hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓血管系ノックアウトマウス(HESR)における心疾患発症機構の解明と心機能評価

ノックアウトマウスが遺伝子疾患モデルとなり、生体におけるある遺伝子機能の欠損が生体内で導かれる影響を明らかにできることは、疾病に至る作用機序の理解にとどまらず、製薬や治療への応用を可能にすることが確信されている。このことから本研究は多大な社会的貢献が期待できると考えている。本研究開始時にはbabyマウスの心電図測定にも難渋し「マウスの心電図計測方法-生後5日目のbabyからadultまで」(呼と循、2004年)たが、これ以降はエコー検査時の心電図計測が順調に行えるようになった。ところが心電図を心不全の経過観察のために用いるために再度工夫が必要になり、2つの方法を考えた。(1)のるだけ心電図(マウスが無麻酔で、心電図電極の上に載り、短時間のうちに心電図計測できるシステム)、(2)テレメトリーでの図を計測(マウスの皮下に送信機を植え込み、無線で送り、受信機で受信する)装置を検討した。(1)は健康マウスで試作器を試したところ心拍が420bpmあり、しかも筋電図を拾い、さらにノイズが多かった。(2)無線で受信できたが、マウス体内には植え込むにはまだ改良が必要であった。本年度はマウスの基本的な心電図の評価方法を確立することが可能であった。本研究では心疾患症機構の解明と心機能評価を目的としたが、今後も研究を続けたい。血管の形成されない動物は生存できない。そのため心臓血管領域におけるノックアウトマウスの大多数は致死的であり、成体まで生き延びるものは珍しい。hesr遺伝子群はNotchシグナル伝達系の標的遺伝子であり転写因子であるhairy and E(spl)遺伝子群のサブファミリーである。心臓形成過程においてhesrノックアウトマウスにおける心奇形は右心系に限局し、心房に発現するhesr1および心室に発現するhesr2がある。本マウスは生存・生殖可能で成体になることがあるため、経時的に心機能評価が可能であることに注目し、本研究を計画した。解剖学的には心不全で死亡した本ノックアウトマウスの剖検では著明な右房および右室肥大があった。まず非侵襲的に行うことが可能であるエコー検査をPMS社製エコー診断装置HDI-5000 Sono CT XRESに小型高性能プローブCL15-7 high frequency linear probeを用いて、心疾患の診断を生後5日目のbabyマウスで行った。三尖弁狭窄症、心室中隔欠損症などが診断された。また、心臓は長軸方向に7mmしかなかったが、左室流入路および左室流出路を描出することが可能であった。エコー検査後に試料を採取し、剖検により診断した。エコー検査時にbabyマウスの心拍は500bpm以上有り、エコーゼリーの加温を含め、体温の維持に苦労した。本年度はbabyマウスの心疾患の診断および心機能評価を中心に行うこととなった。心臓血管領域におけるノックアウトマウスの大多数は致死的であり、成体まで生き延びるものは珍しい。なぜなら血管の形成されない動物は生存できないからである。本マウスは生存・生殖可能で成体になることがあるため、経時的に心機能評価が可能であることに注目した。解剖学的には心不全で死亡した本ノックアウトマウスには著明な右房および右室肥大があった。非侵襲的にエコー検査をPMS社製エコー診断装置HDI-5000 Sono CT XRESに小型高性能プローブCL15-7 high frequency linear probeを用いて行った。

さらにラットを用い満期の母胎から帝王切開で正常babyラット(約5.5g)を得て、生後15分後にPDAの描出を試みたところ、良好に描出され、下行大動脈からPDAに血液が流れ込むところがとらえられた。また、エコー検査後に試料を採取し、樹脂(マイクロフィル)を注入し、周囲の組織を透明化したところPDAが下行大動脈側から収縮している様子が観察できた。また、樹脂の粘度が低く、柔らかいため、細い左右の冠動脈の走行まで観察することが可能であった。ノックアウトマウスが遺伝子疾患モデルとなり、生体におけるある遺伝子機能の欠損が生体内で導かれる影響を明らかにできることは、疾病に至る作用機序の理解にとどまらず、製薬や治療への応用を可能にすることが確信されている。このことから本研究は多大な社会的貢献が期待できると考えている。本研究開始時にはbabyマウスの心電図測定にも難渋し「マウスの心電図計測方法-生後5日目のbabyからadultまで」(呼と循、2004年)たが、これ以降はエコー検査時の心電図計測が順調に行えるようになった。ところが心電図を心不全の経過観察のために用いるために再度工夫が必要になり、2つの方法を考えた。(1)のるだけ心電図(マウスが無麻酔で、心電図電極の上に載り、短時間のうちに心電図計測できるシステム)、(2)テレメトリーでの図を計測(マウスの皮下に送信機を植え込み、無線で送り、受信機で受信する)装置を検討した。(1)は健康マウスで試作器を試したところ心拍が420bpmあり、しかも筋電図を拾い、さらにノイズが多かった。(2)無線で受信できたが、マウス体内には植え込むにはまだ改良が必要であった。本年度はマウスの基本的な心電図の評価方法を確立することが可能であった。本研究では心疾患症機構の解明と心機能評価を目的としたが、今後も研究を続けたい。
日本産野生ギク遺伝資源の評価と利用に関する研究

わが国に自生する園芸的に重要な野生キクについて基本的生育特性を調査し、分枝の発達する位置と長さにより種独特の草姿が決定されることを明らかとした。日長反応では、総ての種で12時間以下の日長でのみ開花する秋ギクタイプの種であった。開花に必要な最低夜温により、10°C以上のいずれの温度でも開花するグループ、15°C以上で開花するグループ、20°C以上でのみ開花するグループに分けられた。また、花芽分化過程を走査型電子顕微鏡で観察したところ、いずれの種も頭状花序の発達過程はよく似ていたが、小花の分化過程は種によって異なった。野生ギクと栽培ギクの正逆交雑を検討したところ、キクタニギクを除く総ての交配で種子が得られた。雑種第1代の実生個体について開花反応を調査したところ、子房親の夏秋ギクの持つ長い限界日長という性質は、容易に野生ギクとの後代に伝わった。ナカガワノギクの分布域は1950年代に報告されたものと基本的に一致したが、周辺環境の変化によりかなり狭くなっていた。現地から採取された36系統を自然条件下で栽培したところ、草姿、葉形、花形、開花期等に大きな種内変異が認められた。大型の草姿を示す系統は倍加した系統であった。また葉緑体DNAのPCR-RFLP解析により自生地植物集団の中に多型が存在する事が明らかとなった。わが国に自生する園芸的に重要と考えられる野生ギク(アシズリノジギク、ナカガワノギク、サツマノギク、リュウノウギク、キクタニギク、シマカンギク、イソギク以上7種)について、自然日長下で栽培し基本的生育特性を調査した。分枝の発達する位置と長さにより種独特の草姿が決定されることが明らかとなった。次に開花に対する日長、温度反応を調査した。25°Cファイトトロンで10、12、14時間日長を与えたところ、総ての種で12時間以下の日長で開花し、14時間では発蕾が著しく遅れ開花しなかった。また、10月より最低夜温10、15、20°Cに設定したハウス内で自然日長を与えたところ、10°C以上のいずれの温度でも開花するグループ、15°C以上で開花するグループ、20°C以上でのみ開花するグループに分けられた。また、自然日長下の花芽分化過程を走査型電子顕微鏡で観察したところ、いずれの種も頭状花序の発達過程はよく似ていた。また小花の分化過程では、種によって花筒の頂部を閉じる前に雄ずいを分化するタイプと花筒の頂部が閉じた後に雄ずいを分化するタイプに大別できた。スプレー系栽培ギクを子房親として野生種7種との交配を試みたところ、キクタニギクを除く6種との間で交雑種子が得られた。ナカガワノギクについて自生地の分布調査を行った。分布域は1950年代に報告されたものと基本的に一致したが、周辺環境の変化によりかなり狭くなっていることが明らかとなった。園芸的に重要な野生ギク(アシズリノジギク、ナカガワノギク、サッマノギク、リュウノウギク、キクタニギク、シマカンギク、イソギク、チョウセンノギク、コハマギク、オオシマノジギク)と栽培ギクの秋ギクタイプ`スプリングソング'および夏秋ギクタイプ`マミー'を用いて、正逆交雑を検討した。キクタニギクを除く総ての交配で種子が得られた。キクタニギクを花粉親としてスプリングソングに交配した場合に少数の種子が得られたが、子房親として場合には種子は得られなかった。次にここで得られた雑種第1代の実生個体について開花反応を調査した。

冬季に播種し以後電照下2回ピンチの上挿し芽苗を7月1日に圃場へ定植すると、全体としてマミーの後代はスプリングソングの後代に比べて早期に開花し、夏秋ギクの持つ長い限界日長という性質は、容易に野生ギクとの後代に伝わった。また、わが国の夏期の高温時に短日処理すると開花遅延するアシズリノジギクと開花遅延の少ないシマカンギク、ナカガワノギクの後代を6月20日及び9月5日から10時間の短日を与えて比較したところ、いずれもマミーの後代の方が開花が早く、アシズリノジギクの後代では9月より短日処理でかなりの個体がロゼット化した。また西南暖地の栽培では開花が不安定なチョウセンノギク、コハマギクとマミーの後代を20°Cファイトトロンで栽培し、日長の最も長い6月に電照を打ち切ると両種の後代ともに多くの個体は発蕾にいたらなかった。前年までに集められた36系統のナカガワノギクの内、大型の草姿を示す3系統の染色体数は72であり、他はすべて36であった。葉の形態観察およびフローサイトメータのデータからもこれら大型系統は倍加した系統と考えられた。集められた36系統のナカガワノギクの全DNAをCTAB法により抽出、PCRにより葉緑体DNAの2つの既知領域すなわち、abcL-ORF106とtranK領域を増幅した。いずれも期待された大きさの断片が増幅された。このPCR産物を16種類の制限酵素処理したところ、rbcL-ORF106領域ではいずれの制限酵素処理でも多型は見られなかった。一方tranK領域をDra IとScrf Iで処理したとき多型が出現し、全系統をA、B2つのタイプに大別できた。このAタイプは他の研究で、栽培ギクに広く認められる多型であった。改めて那賀川流域の5カ所から150系統の葉を採取し、同様のPCR-RFLP解析を行った。5箇所の内1カ所で30個体中14個体がAタイプを示し、他は総てBタイプであった。以上の結果、ナカガワノギクの自生地集団の中に葉緑体DNAのPCR-RFLP解析による多型が存在する事が明らかとなった。
電位依存性カルシウムチャネルとリアノジン受容体の蛋白蛋白相互作用の研究

骨格筋において細胞膜の電位依存性L型カルシウムチャネル(ジヒドロピリジン受容体DHPR)と筋小胞体のリアノジン受容体は興奮収縮連関の中心的機能を果たしている。この2つの分子は蛋白どうしが結合して情報伝達を行っていると考えられているがその分子機構は明らかになっていない。この実験の目的はYeast two hybrid systemを用いて、L型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の物理的な蛋白蛋白結合を明らかにすることで、平成9年度はL型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の蛋白蛋白結合実験を行ない、平成10年度は骨格筋よりcDNAライブラリーを作製し、DHPRと結合する新たなタンパク質の検索を行った。平成9年度:以前の実験から結合部位を予想し、DHPRα1sのアミノ酸番号719-767をもつDNA結合ドメインプラスミドs53と骨格筋型(RyR-1)および心筋型(RyR-2)リアノジン受容体の一部をアクチベータードメインに持つプラスミドsR16(RyR1の1837-2168)とcR16(RyR-2の1817-2142)を作製し、ヒスチジン欠損培地でYeastを培養したところ、sR16とs53の両方を持つYeastのみコロニーの発育が認められた。しかし、β-galactoshidase活性の測定ではいずれの組み合わせでも活性は認められなかった。栄養要求性実験とβ-galactoshidase活性の測定で食い違いがあり、DHPRとリアノジン受容体のあいだの物理的な結合を証明することはできなかった。平成10年度:DHPRのN末、I-IIループ、II-IIIループ、III-IVループ、C末の配列を組み込んだ5つのDNA結合ドメインプラスミド作製し、アクチベータードメインプラスミドには骨格筋のcDNAライブラリーを組み込み、両者の間で相互作用がおこるcDNAの単離を行った。その結果、I-IIループと結合するcDNAとして電位依存性カルシウムチャネルのベータサブユニットが単離された。またN末、II-IIIループ、III-IVループと結合するcDNAは単離できなかったが、C末と結合するcDNAとしてトロポニンTを単離した。興奮収縮連関におけるトロポニンTの生理的意義は明らかではないが、トロポニンTがイオンチャネルの局在化に関係している可能性が示唆された。電位依存性L型カルシウムチャネル(DHPR)とリアノジン受容体(カルシウム放出チャネル)はどちらも骨格筋の興奮収縮連関において必須の分子である。先に我々はL型カルシウムチャネルとリアノジン受容体が相互に情報交換を行っていることを明かにした。現在、L型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の機能的カップリングのメカニズムは蛋白分子どうしの直接結合が推定されているが、L型カルシウムチャネルとシアノジン受容体が直接結合しているのか、介在蛋白を会してこの2つの分子が結合しているのか、明らかにされていない。この実験の目的はYeast two-hybrid systemを用いて、L型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の物理的な蛋白蛋白結合を明かにすることである。

キメラDHPRを用いた実験から予想される結合部位を含むDNA結合ドメインプラスミドs53(DHPRα1s:アミノ酸番号719-767)と、キメラリアノジン受容体を用いた生理学的な実験から予想される結合部位sR16(RyR-1:1837-2168),とそのRyR-2の一致する部位cR16(RyR-2:1817-2142)を含むアクチベータ-ドメインプラスミドを作製した。s53,sR16,cR16はいずれも単独ではヒスチジン欠損倍地で発育しなかった。cR16とs53の組み合わせでもヒスチジン欠損倍地で発育しなかったが、sR16とs53の両方をもつYeastはヒスチジン欠損倍地でコロニーの発育が認められた。しかしb-galactosidase活性の測定ではいずれの組み合わせでも活性を認めなかった。骨格筋において細胞膜の電位依存性L型カルシウムチャネル(ジヒドロピリジン受容体DHPR)と筋小胞体のリアノジン受容体は興奮収縮連関の中心的機能を果たしている。この2つの分子は蛋白どうしが結合して情報伝達を行っていると考えられているが、その結合はL型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の直接結合によるものなのか、介在蛋白を介した結合なのか、その分子機構は明らかになっていない。この実験の目的はYeasttwohybridsystemを用いて、L型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の物理的な蛋白蛋白結合を明らかにすることである。平成9年度はL型カルシウムチャネルとリアノジン受容体の蛋白蛋白結合実験を行ったが、平成10年度は骨格筋よりcDNAライブラリーを作製し、DHPRの細胞内ループと結合する新たなタンパク質の検索を行った。実験はYeast two hybrid systemを用いてDHPRのN末、I-IIループ、II-IIIループ、III-IVループ、C末の配列を組み込んだ5つのDNA結合ドメインプラスミド作製し、アクチベータードメインプラスミドには骨格筋のcDNAライブラリーを組み込み、両者の間で相互作用がおこるcDNAの単離を行った。その結果、I-IIループと結合するcDNAとして電位依存性カルシウムチャネルのベータサブユニットが単離された。これは報告されている結果と一致し、Yeast two hybrid systemが正しく機能していることを示していた。N末、II-IIループ、III-IVループと結合するcDNAは単離できなかったが、c末と結合するcDNAとしてトロポニンTを単離した。以上の結果から新たにトロポニンTがDHPRのC末と結合することを見いだした。興奮収縮連関におけるトロポニンTの生理的意義は明らかではないが、トロポニンTがイオンチャネルの局在化に関係している可能性が示唆された。
ＴＲＰＣチャネルタンパク複合体形成の生理的意義の解明

前年度までに,横行大動脈を狭窄(TAC)を行うことにより心重量の増加に伴った線維化がTRPC3欠損によって顕著に抑制されることを示している.低分子量Gタンパク質RhoAの活性化は心臓の線維化シグナルの中心的役割を担う.TAC1週間後のマウス心臓および機械的伸展刺激を与えたラット心筋細胞でRhoAの強い活性化が確認され,これらはTRPC3阻害により有意に抑制された.RhoAはRho guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs)により活性化される.TAC1週間後の心臓および機械的伸展刺激を与えた心筋細胞において,RhoGEFsの一つであるGEF-H1がTRPC3依存的に活性化し,GEF-H1依存的な心臓の線維化応答が誘導された.興味深いことに,GEF-H1の活性化はNADPHoxidase (Nox)の発現抑制により抑制された.ラット新生児心筋細胞に機械伸展刺激を与えるとTRPC3依存的なスーパーオキシド産生が確認された.Noxは心不全時に発現量が増加し,酸化ストレスを惹起する.Nox2は同じ膜タンパク質あるp22phoxとヘテロ二量体を形成している.培養細胞に共発現させた免疫沈降法の実験から,TRPC3はNox2, p22phoxと複合体を形成した.Nox2とp22phoxの結合は互いのタンパク質の安定化に必要である.TAC1週間後においてNox2のタンパク質発現は顕著に増加していた.このNox2の発現上昇はTRPC3欠損群で顕著に抑制された.mRNAもTAC1週間後に増加したが,TRPC3欠損群で抑制されなかった.以上の結果から,TRPC3はp22phox/Nox2と複合体を形成することで,Nox2依存的な活性酸素種シグナルを介して線維化を誘導することを初めて明らかにした.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。TRPCチャネル群が複合体を形成する意義をシグナル伝達の観点から明らかにすることで,心臓におけるTRPCチャネルの生理的役割を確立する」ことを目的とし,平成24年度は以下の実験を行った.(1)アミノ酸に対するTRPCチャネル活性化の特異性・選択性の決定ラット新生児心筋細胞および心線維芽細胞に対し,全アミノ酸の混合液刺激を行ったところ,pH6.4以下の溶液中においてTRPC3/6依存的なCa^<2+>応答が観察された.また,TRPC3およびTRPC6欠損マウスの心臓ではアミノ酸シグナルのひとつであるオートファジーが亢進していることが明らかとなった.(2)TRPC3およびTRPC6欠損マウスを用いたマイクロアレイ解析およびメタボローム解析TRPC3およびTRPC6欠損マウスの心臓および腎臓を用いて,マイクロアレイ解析を行った.すると,2型糖尿病に関与する遺伝子の心臓における発現レベルがTRPC6欠損マウスにおいて増加し,TRPC3欠損マウスにおいて低下していることが明らかとなった.また,それぞれの欠損マウスの血液・尿サンプルを用いてメタボローム解析を行った.血中ではTRPC3欠損およびTRPC6欠損マウスにおいてトリグリセロール,グルコース量,アンジオテンシン量がWTに比べて低下していた.尿では,TRPC3欠損およびTRPC6欠損マウスにおいて尿中-N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ量が有意に低下していた.(3)糖尿病性心筋症に対するTRPC3/6の関与ラット新生児心筋細胞に対して高濃度グルコース刺激を行ったところ,高濃度グルコース刺激によるAktの継続的な活性化がTRPCの阻害剤により抑制された.このことより,TRPCがグルコース代謝に影響を与えていることが示唆された.そこで,ストレプトゾトシンを用いて高血糖モデルを作成したところ,TRPC6欠損マウスにおいて糖尿病性心筋症による有意な心機能低下および,TRPC3欠損マウスにおいて心機能低下の抑制が観察された.「TRPCチャネル群が複合体を形成する意義をシグナル伝達の観点から明らかにすることで,心臓におけるTRPCチャネルの生理的役割を確立する」ことを目的とし,平成25年度は以下の実験を行った.1TRPC3またはTRPC6欠損マウス心不全モデルの機能解析TRPC3またはTRPC6欠損マウスを用いて横行大動脈狭窄モデルを作成し,心不全モデルを作成した.作成後,毎週,心エコー法により心形態の観察, 6週間後に心臓カテーテルを用いた血行動態の観察により心機能を測定した, TRPC3およびTRPC6欠損の両群において野生型に比べ,横行大動脈狭窄による心機能低下を改善した.さらに,組織切片を作成し,心筋細胞面積およびコラーゲンの蓄積を観察した結果,心肥大は抑制すること無く間質の線維化をTRPC3またはTRPC6欠損で抑制されていることが観察された.2TRPC3活性化による心線維化誘導のメカニズム解明ラット新生児心筋細胞を用いた検討から,メカニカルストレッチ下において線維化シグナルに重要な役割を果す低分子量Gタンパク質RhoAが活性化を介して心線維化のマーカー遺伝子群の発現を誘導していることがわかった.メカニカルストレッチによるRhoAの活性化はTRPC3選択的阻害剤により抑制されたことから, TRPC3の活性化依存的に心線維化が誘導されることが示唆された.3成獣マウス心筋細胞単離の系の確立ならびに, TRPC3およびTRPC6の局在確認成獣マウスの心筋細胞をコラゲナーゼ灌流法により単離する方法を確立した.

単離した成獣マウス心筋細胞を用いて, TRPC3およびTRPC6の心筋細胞における局在を観察したところ,共にT管に局在していることが観察された.前年度までに,横行大動脈を狭窄(TAC)を行うことにより心重量の増加に伴った線維化がTRPC3欠損によって顕著に抑制されることを示している.低分子量Gタンパク質RhoAの活性化は心臓の線維化シグナルの中心的役割を担う.TAC1週間後のマウス心臓および機械的伸展刺激を与えたラット心筋細胞でRhoAの強い活性化が確認され,これらはTRPC3阻害により有意に抑制された.RhoAはRho guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs)により活性化される.TAC1週間後の心臓および機械的伸展刺激を与えた心筋細胞において,RhoGEFsの一つであるGEF-H1がTRPC3依存的に活性化し,GEF-H1依存的な心臓の線維化応答が誘導された.興味深いことに,GEF-H1の活性化はNADPHoxidase (Nox)の発現抑制により抑制された.ラット新生児心筋細胞に機械伸展刺激を与えるとTRPC3依存的なスーパーオキシド産生が確認された.Noxは心不全時に発現量が増加し,酸化ストレスを惹起する.Nox2は同じ膜タンパク質あるp22phoxとヘテロ二量体を形成している.培養細胞に共発現させた免疫沈降法の実験から,TRPC3はNox2, p22phoxと複合体を形成した.Nox2とp22phoxの結合は互いのタンパク質の安定化に必要である.TAC1週間後においてNox2のタンパク質発現は顕著に増加していた.このNox2の発現上昇はTRPC3欠損群で顕著に抑制された.mRNAもTAC1週間後に増加したが,TRPC3欠損群で抑制されなかった.以上の結果から,TRPC3はp22phox/Nox2と複合体を形成することで,Nox2依存的な活性酸素種シグナルを介して線維化を誘導することを初めて明らかにした.26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は特に実験モデル構築および基礎データ取得(時間経過や濃度依存性の確認),スクリーニングによる新たな知見の創出に専念した.その結果,アミノ酸シグナルにおけるTRPCチャネルの重要性については,遺伝子欠損マウスを用いて新たな生理現象を見出し,また,グルコース代謝機構における重要性の予備的データも得ているため.TRPC欠損マウスを用いた心不全モデルを作成し,その機能評価や心臓リモデリングに対するTRPCチャネルの関与メカニズムを調べることを本年度の目的としていたが,その全てが達成されているので,概ね順調に研究は進展していると評価できる.26年度が最終年度であるため、記入しない。TRPCチャネルの生理的な役割については予備的であるが新たな現象を見出しつつある.しかし,TRPCチャネルを甲心とした複合体形成がその生理作用に及ぼすの役割については今後さらなる検討が必要である.また,当初予想していたアミノ酸感受性については,個々のアミノ酸に対する応答性についての知見はまだ得ていないものの,グルコース代謝機構という新たな側面も見えてきた.
口腔と咽頭をつなぐ三叉神経傍核が咀嚼嚥下に果たす役割

本研究は三叉神経傍核が咀嚼嚥下に果たす役割を明らかにすることを目的とし,30年度は自然刺激嚥下の1つである機械刺激誘発嚥下の神経機序の解明を行った.実験には,6-9週齢のSD系雄性ラットを用いた.左側舌骨上筋および左側甲状舌骨筋に係留したワイヤー電極より筋活動電位を導出し,嚥下を同定した.また気管圧および食道入口部圧を同時計測し,それぞれ呼吸と嚥下圧の指標とした.喉頭(披裂間切痕)への機械刺激により誘発された嚥下閾値は,口腔(軟口蓋)および気管と比較して有意に低く,機械刺激に対して喉頭が鋭敏に嚥下を誘発することが確認された.さらに,喉頭に対する強い機械刺激の繰り返しによる嚥下応答低下(脱感作)は,弱い刺激と比較して容易に生じた.また,神経切断実験から,1上喉頭神経2舌咽神経3迷走神経咽頭枝4反回神経の4つが喉頭への機械刺激誘発嚥下に関与することが示され,特に上喉頭神経が主要な役割を果たしていることが示唆された.神経薬理学的実験から,上皮型ナトリウムイオンチャネル(ENaC)の阻害は機械刺激誘発嚥下を抑制し,化学・電気刺激誘発嚥下には影響ないことが確認された.一方,酸感受性イオンチャネルの阻害では機械刺激誘発嚥下の抑制効果は認められなかった.以上より,機械刺激誘発嚥下の応答特性および関連する末梢神経の同定に成功し,さらにENaCが標的受容体の1つであると考えられた.今後は,本研究で用いた刺激様式を使用して,咀嚼嚥下モデル動物を対象とした実験を行っていく予定である.今年度は本研究課題に関連する神経機構の解明に成功した.本成果は,今後の実験の考察を深めることにつながると考えられる.今後は咀嚼嚥下モデル動物を用いて,三叉神経傍核(Pa5)への微小圧注出法を行っていく.咀嚼嚥下モデル動物を用いてPa5への薬物の微量注入を行い,Pa5が咀嚼嚥下に果たす役割の検証を行っていく.本研究は三叉神経傍核が咀嚼嚥下に果たす役割を明らかにすることを目的とし,29年度は三叉神経傍核が嚥下に及ぼす影響の検証を行った.実験には,7週齢のSD系雄性ラットを用いた.左側舌骨上筋および左側甲状舌骨筋に係留したワイヤー電極より筋活動電位を導出し,嚥下を同定した.また気管にカニューレを留置し,気流圧を記録することにより,呼吸サイクルを計測した.孤束核(nTS)および三叉神経傍核(Pa5)へグルタミン酸,GABA,グリシン関連薬剤を微小圧注出法により注入し,嚥下誘発効果を検証した.nTSにおいては,グルタミン酸受容体アゴニストであるNMDAおよびAMPA,GABAA受容体選択的アンタゴニストであるビククリンを注入した際に嚥下誘発が確認されたが,GABAB受容体選択的アンタゴニストであるCGP55845,グリシン受容体アンタゴニストであるストリキニーネでは,嚥下誘発効果を認めなかった.特にNMDAおよびAMPAにおいて,短潜時で嚥下が誘発されたことは,迷走神経および舌咽神経から孤束核内へグルタミン酸が放出され嚥下を誘発するという我々の仮説を支持する結果となった.一方,三叉神経傍核においては,NMDA,AMPA,ビククリン,CGP55845,ストリキニーネのいずれにおいても嚥下誘発効果を示さなかった.以上のように,今年度はnTSおよびPa5をターゲットとして,グルタミン酸,GABA,グリシン関連薬剤の嚥下誘発効果を検証した.今後は,咀嚼嚥下モデル動物を対象として,実験を行っていく予定である.今年度は孤束核および三叉神経傍核へのグルタミン酸,GABA,グリシン関連薬剤の注入による嚥下誘発効の検証に成功した.今後,同様の手法により研究を進めていくことが可能と考えられる.本研究は三叉神経傍核が咀嚼嚥下に果たす役割を明らかにすることを目的とし,30年度は自然刺激嚥下の1つである機械刺激誘発嚥下の神経機序の解明を行った.実験には,6-9週齢のSD系雄性ラットを用いた.左側舌骨上筋および左側甲状舌骨筋に係留したワイヤー電極より筋活動電位を導出し,嚥下を同定した.また気管圧および食道入口部圧を同時計測し,それぞれ呼吸と嚥下圧の指標とした.喉頭(披裂間切痕)への機械刺激により誘発された嚥下閾値は,口腔(軟口蓋)および気管と比較して有意に低く,機械刺激に対して喉頭が鋭敏に嚥下を誘発することが確認された.さらに,喉頭に対する強い機械刺激の繰り返しによる嚥下応答低下(脱感作)は,弱い刺激と比較して容易に生じた.また,神経切断実験から,1上喉頭神経2舌咽神経3迷走神経咽頭枝

4反回神経の4つが喉頭への機械刺激誘発嚥下に関与することが示され,特に上喉頭神経が主要な役割を果たしていることが示唆された.神経薬理学的実験から,上皮型ナトリウムイオンチャネル(ENaC)の阻害は機械刺激誘発嚥下を抑制し,化学・電気刺激誘発嚥下には影響ないことが確認された.一方,酸感受性イオンチャネルの阻害では機械刺激誘発嚥下の抑制効果は認められなかった.以上より,機械刺激誘発嚥下の応答特性および関連する末梢神経の同定に成功し,さらにENaCが標的受容体の1つであると考えられた.今後は,本研究で用いた刺激様式を使用して,咀嚼嚥下モデル動物を対象とした実験を行っていく予定である.今年度は本研究課題に関連する神経機構の解明に成功した.本成果は,今後の実験の考察を深めることにつながると考えられる.今後は咀嚼嚥下モデル動物を用いて,三叉神経傍核(Pa5)への微小圧注出法を行っていく.咀嚼嚥下モデル動物を用いて孤束核および三叉神経傍核への薬物の微量注入を行い,三叉神経傍核が咀嚼嚥下に果たす役割の検証をしていく.咀嚼嚥下モデル動物を用いてPa5への薬物の微量注入を行い,Pa5が咀嚼嚥下に果たす役割の検証を行っていく.(理由)実験計画の見直しにより,購入予定だった備品のいくつかが不要となったため.(使用計画)次年度の動物購入にあて,多くのデータ収集を行う.(理由)購入予定だった備品の多くが不要となったため.(使用計画)次年度の動物購入にあて,多くのデータ収集を行う.
投影型同位体イメージングによる細粒ＣＡＩの鉱物アイソクロン

細粒CAIの鉱物アイソクロンを求めるために必要な投影型二次イオン質量分析装置とイオンイメージセンサを用いた投影型同位体イメージングと高速なイオンイメージセンサの開発を行った.Mg存在度の大きく異なる複数鉱物を同一視野に含むMg同位体イメージの取得および150枚/秒でのイメージセンサの駆動に成功した.隕石中の難揮発性包有物(Ca-Al-rich Inclusion, CAI)は,太陽系で最も古い年代を示す岩石である.中でも結晶サイズの小さい細粒CAIは,原始太陽系星雲ガスから直接凝縮し,ある種の粗粒CAIの前駆体であったと考えられており,ほぼ全てが16Oに富む同位体異常を持つ.しかし,細粒CAIはミクロンオーダー以下の元素組成が大きく異なる鉱物が複雑に入り組んだノジュールを形成しており,鉱物アイソクロンを得るのは困難である.さらに,各鉱物のサイズが小さいために変質を受けやすく,隙間に二次変質鉱物が多く存在することが事態を一層複雑にしている.本研究では,革新的な新開発イオンイメージセンサを用いて,投影型同位体イメージングにより細粒な難揮発性包有物(CAI)のAl-Mg年代を鉱物アイソクロンから求めることを目的とした.2013年に北大で行われたワークショップCosmochemical perspective on the early evolution of the solar systemにおいて,24Mg, 25Mg, 26Mg, 27Alのイメージを取得するAl-Mgイメージング分析のデモンストレーションを行い結果を発表した.細粒CAIの鉱物アイソクロンを求めるために必要な投影型二次イオン質量分析装置とイオンイメージセンサを用いた投影型同位体イメージングと高速なイオンイメージセンサの開発を行った.Mg存在度の大きく異なる複数鉱物を同一視野に含むMg同位体イメージの取得および150枚/秒でのイメージセンサの駆動に成功した.隕石中の難揮発性包有物(Ca-Al-rich Inclusion, CAI)は,太陽系で最も古い年代を示す岩石である.中でも結晶サイズの小さい細粒C AIは,原始太陽系星雲ガスから直接凝縮し,ある種の粗粒CAIの前駆体であったと考えられており,ほぼ全てが16Oに富む同位体異常を持つ.しかし,細粒CAIはミクロンオーダー以下の元素組成が大きく異なる鉱物が複雑に入り組んだノジュールを形成しており,鉱物アイソクロンを得るのは困難である.さらに,各鉱物のサイズが小さいために変質を受けやすく,隙間に二次変質鉱物が多く存在することが事態を一層複雑にしている.本研究では,革新的な新開発イオンイメージセンサを用いて,投影型同位体イメージングにより細粒な難揮発性包有物(CAI)のAl-Mg年代を鉱物アイソクロンから求めることを目的としている.本年度は以下を実施した.(1)ターゲットとする粗粒CAI,細粒CAIを電界放出型電子顕微鏡により観察し元素マップを取得した.(2)FPGAモジュールを購入し,新型イメージセンサ制御ユニットへ組み込んだ.(3)追加モジュール用ソフトウェアを開発し,新型イメージセンサを用いて読み出し速度150枚/秒でイメージを取得する事に成功した.(4)質量分析装置にイメージセンサを設置し,イオンの検出を行った.(5)旧型イメージセンサを用いて粗粒CAIの24Mg, 25Mg, 26Mg, 27Alイメージを取得した.新型イメージセンサにて追加したパルスモジュール間の同期動作の調整に時間を要しているため,新型イメージセンサによるAl/Mg分析が未達成である.新型イメージセンサのソフトウェア調整を行い,Al/Mg分析を行う.平成24年度にシンポジウムでの成果発表を予定していたが,新型イメージセンサでの測定とシンポジウムでの発表を平成25年度に行うこととし,未使用額はその経費に充てる.
エイズウィルスに対する特異的細胞障害性T細胞を誘導しうるワクチンの開発

これまで種々のウイルス感染に対しワクチンの接種が試みられ効果を上げてきたが、そこで使用されてきたのは、生ワクチンにせよ不活化ワクチンにせよウィルスそのものを用いたものであった。しかしながら、血友病患者の間に於て凍結乾燥した血液製剤を介しAIDSが多発したことより、たとえ不活化させたにせよHIVウイルスそのものをワクチンとして人体に応用してゆくのは大変危険であると考えられる。一方、HIVは細胞表面上のCD4分子を介してひとたび細胞内に侵入すると、細胞外の中和抗体と接触することなく細胞融合を通じて細胞から細胞へと伝播してゆくため、感染防御の面からは、中和抗体のみならず感染細胞を直接に障害しその中に潜むウイルスを排除するようなウイルス特異的細胞障害性T細胞(キラ-T細胞:CTL)をも誘導しうるワクチンを開発してゆく必要がある。以上のことから、HIVの構成成分の中で最も抗原性の強いエンヴェロ-プ蛋白(gp160)を用いたサブユニットワクチンの検討を進めてきた。ところが、一般にウイルスの一部分であるgp160の様な非生命体を単独で用いた場合には、ウイルス特異的な中和抗体を誘発することはできてもCTLを誘導することはできないとされていたことがわかったきた。そこで、gp160抗原に対し抗体並びにCTLを誘導しうる免疫系を有することがこれまでの研究により判明したBALB/cマウスに種々のアジュバントと共にこのgp160を免疫し調べたところ、サポニン系のグリコシドを基に作成されたQuill Aというアジュバントでこのgp160を取り囲むようにして作成されたISCOMーgp160(ISCOM:Immunostimulating Complex)を使用した際に、皮下にわずか一回投与するだけで少なくとも4カ月の間抗体と共にクラスI MHC分子に拘束されたCD8陽性なCTLを誘導することに成功した。現在、その毒性並びに更に効率の良い安全なワクチンの開発を検討中である。
老化に伴い出現する糖タンパク質糖鎖の構造解析とその生物学的意義の解明

本年度は、脊髄中に存在し、老化に伴って糖鎖構造が変化するP_0の機能を明らかにするために、これまでに作成した抗P_0-C末端ペプチド抗体を用いて、免疫組織化学的、細胞生物化学的解析を行った。まずP_0が脊髄中のどこに発現しているのか明らかにする目的で、免疫組織化学的解析を行った。ラット脊髄の凍結切片を抗P_0-C末端ペプチド抗体を用いて染色したところ、これまでにP_0の発現が確認されていた脊髄前根、後根に強い反応性が見られるだけでなく、脊髄皮質の神経細胞と思われる部位に強い反応性が認められた。そこで次に、実際に神経細胞に発現しているのかどうか細胞レベルで検討した。ラット新生児の脊髄から、初代培養細胞を調製し、抗P_0-C末端ペプチド抗体と神経細胞のマーカーであるNeurofilament、β-tubulinに対する抗体を用いて検討したところ、抗P_0-C末端ペプチド抗体は神経細胞に対して反応性を示すことが明らかになった。以上の結果から、P_0が脊髄の神経細胞に発現していることが明らかになった。これまでに神経細胞にP_0の発現が認められた報告はなく、P_0の新たな機能が存在すると考えられる。一方、免疫組織化学的解析において、若齢、老齢ラット双方について検討を行ったところ、脊髄皮質に見られる抗P_0-C末端ペプチド抗体陽性の細胞は、若齢に比べ老齢ではその数が減少していること、更に細胞の大きさも小さくなっていることが明らかになった。これまでにP_0の遺伝子にmutationが入った遺伝病が報告されており、これらの患者は運動感覚性ニューロパチーの症状を呈する。これまでは末梢神経のミエリン形成不全がその原因と考えられて来たが、本研究により脊髄の神経細胞にP_0の発現が認められることから、脊髄の神経回路にも異常をきたしている可能性が考えられる。今後、この可能性を検討する必要があると考える。本年度は、抗P_0-C末端ペプチド抗体によって、脊髄に発現が認められた分子に関して、更に詳細な生化学的解析を行った。これまでの結果から脊髄にP_0と相同性を持つ分子量30KDaのタンパク質が存在する可能性が考えられた。そこでNorthern blotting法を用い、P_0のN-末端部分(1-199)、及びアスパラギン結合型糖鎖を含む中央部分(265-466)の発現について検討を行った。その結果、若齢(9週齢)、老齢(30月齢)ともに、両部位のmRNAの発現が検出された。そのサイズも双方とも等しく、これまでに報吉されたP_0のmRNAのサイズと一致した。以上の結果から、週齢に関わらず脊髄中にも末梢神経と同様のアミノ酸配列を持つP_0分子が発現している可能性が強く示唆された。一方、30月齢のみでP_0がレンチルレクチンによって検出されるのは、その糖鎖構造に違いがあるためであると考えられた。そこで様々な糖鎖構造特異的なレクチンを用いて解析を試みたところ、9週齢のP_0に反応性を示すレクチンは見つからなかった、この結果から9週齢のP_0には糖鎖が存在しない可能性が考えられた。そこで、P_0上の糖鎖の検出を試みたところ、30月齢のP_0には、糖鎖が検出されたが、9週齢では検出されなかった。このことから、若齢ラットではP_0分子上に糖鎖は存在しないが、老化と伴に糖鎖を持つ分子が出現する可能性が示唆された。現在、脊髄膜画分中からのP_0の可溶化を試みている。これまでにTritonX-100による可溶化は不可能でSDSによる可溶化は容易であることを明らかにしている。次年度では、この性質を利用した選択的可溶化と、ゲル濾過やその他各種HPLCカラムクロマトグラフィーを組み合わせた方法により、脊髄中のP_0分子の単離精製を行い、加齢に伴う糖鎖の変化について解析を行う予定である。

これまでにP_0の遺伝子にmutationが入った遺伝病が報告されており、これらの患者は運動感覚性ニューロパチーの症状を呈する。これまでは末梢神経のミエリン形成不全がその原因と考えられて来たが、本研究により脊髄の神経細胞にP_0の発現が認められることから、脊髄の神経回路にも異常をきたしている可能性が考えられる。今後、この可能性を検討する必要があると考える。
輪換耕地における基準インテークレートの合理的決定法に関する基礎的研究

畑地潅漑でのインテークレートの測定時に見られるような耕地土層中への水の浸入現象では必ず浸入の転移が生起し、時間の経過につれて相異なるインテーク定数を有する一次浸入域から二次浸入域へと分化発展してゆくものであることが、今までの筆者の研究によって明らかにされて来た。本研究では、浸入の転移時間と可測の土壌物理量との対応関係を、実験室と輪換耕地の両者での浸入測定の結果に基づいて実証的に解明した。その結果、大区画汎用耕地での畑地潅漑の計画・設計上の重要な指標となっている基準インテークレートの合理的算定法に関して有用な技術指針を作成することができた。以下に得られた結果と知見を要約して列挙する。1.実験室での浸入実験の結果浸入の転移時間の長短に最も強く関与する土壌物理量は、土性・土湿・土壌粗密度及び土壌空気の4要因であり、粘土含有量・土壌水分量・仮比重・封入空気圧の増加は浸入の転移の生起(従って二次浸入の出現)を遅らす。2.整備輪換畑と新開拓畑でのインテークレートの測定調査の結果(1)インテークレートの適正な測定時間合理的な基準インテークレートの値を決定するために必要にして充分な測定時間は、砂壌土では12時間(乾燥時),23時間(湿潤時);壌土では23時間(乾),56時間(湿);植壌土では34時間(乾),67時間(湿)も要することが明確になった。これは慣行法での値に比べ著しく長時間となる。(2)浸入の転移の生起を早める促進因子土壌中に形成された水筋や植生の存在、畑地熟化と土壌改良に基づく土壌の団粒化の進展、耕耘・整地などの土壌管理の度合は浸入の転移時間を著しく短縮し、二次浸入域の早期出現を招くことが分った。この場合には、上述の標準測定時間は若干短縮される。
新規いもち病菌Avr遺伝子およびイネ罹病性遺伝子の単離

病原菌感染に必要な宿主因子の機能を低下させることにより、広範囲の病原菌レースに対する抵抗性を宿主植物に付与することが可能である。こうした宿主因子をコードする遺伝子を、罹病性遺伝子と呼ぶ。本研究では、外国イネ由来の新規抵抗性遺伝子と、それに対応するいもち病菌の非病原力(AVR)遺伝子を単離し、AVR遺伝子産物の宿主標的因子を同定することにより、罹病性遺伝子を獲得することを目的に研究を行った。いもち病抵抗性外国イネ系統(Ib3)が持つ新規のいもち病抵抗性遺伝子Piasの単離に成功した。Piasは2つのNLR(NBS-LRR)型遺伝子(Pias-1, Pias-2)が協働することで抵抗性を誘導するペア抵抗性遺伝子であることを明らかにした。さらに、Piasの単離は次世代シークエンサーを活用し、少ない材料で迅速に有力な抵抗性遺伝子の候補遺伝子を選抜できる「RaIDeN」法を独自に開発し達成した。本手法は、特定の基準配列を必要としないことから、植物種を選ぶことなく迅速に抵抗性遺伝子を同定できるため極めて有用性が高い手法と考える。また、Piasを持つ系統に対して感受性を示すいもち菌株(AVR-Piasを持たない)とAVR-Piasを持つ菌株の全ゲノム連関解析と発現解析によってAVR-Piasの単離に成功した。AVR-Piasは、91アミノ酸からなる遺伝子であった。今後、PiasとAVR-Pias間の相互作用機構の解明等に研究を発展させたい。本研究では、外国イネ由来の新規抵抗性遺伝子と、それに対応するいもち病菌の非病原力(AVR)遺伝子を単離し、AVR遺伝子産物の宿主標的因子を同定することにより、罹病性遺伝子を獲得する。平成29年度の主な研究内容は以下の通りである。(1)いもち菌株(2012-1)に対して抵抗性を示す海外系統Ib3が持つペア抵抗性遺伝子Pias-1/Pias-2の単離、(2)Piasに対応するいもち病菌因子AVR-Piasの単離、(3)他の外国イネIb4, Ib17, Ib18が持つ抵抗性遺伝子座の詳細な解析、(4)AVR-Piasの宿主標的因子の探索。得られた研究実績の概要は下記の通りである。(1)については、前年度までに単離済みである抵抗性遺伝子Pi-Ib3(Pias-1)が、近傍に位置するPias-2の存在を必要とすることを明らかにした。(2)については、Piasを持つ系統に対して感受性を示すいもち菌株(AVR-Piasを持たない)と2012-1菌株の全ゲノム連関解析と発現解析によって有力な候補遺伝子を選抜した。候補遺伝子はAVR-Piasを持たないいもち菌株に導入後、Piasを持つ系統に接種することでその機能を確認した。(3)については、複数の候補遺伝子を選抜に至っている。(4)については、解析の準備が整ったので、平成30年度に集中して実施する予定である。本研究の目的は、新規の罹病性遺伝子をAVR遺伝子の宿主標的因子として同定することにある。平成29年度において、新規のペア抵抗性遺伝子(Pias1/Pias2)の単離とその病原菌側の相互作用因子(AVR-Pias)を同定できたことは非常に大きな進展と考えらえる。更に、他の外国イネが持つ新規抵抗性遺伝子の候補遺伝子の選抜も順調に進んでいる。平成29年度において、新規の抵抗性遺伝子とその対応するAVR遺伝子の単離に成功している。同様の手法を用いることで他の外国イネ(Ib4, Ib17, Ib18)が持つ抵抗性因子とその対応するAVR遺伝子の単離を進める。

既に候補遺伝子が選ばれているものについてCRISPR/Cas9システムによる遺伝子ノックアウト系統を作出しその機能を調査することで遺伝子を迅速に単離する。Pias(Pias-1, Pias-2)とAVR-Piasの相互作用機構を酵母2ハイブリッド法や免疫沈降法によって明らかにする。また、AVR-Piasの感受性系統における標的因子をY2H法や免疫沈降法などにより選抜する。選抜した遺伝子を感受性系統でCRISPR/Cas9システムにより遺伝子ノックアウトし、罹病性遺伝子としての機能を調べる。次年度使用額が生じた理由、順調な進捗状況を受け、次年度に非常に多岐に渡る研究計画が予想され、新たに人件費、消耗品費等が生じることが考えられたため。使用計画、シーケンス試薬の購入費、研究を迅速に進めるため研究補助者を雇用する人件費として使用する。
ミトコンドリア膜を舞台としたタンパク質の交通管制機構の解明

ミトコンドリアにタンパク質を適切に配送する交通管制システムについて,脂質の交通も含めた大きなフレームワークで作動機構の解明を目指した。部位特異的光架橋で外膜トランスロケータTOM複合体の各サブユニット間,前駆体との相互作用をマッピングして複合体の動的全体構造を明らかにした。ミトコンドリア上でSTOPコドンを欠いたmRNAに由来する新生鎖がトランスロケータの孔を詰まらせる事態を回避する仕組みを見出した。ミトコンドリア内膜のTam41がカルジオリピン合成の鍵酵素であることを明らかにし,外膜と内膜の間でホスファチジン酸を輸送するUps1-Mdm35について構造を決定し,輸送メカニズムを明らかにした。1.ミトコンドリア外膜トランスロケータサブユニットTom22の相互作用マッピングミトコンドリア外膜のトランスロケータTOM40複合体の中心因子であるTom22および受容体としてのパートナーTom20の様々な部位に,in vivoで部位特異的に,光架橋性アミノ酸BPAを導入した。紫外線照射によりBPA近傍のタンパク質との架橋を行い,架橋産物を抗体で検出・同定した。さらに基質である前駆体をTOM40複合体に膜透過中間体として蓄積させ,Tom22,Tom20,Tim50の相互作用マッピングのパターンがどのように変化するかを解析した。この結果に基づき,Tom22とTom20が協力してプレ配列を認識する仕組み,Tom22の膜間部ドメインから内膜トランスロケータTim50に引き渡される仕組みを検討した。2.ミトコンドリア膜間部のジスルフィドリレーシステムの構造生物学的解析ミトコンドリア膜間部のTim40は可溶性のタンパク質にジスルフィド結合を導入する。Erv1は還元型Tim40を再酸化し,このシステムの回転を持続させる。今回Tim40と基質由来のペプチドの融合タンパク質についてX線構造を決定し,基質認識機構を明らかにした。さらに酵母Erv1のコア部分の二量体のX線構造を決定し,構造決定できなかったN端ループ部分(シャトルジスルフィドを含む)がTim40からErv1コア部分へと電子を伝達する仕組みを考察した。このモデルを検証するために,シャトルジスルフィドを含むループを短くしたErv1,短くしたループをErv1のC端につけた変異体などを作成し,Erv1欠損株の増殖欠陥を相補するかどうか,検討した。1. Tom22アセンブリー過程でin vivo架橋される因子を足がかりとする,新規輸送因子の検索ミトコンドリア外膜のトランスロケータTOM40複合体の中心因子Tom22について,部位特異的にBPAを導入して酵母細胞内で過剰発現すると,Tom22がTOM40複合体に組み込まれる前に,一過的にサイトゾル及び外膜のタンパク質と架橋産物を生ずることを見出した。サイトゾルの因子はHsp70分子シャペロンであったが,外膜の因子は2種類から成り,既知のトランスロケータ構成因子ではなかった。そこでこの架橋相手を質量スペクトル解析により同定したところ,一つは外膜の内在性膜タンパク質のポリン(Por1)であった。Por1を遺伝子破壊すると,Tom22のTOM40複合体へのアセンブリーは促進され,Tom40のアセンブリーは阻害された。また,これらのサブユニットのアセンブリーを担うTOB複合体が不安定化した。Por1はTOB複合体を介したTom22のアセンブリーを促進することが考えられる。2.新生ミトコンドリアタンパク質の品質管理ミトコンドリアタンパク質のmRNAから終止コドンが失われると,できかけのタンパク質がリボソームをストールさせてしまうとともに,ミトコンドリアのトランスロケータの孔も詰まらせてしまう。これは細胞にとって致死となること,Dom34/Hbs1ができかけのタンパク質をストールしたリボソームから強制的にミトコンドリア内に吐き出させ,孔詰まりを解消させることがわかった。これまで知られていなかった「できかけのタンパク質の品質管理」が細胞の正常機能を保つ上で重要であることを示す結果である。酵母ミトコンドリアのタンパク質の交通管制システムについて,ミトコンドリアの膜構造,脂質,レドックス状態,ERとの関係なども含めて,その働く機構を理解することをめざした。(1)ミトコンドリア機能に必須かつミトコンドリア特異的なリン脂質,カルジオリピンの合成経路は,ホスファチジン酸からCDP-DAGを合成するステップがミッシングリンクとなっていた。ERとミトコンドリアの両方で働くのではないかと言われていたCds1は,ERにのみ存在し,ミトコンドリアにはCds1以外のCDP-DAG合成酵素があることが示唆された。そこで,以前われわれが見出した,ミトコンドリア内膜トランスロケータのメンテナンス因子Tam41を酵母から精製し,Tam41がCDP-DAG合成酵素活性を持つことを直接確かめた。このことにより,カルジオリピン合成経路の全体像が完成した。(2)ERとミトコンドリアをつなぐテザリング複合体ERMESの構成因子であるMdm12とMmm1を大腸菌に発現させて精製する実験系をつくった。Mdm12-Mmm1複合体,Mdm12について結晶化に成功した。X線構造解析を実施中である。(3)ERMES複合体構成因子,ミトコンドリア内で脂質輸送に関わる可能性があるUps1/Ups2について,各々遺伝学的に相互作用する因子(各遺伝子欠失株について,合成増殖阻害を示す欠失変異株,多コピーサプレッサーとなる遺伝子)を検索し,多数の関連因子候補を得た。

(4)膜間部で酸化的リフォールディングを行うTim40-Erv1システムについて,基質類似ペプチドとTim40存在下でスピンラベルしたErv1を加え,Tim40のNMRシグナルがペプチドの存在に依存して緩和することを見出した。このことはTim40-基質-Erv1三者の複合体が重要な役割を果たすことを示す。酵母ミトコンドリアのタンパク質の交通管制システムについて,ミトコンドリアの膜構造,脂質,ERとの関係なども含めて,その働く機構を理解することをめざした。1ミトコンドリアのNアンカー型外膜タンパク質Om45が,そのN端側膜貫通(TM)配列を介して外膜にサイトゾル側から組み込まれるのではなく,膜間部側から外膜に組み込まれる膜トポロジーを有することを確かめた。Om45はまず内膜のTIM23複合体と内膜膜電位の働きを使って,外膜TOM40複合体のチャネルを完全に透過し,その後膜間部側から外膜に組み込まれるという,まったく新しい経路を使って外膜に組み込まれることが分かった。2 ERとミトコンドリアをつなぐテザリング複合体ERMESがERとミトコンドリア間で脂質輸送を担うかどうか,論争となっている。そこでERMESの構成因子であるMdm12とMmm1を大腸菌に発現させて精製する条件を確立した。Mdm12について結晶化を行い,X線構造を決定した。Mdm12には深い疎水性ポケットがあり,そこに大腸菌由来のリン脂質が結合していることが分かった。界面活性剤で脂質を除去したMdm12についてもX線構造を決定した。疎水性ポケットの疎水性残基を親水性残基に置換すると酵母の増殖能に欠損が生じた。Mdm12が脂質結合タンパク質であることはERMESが脂質輸送に関わる事を示唆する。そこでさらにin vitroで,リポソームおよび単離ミトコンドリアを用いて,Mdm12およびMmm1-Mdm12複合体について脂質輸送アッセイを行い,特に後者に高い脂質輸送能があることを見出した。ミトコンドリア外膜のTOM複合体は,約1000種類ものミトコンドリアタンパク質の入り口として機能する「タンパク質専用の外膜透過装置」である。しかしTOM複合体は高分解能の精密構造がいまだに決定されておらず,各タンパク質がどのように集合して複合体をつくり,各タンパク質がどのように前駆体タンパク質を効率よく膜透過させるかなどの問題は未解決であった。今回,in silicoの構造予測とin vivo部位特異的光架橋法を組み合わせて, TOM複合体のサブユニット間相互作用をマッピングし,複合体の全体構造を明らかにした。複合体の中心因子Tom40がつくる円筒構造の内側は,前駆体タンパク質が外膜を透過するための通り道として機能し,プレ配列を持つ前駆体およびプレ配列を持たない疎水性前駆体用に,別々に最適化された通り道が用意されていた。Tom40のN末端領域は円筒構造内を貫通して膜間部側でシャペロンタンパク質を集め,疎水性前駆体を効率良く受け渡していた。さらにTOM