hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌におけるANGPTL4の機能解析と治療標的としての評価

口腔扁平上皮癌を用いて高転移株を樹立し、その転移株を用いて癌細胞のNF-кBの恒常的活性化が、浸潤・転移亢進作用を促進し癌転移や生存率低下との相関から予後マーカーとなる可能性を示した。申請者は、転移株のマイクロアレイで発現が上昇していたANGPTL4に着目し、口腔扁平上皮癌の患者予後との関係を解析した。ANGPTL4は血管を経由して腫瘍細胞遊走を促進し、癌転移に関与していることが他の癌腫において言われており我々は、舌癌細胞の肺転移において、ANGPTL4 mRNAレベルの著明な上昇を確認した。ANGPTL4が舌癌の肺転移と関連しているか否かを判断するため、ANGPTL4癌細胞発現率と血漿中のANGPTL4濃度について、患者を転移例と非転移例に分けて比較し、それぞれの臨床パラメータと生存率に関して評価した。舌癌細胞でのANGPTL4発現を免疫組織化学染色で、ANGPTL4の「低発現」群と「高発現」群に患者を分類した。血漿中のANGPTL4濃度をELISA法により測定した。舌癌患者48例中15例(31%)がANGPTL4高発現癌細胞を示した。特に、ANGPTL4高発現癌細胞を示し血漿中のANGPTL2濃度が高い患者の割合は、肺転移のみられない患者と比較すると、肺転移患者において有意に高かった。5年生存率は、ANGPTL4低発現群に比べ、ANGPTL4高発現群では有意に低かった。ANGPTL4高発現癌細胞を示すことと血漿中のANGPTL2濃度が高いことは、どちらも舌癌患者の肺転移と予後不良と関連していた。よって、ANGPTL4の癌細胞における発現と血漿中濃度から、舌癌患者の肺転移および/または予後不良を確実に予測できる可能性がある。さらに、ANGPTL4の癌化促進作用は、舌癌においてANGPTL4を抑制する潜在的治療効果を示唆している。今回、論文にまとめ投稿予定である。本年度中に論文を投稿予定である。今回は、舌癌のみに検体をしぼって研究を行ったが他の口腔癌(上顎・下顎歯肉癌・頬粘膜癌)にも対象を広げていく事がよりANGPTL4の口腔癌の遠隔転移マーカーとしての有用性があがるとともに部位別に差が出ることも予想されるので良い考察ができるともにバイオマーカーとしての価値が上がることを期待している。今回申請者は、転移株のマイクロアレイで発現が上昇していたANGPTL4に着目し、口腔扁平上皮癌の患者予後との関係を解析した。また、ヒト癌や癌細胞株での発現、ANGPTL4の癌細胞増殖・浸潤や転移等の作用および受容体との作用の関係を研究し、ANGPTL4を標的とする癌治療法の開発をめざしている。現在、ヒトの検体を用いて免疫染色・ELISAによる検証をおこなっている。免疫染色においては、遠隔転移をしている患者の検体にANGPTL4の有意な発現をみとめ2017年9月28日30日に開催された日本癌学会学術総会で発表を行った。ELISAにおいては、血清中のANGPTL4の発現を計測しているが、こちらも遠隔転移をしている患者検体のおいて有意な発現をみとめた。現在、ANGPTL4の血清中の発現の関しては患者の検体数をさらに増やして検討していく事を考えている。今後、この結果をまとめ海外発表予定である。検体の数がやや少ないため検討症例のサンプル待ちの状態である。ANGPTL4高発現癌細胞を示すことと血漿中のANGPTL

2濃度が高いことは、どちらも舌癌患者の肺転移と予後不良と関連していた。よって、ANGPTL4の癌細胞における発現と血漿中濃度から、舌癌患者の肺転移および/または予後不良を確実に予測できる可能性がある。さらに、ANGPTL4の癌化促進作用は、舌癌においてANGPTL4を抑制する潜在的治療効果を示唆している。今回、論文にまとめ投稿予定である。本年度中に論文を投稿予定である。他大学でサンプルを共有できれば依頼を行う予定。今回は、舌癌のみに検体をしぼって研究を行ったが他の口腔癌(上顎・下顎歯肉癌・頬粘膜癌)にも対象を広げていく事がよりANGPTL4の口腔癌の遠隔転移マーカーとしての有用性があがるとともに部位別に差が出ることも予想されるので良い考察ができるともにバイオマーカーとしての価値が上がることを期待している。本年度は、現在の結果をまとめ海外報告を検討している。また、他分野とのコラボレーションの話もあるため新たな研究へ資金を運用して行きたいと考える。予想していたより実験結果が早くでたため追加実験器材の購入をせずに済んだ。また、学会報告をしていないため今回、差額が生じたと考えます。本年度は、学会報告、論文報告を行っていきたいと考えます。また、舌以外に検体も他の部位の検体を増やすことで追加実験を行う予定である。
拡張共役系を基盤とする電子移動系の構築と新機能開拓

光誘起分子内長距離エネルギー/電子伝達機能を有する分子の開発と,エレクトロニクス素子に応用可能な薄膜状態での効率の良いキャリア移動系の開発を指向して,以下の研究を行った。1.分子ワイヤを介した光誘起電子移動の外部刺激による制御を目的として,2つのエチニルオリゴチオフェン4量体で共役拡張したチオフェン縮環イミダゾリウムの片末端にドナーとして亜鉛ポルフィリンを他端にアクセプターとして[60]フラーレンを連結した化合物の合成を行った。ベンゾニトリル中でポルフィリン部蛍光のクエンチが観測され,ドナー部からアクセプター部への光誘起分子内電子移動が起こっていることが分かった。イミダゾリウム部の対イオンによりこの割合が変化し,PF_6塩にフッ化物イオンを加えることで,蛍光強度の増大,すなわち分子内電子移動の促進を観測し,対イオンによるスイッチングが可能であることが示された。2.オリゴチオフェン4量体と9量体を基本骨格として,1,3,5-トリ置換ベンゼンを分岐部とする自己集合性のデンドリマー型オリゴチオフェンの合成を進め,NMRケミカルシフトの濃度変化と温度変化ら会合定数と熱力学的定数を決定した。多分岐および9量体の導入が安定化エントロピーに及ぼす効果が大きいことを明らかにした。また,予備的な電界効果トランジスタ特性の評価で,スピンコート薄膜を真空中室温で乾燥することで,良好なp-型特性を観測することができた。3.拡張パイ電子系を有する新規なディスク型分子として,ヘキサチエノトリフェニレンの短段階合成に成功した。この化合物は可視部の電子吸収と低い酸化電位を示し,p-型有機半導体として有望な性質を有している。ヘキサメチル誘導体のX線構造解析でその特異的な構造が明らかになりつつある。また,ディスク型の自己会合および液晶性の発現を目指して,長鎖アルキル基の他,官能基の導入を検討している。オリゴチオフェンを基本骨格として化学修飾よる電子状態の制御および分子間相互作用の制御に基づく高効率電子伝達系の構築と光・電子機能素子への応用をめざし,リン原子架橋型ビチオフェンおよびチオフェン縮環イミダゾリウム部位を組み込んだ共役拡張オリゴマーの合成を行い,物性を評価した。分子軌道計算によりいずれも顕著なLUMOレベルの低下が示唆された。1.ホスフィンスルフィド架橋ビチオフェンのX線結晶構造解析から,ビチオフェン骨格の高い平面性を明らかにした。ボスフィンオキシド架橋ビチオフェンから,SuzukiカップリングあるいはSonogashiraカップリング反応で合成した共役拡張化合物において,チオフェン鎖で共役拡張すると,吸収,蛍光極大の長波長シフトと共に還元電位が観測され,リン原子架橋によるLUMOの低下が寄与していることが明らかとなった。一方,フェニルあるいはフェニルエチニル部位を導入した化合物では,蛍光極大の長波長シフトと良好な蛍光量子収率が観測された。CV測定の結果はフェニルエチニル基による拡張の方がLUMOの低下に寄与することを示している。2.チオフェン縮環イミダゾール誘導体からStilleあるいはSonogashiraカップリングと続くメチル化によって,オリゴチオフェン4量体(4T)および4T-エチニル基で共役拡張したイミダゾリウム誘導体を合成し,物性を評価した。電子吸収スペクトル,蛍光スペクトル共に4T-エチニル基拡張化合物の方が長波長に現れ,分子全体の共平面性が高く,共役拡張効果が大きいことが分かった。異なる支持電解質を用いてCV法による酸化還元電位の測定を行ったところ,比較化合物である4Tは,支持塩の種類によらず酸化電位は同じ値を示したが,拡張分子の酸化電位には顕著な変化が認められ,オリゴチオフェン部の電子状態が対イオンの種類によって制御可能であることが分かった。
マウスガードの咬合付与形態による身体平衡機能の相違と筋疲労との関連

本研究の目的は、健常人とスポーツ選手の身体機能の相違を解明し、さらに競技後の筋疲労に対するコンディショニング効果を検証することである。はじめに、咬合状態と運動機能との関連を調査するため、エリートレベルのジュニアバドミントン女子選手35名を対象として、咬合バランスが良好な群と不良な群に分け、咬合バランスとスポーツテスト(上体起こし、反復横跳び、二重跳び、50 mスプリント)の成績との関連性を検証した。咬合要素に関しては、咬合バランスが良好な群の方が不良な群よりも咬合接触面積と咬合力が有意に大きい結果であった(P<0.01)。なお、本研究で採用したスポーツテストの項目は、体幹の安定化が成績に有利に作用するものと、影響を与えないものとに大別される。前者は反復横跳びと二重跳びであり、それぞれ方向転換を伴う動作、着地時に大きな重力加速度がかかる動作である。後者は上体起こしとスプリントであり、上体起こしは体幹の屈曲を伴う動作を伴うこと、スプリントは遊脚期が長くなるにつれて空中でバランスをとるためバランサーとして顎を利用する際に緩める必要があることから、体幹の安定は不利に働くことがある。本研究の結果、咬合バランスが良好な群は不良な群に比べて反復横跳びと縄跳びの成績が有意に優れていたが(P<0.01)、上体起こしとスプリントの成績に有意な違いは認めれなかった。このことから、良好な咬合バランスは体幹の安定化を補助することが裏付けされ、さらに咬合バランスは主に敏捷性に影響することが示唆された。続いて、咬合状態と身体平衡機能との関連性を調査するため、運動習慣のない健常人と大学生アスリートを対象として、マウスガード未装着時と装着時における重心動揺、姿勢制御機能の相違について検証を開始し、現在継続中である。本年度の研究の結果、咬合状態と身体機能との関連性を運動要素から検証することによって、体幹の安定化に咬合要素が関連することが明確になった。体幹の安定は、平衡機能や姿勢制御に影響する要因であることから、咬合への介入が、スポーツ時のハイパフォーマンス発揮やスポーツに起因する傷害の予防、疲労過多の回避に繋がる可能性が示された。また、生涯スポーツにおいては、平衡調節に対して咬合要素からアプローチすることによって、スポーツ外傷の発生リスクを軽減できる可能性があり、国民が生涯を通じて安心・安全にスポーツに取り組むための一助となることが期待できる。現在、咬合状態と身体平衡機能との関連性を調査するため、運動習慣のない健常大学生34名と大学生アスリート40名を対象として、マウスガード未装着時と装着時における重心動揺、姿勢制御機能の相違について検証を開始している。アスリートの咬合状態は、競技レベルが上がるほど競技特性を反映している傾向があるため、被験者数と対象競技を増やして調査する必要がある。また、平衡調節入力に影響する視覚の影響についても調査したいと考えている。

現在、咬合状態と身体平衡機能との関連性を調査するため、運動習慣のない健常大学生34名と大学生アスリート40名を対象として、マウスガード未装着時と装着時における重心動揺、姿勢制御機能の相違について検証を開始している。アスリートの咬合状態は、競技レベルが上がるほど競技特性を反映している傾向があるため、被験者数と対象競技を増やして調査する必要がある。また、平衡調節入力に影響する視覚の影響についても調査したいと考えている。(次年度使用額が生じた理由)本年度は運動要素に着目した検証を行ったため筋電計を必要とせず、また英文校正料の支出もなかったため、次年度使用額が生じた。(使用計画)研究資料収集と成果発表のための国内旅費と、論文投稿料に使用する予定である。
光センサーを介した植物の低温耐性増強機構の解明

本研究では、「光センサー」としての葉緑体による低温シグナル伝達活性化機構を明らかにすることを目的とした。低温誘導性遺伝子COR15Aのプロモーターにルシフェラーゼを融合したコンストラクトをシロイヌナズナに導入した結果、低温応答を可視化することができた。さらに、この植物を用いて低温シグナル伝達系を活性化する化合物のスクリーニング系を開発した。また、葉緑体形成異常が低温シグナル伝達に与える影響を詳細に解析するため、シロイヌナズナの無菌培養法を用いて葉緑体形成異常変異体の種子を回収する系を開発した。植物は、凍結しない程度の低温にさらされると、次に襲ってくるさらに低い温度に対して高い耐性を獲得する能力があり、これは植物の「低温馴化」として知られている。植物が低温馴化するためには、「低温処理」に加えて「光」が必要であることが知られているが、そのメカニズムの詳細は明らかになっていない。本研究では、植物細胞内の「光センサー」である「葉緑体」と「光受容体タンパク質」に焦点をあて、これらの光センサーが低温耐性を強化する仕組みを明らかにすることを目指すことにしている。今年度は、低温誘導性遺伝子COR15Aプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を融合したコンストラクトを作製し、これをシロイヌナズナに形質転換した。また、機能的な葉緑体でのみレポーター活性を発現できるコンストラクトも作製し、これもシロイヌナズナに形質転換した。形質転換種子のスクリーニングを行ったところ、いずれのコンストラクトも数十ラインの形質転換体を得ることができた。これらの植物の次世代の種子を検定したところ、導入遺伝子を1コピーのみ持つ植物体を得ることができた。現在、レポーターをホモに持つ個体のスクリーニングを行っている。平成26度は、前年度作出した低温誘導性遺伝子COR15Aプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を融合したコンストラクトを持つ植物を選抜し、光依存的な低温シグナル活性化物質の探索系確立を試みた。まず、COR15A遺伝子の開始コドンまで含む「COR15A ATG:LUC」あるいは第一イントロンまでを含む「COR15Apro 594:LUC」融合遺伝子を持つ植物において、ルシフェラーゼ活性の低温応答を調査した。その結果、COR15AATG:LUCでは低温によりルシフェラーゼ活性が増大したが、COR15A 594:LUCではほとんど変化しなかった。また、COR15AATG:LUCにおけるルシフェラーゼの活性は、内在性COR15A遺伝子の発現レベルを反映していた。このことから、以降の解析ではCOR15A ATG:LUCを用いることとした。次に、このCOR15AATG:LUC植物の葉をアブシジン酸で処理したところ、ルシフェラーゼの発現が著しく増大することが確認できた。すなわち、外から加えた化合物に応答してCOR15AATG:LUCが誘導されたことが確認できた。現在、COR15AATG:LUC葉とマイクロプレートを用いて、化合物ライブラリー中から光依存的な低温シグナル伝達活性化に関与する化合物のスクリーニングを行っている。この他に、光により誘導され低温応答を活性化する「葉緑体シグナル」を探索するため、葉緑体シグナル伝達が異常になった変異体ppi2のホモ変異体種子を獲得する系を確立した。農学予定通り、低温応答性レポーター遺伝子を持つ植物を作出でき、次年度以降に行うスクリーニングの基盤整備ができたため。H25年度の研究の進展は順調であったため、次年度以降も引き続き当初計画に従って研究を進める予定である。学会誌投稿料を予定していたが、採択まで至らなかったため、その分が残金として発生した。それ以外の経費はほぼ予定通り使用している。繰越金を投稿中の論文の出版費用に使用するが、それ以外は当初計画通りに使用する予定である。
『全国方言文法辞典』のための諸方言の文法に関する記述的研究

本年度は、上記の研究課題を達成するために、以下の調査・分析を行った。(1)各地の方言模擬会話の作成と音声収録『全国方言文法辞典』に掲載する資料として、各地方言に特徴的な文法的表現を盛り込んだ方言模擬会話を作成し、現地の話者に訂正をしてもらったうえで、実際に当該の会話を演じてもらい、音声を収録するという調査を行った。今年度、収録した方言と文法項目・話者は、以下の通りである。(a)秋田県本荘方言[文法項目]推量表現、原因・理由表現、依頼表現、勧誘表現、敬語[話者]老年層(5060代)2名(b)京都方言[文法項目]動詞音便形・形容詞音便形・命令形、断定の助動詞、否定表現、可能表現、アスペクト表現、敬語[話者]老年層(5060代)2名、若年層(20代前半)8名(2)東北方言の文法形式の意味・用法の地域差に関する分析平成15、16年度に実施した調査の結果を踏まえて、東北方言の方向・着点を表す格助詞サ、対象を表す格助詞コト・トコ、テンス形式テアッタ・タッタの意味・用法の地域差を分析した。その結果、これらの文法形式が、東北地方の日本海側の地域では意味・用法の拡張が進み、太平洋側では本来の意味・用法が維持される傾向があることが分かった。『全国方言文法辞典』は、こうした「文法化」の程度に地域差があることを踏まえた記述を行う必要がある。なお、今回の分析の結果は、「方言における文法化-東北方言の文法化の地域差をめぐって-」『日本語の研究』3巻1号に掲載されている。本年度は、上記の研究課題を達成するために,以下の調査を行った。(1)東日本日本海沿岸地域における方言実地調査長野県下水内郡栄村小赤沢(秋山郷)、秋田県由利郡矢島町、青森県弘前市において、主に、原因・理由表現、推量表現について、調査を実施した。東日本の日本海沿岸地域では、原因・理由表現としてサカイ類の表現が用いられ、推量表現として指定辞(断定の助動詞)活用語尾に由来する形(ダロウ・デロ・ロ等)が用いられている。これは、近畿地方から北陸・新潟・山形県庄内地方・秋田県由利地方にかけて連続的に分布するものであるが、これらの表現を地域ごとに比較すると、近畿・北陸地方では形態的にも用法の上でも語の本来の出自が維持される傾向があるのに対し、新潟以北になると形態的にも用法の上でもより単純化した性質を持つ傾向が認められる。すなわち、中央部よりも周辺部において「文法化」の現象がより進行していると言える。これらの調査の結果を踏まえ、論文「北日本の日本海沿岸地域に見られる文法体系の単純化現象」(真田信治監修『日本海沿岸の地域特性とことば』桂書房、2004年3月刊行予定)をまとめた。(2)方言文字化資料の用例分析方言の語りを文字化した昔話集をテキストとし、格助詞の用例を採集した。そのうち、東日本方言で用いられる、目的語を表す格助詞コト・トコ類について分析したところ、太平洋側の地域では形態的にも用法の上でも名詞「こと」の意味が維持されているのに対し、日本海側の地域では名詞的な性質が希薄化し、目的語を表す汎用の格助詞として多用されるようになっていることが、数量的にも確認された。この分析結果を、論文「格助詞相当形式コト・トコ類の文法化の地域差」(『社会言語科学』7巻1号、2004年7月刊行予定)にまとめた。本年度は、上記の研究課題を達成するために、以下の調査、成果報告を行った。(1)秋田県沿岸部における方言実地調査秋田県の日本海沿岸部(山本町、八郎潟町、秋田市、本荘市、仁賀保町、金浦町、象潟町)において、方言の実地調査を行った。調査項目は、格表現、原因・理由表現、テンス・アスペクト表現、否定表現、推量表現等である。秋田県沿岸部の方言では、テンス・アスペクトの表現体系に特徴が見られる。特に過去時制を表す「テアッタ」が、完成相過去と継続相過去の両方を表すという現象が認められていたが、これがこの地域一帯に見られることが確認された。(2)昔話資料のデータベース化と用例分析方言で語られた昔話の文字化資料を電子化し、コーパスを作成した。そのコーパスから用例を採集することにより、方言の格表現、テンス・アスペクト表現、推量表現の形式と用法を、地域別に集計し、計量的な観点によって分析した。東北方言の格助詞「サ」の調査では、存在場所の用法(「サ」の用法としては新しい用法)での「サ」の使用率が、青森6.1%、秋田28.6%、山形63.0%となっており、昔話の話者の世代(ほぼ明治生まれ)では、山形を中心に「サ」の用法の拡張が起きていたと言える。一方、現在の若年層に行ったアンケート調査では、青森98.0%、秋田91.7%、山形87.0%の使用率であり、北部の地域ほど加速度的に存在場所の用法での「サ」の使用が浸透したことが分かる。(3)研究成果の公開本研究の成果報告書として、『秋田県本荘・由利方言調査報告』を刊行した。

(1)各地の方言模擬会話の作成と音声収録『全国方言文法辞典』に掲載する資料として、各地方言に特徴的な文法的表現を盛り込んだ方言模擬会話を作成し、現地の話者に訂正をしてもらったうえで、実際に当該の会話を演じてもらい、音声を収録するという調査を行った。今年度、収録した方言と文法項目・話者は、以下の通りである。(a)秋田県本荘方言[文法項目]推量表現、原因・理由表現、依頼表現、勧誘表現、敬語[話者]老年層(5060代)2名(b)京都方言[文法項目]動詞音便形・形容詞音便形・命令形、断定の助動詞、否定表現、可能表現、アスペクト表現、敬語[話者]老年層(5060代)2名、若年層(20代前半)8名(2)東北方言の文法形式の意味・用法の地域差に関する分析平成15、16年度に実施した調査の結果を踏まえて、東北方言の方向・着点を表す格助詞サ、対象を表す格助詞コト・トコ、テンス形式テアッタ・タッタの意味・用法の地域差を分析した。その結果、これらの文法形式が、東北地方の日本海側の地域では意味・用法の拡張が進み、太平洋側では本来の意味・用法が維持される傾向があることが分かった。『全国方言文法辞典』は、こうした「文法化」の程度に地域差があることを踏まえた記述を行う必要がある。なお、今回の分析の結果は、「方言における文法化-東北方言の文法化の地域差をめぐって-」『日本語の研究』3巻1号に掲載されている。
「ポータブル」ロボット切削加工システムの基礎となる空間精度の新しい測定法

「オープンループレーザトラッカ測定」と呼ぶ,ロボットの位置決め精度を測定するための新しい測定法を提案し,スカラ型ロボットを対象として,その試験を行った.この測定法は,ロボットの手先に,レーザ干渉計を取り付ける.可動領域内の様々な位置にロボットの手先を位置決めしたとき,レーザ光が常に,床に設置された反射鏡に入射するように,ロボットの姿勢を制御する.それにより,ロボットの手先から反射鏡までの距離を,可動領域全体を網羅する多数の点で測定する.スカラ型ロボットを用いて実験を行った.さらに,可動領域全体を網羅する多数の測定点で得られたデータから,ロボットの幾何学パラメータを同定するアルゴリズムを構築した.一般にロボットは,アームの自重による弾性変形,関節のバックラッシュなど,非線形要因の影響も大きい.ロボットの幾何学パラメータの同定に関する過去の研究は多いが,それらのほとんどすべては,リンク長の誤差,各関節の初期角度の誤差だけをモデル化の対象としている.非線形要因の影響を考慮に入れ,各関節の運動誤差を「誤差マップ」の形で表現し,それを基礎とした新しい幾何学モデルを提案した.また,提案した「オープンループレーザトラッカ測定」法から,誤差マップの同定方法を構築した.実験によって,実際にスカラ型ロボットの2関節の誤差マップを同定した.誤差マップを同定すれば,ロボットの運動を詳細に予測できる幾何学モデルが得られる.比較測定を行い,同定した幾何学モデルから推定されるロボットの誤差軌跡と,実際の軌跡がよく一致することを確認した.「オープンループレーザトラッカ」測定法と,それを用いたロボットの幾何学モデルの同定法を構築し,その有効性を実験で確かめることができた.同定したロボットの詳細な幾何学モデルを使って,可動領域全体で,2次元運動誤差を予測できることを確認し,その予測精度を,市販のレーザトラッカを使って比較測定した.その結果,当初の目標以上のモデル化精度が得られていることが分かった.提案した方法を使って,スカラ型ロボットの誤差補正を行う方法を提案し,その効果を実験で検証する.提案した方法は,現時点ではスカラ型ロボットによる2次元平面内での位置決めを対象としている.それを,6自由度ロボットを用いた3次元空間内での位置決めに拡張する.「オープンループレーザトラッカ測定」と呼ぶ,ロボットの位置決め精度を測定するための新しい測定法を提案し,スカラ型ロボットを対象として,その試験を行った.この測定法は,ロボットの手先に,レーザ干渉計を取り付ける.可動領域内の様々な位置にロボットの手先を位置決めしたとき,レーザ光が常に,床に設置された反射鏡に入射するように,ロボットの姿勢を制御する.それにより,ロボットの手先から反射鏡までの距離を,可動領域全体を網羅する多数の点で測定する.スカラ型ロボットを用いて実験を行った.さらに,可動領域全体を網羅する多数の測定点で得られたデータから,ロボットの幾何学パラメータを同定するアルゴリズムを構築した.一般にロボットは,アームの自重による弾性変形,関節のバックラッシュなど,非線形要因の影響も大きい.ロボットの幾何学パラメータの同定に関する過去の研究は多いが,それらのほとんどすべては,リンク長の誤差,各関節の初期角度の誤差だけをモデル化の対象としている.非線形要因の影響を考慮に入れ,各関節の運動誤差を「誤差マップ」の形で表現し,それを基礎とした新しい幾何学モデルを提案した.また,提案した「オープンループレーザトラッカ測定」法から,誤差マップの同定方法を構築した.実験によって,実際にスカラ型ロボットの2関節の誤差マップを同定した.誤差マップを同定すれば,ロボットの運動を詳細に予測できる幾何学モデルが得られる.比較測定を行い,同定した幾何学モデルから推定されるロボットの誤差軌跡と,実際の軌跡がよく一致することを確認した.「オープンループレーザトラッカ」測定法と,それを用いたロボットの幾何学モデルの同定法を構築し,その有効性を実験で確かめることができた.同定したロボットの詳細な幾何学モデルを使って,可動領域全体で,2次元運動誤差を予測できることを確認し,その予測精度を,市販のレーザトラッカを使って比較測定した.その結果,当初の目標以上のモデル化精度が得られていることが分かった.提案した方法を使って,スカラ型ロボットの誤差補正を行う方法を提案し,その効果を実験で検証する.提案した方法は,現時点ではスカラ型ロボットによる2次元平面内での位置決めを対象としている.それを,6自由度ロボットを用いた3次元空間内での位置決めに拡張する.
PTHrP産生口腔腫瘍の微小環境における間質細胞の変化は何に基づいているか？

以上の結果は、口腔癌細胞が産生したPTHrPがPTH/PTHrPレセプターを介したERK活性化を介して周囲微小環境の線維芽細胞をCAFに誘導することを示唆している。これまで癌研究は実質である癌細胞の性質を探り、癌細胞をターゲットとした治療法の開発を目指すものが主体だった。しかし、近年、癌微小環境の重要性が明らかになっている。今回,口腔癌細胞と間質細胞の相互作用について以下のような検索を行った。1)口腔扁平上皮癌患者からの病理検体における間質の異常性の検索:北海道大学病院歯科診療センターを受診し、扁平上皮癌および前癌病変と診断された患者からの試験切除標本を病理学的に検索した。その結果PTHrPおよびHuR免疫染色により腫瘍細胞におけるPTHrP発現HuRの局在変化には相関がみられ、PTHrP陽性症例では間質の線維芽細胞にαSMA陽性のcancer associated fibroblast (CAF)が有意に多いことが示された。さらにCD34陽性の血管内皮細胞は径が小型で幼若なものが多いことが明らかになった。2) PTHrP高発現口腔癌細胞による正常線維芽細胞のCAF誘導効果(1) PTHrP高発現腫瘍細胞と線維芽細胞株の共培養:我々が既にPTHrPを高発現していることを明らかにした口腔癌細胞株HSC2と正常線維芽細胞株を共培養したところ、線維芽細胞の増殖活性の亢進とαSMAの発現亢進が認められ、このような所見はPTHrPによるCAFへの誘導効果を示している。(2)siRNAによるPTHrPノックダウン効果: HSC2細胞にPTHrP siRNAを導入し、PTHrPノックダウンを行い、PTHrPのmRNAfレベルでの発現が約1/5に減少した。このPTHrPノックダウンHSC2細胞と正常線維芽細胞と共培養したところ、HSC2細胞との共培養に比べて線維芽細胞の増殖活性は著しい減少が認められ、αSMA発現亢進も認められなかった。腫瘍間質に存在する線維芽細胞cancer-associated fibroblasts(CAF)は、正常細胞とは異なる形質を発現しており、癌細胞との相互作用の重要性が注目されている。今回、口腔癌細胞と間質細胞の相互作用について検索した。1)病理検体での間質の異常性:当院歯科診療センターの扁平上皮癌および前癌病変患者からの生検材料を病理学的に検索した。その結果腫瘍細胞でのPTHrP発現とHuRの局在変化には相関がみられ、PTHrP陽性症例では間質の線維芽細胞にαSMA陽性のCAFが有意に多かった。更にCD34陽性の血管内皮細胞は径が小型で幼若なものが多かった。2)PTHrP高発現口腔癌細胞による正常線維芽細胞のCAF誘導効果(1)PTHrPを高発現している口腔癌細胞株HSC2と正常線維芽細胞株を共培養すると、線維芽細胞の増殖活性の亢進とαSMAの発現亢進が認められ、このような所見はPTHrPによるCAFへの誘導効果を示した。(2)HSC2細胞にPTHrP siRNAを導入し、ノックダウンするとPTHrPのmRNAレベルでの発現が約1/5に減少した。このPTHrPノックダウンHSC2細胞と正常線維芽細胞との共培養では、線維芽細胞の増殖活性は著しく減少し、αSMA発現亢進も認めなかった。(3)線維芽細胞株MRC5,DP31,DP36はPTHrP受容体であるPTH1Rを発現していた。HSC2培養上清で処理したDP31,DP36は通常培養下のものと比較しERKのリン酸化が亢進していた。チロシンキナーゼ型細胞膜レセプターの多くは、レセプターの下流のシグナル伝達系でMAPキナーゼ、とくにERKのリン酸化により細胞増殖や分化が誘導されることが知られている。今回の検索結果より、PTH/PTHrPレセプターを介したERKのリン酸化により、線維芽細胞のCAFへの誘導が生じていることが示唆された。臨床病理学的検索ならびに細胞生物学的なPTHrPの過剰発現系とノックダウン系による解析が終わり、論文を作成中で概ね順調に進展している。口腔外科学iTRAQ法によるPTHrP髙発現がん細胞が産生するタンパクの網羅的解析ならびに悪性度に関係するmiRNAの同定を行い、異常性を獲得する分子機構を標的とした治療法の開発をめざす。申請時にはgentle MACS Dissociator(組織分散装置)の購入を予定していたが、申請から減額になり、機器の購入には至らなかったことで次年度使用額が生じた。また、PTHrP高発現口腔癌細胞が産生するタンパク質の網羅的解析のために計上していたmiRNAアレイ受託解析費用も、本解析が未施行のため次年度使用額が生じた。PTHrP高発現口腔癌細胞が産生するタンパク質の網羅的解析は次年度に行う予定であり、その際にmiRNAアレイ受託解析費用が必要となる。その他、大きな変更は無いと思われる。
僧帽弁用フリーハンドホモグラフト弁の開発に関する実験的研究

弁膜症に対する外科的治療は人工弁が主体であるが,代用弁としての同種生体材料による弁は抗感染性,抗血栓性に優れており,大動脈弁位や肺動脈弁位は臨床応用においてその素晴らしい成績が報告されている.一方僧帽弁位では外科的修復術として近年弁形成術が再注目されているが,その手技の完成度については未だ確立されたものではなく,また同種生体弁について満足できる結果が得られていないのが現状である.我々は同種生体材料使用の際に問題となる供給源という点から凍結保存法に着目し,手術手技の簡便化と同種生体弁の優れた利点を考慮し,僧帽弁用フリーハンドホモグラフト弁の実験的研究を進めてきた.今回,同弁についてその可能性と移植後急性期の血行動態についてブタを用いた移植を計6頭に行い,その結果を取りまとめて報告する.〈方法〉ブタを用いて僧帽弁を腱索及び乳頭筋を残して採取,凍結保存した後急速解凍し,人工心肺下に同種弁移植術を行った(n=6).人工心肺離脱後,血行動態評価として大動脈圧(AP),左室圧(LVEDP),左房圧(LAP)を測定し,弁機能評価として心臓超音波診断装置を用いた.病理組織学的評価を行うため解凍後及び実験終了後の弁組織を採取した.〈結果〉人工心肺離脱後のAP124±6mmHg,LVEDP7±1mmHg,LAP8±2mmHgであった.4例に弁形成術や弁輪形成術の付加的処置を行った.心臓超音波診断装置では全例で弁逆流をほとんど認めなかった.病理組織像では解凍後の乳頭筋の組織構築は保たれており,移植手術終了後では炎症性細胞の浸潤は特に認めなかった.〈結論〉ブタを用いた僧帽弁用フリーハンドホモグラフト弁の弁機能及び血行動態は良好なものであり,またホモグラフトの病理組織学的構築は満足できるものであった.今後より長い耐久性を期待し,更なる検討が必要である.<目的>Free-handhomograft弁を用いた僧帽弁形成術の可能性について追求すること。3年間の予定は次の通りである。平成8年度:同種弁の保存法と移植手技の検討、平成9年度:Langendorff潅流心モデルによる急性期弁機能の評価、平成10年度:生存実験による慢性期における弁の評価。<方法>-平成8年度-ブタ(体重:20kg)を用いてhomograft僧帽弁を作成(保存液にはRPMI1640をベースに10%FBS、5%DMSOを加えたものを用いてprogramed freezing)し、それをhole valveとして同種移植した。その後逆流テスト(心尖部の注入用カニュラから左室に容量負荷を加えて、大動脈起部の圧を測定しながら左房への逆流の程度を測定)により心臓内でのfree-handhomograft弁の評価と、保存後の乳頭筋組織の病理組織学的検討を行った。<結果>homograft弁移植後の逆流テストでは左室圧が20mmHg前後で約80%の逆流が認められた。注入量:50ml逆流量:40ml大動脈圧:1823mmHg保存解凍後の病理組織学的検討では左室乳頭筋のHE染色標本で組織構築は保たれているのが確認され、特に凍結保存による大きな変化は見られなかった。<考察>計測終了後解剖を行い技術的に問題がなかったかどうか検討を行った。左房側、心室側から観察するに弁輪の縫着、乳頭筋への縫着には問題なく、腱索の長さについては後尖の前交連側がやや短めであったがcoaptationは比較的良好で、逆流テストでも漏れは少量であった。弁機能評価について、今回の方法では心筋は弛緩した状態であり弁輪部の支持性に欠いた状態であった事が逆流に多大な影響を及ぼしたのではないかと考えられ、今後拍動心を用いた実験が必要であると思われた。弁膜症に対する外科的治療は人工弁が主体であるが,代用弁としての同種生体材料による弁は抗感染性,抗血栓性に優れており,大動脈弁位や肺動脈弁位は臨床応用においてその素晴らしい成績が報告されている.一方僧帽弁位では外科的修復術として近年弁形成術が再注目されているが,その手技の完成度については未だ確立されたものではなく,また同種生体弁について満足できる結果が得られていないのが現状である.我々は同種生体材料使用の際に問題となる供給源という点から凍結保存法に着目し,手術手技の簡便化と同種生体弁の優れた利点を考慮し,僧帽弁用フリーハンドホモグラフト弁の実験的研究を進めてきた.今回,同弁についてその可能性と移植後急性期の血行動態についてブタを用いた移植を計6頭に行い,その結果を取りまとめて報告する.〈方法〉ブタを用いて僧帽弁を腱索及び乳頭筋を残して採取,凍結保存した後急速解凍し,人工心肺下に同種弁移植術を行った(n=6).人工心肺離脱後,血行動態評価として大動脈圧(AP),左室圧(LVEDP),左房圧(LAP)を測定し,弁機能評価として心臓超音波診断装置を用いた.病理組織学的評価を行うため解凍後及び実験終了後の弁組織を採取した.〈結果〉人工心肺離脱後のAP124±6mmHg,LVEDP7±1mmHg,LAP8±2mmHgであった.4例に弁形成術や弁輪形成術の付加的処置を行った.

心臓超音波診断装置では全例で弁逆流をほとんど認めなかった.病理組織像では解凍後の乳頭筋の組織構築は保たれており,移植手術終了後では炎症性細胞の浸潤は特に認めなかった.〈結論〉ブタを用いた僧帽弁用フリーハンドホモグラフト弁の弁機能及び血行動態は良好なものであり,またホモグラフトの病理組織学的構築は満足できるものであった.今後より長い耐久性を期待し,更なる検討が必要である.<目的>Free-handhomograft弁を用いた僧帽弁形成術の可能性について追及すること。3年間の予定は次の通りである。平成8年度:同種弁の保存法と移植手技の検討、平成9年度:Langendorff潅流心モデルによる急性期弁機能の評価、平成10年度:生存実験による慢性期における弁の評価。<方法>-平成9年度-ブタ(体重:20kg)を用いてhomograft僧帽弁を作成(保存液にはRPMI 1640をベースに10%FBS、5%DMSOを加えたものを用いてprogramed freezing)し、人口心肺を用いて心停止下にwhole valveとして同種移植、弁置換を行い、人工心肺離脱後、血行動態評価として大動脈圧(AP)、左室圧(LVEDP)、左房圧(LAP)を測定し、弁機能評価として心臓超音波診断装置による逆流の程度、弁形態の観察を行った。<結果>血行動態:上行大動脈圧110/60、左室圧105、左室拡張末期圧8、左房圧10(単位mmHg)超音波所見:僧帽弁逆流residual leakageI度、弁開閉特に問題なし<考察>人工心肺より離脱は比較的用意で、その後の心収縮、僧帽弁機能には特に問題なく良好な血行動態が認められ、僧帽弁用homograftは、移植後急性期における機能評価としては満足しうるものであった。〈目的〉代用弁としての同種生体材料による弁は機械弁や異種生体弁に比べ抗感染性,抗血栓性に優れている.我々は同種生体材料使用の際に問題となる供給源という点から凍結保存法に着目し,手術手技の簡便化と同種生体弁の優れた利点を考慮し,僧帽弁用freehand cryopreserved allograft,の実験的研究を進めてきた.本年度は本研究の最終年度となるが,同弁についてその可能性と移植後血行動態について検討した.〈方法〉ブタを用いて僧帽弁を腱索及び乳頭筋を残して採取,凍結保存した後急速解凍し,人工心肺下に同種弁移植術を行った(n=6).人工心肺離脱後,血行動態評価として大動脈圧(AP),左室圧(LVEDP),左房圧(LAP)を測定し,弁機能評価として心臓超音波診断装置を用いた.〈結果〉人工心肺離脱後のAP124±6mmHg,LVEDP7±1mmHg,LAP8±2mmHgであった.4例に弁形成術や弁輪形成術の付加的処置を行った.心臓超音波診断装置では全例で弁逆流をほとんど認めなかった.〈結論〉ブタを用いて僧帽弁用freehandcryopresered allograftの移植実験において,何らかの付加的処置を必要としたが,移植直後における血行動態は良好であった.
食道癌の新規治療法の開発を目指したＬＩＮＥ－１メチル化レベルの網羅的解析

200例以上の食道扁平上皮癌のLINE-1メチル化レベルを解析し、LINE-1低メチル化症例は予後不良であることを明らかにした。CGHアレイ解析の結果、LINE-1低メチル化症例では、CDK6など癌関連遺伝子を含む領域において高頻度にコピー数の増幅・欠損を認めた。食道癌128例の免疫染色を行った結果、CDK6発現症例は統計学的に有意ではないものの予後が不良であり、またCDK6発現を交絡因子として解析したところ、LINE-1低メチル化の予後に対する影響は減弱した。LINE-1低メチル化症例においては、CDK6に代表とされるような癌関連遺伝子の増幅がおこり、悪性度の獲得に繋がっていると考えられた。ゲノム全体の低メチル化(=LINE-1の低メチル化)は、癌において重要なエピジェネティックな変化であるが、食道癌におけるLINE-1メチル化の意義を検討することが本研究の目的である。まず、Pyrosequencing technologyにより、パラフィン包埋ブロックを用いて食道癌LINE-1メチル化レベルが正確に測定できるかを検討した。Pyrosequenceは、bisulfite→PCR→Pyroという行程からなるが、それぞれ行程を5回ずつ独立して行うことにより、その再現性を評価した。bisuifite行程及びPyro行程の標準偏差は、それぞれ1.44-2.90、0.63-3.25と比較的低値であった。また、同一腫瘍から5枚の切片を作成することにより、同一腫瘍内のheterogeneityを評価したが、標準偏差は1.37-3.31であった。これらの結果から、食道癌パラフィンブロックから作成された代表切片を用いて、PyrosequenceによりLINE-1メチル化レベルを測定することの妥当性が示された。Pyrosequenceは多数のサンプルを迅速に測定することができ、臨床応用に非常に適したツールであることから、今回の結果は非常に意義があると考えられる。この結果を示した論文は、Ann Surg Oncol.に採択された。次に、このassayを用いて、食道癌217例のLINE-1メチル化レベルを測定した。食道癌のメチル化レベルは、正常上皮と比べて有意に低値であった(p<0.0001;N=50)。癌部におけるLINE-1メチル化レベルは、平均値64.5;中央値65.0;最小値24.8;最大値91.8であった。食道癌LINE-1低メチル化症例は、高メチル化症例に比べて有意に予後不良であった(log-rank p=0.0008;単変量リスク比=2.32,95%信頼区間1.38-3.84,p=0.0017;多変量リスク比=1.81,95%信頼区間1.06-3.05,p=0.031)。このことから、食道癌LINE-1メチル化レベルは、食道癌の予後予測因子となりうることが示された。食道癌は非常に予後の悪い疾患であるが、今回の結果は患者別の個別化治療に貢献できる可能性があり、非常に臨床的意義があると考えられる。この結果は、外科分野の一流誌であるAnnals of Surgeryに採択された。癌におけるDNAメチル化異常の特徴として、ゲノム全体の低メチル化と、遺伝子プロモーター領域の部分的な高メチル化がある。ゲノムワイドな低メチル化は、がん原遺伝子発現や染色体不安定性などを介して、様々な癌種の発癌・浸潤転移において重要な役割を果たす。LINE-1はゲノム全体の約17%を占める転位因子であり、LINE-1のメチル化レベルはゲノム全体のメチル化レベルの指標になる。我々は、200例以上の食道扁平上皮癌のLINE-1メチル化レベルを解析し、LINE-1低メチル化症例は予後不良であることを明らかにしてきた(Ann Surg, 2013)。しかし、LINE-1低メチル化が癌悪性度に寄与するメカニズムについては明らかになっていない。今回、LINE-1低メチル化とDNAコピー数異常の関係を評価するために、LINE-1低メチル化食道癌症例と高メチル化症例を用いてCGHアレイ解析を行った。その結果、LINE-1低メチル化症例では、CDK6など癌関連遺伝子を含む領域において高頻度にコピー数の増幅・欠損を認めた(P=0.0013)。また、食道癌切除症例においてLINE-1メチル化レベルとCDK6発現は有意に相関していた(mRNA level:P=0.039、protein

level:P=0.0001)。食道癌細胞株においても同様の結果が得られ、FISHによってCDK遺伝子増幅とLINE-1メチル化レベルとの関連が確認された。食道癌128例の免疫染色を行った結果、CDK6発現症例は統計学的に有意ではないものの予後が不良であった(P=0.064)。また、CDK6発現を交絡因子として解析したところ、LINE-1低メチル化の予後に対する影響は減弱した(ハザード比:2.96→2.32)。これらの結果から、LINE-1低メチル化症例においては、CDK6に代表とされるような癌関連遺伝子の増幅がおこり、悪性度の獲得に繋がっていると考えられた。これらの内容を、Clinical Cancer Researchに発表した。前年度までにLINE-1低メチル化食道癌は予後不良であることを明らかにし、『Annals of Surgery』に今年度に掲載された。今年度はそのメカニズムを解明するための研究を推進した。LINE-1メチル化レベルはゲノム全体のメチル化レベルの指標であるので、LINE-1低メチル化症例においてはゲノム全体のメチルレベルが低いことになり、ゲノム全体が低メチル化になると、ゲノム不安定性に繋がることが報告されている。我々はLINE-1低メチル化症例ではゲノム不安定性からDNAコピー数の異常をきたし、癌の悪性度に繋がるのではないかとの仮説をたて、LINE-1低メチル化症例3例とLINE-1高メチル化症例3例をCGH arrayにて解析した。すると、LINE-1高メチル化症例ではほとんどコピー数の異常をきたしていないのに対し、LINE-1低メチル化症例ではゲノム全体にわたり広範囲コピー数の異常をきたしていることが分かった(P=0.0047)。また、我々はepigenetic field defectの観点から、正常食道上皮におけるLINE-1メチル化レベルに関して食道癌のリスク因子(喫煙、飲酒)との関係を検討した。食道癌症例非癌部のメチル化レベルは、食道癌を有さない剖検例の食道上皮(n=20)よりも低値で(P = 0.017)、“Epigenetic Field Defect"の概念を支持した。非癌部のメチル化レベルは喫煙歴と相関し(Brinkman Index :p=0.0002)、アルコールや年齢とは相関しなかった。正常食道上皮の低メチル化は、喫煙を誘因とするEpigenetic Field Defectのsurrogate markerの1つとなりうるかもしれない。LINE-1は、食道癌の“浸潤転移"だけでなく“発生"においても重要な役割を果たしていることが示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画書に記した予定通りに研究は遂行され、意義深い結果が得られた。これらの結果は、Annals of Surgery、Annals of Surgical Oncologyという外科分野の一流誌に既に採択されている。また、そのメカニズム解明においても興味深い結果が得られており、来年度以降の研究の進展が期待される。
ゼブラフィッシュ初期胚特異的転写因子 ZFPOU2の機能解析

平成5年度から3年間で、ゼブラフィッシュ初期胚で発現している未分化細胞特異的転写因子zebrafishpou2のクローニングと機能解析を行った。pou2はPOU転写因子群に属し、そのPOUドメインは哺乳類のOct-3と相同性がある。pou2遺伝子のmRNAは母性RNAとして検出される。また、発現パターンの解析から割球の多分化能の消失に伴いpou2の発現が消失していることが判明した。この遺伝子産物をRNA注入法で初期胚で過剰発現させると原腸形成が著しく阻害され発生の進行が停止することが観察された。種々のマーカーを用いた解析から、原腸形成阻害は中胚葉誘導が正常に起こらないためと考えられた。従って、pou2遺伝子産物は初期発生、特に原腸胚期までの割球の多分化能の維持や発生運命の決定に深く関与していることが明らかになった。pou2 mRNAは原腸胚期に胚全体で消失する直前、epiblastで一過的に発現上昇が起こり、一方陥入したhypoblastで発現が急速に消失することがわかった。この特徴的な発現パターンと細胞分化の関係を明らかにするために、この時期の胚細胞の分化状態を細胞移植法により検討した。biotin標識したドナー胚から細胞を取り出し、宿主胚の種々の場所に移植した。その結果、epiblastにおけるpou2遺伝子の一過的発現上昇は神経細胞の分化決定時期に対応し、また、hypoblastでの発現消失はhypoblastの誘導能獲得の時期に対応しているとことが明らかとなった。このことはpou2遺伝子産物の役割が各胚葉で異なっていることを示唆している。以上のように、初期胚で特徴的発現を示す転写因子pou2の初期胚での役割が明らかになった。平成5年度では、既にクローニングが完了しているゼブラフィッシュ初期胚未分化細胞特異的転写因子zebrafishpou2の発現と機能解析を中心に以下のことを行った。zebrafishpou2はPOU転写因子群に属し、そのPOUドメインは哺乳類のOct-3と相同性がある。pou2遺伝子のmRNAは母性RNAとして検出され胞胚期までのすべての割球に存在し、原腸胚期から神経胚にかけて発現が消失する。詳しい発現パターンの解析から割球の多分化能の消失に伴いpou2の発現が消失していることが判明した。また、pou2遺伝子からはオクタマー配列を認識しDNAと結合するpou2とDNA結合能を持たないalternative splicing産物、t-Pou2が産生されていた。このPou2およびt-Pou2の初期胚における機能を探るために合成RNAを一細胞期の受精卵に注入しこれらの産物を過剰発現させ、その後の発生を観察した。Pou2を過剰発現した胚のほとんどは正常に発生し12時間後に神経胚に到ったが、t-Pou2を過剰発現した個体の約7割は胞胚期から原腸胚期にかけて発生が停止もしくは著しく遅れ神経胚には到らなかった。発生異常を示すこれらの個体では、原腸形成に伴って分離する胚盤葉下層(将来の中・内胚葉)の形成に異常が認められ、初期中胚葉細胞の分化マーカー遺伝子であるT(Brachyury)遺伝子の発現が抑制されていた。これらの結果は、pou2遺伝子産物が初期発生、特に原腸胚期までの割球の多分化能の維持や発生運命の決定に関与していることを示している。今後は、pou2遺伝子産物の作用機序について同じ時期に発現しているPOU転写因子群との関わりに注目し解析していく予定である。

これまでにZFPOU2遺伝子の発現が胚全体で消失する際にはepiblast(胚盤葉上層:将来の外胚葉)で一過的に発現上昇が起こり、陥入したばかりのhypoblast(胚盤葉下層:将来の中・内胚葉)で発現が急速に消失することがわかった。また、過剰発現で発生異常を示す固体の多くがhypoblastの分化が起こっていないことも新たに判明した。これらの結果は、ZFPOU2遺伝子産物はhypoblastの分化に抑制的に働くことを示している。また、これまでの予想から、ZFPOU2遺伝子の発現と細胞の多分化能の保持の関係が示唆されてきたので、隣接するhypoblastとepiblastで多分化能性の違いが生じている可能性があった。そこで、本年度後半ではepiblastの多分化能喪失時期を厳密に決定して、ZFPOU2遺伝子の発現消失時期との比較を行った。細胞や組織の運命決定の時期を調べるには、注目する場所に存在する細胞や組織を別な場所に移植して、その発生運命が変更されるかどうかを調べる必要がある。我々はこの方法で、epiblast細胞の分化決定が55%-epiboly(受精後6.5時間)の時期に起こっているということを明らかにした。この時期は、陥入したhypoblast細胞の運命決定の時期と一致しており、またepiblastではZFPOU2 mRNAが一過的に上昇している時期である。従って原腸形成期でのZFPOU2遺伝子の発現は、胚葉の多分化能の維持とは直接関連づけられないことが判明した。平成6年度の研究で、ZFPOU2遺伝子のmRNAは原腸胚期に胚全体で消失する直前、epiblastで一過的に発現上昇が起こり、一方陥入したhypoblastで発現が急速に消失することがわかった。この特徴的な発現パタンと細胞分化の関係を明らかにするために、この時期の胚細胞の分化状態を細胞移植法により検討した。bitotin標識したドナー胚から細胞を取り出し、宿主胚の種々の場所に移植した。異所的に移植されたドナー細胞での分化マーカーの発現をin situ hybiridization法とavidine-peroxidase染色で検出した。その結果、神経上皮の前後軸に沿った領域特異性は原腸形成開始直後(初期原腸胚)に決定され始めるこが判明した。さらに、この過程には神経上皮を裏打ちするhypoblastが重要な役割を担っていることも明らかとなり、hypoblastからepiblastへの垂直方向の誘導がゼブラフィッシュで初めて確認された(Miyagawa et al,1996)。つまり、epiblastにおけるZFPOU2遺伝子の一過的発現上昇は神経細胞の分化決定時期に対応し、また、hypoblastでの発現消失はhypoblastの誘導能獲得の時期に対応していると言うことができる。このことはZFPOU2遺伝子産物の役割が各胚葉で異なっていることを示唆するもので興味深い。この遺伝子は、alternative splicingで機能の異なる遺伝子産物が作られているが、これら遺伝子産物の各胚葉での機能を今後調べるつもりである。一方、今回の移植実験の結果はゼブラフィッシュの神経上皮が胚発生の極めて初期の原腸形成初期に既に領域特性を獲得していること示している。
脳血管床の脳内制御機構の研究-特にクロトー老化抑制遺伝子の動的役割-

KlothoマウスとWildマウスの比較解析結果I]生理的パラメーターの比較4週齢及び6週齢両群に於いてKlothoマウスの体重がwild群に比し少なく、高度の有意差がみられた。体温及びヘマトクリットに有意差はなかったが、血糖値はKlotho群が有意に低血糖であった。Klotho群の4週齢と6週齢の生理的パラメーターには有意差はなかった。4週齢及び6週齢についてwlld群6匹、Klotho群7匹づつでLCGuの測定をおこなった。尚、低血糖群(Klotho)ではSudaらの報告にあるlumped constantを用いLCGUを算出した。(iii)Wild群の4週齢と6週齢の比較:Wild群では4週齢と6週齢の間には全脳にわたって有意差は認めなかった。(iv)Klotho群4週齢と6週齢の比較:Klotho群内の比較では6週齢のLCGUは全脳にわたって4週齢より高度に有意に低下していた。Klotho mouseにおけるアセチルコリンによるNO系を介する脳血管の反応性の低下、これは前田らの先の実験結果から前脳基底部の関与が示唆されていたが、Klotho mouseの4週齢に於いて、特に前脳基底部のLCGUが特異的に低下を来たしている所見は得られなかった。ただ、3週齢と4週齢との間でこれら特定の部位(前脳基底部やコリン作動系受動性橋被蓋領域)の機能低下が先行して発現している可能性は充分に考えられる。3週齢4週齢の間ではKlotho mouseの体重は更に小さく実験か極めて困難であるが、今後検討してみたいと考えている。Klotho mouse(極小動物)の脳局所糖利用率LCGU)の測定の為の基礎実験Klothoマウス脳の組織学的・代謝学的検討:I]Klotho mouseの脳実質の組織学的検索:Klotho type groupとWild type group各々3匹を使用し、通常の組織学的染色(HE, KB)、各種免疫抗体染色(S-100,GFAP,シナプトフィゾン,NSEニューロフィラメント等)を用い、比較検討した。Klotho mouseはWild typeに比し、新旧皮質ともに神経線維成分が粗になり、神経細胞も減少している傾向にあった。特にグリアの明確な増生等はみられなかった。KlothoマウスとWildマウスの比較解析結果I]生理的パラメーターの比較4週齢及び6週齢両群に於いてKlothoマウスの体重がWild群に比し少なく、高度の有意差がみられた。4週齢及び6週齢についてwild群6匹、Klotho群7匹づつでLCGuの測定をおこなった。