hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
事象知覚の前提となる物体同一性の心的表現に関する認知・脳科学的検討

時空間位置の移動にかかわらず、当該物体を同一のものとして知覚する「物体の同一性」を脳内で表現するための感覚間の情報統合過程について検討した。従来の感覚間統合研究では、ある感覚の単一刺激が他の感覚の単一刺激と続合されるか否かを問題としてきたが、本研究では、感覚間情報統合の様式が必ずしも刺激間の一対一の対応関係には限られない可能性を検討した。2つの物体が交差する運動軌道をもち,通過もしくは反発事象の知覚がなされる「通過・反発刺激」を複数用意し、各刺激の運動軌道が2次元画面上の1点で直交する「多重通過・反発刺激」を作成した。各刺激の運動開始時間をずらすことで交差間の遅延時間(0-250ms)を操作し、また,先に運動を始める刺激の交差時に,反発知覚を誘発する音刺激の提示の有無を操作した。実験参加者は、複数の通過・反発刺激が全て反発知覚されたか否かを判断した。結果、交差間の遅延時間にかかわりなく、単一の音刺激が複数の視覚刺激において反発知覚を強めた。さらに,本研究では,視聴覚相互作用の安定した生起には視聴覚刺激の提示の直前・直後に一定の時間範囲を必要とする可能性を検討した。実験参加者は「通過・反発刺激」を観察し,交差時に2つの物体が通過する,もしくは反発するように知覚されたかを判断した。交差する前と交差した後の運動時間,交差時に提示される音刺激の有無を操作した.結果として,通常は音刺激の提示は頑健な反発知覚を誘発するが,交差前・後のいずれかにおいて運動時間が100msに満たない場合に反発知覚が減衰することが明らかとなった。上記を含む研究成果は,「物体同一性」の知覚に関する概説としてまとめられ,心理学評論誌にて発表された。共同研究も熱心に行い、日本基礎心理学会第27回大会優秀発表賞を共同で受賞し、この他PETおよびfMRIを用いたニューロイメージング研究にも取り組んだ。時空間位置の移動にかかわらず、当該物体を同一のものとして知覚する「物体の同一性」を脳内で表現する視覚情報選択・統合過程について、2物体が交差する運動軌道をもつ通過・反発刺激を用いて心理物理学的に検討を行った。この刺激では、2物体が通過、あるいは反発する形で物体の同一性が知覚される。本研究では、物体の運動と表面特徴情報の統合の進行状況を操作するために、2物体に異なる表面特徴を持たせ、交差後の2物体の表面特徴交換の有無、交差後の刺激提示時間を操作した。その結果、特徴交換後150-200msの間刺激が提示され続けなければ、運動と表面特徴が統合されず、安定した通過・反発の知覚判断ができないことが明らかとなった。この結果は、運動速度や表面特徴の種類に依存することなく一定であった。さらに、物体同一性を規定する際の視覚情報の取捨選択方略を検討するために、通過・反発刺激に局所・大域情報をもつ運動物体を用いて、交差後の局所・大域情報交換の有無を操作した実験を行った。その結果、大域情報の交換のみが通過・反発判断に影響を与えた。しかしながら各情報交換に関する検出課題を行ったところ、局所情報の変化は大域情報と同様に知覚されていることが明らかとなった。この結果は、両情報を知覚はできるが、選択的に大域情報を用いている可能性を示唆した。以上より、視覚系は物体同一性を脳内表現する際に、物体の持つ情報のうち大域情報を選択し、情報を統合するという複数の処理プロセスが150-200msという時間範囲の中で機能していることを本研究は示した。
食品成分は脂肪組織および膵β細胞の低酸素による機能障害を軽減できるか

本年度は、脂肪細胞における低酸素による機能障害の緩和に作用する食品成分の探索を実施した。Piceatannol、resveratrolはポリフェノールの1種で、パッションフルーツやブドウに含まれ、サーチュイン(Sirtuin)遺伝子の1つのSIRT1などを介して、血管弛緩作用、抗酸化作用および抗炎症作用などを有することが報告されている。本年度は、piceatannol、resveratrolが、脂肪細胞の低酸素による炎症性サイトカインの分泌促進や小胞体ストレスの亢進、それに伴うadiponectin分泌低下などに対する効果について検討を行った。脂肪細胞における低酸素暴露によって、抗炎症性サイトカインであるadiponectinの分泌量は減少し、炎症性サイトカインの1つであるTNF-αの分泌量は増加していた。また、炎症性応答に関連する各種因子(NF-κB、TLR4、PAI-1)や小胞体ストレスに関連する各因子(ATF4、CHOP、XBP-1、ATF6)のmRNA発現量は、低酸素暴露により有意に増加していた。piceatannolを添加することによって、adiponectinの分泌量は回復し、TNF-α分泌量は有意に抑制された。さらに、多くの炎症応答・小胞体ストレス関連遺伝子のmRNA発現量が抑制された。このことから、piceatannolには、脂肪細胞の低酸素状態による炎症応答を抑制する作用があることが示された。さらに、SIRT1のmRNA発現量が、低酸素暴露により有意に低下することも初めて明らかになった。一方で、piceatannol添加によって、SIRT1のmRNA発現の有意な回復は認められなかった。このことから、piceatannolによるadiponectin分泌量の回復や炎症応答の軽減には、SIRT1を介さない経路が関与していることが示唆された。低酸素による脂肪細胞の機能障害を緩和しうる食品由来成分の探索・評価を実施した結果、ピセアタンノールにその効果があることが示された。アディポネクチンの分泌回復と小胞体ストレスの緩和や一部炎症応答の抑制が認められたため、今後、さらなるメカニズムの解明と動物実験による機能性の評価を進めていく予定である。一方で、ピセアタンノールによえう低酸素による機能障害の抑制効果は限定的であり、その効果の度合いも顕著なものではなかったため、さらに効果の高い食品成分のスクリーニングも進めていく予定である。本年度の研究成果を踏まえ、低酸素による脂肪細胞の機能障害の緩和に効果のある食品成分のスクリーニングと機能解析を引き続き実施する。合わせて、効果のあった食品成分の動物への投与実験を進める。また、膵β細胞の低酸素によるインスリン分泌低下などの機能低下に回復効果を有する食品成分の評価についても脂肪細胞の結果を踏まえて実施していく予定である。
受精に依存した胚発生開始の遺伝的制御機構の解析

有性生殖を行う生物の胚発生は受精によって引き起こされる。野生型ショウジョウバエの未受精卵でも、減数分裂完了後の雌性前核は核分裂が抑制されており、卵の受精がその抑制解除に必須である。本研究では、アナナスショウジョウバエの有性生殖系統の未受精卵と受精卵、および単為発生系統の未受精卵における核分裂を細胞学的に比較解析した。その結果、いずれの胚発生開始にも、中心体の働きが重要であることが分かった。特に、精子が関与しない単為発生胚では、卵細胞質中に複数個の中心体が新規合成されていた。これのら中心体が、半数体の雌性前核の分裂と、娘核の融合による二倍体核形成に重要であることが明らかになった。アナナスショウジョウバエの単為発生では、基本的に一つの半数体の減数分裂産物の倍加によって2倍体雌がつくられることが分かっている。しかしその細胞学的機構についてよく分かっていない。本研究におけるこれまでの成熟卵および初期胚の解析から、単為発生胚では、雌性前核のまわりに、野生型の減数分裂で見られるような中心体非依存型の紡錘体が形成されることが分かった。このような紡錘体は、中心体を持たないまま第1回目の体細胞分裂をする場合と、極が卵細胞質中に新規合成されている中心体と結合して分裂する場合がある。さらに、半数体核を持つ2つの紡錘体の片側の極だけが中心体と融合している例や、減数第2分裂で見られる紡錘体のように2つの紡錘体が縦列した例も認められた。単為発生では、このような変則的な紡錘体形成が2つの半数体核を融合して2倍体化を導く重要な働きを持っていると考えられる。アナナスショウジョウバエにおいて単為発生を可能にしている遺伝子のマッピングを行っている。有性生殖と単為生殖が可能な系統の有性生殖のみを行う野生型系統への戻し交配によって作製し、ライン化した多数の単為生殖系統の解析から、単為発生を確実に行うためには、第2染色体左腕と第3染色体左腕の特定の領域をあわせ持つことが必要なことが分かった。また、遺伝子発現の観点からも単為生殖機構の解析を進めた。初期発生に必要な因子は、卵形成過程において発現され、卵細胞質中に蓄積されている。そこで、雌から成熟卵母細胞を集め、mRNAを抽出してサンプルとした。有性生殖のみを行う2系統と単為生殖可能な3系統、計5系統のRNA-seq解析を行った。有性生殖群と単為生殖群の間で遺伝子の発現量を比較したところ、16遺伝子が発現量の上昇を、25遺伝子が減少を示した。単為生殖を引き起こしている遺伝子は第2染色体上の劣性突然変異で、これはアナナスショウジョウバエだけではなくその近縁2種の間でも保存されていることが分かっている。この突然変異を探索するために、アナナスショウジョウバエとその近縁種から、野生型の有性生殖1系統と突然変異の単為生殖3系統を選び、それらのゲノムの塩基配列をイルミナ社の次世代シーケンサーで解読した。得られた配列を公開されているアナナスショウジョウバエのゲノム情報と照合したところ、単為生殖系統に特異的な多型は、第2染色体の単為生殖遺伝子が遺伝学的にマップされている領域内に、一塩基多型と挿入欠失多型の合計93,716ヶ所見つかった。この結果は予想よりもかなり大きな値であるが、今後の、受精依存的な発生開始を決定づける遺伝子の特定の基礎となる重要なデータである。また、単為発生胚における発生の細胞学的特性を明らかにするため、初期胚を固定し、染色体と中心体の挙動を解析した。野生型雌が産んだ未受精卵における発生はまったく認められず、染色体は、雌性前核および極体として観察された。一方、単為発生胚では高い割合で核分裂の周期が始まっていた。単為発生胚に特異的な表現型として、中心体様の構造が卵の前極に新規に形成されていることが明らかになった。このような構造は一つの胚あたり複数個形成されており、それらのうちいくつかは染色体の分配に関与しており、残りは卵細胞質中に核とは独立して存在した。野生型では、未受精卵に中心体は形成されない。中心体の新規合成が、単為発生の成立に重要な役割を持っていることが強く示唆された。未受精卵からの単為発生における核分裂の開始と2倍体化達成の機構の解明は、本研究課題において最も重要な点である。

これまでに、単為生殖系統雌が産む卵の細胞質で新規合成される中心体が単為発生に重要な役割を持つことが示唆されていたが、その機能は不明であった。最終年度、これら中心体の単為発生開始期における2つの機能を明らかにした。まず、DNA複製後の雌性前核の染色体が分裂期中期から後期へ移行するために、中心体が必要であることを示唆するデータを得た。中心体を持たない有性生殖系統の卵において、紡錘体は中期で停止し、それ以降のステージは認められなかった。一方、単為発生卵では、中心体が結合した紡錘体において後期と終期が観察された。第2に、単為発生胚の2倍体化において、1つの中心体が2つの1倍体娘核を融合する働きを持つことが分かった。第1回目の核分裂で形成された2つの半数体の娘核は、一つの中心体を起点とした2方向への紡錘体によって捕らえられる。この第2回目の核分裂の終期、2つの娘核は極において融合し、2倍体核が形成される。単為発生遺伝子の特定は、単為生殖系統の有性生殖系統への戻し交配を繰り返して複数のアイソジェニックな単為生殖ラインを確立し、分子マーカーを指標に、それらが保有する単為生殖系統由来のゲノム領域を決定する方法で行った。その結果、第2染色体左腕、右腕、第3染色体左腕に、単為発生を引き起こすために重要な染色体領域が存在することが明らかになった。本研究において、アナナスショウジョウバエの有性生殖の進化の過程で出現した単為生殖に関して、その細胞学的および遺伝学的基盤を解析した。単為発生において見られるユニークな細胞学的現象は、有性生殖の成立を理解するための重要な手がかりとなり、また本研究成果の応用により単為生殖と有性生殖の両方が可能な有用モデル生物の作製が可能になると考えられる。細胞遺伝学アナナスショウジョウバエの胚の免疫染色に適したチューブリン抗体を得ることができたため、単為発生胚における核分裂と2倍体化の細胞学的解析を進められるようになった。またRaff博士より提供していただいた別の抗体も本研究に利用できることが分かり、単為発生胚で新規合成される中心体は、中心体の最も外層に位置するCentrosominに加え、より内部に存在する中心体構成因子も持っていることが明らかになった。単為発生を引き起こす遺伝子の特定も、ゲノム解析と成熟卵の遺伝子発現解析、また戻し交配により単為生殖に不要な領域を野生型の染色体に置換する実験が予定通りに進んだ。これにより単為発生の成立には、複数の遺伝子について単為発生型の対立遺伝子を同時に持つことが分かった。単為発生の原因遺伝子の特定に関して、ゲノムシーケンスの結果、予想を上回る数の単為生殖系統に特異的な多型が認められた。そのため現状での遺伝子の特定は困難である。得られたデータを利用しながら、さらに遺伝子領域を狭め限定するための実験が必要である。初期胚の細胞学的解析に関しては、中心体の構成因子の一つCentrosomin(Cnn)に対する抗体を用い、細胞質中に中心体様の構造が多数形成されていることを発見した。この中心体様の構造がどのような中心体構成因子からできているかを、野生型との比較により詳細に調べようとしたが、抗-Cnn抗体以外の中心体構成因子の抗体で染色することはできなかった。また、微小管についても免疫染色ができなかった。そのため、今後、胚の固定法に改良を加え、解析を進める必要がある。単為発生における2倍体化の細胞学的機構が明らかになりつつある。引き続き、2倍体化に決定的なごく初期の体細胞分裂を行う胚の免疫染色を行い、1つの半数体核から2倍体核が形成される機構の詳細を明らかにする。アナナスショウジョウバエの単為発生を引き起こす遺伝子を特定するため、引き続き戻し交配を行い、単為発生に必要な遺伝子の特定に向けたマッピングを行う。
プラズモン光ピンセットで捕捉した分子のキラル分光分析

本研究では,これまでに我々が実験で見出したアキラルな(キラルでない)金属ナノ構造が発生する「制御可能な強くねじれた光」を極限利用することで,極微量のキラル分子の検出・分析が可能であることを実証する。光の極限利用のために,プラズモン光ピンセットを用いて強くねじれた光が発生する領域にキラル分子を捕捉し,強くねじれた光とキラル分子の相互作用効率を極限まで高める。本研究が完成すれば,極微量のキラル分子の分光分析が可能になり,分析対象が溶液中のキラル分子から気体中のキラル分子まで広がる。その結果,例えば衣服等に付着した微量の病原体(ウイルス等)を検出するデバイスが開発でき,防疫に大いに貢献する。
脂溶性生理活性物質をリガンドとする新規核内レセプターの検索

本研究では、下記の3点に焦点を当て、核内レセプターリガンドとして働く新規低分子量脂溶性生理活性物質同定を試みた。1.RXRとのヘテロ2量体化を利用した新たな核内レセプターの検索:VDRをはじめとした非ステロイドホルモン型レセプターは、RXRとヘテロ2量体化することでDNAに結合、レセプター機能を発揮することが知られている。このヘテロ2量体化に着目し、RXRをプローブとしてこれと会合するレセプターを検索し、これを酵母内で発現させ、RXRとのヘテロ2量体は、タンパク-タンパク相互作用に基づくtwo-hybrid法にて検出した。取得されたcDNA断片を用い、cDNAライブラリーから全長cDNAの取得を試みた。2.組織特異的ビタミンDレセプター欠損マウスの作出と表現型の解析:標的組換えによるVDR欠損マウスの表現型の解析を行った結果、重篤なクル病を呈しており、骨形成、皮膚などに明らかな異常が認められた。更にRXRβとRXRγの2重欠損マウス(VDR-RXRβ、VDR-RXRγ)を作製し、これらの異常がVDR単独欠失より軟骨で強調されることを見出した。これら動物の表現型を詳細に解析することで、皮膚、軟骨組織においてはビタミンDが血中カルシウムを介さず直接作用することがわかった。既にCreを発現させる皮膚特異的プロモーター(K_1、K_2、K_5、K_<10>遺伝子プロモーター)や軟骨特異的プロモーター(プロコラーゲンII型遺伝子プロモーター)をもつ発現ベクターの作製に成功しており、現在共同研究者であるフランス・パスツール大学、P.Chambon教授らのグループとともに、このようなCreをもつトランスジェニックマウスを分担して作製しているところである。3.新規核内レセプターリガンドの同定:上記の方法にて得られた新たなレセプターリガンド同定を目的にレセプターの転写促進能を活性化するリガンドを検索した。得られた新規レセプターcDNAを用いた発現ベクターにより、動物細胞内もしくは酵母内で発現させ、血清あるいは食物中の低分子量脂溶性画分を培地中に加えて、転写促進能を指標にリガンドを検索した。ステロイド甲状腺ホルモン、脂溶性ビタミンA、Dをリガンドとする核内レセプターは1つの遺伝子スーパーファミリーを形成し、ヒトを始めとした高等捕乳動物では100種近くも存在すると考えられている。本年度は核内レセプターリガンドとして働く新規低分子量脂溶性生理活性物質同定を最終目的に、下記の3点に焦点を当て、研究を進めた。1.相同性を利用した新たな核内レセプターの検索:核内レセプター群はともに相同性が極めて高いため、相同性を利用した新たな核内レセプターの検索が可能である。本年度は、数多くのビタミンD誘導体が存在するのにもかかわらず、レセプターがVDR1種のみしか知られていないことに着目し、特にVDRと相同性の高い核内レセプターの同定を試みた。2.RXRとのヘテロ2量体化を利用した新たな核内レセプターの検索:VDRをはじめとした非ステロイドホルモン型レセプターは、RXRとヘテロ2量体化することで、DNAに結合、レセプター機能を発揮することが知られている。そこでこのヘテロ2量体化に着目し、RXRをプローブとして、これと会合するレセプターを検索した。

3.組織特異的ビタミンDレセプター欠損マウスの作出と表現型の解析:既に標的組換えによるVDR欠損マウスの作出に成功し、その表現型の解析を行った。その結果、重篤なクル病を呈しており、骨形成、皮膚などに明らかな異常が認められた。更にRXRβとRXRγの2重欠損マウス(VDR-RXRβ、VDR-RXRγ)を作製し、これらの異常がVDR単独欠失より軟骨で強調されることを見出した。これら動物の表現型を詳細に解析することで、皮膚、軟骨組織においてはビタミンDが血中カルシウムを介さず直接作用することがわかった。本研究では、下記の3点に焦点を当て、核内レセプターリガンドとして働く新規低分子量脂溶性生理活性物質同定を試みた。1.RXRとのヘテロ2量体化を利用した新たな核内レセプターの検索:VDRをはじめとした非ステロイドホルモン型レセプターは、RXRとヘテロ2量体化することでDNAに結合、レセプター機能を発揮することが知られている。このヘテロ2量体化に着目し、RXRをプローブとしてこれと会合するレセプターを検索し、これを酵母内で発現させ、RXRとのへテロ2量体は、タンパク-タンパク相互作用に基づくtwo-hybrid法にて検出した。取得されたcDNA断片を用い、cDNAライブラリーから全長cDNAの取得を試みた。2.組織特異的ビタミンDレセプター欠損マウスの作出と表現型の解析:標的組換えによるVDR欠損マウスの表現型の解析を行った結果、重篤なクル病を呈しており、骨形成、皮膚などに明らかな異常が認められた。既にCreを発現させる皮膚特異的プロモーター(K_1、K_2、K_5、K_<10>遺伝子プロモーター)や軟骨特異的プロモーター(プロコラーゲンII型遺伝子プロモーター)をもつ発現ベクターの作製に成功しており、現在共同研究者であるフランス・パスツール大学、P.Chambon教授らのグループとともに、このようなCreをもつトランスジェニックマウスを分担して作製しているところである。3.新規核内レセプターリガンドの同定:上記の方法にて得られた新たなレセプターリガンド同定を目的にレセプターの転写促進能を活性化するリガンドを検索した。得られた新規レセプターcDNAを用いた発現ベクターにより、動物細胞内もしくは酵母内で発現させ、血清あるいは食物中の低分子量脂溶性画分を培地中に加えて、転写促進能を指標にリガンドを検索した。
メダカ卵への新たな物質導入法による化学物質の発生影響評価法

高電界パルス印加により初期発生中のメダカ卵に物質を導入する方法を用い新規化学物質影響評価法の開発を試みた.メダカ卵の発生に遺伝子発現および形態観察レベルでほとんど影響を与えず,物質の取り込み量を有意に高める高電界パルス条件を見出した.実際にビスフェノールAを用いて定量を行ったところ,外液濃度以上の卵内への取り込みがGC-MSで定量できた.また,特異的な遺伝子発現の変動が起こっていることをDNAマイクロアレイで確認した本年度は,以下のような結果が得られた.高電界パルスの印加条件の検討を行い,昨年度より導入効率が高い条件を見出すことができた.この条件を用いることで,シクロヘキシミドを導入するとほぼ100%のメダカに死亡あるいは発生異常が生じた.また,アクチノマイシンDでも死亡,異常発生率の上昇が見られ,高分子の導入効率を上げることに成功した.実際に化学物質の発生影響評価の可能性を探るため,ビスフェノールA(BPA)を用いて導入量の定量およびDNAマイクロアレイによる遺伝子発現変動の解析を行った.導入量については,外液濃度50uM BPA溶液を用い,暴露卵を十分に洗浄した後,外側の水分をキムワイプで除去し,エッペンドルフチューブ内でホモジネートした.遠心分離後,得られた溶液を卵抽出液とした.卵抽出液中のBPA濃度をGCーMSで分析した.BPA溶液に浸漬しただけのコントロールでは卵抽出液のBPA濃度は約2 uMであったが,パルスを行った卵の抽出液のBPA濃度は約90 uMであり,メカニズムは不明であるが,外液より高い濃度で取り込まれていることが分かり,パルス印加の取り込み効果が高いことが確認された.また,DNAマイクロアレイの結果から,BPA溶液に浸けただけで有意な発現変動を示す遺伝子が数個存在したが,パルス印加後の方が多くの遺伝子の発現が変動しており,BPAの発生途中の卵への導入量が増加したことで影響が増したことと考えられた.以上の結果から,まだ詳細な検討が必要ではあるが,本研究で検討した高電界パルスによるメダカ卵への化学物質導入試験系は発生影響評価手法として有効であることが示唆された.高電界パルス印加により初期発生中のメダカ卵に物質を導入する方法を用い新規化学物質影響評価法の開発を試みた.メダカ卵の発生に遺伝子発現および形態観察レベルでほとんど影響を与えず,物質の取り込み量を有意に高める高電界パルス条件を見出した.実際にビスフェノールAを用いて定量を行ったところ,外液濃度以上の卵内への取り込みがGC-MSで定量できた.また,特異的な遺伝子発現の変動が起こっていることをDNAマイクロアレイで確認した平成23年度は,物質導入のための高電界パルスの受精卵への影響およびタンパク合成阻害剤導入による効果について形態観察およびDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現変動解析で観測した.受精後8時間のメダカ卵に塩水,シクロヘキシミドまたはアクチノマイシンDの塩水溶液を外液とし高電界パルスを印加して各物質をメダカ卵内へ導入し,形態観察を行いながら受精後8日目まで培養した.各群3個のメダカ卵からRNAを抽出し,DNAマイクロアレイ解析を行った.塩水で高電界パルス印加のみを行った群は未処理コントロール群と比較して遺伝子発現の有為な変動は見られなかったことから,高電界パルス印加によるメダカ卵へのダメージはないか,受精後8日目までに完全に回復すると考えられた.シクロヘキシミドまたはアクチノマイシンD導入群ではそれぞれ特有の形態異常が観察され,DNAマイクロアレイ解析では有為に発現量が変動した遺伝子が確認できた.また,シクロヘキシミドまたはアクチノマイシンD導入群で発現量が変動した遺伝子の種類が異なっていたことから,フェノームおよびトランスクリプトーム解析を合わせて行うことで化学物質の影響を詳細かつ明確に調査することができる非常に有用な発生影響評価法となりうることが示された.また,メダカ卵に印加するパルスについても検討を行い,特殊な波形のパルスを印加することでメダカ卵への物質導入量を増加させることに成功した.24年度はメダカ卵内への物質導入量の定量を行うこと,改良した高電界パルスを用いてより分子量の大きい物質の導入を試みることで,さらに広範囲へ応用可能な技術とすることを目指す予定である.当該年度の最大目標であった物質導入による発生影響の確認比較および高電界パルスをメダカ卵に付加することによる悪影響の有無についての遺伝子レベルでの確認は予定通り行えた.物質の導入による発生影響試験は2種類のタンパク合成阻害剤で明らかに個体発生に対する毒性による影響に違いが生じることを確認した.また,高電界パルス影響についても高電界パルス処理有無のメダカ卵の発生状況の比較およびパルス印加8日後の遺伝子発現状況をDNAマイクロアレイで調査し,影響がほとんど無いことが確認できた.以上のことから判断して本研究課題はおおむね順調に進展していると考える.計画通りに進め,取り込み量の定量化および他の化学物質暴露による発生影響の評価について検討し,実用化の可能性について検討する.今年度の予算は,わずかに繰り越しが生じた.これは対外発表を行った学会が近郊であったため,代表者の旅費の使用が節約できたためである.次年度は実用化について検討するため,高額なマイクロアレイ解析を多く行う必要があるため,消耗品に繰り越し分は充当し,より詳細な解析を試みる予定である.
易分解性SAPO-34由来パーツを材料とした水素分離膜の開発

リン酸系ゼオライトSAPO_34とA型ゼオライトを硫酸に溶解させ,アルミナ支持体上にスピンコート法により塗布した.作製した膜は水素/プロパン分離係数130の高い性能を示した.NMR測定から作製した膜は,SAPO-34由来のパーツとシリカから構成されており,これらが水素の透過経路になっていると考えられる.さらに,水溶性塩のナノ粒子が欠陥を塞いでいることが示唆された.水素は環境負荷の小さいエネルギーとして着目されているが,その利用には水素の分離精製が必要不可欠である.中でも分離法は省エネルギー型の分離精製プロセスとして,産業界から大きく着目されている.我々は,「ゼオライトの高い水熱安定性」と「大面積への容易な製膜」の両立を目指したゼオライトナノブロックを考案している.本研究では,既往研究の課題であった製膜溶液の安定性改善を目指し,新たに見出した易分解性SAPO-34と名づけたゼオライト類似化合物を原料とした新規なゼオライトナノブロック膜の開発に取り組む.本年度は,1SAPO-34ナノブロックの構造解析,21 cm角平板支持体への製膜条件の探索を行った,1のSAPO-34ナノブロックの構造解析では,易分解性SAPO-34を塩酸に溶解させ,乾燥して得られたサンプルの固体NMR解析を行った.その結果,溶解前に見られたSAPO-34骨格を示すピークが確認でき,溶解後もSAPO-34骨格が部分的に存在していることが判った.また,骨格中のSi比率を小さくすることで,残存する骨格が増えることも見出した.ゼオライトの酸による溶解は,ゼオライト中のイオン交換サイト付近で起こることが知られており,SAPO-34のイオン交換サイトはSiであることから,今回得られた結果は先の事象と一致する.2の平板支持体への製膜条件の探索では,まずSAPO-34を塩酸で溶解させたものを製膜溶液としたが,緻密な膜が得られなかった.そこで,SAPO-34と既往研究で用いていたA型ゼオライトの混合物を硫酸に溶解させたものを製膜溶液とすることで,水素/プロパン分離係数100以上の膜を得ることができた.既往研究として,「ゼオライトの高い水熱安定性」と「大面積への容易な製膜」の両立を目指したゼオライトナノブロック膜を考案している.本研究では,既往研究の課題であった製膜溶液の安定性改善を目指し,新たに見出した易分解性SAPO-34と名づけたリン酸系ゼオライトを原料とした新規なゼオライトナノブロック膜の開発を最終目標とし,次の3項目,1易分解性SAPO-34の骨格組成分析による耐酸性の考察,2溶解後のSAPO-34の構造解析,3平板支持体(1 cm×1 cm)への製膜法を確立し,SAPO-34を原料としたゼオライトナノブロック膜のガス透過特性を評価に取り組んだ.ICPによる元素分析より,易分解性SAPO-34はAl含有量が少ないことが判り,これが耐酸性に影響を及ぼしていることが確認できた.また,溶解前後の固体NMR分析より,溶解後のAl原子は溶解前と同じ構造を維持しており,SAPO-34骨格が部分的に残っていることが確認できた.一方,Si原子はSi(OAl)4構造からSi(OSi)4構造へと変化しており,骨格から外れたSiを含む骨格パーツ同士が結合し,シリカとして存在することが判った.平板支持体への膜作製では,SAPO-34のみでは緻密な膜が得られなかった.そこで,SAPO-34と既往研究で用いたA型ゼオライトの混合物を原料として用いることで,水素/プロパン分離係数130の膜の作製に成功した.洗浄処理により水溶性塩を取り除いた膜では分離性能が得られなかったことから,今回作製した膜の微細構造は,SAPO-34由来のゼオライトナノブロックとシリカで構成されるネットワークがガスの透過経路となり,大きな欠陥を水溶性塩が塞いでいるものと考えられる.リン酸系ゼオライトSAPO_34とA型ゼオライトを硫酸に溶解させ,アルミナ支持体上にスピンコート法により塗布した.作製した膜は水素/プロパン分離係数130の高い性能を示した.NMR測定から作製した膜は,SAPO-34由来のパーツとシリカから構成されており,これらが水素の透過経路になっていると考えられる.さらに,水溶性塩のナノ粒子が欠陥を塞いでいることが示唆された.本年度の目標は,平板支持体上に水素/二酸化炭素分離能を有する膜の合成条件を確立であった.しかしながら,SAPO-34のみを原料とすることでは緻密な膜が得られなかった.この理由として,既往研究で課題であった溶液の不安定さの原因であるシリカネットワークの形成が,膜を緻密化する働きを併せもっていたことが考えられた.そこでSAPO-34とA型ゼオライトを混合することで,SAPO-34由来パーツを,A型ゼオライトを溶解することで形成されるシリカネットワークに結合させ,緻密な膜を得ることを考えた.また,製膜溶液の安定性と,緻密化に必要なシリカネットワークの両立を目指し,不揮発性の硫酸をゼオライトを分解する酸水溶液とした希薄な製膜溶液を用いた.その結果,二酸化炭素よりも大きな分子であるプロパンに対し,高い水素選択能を有する膜の開発に成功した.今後,更に製膜条件の絞り込みを行い,水素/二酸化炭素分離能を有する膜の合成条件の確立に取り組む.

化学工学シリカネットワークの形成を目的としたA型ゼオライトの添加と,不揮発性の硫酸の利用は,緻密なゼオライトナノブロック膜を得る有用なアプローチと考えられる.今後の方策として,SAPO-34とA型ゼオライトの混合比率や,硫酸アルミニウムなどの水溶性の不純物の影響などを検討し,高い水素/二酸化炭素分離能をもつ膜の開発に取り組む.少額のため来年に繰越す。平成27年度の物品費として使用する。
パイ粒子の散乱長測定とQCDの検証

本研究の目的はπ^-とπ^+がクーロン力で束縛されたπ^-π^+原子の崩壊寿命を実験により直接測定することで、π中間子のS波散乱長を求め,この散乱長をカイラル摂動理論で計算した散乱長と5%以内の精度で比較することにより、非摂動領域でのQCDの検証を行うことである.CERNに提案した実験PS212(通称DIRAC)は1996年に研究評議会で採択されて,以来準備を進め,1999年には本格的なデータ取得を開始した.以後バックグラウンドを減らすための色々な対策をとりながら,PSからの引き出しビーム強度を徐々にあげて実験を続けてきた.日本グループの担当するトリガーについていえば,ScifiホドスコープやdE/dxカウンターのチューニング,読み出し回路や積分回路の改良,トリガーロジック回路の改良等によって実験条件の改良に大きく寄与してきた.現状ではデータ取得はほぼスムースに進行しており,1999年中に得られたデータの予備解析は終わり,2000年に取得したデータについて今解析を進めている所である.予備解析の結果として,1999年データについて緩いカットにおいて266±79の,きついカットにおいて160±45の,全体としては約240個の原子対が同定されている.1999年に比べ現在の10倍以上の強度を考えると2-3年後には5%の精度で散乱長が決められると考えられる.結果の一部はすでに学会等で報告されているが,1999年データについては2001年5月に,2000年データについては同じく秋までに結果を出版すべく準備を進めている.本研究の目的はπ^-とπ^+がクーロン力で束縛されたπ^-π^+原子の崩壊寿命を実験により直接測定することで、π中間子のS波散乱長を求め,この散乱長をカイラル摂動理論で計算した散乱長と5%以内の精度で比較することにより、非摂動領域でのQCDの検証を行うことである.CERNに提案した実験PS212(通称DIRAC)は1996年に研究評議会で採択されて,以来準備を進め,1999年には本格的なデータ取得を開始した.以後バックグラウンドを減らすための色々な対策をとりながら,PSからの引き出しビーム強度を徐々にあげて実験を続けてきた.日本グループの担当するトリガーについていえば,ScifiホドスコープやdE/dxカウンターのチューニング,読み出し回路や積分回路の改良,トリガーロジック回路の改良等によって実験条件の改良に大きく寄与してきた.現状ではデータ取得はほぼスムースに進行しており,1999年中に得られたデータの予備解析は終わり,2000年に取得したデータについて今解析を進めている所である.予備解析の結果として,1999年データについて緩いカットにおいて266±79の,きついカットにおいて160±45の,全体としては約240個の原子対が同定されている.1999年に比べ現在の10倍以上の強度を考えると2-3年後には5%の精度で散乱長が決められると考えられる.結果の一部はすでに学会等で報告されているが,1999年データについては2001年5月に,2000年データについては同じく秋までに結果を出版すべく準備を進めている.素粒子の標準理論の検証は現在最大の課題の一つである.その中で強い相互作用を記述するQCD(量子色力学)のasymptotic freedomについては多くの高エネルギー反応においてその有効性が検証されてきているものの,ハドロン相互作用の理解のためには,非摂動領域での実験による理論の検証が不可欠である.この領域での計算は一般に非常に複雑であり,信頼性のある精度の高い理論計算は難しいが,そのなかでπ中間子散乱は計算によって非常に高い精度の予測のできる希有の例である.本共同研究は,CERN(欧州共同原子核研究機構)の陽子シンクロトロンにおいてπ^+π^-原始の寿命を直接測定することによりπ^+π^-散乱長を求める実験(PS212,通称DIRAC)をロシア,欧州の研究者との協力で行うものである.1998年度にビームラインが完成し,6週間与えられたのテストビームによって得られた検出器,データアキジションシステムのテストデータの解析を本年度初頭に行った.その結果を踏まえて検出奇形に改良を加え,6月から本データの取得を開始した.8月には日本グループの担当するシンチレーティングファイバーホドスコープ及びレベル2トリガーについての論文を作成するための基礎データ取得を1週間狭んで9月から再び本データの取得を11月まで続け,現在は得られたデータの解析中である.データは予定の4ターゲット中から集中的にNiとPtについて取得した.統計はかなり良く,解析の途中経過については1999年12月INSシンポジウムにおいて発表した(論文3,4参照).それと平行して今後の検出器系の改良のために1)dE/dxカウンタ信号の新しいインテグレータの製作.2)半導体検出器を用いた新しいdE/dxカウンタの製作.3)スペクトロメータマグネット中に新しいシンチレーティングファイバーホドスコープ面を増やす準備等のR&Dやテストも行ってきた.本研究はCERNにおけるPS212(通称DIRAC実験)を通じて陽子シンクロトロン(PS)で加速された24GeV/cの陽子ビームを用いて生成されたπ^+π^-原子の寿命を直接測定することによってパイ中間子の散乱長を求め,これをカイラル摂動理論で求められているものと比較することにより非摂動領域でのQCD(量子色力学)の検証を行うことを目的としている.我々は本科学研究費を主に実験旅費として本年度も研究を進めてきた.

平成12年度はビームは5月から11月迄与えられ,その間データ取得を行った.又それと平行して取得データの解析と実験装置の改良を行った.解析について言えば1999年中に得られたデータの予備解析は終わり,2000年に取得したデータについての解析が進行中である.予備解析の結果として,1999年データについて緩いカットにおいて266±79の,きついカットにおいて160±45の,全体としては約240個の原子対が同定されている.装置の改良についてはデータのバックグラウンドを減らすための色々な対策をとりながら,PSからの引き出しビーム強度を徐々にあげて実験を続けてきた.日本グループの担当するトリガーについていえば,ScifiホドスコープやdE/dxカウンターのチューニング,読み出し回路や積分回路の改良,トリガーロジック回路の改良等によって実験条件の改良に大きく寄与した.現在の状況を考えると2-3年後には5%の精度で散乱長が決められると考えられる.結果の一部はすでに学会等で報告されているが,1999年データについては2001年5月に,2000年データについては同じく秋までに結果を出版すべく準備を進めている.
超高圧下における金属材料の弾性率計測手法の確立

本研究では、電磁超音波共鳴法を応用し、1万気圧近傍の超高圧環境下における金属材料・圧電体材料の剛性率計測手法を新たに開発することを目的とする。昨年度は、高圧用電磁超音波センサーの開発、最大到達圧力約1万気圧のピストンシリンダー型高圧発生装置を開発するとともに、Al多結晶、α-Mn多結晶、およびSiO_2圧電体単結晶を試料として採用し、それぞれに対する高圧計測を実施した。実験の結果、α-MnおよびSiO_2圧電体単結晶に関しては到達圧力約0.2万気圧まで、またAl多結晶に関しては到達圧力約0.6万気圧まで良好な共鳴スペクトルを得ることに成功した。Al多結晶試料の到達圧力は、共鳴計測において過去に報告例の無い最大のものである。得られた共鳴スペクトルはガウス関数でフィッティングし、その中心軸を共鳴周波数として決定した。共鳴周波数、横波の音速、および剛性率はいずれも圧力の増加とともに線形的に増加する傾向が認められた。Al多結晶に対する計測結果を準調和近似理論をもとに解析した結果、格子の非線形性を示すグリューナイゼンパラメータγは、γ=2.683となった。この結果は、これまでに報告されているAlの高次弾性定数から計算される値と定量的にほぼ一致することから、本研究で開発した手法は十分に信頼性の高いものであると結論される。本年度は、これまでに得られた結果を学術論文として取りまとめた。なお、関連論文は現在投稿中である。今後は、この計測手法を用いて、各種金属材料単結晶、および圧電体単結晶材料の計測を行っていく予定である。本年度は、高圧用電磁超音波センサーの開発、最大到達圧力約1万気圧のピストンシリンダー型高圧発生装置を開発するとともに、Al多結晶、α-Mn多結晶、およびSiO_2圧電体単結晶を試料として採用し、それぞれに対する高圧計測を実施した。今後は、これまでに得られた結果を学術論文として取りまとめるとともに、この計測手法を用いて、各種金属材料単結晶、および圧電体単結晶材料の計測を行っていく予定である。
組換えDNAを用いたインフルエンザウイルス血球凝集素の抗原及び結合部位の解析

HINI型インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)の遺伝子RNAよりCDNAをクローニングし、SV40の後期プロモーター下流に接続した。T抗原領域に欠損をもつウイルスdl1055をヘルパーとしてCV-1細胞よりSV-HAウイルスを回収し研究に用いた。SVHAウイルスをCV-1細胞に感染するとHAが産生され、HAはゴルジを経て細胞膜上に突出した。このHAの抗原性を5種類の異なった単一抗体で調べたところ、インフルエンザウイルスのHAの抗原性と一致した。又、このHAは血球凝集能及び細胞融合能を示した。したがってSV-HAより発現されたHAはインフルエンザウイルスにより発現されるものと同質のものであることが確かめられた。このHACDNAの発現系を用いて先ずエピトープの決定をおこなった。エピトープ264は1977年から1978年にかけてインフルエンザウイルスの抗原変異に重要な役割を果したと考えられているが、エピトープの位置は単一抗体変異株によっては正確にきめられなかった。いくつかのアミノ酸がエピトープに含まれると考えられてはいたが確証はなかった。我々はHACDNAをM13のファージDNAに組み込み、部位突然変異法によってアミノ酸変化をひきおこす変異をHACDNAに挿入し、上述の発現系でもってこの変異DNAを発現させ、螢光抗体法によって単一抗体264との結合活性を検討した。その結果、189,190,219番目のアミノ酸がエピトープ264に含まれること。以前考えられていた225,227番目のアミノ酸はこのエピトープに含まれないことが明らかになった。次に、この手法を用いて血球凝集能活性をもつ部位を検策し、226番目のアミノ酸を欠損させる変異DNAの発現によって得たHAは血球凝集活性を失なうことが明らかになった。
アリルアルコールを直接用いるカルボニル化合物の求核的アリル化反応の開発

本研究は、平成16年度特別研究員申請書に記述の通り、省資源・省エネルギー環境調和型をキーワードとする物質変換プロセスの開発をコンセプトとし、研究課題名に記載される反応について検討を実施した。従来、カルボニル化合物の求核アリル化反応は、アリルアルコールを強酸処理の後にアリルハライドとし、マグネシウム・錫(猛毒)等の金属試薬を用いて非水条件下でアリル金属に変換する必要性があった。一方、我々が新規に開発したパラジウム触媒とトリエチルホウ素あるいはジエチル亜鉛共存下における同アリル化反応は、アリルアルコールを何ら修飾する必要がない画期的な環境調和型化学プロセスである。平成16年度は、平成15年度にて得られた知見をもとに、次の2つの課題、(1)本アリル化反応の基礎的且つ本質的な検討を行う。(2)分子内反応への応用を試みる。を設定した。(1)の課題については、アリルアルコールを基本原料とし、様々なカルボニル化合物(アルデヒド・ケトン)へのアリル化が可能であることを示した。同時に、その反応性、基質許容性、生成物の位置及び立体選択性が、用いたアリルアルコール若しくはカルボニル類の化学的性質、物理的性質に対して一定の相関かあることを見出した。その相関は、反応機構的に充分に説明可能な現象であり、この成果がAngew.Chem.Int.Ed.Eg.42,3392(2003)。ならびにTetrahedron,61(2005)in press.に掲載された。更に、本アリル化反応をイミンやN, O-アセタールへと展開可能であることも示した。イミンにおけるアリル化反応に関してはてOrg.Lett.7,637,(2005)に記載されている。一方で、上述のアリルアルコールを利用したアリル化反応で得られた知見をもとに、アリルエーテルを原斜とするアリル化反応への展開を試みた。結果、本触媒システムがアリルエーテルを用いるアリル化反応へと応用可能であることを示した。更に、用いるアリルエーテルに糖鎖骨格を組み込むことによって、その反応の位置及び立体選択性をコントロールすることに成功した。この成果は、現在、執筆中であり2005年3月末に投稿を予定している。(2)の課題についても、分子内への応用が可能であることを示した。この成果についても近く投稿予定である。本研究は、平成15年度特別研究員申請書に記述の通り、省資源・省エネルギー・環境調和型をキーワードとする物質変換プロセスの開発をコンセプトとし研究課題名に記載される反応について検討している。従来、カルボニル化合物の求核アリル化反応は、アリルアルコールを強酸処理の後にアリルハライドとしマグネシウム・錫(猛毒)等の金属試薬を用いて非水条件下でアリル金属に変換する必要性があった。一方我々が新規に開発したパラジウム触媒とトリエチルホウ素あるいはジエチル亜鉛共存下における同アリル化反応は、アリルアルコールを何ら修飾する必要がない画期的な環境調和型化学プロセスである。平成15年度は、上述の新規アリル化反応の利便性、経済性を高めるべく次の2つの課題、(1)パラジウム・トリエチルホウ素およびエチル亜鉛触媒系により、水酸基の保護脱保護を必要としない糖アルデヒド(アルドース)のアリル化反応の開発。(2)非乾燥系溶媒、あるいは水そのものを溶媒として利用したアリル化反応の開発を設定した。(1)の課題についてはグルコース、デオキシリボース、エリスリトール等の糖アルデヒトを利用したアリル化反応について検討した。結果、デオキシリボースについては全く保護することなくアリル化反応が進行することを見出した。グルコース、エリスリトールに関しては、現在、保護を必要とするプロセスにとどまっているものの、糖アルデヒドの骨格に由来する特異な立体選択性を示すという興味深い知見を得た。同時に基礎研究として2-アリルオキシテトラヒドロピランおよびフランを利用した同アリル化反応に関する検討も実施しており、その成果はAngew.Chem.Int.Ed.Eg.,42,3392(2003)に記載されている。(2)の課題については当初、非乾燥系溶媒あるいは水そのものを溶媒とする方向で検討を進めていたものの、同タイプのアリル化反応やグリニャール反応ではあまり好ましくない非極性溶媒、特にトルエンを溶媒として利用することで反応が良好に進行することが見出された。この知見は興味深いものであり、その原因の解明を詳細に検討するとともに、得られた情報を水系溶媒中でのアリル化反応の開発にフィードバックする予定である。を設定した。

(1)の課題については、アリルアルコールを基本原料とし、様々なカルボニル化合物(アルデヒド・ケトン)へのアリル化が可能であることを示した。同時に、その反応性、基質許容性、生成物の位置及び立体選択性が、用いたアリルアルコール若しくはカルボニル類の化学的性質、物理的性質に対して一定の相関かあることを見出した。その相関は、反応機構的に充分に説明可能な現象であり、この成果がAngew.Chem.Int.Ed.Eg.42,3392(2003)。ならびにTetrahedron,61(2005)in press.に掲載された。更に、本アリル化反応をイミンやN, O-アセタールへと展開可能であることも示した。イミンにおけるアリル化反応に関してはてOrg.Lett.7,637,(2005)に記載されている。一方で、上述のアリルアルコールを利用したアリル化反応で得られた知見をもとに、アリルエーテルを原斜とするアリル化反応への展開を試みた。結果、本触媒システムがアリルエーテルを用いるアリル化反応へと応用可能であることを示した。更に、用いるアリルエーテルに糖鎖骨格を組み込むことによって、その反応の位置及び立体選択性をコントロールすることに成功した。この成果は、現在、執筆中であり2005年3月末に投稿を予定している。(2)の課題についても、分子内への応用が可能であることを示した。この成果についても近く投稿予定である。
気道上皮,肺癌に対する遺伝子治療のためのDNAウイルスベクターの有効性の検討(Adeno virus VectorとAdeno-associated virus vectorの遺伝子導入効率,細胞特異性に関する研究)

気道上皮細胞に対するAAV vectorの遺伝子導入効率をAd vectorと比較検討multiplicity of infection(moi)1-100の間では、ほぼ同等の遺伝子導入効率を達成することを見い出し、論文として報告した(J Virol 72:8904-8912,1998)。またこの関係は、嚢胞性線維症(CF)患者と正常者(nonCF)しとで、差がないことを見い出し、AAV vectorの遺伝子発現についてCFTRは関与しないことを報告した。むしろ、ウイルス力価、培養環境、培養液体量、ウイルス暴露時間などが重要であることを報告した(J Virol 72:8904-8912,1998,Thromb Res 93:35-42,1999)。しながら、高濃度のAAV vectorの作成は現時点では困難なため、AAV vectorの遺伝子導入効率を上げる手段として、宿主細胞のDNApolymeraseなどの酵素群を活性化させる手段として、DNAtopoisomerase inhibitorの前処置によって遺伝子導入効率をw倍程度にまで上昇させる現象を見い出し論文として報告した中本胸部疾患学会誌35:1312-1317,1997)。また、より生体内への遺伝子導入に近いモデルとして、器官培養下の気管支への遺伝子導入についても検討し、論文として報告した(日本呼吸器学会誌in press)。DNAウイルスベクターの誘導するアポトーシスについては、肺癌細胞について腺癌と扁平上皮癌について検討し、いずれもmoi依存性にアポトーシスを誘導し、結果として遺伝子の一過性発現の原因になっていることを見い出し、現在論文投稿中。まず気道上皮細胞に対するAAV vectorの遺伝子導入効率をAd vectorと比較検討multiplicity of infection(moi)1-100の間では、ほぼ同等の遺伝子導入効率を達成することを見い出し、論文として報告した。しかしながら、高濃度のAAV vectorの作成は現時点では困難なため、AAV vectorの遺伝子導入効率を上げる手段として、宿主細胞のDNApolymeraseなどの酵素群を活性化させる手段として、DNA topoisomerase inhibitorの前処置によって遺伝子導入効率を10倍程度にまで上昇させる現象を見い出し論文として報告した。また、Ad vectorは細胞種によって遺伝子導入効率が異なることが知られているため、他の肺内細胞への遺伝子導入を検討した。肺線維症などで主役となる肺線維芽細胞に対する遺伝子導入を二つの異なったプロモーターを有するAd vectors(Ad-CMV-lacZ,Ad-RSV-LacZ)で比較し、ともに有効な遺伝子導入を達成することを報告した。同様の検討を、血管内皮細胞、肺癌細胞、などでも行っている。また、より生体内への遺伝子導入に近いモデルとして、器官培養下の気管支への遺伝子導入についても検討し、データを重ねている(論文準備中)。また、DNAウイルスベクターの誘導するアポトーシスについても、主に肺癌細胞株を中心に検討している。
1分子イメージングによるシャペロニンの作用機構の解明

1分子のレベルでのシャペロニンGroELとGroESが結合解離するようす、およびタンパク質の折れ畳みの1分子観察の統計的な解析から、これまで知られていない新しいGroEL/ES複合体の中間体があることを提唱した。さらにこの新しい中間体の存在を確かめるために、ATP加水分解の速度論的な解析を行った。また、シャペロニンと変性タンパク質との相互作用の1分子イメージングを行い、シャペロニン機能の全貌を1分子レベルで調べる手がかりを得た。1分子のシャペロニンが機能するようすをリアルタイムで調べるための第一歩としてシャペロニンGroELとGroESが結合解離するようすを1分子レベルで観察することに成功した。また、この実験系を発展させて変性タンパク質の折れ畳みの1分子観察を行った。Green Fluorescent Protein(GFP)とGroEL変異体を使用して1分子タンパク質フォールディングを見ることができた。以上の観察の時間経過を統計的に解析した結果、これまで知られていなかった新しいGroEL/ES複合体を検出することができた。
肥大型心筋症における心室細動の発生メカニズムとその予防-臨床及び基礎からの検討-

Beta受容体に対する自己抗体は、同じ程度の心病変でありながら、より不整脈死が多い心筋症患者群でより高率に検出される。ゆえに我々が用いた、Beta受容体自己免疫型肥大型心筋症ウサギは、それら患者に対する、治療法の選択に重要であると考える。微小電極法による活動電位記録によると、より低頻度刺激時に活動電位の延長を認め、その他のVmaxや活動電位振幅などに大きな変化はなかった。肥大型心筋症ウサギの3割に異常なEarly after depolarization型の活動電位が観察され、1例に自発的なTriggered activityによる不整脈を観察した。現在、その活動電位の延長が、どのイオンチャネルの変化により起こっているのかをパッチクランプ法により解析中である。現在の所、自己免疫性肥大型心筋症ウサギの作成と微小電極法による活動電位記録を行っている。心電図ではあまりQT時間に変化は無い、しかし乳頭筋を単離し、ペーシング周期を1Hz以下にすると活動電位持続時間は肥大型心筋症ウサギで、有意に延長していた。Vmaxや静止膜電位にはほとんど変化は無かった。その他体重などに大きな変化は無かった。活動電位波形であるが、正常ウサギには観察されないが、肥大型心筋症ウサギの3割に異常なEar1y after depolarization型の活動が観察される。またE4031 100nMにより、正常ウサギでは激発活動は観察されないにも関わらず。肥大型心筋症ウサギでは、激発活動が観察され、特にEarly after depolarization型を示した活動電位では、再分極を起こさないTonic depolarizationを呈する事が確認され、この異常がIKr等の異常では無いことが確認できた。ベーター受容体の阻害薬であるBisoprolol ImicroM投与にても、この活動電位に全く変化が無いことから、自己抗体による持続的なBeta刺激によるL型Ca電流の増加に伴う変化ではなく、むしろ細胞内環境の異常による物であると考えられた。現在、パッチクランプ法による電流解析と、Fura-3を用いた細胞内Ca濃度測定を行い、この活動電位の延長がどのようなメカニズムでおこっているかを確認する作業に移っている。