hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗がん剤の作用機序における活性酸素シグナル伝達機構の解明

本研究の目的は、抗がん剤と活性酸素(ROS)との関係に注目し、抗がん剤の効果・副作用の発現を酸化ストレスの観点から明らかにすることである。今回、薬物としてマイトマイシンC (MMC)、ピラルビシン(THP)、カルノシン酸(CA)を使用した。THP, CAは、Cu(II)存在下では濃度依存的にDNAを損傷し、この損傷にはROSが関与していた。また、培養細胞の実験で、MMC, THP, CAの細胞死において共にH2O2の関与を示唆しており、これらの細胞死誘導因子すなわち抗がん作用因子としてROSの1つであるH2O2が重要であることが明らかになった。本研究課題の目的は、現在臨床の場で使用されている抗がん剤と活性酸素種(reactive oxygen species : ROS)との関係に注目し、抗がん剤の効果および副作用の発現機構を酸化ストレスの観点、すなわち酸化ストレスマーカーの観点から明らかにすることである。今年度は、DNAのアルキル化、活性酸素種(ROS)によるDNA鎖切断などを介して抗がん作用を示すマイトマイシンC (MMC)を用いて検討した。実験には、ヒト骨髄性白血病細胞HL-60およびHL-60由来でカタラーゼ高活性のHP100細胞を用いた。アポトーシスの検出はDNAラダー、核凝縮、Caspase-3/7活性で評価した。細胞毒性はLDH遊離で評価し、細胞内ROS産生は、CM-H2DCFDAと反応させ蛍光強度イメージサイトメーターで測定した。MMCによる24時間処理後のDNAラダーは、HL-60において0.5μMから観察されたのに対して、HP100では2.0μMから観察された。また、核凝縮、LDH遊離を指標とした細胞死、Caspase-3/7活性についてもHL-60で顕著であり、HP100においてMMCによるアポトーシスの抑制が認められた。さらに、細胞内ROS産生も同様の傾向であった。HP100はHL-60のカタラーゼ過発現株であり、HL-60の18倍のカタラーゼ活性を持ち、過酸化水素に対し340倍耐性を示す細胞である。したがって、MMCのアポトーシス誘導因子すなわち抗がん作用因子としてROSの1つである過酸化水素が重要であることが明らかになった。すなわち、過酸化水素がMMCの作用発現における重要な酸化ストレスマーカーの1つであることが示された。今年度は、DNAトポイソメラーゼII反応の阻害や活性酸素種(ROS)によるDNA鎖切断などを介して抗がん作用を示すピラルビシン(THP)を用いて検討した。実験には、プラスミドDNAを用い、THPと金属イオンをリン酸緩衝液で反応させた。反応後、アガロースゲル電気泳動でDNA損傷を検出した。O2-の測定はシトクロムc還元法で行い、550 nmの吸光度を測定した。ヒト白血病細胞HL-60及びHL-60由来catalase高活性のHP100細胞を用い、LDH遊離を指標とした細胞死とHoechst 33342での蛍光染色による核凝縮を観察した。さらにDNAラダー、細胞内ROS生成とミトコンドリア電位、Caspase 3/7活性を測定した。Cell-freeの実験において、THP単独ではDNA損傷は認められず、Cu(II)存在下THPは濃度依存的にDNAを損傷した。この損傷はmethionalおよびCu(I)と特異的に結合するbathocuproineにより抑制され、catalaseで抑制されたが、フリーOHラジカルスカベンジャーでは抑制されなかった。また、Cu(II)存在下でTHPはO2-を生成した。細胞実験において、THPによる細胞死、核凝縮、細胞内ROS生成、Caspase 3/7活性上昇はHL-60 > HP100であった。THPはCu(II)存在下で活性酸素種を生成し、DNAを損傷した。その活性種はOHラジカルよりもCu(I)とH2O2とによるcomplexと考えられ、ヒト培養細胞での結果もH2O2の関与を示唆していた。以上の結果から、THPの抗がん活性発現機構にH2O2が関与し、すなわちH2O2が抗がん活性のマーカーとして有用であることが示唆された。今年度は、抗がん剤ではないが、健康食品として使用されている西洋ハーブのローズマリー含有成分の1つであるカルシノン酸(Carnosic Acid : CA)を用いて検討した。CAには抗酸化作用や神経保護作用など様々な生理活性が報告されているが、酸化促進作用も報告されている点に注目した。実験には、プラスミドDNAとヒト白血病細胞HL-60及びHL-60由来catalase高活性のHP100細胞を用いた。Cell-freeの実験において、CA単独ではDNA損傷は認められず、Cu(II)存在下でCAは濃度依存的にDNAを損傷した。

この損傷はmethionalおよびCu(I)と特異的に結合するbathocuproineにより抑制され、catalaseで抑制されたが、フリーOHラジカルスカベンジャーでは抑制されなかった。また、Cu(II)存在下でCAはO2-を生成した。細胞実験において、CAによりDNAラダーが形成され、Caspase-3/7活性が上昇した。CAによる細胞生存率は、2hではHL-60 ≒HP100であったが、4h, 24hではHL-60 < HP100であった。また、ミトコンドリア膜電位の変化は、2h, 4h共にHL-60 > HP100であった。CAはCu(II)存在下で活性酸素種を生成し、DNAを損傷した。その活性種はOHラジカルよりもCu(I)とH2O2とによるcomplexと考えられた。CAによるDNAラダー形成、Caspase-3/7活性上昇が見られたことから、CAによる細胞死はアポトーシスであることが示唆された。CAによる細胞生存率、ミトコンドリア膜電位の変化におけるHL-60とHP100との差異は、HP100がHL-60由来のカタラーゼ過発現株であることから、CAによる細胞死にはH2O2が関わっていると考えられた。本研究の目的は、抗がん剤と活性酸素(ROS)との関係に注目し、抗がん剤の効果・副作用の発現を酸化ストレスの観点から明らかにすることである。今回、薬物としてマイトマイシンC (MMC)、ピラルビシン(THP)、カルノシン酸(CA)を使用した。THP, CAは、Cu(II)存在下では濃度依存的にDNAを損傷し、この損傷にはROSが関与していた。また、培養細胞の実験で、MMC, THP, CAの細胞死において共にH2O2の関与を示唆しており、これらの細胞死誘導因子すなわち抗がん作用因子としてROSの1つであるH2O2が重要であることが明らかになった。ピラルビシンと活性酸素種(reactive oxygen species : ROS)との関係について、抗がん剤の効果および副作用の発現機構を酸化ストレスの観点、すなわち酸化ストレスマーカーの観点から明らかにできた。こうした点からおおむね順調に進展していると考える。がん治療薬学、酸化ストレス学、医療薬剤学平成27年度は、他の抗がん剤について検討していく予定である。コメット法やフローサイトメトリー法を取り入れ、解析を実施する予定である。マイトマイシンCと活性酸素種(reactive oxygen species : ROS)との関係について、抗がん剤の効果および副作用の発現機構を酸化ストレスの観点、すなわち酸化ストレスマーカーの観点から明らかにすることができた。こうした点からおおむね順調に進展していると思われる。当初は、ピラルビシンの他にも実験する予定であった。しかしながら、実施できなかったために、アポトーシス解析用試薬、ROS解析用試薬の購入額が予定より少なかった。平成26年度は、マイトマイシンCによるDNA損傷が、単なるDNAのアルキル化なのか、活性酸素種(ROS)によるDNA鎖切断なのかを、8-OHdGの生成、コメット法などを用いて解明していく予定である。そして、アントラキノン系の抗がんなど他の薬剤についても検討したい。
栽培コムギの適応と分化に関するSCARマーカーを用いた解析

中国西・北部では乾燥条件下での春播き栽培,また中国東・南部では湿潤条件下での秋播き栽培が行われている.従って,両地域のコムギは低温や水分などの環境ストレスに対する適応力が異なると考えられる.そこで本研究では,東アジアのコムギにおける遺伝的・生態的分化を塩基配列レベルで解析するために,適応的に中立と考えられるRAPD多型及び適応に関与する遺伝子領域におけるPCR-RFLP多型を解析した.中国,朝鮮半島及び日本の在来コムギ56品種を供試して,14種類のRAPDマーカーについて解析した結果,新疆,寧夏・甘粛省,中国東北部,チベットからなる地域群と四川省,中国沿岸部を含む地域群の2つに大別され,中国国内において西・北部と東・南部で遺伝的に分化していることが示された.この傾向は春播型品種において顕著であった.ABA応答性遺伝子のEm遺伝子領域を解析した結果,Taq I,Dra I,Hinf I,Hinc IIの4種類の制限サイトの有無(+,-)より,56品種は(A)+-++,(B)+---及び(C)-+++の3タイプに分類され,またEmH2A遺伝子領域ではTaq Iサイトの有無という変異が認められた.両遺伝子のPCR-RFLP多型の地理的分布を解析した結果,特に春播型コムギにおいて明瞭な地理的変異が認められ,一般に東方の地域において,EmのB型,EmH2Aの切断型が多く存在した.そこで,RAPD分析の結果も加味して検討した結果,-Emの変異型の頻度はRAPDで分類されたクラスターによって明瞭に異なり,特にB型は,春播型では第I,III,VIの3クラスターにしか存在しなかった.B型ではABA応答性領域における塩基置換が多く見られたことから,Em遺伝子のABA応答性が変化している可能性が示唆された.従って,温暖,湿潤条件に適応する際にEm遺伝子のB型が選抜され,その結果として中国西・北部などとは異なるユニークな品種群が成立したと考えられる.中国西・北部では乾燥条件下での春播き栽培,また中国東・南部では湿潤条件下での秋播き栽培が行われている.従って,両地域のコムギは低温や水分などの環境ストレスに対する適応力が異なると考えられる.そこで本研究では,東アジアのコムギにおける遺伝的・生態的分化を塩基配列レベルで解析するために,適応的に中立と考えられるRAPD多型及び適応に関与する遺伝子領域におけるPCR-RFLP多型を解析した.中国,朝鮮半島及び日本の在来コムギ56品種を供試して,14種類のRAPDマーカーについて解析した結果,新疆,寧夏・甘粛省,中国東北部,チベットからなる地域群と四川省,中国沿岸部を含む地域群の2つに大別され,中国国内において西・北部と東・南部で遺伝的に分化していることが示された.この傾向は春播型品種において顕著であった.ABA応答性遺伝子のEm遺伝子領域を解析した結果,Taq I,Dra I,Hinf I,Hinc IIの4種類の制限サイトの有無(+,-)より,56品種は(A)+-++,(B)+---及び(C)-+++の3タイプに分類され,またEmH2A遺伝子領域ではTaq Iサイトの有無という変異が認められた.両遺伝子のPCR-RFLP多型の地理的分布を解析した結果,特に春播型コムギにおいて明瞭な地理的変異が認められ,一般に東方の地域において,EmのB型,EmH2Aの切断型が多く存在した.そこで,RAPD分析の結果も加味して検討した結果,-Emの変異型の頻度はRAPDで分類されたクラスターによって明瞭に異なり,特にB型は,春播型では第I,III,VIの3クラスターにしか存在しなかった.B型ではABA応答性領域における塩基置換が多く見られたことから,Em遺伝子のABA応答性が変化している可能性が示唆された.従って,温暖,湿潤条件に適応する際にEm遺伝子のB型が選抜され,その結果として中国西・北部などとは異なるユニークな品種群が成立したと考えられる.世界の各地域に適応して栽培地域が広がった栽培コムギのうち,特に地形的にも変化に富み,日本との関係も深いアジア東部において,アイソザイムなどの遺伝子頻度がまったく異なる2地域群に明瞭に分化していることが明らかになりつつある.そこで本研究では,栽培地域の拡大にともなって生じた遺伝的分化のダイナミズムを明らかにするために,ゲノム中の大部分を占める非コード領域に加えて,自然及び人為選抜の対象となる遺伝子座における塩基配列の変異を解析している.本年度の研究実績の概要は下記の通りである.2.中国及び日本のコムギにおける遺伝的変異を代表すると考えられる56品種について,上記のRAPD多型を解析した.その結果,中国西・北部の春播き栽培地域では多様な遺伝的変異が観察されたのに対して,中国東・南部,朝鮮半島及び日本では各地域に特徴的な少数のタイプに限られており傾向を異にした.しかも後者に特徴的なタイプは中国西・北部ではほとんど観察されなかった.これらの結果より,小麦の東進に際して強力な選抜が加わったことが明らかである.世界の各地域に適応して栽培地域が広がった栽培コムギのうち,特に地形的にも変化に富み,日本との関係も深いアジア東部における遺伝的分化を明らかにするために,ゲノム中の大部分を占める非コード領域に加えて,自然及び人為選抜の対象となる遺伝子座における塩基配列の変異を解析した.結果の概要は下記の通りである.1.中国及び日本のコムギ56品種におけるRAPD多型を解析した結果,中国西・北部の春播き栽培地域では多様な遺伝的変異が観察された.

これに対して,中国東・南部,朝鮮半島及び日本では播性によって傾向が異なり,春播型品種群では遺伝的変異が小さく西・北部には見られないユニークなタイプに収斂していることが示された.従って,寒冷・乾燥条件の西域の春播き栽培地域から湿潤・温暖な東方の秋播き栽培地域への伝播に際して強力な選抜が加わり,ボトルネック効果によりユニークな品種群が成立したことが明らかとなった.一方,同地域の秋播型品種群では遺伝的変異が大きく西・北部と共通のタイプも多く見られたことから,西域のコムギとの直接的な関連が明らかになった.2.中国の西・北部と東・南部では冬の寒さ及び登熟期の湿度条件が大きく異なるので,両地域間での生態的分化には,低温,乾燥,多湿などのストレスに対する適応力が関与していると考えられる.そこで,低温やABAにより誘導される各種遺伝子の塩基配列レベルでの変異を明らかにするために,構造遺伝子領域を特異的に増幅できるSCARプライマーセットを設計した.解析の結果,ABAにより誘導されるEmH2A遺伝子の3′側非転写領域においてPCR-RFLP多型が観察された.現在,本領域におけるPCR-RFLP多型の地理的変異と遺伝的分化との関係を検討中である.
てんかん発作の誘発に関連するシナプトソーム膜蛋白合成の研究

Elマウスの大脳皮質より分離したシナプトソーム形質膜についてin vitroにおける蛋白質合成に及ぼす発作の影響について検討を加えた。蛋白質合成の実験には、[【^(14)C】]-ロイシンを用いて、その取り込みを指標とした。構成蛋白質はSDS-PAGEのゲル電気泳動で分析し、合成された蛋白質についてフルオログラフィーを行った。実験に用いたマウスは、痙攣履歴のあるEl(+)マウスと痙攣履歴のないEl(o)マウスおよび発作非感受性のddyや【C_(57)】BLマウスなどであった。発作間歇期におけるEl(+)マウスのシナプトソーム形質膜での蛋白合成に及ぼす【Na^+】,【K^+】,RNase,chloramphenicol,cycloheximide,puromycin,Ouabainなどの影響を検討したが、El(o)やddyと比較して有意差は認められなかった。El(+)マウスの放り上げ刺激で起る痙攣では、強直期を除いて、形質膜の蛋白合成は発作直前から促進し、発作30分後で発作間歇期まで回復した。形質膜のSDS-PAGEによる分析のパターンでは、15K,44K,54K,67K,120Kの5個のmajor bandsと2030個のminor bandsが観察された。発作間歇期のEl(+)マウスにおいて、67K蛋白質がddyやEl(o)より減少していた。El(+)マウスの放り上げ刺激による痙攣発作の直後では、間歇期に比べて120K蛋白質の減少がみられた。シナプトソーム形質膜で合成される蛋白質は、18K,62K,80Kの3種であった。ddy,【C_(57)】BL,El(o)でも同様な蛋白質の存在が確認されたが、62K蛋白質のラベルは発作時に減少し、その後一時増大するが、発作30分後には間歇期と同程度のラベルに達し、形質膜全体の蛋白質合成の変化と類似していた。ポリゾームの糸で合成された蛋白質は、54K,62K,78K,92K,104K,125Kの6種で、El(+)マウスの発作で特に顕著な変化はみられなかった。El(+)マウスの発作では、形質膜の62K,120K蛋白質がけいれん発作と密接な関連があるものと考えられる。
腎糸球体、尿細管機能の調節機構の細胞生物学的解析

(1)アルギニンバソプレッシン(AVP)の尿細管作用: AVPの受容体にV1,V2と呼ばれるsubtypeが存在することは広く知られている。我々は尿細管細胞において、これらのsubtypeの局在ならびにシグナル伝達機構をfura2による細胞内カルシウム濃度測定を用いて検討した。AVP(V1,V2受容体刺激剤)の投与は、皮質集合管(CCD)、髄質外層集合管(OMCD)、髄質内層集合管(IMCD)における細胞内カルシウムの上昇を引き起こした。また、V2受容体刺激剤であるdDAVPの投与も同様に細胞内カルシウムの上昇を引き起こしたが、AVPとdDAVPの反応の違いからCCDではV1,V2両受容体、OMCDIMCDでは主にV2受容体を介した細胞内カルシウムの上昇のメカニズムが示唆された。さらにこれら細胞内カルシウムの上昇は主に細胞外からのカルシウム流入、しかもDHP感受性カルシウムチャンネルの関与を受けていることが示唆された(J.C.Iin.Invest.submitted,日本腎臓学会'89,アメリカ腎臓学会'89にて発表)。(2)エンドセリンの腎作用:エンドセリンは、近年発見されたホルモンで、強力な血管収縮作用を有し生体の血圧調節、臓器の血流調節等に重要な役割を果たしていることが知られている。我々はエンドセリンのin vivoラット腎動脈注入実験にて、尿量、糸球体濾過量、腎血漿流量を著明に低下させるが尿中総Na排泄率は変化させないことを示した。また、カルシウム拮抗剤であるニカルジピンの投与はエンドセリンの腎作用を抑制することがわかった。さらに、心房性ナトリウム利尿ペプチド(AMP)とエンドセリンの相互作用を検討したところANPはエンドセリンの腎機能低下を著明に抑制することが明らかとなった。一方、エンドセリンのメサンギウム細胞への影響を検討したところ、エンドセリンは細胞収縮作用および細胞内カルシウム上昇、プロスタグランジンE2の増加を認めた。以上のことより、エンドセリンは腎に直接作用して腎機能を低下させるが、これらの作用は、ニカルジピンおよびANPにより抑制されること、メサンギウム細胞が関与することが示唆された(Am.J.Physiol.1990in press)。(1)メサンジウム細胞機能の調節:a)昨年度我々は見出したウシ胎児血清によるメサンジウム細胞の脱分極現象が細胞膜のクロールイオンに対する透過性の亢進によるものであることを明らかにした.この脱分極機構はangiotensin II (AII)による脱分極反応の場合と同様である.b)我々は,メサンジウム細胞の電気生理学的特性の検討を進め,nonーselective cation channel,K channel,Cl channelが存在することを確認した.さらに,これらのchannelの生理学的役割を解明する目的で,がこれらのionchannel活性におよぼす影響を検討した.さらに, AII, vasopressin(AVP)投与直後にnonーselective cation channelが一過性に開口し,後れて(Caーactivated)K channelが開口することを見い出した.nonーselective cation channelは細胞外液Caイオンの細胞内への流入経路として生理的に重要な役割を果している可能性が強い.c)本年度我々は血小板粗抽出物中に強力なメサンジウム細胞増殖刺激作用を見出し,現在この因子を精製中である.d)昨年度我々が開発した単一メサンジウム細胞での細胞内Ca濃度測定法を用い,心房性抗利尿ホルモンがAII,AVPによる細胞内Ca濃度上昇に及ぼす影響を検討中である.(2)AVPの腎作用:昨年度我々は,細胞外液Cn濃度の上昇によるAVP依存性cAMP産性の抑制が, adcnylate cyclasc活性を抑制することが知られているGTP結合蛋白(Gi)を介して行われていることを証明した.本年度我々は同様の手法を応用し,髄質集合管におけるα2ーagonist,髄質ヘンレ上行脚におけるPGE2によるAVP依存性cAMP産生の抑制作用がいずれもGiを介したものであることを見出した.(3)細胞増殖因子の尿細管作用:腎におけるEGF産生量に変化を与える可能性のあるモデルとして,片腎摘出ラットを作成しEGF mRNAレベルの変化を検討中である.1.メサンジウム細胞機能の調節(1)クロライドイオンのメカンジウム細胞増殖に対する影響。陰イオンチャンネル阻害剤(DIDS,SITS)を用いてクロライドイオンを含む陰イオンの細胞内への流入を阻害すると、4ミジン取り込み法で見たメサンジウム細胞の増殖が抑制された。この際プロスタグランデインE_2(PGE_2)およびF_2の産生の亢進が見られた。またインドメサシンを前投与するとDIDSによる細胞増殖抑制効果が消失した。以上から、陰イオンチャネルブロッカーのメサンジウム細胞増殖抑制効果はPGの産生を介して行われることが明らかになった。(2)メサンジウム細胞外気質の産生。私達はNathernblat法を用いて、メサンジウム細胞がTGFβを産生することを見いだした。このTGFβによりフィブロネクリン、コラーゲン等の細胞外気質産生の調節がなされる可能性があり、さらに検討を加えている。2.AVPの尿細管作用(1)AVP作用の抑制制蛋白(Gi)にする調節。私達は百日咳毒素を用いてGiの作用を抑制することにより、髄質部ヘンレ上

行脚太い部(MAL)骨髄質部集合管(MCT)にGiが存在し、MCTがα_2adrenergicagovistで、MALでは高カルシウム、PGE_2がそれぞれGiを介してAVP依存性のcAMP生成を抑制することを示した。(2)AVP受容体subtypeの検討のAVPの受容体V_1、V_2と呼ばれるsubtypeが存在するが、私達は尿細管の細胞内カルシウム濃度をFura2を用いて測定することにより、これらの局在と生理的役割を検討し、NCTでV_1受容体が存在することを示唆する所見を得、さらに検討している。3.エンドセリンの腎作用。ラット腎動脈護流系を用いて、エンドセリンの腎作用を検討した。(1)アルギニンバソプレッシン(AVP)の尿細管作用: AVPの受容体にV1,V2と呼ばれるsubtypeが存在することは広く知られている。我々は尿細管細胞において、これらのsubtypeの局在ならびにシグナル伝達機構をfura2による細胞内カルシウム濃度測定を用いて検討した。AVP(V1,V2受容体刺激剤)の投与は、皮質集合管(CCD)、髄質外層集合管(OMCD)、髄質内層集合管(IMCD)における細胞内カルシウムの上昇を引き起こした。また、V2受容体刺激剤であるdDAVPの投与も同様に細胞内カルシウムの上昇を引き起こしたが、AVPとdDAVPの反応の違いからCCDではV1,V2両受容体、OMCDIMCDでは主にV2受容体を介した細胞内カルシウムの上昇のメカニズムが示唆された。さらにこれら細胞内カルシウムの上昇は主に細胞外からのカルシウム流入、しかもDHP感受性カルシウムチャンネルの関与を受けていることが示唆された(J.C.Iin.Invest.submitted,日本腎臓学会'89,アメリカ腎臓学会'89にて発表)。(2)エンドセリンの腎作用:エンドセリンは、近年発見されたホルモンで、強力な血管収縮作用を有し生体の血圧調節、臓器の血流調節等に重要な役割を果たしていることが知られている。我々はエンドセリンのin vivoラット腎動脈注入実験にて、尿量、糸球体濾過量、腎血漿流量を著明に低下させるが尿中総Na排泄率は変化させないことを示した。また、カルシウム拮抗剤であるニカルジピンの投与はエンドセリンの腎作用を抑制することがわかった。さらに、心房性ナトリウム利尿ペプチド(AMP)とエンドセリンの相互作用を検討したところANPはエンドセリンの腎機能低下を著明に抑制することが明らかとなった。一方、エンドセリンのメサンギウム細胞への影響を検討したところ、エンドセリンは細胞収縮作用および細胞内カルシウム上昇、プロスタグランジンE2の増加を認めた。以上のことより、エンドセリンは腎に直接作用して腎機能を低下させるが、これらの作用は、ニカルジピンおよびANPにより抑制されること、メサンギウム細胞が関与することが示唆された(Am.J.Physiol.1990in press)。
コルチコステロイド受容体の神経細胞内ダイナミクス

脳内コルチコステロイド受容体にはグルココルチコイド受容体(GR)とミネラルコルチコイド受容体(MR)の2種類が存在し、いずれもホルモン誘導性の転写制御因子であり、低分子脂溶性ホルモンのコルチコステロイドとの結合により活性化され、細胞質から核へ速やかに移行し、脳内で発生、分化、ストレス応答など多彩な作用を発揮することが知られている。また共通のリガンドであるコルチコステロイドに対して、MRはGRよりもおよそ10倍親和性が高いことも知られており、この親和性の差を反映して恒常状態ではMRが主として活性化されるのに対し、ストレス状況下などコルチコステロイドの分泌が増加した状態ではMRに加えてGRも活性化されると考えられている。しかしながら、ストレスやサーカデイアンリズムなどに伴いダイナミックに変動するホルモン環境に対し、これら2つの受容体がいかにして神経細胞の突起、細胞質から核へ移行し、標的遺伝子の転写を調節するのか、という生物学にとって極めて基本的かつ重要な問題が未だ明確にされていないのが現状である。本研究では、これら受容体が核局在化シグナル(nuclear localization signal ; NLS)を有することから、このNLSを認識する輸送因子であるインポーチンαおよびβに着目した。平成17年度は、海馬培養神経細胞にCFP-GRあるいはCFP-MRとYFP-インポーチンαの種々のサブタイプを共発現させ、コルチコステロイドを投与した際に受容体とインポーチンαが同時に核内へ輸送されるかを、live cell imagingの手法を用いて解析した。その結果サブタイプにより、核輸送に違いがあることが明らかになった。平成18年度は、GRとインポーチンα1あるいはα3は結合するが、これら複合体は樹状突起から細胞体、核の方には輸送されない、という2点に必要な部位の決定を行い、ミュータントを作成した。現在、受容体とインポーチンαとの複合体を核へ輸送するモーター分子を探索する実験が進行中である。

平成18年度は、GRとインポーチンα1あるいはα3は結合するが、これら複合体は樹状突起から細胞体、核の方には輸送されない、という2点に必要な部位の決定を行い、ミュータントを作成し、受容体とインポーチンαとの複合体を核へ輸送するモーター分子を探索していく。脳内コルチコステロイド受容体にはグルココルチコイド受容体(GR)とミネラルコルチコイド受容体(MR)の2種類が存在し、いずれもホルモン誘導性の転写制御因子であり、低分子脂溶性ホルモンのコルチコステロイドとの結合により活性化され、細胞質から核へ速やかに移行し、脳内で発生、分化、ストレス応答など多彩な作用を発揮することが知られている。また共通のリガンドであるコルチコステロイドに対して、MRはGRよりもおよそ10倍親和性が高いことも知られており、この親和性の差を反映して恒常状態ではMRが主として活性化されるのに対し、ストレス状況下などコルチコステロイドの分泌が増加した状態ではMRに加えてGRも活性化されると考えられている。しかしながら、ストレスやサーカデイアンリズムなどに伴いダイナミックに変動するホルモン環境に対し、これら2つの受容体がいかにして神経細胞の突起、細胞質から核へ移行し、標的遺伝子の転写を調節するのか、という生物学にとって極めて基本的かつ重要な問題が未だ明確にされていないのが現状である。本研究では、これら受容体が核局在化シグナル(nuclear localization signal ; NLS)を有することから、このNLSを認識する輸送因子であるインポーチンαおよびβに着目した。平成17年度は、海馬培養神経細胞にCFP-GRあるいはCFP-MIとYFP-インポーチンαの種々のサブタイプを共発現させ、コルチコステロイドを投与した際に受容体とインポーチンαが同時に核内へ輸送されるかを、live cell imagingの手法を用いて解析した。その結果サブタイプにより、核輸送に違いがあることが明らかになった。平成18年度は、GRとインポーチンα1あるいはα3は結合するが、これら複合体は樹状突起から細胞体、核の方には輸送されない、という2点に必要な部位の決定を行い、ミュータントを作成した。現在、受容体とインポーチンαとの複合体を核へ輸送するモーター分子を探索する実験が進行中である。
北海道での環境教育のための移動サンゴ飼育水槽の開発と教材化

まず移動型サンゴ飼育水槽システムの検討を行った。サンゴの主な飼育条件は強い光、安定した水温、貧栄養な水質などである。移動式水槽とするために小型でシンプルかつ維持管理の容易なシステムとして、閉鎖系でかつ濾過システムを持たない、DSB(Deep Sand Bed)方式を採用することにした。これは底砂に細かいサンゴ砂を5cm程度敷いて、底砂とその上に配置したサンゴ岩で硝化と反硝化を担わせるものである。キャスター付の水槽台に水槽を設置し、硝化細菌と反硝化細菌を十分に繁殖させるために約1ヶ月間放置した。照明は高照度のPL管蛍光灯を使用した。硝化の最終生成物である硝酸塩濃度が試薬の検出限界以下で貧栄養状態であることを確認後、キクメイシ(Favia sp.)、タバネサンゴ(Caulastrea sp.)、アザミサンゴ(Galaxea fascicularis)の3種類のサンゴ、そしてヒメジャコガイ(Tridacna crocea)を導入し栄養塩を吸収させるために海藻を移植した。また砂を適度に撹拌して表面のコケと底砂に酸素を供給して硝化を促進するため、ベントス食性のハゼを導入した。数日後アザミサンゴなどの共肉が痩せ始めて明らかに状態が悪化し始めたので、蛍光灯から高輝度が得られるメタルハライドランプに一時的に変更し、生体が新環境に適応・回復するのを待った。約一ヶ月後、生体の状態を確認しつつランプを小さいものに変更し、更に一ヶ月後、蛍光灯に戻し状態が維持されている。その間、展示説明用にサンゴとサンゴ礁を解説したポスターを学生の協力の下、作製した。予算が申請より減額されたため移動展示を実施することができなかったが学内での移動を試行し、何ら問題がないことを確認した。
レジンセメントの歯質接着性向上に寄与する新規化合物の探索

本研究では、象牙質の主要な構成成分であるI型コラーゲンに結合する配列、カルシウムイオンやハイドロキシアパタイトと結合するとされる配列をもつ化合物を利用し、接着性セメントに歯質との化学結合性を付与すること目的とした。様々なオリゴペプチドを合成後、歯面処理材あるいはレジンセメントに添加した試作セメントを作製し、接着強さを微小引張り試験法にて評価した。また、キトサンオリゴペプチドやフッ化ナトリウムを配合した試作レジンセメントを作製し、配合量を考慮することにより接着強さを低下させずに多様の機能を付加することが可能であることを明らかにした。本研究は、歯質、特に象牙質接着と化学的に結合する新規化合物を探索し、機械的嵌合のみならず、化学的にも歯質と結合する接着性レジンセメントの開発を最終目標としている。その手段として、象牙質のコラーゲンや、ハイドロキシアパタイトと結合する機能性低分子化合物を利用することを考案した。本年度は、歯質接着に有効な化合物の選出を開始した。第一段階として、プロテインデータベースから象牙質の主要な構成成分であるI型コラーゲンに結合するモチーフ、カルシウムイオンと結合する領域、骨形成や組織再生にも関わっていることが予想される分子群から可能性のある配列を検索し、ペプチドを合成した。これらのペプチドを歯面処理材あるいはレジンセメントに添加して試作セメントを作製した。ペプチドの安定性、溶解性についても、検討を行っているところである。また、接着強さの評価をするにあたり、接着試験試料の作製法を検討した。コントロールのレジンセメントを使用して、抜去歯との歯冠修復用コンポジット試片との接着方法、接着試料の切断方法について予備実験を行い、安定した試料を得ることができるようになった。来年度は、さらに情報収集を行うとともに、候補の化合物のスクリーニングおよび、試作セメントによる微小引張り接着試験を行い、接着強さの評価を行う予定である。ペプチド配列の詳細および、化合物のセメントへの添加方法については、さらに検討を加える必要があると考えている。本研究は、歯質、特に象牙質と化学的に結合する新規化合物を探索し、機械的嵌合のみならず、化学的にも歯質と結合する接着性レジンセメントの開発を最終目標としている。本年度は、象牙質の主要な構成成分であるI型コラーゲンに結合する領域およびカルシウムイオンと結合する領域のペプチドを合成し、歯面処理材あるいはレジンセメントに添加した試作セメントを作製した。その後、ヒト抜去歯と歯冠修復用コンポジット試片を接着して、微小引張り試験法にて接着強さを評価するとともに、破断面の観察および接着界面のSEM観察を行った。その結果、コラーゲン結合ペプチドペプチドを歯面処理材に添加して使用した試作セメントにて、接着強さの向上を認めた。ペプチドの種類によっても効果に差が認められた。レジンポリマーにペプチドを加えた場合には、接着力の向上は認められず、逆にコントロールのレジンセメントよりも接着強さが低下する場合もあった。従って、セメントへの添加方法について、今後さらに検討が必要である。キトサンオリゴマーを配合し抗菌性を付加する実験では、レジンポリマーに対する配合比6:1の場合に、接着強さに対して有意な低下を与えず、抗菌効果を発揮することが明らかとなった。こちらについてもセメントへの添加方法をさらに検討するとともに、キトサンの作用機序の解明について明らかにし、その特性を考慮した改良セメントの臨床応用について検討していく予定である。本研究では歯質と化学的に結合する接着性レジンセメントの開発を目標として、既に明らかとなっているタンパク質のアミノ酸配列の中から、象牙質の主要な構成成分であるI型コラーゲンに結合する領域、カルシウムイオンと結合する領域、ハイドロキシアパタイトと結合する領域などの配列に着目した。それぞれのオリゴペプチドを合成後、歯面処理材あるいはレジンセメントに添加した試作セメントを作製し、ヒト抜去歯と歯冠修復用コンポジット試片を接着した場合の接着強さを微小引張り試験法にて評価するとともに、破断面の観察および接着界面のSEM観察を行った。本年度は、ペプチドの種類や添加方法を変えて、接着強さを比較検討したところ、レジンセメントそのものに添加するとかえって接着強さを阻害することがあるが、歯面処理材に添加あるいはペプチド液で追加の歯面処理をすることにより効果を得ることができた。しかし、コントロールのセメントと比較した場合に有意差を得ることはできなかった。セメントの多機能化をめざした検討においては、昨年度に引きつづき、キトサンオリゴペプチドを添加したセメントを作製し、抗菌性効果を検討した。さらに二次う蝕抑制効果の付与を目的として、フッ化ナトリウムを配合した試作レジンセメントを作製した。これらの配合が象牙質接着強さに及ぼす影響について検討したところ、配合量を考慮することにより接着強さを低下させずに機能を付与することが可能であることが明らかとなった。
新しい視点(国際比較)による亜急性硬化性全脳炎の発病機構の解析

1.「SSPE(亜急性硬化性全脳炎)の発生を各国の間で比較する」(1)頻度:15歳未満の人口百万当たりのSSPEの年間発生頻度はカラチでは日本の15-25倍であることを明らかにした。パプアニューギニア(PNG)ではカラチの数倍の値が報告されている。(2)SSPEにおける麻疹罹患年齢:カラチでは日本に比べその平均値が高く、0-1歳罹患者の割合が少なく、2歳以上罹患者の割合が多いことを明らかにした。(3)潜状期(麻疹罹患からSSPE発病までの期間)の長さ:SSPE全体ではカラチと日本でほとんどちがいはないが、麻疹罹患年齢の低い者では潜状期が長く、高い者では潜状期が短い傾向がカラチでみられたのに対し、日本では麻疹罹患年齢層によるそのようなちがいがないことを明らかにした。2.「その背景要因を各国の間で比較する」麻疹予防接種の普及度:導入年代はパキスタンが1970年代、日本が1967-71年であり、本格的導入はパキスタンにおけるEPI開始が1981年、インドネシア(IDN)におけるEPI開始が1981-82年、PNGにおけるEPI開始が1982年、日本における義務化が1978年であり、普及率の到達度は現在パキスタン80%、IDN90%、PNG48%、日本74%である。予防接種の臨床的有効性はパキスタン75%、IDN98%、日本98%とパキスタンが劣っている。3.「危険因子の所在を各国の間で比較する」カラチでは麻疹罹患年齢を問わず日本よりSSPE発病のリスクが大であるが、特に5歳以上での麻疹罹患者においては日本と比べきわめて大きなリスクがあることを明らかにした。亜急性硬化性全脳炎(subacute sclerosing panencephalitis, SSPE)は麻疹ウイルス変異型(M蛋白産生欠損)によって起こる致死的脳炎である。通常、麻疹(はしか)にかかった小児のごく一部に、数年の潜伏期を経て発病する稀少な疾患である。持続感染の機構や抗ウイルス中和抗体の存在下におけるウイルス増殖の機構など、興味ある未解決の課題を多く含んでいる。1.1982年以来、実施してきたウイルス性脳炎(SSPEを含む)日パ共同研究の過程で、SSPEの多発、大半のSSPE患者が2歳以後に麻疹に羅患していることなどパキスタンにおける特異点が鮮明になってきた。2.これらの結果とこれまでに集めた日本の資料との対比により、麻疹羅患後のSSPE発病のリスクが日本に比べ大きく、そのリスクに麻疹羅患年齢により差異がない点、日本と異なることを明らかにした。以上より、SSEPの発病機構の解析には、異なる地域の間の比較(発生率、背景要因など)が、同じ地域内での研究のみでは得られない新しい視点を与えることが判明してきた。SSPE発生における地域特有のリスクを明らかにすることによって、SSPEの発病機構の解析を進めることを目的として、本年度は(1)パキスタンにおける研究データ・資料の整理と、(2)日本および諸外国の資料を入手・整理を実施した。1.パキスタンにおける研究データ・資料の整理(1)1982-93年にパキスタンで集めた137例のSSPE患者に関するデータ、(2)パキスタンにおける麻疹発生の資料、(3)パキスタンにおける麻疹ワクチン接種に関する資料・データ、(4)小児免疫能データ、(5)住民HLAパタンに関するデータ。2.日本の資料を下記について入手・整理

(1)麻疹の発生(頻度、羅患年齢分布、年次的変化)、(2)麻疹ワクチン(普及率)、(3)SSPEの発生(頻度、発病年齢、分布、麻疹羅患歴、SSPEの潜伏期間、性比、激症例比率、麻疹抗体値度、年次的変化)1.パキスタン国カラチで1982-96年の間に実施した調査研究の結果とインドネシア国(IDN)とパプアニューギニア国(PNG)で1996-97年に実施した予備調査の結果と、文献に報告されている日本における実態とに基づき、亜急性硬化性全脳炎(SSPE)の発生状況、その背景要因および危険因子の所在を、各国の間で比較した。2.その結果、SSPEの発生に基づき、(1)15-20歳未満人口当たりのSSPEの年間発生に、カラチ2.9-14、PNG65、日本0.17-0.57の差異、(2)SSPE患者の麻疹罹患年齢の平均に、カラチ2.5(±2.1)歳、日本1.27(±1.52)歳の差異、2歳以上罹患麻疹(late measles)の割合に、カラチ65%、日本29%の差異、(3)SSPE全例の潜伏期の長さに、カラチ7.6(±3.8)歳、PNG5.3歳、日本7.4(±3.0)歳の差異、潜伏期の長さに、カラチでは2歳未満罹患麻疹(early measles)で8.5(±3.5)歳、late measlesで6.9(±3.8)歳と麻疹罹患年齢による違いがみられたのに対し、日本ではそのような違いがないという差異、(4)SSPE発病時の発熱者の割合に、カラチ25%、日本0%の差異、(5)激症例の割合に、カラチ33%、日本9%と言う差異を見出した。3.背景要因につき、(1)麻疹予防接種導入年次にカラチ1981年、IDN1981-82年、PNG1982年、日本1967-71年(義務化1978年)の違い、(2)麻疹予防接種普及率が70%に達した年次にカラチ1985-89年、日本1989年、IDN1989-90年、PNG未到達の違い、(3)麻疹の致死率にカラチ2-6.5%、IDN0.5-15.9%、日本0.1%未満の違いを見出した。
教職協働を実現するPBLを利用した大学職員の能力開発に関する研究

■課題設定の背景と研究の目的2008年、中教審『学士課程答申』は、多様な学生に対応するためにサービスラーニングの拡充を求めた。ことにより職員が教育に直接参画(教育の教職協働)することとなったが、これは同時に教員から職員への責任委譲が含まれた。しかしながら、教育・学生支援の場で責任の委譲が推し進められるほど職員の専門性と信頼性が担保されているとは言いがたく、SDの充実化が急務の課題と位置付けられた。そこで、この研究では、新たな教職協働に関わる人材育成をテーマに掲げ、職員の能力開発プログラムに目的活動を促す「PBL(Project-Based Learning)」を利用したSD研修の有効性を検証するものである。■研究方法1.教職協働に関する先行事例を概観し、特徴的な大学を数校抽出しインタビュー調査を行う。2.特徴的な研修会に参加し、SDプログラムの実施方法及びPBLの展開の仕方を取得する。3.PBLを導入した研修会を行い、その効果を経済産業省「社会人基礎力」の評価指標を利用し測定する。■研究成果インタビューの結果、教職協働は、教員と職員の分業により効果的に且つ効率的に成果を挙げるために行われることに収敷され、それに必要なスキルはSD研修で養成されていることが明らかになった。大学教育におけるPBLは、医歯薬学系で確立されたProblemベースが大半である。この学習法には、クリアしなければならない課題が予め盛り込まれているのが特徴である。また、大学職員を対象とする大学院(名城大学、名古屋大学)では、Projectベースのプログラムが導入されているが、成果の検証については今後の課題となっていることを確認した。そこで、評価まで行われていることを鑑みて、Problemベースの研修プログラム(テーマ「多様な学生への対応策の構築」)を自学の教職員(教36/職10名)に対し実施した。その結果、研修そのものが教職協働となったとの評価を得ることが出来たと共に、社会人基礎力の「働きかけ力」「課題発見力」「状況把握力」が受講者の80%を超えて身についたとの結果が得られ、その有効性が確認出来た。
テーテンス主要著作の読解を基礎としたカントと経験主義との関係の再検討

カントと経験主義との関係を再検討するために、ヨハン・ニコラウス・テーテンスの哲学的著作を精査した。その成果として、次の2点が挙げられる。第一に、テーテンスが、観察的な方法に依拠して、経験の可能性の制約を析出しようとしていたことを明確化した。この点に、カントとテーテンスの共通の目標を見出すことができる。第二に、テーテンスの観察哲学が、カント『純粋理性批判』にどのような影響を与えたのかを解明した。結果的に、ある特定のタイプの18世紀ドイツ経験主義とカントとの間に、密接な関係があることが明らかとなった。平成25年度の活動は、1)海外での資料収集、2)読解作業、3)発表の3つに分けられる。1)3月から8月にかけて、キール大学の研究者と連絡を取り、資料収集のために有益な情報を揃えた。これに基づいて、8月、ドイツに赴き、ベルリン国立図書館、キール大学図書館、ショレスヴィッヒ・ホルシュタイン州立図書館にて、国内で入手困難な文献の複写を行った。具体的には、1900年前後に出版されたテーテンス関連の博士論文、著作集に収められていないテーテンスの著作群、テーテンスの著作の書評、テーテンスの書簡である。キール大学では当地のテーテンス研究者とディスカッションをする機会もあり、今後の研究を進める上で有意義であった。2)上記の活動をふまえて、テーテンスの『人間本性とその展開に関する諸試論』を読解した。読解から「認識の成立における判断の働き」というトピックにおいて、トマス・リード、テーテンス、カントの間に、いわば議論の積み重ねともいえる展開が見いだされること、テーテンスの「創作力(Dichtkraft)」論とカントの「図式論」との関連が、両者の幾何学的概念のとらえ方に着目すると明確になること、そして18世紀後半におけるドイツの思想状況を読み解くにあたって、心の能動性と受動性の問題が一つの軸になりうることが明らかになってきた。豊富な参考文献を収集したことで、読解の精度、質を高めることができた。3)この成果を、カント研究会第279回例会において「カントとテーテンスーtranszendent(al)をめぐって」というタイトルで発表をした。国内のカント研究者と質疑応答を行い、今後の研究のために有益な示唆を多く得た。このほか18世紀ドイツの大学の情況に焦点を絞った「近代的大学創設期におけるドイツの大学論と市民的責任感の育成」という論文(加野・葛城編『高等教育における市民的責任感の育成』所収)を発表した。本研究は、(1)テーテンスの認識論の全体構造を解明し、(2)それを踏まえてカント認識論の成立過程、および内的構造について改めて考察し、(3)さらに18世紀のドイツ哲学の枠組みの中でのカントの位置の再検討を行うことを狙っている。平成24年度は、特に(1)と(2)に関わる研究を行った。まず、テーテンス『一般思弁哲学について』(1775)を詳細に読解し、この書がカント『純粋理性批判』(1781)に与えた影響を、特に「超越論的(transzendental)」という概念を軸に考察した。この研究の成果が、論文「テーテンス『一般思弁哲学について』とカント」(『香川大学教育学部研究報告第I部』第139号所収)である。一連の作業から、カントの超越論的哲学を18世紀ドイツ哲学史に改めて位置付けるための一定の見通しを得た。今後はテーテンスのもう一つの主著『人間本性とその展開についての哲学的試論』(1777)の読解をもとに、上記の見通しを実質化していくことが課題となる。さらに「『純粋理性批判』「図式論」の役割とその哲学史的位置について」という題目で口頭発表を行い、このテーマに関してカント研究者諸氏と議論を行った。この発表では、カントのカテゴリーの理論とカント以前の概念論との連続性を明確化し、近世哲学における概念をめぐる論争という文脈に沿って「図式論」を読解することを試みた。ここでは、「想像力」、「抽象」といった概念がポイントとなるが、今後はこれらの概念についての研究と、上述の「超越論的哲学」に関する研究とを有機的に関連付けることも課題となる。本年度の研究成果は、前年度までに行った、テーテンスの二つの主著、『一般思弁哲学について』(1775)と『人間本性とその展開についての諸試論』(1777)の読解を踏まえて執筆した二つの論文である(「テーテンスとカントー超越的/超越論的をめぐって」(日本哲学会編『哲学』第66号掲載)、「テーテンス『人間本性とその展開についての諸試論』とカント」(『香川大学教育学部研究紀要』第一部第

143号掲載))。前者では、『一般思弁哲学について』の中心概念である「超越的(transzendent)」の意味が、『純粋理性批判』の「超越論的(transzendental)」へとどのように引き継がれていったのか、明らかにした。論文の中で、テーテンスが「観察」という方法に依拠しつつ、経験の成立条件の析出を目指している点で、ヴォルフの立場とは区別されることを明確化したが、これは当時の状況を「ヴォルフ主義的な経験主義的潮流」VSカントという図式で読み解く従来の研究手法が不十分であるを示すものでもある。後者では、『人間本性とその展開についての諸試論』の第一部全体の見取り図を描くとともに、そこで展開されている経験的心理学が、『純粋理性批判』の「超越論的演繹論」の構成に与えた影響を解明した。「超越論的演繹論」(特に第1版)において、カントは心の能力の使用を「経験的」と「超越論的」に区別しているが、この「経験的使用」において、テーテンスの経験的心理学的考察を積極的に受け入れていることが確認できる。しかし、これはあくまでも上記の使用の区別を前提にしてのことであり、カントの超越論的な考察の中に経験的心理学が混入しているわけではない。こういった点が明らかとなった。西洋哲学史平成25年度の最大の課題であったドイツでの資料収集も、首尾よく終えることができた。文献を入手したことももちろんだが、ドイツのテーテンス研究者と意見交換を行うことができた点も、今後の研究の進展を促すものである。また読解作業においても、研究実績の概要において示した一定の成果を得ており、年度末にはこの成果を発表することもできた。本研究は、(1)テーテンス認識論の全体構造を解明し、(2)それを踏まえてカント認識論の成立過程、および内的構造について改めて考察し、(3)さらに18世紀ドイツ哲学の枠組みの中でのカントの位置の再検討を行うことを狙っている。交付申請書では、平成24年度に、全体の基礎作業としてドイツで資料収集を行うこと、そして(1)を達成すべく、テーテンスの主要著作、Ueber die allgemeine speculativische Philosophie(1775)、Philosophische Versuch ueber die menschliche Natur und ihre Entwicklung(1777)を精読すること、を計画していた。ドイツでの資料収集については、本務校の業務の関係で平成24年度中に行うことができなかったので、研究費の繰り越しを行い、平成25年度中に行う。テーテンスの主要著作の読解は計画通り進んでおり、その成果の一部を論文として『香川大学教育学部研究報告第I部』第139号に掲載することができた(「テーテンス『一般的思弁哲学について』とカント」)。また計画では、平成25年度にカントがテーテンスのアイデアをどのように摂取し、変容させたかを検証する、としていたが、平成24年度に行った口頭発表「『純粋理性批判』「図式論」の役割とその哲学史的位置について」は、一部この内容に関わる部分を扱った。また計画にはなかったが、キール大学で行われている、テーテンスの講義ノート編集プロジェクトの主要メンバーとコンタクトをとり、情報交換を行うことができた。このことは、今後の研究を進めるにあたって非常に有益であった。
組織工学的再生技術によるハイブリッド型循環器系組織の開発

(1)ハイブリッド血管:セグメント化ポリウレタンの管状薄膜にエキシマレーザーで多孔化による技術及び多孔化にする最適コンプライアンスを与える設計をする。また、これを階層的にコラーゲンのゲル内及びゲル上に播種して管状構造化するデバイス及び技術は独自に開発している。本研究の中核課題のエラスチン層状構造を有する"中膜"層は、合成エラスチンの冷水溶液を37度に加熱したハイブリッド外膜にコーティングしてから平滑筋細胞を含む冷コラーゲン溶液をコーティングして37度に加熱することにより薄膜形成させ、ついでこれを数回繰り返して層状エラスチン間に平滑筋細胞を含んだ"中膜"を形成させる。エラスチン溶液をコーティングして厚い"人工内弾性板"を形成させ、コラーゲンとヘパリンよりなる"人工基底膜"を形成させる。最後に内皮細胞を生着させる。2)ハイブリッド弁:三尖弁型のメッシュ型シートを作成する。これに血管壁の線維芽細胞を混和したコラーゲン・ヘパリン混合溶液を染み込ませてコーティングする。培養し、自己収縮した高密度ハイブリッド組織薄膜を三尖弁型メッシュ内外に形成させる。ついで拍動を起こす流体力学モック回路の中に組み込み、流れの解析装置で観測しながら、培養液と酸素付加状態で拍動を加える。経時的に細胞及びマトリックスが高密度・高配向するのを観測する。ついで内皮細胞を播種し、単層被覆させた後、同様な流体力学的ストレスを加え、血管内皮細胞の脱落及びハイブリッド組織の破壊がないことを確認する。(3)ハイブリッド心筋:既に開発した高密度・高配向の繊維状ハイブリッド骨格筋組織にパルス電気刺激を加えて、収縮応答性を調べる。上記のハイブリッド組織形成時に血管内皮細胞のみに作用する細胞成長因子を包埋し、この組織内を皮下組織に植え込み、毛細管血管が誘導されたかどうか検証する。(1)ハイブリッド血管セグメント化ポリウレタンの管状薄膜にエキシマレーザで多孔化する技術及び多孔化による最適コンプライアンスを与える設計をした。犬頚静脈より内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞を個別に採取し、大量培養する技術は既にこの数年間で確立し、ルーチン的に使用した。また、これを階層的にコラーゲンのゲル内及びゲル上に播種して管状構造化するデバイス及び技術は独自に開発した。本研究の中核課題のエラスチン層状構造を有する"中膜"層は、合成エラスチンの冷水溶液を37度に加熱したハイブリッド外膜にコーティングしてから平滑筋細胞を含む冷コラーゲン溶液をコーティングして37度に加熱することにより薄膜形成させ、ついでこれを数回繰り返して層状エラスチン間に平滑筋細胞を含んだ"中膜"を形成させた。エラスチン溶液をコーティングして厚い"人工内弾性板"を形成させ、コラーゲンとヘパリンよりなる"人工基底膜"を形成させた。(2)ハイブリッド心筋既に開発した高密度・高配向の繊維状ハイブリッド骨格筋組織にパルス電気刺激(電極としてfield電極又は組織内に密着あるいは挿入)を加えて、収縮応答性(収縮力、収縮弛緩サイクル及び耐疲労性)を調べた。このために、変位センサを組み込んだ繰り返しパルス発生器及び解析装置を特別仕様で設計・製作した。上記のハイブリッド組織形成時に血管内皮細胞のみに作用する細胞成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor)を包埋し、この組織内を皮下組織に植え込み、毛細管血管(Angiogenesis)が誘導されたかどうか検証した。(1)人工基材の構造的設計:生体内の力学的ストレス場をin vitroで模倣し、且つin vivoで検証出来る基材を開発した。