hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非PKC型ジアシルグリセロール受容タンパク質選択的リガンドの開発

細胞増殖やがん化といった細胞内シグナル伝達に関与するC1ドメインの新規リガンドとしてセリ科植物由来のセスキテルペンラクトンであるタプシガルギンに着目し,様々なタンパク質のC1ドメインに対するその結合能を評価した.タプシガルギンは既知のC1ドメインリガンドが強く結合するnovelプロテインキナーゼC (PKC)にはほとんど結合せず,RasGRP4やChimaerinのC1ドメインに一桁μMの結合阻害定数を示した.したがって,タプシガルギンはこれらのタンパク質選択的なリガンドのシードとして期待できる.1,2-sn-ジアシルクグリセロール(DAG)は,細胞内情報伝達に関わるプロテインキナーゼC (PKC)のエフェクター分子として知られているが,近年RasGRPといったDAG受容タンパク質が,がんをはじめとする様々な疾患において重要な役割を果たしていることが明らかにされている.しかし,既知のリガンドはPKCとこれらの非PKC型DAG受容タンパク質を区別できない.本研究では,天然セスキテルペンラクトンであるタプシガルギンをリードとした非PKC型DAG受容タンパク質選択的なリガンドの開発を目的としている.平成27年度は,1)タプシガルギンのC1ドメイン選択性の評価,2)タプシガルギン誘導体の合成とC1ドメイン選択性の評価,について研究を行った.化学合成した8種類のC1ドメインに対するタプシガルギンの結合能をトリチウム標識ホルボールエステル結合阻害試験により評価したところ,タプシガルギンは主要なPKCアイソザイムであるPKCδC1Bドメインに全く結合しなかった一方で,RasGRP4 C1ドメインに対して有意な結合能を示した.8位ブタイノル基改変誘導体ならびに3位側鎖飽和誘導体の活性評価から,タプシガルギンのC1ドメイン結合能には8位には適切な長さあるいは疎水性のアシル基が必要であること,3位側鎖の不飽和エステル構造は活性に必須ではないことが明かとなった.平成27年度は研究計画に従い,タプシガルギンのC1ドメイン選択性の評価と各種誘導体の合成および活性評価を行った.1,2-sn-ジアシルグリセロール(DAG)は,細胞内情報伝達に関わるプロテインキナーゼC (PKC)のエフェクター分子として知られているが,近年RasGRPといったDAG受容タンパク質が,がんをはじめとする様々な疾患において重要な役割を果たしていることが明らかにされている.しかし,既知のリガンドはPKCとこれらの非PKC型DAG受容タンパク質を区別できない.本研究では,天然セスキテルペンラクトンであるタプシガルギンをリードとした,非PKC型DAG受容タンパク質選択的なリガンドの開発を目的としている.本年度は,1)タプシガルギンのPKCアイソザイム選択性の評価,2)タプシガルギン単純化アナログの設計と合成,について研究を行った.前年度に結合試験を行ったPKCδC1Bドメイン以外のPKC C1ドメイン(conventional PKCはC1A,novel PKCはC1B)に対するタプシガルギンの結合能を評価した結果,タプシガルギンはnovel PKC C1Bドメインに対しては全く結合せず,α-C1Aおよびγ-C1Aドメインに対してわずかに結合能を示すことが明らかとなった.タプシガルギンはRasGRP4 C1ドメインに対して阻害定数Kiが1.9 μMで最も強く結合したことから,RasGRP選択的なリガンドのリードとして有望であることが示唆された.これまでに結合試験を行ったC1ドメインのアミノ酸配列を比較したが,タプシガルギンが相対的に強く結合するタンパク質の発がんプロモーター結合部位のアミノ酸残基に特徴的なアミノ酸残基やパターンは見出されなかった.次に,前年度に得られた構造活性相関の知見から,タプシガルギンのシクロペンテン環を除去または芳香環で置き換えた単純化アナログを設計し,合成を開始した.本年度は,鍵中間体の不斉点構築の反応条件について検討した.研究計画では,本年度にタプシガルギン単純化アナログの合成が完了している予定であったが,現在のところ合成が半ばである。今後は合成経路やアナログ設計の再検討を行う必要がある。1,2-sn-ジアシルグリセロールル(DAG)は,細胞内情報伝達に関わるプロテインキナーゼC (PKC)のエフェクター分子として知られているが,近年RasGRPといったDAG受容タンパク質ががんをはじめとする様々な疾患において重要な役割を果たしていることが明らかにされている.しかし,既知のリガンドはPKCとこれらの非PKC型DAG受容タンパク質を区別できない.本研究では,天然セスキテルペンラクトンであるタプシガルギンをリードとした,非PKC型DAG受容タンパク質選択的なリガンドの開発を目的としている.本年度はまず,ホモロジーモデリングにより作成したRasGRP4 C1ドメインの立体構造とタプシガルギンとのドッキングシミュレーションを行った.その結果,これまでの構造活性研究によって活性に重要であることを明らかにした8位ブタノイル基がC1ドメインのリガンド結合窪みと相互作用したドッキングモデルが得られた.この結合モデルは今後C1ドメインを標的としたタプシガルギンアナログを合成するうえでの基盤となるものである.さらに,前年度に続いて,タプシガルギンのシクロペンテン環を除去または芳香環で置き換えた単純化アナログの合成を行ったが,計画した環化前駆体を合成することができなかった.

そこで,シクロペンテン環を除去するとともに7員環を6員環に縮小した新規アナログを設計した.この新規アナログの水素結合性官能基がタプシガルギンに近い空間的配置を取り得ることを分子モデリングにより確認した.新規アナログの合成を進めた結果,鍵となる環化前駆体の数段階前の中間体を高い不斉収率で合成することができた.細胞増殖やがん化といった細胞内シグナル伝達に関与するC1ドメインの新規リガンドとしてセリ科植物由来のセスキテルペンラクトンであるタプシガルギンに着目し,様々なタンパク質のC1ドメインに対するその結合能を評価した.タプシガルギンは既知のC1ドメインリガンドが強く結合するnovelプロテインキナーゼC (PKC)にはほとんど結合せず,RasGRP4やChimaerinのC1ドメインに一桁μMの結合阻害定数を示した.したがって,タプシガルギンはこれらのタンパク質選択的なリガンドのシードとして期待できる.今後は当初の研究計画に従い,RasGRP4 C1ドメインとPKCδC1Bドメインのアミノ酸配列の差異に着目し,RasGRP4 C1ドメインに特徴的なアミノ酸残基をPKCδC1Bドメインに導入した変異ペプチドを化学合成し,それらに対するタプシガルギンの結合能を評価することで,結合部位ならびに結合に重要なアミノ酸残基の同定を目指す.また,タプシガルギンの絶対的な結合能を高めるため,C1ドメインリガンドの共通構造である1級あるいは2級水酸基を持つタプシガルギン単純化アナログを設計・合成し,そのC1ドメイン結合能を評価する.1)タプシガルギン単純化アナログの設計・合成今後は,設計したタプシガルギン単純化アナログの合成を進める.タプシガルギンのシクロペンテン環を芳香環に置換したアナログでは,オルソ位に置換基を持つベンズアルデヒド誘導体の不斉アリル化により最初の不斉点導入を試みたが,十分な不斉収率が得られなかった.したがって,高い不斉収率で不斉点が導入可能な中間体の設計,合成経路の再検討を行い,タプシガルギン単純化アナログを合成する.2)タプシガルギンアナログの各種生物活性評価合成したアナログについてRasGRPに対する結合能と選択性を評価する.RasGRPは原がん遺伝子産物Rasの活性化因子であるため,Rasタンパク質の活性化について調べる.農学必要な物品購入を行った結果生じた.平成28年度分と合わせて物品購入に使用する.
アクチナイド化合物におけるマグネト・サ-マル効果の研究

アクチナイド化合物の研究に取り組む前段階として、既に様々な物性が比較的よく判っている希土類化合物についてマグネト・サ-マル効果の研究を行った。研究対象として、非常に複雑な磁気構造を持つことで知られているCeSbを選んだ。測定には希釈冷凍機を用い、最低温度35mK、最高磁場8.5Tまでの測定を行った。超伝導サ-マル・スイッチを介し、希釈冷凍機から伝導で冷却されているエポキシ製試料セル磁場中心に設置し、セル中に充たした液体ヘリウム4に試料を直接浸すことにより、試料を冷却した。断熱状態で磁場掃引を行い、試料に直接装着した温度計から得られる信号を観測したところ、磁気ドメインの転移に対応する磁場強度で、極めて大きなマグネト・サ-マル効果が見いだされたほか、測定磁場の全領域で多数の信号が観測された。これらの信号は全て、温度の上昇とともに強度が減少し、500mKで消失した。特徴的なことは、強磁性状態へ転移する磁場強度での信号が、磁場上昇時については78個からなる非常に尖鋭な構造を持つのに対し、磁場の下降時では構造を持たず単一ピ-クを示すことである。詳細はまだ不明であるが、これらの様子は電子スピンの揺らぎを直接反映している可能性も考えられる。現在、これらの信号の解析を行いつつあるが、マグネト・サ-マル効果の観測が磁気的性質についての知見を与える一手法たり得ることが示された、と思われる。
炎症性腸疾患におけるサイトメガロウイルス再活性化および感染成立機構

潰瘍性大腸炎(UC)は腸管特異的に炎症が生じる炎症性腸疾患の一つで、サイトメガロウイルス(CMV)感染はその増悪因子のひとつとされている。しかし、CMV感染がUCの病態に与える詳細な影響は明らかではない。そこで実際生体内でCMV感染がUCの病態に与える影響について検討した。方法)CMV感染合併UC腸管検体から作成したcDNAを用いて、各種炎症性サイトカインの発現をリアルタイムPCRで検討した。腸管炎症部位での好中球やマクロファージの数やフェノタイプを、MPO(好中球)、CD80(M1マクロファージ)、CD163(M2マクロファージ)の免疫染色にて検討した。更に腸管炎症部位におけるCMV感染細胞の有無を免疫染色にて検討した。結果)(1)CMV感染検体では非感染検体に比しTh1型サイトカインのTNFα、IFNγ、Th17型サイトカインのIL-17の発現が亢進していた。(2)CMV感染検体では非感染検体に比し、浸潤する好中球数が多く、M1マクロファージ/M2マクロファージ比が上昇していた。(3)腸管の高度炎症部位ではCMV抗原陽性細胞を認めた。考察)CMV感染の刺激によりマクロファージやCTLからのTNFα、IFNγなどのTh1型サイトカイン発現が亢進し、更にそれが炎症部位のマクロファージのM1 typeへの偏向を誘導したと考えられた。IL-17の発現亢進は、CMV感染によりIL-17産生CD4T細胞が増加することを示したvitroでの報告に合致する所見であった。増加したIL-17は炎症部位への好中球遊走に寄与したと考えられた。UCにおいてCMV感染は各種炎症性サイトカインの発現増強により、腸炎増悪に関与することが証明された。今後CMV感染を合併したUC患者の病態の更なる解明によりその治療方法の確立が可能になるものと思われる。クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は腸管特異的に炎症が生じる難治性疾患である。その難治化の要因の1つにサイトメガロウイルス(Cytomegalovirus:以下CMV)再活性化があげられる。よって炎症性腸疾患におけるCMV再活性化の機序解明は臨床的に重要な課題である。本年度は、CMV再活性化によるマクロファージの機能変化について検討した。具体的な方法を以下に示す。マクロファージ細胞株にCMV感染させ、炎症性サイトカイン(TNFα、IL-6、IL12、IFNγ)の産生量をELISAにて測定した。CMV感染後、LPSやCPG-DNAによる刺激を加え、感染細胞と非感染細胞におけるTLRシグナルに及ぼす違いを比較検討した。(結果)CMV感染させたマクロファージでは非感染細胞に比しTNFα、IL-6、IL12の炎症性サイトカインの産生が著明に増加していた。LPSなどの刺激によるサイトカイン産生増加は、感染細胞では非感染細胞に比較して有意に増強していた。(考察)CMV感染によりマクロファージは、TNFαなどのサイトカイン産生能を有するM1 typeへの機能変化をきたしたと考えられた。CMVの再活性化した感染細胞では、TLR刺激によるサイトカイン産生が非感染細胞に比し増強したと思われた。(今後)1.CMV感染細胞においてTNFαやIL-6に対する抗体を用い、各種サイトカイン産生やCMV再活性化への影響を検討する。2.CMV感染細胞におけるTGFβ刺激の影響を検討する。3.CMV腸管局所粘膜における感染成立機構の解明をするために、実際の炎症性腸疾患患者の生検標本において、CMVの侵入に必要とされるEGFRやPDGFRなどの抗体を用いた免疫染色を行い、発現の分布や量について非感染検体と比較検討する。

増加したIL-17は炎症部位への好中球遊走に寄与したと考えられた。UCにおいてCMV感染は各種炎症性サイトカインの発現増強により、腸炎増悪に関与することが証明された。今後CMV感染を合併したUC患者の病態の更なる解明によりその治療方法の確立が可能になるものと思われる。
マウスにおける血管内皮細胞由来血管運動調節因子に関する基礎的研究

血管内皮細胞が産生する血管運動調節因子、すなわち、内皮由来収縮因子(EDCF)および内皮由来弛緩因子(EDRF)のバランスの制御破綻が血栓形成や動脈硬化の進展に関与する証拠が提示されるなど、これら因子の生理学的および病態生理学的意義に関する論議は盛んである。我々はラットを用いて、EDRFの一つである内皮由来過分極因子(EDHF)が、より径が小さい動脈では内皮由来一酸化窒素(EDNO)を上回る役割を果たし、かつ、その作用が平滑筋細胞膜電位過分極によるL型カルシウムチャネルの抑制に加えて収縮蛋白のカルシウム感受性を低下させる可能性があることを示唆した。また、雌性ラットにおいて、エストロゲン欠乏が内皮依存性弛緩反応、特にEDHFに依存する弛緩の障害をもたらすことを明らかにした。更なる分子機序の解明には遺伝子操作が容易なマウスを用いた研究が期待されるのであるが、その血管運動反応性を測定する基本的技術としてのマイクロベッセルパーフュージョンシステムが十分に有用であることを確認し、この後の研究の発展の礎石をおいた。血管内皮が産生している内皮依存性弛緩因子(EDRF:一酸化窒素(EDNO)、内皮由来過分極因子(EDHF)、プロスタサイクリン)および収縮因子(EDCF)は、血管トーヌスの局所調節に重要な役割を果たしていて、様々な血管病変における病態生理学意義が論じられている。本研究は、遺伝子改変動物に用いられることが多いマウスの血管内皮が産生する「血管運動調節因子」について体系的な理解を得るために計画された。当面は、EDRFに焦点を合わせて研究を進めている。主要設備であるマイクロベッセルパーフージョンシステムの設置が遅れたためにマウスを用いた研究の遂行が出来なかったが、次年度研究のためにラットを用いて予備的な研究を進めた。得られた成果を記す。1)マウス動脈はいずれも平滑筋層が薄く、電気生理学的に、平滑筋細胞の過分極反応からEDHFを測定することが困難であることが明らかとなった。次年度の研究遂行のためのラットを用いた予備的検討では、1) 3種のEDRFの関与の度合いが性によって異なる。2)雌性ラットの性周期によってEDNOおよびEDHFによる血管弛緩が影響を受ける。3)卵巣摘出によるエストロゲンの減少はEDHFによる血管弛緩を強く抑制する。ことを明らかにした。これらの成果を参考に次年度ではマウス血管での検討をマイクロベッセルパーフージョンシステムを用いて行う。購入したマイクロベッセルパーフージョンシステムによるマウス腸間膜動脈(径100μm以下)の血管運動測定をおこなった。α-受容体刺激薬であるphenylephrineおよび血管平滑筋細胞膜電位脱分極を惹起する高カリウム液(40mM)による血管収縮は、CCDカメラによって明瞭にディスプレー画面に映出されて目視が可能であり、また、適切に設定されたエッジデテクターによって収縮(内腔の狭小化)がディジタルもしくはアナログで記録された。血管内皮由来弛緩因子、すなわち、EDNO、PGI_2およびEDHFの関与の度合いを知る目的で行った検討では、acetylcholineで誘発した内皮依存性弛緩反応はEDNO合成阻害薬およびPGI_2産生酵素阻害薬の前処置によりかなり減弱するすることが明らかとなった。ラット腸間膜動脈本幹(径1mm)ではEDNOとEDHFによる反応はほぼ同程度に内皮依存性弛緩に関与し、より細い分枝(径0.5mm)ではEDHFによる弛緩が強くなることを報告しているが(TomiokaH.et al., J.Vascular Res., 36:311,1999)、マウス腸間膜動脈主幹ではEDNOによる弛緩反応の関与が大きい様に思われる。したがって、血管径が血管内皮由来弛緩因子の関与の度合いを決定する要因の一つであるが、そこに種差があるかもしれない。更なる検討が必要である。
メチルプレドニゾロンのシスプラチン腎毒性および抗腫瘍作用に対する影響の検討

メチルプレドニゾロンのシスプラチン抗腫瘍効果におよぼす影響の検討(目的)われわれは、メチルプレドニゾロンがシスプラチンの腎毒性を軽減することを報告しているが、シスプラチンの抗腫瘍効果への影響の検討は十分ではない。今回、メチルプレドニゾロンのシスプラチン抗腫瘍効果への影響をim vitro,in vivoで検討した。(方法)1.ヒト膀胱癌培養細胞株(T24、KK47)をシスプラチン単独、メチルプレドニゾロン単独、シスプラチンとメチルプレドニゾロン併用の3者で3日間インキュベーションし、それぞれの細胞増殖をMTT法にて比較した。2.ラット可移植膀胱癌をラットの背部へ移植し、腫瘍長径が23cmに発育した後、シスプラチン単独投与、メチルプレドニゾロンとシスプラチン併用投与の2群間で腫瘍の発育を比較した。(結果)1.メチルプレドニゾロンはヒト膀胱癌培養細胞株T24、KK47の両者に対するシスプラチンの抗腫瘍効果を減弱することなく、むしろ併用することで抗腫瘍効果を増強した。2.ラットに移植されたラット膀胱癌はシスプラチン単独投与、シスプラチンとメチルプレドニゾロン併用投与群の両者で発育に差は見られなかった。(結論)メチルプレドニゾロンはシスプラチンの抗腫瘍効果を減弱することなく、シスプラチン腎毒性を軽減すると考えられた。
嚥下関連筋のサルコペニア　‐評価法確立と予防‐

超音波断層装置を用いてオトガイ舌骨筋の面積を計測することが可能である.この評価法について,再テスト法を含めた,検者内信頼性と検者間信頼性の検討を行った.被験者の姿勢,模擬食品の種類や量,嚥下様式を統一することにより,再テスト信頼性や検者内信頼性はICC 0.8以上と高い信頼性であった.本評価法を用いて,予定手術患者44名を対象にオトガイ舌骨筋面積の計測を行った結果,術前と術後7日目,術前と術後14日目でオトガイ舌骨筋面積は有意に低下した.手術侵襲や術後廃用による筋萎縮は,四肢体幹の骨格筋のみならず嚥下関連筋においても引き起こされる可能性が示された.超音波による舌骨上筋群の評価法について,再テスト法を含めた,検者間・検者内信頼性の検討を行った.被験者の姿勢,模擬食品の種類や量,嚥下様式を統一することにより,再テスト信頼性や検者内信頼性はICC 0.8以上と,高い信頼性であった.現在,この超音波検査の手法を用いて,嚥下関連筋の廃用性筋萎縮を証明することを目的とした縦断的研究を進めている.これまでの研究結果は,9th ISPRM World Congress,第52回日本リハビリテーション医学会学術集会,第21回日本摂食嚥下リハビリテーション学会学術大会にて,発表を行なっている.平成27年度に超音波検査の信頼性についての研究は終了し,現在は,患者を対象とした縦断的研究を進めている.現在のところ,予定通りに研究が進んでいる.嚥下関連筋の筋量を定量的に評価する方法は確立されていない.超音波断層装置を用いてオトガイ舌骨筋の面積を計測することが可能であるが,われわれはこの評価法の検者内信頼性と検者間信頼性が非常に高いことを確認しており,嚥下関連筋の筋量を非侵襲的かつ定量的に評価する方法であると考えている.本評価法を用いて,嚥下関連筋の筋量変化を経時的に評価していく縦断的研究を実施した.予定手術患者44名に対して,術前,術後7日目,14日目でオトガイ舌骨筋面積の計測を行った.同時に,四肢骨格筋量や栄養状態の指標として,大腿四頭筋厚,握力,%AMC,血清アルブミン値,BMIの計測を行った.その結果,術前と術後7日目,術前と術後14日目でオトガイ舌骨筋面積,大腿四頭筋厚,握力,%AMC,血清アルブミン値は有意に低下した.%AMCは術前と術後14日目で有意に低下した.この結果から,手術侵襲や術後廃用による筋萎縮は,四肢体幹の骨格筋のみならず嚥下関連筋においても引き起こされる可能性が示された.そして,オトガイ舌骨筋の筋萎縮は,術後早期から引き起こされ,術後14日経過しても萎縮したままであることが示された.さらに,術後の食事摂取量が不十分な患者は,オトガイ舌骨筋の筋萎縮のリスクが高いことが示された.今後は,嚥下関連筋の筋萎縮予防を目的とした電気刺激療法やリハビリテーションの効果についての研究を進めていきたいと考えている.平成28年度は,超音波断層装置を用いて嚥下関連筋の筋萎縮を証明する研究まで行った.この分野の研究報告は少なく,自ら学術集会や勉強会に参加し,専門分野の方との意見交換,新しい知見を得ることが必要であった.そのため,研究はおおむね計画通りに進んでいるが,交付申請時の計画より旅費の割合が増えている.超音波断層装置を用いてオトガイ舌骨筋の面積を計測することが可能である.われわれはこの評価法の検者内信頼性と検者間信頼性が非常に高いことを確認しており,嚥下関連筋の筋量を非侵襲的かつ定量的に評価する方法であると考えている.平成28年度は,予定手術患者44名を対象に,嚥下関連筋の筋量変化を経時的に評価していく縦断的研究を実施した.その結果,手術侵襲や術後廃用による筋萎縮は,四肢体幹の骨格筋のみならず嚥下関連筋においても引き起こされる可能性が示された.そして,オトガイ舌骨筋の筋萎縮は,術後早期から引き起こされ,術後14日経過しても萎縮したままであることが示された.さらに,術後の食事摂取量が不十分な患者は,オトガイ舌骨筋の筋萎縮のリスクが高いことが示された.平成29年度(最終年度)は,前年度までの研究成果をもとに,嚥下関連筋の廃用リスクのある患者を対象に,電気刺激療法の効果についての研究を進めていく方針であった.しかし,近年,電気刺激療法にかわる療法として,経皮的磁気刺激療法が広がりつつある.また,オトガイ舌骨筋の筋力増強訓練として,舌挙上訓練が効果的であることが知られるようになってきた.研究計画を立案した当時と比較して,訓練内容にも変化がみられているため,計画内容の変更が必要と考えられた.超音波断層装置を用いてオトガイ舌骨筋の面積を計測することが可能である.

この評価法について,再テスト法を含めた,検者内信頼性と検者間信頼性の検討を行った.被験者の姿勢,模擬食品の種類や量,嚥下様式を統一することにより,再テスト信頼性や検者内信頼性はICC 0.8以上と高い信頼性であった.本評価法を用いて,予定手術患者44名を対象にオトガイ舌骨筋面積の計測を行った結果,術前と術後7日目,術前と術後14日目でオトガイ舌骨筋面積は有意に低下した.手術侵襲や術後廃用による筋萎縮は,四肢体幹の骨格筋のみならず嚥下関連筋においても引き起こされる可能性が示された.平成27年度の研究結果をもとに,平成28年度は,患者を対象とした縦断的研究を進める.予定対象人数は30名である.当初の計画通り,平成29年度は,嚥下関連筋の筋萎縮予防を目的とした電気刺激療法やリハビリテーションの効果についての研究を進めていきたいと考えている.摂食嚥下事情により学会参加人数が減り,その旅費が使用されなかった.また,研究は計画通りに進んでいるが,論文作成に時間を要しているため,その諸費用が次年度に持ち越される予定である.平成28年度後半から,嚥下関連筋の筋萎縮予防を目的とした電気刺激療法に関する研究を開始する方針であった.しかし,研究を開始する前に,これまで行った研究成果の報告や情報収集を行う必要があったため,電気刺激療法に関する研究は,平成29年度から開始する方針としたため,未使用額が生じた.学会に参加し,研究報告や情報収集をする.また,論文作成・発表に必要な費用に使用する.患者を対象とした研究を進めるため,データ収集や解析に必要な諸費用に使用する.平成29年度は,嚥下関連筋の筋萎縮予防を目的とした電気刺激療法やリハビリテーションの効果についての研究を進める予定である.未使用額は,電気刺激療法に必要な電極など,研究遂行に必要な消耗品の購入,研究成果報告や情報収集のための学術集会参加のために使用する計画である.
本研究では、カナダ・オンタリオ州のキッド・クリーク鉱山で発見された地下約2.4kmから湧出する地球最古(始生代、約26.4億年前)の閉鎖系地下水圏を対象に、水・エネルギー供給がほぼ皆無の超極限環境に生息する微生物群の量、多様性、代謝活性、ゲノム構造・機能に関する調査と分析研究を行う。本研究により、ラジオリシス等の非生物学的な地化学反応等に依存する地球共生型の微生物生態系の存在が証明され、そのゲノム進化や存続メカニズムの詳細が解明されれば、地球内部環境における生命圏の広がりや機能・進化の理解に資するのみならず、火星の地下圏等の地球外天体における生命生息や存続の条件を理解する上で重要な糸口となる。
リガンド依存的な濃度変化を利用したタンパク質の機能制御

有価物質を効率よく生産する改良型微生物を探索するために,転写因子を用いて有価物質そのものや前駆体となる化合物の細胞内濃度を定量する試みが行われてきた。しかしながら,必ずしも標的分子を認識して機能する転写因子が存在するとは限らず,転写因子をそのままバイオセンサとして適用するには限界があった。そこで,タンパク質がリガンドと結合すると構造安定性が向上するという普遍的事実に基づいて,結合安定化に伴う実効濃度変化を利用したセンサ開発を進めてきた。本年度は特に,この実効濃度変化というモードで駆動するセンサ開発において,結合素子に酵素を適用できるかどうかを調査した。酵素をも結合素子として採用できれば標的にできる代謝物の数は飛躍的に増え,代謝工学をはじめ,さまざまな分野で利用されると期待される。第1年度の研究で得た亢進型転写因子LuxR変異体へさらにランダム変異を導入し,適度に不安定化させ,かつsuper activatorして振る舞うように改変した。この改変型LuxRにいくつかの転写因子を融合したところ,細胞内の標的分子濃度の上昇に応じてLuxRの転写亢進レベルが上昇することが分かった。さらに,LuxRと融合することによって酵素さえもセンサ素子として振る舞い得ること,そしてそれらにランダム変異を導入すると性能がさらに高まることも分かった。酵素がセンサ素子として使い得るということは,天然・人工を問わず,代謝ネットワーク内のあらゆる代謝物に対してオンデマンドなセンサ開発が可能なことを示している。基質結合に伴う実効濃度変化というモードで代謝物センサを作製するためにさまざまな酵素をLuxRに融合してランダム変異を導入することによって,センサ性能のみならず酵素活性を向上させられることが分かった。あらゆる酵素でこうした変異体が得られるかは不明だが,投資価値有りと判断されたため,本年度の進捗は概ね順調である。次年度は主に,(1)リガンド結合に伴う実効濃度変化を利用した代謝物センサの工法確立,および(2)作製するセンサを利用した代謝工学への応用,の2つに注力する次第である。(1)サイズ,複合体形成の有無,酵素番号などの観点からさまざまな酵素を選出し,LuxRと融合したときにセンサとして振る舞うかどうかを調べる。得られる結果をもとに,センサ性能を高めるために必要な変異の種類について整理し,実効濃度変化を駆動力とする代謝物センサの作製指針を固める。(2)酵素をも結合素子として採用することによって,あらゆる代謝物をGFP蛍光に置き換えることが可能になる。これまではクロマトグラフィなどによって初めて検出されていた代謝物も細胞ベースで可視化することが可能となり,任意酵素の進化工学をハイスループットに行うことができるようになる。そこで,(1)で作製するセンサを用いて,その標的代謝物を生産する酵素のランダム変異ライブラリの中から,高活性変異体の取得を試みる。本研究の目的は,生体分子を検出するセンサを効率的に作製する手法を開発することである。そこで,「検出したい化合物と結合するタンパク質」と「それを読み出すタンパク質」を融合してランダム変異を蓄積させ,リガンドとの結合に依存する形で安定性を保ち機能するセンサの創りやすさや性能評価を進めている。本年度は,複数の転写因子を融合した多入力・多出力型転写因子を作製し,このセンサに見られる特徴および論理演算の集積方法としての可能性を評価した。L-arabinoseに応答する亢進型転写因子AraCおよびAHLに応答する亢進型転写因子LuxRを融合した2入力・2出力型転写因子ALを作製し,変異誘発PCRによってランダム変異を蓄積したライブラリを作製した。このライブラリをサンプリングまたはスクリーニングすることによって,両リガンドと結合したときのみ転写亢進を示すAND gateや,どちらかのリガンドと結合して転写亢進を示すOR gate,片方のリガンドにしか応答しないARA gateおよびAHL gateとしてそれぞれ振る舞う変異体が得られ,4種類の論理回路をひとつのタンパク質内に埋め込むことができた。特にAND gateでは,片方のリガンドとの結合がもう片方へのリガンド応答性を優位に変化させるという特徴が見られ,感度調節機能も有していることが分かった。さらに,前述のALのN末端側に抑制型転写因子TetRを融合した3入力・3出力型転写因子TALを作製し,変異蓄積および機能選抜を4世代に渡って繰り返したところ,結合したリガンドの数に応じて転写抑制活性が高まる変異体,すなわちデジアナコンバータとして振る舞う変異体が得られた。この変異体の可溶性を調べるとリガンドと結合したときのみ可溶化することが分かり,リガンドが化学シャペロンとしてはたらいてタンパク質の濃度を変化させていることが示された。All-in-One型センサの開発を目指して,研究開始当初はLuxRをGFPおよびセレクション用タンパク質と融合して進化工学を行なったが,AHL濃度に応じてGFP蛍光の変化する変異体は得られなかった。ところが,並列して行なっていた転写因子の融合型センサではさまざまな論理回路を1つのORF内に集積することができ,センサ開発の基本フォーマットとして有効であることを見出した。本年度は,この研究内容および修士2年の学生とともに行なった研究内容で特許申請することができ,さらには原著論文として近々投稿する予定である。「タンパク質の直列融合,そしてランダム変異蓄積」というセンサ開発法は単純でありながら歩留まりが良く,次年度に計画している代謝物センサや生理活性分子センサの開発を加速させると期待している。

しかしながら,必ずしも標的分子を認識して機能する転写因子が存在するとは限らず,転写因子をそのままバイオセンサとして適用するには限界があった。そこで,タンパク質がリガンドと結合すると構造安定性が向上するという普遍的事実に基づいて,結合安定化に伴う実効濃度変化を利用したセンサ開発を進めてきた。本年度は特に,この実効濃度変化というモードで駆動するセンサ開発において,結合素子に酵素を適用できるかどうかを調査した。酵素をも結合素子として採用できれば標的にできる代謝物の数は飛躍的に増え,代謝工学をはじめ,さまざまな分野で利用されると期待される。第1年度の研究で得た亢進型転写因子LuxR変異体へさらにランダム変異を導入し,適度に不安定化させ,かつsuper activatorして振る舞うように改変した。この改変型LuxRにいくつかの転写因子を融合したところ,細胞内の標的分子濃度の上昇に応じてLuxRの転写亢進レベルが上昇することが分かった。さらに,LuxRと融合することによって酵素さえもセンサ素子として振る舞い得ること,そしてそれらにランダム変異を導入すると性能がさらに高まることも分かった。酵素がセンサ素子として使い得るということは,天然・人工を問わず,代謝ネットワーク内のあらゆる代謝物に対してオンデマンドなセンサ開発が可能なことを示している。基質結合に伴う実効濃度変化というモードで代謝物センサを作製するためにさまざまな酵素をLuxRに融合してランダム変異を導入することによって,センサ性能のみならず酵素活性を向上させられることが分かった。あらゆる酵素でこうした変異体が得られるかは不明だが,投資価値有りと判断されたため,本年度の進捗は概ね順調である。本年度に確立した高速かつ汎用的なセンサ開発手法を用いて,さまざまな生体分子を検出するセンサの開発に取り組む。具体的には,代謝工学で重要視されているMEP経路やMEV経路の代謝中間体や,生理学で着目されているストレス応答分子の検出である。さらに,得られるセンサの変異解析や物性評価を通じ,本手法で獲得するセンサの特徴づけを進め,センサの合理的な設計指針の抽出を試みる。また,当初は1つのORF内に結合ドメインと出力ドメインを封じ込めた,All-in-One型センサの開発を予定していたが,申請者の試した限りではAll-in-One型センサとして振る舞う変異体は未だ獲得できていない。本年度の研究に鑑みると,転写因子との融合は出力強度を増幅できたり,獲得したセンサの感度を調節できたりするといった利点があり,転写因子ならではの付加価値をセンサに付与できる。これを考慮し,少なくとも次年度は転写因子を機能読み出し用のタンパク質として採用したセンサ開発および特徴付けを継続して行う予定である。次年度は主に,(1)リガンド結合に伴う実効濃度変化を利用した代謝物センサの工法確立,および(2)作製するセンサを利用した代謝工学への応用,の2つに注力する次第である。
光酸素発生デバイスの構築と光機能界面への応用

近年、水の可視光分解システムの開発を主眼とし、機能性錯体を固定化した酸化チタン微粒子電極を用いた光電気化学セルの研究が注目を集めているが、光電気化学セルを用いた水の可視光分解を達成するためには、酸素発生触媒部から光増感部への電子移動の最適化が重要となる。本年度は、ルテニウム光増感剤及び酸素発生触媒をそれぞれ修飾した酸化チタン電極、更に、光増感部及び酸素発生触媒部を併せ持つルテニウム二核錯体を修飾した酸化チタン電極を作製し、その光電気化学セルの機能評価を行った。その酸素発生触媒には、我々が以前にその触媒活性を見出した単核ルテニウム錯体触媒、並びにモリブデン含有コバルトポリオキソメタレート錯体を用いた。それぞれの電極について、アンペロメトリー測定を行ったところ、光照射に伴い電流の大幅な向上が見られ、電極表面上で光酸素発生を駆動する光アノードとして機能することが示唆された。一方、均一系で光化学的な酸素発生を促進する光酸素発生デバイスの開発にも取り組んだ。具体的には、[Ru(bpy)3]2+誘導体に、二つのコバルト錯体からなる酸素発生触媒部位を共有結合させることにより、分子内における酸素ー酸素結合形成を活性化することのできる光酸素発生デバイスの合成と機能評価を行った。その結果、本錯体は、光を駆動力とした酸素発生反応を進行しないことが判明したものの、その酸素発生触媒挙動を電気化学的に評価したところ、その触媒回転頻度は、60 s-1と優れた触媒特性を示すことが判明した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、光酸素発生デバイスの構築と光機能界面への応用を目的としている。平成24年度には、光酸素発生システムの構築を目的とし研究を行った。具体的には、cobalt tetrakis(N-methylpyridinumyl)porphyrin、tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin、tetrakis(4-sulfophenyl)porphyrinそれぞれを配位子として有する3種の水溶性コバルト錯体(CoTMPyP、CoTCPP、CoTPPS)を合成し、[Ru(2,2'-bipyridine)3]2+を光増感剤とする光酸素発生触媒系における触媒機能の評価を行った。その結果、これら全ての錯体が酸素発生触媒として機能することが明らかとなった。次に、CoTPPSについて、その光酸素生成反応における酸素発生量のpH依存性を調べたところ、pH = 812の領域ではpH = 11において最も高い活性を持つことを見出した。そのpH = 11の条件において、TON = 171(30 min)、TOF = 0.19 s-1という結果が得られた。これらの結果から、CoTPPSは均一系光酸素発生触媒として、高い活性を示すことが判明した。また、これら全ての錯体について、光触媒反応溶液中におけるCoOx生成の有無を検証するために、DLS法を用い散乱強度の変化を測定した。結果、比較化合物として[Co(2,2'-bipyridine)3]2+を用いた場合は散乱強度が大きく増加し、CoOxの生成が示唆されたのに対し、コバルトポルフィリン錯体については触媒反応中の散乱強度の変化が観測されなかった。これより、コバルトポルフィリン錯体は、触媒反応中にCoOxを生成することなく分子性触媒として作用していることを明らかにした。初年度は、当初は予定していなかった、触媒回転数の非常に大きい酸素生成触媒を見出し更にその安定性の評価に成功するなど、当初の研究計画で予測していた以上の優れた結果が得られている。初年度は当初の計画以上に進展しているが、平成25年度に予定していた光酸素発生デバイスの実証試験には至っておらず、平成25年度は当初の計画通り光酸素発生デバイスの機能評価を行う。
高圧下電子輸送現象測定による低次元伝導体の次元性の検討

低次元伝導体における電気伝導の次元性を検討する事を目的として,擬一次元半導体TiS_3と、電荷密度波の生成が知られている擬二次元伝導体η-Mo_4O_<11>について以下の点を明らかにした。◎擬一次元半導体TiS_31.化学気相法による,単結晶の最適育成条件を確立した。原材料を真空封入したアンプルを,低温側480°C,高温側520°Cに保った時,最も良質のTiS_3単結晶が得られる。2.TiS_3は,電子を多数キャリアとするn型の不純物半導体である。伝導帯の底に存在する準位がフェルミレベルをピンするため,10^<17>cm^<-3>程度のキャリアが内在する。さらに,バンドギャップ中に10^<18>cm^<-3>程度のドナーが準位を形成し,100K以上になると,ここから電子が供給される。このときの活性化エネルギー△は約24meVである。3.キャリアの散乱は,100K以下ではイオン化不純物散乱が支配的であり,それ以上の温度ではLAフォノン以外に(i)バンド構造の低次元性を反映した異常散乱,(ii)有極性光学フォノンによる散乱など何らかのキャリア散乱機構が働いている。4.室温におけるラマン散乱の測定から,295,365,553cm^<-1>に,光学活性なフォノンによるラマンバンドが観測された。◎擬二次元伝導体η-Mo_4O_<11>1.77Kでb-軸方向にしきい電場以上の電場をかけると,不純物や格子欠陥等によるピン止めを外して電荷密度波が並進運動し,電気伝導に寄与し始める。2.bc面内(2次元伝導面内)で電場の方向を変えても,電荷密度波はb-軸方向にしか並進運動しない。これは,電荷密度波の並進運動が,1次元的であることを示している。3.以上の結果は,電荷密度波の並進運動の次元性は,実空間における結晶構造(2次元的)よりも,結晶の対称性すなわちネスティングベクトルが単一かどうかで決定されることを示唆している。低次元伝導体における輸送係数(電気抵抗・ホール効果および熱電能)の圧力および応力変化を測定する事により、電気伝導の次元性を検討する事を目的として、初年度は、主に単結晶育成条件の確立と、加圧装置の開発を行った。1.1100°Cチューブ炉を用いた化学気相法による、低次元伝導体単結晶(三硫化チタンやモリブデン酸化物)の最適育成条件を確立した。特に低次元半導体三硫化チタンの場合、原材料を真空封入したアンプルを、低温側480°C、高温側520°Cに保った時、最も良質の単結晶が得られることが明らかとなった。2.静水圧と応力の効果の差を明確に観測する必要から、静水圧印加装置をピストン-シリンダー型からダイヤモンドアンビル型セルに変更した。さらにダイヤモンドアンビルの自作を試みたが、充分なアンビル平行度を満足するだけの寸法精度が実現出来なかったため、最大圧力70kbarを実現するようキュロット径・材質などを検討した上、ダイヤモンドアンビルセルを購入した。

これを用いてセルを顕微鏡下で加圧できる装置を開発し、静水圧および横軸応力印加装置に改造した。3.ダイヤモンドアンビルで加圧中に、電気的測定用のリ-ド線(全線φ50μm)と、金属ガスケットがショートするトラブルが発生した。現在これを克服するため、各種絶縁体複合材料をガスケットの材質として検討している。この問題が解決すれば、ダイヤモンドアンビル型セルでの電気的測定の簡便性が飛躍的に向上し、高圧物性測定技術へ貢献するものと期待される。次年度以降は、これらの成果を元に輸送係数(電気抵抗・ホール効果および熱電能)の圧力および応力変化を測定し、低次元伝導体の電気伝導の次元性に関する情報を得る。低次元伝導体における輸送係数(電気抵抗・ホール効果および熱電能)を測定する事により,電気伝導の次元性を検討する事を目的として,擬一次元半導体TiS_3と,電荷密度波の生成が知られている擬二次元伝導体η-Mo_4O_<11>について以下の点を明らかにした。1.初年度に確立した条件を元に育成した擬一次元半導体TiS_3単結晶について,常圧でのバンド構造に関する情報を得るため,輸送係数の測定を行なった結果,以下の事実が明らかとなった。(1)TiS_3は,電子を多数キャリアとするn-型の不純物半導体であり,室温ではキャリアは縮退している。(2)不純物準位からの活性化エネルギーは80K以上で約75meV,それ以下の低温で30から40meVである。2.擬二次元伝導体η-Mo_4O_<11>は,MoO_6の8面体とMoO_4の4面体が層状に積み重なった構造を持っている。この物質では,105K以下でもb-軸方向に電荷密度波が立つことが知られている。この物質の電荷密度波の動的挙動の次元性について,以下の事実が明らかとなった。(1)77Kでb-軸方向に約20mV/cm以上の電場をかけると,電荷密度波が不純物や格子欠陥等によるピン止めを外して並進運動し,電気伝導に寄与し始める。(2)bc-面内(2次元伝導面内)で電場の方向を変えても,電荷密度波はb-軸方向にしか並進運動しない。これは,電荷密度波の並進運動が,1次元的であることを示している。(3)以上の結果は,電荷密度波の並進運動の次元性は,実空間における結晶構造(2次元的)よりも,結晶の対称性すなわちネスティングベクトルが単一かどうかで決定されることを示唆している。今後,常圧におけるこれらの成果をさらに発展させ,低次元伝導体の電気伝導体の次元性に関する情報を明らかにしていきたい。
医学部、看護学部におけるESP教育の実態と将来像の系統的研究

I.医学部(80校)、4年制看護系大学(97校)対象の全国調査A.医学部(回収率66.3%)a.日本医学教育学会の調査(平成7年)との比較項目-1.教員の数(変化なし)2.単位数(変化なし)3.ESP(1)「医学英語」(64.8%から86.8%へ増加)(2)「英語論文作成」(22.2%から30.2%へ増加)4.課外活動(74.1%から84.9%へ増加)b.新項目-1.海外への渡航機会提供(56.6%)2.外部試験(35.8%)、3.医学に特化した検定試験の必要性-(大半が認める)B.看護学部(回収率58.8%)1.ESP:(1)「医療英語」(84.2%)、(2)「英語論文作成」(36.8%)、2.課外活動(医学部ほど活発に行われていない)3.海外への渡航機会提供(49.1%)、4.外部試験(28.6%)、5.看護に特化した検定試験の必要性-(大半が認めている)6.国際看護についての科目(52.6%)7.大学院での英語科目設定(33.3%)II.英語使用度、英語教育要望調査(全国の3,165名の医師対象)(回収率37.3%)A.英語の使用状況「英語論文講読」51.4%-週1回以上「外国人患者診察」48.8%、「英文手紙・Eメール作成」60.4%、「英文診断書作成」21.6%、「英語論文執筆」30.5%、「英語抄録執筆」40.1%、「英語での学会発表」21.3%-年1回以上B.医学部での英語教育要望調査「医学英語語彙」「診療英会話」「英語論文講読」「英語論文執筆」「英語抄録執筆」「英語での学会発表」各項目を大学で教育する「必要がある」と答えた医師は9割を越えた。「英語論文講読」以外では英語の使用頻度は高いとは言えないが、大学英語教育に対する要望は高く、英語教育を充実する事で医師の質を高め、国際的に通用する医学者・医師を増やす事が出来る事は確実である。全ての医科大学・医学部の学長・医学部長(80校)、看護大学の学長・看護学部(学科)長(97校)に英語教育についてのアンケート用紙を送付した。両学部に共通の項目は(1)英語教育を取り巻く環境(教員数・単位数等)(2)英語教育としての課外活動(3)学生の海外渡航機会(4)外部英語試験導入(5)医学(看護)に特化した英語検定試験の必要性である。なお看護学部に大学院の英語科目、「国際看護学」に関する科目についての項目を追加した。(1)医学部の調査結果-回収率は66.3%であった。

日本医学教育学会において平成7年に医学部における英語教育の実態と改善策について調査が行われたが、その後7年の変化は、(1)教員の数、単位数は大きな変化はみられなかったが、「医学英語」は前回の63.0%から84.9%へ、「英語論文作成」は16.7%から28.3%に増加していた。(2)課外活動は大きな変化は見られなかった。新しく調査した(3)では56.6%の大学で学生が海外へ行く機会を提供しており、(4)外部試験は35.8%が導入、(5)医学に特化した検定試験の必要性は大半の大学が認めていた。(2)看護学部の調査結果-回収率は58.8%であった。(1)教員の数、単位数については医学部と大きな差は見られなかった。「医学(療)英語」も84.2%で取り入れられていた。「英語論文作成」は数の上では医学部を上回る36.8%の大学でとりいれられていた。(2)課外活動は医学部ほど活発に行われていなかった。(3)では49.1%の大学で機会を提供しており、(4)外部試験は24.6%が導入、(5)看護に特化した検定試験の必要性は大半の大学が認めていた。大学院では33.3%で英語科目が設定されていた。国際看護についての科目は52.6%の大学で設定されていた。15年7月までに資料集として作成し、ご協力いただいた大学のうちご希望があれば配布する予定である。14年度に全国の医学部における英語教育の調査を行ったが、15年度には全国の医師対象に(1)英語の使用状況及び(2)医学部での英語教育要望調査を行った。全国の大学医学部勤務医師400名、厚生労働省の臨床研修指定病院、高度専門医療機関勤務医師1,765名、開業医1,000名、計3,165名にアンケート用紙を送付し、上記(1)(2)について調査し、英語教育実態調査結果と比較検討し現在医学部で将来必要な英語力をつける教育が行われているかを検証した。(なお、このアンケート調査に関しては、その趣旨を充分説明したうえで協力を得た。)医学部勤務医師61.8%、臨床研修指定病院、高度専門医療機関勤務医師40.3%から回答を得た。(開業医は回収中)(1)「英語論文講読」は4割の医師が週1回、「外国人患者診察」は3割「英文手紙作成」は2割が半年1年に1回、「英文診断書作成」「英語論文執筆」「英語抄録執筆」「英語での学会発表」は3割が数年に1回の頻度で行っている。(2)「医学英語語彙」「診療英会話」「英語論文講読」「英語論文執筆」「英語抄録執筆」「英語での学会発表」各項目を大学で教育する「必要がない」と答えた医師は1割に満たなかった。一方、教育実態は、上記の項目を1つでも取り入れている大学は9割に上るが6年間を通じて全項目を取り入れている大学はほとんどない。英語の使用状況は「英語論文講読」を除く項目では頻度が低いけれども、大学の英語教育に対しては大部分の医師が医学・医療に特化した英語教育を要望している。この要望に対して、6年間一貫した体系的な医学英語教育を実施している大学はほとんどなく、充分この要望に応えられていない。また今までこのような教育に力が入れられていなかったために使用頻度が低いとも推察出来る。平成14・15年度に、全国医学部、看護学部の英語教育実態調査、全国3000人の医師を対象にした英語使用度・英語教育要望調査を実施し、それらを分析した結果から両学部の英語教育について次のような提言を行いたい。ESP(専門に特化した英語)教育を3種類(ESP Step 1,2,3)に分ける。(ESP Step 1)日本人、欧米人英語教員が担当し、医学・看護英語の基礎力をつけさせる。教員は専門知識もできうる限り勉強し、ESP教員に徹する必要がある。(ESP Step 2)(医学部)専門科目担当者が英語教育を担っている大学は全国の医学部の35.8%であった。総合大学においてこの傾向が見られたが、医療系大学・単科の医科大学においても専門分野の教員に診療英会話、論文作成を中心に英語教員では出来ない分野を補完する必要がある。(看護学部)専門科目の教員が英語教育に携わっているケースは学部レベルではほとんどない。
陣痛発来・頚管熟化機構の解明-サイトカイン・接着因子の関与について

妊娠正期妊婦から膣頚管粘液を毎週自然陣痛発来まで採取し、各種サイトカイン濃度を測定したところ測定時から4日以内に自然陣痛発来した妊婦の膣頚管粘液中の癌胎児性フィブロネクチン、IL8は有意に高値を示したがIL1,IL1ra,IL6,IL6 soluble receptor,TNF,TNF soluble receptor,IL10には有意な差を認めなかった。このことから癌胎児性フィブロネクチン、IL8測定により、陣痛発来時期の推定が可能と考えられた。また経膣自然分娩例、陣痛開始後の帝王切開例、陣痛発来前の予定帝切例の胎盤組織における、cPLA_2、sPLA_2mRNAの発現量を測定したところ陣痛発来前の予定帝切例では脱落膜側でsPLA_2mRNAの発現を、羊膜側でcPLA_2mRNAの発現を認め、腟側と子宮底部側では膣側に発現を強く認めた。しかし、陣痛発来後時間を経過したものでは、cPLA_2、sPLA_2mRNAともに脱落膜側に非常に強く発現しており、羊膜での発現が減少していた。このことからcPLA_2、sPLA_2mRNA誘導には解剖学的に膣側の因子(炎症の影響)が関与する可能性が強いこと、陣痛発来後には、無血管領野である羊膜では基質の欠乏からかPG産生が低下する可能性が示唆された。帝切の胎盤組織から得た培養細胞にTGFβを添加すると濃度依存性にサイトカイン産生を抑制した。
法医学試科からの微量細菌毒素分析法の開発に関する研究

本研究の目的は、尿や血液、胃内容物などの法医学試料から簡便で再現性の高い細菌由来毒素分析法の開発である。本年度は、入手可能な毒素の調査を継続して行った。また、不揮発性化合物を固相マイクロ抽出(SPME) -GC/MSで分析するための誘導体化法について検討した。1)入手可能な毒素の調査細菌由来毒素の入手について調査した結果、規制が少なく比較的入手が容易であったが、入手可能な毒素の種類と量が少なく、実際の中毒症例の分析に応用するには限界がある。2)従来法との比較従来の溶剤抽出や固相抽出に比べて多量の有機溶剤を使用せずに簡便に抽出可能であり、環境に配慮した分析法であることが示された。3)試料溶液中での誘導体化法の検討不揮発性化合物を抽出し、操作を簡略化するために誘導体化を検討した。(1)誘導体化法の検討SPMEファイバー上と試料溶液中での誘導体化を検討したが、誘導体化剤の汚染や誘導体の揮発性を考慮すると試料溶液中での誘導体化が有効であった。(2)アミノ基の誘導体化アミノ基の誘導体化にはアシル化やシリル化があるが、水分によって誘導体化が妨害される。塩化ギ酸アルキルはアルカリ性下で容易にアミノ基をホルミル化することが可能であった。また、誘導体は加温することでSPMEでの抽出が可能であり、簡便な分析法開発に応用できることが示された。(3)水酸基の誘導体化種々の誘導体化を検討したが、現在のところ最適な条件は得られていない。本研究の目的は、尿や血液、胃内容物などの法医学試料から、簡便で再現性の高い上記毒素分析法の開発である。本年度は、中毒事例の実態を調査し、入手可能な毒素の種類を調査するとともに、如何なる毒素が固相マイクロ抽出(SPME)法とGC/MSを組み合わせた分析法で検出可能であるかの基礎検討を実施した。1)中毒事例の実態調査科学警察研究所発行の薬物による中毒事故等の発生状況や(財)日本中毒情報センターからの受信状況から、海産性毒素ではフグ(テトロドトキシン)と貝毒が、細菌性毒素ではアマニチン(キノコ毒)やアフラトキシン(カビ毒)が、中毒症例の多い原因物質であった。また、海産環形動物イソメの毒素を原料とした農薬(cartap)による中毒も散見される。さらに、WHOでは、anatoxinやmicrocystinなどのアオコ由来の毒素による中毒も危倶している。2)標準品の入手多くの標準品が入手不可能(市販されていない)であり、中毒発生時における原因物質特定の使用となっている。また、国内法による規制が厳しく、分析機関での入手配慮への検討が望まれる。3)分析法の基礎検討標準品の入手できたanatoxinとcartapについて、SPMEを用いた分析法について検討した。両化合物ともSPMEで抽出できることが判明したので、次年度以降、高感度分析法の確立を行う。本年度は、入手可能な毒素の種類を調査するとともに、アオコ毒素(anatoxin)とイソメ毒素(nereistoxin)を用いて、固相マイクロ抽出(SPME)法の有用性を検討した。また、ペプチド毒素の検出について基礎検討を実施した。1)入手可能な毒素の調査細菌由来毒素について調査した結果、サキシトキシン(貝毒)が化学兵器禁止法の制約を受け、厳しい規制がかかっていたが、他の毒素は特に規制が無く、比較的入手が容易であった。今後、さらに調査を続け、国内での標準品の入手状況について把握する。2)従来法との比較anatoxinやcartapなど、ヘッドスペース法にてSPMEで抽出可能な化合物については、従来の溶剤抽出や固相抽出に比べても多量の有機溶剤を使用せずに簡便に抽出可能なことが示された。3)アオコ毒素(ペプチド)の分析条件の検討マイクロシスチン類はポリペプチドであるため、GCでの検出は困難であった。マイクロシスチン類を酸あるいはアルカリで加水分解し、分解物をGCで検出することが有効であった。マイクロシスチンの分解物には、天然に存在しない化合物が生成するため、その存在の裏付けにできる可能性が示された。4)アオコ毒素(ペプチド)の抽出条件の検討SPMEでの抽出条件を検討したが、現在のところ最適な条件は得られていない。来年度も引き続き最適条件の検討を継続する。

(1)誘導体化法の検討SPMEファイバー上と試料溶液中での誘導体化を検討したが、誘導体化剤の汚染や誘導体の揮発性を考慮すると試料溶液中での誘導体化が有効であった。(2)アミノ基の誘導体化アミノ基の誘導体化にはアシル化やシリル化があるが、水分によって誘導体化が妨害される。塩化ギ酸アルキルはアルカリ性下で容易にアミノ基をホルミル化することが可能であった。また、誘導体は加温することでSPMEでの抽出が可能であり、簡便な分析法開発に応用できることが示された。(3)水酸基の誘導体化種々の誘導体化を検討したが、現在のところ最適な条件は得られていない。