hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レギュラトリ科学と政策科学に基づく安全安心科学による技術システムの社会実装展開

本研究では,工学をベースとし,これに社会学的アプローチを加えて構築してきたこれまでの安全学に,レギュラトリ科学と政策科学的要素を学術基盤として導入することにより,安全安心科学の学理構築と技術システムの社会実装への方法論を創出することを目的として調査研究を実施した。レギュラトリ科学,政策科学に基づく新たな安全安心科学を創出するための検証として,これまでの原子力施設,エネルギー貯槽,石油化学プラント等,巨大技術システムの建設,運転,維持管理におけるリスク概念導入,リスクベースアプローチの実績とその後の成果について,各種の調査およびヒヤリング等を実施し,その限界について考察を行った。現代社会の安全は,リスクの解析,評価,対応のそれぞれのステップで,学問的に創造的再構築することが求められている。安全が,影響を及ぼす直接の安全事象に対する学問であるとすると,安心は安全に関与する組織や制度に対する信頼体系を構築することによって得られるものあり,安全安心科学の体系化と社会実装は,国家が総力を挙げて総合的に取り組むべき重要な対象である。本研究では,工学をベースとし社会学的アプローチを加えて構築してきたこれまでの安全学に,レギュラトリ科学と政策科学的要素を学術基盤として導入することにより,安全安心科学の学理構築と技術システムの社会実装への方法論を創出することを目的として調査研究を実施した。本研究では,レギュラトリ科学,政策科学に基づく新たな安全安心科学を創出するための検証としてこれまでの原子力施設や化学プラント等,巨大技術システムの建設,運転におけるリスク概念導入,リスクベースアプローチの実績とその後の成果について,各種の調査およびヒヤリング等を実施し,その限界について考察を行った。その結果,リスクベース工学の利活用における留意点と本質安全との比較検討を行い,その成果を3回の公開セミナー,シンポジウムにて発表し,関係者,聴講者とともに討論を展開した。巨大技術システムにおける安全確保のために,従来から工学的手法によるリスクの同定,発生頻度や影響規模の評価などが行われており,こうしたリスク評価の結果に基づいて安全性向上のための対策が施され,さらにその対策の効果についても工学的な評価が行われつつある。技術システムにおける安全確保のための一連の活動の重要な課題のひとつは,安全目標の設定すなわち,「どこまで安全性を追求すれば十分なのか(How safe is safe enough ?)」という問題である。原子力施設や種々の化学プラントのような巨大技術システムでは,災害や事故時の影響がシステムの内部にとどまらず,周辺の住民や環境に広範かつ壊滅的な影響を及ぼすことは周知の通りである。また,最近では規制緩和と安全確保の両立という観点からも社会的に受容される安全水準に関する定量的な議論のための基盤となる方法論や手法を整備することが必要となっている。ここでは,リスクが未実証な新技術等もあり,政策決定のためには,ハザードの受け手となる各ステークホルダー間での科学的知見と規制,政策を補完するレギュラトリ科学の導入が必要である。本研究では,巨大技術システムについて申請者らが提案した社会受容性に基づく安全性向上の仮説モデルをベースに,各種技術システムの設計や建設,運転におけるリスク概念の導入,リスクベースアプローチの実績について,各種調査を行うとともに,一般市民ならびに各界の有識者ヒヤリングによって検証を行った。原子力施設,化学プラントおよび交通システムを例に,リスクベースアプローチの限界についての仮説をたて,議論を提起し,公開セミナー,シンポジウムで討論を行った。安全が影響を及ぼす直接の安全事象に対する学問であるとすると,安心は安全に関与する組織や制度に対する信頼体系を構築することによって得られるものあり,安全安心科学の体系化と社会実装は,国家が総力を挙げて総合的に取り組むべき重要な対象である。本研究では,レギュラトリ科学と政策科学に基づく新たな安全安心科学を創出するための検証として,これまでの原子力施設,化学プラント等,巨大技術システムの建設,運転におけるリスク概念導入,リスクベースアプローチの実績とその後の活用における留意点と本質安全との比較検討を行い,その成果を公開セミナーにて発表し,関係者,聴講者とともに討論を展開した。一方,各技術システムのリスクの比較検討を行うために,燃料電池自動車用水素ステーションを例にリスク分析と評価を行った。特に,従来の工学的リスク評価を実施する前段階にHazard Identification (HAZID) studyを実施することにより,システムの内的要因とともに自然災害や環境変化等,外的要因に由来するシナリオについても考慮した事前評価を行った。巨大技術システムにおける安全確保のために,従来から工学的手法によるリスクの同定,発生頻度や影響規模の評価などが行われており,こうしたリスク評価の結果に基づいて安全性向上のための対策が実施され,さらにはその対策の効果についても工学的な評価が行われつつある。原子力施設や石油精製施設,化学プラントのような巨大技術システムでは,災害や事故時の影響がシステムの内部にとどまらず,周辺の住民や環境に広範かつ壊滅的な影響を及ぼすことは周知の通りである。

また,最近では規制緩和と安全確保の両立という観点からも社会的に受容される安全水準に関する定量的な議論のための基盤となる方法論や手法を整備することが必要となっている。ここでは,リスクが未実証な新技術等もあり,政策決定のためには,ハザードの受け手となる各ステークホルダー間での科学的知見と規制,政策を補完するレギュラトリ科学の導入が必要である。本研究では,巨大技術システムについて申請者らが提案した社会受容性に基づく安全性向上の仮説モデルをベースに,各種技術システムの設計や建設,運転や維持管理におけるリスク概念の導入,リスクベースアプローチの実績について,各種調査を行うとともに,一般市民ならびに各界の有識者ヒヤリングによって検証を行った。さらに,原子力施設,化学プラント及び交通システムを例に,リスクベースアプローチの限界について仮説を立て,議論を提起し,公開セミナやシンポジウムにおいて討論を行った。現代社会の安全は,リスクの解析,評価,対応のそれぞれのステップで,学問的に創造的再構築することが求められている。安全が,影響を及ぼす直接の安全事象に対する学問であるとすると,安心は安全に関与する組織や制度に対する信頼体系を構築することによって得られるものあり,安全安心科学の体系化と社会実装は,国家が総力を挙げて総合的に取り組むべき重要な対象である。本研究では,工学をベースとし,これに社会学的アプローチを加えて構築してきたこれまでの安全学に,レギュラトリ科学と政策科学的要素を学術基盤として導入することにより,安全安心科学の学理構築と技術システムの社会実装への方法論を創出することを目的として調査研究を実施した。本研究では,レギュラトリ科学,政策科学に基づく新たな安全安心科学を創出するための検証として,これまでの原子力施設,エネルギー貯槽,石油化学プラント等,巨大技術システムの建設,運転,維持管理におけるリスク概念導入,リスクベースアプローチの実績とその後の成果について,各種の調査およびヒヤリング等を実施し,その限界について考察を行った。さらに,普及が進む新技術として燃料電池自動車用水素ステーションを例に,リスクアセスメントの結果を基に新技術と既存法規制の関係について考察するとともに社会受容性に関する検討を行い,また,セキュリティリスクに関する検討を行った。その結果,各種の技術システムにおけるリスクベース工学の利活用における留意点と法規制との比較検討レギュラトリ科学と政策科学について検討し,その成果を3回の公開セミナー,シンポジウムにて発表して,関係者,聴講者とともに討論を展開した。
表面進行波を利用した極微細線加工法に関する基礎的研究

1.進行波励振法の確立引抜きダイス上での進行波伝播は以下にようにして行った。高周波電力で圧電振動子を機械振動し、それをホーンで増幅し、ダイス前面を励振する。ダイス内を前面から後面へ伝播した振動を継続的に後面へ進行させるためには後面に励振と同様の組合わせであるホーン、圧電振動子を接続し、振動子で機械振動を電気エネルギに変換、このエネルギを電気回路中の抵抗器で消散させる。誘電体でもある振動子の静電容量を補償するため、L=7.25mHのインダクタンスを接続し、抵抗値は機械的と電気的インピーダンスマッチングを考慮し、R=2.157Ωとする。2.引抜き装置表面進行波を利用した引抜き装置の主要部は、大きく、ダイス部、ドローベンチ部、発振部、コンピュータコントロールおよび記録部に分かれる。引抜き力はチャック部に取り付けられた板ばね形式のロードセルの変形をそこに貼られたひずみゲージで取り出し、引抜き行程はモータの回転量をタコメータで検出し、電気信号としてXーYレコーグに記録した。3.7/3黄銅の焼なまし材を素線とし、ダイス角0.5°、断面減少率12%、超音波公称共振周波数20KHzで、工程を通常、順および逆方向進行波付加と変更、また、引抜き速度を変化させて実験を行い、以下が判明した。(1)順方向進行波付加が引抜きにとって有効であることは引抜き応力の減少で顕著である。(2)順方向進行波付加で引抜き応力は加工を進めても一定となる。(3)引抜き速度を増せば、引抜き応力を減少させる。4.上界法による引抜き応力の算出動的可容速度場として(i)球面速度場、(ii)塑性流は求心流、(iii)速度不連続は剛塑性境界のみ、(iv)表面進行波による工具の動きはUu、の仮定の下に求めた引抜き応力により表面進行波の効果を予測できた。1.表面進行波励振に関する基礎試験(1)発振回路の製作:出力パワーが加工用に充分であるために,共振周波数0.1Hz1MHz,許容電圧450Vの発振回路を,ファンクションジェネレータ(岩崎通信製),ドライブ回路,パワーMOSFETモジュール(三菱15TF-19),トランスによって製作し,所期の性能が発揮されたことを確認した.(2)表面進行波励振:発振及び吸振にボルト締めランジュバン型超音波振動子(日本特殊陶業製, DA2350),ネーバル黄銅製ホーンを用い,セラミック工具(日本ガイシ製, Si_3N_4)面上に表面進行波を励振させる実験を行い,その特性を把握した.2.超音波振動子の設計製作振動子はボルト締めランジュバン型超音波振動子(D4520,日本特殊陶業製)とし,加工出力を上げるために段付複合エキスポネンシャル型ホーン(ネーバル黄銅製,先端はφ15mmで円錘特殊形状を有し,基部径φ50mmで,厚さ2mm, φ64mmのフランジ付き)を接続した.また,振動子,ホーンとも引抜き線材を通すためφ3mmの貫通穴を設けた.3.引抜装置の設計製作ダイスはセラミック・Si_3N_4製とし,幾何学主要寸法はダイス角3゚,最小穴径φ1mm,ベアリング部長さ約3mm,逃げ部長さ8mmとした.

引抜き駆動をDCサーボモータ(三洋製CN3000-10)で行い,微小引抜力測定を自作の高感度力計をチャックの先端に取り付けて行った.4.コンピュータ制御システムの開発加工中に引抜速度,超音波周波数を可変な制御システムを開発,また,引抜力等の測定量もコンピュータに取り込むようにした.1.進行波伝達系昨年度の予備研究に引き続き、当初は、進行波の波長等を考慮し、振動子をピエゾ圧電素子、ホーンをベリリウム銅、ダイスを室化珪素で進行波伝達系を製作したが、接合面の精度等で満足な結果が得られなく、結局、ホーンをジュラルミン、ダイスをSKD11に変更して製作した。2.進行波励振法の確立進行波を伝播させるために励振側、吸振側ともに同一組合わせのピエゾ圧電振動子、ホーンを用意し、励振側では高周波電力を振動子で機械振動に、吸振側では機械振動を高周波に変換、最終的に変換された電気エネルギを抵抗器で消散させた。電気回路中には振動子の静電容量を補償するため、L=7.25mHのインダクタンスを接続し、抵抗値はインピーダンスマッチングを考慮し、R=2,157Ωとする。3.引抜き装置引抜き装置主要部は、ダイス部、ドローベンチ部、発振部、コンピュータ制御部、記録部から成る。引抜き力はチャッ部のロードセル、行程は駆動モータの回転量で測定した。4.素線:7/3黄銅の焼鈍材、ダイス角:0.5°、断面減少率:12%、超音波共振周波数:20KHzで、通常引抜き、進行波付加引抜きを速度を変えて試験し、以下の結果を得た。(1)進行波付加によって引抜き応力は工程を通じて一定、低値となった。(2)引抜き速度増加で、引抜き応力は減少した。4.上界法による引抜き応力の産出動的可容速度場として(i)球面速度場、(ii)塑性流は求心流、(iii)速度不連続は剛塑性境のみ、(iv)表面進行波による工具の動きはUu、の仮定の下に求められた引抜き応力により表面進行波の効果を予測できた。
実験室における天然変性タンパク質のＸ線１分子動態計測装置開発

X線1分子追跡法Diffracted Xray Tracking DXTは、目的のタンパク質をナノ結晶で標識し、ナノ結晶からのX線回折スポットの角度変化を観測することでマイクロ秒の高時間分解能、ナノメートルの高空間分解能で1分子の内部運動を捉えることができる。この先端的オリジナル計測法を、このDXTを単色X線を用いた回折強度の自己相関や強度揺らぎを測定することで回折スポットの運動速度を評価できることを実験室X線光源の利用において確認した。この単色X線を使用した回折1分子計測法では、回折X線強度の明確な点滅(X線ブリンキング)を発見した。初年度研究目標は(1)X線光源集光法の最適化(2)溶液粘性制御と分子内動態の定量的相関データの構築(3)1分子動態計測の自動化と汎用的解析ソフト整備でした。(1)においては、研究室に昨年度末に設置した実験室レベルX線光源としては比較的高輝度なRigaku FR-Dを用いて実験を行った。本光源は2つのX線ポートがあるので、1つは単色化した実験を行い、もう1つは準白色化したX線光源で実験を行った。X線検出器としては世界で一番高感度と言われているピラタス検出器を用いた。準白色X線実験では、大型放射光施設SPring-8においてX線1分子追跡法(Diffracted X-ray Tracking; DXT)で用いている良質な金ナノ結晶で、かつ大きめの直径100nmにおいて計測したが、最終的に時分割的なデータが取れそうなラウエ回折斑点を得ることが出来なかった。これはX線の集光システムに問題があるが、これを直接的に改善するには大きな投資が必要となるので、まずは実験室レベルのラウエ実験はペンデングとした。一方、単色X線の実験では、50kV,60mAと最大強度利用ではあったが、1秒レベルの積算で金の回折リングが2本検出することができた。これは予想以上に単色化することで、検出器系のS/Nが改善されて高感度検出が実現したことになる。通常、DXTは準白色によってX線回折斑点を追跡しているが、これを単色にしても実験が可能な手法の考案がすでに完成しているので、その実践を本格的に行うこととした。(2)は放射光を用いた基本的なデータを取得した。(3)においては、現状のRiguku光源装置で利用しているCtystalClearというソフトでは実現できない角度スキャンが多々あるので、新しいソフトを自作することにして現在完成されようとしている。実験室のX線光源を用いた実験において秒レベルのナノ結晶の回折リングの検出に成功した。これは実験室X線1分子計測の大きな第一歩である。本研究開発装置の基本原理であるX線1分子追跡法Diffracted X-ray Tracking(DXT)を世界で初めて実験室レベルのX線を用いて可能であることを実験で確認することに成功した。これは通常DXTで用いていた白色X線を単色化して実験を行い、非常にS/Nの良い状態で1分子動態情報を獲得する新しい計測手法の実用化に成功したことになる。このDXTの単色化は他にも非常に有効な成果と言える。放射光利用においても、ナノ秒レベルの高速測定の実現を確実なものにし、標識するナノ結晶も目標直径20nmよりも小さい標識サイズにできる可能性が出てきた。これは1997年に私がDXTを考案して以来の大きな変革を実現したことになる。特に、放射光を用いたタンパク質分子のダメージに関しても、白色光から単色光への利用は、大きなブレイクスルーとなるだろう。また、今まで、X線を用いた1時間程度の長い時時間帯の構造変化をモニターする手段が全くなかったが、この単色DXTによって、その可能性が出てきた。白色光利用を単色化しただけではあるが、使える装置が多様化できたし、ダメージに関しても楽観的になることもできた。今後は、タンパク質相互作用等のスクリーニング装置として、多くのアプリケーションが広がることを期待できる。勿論、本申請のタウに関してもその動態特性がこの単色DXTで測定できることも確認された。また、この実験で物理現象の基本であるポアソン分布への再考も検討できることが分かった。X線計測では強度分布と積算時間の関係はポアソン分布で明確に定義される。強度の標準偏差を狭くしたければ、積算時間を長くすればよい。しかし、X線光源がある時間軸で空間的に運動していたら、その関係は成立しないことを定量的に示すことにも成功したのだ。実験室X線光源を用いたX線1分子計測に成功した。特許も申請完了。現在、論文を執筆中。海外共同研究も進展中。周辺の反響もあり、ラボX線光源をもう一台入手することもできた。研究を加速できそうである。タンパク質1分子の観察は驚異的な発展を遂げており、生体内における分子ダイナミクスを高速・高精度性に観察することが可能となってきた。量子プローブ唯一の1分子動態情報を取得できるX線1分子追跡法(Diffracted X-ray Tracking; DXT)は、佐々木らによって1998年に考案され、今日まで困難と言われてきた巨大分子に対しても分子動態を明確化してきた。DXTは目的のタンパク質をナノ結晶で標識し、ナノ結晶からのX線回折スポット(ラウエ法)の角度変化を観測し、マイクロ秒の高時間分解能でかつナノメートルの高空間分解能でタンパク質1分子の内部運動計測を実現した。

分子動態計測は色々な系で実現しており、DNAや膜タンパク質分子(bR, KcsA, nAChR,α7AChR, AChBP, GLIC)の分子内部運動の1分子計測に成功してきた。しかし、現在までDXT法はそれほど普及していない。普及しない1つの理由に、白色X線を用いた計測であることが挙げられる。通常の放射光施設は9割以上のユーザーが単色X線を利用するので、近年では、ビームライン設計段階で白色X線の利用は検討されることは少なくなってきた(最近は徐々に白色X線が見直されてきた)。そこで我々は、DXTを改良して多くのユーザーに使われることを目的に、単色X線を用いた回折強度の自己相関を測定することで回折スポットの運動特性評価の可能性を提案し、実験的に確認することに成功した。この単色X線を使用した回折1分子計測法では、得られる回折スポットのすべての動きを追跡することはできないが、回折X線強度の明確な点滅(Blinking X-ray: X線ブリンキング)を検出することができる。我々は、このX線ブリンキングから生体内の局所的な環境に依存した単一分子動態を評価した。X線1分子追跡法Diffracted Xray Tracking DXTは、目的のタンパク質をナノ結晶で標識し、ナノ結晶からのX線回折スポットの角度変化を観測することでマイクロ秒の高時間分解能、ナノメートルの高空間分解能で1分子の内部運動を捉えることができる。この先端的オリジナル計測法を、このDXTを単色X線を用いた回折強度の自己相関や強度揺らぎを測定することで回折スポットの運動速度を評価できることを実験室X線光源の利用において確認した。この単色X線を使用した回折1分子計測法では、回折X線強度の明確な点滅(X線ブリンキング)を発見した。現状のRiguku光源装置で利用しているCtystalClearというソフトでは実現できない角度スキャンが多々あるので、新しいソフトを自作することにした。実験室レベルでの光源利用によるX線1分子追跡法が実現できる基本的な技術が揃いつつある。また、この単色X線を用いた実験を、逆に放射光利用で行うならば、より小さいナノ結晶における実験が可能になるかもしれない。実験を急ぎたい。論文を仕上げて、より汎用的な方法論へと完成度を上げる。タウに関しても基本データが測定できたので、論文化を急ぐ。29年度が最終年度であるため、記入しない。X線1分子計測29年度が最終年度であるため、記入しない。
場を介して相互作用する自己駆動粒子の集団運動

本研究は、水面を自発的に滑走する樟脳船の集団に現れる秩序構造の発見と解析を目的として行った。樟脳船を円形の擬一次元水路に多数浮かべると時空間的な周期構造を示す。この機構を数理的に詳しく解析するために、樟脳船からの分子供給速度や昇華速度などの基礎データを測定した。この成果と数理モデルを元に、水面における樟脳船が相互作用可能な距離を見積もることに成功した。新たな秩序構造発見のために、2次元水面に樟脳粒を多数浮かべ、その集団運動を観察した。その結果、数密度がある一定以上に増えると停止と運動を非周期的に繰り返す間欠運動が現れることを発見した。一定数以上になると樟脳粒は動かなくなることは既に知られていたが、間欠運動の発現は新たな集団運動の発見である。この機構を数理的に詳しく解析するために、樟脳船からの分子供給速度や昇華速度などの基礎データを測定すること、そして新たな集団運動の発見のために2次元水面における樟脳粒の集団の観察を行った。初年度は表面張力計を導入し、樟脳船の周囲における表面張力の空間勾配を計測するとともに、可視化粒子を用いて2体の樟脳船の周囲における対流構造の観察を行った。この結果、表面張力および対流の2つの視点から2体の樟脳船の間にはたらく相互作用を明らかにした。表面張力の空間的な分布については、樟脳船周囲における樟脳分子のふるまいに立脚した数理モデルの解析を行い、そこから得られた結果を踏まえることで、より正確な相互作用の導出を行った。また、複数の樟脳船が塊で運動するクラスター状態の出現が、樟脳船単体の速度および相互作用範囲に依存する事を示唆する結果を得た。さらに、2次元系における樟脳船の集団運動の観察も行い、数密度がある一定以上に増えると停止と運動を周期的に繰り返す間欠運動が現れることを発見した。一定数以上になると樟脳船は動かなくなることは既に知られていたが、間欠運動の発現は新たな集団運動の発見である。最終年度にこの発見を詳しく調べた。具体的には、ゲルシステムを用いて樟脳濃度をコントロールし、加えて水相をに工夫を加えて樟脳粒の数が増えても水相の樟脳濃度の増加を抑えることに成功した。この新たなシステムを用いて系統的に観察を進め、樟脳粒の間欠運動が粒周縁長の長さに依存していること、数が多いときには間欠運動が同期することを明らかにした。本研究は集団運動を系統的に研究することが可能な無生物系のシステムの構築を目指して行われている。対象としたのは、水面を自発的に滑走する、樟脳船と呼ばれるシステムの集団運動である。この樟脳船は、円形の擬一次元水路に多数浮かべると、時空間的な周期構造を示すことをすでに我々は報告している。本研究においては、このシステムを拡張し、(1)2体の樟脳船間の相互作用機構の解明、(2)単体の運動特性と集団運動の関係性の解明、(3)2次元場における樟脳船の集団運動の、主に3つの目的に分けて計画を立ててきた。当該年度は(1)および(2)の一部を行うよう計画されていた。当該年度は表面張力計を導入し、樟脳船の周囲における表面張力の空間勾配を計測するとともに、可視化粒子を用いて2体の樟脳船の周囲における対流構造の観察を行った。この研究成果は、当該年度の3月に行われた日本化学会92春季年会にて発表した。

加えて、ゲルシステムを用いて樟脳濃度をコントロールすることで、樟脳船同士の間欠運動が同期する現象も観察した。この新たな現象については、発表に向けて論文執筆中である。当初の計画では、(1)2体の樟脳船間の相互作用機構の解明および(2)単体の樟脳船の運動特性と集団運動の関係までが初年度に行うべきところであった。(1)については年度の前半に実験結果を得ることができ、成果をまとめて学会発表を行うことができた。(2)についても年度の中ごろから成果を出し始め、本研究成果から発展した共同研究においても2報の論文執筆に至った(次年度の4,5月にアクセプト)。さらには上記の2点に加えて、当初の計画では2年目に行う予定であった(3)2次元系における樟脳船の集団運動の観察まで行い、有意な結果を得ることができた。すなわち、2次元水面に樟脳船を多数浮かべると、ある数密度以上において樟脳船の間欠運動が見られること、さらに個々の樟脳船の間欠周期の位相が揃う、同期現象が確認されることを発見した。この様に当初の計画が順調に進んだことで、さらに実験系を拡張することが可能となった。加えて、当初計画していた実験を拡張し、樟脳船単体が実際に出力している力の直接測定や、界面活性剤水溶液表面における単体樟脳船の運動特性に関する観測などを行い、研究をより発展的なものにした。以上の成果から、本研究は当初の計画以上に進展していると判断した。初年度に当初の計画以上に順調に実験結果を出すことができた。今年度は、これらの研究結果をさらに発展させるとともに、成果を論文にまとめ、期間内に順次出版していくことを主に進めていく。また、今回の結果を礎として、数理科学的な研究へと発展できるよう進めていく。研究の発展としては、単体の運動特性と集団運動の関係に関する実験および2次元系における樟脳船の集団運動に関して、明確な相図を書き、定量的なデータを揃える。これらの実験を夏までに行い、秋以降に論文としてまとめる。今年度の研究成果の出版に関しては、樟脳船間の相互作用についての研究と船の力学測定の結果を一つの論文にまとめることを進める。さらに単体の運動特性を制御することで、「クラスターモード」という新たな集団運動が発見された結果についても論文執筆を進めている。これらの成果を、秋をめどにして執筆を進めていく。次年度は、アメリカで行われる国際会議に出席するための渡航費、学会参加費等に40万円を計上する。この学会では、自律運動系のセッションが組まれており、本研究に関わる重要な講演が多く予定されているので、そこで情報収集を行うとともに議論を重ねる。加えて、研究議論を目的として国内出張費15万円を計上する。本研究に関わりの深い研究が広島大学の研究グループおよび北海道大学の研究グループで進められているので、各々の大学に赴き、情報交換および研究議論を重ねることで、本研究の推進に役立てる。また、論文執筆を計画しているので、その校閲料として5万円を計上する。その他、実験で使用する薬品や実験器具類、結果を記録するメディア類など、消耗品に合わせて30万円を計上する。
緑茶成分と他の植物ポリフェノール類の体内挙動と胃がん予防に関する研究

ニトロソアミン(NA)は変異・発がん物質として知られ、ヒト胃内の酸性条件下で、亜硝酸塩と第二級アミンとの反応により容易に生成する。NAは胃がんや肝がんなどの発生に深く関与することが示唆されており、NA生成を抑制することは発がん予防の観点から極めて重要である。本研究では生体内におけるがん発生に関与すると思われるNAの生成を抑制するにはどの程度の濃さの緑茶を量的にどの位飲用したらよいかを明らかにすることを目的として、モルホリンのニトロソ化反応をモデル系に用いて検討した。さらに全国13都道府県14地域で実際に飲用されている緑茶浸出液のカテキン濃度を測定し、各地域におけるがん及び糖尿病標準化死亡比(SMR)との相関を調べた。緑茶を通常飲む濃度(茶葉5gに対し熱水200ml)で煎じ、1煎目から8煎目までの浸出液を得た。浸出液に亜硝酸ナトリウムを加えてpH3.0に調整し、モルホリンを加えて反応させ、生成したニトロソモルホリン量をHPLCで定量した。1、2煎目の浸出液はNAの生成を有意に抑制したが、3煎目以降の浸出液では逆にNAの生成を促進した。さらに、乾燥葉の量を変えて(05g)煎じた浸出液のNA生成能を検討したところ、5gの乾燥葉では抑制していたが、5g以下の少量の茶葉では促進した。また、13都道府県14地域の一般家庭で日常的に飲用されている緑茶浸出液について、湯呑み茶碗一杯分(100ml)の浸出液中のカテキン量を測定し、がん及びSMRとの相関を調べたところ、男性では胃、食道、結腸、肝臓、肺がんのSMRと、女性では糖尿病SMRとの間に有意な相関を確認できた。以上の結果より、ヒトの発がん抑制には実際に飲用している緑茶浸出液の濃度、特にカテキン濃度が深く関わっていることが明らかなった。日常的に緑茶を飲用する方法で、得た緑茶抽出液(抽出温度:80°C,70°C,37°C,18煎目)を試料とし、HPLC法により、主要な4種のカテキンの含量を測定した。また、緑茶抽出物の抗酸化活性、ラジカル捕捉活性、抗変異原性を検討した。その結果、(1)使用する熱水の温度は7080°Cにすること、(2)茶葉は23煎で取り替えることが望ましいことが明らかになった。また、13都道府県14地域の一般家庭で日常的に飲用されている緑茶浸出液をサンプリングし、湯呑み茶碗一杯分(100ml)の浸出液中のタンニン量、カテキン量を測定した。これらの濃度と試料採取地域の胃がん標準死亡比(SMR)との相関を調べたところ、緑茶浸出液のカテキンの含量はタンニンのほぼ半量であり,緑茶生産地域の緑茶中のタンニン量やカテキン量は非生産地域のそれらと比べて多いことを確認した。緑茶浸出液中のタンニン量やカテキン量と胃がんSMRとの相関関係を有意水準0.05にて検定した結果,勇性のSMRはタンニン量及びカテキン量との間に有意な相関を示した。また,女性のSMRはタンニン量とのみ有意な相関を示した。以上の結果から,我々が日常的に飲用している緑茶には抗酸化性,抗変異原性等の生物活性を期待できること,また,そのカテキン濃度が胃がんの予防に関与していることなどが示唆された。サンプリング実験については今後、精度を上げるために,調査地点と各調査地点毎のサンプル数を増やし,さらに調査時期を変えて複数回調査し,一日当たりの緑茶摂取量と疾病との関連について把握するアンケートなどを行う必要があると考えている。

以上の結果より、ヒトの発がん抑制には実際に飲用している緑茶浸出液の濃度、特にカテキン濃度が深く関わっていることが明らかなった。
組み換えバキュロウイルスを用いた腎症候性出血熱ワクチンの開発に関する研究

1.エンベロープ蛋白上の中和抗体の誘導に関与する抗原は同時に感染増強抗体をも誘導することが単クローン性抗体を用いた研究によって明らかになった。さらに、感染の中和と増強は、作用する抗体の濃度に依存し、高濃度では感染を中和し、低濃度では感染を増強した。すなわち、ある特定のエピトープのみを含む抗原をワクチンとして用いても、感染中和抗体のみを誘導することは困難であると判断される。2.高い病原性をもつウイルスの構成蛋白をより安全かつ効率的に精製することを目的に、バキュロウイルスを発現ベクターとして組み換えエンベロープ蛋白の調製を試みた。発現蛋白の抗原性は単クローン性抗体の結合能で判定する限り、本来のウイルスのものと区別することは出来なかった。しかし、中和抗体の誘導能は極めて低く、機能的な抗体の誘導には問題があることが明らかになった。3.以上のような限界の存在下では、組み換え蛋白とアジュバントの組合せによって高レベルの中和抗体を持続させる試みが今後必要であると考えている。また、組み換えEnv.蛋白や組み換え核蛋白で免疫された脾臓細胞の移入によっても感染からの回復に有効であることがマウスを用いた実験感染で明らかになった。このため、細胞性の免疫の誘導も考慮したワクチンの開発が今後期待される。4.本疾患の発症メカニズムとして感染個体の免疫応答の可能性が示唆されているものの未だ不明な点が多く残されている。今後、ヒトと類似した症状を発現する動物モデルの開発を通して本症の発病病理を明らかにすることが効果的な予防・治療法の開発にとって不可欠である。1.HFRSウイルスエンベロ-プ蛋白上の中和と感染増強に関与する抗原決定基の解析HFRSウイルスハンタン株のエンベロ-プ蛋白上の10の抗原領域に対する23クロ-ンの単クロ-ン性抗体を用いてそれぞれの中和活性と感染増強活性を測定した。その結果、本蛋白を構成するG1とG2蛋白のいずれもがウイルスの中和に関与する抗原領域を保有していた。しかし、マクロファ-ジに対する感染の増強にはウイルスの中和に関与する抗体のみならず非中和性の赤血球凝集抑制抗体のいずれもが関与していることが明らかになった。2.単クロ-ン性抗体で受身免疫されたマウスへの攻撃接種実験上記in vitroでの試験で中和活性を示した単クロ-ン性抗体は全て攻撃接種されたマウスを致死的感染から防御し、本蛋白の感染防御抗体の誘導能が確認された。しかし、非中和性の抗体を移入されたマウスでは攻撃接種から死亡までの日数がむしろ短縮し、抗体依存性の早期死亡現象が観察された。マクロファ-ジに対する抗体依存性感染増強と早期死亡現象との関連性について今後さらに検討する予定である。3.バキュロウイルスをベクタ-として発現された組換えエンベロ-プ蛋白の性状解析組換え本蛋白の抗原性状が本来のウイルス蛋白のものと極めて一致していることを種々の免疫血清や単クロ-ン性抗体を用いて検討し、明らかにした。発現蛋白の分子量や発現量を電気泳動法で確認したが、発現量が予想より少なく、今後、発現蛋白のラジオアイソト-プラベルによる更に詳細な解析を計画している。4.HFRSウイルスエンベロ-プ蛋白の各抗原決定基に対応する遺伝子領域の決定。大腸菌での発現を目的として、pUEX1ー3プラスミドへのサブクロ-ニングを継続している。1.組み換えバキュロウイルス発現HFRS

エンベロ-プ蛋白(組み換えEnv.蛋白)の免疫原性について組み換えEnv.蛋白で免疫されたマウスは,HFRSウイルス感染Vero細胞を抗原とした間接蛍光抗体法で1:1,280倍抗体を産生した.すなわち,組み換え蛋白の抗原性が本来のウイルス抗原と免疫学的にきわめて類似したものであることが明らかになった.しかし,中和活性は補体存在下で低力価(1:20倍)観察されるのみで,間接蛍光抗体価に比較して明らかに低力価であり,機能的な抗体の誘導には問題のある可能性が示唆された.2.組み換えEnv.蛋白のPAGE電気泳動による解析組み換えEnv.蛋白発現昆虫細胞を可溶化した後PAGE電気泳動し,クマシ-染色によって発現蛋白を解析した.しかし,10^5個相当の細胞を泳動したにもかかわらず,組み換えEnv.蛋白特異的なバンドを検出することが出来ず,発現蛋白量は1μg/10^5cell以下が予想外に少ないことが判明した.3.組み換えEnv.蛋白の防御免疫活性の解析組み換えEnv.蛋白に対する免疫血清および免疫リンパ球を哺乳マウスに移入後,ウイルスの攻撃接種実験を行った.その結果,いずれもマウスを死亡から防御する効果があり,防御免疫活性を有することが明らかになった.4.カイコバキュロウイルスによる組み換えEnv.蛋白発現系確立の試み高発現量の組み換えEnv.蛋白を得るために,カイコバキュロウイルスを発現ベクタ-とした系の確立を進めている.これまでに,HFRSウイルスの核蛋白とEnv.蛋白とEnv.蛋白を発現する換えバキュロウイルスの確立に成功した.現在,カイコ虫体中での発現を試みている.1.高発現量の組み換えハンタウイルス構成蛋白を得るために,カイコバキュロウイルスを発現ベクターとした発現系の確立を試み,エンベロープ蛋白と核蛋白をコードするcDNAをそれぞれ別々にカイコバキュロウイルスのウイルスDNAに組み込むことに成功した.さらに,それぞれの組み換えウイルスが,in virtoの系で蛋白を発現し,それらがいずれも本来のウイルス蛋白と極めて一致した抗原性を保持していることを,単クローン性抗体の反応性から確認した.2.それらの組み換えウイルスをカイコ虫体に接種して体液(ヘモリンフ)中に組み換え蛋白の発現を確認した.さらに,そのヘモリンフからの組み換え蛋白(組み換え核蛋白)の可溶化が塩基性条件下での6M尿素処理によって可能であることが明らかになった.この可溶化物はカラムクロマトグラフィーによってさらに精製可能であり,今後の応用への可能性が拡大した.3.組み換え核蛋白に対する免疫血清および免疫リンパ球をウイルス感染哺乳マウスに受身投与したところ,いずれもマウスを死亡から部分的に防御する免疫活性を有することが明らかになった。抗組み換え核蛋白抗体にはウイルス中和活性がないことから,細胞依存性の防御免疫活性であることが示唆された.さらに,抗核蛋白抗体には抗体依存性の感染増強活性もないことから,ワクチンの構成成分としての可能性も考えられた.
L型Caチャネルの調節機構の複雑性

L型Caチャネルは、神経、筋組織等において、重要な役割を果たしているが、その調節機構については未解明の部分が多い。申請者らは、同チャネルの活性に細胞内蛋白因子とATPが関与することを発見し、その蛋白因子の一つがカルパスタチンであることを見出したが、最近、更なる因子としてカルモジュリン(CaM)やCaM依存性蛋白キナーゼ(CaMKII)が浮上してきた。CaMはATP存在下でCaチャネルと結合して、チャネルを活性化可能状態にすると考えられる。本研究では、L型Caチャネルの調節に対し、カルパスタチン、CaM、CaMKIIなどがどのように関与するかについて検討した。(1)カルパスタチンの対チャネル活性化領域を、断片ペプチド法により検討し、ドメインLのアミノ酸番号54-64近傍の局在を示唆する結果を得た。(2)CaMのチャネル活性化作用について、Ca結合能を消失させた変異CaMを用いて検討し、apoCaMの状態で作用してチャネルを活性化することを示した。(3)Caチャネルの基礎活動において、CaMKIIが部分的に関与していることを示した。(4)CaチャネルのCa依存性促通と不活性化について検討し、CaMが両者に直接的に関与し、CaMKIIは修飾的に関与することを示唆する結果を得た。以上の成果より、Caチャネルの調節機構は、カルパスタチンやCaMの細胞内因子が関与する複雑なものであり、それをCaMKIIやAキナーゼなどの蛋白キナーゼが更に調節するという多層的なものであることが示唆される。L型Caチャネルは、神経、筋組織等において、細胞機能に重要な役割を果たしており、その調節機構を解明することは、細胞機能制御の観点において重要である。申請者らは、同チャネルのrundown現象が細胞内蛋白因子とATPの喪失に起因することを発見し、その蛋白因子の一つがカルパスタチンであることを見出したが、他の因子については不明のままである。最近、カルモジュリン(CaM)がrundownしたチャネルの活性を回復させることが示唆されたので、本年度の研究は、L型CaチャネルのrundownにCaMがどのように関連しているかについて重点的に実施された。モルモット単離心筋細胞において、パッチクランプ法(cell-attached mode)によりL型Caチャネル電流を記録した。その後、inside-out法によりチャネルをrundownさせた後、CaM等を投与しチャネル活性の回復を見た。その結果、CaM(0.03-3μM)は3mM ATP存在下でCaチャネルを用量依存性に活性化することが判明した。CaMの効果には、ATPの存在が必要であり、また、フリーCa濃度が0.5μM以上になると効果が見られなくなった。更に、この効果はCaMキナーゼII阻害剤(KN-62、CaMKII281-309、AIP:autocamtide related CaMKII inhibitor peptide)には影響を受けなかった。以上のことより、CaMはL型Caチャネルとダイナミックに結合し、CaMはATPとともにチャネルの活性に必要であると考えられた。従って、CaMのチャネルからの解離は、チャネルを不活性状態(即ちrundown)にすると推察される。本年度は、L型CaチャネルのCaMによる活性化にCaMKIIやAキナーゼ(PKA)がどのように関与するかについて検討した。その後、inside-out法によりチャネルをrundownさせた後、CaMKIIやPKAを投与しチャネル活性の回復を見た。

その結果、CaMKIIによるチャネルリン酸化は、それ自体ではチャネルの最大活性化を起こさないがCaMによるチャネル活性化を増強あるいは維持するという結果が得られた。一方、PKAにも同様の効果が認められたが、CaMKIIより効果が弱く、一定時間のrun-down後に作用させたPKAの効果は更に弱かった。以上の結果から、L型CaチャネルのCaMによる活性化には、CaMKIIやPKAによるチャネルリン酸化が関与していると推察された。
中学校英語授業での代替評価の効果

本研究の目的は英語授業で6か月間にわたり代替(形成的)評価を授業活動で使用したクラス(実験群)と使用しなかったクラス(統制群)の学習での成果を比較し、評価活動の影響を調査するものである。リスニングでは統計的には授業内評価活動の影響は見られなかった。事後テストでは実験・統制群の違いに関わらず、統計的に有意な伸びがみられた。自己評価でも、実験・統制群の違いは事後ではみられなかった。スピーキングに関しては現在分析中である。22年度はパイロット研究、およびスピーキング、リスニングテストの信頼性、妥当性の検討を行った。後学期の10月から2月まで、ある市立中学校三年生6クラスがランダムに二つのグループにわけられ、実験群は相互評価を含んだスピーキングの言語活動を計五回、統制群は同様のスピーキング活動を行ったが評価活動は行わなかった。いずれも活動は通常授業の中で行われ、内容は教科書の内容、あるいは教科書の発展的な活動であった。活動は四人組にまずなり、スピーキング練習をペアでしてから発表するペア、観察するペアを交代しながら四度ほど行い、観察をする二名が評価表を用いて評価をしてフィードバックを返すというものであった。テストはスピーキング、リスニングの事前テスト、事後テストおよび自己評価を行ったが、リスニング事前テスト以外の結果は現在分析中である。さまざまな事情でスピーキングテストは事前、事後に同じものを使用しており、別のバージョンに関してはパイロットを行なうことができなかった。これに関しては23年度の本実験で使用するかどうか検討する必要がある。リスニングの事前テストは今回が四度目の実施であった。それ以前の三回の実施を通して問題の改善、選定、削除などが行われていた。四回目の結果は三回目の結果と一緒に分析を行い、結果としてはこれまでで最も高い信頼性があるバージョンとなった。また、三回目のバージョンを受けた学校の生徒が全体として、四回目の学校の生徒より全体に高い能力があることもわかった。このバージョンは23年度行う予定の本実験の事前事後テストとして使用するのにあたり、結果は良好であり実験自体にとって非常に望ましいものとなった。本研究の目的は英語授業で一年間にわたり代替(形成的)評価を授業活動で使用したクラス(実験群)と使用しなかったクラス(統制群)の学習での成果を比較し、評価活動の影響を調査するものである。つまり代替評価を使用した実験群は、リスニング、スピーキング、成績の点数において、代替評価を用いない統制群より顕著な学習の伸びがみられるかどうかを調査した。本年度は本実験を行った。ある中学校三年生四クラスおよそ116名が参加し、四クラスのうちランダムに二クラスを統制群、二クラスを実験群とした。6月にリスニング、スピーキングテスト、総括的自己評価の事前テストを両グループで行い2月から3月に事後テストを行った。実験群では授業内で7月から2月までをピア評価と振り返り(自己評価)の活動を週に一度スピーキング活動の際に使用し計八回行われた。ピア評価はスピーキングの活動を四人グループで行い、二名がペア活動を行っている際に残りの二名が評価表を用いて観察評価を行い、活動者にフィードバックを返すことをおこなった。また、この活動の際、もらったフィードバックを見て自分でコメントをする振り返りも行った。統制群では上記のいずれの代替評価活動も用いず、その時間分の練習の回数が数回増えた。統制群は活動は四人組で行われず、ペアのみで行い観察はなかった。スピーキングテストの評価は現在評価者が分析中である。その他のデータも全て現在のところ分析中であり、現在のところ結果はでていない。また実際のピア評価自体のコメントデータも全て入力を行い、テキスト分析を行い、どのようなコメントがされているかも調査する予定である。本研究の目的は英語授業で一年間、形成的評価を授業活動で遂行したクラス(実験群)としなかったクラス(統制群)の学習での成果を比較し、評価活動の影響を調査するものである。つまり代替評価を使用した実験群は、リスニング、スピーキング、自己評価の点数において、代替評価を用いない統制群より顕著な学習の伸びがみられるかどうかを調査した。本年度はデータの分析を行った。しかしながら、上位中位下位と三群にそれぞれを分けると、中位下位群は実験・統制両方で伸びがみられたが、上位群に関しては統制群が下がる傾向が見られた。また統計的に有意な伸びもみられなかったが、上位中位下位の三群にわけると、実験群では上位・中位に上昇傾向が見られたが、実験群にはそれがなかった。しかし、いずれも実験群への効果はこの二つの指標ではみられなかった。

生徒の相互コメントの一部もコメントの「機能」と「内容」の二通りのコーディングを行い、前期・中期・後期に分けて頻度を分析したところ次のようなことがわかった。コメント機能では期間にかかわらず、「誉め」が圧倒的に多い。また後期に「アドバイス」が少し上昇する。コメント内容の面では「話の内容」「流暢さ」「アイコンタクト」などが期間に関わらず多い。これらのカテゴリは全て生徒たちが使用した相互評価表にあるカテゴリだが、後期になると「質問をする・答える」「話をつなぐ」などの評価表にないカテゴリが上昇する傾向が見られた。また、別の到達度テストスコアとはコメントの「内容」は相関がないことがわかった。つまり、到達度に関わらず、多様なコメントを受けているということになる。欠席者の問題や、スピーキングテストのパイロットの不十分さがあったが、予定通りデータは採取できているので。24年度が最終年度であるため、記入しない。全てのデータの入力をして、分析を行う。実際の生徒のフィードバックはテキストデータなので質的な分析を行い、テストによるデータは統計処理を行う。スピーキングテストはパイロットが不十分であるので、さらなるパイロットデータを6月に採取する予定である。
mRNAの安定性によるメチオニン生合成制御の分子機構-シロイヌナズナmto1変異株を用いた解析-

シロイヌナズナのシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)遺伝子は563アミノ酸のORFを持ち,この内の183アミノ酸が第1エキソンによってコードされている.高等植物のCGSのアミノ酸配列を比較すると,第2エキソン以下のアミノ酸配列の相同性が高いのに対して,第1エキソンの部分は長さも異なり,相同性は低い.しかしながら,mto1変異部位を含む35アミノ酸の領域(「MTO1領域」と呼ぶ)は極めて良く保存されており,この領域が制御を担っていると期待される.第1エキソン部分について,N-末端側からと,C-末端側からの欠失変異を作製し,読み枠を合わせてβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子につなぎ,CaMV35Sプロモーターの制御下においた.得られたDNAを野生型のシロイヌナズナカルスから調製したプロトプラストに電気穿孔法で遺伝子導入し,一過的発現でのレポーター活性をメチオニン添加の有無で比較した.その結果,MTO1領域を持っている場合にはメチオニン添加に応答してGUS活性の低下がみられたが,MTO1領域のN-末端側のみ,あるいはC-末端側のみを持つ場合にはメチオニン添加に対する応答は見られなかった.一方,MTO1領域を持っていても,mto1-1変異を導入したDNAの場合はメチオニン添加によるGUS活性の低下はみられなかった.このことは,MTO1領域がメチオニン添加に応答したCGS遺伝子発現制御のための必要十分な遺伝情報を持っていることを示している.さらに,MTO1領域を持つがそのN-末端,C-末端の両側に欠失を持つものについて同様の実験を行ったところ,mto1-1変異を持つ場合はメチオニン添加に応答しなかったが,野生型の場合はメチオニン添加に応答した.ただし,この場合は応答の程度がMTO1領域の両側を持つ場合に比べて弱くなっていた.従って,MTO1領域の両側の領域は,この制御の反応を助ける機能があるものと考えられる.おそらくはスペーサーとしての機能を持つものと考えられる.シロイヌナズナのシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)遺伝子は563アミノ酸のORFを持ち,この内の183アミノ酸が第1エキソンによってコードされている.高等植物のCGSのアミノ酸配列を比較すると,第2エキソン以下のアミノ酸配列の相同性が高いのに対して,第1エキソンの部分は長さも異なり,相同性は低い.しかしながら,mto1変異部位を含む35アミノ酸の領域(「MTO1領域」と呼ぶ)は極めて良く保存されており,この領域が制御を担っていると期待される.第1エキソン部分について,N-末端側からと,C-末端側からの欠失変異を作製し,読み枠を合わせてβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子につなぎ,CaMV35Sプロモーターの制御下においた.得られたDNAを野生型のシロイヌナズナカルスから調製したプロトプラストに電気穿孔法で遺伝子導入し,一過的発現でのレポーター活性をメチオニン添加の有無で比較した.その結果,MTO1領域を持っている場合にはメチオニン添加に応答してGUS活性の低下がみられたが,MTO1領域のN-末端側のみ,あるいはC-末端側のみを持つ場合にはメチオニン添加に対する応答は見られなかった.一方,MTO1領域を持っていても,mto1-1変異を導入したDNAの場合はメチオニン添加によるGUS活性の低下はみられなかった.このことは,MTO1領域がメチオニン添加に応答したCGS遺伝子発現制御のための必要十分な遺伝情報を持っていることを示している.さらに,MTO1領域を持つがそのN-末端,C-末端の両側に欠失を持つものについて同様の実験を行ったところ,mto1-1変異を持つ場合はメチオニン添加に応答しなかったが,野生型の場合はメチオニン添加に応答した.ただし,この場合は応答の程度がMTO1領域の両側を持つ場合に比べて弱くなっていた.従って,MTO1領域の両側の領域は,この制御の反応を助ける機能があるものと考えられる.おそらくはスペーサーとしての機能を持つものと考えられる.メチオニン生合成の鍵となる段階を触媒する酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は,mRNAの安定性の段階で負のフィードバック制御を受けており,この制御にはCGS自身の第1エキソンポリペプチドが関与している.野生型のシロイヌナズナではメチオニンを与えて栽培することによりCGSmRNAの蓄積を抑える機構が働くが,遊離メチオニンを過剰に蓄積するmto1変異株ではこの制御が欠損している.アクチノマイシンにより新たな転写を止め,CGSmRNAの安定性の解析を行った結果,野生型のCGSmRNAはメチオニン添加により急速に分解されるが,mto1変異を持つCGSmRNAはメチオニン添加に関係なく安定であることが示された.一過的発現系を用いた解析によりこの制御にはCGSの第1エキソンポリペプチドが関与していると考えられた.mto1変異が見られた全てのアミノ酸のコドンについて同義コドンに置き換えたサイレントな変異を作製し,一過的発現系を用いた解析をおこなった.その結果,サイレント変異はいずれも野生型の性質を示し,アミン酸配列が重要な機能を持つことが確認された.CGSの第1エキソンは183アミノ酸からなるが,3'側と5'側から第1エキソンのコード領域を順次欠失させて,一過的発現系を用いた機能解析を行った.その結果,第1エキソンの中央部がメチニオン添加に応答して遺伝子発現を制御する機能を持つと考えられた.

また,酵母のtwo-hybirdシステムを用いたスクリーニングを行い,CGSの第1エキソンポリペプチドと相互作用を持つと期待される候補株を4つ得た.シロイヌナズナのCGS遺伝子は563アミノ酸のORFを持ち,この内の183アミノ酸が第1エキソンによってコードされている.高等植物のCGSのアミノ酸配列を比較すると,第2エキソン以下のアミノ酸配列の相同性が高いのに対して,第1エキソンの部分は長さも異なり,相同性は低い.しかしながら,mto1変異部位を含む35アミノ酸の領域(「MTO1領域」と呼ぶ)は極めて良く保存されており,この領域が制御を担っていると期待される.第1エキソン部分について,N-末端側からと,C-末端側からの欠失変異を作製し,読み枠を合わせてβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子につなぎ,CaMV 35Sプロモーターの制御下においた.得られたDNAを野生型のシロイヌナズナカルスから調製したプロトプラストに電気穿孔法で遺伝子導入し,一過的発現でのレポーター活性をメチオニン添加の有無で比較した.その結果,MTO1領域を持っている場合にはメチオニン添加に応答してGUS活性の低下がみられたが,MTO1領域のN-末端側のみ,あるいはC-末端側のみを持つ場合にはメチオニン添加に対する応答は見られなかった.一方,MTO1領域を持っていても,mto1-1変異を導入したDNAの場合はメチオニン添加によるGUS活性の低下はみられなかった.このことは,MTO1領域がメチオニン添加に応答したCGS遺伝子発現制御のための必要十分な遺伝情報を持っていることを示している.さらに,MTO1領域を持つがそのN-末端,C-末端の両側に欠失を持つものについて同様の実験を行ったところ,mto1-1変異を持つ場合はメチオニン添加に応答しなかったが,野生型の場合はメチオニン添加に応答した.ただし,この場合は応答の程度がMTO1領域の両側を持つ場合に比べて弱くなっていた.従って,MTO1領域の両側の領域は,この制御の反応を助ける機能があるものと考えられる.おそらくはスペーサーとしての機能を持つものと考えられる.