hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異なる反応を示す糖質酵素の新規な立体構造に基づく分子解析と応用

近年の糖質酵素の分類は、構造の類似性からなされる。研究対象は、α-グルコシダーゼと相同する酵素グループであり、産業界で重要な酵素が属する。すなわちα-グルコシダーゼ、グルカンリアーゼ、環状4糖合成酵素とα-キシロシダーゼであり、4つの反応(加水分解・糖転移・環状化・脱離反応)を触媒する。本研究の目的は、我々が解析した本グループの立体構造に基づき、多様な反応の分子機構を明らかにし、得られた知見を応用研究に結びつけることにある。具体的には、X線解析法で得られた酵素-基質の分子認識を検討し、基質とアミノ酸の相互作用を解明;触媒アミノ酸の置換酵素の反応を解析し、触媒残基の機能を究明;4酵素は構造が類似するが全く異なる作用を示すので、個々の反応を発揮させる構造因子を解明;得られた知見から産業に重要な酵素を作製、である。本研究で得られた成果を述べる。(1)酵素-基質の立体構造から、α-キシロシダーゼの反応に重要なアミノ酸残基を予想した。その予想に基づいたアミノ酸置換をα-キシロシダーゼに行い、α-キシロシダーゼ活性を消失させ、α-グルコシダーゼ活性を発現させることに成功した。(2)解離型とプロトン化型の触媒基を決定し、機能を究明した(中間体安定とグルコシド結合切断)。(3)転移環状化と脱離反応の2つの作用は、反応中間体に水分子が攻撃(加水分解)しないことで生じると仮定し、加水分解型の酵素であるα-グルコシダーゼの触媒水(水解反応の水分子)を除去するようなアミノ酸変異を導入した。変異酵素は加水分解活性を失い転移作用のみを示すことが認められ、転移環状化と脱離の反応機構に関し初発ステップを実証できた。残り半分[分子内転移(環状化)と基質C2水素の引抜(脱離)]の解析が期待される。(4)α-グルコシダーゼのサブサイト+1にあるアミノ酸に変異導入すると、糖転移の結合生成能が変わり、新規な転移能力を示す酵素が得られた。有用なオリゴ糖の調製に成功した。近年の糖質酵素の分類は、構造の類似性からなされ、100近いファミリーに分けられる。我々の研究対象は、α-グルコシダーゼと相同するグループであり、産業界で重要な酵素が属する。本研究の目的は、我々が明らかにした本ファミリーの立体構造に基づき、多様な反応の分子機構を明らかにし、得られた知見を応用研究に結びつけることにある。具体的には、i)X線解析法で得られた酵素-基質の分子認識を検討し、実験的に基質とアミノ酸の相互作用を調べる。ii)触媒アミノ酸の置換酵素の反応を解析し、触媒残基の機能を究明する。iii)4酵素は構造が類似するが全く異なる作用を示すので、個々の反応を発揮させる構造エレメント(アミノ酸やループなどの部分構造)を解明する。iv)得られた知見から、産業界の要求に適う酵素を作製する。本年度に得られた研究成果を以下に示す。1)酵素-基質の立体構造から、α-キシロシダーゼの反応に重要なアミノ酸残基が予想された。

2)その予想に基づいたアミノ酸置換をα-キシロシダーゼに行い、α-キシロシダーゼ活性を消失させ、α-グルコシダーゼ活性を発現させることに成功した。他にも重要な構造エレメントがあるので、解析を進めている。3)複数のα-グルコシダーゼに関して、解離型とプロトン化型の触媒基を決定した。4)本ファミリーに属す酵素の立体構造解析を意図した結晶化を開始した。時間を要するため、次年度以降も継続させたい。近年の糖質酵素の分類は、構造の類似性からなされ、100近いファミリーに分けられる。我々の研究対象は、α-グルコシダーゼと相同するグループであり、産業界で重要な酵素が属する。すなわちα-グルコシダーゼ、グルカンリアーゼ、環状4糖合成酵素とα-キシロシダーゼであり、4つの反応(加水分解・糖転移・環状化・脱離反応)を触媒する。本研究の目的は、我々が明らかにした本ファミリーの立体構造に基づき、多様な反応の分子機構を明らかにし、得られた知見を応用研究に結びつけることにある。具体的には、i)X線解析法で得られた酵素-基質の分子認識を検討し、実験的に基質とアミノ酸の相互作用を調べる。ii)触媒アミノ酸の置換酵素の反応を解析し、触媒残基の機能を究明する。iii)4酵素は構造が類似するが全く異なる作用を示すので、個々の反応を発揮させる構造エレメント(アミノ酸やループなどの部分構造)を解明する。iv)得られた知見から、産業界の要求に適う酵素を作製する。本年度の研究成果を以下に示す。1)我々が得た立体構造から脱離酵素の触媒アミノ酸を予想し、それに基づいた解析を進めている。2)生澱粉吸着を行うドメインと蛍光タンパク質との融合体を構築し、吸着の動的解析や直接関与のアミノ酸残基の決定に成功した。3)細菌α-グルコシダーゼについて、糖転移作用を支配するアミノ酸残基を決定し、本反応を飛躍的に増加させることに成功した。また、加水分解の際に、基質分子のサイズを認識し、結合特異性を支配するアミノ酸を決定した。4)細菌酵素に関しX線結晶構造解析に成功した。基質複合体の結晶も得られたので、構造解析を進行中である。近年の糖質酵素の分類は、構造の類似性からなされる。研究対象は、α-グルコシダーゼと相同する酵素グループであり、産業界で重要な酵素が属する。本研究の目的は、我々が解析した本グループの立体構造に基づき、多様な反応の分子機構を明らかにし、得られた知見を応用研究に結びつけることにある。具体的には、a)X線解析法で得られた酵素-基質の分子認識を検討し、実験的に基質とアミノ酸の相互作用を調べる。b)触媒アミノ酸の置換酵素の反応を解析し、触媒残基の機能を究明する。c)4酵素は構造が類似するが全く異なる作用を示すので、個々の反応を発揮させる構造因子を解明する。d)得られた知見から産業に重要な酵素を作製する。本年度の成果を以下に示す。環状化反応の2つ特徴を検証した。すなわち、1)反応中間体への水分子の攻撃が起らずに転移反応が優先、2)基質分子内での転移である。・α-グルコシダーゼの触媒水を立体構造から予測し、触媒水を固定するアミノ酸を置換した。
ロボットを援用した人工膝関節の動態計測と耐久性評価に関する研究

本研究目的は,ロボットを援用して人工膝関節の動態計測と耐久性評価を行うことである.単面投影像のみから物体の動態推定を行う計測手法を人工膝関節のX線撮影像に応用すれば,簡便かつ非侵襲的な人工膝関節の動態計測が可能となり,臨床的応用価値も高い.上記の動態推定アルゴリズムの代表例であるBanksら(1996)のアルゴリズムには臨床応用上,いくつかの問題点が残されていたため,本研究ではまず,このアルゴリズムの改良に取り組み,以下の成果を得た.1)Banksらのパターンマッチングアルゴリズムを改良した二段階推定法の採用により,高速・高精度推定を実現した.2)オーバーラップ像に対し,曲線補間とクリッピング処理を併用することにより,高精度かつ効率的な推定が可能であることを確かめた.3)大腿骨コンポーネントとポリエチレンインサート間の幾何学的接触モデル式を導出した.4)シミュレーションと実験で,奥行き方向の推定精度改善と,関節面間の接触点導出を行った.次に,歩行計測で求めた人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢をロボットで再現し,in-vitro条件下で人工関節投影像をCCDカメラで撮影した.しかる後,得られたCCD像と上記X線画像とをピクセルごとに照合し,X線像からのin vivoデータの妥当性検証や本アルゴリズムの精度検定を行った.また,人工関節置換術直後の患者のFluoroscope画像を収集・解析し,人工関節の装着アライメントや片当りの有無などを評価した.本研究目的は,ロボットを援用して人工膝関節の動態計測と耐久性評価を行うことである.単面投影像のみから物体の動態推定を行う計測手法を人工膝関節のX線撮影像に応用すれば,簡便かつ非侵襲的な人工膝関節の動態計測が可能となり,臨床的応用価値も高い.上記の動態推定アルゴリズムの代表例であるBanksら(1996)のアルゴリズムには臨床応用上,いくつかの問題点が残されていたため,本研究ではまず,このアルゴリズムの改良に取り組み,以下の成果を得た.1)Banksらのパターンマッチングアルゴリズムを改良した二段階推定法の採用により,高速・高精度推定を実現した.2)オーバーラップ像に対し,曲線補間とクリッピング処理を併用することにより,高精度かつ効率的な推定が可能であることを確かめた.3)大腿骨コンポーネントとポリエチレンインサート間の幾何学的接触モデル式を導出した.4)シミュレーションと実験で,奥行き方向の推定精度改善と,関節面間の接触点導出を行った.次に,歩行計測で求めた人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢をロボットで再現し,in-vitro条件下で人工関節投影像をCCDカメラで撮影した.しかる後,得られたCCD像と上記X線画像とをピクセルごとに照合し,X線像からのin vivoデータの妥当性検証や本アルゴリズムの精度検定を行った.また,人工関節置換術直後の患者のFluoroscope画像を収集・解析し,人工関節の装着アライメントや片当りの有無などを評価した.本研究目的は,ロボットを援用して人工膝関節の動態計測と耐久性評価を行うことである.単面投影像のみから物体の動態推定を行う計測手法を人工膝関節のX線撮影像に応用すれば,簡便かつ非侵襲的な人工膝関節の動態計測が可能となり,臨床的応用価値も高い.上記の動態推定アルゴリズムの一つにBanksら(1996)の考案によるパターンマッチング法がある.しかしながら,Banksらのアルゴリズムには臨床応用上,いくつかの問題点が残されていたため,本研究ではまず,このアルゴリズムの改良に取り組み,以下の成果を得た.1)Banksらのパターンマッチングアルゴリズムを改良した二段階推定法の採用により,高速・高精度推定を実現した.2)オーバーラップ像に対し,曲線補間とクリッピング処理を併用することにより,高精度かつ効率的な推定が可能であることを確かめた.3)大腿骨コンポーネントとポリエチレンインサート間の幾何学的接触モデル式を導出した.4)シミュレーションと実験で,奥行き方向の推定精度改善と,関節面間の接触点導出を行った.次に,本研究で開発した人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢推定アルゴリズムを装着者歩行時における人工関節のX線像に適用し,当該アルゴリズムの推定精度や汎用性などを検定した.まず,各種の人工関節装着者を対象に,歩行時の人工関節動態のX線連続画像および床反力データを収集,統計処理し,人工関節の相対位置・姿勢データと力データを合成したデータを生成した.次に,前記の歩行計測で求めた人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢をロボットで再現し,in vitro条件下で人工関節投影像をCCDカメラで撮影した.しかる後,得られたCCD画像と上記X線画像とをピクセルごとに照合し,X線像からのin vivoデータの妥当性検証や本アルゴリズムの精度検定を行った.本研究目的は,ロボットを援用して人工膝関節の動態計測と耐久性評価を行うことである.単面投影像のみから物体の動態推定を行う計測手法を人工膝関節のX線撮影像に応用すれば,簡便かつ非侵襲的な人工膝関節の動態計測が可能となり,臨床的応用価値も高い.上記の動態推定アルゴリズムの一つにBanksら(1996)の考案によるパターンマッチング法がある.しかしながら,Banksらのアルゴリズムには臨床応用上,いくつかの問題点が残されていたため,本研究ではまず,このアルゴリズムの改良に取り組み,以下の成果を得た.1)Banksらのパターンマッチングアルゴリズムを改良した二段階推定法の採用により,高速・高精度推定を実現した.2)オーバーラップ像に対し,曲線補間とクリッピング処理を併用することにより,高精度かつ効率的な推定が可能であることを確かめた.

3)大腿骨コンポーネントとポリエチレンインサート間の幾何学的接触モデル式を導出した.4)シミュレーションと実験で,奥行き方向の推定精度改善と,関節面問の接触点導出を行った.次に,本研究で開発した人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢推定アルゴリズムを装着者歩行時における人工関節のX線像に適用し,当該アルゴリズムの推定精度や汎用性などを検定した.まず,各種の人工関節装着者を対象に,歩行時の人工関節動態のX線連続画像および床反力データを収集,統計処理し,人工関節の相対位置・姿勢データと力データを合成したデータを生成した.次に,前記の歩行計測で求めた人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢をロボットで再現し,in vitro条件下で人工関節投影像をCCDカメラ撮影した.しかる後,得られたCCD像と上記X線画像とをピクセルごとに照合し,X線像からのin vivoデータの妥当性検証や本アルゴリズムの精度検定を行った.最後に,人工関節置換術直後の患者のFluoroscopy画像を収集し,現在,解析中である.本研究目的は,ロボットを援用して人工膝関節の動態計測と耐久性評価を行うことである.単面投影像のみから物体の動態推定を行う計測手法を人工膝関節のX線撮影像に応用すれば,簡便かつ非侵襲的な人工膝関節の動態計測が可能となり,臨床的応用価値も高い.本研究ではまず,このアルゴリズムの改良・開発に取り組み,以下の成果を得た.本研究で開発した人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢推定アルゴリズムを装着者歩行時における人工関節のX線像に適用し,当該アルゴリズムの推定精度や汎用性などを検定した.まず,各種の人工関節装着者を対象に,歩行時の人工関節動態のX線連続画像および床反力データを収集,統計処理し,人工関節の相対位置・姿勢データと力データを合成したデータを生成した.次に,前記の歩行計測で求めた人工関節コンポーネントの三次元位置・姿勢をロボットで再現し,in vitro条件下で人工関節投影像をCCDカメラ撮影した.しかる後,得られたCCD像と上記X線画像とをピクセルごとに照合し,X線像からのin vivoデータの妥当性検証や本アルゴリズムの精度検定を行った.最後に,人工関節置換術直後の患者のFluoroscopy画像を収集し,解析を行った.以上の研究成果については,著名な英文ジャーナルMedical Biological Engineering&Computingに投稿(2編)した.ただし,当該誌への掲載が早くて翌年度(平成20年度)になると見込まれたため,その掲載費用のために科研費繰り越し手続きを行った.その後,ジャーナルエディターより,2編の論文を1編に集約すること,また,出版社より電子掲載の適用で掲載費の大幅減額が可能となった旨,通知があり,予定していた繰越金に剰余が生じた.予定していた論文掲載(および別刷り)費用以外の剰余を他目的で使用することはできないため,残額返金の措置を講じた.
フェムト秒近赤外分光による芳香族高分子中の非局在化カチオン状態の時間発展の研究

側鎖に大きな芳香族基を持つビニルポリマーは、側鎖芳香族基間のホールマイグレーション(電荷シフト反応)によって光電性を示す。我々は、レーザー光の偏光特性と短時間パルス性を利用した過渡吸収二色性の測定を行い、(a)側鎖間の電荷シフト反応は、(サブナノ秒)^<-1>から(ナノ秒)^<-1>程度の速度定数で進行し、電子移動理論から予測される値の10^3から10^9倍と非常に大きいこと、また、(b)この速度定数は活性化エネルギーをほとんど必要としない(溶液中で<<12kcal/mol、固体系では室温から77Kまで速度定数は変化しない)ことを示した。しかし、電荷分離直後のイオン対が対間距離を増大させる過程(A^-D^+D→A^-DD^+)はクーロン引力に逆らう吸熱過程であり、初期電荷シフト反応に対し見積もられるエネルギー差は、中極性媒体中でも数十Kcal/molと大きく、(a)、(b)の結果は全く説明が付かない。この実験結果(a)(b)の解釈のために、芳香族基にカチオンが非極在化したときに現れる近赤外部の電荷共鳴帯の吸収スペクトルの精度良い測定や、カチオン吸収二色性の絶対量の時間発展を検討し、相互作用、非局在化の時間発展、それを支配する因子について検討した。その結果、電荷分離直後にいくつかの芳香族基に非局在化したカチオン状態が3-5psの時定数生成し、非局在化カチオンとして振る舞うことによって対間距離を実質的に伸ばしクーロン引力を軽減し、かつ電子移動反応における再配向エネルギーの低下を引き起こすと考えられる結論を得た。このような非局在化の過程により生成したカチオン状態の平均サイズが、従来のOnsagerモデルで考えられてきた熱化距離と対応することを提案した。また、近赤外の電荷共鳴帯の測定も行い、上記の考えを支持する結果を得た。側鎖に大きな芳香族基を持つビニルポリマーは、側鎖芳香族基間のホールマイグレーション(電荷シフト反応)による光電性を示す。我々は、レーザー光の偏光特性と短時間パルス性を利用した過渡吸収二色性の測定を行い、(a)側鎖間の電荷シフト反応は、(サブナノ秒)^<-1>から(ナノ秒)^<-1>程度の速度定数で進行し、電子移動理論から予測される値の10^3から10^9倍と非常に大きいこと、また、(b)この速度定数は活性化エネルギーをほとんど必要としないことを示した。これらの実験結果の解釈のために、電荷分離直後にいくつかの芳香族基に非局在化したカチオン状態が生成し、非局在化カチオンとして振る舞うと考えるモデルを提案した。この非局在化カチオン状態の生成を検証するために、以下の近赤外部の測定を計画した。PVCz系では芳香族基間に非局在したカチオンは、近赤外部(1から1.7μm)に電荷共鳴(Charge Resonance : CR)帯といった特徴的な吸収を示す。このCR帯の極大位置は相互作用の程度に対して定量的な知見を与える。したがって非局在化の程度を、このCR帯の位置や形状、またその時間依存性から情報を取得することが可能である。平成14年度はこの測定を行うために、近赤外部のマルチチャンネル検出器を購入しソフトウェア、ハードウェア、また近赤外部のピコ秒モニター光源の検討などを含めた時間分解システムの作成を行った。現在は装置の開発をほぼ完了し、参照資料などを用いた最終的な検定を行っている。

また、既存のピコ秒レーザーを励起光源として、ホール移動に関連した電荷共鳴吸収のピコ秒領域での時間変化を溶液系を対象に測定を行い、実際にポリマー系の測定が可能であることを確認した。来年度は、本装置を用いピコ秒、フェムト秒領域の近赤外部の本格的な測定を行う。側鎖に大きな芳香族基を持つビニルポリマーは、側鎖芳香族基間のホールマイグレーション(電荷シフト反応)によって光電性を示す。我々は、レーザー光の偏光特性と短時間パルス性を利用した過渡吸収二色性の測定を行い、(a)側鎖間の電荷シフト反応は、(サブナノ秒)^<-1>から(ナノ秒)^<-1>程度の速度定数で進行し、電子移動理論から予測される値の10^3から10^9倍と非常に大きいこと、また、(b)この速度定数は活性化エネルギーをほとんど必要としない(溶液中で<<12kcal/mol、固体系では室温から77Kまで速度定数は変化しない)ことを示した。しかし、電荷分離直後のイオン対が対間距離を増大させる過程(A^-D^+D→A^-DD^+)はクーロン引力に逆らう吸熱過程であり、初期電荷シフト反応に対し見積もられるエネルギー差は、中極性媒体中でも数十Kcal/molと大きく、(a)、(b)の結果は全く説明が付かない。この実験結果(a)(b)の解釈のために、芳香族基にカチオンが非極在化したときに現れる近赤外部の電荷共鳴帯の吸収スペクトルの精度良い測定や、カチオン吸収二色性の絶対量の時間発展を検討し、相互作用、非局在化の時間発展、それを支配する因子について検討した。その結果、電荷分離直後にいくつかの芳香族基に非局在化したカチオン状態が3-5psの時定数生成し、非局在化カチオンとして振る舞うことによって対間距離を実質的に伸ばしクーロン引力を軽減し、かつ電子移動反応における再配向エネルギーの低下を引き起こすと考えられる結論を得た。このような非局在化の過程により生成したカチオン状態の平均サイズが、従来のOnsagerモデルで考えられてきた熱化距離と対応することを提案した。
軟体動物の筋収縮調節と温度適応に関する研究

筋収縮を神経刺激に応じて制御するタンパク質であるトロポニン-トロポミオシンについて、軟体動物のものは古くから研究されてきた脊椎動物のものとは異なるメカニズムで作用することを明らかにした。また、このメカニズムが他の無脊椎動物にも存在する普遍的なものである可能性を示した。さらに、軟体動物が、特性の異なるトロポニンの様々な分子種を筋細胞内に作り出し、それが温度環境への適応や、種毎の生態の相違に関連している可能性も示した。(1)軟体動物筋トロポニン-トロポミオシン収縮調節系の分子作用機構を明らかにする(2)軟体動物筋の収縮調節機構と温度適応の関連を明らかにする筋収縮を神経刺激に応じて制御するタンパク質であるトロポニン-トロポミオシンについて、軟体動物のものは古くから研究されてきた脊椎動物のものとは異なるメカニズムで作用することを明らかにした。ウサギまたはアカザラガイの筋収縮調節タンパク質であるトロポニン(Tn)の収縮抑制サブユニット(TnI)について、一次構造上の異なる3つの部位に、唯一のCysを含む変異体を大腸菌発現によって作成した。これらのCysを蛍光ドナー試薬(IAEDANS)でラベルした後、他のサブユニット(TnCおよびTnT)とともにTnを構成させた。一方、アクチンのCys-374を蛍光アクセプター試薬(DABMI)でラベルし、前述のTn、および、トロポミオシンと混合して、筋原線維中のアクチンフィラメントに相当する複合体を調製した。蛍光エネルギー移動法により、ドナー・アクセプター間の距離を求めた結果、ウサギTnIのCys-133について、Ca^<2+>非存在時/存在時におけるアクチンとの距離は4.17nm/5.47nmであった。この結果は既報と良く一致しており、TnIのCys-133付近がCa^<2+>非存在時にはアクチンに結合して収縮を抑制し、Ca^<2+>存在時にはアクチンから離れて収縮の抑制が解除されるという、近年提唱されているTnの作働機構を反映していると考えられた。一方、アカザラガイTnIのCys-133に相当する部位を同様にラベルして実験を行うと、アクチンとの距離はCa^<2+>非存在/存在時に、3.89nm/4.37mと見積もられ、Ca^<2+>の有無に関わらずアクチンと接近していることがわかった。さらに、蛍光ドナー試薬に代えて、二価性架橋試薬(BP-Mal)を導入し、この部位に近接するサブユニットの同定を行ったところ、ウサギでは、Ca^<2+>非存在時にアクチン、存在時にはTnCに近接していることが示されたのに対し、アカザラガイでは、Ca^<2+>の有無にかかわらずTnTに近接していた。以上の結果より、軟体動物Tnにおいては、TnIのCys-133付近の機能や高次構造が脊椎動物Tnとは大きく異なっていることが示された。1.アカザラガイの精巣よりゲノムDNAを調製し、トロポニンI(TnI)をコードするcDNAをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、TnI遺伝子はシングルコピーであることが示唆された。さらに、cDNAの塩基配列に基づくプライマーを用いたゲノミックPCRにより、幾つかのTnI遺伝子断片が得られ、それらのサイズから、遺伝子の全長は40から50kbp以上に及ぶことが示唆された。TnIのC端側(89残基)をコードする領域については、5460bp全配列を決定し、この領域に7つのイントロンの存在を確認した。他生物TnI遺伝子との配列比較により、これらのイントロンのうち、イントロンaは、動物界に広く保存されている一方、イントロンbは、脊索動物以外にのみ存在しており、無脊椎動物から原始脊索動物が分岐した後に失われたと考えられた。また、イントロンcに見られる38-110bpの塩基配列と相同な配列が、近縁種であるアズマニシキガイのゲノムの複数箇所に存在することが明らかになった。2.軟体動物トロポニンの分子作動機構についての知見を得るため、Biacore(表面プラズモン共鳴法)を用いて、サブユニット間相互作用の解析を行った。その結果、アカザラガイでは、トロポニンT(TnT)がトロポミオシンとほとんど相互作用しないことが明らかになった。また、TnIとトロポニンC(TnC)の相互作用をEDTA、Mg+EGTA、Mg+Ca存在下で比較したところ、EDTAとMg+EGTA存在下では結合定数に差違がなく、Mg+Ca存在下ではMg+EGTA存在下よりも約8倍結合定数が増大した。一方、ウサギTnIとTnC間の相互作用は、Mgの存在によって約8倍、さらにCaが存在すると、約40倍増強し、軟体動物トロポニンでは、二価金属に依存した高次構造変化が小さいことが示唆された。1.前年度に引き続き、アカザラガイ精巣から抽出しだゲノムDNAをテンプレートとしたPCRにより、トロポニンI(TnI)遺伝子の構造解析を進めた。今年度は、TnIのN端側をコードする11,810bpの塩基配列を決定した。

この領域は、大部分がイントロンであり、このイントロンは、横紋閉殻筋における主要アイソフォームである52K-TnIおよび平滑閉殻筋に多く比較的高温の条件でも機能できる19K-TnIの、両方のmRNAに共通する配列と、19K-TnIのmRNAのみに見られる配列から成るエキソンに挟まれていた。さらにこのイントロンに、近縁二枚貝であるアズマニシキのHSP70遺伝子の塩基配列と相同性を示す部位が見出された。HSP70は熱ストレスで発現誘導されるタンパク質であることから、この配列がTnIアイソフォームやHSP70の温度依存的な発現制御に関わっている可能性も考えられた。2.軟体動物トロポニンの分子作動機構についての知見を得るため、52K-TnI(全長292残基)の種々の部位に唯一のCysを導入した変異体を作成し、二価性光架橋試薬(BP-Mal)でラベル後、トロポニンC(TnC)およびトロポニンT(TnT)と共に再構成トロポニンとし、さらに光照射後、架橋産物を分析することで、それぞれの部位がいずれのサブユニットと近接しているかを検討した。その結果、52K-TnIのみに存在する残基8、26、48、73、90、および115はいずれもほとんど架橋産物を生じず、これらがTnCやTnTから空間的に離れていることが示された。一方、両アイソフォームに共通する残基147、149、160、並びに162は主にTnCとの架橋産物を生じ、さらにこれらの残基とTnCの距離はCa^<2+>依存的に変化していることが示された。また、残基200および266はCa^<2+>の有無に関わらずTnTに近接していた。(1)アカザラガイ・トロポニンCのC末端ドメインと、このドメインと結合する部位を含むトロポニンIの断片を調製し、両者の結合を等温滴定型カロリメトリーによって解析した結果、結合はMg^<2+>によって変化しないが、Ca^<2+>の存在によって約3倍強くなることが示され、この相互作用の変化が筋収縮の引き金になっていることが示唆された。また、化学架橋試薬を用いた検討により、この時、トロポニンIの残基147付近がトロポニンCから遠ざかる一方、残基160付近は逆にトロポニンCに接近するような構造変化をしていることが明らかになった。(2)寒水域に生息するホタテガイと、より暖水域に生息するアカザラガイの間で、横紋閉殻筋に存在するトロポニンCの2つのアイソフォーム(ShortタイプとLongタイプ)の比率が異なることが明らかになった。両アイソフォームはC末端ドメインの8残基のみが異なるが、それぞれの筋収縮調節能を比較したところ、ホタテガイに多いLongタイプの方がより低いCa^<2+>濃度で収縮を活性化させることが明らかとなった。これは、ホタテガイの横紋閉殻筋がアカザラガイのものより速く収縮・弛緩することを意味しており、ホタテガイの低水温への適応や、アカザラガイが岩着生であるのに対し、ホタテガイは底生性で遊泳のために速く殻を開閉させ必要がある等、生態の相違にも関連すると考えられた。(3)節足動物(アメリカンロブスター)のトロポニンCについて、N末端およびC末端ドメインのいずれか一方にしかCa^<2+>を結合しない変異体を作成し、その機能を野生型トロポニンCと比較したところ、C末端ドメインにしかCa^<2+>を結合しない変異体もある程度の筋収縮活性化能を持つことが示された。従って、C末端ドメインへのCa^<2+>結合による筋収縮活性化の機構は、軟体動物のみならず節足動物にも存在し、動物界に普遍的に存在する可能性が示された。
癌細胞から正常細胞への細胞外プッシュミーアウトシグナル関連分子の同定

上皮細胞層に、がん変異細胞が生じた時、その変異細胞は正常細胞層から排除される。この現象は、変異細胞が単独で存在するときには見られない。そのため、変異細胞側からシグナル発信により、正常細胞の抗腫瘍能を惹起していると考えられる。しかし、この変異細胞からのシグナルの実体は不明である。正常細胞で発現が亢進している遺伝子の更に下流で発現しているタンパク質に注目したところ、プロスタグランジン群であることが分かった。種々の解析から、特定のプロスタグランジンが変異細胞の逸脱能を抑制していることがわかった。本研究から、変異細胞自身が逸脱しようとすることを、正常細胞側からのシグナルが制御することが明らかとなった。変異細胞からの細胞外シグナルが、正常細胞の抗腫瘍作用を惹起することが分かってきた。例えば、S1Pの受容体が変異細胞に発現しており、正常細胞から放出されるS1Pが変異細胞の逸脱を正に制御していることが分かってきた。しかしながら、変異細胞側から正常細胞に作用する細胞外シグナル因子は、現在のところ分かっていない。変異細胞と正常細胞の共培養特異的に正常細胞内で発現している遺伝子群は既にマイクロアレイ解析により同定している。これを基に、同定された遺伝子が実際に正常細胞側、変異細胞側どちらで発現しているかを確認した。方法としては、共培養した変異細胞と正常細胞をセルソーティングによりそれぞれを分離し、それぞれの細胞における遺伝子発現を定量的PCRにて解析した。その結果、マイクロアレイで発現が同定された遺伝子の一部について、定量的PCRでも発現が亢進していることが確認された。現在、これら遺伝子の内在性発現をモニターするためのレポーターアッセイ正常細胞をCRISPR/Cas9システムを基にしたノックイン法により作製している。作製はほぼ終了しており、正常細胞との共培養で、レポーターアッセイに適した細胞をイメージングアナライザーによって選別しているところである。今後は、選別されたレポーター正常細胞とプールドsgRNAライブラリーを感染させた変異細胞とを混合し、スクリーニングに進む予定である。マイクロアレイ解析で同定した共培養特異的に発現する遺伝子について、実際に正常細胞において発現しているかを定量的PCR法にて確認しようとした。その時のセルソーティングにおける細胞の回収率が低かったため、十分なRNA量を得ることができなかった。十分なRNA量を得るために、スケールアップし、セルソーティングを行うための条件検討に時間を要した。しかし、本年度ではCRISPRスクリーニングに着手できると段階にあり、概ね計画通りに進展していると考えている。概要としては、同定した遺伝子の解析をおこなっている過程で、液性因子の上流であることが分かった転写因子COX-2が発現亢進していることに注目した。COX-2の正常細胞側でのノックアウトは、変異細胞の排除効率を促進した。COX-2の下流で発現を制御されている同液性因子は、プロスタグランジン・ファミリーに属し、正常細胞から放出され、変異細胞の逸脱効率を負に制御することが分かってきた。このことから、正常細胞側からのシグナルも変異細胞の排除を制御することが分かってきた。当初の目的としていた、変異細胞と正常細胞のコミュニケーションに関与する細胞外シグナルを同定するという目的は達成された。さらなる解析をするため、作製したレポーター細胞を用いて、CRISPR/Cas9スクリーニングをおこなう予定である。本年度は、プールドsgRNAライブラリーを持ちたスクリーニングを主に行う。1.全ゲノムを対象としたCRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトスクリーニング変異細胞にプールドsgRNA/Cas9発現レンチウイルスライブラリーを感染させる。感染させた変異細胞を1ウェルあたり1細胞になるように、予め正常細胞を播種した1536ウェルプレートに撒く。両種細胞が接着した後、テトラサイクリンにてGFP-RasV12の発現を誘導し、周辺正常細胞の蛍光をイメージングアナライザーにて定量的に解析する。ノックアウトによって蛍光が減弱しているウェルにて、単一細胞ジェノタイピングをおこなう。これにより、sgRNAのガイド配列部位のみをPCRにより増幅し、ターゲット遺伝子を同定する。ライブラリーのスケールは、(全遺伝子数)

X(一遺伝子に対して4 sgRNA)= 80000のsgRNAが含まれる。このため、スクリーニングに約52枚の1536ウェルプレートを使い、一次スクリーニングを二回おこなう。最終的に、全ゲノムより100遺伝子程度まで絞り込む。2.検証スクリーニングおよび生化学的手法による検証検証二次スクリーニングでは、1.で作製した他のCCI遺伝子発現をモニターできるレポーター細胞を用いて、さらなる絞り込みをおこなう。最終的には、ヒト、マウス細胞もしくは、すでに細胞競合が見やすいMDCK細胞にて、共焦点顕微鏡下で細胞競合の有無を確認する。28年度が最終年度であるため、記入しない。生物学28年度が最終年度であるため、記入しない。
２次元半導体ＭｏＳ２トランジスタにおける界面特性の理解と制御

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
高齢者の運動トレーニングによる血漿蛋白質増加機構と血液量・体温調節能への効果

平成14年度は、一過性の高強度インターバル運動後の血漿量および血漿蛋白量の変化を若年者と高齢者また、サプリメント摂取が血漿蛋白量と血漿量を増加させるか否かを検討した。その結果、高齢者では運動後の血漿蛋白質量および血漿量増加機能が減弱していること、さらに、運動直後の糖質蛋白質サプは、若年者、高齢者両群において、これらの機能を改善することが明らかとなった。平成15年度は、実際に持久性運動トレーニングを行った際、サプリメント摂取群では非摂取群に比べ血液量の増加が亢進しているか、もし、亢進している場合、それは好気的運動能、体温調節能をより改善するのに役だっているか、の2点について検討した。その結果、蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセボ摂取群に比べて、持久性トレーニング後に血液量、下肢骨格筋量の増加が亢進し、それらと共に最大酸素摂取量、体温調節能の増加も亢進した。平成16年度は、平成15年度の高齢者の結果について若年者においても同様の結果が得られるか、否かを検討した。その結果、蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセボ摂取群、両群とも、持久性トレーニング後に血液量、心拍出量、最大酸素摂取量、体温調節能の増加が亢進した。また、体温調節能は、蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセボ摂取群に比べ優位に改善した。しかし、血漿蛋白質量、血漿量はサプリメント群で、プラゼボ群に比べ、増加傾向は認めたものの有意差を認めなかった。今後、トレーニングの運動強度、体温調節反応の検査条件を変えて、検討する必要がある。以上、運動直後の蛋白質サプリメントの摂取は、若年者、高齢者において、運動トレーニング後の体温調節能の改善を増強することが明らかとなった。これに、血漿量の増加がどのように関与しているか、は今後の研究課題である。本研究では、一過性の高強度インターバル運動後のPVおよび血漿蛋白量の変化を若年者と高齢者で比較した。また、サプリメント摂取が血漿蛋白量とPVを増加させるか否かを検討した。被検者は、健常な若年(Y群、21±1歳(mean±SE))および高齢男性(O群、68±2歳)各8人とした。各被検者は実験前日の夕食、運動負荷当日の3食、さらに翌日朝食は体重当たり一定の栄養成分の食事を摂取させた。運動負荷当は10:00の朝食後、1時間の座位安静の後PVの初期値を測定を行った。続いて11:30に、72分間の高強度インターバル運動(80%VO_<2peak>4分間の自転車エルゴメータ運動を20%VO_2peak5分間の運動を挟んで8セット)の直後に、蛋白質・糖質サプリメント(CHO-pro;総熱量、3.1kcal/kg;総蛋白量、0.18g/kg)あるいはプラセボ(Placebo;総熱量、0.5kcal/kg;総蛋白量、0.00g/kg)を摂取する2条件で行った。その後、5時間の安静座位の後17:00に帰宅させた。翌日7:00に実験室にて朝食を摂取後、約3時間安静座位を保たせ、10:00に採血を行い、運動前値に対するPV(ΔPV)および血漿総蛋白変化量(ΔTP_<cont>)変化量を測定した。ΔTP_<cont>は、placebo摂取群で、Y群、O群でそれぞれ、-36.9±25.0、-60,6±16.4mg/

kgであったが、CHO-pro摂取群では55.5±31.3、9.6±9.9mg/kgであり、Y群、O群共に有意に増加した。この際、ΔTP_<cont>は、サプリメント摂取の有無に関わらず、O群はY群に比べて有意に低値を示した。ΔPVは、placebo摂取群ではY群、O群でそれぞれ、0.36±0.20、0.45±0.42ml/kgであったが、CHO-pro摂取群では1.35±0.62、2.03±0.31ml/kgであり、Y群、O群共有意に増加した。以上の結果から、高齢者では若年者に比べ運動後の血漿蛋白質量および血漿量増加機能が減弱していること、さらに、運動直後の糖質蛋白質サプリメント摂取は、若年者、高齢者両群において、これらの機能を改善することが明らかとなった。前年度の研究によって、高齢者では若年者に比べ運動後の血漿蛋白質量および血漿量増加機構が減弱していること、さらに、運動直後の糖質蛋白質サプリメント摂取は、若年者、高齢者両群において、これらの機能を改善することを明らかにした。そこで、今年度はこれらの研究結果を踏まえ、実際に持久性運動トレーニングを行った際、サプリメント摂取群では非摂取群に比べ血液量の増加が亢進しているか、もし、亢進している場合、それは好気的運動能、体温調節能をより改善するのに役だっているか、の2点について検討した。健常な高齢男性を対象とし、それを糖質蛋白質サプリメント摂取群(n=8)と非摂取群(n=8)の2群に分け、それぞれ8週間の持久性運動トレーニング(最大酸素摂取量の6075%の運動強度で60分間を、3回/週、計24回)を行わせた。毎回の運動直後にサプリメントあるいはプラセボを摂取させた。トレーニング前後に血液量(Evans Blue希釈法)、下肢骨格筋量(MRI法)、最大酸素摂取量、および気温30°Cの環境下において、最大酸素摂取量の60%の運動強度で20分間の自転車こぎ運動を行った際の体温調節能を測定した。その際、運動中の心拍出量(ICG法)を測定した。その結果、蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセぼ摂取群に比べて、持久性トレーニング後に血液量、下肢骨格筋量の増加が亢進し、それらと共に最大酸素摂取量、体温調節能の増加も亢進した。これまでの研究によって、高齢者では若年者に比べ運動後の血漿蛋白質量および血漿量増加機構が減弱していること、さらに、運動直後の糖質蛋白質サプリメント摂取は、若年者、高齢者両群において、これらの機能を改善することを明らかにした。さらに、昨年年度は、高齢者を対象に持久性運動トレーニングを行い、サプリメント摂取群では非摂取群に比べ血液量の増加し、体温調節能の改善も亢進していることを明かにした。そこで、平成16年度は、若年者においても同様の結果が得られるか、否かを検討した。健常な若年男性を対象とし、それを糖質蛋白質サプリメント摂取群(n=8)と非摂取群(n=8)の2群に分け、それぞれ持久性運動トレーニング(最大酸素摂取量の60%の運動強度で60分間を、5回/週、2週間、計10回)を行わせる。毎回の運動直後にサプリメントあるいはプラセボを摂取させる。トレーニング前後に血液量(Evans Blue希釈法)、最大酸素摂取量、および気温30°Cの環境下において、トレーニング前の最大酸素摂取量の60%の運動強度で20分間の自転車こぎ運動を行った際の体温調節能を測定する。蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセボ摂取群、両群とも、持久性トレーニング後に血液量、心拍出量、最大酸素摂取量、体温調節能の増加が亢進した。また、体温調節能は、蛋白質・糖質サプリメント摂取群はプラセボ摂取群に比べ優位に改善した。
教育効果メカニズムにおける武力紛争の影響の理論化と実証

本研究は、紛争の影響を受けた国家における効果的な教育復興支援政策を模索するために、紛争が教育効果に対してどのような影響を及ぼしているのかを量的手法によって実証的に明らかにすることを目的としている。教育効果の要因分析(学校効果研究)の理論を紛争と教育の議論に導入して本研究の分析枠組みを構築し、アフガニスタン及び東ティモールを事例として生徒個人の紛争経験が短期的・長期的観点から学力試験結果とその主要因にどのような作用を及ぼしていくのかを検証することで、紛争が教育に与える影響のメカニズムを解明し、紛争後の効果的な教育支援政策に寄与し得る理論的な枠組みを構築することを目指す。
中国における日本サブカルチャーの受容の現象学的研究

1,フィールドワークこれまで同様、大学の休み期間を利用し、中国で開催された日本サブカルチャー関連イベントの現地調査を行った。今年度は広州や上海などの大都市だけでなく、中国西南地方および江蘇省の小都市で開催されたイベントにも注目した。2016年7月8月に、広州市で「第13届蛍火虫動漫遊戯嘉年華(FFACG2016)」、上海市で「第三届魔都聯合学祭」、昆明市で「創意云南2016文化博覧会動漫展」を、2017年1月2月に、南通市近辺(海安市、如皋市、海門市)で「今宵動漫展---海安站03」「2017如皋萌の動漫新年音会」など複数のイベント、啓東市で「萌動漫遊戯嘉年華」、上海市で「第四届理想郷漫展」を調査してきた。画像/映像資料を獲得し、また、イベント参加者やサブカルチャー同好サイト運営者、大学の同好サークルメンバーなど、一部のサブカルチャー受容者にインタビューを行った。2,理論研究と研究発表メルロ=ポンティやレヴィナスなどの現象学理論を中心に援用しながら、日本サブカルチャー受容者の言説の中で「二次元世界」という世界の出現、アニメ鑑賞などの過程において中国受容者の日本語音声に対する聴覚体験、また、「二次元」なるものという他者との関係性およびそれを「愛」することの意味などについて理論研究を展開させてきた。それらの考察に基づいて、国際日本学研究会やコンテンツ文化史学会の大会で口頭発表を行い、外国語論文を含む3つの論文を発表している。本年度の研究を以て、本研究は完成に近づき、博士論文の執筆段階に入っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。理論研究に関しては、これまでの研究でメルロ=ポンティ現象学を用いて構築してきた日本サブカルチャー受容者の身体論を再検討し、さらにリオタール、レヴィナスなどの理論を吸収し、日本サブカルチャーに対する「愛」という概念を中心に、本研究の根幹となる、「サブカルチャー翻訳」についての新理論を模索している。2014年7月および2015年2月に、中国に2度渡航し、現地調査を行った。2000年代に日本サブカルチャーを紹介したメディアを調査するために、中国国内有数の日本アニメ情報誌『動感新勢力』などの200508年の全号およびサブカルチャー評論誌『二次元狂熱』の2013年度の全号を収集した。早期字幕組の翻訳を考察するために、200305年に中国で販売されたと思われる日本アニメ7タイトルの映像DVD、また、200408年に中国人愛好者に個人的に作られた日本アニメやPCゲームのデータDVD計40枚を収集し、データ化して分析を行った。また、中国人同人活動における翻訳表現や日本語の使用状況を調べるために、上海、北京、南京、広州で開催された日本サブカルチャー関連の大型イベント「梦次元夏日祭」や「YACA 2015春季動漫画展」などに参加し、映像記録を取り、代表的と思われる同人誌を一部収集した。さらに、『二次元狂熱』編集長のL氏、日本サブカルチャー関連イベント運営者のX氏、大手ネットサービス会社「網易」(NetEase)でゲームクリエイターを務めているW氏などにインタビューを行った。これらの調査により本研究の理論的展開を裏付ける重要な一次資料が獲得できた。1、既収集資料の分析:日本アニメ字幕組の翻訳形態を考察するために、2003年2005年に中国で作られ販売されたと思われる日本アニメ映像DVDおよび2002年2013年に中国人愛好者に翻訳され、ネットで配信された日本アニメの影像データの分析を全面的に行った。また、中国における「恋声」(いわゆる声優萌え)の現象を考察するために、2000年代において日本サブカルチャーが中国で紹介されたメディアを調査し、中国国内有数の日本アニメ情報系雑誌『動感新勢力』と『動画基地』の20052008年の全月刊号および日本サブカルチャー評論誌『二次元狂熱』の2013年度の全月刊号において声優関連の記事を探して分析を行った。2、資料収集と現地調査:前年度に続き、日本アニメ字幕組の翻訳を考察するために、2008年2013年の間にネットで流通している、または中国人愛好者に私的に保存された中国語字幕付き日本アニメのデータを収集した。2015年7、8月に、中国で開催された日本サブカルチャー関連のイベント「成都百合Only2015」(成都市)および「琴川漫文化交流展12」(常熟市)に赴き、2016年2月に上海市で開催の「魔都境界漫02」および「OTL御宅之萌漫展」に参加し、映像記録を取り、中国人によるキャラクターグッズなどを収集し、中国人オリジナル同人誌における翻訳や日本語の使用状況を調査するために、代表的と思われる同人誌を一部収集した。成都市、吉林市、長春市などの都市で日本サブカルチャー同人商品の受容に関するフィールドワークを行った。3、研究発表:2015年4月に香港大学で開催されたグローバル・クリエイティブ・インダストリーズ研究会で、8月に国際日本学研究会大会で口頭発表を行い、中国の学術誌に論文2本を投稿した。2016年4月にまた日本の学術誌に論文2本を投稿する予定である。

1、中国人愛好者に再生産された日本アニメの映像データ、それに関連する雑誌や同人誌などの収集と分析はほぼ完了した。2、中国現地でのフィールドワークはおおむね順調で、関連イベントの写真記録、愛好者のインタビューなどの一次資料が蓄積してきている。3、現象学の理論研究を深めるにつれ、上記の一次資料を読みほどくための理論的新発見がいくつかある。4、前年度に論文発表がやや遅れたが、現在執筆完了の論文が投稿できる状態にあり、近日中投稿する予定である。1,フィールドワークこれまで同様、大学の休み期間を利用し、中国で開催された日本サブカルチャー関連イベントの現地調査を行った。今年度は広州や上海などの大都市だけでなく、中国西南地方および江蘇省の小都市で開催されたイベントにも注目した。2016年7月8月に、広州市で「第13届蛍火虫動漫遊戯嘉年華(FFACG2016)」、上海市で「第三届魔都聯合学祭」、昆明市で「創意云南2016文化博覧会動漫展」を、2017年1月2月に、南通市近辺(海安市、如皋市、海門市)で「今宵動漫展---海安站03」「2017如皋萌の動漫新年音会」など複数のイベント、啓東市で「萌動漫遊戯嘉年華」、上海市で「第四届理想郷漫展」を調査してきた。画像/映像資料を獲得し、また、イベント参加者やサブカルチャー同好サイト運営者、大学の同好サークルメンバーなど、一部のサブカルチャー受容者にインタビューを行った。2,理論研究と研究発表メルロ=ポンティやレヴィナスなどの現象学理論を中心に援用しながら、日本サブカルチャー受容者の言説の中で「二次元世界」という世界の出現、アニメ鑑賞などの過程において中国受容者の日本語音声に対する聴覚体験、また、「二次元」なるものという他者との関係性およびそれを「愛」することの意味などについて理論研究を展開させてきた。それらの考察に基づいて、国際日本学研究会やコンテンツ文化史学会の大会で口頭発表を行い、外国語論文を含む3つの論文を発表している。本年度の研究を以て、本研究は完成に近づき、博士論文の執筆段階に入っている。理論研究と並行して、フィールドワークおよびデータ収集といった質的な調査も順調に進んできた。愛好者たちのインタビュー、現在入手困難となった雑誌やDVDの収集などによって、これからの現象学的分析の展開に堅実な基礎を築くことができた。研究の過程中で、博士論文の理論的構想を醸出することができた。日本においてだけではなく、中国の学術誌に論文投稿、国際会議での発表なども含め、本研究を海外へ発信することを果たした。フィールドワークに関しては、一方で、引き続き中国現地で日本サブカルチャー愛好者グループのメンバーにインタビューを行い、言説を集めて分析する。具体的に、広東省または雲南省、福建省で開催されるイベントに赴き、調査する。他方では、日本の声優による声の演出をより深く理解するために、アニメ制作会社または声優養成機関、専門学校に赴き、声優(可能であれば)や音響監督などの現場の人間から話を聞く。理論研究に関しては、今まで構築してきた、受容者の日本サブカルチャーに対する視覚体験、聴覚体験、愛情の生成にかかわる理論をまとめ、受容者がいかにその趣味愛好の世界を見出し、そしてそこを生きるかの全体像を言語化していく。研究発表に関しては、国際日本学研究会、コンテンツ文化史学会、カルチュラル・スタディーズ学会などの学会誌、また香港大学のアジア研究論文集への投稿を予定している。28年度が最終年度であるため、記入しない。(I)引き続き字幕組や同人活動における翻訳の一次資料を収集する。今年度も中国に渡航し、関連イベントの現地調査を行う予定がある。(II)
iPS由来心筋細胞移植後の自然免疫による拒絶メカニズムの解明とその治療法の開発

本研究ではMHC適合モデルによる自然免疫応答に伴う移植後拒絶反応が移植細胞の生着に及ぼす影響を検討した。方法としてはC57BL/6由来iPS細胞を心筋細胞へ分化誘導し、心筋細胞シートを作成し、C57BL/6マウスの皮下へ移植した(同種移植)。MHC適合モデルにおけるiPS細胞由来心筋細胞移植において移植後の全身性NK細胞活性化とそれに伴う移植細胞のNK細胞を介した拒絶反応を認め、それに伴い移植細胞の生着が阻害された。この原因としてiPS細胞由来心筋細胞上のMHC class1の低発現やCD226リガンド(CD112, CD155)、NKG2Dリガンド(RAE-1)の発現を認めた。in vitroではIFN-g添加によりiPS細胞由来心筋細胞上のMHC class1の発現誘導や、CD226, NKG2Dの阻害により、iPS細胞由来心筋細胞に対するNK細胞の細胞障害性が抑制された。さらにin vivoにおいてもIFN-g添加によるMHC class1の発現誘導やCD226, NKG2Dの阻害により移植部位へのNK細胞浸潤の抑制、移植細胞のアポトーシスの抑制を認めた。このようにin vivo移植後のNK細胞による免疫応答が移植後自然免疫応答として移植細胞の生着を阻害しうることが示唆された移植細胞の長期生着にはNK細胞による自然免疫応答に対する治療戦略が必要であると考えられた。本研究ではMHC一致モデルによる自然免疫応答に伴う移植後拒絶反応が移植細胞の生着に及ぼす影響を検討した。移植iPS心筋細胞部位に浸潤する免疫細胞(NK細胞、Tリンパ球、顆粒球、マクロファージ)を免疫組織染色により検討した結果、NK細胞の心筋細胞シートへの著明な浸潤を認めた。そのためdepletion抗体にてマウス生体内のNK細胞を除去した群とコントロール群との移植細胞の生着を比較したところ、NK細胞除去したマウスにおいてより良好な移植細胞の生着を認めた。またコントロール群では生体内のNK細胞の活性化を認めた。次にiPS細胞由来心筋細胞上に発現するNK細胞の活性化または抑制を促すリガンドの発現をFACSにて解析したところ抑制性リガンドであるMHC class1の低発現と活性化リガンドであるCD226に対するリガンド(CD112, CD155)とNKG2Dに対するリガンド( RAE-1)の発現を認めた。最後にiPS細胞由来心筋細胞とNK細胞をin vitroで共培養し、NK細胞のiPS細胞由来心筋細胞に対する細胞障害性を検討した。iPS細胞由来心筋細胞培養中にIFN-γを加えることでMHC class1発現を誘導することやCD226やNKG2Dを介した活性化経路を阻害することで、その細胞障害性が抑制された。本研究において、iPS細胞由来心筋細胞移植後のNK細胞による拒絶反応がその生着を阻害することが明らかになった。またこの拒絶反応を抑制するためにMHC class1発現の誘導やCD226とNKG2Dを介した活性化経路の阻害が重要である可能性が示唆された。研究は概ね順調に進展している。iPS細胞の分化誘導効率が不安定であることや、移植後腫瘍形成する個体もあった。しかしNK細胞による自然免疫応答と移植細胞の生着について明らかにできたため。in vivoでもin vitroと同様にNK細胞の細胞障害性を抑制し、移植細胞の生着を延長するか検討する。実験より得られたデータから解析を行い、論文作成を行う。(理由)予定より、組織の染色やデータの解析にかかる費用等を節約することができたため(使用計画)次年度は、これまでに繰り越してきた費用を用いて、データの解析あるいはin vivoの追加実験を行う予定である