hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大規模ゲノム情報解析を加速する並列計算システム

ゲノム研究に用いられる大規模並列計算では計算に用いるソフトウェア数が膨大となり、様々なバージョンや依存関係を持ち、時には互いにコンフリクトするソフトウェアを同時に使用しなければならない。このような目的のためにはコンテナ仮想化がよく用いられるが、DockerやSingularityのような管理者権限を用いてインストールする必要があるコンテナ仮想化エンジンは、限られた数の科学技術向けHPCクラスターでしかサポートされていない。また、Univa Grid EngineやCUDAなどのホスト環境を必要とするソフトウェアはコンテナ内からホスト環境へのアクセスを必要とする。これらの問題を解決するため、管理者権限を一切使用しない、ホスト環境との“composability"を実現したコンテナ仮想化エンジンLPMXを開発し、オープンソースで公開した。また、ファイルシステムレイヤーをサポートし、Dockerイメージを直接用いることができるよう実装した。一方、ゲノム研究ではパイプライン的な計算を多用し、例えばがん研究では100以上の解析ソフトウェアを用いることもあるが、解析ソフトウェアのインストールには数ヶ月の時間がかかる事もしばしばあった。そこで、以前から開発を行っていたLocal Package manager(LPM)を改良し、セットアップ方法を共有することで解析ソフトウェアのセットアップに必要なハンズオンタイムを大幅に短縮した。また、ユーザーからのパッケージ投稿を(再度)可能とした。また、Bioconda等の広く利用されているサードパーティーパッケージをサポートすることでユーザーに対してより高いユーザビリティを提供できるようになった。また、コンテナ仮想化との統合を進めている。現在公開しているプロトタイプモデル実装のTiny Cloud Engineをベースに、ゲノム研究の現場において実用的なワークフロー並列実行エンジンの開発・設計・実装を進めた。特に、生物学研究でよく使われているいくつかのスーパーコンピューターセンターにおける仕様を調査し、様々なネットワーク構成・セキュリティ設定においても動作することができるようにモジュール設計を改良した。大規模ゲノム解析で頻出するタイプの、通信が必要となるデータ分割式の並列計算を非並列アルゴリズム実装をベースにして簡便に記述する手法をいくつかのアプリケーションにおいて検討し、精度と性能の評価を行った。アプリケーションのファイルアクセスを自動で追跡するライブラリについて、移植性や動作の制限について現状の問題点を回避する手法を開発した。また、解析に使用する巨大なデータファイルを計算に先立って移動する必要が無いように、データファイルの格納位置がローカルでない場合の処理ルーチンを実装した。ファイルの実体がリモートでもローカルでもどちらでもアクセスできるように、暗号化および認証を行う安全なデータ転送プロトコルを設計・実装・公開した。また、リモートにデータが存在する解析結果を簡便に表示するために、リモートに存在する画像やHTMLファイルを透過的にローカルのビューアーやブラウザーで開くことのできる機能も実装・公開した。リモート側から可能な動作の制限システムを実装・公開した。おおむね計画通りに進んでいると言える。特に本研究を進めるうえで必要となるマルチノード環境での死活監視とメンバーシップ管理および分散データベースを実現するために必要な実装のうち多くの機能が、企業が開発して既に無料でソースコードを公開している分散ミドルウェアで既に実現されていることが分かったためかなりの手間が省けたと言って良く当初の計画と比べてシステムの実用に向けて予定より大きく進んでいる。また、ソフトウェアの仮想化をサポートするスーパーコンピューターセンターが増えてきたために計画は加速されている。一方、ゲノム解析ソフトウェアの動作を動的に解析するためのREMモジュールで使用していたシステムコールのフック部において、macOSのセキュリティ対策による仕様変更により動作しなくなってしまった仕組みがあり、様々な回避方法を検討したもののユーザーの利便性を落とさずに解決する方法は存在しないことが分かった。現在では、macOSのセキュリティ対策設定を一部無効にすることを前提とすることで開発を継続しているが、この調査・検討のためにかなりの時間を消費しており、総合的にはほぼ予定通りの進捗である。再現性のあるワークフローを実現するために、HPCクラスター上で動作させるコンテナシステムについて開発を行った。当初はDockerの利用を想定していたがアカデミア向けのスーパーコンピューターではセキュリティ上の懸念やメンテナンスのコストが高いこともあり、ゲノム解析向けのスーパーコンピューターではDockerは利用出来ないことが多い。また、Dockerはゲノム解析向けのワークフロー実行に対してはcomposabilityが極めて低く使い勝手が悪かった。これらの問題を解決する新しいタイプのコンテナシステムの設計・実装を行った。新システムでは、コンテナ内のプロセスからホスト上の実行バイナリや他コンテナ上の実行バイナリをシームレスに実行できる仕組みを導入し、ゲノム解析パイプラインを開発する際に重要となるcomposabilityの高さを実現した。また、これによりユーザーのパイプライン開発時間を短縮した。また、HPCクラスター上で便利に利用することができるワークフローエンジンTCEを昨年度に引き続いて改良した。商用クラウドのAmazon EC2を中小の研究室でゲノム解析に利用する際にはブラウザからの操作を用いるのが推奨される方法であったが、仮想マシンやVPC、スナップショットやDNS情報を管理するコマンドラインツールを作成し、中小規模の研究室での主な利用シナリオにおいて、ユーザーが短期間に学習でき、短時間で必要な計算機資源の構築を行えるシステムを作った。特に本研究を進めるうえでは「さまざまな研究グループが作成したツール群をお互いに干渉することなく、非常に少ない手間で統合する」ことをユーザーができるようにする必要があるが、初期設定も含めてユーザーランドの権限のみで動作するcomposableなコンテナシステムなどをはじめとして当初の計画には無かった便利なアイディアをいくつか実装しておりシステムソフトウェアの実装に関しては進捗は期待以上であると言える。ドキュメントやチュートリアル・コミュニティーの整備や講習会の開催についてはやや送れているため、総合的にはおおむね計画通りとした。

ゲノム研究に用いられる大規模並列計算では計算に用いるソフトウェア数が膨大となり、様々なバージョンや依存関係を持ち、時には互いにコンフリクトするソフトウェアを同時に使用しなければならない。このような目的のためにはコンテナ仮想化がよく用いられるが、DockerやSingularityのような管理者権限を用いてインストールする必要があるコンテナ仮想化エンジンは、限られた数の科学技術向けHPCクラスターでしかサポートされていない。また、Univa Grid EngineやCUDAなどのホスト環境を必要とするソフトウェアはコンテナ内からホスト環境へのアクセスを必要とする。これらの問題を解決するため、管理者権限を一切使用しない、ホスト環境との“composability"を実現したコンテナ仮想化エンジンLPMXを開発し、オープンソースで公開した。また、ファイルシステムレイヤーをサポートし、Dockerイメージを直接用いることができるよう実装した。一方、ゲノム研究ではパイプライン的な計算を多用し、例えばがん研究では100以上の解析ソフトウェアを用いることもあるが、解析ソフトウェアのインストールには数ヶ月の時間がかかる事もしばしばあった。そこで、以前から開発を行っていたLocal Package manager(LPM)を改良し、セットアップ方法を共有することで解析ソフトウェアのセットアップに必要なハンズオンタイムを大幅に短縮した。また、ユーザーからのパッケージ投稿を(再度)可能とした。また、Bioconda等の広く利用されているサードパーティーパッケージをサポートすることでユーザーに対してより高いユーザビリティを提供できるようになった。また、コンテナ仮想化との統合を進めている。引き続いてTiny Cloud Engineの次期バージョン開発を続けていく。ゲノム解析で使用する解析パイプラインを実際にシステム上に実装して自分たちのグループで使用することで問題点の洗い出しと改良に努める。また、大規模ゲノム解析計算を行っている外のグループと協業してスケーラビリティとロバストネスの向上に努める。また、ある程度多くの環境で動作する目処がついた時点でソフトウェアの公開を行う予定である。
tRNA修飾ネットワークのカギ酵素m7Gメチル化酵素の構造と機能の変遷の追及

平成22年度は、次のような課題を実施した。(1)tRNA m7G46修飾の役割を明らかにする。好熱菌tRNA m7G46修飾酵素遺伝子破壊株を用い、温度変動時の生育状況、タンパク質合成量、他tRNA修飾量の変動に着目し、生化学解析、分子生物学的解析を行った。これにより、本研究の最大目標である、m7G修飾を中心としたtRNA修飾ネットワークを提示することができた。(2)好熱菌型TrmBの触媒メカニズムの推定とX線結晶構造解析好熱菌型TrmB変異酵素を14種作成し、これらの反応速度論的解析を行った。この結果と、既知TrmB-AdoMet複合体の構造解析データから、反応メカニズムの推定を行った。さらに、TrmB-tRNA-AdoMet複合体の結晶化にも着手した。これまで未同定であった古細菌由来m7Gの存在を明らかにした。現在、当該酵素遺伝子候補の解析が進行中であり、遺伝子の同定を目指している。また、東京薬科大学の協力により、当研究室でも培養を行うことができるようになった。平成20年度は、次のような課題を実施した。(1)好熱菌型TrmBの触媒メカニズムの推定tRNA m7G46メチル化酵素(TrmB)は、真正細菌、真核生物、古細菌に共通してみつかっており、機能解析、構造解析等がすすめられているが、その詳細な反応メカニズムは分かっていなかった。そこで、当該酵素の触媒メカニズムを明らかにするために、変異酵素を14種作製し、これらを用いて反応速度的解析および熱力学的解析を行った。以上の実験から、基質tRNAおよびメチル基供与体のAdoMetとの結合に関係するアミノ酸残基を同定した。また、構造データをもとに、反応メカニズムの推定を行った。(2)tRNA m^7G46修飾の役割を明らかにする好熱菌TrmB遺伝子破壊株を作製したところ、破壊株は高温では非常に生育が悪くなるということを明らかにした。また、遺伝子破壊株tRMAは、m7Gだけではなく、他のtRNA修飾ヌクレオシドも減少していることが分かった。このことから、TrmBと他のtRNA修飾酵素との連動性が示唆され、現在、投稿論としてまとめつつある。古細菌tRNA中に46位以外にm7Gかおることを発見した。また、これまで古細菌で見つかっていなかった新規な修飾ヌクレオシドも発見し、質量分析により修飾位置を同定した。平成21年度は、次のような課題を実施した。(1)tRNA m7G46修飾の役割を明らかたする。好熱菌trmB遺伝子破壊株を作製したところ、破壊株は高温では非常に生育が悪くなるが事が明らかになった。タンパク質合成量を詳細にみると、高温環境下だけでなく、表現系変化のなかった至適生育温度においても、タンパク質合成量が減少していることを確認した。また、遺伝子破壊株tRNAは、他の修飾ヌクレオシドの量も減少しており、融点の低下、tRNAの分解が起こっていた。これらのことから、tRNA m7G46は、他のtRNA修飾酵素と連動しており、修飾ネットワークのカギ酵素である事を示唆した。(2)好熱菌型TrmBの触媒メカニズムの推定とX線結晶構造解析tRNA m7G46メチル化酵素は、真正細菌、真核生物に共通して見つかっており、機能解析、構造解析等が進められているが、その詳細な反応メカニズムは分かっていなかった。そこで、好熱菌型TrmBの変異酵素解析や熱力学的解析を進めることにより、既知の構造データをもとにして、反応メカニズムの推定を行った。現在、TrmB-tRNA-AdoMetの三者複合体X線結晶構造解析を進めているところである。古細菌tRNA中にm7Gがある事を発見した。これをメチル化する修飾酵素遺伝子の同定をめざし、候補遺伝子の大量発現系を構築した。現在、この候補遺伝子について解析を進めると同時に、古細菌の培養も行っているところである。
ヒトCDNAバンクの全カタログ化をめざした新しいベクターシステムの開発と応用

本年度はこれまでに作製してきたベクターを用い実際に高品質のcDNAライブラリーを作製してきた。まず作製にあたり、従来本研究の初年度において我々が開発してきたコンピタントセルを用いてのcDNAライブラリーを作製するよりエレクトロポレーション法による方がよりサイズの長いプラスシドDNAが取り込まれることを本年度に見い出した。ところがライゲース混液はこの方法には不適であり、エタノール沈澱などの処理も有効でない。そこで我々は、熱変性・フェノール処理・フィルター処理を行うことでこの困難を克服しうることを見い出し、これによって10^<10>ctu/pBR_<322>の高効率をそのまま利用しうることが可能となった。cDNAライブラリー作製法は2つの方法論を改善した。ひとつは我々が“自己閉環法"と呼んでいるもので、ベクタープライマーにCテイルを施し、その後BsfXIで切断してG_4を突出させて、そのまま閉環する方法である。ベクターのマルチクローニングサイトを有効に利用し、フィルター処理をうまく用いることによって簡便、迅速に高品質のcDNAライブラリーが作製できるようになった。たとえば5μgのmRNAからスタートして平均鎮長12Kbの1.2×10^64.8×10^7ctuの独立級クローンを持つcDNAライブラリーを作製できた。我々がリンカープライマー法と呼んでいる方法はもっと効率が良い。これはGubler-Hottman法を改善したものであるが、彼らの方法の欠点はほぼ解消してある。この方法を用い作製したcDNAライブラリーは、1μg相当のmRNAについて平均鎮長約1、8Kbの6.2×10^7ctuの独立クローンを持つ.また1種のcDNAインサートを何種類ものベクターに〓〓に入れられるのも便利な点である.この効率は20ng程度のpoly(A)^+RNAから100万個の独立クローンを持つcDNAライブラリーをPCR法を〓さずに作製できることを示し、その可能性が広がったと思う。本年度に達成した実績は以下の2点である。1.大腸菌コンピタントセルの高効率化我々の目的の一つに高品貭なcDNAライブラリ-の作製法を更に高度化することがあげられる。高品貭の条件にはフルレングス(全長)cDNAが大半を占め、空(ベクタ-のみ)の少いことの他に,インディペンダントなコロニ-が多いことがあげられる。その際、ライブラリ-作製に用いるmRNAは少ければ少い程良い。ヒト細胞には20万個のmRNA分子が存在すると言われているので安全を見越して,100万cfuのコロニ-サイズを持つcDNAライブラリ-をlng mRNAを出発点として達成するのが当初の目的であった。この目的達成のためには高効率なコンピタントセル作製が必須であり、従来の方法では困難であった。今回我々が開発に成功した方法1)によればlng mRNAあたり数百千万cfuのコロニ-サイズを持つcDNAライブラリ-作製が日常的に可能になる。これは此迄最高といわれたHanahan法より数倍も高効率なものである。ヒトcDNAバンクのカタログ化の目的にはpcD2系(OkayamaーBerg法)は不便な所もあるので、これを幾つか改良したpcD3系ベクタ-を作製した。主な改善点は以下のようである。(1)SSDNAが作れるように、両方の向きにf1 oriを挿入したものを各々作製したこと。(2)T7プロモ-タ-を導入し、cRNA化を可能にしたこと。

(3)高等効物細胞では稀にしか切断しないと考えられている制限酵素サイトを18ケ所も持つ約120bpからなるマルチクロ-ニングサイトを導入したこと。(4)プラスミドDNA量を増加させるため,pBP322系よりpUC系に変えたこと。これらの改善よにり特に発現型差cDNAライブラリ-の作製が可能になった点が将来の有用性から見て期待されるものと信じている。本年度に達成した実績は以下の3点である。(1)pcD3系ベクタ-群の改良と応用性の拡張pcD3系ベクタ-(昨年度作製したもの)の宿主域を広げる目的で,幾つかの新しいベクタ-を作製した。その際マルチクロ-ニングサイトを更に改良して新しい制限酵素サイトと逆向きのT3RNAプロモ-タ-を挿入した。哺乳動物(pFP3/pFM3),分裂酵母(pFL3),パン酵母(pFY3)を宿主として機能発現クロ-ニング可能なベクタ-群が完成した。またレアカッタ-としてオメガクレ-ス(18塩基認識)のサイトを挿入したことでインサ-トの挿入、切り出しが楽になる計画である。(2)幾つかのcDNAライブラリ-作製とその機能発現能の確認このベクタ-を用いてヒト(HeLa)およびパン酵母由来のmRNAを用いてcDNAライブラリ-を作製した。既にpCD2ベクタ-系を用いて、分裂酵母のcdc2^-変異株を機能相補できるヒト遺伝子として我々が昨年クロ-ニングに成功した2B145をプロ-ブとし、HeLa cDNAライブラリ-をコロニ-ハイブリダイゼ-ション法によりスクリ-ニングすることで、pcD3ベクタ-に挿入された2B145をクロ-ン化した。これが確かにcdc2^-変異株を相補することからpcD3ベクタ-の有用性が証明されたことになる。(3)分裂酵母変異株(cdc10)を宿主とした機能相補クロ-ニングこのライブラリ-の有用性と高品質性をテストするため,cdc10変異株を宿主としてHeLaおよびパン酵母cDNAライブラリ-を用いて機能相補クロ-ニング行った。その結果,ヒトより10B135など幾つかの遺伝子が単離された。同様にパン酵母からは10Y120など10クロ-ン近くの遺伝子が単離された。現在これらの塩基配列を決定しつつあるが、このベクタ-を用いたライブラリ-の有用性は確かに証明された。本年度はこれまでに作製してきたベクターを用い実際に高品質のcDNAライブラリーを作製してきた。まず作製にあたり、従来本研究の初年度において我々が開発してきたコンピタントセルを用いてcDNAライブラリーを作製するよりエレクトロポレーション法による方がよりサイズの長いプラスシドDNAが取り込まれることを本年度に見い出した。ところがライゲース混液はこの方法には不適であり、エタノール沈澱などの処理も有効でない。そこで我々は、熱変性・フェノール処理・フィルター処通を行うことでこの困難を克服しうることを見い出し、これによって10^<10>ctu/pBR322の高効率をそのまま利用しうることが可能となった。cDNAライブラリー作製法は2つの方法論を改善した。
ヘルペスウイルスのウイルスゲノム複製依存的転写制御機構

ヘルペスウイルスの転写制御はまず、主として宿主の転写因子によって活性化される前初期遺伝子が活性化される。そして、その前初期遺伝子がウイルスのDNA複製に必要な初期遺伝子を活性化し、DNA複製が開始される。そして、DNA複製に依存してウイルスの構造蛋白の産生に必要な後期遺伝子が活性化される。ヘルペスウイルスの転写はこうした厳密なカスケードによって制御されている。しかし、どうして前初期遺伝子は初期遺伝子のみを活性化し、後期遺伝子は前初期遺伝子のみでは活性化されないのか、ヘルペスウイルスの後期遺伝子の転写活性化がウイルスDNAの複製依存的に起こるのか、その分子機構は全く不明である。本研究は組換えヒトサイトメガロウイルス(HCMV)を用いてその分子機構を明らかにし、ヘルペスウイルスの遺伝子カスケードの制御機構の一端を明らかにした。そこで、本研究は組換えヒトサイトメガロウイルス(HCMV)を用いてその分子機構を明らかにし、ヘルペスウイルスの遺伝子カスケードの制御機構の一端を明らかにすることを目的とした。そこで、本年度はヒトサイトメガロウイルス(HCMV)UL79遺伝子はウイルス増殖に必須で、UL79欠損ウイルスを用いた解析からUL79遺伝子は後期遺伝子プロモーターを特異的に活性化する後期遺伝子特異的な転写活性化因子であることを明らかにした。そこで、本年度はヒトサイトメガロウイルス(HCMV)UL87及び95遺伝子はウイルス増殖に必須で、UL87あるいは95を欠損したウイルスを用いた解析からUL87及び95遺伝子は後期遺伝子プロモーターを特異的に活性化する後期遺伝子特異的な転写活性化因子であることを明らかにした。ヘルペスウイルスは細胞に感染すると、主として宿主の転写因子によってウイルスの前初期遺伝子が活性化される。そして、その前初期遺伝子がウイルス遺伝子の転写活性化因子としてウイルスのDNA複製に必要な初期遺伝子を活性化し、DNA複製が開始される。ヘルペスウイルスのDNA複製と遺伝子の転写は厳密に共役しながら、ウイルスの増殖のために最適化されている。そして、これらの厳密にコーディネートされたウイルスのDNA複製と転写はいわゆる"Replication Compartments(RCs)"と呼ばれる核内の特定の場所で行われる。ヘルペスウイルスのDNA複製はローリングサークル型であり、RCsの場の形成はウイルスの爆発的な増加に必須であると考えられる。しかし、RCsを介してウイルスDNAの複製と後期遺伝子の転写の共役がどのように制御されているのか、その分子機構は不明である。今回私達はHCMVがコードするUL79,87及び95がウイルスDNAの複製には影響を及ぼさないにもかかわらず、ウイルスの後期遺伝子発現に必須な転写活性化因子であることを明らかにしてきた。さらにウイルス感染後、これらのウイルスがコードする後期遺伝子の転写に特異的な転写活性化因子がpre-RCs、及びRCsにリクルートされ、ウイルスDNAポリメラーゼ付随因子であるUL44と共局在することを示した(Iomuraet.al.,J.Virol,2011)。
細胞間接着制御系の網羅的解析

個体の発生過程や組織の再構築時にはcadherinを介した細胞間接着のダイナミックな再構築が重要な役割を果たしている。このような細胞間接着の再構築には、空間的位置情報と時間情報が正確に細胞内に伝達、統合され、'接着装置が再構築されることが必須である。申請者らは低分子量GTP結合蛋白質Rhoファミリー(Rac1、Cdc42)と標的蛋白質IQGAP1がcadherinを介した細胞間接着を制御していることを明らかにした。しかし、これら限られた分子にのみ焦点をあてたアプローチだけでは細胞間接着の制御に関わる分子を網羅的には解析できない。本研究では細胞間接着の分子基盤をより網羅的に明らかにすることを目的とする。本研究では、細胞間接着再構築時に関与する蛋白質を網羅的に同定し、性状解析を試みた。cadherin, catenins, IQGAP1およびRhoファミリー結合蛋白質についてアフィニティーカラムや免疫沈降を行い、β-catenin結合蛋白質としてスキャフォールディング蛋白質KIAA0705と、KIAA0705を介してβ-cateninに結合する蛋白質として低分子量GTP結合蛋白質Rap1の活性制御蛋白質PDZ-GEF1を同定した。またPDZ-GEF1結合蛋白質としてPSD-95とBPAG1eを同定した。さらにRNA干渉法により、これらの蛋白質を機能欠損させた場合の表現型を調べた。その結果、Rac1やIQGAP1の機能を欠損させた細胞においては、細胞間接着部位へのE-cadherin, β-catenin, α-cateninの集積が有意に低下することが明らかとなった。またIQGAP1の機能を欠損させた場合Rac1の活性が低下することを見出した。以上のことより、E-cadherinを介した細胞間接着によりRac1が活性化され、IQGAP1を介したアクチンの集積を促進し、その結果細胞間接着が増強する、といったpositive feedback loopを想定している。
3次元RISM理論による嗅覚受容体における分子認識機構の解明

本研究では、嗅覚受容体のなかでもマウスなどの哺乳類の嗅覚受容体を研究対象とした。これらの嗅覚受容体について、Homology Modelingにより構造を再現し、3次元RISM理論により認識部位を特定した。平成23年度の研究計画では、1年次課題の達成後、複数の変異体と種々の匂い物質との親和性の比較を行うことを目標としたが、既存の方法論では課題達成は困難であることが分かった。そこで、受入研究者である平田先生より提案があり、より汎用的な、分子認識問題のための理論および計算手法・ユーティリティーツールを開発することを試みた。この方法を用い、フォスフォリパーゼA2-アスピリン結合系の解析を試みた。フォスフォリパーゼA2は、発熱や痛みのもとになるアラキドン酸を合成することで知られている。また近年、非ステロイド性の薬剤として有名な、アスピリンも結合することが実験によって明らかにされ、新薬の開発にも繋がるため、創薬分野でモデルタンパク質の一つとされている系である。新手法より得られた3次元分布関数からリガンド分子の位置と配向を決定するため、"平均場"及び"重ね合せ"に基づくスコア関数を用意し、リガンド分子の位置・配向性を評価した。用意したスコア関数におけるトップスコアの構造は、結合サイト内においてX線構造を再現するような配向性を持っていることが分かった。この成果は、開発されたツールにより当初目的としていた嗅覚受容体の新規匂い物質の理論的な予測に限らず、ドラッグディスカバリーやドラッグデザインといった創薬分野にも拡張できることを意味している。これらの嗅覚受容体について、Homology Modelingにより構造を再現し、3次元RISM理論により認識部位の特定を進めている。平成22年度の研究計画では、まずマウス嗅覚受容体と匂い物質の応答性を理論的に再現することを目標として掲げた。対象としたマウスの嗅覚受容体mOR(mouse Olfactory Receptor)はそれぞれmOR-EG、mOR-EVであるが、匂い分子を認識した状態でのX線構造が得られていないため、分子の親和性に対する定量的な議論や、蛋白質の構造揺らぎと分子認識の関係など分子論的な考察が未だなされていなかった。そこで、3次元RISM理論により嗅覚受容体mOR-EG、mOR-VRに対する匂い分子の分布を直接得るにとで親和性の議論を定量的に行った。既にX線構造が存在するイヌの嗅覚受容体を初期構造として、マウスの嗅覚受容体を予測し、構造最適化により溶媒中での平衡構造を得た。その後、3次元RISM理論を用いて各匂い分子の分布を求め、分子認識部位を特定した。さらに、分子の分布関数から、その構造を把握することのできるツールを開発し、この系に応用した。このツールでは、嗅覚受容体に限らず、多くの蛋白質における分子認識機構の研究に適応することができる。
バースト発火による複数の量の符号化

網膜の出力細胞である網膜神経節細胞は、数十数百ミリ秒程度の画像入力に応答して活動電位を発生(発火)する。この発火には数ミリ秒程度のランダムでない時間パターンがあることが観察されている。そこでこのような数ミリ秒程度の時間パターンが情報伝達に果たす役割を解析した。また網膜内ON-経路とOFF-経路で非対称な情報処理の細胞機構や神経細胞維持の分子機構の解析も行った。多くの神経回路において個々の神経細胞は単一の量を符号化していると通常仮定されている。脊椎動物網膜の神経節細胞は光入力に応じてバースト発火をする。申請者は、これらのバースト発火が、さまざまな光入力に特異的なミリ秒スケールの多様な時間パターンを持つ可能性を示唆する結果を得ている。この可能性を検討することにより、局所神経回路の動作原理の解明への貢献を目指す。研究実施計画1-1に従い4つの発火からなるバースト発火のスパイク間隔パターンが情報を担っているか否かを調べた。その結果3つのスパイク間隔が少なくとも2自由度の符号化を行っていることが確認できた。さらに多くの自由度を持つか否か検討中である。研究実施計画1-2に従い空間パターンを持った光刺激を網膜に与えバースト発火パターンを調べる実験を行った。現在解析に適した光パターンの探索を行っている。これらに加え、網膜バースト発火パターンの情報がどのように脳へ伝わるのかを精密に調べるために、外側膝状体スライスを用いた実験を行った。視神経を電気刺激でバースト発火させ、外側膝状体の神経細胞からパッチ記録を行った。まず視神経からの入力によって生じるシナプス電流がバースト発火のタイミングを保存できる程度に正確か否かを調べた。その結果記録した全てのシナプスにおいてシナプス電流は極めて時間的に正確であり、網膜バーストのパターンをよく伝えることがわかった。さらにこの入力が引き起こす外側膝状体の発火パターンがどのように入力情報を伝えるか検討した。この結果視神経からの入力による外側膝状体の神経細胞の発火は入力の時間パターンを極めてよく反映することがわかった。外側膝状体の発火パターンは網膜バースト発火のパターンの2ms程度の違いを十分弁別できるだけの精度を持ち、網膜バースト発火のパターンにコードされた情報を大脳新皮質に伝えることができることがわかった。自然な画像入力は網膜神経節細胞のバースト発火を引き起こす。これまでにバースト内の神経発火の間隔が入力に応じて変化し、入力の情報を符号化していることを見いだした。この正確な発火パターンが、外側膝状体の正確な発火パターンを引き起こし、脳につたえられることを示した。バースト発火の情報が脳に伝えられることを示す結果である。自然な画像は複雑な統計的な特徴を持つため、自然画像に対する網膜応答の解析は一般に難しい。そこで自然画像に対する網膜神経節細胞の応答からその受容野を効率よく推定する方法を開発した。自然画像によって生じるバースト発火の解析に貢献すると期待される。バースト発火は単一細胞の出力の時間方向での相関だが、神経発火は異なる網膜神経節細胞間でも同期などの相関を持つことがしられている。このような空間方向での相関の重要性を調べるために、脳が空間方向での相関の情報を用いて複号する場合と、相関の情報を無視して複号する場合での情報伝達効率の差の解析に参加した(共同研究)。網膜にはATP受容体が存在し、ATPがなんらかの生理機能を担っているのではないかと推定されてきていたが、実体は不明であった。ATPが網膜神経節細胞の光応答を修飾することを示し、さらにこの修飾がON経路とOFF経路で異なっていること見いだした(共同研究)。網膜の出力細胞である網膜神経節細胞は、画像入力の数十ms数百ms程度の時間スケールの変化に応答して活動電位を発生(発火)する。ところがその発火には数ms程度のランダムでない時間パターンがあることが観察されている。そこでこのような数ms程度の時間パターンが情報伝達に果たす役割を検討している。時間パターンの一つは、バースト発火内の発火パターンである。自然な画像入力の下で網膜神経節細胞はバースト発火を引き起こす。これまでの研究によりバースト内の神経発火の間隔が入力に応じて数msの時間スケールで変化し、入力の情報を符号化していることを示した。さらに、バーストが3発の発火を含む場合は、2つの時間間隔が入力情報の2つの特徴を符号化していることがわかった。この正確な発火パターンは、外側膝状体の正確な発火パターンを引き起こし、情報が脳につたえられることもすでに示せている。論文審査中。時間パターンの第2は、同期発火である。バースト発火を含む網膜神経節細胞のスパイクは、異なる網膜神経節細胞の間で同期する傾向がある。ところがこのような同期発火の情報処理における機能は不明な点が多い。そこで同期発火の情報伝達における機能を、東京大学岡田研究室との共同研究によって検討した。神経節細胞の同期発火を考慮して脳が複号する場合と、同期発火がないと仮定して複号する場合での情報伝達効率の差を解析した。

その結果、両者の場合での情報伝達効率の差は小さいことがしめされ、同期発火の統計的性質を用いなくても、大部分の情報を脳は得ることができることが示唆された(論文印刷中)。網膜の出力細胞である網膜神経節細胞は、画像入力の数十ms数百ms程度の時間スケールの変化に応答して活動電位を発生(発火)する。ところがその発火には数ms程度のランダムでない時間パターンがあることが観察されている。本研究では、このような数ms程度の時間パターンが情報伝達に果たす役割を検討した。第一に、バースト発火内の発火パターンを解析した。自然な画像入力の下で網膜神経節細胞はバースト発火を引き起こす。これまでの研究によりバースト内の神経発火の間隔が入力に応じて数msの時間スケールで変化し、入力の情報を符号化していることを示した。特に、バーストが3発の発火を含む場合は、2つの時間間隔が入力情報の2つの特徴を符号化していることがわかっている。この正確な発火パターンは、外側膝状体の正確な発火パターンを引き起こし、情報が脳につたえられることも示した。第二に、同期発火の機能を検討した。バースト発火を含む網膜神経節細胞のスパイクは、異なる網膜神経節細胞の間で同期する傾向がある。ところがこのような同期発火の情報処理における機能は不明な点が多い。そこで同期発火の情報伝達における機能を、東京大学岡田研究室との共同研究によって検討した。神経節細胞の同期発火を考慮して脳が複号する場合と、同期発火がないと仮定して複号する場合での情報伝達効率の差を検討した結果、両者の場合での情報伝達効率の差は小さいことがしめされ、同期発火の統計的性質を用いなくても、大部分の情報を脳は得ることができることが示唆された。結果を論文として発表した。さらに共同研究によって動物の視覚関連行動の解析などを行った。
岩石コア中の流体挙動把握のためのキャパシタンスCT法の開発

岩石コア中のガス・水・油などの流体の内部での流動状態を直接的に可視化する新たな手法として,キャパシタンスCT法の適用を検討したものである。円筒領域を対象としてその外面に多数設けた電極相互間の静電容量計測値から内部誘電率分布を可視化する方法であり,実際的な計測システムを製作するとともに,内部可視化をほぼリアルタイムで実現する画像再構成アルゴリズムと,オフライン処理としての画像改善手法を提案した。砂質あるいは岩質材料中の流体の流動状況を外部からのキャパシタンス計測によって画像化するという基本的な考え方の実現性に関して,本年度は主にシミュレーションに基づく研究を実施した。すなわち,2次元FEM電場解析によって,次の2点について検討した。・誘電率分布の画像化(逆解析手法)についての基本的検討計測されたキャパシタンスから,対象内部の誘電率分布を映像化する,いわゆる逆問題を解く方法として,本年度は最も簡単な(リアルタイム画像化において有利な)バックプロジェクション法について、いくつかの誘電率分布パターンを対象として検討を行い,この方法がある程度有効な方法であることを確認した。・有効なキャパシタンス計測システムの模索対象境界面における多数点でのキャパシタンス計測を前提として,種々の,内部の誘電率分布をより精度よく画像化することが可能な電極構造や電極配置について検討し,電極数は処理速度の増大や電気容量の減少に伴う計測精度の劣化が問題とならない限り多数設けるのがよいこと,また,キャパシタンス計測を行う正負の電極の組み合わせとして,再隣接の電極の組合せは,他の組合せに比べ近接域の感度が極端に高くなるため,全体としての誘電率分布推定に逆に悪い影響を与えるため,用いない方がよいことが明らかとなった。砂質あるいは岩質材料中の流体の流動状況を外部からのキャパシタンス計測によって画像化する方法の開発に関して,昨年度に続いたシミュレーションに基づく検討に加え,本年度は,システムの試作も含め,画像化の実際について,いくつかの検討を行った。・誘電率分布画像化の逆解析手法についての検討本質的に非線形であるこの逆問題の解法として,一媒質の均一な分布状態を基準とした線形化インバージョンの方法が有効であり,とくに,二媒質の分布のオンライン可視化においては,単なるバックプロジェクションではなく,正則化つきの最小二乗型一般逆行列に基づく方法が最も適していることが明らかとなった。また,二媒質の分布のオフライン可視化においては,二値最適化問題として取り扱う遺伝的アルゴリズムの利用が十分なる可能性をもつことを確認した。・キャパシンスCTシステムの試作円筒形状を対象とし,その周囲面に8枚の電極を配置したキャパシタンス計測ならびにそれに基づく断面内部誘電率分布のオンライン画像化(数秒/1フレーム)を実現する試作システムを構築した。分解能や精度の向上のたあにば,電極構造・数・配置とガード電極の形状など,さらに検討が必要であるものの,空気中に高分子材料を挿入することで模擬した誘電率コントラスト1:3程度の二媒質の分布の画像化が,わずか8枚の電極であっても,挿入物質の形状を認識できるレベルで可能であることが実験的に確認された。静電容量計測にもとづく岩石コアなど円筒領域内の誘電率分布可視化について,その方法とシステム開発を目的とする本研究課題の最終年度に得られた成果は,以下の2項目に集約される。・リアルタイム可視化とオフラインでの画像改善リアルタイムに近い断面可視化を実現するためには,円筒面状での多数の組合せによる電極間キャパシタンス計測データから内部誘電率分布を求める逆問題解析に,単一ステップで解の得られる線形インバージョンの方法を用いる必要がある。正則化最小二乗解にもとづく方法が,もっとも良い再構成画像の得られることは昨年度までに明らかにしてきたが,さらに,オフライン処理として,非線形反復計算によって再構成画像をかなり改善することができ,より明瞭な誘電率分布を求めることができることが示された。このことは,本手法が適用対象としている様々な実験に対して,リアルタイムでのモニタリングと,実験後の詳細解析という2段階の評価フェーズを提供できることを示すものである。・計測システムの最適化と円筒領域内の多断面可視化内部誘電率分布の再構成画像の品質は,計測ヘッドに設ける複数の面状電極の数・寸法・配置に依存する。したがって,数値シミュレーションにもとづいて,これら形状パラメータの最適化を図り,その結果にもとづいて,3つの断面の同時可視化を可能とする計測ヘッド(各断面の電極数12)を製作した。そのシステムを用いた実験から,軸方向に誘電率分布が異なる構造の上下動の可視化を試み,ある程度の解像度をもってその動的な変化を,約5秒/フレームの更新速度で画像化できることが示された。
季節海氷域における融解期の海氷・海洋結合システム

夏季南極海海氷域の熱収支から、大気からの熱のインプットはアルベドの違いから海氷面より開水面からのほうがずっと大きく、海氷融解は開水面からの熱が海氷を側面と底面から融かしていく過程が重要であることが定量的に確かめられた。海氷の融解が大気から開水面に入る熱によってのみで行われると成り立つ、(海氷融解率)=(開水面の割合)*(大気からの熱的外力)という単純な関係が、現実のデータ(マイクロ波放射計による海氷密接度データ)からも示唆された。人工衛星による海氷データを用いて調べたところ、ほとんどの年で融解最盛期の12月と結氷期の4月における海氷密接度のアノマリーの空間分布はよく一致していた。12月は海氷分布の年々変動が最も大きい月でもあるので、この時期に大気から海洋上層中に与えられる熱は、年により大きく異なることになる。解析の結果、融解期における海氷の多少が、海洋上層へ与えられる熱の多寡を生み、それが海に記憶されて、海氷が一度消滅した後、結氷期にも反映されることが示唆された。海氷の融解は開水面から海洋混合層に入った熱によってのみ起こるとする簡略な海氷・海洋結合モデルを提出した。モデルから、海氷密接度と混合層の水温との関係は、あるカーブに収束することが示され、昭和基地沖やロス海での観測をよく説明している。また、このモデルは南極の子午面方向の海氷後退をある程度説明しえ、第0近似的には海氷融解は1次元バランスで決まっていることも示唆される。さらにモデルを2次元に拡張し、風による移流の効果(力学効果)を組み入れると、「海氷を発散させる風が卓越し海氷密接度が減じると、開水面を通しての熱がますます増大し、さらに密接度が減じる」というアイスアルベドフィードバック効果が表現でき、この効果が年々の海氷後退の違いをもたらしていることが示唆された。季節海氷域における海氷融解過程は、定性的にはまず短波放射が開水面に吸収され、その熱が海氷を側面と底面から融かしていく過程が重要であろうと考えられている。この課程を定量的に理解するために、代表的な季節海氷域である南極海域の場合について研究を行った。まず、ECMWF客観解析データを用いて夏季南極海海氷域の熱収支を調べた。その結果海氷の融解が盛んな12月の熱収支は、海氷面で+10+30Wm-2,開水面で+100+150Wm-2程度であった。従って、開水面では大気(主に日射による)から正の大きな熱フラックスがあるのに対し、海氷面では熱のやり取りが非常に小さいことがわかった。砕氷艦しらせによる現場データからほぼ同様な結果が得られた。以上は上記の定性的理解と矛盾しない。もし、海氷の融解が大気から開水面に入る熱によってのみ行われるとすれば、(海氷融解率)=(開水面の割合)*(大気からの熱的外力)という単純な関係が成り立つはずである。本研究ではこのような関係が本当に見られるかを、マイクロ波放射計(DMSP SSM/I)による海氷密接度データを用いて調べた。解析は、南極海を経度幅30度で12個のセクションに分割して行った。

海氷融解が盛んな11月から12月にかけては、海氷の張り出しの大きいウェッデル海東部から昭和基地沖のセクション、ならびにロス海付近のセクションでは、この関係が非常によく成り立っていることがわかった。詳しく見ると、海氷の融解が11月頃からはじまり12月にピークを向かえるという大局的な変動は、大気場の熱的外力が決定しているが、融解のsynopticな変化や年によるピークの違いなどは開水面の割合が支配要因となっている。昨年度の研究では、熱収支解析から南極海域の海氷融解は、まず短波放射が開水面に吸収され、その熱が海氷を側面と底面から融かしていく過程が重要であることが確かめられた。従って、南極海のような季節海氷域における海氷融解は海氷と海洋を結合した系として考えることが不可欠となる。本年度は、海氷の融解は開水面から海洋混合層に入った熱によってのみ起こるとする簡略な海氷・海洋結合モデルを提出した。モデルから、海氷密接度と混合層の水温との関係(CT-relation)は、あるカーブに収束することが示される。これは日本南極観測隊の観測から発見されたCT-relationをよく説明するものである。また、このモデルは南極の子午面方向の海氷後退をある程度説明しえ、第0近似的には海氷融解は1次元バランスで決まっていることが示唆される。南極の周極性を勘案し、モデルを2次元に拡張し、風による移流の効果(力学効果)を組み入れると、1次元モデルで再現されなかった海域もよく再現される。さらに、2次元モデルでは、「海氷を発散させる風が卓越し海氷密接度が減じると、開水面を通しての熱がますます増大し、さらに密接度が減じる」というアイスアルベドフィードバック効果が表現でき、この効果が年々の海氷後退の違いをもたらしていることが示唆された。本モデルでは、海氷と混合層との熱交換係数Khが唯一の未知のパラメーター(直接観測が困難という意味で)となる。CT-relation及び海氷後退期のモデル計算から、観測と最もよく合うKhを求めると、ほぼ同じ値となり、また、この値はMcPhee(1992)の渦相関法からの観測結果とも矛盾しない。以上、融解期に限ると南極海では簡略な海氷・海洋結合モデルが適用可能であることが示唆された。昨年度までは、代表的な季節海氷域である南極海を例にとって融解期における海氷・海洋結合システムを研究してきた。今までの研究から、夏季の南極では、大気から(主に短波放射によって)開氷面を通して入ってくる熱が非常に大きく、この熱によってほとんどの海氷融解が生じることが示され、その過程を適切に表した結合モデルを提出された。本年度は海氷融解期の海氷のアノマリーが次に海氷結氷期へどう影響を与えるかを結合システムという観点から研究した。過去20年間のマイクロ波放射計による海氷密接度データから、融解最盛期である12月の海氷のアノマリーは次の結氷期である4・5月の海氷のアノマリーと極めて高い相関があることがわかった。12月は最も短波放射が大きい時期で、この時期の海氷の多寡は、海洋上層中に与えられる熱を大きく変えることになる。これが海に記憶されて、海氷が一度消滅した後、結氷期に反映されるために、融解期と結氷期の相関が高くなると考えられる。熱収支解析からも以上のシナリオがもっともらしいことが確かめられた。このような特徴は簡略な海洋・海氷結氷モデルでも表現することが可能である。また、12月と4・5月のアノマリーの相関は空間的に少しずれたところに最大が表れる。この差は、海流によって上層のアノマリーが移流されたと考えると説明がつき、この点からも海の上層の熱のアノマリーが結氷時期をコントロールしていることが示唆される。なお、融解期のアノマリーは次の結氷期に対し強い影響を与えるが、結氷期のアノマリーは次の融解期にほとんど影響を与えないことも解析から示唆された。
一細胞レベルでのヒト胆汁排泄能力の定量的見積りによる医薬品の動態・毒性解析

本研究では、高感度質量分析計による一細胞における物質濃度の計測技術を活用して、肝細胞を極性維持した状態で培養可能なサンドイッチ培養系における薬物の挙動を定量化することを目的とした。その結果、胆管腔を蛍光色素の集積を使ってガイドすることで、胆管腔内の薬物の回収を確認できることを見出した。しかし、培養時に使用するマトリゲルがプローブの通過を妨害しており、高感度な薬物の測定においては更なる技術の向上が求められることが分かった。そこで、HepaRG細胞が胆管腔をゲル無しで構築可能であることを見出すと共に、複数の薬物の胆管腔への排出も観察されたことから、代替細胞の利用も考慮できることを見出した。本研究では、sandwich培養によって、肝細胞間に胆管腔が効率よく形成され、それゆえ医薬品の胆汁排泄のin vitro評価系として活用されているが、胆管腔を2価イオンをbufferから排除することにより胆管腔を開閉することにより差分として、胆管腔内の薬物量を測定せざるを得ないため、非常に高いbackgroundが胆管腔内の薬物の定量の精度に影響しているのが現状である。本プロジェクトでは、微細空間の薬物量を測定可能なLC-MS/MSシステムを用いることで、直接的に胆管腔内の薬物量を測定することにより、より精度よくin vitroにおいて胆汁排泄される薬物量を測定できる実験系を構築することを目的としている。本年度は、sandwich培養されたヒト肝細胞を用いて、実際にすでに胆汁排泄されることがわかっている薬物数種について、直接胆管腔内の薬物濃度の測定を実施し、感度を調べた。胆管腔の位置を顕微鏡下で明確にするために、胆管腔内に排出される蛍光基質であるCDF-DAをあらかじめ入れておくことで、正確にプローブを胆管腔にガイドすることに成功した。しかしながら、sandwich培養の際に用いられているmatrigelが、微量サンプルを採取する微細プローブの細胞へのアクセスをさえぎっており、以後、matrigelの中を効率よくプローブが進めるよう、ゲル内を通過中は陽圧をかけて胆管腔にいたったときに陰圧に切り替えて採取できるような工夫を執り行った。現時点では、taurocholateおよびrosuvastatinの胆管腔内への排出が確認されているが、今後、濃度依存的な効果などを見るためには、より効率よい胆管腔内の薬物採取のための新しい技術開発が求められ、次年度も継続して研究を実施する。本研究では、共同研究者の升島らが開発した細胞レベルの微小空間から採取した微量サンプル中の化合物をLC-MS/MSにて定量する実験系を用いて、sandwich培養肝細胞における細胞質および胆管腔内の薬物濃度を測定することによって、1細胞レベルでの化合物の胆汁排泄クリアランスを定量化することを目標とした。前年度、胆管腔内の薬物の定量を試みたが、sandwich肝細胞培養系において肝細胞を挟むために重層しているコラーゲンや的リゲルなどのゲル層をプローブが突破するのが困難であったことから、肝細胞においてゲル層の厚みを薄くすることを試みたが、ゲル層が薄くなると、肝細胞間に形成される胆管腔の形成効率が低下することが分かり、本戦略は断念せざるを得なかった。一方で、比較的肝細胞の性質を維持しており、ゲル無しでもある程度の効率で胆管腔を形成するHepaRG細胞を用いて、ロスバスタチンやタウロコール酸などの胆管腔への排出を従来法で測定したところ、肝細胞よりは若干クリアランスが小さいものの、十分胆汁排泄トランスポーターの能力を反映した排出が観察されたことから、今後、HepaRG細胞を用いることで、当初の目的が達成可能となることが確認された。分子薬物動態学当初の予定と反して、sandwich culture時に用いるMatrigelの層が厚いため、胆管腔内の薬物を採取する微細プローブがゲル層に阻まれてしまい、結果として、予想以上に胆管腔内の薬物が取れていないことが考えられたため、当初予定していたよりも、薬物のLC-MS/MSによる測定感度が得られていないため。今後は、Matrigelの厚みを極力減らすことにより、sandwich培養と同様の極性誘導・トランスポーター発現維持の効用を維持した状況で、かつ、採取プローブがより胆管腔に容易にアクセスできる条件を検討することにより、当初の目的に到達する。さらには、ゲル内をプローブが通過する際に、陽圧をプローブ内にかけることにより、プローブがゲル内を容易に通過できるよう工夫を行う。すでに一定の効果がありそうだということを示唆するデータを取得済みである。データ採取にいたるまでの技術開発、特にmatrigelを通過した後に効率よく胆管腔内の薬物を採取するための工夫が予想外に必要であったため、実際の薬物を用いた胆汁排泄に関わるデータ取得が若干遅れているため。

技術的な問題をクリアできそうなさまざまな解決策が考えられ、その一部は効果があることがすでに検証されつつあるので、実験系の構築が終わり次第、当初の予定通りの研究計画に追いつくべく、加速化する予定である。
骨細胞ネットワークを介したPTH新規作用　－ミニモデリングと骨基質溶解・石灰化－

本研究は、骨における副甲状腺ホルモン(PTH)の二つの作用について検索を行った。第一点は、PTHの高頻度投与では多数の骨梁が誘導されるが、PTHの低頻度投与では骨梁数が増加しないものの、骨梁幅が増加することを明らかにした。前者は活発な骨リモデリングに依存する一方、後者はミニモデリング(破骨細胞の骨吸収に依存しない骨形成)と骨リモデリングの両方に依存することが推察された。第二点は、PTH投与後短時間において、骨細胞はその周囲の骨基質を溶解(骨細胞性骨溶解)し、また、再石灰化する可能性を明らかにした。平成26年度の研究概要は、(1)PTHが骨細胞ネットワークを介してミニモデリングを制御するメカニズムの解明、(2)PTHが骨細胞周囲の骨基質を溶解・再石灰化するメカニズムの解明の2点である。(1)に関しては、野生型マウスに20μg/kg/day,80μg/kg/day, 80μg/kg/doseのPTH(1-34)を、2日に1回、1日に1回、1日に2回、1日に4回の2週間投与した実験を行っている。各種の組織化学、および、透過型電子顕微鏡にて解析したところ、ミニモデリングは、PTH投与頻度が低い群で誘導されること、細胞学的メカニズムとして、前骨芽細胞の増殖ではなく、休止期骨芽細胞が活性型骨細胞へと変化し、基質合成を誘導することを明らかにした。また、(2)に関しては、マウスの腎動静脈を結縛した後にPTH投与すると、その直後1時間以内に、血中カルシウム濃度が上昇することを確認している。骨細胞は、細胞性ネットワークを形成しており、作られたばかりの海綿骨よりも成熟骨である皮質骨において規則的な配列を示し、また、より機能的な細胞ネットワークを形成していると考えられている。その結果、皮質骨におけるいくつかの骨細胞において、骨小腔の拡大、骨細胞周囲の基質の流出を組織化学・電子顕微鏡観察にて確認することができた。このメカニズムとして、腎臓型プロトンポンプが関与している可能性を獲得しつつある。また、PTH投与による骨細胞周囲の基質の性状変化について、原子間力顕微鏡を用いて解析すると、形態学的に目に見えなくとも、PTH投与後の骨細胞周囲の基質の弾性係数が低下していることも明らかにしている。さらに、この現象については、破骨細胞による関与を除外する必要があるため、破骨細胞が存在しないRANKL-/-マウスでも同様の実験を行ったところ、野生型マウスと同じ結果を得ることができた。平成26,27年度の挑戦的萌芽研究では、「骨細胞ネットワークを介したPTH新規作用ーミニモデリングと骨基質溶解・石灰化ー」というテーマで研究を進めた。その内容の一つは、PTHの間歇投与による骨形成として、リモデリングだけでなく、ミニモデリング(破骨細胞の骨吸収に依存しない骨形成)による可能性、もう一つは、PTHの単回投与で骨細胞が周囲の骨基質溶解ならびに再石灰化を誘導する可能性についてである。前者に関しては、野生型マウスにhuman PTH(1-34)間歇投与を、2日に1回、1日に1回、2回、4回とし、投与量を20μg/kg/day, 20μg/kg/does, 80μg/kg/day, 80μg/kg/doesの計16群のモデルマウス(各群6匹)を作製して行った。その結果、PTH投与頻度が高い場合、高代謝回転型の骨リモデリングを示しながら骨形成を誘導するのに対して、PTH投与頻度が低い場合には骨リモデリングだけでなくミニモデリングで骨形成を誘導することが明らかになった。現在、この研究成果はEndocrinologyにrevise中である。また、後者については、マウスに外頸静脈からhPTH(1-34; 80μg/kg)を投与し、皮質骨の骨細胞を観察すると、経時的に骨小腔周囲の骨基質から骨ミネラルが流失し、コラーゲンなどの有機成分が露出してくること、また、骨小腔の壁は粗造となりやや拡大することを明らかにしている。さらに、骨小腔周囲の骨基質に形状変化が認められなくとも、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションにより骨基質の物性を計測すると、PTH投与では骨小腔周囲の弾性率が低下し、物理的に脆弱化していることを確認している。この研究成果は、現在、論文作成中である。以上、骨細胞ネットワークを介したPTH新規作用の一端が明らかとなった。平成26年度の研究概要として、(1)PTHが骨細胞ネットワークを介してミニモデリングを制御するメカニズムの解明、(2)PTHが骨細胞周囲の骨基質を溶解・再石灰化するメカニズムの解明の2点を掲げた。(1)に関しては、マウスを用いた動物実験であるが、実験系が複雑ではないため、PTH投与によるミニモデリングの誘導を確認・再現することができている。