hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高速イメージング法を用いた細胞不均一性分析

薬剤感受性細胞K562が当薬剤ADMで50%死滅する濃度を示すIC50が237 nMであることを考慮すると、がん細胞を殺さない非常に低い薬剤濃度でも薬剤感受性と薬剤耐性のがん細胞を識別できたと言える。この結果は、今後臨床応用を考える際に非常に有望な結果である。本年度は臨床応用を意識した、薬剤耐性モデルにおいても、本研究で開発した技術が適用できることを示せたことで計画通りに進んでいると判断した。薬剤で細胞の形態学的変化を誘導し、細胞の薬剤に対する感受性の違いからどの細胞であるかを判断するという非常に単純な理論であるが、形態学的変化を観察する対象がラベルフリー画像であることと、薬剤耐性がん細胞と薬剤感受性がん細胞の(薬剤添加後であっても)見た目が非常に似ていることから、区別が困難になると予想されていた。しかし、結果は予想以上に良好で、がん細胞を死滅させるよりもかなり低い濃度の添加であっても、両種類の細胞を96.9%もの高い精度で識別できたのは、大きな進捗であったと言える。これは更には、本技術が多様な場面に応用できうる可能性を示しているとも言える。細胞の薬剤応答性は細胞の根本的な生物学を探るのに重要なだけでなく、新規薬剤の創造にも重要な要素となります。本研究では、薬剤で処理された細胞の無標識画像を撮り、薬剤に誘導された形態学的変化を画像から評価することにより、細胞の薬剤応答性を定量評価するという手法を提案しました。受け入れ研究室で開発されたOptofluitic time-stretch (OTS)顕微鏡により、大量の細胞の無標識画像が高いスループットで撮影できることから、従来のハイスループットスクリーニングと同じ速さで画像情報が得られるため、スクリーニングを初め、血液検査などへの応用も期待されます。前年度までに、ヒト乳がん細胞株であるMCF-7やヒト白血病細胞株であるK562を用いた原理実証を果たし、無標識画像を用いて、薬剤によって形態変化が誘導されること、そしてこれが無標識画像によって検出・評価可能であることが分かりました。今年度はこれまでの原理実証をさらに深く、多方面から調べ、本研究で提案する手法の限界がどこにあるのか、どこまで実用性があるのかを明らかにしました。また、本手法の汎用性を調べるために、様々な試料を試しました。例えば、白血病細胞の薬剤応答性の違いから細胞の薬剤耐性を調べるられることが分かっただけでなく、薬剤処理した白血病細胞の薬剤応答性が、全血においても調べられることを示すことができました。この結果は、本研究で提案する手法が血液検査にも応用できることを示唆しています。さらにマウスに移植したヒトがん細胞からも、同様の手法で薬剤応答性が調べられることを示しました。これにより、本研究で開発、提案する手法が非常に幅広い応用性、汎用性を持つことが分かり、蛍光標識を使わない新たなスクリーニング技術及び血液検査技術を確立しました。本年度は接着細胞に対する薬剤刺激の条件検討を終えたが、臨床現場での応用性を考慮すると、浮遊細胞でも薬剤刺激による形態学的変化を調べることは不可欠である。既にヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞株であるK562を用いた検討を開始したが、浮遊細胞の形態学的変化の計測は接着細胞よりも困難であることが見込まれる。
B細胞抗原レセプターを介するアポトーシスを制御している遺伝子の解析

未熟B細胞を特異抗原あるいは抗IgM抗体(alpha-mu)で刺激することにより、アポトーシスの特質を備えたプログラムされた細胞死(PCD)がもたらされたことが知られており、自己抗原に対する免疫寛容導入のin vitroでのモデルとして注目されている。PCD誘導の際には、新たなmRNA、蛋白合成を必要とするが、その詳細な分子機構については不明な点が多いことから、本研究ではサブトラクション法を用いてPCDの際に発現が変化する遺伝子群の同定を試みた。今年度は、主としてサブトラクションライブラリーの作成およびサブトラクション効率の検定を行った。(1)マウス未熟B細胞株であるWEHI-231由来で本研究室で樹立したCD45陰性変異株である10-5細胞においてalpha-mu刺激によりPCD誘導が強く認められた。(3)(+)-(-)と(-)-(+)との両方向からのサブトラクションを2回行ったところ、それぞれ対照群に比べて目的遺伝子群は10倍以上に濃縮されていた。(4)(+)-(-)サブトラクシヨンライブラリーからPCDに際してup-regulateを受ける候補遺伝子クローンを単離し、現在その塩基配列も含めて解析中である。
マイクロプロセッサの立体アレイによる3次元情報の高速処理に関する研究

多次元巡回形ディジタルフィルタを状態空間モデルを用いて有限語長で実現する場合,実際に得られた伝達関数は元の伝達関数と一致しないのが普通である.このずれを最小にするフィルタ構造を合成するために,係数の感度を定義し,その大きさが可制御性グラミアンと可観測性グラミアンによって表わされること,及び等価変換行列に左右されることを示し,状態変数にスケーリングの制約がない場合及びある場合について,それぞれ感度最小フィルタ構造の合成法を開発した.次に,多次元巡回形ディジタルフィルタに対するリアプノフ安定定理を導出し,この条件が成立するための必要十分条件を導いた.さらに,有限語長実限に起因する加算のオーバーフローによるリミットサイクルが発生しないための十分条件を示した.これらは従来の理論を特別な場合として含む,安定な一般的なものである.また,この多次元リアプノフ安定定理に基づく多次元巡回形ディジタルフィルタの設計法も開発した.多次元情報の高速処理については2種類の並列処理方式を考案した. 1つは多次元データの1標本点に1つのプロセッサを対応させ,複数の標本点を同時に処理する方式である.他の1つは1標本点を複数のプロセッサで処理する方式である.これらの併用により高並列処理が可能になる.試作機では,プロセッサとしてDSP4台の他にホストとしてPCー9801を用いている.ホストは各メモリへのプログラム,データの書き込み, DSPのセット及びリセット,処理結果の回収等を行う.2種類の並列処理方式を実現するために, 2つのデータバスが用意されている.1つは完全結合方式でDSP間のデータ転送が効率よく行われる.他は,各メモリとも4つのDSPからアクセスできるが,読み出しと書き込みとではアクセス方法が異なるものである.現在,この実験システムは試作中である.3次元ディジタルフィルタの設計理論に関する研究については、3次元鏡像多項式を導出した後、周波数特性に存在する対称性に着目して、3次元巡回形ディジタルフィルタの周波数領域における有効な設計法を開発した。これによれば、対称性の導入によりパラメータ総数を減少でき、フィルタリングで行う際の高速処理を可能にするものである。また、所望の3次元インパルス応答を有する3次元巡回形ディジタルフィルタの最適設計についても研究し、二つの空間領域設計法を確立した。一つはインパルス応答(1次情報)とその相関データ(2次情報)に基づく方法であり、他の一つはハンケル行列の特異値分解に基づくものである。さらに、3次元ディジタルフィルタを有限語長で実現する際の丸め誤差の影響について解析し、信号のオーバーフローを防ぐ方法について考察した。そして、最適なスケーリングを行いつつ丸め誤差を最小にする最適な状態空間モデルの構造を合成する手法を開発した。これは高速フィルタリング処理装置を実現する際に有用となる。次に、マイクロプロセッサの立体アレイを用いた3次元並列処理方式による3次元データの高速フィルタリング処理装置に関する研究については、ハードウェアとソフトウェアの基本設計に続いて、個別的な詳細設計もほぼ完了した。現在は試作の段階に入りつつある。多次元巡回形ディジタルフィルタを状態空間モデルを用いて有限語長で実現する場合,実際に得られた伝達関数は元の伝達関数と一致しないのが普通である.このずれを最小にするフィルタ構造を合成するために,係数の感度を定義し,その大きさが可制御性グラミアンと可観測性グラミアンによって表わされること,及び等価変換行列に左右されることを示し,状態変数にスケーリングの制約がない場合及びある場合について,それぞれ感度最小フィルタ構造の合成法を開発した.次に,多次元巡回形ディジタルフィルタに対するリアプノフ安定定理を導出し,この条件が成立するための必要十分条件を導いた.さらに,有限語長実限に起因する加算のオーバーフローによるリミットサイクルが発生しないための十分条件を示した.これらは従来の理論を特別な場合として含む,安定な一般的なものである.また,この多次元リアプノフ安定定理に基づく多次元巡回形ディジタルフィルタの設計法も開発した.多次元情報の高速処理については2種類の並列処理方式を考案した. 1つは多次元データの1標本点に1つのプロセッサを対応させ,複数の標本点を同時に処理する方式である.他の1つは1標本点を複数のプロセッサで処理する方式である.これらの併用により高並列処理が可能になる.試作機では,プロセッサとしてDSP4台の他にホストとしてPCー9801を用いている.ホストは各メモリへのプログラム,データの書き込み, DSPのセット及びリセット,処理結果の回収等を行う.2種類の並列処理方式を実現するために, 2つのデータバスが用意されている.1つは完全結合方式でDSP間のデータ転送が効率よく行われる.他は,各メモリとも4つのDSPからアクセスできるが,読み出しと書き込みとではアクセス方法が異なるものである.現在,この実験システムは試作中である.
グローバル人材育成のための学際的ヒューマンライツ教育の創出－日英米の比較を基に－

グローバル化する社会の中で、構成員である私たちが多文化理解を深め、共生関係を構築するために、『人権の共通価値化』を図ることが課題である。この課題の解決には、人権の普遍性を表面的に学ぶだけでなく、地域固有の人権問題を位置づける教育、いわゆる『学際的人権教育』が有効かつ必要であると考える。しかし、日本では高等教育における人権教育の方針が確立しておらず、大学や教員の裁量により展開されている。このような現状をふまえ、本研究では『グローバル人材の育成』という観点から、日本の人権教育の実態を批判的に分析し、英米の人権教育の成果を融合させながら、新たな枠組みを構築・プログラムを創出し、国内外に発信する。
外国語としての英語語彙学習力の発達と指導の効果

本研究は,より効果的な英語語彙学習・指導の開発を目指して,日本人英語学習者の英語語彙学習力の調査を行った。具体的には,(1)日本人英語学習者向けに,語彙サイズテスト,英語接辞テスト,および文脈からの推測テストを開発し,(2)それぞれの知識・能力の関係性について明らかにし,(3)その発達を調査した。その結果,語彙サイズ,接辞知識,および文脈からの推測能力には,有意な正の関係が認められることが明らかとなった。さらに,本研究で作成した診断フィードバックや自主学習用教材により,学習効果が高まる可能性が示唆された。本研究は,より効果的な英語語彙学習・指導法の開発を目指して,日本人英語学習者の英語語彙学習力(語彙学習を効率的に行うための知識・スキル)の調査を行うことを主目的とする。具体的には,英語語彙力と語彙学習力(接辞知識と文脈からの推測力)との相互関係を調査する。本研究の初年度にあたる今年度は,研究のための準備期間と位置づけられ,実験で使用する言語テスト開発が主目的となった。今年度は,本研究で使用する語彙テスト(接辞テスト,文脈からの推測テスト)の準備を行った。Sasao (2013)で開発したWPT (Word Part Test)とGCT (Guessing from Context Test)を,日本人学生が受験しやすいように,指示文や例題などに日本語訳を施した。また,テスト受験者が今後の学習の参考となるように,各自の点数に基づいたフィードバックを作成した。こうして作成した2種類の語彙テストを,日本人英語学習者を対象に予備調査として実施し,さらなるテストの改良を行った。さらに,当該語彙テストの効果的な実施を目指して,Moodle上でオンラインで受験可能なテストの開発に取り組んだ。自信度や反応時間のデータが得られるように,新たなプラグインを開発中である。平成27年度は,英語語彙知識と語彙学習力との間の関係を調査するために,前年度に作成した語彙テストを実施した。具体的には,Paul Nation氏が開発したVST (Vocabulary Size Test) bilingual Japanese versionと,Sasao (2013)をもとに作成したWPT (Word Part Test)とGCT (Guessing from Context Test)を,日本人大学生を対象に紙媒体で実施した。その結果,VSTで測定される語彙知識(語の形式と意味の関係性に関する知識量)と,WPTおよびGCTで測定される語彙学習力の間には強い関係性が見られることが明らかとなった。また,オンライン上で効率的なデータ収集および迅速なフィードバックが可能となるようにWPTのCAT (Computer Adaptive Test)化を試みた。予備調査を実施した結果,CAT化することによって,紙媒体で実施するよりも少ない質問項目で信頼度の高い結果を得られることがわかった。また,調査の段階で,WPTに使用される例語や選択肢を変えても,項目難度への影響がほとんどないという結果が得られた。これはWPTの妥当性を示す一つの証拠と考えることができる。さらに,次年度の研究課題である語彙学習力への指導の効果検証の調査準備として,接辞の知識と文脈からの推測能力の指導に関する先行研究を整理した。通常の英語授業では,十分な語彙指導を行う時間的余裕がない場合が多いため,授業外時間に自学自習できるタスクの作成を行った。平成27年度に調査予定であった英語語彙知識と語彙学習力との関係性に関する実証データの収集が計画通り完了した。また平成28年度に予定している指導の効果検証に関する準備も計画通りに完了した。本研究は,より効果的な英語語彙学習・指導の開発を目指して,日本人英語学習者の英語語彙学習力の調査を行うことを目的としている。具体的な調査は以下の3点に集約される。(1)日本人英語学習者向けに,語彙サイズテスト(Vocabulary Size Test:VST),英語接辞テスト(Word Part Levels Test: WPLT),および文脈からの推測テスト(Guessing from Context Test: GCT)を開発した。(2)それらのテストを用いて,英語語彙サイズ,接辞知識,文脈からの推測能力の関係性について明らかにした。(3)接辞知識と文脈からの推測能力の発達について実証データに基づいて分析を行った。これまでの研究を通して,日本人英語学習者にふさわしいと考えられるVST,WPLTおよびGCTを作成し,さらに,語彙サイズ,接辞知識,および文脈からの推測能力には,中程度以上の関係が認められることが明らかとなった。最終年度である平成28年度は,とくに上記(3)に焦点を当てて実証研究を行った。具体的には,英語接辞および文脈から推測する際の手がかりを一覧にまとめた学習用教材を自主学習させることにより,接辞知識および推測能力がどのように発達するかについて調査した。約3か月の間隔をあけてテストを実施した結果,成績の有意な向上が見られた。自習教材を配布しなかった統制群についても,実験群より劣るものの,有意な成績の向上が認められた。このことから,WPLTおよびGCTを受験し,接辞知識や未知語推測における診断フィードバックを受け取ることによって,当該知識・能力への意識が向上し,学習効果が高まる可能性が示唆された。

具体的には,(1)日本人英語学習者向けに,語彙サイズテスト,英語接辞テスト,および文脈からの推測テストを開発し,(2)それぞれの知識・能力の関係性について明らかにし,(3)その発達を調査した。その結果,語彙サイズ,接辞知識,および文脈からの推測能力には,有意な正の関係が認められることが明らかとなった。さらに,本研究で作成した診断フィードバックや自主学習用教材により,学習効果が高まる可能性が示唆された。今年度の計画は,本研究で使用する語彙テストの開発であった。予備調査を通して,次年度以降の調査研究のための準備が予定通り行えた。研究計画当初は,対面指導による効果検証を行う予定であったが,通常の英語授業においては語彙指導に割くことのできる時間が極めて少ないため,対面指導を実際の授業に導入するのは現実的に難しいということが,調査を進めるに従い明らかとなった。よって,学習者が自学自習により学習を進められるタスクの開発を行い,その効果検証を行うこととする。応用言語学平成27年度は,当初の予定通り,作成した2種類の語彙テストと,すでに多くの研究がなされているPaul Nation氏による語彙サイズテスト(Vocabulary Size Test)を実施し,それらの相互関係を調査する。平成27年8月と平成28年3月に開催された国際学会に出席予定であったが,校務のため出席できなかった。そのため,旅費の一部を次年度に繰り越した。指導の効果の調査のために,当初は携帯型電子黒板とタブレット端末の購入を予定していたが,携帯端末を利用したタスク型の指導が行える可能性が出てきたため,購入を先延ばしにした。タスク型指導の方が,学習・指導の統制がとりやすく,学習履歴の分析が可能である等の利点があるが,実行可能性の観点から,本研究の計画に含めていなかった。情報工学を専門とする学生の協力を得ながら,予算の範囲内で本研究に必要な機能を実装したプログラムを開発することが可能か協議を行う予定である。今年度は国際学会に出席し,研究成果の発表を行う予定である。携帯端末を利用したタスクの作成への謝金に使用する予定である。本研究において必要な機能を実装できない,または予算的に不可能であると判明した場合は,当初の予定通り携帯型電子黒板とタブレット端末の購入し,調査研究を進めていく。
慢性骨髄性白血病の原因遺伝子産物(Bcr-Abl)と14-3-3の相互作用

Bcr-Abl蛋白質キナーゼは、慢性骨髄性白血病(CML)の患者で、染色体転座によって活性化されたセリン/スレオニン/チロシンキナーゼである。本研究では、このBcr-Ablキナーゼに結合し、このキナーゼでリン酸化されることが報告されている14-3-3蛋白質(以下14-3-3)をモデルとして、両蛋白質の相互作用に関わる構造上の特徴を明らかにすることを主目的とした。バキュロウイルス/昆虫細胞タンパク質発現系を用いて調製したBcrキナーゼとさまざまの14-3-3部位欠質体との相互作用を解析した結果、14-3-3のアミノ酸番号で171-213の領域がBcrキナーゼとの結合に本質的であることが分かった。この領域はトリプトファン水酸化酵素に対する14-3-3の結合領域として以前に同定したもの(box1と命名;Ichimura et al.,JBC,1995)と完全に一致しており、box1がBcrキナーゼに対しても共通の結合領域であることが明らかとなった。さらに、この結合はBcrの自己リン酸化に依存したものであり、フォスファターゼ処理したBcrには14-3-3とbox1はもはや結合しなかった。一方、Bcrキナーゼに結合した14-3-3或いはbox1は、Bcrのキナーゼ活性を何ら修飾しなかった。このことは、Bcrキナーゼのシグナル伝達経路において、14-3-3はBcrの活性を直接制御しているのではなく、Bcrとその細胞内基質、或いはBcrと他のシグナリング蛋白質を組織化するコーディネーターとして働いている可能性を示唆した。
鼻アレルギーにおけるマトリックスメタロプロテアーゼの新たな役割

2.通年性鼻アレルギー患者の下甲介粘膜前端に抗原ディスクを置いて誘発し、30分、6時間、12時間後の下甲介粘膜を生検し、免疫組織学的にMMP2、9、13およびTIMP1、2の発現が経時的にどのように変化しているか検討し、以下のことを確認した。(1)MMP2は30分後に上皮層と固有層で増加し、12時間後に特に上皮層で増加していた。(2)MMP9は30分後に特に固有層で増加し、6時間後には特に上皮層で、12時間後にはまた固有層で増加していた。(3)MMP13は30分後に上皮層と固有層で増加し、6時間後には上皮層で、12時間後には固有層で増加していた。(4)TIMP1は、30分、6時間、12時間後のいずれでも、対照の上皮層では発現していなかったが、上皮層、固有層全てで増加していた。特に6時間後の上皮層での増加が著しかった。3.30分後の結果より、MMP2、13は鼻アレルギーの即時反応において炎症細胞である肥満細胞やT細胞の上皮内への浸潤に関与している可能性が考えられた。更に、30分後のMMP2/TIMPおよびMMP13/TIMPの比は、上皮層で7.8と8.2、固有層で1.8と1.2であったが、6時間後にはそれぞれ0.7と0.9、5と2.4であった。また、肥満細胞からの刺激で上皮細胞からMMP2、9の産生が増加することが報告されており、12時間後には再びMMP2が増加したものと考えられた。今後は更に症例数を増やし、MMPやTIMPの活性型についても検討する。1.通年性鼻アレルギー患者の下甲介粘膜において、マトリヅクスメタロプロテアーゼ(MMP)2,9,13とその抑制因子であるTissue Inhibitor of Metalloproteiases (TIMP)1、それぞれの発現を免疫組織学的に確認した。2.通年性鼻アレルギー患者の下甲介粘膜前端に抗原ディスクを置いて誘発し、30分、6時間、12時間後の下甲介粘膜を生検し、免疫組織学的にMMP2,9,13の発現が経時的にどのように変化しているか検討し、以下のことを確認した。(1)MMP2は、30分後には固有層にのみ増加しており、その後上皮層にも増加していた。(2)MMP9は、30分後に上皮層と固有層で増加し、また12時間後に固有層で増加していた。(3)MMP13は、30分後に上皮層と固有層で増加し、また12時間後に固有層で増加していた。3.30分後の結果より、MMP9,13は鼻アレルギーの即時反応において、炎症性細胞である肥満細胞やT細胞の上皮内への浸潤に関与している可能性が考えられた。また、肥満細胞からの刺激で上皮細胞からMMP2,9の産生が増加することが報告されており、12時間後の結果は、これを裏付けるものと考えられた。今後は、症例数を増やすとともに、その他のMMPやTIMPについても検討を重ねていく。また、MMPやTIMPの活性型についても検討する。
口臭原因物質である短鎖揮発性脂肪酸が歯周炎に及ぼす影響についての基礎的研究

幾つかの口臭原因物質が、生物活性を有していることが示されている。実際、私供は、口臭原因物質メチルメルカプタンが、マクロファージに対して、様々な生物活性を有している可能性を示している。また、酪産(ブチル酸)を中心とした揮発性脂肪酸も強い悪臭物質で、口臭に関与することが報告され、さらに、種々の細胞に対して、アポトーシスを誘導することが示されている。しかしながら、ブチル酸のマクロファージに関する作用につての検討はほとんど無い。そこで、ブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸が、歯周炎の病態形成に関与する病原性因子として機能するか否か検討することは意義あることと考え、昨年度、検討を行った。その結果、炎症を終焉に誘導する物質として注目されている一酸化窒素(Nitric oxide; NO)により誘導されるマクロファージ様細胞RAW264.7細胞のアポトーシスを、揮発性脂肪酸であるブチル酸が抑制した。故に、この揮発性脂肪酸が、RAW264.7細胞のアポトーシスを強く抑制するメカニズムを検討した。その結果、以下の知見を得た。RAW264.7細胞において、酪酸はNOによって誘導されるcytochrome cの放出とcaspaseの活性化を阻害したが、NO誘導性癌抑制遺伝子p53とアポトーシス促進性タンパク質Baxの発現を抑制しなかった。酪酸は、アポトーシス抑制タンパク質のBcl-2の発現を誘導した。このBcl-2のanti-sense oligonucleotideを用いた実験から、酪酸誘導性Bcl-2が、NOによって誘導されるRAW264.7細胞のアポトーシスに重要な役割を担っている可能性が明らかとなった。幾つかの口臭原因物質は、すでに、生物活性を有していることが明らかにされている。実際、私の属する研究グループも、口臭原因物質メチルメルカプタンが、マクロファージに対して、様々な生物活性を有している可能性を示している。しかしながら、ブチル酸のマクロファージに関する作用についての検討はほとんど無い。そこで、ブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸が、歯周炎の病態形成に関与する病原性因子として機能するか否か検討することは意義あることと考えた。故に、口臭原因物質である揮発性脂肪酸が、マクロファージの活性化誘導作用と本細胞のアポトーシスの抑制作用を有するか否かについて詳細に検討することを企画した。1.RAW264.7細胞のアポトーシスに及ぼすブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸の作用炎症を終焉に誘導する物質として注目されている一酸化窒素(Nitric oxide;NO)により誘導されるRAW264.7細胞のアポトーシスが、揮発性脂肪酸の一つであるブチル酸が抑制した。2.ブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸がRAW264.7細胞の炎症性サイトカインを誘導するか否かの研究RAW264.7細胞の炎症性サイトカイン(TNF-alphaとIL-1)の発現に、ブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸は、全く影響しなかった。幾つかの口臭原因物質が、生物活性を有していることが明らかにされている。

そこで、ブチル酸を中心とした揮発性脂肪酸が、歯周炎の病態形成に関与する病原性因子として機能するか否か検討することは意義あることと考え、昨年度、検討を行った。その結果、炎症を終焉に誘導する物質として注目されている一酸化窒素(Nitric oxide; NO)により誘導されるマクロファージ様細胞RAW264.7細胞のアポトーシスを、揮発性脂肪酸であるブチル酸が抑制した。故に、この揮発性脂肪酸が、RAW264.7細胞のアポトーシスを強く抑制するメカニズムを検討した。その結果、以下の知見を得た。RAW264.7細胞において、酪酸はNOによって誘導されるcytochrome cの放出とcaspaseの活性化を阻害したが、NO誘導性癌抑制遺伝子p53とアポトーシス促進性タンパク質Baxの発現を抑制しなかった。酪酸は、アポトーシス抑制タンパク質のBcl-2の発現を誘導した。このBcl-2のanti-sense oligonucleotideを用いた実験から、酪酸誘導性Bcl-2が、NOによって誘導されるRAW264.7細胞のアポトーシスに重要な役割を担っている可能性が明らかとなった。
教育研究機関における労働安全衛生の管理に関する研究

平成16年3月に国立大学93校を対象にして、独立法人化に伴う労働安全衛生の管理状況をアンケート調査した。国立大学法人35校、150学部より回答があった。「化学物質の取り扱いなし」の36学部と「化学物質の取り扱いあり」の114学部に分類し労働安全衛生管理の状況を検討した。結果を要約すると、(1)安全衛生委員会「あり」の割合は「化学物質の取り扱いあり」の学部で78%、「化学物質の取り扱いなし」の学部で74%と著しい違いは認められなかった。(2)一般健康診断の実施率は「化学物質の取り扱いあり」の学部と「化学物質の取り扱いなし」の学部はいずれも97%以上の高率であった。(3)労働衛生保護具の利用率は「化学物質の取り扱いあり」の学部で86%と高率であった。(4)労働安全衛生教育「あり」の割合は「化学物質の取り扱いあり」の学部で43%に認められた。(5)化学実験をしている時、ヒヤリ体験や事故を起こしたことが「あり」の割合を観察した。「化学物質の取り扱いあり」の学部の研究者で39%、学生で49%がヒヤリ体験や事故を起こしたことが「あり」であった。本研究の結果より、労働安全衛生法による管理組織は各国立大学法人で整備されているが明らかになった。今後の方向性としては安全衛生マネジメントシステムが導入して安衛法の管理組織と連携させることが大学の研究現場の実態としての安全管理が推進できると考えられる。「化学物質の取り扱いあり」の学部の学生の半分近くがヒヤリ体験をしていることから、これらのヒヤリ体験が現場のリスク低減に繋げる仕組みが大きな事故を防止する上で効果的ある。また、研究現場がこのようなヒヤリが起こりうるようなリスクを抱えている現状であることから、これを改善する対策が求められる。安全衛生マネジメントシステムはこのようなリスク低減に研究室全員で取組む自主管理システムであるので、このようなシステムの導入の効果が期待される。【背景】国立大学の独立法人化に伴い、各大学においては労働安全衛生法が平成16年4月1日より適用される。本研究は教育研究機関の学生及び教職員の健康と安全の確保、快適な作業環境の形成、健康増進を図ることを目的として、教育研究機関における労働安全衛生の管理状況を調査する。【方法】1.対象となる教育研究機関:平成15年度全国大学一覧(文教協会)より国立大学93校を選択した。全国大学一覧に記載してある大学本部の住所と学部数を確認した。2.労働安全衛生に関する調査票:国立大学における労働安全衛生の管理状況を調査するために調査票を作成した。調査項目は(1)大学名、(2)学部名、(3)学部教職員数、(4)学部学生数、(5)健康診断の有無、(6)作業環境測定の有無、(7)労働衛生保護具装着の有無、(8)労働安全衛生管理組織の有無、(9)取り扱っている化学物質数、(10)労働安全衛生教育の有無、(11)化学実験をしているときの事故の有無、である。3.調査票の郵送と回収:各学部の労働安全衛生担当者宛の調査票を大学本部に一括して郵送する。各学部が記入した調査票は大学本部より一括して本研究班の事務局へ返送する。協力依頼の文書に文部科学省科学研究費特定領域研究「環境安全学の創成と教育プログラムの開発」が作成したパンフレット「環境安全学を礎に-環境安全に係わる教育システムの開発-」を同封し、本研究の理解と調査票の回収率の向上に努める。

【結果】平成16年3月15日に国立大学93校に調査票を郵送した。各大学からの調査票回収は平成16年4月17日の予定である。【背景】国立大学の独立法人化に伴い、各大学においては労働安全衛生法が平成16年4月1日より適用された。本研究は教育研究機関の学生及び教職員の健康と安全の確保、快適な作業環境の形成、健康増進を図ることを目的として、教育研究機関における労働安全衛生の管理状況を調査した。【方法】1.対象となる教育研究機関:平成15年度全国大学一覧(文教協会)より国立大学93校を選択した。2.労働安全衛生に関する調査票:国立大学における労働安全衛生の管理状況を調査するために調査票を作成した。調査項目は(1)大学名、(2)学部名、(3)学部教職員数、(4)学部学生数、(5)健康診断の有無、(6)作業環境測定の有無、(7)労働衛生保護具装着の有無、(8)労働安全衛生管理組織の有無、(9)取り扱っている化学物質数、(10)労働安全衛生教育の有無、(11)化学実験をしているときの事故の有無、である。3.調査票の郵送と回収:平成16年3月に国立大学93校に調査票を郵送した。平成16年4月に各大学から調査票を回収した。学部を理系学部、文系学部に分類し、労働安全衛生管理の状況を検討した。【結果】1.平成16年4月に35校、150学部(理系学部112、文系学部38)より回答があった(回収率35%)。2.安全衛生委員会「あり」の割合は理系学部で78%、文系学部で74%と著しい違いは認められない。3.化学物質を取り扱っている学部は理系学部で95%以上、文系学部で20%未満と理系学が著しく多い。4.一般健康診断の実施率は理系学部で100%、文系学部で97%と著しい違いは認められない。5.労働衛生保護具の利用率は理系学部で82%、文系学部で18%と理系学部が著しく多い。6.労働安全衛生教育「あり」の割合は理系学部で41%、文系学部で13%と理系学部の方が多い。7.化学実験をしているときひやり体験や事故を起こしたことが「あり」の割合は、理系学部で38%、文系学部で5%と理系学部の方が多い。平成16年3月に国立大学93校に、独立法人化に伴う労働安全衛生の管理状況をアンケート調査した。国立大学法人35校、150学部より回答があった。「化学物質の取り扱いなし」の36学部と「化学物質の取り扱いあり」の114学部に分類し労働安全衛生管理の状況を検討した。結果を要約すると、(1)安全衛生委員会「あり」の割合は「化学物質の取り扱いあり」の学部で78%、「化学物質の取り扱いなし」の学部で74%と著しい違いは認められなかった。(2)一般健康診断の実施率は「化学物質の取り扱いあり」の学部と「化学物質の取り扱いなし」の学部はいずれも97%以上の高率であった。(3)労働衛生保護具の利用率は「化学物質の取り扱いあり」の学部で86%と高率であった。(4)労働安全衛生教育「あり」の割合は「化学物質の取り扱いあり」の学部で43%に認められた。(5)化学実験をしている時、ヒヤリ体験や事故を起こしたことが「あり」の割合を観察した。
ヘルペスウイルスが発現するリン酸化酵素の生理機能の解明

本研究により、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)がコードするリン酸化酵素(ORF36)はE2Fの転写活性化を行い、細胞周期のG1期からS期移行を促進していることを明らかにした。つまり、ORF36はRbをリン酸化し、このリン酸化はRbからのE2Fの遊離とE2F活性化を誘導することが明らかにした。次に、KSHVがコードするORF21、ORF36、ORF73(LANA)の細胞内における分解と動態について解析を行った。その結果、ORF21、ORF36、ORF73は全て短寿命であるが、ORF73のC末端側断片は非常に安定であり、ORF73のC末端側断片はミトコンドリア蛋白質であるp32前駆体と結合し、p32のミトコンドリア内での成熟と機能(アポトーシス亢進活性)を阻害することを見いだした。また、KSHVの増殖抑制活性を有する化合物(抗KSHV化合物)の探索も実施した。1994年に発見され、γヘルペスに属すカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)は、感染者の免疫不全時に、B細胞性リンパ腫やカポジ肉腫等の日和見腫瘍を起こす。KSHVは、既存の抗ヘルペスウイルス薬であるアシクロビル(ACV)やガンシクロビル(GCV)に抵抗性を有することから、KSHVに対する有効な抗ウイルス薬の開発が急務とされている。我々はKSHV感染がん化B細胞に対して、高いウイルス選択性と殺細胞活性を有するヌクレオシド誘導体類を開発している。これら核酸代謝拮抗薬のウイルス選択性はKSHVの発現するチミジンリン酸化酵素(ORF21)やリン酸基転移酵素(ORF36)によるモノリン酸化効率と推測されるが、その真偽や作用機序は不明である。また、KSHVのORF21とORF36の基質特異性や生理的基質が明らかになれば、それらの情報は抗KSHV薬設計や開発を行なうための有益な情報となる。そこで、我々はKSHVのORF21とORF36の基質特異性の解析や、生化学的な機能解析を行なった。ACVと我々の開発した核酸誘導体類をin vitroリン酸化反応の基質に用い、KSHVの発現するチミジンリン酸化酵素(ORF21)によるリン酸化を行い、逆相HPLC(C30)により各ヌクレオシド誘導体類のモノリン酸化効率を測定した。その結果、KSHVのORF21はHSV-1のTKと比較すると、ACVのモノリン酸化活性が顕著に低いことが明らかになった。さらに、KSHVのORF21は我々の抗KSHV化合物をモノリン酸化することから、抗KSHV化合物のウイルス選択的な殺細胞活性は、ORF21によるモノリン酸化作用に起因することが明らかになった。一方で、KSHVのORF36の機能解析により、ORF36はORF36がE2F依存的転写活性化に関与し、KSHV感染細胞の細胞周期のG1期からS期移行を促進していることを明らかにした。また、NF-kB、Wnt、E2F、AP-1、STAT等のルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を用いたプロモーター解析によりORF36がE2F経路の転写活性化を亢進することを明らかにしている。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)は、感染者の免疫不全時に、B細胞性リンパ腫やカポジ肉腫等の日和見腫瘍を起こす。また、KSHVに対して有効な抗ウイルス剤は見つかっていないことから、抗KSHV薬の開発が急務とされている。抗ヘルペスウイルス薬ACVやGCVなどの核酸代謝拮抗薬のウイルス選択性はKSHVの発現するチミジンリン酸化酵素(ORF21)やリン酸基転移酵素(ORF36)によるモノリン酸化効率と推測されるが、その真偽は不明である。また、KSHVのORF21とORF36の生理的基質が明らかになれば、それらめ情報は抗KSHV薬設計や開発を行なうための有益な情報となる。そこで、我々はKSIWのORF21とORF36の基質特異性解析と機能解析を行った。その結果、KS田に対して増殖抑制活性を持つ核酸代謝拮抗化合物としてGCVとソリブジンを見出した。さらに、HeLa細胞にKSHV ORF21を恒常的に発現させたORF21-HeLa細胞を用いて、GCVの殺細胞活性を測定した結果、ORF21はGCVをモノリン酸化してHeLa細胞のDNA複製を阻害していた。

これらの結果より、核酸を骨格とする抗KSHV薬の開発において、KSHVのORF21はウイルス特異性を薬物が発揮するための絶好の標的分子となることが明らかとなった。一方で、KSHVのORF36の機能解析により、ORF36はpRbと結合し、さらにpRbをリン酸化することを明らかにした。また、pRbのリン酸化は、E2FのpRbからの遊離を促進しE2Fの転写活性化を促進していることが明らかにされた。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)は健常者に感染すると深刻な疾患を起こさずに潜伏感染し、エイズや免疫抑制剤投薬下等の免疫不全時にカポジ肉腫やB細胞性リンパ腫を引き起こす。しかし、KSHVは発見されてから17年しか経っていないため、その感染や発がんの仕組みなど不明な点が多い。また、有効な抗KSHV薬が無いため、その開発が期待されている。そこで、本研究ではKSHVゲノムがコードするウイルス性リン酸化酵素(ORF21およびORF36)に焦点をあて、KSHVリン酸化酵の生理機能や細胞内における動態の解析と抗KSHV薬の開発を実施した。今までの研究により、ORF36はE2Fの転写活性化を行い、細胞周期のG1期からS期移行を促進していることを明らかにした。なお、転写因子であるE2Fは、がん抑制遺伝子産物Rbに結合されると不活性化されているが、RbがCDK/サイクリン複合体によりリン酸化されると、E2FはRbから遊離し転写因子として機能する。今年度の研究において、ORF36はRbをリン酸化し、このORF36によるRbのリン酸化はRbからのE2Fの遊離とE2F活性化を誘導することが明らかにされた。次に、KSHVがコードするORF21、ORF36、ORF73(LANA)の細胞内における分解と動態について解析を行った。その結果、ORF21、ORF36、ORF73は全て短寿命であり、細胞内のユビキチン・プロテアソーム系で分解されていた。さらに、ORF73のC末端側断片は非常に安定であり、分解を免れたORF73のC末端側断片はミトコンドリア蛋白質であるp32前駆体と結合し、p32のミトコンドリア内での成熟(プロセッシング)と機能(アポトーシス亢進活性)を阻害することを見いだした。最後に、我々はKSHVの増殖抑制活性を有する化合物(抗KSHV化合物)の探索を行い、プロテアソーム阻害薬(MG132、PSI、ラクタシスチン)、アデノシン誘導体であるsangivamycin、および、HSP90阻害剤のゲルダラマイシン(GA)、ラディシコール、GAの誘導体17-AAGを抗KSHV化合物として同定した。
近代日本と地方企業家-諸井恒平の企業家活動

本年度は、本研究(「近代日本と地方企業家-諸井恒平の企業家活動-」)の最終年度であった。そこで、夏休みまでは資料調査などに時間を割いたが、夏休み後は実績報告書の作成に集中した。諸井恒平の中心的な事業は、煉瓦製造事業、鉄道事業、及びセメント製造事業であったが、それだけにとどまらず恒平は武蔵水電・帝国電灯などの電灯事業にも関係していた。また、日本工業倶楽部の設立にも尽力し、鉄道事業でも秩父鉄道だけでなく、西武鉄道や東京大宮電気鉄道などの、いわゆる都市近郊鉄道の経営にも関係していた。このように恒平の企業家活動はきわめて広範にわたっていたため、資料調査の範囲も当初構想していたよりも広域化することになった。とくに、諸井恒平の秩父鉄道以外の鉄道業や電灯事業への関わりについては、これまでほとんど明らかにされていないので資料調査にかなり時間を割かなければならなかった。日本工業倶楽部との関係については、幸いかなりの文献を集めることができた。また、『恒平日誌』についても解読を進めることができた。しかし、以上のような成果にもかかわらず、実績報告書は日本煉瓦・秩父鉄道・秩父セメントにおける諸井恒平の企業家活動を中心にまとめざるを得なかった。『恒平日誌』の残りの部分の読解とともに、まとまった研究成果を発表するには3年間は余りに短かすぎた。本研究での成果を踏まえてさらに研究を進め、諸井恒平の企業家活動の全貌を明らかにすることは今後の課題としたい。本年度は、諸井恒平にかかわる基本的な資料の整理と収集に重点を置いた。まず、諸井が1885年から1941年までほとんど休まずに記していた『諸井恒平日誌』の解読をアルバイトを利用しながら進めた。当初は、『日誌』をすべて解読しようと思っていたが、作業を進めていくうちに、量が膨大でしかも解読がかなり困難なため、とても3年間という限られた期間ではすべてを解読できないということがわかり、重点的に解読を進めることにした。『日誌』の不備は、諸井家及び埼玉県立文書館などの機関が所蔵する資料で補うことにした。資料調査は、諸井家、埼玉県立文書館のほか、福島県立図書館、猪苗代水力発電所、山梨県立図書館、山梨県庁、山梨県史編纂室、長野県立図書館などに及んだ。また、国立国会図書館では『大日本窯業協会雑誌』の煉瓦・セメント業関係の記事を収集し、『東京経済雑誌』『東洋経済新報』『ダイヤモンド』などの雑誌からも諸井が関係した企業や産業関係の資料を収集した。雑誌記事の収集は、さらに継続する必要があるが、かなり興味深い資料を収集することができた。書籍についても、日本工業倶楽部関係のものも含めて貴重なものを購入することができた。諸井恒平は、日本煉瓦製造、秩父鉄道、秩父セメント、武蔵水電、旧西武鉄道、帝国電灯、東京大宮電鉄、小倉石油などの諸企業の経営に携わった地方企業家である。しかも、諸井は単なる地方企業家にとどまらず、日本工業倶楽部の理事を務めるなど旺盛な財界活動をも展開し、渋沢栄一の思想的影響を強く受けた企業家の一人でもあった。そのため、資料調査の範囲も多岐にわたったが、今後もできる限り諸井関係資料は収集していかなければならない。本年度も、以下のように昨年度に引き続き資料の調査・収集に重点を置いた研究を実施した。まず、『諸井恒平日誌』の解読を進めた。解読に当たっては、アルバイトを使用した。しかし、『諸井恒平日誌』は、膨大な量にのぼるばかりでなく、かなりの細かい字でぎっしりと書かれているため、解読は困難をきわめた。そのため、限られた時間と限られた予算ですべてを解読することは不可能と判噺し、解読する年次を重点化することにした。本年度は昭和初年のものを重点的に解読した。というのは、明治期の諸井恒平の事業活動については、『日本煉瓦百年史』などの執筆を通じてある程度明らかになっているからである。第2は、諸井恒平の個人資料の整理・収集である。

諸井恒平の個人資料は、諸井家に残されており、目録まで整備されている。そのため、調査・収集作業は比較的容易であった。第3は、諸井恒平が関係した企業の資料調査と収集である。諸井恒平は、埼玉県本庄に生まれ、日本煉瓦製造、秩父鉄道、秩父セメント、武蔵水電、旧西武鉄道、帝国電灯、車京大宮電鉄、小倉石油などの諸企業の経営に携わっている。すなわち、諸井恒平の事業活動の範囲は窯業、鉄道業、電力業、石油業などに及び、かなり広範な事業活動を展開していた。そのため、今年度は各地の公文書館などで、諸井がかかわった事業に関する資料をできる限り集めることにした。その結果、電力業についてはかなりの資料を収集することができた。最後に、日本工業倶楽部など当時の経済団体の資料や文献を収集した。諸井は、財界活動にもきわめて熱心であったからである。本年度は、『諸井日記』の解読を進めるとともに、諸井恒平が営んできた事業に関する若干の補充調査を行った。諸井恒平の企業家活動は、煉瓦製造事業、鉄道事業及びセメント製造事業を中心に展開されていた。諸井恒平が取り組んだこれらの事業は、それぞれ日本煉瓦、上武(秩父)鉄道及び秩父セメントという企業を通じて営まれた。恒平は、埼玉県を事業基盤として企業家活動を展開したのであるが、これらの事業はその代表的なものであり、それぞれが有機的に結合していた。すなわち、恒平は日本煉瓦の経営の中で輸送問題の重要性を認識し、その後上武鉄道の経営に入っていった。そして、それは恒平がセメント事業への参入を考えるようになるのとほぼ同じ時期であった。セメント事業に参入して、秩父セメントを設立してからは秩父鉄道がセメントの輸送手段として重要な役割を果たすことになったのである。第二次大戦後、恒平が育てたこれらの事業は、秩父セメントを中核とする秩父セメントグループの事業として発展した。しかし、諸井恒平の企業家としての活動はこれだけにとどまらなかった。恒平は武蔵水電・帝国電灯などの電灯事業、西武鉄道・東京大宮電気鉄道などの鉄道事業にも関係した。また、日本工業倶楽部の設立にも尽力した。本年度は、こうした諸井恒平の企業家活動に関する成果報告書の執筆に全力を注いだ。
狂犬病ウイルスの神経病原性発現の分子的基盤-宿主細胞因子の解析

本研究では狂犬病ウイルスの病原性の発現にかかわるウイルスの侵入過程について、ウイルス側および宿主細胞側の因子について解析を行った。特に次の3つの項目に分けて述べる。(1)中性pHでの膜融合にかかわる細胞因子について、従来の研究から細胞因子として、少なくともアセチルコリンレセプターが狂犬病ウイルスの感染の初期過程に促進的に働くことが示唆されているので、ウイルスによる中性pHにおける膜融合に不可欠の神経特異的な細胞因子としてもアセチルコリンレセプターがかかわっているという仮定のもとに研究を行った。この目的のためにアセチルコリンレセプター遺伝子(αおよびβサブユニット遺伝子)のクローニングを行った。クローン化した遺伝子を発現させてアセチルコリンレセプタータンパク質を作らせてウサギを惑作し抗血清を作成した。この抗血清を用いて狂犬病ウイルスの神経由来の細胞における感染ブロック試験を行ない期待する成果を得た。現在α、β遺伝子を非神経由来の細胞に発現させて狂犬病ウイルスに対する感受性を検討している。NA細胞ではレセプターの発現と感受性は相関性を示した。(2)膜融合ドメインの検討.HIVやハシカウイルスの膜融合タンパクと類似のアミノ酸配列をもつ領域を狂犬病ウイルスGタンパク質に見出し、この領域に点突然変異を導入したところ、Gタンパク質のもつ中性pH条件下の細胞融合能が失われる結果を得た。(3)〓上毒の変異の本質について。〓上毒の感染はNA細胞におけるレセプター発現と相関性を示した。しかし、細胞融合活性は酸性pH依存性を示したことから、神経由来の細胞に対する中性pHでの細胞融合能は神経系の細胞への馴化と関連するもので、末梢感染力とは直接関連しないものと思われる。狂犬病ウイルスの神経病原性に関与する細胞因子の同定を目差して、二つの角度から研究を進めた。まずアセチルコリン・レセプター(AChR)のcDNA作成とこれを用いた研究で,中枢神経系のニューロンのAChRは筋肉細胞のものとは異なり、α・βの二つのサブユニットから構成されているので、この二つのサブユニットをコードするcDNAの作成を進めた。まずβサブユニットのcDNAは作成できた。αサブユニットは5'側約半分のcDNAを作成できたが、目下残りの部分の仕上げを急いでいる。次に、現在までに作成できたcDNAを用いて、本課題と関連する解析を行っており、一つはAChRのcDNAをプローブとしたNortherm blot解析で、神経系由来の腫瘍細胞(NA細胞)をNa-butyrateで処理した時の神経細胞特異的な遺伝子発現と、狂犬病ウイルスGタンパクによるNA細胞の被融合能の穫得との時間的、量的な関連性を調べている。cDNAを用いたもう一つの解析はAchRのcDNAをレトロウイルス系発現ベクターに組込み、AChRを発現しない非神経系由来BHK細胞にAChR遺伝子を導入する研究で、既に作成したAChR-β遺伝子を発現ベクターを用いてAChR常時発現細胞の樹立を試みている。病原性の有無と中性pHでの細胞融合能との関連性について別の角度からも研究した。AChRがウイルスによる細胞融合に関与するのなら、AChRをもつ筋肉細胞に対しても狂犬病ウイルスが中性pHにおいて細胞融合作用を示すかどうかを調べた(狂犬病ウイルスは筋肉細胞でもよく増殖する)。AChRを発現する横紋筋由来の腫瘍細胞及びAChRを発現しない細胞株を用いて、狂犬病ウイルスの中性pH条件下での細胞融合能、並びにエンドソーム内pHが低下しない条件下でのウイルス感染の成立を調べたところ、このような条件下で病原型ウイルス株の感染が成立するのは、AChRを発現している細胞だけであり、一方非病原性株はエンドソーム内pHが低下する条件下でしか感染が成立しないことがわかった。

本年度の研究では、まず神経芽腫細胞(NA)と狂犬病ウイルス野性株(いわゆる街上毒)との相互作用について解析を行った。NA細胞はブチル酸ソーダで処理することにより細胞分化形質の発現を誘導すると街上毒に対する感受性が高まると同時にアセチルコリンレセプター(AChR)遺伝子の発現も大きく増加することがわかった。またNA細胞の分化誘導によりAChRの種々のサブユニットのうち、α_3およびβ_2が発現することが示された。これに対して脳内継代により末梢感染力を失った狂犬病ウイルス実験室株(いわゆる固定毒,例えばTEP株やERA株がある)に対して、NA細胞は分化誘導をさせなくても十分に高い感受性を示した。一方、比較として非神経由来のBHK-21やCOS-7細胞について調べると、これらは固定毒に対しては十分に高い感受性を示すのに対して、街上毒に対する感受性は非常に低いことがわかった。従って、このような細胞を用いることにより、神経細胞に特異的な因子を固定することが可能になることが示唆された。この問題と関連して、昨年度から引き続き行ってきたAChRのα_3およびβ_2サブユニットの遺伝子のクローニングの作業は本年度の初めに完成した。次にこれらの遺伝子を大腸菌で発現させてその産物の大きさを調べたところ期待するものが作られることがわかったので、これを精製して、免を免疫し抗AChR抗血清を作成することができた。次にこの抗血清を用いて、NA細胞における狂犬病ウイルスの感染に及ぼす阻止効果を調べたところ、感染が有意に阻止されることが分った。以上に述べた実験結果はAChRが狂犬病ウイルスの感染の成立に重要な関わりを持つことを示すものである。この結論を確かめるために、現在AChR α_3,β_2両遺伝子をCOS-7細胞に発現させて街上毒の感染効率に及ぼす効果を調べる作業を進めている。今の段階では両サブユニットとも発現がみられるが、同一の細胞でうまく発現させる工夫が必要となっており、今後の研究課題である。
新機能の導入による食品蛋白質の設計と改造

食品蛋白質の酵素消化によって種々の生理活性を持ったオリゴペプチドが派生する。このようなペプチドを探索するとともに、将来、遺伝子の塩基配列を置換することによって機能性のより優れた食品蛋白質を生産するための基盤として、得られた生理活性ペプチドについてアミノ酸残基を置換、または削除した誘導体を合成し、それらの構造-活性相関を検討した。牛乳κ-カゼインからトリプシン消化によって派生するcasoxin C(Tyr-lle-Pro-lle-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg)はオピオイドアンタゴニスト活性、回腸収縮活性、動脈収縮および弛緩活性をもつ多機能性ペプチドである。本ペプチドのC末端5残基とラミニンペンタペプチド(Tyr-lle-Gly-Ser-Arg)との間にはホモロジーが見られる。casoxin CおよびそのC末端ペンタペプチドはラミニンペンタペプチドのようなガン転移阻害活性を示さなかったが、ラミニンペンタペプチドと一致するように2残基を置換して合成した[lle^7,Gly^8]-casoxin Cはガン転移阻害活性を示した。人乳αsi-カゼイン由来のcasoxin D(Tyr-Val-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe)は内皮依存性の動脈弛緩活性を有するペプチドであり、自然発症性高血圧ラットに静脈内投与した際には、血圧降下作用を示す。casoxin Dはブラジキニンレセプターに結合し、内皮由来弛緩因子としてプロスタサイクリンの放出を介して作用する。合成種々のcasoxin D誘導体のうち、Tyr-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe、Val-Val-Phe-Pro-Pro-Phe、およびTyr-Val-Phe-Pro-Pro-Pheはそれぞれ、casoxinDの約1/4,1/7および1/10の濃度で動脈弛緩活性を示した。特にTyr-Pro-Phe-Pro-Pro-Pheは経口投与の際にも血圧降下作用を示した。一方、Tyr-Pro-Phe-Pro-Pro-Leuはcasoxin Dの数万分の1の濃度で動脈弛緩活性を示し、しかもその際の内皮由来弛緩因子はプロスタサイクリンではなく一酸化窒素(NO)であった。その他、小麦グルテン消化物からオピオイドペプチドを単離し、1残基の置換によってさらに高い活性をもった誘導体を得ることに成功した。遺伝子の塩基置換によって,よりすぐれた生体調節機能を具えた食品蛋白質を設計,生産するための基盤として,カゼインから我々が既に単離している生理活性ペプチドについて,アミノ酸残基を置換した誘導体を合成し,どのようなアミノ酸残基の置換,さらには遺伝子の塩基置換が望ましいかを推定した。牛乳κーカゼインのトリプシン消化により派生するcasoxin C(TryーIIeーProーIIeーGlnーTyrーValーLeuーSerーArg)は種々の生理活性を持った多機能性ペプチドである。本ペプチドのC末端

5残基とガン転移阻害活性を持つラミニンペンタペプチド(TyrーIIeーGlyーSerーArg)の間にはホモロジ-が認められるが,casoxin Cそのものはガン転移阻害活性を示さなかった。そこでcasoxin CのLeuをGlyに,またValーLeuをIIeーGlyに置換したペプチドを化学合成したところ,後者はガン転移阻害活性を示した。一方,この置換ペプチドは,casoxin Cが本来持っていたオピオイドアンタゴニスト活性および回腸収縮活性を示さないが,アンジオテンシン転換酵素阻害活性は保持していた。牛乳α_<s1>ーカゼインのペプシンーキモトリプシン消化によって派生するcasoxin D(TyrーValーProーPheーProーProーPhe)は動脈弛緩活性を持ったペプチドである。desーTyrーcasoxin Dも同様な活性を示すが,牛乳βーカゼイン中に存在し,これと2残基のみ異なるValーValーValーProーProーPheは活性を示さない。この配列を一残基置換して得られたValーValーPheーProーProーPheはcasoxin Dの約7倍の動脈弛緩活性を示した。これらの事実はカゼインのアミノ酸残基を12残基置換するための塩基置換を遺伝子に施すことにより新たな生理活性を導入しうることを示している。