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子宮内膜症のＳＦ－１プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の検討

これまでの検討で、正常子宮内膜に比べ子宮内膜症の局所ではStAR・アロマターゼおよびSF-1が過剰に発現していることが明らかになった。これまでに、局所におけるエストロゲン合成に関してSF-1によるアロマターゼ発現制御機構を検討してきた。しかしながら、これだけでは十分なエストロゲン合成機能を評価できるわけではなく、他の制御因子が関与していることが推察された。今回、コレステロールからエストロゲン合成する過程の6つの酵素のうち、最初の段階に関わりSF-1に発現を制御されるStARに着目し、StARプロモーター領域近傍で発現制御するエピジェネティックな機構が存在するか着目し、その領域の詳細な検討を試みた。研究方法はSF-1と同様に、採取した卵巣子宮内膜症性嚢胞・正常子宮内膜および子宮内膜症腹壁病変の間質細胞をそれぞれ初代培養したものを使用した。結果だが、正常子宮内膜ではStARプロモーター領域におけるメチル化が強く、StARの転写・発現が抑制されていたが、子宮内膜症組織でも正常子宮内膜同様にメチル化が高率で認められた。このことより、SF-1プロモーター領域と異なり、StARに関してはプロモーター領域のメチル化が発現の重要な制御因子ではないことが想定された。以上より、CpGアイランドがSF-1の発現に強く関与していると推察されたが、StAR発現に関しては重要でないと考えられた。アロマターゼは局所におけるエストロゲン合成のkey enzymeであり、その発現量は主にSF-1によって制御されている。これまでにSF-1プロモーター領域にCpGアイランドが密に存在すること、およびその領域で子宮内膜症においてメチル化されたDNAが高発現していることを確認した。また、SF-1プロモーター領域に存在するE-boxとその転写因子が子宮内膜症におけるSF-1過剰発現に深く関与することを報告してきたが、今回SF-1プロモーター領域近傍にSF-1発現を制御するエピジェネティックな機構が存在するに着目し、その領域の詳細な検討を試みた。正常子宮内膜ではSF-1プロモーター領域におけるDNAメチル化によりSF-1の転写が抑制されていたが、子宮内膜症組織では脱メチル化が高率で起こっていた。このことより転写が促進されSF-1が過剰発現していることが想定された。そのため正常子宮内膜細胞を用いて、脱メチル化を目的に5-aza-dC処理を行った。その後、real-time PCR法でSF-1発現を検討したところ、SF-1の発現量は10倍以上に上昇した。さらに子宮内膜症細胞に形質移入してルシフェラーゼ活性を測定したところ、-110/+239の領域でSF-1の発現が増強し、-65/+239の領域ではその増強効果が減弱することが確認できた。以上より-110/+239の領域に存在するCpGアイランドがSF-1の発現に強く関与していることが推察された。
超局所解析的・半古典解析的手法によるスペクトル・散乱理論の研究

研究代表者の中村は,長距離型摂動を持つ拡張されたシュレディンガー作用素に対する散乱行列がフーリエ積分作用素であること,またその応用として散乱行列のスペクトルが決定できるモデルについての研究を継続し,論文をほぼ完成させた.また,只野之英氏との共同研究で,離散シュレディンガー作用素が連続極限でシュレディンガー作用素にノルム・レゾルベント収束すること,したがってスペクトルが収束することを証明した.研究分担者の藤家は,2018年度は,主に次の2つの課題を研究した.(1) A.Martinez,渡部との共同研究で,エネルギー交差を持つ一次元シュレディンガー方程式系の量子共鳴の半古典極限における漸近分布について,エネルギー交差レベルより高いレベルにおいて,超局所解析の手法を用いて量子共鳴の漸近分布を明らかにした.(2) S.Kamvissisとの共同研究で,非線形シュレディンガー方程式のLax対として現れるZakharov-Shabat作用素の反射係数の漸近挙動,固有値の漸近分布を,完全WKB法を用いて明らかにした.研究分担者の足立は,神戸大学の清瀬周氏との共同研究で,(1)定電場と定磁場の両方が印加されている空間内の多体量子力学系に対するAvron-Herbst型の公式を導出し,それを応用して,1個の粒子のみ荷電しており,他の粒子は非荷電であるような系に対する漸近完全性を証明した;(2)時間周期的ポテンシャルをもつ2体Schrodinger作用素に付随するFloquet Hamiltonianに対する新たなconjugate operatorを提唱しMourre評価を得た.その研究の続きで,時間周期的ポテンシャルをもつ3体Schrodinger作用素に付随するFloquet Hamiltonianに対するconjugate operatorを構成し,Mourre評価を得た.研究実績の概要にあるように,研究目的に合致した多数の研究成果が得られた.具体的には,例えば,中村の研究成果は,散乱理論の中核的な研究対象の一つである散乱行列の数学的構造に対する理解を深める結果である.藤家の研究成果は,古典力学的に複雑な構造を持つ力学系を量子化した系の半古典極限におけるスペクトル構造に新たな光をあてるものである.足立の研究成果は,外部電場,磁場等の下での電子の散乱理論の解析という,長い歴史を持つ困難な研究領域に確実な発展をもたらした.数学の研究に関しては、研究成果が出版されるには時間がかかるが,多くの研究成果はすでにプレプリント等の形で公表されている.また,研究目的の一つである若手研究者に対する研究助成も着実に行われており,上記の研究成果の多くは,若手研究者との共同研究成果であることも,それを反映している.前項までで述べたように,研究計画の主目的である量子力学のスペクトル理論,散乱理論を超局所解析的な手法,アイデアを利用して深める,という課題は着実に実行されている.したがって,当初の研究計画にもとづき,引き続き,研究代表者,研究分担者の自発的な研究活動によって,当該研究計画の目標の実現を目指す.具体的には,国際交流,国際会議での研究発表のための外国旅費の支出,国内における研究交流のための国内旅費の支出に予算の大部分を引き続き充てる.必要に応じて,それに付随する諸費用,謝金,研究のための計算機環境の整備,などに予算を支出する.中村(研究代表者)は、離散シュレディンガー作用素とユークリッド空間上のシュレディンガー作用素を含む一般化されたシュレディンガー型作用素に対する超局所的散乱理論の構築を中心に研究を行った。具体的には、磯崎・北田型の超局所レゾルベント評価の新しい証明法による一般化(論文投稿中)、A. Pushnitski(ロンドン大学キングス・カレッジ)との共同研究による散乱行列の高エネルギー漸近展開(論文準備中)、などの成果が得られた。他にも、長距離型散乱理論の超局所的手法による一般化と精密化、ユークリッド空間上のシュレディンガー作用素への半古典測度の応用(F. Macia(マドリッド工科大学)との共同研究)、量子スピン系に対するLieb-Robinson評価の一般化(松田拓朗(東京大学)、高麗徹(学習院大学)との共同研究)、などの研究が進行中である。足立(研究分担者)は、時間周期的でパルス状の磁場の素で運動する電子モデルに対する散乱理論を構築した(川本昌紀(神戸大学)との共同研究)。藤家(研究分担者)は、エネルギー交差のある場合の量子力学的共鳴の半古典解析に関する研究成果を得た(A. Martinez(ボローニャ大学)、渡部拓也(立命館大学)との共同研究)。また、M. Dimmassi(ボルドー大学)との共同研究で、定電場中の量子力学的粒子のスペクトル・シフト関数に関する研究成果を得た。研究目的である、量子力学系に対する超局所解析、散乱理論に関する研究成果が、順調に得られつつあり、また新たな研究計画も進行中である。研究発表状況からも、全般的に見て、順調に研究が遂行されていると判断している。研究代表者の中村は、散乱理論における超局所解析の手法の研究を継続して行ってきている。特に散乱行列の擬微分作用素、あるいはフーリエ積分作用素としての表現、半古典極限、また長距離散乱や、離散系などの一般的なモデルへの拡張を研究しており、離散シュレディンガー作用素などの拡張された量子力学的モデルの散乱行列の超局所的表現、超局所的レゾルベント評価などの研究成果を得た。関連する研究成果として、多数多体量子系のモデルである量子スピン系のLieb-Robinson評価についての理論の拡張を、松田(東京大学・大学院生)、高麗(学習院大学)との共同研究の成果として得た。また、J. Behrndt(グラーツ大学), F. Gesztesy(ベイラー大学)との共同研究としてスペクトルシフト関数に関する研究成果を得て出版準備中である。

現在進行中で未出版の研究課題としては、マドリッド工科大学のF. Macia(マドリード工科大学)との共同研究として、半古典不足測度の非コンパクト領域への拡張された理論を構築中である。研究分担者の藤家は、複数の障壁を持つ量子系の半古典量子化条件、量子力学的共鳴の半古典解析に関する研究成果を、A. Martinez(ボローニャ大学), J. F. Bony(ボルドー大学), T. Ramond(パリ大学), M. Zerzeri(パリ大学),渡部拓也(立命館大学)らとの共同研究で得た。研究分担者の足立は、川本昌紀(京都大学)との共同研究で、時間周期的な電磁場内での量子力学的散乱理論に関する研究成果を得た。研究目的である、量子力学系に対する超局所解析、半古典解析、散乱理論などの漸近解析に関する研究成果が順調に得られつつあり、新たな研究計画、例えば等質的破面集合に対する半古典不足速度の理論の構成なども、進行中である。若手研究者に対する研究助成も着実に行われており、順調に研究計画が遂行されていると判断している。研究代表者の中村は,今年度は以下のような研究を行った.(1)長距離型摂動を持つ拡張されたシュレディンガー型作用素について,散乱行列が古典力学の散乱写像の母関数を相関数とするフーリエ積分作用素であることを証明した.(2)前項の結果の応用として,特定の長距離型摂動を持つシュレディンガー作用素の散乱行列のスペクトルの性質を決定した.(3) Fabricio Macia(マドリード大学)との共同研究で,非コンパクト領域での半古典不足測度の研究を進めた.(4)平良晃一(東京大学)との共同研究で,擬リーマン計量を持つシュレディンガー型作用素の本質的自己共役性についての研究成果を得た.研究分担者の藤家は,今年度は,以下のような研究を行った.(1)双曲型不動点の周りでの解の特異性伝播の定理を精密化した.また,この超局所解析の定理と,量子共鳴の半古典漸近分布の問題の間の相関関係を明らかにした.(2)行列値ポテンシャルを持つ一次元シュレディンガー作用素の量子共鳴の分布を,特にエネルギー交差の近くで明らかにした.(3)行列値ポテンシャルを持つシュレディンガー作用素のスペクトルシフト関数が完全な漸近展開を持つための十分条件を与えた.(4)非自己共役なZakharov-Shabat作用素の固有値の半古典漸近分布を完全WKB法を用いて明らかにした.研究分担者の安達は,今年度は以下のような研究を行った.板倉恭平氏,伊藤健一氏(共に神戸大学),Skibsted氏との共同研究で,Rellichの定理,極限吸収原理,超局所レゾルベント評価など,多体シュレーディンガー作用素のスペクトル理論における重要な題材に対して,それらの証明の新たな枠組を開発した.そのおかげで,滑らかさなど,ポテンシャルに課すべき条件をこれまでよりも緩めることができるようになる.研究実績の概要にあるように、研究目的に沿った研究成果が順調に得られている。
転写因子HOXD9が子宮頸部腺癌の悪性形質に関与する分子機構の解明と治療法の開発

昨年に引き続き、HPV18型陽性の子宮頸癌におけるHOXD9の検討を行った。HOXD9がHPV18型陽性の子宮頸癌に与える分子生物学的影響を検討するため、Hela細胞とSKG1細胞でHOXD9遺伝子を抑制し、E6遺伝子、P53遺伝子およびP53タンパクの発現を検討した。HOXD9を抑制すると2つの細胞株ともに、E6遺伝子発現が著名に抑制され、P53遺伝子の発現は変化なかったが、P53タンパクの発現は増強した。これらのことから、HOXD9はHPV18方型のE6遺伝子の発現を抑制することでP53遺伝子の分解を抑制することが示唆された。HPV18型でのE6/E7遺伝子のプロモーターであるP105プロモーターについて、プロモーアッセイを実施するため、pGL3-P105プラスミドを作成し、HPV18型陽性細胞株であるHeLa株およびSKG-I株に導入して、HOXD9によってP105プロモーターが制御されているか検証を行った。HOXD9遺伝子を抑制すると、ルシフェレース活性が顕著に低下し、P105プロモーターが抑制されたことが示唆された。次にHela株を用いたChip assayを行った。actin標識したHOXD9タンパクをHela細胞に導入して強制発現させ、抗actin抗体で沈殿させるとP105プロモーターが沈殿した。このことから、HOXD9はP105プロモーターに直接結合して発現を制御することが判明した。まず、子宮頸癌における組織型別にHOXD9の発現に差があるか、自験例とTCGAデータベースで検討した。自験例では扁平上皮癌26例と腺癌24例でHOXD9の発現に差は無かった(p=0.43)。一方でTCGAデータベースでは扁平上皮癌187例、腺癌44例で有意に腺癌においてHOXD9の発現が低かった(p<0.001)。子宮頸部腺癌細胞株HeLa細胞でHOXD9の抑制株を作成したところ、細胞増殖が著明に抑制された。HOXD9はHPV18型であり、P97プロモーターを持たないため、P97 reporter plasmidであるpGL3-P97プラスミドを導入してレポーターアッセイを行ったところ、抑制株で有意にP97プロモーターが抑制された。子宮頸部腺癌ではHPV16型またはHPV18型の2種のHPVのいずれかが検出される。HPV18型の子宮頸癌細胞株であるSKG-I株でHeLa株と同様にHOXD9の抑制実験を行ったところ、著明に増殖能が抑制された。以上より、HOXD9は従来、申請者らが検討してきたHPV16型だけでなく、HPV18型でも同様に悪性形質に重要な働きを有すると考えられた。現在、HPV18型でのE6/E7遺伝子のプロモーターであるP105プロモーターについて、プロモーターアッセイを実施するため、pGL3-P105プラスミドを作成し、HPV18型陽性細胞株であるHeLa株およびSKG-I株に導入して、HOXD9によってP105プロモーターが制御されているか検証を行っている。子宮頸部腺癌でもHOXD9がHPV16型のP97プロモーターを介してE6/E7遺伝子を制御することが確認でき、さらにHPV18型においてはP105プロモーターを検討するため、pGL3-P97プラスミドの作成も順調に進んでいる。子宮頸部腺癌では検出されるHPVは16型および18型に限定される。申請者らは、既にHPV16型について、HOXD9がP97プロモーターを制御してE6/E7遺伝子の発現を促進することを示している。

本研究では時にHPV18型について、P105プロモーターがHOXD9に制御されるのかをプロモーターアッセイによって検討し、さらに直接P105プロモーターに結合するかをChIPアッセイを用いて検討する。その上で、HPXD9の働き抑制する既存薬をスクリーニングしてdrug repositioningの面から子宮頸癌の治療法の開発を目指す。効率的かつ計画的に実験を行った結果、約9万円を次年度に繰り越した。繰越金はマイクロアレイ解析に使用する予定である。
局所麻酔薬の脳内gamma-アミノ酪酸受容体・ベンゾジアゼピン受容体複合体に対する影響

塩酸リドカインはどの程度、ベンゾジアゼピン(BZP)受容体に抑制的な影響を与えるか検討した。すなわち、in vitroでラット全脳より調整したシナプス膜可溶化分画に含有している、BZP受容体に対する影響を塩酸リドカインと拮抗薬フルマゼニールで比較検討した。その結果、[^3H]フルニトラゼパムのシナプス膜可溶化分画に対する結合のスキャチャードプロット解析はKd=2.96 nM,Bmax=0.97pmol/mg proteinとなった。この結果からgamma-アミノ酪酸(GABA)_A受容体・BZP受容体・CI^-チャンネル複合体の存在が確認できた。[^3H]フルニトラゼパムのBZP受容体シナプス膜可溶化分画に対する結合量は0.209±0.014 pmol/mg protein〔(mean±S.D.)コントロール、100±6.9%〕となった。100nM塩酸リドカインは[^3H]フルニトラゼパムの受容体結合を79.2±5.0%(mean±S.D.)まで有意に減少させた。また、BZP受容体拮抗薬である100nMフルマゼニールは3.9±2.5%(mean±S.D.)まで有意に減少させた。GABA_A受容体作動薬の10muMムシモールにより、[^3H]フルニトラゼパムの受容体結合は156.1±10.1 %(mean±S.D.)まで増加した。この状態で100nM塩酸リドカインを添加すると117.1±12.5%(mean±S.D.)まで減少し、100nMフルマゼニールは9.5±6.8%(mean±S.D.)まで減少した。120 mMNaCIにより、[^3H]フルニトラゼパムの受容体結合は138.5±10.5%(mean±S.D.)まで増加した。この状態で100nM塩酸リドカインを添加すると120.8±14.0%(mean±S.D.)まで減少し、100nMフルマゼニールは4.8±3.1%(mean±S.D.)まで減少した。100nMでは塩酸リドカインとフルマゼニールで有意差を認め、フルマゼニールがより多く減少させた。したがって、BZP受容体に対する塩酸リドカインの影響はフルマゼニールより有意に少ない事が認められた。以上の結果から、塩酸リドカインはGABA受容体・BZP受容体・CI^-チャンネル複合体に対し抑制的に作用した。しかし、BZP受容体に対し拮抗的に影響しない事が示唆された。

以上の結果から、塩酸リドカインはGABA受容体・BZP受容体・CI^-チャンネル複合体に対し抑制的に作用した。しかし、BZP受容体に対し拮抗的に影響しない事が示唆された。
コウモリの聴覚野FM-FMニューロンのモデリング

本研究の目的は、空間情報を抽出する並列分散型の信号処理手法を構築することであり、このために標的距離に同調したコウモリのFM-FMニューロンのモデル化、および方位情報の抽出、信号数検出のためのための効率的なアルゴリズムの開発を行なった。1.特定のこだま遅延に同調したニューロンでは、定位音に一定の時間遅延を与えることと、信号間の相関処理(あるいは積演算)が基本になる。本研究では、FM-FMニューロンの遅延同調特性の発現機構をモデル化するために、一次および二次遅れ系を時間域応答に持つニューロンからなる多層型ニュールネットワークを取り上げ、単純な構造のニューラルネットで一つの遅延同調ニューロンが模擬できるかどうかを検討している。2.雑音中の多重化された正弦波信号を分離識別することは、一次聴ニューロンの役割である。データ長が十分に長くない場合には、単純なフィルタにより正弦波を分離することは困難である。本研究では、少ないサンプルデータから正弦波成分を高い精度で分離する手法を開発した。3.MDL基準に基づく信号数検出法は、十分多くのサンプル数が入手できる場合、極めて良い性質を持つが、サンプル数が少ない場合には、信号数検出に失敗する。本研究では、この原因を明らかにし、少ないサンプルから信号数を検出するための評価基準を提案した。4.最大尤度方位推定法は高精度、高分解能を有する手法であるが、一般に膨大な計算量を必要とする。最大尤度方位推定法のための交互射影法は、計算の効率化を計った繰り返し算法であるが、解が振動することがある。本研究では、この原因が評価関数の不連続性にあることを明らかにし、これを連続化する手法を提案し、良好や収束特性を実現した。
デングウイルス遺伝子発現に関する研究

1.前年度に作成したデングウイルスコア遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルス(373-core)をSf-9細胞に感染させ、2448時間培養後固定し、デング熱患者の回復期血清を用いペルオキシダ-ゼ抗ペルオキシダ-ゼ(PAP)法で染色した。その結果、患者血清と373-core発現蛋白質との反応は認められなかった。このことは、(1)373-core発現蛋白質にはデングウィルスコア抗原の一部のみ発現されており、患者血清中のコア抗体のうち、発現蛋白の抗原に対応するコア抗体が無いか或は非常に少ない。(2)デングコア蛋白質は感染細胞の表面或は細胞外への移動が無いため、免疫系細胞による認識がされにくく、従ってコア抗体の産生が悪いこと等が考えられる。2.前年度とほぼ同じ方法で、デング4型ウイルスのE蛋白質遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウルイス(401E)を作成した。この401E感染細胞内には非感染細胞中には見られない分子量約43kの蛋白が発現していた。この401E感染細胞を前記と同様の方法で固定しPAP染色を行ったところ、デングウイルス免疫血清、E蛋白に対する単クロ-ン抗体およびデング熱患者回復期血清等との反応が認められた。また、日本脳炎ウイルスに対する抗体とも僅かに反応が認められた。この401E感染細胞を抗原とし、デング熱患者の血清中の抗体価をPAP法による染色価で調べると、日本脳炎ウイルスワクチンを抗原としたELISA抗体価と非常に良く相関した。このことは401E発現蛋白が診断用抗原として使用できる可能性を示唆している。今後、この発現蛋白の分離・精製と、診断用抗原としての有用性について検討する。1。組換えバキュロウイルスの作成:デング4型ウイルス(D4V)のコア蛋白遺伝子を含んだCDNAを制限酵素(BalII NcoI)で切り取った。この両端にBamHIリンカーを付けた後、バキュロウイルス(AcNPV)のトランスファーベクター(pAc373)のBamHI部位に挿入した。このトランスファーベクターのDNAとAcNPVのDNAとをsf-9細胞に共感染させ、ウイルスの組換え体を作成した。この感染細胞培養液をsf-9に感染させ、プラークを作らせた。このプラークの中からポリヘドリン陰性のプラークを拾い出し、更に3回のクローニングを行ない、組換えバキュロウイルス(373-core)を得た。2。組換えバキュロウイルス感染細胞内の発現蛋白の性状:373-core感染SF-9細胞を固定し、D4Vのコアに対するモノクローン抗体(MA6)を用いたPAP染色を行なたところ、感染細胞の核および細胞質にMAbと反応する蛋白が多量産生されていた。この細胞を更に核と細胞質に分画し、MAbを用いたウエスタンブロット(wB)を行なったところ、核分画に分子量約25Kの発現蛋白が多量蓄積しMAbと特異的に反応していることが認められた。D4Vのコア蛋白の分子量は約15.5Kであることから、この発現蛋白はポリヘドリンの一部と融合した融合蛋白として産生されているものと考えられた。3。発現蛋白の精製および抗体の作成:373-core感染sf-9細胞をSDS-電機泳動し、染色後25Kの発現蛋白のバンドを切り取り溶出した。この蛋白を精製・濃縮し、アジュバンドと共にマウス腹腔に接種した。同様の精製蛋白を5回免疫した後腹水癌細胞を接種し免疫腹水を得た。この免疫腹水を用い、デングウイルス14型および日本脳炎ウイルス感染細胞についてWBを行ったところ、D4Vのコア蛋白とのみ反応し、型特異性が認められた。

1.前年度に作成したデングウイルスコア遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルス(373-core)をSf-9細胞に感染させ、2448時間培養後固定し、デング熱患者の回復期血清を用いペルオキシダ-ゼ抗ペルオキシダ-ゼ(PAP)法で染色した。その結果、患者血清と373-core発現蛋白質との反応は認められなかった。このことは、(1)373-core発現蛋白質にはデングウイルスコア抗原の一部のみ発現されており、患者血清中のコア抗体のうち、発現蛋白の抗原の対応するコア抗体が無いか或は非常に少ない。(2)デングコア蛋白質は感染細胞の表面或は細胞外への移動が無いため、免疫系細胞による認識がされにくく、従ってコア抗体の産生が悪いこと等が考えられる。2.前年度とほぼ同じ方法で、デング4型ウイルスのE蛋白質遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルス(401E)を作成した。この401E感染細胞内には非感染細胞中には見られない分子量約43kの蛋白が発現していた。この401E感染細胞を前期と同様の方法で固定しPAP染色を行ったところ、デングウイルス免疫血清、E蛋白に対する単クロ-ン抗体およびデング熱患者回復期血清等との反応が認められた。また、日本脳炎ウイルスに対する抗体とも僅かに反応が認められた。この401E感染細胞を抗原とし、デング熱患者の血清中の抗体価をPAP法による染色価で調べると、日本脳炎ウイルスワクチンを抗原としたELISA抗体価と非常に良く相関した。このことは401E発現他蛋白が診断用抗原として使用できる可能性を示唆している。今後、この発現蛋白の分離・精製と、診断用抗原としての有用性について検討する。
学校施設の複合化に関する研究

本研究では、学校施設の複合化を手がかりに、学校と地域社会の関係について考えようとした。学校施設の複合化とは、「学校と地域社会の連携」を目指して、学校に他の公共施設、たとえば公民館、幼稚園、保育園、高齢者福祉施設等を併設することである。本研究では、国内の学校複合施設はもとより先駆事例として知られる北欧の学校複合施設、さらには、学校複合施設ではないが地域社会との関係を意識して設計された学校建築にまで対象を広げてフィールド調査を実施し、施設見学や資料収集、聞き取りを行った。こうしたフィールド調査を継続するなかで出会ったのが京都府南山城村の学校統廃合の事例であった。南山城村では、2002年度をもって村内にあった4つの小学校のうち、田山、高尾、大河原の3小学校が廃校となり、2003年度より統合先の南山城小学校が、保育園、保健福祉センターとの複合施設として開校した(2005年度には残る野殿童仙房小学校も廃校、統合された)。本研究では、複合施設である南山城小学校のフィールド調査を行うと同時に、田山地区、高尾地区において、地域住民を対象とする聞き取りを行った。聞き取りの内容は、廃校となった旧田山小学校、旧高尾小学校と地域住民とのこれまでのかかわりそれから新設の南山城小学校、および併設された施設と地域住民とのかかわりについてである。聞き取りは、田山地区は15世帯、高尾地区は16世帯から実施することができた。本研究を通してみえてきたのは、子どもの教育機関としての側面にとどまらない、地域社会の寄り合い所としての学校の姿である。本年度は、学校施設の複合化について、それが地域社会においてどのような意味を持ってくるのかという観点から、主要には以下の二つの項目において研究を進めた。1.京都府南山城村におけるフィールド調査京都府南山城村では、2003年度より村内の三つの小学校の統廃合によって南山城小学校が新たに開校したが、この南山城小学校は、保育園、保健福祉センターとの複合施設である。本研究においては、科研費執行に先行して、廃校になった旧田山小学校をもつ田山地区において、地域住民と田山小学校や複合施設とのかかわりについての聞き取り調査に着手している。科研費によって、この聞き取り調査による膨大な量のテープ起こしとデータの整理を行うと同時に、田山地区に伝承されている雨乞いの儀礼であり、田山小学校をその重要なステージとする田山花踊りを取材し、田山小学校と花踊りのかかわりについて、聞き取り調査を行った。2.学校施設の複合化の事例研究学校施設の複合化の事例をおさえるため、国内においては、もともと複合施設として設計されたわけではないが、空き教室を福祉施設に転用している、宮代町立笠原小学校(埼玉県)を訪問調査した。また、複合施設というわけではないが、明治33年に建てられた現役校舎としては日本最古の木造校舎であり、町並み保存された観光地区の景観の一角を担うなど、まさに地域社会に根ざした、高梁市立吹屋小学校(岡山県)を訪問調査した。さらに、海外においては、デンマークのスティンヴェ校(ファールム市)、スウェーデンのヘーグセートラ校(リーディンゲ市)を訪問調査した。ともに住宅地のなかにあり、地域住民とのかかわりを想定して設計された複合施設である。本研究では、学校施設の複合化について、それが地域社会においてどのような意味を持ってくるのかという観点から研究を進めている。そのなかで、複合施設設置の経緯や、地域住民と複合施設、あるいは複合施設設置にともなって統廃合され廃校となった学校施設とのかかわりについて調査を進めており、複合施設をもつ地域として京都府南山城村をフィールドに定めている。京都府南山城村では、2003年度より村内の三つの小学校の統廃合によって南山城小学校が新たに開校したが、この南山城小学校は、保育園、保健福祉センターとの複合施設である。

昨年度よりすでに、廃校になった旧田山小学校をもつ田山地区において、地域住民と田山小学校や複合施設とのかかわりについての聞き取り調査を行い、さらには旧田山小学校を会場とした田山花踊りの視察、聞き取り調査を行うなど、現地のフィールド調査を行っている。今年度は、田山地区において田山小PTA役員経験者から聞き取り調査を行うとともに、もう一つの廃校となった学校である旧高尾小学校のある高尾地区において、地域住民を対象とした同様の聞き取り調査を行うとともに、旧高尾小学校の視察を行うなど、現地のフィールド調査を行った。また、南山城村におけるフィールド調査と並行して、地域社会における学校施設の意味を考察するために、地域に根ざした学校施設の訪問調査を行った。具体的には、原広司氏が地域と対話しつつ設計を担当した内子町立大瀬中学校、地元に根ざした設計活動を続けた松村正恒氏が八幡浜市役所建設課職員時代に設計した八幡浜市立日土小学校を、それぞれ訪問調査している。本研究では、学校施設の複合化を手がかりに、学校と地域社会の関係をとらえ、地域社会において学校の担う多様な機能や意味について考えようとした。そこで取り上げたのが、京都府南山城村の事例である。京都府南山城村では、2002年度をもって村内にあった四つの小学校のうち、田山、高尾、大河原の三つの小学校が廃校となり、2003年度より統合先の南山城小学校が、保育園、保健福祉センターとの複合施設として開校した(2005年度には残る野殿童仙房小学校も廃校、統合された)。本研究では2004年度より、廃校になった旧田山小学校がある田山地区、旧高尾小学校がある高尾地区において、地域住民に対して聞き取りを行ってきた。聞き取りの内容は、地域住民と廃校となった小学校とのこれまでのかかわりや、廃校となって以降の旧施設とのかかわり、あるいは新設の南山城小学校や併設された他の二つの施設とのかかわりについてである。今年度は、本研究の最終年度にあたるため、研究成果報告書の作成作業を進めた。具体的には、南山城小学校教員への聞き取りや、現地のフィールド調査を行い、これまでの聞き取りを補完するとともに、これまで得られた田山地区15世帯、高尾地区16世帯分の聞き取りデータを、田山・高尾両地区の歴史、人の移動、各種団体、小学校の統廃合、田山・高尾小学校校舎、子ども時代の思い出、奉安殿・二宮金次郎、校歌、運動会のカテゴリーに分類して整理し、再検討を行った。また、南山城村以外にこれまで行ってきた学校複合施設のフィールド調査についても再検討を行った。
相互相関分光法を利用した細胞内分子間相互作用の解析

単1細胞機能の時間的・空間的な情報を得るためにはイメージングの手法が重要であるが、細胞内を早い速度で「離合集散」しながら複合体形成を行い細胞機能を支えている分子を捉えるために申請者は蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy ; FCS)に着目した。なぜならFCSは動きの速い分子の相互作用検出に適し、しかも1分子レベルまでも検出が可能だからである。しかし一方で単1細胞内の分子間相互作用や、分子数の変化は細胞内の測定場所での違いが大きく反映されるために、正しい評価を行うためには多数の点で同時にFCS測定を行い、空間情報として分子の「動き」や「結合」の情報を得る必要がある。これらの点を克服するために、多点同時測定のFCSが有効であると考えた。まず全反射光学系と斜光光学系を検討し,励起光強度が安定に維持できることなどから本研究においては,最終的に全反射光学系を採用した。次に,細胞中の多点として4点でFCS測定を同時に行うことができる測定システムの開発を行ない、細胞内分子間相互作用の統合的理解を目的とした。当初計画していた単1細胞内4点ではなく,検出部としての光ファイバーの設置の安定性から7点測定とし,装置を完成させた。さらに,膜結合性GFPの構築と細胞内発現を行い,実際に単1生細胞中におけるタンパク質の7点同時に蛍光強度変化,ならびそこからのFCS測定が可能であることを実証した。7点からの情報のすべての組み合わせである21通りが可能であるが,その中で数点の空間相互相関解析を試みた。また,膜結合タンパク質としてNaポンプタンパク質等の測定を行った。その結果,複合体を形成することで確実に拡散速度が低下することを明らかにした。今後の研究の方向性として,直接相互作用の検出,細胞内の任意の空間での検出などの必要性が明らかになった。現在,各点の時間相互相関解析が可能とするために,各測定点にダイクロイックミラーの設置を行い,直接相互作用の解析を試みている。時間的・空間的な情報を得るためにはイメージングの手法が重要であるが、細胞内を早い速度で「離合集散」しながら複合体形成に関わる分子を捉える蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS)を用いる。FCSは動きの速い分子の相互作用検出に適し、1分子レベルまでも検出が可能である。単1細胞内の分子間相互作用や、分子数の変化は細胞内の測定場所での違いが大きく反映されるために、正しい評価を行うためには多数の点でFCS測定を行い、空間情報として分子の「動き」や「結合」の情報を得る必要がある。これらの点を克服するために、全反射と斜光光学系を採用し、細胞中の4点(多点)でFCS測定を同時に行うことができる測定システム(薄層斜光および全反射蛍光相関分光装置、Laminated Optical sheet and Total Internal Reflection-Fluorescence Correlation Spectroscopy、LOTIR-FCS)の開発を行ない、細胞内分子間相互作用の統合的理解を目的とした。本年度は多点測定が可能であることを実証することとしたが当初想定した4点ではなく,前倒しで7点測定を完成させた。さらに,膜結合性GFPの構築を行い,実際に生細胞中におけるタンパク質の7点同時測定が可能であることを実証した。現在,7点からの情報のすべての組み合わせである21通りの空間相互相関解析を行っている。また,膜結合タンパク質としてNaポンプタンパク質の測定を行った。
微生物由来のエンド型糖質分解酵素の機能改変とその機能性糖鎖複合体の合成への応用

糖タンパク質の糖鎖付加は、タンパク質の品質管理やウイルス感染、免疫応答など様々な生命現象を仲介する重要な機能を担っていることが明らかとなってきた。それら糖鎖の機能を解析する際や、糖タンパク質性医薬品などを創製する際に必要となるのが、種々のタンパク質に任意の糖鎖を付与する技術である。本研究は、微生物由来のエンド型糖加水分解酵素Endo-Mの糖転移付加活性を利用して、種々の有用糖鎖複合体を容易かつ効率的に合成することを目的として行った。当該年度までに、本酵素の部位特異的変異導入を行い、反応中間体糖鎖を基質とすることにより、非常に高い糖転移付加活性を示す「改良型Endo-M」を取得することに成功した。当該年度においては、酵素反応の基質となる様々な反応中間体糖鎖を容易な化学一酵素反応によって合成し、実際に改良型酵素を用いて生理活性ペプチドであるsubstancePやPAMP12に種々の糖鎖を高収率で付加することに成功した。さらに、その生理活性評価を行った結果、新たに得られた生理活性糖ペプチドは元のペプチドと比較して血中半減期が増長したことが示唆された。また、分子量のより大きい糖タンパク質の合成を視野に入れて、ウシ由来のRNaseBや酵母由来のGDPaseなどの糖タンパク質をモデルとして本法を適用したところ、目的産物が得られた。改良型微生物酵素を利用した本法は、従来の化学的手法と比較して、容易・安価かつ高収率で種々の糖ペプチド・糖タンパク質を合成することを可能にするものであり、糖タンパク質性医薬品や様々な糖鎖複合体を合成する画期的な手法の一つとなることが期待される。糖タンパク質や糖脂質の糖鎖は、細胞の分化や接着、タンパク質の品質管理、ウイルス感染など様々な生命現象において重要な役割を担うことが明らかとされており、最近では、糖鎖の機能や構造に着目した糖鎖医薬品や機能性糖鎖複合体などの創製が試みられている。本研究では、微生物酵素エンドMが有する特異な糖鎖付加機能に着目し、物質生産に有効な本酵素の機能改変型変異酵素を創製するとともに、その実用化を試みている。本研究においてこれまでに、糖鎖付加機能の向上した種々の有用変異体酵素を創製することに成功してきたが、最近、糖鎖付加機能が著しく向上した変異体酵素を新たに見出した。本変異体酵素を用いて実際にいくつかの糖ペプチドの酵素合成を行ったところ、従来の野生型の酵素を用いた際の収率は僅か数パーセントであったのに対し、その収率は90%程度まで飛躍的に向上していることを見出した。また、これまでオキサゾリン誘導体の化学合成は煩雑であったが、最近東北大学の正田らによってオキサゾリン誘導体の簡便な合成法が開発された。実際のその手法を用いて卵黄由来のシアロ糖ペプチドを材料としてシアロオキサゾリン誘導体を合成し、本変異体酵素によって酵素反応を行った結果、さまざまなシアロ糖ペプチドが90%程度の高収率で生産できた。すなわち、平成21年度に実施した研究の成果により、基質の合成から目的物質である糖鎖複合体を得るまでの全ステップが容易かつ効率的な画期的な方法が開発された。平成22年度は、本法を用いて糖タンパク質や生理活性糖ペプチドの酵素合成を行う。また、酵母によるタンパク質生産と組み合わせ、エリスロポエチン、ラクトフェリンなど種々の糖タンパク質性医薬品の生産への実用を試みる。
ヒト癌の脂肪酸・グルコース代謝の特性

1.脂肪酸合成酵素(FAS)は、食道・胃では前癌病変から、また、膀胱でも早期の癌(dysplasia/carcinoma in situ)から高発現する。一方、膵癌では前癌病変部にFASの発現はほとんどみられず、癌部のみに強く発現する。2.膀胱癌ではFASの発現とKi-67標識率の組み合わせが、また軟部肉腫ではFASの発現が予後不良の因子となる。3.結腸癌株、未分化甲状腺癌株はセルレニン処理により細胞内ATP量の低下とともにネクローシス、アポトーシスをきたす。4.adriamycin, AraC, vincristineに耐性の骨髄性白血病株(KY-821とKF-19)は、親株よりもFAS阻害剤であるセルレニンに強い感受性を示し、ほとんどの細胞がアポトーシス・ネクローシスを示した。一方、慢性髄性白血病の急性転化(赤芽球性白血病)株ではこのような現象がみられなかった。抗癌剤耐性株の治療法の手がかりの一部が得られたものと考えられる。6.転移モデルにおいて、脈管内癌細胞にFASの強発現がみられ、これは、癌細胞の脈管内移動のエネルギー源として脂肪酸を用いることを強く示唆する。7.脂肪酸結合蛋白(FABP)の肝型(L-FABP)は、胃癌・肺癌ではFASと類似の発現様式を示す。8.心筋型(H-)FABPは、胃癌では癌のプログレッションに相関し、予後因子の一つである。9.グルコーストランスポーター1(Glut-1)は、胃癌、肺癌で予後因子の一つである。1.胃癌(n=617)におけるグリコーストランスポーター1の発現は、高分化型、深達度、脈管侵襲、リンパ節・肝転移、ステージおよび予後と密接な相関を示した(Cancer投稿中)。2.胃癌における脂肪酸合成酵素(FAS)の発現は、性、年令、高分化型に相関したが予後との関連性はなかった。また、FASは再生上皮、腸上皮化生にも高頻度に発現していた(Histropathology投稿中)。3.食道癌(n=88)ではほぼ全例がFAS陽性であり、その他に再生上皮、前癌病変にもほぼ癌と同程度にFASの発現が認められた(Histopathology投稿中)。4.軟部肉腫(n=64)で、FASは31%に陽性で、FASの発現は腫瘍のサイズ、深在性および予後不良と正の相関を示した(Cancer投稿予定)。5.肺癌(n=190)では68%に肝型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)の発現が認められ、大細胞癌(80%)、腺扁平上皮癌(83%)で陽性率が高かった。予後との相関はなかった。6.胃癌株TAKIGAWAは、L-FABPを産生しているが、二次元電気泳動とウエスターンブロッティングにより、肝のL-FABPとは異なるL-FABPのスポットが検出された。7.甲状腺未分化癌株(n=4)にFASとグルコーストランスポーター1の発現を認めた。8.胃癌株(n=8)および正常胃粘膜(n=4)のFASおよび脂肪酸代謝関連酵素・蛋白の12種のmRNAの発現を調べた。その結果、脂肪酸活性化系、β酸化系、膜脂質合成系および蛋白アシル化系のいずれもが細胞株で正常部に比べて発現が亢進していることが確認された。1.ヒト胃癌におけるグルコース・トランスポーター1(Glut-1)の発現と癌の転移と悪性度、患者の予後との相関性について明らかにし、発表した(Cancer,2001)。また、より広くがんのグルコース代謝を調べるために新たにGlut-1,Glut-3,Glut-5に対する抗体を作製した。

2.ヒト胃癌における脂肪酸合成酵素(FAS)の発現の特性について発表した(Histopathology,2002)。FASは癌部のみならず、腸上皮化生、腺腫などの前癌病変さらには再生上皮にも発現することを確認した。3.ヒト食道癌でもFASは軽度異型上皮からすでに高発現していた(投稿中)。4.ヒト膵癌40例中39例にFASの高発現を認めた。しかし、腺管上皮過形成、腺腫様病変ではFASの高発現はみられず、胃・食道とは異なる発現様式を示すことが分かった。5.甲状腺未分化癌株4株はいずれもFASを発現しており、いずれもFASの阻害剤であるセルレニン処理により細胞死を遂げる。形態学的にはアポトーシスおよびネクローシスの像を呈し、細胞内ATP濃度の著減と平行して細胞死がみられた。6.adriamycin, AraC, vincristineに耐性の骨髄性白血病株(KY-821とKF-19)は、親株よりもFAS阻害剤であるセルレニンに強い感受性を示し、ほとんどの細胞がアポトーシス・ネクローシスを示した。一方、慢性髄性白血病の急性転化(赤芽球性白血病)株ではこのような現象がみられなかった。抗癌剤耐性株の治療法の手がかりの一部が得られたものと考えられる。7.ラット転移実験モデルで、脈管内癌細胞と、脈管外脱出癌細胞によって形成された微小転移巣とでFASの高発現が認められ、脈管内移送時と転移形成の初期増殖巣でFASが発現することが判明した。
発生過程における神経細胞死の制御機構

(1)上頸神経節(SCG)細胞の神経細胞死と細胞内のCa2^+との相関脱分極シグナルの発達に関して、種々の発生段階(E16-P7)のラットSCG細胞及びそれらをNGF処理した時間経過を関数として調べた。その結果、L型Ca2^+チャンネルの発達が最も重要であることが、細胞内Ca2^+濃度のfura-2標識による蛍光画像解析及びRT-PCR法によるL型Ca2^+チャンネル量の測定から判明した。更に、高K^+培地処理による細胞生存は細胞内Ca2^+濃度の上昇によるとすれば(Ca2^+セットポイント仮説)細胞死においては細胞内Ca2^+濃度の降下が起こるはずである。実際、細胞内Ca2^+濃度をBAPTA-AM等でキレートした時、細胞死が起こり、これは染色体の凝縮の前にc-fosの核への移行を伴い、タンパク質合成RNA合成を必要とする積極的な細胞死であった。(2)小脳顆粒細胞の細胞死とその発達生後8日目のラット小脳から顆粒細胞を分離し、培養すると7日目で細胞死が起こった。これが発生過程での細胞死に対する事を示した。それは、その細胞死がシクロヘキシミド、脱分極、BDNFで抑制されること更にアポトーシスであることを示した。又、trkBの存在もRT-PCR法及びanti-trkB抗体を用いたimmunoblotで確かめた。実際、小脳顆粒細胞は外顆粒層から内顆粒層に移動する際、trkBの発現が見られることが明らかになり、その後のシナプス形成で栄養因子依存性を獲得することに対応していると考えられた。(3)プログラム細胞死過程で活性化するメッセージの同定BAPTA-AM、Thapsigargin、calcium ionophoreなどで処理するとBiP/GRP78の免疫染色は増強した。神経栄養因子除去によるアポトーシス過程でもBiP/GRP78が著しく活性化した。このような相関は細胞死と細胞内カルシウム調節機構との関連を示唆する。(1)上顎神経節(SCG)細胞の神経細胞死と細胞内Ca2^+との相関脱分極シグナルの発達に関して、種々の発生段階(E16-P7)のラットSCG細胞及びそれらをNGF処理した時間経過を関数として調べた。実際、細胞内Ca2^+濃度をBAPTA-AM等でキレートした時、細胞死は遅延した。これが発生過程での細胞死に対応する事を示した。

実際、小脳顆粒細胞は外顆粒層から内顆粒層に移動する際、trkBの発現が見られることが明らかになり、その後のシナプス形成で栄養因子依存性を獲得することに対応していると考えられた。(3)上顎神経節細胞のNa^+イオンを介した神経細胞死とその発達膜電位依存性Na^+チャンネルの活性化剤であるベラトリジンはNGF除去による上顎神経節細胞の細胞死を抑制することを見いだしたが、この効果はNa^+イオンの細胞への流入によるものであった。一方、Na^+イオンが過剰に流入すると神経細胞死を誘発し、その効果は神経細胞の成熟に伴って増強された。(1)細胞内カルシウム濃度の低下はアポトーシスによるニューロン死を誘発する。我々は神経細胞生存に関する細胞内Ca2^+ウィンドウの存在を仮定し、Ca2^+イオン濃度がより高い領域もより低い領域も細胞死が起こると考えた。更に、NGF除去すると細胞内Ca2^+イオン濃度の低下が起こり、これがトリッガ-となって細胞死に至ることを想定した。この仮説の当否を検討した。末梢(上頸神経節細胞)及び中枢(小脳顆粒細胞)神経細胞をカルシウムキレート剤BAPTA-AM及びその誘導体で処理することによりアポトーシスを誘発した。アポトーシスの判定は、細胞体の収縮、ビスベンザミド染色による特徴的な染色体の凝縮、Apop-Tag法及び電子顕微鏡観察により確かめた。同時に、細胞内カルシウム濃度をfura-2標識して画像解析装置でモニターするとカルシウムキレート剤処理によりカルシウムレベルは低下した。さらにこのニューロン死は染色体の凝縮の前にc-fosの核への移行を伴い、タンパク質合成RNA合成を必要とする積極的な細胞死であった。(2)プログラム細胞死過程で活性化するメッセージの同定神経栄養因子除去によるアポトーシス過程で活性化する遺伝子を探索したところ、BiP/GRP78が著しく活性化することを見いだした。熱ショック蛋白質HPS70ファミリーのうちBiP/GRP78は小胞体のみに存在し、タンパク質の膜透過、立体構造の安定化に必要な分子シャペロンである。我々はプログラム神経細胞死においてBiP/GRP78が小胞体カルシウムと結合しているという示唆から、細胞死と小胞体カルシウム調節機構とは関わり合っていると考えられた。実際、BAPTA-AM、Thapsigargin、calcium ionophoreなどで処理するとBiP/GRP78は活性化された。このような事実から小胞体からゴルジ装置に至る細胞内シグナリングメカニズムの解明が神経細胞死カスケードの解明を導く糸口になる可能性がある。
USR意識の醸成を目指す教職協働初任者研修の開発と評価

本研究は,USR(大学の社会的責任)意識を醸成するための教職員初任者研修を最新の教育方法を導入して開発すること,および研修前後における教職員の業務に対する意識の変化と組織運営への影響を測定評価することを目的とする。研修は教職員に対話を促し,自身の考えを引き出す方法をとる。海外での事例を参考にし,ICT(情報通信技術)を活用して対話や思考を促進する教育方法を導入することにより,参加者は体験的に教育方法も学ぶことができる。自己評価のため,ルーブリックを作成し,意識変化を調査する。さらに,研修翌年に受講者がどのように学んだことを生かしているかインタビューし,意識変化による組織運営への影響を考察する。
結晶配向制御による低弾性率マイクロバンプ形成手法の開発

三次元半導体実装用金属バンプに用いられる銅はヤング率が結晶方位によって異なる材料である.本研究では,実装構造内残留応力低減のため,ヤング率が最も低い(100)面に配向した銅バンプ作製を可能とするめっき条件,下地材料の探索を行った.(001)面配向のβ-Taバリア層上に銅シード層を形成しめっき成膜した銅薄膜で(100)面配向の増加を確認した.このめっき銅薄膜のヤング率をナノインデンテーション試験により評価したところ,(111)面配向単結晶銅より約20 GPaも小さいヤング率(平均127 GPa)を得た.以上より,結晶方位を制御しためっき銅バンプの作製による低ヤング率化の実現可能性を実証した.半導体チップを積層した三次元実装構造では,金属バンプとバンプ間に充填された樹脂材の弾性率(ヤング率),線膨張係数の差が大きいため,熱硬化時や使用中の温度変化によってバンプ接続部近傍に局所的に高い熱応力や変形が発生し,シリコンチップ割れ,配線の剥離,トランジスタの特性変動など様々な不良の直接的原因となっている.そこで本研究では,金属バンプに用いられている銅のヤング率が結晶方位によって約67 191 GPaまで異なることを利用し,金属バンプと樹脂材料とのヤング率差を低減するため,ヤング率が最も低い(100)面に強配向した銅マイクロバンプの作製手法の検討を行った.めっき法を用いて銅バンプを作製する場合,銅バンプの結晶配向性はめっきシード層の結晶配向性に依存する.そこで,銅の拡散防止層(バリアー層)として用いられているTaの酸化物(例えばδ-Ta2O5)の格子定数が銅の格子定数に近いことに着目し,(100)面配向の銅シード層及びめっき銅バンプを形成する手法として,TaとCuシード層の間にTa酸化物層の導入を検討した.Ta膜堆積後,表面を酸化させTaバリアー層上に酸化膜を形成し,その上にスパッタ法でCuシード層を堆積させた.Cuシード層の結晶配向性をX線回折法,電子線後方散乱回折法を用いて評価したところ,膜厚方向の主配向面が(100)面であることを確認した.このシード層上に電流密度30 mA/cm2で膜厚10 μmのめっき銅薄膜を形成した.その結果,従来のTa/Cu下地層上にめっきした銅薄膜では(111)面強配向を示したのに対し,酸化層導入によって(100)面と(110)面配向が混在した多結晶銅薄膜を得ることに成功した.今後,めっき時電流密度や熱処理の影響を検討し,さらなる(100)面強配向化を試みる.TSV(Through Silicon Via)配線と金属バンプを用いてチップを積層し接続する三次元半導体実装構造では,チップ及び半導体パッケージが線膨張係数の異なる多くの材料で構成されるため,実装時に物性差に起因した熱残留応力が発生する.特に,金属バンプとバンプ間に充填された樹脂材(アンダーフィル)の弾性率(ヤング率),線膨張係数の差が大きいため,熱硬化時や使用中の温度変化によってバンプ接続部近傍に局所的に高い熱応力や変形が発生し,シリコンチップ割れ,配線の剥離,トランジスタの特性変動など様々な不良の直接的原因となっている.このバンプ/アンダーフィルの物性差に起因する残留応力・局所変形を低減するための設計指針として本研究では,結晶方位を制御しためっき銅バンプの作製による低ヤング率化の実現可能性について検討した.バンプに用いられる銅は,ヤング率が結晶方位によって異なる材料であることから,ヤング率が最も低い(001)面に配向した銅バンプ作製のためのめっき条件,下地材料の最適化を行った.電解めっきによって作製された材料の結晶配向性は下地材料の結晶構造,配向性に依存するため銅の(001)面配向が可能な下地材料として,(001)面配向のβ-Taをバリア層に採用し,その上に銅のシード層を成膜した.下地層成膜後,直流電解めっき法で銅薄膜を作製し,結晶配向性をX線回折および電子線後方散乱回折(EBSD:Electron Back Scattering Diffraction)法により,ヤング率をナノインデンテーション試験により評価した.その結果,銅薄膜の(001)面配向化を確認し,(001)面配向単結晶銅と同等のヤング率(平均130GPa)を得た.(111)面配向単結晶銅の平均ヤング率が150GPaであったことから,結晶方位を制御しためっき銅バンプの作製による低ヤング率化の実現可能性を実証した.三次元半導体実装用金属バンプに用いられる銅はヤング率が結晶方位によって異なる材料である.本研究では,実装構造内残留応力低減のため,ヤング率が最も低い(100)面に配向した銅バンプ作製を可能とするめっき条件,下地材料の探索を行った.(001)面配向のβ-Taバリア層上に銅シード層を形成しめっき成膜した銅薄膜で(100)面配向の増加を確認した.

このめっき銅薄膜のヤング率をナノインデンテーション試験により評価したところ,(111)面配向単結晶銅より約20 GPaも小さいヤング率(平均127 GPa)を得た.以上より,結晶方位を制御しためっき銅バンプの作製による低ヤング率化の実現可能性を実証した.Taバリアー層とCuシード層の間にTa酸化物層を導入することで,銅シード層及びめっき銅バンプの(100)面強配向化の見通しを得た.めっき銅薄膜においては,めっき時電流密度が小さいほど,下地層の結晶配向性に依存したエピタキシャル膜を形成しやすいことが既に知られている.したがって,(100)面強配向めっき銅バンプは,(1)中間層としてTa酸化物層の導入,(2)めっき時電流密度の最適化(30 mA/cm2から10 mA/cm2へ下げる),によって達成できると考えられる.また,(100)面配向を有する結晶粒は,ナノインデンテーション試験により他の配向性を有する結晶粒よりも弾性率,硬さともに小さく,(100)面強配向化による低弾性率化も確認されており,研究はおおむね順調に進展しているといえる.信頼性設計今後は,(1)電流密度の最適化による(100)面強配向化の検討,(2)(100)面強配向銅マイクロバンプの作製とナノインデンテーション試験による機械特性評価,(3)(100)面強配向銅マイクロバンプを用いた三次元積層構造サンプルの試作とチップ内局所変形評価,を実施し,マイクロバンプの低ヤング率化による三次元半導体実装構造の低応力化を実現する.