hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軟骨損傷修復に対する遺伝子治療の基礎的研究

難治性の軟骨損傷に対して修復促進を目的として種々の実験的研究が行われている.その中で,軟骨細胞移植および,移植軟骨細胞の代謝活性を賦活化する方法として,成長因子を含むサイトカインの応用は有力な手段である.本研究では,関節軟骨欠損に対する軟骨細胞移植術において,局所での選択的な遺伝子発現を得る目的で,アデノウイルスベクターを用いたex vivo遺伝子導入法の有用性を検討した.ラットの関節軟骨から単離した軟骨細胞へアデノウイルスベクターを用いてLacZ遺伝子を導入した.これら細胞をコラーゲンゲルに包埋誌,LacZの発現をXーgal染色およびβ-gal assayを用いて確認した.ラットの軟骨欠損モデルに対し,包埋軟骨細胞を移植し,欠損部における導入遺伝子の発現を組織学的に検討した.ゲル内のX-gal陽性軟骨細胞は遺伝子導入1週間後で82%,8週間後で55%であった.またONPG assayによるβ-galactosidase活性値は遺伝子導入3日,1,3,5,8週後それぞれ3.94±0.14×10^4,4.13±1.14×10^4,3.38±0.60×10^4,0.61±0.14×10^4,0.51±0.07×10^4 (unit/mg protein)であった.軟骨欠損部へ移植した軟骨細胞における導入遺伝子の発現は8週間維持された.軟骨細胞の形態は保たれ,周囲には豊富な軟骨基質が産生されていた.アデノウイルスベクターによるex vivo遺伝子導入法を用いることで軟骨欠損部において、効率よく導入遺伝子の発現を維持することが可能であった.本法を応用し,軟骨細胞のanabolismを促進し,catabolismを抑制するようなサイトカインを軟骨損傷部分に選択的および持続的に作用させれば軟骨損傷における有用なり治療法になり得ると考える.難治性の軟骨損傷に対して修復促進を目的として種々の実験的研究が行われている.その中で,軟骨細胞移植および,移植軟骨細胞の代謝活性を賦活化する方法として,成長因子を含むサイトカインの応用は有力な手段である.本研究では,関節軟骨欠損に対する軟骨細胞移植術において,局所での選択的な遺伝子発現を得る目的で,アデノウイルスベクターを用いたex vivo遺伝子導入法の有用性を検討した.ラットの関節軟骨から単離した軟骨細胞へアデノウイルスベクターを用いてLacZ遺伝子を導入した.これら細胞をコラーゲンゲルに包埋誌,LacZの発現をXーgal染色およびβ-gal assayを用いて確認した.ラットの軟骨欠損モデルに対し,包埋軟骨細胞を移植し,欠損部における導入遺伝子の発現を組織学的に検討した.ゲル内のX-gal陽性軟骨細胞は遺伝子導入1週間後で82%,8週間後で55%であった.またONPG assayによるβ-galactosidase活性値は遺伝子導入3日,1,3,5,8週後それぞれ3.94±0.14×10^4,4.13±1.14×10^4,3.38±0.60×10^4,0.61±0.14×10^4,0.51±0.07×10^4 (unit/mg protein)であった.軟骨欠損部へ移植した軟骨細胞における導入遺伝子の発現は8週間維持された.軟骨細胞の形態は保たれ,周囲には豊富な軟骨基質が産生されていた.アデノウイルスベクターによるex vivo遺伝子導入法を用いることで軟骨欠損部において、効率よく導入遺伝子の発現を維持することが可能であった.本法を応用し,軟骨細胞のanabolismを促進し,catabolismを抑制するようなサイトカインを軟骨損傷部分に選択的および持続的に作用させれば軟骨損傷における有用なり治療法になり得ると考える.損傷された関節軟骨の修復法として,種々の組織移植や,サイトカインを応用した軟骨修復などが研究され,一部は臨床応用されている.しかし,本来の関節軟骨により完全に修復された報告はなく,未解決の問題である.またサイトカインを直接関節内に投与した場合,作用持続時間や選択的有効性など多くの問題が残されている.そこで新しいdrug deliverysystemとしてアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入法を軟骨損傷に対して応用しその有用性を明らかにしていくことが本研究の目的である.生後2週齢のウイスターラットの関節軟骨から酵素処理により軟骨細胞を単離した.平板培養し増殖させた後,アデノウイルスベクターを用いてマーカー遺伝子であるLacZ遺伝子を導入した.脱分化した軟骨細胞を再分化させるためコラーゲンゲルに包埋し,培養を続けた.コラーゲンゲル内の軟骨細胞におけるLacZの発現を検討するために,X-gal染色を行い凍結切片を作製し組織学的に検討を行った.コラーゲンゲル内の軟骨細胞周囲にはサフラニンOにより染色された基質産生を認め,その染色性は経時的に増加した.X-galにより染色される軟骨細胞は,遺伝子導入後1週で82%,8週で55%であった.またONPG assayによるβ-galactosidase活性値は遺伝子導入3日,1,3,5,8週後それぞれ3.94±0.14×10^4,4.13±1.14×10^4,3.38±0.60×10^4,0.61±0.14×10^4,0.51±0.07×10^4 (unit/mg protein)であった.導入3週間までは極めて高い活性が維持され,経時的な減少を認めたが導入8週後でも活性は維持されていた.

現在,軟骨全層性欠損の動物モデルを作製し,遺伝子導入後の軟骨細胞を移植し,in vivoにおける導入遺伝子発現および軟骨修復過程を検討中である.難治性の軟骨損傷に対して修復促進を目的として種々の実験的研究が行われている。その中で、軟骨細胞移植および、移植軟骨細胞の代謝活性を賦活化する方法として、成長因子を含むサイトカインの応用は有力な手段である。本研究では、関節軟骨欠損に対する軟骨細胞移植術において、局所での選択的な遺伝子発現を得る目的で、アデノウイルスベクターを用いたex vivo遺伝子導入法の有用性を検討した。ラットの関節軟骨から単離した軟骨細胞へアデノウイルスベクターを用いてLacZ遺伝子を導入した。これら細胞をコラーゲンゲルに包埋し、LacZの発現をX-gal染色およびβ-gal assayを用いて確認した。ラットの軟骨欠損モデルに対し、包埋軟骨細胞を移植し、欠損部における導入遺伝子の発現を組織学的に検討した。ゲル内のX-gal陽性軟骨細胞は遺伝子導入1週間後で82%、8週間後で55%であった。またONPGassayによるβ-galactosidase活性値は遺伝子導入3日、1,3,5,8週間後それぞれ3.94±0.14×10^4、4.13±1.14×10^4、3.38±0.60×10^4、0.61±014×10^4、0.51±0.07×10^4(unit/mg protein)であった。軟骨欠損部へ移植した軟骨細胞における導入遺伝子の発現は8週間維持された。軟骨細胞の形態は保たれ、周囲には豊富な軟骨基質が産生されていた。アデノウイルスベクターによるex vivo遺伝子導入法を用いることで軟骨欠損部において、効率よく導入遺伝子の発現を維持することが可能であった。本法を応用し、軟骨細胞のanabolismを促進し、catabolismを抑制するようなサイトカインを軟骨損傷部分に選択的および持続的に作用させれば軟骨損傷における有用な治療法になり得ると考える。
ポスト災害社会における宗教の役割に関する宗教学的研究

2004年12月のスマトラ沖地震以降いくつかの巨大な地震を経験したインドネシア・スマトラ島各地での現地調査などを通して、復興の過程で宗教が果たした役割と、その後の社会における宗教の位置づけの変化について分析をおこなった。その結果、「宗教国家」インドネシアにおいて通常ゆるぎない権威をもち人々の生活を枠づけている「宗教」が、震災をめぐってゆらぎを見せ、そのことが諸宗教間の協力や対立、あるいは住民たちとの葛藤など様々な動向を生み出していることが明らかになった。今年度は基礎データ収集と予備的調査を中心に研究を進めた。主な成果としては以下のようなものをあげることができる。(1)ニアス関連文献目録の作成ニアスに関する文献目録としてはSuzuki(1958)が知られているが、その後半世紀の時間が経過しており、またインドネシア人研究者による研究がほとんどとりあげられていないなどの問題があった。そこで、Suzukiを補足する形で文献目録の作成をおこない、メンバーの間で共有した。(2)スマトラにおけるクエッショネア予備調査地震に対する住民の意識を探るためのクエッショネアをまず日本語で作成、インドネシア人留学生を交えて内容の検討とインドネシア語への翻訳をおこなった後、2010年11月16日に北スマトラ州メダン市にある国立北スマトラ大学の学生を対象として実施した。高等教育機関に在籍中の学生には「よき社会人」として公認宗教へのコミットメントが求められるインドネシアの現状で、科学的知識、宗教的教義のいわば「建前」の背後にある地震観をいかに浮き彫りにするかが課題であったが、質問を「あなたはどう思うか」「どういう話を聞いたことがあるか」などと微妙にずらすことで、回答者の持つ地震観の多層性を回答に引き出すことができる見通しがついた。(3)「宗教と自然災害研究会」の実施災害復興をめぐる問題は多岐にわたり、さらに広範な研究者と意見交換を行う必要性があるだろうという認識から、「宗教と自然災害研究会」を立ち上げ、11月1日スマトラにおける地震復興プロジェクトに関わってこられた宮城大学の竹内泰准教授を招き、建築学の立場から見た復興の問題について議論をおこなった。平成22年度の末に発生した東日本大震災によって、本研究は大きな影響を受けることとなった。何よりも震災後の社会における宗教の役割をテーマとした本プロジェクトとしては、目の前で進行しつつある被災地救援の動きに対して無関心を装うことはありえなかった。そこでインドネシアの研究は計画通りにすすめつつ、そこでこれまでに積み上げてきた成果や方法を、震災後の日本にも応用的に適用する作業をすすめた。具体的には、被災者に対する聞き取り調査の経験をもとに震災体験記憶の記録をめざした「東北大学震災体験記録プロジェクト」を立ち上げ、成果を書籍の形で発表した他、超宗教の心のケアグループ「心の相談室」や、宮城県震災無形文化財調査プロジェクトなどに本研究での知見を活かすことができた。ニアス島では夏季に調査をおこなった。その主な成果としては、第一にカトリック系NGOカリタス・インドネシアへの聞き取り調査を通して、震災後の時間経過に伴って、被災地の様々なフェイズに応じた支援を息長く行っている様子を確認することができた。第二に、身元不明者の集団埋葬墓に関する調査を通して、この問題が諸宗教の壁を越えた協力体制の構築を要請し、この枠組みがその後のニアスにおける諸宗教協調の枠組みとなっていった様子を明らかにすることができた。また第三に、ニアスの原住民は高地に家を作ることを好み、海側の低地は中国系住民やパダン人など、新来者に貸していることが多く、地震や津波の被害者には圧倒的にこれらの外来者が多かったということがわかった。本年度は、インドネシアのポスト災害社会における慰霊、とりわけ集団埋葬をめぐる問題に焦点をあてて研究調査をおこなった。特にニアス島において、集団埋葬とその後の慰霊が宗教やエスニック・グループの枠組みを超えた形で行われている点に着目し、このような試みをインドネシアの社会の文脈の中で理解することを試みた。六つの国による公認宗教が定められているインドネシアでは、宗教省でそれぞれの宗教(公認されて日が浅い儒教を除き)が異なった部局で管理されていることに象徴されるように、それぞれの宗教の独立性が重視され、公的な場で協働がおこなわれることはあまり一般的ではないからである。そこで本年度は、比較の意味でスマトラ島のパダンやアチェといったポスト災害社会における集団埋葬と慰霊の事例について、文献や現地調査により検討を加えてみた。その結果、災害によって生じた大量の死者の存在が、被災者、地域政府、宗教者たちを動かして、平時の宗教制度の枠組みに収まらない動きを生み出していく様子を確認することができた。例えば西スマトラ州のパダン・パリアマンでは、熱心なムスリムが多いことで知られている地域であるにもかかわらず、地震に起因した土砂崩での死者の扱いをめぐり、権威あるウラマー組織の指令に対して、地域住民、さらには地域政府が公然と反論するという異例の事態が起きていたことが明らかになった。

ここでも、土砂に埋もれてしまった数多くの死者の存在が、平時には見えなかった住民と宗教的制度の間の亀裂を明るみに出したのである。インドネシアのように強固な宗教制度をもつ社会にあっても、大量の震災死者の存在は、その制度をゆるがし、そこに新たな宗教と社会の関係が取り結ばれるきっかけとなりうることが明らかになった。震災の影響はあったが、代表者・分担者の努力で十分にカバーできた。国内の資料調査、海外での調査も順調に進んでいて特に問題はない。24年度が最終年度であるため、記入しない。計画通り進めていくが、とりわけ社会への発振という面では、日本の震災後の状況を念頭におくことに留意する。
ECRエッチングプラズマ中のラジカル反応機構および制御に関する研究

1.ECR励起オン・オフ変調CHF3エッチングプラズマにおいて,赤外半導体レーザー吸収分光法を用いて,ECRポイントにできる限り近い領域におけるCF,CF_2,CF_3ラジカル密度およびラジカルの生成・消滅過程を計測し,ラジカルの振舞いを明らかにした.ECR近傍とECR下流におけるラジカル密度と比較した結果,ラジカルの寿命が非常に長いため,ラジカル密度に大きな相違はないことが判明した.2.オン・オフ放電変調方式により,ECR励起CHF_3エッチングプラズマ中のCF,CF_2,CF_3ラジカルの密度比を制御できることを示し,これらのラジカルとフルオロカーボン膜の堆積速度・組成との関係を高感度フーリエ変換赤外分光装置およびX線光電子分光装置を用いて調べた.その結果,高精度エッチングプロセスにおけるフルオロカーボン膜形成にCF_2ラジカルが寄与していることを明らかにした.3.赤外半導体レーザー吸収分光法を用いて,ECR励起CF_4,C_3F_6,C_4F_8エッチングプラズマ中のCF,CF_2,CF_3ラジカル密度をはじめて系統的に計測し,ラジカルの振舞いを明らかにした.CF_2ラジカル密度は,用いるガスの組成(C/F)比に比例して増加することを見出した.さらに,水素添加によるラジカル密度への影響を調べ,高精度エッチング時におけるラジカルの組成を明らかにした.1.ECR励起オン・オフ変調CHF3エッチングプラズマにおいて,赤外半導体レーザー吸収分光法を用いて,ECRポイントにできる限り近い領域におけるCF,CF_2,CF_3ラジカル密度およびラジカルの生成・消滅過程を計測し,ラジカルの振舞いを明らかにした.ECR近傍とECR下流におけるラジカル密度と比較した結果,ラジカルの寿命が非常に長いため,ラジカル密度に大きな相違はないことが判明した.2.オン・オフ放電変調方式により,ECR励起CHF_3エッチングプラズマ中のCF,CF_2,CF_3ラジカルの密度比を制御できることを示し,これらのラジカルとフルオロカーボン膜の堆積速度・組成との関係を高感度フーリエ変換赤外分光装置およびX線光電子分光装置を用いて調べた.その結果,高精度エッチングプロセスにおけるフルオロカーボン膜形成にCF_2ラジカルが寄与していることを明らかにした.3.赤外半導体レーザー吸収分光法を用いて,ECR励起CF_4,C_3F_6,C_4F_8エッチングプラズマ中のCF,CF_2,CF_3ラジカル密度をはじめて系統的に計測し,ラジカルの振舞いを明らかにした.CF_2ラジカル密度は,用いるガスの組成(C/F)比に比例して増加することを見出した.さらに,水素添加によるラジカル密度への影響を調べ,高精度エッチング時におけるラジカルの組成を明らかにした.
可視光の短波長LEDを利用した歯髄血液酸素飽和度測定に関する基礎研究

歯髄の循環系は、歯の健康を保つ上で重要な役割を果たしている。これまでに、ヒト歯髄光電脈波測定(TLP : Transmitted-Light Plethysmography)による血流測定より乳歯や幼若永久歯の外傷歯の歯髄診断が行われてきた。しかし、歯髄血流が検出されても病的所見が認められるケースが見られ、歯髄に循環障害が起きていると推測された。本研究では歯髄の病態を示す新たな指標として血液酸素飽和度SO_2に着目し、測定の適性波長や、複数波長によるSO_2検出について検討を行った。その結果、歯の透過光を利用して歯髄腔内血液SO_2の変化を検出できる可能性が示唆された。1.研究の目的本研究では、歯髄血液の酸素飽和度(SO_2)測定による新たな歯髄診断器の開発のため、歯髄血液SO_2測定に関する基礎理論の確立を目指している。平成21年度は、歯髄血液のSO_2変化の検出の可否について検討し、適性波長を選択することを目的とし、ヒト上顎中切歯の抜去歯を使用した光学的基礎実験を行った。2.研究の具体的内容本研究ではヘマトクリット3%の新鮮ブタ血液に、96%O_2+4%CO_2または96%N_2+4%CO_2の混合ガスを作用させ、血液の酸化・脱酸素化を行い、SO_2の異なる血液サンプルを作成した。血液のSO_2値は血液ガス分析器により測定した。血液サンプルのそれぞれについて、血液の透過光スペクトルと、歯髄腔に血液を含む歯牙全体の透過散乱スペクトルを測定し、両者を比較することで歯髄血液のSO_2変化の検出精度を調べた。本研究では、歯髄血液の検出に適しているとされる緑色を含む500600nmについて解析を行い、さらにヘモグロビンの非等吸収波長である540nm、560nm、577nmにおいて吸光度の比較を行った。光源として白色光を使用し、透過光を分光器に取り込み500600nmにおける吸光スペクトル(Absorbance(lnI_0/I_t))を取得した。また、照射・受光用光ファイバの尖端には歯髄腔に焦点を合わせた集光用の半球レンズを付与した。測定の結果、SO_2が22%、45%、80%の血液サンプルそれぞれにおいてスペクトルは概ね一致し、3つの非等吸収波長の吸光度についても概ね一致した。本研究では、ヘモグロビン吸光度の高い非等吸収波長を用い、光ファイバ尖端のレンズにより効率的に光を歯髄腔へ到達させることで歯髄血液のSO_2変化を検出することができたと考えられる。今後はこれらの適性波長を使用した基礎実験を進めると同時に、試作器の製作やヒト歯髄脈波測定を行い、歯髄の病態とSO_2の関係についてさらに検証していく予定である。1.研究の目的初年度の抜去歯の光計測により本研究の目的である歯髄血液酸素飽和度測定において、500600nmの波長が適していることが示唆された。平成22年度は、ヒト歯髄脈波測定においてこれらの波長領域のLEDが使用可能であるかどうかを検証し、さらに抜去歯の歯髄脈波シミュレーションモデルにより歯髄血液SO_2の推定を行うことを目的とした。2.研究の具体的内容a.ヒト歯髄脈波の測定:歯髄血液の酸素飽和度測定には複数の波長が必要であるため、470nm、525nm、590nmの3波長の高輝度発光ダイオード(LED)を選択し、健全なヒト上顎中切歯の歯髄脈波測定を行った。その結果、いずれの波長でも脈波の検出が可能であり、特に525nmと590nmではノイズの少ない明瞭な脈波を検出することができた。b.歯髄脈波シミュレーションモデルとSO_2予測に関する考察:抜去歯による歯髄脈波シミュレーションモデルにより、歯髄血液SO_2の予測方法について実験的・理論的考察を行った。ヒト上顎中切歯の抜去歯の歯髄腔内ヘシリコンチューブを挿入し、ヘマトクリット3%のヒト血液を還流させ、ダイヤフラムポンプにて疑似脈波を発生させた。血液の酸素化および脱酸素化にはそれぞれ96%O_2+4%CO_2または96%N_2+4%CO_2の混合ガスを作用させた。血液のSO_2値は血液ガス分析装置により求めた。歯髄脈波測定には470nm、525nm、590nmのLEDを使用し、透過光強度全体(V_t)に占める歯髄脈波振幅(V_<P-P>)の比をそれぞれ求めた。

結果より、590nmと525nm、590nmと470nmの組み合わせにおいて2波長の透過光量変化の比率φ(=In(V_<p-p>/V_t)_<λ1>/In(V_<p-p>/V_t)_<λ2>)と歯髄腔内血液SO_2には強い相関が認められ、これを利用してSO_2を予測できる可能性が示された。複数波長の光電脈波を使用することで歯質での光減衰の影響がある程度相殺され、歯髄腔内血液のSO_2変化を検出することができたためと考えられ、今後は、歯質の厚みや歯髄腔の大きさなど歯の解剖学的形態が異なる歯牙で、歯質の光減衰の影響についてさらに詳細に検証していく予定である。1.研究の目的これまでの研究によりヒト歯髄脈波測定に適した光源波長領域が明らかになり、抜去歯の歯髄脈波シミュレーションから、透過光量変化の2波長の比率φ(=(V_<p-p>/V_t)_<λ1>/(V_<p-p>/V_t)_<λ2>)とSO_2に相関が認められ、両者の関係よりSO_2を予測できる可能性が示された。今年度は、歯質での光減衰値の測定、血液の光学特性とLEDの波長帯域を考慮した理論的考察を行い、更にヒト歯髄脈波測定による酸素飽和度予測を行うことを目的とした。2.研究の具体的内容(a)歯質の光減衰係数の測定:エナメル質と象牙質を含む厚さ11.8mmの切片を作成し、それぞれにおいて減衰スペクトル(450800nm)を取得し、単位厚さあたりの減衰値(dB/mm)を求めたところ、測定波長領域において減衰値:はほぼ一定となった。このことから、歯髄脈波測定の際に使用する波長間においては、歯質での光減衰の差はほぼ無視できるものであると考えられた。(b)SO_2変化に関する理論的考察:LED光源は一定の波長帯域を持つため、その範囲内でのHbとHbO_2の吸光度の影響を受ける。SO_2測定の適性波長について理論的に検証するため、LED波長がシフトした際の透過光量とSO_2について理論解析を行った。その結果、測定に使用した3波長のうち、Hb非等吸収波長の470nmと595nmでは透過率のSO_2依存性が高く、Hb等吸収波長の525nmではSO_2依存性が低いということが分かった。また、470nmと595nmではSO_2と透過率の関係が逆の相関になり、SO_2測定に適した波長の組み合わせであると予想している。(c)ヒト歯髄血液の酸素飽和度予測:抜去歯の測定より求めたSO_2と透過光量の関係からヒト歯髄血液のSO_2の予測を行ったところ、およそ6575%となった。歯髄は歯質に囲まれたコンプライアンスのない組織であるため、指尖と異なり、脈波振幅に動脈血だけでなく静脈血の酸素レベルも反映する可能性があると考えられる。
疾患ｉＰＳ/ES細胞を用いた自己炎症性疾患（中條―西村症候群）の病態解析

NNSは、乳幼児期に凍瘡様皮疹で発症し、繰り返す炎症と進行するやせ・消耗を主症状とする疾患である。NNSは、免疫プロテアソームβ5iをコードしているPSMB8遺伝子に異常がある。NNSと類似の症状を呈する疾患として、海外においてもCANDLE症候群やJMP症候群が知られており、これらはプロテアソーム不全症として新たな疾患カテゴリーを形成し、プロテアソーム遺伝子と疾患を結びつける疾患群(プロテアソーム関連自己炎症疾患群)に分類される。免疫プロテアソームの異常と病態形成の機序については、不明な点が多く、未だ有効な治療法が確立されていない。これまで、患者さん由来のiPS細胞を用いてNNSの疾患モデルを構築し、異常な炎症を引き起こすメカニズムの一端を明らかにした。これによりNNSを含めた免疫プロテアソーム異常症の病態解明、治療法開発が一層進むことが期待される。そこで、PSMB8変異有無以外は遺伝背景をそろえたiPS/ES細胞をCRISPR/Cas9ゲノム集技術を用いて作製し、NNS患者さん由来iPS/ES細胞から作製した単球系細胞を用いた解析により、炎症反応の検討を行った。NNS患者さん由来iPS/ES細胞から作製した単球系細胞は、刺激前から過剰な活性酸素の産生が上昇しており、IFN-gamma + TNF-alpha刺激により、異常なJAK/STAT経路、p38MAPK経路の活性化や様々な生体応答反応経路が亢進していることが分かった。JAK阻害薬、MAPK阻害薬、抗酸化剤の投与により、刺激変異型PSMB8細胞で過剰に産生されていた炎症性サイトカインやケモカインが抑えられ、その効果は、各シグナルの病態への寄与や相互作用を示唆するとともに、新たな薬剤スクリーニングに有用であることが示された。本研究は、患者さん由来のiPS細胞を用いてNNSの疾患モデルを構築し、異常な炎症を引き起こすメカニズムの一端を明らかにした。この成果により、NNSを含めた免疫プロテアソーム異常症の病態解明、治療法開発が一層進むことが期待される。引き続き、中條ー西村症候群に対する創薬のための化合物スクリーニングを行うが、病態解析と創薬スクリーニングを有機的に組み合わせて、研究の進捗を図る。
母体低栄養マウス胎仔を用いた虚血再灌流時の低酸素遺伝子応答解析

本研究は虚血低酸素負荷により脳出血を発症する母体低栄養モデルマウスの脳出血発症前後の遺伝子発現を網羅的な解析し、遺伝子発現変化と調整する転写因子を明らかにし、発症の危険因子を見つけ出すことを目的とした。ミトコンドリア関連遺伝子の発現量がp53発現量でクラスタリングされ、p53の活性阻害薬投与により、脳出血の発症が抑制された。母体低栄養に由来する低酸素耐性低下にはp53シグナル活性によるミトコンドリアの異常活性の関与することが示唆された。胎仔脳出血モデルを作成した。低蛋白食群を妊娠17.5日目に麻酔下で開腹・子宮を露出し、胎児心電図計測装置、超音波による胎仔の心拍数、脳血流監視下で子宮動脈の圧迫開放を行い、胎仔脳に虚血再灌流を負荷した。負荷後、胎仔脳出血を発症した脳を採取した。対照群でも同様に虚血再灌流負荷後の胎仔脳を採取した。これらの脳からmRNAを抽出し、microarrayを実施した。前年度に行ったmicroarrayの結果と併せて、虚血再潅流負荷前後の網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、成人の脳出血との関連が指摘されているs100a10,ミトコンドリア関連のCOX4i1などの発現量が虚血再潅流負荷後にp53と特異的な相関を示した。そこでp53阻害薬であるpifithrin-alpha (PFT-alpha)を低蛋白食群母獣腹腔に妊娠15.5日目および16.5日目に投与した後、虚血再潅流を負荷したところ、胎児脳出血の発症が対照群と同程度まで有意に抑制されることを確認した。このことから胎児脳出血の発症にはp53の活性化が関与していることが示唆された。次に、PFT-alphaが胎児脳出血発症を抑制したメカニズムを明らかにする為に、低蛋白食群にPFT-alphaを投与した群(PFT-alpha群)を作成しmicroarrayを実施した。同様に、臨床的に脳出血発症を抑制するとされているステロイド剤(DX群)を作成し、microarrayを実施した。通常酸素分圧時における母体低栄養の影響を検討本年度は低酸素耐性の差違を生じる背景に存在する通常酸素分圧時の遺伝子発現についてノ研究を実施した。1.母体低栄養マウスの作成(伊藤・佐藤):繁殖に十分な栄養含む餌を与えた1群を対照群とする。もう1群は対照群の餌と比べ蛋白含有量を約半分に制限した低蛋白食群とする。両群ともに正常な雄マウスと交配し、妊娠17.5日目に胎仔脳を採取した。2.遺伝子発現網羅的解析(伊藤・木村・船本・董・Clarissa):採取した胎仔脳からRNAを抽出し、雌雄の各1匹のRNAを等量混合検体を用意した。この検体、両群各6例をマイクロアレイ(東レ3D gene)による遺伝子発現の網羅的解析に供した。得られた遺伝子発現プロファイルに関してgeWorkbenchによる責任転写因子候補の検索を行った結果、HIF1-alphaおよびp53が候補にあがった。3.Western blotによる蛋白質レベルでのシグナル活性の評価(董・船本・Clarissa・伊藤):Western blotによる蛋白質レベルでの評価は雌雄それぞれの検体を用意して解析を実施した。栄養状態によるHIF1-alphaの発現量を調整しているリン酸化酵素であるP-mTOR、HIF1-alphaではは蛋白質量の母体低栄養給餌による変化は認められなかった。一方、P-p53は母体の栄養状態に関係なく雌胎仔の脳では発現を認めたが、雄胎仔では母体低栄養餌給餌群でのみ発現を認めた。p53を抑制的に調整するMDM2は母体低栄養餌給餌群の雌胎仔でのみ発現量が増加していた。これらの結果から、少なくとも雄胎仔脳ではp53シグナルが更新している可能性が示唆された。昨年度までの成果から胎仔脳出血を発症する低蛋白食群ではCOX4i1などのミトコンドリア関連遺伝子の発現量が虚血再潅流負荷によって増加していた。このとから虚血再潅流負荷によるミトコンドリアの異常活性が示唆された。そこで、低蛋白食群、対照群でそれぞれ虚血再潅流負荷前後の脳を採取、ATP活性を定量化し、虚血再潅流負荷負荷後の低蛋白食群でATP活性が増加していることを確認した。COX4i1などミトコンドリア関連遺伝子のmRNA発現量がp53発現量と特異的な相関を示したこと、pifithrin-alpha (PFT-alpha)の低蛋白食群母獣投与により脳出血発症率が対照群と同程度(約20%)まで抑制されたことからp53シグナルの胎児脳出血発症への関与が示唆された。PFT-alphaは核内およびミトコンドリア両方に作用するp53

抑制剤であるため、脳出血発症に寄与するp53シグナルが核内かミトコンドリアかを判別するため、ミトコンドリアのp53シグナルを特異的に阻害するPFT-muを低蛋白食群母獣に投与し、虚血再潅流を負荷したところ、無投与群(約80%)とPFT-alpha投与群(約20%)の中間(約50%)の脳出血発症率を示した。この結果から胎仔脳出血発症に関与するp53シグナルは核内、ミトコンドリア両方に存在することが示された。現在、PFT-alpha投与した低蛋白食群胎仔脳のmicroarrayデータから発症に関するシグナルを特定するべく解析を継続している。実験動物学26年度実施予定であった転写因子阻害剤の投与実験を25年度中に一部実施できた。母体低蛋白食給餌による胎仔脳の遺伝子発現の変化をmicroarrayによって網羅的に解析し、ライブラリの作成をすることが出来た。また、HIF1-alphaおよびp53を責任転写因子候補として抽出することに成功した。下流遺伝子の転写産物に関するWestern blotも実施しており、研究実施計画に記した通りの進展と判断した。研究計画通りに進捗しており、推進に問題は無いと考えている。当初の予定より抗体の納入価格が安価であったため、H24年度予算に残が生じた。次年度以降は研究計画に則り、残金が生じないように使用する予定です。
新しいドラッグデリバリーシステムを用いた消化管大量切除対する治療システムの開発

Lactococcus lactisの遺伝子導入を試みたところ、導入効率はあまりよくないものの導入されたことが確認された。導入する遺伝子の検討を行い、prostasin全長のcDNAを取りきれなかった。われわれの目的とするLactococcus lactisを「運び屋」とする新しいドラッグデリバリーシステムの開発には、以下に導入遺伝子産物の分泌量を高めるかが決定的に重要である。本研究の目的は、消化管大量切除後の「消化管欠落症状」を根本的に改善することを目的として、Lactococcus lactisを「運び屋」とする新しいDrug delivelysystemを用い、吸収にかかわる様々な機能分子を上皮細胞に誘導するシステムを構築することである。そのために、今年度は以下の項目につき検討した。実験に際しては、一定の菌数が投与が必須となるがそのたびの調整では効率が悪い。あらかじめ、5x10^5CFUの菌をグリセロールストックとして分注し、30度静置培養で適正菌数が得られる方法を確立した。2. Lactococcus lactisにエレクトロポレーション法による遺伝子導入の条件設定Competentcellを作成し、-80度にて保存した。エレクトロポレーションの条件として2mmキュベットを選び、Genepulserにて1.5kV、25microF、200ohmsとした。3.実際の遺伝子導入数回遺伝子導入を試みたところ、導入効率はあまりよくないものの、コロニーを用いたPCRにより導入されたことが確認された。4.導入する遺伝子の検討タンパクであまり分子量の大きくないもの、またシグナルペブチドを有する分泌タンパクを候補としてリストアップした。Epidermalgrowthfactor、glucagon-like peptide 2、prostasinを選び、ヒトcDNAをPCRクローニングすることとした。本研究の目的は、消化管大量切除後の「消化管欠落症状」を根本的に改善することを目的として、Lactococcus lactisを「運び屋」とする新しいDrug delivery systemを用い、吸収にかかわる様々な機能分子を上皮細胞に誘導するシステムを構築することである。昨年度の、Lactococcus lactisの菌数の確保のための方法の確立、Lactococcus lactisにエレクトロポレーション法による遺伝子導入の条件設定、に続き今年度は以下の項目につき検討した。実際にタンパクが導入され、機能を発揮しているどうかを簡便に判定するシステムが必要である。このシステムを確立するために、抗菌作用を有するとされる遺伝子の導入を試みた。Lactococcus lactisへの導入効率は非常に悪いものであったあが、2クローンを得ることができた。しかし、培養上清中への分泌はWessternブロットでは確認できなかった。また、機能的にStaphylococcus aureus培養による抗菌活性を指標とするアッセイ系を用いて検討したが、対象の遺伝子非導入Lactococcus lactisと差がなくこれは、この菌が本来持つナイシンによる影響が大きいものと考えられた。われわれの目的とするLactococcus lactisを「運び屋」とする新しいDrug deliverysystemの開発には、以下に導入遺伝子産物の分泌量を高めるかが決定的に重要である。シグナル配列に何を用いるべきかを検討しているが、良好な結果は本研究年度中には得られなかった。
Pdナノ微粒子とナノ構造発光材料との複合化による新しい水素ガスセンサーの開発

本研究の目的は、安全な水素エネルギー社会を築くため、高性能な水素ガス漏れ検知センサーや水素ガス濃度センサーを開発することであり、現在用いられている酸化物半導体センサー等の問題を解決すべく、更に小型で安価な高性能水素ガスセンサーを目指し(目標性能:検知感度100ppm数%程度、応答速度<1s、水素ガス選択性に優れ、室温動作し、広範囲計測が可能)、水素ガスに対して優れた触媒分解作用をもつPdに着目し、これを用いた水素ガスセンサーの開発を行っている。本年度得られた研究方法・成果は下記の通りである。1.紫外発光ナノ構造体の作製と紫外光応答ナノ微粒子支援レーザー堆積法を用いて水平配向したZnOナノワイヤーの作製を行った。図1に一例のSEM像を示す。また、これにAu電極を作製し紫外発光センサーとした,その特性評価として作製したセンサーへ一定の直流電圧を印加し、紫外光照射有無による電流値の時間変化を確認した。結果、応答速度に問題はあるが高感度に反応することが分かった。その結果の一例を図2に示す。2.Pdナノ微粒子作製及び紫外発光センサーへの修飾技術の確立液相レーザーアブレーションを用い、界面活性剤等の添加物を含まない粒子径50nm程度のPdナノ微粒子水溶液を作製し、作製したセンサーへ滴下、修飾を行い紫外光応答変化を確認したがPdナノ微粒子の影響は見られなかった。その原因としてナノ微粒子とナノワイヤーとの付着状態が影響しているのではないかと考え、次に付着面積を大きくすべく、滴下後、Nd:YAGレーザーを照射し、改善を試みたが現在のところ良い結果が得られていない。今後は、TEMにより付着状況を確認しながら、修飾用レーザーの波長や強度を変化させ、紫外光応答変化を確認し、水素ガス暴露実験等を行って行く予定である。図1:水平配向酸化亜鉛ナノワイヤーのSEM像図2:紫外光応答特性本研究の目的は、安全な水素エネルギー社会を築くため、高性能な水素ガス漏れ検知センサーや水素ガス濃度センサーを開発することであり、現在用いられている酸化物半導体センサー等の問題を解決すべく、更に小型で安価な高性能水素ガスセンサーを目指し(目標性能:検知感度100ppm数%程度、応答速度<1s、水素ガス選択性に優れ、室温動作し、広範囲計測が可能)、水素ガスに対して優れた触媒分解作用をもつPdに着目し、これを用いた水素ガスセンサーの開発を行っている。図1:水平配向酸化亜鉛ナノワイヤーのSEM像図2:紫外光応答特性
薬剤耐性H.pylori感染に対する補完・代替療法の開発

Helicobacter pylori(以下H. pylori)は胃炎、胃潰瘍、胃癌、MALTリンパ腫など、胃十二指腸疾患の原因菌であることが知られている。近年、これらの疾患に対して、抗生物質による除菌療法を実施することにより治療が可能になってきたが、抗生物質に対する耐性菌の出現が問題となっている。本研究では、H. pyloriに対してエッセンシャルオイルおよび漢方薬が抗菌活性を有するかどうかをin vitroおよびin vivoで検討した。13種類のエッセンシャルオイルを対象にH. pyloriに対する抗菌効果を検討した結果、レモンバーベナおよびレモングラスが強い抗菌活性を示し、薬剤耐性菌に対しても同様の効果を示した。その抗菌効果は濃度および時間依存性でありpH47の条件においてはpHが低い程より強い抗菌活性を示した。また、クラリスロマイシン感受性株をそれぞれの薬剤含有培地にて継代培養した結果、クラリスロマイシン耐性菌は出現したが、エッセンシャルオイル耐性菌は出現しなかった。さらに、マウスにレモングラスを経口投与した結果、胃内菌数はレモングラス投与群では非投与群に比較して有意に抑制されていた。一方、18種類の生薬のH. pyloriに対する抗菌活性を同様に検討した。その結果、黄連、甘草、丁子が1mg/ml以上の濃度で強い抗菌活性を示した。また、これらの生薬をマウスに経口投与した結果、胃内菌数を有意に抑制した。以上の結果、エッセンシャルオイルおよび漢方薬はH. pyloriに対して抗菌効果を示すこと、またその効果は抗生物質に対する耐性菌に対しても有効で、長期使用によっても新たな耐性菌の出現が認められないことが明らかとなり、抗生物質耐性H. pylori感染症に対する補完・代替療法として有用であることが示唆された。H.pylori標準株であるATCC43504株、臨床分離株であるCPY2052株を対象に、補中益気湯(TJ-41)、十全大補湯(TJ-48)、人参養栄湯(TJ-108)、黄連解毒湯(TJ-15)などの漢方薬あるいはオウギ、ニンジン、カンゾウ、チンピ、オウレンなど18種類の生薬のin vitroにおける抗菌効果を検討した結果、補中益気湯およびオウレン、ダイオウ、カンゾウに強い抗菌効果が認められ、薬剤耐性菌に対してもほぼ同様の抗菌効果を示した。また、10代以上の継代培養を実施しても生薬に対する耐性菌は出現しなかった。13種類のエッセンシャルオイルを対象にH.pyloriに対する抗菌効果を検討した結果、レモンバーベナ(Lippia alternifolia)およびレモングラス(Cymbopogon citratus)が強い抗菌活性を示し、薬剤耐性菌に対しても同様の効果を示した。以上の結果より、一部の漢方薬あるいはエッセンシャルオイルはH.pyloriに対して抗菌効果を示すこと、またその効果は抗生物質に対する耐性菌に対しても有効で、長期使用によっても新たな耐性菌の出現が認められないことが明らかとなった。1、H. pyloriに対する生薬のin vitroにおける効果昨年度の研究の結果、漢方薬としては補中益気湯(TJ-41)に強いH.pyloriに対するin vitroにおける抗菌効果が認められること、薬剤耐性菌に対してもほぼ同様の抗菌効果を示すこと、10代以上の継代培養を実施しても漢方薬に対する耐性菌は出現しないことなどを明らかにした。本年度は漢方薬の成分である生薬の抗菌効果について検討した。

標準株であるATCC43504株、臨床分離株であるCPY2052株を対象に、18種類の生薬のin vitroにおける抗菌効果を検討した結果、オウレン、ダイオウ、チョウジ、カンゾウ、インチンコウに強い抗菌効果が認められた。また、生薬の濃度としては100μg/ml以上、作用時間としては6時間以上で抗菌効果が認められた。2、H. pyloriに対する生薬のin vivoにおける効果H. pyloriに対してin vitroで強い抗菌効果が認められた生薬、オウレン、ダイオウ、チョウジ、カンゾウ、インチンコウのin vivoにおける効果を検討した。C57BL/6マウスにH. pylori CPY2052株を感染させ、各生薬1mg/mlを2週間自由飲水にて投与し、4週間後の胃内菌数を測定した結果、ダイオウには抗菌効果が認められなかったものの、オウレン、チョウジ、カンゾウ、インチンコウに強い抗菌効果が認められた。以上の結果より、オウレン、チョウジ、カンゾウ、インチンコウはH. pyloriに対してin vitroおよびin vivoにおいて抗菌効果を示すこと、またその効果は抗生物質に対する耐性菌に対しても有効で、耐性菌の出現が認められないことから、H. pylori感染に対する補完代替療法として有用である可能性が示唆された。1、H.pyloriに対する漢方薬(生薬)の抗菌効果の検討昨年度までに、漢方薬としては補中益気湯(TJ-41)、生薬としてはオウレン、チョウジ、カンゾウ、インチンコウなどに抗菌効果があることを明らかにした。本年度は、オウレンを主成分とする漢方薬である黄連湯の抗菌効果をin vitroおよびin vivoで検討した。その結果、黄連湯はin vitroでは強いH.pyloriに対する抗菌効果が認められ、薬剤耐性菌に対してもほぼ同様の抗菌効果を示すことが明らかとなったが、in vivoにおいてはその抗菌効果は弱かった。また、生薬の2剤併用療法の可能性を検討したが、相加的効果しか認められず、相乗的効果は認められなかった。昨年度までに、13種類のエッセンシャルオイルを対象にH.pyloriに対する抗菌効果をin vitroで検討した結果、レモンバーベナ(Lippia alternifolia)およびレモングラス(Cymbopogon citratus)が強い抗菌活性を示し、薬剤耐性菌に対しても同様の効果を示すことを明らかにした。本年度はマウス感染モデルを用い、in vivoにおける抗菌効果を検討した結果、レモングラスがin vivoにおいても強い抗菌効果を示した。また、プラウノイ植物抽出精製油であるプラウノトールについても薬剤耐性H.pyloriに対する抗菌効果を検討した結果、in vitroおよびin vivoにおいても有意な抗菌効果を認めた。以上の結果より、一部の漢方薬(生薬)および植物由来物質はH.pyloriに対してin vitroおよびin vivoにおいて抗菌効果を示すことより、H.pylori感染に対する補完代替療法として有用である可能性が示唆された。
土壌水分特性を用いたアジアモンスーン域における豪雨の季節予報

平成19年度は研究目的のひとつである現実的な土壌水分データによる降水量の再現性について大気大循環モデル(GCM)を用い研究を行った。具体的には、著者らが作成した現実的な土壌水分データを高解像度(約50km格子)のGCMに用いることにより、アフリカモンスーン域の雨季の開始時期並びに雨季の降水量の再現性が向上することが初めて示された。一方、中国から日本にかけての東アジアモンスーン域では6月の大気諸量の変動はチベットの陸面情報の高精度化によって改善されるという結果が得られた。降水変動に対しては明瞭な影響が見られなかったが、それはアンサンブル数(サンプル数)を今後増加することで更なる議論が行えるものと考えられる。また以上の結果をまとめ、論文の投稿を行った。長期滞在した米国NASA Goddard Space Flight Centerにおいて、本研究課題である土壌水分特性を用いた季節予報実験(2nd phase of Global Land-Atmosphere Coupling Experiment 2)の準備を行った。この実験には世界で約10大学・研究機関がそれぞれのGCMを用いて参加し、過去50年間の季節予報の再現実験を行い、土壌水分の初期値化による予報精度の影響を分析・検討するものである。著者は日本学術振興会特別研究員として季節スケールにおける土壌水分の役割について研究を行ってきた経験により、同研究プロジェクトを遂行する上で中心的な役割を担うこととなった。単一のモデルによる研究は得られた結果の物理的なメカニズムを解明する上で重要である一方、使用したモデルの特性による影響が否めない。現在進めつつある研究では世界の複数のモデルによる結果を得られることから、より定性的に信頼性の高い議論を行うことが出来るであろう。また結果の物理的な説明には、著者がこれまで行ってきた分析方法や研究成果が有用な手法かつ材料となることが期待される。研究代表者は東京大学気候システム研究センターならびに国立環境研究所により製作された大気大循環モデル(AGCM)を用い、降水変動に与える土壌水分等の陸面境界値の影響度の季節性に着目し評価を行った。実験方法は2種類のアンサンブル実験から構成される。一つ目(コントロール実験)は複数の初期値と月平均値の海面水温データを用いAGCMの計算を行うものであり、いずれの計算でも陸面過程の計算を行うため、大気過程と陸面過程には相互作用が存在する。一方2つ目の実験(陸面実験)ではコントロール実験と同様に複数の初期値と月平均海面水温データを用いた計算を行う。コントロール実験との違いは陸面過程の計算は行わずコントロール実験の1メンバーから計算される土壌水分等の陸面データを地表面における観測値と仮定して全ての陸面実験に毎時間ごと与えるというものである。両アンサンブル実験からメンバー問での降水変動のばらつきの程度をΩと呼ばれる類似度を示す統計指標で評価することにより、陸面データをメンバー間で同じものを与えることによる降水変動への影響度の評価を行った。Ωの統計的性質とΩを用いた新しい予測可能性評価手法に関してYamada et al.(in press)の通りである。その結果、アフリカサヘル地域の雨季の開始時期にあたる46月において降水変動は陸面の影響を特に強く受けることが示唆された。つまり陸面からの正しいもしくはより観測値に近い水・熱フラックスがモデルの中で再現されれば、同地域の雨季の開始の再現性の向上が見込まれることを意味するものである。
筋ジストロフィー犬における刺激伝導系プルキンエ線維の選択的障害の機序の解明

Duchenne型筋ジストロフィーの動物モデルである筋ジストロフィー犬では,作業心筋に病変が見られない早期からプルキンエ線維に変性が生じ,月齢に伴いジストロフィン分子種Dp71の発現増加とジストロフィンのホモログであるユートロフィンの発現が低下していた.また,活性化されたCa依存性プロテアーゼμカルパインにより基質である心筋型トロポニン-Iおよび-T,デスミンが分解およびユビキチン化を受けていた.Duchenne型筋ジストロフィーの動物モデルである筋ジストロフィー犬では,作業心筋に病変が見られない早期からプルキンエ線維に変性が生じ,月齢に伴いジストロフィン分子種Dp71の発現増加とジストロフィンのホモログであるユートロフィンの発現が低下していた.また,活性化されたCa依存性プロテアーゼμカルパインにより基質である心筋型トロポニン-Iおよび-T,デスミンが分解およびユビキチン化を受けていた.1)国立精神・神経センターでコロニーを確立したDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)の動物モデルである筋ジストロフィー犬(CXMD_J)では、生後2週齢頃からDMDやゴールデンレトリバー種の筋ジス犬(GRMD)と同様の心電図の異常Q波が出現し、7ケ月齢では全例に認められた。しかし、心臓超音波検査や病理学的検討では左室後壁の線維化は12ケ月齢以降に出現していた。異常Q波の成因として左室後壁の線維化による起電力の低下が指摘されてきたが、筋ジス犬の解析から異常Q波の出現が左室後壁の線維化に先行することが判明した。さらに、作業心筋に明らかな病変が見られない4ケ月齢のプルキンエ線維には著しい空胞様変性が見られ,透過型電子顕微鏡ではプルキンエ線維内の筋原線維の著明な断裂が確認された。プルキンエ線維では特異的に、1)ジストロフィンC端型アイソフォームDp71とジストロフィンのホモログであるユートロフィンが過剰発現し、月齢に伴いDp71の発現増強とユートロフィンの発現低下が起こっていること、2)Ca依存性プロテアーゼであるμカルパインが過剰発現し、基質である心筋型トロポニン-Iや-T,デスミンが分解されていることを見出し、プルキンエ線維の変性機構にユートロフィンの代償不全や筋タンパク質の分解が関与している可能性を指摘した。この筋ジス犬プルキンエ線維の変性が心電図異常や筋ジス犬で観察される心室性不整脈に関与している可能性がある。Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)の動物モデルである筋ジストロフィー犬(筋ジス犬)では、生後2週齢頃からDMDと同様の心電図の異常Q波が出現したが、心臓超音波検査や病理学的検討による左室後壁の線維化は12ヶ月齢以降に出現していた。そこで、刺激伝導系について詳細に検討した結果、作業心筋に明らかな病変が見られない4ヶ月齢のプルキンエ線維に著しい空胞様変性が見られ,透過型電子顕微鏡ではプルキンエ線維内の筋原線維の著明な断裂が確認された。さらに,プルキンエ線維では、ジストロフィンC端型アイソフォームDp71とジストロフィンのホモログであるユートロフィンが過剰発現し、月齢に伴いDp71の発現増強とユートロフィンの発現低下が起こっていた。また、Ca依存性プロテアーゼであるμカルパインが過剰発現し、基質である心筋型トロポニン-Iや-T,デスミンが分解されていた。さらに、免疫組織化学では、筋ジヌ犬のPurkinje線維では正常対照犬に比べてユビキチンおよびMuRF-1の強い染色性を認め、cTnIと共局在し、免疫沈降法によりユビキチン化を受けた断片化cTnIが検出された。筋ジス犬のプルキンエ線維の変性機構としてにユートロフィンの代償不全や筋タンパク質の分解とユビキチン化が関与している可能性をはじめて見出した。