hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト内因性HSP90の無菌性炎症惹起誘発機構

感染症におけるLPSなど外因性リガンドによるマクロファージや樹状細胞等、自然免疫の活性化機構は相当部分明らかにされた。しかし、内因性リガンドによる炎症惹起や自然免疫活性化機構はまだ不明の部分が大部分である。本研究はマクロファージや樹状細胞上のextracellular HSP90受容体遺伝子を同定し、無菌性炎症の惹起機序や自然免疫から獲得免疫活性化へのあらたな分子機構を解明するものである。その結果、現在までにいくつもの候補遺伝子がとられた。現在、それらの炎症惹起における分子病理学的役割りを決定している。我々はこのようないわば無菌性炎症の惹起に関る内因性リガンドとして組織壊死や細胞死により遊離、放出されたextracellular HSP(熱ショック蛋白質)90が重要な機能を行うことを研究してきた。本研究はマクロファージや樹状細胞上のextracellularHSP90受容体遺伝子を同定し、無菌性炎症の惹起機序や自然免疫から獲得免疫活性化へのあらたな分子機構を解明をめざした。レセプター媒介性エンドサイトーシスの電子顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。すなわちレセプター媒介性エンドサイトーシスによるHSPの取り込みの経過につき、まずAlexa488ラベルしたHSP90を樹状細胞にパルスした後、その動態を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その研究の結果、HSP90は特にstatic early endosomeに局在、ターゲッティングされ、しかも比較的長時間局在することが明らかにされた。このことにより基質としてCpGを結合している場合はTLR7,9等と反応し、IFNαの産生を誘導し、またHSP90がその基質としてMHC class I拘束性ペプチドの場合はこれらendosomeでMHC class Iにペプチド分子をトランスファーしていることが判明した。これらの重要な知見はJ.Immunol.,及びInt.Immunolで"In This Issue"のなかでその号のトップ論文として紹介された。具体的には以下の内容で研究を行った。すなわちビオチン化ヒトHSP90の作製と樹状細胞上に発現するHSP90レセプターのcDNAクローニングであり(1)精製ヒトHSP90を用いてビオチン化Hsp90を作成し、(2)HSP90を結合し取り込むことが証明されている、GM-CSFによって誘導されたヒト末梢血単球由来の樹状細胞よりcDNAライブラリーを調整し、.これをCOS-7細胞に一過性発現させ、これらの細胞にビオチン化HSP90を添加し、セルソーターによりHSP90結合細胞をソーティングした。数回のソーティング操作後プラスミドDNAを回収し、cDNAを得て、遺伝子を同定する作業に入った。現在までにいくつもの候補遺伝子がとられているが、リセプターと思われる本態分子そのものの同定には至っていない。さらに回数を重ね同定、分離を試みているところである。
医療者の心を守る　―脳科学による研修医の疲労感の科学的検証―

研修医の疲労は医療過誤のリスクになり、残業が多いと自殺を考え、睡眠障害が持続するとうつ病になりやすい。初期臨床研修医の平日、宿直日、宿直翌日の日勤勤務(土日祝日は除く)に医療者の労働環境と精神衛生の関係ついて検討した。平日に比べて、宿直翌日の日勤勤務はストレス関連物質のコルチゾール増加を認めた。平日に比べて宿直翌日は疲労を多く感じ、前日の就寝時間は遅く、睡眠時間も少なかった。平日に比べて宿直翌日のコルチゾールが高いほど、怒り、緊張、疲労感を感じる事が多かった。宿直業務はストレス、気分感情、健康状態、睡眠に影響していた。本研究が、医師の仕事の労働環境の理解に寄与する事が期待される。研修医の疲労感および抑うつ感を脳科学的に検証することを目的に小児科に研修に来る研修医を対象に研究をすすめている。ストレスと相関がある唾液コルチゾール値、MHPG値の測定と質問紙の測定を1勤務中の平日、2当直日、3当直翌日(日曜、祝祭日は除く)と3日間行っている。唾液採取を起床時、起床後30分、起床後60分、9時、13時、17時でおこなっている。現在、研修医25名の検体採取、自己式質問紙の記載が終了している。自己式質問紙としては、「身体的障害」、「不安と不眠」、「社会的活動障害」、「重症うつ症状」を評価するGHQ28、職業性ストレス調査票である努力-報酬不均衡モデル、「外在的な努力」、「外在的な報酬」の尺度を測定するオーバーコミットメント、短縮版Profile of Mood statusの記載を行った。質問紙の中で、短縮版Profile of Mood statusは「活気」、「疲労」、「混乱」の4つの尺度から気分や感情の状態を評価している。その中で短縮版Profile of Mood statusの解析結果では、「疲労」にてT得点の平均にて有意な差を認めた。勤務中の平日(T得点平均46.04)と当直日(T得点平均47.61)では有意差はなく、勤務中の平日(T得点平均46.04)と当直翌日(T得点平均49.86)では有意差(p<0.05)がみられた。当直翌日勤務は「疲労」を高めており、質問紙からは負担が大きいことがわかった。現在、唾液コルチゾール値、MHPG値や他の質問紙は、測定や解析中である。(目的)研修医の疲労感および抑うつ感を脳科学的方法によって科学的に検証し、医療者の健全なメンタルヘルス促進を樹立する事を目的とした。(方法)小児科の初期臨床研修医36人を対象とした。年齢は平均27歳5か月(男20人、女16人)。唾液コルチゾールは起床時、起床後30分、起床後60分、9時、13時、17時までの6ポイントを採取した。このサンプルは平日の宿直しない日、宿直する日、宿直翌日の日勤勤務日に採取をした。また同時に、気分感情尺度(短縮POMS)、睡眠、精神健康調査の健康(GHQ28)、健康関連QOL(SF-36)、職業性ストレス調査票(努力ー報酬不均衡モデル調査票)に関する質問紙を用いた。(結果)宿直しない日、宿直する日に比べて、宿直翌日の日勤勤務日はストレス関連物質の日中コルチゾール増加が見られた。宿直翌日の日勤勤務日は早朝のコルチゾールが高いほど、緊張ー不安、怒りー敵意、疲労の気分や感情が高かった。また、宿直する日勤勤務日は早朝コルチゾールが高いほど、仕事や普段の活動をした時に身体的や心理的な問題があった。宿直しない日と宿直する日に比べて宿直翌日の前日就寝時間は遅かった。それに、宿直しない日、宿直する日に比べて宿直翌日は睡眠時間が短かった。(考察)宿直業務はストレスや気分、感情、健康状態、睡眠に大きな影響を与えていた。医療者の健全なメンタルヘルス促進を樹立するために本研究が、研修医また医師の仕事の労働環境の理解に寄与する事が期待される。医師は、患者の生死に携わる仕事であり、長時間の労働時間や心身のストレスを伴うのを避けれない。研修医の疲労は医療過誤のリスクを高め、医師の脱落は過重業務の移譲を起こし、悪循環的に医療の質は衰退していく。医師は患者を守ると同時に、自分自身の命を守るプログラムを作る必要がある。本研究の目的は、研修医の疲労感および抑うつ感を科学的、生物的数量で反映する事である。ストレス関連マーカーによる研修医の疲労、うつ状態の生物学的解析において唾液中のコルチゾールなどのストレスマーカーを包括的測定する事で、ストレスの客観評価をおこなう。

中でも、起床時のコルチゾー反応(awaking cortisol response)は視床下部-下垂体-副腎系の活動を表す指標である。起床時コルチゾール反応は慢性ストレスの人や労働時間の長い人、職場での仕事量が多い人は高い値を示す報告がある。平日の日勤、当直日と当直翌日の3回、唾液採取と自己記入式調査票の検査を行なっている。調査票は、仕事上のモチベーションと精神的健康度、気分状態の評価のため(オーバーコミットメント、General Health Questionnaire(GHQ28)、Profile of Mood Status)を用いている。現在、15名の臨床研修医と、卒後5-10年の中堅医師5名程度の検査が終了している。研究の対象者の25名の採取が終了している。研修医の勤務が忙しいため、現在対象数が目標症例に5名足りていないが研究期間中には目標を達成できる予定である。また、現在唾液コルチゾール、MHPG値の測定中や他の質問紙との解析もすすんでおり、おおむね順調に研究は進展している。医師を対象に平日の日勤、当直日と当直翌日の3回の検査を行なっている。医師は当直翌日も平常勤務を行なっている。そのため、臨床現場での急な対応が必要な時には検体採取ができない時があったり、仕事が忙しく検体採取を忘れていたりする事があるため予定検査人数よりやや遅れが見られている。今後は、研修医25名のストレスと相関がある唾液コルチゾール値、MHPG値の検体測定と質問紙GHQ28、努力-報酬不均衡モデル、オーバーコミットメントの解析をすすめて行く。また、さらに目標症例の残り5名の研修医の唾液検体と質問紙の採取を行っていく予定である。研修医の平日勤務、当直日勤務に比べ、当直翌日の勤務の負担が大きい事や各々の勤務日での精神状態を質問紙を用いて脳科学的に検討していく方針である。今後はストレスの客観評価をおこなうため、コルチゾール検体測定や仕事上のモチベーションと精神的健康度、気分状態の評価のため(オーバーコミットメント、General Health Questionnaire(GHQ28)、Profile of Mood Status)を用いての質問紙との関連の分析を行なっていく方針である。研修医の疲労感および抑うつ感を脳科学的に検証するため、唾液コルチゾール、MHPG値の測定するための機器や消耗品や解析に必要な物品を購入予定である。また、研究成果を発表するために学会発表や論文投稿に必要な諸費用に研究費を使用する予定である。次年度はストレスの客観評価をおこなうため、コルチゾール検体測定検査や仕事上のモチベーションと精神的健康度、気分状態の評価のため(オーバーコミットメント、General Health Questionnaire(GHQ28)、Profile of Mood Status)を用いての質問紙との関連解析の結果を学会で発表し、論文作成予定である。検査費、解析費、人件費、文献、書籍費、学会発表のための旅費用等に研究費を使用予定である。
社会教育における政治教育の歴史的研究

近年、福祉国家再編にともなう1990年代以降のシティズンシップ教育の展開や、2015年の18歳選挙権成立にともなう主権者教育の展開など、日本において教育の再政治化の進行という状況がみられる。本研究の目的は、成人を対象とした「社会教育における政治教育」を理論的、実践的に深めていく手がかりを、選挙権の大幅な拡大をもたらした1920年代の普通選挙成立期(納税条件を撤廃し、25歳以上の成人男子全員に選挙権付与)に求め、社会教育における政治教育の事業や実践を歴史的に捉え返すことである。具体的には、普通選挙の気運の高まりとともに各地で有識者たち(田澤義鋪、武藤山治、岩野森之助)によって展開された社会教育における政治教育運動の実像に迫るとともに、それらが文部省や内務省による施策と連動しながら、1930年代の選挙粛正運動へいかにして接続していったのかという点に着目する。2018年度に行った研究は次の二点からまとめられる。第一が、本研究が対象とする三人の有識者のうち、これまで人文社会諸科学において全く研究対象となってこなかった岩野森之助に関する資料収集を進めたことである。三重県伊賀地方において、医師でありながら地域の教育運動や政治の倫理化運動にも生涯を賭けた岩野に関する手がかりを得るために、当時の新聞記事(三重県版)を中心に資料収集を進めた。第二が、すでに資料収集をほぼ終えている田澤義鋪(元内務官僚、青年団指導者)に関して、その政治教育運動の特徴を、青年団運動との関係から明らかにしたことである。田澤は、青年を対象とする青年団教育は公民教育として展開し、青年団を終えた壮年を対象とする選挙啓発は政治教育として展開し、田澤の中で、両者は立憲政治の担い手を育成するという点で結びついていた。2018年度は、岩野森之助に関する資料収集をある程度進めることができた。また、田澤義鋪に関しては、2017年度に引き続き、資料分析も行い、その成果を雑誌記事および論文として発表した。さらに、実業家でありながら議会活動や政治教育運動を展開した武藤山治に関しても、収集した資料および文献の分析に着手し始めた。したがって、研究目的の達成にむけて、おおむね順調に進展しているといえる。本研究課題を、今後推進していく上では、以下の三つのプロセスが重要となる。第一に、まだ資料収集を終えていない岩野森之助に関して、2019年度前半を目安に資料収集を終えて、後半では分析を行っていくことである。第二に、資料収集をほぼ終えている武藤山治に関しては、その分析を進め武藤が展開した政治教育運動の特徴を明らかにすることである。そして、第三に、民間の政治教育運動(田澤、武藤、岩野)が、政府による施策や事業と若干のズレを持ちつつも、最終的に選挙粛正運動という形にいかに結びついていったのかを考察することである。近年、福祉国家再編に伴う1990年代以降のシティズンシップ教育の展開や、2015年の18歳選挙権成立に伴う主権者教育の展開など教育の再政治化が進行している。本研究の目的は、大人を対象とした「社会教育における政治教育」を理論的、実践的に深めていく手がかりを、選挙権の大幅な拡大をもたらした1920年代の普通選挙成立期に求め、社会教育における政治教育の事業や実践を歴史的に捉え返すことである。具体的には、普通選挙の気運の高まりとともに各地で有識者たち(田澤義鋪、武藤山治、岩野森之助)によって展開された社会教育における政治教育運動の実像に迫るとともに、それらが文部省や内務省による施策と連動しながら、1930年代の選挙粛正運動へとどのように接続していったのかという点に着目する。平成29年度に行った研究は次の二点からまとめられる。第一が、社会教育行政や選挙粛正と関わる行政関連の資料と、民間から政治教育運動を展開した三人の有識者(田澤、武藤、岩野)に関する資料の収集を進めたことである。特に、これまで本格的な分析がなされてこなかった武藤と岩野に関する資料収集に重点をおいた。第二が、すでにある程度資料収集が進んでいる田澤に関して、その政治教育運動の特徴についての分析を行ったことである。特に田澤が政治教育運動の一環として刊行した雑誌『新政』の創刊(1924年1月)から終刊(1927年12月)までの流れを丹念に分析した。青年団員よりも上の年齢層に対する相互的な政治教育(雑誌上での編集者と読者、及び読者同士の交流)を重視していた田澤は、雑誌等を通じた政治教育の普及徹底という段階から、実際の政治に影響を及ぼすべき政治革新運動という段階へと引き上げていくことを決意し、それが、選挙粛正同盟会の結成(1927年8月)、雑誌の終刊(1927年12月)へとつながっていったと捉えられる。平成29年度は、1920年代から30年代の社会教育施策や選挙粛正施策に関する行政資料、及び、民間から政治教育運動を展開した武藤山治、岩野森之助に関する資料の収集を、ある程度進めることができた。また、田澤義鋪に関しては、本格的な資料分析にも着手して、その途中経過を学会で発表した。

本研究の目的は、成人を対象とした「社会教育における政治教育」を理論的、実践的に深めていく手がかりを、選挙権の大幅な拡大をもたらした1920年代の普通選挙成立期(納税条件を撤廃し、25歳以上の成人男子全員に選挙権付与)に求め、社会教育における政治教育の事業や実践を歴史的に捉え返すことである。具体的には、普通選挙の気運の高まりとともに各地で有識者たち(田澤義鋪、武藤山治、岩野森之助)によって展開された社会教育における政治教育運動の実像に迫るとともに、それらが文部省や内務省による施策と連動しながら、1930年代の選挙粛正運動へいかにして接続していったのかという点に着目する。2018年度に行った研究は次の二点からまとめられる。第一が、本研究が対象とする三人の有識者のうち、これまで人文社会諸科学において全く研究対象となってこなかった岩野森之助に関する資料収集を進めたことである。三重県伊賀地方において、医師でありながら地域の教育運動や政治の倫理化運動にも生涯を賭けた岩野に関する手がかりを得るために、当時の新聞記事(三重県版)を中心に資料収集を進めた。第二が、すでに資料収集をほぼ終えている田澤義鋪(元内務官僚、青年団指導者)に関して、その政治教育運動の特徴を、青年団運動との関係から明らかにしたことである。田澤は、青年を対象とする青年団教育は公民教育として展開し、青年団を終えた壮年を対象とする選挙啓発は政治教育として展開し、田澤の中で、両者は立憲政治の担い手を育成するという点で結びついていた。2018年度は、岩野森之助に関する資料収集をある程度進めることができた。また、田澤義鋪に関しては、2017年度に引き続き、資料分析も行い、その成果を雑誌記事および論文として発表した。さらに、実業家でありながら議会活動や政治教育運動を展開した武藤山治に関しても、収集した資料および文献の分析に着手し始めた。したがって、研究目的の達成にむけて、おおむね順調に進展しているといえる。本研究課題を、今後推進していく上では、次の三つのプロセスが重要となる。第一が、田澤義鋪についてさらに掘り下げて検討していくことである。雑誌『新政』のさらなる分析を通じて、田澤の政治教育運動の特徴についての考察を深めていくことが求められる。第二が、武藤山治と岩野森之助の政治教育運動の特徴を資料分析を通じて明らかにするとともに、1920年代から30年代の社会教育施策と選挙粛正施策の分析を通じて、両施策の相関関係、及び政府による政治教育事業の特徴を明らかにすることである。そして、第三が、民間の政治教育運動が、政府による施策や事業と若干のズレを持ちつつも、最終的に選挙粛正運動という形でいかに結びついていったのか、そしてその過程において、戦後教育基本法の政治教育条項の理念とつながる視点がいかにして生成されていったのかを明らかにすることである。本研究課題を、今後推進していく上では、以下の三つのプロセスが重要となる。第一に、まだ資料収集を終えていない岩野森之助に関して、2019年度前半を目安に資料収集を終えて、後半では分析を行っていくことである。第二に、資料収集をほぼ終えている武藤山治に関しては、その分析を進め武藤が展開した政治教育運動の特徴を明らかにすることである。そして、第三に、民間の政治教育運動(田澤、武藤、岩野)が、政府による施策や事業と若干のズレを持ちつつも、最終的に選挙粛正運動という形にいかに結びついていったのかを考察することである。
全能性細胞で特異的に発現する遺伝子群の機能解析

(本研究の目的)ES細胞は高い増殖能と分化全能性を有しており、再生医学への応用も期待されているが、その特性がいかに維持されているかはほとんどわかっていない。本研究ではES細胞で特異的に発現する遺伝子群の網羅的同定および機能解析により、ES細胞が自己複製するメカニズムの解明を目指している。ES細胞と他の臓器細胞由来のESTライブラリーを比較した結果、ES細胞特異的発現が示唆される遺伝子を40以上同定した。ノーザンブロット解析の結果、ホメオボックス転写因子やRas類似蛋白質など9遺伝子についてES細胞特異的発現が確認された。本研究においては、ES細胞特異的発現遺伝子の同定を引き続き進めるとともに、それらの機能を遺伝子ノックアウトにより解析する。またES細胞特異的な遺伝子発現様式がもたらされるメカニズムを解明する。(今年度の成果)遺伝子ノックアウトによる機能解析平成13年度は2遺伝子についてはホモ変異マウス作成を終了し、現在解析を進めている。1遺伝子についてはヘテロ変異マウスを作成し、現在交配中である。1遺伝子は相同組換えES細胞を樹立し、ブラストシストへの微小注入を行っている。他の2遺伝子についてはターゲティングベクターを作成し、現在ES細胞へ導入中である。ES細胞特異的な発現調節領域の解析1遺伝子について、ES細胞特異的に発現するために必要なシスエレメントを、レポーター遺伝子を用いた解析により同定した。その結果、転写開始点から約500塩基上流にオクタマー-配列およびSox認識配列が存在しており、転写因子Oct3とSox2が協調して、ES細胞特異的な発現をもたらしていることが明らかとなった。新規遺伝子の同定今年度はES細胞特異的な発現を示す2遺伝子を新たに同定した。今後これらについても機能解析を進めていく予定である。
多分子型の「細胞接着関連ペプチドと高分子とのハイブリッド体」の合成研究

1.多分子型のペプチドハイブリッド体のアポトーシス活性:前年度合成した多分子型のPEGハイブリッド体についてアポトーシス活性を測定した。強い細胞死を誘導する活性が、観察されたものの、アポトーシスの誘導によっておこるDNAフラグメンテーションなどの細胞の形態変化が観察されなかった。引き起こされた細胞死は、表層でのインテグリンを介うる接着を阻害したことによるものかどうか現在検討中である。2.細胞接着関連ペプチド(RGD)とPEGとのハイブリッド体を付与したアデノウイルスベクターの作成とその遺伝子導入効率:すでに、ポリエチレングリコールを付与したアデノウイルスベクターが、遺伝子導入のできることが報告されている。ペプチドが2分子ついた2分子型PEGハイブリッド体[(YGGRGDTPβA)2-PEG-βACをデザインした。このハイブリッド体は、Fmoc法に従って固相合成した。PEGは、アミノ酸型のFmoc-PEG-OHを用い、固相上で導入した。また、ベクターの表層タンパク質のリジン側鎖のアミノ基など求核性の官能基を介し、アミド結合などでハイブリッド体を付与できるよう、ハイブリッド体のPEGの末端Cysに活性エステルを導入した。このようにして調整したハイブリッド体活性エステルを用いてベクター表層にハイブリッドを付与した。作成したベクターは、PEGのみを付与したベクターよりも高い遺伝子導入効率を示した。1.二分子のペプチドを有するPEGハイブリッド体のデザインとその合成ペプチドの合成は固相法が発達しており、長鎖ペプチドでも近年では合成できるようになった。二機能型ペプチド-PEG(ポリエチレングリコール)ハイブリッド体を固相合成するために、固相上でPEGを導入する手法の開発を検討した。PEGの両端の一方をCOOH基、もう一方をアミノ基へと変換したアミノ酸タイプのPEG(Fmoc-aaPEG-OH)の簡便な合成を検討し報告した。Fmoc-aaPEG-OHを利用し、他のアミノ酸と同じように固相上の合成に供した。C端、N端に細胞接着配列関連のペプチドを導入したbivalentなハイブリッド体(PHSRN-PEG-RGD)の合成に成功した。このハイブリッド体について、マウスメラノーマ細胞における癌転移抑制活性を検討し報告した。2.アポトーシス活性をもつハイブリッド体の合成RGD配列のもつcaspasc 3に対するダイレクトな活性化作用に注目し、細胞内でアポトーシスを誘導するようなPEGとのRGD-PEGハイブリッド体の合成検討を行った。まず、PEGの分子量サイズを2000から3000のものを選択し、RGD配列のみのPEG-RGD、RGD-PEG、またさらに活性の高い配列GRGDNP-PEG、PEG-GRGDNPのハイブリッド体を合成した。現在、そのコントーロールペプチドRGDおよびGRGDNPとともにそのアポトーシス活性を測定中である。1.アポトーシス活性をもつモノマー型ハイブリッド体の合成RGD配列はアポトーシス実行過程で重要な役割を果たすcaspase 3に対する直接の活性化作用を有している。そこで、アポトーシス活性を有するRGDとPEGとのハイブリッド体としてRGD配列のみのPEG-ROD、ROD-PEG、さらに活性の高い配列GRGDNPをもつGRGDNP-PEG、PEG-GRGDNPをデザイン、合成した。これらのハイブリッド体は、正常細胞(胸腺細胞)においてアポトーシス活性を示さなかった。現在、腫瘍細胞(K562)でのアポトーシス活性を測定中である。2.アポトーシス活性をもつ多分子型のハイブリッド体の合成また、アポトーシス活性を有するRGDを多数もつ多分子型のハイブリッド体の合成も行った。2分子型として(RGD)_2-PEGと(GRGDNP)_2-PEG、4分子型として(RGD)_4-PEGと(GRGDNPβA)_4-PEGをデザインし合成を行った。テトラマー(GRGDNPβA)_4-PEGのβAはスペーサーとして導入した。PEGの分子量サイズは3000から4000のものを選択した。合成はこれまでに確立したハイブリッド体の固相合成法を用いて行い、いずれも収率よく得ることができた。アミノ酸分析、ToF-MSを用いて確認同定した。これらのハイブリッド体についても、現在、腫瘍細胞(K562)でのアポトーシス活性を測定中である。
就労者の日常の出来事とストレス回復力に応じた糖尿病予防教育プログラムの開発

就労者の糖尿病予防教育の内容を、ストレスと飲食の関係を含めて検討した。主な方法はインタビュー調査と量的調査研究である。保健行動阻害要因には「食欲・飲酒量を調整する難しさ」があった。ストレスによる過食者は約25%存在した。横断的検討では、保健行動には、日常いらだち事、ストレス緩衝となる出来事(Daily Uplifts)、ストレスからの回復力、ストレス対処スタイルが関係していた。縦断的検討でも、過去の日常いらだち事やストレス時の飲食行動が、現在の保健行動と関連した。糖尿病予防教育には、日常いらだち事を軽減し、ストレス代償行為としての飲食を避けるためのストレスマネジメントの必要性が示唆された。就労者の日常の出来事とストレス回復力に応じた糖尿病予防教育プログラムを検討するために、平成25年度は、保健行動に影響を与える各要因間の関係性を検討するための量的調査研究推進に向けた準備を実施した。具体的には、まず国内外の53文献を用いてDaily Hassles(日常いらだち事)の緩衝要因である「Daily Uplifts(日常経験するポジティブな出来事)」とは何かについて概念分析の手法を用いて明らかにした。さらに40歳以上男性就労者へのインタビュー調査を行い、保健行動の阻害要因・促進要因、および男性就労者が認識するDaily Upliftsの検討を実施し、量的調査研究に含めるべき要因や項目を検討した。また量的調査研究の実現に向けた具体的調整として、調査協力企業の検討と依頼、調査研究方法の検討を実施した。その結果、Daily Upliftsについては、概念分析によってその定義が明確化され、さらにインタビュー調査によってDaily Upliftsを把握するための具体的な項目を抽出することができた。加えてインタビュー調査からは保健行動の阻害要因・促進要因とその関係性が明らかとなり、調査研究における具体的な項目や分析の方向性に関する示唆を得た。また量的調査研究の実現に向けた調整では、2事業所約350名から質問紙調査の調査協力許諾を得ることができた。さらに特定の地域や企業への偏りを避けた状態での回答を得るため、インターネット調査を併用し分析に活用することとし、調査に向けた具体的準備を進めることができた。就労者の日常の出来事とストレス回復力に応じた糖尿病予防教育プログラムを検討するために、平成27年度は、保健行動に影響を与える各要因間の関係性を検討するため、インターネット調査および質問紙調査の2つの量的調査研究を実施した。インターネット調査では、様々な背景をもつ40歳以上の就労者を対象に、日常の出来事(Daily Hassles, Daily Uplifts)やストレス回復力(Resilience)、保健行動の実践状況、運動・身体活動と食生活に関する行動変容ステージ、ストレス時の飲食行動(過食・食欲不振・深酒)、コーピング、定期健康診断の受診状況と結果についての調査を実施した。その結果、Daily Hassles・Daily Uplifts・Resilience、およびストレス時の飲食行動と保健行動の実践に有意な関係が認められた。加えて、ResilienceへDaily Upliftsが一定の影響を与えることが示唆された。さらに保健行動継続支援に役立てるためにDaily Upliftsを定量的に把握できるよう、Daily Upliftsに関する尺度開発に向けた因子分析を行い、一定の結果を得た。質問紙調査では、中小企業と大企業の計2企業を対象に2年分の定期健康診断結果をマッチングさせた後ろ向きコホート調査を実施し、健診結果と本研究を構成する主要な関連概念との関係性を検討しようとした。結果は現在まだ分析を継続中であるが、単年度の健診結果とストレス時の飲食行動では、例えばストレス時の過食に「よく当てはまる」群は「全く当てはまらない」群より平均体重が有意に大きい等が認められており、保健行動の支援においてはストレスマネジメントに向けた支援も重要であると考えられた。平成27年度は26年度の調査対象者へフォローアップ調査を行い、得られた結果をもとに縦断的な検討を行った。また、平成26・27年度に行った調査のより詳細な分析を進め、保健行動と関連要因の関係を検討し、学会等で成果の公表を行った。インターネット調査による縦断的検討の結果、現在の飲食量調整には、過去の日常いらだち事の量やストレス時の飲食行動が関係していた。例えば、「腹八分目を心がけている」の実践には、食生活の改善に関する行動変容ステージが高い、気分転換によるコーピング行動の実践、日常いらだち事の量が少ない事などが影響していた。また、過去の健診結果で肥満の改善を指摘されたとの自覚者は食生活に関する行動変容ステージが高い者の割合が多かったが、過去のBMI値による肥満/非肥満の二区分と食生活に関する行動変容ステージには関連を認めなかった。これらのことから保健行動の実践につながる保健指導のためには、日常いらだち事やコーピングスタイルを含めて把握する必要があり、さらに単に健診結果を返却するのではなく結果が持つ意味を当事者が自覚できるようにフィードバックする必要性が伺えた。インターネット調査の横断的検討からは、間食しない・運動実施・適正体重維持・適正睡眠・腹八分目の実践という保健行動の未実践者で日常いらだち事得点が高いこと、実践保健行動の総数にレジリエンスやDaily Upliftsが関係していること、朝食摂取・間食しない・野菜摂取を心がけているとの食事関連の保健行動実践者には配偶者のいる者の割合が多いことが明らかとなった。保健行動の実践を支援するためには、日常いらだち事の把握だけでなくレジリエンスやDaily Upliftsの把握、さらには食を支援する配偶者からのソーシャルサポートの有無を考慮した保健指導が必要であることが伺えた。

平成26年度および27年度に実施した調査研究の分析結果全体を統合したまとめや考察を十分に実施できておらず、糖尿病予防教育プログラム(暫定案)の作成にについても未着手であるため、やや遅れているとした。平成28年度はこれまでに実施した調査の結果から得た考察を整理、統合した。また糖尿病予防教育プログラムの検討上、追加で分析が必要になると考えられた観点、特に健診結果の指摘の有無と翌年の保健行動、食生活関連保健行動の未実践者の行動変化に関係する要因などを検討した。健診結果の指摘の有無と翌年の保健行動の関連については、インターネット調査において、脂質代謝、糖代謝、血圧の指摘事項あり者は保健行動のうち「適正体重維持」においてのみ、指摘事項なし者より実施者割合が少なかった。また肥満の指摘事項あり者は「適正体重維持」「腹八分目」において、指摘事項なし者より実施者割合が少なかった(χ2検定、p<0.05)。加えて、食生活関連保健行動未実践者を翌年の保健行動実践有無にて区分し、属性、日常いらだち事尺度、レジリエンス尺度、コーピング特性簡易尺度得点平均値を比較した結果、翌年「腹八分目」について、「年齢」は未実践群より実践群が高く、「月間残業時間」「日常いらだち事尺度得点」は実践群より未実践群が高い結果を示した(t検定、p<0.05)。後ろ向きコホート調査では、保健行動実践有無と肥満有無で区分した4群における、2年分の定期健診結果変動値の平均における差異を検討した。結果、保健行動「間食しない」における「体重」「GOT」「GPT」のみ有意であった(一元配置分散分析、p<0.05)。これらのことから、日常の出来事とストレス回復力に応じた糖尿病予防教育を検討する上では、保健行動「適正体重の維持」に焦点をあて、特に「腹八分目」の実践を促進できるよう「残業時間」調整や「日常いらだち事」が軽減できるようストレスマネジメントの啓発が重要であると考えられた。また、肥満者が「間食をしない」よう支援することが「適正体重の維持」に繋がる可能性が示唆された。就労者の糖尿病予防教育の内容を、ストレスと飲食の関係を含めて検討した。主な方法はインタビュー調査と量的調査研究である。保健行動阻害要因には「食欲・飲酒量を調整する難しさ」があった。ストレスによる過食者は約25%存在した。横断的検討では、保健行動には、日常いらだち事、ストレス緩衝となる出来事(Daily Uplifts)、ストレスからの回復力、ストレス対処スタイルが関係していた。縦断的検討でも、過去の日常いらだち事やストレス時の飲食行動が、現在の保健行動と関連した。糖尿病予防教育には、日常いらだち事を軽減し、ストレス代償行為としての飲食を避けるためのストレスマネジメントの必要性が示唆された。労働者の日常の出来事とストレス回復力等の要因間の関係性を把握するためのインターネット調査、および労働者の定期健康診断結果の変化と要因の関係性を把握するための後ろ向きコホート調査の2種類の量的調査をすでに終えている。
羊膜と羊膜幹細胞を用いた消化・吸収能且つ蠕動能を持つ全周性腸管の再生

消化・吸収能を持ち且つ蠕動能を持つ全周性腸管の再生を最も困難にしている腸管上皮組織の再生の問題を克服するため、我々は優れた組織・細胞再生誘導能力や多分化能を持つ羊膜や羊膜幹細胞を用いることにより検討を行った。培養実験において、羊膜上培養や羊膜幹細胞等との共培養により、腸上皮細胞の増殖分化が誘導促進された。しかしながら、動物モデル(ラット)を用いた腸管の再生実験において、平滑筋組織様組織の再生は認められたが、腸上皮組織の再生は認められなかった。意義と目的:我々は、これまで食物の消化・吸収と消化内容物の運搬機能を持つ全周性腸管の再生を困難にしてきた1)再生腸管の瘢痕化2)腸管平滑筋再生不良の問題を克服し、蠕動能を有し瘢痕狭窄が無い全周性食道の再生に成功した。本研究はこれを発展させ前述の腸管再生を困難にしている最大の問題である3)腸管上皮の再生に対し、優れた組織・細胞再生誘導能や多分化能を持つ羊膜及び羊膜幹細胞を用いて、消化・吸収能と蠕動能を持つ全周性腸管の再生を動物モデル(ラット)において行うことである。実験方法:I.in vitroにて羊膜上でi)腸上皮細胞一(腸上皮下)筋線維芽細胞ii)羊膜上皮幹細胞-筋線維芽細胞iD腸上皮細胞-羊膜間葉系幹細胞を供培養しその状態を観察する。II.前述の供培養に平滑筋細胞を加えたロール状の複合細胞シートを実験動物の腹腔内にて大網にて熟成後小腸と吻合し、腸管再生の状態と栄養状態を観察する。結果:22年度は、I.についてその準備と実験を行った。まず筋線維芽細胞の単離・培養を酵素法と組織片培養法にて行い、その手技・方法を確立し、後者においてより長期の継代培養が可能なことを確認した。腸上皮細胞はその単培養が困難であるため、単離法の手技を確立した。羊膜上の共培養については、羊膜の提供元である再生医療支援機構が、JSTTの承認認定を得る必要から羊膜の入手が遅れたため(23年4月から再開)、腸上皮と筋線維芽細胞の共培養を行った所、腸上皮細胞の長期培養と多層構造や立方体様形態をとる事を観察した.羊膜細胞については、2系統の近交系の妊娠ラットから羊膜細胞の分離・培養を行ったが、羊膜上皮細胞は数代(3-5代)で増殖が止まり継代培養が困難であったが、間葉系細胞は安定した継代培養を行い得た為、筋線維芽細胞との共培養を施行した(現在継続中)。それぞれの羊膜幹細胞については、現在共同実験施設での分離を依頼中である。意義と目的:我々は、食物の消化・吸収と蠕動機能を持つ全周性腸管の再生を困難にしてきた原因のうち1)再生腸管の癩痕化、2)腸管平滑筋再生不良、の問題を克服し、全周性食道の再生に成功した。本研究はこれを発展し、前述の腸管再生を困難にしている最大の問題である3)腸管上皮の再生に対し、組織・細胞再生能や多分化能を持つ羊膜や羊膜幹細胞を用いて、消化・吸収と蠕動能を持つ全周性腸管の再生を培養上および動物モデル(ラット)において行うことである。方法:I.in vitroにて羊膜上で、i)腸上皮細胞-(腸上皮下)筋線維芽細胞、ii)腸上皮細胞-羊膜間葉系幹細胞幹細胞、ii)羊膜上皮幹細胞-筋線維芽細胞、を供培養しその状態を観察する。II.前述の供培養に平滑筋細胞を加えた筒状の細胞シートをラットの腹腔内にて熟成後、小腸と吻合し作製した腸管の再生の状態を観察する。結果:前年度より羊膜の入手が遅れていたこと、羊膜幹細胞の入手が困難になったこと、また羊膜上皮細胞は長期培養が困難であったことより、(1)腸上皮細胞-暢上皮下)筋線維芽細胞(上記IiDおよび(2)腸上皮細胞-羊膜間葉系細胞の共培養の観察を中心に行うこととした。しかしながら、腸上皮の維持・培養は通常では非常に困難であることから、コラーゲンゲルによる3次元培養法を用いても共培養を行うこととし、また腸上皮細胞の単離の際には、筋線維芽細胞やその他の細胞の混入が避けられないため、培養腸上皮(IEC-6)細胞を用いても共培養を行った。結果、筋線維芽細胞との長期培養にて培養腸上皮細胞が多層構造や立方体様形態をとる事を観察した。

また羊膜間葉系細胞を単離培養し、前述の培養腸上皮細胞と共培養を行ったところ、やはり多層構造等の変化を確認した。その後、羊膜を入手可能となり、腸上皮と筋線維芽細胞との共培養や腸上皮を含む組織片(organoid)培養を現在も継続して行っている。意義と目的:我々は食物の消化・吸収と蠕動機能を持つ全周性腸管の再生を困難にしている1)再生腸管の瘢痕化2)腸管平滑筋再生不良の問題を克服し、消化・吸収を行う腸管ではないが蠕動能を持ち瘢痕狭窄が無い全周性食道の再生に成功した。本研究はこれを発展し、前述の腸管の再生を困難にしている最大の問題の3)腸管上皮の再生に取り組むため、優れた組織・細胞再生能や多分化能を持つ羊膜や羊膜幹細胞を用いて、その培養上の観察や動物モデルにて前述の腸管の再生実験を行う。方法:I.in vitro実験羊膜上やコラーゲンゲル上で1腸上皮細胞単独、或いは1と2腸上皮下筋線維芽細胞や3羊膜幹細胞を供培養しその状態を観察する。対象として株化された培養腸上皮(IEC-6)細胞を用いて同様の実験観察を行う。II.in vivo実験前述の腸上皮細胞の羊膜上培養や供培養に、平滑筋細胞を加えた筒状の細胞シートを、ラット腹腔内で大網に包埋することで作製した腸管の組織再生の状態を観察する。結果:前年に引き続き実験を行い以下の結果を得た。I.1)単離腸上皮細胞は、羊膜上にて1週程度培養可能であり、一部に細胞の立方化や重層化を認めた。2)単離腸上皮細胞は、コラーゲンゲル上では培養出来なかったが、前述の細胞との供培養により、1週程度培養可能であった。3)株化腸上皮細胞は、羊膜上やコラーゲンゲルでの共培養により、3週間以上維持培養が可能で、細胞の立方化や重層化を認めた。羊膜の含有成分や腸上皮下筋線維芽細胞や羊膜幹細胞の分泌する液性成分が、腸上皮細胞の増殖や分化を誘導促進すると考えられた。II.前述の腸上皮細胞の羊膜上の単培養や供培養に、平滑筋細胞を加えラットの大網に包埋し、5週間後にその再生腸管の観察を行った。一部に平滑筋様組織の再生を認めたが、腸上皮組織の再生は認められなかった。さらに技術的な改良が必要と考えられた。前年度より1)羊膜の入手が遅れていた(羊膜の提供元である再生医療支援機構がJSTTの承認認定を得るため)2)羊膜幹細胞の入手が困難となった(供給元を予定していた生物資源応用研究所の共同研究者の退任のため3)羊膜上皮細胞の継代維持が困難(数代(3-5代)で増殖が止まり継代培養が困難)4)腸上被細胞の単離、培養維持、同定が困難24年度が最終年度であるため、記入しない。上述の1)については、23年度途中より羊膜を入手可能となり、現在も継続実験中である。2)3)に対しては、羊膜間葉系細胞を用いて、腸上皮細胞との共培養を行い観察を行うこととした4)についてはコラーゲンゲルによる3次元培養法や、培養腸上皮(IEC-6)細胞を用いて共培養を行うこととした。24年度が最終年度であるため、記入しない。
量子限界に挑む新原理の超伝導単一光子検出器の実証

本研究開発では,新原理に基づく超伝導単一光子検出器の原理実証を行う.バイアス電流を運ぶ超伝導ナノストリップが光子を吸収して生じる量子化磁束を,単一磁束量子(SFQ)回路により検出することにより単一光子を計数する新型検出器であり,常伝導転移をともなう従来型の超伝導ナノストリップ検出器に比べて桁違いの計数率が期待される.前年度に評価したNb薄膜の物性値(磁場侵入長やコヒーレンス長)を基に,超伝導ナノストリップとSFQ回路を集積したモノリシック検出システムの設計見直しを行った.特に,超伝導ナノストリップとSFQ回路がともに正常動作するようバイアス電流を分配する回路について再検討し,ナノストリップとSFQ回路で構成される閉回路に存在していた抵抗を不要とし,その閉回路を(抵抗のない)超伝導ループとすることが可能であることが明らかになった.この新設計により,光子を吸収した超伝導ストリップに発生した量子化磁束が磁束量子化の条件を保ったまま閉回路に捉えられ,SFQ回路で確実に検出されるようになった.つまり,磁束量子化を利用するという本検出器の特徴を最大に活かすような回路を構成することができた.さらに,この新たな設計に基づいて超伝導ナノストリップとSFQ回路を集積したモノリシック検出システムを作製し,その基本動作を実験的に検証した.現時点では,まだ光照射による単一光子検出の実証には至っていないが,今後はその実証を進める予定である.なお,本研究開発の起点となった特許「光子検出装置及び光子検出方法」が査定されたことを付記する.本研究開発では,新原理に基づく超伝導単一光子検出器の原理実証を行う.バイアス電流を運ぶ超伝導ナノストリップが光子を吸収して生じる量子化磁束を,単一磁束量子(SFQ)回路により検出することにより単一光子を計数する新型検出器であり,常伝導転移をともなう従来型の超伝導ナノストリップ検出器に比べて桁違いに高い計数率が期待される.本年度は,時間依存Ginzburg-Landau (TDGL)方程式と熱拡散方程式とを連成して,超伝導ナノストリップが光子を吸収して量子化磁束(渦糸)が発生する過程を再現する数値シミュレーションを行った.超伝導材料としてNbとNbNとを想定してシミュレーションを行い,Nbの場合は量子化磁束が発生しにくいような振舞が見られた.ただし,現在はTDGL方程式の解である秩序パラメータの定性的な振舞から量子化磁束の発生を判断しているが,より定量的な解析を行う必要がある.また,既存の超伝導デバイス評価用冷凍機を改造して,光ファイバの導入を可能にするとともにSFQ回路の正常動作のための磁気シールドを施した.さらに,Nbを用いたSFQ回路の超伝導配線の一部を超伝導ナノストリップ構造に加工することにより,超伝導ナノストリップとSFQ読み出し回路とを同一チップ上に集積化したモノリシック検出器システムを構成した.ナノストリップに光を照射しない状況で,SFQ回路の出力確率がバイアス電流とともに対数的に増加する実験結果が得られたが,これは熱励起による量子化磁束の発生(ダークカウント)を示唆するデータであると考えられる.TDGL方程式と熱拡散方程式との連成解析手法を確立した.また,デバイス評価用冷凍機を改造するとともに,光子を吸収する超伝導ストリップと単一磁束量子(SFQ)回路を統合した超伝導モノリシックデバイスを設計および作製した.光を照射しない場合のデバイス応答を測定し,熱励起による量子化磁束の検出を示唆する実験結果を得ることができ,本年度の目標は概ね達成した.本研究開発では,新原理に基づく超伝導単一光子検出器の原理実証を行う.バイアス電流を運ぶ超伝導ナノストリップが光子を吸収して生じる量子化磁束を,単一磁束量子(SFQ)回路により検出することにより単一光子を計数する新型検出器であり,常伝導転移をともなう従来型の超伝導ナノストリップ検出器に比べて桁違いの計数率が期待される.本年度は,超伝導ナノストリップとSFQ回路を集積したモノリシック検出システムを構成するNb薄膜について,様々な物性値を評価した.試料の超伝導転移温度,磁場中抵抗の温度依存性,および転移温度付近におけるホール電圧等の測定より,コヒーレンス長,磁場侵入長,準粒子密度,および平均自由行程等を評価した.特に磁場侵入長は超伝導ナノストリップのインダクタンスを決定する重要なパラメータであり,その精密な値の評価により,検出システムの詳細設計が可能になった.また,本検出システムにより量子化磁束が確実に検出できることを実証するため,円孔を空けた超伝導ストリップにバイアス電流を流すことで,光照射なしに量子化磁束を発生させてSFQ回路の応答を検証するシステムを考案した.時間依存Ginzburg-Landau (TDGL)方程式のシミュレーションにより,量子化磁束を発生させるための,ナノストリップの幅,円孔のサイズ,およびバイアス電流値などの条件を明らかにした.さらに,本研究で実証を目指している新型光子検出器の国外特許出願を行った.デバイス作製工程の見直しにより,超伝導モノリシック検出システムが正常動作する設計の見通しを得た.Nb物性値評価により検出システムの詳細設計が可能になり,またSFQ回路による量子化磁束の検出を明確に実証するための設計指針が明らかになった.光照射の実験には至らなかったが,より良い検出システム設計が可能になった点で,本年度までの進捗は概ね順調であると言える.本研究開発では,新原理に基づく超伝導単一光子検出器の原理実証を行う.

バイアス電流を運ぶ超伝導ナノストリップが光子を吸収して生じる量子化磁束を,単一磁束量子(SFQ)回路により検出することにより単一光子を計数する新型検出器であり,常伝導転移をともなう従来型の超伝導ナノストリップ検出器に比べて桁違いの計数率が期待される.前年度に評価したNb薄膜の物性値(磁場侵入長やコヒーレンス長)を基に,超伝導ナノストリップとSFQ回路を集積したモノリシック検出システムの設計見直しを行った.特に,超伝導ナノストリップとSFQ回路がともに正常動作するようバイアス電流を分配する回路について再検討し,ナノストリップとSFQ回路で構成される閉回路に存在していた抵抗を不要とし,その閉回路を(抵抗のない)超伝導ループとすることが可能であることが明らかになった.この新設計により,光子を吸収した超伝導ストリップに発生した量子化磁束が磁束量子化の条件を保ったまま閉回路に捉えられ,SFQ回路で確実に検出されるようになった.つまり,磁束量子化を利用するという本検出器の特徴を最大に活かすような回路を構成することができた.さらに,この新たな設計に基づいて超伝導ナノストリップとSFQ回路を集積したモノリシック検出システムを作製し,その基本動作を実験的に検証した.現時点では,まだ光照射による単一光子検出の実証には至っていないが,今後はその実証を進める予定である.なお,本研究開発の起点となった特許「光子検出装置及び光子検出方法」が査定されたことを付記する.これまで作製した超伝導モノリシックデバイスが正常に動作しない場合が多く,有効な実験データを得ることが非常に困難であった.そこで,デバイス作製工程を見直して歩留まりを向上させ,これにより多くの有効なデータ得られるものと期待される.また,光照射時の実験を行うとともに,検出器の動作を再現する定量的かつ本格的な数値シミュレーションを進める予定である.Nb薄膜・ナノストリップの物性値が確定したので,ナノストリップおよびSFQ回路を詳細設計して検出システムを完成させ,量子化磁束の検出を実証する.さらに実際に光照射する実験により,本検出器の原理実証を行なう.
椎間板加齢性変化の現象解明と抗サイトカイン治療の開発

腰痛による運動器障害を軽減し、健康格差を縮小して健康寿命を延伸することは喫緊の課題といえる。椎間板変性に伴う炎症や知覚神経侵入が腰痛の原因の一つと報告されている。本研究では、炎症惹起の新しいメカニズムとしてPAR-1アゴニストによる刺激を仮定し、マウス椎間板でのPAR-1受容体発現を示した。また、この刺激により放出されたサイトカインにより、実際にマウスマクロファージの遊走能を増強することを証明した。これらの結果は、椎間板変性過程の惹起や炎症活性化の解明につながるものである。さらに、この経路をブロックすることにより腰痛の新しい治療法を目指していくこととなる。椎間板変性のメカニズムを特定することは、腰椎疾患の成因解明に極めて重要である。我々は、これまでに椎間板ヘルニア退縮のメカニズムを同定してきており、炎症性サイトカイン(TNF-α、TWEAK、MCP-1)や蛋白分解酵素(MMPs)や血管新生因子(VEGF)やマクロファージの遊走が、重要であることが明らかとなっている。椎間板ヘルニア退縮と椎間板変性の機序において、いずれも炎症に起因することがわかっており、今回、これら一連のメカニズムのイニシエーターを同定すべく、実験を行った。椎間板内には炎症誘導作用を有するプロテアーゼ受容体PAR(protease-activated receptor)-2の発現がみられ、炎症性サイトカインInterleukin(IL)-1βの発現を誘導し分解酵素MMP-3およびMMP-13mRNAの発現を促進することが分かった。以前に、我々はリン酸タンパクであるOsteopontin(OPN)をMMP-3、MMP-7、トロンビンが切断し活性化することを報告した。OPNは炎症性細胞の走化能を有する。よって、椎間板変性過程の惹起や炎症活性化のメカニズムにMMPによるOPN、PAR-2の活性化に関与している可能性がある。現在、マウス椎間板における組織培養を行い、PAR-2の刺激に対する炎症性サイトカインや血管新生因子の反応を検討している。細胞Xとの共培養、細胞Xから放出されるサイトカインYが、椎間板のPAR-2の基質分解し、活性化させている可能性のある実験結果を得ている。今後は、PAR-2基質分解とこれによる活性化のシステムをin vitroで明らかにすること、また、この断片化され活性化したPAR-2による椎間板への炎症、分解作用について検討することが目的となる。当初の計画のMMPー7を含むMMPsでのPARー2の基質分解と椎間板細胞(線維輪)ので活性化は確認できたが、1科学的な直接的反応であるのか、2受容体を介した反応であるのか、3その他の反応の2次的なものであるのかが証明できていない。今後はレセプターの同定(PAR-1,2,3,4)や細胞内シグナルなどのシグナル伝達経路を解明する計画である。達成度としては70%程度と考える。平成27年度の研究成果としてマウス椎間板内には炎症誘導作用を有するプロテアーゼ受容体PAR(protease-activated receptor)-2の発現がみられ、炎症性サイトカインInterleukin(IL)-1βの発現を誘導し分解酵素MMP-3およびMMP-13mRNAの発現を促進することが分かった。平成28年度の研究成果として、マウス椎間板にはさらに他のプロテアーゼ受容体Xが発現していることを、PCR法,ウエスタンブロット法,免疫染色法にて確認した。また物質Yはこの受容体Xを介し、複数の炎症性サイトカインを産生させることを、サイトカインアレイでスクリーニングし、ELISA法にて定量した。現在、マウス椎間板における組織培養を行い、物質Yの刺激に対する血管新生因子の反応を検討している。細胞Zの共培養、細胞Zから放出されるサイトカインAの活性化についても検討している。今後は、物質Yと受容体Xの基質分解による椎間板への炎症、分解作用について検討することが目的となる。当初の計画のMMPー7を含むMMPsでのPARー2の基質分解と椎間板細胞(線維輪)ので活性化は確認できている。受容体を介した反応であることの証明も進行している。これに関与する他の受容体Xの同定がなされ、これに特異的な刺激物質であるYとの反応性も確認された。今後の課題として、両者の受容体を介した細胞内シグナルの伝達経路を解明する計画である。

椎間板ヘルニア退縮と椎間板変性の機序において、いずれも炎症に起因することがわかっており、今回、これら一連のメカニズムのイニシエーターを同定すべく、実験を行った。平成27年度の研究成果としてマウス椎間板内には炎症誘導作用を有するプロテアーゼ受容体PAR(protease-activated receptor)-2の発現がみられ、炎症性サイトカインInterleukin(IL)-1βの発現を誘導し分解酵素MMP-3およびMMP-13mRNAの発現を促進することが分かった。平成28年度の研究成果として、マウス椎間板にはさらに他のプロテアーゼ受容体Xが発現していることを、PCR法,ウエスタンブロット法,免疫染色法にて確認した。また物質Yはこの受容体Xを介し、複数の炎症性サイトカインを産生させることを、サイトカインアレイでスクリーニングし、ELISA法にて定量した。29年度の研究成果として、マウス椎間板の組織培養を行い、物質Yの刺激による炎症惹起のメカニズムは今までのTNF-a、TWEAKなどとは違うことをみいだした。その一方で物質Yの刺激により培養椎間板から放出されるサイトカインの種類、機能は同様のものであった。(現在、論文投稿中)腰痛による運動器障害を軽減し、健康格差を縮小して健康寿命を延伸することは喫緊の課題といえる。椎間板変性に伴う炎症や知覚神経侵入が腰痛の原因の一つと報告されている。本研究では、炎症惹起の新しいメカニズムとしてPAR-1アゴニストによる刺激を仮定し、マウス椎間板でのPAR-1受容体発現を示した。また、この刺激により放出されたサイトカインにより、実際にマウスマクロファージの遊走能を増強することを証明した。これらの結果は、椎間板変性過程の惹起や炎症活性化の解明につながるものである。さらに、この経路をブロックすることにより腰痛の新しい治療法を目指していくこととなる。PARのレセプターは、現在4種類存在することが知られているが、今回の反応がどのレセプターを介して起こっているかを、アンタゴニストやアゴニストやノックアウトマウスを用いて同定する。また、PCR法やWestern Blotting法を用いて細胞内シグナルの検討を行う。その実験結果をもとに、最適な標的分子を同定し、実際に自然発症腰椎変性ビーグル犬を用いて抗サイトカイン療法を行い、椎間板変性の抑制の評価および治療効果の検討を行う。具体的には、若年ビーグル犬に、サイトカインYのアンタゴニストなどを経皮的に投与する。評価は、MRI、歩行可能距離、四肢筋力などにて治療効果の検討を行う。PARの受容体は、現在4種類存在することが知られているが、今回の反応がどのレセプターを介して起こっているかを、アンタゴニスト/アゴニスト、またSiRNAの導入を行い明らかにしていく。また、タンパクのリン酸化をWestern Blotting法を用いて評価し細胞内シグナルの検討を行う。今回、関与の明らかになった受容体Xについても同様の検討を行っていく。具体的には、若年ビーグル犬に、物質Yのアンタゴニストなどを経皮的に投与する。