hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬剤排出ポンプチャネル機能に必須な細胞外領域の発見及びそこを標的としたポンプ阻害

院内感染の主要起因菌である緑膿菌は高度多剤耐性を示すので、多くの抗生剤が効かず臨床上大きな問題となっている。本菌の多剤耐性には多剤排出ポンプが寄与し、緑膿菌ゲノムには多種類のポンプ遺伝子が存在する。しかし本菌で構成的に発現し、主要な役割を果たすのはMexAB-OprMである。このポンプは三つのサブユニットからなり、MexBは内膜でトランスポーターとして、OprMは外膜で薬剤のチャネルとして、MexAはペリプラズムでこれらタンパクを連結するリンカーとして機能する。この中でOprMに着目して、その構造機能相関に関する研究を行った。(1)OprMの機能構造相関を明らかにするため、そのオリゴマー構造、さらにそのホモログであるOprJとOprNのオリゴマー構造を調べた。その結果、OprMとOprNは三量体を形成するが、OprJは四量体であることが分かった。このようなオリゴマー構造の多様性は排出機能に密接に関連すると考えられるが、その分子的意義はこれからの課題である。(2)468アミノ酸からなるOprMは細胞外に突き出した二つの小さなループ(P100P109(E1)及びR311G320(E2))をもつ。これらループの役割を調べるためにシステインスキャニングを行った。その結果、E1及びE2はともにポンプが正常に機能する上で必須であることが分かった。さらにポンプの基質認識にも関与していることが明らかとなった。(3)このような結果はポンプ阻害剤の標的として、E1及びE2が使えることを示唆する。まずループの働きを阻害する可能性のある分子としてモノクローナル抗体(mAb)を考えた。そこでE2と同じアミノ酸配列も持つペプチドを合成しマウスに免疫し、ハイブリドーマを作成した。その結果、ペプチド結合活性を有するmAbを分泌する細胞を調製する事ができた。次に、これら抗体のポンプ阻害活性を調べてゆく。緑膿菌は院内感染の主要起因菌で自然および獲得多剤耐性を示すので、化学療法が多くの場合困難となり、臨床的に大きな問題となっている。本菌の多剤耐性は多剤排出ポンプによって担われる。本菌には数種類のRND型排出ポンプが存在し、その中で主要なポンプがMexAB-OprMである。このポンプは三成分からなり、外膜で薬剤が透過するチャネルを形成しているOprMはペリプラズム側に大きなαヘリックスドメインを突き出し、膜貫通領域は透過孔をつくるβバレルからなる。また菌体外には10アミノ酸からなる二つの小さなループがあるが、これは単に膜貫通領域をつなぐものと考えられた。この考えが正しいかを検討するために、本当にこの細胞外ループがポンプ機能には関与しないかを調べた。まずOprM遺伝子をpUCPプラスミドにクローニングし、二つのループにある総計20のアミノ酸をそれぞれCysに置換した変異体を構築した。次にこれら変異体をOprM欠損緑膿菌株に導入し、得られた形質転換株が野生型と同じように薬剤耐性を回復するかどうかを薬剤感受性から調べた。その結果、第一のループの109番目のプロリンが変異したタンパクでは耐性は回復せず薬剤感受性となった。さらに第二のループのなかでもポンプ機能に影響するいくつかのアミノ酸があり、特に311番アルギニンと318番アスパラギン酸の変異は大きく薬剤感受性となった。

これらの効果が単に変異タンパクの発現が低いからという可能性もあるので、形質転換株のOprMタンパクの発現を調べた。まず菌を超音波破砕し、分画せずにそのまま電気泳動にかけ、膜にblotした後、抗OprM抗体を用いてタンパクを検出した。その結果、全ての形質転換株でOprMが安定して発現していることが確認された。以上の結果からOprMの細胞外ループはポンプ機能に重要な役割を果たす領域であることが明らかとなった。高度多剤耐性をもつ緑膿菌は多くの抗生剤が効かないので臨床上大きな問題となっており、新たな治療法の開発が切望されている。本菌の多剤耐性には多剤排出ポンプが寄与するが、緑膿菌ゲノムには多種類のポンプ遺伝子が存在する。しかし構成的に発現し、主要な役割を果たすのがMexAB-OprMである。このポンプは三サブユニットからなり、MexBは内服でトランスポーターとして、OprMは外膜で薬剤のチャネルとして、MexAはペリプラズムでこれらタンパクを連結するリンカーとして機能する。(1)OprMの機能構造相関を明らかにするため、そのオリゴマー構造、さらにそのホモログであるOprJとOprNのオリゴマー構造を調べた。その結果、OprMとOprNは三量体を形成するが、驚いたことにOprJは四量体であることが分かった。このようなオリゴマー構造の多様性は排出機能に密接に関連すると考えられるが、その分子的意義の解明はこれからの課題である。(2)468アミノ酸からなるOprMには、細胞外に出ている小さなループが二つあり、それらはP100P109(E1)及びR311G320(E2)である。驚いたことにポンプが正常に機能するにはEIとE2が必須である事が分かった。さらにこれらループはポンプの基質認識にも関与することが示された。(3)以上の結果から、ループの働きを抑制すれば、ポンプ機能の阻害につながると考えられる。そこでループの働きを阻害する物質としてモノクローナル抗体(mAb)を考えた。ループに特異的なmAbがループに結合することで、ループの働きを抑制する可能性である。そこでまずE2ループと同じ配列も持つペプチドを合成し、それをマウスに免疫し、ハイブリドーマを作成した。その培養上清にペプチド結合活性があるかを調べた結果、結合活性をもつmAbを産生する細胞の存在が確認でき、その数は17クローンであった。
阿蘇山中岳噴火に伴う地下比抵抗構造時間変化の解明

平成27年度は、ACTIVEデータから阿蘇火山の浅部比抵抗構造を推定することを目的に、第一段階として三次元順計算コードの開発を行った。当初の予定どおり、フリーソフトGmshを用いて阿蘇火山の地形を表現する四面体メッシュを作成した。四面体メッシュでは、観測データと比較可能な精度の高い計算結果を得る為、ACTIVE観測の送信電極付近と、受信機付近のメッシュを特に細かく設定できる仕様とした。一方、順計算の計算手法について、当初の計画では、磁場の誘導方程式を鉛直磁場について解くことを計画していたが、複雑な地形の下では、磁場三成分について解くことが必要であることが明らかとなり、開発方針の変更を余儀なくされた。本研究では新たに、磁場三成分をベクトルポテンシャルによって表現し計算する有限要素(FEM)法を採用し、節点要素を用いる手法(node-based FEM法)と辺要素を用いる手法(edge-based FEM法)の二種類のコード開発を開始した。平成27年度が終了した現時点において、edge-based FEM法による三次元コードの開発が完了し、地形のない層状大地において、電流水平双極子の解析解(Ward and Hohmann, 1988)を、鉛直電流を含まないPMモードにおいて精度よく再現することに成功した。今後、node-based FEM法でも開発を完了させ、精度と計算コストの両面からedge-based FEM法と比較検討し、適した計算手法を採用して阿蘇火山の地下構造の推定を目指していく。平成27年度における本研究の意義は、諸外国に比べてやや立ち遅れている、人工電流を考慮できる三次元有限要素計算手法の開発において、大きな前進を遂げた点にある。今後、この研究を引き続き進めていくことで、日本における火山電磁モニタリング計算の基礎を確立することが期待できる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
不斉機能を有する新しい金属ポルフィリン錯体

ヘム蛋白質は、蛋白質の不斉の空間内にヘムが存在するという形をしている。このようなヘム蛋白質は生体内で多くの反応の酵素となり、チトクロームP-450はその一つである。現在この酵素モデルは多く提案されているが、ヘム蛋白質の蛋白部分を模倣したモデルはない。本研究は蛋白質部分を含む新しいポルフィリン錯体を合成し、チトクロームP-450と同様のエポキシ化反応(スチレンの不斉エポキシ化)を行った。またこの結果よりヘム蛋白質の蛋白部分の効果についても考察した。蛋白部分に相当するペプチド鎖を有する、特に4本のペプチド鎖を有する錯体を例に合成例を示す。まず、ベースとなるエチオポルフィリンを硝酸亜鉛-無水酢酸系でニトロ化し、過塩素酸で脱亜鉛後、鉄を導入した。これをPd/C触媒存在下、水素源にNaBH_4を用いてニトロ基をアミノ基とし、γ-BLG・NCAと反応させて目的のモデル錯体を合成した。P-450モデル反応としてはヨードソベンゼンを酸素化剤として使用した。不斉収率の測定はシフト試薬を用いるNMR法によった。例えばγ-BLGをアミノ酸残基とした3本ペプチド鎖型のモデルにおいて反応は効率良く進行したが、不斉収率は低かった(例えば収率;60.3%でe.e.11.2%)。しかし、4本ペプチド鎖を持つ今回のモデルは収率はあまり低下させることなしに不斉収率を大きく向上させた(例えば収率;52.6%でe.e.53.8%)。このように、特定の空間配座を持たない本錯体混合物が比較的高い不斉を導いた事実は趣味深い。また鎖長の変化は不斉誘導に大きく影響し、特に重合アミノ酸数をn=2.0からn=4.4とし鎖長を延ばした時、化学収率の低下なしに不斉収率が16.9%から53.8%へと飛躍的に増加した。これは単に立体規制によって不斉が誘導されたのでなく、基質を取り込んだ際、ペプチド鎖のコンホメーションが変化し、基質を最も好ましい空間配置につかせたことを示唆している。しかしn=6.2では、多分ペプチド鎖がヘリックスをまいたためか、自由度が減り化学収率と不斉収率の双方が低下することがわかった。ヘモグロビンはヘムとグロビン蛋白質からなる。この蛋白質部分はヘムを内包し,それに疎水性の場と立体障害を与え,全体としてヘムに安定な酸素運般機能を付与しかつヘモグロビンを水溶性にする働きをしている。現在公表されているモデルはヘモグロビンの機能のいくつかを欠いており,本研究ではこの欠点を克服したヘモグロビンモデルをデザインした。以下本年度に達成された成果を記述する。1)アトロ-プ異性体の合成と分離oーシアノベンズアルデヒドとピロ-ルからテトラ(oーシアノフェニル)ポルフィリンを合成した。当初この段階でααββまたはαβαβーアトロ-プ異性体の分離を行ない,この加水分解によりシアノ基がカルボキシル基又はその酸アミド基に転化されたポルフィリンを合成した。

しかしこの経路では加水分解の段階でラセミ化が起こり,意図するアトロ-プ異性体が得られなかった。このラセミ化は,加水分解後にアトロ-プ異性体の分離を行うことで解決できた。なお加水分解反応では,シアノ基が酸アミド基に転化された。2)アトロ-プ異性体のアミド交換反応1)で合成したアトロ-プ異性体の酸アミド基に,各種アミノ酸およびジアミン(ネオペンチルジアミン)の導入を試みた。この時温度を3540°Cに保ちながら三弗化ホウ素エ-テラ-トを触媒とすると,ラセミ化が全然起こらずに所期の反応の進行することがわかった。3)金属ポルフィリン錯体の合成2)で合成したアミド化アトロ-プ異性体にFeを導入した。この反応に関しては過去にいくつかの方法が知られているが、本研究で合成したポルフィリンの場合には無水臭化第一鉄ー2,6ールチジンを用いる方法が最適であった。本年度は,生体内に存在するヘム蛋白酵素に類似した構造をもつ酵素モデルを合成し,その触媒活性を検討した。昨年度のモデルは,0ーシアノベンズアルデヒドとピロ-ルの結合に基づくポルフィリン錯体であった。本年度合成した金属ポルフィリン錯体はエチオポルフィリンに基づくものであった。先ず常法により合成したエチオポルフィリンのメソ位を硝酸ー硫酸系でニトロ化し,ついでこれを臭化鉄,2,bールチジンを用いて金属化した。さらにこの鉄ポルフィリン錯体をオ-トクレ-プ中,pd/C触媒の存在下にニトロ基のアミノ基への水素化を行い,これに一酸化炭素を通気することによってトリアミノエチオポルフィリン鉄ーカルボニル錯体を合成した。そして生成したアミノ基を開始点としてアミノ酸NCA,すなわちLーPheとγーBLAーNCAの開環重合を行い,へん蛋白貭の蛋白質に相当する部分を構築した。次のこのように合成した新しいペプチド鎖を有する金属ポルフィリン錯体を用いて,チトクロ-ムP450の酵素反応に類似したスチレンの不斉エポキシ化反応を行った。この反応において,昨年合成した金属ポルフィリン錯体は高い不斉収率でスチレンオキシドを生成するものの,その収率は数パ-セントにすぎなかった。しかし本年度合成した金属ポルフィリン錯体は活性中心の付近が広いため,著るしく高い収率(たとえば97.6%)でスチレンオキシドを与えた。さらにこの錯体は立体的に規制された不斉の場を有さないにも拘らず,高い不斉収率を誘導した(たとえば収率45.2%で不斉収率60.6%)。これらの結果は,ヘム蛋白貭の蛋白貭セグメントの機能を理解する上で重要な知見を与えるものと考えられる。一原子酵素添加酵素チトクロームP-450はヘム蛋白質の1つであり、この蛋白部分がその酵素活性、例えば反応速度、反応特異性に大きな影響を与えている。しかし現在蛋白部分を模倣した酵素モデルは提案されていない。本研究では蛋白部分を含む新しいポルフィリン錯体を合成し、チトクロームP-450のモデル反応としてのスチレンの不斉エポキシ化反応に適用してきた。本年は昨年からの延長として4本ペプチド鎖型のモデル錯体を合成し、そのペプチド鎖のモデル反応に及ぼす効果を検討した。モデル錯体はペプチド鎖を4つのメソ位に有するFeエチオポルフィリンであり、常法によるスチレンのエポキシ化反応に適用した。反応媒体としては塩化メチレンを使用したが、ペプチド鎖の効果を見るために少量のメタノールを添加しても反応を行った。酸素化剤としてはヨードソベンゼンを使用し、不斉収率の測定はNMR法によった。4本ペプチド鎖型錯体モデルは特定の空間配座を持たないにもかかわらず、不斉エポキシ化の触媒となった。
細胞内シグナル伝達による自己応答性の制御

(1)これまでに、リポ多糖体(LPS)による樹状細胞(DC)やマクロファージ(Mφ)の活性化をcyclic adenosinemonophosphate(cAMP)が抑制する分子機構が、LPS+cAMP刺激によって発現誘導される転写因子c-Fosによるものであることを明らかにした。c-FosのmRNA発現誘導はcAMP刺激のみでおきるが、タンパク質の蓄積にはLPS刺激によるIKKβのキナーゼ活性が必要であり、IKKβはc-Fosタンパク質の308番目のセリンをリン酸化し、c-Fosタンパク質を安定化させることを見いだした。そこで、308番目のセリンをアスパラギン酸に置換した安定型変異c-FosをDCで過剰発現させたトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、骨髄由来DC(BMDC)のLPS応答性を解析した。Tgマウス由来のBMDCは、LPS刺激によるIL-12、TNFα等の炎症性サイトカインの産生が低下し、抗炎症性サイトカインであるIL-10の産生が亢進した。従って、c-Fosタンパク質の安定化による炎症性遺伝子の発現抑制がin vivo系でも機能していることが示唆された。(2)一方、自己応答性を規定するヘルパーT細胞の分化・機能を制御するTGFβ/Smadシグナルの役割の解析から、TGF-β刺激による制御性T細胞の分化制御因子であるFoxp3の誘導には、Smad2とSmad3が相補的に機能していずれかが必要であるが、炎症性Th17ヘルパーT細胞の分化制御因子であるRORγtの誘導には、何れのSmadも必要でないことが示された。また、TGF-β刺激によるTh1/Th2ヘルパーT細胞の分化抑制が、Smad2/Smad3欠損T細胞で著しく低下したが、Foxp3欠損T細胞では正常にみられた。従って、TGF-βはSmadを介してエフェクターT細胞の分化を制御するが、そこにFoxp3は必ずしも必要ないことが示唆された。本年度は、免疫系の自己応答性を制御するサイトカインネットワークとそのシグナル制御機構の分子基盤を解明するため、1.自己応答性を規定するヘルパーT細胞の分化・機能を制御するTGFβ/ Smadシグナルの解析、2. cAMP(cvclio adenosine mononhosphate)による樹状細胞(DC)やマクロファージ(Mφ)の活性化抑制機構の解明に取組んだ。1. TGFβのシグナル伝達倉子であるSmad2およびSmad3の欠損マウスを用いて、in vitroでSmad2あるいはSmad3単独欠損T細胞は、TGF-β刺激によるFoxg3(制御性T細胞の分化制御因子)陽性iTreg(誘導型制御性T細胞)の誘導が減弱し、両欠損T細胞では完全に消失することを見いだした。つまり、Smad2とsmad3は重複性の機能を有し相補的である。一方、炎症性のTh17ヘルパ-T細胞合化では.その分化制御因子であるRORgtのmRNA誘導は、何れのSmad欠損T細胞においても野生型と同等であった.従って、TGF-βシグナルがiTregとTh17の誘導で、それぞれSmad依存性と非依存性であることが初めて明らかとなった。2. PGE2などの細胞内cAMP濃度を上昇させる生理活性物質は、免疫応答を負に制御することが知られているが、その分子機構は不明である。リボ多糖体(LPS)によるDCやMφの活性化をCAMPが抑制する分子機構が、LPS+cAMP刺激によって発現誘導される転写因子c-Fosによるものであることが明らかとなった。(1)c-Fosは炎症性遺伝子の発現に必須な転写因子NF-κBのp65サブユニットと結合しプロモーター結合を阻害することで炎症性遺伝子の発現を抑制すること、(2)c-FosのmRNAi発現誘導はcAMP刺激のみでおきるが、タンパク質の蓄積にはLPSによるNF-kBの活性化に必須なキナーゼIKKBが必要であること.更に、(3)IKKBはc-Fosタンパク質の308番目のセリンをリン酸化し、c-Fosタンパク質を安定化きせるという新たな知見を得た。炎症性遺伝子の発現に必須のIKKβがc-Fosタンパク質の安定化に寄与することで炎症性遺伝子発現を抑制するという、新規のネガティブフィードバック機構を発見した。

(2)一方、自己応答性を規定するヘルパーT細胞の分化・機能を制御するTGFβ/Smadシグナルの役割の解析から、TGF-β刺激による制御性T細胞の分化制御因子であるFoxp3の誘導には、Smad2とSmad3が相補的に機能していずれかが必要であるが、炎症性Th17ヘルパーT細胞の分化制御因子であるRORγtの誘導には、何れのSmadも必要でないことが示された。また、TGF-β刺激によるTh1/Th2ヘルパーT細胞の分化抑制が、Smad2/Smad3欠損T細胞で著しく低下したが、Foxp3欠損T細胞では正常にみられた。従って、TGF-βはSmadを介してエフェクターT細胞の分化を制御するが、そこにFoxp3は必ずしも必要ないことが示唆された。
半導体表面におけるフローティング相

本研究課題では、半導体の典型的な清浄表面のひとつであるGe(111)表面においてフローティング相が存在するか否かを理論の立場から明らかにすることを目標として、この表面のモデルに対するシミュレーション計算を詳細に行うことによりその可能性を議論した。ここで言うフローティング相とは、長距離秩序を持たず、その内部では整合構造を取る非整合壁で隔てられたドメインが流動するために二体相関関数が粒子間距離の羃で減衰する熱力学的に安定な相のことである。以下に、本研究で得られた成果の概要を記す。秩序状態としてc(2×8)構造を取り、Ge(111)表面の無秩序状態における温度変化をよく記述する格子ガスモデルにおける有効相互作用パラメタの値がこの表面に対応すると見積もられる値を取る場合について、秩序相と無秩序相の間の温度領域に別の新しい相が存在することを確認し、その温度範囲を特定した。この状態では、実空間での相関関数が遠距離で粒子間距離の羃関数として減衰し、その指数が温度とともに変化することを示し、互いに非整合壁に隔てられたドメインが流動する状態にあることと相関関数の運動量空間でのピーク位置が秩序状態での位置から(2×2)構造の超格子ブラッグ点の方向に変位することを示した。この状態が有限温度での分子動力学計算に対しても安定であることは十分に検討できなかったが、以上のことより、Ge(111)表面の秩序相と無秩序相の間にフローティング相が存在する可能性の高いことが結論できる。本研究課題に密接に関連する問題として、この表面に金属原子等が吸着することによる再構成とその相転移の問題がある。このような問題を取り扱うための多成分からなる系に対する分子動力学計算プログラムの整備も併せておこなった。
ガングリオシドGM3によるアディポサイトカイン発現の制御

脂肪細胞から分泌される分子(アディポサイトカイン)の中には、さまざまな生理活性をもっており、肥満の病態に関与している。このような物質の発現制御機構の解明はインスリン抵抗性の病態の理解に有用であると考えられる。今回マウス培養脂肪細胞3T3-L1を用いて、ガングリオシドGM3によるアディポサイトカインmRNA発現の変化について、検討した。細胞株3T3-L1を通常の方法で脂肪細胞に分化させ、day1014で血清を除き0.5%BSAとして、GM3を培養液に添加し、24時間後に細胞を回収し、RNAを抽出した。マウスレプチン・アディポネクチン・PAI-I・レジスチンのmRNA発現の変化を検討するため、Aplied BiosystemのAssay on demandによりプライマー、プローブを購入し、ABI 7700を用いてreal time RT-PCRを施行した。内因性コントロールとしてGAPDHを用いた。予備実験でレプチン、アディポネクチンmRNAはどちらも、GM3を加えなかったものと比較してGM3 50μMで最もよく変化する可能性があったので、以後の実験はGM3の濃度を10,25,50μMとして行った。すべての結果はn=69のものである。統計学的検討はANOVAにより行った。我々は脂肪細胞におけるTNF-α刺激によるインスリンシグナルの抑制は、GM3が増加することを介する可能性を以前示した。TNF-αはアディポネクチン、PAI-Iの発現を変化させることが知られており、この変化にもGM3が関与すると予想したが、アディポネクチン、PAI-IはともにGM3を加えることによりmRNAの発現に変化はみられなかった(それぞれp=0.866,p=0.800)。そのほかのアディポサイトカインとして、レジスチンも検討したところ、P=0.093と有意ではないが、GM3を加えることにより、mRNAが増加する傾向がみられた(GM3 50μMで対象と比較して1.39±0.40倍)。さらにレプチンmRNAは有意に増加し(p=0.042)、GM3 50μMでは対象と比較して2.22±1.10倍だった(p=0.01,Fisher's PLSD)。GM3はレプチンの発現を増加させる可能性があることが示唆された。脂肪細胞から分泌される分子(アディポサイトカイン)の中には、インスリン感受性を変化させるものがある。このような物質の分泌制御機構の解明はインスリン抵抗性の病態の理解に有用であると考えられる。細胞株3T3-L1を通常の方法で脂肪細胞に分化させ、day 1014で血清を除き0.5%BSAとして、GM3を培養液に添加し、24時間後に細胞を回収し、RNAを抽出した。加えたGM3の濃度は、これまでインスリンシグナルを抑制するとされている100μMのほか、50μMでも刺激した。マウスレプチン・アディポネクチンのmRNA発現の変化を検討するため、Aplied BiosystemのAssay on demandによりプライマー、プローブを購入し、ABI 7700を用いてreal time RT-PCRを施行した。レプチン/GAPDH、アディポネクチン/GAPDH mRNAはどちらも、GM3を加えなかったものと比較してGM3 50μMで最もよく抑制されていた。インスリンシグナルを抑制するとされている100μMでは、明らかな傾向はみられなかった。しかし、3T3-L1の分化後の日数や刺激時間などにより、結果が一定していないため、現在再現性のチェックを繰り返している。また、50μM以下の濃度でも発現が変化する可能性があり、さらに低濃度のGM3による変化についても検討を続けている。レジスチンのmRNA発現についても検討しているが、アディポネクチン、レプチンの変化と同様の傾向を示しているが、その変化は大きくはなかった。現時点で、GM3はアディポネタチン、レプチンの発現を抑制する可能性があることが示唆された。

我々は脂肪細胞におけるTNF-α刺激によるインスリンシグナルの抑制は、GM3が増加することを介する可能性を以前示した。TNF-αはアディポネクチン、PAI-Iの発現を変化させることが知られており、この変化にもGM3が関与すると予想したが、アディポネクチン、PAI-IはともにGM3を加えることによりmRNAの発現に変化はみられなかった(それぞれp=0.866,p=0.800)。そのほかのアディポサイトカインとして、レジスチンも検討したところ、P=0.093と有意ではないが、GM3を加えることにより、mRNAが増加する傾向がみられた(GM3 50μMで対象と比較して1.39±0.40倍)。さらにレプチンmRNAは有意に増加し(p=0.042)、GM3 50μMでは対象と比較して2.22±1.10倍だった(p=0.01,Fisher's PLSD)。GM3はレプチンの発現を増加させる可能性があることが示唆された。
里山環境の人為的遷移の歴史分析ならびに野外実験にもとづく新里山創成

1.里山と有機的関係と保っていた時代(1950年代)における集落の空間的特質(空間構成から読み解ける性質)を、実証フィールドのある集落(高知県土佐山田町佐岡地区中後入、以下「佐岡地区中後入」)を対象に現地調査と、地図調査(国土地理院発行の航空写真+地理院地図)を行うことで明らかにした。記録内容は、集落スケールにおいては地形、街路、居住域、聖地・葬地の5項目の構成を、個別建築のスケールでは第二次世界大戦以前に建設された古民家の空間類型、特に屋敷構えを持つ農家に焦点をあてて、その類型と分布の考察をおこなった。また、視点を広げ、「佐岡地区中後入」を含む物部川流域圏中流部の屋敷構えと神社の分布、空間形式の分析も行い、「佐岡地区中後入」の特質との比較分析も行った。2.「佐岡地区中後入」を対象に歴史文献を収集し、歴史学的調査(文献調査)と民俗学的調査(古老への聞き取り調査)から、中世近世の地名の現地比定、大正・昭和期の里山の土地利用や屋敷地での生業の在り方などを明らかにし、記録した。「佐岡地区中後入」において、集落と里山がどのような関係性を持ちながら形成されてきたか(=里山の形成過程)を示した。同時に1の空間的特質と空間形成過程との影響関係についても示した。3.実証フィールドの里山を対象に、ボクセルモデルを用いた落葉広葉樹林における衛星画像シミュレーションを行った。4.「佐岡」の実証フィールドの休耕地(元棚田)を対象に昨年度作成した屋根付き気候測定装置(屋根角度、床高さが可変)にて微気候計測を行った。同時に里山林内でも微気候計測を行った。また、微気候計測している林地にて、植林放置されている杉を伐採した。今後は伐採前後で微気候数値がいかに変化するのかを比較分析する予定である。理由I里山の人為的遷移過程の環境歴史学的分析記述里山との有機的な連関が急速に衰退した時代(戦後の高度経済成長期)から現在までの里山空間の変遷、現況については、昨年に引き続き、実証フィールド近辺を対象に記録することができた。同時に歴史・民俗学的手法による里山の人為的遷移過程については文献収集が完了し、里山が豊かかりし頃(大正・昭和期)の生業や土地利用の状況などを聞き取ることができた。聞き取れた情報が膨大であり、GIS上でのデータ整理が今後の課題である。II実証フィールドでの介入実験森林でのボクセルモデルを用いた環境計測手法のひとつを提示でき、また介入実験として林地の伐採を行うことができた。しかし、新たに有用植物などを栽培するに当たっては地権者への更なる土地利用の許可を得ねばならず、それは極めて困難であることが分かっている。そのため、林地内の微気候変化の分析にとどまらざるを得ない状況である。I里山の人為的遷移過程の環境歴史学的分析、記述現在、「佐岡」における3集落(11の小集落を含む)の歴史環境の記録と空間的特質の分析を終えている。今年度は「佐岡」で1集落を記録し、さらに物部川流域圏の下流域での集落の空間的特質を把握することで、物部川流域圏における「佐岡」の歴史的、空間的特質とその位置づけを明らかにする。同時にそこで得られた情報をGIS上に記録する。II実証フィールドでの介入実験地権者への土地利用(林地の伐採)の許可が昨年度末時期に得られ、その後に林地伐採を行った。本年度はこれまでおこなってきた伐採前の林地微気候と伐採後の林地微機構を比較分析する。また、樹木伐採後の植生変化の把握と記録も行う。1.里山と有機的関係と保っていた集落の生活様態が急激に変化し衰退した、戦後からの里山の空間変遷と、空間現況を、実証フィールド近辺の集落(高知県土佐山田町佐岡地区。以下「佐岡」)を対象に現地調査と、地図調査(国土地理院発行の航空写真+地理院地図)を行い記録した。記録内容は、集落スケールにおいては地形、河川と水路、土地利用、居住域、聖地・葬地の5項目の構成と変遷を、個別建築のスケールでは第二次世界大戦以前に建設された古民家の空間類型、特に屋敷構えを持つ農家に焦点をあてて、その類型と分布の考察をおこなった。2.「佐岡」を対象に歴史文献を収集し、日本史学的調査(文献調査)と民俗学的調査(古老への聞き取り調査)から、中世近世の地名の現地比定、大正・昭和期の里山の土地利用や屋敷地での生業の在り方などを明らかにし、記録した。屋敷地の歴史的変遷については、1の現況調査でみられた空間類型との、影響についても考察し、現在みる民家の空間が中世や江戸時代の歴史に関わりを持つことを示すことができた。3.高知県四万十町の武内文治氏(高知歴史環境GIS研究会メンバー)と連携・協力しながら、地名民俗調査のデータベース化、GIS利用による地図作成方法などを、四万十町をモデルケースに調査研究した。4.「佐岡」の実証フィールドの里山を対象に、ボクセルモデルを用いた林床でのPAR推定手法を提示した。5.「佐岡」の実証フィールドの休耕地(元棚田)を対象に微気候計測のための屋根付き気候測定装置(屋根角度、床高さが可変)を建設、設置した。

この気候測定装置は、気候分析後、可能な限り、良好な温熱環境を満たす、東屋として再編する予定である。I里山の人為的遷移過程の環境歴史学的分析記述里山との有機的な連関が急速に衰退した時代(戦後の高度経済成長期)から現在までの里山空間の変遷、現況については実証フィールド近辺を対象に記録することができた。同時に歴史・民俗学的手法による里山の人為的遷移過程については文献収集が完了し、里山が豊かかりし頃(大正・昭和期)の生業や土地利用の状況などを聞き取ることができた。GIS上でのデータ整理が今後の課題である。II実証フィールドでの介入実験森林でのボクセルモデルを用いた環境計測手法のひとつを提示できたが、介入実験の進捗は遅れている。地権者への土地利用の許可を得ること、介入実験前の微気候計測などが未完であり、今年度の課題となっている。1.里山と有機的関係と保っていた時代(1950年代)における集落の空間的特質(空間構成から読み解ける性質)を、実証フィールドのある集落(高知県土佐山田町佐岡地区中後入、以下「佐岡地区中後入」)を対象に現地調査と、地図調査(国土地理院発行の航空写真+地理院地図)を行うことで明らかにした。記録内容は、集落スケールにおいては地形、街路、居住域、聖地・葬地の5項目の構成を、個別建築のスケールでは第二次世界大戦以前に建設された古民家の空間類型、特に屋敷構えを持つ農家に焦点をあてて、その類型と分布の考察をおこなった。また、視点を広げ、「佐岡地区中後入」を含む物部川流域圏中流部の屋敷構えと神社の分布、空間形式の分析も行い、「佐岡地区中後入」の特質との比較分析も行った。2.「佐岡地区中後入」を対象に歴史文献を収集し、歴史学的調査(文献調査)と民俗学的調査(古老への聞き取り調査)から、中世近世の地名の現地比定、大正・昭和期の里山の土地利用や屋敷地での生業の在り方などを明らかにし、記録した。「佐岡地区中後入」において、集落と里山がどのような関係性を持ちながら形成されてきたか(=里山の形成過程)を示した。同時に1の空間的特質と空間形成過程との影響関係についても示した。3.実証フィールドの里山を対象に、ボクセルモデルを用いた落葉広葉樹林における衛星画像シミュレーションを行った。4.「佐岡」の実証フィールドの休耕地(元棚田)を対象に昨年度作成した屋根付き気候測定装置(屋根角度、床高さが可変)にて微気候計測を行った。同時に里山林内でも微気候計測を行った。また、微気候計測している林地にて、植林放置されている杉を伐採した。今後は伐採前後で微気候数値がいかに変化するのかを比較分析する予定である。理由I里山の人為的遷移過程の環境歴史学的分析記述里山との有機的な連関が急速に衰退した時代(戦後の高度経済成長期)から現在までの里山空間の変遷、現況については、昨年に引き続き、実証フィールド近辺を対象に記録することができた。聞き取れた情報が膨大であり、GIS上でのデータ整理が今後の課題である。II実証フィールドでの介入実験森林でのボクセルモデルを用いた環境計測手法のひとつを提示でき、また介入実験として林地の伐採を行うことができた。しかし、新たに有用植物などを栽培するに当たっては地権者への更なる土地利用の許可を得ねばならず、それは極めて困難であることが分かっている。そのため、林地内の微気候変化の分析にとどまらざるを得ない状況である。I里山の人為的遷移過程の環境歴史学的分析、記述
抗体磁気ビーズを用いた内在性微量タンパク質複合体プロテオミクス法の開発

細胞内の生理的条件下でのタンパク質相互作用を解析するため、高親和性抗体と低ノイズのビーズを用いた細胞内微量タンパク質複合体の免疫分離法を開発した。細胞内でのシグナル伝達や転写調節には複数のタンパク質が相互作用し、複雑で繊細な調節を可能としている。これらのメカニズムに関与するタンパク質は微量で通常の電気泳動やカラムクロマトを用いるプロテオームの技法では効率よく検出できない。また、強制発現法や2ハイブリッド法を用いる相互作用解析では、候補タンパク質を検出することはできるが、生理的な状態を反映しているといえない。本研究では、独自に開発したバキュロウイルス発現系を用いる免疫法や高感度検出系を組み合わせるスクリーニング法などにより、ターゲットタンパク質に対する高親和性の抗体を作成し、さらに非特異的結合を低減する表面処理をほどこした磁気ビーズに抗体を固定化してターゲットタンパク質を効率よく集めることにより、核内受容体HNF4αなどの転写因子を105個程度の細胞より検出することに成功した。この免疫分離法とショットガンLCMS/MS法を組み合わせることにより、転写調節因子について10^6個程度の細胞より数種類の複合体タンパク質を同定し、MS/MS/MS解析により複合体を形成する内在性のタンパク質についてリン酸化修飾を同定することができた。また、細胞膜上に複合体を形成するタンパク質についてもMS解析が可能であることがわかった。従来、相互作用するタンパク質の同定には大量のサンプルが必要であったが、本研究で開発された方法により、少量で相互作用するタンパク質のダイナミズムを解析することが可能になると考えられる。バキュロウイルスに発現させたHNF4αを用いてマウスに免疫し、得られたモノクローナル抗体のクローンから、GSTフユージョンHNF4α部分ペプチドを用いて、BIACOA測定により、Kd10^<-9>M付近の高い親和性を持つクローンを数種類作製した。これらの抗体を産生するハイブリドーマの無血清培養上清より抗体をプロテインGカラムにて精製し、磁性ビーズに固定化した。HNF4αは肝臓由来のHepG2細胞や小腸由来のCaCo2細胞に分布することから、これらの細胞の破砕液あるいは核抽出液を抗体ビーズと反応させ、洗浄したのちSDSPAGEゲル電気泳動にて解析した。その結果、市販のプロテインGビーズを用いた免疫沈降サンプルではシングルタンパク質バンドが同定されなかったが、磁性ビーズによるサンプルでは数10本のバンドがサイプロルビー染色で同定され、混入する抗体分子を除いたバンドについて、ゲル切り出しMS同定を行なったところ、HNF4αおよびHNF4γが同定され、さらに数種類のタンパク質が同定された。このサンプルは培養ディッシュ2枚分の細胞から調整されたものであり、効率よく転写因子複合体を回収できたと考えられる。さらにHNF4αとHNF4γの強制発現系を用いてこれらのタンパク質が複合体を形成することを確認した。内在性タンパク質についても、HNF4γに対する特異抗体を作製し、HNF4αと共沈することを確認した。さらに感度をあげ、複合体タンパク質の同定精度を高めるため、抗体磁性ビーズに回収された複合体サンプルから酸抽出により複合体を分離し、トリプシン処理を行なってショットガンLC-MSMSで断片を検出する方法を行い、上記サンプルより同様にHNF4α、γを同定し、また核内受容体のコファクターとして報告されているタンパク質数種類、クロマチンリモデリングに関与するタンパク質数種類、スプライシングに関与するタンパク質数種類を同定した。
ホロニック地域エネルギーマネジメントシステム(DEMS)の方法論に関する研究

ホロニックの概念を取り込んだ地域エネルギーマネジメントシステム(DEMS=district energymanagementsystem)の構築を目指して、3年間の研究機関内で多種多様なエネルギー供給システムを取り上げた。より具体的には、各種コージェネレーションシステム、氷蓄熱ヒートポンプシステム等である。これらの個々の分散型エネルギー供給システムが、単にそれぞれ独立して経済性や省エネルギー性を追求するにとどまちず、地域全体としてどのように省エネルギー性およびCO_2排出量をふくむ環保全性にどのように関連してくるのかを方法論的に検討した。この課題に対する方法論的アプローチとしては、基本的に自然は無駄をしないという哲理を反映した最適化手法を導入し、また多目的最適北手法等を援用して、単に経済性のみならず省エネルギー性や環境保全性に関するトレードオフに関する分析も実施した。まずホロニックDEMSとして想定される各種エネルギー供給システムの分類および整理に基づき、それらから構成きれる一般的なエネルギー供給システムを作成し、その中からエネルギー需要量に適したシステムを選定するための混合整数線形辞画法に基づく機器構成最適化手法を構築した。また、エネルギー供給システムの経済性、省エネルギー性、環境保全性の間には、トレードオフ関係が存在するため、ε制約法に基づく多霞的最適化手法を構築し、経済性、省エネルギー性、環境保全徃の重要度に応じて適切なシステムの機器構成を朗らかにした。さらに、ホロニックDEMSとして長期的にエネルギー供給システムを検討するに当たって、機器の更新が経済性、省エネルギー性、環境保全性に重要な影響を及ぼすものと考えられ、エネルギー供給システムの機器更新を最適に行うための方法論について検討を行い、基本的な特性を明らかにした。以上述べてきたエネルギー供給システムの構築は、基本的に新規の建物群に対する計画立案を前提としているが、建築物の長寿命化を考えるとシステムの更新(リニューアル)計画問題がより重要である。そのため、最適更新計画問題に研究の後半では力点を置き、その結果として新規システム計面問題と異なる各種の新しい知見を導出することができた。ホロニックの概念を取り込んだ地域エネルギーマネジメントシステム(DEMS=district energymanagementsystem)の構築を目指して,本研究課題では3年間の計画で,多種多様なエネルギー供給システムを取り上げていく予定である.より具体的には,各種のコージェネレーションシステム,氷蓄熱式ヒートポンプシステム,太陽光および風力発電システム等である.これらの個々の分散型エネルギー供給システムが,単にそれぞれ独立して経済性や省エネルギー性を追求するにとどまらず,地域全体における省エネルギー性やCO_2排出量を含む環境保全性にどのように関連してくるのかを方法論的に検討することにした.この課題に対する方法論としては,基本的に各種のシステム最適化手法の導入を想定しており,多目的最適化法,多レベル計画法,ゲーム理論等を用いたアルゴリズムの開発に取り組んでいる.初年度においては,まずホロニックDEMSとして想定される各種エネルギー供給システムの分類および整理を行うとともに,適用可能な方法論の概略の絞り込みを行った.より具体的な定量的分析を行っていくために,本年度はガスタービン・コージェネレーションシステムをまず具体的に取り上げた.まず,エネルギー供給対象施設として最大電力需要量が約8MWh/h程度の地域を想定し,年間に渡る電力・冷暖房・給湯需要量を設定した.導入するガスタービン発電機等の規模特性をより明確に分析するために,混合整数双線形計画法を導入し,コージェネレーションシステム全体を合理的に最適設計計画するためのアルゴリズムを確立した.また,数値計算事例を通じて,従来手法と比較して提案手法の汎用性や計算効率等を含む有効性を確認することができた.ホロニックの概念を取り込んだ地域エネルギーマネジメントシステム(DEMS

=district energymanagementsystem)の構築を目指して,本研究課題では3年間の計画で,多種多様なエネルギー供給システムを取り上げて行く予定である.より具体的には,各種のコージェネレーションシステム,氷蓄熱式ヒートポンプシステム等である.これらの個々の分散型エネルギー供給システムが,単にそれぞれ独立して経済性や省エネルギー性を追求するにとどまらず,地域全体における省エネルギー性やCO_2排出量を含む環境保全性にどのように関連してくるのかを方法論的に検討することにした.平成16年度においては,平成15年度において実施したホロニックDEMSとして想定される各種エネルギー供給システムの分類および整理に基づき,それらから構成される一般的なエネルギー供給システムを作成し,その中からエネルギー需要量に適したシステムを選定するための混合整数線形計画法に基づく機器構成最適化手法を構築した.また,エネルギー供給システムの経済性,省エネルギー性,環境保全性の間にはトレードオフ関係が存在するため,ε制約法に基づく多目的最適化手法を構築し,経済性,省エネルギー性,環境保全性の重要度に応じて適切なシステムの機器構成を明らかにした.さらに,ホロニックDEMSとして長期的にエネルギー供給システムを検討するに当って,機器の更新が経済性,省エネルギー性,環境保全性に重要な影響を及ぼすものと考えられ,エネルギー供給システムの機器更新を最適に行うための基本的な方法論について検討を行い,基本的な特性を明らかにした.本研究課題では,ホロニックの概念を取り込んだ地域エネルギーマネジメントシステム(DEMS=district energymanagementsystem)の構築を目指して,各種のコージェネレーションシステム,氷蓄熱式ヒートポンプシステム等の多種多様なエネルギー供給システムを取り上げ,これらの個々の分散型エネルギー供給システムが,単にそれぞれ独立して経済性や省エネルギー性を追求するにとどまらず,地域全体における省エネルギー性やCO_2排出量を含む環境保全性にどのように関連してくるのかを方法論的に検討することを目的とした.
乳酸菌による病原菌と上皮細胞とのクロストークへの干渉と感染症予防への応用

上皮細胞への侵入性を有する病原菌に対する乳酸菌の影響を調べたところ、Lactobacillus amylovorus、L. crispatusおよびL. gasseriはSalmonella TyphimuriumおよびArcobacter butzleriのCaco-2細胞への侵入を40-50%低下させた。その機構について以下のように推定した。L. acidophilusではCaco-2細胞のアクチンフィラメントの再構成を促進することが見いだされたことから、細胞骨格タンパク質への作用がlactobacilliの侵入阻止活性と関連していると推定された。また、Bifidobacterium animalis subsp. Lactis F、B. longum MおよびB. breve YはA. butzleriによる細胞障害を軽減する効果を有していたことから、lactobacilliにおいても毒素の中和作用が侵入阻止活性と関連している可能性が示唆された。まず、細胞侵入性病原菌である腸管侵入性大腸菌(EIEC)、リステリア菌、赤痢菌およびサルモネラ菌(Typhimurium)株の中から、経上皮電気抵抗値(TER)測定法あるいはゲンタマイシン処理法のいずれかによる評価系に適した菌株を選抜した。その結果、サルモネラ菌がCaco-2細胞に侵入するのをゲンタマイシン処理法で評価するのが最適であると判断された。そこで、この方法を用いて、腸管系乳酸桿菌であるLactobacillus acidophilus、L. crispatusおよびL. amylovorus株の中から侵入阻止活性のある菌株を選抜した。その結果、L. crispatus菌株で侵入阻止活性が高かった。ここで、このL. crispatus菌株はサルモネラ菌株に対して抗菌作用を持たないことを確認した。次いで、侵入阻止活性が、サルモネラ菌の初期付着かその後のエフェクターによるアクチンの再構成段階への作用に対するものかを明らかにするために、Caco-2細胞の生および死細胞を用いた阻害試験を行なった。その結果、いずれの段階でも阻害効果が見られた。そこで、L. crispatus菌株およびサルモネラ菌株のCaco-2死細胞表層における付着部位を顕微鏡観察により比較した。その結果、両菌株の明瞭な偏在は認められなかった。次いで、L. crispatus菌株の活性成分とその作用機構について知るために、菌体表層成分を分画し、阻止活性およびサルモネラ菌体やCaco-2細胞表層への結合性を調べている。Campylobacterによる下痢症(食中毒を含む)は先進諸国の細菌性下痢症の主要な原因とされている。しかし、Campylobacter下痢症と診断された患者から分離保存されていた菌株を分子生物学的手法で再同定すると、Arcobacterと同定される場合のあることがベルギーで報告されている。Campylobacterも下痢の発症機構は充分には解明されてはいないが、Arcobacterについては殆ど知られていない。本年度の研究で、鶏肉から分離したArcobacter butzuleri菌株がヒト大腸由来培養細胞であるCaco-2細胞に対して侵入性を示すことおよび菌体抽出液が培養細胞の空胞化や多核化等の形態異常を惹起する(以下細胞毒性という)ことを明らかにした。一方で、細胞への侵入や細胞毒性は、乳酸桿菌やビフィズス菌の添加により低下することが示された。C.jujuniの場合、細胞への侵入には細胞骨格タンパク質のうち、微小管やミクロフィラメントの関与が示されている菌株もある。そこで、cytochalasin-Dやcolchicine等細胞骨格タンパク質の再構成阻害剤が.A.butzleriの細胞侵入性や乳酸桿菌およびビフィズス菌による侵入阻害作用に与える影響を試験している。また、C.jejuniの例に倣って、タイトジャンクションの健常性の指標である経上皮電気抵抗値(TER)や炎症反応の指標であるサイトカイン類に与える影響も試験している。
安全性に優れた高体積貯蔵密度な水素貯蔵法の確立

水素エネルギー社会の実現に向け,水素貯蔵技術の確立は急務である.水素吸蔵合金を用いた水素貯蔵法は,体積密度・安全性に優れるものの、水素吸蔵によって生じる合金の体積膨張に伴う,容器の変形・破損が課題となっている.本研究では,水素吸蔵合金の容器内充填状態を対象に,ミクロおよびマクロな過渡的可視化を行うことで,合金種による充填層の膨張挙動の差異を明らかにし,膨張によって発現する応力に影響を及ぼしうる因子を明らかにした。本研究は、既存技術の問題点解消による優れた水素貯蔵技術の確立を目的とする。本研究で使用するのは、水素吸蔵合金と呼ばれる水素と可逆的に結合可能な合金である。特に、LaNi5をはじめとした一部の合金は、温度0-100度、圧力1 MPa未満の下で水素を吸蔵し、水素化物を形成可能である。また、形成した水素化物は、上記範囲内の条件下で水素を放出し、合金と水素に分離する。水素化物の内部では、液体水素を凌ぐ高い体積密度で水素が存在する。そのため、この合金を用いれば、高い体積密度で水素を貯蔵可能である。これらの合金を水素貯蔵に利用する場合、粉砕した後に容器に充填し、その容器内で水素を吸放出させるのが最も簡便である。ここで、水素を吸蔵する前の合金と比較して、水素吸蔵後の合金水素化物の体積は1.3倍程度である。そのため、容器内に充填した合金粒子に水素を吸蔵させると、その粒子が容器内で体積膨張し、容器を内側から押すことが知られている。これにより、容器が大きくひずんだ報告もあり、この力は安全な水素貯蔵の妨げとなるものである。そこで、可視化を中心とした実験により、合金充填層が容器に力を及ぼす過程を詳細に解明し、この力を適切に制御する手法を確立することにより、優れた水素貯蔵技術を確立する。平成27年度は、直径10 mm程度の合金充填層について、マクロな膨張挙動を可視化する実験装置を構築した。上記で挙げたLaNi5を試料とし、合金充填層が吸蔵した水素量の増加に伴う見かけの体積の増加を評価した。実験結果から、合金充填層が吸蔵した水素量に対し、合金充填層の見かけの体積膨張率が非線形に増加することを確認した。また、合金充填層の3次元構造を今後取得する予定であり、その評価のためのソフトウェア開発を行った。その結果、粒子群の3次元画像を、粒子群を構成する個々の粒子の画像に切り分けることができるようになった。マクロな膨張挙動を可視化するための実験装置の構築が完了し、同実験装置を使用した予備実験も実施した。これにより、本格的な実験の実施に目処が立った状況にある。また、今後取得予定である合金充填層の3次元構造について、その評価に必須である3次元画像解析プログラムの構築を進めることができた。特に、LaNi(5)をはじめとした一部の合金は、温度0ー100度、圧力1 MPa未満の下で水素を吸蔵し、水素化物を形成可能である。水素化物の内部では、液体水素をしのぐ高い体積密度で水素が存在する。そのため、容器内に充填した合金粒子に水素を急増させると、その粒子が容器内で体積膨張し、容器を内側から押すことが知られている。平成28年度は、前年度に製作した可視化のための実験装置を用いて、LaNi(5)およびTiFe(0.8)Mn(0.2)を対象とした充填層の膨張挙動可視化実験を実施した。この結果から、充填層の膨張挙動について、合金種によって明らかに相違があることを確認した。また、合金充填層の3次元構造を取得し、その評価を実施した。この結果からも、合金種による充填層の膨張挙動に差異がみられることを確認した。さらに、合金粒子の容器に発現するひずみを測定し、上記の膨張挙動の差異がこのひずみにどのように影響するかを検討した。

LaNi5の膨張挙動について、詳細な可視化と膨張挙動の定量的評価を実施する。マクロな膨張挙動を可視化するための装置と基本的な実験方法については既に準備済みである。今年度は実験実施による知見の獲得とともに、より優れた評価手法を模索する。ミクロな膨張挙動については、予定通りマイクロX線CTを用いて合金充填層の充填構造を撮像し、その3次元像を解析することで、定量評価を実施する。3次元像の解析のためのプログラムは現在構築を進めている段階である。化学工学今年度は合金充填層のマクロ可視化に注力したため、3次元像の取得とその評価については実施されていない内容がある。そのため、そこに係る費用を次年度使用額としている。次年度において、3次元像の取得のための移動旅費・設備使用料、3次元像評価のための計算機購入に充当する予定である。
栄養素の過不足を利用したプリ骨格異常モデルの構築

ブリの骨格形成を蛍光色素により観察した。ブリでは、孵化後2-3日齢から擬鎖骨が観察され、その後成長に伴って日齢14前後から顎骨、鰓覆骨、神経頭蓋が観察されるようになった。また、背骨に関しては日齢15から神経棘が観察されるようになり、成長に伴って椎体と下尾骨も観察されるようになった。しかし、予想された通り18日齢ごろから体表の色素が発達し始め観察が難しくなるとともに、日齢22前後から体幅が厚くなり観察がさらに困難となり日齢27では観察することができなくなることが判明した。成長の速い個体群と成長の遅い個体群を別々に観察して、栄養素の摂取の良否と骨格異常率に差があるかを検討するため2回の実験を実施した。その結果、一回目の実験では成長の速い個体群で有意に骨格異常率が高く、2回目の実験では逆に成長の遅い個体群で有意に骨格異常率が高い結果となり、成長差の違いと骨格異常率には明確な関連性が見られないことが明らかとなった。ブリの骨格異常について蛍光色素観察が可能かを検討した。水産総合研究センター五島栽培漁業センターで人工種苗生産されているブリの人工種苗に蛍光色素による骨の生体染色が可能であるかを調べた。ブリの人工種苗は、ワムシまたはアルテミアを栄養強化して各々孵化後1-25または19-29日まで給餌して飼育した。ブリ木工種苗は、受精卵(0日目)から孵化後29日齢までのものを採取し、カルセイン1g/Lの染色液により生きたまま染色した,染色後、筋肉などから非特異的な染色を除くため、97%海氷→95%説海水中に移動した後、60分間以上静置した。その後、フェノキシエタノールで麻酔し、蛍光顕微鏡を用いて紫外線照射下で観察した。その結果、日齢23で偽鎖骨が、日齢14で顎骨、鰓蓋骨、神経頭蓋が観察された。また、目齢15前後から神経棘および脊椎骨、尾骨が観察され始めた。また、日齢18日前後から体表色素の発達が始まるとともに、日齢22以降は体幅の増加により脊椎骨の観察が困難になるとが判明した。以上の観察済みの個体は、フォルマリン固定により保存し、アリザリンレッドによる観察を実施する予定である。以上の成果により、ブリにおいてもカルセイン染色により骨格の観察が可能であることが明らかとなり、各骨格要素の出現時期の概要が明らかとなった。これらの基礎データは次年度以降実施する予定の研究の進展に重要である。さらに、カルセインで生体染色を施して観察を行ったものをアリザリンレッドによる染色を行うため、エタノール中に保存した。これらを蛍光顕微鏡下で紫外線を照射して観察すると、固定後でもカルセインによる染色が保持されることが判明した。通常カルセインにより生体染色したものをフォルマリンなどで固定すると速やかに染色が失われることが知られており、固定後のサンプルでも染色性が維持される場合があることが判明した。ブリ類は、年間約15万トンと我が国で最も多く生産されている。しかし、ブリ類の人工種苗には骨格異常個体が多くその防除技術の開発が急務である。そこで、本研究では栄養素の過不足によりどの程度の骨格異常が発生するかを検討するとともに、骨の蛍光色素染色を行って、その利用性を検討することを目的とした。まず、ブリで骨の蛍光染色が可能かを検討した。成長に伴って筋肉が厚くなったり、体表面の色素の発達により観察できなくなることが予想されたので、ブリの受精卵を500L水槽に収容して21-22°Cで飼育し、体サイズのことなる仔稚魚を観察に供試した。その結果、孵化後2-3日齢から擬鎖骨が観察され、その後成長に伴って日齢14前後から顎骨、鰓覆骨、神経頭蓋が観察されるようになった。また、蛍光色素染色以外にもX線による観察を同時に行って、カルセイン染色像とほぼ同様に骨格が観察できることも確認した。