上、中腔などといった、実際には構築が難しい構造が存在するため、まず、動脈や門脈などの脈管系をはじめとしてモデルの作成法を確立し、血管内治療の術前および術中に使用可能なモデルの作成を行った、また、中腔の血管モデルにより、実際にカテーテル等を用いた血管内治療の術前シミュレーションを可能とした。中腔の血管モデルに関しては、動脈瘤や狭窄病変に対して、実際の造影CTのデータから複数のモデルを作成してモデルの正確性および再現性の評価を行い、学会発表および論文化を行った。おおよそ計画に沿って進められていると考えられる。拡張現実(Augumented Reality)および三次元印刷(3D Printing)の技術を、相互活用的に画像下治療(Interventional Radiology)の領域に応用し、画像下治療の有効性および安全性の向上につなげる環境を構築するにあたり、ビデオシースルー型のヘッドマントディスプレイによる仮想現実システムを最終的な目標として、段階的にシステムを構築し、3Dプリンターによる三次元印刷モデル等による評価、実際の臨床の現場における評価を目指している。

仮想現実システムとしては、引き続き、通常のディスプレイにおいて、固定および移動したカメラより撮像した画像に、CT(Computed Tomography)やMRI(Magnetic Resonance Imaging)などにもとづく三次元画像を投影するシステムの構築を続けており、テストを繰り返しながら、実際の生検などに使用可能なシステムの構築を進めている。また、ヘッドマウント式のディスプレイおよびカメラを用いて、これらに投影可能なシステムの開発を目指し、これらの使用可能性についての検討を行った。また、3Dプリンターによる三次元印刷モデルの血管内治療など、術前シミュレーションへの応用としては、引き続き、腹部動脈瘤や門脈、肝静脈狭窄などの血管疾患を対象として、血管内治療の術前シミュレーションに使用可能な中腔モデルを作成し、評価を行うとともに、三次元印刷モデルを鋳型とした中腔モデルの作成について検討を行い、実際にカテーテル等を用いた血管内治療の術前シミュレーションへの使用可能性について検討した。おおよそ計画に沿って進められていると考えられる。拡張現実(AR; Augumented Reality)および三次元印刷(3DP; 3D Printing)の技術を、相互活用的に画像下治療(IVR; Interventional Radiology)の領域に応用し、画像下治療の有効性および安全性向上につなげるシステムを構築するにあたり、通常のモニターおよびビデオシースルー型のヘッドマントディスプレイによる仮想現実(Augumented Reality)システムを目標として、段階的にシステムを構築し、3Dプリンターによる三次元印刷(3D Printng)モデルなどにてテストし、実際の使用における評価を目指している。仮想現実(Augumented Reality)システムとしては、通常のモニターにおいて、固定および移動したカメラより撮像した画像に、コンピュータ断層画像(CT; Computed Tomography)や核磁気共鳴画像(MRI; Magnetic Resonance Imaging)などによる三次元画像を投影し、テストを繰り返しながら、実際の生検などに使用可能なシステムの構築を進めている。
会話の中に含まれる意味の交換を楽しむ小学校英語活動の授業開発とその効果

小学校の外国語活動に求められることは、コミュニケーションへの積極性を高めることである。それは、小学校高学年から育まれるものではなく、むしろ小学校低学年から少しずつ丁寧に育んでいくものである。コミュニケーションへの積極性を育むために、会話行為の中に「意味」を含むインタラクティブな授業を構想・展開することに着眼した。相手の意思や意図を大切にし合う行為が生まれるような場面や、自分が相手から得たい情報を学習した書語表現や非言語を大いに活用して獲得したりする場面を意図的に創出することが、児童のコミュニケーションの積極性を高めると考えたのである。本研究は、特に小学校外国語活動が必修化される前の14年生を中心とした授業を開発することを最終目標とし、本年度は授業開発の対象を4年生と設定し、その効果を検証した。実践では、とっておきの相手にプレゼントを贈るための品物を買う活動「Let's get the specialgift.」を構想した。会話場面は、「とっておきの相手にプレゼントを贈るため、大型ショッピングモールに来たが、どの場所で何を売っているか分からない。モールの店員に尋ねれば売り場の場所を教えてもらえる」と設定した。本活動で扱うことが予想される言語表現(場所を尋ねる表現、道順を尋ねる表現、数字、買い物をする際の店員と客のやりとり、)は、事前に扱っておき、本活動で児童が活用できるようにした。授業では、ショッピングモールの店員・買い物をする客・店の売り場を案内する店員の3つの役割に分かれて活動を行った。本実践の中で、見られた児童の象徴的な姿は、次の三つである。一つは、これまでに身に付けた書語表現のもつ意味をきちんと理解して相手と会話をしている姿である。二つは、非言語も大いに活用して意味を交換している姿である。三つは、自分の思い(意味)がきちんと相手に伝わっているかどうかを聞き返す行為を大切にする姿である。児童は、会話に含まれる意味を意識し、仲間との会話を楽しんでいた。このことから、会話行為における意味に着眼する授業は、児童のコミュニケーションへの積極性を高める上で効果があることを検証できた。
αアミノニトリル誘導体の固相熱異性化反応

結晶状態での熱による純化の機構解明1キラルテンプレートの合成および光学分割2ストレッカー反応による基質合成3 DSC測定および熱異性化4種々の物理データの測定および結晶構造と熱異性化の相関1 4を検討した結果次の事実が判明した。最初に,cis-2-amino-1-indanolとベンズアルデヒドとのストレッカー生成物で詳しく検討した。その結果,R体(熱不安定型)とS体(熱安定型)の混合物を結晶状態で加熱するとS体のみに異性化する。一方,ある種の溶媒に溶かしてしばらく放置すると,純粋な異性体はほぼ1対1の混合物に異性化する。コンピュータでエネルギーを計算した結果,溶液中では両異性体間にはほとんどエネルギー差がないが,両者の結晶構造では約8kcal/molもの差があることが判明し,実験事実を良く支持しており,これらの異性化(純化)が,固相特有のものであることが証明された。4軸X線回折の結果から,両異性体の結晶構造を比較すると分子内および分子間の水素結合のパターンが大きく異なり,結晶状態での熱安定性の差になっていることが判明した。他の十数種類の基質でも熱による純化を確認したが,それぞれの基質により両異性体の結晶構造のパターンが必ずしも類似しておらず,この機構をすべての基質に適用できるか否かは,今後検討を要す。5光学的に純粋な非天然型αアミノ酸の新規合成法の検討まず,結晶状態で熱による純化で光学的に純粋な単一異性体に異性化した後,メタノリシスして光学的に純粋なαアミノカルボン酸メチルエステルに誘導した。その後加水素分解によりキラルテンプレートを切除し光学活性なαアミノ酸メチルエステルに誘導した。収率もまずまずで,新しいアミノ酸の不斉合成法の可能性を示したといえる。しかし,キラルテンプレートを切り離した後にラセミ化が起こり光学純度が低下している。今後,切り離しの順番や保護基導入条件の工夫などを行い,改良する必要がある。1キラルテンプレートの合成および光学分割2ストレッカー反応による基質合成合成した全てのテンプレートとベンズアルデヒドとのストレカー反応を行い,相当するアミノニトリル体を収率よく得た。さらに,cis-1-amino-2-indanolと種々ベンズアルデヒド類(ベンズアルデヒド,p-メトキシベンズアルデヒド,p-メトキシカルボニルベンズアルデヒド。p-クロロベンズアルデヒド,p-ヒドロキシルベンズアルデヒド,2-フェニルアセトアルデヒドなど)とのストレッカー反応を行い,何れも高収率で相当するαアミノニトリルを得た。しかしながら,ケトン類との反応は収率が低く,今後検討を要する。3 DSC測定および熱異性化cis-1-amino-2-indanolとp-ヒドロキシルベンズアルデヒドとのストレッカー生成物以外は熱異性化に起因すると考えられる発熱ピークが観察された。4種々の物理データの測定および結晶構造と熱異性化の相関cis-1-amino-2-indanolとベンズアルデヒドとのストレッカー生成物の4軸X線回折を行い,安定型がS体,不安定型がR体であることが判明した。さらに,加熱による熱異性化の刑事変化を粉末X線回折により追跡し,2種類の結晶が1種類の結晶に完全に収束することを確認した。これらの結果は,国内の学会で2回発表し,現在欧文誌に投稿している。
BmMLVの安定的遺伝子発現機構の解明と遺伝子発現ベクターの開発

Bombyx mori macula-like virus(BmMLV)は、カイコ由来培養細胞から発見された持続感染型RNAウイルスである。本研究では、BmMLVの持続感染メカニズムを明らかにするため、まずBmMLVの新規サブゲノミックRNAを同定した。次に、本ウイルスの安全性を確保するため、本ウイルスの物理的不活化法を開発するとともに、本ウイルスが哺乳類由来培養細胞では増殖しないことを明らかにした。加えて、本ウイルスの感染継時的なRNA-seq解析を行った結果、ウイルスの増殖に伴って変動する多数の宿主遺伝子を同定した。Bombyx mori macula-like virus(BmMLV)は、カイコ培養細胞から発見された新規の持続感染型RNAウイルスであり、無病徴の持続感染型の増殖様式を有するウイルスである。そこで本研究ではBmMLVの増殖メカニズムを解明することで、本ウイルスを新たな外来タンパク質発現ベクターとして利用することを目指す。本年度はまず、BmMLVのサブゲノミックプロモーターの同定を試みた。BmMLVの属するチモウイルス科にはサブゲノミックプロモーター領域に特有のTymo-Box、或いはMarafi-Boxが存在することが知られている。しかしながら、BmMLVのサブゲノミックプロモーターと推定される領域には、上述のような既知配列に相同性を示す領域を見出すことは出来なかった。次に、サブゲノミックプロモーターと推定される領域の二次構造予測を行った結果、複数のステム・ループ構造が存在することが予測された。そこで、これらの領域を1000、500、200、50塩基有し、その下流にホタルルシフェラーゼを連結したプラスミドDNAを構築し、BmMLV陽性細胞へと導入した結果、50塩基の領域で十分なプロモーター活性を有することを明らかにした。更に、その領域には6塩基のステム構造からなる二次構造が存在することが予測されたため、ステムの長さを徐々に短くする変異導入を行った結果、プロモーター活性が顕著に低下することを明らかにした。この結果は、見出した二次構造がプロモーター活性に重要な働きを有することを示しており、外来タンパク質発現の為のプロモーターとして有効である可能性を示している。今後、ループ構造に変異導入を施すだけでなく、逆にステムの領域を大きくすることでより強力なプロモーター活性を持つことが出来るのか調査する予定である。本年度はまず、昨年度に転写開始点の50塩基上流まで同定したBmMLVのサブゲノミックプロモーターの解析を進めた。その結果、転写開始点の50塩基上流までの領域は確かにプロモーター活性を有するものの、レポーターアッセイの結果、その活性はアクチンのプロモーター活性などに比べると決して高くはないことが明らかとなった。そこで、本ウイルスの転写するサブゲノミックRNA(sgRNA)を全て同定することを目的として、種々のノーザン解析とprimer extension解析を行った。その結果、従来考えられていたsgRNAの他に、新たなsgRNAが存在することを明らかにした。新たに見出したsgRNAには機能未知の推定ORFが見出された。しかしながら、当該ORFの推定アミノ酸配列に基づく抗体を作製した結果、本ORFの翻訳産物である推定タンパク質を確認することは出来なかった。本sgRNAはチモウイルス科で未報告であり、加えてタンパク質へと翻訳されていない可能性があり興味深い。一方で、BmMLVを発現系として利用する場合には、その安全性が非常に重要である。BmMLVに関しては熱やUVによる不活化が可能であるものの、これらの手法では発現タンパク質を変性するおそれがある。そこでγ線によるウイルスの不活化を検討した結果、10kGyの照射によって本ウイルスが不活化されることを見出した。Bombyx mori macula-like virus(BmMLV)は、カイコ培養細胞から発見された持続感染型RNAウイルスであり、無病徴でありながら大量のウイルス粒子を産生する特徴がある。近年では、カイコ培養細胞のみならず、ミツバチやミツバチヘギイタダニからも本ウイルスの仲間が発見されており、その増殖メカニズムは興味深い。本年度はまず、BmMLVの安全性を確認するために、数種の哺乳類培養細胞において本ウイルスが増殖可能かどうか調査した。その結果、哺乳類由来培養細胞においてはBmMLVは増殖しないだけでなく、BmMLVを添加してもこれら哺乳類細胞の増殖自体に影響を与えないことが明らかとなり、その安全性が確認出来た。更に、本ウイルスをカイコ由来培養細胞へ接種した後、継時的なRNA-seq解析を行った。その結果、BmMLVの感染による宿主遺伝子の転写は10のクラスターに分類され、細胞接着因子を始めとして多くの宿主遺伝子の転写量が変動していることが明らかとなった。また、本年度はBmMLVの増殖について、他のウイルスとの共感染実験に取り組み、あるウイルスにおいては緊密なウイルスーウイルス間の相互作用が存在することを見出した。これらの結果は非常に興味深いものであり、今後も本ウイルスの解析を切り口とした、RNAウイルスの持続感染メカニズムの解明に取り組む予定である。

本研究では、BmMLVの持続感染メカニズムを明らかにするため、まずBmMLVの新規サブゲノミックRNAを同定した。次に、本ウイルスの安全性を確保するため、本ウイルスの物理的不活化法を開発するとともに、本ウイルスが哺乳類由来培養細胞では増殖しないことを明らかにした。加えて、本ウイルスの感染継時的なRNA-seq解析を行った結果、ウイルスの増殖に伴って変動する多数の宿主遺伝子を同定した。本研究は、持続感染型のRNAウイルスであるBmMLVを外来タンパク質発現ベクターとして利用することを目的としている。そのため、目的のタンパク質の発現量を左右するプロモーター領域の特定、また本ウイルスの安全性は非常に重要である。本年度は、BmMLVの感染過程で作られるサブゲノミック(sg)RNAの同定を試みた。その結果、新たなsgRNAを同定しただけでなく、sgRNAにコードされるORFの推定タンパク質の抗体を作製し、この推定タンパク質の検出を試みた。しかしながら、本推定タンパク質の検出には至らなかった。一方で、近年、蚊からBmMLVに近縁のウイルスが検出されただけでなく、ミツバチからもBmMLVに近縁のMLVが検出されている。これらの報告は、BmMLVの属するマキュラウイルスが昆虫ー植物間において、幅広く存在していることを示すものである。そのため、本ウイルスの宿主域の決定や不活化法の確立は喫緊の課題である。そこで本年度はBmMLVの不活化条件の確立にも取り組み、γ線照射による簡便なウイルス不活化法を確立することができた。これらはBmMLVの増殖メカニズムの解明に寄与するだけでなく、発現ベクターとして考えた場合の安全性という側面においても重要な結果であると考えられる。以上より、本年度は、概ね順調に進展していると自己評価した。昆虫ウイルス学次年度は1サブゲノミックプロモーターを利用した遺伝子発現系の開発、2RNA-seqを利用したBmMLV感染細胞のトランスクリプトーム解析を進め、本ウイルスと宿主の相関を明らかにし、遺伝子発現ベクターの開発に繋げたいと考えている。そのため、目的のタンパク質の発現量を左右するプロモーター領域の特定、またその改良は非常に重要である。本年度は、このプロモーターの候補として、50塩基のサブゲノムプロモーター領域を同定した。同定したプロモーターには一つのステム・ループ構造が存在したことから、この二次構造がプロモーター活性に与える影響を調査した結果、少なくともステム領域が重要であることが明らかとなった。一方で、本年度はBmMLVのcoat protein(cp)領域を他の有用遺伝子に置換するため、BmMLVの感染性クローンであるpHMLVのcp領域へマルチクローニングサイトを挿入するなど予備的なplasmidの構築を行った。
放射線療法後に発生した大腸癌:線量効果関係と遺伝子変化

子宮癌などのため放射線治療を受けた人々では、大腸癌が増加することが知られている.そこで,当施設に保存されている3000例の大腸癌切除例から,放射線照射の既往歴のあるものを選び出し,臨床病理学的特徴の解明,さらに線量効果関係・遺伝子変化検討する研究を計画して,以下の結果をえた.当施設において放射線治療後に発見された大腸癌は29症例であり,その特徴として(1)直腸前壁に多い,(2)組織型は粘液癌が多く,時に非常に分化のよい超高分化腺癌がみられる,(3)比較的予後が良好である(とくに粘液癌において),(4)比較的長期間のintervalがある(10年以上),(5)多くに放射線大腸炎の組織所見があり,ときにdysplasiaやcolitis cystica profunda(CCP)が併存する,(6)Intervalが長くなるにつれて,粘液癌の比率が増え,放射線大腸炎やdysplasia,CCPの出現頻度も増え,良好な予後を示す症例も増える,などがあげられた.また,放射線誘発大腸癌の発生は,放射線が直接粘膜細胞に作用し癌化を起こさせるのではなく,放射線照射による長期間の慢性炎症に起因して癌が発生する可能性が示唆された。本研究では,所期の線量評価,および遺伝子変化の検索において有意な結果を得ることができなかった.線量評価については,A点照射量の記載がpilot studyでの予想以上にまちまちであったこと,また遺伝子の検索については,材料の組織中のDNAが予想以上の変性を被っており,これまで行ってきた方法,実験条件ではPCRでの安定な増幅が不可能であったことが原因である.とはいえ,材料の豊富さ,照射設備の一定さという点では,当研究所の材料は,比類のないものであり,上記の目的を達成するために今後も方法の改善に取り組む予定である.子宮癌などのため放射線治療を受けた人々では、大腸癌が増加することが知られている.そこで,当施設に保存されている3000例の大腸癌切除例から,放射線照射の既往歴のあるものを選び出し,臨床病理学的特徴の解明,さらに線量効果関係・遺伝子変化検討する研究を計画して,以下の結果をえた.当施設において放射線治療後に発見された大腸癌は29症例であり,その特徴として(1)直腸前壁に多い,(2)組織型は粘液癌が多く,時に非常に分化のよい超高分化腺癌がみられる,(3)比較的予後が良好である(とくに粘液癌において),(4)比較的長期間のintervalがある(10年以上),(5)多くに放射線大腸炎の組織所見があり,ときにdysplasiaやcolitis cystica profunda(CCP)が併存する,(6)Intervalが長くなるにつれて,粘液癌の比率が増え,放射線大腸炎やdysplasia,CCPの出現頻度も増え,良好な予後を示す症例も増える,などがあげられた.また,放射線誘発大腸癌の発生は,放射線が直接粘膜細胞に作用し癌化を起こさせるのではなく,放射線照射による長期間の慢性炎症に起因して癌が発生する可能性が示唆された。本研究では,所期の線量評価,および遺伝子変化の検索において有意な結果を得ることができなかった.線量評価については,A点照射量の記載がpilot studyでの予想以上にまちまちであったこと,また遺伝子の検索については,材料の組織中のDNAが予想以上の変性を被っており,これまで行ってきた方法,実験条件ではPCRでの安定な増幅が不可能であったことが原因である.とはいえ,材料の豊富さ,照射設備の一定さという点では,当研究所の材料は,比類のないものであり,上記の目的を達成するために今後も方法の改善に取り組む予定である.1.材料の登録以前行った病理組織学的検索で用いた症例(1946年1990年)を1994年まで延長し,骨盤照射の既往歴をもつ大腸癌症例を登録した.2.線量データの再収集これまでに収集した30例のうち,当研究会附属病院で照射された約7割の線量データをデータベースに登録中である.残りの3割(他施設での照射例)のうち,線量評価が可能な症例については,線量データに関して照射施設に問い合わせ中である.3.遺伝子解析パラフィン・プロックから薄切した切片中の癌組織を,microdissection法を用いて切り出した.切り出した微小組織中のDNAをPCRを用いて増幅し,ras遺伝子の変化については,dot blottingによって検索中である.p53蛋白の発現については,免疫染色により,データを得つつある.4.問題点いくつか問題点が生じている.第一に,他院で照射された症例について,資料の破棄のため線量データを集めるのが予想以上に困難であったこと,第二に,パラフィンプロックから抽出したDNAの検索において,dot blotting以外の比較的長いDNA鎖を利用する解析で,結果が安定しない(すなわち再現性を得るのが難しいこと,などである.)子宮癌などのため放射線治療を受けた人々では,大腸癌が増加することが知られている.そこで,当施設に保存されている3000例の大腸癌切除例から,放射線照射の既往歴のあるものを選び出し,(1)発癌および放射線大腸炎を指標とする線量効果関係の解明,(2)照射後の大腸癌と一般の大腸癌とにおけるがん遺伝子,がん抑制遺伝子変異の変異を比較する研究を行い,現時点までに以下の結果を得た.1.症例の登録骨盤照射の既往のある大腸癌症例の登録を,1995年まで延長して,総計32例を登録した.

2.放射線照射データの再収集登録した32例のうち,当施設での照射例(23例)全例,他の施設で照射された9症例のうち2例,計25例のデータを収集した.3.組織型の解析32例の組織型は,超高分化腺癌3例,高/中分化腺癌20例,低分化腺癌0例,粘液癌8例,扁平上皮癌1例であり,粘液癌が比較的多いという傾向が確かめられた.4.線量との関係線量計算はまだ進行中で,これまでのところ,放射線大腸炎,大腸癌の組織型ともに,線量との有意な関係は認めていない.今度,放射線大腸炎の程度を23段階に細分化して検討する.5.遺伝子解析パラフィンブロックを用いた検討は,p53,rasに関しては,いくつかの例について結果がでたが,いずれも再現性に乏しく,現時点で有意な結果を得ていない.新鮮材料では,これまで3例について,ras遺伝子の変異を検討したが,いずれも粘液癌でなかったせいか,突然変異を検出できなかった.今度は,粘液癌の新鮮材料を用いて検討する予定である.
Navier-Stokes方程式に現われる特異摂動の解析

共同研究者の柳沢先生(奈良女子大学)とは,Prandtl方程式の特異解・(非圧縮性)Navier--Stokes方程式の解の微分可能性・圧縮性Navier--Stokes方程式のゼロ粘性極限について,様々な議論を行った.具体的な論文にはならなかったが,Prandtl方程式についてのお互いの認識,特に非定常Prndtl方程式の解の存在定理の予想しうる形について等,を新たにしたものがあった.また儀我先生(北海道大学),石村先生(一橋大学)とも共同研究を行い次の結果を得た.儀我先生とは,有界な初期値から始まるNavier--Stokes方程式の解について,今まで知られていなかった解の時間的局所存在・一意性・2次元の時間的大域解の存在を示した.さらに半線形放物型方程式のBlow up rateを複雑なBoot strap methodを使い計算した(準備中).直接流体とは関係のない方程式であるが,この研究が放物型方程式の解にたいする特異性解析の解析手段を得ることに役に立つ事は疑いようの無いことである.石村先生とはPrandtl方程式の自己相似解(Blasius解)が爆発する場合を取り扱い,詳しいBlow up rateを計算した(投稿中).なお投稿中の論文は準備中の論文は共同研究者の柳沢先生(奈良女子大学)とは,Prandtl方程式の特異解・(非圧縮性)Navier--Stokes方程式の解の微分可能性・圧縮性Navier--Stokes方程式のゼロ粘性極限について,様々な議論を行った.具体的な論文にはならなかったが,Prandtl方程式についてのお互いの認識,特に非定常Prndtl方程式の解の存在定理の予想しうる形について等,を新たにしたものがあった.また儀我先生(北海道大学),石村先生(一橋大学)とも共同研究を行い次の結果を得た.儀我先生とは,有界な初期値から始まるNavier--Stokes方程式の解について,今まで知られていなかった解の時間的局所存在・一意性・2次元の時間的大域解の存在を示した.さらに半線形放物型方程式のBlow up rateを複雑なBoot strap methodを使い計算した(準備中).直接流体とは関係のない方程式であるが,この研究が放物型方程式の解にたいする特異性解析の解析手段を得ることに役に立つ事は疑いようの無いことである.石村先生とはPrandtl方程式の自己相似解(Blasius解)が爆発する場合を取り扱い,詳しいBlow up rateを計算した(投稿中).なお投稿中の論文は準備中の論文は平成11年度は本研究の最初の年であったので、基礎的な研究を行った.共同研究者の柳沢氏とは,Navier-Stokes方程式の特異摂動方程式である非定常境界層方程式を次の様な側面からの解析を行った.ある仮定の下に導かれるStagnation Point上の2階非線形放物型方程式を取り扱った.その方程式は遅れの項(積分項)を非線形項として含む方程式である.松井はその定常解(遅れを持った非線形常微分方程式)が存在しないことを示し,柳沢は非定常解の局所存在を示した,これらの結果は現在のところ満足行く結果には達していないので,今後の研究と併せて発表していく予定である.また松井は本研究に対する別の側面の基礎として,Navier-Stokes方程式の構造を調べる研究を北海道大学の儀我氏とその学生とで行った.具体的には初期値問題を取り扱ったのであるが,その初期値に対しては「空間の無限遠での減衰」は仮定せず解の存在とー意性を取り扱った.次の結果を得た.さらにー意性に関しては,上の結果でp(t,x)=\sumR_iR_j A_{ij}としても成り立つという結果を得た.ただしA_{ij}は本質的に有界な関数である.以上が本年度における研究実績の報告である.研究分担者の柳沢さんと次の解析を行った.京都大学の浅野潔先生が球の周りで得た境界層方程式に対し,その見直しと解の存在について調べた.浅野先生は得た方程式を線形化し,定常解の存在を調べどのような場合に解が構成できるかの条件を得ている.我々はその方程式をそのままにし,非線形のまま定常解を構成することを試みた.具体的には遅れを持った非線形2階常微分方程式の境界値問題である.すなわちυ=υ(s;θ)を未知関数(ただしθはパラメーター)とすると次の方程式となる.ただしνは粘性係数,bは球の半径である.この方程式を解析した結果,解が存在しないことが解った.浅野先生による線形方程式の解析では,乱流に移行するとでも言えるような流れが構成できている.このことは非線形性が,境界層の存在に寄与しているわけではないということ教えてくれていると思われる.代表者個人では次の解析を行った.領域{-∞<x<∞,0<y<∞}における2次元非定常Plandtle境界層方程式(y=0が境界である)の解の構成を行っている.私の知る限りAnalyticな初期条件に対する解の存在は,最近幾つかの結果がある.しかしAnaliticityを仮定しない場合は,依然Oleiniの古典的な結果しかない.現在の研究は,Analyticityを仮定しない場合である.共同研究者の柳沢先生(奈良女子大学)とは,Prandtl方程式の特異解・(非圧縮性)Navier--Stokes方程式の解の微分可能性・圧縮性Navier--Stokes方程式のゼロ粘性極限について,様々な議論を行った.

具体的な論文にはならなかったが、Prandtl方程式についてのお互いの認識,特に非定常Prandtl方程式の解の存在定理の予想しうる形について等,を新たにしたものがあった.また儀我先生(北海道大学),石村先生(一橋大学)とも共同研究を行い次の結果を得た.儀我先生とは,有界な初期値から始まるNavier-Stokes方程式の解について,今まで知られていなかった解の時間的局所存在・一意性・2次元の時間的大域解の存在を示した.さらに半線形放物型方程式のBlow up rateを複雑なBoot strap methodを使い計算した(準備中).直接流体とは関係のない方程式であるが,この研究が放物型方程式の解にたいする特異性解析の解析手段を得ることに役に立つ事は疑いようの無いことである.石村先生とはPrandtl方程式の自己相似解(Blasius解)が爆発する場合を取り扱い,詳しいBlow up rateを計算した(投稿中).なお投稿中の論文は準備中の論文は
配位不飽和性を制御因子とする鉄触媒の設計概念の創出と特異的触媒反応の実現

配位子の立体的、電子的性質を制御因子とする、配位不飽和鉄種の設計をおこない、アルケンを中心とした反応基質との素反応過程の解明と触媒反応への展開をおこなった。トリアザシクロノナン配位子を持つFe(II)16電子種は、原子移動型ラジカル重合のよい触媒となるが、その前駆体の設計により高い活性と制御性を実現した。エチレンジアミン配位子と2つのメシチレン基を持つFe(II)14電子種は、電子受容性アルケンと反応してカップリングと共役付加を起こす。ジシラメタラサイクル構造を持つFe(II)16電子種は、アルケンとの反応により環状ケイ素化合物を生成する。本研究は、配位不飽和鉄錯体の設計、合成、構造・電子構造解析、素反応過程の解明をおこなう錯体化学的検討と、得られた知見から触媒反応を設計し実現する研究手法で、従来Pd等の貴金属で実施されている分子触媒反応を、地球上に豊富な資源量を持ち、安価で環境負荷の少ない鉄で達成することを目的としている。その実現の鍵として、14電子(L)2Fe(II)(mesityl)2(L=配位子)型鉄錯体の設計、合成し、その素反応過程を解明することにより鉄触媒反応の実現を図る。平成22年度の成果として、14電子(tetramethylethylenediamine)Fe(II)(mesityl)2錯体の基礎的な反応性を、とくに電子不足アルケンとの反応を中心に検討した。優れた電子受容体であるテトラシアノエチレンとの反応では、鉄上の2つのメシチル基がカップリングしてジメシチルが生成する。電子受容性が劣るフマル酸やマレイン酸エステルでは、カップリング反応のほかに1,4付加反応に由来するアルケンへのメシチル基の導入反応が起こる。種々のα,β-不飽和ケトンでは1,4-付加反応が選択的におこり、β-メシチルケトンを与える。種々のα,β-不飽和ケトンの反応を検討し、S-cis構造をとりうる基質では共役付加が、s-trans構造をとりうる基質ではエノレートの生成が、そして、アルデヒドでは1,2-付加が起こることが明らかとなった。これらの成果は、鉄錯体の素反応からは、鉄触媒による求核剤の共役付加反応、エノレート生成、1,2-付加反応が実現することを示唆した重要な知見である。研究は配位不飽和鉄錯体の設計、合成、構造・電子構造解析、素反応過程の解明をおこなう錯体化学的検討と、得られた知見から触媒反応を設計し実現する、有機・高分子合成研究の2段階からなる。平成22年度において、14電子L2Fe(II)(Y)2型錯体を鉄周りの立体環境、鉄と配位子間の電子の授受に着目して設計し、窒素系配位子Lをもつ14電子L2Fe(II)(Y)2型錯体として、14電子(η-tetramethylethylenediamine)Fe(II)(mesityl)2錯体の基礎的な反応性を、とくにシアノにやカルボニル基に共役した電子不足アルケンとの反応を中心に検討した。平成23年度は、これを発展させ、量論反応としての共役付加反応のほか、基質によりケトンとの反応において、エノレート生成反応、テトラシアノエチレンとの反応においてカップリング反応、アルデヒドとの反応においては炭素一酸素二重結合への1,2-付加反応が起こることを見出し、基質汎用性についての検討をおこなった。また、京都大学化学研究所の中村正治研究室の協力を得て、これらの反応の不斉合成化と触媒反応化を検討した。触媒化は限られた基質での成功を収めたが、典型元素求核剤に限界があり、また、不斉合成が達成しにくいことから、さらに詳細に検討する必要があることが明らかとなった。これらの成果を、配位子の観点から整理し、(L)2Fe(II)(Y)2錯体のLを現在のテトラエチレンジアミンからリンやシラン系配位子への拡張、(L)2Fe(II)(Y)2錯体をあわせて素反応過程を明らかにするとともに、アミド等カルボニル化合物およびアルケンの触媒的化学変換反応についての基礎的な知見を収拾した。
体外培養における多能性幹細胞からの機能的な原始卵胞の作製

本研究の目的は卵巣中の卵母細胞/卵子の源である原始卵胞の成立・維持機構を体外培養系を用いて明らかにすることである。特に本研究ではまず多能性幹細胞からの卵母細胞系列の分化誘導形を開発し、その過程において原始卵胞がどのように確立されていくかを解析する。多能性幹細胞は遺伝子改変が容易であり、それらから原始卵胞が作られる培養系を開発できれば、これまで不明な点が多い原始卵胞の成立・維持機構の解明に貢献し、不妊症の解明にも大きく貢献すると思われる。減数分裂特異的レポーターES/iPS細胞の樹立:減数分裂特異的レポーターはRec8とStra8の下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を導入した。計画書ではBACを用いることになっていたが、遺伝子発現の特異性を考慮してノックインを行うことにした。現在までにノックインコンストラクトの構築を終え、細胞に導入している。原始卵胞の遺伝子発現プロファイリング:原始卵胞の構成細胞の単一細胞レベルでの遺伝子発現プロファイリングを行うために、微量サンプル(1細胞)からのcDNA合成・合成のための条件を検討した。まずは比較的調整のしやすい胎仔の生殖巣の細胞を酵素処理により解離し、cDNAの合成・増幅に供した。実験開始当初は増幅したcDNAの平均長が次世代シークエンスで解析するために必要な長さに達していなかった。その後の条件検討により平均長は理想よりもやや短いものの、解析に使用できると考えられる質のcDNAライブラリーを得た。次に実際に原始卵胞の遺伝子発現をプロファイリングするために、生後8日目の卵巣より原始卵胞を採取するための条件を検討した。酵素処理の条件検討により原始卵胞(卵母細胞と顆粒膜細胞の複合体)を単離する条件を決定し、さらに原始卵胞を卵母細胞と顆粒膜細胞に分離する酵素処理の条件を決定した。得られたそれぞれの単一細胞からcDNAを合成・増幅した。これまでおおよそ卵母細胞20個程度、顆粒膜細胞30個程度からcDNAライブラリーを調整した。現在、原始卵胞より得られたそれぞれのcDNAライブラリーに次世代シークエンサーの解析に用いるためにバーコード標識を順次行っている。このバーコード標識は一度に多くのサンプルをシークエンサーで処理するために必要である。これらのバーコード付加処理が終了した時点でシークエンス解析による遺伝子発現プロファイリングを行う。卵子は全能性を担う唯一の細胞であり、その発生過程の異常は次世代の個体の疾患原因ともなることから、生物学的・医学的に極めて価値の高い細胞である。しかしながら卵子の発生過程の解明は、卵母細胞の初期分化過程が胎生期におこることや得られる成熟卵子の数が少量であることから、十分に進んでいない。本研究ではマウスの多能性幹細胞(ES/iPS細胞)から始原生殖様細胞(PGCLCs)を経て卵子までの発生過程を忠実に再現する完全体外培養系の開発を目指す。具体的にはまず始原生殖細胞から原始卵胞までの分化過程を体外培養で再現するために、原始卵胞特異的レポーターES細胞の樹立、培養条件の検討、PGCLCsの増殖や減数分裂を制御する因子の検索、体外培養で得られた原始卵胞の機能的解析を行う。本年度の研究により、本研究で再現する原始卵胞形成過程の遺伝子発現解析を行った。具体的には始原生殖細胞、減数分裂移行期の卵母細胞、原始卵胞卵における遺伝子発現をRNA-seqにより解析した。その結果、原始卵胞卵に特異的、または比較的に強く発現している遺伝子を97個単離した。これらの遺伝子から最も特異的かつ発現量の多い遺伝子を選択し、レポーター遺伝子の構築を開始した。また、本年度の培養条件の検討により、効率良く多くの始原生殖細胞が減数分裂に移行する条件を決定した。この条件では約半数の始原生殖細胞が減数分裂に移行すると考えられた。次に、PGCLCsの増殖や減数分裂を制御する因子の探索を行った。始原生殖細胞を様々な組織の細胞と培養した予備実験の結果、始原生殖細胞の増殖や減数分裂の支持能は雌生殖巣の細胞と一部肺細胞に認められた。このため予備実験に用いたそれぞれの組織の遺伝子発現をRNA-seqにより解析し、生殖巣と肺細胞に特異的に発現している因子の検索を行った。現在までにRNA-seqを終了し、データを解析している。現在までの研究により、ES細胞から分化誘導した始原生殖細胞を胚齢12日目の雌生殖巣の体細胞と共培養させ、培養皿上で卵子にまで分化させる培養系を確立した。この培養法で得られた卵子は体外受精により健常なマウスになることが確認された(論文作成中)。またES細胞に加えてiPS細胞からも同様に受精可能な卵子を分化誘導することができた。この培養系では始原生殖細胞が卵子になる過程において、成体内の卵巣に見られるような原始卵胞のステージを経ないことが明らかになった(つまりすべての卵母細胞が活性化される)。本研究の計画にあるとおり、この培養系の確立により体外培養での原始卵胞の作製のための基盤が確立された。培養系の確立と並行して、体外培養で得られた卵母細胞系列と体内の卵母細胞系列の各ステージの遺伝子発現を比較した。その結果、成体の卵巣中の原始卵胞で特異的に発現する遺伝子群を多数単離した。これらの遺伝子群は原始卵胞の維持に必要な遺伝子群と思われるが、その遺伝子数が多数であるために、機能解析のためには絞り込みを必要とした。