hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
種間交雑の促進機構と抑制機構

近縁の2種が同所的に生息するようになると,急速に形質置換を引き起こすことがある.しかし,元来近縁な2種であるため,種間交雑が生じる可能性も高い.形質置換は2種の形態差を大きくするが,種間交雑は2種の形態差を小さくする.カワトンボとオオカワトンボが同所的に生息する29ヶ所の集団に対して2種間の形態差を調べた結果,形態の種問差が大きい場合と小さい場合が認められた.さらにこれら29集団の核(ITS領域)とミトコンドリア(COI領域)のDNA解析を行った結果,交雑が起こらず形質置換が生じている集団と,交雑が生じて形質置換が起こっていない集団があった.交雑が生じていない集団では,翅色の種間差が交雑を抑制するための機構として働いている可能性が高い.近縁の2種が同所的に生息するようになると,急速に形質置換を引き起こすことがある.しかし,元来近縁な2種であるため,種間交雑が生じる可能性も高い.形質置換は2種の形態差を大きくするが,種間交雑は2種の形態差を小さくする.カワトンボとオオカワトンボが同所的に生息する29ヶ所の集団に対して2種間の形態差を調べた結果,形態の種問差が大きい場合と小さい場合が認められた.さらにこれら29集団の核(ITS領域)とミトコンドリア(COI領域)のDNA解析を行った結果,交雑が起こらず形質置換が生じている集団と,交雑が生じて形質置換が起こっていない集団があった.交雑が生じていない集団では,翅色の種間差が交雑を抑制するための機構として働いている可能性が高い.日本にはカワトンボ属2種(カワトンボとオオカワトンボ)が生息する。これら2種の共存生息地として24ケ所、カワトンボの単独生息地として1ケ所、オオカワトンボの単独生息地として1ケ所を選び、成虫の野外採集を行った。各調査地から2060個体を採集し、合計1024個体について、核DNAのITS1領域の塩基配列の決定(種の同定)、ミトコンドリアDNAのCOI領域の塩基配列の決定(種間での共有率から交雑の程度を推定)、翅色の観察(形質置換の程度を判定)、外部形態の測定(頭幅、翅長、縁紋の形態の種間差を定量化)を行った。その結果、カワトンボとオオカワトンボの間で全く翅色に差がない個体群では、ミトコンドリアDNAの共有率が著しく高く、かつ、外部形態の種間差が減少する傾向が認められた。逆に、カワトンボとオオカワトンボの間で翅色がまったく異なる組み合わせとなっている個体群では、ミトコンドリアDNAの種間での分化が生じており(種間で共有しない)、かつ、外部形態の種間差が大きくなっていた。前者では種間交雑が進み、後者では種間交雑が抑制されていると考えられる。形質置換が実際にどのように種間交雑に影響を与えているかについてはこれまで推論の域をでなかったが、本研究によってはじめて形質置換の程度と交雑の程度の相関が具体的に測定された。今後、形質置換が配偶行動のどの段階に影響を及ぼしているのか野外における実験的研究が必要である。近縁の2種が同所的に生息するようになると,急速に形質置換を引き起こすことがある.しかし,元来近縁な2種であるため,種間交雑が生じる可能性も高い.形質置換は2種の形態差を大きくするが,種間交雑は2種の形態差を小さくする.カワトンボとオオカワトンボの分布をみると,異所的集団と同所的集団が認められる.このうち,29ヶ所の同所的集団に対して2種間の形態差を調べた結果,形態の種間差が大きい場合と小さい場合が認められた,さらにこれら29集団の核(ITS領域)とミトコンドリア(COI領域)のDNA解析を行った結果,交雑が起こらず形質置換が生じている集団と,交雑が生じて形質置換が起こっていない集団があった.もし交雑が起こらなければ,2種間で急速に形質置換が生じるのではないかと考えられた.こうした集団を地理的に並べて見ると,九州などの西日本では2種間の遺伝的差異が大きく,もっとも複雑な翅色多型の組み合わせが認められるのに対し,関東や中部地方の東日本では2種間の遺伝的差異が不明瞭で種間の翅色多型に種間差がなくなっていた.この両者の中間域では,翅色の組み合わせに種間差が生じ,遺伝的差異の大きい集団から小さい集団が連続的に見いだされた.このように,翅色は同所的集団において,2種の間での交雑を抑制する配偶行動上での有効な信号となっている可能性が高い.
細胞アセンブルに向けた力学場計測

細胞を用いて臓器のような3次元形状を形成するために、細胞を人為的操作によって任意の形に積み重ねていく方法、細胞が持つ性質を利用して構造体を形成させる方法、が提案され、研究が進められている。後者の方法の場合、細胞や細胞集団による運動性と力学性質を理解することは大変重要である。このために本研究では、1ゲノム編集した細胞での力学性質と運動性の評価、2モデル上皮細胞株を用いた集団的運動性の機構解明、3iPS細胞由来の心筋細胞での力学性質の機構解明、にそれぞれ取り組んだ。2では、細胞ー基質間に発生する力を評価する技術、細胞集団における細胞の各細胞の核の位置の時間変化を計測する技術を構築し、それらに基づいた研究成果を発表した(2015年水谷武臣、バイオアセンブラシンポジウム)。3では、ヒトiPS細胞由来の心筋細胞に対して、心拍エネルギーの計測に成功した(2016 T. Mizutani, Regenerative Therapy)。iPS心筋細胞内には、心筋型のミオシンによる繊維と非心筋型のミオシンによる繊維が存在し、非心筋型のミオシンの繊維が拍動の抵抗となっていることを明らかとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。胚発生過程では、細胞集団が移動することで器官のような3次元の形態を形成します。このとき、個々の細胞はランダムウォークするのではなく何らかの規則によって運動しなければなりません。本研究課題では、「細胞ー基質間」、「細胞ー細胞間」の力学場測定を通じて、細胞や細胞集団が3次元運動する際の法則を明らかにしてゆきます。本年度は、蛍光タンパク質融合細胞間接着タンパク質を細胞に発現させ、ライブイメージングを行いました。細胞間接着部間の蛍光強度プロファイルを解析することで、細胞間接着距離の時間変化つまり歪を定量化可能の方法を確立しました。その手法を用いて、細胞ー細胞間が離れたもしくは縮まったという情報と細胞運動との対応を解析しています。また、細胞集団が運動する際の集団の先頭にくる細胞に着目し、後続の細胞との違いを生化学因子の観点から調べました。その結果、Rac1が先頭の細胞で有意に活性化され、さらに、インテグリンb1、PI3Kといったタンパク質も先頭の細胞の端に局在化することが判明しました。これらの因子に対する阻害剤を用いたところ、細胞集団の運動が阻害されました(2015 N. Yamaguchi, Scientific Reports)。また、個々の細胞に圧縮刺激(歪)を加えた時に、細胞がどのような応答を示すのかを調べました。細胞を圧縮すると、細胞の力を調節しているミオシン調節軽鎖の活性が減少しました。さらにミオシン調節軽鎖の活性の減少をもたらしたシグナル因子を探索したところ、RhoAのリン酸化が重要であることを明らかにしました(2015 K. Takemoto, Plos One)。当初の立案した実験計画に従い、細胞集団における細胞ー細胞間の変形を評価することに成功しているため。当初計画していた通りに進めていく。
高温ねじり加工法によるMFS物質のキンク強化材料化に不可欠なキンク形成素因子抽出

超々ジュラルミンを超える高強度を有するLPSO型マグネシウム合金は高温下の強ひずみ加工で形成されるキンク帯により強化されることは分かっているが、その各種キンク形成因子は明らかになっていない。本研究では単純なひずみ分布が得られ、かつ加工温度を容易に調整可能な『ねじり加工』を用い、ひずみ量とそれを与える温度の影響ならびにキンク形成の閾値を明確にし、キンク強化に最適な加工法の指針を示すことを目的とする。
無侵襲的に簡易に計測可能で、かつ嫌気的代謝閾値の代替となり得る体力指標創出の試み

近年の「健康維持・体力向上」機運の高まりを受けて,個々人の「体力」を簡便に客観評価可能な指標を見出すべく,健常成人65名を対象にエルゴメータによる運動負荷実験を行い呼吸・循環及び乳酸代謝の負荷応答を測定・解析した.その結果,従来体力指標として用いられてきた嫌気的代謝閾値(AT)及び乳酸性閾値(LT)の出現点(負荷値)と,無侵襲的に得られた循環応答曲線の変曲点における負荷値との間に良好な直線相関があり,代替指標と成り得る可能性を確認した.昨年度に続き簡易体力指標創出を目指してエルゴメータによるRamp負荷に対する循環及び呼気ガス応答の同時計測実験を行い、被験者数を昨年度の12名から38名まで増加した。昨年度と同様に嫌気的代謝閾値(AT)を求め、この時の負荷値(Lat)と心拍数:HR、一回拍出量:SV、心拍出量:COの応答の変曲点における負荷値(Lhr, Lsv, Lco)との相関を検討した。その結果、Latとの相関についてLhrが最も良かった者が18名、Lsvが16名、Lcoが18名とほぼ同数となった。またこれら全データとLatとの相関は回帰直線の傾き:a=0.915、相関係数:r=0.922と良好な直線相関となった。以上より無侵襲的に得られるLhr, Lsv, Lcoのうち、どれか一つを何らかの基準により選定できれば高精度でLatを推定可能であることがわかった。なお選定基準としては過去の運動履歴やその種類(瞬発力か持久力かなど)などを考慮する必要があると予想される。一方、血中乳酸濃度(BLC)の負荷応答から得られる乳酸性閾値(LT)は古くからATと同様に体力評価指標として用いられているが、血液サンプリングを要し連続測定できないなどの問題がある.そこで今年度の新たな研究課題として無侵襲的に得られる循環諸量から上記ATの代替としてLTを推定可能か実験的に検討した。健常成人男性27名を対象にエルゴメータ多段階負荷に対する循環及びBLC応答を計測し、LT時における負荷値(Llt)とLhr, Lsv, Lcoとの相関を検討した。その結果LcoにおいてLltと最も良い相関(a=0.819、r=0.903)が得られたことより、LTと循環機能との関係性については心臓の「変時作用」を反映するHRと、「変力作用」を反映するSVの両側面を含んでいるCO(=HR×SV)を用いた方がより高精度でLTを推定可能であると考えられた。近年の「健康維持・体力向上」機運の高まりを受けて,個々人の「体力」を簡便に客観評価可能な指標を見出すべく,健常成人65名を対象にエルゴメータによる運動負荷実験を行い呼吸・循環及び乳酸代謝の負荷応答を測定・解析した.その結果,従来体力指標として用いられてきた嫌気的代謝閾値(AT)及び乳酸性閾値(LT)の出現点(負荷値)と,無侵襲的に得られた循環応答曲線の変曲点における負荷値との間に良好な直線相関があり,代替指標と成り得る可能性を確認した.嫌気的代謝閾値に替わる簡易な体力指標創出を目指して以下の実験を行った。健常成人12名(男性運動者・非運動者,各3名,女性運動者・非運動者,各3名,平均年齢20歳)を被験者として,エルゴメータによるRamp負荷に対する心拍数(HR),心拍出量(CO),一回拍出量(SV)の応答の違いを比較・検討した.また,呼気ガス分析装置を用いて酸素摂取量(VO2)及び二酸化炭素排出量(VCO2)を同時計測し「嫌気的代謝閾値(AT)」を求めた.【心拍数と一回拍出量の関係】循環機能計測の結果を「最大心拍数に対する心拍数の比(%HRmax)」を横軸,安静時の値を1として規格化した「規格化一回拍出量(nSV)」を縦軸に表示したところ、男性・女性共に運動者は最大心拍数に近い心拍数においてもSVを増加させることができるが,非運動者ではSVはほとんど増加せず,逆に最大心拍数に近い心拍数で減少する例も見られた.また,運動者ではSVの最大値は安静時の1.52.5倍に達しており心臓の収縮力に余裕がある,即ち極めて高い心予備力を有していることが確認できた.【嫌気的代謝閾値(AT)と一回拍出量の関係】呼気ガス分析の計測結果を「エルゴメータ負荷量(Load)」を横軸,「規格化一回拍出量(nSV)」及び「ガス交換比R(R=VCO2/VO2 )」を縦軸に表示したところ、AT時の負荷値がnSVの変曲点(下降から上昇に変わる点)付近にあり,Ramp負荷に対するSVの変化からATを推定可能であることが示唆された.以上より、%HRmaxとnSVとの関係から心臓の予備力を二つの側面,すなわち変時作用と変力作用の両側面から評価可能であることが確認できた.またAT値とSV変曲点には相関があることが確認できたため,胸部電気的アドミタンス法を用いて横軸Load,縦軸nSVmaの関係から簡易的に体力評価可能であることが示唆された.

Ramp負荷に対する呼気ガス分析の結果と無侵襲循環機能計測の結果とを突き合せたところ、一回拍出量の変化から嫌気的代謝閾値を推定する可能性をが示唆され、当初見込みの妥当性が確認できた。また循環機能計測の結果から各被験者の心機能予備力を変時作用および変力作用の両面から推定可能であることが示唆された。次年度においては健常成人の被験者数を増やして循環機能計測結果と呼気ガス分析結果との関係性をさらに検討し、一回拍出量だけでなく心拍出量や心拍数から嫌気的代謝閾値が推定可能かどうか確認する。また運動負荷に対する血中乳酸値(BLC)の変化にも着目して実験を行う。具体的にはRamp負荷に対してBLCが急激に増加するいわゆる「乳酸閾値」と循環応答との関係を検討し、簡易な体力指標の確立を目指す。現有の自転車エルゴメータは最大負荷値が200WでPCによる負荷制御ができないため、最大負荷400W以上でPC制御可能なエルゴメータを新規購入する(800,000円程度を予定)。また血中乳酸値計測のための試験チップ購入(25個入り6500円を30セット程度)にも充てる予定である。
肝内結石症からの胆道発癌プロセスと糖鎖分子マーカー活用による肝内胆管癌の早期診断

肝内胆管癌の診断のための分子マーカー探索を主たる目的とし,肝内胆管癌の組織切片中の局所領域(癌部および非癌部)における癸現糖鎖の差異を調べるために.レクチンアレイ解析を施行中である.肝内結石症合併型肝内胆管癌14例て癌蔀14例,非癌蔀14例),非合併型患者数29症例(癌部30例,非癌部33例)について,以下の手順に従い比較糖鎖プロファイリングを試みた.まず,各組織切片中の癌上皮と非癌上皮について.1mm2に相当する領域をスクラッチし、抗原賦活化後,0.5%NP40によりタンパク質の抽出を行った.得られたライセート中に存在するタンパク質をCy3標識し,レクチンアレイにアプライした.これらレクチンアレイ解析のデータを用いて,癌部と非癌部の比較解析を行ったところ,幾つかのレクチン種で有意な差が見出された.そこで,肝内胆管癌的診断マーカーの有力候補になると考えるレクチンAについで,正常肝(転移性肝癌);肝内胆管癌,混合型肝癌,肝細胞癌の標本における発現を組織化学にて検討した.レクチンAの発現率は.正常肝(32%).肝内胆管癌(88%).混合型肝癌(80%),肝細胞癌(0%)であり,肝内胆管癌においては高い発現率であった.このことよりレクチンAは,肝内胆管癌および混合型肝癌め診断マーカーとして有用である可能性が示唆された.今後においては,同定されつつあるレクチンAのキャリアー分子について,癌上皮部分には高発現レベルを示し.正常上皮あるいは異型上皮においては低発現レベルを示す分子を抽出し,上記の組織標本によるvalidationを行い.肝内胆管癌の診断に有用であると考えられるキャリアー分子の絞り込みを行っていぐ予定である.さらに,臨床現場におげる生検,胆汁,血清標本を対象とする診断マーカーの検出系を構築していく計画である.肝内胆管癌の診断のための分子マーカー探索を主たる目的とし,肝内胆管癌の組織切片中の局所領域(癌部および非癌部)における発現糖鎖の差異を調べるために,レクチンアレイ解析を施行中である.肝内結石症合併型肝内胆管癌14例(癌部14例,非癌部14例),非合併型患者数29症例(癌部30例,非癌部33例)について,以下の手順に従い比較糖鎖プロファイリングを試みた.まず,各組織切片中の癌上皮と非癌上皮について,1mm^2に相当する領域をスクラッチし、抗原賦活化後,0.5%NP40によりタンパク質の抽出を行った.得られたライセート中に存在するタンパク質をCy3標識し,レクチンアレイにアプライした.これらレクチンアレイ解析のデータを用いて,癌部と非癌部の比較解析を行ったところ,幾つかのレクチン種で有意な差が見出された.肝内胆管癌の診断マーカーの有力候補になると考えるレクチンについて,正常肝(転移性肝癌),肝内胆管癌,混合型肝癌,肝細胞癌の標本における発現を免疫組織化学にて検討中である.今後においては,同定されつつあるレクチンのキャリアー分子について,癌上皮部分には高発現レベルを示し,正常上皮あるいは異型上皮においては低発現レベルを示す分子を抽出し,上記の組織標本によるvalidationを行い,肝内胆管癌の診断に有用であると考えられるキャリアー分子の絞り込みを行っていく予定である.さらに,臨床現場における生検,胆汁,血清標本を対象とする診断マーカーの検出系を構築していく計画である.肝内胆管癌の診断のための分子マーカー探索を主たる目的とし,肝内胆管癌の組織切片中の局所領域(癌部および非癌部)における癸現糖鎖の差異を調べるために.レクチンアレイ解析を施行中である.肝内結石症合併型肝内胆管癌14例て癌蔀14例,非癌蔀14例),非合併型患者数29症例(癌部30例,非癌部33例)について,以下の手順に従い比較糖鎖プロファイリングを試みた.まず,各組織切片中の癌上皮と非癌上皮について.1mm2に相当する領域をスクラッチし、抗原賦活化後,0.5%NP40によりタンパク質の抽出を行った.得られたライセート中に存在するタンパク質をCy3標識し,レクチンアレイにアプライした.これらレクチンアレイ解析のデータを用いて,癌部と非癌部の比較解析を行ったところ,幾つかのレクチン種で有意な差が見出された.そこで,肝内胆管癌的診断マーカーの有力候補になると考えるレクチンAについで,正常肝(転移性肝癌);肝内胆管癌,混合型肝癌,肝細胞癌の標本における発現を組織化学にて検討した.レクチンAの発現率は.正常肝(32%).肝内胆管癌(88%).混合型肝癌(80%),肝細胞癌(0%)であり,肝内胆管癌においては高い発現率であった.このことよりレクチンAは,肝内胆管癌および混合型肝癌め診断マーカーとして有用である可能性が示唆された.

今後においては,同定されつつあるレクチンAのキャリアー分子について,癌上皮部分には高発現レベルを示し.正常上皮あるいは異型上皮においては低発現レベルを示す分子を抽出し,上記の組織標本によるvalidationを行い.肝内胆管癌の診断に有用であると考えられるキャリアー分子の絞り込みを行っていぐ予定である.さらに,臨床現場におげる生検,胆汁,血清標本を対象とする診断マーカーの検出系を構築していく計画である.
根尖性歯周疾患の病態機序の解明-樹状細胞の動態と免疫機能分子発現の解析-

根尖性歯周炎の病変部における樹状細胞の役割を追究することを目的とし、ラット臼歯を露髄・開放のまま放置することにより誘発した実験的根尖性歯周炎を試料として、樹状細胞の超微形態、分布密度および免疫機能分子発現状況の経時的変動を電顕免疫組織化学的に検索した。その結果、最も病変拡大傾向が明瞭な誘発14日経過後(拡大期)では、MHCクラスII分子陽性細胞の大多数はマクロファージと同定され、樹状細胞は少数が存在するのみであった。一方、誘発28日経過後(慢性期)では、破骨細胞が減少し病変の拡大がすでに停止していたが、この時期では特に病変の外周部において、MHCクラスII分子陽性細胞の多くが樹状細胞と同定されるとともに、これらがMHCクラスII分子陰性のリンパ球と接触像を示すことも観察された。これらの樹状細胞は、拡大期では細く短い細胞突起を有する小型で細胞小器官の発達に乏しい細胞として観察されたが、慢性期では長い樹状突起を有する大型の細胞として同定された.さらに慢性期では、これらの樹状細胞がCD11c、OX62に対する免疫反応性と超微形態より二種の亜群に分類されることも明らかとなった。すなわち、上述の長い細胞質突起を有する大型の細胞のほとんどはCD11c陽性を示したが、OX62陽性の細胞はしばしば小型楕円形の胞体を有し、突起も短く少数が存在するのみであった。以上より,実験的根尖性歯周炎の病変部では、樹状細胞が組織内での分化・成熟による多様性を示しつつ主として病変外周部に偏在し,抗原提示細胞として局所の免疫反応性を高めることを通じて、慢性期における免疫応答の緩徐かつ持続的な活性化に関与している可能性が示唆された.根尖性歯周炎の病変部における樹状細胞の役割を追究することを目的とし、ラット臼歯を露髄・開放のまま放置することにより誘発した実験的根尖性歯周炎を試料として、樹状細胞の超微形態、分布密度および免疫機能分子発現状況の経時的変動を電顕免疫組織化学的に検索した。以上より,実験的根尖性歯周炎の病変部では、樹状細胞が組織内での分化・成熟による多様性を示しつつ主として病変外周部に偏在し,抗原提示細胞として局所の免疫反応性を高めることを通じて、慢性期における免疫応答の緩徐かつ持続的な活性化に関与している可能性が示唆された.根尖性歯周疾患は、根管内細菌あるいはその産生物の侵襲に対して根尖部の歯周組織で営まれる生体防御反応をその本態とするものであり、免疫学的機序がその成立・進展あるいは慢性化に深く関与していることは疑いがない。一方樹状細胞は生体内で最も有力な抗原呈示細胞であり、この機能を通じて外来抗原刺激に対する免疫応答の発動、あるいは免疫応答の質の決定という重要な役割を演じる。樹状細胞の膜表面には様々な免疫機能分子が発現されることが知られているが、樹状細胞表面に発現される一連の免疫機能分子群は、樹状細胞・Tリンパ球間の相互作用(抗原提示)におけるTリンパ球への情報伝達に深く関与することが近年注目されている。ところが根尖性歯周炎などの歯性炎症における樹状細胞の挙動については、従来ほとんど検索がなされていなかった。本研究は樹状細胞およびそれらが発現する免疫機能分子が根尖性歯周疾患の病態進行の過程に対してどのように関与しているかを、免疫組織化学的手法を用いて明らかにすることを目的とする。本年度はラット臼歯を露髄させ開放のまま放置することにより誘発した実験的根尖性歯周炎を検索の対象として,樹状細胞マーカーに対する電顕免疫組織化学的検出法の確立をはかるとともに、これらを発現する細胞の局在・密度の経時的推移を検索した。すなわち、モノクローナル抗体OX6(抗MHCクラスII分子)、8A2(CD11c)、ED1(ライソゾーム系小器官を認識)、OX62(樹状細胞、γδT細胞を認識)に対する電顕検索を可能とし、併せて実験的根尖性歯周炎の拡大期ではマクロファージ様細胞が優位であるものの、これが慢性期へと移行するに従い、樹状細胞様の超微形態と細胞マーカーへの反応性を備えた細胞が優勢となることを見出した。根尖性歯周疾患には、根管内の細菌やその産生物の侵襲に対して根尖部の歯周組織で営まれる免疫応答が深く関与する。

また、樹状細胞は生体内で最も強力な抗原提示細胞として、抗原刺激に対する免疫応答の発動、あるいは免疫応答の質の決定に重要な役割を演じることが知られている。樹状細胞の表面に発現される一連の免疫機能分子群は、樹状細胞とTリンパ球との間の相互作用(抗原提示)におけるTリンパ球への情報伝達に深く関与することが近年注目されている。ところが、根尖性歯周炎あるいはその前駆疾患と位置づけられる歯髄炎などの歯性炎症における樹状細胞の挙動については、依然として十分な検索は行われていない。そこで本研究は、樹状細胞およびそれらが発現する免疫機能分子が根尖性歯周疾患の病態機序にどのように関与しているかを、免疫組織化学的手法を用いて明らかにすることを目的とするものである。本年度は、正常ラット歯根膜、もしくはラット臼歯を露髄させ開放のまま放置することにより誘発した実験的根尖性歯周炎を検索の対象として,樹状細胞マーカーに対する電顕免疫組織化学的を実施するとともに、これらを発現する細胞の局在・密度の経時的推移を検索した。すなわち、モノクローナル抗体OX6(抗MHCクラスII分子)、8A2(CD11c)、ED1(ライソゾーム系小器官を認識)、OX62(樹状細胞、γδT細胞を認識)を用いて樹状細胞の超微形態学的同定と分布密度の定量を経時的に実施した。その結果、正常ラット歯根膜に分布する樹状細胞が形態・樹状細胞マーカー発現状況の両面で多様性を示すこと、実験的根尖性歯周炎の拡大期ではマクロファージ様細胞が優位であるものの早期より未熟な樹状細胞も出現すること、及び、これが慢性期へと移行するに従い、成熟した樹状細胞様の超微形態を呈する細胞が優勢となることを観察した。根尖性歯周疾患には、細菌およびその産生物の根管経由の侵襲に対して根尖歯周組織で営まれる免疫応答が深く関与する。また、樹状細胞(DC)は生体内で最も強力な抗原提示細胞として、抗原刺激に対する免疫応答の発動、あるいは免疫応答の質の決定に重要な役割を演じることが知られている。ところが、根尖性歯周炎におけるDCの挙動については、依然として十分な検索は行われていない。そこで本研究では、DCおよびそれらが発現する免疫機能分子が根尖性歯周疾患の病態機序にどのように関与しているかを免疫組織化学的手法を用いて検索し、以下の知見を得た。1.正常ラット歯根膜において、モノクローナル抗体OX6(抗MHCクラスII分子)、8A2(CD11c)、ED1(ライソゾーム系小器官を認識)、OX62(DC、γδT細胞を認識)を用いてDCの超微形態学的同定と分布密度の定量を経時的に実施したところ、DCが形態・細胞マーカー発現状況の両面で多様性を示すことが明らかとなった。2.ラット臼歯を露髄させ開放のまま放置することにより誘発した実験的根尖性歯周炎を検索の対象として,上記のマーカーを用いてDCの超微形態学的・組織形態解析学的検索と分布密度の定量を経時的に実施した。その結果、(1)病変部の拡大期ではマクロファージ様細胞が優位であるものの早期より未熟なDCも出現すること、(2)慢性期へと移行するに従い、成熟したDC様の超微形態を呈する細胞が優勢となること、および(3)DCが超微形態と細胞マーカーへの反応性の面からCD11c陽性の成熟DCとOX62陽性の未成熟DCの二群に大別されうることが明らかとなった。以上より、成熟度の異なるDCの亜群がその機能に応じて根尖病変部で営まれる生体防御反応の成立・持続過程に関与する可能性が判明した。
B細胞活性と免疫記憶の形成に関わる分子機構の解明

本研究においてB細胞活性と免疫記憶形成に関わる分子機構の解明を目的として研究を行い、これまでに記憶B細胞が免疫早期に産生され、一定の頻度で長期に維持されることを明らかにした。またこの過程でFas-FasLを介した刺激により記憶B細胞のレパートリーの形成と抗原非存在下での維持が調節されることを明らかにした。一方、胚中心形成後の記憶B細胞産生に関わる分子機構に不明の点が多いことからRasの役割について優性抑制型RasをB細胞に強発現するモデルマウスを作製し解析した。この結果、Ras活性が抑制されると高親和性記憶B細胞の頻度が減少し、また2次抗原刺激においてB細胞の応答が阻害されるGCB細胞でのことが明らかとなった。しかしRas活性が抑制されても一次免疫応答における抗体産生のレベルと親和性の上昇、胚中心形成、体細胞変異の蓄積、高親和性GCB細胞と抗体産生細胞の選択は阻害されなかった。以上の結果はRasを介した刺激伝達系は高親和性細胞を有する記憶B細胞集団の確立と2次刺激に対応する記憶B細胞活性と最終分化に重要な役割を果たす可能性を明らかにした。IgG陽性高親和性記憶B細胞は胚中心で胚中心B細胞より産生されると考えられ、発現するVH遺伝子に体細胞変異の蓄積を有する。一方、我々はこれに反して、IgG陽性低親和性B細胞が胚中心形成前あるいは体細胞変異導入前に産生されることを示唆した。この問題に関し、胚中心形成に必要なBcl-6の発現を欠くネズミにおいて低親和性記憶細胞が産生され、この細胞VH遺伝子には体細胞変異の蓄積のないことを明らかにした。これらの結果は、これまで考えられていたシナリオと異なり記憶B細胞に2つの経路すなわち胚中心依存性及び非依存性の経路が存在することが明らかにされた。1.これまでにFas不全(lpr)マウスでは、高親和性B細胞クローンの選択の遅延が起こり、また記憶B細胞にはFasが胚中心B細胞の選択と記憶B細胞の構成に関与することを明らかにした。lprマウスで認められた異常が、B細胞のFasの機能不全を反映するか否かを明らかにするため、lpr及び正常マウス脾臓よりB, T細胞を精製し、lpr B細胞と正常B, T細胞をRAG-1欠損マウスに移入した。移入後抗原刺激を行い産生される記憶B細胞の数と蓄積する体細胞変異の数を解析した、この結果、同一環境下においてlpr記憶B細胞の細胞数及び蓄積する体細胞変異の数は正常B細胞と比較し著明に上昇し、これらの結果はB細胞上のFasを介したシグナルで記憶B細胞の産生が制御されている可能牲が明らかにされた。2.胚中心反応において胚中心B細胞から記憶B細胞が分化すると考えられているが、その機構は不明である。我々は胚中心B細胞活性維持と記憶B細胞分化においてrasが関与するか否かを明らかにする目的で、優性抑制型H-rasを強発現するトランスジェニックマウスを免疫し、免疫後の胚中心及び記憶B細胞の産生とそれぞれに蓄積する体細胞産生の数とパターンを解析した。この結果、優性抑制型rasの発現により胚中心B細胞の産生が強く抑制されたが、記憶B細胞のレベルは正常マウスとほぼ同じレベルであった。一方、各B細胞に蓄積する体細胞変異の数は正常及びトランスジェニックマウス間で同レベルであった。これらの結果は、胚中心B細胞活性と記憶B細胞への分化が異なった機構により誘導されることを示唆する。記憶

B細胞維持におけるFasの役割を明らかにする目的で、正常およびFas不全C57BL/6マウスをNP-CGで免役し、免疫後40日目に記憶B細胞を精製し、あらかじめCG蛋白で免役した同系のマウスに移入した。移入後直ちに免疫すると高いレベルの高親和性IgG抗体による二次免疫反応が惹起される。しかし、正常マウス由来記憶B細胞を移入し10日放置後免疫する二次免疫反応のレベルは著明に低下し、さらに3週間放置すると二次免疫反応の誘導はまったく認められず、記憶B細胞はこの環境下で細胞死に陥った可能性が示唆された。しかし、Fas不全記憶B細胞を移入し10日あるいは3週間放置し免疫すると、二次免疫反応の誘導はいずれも同様に認められ、この結果は、正常記憶B細胞はFasを介したシグナルにより細胞死に陥った可能性が示唆された。正常マウス由来記憶B細胞を移入後に坑Fasリガンド(FasL)抗体を投与すると、移入後10日放置しても二次免疫反応の誘導は認められ、この結果はFas-FasLを介したシグナルにより記憶B細胞の維持が抑制される可能性が示唆された。これらの結果は、記憶B細胞の維持に、Fasを介したシグナルとそれに拮抗する未知のシグナルが関与する可能性を示唆する。記憶B細胞の生存に関与する因子を明らかにする目的で、記憶B細胞に強発現する遺伝子をクローニングした。この結果得られた遺伝子の内3つのクローンが細胞の生存維持に関与する可能性が示唆された。しかし、いずれの遺伝子をB細胞株へ強発現させても、Fasを介したアポトーシスへの感受性が低下することはなかった。Fasを介したシグナルとそれに拮抗する未知のシグナルを今後さらに異なったシステムを用いて探索する予定である。
記号計算に基づいた並列最適化問題の研究

本研究では,記号計算の成果を活用することにより,最適化問題の中でも重要な整数計画問題に対する新たな解法を与える.新しく得られた研究成果は次の通りである.1.論理式による問題記述法の提案高度に複雑な現実問題に対して整数計画法を応用する場合,問題をどのようにモデル化し記述するかが重要な問題となる.本研究では,一階述語論理の論理式により問題を記述すると,これを自動的に整数計画問題へと変換する理論的枠組を提案した.論理式を用いることで,従来知られている方法よりも問題のモデル化や解析が容易になった.論理式から整数計画問題への変換に関する研究成果の発表は,記号計算に関するシンポジウムIMS'99において行なった.また,研究論文は学術誌IEICEに掲載されることが決定している.(文献一覧を参照)2.ラベル付けアルゴリズムの実装シンプレックス行列により表現される連立1次方程式が整数解を持つかどうかの判定問題はNP完全であることが知られており,効率的な判定アルゴリズムを作るのは難しい.この問題の解法として,整数ラベル付け規則と行列の三角化に基づくYangのアルゴリズムが知られている.本研究では,このアルゴリズムを実現するシステムILINを作成し,大規模な(500変数の問題を含む)整数計画問題の解を求める実験を行なった.ラベル付けアルゴリズムの実装に関する研究成果は,学術誌IEICEに公表済みである.(文献一覧を参照)本研究では,記号計算の成果を活用することにより,整数計画問題の新たな解法を与える.新しく得られた研究成果は次の通りである.1.アルゴリズムMGBAの提案本研究では,整数計画問題,確率的整数計画問題,チャンス制約付き整数計画問題といった最適化問題を,次の3段階により解決する:(1)最適化問題を多項式問題に変換,(2)Grobner基底の利用により多項式問題を解決,(3)多項式問題の解を最適化問題の解に変換.このアイデアに基づく整数計画法の新たな解法として,MGBA(Minimised Geometric Buchberger Algorithm)というアルゴリズムを提案した.これは,HostenとSturmfelsが開発したGRIN法とThomasが開発した切断Grobner基底法とを組み合わせて得られるものである.新たに提案したアルゴリズムでは,Grobner基底を生成する集合を計算し,切断既約Grobner基底を生成する集合へと最小化することにより,効率化を図っている.MGBAを計算機上に実装し,既存の解法である幾何学的BuchbergerアルゴリズムやGRIN法のアルゴリズムとの比較を行なった結果,実行時間の大幅な短縮を確認できた.2.ラベル付けアルゴリズムの実装シンプレックス行列により表現される連立1次方程式が整数解を持つかどうかの判定問題はNP完全であることが知られており,効率的な判定アルゴリズムを作るのは難しい.この問題の解法として,整数ラベル付け規則と行列の三角化に基づくYangのアルゴリズムが知られている.本研究では,このアルゴリズムを実現するシステムILINを作成し,大規模な(500変数の問題を含む)整数計画問題の解を求める実験を行なった.ラベル付けアルゴリズムの実装に関する研究成果は,学術誌IEICEに公表済みである.本研究では,記号計算の成果を活用することにより,最適化問題の中でも重要な整数計画問題に対する新たな解法を与える.新しく得られた研究成果は次の通りである.1.論理式による問題記述法の提案高度に複雑な現実問題に対して整数計画法を応用する場合,問題をどのようにモデル化し記述するかが重要な問題となる.本研究では,一階述語論理の論理式により問題を記述すると,これを自動的に整数計画問題へと変換する理論的枠組を提案した.論理式を用いることで,従来知られている方法よりも問題のモデル化や解析が容易になった.論理式から整数計画問題への変換に関する研究成果の発表は,記号計算に関するシンポジウムIMS'99において行なった.また,研究論文は学術誌IEICEに掲載されることが決定している.(文献一覧を参照)2.ラベル付けアルゴリズムの実装シンプレックス行列により表現される連立1次方程式が整数解を持つかどうかの判定問題はNP完全であることが知られており,効率的な判定アルゴリズムを作るのは難しい.この問題の解法として,整数ラベル付け規則と行列の三角化に基づくYangのアルゴリズムが知られている.本研究では,このアルゴリズムを実現するシステムILINを作成し,大規模な(500変数の問題を含む)整数計画問題の解を求める実験を行なった.ラベル付けアルゴリズムの実装に関する研究成果は,学術誌IEICEに公表済みである.(文献一覧を参照)
CCN2の機能制御による腎不全進行阻止を目指した抗腎線維化療法の開発

CCN2は4つのモジュールを持ち分子間の結合を仲介する事で腎線維化に関与する。In vitroで第4モジュール欠損mCCN2は線維芽細胞の細胞外基質産生を低下させた。第4モジュールを欠損したmCCN2のノックインマウスを作成し、片側尿管結紮モデルおよび5/6腎摘モデルを作成したところ、腎線維化が有意に抑制された。全腎抽出蛋白を用いたウエスタンブロットでは、結紮腎におけるリン酸化Aktの減少が確認された。また第4モジュールを標的としたデコイペプチドは、腎線維化抑制効果を示した。CCN2の第4モジュールを介した作用が腎線維化に重要である可能性が高く、CCN2第4モジュールは重要なターゲットである。我が国では、毎年3万人の慢性腎臓病(Chronic kidney disease:CKD)患者が末期腎不全に至って透析導入されており、CKDの進行抑制法の開発は急務である。腎線維化は原因疾患を問わず、CKDが末期腎不全への過程でたどる最終共通路であり、理想的な治療標的と考えられる。我々は10年以上に渡ってTGF-b1の線維化促進作用を中継するmatricellular蛋白であるCCN2が、腎線維化に重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。CCN2は4つのモジュールから構成されており、我々は第4モジュールを欠損した変異型CCN2発現マウス(CCN2Ex5unfx/unfxマウス)を作成したところ、予備実験において有意な腎線維化抑制効果を確認した。そこで平成25年度は閉塞性腎症(UUO)モデルを作成して検討を進めたところ、変異型マウスにおいて著明な腎線維化抑制効果が確認された。またin vitroの予備検討において、このマウス由来の胎児線維芽細胞はECMとの接着異常を介して、アポトーシス誘導などの変異形質を示し、CCN2第4モジュールはECMからのシグナルを線維芽細胞に伝達してアポトーシスを抑制し、臓器線維化を促進する可能性が示唆された。そこで平成25年度は変異型CCN2を発現し、かつ線維芽細胞特異的にアポトーシスが抑制されるマウス(FSP1.Cre;FxSTOP.p35;CCN2Ex5unfx/unfx)を作出し、UUOモデルにおいて検討を行ったところ、腎線維化の抑制効果が同等に認められた。よって変異型CCN2による腎線維化抑制効果は線維芽細胞におけるアポトーシス促進を介したメカニズムでは無い可能性が示された。我々は10年以上に渡ってTGF-&#61538;1の線維化促進作用を中継するmatricellular蛋白であるCCN2が、腎線維化に重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。CCN2は4つのモジュールから構成されており、我々は腎線維化における第4モジュールの重要性を支持するデータを得たため、第4モジュールを欠損した変異型CCN2発現マウスを作成したところ、水腎症モデルマウスを用いた予備実験において有意な腎線維化抑制効果が確認された。昨年度はこの線維化抑制効果が間質線維芽細胞のアポトーシス促進を介する可能性を評価したが、否定的な結果であった。本年度は引き続き水腎症モデルマウスにおける腎線維化抑制効果のメカニズムを検討するため、時系列にそって腎組織より蛋白およびRNA検体を採取し、線維化マーカーの変動と細胞内情報伝達系の変化をqPCRとウエスタンブロット法にて比較検討した。その結果、線維化の進展に前駆してPI3K-Akt-GSK3b経路のリン酸化が抑制されることを明らかにし、CCN2第4モジュールはインテグリンからの細胞内情報伝達に影響する可能性が示唆された。また本年は変異型CCN2発現マウスを用いて新たに5/6腎動脈結紮モデルを作成し、より慢性的な線維化も抑制される可能性を確認した。CCN2は4つのモジュールから構成されており、最近、我々は腎線維化における第4モジュールの重要性を支持するデータを得たため、第4モジュールを欠損した変異型CCN2発現マウスを作成したところ、予備実験において有意な腎線維化抑制効果が確認された。本研究ではこの変異型CCN2発現マウスを用いて、よりヒトCKDに近い病態における腎線維化抑制効果を検討する。本年度は昨年度に引き続き、水腎症モデルマウスにおけるインテグリンを介したPI3K-Akt-GSK3b経路の活性化を抑制する第4モジュールを標的としたデコイペプチドを設計し、in vivoにおける線維化抑制効果を検討した。

その結果、既報のインテグリン結合部位とは異なる部位に対応するデコイペプチドによりCCN2を介した線維化抑制効果が認められた。さらに野生型および変異型CCN2発現マウスにおいて水腎症作成24時間後の腎臓組織蛋白を抽出し、プロテインアレイを用いた網羅的な蛋白レベルの変化を検討したところ、CCN2による線維化促進作用の新たな細胞内情報経路の候補が検出された。また変異型CCN2発現マウスを用いた5/6腎摘モデルの作成を継続し、有意に線維化が抑制されることを確認した。CCN2は4つのモジュールを持ち分子間の結合を仲介する事で腎線維化に関与する。In vitroで第4モジュール欠損mCCN2は線維芽細胞の細胞外基質産生を低下させた。第4モジュールを欠損したmCCN2のノックインマウスを作成し、片側尿管結紮モデルおよび5/6腎摘モデルを作成したところ、腎線維化が有意に抑制された。全腎抽出蛋白を用いたウエスタンブロットでは、結紮腎におけるリン酸化Aktの減少が確認された。また第4モジュールを標的としたデコイペプチドは、腎線維化抑制効果を示した。CCN2の第4モジュールを介した作用が腎線維化に重要である可能性が高く、CCN2第4モジュールは重要なターゲットである。変異型CCN2発現マウスにおける腎細胞内情報伝達系の異常を明らかとすべく、時系列でサンプリングを行いさまざまな情報伝達系蛋白のリン酸化状態の変化を検討した。線維化に関わる情報内伝達系は多岐に渡っており、可能性の高いものから検討を加えていったため、時間を要している。腎臓内科学よりヒトCKDの病態に近い5/6腎動脈結紮モデルの個体数を増やし、結果をより確実なものとする。また本モデルにおける腎線維化抑制効果も、インテグリンからの細胞内情報伝達の変化に関連したものなのかを明らかとする。さらにin vitroで有効性が確認された第4モジュールを標的にしたデコイペプチドのin vivoにおける有効性を、野生型マウスを用いた水腎症モデルを対象に検討する。本研究のひとつの目的である変異型CCN2の腎線維化抑制効果の検証については、十分な数の検討を繰り返したことで、少なくともUUOモデルにおいては有意な腎線維化抑制効果を示すことを明らかにできた。その機序の仮説として考えた腎線維芽細胞のアポトーシス誘導効果については、遺伝子改変動物を用いた検討では否定的であった。仮説は否定されたが、アポトーシス誘導というメカニズムの関与を否定することができ、さらなる機序の解明を行う契機となった。進捗状況の多少の遅れから、デコイペプチドを用いたin vivoの実験を次年度に先送りすることとなったため。平成26年度はCCN2Ex5unfx/unfxマウスのUUOモデルにおける腎線維化抑制効果の新たなメカニズム解明のため、まずは細胞内情報伝達系の変化を明らかとすべくウエスタンブロット法にてFAKシグナル経路やWNTシグナル経路のリン酸化タンパクを中心に検討する。またin vitroで有効性が確認された第4モジュールを標的にしたデコイペプチドのin vivoにおける有効性を、UUOモデルを対象に評価する。さらに当科にて開発した進行性腎線維化モデル(5/6腎血管結紮モデル)における変異型CCN2の腎線維化抑制効果を検討する。CCN2Ex5unfx/unfxマウスのUUOモデルにおける腎線維化
ラテンアメリカ出身者の日本留学後の追跡調査~個人および社会への影響を探る~

帰国後10年以上を経たラテンアメリカ出身の元日本留学生42名に聞き取り調査を行ない、留学の長期的成果を考察した。留学は職業選択・進路に影響を与えたこと、大きな文化差を乗り越えた自信により本人が成長し、職場や地域、次世代にも成果を伝えていること、日本留学の後さらに西欧に留学した人は特に、ラテンアメリカ・日本・西欧を見渡す国際的視点が培われ活躍や周りに与える影響が注目される。その詳細を分析し、今後の教育交流にあたっての知見を得た。研究実施計画に沿って、ペルー在住の元日本留学生への聞き取り調査を進めた。4月7月に在ペルーの元日本留学生会や、1970年代80年代に日本に留学していた元留学生個人との連絡調整を行い、8月に海外出張調査を行った。リマ市滞在中に13名の元留学生を対象として、それぞれの職場等へ赴いて、一人約2時間の聞き取り調査を行った。聞き取り調査に加えて、在ペルー日本国大使館やリマ市の主要大学や文化施設を訪問し、研究・生活環境を見学し、関係者と意見交換した。滞在にあたっては、現地で調査補助者を謝金を使って雇用し、移動の助けや現地での連絡調整に従事させた。その後国内在住の元留学生にも聞き取り調査を行い、その他数名とも連絡をとって、調査対象者を増やした。聞き取り調査結果はすべて録音し、謝金を使用して文字化した。文字化した結果の分析を進める中で、日本留学の効果が、留学後20年、30年という長期的視野から検証でき、そこにはラテンアメリカの文化の政治・社会状況や文化の特徴が大きく関わっていることが予測できる。留学の成果は、教育者は学生指導に活かし、会社員はリーダーとして組織運営に活かしている。専業主婦になった人についても次世代教育に留学の成果がみてとれる。平成20年度にさらにラテンアメリカ数都市での調査を行い、合わせて分析を行なう計画である。ラテンアメリカの3カ国(ペルー、メキシコ、アルゼンチン)にて、帰国後10年以上を経た元日本留学生42名に聞き取り調査を行ない、留学の成果が長期的に個人や社会にどのように影響し、波及しているかを考察した。その結果、個人への影響として、留学がどの専攻分野においても職業選択・進路に大きな影響を与えたことがわかった。教育分野の仕事においては、多くの場合、日本で学んだ責任感・努力の大切さ等を伝えながら、学生たちを厳しく指導している。研究においては、日本で習得した研究方法や当時の新しい技術がきっかけになり、先駆的な成果を挙げていることが多い。数年関連企業で働いた後、起業して成功している人もいる。日本語や日本文化を専門とする元留学生の場合は、日本語能力を活用したいがために、企業における通訳・翻訳担当といった域に留まる人が少なからず見られた。生活においては、日本で培った自律の精神や、大きな文化差を乗り越えたことにより、より自信を持って暮らしており、それらを次世代に伝える努力もしている。日本と母国の貨幣価値差を利用して奨学金の一部を貯蓄し、帰国後の生活基盤整備に充てたことにより発展につながった例も見られた。女性の場合、留学経験が独身や離婚につながったと本人が感じている例が少なからずあり、母国の男性優位主義との関係が述べられた。社会への影響として、留学の成果は職場や地域に波及していることがわかった。職場で指導的役割にいる年代となっているので、日本で学んだチームプレイや責任感を自ら実行し、同僚や部下とも分かち合っていた。日本留学の後さらに他の国(いずれも西欧圏)に留学した人もあり、彼らについては特に、ラテンアメリカ・日本・西欧を見渡す国際的視点が培われ、評価され、昇進や活躍がめざましく、個人・社会への影響が大きいことがわかった。
薄膜を有する構造物の信頼性評価に関する研究

本研究ではハードディスクと磁気ヘッドの衝突(クラッシュ)による保護薄膜の損傷が大きな問題となっている点に着目し,薄膜を有する構造物に過渡的な衝撃力が作用する場合の現象について数値的および実験的な考察を行った.接着強度,膜厚,ヤング率など,薄膜構造の機械的性質を,衝撃力を用いて評価する方法について検討することを目的とした.今年度は基礎的な検討として,カンチレバ-式の薄膜衝撃試験装置の試作に伴う数値シミュレーションを実施し,装置作成のための諸元の見積りを行った.半球状の圧子を有するカンチレバ-をはりでモデル化し,また薄膜を弾性床モデルで近似することにより,Helzの接触理論を導入して衝撃荷重と薄膜の機械的性質との関連について数値実験を行った.その結果,衝撃荷重の大きさは,基材の性質を反映せず,概ね膜の弾性定数に比例する値を得ることが確かめられた.また基材の弾性率が大きい場合には,膜厚の変化に伴う衝撃荷重の変化は小さくなり,膜厚が小さい場合の方が,衝撃荷重の振幅が膜厚により大きく変化し得ることが明らかになった。また,測定感度はカンチレバ-の曲げ剛性および長さに極めて依存するため,測定する膜の厚さに応じて適切なカンチレバ-を用いる必要が生ずることが明らかとなった.本研究ではハードディスクと磁気ヘッドの衝突(クラッシュ)による保護薄膜の損傷が大きな問題となっている点に着目し,薄膜を有する構造物に過渡的な衝撃力が作用する場合の現象について数値的および実験的な考察を行った.接着強度,膜厚,ヤング率など,薄膜構造の機械的性質を,衝撃力を用いて評価する方法について検討することを目的とした.今年度は基礎的な検討として,カンチレバ-式の薄膜衝撃試験装置の試作に伴う数値シミュレーションを実施し,装置作成のための諸元の見積りを行った.半球状の圧子を有するカンチレバ-をはりでモデル化し,また薄膜を弾性床モデルで近似することにより,Helzの接触理論を導入して衝撃荷重と薄膜の機械的性質との関連について数値実験を行った.その結果,衝撃荷重の大きさは,基材の性質を反映せず,概ね膜の弾性定数に比例する値を得ることが確かめられた.また基材の弾性率が大きい場合には,膜厚の変化に伴う衝撃荷重の変化は小さくなり,膜厚が小さい場合の方が,衝撃荷重の振幅が膜厚により大きく変化し得ることが明らかになった。また,測定感度はカンチレバ-の曲げ剛性および長さに極めて依存するため,測定する膜の厚さに応じて適切なカンチレバ-を用いる必要が生ずることが明らかとなった.
脊髄性筋委縮症の治療におけるVPAと塩酸アマンタジンの効果の基礎的研究

SMA(Spinal muscular atrophy)は,染色体5q13領域のテロメア側にあるSMN1遺伝子の欠失で脊髄の前角細胞にある運動神経の変性により全身の筋委縮が特徴である。SMN1と高い相同性を持つSMN2は、SMAの軽症型のSMAIIIでは3から4コピー存在しSMN1の欠失を代償していると考えられている。最近、てんかんに使用されるVPA(デパケン)が, SMN2のコピー数、SMN蛋白を増加させることが、またSMAIIの症例にアマンタジンを使用し有用性が報告された。VPAおよびアマンタジンのSMAに対する有効性の基礎的研究として、SMAの患者さんの培養皮膚線維芽細胞を確立しSMNmRNAとSMN蛋白レベルで解析した。結果:VPA投与の有効性とアマンタジンの無効性が明らかにされた。対象と方法:脊髄性筋委縮症(SMA)IとII型の患者さんからインフォームドコンセントを得て、皮膚生検を行い、培養皮膚線維芽細胞を確立した。培養皮膚線維芽細胞に治療量のバルプロ酸Na(VPA),塩酸アマンタジンを加え1から3日間培養し、これらの薬剤を加えない培養細胞(コントロール)とからtotal RNAを抽出した。total RNAからRT-PCR法にてcDNAを作製した。SMN2 cDNA量(mRNA)をTaqmanプローブを用いたReal-time PCR法を用いて解析した。また、これらの培養細胞からSMN蛋白を定量化するのに抗SMN抗体を用いてWestern blotにて解析した。標準蛋白としてのβ-tubulinは抗β-tubulin抗体で解析した。結果:コントロール培養細胞のSMN2 transcript (mRNA)を1とすると、VPAを加えて1日培養したSMN2 transcriptは2,7と約3倍に増加していた。塩酸アマンタジンを加えて1日培養したSMN2 transcriptは1,2と増加していなかった。VPAに塩酸アマンタジンを加えた培養細胞のSMN2 transcriptはVPA単独と変わらなかった。SMN蛋白解析では、正常ヒト線維芽細胞のSMN蛋白に比べ、SMA患者培養細胞は著名に減少していた。β-tubulinは、正常ヒトとSMA患者では同程度に発現していた。VPAを加えたSMA患者培養細胞のSMN蛋白は、VPA未添加SMA培養細胞に比べ著名に増加していた。塩酸アマンタジンを加えたSMA培養細胞のSMN蛋白は、添加SMA培養細胞と変わらなかった。β-tubulinは、全ての条件で同じ発現をしていた。SMNmRNAとSMN蛋白解析は同様の傾向を示し、VPA添加はSMNmRNAおよびSMN蛋白の増加を確認したが、塩酸アマンタジンでは増加を示さなかった。皮膚線維芽細胞の培養が順調に進んでいるために、mRNAおよび蛋白解析もおおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、対象にしているのは2名のSMA患者さんで1名はSMN1遺伝子のホモ欠失(SMAの95%)で、他の1名はSMN遺伝子のヘテロ欠失を持つ。この両者でのSMN mRNAとSMN蛋白の違いを解析中である。最近、SMN1遺伝子のホモ欠失、およびヘテロ欠失も認めない臨床所見よりSMA II型の患者さんから皮膚線維芽細胞を培養している。今年はこのSMAに特徴的なSMNmRNAおよびSMN蛋白な所見の有無を解析予定である。