hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顕著な生物活性と特異な化学構造を有するマクロライドの全合成研究

7-ブロモ-4,5-エポキシ-4-メチルへプタ-2,7-ジエノエートを基質とし、ボランによる還元的SN2'反応を行った。この基質は二つのアルケンがエポキシに隣接しているが、エステル側のアルケンだけがヒドリドと反応した。その結果、所望のZ型三置換アルケンを有するエステル化合物およびジオール化合物が生成した。これらは、それぞれ一段階でラクトンに変換後、さらに数工程で、ベンツリシジンの南半球部に相当し、ジヒドロピラン環を有するカルボン酸セグメントを合成した。別途、北半球部のポリプロピオネート部に相当するアルコールセグメントを合成し、これらをエステル化により連結した。最後に閉環メタセシスで20員環ラクトンを構築することになっていたが、様々な検討を行う中で、20員環ランクトンを形成すると途端に酸や塩基に弱くなることがわかった。そこで、全ての保護基を除去後、最終段階で閉環メタセシスを行った。その結果、数百ミリグラムレベルの合成を実現できた。現在、合成中間体の物性データを集め、投稿準備中である。ピペステライドBの最終的なマクロラクトン化反応は解決されてないが、その鍵工程は解決している。トルビエルチンの合成は、進展が遅れているが、ベンツリシンジンの全合成が完成した。不斉中心に囲まれたり片側が不斉中心に隣接したZ型三置換アルケンは、顕著な生理活性を有する天然物の部分構造として広く存在する。しかし、その合成は今なお困難な課題の一つである。申請者らは最近、エポキシ不飽和エステルからのZ型三置換アルケンの一段階合成法を見出した。エポキシ不飽和エステルをボラン・THF錯体と反応させると、エステルと隣接したアルケン炭素にヒドリドが攻撃する(SN2'反応)。反応は基質がS-cis構造をとったときのみ起こり、またヒドリドの攻撃はエポキシドと同じ側から起こる。本課題研究では、本反応を鍵工程として幾つかの天然物合成を検討してきた。そうした試みの中で昨年度は、ベンツリシジンの全合成に成功した。時間がかかってしまったが、2019年にほとんどの合成中間体の構造データをようやく揃えることができ、現在論文を執筆中である。また、2019年度は主に、トルビエルチンCの誘導体の合成に取り組んだ。トルビエルチンCは、冬虫夏草の一種から単離された化合物で、前立腺癌細胞の増殖阻害活性が報告されている。トルビエルチンCそのものは合成されてないが、その5ーエピ体(非天然体)は合成されている。興味あることに、その抗腫瘍活性はトリビエルチンCと同程度であるという報告もある。これらの化合物は二つの不斉中心に囲まれたZ型三置換アルケンを有している。そこで、われわれは8ーエピ体の全合成を検討した。その結果、Z型三置換アルケンを含む3位から11位までのポリケチド部位を合成した。また、そのカップリング相手となるフェニルアラニンとアクリル酸の縮合体を合成した。本研究課題の期間には間に合わなかったが、残る課題はポリケチド部とアクリルフェニルアラニンを連結するだけである。エステル化の後に閉環メタセシスを行う予定であり、近々合成できるものと考えている。合成後は、速やかに抗腫瘍活性を評価する予定である。2017年度はピペステリドBの大環状構造を構築することで、本化合物の最初の全合成を目指す。また同時にトルビエルチンCの合成研究を進めていく予定である。
脊椎動物におけるアドレノメデュリンファミリーの新規受容体の探索

本年度は、発現クローニングによって受容体遺伝子を同定するための準備段階として、まず対照として用いる既知のAM受容体遺伝子(CLR, calcitonin receptor-like receptorおよびRAMP, receptor activity-modifying protein)のウナギにおけるホモログのcDNAクローニングを行った。その結果、CLR1遺伝子の配列を決定し、この発現分布を調べたところ、浮き袋の奇網などの血管が豊富な組織に存在することがわかった。新規受容体は既知の受容体遺伝子と似た構造をもつと考えられるため、得られたアミノ酸配列をもとに、現在利用できる硬骨魚類のゲノムデータベースを検索したが、相同性による新規遺伝子の候補は見つけることができなかった。現在、タンパク質のアフィニティによる結合アッセイを行うため、RI標識したリガンド分子を準備中である。また、ウナギにおいてはAM1よりもAM2/AM5のほうがより強力な生理作用を示したが、このような現象が他の硬骨魚類でも一般的であることを確認するため、ウナギ以外の種においてもAMファミリーの機能解析を行った。ゼブラフィッシュの受精卵を用いてAMファミリーの各遺伝子をノックダウンすることで、発生・分化におけるAMファミリーの機能を解析しようと試みた。ゲノムデータベースの解析によって、ゼブラフィッシュにはAM2遺伝子が存在しないことが明らかになったため、AM2のパラログであるAM3、およびAM1、AM5の各mRNAに結合するアンチセンスモルフォリノオリゴを設計し、受精卵へのマイクロインジェクションを行った。その結果、AM1およびAM3遺伝子をノックダウンした群では血管分化の阻害が観察された。より顕著な表現型がみられたのはAM5をノックダウンした群であり、この群では頭部の水腫、赤血球の減少、運動性の著しい低下など多くの異常が観察された。現在、これらの部位の発生にかかわる遺伝子とAM5遺伝子との相互作用について解析を行っている。
多機能プロテアーゼインヒビター創製のための基礎研究

デイゴ種子キモトリプシンインヒビターECIは、1分子で2分子のキモトリプシンを阻害することが推定されているが、その詳細な阻害機構は不明である。本申請研究では、ECIの第一の反応部位Leu^<64>を他の19種のアミノ酸に置換した変異体と、N末端10アミノ酸残基を削除した欠損体、さらにECIに存在する4つのループ構造の各2残基を欠損した4種の変異体を作製し、それらのキモトリプシン阻害活性を調べた。Leu^<64>の変異体とループ構造の変異体は、それぞれ変異を導入したプライマーを用いた部位特異的置換法により、またN末端10アミノ酸残基の削除は、PCR法により作製した。変異体遺伝子の大腸菌内での発現は、発現ベクターとしてpET-22b、宿主菌としてBL21(DE3)株を用いた。キモトリプシンに対する阻害活性は、カゼイン法を用いて測定した。その結果、64位をアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンに置換した変異体は、野生型とほぼ同程度の阻害活性を保持していたが、その他のアミノ酸に置換した変異体の阻害活性は野生型の約1/5に低下していた。N末端10アミノ酸残基を削除した変異体は、ほとんど阻害活性を示さなかったが、4種のループ構造の変異体は完全な阻害活性を保持していた。本研究より、ECIにおいて、第一の反応ループの周辺構造がキモトリプシンとの相互作用に重要であることが示唆された。今後、第一の反応ループに位置する各アミノ酸の阻害活性への寄与をさらに詳細に調べていきたい。
配列特異的ＤＮＡ脱メチル化を促す非コードＲＮＡによる哺乳類神経分化制御機構の解明

本課題は、ラットPC12細胞の不可逆的な神経分化に関わるローカルなエピジェネティック制御因子promoter-associated noncoding RNA(pancRNA)の同定と作用機序の解明を目的としている。本年度は前年度に行ったPC12のダイレクショナルRNA-seq解析結果を元に、PC12の不可逆分化に関わる領域特異的エピゲノム制御因子である機能的非コードRNAであるpancNusap1を同定し、研究目標を達成した。RNA-seqデータの解析より、不可逆的に分化に関わるpancRNAとそのmRNAのペアとして、M期進行にかかわる遺伝子Nusap1とそのプロモーターから発現しているpancRNA、pancNusap1のペアに着目した。Nusap1とpancNusap1の発現状態はプロモーターのヒストンのアセチル化変化を伴って正に相関しており、細胞の増殖が活発なほど発現が高く、不可逆分化後は強く発現抑制されていた。レンチウィルスを用いたpancNusap1の人為的な発現抑制は、Nusap1遺伝子の発現抑制とNusap1プロモーター領域のヒストンアセチル化レベルの低下、細胞周期の停止を引き起こした。逆に、不可逆分化PC12におけるpancNusap1の人為的な過剰発現は、転写方向特異的に、Nusap1の発現上昇、Nusap1プロモーターのヒストンアセチル化レベルの上昇、さらには可逆的な分化状態への転換を促した。これらの事実から、PC12細胞の不可逆的分化過程では、cAMP依存的にpancNusap1の発現が抑制され、その結果Nusap1プロモーター領域のヒストンアセチル化レベルの低下を引き起こし、Nusap1の発現と細胞増殖がエピジェネティックに抑制された結果、不可逆的な分化を引き起こしているということが考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本課題は哺乳類神経分化制御に関わるローカルなエピジェネティック制御機構を明らかにすることを目的としている。神経分化のモデル系としてはNGF刺激により神経細胞様に分化するラットPC12細胞を用い、プロモーターからアンチセンス方向に転写されるpromoter-associated noncoding RNA(pancRNA)に着目し研究を進めている。本研究の骨子は以下の二点に要約される。[1]pancRNAを介したローカルなエピジェネティック制御機構の解明既に未分化特異的pancRNAが同定された遺伝子プロモーター領域からに対してバイサルファイトシーケンス法とChlP法により、NGFによる分化前後でエピジェネティックな制御に関わっているかを調べた。その結果、プロモーター領域のDNAメチル化変化を伴わずヒストン修飾が分化過程で変化しており、今回解析した未分化PC12細胞特異的pancRNAはヒストン修飾を制御することで訳NAの発現制御を行なっていることが予想された。また、未分化特異的pancRNAをshRNAによりノックダウンしたところ、未分化PC12細胞は細胞死を起こしてしまう現象が確認された。[2]細胞の分化記憶決定機構へpancRNAが果たす役割の解明PC12細胞はNGF刺激のみでは、分化後に未分化細胞培養条件にもどしてやると神経突起が収縮し、細胞周期が再び復活するが、NGFに加えてcAMPを分化メディウムに加えてやると、未分化細胞培養条件に戻しても細胞周期は復活せず、分化記憶が固定される。この系を用い、分化記憶を誘導あるいは維持することにpancRNAが機能しているという仮説を検証している。未分化PC12細胞、NGFのみ加えた分化細胞、NGFとcAMPを加えた分化細胞のダイレクショナルRNA-seq解析を行うため、今年度解析用cDNAライブラリーの作成を終了した。神経分化のモデル系としてはNGF刺激により神経細胞様に分化するラットPC12細胞を用い、プロモーターからアンチセンス方向に転写されるpromoter-associated noncoding RNA (pancRNA)に着目し研究を進めている。[1] pancRNAを介したローカルなエピジェネティック制御機構の解明前年度までにマイクロアレイのデータをもとにした解析からは、未分化PC12細胞特異的なpancRNAセットは同定できていたが、分化PC12特異的なpancRNAは同定することができていなかった。今年度はより検出可能なダイナミックレンジが大きく、エラー率の低い、ダイレクショナルトランスクリプトーム解析を行った結果、PC12分化過程でpancRNA,遺伝子ともに有意に発現上昇している38の遺伝子領域を同定することができた。一方、pancRNA、遺伝子がともに有意に発現減少している領域は116あった。[2]細胞の分化記憶決定機構へpancRNAが果たす役割の解明PC12細胞はNGF刺激のみでは、分化後に未分化細胞培養条件にもどしてやると神経突起が収縮し、細胞周期が再び復活するが、NGFに加えてcAMPを分化メディウムに加えてやると、未分化細胞培養条件に戻しても細胞周期は復活せしない。本年度はダイレクショナルトランスクリプトーム解析より、NGFのみで分化させた場合と比較して、cAMPによる分化記憶固定後のPC12細胞において、有意に発現の高いpancRNAをもつ38の遺伝子領域を同定した。さらにこれらの遺伝子群がPC12の分化記憶決定を左右しない場合も想定し、NGFのみで分化させた場合と比較して、cAMPによる分化記憶固定後のPC12細胞において有意に発現の高い1659のpancRNAを持たない遺伝子領城を同定した。

本課題は、ラットPC12細胞の不可逆的な神経分化に関わるローカルなエピジェネティック制御因子promoter-associated noncoding RNA(pancRNA)の同定と作用機序の解明を目的としている。本年度は前年度に行ったPC12のダイレクショナルRNA-seq解析結果を元に、PC12の不可逆分化に関わる領域特異的エピゲノム制御因子である機能的非コードRNAであるpancNusap1を同定し、研究目標を達成した。RNA-seqデータの解析より、不可逆的に分化に関わるpancRNAとそのmRNAのペアとして、M期進行にかかわる遺伝子Nusap1とそのプロモーターから発現しているpancRNA、pancNusap1のペアに着目した。Nusap1とpancNusap1の発現状態はプロモーターのヒストンのアセチル化変化を伴って正に相関しており、細胞の増殖が活発なほど発現が高く、不可逆分化後は強く発現抑制されていた。レンチウィルスを用いたpancNusap1の人為的な発現抑制は、Nusap1遺伝子の発現抑制とNusap1プロモーター領域のヒストンアセチル化レベルの低下、細胞周期の停止を引き起こした。逆に、不可逆分化PC12におけるpancNusap1の人為的な過剰発現は、転写方向特異的に、Nusap1の発現上昇、Nusap1プロモーターのヒストンアセチル化レベルの上昇、さらには可逆的な分化状態への転換を促した。これらの事実から、PC12細胞の不可逆的分化過程では、cAMP依存的にpancNusap1の発現が抑制され、その結果Nusap1プロモーター領域のヒストンアセチル化レベルの低下を引き起こし、Nusap1の発現と細胞増殖がエピジェネティックに抑制された結果、不可逆的な分化を引き起こしているということが考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。未分化PC12細胞特異的なpancRNAは分化過程で減衰し、ヒストン修飾状態を制御していることが示唆された。さらに未分化状態でノックダウンすると、細胞死を引き起こす未分化特異的pancRNAを同定した。また、ダイレクショナルRNA-seq解析のためのライブラリー調製も終わっており、おおむね計画通りすすんでいる。トランスクリプトーム解析におけるノンコーディングのRNAの解析パイプラインは明確には固定されていない、そのため今年度中に同定したpancRNAの機能解析を行う予定であったが周に合わなかった。しかしpancRNAの同定ま,では既におわっている。今後はRNA pull-down assayからのMS/MS解析によるpancRNA相互作用たんぱく質の同定を進めると同時に、ダイレクショナルRNA-seq解析からの分化記憶固定因子のスクリーニングを行う。
光誘起電子移動の分子サイズ効果

電子移動に起因する蛍光消光機構が電子移動反応の自由エネルギー変化△Gの値に依存するという新しい概念に基づいて、消光機構の△G依存性およびラジカル対内逆電子移動に対する(1)分子の持つ電荷の影響と(2)分子のサイズの影響を調べた。(1)蛍光体として芳香族化合物を、消光剤として2荷の正電荷をもつイオンを用いた系と、蛍光体として1荷の正電荷をもつN-メチルアクリジニウムイオンを、消光剤として芳香族化合物を用いた系の二つの系について、消光機構とラジカル対内逆電子移動に対する分子の持つ電荷の影響を調べた。その結果、(i)消光機構の△G依存性とラジカル対内逆電子移動に対して電荷の影響は無いこと、(ii)電荷の影響は、ラジカル対が解離してフリーラジカルを生成する過程に現れることを見いだした。(2)蛍光体として芳香族化合物を、消光剤として1荷の負電荷をもつ3原子から成るチオシアン酸イオンを用いて、消光機構とラジカル対内逆電子移動に対する分子のサイズの影響を調べた。その結果、(i)消光機構は△G>-1.0eVのときエキシプレックス形成、△G>-1.0eVのとき長距離電子移動であること、(ii)消光機構の切替が起こる△Gの値が、蛍光体と消光剤が共に芳香族分子の場合の-0.5eVから大きく負の側に変化した理由は、分子サイズの小さい3原子イオンを消光剤として用いたため、溶媒分子の再配向エネルギーが増加し、正常領域における長距離電子移動速度が減少したとして説明できること、(iii)2原子分子である酸素分子を消光剤として用いた場合、再配向エネルギーがさらに大きくなるため、消光機構の切替が起こる△Gの値はさらに大きく負の側に移動するので、蛍光消光は専らエキシプレックス形成によって起こることを見いだした。
網羅的がん遺伝子検査による膵がん個別化治療の実現可能性の検証に関する研究

今年度は北海道大学病院がん遺伝子診断外来を受診した膵がん患者を対象に実臨床におけるがん遺伝子パネル検査を用いた膵がんクリニカルシークエンスの現状および問題点につき以下のことを明らかにし、英語論文に報告した。1.筆者らの検討では実臨床における膵がん患者を対象としたクリニカルシークエンスにおいてPS:0, PS:1症例はそれぞれ全体の75%、10%であったが、PS:2症例も15%の症例で認められた。また、標準治療がすべて終了していない患者の割合は65%と、比較的早い段階でがん遺伝子パネル検査を申し込まれる患者も多く、膵がんの場合はその病勢を考慮すると、より早期からの適応が本来は望ましいと考えられた。2.膵がんクリニカルシークエンスでは核酸の品質不良あるいは収量不足による再生検率は25%であり、特に手術検体で14%、EUS-FNA検体で18%、ERCP検体で100%の再生検率であった。3.膵がんクリニカルシークエンスの有用性としてはActionable遺伝子異常の検出率は100%、Druggable遺伝子異常の検出率は35%であったが、最終的に遺伝子情報に基づいた治療を実施できた症例は全体の10%に過ぎなかった。4.膵がんクリニカルシークエンスにおいて5%の症例において膵発がんの原因と考えられる二次的所見が検出された。5.膵がんクリニカルシークエンスにおいて初回の外来診察から解析レポートの完成および患者への結果説明までのturnaround timeはそれぞれ20日、26日であった。検査申し込み後の生存期間中央値は10.3ヶ月であり、比較的早い段階で検査を希望される方が多い結果となった。研究実施場所が北海道大学病院から慶應義塾大学に異動し、体制が変わったため、作成したオリジナル膵がん個別化治療遺伝子パネルを使用した研究が遅れている。慶応義塾大学病院における膵がん症例を対象に本研究で作成したオリジナル膵がん個別化治療遺伝子パネルを使用した研究を推進する。2017年度は北海道大学病院がん遺伝子診断部を受診した膵がん患者を対象にクリニカルシークエンスの実臨床における現状をまとめた。膵がん20症例を対象に1実臨床で160のがん関連遺伝子を標的とした遺伝子パネル検査を実施し、再生検実施率(25%)、Druggable遺伝子異常検出率(25%)、二次的所見検出率(5%)、治療実施率(5%)、Turnaround time中央値(20日)、シークエンス実施後生存期間中央値(10.3ヶ月)などの膵がんクリニカルシークエンスにおけるreal-world evidenceを報告した。同研究成果を国内外の学会で報告し、現在英語論文を投稿中である。さらに本研究に付随して膵がん遺伝子検査用の検体採取における新たな検体採取法として肝予備能検査に用いるindocyanine green (ICG)蛍光法を用いたエコーガイド下肝腫瘍生検法を開発した。同法の有用性につき2018年度に国内外の学会で報告予定としている。また、膵がんにおける分子生物学的特徴が明らかになりつつあり、新たな治療標的の発見や低頻度ながらも既存の薬剤の治療標的となりうる遺伝子異常が検出されることが判明してきた背景から、Druggable遺伝子異常の検出率を向上させる目的で「膵がんの予後予測バイオマーカーとなりうる遺伝子群」「既存の抗悪性腫瘍薬の標的となりうる遺伝子群」「今後臨床導入が期待される抗悪性腫瘍薬の標的となりうる遺伝子群」「免疫チェックポイント阻害薬の有効性に関与する可能性が考えられる遺伝子群」の合計200の膵がん関連遺伝子を対象とした膵がん個別化治療開発に有用なオリジナル膵がん遺伝子パネルを作成した。今後、患者由来検体を対象に同遺伝子パネルの有用性を検証予定としている。膵がん患者における市販の遺伝子パネル検査でのActionableおよびDruggable遺伝子異常の検出率、および実臨床における問題点が明らかになった。本研究課題における最重要事項であるオリジナル膵がん遺伝子パネルの作成が2017年度内に終了し、実際の患者検体での検証を見込める段階になったため。検査申し込み後の生存期間

中央値は10.3ヶ月であり、比較的早い段階で検査を希望される方が多い結果となった。研究実施場所が北海道大学病院から慶應義塾大学に異動し、体制が変わったため、作成したオリジナル膵がん個別化治療遺伝子パネルを使用した研究が遅れている。今後は現在開発中のオリジナル膵がん遺伝子パネルを用いて、患者検体での有用性を検証する。具体的には現在英語論文投稿中の160のがん関連遺伝子を標的とした遺伝子パネル検査の成績と新たに開発した200の膵がん関連遺伝子を標的としたオリジナル膵がんパネルの有用性を比較検証し、ActionableおよびDruggable遺伝子異常の検出率の向上や新たな治療標的の検出につき検証する。慶応義塾大学病院における膵がん症例を対象に本研究で作成したオリジナル膵がん個別化治療遺伝子パネルを使用した研究を推進する。当初本助成金より支出予定であった試薬代などに他の研究費を充てたため。繰り越し分に関しては2017年度の研究成果の英語論文発表に係る費用に充てる予定。研究実施場所が北海道大学病院から慶應義塾大学に異動し、体制が変わったため、使用を予定していた臨床検体が使用できず、作成したオリジナル膵がん個別化治療遺伝子パネルを使用した研究が一時止まったため。今年度に慶應義塾大学病院の症例を対象に新たに研究を再開する計画としている。
操作履歴情報の利用によるVR可視化の高効率化

VR可視化の高効率化を目的として、VR可視化ソフトウェアVFIVEで記録した操作履歴中から、特定の有用な操作群を抽出するための手法を検討した。また、操作履歴の表示および選択のための携帯端末用ユーザインタフェースに対して、検討した手法を実現する為の機能の実装を行った。VR可視化の高効率化の一環として、VFIVEを安価なヘッドマウントディスプレイ型VR装置上でも動作するようにし、デスクサイドVR可視化環境を構築した。VR可視化ソフトウェアVFIVEで記録した操作履歴中から、ユーザが再適用する可能性が高い操作群を抽出するための手法を検討するとともに、操作履歴の表示および選択のための携帯端末用グラフィカルユーザインタフェース(GUI)に対して、検討した手法を実現する為の機能の実装を行った。本年度は、1.ユーザの自発的操作に基づく特定操作群の抽出、および、2.適用された可視化操作間の時間間隔に基づく特定操作群の抽出、の二つのアプローチでの抽出方法の検討を行った。1.では、得られた可視化結果が有用であると感じた際に、ユーザ自身が操作履歴中にその旨を記録するための可視化操作をVFIVEに実装し、携帯端末上ではその直前の操作群のみを表示・選択可能となるような機能をGUIに対して実装した。この際、ユーザによる記録操作時の可視化画像についても、携帯端末上で確認できるようにした。本手法を用いることにより、携帯端末上に全ての操作が提示される場合と比較してより短時間で目的の描画結果を再描画することができることを確認した。2.では、VFIVE上での可視化操作により記録される操作履歴情報の構成要素として、各操作が適用された時刻情報を新たに付与し、操作間の時間間隔が一定の閾値を超えた場合、ユーザが比較的長時間観察した、即ち特徴的な三次元構造を持つ描画結果が得られたために長時間の観察行動が発生したと推定し、その直前の操作群のみを携帯端末上に表示する機能をGUIに対して実装した。被験者実験を実施し、適当な時間間隔の閾値を設定した場合において、幾つかの可視化操作群を抽出できることを確認した。抽出した操作群中に有効な描画結果を導く操作が含まれているかについては、引き続き評価を行う予定である。VR可視化の高効率化を目的とし、CAVE型VR装置用可視化ソフトウェアVFIVEでユーザが適用した操作履歴中から、有効な操作、すなわちユーザが再適用する可能性が高い操作群のみを抽出するための手法を検討するとともに、操作履歴の表示および取捨選択のための携帯端末用グラフィカルユーザインタフェースに対して、検討した手法による操作抽出を実現する為の機能の実装および検証のための検討を引き続き行った。また、本研究の主目的であるVR可視化の高効率化のための一検討として、本研究で用いているCAVE型装置用VR可視化ソフトウェアであるVFIVEをHMD型VR装置(Oculus Rift)上で動作するようプログラムの移植を進めた。本装置は立体映像の提示だけでなく、ヘッドトラッキング機能を有しているため、大型かつ高額のCAVE装置および開発用ライブラリを持たない環境、例えば研究者がデスクに居ながらにしてCAVE装置のような没入感の高いVR可視化環境を構築することができる。このため、当初計画において研究成果の可搬型プレゼンテーション環境として予定していた、プロジェクタを使用したシステム構成よりも効果的かつ実用的なものとなった。CAVE装置用プログラムをHMD環境で動作させるための移植作業は困難であったが、現在までにオリジナルバージョンのVFIVEが有する可視化機能の多くの動作が確認できるまでに移植が進んでいる。本システムについては、VR関連の研究会においてデモンストレーションを実施、システムやそのユーザインタフェース等について体験者から意見を聴取した。バーチャルリアリティ(VR)技術を用いたデータ可視化の高効率化を目的として、CAVE型VR装置用可視化ソフトウェアVFIVEを、ヘッドマウントディスプレイ(HMD)型VR装置であるOculus Rift上で動作するよう、プログラムの移植を前年度に引き続き実施した。前年度までの研究において未実装だった可視化機能について移植をほぼ完了させると共に、同じく未実装であったメニュー選択による可視化機能の切り替えや、適用する可視化パラメータの変更についても、Oculus Riftのヘッドトラッキング機能とワイヤレスコントローラでの操作を組み合わせることにより、CAVE型VR装置での実行時と同様の操作を可能とした。更に、Oculus Rift前面に取り付けた二眼カメラで取得した実映像に対して3-D CGによる可視化結果をオーバレイ表示することにより、装置を装着していない他者との間でコミュニケーションを取りながら可視化作業を進めることも可能とした。これはCAVE型VR装置用VFIVEには無い新しい機能である。本移植により、大型かつ高額なCAVE型VR装置を持たずとも、研究者はデスクに居ながらにして没入感の高いVR環境での可視化を行うことが可能となった。前年度までに実施した、VFIVEの操作履歴中から一定条件を満たす操作群(再適用に値する有効な操作群)のみを抽出するための手法の検討および操作履歴の表示および取捨選択のためのユーザインタフェースの開発および評価と併せて、全研究期間を通じて本研究の主目的であるVR可視化の高効率化に資する研究を実施することができた。

平成25年度に実装した特定操作の抽出手法について、被験者実験を通じた有効性の評価を行うべく準備を進めていたが、本年度内の実施には至らなかった。しかしながら、本年度開始したHMD型VR装置へのVFIVEの移植により、可搬型VR可視化環境の構築については大きな進捗が見られた。本研究の主目的はVR可視化の高効率化にあることから、研究計画には変更があったものの当初目的とは合致するものと考える。データ可視化提案手法の有効性に関する評価を進めるとともに、可搬型VR可視化環境の構築を進める。現在使用しているHMD型VR装置においては外界環境の把握が困難であるが、外部映像入力装置の利用による現実空間(実写映像)と可視化結果(3-D CG)との重ね合わせ(MR)表示機能を実装することでこれを解決する。以上、全体の研究結果を総括し、本研究におけるデータ解析手法の有効性と課題について、結論を得る。本計画は、CAVE型VR装置を用いた三次元データの可視化に関し、装置外に出ることなく、ユーザが適用した全ての可視化操作の履歴中から、そこに点在する有用な操作群のみを効率的に抽出することでデータ解析の効率向上を目的としたものである。当初計画として掲げた、全操作履歴情報中から特定の条件を満たす操作群のみを抽出する手法については、おおむね予定通りに携帯端末用ユーザインタフェースに対する実装が完了した。しかしながら、その有効性に関する評価についてはまだ不十分な点もあるため、今後引き続き評価を進める。可搬型のプレゼンテーション環境の構築にあたり、同環境において使用する映像提示装置であるHMD型装置への可視化ソフトウェアの移植を行ったが、購入予定であったグラフィックスハードウェアのスペックの検討を更に重ねる必要が生じ購入しなかったため、未使用額が生じた。本年度実装した、履歴情報中に含まれる情報に基づく特定操作群の抽出手法の有効性に関する評価を進める。また、新たなアプローチとして、可視化操作により得られた描画結果に基づき、特定の操作を抽出する手法についての検討および実装を進める。本研究においてVR可視化ソフトウェアとして用いているVFIVEはCAVE型VR装置での動作を前提としたものであるが、このような大型かつ特殊な装置を使用できない環境下でのVR可視化プラットフォームとして、3-D表示可能なプロジェクタ等を使用した可搬的な立体映像表示環境を構築し、プレゼンテーション等の実施が可能なシステムの構築についても進める。HMD型立体映像提示装置に適したグラフィックスハードウェアへの更新の他、論文投稿費用に使用する。当初計画では平成25年度設備備品としてグラフィックスワークステーションの導入を予定していた。これは可搬型のプレゼンテーション環境を構築するためのものであったが、同環境において使用する映像提示装置として、計画立案時には販売されていなかった安価なHMD型装置を複数台使用したシステムについて現在検討を進めている。
ロマン主義における信仰対象の変容と『ドイツ伝説集』の精神史的特性の解明

本研究は、ドイツ精神文化史において、グリム兄弟のコスモロジー(宇宙観)がどのような位置づけにあるのか解明することを試みたものである。『ドイツ伝説集』は、ドイツの説話伝承文学史上、重要な位置にありながらも、その構成が意図的なされたものでないとの誤解をうけたことよって、伝説の配列は充分に把握されていなかった。そこで伝説各話の配置に関する概念と、ロマン主義の詩的精神の関係性について論じるために、超自然的な力を持つモティーフの問題を検討した。本研究の目的は、19世紀前半にグリム兄弟によって編纂された『ドイツ伝説集』を題材としており、平成23年度の研究実施計画では、『ドイツ伝説集』に収録されている伝説の類話の調査を主としていた。ドイツ本国においても、『ドイツ伝説集』の類話研究とその比較は、ごく限られた数種類のモティーフ研究に留まっており、グリム研究において、調査が進んでいない分野といえる。平成23年(2011年)10月16日から、ドイツの伝説に関する調査とドイツ民俗学研究者との意見交換を目的に、ドイツ南西部のフライブルク市を中心に資料叡集のため渡航した。ドイツ語圏と近接する国々の膨大な伝説を集めたグリム兄弟は、『ドイツ伝説集』の名にふさわしいと彼らが考える伝説を抽出し、それをひとつの伝説集として再構築したが、第二次世界大戦以降、ドイツナショナリズムの問題と新しい神話」運動の関連が指摘され、『ドイツ伝説集』についても、現在は『グリム童話集』研究の一資料としての取り扱いしかされていないのが現状である。渡航先である南西ドイツのフライブルク市のヨハネス・キュンツィヒ・インスティテュートJohannes-Kunzig-Institut fur ostdeutscheVolkskunde in Freiburgにある「フライブルク・ザーゲ資料所」FreiburgefSager Sagenarchivには、『ドイツ伝説集』をはじめとする19世紀から20世紀に編纂された種々の伝説資料が数多くあり、幸運にもグリムの出典研究に必要な資料を見せて頂くことができた。この資料所の責任者であるMichael Prosser-Schell先生と、創立者である故Lutz Rohrich先生の共同研究者であったGertraud Meinel先生のご厚意によって、貴重な資料を写すことをご許可頂いた。この資料所に所属されている研究者たちの専門領域は、ドイツ民俗学であり、『ドイツ伝説集』資料が文学的な研究対象としては重視されていないということを確認した。前述の指摘の通り、ナショナリズム問題による研究の体系化の遅れがその原因であり、わが国において『ドイツ伝説集』を文学的視点、とりわけ説話研究の手法を活用し、その分析を進めることは、今後のグリム研究に寄与するものと思われる。これらの研究成果の一部は、すでに阪神ドイツ文学会に投稿し掲載予定であるが、さらなる研究結果については2012年度に本研究センターにおいて発表したい。資料の和訳による術語のデータ化については、現在日本の説話研究で使用されている術語及び用語との相違に注意を払って、整理を進めている。本研究は、19世紀初頭に公刊されたグリム兄弟の『ドイツ伝説集』を研究対象としている。研究の目的は、ドイツ語圏の伝説研究の視点から、『ドイツ伝説集』を中心にヨーロッパ文化の表層にある正統派キリスト教と、その深層にある「異教的・異端的なもの」を解明することにあった。この研究テーマを平成23年度から継続してきたが、平成24年度においては、特に伝説における〈腐らない遺体〉のモティーフに注目し、死体が引き起こす怪異に関する伝承について比較を行った。〈腐らない遺体〉モティーフは、キリストの不朽遺体伝承にはじまり、肉体の一部が生前の姿のまま残る話など、東西にさまざまな型がみられるが、『ドイツ伝説集』における話型は、死者でありながら生前と同じ生活を続けるという型が主であった。伝説集に描かれている〈腐らない遺体〉の伝承は、死者の生前の身分・立場(王・英雄、聖者、市民)によって、話型を大別できる。また、死者が生前に行った善行、あるいは生前の超人性、死に至る過程の特殊性から、さらに分類することが可能であることがわかった。そして、この話型は、語りの目的によって使い分けがあり、『ドイツ伝説集』の腐らない死体は、死者が市民の場合には死への哀惜が、王・聖者・英雄の場合には死を超越する個人の能力、あるいは王や聖者が果たすべき使命の重要性が語られていた。伝説における死体の超越的な力は、土・火・水・気で表される四大要素のうち、土の属性に起因しており、『ドイツ伝説集』が、死体を含む土の属性と関連の深いモティーフを中心に構成されていることを明らかにした。またヤーコプ・グリムの研究書である『ドイツ神話学』から、伝説の原型について論じ、キリスト教が普及する以前のドイツ語圏の自然信仰との関連を指摘した。本研究は、『グリム兄弟「ドイツ伝説集」のコスモロジー』として、鳥影社から2013年に出版されることとなった。

平成23年度の研究計画である南西ドイツのフライブルク市のヨハネス・キュンツィヒ・インスティテュートJohannes-Kunzig-Institut fur ostdeutscheVolkskunde in Freiburgにある「フライブルク・ザーゲ資料所」FreiburgefSagerSagenarchivでの資料収集を計画通り実施できた。この資料所の責任者であるMichael Prosser-Schell先生と、創立者である故Lutz Rohrich先生の共同研究者であったGertraud Meinel先生のご厚意によって、貴重な資料を写すことをご許可頂いた。これらの成果の一部については阪神ドイツ文学会発行の『ドイツ文学論攷』第53号に投稿し掲載された。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、平成23年に実施した調査資料をもとに、「民衆の信仰対象の変容解明」をテーマとして、伝説や神話における「死体」について取り扱う。ワーグナーの小オペラ「ファールンの鉱山」について、『ワーグナー事典』の執筆者であり、研究代表者の博士課程での指導教官であった谷本慎助教授との継続的な意見交換を行う。『ドイツ伝説集』における異教的・異端的な要素を含む伝承モティーフについて、類話の検討を予定している。なお、その研究成果については、神戸大学国際文化学研究科の異文化研究交流センターでの発表を行い、論文の投稿の準備を進めている。現在、研究代表者が妊娠中のため、体調によっては産休を取得する可能性があり、研究の遂行上遅延の可能性が生じる場合には、研究期間の延長申し出を考えている。
シュガーボールによる新しい高分子医薬の基盤開発

(a)シュガーボールカプセルの合成:優れた細胞認識能を有し、かつカプセル化の効率が高い、新規の糖・脂質ハイブリッド型シュガーボールの合成を行った。デンドリマーとしては、生物学的応用も考慮して、工業的に生産されているポリ(アミドアミン)デンドリマーを用いた。糖ペプチド部分の合成には、糖置換アミノ酸N-カルボキシ無水物(糖NCA)を使用し、ペプチドN末端にラウロイル、カプロイル、ブチリル基を導入した。これらのシュガーボールあるいは前駆体の精製に、備品として購入したタンパク質精製装置が極めて有用であった。ゲスト分子として、薬剤モデルのANS(1-アニリノナフタレン-8-スルホン酸)の封入を行った。また、新規デンドリマー関連重合体として、ポリリシンを軸ポリマーとするシリンダー状デンドリマー(シュガーシリンダー)を合成した。デンドリマー分岐鎖部分は、ポリ(アミドアミン)骨格を用いた。デンドリマーの化学構造は、NMR, IR, MALDI-TOF MSなどの測定により確認し、大スケールでの合成を行った。(b)薬物および遺伝子送達システムへの応用:(b-1)薬物送達システム:シュガーボールの細胞認識能を、ヒママメレクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により評価した。蛍光プローブ(ANS)カプセル化シュガーボールでも、同様の試験を行い、その分子認識能に差がないことを明らかにした。(b2)遺伝子送達システム:シュガーボールカプセルとプラスミドDNAとの複合化を電気泳動、CD測定などにより解析した。レクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により、細胞標的性を調べた。DNAがシュガーボールに巻き付き、レクチンと結合することを明らかにした。シュガーボールとDNAとが複合化した状態で、シュガーボールは極めて高い分子認識能を示すことを見出した。さらに、ポリリシン型シュガーシリンダーについて、細胞認識の評価、DNAとの複合化の調査、遺伝子導入の評価などを行なった。ポリリシンを軸とするシュガーボールは、末端糖鎖間隔が低世代で最適化でき、細胞認識能の向上が期待できる。また、分子形状の特徴から、DNAとの複合化についても好適と考えられ、シュガーボール/DNA複合林については、電荷比を変えた実験において、複合化能力を詳細に調べた。分解酵素に対する優れた耐性があることを明らかにし、DNAの高次構造についてもCD測定などにより考察した。合成と機能評価で得られた知見を相互に交換することによって、効率よく実用化に向けた、構造、手法の最適化を行った。(a)シュガーボールカプセルの合成優れた細胞認識能を有し、かつカプセル化の効率が高い、新規の糖・脂質ハイブリッド型シュガーボールの合成を行った。末端アミノ基には、脂肪酸を導入した。また、糖ペプチド部分の合成には、糖置換アミノ酸N-カルボキシ無水物(糖NCA)を使用した。

続いて塩化ラウロイル、塩化カプロイル、塩化ブチリルなどとの反応により、ペプチドN末端にアルキル基を導入した。脱保護にはヒドラジンを用いた。これらのシュガーボールあるいは前駆体の精製に、備品として購入したタンパク質精製装置が極めて有用であった。ゲスト分子として、薬剤モデルとしてANS(1-アニリノナフタレン-8-スルホン酸)の封入を行った。(b)薬物および遺伝子送達システムへの応用(b-1)薬物送達システム:シュガーボールの細胞認識能を、ヒママメレクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により評価した。蛍光プローブ(ANS)カプセル化シュガーボールでも、同様の試験を行い、その分子認識能に差がないことが明らかになった。(b-2)遺伝子送達システム:シュガーボールカプセルとプラスミドDNAとの複合化を電気泳動、CD測定などにより解析した。さらにレクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により、細胞標的性を調べた。DNAがシュガーボールに巻き付き、さらにレクチンと結合することを明らかにした。シュガーボールとDNAとが複合化した状態で、シュガーボールは極めて高い分子認識能を示すことを見出した。(a)ポリリシン型シュガーボールカプセルの合成平成12年度で得られた知見を活かし、デンドリマーおよび脂質バリアーのアルキル鎖長を変えた糖・脂質ハイブリッド型シュガーボールの合成を行った。また、デンドリマーとして、ポリリシンを軸ポリマーとするシリンダー状デンドリマー(シュガーシリンダー)を合成した。デンドリマー分岐鎖部分は、ポリ(アミドアミン)骨格を用いた。デンドリマーの化学構造は、NMR,IR,MALDI-TOF MSなどの測定により確認した。大スケールでの合成を行った。(b)薬物および遺伝子送達システムへの応用ポリリシン型シュガーシリンダーについて、細胞認識の評価、DNAとの複合化の調査、遺伝子導入の評価などを行なった。ポリリシンを軸とするシュガーボールは、末端糖鎖間隔が低世代で最適化でき、細胞認識能の向上が期待できる。また、分子形状の特徴から、DNAとの複合化についても好適と考えられ、シュガーボール/DNA複合体については、電荷比を変えた実験において、複合化能力を詳細に調べた。分解酵素に対する優れた耐性があることを明らかにし、DNAの高次構造についてもCD測定などにより考察した。合成と機能評価で得られた知見を相互に交換することによって、効率よく実用化に向けた、構造、手法の最適化を行った。
遷移金属触媒を用いる新規二酸化炭素固定化反応の開発

二酸化炭素の有効利用技術の開発は環境・資源両問題における重要な課題のひとつである。本研究ではニッケル錯体を用いることにより二酸化炭素の化学的固定を行い、カルボン酸合成法の開発について検討を行った。通常、オレフィン類と二酸化炭素の酸化的環化反応は高圧を必要とするが、メチレンシクロプロパン等歪みのかかったオレフィンでは常圧でも反応することを我々は見出している。今回はメチレンシクロプロパン(約13kcal/mol)よりも歪みエネルギーの小さいノルボルネン(約9.6kcal/mol)のカルボキシル化について検討した。1気圧の工酸化炭素雰囲気下、ベンゾノルボルナジエンにNi(cod)2およびDBUを作用させた後、塩酸で処理したところ目的とするカルボキシル化生成物が25%の収率で得られた。続いてリチウム塩の添加効果を検討したところ、興味深いことに用いたアニオンに応じて収率が向上することがわかった。トリフルオロメタンスルホン酸塩(25%)やヨウ化物(22%)ではほとんど添加効果がないのに対し、臭化物(45%)、塩化物(56%)と順に収率が向上し、フッ化物では66%収率と最もよい結果を与えた。一方カチオンの影響はあまりなくリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩いずれも同等の収率であった。これは生成したニッケララクトンとこれらの塩がトランスメタル化することにより、強固なニッケルーフッ素結合を形成し、より安定化されたためと考えられる。常圧の二酸化炭素雰囲気下、メチレンシクロプロパンにニッケルO価錯体とアミン塩基を作用させることにより炭酸固定が進行し、カルボン酸が得られることを見出した。興味深いことに、用いる反応溶媒およびアミン塩基によって異なるカルボン酸が得られた。アミン塩基としてDBUのようなアミジンを用いた場合、酸化的環化反応経由で反応が進行し、トルエン溶媒ではシクロプロパンカルボン酸が得られた。一方、同様にDBUを用いた場合においてもNMPのような極性溶媒中で反応を行うと、中間体として生成したニッケララクトンのβ-炭素脱離が進行し、アクリル酸誘導体が得られた。また、アミン塩基としてアミジンよりも塩基性の高いグアニジンであるMTBDを用いると三員環が開裂した直鎖状のγ,δ-不飽和カルボン酸が得られた。これは上記のDBU塩基の系とは異なる反応機構で進行していると考えられる。すなわち、ニッケル錯体がメチレンシクロプロパンのproximalな炭素-炭素結合間に挿入し、生成したニッケル-sp^3炭素結合間に二酸化炭素が挿入することによって生成したと考えられる。なお、重水素化実験の結果、本反応においてMTBD窒素原子上に存在するメチル基のC-H結合活性化が起こっていることを明らかにした。本研究の成果は二酸化炭素をC1資源として活用したカルボン酸の新しい合成法の開発と同時に、効率的な合成における重要な素ステップとして注目されている炭素-水素結合の活性化を見出した点で有意義である。本研究では二酸化炭素の化学的固定によってアミノ酸へと変換することに成功した。1気圧の二酸化炭素雰囲気下、一置換アレン類にニッケル0価錯体およびアミジン塩基であるDBUを作用させたところ、酸化的環化反応によってニッケララクトンが生成した。続いてこのニッケララクトンに求電子的なアミノ化反応剤であるジベンゾイルジアゼンを作用させたところ、アミノ化が進行し、アレンの末端炭素上にアミノ基が、中央の炭素にカルボキシル基が導入されたβ-アミノ酸誘導体が位置および立体選択的に得られた。本反応はエーテルおよびカルボン酸エステル、またフタルイミドなどが共存していても進行することを確認した。また、アレンに加えて、末端アルキンやベンジリデンシクロプロパンでも同様の反応が進行した。アルキンの場合には末端炭素上にカルボキシル基が、内部炭素上にはアミノ基が導入され、Z体のみが生成する。ベンジリデンシクロプロパンにおいては三員環の開裂を伴うことなく反応し、シクロプロパン環上にカルボキシル基が、ベンジル位にアミノ基が導入された。また、得られたアミノ酸誘導体は窒素-窒素結合を持つ。これは2価ヨウ化サマリウムによって切断することができた。この際、低温で処理することによってα,β-不飽和エステルの還元を抑えることに成功した。以上、本研究では二酸化炭素をC1資源として利用し、不飽和炭化水素のアミノカルボキシル化を実現した。この結果は反応性に乏しい二酸化炭素を反応させ、付加価値の高い化合物へと変換できる可能性を示したという点で興味深いと考えられる。

トリフルオロメタンスルホン酸塩(25%)やヨウ化物(22%)ではほとんど添加効果がないのに対し、臭化物(45%)、塩化物(56%)と順に収率が向上し、フッ化物では66%収率と最もよい結果を与えた。一方カチオンの影響はあまりなくリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩いずれも同等の収率であった。これは生成したニッケララクトンとこれらの塩がトランスメタル化することにより、強固なニッケルーフッ素結合を形成し、より安定化されたためと考えられる。
過冷却プログラム凍結したヒト肝幹細胞を利用した再生外科治療の橋渡し的基礎研究

ヒト肝細胞の分離に際してドナー細胞採取に係る安全性の検討と手技の確立を企図した。安全かつ効率的なドナー採取の手技を確立しビデオも併せて報告した。ドナー細胞採取時の乳酸値の意義を明らかにした。術後の合併症に関して一定の基準を作成し提案した。ドナー採取におけるハーベスト方法に関して解剖学的領域による検討を行った。細胞の栄養バランスとしてBCAAの重要性に関して臨床的意義を明らかにした。肝幹細胞のバンク化を目指し、検体材料から細胞分離と細胞の性質を解析した。その過程で、継代可能な肝幹細胞の単離と培養に成功し、特許を出願した。肝再生置換療法のための肝幹細胞の抗原発現と細胞のセレクションを行った。これまでに肝幹細胞のバンク化を進めていく上で、検体材料から細胞分離と細胞の性質を解析してきた。その過程で、継代可能な肝幹細胞の単離と培養に成功し、現在、特許を出願したところである(特願2016-16210号)。培養基質に工夫を加え、基質Xと基質Yを使用することで、再増殖可能な肝細胞の培養法を開発した。加えて、基質特異的な細胞接着性を発見し、発表の準備を行っている。これらの中心的研究に加えて、副次的研究については公開し、発表してきた。細胞単離のためには脳死ドナーや生体ドナーが考えられる。細胞移植の為に過大な侵襲を宿主に与えることは倫理上許容範囲を逸脱しており、低侵襲な組織採取法の開発が望まれる。細胞採取に際して腹腔鏡を使用した方法は、理想的ではあるが、手術の難易度は高く、術中に起きうる出血などの偶発症に対応しにくい。体外式に肝血流をコントロールする方法を開発し、特許を取得した(特許第5788893号)ので、紙面にて発表した(Mizuguchi T, et al. Surg Laparosc Endosc Percutan Tech 2015;25:e16-20)。従来の開腹手術と腹腔鏡手術の成績を比較することは容易ではなく、倫理的にも質の高い研究は計画しにくい。統計学的に均一な対象を選択するプロペンシティー解析を用いて、手術の短期成績と長期成績に関して明らかにした(Meguro M, Mizuguchi T, et al. Surgery 2015 ;158:573-87)。また、対象患者の年齢によっても手術の成績は異なることが推測されるが、これまでの多くの報告では若年者と高齢者に相違を認めていなかった。そこで、メタ解析を疾患ごとに行い、高齢者に特有な手術リスクを明らかにした(Mizuguchi T, et al. Surg Today 2015;45:259-270)。これに加え、体外式人工肝臓への応用を考慮した胆管再構成の基礎実験に着手し発表した。キメラマウスを作成し、現在、解析を行っている。加えて、細胞単離と培養法の開発に成功し、特許の申請を行うところまで終了した。当初の研究計画では予想されなかった成果であり、計画以上と考えている。肝再生置換療法の効率化を目指し、肝幹細胞の抗原発現と細胞のセレクションを行った。CD45- TER119-CD31- EpCAM- ICAM-1+は、アルブミンとHNF4を発現する肝細胞であった。8週齢からのこの細胞は81.9%に単核細胞を認めたが、20週齢では48.0%と減少していた。EpCAM+ICAM+細胞はアルブミンを発現しないが、EpCAM- ICAM-1+はアルブミンを発現しており、この細胞分画に肝幹細胞が含まれている可能性が高い。実際、この細胞をマトリゲル上で培養し、OSM添加することで単層培養の肝細胞と比較してもアルブミン産生は高く、CYP3A4の発現も見られる。肝細胞再生置換モデルにこの細胞を使用した場合、移植前にOSMで前処理することで再生置換効率が上昇した。このことは、OSMによって選定された肝幹細胞の再生誘導を促進する方法を発見し、ヒト細胞への応用が期待できるものと考えている(Tanimizu N, Mizuguchi T, et al. Stem Cells, 2016)。肝細胞にやや分化傾向にある小型肝細胞はThy1+に細胞に含まれている。肝細胞の再生置換モデルで発生する小型肝細胞クラスターは、Thy1を高率に発現しており、クラスターをマイクロダイセクションし、遺伝子の網羅的解析を行った。結果としてIL17RBの遺伝子発現が亢進しており、リガンドのIL25の誘導が予想された。類洞内皮細胞にIL17RBの誘導を確認し、Kupffer細胞にIL25の誘導を確認した。これらの誘導と小型肝細胞クラスターの形成は生体内でクラスター内に見られたことから、IL25の誘導と関連伝達系の活性化が小型肝細胞のクラスター形成に関与していることを証明した(Ichinohe N, Mizuguchi T, etal. Stem Cells, 2017)。

細胞の栄養バランスとしてBCAAの重要性に関して臨床的意義を明らかにした。肝幹細胞のバンク化を目指し、検体材料から細胞分離と細胞の性質を解析した。その過程で、継代可能な肝幹細胞の単離と培養に成功し、特許を出願した。肝再生置換療法のための肝幹細胞の抗原発現と細胞のセレクションを行った。ドナー細胞の確保は、合併症を作らず、安定して採取できている。動物実験・遺伝子組み換え動物の使用許可で時間を取られている以外は、ほぼ順調を考えている。キメラマウスの解析を行い、凍結細胞のロット確認を行っていく。特許の申請に加えて、企業への導出を念頭に開発交渉に入りたい。消化器外科平成27年度以降の研究計画細胞障害評価:過冷却保存細胞は37°Cの温浴槽にて急速加熱を行い、細胞遠心後の凍結液上清中のAST/ALTおよびLDHを測定する。細胞の一部は蛍光標識によるDead/Alive cell検出キット(Molecular Probe)により二重標識を行い、顕微鏡下でシグナルを解析し生存率を決定する。コントロールにTrypan Blueによる評価も行う。また、解凍後に生理食塩水で洗浄し、30分の氷上整置後の細胞にも同様の解析を行う。逸脱酵素の測定と細胞状態の形態学的検討により、もっとも良い条件の凍結保存方法が開発できる。最終的にはApoptosis検出キット(Molecular Probe)および細胞内ATPの測定と走査電顕による形態観察を追加する予定である。凍結・解凍ヒト小型肝細胞培養実験:一部の細胞はわれわれの開発したヒト肝細胞培養を行う。凍結ヒト小型肝細胞を解凍し培養・薬物代謝酵素の誘導・確認試験を行う。培養後1日目に生着率および生存率(細胞障害評価を参照)を検討し、リファンピシンによるCytochrome P450 Cyp 3Aの誘導実験を行い、RT-PCR法およびWestern blot法により酵素誘導能を確認する。また、BrdUラベルによる免疫染色により細胞増殖能を評価し、in vitro標準培養ヒト肝細胞の適正を検討する。ヒト化肝臓ハイブリットマウスの作製:マウスにはIL-2Rγnull (NOG)マウスを使用する。肝臓には放射線を照射し、48時間後に脾臓内過冷却保存ヒト肝細胞移植(5 X 105 cell/animal)および新鮮ヒト肝細胞移植(5 X 105 cell/animal)を行う。前回までの検討では、放射線照射を検討項目としていたが、重度免疫不全モデルでは持続する肝炎が観察されることから必ずしもこれを必要としない。そこで、複数の同様モデルの再生置換率を1ヶ月、3ヵ月とし最長で6ヶ月の観察を行い比較検討する。脾内肝細胞移植では脾臓下極より27G針によりマイクロ顕微鏡下に移植を施行予定。動物実験委員会による審査の結果、遺伝子組み換え動物実験の申請・許可が条件となり、この申請手続きに時間を要し、当初に予定していた動物購入ができなかったため、次年度にその分を繰り越した。