hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発熱性能を自由にデザインできる自己発熱ナノ粒子実現への挑戦

癌細胞の非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiから構成され,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造に成功した.φ10nmのシリカ微粒子とφ100300nmのポリスチレンビーズと純水からなる懸濁液をミスト化し,低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.種々の条件を変化させ,粒子径,空孔径,空隙率の制御に成功した.次に,溶融塩プラズマ電解法等を用い,多孔形状を崩さずにシリカ粒子中の酸素濃度を27at%まで下げることができた.スパッタや溶融塩メッキ技術でTi堆積後に粒子に電気刺激を与えた結果,自己伝播発熱反応を示すことを確認した.2年の研究期間の初年度となるH26年度,まずは霧化加熱自己組織化法を用いて様々な空隙率,空孔径,粒径を持つ多孔質シリカナノ粒子の作製技術の確立に努めた.シリカゾルはφ10nmのものを採用した.ポリスチレンビーズは自作することとし,φ80400nmで標準偏差10nm未満の均一なポリスチレンビーズの量産技術を確立した.霧化時の振動数,窒素流速,5ゾーン電気炉の温度分布を変更させて多孔質シリカナノ粒子の出来栄えを評価した結果,今回の実験範囲ではこれらのパラメータの影響は小さかった.また,シリカゾルとポリスチレンビーズの割合や濃度を種々変化させて混合してゾルを作り,綺麗な配列を持つ多孔質シリカナノ粒子の製造条件を模索した.その結果,いずれの条件においてもスラリーの濃度が3%程度が最適であることがわかった.それ未満の場合は空孔が不規則に配列した多孔質ナノ粒子ができ,それより大きい場合は表面がささくれ(突起が多く目立つ)ている多孔質ナノ粒子ができた.さらに,2種類の異なる粒径を持つポリスチレンビーズを様々な条件で配合し,これとシリカゾルを混合して作ったスラリーを用いて多孔質ナノ粒子を作った結果,大きなポリスチレンビーズがあったところにできた穴の周りに小さな穴が規則正しく開いた条件を見出すことに成功した.この条件は,単一ポリスチレンビーズでの最適条件と近いものであった.以上のことから,様々な空隙率と空孔径を持つ多孔質シリカナノ粒子の製造技術を確立することができた.粒径制御は今後の課題であり,サイクロン方式などを採用して粒子サイズの選別を行う必要がある.多孔質シリカナノ粒子の還元実験を幾つか試みた.溶融塩技術を用いればシリカ中の酸素を減らすことが可能であったが,粒子形状が崩れることが大きな課題である.これを解決すべく,現在,放射光を用いた還元にも取り組んでいる.本研究では,癌細胞の次世代非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiから構成され,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造技術を開発した.φ10nm程度のシリカ微粒子とφ100300nm程度のポリスチレンビーズと純水からなる懸濁液をミスト化し,それを低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.電気炉温度,窒素流量,ポリスチレンサイズおよび濃度を変化させ,粒子の最適製造条件を導出した.次に,溶融塩プラズマ電解法等を用いてシリカ粒子の還元を試みた.その結果,多孔質粒子の形状を崩さずにシリカ中の酸素濃度を27at%まで下げることに成功したが,完全にSiに還元することはできなかった.その後,スパッタや溶融塩メッキ技術で多孔質シリカ粒子の表面と空孔にTiを堆積させた.Ti被覆シリカ粒子に電気刺激を与えた結果,自己伝播発熱反応を示すことを確認した.多孔質シリカナノ粒子の粒径,空隙率,空孔径等を自由に変化させることができる実験技術を確立した.今後は,様々なサイズならびに空隙率の多孔質シリカナノ粒子にTiを上手く堆積させ,発熱性能の変調を調べることが課題である.癌細胞の非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiから構成され,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造に成功した.φ10nmのシリカ微粒子とφ100300nmのポリスチレンビーズと純水からなる懸濁液をミスト化し,低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.種々の条件を変化させ,粒子径,空孔径,空隙率の制御に成功した.次に,溶融塩プラズマ電解法等を用い,多孔形状を崩さずにシリカ粒子中の酸素濃度を27at%まで下げることができた.スパッタや溶融塩メッキ技術でTi堆積後に粒子に電気刺激を与えた結果,自己伝播発熱反応を示すことを確認した.霧化加熱自己組織化法で様々な空隙率と空孔径を持ち,綺麗に穴が配列した多孔質シリカナノ粒子の製造技術を確立することができた.粒径の制御が課題であるが,これはサイクロン方式を霧化直後と粒子製造直後の2箇所に配置することで解決可能と考えている.また,シリカの還元を幾つかの手法で実現した.これまでシリカの還元は困難とされてきたが,溶融塩技術を用いればそれが可能であることを実証した.

課題は粒子の多孔質性が崩れることであり,溶融塩実験条件の最適化を図るとともに放射光還元などを利用して課題解決を行っていく.ナノテクノロジ多孔質シリカナノ粒子の製造技術の最適化を概ね行うことができたので,これからは(1)粒子の多孔性を維持したまま多孔質シリカナノ粒子の還元を行う実験,(2)多孔質シリカナノ粒子の空隙部分にTiを充填する溶融塩メッキ実験,(3)スパッタを用いたTi/SiO多層膜の作製と発熱性能評価,を主に行っていく.(1)では多孔質シリカナノ粒子を適度な条件で真空アニールすると,表面がシリカゾルの集合体からシリカシェルに変化することがわかっている.これを利用して,還元時に崩れにくい多孔質シリカナノ粒子を作る.また,溶融塩還元に加えて放射光還元にも挑み,多孔質性を極力崩さずにできるだけ酸素を脱離させる実験技術を確立する.(2)では溶融塩技術を用いて通常はメッキできないTiを析出させる技術を開発する.さらに還元後の多孔質シリカナノ粒子(できれば多孔質シリコンナノ粒子)の主に空隙内にTiを析出させる技術を構築する.(3)ではスパッタ技術を用いてTi/SiO多層膜を成膜し,発熱反応を発現できる酸素含有量の実験的調査を行う.この結果をもとに,多孔質シリカナノ粒子の還元の最低条件を決定する.
日韓における地方財政の中央政府への依存と経済発展との関係について

地方分権が進むつれ、地方財政の中央政府への依存問題は、その重要性を増している。これらの問題をめぐって、平成12年と平成13年、2回にわたって、東アジア地域を対象に国際シンポジウムが行われた。平成12年の結果は、Hitotsubashi Journal of Economics等に発表された。また、平成13年2月には、「アジアにおける分権化と経済発展」を主題に国際シンポジウムが行われ、「韓国の地方分権化と経済発展について」発表した。その後の研究は、日韓の地方税の比較研究に焦点を絞った。平成13年9月には、韓国地方財政学会が主催し、「東アジア地方財政の危機」を主題に行われた国際学術大会に参加し、「広域自治団体と基礎自治団体における地方税の日韓比較」について発表を行った。その論文の目的は、日本と韓国の地方税の実態とその問題点を取り上げ、税財源改革の課題を議論することにあった。内容としては、まず両国の地方税体系、主要地方税の伸張性と安定性、地方税の地域間格差、及び地方税と地方公共サービスとの関係などについて取り扱った後、地方税改革に関する議論や本稿での分析に基づいて政策示唆点について調べた。日本の地方税体系は、景気の影響を受けやすい住民税や事業税などの所得課税の割合が高いため、最近の経済不況によって地方税収の変動と落ち込みが激しかった。これに対して、韓国の地方税は、取得税、登録税など、資産の取引に関連する資産課税の割合が高く、自動車税、住民税、タバコ消費税などが、両税に次ぐ体系となっている。その示唆点においては、税源の偏在性が少なく、税収の安定性を備えた地方税体系を構築していくための地方税改革に関し、外形標準課税の導入必要性、個人住民税における比例的な税率構造の構築等について議論した。まず、本研究では、韓国の地方財政と経済発展との関係についてまとめた。韓国の場合、1)中央政府からの財政移転が年末に近い時点で行われているため、多額の繰越金が存在し、それが地方歳入と歳出の間に大きなギャップをもたらしていること、2)1)で指摘した繰越金がこの税外収入に含まれているので、統計上では税外収入の地方歳入の45%も占めているが、実際には利子収入や財産収入などの本来の税外収入の割合は20%も至らないこと、3)地方税の場合、国税対地方税が8対2の割合で、地方税の税収が少ないことに加え、地方税の税率と税目についても地方政府ではなく中央政府がそれを定めていること、4)地方債の発行について中央政府の許可が必要であり、地方債による事業の損失について中央政府や一般会計から補填が行われていること、5)韓国では、地方財政と地方教育財政が分離されて運営されており、地方教育財政の場合、中央政府からの依存が非常に高いこと、などが明らかになった。次に、以上の特徴から政府間財政移転の役割が欠かせない変数となり、財政移転の経済効果を調べる必要がある。結果によると、政府間財政移転は、モラル・ハザードの問題を抱え込みながら、地域の経済平等化だけではなく、資本支出を通じて地域の経済発展にも重要な役割を果たしている。最後に、韓国の地方財政を主な対象にしたのは、2000年1月の「アジア地域における分権化と経済発展」と、2001年2月の「アジア地域における政府間移転の経済効果」について、国際シンポが行われ、筆者が韓国を担当したからである。
白血病細胞における細胞骨格・転写・細胞周期の制御異常

t(8;21)転座、inv(16)逆位はそれぞれ、Runx1-MTG8及びPEBP2beta-SMMHCキメラ遺伝子を生成する。AMLとしては各々、M2及びM4サブタイプの形態学的表現型を示す。上記の2つ、及びその他の染色体異常を伴うAML、合計54症例を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施した。コントロールを適切に取ることにより、lineage/stageに依存せずに発現変動を示すと考えられる遺伝子群を抽出した。t(8;21)とinv(16)に共通して発現上昇する遺伝子群も存在したが、t(8;21)特異的に又はinv(16)特異的に発現上昇する遺伝子群も検出することができた。2つのキメラ蛋白は、正常のRunx1/PEBP2beta転写因子機能に対してドミナント・ネガティブに作用することが知られているが、それのみによって2つの型の白血病細胞における遺伝子発現パタンを説明できるものではないことが示唆された。WT1の4種類のアイソフォームおよびDSRCT (desmoplastic small round cell tumor)の発症に関わるとされるEWS-WT1キメラがん遺伝子の発現細胞からRNAを調製し、20,000遺伝子を網羅するマイクロアレイを用いて発現プロファイルを作成した。これにより、WT1のアイソフォームとEWS-WT1の各々に特異的に誘導される遺伝子群を同定した。EWS-WT1発現細胞では、血管新生抑制因子BAI-1と接着と運動にかかわるTALLA-1に着目して解析を進めた。Jurkat細胞において、抗TALLA1抗体は細胞どうしの接着性を著しく促進させること、抗CD3抗体と協調的にERKのリン酸化を促進することを示した。二つの白血病関連蛋白質であるPEBP2β蛋白とWT1蛋白とにつき、細胞内局在と細胞周期・転写制御との関連、また標的遺伝子候補につき解析し以下の結果を得た。(1)血球細胞の分裂時においてPEBP2β蛋白は複製した二つの中心体とその細胞内移動を同じくする。また血球遊走時に、ユロポッド内の中心体周囲にPEBP2β蛋白は密に分布する。(2)PEBP2β蛋白と結合する因子として、細胞骨格成分であるフィラミンA分子を同定した。フィラミンAが存在する場合にはPEBP2β蛋白は細胞質に局在し、PEBP2依存性の転写活性化は起こらない。一方フィラミンAが欠如する場合は、PEBP2β蛋自は核に局在し、PEBP2依存性に転写が活性化される。(3)WT1蛋白と結合する因子として、転写伸長を制御するCA150蛋白質を同定した。またWT1蛋白とGATA蛋自の両方に結合する因子として、WTAPを同定した。同定した両因子の意義につき、解析を進めている。(4)WT1発現細胞、EWS-WT1キメラ蛋白を発現する細胞を用いて、12,000遺伝子の発現プロファイルを作製した。この中でEWS-WT1により発現が亢進する遺伝子として80-200種、WT1により発現が亢進もしくは抑制される遺伝子として200-600種を同定できた。さらにこれら同定した遺伝子につき、マイクロアレイの結果とRT-PCRの結果とがよく相関することを確認した。PEBP2β蛋白の細胞内局在は、細胞周期制御や転写制御に直接関わる、重要な因子と考えられる。その意味でPEBP2β蛋白と結合するフィラミンA分子を同定できたことは今後、PEBP2β-SMMHCキメラ蛋自による細胞周期・転写の脱制御、さらに白血病細胞の特性を解明する上での鍵となりうる。またWT1蛋白やEWS-WT1キメラ蛋白により発現を変動する遺伝子の中には、膜蛋白質が多く含まれている。白血病細胞の接着・運動性の変化を、それら膜蛋白質との関連から探求できる糸口を把むことができた。2つの白血病関連蛋白質であるPEBP2β蛋白とWT1蛋白とにつき、以下の結果を得た。(1)酵母ツーハイブリッド法を用いて、PEBP2β蛋白と会合する因子として、アクチン結合蛋白であるフィラミンA分子を同定した。両蛋白が会合しうることは、cDNAの細胞へのコゥトランスフェクションと免沈・ブロット法にても確認できた。フィラミンAが存在する場合には、PEBP2β蛋白は細胞質に局在しフィラミンAと共局在する。また核移行するRunx1蛋白が共存しても、PEBP2βは細胞質に止まり転写活性化に参画しない。一方、フィラミンAが欠損する場合にはPEBP2β蛋白はRunx1とともに核移行し、転写活性化に参画する。組織培養細胞を用いて、PEBP2β蛋白の細胞質vs核局在の振り分け機構を明らかにできた。生体組織における意義についての解析が、今後必要となる。(2)高効率の遺伝子導入により一過性の発現細胞でマイクロアレイ解析を可能にした。これを用いてWT1の4種類のアイソフォームおよびEWS-WT1キメラ遺伝子の発現細胞RNAを調製し、20,000遺伝子を網羅するマイクロアレイの解析を行った。その結果、WT1のアイソフォームとEWS-WT1のそれぞれに特異的に発現誘導される遺伝子群を同定した。特に、EWS-WT1発現細胞では、遺伝子内部からの転写が活性化される結果、血管新生抑制ドメインを持たないBAI1蛋白質が発現する可能性が示唆された。Runx転写因子のパートナーであるPEBP2β蛋白は、それ単独では細胞質に局在したり核に局在したりと観察所見がまちまちであった。

PEBP2β蛋白と結合する因子の1つとして、細胞骨格蛋白であるフィラミンA分子を同定した。フィラミシAの存在下ではPEBP2βは細胞質に局在する。一方、フィラミンAの欠損下ではPEBP2β蛋白は核に移行し、Runx依存性の転写活性化に寄与しうることを明らかにした。本所見は、inv(16)ヒト急性骨髄性白血病でのPEBP2β-MYH11キメラ遺伝子産物の作用機構を理解する上で参考となる。一方Runx1転写因子の機能に関して、Tリンパ球分化の様々な段階で(胸腺髄質におけるCD4+細胞の増殖、及び末梢ナイーブCD4+細胞のTh2分化など)、多岐にわたる機能を発揮することを示した。DSRCTの発症に関わるとされるEWS-WT1キメラがん遺伝子の発現細胞からRNAを調製し、20,000遺伝子を網羅するマイクロアレイを用いて発現プロファイルを作成、EWS-WT1に特異的に誘導される遺伝子群を同定した。それらの中でBAI-1は血管新生抑制ドメインを持たないバリアントである。テトラスパンニングファミリーのTALLA-1は細胞膜と細胞内に点状に存在し、その局在はエンドソーム、リソゾームへのsorting signalであるYxxφモチーフにより制御される。TALLA-1と複合体を形成する蛋白質の同定を行い、イムノグロブリンスーパーファミリーに属するEWI-2、EWI-Fを見いだした。t(8;21)転座、inv(16)逆位はそれぞれ、Runx1-MTG8及びPEBP2beta-SMMHCキメラ遺伝子を生成する。AMLとしては各々、M2及びM4サブタイプの形態学的表現型を示す。上記の2つ、及びその他の染色体異常を伴うAML、合計54症例を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施した。コントロールを適切に取ることにより、lineage/stageに依存せずに発現変動を示すと考えられる遺伝子群を抽出した。t(8;21)とinv(16)に共通して発現上昇する遺伝子群も存在したが、t(8;21)特異的に又はinv(16)特異的に発現上昇する遺伝子群も検出することができた。2つのキメラ蛋白は、正常のRunx1/PEBP2beta転写因子機能に対してドミナント・ネガティブに作用することが知られているが、それのみによって2つの型の白血病細胞における遺伝子発現パタンを説明できるものではないことが示唆された。WT1の4種類のアイソフォームおよびDSRCT (desmoplastic small round cell tumor)の発症に関わるとされるEWS-WT1キメラがん遺伝子の発現細胞からRNAを調製し、20,000遺伝子を網羅するマイクロアレイを用いて発現プロファイルを作成した。これにより、WT1のアイソフォームとEWS-WT1の各々に特異的に誘導される遺伝子群を同定した。EWS-WT1発現細胞では、血管新生抑制因子BAI-1と接着と運動にかかわるTALLA-1に着目して解析を進めた。Jurkat細胞において、抗TALLA1抗体は細胞どうしの接着性を著しく促進させること、抗CD3抗体と協調的にERKのリン酸化を促進することを示した。
AIを利用した対話型電子カルテ病名精度検証システムの開発

我が国ではMID-NET、NDB、千年カルテその他電子カルテやレセプトデータ等を活用する医療ビッグデータの大型国家プロジェクトが多数実施されている。しかし、我が国の電子カルテに登録されている病名情報は、いわゆる「レセプト病名」で、精度が極めて低い。我が国の臨床研究のコスト削減と効率化のために、AI(機械学習)の活用が期待されている。本研究において、AI技術を利用し、専門医がAIと対話型で電子カルテに格納された病名の精度を検証する「対話型電子カルテ病名精度検証システム」の開発を行う。本研究により、我が国の電子カルテやレセプトを集積した医療ビッグデータの研究利用が加速することが期待される。
第二次世界大戦と石油業

本研究は、1937年の日華事変を契機に本格化した戦時石油統制策と、そのもとで進められた戦時下の石油業の再編過程を、欧米の主要交戦国との比較において、総合的に研究することを目的とした。研究の重点は、【.encircled1.】戦時下における採掘・精製・販売の各部門の企業展開を具体的に明らかにすること、【.encircled2.】戦時下の石油企業の再編成と石油専売制実施・石油統制会の結成に至る石油統制政策の諸特徴を解明すること、に置いた。本来3ケ年計画で進めていた本研究では、前年来の作業であるアメリカ戦略爆撃調査団(USSBS)報告の太平洋戦線の部Reports 51、52(Oil in Japan's War)の複写と翻訳に加え、本年はヨーロッパ戦線の部の最終報告書から石油業関係の部分の複写・翻訳作業に着手し、諸報告の翻訳を終わる見通しをつけつつある。この翻訳・分析と並行して日本語文献によって史実のノートに努め、本年度は特に次の課題を深めた。【.encircled1.】1942年頃の国内精製会社8ブロックの編成と8社の各経営内容、および瀬戸内に精製施設をもち9社目の会社として戦時下を通じて営業を続けた太陽石油(株)の陸・海軍指定関係等を追跡、採掘部門=帝国石油(株)と石油精製8ブロック編成という国内の分業体制の実相を究明した。【.encircled2.】さらに、1940年から47年にかけての石油配給機構の変遷を分析し、43年6月の石油専売法制定以後の陸海軍の燃料補給ルート並びに、燃料局・石油配給統制会社-府県石配-配給所といった配給ルートと価格、地域の石油業者の統廃合の実相などを究明。あわせてこの作業のなかで、戦後再編後の石油販売組合においても石油末端価格の協定等「統制色」の強い組織として高度成長期まで存続したことも明かとなった。なお、販売統制機構、人造石油製造などドイツ・イタリアとの比較において、日本の戦時石油統制の特徴を明らかにする作業は、早期に達成したい。
情報伝達分子システムの再構成系における1分子反応解析

我々は以前、情報を処理するEGF-Ras-MAPKシステムを、細胞構造を保ったまま細胞膜を透過性にした細胞(セミ・インタクト細胞)内に再構成した。本研究の目標は、システムの種々の段階に対する入力に対応するMAPKの活性化(出力)をセミ・インタクト細胞内で定量的に解析することである。EGF-Ras-MAPKシステムの最終段階の情報分子であるERKはMEKによるリン酸化を受けて活性化し、核内へ集積する。CFP-ERKの核移行量を出力として、EGF受容体へのEGFの結合数(入力)を変化させて、システムの入出力応答関係を解析した。ERKの核移行反応が、1nM EGF付近で急激に立ち上がる過剰応答性(ultrasensitive)の反応であることが明らかになった。Hill係数(過剰応答性の指数)を正確に決定するには、今後閾値付近を詳細に計測する必用があるが、おそらくは10以上の値であると思われる。これは、最近我々が生細胞で計測したEGFによる細胞内カルシウム応答のHill係数(3.9)に比べてもかなり大きな値であり(Uyemura et al.2005)、Ferellらによって計測されたカエル卵母細胞の別種のMAPKカスケードと同様に、Rasの下流で働くRaf-MEK-ERKのMAPKカスケードも2桁以上のHill係数を持っている可能性を示唆している。大きな過剰応答性を反映して、個々の細胞で見ても反応は全無的であり、中間的な核移行量を示す細胞はほとんど見られなかった。生体内でのEGF濃度はサブnMオーダーと言われており、このようなシステムを持つ細胞の集団は生体内では応答する細胞としない細胞に2分されてしまう可能性が高い。
歯の移動時における歯根吸収の開始機序について-組織化学的観察-

矯正的歯の移動時に歯根吸収や歯根の短小化などの現象が観察される。しかし、どのような機序で歯根吸収が行われるのか現在でも不明な点が多い。本研究では、ラット臼歯を強い力で移動し、移動後1週間以内の比較的短時間の歯根周囲組織の変化を観察し、歯根吸収開始からその修復までの経時的過程を、特に破歯細胞の動態に注目し、歯根吸収の開始機序、修復機構について検討した。TR-ACP活性染色を用いることにより、通常のH・E染色標本に比較し、歯根吸収する破歯細胞の動態を容易にかつ正確に把握することが可能であった。歯根吸収は、主に圧迫側に観察されたが、硝子様変性部周囲に集中して出現するものと、その他の部位で散在的に認められるものがあった。経時的変化の観察により、歯根を吸収する破歯細胞は、単核の前駆細胞として出現し、セメント質表面で多核化し、吸収が進行することが示唆された。また、1週間後には、根側面部において、破歯細胞による吸収が終了し、吸収窩表面では、TR-ACP陽性のライン、いわゆるセメントラインを形成し、吸収が停止あるいは終了していると思われる像も観察された。また一部において、セメント質の修復が起こっている部位も観察された。
完備化に基づくプログラム自動変換の研究

完備化に基づくプログラム融合変換のアイデアを,高階プログラムに適用するためには,高階書き換えシステムの完備化を実現する必要がある。しかし,高階書き換えシステムの完備化手続きの多くは机上の提案にとどまっており,実装にはいたっていない。これは,完備化手続きを実装するために不可欠な高階書き換えシステムの停止性が,簡単に判定できなかったからである。本研究では,項の幅の上界を設定することで,固定次数の関数記号に対する単純化順序の定義が,可変次数の関数記号に対してもそのまま有効に働くことに注目し,S式書き換えシステムの停止性が辞書式経路順序で簡単に判定できることを示した。実際に利用される高階書き換えシステムの多くは,S式書き換えシステムで表現できるため,ここで提案された停止性判定法をもちいて完備化可能である。我々は,S式書き換えシステムの完備化手続きを計算機上に実装し,高階書き換えシステムの完備化と融合変換が容易に実現できることを実験によって明らかにした。さらに,本研究で目指している完備化に基づくプログラム変換の適用範囲を広げることを目的として,高階関数を含む帰納的定理の自動証明法を検討し,高階書き換えシステムにおける潜在帰納法の枠組みを提案するとともに,潜在帰納法の適用に不可欠な十分完全性の判定が決定可能であることを明らかにした。また,書き換え代入に基づく2階のパターンマッチングを提案し,パターマッチングをもちいたプログラム変換手続きを改良するとともに,書き換え帰納法に基づく高階プログラムの融合変換の実験を行った。
断層の固着滑り機構を考慮に入れた地震動の生成に関する研究

本研究は、岩石の固着すべり破壊実験で得られた構成則を組み込んだ非線形動的有限要素法により、そのすべり破壊過程をシミュレーションし、実験結果と比較することにより、本手法の有効性の検討、そして実際の断層運動への適用性を検討したものである。具体的には岩石の切断面を修正ジョイント要素で表現し、この構成関係に実験で観測された構成則をモデル化して与えた。そして、減衰定数、最大せん断強度に達するすべり量、残留強度についてパラメトリックスタディを行った。その結果以下のような知見を得た。(1)岩石の固着すべり実験に基づく構成則をジョイント要素に適用した。この構成則は降状後瞬時に残留強度になるのではなく、すべり量に対して指数関数的に応力降下が起こるもので、スリプウイ-クニングモデルに属するものである。(2)スリップウイ-クニングに先だって、応力とすべり量がほぼ線形関係にあるスリップハードニングの領域が存在するが、この線形関係を修正ジョイント要素のせん断ばね定数で表し、ジョイント要素のせん断ばねに物理的意味をもたせた。(3)すべり量の立ち上がり状況やすべり速度の分布など岩石実験結果をよく再現することができた。解析で得られた最大すべり加速度は、実験的に求まった最大すべり加速度とほぼ一致していた。(4)このほか減衰定数、最大せん断強度に達するすべり量、残留強度に関する結果も、本解析手法の妥当性を示すものであった。これらのことから、本研究で構築した構成則を用いて解析された破壊の先端域の動特性は、実験結果をよく再現しており、本手法の有効性を確認できたものと考える。本研究の目的は、室内実験で得られた岩石の固着すべりの構成関係を出来るだけ忠実にジョイント要素の構成式に導入し、断層の破壊メカニズムを考慮に入れた断層近傍の地震動推定を、有限要素法を用いて統一的に扱う手法を提示することである。本年度はその第1歩として、実験結果からジョイント要素の構成関係を構築し、すべり特性に関してパラメトリックスタディを行った。そして解析結果と実験結果の滑り特性を比較検討し、以下のことを明らかにした。(1)実験に基づいて本研究で用いた構成式は、降伏後瞬時に残留強度になるのではなく、すべり量に対して指数関数的に応力降下が起こるスリップウィークニングモデルに属するものである。(2)スリップウィークニングに先だって、応力とすべり量がほぼ線形関係にあるスリップハードニングの領域が存在するが、この線形関係を修正ジョイント要素のせん断バネで表し、ジョイント要素のバネに物理的意味を持たせた。(3)地殻部分の減数定数の大きさの違いの影響は破壊初期段階に現れるが、破壊が進行するにつれてその影響は小さくなり、最終的なすべり量はほぼ同一となった。(4)最大せん断強度に達するすべり量(ジョイント要素のバネ定数に対応)および残留強度の大きさを4倍程度変化させても、すべり量、すべり速度、破壊伝播速度などの諸量にはほとんど影響がなかった。(5)数値解析から得られたすべり量の立ち上がり状況やすべり速度の分布は岩石実験結果を良く再現していることが確認できた。また、最大すべり加速度も両者良く一致していた。この構成則は降伏後瞬時に残留強度になるのではなく、すべり量に対して指数関数的に応力降下が起こるもので、スリップウイ-クニングモデルに属するものである。

(2)スリップウイ-クニングに先だって、応力とすべり量がほぼ線形関係にあるスリップハードニングの領域が存在するが、この線形関係を修正ジョイント要素のせん断ばね定数で表し、ジョイント要素のせん断ばねに物理的意味をもたせた。(3)すべり量の立ち上がり状況やすべり速度の分布など岩石実験結果をよく再現することができた。解析で得られた最大すべり加速度は、実験的に求まった最大すべり加速度とほぼ一致していた。(4)このほか減衰定数、最大せん断強度に達するすべり量、残留強度に関する結果も、本解析手法の妥当性を示すものであった。これらのことから、本研究で構築した構成則を用いて解析された破壊の先端域の動特性は、実験結果をよく再現しており、本手法の有効性を確認できたものと考える。
凝縮・液膜・飛沫を考慮した液滴衝撃エロージョンのモデリングと低圧タービンへの応用

既報のエロージョン予測法を拡張し,液滴衝撃エロージョンをモデル化した.二相流の時間スケールに対し,壁面形状変化の時間スケールが大きいことから,弱連成として取り扱うことができ,衝突液滴の位置・速度を得るため,オイラー・ラグランジュ法を使った.液滴の発生には凝縮を考慮し,発生箇所・直径を計算できるよう拡張した.液膜の存在や衝突による飛沫の効果があるため,損傷量の相関式が固気系よりも複雑となった.相関式は,液滴の衝突速度・衝突角度・材料特性に加え,液膜の有無・衝突による飛沫を考慮して構築した.構築した手法を用いてベンドと低圧タービンを対象とした解析を行い,実験データを妥当に再現できることを示した.申請者らの開発したサンド・エロージョン予測手法をベースに,液滴衝撃エロージョン特有の現象をモデル化・導入した.液滴衝撃エロージョンは連続相・分散相の時間スケールに対して,壁面形状変化の時間スケールが著しく大きいことから,弱連成問題として取り扱うことができ,液滴の衝突位置・衝突速度を得るために,オイラー・ラグランジュ法を使った.一方,液滴衝撃エロージョンの場合,液滴は単純に上流から流入するだけではなく,温度変化に伴う凝縮を考慮する必要がある.凝縮をオイラー的に取り扱う場合の計算例は多数あるが,ラグランジュ法では例がなく,液滴の発生箇所・液滴直径を計算できるよう拡張した.また,液膜の存在や衝突による飛沫の効果があるため,損傷量を計算する相関式がサンド・エロージョンよりも複雑になる.従って,損傷量を計算する相関式は,液滴の衝突速度・衝突角度・材料特性に加え,液膜の有無・衝突による飛沫を考慮して構築した.本研究の平成24年度までの途中経過は計算工学会およびWCCMにおいて報告した.平成25年度は,これらの計算手法を用いて正方形断面90度ベンドおよび低圧タービンを対象としたシミュレーションを行い,構築したモデルが実験データを妥当に再現できることを示した.本研究で得られた成果の公開については年度内に完了できなかったが,可能な限り速やかに学会発表および論文投稿などの形で成果発表を行うつもりである.既報のエロージョン予測法を拡張し,液滴衝撃エロージョンをモデル化した.二相流の時間スケールに対し,壁面形状変化の時間スケールが大きいことから,弱連成として取り扱うことができ,衝突液滴の位置・速度を得るため,オイラー・ラグランジュ法を使った.液滴の発生には凝縮を考慮し,発生箇所・直径を計算できるよう拡張した.液膜の存在や衝突による飛沫の効果があるため,損傷量の相関式が固気系よりも複雑となった.相関式は,液滴の衝突速度・衝突角度・材料特性に加え,液膜の有無・衝突による飛沫を考慮して構築した.構築した手法を用いてベンドと低圧タービンを対象とした解析を行い,実験データを妥当に再現できることを示した.申請者らの開発したサンド・エロージョン予測手法をベースに,液滴衝撃エロージョン特有の現象をモデル化・導入した.液滴衝撃エロージョンは連続相・分散相の時間スケールに対して,壁面形状変化の時間スケールが著しく大きいことから,弱連成問題として取り扱うことができ,液滴の衝突位置・衝突速度を得るために,オイラー・ラグランジュ法を使った.一方,液滴衝撃エロージョンの場合,液滴は単純に上流から流入するだけではなく,温度変化に伴う凝縮を考慮する必要がある.凝縮をオイラー的に取り扱う場合の計算例は多数あるが,ラグランジュ法では例がなく,液滴の発生箇所・液滴直径を計算できるよう拡張した.また,液膜の存在や衝突による飛沫の効果があるため,損傷量を計算する相関式がサンド・エロージョンよりも複雑になる.従って,損傷量を計算する相関式は,液滴の衝突速度・衝突角度・材料特性に加え,液膜の有無・衝突による飛沫を考慮して構築した.本研究の途中経過は計算工学会およびWCCMにおいて報告した.現状では本研究のターゲットである低圧タービンへの応用には手が届いていないが,研究室レベルの小規模な実験データとの比較により,構築したモデルが実験データを妥当に再現できることを示した.平成25年度は,平成24年度に構築したモデルの修正と低圧タービンへの応用に注力する.やや当初の予定よりも遅れが生じているため,平成25年度に新たに導入予定の計算機を用いて,当初予定した計画を達成するつもりである.平成24年度から申請者は東京理科大学から宇宙航空研究開発機構へ異動した.この状況は予定外であったため,異動後しばらくは研究環境が十分整っていなかったため,当初の予定より遅れが生じている.平成24年度の遅れを取り戻すため,当初よりも物品費の割合を増やし,計算機のリソースを拡充することで対応する.前項で述べたとおり,計算リソースを増やすため,当初予定していた旅費を減らし,物品費の割合を増やして研究を推進する.旅費を減らした分,研究成果の発表は近隣で開催される学会に変更する予定である.
ナノ融合分子集合体による機能開拓とバイオ応用

本研究ではバイオインスパイアードプロセスとして分子制御による精緻な設計に基づいて、ナノ融合分子集合体による動的融合機能材料の構築を行った。その応用展開として、バイオメディカル分野に焦点をあてた研究を展開した。具体的には、磁場に応答して内包物を放出するカプセル材料の開発、アップ近赤外光による光線力学療法用薬剤の開発、MRI造影剤やガン温熱療法用薬剤としての多糖ナノゲルー酸化鉄ナノ粒子ハイブリッドの開発、ならびにホウ素中性子捕捉療法に向けた高濃度無機ホウ素含有ナノ粒子の開発に成功した。本研究では、材料構築のユニットをナノレベルで組織化し、それらの特性を巧みに融合して高度な機能を発現させる技術の確立を目指す。特に無機材料と有機材料を合理的な分子設計のもと精密に融合し、バイオ応用展開を実現する。ナノ粒子などの無機ユニットと脂質などの有機ユニットを交互積層法などによって分子集合体とする。これらのバイオ応用展開として、薬物運搬体、さらに光線力学療法用粒子等についても有機分子単独では実現し得ない機能発現をナノ融合分子集合体により実現し、革新的なバイオ・メディカル素子創成の方法論を開拓する。5年間の研究計画の初年度にあたる本年度は以下のような成果を得た。目的の患部にすばやく送達し、外部からのシグナルに応答して内包物を放出するドラッグ・デリバリー用のハイブリッドカプセルとして、磁場応答リポソームを開発した。オレイン酸で疎水化したFe_30_4ナノ粒子と温度感受性高分子をリポソームに組み込んだリポソームを合成した。このリポソームに交流磁場を印加すると、Fe_30_4ナノ粒子の発熱が起こり、その熱によって温度感受性高分子が構造変化を起こし、脂質膜を乱すことで内包物の放出を誘起することを見出した。近赤外光による光線力学療法を実現するために、可視光で活性酸素を発生させるフラーレンと近赤外光から可視光を発光させるアップコンバージョン(UPC)蛍光ナノ粒子の融合した材料の創成を目指している。その第一段階として、水に分散するUPC蛍光ナノ粒子の合成を行った。オレイン酸で被覆したNaYF_4粒子を溶液プロセスで合成し、これを脂質膜で修飾することで水に凝集することなく分散させることに成功した。また酸化物系のUPC蛍光体においても高輝度化をケイ素の添加によって実現した。1.分子制御に基づくアップコンバージョン(UPC)ナノ粒子の開発量子ドット等の蛍光ナノ粒子はバイオイメージング等の分野で応用が期待されており、盛んに研究されているが、励起光源として生体組織への透過性が低い紫外光を用いている点など課題も多い。これに対し、生体組織への透過性が高い近赤外光を励起光源とするアップコンバージョン(UPC)蛍光体が注目を集めている。昨年度までに液相プロセスでUPC蛍光ナノ粒子を合成し、これを脂質膜で修飾することにより、水系溶媒に対して安定に分散可能なUPC蛍光ナノ粒子の合成に成功している。本年度は複合化に用いる脂質の種類によって粒子の表面電荷等を制御し、特定の表面に吸着する性質を付与することに成功した。またフッ素を含まない、酸化物UPC蛍光体の蛍光増強についても検討した。2.分子制御融合プロセスによる二酸化チタン構造構築と新機能開拓TiO2は優れた光触媒として知られている。A01班垣花グループと共同で開発したグリコール酸Ti錯体を用いることで合成が困難なブルカイトおよびブロンズの単相合成に成功した。ポリスチレン(PS)粒子にグリコール酸チタン錯体とカチオン性ポリマーを交互積層法によってコーティングし、PSコアを溶解除去後に水熱処理することで中空ブルカイト粒子を作製した。錯体によってミクロな結晶多形の構造を制御し、同時に交互積層法によってマクロな中空構造を付与することに成功した。ブロンズ型TiO2ナノ粒子をメタノールに分散し、ガラス基板へスピンコート後、500°Cで加熱することでブロンズ薄膜を作製した。このブロンズ薄膜はUV光照射によって親水化し、さらに暗所でもその高い親水状態が保持されることを見出した。本研究では分子制御による精緻な設計に基づいて、ナノ融合分子集合体による動的融合機能材料の構築を行い、その応用展開として、バイオメディカル分野に焦点をあてている。以下にいくつかのトピックの成果を述べる。1.多糖ナノゲルー無機ナノ粒子ハイブリッドの合成とバイオ応用ここでは、生体適合性と分散性に優れる多糖ナノゲルとハイブリッド化したナノ粒子の作製を行った。表面がオレイン酸で被覆された酸化鉄ナノ粒子を合成し、これをテトラヒドロフランに分散させ、CHPナノゲル分散溶液にインジェクションすることによって酸化鉄含有ナノゲルハイブリッド粒子を得た。TEM観察によれば酸化鉄ナノ粒子がクラスターを形成しナノゲルと複合化し、クラスターサイズはインジェクションする酸化鉄ナノ粒子分散液濃度で制御できることが分かった。得られたハイブリッドは既存のT2造影剤と同等以上のMRI造影剤としての性能を有することが確認された。またこのハイブリッド粒子への交流

磁場印加による発熱も確認され、磁気ハイパーサーミアへの応用の可能性も示された。2.無機ナノシートを用いた金属・有機分子との融合マテリアルの創成ここではアップコンバージョン蛍光体の新しい形態としてナノシートに着目し、UPC蛍光ナノシートを開発するとともに、近赤外領域に局在表面プラズモン共鳴(LSPR)による吸収を有する金ナノロッドと融合することでそのUPC蛍光の増強を試みた。層状結晶であるK(La,Er,Yb)Nb2O7を合成し、その層間イオンの交換によって剥離し、(La,Er,Yb)Nb2O7-ナノシートを作製した。これを波長980 nm付近にLSPR吸収を有する金ナノロッドと融合すると、ナノシート単独と比較してUPC発光強度が2倍近くに増強された。このナノシートはポルフィリン類との融合で近赤外光照射による一重項酸素発生機能が発現することも確認できた。本研究課題では分子制御による精緻な設計に基づいて、ナノ融合分子集合体による融合材料の構築を行い、新機能開拓のアプローチの確立に取り組んだ。特に無機材料と有機材料の特性を巧みに融合して高度な機能を発現させる技術を確立し、得られた融合機能材料のバイオメディカル分野への応用展開を行った。具体的には、光線力学療法、オンデマンドドラッグデリバリー、中性子補足療法などに応用可能な新規材料をナノ融合分子集合体について検討した。近赤外光による光線力学療法のための融合マテリアルの開発においては、オレイン酸で被覆されたアップコンバージョン(UPC)蛍光ナノ粒子と脂質を複合化したナノクラスターを調製し、その疎水場にC70フラーレンを導入したナノハイブリッドクラスターを開発してきた。これまでにUPC蛍光粒子からの励起エネルギー移動に基づいて、近赤外光照射による一重項酸素発生を実現した。本年度はUPCの発光効率の向上やC70導入量の最適化を行い、光線力学活性の飛躍的な向上が達成された。また、中性捕捉療法用融合マテリアルの開発においては、REMOn(RE=希土類、M=B, Vなど)ナノ粒子を水熱プロセスや均一沈殿法等で合成し、領域内の阪市大長崎グループとの共同研究によりその機能評価を行った。粒子の毒性を軽減させるためコンドロイチン硫酸ナトリウムを被覆し、担がんマウスに静脈注射して導入後、腫瘍部位へ中性子線を照射した。その結果、従来のホウ素薬剤(ボロフェニルアラニン)に比べてより高い腫瘍増殖抑制効果を示した。ホウ素の高濃度化に有利な無機材料と、毒性軽減や腫瘍への集積効果をもつ有機分子との融合によって、バイオメディカル応用に有効な融合マテリアルの創成が実現した1.分子制御に基づくアップコンバージョン(UPC)ナノ粒子の開発生体組織への透過性が高い近赤外光を励起光源とするアップコンバージョン(UPC)蛍光体がバイオイメージングなど、バイオメディカル分野で注目を集めている。本研究課題では近赤外
AP1阻害感受性の差を利用した肺癌治療の新たな分子標的の同定

発癌に関わる転写因子AP1の阻害に対して、感受性のある肺癌細胞で特異的に発現の低下する27個の遺伝子をマイクロアレイを用いて同定した。この中で、DNA複製のライセンス化に関わるMCM4遺伝子に着目し、siRNAによる発現抑制が複数の肺癌細胞株の増殖を抑制することを見出した。肺癌切除標本を用いた免疫組織化学的検討では、MCM4蛋白質の発現が、Ki67などの増殖マーカーと有意な相関を示した。MCM4は肺癌の増殖に重要な役割を果たし、新たな分子標的となる可能性が示唆された。多くの増殖シグナルに関与する核内転写因子APIの主要成分であるcJunが肺癌において過剰発現している。研究代表者はc-jun dominamt negative negativeであるTAM67が、NCI-H520(H520)を除き、NCI-H1299(H1299)を含む複数の細胞株の増殖を抑制することを示してきた。H1299とH520のAP1阻害に対する感受性の差は、細胞増殖抑制に関わるAP-1の重要な下流遺伝子が、感受性細胞のH1299のみで制御されていることを示唆している。本研究では、2つの肺癌細胞におけるAP1下流遺伝子の網羅的解析を行い、感受性細胞H1299のみで発現が抑制される遺伝子を同定し、肺癌細胞における機能と、ヒト肺癌組織における発現変化を明らかにすることによって、肺癌治療の新しい分子標的を同定することを目的とした。本年度は、TAM67感受性細胞H1299と非感受性細胞H520において下流の遺伝子の発現変化をGene chipを用いて網羅的に解析を行ない、AP-1阻害感受性細胞で特異的に発現の低下する遺伝子27個をリスト化した。この中でDNA複製のライセンス化に関わる遺伝子minichromo some maintenance(MCM)4に着目し、TAM67による発現抑制を、定量的RT-PCR法とウエスタンブロット法によって確認した。NSCLC細胞3株において、siRNAによってMCM4蛋白質の発現を抑制すると、H1299を含む2株で細胞増殖抑制効果が認められた。以上より、MCM4はAP-1の下流でNSCLCの細胞増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。次年度は、MCM4の肺癌組織における発現を解析し、分子標的としての可能性を検討する。多くの増殖シグナルに関与する核内転与因于AP1の主要成分であるcJunが肺癌において過剰発現している。研究代表者はc-jun dominant negative mutantであるTAM67が、NCI-H520(H520)を除き、NCI-H1299(H1299)を含む複数の細胞株の増殖を抑制することを示してきた。本研究では、感受性細胞のみで発現が抑制される遺伝子を同定し、肺癌細胞における機能と、ヒト肺癌組織における発現変化を明らかにすることによって、肺癌治療の新しい分子標的を同定することを目的とした。昨年度までの研究で、TAM67感受性細胞H1299と非感受性細胞H520において下流の遺伝子の発現変化を網羅的に解析し、AP-1阻害感受性細胞で特異的に発現の低下する遺伝子をリスト化した。この中でDNA複製のライセンス化に関わる遺伝子minichromosome maintenance(MCM)4に着目し、TAM67による発現抑制を、定量的RT-PCR法とウエスタンブロット法によって確認した。本年度は、MCM4の肺癌組織における発現を、159症例の肺癌切除標本を用いた免疫組織化学法によって検討した。肺癌細胞におけるMCM4蛋白質は、近接する正常気管支上皮細胞より、有意に発現が亢進していた。MCM4の高発現は、重喫煙、低分化、非腺癌、Ki67陽性率、およびサイクリンEの発現と有意な相関を示した。予後との明らかな相関は認めなかった。以上より、MCM4はNSCLCの細胞増殖に重要な役割を果たしており、過剰発現の認められる非小細胞肺癌において、新たな分子標的となる可能性が示唆された。多くの増殖シグナルに関与する転写因子AP1の主要成分であるcJunが肺癌において過剰発現している。昨年度までに、H1299とH520における下流の遺伝子の発現変化を網羅的に解析し、AP-1阻害感受性細胞で特異的に発現の低下する遺伝子をリスト化した。

この中で、DNA複製のライセンス化に関わる遺伝子minichromosome maintenacce (MCM)4が、ヒト肺癌細胞で発現が亢進し、肺癌細胞の増殖に必須であることが示され、肺癌治療の新たな分子標的となる可能性が示された。本年度は、上記の遺伝子リストの中から、cJunによる線維芽細胞の悪性形質転換の主要なエフェクター因子として作用し、乳癌細胞において癌幹細胞の維持に必須であることが報告された細胞接着因子のインテグリンα6に着目した。TAM67によってH1299細胞でのインテグリンα6蛋白質の発現が抑制された。また、H1299細胞を含む複数の肺癌細胞株で、インテグリンα6に対する中和抗体が、足場依存性の細胞増殖を抑制し、更にclonogenicな足場非依存性増殖を著明に抑制されることが示された。インテグリンα6はcJunの下流で作用し、肺癌細胞の増殖に必須であること、更にclonogenicな増殖が著明に抑制されたことから、肺癌幹細胞の維持に関係している可能性が示唆された。
口腔扁平上皮癌のサイトケラチン19発現とテロメレース活性

扁平上皮癌の免疫組織染色の研究成果:1)組織学的文化度の低い扁平上皮癌組織が高いものより、G-SCF、G-CSFRともに発現率が高い。2)転位頸部リンパ節の扁平上皮癌組織が、その原発部位に比較してG-CSFRの発現率が高い。扁平上皮癌培養細胞(SCC25)による研究:培養扁平上皮癌細胞(SCC25)に対するG-CSF)の作用の検討にて知見が得られた。(第4回アジア口腔顎顔面外科学会、韓国済州島、2000年6月発表予定、accept済み)1)培養液中に1μg/ml濃度でG-CSFを添加すると、細胞増殖が有意に増加する。2)GーCSF添加、非添加培養液中のサイトカインの組成、濃度が異なる。上記より、扁平上皮癌細胞のGーCSFRを発現するクローンの中には転移浸潤能が高いものがあるのではないか、という関係が示唆された。口腔扁平上皮癌テロメレース活性の測定:現在、口腔扁平上皮癌組織のテロメレース活性測定、扁平上皮癌組織にテロメレースの高い活性があることを確認。現在上記の増殖能変化との関係を研究中。扁平上皮癌の免疫組織染色の研究成果:口腔扁平上皮癌患者血清中のCYFRA値とその扁平上皮癌組織のCytokeratin 19の発現。(投稿中);1)口腔扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしてCYFRAはSCC抗原と同等の陽性率,感受性,特異性を持つ。1)分化度の低い扁平上皮癌組織が,G-CSF,G-CSFRともに発現率(陽性細胞率)が高い。2)頸部リンパ節へ転移した扁平上皮癌組織が,G-CSFRの発現率(陽性細胞率)が高い。G-CSF,G-CSFRの発現,陽性細胞率が高い扁平上皮癌が,予後不良である,転移浸潤能が高いのではないか,という関係が示唆された。口腔扁平上皮癌テロメレース活性の測定:現在,口腔扁平上皮癌組織のテロメレース活性測定を収集中,症例数が少ないが,扁平上皮癌組織にテロメレースの高い活性があることを確認。
マラリア肝内型原虫の感染維持機構の解明

本研究ではマラリア原虫の肝細胞内寄生の分子的基盤を明らかにすることを目的とし、原虫遺伝子の発現解析、およびそれらの遺伝子の逆遺伝学的手法を用いた機能解析をおこなった。今年度以下の成果を上げた。1.中腸スポロゾイトおよび唾液腺スポロゾイトのESTの大量解析をおこなった。解析したEST数はそれぞれ1-2万である。解析データは今後、一般に公開する予定である。このことを視野に入れて、現在データベース化の作業をおこなっている。2.肝細胞感染ステージの原虫精製法を確立し、このステージのEST解析をおこなった。現在肝細胞感染30時間後の原虫の解析をおこなっている。今後さらに感染後の時間の異なる肝内型原虫を精製し、ESTの解析をおこなう。時間軸での遺伝子発現の変化を解析しその機能を知る手がかりとするとともに、肝臓感染維持機構の全体像を明らかにしたい。3.スポロゾイトEST解析データをもとに肝臓感染後にはじめて翻訳される2種類の遺伝子を同定した。免疫電顕法により感染細胞内での局在を調べたところ両者とも、原虫が感染肝細胞内に形成する寄生胞に局在することが明らかになった。これらの遺伝子をノックアウトし、原虫の肝臓への感染性を解析したとろ、約1万分の1まで感染性が低下した。従ってこれらの遺伝子が肝細胞内での感染維持に重要であることが分かった。現在、同様の手法を用い肝細胞感染に関わる新たな遺伝子を探索中である。4.上に述べた遺伝子の制御に関与する翻訳制御エレメント配列はmRNAの非翻訳領域に存在している可能性が高い。翻訳制御機構を解明する目的で、非翻訳領域を改変した原虫を複数作製した。これらの原虫を用い現在シス配列同定を試みている。
カルパイン及びカルパチスタン遺伝子発現検査技術の開発とその病因病態解析への応用

我々はヒト型のカルパインI,II及びカルパスタチン遺伝子と単離し、各遺伝子に対する特異的cDNAプロ-ブを作成した。また、遺伝子構造と機能の関係を詳細に研究し、カルパインI,IIの大サブユニット及びカルパスタチンの機能ドメインに特異的なアミノ酸配列部位を化学合成し、これらのオリゴペプチドを抗原として、それぞれに対する特異的モノクロナ-ル抗体を得た。これらの抗体を用い、各組織及び疾患におけるカルパインーカルパスタチンの分布、変動を探るサンドイッチ方式のELISA測定系を確立した。HTLVーI(成人T細胞性白血病ウィルス)感染ヒトリンパ球においてカルパインII及びカルパスタチンの遺伝子発現が特異的に上昇することを発見し、これを実験的に証明した。これら主研究に付随して、カルパスタチンは細胞内でリン酸化されるタンパク質であること、カルパインの一部は細胞膜と結合することも明らかにした。更に、機能的なカルパスタチンペプチドを化学合成し、これを培養細胞に導入することで、プロテインキナ-ゼCのダウンレギュレ-ションにカルパインが関与することを見出した。今後は、カルパインカルパスタチン遺伝子転写制御領域の解析、各種疾患における病態との関連性の追求、更にはカルパインーカルパスタチン系の生理的意義の検索が重要な課題である。カルパインは細胞内Ca^<2+>依存性プロテアーゼで、カルパスタチンはその内因性特異インヒビターである。両者の遺伝子発現の動態をmRNA及び翻訳蛋白質水準で捕える技術を開発し、これを臨床検査として実用化する基礎研究を行い、各種患者についての新しい病因病態情報を収集することが本研究の目的である。本年度は本研究計画の初年度に当り、まず基礎的生化学的研究と、臨床検査に関する基礎技術の開発研究を実施して次の成果を得た。1.カルパスタチンの構造機能相関に関する研究は、カルパスタチンのDNAプローブを得るために不可欠で、このためカルパスタチン全一次構造解析と、その部分ペプチドのカルパイン阻害作用の研究を行ったカルパスタチンには4つの相同ドメイン構造が存在し、その単独ドメインでも阻害活性を現わすことが明らかとなった。2.病態モデルとしてヒト造血系細胞、特にTリンパ球に関して、成人T細胞白血病レトロウイルス(HTLVーI)感染有無によるカルパイン及びカルパスタチンの遺伝子発現の様相を研究した。HTLVーI感染細胞では例外なくカルパインII及びカルパスチタンが強く発現していることが明らかとなった。3.ヒト・カルパインI及びIIに対して、そのアミノ酸配列から予想される相異なったエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製した。カルパインIに対しては極めて特異性の高い抗体が得られた。4.ヒト・カルパスタチンの全体分子及びその阻害活性ドメインに対するモノクローナル抗体の製作を進め、エピトープを異にする3種の抗体を得た。5.ヒト・カルパイン小サブユニットのDNAプローブを作製して、特異性を確認した。〔目的〕カルパインは細胞内カルシウム依存性プロテア-ゼで、カルパスタチンはその内因性特異インヒビタ-である。両者の遺伝子発現の動態をmRNA及び翻訳蛋白質水準で捕える技術を開発し、これを臨床検査として実用化する基礎研究を行い、各種患者についての新しい病因病態情報を集収することが本研究の目的である。〔経過および成果の概要〕ヒトカルパインには低カルシウム要求性のカルパインIと、高カルシウム要求性のカルパインIIとが存在し、それぞれ80kDa(大)および30kDa(小)サブユニットからなるヘテロ二量体である。小サブユニットは共通であるので、各大サブユニットにつき、それぞれに特徴的なアミノ酸配列部位をとらえてオリゴペプチドを合成し、これを免疫源として、それぞれ1種の高度特異モノクロイル抗体を得た。これに、両カルパイン共通の抗体を組合わせて、それぞれを識別する酵素免疫測定法の確立につき、なお実験中である。カルパスタチンには心筋等の全長M型と、赤血球等の短縮E型とが存在するので、この両者を識別するための特異抗体を作製することを試みた。このため、カルパスタチンの繰り返しドメインの各々に対するモノクロナル抗体数種を得て、そのうちの適宜の2種を組合わせたサンドイッチ法EIAとほぼ完成した。一方、カルパスタチンcDNAを用いた同mRNA定量法についても、特にドメイン3に対するcDNAを用いる方法につき、HOS細胞等を用いて検討中である。