hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオイメージングによるウイルス感染と細胞応答の定量解析

本研究においては、細胞への感染成立には、インフルエンザウイルス粒子が何個必要かという命題を解くために、研究を行っている。そのため、ウイルス粒子が細胞内侵入する際に重要なシグナル伝達経路の解析と、ウイルス粒子の精密計測により粒子数とその経路の関係性を検討した。シグナル伝達解析においては感染時のカルシウム上昇に着目し、その責任分子の機能解析を進めた。同定した責任分子は24回膜貫通型の膜タンパク質であり、生化学的解析を行うための可溶化が困難であった。種々の界面活性剤を用いて可溶化条件を検討したところ、凝集せずに単量体として可溶化することに成功した。この条件を用いることで、この責任分子とウイルス粒子の結合を介してカルシウム上昇が引き起こされることが明らかになった。また、領域内の東京大学工学系研究科・野地先生、田端先生との共同研究により、用いるウイルスサンプルの粒子数とMOIの関係を明らかにしたうえで、感染性の評価を行った。その結果、ウイルス感染効率はこれまで考えられていたMOIよりも、粒子数に依存することが明らかになった。また、粒子数が多い時と少ない時では異なる細胞の応答性が観察された。粒子数が多い時には感染にある種の正のフィードバックのようなブースト機構が存在すること、そのブースト機構にカルシウムが重要であることが解った。実際に高い複製が認められ、多くの粒子が取り込まれたと考えられる細胞には、上記の責任分子が多く発言していた。一方で、複製が盛んではない(0ではない)細胞においては上記の責任分子の発現量が低く、カルシウム応答も見られないことから、カルシウム非依存性のメカニズムによりウイルスが感染するものと考えられた。両者の境界は細胞1つあたりウイルス粒子20個程度であり、感染には数10個程度の粒子が必要であることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、蛍光ラベルしたウイルス粒子あるいはウイルス様粒子と、FRETの原理を利用した各種バイオセンサーによるバイオイメージングを中心に、生化学・分子生物学・細胞生物学手法を統合的に用い、全体をシステムとして扱うことで、「何個のウイルス粒子が、その後の細胞応答と感染成立に必要か?」という命題にチャレンジする。本年度は以下の項目について研究を行った。(A)粒子取込に必要な細胞内シグナルは何個のウイルス粒子により発動するか:蛍光標識したウイルス粒子の吸着・侵入をライブセルで可視化すると同時に、FRETバイオセンサーを用いた細胞内シグナルの動態観察を、2秒毎のタイムラプスイメージングで行った。その結果、細胞全体でのカルシウム上昇に先行する、ウイルス粒子結合部位周辺で感染直後に一過性に生じるカルシウム上昇の検出に成功した。(1)ウイルス粒子数の精密測定に共同研究で成功した。この粒子数が既知のウイルス粒子をカルボシアニン膜色素DiDで染色し、ポリエチレンイミンでコーティングしたカバーガラスに、粒子1つ1つが独立して存在するように吸着させる。ここで観察されるスポットの蛍光強度から、ウイルス粒子1つあたりの蛍光強度を算出する。同時に標準蛍光色素溶液を作製し、1粒子当たり蛍光色素の標識量と、粒子ラベル化効率のばらつきと平均蛍光強度を決定した。(2)粒子数依存的なウイルス粒子の細胞内動態:上記で作製したウイルス粒子の吸着・侵入をライブセルで可視化した。(3)粒子数依存的な細胞応答の定量解析:各種シグナル伝達因子の活性化をモニターするFRETバイオセンサーを発現させた細胞に、上記で決定した条件のウイルス粒子数を感染させ、生じる細胞応答を定量的に解析した。これにより、細胞応答に必要なウイルス粒子すを決定することができた。計画調書で記載した平成26年度の予定に加え、翌年度実施される予定の研究も着手し、成果が得られつつあるので。

27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り以下の研究を推進する。(B)ウイルス粒子の取込および感染性子孫粒子の形成に必要な細胞応答の強度の決定。(C)感染成立・伝搬力可能な子孫ウイルス形成に至る必要十分はウイルス量・シグナル強度の決定。(D)隣接する細胞へ感染を伝播するために必要最小条件の決定。(E)得られたパラメータの統合的解析。
日本近世出版法制研究補完及び文学史との相関追求

最終年度においては、幕府が藩に知らせた出版法があるかないかの確認作業を終え、論文化することを試みた。これまで幕府が藩に出版法を伝えたかどうかを確かめた者がいないからである。幕府が藩に知らせた法令を記録した史料として知られている地方法制史料のうち、岡山藩の史料である岡山大学附属図書館池田家文庫の『東御法令』と加賀藩の史料である金沢市立玉川図書館近世史料館加越能文庫『公儀御触』の内容を点検し、幕府が藩に出版法を知らせた形跡がないことを確認した。しかし、岡山藩の史料は年次順、加賀藩の史料は分類体であり、形態がことなっているし、岡山藩の分類体法令集『法例集』に使用された史料名を見ると、江戸時代岡山藩には『東御法令』とは別の逐次記録史料があったようであり、もし『東御法令』が採択実施法令集だとすると、『東御法令』以外にも幕府が岡山藩に伝えた法令があった可能性がある。一方、加賀藩の史料は江戸時代前期の法令を収録していない江戸時代後期の法典である。『東御法令』と『公儀御触』に出版法が収録されないからと言って、単純に幕府が出版法を藩に伝えなかったとは言えないかもしれない。そのため加賀藩の諸史料を網羅的に拾った編年体の史料集『加賀藩史料』(全17巻)の内容を補足点検する作業に入って年度末に至った。また、念のため幕府が藩に伝えた法令を記録する史料として知られるもうひとつの(最後の)史料である熊本大学附属図書館永青文庫の収録内容を点検すべきであると考えている。なお、研究期間全体を振り返れば、研究期間前半年度に行った作業によって、大阪出版法の補足作業を終えた研究期間となった。今後、研究期間中に未完成となった文学史との相関の追求、特に大阪の西鶴作品に注目して法と文学との具体的関係を考察していくことになろう。本研究計画にはその目的に二つの柱がある。江戸時代出版法制度の実態究明とその文学史動向との関係追求である。現在未解明の三都(江戸、京都、大阪)以外の出版法については、『御触書集成目録』解題執筆者服藤弘司氏の論文集『幕府法と藩法』によって、それを確認すべき史料の存在を洗い出し、翻刻史料の収集を行い、未翻刻史料の研究期間中の閲覧あるいは複製計画を立てつつある。また、それでは把握できない代官史料の存在についても法制史料解題の類からその存在を洗い出し、計画の中に入れつつある。また、三都のうち最も法令文の欠落の多い大阪に関してその補充作業を試みている。今年度は活字紹介の行われていた『大坂御仕置御書出之写』中にふくまれる新出出版法令によって大阪のみならず、江戸・京都の元禄二年不明法令を推定し、江戸時代前期法令の不明状況を推定する手がかりを得た(「元禄二年「異説」の捜索」)。また、江戸に関して、京都と同じく、江戸時代前期に奉行所への出版申請制があったことが、国学者荷田在満が書き残した記録からわかることを明らかにした(「江戸時代前期の江戸における町奉行所出版許可制の存在について」)。江戸では人の噂に関する出版を規制する法令があったから、この町奉行所出版申請制度は江戸における人の噂に関する出版規制を人々に厳守させる結果をもたらしたはずである。現在、三都出版法と三都浮世草子の作品内容及び質の相違との相関関係の有無につき考定すべく、江戸浮世草子の内容確認を行いつつある。研究課題に関しては、史料の所在確認、史料の収集計画、成果執筆計画、等、すべてに関して順調に進めており、今後の見通しに関しても特に問題はないと思われ、さらに、すでに研究成果を論文として発表しつつある。現在未解明の三都(江戸、京都、大阪)以外の出版法については、岡山大学附属図書館池田家文庫所蔵の岡山藩法制史料を複写収集し、幕府発令の出版法がどの程度岡山藩に通達されるものかを確認中である。また、『御触書集成目録』解題執筆者服藤弘司氏の論文集『幕府法と藩法』に使用される翻刻史料等について内容を確認中である。また、未翻刻史料について閲覧あるいは複製計画を立てた。今年度は大阪市史史料編纂所所蔵の御八幡宮文書(紙焼写真)および尼崎地域歴史史料館所蔵の庄屋文書を閲覧調査し、必要な史料の複写収集を行った。また、すでに紹介のある大阪触補充史料につき、出版令にしぼった観点からその意義を考察し、また、未紹介の岡山藩法制史料によってその省略部分が補えることを報告した(「『せん年より御ふれふみ』『大坂岡山御触留』で補われる江戸時代大阪出版法令についてー附、岡山大学附属図書館池田家文庫蔵『宝暦三癸酉八月ヨリ大坂岡山御触留』所収大阪触達番号一覧ー」)。さらには、紹介済みであるにもかかわらず、あまり分析の進展しない史料・大坂本屋仲間記録を用いて、江戸時代中後期の出版法制度維持の中心的役割をになった大阪本屋仲間の中心的存在である行司の固定的性格について史料的に跡づけ、行司の行政的責任の重さとその資格について考察した(「江戸時代大阪本屋仲間行司の固定的性格」)。出版法制史と文学史との相関考察については、課題として次年度以降に持ち越した。

研究課題に関しては、史料の所在確認、史料の収集計画、成果執筆計画、等、全方面に関して進んでおり、今後の見通しに関しても特に問題はないと思われ、さらに、すでに研究成果を論文として発表しつつある。本研究計画では、江戸時代出版法制度の実態究明とその文学史動向との関係追求を二本の柱としている。そして、本研究計画最終年度の前年度にあたる今年度は、それらの課題について行ってきた昨年度までの作業をふまえて、平成21年時の作業認識である山本秀樹『江戸時代三都出版法大概ー文学史・出版史のためにー』(岡山大学文学部研究叢書29、岡山大学文学部)を再度見直し、本研究計画の総括形としての公開に向けて修正しつつある。その修正点を例記するとすれば、たとえば江戸時代の書籍法が原則出版法ではなく、(写本をも対象とする)書物法であり、書物の存在自体を許さない禁書法ではなく、禁流通法であったこと。あるいは、これまでに発掘した大阪書物法データの補充。そして、それによって明らかになった、元禄時点において三都出版業者の幕府権力による把握が行われていたこと。及び、享保期江戸本屋仲間の成立が出版検閲権の民間への委託を意味したのではないかということ、等の修正である。一方、本研究計画の第一の柱である江戸時代出版法制度の実態究明の中心作業の一つに位置づけた、三都(江戸・京都・大阪)以外の出版法制度の解明については、前年度来の継続作業として、収集した岡山大学附属図書館池田家文庫・金沢市立玉川図書館近世史料館加越能文庫所蔵史料の分析作業を継続中である。また、幕領を管轄した代官史料の発掘については、著名な大規模史料である伊豆の国市韮山の江川文庫が今なお整理中非公開であるため、他の代官史料を探し求めているが、法令史料をふくむような代官史料にいまだ見当たっていない。今後も情報収集につとめなければならない。少なくとも岡山大学附属図書館池田家文庫及び金沢市立玉川図書館近世史料館加越能文庫所蔵の幕府法令史料によって、当初の課題として設定した三都(江戸・京都・大阪)以外の出版法の有無の確認は取れるであろう。一方、当初見込んでいた幕府代官史料がいまだ未確認の状態となっているが、もし来年度までに幕府代官史料が未発掘のまま研究計画終了を迎えたとしても、少なくとも上記史料によって三都以外の出版法状況を推知する手段は得られたことになり、三都の状況しか知られなかったこれまでとは認識の地平の広がりが決定的に異なることになろう。最終年度においては、幕府が藩に知らせた出版法があるかないかの確認作業を終え、論文化することを試みた。これまで幕府が藩に出版法を伝えたかどうかを確かめた者がいないからである。幕府が藩に知らせた法令を記録した史料として知られている地方法制史料のうち、岡山藩の史料である岡山大学附属図書館池田家文庫の『東御法令』と加賀藩の史料である金沢市立玉川図書館近世史料館加越能文庫『公儀御触』の内容を点検し、幕府が藩に出版法を知らせた形跡がないことを確認した。しかし、岡山藩の史料は年次順、加賀藩の史料は分類体であり、形態がことなっているし、岡山藩の分類体法令集『法例集』に使用された史料名を見ると、江戸時代岡山藩には『東御法令』とは別の逐次記録史料があったようであり、もし『東御法令』が採択実施法令集だとすると、『東御法令』以外にも幕府が岡山藩に伝えた法令があった可能性がある。一方、加賀藩の史料は江戸時代前期の法令を収録していない江戸時代後期の法典である。
東アジア漂海民の家船居住と陸地定住化に関する比較研究

東アジアから東南アジアにかけて広範囲に分布する家船居住の実態をあきらかにするための前提として、これまでの研究史を整理し、この地域における家船の分布図と家船呼称の分布図を作成した。一方、山口県の見島、マレーシアのペナン島とケタム島、ベトナムの香河、カンボジアのトンレサップ湖などで水上居住に関するフィールドワークを進めた。ベトナムのフエには約2万艘の家船が現存する。すてに相当の研究が蓄積されており、関係論文2篇を入手し、これを翻訳した。最も集中的な調査をおこなったのは、カンボジアのトンレサップ湖である。トンレサップは東南アジア最大の淡水湖であり、雨期と乾季で水位が約6メートル上下する。ここにチョンクニアスという大規模な水上集落が形成されており、そこにはおびただしい数の家船・筏住居・杭上住居が共存している。水上居住民の陸地定住化のプロセスを考察するにあたって、きわめて示唆にとむ。また、湖岸のスクウォッターとしての杭上住居だけでなく、一般農村の高床住居についても調査し、両者の構造・間取りを比較した。トンレサップ湖には、クメール人だけてなく、ベトナムからの難民が多数流入している点も興味深い。東南アジアでは、日本・中国では消滅しつつある家船居住が現在なお迫力をもって息づいており、これらの調査研究成果を中心にして、報告書を刊行した。東アジアから東南アジアにかけて広範囲に分布する家船居住の実態をあきらかにするために、これまでの研究史を整理し、関係文献を集成した上で、この地域における家船の分布図と家船呼称の分布図を作成した。これら文献研究を進める一方、日本と東南アジアでのフィールドワークも進めてきた。日本ではこれまでおこなってきた日本海沿岸離島調査の一環として、山口県の見島を訪れ、萩・見島一帯でもかつては家船居住民の存在したことを確認できた。東南アジアの水上居住民については、01年9月にタイとマレーシア、02年2月にヴェトナムで調査をおこなった。タイでは、現地の水上居住民研究研究者であるChaweewan Denpaiboon女史に導かれ、ピサノロークとウータイタニで筏住居を調査した。マレーシアではペナン島とケタム島で華人の水上集落を調査した。ヴェトナムでは、まずホーチミン市内とその近郊のミトーでメコン支流沿岸域の水上住居を調査した。ついで、フエではヴェトナム文化芸術研究所中央ヴェトナム支局のNgyen Huu Tong支局長と意見交換を交わした。フエでは香河の上流域から下流のラグーンにかけて、2万艘以上の家船居住民がいる。そのうち、市内の家船居住民は都市域での労働(自転車タクシーの運転手兼ポン引や土砂運搬など)に携わり、上流とラグーンの家船居住民は漁労を生業としている。これについては、すでにNgyen Huu Tong氏の指導する大学院生が論文を著しており、関係する2篇の論文コピーをいただいた。いずれもヴェトナム語の論文であり、来年度、ヴェトナム語の専門家に翻訳を依頼する予定である。フエでは上流から下流まで広い範囲をクルージングし、多数の家船を写真撮影もしくはスケッチした。フエの成果は予想以上であり、来年度以降も主要なフィールドとして継続調査することにした。今年度はこれまで蓄積してきた研究、とくに初年度に作成した日本・東アジア・東南アジアにおける家船分布図・家船呼称分布図に基づく研究論文を鳥取環境大学紀要創刊号と台湾中央研究院APARP(中央研究院東北亜研究論文系列)No.17に発表した。また、2002年2月に訪れたベトナム・フエ市で意見交換したNgyen Huu Tong氏(ベトナム文化芸術研究所中央ベトナム支局長)に提供していただいた論文2篇(いずれもフエを中心とするベトナムの水上居住に関する論考)のうちの一篇を、ベトナム語の専門家に依頼して翻訳した。一方、2002年12月には、カンボジアのトンレサップ湖において約1週間の調査をおこなった。トンレサップはきわめて広大な湖であり、雨期と乾季で水位が数メートルも上下する。

代表者の浅川は、アンコール遺跡群で名高いシェムレアップ市に滞在し、その東の郊外にあたるトンレサップ湖西岸の水上集落を調査した。そこには家船・筏住居・杭上住居が共存しており、学校や教会などの公共施設までもが筏の上に築かれている。家船・筏住居・杭上住居の共存という点は、水上居住民の陸地定住化のプロセスを考察するにあたって、きわめて示唆にとむものである。また、湖岸のスクウォッターとしての杭上住居だけでなく、一般農村の高床住居についても調査し、両者の構造・間取りを比較した。トンレサップ湖には、クメール人だけでなく、ベトナムからの難民が多数流入している点も興味深く、可能ならば、来年度以降も継続的に調査をおこないたい。今年度は3ヶ年計画の研究の最終年度にあたり、研究成果報告書の編集を第一とした。報告書の構成は以下のとおりである。序家船と水上居住-日本海島嶼から東南アジア内陸水域まで(浅川)第1章東アジア漂流民と家船居住(浅川)第2章東亜的漂海民和家船住宅(同上中国語論文)第3章家船の陸上がりと水陸の境界-中国広東省中山市の事例(長沼さやか)第4章1975年以前の香河におけるヴアンと船上生活(ファン・ホアン・クイ/訳グエン・テ・フン&山形真理子)第6章香河水上居民の住居と生活-実態と問題提起116ホアン・バオ(訳山形真理子&グエン・テ・フン)第8章トンレサップ湖の水上居住-家船・筏住居・高床住居-(浅川)第12章は東方アジアの水上居住を広域的に捉えた総論である。第3章は中国の蛋民を「水陸の境界」という視点からとらえた論考。第47章は、本科学研究費で訪れたベトナム・フエ市で提供された関係論文の翻訳と原典、第8章は本科学研究費で訪れたカンボジア・トンレサップ湖の水上居住に関するレポートである。日本・中国では消滅しつつある家船居住が東南アジア各地では現在なお迫力をもって息づいており、とくにベトナム香河流域の家船とカンボジアのトンレサップ湖で展開する水上居住の多彩さは驚異的である。これらの調査研究成果をできるだけくわしく取り上げた報告書としたつもりである。
精神分裂病における新しい細胞内セカンドメッセンジャー標的遺伝子群の遺伝解析

平成14年度より開始した本研究について、その成果について以下に記した。1)候補遺伝子の遺伝子構造の決定:cAMP-GEFI、cAMP-GEFII、CalDAG-GEFI、CalDAG-GEFII、それぞれの遺伝子の遺伝子構造の決定に関しては終了した。手法は、データベースに登録されている、Human Genome Projectのドラフトシーケンスとそれぞれの遺伝子のmRNAの配列を比較し、エクソン領域、イントロン領域、プロモータ領域の決定を行った。2)SNPの分離:それぞれの遺伝子に関して、エクソン領域をはさむ領域及びプロモータ領域についてプライマー対の作成を行い、それぞれの領域を増幅し、塩基配列の決定を行った。約100名の配列を比較し、データベースの情報とともにSNPの同定を行った。3)統合失調症罹患群・対照群の検体収集:統合失調症の患者及び非罹患対照群のサンプル収集は、九大病院・精神科神経科及び関連病院で行い、総数約900名となった。4)多型のゲノタイピングの決定:5)ゲノタイプのデータの統計処理、ハプロタイプを使った相関解析:統計解析は、カイニ乗検定を用いて、それぞれの多型に関して対照群、統合失調症群でアレル頻度に有意差がないかを検討した。また、それぞれの遺伝子群における、多型同士の相関がないかの検討もロジスティック回帰分析にて行った。ゲノタイプデータをもとに、ハプロタイプを推定し、推定されたハプロタイプの頻度におけるさも検討した。1)候補遺伝子の遺伝子構造の決定:(川嵜)ヒューマン・ゲノム・プロジェクト(Human Genome Project)によってデータベースに登録されているそれぞれの遺伝子が含まれる領域の染色体DNA塩基配列のファイルを利用し、我々がクローニングによって得たcDNAの塩基配列をコンピューター上で比較することによって、プロモーター領域及びニクソン・イントロン構造を決定した。この操作には、当初の予定通り、塩基配列比較を目的としたソフトウェア(DNA・蛋白解析ソフトウェア(Lasergene))を用いた。2)SNPの分離:(川嵜、林)3)精神分裂病罹患群・対照群の検体収集:(川嵜)精神分裂病罹患群については、臨床チームによる半構造化面接を行い診断、発症、治療経過、病型、薬剤反応性、生活歴、家族歴などの詳細な医学的情報の収集、データ解析を行った。健常対照群についても心理検査のアンケートを行い、DNAサンプルを収集した。精神分裂病患者約200名、健常対照群約400名の収集を行った。4)アレル頻度と多型の評価(川嵜、林)精神分裂病群、健常対照群について、上記で分離されたSNPを含む多型に関して、ゲノタイピングを行いそれぞれの群におけるアレル頻度を計算し、統計解析を行った。現在のところ、それぞれ約100名のサンプルの解析を行っている。一部の多型に関しては、ハプロタイプの決定法の実験系を確立し、その決定を行っている。
東濃西部方言プロソディの音声学的研究

継続的におこなってきた東濃(岐阜県南東部)西部の方言の音声に関する調査のうち、平成30年度は、多治見市の高齢層の談話音声データを収集し、そのプロソディの分析をおこなった。調査対象者に録音の許可を得たものではあるが、これまでの読み上げ式によるアクセント調査とは異なり、自然な会話におけるリズムとイントネーションを分析することができたことにより、次のことが明らかになった。第一に、モーラ方言でありながら文や節の末尾以外の位置で1拍音節の長さのばらつきが大きく、その要因は文初頭1拍音節が長いことである。この結果は10人の調査対象差全員に見られ、文初頭拍と語中拍の持続時間には有意差が認められた。また、文初頭拍のうちでも、初頭拍に頭子音がない場合には延伸しないことも明らかになり、頭高型アクセントによりその初頭拍が高い場合も延伸が少ないことがわかった。第二に、頭高型以外のアクセントを持つ語が文頭にある場合に見られる文頭のイントネーションの上昇が、当該方言では東京方言等に比べて遅く、いわゆる遅上がりの現象が見られることがわかった。特にアクセント核が3拍目以降ないし無核の場合にその傾向が顕著であり、文頭拍の延伸と文頭イントネーションの上昇幅との相関も認められた。これらの結果は学術論文にまとめたほか、初学者向けの叢書への寄稿「音声面での「○○語(方言)らしさ」の定義は可能かー東濃西部方言の実例をもとにー」(2019年)にまとめ、公開研究交流会第12回「人文知」コレギウムで発表した。調査地域においてもコミュニティラジオFMPiPiで取り上げられたほか、HP「多治見弁の部屋」およびブログサイト「多治見弁blog」において市民向けに簡易な形で紹介している。本研究では、岐阜県東濃地方西部のうち多治見市の方言を対象に、アクセントやイントネーションの特徴を音声学的に整理するための取り組みを行っている。今年度は、これまでにおこなってきたアクセント調査のデータから、形容詞の諸活用形のアクセントについて分析した。その結果、終止形のアクセントは、語類による区別がなく、すべて中高型(ただし、2拍目が引き音の「遠い」「多い」は頭高型と中高型が拮抗)であり、内輪東京式アクセントの特徴を示していることがわかった。そのほか、「けりゃ」または「けや」となる仮定形では、「け」の直後でピッチが下がる型、「かった」という過去形では「か」の直後で下がる型、「(く)なる」となる連接形では「な」と直後で下がる型が優勢であることがわかった。また、「ても」となる中接形と「ない」という否定形では、語幹にピッチの下がり目があるほかに、「ても」の「て」、「ない」の「な」の直後にも急激な下がり目が見られる例が多く、1つの文節に2つの下がり目があるということが確かめられた。この2段下がりの現象は、今後の音声学的分析の中心になるところである。また、読み上げ式のアクセント調査では観察されにくい、自然発話の中でのイントネーションで、こうした2段下がりがどのような場合に現れるかを調査するために、調査対象者の許可を得て、3組で計約1時間の自然な会話の録音をおこない、次年度の分析の準備とした。これまでの調査の整理を行い論文を発表するとともに、今後の研究のための準備となるデータ収集を順調におこなうことができたため。本研究では、岐阜県東濃地方西部のうち多治見方言を中心に、アクセントやイントネーション、リズムといったプロソディ上のの特徴を音声学的に整理するための取り組みをおこなっている。これまでに整理したアクセントの特徴をもとに、今年度は、読み上げ音声では抽出することのできない自発音声のリズムを確認するため、調査と分析をおこなった。具体的には、一定のテーマで方言話者2組に会話してもらった音声を録音し、音響分析・計測した。多治見方言は共通語と同様に、モーラを基準としたリズムを持つと考えられるが、今回の調査により、文中での位置によって拍の長さが変動することが明らかになった。具体的には次のとおりである。1)文や節の末尾では、共通語と同様に延伸することがあり、長さのばらつきが大きい。2)文や節の初めでは、1拍音節が語中の位置に比べておよそ1.4倍の長さをもつ。3)節の初めを除く語頭では、語中のおよそ1.3倍の長さとなるが、ばらつきが大きい。このうち2)、3)は先行研究に見られる共通語の特徴と異なる点であり、イントネーション上の特徴と合わせて、東濃西部方言らしさを形成するプロソディの特徴であると考えられる。こうした研究成果を、今年度、学術論文として発表した。さらに、老人会での講演・同地域のコミュニティラジオFMPiPiへの出演・前研究課題から継続している一般市民向けホームページやブログの更新により、地域への還元をおこなった。これまでに収集したデータの量は十分ではないが、質の高いデータを得られているため、効率よく分析を行うことができ、リズムに関する調査としては目的を達成することができた。さらに、これまでの研究の成果を学術論文だけでなく、老人会での講演・同地域のコミュニティラジオFMPiPiへの出演・前研究課題から継続している一般市民向けホームページやブログの更新により、地域への還元を進めることができた点が挙げられる。継続的におこなってきた東濃(岐阜県南東部)

西部の方言の音声に関する調査のうち、平成30年度は、多治見市の高齢層の談話音声データを収集し、そのプロソディの分析をおこなった。調査対象者に録音の許可を得たものではあるが、これまでの読み上げ式によるアクセント調査とは異なり、自然な会話におけるリズムとイントネーションを分析することができたことにより、次のことが明らかになった。第一に、モーラ方言でありながら文や節の末尾以外の位置で1拍音節の長さのばらつきが大きく、その要因は文初頭1拍音節が長いことである。この結果は10人の調査対象差全員に見られ、文初頭拍と語中拍の持続時間には有意差が認められた。また、文初頭拍のうちでも、初頭拍に頭子音がない場合には延伸しないことも明らかになり、頭高型アクセントによりその初頭拍が高い場合も延伸が少ないことがわかった。第二に、頭高型以外のアクセントを持つ語が文頭にある場合に見られる文頭のイントネーションの上昇が、当該方言では東京方言等に比べて遅く、いわゆる遅上がりの現象が見られることがわかった。特にアクセント核が3拍目以降ないし無核の場合にその傾向が顕著であり、文頭拍の延伸と文頭イントネーションの上昇幅との相関も認められた。これらの結果は学術論文にまとめたほか、初学者向けの叢書への寄稿「音声面での「○○語(方言)らしさ」の定義は可能かー東濃西部方言の実例をもとにー」(2019年)にまとめ、公開研究交流会第12回「人文知」コレギウムで発表した。調査地域においてもコミュニティラジオFMPiPiで取り上げられたほか、HP「多治見弁の部屋」およびブログサイト「多治見弁blog」において市民向けに簡易な形で紹介している。今年度おこなった会話の音声データを効率よく分析するため、謝金を活用して学生アルバイトを雇用し、文字起こしの下書きを依頼する。また、そのうちで、特定のイントネーションの個所を音響的に分析するため、今年度購入したソフトウェアを活用する。さらに、分析に適した音声データを得るための協力者を増やすために、市民向けの方言HPの拡充や、研究成果の一部を還元する講演を積極的におこなっていく。最終年度は、今年度の研究による結論を補強するべくデータを増やして分析するとともに、プロソディ上の特徴の核となると考えられるイントネーションの角度からも分析をすすめる。そのために、多治見市を中心に一週間程度、会話音声の収集をおこない、データ整理の補助に謝金を支払うことで学生に作業を依頼する予定である。最終的には調査結果を学術論文にまとめるとともに、公開講演会で一般向けの講演を行い、その内容を講演会関連の論文集に発表する。主として、データ収集の際に使用する文具類の納品が次年度4月に持ち越されたため。次年度使用額が生じたのは、購入物品の金額の見積もりが実際と異なったことと、購入予定の図書の発行が遅れたため。現有のノート型PCが故障し調査に使用することができなくなったため、次年度使用額に余裕が生じた分は、次年度の調査用PC購入に充てる。既に次年度使用分となった文具類の発注・受注は完了し、納品・支払いが行われたことにより、持ち越された分は消化された。翌年度使用分は当初の予定通り執行する。
異なる陰イオン界面を利用した室温強磁性半導体の探索

本研究は,キャリアドーピングを界面から試みることにより,最近盛んなワイドギャップ半導体研究において問題となっている少ないキャリアドーピング量を劇的に改善させることを目的としている。旧来の半導体では,自身の一部の原子を置換し,キャリアドーピングを行っていたが,キャリアドーピングを,伝導層を乱さないように,銅酸化物高温超伝導体のブロック層のように層状構造の界面を利用してできれば,大きなブレークスルーになることが期待される.もしこのようなことが実現させられれば,今まで不可能だったワイドギャップ半導体への十分なキャリアドーピングもできるようになり,紫外光レーザーや表題の室温強磁性半導体が実現でき,産業上の影響は計り知れない.今年度に研究室現有のNd : YAGレーザーを用いたレーザーアブレーション薄膜作成装置の整備として,多層膜を可能にするターゲット自動交換システムを導入した.現在,基板としてc面(0001)サファイア基板を用いて,ZnOを500°Cでバッファー層として積層し,その後700°Cで積層させ,Crを蒸着し,その後,AlNをAl基板を用いて窒素ガス中で積層させている.当初はMnを界面に挿入する予定であったが,Cr_2O_3はコランダム型の構造であり,a軸長は4.96Åで,α-Al_2O_3の4.76Åと格子ミスマッチが5%と十分に小さいことからCrへと方針を変えた.さらにCr_2O_3はc面内でのスピン構造が強磁性的であることから,もし面内のスピン構造を保ちながら,積層方向でも層間に挿入するZnO, AlNやα-Al_2O_3膜の厚さを調節して,強磁性相互作用が得られれば,試料全体が強磁性体となりうる.ちなみにZnOはウルツ鉱型であり,18%と大きな格子不整をもつことから,α-Al_2O_3層を含めて積層方法は実験を行いながら,現在最善の方法を模索している.本研究は,キャリアドーピングを界面から試みることにより,最近盛んなワイドギャップ半導体研究において問題となっている少ないキャリアドーピング量を劇的に改善させることを目的としている。旧来の半導体では,自身の一部の原子を置換し,キャリアドーピングを行っていたが,キャリアドーピングを,伝導層を乱さないように,銅酸化物高温超伝導体のブロック層のように層状構造の界面を利用してできれば,大きなブレークスルーになることが期待される.もしこのようなことが実現させられれば,今まで不可能だったワイドギャップ半導体への十分なキャリアドーピングもできるようになり,紫外光レーザーや表題の室温強磁性半導体が実現でき,産業上の影響は計り知れない.今年度に研究室現有のNd : YAGレーザーを用いたレーザーアブレーション薄膜作成装置の整備として,多層膜を可能にするターゲット自動交換システムを導入した.現在,基板としてc面(0001)サファイア基板を用いて,ZnOを500°Cでバッファー層として積層し,その後700°Cで積層させ,Crを蒸着し,その後,AlNをAl基板を用いて窒素ガス中で積層させている.当初はMnを界面に挿入する予定であったが,Cr_2O_3はコランダム型の構造であり,a軸長は4.96Åで,α-Al_2O_3の4.76Åと格子ミスマッチが5%と十分に小さいことからCrへと方針を変えた.さらにCr_2O_3はc面内でのスピン構造が強磁性的であることから,もし面内のスピン構造を保ちながら,積層方向でも層間に挿入するZnO, AlNやα-Al_2O_3膜の厚さを調節して,強磁性相互作用が得られれば,試料全体が強磁性体となりうる.ちなみにZnOはウルツ鉱型であり,18%と大きな格子不整をもつことから,α-Al_2O_3層を含めて積層方法は実験を行いながら,現在最善の方法を模索している.
熱帯地方におけるブロイラーの脂肪蓄積の低減化に関する共同研究

平成8年度1)ブロイラーを7日齢から17日齢までの10日間、自由採食の75、65、55及び45%を給与し、その後56日齢まで自由採食させた。2)27日齢の体重は雌雄ともに対照区が処理区より大きかった。3)その後、処理区の増体量が大きくなり、67週齢には対照区の体重に追いつき、8週齢では、雌では65と45%給与区が、雄では55と45%給与区が対照区より大きかった。4)飼料要求率はいずれの処理区においても対照区より低く、改善された。5)8週齢終了時での腹腔内脂肪重量及び屠体中の脂肪含量は、雌では55と45%給与区が低かったが、雄では処理によって影響が観察されなかった。6)屠体中のタンパク質含量は雄では処理区の方が増加する傾向を示した。平成9年度1)低タンパク質飼料の利用が可能ならば、飼料費を低廉化することができるが、成長の抑制及び脂肪蓄積が増大する。2)低タンパク質飼料(CP17%)に色々なレベルでメチオニンとシスチンを添加し、ブロイラーの肥育前期(03週齢)と後期(36週齢)に給与した。3)ブロイラーの肥育前期に、0.54%のメチオニンとシスチンを添加した低タンパク質飼料を給与し、その後、6週齢まで通常の飼料を給与することにより、増体重は改善され、脂肪蓄積、特に、筋肉中のトリグリセリド含量が低下した。[研究目的]ブロイラーの急速な育種選抜によって、出荷時の体重は年々、大きくなっているが、栄養生理学分野の研究が完全に追いついているとはいえず、ブロイラーの代謝障害が数多く発生している。その典型的なものが脂肪肝症と腹腔内脂肪の過剰蓄積である。一年中高温であるタイ国では日本以上に脂肪肝症や脂肪の過剰蓄積が発生し、家禽産業に大きな損失をもたらしており、解決が急がれている。このような脂質代謝異常の発生メカニズムを解明し、その予防法を確立する。[実験方法]7日齢のブロイラーを5区に分け、7日齢から17日齢までの10日間、自然採食(対照、100%)区、自然採食量の75%、65%、55%及び45%の5段階の飼料をそれぞれの区に給与した。その後、56日齢(出荷時)まで自由に採食させた。[結果]27日齢の体重は、雄、雌ともに対照区が飼料制限区に比べて大きかった。しかし、その後、雄、雌ともに処理区の増体量が大きくなり、6から7週齢終了時には対照区の体重に追いつき、8週齢終了時には、雄では55と45%制限区が、雌では65と45%制限区が対照区より大きかった。飼料要求率は雌では75%以外の処理区、雌では65と45%が対照区より大きかった。飼料要求率は雌では75%以外の処理区、雌ではいずれの処理区においても対照区より低く、改善された。8週齢終了時の腹腔内脂肪重量は、雌では55と45%制限区が低かったが、雄では飼料制限による影響は観察されなかった。屠体中の脂肪含量は、雌では55%と45%給与区が低く、水分含量はいずれの処理区も対照区より高かった。タンパク質含量は、雄では飼料制限区の方が増加する傾向を示した。タイ、カセサート大学における実験においても同様の結果が得られ、ブロイラーを7日齢から10日間、自由採、飼料要求率が改善され、腹腔内脂肪重量及び屠体中の脂肪含量も低下した。また雄、雌、ともに斃死率は大きく改善された。「研究目的」

平成8年度の両大学の実験から、ブロイラーを7日齢から10日間、自由採食量の55%から45%に飼料給与量を減らすことによって、8週齢時には体重、試料要求率が改善され、腹腔内脂防重量及び屠体中の脂肪含量も低下する結果を得た。ブロイラーの制限給与は総エネルギーの摂取量を制限とするよりもタンパク質の摂取量を制限する方が経済的にも、管理面からも好ましい。しかし飼料中のタンパク質含量を低くすると脂肪蓄積、すなわち腹腔内脂肪含量が増大するために一般的には行われていない。それで本研究は、ブロイラーの飼料中粗タンパク質含量を低い値とし、その飼料にメチオニン(met〉及びシスチン(cys)などの含硫アミノ酸を添加することによってブロイラーの脂肪蓄積の増加を抑制、さらに減少させることができるかを検討した。「方法」ブロイラーヒナを平飼い条件下で7日齢から21日齢まで粗タンパク質含量(CP)23%及び17%の飼料に種々のレベルでメチオニンとシスチン添加した飼料を21から56日齢まで市販の飼料を給与し、体重、試料摂取量及び斃死率を測定した。「結果」実験終了時において、met+cysを1.07%含有している17%CP区の方が23%CP飼料区より体重、増体量及び胸筋重量は有意に大きかった。腹腔内脂肪重量は17%CP飼料区が23%CP飼料区に比べて大きかったが、17%CP飼料区にmet+cysを1.07%添加した区では23%CP飼料区とほぼ同じ値にまで減少した。そして実験終了時では処理間で有意な差は観察されなかった。実験終了時における血清中の各脂質画濃度及び肝臓中トリグリセリド含量は23%CP飼料区より17%CP飼料区にmet+cysを添加した区の方が低かった。本研究結果から、ブロイラーの成長初期にmet+cysを添加した低タンパク質飼料を給与し、その後、出荷時まで市販の飼料を給与することによって、成長の改善及び脂肪の蓄積を減少させることができた。
山林火災後の植生回復と微気象の変化及び斜面全体の地表面温度分布について

1992年2月に林野火災が発生した岡山県倉敷市と玉野市にまたがる瀬戸内海に面した王子が岳において、火災跡地での浅層部の土壌水分の観測、地表面温度やその他の微気象要素の観測を行った。その結果、同じ林野火災でもその燃焼の程度によって、後の微気象や植生回復に大きな違いが生じることが明らかになった。すなわち、木本まですべて燃焼した場所、木本は残存し林床植物のみが燃焼した場所、火災の影響を受けなかった場所で比較してみると、放射温度計(サーモトレーサ)による地表面温度の面的な観測値や、テンションメータによる土壌水分の観測値に違いがみられた。まず、晴天日の日中、サーモトレーサによる地表面温度の観測では、木本まで全焼した場所が他の場所に比べてやや高温であることが確かめられた。逆に林床植物のみが燃焼した場所では、かえって何も影響を受けなかった場所よりも若干低温になる様子がみられた。また土壌水分の秋季から冬季にかけての連続測定の結果をみると、林床植物のみが焼失した場所で最もPF値が低い場合が多く、他の場所に比べて湿潤であった。林床植物のみが焼失した場所では、火災時に地温がさほど上昇せず、再生のための種子や地下茎が生存していた。またコシダを中心とする林床植物の地上部が燃え、炭化した有機体となって植生回復のための肥料となった。それ故下草が再生し、以前よりも繁茂する様子が観察された。このことと共に火災時に木本が生き残ったため、この林が日射を遮断し、地表面温度の上昇を抑えたことが、蒸発散を抑制し、より湿潤な状態が保たれる結果となった。本研究では、これらについても定量的に裏付けることができた。今後も観測を継続し、より大きなスケールの気象現象との関わりについても考察したい。
新規な生体用近赤外蛍光プローブの開発

生体物質の挙動を調べる有力な手段となる蛍光イメージングプローブ法では、600 nm以下のヘモグロビンの吸収や、1000 nm以上の水の吸収の影響を受けない650 nm900 nmの“生体の窓"と呼ばれる近赤外領域の光の利用が重要となっている。本研究では、650 nm900 nmで蛍光発光する生体用近赤外蛍光プローブの開発を計画し、幾つかの新規近赤外蛍光プローブの合成に成功した。2-アミノトリプタンスリンを基本骨格構造とする650nm以上に蛍光極大波長を持つ新規近赤外蛍光色素の開発を行うため、平成25年度は、環拡張型、アルキニル基導入型、分子内FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)型の新規2-アミノトリプタンスリン誘導体を合成し、その吸収・発光特性について検討した。環拡張型としては、2-アミノトリプタンスリンの5員環の隣のベンゼン環をナフタレン環、アントラセン環に拡張した。その結果、2-アミノトリプタンスリンの蛍光極大波長はメタノール中での632 nmが最長波長であったが、環を拡張することで650 nm以上に蛍光極大波長を示すようになることがわかった。但し、アントラセン環を含む系では、蛍光強度が著しく低下するというマイナス面も見られた。アルキニル基導入型としては、2-アミノトリプタンスリンの7-位又は9-位にフェニルエチニル基を導入した系を合成した。これらの系も、650 nm以上で蛍光極大波長が観測された。特に9-位にフェニルエチニル基を導入した系ではメタノール中で662 nmの蛍光極大波長を示すことがわかった。分子内FRET型としては、2-アミノトリプタンスリンと7-メトキシクマリン又はウンベリフェロン(7-ヒドロキシクマリン)を、長さの異なるポリエーテル鎖でつないだ系を合成した。これらの系は、分子内FRETにより溶媒極性の違いによって紫又は青から赤色迄の可視領域全般の色を示す事が可能であり、非常に優れた蛍光ソルバトクロミズを示すことがわかった。650nm900nmの生体の窓と呼ばれる波長領域に蛍光極大波長を持つ新規近赤外蛍光色素の開発を行うため、平成25年度から行っている2-アミノトリプタンスリンを基本骨格に持つ環拡張型、アルキニル基導入型、分子内FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)型の各種誘導体の合成に加えて、平成26年度は鈴木ー宮浦クロスカップリングによる共役拡張型とトリプタンスリンの2-位のアミノ基をジメチルアミノ基やヒドロキシル基に変換した系の合成を中心に行い吸収・発光挙動について検討した。その結果、トリプタンスリンの2-位のアミノ基をより強い電子供与性基であるジメチルアミノ基にすることで6-位のカルボニル基との間で起こるICT(分子内電荷移動)の度合いが高まり蛍光極大波長が大きく長波長側にシフトすることがわかった。更に、2-ジメチルアミノトリプタンスリンの8-位又は9-位にブロモ基を導入すると蛍光極大波長は更に長波長側にシフトし、プロトン性溶媒及び非プロトン性極性溶媒において650nm以上の近赤外領域で蛍光極大が観測されることがわかった。また、トリプタンスリンの2-位のアミノ基をヒドロキシル基に変換した系では、プロトン解離したアルカリ水溶液中で吸収極大波長及び蛍光極大波長がともに近赤外領域で観測されることがわかった。2-アミノトリプタンスリンのベンゼン環をアントラセン環に環拡張すると、蛍光極大波長は長波長側にシフトするがほとんど蛍光を示さなくなることがわかったが、金属イオンに対する応答性の実験ではアルミニウムイオンが存在するときのみ選択的に蛍光強度の増大が起こることがわかった。650 nm900 nmのヘモグロビンや水の吸収の影響を受けない所謂“生体の窓"と呼ばれる波長領域に蛍光極大波長をもつ新規近赤外蛍光プローブの開発のため、平成25年度及び平成26年度に引き続き、トリプタンスリンの2-位に強い電子供与性基が導入された種々のトリプタンスリン誘導体を合成し、吸収・発光挙動について調べた。また、14種類の金属イオン対する蛍光応答性について調べた。2-ヒドロキシトリプタンスリンは、アセトニトリル中での蛍光極大波長は約500 nmであり、Mg(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Ag(I), Zn(II), Cd(II), Pb(II)の存在による蛍光スペクトルの変化は示さなかったが、Fe(II), Fe(III)を添加すると蛍光消光しながら蛍光極大波長はレッドシフトし、Cu(II)存在下では完全に蛍光消光した。一方、Ca(II), Hg(II), Al(III)を添加すると長波長側の約600 nmに新たな蛍光バンドが観測された金属イオンの蛍光検出が可能であることがわかった。一方、水溶液中では金属イオンが存在の有無に関わらず、即ち周辺環境の変化に影響せず、近赤外領域の約660 nmで蛍光を示すことが分かった。また、2-ヒドロキシトリプタンスリンの1-位にベンゾチアゾールを導入すると励起状態分子内プロトン移動(ESIPT)により固体状態でも600 nm以上の波長で赤色蛍光を示すことなどがわかった。

生体物質の挙動を調べる有力な手段となる蛍光イメージングプローブ法では、600 nm以下のヘモグロビンの吸収や、1000 nm以上の水の吸収の影響を受けない650 nm900 nmの“生体の窓"と呼ばれる近赤外領域の光の利用が重要となっている。本研究では、650 nm900 nmで蛍光発光する生体用近赤外蛍光プローブの開発を計画し、幾つかの新規近赤外蛍光プローブの合成に成功した。トリプタンスリンの2-位の置換基をアミノ基からジメチルアミノ基やヒドロキシル基に置換することで、多くの溶媒中で近赤外蛍光を示す系の合成に成功している。特に、ヒドロキシル基を持つ系(或いはそのナトリウム塩)は水溶性であり、生体蛍光プローブとしての応用に適している。以上のように、研究はおおむね順調に進展していると言える。有機光化学,超分子化学2-ヒドロキシトリプタンスリンはエステル化反応で2-アセトキシトリプタンスリンにすることで細胞膜の透過性が向上し細胞内に入り、エステラーゼによりエステル結合が切れると細胞内に留まり蛍光を発する蛍光イメージングプローブとしての性質を示すことが期待できる。今後は、その様なことが実際に起こるか実験で確認するとともに、トリプタンスリン骨格を持つ近赤外蛍光色素とBODIPYなどの既存の蛍光色素とを組み合わせた系を用いてFRETのon, offなどを利用した蛍光プローブを検討していく予定である。平成25年度の研究実施計画で予定していた2-アミノトリプタンスリンを基本骨格構造とする650nm以上に蛍光極大波長を持つ幾つかの新規近赤外蛍光色素の合成に成功しており、研究はおおむね順調に進展していると言える。物品の調達方法の工夫や所属機関の校費利用などにより、当初計画よりも経費の使用が節約できたため。引き続き2-アミノトリプタンスリンを基本骨格構造とする650nm以上に蛍光極大波長を持つ新規近赤外蛍光色素の開発を進める。また、蛍光ソルバトクロミズムによる周囲の環境(極性)変化を調べる蛍光プローブとしての応用や、近赤外蛍光色素とCa(II), Na(I), K(I), Zn(II), Fe(II), Fe(III), Mn(II)等の必須金属イオンを含む各種金属イオンとの相互作用による蛍光変化、分子内に2種類の蛍光色素を含む系ではFRETのon, off挙動による蛍光変化等について検討し、金属イオン用蛍光プローブとしての性質を調べる。過度に節約することなく、翌年度分として請求した助成金と合わせて研究遂行のために適切に使用する計画である。過度に節約をすることなく、翌年度分として請求した助成金と合わせて研究遂行のために適切に使用する計画である。
抗アポトーシスタンパクＨＳＰ２７の細胞内導入法を用いた効果的な骨造成法の開発

我々は骨増成法に併用される細胞移植時の移植細胞アポトーシスを抑制する方法として抗アポトーシスタンパクHSP27の移植骨芽細胞への影響を解析した。マウス骨芽細胞を用いたin vitroの実験系においてHSP27一過性過剰発現は分化能、石灰化能に大きな変化はみられなかったが、骨芽細胞のアポトーシスを抑制した。さらに、移植細胞への影響を解析するために行ったラット頭蓋欠損部細胞移植実験では、移植細胞のアポトーシスが抑制および生存細胞中の細胞増殖マーカーの発現上昇が確認された。本研究の目的は抗アポトーシ能が期待されるHSP27を用いて、効果的な骨増生法を開発することである。第一段階として、HSP27の骨芽細胞分化に及ぼす影響を解析するためにHSP27過剰発現ベクターの構築を行った。HSP27の過剰発現により、骨芽細胞株(MC3T3-E1)においてTNF-αに誘導されるアポトーシスへの抵抗能が確認された。また骨芽細胞の増殖能をMTTアッセイにより解析したところ、HSP27の過剰発現による影響は検出されなかった。さらに骨芽細胞の石灰化能へ及ぼす影響をアリザリンレッド染色によって評価したところ、HSP27の過剰発現による影響は検出されなかった。また骨芽細胞関連遺伝子(Cbfa1/Runx2、Col1a2、Alpl)の発現において抑制が認められた。以上の結果からHSP27は骨芽細胞において抗アポトーシス能を示すものの、細胞の分化増殖には影響を及ぼさない可能性が示唆された。これらの知見を細胞移植法に応用するために、移植細胞の初期挙動についての解析を行った。温度応答性細胞培養皿上にてヒト骨由来細胞をシート状に培養し、細胞シートを免疫不全ラット(F344/NJcl-rnu)頭蓋骨骨膜下へ移植し、移植細胞の増殖能、アポトーシス並びにHSP27の発現を免疫組織化学的に評価した。移植部位において、移植後3日よりPCNA陽性細胞が認められ、5日目に最大となった。また、移植後5日には移植部への血管の侵入が認められた。移植細胞のアポトーシスはTUNEL染色にて評価した。移植細胞のTUNEL陽性細胞率は移植後3日に最大となった。更に、移植細胞ではHSP27の産生が認められ、移植3日後に最大となり、その後産生は低下した。以上の結果より、一定数の移植細胞がアポトーシスによって失われていること、初期の移植細胞においてHSP27の発現の更新が認められることが明らかとなった。前年度に、第一段階として、HSP27の骨芽細胞分化に及ぼす影響を解析を行い、HSP27は骨芽細胞において抗アポトーシス能を示すものの、細胞の分化増殖には影響を及ぼさない可能性が示唆された。今年度は、さらに、HSP27過剰発現骨芽細胞のラット頭蓋骨欠損部への移植野におけるアポトーシスをTUNEL染色にて検出したところ、3および7日後においてはHSP27過剰発現によりTUNEL陽性細胞率が有意に減少していた。細胞増殖能を示すPCNA陽性細胞率は移植7日後においてHSP27過剰発現細胞が有意に高値を示した。しかしながら、移植4, 6週後の移植野における新生骨量をマイクロCTにて解析したところ、両群間において有意差は認められなかった。本研究では抗アポトーシス遺伝子であるHSP27を移植骨芽細胞に導入して、より効果的な骨増成を期する試みを行ったが、細胞の生存率は向上したものの、最終的な新生骨量に変化は見られなかった。骨形成能を有する細胞の移植は盛んに試みられているものの、本研究結果でも見られるように、その効果については依然として議論が分かれるところである。移植細胞の生存率を改善することによる効率的な骨増成を今後臨床応用に直接結び付けるためには、より長期的な解析と、骨形成の場における移植細胞の直接的な寄与についても検討することが必要であろう。本研究の目的は抗アポトーシスタンパクHSP27をPTD法を用いて骨芽細胞に安全に導入し、効果的な骨増生法を開発することである。マウス頭蓋冠由来細胞株(MC3T3-E1,subclone4)を分化培地にて分化誘導し、骨芽細胞分化過程におけるHSP27の発現を解析した。石灰化起点とHSP27遺伝子発現の上昇に相関が認められ、骨芽細胞分化への寄与が強く示唆された。更に一過性過剰発現ベクター(pCMV-SPORT6-HSP27)を用い、骨芽細胞における細胞増殖能、骨芽細胞関連遺伝子発現、TNF-α誘導アポトーシスへの影響について解析を行った。HSP27の過剰発現により細胞増殖能に変化は認められなかったが、骨芽細胞関連遺伝子であるCbfa1/Runx2、Col1a2、Alpl、Opnの発現抑制が観察された。

さらに石灰化能は抑制され、TNF-αに誘導されるアポトーシスのに対しては抵抗能が認められた。以上の結果より、骨芽細胞におけるHSP27の過剰発現は、抗アポトーシス作用を示すも、骨芽細胞への分化を抑制する事から、移植初期には有効であるが、長期的な骨増生にはネガティブ抑制的に作用する可能性が示唆された。更に細胞の移植条件を検討する為に、骨芽細胞をコラーゲン溶液、β-TCP顆粒と混合し、ラット皮下に移植を行った。移植1日後では、ある程度の移植細胞の生存が確認されたが、移植3日後、7日後では移植細胞の生存はほとんど確認されず、観察された細胞の大部分は炎症性細胞であった。移植細胞の生着率と骨増生能の相関についてはこれを裏付ける基礎的データが依然として欠如していることから、HSP27の骨芽細胞に及ぼす影響の解析と並行して移植条件とその評価法についての検討が必要である。当初の予定通り、HSP27が骨芽細胞に及ぼす影響の解析は順調に進んでいる。また上述の通り一定の成果を上げている。HSP27過剰発現・骨芽細胞の抗アポトーシス能、石灰化能への影響の解析についてはおおむね順調に進んでおり、現段階では移植条件の検討を行なっている。H24年度までは、HSP27が骨芽細胞に及ぼす影響について、一過性過剰発現ベクターを用いてその影響の解析を行った。しかしながら一過性過剰発現ベクターの効果が約7日程度であるのに対し骨芽細胞の分化、石灰化には3ー4週間を要する。このために実験の後期では過剰発現の状態は維持されていない。従って現在、恒常性発現ベクターの構築を行い、その解析を進めているところである。さらにHSP27過剰発現細胞の抗アポトーシス能、石灰化能への影響を動物実験にて行う予定である。更に、PTD法を用いて導入するHSP27タンパクの精製についての準備を進めている。HSP27が骨増生に対して抑制的に働く可能性があることから、細胞への導入時期、期間の検討が必要である。移植初期の短期間に導入する方法について検討を行なっている。骨芽細胞の移植条件の検討を行なっているが、更に移植細胞の生着率と骨増生能との相関についてはこれを裏付ける基礎的データが欠如していることから、これについても意欲的に並行して取り組んでいる。PTD法を用いて導入するHSP27タンパクの精製のため、実験動物の購入および薬品(抗体・酵素・試薬)、ガラス・プラスチック器具に前年度未使用研究費を含めて使用する計画である。移植条件の検討のため、実験動物の購入および薬品(抗体・酵素・試薬)、ガラス・プラスチック器具に前年度未使用研究費を含めて使用する計画である。
Fast Graph Algorithms for Phylogenetics

本研究では、同意木の中でもよく使われる、過半数に基づく同意木、緩やかな同意木、貪欲同意木、頻度差同意木、アダムス同意木、R*同意木と2種類の局地同意木に関して高速アルゴリズムを構築した。上記のうちのいくつかは、数十年ぶりに改善に成功したものである。次に、いくつかの基礎的な合成木問題の計算複雑さを示し、NP困難性を示す派生問題に対し近似アルゴリズムを設計した。ふたつの進化系統樹に対する根付き三つ組を計算するための、高速かつメモリ効率的な重心道に基づくアルゴリズムを示した。最後に、閉路が互いに素な進化系統ネットワークであるゴールド木間の根付き三つ組距離を高速に計算する手法を示した。