hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電気化学センサーを用いた薬物作用のin situモニタリング

高感度・高選択性の微小化アセチルコリンセンサーを開発し、覚醒マウスの海馬におけるアセチルコリン濃度の変動をその場で追跡した。また、カリウムセンサーや酸素電極などの電気化学センサーを利用して、ポルフィリンやクロリン系光増感剤がいかに細胞膜を光不活性化するかを解明した。さらに、溶血活性の低い膜作用性抗菌物質(シクロデキストリン誘導体)や細菌膜に存在するメナキノンと相互作用し、細菌膜の透過性を亢進する新規抗生物質(ライソシン)の作用機構解明にカリウムセンサー法が有効であることを示した。本年度得られた研究成果は以下の通りである。1.イオンセンサー法を用いて脳内アセチルコリン濃度を計測するためにセンサーの微小化・高感度化を検討した。センサー膜は、イオン交換体(テトラキス[3,5-ビス(2-メトキシヘキサフルオロ-2-プロピル)フェニル]ホウ酸ナトリウム)、膜溶媒(2-フルオロ-2'-ニトロジフェニルエーテル)及びポリ塩化ビニルをテトラヒドロフランに溶解させた溶液を、内径0.2 mm、外径0.4 mmのテフロン製のチューブの先端に浸し、チューブ内に溶液を導入させ、その後テトラヒドロフランを蒸発させて作製した。チューブ内に入れる電解質溶液を検討した結果、コリンを低濃度含む溶液が最適であり、生理食塩水中で0.3μMの検出下限を与えた。今後、脳内アセチルコリン濃度のin situ測定を目指して研究を進めていく。2.構造類似の一連のポルフィリン(プロトポルフィリン、メソポルフィリン、デューテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン)の細菌に対する光不活性化作用を比較検討するために、カリウムイオンセンサー、酸素電極、テトラフェニルホスホニウムセンサーを用いて、それぞれ膜透過性亢進作用、呼吸阻害、膜電位変化を「その場」で測定した。これらのポルフィリンが引き起こす光不活性化作用の強さは、細胞膜への進入能力の指標となる赤血球の形態変化を引き起こす強さと、よい相関関係があることを見出した。また、新たに合成したシクロデキストリン誘導体などの膜作用性薬物の細菌に対する作用を直接的に評価するために、カリウムイオンセンサーを用いた膜透過性亢進作用の測定と生存率の評価を同時に行った。膜作用性薬物ではこれらの間に強い相関関係がみられ、抗菌作用機構の解明にカリウムイオンセンサー法が有効な測定法であることが示された。1.昨年度の研究実施状況報告書に記載した微小化・高感度化させたアセチルコリンセンサーに関して、時間応答性を検討した。その結果、センサーの応答速度は50ミリ秒以内であり、既存の測定法に比較しても良好であった。次に微小化したアセチルコリンセンサーを用いて、脳内アセチルコリン濃度のin situ測定を試みた。記憶・学習に重要な領域であり、てんかん発作の好発部位でもある海馬に着目し、覚醒マウスの海馬にアセチルコリンセンサーを設置した。海馬への投射部位として知られる乳頭体上核を抑制すると、海馬アセチルコリン濃度が上昇することを見出した。すなわち、乳頭体上核から海馬へは、アセチルコリン性神経伝達が存在することが明らかとなった。2.構造類似の一連のクロリン系光増感剤の細菌に対する光不活性化作用を、膜透過性亢進作用、呼吸阻害、膜電位変化の観点から、それぞれカリウムイオンセンサー、酸素電極、テトラフェニルホスホニウムセンサーを用いて検討した。その結果、クロリン系光増感剤は、これまで検討してきたポルフィリン系色素と同様に、細菌膜に対して膜透過性亢進や呼吸阻害を引き起こし、膜電位を消失させることで細菌を不活性化させることが明らかとなった。また、カイコを用いたアッセイ法から見出された新規抗生物質ライソシンの作用機序の解明にカリウムイオンセンサー法を適用した。その結果、ライソシンは、細菌のエネルギー生産に関わる電子伝達系の補因子として利用されるメナキノンと相互作用して細菌細胞質膜の透過性変化を引き起こし、抗菌作用を発現することが明らかとなった。3.その他、グルコースセンサーの高感度化を過酸化水素の電気分解を促進させる触媒探索の観点から進めた。最終年度および研究期間全体で得られた研究成果は以下の通りである。1.アセチルコリンセンサーの開発と応用:最終年度は、主に、開発したアセチルコリンセンサーを用いて脳内の自発的なアセチルコリン変動を測定した。覚醒マウスの海馬にセンサー電極を設置し、頭部固定下でのアセチルコリン変動を測定したところ、時間と共にセンサー電位が低下することを見出した。研究期間全体では、サブμMレベルのアセチルコリンを測定できる高感度センサーを開発し、さらに微小化することで脳に適用可能なセンサーに改良し、覚醒マウスの海馬における刺激誘発性さらには自発性のアセチルコリン変動を明らかにした。2.センサー法を利用した細胞膜を標的とする薬物の作用機構の解明:最終年度は、主に、クロリン系光増感剤の光不活性化作用を、赤血球の形態変化と関連づけて検討した。その結果、赤血球膜に大きな損傷を与えたクロリン系色素は、赤血球の形態をエキノサイト型に変形させたことから、膜脂質二重層の外層部分に蓄積したクロリンが光不活性化作用に関与していることを明らかにした。

研究期間全体では、ポルフィリンやクロリン系光増感剤は、1細菌膜に対して膜透過性亢進や呼吸阻害を引き起こし、膜電位を消失させることで細菌を不活性化させること、2光不活性化作用の強い光増感剤は赤血球の形態をエキノサイト型に変形させることを明らかにした。3.その他、研究期間全体では、シクロデキストリン誘導体や新規抗生物質ライソシンなどの膜作用性薬物の抗菌作用発現機構の解明にカリウムセンサー法が有効であることを示した。また、酵素センサーの高感度化を、過酸化水素の電気分解を促進させる触媒探索の観点から進めた。高感度・高選択性の微小化アセチルコリンセンサーを開発し、覚醒マウスの海馬におけるアセチルコリン濃度の変動をその場で追跡した。また、カリウムセンサーや酸素電極などの電気化学センサーを利用して、ポルフィリンやクロリン系光増感剤がいかに細胞膜を光不活性化するかを解明した。さらに、溶血活性の低い膜作用性抗菌物質(シクロデキストリン誘導体)や細菌膜に存在するメナキノンと相互作用し、細菌膜の透過性を亢進する新規抗生物質(ライソシン)の作用機構解明にカリウムセンサー法が有効であることを示した。1.微小化・高感度化させたアセチルコリンセンサーを用いて、脳内アセチルコリン濃度変化を「その場で」定量することができた。2.さらに、センサー法は、様々な色素の光不活性化作用機構の解明や膜作用性薬物の抗菌作用発現機構の解明に応用できることを示した。物理系薬学開発したアセチルコリンセンサーを用いて、脳内アセチルコリン濃度変化を詳細に検討する。さらに、色素全体の光不活性化機構や膜作用性薬物の作用機構の解明のためにセンサーの応用研究を進めていく。また、グルコースや乳酸センサーの高感度化も並行して進めていく。1.微小化・高感度化させたアセチルコリンセンサーが開発できたことにより、これからの研究の進展が期待できる。2.今年度得られたポルフィリンによる光不活性化作用の結果を踏まえて、今後、光線力学療法などに用いられているポルフィリンオリゴマーなどの作用機構解明に展開できると考えている。また、カリウムイオンセンサー法を用いた膜透過性亢進作用の測定と生存率の同時評価は、今後、様々な膜作用性薬物の抗菌作用機構の解明に応用できると考えている。物品費の金額調整ができず、僅かな未使用額(82円)が生じた。開発したアセチルコリンセンサーを脳内アセチルコリン濃度測定に応用する。さらに、酵素電極を用いたグルコース濃度測定法の開発なども並行して進めていく。また、ポルフィリンオリゴマーなどを用いて、色素全体の機構解明を目指して検討する。また、膜作用性薬物の作用機構解明のために、細胞質からのカリウム流出と細菌の生存率との同時測定を進めていく。次年度、物品費に使用する。細菌に対する薬物作用の研究を遂行する上で、現在、細菌保存用の超低温フリーザーは他の研究室にあるものを借用しているが、今後より活発に研究を進めるために、超低温フリーザーの購入が必要となり、次年度使用額が生じた。上述した超低温フリーザーを購入する予定である。
老星ジェットの探査と超精密解像観測

「宇宙の噴水」と呼ばれる進化末期の恒星から放出される水蒸気メーザー放射を伴う高速双極ジェットが付随する天体について研究を進めた。そのうちの1天体からは二重螺旋状パターンを示すジェットを発見し、年周視差計測から距離を直接推定する事ができた。一方別の天体では、一酸化炭素輝線の高速度成分を電波スペクトルから発見し、同時に異様に小さい^<12>CO/^<13>CO電波強度比を確認した。これらの結果から、「宇宙の噴水」を作り出す恒星は比較的質量の大きい(2-8太陽質量)ものであり、恒星ジェットがその後形成される惑星状星雲の形状形成に大きく関わるという確証を得た。恒星の進化末期には激しい質量放出がなされる。宇宙における“物質の輪廻"に大きく関わるこの現象は、実は極めて複雑である。特に、恒星は極めて球形に近いにも関わらず、宇宙空間にまき散らされるガスの分布や運動が球対称的なものから著しく異なることは、注目に値する。これは、まき散らされたガスが電離されてできた惑星状星雲の形状から確認できる。では、このような質量放出現象の非球対称性は、恒星進化途上の何時どのように発現するのか?本研究テーマは、星周ガス分布/運動の非球対称性を生み出す主要因と考えられる恒星からの細長い高速ガス放出流(ジェット)が、何時どのように駆動され発現するのかを解明することである。本年度では主に、(1)「宇宙の噴水」天体に付随するジェットや星周ガス縁から放射される一酸化炭素輝線の探査、(2)同領域からの水蒸気メーザー及び水酸基メーザースポット群の三次元運動の解明、(3)「宇宙の噴水」天体の距離と銀河系中での運動の計測を行った。その結果は以下にまとめられる。(1)水蒸気メーザーに見られる高速ジェットとほぼ同じ膨張速度を示す一酸化炭素輝線を検出し、細く絞られたジェットの生成と共にジェットとの垂直面に近い方向からも高速のガス流(赤道流)が形成されることを見いだした。老星からの質量放出のスピードが最高潮に達した時にジェットが形成される、あるいはジェット形成の副産物としてこのような赤道流が発生することが確かめられた。(2)前述(1)を支持するように、水蒸気メーザースポット群の運動に見られる双極ジェットの発生源と、水蒸気及び水酸基メーザースポット群の運動に見られる赤道流の発生源とで、それら位置が数10AU以内で一致することを見いだした。(3)「宇宙の噴水」天体の1つで年周視差計測に成功した(約13,000光年)。この天体の質量やジェットの実サイズを直接推定できただけでなく、この天体の軌道が銀河系回転の方向に良く一致していることを見いだした。どうやら「宇宙の噴水」天体は、比較的大きな質量を持つ星であることが推察された。これらのことは、それぞれ異なる質量を持つ恒星がその後それぞれどのような進化を遂げて星周空間に異なる影響を与えるのかを理解するのに大いにつながるものである。特に、太陽やそれよりやや重い星々の進化とそれらの星々による星周物質の進化の解明へとつながることが期待される。宇宙における"物質の輪廻"に大きく関わるこの現象は、実は極めて複雑である。本年度では主に、(1)同領域からの水蒸気メーザー及び水酸基メーザースポット群の三次元運動の解明、(2)「宇宙の噴水」天体の距離と銀河系中での運動の計測を行った。(1)観測されたジェットの1つが螺旋運動を伴っている可能性を見いだした。このような動きは、ジェットが磁気流体力学的な作用を受けていることを示唆するが、確実な結論を得るにはさらなる詳細な調査が必要である。(2p)「宇宙の噴水」天体や関連する天体、併せて3天体について、正確な年周視差計測に成功した。これらの天体の質量やジェットの実サイズを直接推定できただけでなく、軌道も銀河系回転の方向に良く一致していることが、去年度よりも高い確度で示された。

これらのことは、それぞれ異なる質量を持つ恒星がその後それぞれどのような進化を遂げて星周空間に異なる影響を与えるのかを理解するのに大いにつながるものである。特に、太陽やそれよりやや重い星々の進化とそれらの星々による星周物質の進化の解明へとつながることが期待される。恒星の進化末期には激しい質量放出がなされる。宇宙における"物質の輪廻"に大きく関わるこの現象は、実は極めて複雑である。特に、恒星は極めて球形に近いにも関わらず、宇宙空間にまき散らされるガスの分布や運動が球対称的なものから著しく異なることは、注目に値する。では、このような質量放出現象の非球対称性は、恒星進化途上の何時どのように発現するのか?本研究テーマは、星周ガス分布/運動の非球対称性を生み出す主要因と考えられる恒星からの細長い高速ガス放出流(ジェット)が、何時どのように駆動され発現するのかを解明することである。本年度では主に、(1)このような天体に付随する水蒸気メーザーメーザースポット群の三次元運動の解明、(2)「宇宙の噴水」天体の距離と銀河系中での運動の計測、さらに(3)一酸化炭素輝線分光観測によるジェットの全体像の把握、を行った。その結果は以下にまとめられる。(1)観測されたジェット天体の1つで、見かけ上二重螺旋構造を持つジェットを発見した。このようなパターンは、ジェットが磁気流体力学的な作用を受けてガス放出しつつ、その主軸が歳差を伴っており、さらに、1つの天体が断続的にジェットを放出していることを示唆する。(2)「宇宙の噴水」天体や関連する天体、併せて3天体について、正確な年周視差計測に成功した。そのうち2件は査読論文として報告した。(3)一酸化炭素輝線も水蒸気メーザー同様に高速度成分をもち、かつ^<12>CO/^<13>CO強度比が極端に低いことも示された。どうやら「宇宙の噴水」天体は、比較的大きな質量を持つ星であるらしい。特に、太陽よりやや重い星々の進化とそれらの星々による星周物質の進化の解明へとつながることが期待される。
電磁場観察・探針導入・微細加工技法を融合させたTEMの先端材料評価法の確立と応用

近年、絶縁体のエポキシと導体であるAgの凝集体で構成される導電性Agペーストにおいて、導電機構の基礎的な理解が渇望されている。硬化直後の導電性AgペーストのI-V曲線は非線形であり、所定の電流を通電した後では、オームの法則に従う線形のI-V曲線を示す。このような、通電に伴うI-V特性の不可逆的な変化は、通電に伴う新たな導電経路が形成されることを示唆している。そこで、本研究では、TEM内で薄膜化した導電性Agペーストに、Pt-Ir微小電極により電流を局所的に流し、通電前後で生じる導電性Agペースト内の微細構造・電気抵抗値・電場の変化を評価した。電流1μAを流した結果、電気抵抗値が半分以下に低下し、Agの凝集体の形態がエポキシとの界面で僅かに変化している箇所が確認できた。また、電子線ホログラフィーにより、電圧印加時の導電性Agペースト内の電位分布像の可視化に成功した。通電前後の電位分布像の観察からAgの凝集体の電位を解析した結果、エポキシを介して隣接する一部のAgの凝集体間で電位が等しくなる様子が確認でき、通電により新たな導電経路が形成されると考えられ、Agペーストの導電機構に関わる重要な知見が得られた。また、TEM内での局所導電性評価手法を金属などの低電気抵抗率の材料に応用するため、ピエゾ駆動2探針ホルダーに四端子回路を敷設した。その結果、抵抗の測定精度が少なくとも10^<-2>Ω以下であり高精度化か達成された。さらに、測定空間分解能を向上させるため、カーボンナノチューブ探針の作製も行い、薄膜試料への安定したポイントコンタクトを実現し、TEM内局所導電性評価手法の高度化が図れた。本研究では、導電性Agペースト等が抱える本質的な問題を解決するため、試料の微細加工・電磁場の可視化・探針の操作を融合した電子顕微鏡周辺技術の高度化を行った。近年、絶縁体のエポキシと導体であるAg粒子で構成された導電性Agペーストは、環境に優しい実装材料として注目されており、Pbフリー化が望まれる高温はんだの代替材料として期待されている。Agペースト内部の導電機構は、いまだ明らかになっておらず、今後高い電気伝導度を持つ導電性Agペースト材料の開発に向けた導電機構の基礎的な理解が渇望されている。一般的に、導体であるAgを高く充填すると電気抵抗の低下が期待されるが、過剰なAg粒子の充填により逆に電気抵抗が上昇する事が報告されている。そこでAg粒子のマクロな分散状態と導電経路の発達状況を調べるため、Ag粒子充填率が異なる80,88,92,94wt%の試料について、SEM及びTEMによる形態評価を行った。その結果、Ag粒子充填量の上昇に伴いAg粒子同士の接続が発達していたが、過剰なAgが充填された92,94wt%の試料では空孔が散見された。この形態的変化が電気抵抗値上昇の要因であると考えられる。さらに、TEM内での探針を利用した電気的な評価や、電子線ホログラフィーを利用した導電性Agペースト内の電場評価を行うため、FIBを利用して作製した導電性Agペーストの薄膜状試料を、先端を平坦化したSTM用Pt-Ir探針に保持させ、電子線による帯電を大幅に低減させた試料の作製に成功した。本試料では探針による局所的な電気計測も可能であり、エポキシ中で離れたAg粒子間のI-V計測を実現した。また、帯電が少ない本試料では、電子線ホログラフィーによる電場評価が可能になり、電圧印加前後の位相情報の差し引きすることで、内部ポテンシャルによる位相変化を除去した電位分布像が得られた。

さらに、測定空間分解能を向上させるため、カーボンナノチューブ探針の作製も行い、薄膜試料への安定したポイントコンタクトを実現し、TEM内局所導電性評価手法の高度化が図れた。
超分子ヒドロゲルの階層的ダイナミクスに基づくゾル－ゲル転移の制御

超分子ヒドロゲルは、自己組織性の低分子(ゲル化剤)から形成される。超分子ヒドロゲルを機能性材料として応用展開するためには、ゾルーゲル転移を正確に理解し、制御することが必要である。本研究では、超分子ヒドロゲルのゾルーゲル転移と繊維状会合体の形態、凝集状態、およびそれらの動的な挙動とゾルーゲル転移の関係を明らかにすることを目的とした。これまでに、繊維状会合体およびその凝集状態の制御に関する研究を実施し、さらに、繊維状会合体の動的挙動についても検討した。その結果、繊維状会合体の融合はある程度抑制されており、ゾルーゲル転移に要する時間は繊維状会合体の形態、ひいてはその拡散に強く依存することが示された。本年度は、ゲル化剤の化学構造に基づきゾルーゲル転移に要する時間が異なるゲルを作製し、ゲルの構造・物性とそれらの不均一性を検討した。異なる3種類の両親媒性分子を用いて、ゾルーゲル転移に要する時間が異なるゲルを調製した。これらのゲルの局所物性を粒子追跡法に基づき評価した結果、特定の空間スケールにおいて、網目サイズは不均一であることが明らかとなった。また、網目サイズの不均一性の空間スケールが小さいほど、ゾルーゲル転移に要する時間は短かった。このことは、不均一性がゾルーゲル転移の速度と関係することを示している。さらに、ゲル化剤から成る繊維状会合体のモデルとして、形態が比較的安定なセルロースナノファイバー(CNF)を用いて検討を行った。不均一性を制御したCNF分散液と高分子水溶液を原料とし、CNF/高分子複合膜を作製した。その結果、原料であるCNF水分散液の不均一性のサイズスケールを減少させることによって、複合材料の伸長特性を大きく向上することが明らかとなった。これは、不均一構造に基づく複合材料の新たな設計指針になり得る。29年度が最終年度であるため、記入しない。自己組織性の低分子を水に分散すると、繊維状会合体とそのネットワーク構造に基づく超分子ヒドロゲルがしばしば形成される。超分子ヒドロゲルを機能性材料として応用展開するためには、ゾルーゲル転移の理解ならびに制御が必要不可欠である。これまで、ゾルーゲル転移は物性における均一化を伴って進行することを明らかにした。本研究では、超分子ネットワーク系のゾルーゲル転移を理解・制御することを目的とし、繊維状会合体の形態、凝集状態、および動的な挙動との相関を検討する。これまでに、超分子ヒドロゲル中の繊維状会合体とそのネットワーク構造は、熱力学的な平衡から離れた準安定状態であることが知られている。したがって、ゲルの形成過程において外部刺激を加えることによって、最終的に得られる超分子ヒドロゲルの構造と物性、ひいてはゾルーゲル転移を制御することが可能であると着想した。初年度ではとくに、ゲルの形成過程における剪断印加が構造・物性に与える影響を検討した。その結果、剪断印加によって得られた高流動性のゾルは、室温にて静置すると、自発的にゲルとなることが明らかになった。赤外分光測定を行った結果、剪断印加は、分子会合状態に影響を及ぼさないことが確認された。しかしながら、原子間力顕微鏡に基づき繊維状会合体の形態を評価した結果、剪断印加によって、会合体の幅と長さが減少することが明らかになった。これらの結果は、繊維状会合体の形態がゾルーゲル転移に要する時間と関係していることを示している。次年度は、繊維状会合体の形態と動的挙動との関係を明らかにし、繊維状会合体の動的挙動がゾルーゲル転移に与える影響を明らかにする予定である。超分子ヒドロゲル中の繊維状会合体およびその凝集構造の制御に関する研究を実施した。とくに、調製条件が最終的な超分子ヒドロゲルの構造・物性に与える影響を検討し、繊維状会合体の形態とゾルーゲル転移の関係について新たな知見が得られた。得られた成果の一部は学会にて発表済みである。また、繊維状会合体の形態と動的挙動との関係を明らかにするため、モデルケースとして繊維状粒子であるセルロースナノファイバー(CNF)の動的挙動についても検討を進めており、まとまった成果が得られてきている。以上のように、当初の計画にとどまらず、幅広く研究を進めている。結果の一部は学術論文として発表準備中である。超分子ヒドロゲルを機能性材料として応用展開するためには、そのゾルーゲル転移を正確に理解し、設計・制御することが必要である。本研究では、超分子ヒドロゲルのゾルーゲル転移の理解・制御を目指し、繊維状会合体の形態、凝集状態、および動的な挙動とゾルーゲル転移との相関を検討することを目的とした。これまでに、繊維状会合体およびその凝集状態の制御に関する研究を実施し、ゾルーゲル転移に要する時間は、繊維状会合体の形態に強く依存することが確認された。本年度ではとくに、繊維状会合体の形態とその動的挙動、ひいてはゾルーゲル転移との関係について検討した。超分子ゲル中の繊維状会合体の動的挙動について検討するため、会合体間の融合(Phantom-crossing)をフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)に基づき評価した。その結果、繊維状会合体は、ある程度抑制されていることが示唆された。また、繊維状会合体のモデルとして、その形態が比較的安定なCNFを用いて検討を行った。

粒子追跡法に基づき評価した結果、CNF分散水溶液の物性は、数十マイクロメートル程度のサイズスケールにおいて、不均一であった。また、CNF分散液に超音波照射し、室温にて静置すると、不均一性のサイズスケールが減少することが明らかになった。これは、CNFの拡散に伴う凝集状態の変化を反映していると考えられる。次年度は、両親媒性分子を構成する親水基、疎水基、水素結合部位がそれぞれ異なる誘導体を合成し、それぞれの部位が超分子ゲルの繊維状体中の会合体の形態ひいては、ゾルーゲル転移の可逆性に与える影響を検討する予定である。超分子ヒドロゲル中の繊維状会合体およびその凝集状態の制御に関する研究を実施した。とくに、繊維状会合体間の融合(Phantom-crossing)の可能性を検討し、繊維状会合体の動的挙動とゾルーゲル転移の関係について新たな知見が得られた。また、繊維状会合体の形態と動的挙動との関係を明らかにするため、モデルケースとして繊維状コロイドであるセルロースナノファイバー(CNF)の動的挙動についても検討を進めており、当初の計画にとどまらず、幅広く研究を進めている。研究成果の一部は論文1報ならびに学会にて発表済みである。現在、続く論文の発表準備中である。超分子ヒドロゲルは、自己組織性の低分子(ゲル化剤)から形成される。超分子ヒドロゲルを機能性材料として応用展開するためには、ゾルーゲル転移を正確に理解し、制御することが必要である。本研究では、超分子ヒドロゲルのゾルーゲル転移と繊維状会合体の形態、凝集状態、およびそれらの動的な挙動とゾルーゲル転移の関係を明らかにすることを目的とした。これまでに、繊維状会合体およびその凝集状態の制御に関する研究を実施し、さらに、繊維状会合体の動的挙動についても検討した。その結果、繊維状会合体の融合はある程度抑制されており、ゾルーゲル転移に要する時間は繊維状会合体の形態、ひいてはその拡散に強く依存することが示された。本年度は、ゲル化剤の化学構造に基づきゾルーゲル転移に要する時間が異なるゲルを作製し、ゲルの構造・物性とそれらの不均一性を検討した。異なる3種類の両親媒性分子を用いて、ゾルーゲル転移に要する時間が異なるゲルを調製した。これらのゲルの局所物性を粒子追跡法に基づき評価した結果、特定の空間スケールにおいて、網目サイズは不均一であることが明らかとなった。また、網目サイズの不均一性の空間スケールが小さいほど、ゾルーゲル転移に要する時間は短かった。このことは、不均一性がゾルーゲル転移の速度と関係することを示している。さらに、ゲル化剤から成る繊維状会合体のモデルとして、形態が比較的安定なセルロースナノファイバー(CNF)を用いて検討を行った。不均一性を制御したCNF分散液と高分子水溶液を原料とし、CNF/高分子複合膜を作製した。その結果、原料であるCNF水分散液の不均一性のサイズスケールを減少させることによって、複合材料の伸長特性を大きく向上することが明らかとなった。これは、不均一構造に基づく複合材料の新たな設計指針になり得る。本研究では、自己組織化分子の設計に加え、その繊維状会合体の凝集状態がゾルーゲル転移に与える効果を系統的に明らかにし、制御することを目指す。
webメールを用いた恋人間暴力の予防的介入プログラムの開発

本研究では,webメールを用いた恋人間暴力の予防的介入プログラムを開発するための基礎的な調査を行った。研究1では,恋人がいる成人を対象に,恋人の行動に対する行動のパターンと恋人間暴力の関連を検討した。その結果,恋人のネガティブな行動に対して宥和な行動を取るような反応パターンを有する人は,恋人と暴力的な相互作用を行うことが示された。研究2では,対象を夫婦関係に広げ,関係を維持する動機づけと暴力的な相互作用との関連を検討した。その結果,関係を続けなければならないという動機づけを有する人が,配偶者と暴力的な相互作用を行っていることが示された。本研究の目的は,webメールを用いた恋人間暴力の予防的介入を開発することであった。平成28年度は,恋人間暴力の予防的介入を実施するために重視すべき要因を検討する予定であった。しかし,恋人間暴力の測定に使用する予定であった尺度が,恋人間暴力を測定する尺度としての妥当性が十分に担保されていないことから新たな尺度の選定が必要になったこと,恋人間暴力の予防的介入のための先行研究のレビューに時間を要したことなどから,調査を一部実施するのみにとどまった。実施した調査では,20歳から30歳で未婚かつ恋人がいる人を対象とした。分析では,まず暴力の被害経験に対して,潜在ランク理論による分析を行い,調査対象者を暴力の被害経験の程度によってグループ分けした。その後,コミットメントやアタッチメント,関係内での行動などがグループによって異なるかを検討した。その結果,心理的暴力の被害が大きいグループでは,暴力加害の経験も多く,カップルで暴力的な相互作用が展開されている可能性があった。また,心理的暴力の被害が大きいグループは,恋人にコントロールされている感覚が強いこと,精神的健康が低いことが示唆された。また,恋人のネガティブな行為を許しやすい人ほど,暴力の被害経験が多いことも示唆された。以上のことから,介入においては,恋人からの自律性を高めるとともに,恋人のネガティブな行為を許さず指摘するような行動パターンを形成する手法が望まれると考えられよう。測定に使用する予定であった尺度が,恋人間暴力を測定する尺度としての妥当性が十分に担保されていないことから新たな尺度の選定が必要となった。そのため,調査実施が計画よりも遅くなった。平成29年度は,予防的介入を実施するために重視すべき要因の検討を中心に研究を行った。具体的には,以下の2つの研究を実施した。第1に,20歳から35歳の恋人がいる人を対象とした調査を実施し,恋人からのネガティブな行為に直面した際の行動計画が恋人からの暴力加害・被害に与える影響を検討した。その結果,恋人からネガティブな行為をされた場合にネガティブなフィードバックを与えることが暴力被害の少なさと関連することが示唆された。第2に,対象を恋愛関係から広げ,夫婦関係を対象にした縦断的研究を実施した。その結果,別れを避けようとする回避コミットメントの強さが,配偶者からの心理的暴力加害を引き起こし,結果として心理的暴力被害の高さと結びつくことが示唆された。また,回避コミットメントの強さが,配偶者への暴力加害を引き起こし,配偶者の被害の高さに結びつくことも示唆された。また,予防的介入を実施する際に有効な手立てや,高校生・高校教諭・社会人などのニーズおよび恋人間暴力についての知識や考えを検討するため,首都圏の高校や首都圏および青森県のNPOで聞き取り調査を行うとともに,DV予防啓発のために心理学講習会を実施した。以上の調査を踏まえ,webメールを用いた恋人間暴力の予防的介入を計画し,予備調査と位置づけて少人数の大学生に対して実験を実施するとともに,実験へのフィードバックを得た。実施した調査を新年度から引き続き継続し,実施していく。また,新たな調査も実施し,2本の調査を同時並行的に実施していく。その後,それらの結果を統合し,予防的介入のプログラムを決定し,実験を行う。また,高校生や高校教諭などにも聞き取り調査を実施し,介入プログラムについて教育現場の観点からの助言を得ていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。社会心理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
明珍恒男撮影写真資料の美術史的研究-仏像彫刻修理写真を中心に-

東京国立博物館保管の明珍恒男撮影写真資料のほぼすべての原板について,焼付作成とフィルム化を完成し,被写物の全貌を容易に一覧することを可能ならしめ,この写真資料の利用価値を大きくひろげることができた。また被写物の分類目録,被写物の現状との関係を中心として写真資料からえられる情報についての詳細な調書を作成した。大部分をしめる彫刻については研究代表者山本,研究分担者丸山・浅見・松田が分担し,彫刻以外の被写物については研究分担者安達(文書・歴史資料),加藤(工芸品)が分担し,研究代表者が統括した。一部の写真の被写物確認あるいは関連資料確認のために現地調査も実施した。従来,被写物不明であった写真についてもそれが確認されたものも少なくない。さらに研究代表者・分担者による討議をへたうえで,以上の調書の内容を要約・集成し,目録および写真図版を付した報告書を作成した。これによって全国の多くの研究者がこの写真資料を容易に利用できることとなったはずである。以上の調査研究の過程で,法隆寺食堂塑像群,法華寺維摩居士像に関するものなどをはじめとする,彫刻史研究上に重要な内容をもつ写真資料の発見もあった。これらは当該作品の構造技法等の理解をすすめるためにきわめて有効であり,それぞれの問題について別途個別研究を行い,論文発表を準備中である。東京国立博物館保管の明珍恒男撮影写真資料の原板はすべて、現状では扱いの困難なガラス原板である。その保存状態は良好ではないが、十分に注意して焼付を作成した。保存状態良好の原板中からは、その映像が美術史的に貴重とみられるものを選択し、これらをデュープしてフィルム原板を作成した。また、その他の原板についても焼付からの複写を行なってフィルム原板を作成し、もって明珍恒男撮影写真資料のほぼすべての原板について、フィルム化を完成した。これにより被写物の全貌を容易に一覧することが可能となり、同時にこの写真資料の美術史研究上の利用価値を大きくひろげることができた。さらに被写物の分類目録、被写物の現状との関係を中心として写真資料からえられる情報についての詳細な調書の作成を開始している。一部の写真の被写物確認あるいは関連資料確認のためには現地調査(京都、奈良等)も実施している。これらの調査研究の過程で、被写物が不明であった写真についてもそれが確認されたものもある。また美術史ことに彫刻史上に重要な作品である法隆寺食堂塑像群、法華寺維摩居士像等に関する、これまで知られていなかった修理中の写真資料の発見もあった。それらは当該作品の構造技法等の理解をすすめるためにきわめて有効であり、調書の作成にとどまらず、それぞれの問題について別途個別研究を行い、論文発表を準備中である。平成7年度においては東京国立博物館保管の明珍恒男撮影写真資料のほぼすべての原板について、焼付作成とフィルム化を完成し、被写物の全貌を容易に一覧することを可能ならしめ、この写真資料の利用価値を大きくひろげることができた。さらに被写物の分類目録、被写物の現状との関係を中心として写真資料からえられる情報についての詳細な調書の作成を開始していたが、8年度はこれらを完成した。大部分をしめる彫刻については研究代表者山本、研究分担者丸山・浅見・松田が分担し、彫刻以外の被写物については研究分担者安達(文書・歴史資料)、加藤(工芸品)が分担し、研究代表者が統括した。従来、被写物不明であった写真についてもそれが確認されたものも少なくない。さらに研究代表者・分担者による討議をへたうえで、以上の調書の内容を要約・集成し、目録および写真図版を付した報告書を作成した。また7年度おいてみいだされていた、法隆寺食堂塑像群に関するものなどをはじめとする、彫刻史研究上に重要な内容をもつ写真資料についての個別研究も続行した。
本研究の目的は、ドイツ中等教育制度の二分岐型化に伴う学校配置計画の再編過程の実態を明らかにすることであり、テューリンゲン州、メクレンブルク-フォアポンメルン州及びザールラント州を対象として調査・分析を行った。その結果、ドイツにおける中等教育制度の二分岐型化及び学校配置計画の再編は、平等な中等教育機会の保障という前提を共有しつつ、各地域によって異なる人口動態や歴史的経緯などの具体的課題に応じて多様な形をとって進められている状況が明らかとなった。本研究は、ドイツ中等教育制度の二分岐型化に伴う学校配置計画の再編過程の実態を明らかにすることを通じて、中等教育制度改革という州レベルの改革が、地域レベルにおいてどのように受容、実施されていったかに迫ろうとするものである。研究対象としてメクレンブルク-フォアポンメルン州、テューリンゲン州およびザールラント州の3州を予定しているが、平成27年度については、主にメクレンブルク-フォアポンメルン州に焦点を当てて研究を進めた。具体的には、インターネット等を活用して日本国内からアクセスできる資料等の状況や州文部省からの助言等をもとに、フォアポンメルン-グライフスヴァルト郡を研究対象として選定して関連諸資料の分析を進めた。そこから、当地における90年代から2000年代前半にかけての生徒数急減期における学校配置計画再編の状況と、2020年ごろから見込まれている再度の生徒数減少期に向けた学校配置計画再編における課題を整理した。その結果、当地における学校配置計画が、最小生徒数と最長通学時間という2つの要件を満たすことを条件として策定されていること、今後さらなる生徒数減少が進んだ場合、2つの要件を同時には満たせない事例が出る可能性があること、そのためギムナジウムと地域学校を連携型総合制学校へと統合する方策が有望視されていることが明らかとなった。以上の知見については、平成28年3月に現地にて郡教育事務所、地域学校2校、連携型総合制学校1校および州文部省への聞き取りを行い、当事者の認識との照合を進めた。そのほか、テューリンゲン州についても正規学校からゲマインシャフツシューレへの転換の手順に関する諸資料の収集、整理を進めた。以上のとおり、平成27年度においては、対象とする3州のうち、1州の調査、分析をほぼ終え、1州については次年度以降の調査、分析への基盤を整えることができた。平成27年度においては、研究対象とするメクレンブルク-フォアポンメルン州、テューリンゲン州およびザールラント州の3州のすべてにおいて、調査対象とする市ないし郡を選定するとともに、1州ないし2州について、現地調査を行うこと、さらに、1州について調査結果の分析まで進め、学会発表および学会誌への投稿を行うことを目標としていた。実際には、メクレンブルク-フォアポンメルン州について調査対象とする郡を選定し、現地調査のうえ分析をを進め、分析結果の学会発表まで行うことができた。また、テューリンゲン州については、調査対象とする市ないし郡の選定までは進められなかったが、今後の調査、分析にとって必要な関連資料の収集、整理を順調に進めることができた。調査対象の選定、学会誌投稿に向けた原稿化の作業に若干の遅れはあるものの、全体としての研究スケジュールを見直すほどのものではなく、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」と評価することができる。研究対象としてメクレンブルク-フォアポンメルン州、テューリンゲン州およびザールラント州の3州を取りあげている。平成28年度については、前年度中に現地調査を行ったメクレンブルク-フォアポンメルン州の調査結果の分析を進め、論文として発表する準備を行った。また、新たにテューリンゲン州およびザールラント州での現地調査を行い、調査結果の分析を進めた。テューリンゲン州に関しては、人口の希薄化が進むキフホイザー郡を対象として選び、既存の非ギムナジウム校であるオルディスレーベン通常学校(レーゲルシューレ)がゲマインシャフツシューレへと転換していった経緯とその影響について、当校、郡教育事務所および州文部省において聞き取り調査を行った。ザールラント州に関しては、非ギムナジウム校のゲマインシャフツシューレへの転換の経緯と実態について、州文部省、ザールブリュッケン市内ゲマインシャフツシューレ2校およびザールプファルツ郡内の1校において聞き取り調査を行った。テューリンゲン州での調査からは、生徒数減少局面における個別学校の生き残り策としてゲマインシャフツシューレへの転換が選択されている様子が明らかとなった。また、ザールラント州での調査からは、総合制学校の人気の高まりと収容力不足への対応として、拡大実科学校のゲマインシャフツシューレへの転換がなされた実態が明らかとなった。以上のように、予定していた3州すべての調査を平成28年度までに実施することができ、最終年度となる次年度にそれらの調査結果を総合的に分析し、研究成果をまとめるための基盤が整った。平成28年度においては、平成27年度に予定していたものの作業が遅れていた、メクレンブルク-フォアポンメルン州について調査結果に基づく論文執筆を進めるとともに、テューリンゲン州およびザールラント州での現地調査の実施と調査結果の分析、学会発表、学会誌への投稿を行うことを計画していた。メクレンブルク-フォアポンメルン州に関する調査結果については、所属研究機関の研究年報(平成29年6月刊行予定)への投稿を行った。
また、テューリンゲン州については平成28年5月、ザールラント州については平成28年11月にそれぞれ調査を実施し、両調査の結果に基づいて分析を進め、平成29年3月の東北教育学会大会において成果発表を行った。また、テューリンゲン州の調査結果については論文化し、学会誌への投稿も行った(現在査読中)。以上のように、平成28年度においては前年度までの遅れを取り戻し、当初の計画にほぼ沿って研究を進捗させることができた。したがって、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」と評価することができる。本研究では、ドイツ中等教育制度の二分岐型化に伴う学校配置計画の再編過程の実態を明らかにすることを目指してきた。研究計画の最終年度である平成29年度は、平成27年度、28年度の研究成果を点検し、不備を補足するとともに、これまでの知見の最終的な成果への総合を行うことを計画していた。まず、これまでの成果の点検から、中等教育制度の二分岐型化と学校配置計画の再編過程について理解するためには、これらの改革が地域における学校制度改革全体の中でどのように位置づけられているかにまで視野を広げて調査する必要があることが明らかとなった。そこで、調査対象として、テューリンゲン州イエナ市を取りあげ、市の教育行政部局、市内の公立ゲマインシャフツシューレ(初等・中等一貫の非ギムナジウム校)およびギムナジウム、終日制化に伴う学校支援団体に対する訪問調査を行った。そこから、中等教育制度の二分岐型化に伴う学校配置計画の再編過程は、当地においては、東西ドイツ統一後の人口変動や地域の荒廃への対応とその中での各学校の教育の改善、特に教育への多様なニーズを抱えた生徒や家庭への対応という、市の教育政策全体の中に位置づけられて進められたことを確認した。テューリンゲン州イエナ市における以上の調査結果および前年度までに行ったメクレンブルク-フォアポンメルン州フォアポンメルン-グライフスヴァルト郡、テューリンゲン州キフホイザー郡、ザールラント州における調査の成果から、ドイツにおける中等教育制度の二分岐型化が、二分岐型制度の理念の受容を前提としつつ、より実際的には各地域における具体的な課題に応じて多様な形をとって進行している状況が明らかとなった。以上のとおり、平成29年度においては、研究計画に基づき着実に研究を進め、これまでの研究成果の総合的な考察をすすめることができた。本研究の目的は、ドイツ中等教育制度の二分岐型化に伴う学校配置計画の再編過程の実態を明らかにすることであり、テューリンゲン州、メクレンブルク-フォアポンメルン州及びザールラント州を対象として調査・分析を行った。その結果、ドイツにおける中等教育制度の二分岐型化及び学校配置計画の再編は、平等な中等教育機会の保障という前提を共有しつつ、各地域によって異なる人口動態や歴史的経緯などの具体的課題に応じて多様な形をとって進められている状況が明らかとなった。平成27年度はおおむね順調に研究を進めることができた。したがって、基本的には、今後の研究推進にあたっても、当初の計画を維持する方向で進める方針である。
乳癌免疫微小環境における脂質メディエーター分子の役割解明と治療応用を目指した研究

近年、腫瘍免疫の重要性が明らかとなり、「微小環境において如何に腫瘍免疫を制御し、ミクロ病変を根絶できるか」が癌の転移・再発抑制の1つの鍵と考えられる。申請者は「乳癌患者の腫瘍免疫微小環境において脂質メディエーター・スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)が重要な役割を担っている」と仮説を立て、本研究を企画した。本研究の目的は、腫瘍免疫微小環境におけるS1Pの役割を解明し、その臨床的意義を明らかにして治療応用を目指すことである。本研究では、動物実験及び患者検体の解析により腫瘍免疫微小環境における脂質分子の働きを解明し、脂質分子を標的とし腫瘍免疫微小環境を制御する新たな治療開発のための研究基盤を築く。
副鼻腔炎における好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死がもたらすムチン分泌と上皮障害

好酸球性ムチン内の顆粒蛋白であるMajor basic protein (MBP)やEosinophilcationic protein (ECP)をELISA法を用いて定量した。さらに、好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死の結果、顆粒蛋白の細胞外への放出が確認できる。MBPやECPの刺激による培養鼻腺細胞からのムチン分泌を定量する。顆粒蛋白によるムチン分泌の知見を得た。活性化した好酸球と培養鼻腺細胞の共培養下で、好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死による顆粒蛋白の放出と鼻腺細胞の分泌応答をin vitroで再現する試みを施行した。副鼻腔粘膜に多数の好酸球浸潤を伴い、難治性かつ再発性の鼻ポリープを伴う好酸球性副鼻腔炎が注目されている。好酸球性副鼻腔炎においては特徴的な好酸球性ムチンの鼻漏を繰り返すことが再発の徴候であり、粘液産生が病態に深く関わりあうことが推察される。そこで、好酸球から放出される細胞障害性を有する顆粒蛋白と粘液産生の現場である鼻腺細胞の相互作用に注目した。好酸球性副鼻腔炎の鼻ポリープおよび好酸球性ムチン内に存在する好酸球が細胞外DNAトラップ細胞死に至っていることを証明、確認された。好酸球性ムチン内の顆粒蛋白であるMajor basic protein (MBP)やEosinophilcationic protein (ECP)をELISA法を用いて定量した結果、1)で証明した好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死の結果、顆粒蛋白の細胞外への放出が確認できた。MBPやECPの刺激による培養鼻腺細胞からのムチン分泌を定量した。顆粒蛋白によるムチン分泌の新知見が得られた。鼻腺細胞・表面上皮細胞の培養内視鏡下副鼻腔手術にて摘出したポリープをプロテアーゼにて処理し、上皮細胞を剥がして培養した。上皮が剥がれたポリープをミンチした後、鼻腺細胞のみ単離した。フィルター上に純化培養した。フィルターに培養した細胞がconfluentになった後、Ussing chamberを用い短絡電流測定装置にてvoltage-clamp法でイオン電流の解析を行い、細胞の純化を確認し、培養系が樹立していることを立証できた。活性化した好酸球と培養鼻腺細胞の共培養下で、好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死による顆粒蛋白の放出と鼻腺細胞の分泌応答をin vitroで再現した。好酸球は細胞内顆粒を多く保有し、その顆粒には4種類の顆粒蛋白に加えて、サイトカイン、キモカイン、成長因子も含まれている。古典的な脱顆粒現象は顆粒膜を正常に保持したままエクソサイトーシス、ピースミール脱顆粒、細胞融解性脱顆粒を介して生じてくる。一方、最新の研究では、活性化された好酸球はアポトーシスやネクローシスとは異なる新規の能動的な細胞死(細胞外DNAトラップ細胞死)によって細胞内顆粒を放出することが報告されている。

その結果、細胞崩壊で放出されたDNAのネットによって好酸球の死後も排除されずに留まり、継続する生物学的活性を惹起して、アレルギー病態を形成することが判明した。これまで好酸球は細胞死によってアレルギー反応が終息に向かうと考えられてきたが、新規の細胞死の発見により細胞死は組織障害の増悪化をもたらすことが示されたのである。我々の研究グループは世界で最初にヒト鼻腺細胞の純化培養に成功しており、神経伝達、炎症性起因物質による分泌応答の機序の解明を行ってきた。そこで本研究では、好酸球性副鼻腔炎の増悪・再発機序の解明の目的で、好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死による鼻腺細胞の好酸球性ムチンの分泌応答および表面上皮の組織障害に着目した。その結果、好酸球と鼻腺・表面上皮細胞の共培養系を用いて、好酸球の細胞死とムチン分泌と組織障害を明らかになった。耳鼻咽喉科学好酸球性副鼻腔炎の鼻ポリープおよび好酸球性ムチン内に存在する好酸球が細胞DNAトラップ細胞死に至っていることを証明、確認する。好酸球性ムチン内の顆粒蛋白であるMajor basic protein (MBP)やEosinophilcationic protein (ECP)をELISA法を用いて定量する。1)で証明した好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死の結果、顆粒蛋白の細胞外への放出が確認できる。MBPやECPの刺激による培養鼻腺細胞からのムチン分泌を定量する。顆粒蛋白によるムチン分泌の新知見が得られる。活性化した好酸球と培養鼻腺細胞の共培養下で、好酸球の細胞外DNAトラップ細胞死による顆粒蛋白の放出と鼻腺細胞の分泌応答をin vitroで再現する。研究の独創的特色は、難治性・再発性の好酸球性副鼻腔炎の病態の特徴である好酸球性ムチンの発症の機構を全く斬新な発想で解明することである。つまり、近年明らかになった好酸球の新規の細胞死が好酸球性ムチンの産生の中心的役割を果たしていることを検証する。これらの機序を好酸球と鼻腺・表面上皮細胞の共培養系を用いて、好酸球の細胞外トラップ細胞死とムチンの形成は活性化された好酸球の顆粒蛋白を能動的に放出させて、局所に長期間に渡り停滞せしめて組織障害を高度に引き起こすことを明らかにする。本研究によって好酸球の新たな細胞死によって惹起される病態が解明され、好酸球性副鼻腔炎の増悪・再燃の分子メカニズムを世界に発信することができる。好酸球の細胞外トラップ細胞死を制御する薬物を開発することによって鼻汁、鼻閉、後鼻漏、嗅覚障害などの鼻症状、頭痛、頬部痛などに悩み、苦しむ国内の数百万人の患者への大きな福音となり、国民生活の質的向上をもたらす極めて有意義な研究を目指す。若干の研究の遅れに伴い、当初購入を予定していた実験機器や試薬等、一部購入を見送った為。適時年度計画を見直しつつ、好酸球の新たな細胞死によって惹起される病態の解明に向けた研究に必要な機器・試薬等を購入する。
VHL癌抑制蛋白の機能喪失による発がんのメカニズムの解析

1.転写伸長因子エロンガンAの遺伝子欠失ES細胞とマウスの作製VHL癌抑制蛋白と相互作用する転写伸長因子エロンガンの触媒サブユニットであるエロンガンAを欠失したES細胞を作製した。エロンガンA(-/-)のES細胞では、細胞増殖速度の低下と細胞体積の増大を認めるが、解析によりこれらが細胞周期G2/M期での停止に基づくものであることが判明した。次いで、野生型と作製したエロンガンA(-/-)のES細胞とを用いてDNAチップ解析を実施したところ、両者の間で一群の遺伝子の発現量にのみ有意な差が認められ、エロンガンAがある特定の遺伝子の発現をのみ調節していることが判明した。現在、発現に差の認められた遺伝子とG2/M期停止との関連について解析中である。また、ヘテロマウスの掛け合わせによりホモのエロンガンA欠失マウスを作製中である。2.新規転写伸長因子エロンガンA3の単離と機能解析エロンガンAファミリーの新規メンバーであるエロンガンA3のcDNAをクローニングした。エロンガンA3は、エロンガンAと同様それ自身で転写伸長活性を有するが、エロンガンAとは異なりエロンガンBCとの結合による転写伸長能の活性化を受けないことが判明した。そこで、エロンガンA3のいくつかの領域を該当するエロンガンAの配列で置換したキメラ蛋白を作製してエロンガンBCに対する反応性を調べた結果、エロンガンAのC末端領域の配列がBCによる括性化に重要であることが明らかになった。3.VHL癌抑制蛋白の新規標的分子の単離BaitであるVHL蛋白を安定化させるためにエロンガンBとCとを共発現する酵母株を用いてTwo-hybridスクリーニングを実施した結果、ショウジョウバエの癌抑制蛋白の1つであるTid(tumorou s imaginal discs)56のヒトホモログTid-1がVHL蛋白と相互作用する分子として単離された。
宿主細胞侵入に関わる原虫酵素群の基質探索系の確立

原虫の複雑なライフサイクルの中で、Ca^<2+>シグナルに関わる酵素であるプロテインキナーゼの基質及び感染における役割を解析することで、これらの酵素群があるステージから次のステージに移行するのに重要なシグナル伝達を担っているという知見が研究成果として数多く得られた。これらの研究成果は、原虫のステージ移行に重要となる原虫酵素群を阻害することで原虫独特のライフサイクルを遮断する、新しい原虫薬の開発につながると考えられる。アピコンプレックス類に属する原虫は形態的・遺伝学的に共通の特徴を持ち、家畜に重篤な症状、経済的損失を引き起こす。しかしながら、その特異な遺伝子配列から分子生物学的解析は遅れ、その対策が急務となっている。研究代表者らが小麦胚芽無細胞蛋白質合成系を利用することで確立した原虫酵素、特に細胞内シグナル伝達で中心的役割をなすプロテインキナーゼ(PK)の発現・精製系を用いて、本研究では原虫PKの基質蛋白質同定を目指した。特に、原虫の宿主細胞侵入に大きな役割を果たしていると考えられるカルシウム依存性プロテインキナーゼ(Calcium dependent proteinkinase(CDPK))の機能発現機構を基質、会合分子との相互作用の点から解析を行った。今年度は、原虫の保存しているCDPKの中から、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)のCDPK isoform 3(TgCDPKif3)、TgCDPK1、及びマラリア原虫(Plasmodium falciparum)のPfCDPK4について性状解析を行った。TgCDPKif3については、宿主細胞への侵入時の動力装置の構成蛋白質であるaldolaseを基質としてリン酸化し、その侵入に関係していることが示唆された。TgCDPK1は以前より宿主細胞への侵入時に重要な役割を果たしていることが報告されていたが、今回の解析から原虫の滑走運動を直接制御していることが明らかとなった。また、PfCDPK4は有性生殖期の雄性ガメトサイトにおいて特異的に発現していることがいることがわかった。これらの解析結果は、原虫の遺伝子発現機構、シグナル伝達機構の根本的な解明、抗原虫薬・原虫ワクチンの開発に有用な基礎的データの蓄積につながると考えられる。今年度は主に、Ca^<2+>シグナルに関連することが予想されるトキソプラズマ原虫のPKであるTgPKA-c(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit)とTgCaMKrk(CaMK-related kinase)の解析を行った。トキソプラズマ原虫のPKA-cについてはいまだ報告がなかったが、今回その遺伝子を同定し、その薬剤感受性について解析を行った。また、未同定であったregulatory subunit(TgPKA-r)を同定し、原虫内で過剰発現されることで原虫の宿主細胞内での増殖が低下することが明らかとなった。また、in vitroでPKA-cがPKA-rをリン酸化することが明らかとなった。次に、TgCaMKrkでは、我々が同定したマラリア原虫の唯一のCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼであるPfPK2の相同遺伝子として機能解析を行った。TgCaMKrkにはregulatoryドメインが保存されていなかったためCa^<2+>/カルモジュリン依存性は観察されなかったが、侵入動力装置であるglideosomeの構成因子をin vitroでリン酸化することが明らかとなった。