hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニッケル,パラジウムおよび白金のカルコゲニドクラスターの合成とその酸化還元挙動

本年度の実施計画に従ってM^<2+>(M=Ni,Pd,Pt)/dppe[1,2ービス(ジフェニルホスフィノ)エタン]/NaSH,NaSeHの系について合成を行い、[M_3E_2(dppe)_3]^<2+>(M=Ni,Pd,Pt;E=S,Se)で表される合計6種の3核錯体を得ることに成功した。このうち[Ni_3S_2(dppe)_3][PF_6]_2・MeCNと[Ni_3Se_2(dppe)_3][BPh_4]_2のX線結晶構造解析を行った。これら錯陽イオンの構造は3つの四角形の配位平面NiE_2P_2が2つのμ_3ーE(E=S,Se)を共有した形である(図)。錯体の中央にはNi_3E_2からなる3核両錐の核があり、結合距離などは[Ni_3S_2(dppe)_3][PF_6]_2・MeCNではNiーS2.192,Ni...Ni2.827,S...S2.924Aであり、[Ni_3Se_2(dppe)_3][BPh_4]_2ではNiーSe2.311,Ni...Ni3.004,Se...Se3.051Aである。金属間には直接の相互作用はなさそうである。得られた錯体について20°Cと-18°CでN,Nージメチルホルムアミド(DMF)とアセトニトリル(MeCN)中でサイクリックボルタムグラム(CV)を測定した。[Ni_3E_2(dppe)_3]^<2+>( E=S,Se)はともに-18°C,MeCN中で2つの可逆なカップルを示し、これらは1電子が関与している酸化還化波である。[M_3E_2(dppe)_3]^<2+>(M=Pd,E=S,Se;M=Pt,E=Se)は-18°C,DMF中で可逆な1つのカップルを示し、これは2電子が関与した酸化還元過程である[Pt_3S_2(dppe)_3]^<2+>は可逆なカップルを示さなかった。このようにして得られたCVの酸化還元電位から[M_3E_2(dppe)_3]^<2+>について還元されやすさを金属について比較するとNi>Pd>Ptの順であり、EについていえばSe>Sである。
2次元相関法による心室・房内血流ベクトル局所心筋壁運動ベクトルの計測

本研究の目的は主に以下の2つの対象からなる。即ち1)局所心筋壁の2次元運動の定量化、及び2)心腔内血流速2次元ベクトルの定量化である。この背景としては、1)従来局所心筋壁運動の定量化は多くの方法が提案されているが、各心時相で心内膜をマニュアルまたは自動トレースして評価する方法は何らかの動きの仮想中心を必要とし、局所心筋壁機能の異常のある場合や刺激伝導系の異常のある場合そのような仮定が妥当である保証はない。動きの方向を仮定せず、心筋壁の回転運動等も含め、リアルに計測する。2)現在の市販されているドプラ装置は超音波ビーム方向の速度のみ計測可能で方向依存性がある。そこで2次元流速ベクトルを推定できればこの問題は解消され、より多くの情報を提供できる。方法としては最近市販された高フレームレート超音波装置にコンピュタにより1)では相関法を適用して、2)では流体の法則を適用して計算機処理にて求めた。1)では相関法を複合した指標を用いた。即ち、相関係数が低下する場合、大きなROIとの相関、初期画像との相関、動きの慣性モーメントを追加した。これら指標の重み付けは人の追跡結果との2乗誤差が最小になるよう決定した。この結果、自動的に局所の2次元運動が追跡でき、異なる病態を反映する追跡結果が実用レベルで得られることが分かった。本手法、結果の詳細は以下の論文及び循環器学会、ME学会総会に発表した。心エコー画像における局所心筋壁2次元運動の追跡電子情報通信学会論文誌D-II volJ79 p286-294 1996 2)については現在論文投稿を準備中である。高フレームレート心エコー画像(6089フレーム/秒)の超音波断層画像を640*512の解像度、6bit階調の輝度で改良された超音波装置より光磁気デスクに記録し、約20*20ピクセルの関心領域(ROI)を心内膜を含む心筋壁に数個設定し、1心周期に渡り2次元相関法を用いて追跡させた。相関係数は駆出期、拡張早期、心筋壁の変形が大きい時相で0.7前後に低下し、超音波エコーの分解能の特性である、ビームに垂直方向、測方向分解能の低下に対応してこの方向に運動追跡エラーを生じる傾向が判明した。超音波エコー画像での2次元相関分布はランダムに輝度値を与えたシミュレーション画像に較べ、尖度が低い画像を呈し、心筋壁の変形の大きい時相ではより著明となる。このため、相関法に、改良を加え、一片が2倍長のROI、初期画像との相関、運動ベクトルの連続性を考慮した移動方向の重み付けを加え、ほぼ良好な追跡が可能となった。精度の検討のため8人の人間による追跡と比較したがほぼ近似した追跡が可能であった。種種の臨床例を用いて、評価したが、心筋壁運動の自動追跡が可能で病態をよく反映した。即ち心筋梗塞や不整脈では局所的な壁運動の低下が客観的に定量的に計測される。CTやMRIに較べ、高時間分解能で計測可能で刺激伝導系の異常や不整脈等の解析にも使える可能性がある。心筋壁運動機能評価の有用な手法となり得ると考えられる。本結果は平成6年度日本循環器学会総会(3月東京、演題:高フレームレート心エコー画像からの局所心筋壁2次元運動ベクトルの計測)、ME学会総会(5月高松、演題:超音波心エコー画像における相関法を用いた局所心筋壁の2次元運動の定量化)で発表される。マイクロバブルを用いた心腔内血流の可視化と2次元血流ベクトルの計測は精度の検討、手法の改良、問題点を現在検討中で今後研究を進める。

本年度はマイクロバブルを犬左心室内に血流と共に入れ、高フレムレート(6089/秒)で記録した輝度画像(B-mode)に適当なROIを設定し、2次元相関法で流れの2次元ベクトルを求め、その精度をドップラー法で計測した値と比較し精度を検討した。即ち、2次元相関法で求めた、2次元ベクトルの超音波ビーム方向の速度を比較した。この際、マイクロバブルがROI内に十分あり、2次元相関値が0.7以上の相関値を示す例で検討したところ0.85前後の相関を得た。さらに連続の式を用いてドップラー法で推定した場合の2次元ベクトルについてマイクバブルの2次元相関でもとめたベクトルと相関の悪い例の原因につて解析を進めている。その原因として、本来3次元空間の流れを連続の式を使う際、2次元を仮定している点、心筋壁境界での心筋の動き等の要因を検討中である。
弱毒ポリオウイルスを用いた神経芽腫の新しい治療法の研究

1才半以降に発症する神経芽腫の予後は不良であり、新しい治療法の開発が望まれている。これまで我々は、in vitroとin vivoの実験により、ポリオウイルス(PV)は神経芽腫に対し強い抗腫瘍効果をもち、さらにPVにより神経芽腫が治癒したマウスには、神経芽腫に対する抗腫瘍免疫が誘導されることを証明してきた。これらの基礎実験を踏まえ、三重大学病院では再発・難治性神経芽腫の患者さんを対象に、PVによる神経芽腫の第1相臨床試験を開始し、現在まで2名の患者さんの治療を行った。神経芽腫は小児固形腫瘍で最も多い悪性腫瘍で、1歳以降に発症する場合は外科的治療・化学療法・放射線療法を使用した集学的治療を行っても予後は非常に不良であり、新しい治療法の開発が強く望まれています。これまで申請者らは、マウスを用いた研究でポリオウイルス(以下PV)は神経芽腫細胞に対して強い抗腫瘍活性を持ち、マウスに移植した腫瘍が消失する事を報告してきました。これまでの研究で申請者らが用いた神経芽腫細胞株は、マウス神経芽腫細胞株(Neuro-2a)にCD155をトランスフェクトして発現させた細胞(Neuro-2aCD155)であるため、強制発現させたCD155が抗腫瘍免疫の標的分子になっている可能性があります。そこでCD155を発現していないマウス神経芽腫細胞株(Neuro-2a)を、すでに抗腫瘍免疫を獲得したCD155tgA/Jマウスに移植し腫瘍の形成が認められるか否かを検討したところ、腫瘤形成しませんでした。このことから、我々がトランスフェクトしたCD155は抗腫瘍免疫の標的分子になっていないことが明らかになりました。次にin vitroでの抗腫瘍効果の実験を行いました。Neuro-2aCD155とNeuro-2aに対し抗腫瘍免疫を獲得したCD155tgA/Jマウスから脾細胞を採取し、神経芽腫細胞株(Neuro-2aとNeuro-2aCD155)と混合培養したところ、上清中LDHの上昇が認められました。しかし、抗腫瘍免疫を獲得していないCD155tgA/Jマウスの脾細胞と神経芽腫細胞株を混合培養した上清中のLDHは上昇していませんでした。さらに、CD4, 8, NKのそれぞれの細胞を脾細胞から除いて腫瘍細胞障害実験を行いましたところ、CD8細胞を除去したマウス脾細胞は神経芽腫細胞株に対し抗腫瘍効果を示しませんでした。このことから、神経芽腫をPVで治療することにより抗腫瘍免疫が誘導されることがin vivoとin vitroの実験で証明され、CD8T細胞が抗腫瘍免疫獲得に重要であることが証明されました。一方、ポリオウイルス(以下PV)は小児麻痺の原因ウイルスで、ポリオウイルスレセプター(以下CD155)を介して脊髄の前角細胞に感染し、アポトーシスを誘導することにより運動神経麻痺を発症します。こうしたPVの神経細胞に対する親和性に着目し、申請者らはPVを神経芽腫の治療に応用しようと試みてきました。これまで申請者らは、マウスを用いた研究でPVは神経芽腫細胞に対して強い抗腫瘍活性を持ち、マウスに移植した腫瘍が消失する事を報告してきました。さらに驚いたことに神経芽腫をPVで治療することで抗腫瘍免疫が誘導されることが示唆されました。今回我々は抗腫瘍免疫獲得の機序の解明を目指しました。まず、CD155が抗腫瘍免疫の標的分子か否かの検討を行うため、PVの中和抗体を獲得後に右側腹部に1x107のNeuro-2aCD155細胞を皮下移植し、7-12日後に150mm3の腫瘤を形成した時点でSabin1の腫瘍内投与を1週間毎日行いました。その後180日間腫瘍サイズをモニターし、腫瘍再発を認めないマウスの左側腹部に1x107のNeuro-2aCD155細胞を移植した後2ヶ月間腫瘤形成の有無を経過観察しました。90%のマウスが180日間の経過観察中に再発を認めず、1st tumor-rechallengeの後に腫瘤形成したマウスは一例も認めませんでした。腫瘍再発を認めないマウスの腹部に1x107のNeuro-2a細胞を移植(2nd tumor-rechallenge)したが、すべてのマウスで腫瘤形成は認められず、CD155が抗腫瘍免疫の標的分子になっていないことが明らかになりました。1歳半以降に発症する神経芽腫の予後は不良であり、新しい治療法の開発が強く望まれている。

これまで申請者らは、マウス(CD155tgA/Jマウス)を用いた研究でポリオウイルス(以下PV)は神経芽腫細胞(Neuro-2aCD155)に対して強い抗腫瘍活性を持ち、マウスに移植した腫瘍が消失する事を報告してきた。さらに、PVにより神経芽腫(Neuro-2aCD155)が治癒したCD155tgA/Jマウスに神経芽腫細胞株(Neuro-2aCD155とNeuro-2a)を移植したところ、腫瘍の形成は認められなかった。次に、PVにより神経芽腫(Neuro-2aCD155)が治癒したCD155tgA/Jマウスから脾細胞を採取し、神経芽腫細胞株と混合培養したところ、培養上清中のLDH上昇が認められた。しかし、抗腫瘍免疫を獲得していないCD155tgA/Jマウスの脾細胞と神経芽腫細胞株(Neuro-2aCD155とNeuro-2a)を混合培養した培養上清中のLDHは上昇しなかった。さらに、PVにより神経芽腫(Neuro-2aCD155)が治癒したCD155tgA/Jマウスの脾細胞から、CD4, 8, NKのそれぞれの細胞を除去して腫瘍細胞障害実験を行ったところ、CD8細胞を除去したマウス脾細胞は神経芽腫細胞株(Neuro-2aCD155とNeuro-2a)に対し抗腫瘍効果を示さなかった。このことから、神経芽腫をPVで治療することにより抗腫瘍免疫が誘導されることがin vivoとin vitroの実験で証明され、CD8T細胞が抗腫瘍免疫獲得に重要であることが証明された。次に、in vitroでの抗腫瘍効果を確認した。これらの基礎実験をもとに、三重大学病院では、神経芽腫をPVで治療する第1相臨床試験を開始し、現在2人の患者さんを治療した。小児血液腫瘍現在まで予定通り順調に研究を施行し、仮説通りの結果が得られているため、おおむね順調に順調に進展していると考える。現在まで予定通り順調に研究を施行し、仮説通りの結果が得られているため、おおむね順調に進展していると考える。ポリオウイルスが神経芽腫に感染することによって作られる、どの物質(タンパク質)が抗腫瘍免疫を惹起するか同定する研究が必要となる。多くのタンパクの中から、目的の物質を見つけることは困難が予想される。そのため、新規物質の同定に長けている施設と共同研究することを検討したい。1.臨床応用可能な、より安全な弱毒PVの開発2010年から三重大学医学部附属病院で開始した第1相の臨床試験では、再発神経芽腫の患者さんに対し、ポリオウイルスのワクチン株であるSabin 1の腫瘍内投与を行い治療しました。神経芽腫患者さんに対するSabin 1での治療による、有害事象は認められておりませんが、腫瘍細胞内で増殖を繰り返すことによって強毒化する可能性もあり、臨床応用可能な安全な弱毒PVの開発を行います。そこでまず、ヒト神経芽腫細胞を用いて、Sabin 1を継体培養します。その過程で、神経芽腫の細胞株が強い細胞変性効果(cytopathic effect; CPE)を示した時点で、培養上清からPV-RNAを抽出しRT-PCRを行い、塩基配列を決定します。更に、CD155トランスジェニックマウスを用いて、変異ウイルスの毒性を評価します。2. PV感染により細胞死した神経芽腫細胞をワクチンとした抗腫瘍免疫の誘導今までの申請者らの実験結果から、神経芽腫をPVで治療することにより抗腫瘍免疫が誘導されることが示唆されています。抗腫瘍免疫誘導に関わる抗原を同定する第一段階として、PV感染で細胞死した神経芽腫細胞には抗腫瘍免疫誘導能があるか否かを検討する必要があります。
補酵素類似機能を有する含窒素複素環化合物の開発と有機合成への〓

生体内低分子有機化合物である補酵素分子のエシェンシャルを抽出し,その構造と機能に近づくあるいはそれを超える分子の開発とその分子設計を目的として本研究を行ない以下に挙げるいくつかの成果を得た.1.電子欠損状態にある共役二重結合を有する含窒素化合物の設計を行ない幾つかの機能性を有する化合物の合成を行った.そのうち5-アリールバルビツール酸誘導体は簡単な構造であるにもかかわらず極めて優れたアルコール,特にアリール,ベンジルアルコールに対する酸化能力をもつことが判明した.更にこの誘導体はチオールのジスルフィドへの酸化にも有効でありこれを利用して非対称ジスルフィドの新規合成法の開発に成功した.1.種々な電子及び立体状態にある5-デアザフラビンの一群の化合物の設計と合成を行ないそのうち軸不斉をもつ5-デアザフラビン誘導体はある種のカルボニル化合物に対して予備的ではあるが高い光学収率でもって不斉還元を行う能力を有することが判明した.又,一連の軸不斉を有する化合物のredox及び熱に対する光学的挙動を検討した.1.光学不活性なモデルを用いて光学活性な金属触媒存在下不斉還元を検討し幾つかの興味ある知見を得た.1.redox補酵素F420の全合成研究を完結したが,その際数多くの補酵素モデルとなり得る化合物の合成が出来た.これらの化学的機能については現在検討中である.生体内低分子有機化合物である補酵素分子のエシェンシャルを抽出し,その構造と機能に近づくあるいはそれを超える分子の開発とその分子設計を目的として本研究を行ない以下に挙げるいくつかの成果を得た.1.電子欠損状態にある共役二重結合を有する含窒素化合物の設計を行ない幾つかの機能性を有する化合物の合成を行った.そのうち5-アリールバルビツール酸誘導体は簡単な構造であるにもかかわらず極めて優れたアルコール,特にアリール,ベンジルアルコールに対する酸化能力をもつことが判明した.更にこの誘導体はチオールのジスルフィドへの酸化にも有効でありこれを利用して非対称ジスルフィドの新規合成法の開発に成功した.1.種々な電子及び立体状態にある5-デアザフラビンの一群の化合物の設計と合成を行ないそのうち軸不斉をもつ5-デアザフラビン誘導体はある種のカルボニル化合物に対して予備的ではあるが高い光学収率でもって不斉還元を行う能力を有することが判明した.又,一連の軸不斉を有する化合物のredox及び熱に対する光学的挙動を検討した.1.光学不活性なモデルを用いて光学活性な金属触媒存在下不斉還元を検討し幾つかの興味ある知見を得た.1.redox補酵素F420の全合成研究を完結したが,その際数多くの補酵素モデルとなり得る化合物の合成が出来た.これらの化学的機能については現在検討中である.
熱力学的計算による炭素/セラミックス複合材料の高温耐酸化性評価に関する研究

1.C/B_4C/SiC/ZrB_2系複合材料の酸化特性評価上記組成の炭素/セラミックス複合材料は、酸化雰囲気および酸化処理温度の違いにより異なった酸化挙動を示した。本複合材料は、乾燥空気雰囲気下・6001400°Cにおいて優れた耐酸化性を有しているが、湿潤空気雰囲気下・800900°Cにおいて、その耐酸化性が乾燥空気雰囲気と比較し著しく劣化することを明らかにした。複合材料各成分および酸化生成物の反応特性評価炭素、B_4C、SiC、ZrB_2、B_2O_3およびSiO_2標準試料粉末の高温化学反応特性を評価した結果、B_4C、ZrB_2、B_2O_3の各粉末は、雰囲気の違いにより異なった挙動を示し、これらの粉末は、乾燥空気雰囲気中よりも湿潤空気雰囲気中において高い化学反応性を示すことを明らかにした。3.複合材料の酸化機構の熱力学的考察1、2の結果より、「本複合材料の耐酸化性の劣化は、酸化保護膜として機能するB_2O_3と水蒸気の反応により生じる。」こと、また、「耐酸化性の発現は、SiO_2成分酸化保護膜生成に起因する。」ことをそれぞれ明らかにした。B_2O_3と水蒸気の反応性を熱力学的計算により概算した結果、水蒸気分圧と反応生成物H_3BO_3との関係を明らかにし、耐酸化性劣化のメカニズムを理論的に説明した。4.新複合材料開発の検討水蒸気雰囲気下において優れた耐酸化性を有する複合材料開発の方策として、[a.水蒸気雰囲気と反応性の高いホウ素を組成から除く。」「b.水蒸気雰囲気と反応性の低いケイ素を機能的に用いる。」このなどを考察した。
レーザー励起Ca^+とH_2Oの低エネルギーイオン―分子反応と生成イオンの光解離

平成15年度の研究成果は以下の(A),(B)である。(A)生成イオンの質量分析とパルス計数法を組合わせた測定系を新たに構築し、Ca^<+^*>(D_J)+H_2O反応によって生成されたイオンの質量数を特定した。その結果Ca^<+^*>(D_J)+H_2O→CaOH^++H反応チャンネルが支配的であることを明らかにした。<詳細>線形トラップの軸方向にチャンネルトロン付き四重極質量分析計を設置して、トラップから引出された反応生成イオンの質量分析を行った。昨年度まではCa^<+^*>(D_J)+H_2O反応によって生成される可能性があるCaOH^+(M=57)、HCaOH^+(M=58)イオンを区別できなかったが、質量分析計と高感度なパルス計数法を組合わせることにより、生成イオンの質量数がM=57であることを特定できた。(B)深紫外光照射によるCaOH^+の光解離反応CaOH^++hv→Ca^++OHの実現を試み、それに成功した。<詳細>光解離反応を起こすために必要な光子のエネルギーを事前に知るために、Gaussian03 software packageによる分子及び分子イオンのab initio計算を行った。その結果、CaOH^+→Ca^++OH解離エネルギーは約4.59eVであり、CaOH^+の光解離を行うためには波長270nm以下の深紫外光が必要とわかった。そこで、深紫外領域に比較的広い放射分布をもつ水銀キセノンランプを準備し、生成イオンへ照射した。その一方で、YAGレーザーの4倍波(266nm)をCaOH^+イオンへ照射し、同様に光解離を試みた。光解離反応の有無はCa^<+^*>(D_J)+H_2O→CaOH^++H反応によって一度失われたCa^+からのレーザー誘起蛍光強度が、紫外光照射によって回復するかどうかにより確認した。紫外光照射を波長選択的に行うため、シャープカットフィルター、干渉フィルターを光学系に挿入し、特定領域の波長のみをもった紫外光を照射し、大まかな光解離断面積の波長依存性を測定した。その結果、光解離は266nmの光子では起こらず、λ=255nm以下の深紫外光によって起こることを明らかにした。また光解離断面積は10^<-18>cm^2程度の大きさをもつことが分かった。以上の成果はRIKEN Accel.Prog.Rep.2003及び第59回日本物理学会年次大会(2004年3月福岡)で公表予定である。[概要]平成14年度には、当初の研究計画に従い(A)レーザー誘起蛍光質量分析法(LIFMS法)による極微量なCa^<+*>(D_J)+H_2O反応生成イオンの検出を行った。実験(A)ではレーザー冷却されたCa^+イオンを利用して、Ca^<+*>(D_J)+H_2O反応生成イオンの共同冷却実験を行った。共同冷却されたイオンの温度はCa^+の蛍光スペクトル線幅から推定し、少なくとも200Kまで冷却されていることを確認した。またLIFMS法による測定からCa^<+*>(D_J)+H_2O反応による生成イオンがCaOH^+又はHCaOH^+であることを確認した。しかし分解能の限界から質量数を特定するには至らなかった。質量数の特定を行う実験は現在進行中である。一方、本研究で採用したLIFMS法の特徴を生かし、超高真空領域でのCa^<+*>(D_J)+H_2O反応の有無を確認する実験を行った。残留H_2O圧力が約10^<-8>Paという極低圧下においてCa^<+*>(D_J)+H_2O反応が検出されるかどうか測定を行った結果、反応時間2×10^3s以上において質量数M=5758付近に有意な質量スペクトル信号を確認でき、励起状態であるCa^<+*>(D_J)は基底状態Ca^<+*>(S_<1/2>)に比べてH_2Oとの反応性が非常に高いことを実験的に明らかにした。LIFMS法は生成イオンに対する検出感度が高いが、定量的測定には向いていない。そこで上記実験(B)では、光ポンピング法を用いて、バッファーガス冷却下におけるCa^<+*>(D_J)+H_2O→products反応速度定数を測定を行い、反応速度定数が10^<-11>cm^3s^<-1>のオーダーであることを明らかにした(例えばイオン温度T=3.1(1)×10^3Kにおける反応速度定数はk=1.8(1)×10^3s^<-1>Pa^<-1>である)。また、反応速度定数の温度依存性を測定し、Ca^<+*>(D_J)+H_2O反応が低温であるほど反応速度が増すことを示した。実際に測定を行ったイオン温度領域(T=10005000K)においては約2倍の反応速度の増加が観測されている。以上の成果はJ. Phys. B36(2003)33-46に公表した。

(A)生成イオンの質量分析とパルス計数法を組合わせた測定系を新たに構築し、Ca^<+^*>(D_J)+H_2O反応によって生成されたイオンの質量数を特定した。その結果Ca^<+^*>(D_J)+H_2O→CaOH^++H反応チャンネルが支配的であることを明らかにした。<詳細>線形トラップの軸方向にチャンネルトロン付き四重極質量分析計を設置して、トラップから引出された反応生成イオンの質量分析を行った。昨年度まではCa^<+^*>(D_J)+H_2O反応によって生成される可能性があるCaOH^+(M=57)、HCaOH^+(M=58)イオンを区別できなかったが、質量分析計と高感度なパルス計数法を組合わせることにより、生成イオンの質量数がM=57であることを特定できた。(B)深紫外光照射によるCaOH^+の光解離反応CaOH^++hv→Ca^++OHの実現を試み、それに成功した。<詳細>光解離反応を起こすために必要な光子のエネルギーを事前に知るために、Gaussian03 software packageによる分子及び分子イオンのab initio計算を行った。その結果、CaOH^+→Ca^++OH解離エネルギーは約4.59eVであり、CaOH^+の光解離を行うためには波長270nm以下の深紫外光が必要とわかった。そこで、深紫外領域に比較的広い放射分布をもつ水銀キセノンランプを準備し、生成イオンへ照射した。その一方で、YAGレーザーの4倍波(266nm)をCaOH^+イオンへ照射し、同様に光解離を試みた。光解離反応の有無はCa^<+^*>(D_J)+H_2O→CaOH^++H反応によって一度失われたCa^+からのレーザー誘起蛍光強度が、紫外光照射によって回復するかどうかにより確認した。紫外光照射を波長選択的に行うため、シャープカットフィルター、干渉フィルターを光学系に挿入し、特定領域の波長のみをもった紫外光を照射し、大まかな光解離断面積の波長依存性を測定した。その結果、光解離は266nmの光子では起こらず、λ=255nm以下の深紫外光によって起こることを明らかにした。また光解離断面積は10^<-18>cm^2程度の大きさをもつことが分かった。以上の成果はRIKEN Accel.Prog.Rep.2003及び第59回日本物理学会年次大会(2004年3月福岡)で公表予定である。
AD・PD患者での糖脂質による各原因蛋白修飾の実態とその意義の解明

本研究では、我々が同定したTrkと酸性糖脂質であるGM1による脂質修飾の実態解明のため、Trkのjuxtamembrane領域に様々なdeletion mutantを作成し、Trkを発現しないPC12細胞(PCnnr)に変異cDNAを含むベクターをtransfectし、stable transformantを作成した。各々の変異cDNAを恒常的に発現するcell lineを放射性同位元素でwhole cell labelし、抗Trk抗体で免疫沈降(IP)し、そのIP物より全脂質を抽出し薄層クロマトプレート(TLC)で展開、GM1を同定した(論文作成中)。これら変異Trkを発現するstable transfectantでは、Trkのリガンドに対する反応性は失われ、細胞内traffickingにも異常をきたすことを解明した(論文作成中)。一方、PD,AD,ALS,MS患者試料中特に髄液での中性糖脂質などの脂質類をLC-MS/MSを用いた高感度アッセイ法で測定した.さらに、神経学的に正常な泌尿器患者200例の解析も同時に行い、その脂質プロファイル化を行った.その結果、主要な糖脂質特に中性糖脂質には年齢及び性別で有意に異なるプロファイルパターンを呈する事が判明した(論文準備中).この事実を基に、現在までに解析が終了している各種神経疾患患者での異常検出に応用し、各疾患での異常所見の特定を終了した.PD、MS、ALSなどの神経疾患で新規脂質や糖脂質の異常とそれらが神経炎症に如何に関連するかを免疫学的・生化学的に追求する研究に取りかかっているが、残念ながら本研究の最終年までに終えることが出来なかった.今後、他の研究費によりこの仕事を完成させる予定である.研究実績の概要これまでの当研究室で蓄積されてきた知見を考慮するとTrkのjuxtamembrane領域にGM1との結合部位が存在する事が想定されるため、Trkの同部位に様々なdeletion mutantを作成し、Trkを発現しないPC12細胞(PCnnr)に変異cDNAを含むベクターをtransfectし、stable transformantを作成した。各々の変異cDNAを恒常的に発現するcell lineを放射性同位元素でwhole cell labelし、抗Trk抗体で免疫沈降(IP)し、そのIP物より全脂質を抽出し薄層クロマトプレート(TLC)で展開、GM1を同定した(この方法はPNAS 1995で既に詳細報告済)。これらの検討により、結合部位を欠くTrkのリガンドに対する反応性は失われ、細胞内traffickingにも異常をきたすことを解明し(論文作成中)。現在、これら変異Trkのstable transformantより、脂質ラフトを既報の方法(Glcyconj J 2000)で調整し、ラフトの脂質組成や他のシグナル伝達分子機能に及ぼす影響を明らかにしている所である。一方、SH-SY5Yを用いたalpha-synuclein (a-syn)と糖脂質の関係、また変異tauを発現するstable transformantの作成を試みる時間的・人的余裕が当該年度にはなく、次年度への繰り越しとなるなど若干の実験進行の遅れを認めている。一方、PD,AD,ALS,MS患者試料中特に髄液での中性糖脂質などの脂質をLC-MS/MSを用いた高感度アッセイ法で測定する検討を始めた。現在までの所未知の異常を複数確認しており、これら神経変性疾患・神経免疫疾患に糖脂質代謝に関する重大な異常が存在する可能性を見だしたので、この点も追及する。現在までの進捗状況の区分を上記とした理由Trk蛋白のGM結合を欠くdeletion mutantの作成・評価に時間が要したのが、一番大きな理由であるが、本研究遂行中に報告された多発性硬化症(MS)や筋委縮性側索硬化症(ALS)などの患者及びPD患者に糖脂質特に本研究室が専門に取り組んでいる中性糖脂質代謝に大きな異常があり、しかも病因に大きく関わっている事実が報告された。そのため、これら疾患患者の特に脳脊髄液中でのこれら糖脂質代謝の異常を速やかに同定する必要性が生じたため、2年次以降に検討する予定であった患者試料中のこれら糖脂質の異常の検索を優先させることとしたため、細胞培養系の検討が遅れる結果となった。幸いLC-MS/MSを使用した高感度測定系で患者脳脊髄液中の糖脂質を測定できる系を作り上げる事が出来た為次年度以降はこの測定系を用いタイムリーなアッセイが出来る予定である。尚、当該年度に共同研究者が辞職・開業した事や技術補佐員が結婚で遠方に移住したことによる影響も少ならずあったことは大変残念で予期せぬ事態であった。これまでの当研究室で蓄積されてきた知見を考慮するとTrkのjuxtamembrane領域にGM1との結合部位が存在する事が想定されるため、Trkの同部位に様々なdeletion mutantを作成し、Trkを発現しないPC12細胞(PCnnr)に変異cDNAを含むベクターをtransfectし、stable transformantを作成した。

一方、SH-SY5Yを用いたalpha-synuclein (aーsyn)と糖脂質の関係、また変異tauを発現するstabletransformantの作成を試みる時間的・人的余裕が当該年度にはなく、次年度への繰り越しとなるなど若干の実験進行の遅れを認めている。一方、PD,AD,ALS,MS患者試料中特に髄液での中性糖脂質などの脂質をLC-MS/MSを用いた高感度アッセイ法で測定する検討を始め,現在までの所PD、MS、ALSなどの神経疾患で新規脂質や糖脂質の異常とそれらが神経炎症に関連する免疫学的・生化学的機序の一部の解明に成功している。最終年度には、その全容を解明し新規治療法の開発に結びつけたい。現在までの進捗状況の区分を上記とした理由Trk蛋白のGM結合を欠くdeletion mutantの作成・評価に時間が要したのが、一番大きな理由であるが、本研究遂行中に報告された多発性硬化症(MS)や筋委縮性側索硬化症(ALS)などの患者及びPD患者に糖脂質特に本研究室が専門に取り組んでいる中性糖脂質代謝に大きな異常があり、しかも病因に大きく関わっている事実が報告された。そのため、これら疾患患者の特に脳脊髄液中でのこれら糖脂質代謝の異常を速やかに同定する必要性が生じたため、2年次以降に検討する予定であった患者試料中のこれら糖脂質の異常の検索を優先させることとしたため、細胞培養系の検討が遅れる結果となった。幸いLC-MS/MSを使用した高感度測定系で患者脳脊髄液中の糖脂質を測定できる系を作り上げる事が出来、種々の神経疾患(PD、ALS、MS、CIDP,EMRNなど)患者髄液・血液での解析が進んだ。こうした知見から、新規脂質やある種の糖脂質が神経炎症の引き金となっているデータを得ており、最終年度はこれらの全容を明らかにしたい。いずれにしろ、特に神経変性疾患では原因タンパクの蓄積ー細胞死という単純な図式では説明できない免疫系特にアストロサイト、ミクログリア、マクロファージといった免疫細胞とのクロストークの実態を解明しないと本質には迫れないという事実が明らかになった。本研究では、我々が同定したTrkと酸性糖脂質であるGM1による脂質修飾の実態解明のため、Trkのjuxtamembrane領域に様々なdeletion mutantを作成し、Trkを発現しないPC12細胞(PCnnr)に変異cDNAを含むベクターをtransfectし、stable transformantを作成した。各々の変異cDNAを恒常的に発現するcell lineを放射性同位元素でwhole cell labelし、抗Trk抗体で免疫沈降(IP)し、そのIP物より全脂質を抽出し薄層クロマトプレート(TLC)で展開、GM1を同定した(論文作成中)。これら変異Trkを発現するstable transfectantでは、Trkのリガンドに対する反応性は失われ、細胞内traffickingにも異常をきたすことを解明した(論文作成中)。一方、PD,AD,ALS,MS患者試料中特に髄液での中性糖脂質などの脂質類をLC-MS/MSを用いた高感度アッセイ法で測定した.
多能性幹細胞および組織幹細胞におけるnucleosteminの機能解析

二回の連続したターゲティングによってコンディショナルノックアウトES細胞の作製に成功した。この細胞を用いてNucleosteminをES細胞で欠損させることにより増殖の停止と細胞死が誘導されることを見出した。また、ES細胞の未分化性の維持に重要な働きをしているOct3/4,Nanog,Sox2といった遺伝子の発現がNucleostemin欠損に伴い減少することを明らかにした。このことからNucleosteminが上記の未分化性維持にかかわる因子の発現を誘導あるいは維持している可能性が示唆される。このことに関して強制発現系をもちいて検証したところ、Nucleosteminに未分化性に関わる遺伝子の発現を誘導する活性があることを示唆する結果を得た。生体内ではさまざまな組織に幹細胞が存在し、新たな細胞を供給し続けることによって恒常性の維持が行われている。幹細胞は自己複製と未分化性の維持といった共通の特徴を持っていることから、各組織幹細胞間で共通の分子メカニズムの存在が示唆されている。研究代表者は様々な組織幹細胞で強い発現の見られるNucleostemin (NS)に着目し、その機能の解析を通して組織幹細胞間で共通の分子基盤を明らかにすることを目的としている。具体的にはNucleostemin遺伝子を誘導性に欠損させることのできるNucleosteminコンディショナルノックアウトマウス、およびコンディショナルノックアウトES細胞を作成して、その機能解析を行う。NucleosteminをES細胞で欠損させることにより増殖の停止と細胞死が誘導されることを見出した。また、ES細胞の未分化性の維持に重要な働きをしているOct3/4, Nanog, Sox2といった遺伝子の発現がNucleostemin欠損に伴い減少することを明らかにした。このことに関して強制発現系を用いて解析を行っている。研究代表者は様々な組織幹細胞で強い発現の見られるNucleostemin (NS)に着目し、その機能の解析を通して組織幹細胞間で共通の分子基盤を明らかにすることを目的とした。具体的にはNucleostemin遺伝子を誘導性に欠損させることのできるNucleosteminコンディショナルノックアウトマウス、およびコンディショナルノックアウトES細胞を作成して、その機能解析を行った。
内因性および外因性因子によるメタボリックシンドロームの抑制性制御機構の解明

実験動物生産供給業者の繁殖コロニーに由来する交雑系マウスddYに高脂肪食を15週間負荷することにより見出される易肥満群(HFDーfat)と肥満抵抗群(HFDーlean)では肝遺伝子発現および肝の代謝生化学的性質が大きく異なることを見出した。また、上記ddY系統を起源とするddYーH(肥満)とddYーL(非肥満)は、前田が近交系化により分離した系統であり、これらの類似性に基づき、肥満あるいは肥満抵抗性の原因となる背景について解析を行った。ddYーHならびにddYーL系統、業者コロニーに由来する交雑系ddYの3群について、4週齢から高脂肪餌(以下HFD、60%kcal脂肪)、低脂肪餌(以下LFD、10%kcal脂肪)、あるいは通常の繁殖維持に用いられる標準固形飼料(MF)を摂取させ、6・9・12週齢における体重、摂餌量、耐糖能、脂肪吸収、採血、解剖と検体の採取を行った。L系統の摂餌量はH系統に比べて少ない傾向はあるものの、ddYーH系統はLFDおよびHFDにより高度に肥満を呈するのに対して、ddYーL系統は、HFDによる体重増加は軽度であった。12週齢におけるOGTT糖負荷試験、空腹時血糖、血中トリグリセリド値、肝トリグリセリド値、血中インスリン濃度の何れもL系統ではHFD負荷を行っても低値を示した。以上のことから、肥満抵抗性としての性質は、ddYーL系統において近交系マウスの性質として分離出来ていることが推察された。交雑系ddYから15週間の高脂肪食負荷後に分離した易肥満群(HFDーlean)と肥満抵抗群(HFDーlean)の解析は順調に進んでいる。並行して、近交系として作出したddYーLおよびddYーHは自家繁殖によるため、マウス維持供給に多大な労力を有するものの、概ね順調に進んでいる。解析サンプル数は582と多くなり、順次進めている。しかし、30年度9月に横浜薬科大学・新研究棟が完成し、それに伴い11月ー2月の間に田辺の研究室の学内引っ越すこととなった。そのため30年度は組織抽出サンプルの取得と遺伝子・タンパク質発現の解析の部分にやむを得ないやや遅れが生じた。研究成果の一部は、第39回日本肥満学会(神戸)で1演題、第92回日本薬理学会年会(大阪)で1演題、第139回日本薬学会139年会(千葉)で1演題、それぞれ共同演題として研究発表を行った。前述の研究室移転は完成し、装置および実験環境はすでに回復した。今後、遅れを取り戻すべく、前年度にまでに取得したサンプルを用いての解析を鋭意進める。1近交系としてまた、1脂肪細胞(Adipo)ーマクロファージ(mφ)相互作用におけるメカニカルストレス応答性分子の探索を目的として、コラーゲンゲル三次元構築下でのAdipoーmφのストレッチ実験、2引き続き、ヌクレオフェクター導入装置および顕微鏡ステージ上での培養ストレッチ刺激装置を活用し、培養脂肪細胞へのメカニカルストレス受容体候補分子の過剰発現またはノックダウンにより、メカニカルストレス下流シグナルの変化(リン酸化、Ca2+動態、ストレスファイバー再構築など)についても、継続して実施する。交雑系ddY系マウスの肥満抵抗性個体の代謝特性と生理・薬理学基盤を解明する為、肥満抵抗性群(lean)、易肥満群(fat)、通常餌群(ND)を対象に肝と脂肪組織における糖・脂質代謝関連因子ほか計84種類の内因性遺伝子の発現と腸内細菌13種をリアルタイムPCR法で解析した。また、血中の糖・脂質およびアディポサイトカイン、肝グリコーゲン量を測定した。fatは明確な耐糖能異常およびインスリン感受性の低下を示したが、leanでは空腹時血糖がNDより低く、ipGTTとITTはNDと同等であった。長期のHFD負荷にもかかわらずleanでは肝脂肪蓄積が強く抑制された。leanの血中LDL値は有意に低く、肝リポタンパク質関連遺伝子(apoBほか)と下流分子(cdeb、fsp27)、肝での脂肪蓄積に関連する核内受容体(PPARγ、SREBP-1sほか)や酵素、β酸化関連酵素(CPT-1aほか)、脂質輸送・異化排泄関連分子(CD36ほか)の発現はfatに比べ低く、NDと同程度であった。各種リパーゼの発現には明確な差は見られなかった。fatは高レプチン血症を呈したが、leanの血中レプチン量はNDと同程度であった。また、leanの肝では、特にアドレナリンβ2受容体の発現上昇が強く抑制されていた。脂肪組織においてはβ1ー3何れの受容体も発現に差はみられなかった。fatの肝グリコーゲン量は低値を示したが、lean肝ではNDと同程度のグリコーゲン蓄積であった。一方、腸内細菌叢には群間で明確な差は見いだせなかった。以上の結果からddYコロニーlean個体では、高脂肪摂餌によっても一連の脂質合成・蓄積関連遺伝子の発現が上昇せず脂肪肝形成が抑制され、血中レプチン量が低値かつ肝β2受容体の発現が低レベルのため肝グリコーゲン分解が抑制され、ひいては耐糖能やインスリン感受性が正常に留まる可能性が示唆された。肥満・非肥満マウスの摘出組織における各種解析や脂肪組織からの脂肪前駆細胞の取得も行い、当該年度の解析および次年度に引き継ぐ試料調製も概ね順調に実施した。

共同研究者の前田博士および斉藤博士とは、随時の相互訪問および情報通信により実験技術授受および情報交換を行っており、実験データの取得および解析は概ね順調に行われていると考える。研究成果の一部は、第38回日本肥満学会(大阪)で1題、題138回日本薬理学会関東部会(東京)で2演題、それぞれ共同演題として研究発表を行った。実験動物生産供給業者の繁殖コロニーに由来する交雑系マウスddYに高脂肪食を15週間負荷することにより見出される易肥満群(HFDーfat)と肥満抵抗群(HFDーlean)では肝遺伝子発現および肝の代謝生化学的性質が大きく異なることを見出した。また、上記ddY系統を起源とするddYーH(肥満)とddYーL(非肥満)は、前田が近交系化により分離した系統であり、これらの類似性に基づき、肥満あるいは肥満抵抗性の原因となる背景について解析を行った。ddYーHならびにddYーL系統、業者コロニーに由来する交雑系ddYの3群について、4週齢から高脂肪餌(以下HFD、60%kcal脂肪)、低脂肪餌(以下LFD、10%kcal脂肪)、あるいは通常の繁殖維持に用いられる標準固形飼料(MF)を摂取させ、6・9・12週齢における体重、摂餌量、耐糖能、脂肪吸収、採血、解剖と検体の採取を行った。L系統の摂餌量はH系統に比べて少ない傾向はあるものの、ddYーH系統はLFDおよびHFDにより高度に肥満を呈するのに対して、ddYーL系統は、HFDによる体重増加は軽度であった。12週齢におけるOGTT糖負荷試験、空腹時血糖、血中トリグリセリド値、肝トリグリセリド値、血中インスリン濃度の何れもL系統ではHFD負荷を行っても低値を示した。以上のことから、肥満抵抗性としての性質は、ddYーL系統において近交系マウスの性質として分離出来ていることが推察された。交雑系ddYから15週間の高脂肪食負荷後に分離した易肥満群(HFDーlean)と肥満抵抗群(HFDーlean)の解析は順調に進んでいる。並行して、近交系として作出したddYーLおよびddYーHは自家繁殖によるため、マウス維持供給に多大な労力を有するものの、概ね順調に進んでいる。解析サンプル数は582と多くなり、順次進めている。しかし、30年度9月に横浜薬科大学・新研究棟が完成し、それに伴い11月ー2月の間に田辺の研究室の学内引っ越すこととなった。そのため30年度は組織抽出サンプルの取得と遺伝子・タンパク質発現の解析の部分にやむを得ないやや遅れが生じた。研究成果の一部は、第39回日本肥満学会(神戸)で1演題、第92回日本薬理学会年会(大阪)で1演題、第139回日本薬学会139年会(千葉)で1演題、それぞれ共同演題として研究発表を行った。前年度に取得したサンプルを用いて解析対象遺伝子および組織を更に拡大して継続する。また、1脂肪細胞(Adipo)ーマクロファージ(mφ)相互作用におけるメカニカルストレス応答性分子の探索を目的として、コラーゲンゲル三次元構築下でのAdipoーmφのストレッチ実験を行い、Adipo側・mφ側それぞれの特異的遺伝子発現変動や細胞内シグナルの変化を解析する。2食餌性肥満に抵抗性を示すddYコロニー由来のHFDlean個体およびddY-L系統の遺伝子発現および遺伝子多型の解析を行う。他の近交系マウス(PWKなど)において報告のある肥満抵抗性関連遺伝子の関与(pref-1,Igf2, Peg3など)の有無、他の関連遺伝子座の多型の有無について解析する。
サルモネラ感染におけるToll-like receptors依存性生体防御機構の解析

我々はこれまでに、免疫反応に抑制的に働くと考えられてきた制御性T細胞が、腸管特異的に濾胞性ヘルパーT細胞に分化し、腸管IgA産生に関与していることを明らかにした。そこで、いくつかある制御性T細胞サブセットの間で濾胞性ヘルパーT細胞の分化能に差異があるのか検討するため、内在性の制御性T細胞である胸腺由来の制御性T細胞と誘導性の制御性T細胞である腸管由来の制御性T細胞に注目し、これらを競争的条件下でT細胞欠損マウスに移入することで両制御性T細胞の濾胞性ヘルパーT細胞の分化能を比較した。その結果、胸腺由来の制御性T細胞に比べ腸管由来の制御性T細胞が、より腸管において濾胞性ヘルパーT細胞へと分化することが明らかとなった。これらの差異は、腸内細菌による制御性丁細胞への感作の有無が一因であると考えられた。そこで次に、腸管内に常在細菌が存在する正常マウス及び腸管内に常在細菌が存在しない無菌マウスよりそれぞれ制御性T細胞を単離し、それらをT細胞欠損マウスに移入することで、腸内細菌による感作の有無が腸管内における濾胞性ヘルパーT細胞への分化能に差異を及ぼすのかについて検討した。腸内細菌が存在する正常マウス由来の制御性T細胞が、無菌マウス由来の制御性T細胞に比べ、より濾胞性ヘルパーT細胞へと分化したことから、腸内細菌による制御性T細胞への感作が濾胞性ヘルパーT細胞への分化に影響を及ぼしていることが明らかとなった。さらに、濾胞性ヘルパーT細胞の分化における腸内細菌の関与を検討するため、抗生物質を投与したT細胞欠損マウスに制御性T細胞を移入したところ、腸内細菌が除去されたマウスにおいては、制御性T細胞は濾胞性ヘルパーT細胞へと分化することができなかった。以上の結果から、制御性T細胞は、腸内細菌による直接的かつ間接的な影響を受けることで、腸管特異的に濾胞性ヘルパーT細胞に分化するということが示された。腸管IgAは、腸管内における常在菌の菌体制御に関与しているだけでなく、サルモネラなどの病原菌に対する防御機構においても重要な役割を果たしている。こうした病原菌防御に重要な抗原特異的なIgAは、主にパイエル板においてCD4^+T細胞依存性に産生されるという事が知られているが、このIgA産生機構にT細胞がどのように関与しているのかについて不明な点が多い。そこで、パイエル板でのIgA産生におけるCD4^+T細胞の役割を調べるため、CD4^+T細胞の主要なサブセットであるT_H17細胞とFoxp3^+の制御性T細胞をRorγt-GFPノックインマウス、Foxp3-GFPノックインマウスよりそれぞれ単離し、T細胞をもたないCD3ε欠損マウスに移入した。まず、病原菌を感染させていない状態でこれらのT細胞を移入したマウスを観察したところ、非常に驚いた事にFoxp3^+の制御性T細胞を移入したマウスのパイエル板では胚中心が非常に効率良く形成されたが、Foxp3^-のT細胞やT_H17細胞を移入したマウスのパイエル板では胚中心の形成は観察することができなかった。さらにFoxp3^+T細胞移入マウスの詳細な解析を行ったところ、移入細胞の大部分が制御性T細胞の主要な転写因子であるFoxp3の発現を失い、胚中心の内部へと移動し、胚中心内部においてB細胞を補助すると考えられている濾胞性ヘルパーT細胞へと分化することで、腸管特異的にパイエル板において胚中心を誘導し、IgAの産生に関与していることが明らかとなった。以上の結果より、制御性T細胞は腸管においてこれまで考えられていたような単なる免疫抑制として働いているだけでなく、腸管IgA産生を介して腸管内の恒常性維持に関与していることが示された。濾胞性ヘルパーT細胞は胚中心内部に存在するT細胞であり、B細胞を補助することでパイエル板における腸管IgA誘導に積極的に関与していることが示唆されているものの、このT細胞に関しては未だに不明な点が多い。我々はこれまでに、免疫反応に抑制的に働くと考えられてきた制御性T細胞が、腸管特異的に濾胞性ヘルパーT細胞に分化し腸管IgA産生に関与していることを明らかにしてきた。そこで、この興味深い現象のメカニズムを解明するため、まず制御性T細胞の中でもどのようなサブセットがより濾胞性ヘルパーT細胞に分化するのかを検討することとした。制御性T細胞には、主に2つのサブセットが存在すると考えられている。すなわち、胸腺において分化した内在性の制御性T細胞と常に抗原にさらされている腸管などの末梢においてナイーブT細胞より分化誘導される誘導性の制御性T細胞である。そこで、胸腺及び腸管より単離した制御性T細胞を、T細胞を持たないCD3ε欠損マウスに移入した。その結果、各組織におけるT細胞の分布及び移入した制御性T細胞のFoxp3の発現維持、またパイエル板における濾胞性ヘルパーT細胞への分化において両制御性T細胞間に違いが見られた。さらに、各組織由来の制御性T細胞の細胞動態を確認したところ、胸腺由来の制御性T細胞はさまざまな末梢リンパ組織に移動するのに対し、腸管由来の制御性T細胞は腸管へと移動する傾向が認められた。以上の結果から、制御性T細胞の中でもより濾胞性ヘルパーT細胞に分化することができるサブセットが存在すること、さらにそれぞれのサブセットでは異なる細胞動態をもつことが示された。

我々はこれまでに、免疫反応に抑制的に働くと考えられてきた制御性T細胞が、腸管特異的に濾胞性ヘルパーT細胞に分化し、腸管IgA産生に関与していることを明らかにした。そこで、いくつかある制御性T細胞サブセットの間で濾胞性ヘルパーT細胞の分化能に差異があるのか検討するため、内在性の制御性T細胞である胸腺由来の制御性T細胞と誘導性の制御性T細胞である腸管由来の制御性T細胞に注目し、これらを競争的条件下でT細胞欠損マウスに移入することで両制御性T細胞の濾胞性ヘルパーT細胞の分化能を比較した。その結果、胸腺由来の制御性T細胞に比べ腸管由来の制御性T細胞が、より腸管において濾胞性ヘルパーT細胞へと分化することが明らかとなった。これらの差異は、腸内細菌による制御性丁細胞への感作の有無が一因であると考えられた。そこで次に、腸管内に常在細菌が存在する正常マウス及び腸管内に常在細菌が存在しない無菌マウスよりそれぞれ制御性T細胞を単離し、それらをT細胞欠損マウスに移入することで、腸内細菌による感作の有無が腸管内における濾胞性ヘルパーT細胞への分化能に差異を及ぼすのかについて検討した。腸内細菌が存在する正常マウス由来の制御性T細胞が、無菌マウス由来の制御性T細胞に比べ、より濾胞性ヘルパーT細胞へと分化したことから、腸内細菌による制御性T細胞への感作が濾胞性ヘルパーT細胞への分化に影響を及ぼしていることが明らかとなった。さらに、濾胞性ヘルパーT細胞の分化における腸内細菌の関与を検討するため、抗生物質を投与したT細胞欠損マウスに制御性T細胞を移入したところ、腸内細菌が除去されたマウスにおいては、制御性T細胞は濾胞性ヘルパーT細胞へと分化することができなかった。以上の結果から、制御性T細胞は、腸内細菌による直接的かつ間接的な影響を受けることで、腸管特異的に濾胞性ヘルパーT細胞に分化するということが示された。