hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体温と代謝の自律性・行動性調節を担う神経回路機構の解明

1.研究代表者は、体温調節行動に必要な温度感覚伝達を担う神経伝達路を特定することに成功した。教科書的に知られた、温度を意識の上で知覚する仕組みとは別に、体温調節を目的とした皮膚温度感覚を脳へ伝達するための神経路を世界に先駆けて発見した研究成果であり、査読付き国際誌に論文発表した(Yahiro et al., Sci. Rep. 7:5031, 2017)。この成果を国際プレスリリースしたことにより、国内外のメディアを通じて本研究成果が広く報道された。行動性体温調節メカニズムについては、温度生物学領域の南班とも協働して温度選択行動解析実験を実施した。2.研究代表者は昨年度、国際共同研究によって、視床下部が飢餓を感知して脳内で生み出される飢餓信号が、代謝(熱産生)を抑制するとともに摂食を促進する上で鍵となる延髄の神経細胞を発見し、査読付き英文国際誌に論文発表した(Nakamura et al., Cell Metab. 25:322-334, 2017)。今年度は、この発見に関連して、生体の栄養状態に応じてエネルギー恒常性を制御する脳の神経回路メカニズムに関する英文総説を、研究代表者が責任著者となって国際誌に発表した(Nakamura & Nakamura, Pflugers Arch. 470:823-837, 2018)。3.研究代表者は米国UCSFに滞在して国際共同研究を行い、遺伝子組換えマウスを使った褐色脂肪熱産生の計測実験を行った。また、昨年度に引き続き、研究分担者の山田と研究代表者が共同研究を行い、肝臓からの栄養情報が脳の体温・代謝調節機能に作用する仕組みの解析を行った。4.研究代表者は、体温のセットポイント決定機構を解明するため、ラット体温調節中枢の体温調節ニューロンの組織化学的解析を行った。本研究の主要目的の一つが体温調節行動を発現する基盤となる脳の神経回路を解明することである。この仕組みは、生体に備わった様々な本能行動に共通したメカニズムにも通じる可能性があり、その仕組みを解明することは本能行動全体の仕組みを理解する上でも重要な意味を持つ。研究代表者は今年度、体温調節行動を起こす上で必要な環境温度情報を皮膚の温度センサーから脳へ伝達するための神経路を同定することに成功し、その研究成果を一流国際誌に論文発表することができた。今後、温度生物学領域の南班とも協働して、温度感覚の情報がどのようにして体温調節行動につながる情動を発現させるのかという問いに焦点を当てて研究を進める予定である。その他の研究項目についても、エネルギーバランスを調節する中枢神経回路モデルを総説として発表し、また、国際共同研究を進めるなど、おおむね順調に進展している。一方で、一部の遺伝子改変マウスの繁殖が予想以上に不順であったなど、不慮の事象によって若干の遅れが見られたが、次年度の計画を見直して遅れを取り戻すことができる見通しである。以上の進捗状況に鑑み、本研究はおおむね順調に進展しているものと判断する。本年度は研究代表者が行動性体温調節に必要な温度感覚を伝達する神経路を特定することに成功し、論文発表したが、体温調節行動の中枢神経回路メカニズムについては、「温度情動」が関与する可能性が高く、温度生物学領域の計画研究代表者であり、情動研究の専門家である南雅文教授(北海道大学)と共同研究を行うことで解明を進める。また、肝臓から脳への栄養情報がどのようにして体温・代謝調節系に影響を与えるのか、その仕組みは興味深く、温度生物学においても大変重要な問題である。この点について、研究代表者と研究分担者の山田との共同研究や国際共同研究をさらに進め、詳細な解析を続けていく。また、体温のセットポイント決定メカニズムや概日リズム形成メカニズムについても引き続き、領域内外の共同研究を通じて精力的に進めていく予定である。1.体内の栄養状態が末梢から脳へ伝達され、体温や代謝を調節する神経回路へ作用することで飢餓を生き抜き、過剰なエネルギーを消費することは恒常性維持の重要な調節機能である。本年度は、研究分担者の山田と研究代表者が共同研究を行い、糖尿病治療薬であるsodium glucose cotransporter-2阻害剤、dapagliflozinの投与が体重を減少させないのは、褐色脂肪組織での代謝性熱産生が低下することが原因であることを解明し、論文発表した(Chiba et al. PLoS One, 2016)。マウスにdapagliflozinを投与すると、褐色脂肪組織の交感神経活性が低下して熱産生が減少した。この熱産生低下は、dapagliflozinによって糖貯蔵が低下する肝臓が飢餓信号を迷走神経経由で脳に伝えることにより、延髄からの交感神経出力が抑制されることで生じることが分かった。この研究で得られた知見は肥満者の糖尿病治療方針の策定に重要なものである。2.研究代表者はオレゴン健康科学大学との国際共同研究によって、視床下部が飢餓を感知して生み出す信号が代謝(熱産生)を抑制するとともに摂食を促進する上で鍵となる延髄の神経細胞を発見した。この神経細胞は視床下部由来の飢餓信号によって活性化され、褐色脂肪熱産生を抑制するとともに咀嚼や摂食、唾液分泌を促進することが分かった。3.研究代表者は温度生物学領域の南班と協働して行動性体温調節に必要な温度情報を脳へ伝達する神経経路を同定するため、ラットの行動実験セットアップを構築し、温度選択行動解析の予備検討実験を実施した。

4.研究代表者は、体温のセットポイント決定機構を解明するため、ラット体温調節中枢の温度感受性ニューロンから神経活動記録を行った。また、視交叉上核からの時計信号が体温調節中枢へ伝達する仕組みの解析にも着手した。本研究の主要目的の一つが栄養状態に基づいて体温と代謝が適切に調節される仕組みを解明することである。この仕組みは、人間を含めた哺乳類に共通して備わった、「温度を利用した生命機能」の代表的な例であることから、本新学術領域のA02の重要な推進課題となっている。また、そのため、この研究項目は研究代表者と研究分担者の山田が協働して推進している。その研究項目において、本年度は研究分担者の山田と研究代表者との共同研究として、糖尿病治療における重要な知見を得ることに成功し、論文発表の成果を挙げることができた。また、研究代表者は飢餓反応の発現に重要な機能を担う新規の神経細胞群を同定することに成功した。その他の研究項目についても、本新学術領域の発足初年度ということで、研究の着手や予備検討実験を計画通りに実施することができた。一方で、本研究に参画する研究員の採用が遅れたため、行動実験の開始に若干遅れがあったが、次年度に速やかに実施して遅れを取り戻すことができる見通しである。以上の進捗状況に鑑み、本研究は当初の計画以上に進展しているものと判断する。1.体内の栄養状態が末梢から脳へ伝達され、体温や代謝を調節する神経回路へ作用することで飢餓を生き抜き、過剰なエネルギーを消費することは恒常性維持の重要な調節機能である。今年度は、研究分担者の山田と研究代表者が共同研究を行い、肝臓からの栄養情報が脳の体温・代謝調節機能に作用する仕組みの解析を行った。2.研究代表者は米国・オレゴン健康科学大学との国際共同研究によって、視床下部が飢餓を感知して脳内で生み出される飢餓信号が、代謝(熱産生)を抑制するとともに摂食を促進する上で鍵となる延髄の神経細胞を発見し、査読付き英文国際誌に論文発表した(Nakamura et al., Cell Metab. 25:322-334, 2017)。この神経細胞は視床下部由来の飢餓信号によって活性化され、褐色脂肪熱産生を抑制するとともに咀嚼や摂食、唾液分泌を促進することが分かった。生体が飢餓を生き延びるために備わった脳の基本的な仕組みを解明した研究成果である。この成果を国際プレスリリースしたことにより、国内外のメディアを通じて本研究成果が広く報道された。3.研究代表者は温度生物学領域の南班と協働して行動性体温調節に必要な温度情報を脳へ伝達する神経経路を同定するため、ラットの行動実験セットアップを用いて、温度選択行動解析実験を実施し、体温調節行動に必要な温度感覚伝達を担う重要な神経伝達路を特定することに成功した。4.研究代表者は、体温のセットポイント決定機構を解明するため、昨年度に引き続き、ラット体温調節中枢の温度感受性ニューロンから神経活動記録を行った。また、視交叉上核からの時計信号が体温調節中枢へ伝達する仕組みの解析も実施した。この仕組みは、人間を含めた哺乳類に共通して備わった、「温度を利用した生命機能」の代表的な例であることから、本新学術領域のA02が解明を目指す重要な推進課題となっている。
遺伝子発現制御配列と反復配列の進化的変動の分析

真核生物のゲノムにはマイクロサテライトや転移因子由来の散在性配列など、多様な反復配列が存在しており、ヒトではゲノムの40%以上を占めていることは、よく知られている。従来の分子生物学的研究では、これらの配列の存在意義は不明であり、全く無意味な配列(ジャンクDNA)であるとの推測すらなされていた。ところが近年、これら反復配列の一部が遺伝子発現制御に積極的に関与している事例が続々と報告され、さらに散在性配列(Alu配列)がゲノム大域的に何らかの貢献をしている可能性も示唆されている(International Human Genome Sequencing Consortium 2001)。本研究では、発現情報と反復配列の相関に関する分析を行なった。選別したヒト公開アレイデータを用いて、クラスタリングを行ない、絞り込んだ遺伝子セットに関して、発現情報と遺伝子制御領域構造(5'上流配列)の相関を分析した。その際、反復配列が転写制御に関与する可能性に注意して解析を行なった。その結果、次のような特徴が明らかになった。1.組織特異的発現を示すヒト遺伝子群の5'上流500bpにおいて、Low complexity repeats及びSimple repeatsの頻度が顕著に増加している。2.発現組織の違いにより、5'上流域における反復配列の分布パターンに差異が認められる。3.これらの傾向は、ヒト及びマウスに共通して認められる。今後、個別の反復配列の種間差異が、遺伝子発現に及ぼす影響を評価するために、マウスの発現情報も統合して解析する予定である。
四肢動物類の頸胴部領域進化様式とメカニズム：化石記録と胚発生からのアプローチ

まず爬虫類の胚発生の観察に関するプロジェクトについては、四肢を失い伸長した体を持つコーンスネークと、その比較の対象として四肢の発達したヒョウモントカゲモドキとソメワケササクレヤモリの繁殖のためのセットアップを完成し、受精卵の採取を開始した。本年度はヒョウモントカゲモドキとソメワケササクレヤモリそれぞれについて数個づつしか卵を得ることができず、またコーンスネークについては卵を得ることができなかった。そのため、後者の代換として、研究施設より受精卵を持つシマヘビ5個体を購入し、その卵について定期的にサンプリングし、ディープフリーザーに保存した。また、胚観察の技術習得のため、Yale UniversityのBhart Anjan-Bhullark研究室に2ヶ月弱滞在し、胚の固定法、その透明化および組織を区別する免疫染色法(CLARITY)、そのような胚標本の共焦点レーザー顕微鏡を用いたデータ取得法、さらにソフトウエアVGStudiio Maxを用いた各組織の立体構築法を習得した。また実際にウズラとコーンスネークについて、筋肉、神経、軟骨を標識した胚標本を作成し、そのレーザー顕微鏡データを取得した。さらに、同研究室と共同の計画を立ち上げ、彼らがすでに保持している同様のデータを共有してもらうことができた。また成体の状態の解剖学的観察については、オオトカゲ類の中で原始的な特徴を保持していると期待されるLanthanotusの解剖を行い、中軸筋肉系については他のオオトカゲ類と共通している特徴が多いことを発見した。Yale Universityの滞在中に、研究遂行に必要な様々な技術を習得し、またデータの共有をすることができた。同時に、同大学付属博物館において、四肢動物類の原始的な状態を把握する上で重要な分類群の複数種についてデータを得ることができた。一方で、ラボにおいて爬虫類の受精卵を安定して得られる段階までは至っておらず、そのための工夫に想定以上に時間がかかった。また化石種についてデータを得るための海外渡航の時間がままならず、この点についても当初よりも計画の遅れが明らかである、まずYale Universityの共同研究者共より得たウズラ、ヤモリ、ヘビの胚データをソフトウエアVGStudio Maxを用いてセグメテーションすることにより、筋肉、骨格、神経系の形態発達のシークエンに関するデータを効率的に得る。また同大学で習得した技術を用いることにより、胚の固定や観察のプロセスをかなり効率的に行うことができるようになると期待される。一方で、申請プロジェクトの中では化石分類群のデータ取得がもっとも遅れていることを鑑み、比較的距離のお互いの間の距離が近いヨーロッパの研究機関(University of Cambridge、University of Copenhagen、Museum National d'Histoire Naturelle, Parisなどを)一回の旅程に含めて集中して訪問することにより、古生代の基幹的四肢動物類から派生的な分類群まで系統樹を幅広くカバーする時間的に効率的な標本調査を行う。本年度の研究作業はまず,研究に用いる現生種標本の収集から開始した.具体的には,原始形質の確認のために,頸部を持たないいわゆる魚類(ハイギョ類Protopterus,サメ類)などを得て,ProtopterusについてはCTスキャン撮影を行い頸部骨格データを収得し,コンピューターでて3Dデジタル観察を行った.また,頸部と胴部の境界が明瞭に認識できる派生的特徴を持つ有羊膜類として,哺乳類の中では比較的原始的な有袋類のMonodelphisを入手し,また特殊化した例としてのヘビ類の標本も得た.化石標本については,茨城県立自然史博物館から,頸部の分化前の状態を示すデボン紀の肉鰭類Eusthenopteron及びジュラ紀のサメ類Hybodusの標本を借用し,頭部から脊柱にかけての部位についてCTスキャン撮影を行った.また,頸部が極端に退化傾向にある魚鰭類の中で,最も初期のものの一つであるUtatsusaurusの標本を北海道大学博物館において観察した.また,より派生的なジュラ紀の魚鰭類Ichthyosaurusの標本を茨城県立自然史博物館から借用し,CTスキャン撮影を行った.これらのCTスキャンデータについては,本研究費で購入したソフトウエアAmira及びコンピューターを用いて3Dデジタル構築を行い,その骨格形態の観察を行った.発生学的研究については,まず組織切片観察用の透過型顕微鏡を購入・整備した.爬虫類の繁殖に関しては,飼育場所及び用品の整備等にとどまり,胚を得るまでには至らなかった.申請研究初年度であったため,研究設備(透過型顕微鏡,デジタル3Dl構築用ソフトウエア及びコンピューター)の購入及びセットアップに予想以上の時間がかかった.解剖やCTスキャン撮影に用いる現生標本の入手はある程度進んだが,予定していた,ルゴール染色を用いた軟組織コントラスト強化CT撮影(diceCT)に適当な,比較的小型の個体が入手できなかったため,CT撮影では骨格形態のみのデータを得るにとどまった.化石の標本に関する観察やデータ収集に関しては,手始めに本邦で観察できるものから開始した.計画ではヨーロッパの博物館に長期滞在してデータを得るはずであったが,教育関連の出張などのため,そのためのまとまった時間が取れなかったことが原因である.発生学的な側面については,胚を得るまでに至らなかったことが最大の原因である.本研究室ではこれまで化石と遺骸のみを扱ってきたため,生体飼育のための経験に乏しい.そのためまず爬虫類の飼育に関する文献を収集し,それに基づいた学習を進めてきたが,実際に繁殖させるまではできなかった.まず爬虫類の胚発生の観察に関するプロジェクトについては、四肢を失い伸長した体を持つコーンスネークと、その比較の対象として四肢の発達したヒョウモントカゲモドキとソメワケササクレヤモリの繁殖のためのセットアップを完成し、受精卵の採取を開始した。

本年度はヒョウモントカゲモドキとソメワケササクレヤモリそれぞれについて数個づつしか卵を得ることができず、またコーンスネークについては卵を得ることができなかった。そのため、後者の代換として、研究施設より受精卵を持つシマヘビ5個体を購入し、その卵について定期的にサンプリングし、ディープフリーザーに保存した。また、胚観察の技術習得のため、Yale UniversityのBhart Anjan-Bhullark研究室に2ヶ月弱滞在し、胚の固定法、その透明化および組織を区別する免疫染色法(CLARITY)、そのような胚標本の共焦点レーザー顕微鏡を用いたデータ取得法、さらにソフトウエアVGStudiio Maxを用いた各組織の立体構築法を習得した。また実際にウズラとコーンスネークについて、筋肉、神経、軟骨を標識した胚標本を作成し、そのレーザー顕微鏡データを取得した。さらに、同研究室と共同の計画を立ち上げ、彼らがすでに保持している同様のデータを共有してもらうことができた。また成体の状態の解剖学的観察については、オオトカゲ類の中で原始的な特徴を保持していると期待されるLanthanotusの解剖を行い、中軸筋肉系については他のオオトカゲ類と共通している特徴が多いことを発見した。Yale Universityの滞在中に、研究遂行に必要な様々な技術を習得し、またデータの共有をすることができた。同時に、同大学付属博物館において、四肢動物類の原始的な状態を把握する上で重要な分類群の複数種についてデータを得ることができた。一方で、ラボにおいて爬虫類の受精卵を安定して得られる段階までは至っておらず、そのための工夫に想定以上に時間がかかった。また化石種についてデータを得るための海外渡航の時間がままならず、この点についても当初よりも計画の遅れが明らかである、成体の解剖学的観察については,すでに入手した標本の解剖を進めるとともに,小型の個体の入手の努力を続け,組織コントラスト強化CT撮影を行うことにより,軟組織からなる器官の位置関係に関する解剖学的データを得る.発生学的側面の研究については,引き続き爬虫類(コーンスネークとヤモリ類)の飼育を進め、胚入手を試みる.また,自ら繁殖を試みるだけでなく,日本蛇族研究所(群馬県)などから,すでに胚を持っているメスのシマヘビを入手し,それらに卵を産ませることにより,胚標本の作成を行う.一方,鳥類の胚については,新顎類のニワトリの発生過程との比較のため,古顎類エミューの受精卵を購入し,発生を進ませつつ順次胚標本を作成していく予定である.また,9月,10月の二ヶ月間,米イェール大学に滞在し,新進気鋭の進化発生学者Bahrt Anjan Bhullar助教の元で,爬虫類胚の観察及び実験技術を学んでくる予定にしている.特に日本では入手の困難なワニ胚を中心に観察を行うことを目標にしている.
ディーゼル船排熱回収プラントのス-トファイア-の解析と信頼性向上に関する研究

デイ-ゼル主機の排熱回収の蒸気発生器である排ガスエコノマイザの伝熱面は、排ガス中に含まれるス-トで汚され、種々の障害に悩まされる。とくに問題なのは堆積したス-トが燃焼し、ひどい場合には伝熱面がメルトダウンに至る「ス-トファイア」と呼ばれる深刻な事故が生じることである。本研究によりス-トファイアの機構を解明し、防止のための方策を提示できた。1事故実態の調査分析・・・・ス-トファイア事故データを集めて分析し、主な関係因子は運転状態、循環条件、伝熱面の形状であることを明らかにした。2ス-トファイアのシミュレーションモデルの構築・・・・ス-トファイアの計算機シミュレーションモデルを構築した。モデルは実際の現象をうまく再現していることが確認され、伝熱面に堆積したス-トが燃焼する諸条件、伝熱面の上昇温度などが推定可能になった。3鉄鋼材料の酸化速度に関する分析・・・・上のシミュレーションモデルにより、堆積したス-トの燃焼熱だけでは伝熱面が溶融するまでには到らないことがわかった。そこで伝熱面フィンなど鉄鋼材料の酸化速度に関する諸条件を調べた。その結果実用されているフィンの場合、一定の条件ではメルトダウンを引き起こす熱源となり得ることが明らかになった。4メルトダウンの機構・・・・メルトダウンに到る過程は以下のようであることが解明された。ス-ト燃焼発生→→不均等加熱のためドライアウト発生→→熱除去効果喪失のためフィン温度急上昇→→フィン材の酸化速度急上昇による酸化熱のためフィン温度さらに上昇→→メルトダウン5水循環設計条件の分析・・・・排エコは、強制循環の並列水平管で構成され、しかも低圧なので水側がドライアウトしやすく、水循環設計条件が重要である。国内排エコの設計条件を調査した。その結果ドライアウトの可能性の高い設計がなされている排エコも存在することが明らかになった。6本研究の結果に基づいて一連のス-トファイア防止策を提言し、海運、造船、排エコメーカなどでそれが採用され、現在ス-トファイア事故は急減することとなり、大きな成果を得た。【平成8年度の成果】1ス-トファイア発生事故の調査分析デイ-ゼル主機の排熱を、排ガスエコノマイザ(以下排エコという)で回収して蒸気をつくり、蒸気タービン発電を行なうなどさまざまな熱源として利用されているが、排エコの伝熱面はデイ-ゼル排ガス中に含まれるス-ト(その多くは未燃炭化水素)で汚され、種々の障害に悩まされる。とくに問題なのは堆積したス-トが燃焼し、ひどい場合には伝熱面がメルトダウンに至る、「ス-トファイア」と呼ばれる深刻な事故が生じることである。11ス-トファイア事故データを日本海事協会等の協力を得て集め、事故発生の特徴を分析した。12さまざまな因子が関係するが、とくに主機の運転状態、排エコ水循環条件、伝熱面の形状(フィン付き管)が大きく関係していることがわかった。2ス-トの性状、伝熱面の堆積状態の調査分析フィン付き管に堆積したス-トがなんらかの原因で発火燃焼することが、実際に生じることがわかったので、デイ-ゼル排ガス中のス-ト、堆積ス-トを採取し分析した。

3排エコの水循環設計条件の調査分析排エコは、強制循環の並列水平管で構成され、しかも低圧なので水側がドライアウトしやすい。したがって水循環設計条件が重要なので、国内排エコメーカの協力を得て調査した。4ス-トファイアのシミュレーションモデルの構築と計算の実施以上13をもとに、ス-トファイアの計算機シミュレーションをおこなった。結果は実際のス-トファイアを非常にうまく再現していることが確認された。それでさまざまな条件で計算し、ス-トファイアの発生の過程を明らかにできた。【次年度】ス-トファイアの発生メカニズムが明かにされたので、伝熱管がメルトダウンする過程を分析し、対策法について検討する。デイ-ゼル主機の排熱回収の蒸気発生器である排ガスエコノマイザの伝熱面は、排ガス中に含まれるス-トで汚され、種々の障害に悩まされる。とくに問題なのは堆積したス-トが燃焼し、ひどい場合には伝熱面がメルトダウンに至る「ス-トファイア」と呼ばれる深刻な事故が生じることである。本研究によりス-トファイアの機構を解明し、防止のための方策を提示できた。1事故実態の調査分析....ス-トファイア事故データを集めて分析し、主な関係因子は運転状態、循環条件、伝熱面の形状であることを明らかにした。2ス-トファイアのシミュレーションモデルの構築....ス-トファイアの計算機シミュレーションモデルを構築した。モデルは実際の現象をうまく再現していることが確認され、伝熱面に堆積したス-トが燃焼する諸条件、伝熱面の上昇温度などが推定可能になった。3鉄鋼材料の酸化速度に関する分析....上のシミュレーションモデルにより、堆積したス-トの燃焼熱だけでは伝熱面が溶融するまでには到らないことがわかった。そこで伝熱面フィンなど鉄鋼材料の酸化速度に関する諸条件を調べた。その結果実用されているフィンの場合、一定の条件ではメルトダウンを引き起こす熱源となり得ることが明らかになった。4メルトダウンの機構....メルトダウンに到る過程は以下のようであることが解明された。ス-ト燃焼発生→→不均等加熱のためドライアウト発生→→熱除去効果喪失のためフィン温度急上昇→→フィン材の酸化速度急上昇による酸化熱のためフィン温度さらに上昇→→メルトダウン5水循環設計条件の分析....排エコは、強制循環の並列水平管で構成され、しかも低圧なので水側がドライアウトしやすく、水循環設計条件が重要である。国内排エコの設計条件を調査した。その結果ドライアウトの可能性の高い設計がなされている排エコも存在することが明らかになった。6本研究の結果一連のス-トファイア防止策を提言し、海運、造船、排エコメーカなどでそれが採用され、現在ス-トファイア事故は急減することとなり、大きな成果を得た。
科学技術を活用する力を養う技術科の授業

○研究の目的新学習指導要領で重視されている科学技術については,基礎的な素養を身につけ知識・技能の活用に重点が置かれている。しかし,科学技術を社会で活用する場面では,理論通りにいかず経験や具体的な場面で工夫して問題を解決していくことが多い。このことは,技術・家庭科でもっとも重視しでいるしくみや原理を利用してものを作りながら体験的に学ぶ学習そのものである。そこで,この科学技術を活用する力を養う技術科の授業を行うための教材開発と授業構成の研究を行った。○研究方法研究は,「(1)計測と制御の新たな題材開発と指導過程作り」と「(2)エネルギー変換を学習する新たな題材開発と指導過程作り」の2本立てで行った。(1)については,3年生で「自律型ロボットの計測と制御」の研究を行った。また,(2)については「タッパー型水素燃料電池カー」の製作を3年生の選択技術で行い,「木で作るガリレオ式時計の製作」を1年生で行った。すべて,中学校では初めて扱われる題材であり科学技術を活用する必要性があることから,題材の開発と授業構成を研究した。○研究成果(1)については,自律型ロボットに赤外線の距離センサーを取り付け,対象物との距離を計測しパソコンでアナログ値を表示させ,その値を生徒がグラフ化することでセンサーの特性を理解させる授業を行った。この実験と作業により生徒は,距離センサーの特性を理解しそれをロボットで機能させるために,しきい値を検討し制御に生かすことができた。この授業により,新学習指導要領で必修となったプログラミングによる計測・制御の新しい授業モデルとして提案することができた。また,(2)のタッパー型水素燃料電池カーも中学生が自分で化学反応させた金属を利用して発電させることができ科学と技術の活用を体験的に学習することができた。また,ガリレオ式時計もエネルギー効率を考える新しい授業を提案することができた。
ファイブロネクチンを細胞表面に発現する各種癌に対するヘパリンの抗腫瘍効果

【目的】我々は癌細胞表面に発現しているファイブロネクチン(FN)には二つのヘパリン結合部位が存在することに着目し,FN発現癌細胞ではヘパリンがこの結合部位と反応することにより細胞にシグナルが伝達され抗腫瘍効果が発現するのではないかとの仮説をたてた.2.次に細胞死を誘導し得た細胞群に対し、その細胞死がアポトーシスなのかネクローシスなのかを検討するため、500IU/mlのヘパリンを細胞に添加し細胞の形態変化を認めた後細胞を回収し、DNA Laddering法、TUNEL法を施行した結果その細胞死がアポトーシスであることが判明した。3.ミトコンドリアに存在するアポトーシス抑制遣伝子の一種であるbcl-2,bcl-XLを、FN発言癌細胞にそれぞれ遺伝子導入後、ヘパリンを投与したところ、アポトーシスが抑制された。4.同様に経路を倹討する目的でヘパリンによりアポトーシスを誘導した細胞の蛋白を抽出し、caspase-3,8抗体を使用しWestern blotting法で検討したところcaspase-3の発現が認められた。【背景・目的・方法】ヘパリンは1980年代にDICを併発した癌患者に大量投与したところ,癌が縮小した症例が存在したことから注目されいくつかの臨床研究がなされた.研究結果はまちまちであったがこのヘパリンによる癌縮小効果は血小板などの凝集抑制作用による癌細胞被包抑制の観点から論じられた.我々は癌細胞表面に発現しているファイブロネクチン(FN)に二つのヘパリン結合部位が存在することに着目し,FN発現癌細胞ではヘパリンがこの結合部位と反応することにより細胞にシグナルが伝達され抗腫瘍効果が発現するのではないかとの仮説をたてた.この仮説を検証するため平成12年度ではin vitroの実験において1)FNの発現している癌細胞にヘパリンを濃度依存性に投与することにより細胞を死滅させる効果が発現するか?2)FNの発現している癌細胞に、FNのヘパリン結合部位に対する抗体(IST-1,IST-2)を投与することにより、ヘパリンを投与を投与した時と同様の効果が発現するか?3)細胞死誘導されるとしたらその死はアポトーシスなのかネクローシスなのか?に焦点を絞り検討した.【結果】1)FN発現細胞では投与したヘパリンの濃度に比例して細胞死が増加して発現した.2)FN発現細胞では投与した抗体の濃度に比例して同様に細胞死が増加して発現した.【考察】ヘパリンは多種類の癌で発現しているFNを介して細胞にアポトーシスを誘導し抗腫瘍効果を発現するとこれまでの実験結果より推定される。次年度はこのアポトーシスの誘導経路、生体におけるヘパリンの癌縮小効果、浸潤,転移抑制効果などを検討予定である。【目的】我々は癌細胞表面に発現しているファイブロネクチンには二つのヘパリン結合部位が存在することに着目し,FN発現癌細胞ではヘパリンがこの結合部位と反応することにより細胞にシグナルが伝達され抗腫瘍効果が発現するのではないかとの仮説をたてた.この仮説を検証するため1)FNの発現している癌細胞にヘパリンを投与することにより細胞を死滅させる効果が発現するか?2)細胞を死滅させる効果はFNのヘパリン結合部位を介して誘導されるのか?3)細胞死が誘導されるとしたらその死はどういうものか?4)in vivoでは,FN発現細胞でもヘパリンによりヘパリナーゼ活性抑制効果のみしか発現しないのか?に焦点を絞り現在検討中である。【結果】平成13年度までの研究において次の点が明らかとなった。2.次に細胞死を誘導し得た細胞群に対し、その細胞死がアポトーシスなのかネクローシスなのかを検討するため、500IU/mlのヘパリンを細胞に添加し細胞の形態変化を認めた後細胞を回収し、DNA Laddering法、TUNEL法を施行した結果その細胞死がアポトーシスであることが判明した。3.現在成体(ヌードマウス)に上記の細胞株を移植後、ヘパリン投与によるヘパリナーゼ活性抑制効果とともにヘパリン結合部位との反応による直接的な細胞死を確認するため動物実験を施行中である。【目的】我々は癌細胞表面に発現している

ファイブロネクチン(FN)には二つのヘパリン結合部位が存在することに着目し、FN発現癌細胞ではヘパリンがこの結合部位と反応することにより細胞にシグナルが伝達され抗腫瘍効果が発現するのではないかとの仮説をたてた。2.次に細胞死を誘導し得た細胞群に対し、その細胞死がアポトーシスなのかネクローシスなのかを検討するため、500IU/mlのヘパリンを細胞に添加し細胞の形態変化を認めた後細胞を回収し、DNA Laddering法、TUNEL法を施行した結果その細胞死がアポトーシスであることが判明した。3.ミトコンドリアに存在するアポトーシス抑制遺伝子の一種であるbcl-2,bcl-XLを、FN発現癌細胞にそれぞれ遺伝子導入後、ヘパリンを投与したところ、アポトーシネが抑制された。4.同様に経路を検討する目的でヘパリンによりアポトーシスを誘導した細胞の蛋白を抽出し、caspase-3,8抗体を使用しWestern blotting法で検討したところcaspase-3の発現が認められた。
内因性ジギタリスの構造解析とその電解質・血圧調節に占める役割の解明

内因性ジギタリスが種々存在する中で、両生類で発見され、現在、ヒトでも確認されているbufadienolideにはトキシン型が存在し、それらが生理活性を有することを明らかにした。食塩負荷で増量することも明らかにした。産生部位の同定と生理的な分泌調節を検討するために細胞培養系で検討し、副腎皮質、副腎髄質、視床下部由来の神経細胞などでの産生を確認した。また、視床下部由来細胞株からウアバイン産生を確認し、その分泌にはアルドステロンが鉱質コルチコイド受容体を介して関与することを明らかにした。以前からの一連の研究成果として、すべての高血圧の成因が食塩代謝と関連し、脳内レニン-アンジオテンシン-アルドステロン(RAA)系とウアバインが中心的役割を演じていることを明らかにした。我々が作成したモノクローナル抗体を用いる尿中MBT濃度を測定するELISA系はほぼ完成型であるが、血漿中にはこの反応系に干渉する物質が含有されていて、通常の方法では正確な測定ができない。そこで、C_<18>ODS逆相前処理カラムでMBT分画を濃縮抽出して測定する系を確立し、実験に用いた。自然発症高血圧ラットにおける食塩代謝と高血圧との関連を検討する目的で、MBTの動態を調べた。その結果、SHRに食塩負荷すると血圧上昇とともに尿中MBT排泄量は増加したことから、食塩の代謝と同時に血圧上昇にもMBTが関与する可能性が示唆された。このような反応におけるレニン-アンジオテンシン系の関与を検討する目的で、AT-1受容体拮抗薬のテルミサルタンを投与して、投与4週間後の血圧差が30mmHg程度になるほど降圧させた。対照食塩負荷群ではMBT尿中排泄は著明に増加するが、食塩負荷テルミサルタン群では増加が抑制され、MBT血中濃度も有意に減少していた。そこで、この現象をより明確に証明する目的で、細胞培養系で検討した。副腎皮質由来細胞株であるY-1細胞にテルミサルタンを添加した培養上清中のMBT濃度では影響が見られなかったが、副腎髄質由来細胞株であるPC-12細胞培養系では、アンジオテンシンIIの添加で濃度依存的に培養上清中MBT濃度が上昇した。それぞれの実験系の逆条件での再検を実施中であるが、MBTの由来は副腎皮質だけでなく髄質でもある可能性を別の系で指摘しており、更なる検討を予定している。内因性ジギタリスの中でもMarinobufotoxin(MBT)を標的にして研究しており、世界的にみても独創的な課題である。今年度については、交付申請書で述べたように、アルドステロン(Ald)の特異的受容体拮抗薬であるエプレレノン(Epl)を入手したので、ラットに投与し、食塩負荷の影響とともに検討した。その結果、食塩負荷ラットの血圧は上昇し、Eplの投与は、その血圧上昇を有意に低下させた。同様に、食塩負荷をしない群でも血圧を低下させた。Marinobufogenin(MBG)様免疫活性(MBGi)をELISAにて測定したところ、血中濃度は各群の血圧変動に一致して、特に食塩負荷をしていない群での低下が顕著であった。さらに、副腎中のMBGiを測定したところ、Epl投与群で非投与群に比して有意に減少していた。このことから、Aldは、少なくとも副腎からMBGやMBTの産生を刺激している可能性が高い。ただし、今回の検討では、食塩負荷の影響が、従来の研究成果と異なり顕著に見られなかったことは実験系に何らかの問題があった可能性があり、詳細な点について検討中である。さらに、内因性ジギタリスの産生部位として知られている脳内での変動を検討中であるが、視床下部をブロックで切り出し、その中のMBGiを測定したところ濃度といしては高くないが、Epl群で低値傾向を示したことから、脳内でのAldの役割も重要に関与するものと考えている。脳内でのMBGやMBTの存在とその局在については昨年に引き続いて免疫組織化学やマススペクトロメトリーで検討中である。内因性ジギタリスとして、今年度にはmarinobufotoxin(MBT)に加えてtelocinobufotoxin(TCT)を標的にして研究してきた。また、ウアバインの中枢神経系での役割が再び脚光を浴びており、その産生部位の特定についても検討した。その結果は、次の通りである。

(1)Bufadienolideは、副腎皮質で産生されるというのが定説であるが、ジギタリスは神経系に存在するというのが私の持論であり、それを証明するために抗体を用いた免疫組織化学で脳内の局在を検討したが、うまく染色できなかった。そこで、発生学的に神経由来である副腎髄質由来細胞株のPC-12細胞でMBTの産生を無血清培地で検討し、時間依存的に、培養上清中にMBTが増量することを明らかにした。(2)健常人血清を用いて、その中にTCTが存在する可能性をHPLC/質量分析系にて解析し、蛙から精製したTCTと同じ質量シグナルを有する物質が血清中に存在することを明らかにした。(3)視床下部の室傍核の神経細胞由来と考えられるN-1細胞株を用いて、無血清培地で検討すると時間依存的に培養上清中にウアバインが増加し、アルドステロンを添加すると用量依存的にその増加が促進された。そこで、鉱質コルチコイド受容体遮断薬のエプレレノンを前もって添加するとアルドステロンによるウアバインの増加反応が遮断された。したがって、室傍核では、ウアバインを産生しており、アルドステロンが分泌刺激作用を有することが明らかになった。
ハイブリッド型フィラーの配合・表面処理法および超加速劣化試験

前年度に引き続さ、2-3成分系ハイブリッドフィラーについて検討した。粒子の形状(無定形、球形)および粒径(0.5-5.9μm)の異なる溶融石英微粉末を混合し、2種類のフィラーの組み合わせおよび配合率を変化させて2成分系混合フィラーを作製した。また、粒径1.7μm以下のフィラーについて、同様に組み合わせおよび配合率を変化させた2成分系混合フィラーを作製し、これに30wt%のミクロフィラーを添加して3成分系とした混合フィラーを作製した。これらの2-3成分系フィラーを用いて、光重合コンポジットレジンを試作し、圧縮強さおよび間接引張強さを調べた。また、市販のコンポジットレジンについて超加速劣化試験を行った。これらの結果、以下の結論を得た。1)粒子形状の異なるフィラーを組み合わせた2成分系では、配合率による差は認められず、いずれの形状でも粒径が小さくなるほど圧縮強さは増加した。2)粒子形状の同じフィラーを組み合わせた2成分系では、無定形同士では配合率による影響は認められなかった。球形同士では、比較的大きい粒径のフィラー(S-6)と組み合わせた場合には、粒径の小さいフィラーの配合率が高くなるほど強度は増加したが、1.4μm以下の組み合わせでは、配合率による差は小さくなった。3)ミクロフィラーを添加した3成分系フィラーでは、組み合わせる粒径の小さいほど、また、小さいフィラーの配合率が大きいほど強度は大きくなった。間接引張強さからは、無定形に球形フィラーを加えた組み合わせの一部で強度が大きくなるものが認められた。4)水蒸気圧2気圧から3気圧と加圧度が上がるにつれて、劣化が加速され、同一の強度の低下を示す保存期間が短縮された。ハイブリッド型フィラーの粒子の形状や平均粒径の構成を変化させて機械的性質の検討を行った。まず,無定形フィラー4種類(平均粒径1.7,5.4,10.0,21.5μm),球形フィラー5種類(平均粒径0.46,1.38,5.9,10.5,31.2μm)を用いて,2成分系のハイブリッド型フィラーを作製した。配合方法は,互いに形状の異なるものを50%づつ混合したもの,および形状が同じもの同士を混合したものとした。また,ミクロフィラーを添加した場合の粒径および形状の影響をみるため,上記9種類にミクロフィラー(平均粒径0.04μm)を30%添加したものを作製した。それぞれのフィラーのシラン処理剤による被覆度が50molecules/nm^2となるように比表面積から算出した量のγ-MPTSで処理し,90°Cで2時間熱処理したフィラーを用い,光重合型コンボジットレジンを作製し,圧縮強さおよび関接引張強さを調べた。それぞれ繰り返し3回の実験を行った結果,以下の知見を得た。1.無定形と球形を混合した場合には,組み合わせる粒径が小さいほど強度は大きくなり,両者ともに最小の粒径の組み合わせで最大となった。2.形状が同じもの同士の混合では,粒径が小さい組み合わせほど強度が大きく,それぞれの粒径のフィラーを単独で用いるより,異なる粒径のものを混合したほうが強度が大きくなった。3.ミクロフィラー添加では,粒径が小さいほど強度は大きくなり,無定形より球形に添加したほうが強くなった。今後の課題として,強度的に優れたハイブリッド型フィラーについて,表面処理方法を変化させた時の機械的性質の影響(長期水中浸漬,超加速劣化試験を含める)を調べる必要があると思われる。前年度は試作光重合型コンポジットレジンの2成分系フィラーの構成について検討し、粒径が小さい組み合せで優れた機械的性質を示し、ミクロフィラー添加により強度が増大することを報告した。そこで、本年度は、粒子の形状と粒径を変えた2成分系フィラーについて、配合比を1:3,1:1,3:1と変えた場合、および、これらにミクロフィラーを30%添加して3成分系とした場合の機械的性質について検討した。また、超加速劣化試験装置(平山製作所製)を用いて、加圧した100%水蒸気中での市販材料の超加速劣化試験を行い耐水性の評価の可能性について検討した。(1)無定形フィラーと球形フィラーを混合した場合:圧縮強さは、混合するフィラーの粒径が小さいほど大きくなり、配合率による影響は小さかった。間接引張強さは、混合する粒径が小さいほど大きくなり、大きい球形フィラーで、配合率が増大すると減少した。(2)無定形フィラー同士を混合した場合:圧縮強さ・間接引張強さのいずれにも配合率の影響は認められなかった。(3)球形フィラー同士を混合した場合:圧縮強さは、粒径が小さいほど強く、粒径が大きいものとの組み合わせで、配合率が増加すると大きくなった。間接引張強さは、配合率が増加すると減少した。(4)ミクロフィラーを30%添加した場合(3成分系):圧縮強さは、配合率による影響は小さかった。間接引張強さは、球形フィラー同士では、全体として配合率の増加により減少したが、逆に、強くなるものもあった。(5)超加速劣化試験について:圧縮強さは、いずれの保存期間が長くなると低下したが、高温で保存するほど強度の低下が大きかった。

間接引張強さは、いずれの温度でも、保存期間が長くなると減少し、121°C(2atm)では4日以降で、また、134°C(3atm)では1日で強度が低下した。前年度に引き続さ、2-3成分系ハイブリッドフィラーについて検討した。粒子の形状(無定形、球形)および粒径(0.5-5.9μm)の異なる溶融石英微粉末を混合し、2種類のフィラーの組み合わせおよび配合率を変化させて2成分系混合フィラーを作製した。また、粒径1.7μm以下のフィラーについて、同様に組み合わせおよび配合率を変化させた2成分系混合フィラーを作製し、これに30wt%のミクロフィラーを添加して3成分系とした混合フィラーを作製した。これらの2-3成分系フィラーを用いて、光重合コンポジットレジンを試作し、圧縮強さおよび間接引張強さを調べた。また、市販のコンポジットレジンについて超加速劣化試験を行った。これらの結果、以下の結論を得た。1)粒子形状の異なるフィラーを組み合わせた2成分系では、配合率による差は認められず、いずれの形状でも粒径が小さくなるほど圧縮強さは増加した。2)粒子形状の同じフィラーを組み合わせた2成分系では、無定形同士では配合率による影響は認められなかった。球形同士では、比較的大きい粒径のフィラー(S-6)と組み合わせた場合には、粒径の小さいフィラーの配合率が高くなるほど強度は増加したが、1.4μm以下の組み合わせでは、配合率による差は小さくなった。3)ミクロフィラーを添加した3成分系フィラーでは、組み合わせる粒径の小さいほど、また、小さいフィラーの配合率が大きいほど強度は大きくなった。間接引張強さからは、無定形に球形フィラーを加えた組み合わせの一部で強度が大きくなるものが認められた。4)水蒸気圧2気圧から3気圧と加圧度が上がるにつれて、劣化が加速され、同一の強度の低下を示す保存期間が短縮された。
土に還るロボット：生分解性ソフトアクチュエータの変性機序の解明と設計法の確立

ソフトロボットが微生物などによって土に還ることができる特性、すなわち生分解性を持つことができれば、環境にやさしいロボットとなることが可能となる。生分解性材料は微生物による分解によって刻々と変性する。そのため、生分解性材料によるソフトロボットを実現するためには、その構成材料の分解過程を設計と制御に反映することが重要となる。本研究はこれらを明らかにし、生分解性ソフトアクチュエータの設計法を確立することを目的とする。
成熟脂肪細胞のDirect Reprogrammingによる骨再生システムの開発

本研究の目的は、生体内でダイレクトリプログラミングや骨芽細胞分化に有効な遺伝子を搭載した遺伝子活性化基質(GAM)によって、非培養脂肪細胞を生体内で骨芽細胞へ直接分化転換させる新規骨再生法を開発することにある。実験は、まず非培養脂肪細胞の骨再生に対する有効性評価と、局所で骨再生を誘導するGAM開発の二つを検討した。その結果、非培養脂肪細胞は、骨芽細胞分化刺激因子の存在下で骨再生の有用なツールになり得ること、そして、骨芽細胞分化に関わるRunx2や機能性miRNAによるGAMの骨再生に対する有効性が示唆された。現在、非培養脂肪細胞-GAM複合体による骨再生の有効性を評価しているところである。成熟脂肪細胞を骨芽細胞へ分化転換させる遺伝子の候補を探索するために、本年度はまず培養脂肪由来MSCs(ADMSC)を使用して、それを効果的に骨芽細胞へ分化誘導する遺伝子の探索を行った。候補遺伝子としては、Runx2、Wnt3a、およびBMP4を使用した。実験は、まずこの各遺伝子をエレクトロポレーション法によってADMSCと骨髄由来MSCs(BMMSC)に導入し、その後の骨芽細胞分化の状態を評価することから始めた。その結果、BMMSCではRunx2、Wnt3a、BMP4のいずれも導入後の培養において、ALP活性の有意な上昇と骨芽細胞分化の後期マーカーであるOpsteocalcin(OC)やBone sialoprotein(BSP)のmRNA発現上昇を認めた。しかしながら、ADMSCではRunx2を導入した時に同様の傾向を認めたものの、Wnt3aやBMP4の導入では効果が十分ではないことが明らかになった。我々の以前の研究からADSCはBMSCと比較してより未分化な状態にあると考えられるため、BMP4などの分泌蛋白より、転写因子であるRunx2の導入の方が、未分化状態が高いADSCから骨芽細胞分化を誘導するのに有効であると考えられた。現在、同様の実験を成熟脂肪細胞から天井培養にて抽出した前駆脂肪細胞にて行なっているところである。次に、候補遺伝子を組み込んだ基質(GAM)を生体に移植することで、移植部位における生体細胞の遺伝子の取り込みによる骨形成が可能かどうかを確認するための実験を計画した。実験は、まずアテロコラーゲンとβ-TCPからなる基質にGFPとRunx2遺伝子を搭載したプラスミドベクターを組み込んだGAMを作製し、マウス頭蓋骨上に移植を行った。評価は、移植2週後の移植試料におけるGFPの発現と、移植4,8週後の骨形成の程度を組織学的に解析を現在行っているところであるが、Runx2遺伝子を搭載したGAMの骨形成促進作用を一部認めている。本年度は前年度に引き続き、生体での遺伝子導入を可能にする基質の作製を試みた。前年度、脂肪由来MSC (ADMSC)の骨芽細胞分化に有効な導入遺伝子としてrunx2やbmp4を選択して使用したところ、in vitroにおける分化誘導性については、runx2の高い有効性を認めた。しかしながら、生体でも同様の効果が得られるかを調べるため、これら両遺伝子をコードするplasmid DNA (pDNA)を搭載した遺伝子活性化基質(GAM)を作製して、移植実験を行った。移植はラット頭蓋骨上(骨膜下)と頭蓋骨に作製した欠損部に行い、移植後2, 4, 8週後に試料を採取して、新生骨の形成を観察した。その結果、両遺伝子を搭載したGAMは、遺伝子の搭載のない基質と比較して、顕著な新生骨の形成を認めたものの、欠損部での骨形成に関しては、bmp4を搭載したGAMについて新生骨形成の亢進を認めた。現在、in vitroにおいては、成熟脂肪細胞を使用して、それらにbmp4やrunx2と共にoct4などの初期化因子を導入することで、骨芽細胞への直接転換が図れるか実験を行っているところである。分化転換を図ることのできる遺伝子の組み合わせを抽出できれば、それらを本年度作製したGAMに搭載することで、生体での分化転換が可能かを検証していくつもりである。本年度は前年度に引き続き、生体での遺伝子導入を可能にする基質の作製を継続して行なった。前年度までにbmp4やrunx2をコードするプラスミドDNAを搭載した遺伝子活性化基質を開発し、in vivoにてその有効性を確認していたため、本年度はこれに成熟脂肪細胞を搭載した場合に、その骨芽細胞分化を直接誘導する遺伝子の探索を行った。その結果、有効と思われるmicro(mi)RNAの候補を抽出することができた。実際に、in vitroにて脂肪細胞にこのmiRNAを導入したところ、Runx2の発現亢進を認めている。そのため、本年度から、このmiRNAの導入による脂肪細胞の特性変化について詳細な解析を行うと共に、ruunx2やbmp4遺伝子と共にこのmiRNAを組み込んだGAMを作成し、脂肪細胞と合わせて移植する実験を開始した。現在、その移植試料の解析を行うと共に、有効と思われるmiRNAと初期化因子の組み合わせで成熟脂肪細胞の骨芽細胞への直接分化転換が図れるか検討も行っているところである。miRNAの選定およびその機能解析に時間を必要としており、成熟脂肪細胞の分化転換を図る条件設定にも時間を要すると考えられるため。本年度も前年度に引き続き、生体での遺伝子導入を可能にする基質の検討について、脂肪細胞との相互作用の観点から実験を行なった。昨年度抽出した有効と思われるmicro(mi)RNAについて、脂肪MSC以外に骨髄MSCに導入した場合の脂肪分化抑制や骨芽細胞分化に関わる因子の特性変化を詳細に検討したところ、両組織のMSCにも同様の特性変化を及ぼすことが分かった。そのため、当該miRNAと搭載したGAMについて、脂肪MSCや骨髄MSCおよび非培養脂肪細胞と組み合わせて移植実験を実施した。

現在、移植試料の解析を進め、最も有効と思われる条件の確立を目指して、評価を進めているところである。また、基質材料や導入ベクターについても、従来のアテロコラーゲンやplasmidDNA以外に様々な材料とその組み合わせを検討しており、それらの知見を総括して、高機能な分化転換誘導型GAMの作製を目指している。その中で従来より効率的にplasmid DNAを生体細胞に送達できる新規ナノデバイスに着目し、その材料について、まずin vitroにおいて脂肪MSCや骨髄MSCへ効率的にpDNAをデリバリーできるか評価したところ、従来の遺伝子導入法と比較して、高い導入効率を発揮することを見出した。そのため、現在非培養の脂肪細胞においても同様の導入効率を発揮しうる条件を検索するため、BMP4をコードするpDNAのデリバリー効果について検討を実施しているところである。本研究の目的は、生体内でダイレクトリプログラミングや骨芽細胞分化に有効な遺伝子を搭載した遺伝子活性化基質(GAM)によって、非培養脂肪細胞を生体内で骨芽細胞へ直接分化転換させる新規骨再生法を開発することにある。実験は、まず非培養脂肪細胞の骨再生に対する有効性評価と、局所で骨再生を誘導するGAM開発の二つを検討した。その結果、非培養脂肪細胞は、骨芽細胞分化刺激因子の存在下で骨再生の有用なツールになり得ること、そして、骨芽細胞分化に関わるRunx2や機能性miRNAによるGAMの骨再生に対する有効性が示唆された。現在、非培養脂肪細胞-GAM複合体による骨再生の有効性を評価しているところである。研究予定期間の前半を終了したが、効率が良いと言えないものの一定の効率で生体における遺伝子の導入を可能とする基質を作製することができた。そのため、概ね計画は順調に進展していると評価した。候補因子を組み込んだGAMに脂肪細胞を播種した試料のin vivoにおける骨再生効果を確認していくことを優先する。28年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学・再生医学非培養の脂肪細胞を使用した骨再生の可能性を、分化転換の誘導を含めてGAMを応用することで検討していく。遺伝子の選定についての実験は進行が若干遅れがちではあるが、これは当初次年度以降に予定していたGAMを使用したin vivoでの検討を本年度から開始したためである。そのため、おおむね計画は順調に進展していると評価した。当初本年度に実施を予定していた成熟脂肪細胞の分化転換を図る条件設定の工程に使用する試薬等の購入費が、計画の若干の遅れにより未使用額として生じたため。候補因子を組み込んだGAMに脂肪細胞を播種した試料のin vivoにおける骨再生効果を確認に必要な試薬等の購入費に使用予定である。実験は、当初の計画通りに進行する。