hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリア生合成を司る細胞内統合的ネットワークの解明

本研究では,サイトゾルからミトコンドリアへのタンパク質の輸送,および膜間の脂質の輸送を中心に,ミトコンドリアが細胞内でいかに作られるかという根源的問題の分子機構を統合的に理解することをめざしている。まずタンパク質の交通については, TOM複合体の動的制御におけるポリン(Por1)の役割に関する解析結果が,投稿準備段階である。Por1はTOM複合体の3量体-2量体間平衡を制御すること, 3量体と2量体は膜透過させる基質が異なることを見いだし, TOM複合体の3量体-2量体間の動的平衡の意義がはじめて明らかになった。TOM複合体の構造解析については, S. cerevisiaeのTOM複合体についてGraFix法による架橋を最適化することで,クライオ電顕観察で解析に適した粒子像を多数得ることに成功した。また精製TOM複合体の高速AFM観察にもはじめて成功, 3量体が一部壊れると2量体に変化する瞬間を目撃することができた。ミトコンドリア外膜でタンパク質の品質管理に関わるAAAタンパク質のMsp1について,分解基質のユビキチン化に,意外にも異なるオルガネラであるERのE2, E3が関与すること,別のAAAタンパク質Cdc48もMsp1と協力して働くことを見いだした。これらについては学会発表を行った。脂質輸送については, ER-ミトコンドリア間コンタクト部位をつくるERMES複合体のサブユニットMdm12と脂質の複合体の構造を決定した。さらにMdm12およびもう一つのサブユニットMmm1は単独では膜間で脂質輸送を効率よく行えないが, Mmm1-Mdm12複合体をつくると膜間で効率よく脂質輸送を行えること,したがってERMESの脂質輸送能を担う最小単位であることを証明し,論文として発表した。また出芽酵母では様々なオルガネラ(ER,ミトコンドリア,液胞,ペルオキシソーム,脂肪滴)間でコンタクト部位が形成されることをsplit-GFPを用いて発見,論文として報告した。タンパク質輸送については, TOM複合体の動的制御におけるポリン(Por1)の役割に関する解析を進め, Por1がTOM複合体の3量体-2量体間平衡を制御すること, 3量体と2量体は膜透過させる基質が異なることを見いだすなど,当初の予想を超える重要な発見があった。トランスロケータの構造解析については,外膜のTOM複合体, SAM複合体,内膜のTIM23複合体について,クライオ電顕観察に向けた試料の調製が順調に進み, TOM複合体, SAM複合体(Mdm10が解離したアポ複合体,結合したホロ複合体)については,解析可能な粒子を多数観察することに成功,TOM複合体の高速AFM観察にも成功した。ミトコンドリア外膜でタンパク質の品質管理に関わるAAAタンパク質のMsp1については,基質のユビキチン化にERのタンパク質が関わるなど,予想を超えた結果が得られた。オルガネラ間コンタクトについては, split-GFPを用いて酵母細胞内で様々なオルガネラ間にコンタクト部位が存在することを見いだし,さらに,哺乳細胞を用いた系でも,ミトコンドリア・小胞体間に加え,ミトコンドリア・リソソーム間,ミトコンドリア・ゴルジ体間にもコンタクトサイトがあることを見出した。ERMESのクラスタリングが,ミトコンドリアの融合と分裂以外にも,小胞体ストレス誘導条件下で劇的に増加すること,このERMESクラスタリングの増加が, ERMESタンパク質の増加によるものではないことや,小胞体ストレス関連因子Ire1やHac1が欠損した条件でも起きることを見出すなど,予想を超えた進展があった。研究を開始して3年近くが経過したが,特に問題は生じていない。酵母細胞を大量に効率よく破砕するための設備機器(マルチビーズショッカー)を導入し,使用を開始している。研究代表者のグループでは研究員4名(エフォート管理による),研究補助員3名,研究分担者のグループでは研究員1名を雇用し,順調に研究が進んでいる。今後の研究計画は以下の通り。・Por1によるTOM複合体の3量体-2量体の動的平衡の制御はきわめて重要な発見なので, Tom22との相互作用に欠損があるPor1変異体を取得し,これを用いて動的平衡制御の分子機構の解析を進める。・外膜トランスロケータTOM複合体, SAM複合体,内膜トランスロケータのTIM23複合体については,クライオ電顕観察に適した試料調製が進んでいるが,クライオ電子顕微鏡の測定の順番待ちが律速となっている。共同研究を行っている吉川研(東大)で最新の電顕が近く稼働するので,これを用いた効率よい高分解能単粒子解析を期待している。また高速AFM観察に成功したので,ミトコンドリアタンパク質前駆体にAFMで観察しやすいDNAを結合させた人工基質を用いて, TOM複合体のチャネル内に基質が入る瞬間をリアルタイム観察したい。・Msp1の機能解析については,いま最もホットでかつ競争の激しいテーマであるため,ミトコンドリア, ER,サイトゾルのタンパク質が協力して実行する基質分解の経路と機構の解明を論文発表に向けて詰めるとともに, Msp1の外膜の異常タンパク質分解以外の機能の検索も進める。すでにMsp1過剰発現により,様々なミトコンドリアタンパク質のインポートが低下することを見いだしているので,その理由を明らかにしたい。・オルガネラ間コンタクトについては, split-GFPを用いたオルガネラ間相互作用評価実験系を用いて,新規オルガネラ間相互作用調節因子の検索および,様々な条件下(栄養,ストレスなど)でオルガネラ間相互作用の変化(ダイナミクス)を検証する。

ERストレスによってER-ミトコンドリア間コンタクトであるERMESクラスターが増加する分子メカニズムを明らかにする本研究では,サイトゾルからミトコンドリアへのタンパク質の輸送,および膜間の脂質の輸送を中心に,ミトコンドリアが細胞内でいかに作られるかという根源的問題の分子機構を統合的に理解することをめざしている。まずタンパク質の交通については, 1000種類以上のミトコンドリアタンパク質の入り口として機能する「タンパク質専用の外膜透過装置」TOM複合体について,構成タンパク質がどのように集合して複合体をつくり,どのように前駆体タンパク質を効率よく膜透過させるかについて,計算科学による構造予測と部位特異的光架橋法を組み合わせて解析を行った。複合体の中心因子Tom40がつくる円筒構造の内側は,前駆体タンパク質が外膜を透過するための通り道として機能し,異なるタイプの前駆体ごとに,別々に最適化された通り道が用意されていた。Tom40のN末端領域は円筒構造内を貫通して膜間部側でシャペロンタンパク質を集め,疎水性前駆体を効率良く受け渡していた。さらにTOM複合体にはTom40から成る孔が3つの完成型と,孔が2つの準備型の2つの状態があり,それらを可逆的に変換することで新しいTom40を古いTom40と入れ替え,完全な機能をもつ複合体を維持していることが示唆された。脂質の交通については,ミトコンドリアの外膜から内膜に脂質を輸送するUpsタンパク質・(Ups1, Ups2)に関して,構造解析(Ups1)とin vitroでの脂質輸送解析(Ups1, Ups2)を行うとともに,酵母細胞から単離したミトコンドリア-ER膜画分を用いて, in vitroでERからミトコンドリアへのホスファチジルセリン(PS)輸送とミトコンドリアからERへのホスファチジルエタノールアミン(PE)輸送をモニターするアッセイ系を確立。この系を用いてミトコンドリア-ER間コンタクトを形成するERMESがPS輸送には関わるがPE輸送には関わらないことを見出した。タンパク質輸送については, TOM複合体のアセンブリー構造の解析が完了したので,これにもとづきラテラルリリースの機構解析を進めている。PINK1や0m45誘導体を含めた基質の検討, Tom40チャネルのラテラル開閉を点変異導入したCys間の架橋で阻害する条件検討を進め,順調に成果があがっている。酵母細胞へPINK1-Parkinシステムを導入したシステムを使って, PINK1-Parkin発現による細胞の増殖阻害を強める,あるいは弱める低分子化合物のスクリーニングを行っている。スクリーニングは順調に進んでおり,候補化合物が得られている。ノンストップ(NS)タンパク質のミトコンドリア膜, ER膜上での品質管理について,サイトゾルのユビキチンリガーゼLtn1の有無の影響の解析を行い,順調に結果が出ている(一部投稿中)。脂質輸送については, ER-ミトコンドリア間の脂質(PSとPE)の輸送をモニターできるin vitroアッセイ系の確立に成功し,現在投稿中である。この系を用いて, ERMESがER-ミトコンドリア間のPS輸送に関わる事を直接証明することに成功した(投稿中)。
看護職のストレスと睡眠に生かすマインドフルネス：生理機能からの客観的効果検証

看護職は心理的ストレスが高いと報告されている。業務量の多さや業務内容の特殊性、そして、睡眠の時間帯を意図的に変える必要があるため、慢性的な疲労や心理的ストレスを抱え、発がんリスクが高く、うつ病など精神保健上の問題を引き起こしやすいと考えられる。一方、労働環境や交代制勤務によって睡眠不足・睡眠の質の低下が引き起こされ、睡眠の質の低下が看護職の離職選択における最も重要な因子であるともいわれている。このように、看護職では、睡眠時間の不足あるいは質の低下が心理・身体的ストレスを引き起こしたり、日中のストレスが入眠障害や過覚醒といった睡眠障害の原因になっている可能性も考えられる。そこで、今年度は、看護職の違いによる努力ー報酬不均衡モデル、自覚的心理ストレスおよび睡眠の比較を行った。総合病院と訪問看護ステーションの看護師を対象に調査を行った。努力ー報酬不均衡モデルにERIモデル、自覚ストレスにうつ尺度のBDI-IIと不安尺度のSTAI、睡眠の質や量のPSQIを用いた。同時に昼食前に唾液と尿、就寝前に唾液を採取した。いずれの調査も日勤がある平日と勤務のない休日の2日間実施した。Mann-Whitney U検定を行った結果、ERIモデルの比較では、総合病院と訪問看護ステーションの看護師では有意な差を認めなかった。しかしながら、うつ尺度、不安尺度、睡眠で有意な差を認め、総合病院でいずれも有意に高値であった。。この状況は平日のみならず、休日でも同様の傾向が認められ、平日のストレスが休日にも影響していることが推察できた。今後、これらの心理的ストレスがバイオマーカーとどのような関連があるのか、また、マインドフルネスによる効果を検証していく。唾液および尿の採取は終わっており、バイオマーカーの測定を実施する。また、勤務中と睡眠中の自律神経活動をWHS-1で測定しているため、これらの解析も実施する。しかしながら、対象者数が少ないため、今後さらに協力してもらえる施設を探す必要がある。勤務形態により心理的ストレスが異なることが考えられた。しかも日中のストレスが入眠障害や過覚醒といった睡眠障害の原因となり、それが休日にも影響を及ぼしていることが推察できる。これらの心理的ストレスと睡眠不良に関連するバイオマーカーを探索すると同時に、心理的ストレスおよび睡眠不良が平日および休日に持続しているものへのマインドフルネスの介入を今後実施していく。このマインドフルネスの介入時にも自覚ストレスにうつ尺度のBDI-IIと不安尺度のSTAI、睡眠の質や量のPSQIを用いる。同時に昼食前に唾液と尿、就寝前に唾液を採取する。いずれの調査も日勤がある平日と勤務のない休日の2日間実施する。。本年度は調査をメインに行い、採尿ならびに唾液の採取をした。これらの検体に関しては、-30度で保存しており、今年度測定を実施する。

今年度測定を予定していた尿や唾液のストレスマーカーを次年度に行うようにしたため、繰越が多くなった。来年度は、測定に加えて、学会発表ならびに論文の作成を予定している。
電流と熱流の結合による巨大ゼーベック効果の包括的理解

本研究では、近年急速に注目されている有機熱電変換材料に関して、前回の新学術領域研究等にて報告している巨大なゼーベック係数の発現機構の解明を指向し、物性計測・化学計算・物性理論等の多角的アプローチを行う。平成30年度は、前年度までに実施してきた単結晶試料における熱電測定手法を用いて、同新学術領域内外における共同研究により提供された単結晶試料の測定を行い、複数の試料において数10 mV/K程度の巨大ゼーベック効果を見出した。また、測定中の試料に光照射を行った実験では、ゼーベック係数の減少が観測された。これにより、キャリア密度の増加によりゼーベック係数が変調を受ける可能性が強く示唆された。この結果は、以前に見出された熱励起によるゼーベック係数の変化とも符合する結果を与えた。さらに、共同研究により、物性理論において新概念を導入することで、これらの実験結果を理論的に説明できる結果がごく最近になって得られつつある。また同年度は、ペレット状に成形した粉末試料における熱電特性の測定法の開発も行った。この測定法では、昇華性や溶解性の無い試料にも適用できるため、より広範な試料のスクリーニング等において有益であると考える。この測定法を用いて、長さの異なるアルキル基をもつチエノアセン誘導体の測定を行ったところ、構造相転移に伴う導電性と熱電特性の変調が観測され、アルキル基が長いほどこの効果が顕著に得られることがわかった。これらの結果から、特に側鎖に関する設計指針が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は、単結晶試料における熱電測定を行い、複数の試料において10 mV/K程度の巨大ゼーベック効果を見出した。これにより巨大ゼーベック効果が、薄膜特有の結晶粒界や構造欠陥に起因して発現しているわけではないことが判明した。中でも、薄膜試料では巨大ゼーベック効果を示さなかったペリレンビスイミド類縁体について、単結晶試料においてのみ巨大ゼーベック効果を発現した。以前の薄膜試料のX線回折から、薄膜内で分子が基板に対して平行配向している傾向が強く出ており、巨大ゼーベック効果を示した他の薄膜が垂直配向優勢であることとは対照的であったため、分子スタック方向に温度差を印加することが巨大ゼーベック効果発現の条件の一つとして考えられた。今回巨大ゼーベック効果を発現したペリレンビスイミド類縁体の単結晶は分子スタック方向に結晶成長し、その方向に温度差を印加して熱電測定を行ったために上記条件が成立したと考えられる。これにより分子配向の効果について、より確かなものとなった。観測されたゼーベック係数は高温域では低下する傾向が見られた。これは熱励起による試料中のキャリア密度の増加に伴い、導電率の増加とゼーベック係数の減少が同時に起こっているものと予想される。試料中のキャリアの状態について、さらなる調査が必要であると考えられる。単結晶試料の熱電測定に関しては概ね順調に進行している。特に単結晶の作製とハンドリング技術に関して、想定以上に進行している。併せて実施を予定していたペレット試料での熱電測定については、測定用の改良型冶具の設計開発の面で、特殊部品の調達の問題からやや遅れているが、既存の冶具を用いた実験を繰り返しており、基礎的な知見が蓄積されつつある。新型冶具が到着次第、効率的に測定を開始する予定である。すでに新学術領域内での共同研究を進めており、いくつかの有望な候補材料に関しての熱電測定が可能であることを確認し、暫定的な結果が得られている。測定装置の準備が整い次第、ペレット試料での熱電測定を実施する。

ペレット試料の測定は昇華性や溶解性等の試料固有の物理的性質によらず、広範な試料について測定可能であり、ゼーベック係数・導電率・熱伝導率を同一方向で測定することで、より正確な熱電評価を行うことができる。これまでの予備実験からペレット試料の成形条件等の基礎的な知見は得られつつあるため、本年度の早い段階で本測定に着手できると判断している。また、単結晶試料での測定に関して、極低温で熱刺激電流測定を行うことで、トラップ状態の評価を行う。これまでの熱電測定において、比較的大きな導電率活性化エネルギーが観測されており、これと巨大ゼーベック効果との関連が疑われる。従来、バンドギャップに相当する活性化エネルギーが得られるはずであるが、試料内部の状態によって異なる振る舞いが得られる可能性がある。熱刺激電流測定では、外部電圧を印加することで蓄積されたキャリアを低温で封じ込め、徐々に温度を制御することで電流を検出し、試料内のトラップの深さを見積もる。単結晶試料のような比較的トラップの少ないと想定される試料と、薄膜試料等とを比較測定することで、内在する荷電状態のエネルギー等についての評価を行う。必要に応じて、分光的手法による解析等も適宜行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒト歯髄幹細胞の骨芽細胞分化における遺伝子制御システムの解明

本研究は骨組織や歯髄、象牙質発生の基礎的知見を得ることを目的とし、骨発生に必須であり、歯の発生にも深く関与するヘッジホッグシグナルのヒト歯髄幹細胞における役割の検証をin vitroで行った。ヘッジホッグシグナルのアゴニストのSmoothened agonist(SAG)やアンタゴニストであるCyclopamineを用いた骨芽細胞分化誘導の検証では、ヒト歯髄幹細胞において、アルカリフォスファターゼ染色およびリアルタイムPCRによる骨芽細胞マーカーの発現等、他の幹細胞とは異なった反応を示し常に興味深い結果が得られた。今後はヒト歯髄幹細胞の骨分化におけるGliファミリーの転写メカニズムを、バイオインフォマティクスを駆使した網羅的な解析の後にin vitro、in vivoの両面から検証を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ガラクト-スを認識するレクチンの多様な糖結合特異性に関する研究およびその応用

1.B-dガラクト-ス残基に親和性を示すレクチンの開発キカラスウリの根から異なる糖結合特異性を示すレクチンを見出して分離精製し、詳細な糖結合特異性を明らかにした。1つはNーアセチルラクトサミンのβーガラクト-ス残基のCー6位の水酸基がシアル酸や硫酸基で置換された場合に強い結合性を示す。一方のレクチンはType1およびType2の鎖のβーガラクト-ス残基のCー2位の水素基がフコ-スおよびNーアセチル基で置換された場合に強い親和性を示すレクチンであることを明らかにした。これまで血液型Type1Hおよび2Hの両者に親和性を示すレクチンは発見されておらず、本報告が始めてありその応用が期待される。2.各種レクチンを組み合わせた糖タンパク質糖鎖の微量構造解析消化器系癌および肝癌で出現増大する糖タンパク質の特異的糖鎖を明らかにした。肝細胞の癌化によってトランスフェリンおよびγーOTTPのアスパラギン結合糖鎖の分岐数が増大し、さらにトランスフェリンにXー抗原決定基および還元末端に結合したFucα1→6残基が出現することが判明した。一方、腸上皮細胞で産生されてapical sideに配列する癌胎児性糖タンパク質は正常時、Type1鎖を中心とした糖鎖であるが、癌化に伴いほとんどがType2鎖を基本骨格としたものに変わり、XおよびY抗原決定基が増大、出現することを明らかにした。3.レクチンを応用した肝癌および肝硬変診断薬の開発肝癌患者血清に見出されたフコシル化トランスフェリンが慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと到る過程のどの段階で発現するかをフコシル残基に親和性を示すヒイロチャワンタケレクチン(AAL)ーセファロ-スカラムを応用して解析した。その結果、肝硬変の段階から著しくAALー結合率が増大することが明らかとなった。この変化は肝細胞の硬変化と相関々係があるものと考えられ、肝疾患診断への応用が期待される。
アルコール依存症の回復支援―１次嗜癖の諸相の解明と効果的な看護支援の構築―

アルコール依存症者はアルコール依存症でない者と比べ、多くの人が生きづらさを感じていた。また、アルコール依存症者が生きていく社会的背景には、家族関係の破たん、社会的な安定の欠如、クロスアディクションへの移行などがあり、生活を営んでいくうえで困難な状況を抱えていた。さらに、アルコール依存症者の一次嗜癖の特徴として、人間関係の形成・維持の困難さ、物事への認知の偏りが判明した。アルコール依存症者の「生きづらさ」は断酒期間が3年以上になると徐々に低減し、20年以上ではアルコール依存症でない者と同等になることが明らかとなった。本研究では,生育歴によって形成される1次嗜癖が2次嗜癖であるアディクションを成立させているという概念を提唱しており,アルコール依存症者の「生きづらさ」は1次嗜癖から生じるものであると考える。そこで,アルコール依存症者の生きづらさの存在と1次嗜癖の回復過程を明らかにするために,自記式質問紙留置調査法による量的研究を行った。研究対象は,関東甲信越全都県のアルコール依存症の自助グループに参加し回復を目指して取り組んでいる男性アルコール依存症者である。また,コントロール群として,同地域の30-70歳代の健康な男性を対象とした。アルコール依存症者本人が書いた手記の分析を基に開発した「生きづらさ」に影響する因子に関する質問と評価過敏性-誇大性自己愛尺度(中山他, 2006)で構成した質問紙を用いた。分析方法は,アルコール依存症者群およびコントロール群の各項目について,単純集計,基本統計量(平均値,標準偏差等)の算出を行い比較した。また,アルコール依存症者を断酒期間で4群に分けて,統計的な分析を行った。今回対象としたアルコール依存症者の半数以上が生きづらさを抱えており,コントロール群よりも生きづらさを強く感じていた。アルコール依存症者の「生きづらさ」は,アルコール依存症者の他者評価への過敏な傾向と他者を理解する力と自己を承認する力が低く,孤独感の欠如,認知の歪みが強いという形で現れることが特徴であった。これらはアルコール依存症者特有の「生きづらさ」であり,幼い頃の愛着欲求の充足困難と自我確立の阻害に起因するという依存の精神病理の傾向である一次嗜癖の存在を証明できたと考えられる。アルコール依存症者の生きづらさは,断酒期間が長くなると低減し,生き方への満足感と自己肯定感,他者を理解する力が高くなるが,孤独感を感じるようになることが明らかとなった。アルコール依存症者の自助グループのミーティング(25回)での分かち合いや,手記(「BOX-916 2010年1月2012年4月」・「回復への道PART1,4」・「信じるようになった」に掲載された92編)から「回復」および「生きづらさ」に関する内容を抽出し,その類似性で分類し「人との関係」,「生きる」,「感謝・喜び」,「過去の自分への気づき」,「自分に対する考え」,「他者に対する考え」,「考え方の変化」,「感情」,「居場所」,「仕事」の10個のカテゴリーを抽出した。これらの結果から,アルコール依存症者の回復に影響する「生きづらさ」は,その人の物事に対する認知や言語的・非言語的な対人行動,人間関係の形成と維持,自己肯定感,対人信頼感,感情のコントロール,社会的な役割に対する満足感の7つの因子の程度で決定されると考え,アルコール依存症者の「生きづらさ」と「生きづらさ」に影響する因子の概念的定義と枠組みの明確化した。本研究では,これらの概念に基づいて,「生きづらさ」に影響する7つの因子と心理特性である「誇大性」と「過敏性」の傾向に着目して,アルコール依存症者の「生きづらさ」の存在とその特徴を探索的に明らかにし,回復過程を考察する。本研究の研究仮説は,1アルコール依存症者は多くの「生きづらさ」に影響する因子を抱えている,2アルコール依存症者には特有の「生きづらさ」がある,3断酒期間が長くなると「生きづらさ」は軽減する,とした。研究デザインは,横断的後ろ向きデザイン,自記式質問紙留置調査法による量的研究を用いて,仮説検証を行う。アルコール依存症者特有の「生きづらさ」を特定するために,アルコール依存症者群とアルコール依存症ではない健康者の集団をコントロール群として調査を行う。「生きづらさ」を測定する尺度はないため,「生きづらさ」に影響する因子に関連する質問項目を作成した。

今回対象としたアルコール依存症者の半数以上が生きづらさを抱えており,コントロール群よりも生きづらさを強く感じていた。アルコール依存症者の「生きづらさ」は,アルコール依存症者の他者評価への過敏な傾向と他者を理解する力と自己を承認する力が低く,孤独感の欠如,認知の歪みが強いという形で現れることが特徴であった。これらはアルコール依存症者特有の「生きづらさ」であり,幼い頃の愛着欲求の充足困難と自我確立の阻害に起因するという依存の精神病理の傾向である一次嗜癖の存在を証明できたと考えられる。アルコール依存症者の生きづらさは,断酒期間が長くなると低減し,生き方への満足感と自己肯定感,他者を理解する力が高くなるが,孤独感を感じるようになることが明らかとなった。これまでに明らかとなった結果を学会や勉強会等で医療者に報告し、効果的なアディクション看護支援を検討した。本研究では,生育歴によって形成される1次嗜癖が2次嗜癖であるアディクションを成立させているという概念を提唱しており,アルコール依存症者の「生きづらさ」は1次嗜癖から生じるものであると考える。そこで,アルコール依存症者の生きづらさの存在と1次嗜癖の回復過程を明らかにするために,自記式質問紙留置調査法による量的研究を行った。研究対象は,関東甲信越全都県のアルコール依存症の自助グループに参加している男性アルコール依存症者である。また,コントロール群として,同地域の30-70歳代の健康な男性を対象とした。アルコール依存症者本人が書いた手記の分析を基に開発した「生きづらさ」に影響する因子に関する質問と評価過敏性-誇大性自己愛尺度(中山他, 2006)で構成した質問紙を用いた。分析方法は,アルコール依存症者群およびコントロール群の2群、アルコール依存症者を断酒期間で4群に分けて,統計的な分析を行った。今回対象としたアルコール依存症者の半数以上が生きづらさを抱えており,コントロール群よりも割合が高かった。アルコール依存症者の「生きづらさ」は,他者評価への過敏な傾向、他者を理解する力と自己を承認する力が低く,孤独感の欠如,認知の歪みが強いという特徴があった。これらは幼い頃の愛着欲求の充足困難と自我確立の阻害に起因する依存の精神病理の傾向であり、一次嗜癖の存在を証明できたと考えられる。さらに、アルコール依存症者の生きづらさは,断酒期間が長くなると低減し,生き方への満足感と自己肯定感,他者を理解する力が高くなるが,孤独感を感じるようになることが明らかとなった。アルコール依存症者の回復過程は,自助グループの仲間との関係の中で,他者を理解する力を高め,自分の内側をみつめて孤独を感じるようになり,自分の生き方への満足感と自己肯定感が高まる経験を積み,自己を成長させていくことである。アルコール依存症者はアルコール依存症でない者と比べ、多くの人が生きづらさを感じていた。また、アルコール依存症者が生きていく社会的背景には、家族関係の破たん、社会的な安定の欠如、クロスアディクションへの移行などがあり、生活を営んでいくうえで困難な状況を抱えていた。さらに、アルコール依存症者の一次嗜癖の特徴として、人間関係の形成・維持の困難さ、物事への認知の偏りが判明した。アルコール依存症者の「生きづらさ」は断酒期間が3年以上になると徐々に低減し、20年以上ではアルコール依存症でない者と同等になることが明らかとなった。
エピゲノムによるブナ林衰退と一斉開花の環境影響評価：季節の隔たりがある因果解析

森林衰退の環境影響評価において、誘因となる環境変動と植物影響に季節的な時間のズレがある場合の因果関係を評価することは難しい。ゲノムのDNAメチル化は環境情報をDNAの化学修飾として記録して、その後の遺伝子発現を制御するエピゲノムの機能をもつため、生物指標としては「時間的ズレがある因果関係の評価」に利用できる可能性がある。本研究ではブナ衰退林の一斉開花の乱れを対象に、春季の高濃度オゾンがDNAメチル化を介して夏季の関連遺伝子群の発現調節に負の影響を与えて花芽分化を抑制することを明らかにする。以上、関連遺伝子のDNAメチル化が時間の隔たりがある因果関係を評価する生物指標としての有効性を検討する。
トリプレット病発症機構解明のモデル細胞開発とその解析-ジョセフ病をモデルとして

[目的]昨年度は非神経であるBHK細胞にポリグルタミン鎖の伸長したtruncated formのataxin-3を一過性に発現させ、凝集体形成と細胞死を来すような系を確立したが、本年はこの細胞死と細胞周期との関連を明らかにすることを目的として実験を行った。[方法]CAGリピートが77回に増大した異常MJD遺伝子に由来し、C末側にmycタグをつけ、N末側を削ったtruncated ataxin-3をCMVプロモーター下に発現するプラスミド、pMJD-Q77(dN286)を用い、リン酸カルシウム法にてBHK細胞に一過性に発現後、細胞を通常の10% fetal bovine serum(FBS)下ないしは0.5%FBS下にて培養し、その後の細胞死を比較検討した。また細胞周期をG1期に強制的に止める目的で、BHK細胞にpMJD-Q77(dN286)とともにcyclin-dependent kinase inhibitorであるp21^<cip1>をco-transfectionした際の細胞死を同様に検討した。さらに、truncated ataxin-3(Q77)の細胞毒性における細胞周期停止効果を神経系にても確認する目的でPC12細胞を用い、未分化PC12細胞およびNGF処理PC12細胞にそれぞれpMJD-Q77(dN286)をtransfectionした際の細胞死を検討した。なお組み替えタンパクの発現は抗myc抗体を用いた免疫組織化学法にて、細胞死は核をHoechist dyeにて染色した際の形態変化から検討した。「結果]BHK細胞ではtruncated ataxin-3(Q77)による細胞死は、低血清状態で培養し細胞周期をG0/G1に停止させることにより通常の17%から54%に増加した。またp21^<cip1>のco-transfectionによる細胞周期のG1への停止でも細胞死は44%と増加していた。さらにPC12細胞でも、未分化な細胞周期を回っている状態でのtruncated ataxin-3(Q77)による細胞死は15%であったが、NGF処理後に神経細胞様に分化し、細胞周期が停止した状態では48%まで増加していた。[結論・考察]以上より、ポリグルタミン鎖の伸長したataxin-3断片による細胞死は細胞周期が停止した場合により増強されることが明らかとなった。神経細胞の細胞周期はG0に停止しているので、この結果はポリグルタミン病でなぜ神経細胞がより細胞死を来しやすいかを考える基礎となりうる知見と考えられる。[目的]今年度は非神経細胞である培養BH鴫細胞にMJD原因遺伝子産物であるataxin-3由来の一連の組み替えタンパクを一過性に発現させ細胞死を来すような系を確立し、組み替えタンパクの長さと細胞内における凝集体形成性および細胞死の関連を追求することを目的に実験を行った。[方法]CAGリピート数が10回(Q10)のヒト正常

MJD遺伝子と77回に増大した(Q77)異常MJD遺伝子に由来しC末側にmycタグをつけた組換えタンパクをCMVプロモーター下に発現するプラスミドを構築した。さらに組換えタンパクのN末側からアミノ酸配列を順次切り詰めた種々の長さのMJD遺伝子産物を発現する複数のプラスミドを作製した。これらのプラスミドを塩化カルシウム法を用いてBHK細胞に導入し一過性に発現させる系を確立した。組み替えタンパクの発現は抗myc抗体を用いた間接蛍光抗体法で観察し、同時に核DNAを日oechst dyeにて染色して核濃縮や断片化を細胞死の指標として検討した。[結果]通常の培養条件下では、全長の正常(Q10)並びに異常(Q77)ataxin-3の約70-80%は核に集積した。リピート数10回の全長並びに短縮型ataxin-3の発現系では凝集体形成、細胞死とも明らかなものはなかったが、リピート数77回のataxin-3ではN末側の欠損部分の大きさに比例して細胞内凝集体の形成頻度が増加した。Q77を有しN末側から286個のアミノ酸を欠損するataxin-3fragmentの発現では有意に高い頻度(約15%)の細胞死が観察されたが、N末側から268個のアミノ酸を欠損するfragmentの発現では有意の細胞死は観察されず、細胞内凝集体形成性と細胞死の誘導性の間に解離が認められた。さらに今回の系で観察された細胞死は低血清培養条件下で増強された。[結論・考察]今回の結果からQ77を有するataxin-3の短縮型タンパクの発現では、凝集体形成と細胞死の間に解離が存在することが明らかとなった。〔目的〕昨年度は非神経であるBHK細胞にポリグルタミン鎖の伸長したtruncated formのataxin-3を一過性に発現させ、凝集体形成と細胞死を来すような系を確立したが、本年はこの細胞死と細胞周期との関連を明らかにすることを目的として実験を行った。〔方法〕CAGリピートが77回に増大した異常MJD遺伝子に由来し、C末側にmycタグをつけ、N末側を削ったtruncated ataxin-3をCMVプロモーター下に発現するプラスミド、pMJD-Q77(dN286)を用い、リン酸カルシウム法にてBHK細胞に一過性に発現後、細胞を通常の10%fetal bovine serum(FBS)下ないしは0.5%FBS下にて培養し、その後の細胞死を比較検討した。また細胞周期をG1期に強制的に止める目的で、BHK細胞にpMJD-Q77(dN286)とともにcyclin-dependent kinase inhibitorであるp21^<cipl>をco-transfectionした際の細胞死を同様に検討した。さらに、truncated ataxin-3(Q77)の細胞毒性における細胞周期停止効果を神経系にても確認する目的でPC12細胞を用い、未分化PC12細胞およびNGF処理PC12細胞にそれぞれpMJD-Q77(dN286)をtransfectionした際の細胞死を検討した。なお組み替えタンパクの発現は抗myc抗体を用いた免疫組織化学法にて、細胞死は核をHoechist dyeにて染色した際の形態変化から検討した。
生体適合性を高め長期腹膜透析を可能とする機能性レドックスナノ粒子の開発

腹膜透析は在宅治療が可能であり,生活の質(QOL)の高い血液浄化療法であるが,被嚢性腹膜硬化症(EPS)や腹膜劣化により長期治療が困難となっている.この問題の解決のため,腹膜透析液中に含有可能であり,腹膜における炎症局所で抗酸化作用を発揮するとともに,老廃物を吸着することにより透析効率を高める,シリカ含有レドックスナノ粒子(SiRNP)を開発した.本研究はDDS(Drug Delivering System)技術の応用により、機能性ナノ粒子含有腹膜透析液を開発し、生体適合性を高め、長期腹膜透析を可能とすることを目的とする。申請者らが近年開発してきた酸化ストレス部位特異的に抗酸化作用を発揮するナノ粒子を基に、活性酸素消去による腹膜保護と老廃物吸着能を有するナノ材料を設計し、安全でQOLの高い腹膜透析を可能にし、長期にわたる腎代替療法に利用できるシステムを構築するものである。本研究では,まず薬理効果の高いニトロキシルドジカル・誘導体を選定し,次いでこの化合物のナノ粒子を合成する。その後,動物実験により生体内安定性・安全性の確認するとともに,腹膜炎モデルにおいて腹膜保護機能効果を検討し,最終的に腎不全モデルにおける効果を評価する。平成25年度においては,上記計画のうち,腹膜炎モデルにおける評価を中心に施行した。本研究では,まず薬理効果の高いニトロキシルドジカル・誘導体を選定し,次いでこの化合物のナノ粒子を合成する.その後,動物実験により生体内安定性・安全性の確認をするとともに,腹膜炎モデルにおいて腹膜保護機能効果を検討し,最終的に腎不全モデルにおける効果を評価する.平成24年度においては,上記計画のうち,ニトロキシドラジカルの選定・ナノ粒子の合成,動物実験における基礎的動態の確認及び,一部腹膜炎モデルの評価も施行した.本研究はDDS(Drug Delivering System)技術の応用により、機能性ナノ粒子含有腹膜透析液を開発し、生体適合性を高め、長期腹膜透析を可能とすることを目的とする。研究代表・分担者らが近年開発してきた酸化ストレス部位特異的に抗酸化作用を発揮するナノ粒子を基に、活性酸素消去による腹膜保護と老廃物吸着能を有するナノ材料(SIRNP)を設計し、安全でQOLの高い腹膜透析を可能にし、長期にわたる腎代替療法に利用できるシステムを構築するものである。SIRNPは既報(Bioconjugate Chem. 20:1792-8 2009, Biomaterials 32:8021-8 2011)に基づき,ニトロキシドラジカルTEMPOを内包する数十nmサイズのナノ粒子として合成した.SiRNPはRNPにゾル-ゲル法にてシリカ粒子を融合させ作成した.SiRNPはCG誘発性EPSモデルラットに対して腹膜中のスーパーオキサイドを効果的に消去し、腹膜の厚膜化を抑制した.非粒子化TEMPOLでは腹膜保護効果は微弱であった.腹腔内投与されたTEMPOLは速やかに血中に拡散したが,SiRNPは血中への移行が認められなかった.SiRNPは腹膜透析においてEPSを予防し,高いQOLを実現できるバイオマテリアルとして期待できる.腎臓内科学,人工透析学,酸化ストレス医学本研究は以下の各ステップからなる。1薬理効果の高いニトロキシルラジカル・誘導体の選定,2この化合物のナノ粒子合成,3動物実験による生体内安定性・安全性の確認,4腹膜炎モデルにおける腹膜保護機能効果検討,5腎不全モデルにおける生体内安定性および腹膜保護機能効果検討。平成24年度においては,当初計画通り上記ステップ1-3までを遂行している。平成25年度は, 4においては腹膜炎モデルを用い,ナノ粒子腹膜保護機能をESR法や組織学的手法により評価することを中心に行い,また一部ステップ5において実際の腎不全動物における動態と腹膜保護効果を評価した。ナノ粒子は,我々が既に確立したニトロキシドラジカル含有ナノ粒子(RNP)の疎水性コア中でゾルーゲル法によりシリカ粒子を形成せしめた(SiRNP)粒子を合成した。これらをクロルヘキシジンにより惹起された被嚢性腹膜硬化症モデルマウスに腹膜透析液とともに腹腔内投与し,腹膜保護効果の検討を行った。SiRNP投与群では腹膜中皮細胞の脱落予防など腹膜保護効果が認められた。本研究は以下の各ステップからなる.1.薬理効果の高いニトロキシルラジカル・誘導体の選定,2.この化合物のナノ粒子合成,3.動物実験による生体内安定性・安全性の確認,4.腹膜炎モデルにおける腹膜保護機能効果検討,5.腎不全モデルにおける生体内安定性および腹膜保護機能効果検討

.1では使用されるニトロキシドラジカル誘導体に関し,薬理効果が高く,かつ合成可能なものを決定し,2においてはその合成プロセスを確認する.3ではin vivo/ex vivoでの安定性を評価し,またLD50測定など安全性の検討を行う.4においては腹膜炎モデルを用い,ナノ粒子腹膜保護機能をESR法や組織学的手法により評価する.5においては実際の腎不全動物における動態と腹膜保護効果を評価する.平成24年度においては,当初計画通り上記ステップ1-3までを遂行し,また同時並行的なパイロットスタディとしてステップ4の検討も行った(このステップは当初平成25年度以降予定).ニトロキシルラジカル・誘導体は,当初予定通り6員環(TEMPO)を使用することにより,効果が得られることを確認した.このナノ粒子の合成については,我々が既に確立したニトロキシドラジカル含有ナノ粒子(RNP)の疎水性コア中でゾルーゲル法によりシリカ粒子を形成せしめた(SiRNP)粒子を合成した。これらをマウスに投与し,基礎的な導体及び安全性の検討を行った.当初計画に基づき,これまでの結果を基に,腎不全モデルにおける検討を中心に進める。腎不全モデルでは,SiRNPを含有させた腹膜透析液を使用し,血清クレアチニンやBUNなど腎不全指標に対する検討を行う。電子スピン共鳴法(ESR)を用い,本粒子の体内動態,形状変化の追跡を行う。これらはこれまでに開発されたRNP-pH, RNP-nonpHの両ナノ粒子とともに4-hydroxy-TEMPOやamino-TEMPOなどの非粒子化低分子TEMPO誘導体と効果比較を行う。スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルの発生量の定量を行う。また、過酸化脂質、プロテインカルボニル、8OHdGの定量を行うとともに、TGF、VEGFやAng IIの発現を評価する。当初計画に基づき,引き続き上記ステップ3の検討を行うとともに,既に一部施行しているステップ4およびステップ5へ研究を進める.具体的には,ステップ3として尿毒症性物質や生理活性物質等のナノ粒子への吸着試験をモデル実験系で行い、in vitro、in vivo用の評価のデータを収集する。ステップ4として腹膜炎モデルにおける腹膜保護効果・抗酸化ストレス効果の評価を行う.腹膜炎モデル動物の作製は既報に従い,クロルヘキシジン投与によりラットを用いて作製する。RNP-pH, RNP-nonpHの両ナノ粒子とともに4-hydroxy-TEMPOやamino-TEMPOなどの非粒子化低分子TEMPO誘導体をPD液中に含有させ投与する.またGSHなど既知の抗酸化剤をコントロールとして用いる.腹膜機能評価は透析液投与4時間後に透析液及び血液を回収し、クレアチニン濃度比にて評価を行う。蛍光プローブを用い、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルの発生量の定量を行う。腹膜は被嚢化を評価するとともにH&E染色により組織の評価を行う。
タッチパネル式情報提供コンピュータを活用した糖尿病患者のセルフケア自己評価の試み

糖尿病患者のセルフケアに対する主観的な評価を理解するために、外来受診時にセルフケア自己評価尺度(タッチパネル式情報提供コンピュータ)を活用した関わりの言動から、どのような自己評価がなされていたのかを明らかにし、その結果を考慮し、外来看護システムの中でも活用できるセルフケア自己評価アプリケーションと管理システムを作成した。本研究の目的は,患者の主観的な評価をセルフケア自己評価尺度(平成20年度作成)を用いてより客観的に測定するとともに,縦断的に変化をおって調査を行い,患者が自己評価を繰り返し行うことでセルフケアの向上がはかれるのか,またその結果が糖尿病の自己管理状況と関連するのかを明らかにすることである。そのための準備として、セルフケア自己評価尺度を導入したタッチパネル式情報提供コンピュータを外来に設置するための準備として、受診の際にどこでも、かつ手軽に実施できるように、充電時間が長く、軽量で、タッチパネル式のタブレット式ノートパソコンを購入し、作成したアプリケーションを投入した。また、縦断的に変化を追って調査を行う際のデータの保管方法として、紙媒体のデータになるため、PDF化し、整理して保管ができるソフトの準備および調査場所の確保を行った。実際の調査は、準備に時間がかかり、平成23年の5月から実施する予定である。本研究の目的は、患者の主観的な評価をセルフケア自己評価尺度(平成20年度作成)を用いてより客観的に測定するとともに、縦断的に変化をおって調査を行い、患者が自己評価を繰り返し行うことでセルフケアの向上がはかれるのか、またその結果が糖尿病の自己管理状況と関連するのかを明らかにすることである。そのための準備として、セルフケア自己評価尺度アプリケーションを導入したタッチパネル式情報提供コンピュータ(平成22年度作成)を外来に設置した。平成23年6月から、外来の糖尿病患者に面接を通して、自己評価を一緒に試み、縦断的に変化を追って調査を開始した。データの保管方法として、紙媒体のデータを対象ごとのファイルに綴じ、鍵のかかる保管庫で管理した。面接は、自己評価を繰り返し試みた対象のセルフケア状況の変化やアプリから算出されるセルフケア自己評価得点、HbA1cとの関連を明確にしながら面接を進めた。データはセルフケア自己評価得点結果(タッチパネル式コンピュータよりプリントアウトしたもの)と面接時の対象の言動を面接記録用紙に都度記入して収集した。面接実施者は研究代表者を含めた4名、対象者は20名を予定していたが、途中、病態の悪化での長期入院、診療計画の変更、転院の諸事情により、3名減員し17名の継続となった。面接開始後8ヶ月の時点で中間評価を行い、目的に応じたデータが得られたと判断し、平成24年3月から4月の面接で、対象者の意向を確認し面接を終了することを決定した。【1.外来看護におけるタッチパネル式情報提供コンピュータ活用の有効性の検討】1平成23年6月平成24年4月の調査データの分析:糖尿病患者のセルフケアに対する主観的な評価を理解するために、セルフケア自己評価尺度(タッチパネル式情報提供コンピュータ)を活用した関わりの中でどのような自己評価がなされていたのか、その言動を明らかにすることを目的に、質的統合法KJ法を用いた。分析対象は15事例で、個別分析においては対象の生活背景・価値観・ライフサイクルに応じて、さまざまな言動があった。分析の段階は個別分析中であるが、セルフケア自己評価の言動は、自己の葛藤や試行錯誤の調整の循環であり、対象の自律に向けてのポジティブな循環となり、自己を意識したセルフケア実践のプロセス評価であると推測された。看護師は、この糖尿病患者の自己評価の様相に寄り添い、生涯にわたり糖尿病患者とともにセルフケアを促進していくことが重要であることがわかった。これらの成果は、対象と研究者が共にセルフケア自己評価尺度という同じ物差しとその結果が示された可視化されたグラフを通して、対象のセルフケアについて考えることができたことと、対象者に寄り添う看護師の存在も重要であることがわかった。そのため、看護師が多忙な外来業務の中でも患者の自己評価の状況を察知できるようなシステムつくりが必要である。21の結果をもとに協力施設の外来看護師に有効性・利便性についての説明を行い、システムつくりに同意を得た。【利活用に向けたシステムつくり】1協力施設に限らず、地域の糖尿病療養指導士が活用できるようにアプリケーションのシステムの整備を行い、2協力施設の外来システムの中にタッチパネル式情報提供コンピュータのシステムを組み込んだ。調査開始時期が遅れ、データは収集できたが、計画していた分析までに至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。【外来看護におけるタッチパネル式情報提供コンピュータ活用の有効性の検討】1これまでの調査結果を分析する。2調査成果をもとに協力施設の外来看護師と有効性・利便性についての検討会議を設ける。【利活用に向けたシステムつくり】1タッチパネル式情報提供コンピュータのシステムの整備を行う。2協力施設の外来システムの中にタッチパネル式情報提供コンピュータのシステム活用を組み込む。【外来看護におけるタッチパネル式情報提供コンピュータ活用の試行および評価】報告書のまとめ、その後,看護系の学会で公表する。
膀胱癌に対する抗体検出に付随する新規腫瘍マーカーの解析

本研究の目的は低侵襲性で患者への負担の少ない体液を対象とした膀胱がん診断法の確立である。膀胱癌特異的単クローン性抗体、患者血清中の自己抗体が認識する腫瘍関連蛋白質を同定した。検出蛋白質のうち膀胱癌と臨床病理的な相関関係が認められたものが数多く得られた。本研究で得られた成果の一部を特許申請した。残り多くの検出した蛋白質について、さらに検討・適正化を進め、臨床への実用化を目指す予定である。獲得した単クローン性抗体を用いた一次スクリーニング、患者血清を一次抗体として用いた腫瘍関連タンパク質の一次スクリーニングの結果を健常人血清、非腫瘍性疾患患者血清と比較して、腫瘍特異的マーカーとして同定されたものについて、さらに多数例を用いて二次スクリーニングを行う。統計学的に有意であり、ROC curveからAUC値が0.7以上であるマーカーに関しては、さらに多数例の膀胱癌患者血清を用いて、単独で特定の膀胱癌の早期診断マーカーとして使用できるものか、複数のマーカーを組み合わせて使用することで診断できるか否かをバイオインフォマティクスの手法を用いて検討した。本年度は20種の膀胱癌関連蛋白を血清中より検出することができた。現在、さらにスクリーニングを進めている。抗がん剤(シスプラチン)の感受性を指標に、治療前血清で抗がん剤の感受性を予測できるか否かを一次スクリーニング、二次スクリーニングと同様の方法で検討し、早期診断に関する腫瘍関連タンパク質に関しは、精製タンパク質を用いて単クローン性抗体の作製を行うか、市販の抗体を購入して、膀胱癌組織マイクロアレイを用いて免疫染色を行った。作製済みの単クローン性抗体が、昨年度の検討でホルマリン固定した膀胱癌細胞株4種類に特徴な染色性を示した場合、作製済みの膀胱癌組織マイクロアレイを用いてさらに免疫染色を行った。その結果から、得られた抗体の発現と臨床病理学的因子との関連性を統計学的に検討を行ったところ、シスプラチン感受性との関連性が示唆された抗体に関しては、治療効果の明らかな抗がん剤治療前の膀胱癌組織を免疫染色し、抗がん剤感受性を予測できる抗体か否かを検討した。シスプラチン感受性に関する抗体に関して実際の臨床検体(病理組織や血清)を用いて現在も検討を進めている。獲得済みの膀胱癌特異的抗体、自己抗体が認識するタンパク質に対して、収集済みの多数例膀胱癌患者血清および腫瘍組織との反応性から、早期診断、抗癌剤感受性予測マーカーの獲得を遂行した。■樹立済み抗体を用いた患者血清との反応性の検討:シスプラチン耐性細胞株を複数樹立し、それらを免疫源に抗体を作製、元の感受性株と耐性株を免疫組織化学的スクリーニング法で両者に反応性の相違が認められた抗体を樹立。膀胱癌特異的抗体と患者血清との反応性と.血清からアルブミンと免疫グロブリンはカラムを用いて除いた後、20倍希釈でPVDF膜に所有のマイクロドットアレイヤーを用いドットした。Blocking剤で処理したPVDF膜は、樹立した単クローン性抗体の培養上清を用いての反応から、TBS-Tで洗浄後、HRP標識二次抗体との反応を行った。Dot Blot Chip System ver.4ソフトウエア(ダイナコム)上で解析し、全ての抗体に関してこの一次スクリーニングを実施。来年度に行う二次スクリーニングに持って行く抗体類を選択を現在も行なっている。膀胱癌組織との反応性はホルマリン固定した膀胱癌細胞株(grade 1細胞株RT-4, grade 2細胞株5637,grade 3細胞株T24,転移巣より樹立されたTCCSUP)を用いて染色し臨床病理学的検討、予後との相関関係、単変量、多変量解析を行い、腫瘍マーカーとしての有用性を検討している。本研究費を受諾することで、膀胱癌(尿路上皮癌)の腫瘍マーカーの探索を遂行してきた。膀胱癌特異的単クローン性抗体を600個、膀胱癌患者血清中の自己抗体が認識する腫瘍関連蛋白質163個を同定した。一次スクリーニングを行うことで膀胱癌特異的抗体を204個、自己抗体を138個獲得した。検出蛋白質のうち膀胱癌と臨床病理学的な相関関係が認められたものが数多く得られた。本年度においては、膀胱癌特異的蛋白としてnestin、periplakinを、血清蛋白としてS100A6、自己抗体としてMMP2、calreticulinを同定した。Nestin、periplakinにおいては手術標本を用いた免疫染色の検討を行った。Nestinは進行癌で発現が増強し、生命予後も不良であった。また、periplakinは進行癌で発現が消失し、生命予後も不良であった。加えて、血清periplakinの膀胱癌症例での動態を検討し、健常者と比較し膀胱癌症例での発現が有意に低下していた。本蛋白質は血清マーカーとして膀胱癌の検出に利用できる可能性を示唆していた。血清S100A6は健常者と比較し膀胱癌症例で発現有意に上昇しており、治療後など経過観察の腫瘍マーカーのとして有用性を示した。

また、自己抗体としてのMMP2、calreticulinについて、膀胱癌症例で有意に上昇していた。膀胱癌に関する自己抗体の存在について始めて報告した。本研究で得られた成果の一部を「膀胱癌の診断」(特願2015-020750)と題して特許申請を行った。残り多くの膀胱癌に関連する蛋白質を同定しているため、今後さらに検討、適正化を進め、特許取得、臨床への実用化を目指す予定である。泌尿器科学、腫瘍学膀胱癌特異的と考えられる腫瘍タンパクを20種類同定した。その20種類に関して現在スクリーニングを行なっている。引き続き、臨床病理学的所見や健常者、良性疾患症例と比較検討を行い、有用性を見いだす予定である。継続した研究の進行度についてを以下に略記する。■血清中の自己抗体を利用した腫瘍関連抗原の同定:一次スクリーニングを行って有用な血清中の蛋白に関して、二次スクリーニングを行い、現状の20種の蛋白を選択した。シスプラチン感受性に関する蛋白も現在二次スクリーニングを行っている。現在までのところ概ね順調に研究は進行している。(80%)膀胱癌特異的と考えられる腫瘍タンパクを8種類同定した。その8種類に関して現在スクリーニングを行なっている。今後、臨床病理学的所見や健常者、良性疾患症例と比較検討を行い、有用性を見いだす予定である。計画書に記載し、昨年度までに研究があまり進行しておらず、現在開始しているものを以下に略記する。■血清中の自己抗体を利用した腫瘍関連抗原の同定:細胞株を二次元電気泳動しPVDF膜に転写後、展開された蛋白を用いて、膀胱癌症例での細胞異型度(grade)1から3までの患者血清、正常者血清を8名ずつ用いて一次抗体とし、網羅的に自己抗体が認識する腫瘍関連抗原を同定を行なう。このタンパク質をマイクロドットプロットアレイヤーを用いた膀胱癌患者血清中の蛋白質、自己抗体解析法で、一次スクリーニングを実施を行なっている。1.獲得した新規蛋白質20種に関してさらにスクリーニングを行う。実際の患者血清中での発現を検討する。2.抗がん剤(シスプラチン)の感受性を指標に、治療前血清で抗がん剤の感受性を予測できるか否かを上記同様に検討していく。早期診断に関する腫瘍関連タンパク質に関しては、精製タンパク質を用いて単クローン性抗体の作製を行うか、市販の抗体を購入して、膀胱癌組織マイクロアレイを用いて免疫染色する。3.作製済みの単クローン性抗体が、昨年度の検討でホルマリン固定した膀胱癌細胞株4種類に特徴な染色性を示した場合、作製済みの膀胱癌組織マイクロアレイを用いてさらに免疫染色を行う。その結果から、得られた抗体の発現と臨床病理学的因子との関連性を統計学的に検討する。シスプラチン感受性との関連性が示唆された抗体に関しては、治療効果の明らかな抗がん剤治療前の膀胱癌組織を免疫染色し、抗がん剤感受性を予測できる抗体か否かを検討する。研究費の大半は研究用消耗品に当てる。前年度と同じ内容の消耗品を購入予定である。また、研究成果発表のため、国内学会への参加費100千円と英文論文作成のため、外国語論文の校閲費と論文投稿料(別册、カラーページ印刷代)として200千円を計上している。