hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲーティングナノポアによる単分子流動制御技術の開発

負のゲート電圧を印加すると、ナノポア界面にはカチオンが集積されるため、負に帯電するDNAの電気泳動方向とは反対方向の電気浸透流がナノポア界面近傍で生じる。その結果、負のゲート電圧が、DNAの通過時間を遅くしたと考えられる。流体力学と電磁気学を同時に取り入れるマルチフィジックスモデルを用いて、SGNP内のDNAの流動ダイナミクスをシュミレーションしたところ、負のゲート電圧印加により、DNAの電気泳動方向とは反対方向の電気浸透流が発生することが支持された。一方、正のゲート電圧を印加すると、ナノポア界面にアニオンが集積される結果、DNAの流動方向と同じ方向に電気浸透流が発生するため、DNAの通過時間は短くなることが示唆された。ゲーティングナノポア内における1分子流動ダイナミクスを、電気泳動と電気浸透流を含めたマルチフィジックスモデルでシュミレーションし、1分子流動速度のゲート電圧依存性・イオン濃度依存性を明らかにすることで、ゲーティングナノポアデバイスの動作原理を理論的に示すことができた。さらに、微細加工技術により、ゲーティングナノポアデバイスを開発し、1ms以上の遅い1分子通過時間をゲート電圧の変調で実現した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度計画した10nm以下のゲーティングナノポアデバイス(GNP)より微細化された2nmのGNPの開発に成功し、ゲート電極を組み入れたSGNPの開発に成功した。さらに、直径20nmのSGNPを用いて、ゲート電圧によるDNAのナノポア通過時間の変調を実現し、実験結果とシュミレーションを合わせることで、ゲート電圧による電気浸透流制御を用いた1分子流動ダイナミクス制御技術の可能性を実証した。一方で、1分子解析を基盤とするDNAシークエンサーや生体分子解析では、検出物質のナノポアへの導入率・捕捉率の低さが重要な解決課題となっている。本研究では、1分子DNAの塩基配列決定精度の向上を目指して、ナノポアを通過するDNAの速度を遅くする流動制御技術の開発に注力してきた。しかし、本研究目的を越えて、ゲート電圧によるナノポア通過速度の制御技術が、1分子DNAのナノポアへの捕捉率を向上させる技術にも応用可能であることに気が付いた。そこで、1分子DNAのナノポアへの捕捉率を流体力学と電磁気学を同時に組み入れたマルチフィジックスモデルを用い、また、DNAのコンフォメーション変化によるエントロピートラップを考慮したシュミレーションを行ったところ、正と負のゲート電圧が、それぞれ高い・低いDNA捕捉率を与えることを見出した。1分子DNAの捕捉率の観点から実験結果を解析すると、負のゲート電圧は、遅いDNA通過速度を与える一方で、低い捕捉率を与えることを明らかにした。この結果は、ゲート電圧による1分子流動制御技術が、1分子DNAシークエンサーに高い捕捉率と高い塩基読取精度を同時に与える技術になることを示唆しており、1分子流動制御技術の新しい展開が見えてきた。今後の研究では、1分子流動速度のゲート電圧依存性・イオン濃度依存性の詳細を実験的・理論的に検討し、1分子流動ダイナミクスの基礎科学を構築するとともに、1分子の流動速度制御技術を開発する。
アントラセン骨格を組み込んだ含窒素大環状化合物の合成と酸化還元挙動の解明

アントラセン骨格を組み込んだ大環状分子として,最終年度は2,7-アントリレンユニットを組み込んだ大環状分子の合成を中心に進めた.昨年度,パラフェニレンジアミンと2,7-ジブロモアントラセンとのカップリングにより大環状分子を合成したので,今年度はメタあるいはオルトフェニレンジアミンとのカップリングを行い,目的化合物の合成に成功した.サイクリックボルタンメトリーにて酸化還元電位を調べたところ,パラ体と異なり非可逆なプロファイルがそれぞれ観測された.これは窒素原子と連結している芳香族との相互作用により複雑に酸化されることが示唆された.この結果から大環状分子の酸化種の安定性が置換位置によって異なることを見出した.また2,7-アントリレンユニット同士を窒素で直接連結した大環状分子の合成も試みた.当初2,7-ジブロモアントラセンとp-アニシジンとのカップリングを行ったが,生成物が非常に酸化されやすく取扱いが非常に困難であった.そこで2,7-ジブロモアントラセンの9,10位にフェニル基などを導入することで安定性の向上を図った.同様にカップリングを行ったところ,立体障害により環化反応が進まず,ポリマー化が優先的に起こった.このため,嵩高くない置換基としてアルキル鎖を導入することで環化反応を阻害しないように工夫して,2,7-アントリレンユニットを組み込んだ含窒素大環状分子の合成を進めている.本研究期間において,アントリレンユニットの様々な置換位置を窒素で連結した大環状分子の合成に成功し,それら酸化種の電子的特性を電子スペクトルとDFT計算により明らかにした.特に9,10-アントリレンユニットを組み込んだ含窒素大環状分子が構造的な要因により特異な電子物性を持つことを見出した.本研究により,アントラセンの構造的特徴を活かした新たな分子デザインの創出とその設計指針を確立することができた.アントラセン骨格を組み込んだ含窒素大環状分子として,今年度は9,10-アントリレンユニットを用いた化合物を中心に研究を進めた.はじめに原料となるジアミノアントラセン誘導体の合成方法を最適化した.9,10-ジアミノアントラセンは市販品であるジブロモアントラセンとp-アニシジンによるカップリング反応により合成した.一部酸化した副生成物も得られたが,反応条件を最適化することで減少させることができた.これを用いて,種々の含窒素芳香族ユニットとのカップリング反応を試みた.はじめにカルバゾールユニットとの大環状化を行ったところ,一段階のカップリング反応としては良好な収率で合成することができた.また上記の方法を利用して新たにカルバゾールを基盤とした大環状化合物の合成にも成功した.合成した大環状分子の物性を明らかにするために,種々の分光学的測定を行った.またサイクリックボルタンメトリーにより酸化還元電位を測定し,酸化側では可逆なプロファイルを得ることができた.酸化状態における電子構造を考察するために電解UV測定を行ったところ,近赤外領域まで達する新たな吸収帯が確認できた.吸収帯の帰属を行うために,DFT計算の結果を用いて検討した.また,その他の置換位置を持つジアミノアントラセン誘導体の合成検討も行った.はじめにジブロモアントラセン誘導体の合成を行った.当初はBergman環化を利用して1,2-ジブロモアントラセン誘導体の合成を試みたが,副生成物の分離が困難であった.このため多段階となるがFriedel-Crafts反応を経由させて,前駆体のアントラキノンの合成を試みたところ,中程度の収率で得ることができた.現在,これらを利用してジアミノアントラセン誘導体の合成に着手している.様々な置換位置を有する原料となるいくつかのジアミノアントラセン誘導体の合成に成功している.9,10-ジアミノ体を利用した含窒素大環状分子の合成とその解析が順調に進行しており,特に酸化状態での物性において非常に興味深い結果が得られており,成果をまとめる段階となった.副次的な化合物も合成できており,それらの物性評価に着手している.またその他の置換位置を持つアントラセン誘導体の合成も進めており,他の大環状分子の合成を進めることが可能となった.以上のことにより,本研究課題の最初の1年間の進捗状況はおおむね順調に進んでいる.アントラセン骨格を組み込んだ含窒素大環状分子として,今年度は2,3-置換および2,7-置換アントリレンユニットを導入した化合物を中心に研究を進めた.2,3-ジブロモアントラセンとp-アニシジンによるカップリング反応を用いて,パイ拡張型phenazine誘導体の合成に成功した.カップリング部位が立体的に混み合っていることから,現在反応条件を検討し,収率向上を目指している.パイ拡張型phenazine誘導体について良好な結晶が得られたのでX線結晶構造解析を行ったところ,分子構造は平面性が高く,パッキングは窒素を挟んだアントラセン部位同士が分子間でπーπスタックしている構造をとることがわかった.合成中間体である2,3-ジアミノアントラセン誘導体を用いて,ドナー/アクセプター型含窒素芳香族化合物の合成も試みた.合成した誘導体を用いて種々の分光学的測定を行った.吸収帯の帰属を行うために,DFT計算の結果を用いて検討した.一方,2,7-アントリレンを組み込んだ含窒素大環状化合物の合成も検討した.はじめに2,7-ジアミノアントラセンとジブロモベンゼンとのカップリングを試みたところ,ポリマーのような混合物が得られるのみであった.

そこで2,7-ジブロモアントラセンとパラフェニレンジアミンユニットとのカップリング反応を行ったところ,目的とする大環状化合物の合成に成功した.酸化還元電位を調べるためにサイクリックボルタンメトリーを測定し,可逆な3段階の4電子酸化波が観測され,酸化種が安定に存在できることが示唆された.酸化条件での電解吸収スペクトルも測定し,近赤外領域に幅広い吸収帯が観測された.これはTD-DFT計算の結果より電荷共鳴と電荷移動吸収に帰属できると示唆された.現在,置換位置による酸化種の安定性や電子状態への影響を調査しているところである.2,7-置換カルバゾールと9,10-ジアミノアントラセンおよび9,10-ジアミノアントラセンとパラフェニレンジアミンを交互に組み込んだ含窒素大環状分子の構造および酸化状態の分光学データ解析をDFT計算の結果から考察し,特に酸化状態の物性で非常に興味深い結果が得られた.これらの研究成果を取りまとめた論文を学術誌に発表することができた.また2,3-ジアミノアントラセン骨格を有する大環状分子について,副次的な化合物も合成できており,それらの物性評価に着手している.いくつかの含窒素大環状分子についても分光学および構造解析が進んでおり,成果をまとめる段階まできている.以上のことにより,本研究課題の2年目の進捗状況は概ね順調に進展している.アントラセン骨格を組み込んだ大環状分子として,最終年度は2,7-アントリレンユニットを組み込んだ大環状分子の合成を中心に進めた.昨年度,パラフェニレンジアミンと2,7-ジブロモアントラセンとのカップリングにより大環状分子を合成したので,今年度はメタあるいはオルトフェニレンジアミンとのカップリングを行い,目的化合物の合成に成功した.サイクリックボルタンメトリーにて酸化還元電位を調べたところ,パラ体と異なり非可逆なプロファイルがそれぞれ観測された.これは窒素原子と連結している芳香族との相互作用により複雑に酸化されることが示唆された.この結果から大環状分子の酸化種の安定性が置換位置によって異なることを見出した.また2,7-アントリレンユニット同士を窒素で直接連結した大環状分子の合成も試みた.当初2,7-ジブロモアントラセンとp-アニシジンとのカップリングを行ったが,生成物が非常に酸化されやすく取扱いが非常に困難であった.そこで2,7-ジブロモアントラセンの9,10位にフェニル基などを導入することで安定性の向上を図った.同様にカップリングを行ったところ,立体障害により環化反応が進まず,ポリマー化が優先的に起こった.このため,嵩高くない置換基としてアルキル鎖を導入することで環化反応を阻害しないように工夫して,2,7-アントリレンユニットを組み込んだ含窒素大環状分子の合成を進めている.本研究期間において,アントリレンユニットの様々な置換位置を窒素で連結した大環状分子の合成に成功し,それら酸化種の電子的特性を電子スペクトルとDFT計算により明らかにした.特に9,10-アントリレンユニットを組み込んだ含窒素大環状分子が構造的な要因により特異な電子物性を持つことを見出した.本研究により,アントラセンの構造的特徴を活かした新たな分子デザインの創出とその設計指針を確立することができた.9,10-アントリレンユニットを持つ化合物では,様々な含窒素芳香族ユニットを組み込んだ大環状化合物の合成に取り組み,その物性を電子スペクトルやサイクリックボルタモグラムにより明らかにする.
オキシトシンの新規機能の展開:摂食制御の神経経路と生理的病態的役割

室傍核nesfatin-1(Nesf)-オキシトシン(Oxt)ニューロン系の下流神経経路と上流制御系(1) Oxtニューロン神経終末は延髄孤束核(NTS)POMCに加えて、視床下部弓状核(ARC) POMCニューロンにコンタクトしていた。Oxtの脳室内投与により弓状核POMCニューロンにc-FOS発現が見られた。Oxtは単離弓状核POMCニューロンの細胞内Ca^<2+>を増加させた。以上の結果より、Oxtは弓状核POMCニューロンにも神経伝達することが明らかとなった。(2) 48時間絶食後に2時間再摂食させた条件で、室傍核(PVN) Oxt及び弓状核POMCニューロンのmRNAは変化せず、Oxt-mRFP-Tgラットの室傍核RFP蛍光の更なる増加は捉えられなかった。(3)室傍核Oxtニューロンを制御しているNesfニューロンが、食事因子の高グルコースとインスリンにより活性化されることを明らかにした。末梢投与Oxtの摂食・代謝作用(2)高脂肪食負荷により肥満したマウスにOxtの末梢投与(皮下および浸透圧ポンプ)を2週間行ったところ、延髄孤束核と室傍核が活性化され、摂食抑制とエネルギー消費亢進により体重が減少し、内臓脂肪蓄積・脂肪肝・高血糖が改善した。末梢投与Oxtの中枢情報伝達と抗肥満・抗メタボリックシンドローム効果について論文を発表し(Aging 3 : 1169-1177, 2011)、特許を出願した。Nesfのストレス応答への関与(1)ラットに拘束ストレスを負荷すると、ストレス関連神経核に局在するNesfニューロンが活性化された。(2) Nesfを脳室内投与すると、ストレス関連神経核のCRH・ノルアドレナリン・セロトニンニューロンが活性化され、さらに、血中ACTH,コルチコステロンレベルが上昇した。1.室傍核オキシトシン(Oxt)ニューロンの摂食抑制作用の仲介神経経路の解析:Oxt脳室内投与による摂食抑制が、メラノコルチン受容体(MC3/4R)ブロッカーで阻害されることを見出しており、MC3/4Rのリガンドである・・MSHを産生するPOMCニューロンがOxtの標的であると推定される。POMCニューロンは脳内で視床下部(ARC)と延髄(NTS)の2か所にのみ局在する。ARCのPOMCニューロンがOxtの標的であるかをラットにおいて検討した。形態学的観察の結果、室傍核OxtニューロンがARC POMCニューロンに投射していることが示された。またOxtは単離したARC POMCニューロンに直接作用し細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)を増加させた。このOxtの[Ca^<2+>]i増加作用は、レプチン抵抗性の肥満モデル動物であるZucker Fatty Ratでも正常動物と同様に観察された。以上の結果より、室傍核Oxtニューロンの標的として、以前報告した孤束核POMCニューロンと共に、ARC POMCニューロンが関与すること、OxtのARC POMCニューロン活性化作用はレプチン作用とは独立していることが明らかになった。2.室傍核Nesfatin-1-Oxt系のストレス性摂食変調への関与:ラットに拘束ストレスを負荷すると、視床下部と延髄のNesf神経細胞が神経活性化マーカーc-FOSを発現した。次に、Nesfatin-1を脳室内投与すると、視床下部・延髄のストレス

関連神経核にc-FOS発現が誘導され、その一部はCRH,セロトニン、ノルアドレナリンニューロンに局在した。さらにNesfatin-1の脳室内投与は血中ACTH、グルココルチコイドを増加させた。Nesfatin-1がストレス応答に関与することが明らかとなった。食事による室傍核Oxtニューロン、POMCニューロン活性化の検討1.Oxtニューロン軸索は孤束核POMCに加えて、弓状核POMCニューロンに投射していた。Oxtの脳室内投与により弓状核POMCニューロンにc-FOS発現が見られた。Oxtは単離弓状核POMCニューロンの細胞内Ca^<2+>を増加させた。以上の結果より、室傍核Oxtは弓状核POMCニューロンにも神経伝達することが明らかとなった。2.絶食後の再摂食によるニューロン活性化を検討した。48時間絶食後の2時間再摂食により室傍核オキシトシン(Oxt)、弓状核POMCニューロンのmRNAは変化しなかった。3.Oxt -mRFP-Tgラットの室傍核RFP蛍光は非常に強く、絶食後の再摂食による更なる増加は捉えられなかった末梢投与Oxtの摂食・代謝作用の検討2.末梢投与Oxtの中枢情報伝達と抗肥満効果:高脂肪食負荷による肥満マウスに2週間末梢Oxt投与(皮下および浸透圧ポンプ)すると、延髄とPVNが活性化され、摂食抑制・エネルギー消費亢進による抗肥満効果を示し、内臓脂肪蓄積・脂肪肝・高血糖を改善し抗メタボリックシンドローム効果を示した。特許を出願し、論文発表した(Aging3:1169-1177,2011)。
顔と身体表現の多文化比較フィールド実験研究

研究1の感情認識と研究2の感情表出について、表情判断のタブレット実験、表情表出の描画実験により順調に進展している。2017年度のフィールド実験として、タンザニア・カメルーン・タイ・フィンランドで単純顔の表情描画実験を実施した。2018年度のフィールド実験として、タンザニア・カメルーン・中国雲南・ケニアで表情判断実験および人物模写描画実験を実施した。日本国内にて、これらの実験結果との比較のためのコントロール実験を実施した。人類学と実験心理学の越境的学際融合に関して、以下のような取り組みを行った。計画班人類心理会議をこれまでに6度開催し、フィールド実験の進め方や得られたデータの解釈、人類学と実験心理学の越境的学際融合の進め方についてなど密に議論を行っている。計画班A01-P01床呂氏や公募班A01-K102田氏なども参加し、領域全体に渡る人類学=実験心理学の研究連携のハブとして機能している。越境的学際融合のため2018年度文化人類学会分科会「文化人類学と異分野のコラボレーションー達成したこと・問題点・今後の課題」にてフィールド実験研究の取り組みや課題、学際融合の実情を紹介し議論を進めた。A01-P01床呂氏がコメンテーターとして参加した。計画班C01-P01と合同で第3回顔身体カフェ「顔を描く・顔を描かれる・顔を知る」を開催した。顔を「描く」ことによる内面の表出についての調査を行い、実験計画(自画像描画)の立案につながっている。我々が当たり前のように顔として認識し、顔として扱っているものが、他の地域や文化の人たちにとってはそう見えていないのかもしれないという可能性を複数の研究結果が示している。トランスカルチャー状況における「顔」とは何かについてもう一度考え直すこと、そして安易な先入観や思い込みを排除して丁寧に調査することが、我々には必要であろうという結論に至っている。フィールド実験を通じた成果は以下の通りである。単純顔の表情描画実験の結果は顔の単純化表現、顔認識の枠組み構造の多様性が示唆される結果となった。単純顔の表情判断実験では、タンザニアやカメルーンで収集した笑顔については、日本よりも当該地域の人々の方が「笑顔」と判断する割合が高かった。我々にはすぐには検出できないような「その地域の笑顔の特徴」を捉えているのかもしれないが、判断バイアスなのか表情判断の精度が高いのか、更なる検証を要する。人物模写描画実験では、単純顔ではなく顔写真を模写する課題を実施した。フィールド実験における語りの人類学的研究として、フィールド実験の過程で、インフォーマントとの対話の中から興味深い仮説が得られている。顔の抽象化や顔認識の枠組みの様式には、我々が思っているよりも多様性があるのかもしれない。現在この仮説の検証実験を準備中である。このように顔研究について事前の計画を遥かに超える興味深い知見が集められている。そして本計画班のもうひとつの目的でもある異分野融合ー心理学と人類学のコンパクトな学際研究ーについては、単に融合して進めるというだけでなく、具体的にどのようなアウトプットが可能なのか、研究スタイルの違いをどのようにフィットさせればいいのか、これら様々な問題に対して議論のフェイズを抜け実践を重ねる段階まで至っており、人類学と実験科学の融合という新領域創成にひとつの道筋が見えつつある。以上のことを総合的に考えると、当初の計画以上に研究が進展していると評価できる。研究計画に大きな変更はないが、これまでのフィールド実験で得られた研究成果をもとに、方向性の修正を柔軟に行っている。第一に、これまでの研究経過でも述べたように「感情」の表出と認識から出発し、「顔」とは何かという問いに直面することとなった。この問いに正面から取り組むために、描画実験を改善し、顔研究のウェイトを上げて、身体(ジェスチャ)研究のウェイトをやや落としている。研究手法として、当初は各地域・環境・文化の人類学的背景の上で、フィールド実験データに対する定量的検証を行い、解釈することをアウトプットとして想定していた。この方向性にはかわりはないが、人類学と実験心理学の境界を超えたフィールド実験研究のダイナミックなプロセス、特に人類学者が実験を行う際のインフォーマントとの「対話」の中に、報告すべき重要な知見が溢れているということがさらに明確になった。このため、実験データの定量的検証に加え、(実験心理学分野では通常は無視する)実験時の語りの解析にもより注力していくこととした。したがって、今後の研究ではフィールド実験の結果としての定量的データだけでなく、フィールド実験の過程で生み出される語りのような質的(場合によっては量的)データについても、それ自体を研究成果として論文化を進めていく。顔身体学フィールド実験として、アフリカ(タンザニア)・カメルーン・フィンランド・タイ等世界各国にて実験・調査を実施した。また日本国内にて多地域の表情刺激について判断を行う表情弁別実験を実施した。文化人類学者が博士研究員として研究チームに加わり、研究手法、研究内容についてこれまで以上に多角的な視点で評価、議論できる体制が整った。12月に東京外国語大学で開催された「トランスカルチャー状況下における顔身体学の構築第2回公開シンポジウム」にて実験・調査渡航の報告発表を行った。3月にはバリ島ワークショップにてフィールド実験チュートリアルを行い、文化人類学チームと研究手法の共有を図った。同じく3月には心理学チームに同行してスイス・フランスの共同研究者を訪問し、国際連携でのフィールド実験共同研究についての議論を行った。

またフィールド実験という研究の方法論を含む、本研究チームの活動内容については多くの場で招待講演等を行った(日本視覚学会2018年冬季大会・大会企画シンポジウム「多文化をつなぐ顔と身体表現」、第1回犬山認知行動研究会議、関西学院大学KG-RCSP合同ゼミ、専修大学社会知性開発研究センター/心理科学研究センター「心理学における再現可能性入門」)。以上のように、研究初年度であったが、フィールド実験によるデータ取得と予備調査、国内外での研究チームの活動報告、様々な活動を通して文化人類学・哲学との連携体制を構築することが出来た。最大の目標であった顔身体学フィールド実験としては、アフリカ(タンザニア)・カメルーン・フィンランド・タイ等世界各国にて実験・調査を実施した。また日本国内にて多地域の表情刺激について判断を行う表情弁別実験を実施した。これらのデータについては現在、整理中であり、一部は学会発表等で報告している。予定していたとおり文化人類学者が博士研究員として研究チームに加わり、研究手法、研究内容についてこれまで以上に多角的な視点で評価、議論できる体制が整った。これにより、次年度以降の研究の計画立案も順調に進んでいる。その他、アウトリーチ活動も行っており(マハレ珍道中第9回帰路、一人旅、ムガンボ村にて船を待つマハレ珍聞, 30 (2017冬)、認知心理学者のタンザニア滞在記、心理学ワールド)、初年度としては順調に進んでいると言える。研究1の感情認識と研究2の感情表出について、表情判断のタブレット実験、表情表出の描画実験により順調に進展している。2017年度のフィールド実験として、タンザニア・カメルーン・タイ・フィンランドで単純顔の表情描画実験を実施した。2018年度のフィールド実験として、タンザニア・カメルーン・中国雲南・ケニアで表情判断実験および人物模写描画実験を実施した。日本国内にて、これらの実験結果との比較のためのコントロール実験を実施した。人類学と実験心理学の越境的学際融合に関して、以下のような取り組みを行った。計画班人類心理会議をこれまでに6度開催し、フィールド実験の進め方や得られたデータの解釈、人類学と実験心理学の越境的学際融合の進め方についてなど密に議論を行っている。計画班A01-P01床呂氏や公募班A01-K102田氏なども参加し、領域全体に渡る人類学=実験心理学の研究連携のハブとして機能している。越境的学際融合のため2018年度文化人類学会分科会「文化人類学と異分野のコラボレーションー達成したこと・問題点・今後の課題」にてフィールド実験研究の取り組みや課題、学際融合の実情を紹介し議論を進めた。A01-P01床呂氏がコメンテーターとして参加した。計画班C01-P01と合同で第3回顔身体カフェ「顔を描く・顔を描かれる・顔を知る」を開催した。顔を「描く」ことによる内面の表出についての調査を行い、実験計画(自画像描画)の立案につながっている。
新規開発アデニル酸シクラーゼ阻害薬による心筋細胞アポトーシス抑制

平成16年度に引き続き5型アデニル酸シクラーゼ抑制薬の検討を行った。5型アデニル酸シクラーゼは心臓におけるβ受容体の下流酵素であり、この酵素を標的とした薬剤はβブロッカーの欠点を解決しうる可能性を持つが、5型アデニル酸シクラーゼの生理的機能は未だ不明である。そこで本研究の目的は5型アデニル酸シクラーゼの心筋収縮及びアポトーシスに果たす役割を解明し、また新たに開発した5型アデニル酸シクラーゼ特異的抑制薬(PMC-6)の効果について調べることである。マウス及びラットの心筋初代培養を用いて、β受容体刺激時の心筋収縮及びアポトーシスをノックアウトマウス或いはPMC-6存在下で検討した。10週令マウスの分離心筋細胞を用いて、イソプロテレノール刺激時の心筋細胞収縮に対するPMC-6の効果を調べたところ、PMC-6はcAMP産生を減少させるにも関わらず心筋細胞の収縮性に影響を与えなかった。次に5型アデニル酸シクラーゼノックアウトマウスを用いてイソプロテレノール刺激時のアポトーシスについてTUNEL法で調べたところ、ノックアウトマウスの心筋細胞ではアポトーシスが誘導されなかった。次にPMC-6の効果を調べたところ、TUNEL法、DNA fragmentation ELISA法、caspase-3活性測定法の全てにおいてイソプロテレノール刺激によるアポトーシスを抑制した。これらより5型アデニル酸シクラーゼはβ受容体を介した心筋収縮には関与せず、アポトーシス誘導に選択的に働いていることが示唆された。結論としてPMC-6は、喘息患者にも投与可能な、且つ心機能に影響を与えない心臓特異的なアポトーシス阻害剤となる可能性が示された。次にin vivoでの検討を行うべくマウスの皮下に浸透圧ポンプを埋め込み、イソプロテレノールの持続注入下でPMC-6の効果を検討することとし現在基礎検討中である。βブロッカーは心機能抑制や喘息患者に対する慎重投与などの欠点を持つ。方法:マウス及びラットの心筋初代培養を用いて、β受容体刺激時の心筋収縮及びアポトーシスをノックアウトマウス或いはPMC-6存在下で検討した。また、PMC-6はイソプロテレノールによるフォスフォランバンのリン酸化にも影響を与えず、5型アデニル酸シクラーゼは心筋収縮に関与しないことが示唆された。

次にin vivoでの検討を行うべくマウスの皮下に浸透圧ポンプを埋め込み、イソプロテレノールの持続注入下でPMC-6の効果を検討することとし現在基礎検討中である。
デジタル化社会における公平な課税―「フェア・シェア」の探求

海外の租税法研究者との議論を通して,「フェアな課税」はフリーライダーを排除できる市場・社会において実現可能であることが確認できた。そのようなフリーライダーが,高度にデジタル化した市場において,急激に増大している。「新しいビジネスには新たな税」という考え方もありうるが,既存の課税システムを基本的に維持しつつ,申告納税手続の煩雑さを軽減するための新技術を活用するべきであろう。「公平課税」は,伝統的に国家によって保障されてきた。しかしながら「フェアな課税」は,納税者自らが実践していくものである。その意味で,高度にデジタル化された社会における納税者は,高い納税者意識と社会的責任を持つ必要がある。当初計画に沿い、EU域内の研究者との連携による下記セミナーを開催した。これらのセミナーには、大学院生を含む若手研究者にも報告者及び開催者として参加してもらうことを通して、EU域内の若手研究者との交流をはかることもできた。3上記2の共同セミナーの翌日1月16日、ウィーン側報告者4名と主催者で、前日のセミナーの論点整理と報告書作成のための準備会合を開催し、2015年夏を目途に、セミナー報告書(ディスカッション・ペーパー)を刊行するための手順を決定した。2課税における「フェアネス」は、日本の社会ではまだ十分に理解を得ていないことから、研究代表者においては学会報告や公表論文を通して、この考え方の紹介を行った。学会報告として「消費課税における事業者と消費者」(日本税法学会第105回大会・2015年6月13日開催)、公表論文として「デジタル化社会における消費課税の新たな手法」(税務弘報63巻5号48-54頁、2015年5月)、「消費課税における『事業者』と『消費者』ーフェアネスの視点からの考察ー」(税法学537号209-224頁、2015年5月)など。3グローバルな視点から最新の租税情報を入手するために、IFA総会(2015年度は2015年8月30日から9月4日までスイス・バーゼルにて開催)への出席が不可欠であるところ、研究代表者及び研究分担者が勤務校の公務のために日本を離れられないため、研究協力者(古賀敬作・大阪経済大学経営学部専任講師)を派遣し、「国際課税の最近の展開」や「国境を越えるサービスの提供と消費税」などのテーマに関する情報収集を行った。また、IFA総会に予定通り、古賀敬作・大阪経済大学経営学部専任講師を派遣することができ、国際租税の最新情報を入手することができた。今年度は、国内で組織した研究会(日本税務研究センター・「消費税の研究」特別研究会)を基盤に、フェアな消費税および現代的消費税の在り方を検討した。その成果は、下記のとおりである。1「消費税の税率構造とインボイスー伝統的消費税と現代的消費税からの示唆」税理59巻5号1ー9頁(2016年4月)2「仕入税額控除」公益財団法人日本税務研究センター編『消費税の研究』465ー514頁(2017年1月)また、研究代表者・西山および研究分担者・柴は、中央大学法学会・法学新法において、下記の論文を公表した。3西山由美「消費課税におけるインボイスの機能と課題ーEU域内の共通ルールと欧州司法裁判所判例を素材としてー」法学新法123巻11・12号119ー150頁(2017年3月)4柴由花「非居住者・多国籍企業の情報:自動的情報交換に関連するEUルールの模索」法学新報123巻11・12号357-388頁(2017年3月)研究報告としては、大阪経済大学で研究代表者・西山および研究分担者・柴は、下記の高騰報告を行った。5西山由美「消費税とフェアシェア」大阪経済大学:ビジネス法コース・税法務プログラム(2016年8月13日)6柴由花「中小企業の事業承継と税不動産を中心として」大阪経済大学:経営・ビジネス法情報センター、経営学部、大学院経営学研究科共催経営と法セミナー(2016年8月20日)上記の業績の中でも、とくに公刊された論文14は、2016年に耳目を集めたパナマ文書やBEPS(税源浸食・利益移転)の問題を踏まえ、真にフェアな課税を実現するための取引情報・税務情報の透明化に向けた制度設計の在り方に着目している。最終年度(2016年度)には、「公平課税」の権威であるドイツの教授を招聘し、「課税におけるフェアネス」をテーマにセミナーを開催する予定であったが、同教授の体調不良による来日断念により、計画変更をせざるをえなかった。また研究代表者・西山が、同僚の急病に伴って急きょ、平成28年度4月より大学院(法と経営学研究科)主任を務めることになり、完成年度の組織運営に忙殺され、同年度中の新たなセミナーの開催計画を立てることができず、本科研費課題を1年延長せざるをえなくなった。しかしながら、海外の研究者との共同研究に代え、国内の研究者と研究会(「消費税の研究」特別研究会)を組織し、法学、経済学、財政学の専門家とともに「フェアかつモダンな消費税」の研究を行った。研究代表者・西山は、この研究会に副部会長としてかかわり、研究会の成果を580頁に及ぶ報告書(「消費税の研究」)としてまとめることができた。

以上により、当初計画の海外研究者とのセミナー開催は、2017年度に持ち越されたものの、国内研究者との共同研究を通して本科研費課題に即した研究成果を出すことができたことから、進捗状況としては「やや遅れている」に相当するものと判断した。最終年度には,1研究の総括として国際セミナーを開催および2研究課題に即した論文の公表3デジタルエコノミーに即応した税制を持つオランダでの実地調査を行った。1の開催準備は,研究代表者と研究分担者が協力して行った。1について,2017年10月27日に明治学院大学にてRichard Krever教授(西オーストラリア大学)を招へいし,「ポスト・モダン消費税に向けて」というテーマでセミナーを開催した。地域横断的に世界中の消費税を実地で研究しているKrever教授の視点を通した「フェアな消費税の在り方」について,研究者,実務家およびこの分野を学ぶ大学院生とともに議論を行った(参加人数はゲストを含め19名)。2について,次に,2017年度に本研究課題について公表した研究代表者の論文(単著)は,以下のとおりである。(a)「消費税と脱税」木村弘之亮先生古稀記念論文集編集委員会編『公法の理論と体系思考』・・・相対的に消費税率の高いEU域内では,消費税の脱税スキームが蔓延している。欧州司法裁判所の判例を用いてその実態を概観し,各加盟国の対策について考察を加えた。(b)「消費課税ー国境を越えるデジタル取引をめぐって」金子宏監修『現代租税法講座・国際課税』・・・国境を越えるデジタルサービスに対する消費課税ルールの不備が,フェアな課税を阻んでいることに鑑み,2016年10月から日本でも導入されるリバースチャージ制度の課題について検討を行った。(c)「金融サービスに対する消費課税」論究ジュリスト24号・・・Krever教授の近著“VAT and Financial Services"を素材に,金融サービス領域での仕入税額控除の遮断について論じた。33月にアムステルダムのIBFDでオランダ税制の調査を行った。海外の租税法研究者との議論を通して,「フェアな課税」はフリーライダーを排除できる市場・社会において実現可能であることが確認できた。そのようなフリーライダーが,高度にデジタル化した市場において,急激に増大している。「新しいビジネスには新たな税」という考え方もありうるが,既存の課税システムを基本的に維持しつつ,申告納税手続の煩雑さを軽減するための新技術を活用するべきであろう。「公平課税」は,伝統的に国家によって保障されてきた。しかしながら「フェアな課税」は,納税者自らが実践していくものである。その意味で,高度にデジタル化された社会における納税者は,高い納税者意識と社会的責任を持つ必要がある。1当初の予定通り、Lang教授(ウィーン経済大学)及び4名の若手研究者を招聘して、共同セミナーを開催することができた。2上記共同セミナーは、ウィーン側4名及び日本側3名の若手研究者が報告を担当し、これに実務家の特別講演が加わり、中堅世代の研究者が質疑応答をリードする形式をとることにより、率直かつ活発な意見交換を実現できたことに加え、両国の若手研究者同士の交流の機会をもつこともできた。3上記共同セミナーに先立ち、「フェアネス」の概念の理解を深めるために、Hemels教授(エラスムス大学)とのセミナーを開催することができた。4これまでのEU域内の租税法研究が英独仏中心であったが、中堅国であるオーストリアやオランダの研究者との交流を通して、EU域内の租税政策への理解を深化させることができた。
VLPを用いたノロウイルスの浄水処理性評価

培養ができないことから明かではなかったノロウイルスの浄水処理性を、ウイルス外套タンパク粒子(VLPs)を用いることにより明らかにした。また、免疫PCRによるノロウイルスの高感度検出系を確立し、VLPsと組み合わせることにより、より詳細なノロウイルスの浄水処理性を調べた。その結果、凝集を前処理として組み込んだMF膜処理は、分画分子量1kDaのUF膜処理と同等のノロウイルス除去性を有することが示された。微生物(原虫,細菌,ウイルスなど)を用いた水処理実験を行う際には、実験に先立ち、対象微生物を培養し、大量のストックソリューションを作成する必要がある。ところが、ノロウイルスは、これまで多くの努力が払われてきたにも関わらず、未だ細胞を用いた培養が確立されておらず、ウイルスの大量培養ならびに添加実験が極めて難しい状況にあるのが現状である。近年、培養不能なノロウイルスの構造や抗原性を調べるため、ウイルス外套タンパク(VLPs : Virus Like Particles)を遺伝子組換え生物を用いて発現させる手法が確立された。また、発現されたVLPsを用いることによりノロウイルスの酵素免疫測定法が開発され、現在では検出キットが市販されるようになった。本研究では、VLPsを用いてノロウイルスの室内水処理実験を行うことを目的とした。本年度は、ウイルスの超微粉化活性炭への吸着性を調べた。その結果、ウイルスを吸着することのできる活性炭と、できない活性炭があることが分かった。この差異は、(1)活性炭の表面電位が異なること、(2)活性炭表面に40100nm程度の細孔が存在するか否か、に依存する可能性が示された。また、1時間の接触でウイルスが1log程度除去できることが分かった。現行の水処理ではウイルスは活性炭の除去対象とは考えられていないが、カビ臭抑制などの主目的の他にも、副次的効果としてウイルス除去にもいくぶん貢献していることが示された。昨年度は、遺伝子組換え技術によりノロウイルスVLPを発現させ、その形状,サイズ,比重などが野生ノロウイルスと同様であることを確認した。また、このVLPを用いて、凝集-沈澱-砂ろ過という一般的な浄水処理プロセスでのノロウイルスの処理性をベンチスケールの室内実験により世界で初めて評価することに成功した。しかしながら、昨年度に用いたVLPの定量法(市販のキットを用いたELISA法)では感度不足であるため、室内実験設備に添加するVLP濃度が、実処理施設に流入すると予想される濃度より遙かに大きい値での実験しか行うことができなかった。本年度は、浄水処理過程におけるウイルスの処理性を評価する目的で、ノロウイルス外套タンパク粒子(VLPs)を使用した実験を行っているが、検出系のELISA法の代替となるimmuno-PCR検出系を構築した。外套タンパク粒子は内部にRNAやDNAを持たないため、検出用の抗体にタグ配列を結合し、PCRによる高感度検出を目指した。抗原抗体反応を行うプレートの形状の影響排除、反応プログラムの至適化、制限酵素EcoRIによるタグ配列の分離回収、プライマー濃度等組成の至適化を行った結果、10^<10>10^<12>VLPs/mLで濃度依存性が観察された(図7)。この範囲内でVLPsのimmuno-PCRによる定量が可能となり、ELISA法と同等の感度に達した。使用する抗体等の最適化を進めることで、さらに感度向上が期待された。昨年度までに、遺伝子組換え技術によりノロウイルスVIP(ノロウイルスの外套タンパク粒子)を発現させ、その形状,サイズ,比重などが野生ノロウイルスと同様であることを確認した後、凝集ー沈澱ー砂ろ過でのノロウイルスの処理性をベンチスケールの室内実験により世界で初めて評価することに成功した。しかしながら、これまで用いてきたVLPの定量法(市販のキットを用いたELISA法)では感度不足であるため、室内実験設備に添加するVLP濃度が、実処理施設に流入すると予想される濃度より遙かに大きい値での実験しか行うことができなかった。本年度は、検出系のELISA法の代替となるimmuno-PCR検出系を構築した。抗原抗体反応を行うプレートの形状の影響排除、反応プログラムの至適化、制限酵素EcoRIによるタグ配列の分離回収、プライマー濃度等組成の至適化を行った結果、10^5VLP/mL程度まで定量が可能となった。これにより、これまで用いてきたELISA法の1,00010,000倍の高感度でノロウイルスVLPを定量することができるようになった。この手法を用いて、MF膜,UF膜,凝集ーMF膜処理でのノロウイルスの除去性を調べたところ、以下の知見を得た。(1)分画分子量1kDaのUF膜を使うと、ノロウイルスを4log除去できた。

(1)孔径0.1umのMF膜ではノロウイルスは除去できなかったが、PACIを用いた前凝集処理を行うことにより、分画分子量1kDaのUF膜と同等の除去率が得られた。(3)大腸菌ファージQβもMS2も、MF膜,UF膜,凝集ーMF膜処理でのノロウイルスの代替指標として用いることはできないと判断された。
難治性卵巣がんに対する新規がん胎児性抗原を標的とした免疫療法の開発

難治性卵巣がんの免疫療法として「卵巣明細胞腺がんに対するHLA-A24および-A2結合性Glypican-3(GPC3)由来ペプチドワクチン療法の臨床第II相試験」をスタートさせており、症例登録が徐々に進んでいる。Ex vivo IFNγELISPOTアッセイを用いた免疫学的モニタリングにてワクチン投与前に比べ、ワクチン投与後でGPC3特異的CTLが末梢血中に増加していることおよび安全性が確認できつつある。また、進行症例1例においてPRの結果を得ており今後さらに症例の集積を行う。卵巣がん患者の死亡数は年々増加しており、上皮性卵巣癌の中で明細胞腺癌は抗がん剤抵抗性であることから、進行、再発癌の予後が極めて不良であり、新規治療法が期待されている。我々は卵巣明細胞腺癌患者60例における免疫染色の結果、患者の約50%に新規がん胎児抗原であるGlypican-3(GPC3)が発現していることを確認した。また、1期症例に限定するとGPC3の発現は予後不良因子になることを見出した。また、癌組織のRT-PCRによる解析では約60%の患者においてGPC3mRNAの発現が確認された。さらに、卵巣明細胞患者の血清のELISA染色において、約40%の患者血清中においてsoluble GPC3の発現が確認された。また、悪性卵巣胚細胞腫瘍の1つである卵黄嚢腫瘍の免疫染色において100%の症例においてGPC3の発現が認められた。以上の結果からGPC3は癌免疫療法の腫瘍抗原となり得る可能性が示唆された。また、我々は卵巣がん細胞株におけるGPC3の発現の検討を行い、卵巣明細胞腺癌細胞株においてGPC3の強発現を確認した。その他、卵黄嚢腫瘍細胞株でも発現を認めた。特にKOC7C細胞ではGPC3が強発現していた。我々は、日本人の多くが所有するHLA-24とHLA-2に結合親和性の高いGPC3エピトープペプチドを作製した。また、卵巣明細胞腺癌患者から文書による同意を得て、末梢血単核球(PBMC)を採取し、ペプチド特異的CTLの誘導をELISPOTアッセイ、Tetramerアッセイにて検討し、ペプチド特異的CTLのクローン化に成功した。今後、このクローンを用いてGPC3発現細胞株(KOC7C)およびshRNA導入によるGPC3発現抑制細胞株における細胞障害性についての検討を予定している。卵巣明細胞腺がんにおけるGlypican-3 (GPC3)ペプチドワクチン療法の基礎的検討を行うことを目的として本年度の研究を行った。HLA-A2拘束性GPC3ペプチド特異的CTLクローンを用いて卵巣明細胞腺がん細胞株に対するIFN-γELlSPOT assayおよび細胞傷害性試験を行った。その結果、IFN-γELISPOT assay及び細胞傷害性試験により、GPC3ペプチド特異性が認められ、明細胞腺がん細胞株KOC-7cを傷害した。GPC3-shRNA導入によりKOC-7cのGPC3発現量を低下させることでこのCTLの反応は抑制された。様々ながん種を対象とした検討では、CTLクローンの免疫応答はGPC3の発現量に左右される結果であった。subtoxicな抗がん剤用量であっても、前治療を併用することでCTLによる細胞傷害効果の上乗せが認められた。GPC3発現量とGPC3ペプチド特異的CTLクローンの免疫応答について相関関係が認められたことから、臨床試験に用いているHLA-A2のGPC3ペプチドについては、HLA-A2陽性のGPC3陽性がん細胞から内因性に提示される本ペプチド量は、GPC3自体の発現量を調べることで推測されうると考えられた。subtoxicな抗がん剤用量での前治療とGPC3特異的CTLの併用によって細胞傷害性に上乗せ効果が得られたが、卵巣明細胞腺がんのGPC3ペプチドワクチン臨床試験では抗がん剤併用群も設定しており、その作用機序を含めた追加解析を計画している。本年度は臨床試験を中心に研究を行った。ペプチドワクチンを投与された卵巣明細胞腺がん患者におけるEx vivo IFNγELISPOTアッセイを用いた免疫学的モニタリングにて17症例中16症例(寛解群11例、化学療法併用群1例:および進行群4例)においてワクチン投与前に比べ、ワクチン投与後でGPC3特異的CTLが末梢血中に増加していることが確認できた。TC(パクリタキセル+カルボプラチン)療法と併用された1例のみではあるが、免疫抑制作用のある化学療法併用群においてもGPC3特異的CTLが誘導された結果が確認できた。現在までの登録症例は20例とまだ少数例ではあるが、注射部局所の発赤や硬結は全例にみられたものの、投与中止基準に相当するGrade4のような重篤な非血液有害事象の発生は1例もみられなかった。

現時点で、寛解群(ワクチン投与計10回のプロトコール終了7例およびワクチン投与中6例)の平均観察期間は7.6か月とまだ短いものの、全例において再発は認められていない。進行群5例中1例で、治療開始3か月時点でPRの臨床効果(肝転移、傍大動脈および右外腸骨リンパ節転移の縮小あり、新規病変なし)を認めた。また、この症例を含み進行群5例中3例で、ワクチン投与前に比べ腫瘍マーカーの低下がみられた。HLA-A2402陽性であった進行群患者2名のワクチン投与後PBMCからのGPC3ペプチド特異的CTL誘導ではそれぞれの患者のPBMCから12個および10個のクローンが樹立された。樹立された22個のCTLクローンは、すべてDextramerを用いたFACS再解析で、ほぼ100%GPC3デキストラマー陽性のGPC3ペプチド特異的CD8陽性キラーT細胞であり、GPC3ペプチドをパルスした標的細胞(T2細胞)に対してIFNγELISPOTアッセイにおいても明らかなGPC3ペプチド特異性が認められた。
明末北曲雑劇における本文批判とその刊行に関する考察

従来、明代に編纂された『元曲選』より成立の早い戯曲テクストについて、その本文は大同小異であり、いずれも宮廷本が起源とされてきた。だが、南京の書肆継志斎が刊行した「揚州夢」を調査した結果、これに近いテクストが民間に伝わり、継志斎本収載の「揚州夢」がこの民間に伝わるテクストに拠っていることが判明した(福永2018)。この議論は、「価値のあるものは民間にある」という思想が士大夫層に浸透していることを「揚州夢」の本文批判をとおして明らかにしたものであるが、本研究はそれをさらに発展させることを目的とする。
血小板活性化因子(PAF)の新しい酵素的微量定量法とその応用

血小板活性化因子(PAF)は, 1-アルキルー2-アセチルーsn-グリセロー3-ホスホコリンの構造を持つリン脂質メディエーターであり,微量で様々な生理活性を示す.生体内での血圧の恒常性やアナフィラキシー,炎症反応等でPAFが作用している可能性が示唆されているが,簡便で再現性のある微量定量法がないため,未だ生体内反応における真の重要性は明らかにされていないのが現状であった.従来PAFの定量はおもに生物学的方法は試料の血小板活性化能を測定するもので,検出限界(10^<-13>モル)は低いが,活性化させずに血小板を調製することが難しく,再現性に問題がある.一方質量分析法は検出限界(2×10^<-11>モル)が高く,質量分析計が必要である.我々はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の測定法をコリンの微量定量に応用し,簡便で再現性よく10^<-11>モルのPAFを定量できる測定系を構築した.すなわち試料中の脂質からHPLCでPAF画分を分離後,ホスホリパーゼD処理で得たコリンを[^3H]-アセチルCoA存在下コリンアセチルトランスフェラーゼで[^3H]-アセチルコリンとし,抽出後放射活性を測定する.様々な条件検討を行った結果,ホスホリパーゼDはストレプトマイセスクロモホスカス由来の部分精製酵素,コリンアセチルトランスフェラーゼはヒト胎盤より部分精製酵素を用いることで感度を向上させた.反応液量を15μlとし,ホスホリパーゼD, [^3H]-アセチルCoA,コリンアセチルトランスフェラーゼを同時に加え6時間で定量できるようにした.アセチルコリンの抽出に用いる溶媒混合比を変えて感度を向上させた.この新しい酵素的定量法を応用し,マクロファージ様細胞株J774.1をA23187刺激した際にPAFの産生及び放出が起こることを示した.またカゼイン投与で誘導したラット腹腔侵出液中に多量のPAFを検出した.血小板活性化因子(PAF)は, 1-アルキルー2-アセチルーsn-グリセロー3-ホスホコリンの構造を持つリン脂質メディエーターであり,微量で様々な生理活性を示す.生体内での血圧の恒常性やアナフィラキシー,炎症反応等でPAFが作用している可能性が示唆されているが,簡便で再現性のある微量定量法がないため,未だ生体内反応における真の重要性は明らかにされていないのが現状であった.従来PAFの定量はおもに生物学的方法は試料の血小板活性化能を測定するもので,検出限界(10^<-13>モル)は低いが,活性化させずに血小板を調製することが難しく,再現性に問題がある.一方質量分析法は検出限界(2×10^<-11>モル)が高く,質量分析計が必要である.我々はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の測定法をコリンの微量定量に応用し,簡便で再現性よく10^<-11>モルのPAFを定量できる測定系を構築した.すなわち試料中の脂質からHPLCでPAF画分を分離後,ホスホリパーゼD処理で得たコリンを[^3H]-アセチルCoA存在下コリンアセチルトランスフェラーゼで[^3H]-アセチルコリンとし,抽出後放射活性を測定する.様々な条件検討を行った結果,ホスホリパーゼDはストレプトマイセスクロモホスカス由来の部分精製酵素,コリンアセチルトランスフェラーゼはヒト胎盤より部分精製酵素を用いることで感度を向上させた.反応液量を15μlとし,ホスホリパーゼD, [^3H]-アセチルCoA,コリンアセチルトランスフェラーゼを同時に加え6時間で定量できるようにした.アセチルコリンの抽出に用いる溶媒混合比を変えて感度を向上させた.この新しい酵素的定量法を応用し,マクロファージ様細胞株J774.1をA23187刺激した際にPAFの産生及び放出が起こることを示した.またカゼイン投与で誘導したラット腹腔侵出液中に多量のPAFを検出した.血小板活性化因子(PAF)は微量で強い生理作用を発現し、血小板活性化だけでなく血圧降下,血管透過性上昇など広範な生理作用を持つため、炎症やショック時におけるケミカルメディエーターとして注目されている。PAFの生体内動態を知り、役割を明らかにするためには、正確にPAFの量を定量する必要がある。しかしPAFの定量法としては従来、血小板活性化を指標とした生物学的方法と、質量分析を用いた方法しか報告されておらず、前者は定量性および再現性に欠け、後者は感度が劣り操作が煩雑である欠点を持っていた。そこで本研究では、PAFがコリン残基含有リン脂質であることに注目し、酵素反応を組みあわせた新しいPAFの酵素的微量定量法を考察した。すなわち、まず試料中からHPLCで精製したPAF画分をホスホリパーゼD処理することにより定量的にコリンを得た。次に生成したコリンにコリンアセチルトランスフェラーゼと放射標識アセチルコリンを作用させ生じる放射標識アセチルコリンを有機溶媒に抽出し定量した。酵素源はいろいろ検討の結果、ホスホリパーゼDとしてはストレプトマイセスクロモホスカス由来の部分精製品を、コリンアセチルトランスフェラーゼとしてはヒト胎盤からやはり部分精製したものを用いることにした。また、種々の条件を検討したところ、pmolオーダーのPAFを測定することが可能となった。最近PAFを静脈投与することによりラットに実験的胃潰瘍を惹起できることが報告された。

そこで、本定量法を用いてラット胃粘膜中のPAF画分の定量を行うことにした。現在までのところ未処理ラットの胃粘膜中には比較的多量のlyso PAFを含んでいることが明らかとなった。ストレス付加により生じるストレス潰瘍について検討中である。
量子ビーム架橋技術を用いたコラーゲンゲルにおけるヒト歯髄幹細胞の幹細胞特性の解明

本研究で使用する、電子線やγ線、イオンビームなどの量子ビームを応用した架橋技術によるコラーゲンゲルは、コラーゲンの硬さ(強度)を2次元あるいは3次元的に制御したハイドロゲル化により、歯髄幹細胞の機能性足場となる。本技術は、薬剤を用いず生体適合性を保った状態でコラーゲンをハイドロゲル化することにより、その硬さを神経や血管組織、硬組織に適合した強度にコントロールすることを可能とする。本研究を基盤とし、歯髄幹細胞を用いた量子ビーム架橋コラーゲンハイドロゲル材料の先端バイオデバイス応用による高度な物性制御技術を駆使して、新規再生治療法に向けた研究開発を進める。