hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞ネクローシスをアポトーシスに導く蛋白質の探索と網膜虚血モデルでの応用

ネクローシスモデルとして胎生17日胚ラット大脳皮質細胞を培養開始直後から無血清で低密度培養する「無血清培養モデル」を確立した。細胞密度を高くすると神経細胞死が遅延し、細胞死がアポトーシスにモードスイッチすることを見いだした。この高密度培養で見られる変化は、高密度培養の上清(CM)によっても同様に引き起こされた。薬理学的な解析から、CMはPLCおよびPKCの活性化を引き起こし、グルコースの取り込み及び細胞内ATP量を増加させてネクローシスを抑制し、一方でミトコンドリアからのチトクロームc(cyto c)遊離によりアポトーシスを誘導した。さらにCM中より単離精製した蛋白質NDIに同様の効果があることを見いだした。低密度培養ではグルコース取り込みが急激に減少していたことから、これを補うため培地中のグルコース濃度を増加させたところ細胞死が遅延し、その細胞死はネクローシスからアポトーシスにモードスイッチしていた。この場合も、細胞内ATP増加によりネクローシスが抑制され、一方でBaxの発現増加、cyto c遊離、カスパーゼ活性化を介してアポトーシスが引き起こされた。このように誘導されたアポトーシスは神経栄養因子より有意に抑制された。次にマウス網膜虚血・再灌流モデルで見られる細胞死に対するグルコースの効果を検討したところ、グルコースは虚血の前だけではなく24時間後に処置しても有意に網膜保護効果を示した。さらに今回確立した「無血清培養モデル」を用いて海洋微生物ライブラリーからネクローシスを抑制する物質を産生するクローンを探索した結果、強いネクローシス抑制効果を有する物質を産生するクローンを単離した。そのうち2つのクローンは網膜虚血傷害を抑制することも明らかになった。今回の研究によって、神経細胞死に抑制的に働く細胞死モードスイッチを引き起こすNDI蛋白質を発見し、また海洋微生物ライブラリーよりネクローシス抑制分子を見いだした。これまで、無血清培養による飢餓ストレスが、脳虚血に見られる虚血焦点(コア)とその周辺(ペナンブラ)を模した細胞培養系であることを様々な観点から証拠付けた。さらに生体内では細胞破壊的なネクローシスから細胞死収束的なアポトーシスへの変換が生ずるが、全く同様な現象がこの培養系で観察された。培養上清に見出された細胞死抑制蛋白質NDIはネクローシス細胞から放出され、周りの細胞を細胞死から保護する、もしくはアポトーシスに変換させるというメカニズムを持つことが示唆されている。その一方で高密度培養時は細胞死が遅延するが、そのとき発現が誘導されるHDS遺伝子を見出しているモデル細胞系として培地中にテトラサイクリンを添加することによりHDSの発現が増加もしくは減少するPC12細胞株を樹立した。今後はこれらの細胞に対して各種の細胞死誘導を行い、細胞死抑制能や細胞の形態変化などを検討し、HDSの細胞死抑制メカニズムに迫る。また、マウス個体を用いた神経細胞死評価系として、頸動脈結紮モデルと網膜虚血モデルを検討した。頸動脈結紮モデルでは海馬周辺の神経細胞が脱落するが、細胞死の形態はネクローシスであることを確認した。網膜虚血モデルは眼圧上昇による細胞死であり、ネクローシス像が所々に認められたが、その周辺にはアポトーシス像も観察された。さらにネクローシスによる細胞死がガラス体へのNDI投与により緩和され、NDIアンチセンス投与ではより重篤なネクローシスへ誘導されることが観察された。虚血時などに見られるネクローシスによる破壊的神経細胞死をアポトーシスに変換し、傷害の拡大を阻止する脳保護機構について研究を進めてきた。

無血清高密度大脳皮質細胞培養上清に神経細胞のネクローシスをアポトーシスに変換する蛋白質NDIを見出していたが、部分精製標品中に含まれるSDS-PAGE上NDIと異なる移動度を示す蛋白質バンドを質量分析により解析したところ、NDIが部分的に修飾されたものであることが確認されたが、その活性には差異は見られなかった。このNDIには通常の分泌蛋白質が有する分泌シグナル配列が存在しないが、この分泌は、非古典的蛋白質分泌阻害剤により阻害され、その結果高密度培養条件下での生存効果が抑制されたことから、無血清ストレスに応じて細胞外に放出され機能することが確認された。無血清培養神経細胞でのネクローシスがNDIによりアポトーシスに変換される条件下で、神経栄養因子を併用することにより生存促進効果を確認され、アポトーシス変換後の細胞死を既存のアポトーシス抑制機序により阻止できることが示された。一方、既存の神経保護作用を有する多くの栄養因子は、ネクローシス抑制作用を有さなかったが、インシュリンにはその効果があることを見出した。網膜の虚血実験系において、組換えNDI投与による細胞死保護作用を光学顕微鏡観察、及び、電子顕微鏡観察により確認し、ネクローシスによる細胞死を抑制することを明らかにした。この系においてNDIアンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理では網膜に対する傷害は観察されなかったが、虚血処置を併用することにより傷害を悪化させることを見出し、生理的なNDIによる神経保護効果を確認した。NDI関連蛋白質として、NDI結合活性を指標にNDI受容体候補をクローニングし、in vitro実験系により相互作用を確認した。もう一つの関連蛋白質であるNDIの下流で働くHDS1のEGFP融合蛋白質をCHO細胞に発現させ、細胞質及び核にも存在することを明らかにした。
心不全治療計画のコンピュータシミュレーションによる研究

1.本研究の目的循環系の機能は各部の血圧,血流量などの多くの変数が複雑な力学系,神経・体液調節系によって制御されている.従ってモデルに基づいた循環応答のコンピュータシミュレーション技法は病的状態の定量的な診断や最適治療計画作成の為に有用である.本研究の目的は心不全のコンピュータ支援システムに通常統用いられる計学的なデータや経験的ルールに加えて循環力学モデルに基づくシミュレーションを導入することにあった.2.循環力学モデルの実験的並びに理論的検討循環系のモデルにはそれぞれ単一の体・肺脈管回路と左右心室力学モデルを設定した.心臓には多くの既報のモデルの中からEMAXモデルを採用した.このモデルに基づいて従来右心バイパスの実験の解析などに用いられている静脈還流や平均循環充満圧の概念の誤差を推定し,動物実験的に確認した.3.心臓学コンピュータシミュレーション支援システム(Heart)循環系の力学モデルに基づく心不全のコンピュータシミュレーションが心不全の診断治療に対して従来より精密な定量的情報を与える事を臨床データと対比して検討した後,心不全状態のシミュレーションに心不全治療に関する教科書的知識と薬剤情報等のデータベースを付加え,よりトータルなCAI(Heart)の完成した.本CAIシステムはデータファイル言語QRS上に作成されたテキストを中心として図表の表示,プログラムの施行,データベースの呈示などが行なわれる.テキストの内容は基本となる循環生理学,内科学の知識ベースが階層構造を成している.プログラムはTurbo pascalによってねPc9800,またはIBM Pc/AT用に書いた.4.結論本CAIシステムは単なる知識の供給にとどまらず,シミュレーションによる動的応答が可能であり,循環器学に関する医学教育,卒後教育,診療支援システムとして有用である.1.本研究の目的循環系の機能は各部の血圧,血流量などの多くの変数が複雑な力学系,神経・体液調節系によって制御されている.従ってモデルに基づいた循環応答のコンピュータシミュレーション技法は病的状態の定量的な診断や最適治療計画作成の為に有用である.本研究の目的は心不全のコンピュータ支援システムに通常統用いられる計学的なデータや経験的ルールに加えて循環力学モデルに基づくシミュレーションを導入することにあった.2.循環力学モデルの実験的並びに理論的検討循環系のモデルにはそれぞれ単一の体・肺脈管回路と左右心室力学モデルを設定した.心臓には多くの既報のモデルの中からEMAXモデルを採用した.このモデルに基づいて従来右心バイパスの実験の解析などに用いられている静脈還流や平均循環充満圧の概念の誤差を推定し,動物実験的に確認した.3.心臓学コンピュータシミュレーション支援システム(Heart)循環系の力学モデルに基づく心不全のコンピュータシミュレーションが心不全の診断治療に対して従来より精密な定量的情報を与える事を臨床データと対比して検討した後,心不全状態のシミュレーションに心不全治療に関する教科書的知識と薬剤情報等のデータベースを付加え,よりトータルなCAI(Heart)の完成した.本CAIシステムはデータファイル言語QRS上に作成されたテキストを中心として図表の表示,プログラムの施行,データベースの呈示などが行なわれる.テキストの内容は基本となる循環生理学,内科学の知識ベースが階層構造を成している.プログラムはTurbo pascalによってねPc9800,またはIBM Pc/AT用に書いた.4.結論本CAIシステムは単なる知識の供給にとどまらず,シミュレーションによる動的応答が可能であり,循環器学に関する医学教育,卒後教育,診療支援システムとして有用である.1.実験的研究成果:雑犬を麻酔下に開胸し、心拍出量・冠循環血流量測定のための電磁流量計プローブを装着し、またオクルーダにより冠循環血流抵抗を調節した。今年度の実験では下肢筋の電気的刺激による運動のシミュレーション下に、または動静脈シヤント開閉による動静脈圧変下の下に、循環系各部の血圧、換気量の測定、および動静脈血・冠静脈洞流出血のガス分析、心電図記録を行った。これらの結果を我々の心筋虚血指数I=KC・(100CUO+1)/(Pas-Pvs)の確認と係数の推定に用いた。(日本生理学会発表予定)2.心不全治療のコンピュータ指針の作成:循環系力学モデル、心筋虚血指数、および薬力学的モデルを基に心不全のシミュレーションおよび治療計画のコンピュータ支援システムを作成した。今年度はとくに心不全治療に用いられる種々薬剤の薬動力学上の文献的知識を用いてモデルを作成し、最適治療計画の中に組み入れた。その結果、患者個人について具体的な治療計画を呈示することが出来た。コンピュータ支援システムの評価のために、患者資料について、専門医の判断とコンピュータ指針とを比較検討した。疾患の種類は、高血圧性心不全、虚血性心疾患、心筋症に亘っている。このプログラムは、疾患の種類、NYHAの重症度、覗血的データを入力すると心力学上のパラメータを計算しパイグラフで表示する。また最適治療計画の計算は、16ビットパソコンレベルの機器でTurbo Pascalを用いてプログラムすると30秒1分位で完了した。これら計算機outputと専門医の判断とはおおむねよく一致した。疾患の種類を弁膜症や不整脈にまで拡張して本課題の目標を達成すべく、現在研究続行中である。なおこの研究成果の一部は第5回医療情報学会(国際,ワシントン市)MEDINFO'86で金賞論文となった。
核融合炉用液体増殖材と低放射化材料溶接材の共存性

核融合炉液体増殖材と低放射化材料溶接材との共存性を明らかにするにするため、溶接素材における基本的な腐食試験を行うとともに、低放射化材料と316L鋼との異材溶接材の試作と機械特性、照射特性の評価を行った。低放射化フェライト鋼F82H(Fe-8Cr-2W-0.1C)及び316Lステンレス鋼(Fe-18Cr12Ni-2Mo)の異種溶接材を電子ビーム溶接で作成した。板材の厚さは7mmで電子ビーム入熱は3kW、溶接速度は1m/minである。溶接材から硬さ試験片、組織観察試料、加速器照射試料を切り出した。光学顕微鏡観察、及び走査型電子顕微鏡観察の結果、溶接割れなどの欠陥は観察されなかった。硬さ試験より、溶接金属ではビッカース硬さで400Hv以上の非常に硬い相が生成し、これを溶接後熱処理で母材の硬さ(200Hv)まで軟化させることはできなかった。このような溶接材は脆いことが予想される。この相は現在解析中であるが、マルテンサイト相と推定される。この相の生成を避けるため、20年度は溶接時の照射位置を突き合わせ位置からずらすなどの溶接条件の最適化をする予定である。一方で、溶接部の照射硬化が母材より大きいかどうかを評価するため、加速器でプロトン照射を行った。溶接金属、母材ともに照射硬化は観察されたが、データのばらつきが大きく、定量的には過去のデータと矛盾するものもあるため、現在追試験を準備しているところである。また、溶接材の基本特性となる引張、曲げ、衝撃データをとるため、追加の試料作成準備を行った。以上の成果を日本金属学会2008年度春期講演大会にて発表した。低放射化バナジウム合金の異材溶接材作成においては、溶接条件を求めるために使用する純バナジウムの加工を行って4mm厚の板材を作成した。20年度はこれの熱処理を行い、316ステンレス鋼と突合せ溶接実験をして溶接条件の最適化をする。電子ビーム溶接にて、低放射化フェライト鋼F82H(Fe-8Cr-2W-0.1C)、純バナジウム(V)及び316Lステンレス鋼(Fe-18Cr-12Ni-2Mo)の異種溶接材を作製した。F82H-316L溶接材では、電子ビーム照射位置が突合せ位置の場合、溶接位置が突き合わせ位置の場合には、溶接金属の硬さが400Hvあり脆化していることが示唆された。これを溶接後熱処理しても、元の硬さ200Hvまで回復させることはできなかった。シェフラーの状態図及び溶接金属の電子顕微鏡を用いた蛍光X線分光分析によると、溶接金属ではマルテンサイト相が生成していると考えられる。この相の生成を抑えるために、電子ビーム照射位置のシフトを行った。その結果、照射位置を316L側に0.2mmシフトし、750°C×1hrの溶接後熱処理を施すことで、上記の硬化を回避することができ、溶接条件が明らかとなった。溶接試料について、引張試験、曲げ試験、シャルピー試験を行い、母材並みの良好な機械的特性を確認した。一方で、加速器で0.5dpaまでプロトン照射を行った結果、照射硬化量は57Hvであり、これは316Lの過去のデータ145Hvより小さく、また照射欠陥も特異なものはできないことから、照射後の機械的特性は母材より悪くなることはないと考えられる。以上の成果を日本原子力学会「2008年秋の大会」及び、第18回核融合エネルギー工学トピカル会議にて発表した。一方、純V-316L溶接では溶接金属の硬さが550Hvと想定外に硬化したことから、原因を究明中である。また、液体増殖材溶融塩Flibe中での腐食を模擬するための、HFガス腐食試験装置の準備を行った。電子ビーム溶接にて、低放射化フェライト鋼F82H(Fe-8Cr-2W-0.1C)、純バナジウム(V)、低放射化V合金及び316Lステンレス鋼(Fe-18Cr-12Ni-2Mo)の異種溶接材を作製した。F82H-316L溶接材では、平成20年度に求めた溶接条件で試料を作成し、溶接金属、熱影響部(HAZ)、母材に加速器で0.11.0dpaまでプロトン照射を行った。結果、溶接金属の照射硬化量は1dpaで135Hvで、316L鋼母材と同程度であり、照射硬化の促進は認められなかった。F82H母材及びF82H側HAZの照射硬化量は30Hvであり、316L鋼と比較すると小さいが、HAZの中に50Hv軟化した脱炭層の形成が認められ、これが1dpa照射後も周囲より軟化したままであったため、機械強度への影響がありうることが明らかとなった。純バナジウム-316鋼の溶接材においては、母材が150-200Hvであるのに対し、溶接金属は溶接ままで600Hvと硬く、さらに1273K×1hrの溶接後熱処理によって1000Hv程度の非常に硬い相ができることが明らかになった。

この硬化相は、電子ビームの照射位置を純V側に0.4mmずらすことで、その体積を小さくすることができた。硬化相は、Fe-Vのシグマ相、あるいはV_3Ni相であると推定された。純V-316L鋼の溶接実験で求めた溶接条件にて低放射化V合金-316L鋼の継手を製作し、溶接部の硬さ分布測定、微細組織観察を行った。以上の成果をまとめ、日本原子力学会にて発表し、また科学雑誌に論文投稿した。
バルト、ブランショ、デリダにおけるエクリチュール概念と発話理論の関係

モーリス・ブランショ、ロラン・バルト、ジャック・デリダは、いずれも20世紀フランスにおいて「エクリチュール」を概念化し、根源的な営みとして捉えた批評家であり思想家である。彼らのエクリチュール概念は、それが主体の理性的な統御を免れるものだという点においては共通している。しかし、構造主義が依拠した発話理論の言語学との関係という観点から見ると、彼らのエクリチュール概念はそれぞれに異なっている。本研究は、関連テクストの精査により、エクリチュール概念と発話理論の関係性という見地から彼らの思想の共通性や差異を明らかにし、それを通して、ブランショやデリダと構造主義との距離をも明らかにする。
負の電子親和力状態表面の微視的構造の研究

Cs/Cs2O/半導体方面などで現れるNEA表面では、仕事関数が吸着Csと吸着酸素のまわりで複雑に変化していると考えられる。NEA状態の原子的な構造と動作機構を明らかにするためには、表面の微視的な構造と仕事関数の原子尺度での変動を観察する必要があると考えられる。STMで測定されるトンネルバリアは表面の仕事関数に強く依存している。このトンネルバリアを二次元的に測定すれば、表面の原子尺度の構造と同時に仕事関数の表面での分布を解析することができる。本研究では、STMを用いてトンネルバリアの二次元的な分布を測定する方法を確立し、表面構造とトンネルバリアの二次元的な分布を対応させることに成功した。まず、STMの走査中に、エピゾのz軸印加電圧に、微小な振幅をもち、かつSTMのフィードバックが追従しない十分に短い周期をもつ正弦波電圧を外部から加える。補助金で購入したロックインアンプを用いて、トンネル電流信号のうち外部から加えた正弦波電圧と同じ周波数成分を取り出すことにより、トンネルバリアに比例した信号を取り出す。この信号を二次元像にすることによりトンネルバリアの表面上での分布を分析した。Si (111)表面を観察すると、ロックインアンプを通して検出した信号像においても7×7構造を原子尺度で観察することが出来た。検出信号像を見ると、原子位置でははトンネルバリアが小さく、コーナーホールはトンネルバリアが大きく観察された。また表面に吸着しているコンタミ層は、トンネルバリアが大きく観察された。これらの結果から本研究で用いた方法によりトンネルバリアが正しく観察されていると考えられる。さらにステップを観察してみると、ステップ直上と考えられる位置では、トンネルバリアは大きく観察されたが、二重の線のように観察された。これがダブルステップによるものか、ステップ直上の両側に何らかの構造が出来ているためかはさらに詳細な解析が必要である。また、トンネル電流を表す式を展開した一次項まででは、トンネルバリア像に表面の凹凸の情報は入ってこないが、さらに高次の項や電子状態密度の空間分布などを考慮して解析を行うと表面での波動関数の形などの情報も得られると考えられる。今後、トンネルバリア像のさらに詳細な解析とともに、酸素やアルカリ金属を吸着させ表面の仕事関数を変化させた表面でのトンネルバリア像の観察を行うことにより、NEA状態の機構を解析できると考えられる。
湿度の感性、生理への影響の探索

研究では、行動実験と機能的脳画像法(fMRI)を用いて、1濡れ感に関わる脳部位を同定し、2温冷感と圧覚の2つの異なる感覚から形成されると推察される濡れ感を、脳内情報伝達解析により明らかにする.さらに、3濡れ感により温熱的不快感が生じるメカニズムを明らかにする.4生理学的、電気生理学的手法を用いて、皮膚の濡れによる発汗抑制のメカニズムを明らかにする.湿度や皮膚表面の濡れは、ヒトの体温調節に大きな影響を与える因子であるにもかかわらず、濡れや湿度に関するセンサーの存在は否定され、皮膚表面の濡れの受容を起点とした体温調節反応のメカニズムも明らかになっていない。本研究は、行動実験とfMRIを用いた観測を通して、蒸れ感や濡れ感に対する脳部位の同定や、脳内情報伝達解析を行い、これらの感覚に関する感性要素の形成メカニズムを明らかにしようとするものである。蒸れ感および濡れ感の形成メカニズムを明らかにする試みは、脳・感性情報処理分野における重要な課題であるにもかかわらず、これまで必ずしも十分には行われていない。従って、本研究の学術的意義は高く、かつ期待される成果は、高度な仮想現実感を実現するなどの応用面でも有益と考えられる。研究では、行動実験と機能的脳画像法(fMRI)を用いて、1濡れ感に関わる脳部位を同定し、2温冷感と圧覚の2つの異なる感覚から形成されると推察される濡れ感を、脳内情報伝達解析により明らかにする.さらに、3濡れ感により温熱的不快感が生じるメカニズムを明らかにする.4生理学的、電気生理学的手法を用いて、皮膚の濡れによる発汗抑制のメカニズムを明らかにする.
精神疾患特異的iPS細胞における神経発達異常の検証

疾患特異的iPS細胞は、多くが未解明のヒトにおける疾患の成立過程を解析できる画期的実験系である。近年、神経発達や投射経路など発達初期の異常が精神疾患の原因として注目されているが、これら発達の初期過程が実際の患者どのように変化しているのかは不明である。そこで本研究では、精神疾患の疾患特異的iPS細胞の樹立および分化後の神経機能の解析を行った。その結果、患者および健常者からiPS細胞を樹立するとともに、迅速な神経分化誘導法の開発に成功した。さらにこれらの手法とトランスクリプトーム解析を組み合わせることで、治療薬への反応性に関わる可能性のある候補遺伝子の同定に成功した。疾患特異的iPS細胞は、多くが未解明のヒトにおける疾患の成立・発展過程を、遡って解析できる画期的実験系である。近年、神経発達や投射経路など発達初期の異常が精神疾患の原因として注目されているが、これら発達の初期過程が実際の患者でどのように変化しているのかおよびその原因である分子群を解明した研究は存在しない。本研究は、精神疾患の疾患特異的iPS細胞の樹立および分化後の神経機能の解析を行うことで、これら疾患の成立、発展過程に関わる分子ネットワークを解明することを目指すものであり、平成26年度においては、以下の検討を行った。1.エピソーマルベクターを用いた手法により、患者由来iPS細胞および対照群として健常者由来iPS細胞を、それぞれ複数人の患者および健常者から樹立した。2.樹立したiPS細胞における未分化マーカーの発現、増殖速度やコロニーの形態などについて、健常者由来iPS細胞および患者由来iPS細胞の間の差について検討した結果、両群間に顕著な差は見られなかったことから、幹細胞としての性質に著明な差はないと考えられた。3. iPS由来神経細胞の機能解析に必要となる神経分化誘導プロトコルの確立を行った。その結果、neurogenin2発現レンチウイルスベクターを用いた迅速な神経細胞への分化誘導プロトコルおよび低分子を用いた神経幹細胞への分化誘導プロトコルについて確立した。神経幹細胞を神経細胞へと終末分化させる条件については、長期培養時の生存率に問題があるため、次年度以降も継続して検討を行う予定である。4.確立したneurogenin2発現レンチウイルスベクターを用いた分化プロトコルを、樹立した患者由来iPS細胞へと適用し、神経細胞における機能解析を実施した。本研究は、精神疾患の疾患特異的iPS細胞の樹立および分化後の神経機能の解析を行うことで、これら疾患の成立、発展過程に関わる分子ネットワークを解明することを目指すものであり、平成27年度においては、以下の検討を行った。1.前年度に引き続き、エピソーマルベクターを用いた手法により、患者由来iPS細胞および対照群として健常者由来iPS細胞を、それぞれ複数人の患者および健常者から樹立した。2.前年度に引き続き、樹立したiPS細胞における未分化マーカーなどの発現について、健常者由来iPS細胞および患者由来iPS細胞の間の差について検討した結果、両群間に顕著な差は見られなかったことから、幹細胞としての性質に著明な差はないと考えられた。3.前年度に確立したneurogenin2発現レンチウイルスベクターを用いた分化プロトコールを、樹立した患者および健常者由来iPS細胞へと適用し、神経細胞における機能解析を実施した。その結果、治療薬への反応性と相関して、発現変化が見られる遺伝子を複数同定することに成功した。今後この同定した分子が、神経細胞において果たしている役割を詳細に解明していく予定である。当初計画通りに進展していることに加えて、neurogenin2発現による分化系の確立が早期に完了したため、平成27年度に実施予定であった、患者由来iPS細胞を分化させて得られる神経細胞における機能解析を、前倒しで実施できた。従って、当初の計画を上回る進展が得られたと考えられる。神経薬理学当初計画通り、患者由来iPS細胞のさらなる樹立を行うとともに、幹細胞・神経幹細胞・神経細胞の各段階における機能異常の可能性およびその背景にある分子機構について検討を行い、疾患の成立・発展過程に関わる分子ネットワークの同定を目指す。低分子を用いた神経幹細胞への分化誘導と、その後の終末分化により、神経細胞を得ることに成功しているが、シナプス密度などの検討に不可欠である長期培養に耐えうる実験条件の同定には至っていない。多数の成長因子の影響について、長期にわたり細胞を維持培養することで明らかにする必要がある。従って、当初研究目的を達成するためには、本年度使用予定であった金額の一部を次年度使用額として計上する必要があると考えられる。

スパイン密度など、長期培養した後にのみ解析可能かつ神経機能において重要であるパラメーターについて評価するため、神経幹細胞を終末分化させる際の培養条件(成長因子の有無、フィーダー細胞との共培養など)について検討を行い、iPS由来神経細胞の分化・成熟を維持することができる培養条件の確立を図る。
骨代謝におけるマスト細胞の役割の解明

C57BL/6マウス新生仔の頭頂骨由来骨芽細胞を採取し、ビタミンCとβ-glycerophosphateを含む骨芽細胞分化培地にて培養し分化を誘導した。その際に、GSK3・阻害剤であるSB216763を0、2.5、10・Mの濃度にて添加し、各分化段階におけるオステオカルシンなどの骨芽細胞分化マーカー分子または細胞内シグナル分子の発現量の比較、骨芽細胞による石灰化の検出を主として解析を行った。骨芽細胞の各分化段階において、SB216763処理により細胞内β-cateninが増大した。また、MAPキナーゼの1つであり、骨芽細胞分化の後期段階に関与することを報告した(Matsuguchi T, Chiba N, et.al. JBMR 2009)JNK1/2も増大していた。また、分化マーカーであるが石灰化を抑制するオステオカルシンはSB216763の濃度依存的に減少していたが、これに反して石灰化を促進するオステオポンチンは著明に増大していた。さらにアリザリンレッド染色を用いて石灰化を検出したところ、SB216763により骨芽細胞の分化・成熟にはやや遅れが見られるが、石灰化作用により生じるスポットの大きさは濃度依存的に増大していた。頭頂骨由来骨芽細胞にはある程度分化が進んでいる細胞も含まれていることから、SB216763の処理により未熟な骨芽細胞の分化は遅延するが、一定の分化段階に達している骨芽細胞による石灰化を強力に促進する可能性が考えられる。成熟個体においては、ある程度分化が進んだ骨芽細胞がマウス新生仔の頭頂骨に比較して多く存在すると考えられ、GSK3シグナルの解明が骨破壊による損傷・疾患の治療などに役立つことが期待される。
消化器がん総合的治療戦略確立のためのトランスレーショナルリサーチ

本研究の目的はDNAチップ技術を応用し、従来の病理組織診断ではできなかった消化器癌に対する悪性度・予後予測診断システムを確立し、臨床へ実践的に応用することである。本研究は、臨床フィールドとして、参加施設の協力体制のもと数千例の癌症例のサンプリングと登録を行ない、統一された臨床病理学的データを整理すること、また基礎研究フィールドとして、共同研究契約を締結した実験施設と解析施設において、DNAチップなどを用いた網羅的な分子生物学的解析データの解析を行うことを2本柱とし、2006年4月現在、約4000例の消化器癌症例の登録を完了した。具体的には、1)大阪大学と関連病院で切除された各癌腫の切除標本および臨床病理学的情報を収集し、標本、情報の整理・管理を行なうマルチセンターシステムを構築した。2)収集された各消化器癌切除標本からmRNAを抽出し厳密なquality checkをした後、target DNA(臨床検体)を調整し、ヒト全遺伝子型DNAチップを用いて、各種の消化器癌で数100から1000例のヒト全遺伝子発現データを取得した。3)大腸癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、膵癌など各疾患で癌の発育・進展に関連する遺伝子群の抽出し、新規腫瘍マーカーや治療標的を同定した。4)各疾患で転移・再発・予後や、化学療法、放射線療法などの治療応答性に関する特徴的な遺伝子発現パターンを認識し、遺伝子発現プロファイルの応用による予測診断システムを確立した。大阪大学および関連病院の倫理委員会の承認のもと、各施設の全消化器癌の切除標本・臨床病理学的情報の収集システムを構築した。これにより大阪大学を中心とした消化器癌の標本およびデータの整理・管理システムが完成した。DNAチップ研究所と共同研究下に、約30000種類のヒト遺伝子からそれぞれ特異的な60merのオリゴDNA設計し、スライドグラス上に超高密度にスポットしヒト全遺伝子型DNAチップを開発・作製した。ヒト全遺伝子型DNAチップを用いた種々のcell lineを用いた予備検討では、非常に高いデータ再現性と定量性を得ることができ、実験プロトコールの検討を重ね、ヒト癌サンプルでも同様のデータが取得できるようになった。予備検討により決定された一定のプロトコールに従い、control referenceとの競合ハイブリダイゼーションにより、ヒト全遺伝子型DNAチップの遺伝子発現データを取得している。現在、大腸癌を対象とした癌部で発現亢進・減弱する遺伝子の検討では、従来文献報告されている遺伝子が矛盾することなく多数同定された。また肝転移予測能の検討では、preliminaryなデータで約80%と高い値を得ることができている。今後、大腸癌のリンパ節転移、化学療法感受性の検討の他、肝細胞癌、食道癌、胃癌と解析をすすめる予定で、各消化器癌において、関連遺伝子の同定および生物学的特性を反映した悪性度・予後予測診断への応用が期待される。本研究の目的はDNAチップ技術を応用して、これまでの病理組織診断ではできなかった消化器癌に対する悪性度・予後予測診断システムを確立し、実践の臨床へ応用することである。ヒト全遺伝子に対して特異的配列をもったオリゴDNA(30000種類)を搭載したヒト全遺伝子型DNAチップを用い、各消化器で数100から1000例規模を対象として、各種癌における遺伝子発現からみた再発・予後解析に加え、大腸癌での肝転移、胃癌・食道癌でのリンパ節転移並びに腹膜播種、肝細胞癌・膵癌における再発形式予測などの予測診断システムを確立するとともに、それぞれ関連遺伝子群の同定による治療標的の抽出を行っている。具体的には、1)平成16年度より引き続き、大阪大学と関連病院で切除された各癌腫の切除標本および臨床病理学的情報を収集し、マルチセンターシステムとして標本、情報の整理・管理を行ない、2)収集された各消化器癌切除標本からmRNAを抽出し、超微量mRNA分析用マイクロラボチップによるquality checkを行なった上で、Target DNA(臨床検体)の調整を進め、3)予備検討により決定されたプロトコールに従い一定条件下でヒト全遺伝子型オリゴDNAチップによる遺伝子情報を取得した。

解析はa)全ての癌腫において再発・予後解析を行う。b)大腸癌については肝転移、化学療法感受性、リンパ節転移に関連する解析を中心に行う。c)食道癌については、リンパ節転移に関連する解析を中心に行う。d)胃癌については、腹膜播種、リンパ節転移に関する解析を中心に行う。E)肝臓癌については、再発形式、化学療法感受性に関する解析を中心に行っている。本研究の目的はDNAチップ技術を応用し、従来の病理組織診断ではできなかった消化器癌に対する悪性度・予後予測診断システムを確立し、臨床へ実践的に応用することである。本研究は、臨床フィールドとして、参加施設の協力体制のもと数千例の癌症例のサンプリングと登録を行ない、統一された臨床病理学的データを整理すること、また基礎研究フィールドとして、共同研究契約を締結した実験施設と解析施設において、DNAチップなどを用いた網羅的な分子生物学的解析データの解析を行うことを2本柱とし、2005年12月現在、すでに3000例以上の消化器癌症例の登録が終了している。具体的には、1)平成17年度より引き続き、大阪大学と関連病院で切除された各癌腫の切除標本および臨床病理学的情報を収集し、マルチセンターシステムとして標本、情報の整理・管理を行なう、2)収集された各消化器癌切除標本からmRNAを抽出し、超微量mRNA分析用マイクロラボチップによるquality checkを行なった上で、target DNA(臨床検体)の調整を進める、3)ヒト全遺伝子に対して特異的配列をもったオリゴDNA(30000種類)を搭載したヒト全遺伝子型DNAチップを用い、予備検討により決定されたプロトコールに従い一定条件下で大腸癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、膵癌など各種の消化器癌で数100から1000例規模を対象として、遺伝子発現からみた転移・再発・予後・再発形式に加え、治療応答性の解析などの予測診断システムを確立する、4)各疾患それぞれで関連遺伝子群の同定による治療標的の抽出を行うことである。
固体・液体状態の金属及び合金の分光放射率とその推算モデル

本研究は,高温エリプソメータ及びコールドクルーシブル放射率測定装置を用いて,固体・液体状態の金属及び合金の垂直分光放射率の測定を行い,放射機構に基づいて,放射率の推算式を構築することを目的として行った。以下,得られた成果を列記する。(1)Cu,Ag,Au,Fe,Co及びNiの純金属の放射率を各金属の融点で,波長範囲500-2500nmにおいて測定し,放射率が融解にともなって増大することを明らかにするとともに,1000nm以上の波長において,それらの放射率を推算できる推算式を作成した。(2)FZ-Si及び900ppmのSbを含有するポットスクラップSiの放射率をそれぞれの融点で,500-1000nmの波長範囲において測定した。固体Siの放射率は液体Siよりも大きく,前者は正の波長依存性,後者は負の波長依存性を示すこと,900ppm程度の不純物はSiの放射率に有意な影響を与えないことを明らかにした。また,固体Siの放射率は束縛電子モデルで,液体Siの放射率は自由電子モデルで記述できることを示した。(3)固体及び液体Ni-Cu2元系合金の放射率を800-2000Kの温度範囲で測定した。固体,液体に関わらず,放射率の温度係数は正であり,その組成依存性は上に凸の放物線的な関数であること,さらに,液体の放射率は,負の波長依存性を示すことを明らかにした。また,自由電子モデルによる計算値が測定値の温度及び組成依存性を表現すること,これらの値の差がd電子の放射に対応し,その大きさは波長のみに依存することを示し,これらのことから,放射率を温度,組成及び波長の関数として定式化した。(4)Ni-Co2元系固体合金の632.8nm,温度300-1600Kにおける放射率を測定した。組成によらず,放射率の温度係数はキュリー点以下では負,以上では正となることを明らかにした。(5)Ni-Cr2元系液体合金の放射率を1600-2000Kの温度範囲で測定した。放射率の温度係数及び波長依存性は,Ni-Cu系と同様であったが,組成依存性に関しては,特に短波長域において,80at%Ni付近で極小値を取ることを明らかにした。(1)補助を受けて導入したマルチチャンネル分光器等を用い,コールドクルーシブル放射率測定システムを構成した。本装置により,現在までにCu,Ag,Auの純金属の放射率を測定し,その固液変態に伴う放射率の変化を明らかにした。また,相変態によっても放射率が不変である波長領域があることを明らかにした。(2)Si中に溶解したSbが放射率に及ぼす影響を調べるため,実際の単結晶作製プロセスにおいて生じたSbを含有するポットスクラップシリコンと不純物濃度の極めて低いFZシリコンの放射率を測定・比較し,その間には有意差がないことを確認した。また,Siは固体では半導体的な,液体では金属的な性質を示すことから,固体シリコンには束縛電子モデルを,液体シリコンには自由電子モデルを適用し,Siの放射率を計算によって求めた。

さらに,このモデルを用いてSbを900ppm含有したSiの放射率を求めたところ,実験結果と同様,純粋なSiの放射率と有意な差は認められなかった。(3)抵抗炉とエリプソメータを組み合わせた高温用エリプソメータを用い,固体金属表面の複素屈折率を測定し,この値から放射率を求めるという方法を構築した。この方法によりCu-Ni合金の放射率を873Kから各組成の固相線温度までの温度範囲で測定した。長波長域において放射率と電気抵抗率の関係を表すHagen-Rubensの法則により求めた放射率値は,実験値の組成及び温度依存性をよく表したことから,この合金の熱放射は,主に自由電子-フォノン散乱に支配されていることがわかった。しかし,計算により得られた放射率の絶対値は,実験値とわずかに異なった。この差は,その放射にはフェルミ面近傍の自由電子だけでなく,dバンドから励起・緩和する内殻電子も寄与していることを示唆している。(4)購入したマルチチャンネル分光器と二色放射温度計を組み合わせることにより,任意の温度で放射率を測定できるシステムを開発中である。放射温度計の放射率比の校正は物質の相転移点で行う予定である。これにより,合金の放射率の温度依存性と組成依存性以外に,波長依存性をも明らかにすることができる。(1)Si中に溶解したSbがSiの放射率に及ぼす影響を調べるため,コールドクルーシブル放射率測定システムを用いて,実際のSi単結晶製造プロセスにおいて発生したSbを含有するポットスクラップシリコンと,不純物濃度の極めて低いFZシリコンの放射率を測定・比較し,その葦が有意なものでないことを確認した。(2)コールドクルーシブル放射率測定システムを用いて,Cu, Ag, Au, Fe, CoおよびNiの純金属の放射率を各金属の融点で,波長範囲5002500nmにおいて測定し,その融解にともなう放射率の変化を明らかにした。また,1000nm以上の波長において,それらの放射率を推算できる経験式を作成した。(3)昨年度,高温用エリプソメータを用いて,固体金属表面の複素屈折率を測定し,この値から放射率を求めるという方法を考案した。この方法により,Cu-Ni合金の633nmにおける放射率を873Kから各試料組成の固相線までの温度範囲で測定した。各試料の電気抵抗率の値を用いてHagen-Rubensの関係から計算した放射率に対して,本研究による測定値をプロットすると,純Cu以外の測定値は,計算値より約0.038大きくなることがわかった。この差より,高い状態密度を有するdバンドからフェルミレベル以上への遷移(バンド間遷移)が,Niを含有した試料については一定の影響を及ぼしていることを明らかにした。同様の測定を現在,Ni-CrおよびNi-Co合金を用いて行っている。(4)昨年度購入した赤外用マルチチャンネル分光器と二色放射温度計をコールドクルーシブル放射率測定システムにインストールすることにより,より広い波長範囲で,かつ任意の温度において,液体合金の放射率測定を可能とした。この場合,二色放射温度計に入力する放射率比は,各合金の液相線温度において校正することが最適であることを確認した。液相線温度は示差熱分析法により決定した。現在,このシステムを利用し,溶融Cu-Ni合金の5002600nmにおける放射率を,各試料の液相線から約200K以上の温度までの範囲で測定している。純CuおよびNiの放射率測定結果は,過去の報告値と波長依存性・温度依存性ともによい一致を示している。
微生物起源Mn酸化物による放射性Csの新規固定機構の解明

Mn酸化物への放射性Csの吸着と脱離行為に系統的分析を行った。Mn酸化物の表面に、マルチサイトの吸着を存在しているのを発見した。微生物起源Mn酸化物の表面微量平衡電荷イオンの存在は、低濃度放射セシウムへの吸着には強烈な影響がある。層状Mn酸化物と比較すると、トンネル状Mn酸化物は特異的な吸着挙動を示した。このような吸着挙動の違いは、層状とトンネル状Mn酸化物の構造の違いが影響していると考えられる。原子力学
原始クラミジアが共生するアメーバは何故レジオネラの感染から回避できるのか

自然環境に広く生息するアカントアメーバ(以下アメーバ)の約10%程度に難培養性細菌が共生する。私達は、レジオネラ(Legionella)の感染を阻止する難培養性細菌が共生するアメーバを見つけ、その共生基盤を明らかにするために本研究を行った。その結果、この共生細菌は、レジオレラの分泌装置(T4ASS)分子群を感知し、宿主アメーバの貪食機構への修飾作用が、この撃退現象に関与することを発見した。また共生細菌の責任分子候補としてセリンスレオニンキナーゼをコードするキメラ様遺伝子(peg2639)を同定した。自然環境に広く生息するアカントアメーバ(以下アメーバ)の約10%程度に難培養性の偏性細胞内寄生性細菌が存在する。何故一部のアメーバは細菌を共生させなければならないのか。その理由を解き明かすために難培養性細菌ネオクラミジア(Neochlamydia)が共生するアメーバ株を札幌の土壌から樹立した。この共生細菌はアメーバから一度とりだすと二度とアメーバに感染できない。その一方、抗菌剤で除菌したアメーバの発育スピードや運動能は促進され、この細菌を共生させる上でアメーバは大変な"コスト"を支払っていることになる。その代償はなにか。極めて興味深いことに、我々は、このネオクラミジア共生アメーバには、アメーバの天敵ともいえるレジオネラが感染できないことを見つけた。どのようにネオクラミジアの分子基盤を巧みに利用あるいは協調してこのアメーバはレジオネラを排除するのだろうか。そこでこのネオクラミジアのゲノム情報を踏まえ、レジオネラへの対抗手段を細胞・分子レベルにて以下の3つの研究課題を通して検証する。初年度はネオクラミジアのドラフトゲノム情報を踏まえDNAマイクロアレイを用いて行ったトランスクリプトーム解析と2D-DIGEを行った。その結果、レジオネラ感染時に顕著に発現上昇するいくつかの遺伝子を見つけた。その中には真核生物に広く保存されているセリン・スレオニンキナーゼが含まれていた。また2D-DIGEを用いたプロテオーム解析を行った結果、ネオクラミジア除菌アメーバではアクチンのタンパク発現が顕著に低下していることを見つけた。2年目はこれらの知見を踏まえ、キナーゼやアクチンと会合する分子を同定することで、これら分子のレジオネラ感染制御における役割を明らかにしたい。それに関連して私達は、自然環境に広く分布するアメーバの天敵ともいえるレジオネラ(Legionella)の感染から身を守るために難培養性細菌(Neochlamydia S13)が共生するアメーバを発見した(Ishida et al., PLoS ONE, 2014)。レジオネラは細胞壁から突き出た2種類の分泌装置(T4ASSとT4BSS)から様々なエフェクター分子を宿主アメーバへと打ち込むことでレジオネラの増殖環境の最適化を行っているので、これら分泌装置やそれらエフェクター分子はNeochlamydia S13が、レジオネラ撃退現象を惹起する上で、重要な誘引物質と考えられた。そこで2D-PAGEを用いたプロテオーム解析やNeochlamydiaのドラフトゲノム配列をもとに構築したDNAマイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を用いて、共生細菌を介したアメーバのレジオネラの撃退機構に関わる分子基盤を明らかにために本研究を実施した。その結果、Neochlamydia S13が、宿主アメーバのアクチンの再構築を修飾することで、このレジオネラ撃退現象が誘導されていることを見出した。その過程でNeochlamydia S13がレジオネラのT4ASS分子群を感知し、撃退現象が誘導されることも発見した。さらにその菌体側責任分子候補として、セリンスレオニンキナーゼをコードするキメラ様遺伝子(peg2639)が同定された。これらの研究成果は、このアメーバで見られるレジオネラ撃退現象を解明する上で極めて有用な成果であると考えられ、細胞内から病原体を排除する新たな概念を導き出す可能性を秘めている。レジオネラの撃退現象を安定的に確認できるようになるまで時間を要した。またアメーバ内での安定した遺伝子発現系はこれまで構築することができなかった。その一方、レジオネラ撃退現象の実験系が安定してからは、トランスクリプトーム解析と2D-DIGEを用いたプロテオーム解析を行い、レジオネラ撃退現象に関わると考えられる分子の同定に成功した。この候補分子は今年度の研究の軸となる極めて有用な結果だと考えている。よって評価区分を「おおむね順調に進展している」とした。細菌学トランスクリプトーム解析でレジオネラ発現時に上昇したネオクラミジア遺伝子はレジオネラ撃退現象に深く関わっている可能性がある。そこでまずアメーバ内での安定的な遺伝子発現系の構築を行った上で、トランスクリプトーム解析で同定された候補遺伝子をアメーバ内で発現させ会合分子の同定作業を行いたい。

またトランスクリプトーム解析でアクチンがネオクラミジア除菌アメーバで発現の減少が認められたことより、共生細菌が、宿主アメーバのアクチン重合や発現の制御に関与している可能性が考えられた。そこでアクチンをbaitとして会合するであろうネオクラミジア菌体分子の同定作業を進めたい。さらに1,000円未満の端数額。次年度の消耗品購入時に使用する。
アトピー性皮膚炎における皮膚バリア構成分子フィラグリン発現調節破綻の解析

本研究計画では、アトピー性皮膚炎における皮膚バリア機構の破綻がどのような機序によって制御・誘導されているのかを、自然発症モデルNC/Ngaマウスを用いて、フィラグリンの機能に着目して解析を実施した。・皮膚炎の発症以前から、経時的に皮膚サンプルを採取し、フィラグリンの発現を遺伝子レベルおよびタンパクレベルで検出した。通常マウスでは、出生直後から数週間皮膚フィラグリンの発現が認められるが、その後検出ができなくなる。しかしながら、NC/Ngaマウスの皮膚では、皮膚炎の出現に伴い再び皮膚フィラグリンの発現が認められるようになった。・NC/Ngaマウスから遺伝子を抽出し、Long-range PCR法によってフィラグリン遺伝子を増幅、シークエンス解析を実施して、遺伝子異常の有無を解析する系を整え、現在も解析を進めている。・NC/Ngaマウスから皮膚ケラチノサイトを分離・培養し、分化誘導因子(マトリックスメタロプロテアーゼ)の発現や分化マーカー(ケラチン10およびケラチン14)の発現を正常な対照マウスと比較したところ、NC/Ngaマウスの皮膚ケラチノサイトでは、分化マーカーの発現および分化を促進するMMP-9の産生が低下していることが明らかとなった。また、増殖刺激をかけたとき、NC/Ngaマウスの皮膚ケラチノサイトではプロフィラグリン産生が増加することが明らかとなった。・得られた研究成果は、国際学会や学術集会、および国際的学術論文に広く発表した。
アデノウイルスベクターを用いたアポトーシス抑制分子発現による移植腎拒絶回避の試み

(1)XIAPのcloning:腎癌細胞株ACHNよりtotal RNAを抽出し、2組のprimerを用いたRT-PCR法にて、XIAPのcloningを行った。それぞれ1601bpと1651bpのproductが得られ、XIAPのsequenceであることが確認された。(2)XIAP発現ベクターの作成:XIAP PCR product (1601bp)のPtargeT mammalian expression vector (Promega社)へのligationを行った。これを、E.coliにtransformし培養後、plasmidを回収した。Sequenceの結果、misincorporationのないXIAP発現ベクターが得られた。(3)XIAPの導入:electroporationにて、XIAP発現ベクターを尿細管由来293細胞株へ導入した。Immunoblottingにて、これらのXIAP transfectantantは、通常の293細胞やPtargeTのみを導入した293細胞に比較し、有意なXIAP蛋白の発現増加を認めた。(4)XIAP導入効果:われわれはXIAPantisense oligonucleotideを用いた膀胱癌細胞株に対するapoptosisの誘導とこの系におけるBcl-2の発現の減弱を報告した。今回XIAP発現ベクターを導入系で種々のapoptosis刺激による関連分子の推移、Feedback-loopの解析をおこない、apoptosis耐性を示唆する知見を得た。このことは移植腎急性拒絶反応における尿細管細胞のapoptosis耐性誘導による移植腎障害回避に本法が臨床応用可能であることを示唆する。XIAPのcloning:腎癌細胞株ACHNよりtotal RNAを抽出し、2組みのprimerを用いたRT-PCR法にて、XIAPのcloningを行った。それぞれ、予想されたsizeである1601bpと1651bpのproductが得られ、XIAPのsequenceであることが確認された。XIAP発現ベクターの作成:XIAP PCR product(1601 bp)のPtageT mammalian expression vector(Prokmega社)へのligationを行った。XIAPの導入:electrophorationにて、XIAP発現ベクターを尿細管由来293細胞株へ導入した。Immunoblottingにて、これらのPtargeT-XIAPtransfectantantは、通常の293細胞やPtargeTのみを導入した293細胞に比較し、有意なXIAP蛋白の発現の増加を認めた。今後の計画:現在、XIAP発現ベクターを導入した尿細管由来293細胞株へのapoptosis刺激による関連分子の推移、Feedback-loopを解析中である。このことは移植腎急性拒絶反応における尿細管細胞のapoptosis耐性誘導による移植腎障害回避に向けた治療法の開発につながるものである。
骨類似機能を発揮するパウダー/ソリッド三次元造形複合体の創製

生体用金属インプラントは、(1)低ヤング率、(2)歩行時・破損時の衝撃吸収性、(3)骨組織に類似の力学的振る舞いと周囲骨への正常な働きかけ、を兼ね備える必要があり、通常の溶融ソリッド部だけからなる造形インプラントでは、その実現が困難である。一方で、造形時に利用する原料粉末は造形後除去する必要があるため、表面から内部までの連結孔をもつ三次元多孔質構造体にしなければならないという強い制約があった。そこで、本研究提案課題では、粉末を除去するという常識・既成概念を払拭し、造形した三次元多孔質構造体の隙間空間に粉末を意図的に充填し、しかも粉末同士がネックを形成した状態である「(ネック形成)パウダー/ソリッド造形複合体」ともいうべき新材料を提案し、開発することにあった。最終的な開発製品としては、あたかも生体骨として振舞うことの出来る「低ヤング率」と「衝撃吸収性」を兼ね備えた、骨類似機能を持つ造形複合体の創製であった。研究課題は2009年4月1日に内定され、通知されたのち研究準備を開始し、パウダー/ソリッド三次元造形複合体の設計図面の作成を行った。しかしながら2009年5月11日付で科学研究費補助金・若手研究(S)の内定があり、重複制限により補助事業を廃止することとなった。その際、研究分担者が研究代表者になることで本研究を継続することは困難であるものと判断した。
酵母染色体複製起点結合タンパク質及び開始複合体についての生化学的研究

出芽酵母の染色体複製起点は11塩基対のコア配列とそれに隣り合うエンハンサー配列からなる。エンハンサー配列内にはコア類似配列が複数個現れる場合が多い。私は大腸菌において、特異的な配列を持つ一本鎖DNA上に複製複合体プライモソームが形成されることを見い出してきたので、酵母においても同様な複製複合体を単離する目的でコア配列を合む一本鎖DNA(T-rich鎖)に結合するタンパク質の単離を試みた。その結果、RNA結合モチーフとして提唱されているRNA recognition motif(RRM)を有するCTBP-1およびCTBP-5(すでに報告されているSSB1と同一であった)を単離した。CTBP-1(これと同じ遺伝子が最近RBP1として報告された)についてはその結合特異性および結合に必要なタンパク質ドメインについて詳細な解析を行った。その結果、CTBP-1はピリミジンを含むpolydeoxyribonucleotideに強く結合すること、結合にはRNP-1とRNP-2を含む1個のRRMのみで十分であること、CTBP-1に含まれる2個のRRMは単独では元のタンパク質の10分の1の親和性をもつにすぎないが、2個存在することにより強い親和性を示すことなどを明らかにした。CTBP-1は酵母の増殖に必須ではないことから染色体複製に必須な役割をはたしている可能性は否定された。染色体上に存在するpolypyrimidineあるいはCTの繰り返し配列はH-DNAあるいはtriple helix構造などの特徴的な高次構造をとることが知られており、CTBP-1はこれらの構造と相互作用する可能性を検討している。酵母の複製起点(ARS)に保存される11塩基対のコア配列に特異的に結合する酵母タンパク質を検索した結果、コア配列T-rich鎖一本鎖DNAに特異的に結合するタンパク質が核抽出液中に存在することを、gel shift assayおよびSouth-western法により確認した。それらをコードする遺伝子をクローニングするために酵母染色体DNAをGST融合ベクター、pGEX-3Xおよびその誘導体にクローニングし、GST融合タンパク質ライブラリーを作製した。このライブラリーをコア配列T-rich鎖を含むオリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングした結果、これまでにCBP-1およびCBP-2の2個のクローンを単離した。CBP-1タンパク質はgel shift assayにより野生型コア配列には結合するが、点変異をもつコア配列への結合は減少していることを確認した。酵母核抽出液をATPγSの存在下で、A50mゲル濾過で分画した結果、void volumeに近い高分子量画分に外から添加したARS配列を含む環状DNAを複製する活性と内在性基質タンパク質をリン酸化する能力が共溶出することを見いだした。さらにCDC7タンパク質に対する抗体を用いたimmunoblottingにより同じ高分子量画分にCDC7タンパク質が存在することが明らかとなった。以上の事実は複製能をもつ高分子量タンパク質複合体(複製開始複合体)が核抽出液中に存在し、その中にG1からS期への移行を抑制すると考えられているCDC7キナーゼも含まれていることを示唆し、大変興味深い。(1)S期の細胞を濃縮した酵母細胞から調製した核抽出液を用いてin vitroDNA複製を行った結果、二本鎖、一本鎖DNAいずれを鋳型に用いても複製能が検出された。一本鎖DNAは二本鎖の約10倍の活性を示した。(2)同じ核抽出液をATPγS存在下にゲル濾過で分画した結果、分子量約5000KDaの高分子量複合体にDNA複製能を見出した。さらに、内在性のタンパク質を基質としたリン酸化能とCDC7タンパク質がこの高分子量複合体と共溶出する。2 ARS配列に結合するタンパク質(1)酵母の複製複合体の構成因子を同定する目的で、ARSのT-richコア配列一本鎖DNAに結合するタンパク質のクローン化を試み、RNA結合モチーフとして提唱されているRNP配列を有するCTBP-