hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「看護管理者用SOC（首尾一貫感覚）向上プログラム」の開発とその有用性の検証

平成29年度までに実施した研究成果(プログラム内容)および、それを根拠とした看護管理のあり方について、看護学会の交流集会等で周知するとともに会の参加者と意見交換を図った。またそれらの結果を論文作成に活かすことを試みた。一方、これまでの所見をもって高度実践看護師の育成および、高度実践看護師の看護管理方法について示唆を得るために、そのような立場にある管理者および教育者、研究者の意見を聴取する機会を設けた。結果、高度実践看護師の育成は現看護界において必須であるという価値観が浸透する中、資格を得た高度実践看護師の看護管理方法について、複数の今後の課題が掌握された。今後引き続き、管理者用SOC向上プログラムの洗練化と周知を進めるための基盤づくりを行った。本研究目的は、看護管理者を対象としたSOC(sense of coherence:首尾一貫感覚)(以降、SOCとする)向上プログラムを実施し、その有用性を評価することである。研究意義は、SOCのコンセプトを指標に看護師の自律性や管理能力を掌握し、コンセプトを基軸としたキャリアデザインを発展し得る可能性を確認できることである。したがって初年度である平成27年度は、看護管理者を対象とした研修会(介入)遂行に備えて、研修会のデザイン構築のため、他の看護管理者ないし看護師を対象とした研修会の視察および、SOC向上研修会に関連した文献検討等を実施した。すべて平成28年度の介入準備としての試みであったが、具体的には都内で行われている認定看護管理者コースの授業見学を行うとともに、研究対象となる候補病院を探索した。研究対象の選択要件は、関東および九州圏の、看護師配置7対1をクリアする500床以上の病院の看護部あったが、無作為抽出ではなくコンビニエントサンプリングとしたため、該当する病院を知人等を通じて探索した。なお上記試みの結果であるが、認定看護管理者コースでの授業デザインは、講師の学生の主体性を徹底的に重視した内容が画期的であり、われわれの介入(研修会)デザインを描くうえで大変参考になった。看護管理者の主体性は一般看護師のそれと比較してパワフルであることは推察されていたが、看護管理者の遂行能力も非常に高いものであった。だからこそ看護管理者の自由度を保証した、看護管理者(受講生)の横の関係を促進する促しやファシリテーションが重要であることが示唆された。初年度として予定通りに進捗している。研修会のデザイン構築のため、他の看護管理者ないし看護師を対象とした研修会の視察および、SOC向上研修会に関連した文献検討等を実施した。関東圏8施設、九州圏1施設の計9件の中・大規模病院の看護管理者、計180を対象に、「改訂版首尾一貫感覚(SOC: sense of coherence)向上プログラム」を実施した。1施設ごと、90分ないし120分のSOC研修会を年3-4回実施した。各回ではSOC、ストレスコーピング、感情コントロール等に関する講義と、事例を用いたコンサルテーションのグループワークを行った。なお、研修前と後に、SOC評価尺度(山崎,1999)、看護専門職における自律性測定尺度(菊池,1999)、看護管理者のコンピテンシー評価尺度(本村,2013)、属性等を含む匿名式の質問紙調査を実施し、尺度得点の推移を検定した。また本プログラムの有用性を掌握するために、全研修会終了後4施設の看護部にてインタビュー調査を実施した。結果、対象者180名の職位は、看護師長が5割、副看護師長が3割であった。参加者の中で研修前後の質問紙が返信されたのは140名(男性16名、女性124名)であり、対象者の研修前後のSOC平均得点、自律性平均得点、コンピテンシー平均得点に有意な相違は認められなかった。しかし3尺度得点間にはすべての組合せで、正の相関が認められた(SOCが高いほど自律性とコンピテンシーは高かった)。さらに、インタビュー調査から得られた研修に対する意見としては「SOCを学ぶことで資源を探すことや、体験の意義づけ、予測性の重要性について理解できた」「師長同士で事例検討を行うことで、普段の交流では得られない学びが得られた」「日常の臨床の中でSOCを結びつけるにはもう少しトレーニングが必要かもしれない」「管理者にとってSOCの視点は参考になるし、管理者以外にも学んでほしい」「SOCの概念が抽象的で、理解しづらい点もあった」等があった。毎回の研修会は意図したとおりに終了し、参加者からはおおむね良い評価を得たと考えられる。協力病院看護部及び看護管理者の同意を得て、順調に首尾一貫感覚向上プログラムを実施することができた。毎回の講義とコンサルテーション事例検討会についても、好評を得た。特に終了後のインタビュー調査では、本プログラムが斬新であり、新しい指標を持ってコンサルテーションすることの意義を了解した旨の感想を得ることができた。最後に、尺度を用いた質問紙調査の分析結果からも、関心深い所見を得ることができた。なお、対象者数を計画当初、500名としていたが実際は目減りしている。ただし、平成29年度も同プログラムを他の病院看護部で実施する予定である。それによって補うことが可能である。

各回ではSOC、ストレスコーピング、感情コントロール等に関する講義と、事例を用いたスーパービジョンのグループワークを行った。なお、研修前と後に、SOC評価尺度(山崎,1999)、看護専門職における自律性測定尺度(菊池,1999)、看護管理者のコンピテンシー評価尺度(本村,2013)、属性等を含む匿名式の質問紙調査を実施し、尺度得点の推移を検定した。また本プログラムの有用性を掌握するために、全研修会終了後4施設の看護部にてインタビュー調査を実施した。結果、対象者180名の職位は、看護師長が5割、副看護師長が3割であった。参加者の中で研修前後の質問紙が返信されたのは140名(男性16名、女性124名)であり、看護管理者としての経験年数は5年未満44.9%、10年未満24.7%、15年未満15.7%、20年未満9.0%、25年未満5.6%であった。また140名の対象者の研修前後のSOC平均得点、自律性平均得点、コンピテンシー平均得点に有意な相違は認められなかった。しかし3尺度得点間にはすべての組合せで、正の相関が認められた(SOCが高いほど自律性とコンピテンシーは高かった)。さらに、毎回の研修会は意図したとおりに終了し、インタビュー調査から得られた研修に対する意見からは、参加者の評価が肯定的であることが示唆された。平成29年度に実施予定であった、一般演題等の学会発表、商業誌への投稿・掲載等による成果発表以外での発表が停滞しており、本年度はそれに着手する予定である。具体的には開発した看護管理者SOC向上プログラムのマニュアル作成とその全国配布等である。平成29年度までに実施した研究成果(プログラム内容)および、それを根拠とした看護管理のあり方について、看護学会の交流集会等で周知するとともに会の参加者と意見交換を図った。またそれらの結果を論文作成に活かすことを試みた。一方、これまでの所見をもって高度実践看護師の育成および、高度実践看護師の看護管理方法について示唆を得るために、そのような立場にある管理者および教育者、研究者の意見を聴取する機会を設けた。結果、高度実践看護師の育成は現看護界において必須であるという価値観が浸透する中、資格を得た高度実践看護師の看護管理方法について、複数の今後の課題が掌握された。今後引き続き、管理者用SOC向上プログラムの洗練化と周知を進めるための基盤づくりを行った。本年度は介入(看護管理者を対象としたSOC向上プログラムの実施)を行う。対象は、関東圏の病院8施設と、九州圏の病院1施設である。具体的には虎の門病院(東京)、東京西徳洲会病院(東京)、丸木記念福祉メディカルセンター(埼玉)、埼玉医科大学附属病院(埼玉)、埼玉医科大学国際医療センター(埼玉)、光の家(埼玉)、国立病院機構東埼玉病院(埼玉)、千葉徳洲会病院(千葉)、国立病院機構小倉医療センター(福岡)である。平成29年度も同プログラムを他の病院看護部で実施することで、管理者に対するSOCプログラムの有用性をさらに検証することが可能である。当初の予定通り、看護管理者用SOC向上プログラムの意義と手順(フローチャート)等を記載したマニュアルと、必要教材についてパッケージ化して看護管理者養成機関及び病院看護部に配布する。学会発表等を通じてプログラムの周知を図る。
ケイ素、フッ素系高分子物質の乳化・可溶化および機能付与

ケイ素およびフッ素系高分子物質は、化粧品、医薬品、表面加工剤など私たちの生活において幅広く利用されている。しかし、ケイ素およびフッ素系高分子物質を希釈できる溶剤は、その種類が乏しく、かつ経済・安全性に問題があり実用的ではない。ゆえにこの機能化のためには界面活性剤を用いて「乳化・可溶化」を行い、水中に分散させるのが最適である。しかし、界面活性剤は周囲の環境により集合傾向が変化してさまざまな分子集合体(ミセル、逆ミセル、ライオトロピック液晶、マイクロエマルションなど)を形成し、状態の理解は困難をきわめる。そこで、乳化・可溶化形成を系統的に理解するために、水/界面活性剤/シリコーンあるいはフルオロカーボン系の形成するさまざまな液相を、相平街図を作成して系統的な理解を試みた。その結果、水/界面活性剤/シリコーンオイル(ケイ素系高分子)系においてマイクロエマルションの形成に成功した。また、このマイクロエマルションから乳化調製を行うと、乳化機を必要とせずにサプミクロンオーダーの非常に微細かつ分散安定な水中油滴型エマルションが得られることを見いだした。これらの成果は国内・国外の討論会で公表しており(※)、論文投稿の準備も進んでいる。なお、フルオロカーボン(フッ素系高分子)は予備的実験の段階ではあるが、マイクロエマルション形成の可能性をあることがわかっており、今後も継続して研究する予定である。(※)・中村,藤井「水/界面活性剤/シリコーンオイル系の溶存状態に関する研究」第37回油化学討論会(1998)ケイ素およびフッ素系高分子物質は、化粧品、医薬品、表面加工剤など私たちの生活において幅広く利用されている。しかし、界面活性剤は周囲の環境(温度、水、油、第三成分の添加など)に上り、集合傾向が変化してさまざまな分子集合体(ミセル、逆ミセル、ライオトロピック液晶、マイクロエマルションなど)を形成し、状態の理解は困難をきわめる。そこで、乳化・可溶化形成を系統的に理解するために、水/界面活性剤/シリコーン(あるいはフルオロカーボン)系の形成するさまざまな液相を、相平街図を作成して明らかにする必要がある。本研究は、今年度に水/界面活性剤/シリコーンオイル(ケイ素系高分子)系、次年度に水/界面活性剤,フルオロカーボン(フッ素系高分子)系おける、可溶化系のモデルとなるマイクロエマルション形成を試みることを目的とした。今年度は、水/界面活性剤/シリコーンオイル(ケイ素系高分子)系を系統的に調査し、マイクロエマルションの形成に成功した。また、このマイクロエマルションから乳化調製を行うと、乳化機を必要とせずにサブミクロンオーダーの非常に微細かつ分散安定な水中油滴型エマルションが得られることを見いだした。これらの成果は論文投稿準備中であり、来年度内には成果を公表できる。次年度分のフルオロカーボンは予備的実験の段階ではあるが、マイクロエマルション形成の可能性をあることがわかった。(※)・中村,藤井「水/界面活性剤/シリコーンオイル系の溶存状態に関する研究」第37回油化学討論会(1998)
ホスピタル・プレイから導くハイリスク児を対象にした遊育理論確立のための調査研究

今年度は海外4か国において、学会発表、研修受講、病院見学等を行い、海外における先進的な事例を学んだ他、国際大会において日本におけるHPSの活動を発表することにより、今まで行ってきた研究成果を世界へ発信することができた。ニュージーランドでは、HPS専門職団体が主催する国際大会において、日本のHPSが開発した「メディカルかるた」について研究発表を行った。また、親子の関係性を修正、強化するために効果的なフィリアルプレイセラピーの研修を受けた。チェコ共和国では学会に参加し、研究発表を行った。学会を主催するOMEPは、幼児教育・保育に関する研究の振興、幼児教育・保育に関する情報の伝搬、幼児、殊に困難な状況にある幼児のためのプログラムの促進、保育者養成への協力を行うために1946年に設立された国際団体であり、初期メンバーが英国HPSの養成に深く関わっている。インドでは、ドラマセラピーを確立したSue Jennings博士のトレーニングに参加した。また、Children's Firstが主催したシンポジウムに参加し、ポスター発表を行った。イギリスでは、多職種の連携を見ることを1つのテーマとし、15歳以上の難病指定を受けている疾病のある子ども5人が在籍する特別支援学校のクラスに入り3日間を過ごした。私が研修を行ったクラスには、教員の他に二人のTeaching Assistant(医療的ケアを行う資格を保持している)、一人の介護福祉士(特定の子どもを一人担当し、医療的ケアを行う資格を保持している)、そしてボランティアが入っていた。介護スタッフも教員資格を持っていたり、その場にふさわしいトレーニングを受けている。医療的ケアの講習会も段位があり、少しずつステップアップしていく方式になっていた。日本の子どもたちも、このような連携が存在する環境の中で教育、福祉、医療を受けられたら良いと感じた。本研究は、これまで蓄積してきたホスピタル・プレイにかんする研究や教育実践を踏まえ、病児のみならず、被虐待児や医療的ケアを必要とする在宅重症心身障がい児等、ハイリスクな子どもたちに対し、遊びを用いた支援方法を国内外の先進事例を取り入れながら、「遊育」ということばで融合していこうという試みである。平成27年度においては、1型SMA児が集う、遊びのワークショップを企画し、そこで人工呼吸器を付けた子どもに対する遊び支援の在り方を、臨床的に研究した。また、被虐待児については、研究代表者が担っている静岡市アドヴァイザー業務を通して、プレイ・セラピーの効果などを検証しており、里親に対するトレーニングにも参画する中で、里親としての課題やサポートの在り方について検証している。プレイ・セラピーについては、アドラー派プレイ・セラピーを確立したコットマン博士との連携が可能となり、書籍の協働発刊について検討が始まっている。国内外の先進事例の融合を最終的に目指す本研究の第一段階として、ハイリスクな子どもを支援する家族会やNPO団体、また長きにわたり被虐待児を遊びを使って支援してきたコットマン博士や、児童福祉の行政とのつながりができてきたことで、実践的な研究を進める面が形成されたと考えるからである。より多くの子どもたちを支援できるように、研究代表者は研究内容を支援者の研修や教育プログラムに応用しており、プログラムを受けたHPSなどの支援者は、先進事例を取り込みながら、ハイリスク児に対する支援を概念化して取り組むことが可能となっている。本研究は、病児や被虐待児、被災児や遺児などハイリスクな子どもたちを支援する国内外の先進事例を統合すること、遊びを用いた支援の仕組みを提示し、遊びがすべての子どもを育む「遊育理論」を確立するための研究を進めること、そして結果として、日本社会における遊びの価値をとらえ直すための研究を行うことを柱として計画されたものである。まず、第1の先進事例の統合にかんしては、2016年の1月に、オーストラリアで開発された、自閉症スペクトラムの子どもたちの生きるスキルを高める援助プログラム、Learn to Playをおよそ80名のHPS及び関連領域の受講生に対し教えたことを成果として挙げる。遊育理論の確立にかんしては、人工呼吸器などを装着した医療的ケア児に対し、HPSが在宅の支援活動をおこなう中で、遊びが子どもの健やかな育ちを支えることが、家族にも明らかになってきたという実感を持っている。3つ目の価値の問い直しについても、PTやOT、また特別支援学校の教員とのコラボレーションを通して、遊びの持つ力に対する理解が深まっており、領域を横断した成果が生まれてきている。HPSを養成する教育活動を始めて今年度で10年目となるのだが、ようやくあちらこちらに投げていた種が芽吹いたという印象で、これまで連携してこなかった領域の専門職から、子どもの支援に対する問い合わせが来るようになった。特別支援学校の訪問教育の内容に対する助言を行ったり、リハビリテーションにかんする協働を行ったりすることによって、より具体的な遊びの持つ力を臨床的に示すことが可能となっている。領域を横断した研究は、新しい知見を相手に与えることが出来るため、非常に有効である。またHPSに対する理解も深まっており、コンサルテーションの役割を担うことの重要性を理解した。それと同時に、ハイリスクの子どもというカテゴリーが非常に大きいことにも気づかされている。例えば、乳がんでお母さんの終末期を迎えたきょうだい2人の支援をおこなったが、このような事例は今後増加すると考える。一方、子どもにとっての遊びとは、子どもがどのような環境下にあろうとも変わりはなく、遊びの目的は遊びにあるという原則は、たとえハイリスクな子どもであっても変わりはない。

本研究は、病児や被虐待児、被災児や遺児などハイリスクな子どもたちを支援する国内外の先進事例を統合すること、遊びを用いた支援の仕組みを提示し、遊びがすべての子どもを育む「遊育理論」を確立するための研究を進めること、そして結果として、日本社会における遊びの価値をとらえ直すための研究を行うとこを柱として計画されたものである。まず、第1の先進事例の統合にかんしては、2016年1月に、オーストラリアで開発された、自閉症スペクトラムの子どもたちの生きるスキルを高める援助プログラム、Learn to Playを約80名のHPS及び関連領域の受講生に対し教えたことを成果として挙げる。遊育支援の確立に関しては、人工呼吸器などを装着した医療的ケア児に対し、HPSが在宅の支援活動を行う中で、遊びが子どもたちの健やかな育ちを支えることが、家族にも明らかになってきたという実感を持っている。3つ目の価値の問い直しについても、PTやOT、また特別支援学校の教員とのコラボレーションを通して、遊びの持つ力に対する理解が深まっており、領域を横断した成果が生まれてきている。病児を遊びを用いて支援すること、またその専門家としてのホスピタル・プレイ・スペシャリストの役割と日本における位置づけ、支援を受ける子ども及び家族からの評価など多面的に研究が広がっていると考える。また、研究を通してハイリスクな子どもたちに、遊びという子どもとしての姿を最も顕著に表すことが可能な活動が、許されていないという深刻な現状も明らかとなっている。医療が作り出すトラウマに対する理解と、それを最低限防ぐ方法など、医療関係者に教育することの重要性が明らかとなっている。また、医療的ケア児が遊びを通して自己表現が可能になると、家族との関係性が好転することも明らかとなっている。もちろん、その背景には医療的ケア児と家族が地域の中で孤立している問題があり、改めて医療が生かすことと、子どもとして生きることをつなげていくことの重要性を認識している。諸外国の先進事例に関しては、感覚障害児に対するコミュニケーション方法を開発実践している専門家との協働により、医療的ケア児、家族、ケアワーカー、およびリハビリの関係者などに方法論を伝えることができた。新しい支援方法を取り込んだ結果、どのような変化が生まれるのか、研究を進めていきたいと考える。国内調査では遺児を対象としたグリーフケアプログラム実践団体2団体への面接調査を実施し、主に実践方針とその内容、課題について聞き取りを行った。いずれの団体も定期開催プログラムへ継続参加する親子が増えつつあり、子どもとともに、保護者への支援の必要性が明らかとなった。今後の課題として、思春期の子どもへのケアプログラムの内容と広報の検討であることが共通点であった。年齢にふさわしい環境と「話す」ことを中心としたプログラムとともに、「プレイ(遊び)」も取り入れることがグリーフケアとトラウマの予防に重要と考える。今年度は海外4か国において、学会発表、研修受講、病院見学等を行い、海外における先進的な事例を学んだ他、国際大会において日本におけるHPSの活動を発表することにより、今まで行ってきた研究成果を世界へ発信することができた。
特発性肺線維症に発生する肺癌を、炎症、前癌状態から究明する

特発性肺線維症は、原因不明の間質性肺炎であり、肺癌を高率に合併する難治疾患である。背景に特発性間質性肺炎を有する、または有さない扁平上皮癌で発現の違いを検討し、発現亢進分子として、癌遺伝子MYCNや骨格系蛋白であるMYH11、機能がまだ未解析のARMC4などが、発現が減弱している分子として細胞骨格系蛋白を分解するMTSS-1が検出された。MTSS-1の発現をティシューマイクロアレイにて解析し、その発現の有無で短期的予後に違いはなかった。東京京大学医学部附属病院で切除された肺癌の外科手術材料の核酸抽出を施行し、DNAチップ、特にエクソンアレイにて解析した。2005年以降に採取された検体を順次抽出し、現在は肺扁平上皮癌12例、対象として肺腺癌24例を施行している。肺扁平上皮癌12例のうち、特に1例は特発性肺線維症/特発性問質性肺炎の症例で、3例は肺気腫や他の間質性肺炎が疑われる症例であった。症例数は少ないが、肺線維症4例と他の8例のクラスターリングを施行した。肺線維症群で特に発現の亢進している遺伝子群はリンパ球系表面抗原やケモカインやサイトカインのリガンドや受容体であった。このデータからは肺線維症という炎症を背景にした病変の浸潤リンパ球を見ている可能性があるが、ケモカインやサイトカインのリガンドや受容体が腫瘍で発現している可能性も想定される。また特に発現の低下している遺伝子群は細胞周期を負に調節する因子が見られる。亢進または低下している分子を、組織病理学的にどのような特徴があるのかを今後検討する予定である。培養細胞の扁平上皮化生誘導モデルにおいて、TGFβ刺激化にSlug, Jag1,p63は有意に発現の亢進していた。上記の肺癌切除症例での発現の発現解析のクラスタリングでは有意に変化している分子群としてはリストされなかった。肺扁平上皮癌12例でJag1とSlugはそれぞれ10例、11例の発現が確認された。またp63に関しては5例で、3例は肺線維症症例であった。症例が少ないためかいずれの分子の発現も統計学的有意差は得られなかった。組織中での発現での検討が必要であること、また現時点では症例数は少なく今後もさらに追加し検討していく予定である。2005年以降に採取された検体を順次抽出し、現在は昨年度に施行症例とあわせて肺扁平上皮癌20例、肺腺癌24例を施行し、組織学的に明らかなUIP patternを示す扁平上皮癌7例と、臨床的背景もあわせUIP patternなどの組織学的に間質性肺炎パターンを有さない扁平上皮癌7例を比較対象としてクラスタリング解析を施行した。UIP patternを示す症例で発現の高い分子群として、1)ダイニンなどのモーター蛋白関連分子や、2)分子機能はまだ未解明ではあるが、気管支上皮に高発現し繊毛形成に重要と考えられる分子群などが上位に上がっている。通常間質性肺炎を背景とする場合、気管支上皮化生や扁平上皮化生を起こし、これらの化生上皮由来の腫瘍が発生すると考えられている。上記で抽出した分子に関して、その発生と予後解析を含む臨床病理学的検討をし、肺線維症からの腫瘍発生で真に重要な分子を抽出する予定である。また東京大学医学部附属病院で1999年以降2008年までに切除された肺扁平上皮癌症例のうち、追加検索可能な症例128例のパラフィンブロックより、組織マイクロアレイを作成した。上記のエクソンアレイで候補にあがった分子で、予後を含めた臨床病理学的項目を併せて検討し、免疫染色やin situ hybridizationなどの利用して、その分子の組織病理学的な分布をとその機能などを併せて検討する予定である。2005年以降に採取された検体を順次抽出し、組織学的に明らかなUIP patternを示す扁平上皮癌10例と、臨床的背景もあわせUIP patternなどの組織学的に間質性肺炎パターンを有さない扁平上皮癌8例を比較対象としてクラスタリング解析を施行した。UIP patternを背景に有する肺扁平上皮癌で発現が低下している分子としてmetastatis suppressor 1 (MTSS1)が検出された、この分子は当初膀胱尿路上皮癌のうち、非転移性腫瘍由来の細胞株で発現しているが、転移性膀胱尿路上皮癌では発現の低下している分子として報告されている。同様に、前立腺癌や乳癌でも同様の報告がある。この分子はアクチンなどの細胞骨格を分解する機能を有し、腫瘍細胞を動的に調整する分子と考えられる。

転移は、患者の予後や腫瘍の悪性度の指標として重要な因子である。免疫染色にて組織マイクロアレイを染色試行し、解析した。マイクロアレイを解析した症例はその免疫染色の発現に関してはほぼ同様であった。短期間の予後を含めた解析では、MTSS1発現の有無で明らかな違いは見られなかった。過去の症例にさかのぼり、長期予後について今後この分子に注目し、解析する予定である。間質性肺炎の扁平上皮癌の癌化メカニズムには、扁平上皮化生が初期的な現象として重要であることを我々は報告している。分子レベルでの通常型腺癌と扁平上皮癌で癌胎児抗原であるGPC3の発現が異なる。GPC3の発現と同様の挙動を示す分子として細胞接着デスモソームを構成する重要なタンパクである、Desmoglein3(DSG3)やPlakophilin1 (PKP1)、細胞骨格タンパクであるCytokeratin 5, Cytokeratin 13, Cytokeratin 15が見いだされた。GPC3と骨格系タンパクや、MTSS1の機能や、その発現意義を今後とも予後指標として継続的に検討していく予定である。
リズム障害への応用を目指した光感受性時計細胞の構築

本研究は、哺乳類の生物時計の光受容体であるメラノプシンを株化細胞や初代培養細胞に導入することにより、光照射によりサーカディアンリズムを同調できる時計細胞を構築すること、さらに、マウスへの遺伝子導入や導入細胞の移植を介し、直接光同調可能な末梢時計を作成することを目的とした。そこで、生物時計の光受容体であるメラノプシンに注目し、遺伝子導入により末梢時計を直接光感受細胞とし、光照射により体のリズムを整えることが可能かどうかを検討した。メラノプシン強制発現プラスミドは、海外共同研究者のPanda博士より提供を受けた。導入細胞の検出のため、メラノプシン配列下流に蛍光色素GFPを挿入し、融合蛋白の強制発現ベクターを作成した。さらに、このベクターをマウス由来線維芽細胞株NIH3T3に導入し、強制発現させることに成功した。光照射は、ファイバー光源を用い、昼色光と、緑色域単色光を使用した。光受容後の細胞内情報伝達系の活性化は、メラノプシンとカルシウム結合性蛍光色素カメレオンの共導入後、FRET解析にて検討した。しかし、同一細胞である確率が必ずしも高くないこと、また、メラノプシン安定発現株へのカメレオン一過性導入は、導入効率が極端に低下することなどから、同一細胞での細胞内情報伝達の確認はできなかった。一方、昨年11月に、共同研究者のPanda博士は、強制発現株における光照射後のリズム脱同調を発表したため、同様に光照射を行ったところ、培養液の温度上昇のため、細胞に著しい障害を与えることが判明した。メラノプシンは多くの細胞に共通の細胞内情報伝達系を利用できる利点があるが、細胞内カルシウム上昇によるリスクもあり、今後はチャネルロドプシンなどの利用も考慮し、検討する必要がある。哺乳動物の生物時計は、視床下部視交叉上核(SCN)の中枢時計が全身の末梢時計を統合する多振動体階層機構を形成すると考えられる。哺乳類のサーカディアンシステムが鳥類までと大きく異なる点は、生物時計細胞が直接光を受容できないことである。このため、視覚障害者だけでなく、健常視覚者でも、適切な位相に光照射を受けない状況下では、サーカディアンリズムが24時間の明暗サイクルから脱同調し、睡眠障害をはじめとする様々な不調を生じる。本研究は、生物時計の光受容体であるメラノプシンに注目し、遺伝子導入により末梢時計を直接光感受細胞とし、光照射により体のリズムを整えることが可能かどうかを検討することにある。本年度は、時計遺伝子レポーター細胞を用い、光受容後、細胞内情報伝達を介して時計がリセットされる条件を検討し、光受容時計細胞を構築することを目的として実験を行った。共同研究者の米国Salk研究所のPanda博士よりマウスメラノプシンcDNAの提供を受け、CMV支配下にメラノプシンを強制発現させると共に、導入細胞の確認のため、IRES配列を介してGFPやRFPなどの蛍光蛋白を発現するメラノプシン導入ベクターの作成を行った。NIH3T3細胞にて、一過性発現を検討したが、当初作成したベクターでは、マーカーであるGFPの蛍光およびウェスタンブロットによるGFP蛋白の確認ができなかったため、再度、IRESを介してメラノプシンとGFPを発現するベクターおよびメラノプシンGFP融合蛋白配列の強制発現ベクターを作成した。現在、一過性発現および安定発現株を作成し、蛍光による導入細胞を確かめると同時にメラノプシンのみの強制発現ベクターとYellow Cameleonのco・transfectionによるカルシウム上昇を発光の指標として検討中である。
SRY領域をターゲットとしたPCR法による性別判定法

当研究室においてはPCR法を利用した種属鑑別と性別判定を法医学における従来の血痕予備試験に相当する検査法として位置付け、より実際的で確実な方法の確立に努めている。現在、女性の不活性X染色体にメチルシトシン塩基が非常に少ないことを利用し、DXZ4と呼ばれる領域の女性特異的バンドを検出している。これは今までの除外診断的な判定法ではなく積極的な女性判定法である。この方法とSRY領域(Sex-determining regionY)を増幅し男性と判定する方法を同時に行うことにより、より確実な性別判定を行うことを試みている。今回は、特にSRY領域による性別判定法の確率に的を絞った。本研究ではPCR法による性別判定法の法医学的マニュアル作成のため下記の検討を行った。1.正常人の末梢血からDNAを抽出しコントロールとした。男女各20例以上行い、その結果コントロール群では確実に、性別判定が可能であった。2.性別判定PCR法に必要なDNA量を測定しその限界の検討を行った。現在数ngのDNAがあれば判定可能である。3.血痕や白骨などの陳旧資料からDNAを抽出し性別判定を試み、数例では判定可能であった。4.資料の経時的変化、特に雑菌などの混入による影響の検討を行い、さらに、実験を継続中している。産婦人科学的資料、繊毛や性染色体異常などの症例の検討を行った。産婦人科、小児科の協力を得てターナー症候群などの性染色体異常の症例のDNAや繊毛疾患の資料を集めており、特にこの分野では更なる発展性があると思われた。
高齢者における農産物購買時の情報過負荷の発生状況に関する実証的研究

本研究では、商品選択場面における情報過負荷の発生状況に注目し、高齢者の農産物購買時の意思決定の特徴を、個別面接調査、発話プロトコル法、脳活動(感情状態)計測、視線計測により実証的に明らかにする。本研究によって、情報過負荷の低減方策も明らかになることから、高齢者に過度な負担をかけることなく意図した通りに商品を選択するための商品情報の提示方法を提案できる。
グルクロン酸転移酵素の新しいファミリーの遺伝子構造とその発現制御

グルクロン酸転移酵素は種々の基質に対応して多数の分子種が知られている。本酵素群は、構造と基質特異性の上から2つのファミリーに分類される。このプロジェクト研究ではファミリー1の遺伝子の構造を明かにし、その発現制御の解析をおこなった。ファミリー1を構成する遺伝子は、(1)5'上流に基質結合ドメインをコードするエクソンが約12Kb間隔でクラスターを形成し、その3'下流に共通な基質であるUDP-グルクロン酸が結合するドメインが1ケ所存在する、(2)この遺伝子複合体から基質結合ドメインを異にし、共通のUDP-グルクロン酸結合ドメインをもつキメラ酵素が抗体産生遺伝子に類似して多数つくられる。現在9個まで同定している、(3)基質結合ドメインはアミノ酸配列の相同性と基質特異性の上からフェノールクラスター(A1-4)とビリルビンクラスター(B1-5)の2つに分けることが出来る、(4)各々のアイソザイムは異なる発現と誘導を受けている。A1とA2の2つのアイソザイムは3-メチルコランスレン(3MC)により著しく誘導される。B1は構成的に発現し、ビリルビン活性を持つ主要なアイソザイムである、(5)各基質結合ドメインをコードする第Iエクソンの上流にはプロモーター/エンハンサー領域が存在する。A1上流には3MCに応答するシスエメント"GCGTG"が同定された。現在A2とB1上流の解析も行っている。また高ビリルビン血症を伴う疾患ラット(Gunnラット)には、各アイソザイムに共通なUDP-グルクロン酸をコードするエクソン4にフレームシフトを伴う1塩基の欠失が見いだされた。これが原因となり、Gunnラットではファミリー1に属する一群の酵素が完全欠損する。本研究を通して分子多様性を作りだす新しい遺伝子構造とその発現制御の機構が明かにされた。グルクロン酸転移酵素ファミリーの一群には基質結合ドメインを異にし、同一のアミノ酸配列よりなる共通のUDP-グルクロン酸結合ドメインを持つキメラ酵素群が存在することを遺伝子の構造レベルで明らかにする。研究成果の概要を以下に記す。本酵素群を指定する遺伝子の構造を解析した。その結果、5'上流に基質結合ドメインを指定するエクソンが10kb間隔でクラスターを形成して配列していた。3'下流にはこれら基質結合ドメインに対応する共通なUDP-グルクロン酸結合ドメインを指定するエクソンが一ケ所存在する新しい遺伝子構造を有することが判明した。全体として約200kbの大きさである。現在、基質結合ドメインに相当するエクソンは9個見つかっている。この部分に相当する特異的プローブを用いて発現を調べたところ、各々は異なって発現していた。又、本酵素群の誘導剤である3-メチルコランスレンとフェノバルビタールを検討したところ、各々の誘導剤によって異なった誘導を示した。現在、さらに詳細な遺伝子の構造とその発現制御の仕組みを検討している。新しい遺伝子ファミリーの生成機序と、その発現を遺伝子の構造レベルで理解できる基盤が確立された。グルクロン酸転移酵素フアミリーの中には、基質結合ドメインを異にするが共通のUDP-グルクロン酸結合ドメインをもつ一群が存在する。このキメラ酵素群は、1つの遺伝子座(200Kb)からなる複合体より形成される。高ビリルビン血症を伴うラット(Gunnラット)には、この一群のアイソザムが完全欠損している。本年度は特に染色体DNAの構造解析の結果を基に、本酵素群の発現制御の解析を行った。

遺伝子複合体の構造解析を更に詳細に行い、ビリルビンが結合するドメインは5個(B1-B5)、フェノール類が結合するドメインは4個(A1A4)のエクソンより構成されており、これらが約12Kb間隔でクラスターを形成していることを明かとした。一方、これらのクラスターの下流に、共通の基質であるUDP-グルクロン酸が結合するエクソンが1ケ所存在していた。この遺伝子複合体から少なくとも共通のグルクロン酸結合ドメインを持つ9個のキメラ酵素が作られる。その内2個は偽遺伝子であった。特に、A1A4の発現調整に係わる塩基配列を解析した。A1とA2の上流には発癌物質(3-メチルコランスレン)によって誘導されるエレメントが見い出された。又、両者は臓器特異的誘導を受けることが明かとなった。さらに、ラット肝培養細胞系を用いて、これらの事実が確認された。各アイソザイムに特異的な抗体を用いてタンパク質レベルでも検討を行った。現在CAT-アッセイ法を用いて、誘導に関与しているエレメント(塩基配列)の同定を行っている。又、ビリルビンとフェノールを基質とするメジャー型のアイソザイムの精製を行い、それらを人工リポソーム膜に組み込み膜での存在状態を解析している。本年度は、これまでに明らかにしてきたグルクロン酸転移酵素遺伝子複合体の構造を基に、各アイソザイムの発現調節の解析を行った。(1)各アイソザイムのタンパク質レベルでの発現を解析するために、cDNAより推定されるアミノ酸配列から、B1,B2,B5,A1,A2に対して特異的なアミノ酸配列を選びだし、その合成ペプチド(14個)に対する抗体を作製した。また、カルボキシル末端側に対して各アイソザイムに共通な抗体を作製した。これら抗体を用いてアイソザイムの発現を調べたところ、B1は構成的に発現しビリルビン活性をもつ主要なアイソザイムであった。また、クロフィブレートやデキサメタゾンにより2-3倍に誘導された。A1,A2は3-メチルコランスレン(3MC)により強く誘導された。酵素活性も誘導に対応して変動していた。(2)各アイソザイムは異なる発現調節を受けていることより、各々の第1エクソンの上流にプロモーター/エンハンサー領域が存在ことが強く示唆されてきた。本年度は特に、3MCにより誘導されるA1アイソザイム(4-ニトロフェノールを基質とする)の発現調節機構の解析を行った。A1の上流には特別のエクソンA1*が存在する。この上流約1.1KbとCATの構造遺伝子からなるキメラプラスミドを作製し、ラット初代培養細胞に導入して3MCに応答するエレメントを解析した。その結果“GCGTG"コア配列が同定された。現在A2,B1,B2,B5の上流の塩基配列と発現調節領域の解析を行っている。また、B1,A1アイソザイムは出生を境に発現の変動がみられた。
新規ヒドロゲナーゼの採取とモデル錯体の合成

水素燃料電池は、エネルギー効率が高いことや発電中の副生成物が水のみであることから、クリーンな発電システムとして実用化への期待度が高い。しかし、従来の水素燃料電池の電極触媒に使用されている白金は枯渇資源であり、その代替触媒の開発が必要とされている。これまで多くの研究機関が白金代替触媒の開発を目指してきたが、未だ実用的な触媒は開発されていない。天然には、ヒドロゲナーゼと呼ばれる水素活性化酵素が、容易に水素から電子を取り出すことがかねてより知られていた。この酵素は、燃料電池のアノード(水素極)触媒と同じ働きをしており、単位分子あたりでは白金の水素酸化能を超えているが、酸素や熱に対する不安定性から、実際の燃料電池の電極触媒としての利用はできなかった。我々は、自然には酸素や熱に安定な未知のヒドロゲナーゼが存在すると考え、種々多様な土壌を採掘し、新しいヒドロゲナーゼの探索を行った。その中から、過酷な環境に耐性のあるヒドロゲナーゼをふるい分け、最終的に精製したヒドロゲナーゼをS-77と命名した。このヒドロゲナーゼS-77をアノード触媒として半電池での触媒活性測定を行うと、単位重さあたりの活性は、白金に比べて637倍であった。実際に、水素燃料電池を作製し、水素と酸素を供給して燃料電池評価実験を行うと、白金燃料電池に比較して1.8倍の最大電力密度を示した。また、インピーダンス測定では白金よりも低い抵抗値を示した。本年度は、新たに探索、精製したヒドロゲナーゼS-77から作成した酵素電極を用いて、白金を凌駕する燃料電池の開発に成功した(Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 8895-8898、表紙に採択、プレスリリース2014年6月4日「燃料電池の白金触媒を超える水素酵素「S-77」電極の開発に成功(白金の637倍の活性)」)。ヒドロゲナーゼは、常温・常圧で水素から電子を取り出す酵素である。即ち、この酵素は燃料電池のアノード触媒と同じ機能を持つ。通常のヒドロゲナーゼは酸素に曝されると活性中心が酸化され、水素酸化活性を失う。しかし、最近、一旦酸化された活性中心を水素によって再生できる酸素耐性ヒドロゲナーゼの存在が明らかになった。酸素耐性ヒドロゲナーゼは、水素によって酸素を還元し、水を生成することで活性中心を保護している。つまり、この酵素は燃料電池のカソード触媒と同じ機能を持つ。以上のことから、ヒドロゲナーゼモデル触媒の開発は、燃料電池の電極触媒開発において非常に重要である。これらの点を踏まえて、今年度は主に下記の研究を推進した。(1)新規ヒドロゲナーゼモデル錯体の開発新規イリジウム錯体を用いた水素活性化システムの構築を行った(Eur. J. Inorg. Chem. 2013, 3978-3986)。本イリジウム錯体は、触媒的に水素を酸化し、水素から取り出した電子で基質を還元することが可能である。さらに、触媒サイクルの重要な還元活性種の単離と結晶化にも成功した。本モデル錯体による成果は、ヒドロゲナーゼの触媒メカニズムの解明においても非常に重要であり、今後は酵素とモデル錯体の相補的な研究が必要であると思われる。(2)酸素耐性ヒドロゲナーゼモデル錯体による水素と酸素の活性化メカニズムの研究上述したように、ヒドロゲナーゼは非常に興味深く、今後より注目される酵素であるが、その触媒メカニズムは不明な点が多い。本研究では、ヒドロゲナーゼモデル錯体を用いて、水素や酸素の活性化メカニズムの解明を行った(化学、2013、68、12-16、現代化学、2013、68、52-57)。

本年度は、新たに探索、精製したヒドロゲナーゼS-77から作成した酵素電極を用いて、白金を凌駕する燃料電池の開発に成功した(Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 8895-8898、表紙に採択、プレスリリース2014年6月4日「燃料電池の白金触媒を超える水素酵素「S-77」電極の開発に成功(白金の637倍の活性)」)。「研究実績の概要」にも記載したように、本挑戦的萌芽研究では、研究成果を順調を挙げており、論文や学会発表により、本成果を逐次報告している。初年度に報告した新規イリジウム錯体の研究では、ヒドロゲナーゼモデルの水素酸化反応において、これまでに解明されなかった還元活性種の構造を明らかにすることに成功した。また、酸素耐性ヒドロゲナーゼモデル錯体による水素と酸素の活性化メカニズムの研究では、分子燃料電池の電極反応メカニズムの解明も行った。分子燃料電池は、分子触媒を電極触媒に用いた燃料電池のことであり、これまでにこのような報告例はない。このような新しい燃料電池についての詳細な検討は非常に重要である。以上のことから、「おおむね順調に進展している。」と考える。今後は、より高活性なヒドロゲナーゼモデル錯体を開発するとともに、新規ヒドロゲナーゼの探索と単離を行う。自然界の特殊環境から採取したヒドロゲナーゼは、これまで知られていない原理や機能を有している可能性がある。通常のヒドロゲナーゼは、酸素と熱に対して不安定で、わずかな酸素や熱で失活してしまうため、高度な専門的知識と技術が無い限り取り扱いが困難であると考えられていた。しかし、自然界では、過酷な環境におかれた菌体は、その環境で生育する必要性に応じて、酵素に耐熱性や耐酸素性の機能を持たせる進化を遂げる。自然界には未だ解明されていない原理や摂理が多く残っており、新規ヒドロゲナーゼを探索・採掘し、分析する。
日本人の自然観に関する民族生態学的研究

昭和62年・63年の二ケ年日本人の自然観に関する民俗生態学的研究を行ってきた。調査地として選んだ沖縄県八重山郡竹富町黒島及び山形県東田川郡朝日村大鳥はいずれも所与としての自然環境は比較的豊かなところである。一つは亜熱帯の、他はブナ帯の典型的な場所である。その中で調査は主として過去3050年前の自然と人間の関係を軸とした総体的な生活復原を試みたものである。両地域とも30年、50年前というと現在とはかなり異なっており交通事情は現在と比較できぬ程劣悪であった。生活はかなり周辺と隔絶されていて自給的様相が強かった。かかる生活条件の中では特に自然物の利用は高度に発達していて、その利用体系は生活の中で重要な位置を占めていた。こうした利用体系の背景には厖大な民俗的知識が存在し、これを基に風土観とでもいうべき自然認識の構造があることがわかった。それは環境構造にパラレルな固有の風土観(民俗認識を基盤とした一種の自然観・人間観の総体)ともいえる。これはいわゆる文献や文写を素材にして過去から現在の日本人の風土観・自然観を抽出したものとは異って、日本の地域性の一つの具体的・現実的表現ともいえる。多様な風土を実証的に記述できるということである。そしてこの風土観の生成に生物的自然・地理的自然・地形的自然・気候的自然がダイナミックに関連し、そのメカニズムについて仮説をたてることができた。これは新たな風土学にもなりうる可能性をもっている。所子の自然の豊富な2つの地域,沖縄県八重山郡竹富町黒島と山形県東田川郡朝日村大鳥の住民の自然観に関する民俗生態学的研究を行った.前者は隆起サンゴ礁性の小島嶼であり,ここには亜熱帯性植物が繁茂する.ここで島民の伝統的な野生植物利用は多岐にわたり,200種は越える.そしてそれぞれの種は,その特性に応じて伝統的生活の中の食物・建材・民具の素材として重要な役割を果してきたことがわかった.その背景にはしなやかな民俗分類とでもいえる自然観が存在するが,これは単に実用的な面だけでなく野生植, (魚なども同様である)の多くに伝承的物語が付随する形式となっている.そしてこのことが八重山諸島に住む人々の海洋観・季節観・世界観の形成に密接に関連があることが判明した.特に自然暦に関する豊富な民俗知識は日本列島の他の地域と比較し,極めて独得なものであり沖縄文化の独自性を考察する上で重要である.後者は落葉広葉樹林帯,通称ブナ帯をその環境とする村であるが,ここでは熊取り,山菜,茸取りを生業の中心にしていた住民の自然観を調査した.黒島と同様にここでも植物(特に菌類)・小動物(昆虫)・大型哺乳類(クマ・カモシカ)の豊富な利用があり,背景にしなやかで精緻な民俗分類が存在する.こうした民俗分類が形成される上で,個々の種についての細かな山村民の自然観察がある.この自然観察の中に自然観がよく表出されていて一種の共生の論理とでもいうべき山村民のエスノフローラ観,エスノファウト観を抽出することができた.この環境の異なる2地域の自然観,相異を今後もう少し抽象的なレべルで抽出し,自然観の形成過程における風土の役割を問題としたい.今年度も前年度に引きつづき二つの典型的に異なる環境、亜熱帯林に位置する沖縄県八重山郡竹富町黒島と落葉広葉樹林帯(通称ブナ帯)に位置する山形県東田川郡朝日村大鳥をとりあげ、住民の自然に対する適応的行動・民俗について調査してきた。両調査地とも62年度に実施した調査の補充が重点であった。しかし今年度はそればかりでなく、さらに住民の超自然に対する認識と自然認識の関係にも注意を払ってきた。

自然認識の対象としては黒島では植物・魚類・鳥類、大鳥では植物(特に菌類)・淡水魚類・昆虫・哺乳類など生物的自然を主要なものとした。超自然とのかかわりの中では方位・地形認識(民俗的認識の結果としての地名を含む)が重要な対象であることが判明した。特に黒島は隆起サンゴ礁に囲まれた裾礁島であり、生業活動の上でも民俗宗教活動の面でもリーフの認識・島の地形認識が大きな意味をもっている。その典型は水信仰であり、黒島は最近西表島からの海底送水が実現するまでは水を天水と井戸に頼っていた。この井戸は潮の干満と大きな関係があり、島に数十ある井戸は満潮で湧水するもの、干潮で湧水するものなど多様である。そしてそれによって日常活動が規定されていた。日照りで雨乞が必要な時はツカサ(民間宗教家)など沖縄の民俗宗教を特色づける人々の活動があった。こうして生活水として井戸、聖なる場として井戸の両側面から島の民俗は大きな影響をうける。又大鳥では雪という自然がどのように生活を限定し、雪に対する感覚をどのように発達させているかを知ることができた。雪は風土的道具となっている。黒島の水、大鳥の雪に対する自然認識を解明できたことは前年度の生物的自然に対する認識の上部構造としての感覚を民俗レベルで体系的に記述できる材料を得たことになる。
オートファジー破綻がもたらす病態のNrf2を標的とした治療戦略

Nrf2は多くの下流遺伝子の発現を制御する転写因子である。Nrf2の活性はユビキチンリガーゼアダプター分子であるKeap1によって負に制御されている。Keap1に結合したNrf2は、ユビキチン化されてタンパク質分解を受ける。タンパク質分解機構のひとつとして、プロテアソームと並んでオートファジーが知られている。我々はこれまでに、Keap1タンパク質がオートファジーによって分解されることを明らかにしている。肝臓においてオートファジーの機能が破綻すると、本来分解されるべきp62タンパク質やユビキチン化タンパク質が異常蓄積する。p62はKeap1とNrf2の結合を妨げるため、オートファジーの機能が破綻した肝臓ではNrf2が活性化する。オートファジーの機能が破綻したマウス肝臓は、肝腫瘍を形成する。この肝腫瘍の形成には、オートファジーの破綻により活性化したNrf2が関与することを示した。Nrf2の活性は主にKeap1によって制御されているが、二次的なNrf2の制御系として、リン酸化されたNrf2がbTrCPによってユビキチン化を受けることが最近報告された。そこで、オートファジーの機能が破綻したマウスの肝臓において、Nrf2のリン酸化に関わるシグナルカスケードとしてAktのリン酸化を調べたところ、オートファジーの破綻によりAktのリン酸化が亢進していることが明らかとなった。よって、オートファジーの機能が破綻した際におこるNrf2の活性化メカニズムとして、p62タンパク質の蓄積に加えて、AktシグナルカスケードによるNrf2リン酸化の抑制によるNrf2タンパク質分解の抑制が考えられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質分解機構であるオートファジーの機能が破綻すると転写因子Nrf2が活性化する。p62は細胞内のユビキチン化タンパク質をオートファジー分解へと導く、選択的オートファジーの鍵となる分子である。Nrf2は通常、ユビキチン化されてプロテアソームにより分解されるが、そのユビキチン化にはKeap1とβTrCPが関与する。オートファジーの機能破綻により異常蓄積するp62はKeap1とNrf2の結合を阻害するため、ユビキチン化を免れたNrf2が活性化する。本研究ではオートファジーの機能破綻におけるNrf2の活性化メカニズムと、それが引き起こす肝病態を明らかにすることを目的とした。Nrf2に依存しないp62の発現にも着目し、その病態形成に対する寄与を調べた。その結果、オートファジーの機能が破綻した肝臓において、Keap1に依存しないNrf2の活性化に関与すると考えられるAktのリン酸化が検出された。複合的な遺伝子欠失マウスの作製が進み、組織解析ができた。恒常的なNrf2の活性化が引き起こす病態の改善を目指して解析を進める。
表皮初期発生制御におけるADAMTS-2の機能解析

マウスES細胞をBMP4存在下で浮遊培養すると、神経細胞への分化は抑制されるが表皮への分化誘導は見られない。しかし、ES細胞塊をファイブロネクチン上で接着培養すると、高い効率で表皮幹細胞へ分化した。BMP4存在下で接着培養したES細胞の遺伝子発現を網羅的手法で解析すると、メタロプロテアーゼADAMTS-2が同定された。ADAMTS-2の発現開始時期は表皮幹細胞マーカーよりも先行しており、表皮への運命決定における新規機能が示唆される。ヒト表皮発生の分子機序を明らかにするためマウスES細胞で確立した分化法のヒトES細胞への応用を試みたが表皮への分化はみられず、異なるメカニズムの可能性が示唆された。これまで我々は、マウスES細胞を無血清培地中で分散浮遊培養し、形成されたES細胞塊をBMP4存在下にてファイブロネクチン上でさらに接着培養することで、1)非神経外胚葉への分化が誘導されること、2)高い効率で表皮幹細胞(CK15, CK14陽性)への分化が確認され、その発現のタイミングが胚発生の時間軸とよく一致すること、を見いだして来た。また、BMP4存在下にて表皮幹細胞へ分化途中のES細胞を用いて網羅的解析を行い、3)細胞外マトリックスの再構成に関与するメタロプロテアーゼADAMTS-2を同定した。興味深いのは、ADAMTS-2の発現開始時期が表皮幹細胞のマーカー発現に先行していることである。このことは、表皮への運命決定において、メタロプロテアーゼが新規機能を果たす可能性を示唆している。ADAMTS-2は、ヒトにおいて皮膚の脆弱性をおこす難病「エーラスダンロス症候群」の原因遺伝子の一つともされているが、初期発生における表皮への運命決定との関連については報告が無く、その表皮分化における機能の解明は、再生医療の観点からも重要である。そこで本研究課題では、哺乳類の表皮発生を制御する因子の一つとしてADAMTS-2に注目した。平成27年度は、マウスES細胞の分散浮遊培養で生じるES細胞塊で、BMP4添加条件下でADAMTS-2の機能阻害実験を行い、表皮幹細胞への分化や生存・増殖に与える影響について検証することを目的として実験を行った。ADAMTS-2の機能阻害実験をsiRNAのトランスフェクションにより試みているが、siRNAでADAMTS-2の発現を抑制できる期間が予想より短いという問題が生じている。このことが、表皮幹細胞分化におけるADAMTS-2の機能を解析する上での障害の一つとなっている。また、BMP4の効果にロット差があり、表皮分化の誘導効率が不安定になることがあり、実験の遅れに繋がっている。改善策として、低分子化合物による代替法へのスイッチングが必要と考えている。これまでの研究により、無血清培地中で浮遊培養したマウスES細胞塊をTGF-bスーパーファミリーに属するBMP4タンンパク質の存在下にて接着培養することで、高い効率で表皮幹細胞への分化を確認した。表皮幹細胞への分化は、形成した細胞塊をファイブロネクチン上で接着させることが必須であり、浮遊状態のままやラミニン上での接着培養では効果が見られなかった事から、表皮幹細胞分化における細胞外マトリックスの特異性が示唆された。これまでに、BMP4存在下または非存在下において、表皮幹細胞に分化途中のES細胞で遺伝子発現の比較を行った。その結果、コラーゲンの成熟を制御し、細胞外マトリックスの再構成に関与すると予想されるメタロプロテアーゼADAMTS-2を同定した。ADAMTS-2は、ヒトにおいて皮膚の脆弱性をおこす難病エーラスダンロス症候群の原因遺伝子の一つともされているが、初期発生における表皮への運命決定との関連については報告が無い。経時的なPCR解析を行ったところ、ADAMTS-2の発現開始時期が表皮幹細胞のマーカー発現より先行していることが明らかとなった。このことは、表皮への運命決定においてメタロプロテアーゼが新規機能を果たす可能性を示唆している。平成28年度は、哺乳類の表皮発生を制御する因子としてADAMTS-2の機能解析を進めるため、ノックダウン法によるADAMTS-2の機能阻害実験を行い、表皮幹細胞への分化に与える影響について検証した。さらに、マウスでの分化条件をヒトES/iPS細胞に応用することで、ヒト表皮幹細胞分化実験を行った。リコンビナントBMP4の効果にロット差がある影響で、表皮分化の誘導効率が一定しないという問題が続き、結果に振れが生じることで実験の遅れに繋がっている。また、マウスES細胞での分化条件が、ヒトES/iPS細胞においてはそのまま当てはまらないことがあり、条件検討に予想より時間を費やしていることも挙げられる。表皮(後の皮膚)への分化を制御する分子として、これまでに、神経分化抑制因子BMP4が報告されている。しかしながら、報告の多くは両生類などを用いた研究であり、哺乳類の表皮分化の分子機構については不明の点が多かった。本研究課題ではES細胞を用い、哺乳類初期発生における表皮の分化機構を分子レベルで明らかすることを目的とし、研究を進めてきた。マウスES細胞を分散後に、無血清培地中で浮遊培養すると細胞塊が形成されるが、このES細胞塊をBMP4存在下で浮遊培養するだけでは表皮への分化はほとんど見られない。しかしながら、形成した細胞塊を細胞外マトリックス成分の一つであるファイブロネクチン上で接着培養することで、高い効率で表皮幹細胞(CK15及びCK14陽性)へ分化することが本研究で明らかとなった。BMP