hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安心さがし行動の上方・下方螺旋メカニズムを規定する関係性目標の効果

低自尊心者の安心さがしは他者からの拒絶を引き起こし、高自尊心者の安心さがしは受容を引き寄せることが示されてきた。本研究の目的は、この問題を関係性目標の観点から検討することである。分析の結果、低自尊心で安心さがしする人は、他者と良好な関係を形成しようとする接近的動機づけが低く、他者からの拒絶場面で、自己本位的な行動傾向を示した。逆に、高自尊心で安心さがしする人は、接近的動機づけが高く、他者を配慮する行動を示した。また、自尊心や安心さがしレベルに関わらず、男性の思いやり目標の高さが、女性の自己拡大・充足感を高めることが示され、上方螺旋過程の生起には思いやり目標が重要な要因となることが示唆された。安心さがしとは、重要他者に本当に自分のことを大切に思ってくれているかを確認する行動である。低自尊心者がとる安心さがし行動は、他者からの拒絶を引き起こす下方螺旋過程の様相を呈し、逆に、高自尊心者の安心さがし行動は、受容を引き寄せる上方螺旋過程を生み出す。本研究の目的は、関係性目標の観点から、両過程の発生メカニズムを解明することである。具体的には、低自尊心者であっても、高自尊心者と同様に他者を思いやり、自己に固執しない関係性目標を持つことで、他者との関係を尊重した安心さがしを行うことによって、他者からの受容を引き出し、心理的な健康を実現するプロセスを実証的に明らかにする。本年度は、予備的な検討として、2つの調査を行い、次のような知見を得た。1)大学生の同性の友人ペアに対する調査を行い、上記プロセスに対する他者からの受容期待の効果を検討した。分析の結果、低自尊心者で安心さがしを行う人が、他者からの受容期待を抱く場合、そうでない場合よりも、実際の友人からの評価が低いことが示された。2)大学1年生の同性の友人ペアに対する2波のパネル調査を行い、上記プロセスに対する自己開示の効果を検討した。分析の結果、友人関係の初期段階において、低自尊心者が、自分自身の重要性についての安心を繰り返し求めるにも関わらず、人間関係に関する内容の自己開示をしない場合には、高自尊心者と比べて、実際の友人の印象(特に、個人的親しみやすさ)を低下させることが示された。以上の知見から、安心さがしの下方螺旋過程を生起させる要因として、受容期待の高さという認知的要因と自己開示の不足という対人的要因が存在することが示された。今後、これらの要因を検討対象に加えた上で、本研究の目的である、上方・下方螺旋過程に対する関係性目標の調整効果について検討する。低自尊心者がとる安心さがし行動は、他者からの拒絶を引き起こし、逆に、高自尊心者の安心さがし行動は、受容を引き寄せる。本年度は、予備的な調査を行い、次のような知見を得た。1)大学生の同性の友人ペアに対する調査を行い、自尊心と安心さがしがサポート受容に及ぼす影響について検討した。分析の結果、低自尊心で安心さがしをする人は、高自尊心者に比べて、相手に対してサポートを提供していなかった。この人々は、自己受容への不安のみに注意を向け、友人をサポートしていないため、他者から拒絶される可能性がある。2)大学1年生の同性の友人ペアに対して、2波のパネル調査を行い、自尊心と安心さがしが自己と友人の心理的距離に及ぼす影響を検討した。分析の結果、低自尊心で安心さがしをする人は、二者間の心理的距離がより親密になったと認知したのに対して、友人はそのように認知していなかった。それに対して、高自尊心で安心さがしをする人は、心理的距離は親密になったと認知していないにも関わらず、友人はより親密になったと認知していた。このように低自尊心で安心さがしをする人は、自他の心理的距離を誤認しており、その結果、他者からの拒絶される可能性が示唆された。以上の知見から、安心さがしの下方螺旋過程を生起させる要因として、自他の心理的距離の誤認という認知的要因と友人に対するサポート不足という対人的要因が存在することが示された。低自尊心者の安心さがし行動は他者からの拒絶を、逆に高自尊心者の安心さがし行動は受容を引き寄せる。本年度は、大学生に対する調査を行い、次のような知見を得た。1)親友から無視された場面の行動に関する自由記述データの分析によって、低自尊心者と高自尊心者の安心さがしの質的な差異を検討した。分析の結果、同性の親友に関して、低自尊心で安心さがしする群は、「怒る」や「無視」という語と近接しており、自己本位的な傾向を示したのに対して、高自尊心で安心さがしする群は、「悲しい」、「落ち込む」という感情語や「謝る」という行動語と近接しており、他者本位の行動をとることが示唆された。

2)親友から無視された場面での反応について、量的尺度を用いて検討した。分析の結果、低自尊心者で安心さがしをする人ほど、これまで通りに関わることをやめる消極的な破壊行動をとることが示された。これに対して、高自尊心者は安心さがしをしてもしなくても、消極的な破壊行動が低かった。3)友人関係を構築する動機づけに焦点を当て、低自尊心者と高自尊心者の安心さがしの差異について検討した。分析の結果、高自尊心者が安心さがしをするほど、友人関係を良好にしようとする接近的動機づけが高かった。それに対して、低自尊心者では、有意ではないものの、安心さがしをするほど、接近的動機づけが低くなる方向性を示した。また、友人関係を悪くしないようにする回避的動機づけは、自尊心が低いほど、また安心さがしをするほど、高いことが示された。以上の知見から、低自尊心者と高自尊心者の安心さがしの差異が、親友から拒否されたかもしれない場面での対処行動や、友人関係をどのように構築するかという対人関係動機が関与していることが示唆された。本年度は、研究計画の前段階として、大学生に対する調査を行った。これらは、関係性目標の効果を検討する研究計画をより精緻に行うために必要であると判断し、行われた。現在、これらの知見を踏まえた、さらなる調査が完了し、予備実験を行っている段階であり、全体としては順調に研究が進展していると考える。低自尊心者の安心さがし行動は他者からの拒絶を、逆に高自尊心者の安心さがし行動は受容を引き寄せる。本研究の目的は、両過程の発生メカニズムを解明することである。最終年度の本年度は、恋人および夫婦ペアに対する調査とともに、SNS上での安心さがしに関する調査も実施することで、以下の結果を得た。1)調査会社のモニターの恋人および夫婦ペア300組に対する調査の結果、低自尊心者で相手に対して頻繁に安心さがしを行う人は、相手が認知する親密さよりも自分の認知が高いほど、萎縮認知が高かった。また、低自尊心者で安心さがししない人は、相手が認知する親密さよりも自分の認知が低いほど、見切り認知が高かった。前者は相手に近づきたいのに近づきすぎると拒否される可能性が高いために、近づくことができないというヤマアラシのジレンマ状態を示唆する結果である。2)調査会社のモニターの500名に対する調査の結果、a)自尊心が低くて、恋人や配偶者に対して安心さがしをする人ほど、Twitter上でフォロワーに同情を求め、雰囲気を和らげ、不平を言いたいという動機づけが高く、ネガティブなツイートをより頻繁に行っていることが示された。b)自尊心が低くて、恋人や配偶者に対して直接的に安心さがしをする人ほど、Twitter上でフォロワーにリプライをもらうポジティブなツイートをすることが示された。c)自尊心が低くて、安心さがしツイートをするほど、フォロワーからの受容を経験したかどうかに関わらず、他者からの安心を感じにくいことが示された。この結果は、自己成就予言と類似した現象であることが示唆された。これらの結果は、FTF上で示された、低自尊心者の安心さがしの不適応な側面が、SNS上の対人行動にも拡張可能なものであり、今後の研究を進展しうる基礎的な知見となるものである。低自尊心者の安心さがしは他者からの拒絶を引き起こし、高自尊心者の安心さがしは受容を引き寄せることが示されてきた。本研究の目的は、この問題を関係性目標の観点から検討することである。分析の結果、低自尊心で安心さがしする人は、他者と良好な関係を形成しようとする接近的動機づけが低く、他者からの拒絶場面で、自己本位的な行動傾向を示した。逆に、高自尊心で安心さがしする人は、接近的動機づけが高く、他者を配慮する行動を示した。
新規イオンシーブ電気活性透過膜の創製によるリチウム成分連続分離回収技術の開発

本研究では、多イオン共存条件の下、高リチウムイオン選択性を有する金属イオンシーブ配向透過膜の創製を中心にする。また、高周波パルス膜電位の印加による膜内イオン・電荷移動特性、イオン交換サイトにおけるリチウムイオンの可逆的な吸着・脱着特性、膜の動的輸率と膜構造との関係及び膜のシーブ効果などを調べ、膜の選択透過機構の解明を目指す。更に、補助電場の印加とカップリングによるリチウムイオン選択透過性及び膜中イオン移動速度に対する促進効果を調べ、リチウムイオン透過性および選択性のトレードオフを打破した斬新な電界強化型電気活性膜分離システムを構築し、リチウムイオンの迅速かつ連続的に分離回収する。
バイオナノ粒子を用いた制癌剤の標的細胞選択的送達システム

(1)モデル蛍光化合物(カルセイン)を、本研究のバイオナノ粒子に封入した後種々の培養細胞株培養液に添加したところ、カルセインはヒト肝癌細胞株特異的に導入された。この結果は、バイオナノ粒子の低分子化合物の標的細胞特異的送達用ベクターとして有用性を示すものである。(2)低分子薬剤を効率良く標的細胞に送達するためには、粒子内薬剤封入量を多くする事が要求される。そこでまず、カルセインをモデル薬剤として粒子内の薬剤封入量測定系を設定した。この測定系を用いて、封入操作(エレクトロポレーション)時の条件検討を行ない、カルセイン封入のための至適条件を見い出した。(3)バイオナノ粒子への薬物封入量をさらに上げるために、バイオナノ粒子側の改良も試みた。バイオナノ粒子の主成分であるL蛋白質は酵母菌体内ではモノマーであるが、従来の方法で調製したバイオナノ粒子はその精製過程で分子間ss結合を形成しポリマー化することで、粒子内へ薬物導入しにくい状態になっていた。そこで、粒子形成に不要なCys残基を化学修飾によりblockした粒子および不要なCys残基8個を置換した変異体粒子を調製したところ、薬物封入量を1.7倍および2.5倍増量できたことより、不必要なSS結合抑制が薬物封入量増大に有効であることが示された。薬物封入効率の良い改良型バイオナノ粒子変異体を調製できた。(4)(3)の改良型バイオナノ粒子と(2)の至適封入条件を用いて、抗癌剤(パクリタキセル)を封入したバイオナノ粒子を調製した後、標的細胞(ヒト肝癌細胞株HepG2)に添加した。その結果、抗癌剤単独よりも約5倍強い細胞増殖阻害活性を示した。以上により、バイオナノ粒子の抗癌剤の標的細胞特異的伝達のキャリヤとしての有用性が証明された。H15年度は、1.低分子蛍光物質(カルセイン)を本研究のバイオナノ粒子に封入した後、種々の培養細胞株培養液に添加したところ、カルセインはヒト肝癌細胞特異的に導入された。この結果は、低分子化合物薬剤の標的細胞特異的送達用ベクターとしてのバイオナノ粒子の有用性を示すものである。(論文発表)。2.低分子化合物薬剤の標的細胞特異的送達を効率良く行うためには、薬剤を高濃度で効率良くバイオナノ粒子内に封入する必要がある。粒子への薬剤封入方法を検討するための前提として、封入操作後の粒子回収法および封入効率測定法を確立した。まず、濃縮精製用のtag配列を提示しているバイオナノ粒子にエレクトロポーレーションを用いてモデル化合物(カルセイン)を封入した後、アフィニテフィークロマトグラフィーを用いてfreeカルセインを除去するとともに、粒子画分を濃縮回収した。粒子画分に取り込まれたカルセイン量(蛍光量)を測定した結果、エレクトロポーレーションを行わなかった場合はほとんど蛍光が検出されなかったのに対し、エレクトロポーレーションを行った場合には有意な蛍光が見られた。また、エレクトロポレーション条件を代えると、粒子画分にとりこまれた蛍光量が変化した。従って、この方法によりカルセイン封入量が定量的に測定できることが示された。次年度(H16年)は、この封入効率測定法を活かしてカルセイン封入条件の詳細な検討を行う、および他の低分子薬物の封入法検討も開始する。H16年度は、1.バイオナノ粒子への薬物封入効率を上げるために、バイオナノ粒子の改良と、薬物封入(エレクトロポレーション)条件の検討を行った。

(1)バイオナノ粒子の主成分であるLタンパク質は酵母菌体内ではモノマーであるが、従来の調製法では、その精製過程でss結合を形成しポリマー化していた。しかし、バイオナノ粒子精製時にss結合形成抑制剤を添加すること、あるいは粒子形成に不要なCys残基8個をSerあるいはAla残基に置換した変異体Lタンパク質(M8)を発現させてバイオナノ粒子を調製することにより、Lタンパク質のポリマー形成を抑制でき、薬物封入量が1,7倍および標的細胞導入能が2.5倍増大することを見いだした。この結果は、SS結合を抑制が、薬物封入効率向上に有効であることを示す。これらの方法により、Lタンパク質のポリマー形成が抑制され薬物封入効率が上がった、改良型バイオナノ粒子を調製できた。(2)H15年度に確立した、蛍光低分子化合物カルセインを用いたバイオナノ粒子への薬物封入効率測定系を用いて、エレクトロポレーション条件を検討した。その結果、温度は室温、電圧は50V、time constantが18msec前後になるような電気容量で、2-3回エレクトロポレーションをかけた場合に、粒子をロスすることなく効率よく封入することができることを、見いだした。2.上記1(1)の改良型バイオナノ粒子を用い、1(2)の封入条件を用いて、抗ガン剤パクリタキセルを封入したバイオナノ粒子を調製し、その標的細胞特異的な細胞増殖阻害活性の発揮を調べた。バイオナノ粒子にパクリタキセルをエレクトロポレーションにより封入した後標的細胞(ヒト肝癌細胞株HepG2)に添加した場合、パクリタキセル単独よりも約5倍強い細胞増殖阻害活性を示した。
液体メニスカスを用いた魚卵の凍結保存への挑戦

魚卵の冷凍保存を実現することを目標に,外部氷晶形成時の卵膜への機械的ストレスを低減するために液体メニスカスを用いる全く新しい方法を提案した.サイズの大きな魚卵に対してもメニスカスホルダーを開発し,魚卵全体をトレハロース水溶液で覆うことを可能にした.さらに,常温脱水を事前に施すことにより,内部氷晶生成時の体積膨張による損傷を低減することが可能となった.その結果,解凍後の魚卵形状保存率に格段の改善がみられ,本手法が有効であることが示された.実現が困難とされている魚卵の凍結保存技術を開発すべく、卵膜の親水性を利用して液体メニスカスにより外表面を包み、緩慢冷却によってこれを粥状に凍結して細胞膜を固定する保護層を形成し、その後に全体を急冷する新たな凍結保存法の有効性を検証した。メニスカス溶液には、凍結や乾燥から細胞膜を保護する物質であるトレハロース水溶液を用い、魚卵凍結時の体積膨張破壊を防ぐために、常温での減圧乾燥による脱水処理を加えた。これらにより、氷晶生成による機械的・化学的ストレスを低減することが可能と考えている。実験試料には、凍結と解凍後の形状観察が容易なことから、サイズの大きいサケの卵(イクラ:直径710mm程度)を用いた。これを保持するメニスカスホルダーを試作し、卵とホルダーとのクリアランス、卵の予備脱水量、メニスカス溶液の種類と濃度、さらには3段階冷却法における冷却速度をパラメータとした実験を行った。その結果、25%のトレハロース水溶液を用い、凍結前に約15%の減圧脱水を行った後に3段階冷凍を行うこと、ならびに、解凍を5°Cの空気中での緩慢解凍とすれば、細胞膜の損傷が抑えられ、イクラの形状を維持したまま解凍できることがわかった。特に、メニスカスホルダーに関し、初年度には線径0.7mmの金属線をコイル状に成形し、0.2mLのメニスカス溶液を魚卵周りに保持したが、2年目では線径を0.3mmと細くすることにより、メニスカス溶液を約0.07mLに微量とし、メニスカス液膜の平均厚みを約0.017mmに薄くすることに成功した。その結果、解凍時のイクラの形状保存割合をほぼ100%までに高めることができ、本手法の有効性が明らかとなった。魚卵の冷凍保存を実現することを目標に,外部氷晶形成時の卵膜への機械的ストレスを低減するために液体メニスカスを用いる全く新しい方法を提案した.サイズの大きな魚卵に対してもメニスカスホルダーを開発し,魚卵全体をトレハロース水溶液で覆うことを可能にした.さらに,常温脱水を事前に施すことにより,内部氷晶生成時の体積膨張による損傷を低減することが可能となった.その結果,解凍後の魚卵形状保存率に格段の改善がみられ,本手法が有効であることが示された.実現が困難とされている魚卵の凍結保存技術を開発すべく、卵膜の親水性を利用して液体メニスカスにより外表面を包み、緩慢冷却によってこれを粥状に凍結して細胞膜を固定する保護層とし、その後に全体を急冷する新たな凍結保存法の有効性を検証する。メニスカス溶液にはトレハロースなどの凍結や乾燥から細胞膜を保護する物質を用い、より大型の魚卵に対しては減圧乾燥による適切な脱水処理を加えて氷晶生成による機械的・化学的ストレスを低減する。試料には、凍結と解凍後の形状観察が容易なことから、サイズの大きいサケの卵(イクラ:直径710mm程度)を用いた。溶液の具体としては、トレハロースを凍害防御剤とした水溶液を使用し、トレハロース水溶液のメニスカスによって卵表面を覆い、(1)溶液濃度による浸透圧脱水、(2)膜の氷核からの保護、(3)メニスカス溶液の緩慢凍結による粥状氷晶化がもたらす卵膜の機械的強度改善、そして(4)細胞内凍結の抑制と細胞質の保護といった効果の程度を定量的に評価した。その結果、25%のトレハロース水溶液を用い、凍結前に約15%の減圧脱水を行った後に3段階冷凍を行うこと。ならびに、解凍を5°Cの空気中での緩慢解凍とすれば、細胞膜の損傷が抑えられ、約80%の割合でイクラの形状を維持したまま解凍できることがわかった。サイズの大きなイクラを従来の方法で凍結すると、解凍後にそのほとんどは形状を保てずに、内容物が流出するほどの損傷が生じる。これに対して,外部溶液をメニスカス形状に形成して凍結させる本方法によれば、卵の表面膜を保存することができ,解凍後の形状が保て,その保存効果が80%にも及ぶことが明らかとなった。以上の成果は,メニスカスを形成するメニスカスホルダーが上手く開発できたこと,および冷却と解凍方法が妥当であったことを示しており、当初の目的通り,本方法の有効性がある程度検証できたと判断する。今後は、魚卵の各サイズに対応して,より保存効果が高くなるようなメニスカスホルダーを開発し,同時に処理量を増やすために工夫を行っていく予定である。そのためには、魚卵のサイズによる最適なメニスカス液量を把握する必要があるとともに,事前の脱水量の最適化も必要である。また,保存法の究極的な検証はふ化実験を実際に行うことと考えている。

しかしながら,その専門的知識が限られており,またその経験が全くないため,次年度ではその方向性を見据えた上で、ふ化実験に関する調査研究をまず行うことを考えている。約70万円ほどの次年度使用額が生じたが、これはメニスカスホルダーの開発に予想以上の時間を要したためであり、十分なサンプル実験を行うことができなかったためである。一応のホルダー形状と処理量を増やすための知見が得られたため,次年度では,各種のサイズの魚種に対して検証が行えるよう工夫したメニスカスホルダーを作成し,同時に複数処理が可能な保存プレートを実際に製作して,十分なデータを得る計画とした。そのための物品費としている。
紫外線B 波による皮膚微小循環障害の生理機序解明とその予防に関する研究

太陽光に含まれる紫外線B波(UVB)は、オゾン層の減少に伴い地表への到達量が増加しており、UVBからの保護は保健衛生学上、非常に重要である。本研究では蛍光指示薬を用いて、一酸化窒素(NO)と活性酸素種(ROS)の生体内リアルタイムイメージングを行い、その発生機序や皮膚における産生部位などについて調べた。蛍光指示薬についてはin vitro実験では多くの活用例が示されているものの、動物の生体内イメージングではほとんど例がなく新規な知見が得られた。また、UVBによって亢進する白血球の内皮への相互作用については、P-セレクチンがその主要な役割を担っていることを明らかにした。さらに、ビタミンE、緑茶由来カテキン混合物の事前経口投与により、ROSの発生や白血球内皮間相互作用が抑制され、これらの事前投与が紫外線の短期影響に抑制効果を持つことを示した。紫外線(UV)は、その波長によりUVA(320400nm)、UVB(280320nm)、UVC(280nm以下)に分類される。このうちUVBは波長が短く高エネルギーを持つため、一般的に強い皮膚細胞障害を生じる。具体的には、DNA傷害、皮膚がんの発生、活性酸素の産生、細胞アポトーシスの誘導、一酸化窒素の産生などであるが、個体でしか観察できない高次元の機能である血液循環については、これまで報告が見られない。本研究では、ヘアレスマウス(HR-1)に微小循環を長期に渡って観察が可能となるDorsal Skinfold Chamber (DSC)を装着し、皮膚にUVBを照射した際の影響について特に微小循環系に及ぼす影響を明らかにすることを目的として、生体顕微鏡的な研究手法により検討した。本年度は、UVB照射後短時間(数分以内)のうちにDSC内の細静脈の一部の血管透過性が大きく亢進する現象について、一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤または、活性酸素種(ROS)のスカベンジャーの前投与により濃度依存的かつ顕著な抑制効果が見られることを見いだした。このことから、NOおよびROSが血管の透過性に関与をしていることが示唆された。また、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の投与によっても同反応は抑制された。以上の結果は、照射後短時間で起こる現象において、いわゆる紅斑反応の発生機序として提唱されているシグナルカスケードと同様のカスケードが作用している可能性が高いことを示した。これらの知見をまとめ、論文発表を行った。今後は、反応カスケードの詳細な機序、および、NOやヒドロキシラジカルの皮膚における産生部位や産生能の局在などに関して研究を進めるとともに、かつ反応を抑制する方法について検討し、新たな知見を得ること目標とする。これまでの研究で皮膚組織並びに微小血管床をリアルタイムにイメージングできる観察窓(Dorsal Skinfold Chamber;DSC)を装着したヘアレスマウスを用いて、皮膚にUVBを照射した際に即時性に(照射後数分以内に)一酸化窒素(NO)と活性酸素種(ROS)が発生し血管拡張等の生理作用をもたらすことが間接的に示されている。本研究では蛍光指示薬を用いて、NOとROSの生体内リアルタイムイメージングを行い、その発生機序や皮膚における産生部位などについて調べた。蛍光指示薬についてはin vitro実験では多くの活用例が示されているものの、動物の生体内イメージングではほとんど例がなく、様々な指示薬ならびに投与の方法を検討し今年度は以下の点を明らかにした。NOの産生イメージングにはDiaminofluoresucein-2 diacetate(DAF-2DA)を尾静脈から投与することが最適であった。設定した条件下において、紫外線を照射すると即時的に血管径80μm程度の細動脈の血管内皮で局所的にNOが産生されることがわかった。ROSの産生イメージングには実験直前にDihydrorhodamine 123(DHR)をDSC内に滴下し過剰な試薬を洗浄除去する方法が最適であった。設定した条件下において、紫外線を照射すると即時的に皮膚組織でROSが産生すること、またこれは抗酸化物質のアスコルビン酸やαトコフェロールをマウスに事前投与すると抑制されることがわかった。以上より、本年度は紫外線B波照射直後の皮膚での生理環境の変化を蛍光イメージングでリアルタイムに捉えることに成功し、NOとROSの産生部位を特定し、その機序を明らかにする基礎的な知見を得た。B波紫外線(UVB:波長280320nm)による健康影響は公衆衛生上の大きな問題である。

我々はこれまでに、紫外線照射後数分から数時間のうちに、血管拡張、透過性の亢進、白血球ー内皮相互作用亢進などの即時性反応を報告した。今年度は、蛍光指示薬を用いて活性酸素種(ROS)と白血球内皮相互作用について検討した。ROSの産生イメージングには実験直前にDHR 123をDSC内に滴下し過剰試薬を洗浄除去する方法が最適であった。設定した条件下において、紫外線照射より即時的に皮膚組織でROSが産生することを蛍光シグナルの増強として捉えることができた。またこのシグナルは活性酸素消去剤の投与により抑制されることから、活性酸素特異的なシグナルであることが示唆された。UVB照射後に認められる粘着白血球数の増加は紫外線照射後6時間で有意な増加が認められた。この現象は抗P-selectin抗体をマウス血管内に事前投与し、UVB照射をおこなった場合に阻害された。このことからUVBによる粘着白血球数の増加は、UVB照射後に血管内皮上に発現するP-selectinが関係している可能性が明らかになった。また、UVB照射に関連して増加するROSの蛍光シグナル、および粘着白血球数の増加が、抗酸化物質の事前投与で予防できるかを検討した。抗酸化物質としては、(±)-α-トコフェロール(ビタミンE)、緑茶由来カテキン混合物を検討した。UVBによりDHR123の蛍光輝度値が対照群に比べて有意に上昇するが、ビタミンE投与群では対照群に比して蛍光輝度値の上昇が抑制された。またカテキン混合物投与群でも同様であった。また、UVB照射による粘着白血球数の増加について、ビタミンE投与群、カテキン混合物投与群ではその増加の抑制が認められた。以上より抗酸化物質の投与は紫外線の初期反応に対して充分な予防効果があることが示唆された。蛍光イメージングをおこなうための指示薬については当初想定していた試薬は溶媒の生体毒性などの問題が認められたため、別の指示薬を検討せざるを得なかったが、他の指示薬で良好な結果を得ることができた。また、抗酸化作用をもつ物質を事前投与することで、紫外線影響の予防効果とみられる予備的な知見を得られたが、これに関しては当初の計画よりも早めに進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。DHR、DAF-2の反応の特異性を調べるために、マウスに'あらかじめROS消去剤、NO合成酵素阻害剤を投与しイメージングの特異性を明らかにする。紫外線刺激によって、一般的にはROSやNOがIL-1を回するシグナル伝達を経て誘導型のシクロオキシゲナーゼ(COX-2)の発現を誘導しているという仮説があることから、COX2阻害剤の投与実験をおこなうことで紫外線反応が抑制できるか否かを確かめる。これらの研究活動によって、UVB照射後短時間のうちに起こるシグナル伝達経路を明かにした上で、保健衛生的にUVBの影響を予防するための方策について本動物実験モデルを用いて検討をする。具体的には、ビタミンE誘導体、ビタミンC、カテキン、ポリフェノールなどの抗酸化物質の投与、塗布などをおこない、その摂取効果、薬理効果について本チャンバーモデルを用いて検討をすすめ、紫外線防護に関しての基礎的知見を得ることとする。
電気流体力学における対流パターンの非線形発展

ネマチック液晶の電気流体力学的不安定性によって生じる対流現象の対流点近傍の非線形発展を研究した。その結果、実験的には対流点近傍の非線形発進として、パターン選択のダイナミックス、ジグザグ、スキュドバリコースなどの二次不安定性などが観測され、それらのモードのフーリエ解析が行われた。それより、FWDと呼ばれる欠陥乱流への遷移プロセスが明確にされ、弱い非線形発展によるパターン遷移の相図が完成された。また新しく発見された欠陥格子パターンの諸性質、たとえば、欠陥が格子状に規則正しく配列し局所的に隣合った欠陥とコヒーレントに振動しあっているがその振動周期などの性質が研究され、その分岐過程が二次の転移型であることが明かとなった。一方、対流点近傍で、理論的に外部からある定められた空間周期を強制的に与えた場合にどのようなパターンを非線形発展が生じるかが研究された。その結果、外部摂動周期の振幅を増加するとともに、ノーマルロール対流から波状ロール対流がより安定となるようになり、さらには安定なスキュドバリコースパターンやインコメンシュレートの波状ロールが現れることが分かった。その実験との一致は今後の研究課題として残った。また、化学反応に流れがカップルした場合の現象についても研究がなされ、そこにマランゴニー効果による対流が発生し、それが反応過程と結合しソリトン的挙動を生み出すことが見いだされた。そのダイナミックな挙動は燃焼現象との類似性もみられ、今後の研究に興味がもたれる。
Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎの網膜視細胞分化に関する研究

網膜発生と網膜再生はその過程が一部類似している。そのため、網膜発生から得た知見を網膜再生へ繋げていくことができると考えられる。我々は前年度からの検討により、プログラニュリン欠損マウス発生期(生後9日目)網膜では、網膜神経節細胞の減少、アストロサイトの活性化、視細胞分化の異常などの網膜発生期の異常を認めることを明らかにした。さらに、過去の報告において、プログラニュリンはhepatocyte growthfactor (HGF)受容体を介して、視細胞保護、視細胞分化の促進に働くことを明らかにしている(Tsuruma et al. Stem Cells Transl Med. 2014, Kuse et al. Sci Rep. 2016)。そこで、プログラニュリン欠損マウス網膜において視細胞分化異常が起きている生後9日目の時点で、HGF受容体の寄与を確かめるために、その活性化を野生型マウス網膜と比較検討した。生後9日目のプログラニュリン欠損マウス網膜において、HGF受容体の活性化の低下が認められた。そのため、in vivoにおいてもHGF受容体の減少と視細胞分化の異常が関連していることが示唆された。また、過去の報告において、HGF受容体は網膜神経節細胞の生存に関与することが報告されている(Tonges et al. J. Neurochem. 2011)。一方で、プログラニュリンは直接的にアストロサイトの活性化を抑制することが示されている(Menzel et al. Glia 2017)。以上のことから、プログラニュリンはHGF受容体を介した作用と、それ以外の多様な作用を示し、網膜発生に関与していることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。加齢黄斑変性症や網膜色素変性症などの網膜疾患における視細胞(光や色を感受する細胞)の損失は、患者の生活の質を大きく低下させる。現状、視細胞が変性する疾患である萎縮型加齢黄斑変性症に対する治療薬は存在せず、視細胞の保護や再生を促す薬の探索が切望されている。当研究室では脂肪幹細胞を網膜障害後に投与した場合に保護作用を示すという結果を得ており、それは脂肪幹細胞から分泌される何らかの因子による再生作用の可能性が考えられる。さらに、脂肪幹細胞から豊富に分泌されている因子としてプログラニュリンを見出した(Tsuruma et al. Stem Cells Transl Med. 2014)。プログラニュリンは胚発生、組織修復、腫瘍形成および炎症に関与する成長因子である。本研究は、プログラニュリンの網膜再生への関与を明らかにすることを目的として行った。当該年度は、プログラニュリンの網膜再生に関する詳細な作用を特定することができた。プログラニュリンは、すでにin vitroにおいて見出していた視細胞分化作用に加えて、in vivoでは網膜障害後のBrdU陽性細胞の数を増加させ、網膜前駆細胞の増殖を促進させ、網膜再生に関与していることが明らかになった。さらに、網膜初代培養系におけるプログラニュリンの視細胞分化促進作用メカニズムにHGF受容体の関与があることを解明した。その一方で、プログラニュリン欠損マウスを用いた検討により、網膜神経節細胞や視神経への関与も明らかとなった。これらの結果には当初予定していなかった内容も含まれ、一年を通して期待以上の研究の進展が認められた。我々の過去の報告において、成体プログラニュリン欠損マウスにおける網膜視細胞および網膜神経節細胞の減少を認め、プログラニュリンを網膜初代培養細胞に添加した場合に視細胞分化が促進されたことから、網膜発生への関与が考えられた(Kuse et al. Sci Rep. 2016)。本研究では、網膜発生期からのプログラニュリンの影響を明らかにすることを目的として、プログラニュリン欠損マウスを用いて検討した。網膜発生期におけるプログラニュリンの作用を明らかにすることは、網膜再生における作用にもつながると考えられる。プログラニュリン欠損マウスにおいて、glial fibrillary acidic protein (GFAP)の発現増加が認められ、網膜アストロサイトの活性化が起きていた一方で、ionized calcium binding adaptor molecule 1 (Iba-1)陽性ミクログリアには変化が認められなかった。プログラニュリン欠損マウス視神経においても、同様に、ミクログリアに変化は認められないものの、アストロサイトの活性化が起きていた。また、視神経は主に網膜神経節細胞の軸索から構成されるが、その凝集が認められた。これは、網膜神経節細胞の変性に起因するものと考えられた。上記の変化がどの時期から認められるのかを検討するために網膜発生早期と後期と考えられる生後1日と9日のマウス網膜を評価した。生後1日のプログラニュリン欠損マウス網膜においてアストロサイトの変化は認められなかったものの、生後9日のプログラニュリン欠損マウスでは、アストロサイトの活性化と、網膜神経節細胞の減少が認められた。また、この段階において、プログラニュリン欠損マウスでは視細胞前駆細胞マーカーの増加と成熟視細胞マーカーの減少を認めた。当該年度では、プログラニュリンは網膜発生期における網膜神経節細胞の生存とアストロサイトの過剰な活性化において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。特に、生後9日の段階において、プログラニュリン欠損マウスでは網膜神経節細胞の減少、視細胞マーカーの減少、アストロサイトの活性化などを認めたことや、野生型網膜においてプログラニュリンの発現量が生後9日において増加していたことから、その役割を強く発揮しているのは網膜発生後期であると推察された。

網膜発生期におけるプログラニュリンの作用を明らかにすることは、網膜再生における作用にもつながると考えられる。網膜発生と網膜再生はその過程が一部類似している。そのため、網膜発生から得た知見を網膜再生へ繋げていくことができると考えられる。我々は前年度からの検討により、プログラニュリン欠損マウス発生期(生後9日目)網膜では、網膜神経節細胞の減少、アストロサイトの活性化、視細胞分化の異常などの網膜発生期の異常を認めることを明らかにした。さらに、過去の報告において、プログラニュリンはhepatocyte growthfactor (HGF)受容体を介して、視細胞保護、視細胞分化の促進に働くことを明らかにしている(Tsuruma et al. Stem Cells Transl Med. 2014, Kuse et al. Sci Rep. 2016)。そこで、プログラニュリン欠損マウス網膜において視細胞分化異常が起きている生後9日目の時点で、HGF受容体の寄与を確かめるために、その活性化を野生型マウス網膜と比較検討した。生後9日目のプログラニュリン欠損マウス網膜において、HGF受容体の活性化の低下が認められた。そのため、in vivoにおいてもHGF受容体の減少と視細胞分化の異常が関連していることが示唆された。また、過去の報告において、HGF受容体は網膜神経節細胞の生存に関与することが報告されている(Tonges et al. J. Neurochem. 2011)。一方で、プログラニュリンは直接的にアストロサイトの活性化を抑制することが示されている(Menzel et al. Glia 2017)。以上のことから、プログラニュリンはHGF受容体を介した作用と、それ以外の多様な作用を示し、網膜発生に関与していることが示唆された。今年度の検討において、プログラニュリンがin vivoにおいても網膜再生に関与することが示された。網膜再生の流れの中では、ミュラー細胞の関与も大きいと考えられる。今後はミュラー細胞の増殖・脱分化に関して検討を行うために、すでにゼブラフィッシュにおいてミュラー細胞の増殖・脱分化に関わるとされる因子を、哺乳類でも応用する。初代ミュラー細胞に、それらの因子を添加することで、マウスのミュラー細胞においても脱分化作用が見られるかについて検討する。評価としては、上記と同様にRT-PCR arrayによるmRNAの網羅的な解析により、ミュラー細胞から網膜前駆細胞への脱分化が起きているかについて検証する。その後に、ウェスタンブロットや免疫染色を用いてタンパクの発現変化も検証する。さらに、いくつかの因子を試験し比較することにより、最も効率的にミュラー細胞から網膜前駆細胞への脱分化を促進させることのできる因子を見出す。当該年度の検討により、プログラニュリンが網膜障害後の網膜再生に寄与するだけでなく、網膜発生にも影響を及ぼしている可能性が示唆された。
遺伝子改変動物を用いた恐怖情動記憶消去の分子神経機構の解明

情動記憶には扁桃体、海馬を中心とする神経回路が関与し、記憶の獲得、固定化の過程に加え、消去も能動的な過程と考えられるようになっている。恐怖情動記憶の消去機構の障害はPTSDの病態と密接な関連があると考えられていることから、その分子神経機構の解析は基礎的な記憶のメカニズムの解明とともに、分子標的を明確にとらえたPTSD治療法の開発にもつながる。恐怖情動記憶の消去においては情動記憶の形成に関わる分子の一部に発現変動が認められ、情動記憶の形成と消去ではこのような分子が相反した発現プロフィールを示すことが報告されている。そこで、本研究では、マウスを用いて文脈的恐怖条件付けをおこなった後、条件刺激のみの提示により恐怖記憶の消去をおこない、その過程におけるFynシグナル伝達系の関与について行動学的ならびに生化学的な解析をおこなった。野生型マウスの恐怖記憶消去過程において海馬の活性化型Fynは減少した。そこで、野生型マウスについて恐怖条件付けをおこなったのち、海馬にSrcファミリーチロシンキナーゼ阻害剤PP2を定位的に注入し、引き続いて恐怖記憶の消去を行ったところ、対照にくらべて消去が促進されることが明らかになった。一方、活性型Srcファミリーチロシンキナーゼの脱リン酸化酵素SHP1/2の阻害剤NSC87877を注入すると、消去が抑制されることが明らかになった。以上の結果から、Fynの活性化は恐怖記憶の形成時に亢進するのに対し消去過程では低下すること、海馬Fynの活性抑制によって恐怖記憶消去が促進されることが明らかになった。また、シグナル伝達系上流に位置して活性化型Fynの低下に関与する脱リン酸化酵素が恐怖記憶消去の制御に関わることも明らかになった。さらにFynシグナル伝達系の下流分子は恐怖記憶の形成と消去で異なることが示唆され、記憶形成においてはMMDA受容体活性化が関与するのに対し、記憶消去においては細胞骨格系を介したシナプス構造変化の誘導が関与する可能性がある。Fynチロシンキナーゼは大脳辺縁系に強く発現し、その遺伝子欠損マウスは情動行動異常を示す。本研究ではFyn欠損マウスを情動記憶障害モデルとして、本分子の欠損によって引き起こされる細胞内情報伝達過程の異常と恐怖情動記憶の形成・消去の障害との関連性を解析する。このために、まずFynが情動記憶の形成と消去に関連してどのように変動し、Fyn依存性の蛋白質チロシンリン酸化シグナル伝達系の変動とどのように相関するかを解析し、これらのシステムが恐怖記憶に関連する神経回路を制御する分子神経機構について検討する。これらの知見をもとに、強迫神経症やPTSDと関連がある恐怖記憶消去のメカニズムにおけるFynシグナル伝達系の意義を解明する。結果と考察1.野生型マウスでは文脈的恐怖条件付けにおける記憶獲得過程において、背側海馬でFynの一過性の活性化がおこることを明らかにした。この活性化は条件刺激と無条件刺激の連合に依存していた。また、Fyn欠損マウスでは文脈的恐怖条件付けが障害されていることが明らかになった。2.海馬において恐怖条件付けによるFynの活性化に続いて、NMDA受容体NR2Bサブユニットならびに他のFyn下流蛋白のチロシンリン酸化の亢進が認められた。3.恐怖記憶消去過程では背側海馬の活性化型FynとFyn下流蛋白のチロシンリン酸化が共に低下した。4.恐怖記憶消去においてFyn活性の低下が関与することを確証するために、背側海馬にFynを含むSrcファミリーチロシンキナーゼの阻害剤PP2を定位的に注入した。その結果、PP2は消去過程を促進することが明らかになった。以上の結果から、Fynの活性化は恐怖記憶の獲得時に亢進、消去過程では低下すること、Fyn下流の蛋白質チロシンリン酸化も恐怖記憶獲得時には亢進し、消去過程では低下することが明らかになった。Fynは下流蛋白質のチロシンリン酸化を介して記憶形成の初期過程に関与すると推測される。一方、恐怖記憶消去過程ではタンパク質リン酸化チロシンの脱リン酸化が促進されると考えられ、記憶形成過程とは異なったシグナル伝達経路が関与する可能性がある。

一方、活性型Srcファミリーチロシンキナーゼの脱リン酸化酵素SHP1/2の阻害剤NSC87877を注入すると、消去が抑制されることが明らかになった。以上の結果から、Fynの活性化は恐怖記憶の形成時に亢進するのに対し消去過程では低下すること、海馬Fynの活性抑制によって恐怖記憶消去が促進されることが明らかになった。また、シグナル伝達系上流に位置して活性化型Fynの低下に関与する脱リン酸化酵素が恐怖記憶消去の制御に関わることも明らかになった。さらにFynシグナル伝達系の下流分子は恐怖記憶の形成と消去で異なることが示唆され、記憶形成においてはMMDA受容体活性化が関与するのに対し、記憶消去においては細胞骨格系を介したシナプス構造変化の誘導が関与する可能性がある。
神経伝達物質の化学的研究

細胞膜結合性GTP蛋白を直接活性化し,肥満細胞脱顆粒活性を示す新しいペプチド群を数種の蛙皮膚中から発見し,そのうち4種のアミノ酸配列を解析した.これらのペプチドは20あるいは21個のアミノ酸からなるペプチドアミドで疎水性アミノ酸に富む特異な配列を持つ新規なものであった(中嶋).これらのうちN末端部がホルミル化されたものがあり,このペプチドは好中球,およびマクロファージに対し走化性があった.昨年に引きつづき井村はANFの分泌動態,体内分布をモノクローナル抗体に用いる高感度測定法を駆使して研究し,心不全患者はANFのβ体も産生すること,また心室からもANFが得られることを明らかにした.ANFの脳内投与ではANFは飲水行動抑制,アンジオテンシン, ACTH分泌抑制等やはり脳においても体液,血圧の調節に関与することを示した(井村).宗像,矢内原は各種ペプチドホルモンを化学合成し構造と活性発現について検討した.ニューロキニンAのアナログを11種合成し,子宮筋収縮活性を検討したところVal→Thrの置換で一般に収縮活性は減弱したがガストリン遊離作用は差があらわれずペプチド受容体に微妙な差のあることがわかった.またVal→Alaは拮抗作用があらわれた(宗像).グルコースによるインシュリン分泌を抑制するガラニンはその活性部がN末端部に局在し, C末端部は逆に亢進作用があることが判明した. N末部のTrp→Alaにより活性が半減することTrp→Pheにより活性が上昇する等ペプチドホルモンの活性発現には重要なペプチド部位が存在することを明らかにした.中山は昨年に引きつづきハロアニリンから2置換インドール骨格の合成,ピローリピリジンの効果的な合成法を開発し,これを組み込んだTrpペプチドの合成,インドールアルキルアミンの合成を行った.細胞膜結合性GTP蛋白を直接活性化し,肥満細胞脱顆粒活性を示す新しいペプチド群を数種の蛙皮膚中から発見し,そのうち4種のアミノ酸配列を解析した.これらのペプチドは20あるいは21個のアミノ酸からなるペプチドアミドで疎水性アミノ酸に富む特異な配列を持つ新規なものであった(中嶋).これらのうちN末端部がホルミル化されたものがあり,このペプチドは好中球,およびマクロファージに対し走化性があった.昨年に引きつづき井村はANFの分泌動態,体内分布をモノクローナル抗体に用いる高感度測定法を駆使して研究し,心不全患者はANFのβ体も産生すること,また心室からもANFが得られることを明らかにした.ANFの脳内投与ではANFは飲水行動抑制,アンジオテンシン, ACTH分泌抑制等やはり脳においても体液,血圧の調節に関与することを示した(井村).宗像,矢内原は各種ペプチドホルモンを化学合成し構造と活性発現について検討した.ニューロキニンAのアナログを11種合成し,子宮筋収縮活性を検討したところVal→Thrの置換で一般に収縮活性は減弱したがガストリン遊離作用は差があらわれずペプチド受容体に微妙な差のあることがわかった.またVal→Alaは拮抗作用があらわれた(宗像).グルコースによるインシュリン分泌を抑制するガラニンはその活性部がN末端部に局在し, C末端部は逆に亢進作用があることが判明した. N末部のTrp→Alaにより活性が半減することTrp→Pheにより活性が上昇する等ペプチドホルモンの活性発現には重要なペプチド部位が存在することを明らかにした.中山は昨年に引きつづきハロアニリンから2置換インドール骨格の合成,ピローリピリジンの効果的な合成法を開発し,これを組み込んだTrpペプチドの合成,インドールアルキルアミンの合成を行った.
最先端X線分光法を駆使した水田土壌表層へのヒ素濃集機構の解明と土壌修復への応用

水田土壌は、世界30億人以上に主食(コメ)を提供する食糧生産地であり、とくにアジア圏の人々にとって最重要な農業資源の1つである。しかし近年、水田環境を脅かす土壌汚染や水質汚染が日本を含めたアジア諸国で頻発している。本研究ではとくに、現在世界で最も深刻な水田汚染である「無機ヒ素(As)による水田土壌汚染」を対象とし、1我々が初めて見出した水田土壌表層へのAs濃集現象の化学的、(微)生物学的メカニズムを解明し、2さらにこのAs濃集現象を応用した低コストかつ簡便な新規土壌修復法の確立を目指すことを目的とする。
新たに発見された活性型L1レトロトランスポゾンの実験病理学への応用

1.L1bを哺乳動物発現ベクターpCEP4中にクローニングし、培養HeLa細胞にトランスフェクトして、転移の生じたG418耐性コロニーを多数得た。L1bの転移挿入先の遺伝子の3'RACE法による同定を試みた。しかしながら、全クローンコロニーにおいてL1b内の同一部位を利用したpoly A化が生じており、遺伝子の同定には至らなかった。そこでL1bとG418耐性マーカー遺伝子との間にスプライスドナーを挿入した新たな発現コンストラクトを作製し、同様の検討を行なっている。2.無細胞蛋白合成系によるL1bのORF1およびORF2産物の大量調製を試みた。ベクターとしてpET-21aを使用したが、蛋白質合成は認められなかった。そこで無細胞蛋白合成系により適したpIVEX2.3ベクターを使用したコンストラクトを作製し、同様の検討を行なっている。3.serial analysisof gene expression(SAGE)法を用いて3ヶ月齢のBDF1系マウス精巣でのL1配列の発現パターンを調査した。また、老化して精巣での染色体DNAのメチル化などに乱れが生じた場合にともないL1の転写活性が変化する可能性を調査するために、29ヶ月齢のBDF1系マウス、および促進老化のモデルである14ヶ月齢のSAMP1系マウスを用いて、同様に調査を行なった。その結果、いずれの系統、月齢においてもL1配列の発現は極めて低いことが明らかとなった。L1bのマウス精巣における高発現を誘起するために、精巣特異的プロモーターであるヒストンH1t遺伝子のプロモーターの下流にL1bを連結した発現コンストラクトを作製中である。1.ACI-beigeラットにおけるChediak-Higashi症候群様の症状の原因が、Lyst遺伝子内に存在する二つのL1間の組み換えに起因することを明らかとした。そのうちの一つであるL1bの全長をクローニングし、塩基配列の決定を行なった結果、2つのオープンリデイングフレーム(ORF1とORF2)とその5'上流域にSp1ボックスを含むプロモーター様配列、3'下流域にpoly A配列、またその全長の上下流に短い反復配列が認められ、典型的なL1レトロトランスポゾン構造を有していることが明らかとなった。ORF2にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、これまでに報告されているヒトおよびマウスの活性型L1配列のものと非常に高い相同性を示した。対照的にORF1にコードされる蛋白質のアミノ酸配列にはORF2産物ほどの高い相同性は認められず、種特異性が明らかとなった。同じLyst遺伝子内のL1間の組み換えを有するDA-beigeラットのL1bはORF2内に1塩基欠失を有し、レトロトランスポゾン活性を喪失していることが示唆された。2.突然変異誘発に使用することを考えると生殖系列での発現が必要であるが、L1bはラット精巣で発現されていることが確認された。3.L1bを哺乳動物発現ベクターpCEP4中にクローニングし、培養HeLa細胞にトランスフェクトすることによりレトロトランスポゾン活性を証明した。4.L1bの下流に他の遺伝子(A)を連結してHeLa細胞中で強制発現させると、遺伝子(A)のイントロンのスプライシングが抑制されることを見い出した。
ゼブラフィッシュを用いた水晶体発生の分子メカニズムの解明

水晶体は光を網膜の視細胞へと投射する器官であり、主に上皮細胞および繊維細胞から構成されている。発生過程において繊維細胞は上皮細胞から分化することが知られているが、この分化過程において核を始めとしたオルガネラを失う。この過程は水晶体の透明性の獲得に必須であるが、分子メカニズムの詳細は不明であった。我々はゼブラフィッシュを用いた解析により、この分化過程にプロテアソームが関与することを明らかとした。ヒトの視覚を担う眼は、角膜、水晶体そして網膜から形成される。水晶体は外界からの先を網膜へと投射する重要な器官である。そのため、透明かつ強固な構造をとる必要がある。水晶体を形成する水晶体繊維細胞は水晶体の周辺部にある上皮細胞から作られるが、分化の過程で核、小胞体などのオルガネラを失うことにより透明性を獲得する。さらにこの繊維細胞は形態を大きく変化させて水晶体を形成する。しかしながらこれらの発生過程における分子メカニズムは不明な点が多い。本研究の目的は水晶体の発生異常を示すゼブラフィッシュ変異体(vov変異体、prs変異体)を用いて水晶体発生過程の分子メカニズムを明らかとすることである。水晶体の発生の過程において、初期に分化した細胞が水晶体の中心部を形成し、それらの周りに後から分化した細胞が整然と配向することにより成長して行く。vov変異体ではこの中心部の細胞に核と思われる構造が残っており、初期の水晶体繊維抑胞の発生異常を示す。一方prs変異体は水晶体の中心部は正常に作られるが、恐らく後期の分化が正常に起こらず水晶体が成長することが出来ない。当該年度において我々はこのvov変異体の原因遺伝子が同定に成功した。そしてこの遺伝子が水晶体発生に関与するとの報告は未だないことから、今後この遺伝子の機能解析を行なう事により、水晶体繊維細胞の分化メカニズムの分子レベルでの理解が進む事が期待される。水晶体は光を網膜の視細胞へと投射する器官であり、水晶体上皮細胞、水晶体繊維細胞から形成されており、大部分は繊維細胞で占められている。この繊維細胞は上皮細胞から分化することが知られているが、その際に形態を大きく変化させると共に、核を始めとしたオルガネラを失うことにより透明性を獲得する。我々はこれらの発生過程の分子メカニズムを明らかとするために水晶体発生異常を示すvolvox(vov)変異体を用いて解析を行った。解析の結果vov変異体において上皮細胞には大きな異常は観察されなかったが、繊維細胞は分化マーカーとして知られているAquaporin-0を発現しているものの、繊維細胞形態の異常、脱核過程の異常が観察された。これらの結果はvov変異体は水晶体の発生過程において特に繊維細胞の分化過程の異常を引き起こすことを示している。さらに我々はvov変異体の原因遺伝子の同定にも成功し、プロテアソームのサブユニットであるPsmd6であることが明らかとなった。プロテアソームはタンパク質分解の中心的な役割を果たす複合体であり、ユビキチン化タンパクの分解を介して、細胞の様々な現象に関わることが知られている。解析の結果、このPsmd6、およびユビキチン化タンパク質が発生過程の未成熟な繊維細胞の核に強く局在がみられること、そしてvov変異体ではユビキチン化タンパク質の蓄積が起こっていることから、繊維細胞の脱核過程にはプロテアソームによるタンパク質の分解が必須であることが明らかとなった