hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線治療時の危険臓器移動法の開発

通常の放射線や粒子線治療に際し照射の制約となる腸管等の正常組織を、生体に易しいゲルの注入という簡素な方法で安全な所に移動させ、腫瘍には強い線量を投与する技法を開発した。いくつかゲルの物性と生物学的な特性を調べ、最適なゲルの選択、注入部位と注入法を明らかにした。臨床的にはトモセラピーや小線源治療に併用した。トモセラピーを用いた前立腺癌の治療では、従来の74Gyから83Gyに腫瘍の線量を増加させ、直腸合併症の発生を14%から0%に低下させた。また従来70Gy程度しか照射できなかった前立腺癌の術後再発への治療も同様に改善した。困難だった再照射もこの技法により安全化し臨床的成果を得た。1.実験.低分子5kDa、高分子量2MDa,超高分子量9MDaの天然型のヒアルロン酸(HA)および架橋型HA(SubQ)の暴露後のヒト繊維芽細胞を使ったウェルアッセイプレート遊走実験では、高分子量2,9MDaおよび架橋型のいずれにおいても、遊走促進が強く認められた。低分子5kDaでは遊走はもっとも弱かった。高分子量群間では、やや2MDa>9MDaの傾向が見られ、それらは>>SubQ9であった。遊走は暴露8時間から活発になり12時間でウェル内を埋め尽くした。4時間では遊走も細胞間の乖離も見られず、6ー8時間で乖離が認められた。これらより、HA暴露→乖離:細胞間の接着分子の吸収・代謝による消失による乖離(要確認)→遊走:遊走を可能にするactinなど細胞骨格の誘導(要確認)と運動の発現が、時系列を追って生じていると推測できた。繊維芽細胞でのこれらの基本的な特徴は腫瘍細胞でも程度の大小こそあれ同様と考えられる(追試験必要)。放射線治療を行う場合、臨床的な現状で、小線源を使った一回照射であれば、HA注入から長くとも4時間以内に照射が終了するので、この遊走のメカニズムの発現が発生する前に腫瘍には大量の照射が終了しているために、細胞遊走は発現しない可能性が高い。一方、分割照射の場合は、一回の照射での殺細胞作用には限界があり、HA暴露が遊走を発現させた場合、生残腫瘍細胞の播種を促進する可能性が考えられる。よって分割照射ではHAと腫瘍細胞の接触は回避すべきで、HA注入の方法や部位の(遊走させない)許容範囲は、一回小線源治療と分割照射では異なる可能性があることが示唆された。2.臨床報告。複数例で食道がんのリンパ節再発などに対するHA注入を用いた臨床試験で合併症のない治癒を得た等の新しい臨床成績を、英文にて報告した。(2012年度末で計151.本年度の方向性。転換と新しい方向性。平成13年度4月にスペーサーゲルの国際カンファレンスがパリで開催され、私はそこに招待され講演したが、このカンファレンスにおいて、欧米で認可されて使用されているタイプの安定性が幅広く確認された。これによって方針に若干の修正を余技なくされた。また、前立腺癌治療におけるスペーサーゲルの効用は明らかであったために、他の国とならび、臨床供与を開始した。研究の主眼は、スペーサーゲルによる危険臓器移動を行い、高精度放射線治療機器を用いた場合、どれだけ正確に、効率よく、危険臓器線量を低下させられるか、を検証するという事になった。説明と同意を経て、選択した患者にスペーサーゲルを用いた治療を提供した。ゲル混合物はマクロレインとリピオドールの混合物で院内製剤を行い、しかし院内製剤薬剤の保険請求の基準に達しないために、患者には無償で提供されることになった。臨床データの回収を行った。現時点で治療それを受けて、ために、高精度放射線治療機器との併用による臨床研究を開始し症例を集積中である。高精度・高線量の放射線治療に際して危険臓器を物理的に隔離する際の、生体に安全かつ腫瘍阻止能のある可塑性注入物(インプラント)の開発、基礎および臨床の研究を行った。開発では、注入可能な該物質を多種のヒアルロン酸ゲルの検討に絞りこんだ(ポリエチレングリコールゲルで研究競合を受けている)。また固形スペーサーでは特定部位に合った形状のシリコンバルーンを試作し物性を試験した(生体親和性ポリ乳酸ゲルで競合を受けている)。基質の一つ、架橋体ヒアルロン酸ゲルへの照射実験が連携施設でなされ、照射による崩壊は少なく10%程度までであることが分った。遊走試験では、300MDa,900MDaの天然型高分子ヒアルロン酸ゲルでは8時間後に遊走が活発となり、BSA入り対照よりやや多く見られたが。架橋体では活発ではなかった。

遊走の前に細胞間の乖離が生じ偽足(pod)の伸長はそのあとに発生した。これらの時間的推移は接着因子の細胞間からの消失が先ず生じ、ついで骨格が誘導される現象系列に矛盾しなかった。またこのことは天然型高分子ヒアルロン酸ゲル天然型高分子ヒアルロン酸ゲルスペーサーは最大4時間(通常1-2時間)の小線源治療中で有効な遊走を誘導しえない事を意味した。臨床研究では、1.前立腺のスペーサー治療の患者の追跡での障害の無さ、2.傍大動脈リンパ節の照射後再発での小腸移動照射、3、前立腺がんの照射後再発の直腸回避照射、4.婦人科癌の照射後再発での直腸や小腸の回避照射、5、悪性黒色腫の再発、6.食道癌の照射後再発での食道移動照射、頭頸部や腹壁の腫瘍での皮膚・腹膜・粘膜を温存した根治的な照射計画などで有用性・有効性を確認できた。これらの臨床研究成果の一部は欧文で報告した。最終年度の研究非手術的ゲルスペーサー注入で直腸等の危険臓器を退避させて安全に最高水準の線量を照射する手法を開発してきた。2013年8月にトモセラピーでの高精度放射線治療機に導入後1年半の成績を総括し、放射線障害の発生を制圧しえたか問う。対象と方法:前立腺癌(PK)60例、乳癌骨転移1例、肺癌と子宮頸癌の傍大動脈リンパ節(PALN)再発それぞれ1例、日本61,中国2。PK患者平均年齢72,新鮮例49,非全摘後再発6(小計55),全摘後後再発5, PSA中央値9.55,画像包括評価は低、中、高、超高リスクが各6,10、21、18/55例。結果:前立腺平均総線量は82.4GyE,直腸D2ccは36.5GyEで晩発性直腸障害の発生予測率0%、264日(27-544)経過時点で>G2直腸障害等の発生なし。本結果を2012年-2013年7月のスペーサーなし(A群)36例とで中間比較した。A群の平均総線量(74GyE),平均直腸D2cc(72GyE),晩発性直腸障害の発生は+290日で5/36 (14% )で、いずれも有意な差を認めた(P<0.01)。280日は晩発性障害の発生のプラトーに達しているために、これらの評価結果は妥当性が高いと考えられる。文献的比較ではゲルスペーサー無しの報告では83GyE投与でG2以上合併症が25%だが、本臨床研究は予測・実績とも0%である。結論1:ゲルスペーサーの利用で晩発性直腸障害発生の制圧と必要な高線量の投与とを同時に果たせた。また従来の術後再発への照射は直腸毒性による線量制約を受け予後不良であったが、本法は新鮮例線量と同じ高水準の線量を該当例全てに安全に付与しえた為、成績の向上を期待できると考えた。研究期間全体を通じて実施した研究の成果は、旧年度分の成果と合わせて見ていただきたい。放射線治療1.前臨床試験の用意に躓いた:4ヶ月以上前から動物飼育を開始する必要があり、ベンダーと研究室と予算年度の仕切りにずれができて実験が実施できなかった。2.臨床成果は多数発表できた。3.細胞遊走試験はスタッフ・実験環境の変化のために、腫瘍細胞を用いたものができなかった。4.臨床試験開始のめどが立った。5.細胞遊走試験を依頼できる環境になった(北斗病院腫瘍医学研究所研究所)。6.粒子線治療施設での研修・研究を開始することになった。
軟骨肉腫の遺伝子治療に関する研究

これまで軟骨肉腫の遺伝子治療について動物実験モデルを使用して実施してきた。その結果、軟骨肉腫を皮下に移植したマウスにおいて自殺遺伝子の局所注入と抗ウイルス剤の腹腔内投与で腫瘍の増殖が著しく抑制されることを示してきた。本年度は自殺遺伝子の細胞死巻き添え効果を検討するため、コラーゲンゲル内3次元培養法を用いて実験を行った。3次元軟骨細胞培養系は生体の軟骨腫瘍組織を模倣しているものであることが形態学的検索や生化学的解析で示された.これらの培養系での軟骨細胞間の接着は軟骨細胞より伸びる細胞突起で相互に連結していることが明らかとなった。この機構は特殊な様式のgap junctionであると考えられ物質の移動が可能と考えられた。この培養系で自殺遺伝子導入軟骨細胞は抗ウイルス剤の投与により死滅することが明らかになった。自殺遺伝子非導入細胞も抗ウイルス剤の投与により死滅することが認められ巻き添え効果が明確となった。さらにこれらの効果はTrailの追加投与により増幅されることも示された。本研究の成果により外科的切除術しか有効な治療法が存在しない体幹部軟骨肉腫の治療において、新しい方法としての遺伝子治療の方法が実験的に確立された。今後、これらの研究成果を踏まえ臨床応用の具体的方法論を検討していく必要がある。軟骨肉腫遺伝子治療の有効性の証明は治療成績の飛躍的向上に結びつく可能性があり、今後の研究の発展が大いに期待される。平成12年度科研実績報告書1、軟骨肉腫の動物モデルの確立ヒト軟骨肉腫より樹立した培養細胞株が高率に生着し、腫瘤を形成する動物モデルを確立した。ヒトの軟骨肉腫に類似した動物モデルはこれまで確立されてなく、このモデルの開発により本研究の促進に役立つ。また、in vitroで生体の腫瘍と同様の細胞環境を作成するためコラーゲンゲル内三次元培養法を確立した。この方法での軟骨肉腫細胞は細胞間基質内に存在しており、細胞膜での直接的接合は認められず、自殺遺伝子の殺腫瘍効果の作用機序を解明するのに有効な細胞培養系であることが確認された。2、軟骨細胞への遺伝子導入効率の向上導入効率向上のための交流磁場刺激の条件設定についてのデータを集積した。その結果、1.5MH、50サイクルの磁場を5分間負荷することにより細胞障害性を示さずに、細胞膜に微小変化をもたらすことが確認された。さらに、この条件で一部の抗がん剤が細胞内に流入しやすくなることも確認された。今後、磁場負荷の条件をさらに拡大し、遺伝子導入効率の最適条件を決定する。また、新たな物理的負荷として、超音波、交流電流についても検討中である。3、動物モデルによる遺伝子治療実験先述の動物モデルによる自殺遺伝子導入治療実験を開始した。遺伝子導入と抗ウイルス薬の投与により、腫瘍増大を抑制することが確認された。遺伝子の繰り返し投与による安全性と有効性を検討中である。本研究の目的は軟骨肉腫に対して遺伝子治療を実験的に行い臨床応用への基盤を作ることにある。平成12年度よりの研究でレトロウイルスベクターを用いて単純ヘルペスウイルスのチロシンキナーゼの軟骨肉腫細胞への遺伝子導入と抗ウイルス薬の投与による殺細胞効果を細胞培養系で確認した。さらに、遺伝子導入細胞の死は非導入細胞を巻き添えにすることも確認してきた。本年度の研究では巻き添え殺細胞効果は1個の遺伝子導入軟骨肉腫細胞が周囲に存在する約20個の非遺伝子導入細胞を死に至らしめることを示した。さらに、軟骨肉腫担がんヌードマウスに対して、腫瘍内に遺伝子導入軟骨肉腫細胞を注入し抗ウイルス薬を投与することにより、in vivoで腫瘍の縮小効果がみられることを示した。ヌードマウスの背部腫瘍が約250mm^3になったところで10^6個の遺伝子導入軟骨細胞を注入し、その後抗ウイルス薬を週2回2週間投与することにより腫瘍の大きさは非投与群の4分の1まで抑制されることを明らかにした。組織学的には腫瘍の広範な壊死像を認めた。

また、X-gal染色で注入された遺伝子導入軟骨肉腫細胞が腫瘍組織内に存在していることも確認し、巻き添え殺細胞効果(bystander effect)が動物の生体内でも存在することを示した。3年間の研究期間での成果は軟骨肉腫の遺伝子治療は臨床でも有効である可能性を示唆したものである。骨盤や体幹発生の外科的切除の不能な軟骨肉腫では遺伝子治療を導入することができるものと考えられた。これまで軟骨肉腫の遺伝子治療について動物実験モデルを使用して実施してきた。その結果、軟骨肉腫を皮下に移植したマウスにおいて自殺遺伝子の局所注入と抗ウイルス剤の腹腔内投与で腫瘍の増殖が著しく抑制されることを示してきた。本年度は自殺遺伝子の細胞死巻き添え効果を検討するため、コラーゲンゲル内3次元培養法を用いて実験を行った。3次元軟骨細胞培養系は生体の軟骨腫瘍組織を模倣しているものであることが形態学的検索やや生化学的解析で示された.これらの培養系での軟骨細胞間の接着は軟骨細胞より伸びる細胞突起で相互に連結していることが明らかとなった。この機構は特殊な様式のgap junctionであると考えられ物質の移動が可能と考えられた。この培養系で自殺遺伝子導入軟骨細胞は抗ウイルス剤の投与により死滅することが明らかになった。自殺遺伝子非導入細胞も抗ウイルス剤の投与により死滅することが認められ巻き添え効果が明確となった。さらにこれらの効果はTrailの追加投与により増幅されることも示された。本研究の成果により外科的切除術しか有効な治療法が存在しない体幹部軟骨肉腫の治療において、新しい方法としての遺伝子治療の方法が実験的に確立された。今後、これらの研究成果を踏まえ臨床応用の具体的方法論を検討していく必要がある。軟骨肉腫遺伝子治療の有効性の証明は治療成績の飛躍的向上に結びつく可能性があり、今後の研究の発展が大いに期待される。
米語口語表現における弱形の頻度調査研究

本研究では、学術的口語英語コーパス(MICASE)における17個の弱形の出現頻度を調査した。コーパス調査を行う前に、英語教科書及び弱形に関する指導が中心である学習書、計30冊の本に含まれる弱形をデータベース化し、頻度の高いものを調査対象とした。これらの弱形のコーパスにおける有無を、オーディオファイルを通して確認し、全体的な出現頻度を出した。また、3種類のスピーチイベントにおける出現頻度を比較した。本研究の目的である米口語における弱形の頻度調査を行うために、調査対象とする弱形を事前に選定する必要がある。しかし、弱形に関する先行調査は比較的少なく、幅広く使われているタイポロジーがないため、調査対象とする弱形の選定は困難である。そこで平成21年度の主な研究作業は、弱形を選定する準備に集中し、以下の通りに行った。1.弱形の聞き取りや発音を取り扱う国内外の学習書・教科書および言語学・応用言語学の専門書を合わせておよそ40冊集めた。2.集めた図書に含まれている弱形を調査し、それらについて以下の項目で構成されるデータベースを作成した。(1)弱形に関する項目:言語的環境(linguistic context)、変化している音声や単語、種類(音脱落、同化、連結、弾音化等)。(2)図書に関する項目:タイトル、頁番号、種類(教科書、専門書等)、出版社、出版年、使用言語(日本語又は英語)。現在、データベースはほぼ完成し、次年度に調査対象とする弱形を最終選定している最中である。データベースに収載されている弱形の種類は現在130前後であり、その中から20-30個の形式を選定する予定である。データベース作成と並行に、次年度に利用する学術的英語コーパス(MICASE)の電子トランスクリプトを整理し、アノテーション(注釈)を付加する準備を行った。トランスクリプトはスピーチイベントごと(講義、発表、ゼミ、ディスカッション等)に分け、コーパス分析ソフトで分析できるよう準備した。本研究の中心的目的は、米語口語表現における弱形の頻度を調査することであるが、研究結果の教育的示唆を視野に入れて作業を進めている。昨年度、教材から抽出したデータの整理を完成した後、その結果は教育現場に示唆を与え得るものであると考え、教材調査の主要結果を論文にまとめ、国内外の多くの語学教員が読む全国語学教育学会の学会誌The Language Teacherに投稿した。論文は昨年度受理され、今年度に出版される予定である。弱形の頻度調査については、ほぼ昨年度の計画通り行った。まず、教材から抽出したデータをもとにMICASEコーパスのトランスクリプトにアノテーション(注釈)を付けた。当初2030個の弱形を研究対象にする予定であったが、調査困難であるものもあると判断し、最終的に17個に絞った。なお、MICASEコーパスの中に様々なスピーチイベントが収録されているが、本研究で対象とするものを以下の3種類に絞った:1.Small lecture2.Discussion section 3.Study group。対象にしたスピーチイベントはすべてアカデミックな環境で行ったものであるが、種類によって性質が異なるため、本調査には、その性質が弱形の出現率に影響しているかどうかを調べることができるという利点がある。具体的には、1から3のスピーチイベントは、それぞれフォーマル、比較的フォーマル、インフォーマルなものとなっており、弱形はインフォーマルな場面ほど多く出現すると言われているので、この研究でMICASEのスピーチイベントでそれが当てはまるかどうかを確認できる。現在、トランスクリプトの分析がほぼ完成し、データの整理及び分析に取り掛かっている。分析の結果は研究発表及び論文で報告する予定である。今年度の研究活動は、研究実施計画に記載してある通り、データの整理・分析の完成及び研究結果の公表に集中した。研究課題1(弱形データベース)の成果発表は、主に学会誌のThe Language Teacherに掲載された論文と、JALT Hokkaidoの研究大会における口頭発表で行った。データーベースは教科書及び学習書から抽出した5種類の弱形で形成され、エントリーは計1,043個あり、異なる弱形でみた場合、82個である。これらの弱形の教科書・学習書における出現頻度を出し、頻度の高いものを教授すべきであると判断し、引き続きコーパスの頻度調査(研究課題2)において調査対象にした。頻度調査の結果を学会誌の『函館英文学』に掲載された論文と、函館英語英文学会・全国語学教育学会の研究大会の研究発表で公表した。計17個の弱形は215,598語からなるコーパス(MICASEコーパスの一部)での頻度を、音声を確認しながら調査した。結果として、全体の平均弱化率は48.3%であったが、弱形によって頻度が異なるとういことが分かった。頻度の高いものとしては、「water」などに現れる/t/の弾音化およびgot to->gotta、going to->gonnaのような省略形が挙げられる(それぞれ80.3%、94.4%、88.1%の弱化率)。

頻度の低いものとしては、「making」などにみられる/g/の脱落および/t/+/j/の同化が挙げられる(それぞれ15.0%と26.6%)。弱形の種類の比較に加え、MICASEの中のコンテクスト別の比較も行った。フォーマリティーが異なる3つのコンテクストにおける弱形の頻度を統計的に比較した結果、有意な差はなかった。よって、弱形はインフォーマルのコンテクストのみならず、比較的フォーマルな大学の講義でも現れるということが分かった。
凝固と流れの導入教育用実験装置の開発

本研究では、4°C付近の水の自然対流の観察、および水が凝固(凍結)する過程を観察する教育用実験装置の開発を行った。4°C付近での水の自然対流の実験装置では、4°Cを境に2つの渦がキャビティ内に出現する様子が確認できた。また、凝固の実験においては、キャビティ内の水が徐々に凝固する様子が観察できた。本実験装置は比較的コンパクトであること。また、実験に要する時間が比較的短いことが特徴として上げられる。実験は、それぞれおおよそ20分から30分程度で完了する。物理学や伝熱工学では、物理現象の理解のため、身近な現象を例に現象の説明がされる場合が多い。特に、我々が普段生活している環境、たとえば湖沼における水の挙動や盆地での底冷えの効果(空気の自然対流)などの身近な自然対流現象が例にされることが多い。しかし、4°C付近の温度の水の自然対流の挙動は、一般の流体のそれと異なる挙動を示し、座学での十分な理解が非常に難しい。本研究で製作した実験装置により、思考実験的な理解が困難な4°C付近での水の挙動(凝固と自然対流)を、授業中に学生にデモンストレーションすることが可能となった。伝熱工学では自然対流を表す方程式として、境界層方程式にブシネ近似による外力を用いた式を学ぶ。ブシネ近似が適用できる自然対流には限度があるが、学生にその部分を正確に伝えることは難しい。このブシネ近似の適応限界も、本研究装置を用いて浮力が非線形である流体の挙動を視覚的に伝えることにより、より正確で体験的に学生に理解させることができると考えている。また、現在製作過程にある映像教材は、授業時間や教室等の制約で実演ができない場合に、有効に活用することができると考えている。
ポルフィリン自己組織化単分子膜による微細流路内温度の高空間分解能イメージング計測

本研究では,温度の増加に伴い発光強度が減少する感温発光分子(ポルフィリン誘導体)を新たに合成し,自己組織化単分子膜法によりガラス基板上に化学的に吸着させることで,極めて均一な感温発光薄膜を作製した.さらに,作製した感温発光薄膜を用いて,蛍光顕微鏡上で数百マイクロメートル四方の微小領域内で表面温度のイメージング計測を行い,既存の手法では達成できない高い空間分解能で表面温度分布計測が可能であることを実証した.本研究は,温度変化に応じて発光強度が変化する発光分子(ポルフィリン化合物)を自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer, SAM)法によりガラス基板上に化学吸着させることで感温発光薄膜センサを作製し,微細流路内の温度分布を高い空間分解能でイメージング計測することを目的とするものである.より具体的には,温度感度を有する発光分子を新たに合成し,SAM法によって基板上に固定してマイクロスケールの微細流路内の温度分布計測を実施することで,本手法の有効性を検証しようとするものである.平成26年度は,感温発光分子の新規合成と感温発光薄膜の作製を試みるとともに,微細流路での実証実験の準備を行った.まず,温度によって発光強度が変化することが期待される発光分子として,tetra[3-(pentafluorophenoxy-succinyl-oxyethoxy)phenyl]porphyrin (H2TPFPSOPP)を新規に合成した.発光分子の同定は,吸光および蛍光スペクトル計測,核磁気共鳴分光法によって行った.次に,合成した発光分子をSAM法によってITOガラス上に化学吸着させ,発光薄膜を作製した.温度および圧力を変化させることができる容器を用いて薄膜から放射される放射光強度の温度および圧力に対する感度を調べたところ,圧力にはほとんど依存せず,温度によって発光強度が変化することが明らかとなった.また,上記の研究と併せて,倒立型蛍光顕微鏡を新たに整備し,微細流路での実証実験の準備を進めた.本研究は,周囲温度の変化に応じて発光強度が変化する発光分子(ポルフィリン化合物)を自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer, SAM)法によりガラス基板上に化学吸着させることで極めて均一な感温発光薄膜センサを作製し,微細流路内の温度分布を高い空間分解能でイメージング計測することを目的とするものである.平成27年度は,前年度に新たに合成した発光色素(tetra[3-(pentafluorophenoxy-succinyl-oxyethoxy)phenyl] porphyrin)を用いて感温発光薄膜を作製し,同様に前年度整備した倒立型蛍光顕微鏡によってマイクロメートルスケールでの表面温度分布計測を行った.その結果,ポリマーをバインダーとする従前の感温発光薄膜で生じていた発光分子の凝集も起こらず,均一な発光薄膜が作製されていることが確かめられ,本手法の有効性が実証された.また,発光薄膜の作製に際して,これまでわれわれの研究室で用いてきた超音波洗浄に替えてプラズマ洗浄を採用することで,発光薄膜の発光強度および温度感度が向上することも明らかになった.さらに,これらの成果の一部を第30回宇宙技術および科学の国際シンポジウムや第30回国際衝撃波シンポジウム,日本機械学会第93期流体工学部門講演会において発表した.蛍光顕微鏡によるマイクロスケールでの表面温度分布計測に成功したものの,微細流路での実証実験はまだ行われていないため本研究は,周囲の温度変化に応じて発光強度が変化する発光分子(ポルフィリン誘導体)を自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer, SAM)法によりガラス基板上に化学吸着させることで,極めて均一な感温発光薄膜センサを作製し,微細流路内の温度分布を高い空間分解能でイメージング計測することを目的とするものである.平成28年度は,X線光電子分光法(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)を用いて発光分子の表面吸着状態を分析するとともに,蛍光顕微鏡を用いて微小領域(691 μm x 518 μm)内の温度分布計測を実施した.XPSによる分析結果から,発光色素の保護基に含まれるフッ素元素の信号強度(F1s)が他の元素の信号(例えば,N1s)と比べて十分に小さいことから,発光分子は当初想定していた状態,すなわち保護基が離脱した状態で基板表面に化学吸着していることがわかった.また,蛍光顕微鏡を用いたイメージング計測結果から,高いS/N比で微小領域における温度分布の取得が可能であることが明らかになった.しかしながら,励起光の照射による光劣化の影響は相対的に大きく,実用化のためにはその対策が必要であることもわかった.さらに,これらの研究成果を,第17回流れの可視化に関する国際会議(ガトリンブルグ・アメリカ),第12回学際領域における分子イメージングフォーラム(東京),日本伝熱学会北陸信越支部秋季セミナー(福井),日本機械学会北陸信越支部学生会第46回学生員卒業研究発表講演会(金沢),日本機械学会北陸信越支部第54期総会・講演会(基調講演・金沢)で発表した.本研究では,温度の増加に伴い発光強度が減少する感温発光分子(ポルフィリン誘導体)を新たに合成し,自己組織化単分子膜法によりガラス基板上に化学的に吸着させることで,極めて均一な感温発光薄膜を作製した.さらに,作製した感温発光薄膜を用いて,蛍光顕微鏡上で数百マイクロメートル四方の微小領域内で表面温度のイメージング計測を行い,既存の手法では達成できない高い空間分解能で表面温度分布計測が可能であることを実証した.新規発光分子の合成が当初の予定通り進まず,温度および圧力較正試験や実証実験の準備が遅れてしまった.

今後は,開発した感温発光薄膜を微細流路に適用し,実証実験を行うとともに,その成果を論文に纏め,公表する予定である.熱流体工学より均一なSAM膜の作製方法を探求するとともに,さらに幅広いレンジで圧力および温度較正試験を行うことで,本計測手法の有効性を検証する.また,微細流路を作製し,実証実験の準備を進める予定である.
腎癌血清で減少する糖蛋白の生物学的役割と臨床的意義

平成28年から実施してきた研究内容および、成果について以下に詳述する。目的:画像診断技術の進歩や人間ドック等のスクリーニング機会の増加とともに腎癌の発見頻度は増加している。しかし、それらの中の25-30%は発見時すでに転移を来した進行癌で発見される。限局性腎癌の予後は良好だが、局所進行もしくは転移のある腎癌の予後は未だ不良である。そのため、腎癌血清バイオマーカーの探索は、腎癌の早期発見ひいては腎癌の予後改善に必須の課題である。そこで、本研究は、他の癌種で患者血清中での濃度上昇が報告されているRCC-GP1を用いて腎癌患者血清におけるその濃度を調べ、バイオマーカーとしての可能性について探索した。腎癌の血清マーカーを探索する過程で見出した血清GP-RCC (仮称)は、健常成人のそれと比較して蛋白量が減少する。一方、血清中でのGP-RCCの存在様式は腎癌細胞内のそれよりもさらに糖鎖が多く付加された形であった。これを説明する作業仮説として、血清GP-RCCは腎癌細胞内に取り込まれ、GP-RCCもしくはその糖鎖が癌細胞の悪性形質に影響を与える可能性を考えた。そこで、本研究は血清GP-RCCの糖鎖構造を解析し、糖鎖の有無によって影響を受ける細胞内シグナルの解明と、腎癌の増殖・浸潤に関わる糖鎖構造の同定を目的とする。その上で、GP-RCC糖鎖の診断標的としての有用性を明らかにすると共に、治療標的としての阻害作用を検討することを目的とする。血清GP-RCCレベルはウエスタンブロッティングでは良性疾患患者と比較して減少したが、ELISAでは逆に増加することがわかった。血清GP-RCCレベルは転移のない限局性腎癌患者ではT stageと有意に相関し、腎癌原発巣のサイズを反映していることが示唆された。当初の予定通り進行している。そこで本研究は、他の癌腫で患者血清中での濃度上昇が報告されているRCC-GP1を用いて、腎癌患者血清におけるその濃度を調べ、バイオマーカーとしての可能性について探索した。上記内容を2018年4月に開催される日本泌尿器科学会総会で発表予定である。腎癌患者血清の集積状況が思わしくなく、研究が思うように進んでいない。腎癌患者血清において、GP-RCCは非腎癌患者血清と比して上昇すること、また腎癌のTステージと正の相関をすることが確認された。そこで、今後はGP-RCCの細胞内での動向の詳細を把握するため研究を進めていく予定である。外来や病棟レベルでの患者説明および同意取得を精力的に実施し、血清の数をさらに増やすように計画している。計画的物品購入にも関わらず、ごく少額の残が出たため。研究に必要な物品購入費に充てる。次年度は本研究の集大成として論文発表およびそのデータの学会発表を予定しているため、その旅費などにも使用する予定である。次年度の物品購入に使用する予定です。
組合せ構造を持つ問題に対するアルゴリズムの開発

グラフの辺連結度は、通信網、交通網などのネットワークにおける信頼性問題やVLSIの配線問題など工学上広い応用を持つ。本研究では(i)辺連結度を保存しながら辺を遊離する問題,(ii)実数重み付きグラフの連結度をある目標値κに最適に増大させる問題に対して高速なアルゴリズムを開発した。(i)の問題における辺の遊離とは、指定点sを持つ多重グラフにおいて隣接する2辺(u,s),(s,w)を1本の辺(u,w)に置き換える操作を指す。s以外の2点間の辺連結度をκ以上に保つ辺の遊離が常に可能であることは、Lovaszの定理として知られている。この結果は、グラフの辺連結性に関する諸定理の証明によく使われる古典的な手法であるが、これに対して最大流アルゴリズムに依存しないO(n(m+nlogn)logn)時間の高速なアルゴリズムは開発した。ここで、nはグラフの点数、mはグラフの辺の張られている点対数である。このことにより、他の多くのグラフ連結問題も効率良く解くことができるようになった。(ii)の問題は,与えられたグラフの辺の重みを増加させることで辺連結度を指定された目標の値κに増大させる問題であり,このとき,増加する辺の重みの総和を最小にすることが目的となる.この問題に対しては、(i)の問題を解くアルゴリズムを設計する際に開発した技法を用いて専用のO(n(m+nlogn))時間の高速アルゴリズムを見つけることができた。このアルゴリズムは、従来のどんな方法とも異なり、各目標値κに対する答えを一度にすべて求めることができる画期的な特徴を持つ。
ホルモンによるラットセリン:ピルビン酸トランスアミナーゼ遺伝子発現の制御機構

1.SPT遺伝子上流域に存在すると考えられるホルモン応答領域の解析(1)SPT遺伝子上流域の制限酵素地図の作成と塩基配列-SPT遺伝子(10Kb)を含む全長54Kbの領域の制限酵素地図を作成した。特に-1・3Kbから転写開始点の間は塩基配列を決定し、各種のシスエレメントの検索を行った。(2)培養細胞へのトランスフェクション(Tf)実験の条件-レポーター遺伝子としてはCAT遺伝子以外にホタルのルシフェラーゼを用いる。Tfの効率を補正するためβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むpCH110を使用する。Tfはリン酸カルシウム法で行い、DNA-リン酸カルシウム沈殿との接触は18h,細胞は48h後に回収し、細胞抽出物を得る。組み換え遺伝子を導入する細胞はヒト肝由来のHepG2である。(3)Tf用組み換え体の作製-SPT遺伝子上流-5.5kbのBamHIまでのDNA断片をレポーター遺伝子とつなげたものを最長のクローンとして作製した。現在、5'側からの段階的欠失組み換え体、および内部の欠失組み換え体を用意しているところである。塩基配列が決定されている-1256から+1の間には実際に機能していると思われるシスエレメントが多数存在しているので、この領域については、より細かな欠失組み換え体を作製中である。2.転写開始部位選択機構の解析ラットSPT遺伝子には転写開始部位が二箇所存在し、下流からの転写位置付近には通常見られるTATA Boxが見あたらないので、特に下流のプロモーターについてその解析を行った。SPT遺伝子上流域493塩基(-493)から+106塩基までをCAT遺伝子につないだ組み換え体を非誘導時の正対照として用いた。5'側から段階的に短くしていくと、+21から十37へとけずるとCAT活性が約20%に低下し、更に+37から+64で4%にまで低下した。このことは通常の転写においては下流からの転写がほとんどであり、その転写に関わるエレメントが、+21と+37,+37と+64の間にそれぞれ存在することを示唆している。1.制限酵素地図の作成SPT(セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素)遺伝子上流の転写調節配列解析を行なう上で欠かせない制限酵素地図を作成した。既に単離した遺伝子クロ-ンはコスミド・ライブラリ-より得たものであり、そのインサ-トは45kbにも及ぶ。通常のマッピングは、この長さでは困難であるのでコスミドのCOS部位を特異的に切断するλータ-ミナ-ゼを用いて決定した。その結果、4種の制限酵素についてはほぼ完全な地図が、また更に3種の酵素についても一部不明な箇所があるものの制限酵素地図が作成できた。2.5^1上流域の塩基配列の決定SPT遺伝子の上流1.3kbまでの塩基配列を決定し、各種シスエレメントの検索を行なった。多くのシスエレメントの候補が見出され、今後の実験で実際に機能しているか否か、あるいはトランス因子の結合が見られるか否がを調べる時に参考によると思われる。3.遺伝子解析系の確立のための条件の検討検出感度、手順、経費、安全面などあらゆる点でメリットの多いレポ-タ-

遺伝子である「ルシフェラ-ゼ」を使ってSPT遺伝子上流のシスエメレントを解析するため、各種条件(アッセイ法,トランスフェクションの方法,培養細胞の種類など)の吟味を行なった。ヒト肝ガン細胞株、HepG2では直径60mmのディシュあるいはそれ以下のディシュにトランスフェクションしても十分アッセイが可能であることが明らかとなった。またトランスフェクションの効率を補正するために使う遺伝子は高感度検出法の使えるβーガラクトシダ-ゼの発現ベクタ-(例えばpCH110)が適当であることもわかった。1.SPT遺伝子上流域に存在すると考えられるホルモン応答領域の解析(1)培養細胞へのトランスフェクション(Tf)実験の条件...レポーター遺伝子としてはCAT遺伝子以外にホタルのルシフェラーゼを用いる。Tfの効率を補正するためβーガラクトシダーゼ遺伝子を含むpCH110を使用する。Tfはリン酸カルシウム法で行い、DNAーリン酸カルシウム沈澱との接触は18h、細胞は48h後に回収し、細胞抽出物を得る。組み換え遺伝子を導入する細胞はヒト肝由来のHepG2である。(2)Tf用組み換え体の作製...SPT遺伝子上流-5.5kbのBamHIまでのDNA断片をレポーター遺伝子とつなげたものを最長のクローンとして作製した。現在、5側からの段階的欠失組み換え体、および内部の欠失組み換え体を用意しているところである。-1256bpのHindIIIまでは既に塩基配列を決定しており、この中に実際に機能していると思われるシスエレメントが多数存在しているので、この領域については、より細かな欠失組み換え体を作製中である。組み換え体が揃い次第、Tf実験に入る予定である。2.転写開始部位選択機構の解析ラットSPT遺伝子には転写開始部位が二箇所存在し、下流からの転写位置付近には通常見られるTATA Boxが見あたらないので、特に下流のプロモーターについてその解析を行った。SPT遺伝子上流域493塩基(-493)から、+106塩基までをCAT遺伝子につないだ組み換え体を非誘導時の正対照として用いた。5^1側から段階的に短くしていくと、+21から+37へとけずるとCAT活性が約20%に低下し、更に+37から+64で4%にまで低下した。このことは通常の転写においては下流からの転写がほとんどであり、その転写に関わるエレメントが、+21と+37、+37と+64の間にそれぞれ存在することを示唆している。現在、このあたりのDNA断片を用いてゲルシフト解析を始めようとしているところである。
乾癬表皮におけるcornified cell envelope 形成機構の研究

1.乾癬表皮のcornifiedcell envelope (周辺帯)の形成における構成タンパクの役割をインボルクリン、ロリクリンについて正常表皮比較検討した結果、正常表皮ではインボルクリンの沈着にともない周辺帯の形成が角層下ないし角層直下で起こること、次いで角層上方に至るとインボルクリンの染色性は減少しロリクリンの沈着が認められることが示された。一方、乾癬表皮では周辺帯の形成は、表皮のより下方から始まり、ロリクリンの染色性は低下したたままであり、インボルクリンの抗原性は角層上方まで維持されることが示された。乾癬ではインボルクリン主体の周辺層の形成がより未分化な段階の表皮細胞でなされてしまいその後、他の構成成分になる修飾はあまり起こらないものと考えられる。2.インボルクリンの遺伝子発現はCキナーゼによりAP-1を介して制御されることをわれわれはすでに見いだしているが、本研究により、インボルクリン遺伝子mRNAは乾癬皮疹部で事実、増加していること、またインボルクリン遺伝子は転写因子TEF-1により抑制的な制御を受けることが示された。TEF-1は基底細胞層で発現が強くインボルクリンが基底細胞層で発現しない理由の1つを提供していると推定される。TEF-1とAP-1、特にCキナーゼサブタイプとの関連は今後の問題である。3.乾癬表皮はターンオーバー時間の短縮が認められるが、このことと周辺帯の形成を含む角化機構の異常との関連が明確になった。すなわち乾癬では増殖亢進にともなうターンオーバー時間の短縮の結果、角化のための必要最小時間を維持する過程で細胞数の増加と加速された角化が引きおこされ、表皮機築の変化と周辺帯の形成異常を含む角化の変動がもたらされることが明らかとなった。本年度は、主に乾癬表皮のcornifiedcell envelopeの形成におけるインボルクリンの役割を、免疫電顕を用いて形態面から検討した。その結果、正常表皮ではcornified cell envelopeの形成は角層下方ないし角層直下で起こること、その際、インボルクリンは下方のcornified cell envelopeでは抗原性が保たれているが、角層の中上方では抗原性が消失してしまうことが示された。おそらく正常表皮ではインボルクリンの沈着後、ロリクリン、spr/cornifinといった他のcornifiedcell envelope構成成分が、順番に沈着していくため、インボルクリンの抗原性のマスキングが起こっているものと推定される。これに合致して、通常電顕におけるcornifiedcell envelopeの電子密度も、角化の進行とともに変動していくことも示された。以上の結果は、cornifiedcell envelopeの形成過程が決して瞬間的なものではなく、秩序だった進行性のプロセスであることを示すものである。また、これは同時にcornified cell envelopeの形成が、transglutaminaseの活性化の時点での手持ちの材料によるとする従来のdustbin仮説を否定する根拠にもなっている。一方、乾癬表皮ではcornified cell envelopeの形成は、表皮のより下方から始まり、インボルクリンの抗原性は角層上方まで維持されていた。またcornifiedcell envelopeの電子密度の変動も認められなかった。したがって、乾癬では、インボルクリン主体のcornifiedcell envelopeの形成がより未分化な段階の表皮細胞でなされてしまい、その後、他の構成成分による修飾は、あまり起こらないものと考えられた。これは乾癬表皮のcornifiedcell envelopeがインボルクリン主体の構成要素からなるという従来の推定を支持する所見である。以上の結果は、Journal of Investigative Dermatologyに投稿し、現在、印刷中である。昨年にひき続き、乾癬表皮のcornified cell envelopeの形成における構成タンパクの役割をインボルクリン、ロリクリンについて正常表皮と比較検討した。その結果、正常表皮ではインボルクリンの沈着にともないcornified

cell envelopeの形成が角層下方ないし角層直下で起こること、次いで角層上方に至ると、インボルクリンの染色性は減少しロリクリンの沈着が認められることが示された。一方、乾癬表皮ではcornified cell envelopeの形成は、表皮のより下方から始まり、ロリクリンの染色性は低下したままであり、インボルクリンの抗原性は角層上方まで維持されることが示された。乾癬ではインボルクリン主体のcornifiedcell envelopeの形成がより未分化な段階の表皮細胞でなされてしまい、その後、他の構成成分による修飾はあまり起こらないものと考えられる(Journal of Histochemistry and Cytochemistry (in press))。インボルクリンの遺伝子発現はprotein kinase CによりAP-1を介して制御されることをわれわれはすでに見いだしているが、本年度の研究により、インボルクリン遺伝子mRNAは乾癬で増加していること(Br J Dematol (in press))、またインボルクリン遺伝子は転写因子TEF-1により抑制的な制御を受けることが示された。TEF-1は基底細胞層で発現が強くインボルクリンが基底細胞層で発現しない理由の1つを提供していると推定される(Arch Dermatol Res 287:740-796,1995)。TEF-1とAP-1、特にprotein kinase Cサブタイプとの関連は今後の問題である。乾癬表皮はターンオーバー時間の短縮が認められるが、このこととcornifiedcell envelopeの形成を含む角化機構の異常との関連が明確になった。すなわち乾癬では増殖亢進にともなうターンオーバー時間の短縮の結果、角化のための必要最少時間を維持する過程で細胞数の増加と加速された角化が引きおこされ、表皮構築の変化とcornifiedcell envelopeの形成異常を含む角化の変動がもたらされることが明かとなった。(J Dermatol Sci 10:200-223,1995,Br J Dermatol (in press))。
ChIP-Injection法：生体内活性を指標としたエンハンサー同定法の確立

本研究ではゼブラフィッシュ胚を用いて、生体内活性を指標としたエンハンサー同定法を確立した。胚から尾芽を切断し、抗H3K27Ac抗体によるChIP法により得たDNA断片をEGFPリポーターに挿入したエンハンサー・ライブラリを作製した。EGFPリポーターをゼブラフィッシュの受精卵へ導入し、領域特異的なEGFP蛍光を示すエンハンサーの探索を行った結果、導入した108個のうち39個において、尾芽、体節、脊索などでエンハンサー活性が観察された。4つのエンハンサーについて組換え魚を作製し、スクリーニング時と同様の活性を確認した。さらに、エンハンサーのゲノム位置を明らかにし、ターゲット候補遺伝子を同定した。発生過程において、時期領域特異的な遺伝子発現はエンハンサーにより制御される。エンハンサーには特異的なヒストン修飾(H3K27ac)が存在し、これを認識するモノクローナル抗体によるクロマチン免疫沈降法(ChIP法)と次世代シーケンスを組み合わせたChIP-Seq法により、網羅的にエンハンサー領域が同定されている。しかしながら、ChIP-Seq法で得られた膨大な数のエンハンサー候補断片について、生体内におけるそれぞれの活性を評価することは難しい。そこで、胚への注入が簡便にでき、発生過程を通じて蛍光観察が可能なゼブラフィッシュ胚を用いて、エンハンサー活性を指標とした新たなエンハンサー同定法ChIP-Injection法の確立し、機能解析を行うことを目的とした。具体的には、脊椎動物胚の後端にあり、幹細胞様の性質を有する尾芽をモデルとして、エンハンサーをスクリーングした。平成26年度は、H3K27acに対するChIP法により尾芽エンハンサーlibraryを作製し、ゼブラフィッシュ胚に導入することで、ChIP-Injection法の確立を目的として研究を遂行した。その結果、これまでに解析した53種類の候補断片のうち、尾芽由来の体節、脊索、神経管などに特異的に発現を誘導する13個のエンハンサー候補断片を同定した。さらに、それらのシーケンス解析を行い、ゲノム上の位置を特定し、周辺に存在する遺伝子を調べた結果、エンハンサーの制御下にある候補遺伝子を絞り込んだ。近年、活性化されたエンハンサーには、特異的なヒストン修飾(H3K27ac)が存在することが明らかになり、これを認識する抗体を用いた免疫沈降法と次世代シーケンサーを組み合わせたChIP-Seq法によりエンハンサーが網羅的に同定されている。しかしながら、ChIP-Seq法では、同定されたエンハンサーがどのような活性を有しているのかは不明で、その後、in vivo解析により活性を調べる必要がある。さらに候補断片の数が膨大なため、それぞれの活性を解析することは難しい。そこで、胚への注入が簡便にでき、発生過程を通じて蛍光観察が可能なゼブラフィッシュ胚を用いて、エンハンサー活性を指標とした新たなエンハンサー同定法ChIP-Injection法を確立し、機能解析を行うことを目的とした。脊椎動物の胚発生期に胚の最後端に位置する尾芽をモデルとして、尾芽および尾芽由来の組織に特異的に働くエンハンサーを同定することを試みた。平成26年度までに、切断した尾芽を用いて、H3K27acに対するクロマチン免疫沈降法により得られた断片をEGFPリポーター遺伝子に導入した尾芽エンハンサー・ライブラリーを作製し、幾つかのエンハンサー活性を有する断片を得ていた。平成27年度は、計画に基づきスクリーニングを継続した結果、これまでに107個の候補断片をゼブラフィッシュ胚に導入した結果、39個のエンハンサー候補断片を同定した。さらに、この内の4つについて、トランスジェニック胚を作製し、エンハンサー活性を再現することを明らかにした。また、同定した複数のエンハンサーに関して、同染色体上に存在する遺伝子の発現パターンと類似することを見出した。平成27年度は、当初の計画通りにスクリーニングを継続した結果、これまでに107個のエンハンサー候補断片をゼブラフィッシュ胚に導入し、39個のエンハンサーを同定した。さらに、興味深い活性を示した4つのエンハンサー候補断片について、トランスジェニック魚系統を単離し、スクリーニング時の活性を再現することを確認した。さらに、トランスジェニック魚を用いて、同定したエンハンサーの活性を詳細に解析することが出来た。当初の計画通り、平成27年度は、スクリーニングで得られたエンハンサー断片から、今後詳細に研究を行うエンハンサーの絞りこみが出来たため、概ね順調に進展していると考えられる。個体発生は、時期及び領域特異的な遺伝子発現によって制御されている。これを司る機構としてエンハンサーによる制御が知られており、エンハンサーを同定することは遺伝子発現制御機構を理解するうえで重要である。近年、エンハンサーに特異的に存在するヒストン修飾が明らかとなり、それらに対するクロマチン免疫沈降法と次世代シーケンサーを組合わせた手法によりエンハンサーの網羅的な同定が進んでいる。しかしながら、この方法ではエンハンサーのゲノム上での位置は示されるが、エンハンサー活性はその後、生体内へ導入するなどの解析が必須である。さらに、予想されるエンハンサー数が膨大のため、目的のエンハンサーを絞り込むことは難しい。そこで、受精卵への遺伝子導入や蛍光観察が容易なゼブラフィッシュ胚を用いて、生体内活性を指標とした新たなエンハンサー同定法を確立した。

本研究では脊椎動物の発生において多分化能を有する尾芽に着目し、尾芽領域に特異的なエンハンサーを同定することを目的とした。まず、18-22体節期胚の尾芽を切断し、H3K27Ac抗体を用いたChIP法により得られたDNA断片をそれぞれEGFPリポーターの上流へ挿入した尾芽エンハンサー・ライブラリを作製した。作製したライブラリからEGFPリポーターをゼブラフィッシュの受精卵へそれぞれ注入し、18-22体節期での蛍光観察をもとに領域特異的なEGFP蛍光を示すエンハンサーのスクリーニングを行った。その結果、導入した108個のうち39個において、尾芽由来の組織で特異的な活性が観察された。興味深い活性を示した4つについて組換え魚を作製し、スクリーニング時と同様の活性を確認した。さらに、ゲノム位置を明らかにし、制御候補遺伝子を同定した。以上から、ゼブラフィッシュ胚での生体内活性を指標としたエンハンサー同定法は高効率なエンハンサーの同定法であることが示唆された。平成28年度は、これまでにスクリーニングで同定された中から2つのエンハンサー断片に絞り込み、その領域に結合する転写因子や結合領域などを同定することに成功した。さらに、ゲノム編集技術を用いて、エンハンサー変異体を作製し、その表現形を解析した結果、体節形成に異常が生じていることを見出した。これは、当初立案した計画と照らし合わせ、概ね順調に進行していると考えられる。発生過程において、時期及び領域特異的な遺伝子の発現はエンハンサーにより制御される。近年、活性化されたエンハンサーには、特異的なヒストン修飾(H3K27Ac)が存在することが明らかとなり、これを認識する抗体と次世代シーケンサーを組合わせたChIP-Seq法により、エンハンサーの網羅的な同定が行われている。しかしながら、ChIP-Seq法では、同定されたエンハンサーの活性については不明であり、その後in vivo解析により活性を解析する必要がある。さらに、同定されたエンハンサーの数が膨大であり、それぞれの活性を解析することは難しい。そこで、胚への注入が簡便で、発生過程を通じて蛍光を観察することが容易なゼブラフィッシュ胚を用い、エンハンサー活性を指標とした新たなエンハンサー同定法ChIP-Injection法を確立し、機能解析を行うことを目的とした。脊椎動物胚の後端に存在する尾芽をモデルとして、尾芽および尾芽から分化する体節に特異的に働くエンハンサーを同定することを試みた。切り出したゼブラフィッシュ胚の尾芽に対して、H3K27Acに対するChIP法を行い、エンハンサー候補断片をGFPリポーター遺伝子に繋いだ尾芽エンハンサー・ライブラリーを作製した。これまでに108個のエンハンサー候補断片をゼブラフィッシュ胚に導入し、39個のエンハンサー候補を同定した。さらに、この内の4つについて、トランスジェニック胚を作製し、エンハンサー活性が再現されることを確認した。同定した複数のエンハンサーに関して、同一染色体上にある遺伝子の発現パターンと類似することを見出した。