hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Niche理論に基づく癌幹細胞ワクチン療法の開発

癌幹細胞に対するワクチン療法を開発するために、まずWT1蛋白に対する免疫応答を検討した。WT1は癌細胞の悪性憩室維持に極めて重要な働きを持つ癌幹細胞としての可能性を持った蛋白であり、様々な癌腫で発現が確認されている。日本人に多いHLA-A24のWT-1拘束ペプチドを用いた免疫応答が確認された。また、腫瘍細胞よりCD133抗体を用いて癌幹細胞様細胞を分離してspheres形成を試みた。一部の癌細胞株でspheres形成様のcolonyを確認され最終目標であるNiche抑制による癌幹細胞制御の基礎が構築された。最近、白血病研究より癌幹細胞の存在が提唱され始めた。固形癌においても同様な考え方が予想されていたが、最近になり、大腸癌においてもその存在がcolon cancer initiating cellとして報告されてくるようになった(Nature 2007, 445, 111-115)。従来、癌の治癒のためには完全に手術により腫瘍組織を摘出するか、化学療法などによってtotal cell killを行なうことが必要と考えられてきた。しかし、癌幹細胞の概念では、癌を根治するためにはすべての癌を根絶する必要はなく、癌幹細胞のみを殺傷すれば残りの腫瘍細胞は自然に寿命がきて死滅する可能性が示唆されている。従って癌幹細胞の頻度は低いが、強い免疫原性を有することが予想される。そこで、我々は癌幹細胞ワクチンの確立に向けて、幹細胞に対する免疫が惹起されうるのかを第一検討項目とした。以前より癌ワクチン療法の標的蛋白として注目されているWT1に着目して検討を行った。WT1は様々な癌に発現し、癌細胞の悪性形質維持に極めて重要な働きを行うことが報告されていて、癌幹細胞との関連性も強く示唆されている。日本人に多いHLA-A24のWT1拘束性ペプチド(CMTWNQMNL)を用いて癌患者血液よりCTLの誘導を試みた。方法はin vitroで樹状細胞を用いて誘導し、ペプチド特異的応答を検討した。CIR/A24株を用いて検討したところpeptide特異的な細胞障害活性を確認でき、少なくともWT1 peptideに対する応答は惹起し得ることが確認できた。現在、腫瘍細胞特異的反応について検討を行っている。固形癌においても同様な考え方が予想されていたが、最近になり、大腸癌においてもその存在がcolon cancer initiating cellとして報告されてくるようになった(Nature2007,445,111-115)。以前より癌ワクチン療法の標的蛋白として注目されているWT1に者目して検討を行った。In vitroで誘導されたCTLはSW480(WT1+/A24+)に対する障害活性を認めたが、AZ521(WT1+/A24-)に対しては認めなかった。すなわち、HLA-A24/WT1特異的なCTLの誘導が可能となり幹細胞に対する免疫応答が惹起できる可能性が示唆された。現在、腫瘍細胞よりCD133抗体を用いて、幹細胞の分離を試みている。固形癌においても同様な考え方が予想されていたが、最近になり、大腸癌においてもその存在がcolon cancer initiating cellとして報告されてくるようになった(Nature 2007,445,111-115)。

従って癌幹細胞の頻度は低いが、強い免疫原性を有することが予想される。そこで、我々は癌幹細胞ワクチンの確立に向けて、幹細胞に対する免疫が惹起されうるのかを第一検討項目とした。以前より癌ワクチン療法の標的蛋白として注目されているWT1に着目して検討を行った。WT1は様々な癌に発現し、癌細胞の悪性形質維持に極めて重要な働きを行うことが報告されていて、癌幹細胞との関連性も強く示唆されている。前年度の報告までは、日本人に多いHLA-A24のWT1拘束性ペプチド(CMTWNQMNL)を用いて癌患者血液よりCTLの誘導を試み、誘導したCTLはSW480(WT1+/A24+)に対する障害活性を認めたが、AZ521(WT1+/A24-)に対しては認めなかった。すなわち、HLA-A24/WT1特異的なCTLの誘導が可能となり幹細胞に対する免疫応答が惹起できる可能性が示唆され、WT1癌幹細胞のkey proteinと推測すれば、癌幹細胞に対する免疫応答が惹起することが確認できた。また、CD133を使用して、腫瘍細胞より癌幹細胞を誘導することに関しては、populationが低いことが原因であるためか、spheres形成には成功していない。
プッシュ・プル-エチレン型新規有機分子触媒の開発と医薬品合成への応用

有機分子触媒を用いた立体選択的な反応は,環境に優しい合成法として近年注目を集め,医薬品合成への応用が期待されている。有機分子触媒の中でも,チオウレア型,およびスクアラミド型の有機分子触媒は優れた触媒活性を示し,多くのタイプの触媒が報告されている。しかし,その触媒効率(高用量,長時間の反応時間)は必ずしも満足できるものではなく,より効率的な有機分子触媒の開発が待ち望まれている。そこで,これまで報告例の無いプッシュ・プル-エチレン型の不斉有機分子触媒を開発し,種々の立体選択的不斉反応に応用するすることを目的に本研究に取組んだ。最終年度である平成30年度では,これまでに開発したジアミノメチレンマロノニトリル型のプッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒を用いて,これまでに報告例の無いホスホネートの単純ケトンへの不斉求核付加反応の開発を検討し,高いエナンチオ選択性で目的の付加体を得ることに成功した。また,本反応における比較実験によって,ジアミノメチレンマロノニトリル骨格が既存のチオウレア基やスクアラミド基よりも優れた水素結合供与能を示すことが実証された。さらに,代表的なα,β-不飽和ケトンであるベンジリデンアセトン誘導体へのホスホネートの不斉求核付加反応の開発を検討したところ,1,2-付加選択的に反応は進行し,高い立体選択性で付加生成物を得ることにも成功した。これらの研究成果は,Organic Letter誌において論文報告を達成した。有機分子触媒を用いた不斉反応は,環境に優しい合成法として近年注目を集めている。中でも,チオウレア型有機分子触媒は優れた触媒活性を示し,多くのタイプの触媒が報告されている。そこで,これまで例の無いプッシュ・プル-エチレン型の有機分子触媒を開発し,種々の不斉反応に応用することを目的に今年度取り組んだ。有機分子触媒の活性発現には2つのアミノ基の酸性度が密接に関与している。この酸性度をコントロールすることによって,触媒活性の向上や種々の不斉反応に適合した触媒設計に展開できる。プロトタイプの有機分子触媒は,エチレンユニットを介して電子求引性の2つのシアノ基によってアミノ基の酸性度をコントロールしており,プッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒の特徴である。そこで,シアノ基以外の電子求引性基としてスルホニル基を導入した新規プッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒を数種類調製し,不斉反応として環状ケトンと芳香族アルデヒドとの直接的アルドール反応に適用したところ,高収率,高立体選択的にアルドール付加体を得ることに成功した。また,電子求引性が高まるに従って,その立体選択性が向上する結果も観察された。以上の研究成果は,今後さらに高機能な有機分子触媒を開発する上で,有益な情報となった。シアノ基とは異なる電子求引性基を導入できる触媒合成法は確立しつつある。また,異なる電子求引性基を導入することによって,触媒活性が改善される実験結果も得られている。当初,予定していた平成28年度の研究計画の内,有機分子触媒ライブラリーの構築ははおおむね達成しつつある。また,目的とした不斉反応への適用も一部成功している。従って,おおむね順調に進展していると判断した。そこで,これまで例の無いプッシュ・プル-エチレン型の不斉有機分子触媒を開発し,種々の不斉反応に応用するすることを目的に本研究に取組んだ。今年度では,これまでに開発したジアミノメチレンマロノニトリル型のプッシュ・プル-エチレン有機分子触媒を用いて,5-ベンジルフルフラールとニトロアルケンの立体選択的共役付加反応に適用し,既存の有機分子触媒よりも優れた立体選択性で目的の付加体を得ることに成功した。さらに,同タイプの有機分子触媒を用いたαーシアノケトンのエノン類への不斉共役付加反応への応用についても成功した。本方法論は,既知の金属触媒を用いた方法と比較して,より高い立体選択性を達成しており,有機分子触媒を用いた初の報告例である。また,昨年度より継続して行っているシアノ基以外の電子求引基を導入したプッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒を用いた直接的不斉アルドー反応の基質一般性も明らかにし,より電子求引性の強い官能基導入が触媒活性の改善に寄与することも明らかとした。本研究成果は,Synlett誌において論文報告を達成した。ジアミノメチレンマロノニトリル型のプッシュ・プル-エチレン有機分子触媒のライブラリー構築がほぼ達成できており,その内の数種類は,既存の方法論を凌駕する立体選択性を達成するに至っている。また,スルホン基を中心とする他の電子求引基を導入したプッシュ・プル-エチレン有機分子触媒のライブラリー構築および立体選択的炭素炭素結合形成反応への応用も達成した。以上の研究成果を踏まえ,本研究課題はおおむね順調進展していると判断した。

有機分子触媒の中でも,チオウレア型,およびスクアラミド型の有機分子触媒は優れた触媒活性を示し,多くのタイプの触媒が報告されている。しかし,その触媒効率(高用量,長時間の反応時間)は必ずしも満足できるものではなく,より効率的な有機分子触媒の開発が待ち望まれている。そこで,これまで報告例の無いプッシュ・プル-エチレン型の不斉有機分子触媒を開発し,種々の立体選択的不斉反応に応用するすることを目的に本研究に取組んだ。最終年度である平成30年度では,これまでに開発したジアミノメチレンマロノニトリル型のプッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒を用いて,これまでに報告例の無いホスホネートの単純ケトンへの不斉求核付加反応の開発を検討し,高いエナンチオ選択性で目的の付加体を得ることに成功した。また,本反応における比較実験によって,ジアミノメチレンマロノニトリル骨格が既存のチオウレア基やスクアラミド基よりも優れた水素結合供与能を示すことが実証された。さらに,代表的なα,β-不飽和ケトンであるベンジリデンアセトン誘導体へのホスホネートの不斉求核付加反応の開発を検討したところ,1,2-付加選択的に反応は進行し,高い立体選択性で付加生成物を得ることにも成功した。これらの研究成果は,Organic Letter誌において論文報告を達成した。今後,さらに有機分子触媒ライブラリーを充実することに努める。また,より難易度の高い不斉四級炭素中心構築への応用や,連続する不斉中心構築法の確立を目指す。さらに,開発した有機分子触媒的不斉反応によって得られるキラルな鍵中間体より,生理活性化合物の合成研究に展開する。次年度は,さらなるプッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒のライブラリー構築拡大を推進するとともに,これまでに報告例の無い有用な有機分子触媒反応の開発を目指す。さらに,開発したプッシュ・プル-エチレン型有機分子触媒を用いた不斉反応によって得られるキラルな鍵中間体より,医薬品の合成研究に展開する。当初計画していた触媒合成のにおける各収率が予定よりも高収率に合成することに成功した。そのため,必要と見込んでいた触媒合成のための試薬量が少ない量で平成28年度は達成できた。結果として約10万円程度を次年度に持ち越した。当初計画していた有機分子触媒ライブラリーの構築が順調に進み,触媒合成のための試薬費用が大幅に削減できた。さらに,ターゲットとする立体選択的な有機触媒反応も,予想よりも早期に発見することができた。その結果,約59万円を次年度に持ち越した。次年度は,触媒ライブラリーの更なる構築と生理活性化合物合成に研究費を投じると共に,順調に達成されいる研究成果を国内外の学会発表するための旅費等にも割り当てる予定である。次年度は,さらに有機触媒ライブラリーの充実を計画している。そのため,持ち越した研究費を次年度予算と合わせて,多岐に渡る有機触媒ライブラリーの構築に使用する予定である。
衛星搭載マイクロ波アクティブセンサーによる土中の水分含有率の推定に関する基礎研究

土中の水分含有率の推定は,マイクロ波に対する土の散乱係数が水分含有率により大きく変化することを利用して行われる.この散乱係数は土の等価誘電率に密接に関係している.多重散乱理論を基にした等価誘電率算定法は,これまでいくつか提案されている.その中で,九州大学で提案された等価誘電率算定法を,より実際の媒質に対して適用できるように拡張し,他の手法と比較検討を行った.1.層状散乱体が分布する媒質の等価誘電率土の水分が少ない場合,水は土の粒子を覆うように存在し層状媒質と見なされる.この散乱体がランダムに分布する媒質の等価誘電率を各算定法により算定した.水は高誘電率を有するため散乱効果が大きく,各算定法による等価誘電率に大きな違いが生じた.2.多種類の散乱体が分布する媒質の等価誘電率実際の土は,空気,土,束縛水,自由水の混合物と考えられる.従って多種類の散乱体が分布する媒質にも適用できるように等価誘電率算定法を拡張した.この結果1.の場合と同様,高誘電率散乱体に対して,各算定法間に大きな差が生じた.3.一般の散乱体が分布する媒質の等価誘電率九州大学で提案された等価誘電率算定法をより一般的な散乱体に対して適用できるように,bianisotropic散乱体に対する多重散乱理論を定式化し,等価誘電率算定式を提案した.これまで,bianisotropic散乱体に対する多重散乱理論に基づく等価誘電率算定法は,提案されておらず本算定法は注目すべきものと考えられる.本算定法による等価誘電率を他の算定法の結果と吟味した結果,本算定法が物理的に妥当である結果を得た.しかし,水分量増加とともに生じる束縛水から自由水への状態遷移に対応した算定法はまだ提案できていない.今後は実験結果等を考慮して,より実際に即したモデルに対する算定式を提案する予定である.本年度は,土中の水の分布モデルに対して,散乱理論を用いてその水分を含む土の等価誘電率を評価した.理論的に評価するため,いくつかの散乱理論を用いた結果を比較した.土中の水の状態は,土の粒子の周りを覆っている束縛水と水滴の二つに分けることができる.土の中の水の状態が束縛水から水滴への状態が変化する時,土の媒質定数の変化も大きくなることからこの部分を理論的に把握する事が重要である.1.束縛水が分布する土の等価誘電率束縛水が分布する土の等価誘電率を多重散乱理論を基に導出した評価式で算定した.束縛水のモデルとして,散乱体は,土の粒子を水が覆っている媒質を仮定した.水は高誘電率を有するため,等価誘電率に散乱の影響が大きく影響し,利用する多重散乱理論により評価値に大きな違いが現れた.2.多種類の散乱体が分布する媒質の等価誘電率の評価法実際の土では,束縛水と水滴は同時に存在する.従って,束縛水及び水滴が存在する土の等価誘電率を評価する必要がある.これまで放乱体粒子を1種類に限定していた等価誘電率の評価式を,多種類の粒子にまで利用できるように拡張した.これにより,束縛水と水滴が存在するような,より現実的なモデルに対する土の等価誘電率の算定が可能となる.3.今後の展開これまでに,多種類の粒子及び粒子の媒質定数が層状に分布している粒子のランダム媒質の等価誘電率の算定法を提案した.実際,土の中の水分が増加していった場合には,土中の水は束縛水から水滴へと変化していく.本年度の成果により,土の中の水の分布の状態に応じてその媒質を等価誘電率で評価できるようになった.これを実験値と比較検討することにより,土中の水分含有率の推定問題が理諭的アプローチにより解決できると考えられる.土中の水分含有率の推定は,マイクロ波に対する土の散乱係数が水分含有率により大きく変化することを利用して行われる.この散乱係数は土の等価誘電率に密接に関係している.多重散乱理論を基にした等価誘電率算定法は,これまでいくつか提案されている.その中で,九州大学で提案された等価誘電率算定法を,より実際の媒質に対して適用できるように拡張し,他の手法と比較検討を行った.1.層状散乱体が分布する媒質の等価誘電率土の水分が少ない場合,水は土の粒子を覆うように存在し層状媒質と見なされる.この散乱体がランダムに分布する媒質の等価誘電率を各算定法により算定した.水は高誘電率を有するため散乱効果が大きく,各算定法による等価誘電率に大きな違いが生じた.2.多種類の散乱体が分布する媒質の等価誘電率実際の土は,空気,土,束縛水,自由水の混合物と考えられる.従って多種類の散乱体が分布する媒質にも適用できるように等価誘電率算定法を拡張した.この結果1.の場合と同様,高誘電率散乱体に対して,各算定法間に大きな差が生じた.3.一般の散乱体が分布する媒質の等価誘電率九州大学で提案された等価誘電率算定法をより一般的な散乱体に対して適用できるように,bianisotropic散乱体に対する多重散乱理論を定式化し,等価誘電率算定式を提案した.

これまで,bianisotropic散乱体に対する多重散乱理論に基づく等価誘電率算定法は,提案されておらず本算定法は注目すべきものと考えられる.本算定法による等価誘電率を他の算定法の結果と吟味した結果,本算定法が物理的に妥当である結果を得た.しかし,水分量増加とともに生じる束縛水から自由水への状態遷移に対応した算定法はまだ提案できていない.今後は実験結果等を考慮して,より実際に即したモデルに対する算定式を提案する予定である.
高等植物プロテインキナーゼCの分子特性と硝酸還元酵素リン酸化の環境応答解析

本研究では、まずコマツナの本葉及び根部からPKCの分離・精製を試み、硫安沈殿及び二段階のカラムクロマトグラフィー(陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー)により、リン脂質依存性/カルシウム依存性PK活性画分を得、これについて免疫化学的解析及び自己リン酸化能の解析を行った。その結果、本葉でPKC活性が発現されていると推察された。本部分精製PKC画分とコマツナ部分精製NR画分をin vitroで反応させ、NRタンパク質へのリン酸基転移触媒能を検討した。その結果、NR活性への失活的効果は認められなかったが、PS DO Ca2^+存在下でのみNRタンパク質へのリン酸基付加が検証された。一方、本葉を用いてPKCホモローグ遺伝子の検索を試みた。この目的のために、既知のPKC遺伝子のアミノ酸配列のアライメントをもとに、その保存領域の混合プライマーを作製し、それらを組み合わせて、コマツナmRNAを鋳型に用いてReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をクローン化し、その塩基配列を解析した結果、プロテインキナーゼと考えられる配列を持つクローンを幾つか得た。本研究で、現在、まだ明確な知見のない植物型MAPKK、Rasホモローグ様のキナーゼ断片を同定することができた。さらに、新規なキナーゼと考えられる配列の一部であるbcpk 1はカビ(Trichoderma reesei)PKC様遺伝子と非常に高い相同性(アミノ酸レベルで92.4%)を有していた。bcpk 1はPKCの特徴の1つとして考えられるサブドメインV内のアミノ酸配列であるG-G-D-L-M、サブドメインVla内のF-Y-A-A-E、及びサブドメインVIII内のT-F-C-G-T(-P)を保持しており、このことからPKCとbcpk 1は同じファミリーに属することが示唆された。更に、コマツナゲノムサザンハイブリダイゼーション解析の結果よりbcpk 1がコマツナ遺伝子に存在することが明らかになり、高等植物PKCホモローグ遺伝子が極めて高い確率で存在することが裏付けられた。そこで、現在シロイヌナズナcDNAライブラリー、ライスcDNAライブラリーからbcpk 1をプローブにPKCホモローグ遺伝子全長を含むクローンの選択を行っている。本年度の本研究では、高等植物コマツナ(Brassica campestris L.)の本葉からPKCの分離、精製を試み、硫安沈殿及び二段階のカラムクロマトグラフィー(陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー)により、リン脂質依存性/カルシウム依存性PK活性画分を得、これについて免疫学的解析及び自己リン酸化能の解析を行った。その結果、本葉でPKC活性が発現されていることが判明した。次に、既知のPKC遺伝子のアミノ酸配列のアライメントをもとに、その保存領域の混合プライマーを作製し、それらを組み合わせて、コマツナmRNAを鋳型に用いてReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をクローン化し、その塩基配列を解析した。その結果、プロテインキナーゼと考えられる配列を持つクローンを幾つか得た。

その中の1つで、新規なキナーゼと考えられる配列の一部であるbcpk1は、カビ(Trichoderma reesei)PKC様遺伝子と非常に高い相同性(アミノ酸レベルで92.4%)を有していた。bcpk1はPKCの特徴の1つとして考えられるサブドメインV内のアミノ酸配列であるG-G-D-L-M、サブドメインVIa内のF-Y-A-A-E、及びサブドメインVIII内のT-F-C-G-T(-P)を保持しており、このことからPKCとbcpk1は同じファミリーに属することが示唆された。更に、コマツナゲノムサザンハイブリダイゼーション解析の結果よりbcpk1がコマツナ遺伝子に存在することが明らかになり、高等植物PKCホモローグ遺伝子が極めて高い確率で存在することが裏付けられた。本研究では、まずコマツナの本葉及び根部からPKCの分離・精製を試み、硫安沈殿及び二段階のカラムクロマトグラフィー(陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー)により、リン脂質依存性/カリシウム依存性PK活性画分を得、これについて免疫化学的解析及び自己リン酸化能の解析を行った。その結果、本葉でPKC活性が発現されていると推察された。本部分精製PKC画分とコマツナ部分精製NR画分をin vitroで反応させ、NRタンパク質へのリン酸基転移触媒能を検討した。その結果、NR活性への失活的効果は認められなかったが、PS DO Ca2+存在下でのみNRタンパク質へのリン酸基付加が検証された。一方、本葉を用いてPKCホモローグ遺伝子の検索を試みた。この目的のために、既知のPKC遺伝子のアミノ酸配列のアライメントをもとに、その保存領域の混合プライマーを作製し、それらを組み合わせて、コマツナmRNAを鋳型に用いてReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をクローン化し、その塩基配列を解析した結果、プロテインキナーゼと考えられる配列を持つクローンを幾つか得た。本研究で、現在、まだ明確な知見のない植物型MAPKK、Rasホモローグ様のキナーゼ断片を同定することができた。さらに、新規なキナーゼと考えられる配列の一部であるbcpk1はカビ(Trichoderma reesei)PKC様遺伝子と非常に高い相同性(アミノ酸レベルで92.4%)を有していた。
脳内環境破綻時のアストロサイトＮａｘチャンネルの役割

ナトリウムチャンネルNaxは、細胞外Naレベルの上昇に応答して開口するNaレベルセンサーである。前回、細胞外環境のエンドセリンの濃度が高まると、NaxはエンドセリンB型受容体(ETBR)を介した調節を受け、平常時のNaレベルでも開口するようになることを報告した。Naxは、末梢神経系では非ミエリン化シュワン細胞(non-myelinating Schwann cells)に発現しているが、その生理機能については、これまで明らかになっていなかった。今年度、末梢神経の軸索切断後の神経回復過程において、Naxが重要な役割を果たしていることが明らかになった。坐骨神経を切断すると後肢足裏への刺激に対する脚の引込め応答がいったん失われ、その後に徐々に回復する。この時間経過をNaxノックアウトマウス(Nax-KOマウス)と野生型マウスで比較したところ、Nax-KOマウスの回復が遅れていた。この回復の遅れは、切断部位へ乳酸を投与しておくことによって改善した。さらに、乳酸を輸送するモノカルボン酸トランスポーター(MCT)の阻害剤を野生型マウスに投与すると、回復が遅れた。切断8週間後に、再生した軸索を組織学的に解析したところ、Nax-KOマウスではミエリン化した軸索の数が野生型マウスに比べて少なかった。培養したシュワン細胞からmRNAを回収して解析したところ、Nax、MCT及びETBRの発現が確認された。培養シュワン細胞にエンドセリン-1を投与すると乳酸の放出が促進され、その促進効果はETBRの阻害剤によって抑えられた。また、Nax-KOマウス由来のシュワン細胞を用いた場合には、エンドセリン-1投与によって放出される乳酸の量が野生型よりも少なかった。以上の結果から、末梢神経系の軸索切断後における軸索の再伸長過程において、ETBRを介したNaxの活性化とそれに続く乳酸の放出が重要な役割を担っていることが明らかになった。25年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、これまで脳室周囲器官等のアストロサイトに発現するナトリウムチャンネルNaxの機能と生理的役割について解析してきた。その中でNaxが体液のNa+レベル上昇を感知して開口するNa+レベルセンサーとして機能していることを明らかにした。最近、外傷性脳損傷部位においてNaxの発現が誘導されることが報告された。しかし、脳損傷部位においてNa+レベルが上昇するとは考えにくく、Naxを開口する別の刺激の存在が想定されたが、その実体は不明であった。本研究において、エンドセリンB型受容体(ETBR)を介してエンドセリンシグナルがNaxを開口させることを新たに見出した(Hiyama et al., Cell Metabolism, 2013)。脳損傷部位ではエンドセリンシグナルが活性化することがわかっている。我々のこれまでの研究から、Naxが開口するとアストロサイトから乳酸の放出が亢進することが明らかになっている。乳酸は、神経傷害部位において神経保護作用を示すことが判っている。このことから、Naxが脳損傷部位の神経細胞を保護に関与している可能性が示唆された。本研究は、これまで体液Na+センサーとしての機能しか明らかになっていなかったNaxチャンネルが脳損傷部位において発現するという最新の知見に基づき、その役割を明らかにすることを目的とする研究である。Naxは、細胞外Na濃度の上昇を感知して開口するチャンネルであることがわかっていたが、その他にNaxの開口につながる刺激は明らかになっていなかった。

本研究を進める上で最も大きな問題点は、脳損傷時に細胞外Na+濃度が高まるとは考えられず、Naxがチャンネルとして機能する機構を探らねばならないことであった。本年度の研究により、このエンドセリンによりNaxが開口することが明らかになり、この最大の疑問を解決する目途が立った。これにより、本研究計画は当初描いていた方向に向けて大きく前進した。しかし、当初計画では、もっと早く解決すると考えていたため、想定していた計画に比べると結果的に計画全体が遅れたことになった。また、2光子顕微鏡の導入も、政府調達等の手続きに予想以上に時間がかかり、運用開始時期が25年度春にずれ込むこととなったため、この顕微鏡を用いて解析する実験計画が遅れることとなった。研究計画は、全体的にやや遅れているものの、当初想定していた方向で結果が出始めているので、このままピッチを上げて研究を進める。25年度は、以下のように研究を進める。(1)リアクティブアストロサイトのin vivoイメージング:2光子レーザー走査型顕微鏡を用いて生きたマウスの脳内において脳損傷後のリアクティブアストロサイトの動態を観察する。(2)脳損傷後の脳における分子発現:脳損傷後の脳において、Nax、エンドセリン(ET-1、ET-2、ET-3)、エンドセリン受容体(ETAR、ETBR)、乳酸の輸送体であるMCT等の発現を調べる。(3)脳損傷後の神経細胞障害におけるNaxの役割の検証:Naxが神経保護作用に関与していることを検証するため、脳損傷後の神経細胞死をNax-KOマウスと野生型マウスとの間で比較する。(4)脳損傷後の神経細胞障害におけるエンドセリン及び乳酸の役割の検証:エンドセリンシグナル及び乳酸が神経保護作用に関与していることを検証するため、脳損傷後に、エンドセリン受容体ETBRの阻害剤BQ-788や乳酸輸送を担うモノカルボン酸トランスポーター(MCT)の阻害剤α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (α-CHCA)を、浸透圧ポンプを用いて脳室内に持続的に投与し、アポトーシスを起こしたニューロンの数を計測する。(5)Nax-KOマウスの脳に対するNax遺伝子の導入・発現:主にグリア細胞に感染することがわかっているアデノウィルスを用いて、脳損傷直後のNax-KOマウスの脳にNax遺伝子を導入する。Naxが発現した領域においてアポトーシスの改善が見られるか、検証する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
現代ピアノおよび歴史的ピアノにおける操作性の定量評価と設計

現代ピアノおよび歴史的ピアノのアクションの定量評価を行った。また計算機によるピアノアクションのシミュレーションを行い,実用的な設計方法を考案した。またアクションの動特性の実測値と,計算機シミュレーションの結果を比較し,両者がよく一致することを確認した。ピアノアクションの具体的な改良方法の指針を提案した。以上の結果より,演奏者が所望する任意の動特性を持ったアクションを作成することが可能になった。ピアノアクションの動的特性の規格を提案し、アコースティックピアノの最適なタッチを実現するのが本研究の目的である。ピアニストは演奏会場にあるピアノを使うことを強いられており、動特性の悪いピアノアクションを調整する方法は無い。それゆえ、ピアニストの中には自分のピアノをコンサート会場に持ち込む場合さえあり、改良が切に望まれている。ピアノのアクションは、鍵、ハンマー、ウィッペン等を中心とする多くの回転部品の組み合わせであるが、現在まで動力学特性には公的規格が存在しない。本研究では動特性の規格を提案することを通じてこの状態を解消し、最適なタッチを実現するのが目的である。結果からは、ピアニストが感じるタッチを定量化することが可能になり、ピアニストが求めるタッチに調整を求めることが簡易にできるようになる。平成21年度は、新たに赤外線センサを用いて鍵の動きを捉えることができ装置を開発した。また、アップライトピアノとグランドピアノアクションの測定を行った。この結果、既に提案したモデルの妥当性を検証した。モデルは現代アクションの計測結果と、また歴史的なアクションの計測結果とも一致し、研究の主題である動特性規格の提案とピアノアクションの改良に有効であることを確認した。また、高速度カメラを用いてアクションの動作を視覚的に明らかにした。これにより、これまでに用いてきた動力学モデルの妥当性の検証も行った。以上から、現段階では摩擦項を定数でなく変数としたり、木材の変形を考慮に入れることは必要が無いことが判明した。・アクション動作測定システムの改良従来の加速度計を用いる方法に加え、高速度カメラで捉えたアクションの動きをサンプリングし、アクションの各パーツの動きを追尾するシステムを完成した。・アクションの動力学モデルの計算機上での構築アクションの動作の計算機シミュレーションを行った。単純化した部品について、理論式と計算機シミュレーションが一致することを確認した。まだアクションの具体的な形状をシミュレーションに取り入れることはできていないが、基礎的な計算機実験は終了し、一定の成果を得た。これにより,アクションの動作をある程度定量的に記述可能となった。・歴史的アクションの調査楽器学資料館で所蔵している歴史的ピアノのアクションの調査を行った。文献調査と実際の楽器の調査結果から、日本音響学会研究発表会において2回招待講演を行った。・主観実験の予備調査演奏家の考える「良いタッチ」について、予備調査を行った。・アクション動作測定システムの評価動作システムを従来の方法(高速度カメラで鍵盤を撮影して追尾する方法,およびフォトセンサの前をハンマーシャンクが横切る時間を測定する方法)との比較を行い,民生用の高速度カメラで高品位な測定ができることを確認した。あわせて,ダイヤルゲージによる直接測定も行い,測定システムの誤差評価を行った。・アクション動作測定システムによる動力学計算機シミュレーションの比較アクションの動作の計算機シミュレーションを行い,実際のアクションの動きと計算機シミュレーションが一致することを確認した。前年度までに計算機シミュレーションと以前提案した理論式が一致することは確認しているため,実際の動作が理論式と一致することが確認できた。また,シミュレーションにはアクションの具体的な形状を取り入れた。これにより,アクションの動作が定量的に予想可能になった。・アクションの改良方法の考察アクションの部品に新たに質量を付加する方法によって,JIS規格と矛盾することなく回転運動を制御することを確認した。また,質量追加の効果について,実験と計算機シミュレーションによって評価・考察した。ピアノアクション部品の測定アルゴリズムの改良を行った。民生用高速度カメラを動体追尾に用いる方法によって,従来の方法(高速度カメラで鍵盤を撮影して追尾する方法,およびフォトセンサの前をハンマーシャンクが横切る時間を測定する方法)と同程度の精度で,かつ高速で観測が行えるよう,アルゴリズムの改良を行った。これにより,リアルタイムで観測結果が精度良くえられるようになった。次に動力学計算機シミュレーションの実際のアクションへの応用を実現した。アクションの形とモーメントを変更したときの動特性への影響を計算した。昨年度までの研究でアクションの動作が定量的に予想可能になった。本年度はこれを応用し,実際のアクションの部品の形状やモーメントを変更し,鍵盤でのタッチの変化とハンマーの最終速度への影響を得た。さらに,それらの影響が前述のアルゴリズムで測定した実測値とよく合致することを確認した。さらに歴史的アクションへの適用を実現した。現存している歴史的アクションの動特性の実測値と,計算機シミュレーションの結果を比較した。さらに,主にヨーロッパの博物館で図面だけ残っていて実物が現存しないアクションの動特性も計算可能になった。

応用として,現代アップライトピアノの鍵のモーメントを大きくしてタッチを調整し,さらに部品の形状を回転間接の回転半径を変更することにより,JISなどの規格から逸脱することなく自由に動特性を変更できる方法を考案し,実験と計算機シミュレーションによって評価・考察した。この結果は論文「アップライト・ピアノアクションの改良のための数値シミュレーション」として公表した。これまでに,高速度カメラを用いた拡張システムを構築しアクションの各部分の追尾実験を行った。また、動力学モデルを用いた計算機シミュレーションとの比較を行い,実験との比較を行った。一方,アクションの部品に質量を付加することにより,JIS規格等を逸脱することなくアクションの動特性が制御可能であることを確認した。以上のことから,おおむね予定通りの年次進行で順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに得られた動力学モデルによって,本年度は実際のピアノでの改良実験を行う。これはモデルの逆動力学解析を行うことに相当する。アップライトのアクションを適切に設計・制御することにより,演奏者の望む通りのタッチが得られることが期待できる。最終年度にあたる本年は,これまでの結果からピアノアクション設計の合理的な指針を示す。一方,電子キーボードのアクションは、かならずしも演奏家の評価が高くない。そのため機械部品を用いた電子キーボードで理想的な動特性を持つ形状を設計する。また,最終年度にあたり,これらの成果を論文によって発表する。
社会福祉支援実践における集団的専門性の検討

本研究は、社会福祉支援実践における専門性を若手職員のメンタルヘルスから検討し、若手職員が継続して働くことのできる職員集団のあり方を検討することを目的としてきた。2014年度は、前年度の研究成果を踏まえて、1障害者福祉施設において職員集団の実態に関するヒアリング調査、220代職員への職業意識に関する調査の実施をおこなってきた。1の調査研究からは障害者自立支援法以降に、非正規職員の増加、管理者の増加、事務労働の増加などによって職員集団のあり方が変化し、各法人・事業所でさまざまな工夫がおこなわれていることが確認された。2の調査研究からは、若手職員の中では高い専門性への意識があるものの、一部で、ベテラン管理者層との間に法人理念と実践に関して意識の差を感じていることが明らかになった。また、2014年度は、本研究の最終年度であり、積極的にこれらの研究成果を現場職員に返していった。大きくは定期的に若手職員との研究会と、管理者と共同研究者による研究会を開催し、意見交換をおこなった。また機関誌や研修等で研究成果を報告した。定期的な研究会では、社会福祉の基礎理論を現場職員が学習する機会として定め、日頃の社会福祉支援実践での課題を共有する場とすることで、今後の研究課題を確認する場ともなった。今回の研究活動により得られたネットワーク等は今後の研究にも活用し、福祉人材の確保・育成に向けて研究を展開させていく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、社会福祉支援実践における専門性を職員集団のあり方から検討し、福祉ニーズを持つ人と共に職員が発達し、主体形成していくことを検討していく中で、より質の高い新たな支援実践の枠組みを理論化することを目的としている。平成25年度交付申請書では大きく3点の研究を設定した。まず1点目は、平成25年2月に実施した全国の社会福祉施設へのアンケート調査の分析である。アンケートでは、各事業所の責任者に職員のメンタルヘルスの把握状況、会議、研修などの実態、管理者の職場状況への意識を回答してもらい、分析をおこなった。分析の結果、全国的には職員のメンタルヘルスが管理者によって把握されていない実態が明らかとなった。これらの結果については、日本社会福祉学会で報告し、調査報告書をまとめた。2点目は、社会福祉施設の職員集団の実態を明らかにするためのフィールドワーク調査とその分析である。NPO法人大阪障害者センターがおこなっている「施設実践支援事業」に加わり、各施設を訪問した。平成25年8月には、関西圏にある知的障害児入所施設に1ヶ月間入り、職場の実態や職員へのインタビューをおこない、得られたデータは、分析をおこなった。分析からは職員集団の状態と共に、虐待事例の増加などの地域社会の変容が大きく影響していることが明らかとなり、これらの分析結果は関西社会福祉学会で報告をおこなった。3点目は、海外の社会福祉施設の実態を把握するために10月28日から11月4日までイタリア調査をおこなった。イタリアでは、社会的協同組合をはじめとして福祉供給体が多様化しており、そこに従事する職員の実態もさまざまなであった。本調査をまとめた報告書は5月に発行予定である。平成25年度は、交付申請書以外でも社会福祉施設における若手職員の実態を分析する視点を得るため、困難を有する子ども・若者に関する調査研究などをおこなった。平成25年度に設定した研究課題はおおむね順調に進展している。設定した3点の研究課題のうち2点で学会報告をおこなっている。また研究成果を調査報告書としてまとめている。その他にも、社会福祉施設への訪問、学習会や研究会への参加を通じて、職員集団をはじめとする実態の把握をおこなってきた。本研究の今後の推進方法としては、まず、平成25年度に得られたデータを元にして、学会誌等への投稿論文を執筆することである。学会報告をおこなった日本社会福祉学会、関西社会福祉学会のそれぞれの雑誌への投稿をおこなっていく。
動脈硬化病変におけるリポタンパクの酸化変性機序の解明と病変予防及び薬物治療

申請者が開発した動脈硬化マウスの大動脈への脂質蓄積機序を検討し、以下の知見を得た。1.申請者が開発した動脈硬化マウスの血清脂質はマクロファージに著明に取り込まれた。また、動脈硬化マウスより単離したマクロファージへのリポタンパク由来の脂質の取り込み能は有意に増加した。2.次に、本動脈硬化マウスに抗酸化作用を有する脂質低下薬であるプロブコールを投与して、上記と同様に検討を行った。無投与の動脈硬化マウスに比べてプロブコール投与動物では、血清脂質のマクロファージへの取り込まれた量の増加は著明に抑制されたが、マクロファージの脂質取り込み能には影響はみられなかった。3.さらに、動脈硬化マウスにコレステロール代謝酵素の一つである、acylcoenzyme A:cholesterol acyltransferase(ACAT)の抑制薬で脂質低下作用を有するメリナミドを投与して上記と同様の検討を行った。無投与の動脈硬化マウスに比べてメリナミド投与動物では、血清脂質のマクロファージへの取り込まれ量は僅かに抑制されたが、マクロファージの脂質取り込み能の増加は著明に抑制された。以上の結果より、申請者が開発した動脈硬化マウスの血清脂質がマクロファージに取り込まれ易くなっていること、マクロファージ自身の脂質取り込み能が増加していることが明かとなった。また、前者の作用はプロブコールで抑制され、後者の作用はメリナミドで抑制されることが明かとなった。これらのことより、本動脈硬化マウスの大動脈への脂質蓄積機序として、1)増加した過酸化脂質により血清脂質が変性を受けてマクロファージに取り込まれ易くなっている、2)リノール酸自身(変性脂質または過酸化脂質ではなく)がマクロファージのACATを活性化し、脂質を取り込み能が増加していることが示唆された。
動的環境における感覚・運動連関の予期適応

相反する二種類の視覚運動変換(±90°の回転マウス)環境下で上肢到達運動を同時学習するには,規則的交互に経験させるよりも,ランダムな順に経験させた方が,同じ経験回数であっても学習効果が高い事が示された.このことは,課題の変更にともなう内部モデル切り替えの経験回数ではなく,長期的に課題の提示順序が予期できないことが学習に影響する可能性を示しており,運動学習において意識や注意が学習結果に及ぼす影響が少なくないことを示唆している.相反する二種類の視覚運動変換(±90°の回転マウス)環境下で上肢到達運動を同時学習するには,規則的交互に経験させるよりも,ランダムな順に経験させた方が,同じ経験回数であっても学習効果が高い事が示された.このことは,課題の変更にともなう内部モデル切り替えの経験回数ではなく,長期的に課題の提示順序が予期できないことが学習に影響する可能性を示しており,運動学習において意識や注意が学習結果に及ぼす影響が少なくないことを示唆している.従来研究より,相反する回転変換(+90度/-90度)を施した二種類の視覚運動変換(回転マウス)を,異なる色刺激(文脈手がかり)を与えつつ被験者に同時学習させた場合,各環境を交互に経験させるよりも,ランダムに提示して経験させた方が,事後の運動想起実験(すなわち文脈から回転変換を予期し,マウスの運動方向を補償する実験)の評価が高いことがされている.この現象はランダム提示条件の方が,学習中に色手がかりに注意を向ける必要があったために生じたと考えられているが,従来の説明は仮説の域を出ていなかった.本年度,我々は,「二つの課題の交替頻度」と「予測可能性」が各々異なる複数の学習条件で被験者実験を行い,その結果,「課題の交替頻度ではなく,長期的に課題の提示順序が予測できないこと」が被験者に対し,相反課題の同時学習を促進させることを確認した.このことは,学習者の内因性の予期が,運動の学習に大きく影響を及ぼすことを示唆している.そこで,相反課題の同時学習の前後に,被験者の前頭部(主に側頭葉前部)の機能的脳画像を近赤外光イメージング装置(NIRS)を用いて計測し,環境の提示順序と脳の賦活部位(ニューロン活動)の関係を解明することを試みた.その結果,運動学習の評価指標(方向誤差の減少)と前頭部のニューロン活動の変化(低下)に相関が認められた.しかしながら,学習条件と脳腑活レベルの関係を明らかにするまでには至らなかった.運動学習において,学習者の環境に対する予期が学習過程に影響することが知られている.例えば,運動の初心者が事前に熟練者の運動の様子を観察することは,後段の学習に影響を与える.これは運動イメージを想起することで,脳内で運動をリハーサルすることができるためと考えられている.また.近年の生理学研究の知見によれば,他者が運動する様子を観察したり,その運動を模倣しようとする際には,ミラーニューロンと呼ばれる脳部位が活動することが知られている.本研究では,力覚提示デバイスを用いて未知の動的環境(回転粘性力場)を実現し,その下で,フンダムな順番に提示されるターゲットへの到達運動を課題として,運動学習を行わせる際,「熟練者の運動の様子を観察させる」群と,「観察に加え,模倣することを動機づける」群,そして「観察をさせない群」の3群に分けて運動学習を行わせた.実験の結果,観察を行う群は,しない群と比べて最終的な運動の評価指標が良好であること,ならびに,動機づけを行う群は,しない群と比べて学習初期の評価指標の向上が顕著であることを確認した.さらに,観察時の注視点と脳血流量の動態を調べた結果から,観察を動機づける群は,特にターゲットと腕運動を交互に見比べながら観察をしていることが明らかとなった.このことから,学習に先立って環境の文脈を適切に整えることで学習者の注意状態が修飾され,学習の進展に大きく影響を与えることが示唆された.
バレット食道形成過程におけるＮｏｔｃｈシグナルの機能解析：Ｃｄｘ２との相互作用

本検討は、バレット食道形成過程におけるNotchシグナルとCdx2の相互作用を明らかにすることを目的として行い、以下の結果が得られた。1バレット食道細胞株に胆汁酸刺激を行うと、Cdx2の著明な亢進と共にNotchシグナルの下流の転写因子であるHes-1の低下およびATOH1の発現亢進、NotchリガンドであるDll-1の発現亢進を認めた。2Cdx2 siRNAを培養細胞に導入した系では、胆汁酸刺激をしても腸上皮化生のマーカーであるMUC2の誘導に至らず、Cdx2が中心的に作用し、NotchシグナルはCdx2の発現と関連してバレット食道の形成に影響を与えていることが明らかとなった。今回の研究の目的はバレット食道の形成に重要な因子と考えられているCdx2の発現とNotchシグナルの相互作用について明らかにすることである。今年度は以下の知見を得た。1.バレット食道におけるNotchリガンドの発現状況と胆汁酸による発現変化Notchシグナルに影響を与えるNotchリガンドのバレット食道における発現状況を評価した。バレット食道の生検組織を用いて免疫染色およびPCRで検討すると、Jagged-1は周囲の扁平上皮と比して有意な発現変化は認めなかったが、Dll-1はバレット食道上皮において強い発現亢進を認めた。次にHes-1の発現変化によるDll-1の影響を評価した。食道腺癌培養細胞株に胆汁酸を投与するとNotchシグナルは抑制され、Hes-1発現は低下するが、この時のDll-1は有意な発現亢進が認められた。したがって、胆汁酸の投与はATOH1のみならず、リガンドであるDll-1の発現も亢進させることが明らかとなった。2. Notchシグナル発現変化によるCdx2発現への影響Jagged-1、Dll-1を培養細胞に投与し、Notchシグナルを活性化させた場合のCdx2の発現について評価した。リガンド投与によってHes-1発現は亢進し、ATOH1の発現は抑制されるがCdx2の発現に大きな変化は認めなかった。続いて培養細胞にγセクレターゼ阻害薬(DAPT)を投与し、Notchシグナルを抑制させた系を樹立した。この系では下流のHes-1阻害によりATOH1発現は亢進する。またCdx2およびMUC2も亢進を認めた。しかしながら、Cdx2 siRNAを用いてCdx2の発現を抑制した系ではDAPTの投与によってもMUC2の誘導は亢進しないことから、Notchシグナルの抑制によって誘導されたATOH1はCdx2の発現を介してMUC2を亢進させることが示された。本研究の目的はバレット食道の形成に重要な因子と考えられているCdx2の発現とNotchシグナルの相互作用について明らかにすることである。今年度はNotchリガンドであるDll-1がバレット食道形成に関連する因子に与える影響に着目し、以下の知見を得た。1.胆汁酸刺激によるDll-1発現変化これまで、培養細胞として食道腺癌細胞株(OE-33、OE-19)を中心として検討していたが、バレット食道細胞株(CP-A)を入手し、Dll-1の発現を評価した。これまでの結果と矛盾なく、胆汁酸(DCA 200 microM)投与によって蛋白レベル、mRNAレベルでDll-1の著明な発現亢進を確認した。一方、Cdx2 siRNAを導入したCP-Aに胆汁酸刺激を行うと、Dll-1の発現誘導が著明に抑制されることから、胆汁酸によるDll-1の誘導はCdx-2依存的であることが示された。2. Dll-1遺伝子発現調節によるNotchシグナル-Cdx2発現への影響Dll-1発現ベクターを作成し、食道扁平上皮株(Het-1A)に導入すると、Cdx-2の発現の亢進を認めた。また、Hes-1の下流因子であるATOH-1にも発現亢進がみられた。一方で、Dll-1 siRNAによってDll-1の機能を抑制するとATOH-1の著明な低下を認めたものの、Cdx2およびMUC2の発現変化は著明ではなかった。このことから、Dll-1の発現亢進はATOH-1を誘導し、Cdx2の発現に影響を与えるものの、Cdx2の発現にはNotchシグナル以外の複数の発現調節もなされていることが示された。以上の点から、Barrett食道形成におけるCdx2の発現とNotchリガンドDll-1の相互作用が食道扁平上皮から杯細胞を有する特殊円柱上皮化生への分化を誘導する重要な因子であることが示された。

私共はこれまでに食道扁平上皮の恒常性維持におけるNotchシグナルの意義について検討をおこなってきた。今年度の検討では、バレット食道形成に重要な因子として考えられているCdx2の発現とNotchシグナルの相互作用に着目し、以下の知見を得た。1.胃酸・胆汁酸刺激によるNotchシグナル-Cdx2の発現変化バレット食道を誘導する因子として胃酸・胆汁酸の重要性が指摘されている。これらの因子によってNotchシグナルおよびCdx2発現にどのように影響を与えているかについて食道腺癌細胞株及び食道扁平上皮細胞株を用いて検討した。まず種々の胆汁酸(デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸)刺激によるNotchシグナル(Notch-1、Hes-1、Atoh1)およびCdx2、MUC2の発現をmRNAレベル、蛋白レベルで解析し、これらの発現が酸条件下で変化するかどうかについても評価した。胆汁酸刺激によってCdx2は著明な発現亢進を示し、Notchシグナルに関しては、Hes-1の発現低下とAtoh1の発現亢進が認められた。デオキシコール酸はコール酸に比して強い発現変化を示したが、酸条件下では中性条件下に比して有意な変化を認めなかった。2. Cdx2発現変化によるNotchシグナル調節機構食道腺癌細胞株に遺伝子導入を行い、Cdx2を発現調節した系を作成した。まず、Cdx2の発現ベクターを導入し、発現亢進した系でNotchシグナルの発現を検討するとNotch-1の発現には影響を与えず、Hes-1の有意な発現低下とAtoh1の発現亢進を認めた。次にCdx2 siRNAを導入し、発現抑制した系を用いて検討すると、胆汁酸投与によるNotchシグナルの発現変化が抑制され、Notchシグナルの誘導にCdx2が密接に関わっていることが示唆された。バレット食道の形成過程において、胆汁酸の曝露による様々な転写因子の発現異常が報告されているが、腸上皮化生に関連する因子としてCdx2が最も重要と考えられている。一方、Notchシグナルは腸上皮の分化誘導に重要な因子であるが、バレット食道形成過程での役割およびCdx2との相互作用については明らかではなかった。これまでの検討でバレット食道形成過程におけるCdx2発現変化によるNotchシグナルへの影響について明らかとしてきた。すなわち、食道腺癌細胞株にCdx2発現ベクターを導入し、発現亢進した系ではNotch-1(レセプター)の発現に影響を与えず、下流のHes-1の有意な発現低下とATOH1の発現亢進を認めた。次に、同細胞株にCdx2 siRNAを導入し、発現抑制した系では、胆汁酸投与によるNotchシグナルの発現変化が抑制され、Notchシグナルの誘導にCdx2が密接に関わっていることが示された。今年度の検討でNotchシグナルの発現変化によるCdx2への影響について評価を行った。上述のごとく、Notchリガンドを培養細胞に投与すると下流のHes-1発現は著明に亢進し、ATOH1は抑制される。しかし、Cdx2の発現には有意な変化が見られなかった。また、DAPTを培養細胞に投与するとHes-1の発現は抑制され、ATOH1の発現は有意な増強が見られ,Cdx2やMUC2の発現亢進も認めた。ただし、Cdx2を抑制した系ではMUC2の亢進は見られなかった。これらの検討からはNotchシグナルの発現変化によるMUC2への影響はCdx2を介したものであり、バレット食道形成にはCdx2がより重要であることが示唆される結果であった。
非アルコール性脂肪肝炎NASHの病態解明～腸粘膜バリア機能からのアプローチ～

マウス食餌誘導性NASHモデルにおいて、飼料投与1か月から小腸下部あるいは大腸において腸粘膜バリア機能の低下が観察された。そして、この現象は飼料投与8か月まで持続することが確認された。飼料投与1か月の時点では末梢血GOTおよびGPTの値は増加しているが、肝臓組織のHE染色像からは脂肪肝になり始める状態であったことから、NASH誘発飼料は肝臓の障害が生じる初期の段階から慢性的な腸粘膜バリアの低下(leaky gut syndrome: LGS)を引き起こすことが考えられる。特に小腸下部から大腸にかけてはリポポリサッカライド(LPS)を産生する腸内細菌が多く生息するため、LGS状態が持続することによって腸内細菌由来のLPSが肝臓へ到達し、肝障害を悪化させる可能性が考えられる。また、再現性の検証が未実施である検討ではあるが、上記検討で使用した飼料の成分のうち、トランス脂肪酸を欠如させた飼料を3か月投与して同様の検討を行ったところ、LGSは誘発されなかった。したがって、トランス脂肪酸はLGS誘発の責任因子となりうる可能性が示唆された。今年度は肝障害が誘発されるどの段階でLGSが生じるのかを明らかにすること、ならびにその責任因子の特定を目標として検討を行ってきた。研究実績の概要で述べたように、これら2つの目的はおおむね達成できたことから、当初の研究計画通りの順調な進捗状況であるといえる。トランス脂肪酸不含飼料の投与実験結果について再現性を検討しつつ、腸粘膜バリア機能の低下や肝障害が生じる前後で腸内細菌叢、血中・肝臓中におけるLPS量、発現する生体機能因子のmRNA発現の変化を調べる。これら因子の量的・質的な発現の変化と腸粘膜バリア、NASHの進行度合いとの相関性から発症・増悪因子を絞り込む。検討課題がスムーズに遂行できたため、予定よりも実験動物費用や研究にかかる消耗品、試薬の購入費用が少額で済んだ。次年度は次世代シーケンサーの解析や血中LPSの測定などを迅速かつ正確に行う必要が今年度より多く見込まれるため、それらの費用に繰り越し分を使用する予定である。