hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粘膜免疫活性化による子宮頸癌前癌病変の新規治療戦略に関する研究

子宮頸癌の前癌病変(CIN3)は粘膜病変であり、その制御にはHPVに対する粘膜免疫誘導が有効である。本研究では子宮頸部の粘膜免疫を活性化することによりCIN3の治療をめざした戦略を見出し、トランスレーショナルリサーチとして臨床試験まで研究を進めた。子宮頸癌の前癌病変である子宮頸部上皮高度異形成(CIN2-3)は、HPVの癌蛋白質E7を高率に発現した粘膜病変である。CIN病変を消失させるためには、E7を標的にした細胞傷害性T細胞(CTL)を子宮頸部の粘膜リンパ球に誘導しなければならない。我々は、腸管粘膜由来のIntergrin α4β7+リンパ球が子宮頸部粘膜に存在することを見出した。また我々は、安全性の高い乳酸菌に着目し、乳酸菌E7ワクチンを製剤化し、動物実験によって腸管のIntegrin α4β7+リンパ球にE7-CTLが優位に誘導されることを確認した。したがって、乳酸菌E7ワクチンを経口接種すれば、Intergrinα4β7+のE7-CTLが腸管から子宮頸部に帰巣し、E7陽性CIN病変に細胞傷害性を発揮すると期待できる。そこで、東京大学医学部研究倫理委員会の承認を得て2009年1月からCIN3患者を対象とした第I/IIa探索的臨床試験を開始している。我々は、子宮頸部粘膜における耳HPVE7に対する細胞傷害活性を直接測定するために、子宮頸部粘膜リンパ球を採取し、E7-CTLを測定するアッセイ系を樹立した。これを用いて、ワクチン接種による粘膜免疫誘導能を評価する予定である。治療的ワクチンの臨床的治療効果と局所免疫応答を正確に把握できると期待される。我々は、安全でかつ腸管粘膜との親和性が高い乳酸菌を利用し乳酸菌E7ワクチンを製剤化した。東京大学医学部研究倫理委員会の承認を得て2009年1月からCIN3患者を対象とした第I/IIa探索的臨床試験を開始した。同時に子宮頸部粘膜型リンパ球(CxL)の分離・培養法を樹立し、CIN3症例の30例のCxLにおける抗E7-CTLを測定した。CIN3自然退縮例と増悪例で比較すると、自然退縮例で有意にE7-CTL活性が高いことを見出した。また、本年度は4例のCIN3症例が臨床試験に登録され、試験が実施された。乳酸菌E7ワクチンを内服した全例において、CxLと末梢血の両方でE7-CTLが誘導されていた。臨床試験は、投与量によって4つのコホートを設定しているが、現段階でコホート2(2cap/day乳酸菌として500mg)が終了している。明らかな有害事象は全例で認めていない。臨床効果は、コホート2の1例で病変の明らかな消失が観察された。現在、コホート3継続中である。子宮頸癌に代表されるヒトパピローマウイルス(以下HPV)関連腫瘍細胞は、外来性のHPVウイルス蛋白質E7が癌特異抗原となることから、免疫学的排除が有効な治療戦略といえる。本研究では、子宮頸癌前癌病変(CIN3)が粘膜病変であることに注目し、HPVのE7癌蛋白質を標的にした粘膜免疫を誘導する治療ワクチンを新規CIN3治療薬として実用化できるかを検討することを目的とした。治療薬として乳酸菌Lactobacillus caseiにE7蛋白質を提示した製剤(GLBL101c)をGMPレベルで製剤化し内服薬として用いた。これまでに7例が試験終了し、2例が試験中である。有害事象は全く見られず安全に投与できている。免疫学的検査として子宮頸部局所の粘膜免疫応答を検出する方法を確立した。まず子宮頸部から粘膜型リンパ球(CxL)を分離し、CIN3症例の30例のCxLにおける抗E7-CTLを測定した。CIN3退縮例ではE7-CTL活性が高いことがわかった。そこで、GLBL101cの臨床試験症例について、GLBL101c投与後に、末梢血とCxLのE7-CTLを測定し、CxLに優位にE7-CTLが誘導されていることがわかった。投与量依存性かつブースター効果が確認された。また、コホート3(4cap/day乳酸菌として1g)の3例では、投与後4-9か月で2例がCR、1例がPRとなり、奏効率100%である。CIN3治療(分子標的)薬として実用性が期待できる。
メタボローム解析を駆使した新規腎疾患診断マーカーの開発

本研究では、キャピラリー電気泳動ー質量分析法(CE-MS)を用いて、ネフローゼ疾患患者の尿、および血漿中のイオン性代謝物の一斉分析を行い、病型特異的なバイオマーカーの探索を行った。結果、25種類の代謝物を組み合わせることにより7種のネフローゼ疾患から特定の疾患を判別するモデルを作成することが可能であった。また、未知ピークに関してはLC-MSを用いた分取操作を行い、新規バイオマーカー候補の同定を行うことが可能であった。本研究の目的である種々の腎疾患における疾患診断マーカーを探索するために、本年度はこれまでに各種腎疾患患者729検体の尿について、キャピラリー電気泳動-質量分析装置を用いたメタボローム測定を行った。結果、患者尿中より約220種類の代謝物由来のピークを得ることができ、このうち約150種に関しては標準化合物との比較によって代謝物の同定まで行うことができた。解析に関しては、まず各種腎疾患の中でネフローゼ症候群のタイプを判別するマーカーの探索を行った。膜性腎症、糖尿病性腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、ループス腎炎、アミロイド腎症、巣状糸球体硬化症、IgA腎症の各検体の内、腎生検によってネフローゼを呈すると確定診断された233検体について、各病態で特異的に変動する代謝物の探索を行った。各疾患で平均して10種程度の特異的に増減する代謝物が得られ、その内のいくつかについては単独でも疾患を判別可能なマーカー候補であった。また、一部においては該当する標準化合物が入手できなかったため、同定ができない代謝物も存在した。そこで、分取液体クロマトグラフー質量分析装置を用いた未知化合物の分取・同定システムの立ち上げを行った。このシステムを、今回得られた未同定代謝物の一部に適用して実際の分取作業を開始した。さらに、液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いた疎水性メタボローム解析に関しては、分析カラムの選定や測定条件等に関する基礎検討を行い、測定条件の最適化まで完了した。キャピラリー電気泳動ー質量分析法を用いた親水性代謝物のメタボローム解析については、予定していた全検体の測定、解析まで終了している。未知代謝物の分取に関しても、条件の設定が終了し分取作業を開始した。前年度より継続して、ネフローゼ症候群のタイプを判別するマーカーの探索を行った。膜性腎症、糖尿病性腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、ループス腎炎、アミロイド腎症、巣状糸球体硬化症、IgA腎症の各検体の内、腎生検によってネフローゼを呈すると確定診断された274検体について、各病態特異的に増減する代謝物の探索を行った。幾つかの代謝物については、単独で特定の病態を判別することがある程度は可能であったが、多くの病態は単独の代謝物では判別が難しかった。そこで、5つの代謝物の組み合わせまでを許容した判別モデルの作成を行った。25個の代謝物を組み合わせて用いることで、7種類のネフローゼから特定の病態を判別することが可能であった。モデルの判別能を示す指標である、ROC(受信者動作特性)曲線の曲線下面積値は0.6656(最小)0.9580(最大)であり、十分な判別能を有していることを確認した。さらに、このモデルが用いたデータセット依存的でないかどうかを確認するために、バリデーション用検体として120検体の追加測定を行った。一部で曲線下面積が若干低下するものもあったが、作成したモデルはデータセット依存的ではなく、普遍性があることを確認した。また、モデルに使用した代謝物の一部は未同定ピークであったため、これらの同定作業も継続して行った。前年度までに最適化した分析条件と、今年度追加で最適化した分析条件を組み合わせて、未知ピークの精製度を高める工夫を行った。未知ピークの分取および同定作業を行っているが、尿中より得られる未知ピークの濃度が想定より薄いために、分取回数を増やさなければならず、時間がかかっている。これまでに尿のメタボローム解析を終了したネフローゼ症候群患者の内、血漿検体が手に入った186名分についてもキャピラリー電気泳動ー質量分析を用いたメタボローム解析を実施した。血漿中より89種類の代謝物を同定し、幾つかの代謝物に関しては特定の疾患群で有意に変化していることを見出した。またこれらの中には、特定の症候群において既報の物質や尿毒症物質をして広く知られているものが含まれていた。一方で、各代謝物の尿中存在量と血中存在量の関係性についても調査したが、両者の間に明確な関係性を示す代謝物を見つけることは出来なかった。さらに、尿のメタボローム解析においてバイオマーカーの候補となったピークの内、特定の未知ピークについて、液体クロマトグラフィー質量分析を用いた分取条件の最適化を行った。3種類の分取条件を用いることによって、高純度に未知ピークを分取する事が可能であった。実際に、本法を用いて当該未知ピークの分取を行い、精製した代謝物を核磁気共鳴にて構造推定を行うことができた。推定された構造を持つ化合物に関して化学合成を依頼し、合成した代謝物を同一条件にて測定した結果、泳動時間、精密質量、タンデムマススペクトル共に未知ピークと完全に一致したため、バイオマーカー候補の同定ができた。

本研究では、複数のメタボローム解析手法を併用することにより、ネフローゼ症候群患者尿中より400種類以上のピークを検出することができ、これらを組み合わせた特定疾患鑑別のための精度の高い判別モデルを作成することができた。本研究では、キャピラリー電気泳動ー質量分析法(CE-MS)を用いて、ネフローゼ疾患患者の尿、および血漿中のイオン性代謝物の一斉分析を行い、病型特異的なバイオマーカーの探索を行った。結果、25種類の代謝物を組み合わせることにより7種のネフローゼ疾患から特定の疾患を判別するモデルを作成することが可能であった。また、未知ピークに関してはLC-MSを用いた分取操作を行い、新規バイオマーカー候補の同定を行うことが可能であった。液体クロマトグラフィー質量分析法を用いた疎水性メタボローム解析については、測定条件の最適化が終了しているので、順次測定と解析を行っていく。未知代謝物に関しては、分取作業を完了させ、NMRによる同定を行う。未知ピークの同定作業に注力する。分取にかかる時間の短縮のために、径のより大きなカラムを用いるなど、分取条件の見直しを行う。メタボロミクス検体の前処理と測定を通常よりまとめて行ったことにより、都度使用する消耗品や試薬の消費量を若干抑えることが可能であった。液体クロマトグラフィーにおけるカラムの消耗が想定していたよりも早いことが判明したため、カラムの購入代金に充てる。
甘味嗜好・単純糖質摂取量に着目したゲノムワイド関連解析およびメンデルランダム化法

単純糖質の過剰摂取は肥満・糖尿病・死亡リスク上昇につながると考えられている。単純糖質摂取量の規定因子には遺伝要因と環境要因があると考えられるが、単純糖質摂取における遺伝要因の果たす役割は大きいかもしれない。本研究では、約17,000人の疾病に罹患していない一般集団の大規模ゲノムデータを用いて、ゲノム網羅的関連解析を行い、単純糖質摂取量および甘味嗜好の遺伝要因を明らかにする。今年度は、評価項目である、食物摂取頻度調査票(FFQ)から推計した単純糖質摂取量の妥当性・再現性の分析結果を論文発表した。多目的コホート研究に参加した男女のうち、5年後調査で用いられたFFQに1年間隔で2回答え、さらに28日間の食事記録調査(DR)に参加した551人の男女を対象とし、単純糖質摂取量をFFQとDRの2つの食事調査方法によって、それぞれ算出した。さらに、単純糖質摂取量の客観的な指標である尿中の糖濃度(ショ糖と果糖の尿中濃度の合計)を用いて、妥当性を検証した。その結果、FFQから得た単純糖質摂取量と尿中の糖濃度の相関係数は、0.40で、FFQとDRから得た単純糖質摂取量の相関係数は、コホートIの男性で0.57、女性で0.41、コホートIIの男性で0.56、女性で0.34であった。さらに、1年間隔で2回行ったFFQからの摂取量の相関係数は、コホートIの男性で0.63、女性で0.55、コホートIIの男性で0.66、女性で0.63であった。以上より、FFQで得られた単純糖質摂取量の妥当性と再現性が確認できた。さらに、妥当性の確認された単純糖質摂取量に着目したゲノム網羅的関連解析に着手し、分析中である。今年度の計画は、、甘味嗜好・単純糖質摂取量に着目したゲノムワイド関連解析を実施することである。単純糖質摂取量の妥当性を確認したうえで、すでにゲノムワイド関連解析を実施しており、順調に進捗していると考えている。前年度に引き続き、甘味嗜好・単純糖質摂取量に着目したゲノムワイド関連解析を実施する。その後、再現性の検討のための手続き・分析を行う。次年度以降にインピュテーションやゲノム解析を行う必要が生じたため、次年度使用額が生じた。
インスリン抵抗性異常を基盤とした子宮内膜脱落膜化不全と産科合併症の発症機序の解明

具体的にはヒト子宮内膜において、PPARgammaは子宮内膜脱落膜化とともに経時的に発現が低下していくことが分かった。そこで、PPARgamma agonistであり、インスリン抵抗性改善薬であるpioglitazoneを脱落膜化子宮内膜中に添加した。すると、pioglitazoneの高濃度の添加でPPARのgammaの発現が上昇し、逆に脱落膜化は有意に抑制されることが分かった。しかし、内服常用量として用いられる際に到達する血中濃度付近の低濃度の添加ではPPARgammaの発現は変わらず、脱落膜化マーカーの発現にも変化はなかった。次に、siRNAを用いてPPARgammaとそのコアクチベーターであるPGC-1alphaをknockdownした内膜細胞を作製した。各培養細胞をプロゲステロンとcAMPを添加して脱落膜化させた。PPARgammaのknockdownでは脱落膜化は促進され、PGC-1alphaのknockdownでは抑制される相反する結果を得た。今後、RNA-Seqを用いた網羅解析によりPPARgammaおよびPGC-1alphaとその下流にあるインスリンシグナル系を明らかにし、ヒト子宮内膜の脱落膜化を制御する遺伝子系を明らかにする。脱落膜化制御機構についてはその一部分を明らかにすることができた。今年度は網羅解析を行い全体像を明らかにする必要があるため。また、来年度にかけて患者検体を用いたSNP解析を予定している。インスリン抵抗性の原因とされている遺伝子群にはInsulin Receptor, IRS-1,2,3,4, PI3kinase, Protein tyrosine phosphatase1Bm Protein kinase C, PPAR gammaなどがある。当初の計画ではそのすべてについて脱落膜化に影響するか検証するよていであった。しかし、時間的、予算的にすべてを検証することは不可能であるため現在明らかになったPAPRgammaとその補酵素であるPGC1alphaを中心に今後解析をすすめていく予定である。抗ヒトPPARgammaPPARgamma抗体、抗ヒトPGC1alpha抗体などを購入する必要があるが、今年度の使用限度額を超過してしまうため、残額27,207円については次年度に繰り越すこととしたため。
瞬間結晶化超急冷高保磁力薄帯に関する研究

前者についてはアモルファス薄帯、従って薄帯磁石が得られなかった。Fe-Ni-Co-Cu-B系合金のアモルファス薄帯は得られ、700°C瞬間結晶化によって約600Ocの保磁力の薄帯磁石を得ることができた。〔2〕希土類-Fe-B系アモルファス微細結晶化薄帯磁石の研究(2.1)パルス高磁力下減磁曲線自動計測78Tパルス高磁化力を試料に加え、減磁極線を自動計測するシステムを完成し、超高保磁力材料の減磁曲線の自動計測を可能にした。(2.2)無磁界中結晶化Nd-Fe-B系では初磁化曲線の形状は、Nd、B量の少ない組成では、pinning形、多い組成ではnucleation形となり、後者の保磁力は15koe以上となる。残留磁化は薄帯に平行な方向よりも垂直方向が大きく、結晶が垂直方向に配向していると推定された。(2.3)磁界中結晶化Nd-(Fe_1-xCox)-B系薄帯磁石については、X>0.4の範囲で結晶化温度よりも高いキュリ-温度をもつこと、およびX<0.6の範囲で10koeを越える保磁力を有することが明らかとなった。磁界中結晶化で残留磁化の約30%の増加が認められた。(2.4)磁化過程の解析Nd-Fe-B系においてNd^2、Fe_<14>、B結晶粒界での異方性および交換定数の減少が磁化過程に及ぼす影響を計算解析をし、a)異方性のみの減少の場合は不均質幅が140A以下の範囲では保磁力はnucleationで支配される。b)交換定数の少ない低下はnucleation磁界に殆ど影響を与えない。ことなどを明らかにした。Mn-Al-B系合金については(Mn_<54.5>Al_<45.5>)_<100>-xBx(18≦×≦22)について超急冷薄帯化を試みたが、アモルファス状態が得られなかった。アルニコ-B系についてもB量612wt%の範囲で超急冷薄化を試みたが、Alがアモルファス化を阻害する因子であることが推定され、今後さらにFe-Ni-Co-Cu合金のアモルファス化を試みる。〔2〕希土類-Fe-B系アモルファス結晶化薄帯磁石の研究(2.1)パルス高磁化下減曲線自動計測:78Tの高磁化力を試料に印加できる電源装置を設置し、減磁曲線を自動計測できるシステムをほぼ完成し、明年度からの研究に役立てる。(2.2)磁界中結晶化(a)Nd-(Fe_1-xCox)-B合金をアモルファス化し、これを瞬間結晶化させたのち、析出相のキュリー温度と結晶化温度を調べたところ、X>0.4の範囲で結晶化温度より高いキュリー温度をもつこと、およびX<0.6の範囲で10ko_eを越える高保磁力を持つことが明らかとなった。(b)上記の結果に基いて磁界中で瞬間結晶化させたところ、最大30%の残留磁化の増加が認められ、結晶の配向化による磁石特性の改善が認められた。(2.3)無磁界中結晶化(a)Nd-Fe-Bアモルファス薄帯を650800°Cの範囲で瞬間結晶化したところ、残留磁化は薄帯に平行な方向よりも垂直方向が大きく、結晶が垂直方向に配向していると推定された。(b)薄帯面に沿う水平方向と垂直方向の特性の差は結晶化温度の高いほど顕著となった。

800°Cで瞬間結晶化させた試料では両者の残留磁化に約25%の差がみられた。〔1〕アルニコ系薄帯磁石の研究前年度、Alが超急冷アルニコ-B系合金薄帯のアモルファス化を阻害していると推定されたので、FeーNiーCoーCu合金のアモルファス化を試みて、これに成功し、無磁界中、700°C瞬間結晶化し、最大印加磁界10kO_eのもとで500600〔O_e〕の保磁力が得られた。〔2〕希土類ーFeーB系アモリファス結晶化薄帯磁石の研究(2.1)パルス高磁化下減磁曲線自動計測:前年度設置した高磁化力印加測置に結ばれた測定系の調整に9ケ月程を要したが、減磁曲線の自動計測を可能ならしめた。(2.2)NdーFeーB系合金粉末の固相アモリファス化:純元素粉末を適量混合し、ボ-ルミルを用いて固相アモルファス化を試みて、一部成功した。この成果は今後の研究開発に役立つものと思われる。(2.3)無磁界中瞬間結晶化Nd_<15>Fe_<75>B_0合金をロ-ル周辺速度を20.944.0m/s範囲内でアモルファス化し、650750°Cで瞬間結晶化した結果、周辺速度44.0m/s、結晶化温度700°Cで約16kO_eの保磁力が得られた。(2.4)磁化過程の解析:保磁力発生機構を解明する一助としてNd_2Fe_<14>B結晶粒内に存在する磁気的不均質部が磁化反転過程に及ぼす影響について計算機構解析をした結果、主として次のことが明かとなった。(i)異方性のみが減少している場合は、不均質幅が140A以下の範囲では保磁力はnucleationによって支配されている。(ii)一般に交換定数の変動はnucleation磁界には大きな影響を及ぼさない。
線虫と哺乳類に共通するアロ認証機構の解析

(1)CeIZUMOの局在の解析:まず,CeIZUMO遺伝子の5'UTRと3'UTRをGFP遺伝子と連結させたレポーター遺伝子を作製して野性型オス線虫で発現させた.その結果,近位生殖巣に強いGFPシグナルが観察され,精細胞にCeIZUMOが存在すると予想された.次に,CeIZUMOの細胞質ドメイン内にFLAGタグを挿入したtransgene(TG)を作製し,得られたTGを変異体で発現させた.その結果,変異体の受精能がレスキューされ,FLAGタグがCeIZUMOの機能に大きな影響を与えないことを確認した.現在,抗FLAGモノクローナル抗体を使った免疫染色を行い,詳細なCeIZUMOの局在を解析中である.また,このTGを単一コピーでゲノムに挿入したトランスジェニック線虫も作製中で,CeIZUMO結合タンパク質の同定に使用予定である.(2)CeIZUMOと他のSPE-9クラスタンパク質との関係:SPE-9クラスタンパク質であるSPE-9およびSPE-42の細胞質ドメインに対応するペプチドをウサギに免疫して抗体を得た.現在,これらのペプチド抗体を使って免疫染色を行っている段階である.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)CeIZUMOの局在の解析:まず,CeIZUMO遺伝子の5'UTRと3'UTRをGFP遺伝子と連結させたレポーター遺伝子を作製して野性型オス線虫で発現させた.その結果,近位生殖巣に強いGFPシグナルが観察され,精細胞にCeIZUMOが存在すると予想された.次に,CeIZUMOの細胞質ドメイン内にFLAGタグを挿入したtransgene(TG)を作製し,得られたTGを変異体で発現させた.その結果,変異体の受精能がレスキューされ,FLAGタグがCeIZUMOの機能に大きな影響を与えないことを確認した.現在,抗FLAGモノクローナル抗体を使った免疫染色を行い,詳細なCeIZUMOの局在を解析中である.また,このTGを単一コピーでゲノムに挿入したトランスジェニック線虫も作製中で,CeIZUMO結合タンパク質の同定に使用予定である.(2)CeIZUMOと他のSPE-9クラスタンパク質との関係:SPE-9クラスタンパク質であるSPE-9およびSPE-42の細胞質ドメインに対応するペプチドをウサギに免疫して抗体を得た.現在,これらのペプチド抗体を使って免疫染色を行っている段階である.マウスIZUMO1は精子特異的な免疫グロブリン(Ig)様タンパク質で,配偶子間融合に必須である.しかし,IZUMO1の機能を含めた配偶子間融合機構は依然として不明のままである.研究代表者は,線虫精子上でIg様タンパク質が真の融合因子(fusogen)と結合していると考え,オス特異的なIg様遺伝子F28D1.8を同定した.さらに,この遺伝子の欠失(KO)変異体を調べた結果,KO雌雄同体では配偶子間融合が観察されなかった.また,Ig様ドメイン領域をマウスIZUMO1と交換したF28D1.8のキメラ遺伝子が部分的にKO線虫をレスキューしたので,F28D1.8タンパク質(CeIZUMO)がマウスIZUMO1様の分子であることが示唆された.本研究の目的は,CeIZUMOと結合している分子を同定した後,その結合分子の変異体を解析することで,線虫精子上の配偶子間融合装置を同定することである.CeIZUMOは膜貫通ドメイン以外に疎水性領域をもつので,CeIZUMO自身がfusogenである可能性も考えられた.そこで,疎水性領域を欠失したCeIZUMOをコードするtransgeneを使い,KO線虫のレスキュー実験を行った.その結果,KO変異体の受精能はほとんどレスキューされなかったので,この結果は,CeIZUMOがfusogenである可能性を示唆している.現在,CeIZUMO抗体を作製中で,このタンパク質の局在や結合因子の同定に使用予定である.また,ペプチドタグや蛍光タンパク質タグを融合させたCeIZUMOのtransgeneもKO線虫で発現させ,各種解析に使用する.F28D1.8遺伝子は繰り返し配列が多く,クローニング用の大腸菌や線虫自身にとってtoxicになっている.そのため,transgeneおよびtransgenic線虫の作製に時間がかかっている.コピー数が少ないベクターや,相同組換えによるクローン化ゲノムDNAに基づいたtransgene作製法を使うことで,当面の問題が解決しつつある.25年度が最終年度であるため、記入しない。
金属錯体によるDNAの特殊構造の認識および変換

DNAの湾曲構造は、あらゆる種類のDNA中に存在し、DNAの複製、転写、組み換え、あるいは染色体構造の構築という諸過程において重要な機能を果たしていることが知られている。湾曲DNA構造は、比較的短い(dA)トラクトが繰り返し出現するところに見られるが、このような塩基配列はほとんどの場合、各遺伝子のプロモーターおよびその上流の発現調節領域に存在する。本研究は、チミン塩基を認識する金属錯体を新たに設計・合成し、転写調節領域のATクラスター部位の高次構造を変換することにより遺伝子発現制御を行なうことを目的とした。遺伝子プロモーター領域のATクラスター部位を融解する金属錯体の合成:チミン塩基に選択的に結合する亜鉛錯体が、ウイルスDNAの転写領域に存在するTATA boxを含む19mer DNAの二本鎖構造を不安定化し、その融解温度を低下させることを見出した。これは亜鉛錯体特有のもので、銅錯体やニッケル錯体の場合には、逆に融解温度を上昇させた。現在、イミノプロトンNMRによりAT塩基対の解離過程を解析した。その結果、亜鉛錯体は最初にATクラスター部位に結合し、その部分の高次構造の対称性を著しく低下させることを見出した。また、AT塩基対の両塩基に同時に結合することが期待されるBifunctionalな金属錯体を3種類合成した。これらとATクラスター部位を含みヘアピンタイプのオリゴヌクレオチドとの相互作用を検討中である。
分子種識別トモグラフィを実現する非弾性散乱光干渉断層画像計の開発

非弾性散乱光である誘導ラマン散乱(SRS)光に基づく新規な化学コントラスト光干渉断層計を開発する。当該装置を眼底検査用や皮膚を模倣した光学ファントムに適用し、目的分子種選択的な断層画像を構築する。
構造選択的メタボロームと生合成・消失臓器解析によるABC膜輸送体生体内基質の探索

アミノ基を有する親水性化合物を選択的に検出するメタボロミクス技術を確立し、膜輸送体の生体内基質の解明に応用した。膜輸送体発現細胞と対照細胞を可溶化後、誘導体化試薬と反応させたのち、LC-MS/MSを用い、誘導体構造部分由来のfragmentをproduct ionとしたprecursor ion scanningを行うことで、誘導体化された化合物を選択的に検出した。その後、LC-TOF-MSを用いた精密質量分析とMSMSスキャンを行い、データベースと比較することで候補化合物を推定した。以上の系を用い、SLC22A4の内因性基質解明に成功したことから、実験系が確立されたと判断し、ABC膜輸送体P-glycoprotein (P-gp)の内因性基質探索にも応用した。野生型(WT)および遺伝子欠損マウス(P-gp KO)の血漿、脳、肝臓、腎臓ホモジネートに対し、誘導体化を用いたメタボロミクスと誘導体化を行わない手法も検討し、幅広く内因性基質探索を目指した。WTとP-gp KOの間で有意差を示すピークを探索したところ、検出された約20万個のイオンのうち、179個がWTとP-gp KO間でシグナル強度に有意差があった。P-gp KOでWTよりも強いシグナル強度が検出されたイオンは脳に最も多く検出され、血液脳関門での排出輸送体としての役割が裏付けられた。化合物が推定できたイオンの多くがアシルカルニチンであった。本年度はこのほかに、ABC膜輸送体breast cancer resistance protein (BCRP)の基質の体内動態を定量的に解析するための生理学的薬物速度論モデルを構築した。さらに、内因性基質に対する対照として使用可能なBCRPおよびP-gp共通の生体外基質として、抗がん薬regorafenibと活性代謝物についてこれら膜輸送体の体内動態に及ぼす関与を明らかにした。アミノ基選択的誘導体化も含めたアンターゲットメタボロミクスの系が、今年度に、ほぼ確立した。したがって、次年度以降、種々のサンプルについて未知化合物の探索や同定が可能となり、膜輸送体の生体内基質探索がスムーズに行える状況である。また、遺伝子欠損マウスを用いた系、さらにP-gpやBCRPの特異的阻害剤を投与しこれら膜輸送体を阻害する系も確立できた。したがって、野生型と遺伝子欠損マウスとの比較だけでなく、阻害剤ありとなしの系での比較や、両者を組み合わせた系の比較など、幅広い解析が可能となった。さらに、P-gpとBCRPの基質薬物(外因性基質)を用いた解析も可能となったことから、外因性基質と同様の推移を示す内因性化合物を推定する手法も実施可能となり、これによって、さらに効率的に内因性基質の解明を行うことができる。(1)引き続き、遺伝子欠損マウスを用いた生体内基質のスクリーニングを継続する。欠損マウスより血漿、肝、腎、尿を採取し、野生型と比べ高いシグナルを示す化合物をLC-TOFMSおよび新たに本学に導入され本格的利用が可能となったLC-Orbitrapを使って見いだす。有意差のついた化合物について子マスを検出し、データベースとの照合から化合物を推定する。(2)今年度確立した阻害剤投与によるスクリーニングを並行して実施する。野生型マウスにP-gpとBCRPの両方の阻害剤を投与後、血漿、肝、腎、尿を採取し、(1)と同様の解析を行う。(3)全身レベルでの生体内基質探索だけでなく、皮膚と脳に存在する生体内基質を探索する。(1)と(2)の試験の際に、皮膚と脳を採取し同様な検討を行う。これまでの全身レベルの解析で見出されていないピークを中心に解析を進める。(4)遺伝子欠損マウス臓器可溶化液を基質源として、遺伝子発現細胞を用いたスクリーニングを進める。遺伝子欠損マウス肝、腎、脳、皮膚の可溶化液を遺伝子発現細胞のbasalないしapical側に添加し、basalからapical方向への輸送が逆方向よりも有意に高いピークを選別し、(1)と同様な方法で化合物を推定する。(5)生合成臓器と消失臓器に基づく生体内基質のセレクションについても検討を開始する。(1)(4)で検出された化合物の中から、肝の膜輸送体の活性を定量的に反映するものを選別するため、肝を含む多くの臓器homogenateをマウスより調製後、インキュベーションし、選別した生体内基質の生合成速度を測定する。肝での合成が最も高い化合物を選び、同様な臓器homogenateに添加後の消失推移から、肝の消失効率の高い化合物を選ぶ。選ばれたものをマウスに静脈内投与し、腎外クリアランスが全身クリアランスに近い化合物を選ぶ。

野生型(WT)および遺伝子欠損マウス(P-gp KO)の血漿、脳、肝臓、腎臓ホモジネートに対し、誘導体化を用いたメタボロミクスと誘導体化を行わない手法も検討し、幅広く内因性基質探索を目指した。WTとP-gp KOの間で有意差を示すピークを探索したところ、検出された約20万個のイオンのうち、179個がWTとP-gp KO間でシグナル強度に有意差があった。P-gp KOでWTよりも強いシグナル強度が検出されたイオンは脳に最も多く検出され、血液脳関門での排出輸送体としての役割が裏付けられた。化合物が推定できたイオンの多くがアシルカルニチンであった。本年度はこのほかに、ABC膜輸送体breast cancer resistance protein (BCRP)の基質の体内動態を定量的に解析するための生理学的薬物速度論モデルを構築した。さらに、内因性基質に対する対照として使用可能なBCRPおよびP-gp共通の生体外基質として、抗がん薬regorafenibと活性代謝物についてこれら膜輸送体の体内動態に及ぼす関与を明らかにした。アミノ基選択的誘導体化も含めたアンターゲットメタボロミクスの系が、今年度に、ほぼ確立した。したがって、次年度以降、種々のサンプルについて未知化合物の探索や同定が可能となり、膜輸送体の生体内基質探索がスムーズに行える状況である。また、遺伝子欠損マウスを用いた系、さらにP-gpやBCRPの特異的阻害剤を投与しこれら膜輸送体を阻害する系も確立できた。したがって、野生型と遺伝子欠損マウスとの比較だけでなく、阻害剤ありとなしの系での比較や、両者を組み合わせた系の比較など、幅広い解析が可能となった。さらに、P-gpとBCRPの基質薬物(外因性基質)を用いた解析も可能となったことから、外因性基質と同様の推移を示す内因性化合物を推定する手法も実施可能となり、これによって、さらに効率的に内因性基質の解明を行うことができる。(1)引き続き、遺伝子欠損マウスを用いた生体内基質のスクリーニングを継続する。欠損マウスより血漿、肝、腎、尿を採取し、野生型と比べ高いシグナルを示す化合物をLC-TOFMSおよび新たに本学に導入され本格的利用が可能となったLC-Orbitrapを使って見いだす。有意差のついた化合物について子マスを検出し、データベースとの照合から化合物を推定する。(2)今年度確立した阻害剤投与によるスクリーニングを並行して実施する。野生型マウスにP-gpとBCRPの両方の阻害剤を投与後、血漿、肝、腎、尿を採取し、(1)と同様の解析を行う。(3)全身レベルでの生体内基質探索だけでなく、皮膚と脳に存在する生体内基質を探索する。(1)と(2)の試験の際に、皮膚と脳を採取し同様な検討を行う。これまでの全身レベルの解析で見出されていないピークを中心に解析を進める。(4)遺伝子欠損マウス臓器可溶化液を基質源として、遺伝子発現細胞を用いたスクリーニングを進める。遺伝子欠損マウス肝、腎、脳、皮膚の可溶化液を遺伝子発現細胞のbasalないしapical側に添加し、basalからapical方向への輸送が逆方向よりも有意に高いピークを選別し、(1)と同様な方法で化合物を推定する。(5)生合成臓器と消失臓器に基づく生体内基質のセレクションについても検討を開始する。
光音響映像法を用いたドライケミカルの定量評価に関する基礎的研究

本年度の研究では、研究実施計画に従ってまず除振や高速化などの実験装置のさらなる改良を施した。顕微鏡のソフトウエアなどについても一層扱いやすくなるように努力した。また消耗品で可視域半導体レーザー・ダイオードを購入して、簡単な変調実験などを行なった。しかし、これを昨年度までのシステムと組み合わせて新しいデータを得るまでには至らなかった。逆に、昨年度の研究実績の報告書で指摘しておいた、AO変調器とコンピューターの結合による光音響分光法の新しい方法論である「相関光音響分光法」(ランダムに変調した光を光源として採用する方法)が今年度の研究の過程から実現した。これは本年度の研究計画には予定していなかった事であるが、光音響顕微鏡の解説記事(文献2)中のモデル実験に示す様に基本的な実験が完了してドライケミカルへの応用が可能なレベルにまで達したため、「うれしい誤算」となったものである。なお、今年度の研究では光音響分光法に関する改良が主となってしまったため、残念ながら高速液体クロマトグラフィーとの関連をさせながら本研究の期間内に定量的な把握を行なうまでには至らなかった。この点については来年度以降明らかにすることになるであろう。本研究ではまず実験装置の綱良を行なった。平成3年度に備品として高速AO変調器、ロックインアンプおよびプリアンプを購入する事により、アルゴン・レ-ザ-光の変調周波数の上昇と検出系の高感度化が達成され、これらの装置によってAO変調器とコンピュ-タの結合による新しい方法論(ランダム変調法の採用による相関光音響分光法など)が可能になった。さらに呈色反応の早い変化にも十分対応できるようにするため、光音響セルをはじめ種々の改良を行ない、この結果研究の目的に最適な実験装置を構成することができた。生体試料である尿と血液において、シミュレ-ションの容易な糖に研究の焦点を絞り、2種類の尿検査用紙(ウロヘマコンビスティックスーLとクリニスティックス)と血糖検査用紙(グルコスティックス)を用いた。1)まずすでに退色特性がこれまでの研究で明らかになっているウロヘマコンビスティックスーLについては、ブドウ糖の水溶液の濃度は202000mg/dlの範囲で変化させて比較的直線性の良い検量線を得た。最高感度は8mg/dLで、目視による検査の感度より1桁程度感度を向上させる事ができた。(低濃度域では呈色反応を起こさない検査用紙をリファレンスにして差分処理を行なうダブル・ビ-ム方式を併用した。)2)もう一つの尿糖検査用紙であるクリニスティックスに対しては、呈色反応の反射スペクトルの時間変化を分光測定した結果、退色とは逆に時間経過とともに呈色反応の着色の度合いが強くなることが明らかになった。これらのデ-タ-は今後測定に最適な時間を設定したりするために有用なデ-タ-として用いられる。なお、上記の研究成果は文献[13]に示す様に、京都において開催された医学物理学・生体工学国際会議、および超音波エレクトロニクス・シンポジウムで公表されて、多くの研究者に新しい方法論として提示された。顕微鏡のソフトウェアなどについても一層扱いやすくなるように努力した。しかし、これを昨年度までのシステムと組み合わせて新しいデーターを得るまでには至らなかった。これは本年度の研究計画には予定していなかった事であるが、光音響顕微鏡の解説記事(文献2)中のモデル実験に示す様に基本的な実験が完了してドライケミカルヘの応用が可能なレベルにまで達したため、「うれしい誤算」となったものである。
ポストコロニアル・トライアングル:英国、カリブ海諸島、合衆国を繋ぐ文学/文化研究

本研究の研究成果としては、4年間の助成期間中、雑誌論文5本、学会発表13件、著書が2冊出ている。このうち、著書のうち単著『Women and Mimicryジーン・リース小説研究』(2011年)が出たことにより、リースの小説すべてを網羅する研究書が日本で出版されたことになり、代表作だけに偏っていた批評上の不均衡が改善されたといえる。また、2010年に開催された、英語圏カリブ文学研究者のみならずフランス語圏カリブ文学研究者を対象にした会議において、本研究の対象作家マリーズ・コンデを前にして論文を口頭発表したことは意義があり、その理由は英語圏・フランス語圏カリブ文学研究者に対して、日本のカリブ文学研究の状況を示すことができたからである。本研究は、ジーン・リース、マリーズ・コンデという二人のカリブ系女性作家の作品を比較することで、英領・仏領カリブ海植民地における現代文学/文化の共通性および差異を明らかにし、現代カリブ海文学/文化研究の一部となすことを目的としている。平成21年度は活発ともいえる研究活動を行ったといえる。計5回の研究発表と著書(共著)を1冊著したからである。このうち、平成21年度の本研究補助金によって遂行した研究は、英国(2回)、カリブ海のバルバドス島、合衆国それぞれでの調査および研究発表とともに、上記の図書出版である。まだまだ日本人研究者が多く訪れているとは言い難い、そして研究代表者にとっては長年の念願であったカリブ海地域を訪問できたことは、さらにそこで開催された国際会議で論文を発表できたことは、21年度最大の研究成果だったと言っても過言ではない。カリブ海諸島の現在の学術研究の様子や経済状況を目の当たりにすることができたのは、大きな収穫だった。年度初めの交付申請書では、直接経費120万円のうち、物品費30万円、旅費80万円、謝金等5万円、その他5万円として申請した。しかし実際には旅費に全額を使用した。この理由は、申請時では2回の国際会議での発表が許可されていたのだが、その後、申し込んでいた別の会議から参加許可が下り、国際会議での発表が計3回になったためである。学務の関係から国際会議に出るのは、夏の8・9月となり、航空運賃が高い時期と重なった。またバルバドス島での発表は12月であったけれども、当地ではハリケーンがおさまる時期が12月からであり、つまり12月は観光のハイシーズンとなっており、宿泊費がかなり高額となってしまった。以上の理由から、当初予定していた研究費の使用額配分が偏った。しかし、本研究のサブタイトル「英国、カリブ海諸島、合衆国を繋ぐ文学/文化研究」がいみじくも示すように、本研究はこれら3地域をつなぐ地域研究という要素も色濃いため、敢えて21年度の研究費は旅費に充てた。2010年度の研究成果は実り大きなものであった。まず、本研究対象の作家であるジーン・リースに関する論文で、2005年にお茶の水女子大学に提出した課程博士論文を、中京大学出版助成金を得て、英語による書籍として出版することができた。さらに所属する20世紀英文学研究会編による論文集にも、同じくリースの作品についての論文(日本語によるもの)が所収された。参加した会議や口頭での発表も本研究においては記念すべきものとなった。2010年はジーン・リース生誕120周年であったために、7月にロンドン大学キングズ・カレッジにおいて「ジーン・リースを読む」と題された国際会議が開催され、参加した。(口頭発表は間に合わず、参加のみ。)さらに9月には、本研究のもうひとりの研究対象であるマリーズ・コンデを招待講演者として招聘した会議において、本人を目の前に、コンデの作品について口頭発表をおこなった。ほかの参加者はフランス語で発表するものが多かったが、彼女の作品の多くは、パートナーのR.フィルコックスにより英訳されており、わたしの場合は彼による英訳を対象とし、かつ英語による発表ではあったが、逆に英訳、つまり翻訳を使うことで生まれてくる意義もあるはずだと感じた。フィルコックス本人も参加しており、フロアからの意見として翻訳の可能性について話していた。雑誌論文は所属する大学の紀要にコンデの作品に関する分析を載せた。この原稿のもとになった原稿も本補助金を得て2009年度に口頭発表したものである。本補助金による成果刊行物であることを付記したい。2011年度は研究期間4年のうち第3年目にあたった。

2010年度に本研究のメインの研究対象であるジーン・リースに関する研究書を単著で出版したため、2011年度の研究においては、もうひとりのメインの研究対象のマリーズ・コンデに関する研究を発展させたいと考え、所属している学会の学会誌に投稿したところ、査読の上、掲載が認められた。査読で丁寧なコメントをいただいたので、修正期間中には、参考にするようにと助言された文献を読み、書き直した。結果、自分では満足のいく内容の論文となった。2011年度中に発表した論文は上記一本だけに終わってしまったが、口頭発表では、海外で開催された国際会議で2回の発表をおこなった。ひとつは、ロンドン大学ゴールズスミス校で開催された第6回カリブ女性作家会議で、少数民族の手による物語に関する考察をおこなった。カリブ系作家ジーン・リースと日系アメリカン作家のキョウコ・モリの作品を比較考察した。日系アメリカン作家に関しては、すでに性差という男女の非対称性が作品に色濃く反映されていることを分析していたが、今回は同じヤングアダルトものを執筆しているリースとモリの「民族」の差異を指摘した。カリブ女性作家という文脈で日本人が日系アメリカンによる作品の分析をし、発表をしたことで、どこかしら「ネイティブ・インフォーマント」的な体験を味わったのだが、このときの体験が、2011年9月に同じくロンドン大学セネートハウスで開催された世界文学に関する会議での、池澤夏樹個人編集の世界文学全集(河出書房新社)に関する論文の口頭発表につながったといえる。活字が読まれなくなりつつある現在になぜ敢えて書籍による「世界文学全集」なのかという、さまざまな問題を含みながらも、出版、消費されている現在の日本における世界文学事情を説明した。こちらも日本人による日本の世界文学事情に関する発表だったため好意的な反応だった。本研究の主な研究対象作家は、いずれもカリブ海に出自を持ちつつもヨーロッパに移住して作家となった女性たちで、ひとりは英国で執筆活動をおこなっていたジーン・リース、ふたりめはフランス語で執筆しているもののアメリカ合衆国のコロンビア大学で教鞭を取っていたマリーズ・コンデである。本研究では、彼女たちの作品を比較するために研究副題を「英国、カリブ海諸島、合衆国を繋ぐ文学・文化研究」とつけた。平成24年度は、リースがフランスのパリに住んでいたことがあることと、コンデが最近パリに永住を決めたと聞いたことから、両作家とパリとの関係を探るために、パリでの調査を取り入れた。ただしあくまでも本研究は英語圏作家研究であるため(コンデの場合はパートナーによる英訳作品を対象としている)、パリからロンドンへ渡り、引き続き昨年度までの調査の続きや資料収集をおこなった。パリではリースが居住していたセーヌ左岸に宿を取り、時代は経たものの彼の地が醸し出す雰囲気を味わうとともに、随筆で触れられている場所を訪れた。また国立図書館にあたるビブリオテーク・ナショナールに行き、マリーズ・コンデに関する作品や資料を閲覧した。同じくロンドンでは、大英図書館へ赴き資料収集をおこなうとともに、リースが文壇からまったく消え去っていた第二次世界大戦時のことを調べるため、ロンドンの帝国戦争博物館、マンチェスターにある帝国戦争博物館北部、ブリッツと呼ばれた大爆撃を受けた都市コヴェントリーを訪れ、資料収集をおこなった。上記の調査ののち、ジーン・リースに関する論文は和洋女子大学の紀要に平成25年3月に掲載された。さらに、べつの論文が7月に津田塾大学言語文化研究所の所報に掲載される予定である。
メロンのエチレン受容体Cm-ERS1とCm-ETR1の生化学的機能解析

植物のエチレン感受性調節において、エチレン受容体が重要な役割を果たしていると考えられている。エチレン受容体をコードする遺伝子は、シロイヌナズナで単離されてから、現在では多くの植物種で単離されている。そして、受容体遺伝子の発現は植物の発達時期や器官特異的に調節されていることが明らかにされている。しかし、タンパク質レベルでの機能解析は殆ど行われていない。タンパク質レベルの研究は、アメリカのNew Hampshire大学Schaller教授のグループと本受入研究者のグループで行われているのみである。それらの予備的研究によれば、植物のエチレン感受性調節には受容体のタンパク質レベルでの発現調節や機能調節がより重要であることが示唆されている。機能調節の中で、特に二量体や多量体の形成が重要であると考えられているが、シロイヌナズナAt-ETR1とメロンCm-ERS1で同質二量体のin vivoでの形成が報告されている以外は情報がない。本研究では、受入研究者らが解析を進めているメロンのエチレン受容体遺伝子Cm-ETR1とCm-ERS1を用いてエチレン受容体の発現調節や機能調節をタンパク質レベルで研究する。本年度は、メロンから単離したETR-IIサブファミリーに属する受容体遺伝子Cm-ETR2の細胞内局在に関する解析を行った。細胞レベルでの局在解析では、小胞体(ER)と細胞膜(PM)への局在が観察された。実生の子葉では主にERへの局在、本葉ではERとPMへの局在が観察された。一方、果実では主にPMへの局在が観察された。現在までのシロイヌナズナとメロンの研究からサブファミリーI受容体は、主にERに局在することが報告されている(Chen et al.,2002;Ma et al.,2006)。一方、タバコのサブファミリーII受容体は、主にPMに局在することが報告されている(Xie et al.,2003)。シロイヌナズナやメロンのサブファミリーIエチレン受容体は、SS結合により二量体を形成することが報告されている。一方、サブファミリーIIエチレン受容体は、二量体形成はいままでのところ報告されていない。我々もCm-ETR2について二量体形成を検出しようと様々な実験を行ったが、二量体は検出できなかった。現在までの我々の研究から、二量体形成の有無がエチレン受容体の細胞内局在の違いに関与しているとの仮説を立て、今後の研究を進める予定である。具体的には、酵母細胞内でCm-ETR1,CmERS1を単独で発現した場合に同質の二量体や多量体を作ることができるかどうか、同時に発現した場合に異質の二倍体や多量体を形成できるかどうか、さらにそれらのタンパク質にエチレン結合能力やシグナル伝達能力があるかどうかを調べる。さらに、メロンの細胞内で同様の二量体や多量体を形成しているかどうか、そしてそれらが植物のエチレン感受性調節に果たす役割について明らかにする。本年度は、メロンのエチレン受容体遺伝子Cm-ERS1またはCm-ETR1をそれぞれ酵母用発現ベクターに組み込んだプラスミドを構築した。さらに、構築したプラスミドを単独で導入した組換え酵母を作成した。さらに、特異抗体を用いてそれらの組換え酵母での各エチレン受容体タンパク質の発現確認を行っている。2つの組換え酵母でのエチレン受容体発現が確認できた場合、2種類のプラスミドを同時に組み込んだ組換え酵母を作成し、2つの受容体タンパク質の相互作用を検討する予定である。

機能調節の中で、特に二量体や多量体の形成が重要であると考えられているが、シロイヌナズナAt-ETR1とメロンCm-ERS1で同質二量体のin vivoでの形成が報告されている以外は情報がない。本研究では、受入研究者らが解析を進めているメロンのエチレン受容体遺伝子Cm-ETR1とCm-ERS1を用いてエチレン受容体の発現調節や機能調節をタンパク質レベルで研究する。具体的には、酵母細胞内でCm-ETR1,CmERS1を単独で発現した場合に同質の二量体や多量体を作ることができるかどうか、同時に発現した場合に異質の二倍体や多量体を形成できるかどうか、さらにそれらのタンパク質にエチレン結合能力やシグナル伝達能力があるかどうかを調べる。さらに、メロンの細胞内で同様の二量体や多量体を形成しているかどうか、そしてそれらが植物のエチレン感受性調節に果たす役割について明らかにする。本年度は、メロンからETR-IIサブファミリーに属する遺伝子Cm-ETR2を単離し、その構造解析と発現解析を行った。その結果、この新規受容体遺伝子が発達中のメロン果実において共発現していることが明らかになった。さらに、この遺伝子をタンパク質レベルで検出するために特異抗体anti-CmETR2を作成した。以上により、メロンにおいてサブファミリーIとサブファミリーII受容体をタンパク質レベルで検出する準備(特異抗体)が整ったので、現在、それぞれのサブファミリーの受容体が相互作用する能力はあるのか(酵母での供発現実験)、実際にメロンの細胞内で相互作用しているのか(免疫沈降実験)を調べる実験系の立ち上げを行っている。この実験により、2つのサブファミリーの受容体が実際に相互作用するかどうかの世界で初めての結果が得られるものと期待される。これらに加えて、それぞれのサブファミリーの遺伝子をRNAi技術によりノックアウトするベクターを構築した。植物のエチレン感受性調節において、エチレン受容体が重要な役割を果たしていると考えられている。エチレン受容体をコードする遺伝子は、シロイヌナズナで単離されてから、現在では多くの植物種で単離されている。そして、受容体遺伝子の発現は植物の発達時期や器官特異的に調節されていることが明らかにされている。しかし、タンパク質レベルでの機能解析は殆ど行われていない。タンパク質レベルの研究は、アメリカのNew Hampshire大学Schaller教授のグループと本受入研究者のグループで行われているのみである。それらの予備的研究によれば、植物のエチレン感受性調節には受容体のタンパク質レベルでの発現調節や機能調節がより重要であることが示唆されている。本年度は、メロンから単離したETR-IIサブファミリーに属する受容体遺伝子Cm-ETR2の細胞内局在に関する解析を行った。細胞レベルでの局在解析では、小胞体(ER)と細胞膜(PM)への局在が観察された。
分泌小胞膜-形盾膜融合の分子機構

ERでの合成された蛋白質の特定の膜コンパートメントヘノ選別輸送はいくつかの膜融合過程より成立している。その最終目的地が形質膜である場合、膜融合ステップはエキソサイトシスの形で終了する。この最終ステップてある「分泌小胞膜-形質膜融合」の分子機構を明かにすることが本研究の最終目的である。本年度は、小腸上皮細胞の低浸透圧環境下での細胞膨張によって誘発されるエキソサイトシスに分子機構を調べた。キナクリンで染色した小腸培養上皮細胞株Intestine407の分泌小胞は、低張負荷によって細胞膨張させたときに細胞外へと放出されることが蛍光顕微鏡下で見いだされた。このエキソサイトシスの最終ステップ、即ち分泌小胞-形質膜融合部の開口現象を私達が最近開発した新しいパッチクランプ膜容量測定システムによって経時的・定量的にモニターした。パッチピペットより細胞内透析を行い、細胞内Ca^<2+>を高濃度EGTAでキレートすると浸透圧性エキソサイトシスによる膜容量増(膜表面積増)は消失した。細胞内にNEMやGTPγSを投与しても同様の結果が得られた。細胞内ATPをその非水解性アナログで置き換えても同様に阻止された。これらの結果から、浸透圧性エキサイトシスの最終ステップには細胞内ATPとCa^<2+>の存在が不可欠であること、NEM感受性融合因子やGTP結合蛋白が重要な役割を果たす可能性が高いことが結論された。