hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鼻茸成因とアラキドン酸代謝に関する基礎的ならびに臨床的研究

15-HETEの関連が推察された。また、これら炎症性の粘膜からアレルギー反応の化学伝達物質とされるLTC┣D24┫D2、LTD┣D24┫D2、LTE┣D24も検出され、これらがアレルギー以外の炎症にも関連していることも推察された。これらの成績は論文発表を行った。2、鼻茸をはじめ鼻副鼻腔の炎症性病態の粘膜より、シクロオキシゲナーゼ代謝物であるPGD_2、PGE_2、6-Keto-PGF_2a、TXB_2をRIA法にて検索した。PGE_2と炎症性の粘膜との関連が疑われたが、シクロオキシゲナーゼ代謝物の濃度はリポキシゲナーゼ代謝物のそれの約10分の1であった。3、鼻茸中のリポキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼ酵素活性を、┣D114C-アラキドン酸を用いて検索したところ、15-リポキシゲナーゼ活性が優位であることが判明した。4、鼻茸症例の臨床的検討を進めていくなかで、近年、本邦でも経験例が報告され始めたアスピリン喘息に併発した鼻茸症例2例を認めた。組織学的に好酸球の著明な浸潤等が認められ、その病因がアラキドン酸代謝物と何らか関連していることを疑わしめた。今後、アスピリン喘息症例の鼻茸の基礎的検討も追加することは、本研究に寄与するところが大きいと考えられた。この2例については症例報告を行った。1.「鼻茸からの細胞培養」という目標において、血管内皮細胞および繊維芽細胞の系代培養系を確立した。これらの細胞および培養上清からアラキドン酸代謝物をラジオイムノアッセイにより定量可能であり、また、^<14>C-アラキドン酸を用いての酵素活性検索も可能であった。大血管由来の培養血管内皮細胞は、PGI_2の産生能が高いとされているが、本研究の鼻茸由来の培養血管内皮細胞にはPGI_2の酵素活性は比較的低いことが判明し、鼻茸の血管内皮の特徴の一つと考えられた。2.アラキドン酸代謝物の15-HPETEや12-HPETEは、大血管由来の培養血管内皮細胞の細胞障害性が高いとされている。15-,HPETEの代謝物である15-HETEの鼻茸由来培養血管内皮細胞の増殖に及ぼす影響を検討したが、内皮細胞の増殖の抑制は認められなかった。15-HPETE、12-HPETEの増殖への影響を確認すること、および、^<51>Crラベルの内皮細胞を用いた細胞障害性の検討方法を併用することも必要と考えられる結果であった。鼻茸由来培養血管内皮細胞に対する15-HPETEや12-HPETEの細胞障害性が確認されることは、鼻茸の成因におけるアラキドン酸代謝物の重要な係わりを証明することにつながると考えられる。3.鼻茸症例の成因を把握するために、慢性副鼻腔炎に合併した鼻茸症例、鼻アレルギ-およびアスピリン喘息に合併した鼻茸症例について、臨床的統計解析を継続しているが、アスピリン喘息に伴う鼻茸症例は昭和63年度の2例に加え、さらに1例追加症例が得られた。その結果、慢性副鼻腔炎に合併した鼻茸と、鼻アレルギ-あるいはアスピリン喘息に併発した鼻茸の組織像の違いが主に好酸球の浸潤の有無に係わっていることが示唆されてきている。また、好酸球浸潤の強さとその鼻茸に対するステロイド剤の効果との間に何らかの関連性が認められるような結果が得られてきている。1、鼻茸の各種構成細胞の培養系の確立という目標において、鼻茸および鼻茸様の病的変化を生じた上顎洞粘膜由来の繊毛細胞の培養系を確立した。この細胞の^<14>Cーアラキドン酸の代謝を簿層クロマトグラフィ-法とラジオクロマトスキャン法を用いて検索したところ、15ーHPETE、15ーHETEを産生する15ーリポキシゲナ-ゼおよび12ーHPETE、12ーHETEを産生する12ーリポキシゲナ-ゼ両者の酵素活性が優位であることが判明した。鼻茸をはじめ病的鼻粘膜からは15ーHETEあるいは12ー
生餌から配合飼料への転換が給餌養殖に与える影響の分析

マイワシ資源の水揚状況は年々減少し、95年においては100万トンをやや上回る程度にとどまった。在庫量が払底し、不足分をサンマ、コウナゴ等および輸入で補っている。また豊漁をつづけ、価格低迷が著しいシロザケの養殖餌料への転換が研究されている。しかしながら、輸入生餌については品質劣化が生じ、サケを養魚餌料へふりむける試みも、現在のところ価格面・栄養面にネックがある。生餌餌料の価格高騰により、個別経営の生餌使用割合がいっそう低下し、配合飼料使用比率が高まっている。配合飼料使用量について、具体的に個別経営がどれほど使用したかを示す正確な数値を把握することは難しい。この研究においては、使用餌料全体がいかなる経営論理で生じているかを、養殖経営の視点から解明した。またマイワシ資源の減少が養殖生産のみならず、流通面でいかなる影響を及ぼしているかを、餌料流通と成魚流通から明らかにした。生産原価の削減は、製品価格が低迷しているブリ養殖経営にとって最大の課題である。配合飼料はメーカー価格であるから、餌コストは成魚販売金額の増減にかかわらず固定化される傾向が強い。餌料効率をこれまで以上に向上させることが、個別経営にとって不可避である。濃度の高い餌を養殖業者がどう使いこなすかが経営のポイントであり、いっそうの養殖管理技術が要求される。マイワシ餌料不足とそれによる価格上昇が配合飼料の普及を加速させ、従来のマイワシ大量投餌型の養殖管理・経営が転換を迫られている。イケス毎の計数管理を徹底させ、経営管理能力に優れた経営が生まれつつある。固定経費部分が上昇し損益分岐点があがるなかで、大規模経営化=企業的経営が静かに、しかし深く進行しているのである。鹿児島県垂水市漁協、牛根漁協、東町漁協を中心に研究課題に沿って調査を実施した。併せて、流通調査では東京都中央卸売市場や大手量販店等で聞き取り調査及び資料収集も実施した。、本年度研究実績の概要は以下のとおりである。マイワシ資源、水揚状況は本年度さらに厳しく、マイワシ在庫量が急速に低下している。不足分をサンマ、コウナゴ等様々な魚種で補う動きが活発化しているが、なお生餌料全体が不足気味で、本年度産地餌料価格(マイワシ凍結もの、産地直値)はキロ単価6070円と急騰し、養魚経営を圧迫している。この餌料価格高騰によって、個別養魚経営は生餌料の使用割合がさらに低下し、替わって配合飼料使用割合が向上中である。配合飼料使用料に関して、配合飼料主要購入ルートが漁協・漁連でなく、配合メーカー及びその代理店であり、個別経営が具体的にどれほど使用したかを示す正確な数値把持が難しい。我々の調査では使用餌料全体の3060%程度を配合飼料が占めていることが明らかとなった。配合飼料への転換がいかなる経営論理で生じているのかという課題は生餌と配合飼料の増肉係数、価格格差、投餌労働力の高齢化問題(作業負荷)などが主要因であることが判明したが、複数の要因が何を主要因として他に要因と経営論理としてどのように結合しているのかといった緻密な論理整理には至っていない。流通・市場面に関して、養殖ハマチは生餌使用ハマチと配合使用ハマチの市場評価が必ずしも行われているわけでなく、主として出荷サイズ(3,4,5キロサイズ)を軸として評価がなされ、したがって身質が卸売価格に意外と反映されていないことが明らかとなった。なぜ、養殖ハマチについては魚体(サイズ)が価格形成の重要な要因となっているのかを養殖ハマチ価格形成メカニズムのより掘り下げた調査・分析が次年度の課題といえる。

在庫量が払底し、不足分をサンマ、コウナゴ等および輸入で補っている。また豊漁をつづけ、価格低迷が著しいシロザケの養殖餌料への転換が研究されている。しかしながら、輸入生餌については品質劣化が生じ、サケを養魚餌料へふりむける試みも、現在のところ価格面・栄養面にネックがある。生餌餌料の価格高騰により、個別経営の生餌使用割合がいっそう低下し、配合飼料使用比率が高まっている。配合飼料使用量について、具体的に個別経営がどれほど使用したかを示す正確な数値を把握することは難しい。この研究においては、使用餌料全体がいかなる経営論理で生じているかを、養殖経営の視点から解明した。またマイワシ資源の減少が養殖生産のみならず、流通面でいかなる影響を及ぼしているかを、餌料流通と成魚流通から明らかにした。生産原価の削減は、製品価格が低迷しているブリ養殖経営にとって最大の課題である。配合飼料はメーカー価格であるから、餌コストは成魚販売金額の増減にかかわらず固定化される傾向が強い。餌料効率をこれまで以上に向上させることが、個別経営にとって不可避である。濃度の高い餌を養殖業者がどう使いこなすかが経営のポイントであり、いっそうの養殖管理技術が要求される。マイワシ餌料不足とそれによる価格上昇が配合飼料の普及を加速させ、従来のマイワシ大量投餌型の養殖管理・経営が転換を迫られている。イケス毎の計数管理を徹底させ、経営管理能力に優れた経営が生まれつつある。固定経費部分が上昇し損益分岐点があがるなかで、大規模経営化=企業的経営が静かに、しかし深く進行しているのである。
高次嗅覚中枢における匂い情報コーディング様式の解明

嗅覚系において、匂いの情報は糸球体の空間的発火パターン(匂い地図)として嗅球に表現される。一方、匂い地図がどのように高次中枢に伝達されるのかは未解明であった。本研究では、ゼブラフィッシュの遺伝子工学的単一細胞標識法と画像レジストレーション法を組み合わせ、嗅球ニューロンの軸索投射について以下の知見を得た。1)単一嗅球ニューロンは複数の高次脳領域に投射する。2)各々の高次嗅覚中枢は、糸球体クラスター非選択的な投射、または特定の糸球体クラスターからの優位な投射を受ける。すなわち、高次嗅覚中枢では匂い地図の情報が統合・抽出され、匂いの質を表現する新たな嗅覚情報として再編されることが示唆された。嗅覚は、動物の生命活動(食物の探索、危険回避、繁殖、社会性コミュニケーションなど)に重要な役割を果たしている。匂い分子は鼻の奥に存在する嗅細胞によって受け取られ、その情報は軸索を介して脳の嗅球に送られる。嗅球には糸球体と呼ばれる機能ユニットが存在し、異なる匂いは異なる組み合わせの糸球体群を活性化する。すなわち、匂い情報は活性化した糸球体の空間配置情報(匂い地図)として嗅球上に表現される。匂いの種類に応じた様々な嗅覚行動の発現には、嗅球の「匂い地図」がさらに高次中枢で適切に読み取られる必要がある。本研究では、遺伝子工学的手法による生体イメージングに適したゼブラフィッシュを用いて、嗅球から高次嗅覚中枢への神経投射様式の解析を行った。我々はすでに、嗅球の背内側部糸球体クラスターに樹状突起を接続する投射ニューロンを蛍光タンパク質で可視化し、その軸索が終脳とともに、間脳の手綱核という神経核に投射することを明らかにした。本年度は、背内側部以外の糸球体クラスターと接続する嗅球ニューロンの軸索投射パターンを解析した。嗅球に発現するTbx21遺伝子の周辺ゲノム領域(約200kb)を含むBACクローンに対して、大腸菌内相同組換えによるGa14遺伝子の挿入を行った。作製した改変BACを用いて蛍光タンパク質を発現させ、主に背内側部以外の糸球体クラスター(前腹側部および背側部)と接続する嗅球ニューロンの可視化に成功した。これらのニューロンの軸索投射パターンを解析したところ、背内側部ニューロンと同様に終脳には投射するが、その多くは手綱核には投射せずに視床下部に投射することが明らかとなった。また、終脳への投射おいて、背内側部ニューロンと一部重複しながらも、異なる領域性が認められた。一次嗅覚中枢である嗅球には、糸球体と呼ばれる機能ユニットが存在する。異なる匂いの情報は嗅細胞(感覚ニューロン)の軸索を介して異なる組み合わせの糸球体を発火させ、嗅球上に匂い地図として表現される。一方、種々の匂い刺激に応じた特定の嗅覚行動の発現には、高次中枢が嗅球の匂い地図から情報を抽出・統合して運動系に出力する必要がある。本研究では、遺伝子工学的手法による生体イメージングに適したゼブラフィッシュを用いて、嗅球から高次中枢への軸索投射パターンの詳細な解析を行った。我々は前年度までに、嗅球投射ニューロン(二次ニューロン)特異的な遺伝子プロモーターを同定し、稚魚における蛍光タンパク質のモザイク発現系を確立している。本年度はこの手法を用いて、嗅球の各糸球体クラスターに接続する投射ニューロンの軸索軌跡を単一細胞レベルで可視化し、多数のニューロンサンプルを収集してその投射パターンを解析した。その結果、1)単一嗅球ニューロンは複数の高次脳領域に投射すること、2)異なる糸球体クラスターに接続するニューロン群は、異なる投射領域選択性を示すことが明らかとなった。さらに、上記解析から明らかとなった投射領域において、標的ニューロンタイプ(三次ニューロン)を同定するために、Gal4/UASシステムの制御下に経シナプス性トレーサーWGAと蛍光タンパク質を同時発現するトランスジェニック系統を樹立した。また、高次中枢における匂い情報処理様式の解明には、機能的神経活動マップの解析も必須である。本研究ではErk(MAP Kinase)のリン酸化を神経活動の指標として、各種嗅覚行動にともなう活性化脳領域を複数特定した。匂いの源から発せられた匂い分子は、末梢感覚ニューロンの軸索を介してそれぞれ異なる組み合わせの糸球体を発火させ、その情報は匂い分子の化学構造を基にした「匂い地図」として嗅球に投影される。一方、匂いの質に対応した特定の嗅覚行動を発現するためには、高次中枢が嗅球の匂い地図を適切に読み取って運動系に出力する必要がある。

本研究では、遺伝子工学的手法による生体イメージングに適したゼブラフィッシュを用いて、嗅球から高次中枢への軸索投射パターンの解析を行った。前年度までに、嗅球の各糸球体群に接続する投射ニューロンを単一細胞レベルで可視化することに成功し、個々の嗅球ニューロンが複数の高次脳部位に投射することを見いだした。今年度は多数の画像サンプルを取得し、三次元画像解析によって、主要な高次脳部位である終脳での軸索投射パターンについて詳細な解析を行った。異なる個体に由来する軸索軌跡を同一の座標軸上で解析するために、image registration法を用いて各ニューロンサンプルの軸索軌跡を標準脳画像上にマップした。軸索軌跡からニューロンのクラスター解析を行い、その結果をもとに三次元再構築を行うことで以下の知見を得た。1、後部終脳領域(主要嗅覚領域)は全ての糸球体群から広範囲に投射を受ける。2、後部終脳領域の中心部は異なる糸球体群から重複した投射を受ける。3、後部終脳領域の辺縁部は特定の糸球体群から特異的な投射を受ける。これらの結果から、終脳の嗅覚領域では、嗅球に表現された化学構造に基づく匂い地図の情報が統合・抽出され、匂いの質を表現する新たな嗅覚情報として再編されることが示唆された。交付申請の研究計画にほぼ沿って進展している。嗅球から高次中枢への包括的軸索マップの作製にあたり、必要な画像サンプル数がほぼ得られた。また予定通り、次年度に使用予定のWGAトランスジェニック系統の樹立に成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度に得られた多数の画像データをもとに、画像レジストレーション法を用いて異なる個体に由来する軸索軌跡を基準脳イメージ上に3次元構築し、包括的かつ詳細な軸索投射マップを作製する。また、樹立したWGAトランスジェニック系統の解析から、嗅球ニューロンの標的ニューロン群を同定する。これらの神経解剖学的解析に加えて、機能的神経活動履歴マップの作製を進め、高次嗅覚中枢における匂い情報コーディング様式の解明を目指す。
近世スコラ学との比較に基づくスピノザ形而上学の総合的研究

前年度までに十分進められたスアレス形而上学の分析を用いながら、その後のスコラ学における超越範疇(transcendentia)の変遷を調査することで、超越論的(transzendental)哲学の生成要素を抽出する作業を行った。超越範疇に、それが不可避的に帯びる非十全性という性格を付与し明示化する点において、スアレスの超越範疇論は際立っていた。ここから本研究者は、彼によって与えられたこの新たな規定が超越範疇の認識論化を促し、スアレスにおいてはなお存在論の枠組みのもとで語られていた超越範疇という概念が、その後のとりわけカロフ等に代表されるグノストロギアの系譜に位置する者たちによって徐々に認識論の枠の中で実質的な意義を持つようになり、そのことによって形而上学の対象であるところの「存在である限りの存在」を明らかにするという存在論的な領域での位置価を徐々に失っていったのではないか、という仮説のもとでスアレス以降のスコラ学に関する文献の分析を行った。上記のスコラ哲学を進める上で副産物として得られた幾つかの知見を用いながら、スピノザ形而上学の研究を進めた。『エチカ』全体をユークリッド幾何学のようにリニアに読むのではなく、後の定理によって鍵概念が展開され変換されることによって前の定理の証明が補完され更なる展開を被るというレトロスペクティヴな観点から読解を行うという方法のもとで、本年度は(a)スピノザにおける想像力の自立性という論点を展開することで、超越範疇の批判と対になる彼特有の共通概念への想像力の寄与分を位置付け直す試みを行い、(b)さらに、今日にいたるまで決定的な影響を持ち続けている60年代から70年代にかけて行われたフランスのスピノザ哲学研究を問い直すという目的のもと、『エチカ』における否定性の問題を、とりわけ彼の用いる特異な充足理由律に着目することで分析した。27年度が最終年度であるため、記入しない。(1)スアレスにおける超越範疇(transcendentia)の位置づけの解明:スアレスは伝統的な存在論の枠組みを引き継ぎつつ、超越範疇に異なる規定を与えている。多くの性質を以前のスコラ学者と共有しつつ、超越範疇は存在を認識するための非十全な仕方であるとも主張する。一や真、善といった存在と可換的な超越範疇は、いずれも一定の観点から存在の内実を展開するとはいえその全体を把握させるわけではない。超越範疇に、れが不可避的に帯びる非十全性という性格を付与し明示化する点において、スアレスの超越範疇論は際立っている。この成果は、スアレス以後のスコラ学における超越範疇論の中心化を形而上学の成立可能性という観点から考察する道を切り開く。(2)スアレスにおける存在の一義性/アナロギアテーゼの解明:しばしば曖昧に用いられがちな両テーゼの、スアレスにおける精確な位置づけを整理した上で、その議論構成の特徴を明らかにした。存在が神と被造物に一義的に言われるのか、アナロギア的に言われるのかがその主要な問いとなるが、スアレスは自らの立場である内的帰属のアナロギアを主張する際、他の見解を内在的に批判しているというよりもむしろ自らの存在論の前提(形而上学の対象としての存在は神と被造物に共通している)のもとでそれらを棄却している。ここから、一義性かアナロギアかという問いは、実質的には形而上学の対象設定のもとで既に解の出ている問題へと変容していることが結論された。以上の考察によって、スアレス以後ほとんどのスコラ学者が存在の一義性とアナロギアの問題を表面的には取り扱わない理由を与えることができ、また彼らの表面的な議論の背後に一義性とアナロギアの隠された抗争を見て取ることのできる視座を得るに至った。本年度の研究は以下の三点に区分される。(1)スアレスの形而上学体系に関する分析、ならびにそれ以降の近世スコラ学の研究、(2)そこで得られた知見を補助線とする、スピノザ哲学における古典的な問題に対する解釈作業、(3)とりわけ前年度に集中的に行われたスコラ哲学における存在の一義性/アナロギアテーゼの研究の副産物としての、ジル・ドゥルーズにおける存在の一義性テーゼの再検討。(1)スアレス『形而上学討論集』における超越範疇(transcendentia)論の独自性に関する研究を継続して行い、その成果を論文としてまとめ、さらにそこから得られた成果をスアレスの体系全体に置き直すことで、哲学史における彼の位置づけ、ならびに哲学史を記述する上での一つの有力な視角に対する問い直しの作業を行った。超越範疇が、存在-神-論の歴史にとって決定的な鍵とされてきた(自己)原因概念と同じ位置価を有していることが明らかにされ、存在-神-論の内実そのものを再検討する視座を得るに至った。(2)超越範疇という概念を拒否し、新たに共通概念というタームを導入する点にスピノザ哲学の大きな賭金を見てとることができる。その批判の対象となっているところの超越範疇の実質に着目することから解釈上の古典的な係争問題に対する解を与える作業を進めた。(3)前年度に行われた、スコラ学における存在の一義性/アナロギアテーゼの再検討を踏まえて、ドゥルーズの独自性が実際のところどの点について認められるのかということに関して報告を行った。

しばしば曖昧に用いられがちなこのテーゼを、前年度の成果を活かしつつ整理した上で、ドゥルーズにおける存在の一義性を肯定するためには、通常の存在論においては多義的に用いられる非-存在の一義性こそがその条件となることを明らかにした。前年度までに十分進められたスアレス形而上学の分析を用いながら、その後のスコラ学における超越範疇(transcendentia)の変遷を調査することで、超越論的(transzendental)哲学の生成要素を抽出する作業を行った。超越範疇に、それが不可避的に帯びる非十全性という性格を付与し明示化する点において、スアレスの超越範疇論は際立っていた。ここから本研究者は、彼によって与えられたこの新たな規定が超越範疇の認識論化を促し、スアレスにおいてはなお存在論の枠組みのもとで語られていた超越範疇という概念が、その後のとりわけカロフ等に代表されるグノストロギアの系譜に位置する者たちによって徐々に認識論の枠の中で実質的な意義を持つようになり、そのことによって形而上学の対象であるところの「存在である限りの存在」を明らかにするという存在論的な領域での位置価を徐々に失っていったのではないか、という仮説のもとでスアレス以降のスコラ学に関する文献の分析を行った。上記のスコラ哲学を進める上で副産物として得られた幾つかの知見を用いながら、スピノザ形而上学の研究を進めた。『エチカ』全体をユークリッド幾何学のようにリニアに読むのではなく、後の定理によって鍵概念が展開され変換されることによって前の定理の証明が補完され更なる展開を被るというレトロスペクティヴな観点から読解を行うという方法のもとで、本年度は(a)スピノザにおける想像力の自立性という論点を展開することで、超越範疇の批判と対になる彼特有の共通概念への想像力の寄与分を位置付け直す試みを行い、(b)さらに、今日にいたるまで決定的な影響を持ち続けている60年代から70年代にかけて行われたフランスのスピノザ哲学研究を問い直すという目的のもと、『エチカ』における否定性の問題を、とりわけ彼の用いる特異な充足理由律に着目することで分析した。近世スコラ哲学に関しては、とりわけ超越範疇論という観点からスアレスの独自性に着目することで一定の視座を得るに至っており、これをもとにその後の近世スコラ学に対する分析が進められている。さらに、この作業結果を補助線としたスピノザ研究も並行して進行している。これらの点については、採用二年目の時点において、当初の予定通り計画が進展していると言える。さらに、スアレスのテクストの精読から、存在-神-論という理論モデルそれ自体に対する問い直しの契機がいわば副産物として生じた。これは、とりわけ20世紀後半のフランス哲学を中心に超出の対象とされた存在-神-論の実質そのものを再規定するという意味でそれ自体大きな成果であると考えられる。この点と、スコラ学における存在の一義性/アナロギアの再検討からドゥルーズにおける存在の一義性テーゼの独自性の考察、これら二点については、現在のスピノザ研究が20世紀後半のフランスの哲学者・哲学史家に負うところが極めて大きいことを主な理由として、本スピノザ研究にフィードバックしていくことが期待される。以上から、本研究は当初の計画以上に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究は、以下の二点に集中して進められる予定である。
免疫学的機序による胆管炎のメカニズムの解明-動物モデルによるアプローチ

平成10年度は,主に胆管炎の動物モデルを用いたin vivoでのFasによる細胞死を検討した。まず,前年度の結果より,Fas系統によるアポトーシスを抑制することにより肝GVHDの発症が抑制できるのかとの仮設を建て,実際にGVHD作成時に中和性Fas抗体もしくはヒトIgGとのキメラであるFas-Fcを投与することにより肝病変を予防できることを示した。さらに実験の安定した再現性を図るためにレトロウイルスベクターを用いたSV40T抗原を導入することにより正常BALB/cマウスのIBDECを不死化させ,この細胞が胆管上皮としての性格を保持していることを検討した。この不死化の方法を応用し,Fasが欠損していることが知られているMRLマウス(lpr/lpr)より,胆管上皮細胞を分離・培養しこれを同様に不死化することによりIBDECにおけるFasの関与をさらに検討した。またIBDECの増殖・消失について他のパラメーター(胆汁酸等)の関与を検討し,この際いかにアポトーシスが関与するかも検討した。以上により,免疫学的機序による胆管炎におけるFasシステムの関与が明らかになりその抑制が疾患予防に有効であることが示された。マウス胆管炎の動物モデルとして確立されたGVHDモデルを用い,in vitroで胆管炎を起こしているリンパ球による細胞障害が,Fas systemによるapoptosisによるものかどうかを,本研究者らが確立した正常胆管上皮細胞(IBDEC)を用いて検討した.1.方法としては,(1)IBDECがFasに感受性があるかを,agonistic anti-Fas Ab (Jo2)を使用したCr release assayによる検討,(2)もし感受性がある場合,インターフェロンγ(IFNγ)により感受性が増幅されるかの検討,(3)GVHDマウスの肝浸潤リンパ球を分離し,in vitro cytotoxicity assayの系を確立した上で,上記のFasによる細胞障害が,いかにGVHDにおける胆管障害に関与しているかをFasにたいして抑制的に働くFas-Fcを使用して検討した.2.結果(1) agonistic抗Fas抗体添加により濃度依存性にIBDECは障害された.IFNγはagonistic抗Fas抗体添加による細胞障害性を最大67.3%増強した.(2)GVHDリンパ球により,E : T比の濃度依存性にIBDECは障害された.(3)細胞障害性は,Fas systemに対して抑制的に働くFas-Fc添加により抑制された.3.結論(1)IBDECがFasに対する細胞死に感受性があることを示した.(2)マウスGVHDにおける胆管障害にFas systemが関与していることをin vitro系で示した.平成10年度は,主に胆管炎の動物モデルを用いたin vivoでのFasによる細胞死を検討した。
自己免疫発症における骨髄T細胞、血管外遊走性T細胞及び抗血管内皮細胞抗体の役割

1. MRL-lpr/lprマウスはFas遺伝子異常によりアポトーシスが抑制され自己免疫を発症する。Fasの細胞内シグナル伝達物質の一つでアポトーシス誘導作用を持つ細胞膜透過性C2-セラミドは、lprマウスの異常増殖CD3^+CD4^-CD8^-(DN)T細胞に選択的にin vitroでアポトーシスを誘導した。セラミドに類似構造を持つ新しい免疫抑制物質FTY720の経口投与によりリンパ節及び脾臓CD3^+CD4^-゙CD8^-T細胞の減少、抗ds-DNA抗体の低下、腎炎の改善、生存の上昇率を認めた。2.血管外遊走性T細胞の内皮細胞接着後の遊走を抑制する効果を持つモノクローナル抗体4C8を確立した。4C8抗体は、リンパ球、単球、好酸球表面の80kDa分子を認識する。4C8分子はT細胞活性化の補助刺激伝達分子としての機能も担っている。活動性が高い慢性関節リウマチ患者で単球の4C8発現が高く、遅効性抗リウマチ薬が奏効した患者では低下する傾向を認めた。3.肺高血圧症を合併した全身性エリテマトーデス患者で血清中の抗血管内皮細胞抗体が有意に高値を示す。患者血清精製IgGをヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞に添加培養するとIL-6およびIL-8産生が誘導され、接着分子発現が増強した。抗血管内皮細胞抗体の対応抗原の一つがリボゾームPO蛋白であることを確認した。リボゾームPO蛋白抗原は、ヒト臍帯由来血管内皮細胞表面に表出している。抗リボゾームPO蛋白抗体の結合部位は、PO、Pl、P2に共通のC末端22個のアミノ酸にある。抗リボゾームPO蛋白抗体が中枢神経系ループスの発症に関与していると考えられる全身性エリテマトーデス症例で中枢神経系ループス発症前に肝障害が有意に高率に発現することが認められ、抗抗リボゾームPO蛋白抗体が関与していると推測された。MRL-lpr/lprマウスはFas遺伝子異常によりアポトーシスが抑制され自己免疫を発症する。Fasの細胞内シグナル伝達物質の一つでアポトーシス誘導作用を持つセラミドに類似構造を持つ新しい免疫抑制物質FTY720及び細胞膜透過性C2-セラミドは、lprマウスの異常増殖CD3+CD4-CD8-T細胞にin vitroでアポトーシスを誘導し、経口投与によりリンパ筋及び脾臓のCD3+CD4-CD8-T細胞を減少させ、抗ds-DNA抗体を低下させ、生存率を増加させた。2.血管外遊走性T細胞の内皮細胞接着後の遊走を抑制する効果を持つモノクローナル抗体を確立し、対応抗原の同定を進めている。また、白血球とくに単球を血管内皮細胞と混合培養すると活性化され、GM-CSF及びIL-8の産生が高まり、血管内皮細胞上にICAM-1などの接着分子の発現が誘導された。3.抗血管内皮細胞抗体高値陽性で、かつ肺高血圧症を合併した全身性エリテマトーデス患者血清由来の精製IgGをヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞に添加培養すると血管内皮細胞のIL-6およびIL-8産生を増強し、接着分子発現を増強した。抗血管内皮細胞抗体が肺高血圧症の発症・進展に関与することが推測された。4.ヒト臍帯由来血管内皮細胞表面にリボゾームP0蛋白抗原が表出している。

抗リボゾームP0蛋白抗体の結合部位は、P0、P1、P2に共通のC末端22個のアミノ酸にあるが、全長リコンビナントリボゾームP0蛋白への結合能の方がC末端22個の合成ペプチドへの結合能より強い。抗リボゾームP0蛋白抗体が中枢神経系ループスの発症に関与していると考えられる全身性エリテマトーデス症例で中枢神経系ループス発症前に原因不明の肝障害が有意に高率に発現することが確かめられた。1. MRL-lpr/lprマウスはFas遺伝子異常によりアポトーシスが抑制され自己免疫を発症する。Fasの細胞内シグナル伝達物質の一つでアポトーシス誘導作用を持つ細胞膜透過性C2-セラミドは、lprマウスの異常増殖CD3^+CD4^-CD8^-(DN)T細胞に選択的にin vitroでアポトーシスを誘導した。セラミドに類似構造を持つ新しい免疫抑制物質FTY720の経口投与によりリンパ節及び脾臓CD3^+CD4^-CD8^-T細胞の減少、抗ds-DNA抗体の低下、腎炎の改善、生存率の上昇を認めた。2.血管外遊走性T細胞の内皮細胞接着後の遊走を抑制する効果を持つモノクローナル抗体4C8を確立した。4C8抗体は、リンパ球、単球、好酸球表面の80kDa分子を認識する。4C8分子はT細胞活性化の補助刺激伝達分子としての機能も担っている。活動性が高い慢性関節リウマチ患者で単球の4C8発現が高く、遅効性抗リウマチ薬が奏効した患者では低下する傾向を認めた。3.肺高血圧症を合併した全身性エリテマトーデス患者で血清中の抗血管内皮細胞抗体が有意に高値を示す。患者血清精製IgGをヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞に添加培養するとIL-6およびIL-8産生が誘導され、接着分子発現が増強した。抗血管内皮細胞抗体の対応抗原の一つがリボゾームP0蛋白であることを確認した。リボゾームP0蛋白抗原は、ヒト臍帯由来血管内皮細胞表面に表出している。抗リボゾームP0蛋白抗体の結合部位は、P0、P1、P2に共通のC末端22個のアミノ酸にある。抗リボゾームP0蛋白抗体が中枢神経系ループスの発症に関与していると考えられる全身性エリテマトーデス症例で中枢神経系ループス発症前に肝障害が有意に高率に発現することが認められ、抗抗リボゾームP0蛋白抗体が関与していると推測された。
ハンドルの切り返しを必要とする道路右左折における車両の走行経路計画手法

本研究は,狭小な道路における自動運転知能としての活用を念頭に,狭小道路におけるハンドルの切り返しを含む右左折走行を適切に実現できる経路生成アルゴリズムの構築を目的とする.通路幅や道路の交差角など,走行可能領域の認識結果に基づき,探索的・確率的な手法ではなく車両運動幾何学に基づく車両の軌跡の定式化により,必要な切り返しの回数や最適な操舵パターンを確定的に算出する手法を開発する.本研究は,狭小な道路における自動運転知能としての活用を念頭に,狭小道路におけるハンドルの切り返しを含む右左折走行を適切に実現できる経路生成アルゴリズムの構築を目的とする.通路幅や道路の交差角など,走行可能領域の認識結果に基づき,探索的・確率的な手法ではなく車両運動幾何学に基づく車両の軌跡の定式化により,必要な切り返しの回数や最適な操舵パターンを確定的に算出する手法を開発する.
新規リソソームタンパク質による神経筋組織の恒常性維持機構の解明

プログラニュリン(PGRN)は神経新生の促進や神経炎症、神経変性、神経細胞死の抑制など、多様な神経保護作用を持つ因子である。我々は興奮性アミノ酸アゴニストや抑制性アミノ酸アンタゴニストにより誘起されるてんかん様発作がPGRNノックアウトマウスにおいて増悪することを見出し、PGRNの神経保護作用には過剰な神経興奮を抑制する作用が関与していることを示唆するとともに、興奮性アミノ酸受容体であるNMDA受容体のサブユニット、NR2Aのタンパク質量が海馬で増加していることを見出した。そこで海馬におけるNMDA受容体サブユニットおよびそれらの転写因子のmRNA量を定量したところ、NR2A、NR2B、NR3AサブユニットmRNAの発現量、および転写因子mRNAの発現量がPGRNノックアウトマウスにおいて有意に低値を示した。一方、受容体のリン酸化状態を解析した結果、海馬でのリン酸化NR2A、NR2Bタンパク質量は、遺伝子型間で有意な差が認められなかった。これらのことから、PGRNノックアウトマウスの海馬におけるNR2Aタンパク質量増加の原因はNR2A遺伝子の転写の亢進ではなく、リソソームの機能不全と関連したタンパク質分解の低下による可能性が考えられた。一方、前脛骨筋にカルジオトキシンを用いて筋損傷を行い、マクロファージのマーカーとPGRNの二重免疫染色を行ったところ、PGRNは主にマクロファージに発現することが明らかになった。さらに、筋再生過程におけるPGRNの欠損は、M2型マクロファージの残存、及び筋線維の肥大につながることが示唆された。過剰なM2型マクロファージの残存は骨格筋の線維化に関与することから、PGRNはマクロファージの動態を調節することによって統制のとれた筋再生の進行に寄与している可能性が考えられる。我々は脳の性分化や神経新生に関与するタンパク質としてプログラニュリン(PGRN)を同定した。PGRNの受容体や作用機序については不明な点が多いが、我々はPGRNがリソソームに局在すること、プロモーター領域にCLEAR配列を有すること、オートファジーの機能制御に関与することなどを発見し、PGRNが新規のリソソームタンパク質であることを示した。また、我々はPGRNが脳傷害時にミクログリアにおいて発現が上昇し、その過剰な活性化を抑制することにより神経保護作用を示すこと、筋損傷時にもPGRNの発現が上昇してその修復に関与していることを示唆した。現在までに、PGRNの発現が低下するとリソソームの生合成が増加すること、ソルチリンやマンノース6リン酸受容体がPGRNをリソソームに輸送してその酸性化に関与していることなどを見出している。さらに、リポ多糖投与による感染ストレスモデルにおいては、活性化ミクログリアにおけるPGRNの発現上昇とともに、神経新生の抑制、リソソーム生合成の促進、炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇が起こるが、PGRNノックアウトマウスにおいてはこれらの反応が増悪することから、PGRNは感染時には神経炎症を緩和することにより神経新生を維持していることが示唆された。一方、ペンチレンテトラゾール・キンドリング後に生じるミクログリアの活性化、アストロサイトの増殖、神経細胞の過剰興奮にはIL-1シグナリングが関与していること、またPGRNは神経細胞の細胞間接触を介してアストロサイトにエストロゲン受容体の発現を誘導していることを示した。神経興奮性の上昇が神経炎症に繋がること、また脳傷害時の性ステロイドの神経保護作用の少なくとも一部はアストログリオーシスの抑制によることが知られているため、これらの知見はPGRNの作用解明において重要であり、研究はおおむね順調に進展していると言える。プログラニュリン(PGRN)による神経組織及び筋組織の修復や恒常性維持機構の解明を目的として、実験的脳傷害モデルや筋損傷モデルを用いて、神経組織及び筋組織の損傷時におけるPGRNの発現やその役割を検討する。また、我々は興奮性アミノ酸アゴニストや抑制性アミノ酸アンタゴニストにより誘起されるてんかん様発作がPGRNノックアウトマウスにおいて増悪することを見出し、PGRNの神経保護作用には過剰な神経興奮を抑制する作用が関与していることを示唆している。そこで、特に興奮性アミノ酸受容体の一種であるNMDA受容体の遺伝子、タンパク質発現等を野生型マウスとPGRNノックアウトマウスで比較し、PGRNの作用やその機序を追究する。さらに最近、ペンチレンテトラゾール(PTZ)誘発性キンドリングモデルにおいて、IL-1受容体(IL-1R1)ノックアウトマウスでは神経炎症やてんかん発作が亢進することを発見した。PGRNはミクログリアの過剰な活性化やIL-1等のサイトカイン放出を抑制し、神経保護的に作用することから、PGRNがIL-1シグナリングのもつ神経興奮性の亢進作用を抑制している可能性が考えられる。そこで、PGRNノックアウトマウスを用いて、同様にPTZキンドリングを行い、神経炎症やてんかん発作について検討する。また、我々は既にPGRNおよびIL-1R1ダブルノックアウトマウスの作出に成功しており、本マウスを用いてPGRNの神経興奮性調節作用におけるIL-1シグナリングの役割を解明することを目的に、PTZキンドリングモデル等を用いた解析を行う。また、平成31年度は最終年度であるため、これまでに得られた研究成果を取りまとめ、学会発表や論文投稿を積極的に行う。本年度には、神経組織については感染ストレス時や老齢期における神経炎症、及び海馬歯状回の神経新生におけるプログラニュリン(PGRN)の役割について検討した。

マウスを用いたリポ多糖投与による感染ストレスモデルにおいては、活性化ミクログリアにおけるPGRNの発現上昇とともに、神経新生の抑制、mTORシグナリングの抑制を介したリソソーム生合成の促進、炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇が起こるが、PGRNノックアウトマウスにおいてはこれらの反応が増悪することから、PGRNは感染ストレス時には神経炎症を緩和することにより神経新生を維持していることが示唆された。一方、加齢とともに脳内ではミクログリアの活性化や神経新生の減少が起こるが、PGRNノックアウトマウスではCD68陽性活性化ミクログリア数、リソソーム生合成、炎症性サイトカイン遺伝子発現がいずれも上昇していたが神経新生には差がなかったことから、PGRNは加齢に伴う神経炎症は抑制するが神経新生の減少には影響しないことが示唆された。さらに、ペンチレンテトラゾール・キンドリング後に生じるミクログリアの活性化、アストロサイトの増殖、自発的な神経細胞の過剰興奮にはIL-1シグナリングが関与していること、またPGRNは神経細胞の細胞間接触を介してアストロサイトにエストロゲン受容体の発現を誘導していることが示唆された。一方、筋組織についてはカルジオトキシンを用いて筋損傷を行い、その修復過程におけるPGRNの役割について検討した。その結果、PGRNは主に損傷部位に集積するマクロファージに発現すること、損傷後にはPGRNノックアウトマウスにおいてM2型マクロファージが多く残存することや筋線維径が増加することが明らかとなり、筋修復過程におけるPGRNの欠損は、M2型マクロファージの残存、及び再生筋線維の肥大につながることが示唆された。我々は脳の性分化や神経新生に関与するタンパク質として、成長因子として知られているPGRNを同定した。PGRNの受容体や作用機序については不明な点が多いが、我々はPGRNがリソソームに局在すること、プロモーター領域にリソソームタンパク質に特徴的なCLEAR配列を有すること、オートファジーの機能制御に関与することなどを発見し、PGRNが新規のリソソームタンパク質であることを示した。また、我々はPGRNが脳傷害時にミクログリアにおいて発現が上昇し、その過剰な活性化を抑制することにより神経保護作用を示すこと、筋損傷時にもPGRNの発現が上昇してその修復に関与していることを示唆した。本研究ではPGRNのリソソームタンパク質としての機能を解明し、PGRNによる神経組織及び筋組織の修復や恒常性維持機構を明らかにすることを目指している。現在までに、PGRNの発現が低下するとリソソームの生合成が増加すること、ソルチリンやマンノース6リン酸受容体がPGRNをリソソームに輸送してその酸性化に関与していることなどを見出している。さらに、PGRNの発現低下によるリソソームの機能低下が異常タンパク質の蓄積による神経変性疾患の原因となることを示唆した。また、PGRNが欠損すると興奮性アミノ酸アゴニストや抑制性アミノ酸アンタゴニストにより誘発されるてんかん発作が亢進すること、アストロサイト特異的にエストロゲン受容体を欠失することなどの知見を得ている。
浄水処理負荷を低減するカビ臭発生抑制法の開発

カビ臭はng/Lレベルの極微量濃度でも人間の嗅覚で感知されるため、国や地方自治体に膨大な除去費用(数億円/年)を計上させ、かつ臭い吸着による水産物の経済的損失を与えている。このため、水源池や湖沼で安価にできるカビ臭発生抑制法の開発が渇望されている。本研究の目的は、カビ臭原因生物である放線菌のカビ臭物質産生を惹起する環境条件とカビ臭発生のメカニズムを解明し、水源でのカビ臭発生抑制法を開発すること、である。本研究の推進は、1水道行政の経済的負担軽減、2食料生産、特に水産業の経済的損失軽減、という社会問題の幅広い分野に波及する重要な知見と方法論を提供できる。
魚類における情報を使った闘争の解明

海産魚類ヘビギンポにおいて,異なる戦術を採用する雄間で生じる配偶機会の獲得を巡る争いにおいて,彼らがいかに情報を駆使して獲得の確率を高めているのかを明らかにするため,2018年57月にかけて,愛媛県宇和海において産卵行動をビデオで記録した.後日,スニーカー雄のスニーキングシーケンス内の行動とシーケンス間の行動に着目し,ビデオを詳細に解析した.前者は産卵場所への接近行動(どのようにばれずに近づくか)であり,後者は産卵場所内での場所選択(成功あるいは失敗に終わった試みの後,次は同じ産卵床内のどこに移動するか)である.接近行動に関しては,スニーカーはなわばり雄の行動をよく観察しており,その振る舞いによって移動の距離や速度を変えていることが明らかとなった.また,なわばり雄に近づくにつれ,慎重にふるまうことも分かった.これらの行動は捕食者によるストーキング行動に極めて類似していた.先行研究からはスニーカーはなわばり雄に見つかった後は被食者に類似した逃避行動を持つことも分かっており,あわせて考えると,スニーカーは捕食者の戦略と被食者の戦略を一つのスニーキングイベントでフレキシブルに用いるといえる.この成果をまとめた1編の論文が2月に受理された.シーケンス間の場所選択については現在解析を進めている最中だが,2つの戦略を持つ可能性が示唆された.1つは経験に基づく決定,もう1つはランダム探索である.つまり,本種のスニーカーは成功体験を踏襲し,失敗後はランダムな方向に逃げる.これら2つの組み合わせはトライアル&エラーと見なせる.ゆえに,本種スニーカーは正解がわからない課題(つまり出現の時期や場所に関する情報がない「場所」の探索)に対し,ヒューリスティックな手法を用いている可能性が考えられた.四国を襲った大雨の影響で調査期間を短縮せざるを得なかったが,調査期間中は期待通りのペースで調査ができた.また,そこから得られた成果は,期待していた物以上であり,順調に進捗しているといえる.また,本年度のデータを含めた論文が1編受理されており,この点においても順調といえる.今年度得られた成果のうち,未発表のもの(場所選択)について,データの追加を含しながら解析を進めていく.スニーカーの研究を進める中で,なわばり雄の意思決定もこれまで考えられてきた以上に複雑であることは間違いないと確信を得た.今後はなわばり雄の観点からの研究を進めることで,戦術間の複雑な対立関係を解き明かしていきたい.海産魚類ヘビギンポにおいて,異なる戦術を採用する雄間で生じる配偶機会の獲得を巡る争いにおいて,彼らがいかに情報を駆使して獲得の確率を高めているのかを明らかにするため,2018年57月にかけて,愛媛県宇和海において産卵行動をビデオで記録した.後日,スニーカー雄のスニーキングシーケンス内の行動とシーケンス間の行動に着目し,ビデオを詳細に解析した.前者は産卵場所への接近行動(どのようにばれずに近づくか)であり,後者は産卵場所内での場所選択(成功あるいは失敗に終わった試みの後,次は同じ産卵床内のどこに移動するか)である.接近行動に関しては,スニーカーはなわばり雄の行動をよく観察しており,その振る舞いによって移動の距離や速度を変えていることが明らかとなった.また,なわばり雄に近づくにつれ,慎重にふるまうことも分かった.これらの行動は捕食者によるストーキング行動に極めて類似していた.先行研究からはスニーカーはなわばり雄に見つかった後は被食者に類似した逃避行動を持つことも分かっており,あわせて考えると,スニーカーは捕食者の戦略と被食者の戦略を一つのスニーキングイベントでフレキシブルに用いるといえる.この成果をまとめた1編の論文が2月に受理された.シーケンス間の場所選択については現在解析を進めている最中だが,2つの戦略を持つ可能性が示唆された.1つは経験に基づく決定,もう1つはランダム探索である.つまり,本種のスニーカーは成功体験を踏襲し,失敗後はランダムな方向に逃げる.これら2つの組み合わせはトライアル&エラーと見なせる.ゆえに,本種スニーカーは正解がわからない課題(つまり出現の時期や場所に関する情報がない「場所」の探索)に対し,ヒューリスティックな手法を用いている可能性が考えられた.四国を襲った大雨の影響で調査期間を短縮せざるを得なかったが,調査期間中は期待通りのペースで調査ができた.また,そこから得られた成果は,期待していた物以上であり,順調に進捗しているといえる.また,本年度のデータを含めた論文が1編受理されており,この点においても順調といえる.今年度得られた成果のうち,未発表のもの(場所選択)について,データの追加を含しながら解析を進めていく.スニーカーの研究を進める中で,なわばり雄の意思決定もこれまで考えられてきた以上に複雑であることは間違いないと確信を得た.今後はなわばり雄の観点からの研究を進めることで,戦術間の複雑な対立関係を解き明かしていきたい.予想以上の成果があったことと,宿泊施設の変更に伴い,経費の使用に変更の必要性があったため差額が発生した.
ピンポイントプロテオーム解析による植物病原体応答新規因子の探索と機能解明

代表的な病原糸状菌であるうどん粉病菌に対するシロイヌナズナの応答機構を明らかにすることを目的とし、二次元電気泳動により感染に特異的な変動を示すタンパク質の質量分析解析と、網羅的なショットガンプロテオーム解析を行った。その結果、感染初期に変動する22遺伝子を同定した。それらについてT-DNA挿入変異体を入手しうどん粉病菌感染実験を行うことで、耐病性に強く関与する遺伝子を特定した。また、promoter::GUSとpromoter::GFP、35s::CDsと35s::GFP-CDsのコンストラクトを作成し、野生型と変異体に導入することでそれらの遺伝子のうどん粉病菌感染時の発現組織と細胞内局在を確認する準備を進めており現在T2世代の選抜中である。代表的な病原糸状菌であるうどん粉病菌に対する応答機構を解明し抵抗性を獲得した植物を作成することは、近い未来に訪れる食糧危機の克服に大きく寄与すると考えられる。本研究では局所的・局時的なサンプルを用いたピンポイントのプロテオーム解析による、植物のうどん粉病菌感染初期における病原体応答に関わる因子の探索と機能解析を目的とした。うどん粉病菌は葉の表皮細胞のみに感染する。まずプロテオーム解析のためにパラフィン切片からマイクロダイセクションでシロイヌナズナ葉の表皮細胞のみの回収を試みたが、充分量のサンプルを集めることが非常に困難であった。そこで感染葉全体を用いて二次元電気泳動を行った。その際に通常は解析困難な膜画分のタンパク質を解析できる新規の等電点電気泳動法を取り入れた解析を行った。対照サンプルは感染/非感染の野生株と罹病性変異体を用い、抵抗性反応を差し引いた病原体の認識に関与する因子も同定した。うどん粉病菌感染時に特異的に変動する22種のタンパク質が同定され、これらについてT-DNA挿入変異体を入手しうどん粉病菌に対する罹病性の変化を解析中である。また、promoter::GUSとGFP、35s::CDsとGFP-CDsのコンストラクトを作成し、野生型と変異体に導入してうどん粉病菌感染時の発現部位と機能を確認する準備を進め、現在T2世代の確認中である。あわせて、感染葉全体を用いた定量的RT-PCRによりこれら22の遺伝子の転写量を感染から経時的に調べ、葉全体の転写量の変動とタンパク質の蓄積量が一致しないものを明らかにした。これらは感染表皮特異的なタンパク質蓄積と考えられる。また、上記のサンプルを用いて高精度、高感度なフーリエ変換型質量分析機であるOrbitrapを用い、ショットガンプロテオームにより、さらに微量なタンパク質の変動を網羅的に解析中である。
発達過程における神経細胞K+チャネルの密度と性質の調節機構に関する研究

神経細胞の発火パタンはその細胞の持つイオンチャネルによって決定される。チャネルの機能を決定する因子はチャネルの密度と性質であるが、神経細胞はどのようにこれらの因子を調節して正常な機能を実現しているのかは明らかになっていない。本研究では、脱分極で活性化されるA型K+チャネルの密度と性質が発達過程における調節機構を調べるために、パッチクランプ法と単一細胞RT-PCR法を用いて、発達過程における電流とチャネルのアルファサブユニツトの発現を、線条体コリン作動性介在ニューロンを用いて定量的に調べた。本研究代表者らのこれまでの研究によって、この細胞は強いA型電流を持っていることと、K+チャネルのアルファサブユニットをコードするKv4.2を発現していることが明らかになっている。本研究では、出生から生後57日齢の動物におけるA型電流と、Kv4.2mRNAの発現量を定量的に調べた。その結果、Kv4.2mRNAは生後発達において、指数関数的に増加し、約3週齢で一定のレベルに達することが分かった。一方、A型電流は生後発達においてその振幅は増加したが、電位依存性や時間依存性に顕著な変化が見られなかった。Kv4.2mRNAに比べて、A型電流の増加が緩やかであった。転写と翻訳の機構の上に、mRNAとチャネル蛋白の分解の機構も考慮に入れれば、高い相関係数でKv4.2mRNAとA型電流の発達を記述することができた。これは発達過程における対応したチャネルmRNAと電流の関係を定量的に記述した初めての例である。本研究の結果から、今後のチャネル密度制御に関する研究は転写と翻訳及びチャネル蛋白とチャネルmRNAのターンオーバーのレートを決定することと、それらのレートはどのような分子機構で決定されているのかを明らかにすることが重要であることが示された。本研究結果の一部はJ. Neurophysiol.で印刷中である。