hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコン新素材の理論的量子反応設計

本重点領域研究「知能の極限集積化」平成8年度の公募研究「シリコンデバイス新素材の反応設計の量子化学」の成果をふまえ、ウルトラクリーン化技術によって創製される新機能発現シリコンデバイス新素材の構造、物性、反応性を、量子化学に基づく理論化学的手法を用いて解明し、予測する研究を行った。特に、極限集積化LSI製造のキ-テクノロジーとなっているTiNやTi/Alヘテロ界面の化学結合の詳細ならびにCVDプロセスにおける反応性の解明に関する超高精度・超高信頼性量子化学abinitio計算を行い、その化学的改変及び界面形成の最適条件を見いだす研究を行った。具体的には、平成8年度に行った(1)p型ド-ピングを施したSi表面、Hで終端されたSi表面、Fで終端されたSi表面およびSiO_2表面上のSiH_4、Si_2H_6ガスの熱分解、(2)Alの選択的CVD、および(3)極薄SiO_2膜形成過程の量子化学的研究を深化発展させ、加えて(4)F原子やF分子とHで終端されたSi(111)表面、(5)バリアメタルとしてのTiNやTi/Alヘテロ界面の化学結合の詳細やエッチングプロセス、CVDプロセスにおける反応性の解明を系統的に行った。更に、化学反応性をより定量的に理解する新たな方法として、我々独自の化学反応の領域密度汎関数理論も援用するために、必要な計算プログラムの開発を行った。以上を要するに、平成9年度においては、新たな機能を有する材料設計のための界面量子化学とでも呼称すべき新しい学問の礎を築き、触媒反応設計、疑縮系反応設計、固体表面界面反応設計・物性制御に向けての理論的指針を具体的に与えることを目標とした研究の重要なワンステップを更に上ることが出来た。
培養ヒト気道上皮細胞を用いた漢方薬の抗ウイルス効果に関する研究

本研究では、培養ヒト気道上皮細胞を用いて、急性ウイルス性上気道炎に関わる漢方薬の抗ウイルス効果の有無とその作用機序を解明することを目的としている。昨年度はインフルエンザウイルスとライノウイルスを感染させ、漢方薬を実臨床における推定血中濃度で添加したところ感染後のウイルス放出量に有意な変化が得られなかった。今年度は添加する漢方薬の濃度をより大きくしたもので実験を行い、さらに実際のウイルスRNAを定量して確認し、昨年度とは別の漢方薬も用いるなど実験内容を再検討して実施した。方法:1)ヒト気管上皮細胞およびヒト鼻粘膜上皮の初代培養を行い、ライノウイルスやインフルエンザウイルスを感染させた後に漢方薬指標成分の実臨床における推定血中濃度に調整した漢方薬溶液を作用させ、ウイルス感染抑制作用を検討した。2)漢方薬によるウイルス放出抑制効果の容量依存性を検索するため、溶液濃度の希釈率を変えてウイルス放出量の変化を検討した。3)同様のウイルス感染実験におけるウイルスRNAを抽出しRT-PCRを施行して定量した。結果:気道上皮細胞にインフルエンザウイルスを感染させ漢方薬を作用させるとウイルス力価の抑制傾向を認めた。漢方薬の種類を変えて同様実験を行い、またウイルス力価抑制傾向の容量依存性を検討するため漢方薬濃度を変えた実験を施行してデータを集積している。またそれぞれの漢方薬を添加した場合のウイルスRNAも採取し、RT-PCRにてウイルスRNA定量のデータも蓄積中である。ライノウイルスに関しては実験に使用するために必要な力価をもつウイルスの培養に苦心し、実験が一時中断したため今年度は十分に検討できなかった。本年度は昨年度の実験を進めつつ、漢方薬の種類を追加してその抗ウイルス効果を検討した。途中ウイルス力価を測定するのに必要なMDCK細胞の状態が悪化して結果の信頼性が得られず、新規のMDCK細胞を培養して安定した測定結果が得られるようになるまでに時間を要した。そのため比較検討できるデータがまだ十分集積されていない。また実験に使用する高い力価を持ったライノウイルスの準備に苦心したため一時ウイルス実験が中断するなど予定外の遅延が生じた。種々の漢方薬におけるウイルス力価とウイルスRNA定量のデータを集積し比較検討する。今年度得られた結果と今後集積される結果を基に、さらに実験計画を見直して本実験系における漢方薬の抗ウイルス効果の有無とその機序を検討していく。さらに漢方薬のウイルス感染に対する抗炎症効果を検討するため、炎症性サイトカインの測定も順次施行していく予定である。研究目的:漢方薬は日本の伝統医学で、古来より急性感染症に多く使用されてきた。しかしヒトの体内での薬物動態や作用機序に関する研究はいまだ不十分である。近年の臨床研究において、急性ウイルス性上気道炎に対する漢方薬の有効性が報告され、また動物実験や癌細胞由来の培養細胞株を用いた研究は数多く行われているが、正常ヒト気道上皮細胞を用いた漢方薬に関する実験はほとんど行われていない。本研究の目的は、培養ヒト気道上皮細胞を用いて、急性ウイルス性上気道炎に関わる漢方薬の作用機序を解明することである。方法:1)漢方薬のウイルス放出抑制効果に関する検討:培養ヒト気道上皮細胞にライノウイルス(またはインフルエンザウイルス)を感染させ、それぞれの培養液の上清を採取しウイルス放出量の継時的変化を測定する。容量依存性を検索するため、漢方薬溶液濃度の希釈率を変えてウイルス放出量の変化を検討する。結果:1)ヒト気管上皮細胞またはヒト鼻ポリープ粘膜上皮細胞にライノウイルスを感染させ、漢方薬溶液を作用させてウイルス放出量を確認したが明らかな抑制効果は得られなかった。また培養上清中サイトカイン(IL6,IL8)を測定したが漢方薬の作用によりIL8が低下する傾向が認められた。2)ヒト気管上皮細胞またはヒト鼻ポリープ粘膜上皮細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、漢方薬溶液を添加してウイルス放出量の変化をみたが、明らかな抑制効果は得られなかった。培養上清中サイトカイン(IL6,IL8)の測定ではIL8で低下する傾向が認められた。3)漢方薬溶液の実験に用いた濃度においてヒト気道上皮細胞に細胞障害性のないことを確認した。本年度の研究計画のうち、培養ヒト気道上皮細胞にライノウイルス(またはインフルエンザウイルス)を感染させて漢方薬を作用させウイルス放出量の継時的変化をみること、漢方薬溶液濃度の希釈率を変えてウイルス放出量の変化を検討すること、上清中の炎症性サイトカイン(IL-6,IL-8)の測定までは達成できた。しかし、ウイルスRNA量の比較、ICAM-1のmRNAの発現量を検討、上清中の可溶性ICAM-1の濃度測定、酸性エンドソームの蛍光強度測定は施行できなかった。これは当初の予想より漢方薬の作用によるウイルス増殖抑制効果がはっきり現れなかったため、実験計画を修正して繰り返しウイルス感染実験を行っていたためである。

2)漢方薬によるウイルス放出抑制効果の容量依存性を検索するため、溶液濃度の希釈率を変えてウイルス放出量の変化を検討した。3)同様のウイルス感染実験におけるウイルスRNAを抽出しRT-PCRを施行して定量した。結果:気道上皮細胞にインフルエンザウイルスを感染させ漢方薬を作用させるとウイルス力価の抑制傾向を認めた。漢方薬の種類を変えて同様実験を行い、またウイルス力価抑制傾向の容量依存性を検討するため漢方薬濃度を変えた実験を施行してデータを集積している。またそれぞれの漢方薬を添加した場合のウイルスRNAも採取し、RT-PCRにてウイルスRNA定量のデータも蓄積中である。ライノウイルスに関しては実験に使用するために必要な力価をもつウイルスの培養に苦心し、実験が一時中断したため今年度は十分に検討できなかった。本年度は昨年度の実験を進めつつ、漢方薬の種類を追加してその抗ウイルス効果を検討した。途中ウイルス力価を測定するのに必要なMDCK細胞の状態が悪化して結果の信頼性が得られず、新規のMDCK細胞を培養して安定した測定結果が得られるようになるまでに時間を要した。そのため比較検討できるデータがまだ十分集積されていない。また実験に使用する高い力価を持ったライノウイルスの準備に苦心したため一時ウイルス実験が中断するなど予定外の遅延が生じた。漢方薬の濃度設定、使用する漢方薬の種類、作用させる方法など実験計画を改めて見直し漢方薬の抗ウイルス効果の有無を解明していく。また漢方薬の抗炎症効果を検討するため他の炎症性サイトカインの測定も進める。またウイルスRNA量の測定、炎症に関わる蛋白の活性化に対する影響も検討し、その他の研究計画内容も順次施行していく予定である。種々の漢方薬におけるウイルス力価とウイルスRNA定量のデータを集積し比較検討する。今年度得られた結果と今後集積される結果を基に、さらに実験計画を見直して本実験系における漢方薬の抗ウイルス効果の有無とその機序を検討していく。さらに漢方薬のウイルス感染に対する抗炎症効果を検討するため、炎症性サイトカインの測定も順次施行していく予定である。実験を進めていく課程で炎症に関わる蛋白質を測定する必要が生じたが、その試薬が高額のため本年度の残額では不足する可能性があった。よってその試薬の購入を次年度に延期することとした。その分他の実験用品の購入にあてる余裕が生じたため次年度使用額が生じたが、次年度の助成金と合わせて今後も実験用品に資金が必要である。また実験結果が出た場合その成果の発表・論文作成にも使用する予定である。当初次年度使用額は生じない予定であったが、事務手続き上の不備により残金に端数が生じたため。今後は次年度使用額と合わせて適切に使用する予定である。
ファジィ論的教材選択に基づく外国語学習用短文速訳練習システムの開発研究

英文暗記を基礎とする外国語スピーキング練習システムにおいて、一教材の学習課題の提示をファジィに扱うための提示論理を開発した。学習課題はランダムに選択することを基本とするが、教材内のすべての課題に共通する属性を持たせ学習者属性とのファジィ論理演算により、准ランダム選択を採ることもできる。これにより、学習者の興味ある課題が提示されやすいシステムを開発することができた。また学習の実際の備え、開発システムに時限式・同期式の音声録音機能を付加した。現実のスピーキング環境では、想起した事柄を速やかに英語で口述することが求められるが、この機能により、和文を見聞したあとただちに英語スピーキングする練習を行うのに役立てることができる。国際化の時代、外国語学習の必要性が社会的ニーズとなっている。特に、学生に関しては、英語スピーキングの機会が少ない。本研究では、情報通信技術を援用することにより、外国語スピーキングの練習を行うツールを開発する。今年度は、システム開発を行い、学習効果にかかわる検証実験を行った。学習システムは、所定の日本諸短文集合の中からほぼランダムに一つの短文を選択し、画面提示する。学習者は、それを英語に速訳することを試みる。その後、正解を提示して暗記に努める。この繰り返し学習を進めることにより、あらかじめ用意した外国語短文を全部暗記するようにする。事例として、国際学会発表会場内外で想定される会話を100ほど作成し、英訳回答を用意しまたナレーション録音を行い、データベースに登録した。学習効果に係る検証実のため、3名の生が被験者を務めた。いずれに対しても、30弱の短文を用いて、学習の事前・事後テストとともに、すべての短文暗記を行ってもらった。英語口述回答はすべて録音し、アメリカ人評価者に流暢さ等の観点で評価してもらった。その結果、流暢さに関しては、6ケースのうち、5ケースで統計的に有意な結果が得られた。以上により、本開発システムの実施により、学習効果が得られることが明らかになった。学習システムは、所定の日本語短文集合の中からほぼランダムに一つの短文を選択し、画面提示する。今年度は、暗記学習の学習効果を検証した。そこでは、暗記の対象とする課題群Xと同じく対象としない課題群Yを設定した。事前テストとして、XとYの全課題について、日本語文を提示しそれをただちに英文で口述すると言う内容であり、これを録音した。その後、課題群Xだけを暗記の対象とした。被験者が英文をほぼ全部暗記したと申告した段階で事前テストと同じ内容の事後テストを実施し、録音した。事前・事後テストのすべての録音をネイティブスピーカに聞いてもらい、fluencyの観点で5段階評価をしてもらった。その結果、課題群Xのみならず課題群Yに関しても、fluencyが向上していることが統計上明らかになった。以上の結果から、暗記学習によって、ある程度スピーキングの向上が認められることとなった。これまでに教材選択にファジィ理論を応用した外国語eーラーニングシステム開発を開発したが、今年度は、さらなる一貫性のあるシステム開発を求めた。これまでの試験使用の結果、システムのアーキテクチュア、学習評価に関するユーザビリティに関する改善点が指摘されたとともに、学習評価の信頼性に課題を生じ、新たな教材を開発して改めて評価を行う必要が生じた。主に、以下の活動を行った。■1アーキテクチュア、ユーザビリティ:学習の実運用で用いる諸パラメータに関し、これを学習者自身がある程度自由に設定できるよう、設計変更を行い、ユーザビリティの観点からアーキテクチュアの再構成を行った。■2学習評価:より信頼性の高い評価を行うため、それに資する教材を開発し、再評価をおこなった。■3音声録音提示:学習者の音声は、マイクを通じて録音し、教材音声と比較できるようになっている。通常の録音機能の加え、現実に近い即訳口述の練習ができるよう、教材音声の再生のあと録音時間に制限を設けた設計を図った(時限式)。また、分量の多い即訳の練習を可能にするため、教材音声を途中で区切って音声録音ができるようにした(同期式)。■4教材開発:上記2、3の評価に資するような教材を開発した。その実験教材を用いて、学習効果の測定を行った。

教材選択にファジィ理論を応用した外国語eーラーニングシステムを開発してきた。前年度までの成果を踏まえて、さらなる一貫性のあるシステム開発を継続した。これまでの試験使用の結果、システムのアーキテクチュア、学習評価に関するユーザビリティに関する改善点が指摘されたとともに、本システムの教育的位置づけの明確化といったマクロな視野も一部の課題として議論の上っている。■1アーキテクチュア、ユーザビリティ:学習の実運用では、教材提示や学習進行にかかるパラメータが多数存在する。これを学習者自身がある程度自由に設定できるよう、設計変更を行い、ユーザビリティの観点からアーキテクチュアの再構成を行った。また、学習者にとって煩雑と思われなおかつ使用頻度が多くないと思われる、パラメータの簡略化を図った。■2学習評価:当システムでは、英語学習時の回答を自己評価として行うという方法を取っている。今回、過去の学習の評価結果を表示して比較ができるよう、評価比較提示ソフトの開発を行った。それに加え、学習評価結果の視覚化表示の検討を行った。■3音声録音提示:学習者の音声は、マイクを通じて録音し、教材音声と比較できるようになっている。通常の録音機能の加え、現実に近い即訳口述の練習ができるよう、教材音声の再生のあと録音時間に制限を設けた設計を図った(時限式)。また、分量の多い即訳の練習を可能にするため、教材音声を途中で区切って音声録音ができるようにした(同期式)。■4教材開発:上記2、3の評価に資するような教材を開発した。その実験教材を用いて、学習効果の測定を行った。■5教材選択論理や学習評価法の精緻化を図るため、数学モデルとしての遺伝的アルゴリズムの検討やテスト理論の適用可能性の検討も行った。■6高等教育におけるeーラーニングの位置づけや関連カリキュラムの国内外調査を行った。平成23年度の、いわば繰り越し研究であるため、平成24年度分の研究計画とセットにして研究遂行することができ、効率的な進展を見た。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度が最終年度であるため、今後はより実践的な活動の中でシステム改良を図る予定である。
シイタケ菌におけるプラスミドDNAの探索とその構造解析

本研究課題では、シイタケ菌に存在するプラスミドDNAの種類の究明を目的に、国の内外から収集した野生株を含む多数の菌株を用いてプラスミドDNAの探索を進め、併せてそれらの構造等の諸性質を検討した。その結果、以下の研究成果を得ることができた。(1)野生二核菌糸体90株及び市販栽培品種21株の計111菌株から抽出した細胞の全DNAを電気泳動してプラスミドの保有の有無を分析した結果、シイタケには大きさの異なる6種類のDNAプラスミドが存在することが示された。(2)次に、これらプラスミドの相同性をサザン・ハイブリダイゼーション法で検討したところ、9.0kbあるいは11.1kbのプラスミドはそれぞれ固有の種類であり、残りの4種類については、相互に高い相同性を持つことから前二者とは別の系統類縁的に同じグループに属するプラスミドであるものの、分子長や制限酵素切断地図に違いがあるので、一応異なる種類として扱うことにした。よって、9.0,11.1,9.8,10.8,12.1及び12.3kbの6種類のプラスミドをpLE1,pLE2,pLE3A,pLE4B,pLE3CそしてpLE3Dと称し、区別した。(3)いずれのプラスミドも、制限酵素分析と電子顕微鏡観察によって線状の形態であることが確認され、さらに分子末端に蛋白質を保持することが示唆された。(4)また、どのプラスミドも交配により母性遺伝的に伝達したことから、それらは細胞核ではなく細胞質に存在すると考えられた。伝達されたプラスミドは二核菌糸体の栄養生長中も安定して維持された。しかし、二核菌糸体の有性生殖で形成された担子胞子に由来する一核菌糸でのプラスミドの維持・複製の如何は、細胞核因子に支配されることが示唆された。(5)一方、これらシイタケのプラスミドの地理的分布には、種類によって明らかな違いが認められた。このプラスミドの地理的分布の特徴から、シイタケの原産地は南太平洋熱帯アジアであると推定された。本年度の研究では、以下の成果が得られた。1)シイタケ菌に存在する核外遺伝子としてのプラスミドの探索を目的に、地理的分布の異なる野生二核菌糸体90株及び市販栽培品種21株の計111菌株を供試して、それらの培養菌糸体から既往の方法に基づきそれぞれ抽出した全DNAをアガロースゲル電気泳動で分析したところ、約80%の菌株に核やミトコンドリアDNAとは別に計6種類の低分子DNA(9.0,9.8,10.8,11.1,12.1,12.3kb)が存在することを見い出した。これら低分子DNAの分子長は反復実験においても変化せず、また常に安定的に存在していたことから、それらは核やミトコンドリアDNAの抽出過程での断片化により生じたものではなく、細胞内で自律的に増殖するDNA分子すなわちプラスミドであると考えられた。2)そこで、大きさの異なるこれら6種類のプラスミドの相互の相同性についてサザン・ハイブリダイゼーション法で検討した結果、同じ分子長のプラスミドはそれらを保有する菌株の地理的起源とは無関係に相互に高い相同性を示すことがわかった。

一方、異なる大きさのプラスミドの間では、9.0kbあるいは11.1kbのプラスミドはそれぞれ他のプラスミドとの間で全く相同性が無かったのに対して、残りの4種類のプラスミドは相互に高い相同性を示した。しかし、いずれのプラスミドも核やミトコンドリアDNAとの間には相同性は無かった。3)これらの結果から、9.0kb及び11.1kbのプラスミドはそれぞれ固有のプラスミド種であると考えられた。他のプラスミドについては、それらは系統類縁的に同じグループに属するプラスミドであると推察されるが、大きさに違いがあるので、異なる種類として扱うのが妥当であると考えられた。4)よって、9.0,11.1,9.8,10.8,12.1及び12.3kbの6種類のプラスミドをそれぞれpLE1,pLE2(=既報のpLLE1),pLE3-A,pLE3-B,pLE3-CそしてpLE3-Dと称し、区別した。本年度の研究では、以下の成果が得られた。(1)前年度報告したシイタケの6種類のDNAプラスミドpLE1,pLE2,pLE3-A,pLE3-B,pLE3-CならびにpLE3-Dは、制限酵素分析と電子顕微鏡観察によって、線状の形態であることが確認された。また、どのプラスミド種の検出に際しても、それを含むDNA画分の菌糸体からの分離過程でプロテナーゼK処理を施さないと、その回収量が激減するかもしくはほとんど認められなくなるので、それらは既知の他の菌類の線状DNAプラスミドと同じように分子末端にタンパク質を保持していると思われた。(2)また、交配に伴うこれらプラスミドの伝達様式を明らかにする目的で、互いに異なる種類のプラスミドを持つ一核菌糸間での正逆交配で得た新生二核菌糸体について調べたところ、いずれの交配組み合わせにおいても、それぞれの親一核菌糸体側から生じた新生二核菌糸体は親一核菌糸体と同じ種類のプラスミドを保有することが判明した。このようにシイタケのプラスミドは交配により片親遺伝いわゆる母性遺伝的に伝達することから、それらは細胞核ではなく細胞質に存在すると考えられた。伝達されたプラスミドは二核菌糸体の栄養生長中も安定して維持された。しかし、二核菌糸体の有性生殖によって形成された担子胞子に由来する一核菌糸でのプラスミドの維持・複製の如何は、細胞核因子の種類に交配されることがわかった。(3)一方、これらプラスミドの地理的分布について検討した結果、それには種類によって明らかな違いが認められた。pLE1は南太平洋熱帯アジア地域からニュージランドの菌株、pLE2は南太平洋熱帯アジアから東南ないし極東アジア地域の菌株、pLE3-AとpLE3-Bは南太平洋熱帯アジア地域の菌株、pLE3-Cは極東アジア地域の菌株、そしてpLE3-Dはニュージランドの菌株にそれぞれ存在した。
主要な性決定遺伝子３種類をつなぐ複合型性染色体の性決定と進化

脊椎動物では、これまで少なくとも3種類の主要な性決定遺伝子が同定されている。私たちは、染色体の相互転座によってこれら3つの遺伝子をつなぐ複合型性染色体をカエルに見出した。さらに、同種内で未だ相互転座が生じていない元祖集団も発見した。本研究では、3つの性決定遺伝子で構成される複合型性染色体の性決定様式と元祖型を起点としたその進化機構の解明に臨む。
配偶子分化の分子機構

今年度における各研究者の研究実績は次の通りである。1.ヒトX、Y精子の分離については、成熟精子の調整法および無担体電気泳動の泳動条件の検討を行い、それぞれに相当する二つのピークが比較的よく得られるようになった。現在DNAを抽出し、Yに特異的なプロープを用いてX、Yの同定を行いつつある。2.精子形成に関しては、イモリおよびゼノパスを用いて精細胞を培養し、経時的に^<35>Sメチオニンを取り込ませ、チューブリンを検出したところ、後者の方が早く検出できなくなった。現在チューブリンmRNAの安定性につき調べている。また前先体胞に対する抗体を作り検討中。3.卵胞内における配偶子細胞と体細胞の相互作用の研究では、ニワトリLHのβサブユニットのcPNAのクローニングに成功し、その構造を明らかにした。現在上記の研究と平行して、これまで不可能であった鳥類のLH受容体の検出と基本的性質の解明に努力している。4.造精機能調節のメカニズムについては、精細管内腔ではセルトリ細胞の細胞質に支えられる造精細胞の分裂分化が一定の領域に互って同調して行われ、そこにあるセルトリ細胞の機能同調を示すことを、培養下のセルトリ細胞間コミュニケーションを調べることにより確かめた。5.性腺内微や環境形成に対するマクロファージの関与に関しては、ラットを用いて、偽妊娠中ひ臓除去により血中のプロゲスチンが高くなること、この変化はひ臟移植により抑えられる結果を得た。また黄体の分泌機能がマクロファージとの共培養で維持されることを明らかにした。6.卵形成の分子機構については、硬骨魚を用いて17α、20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オンの作用部位が卵表であることを微小注射によって明らかにした。またその結果卵細胞質内に卵成熟促進因子が新たに生成されることをcell-free系で確かめた。
癌組織血管への新規ターゲティング素子材料の開発とその医用工学的応用

癌細胞に対するモノクローナル抗体を用いた癌バイオ・ターゲティング療法は、抗体-抗癌剤複合体の癌組織移行性め乏しさと、癌関連抗原の多様性のために、期待されたほどの成果をあげていない。一方、癌組織血管内皮細胞(TEC)は、癌種によらず癌組織特有の共通した特性を保持しており、TEC上には癌種によらず癌組織共通の特異的機能分子の存在が強く示唆される。このTEC上の共通特異分子に対する抗体を用いた抗体一抗癌剤複合体は、癌抗原の多様性を考慮する必要が無いうえ、癌組織移行性を考慮せずどもTECを直接攻撃できるなど、決定的な利点を有している。本研究では、癌組織血管を標的とした新規ターゲテイング素子を創製し、臨床応用可能な安全性・有効性に優れた癌バイオ・ターゲティング療法をデザインしようとするものである。以上の観点から、我々がはじめて単離培養に成功した癌組織血管内皮細胞(TEC)を免疫原として、癌組織血管に対するバイオ・ターゲティング素子を作製しようと試みた。免疫組織染色やFACS解析、ELISAなどによりスクリーニングした結果、TECに特異性の高い5種のモノクローナル抗体(TES-23)が得られた。このTES-23の体内挙動をKMT-17担癌ラットを用いて検討したところ、TES-23は静脈内投与後わずか1時間で、negative抗体Mopcの約20倍もの癌組織血管集積性を示した。本結果は癌組織血管の物質透過性を懸念する必要のない「癌組織血管を標的としたバイオ・ターゲティング療法」の高い有用性を示唆しているものと考えられた。さらにTES-23の医用工学的応用を目的に、ネオカルチノスタチンとの免疫複合体を創製したところ、副作用を伴うことなく、著しい抗腫瘍効果が認められ、癌組織血管を標的とした新規癌免疫ミサイル療法の有用性が強く示された。
量子スピン系の新たなモンテカルロ計算方法(確率的状態選択法)

量子スピン系でハミルトニアンから物理量の数値計算をする第一原理的な方法である「確率的状態選択法」の開発を行い、従来の方法では困難であった三角格子スピン系の物理量を計算することを可能にし、エネルギーなど物理量の計算をおこなった。色々なスピンZ成分の状態の最低エネルギーやその他の物理量の計算結果により、三角格子量子スピン系で自発的対称性の破れが実現していることに数値的な証拠を提出し、スピン系での南部ボソンを確認できた。量子力学・場の量子論において、ハミルトニアンから物理量を数値計算する第一原理的方法は極めて重要であり、スピン、電子の多体問題において近年目覚ましく進歩した。具体的に言えば、厳密対角化法、量子モンテカルロ法、密度行列繰り込み群法(DMRG法)などである。しかし、これらの方法に負符号問題、サイズの制限、次元の制限などの大きな欠点がある。この研究課題は、これらの欠点を克服する新たな第一原理的な数値計算方法である「確率的状態選択法」の開発である。確率的状態選択法では、状態にハミルトニアンを次々と演算してゆく間に計算途中で現れる状態を確率的に落すが、統計平均をとることにより、状態を落しても正しい結果を得られることが数学的に保証される。固点節(Fixed Node)法などの方法と違い、この方法は物理的仮定を含まない。この確率的状態選択法をフラストレートした量子スピンシステムに適用して、色々な物理量を計算する。量子力学・場の量子論において、ハミルトニアンから物理量の数値計算をする第一原理的方法は極めて重要であり、申請研究課題は、新たな第一原理的な数値計算方法である「確率的状態選択法」の開発である。この方法はモンテカルロ法の原理的改良になっており、従来ではできなかった確率的計算が可能になっている。H19年度の研究においては、確率的状態選択法の能力をさらに開発して実用的方法とするための改良をおこなった。具体的な計算対象は三角格子ハイゼンベルク量子スピン系(48サイト)である。この系において良い試行状態を作り出す方法について研究をおこない、その方法を確立した。良く知られているように三角格子量子スピン系の古典システムは強いフラストレーションのために、単純な古典配置がない。そこでまず変分モンテカルロ法の考えを利用し、スピンのz成分のみを含む古典ハミルトニアンを用いて、そのエネルギーが最低である状態を見つける。こうして集めた状態数は数百万個で、対称性を考慮した基底では約1万個になる。この1万個の状態を初期状態にして、ハミルトニアンを演算することにより、より良い近似状態を得ていく。この方法は、全スピンが1以上の励起状態の良い試行状態をつくることにも適用できた。また確率的状態選択法の数学的可能性を更に探求し、負符号の問題が生じる系においても十分な状態数をとれば統計的平衡があることを見出した。このことを用いれば、高い精度でエネルギー固有値が求められることがわかり、論文として公表した。平成20年度は制約条件を取り入れた確率的状態選択法を開発して48サイト三角格子量子スピン系の、基底状態および励起状態を含めたエネルギー計算を行なった。確率的状態選択法は多数の確率変数を用いたモンテカルロ法であるので、一部の確率変数を他の確率変数に従属させることができる。この従属性を用いて、確率的状態選択を適用する状態と特定の状態との内積をどのサンプルにおいても一定にする、つまり統計的揺らぎをゼロにすることができる。この方法-「制約条件付き確率的状態選択法」と呼ぶ-の理論的基礎研究をすすめることができた。具体的には、まず小さなサイズで厳密なエネルギー固有状態を求め、制約条件付き確率的状態選択法を適用した結果と比較検討することによって、本方法の有用性を検証できた。更に、この成果を踏まえて、48サイト三角格子量子スピン系のエネルギー計算をおこなった。この計算ではスピンのZ成分が0の状態の最低エネルギーをもとめるだけではなく、スピンのZ成分が1,2,3、4の励起状態の最低エネルギーの計算もおこなった。これらの計算により、三角格子量子スピン系の基本的性質を調べることができ、この系が自発的対称性の破れを起こしていることを強く支持する結果を得た。平成21年度は制約条件を取り入れた確率的状態選択法を48サイト三角格子量子スピン系に適用して、いろいろな物理量の計算に適用できることを示すことができた。

具体的に計算した物理量は基底状態および励起状態、波数ベクトルをもったマグノンを含めたエネルギー計算と基底状態の副格子の磁化である。確率的状態選択法は多数の確率変数を用いたモンテカルロ法であるので、一部の確率変数を他の確率変数に従属させることができる。この従属性を用いて、確率的状態選択を適用する状態と特定の状態との内積をどのサンプルにおいても一定にする、つまり統計的揺らぎをゼロにすることができる。この方法-「制約条件付き確率的状態選択法」と呼ぶ-を実用的計算に適用した。具体的には、48サイト三角格子量子スピン系のエネルギー計算をおこなった。スピンのZ成分が0,1,2,3、4の状態の最低エネルギー計算結果により、三角格子量子スピン系が自発的対称性の破れを起こしていることを理解できた。さらに波数ベクトルをもったマグノンを含めたエネルギー計算により、マグノンスペクトラムは線形スピン波解析では理解できず、系の不安性の理解がすすんだ。量子力学・場の量子論において、ハミルトニアンから物理量の数値計算をする第一原理的方法は極めて重要であり、申請研究課題は、新たな第一原理的な数値計算方法である「確率的状態選択法」の開発である。この方法はモンテカルロ法の原理的改良になっており、従来ではできなかった確率的計算が可能になっている。平成22年度は制約条件を取り入れた確率的状態選択法を48サイト三角格子量子スピン系に適用して、いろいろな物理量の計算に適用できることを示すことができ、これを公表した。制約条件つき確率的状態選択法では選択する状態と特定の状態との内積をどのサンプルにおいても一定にする、つまり統計的揺らぎをゼロにすることができる。この方法を利用して48サイト三角格子量子スピン系のエネルギー計算をおこなった。またとても大きなサイズでは変分モンテカルロ法(VMC)が利用されているが、この方法との融合の研究を始めた。VMCでは試行波動関数でエネルギー期待値などは計算できるがエネルギーの2乗などは困難である。この困難を克服するために確率的状態選択法の適用を研究対象にしてこの2乗の計算が可能であることを示せた。具体的な計算対象は三角格子XY量子スピンシステムである。
機能性ナノ粒子の表面設計と溶剤および樹脂への高密度均一分散

本研究では無機ナノ粒子を高密度に樹脂に充填した新規材料の開発を最終目標としており、初年度ではまず、機能性ナノ粒子の調製法の確立と、樹脂との親和性向上を狙った表面修飾法の確立を目的とした。前者に対しては、申請者らがa-Fe_2O_3ナノ粒子を対象に報告した脂肪酸鉄錯体を原料とした高濃度、低温、大気圧下における高分散性ナノ粒子合成法をFe_3O_4,ZnO,ZnSナノ粒子などに応用できる事を明らかにした。後者に対しては、高分散性ナノ粒子の一般的な保護剤であるオレイン酸について、その不飽和結合部分を酸化させる手法により保護剤にエポキシ環を導入する手法を確立した。このプロセスにより無機ナノ粒子のエポキシ樹脂との親和性向上と分散安定化が期待できる。また、炭化ケイ素をはじめとした炭化物ナノ粒子も高耐熱性をはじめとした機能性を有しており、樹脂への充填剤として期待されるため、その表面状態を自在に設計できることは極めて重要である。本研究では、さまざまな構造を有するアゾ重合開始剤とSiCナノ粒子の表面における不飽和炭化水素を反応させることによって、SiCナノ粒子の表面状態や溶液中における分散性を制御できることが明らかとなった。
病原性微生物が生産する天然物の化学構造決定および生合成機構の解明に関する研究

病原性大腸菌IHE3034株が生産する毒素colibactinは,哺乳類細胞に感染しているときのみ生合成される微量成分であるため,その存在は示唆されているにもかかわらず未だに単離報告がない.そこで本化合物の生合成を試みることとした.まず,colibactin生合成遺伝子のBACライブラリーを獲得した.続いて本ライブラリーから目的の生合成遺伝子群をコードしたクローンを取得した後,遺伝子群を発現するためのベクターを構築することに成功した.目的発現ベクターは,酵母の高い相同組換え能力を利用することで巨大な発現ベクターであっても作成することができた.病原性大腸菌IHE3034株が生産する毒素colibactinは,哺乳類細胞に感染しているときのみ生合成される微量成分であるため,その存在は示唆されているにもかかわらず未だに単離報告がない.そこで本化合物の生合成を試みることとした.まず,colibactin生合成遺伝子のBACライブラリーを獲得した.続いて本ライブラリーから目的の生合成遺伝子群をコードしたクローンを取得した後,遺伝子群を発現するためのベクターを構築することに成功した.目的発現ベクターは,酵母の高い相同組換え能力を利用することで巨大な発現ベクターであっても作成することができた.我々は、米国NIHの協力を得てP3レベル実験室で上記の病原性大腸菌よりゲノムを得た。得られたゲノムを用いゲノミックライブラリーを作成した後、目的の生合成遺伝子群を取得することに成功している。本生合成遺伝子の発現方法に関して2通りのシステムを構築した。一つ目の合成システムは、本生合成遺伝子群を大腸菌を宿主とする発現ベクターに導入し、発現させることで目的化合物を合成するものである。目的の生合成遺伝子群は大腸菌由来であるため、発現の時に用いる宿主は大腸菌が最適であると考えられる。一方で、発現ベクターの構築時に用いる宿主は、酵母であるS.cerevisiを用いた。用いた発現ベクターは大腸菌-酵母のシャトルベクターである。目的の生合成遺伝子であるPKSおよびNRPS遺伝子は一般に510kbと巨大であるため、発現ベクターに適切に導入することが困難となる。また、化合物の炭素骨格を修飾するための酵素遺伝子の発現も必要となるため、多数のオープンリーディングフレーム(open reading frame,ORF)をベクターに導入することが必要不可欠となる。最終的には全長53kbにおよぶ20個のORFを一つの細胞内で発現させる必要がある。そこで我々は、酵母であるS.cerevisiを主に用い、既に確立されている相同組換えによる発現ベクター構築法によって目的の生合成システムを構築した。BACライブラリーの構築:大腸菌IHE3034株の染色体を用いBACライブラリーを作成した.1J-20と1N-6の二つの領域を含むBACを取得することに成功した.生合成遺伝子クラスター:得られたクローンを解析した結果,全長約55kb,18種類の読み枠を有していることが推定された.また,colibactinの炭素骨格生合成に関与すると予測される,ポリケタイド合成酵素およびペプチド合成酵素群を見出すことができた.誘導性プロモーターを持つ発現ベクターの作成:本化合物の生合成には55 kbを超える巨大な生合成遺伝子群が必要となる.しかし一般的には多数の遺伝子を含んだ巨大遺伝子群を発現させるためのベクターを構築することは難しいとされている.そこで,酵母相同組換えを利用したクローニング法を用いることによって,30 kbを超す巨大な発現ベクターであっても容易に構築可能であると考えた.本方法を用いて互いに異なる抗生物質耐性マーカーおよびオリジンを有した3種のプラスミドに,強制発現可能な系でcolibactin生合成遺伝子群をクローニングした.また,先行研究によって本化合物生合成は7つのオペロンを形成していることが報告されている.これを参考にして,オペロン毎にクローニングすることで容易に発現ベクターが作成できると考えた.構築したcolibactin生合成遺伝子発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換した.本形質転換体培養液にisopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideを添加して強制発現を行い現在colibactinの生産を確認中である.また,培養および誘導条件も合わせて検討中である.申請時に研究計画書に記載された計画通りに進捗しているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでのところ、研究計画の変更予定はなく、当初の計画に従って研究を遂行することで成果を得られると考えられる。
認知症ケアを契機とした生命倫理学の刷新―新しいケア文化のかたちを求めて

認知症によって徐々に判断力が減退していく過程で,本人の意思をどこまで尊重できるか、また認知症の進行過程においても本人の思いと自律が生活の広い分野で尊重され,自己決定を行使する能力をできるだけ長く保てるような支援に対して、倫理学の側からその根拠づけをめざす、という研究課題の達成のため、検討を重ねてきた。その成果を日本生命倫理学会第30回大会のワークショップ「尊厳ある人生の最終段階はどのようにして実現できるのか」で発表した。患者本人・家族の価値観・人生観と本人の物語りを尊重し、アドバンス・ケア・プランニングを形骸化させない取り組みが重要であることが確認された。研究代表者がこれまでの研究を踏まえ、『安楽死・尊厳死の現在最終段階の医療と自己決定』という書でまとめた。認知症の進行以前に書いた事前指示書を絶対視する立場が必ずしも自律尊重にはならないこと、理性的な判断のみならず自然的意思という多層的な観点から本人の意思に寄り添うことなど、これまでの生命倫理学の常識を打ち破る観点を提起した。これに対して、臨床に従事する専門職や研究者から多くの反響が寄せられている。倫理コンサルテーション、リハビリテーション、介護、成年後見、道徳教授法などの分野でも、研究分担者が、研究プロジェクトの成果を共有しつつ、それぞれ著作や論文や学会発表・講演等で発表した。研究成果の取りまとめと社会への発信という点で大きな成果をあげることができた。28年度に『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を専門職の養成教育の教科書として上梓し、認知症ケアの倫理的対応力の向上に資することを検証した。29年度には、現場の専門職と専門研究者および市民との公開シンポジウムを開催し、認知症ケアの倫理と法に関する理論と具体との循環のなかから、課題をさらに深めた。また、教科書として使用した養成教育のなかで、学生に対してアンケート調査を実施し、その結果、ケーススタディとグループ討論を通じて、自身の価値観を相対化し、認知症の人への固定観念や偏見を改め、より広く柔軟な視点から問題を捉え直していく上で、ケースブックが有効であることがわかった。30年度には、認知症の進行過程においても本人の思いと自律が尊重されるような支援に対して、倫理学の側からその根拠づけを、日本生命倫理学会のワークショップや著作や論文や学会発表・講演等で発表し、研究成果の取りまとめと社会への発信という点で前進できた。『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を、今日の新しい情勢のなかで、専門職や養成教育担当者などからの意見をふまえ、より倫理的・法的配慮をきめ細かくするなど改善作業を進めていく。自律尊重原則についての従来の理解を検討し直し、認知症の進行過程においても本人の思いと自律が生活の広い分野で尊重され、自己決定を行使する能力をできるだけ長く保てるような支援をめざし、ケアの専門職の倫理的対応力の向上に理論的な基礎を提示する課題に取り組んだ。1.認知症ケアの現場で発生している困難なケースをモデル化して、倫理的・法的な考え方と対応のポイントをまとめたケースブックの作成・編集を行った。当初、平成29年度刊行の予定であったが、当該課題の社会的ニーズの高まるなか、課題の緊要性をふまえて、作業を加速し、予定より早く刊行することができた(『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』南山堂、2017年3月25日刊行)。2.判断力が低減した人の意思について、その捉え方、意思決定支援のあり方、成年後見制度の活用などの観点から理論的検討を重ねた。このテーマは、社会情勢や学会動向からみて、きわめて重要かつ喫緊の課題であることが一層明らかになった。自己決定を理性的判断に基づく合理的判断として一義的に狭く理解するのではなく、反省以前の即時的判断や、情動レベルの意思、ドイツ法の「自然的意思」など多層的なレベルで捉え直す必要がある。こうした研究成果を学術論文、学会発表、市民を対象とした啓発的な講演などで発表した。3.本課題をグローバルな視点からも研究するため、ドイツから専門家を招聘し、ドイツや専門職と情報を共有することを目指し、公開講演会を開催した。『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を、計画より早く平成28年度末に刊行できた。ドイツから専門家を招聘し、認知症をめぐる課題をグローバルな視点から検討するとともに、公開講演会を開催することで、現場の専門職や関連分野の研究者との交流ももてた。理論的研究の成果も一部発表できた。28年度末に研究成果として刊行した『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を、専門職の養成教育や現場の専門職の研修テクストとして活用して、理論と具体との良き循環を促す契機となるかを検証した。教科書として使用した養成教育のなかで、学生に対してアンケート調査を実施し、その結果、ケーススタディとグループ討論を通じて、自身の価値観を相対化し、認知症の人への固定観念や偏見を改め、より広く柔軟な視点から問題を捉え直していく上で、ケースブックが有効であることがわかった。この調査結果を論文で発表した。公開シンポジウムを開催し、臨床倫理学に詳しい医師、認知症の人の社会参加の運動と看護教育に携わる教員、認知症の人のスピリチュアルペインのケアに取り組んでいる専門職を招聘し、認知症の人の自律尊重とケアのあり方をめぐって活発な議論を行った。本シンポジウムには医療と介護の専門職や市民が参加し、認知症の当事者の方からの思いを聴くこともできた。

日本認知症ケア学会の「認知症ケア専門士」の単位認定としても位置づけられ、ケアの専門職の倫理的対応力の向上のための理論的な基礎を提供することができた。認知症ケアを契機とした生命倫理学の再検討を進めるため、研究会を定期的に開催し、自己決定が困難になった認知症の人の代理意思決定者としての家族の役割を研究する専門家、地域で在宅医療に取り組み、思いやりのあるコミュニティを目指す総合診療医、認知症高齢者に寄り添う臨床経験のなかから独自の提言をしている老年医学者を招聘し、認知症の人の自律尊重をめぐって意見交換した。それらの検討成果を学会誌等で発表した。高齢化が進む各国に共通する認知症ケアの倫理的・法的課題をグローバルな視点から検討するため、トータルケアをめぐるベトナムと日本、倫理教育についての日独、高齢者支援に関する日韓の、それぞれの比較調査を行い、成果を発表した。研究成果『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を専門職の養成教育の教科書として活用して、認知症ケアの倫理的対応力の向上に資することを検証し、論文で発表した。現場の専門職と専門研究者および市民との公開シンポジウムを開催し、認知症ケアの倫理と法に関する理論と具体との循環のなかから、課題をさらに深めていく方向性をつかむことができた。認知症によって徐々に判断力が減退していく過程で,本人の意思をどこまで尊重できるか、また認知症の進行過程においても本人の思いと自律が生活の広い分野で尊重され,自己決定を行使する能力をできるだけ長く保てるような支援に対して、倫理学の側からその根拠づけをめざす、という研究課題の達成のため、検討を重ねてきた。その成果を日本生命倫理学会第30回大会のワークショップ「尊厳ある人生の最終段階はどのようにして実現できるのか」で発表した。患者本人・家族の価値観・人生観と本人の物語りを尊重し、アドバンス・ケア・プランニングを形骸化させない取り組みが重要であることが確認された。研究代表者がこれまでの研究を踏まえ、『安楽死・尊厳死の現在最終段階の医療と自己決定』という書でまとめた。認知症の進行以前に書いた事前指示書を絶対視する立場が必ずしも自律尊重にはならないこと、理性的な判断のみならず自然的意思という多層的な観点から本人の意思に寄り添うことなど、これまでの生命倫理学の常識を打ち破る観点を提起した。これに対して、臨床に従事する専門職や研究者から多くの反響が寄せられている。倫理コンサルテーション、リハビリテーション、介護、成年後見、道徳教授法などの分野でも、研究分担者が、研究プロジェクトの成果を共有しつつ、それぞれ著作や論文や学会発表・講演等で発表した。研究成果の取りまとめと社会への発信という点で大きな成果をあげることができた。28年度に『ケースで学ぶ認知症ケアの倫理と法』を専門職の養成教育の教科書として上梓し、認知症ケアの倫理的対応力の向上に資することを検証した。29年度には、現場の専門職と専門研究者および市民との公開シンポジウムを開催し、認知症ケアの倫理と法に関する理論と具体との循環のなかから、課題をさらに深めた。また、教科書として使用した養成教育のなかで、学生に対してアンケート調査を実施し、その結果、ケーススタディとグループ討論を通じて、自身の価値観を相対化し、認知症の人への固定観念や偏見を改め、より広く柔軟な視点から問題を捉え直していく上で、ケースブックが有効であることがわかった。
歯周病関連細菌由来ストレス蛋白質による樹状細胞および抗原特異的T細胞の解析

申請者は昨年までの報告で目的タンパク質であるActinobacillus Actinomycetemcomitans由来DnaKの遺伝子を大腸菌コンピテントセルに導入したところまで報告した。1.その後、IPTGによる目的タンパク質の発現を確認するために何度かSDS-PAGEを行ったが、目的とする70kDa付近にタンパク質の発現を認めなかった。2.そのため、当初の計画にはなかったが導入した遺伝子が正しいものであるかを確認するためインサートプライマーを設計し、シークエンスにて塩基配列を確認した。結果、全配列を確認したわけではないが、開始コドンより1Kbase程度にわたり、目的の遺伝子の塩基配列は正しく組み込まれていることを確認した。3.その後、同施設の研究者の方々に相談し、IPTGによる目的タンパク質の誘導の段階において、なにかしらのエラーがあると考え、タンパク質発現の条件を変える(具体的には、試薬をもう一度チェックした後、タイムコース、IPTGの濃度変更)など何度か試してみたののタンパク質の発現がうまく認められなかった。ウエスタンブロットにより目的タンパク質の確認はできたが、タンパク質の精製の目的のためには発現量が少ないと考えた。以上より、シークエンスの結果から導入した遺伝子は目的タンパク質のものであることは確認したため、タンパク質合成の段階で、発現の誘導がうまく行えていないと考え同施設の研究者の方々に相談し、実験中である。具体的にはタンパク質回収の効率をあげることや発現ベクターをもう一度考え直すことなどを計画し、タンパク質精製が可能な程度の発現を目的に実験を継続している。1.A.a.のDnaKに対するプライマーを以下のように設計し,目的DNAをPCR法により増幅した。2.PCR産物を1.2%アガロースゲルで泳動しゲル切り出し法により目的DNAを得た。4.作成したベクターを大腸菌(TOP10F')(invitrogen)に導入した。5.形質転換した大腸菌を単離しプラスミドを精製し、目的DNAを確認した後BL21コンピテントセル(invitrogen)に導入した。6.単離したコンピテントセルプラスミドを酵素処理し、アガロースゲルで泳動し目的の配列が組み込まれていることを確認した。7.現在、IPTGでタンパク質の発現を誘導し、蛋白を精製する準備を行っている。申請者は昨年までの報告で目的タンパク質であるActinobacillusActinomycetemcomitans由来DnaKの遺伝子を大腸菌コンピテントセルに導入したところまで報告した。
睡眠誘発物質合成酵素L-PGDSの基質認識と生成物放出のメカニズムの解明

本研究では、睡眠誘発物質であるPGD2の合成と輸送を担うL-PGDSの酵素反応および生成物放出のメカニズム解明を目的としている。H29年度までの研究で、様々な基質および生成物の類似化合物の相互作用情報を得た。さらに、L-PGDSのNMR測定を行い、主鎖アミドプロトンのケミカルシフトの帰属をほぼ完了した。一方で、H29年度より始めたL-PGDSと基質および生成物の類似化合物との複合体のX線結晶構造解析では、構造解析に十分な結晶とデータを得ることができない問題があった。H30年度は、主に以下の3つを行った。1)マウスL-PGDSだけでなく、ヒトL-PGDSの結晶構造解析を検討し、結晶条件を特定し構造解析を行った。2)L-PGDSの二つの結合部位(site-1およびsite-2)への結合様式が異なるという結果に加え、それぞれの結合部位の相互作用の熱力学的パラメータ解析から、相互作用の特徴付けを行った。3)従来のL-PGDSの酵素活性測定はRIを利用したものであったが、RIを利用しないELISAでの酵素活性測定系の構築を行った。1)に関しては、H29まででマウスL-PGDSのみでは、タンパク質の凝集などの問題で構造解析ができなかったが、ヒトL-PGDSでは成功し、基質誘導体との複合体および生成物との複合体の構造を決定した。2)に関して、酵素反応が行われるsite1では、基質の形状に合わせた疎水性相互作用により基質が固定されることが示唆され、基質が最初に通過すると考えられるsite2では、水素結合などの極性相互作用によって基質を認識している可能性が示された。1)の複合体の構造とも比較し、site2で基質との極性相互作用に関与するアミノ酸を特定した。これまでの研究から、基質と生成物はいずれも活性中心(site-1)に強く結合し、さらに、もう1つ別の結合サイト(site-2)を持つことがわかっている。L-PGDSの酵素活性には、site-1とsite-2の両方が関わっている可能性があり、これまで着目されてきたsite-1の結合情報や複合体構造情報に加えて、site-2の情報をITCおよびNMRにて取得していく。H28年度は、以下の2つの情報を得た。1) Site-2の領域をリガンドとして生成物PGD2とその類似化合物を用いて、NMR滴下実験にて明らかにした。2) Site-2への基質安定誘導体と生成物PGD2とその類似化合物の親和性をITCによって明らかにした。まず、NMR滴下実験に必要な基本情報として、野生型マウスL-PGDSの主鎖アミドプロトンのケミカルシフトの帰属を行い、主鎖アミドプロトンの93%の帰属を完了した。さらに、NMR滴下実験によって、site-2がL-PGDSのEF-loopおよびGH-loopの先端の領域に存在することを明らかにした。また、ITCによる生成物類似体を用いた相互作用解析によって、site-1とsite-2のそれぞれでプロスタグランジンの認識部位が異なること、また、その認識に重要な官能基部位を明らかにした。平成28年度に計画していた実験に関しては、概ね完了できた。(1)NMR滴下実験によって、基質誘導体と生成物およびその類似化合物の結合部位は明らかにできた。(2)ITCを用いて、基質誘導体と生成物およびその類似化合物の親和性をそれぞれの結合部位ごとに明らかにした。ただし、現在、まだ結合部位の変異体作製は完了していない為、H29年度に持ち越した。H28年度までの研究で、様々な基質および生成物の類似化合物の相互作用情報を得た。H29年度は、主に以下の2つの情報を得た。1)基質および生成物の類似化合物のNMR滴下実験を行い、L-PGDSにおけるそれぞれの化合物の結合部位を同定した。2)変異体を用いた基質および生成物の類似化合物とのITC相互作用解析により、結合に重要なアミノ酸残基の情報を得た。1)に関しては、プロスタグランジンの9位のOH基と15位のOH基の有無によって二つの結合部位(site-1およびsite-2)への結合様式が異なるという結果が得られた。さらに、2)の実験では、L-PGDSのΩ-loop領域およびEF,GH-loop領域のアミノ酸は酵素活性部位から離れているにも関わらず、その変異によって基質類似化合物への親和性が大きく低下した。一方で、H29年度より始めたL-PGDSと基質および生成物の類似化合物との複合体のX線結晶構造解析では、構造解析に十分な結晶とデータを得ることができなかった。L-PGDSのみの結晶化の最適化を行い、かなり高濃度のL-PGDSの条件でないと結晶化しないこと、また、リガンドが存在する(結合する)条件下では凝集沈殿しやすいことがわかった。それらの問題点を解決するためにさらなる条件検討が必要である。平成29年度に計画していた実験、1)L-PGDSの変異体の作製とそれを利用したITC相互作用解析による結合に重要なアミノ酸の同定、2)NMRリガンド滴下実験による基質および生成物の類似化合物の結合部位の同定、3)L-