hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低酸素/低栄養状態におけるmTOR活性に着目した癌幹細胞の放射線抵抗性の解明

肝癌細胞株HepG2においては活性化され、mTORC1の活性化がHepG2細胞の低栄養状態における放射線高感受性に関与することを明らかにした。本年度は、低酸素かつ低栄養状態における放射線抵抗性に対するmTORの関与について検討した。実験検討には、前年度と同様にヒト繊維芽細胞株LM217およびHepG2細胞を用い、コロニーフォーメーションアッセイによる生存率解析を行った。低酸素状態においてHepG2細胞は通常培養条件より10倍程度の高い放射線抵抗性を示し、低酸素/低栄養状態においては放射線高感受性を示した。LM217細胞は低酸素状態において通常培養条件より10倍以上高い放射線抵抗性を示したが、低酸素/低栄養状態においてはより高い放射線抵抗性を示した。また低酸素/低栄養状態では、いずれの細胞株においてもmTOR活性は抑制されていた。LM217細胞の低酸素/低栄養状態における放射線抵抗性にmTORの系が関与する可能性が考えられる。癌の放射線治療において放射線抵抗性細胞の存在は重要である。低酸素細胞は必ず低栄養状態にあることから低栄養状態も放射線抵抗性に関与していると考えられる。低酸素/低栄養状態での放射線抵抗性を選択的に解除する分子標的として細胞内栄養センサーmTORに着目した。通常、低栄養状態の細胞においてmTOR活性は抑制され放射線抵抗性を示すが、肝癌細胞においてmTORは活性化され放射線高感受性を示した。肝癌細胞のmTORの発現抑制によって放射線高感受性が抑制されmTORの放射線抵抗性への関与が示唆された。肝癌細胞においてmTORは低栄養状態での放射線抵抗性の選択的解除に関与する可能性が本研究によって示唆された。本年度では、低栄養状態でmTORが活性化される細胞の放射線高感受性にmTORが関与する可能性を示すことができた。これは代謝と放射線感受性の関係性を示唆しており、低酸素状態だけでなく、低栄養状態も放射線感受性に影響を与える要因のひとつになり得ると考えられ、意義深い。このことから実験結果としては、おおむね順調に進展していると考えられる。低酸素かつ低栄養状態におけるmTORの活性化が放射線感受性に及ぼす影響を解明する。腫瘍組織は正常組織に比べ低酸素かつ低栄養状態にあり、また放射線抵抗性であることも踏まえると、mTORの活性化が放射線抵抗性に関与している可能性が高い。コロニーフォーメーションアッセイによる低酸素かつ低栄養状態における細胞の生存率解析、ウェスタンブロット法によるmTOR活性化および上下流のシグナル伝達解析やsiRNAによるmTORの特異的抑制を実施し、低酸素/低栄養状態での放射線抵抗性に対するmTORの関与を明らかにする予定である。放射線生物学低栄養状態でmTORが活性化される細胞において放射線抵抗性にmTORが関与する可能性を示した。今後の研究の推進方策としては、低酸素かつ低栄養状態におけるmTORの活性化が放射線感受性に及ぼす影響を解明する。
学校看護師の医療的ケアに関する研修プログラムの開発と評価に関する研究

新生児医療・救急医療の進歩・在宅用医療機器の進歩により在宅で過ごす重度障害を来たした患者(重症心身障害児)が最近20年の間に急増した。それに伴い、特別支援学校において人工呼吸器装着等の高度な医療的ケアを必要としながら学ぶ児童生徒が増加している。このような社会的背景から特別支援学校では教員と学校看護師の連携による医療的ケア実施体制の整備が急速に進んでいる。しかし、病院とは異なる教育の場で看護を行うことに対する学校看護師の戸惑いや、学校看護師に対する医療的ケアやリスク管理に対する教育プログラムの不備が指摘されている。医療的ケアを必要とする子ども達が特別支援学校で学ぶために不可欠な学校看護師への教育プログラムをインストラクショナルデザインに基づき構築し、実践、評価することを目的とした。2017年度に実施した学校看護師、教員、養護教諭による多職種連携研修の学校看護師に対する6か月後のフォローを事後テスト、アクションプランを記載することで評価を行い結果をまとめた。人工呼吸器の取り扱いに関する知識は身についていた。アクションプランでは、児童生徒や呼吸器の観察を行うといった確認行動の記載が目立った。また、学校内での多職種連携に対する意識が不十分であることが分かった。2018年度の多職種連携研修では、事前学習と前提テストの後、緊急対応を行う際の多職種連携がイメージしやすいようにグループワークを実施してからシミュレーションを行い、その後グループで振り返りを行う研修を行った。アクションプランの内容では、多職種で反復して訓練することの必要性、マニュアルの見直し、全職員への周知に関して記載があった。概念的な内容が多かったため、今後は机上での職種役割の記載だけでなく、シミュレーション動画の例示を行うとよる具体的な役割分担や連携について自己学習できると考えた。本研究は、特別支援学校において人工呼吸器装着等の高度な医療的ケアを必要としながら学ぶ児童生徒が増加する中で、病院とは異なる教育の場で看護を行う学校看護師に対する医療的ケアやリスク管理に対する教育プログラムをインストラクショナルデザインに基づき構築し、実践、評価することを目的とした研究である。平成28年度は、鳥取県内の特別支援学校3校に勤務する学校看護師27名、養護教諭6名、教員200名および通学する児童生徒の保護者165名に対して、教育現場で医療的ケアを実施する際の課題についてアンケート調査を行い、結果を分析した。アンケート回収率は、学校看護師52%、養護教諭67%、教員40%、保護者33%であった。看護師に対するアンケートでは、吸引、吸入、注入などの基本的なケアに対する手技には自信があり、研修ニーズはなかったが、在宅人工呼吸器、排痰補助装置の使い方といった高度医療機器に関する研修ニーズが高かった。全職種で共通して、学校看護師、養護教諭、教員、保護者、医療機関との連携の取り方、緊急体制マニュアルの作成、リスク管理に関する研修ニーズが高かった。医学的知識や機材の使い方に関する研修のみではなく、多職種連携やリスク管理を想定したシミュレーション教育の必要性があると考えた。学校看護師のみへの研修ではなく、教員、養護教諭、医師等が参加した多職種連携教育を基盤とした研修プログラムの構築が必要である。アンケート調査を解析することで医療的ケアの問題の明確化と現状分析を行うことができた。その結果をもとにした研修プログラムと評価方法の設計が年度内に実施できなかった。アンケート調査を実施する時期が遅かったことと、当初想定していた学校看護師への研修ではなく、教員や養護教諭を含めた多職種連携教育の必要性が出てきており、さらなる研修プログラムと評価方法の検討が必要となったためと考える。平成29年度は、平成28年度に実施した学校看護師、教員、養護教諭に対する学校での医療的ケア実施状況や課題調査の結果をもとに、在宅人工呼吸器の取り扱いの注意点や緊急時対応に関する学習を学校看護師、教員、養護教諭の多職種でシミュレーション研修を実施した。学校看護師の研修効果について検討を行った。【方法】1シミュレーション研修前後に多肢選択式テスト、アクションプラン用紙の記載を実施。220分の講義の後、100分間のシミュレーション研修を実施。35段階リッカート法による研修満足度評価を実施。【結果】事前、事後の多肢選択式テストについては、研修後に正解率が下がった項目もあった。参加者のシミュレーション研修に対する満足度、やりがい、興味深さは高かったが、緊急時対応に「自信が持てた」あるいは「どちらかというと自信がもてた」と回答したのは約半数だった。アクションプランは、研修前と比較して、教員や養護教諭との連携における学校看護師としての役割についての記載が目立った。具体的な観察項目や自由記載では「研修内容は実際に想定される場面であり、多職種で取り組めたことが実践的でよかった」との記載が多かった。【考察】研修時間が十分でなかったため、自信が持てるまで反復して学ぶことができなかった。今後、事前学習を取り入れて、十分な時間でシミュレーションが実施できるよう工夫が必要である。シミュレーションの内容は実践的であること、多職種で行ったことから、学校現場における多職種連携について意識できるきっかけになったと考える。平成29年度に予定していた論文発表ができなかった。

しかし、病院とは異なる教育の場で看護を行うことに対する学校看護師の戸惑いや、学校看護師に対する医療的ケアやリスク管理に対する教育プログラムの不備が指摘されている。医療的ケアを必要とする子ども達が特別支援学校で学ぶために不可欠な学校看護師への教育プログラムをインストラクショナルデザインに基づき構築し、実践、評価することを目的とした。2017年度に実施した学校看護師、教員、養護教諭による多職種連携研修の学校看護師に対する6か月後のフォローを事後テスト、アクションプランを記載することで評価を行い結果をまとめた。人工呼吸器の取り扱いに関する知識は身についていた。アクションプランでは、児童生徒や呼吸器の観察を行うといった確認行動の記載が目立った。また、学校内での多職種連携に対する意識が不十分であることが分かった。2018年度の多職種連携研修では、事前学習と前提テストの後、緊急対応を行う際の多職種連携がイメージしやすいようにグループワークを実施してからシミュレーションを行い、その後グループで振り返りを行う研修を行った。アクションプランの内容では、多職種で反復して訓練することの必要性、マニュアルの見直し、全職員への周知に関して記載があった。概念的な内容が多かったため、今後は机上での職種役割の記載だけでなく、シミュレーション動画の例示を行うとよる具体的な役割分担や連携について自己学習できると考えた。平成29年度は、研修プログラムと評価方法の設計を行い、学校看護師に加え、教育に関連する多職種への研修プログラムを実施する。研修プログラム実施後に作成されたアクションプランの内容をテキストマイニングで分析し、学習成果の検討を行う。平成28年度に実施したアンケート調査について学会で成果発表する。当初は、学校看護師への研修内容の設計であったが、多職種へのアンケート結果から、多職種連携で行うシミュレーション研修のニーズが明らかになった。本年度、シミュレーション研修1回目を実施し、学会発表したことで事前学習を行うなど研修のスリム化、事前事後テストの内容について助言をもらうことができたため、次年度は2回目のシミュレーション研修を開催し、内容のブラッシュアップを行う。看護師用、教員用、養護教諭用、保護者用のアンケート配布および、看護師用、教員用、養護教諭用アンケートの回収も鳥取県教育委員会特別教育支援課からの協力が得られた。その結果、アンケートの送付および回収に必要だった郵送費が少なくてすんだためである。シミュレーション研修を大学内のシミュレーションセンターで実施したことで会場費が不要であった。また、受講生主体の参加型研修としたため講師招聘をせず、謝金が不要であった。次年度は、研修内容のブラッシュアップを行い、受講生への配布資料やコース研修開催を検討している。今年度実施できなかった論文発表を行う。研修プログラムの評価項目を検討する。
骨コラーゲンの新規精製法の確立と遺伝子発現量比較による骨関連細胞の機能解析

I型コラーゲンは真皮などの軟組織と骨などの硬組織の両方に含まれるが、同一遺伝子から転写翻訳される。このようにコラーゲンは組織構造が異なる場に豊富に存在することから組織の形成維持に関与していると考えられるが、その詳細は未だ明らかではない。そのメカニズムを明らかにするためには、硬組織のコラーゲンを回収してその分子構造や会合体形成などを調べ、真皮コラーゲンと比較しなければならない。さらに、組織特有のコラーゲンの翻訳後修飾を調べる必要がある。しかし残念ながら、硬組織の未変性コラーゲンの抽出法は確立していなかった。主な理由は、酸・熱抽出法では骨コラーゲンが変性してゼラチンとなり、また修飾基が脱離するためである。一方、I型コラーゲンは基礎研究のみならず、治療材料、さらに再生医療などの応用研究においても注目されている生体材料である。真皮などから大量に安全に再現性よく回収する技術も開発されており、世界中で軟組織のコラーゲンが生体材料として汎用されている。特に真皮と腱由来コラーゲンは市販されており、容易に入手可能で、医療材料として承認されている製品もある。今後は、骨コラーゲンの抽出法が確立できれば、第3のコラーゲン材料として期待できる。本研究では、骨組織からコラーゲンを抽出する技術基盤を確立してその物性を明らかにし、さらに組織特有のコラーゲンの翻訳後修飾などを検証することを目的としている。また、骨コラーゲンを細胞培養の足場として用いて、細胞の機能変化を調べることを計画している。初年度は、最適な温度、pH、塩濃度などの条件を整えることを考慮し、独自の方法で硬骨からコラーゲンを抽出することを試みた。精製した骨コラーゲンは分子量、純度、線維形成速度などを測定することでその物性を調べた。また、LC-MSで翻訳後修飾を比較する系を確立するため、まず真皮と腱のコラーゲンを供して解析した。平成29年度は、ブタ脛骨を0.5M EDTAにて4°Cで脱灰し、続いて当研究室で精製したタンパク質分解酵素を用いて可溶化することに成功し、その最適化を実施した。その結果、20°Cで3日間反応させることで、骨の乾燥重量で60%以上の回収率でコラーゲンを抽出できた。計画にはなかったが、ブタの関節軟骨(硝子軟骨)からII型コラーゲンを抽出することにも成功した。SDS-PAGEで調べた結果、骨コラーゲンは真皮コラーゲンを同様に2本のα1鎖と1本のα2鎖からなり、些少のβ鎖とγ鎖が含まれることが分かった。純度は90%以上であった。線維形成速度は真皮コラーゲンより少し早く、熱転移温度も数度高いことが示された。さらに生理的条件下で自己会合してゲル化することも明らかになった。つまり、骨コラーゲンの分子構造は真皮コラーゲンと相似であったが、線維形成速度と線維構造に僅かながら違いが認められた。翻訳後修飾の解析を確立するため、真皮と腱のコラーゲンをLC-MSにて調べた結果、両者においてもプロリンの水酸化の位置と数量に違いを定量的に測定することができた。またリン酸化修飾もリン酸化したアミノ酸残基を特定し、真皮と腱での有意の差異を示すことができた。つまり、初年度に水酸化とリン酸化の翻訳後修飾の解析手法を確立した。さらに骨組織からコラーゲン以外の成分を部分的な天然状態で調製できる技術も副次的に開発した。ウシの象牙質から象牙質コラーゲンを抽出することにも成功したが、象牙質コラーゲンの回収率は骨より低いことが示された。これは、象牙質に含まれるコラーゲン量が低いことが関係していると推察した。以上のように、初年度の研究は計画以上に完遂することができた。得られた成果の一部は、2017年の第35回日本骨代謝学会学術集会で口頭発表した。初年度の計画目標は順調に達成しており、特に遅延した事象はなかった。よって次年度以降は計画通りに、1)骨コラーゲンの大量調製、2)LCーMSによる骨コラーゲンの翻訳後修飾の同定と定量解析、3)骨コラーゲン上での骨芽細胞・軟骨細胞の培養と機能変化の検証、を計画する。1)の「大量調製」では、脱灰方法をEDTA浸漬法と塩酸浸漬法を比較することで、時間の短縮と省力化を図ることにする。塩酸は混在する微生物の殺菌作用が期待できるので、得られる骨コラーゲンは安心して細胞培養に供することができる。また、反応温度を30°Cまで上げること、骨基質を細かく粉砕すること、酵素濃度を増やすことでさらに反応時間を短縮できると考えられる。2)の「翻訳後修飾」では、すでにブタとウシの脛骨のコラーゲンをLC-MSにて測定したので、プロリンの水酸化修飾とリン酸化修飾、さらに真皮コラーゲンにない修飾を同定することを計画する。得られる結果を真皮と腱のコラーゲンと比較解析することで、組織特異的な翻訳後修飾を明らかにする。3)の「細胞培養実験」では、骨コラーゲンで培養する骨芽細胞と軟骨細胞が、他のコラーゲンを用いた系より機能が高く保持されているかを検証する。その際、骨由来のコラーゲン以外の既知成分(LC-MSで同定済み)を培地に添加することも試みる予定である。

細胞機能の解析では、各培養条件でRNAを抽出してRT-qPCRにて遺伝子発現パターンの差異を調べる。【今後の目標】すでに真皮と腱において翻訳後修飾の違いを見出しているので、骨を合わせて3つの異なる組織でのコラーゲンの差異を明確にし、骨コラーゲンを新規のバイオマテリアルとして再生医療への応用研究につなげたい。I型コラーゲンは真皮などの軟組織と骨などの硬組織の両方に含まれるが、同一遺伝子から転写翻訳される。このようにコラーゲンは組織構造が異なる場に豊富に存在することから組織の形成維持に関与していると考えられるが、その詳細は未だ明らかではない。そのメカニズムを明らかにするためには、硬組織のコラーゲンを回収してその分子構造や会合体形成などを調べ、真皮コラーゲンと比較しなければならない。さらに、組織特有のコラーゲンの翻訳後修飾を調べる必要がある。しかし残念ながら、硬組織の未変性コラーゲンの抽出法は確立していなかった。主な理由は、酸・熱抽出法では骨コラーゲンが変性してゼラチンとなり、また修飾基が脱離するためである。一方、I型コラーゲンは基礎研究のみならず、治療材料、さらに再生医療などの応用研究においても注目されている生体材料である。真皮などから大量に安全に再現性よく回収する技術も開発されており、世界中で軟組織のコラーゲンが生体材料として汎用されている。特に真皮と腱由来コラーゲンは市販されており、容易に入手可能で、医療材料として承認されている製品もある。今後は、骨コラーゲンの抽出法が確立できれば、第3のコラーゲン材料として期待できる。本研究では、骨組織からコラーゲンを抽出する技術基盤を確立してその物性を明らかにし、さらに組織特有のコラーゲンの翻訳後修飾などを検証することを目的としている。また、骨コラーゲンを細胞培養の足場として用いて、細胞の機能変化を調べることを計画している。初年度は、最適な温度、pH、塩濃度などの条件を整えることを考慮し、独自の方法で硬骨からコラーゲンを抽出することを試みた。精製した骨コラーゲンは分子量、純度、線維形成速度などを測定することでその物性を調べた。また、LC-MSで翻訳後修飾を比較する系を確立するため、まず真皮と腱のコラーゲンを供して解析した。平成29年度は、ブタ脛骨を0.5M EDTAにて4°Cで脱灰し、続いて当研究室で精製したタンパク質分解酵素を用いて可溶化することに成功し、その最適化を実施した。その結果、20°Cで3日間反応させることで、骨の乾燥重量で60%以上の回収率でコラーゲンを抽出できた。計画にはなかったが、ブタの関節軟骨(硝子軟骨)からII型コラーゲンを抽出することにも成功した。SDS-PAGEで調べた結果、骨コラーゲンは真皮コラーゲンを同様に2本のα1鎖と1本のα2鎖からなり、些少のβ鎖とγ鎖が含まれることが分かった。純度は90%以上であった。線維形成速度は真皮コラーゲンより少し早く、熱転移温度も数度高いことが示された。さらに生理的条件下で自己会合してゲル化することも明らかになった。つまり、骨コラーゲンの分子構造は真皮コラーゲンと相似であったが、線維形成速度と線維構造に僅かながら違いが認められた。翻訳後修飾の解析を確立するため、真皮と腱のコラーゲンをLC-MSにて調べた結果、両者においてもプロリンの水酸化の位置と数量に違いを定量的に測定することができた。またリン酸化修飾もリン酸化したアミノ酸残基を特定し、真皮と腱での有意の差異を示すことができた。つまり、初年度に水酸化とリン酸化の翻訳後修飾の解析手法を確立した。
エネルギー消費を促進する食品成分の検索と神経内分泌性機構の解析

本研究は(1)生体内におけるエネルギー消費を促す食品成分の探索と、(2)中枢神経系(視床下部)に働いて食欲(エネルギー摂取)を調節する神経ペプチド類がエネルギー消費に対してどのような作用を示すか明らかにすることを目的とし、以下の実験成績を得た。1.第一の研究では、香味食品の中でショウガならびにラズベリーに着目し、これらの香味食品がエネルギー消費に及ぼす効果を酸素消費量(VO2)と呼吸商(RQ)の面から検討すると共に、その有効成分を解析した。ラットに高糖質食あるいは高脂肪食を与え、それらの食餌にショウガ粉末あるいはその辛味成分であるジンゲロンを添加すると、両食餌群とも暗期12時間の累積VO2の上昇とRQの低下が認められた。すなわち、ショウガ(ジンゲロン)には体内の脂肪の燃焼を盛んにしてエネルギー消費を促進する効果のあることが明らかになった。また、ラズベリーの特徴的な香気成分であるラズベリーケトン(RK)の添加(0.45%)によっても、同様に用量に依存して累積VO2の上昇とRQの低下が観察された。さらに、高脂肪食を1ヶ月間摂取させた場合に認められる中性脂肪の蓄積や脂質代謝異常はRKの添加によって抑制・改善されることが明確になった。2.食欲促進物質のうち、オレキシンAの中枢投与はVO2を著明に増加させたが、NAは逆にVO2を一過性に低下させた。RQはNPY、グレリンの中枢投与で増大したが、NAの投与では一過性に低下した。ガラニン、オレキシンB、MCHはVO2およびRQに対して有意な影響を与えなかった。他方、食欲抑制ペプチド類について調べると、レプチンはRQを低下させたが、暗期の累積VO2に対しては有意な影響を与えなかった。これに対して、CRHはRQを低下させると共に累積VO2を増加させる作用を持つことが明らかになった。エネルギー消費を促進する食品成分を検索する研究の一環として、脂肪酸組成の異なる食用油脂の脂質代謝に及ぼす作用を追究した。すなわち、ラードのような飽和脂肪酸含量の高い油脂の過量摂取による体脂肪の蓄積や脂質代謝異常に対して、短鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸より成るサラトリムの添加がどのような効果をもつかを、不飽和脂肪酸の多い魚油およびサフラワー油の添加効果と対比させながら検討した。エネルギー比で約40%を占めるラード食でラットを1ヶ月間飼育すると、対照標準食ラットに比べて白色脂肪組織重量は著しく増大し、肝臓の中性脂肪(TG)およびコレステロール(TC)含量も約2倍に増加した。また血清TGならびにTC濃度も有意に上昇した。ラードにサラトリムを1:1の割合で添加すると、これらの脂質代謝異常は抑制・改善されたが、サフラワー油の添加は無効であった。魚油の添加は血清TGおよびTC濃度を低下させる効果を示したが、肝臓中の過酸化脂質含量を増加させた。一方、血清中の遊離脂肪酸濃度はラード食と同様に、サフラワー油添加ならびにサラトリム添加で増加したが、魚油添加によって減少した。代謝性熱産生を行う褐色脂肪組織重量はサラトリムあるいは魚油の添加で増大し、エネルギー消費が高まっている可能性がある。実際に、呼吸代謝計測装置を用いてラットの夜間摂食時12時間の累積酸素消費量を測定すると、摂取エネルギー量を一定にした場合、サラトリム添加群では対照標準食やラード食ラットよりも高いことが判明した。サラトリムはラードに添加すると、エネルギー消費を促してラードによる脂肪沈着と脂質代謝異常を改善する効果をもつ食用油脂であることが明らかになった。

エネルギー消費を促進する食品成分を検索する目的で、本年度は主に生姜、唐辛子ならびにカフェインなどの香味食品ないしは香味成分の食餌に対する添加効果を追究した。ラットを高糖質食あるいは高脂肪食で飼育して、小動物代謝計測システムを用いた呼気分析によって酸素消費量ならびに炭酸ガス発生量を48時間連続的に測定し、香味食品添加の前後でエネルギー消費量を算定した。ラットの酸素消費量と呼吸商は、夜間摂食時に高く昼間は低いという日内変動が認められるので、実験食は暗期12時間のみに限定して与え明期には給水のみとした。高糖質食あるいは高脂肪食に2%になるように生姜または唐辛子を添加すると、摂取エネルギー量は減少するにもかかわらず、暗期摂食時の累積酸素消費量は有意に(34%)増加した。一方、交感神経を興奮させる働きを持つ食品成分であるカフェインを0.05%の割合で添加すると、高糖質食よりも高脂肪食で摂食時の累積酸素消費量が有意に増加した。次に呼吸商に及ぼす影響を調べると、各実験食への生姜ならびに唐辛子の添加によって摂食時の呼吸商は低下する傾向を認めたが、カフェインの添加は摂食時の呼吸商を上昇させた。これらの事から、生姜、唐辛子、カフェインのような香味食品は、摂食時の酸素消費量を増加させエネルギー消費を促進する作用のあることが明らかになった。さらに、生姜や唐辛子が脂肪の燃焼を促すと思われるのに対し、カフェインはむしろ糖質を多く燃焼させると考えられる。なお、摂食調節作用をもつ神経ペプチドのエネルギー消費に及ぼす効果については、ラット第三脳室内へ投与するための予備的実験を行った。エネルギー消費を促進する神経内分泌機構を解析する研究の一環として、食欲促進作用を持つ一群の神経ペプチドおよびノルアドレナリン(NA)を無麻酔下でラットの第三脳室内に投与し、酸素消費量ならびに呼吸商がどのように変化するかを小動物代謝計測システムを用いて追究した。用いた神経ペプチドの投与量は、ニュロペプチドY(NPY,200ng),オレキシンAおよびB(300ng-2μg),ガラニン(400-600ng)、メラニン濃縮ホルモン(MCH、3-5μg)、グレリン(1μg)およびNA(16μg)であり、以下の実験結果を得た。1.対照ラットと比べた投与後2時間の摂食量の増加は、NPY、NAが最も大きく、次いでガラニン、グレリン、MCHも摂食量を有意に増加させたが、オレキシンAならびにBは用いた投与量では増加傾向を示したに過ぎなかった。2.2時間の酸素消費量は、オレキシンAの中枢投与で著明に増加したが、NA投与では一過性に低下した。しかし、NPY、ガラニン、グレリン、MCH、オレキシンBなどの投与では酸素消費量に有意な変化は認められなかった。3.呼吸商はNPYの投与で増大し、脂肪の燃焼が抑えられると思われるが、NAの投与では逆に一過性に低下した。また、グレリンの投与は呼吸商を増大させる傾向があった。つまり、これらの食欲促進物質の投与で、体内で燃焼される栄養素が異なってくることを示唆する。しかし、その他の神経ペプチドの中枢投与では、呼吸商に有意な変化がなかった。本研究の結果から、エネルギー消費に及ぼす食欲促進物質の中枢作用は必ずしも一様ではないこと、また、作用物質の種類によって体内で消費される栄養素が異なると考えられる。1.食欲抑制ペプチドのエネルギー
骨形成作用を有する抗DKK-1抗体の効果メカニズムの解明

抗DKK-1抗体の効果メカニズムを解明することで、新たな骨粗鬆症治療薬、骨形成、骨補填剤としての可能性を探索する。骨代謝に関連するWnt/βカテニンシグナルは、骨細胞、骨芽細胞から産生されるDKK1により阻害され、骨芽細胞の分化抑制、破骨細胞の形成促進が報告されている。抗DKK-1抗体はWnt/βカテニンシグナルを阻害しないため、骨形成作用を有すると考えられる。しかしながら、抗DKK-1抗体の骨髄でのメカニズムについてはあまり知られていないのが現状である。本年度は、マウス長管骨の骨髄から分離培養した骨髄細胞を用いて、細胞増殖能、分化能を検討した。細胞増殖能においては、MTSアッセイにて検討し、抗DKK-1抗体投与群、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体+TNF-α投与群、コントロール群において、有意な差は認められなかった。細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性、アリザリンレッド染色について検討したところ、抗DKK-1抗体投与群はコントロール群と差は認められなかったが、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体+TNF-α投与群においては、活性が抑制される傾向にあり、TNF-α投与によって分化が抑えられることが示唆された。また、骨粗しょう症モデルマウスを作製し、マイクロCTを用いて骨量解析を行ったところ、抗DKK-1抗体投与群において、骨量の減少は認められなかった。組織学的検討においても、コントロールと同様の骨量を認めた。現在は、骨粗しょう症モデルマウスを抜歯した後の顎骨の変化、骨形成、骨破壊について検討している。また、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RTーPCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討している。本年度は骨粗しょう症モデルマウスを作製し、形態学的、組織学的検討を行った。μCTを用いて、形態学的検討、また、骨量計測も行った。組織学的には、ヘマトキシリンーエオジン染色、破骨細胞を染色するTRAP染色、各種免疫染色を行っている。また、細胞分化能について、アリザリンレッド染色、RNA抽出、定量Real time PCRの検討も行っている。現在はこれらをまとめて学会発表の準備を進めている。細胞培養実験においては、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となるRNA、タンパクについて、抗DKK-1抗体、TNF-αの影響についてさらに検討を進めていく。また、シグナル伝達経路についても検討を行っていく。動物実験においては、骨粗しょう症モデルマウス、顎骨壊死マウスを作製し、抗DKK-1抗体がどのように作用するかを検討していく。細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性について検討したところ、抗DKK-1抗体投与群はコントロール群と差は認められなかったが、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体+TNF-α投与群においては、活性が抑制される傾向にあり、TNF-α投与によって分化が抑えられることが示唆された。今後は、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RTーPCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討する。現在、動物実験もスタートし、8週齢C3Hマウスの卵巣を摘出し、骨粗しょう症モデルマウスを作製している。今後、抗DKK-1抗体を投与し、抜歯後の顎骨壊死が起こるかどうかについて、マイクロCT等を用いて検討する予定である。細胞増殖能においては、MTSアッセイ、細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性を検討した。

細胞増殖能においては、MTSアッセイにて検討し、抗DKK-1抗体投与群、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体+TNF-α投与群、コントロール群において、有意な差は認められなかった。細胞分化能においては、アルカリフォスファターゼ活性、アリザリンレッド染色について検討したところ、抗DKK-1抗体投与群はコントロール群と差は認められなかったが、TNF-α投与群、抗DKK-1抗体+TNF-α投与群においては、活性が抑制される傾向にあり、TNF-α投与によって分化が抑えられることが示唆された。また、骨粗しょう症モデルマウスを作製し、マイクロCTを用いて骨量解析を行ったところ、抗DKK-1抗体投与群において、骨量の減少は認められなかった。組織学的検討においても、コントロールと同様の骨量を認めた。現在は、骨粗しょう症モデルマウスを抜歯した後の顎骨の変化、骨形成、骨破壊について検討している。また、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RTーPCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討している。本年度は骨粗しょう症モデルマウスを作製し、形態学的、組織学的検討を行った。μCTを用いて、形態学的検討、また、骨量計測も行った。組織学的には、ヘマトキシリンーエオジン染色、破骨細胞を染色するTRAP染色、各種免疫染色を行っている。また、細胞分化能について、アリザリンレッド染色、RNA抽出、定量Real time PCRの検討も行っている。現在はこれらをまとめて学会発表の準備を進めている。今後は、in vitro研究では、骨髄培養細胞からRNAを抽出し、定量性RTーPCR法を用いて、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となる遺伝子についても検討する。さらに、FACSを用いて、実際の細胞がどのくらいの割合で幹細胞になっているかの確認を行う。さらに、シグナル伝達経路の検討として、TNF-αを作用させた際のシグナル伝達経路について、タンパク質リン酸化の検討として、ウエスタンブロッティング、ELISA、リン酸化タンパク質/リン酸化ペプチドの濃縮、キナーゼ活性アッセイを行う。また、動物実験もスタートし、骨粗しょう症モデルマウスを用いて、抗DKK-1抗体を投与し、抜歯後の顎骨壊死が起こるかどうかについて、マイクロCT等を用いて検討する予定である。その後、マウスの顎骨を取り出し、パラフィン包埋後、HE染色、免疫組織化学染色により、シグナル伝達経路の検討を行う。細胞培養実験においては、炎症性サイトカイン、幹細胞化の指標となるRNA、タンパクについて、抗DKK-1抗体、TNF-αの影響についてさらに検討を進めていく。また、シグナル伝達経路についても検討を行っていく。動物実験においては、骨粗しょう症モデルマウス、顎骨壊死マウスを作製し、抗DKK-1抗体がどのように作用するかを検討していく。平成29年度は海外での発表を予定していたが、日程が合わず、断念したため、旅費の予算が変わってしまったため、次年度への繰り越しとなった。今年度は、海外での学会出張、論文投稿などが予定されている。平成30年度は国内学会に参加予定であったが、予定が合わず断念したため。今年度は、国内学会発表、論文投稿を予定している。
ラミニンプロモーター遺伝子の心筋症、腎硬化症、糖尿病病態発症に関する研究

心臓病,腎臓病,糖尿病の患者さんにおいて血管壁が硬くなり、その硬い血管壁の成分の中にラミニンという線維状の物質が異常に増加していることが知られていたが、本研究ではそのラミニンの遺伝子を調節するたんぱく質を見出し検討した。拡張型心筋症、糖尿病、腎硬化症における、ラミニンの病的増加を探求するために、本教室ではハイブリッドシステムによるスクリーニングを施行、新規蛋白Smarce1r, SMARP (Exp.and Clinic.Cardiol. 2004)ならびにトロポニンIの新しいアイソフォーム(トロポニンIr)を見出した(Exp.and Clinic.Cardiol. 2006)。以上の背景から、本年度は研究計画申請書に沿ってSmarce1r, SMARP,トロポニンIrの心臓、腎臓疾患、糖尿病の病態発症との関係解明に、機能解析を以下柱1-3につき検討した。柱1.Smarce1rの遺伝子の調節、発現についてGFPならびにDsRed融合Smarce1rを作製強制発現系で細胞内局在を調べたところSmarce-1rは核内蛋白であることが判明した。Smarce1rノックアウトマウスの作製に関しては、先にクローニングしていたHuman Smarce1r cDNAをプローベにマウスライブラリーのスクリーニングを終了した。柱2.SMARP遺伝子の調節、発現についてSMARP S mRNAの発現をノーザンブロットにて検討したところ、心臓、精巣に特異的に発現することが判明した。また、SMARPの細胞内局在を調べたところSMARPは核小体蛋白であることが判明した。柱3.トロポニンIr遺伝子の調節、発現についてトロポニンIrはトロポニンTとの結合領域のC末端を欠損していたため、トロポニンTとの結合する機能を有するかを検討した。GST-融合蛋白を用いPull-down assay,およびIn vitoの免疫沈降反応を施行しIn cellでの分子間結合力を測定したところ、トロポニンTとの結合が低下していることが解った。現在では心筋細胞にて発現し、免疫沈降反応を施行する段階である。以上の過程にて研究を進めた。以上の背景から、本年度では研究計画申請書に沿ってSmarcelr,SMARP,トロポニンIrの上記病態との関係解明を以下の柱1-3につき検討した。柱1.Smarcelrの遺伝子については融合蛋白Smarcelrを用いて細胞内局在を調べた。Smarcelrノックアウトマウスの作製に関しては、マウスSmarcelr cDNAをクローニングをした。柱2.SMARP遺伝子についてはSMARP mRNAの発現をノーザンプロットにて検討したところ、心臓、精巣に特異的に発現することが判明した。また、Smarcelrと同様にSMARPの細胞内局在を調べSmarcelrとinvivo,invitroの結合能を調べた。柱3.トロポニンIr遺伝子は構造上トロポニンTとの結合領域を欠損しており、トロポニンTとの分子間結合能を、InvivoのPull-down assay,およびIn vitoの免疫沈降反応にて検討し、トロポニンTとの結合力が低下していることを、心筋細胞も含め確かめた。1.Smarcelr遺伝子は融合蛋白を用い細胞内局在を調べたところ、細胞核に局在することを見出した。Smarcelrノックアウトマウスの作製に関しては、マウスSmarcelr cDNAをクローニングした。2.SMARP遺伝子はノーザンプロットを施行したところ、心臓、精巣に特異的に発現した。また、SMARPの細胞内局在を調べたたころ、核小体に局在することが判った。さらに、SmarcelrとSMARPの間のin vivo,in vitroの分子間結合能を確かめた。3.トロポニンIr遺伝子は構造上トロポニンTとの結合領域を欠損しており、In vivoのPull-down assay,およびIn vitoの免疫沈降反応を用いて検討したところ、トロポニンTとの結合力が低下していることを確認された。
カルネキシンおよびカルレティキュリンのノックアウトマウス作製とその機能解析

カルネキシンおよびカルレティキュリンは細胞の小胞体に局在し、膜・分泌蛋白質が成熟する過程でその品質管理に重要なレクチンシャペロンとして機能する。しかしいずれも体細胞に普遍的に発現するために、ノックアウトマウスを作製すると胚性致死もしくは生まれても発育不全のために成熟個体での機能解析を行うことは不可能であることが報告されている。そこで我々はcre/loxPシステムを用いることにより、これらのシャペロンを任意の組織や細胞・時期特異的(コンディショナル)に欠損するマウスを作製し、成熟個体でその機能解析を行うことを計画した。これまでにカルネキシンのコンディショナルノックアウトマウスの作製に成功し、全身でカルネキシンを欠損させた場合には、既報通り成長不全のために殆ど成育しなかった。稀に成熟する個体が得られるので、精子や卵子の受精能力を検討したところ、成長不全に起因する可能性は否定できないものの、野生型に比べて受精能力が劣っていることを見出した。またカルレティキュリンについてもコンディショナルノックアウトマウスの作製に成功した。全身でカルレティキュリンを欠損させた場合には、既報通り胚性致死となることを確認した。精細胞特異的にcreを発現するトランスジェニックマウスと交配して得られたマウスを解析したが、精子でカルレティキュリン遺伝子が欠損することがなかった。用いたトランスジェニック系統が適していなかった可能性が考えられる。ZP3プロモーターの制御下にcreを発現するトランスジェニックマウスとの交配では、卵子特異的にカルレティキュリンを欠損することを、遺伝子レベル、タンパク質レベルで確認することができた。これまでにカルネキシンのコンディショナルノックアウトマウスの作製に成功している。次にCAG-creマウスとの交配により、全身でカルネキシンを欠損させた場合には、既報通りホモ欠損個体は成長不全のために殆ど成育せず、精子受精能の検討ができないことを確認している。次年度は、精細胞の初期に発現するngn3のプロモーターの制御下にcreを発現するトランスジェニックマウスと交配させ、カルネキシンの精細胞特異的な欠損による精子受精能の影響を観察する予定である。現在はCAG-creとの交配により、全身でカルレティキュリンを欠損させた場合に既報通りホモ欠損個体が胚性致死となるかどうか検討中である。その確認後は、上記と同様にngn3-creマウスと掛け合わせることで精子受精能への影響を観察する。
粘土遊びに関する幼児造形教育法の確立

研究の目的は、粘土遊びに関する調査と分析による幼児造形教育の環境モデルを構成することであり、造形活動の環境が幼児の遊びの中で意味や価値として利用されるシステムを生態造形教育学として確立することである。子供が粘土遊びを始める時の環境の意味を明らかにすることに重点を置いた。保育現場(2400人)に造形環境に関するアンケートを実施し、粘土遊びは重要と考えているが実施できていないこととその理由を明らかにした。レッジョ・エミリアの方法論を取り込むことの有用性を示した報告書によって、粘土場の運営を例に挙げながら、保育者と補助者が観察を重視しながら環境システムを構築する方法について具体的に例示した。2年目は、研究の中心となる粘土遊びの実践やデータ収集を中心に行った。高梁中央保育園にて粘土遊びの実践を年間を通して行い、野中哲士先生(心理学)の協力を得てビデオカメラ(4台同時撮影)やデジタルカメラで撮影保存し得られたデータを分析した。本年度の成果としては、大量の粘土を使用した粘土遊びを0歳から5歳児クラスで継続して行い、幼児が粘土遊びを行う際の遊びの移り変わりに関するデータを収集することができた。また本研究で確立しようとしている造形教育法に極めて重要な視点となる、環境が行動を引き出すというアフォーダンス理論(Gibson)について先行研究を行った。関係する国際学会(ICPA)にて研究発表を行う予定である。7月には大地太陽幼稚園(北海道)を訪問し、どろんこ遊びなどを見学しつつ、坂本行正園長から詳しい実践内容説明を聴くことが出来た。8月には日本教育学会(名古屋大学)にて発表を行った。(「粘土場の遊び環境による幼児の行動から始まる思考」)3月にはイタリアのレッジョ・エミリア市を訪問し、ペダゴジスタ(教育学者) Paola Cavazzoni先生からレッジョ・チルドレンの活動について詳しい説明を聴くことができた。また近くのボローニャの幼稚園を訪問し、実際の保育を見学した。担任、園長と情報交換しながら、子どもの造形遊びの環境について検討を行うことができた。「粘土遊びに関する幼児造形教育法の確立」のためのアンケートについて、2月に作成を終え、アルバイトの協力を得て保育園幼稚園(岡山県・島根県)あわせて1200園に発送し、3月末までにアンケートを回収できた。研究最終年度には、昨年実施したアンケート結果と合わせて、具体的に一般の保育現場で可能な粘土場の設置方法について教育法と合わせてまとめることができた。粘土場での実践によって蓄積したデータをもとに、幼児が粘土遊びをしている時のふるまいについて分析を行い、月案、週案、指導案などを含む具体的なプログラムを提案することができた。また粘土遊びに関するアンケート結果を統計的に分析し、保育現場の現状と粘土遊びの環境に必要な点を明らかにすることができた。これらの取り組みや活動を通して保育園や幼稚園との連携を深め今後につながる研究体制を構築できた。イタリアのレッジョ・エミリア市とボローニャ市を訪問し、レッジョ・エミリア・アプローチに関する調査を行った。成果として、未だ日本に紹介されていない活動の広がりやイタリア国内での問題点等を理解することができた。保育の実践の前段階である保育者や保育関係者の研修を含む準備態勢の重要性について課題が明らかとなった。プロジェクト学習としての実践方法を粘土遊びに関する幼児造形教育法として確立し、大量の粘土による遊びの環境、視覚型触覚型の思考の柔軟性、量の認識と量感表現などについて得られた結果をまとめ、幼児の「遊びに始まって遊びに終わる造形活動」が、学ぶ意欲を引き出すための主体的な思考力を育む遊びとなることを示す成果が得られた。これらの成果を粘土遊びの環境と教育法に関する報告書(60ページ)として作成し、保育現場や保育関係者に対して536件送付した。また日本保育学会での発表と会わせて配布できた。今後も保育現場訪問や招待講演等での配布を予定している。日本乳幼児教育学会や国際生態心理学会(ICPA)に参加し発表を行なうことで、国内や海外の研究者と連携しながら子どもの造形遊びの環境について検討を行うことができた。初年度は、研究の基盤となる機材の購入やそれらを使用したデータ収集を中心に行った。研究内容としては粘度遊びプロジェクトの実践、新たに導入したソフトを使用した分析を行った。具体的には高梁中央保育園に新たに彫塑用粘土800kgと新型の土練機を設置し、画用紙などの消耗品についても十分な準備のもとで比較実験的な研究ができた。さらに過去の基礎研究をもとに様々なプロジェクト型の粘土遊びを行った。本年度の成果としては、大量の粘土を使用した粘土遊びを5歳児クラスで継続して行い、幼児のイメージ形成において視覚型と触覚型が現れる原因としての粘土遊び体験の分析データを残すことができた。

結果として、言葉掛けだけの描画では視覚的で基底線を伴った概念的な絵が現れることに対し、大量の粘土で遊んだ後は、触覚的な視点での絵が現れることが分かった。現時点では、幼児の造形教育は、知的な指導によれば平面的視覚型のイメージ形成を促進し、体験型の指導からは立体的触覚型のイメージ形成が生まれることが分かってきた。本研究で確立しようとしている造形教育法には、思考から行動を起こさせる方法と行動から思考を始めさせる2つの方法があることが見えてきた。購入した4台のビデオカメラやデジタルカメラで粘土遊びを撮影保存し、得られたデータをSPSSの統計ソフトを利用して分析した。また硬度計を購入し、幼児に適した粘土の硬さを調べ、実践の積み重ねの中で粘土遊びに最適な物的環境を調査した。文献による先行研究も実践研究と同時進行で進めている。遠隔地にある広島市のゆうき幼稚園には、2度訪問し実践指導を行いながら比較調査をおこなった。3月には23年度のまとめとして、全米美術教育学会(NAEA;NY大会)に参加し、海外の研究者と情報交換しながら子どもの造形遊びの環境について検討を行うことができた。平成24度に使用する予定であった研究費は予定額を100%使用して、アルバイト採用を含め研究への準備や対応が十分にでき、予定していた研究計画を推進することができた。また、先進園視察や学会発表での情報交換も充実した内容であった。具体的な理由としては、粘土遊びの実践に粘土800kgを使用して造形遊びに適した環境を作り、0歳から6歳までの6クラスの子ども達の粘土場で遊ぶ様子をデジタルカメラ等で収録できた。このような環境のもとに、交付申請書の研究実施計画に示した平成24年度の内容、1発展的なプロジェクト学習、2造形遊びに関するアンケート調査、3遊び環境に関するデータ収集、これらについておおむね順調に進展した。特に実践プロジェクトの種類の遊びの実施確認は順調に進んでおり、3年目(最終年)に分析するためのデータを揃えることができた。また高梁中央保育園の保育士と同席して学会発表を行うことができたことは保育現場の研究の活性化にも繋がっており、本研究が目指す幼児造形教育法の確立に相互的に良い進展が見られる。ただ保育園の職員のみによる粘土場の運営は未だ確立しておらず次年度の課題となっている。一方で、小学校や岡山県総合教育センター、レジャー施設(きのこの森;福井県)から粘土遊びの実施依頼があり、小学生や教員と粘土遊びの実践や講演を行うなど研究実施計画を上回る進展も見られるところである。また環境(アフォーダンス理論)として子どもが初めて出会う粘土遊びの研究のために、トンガ王国(この国には粘土遊び文化が無い)にて粘土遊びの実践研究「小麦粉粘土との出会い」(トンガ王国幼児教育への粘土遊びの導入)を現地の土屋勇気(保育士)と協力して行った。平成23年度に使用する予定であった研究費は予定額を100%使用して設備等の準備が十分にでき、予定していた研究計画を推進することができた。また、海外での情報交換も充実した内容であった。さらに3月の順正学園学術交流コンファレンス研究部門に参加し、全分野16組の発表のうち最高賞を得ることができた。
外傷を蒙った根未完成永久前歯の免疫組織化学変化と血管構築現象に関する研究

犬の根未完成永久前歯に不完全脱臼を起こさせ、数週間後に歯髄の変化を病理組織学的に調べたが、歯髄に変化がみられなかった。よって完全脱臼(再植)をおこなったところ、6週間後に歯髄は変性壊死に陥った。そこで外傷により壊死した歯髄が抗原となり、自己免疫反応として根尖周囲組織に影響を及ぼす可能性の有無を免疫学的に調べた。(免疫反応の証明)1体液性免疫:抗原ー抗体反応による。再植した犬の永久前歯歯髄を取り出しPBSを加えてホモゲナイズする。遠心して可溶成分を取る。凍結乾燥法により試料を約10倍に濃縮する。一方で同一個体から採血した血清を調整して、これも凍結乾燥法で約10倍に濃縮する。犬歯髄可溶成分と血清を用いてDouble Diffusion Methodで沈降線の有無をみた。対照では沈降線を生じなかったが、壊死歯髄では明らかに二本の沈降線が見られた。すなわち歯髄組織成分が傷害を受けて自己抗原化したことが体液性免疫反応より確かめられた。次にラットの根未完成臼歯を脱臼させ、歯髄および歯根に生ずる反応を免疫反応としてとらえるために、初期免疫応答における細胞間情報伝達に必須のものであるIa抗原陽性細胞について免疫組織化学的検索を行った。すなわち生後3週のウイスタ-系ラットの上顎左右第一臼歯を被験歯とし、脱臼させ、2週および1カ月後に屠殺し、脱灰標本を作製後、1次抗体にOX6(抗ラットIa抗原陽性細胞)を用いてABC法による免疫染色を行った。しかし今回の実験では歯根の異常吸収や、周囲組織の炎症性変化がみられたにもかかわらず、Ia抗原陽性細胞は観察されなかった。根未完成永久前歯が外傷により不完全脱臼を起こした場合、加えられた衝撃の方向により受傷歯の歯髄や根尖周囲組織に生じる変化に関して病理組織学的実験を行った。実験には生後56カ月の雑種幼若犬8頭を使用し、歯根完成前の上顎第1及び第2切歯を用いた。実験歯牙の歯根形成状態をできるだけ一定に保つため、実験歯牙は乳歯の動揺が著名となる生後45カ月頃より飼育をはじめ、永久歯交換後レントゲン写真を参考に、実験に供した。実験動物はsodium pentobarabital静注による全身麻酔のもとに、打撃装置を作製し、左側上顎第1、2切歯には切端方向より嵌入を生じるまで衝撃を加えた。一方右側上顎第1、2切歯には、唇面にほぼ直角方向より衝撃を加えた。外傷後は整復、固定は行なわず、予後観察を行なった。実験動物は、術後1カ月毎にレントゲン写真と腔内写真を撮影し、術後3カ月まで歯髄壊死による歯の変色やcalcific metamorphosisの出現について観察した。衝撃を加えた際に歯冠の破折が生じたものがみられた。嵌入した症例でも観察期間中に再挺出し、歯冠の変色も観察されなかった。唇面に対し直角に外力を加えた症例の1週間後において、歯槽骨の骨折を疑わせる症例がみられた。観察期間終了後は、実験部位のレントゲン撮影を行い、動物を屠殺する。その後顎骨を切り出し、50%蟻酸とクエン酸ナトリウムの等量混合液で脱灰し、通法に従いパラフィン包埋を行い、切片標本を作製後、HE染色を施し、歯髄および根尖部組織の変化につき病理組織学的に観察する。なお現在は病理組織標本作製中である。