hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Spx蛋白質を介した乳酸菌の酸素分圧応答機構の解明

本研究では、乳酸菌の一種口腔内連鎖球菌Streptococcus mutansを材料としてRNAポリメラーゼ結合タンパク質であるSpx分子を介した酸素応答機構の解析を行った。S. mutansは2つのSpxホモログ(SpxA, SpxB)を持つが、両蛋白とも分子内のシステイン残基が酸化されるとRNAポリメラーゼのαサブユニットに対する結合能が上昇した。また、Spx分子の分解系について検討を行った結果、SpxBの分解はClpXPプロテアーゼ複合体に依存していること、一方SpxAはClpXPによる分解を受けず、その細胞内濃度が常に一定であった。しかし、細胞内のSpxB濃度が上昇しても、抗酸化蛋白質の発現様式に影響は認められなかった。以上より、S. mutansのSpxにおいては、細胞内のSpx分子の濃度変化というよりは分子内のシステイン残基の酸化が酸素分圧の感知に重要な役割を果たすと考えられた。乳酸菌は糖源を資化して乳酸を産生する菌の総称であり、人間や動物の腸管をはじめとして自然界に広く分布する。申請者は、乳酸菌と酸素との関係に注目し、新たな乳酸菌の培養・育種法の開発、宿主内における適応機構の解明を目指してきた。本研究課題では、特に「乳酸菌の酸素分子認識機構」に焦点を絞り、申請者が同定した制御因子であるSpxの制御メカニズムについて解析を行うことで、乳酸菌の酸素応答機構に関する基礎的知見を得ることを目的とした。Spxは枯草菌で潜在的なレドックスセンサーとして報告されているRNAポリメラーゼ結合蛋白質で、ポリメラーゼの転写特性を変化させることでグローバルに転写を制御すると報告されている。申請者はこれまでに乳酸菌の一種、口腔内連鎖球菌の酸素応答に関与する制御因子としてSpxAおよびSpxB両蛋白質を同定しており、本年度はSpxが結合するとされているRNAポリメラーゼα-サブユニットとの結合特性を表面プラズモン共鳴法で解析した。その結果、いずれのSpx蛋白質もα-サブユニットと結合すること、酸化状態で結合量が増加することが明らかとなり、Spx分子自身の酸化還元状態の変化がセンサーとして機能している可能性が示唆された。現在カイネティクス解析を行い、それぞれのSpx分子の解離定数の算出を試みている。また、動物の腸管内に生息する乳酸菌においてSpxがどのような機能を担っているのか検討するため、ヒトや動物の腸管に棲息するLactobacillus reuteriのspx欠損株作製を試みている。本研究で対象としたSpxは、枯草菌で潜在的なレドックスセンサーとして報告されているRNAポリメラーゼ結合蛋白質で、ポリメラーゼの転写特性を変化させることでグローバルに転写を制御すると報告されている。申請者はこれまでに乳酸菌の一種、口腔内連鎖球菌の酸素応答に関与する制御因子としてSpxAおよびSpxB両蛋白質を同定している。昨年度は表面プラズモン共鳴法を用いて、両Spx蛋白質とRNA polymerase α-subunitの相互作用を解析し、酸化型のSpxがより強くα-subunitに結合することを明らかとした。本年度は、Spx分子内のシステイン残基を酸化する因子について解析を行い、過酸化水素を潜在的なシグナル分子として同定した。また、生体内におけるSpx分子の分解系について検討を行い、SpxBの分解が枯草菌同様ClpXPプロテアーゼに依存していること、一方、SpxAはClpXPプロテアーゼによる分解を受けず、その細胞内濃度が酸素の有無に関わらず一定であることを明らかとした。
遷移金属触媒による連続環化反応を用いた多環式インドール骨格の構築と応用

(1)パラジウム触媒による環化反応を用いたスピロインドール誘導体の合成報告者が見出したスピロ環化反応は、インドールの分子内求核付加反応に続く外部求核剤による分子間反応が進行することでスピロインドリンを与える。一方、外部求核剤が反応することなく、β-水素脱離反応が進行することで少量のスピロインドールを生成する。副生成物として得られたスピロインドールは、天然物モチーフとして有用な構造を有しているため、その合成法を確立することも重要であると考えた。そこで、スピロインドール化合物を選択的に与える条件の最適化を実施した。リガンドにdppeを、塩基にBnNH_2とCs_2CO_3を用いた際に、望みのスピロインドールが良好な収率で得られることを見出した。プロパルギルパラジウム錯体を用いた触媒的不斉反応は、2014年に報告された2例に留まっている。報告者が見出したスピロ環化反応の不斉化を検討したところ、SEGPHOSリガンドを用いた際にスピロインドリンとスピロインドールを65-71%eeで与えることを見出した。今回報告者が観察したエナンチオ選択性は、プロパルギルパラジウム錯体を用いた触媒的不斉化の中で最も高いものであった。これらの結果は、プロパルギルパラジウム錯体を用いた不斉反応の潜在的有用性を示すものであると考えている。(2)Apparicine基本骨格構築法の開発既知のApparicine類の全合成経路は、合成の最終段階における環化反応に改善の余地が残されている。報告者は(1)の反応を基に、パラジウム触媒によるインドリルプロパルギルクロリドの連続環化反応を用いたApparicine基本骨格の一挙構築法の開発に着手した。多様な環化前駆体を用いて検討を行ったが、いずれにおいても望みの連続環化体は得られなかった。また、金触媒を用いた新たな経路の開発に着手したが成功には至らなかったため、時間的制約から本合成研究を中止した。26年度が最終年度であるため、記入しない。含窒素複素環化合物は多くの生物活性天然物や医薬品に含まれる有用な基本構造である。中でもインドール骨格を有する縮環構造は、天然物ライク創薬テンプレートとして医薬品開発に広く適用されている。従来の合成法は、縮環型複素環骨格を段階的に構築するものが多いため、本骨格を一挙に構築する効率的な方法論の開発は極めて重要である。所属グループは、プロモアレンがパラジウム触媒存在下においてアリルジカチオン等価体として機能することを見出しており、この反応性を利用した多環式スルファミドの合成に成功している。報告者は、インドリルブロモアレンに対してパラジウムを作用させることで分子内のインドールと外部求核剤が連続的に反応し、多環性スピロインドール類が合成できるものと期待した。最初にインドリルブロモアレンの合成を検討したところ、初期検討に用いる十分量のプロモアレンを合成することは困難であった。そこで、その合成等価体であるプロパルギル化合物を用いることとした。市販のGramineから数工程の変換を行い、インドリルプロパルギルクロリドを合成した。得られたクロリドに対し、パラジウム触媒を用いて種々検討を行ったところ、報告者の期待通りインドール3位、外部求核剤として用いたトシルアミドが連続的に付加し、四環性スピロインドールが良好な収率で得られることを見出した。続いて、得られた最適条件下、少量ながら合成に成功したインドリルブロモアレンを用いたところ、目的の環化体は低収率に留まった。副生成物の解析から、SN2'型の反応の進行により目的の反応が抑制されたものと考えられる。さらに、炭素求核種であるジメチルマロネートを用いたところ、環化様式の異なる四環性スピロインドールが得られることを新たに見出した。現在、得られた結果を踏まえ反応機構の解明を行っている。(1)パラジウム触媒による連続環化反応を用いた多環式スピロインドール類の合成報告者は、昨年度開発したパラジウム触媒による四環性スピロインドール合成の反応機構を解明する目的で、反応の置換基効果に関する検討を行うとともに、反応が熱力学的に支配されている可能性について検証を行った。報告者が見出したスピロインドール合成反応は、主生成物として多環式スピロ環化合物を、副生成物として少量のジエン型スピロ環化合物を与える。環化条件下において、二つの化合物への相互変換は認められず、本反応は速度論的に支配されていることを確認した。得られた結果を踏まえて反応機構を提唱し、学術雑誌への論文の投稿を行った。一方、プロパルギルパラジウム錯体に対する反応において、一段階目の付加段階における反応の不斉化は未だ知られていない。初の不斉反応の開発を目指して、見出したスピロ環化反応の不斉化を試みた結果、SEGPHOSリガンドを用いた際に目的の四環性スピロインドールを52%eeで与えることを見出した。一方、副生成物として得られるジエン体は74%eeを示したことから、二段階目の反応の際にリガンドと基質のミスマッチが生じている可能性が示唆された。

報告者は、誘導体合成にも適用できる簡便合成法の開発を目的として、パラジウム触媒によるインドリルプロパルギルクロリドの連続環化反応を用いたApparicine基本骨格の一挙構築法の開発に着手した。構造活性相関研究への展開を視野に入れ、鍵中間体となるプロパルギルクロリドを三つのシントンから導く収束的な合成経路を立案した。すでに鍵中間体の合成経路を確立し、現在連続環化反応の検討を行うためのスケールアップを行っている。(1)パラジウム触媒による環化反応を用いたスピロインドール誘導体の合成報告者が見出したスピロ環化反応は、インドールの分子内求核付加反応に続く外部求核剤による分子間反応が進行することでスピロインドリンを与える。一方、外部求核剤が反応することなく、β-水素脱離反応が進行することで少量のスピロインドールを生成する。副生成物として得られたスピロインドールは、天然物モチーフとして有用な構造を有しているため、その合成法を確立することも重要であると考えた。そこで、スピロインドール化合物を選択的に与える条件の最適化を実施した。リガンドにdppeを、塩基にBnNH_2とCs_2CO_3を用いた際に、望みのスピロインドールが良好な収率で得られることを見出した。プロパルギルパラジウム錯体を用いた触媒的不斉反応は、2014年に報告された2例に留まっている。報告者が見出したスピロ環化反応の不斉化を検討したところ、SEGPHOSリガンドを用いた際にスピロインドリンとスピロインドールを65-71%eeで与えることを見出した。今回報告者が観察したエナンチオ選択性は、プロパルギルパラジウム錯体を用いた触媒的不斉化の中で最も高いものであった。これらの結果は、プロパルギルパラジウム錯体を用いた不斉反応の潜在的有用性を示すものであると考えている。(2)Apparicine基本骨格構築法の開発既知のApparicine類の全合成経路は、合成の最終段階における環化反応に改善の余地が残されている。報告者は(1)の反応を基に、パラジウム触媒によるインドリルプロパルギルクロリドの連続環化反応を用いたApparicine基本骨格の一挙構築法の開発に着手した。多様な環化前駆体を用いて検討を行ったが、いずれにおいても望みの連続環化体は得られなかった。また、金触媒を用いた新たな経路の開発に着手したが成功には至らなかったため、時間的制約から本合成研究を中止した。26年度が最終年度であるため、記入しない。報告者は予定していたパラジウム触媒による連続環化反応の検討を行い、多環性スピロインドール類が一挙に合成可能であることを見出したため。現在、これらの成果について論文を執筆中である。パラジウム触媒による連続環化反応を用いた多環式スピロインドール類合成の不斉化おいて、中程度のエナンチオ選択性であることが課題として残るが、一段階目の付加反応におけるプロパルギルパラジウム錯体に対する初の不斉反応を見出したため。また、Apparicine基本骨格構築法の開発に関して、環化前駆体の合成経路を確立することができたため。本年度は、昨年度に達成したパラジウム触媒による連続環化反応の開発研究を応用し、求核部位を複数有するインドールとプロパルギル化合物との分子間反応を行う予定である。予備検討において、副反応であるβ水素脱離反応の進行が優先された。
集合知を活用した共生のための日本語読解支援環境の構築と運用実験

本研究の目的は、やさしい日本語による読解支援環境をWeb上に構築することにある。共生社会実現のためには日本語弱者に対する支援が不可欠である。日本語弱者にとって、漢字熟語が多く含まれ、カタカナ語も多用された日本語の文章は難解であり、読解支援のための対応が求められている。本研究では、やさしい日本語への自動書き換えシステムの開発を行った。研究成果のやさしい日本語自動書き換えシステムは、『チュウ太のやさしくなーれ』としてWeb上で無償公開している。これによって、日本語学習者のみならず、日本在住の日本語非母語話者や日本人の年少者・高齢者など、日本語弱者に役立つ日本語の読解支援が可能になった。本研究の目的は、日本語教師の知識と経験を「集合知(Collective Intelligence)」として集めて、共生社会における日本語弱者が自由に利用できる日本語読解支援環境をつくることにある。「日本語弱者」にとって、難しいことばや漢字の多い日本語の文章の読解は困難を極める。そこで、日本語教師の知識と経験に裏打ちされた「わかりやすい文章への書き換え術」を「集合知」として二段階方式で収集し、それをもとに、わかりやすい日本語への自動書き換えシステムを開発する。初年度である平成24年度の中心は、難易度の高い表現に対する書き換えリストの作成と書き換えルールの抽出、さらにそれをもとにした書き換えツールβ版の開発であった。書き換えリストは、単語レベルではなく、前後の助詞にまで配慮した形で、見出し語(難易度の高い表現)と書き換え表現(やさしい日本語での表現)を併記したものを作成した。本年度は、形容動詞(形状詞)とサ変動詞(名詞・サ変可能)に限定した書き換えを行った。理由は次の通りである。(1)形容動詞とサ変動詞は、やさしい表現に置き換えられるものが多い。(2)難易度の高い文での使用頻度が高く、平易化への寄与率が高い。書き換えツールβ版は、上記書き換えリストをもとに作成した。このツールは、入力された文を自動でやさしい日本語に置き換えるツールであり、Web上で稼働可能なものにした。運用実験の結果、置き換え後、品詞に加えて前後の助詞も変わる場合があることがわかり、変換ルールを書き換えリストに明記し、ツールもこれに対応できる仕様に修正を加えた。これによって、形容動詞とサ変動詞に関しては、ほぼ正しい書き換えが可能になった。今後はデータマイニングシステムを利用して複数の書き換え候補がある場合の対応について検討を進め、より精度の高いシステムの完成を目指す。研究2年目にあたる本年度は、やさしい日本語書換えシステムのβ版の機能拡張を行った。β版の改良は、主に次のような流れで行った。1.やさしい日本語書き換えリストの拡充および整備2.やさしい日本語書き換えシステムβ版の機能拡張(リスト整備のための情報収集機能およびリスト変更機能の追加)3.β版を用いた運用実験とその結果を基にした改良4.書き換えリストの自動生成のための基礎データの収集以上により構築したやさしい日本語書換えシステムβ版は「チュウ太のやさしくなーれ」という名称でWeb上で公開している。また、やさしい日本語への書き換えリストの自動生成のための基礎データの収集も継続的に行っている。このデータの収集については次年度も引き続き行い、これをもとに集合知を用いた日本語読解支援環境の構築を目指す予定である。さらに、やさしい日本語への書き換えの自動化のためには、複合語および表現文型の抽出は不可欠である。そのため、上記システムの副産物として「複合語検索システム」および「表現文型抽出ツール」の開発を行った。前者は、各複合語の構成要素についても抽出可能な仕組みにすることにより、汎用性を高めることが可能となった。後者については、接続詞、接続助詞、それ以外の機能表現、複合動詞、名詞修飾節を導く名詞等を自動抽出し、リスト化できるツールであり、日本語教育者および日本語研究者が活用可能である。各々の成果物については、Web上で公開するとともに、学会・研究会で報告した。本研究の目的は、日本語教師の知識と経験を「集合知(Collective Intelligence)」として集め、日本語学習者のみならず、日本に在住の日本語非母語話者や日本人の年少者、高齢者等、いわゆる共生社会における日本語弱者が自由に活用可能な日本語読解支援環境を構築することにある。日本語の読解力が十分にない「日本語弱者」にとって、難しいことばを多く含み、漢字も多用されている日本語の文章の読解は困難を極める。そのため、外国人との共生が様々な形で進んでいる現代において、読みやすくわかりやすい文章が必要とされている。研究代表者は、外国人福祉候補者のための教材作成プロジェクトチームを主導し、教材作りを行っている。その過程においても、日本社会が「共生社会」をめざすためには、より積極的にわかりやすい文章で情報発信を行う必要性を痛感した。一方、一般の日本人にとっては「わかりやすい文章」と言われても、どこをどう直せばいいのかわからないという問題がある。そこで、本研究では、日本語教師の知識と経験がもとになった「わかりやすい文章への書き換え術」を「集合知」として収集し、そのデータをもとに、入力された文章を自動でやさしい日本語に書き換えることができるシステムの開発を行った。研究の最終年度にあたる本年度は、日本語教師の書き換え提案を集合知として自動収集するシステムを完成させた。その際、提案をそのまま書き換えリストに反映させるのではなく、提案リストの形で一時保存し、編集者が適宜必要な修正を行った上で、提案内容を書き換えリストに反映させるという仕組みにした。本研究で開発したシステムは、日本語母語話者および非母語話者による運用実験をもとに改良を加え、やさしい日本語書き換えシステム『チュウ太のやさしくなーれ』として、Web上で公開している。

本研究の目的は、やさしい日本語による読解支援環境をWeb上に構築することにある。共生社会実現のためには日本語弱者に対する支援が不可欠である。日本語弱者にとって、漢字熟語が多く含まれ、カタカナ語も多用された日本語の文章は難解であり、読解支援のための対応が求められている。本研究では、やさしい日本語への自動書き換えシステムの開発を行った。研究成果のやさしい日本語自動書き換えシステムは、『チュウ太のやさしくなーれ』としてWeb上で無償公開している。これによって、日本語学習者のみならず、日本在住の日本語非母語話者や日本人の年少者・高齢者など、日本語弱者に役立つ日本語の読解支援が可能になった。26年度が最終年度であるため、記入しない。日本語教育26年度が最終年度であるため、記入しない。研究の目的は、日本語弱者が自由に利用できる日本語読解支援環境を提供するために、わかりやすい日本語への自動書き換えシステムを開発することである。本年度は、形容動詞とサ変動詞に関して書換えリストの作成と書き換えのルール化を行い、それをもとにした書き換えシステムベータ版を開発するという初期目標を達成した。本研究の目的は「集合知を活用したやさしい日本語書換えシステム」の構築にある。当初の予定通り、「やさしい日本語書き換えリスト」を基にして、入力された文章を自動で書き換えるシステム(「やさしい日本語書換えシステムβ版」)の構築は完了した。次年度からは集合知をどのようにして収集し、システムに反映させるかという課題に取り組む。そのための基礎データの収集はすでに本年度からスタートしているが、次年度以降も継続し、基礎データをもとに集合知を反映したシステムを構築していく予定である。以上のように、本研究は、当初の計画どおりほぼ順調に進展している。複数の書き換え候補がある場合の対応に関しては、現在基本設計を行っているデータマイニングシステムを活用して、より精度の高い書き換えシステムの完成を目指す。今後は、やさしい日本語書き換えシステムに、日本語教師の集合知をどのように反映させるかが課題となる。そのため、収集中の基礎データに加え、国内外の連携協力者の協力も得て、基礎データの充実をはかっていく。システムへの集合知の反映方法としては、目下、2通りの方策を考えている。1.書き換えシステムβ版の結果画面に書換えデータを修正できる仕組みを組み入れ、書き換えリストを拡充していく方法2.システムに学習機能をもたせ、やさしい日本語への書き換え基礎データをもとに書き換え候補を自動収集する方法可能であれば、上記の方策を併用することによって、効率よく、かつ、広範に集合知を収集し、実用性の高いやさしい日本語書換えシステムの構築を目指す予定である。
リアルタイムPCRの融解曲線を利用した遺伝子突然変異スクリーニング法の開発

遺伝子変異のスクリーニングとして、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)法が用いられてきたが、煩雑なうえに、その検出率はおよそ70%程度であり、スクリーニング法としては一般化されていない。自己炎症疾患に限らず、ミスセンス突然変異は多くの疾患でみられる。ミスセンス突然変異は、ヘテロ接合である。本研究は、高性能となったリアルタイムPCRの融解曲線を利用して、正常人のホモ接合との差を検出し、遺伝子異常のスクリーニングに使用することを目指した。LightCycler 480(Roche社)は高性能であり、ジェノタイピングのハイスループット判定にも利用されていることから、ミスセンス突然変異の検出は可能と考え検討した。遺伝子変異のスクリーニングとして、PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism)法が用いられてきたが、煩雑なうえに、その検出率はおよそ70%程度であり、スクリーニング法としては一般化されていない。本研究は、高性能となったリアルタイムPCRの融解曲線を利用して、正常人のホモ接合との差を検出し、遺伝子異常のスクリーニングに使用することを目指している。LightCycler480は高性能であり、ジェノタイピングのハイスループット判定にも利用されていることから、ミスセンス突然変異の検出は、可能と考えられ、検討した。
超音波顕微鏡によるイオン交換強化ガラスの残留応力と表面ゆがみの測定に関する研究

本研究では、イオン交換強化ガラスをモデル材料として、超音波を照射したときに発生する表面弾性波の音速測定から、残留応力と表面のゆがみを測定する事を試みた。まず、イオン交換法により、ソーダガラス表面にNaとKの交換層を形成した。その結果、ガラスの破断強度は無処理に比較して6倍以上増大する事を明かになった。これは、NaよりもKのイオン半径が大きいために、ガラス表面に圧縮応力層が形成されたためである。次に、超音波顕微鏡を使用して、イオン交換ガラス表面の音速を測定し、破断強度と比較した。その結果、両者には比例関係が成立する事を見いだした。また、超音波顕微鏡内に小型の曲げ試験機を設置し、ガラスの音速と曲げ応力の関係を測定した。その結果、音速は曲げ応力(引張)とともに減少した。一方、X-Zモード像の解析から、応力によるガラス表面のゆがみを0.1ミクロンの精度で測定する事ができた。応力と音速の関係およびイオン交換ガラスの音速変化から、ガラス表面の応力分布を決定した。これより、500MPa以上の圧縮応力場の存在が確認された。さらに、周波数を変化させる事により、表面から内部に向かって存在する応力分布を推定する事が可能となった。以上の結果から、超音波顕微鏡による応力と表面ひずみの同時測定の可能性を実証する事ができた。
地域・生活の課題を科学的に思考する消費者教育プログラムの開発と実践研究

本研究の概要は,学校現場における消費者教育のさらなる充実をはかるために,生活や地域の課題を理科学習に組み込み,それらの課題を科学的に思考するプログラムを開発することである。理科学習に消費者教育的な視点を積極的に組み込むことで,全国調査等で長年指摘されてきた生活における理科学習の有用性を生徒が実感しやすくなるとともに,人や環境・社会に対し,科学的思考を伴った倫理的消費行動をできる人材の育成につながることが期待できる。
Ｂ細胞リプログラミングとヒト化マウスモデルによるホジキンリンパ腫発症機構の解析

本研究ではホジキンリンパ腫(HL)発症の分子基盤の解明を目的とした。Epstein-Barr virus (EBV)由来のLMP-1タンパク質はB細胞への感染で誘導され、リンパ芽球様細胞株(LCL)になる過程でHLで認められるCD30とJunBの発現もたらすことが示された。さらに実際のEBV関連リンパ増殖性疾患で上記を示唆する結果を得た。一方LCLとHL間で幹細胞様集団の存在や、ABF-1の過剰な誘導といった共通する特徴の存在が示された。以上からEBV感染の初期段階でB細胞ではHLで認められる特徴の一部がすでに誘導され、その後の進展に関与する可能性が示唆された。SPとその他の分化した細胞集団であるmajor population (MP)をそれぞれソーティングしサイトスピン後、ギムザ染色を行い細胞の形態を解析したところ、SPは小型の単核の細胞からなるのに対し、non-SPはそれより大型の細胞から構成されている事が明らかとなった。マウスを用いたHL発症モデルの作製については何回か移植実験を行い条件の検討を行った。正常B細胞がリンパ芽球様細胞株(LCL)へトランスフォームする過程で誘導される事を確認したLMP-1、JunB、CD30の発現を複数のLCL、Hodgkinリンパ腫(HL)細胞株、B細胞株においてウエスタン法を用いて検討した。LMP-1、JunB、CD30の発現はLCLで、JunB、CD30の発現はHL細胞株で認め、ERK1/2の活性化を伴なっていた。検討したB細胞株においてはLMP-1、JunB、CD30の発現は認めなかった。ヒト化マウスからB細胞を分離してシクロスポリンによる免疫抑制下においてEpstain-Barrウイルス(EBV)を感染させトランスフオーム、LCLを作製した。作製したLCLにレンチウイルスベクターを用いて蛍光蛋白質を発現させた。蛍光蛋白質を発現した細胞はフローサイトメトリーにて分離、発現していない集団はコントロールとして保存した。ヒト化マウス尾静脈から蛍光ラベルしたLCLを注射して、その分布を経時的に蛍光検出機を用いてスキャンして観察した。注射する蛍光ラベルしたLCLの細胞数、蛍光イメージアナライザーの感度に検討を有する事が明らかとなった。この点について条件を検討中である。正常B細胞がLCLへトランスフォームする過程で、B細胞のリプログラミングを阻害する因子であるABF-1の誘導を認めた。ABF-1の誘導はウエスタンブロットおよびRT-PCR法により確認した。ABF-1の誘導機構解析に向けてそのプロモーターを単離、レポータージーンアッセイにより活性誘導に必要な領域を同定した。コンピュータ解析により、この領域に結合しうる転写因子の候補を複数同定する事が出来た。ヒト化マウスへ注射する蛍光ラベルしたLCLの細胞数、蛍光イメージアナライザーの感度に検討を有する事が明らかとなったため。Epstein-Barr virus (EBV)産生細胞株B95.8細胞の培養上清を用いて正常末梢血Bリンパ球にEBVを感染させ、シクロスポリンによる免疫抑制下においてLymphoblstoid cell line (LCL)へとトランスフォームさせた。感染前、20日間、50日間のポイントにおいてEBV由来分子のLMP-1とホジキンリンパ腫(HL)の分子基盤であるCD30、CD40、JunBの誘導とNF-κB、ERK1/2MAPKの活性化を検討した。EBV感染後LMP-1に加えてJunBの誘導とNF-κBの活性化を認めた。CD40はNF-κBによる誘導が報告されているが、EBV感染前からBリンパ球に誘導されている一方、CD30の新たな誘導を認め、ERK1/2MAPKの活性化に伴うJunBによるものと考えられた。LMP-1はCD30およびCD4Oのプロモーターを活性化する事が示され、それぞれNF-κBとJunBを介したものであると考えられた。B細胞の分化に関わる転写因子E2AはHLにおいて抑制因子であるABF-1やId2の過剰な誘導により抑制されていることが報告されている。LCL細胞を用いてABF-1やId2の誘導をウエスタン法により検討したところ、LCL細胞ではこれらの分子の発現誘導を認めたが、HLにおける誘導はむしろ減弱しており、EBV感染が初期の脱分化に寄与する一方、HLにおいてはむしろ他のメカニズムにより置き換えられている可能性が示唆された。ヒト化マウスの尾静脈より蛍光標識したLCLを移植し、ホジキンリンパ腫発症機構の解析のためのモデルマウス作製の検討を行った。さらに、移植したLCLの体内分布をイメージアナライザーで解析した。ホジキンリンパ腫(HL)の半数にEBV感染を認め、HLとEBV感染症とは密接な関係にあることが報告されている。ヒト化マウスに宿主由来のラベルされたLymphoblastoid cell line (LCL)を戻すことによりその分布や増殖状態を観察できる系をもとにHL発症についてニッチ形成も含めて解析を目指した。ヒト臍帯血から分離した造血幹細胞を生まれたばかりのNOD/scid/γc-/-(NOG)マウスに注射することによりマウスの免疫系の全てがヒト免疫細胞で構成されるようになったヒト化マウスの作製に成功した。作製したヒト化マウスからB細胞を分離してシクロスポリンによる免疫抑制下においてEBVを感染させトランスフオーム後LCLを作製し、これにレンチウイルスベクターを用いて蛍光蛋白質を発現させた。

蛍光蛋白質を発現した細胞はフローサイトメトリーにて分離し、ヒト化マウス尾静脈からこの蛍光ラベルしたLCLを注射して、その分布を経時的に蛍光検出機を用いてスキャンして観察した。このステップにおいて実施した蛍光ラベルしたLCLのマウス体内での分布の検出において問題が生じ実験計画の遂行に遅延が生じている。マウスが摂取している餌の蛍光が相対的に非常に強く、LCLの詳細な体内分布の解析が困難であった。このため、実験条件の詳細な検討を行い、条件を変えて再度実験を行うことが必要となってしまった。餌の蛍光は通常の観察では問題にならないが、微量の蛍光を検出する今回の系においてはLCL細胞の分布の検出において大きな支障となる事が明らかとなった。バックグラウンドの蛍光が非常に強く、LCLの詳細な体内分布の解析が困難であった。このため実験条件の詳細な検討を行い、条件を変えて再度実験を行うことが必要となってしまった。免疫抑制下のEpstein-Barr virus (EBV)増殖性疾患およびHodgkinリンパ腫(HL)の診断に用いられた標本切片を用いて、正常B細胞がリンパ芽球様細胞株(LCL)へトランスフォームする過程で誘導される事を確認したLMP-1、JunB、CD30の発現を免疫染色法により検討した。HLにおいてはJunB、CD30の発現を、EBV増殖性疾患においてはLMP-1、JunB、CD30の発現を認めた。EBVはEBV増殖性疾患の全てにおいてEBERを検出するin situハイブリダイゼーションにて検出した。ベラパミルに対するヘキスト染色性をフローサイトメトリー(FCM)により解析することでside population(SP)という分画に癌幹細胞分画が濃縮されることが報告され、癌幹細胞集団の同定の一つの方法として広く用いられている。LCLについてFCMによりソーティングし、ギムザ染色を行いSPとnon-SPの細胞の形態を解析したところ、SPはnon-SPに比べて小型の細胞により構成されている事が示された。B細胞の分化に関わる転写因子E2AはHLにおいて抑制因子であるABF-1の過剰な誘導により抑制されていることが報告されている。ABF-1の誘導をLCL、HL細胞株において遺伝子及びタンパクレベルで解析したところ既に誘導されている事が示された。以上の事は、正常B細胞がLCLとなる過程でEBV感染に伴うLMP-1誘導がJunBを介してCD30を誘導すると考えられた現象が、確かに臨床検体の検討においても示唆されること、LCL形成の過程で既にB細胞としての分化の抑制と腫瘍化への脱制御が進行している事が示唆された。一方、ヒト化マウス尾静脈から蛍光ラベルしたLCLを注射して、その分布を経時的に蛍光検出機を用いて観察したが、非特異的な蛍光が詳細な解析を困難なものとした。本研究ではホジキンリンパ腫(HL)発症の分子基盤の解明を目的とした。Epstein-Barr virus (EBV)由来のLMP-1タンパク質はB細胞への感染で誘導され、リンパ芽球様細胞株(LCL)になる過程でHLで認められるCD30とJunBの発現もたらすことが示された。さらに実際のEBV関連リンパ増殖性疾患で上記を示唆する結果を得た。一方LCLとHL間で幹細胞様集団の存在や、
繊維集合体のぬれ速度測定装置の開発

電気伝導度の変化を利用して繊維集合体の浸透ぬれ速度を測定する装置を試作し測定を行った。直径10mm,高さ3mmまたは7mmの円筒状テフロン製セルに繊維,織物あるいは濾紙を詰め,試料の上下両端に直径16mm,厚さ0.5mmの白金板に0.5mmの穴を37個あけた白金電極を設置し,下部電極に電解質水溶液を接触させると,液体は毛管現象によって固体試料内を上昇する。電極間の電導度の経時変化を求め,試料内の最も短い毛管に液が浸透するのに要する時間と考えられる降伏時間【t_0】および電導度-時間曲線の初期勾配Sをぬれ速度のパラメーターとした。【t_0】の増加とSの減少はぬれ速度の減少をあらわす。セルロース濾紙,ポリエステル布,ナイロン繊維を用いて測定を行った結果,本装置が繊維集合体の浸透ぬれ速度を調べるのに適切な装置であることがわかった。そこで試作装置を用いて各種繊維集合体(シリコン加工したセルロース濾紙,柔軟加工したセルロース濾紙など)の浸透ぬれ速度を調べた。浸透ぬれが起こらない試料では,電導度計の代りに絶縁計を用いることにより、吸湿現象を調べることができた。また、アニオンおよびカチオン界面活性剤水溶液による繊維集合体のぬれ速度測定から,固体試料への界面活性剤の吸着層構造を検討することができた。繊維間隙を毛管とみなしたときのモデル実験として、ナイロンで被覆したガラス管における毛管現象が調べられた。ぬれの尺度となる接触角はナイロンの等電点のpH付近で最大となり、ぬれに界面電気現象が関与していることが明らかになった。さらにぬれの基礎的研究として、ウィルヘルミー法による動的接触角の測定法の検討を行った。ウィルヘルミー法で求めたYoungの接触角を用いて固体の表面自由エネルギーを見積り、さらに表面自由エネルギーの分散力成分と極性成分を算出した。熱力学的に意味のある接触角は三相境界線の上昇あるいは下降速度が0.5mm/minの条件で得られることがわかった。織物など繊維集合体のぬれ速度測定装置を考案し、試作した。両端に多孔性平板白金電極をとりつけたテフロン製のセル中に繊維束や織物を詰め、下端を液体に接触させると毛管現象によって液体がセル中を上昇し、上部電極に液体が接触すると電極間の抵抗が低下する。試料のぬれが進むにつれて抵抗値の変化がおこるので抵抗値の経時変化を自記記録することにより繊維集合体のぬれ速度を調べることができる。この原理に基づいて装置を試作し、セルロースフィルターを試料として用いてぬれ速度の測定を行い、抵抗値-時間曲線の解析から試料のぬれ速度が測定できることを明らかにした。試作装置を用いてセルロース系繊維集合体のぬれに及ぼす市販柔軟剤の影響を調べたところ、標準使用濃度においてもぬれが悪くなることが明らかとなった。そこで市販柔軟剤の主成分であるカチオン界面活性剤のぬれに及ぼす効果を検討した。カチオン界面活性剤として塩化アルキルトリメチルアンモニウムを用い、アルキル基の炭素数を変化させて実験を行ったところ、炭素数が増加すると低濃度でぬれが悪くなる現象がみられた。

塩化デシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウムのいずれにおいても低濃度領域で疎水化(接触角の増大)がおこりぬれが悪くなるが、濃度が増すとぬれがよくなる傾向(接触角の減少)が認められた。こうした現象は繊維基質への界面活性剤の吸着層構造によって説明できる。また、臨界ミセル濃度以上の高濃度ではぬれ速度がおそくなるが、これは繊維の膨潤のためと考えられる(第24回油化学研究発表会、筑波、1985年10月発表)。ぬれに及ぼすアニオン界面活性剤の影響(第37回日本家政学会年会、東京、1985年6月発表)や接触角測定法の検討(第38回コロイド及び界面化学討論会、長崎、1985年10月発表)も行った。
フッ素・銀プラズマイオン注入による抗菌性・歯垢易離脱性を付与した口腔内装置の開発

本研究は,立体的な口腔内装置表面に,抗菌性および防汚性を有するフッ素イオンと抗菌性を有する銀イオンとをプラズマイオン注入法を用いて同時に注入することにより装置表面を改質し,抗菌性,細菌付着抑制およびプラーク易離脱性を付与することを目的として行った。表面元素分析によりフッ素および銀イオンを本法で注入したアクリルレジン試料では,試料表面にフッ素および銀が認められ通常のイオン注入が困難な絶縁体であるアクリルレジンへの本法の適応が証明された。さらに,緑膿菌の増殖を減少させる効果も認められ,将来本法を口腔内装置に応用することにより,デンチャープラークが起因となる誤嚥性肺炎の予防につながると期待された。本研究は立体的な口腔内装置表面に,抗菌性および防汚性を有するフッ素イオンと抗菌性を有する銀イオンとをプラズマイオン注入法を用いて同時に注入することにより装置表面を改質し,抗菌性,最近付着抑制およびプラーク易離脱性を付与することを目的としている。平成25年度はアクリルレジン(PMMA)平板においてその表面物性および細菌学的評価を行った。まず,試料作製についてであるが,PMMA平板をプラズマベースのイオン注入・成膜装置内の試料台に貼り付け,その10mm上方に純銀製メッシュを設置した。その後チャンバー内にフッ化物ガスを充満させ,高エネルギーパルス電圧を印加することによってフッ素イオンおよび銀イオンをPMMA平板表面に注入した。次に作製した試料表面をエックス線光電子分光分析装置(XPS)にてワイドスキャン測定にて表面構成元素の分析を行った。その結果,フッ素および銀のピークが検出され,プラズマベースのイオン注入・成膜法によるPMMAのような帯電性の試料へのイオン注入,しかも2種類のイオンが同時に注入できることが可能であることが示された。さらに,平成25年度は一般細菌である緑膿菌の抗菌性試験をATP発光測定法により行い,フッ素および銀イオン注入試料において緑膿菌の増殖抑制が認められた。また,口腔内細菌で齲蝕原性細菌であるストレプトコッカスミュータンスを用いた抗菌性試験の条件設定等の研究方法の検討も行った。本研究は,立体的な口腔内装置表面に,抗菌性および防汚性を有するフッ素イオンと抗菌性を有する銀イオンとをプラズマベースのイオン注入法を用いて同時に注入・成膜することにより装置表面を改質し,抗菌性,細菌付着抑制性およびプラーク易脱離性を付与することを目的としている。平成26年度は平成25年度に引き続き,アクリルレジン(ポリメチルメタクリレートレジン:PMMA)平板にフッ素および銀イオンを注入した試料を用いて,齲蝕原生細菌であるStreptococcus mutans(ミュータンスレンサ球菌)に対する抗菌性試験をATP発光分析法を用いて行った。さらに,追加試料を作製し,フッ素イオンのみ,銀イオンのみを注入した試料に加えて,プラズマ環境下に置くがフッ素や銀イオンは注入しない試料も作製した。作製した試料に対して表面元素分析をXPSにて行った結果,全ての試料に必要なイオンが注入されていることが確認できた。さらに,抗菌性試験においては,フッ素および銀イオンを両方注入した試料において明らかな細菌増殖抑制効果が示された。平成27年度は平成25年度および平成26年度に引き続き,ポリメチルメタクリレートレジン(PMMA)平板の上に銀メッシュを被せ,フッ化物ガスをプラズマ化して加圧電圧をかけることによりフッ素および銀を同時注入したもの,さらにフッ素イオンのみ(フッ化物ガスを使用し銀メッシュを使用しなかった),銀イオンのみ(フッ化物ガスを使用せず,銀メッシュを使用した)および炭素イオンのみ(フッ化物ガスおよび銀メッシュを使用せずに同一条件で処理をした)を注入したものについての表面物性分析を行った。いずれの試料も必要としたイオンは明らかに注入されており,つまり,帯電性のPMMA材料にもプラズマベースのイオン注入法を用いた方法であれば,フッ素および銀イオンの同時注入が可能であることが示された。また,平成27年度は,立体物へのイオン注入の実施に向けた試作を行った。具体的には,PMMAを材料とした義歯型試料を作製し,フッ素および銀イオンを同時に注入するための条件の調整を行った。その結果,両イオン注入は可能であったが,立体試料表面に均一に両イオンが注入されるためには,試料自体が均質に作製されていることが重要であることが判明し,義歯型試料作製方法をさらに検討する必要が生じた。平成25年度より引き続き行っているPMMA平板試料の評価において,口腔内細菌に対する細菌学的評価の研究方法に関して研究方法を模索してきたが,ATP発光分析法による方法が確立したため,概ね順調に経過している。

さらに,最終年度に予定している立体物へのフッ素イオンおよび銀イオン注入計画については,(株)プラズマイオンアシスト(京都)にて試作品を作製するまで至っており,順調に進展していると言える。小児歯科学平成26年度より本研究に協力している大学院生1名も抗菌性試験の手技をマスターしており,立体物へのイオン注入を本年度は早期に進め,その評価を進めていく予定である。PMMA平板試料の評価においては,口腔内細菌に対する細菌学的評価の研究方法を現在模索しているがその他表面物性分析については概ね順調に進展している。また,最終年度で予定している義歯型試料へのフッ素イオンおよび銀イオン注入の計画についての平成25年度より進行を進めており,その点においても非常に順調であると言える。平成27年度に作製予定の立体試料にかかる費用が当初の見込みよりも多くかかる予定であるために当該年度分を次年度に繰り越した。平成26年度より大学院生1名が本研究に協力することになった。これは非常に大きな推進方策と言える。新たに立体物へのイオン注入を行う予定である。さらに複数の菌種に対する抗菌性試験を施行し,その研究成果を平成27年度に学会発表および論文発表する費用に使用することを計画している。次年度以降に計画している義歯型試料へのイオン注入に予想以上に費用がかかる見込みであるため,当該年度分を次年度に繰り越した。平成26年度はさらに細菌学的な評価を進めるための試薬購入や,国内外の学会における研究成果の発表および平成25年度で得られた研究成果についての論文投稿にかかる費用に使用する予定である。
mTOR、HSP90が口腔癌血管新生に果たす役割

下顎歯肉癌のサンプルにおいてCD31, VEGFR2高発現を認める血管内皮細胞が多く認められた。癌細胞にはVEGFAを強く発現していた。HSP90とmTORの阻害薬は単独で使用するよりも強くVEGFA発現口腔癌細胞増殖を抑制し、同時に血管内皮細胞の増殖を抑制することが明らかになった。ゼラチンザイモグラフィーよりHSP90, mTOR阻害薬の相互作用により血管内皮細胞のMMP-2の活性が抑制することが明らかになった。口腔癌細胞マウス皮下移植モデルにおいて同薬剤の併用療法により腫瘍細胞の抑制だけでなく、血管内皮細胞の抑制が確認された。口腔癌の進展過程において,腫瘍周囲への血管新生は治療法の選択,手術範囲の決定において重要な因子であり、予後を左右する負の要因となっている。申請者はHeat Shock Protein 90(HSP90),mammalian Target of Rapamycin (mTOR)シグナルが下流のVascular Endotherial Growth factor (VEGF)を活性化することにより口腔扁平上皮癌の増殖ならびに血管新生に関与する事を見いだした。この結果をもとに申請者はmTOR,HSP90阻害薬による新規分子標的治療法を検討することとした。申請者はHSP90,mTOR選択的阻害薬Temsirolimus,NVP-AUY922を用いることで口腔扁平上皮癌の増殖が抑制されると同時にVEGF発現が抑制されることを報告した。さらに申請者はTemsirolimus,NVP-AUY922を用い癌血管新生においてHSP90,mTORの働きの一部を明らかにした。HSP90は多くのclient proteinを有しており,この中には血管内皮細胞上のVEGFR2も含まれる。HSP90阻害薬NVP-AUY922はmTOR阻害薬であるTemsirolimusと同調して血管内皮細胞の管腔形成を抑制した。このメカニズムはNVP-AUY922が血管内皮上のVEGFR2の発現を抑制し,それによりMMP2の発現を抑制することが関与すると考えられた。またHSP90はAktのclient proteinであるためin vitroにおいてNVP-AUY922がmTOR阻害薬Temsirolimusの非Akt依存性の抗悪性腫瘍効果を増加させた。上記のようにTemsiroimusとNVP-AUY922は異なるシグナル伝達阻害薬でありながらそれぞれの抗悪性腫瘍効果を増強し合っている。これにより分子標的治療薬の容量を減量させることが可能となり,分子標的治療における最も重要な有害事象である骨髄抑制などの副作用を軽減させる可能性がある。次年度は動物実験におけるNVP-AUY922とTemsirolimusの抗腫瘍効果の検討を継続し,新規分子標的治療法開発に向けた研究を行う。申請者は口腔癌細胞株(HSC-2,SAS)を用いて、mTOR阻害薬、TemsirolimusならびにHSP90阻害薬、NVP-AUY922が口腔癌細胞の増殖能を抑制することを見いだした。NVP-AUY922は口腔癌細胞株(SAS)のアポトーシスを誘導し、マウス皮下腫瘍モデルにおいてNVP-AUY922投与マウスにおいて腫瘍体積の抑制が認められた。また本研究のIn vivo検討において腫瘍組織周囲に誘導される血管がNVP-AUY922投与群において著明に少なかったため、血管新生機構に対するHSP90の検討を行うこととした。血管内皮細胞上に発現し癌細胞が産生するVEGFが結合することにより血管新生が促進されるVEGFR2がHSP90のClient proteinであることは以前より予測されていたが、癌血管新生機構における働きは分かっていなかった。申請者は血管内皮細胞にNVP-AUY922を添加するとVEGFR2の発現が抑制されることを見いだし、血管基底膜を融解し、血管新生の足場を作るMMP-2産生を抑制すること報告した。この結果は血管内皮細胞におけるVEGFR2-MMP2シグナル経路をHSP90阻害により抑制する可能性があることを示唆している。申請者はmTOR阻害薬とHSP90阻害薬を併用することで,癌細胞自体の生存シグナルを抑制するだけでなく,癌細胞が産生するVEGFの阻害とVEGFR2-MMP2シグナルの遮断という3つの経路を阻害する事でより強固な抗腫瘍効果を示すのではないかと考えた。マウス口腔癌皮下腫瘍モデルに対し、Temsirolimus,NVP-AUY922単独投与ならびに併用投与群において単独投与群においても腫瘍体積の抑制が認められたが、併用投与群においてはさらに著明な腫瘍体積抑制効果を認めた。実験計画を適宜検討し当初の計画に沿うよう研究を遂行した。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は当初の予定通り,in vivoにおける検討を主とする。

本研究は最終的に新たな分指標的治療法を確率するための前臨床研究であるため,薬剤の投与方法等実際の臨床に即した濃度,タイミングで行われる必要がある。また腫瘍に対する有効性だけで無く,副作用の検討も必須である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
非円形ノズル効果とバイモーダル励起による同軸噴流の混合制御

本研究では、内周と外周に存在する2つのせん断層を有する同軸噴流における流れの混合過程で噴流せん断層中に発生する渦の挙動・干渉を調べ、噴流の混合促進・抑制する最適条件であるノズル形状、加振条件を明らかにすることを最終目的としている。まず、円形の2つのせん断層の干渉を調べるために、水噴流実験装置においてレイノルズ数3000の同軸噴流について、内側円形噴流と外側環状噴流を同時に加振した場合の振動波形の位相差が内側、外側せん断層内の渦の発達・合体・崩壊に及ぼす影響を調べた。その結果、非加振時の噴流内の自然渦周波数fnを基準として、加振周波数を0.5fnで位相差を与えて加振した場合、特定の位相差で渦合体が促進されて、噴流が広がること、そして、加振周波数1.0fnで加振した場合は中心軸付近の速度が増加し、位相差を与えた場合に3つのパターンがあることを明らかにした。さらに、空気噴流実験装置においても、同軸噴流の混合制御における位相差の有効性を示した。次に、2次元の2つのせん断層の干渉を調べるために、平面噴流の上流側から噴流全体を加振した全体加振と噴流ノズル出口先端の幅1mmのスリットからせん断層を直接加振したせん断層加振、さらにせん断層加振時に上下のスピーカの加振波形に位相差をつけた場合の影響を調べた。その結果、全体加振とせん断層加振の加振位置変化による流れ場に及ぼす影響にあまり差はなく、加振周波数が高い方が、噴流の広がりが大きくなる。そして、せん断層加振時の加振波形の位相差は渦構造に大きく影響を与え、同位相で加振した場合には渦合体が2回生じるために乱れが大きくなり、噴流が広がる。一方、逆位相で加振した場合に、渦合体後の渦が下流域で交互配列となり、安定して流下し、非加振時より乱れが小さくなることを見出した。以上の研究の成果は、日本機械学会の国内及び国際会議にて発表した。
高速度CCD生体顕微鏡による腎糸球体毛細管血流動態解析

本研究で、我々は原尿を濾過する装置である糸球体毛細管血流の可視化し、ラットモデルを用いて病態生理学的研究を行なわんとした。そこで血行動態可視化のために、特に高速度撮影が可能な腎専用のペンシルレンズ型CCD生体顕微鏡を開発した。既に我々は光学系レンズを組み合わせた先端がコーン状であるペンシル型プローブの開発により生体腎内微小血管のin-vivoイメージングの予備実験に成功しているが、生体顕微鏡を高速度化すると血球そのものの移動距離を計測することで、輸入・輸出細動脈の速い血流を含めて糸球体毛細管等の血流速度を評価できることになり、微小循環の調節メカニズムおよびその異常を論ずることが可能となる。本研究では、腎皮質に存在する糸球体毛細管での血流速度分布と共に、糸球体輸入・輸出細動脈の血管径を測定し、病態ラットモデルにおける腎循環調節メカニズムをその基盤である糸球体微小循環レベルで解析した。その結果、高血圧ラット(SHR)では、,正常ラット(WKY)と比してその輸入動脈径は、収縮していることが判明した。また、カルシウム遮断薬では、病態を問わずかつ輸入動脈だけでなく、従来の報告と異なり輸出動脈においても容量依存性の拡張が認められた。糸球体毛細管における赤血球の速度は、WKYラットと比して糖尿病(STZ)ラットでは有意に速いことが、初めて分かった。血圧を上昇させるアンジオテンシンIIに対して、糸球体血流平均速度は濃度依存的に増加することが判明した。腎は心拍出量の20%もの血流によって灌流され、1側腎に約100万個存在する糸球体毛細管から1分間に約100mlの原尿が濾過されており、生命維持にとって最もcriticalな臓器である。しかし、腎糸球体のin-vivo観察は大きく制約され,これまでは水腎症など病的モデルや糸球体が表在化する特殊なラットモデルによる解析に限られ、生理的状態での観察は不可能であった。最近,我々の研究グループは日本光電(株)と共同でCCD生体顕微鏡を開発し,世界で初めて心筋内微小血管の可視化に成功し、それを応用してイヌ、次いでヒトにおける腎内微小血管のin-vivo観察に成功した。今回、我々は原尿を濾過する装置である糸球体毛細管血流の可視化し、ラットモデルを用いて病態生理学的研究を行なわんとした。血行動態可視化のためには、特に高速度撮影が可能な腎専用のペンシルレンズ型CCD生体顕微鏡が必要となる。本年度は、糸球体内血流速度分布計測用ソフトウェアの作製を進めた。動画像の時空間像を作成しウィンドウ間の相関分析より局所血流速度を求めるプログラムを開発した。この評価に、従来型のCCD生体顕微鏡により得られた画像を適用し、その有効性を確認した。ビデオ画像の赤血球に着目し、糸球体の毛細管に直線状の関心領域を設定し、この直線に沿った時空間像を作成すると通常は、斜めの縞状の像が得られる。この、射線の角度が赤血球の速度を反映したものとなる。移動距離の計算により、速度ベクトルが求められる。糖尿病ラットにおける糸球体内での血流速度は、コントロールに比して遅いことが、この方法により明らかとなった。本研究はシステムの性能評価を行い、in vivo実験を進めた。(1)生体腎を用いた血流計測の評価麻酔下のラット腎表面に切開を加えCCD生体顕微鏡を刺入し、高速度CCD顕微鏡で観察して血流画像を録画した。更に、光マーカーを腎動脈から投与した時のマーカーの移動画像の記録も行なった。同時にトランスソニック型超音波血流計で腎動脈血流量を測定した。2種の方法による腎糸球体内血流分布の比較を行い、なおかつグローバルな腎血流と比較検討した。(2)腎微小循環の観察実験モデルラットを用いてコントロールラットとの血流の違い、血流量、流速等を比較検討した。

血管作動物質であるアンギオテンシンIIなどによるインターベンションを行なって反応の相違を観察した。まず、正常ラットを用いて、血圧、血流量、血流速度について検討を行なった。アンジオテンシンII(10,30ng/kg/min)に対する反応は、血圧は濃度依存性に増加し(98±6,105±5mmHg)、腎血流は逆に濃度依存的に減少し(2.0±0.3,1.7±0.2ml/min/100g)、また糸球体血流平均速度は濃度依存的に増加する(641.2±269.6,789.0±185.1μm/s)ことが判明した。これらのアンジオテンシンIIの作用は、すべてアンジオテンシンIIの遮断薬の一つであるAT1遮断薬(Losartan3mg/kg)で消失することも確認した。アンジオテンシンIIは、生体にとって体液を保ちながら尿を生成するには有利であるが、糸球体おける代謝から考えると循環微粒子の接触時間が短くなるので濾過という観点からは生体にとって不利となる。レニンアンジオテンシン系が亢進している高血圧ラットでは、さらに興味深い結果が得られると考えられる。