hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語文章推敲支援ツールの実用化に関する研究

日本語文章推敲支援ツール「推敲」は、日本語ワードプロセッサなどで作られた日本語文章ファイルを解析して、推敲に役立つ情報を書き手に提供することを目的としたツールである。我々は、「推敲」を大型計算機の上に先ず開発した。しかし、大型機には使用上の制約があったり、ユーザインタフェースが不十分であったりして、文章作成のような個人的な仕事を大型機上で行うのは快適ではない。この研究では「推敲」の機能強化、ユーザインタフェースの向上、利用者層の拡大を期し、これをパソコン上で実現した。1.パソコン上で「推敲」を開発するに先立って、正規化日本語テキストに基づく高速文字列照合アルゴリズムのパソコン上での実行可能性を確認した。2.我々の研究室で収集した機械可読の日本語テキスト約百万字を分析した結果から、受身形、接続助詞「が」、否定表現、とりたて詞、指示詞などの候補を高速に検索する字面解析手法を考案した。これらの手法を別の約3百万字の日本語テキストに適用して手法の有効性を評価した。3.パソコン版「推敲」は、1万字の文章中から、指定した条件を満たす文字列を1秒以内に全て検索して表示可能とすることができる。「推敲」のコマンドを構成しているプリミティブな処理単位を、基本コマンドとしてユーザに開放し、ユーザがそれらを組み合わせて、多様な処理を行なえるようにした。処理速度の速さと、ユーザインタフェース設計の自由さが大型機版と比べて大きいこととによって、人間とコンピュータとの協力系として実用的なルーツに発展させることができた。4.使用手引書を作りパソコン版「推敲」を63年度いくつかの大学の研究者に配布して評価を求めた。反応速度には満足してもらっている。編集機能に注文がついている。使用手引書をオンライン化し、「推敲」使用中にヘルプ機能として参照できるようにした。日本語ワードプロセッサの主な仕事は文章の入力,書式の設定,文書の出力と保存であって、文章の推敲を積極的に助けるわけではない。しかし、ワードプロセッサで作られた文章は機械が読める形式で蓄えられているので、計算機で文章の中に踏み込んで推敲に役立つ情報を取り出し、質の高い文章を作る助けをしたい。我々は数年前から九州大学大型計算機センターのFACOM-M382のOS【IV】/F4日本語処理環境(JEF)のもとで日本語文章推敲支援ツール『推敲』の開発を行って来た。しかし、文章作成の基本はあくまで個人的作業である。この研究では、すでに大型計算機上にプロトタイプを実現し、仕様の大部分が確定しているソフトウェアを、個人用計算機(ワークステーションあるいはパーソナルコンピュータ)上に使用できるようにして実用化と普及とを図ろうとするものである。個人用計算機上での実現には処理速度や記憶容量の厳しい制約を考慮せねばならぬ。1.個人用計算機における日本語文字コード体系と日本語ワードプロセッサで用いる日本語テキストのフォーマットとを調査した。個人用計算機上に正規化日本語文字コードに基づく日本語テキスト処理パッケージを構築した。個人用計算機上で、正規化日本語テキストに基づく高速パターンマッチングアルゴリズムの実行可能性を確認した。2.上記1.を利用して、ワークステーション上に『推敲』の既存の機能を移し換えることができた。しかし個人用計算機を考慮したマン-マシンインターフェースは不十分であり次年度の研究課題である。3.我々の研究室で収集した機械可読の日本語文章ファイル約百万字分を解析し、文字の出現頻度に基づく字面解析法を考案した。

これによって文章中から接続助詞『が』や、受身形の検出を高速に行うことができる。これを『推敲』の機能拡張に応用する。日本語文章推敲支援ツール「推敲」は、日本語ワードプロセッサなどで作られた日本語文章ファイルを解析して、推敲に役立つ情報を書き手に提供することを目的としたツールである。我々は、「推敲」を大型計算機の上に先ず開発した。しかし、大型機には使用上の制約があったり、ユーザインタフェースが不十分であったりして、文章作成のような個人的な仕事を大型機上で行なうのは快適ではない。この研究では「推敲」の機能の強化やユーザインタフェースの向上、利用者層の拡大を期して、これをパソコン上で実現した。1.「推敲」では、日本語文章の解析に文法処理や辞書を用いず、字面解析を行なうことによって、すばやい処理を可能にしている。文法解析をしないでも、推敲に役立つ情報を高い精度(95%以上)で抽出することができることを明らかにした。2.パソコン版「推敲」は、1万字の文章の中から指定した条件を満たす文字列を1秒以内に全て検索して表示可能とすることができる。処理速度の速さと、ユーザインタフェース設計の自由さが大型機版と比べて大きいこととにより、人間とコンピュータとの協力系として実用的なツールにすることができた。「推敲」のコマンドを構成しているプラミティブな処理単位を、基本コマンドとしてユーザに開放し、ユーザがそれらを組み合わせて、多様な処理を行なえるようにした。3.使用マニュアルを作りパソコン版「推敲」を本年度いくつかの大学の研究者に配布(東京工大、東京農工大、筑波大、京都大、早稲田大、慶応大、山梨大、静岡大、名古屋工大、日大、熊本大)して評価を行なってもらった。静岡大情報工学科では学生演習に使用している。4.マニュアルをオンライン化し「推敲」を使用中にヘルプ機能としてマニュアルを参照できるようにした。
卵巣腫瘍のエストロゲンレセプターの機能と腫瘍性格に関する研究

過去の研究において、上皮性卵巣腫瘍がエストロゲン(E)産生能を有していることを、内分泌学的,組織化学的,免疫組織化学的,超微形態学的に証明してきたが、一方では、この腫瘍が性ステロイドレセプターであるエストロゲンレセプター(ER),プロゲステロンレセプター(PR)を有することが判明しており、特にER値とエストロゲン産生能との間に密接な相互関係があることを確認してきた。この事実は、本腫瘍が何等かの機能においてホルモン依存性を有するものと推測される。そこで、上皮性卵巣腫瘍が有するER,PRについて、腫瘍の組織学的特徴,ならびに腫瘍内E産生能との関連において検討し、その生物学的意義に関して移植腫瘍,培養細胞を用いて検討した。DCC法により測定した腫瘍組織のER,PR陽性率は、全症例では、それぞれ62.2%,22.2%とERの陽性率がより高率であった。ER陽性率は、閉経前より閉経後腫瘍に、また良性より悪性腫瘍により高率に認められた。組織型では、ムチン性腫瘍に最も高率であったが、腫瘍細胞の組織学的分化度との関連では、高分化型に高率を示した。腫瘍組織内E値が高値を示すものはすべてER陽性を示し、E産生量とER量との間に相関が認められた。autoradiographyによる検討では、分化型細胞に集中して標識エストラジオールのgrainを認め、標識エストラジオールは細胞質より核内に移行することが確認された。ヌードマウス移植実験ではE投与による腫瘍増大速度の促進は認められず、また培養細胞系でもEによる細胞増生の促進効果を認めなかった。すなわち、上皮性卵巣腫瘍細胞におけるER存在の機能的意義は、Eによる細胞増殖の過程に関与するものではなく、むしろ癌細胞の分化に関わる可能性が推測された。
生態系モデルによる資源管理に関する基礎的研究

本研究は漁獲対象資源を含む生態系の挙動をモデル的に解析し、複数種を同時に考える資源管理に必要な基礎的知見を得ることを目的としている。対象水域は従来から研究を行っている東京湾とし、管理の対象としては小型底曳網漁業の重要種であるシャコとマコガレイとした。まずシャコとマコガレイそれぞれの資源について個別に検討した。本年度はシャコについては年齢・成長・産卵などの生活史に関する知見をまとめた。シャコの産卵期は48月で、4・5月と7・8月の2回、産卵盛期がある。最初のピークは2歳以上の個体が主であり、後のピークには1歳の個体の寄与が大きい。48月に産れた稚仔のうち早いものはその年の秋(11月頃)から、また遅いものは翌年の春(4・5月)に漁獲されるようになる。近年、漁獲は周年に及び、漁獲のピークもあまり明瞭でなくなってきた。漁獲量も増えている。寿命はほぼ2年半と考えられる。マコガレイについては産卵期は122月で、5・6月頃1.4歳ほどで網にかかるようになるが、出荷制限サイズに達するのは夏、1.8歳ほどである。年齢査定と銘柄が漁獲量を基に、年齢別の漁獲尾数を求め、マルチコホート解析を行い、漁獲係数、資源量を推定した。自然死亡係数は寿命から推定したが、雌雄で異なるので、解析は雌雄別に行った。1980'87年の加入完了後の総資源尾数は350920万尾と推定された。毎年の漁獲率はかなり高い。このほか東京湾内湾の生態系の機能の経年変化を吟味する一環として、基礎生産と漁業生産の関係の考察も進めた。これによれば、富栄養化のため基礎生産は非常に増大したが、これが必ずしも漁業生産に流れず、効率が大きく低下されたことが示唆される。現在1988年の漁獲統計も加え、試験底曳結果、各種の食性調査に基づき、東京湾内湾の生態系の骨格構造を検討中である。この後にシャコとマコガレイのこの相互関係も考慮した資源管理について考察を進める。本研究は東京湾内湾域を対象水域とし,こゝでの生態系モデルを作成し,これの資源管理への有用性を検討することを目的としている.生態系モデルを用いて資源管理を行う対象種としては小型底曳網漁業の重要種であるシャコとマコガレイとした.本年度はまず東京湾における各種漁業の漁獲統計を整理し,魚種別漁獲量の経年変化を明らかにした.対象種であるシャコは東京湾の環境悪化が最も著しかった昭和40年代半ばに一時漁獲が皆無になったが,その後復活し,現在ではそれ以前を超す漁獲量となっている.特に近年増加が目立ち,昭和61年には年間漁獲量が1000トンのレベルとなっている.近年の特徴は小型が多いことと冬期の漁獲が多いことで,漁獲圧力が過剰になっていることが懸念される.一方マコガレイも昭和40年代後半から漁獲量が増加したが, 50年代半ばにやゝ低迷した.その後変動はあるが,かなり高い漁獲水準を保っている.本種は夏期に漁獲量が多いが,近年春にも小さいピークが見られる.この両種については産卵・成長・成熟等の調査も行い,生活史について予備的にまとめた.また試験底曳による分布調査も行っているが,この結果からはシャコ・マコガレイとも分布が近年拡大している傾向が認められる.この試験底曳で得られた標本について食性調査も行い,まだ十分ではないが,食物連鎖の構造を把握することに努めている.このように今年度は東京湾の生態系の骨格構造について検討するための基礎資料を蓄積し,一部解析を行った.なお,生態系の現在の状態を検討するために漁獲物に流れた基礎生産量の試算も多多良モデルを用いて行った.来年度はさらに必要な情報の蓄積に努めるとともに,これらの情報に基づいて東京湾の生態系モデルを構築し,その中でのシャコ,マコガレイ資源の動態を検討する.その際,モデルをこの2種を中心としていかに簡略化できるかが,有用性を決める鍵となろう.本研究は漁獲対象資源を含む生態系の挙動をモデル的に解析し、複数種を同時に考える資源管理に必要な基礎的知見を得ることを目的としている。漁獲量も増えている。

自然死亡係数は寿命から推定したが、雌雄で異なるので、解析は雌雄別に行った。1980'87年の加入完了後の総資源尾数は350920万尾と推定された。毎年の漁獲率はかなり高い。このほか東京湾内湾の生態系の機能の経年変化を吟味する一環として、基礎生産と漁業生産の関係の考察も進めた。これによれば、富栄養化のため基礎生産は非常に増大したが、これが必ずしも漁業生産に流れず、効率が大きく低下されたことが示唆される。現在1988年の漁獲統計も加え、試験底曳結果、各種の食性調査に基づき、東京湾内湾の生態系の骨格構造を検討中である。この後にシャコとマコガレイのこの相互関係も考慮した資源管理について考察を進める。
コラーゲンアンカリングによる成長因子徐放システムを用いた歯周組織再生の研究

歯周病に対する再生治療剤である塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の適応症拡大を目指して,コラーゲン結合ドメイン(CBD)に着目してきた。CBDとbFGFから成るCBFGFを,ラットの水平性骨欠損モデルに投与するとbFGF単体と比較して歯槽骨再生を促進することが示された。CBDと他物質との組み合わせも期待できるが,これまでの大腸菌生産系による融合タンパク質ではコストと時間を要する。そこで,化学架橋法によってCBDと生理活性物質を連結し,その汎用性を高めることを考えた。本研究では,架橋型CBFGFを作製して有効性を確認し,新たな物質としてCBDとBMPから成る架橋型CBBMPの有効性を評価する。
セキュアグループ通信における多重帰属の鍵管理を容易化する秘密分散方式に関する研究

本研究では、秘密分散技術により鍵は分割され、各メンバとサーバが分割された異なる鍵(メンバ部分秘密鍵、サーバ部分秘密鍵)を所持し、サーバ部分秘密鍵とある一つのメンバ部分秘密鍵によりグループ公開鍵で暗号化されたメッセージを復号できるようなグループ通信システムを想定する。あるメンバが複数のグループに多重帰属しているとき、そのメンバは復号に必要なメンバ部分秘密鍵を複数所有する。多重帰属のために複数の鍵を利用者が管理することは負担であることから、本研究では単一の部分秘密鍵で多重帰属できるセキュアグループ通信方式の開発をした。グループ内のメンバでセキュアに通信を行うとき、一般に、メンバはグループ通信のための鍵を所持する。本研究では、秘密分散(Secret Sharing)技術により鍵は分割され、各メンバとサーバが分割された異なる鍵(メンバ部分秘密鍵、サーバ部分秘密鍵)を所持し、サーバ部分秘密鍵とある一つのメンバ部分秘密鍵によりグループ公開鍵で暗号化されたメッセージを復号できるようなグループ通信システムを想定する。多重帰属のために複数の鍵を利用者が管理することは負担であることから、本研究では単一の部分秘密鍵で多重帰属できるセキュアグループ通信方式の開発を行う。本研究では、グループファイル共有を具体化したシステムの実装を通して、セキュアグループ通信方式の要素技術の確立を目標としている。平成21年度は、メンバがすべてオンラインと仮定し、閾値暗号技術、分散秘密情報の再分散技術、分散秘密情報のリフレッシュ技術を組み合わせて、グループの初期構築と動的な構成変更ができ、かつ、多重帰属するメンバの部分秘密鍵を単一化する機能を有した、セキュアグループ通信の基本手順であるサーバとメンバの段階的復号を実現する秘密分散方式を実現した。そして、システムの設計とサーバとメンバのソフトウェアの一部を実装した。閾値暗号技術、分散秘密情報の再分散技術、分散秘密情報のリフレッシュ技術を組み合わせて、グループの初期構築と動的な構成変更ができ、かつ、多重帰属するメンバの部分秘密鍵を単一化する機能を有した、セキュアグループ通信の基本手順であるサーバとメンバの段階的復号を実現する秘密分散方式を実現し、システムの設計とソフトウェアの実装を行った。また、シミュレーションにより現実的な時間でグループファイル共有ができることを確認した。
象牙質に特異的な非コラーゲン性蛋白質の機能に関する研究

デンチンシアロ蛋白質(DSP)とホスホホリン(PP)とは、いずれも象牙質に特異的な非コラーゲン性蛋白質である。両者は単一の遺伝子DSPPにコードされており、特にPPは象牙質の石灰化に関与する可能性が高いと考えられている。この遺伝子産物の生化学的性質と生理的な役割とを明らかにすることを目的として、まず、ラットの切歯より抽出した全RNAを用いて、PCRによりDSPP遺伝子をクローニングし、シーケンスを行った。この遺伝子のPP部分は繰り返し配列の多い特異な構造をしており、シーケンスは困難を極めた。次に哺乳動物での発現プラスミドpcDNA3.1(-)にDSPP遺伝子を組み込み、これをFuGENE6を用いて、それ自体で石灰可能を示すマウス骨芽細胞用細胞MC3T3-E1と、この細胞の培養上清を培地に加えたときに石灰化するラット歯髄由来株化細胞RPC-C2Aとに導入し、G418耐性の安定発現株を複数単離した。これらの細胞がDSPPmRNAを発現していることはノーザンブロッティングとRT-PCRとで確認した。しかしDSPとPPの抗体は市販されていないため、蛋白質レベルでの発現は確認できなかった。von Kossa染色および石灰化物のカルシウム量を定量することで、これら細胞のもつ石灰可能について検討した結果、これら細胞の示した石灰化度は一様ではなく、またMC3T3-E1細胞の培養上清によるRPC-C2A細胞の石灰化誘導も一律ではないことがわかった。この原因として、細胞内でDSPとPPとが切断されて機能できる構造をとっていない可能性、DSPPと共に他の因子が組み合わさることで石灰化が制御されている可能性が考えられた。したがって、今後、DSP、PPと協調的に石灰化を制御する因子を探索すると共に、両蛋白質のペプチド抗体を作成して、さらなる機能解析を行う必要があると考えられた。まずクローニングできたと考えられるデンチンシアロホスホ蛋白質(DSPP)遺伝子の塩基配列をサイクルシーケンス法により決定することを試みた。その結果、得られた遺伝子は他の生物種(マウス、ヒト)のそれと相同性が高く、クローニングした遺伝子がDSPPであると考えられた。しかしながら、同時期に他のグループよりラットのDSPP遺伝子のシーケンスが発表された。そのデータと比較すると、一部に全く異なる配列が存在することがわかった。このことは、どちらかのシーケンスが間違っている可能性と、部分的に塩基配列が異なるmRNAが複数存在する可能性とがある。そこで両方の可能性を考え、予定通り遺伝子導入の実験を進める一方で、再度遺伝子をとることを試みることにした。遺伝子導入の方は、まずDSPP遺伝子を最も一般的な哺乳動物細胞発現用プラスミドであるpBK-CMVに組み換え、大腸菌株XL1-Blueで増やすことを試みたが、増やせなかった。DSPP遺伝子の特異な構造が大腸菌の生長に悪影響を及ぼしている可能性が考えられたので、別の一般的な発現用プラスミドであるpc DNA3.1(-)に組み換え直し、大腸菌株SURE2を用いて再度試みたところ、今度はうまくプラスミドをとることができた。次にこれを、それ自体で石灰化能を示すマウスの骨芽細胞様細胞MC3T3-E1と、このMC3T3-E1細胞の培養上清存在下で石灰化する、ラット歯髄由来株化細胞RPC-C2Aとに導入し、G418耐性の複数の安定発現株を得た。これらについてノーザンブロッティング法によりDSPP mRNAの発現を、von Kossa染色ならびにカルシウム定量により石灰化度の違いを調べた。その結果mRNA量は増加しているが、石灰化度の変化は一様ではなかった。現在この原因究明、及び新たにDSPP遺伝子をとり直す実験を平行して進めている。

この原因として、細胞内でDSPとPPとが切断されて機能できる構造をとっていない可能性、DSPPと共に他の因子が組み合わさることで石灰化が制御されている可能性が考えられた。したがって、今後、DSP、PPと協調的に石灰化を制御する因子を探索すると共に、両蛋白質のペプチド抗体を作成して、さらなる機能解析を行う必要があると考えられた。
トンボのなわばり防衛行動の比較とその維持機構の解析ー系統進化学的観点から

トンボの縄ばり制と闘争行動については、カワトンボ類(カワトンボ科)とコナカハグロトンボ(ミナミカワトンボ科)について観察した。ニシカワトンボの闘争行動は、5パターンに分けることができた。これ等の闘争行動は、種によって多少違いが認められるものの、オオカワトンボにも適用することができた。コナカハグロトンボでも闘争行動のパターンは同様であったが、闘争中に体を左右に振るのがその特徴であった。これ等の行動観察から闘争行動は系統進化と深く関係していることが示唆された。闘争行動の分析から、ニシカワトンボの橙色翅雄と透明翅雄の雌の獲得戦略は、前者が縄ばり維持で後者がスニーカー戦術であり、同じ戦略がオオカワトンボの橙色翅雄と薄茶翅雄によって採用されていることが明らかになった。コナカハグロトンボの雌の獲得は縄ばりによるが、産卵場所の雄の個体数が多い時は、縄ばりを占有せず集団待期をすることがわかった。電気泳動は、ニシワカトンボとオオカワトンボでアイソザイムを検出した。ニシカワトンボとオオカワトンボでは、泳動先端に近い3本のバンド(E_1、E_2、E_3と記す)に顕著な差が認められるので、これ等を指標として識別することにした。ニシカワトンボでは、E_1ーE_3バンドの出現率は74.3%、57.9%、5.0%であり、一方、オオカワトンボではそれぞれ3.8%、80.8%、63.5%であった。この結果から、バンドE_1ーE_2とE_2ーE_3の組み合わせで両者の違いを明らかにできることが示唆された。ショウジョウトンボの染色体数は、九州本土の各地と南西諸島で採集して調べた。その結果、染色体数は奄美大島より南側の標本では、2♂n=25.n=13で、屋久島より北側の標本では2n♂=24、n=12であることが分かった。これから、日本には少なくとも2亜種のショウジョウトンボが生息していると考えられる。トンボの縄ばり防衛行動については、ニシカワトンボ,オオカワトンボとその他のカワトンボ類およびコナカハグロトンボ(ミナミカワトンボ科)について、直接観察とビデオカメラで記録し、これをスロービデオ装置で再生して、これ等のトンボについて行動分析を行った。その結果、縄ばり防衛行動は分類学的な類縁関係を超えて、共通する幾つかの基本パターンに分けられた。すなわち、縄ばり防衛行動が多様化しているカワトンボ類を中心にすると次のようになる。(A)縄ばり雄が侵入雄を一方的に追う行動、(B)縄ばり雄同士が互に追い合い、向かい合ってから急に方向を変えて戻る行動、(C)ある限られた範囲で輪を描く行動、(D)前の行動に続いて、次第に上昇し、互いに平行になって停止飛翔しながら急激に上昇したり(約30cm)、もぐり込んだりする行動、(E)前の行動をしている時に、両個体が急激に10cm位上昇する行動。勿論これ等の行動は種によってデリケートに異なり、例へば、コナカハグロトンボでは(B)と(C)の行動で体のローリングを伴い、これまで他に例を見ない特異的な興味深い行動も観察された。行動の観察・記録を行った種は、採集して必要な処理をして研究室に持ち帰り、電気泳動装置でアイソザイムパターンの分析を行った。トンボの胸筋をすりつぶし、エステラーゼ・アイソザイムを測定した結果、多数のバンドに分離された。泳動先端より4本のバンド(【E_1】

【E_4】)の変異により、ニシカワトンボとオオカワトンボの雌および雄の各タイプについて分離することができた。一方、ショウジョウトンボを九州本土の各地と種子島以南の南西諸島で採集し、染色体の分析を行った結果、トカラ列島を境に以北と以南で染色体数が異なることが明らかになった。この事は、日本には少なくとも二亜種が生息していると考えられ、新知見となる。カワトンボ類の縄ばり防衛行動については,昨年の分類パターンにしたがって,ニシカワトンボとヒガシカワトンボで対比させると共に,両種(亜種)内における各行動パターンの持つ意義について,縄ばり維持機構の観点から考察した(業績発表,図書).コナカハグロトンボ(ミナミカワトンボ科)については,調査河川の支流部と本流部で,雌の獲得方法が異なった.すなわち,支流では縄ばりによって雌の獲得を行い,その防衛行動に微妙な行動の違いはあっても,基本パターンはカワトンボと同じであった.一方,本流では産卵場所が集中しているため,その場での雄密度が非常に高く,最早縄ばりの維持はコストに合わず,集団待機となる.この場合は,基本パターンの幾つかは見られるものゝ,雌の出現による飛び立ち後(見誤りによる飛び立ちも含め)の雄間の干渉を避けるような行動,つまり,各個体が素早く元の位置に戻ってとまる行動をとっているように見受けられた.カワトンボの電気泳動については,同所的に生息するニシカワトンボとオオカワトンボでは,次のようになった.泳動先端に近い3本のバンド(E_1, E_2およびE_3)が特に顕著な変異を示し,ニシカワトンボではE_1を89%, E_2を67%, E_3を11%の個体が発現した.これに対し,オオカワトンボではE_1が9%, E_2が81%, E_3が72%であった.基本的には, E_1とE_2, E_2とE_3の組合せで,両種(亜種)の差異が明らかにできると思われる.しかし,この数値が示すように,必ずしも明確な差異とは言えず,むしろ,同所性のゆえに起こる種(亜種)間交雑を示唆するものであり,実際の観察と合わせて交雑の頻度を推定する手がかりになることが期待される.ショウジョウトンボの染色体分析は,採集地点を増やした結果,トカラ列島を境に,南では染色体数2nA1E9=25, nA1E9=13,北では2nA1E9=24, nA1E9=12であることが,一層明確となった.
^<18>F-標識PET診断プローブ合成用マイクロリアクターの開発

マイクロリアクターでの^<18>F-標識合成を目的に、使い捨てのチップを用いてサイクロトロンで製造される^<18>F-イオン水から電気化学的に^<18>F-イオンを捕集し、次に極性を逆転させてK+を取り込んだK.222とのコンプレックスとして少量(<60μL)のアセトニトリルやジメチルスルフォキシドなどの無水溶媒中に放出させることで濃縮する迅速な自動システムを完成させた。このように濃縮された^<18>F-イオン溶液を反応基質溶液と混合して加熱したマイクロ流路に通し、^<18>F-標識FDG、FLT、FMISO、フルマゼニル等のマイクロリアクター標識合成を行った。反応時間、温度、溶媒などが収率に与える影響を調べた結果、マイクロリアクターによる^<18>F-フッ素置換反応は極めて迅速であり、効率的であることを見出した。電気化学的手法によりマイクロフローセル内で^<18>F・イオンを迅速かつ効率的に捕集・濃縮し、マイクロスケールでの^<18>F・標識薬剤合成を実現することを本研究は目的にしている。初年度では、以下の1-3)の課題について研究を進め、次年度につながる成果を得た。1)^<18>F-イオンの捕集と脱着条件の最適化:電極材料としてグラッシーカーボンと白金を主に用い、捕集時のターゲット水の流速、捕集と脱着時の印加電圧、脱着時の温度、の各パラメータに関して最適化を行い、ターゲット水からの捕集効率90%、無水アセトニトリルへの脱着効率85%で、^<18>F-イオンを分離濃縮することができた。2)フローセル用ステーションとシリンジポンプシステムの試作および自動化:使い捨てのフローセルチップを固定して加熱および印加可能なステーションを設計し、ターゲット水や溶媒などをセルに流すためのシリンジポンプ-バルブモジュールを組み込んだ小型のシステムを試作した。専用インターフェイスとLabViewによる制御プログラムを開発し、PCで全自動的に^<18>F-イオンの捕集と脱着を行うことに成功した。3)有機溶媒中に濃縮された^<18>F-イオンの反応性の評価:相間移動触媒(K.222)を含む無水アセトニトリルで^<18>F-イオンをフローセルから回収し、[^<18>F]FDG合成をバッチ的に行って反応性を評価した。その結果、通常の標識反応と同等の合成収率が得られ、本システムで濃縮して取り出される^<18>F-イオンは高い反応性を保持していることが確認された。以上の結果から、平成20年度ではマイクロリアクターで種々の^<18>F-標識反応を試みることが可能となった。初年度において確立した^<18>F-フッ素イオン濃縮用フローセルチップを用いて、本年度は以下の項目に関して研究開発を進め、所定の成果を得た。●電気化学的手法による18F-フッ素イオンの濃縮効率を測定した。2mLのターゲット水を出発溶液として、<18>F-フッ素イオンを含む濃縮有機溶媒であるDMSOやアセトニトリルの容積を、フローセルからの^<18>F-フッ素イオンの溶出プロファイルを測定することで評価した。<18>F-フッ素イオンは約40μLの溶媒中に濃縮できる結果を得た。これに基づき、次年度ではセルの形状を工夫することで、回収効率を犠牲にすることなく30μL以下に濃縮することを目指す。●^<18>F-フッ素イオンの捕集・濃縮処理の迅速化を図つた。昨年度では15分以上要した自動操作を、プログラムを改良することで約5分までに短縮できた。●濃縮された^<18>F-フッ素イオンを、マイクロリアクターでの標識反応に用いるため、インターフェイス技術について検討を加え、6方バルブとモニタリング用の小型放射能検出器を利用する効率的な方法を開発した。これにより、反応用のマイクロチップに反応性のある^<18>F-フッ素イオンを連続的(オンライン的)に導入することが可能になった。●PET診断用標識合成薬剤として最も有用な[^<18>F]FDGについて、上記方法を用いて標識合成を行い、^<18>F-フッ素化の効率が90%以上の標識合成が可能であることを実証した。次年度においては、分離精製法を含めたトータルなシステムの構築を図る。本研究の最終年度であり、以下の成果を挙げ研究をまとめた。●^<18>F-フッ素イオン濃縮チップの連続使用に関し、使用回数と回収効率の関係を求めた。

同一チップを10回まで連続使用しても、効率は60%前後で変動するが顕著な低下は観測されなかった。●標識反応利用可能な^<18>F-フッ素イオンを全自動的に迅速に調製するシステムを完成させた。●これらの成果をApplied Radiation Isotopes誌に投稿し受理された。●この濃縮された^<18>F-フッ素イオンをマイクロリアクターでの標識反応に応用し、その反応性の高さを実証した。[^<18>F]FDG合成では、1分以内に90%以上の放射化学的収率で^<18>F-置換反応がほぼ完了した。引き続き室温での6分間のアルカリ加水分解を行い、ほぼ定量的に[^<18>F]FDGを得ることができた。フルオロアルキル剤である臭化フルオロメチル、フルオロメチルトシレート、フルオロエチルトシレート、すでにその有用性が求められている診断プローブであるFMISO、フルマゼニル、FLT、フルオロプロリン、フルオロ酢酸について、反応基質濃度、温度、時間および溶媒(アセトニトリル、DMSO、DMF)に対する依存性を調べた。反応はいずれもほぼ2分以内に完了し、マイクロリアクターの利点である迅速な反応がこれらの反応でも同様に観察された。反応収率は基質濃度と温度、そして特に反応溶媒に大きく依存し、DMFがDMSOに比べ高い収率を与えた。●HPLC精製を念頭に固相抽出法による前精製/濃縮を検討したが、満足のいく成果は得られなかった。従って、既存の技術ではマイクロスケールでのHPLC精製を実現できないと結論した。今後、マイクロリアクター処理に適する新たな濃縮法の開発が、^<18>p-標識プローブのマイクロスケール合成には不可欠であると考える。
定説を覆す電位依存的制御メカニズムを有するNa+チャネルの光生理学的解析

Xenopus tropicalis由来のTwo-pore Na+ channel 3(XtTPC3)について、2つの電位センサードメインの果たす役割の違いについて電気生理学的手法を用いて解析を行った。XtTPC3においては2つの電位センサードメインのうち主にドメイン2がチャネル全体の電位依存性に寄与していることが解った。また、XtTPCは長期の脱分極刺激によって電流量が増大するという特性を持つが、これがホスホイノシチドに依存していることを解明した。さらに、このホスホイノシチド依存性にはドメイン1のS4/S5リンカーおよびS6領域に存在する正電荷のクラスターが重要であることが解った。Two-pore Na+ channel (TPC)は、同一分子内に電位依存性カチオンチャネルに共通する基本単位を2つ持つ。TPCがこのようなリピート構造を持つ意義を明らかにするため、以下の実験を行った。手法としては、ツメガエル卵母細胞を発現系とし、二電極膜電位固定法によりXenopus tropicalis由来のTPC3 (XtTPC3)の電気生理学的解析を行った。(1) XtTPC3は高電位刺激を数秒間与えることで電流量が顕著に増大するという特徴的な電位応答性を持つ。解析の結果、この現象は高電位刺激によってTPC3自体の電位依存性が変化するためであることが解った。さらに、この電位依存性変化は特定のホスホイノシチド(PI)に依存すること、および、このPIがリピートIに結合することを示唆する結果を得た。この結果からは、リピートIがPI依存的な活性制御に特化していることが示唆される。また、電位依存性に重要なS4へリックス上のアルギニン残基への変異をリピートIとIIの両方において試したところ、リピートIIへの変異は電位依存性を大きく変化させるのに対し、リピートIの場合はほとんど影響がないことが解った。これらの結果から、リピートIとIIの役割には違いがあることが示唆された。(2)膜電位固定下化学蛍光検出法(voltage clamp fluorometry; VCF)をXtTPC3に適用し、リピートIIの膜電位依存的な構造変化をリピートIのそれと区別して検出することを試みた。方法としては、膜電位感知に主たる役割を果たす部位(S4へリックス)にシステイン変異を導入し、蛍光性システイン修飾試薬でラベルして蛍光強度変化が観察できるかどうかを調べた。変異導入残基のスクリーニングの結果、リピートIIのS4へリックスの特定の残基において、電位依存的な蛍光強度変化を検出することができた。これまでTPC3はTPC1および2と異なりPIにより影響を受けないとされていたが、本研究によってTPCファミリーはすべてPIによる調節を受けることが明らかになった。これはTPCの研究分野にとって大きな発見といえる。また、VCF法により、リピートIIの動的構造変化をリピートIと区別して捉えることにも成功した。通常のポア電流の解析のみでは2つのリピートの構造変化を区別することは困難である。2つのリピートを持つ意義を明らかにするためにはこの蛍光強度変化の検出が必要不可欠であったため、この結果は今後の詳細な実験を行うための大きな前進であると考えている。当初の計画において、TPC1および2についても解析を行うことも考慮に入れていたが、TPC3がPI感受性という興味深い特性を持つことがわかったため、TPC3のみを主たる対象として計画を進めている。電位センサードメイン(VSD)を同一分子中に2つ持つTwo-pore Na+ channel(TPC)について、特にTPCファミリー3(TPC3)を対象にして研究を行った。前年度までに、(1)蛍光性システイン修飾試薬を用いて膜電位固定下化学蛍光測定を行い、リピートIIのVSDは膜電位依存的な構造変化を起こすこと、(2) TPC3がある種のホスホイノシチド(PI)による制御を受けること、を示唆する結果を得た。本年度はこれらの2点の方向についてそれぞれ研究を行った。(1)前年度までに同定した、修飾性蛍光試薬ラベルにより蛍光変化を確認できるシステイン導入位置に、蛍光性非天然アミノ酸(fUAA)を導入し電流測定を試みた。しかしながら、当該残基へfUAAを導入したTPC3変異体では電流を確認できなかった。そこで、近傍の残基に網羅的にfUAAを導入した変異体を作製して電流測定を行ったところ、電流を測定できる変異体を同定することができた。現在の発現量ではこのfUAA変異体から有意な蛍光変化を得ることはできていないので、発現量を増加させる、より大きな蛍光変化を生じる残基を探索するなどの、さらなる最適化が必要と考えられる。(2)リピートIがPI結合に重要であることを示唆する結果が得られていたため、その結合部位を詳細に解析した。リピートIのS4/S5リンカーとS6ヘリックスには、正の荷電残基が多数存在しており、この領域が負電荷を持つPIの結合に重要ではないかと想定された。これらの残基を中性化した変異体を解析したところ、PI存在下で観察されるTPC3の電位依存性の変化が消失した。この結果は、変異導入によりPIに対する親和性が低下したことを示唆しており、TPC3においてはPIがリピートIのS4/S5リンカーおよびS6領域に結合することで電位依存性が変化することが考えられる。

また、XtTPCは長期の脱分極刺激によって電流量が増大するという特性を持つが、これがホスホイノシチドに依存していることを解明した。さらに、このホスホイノシチド依存性にはドメイン1のS4/S5リンカーおよびS6領域に存在する正電荷のクラスターが重要であることが解った。蛍光性システイン修飾試薬を用いたラベル化に成功してはいるが、ラベル化効率に問題が残るため、近年VCFに用いられ始めた非天然蛍光アミノ酸(fUAA)によるXtTPC3のラベル化を目指す。これまでの結果から、大きな蛍光強度変化を示すラベル残基について見当がついているので、同じ残基をfUAAに置換することで容易に蛍光強度変化を検出できると想定している。現在、fUAA挿入に必要な改変tRNAとligation酵素をコードするプラスミドDNAおよびfUAA自体の注入量などについて、実験条件の最適化を行っている。蛍光検出に成功したのち、それぞれのVSDの電位依存性の違いなどを解析することで、2つのリピートの役割の違いについてより詳細な情報を得ることを目指す。また、fUAAは任意の場所に挿入することができるので、前述のPI結合領域にfUAAを挿入することでPI結合に伴う構造変化をより直接的に捉えることも計画している。イオンチャネルの分子生理学本年度は特にXtTPC3のPI感受性についての解析など、通常の電気生理学的手法を用いた実験に当初予定よりも時間を割いたため、計画より必要額が抑えられた。次年度はfUAAを使用したVCF法の実施など詳細な解析を進めるため、使用額を翌年度分と合算して増額する。本年度と同様に分子生物学的・電気生理学的実験に必要な基本的な試薬・消耗品の購入にあてる。さらに、本年度はVCFに必要なfUAAの購入額を増額する予定である。
カイコ個体内遺伝子導入による実験モデル生物の開発

ヒトの疾患を解析するためのモデル生物を利用することは、医学研究にとって重要なことである。今回、遺伝子疾患解析のために、カイコ個体内での遺伝子発現システムの開発を試みた。AcNPVウイルスに感受性がある特殊なカイコ系統を使用することで、ウイルスベクターによる遺伝子発現法を開発した。具体的には、目的遺伝子(モデル遺伝子としてGFPタンパク質遺伝子)を組み込んだAcNPVウイルスを作成し、特殊なカイコ系統の幼虫に感染させ、GFPタンパク質を発現させることができた。機能未知のヒト遺伝子や遺伝子異常が原因とされる疾患を解析する場合、マウスやラットなど哺乳動物の遺伝子改変動物を作製することが従来から行われてきた。近年になり、下等生物からヒトまでのさまざまな生物のゲノム構造(遺伝子配列)が報告され、多くの遺伝子にヒトホモログhomolog(オーソログortholog)が存在することが判明した。したがって、それぞれの遺伝子の解析の際、条件が合った実験生物モデルを選択することが重要となる。カイコ(幼虫:約8 cm、6 g)は個体サイズが成体マウス(5 cm、約25 g)に近いので生化学的および形態学的解析が可能であり、かつショウジョウバエ研究のように遺伝子操作が容易であるので、ヒト疾患モデル生物として利用価値が高い。本申請では、これらの利点に基づき、ヒト遺伝性疾患解析のモデル生物としてカイコを利用するために、汎用性カイコ内遺伝子発現システムを樹立することを進めた。EGFPやDs-RedcDNAをAcNPV系バキュロウイルス発現ベクター系にサブクローニングし、レポーターコンストラクトを作製した。その後、Bac-to-bacバキュロウイルス発現システムを使用して改変バキュロウイルスを作製した。次に九州大学遺伝子資源開発研究センターから分与可能なカイコ系統のうち、AcNPVが感染し発現可能性の高い各種のカイコ系統(d17,系統など)を譲り受け、感染効率を検討した。さらに、目的遺伝子の安定発現カイコの作製に向けて、piggyBac系によるトランスポゾンシステムの発現ベクター及びその改変バキュロウイルスウイルスを作製した。したがって、それぞれの遺伝子の解析の際、条件に合った実験生物モデルを選択することが重要となる。カイコ(幼虫:約8 cm、6 g)は、個体サイズが成体マウス(5 cm、約25 g)に近いので生化学的および形態学的解析が可能であり、かつショウジョウバエ研究のように遺伝子操作が容易であるので、ヒト疾患モデル生物として利用価値が高い。本申請では、これらの利点に基づき、ヒト遺伝性疾患解析のモデル生物としてカイコを利用するための汎用性カイコ内遺伝子発現システムを樹立することを進めた。まず、EGFP、Ds-Red及びルシフェラーゼ(Luc) cDNAをAcNPV系バキュロウイルス発現ベクター系にサブクローニングし、接種実験用のウイルスを作製した。九州大学遺伝子資源開発研究センターから分与可能なカイコ系統のうち、AcNPVが感染し発現可能性の高い各種のカイコ系統(c11, d17, f10系統など)を譲り受けた。次にどの時期に接種することでウイルス病原性の影響が少なく、かつ目的遺伝子が高発現するかを検討した。さらに、遺伝子以降効率を上げるためにpiggyBacレトロポゾンシステムを使用し、ゲノム移入の効率を上げることを検討した。移入遺伝子の一過性遺伝子発現は認められるものの、病原性を下げることが困難であったため、ゲノム移入まで到達した個体を認めることはできなかった。医歯薬学今年度において、初年度計画していた実験の遂行が概ねできており、来年度は計画通りにさらに研究を発展させる段階にあるから。概ね計画通りに遂行されているので、現在のところ、変更や課題点はない。
即発γ線分析を用いたコンクリート中の塩化物イオン濃度分布の非破壊測定法の開発

本研究は即発γ線分析を利用した非破壊でコンクリート内部の塩化物イオン濃度分布を測定する方法の開発に資するための基礎的な研究である。本研究では所定の塩化物イオン濃度に調整したモルタル板を組み合わせた供試体を用いて,即発γ線分析で計測されるカルシウムと塩化物イオンの計数による即発γ線計数比を指標として用いた供試体表面からの深さの影響を考慮した校正曲線を作成した。本研究の結果をまとめると次のようである。1.モルタル板の厚さに関わらず、同様に校正曲線を得ることができるので、塩化物イオン濃度分布を推定する際,より詳細な分布を得たい場合には,薄いモルタル板を用いて校正曲線を設定すればよい。2.誤差関数に従うような分布を持つ測定対象物の場合には,誤差関数を用いて測定値と比較しながら浸透深さを仮定することにより,塩化物イオン濃度分布をよい精度で推定できる3.中性子の照射角度を対象物の表面とほぼ平行にして測定すると,表面濃度を非破壊で測定することが可能である。4.対象物の前にOwt%のモルタル板を並べて測定し,得られた即発ガンマ線計数比からノイズ等の余分な値を除き,校正曲線を用いて測定範囲の限界位置における塩化物イオン濃度を推定すれば,表面に濃度のピークがない分布の場合に,濃度は過小評価するが,分布形状は比較的よく把握することができた。本研究は、非破壊で試料調整を必要とせず、さらに短時間の測定で分析が可能な即発γ線分析を、コンクリート中の塩化物イオン濃度分布の測定に適用することを目的として基礎的な検討を行ったものである。本研究では、所定の塩化物イオン濃度に調整したモルタル板を組み合わせた供試体を用いて、即発γ線計数比と塩化物イオン濃度の関係およびその関係に及ぼすモルタル板の深さ方向に関する位置の影響を調べ、さらにそれらの関係から、異なる塩化物イオン濃度のモルタル板を組み合わせた供試体の塩化物イオン濃度分布が推定できるのかを検討した。(1)即発ガンマ線計数比と塩化物イオン濃度は比例関係にあり、即発ガンマ線計数比は測定対象物が表面から深い位置になればなるほど指数関数的に減少する。(2)塩化物イオン濃度分布を推定するための位置の影響を考慮した即発ガンマ線計数比と塩化物イオン濃度の較正曲線を提案した。(3)表面の塩化物イオン濃度を既知とし、塩化物イオン濃度分布を仮定することにより、即発ガンマ線分析を用いて非破壊で塩化物イオン濃度分布の推定が可能である。なお、本年度の得られた結果から提案した方法では中性化や雨水の影響によって表面付近の濃度が極端に低くなっているような分布に関しては浸透深さを過大評価することになり、また、内在塩化物イオンが存在する場合には過小評価となる。次年度以降はこの点についての改善とオンサイト計測に関する装置などの検討も行なう予定である。
周産期出血における子宮動脈ＮＢＣＡ　リピオドール塞栓術の基礎研究

周産期出血は母子の生命を脅かす病態である。治療としてNBCAを用いた子宮動脈塞栓術が増えてきたが、塞栓範囲と効果、子宮への障害についての基礎研究は少ない。まず、豚2匹の子宮動脈をNBCAとリピオドールの混和液を用い塞栓した後、子宮を摘出し、NBCAの分布の範囲を検討した。分解能の高い軟X線を用いた場合、より分布範囲を明瞭に確認することが可能であった。次に、豚2匹の子宮動脈を同様に塞栓した後、2週間飼育した。飼育後、血管造影を行い塞栓物質の残存の程度を塞栓直後と比較した。2週間の間では、子宮動脈内への血管内塞栓物質の残存濃度は異なっていたが、分布の範囲の程度には変化はみられなかった。最終年度の本実験を行う前の予備実験として、今年度はホルモン療法にて偽妊娠状態とした豚2匹を用いて、子宮動脈を塞栓物質NBCAを用いて塞栓術を行った。今回、病理標本の制作と、子宮組織切片の染色方法の決定を行った。臨床現場では妊娠子宮が対象となるため、対象となる豚もホルモン療法で偽妊娠状態とし、前年度同様、NBCAを8倍に薄めて塞栓術を行った。最終年度は、豚子宮動脈を塞栓したのち、術部を閉鎖し、3週間程度飼育、その後、子宮動脈の開存性の有無の確認、塞栓物質の到達部位の検討、子宮内膜の障害の程度を評価する予定である。そのため、塞栓物質の到達部位の評価方法、組織障害の程度を決定するのに適した方法について検討を行った。塞栓物質の到達部位の評価では、前年度の病理標本の評価のほか、より分解能の高いレントゲン撮影である、軟エックス線を用いた撮影を塞栓後の摘出子宮に対して行った。この画像では、通常のレントゲン撮影より細い血管まで塞栓物質が到達したことが観察できた。これにより、病理標本で確認する以外にも、末梢部位の塞栓物質が可視的に評価できることが分かった。また、病理標本の染色方法は、H.E染色を用いることで、障害部の評価が可能であり、かつ、組織障害の程度が内膜のどの部分まで及んでいるかを評価することも可能であった。また、来年度の子宮動脈塞術を行った後の飼育については、慶應義塾大学実験動物センターにて、動物実験を行う予定である。そのための倫理委員会に認可申請の書類を提出した。周産期出血は依然、母子の生命を脅かす病態である。子宮摘出術が行われることが多いが、周産期出血の病態では母体患者が出血傾向であり治療を困難としている。現在、子宮摘出にかわる治療法として、子宮動脈からの塞栓術が試みられているが、出血傾向の場合、塞栓物質であるゼラチンスポンジでは生体からの血栓効果が得られず、再出血を来し、子宮摘出術への移行など再治療が必要となる例が多い。そのため、塞栓物質として生体の血栓効果に依存しないNBCAを用いて子宮動脈塞栓術を施行する症例が増えてきた。また、NBCAを用いて子宮動脈を塞栓後に再度妊娠した症例もあり、妊繁性の維持という点でもNBCAを用いた子宮動脈塞栓術は有用な治療法である可能性がある。これはNBCAを用いた塞栓後に子宮動脈が再開通している可能性も示唆している。しかし、現在までNBCAを用いた子宮動脈塞栓後の、塞栓範囲と塞栓効果、子宮組織の障害の程度についての基礎研究はなされていない。ホルモン療法を行った偽妊娠豚2匹の子宮動脈を、NBCAとリピオドールの混和液を用いて塞栓した。その後、塞栓直後に子宮を摘出し、NBCAの分布の範囲を検討した。NBCAとリピオドールは、病理切片であるH.E標本作成時に融解してしまい直接的に観察するのは難しかった。通常のX線撮影より、より分解能の高い軟X線を用いた場合、間接的にリピオドールを描出することができ、より分布範囲を明瞭に確認することが可能であった。つぎに、ホルモン療法を行った偽妊娠豚2匹の子宮動脈を、NBCAとリピオドールの混和液を用いて塞栓し、その後、2週間飼育した。2週間後に、子宮動脈の血管造影を行い塞栓物質の残存範囲を2週間前の塞栓直後の塞栓範囲と比較した。その後、子宮を摘出し塞栓物質の分布範囲、子宮内膜への影響について病理学的に検討を行った。血管造影上では2週間の間では、子宮動脈内の血管内塞栓物質の残存の程度には変化はみられなかった。今年度はホルモン療法にて偽妊娠状態とした豚2匹を用いて、子宮動脈を塞栓物質NBCAを用いて塞栓術を行った。

二年度以降の本実験を行う前の予備実験として、対象となる豚の検討、NBCAの投与濃度の決定、病理標本の作製の手順の決定、子宮組織切片の染色方法の決定を行った。臨床現場では妊娠子宮が対象となるため、対象となる豚もホルモン療法で偽妊娠状態とすることが必要であった。また、豚も子宮動脈の太さに個体差が見られた。このため、可能であれば4匹程度の豚を用いて、異なる太さの子宮動脈を対象として本実験を行う必要がある。NBCAの投与濃度は、通常の臨床現場は8倍に薄めて用いるが、その濃度で病理検体での観察が可能かどうかを調べ、観察可能であることを確認した。臨床の現場に即し、本実験は8倍に薄めた濃度と中心に使用し、病理標本を作成、検討する。病理標本の作製のため、子宮の切片の切断方向の決定、切片標本の厚さの決定を行った。切断方向は、子宮長軸に対して垂直に切断し、観察を行った。これにより損傷を受けた子宮内膜の深さや範囲の検討が可能であった。切片標本の厚さは10μmで観察する。血管内の塞栓物質は、一部が切片作成の処理中に剥離してしまうことが判明したため、作成した連続3切片で観察し、血管内の塞栓物質の有無を判断することとした。病理標本の染色方法は、H.E染色、EVG染色、オイルレッド染色の23つを中心に行った。子宮内膜の損傷の程度はH.E染色で評価が可能であった。血管内の塞栓物質の検討では、血管壁が評価できるEGF染色で血管を同定し、その内部の塞栓物質の有無をH.E染色で評価する方法が適していた。オイルレッド染色では、血管内部の塞栓物質が見やすくなった。今回の予備実験を通して、本実験を行う際の、処置の方法、評価方法の決定を行った。今年度はホルモン療法にて偽妊娠状態とした豚2匹を用いて、子宮動脈を塞栓物質NBCAを用いて塞栓術を行った。最終年度は、豚子宮動脈を塞栓したのち、術部を閉鎖し、3週間程度飼育、その後、子宮動脈の開存性の有無の確認、塞栓物質の到達部位の検討、子宮内膜の障害の程度を評価する予定である。そのため、塞栓方法、塞栓物質の到達部位の評価方法、組織障害の程度を決定するのに適した方法について検討を行った。塞栓方法については、前年度同様、NBCAを8倍に薄めて用いた。塞栓物質の到達部位の評価では、摘出した病理標本の評価のほか、より分解能の高いレントゲン撮影である、軟エックス線を用いた撮影を塞栓後の摘出した子宮に対して行った。この撮像ではより、分解能が高くなり、通常のレントゲン撮影より、より末梢の細い血管に分布する塞栓物質が観察可能であった。これにより、病理標本で確認する以外にも、末梢部位の塞栓物質が可視的に観察できることが分かった。また、病理標本の染色方法は、H.E染色を用いることで、障害部の評価が可能であり、かつ、組織障害の程度が内膜のどの部分まで及んでいるかを決定するのも、この染色方法が適していた。また、来年度の子宮動脈塞術を行った後の飼育については、慶應義塾大学実験動物センターにて、動物実験を行う予定である。そのための倫理委員会に認可申請の書類を提出した。本実験を行う前の予備実験として、対象となる豚の検討、塞栓物質の濃度や、病理標本の作製手順、染色方法の決定を行った。対象となる豚は、臨床現場では妊娠子宮が対象となることを考えると、ホルモン療法で偽妊娠状態とすることが必要と考えられた。しかし、豚も、子宮動脈の太さの個体差が見られたため、可能であれば4匹程度の豚を用いて、異なる太さの子宮動脈を対象として本実験を行う必要があると考えられた。
異なる環境間で起る微生物遺伝子の循環の証明-薬剤耐性・病原性遺伝子の環境中での変遷と運命を知るために-

微生物は自分では地理的移動能力がないにも関わらず、同じ遺伝子が異なる環境の異なる微生物種から見つかることがある。本研究では、微生物間での遺伝子の伝達と拡散の現状把握と機構解明を目的とした。本研究では主に薬剤耐性遺伝子と病原性遺伝子を標的遺伝子とした。まず、テトラサイクリン(TC)耐性遺伝子では、これまでヒトや家畜の臨床菌でしか見つかっていなかった耐性遺伝子tet(M)が養殖魚腸内および養殖場環境に生息する海洋細菌も保有することを明らかにした。このことは、tet(M)が陸上環境と海洋環境両方に存在し、かつ、養殖場でのTCの使用頻度とtet(M)の出現頻度の相関から考えて、tet(M)は海洋中で独自に増殖していることが示唆された。海洋環境には陸上・臨床環境と同様に様々な遺伝子が存在し、異なる細菌間で伝達されていることが示唆される。次に、ベロ毒素遺伝子に関しては、0157 Sakai株のそれと同じものが河川中に常在していることが明らかになった。さらに、本遺伝子は底泥中で活発に発現しており、水中よりは底泥でファージを介したベロ毒素遺伝子の伝達が高頻度で起っていることが示唆された。以上の2つの事例から、沿岸底泥や河川底泥中が種々の遺伝子の増殖・伝達場所であることが強く示唆される。また、ヒトの病原菌である緑膿菌が海洋でも広く分布していることが明らかになり、本菌は地球上で最も広範囲に生息する生物であることが明らかになった。このような菌が陸上と海洋で遺伝子を伝達させることが考えられる。伝達ベクターとしては、非特異的にどのような微生物間でも遺伝子伝達が可能なウイルス様粒子(VLP)が発見され、tet遺伝子もこのベクターで伝達可能であることが示唆された。本研究で、同じ遺伝子が広い範囲の異なる種に分布し、それが異なる環境の微生物生態系で伝達される機構が見えてきた。微生物はそれ自体では地理的移動能力がないが,同じ遺伝子が異なった環境中の微生物から見つかることがある。本研究では,異なった環境に住む微生物間での遺伝子の伝達機構を明らかにし,さらに遺伝子が環境間を循環しながら広範囲に広がってゆくことを観測と実験で解明することを目標としている。研究代表者鈴木と分担者中野のグループおよび分担者那須はそれぞれ薬剤耐性遺伝子,病原性遺伝子を標的とし,それらの分布と伝達様式を調べ,分担者千浦は最近発見された非特異的遺伝子伝達粒子での特定遺伝子の伝達性を調べている。本年度は,新規オキシテトラサイクリン耐性遺伝子tet34を発見し,tet34が広くアジア沿岸のVibiro sp.に分布すること,tet34保有菌は非特異的遺伝子伝達粒子を産生することを明らかにした。また,大阪の河川にベロ毒素遺伝子を持つ菌が増殖可能な状態で棲息していることを明らかにした。これらは,微生物が能動的に遺伝子の伝達をしている可能性を示唆している。分担者木暮は同種でも変異のある細胞の分離法開発およびlux遺伝子の進化を調べている。本年度は,パーコールを用いた密度勾配遠心法で生理状態の異なるsubpopulationを分離することに成功した。さらに,異なる海域から得た菌におけるlux遺伝子の解析から,宿主・系統に応じた特異的変異を見い出した.これは本遺伝子の水平伝播を示唆している。以上のように,本年は1年目であるが,すでに新しい知見をいくつも得ており,次年度はさらに詳細にデータをとって論文作成を行なう予定である。