hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブタ核移植法の開発および遺伝子改変ブタ作出への応用

本研究ではブタ核移植法の確立が極めて重要なポイントとなる。申請書では平成14年度の研究計画において、(1)活性化刺激と(2)卵子の体外成熟培養時間が核移植した胚の発生に及ぼす影響を調べる予定であった。この研究計画に則り、以下の知見を得た。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み合わせた複合活性化法について検討した。実験の結果、活性化刺激を与えた単為発生卵の胚盤胞期への発生率が最も高かったのはイオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドこれら3者の複合刺激を施した処理区であった。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対しても同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。以上から、イオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドの3者複合活性化刺激は核移植した胚の発生率を向上させることが示された。レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差がなかった。しかし、36時間体外成熟培養を施した成熟卵子は核移植胚の胚盤胞期までの発生を支持することができなかった。また、40と44時間の体外成熟培養時間では40時間の方が核移植に供した場合有利に高い発生率を引き出すことが明らかになった。また、研究の進行状況から平成15年度の研究計画の内容にも着手した。移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植の発生に及ぼす影響を調べた。その結果、卵子内の成熟促進因子MPFによる核の凝縮が核移植した胚の発生に重要であることが明らかになった。(2)の実験結果とも考慮し、核の初期化にはMPFの高い卵細胞質に核を曝すことが重要であると推察された。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべく仮親豚への核移植胚移植を行った。核移植の操作間で、特に核注入操作によってレシピエント卵子内のMPF活性が低下してしまうことをつきとめ、問題解決として操作培地中へのMPF活性維持剤であるカフェインを添加することで活性の低下を防ぐことに成功した。またカフェイン処理によって早期染色体凝縮を起こす核移植胚の割合が高まり、体外での発生率を改善することにも成功した。さらに、リアルタイムPCR法によって未分化特異的遺伝子Oct4の遺伝子発現を解析し、核移植胚のOct4発現が体外受精卵よりも低くなることをつきとめた。しかし、全30回に渡って仮親へ核移植卵を胚移植したが妊娠70日前後で流産してしまい、個体を得ることはできなかった。以上本研究をまとめると、体内での発生能力に課題を残しつつも、体外でのミニブタ体細胞由来核移植卵の発生能力を高めることには成功し、新たな問題を提起するとともに本研究の知見はミニブタクローンの研究領域に貢献するものと考えられる。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み台わせた複合活性化法について検討した。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対して同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。2.レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差が無かった。(1)核移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。

(2)の実験結果とも考慮し、核の初期化にはMPFの高い卵細胞質に核を曝すことが重要であると推察された。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべき仮親豚への核移植胚移植を行いたいと考えている。本研究ではブタ核移植法の確立が極めて重要なポイントとなる。申請書では平成14年度の研究計画において、(1)活性化刺激と(2)卵子の体外成熟培養時間が核移植した胚の発生に及ぼす影響を調べる予定であった。この研究計画に則り、以下の知見を得た。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み合わせた複合活性化法について検討した。実験の結果、活性化刺激を与えた単為発生卵の胚盤胞期への発生率が最も高かったのはイオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドこれら3者の複合刺激を施した処理区であった。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対しても同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。以上から、イオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドの3者複合活性化刺激は核移植した胚の発生率を向上させることが示された。レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差がなかった。しかし、36時間体外成熟培養を施した成熟卵子は核移植胚の胚盤胞期までの発生を支持することができなかった。また、40と44時間の体外成熟培養時間では40時間の方が核移植に供した場合有利に高い発生率を引き出すことが明らかになった。また、研究の進行状況から平成15年度の研究計画の内容にも着手した。移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植の発生に及ぼす影響を調べた。その結果、卵子内の成熟促進因子MPFによる核の凝縮が核移植した胚の発生に重要であることが明らかになった。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべく仮親豚への核移植胚移植を行った。核移植の操作間で、特に核注入操作によってレシピエント卵子内のMPF活性が低下してしまうことをつきとめ、問題解決として操作培地中へのMPF活性維持剤であるカフェインを添加することで活性の低下を防ぐことに成功した。またカフェイン処理によって早期染色体凝縮を起こす核移植胚の割合が高まり、体外での発生率を改善することにも成功した。さらに、リアルタイムPCR法によって未分化特異的遺伝子Oct4の遺伝子発現を解析し、核移植胚のOct4発現が体外受精卵よりも低くなることをつきとめた。しかし、全30回に渡って仮親へ核移植卵を胚移植したが妊娠70日前後で流産してしまい、個体を得ることはできなかった。以上本研究をまとめると、体内での発生能力に課題を残しつつも、体外でのミニブタ体細胞
非圧縮性環境予測シミュレーションに対する圧縮性方程式の展開

本研究においては,圧縮性方程式の非圧縮性環境予測シミュレーションへの適用を目途とし研究を行った.初年度は低マッハ数における圧縮性数値解が非圧縮性数値解とどの程度一致するのかに焦点を絞って研究を実施した.その結果,密度変動がマッハ数の二乗程度であれば充分に非圧縮性流れを再現できることが判明した.より複雑な非圧縮性流れに対する応用として,2次元及び3次元一様等方性乱流の直接数値シミュレーションへの適用を行った.乱流のシミュレーションにおいては空間精度を高次にする必要があり,空間微分項の離散化には修正微分求積法を用いることによって高次精度化を図った.しかしながら,非物理的な数値振動が発生したために移流項の離散化に対して流束シフトを行うことにより過度の粘性を付加することなく数値振動を回避することに成功し,非圧縮性数値解と非常に良好に一致する結果が得られた.次年度においては,圧縮性方程式の非圧縮性環境予測シミュレーションへの適用を行った.解析対象は丘陵地形を過ぎる非圧縮性流れであり,層流シミュレーションを実施した.その結果,非圧縮性方程式により得られた参考解との良好な一致が確認された.しかしながら,重力および密度成層効果を考慮したシミュレーションにおいては弱成層に対して非圧縮性参考解との一致が確認されたが,強成層の場合には定性的な一致にとどまった.そこで,支配方程式として従来の密度基準圧縮性方程式を非圧縮性まで包括してシミュレーション可能であると考えられる圧力基準圧縮性方程式に変更して一様マッハ数圧力補正法を用いて検証を行った.その結果,密度基準数値解と異なる数値解が得られ,非圧縮性数値解と比較することにより本研究で採用した圧力基準圧縮性数値解が非圧縮性数値解を再現可能であることを実証した.本研究においては,圧縮性方程式の非圧縮性環境予測シミュレーションへの適用を目途とし研究を行った.初年度は低マッハ数における圧縮性数値解が非圧縮性数値解とどの程度一致するのかに焦点を絞って研究を実施した.その結果,密度変動がマッハ数の二乗程度であれば充分に非圧縮性流れを再現できることが判明した.より複雑な非圧縮性流れに対する応用として,2次元及び3次元一様等方性乱流の直接数値シミュレーションへの適用を行った.乱流のシミュレーションにおいては空間精度を高次にする必要があり,空間微分項の離散化には修正微分求積法を用いることによって高次精度化を図った.しかしながら,非物理的な数値振動が発生したために移流項の離散化に対して流束シフトを行うことにより過度の粘性を付加することなく数値振動を回避することに成功し,非圧縮性数値解と非常に良好に一致する結果が得られた.次年度においては,圧縮性方程式の非圧縮性環境予測シミュレーションへの適用を行った.解析対象は丘陵地形を過ぎる非圧縮性流れであり,層流シミュレーションを実施した.その結果,非圧縮性方程式により得られた参考解との良好な一致が確認された.しかしながら,重力および密度成層効果を考慮したシミュレーションにおいては弱成層に対して非圧縮性参考解との一致が確認されたが,強成層の場合には定性的な一致にとどまった.そこで,支配方程式として従来の密度基準圧縮性方程式を非圧縮性まで包括してシミュレーション可能であると考えられる圧力基準圧縮性方程式に変更して一様マッハ数圧力補正法を用いて検証を行った.その結果,密度基準数値解と異なる数値解が得られ,非圧縮性数値解と比較することにより本研究で採用した圧力基準圧縮性数値解が非圧縮性数値解を再現可能であることを実証した.本年度においては,圧縮性ナビェ・ストークス方程式を基礎方程式とし,低マッハ数における圧縮性数値解が非圧縮性数値解とどの程度一致するのかに焦点を絞って研究を実施した.具体的には,マッハ数の変化による密度変動変化を最も基本的なテーラー・グリーン問題に対して実施した.この場合,圧縮性ナビェ・ストークス方程式は空間微分項に2次精度中心差分法を用いて離散化し,その結果としての時間に関する連立常微分方程式の積分にはルンゲ・クッタ型の数値積分法を用いた.その結果,密度変動がマッハ数の二乗程度であれば充分に非圧縮性流れを再現できることが判明した.次に,2次元正方空洞内非圧縮性流れに対して適用を行った結果,2次精度中心差分法により移流項を離散化すると数値振動が生じたために人工粘性項を付加することによって数値振動を回避する手段を用いた.この場合も,MAC法及びコロケーション差分法により非圧縮性ナビェ・ストークス方程式を解いて得られた数値解と良好に一致することが示された.また,より複雑な非圧縮性流れに対する応用として,2次元及び3次元一様等方性乱流の直接数値シミュレーションへの適用を行った.乱流のシミュレーションにおいては空間精度を高次にする必要があり,空間微分項の離散化には修正微分求積法を用いることによって高次精度化を図った.しかしながら,非物理的な数値振動が発生したために移流項の離散化に対して流束シフトを行うことにより過度の粘性を付加することなく数値振動を回避することに成功した.また,圧縮性方程式の数値解は非圧縮性方程式を高次精度差分法及びスペクトル法で解いた数値解と非常に良好に一致する結果が得られた.本年度においては,圧縮性方程式の非圧縮性環境予測シミュレーションへの適用を行った。解析対象は丘陵地形を過ぎる非圧縮性流れであり,圧縮性方程式の移流:の離散化には2次精度中心差分法に人工粘性項を付加した手法を,圧力勾配項および粘性項には2次精度中心差分法を採用して,層流シミュレーションを実施した.

また,流出境界条件として境界層内・境界層外を同時に取り扱うことにできるナビェ・ストークス特性境界条件(NSCBC)を採用した.その結果,非圧縮性方程式により得られた参考解との良好な一致が確認された.しかしながら,重力および密度成層効果を考慮したシミュレーションにおいては弱成層に対して非圧縮性参考解との一致が確認されたが,強成層の場合には定性的な一致にとどまった.そこで,支配方程式として従来の密度基準圧縮性方程式を非圧縮性まで包括してシミュレーション可能であると考えられる圧力基準圧縮性方程式に変更して,全マッハ数領域において同一の解法で数値シミュレーション可能かどうかの検証を実施した.この手法は一様マッハ数圧力補正法(Mach uniform pressure correction method)と言われ,世界的に見ても適用例が余り散見されない方法である.検証は10%の円弧状隆起を有する平行平板間流れにおいて行った.その結果,一様マッハ数圧力補正法は通常密度基準圧縮性方程式が用いられる超音速・遷音速領域のみならず亜音速領域においても密度基準数値解と良好に一致する結果を得た後,ほぼ非圧縮性であると見なせるマッハ数が0.01以下の準非圧縮性領域に対して適用を行った.その結果,密度基準数値解と異なる数値解が得られ,非圧縮性数値解と比較することにより本研究で採用した圧力基準圧縮性数値解が非圧縮性数値解を再現可能であることを実証した.
神経細胞の発生および老化におけるアポトーシスとDNAメチル化の機序

5-azaytidine(5AzC)は、cytidineのアナログで、ピリミジン環の5位の炭素が窒素に置換されている。投与した5AzCがDNAに取り込まれると、cytidine5位の炭素がメチル化されず、脱メチル化した遺伝子の活性化が起こると考えられている。5AzC誘発アポトーシスにおいては、遺伝子の活性化によって新たに合成された未知のアポトーシス関連タンパク質が関与していると推側され、このタンパク質の同定とその発現調節機構の解明とが最重要課題と思われた。そこで、本研究では5AzCの実験系を用いて、神経系におけるアポトーシス関連遺伝子・蛋白質の分離とその発生機序の解明とを試みた。その結果、5AzC誘発アポトーシスの発現はDNA脱メチル化と深くかかわっていることが明らかとなった。また、5AzCで処置した株化神経様細胞の1種であるPC12細胞においてアポトーシスの発現直前にリボソームタンパクL4(rpL4)の発現増加が認められ、さらに、このタンパク質を強制発現させた細胞にアポトーシスが誘導されたことから、神経組織におけるアポトーシスの発現にrpL4が深く関係することが判明した。一方、最近の獣医医療の進歩によってイヌ、ネコといった伴侶動物の寿命が飛躍的に延びこれにともなって痴呆様症状を示す老齢犬の数が増加してきた。我々は老齢痴呆犬の脳を調べ、アポトーシス細胞の増加が痴呆様症状の程度と深く関連していることを見出した。本研究では、老齢動物の脳でのrpL4を含めたアポトーシス関連遺伝子の発現を調べ、痴呆との関連を解明することも試みたが、残念ながらまだ十分な成果が得られていない。これについては今後の研究で明らかにしていくつもりである。妊娠11日目のICRマウスに5Az、6-azacytidine、cytidine、5-azadeoxycytidine、5-azacytosine、6-azauridine、3-deazauridine、3-deazaadenosine(各0.4mg)を腹腔内投与し、24時間後に胎仔を採取、神経系のアポトーシスを調べた。5Azと5-azadeoxycytidineは全ての胎仔の神経組織にアポトーシスを誘発したが、その他の物質にアポトーシス誘導は認められなかった。次に5Az投与1、3、6、11、24時間後に胎仔脳を採取、DNAを抽出し、メチル化のパターンを調べたが、ゲノムレベルのDNA脱メチル化は認められなかった。以上の結果から本実験系におけるアポトーシスの誘導にはcytidineのピリミジン環5位のC→N置換が必須であることがわかった。DNAのメチル化はシトシン塩基の5位におこることが知られており、DNAメチル化とアポトーシス遺伝子の活性化との関係が考えられた。無処置PC12細胞と5Az(500μg/ml)で10時間処置したPC12細胞からそれぞれmRNAを抽出、cDNAを合成し、subtractionを行ない、発現量に差を認めたクローンを1つ得た。このクローンの塩基配列を決定したところ、rat ribosomal protein L4(RrpL4)であった。この全長をプローブとしてNorthern blot法を行ったところ、5Az処置36時間後に発現のピークが認められた。RrpL4をプローブに用いたin situ hybridyzationの結果、5Az処置および無処置ラト胎仔の神経組織と肝臓で強いシグナルが認められたが、このシグナルとアポトーシス発現部位との関係は明らかではなかった。以上の結果より、5Az誘発PC12細胞アポトーシスにおけるRrpL4の関与が示唆された。ラット副腎の褐色細胞腫由来で神経様細胞への分化能を有するPC12細胞を用いて、5-アザシチジン(5AzC)誘発アポトーシスに関連する遺伝子のクローニングを試みた。

無処置PC12細胞と5AzC(500μg/ml)で10時間処置したPC12細胞からそれぞれmRNAを抽出、cDNAを合成し、subtraction法を行ない、発現量に差を認めたクローンを1つ得た。このクローンの塩基配列を決定したところ、ラットribosomal protein L4(RrpL4)であった。5AzC処置PC12細胞より得たmRNAについて、この全長をプローブとしてNorthern blot法を行ったところ、処置36時間後に発現のピークが認められた。この実験系ではアポトーシスが観察され始めるのは投与後612時間なのでRrpL4の発現がアポトーシスに先行することが明らかになった。また、RrpL4をプローブに用いたin situ hybridyzationの結果、投与後12時間に、5AzC処置および無処置ラットおよびマウス胎仔の神経組織と肝臓で強いシグナルが認められたが、このシグナルとアポトーシス発現部位との関係は明らかではなかった。さらに、このクローンをhamoagglutinin(HA)遺伝子とともにCOS-7細胞にトランスフェクトし、培養したところ、48時間後にHAタンパク質の発現増加と明瞭なDNAの断片化が観察された。以上の結果より、5AzC誘発PC12細胞アポトーシスにおけるRrpL4の関与が示唆された。
強誘電体薄膜の物性制御と次世代メモリデバイスへの応用

今日、高度化されまた今後も拡大化の続く情報化社会を支えるのがまさにコンピュータと通信機器であるが、特に記憶を司るメモリデバイスが非常に重要である。この半導体メモリの中で電源を切っても忘れない不揮発性メモリとして強誘電体メモリ(FeRAM)があり、その研究開発が進められている。しかし、強誘電体薄膜を信頼性の高いメモリデバイスに応用するには、多くの問題点が存在する。高集積化に伴う超微細化によって数十nmの厚さの強誘電体薄膜における分極反転の反復による強誘電性の劣化、分極履歴のシフト、分極の時間的劣化、絶縁性の劣化などである。これらの問題点は、微細な強誘電体薄膜の特性評価をし、薄膜作製法の改良と最適化で克服されようと多くの努力が払われているが、表面的改良ではなく、強誘電体ならびにその薄膜に起こる現象を根本的に理解し、種々の物性や素子特性を根本的に解明、制御する必要がある。本領域研究では薄膜での強誘電性の基本的要因を明確にし、これらを薄膜特有の現象や物性と絡み合わせながら、実験的に起こる様々な問題点を解決し、次世代強誘電体メモリデバイスの実用化をはかるべく、基礎的な性質を検討してきた。そこで、これらの成果を取りまとめ、平成12年度から15年度までの本領域の研究成果を広く公開するために、以下のような公開シンポジウムを開催した。さらに、成果を取りまとめ、英文単行本にまとめSpringerより出版した。公開シンポジウム「強誘電体薄膜の物性制御と次世代メモリデバイスへの応用」成果報告会(公開)日時平成16年12月10、11日場所大阪大学中之島センター出席者専門家など30名講演件数14および研究評価英文単行本総ページ数258強誘電体薄膜の物性制御と次世代メモリデバイスへの応用のために、理論・実験の両面より研究を推進するための体制を整え、以下のように研究を進めた。強誘電体材料探索からみたモルフォトロピック相境界の解析、強誘電体電気特性にとって、その有限バンドはどの程度重要かについて解析を行い理論面から材料探索・デバイス応用へのアプローチを行った。また、高いTcを有するリラクサ強誘電体の濃度相境界における誘電特定の解明と物性制御、ペロブスカイト酸化物濃度相境界近傍の分極反転について調べ強誘電体の性質について詳細な研究を行った。実験的には、化学溶液プロセスによるニオブ酸塩強誘電体薄膜の作製と評価、SBT薄膜の結晶化に及ぼすエキシマ照射効果を調べ良質の強誘電体薄膜を得るための条件を探索した。さらに、ペロブスカイト酸化物トランジスタBSCO/PZT/Nb-STOの作製と特性、SBT、STN膜を用いたMFIS構造の基礎特定を行いデバイス応用のための研究を行った。また、デバイス応用を考えたときに重要な微細化に関してMOCVD法によるPZT薄膜の成長初期過程の観察と強誘電性、菱面体晶系PZT/Ir/SiO_2/Si膜構造の作製と評価並びにグレインサイズ制御より研究を行った。これら強誘電体のミクロな挙動を調べるために走査型非線形誘電率顕微鏡により研究を行った。さらに、次世代メモリデバイスのための完全界面・表面制御と新強誘電体探索、強誘電体メモリに適した材料選択について研究を行った。強誘電体薄膜の物性制御と次世代メモリデバイスへの応用のために、理論・実験の両面より研究を推進するための体制を整え、以下のように研究を進めた。理論面からは薄膜における強誘電性について解析し、上下の電極に対して構造の非対称性についても考慮に入れ、強誘電性発現の条件を明らかにできた。またリラクサ強誘電体のPZN-PT混晶の巨大誘電率の要因について検討を行い、MPBにおける等方向的挙動から生ずる分極の横方向の不安定性に由来することを示唆する結果を得た。実験的には、リラクサ強誘電体のドメイン構造の観察を行い相転移について示した。ケミカルプロセスによりBIT薄膜の作製および希土類元素のドープ、紫外線照射による特性向上、SBT薄膜の結晶化に及ぼすエキシマランプ照射およびSeed層の影響を調べ良質の強誘電体薄膜を得るための条件を明らかにした。デバイスの微細化・高信頼性に必須の薄膜の低温成長をMOCVDでPZT薄膜において成功し、分極反転領域の成長速度を明らかにした。走査型非線形誘電率顕微鏡の高精度化により強誘電体のミクロなドメイン構造の観察に成功した。さらにMOCVDによるPZT薄膜の成長初期核に注目しミクロな強誘電性の挙動について調べた。さらに、次世代メモリデバイスのためのカルコゲナイト化合物、YMnO_3などの新強誘電体を用いたMFSおよびMFIS構造の作製を行った。その表面、界面の構造解析および電気的特性を調べ、保持特性の向上および強誘電体メモリに適した材料選択について研究を行った。強誘電体表面をAFMにより観察し原子ステップに重畳して180度分域に関係すると思われる蛇行ストライプパターンを観測できた。MPB理論により巨大誘電応答の起源を説明することに成功し、さらにマルテンサイト型合金の相転移について理論計算を展開している。

実験的には、リラクサ強誘電体のドメイン構造と誘電特性についてAFM、偏光顕微鏡などで観察し、ドメインの不均一性が相転移温度と誘電特性に大きく影響することを明らかにした。また秩序-無秩序人工格子により相転移を検証した。ケミカルプロセスによりPYN-PT薄膜の作製、BIT薄膜の作製および希土類元素のドープ、紫外線照射による特性向上、PST薄膜の作製条件について調べ良質の強誘電体薄膜を得るための条件を明らかにした。デバイスの微細化・高信頼性に必須の薄膜の低温成長をMOCVDでPZT薄膜および電極において成功し、MFM構造の作製、またナノ構造においても強誘電性を持つことをを示した。走査型非線形誘電率顕微鏡により強誘電体のナノドメイン構造の分極制御に成功した。さらに、次世代メモリデバイスのためのカルコゲナイト化合物、YMnO_3などの新強誘電体を用いたMFSおよびMFIS構造の作製を行った。I層について検討しZrO_2薄膜の作製を行った。高誘電率その表面、界面の構造解析の電子的評価を行い、さらに電気的特性およびを調べ、強誘電体メモリに適した材料選択について研究を行った。強誘電体薄膜の物性制御と次世代メモリデバイスへの応用のために、理論・実験の両面より研究を推進するための体制を整え、以下のように研究を進めた。強誘電体の多分散系における3次元非線形感受率の分散関係を理論的に解析し、緩和時間の分布を特徴づけるパラメーが高次の損失項の係数として現れることを明らかにした。実験的には、リラクサ強誘電体のドメイン構造と誘電特性についてAFM、偏光顕微鏡などで観察し、90°および180°ドメインウォールの観察ができた。また、ドメインウォール構造の解析を行い室温では通常の強誘電体と同様に古典論によって理解できることを示した。ケミカルプロセスによりBIT薄膜の作製および希土類元素のドープ、紫外線照射による特性向上、さらにBiSiO添加やGe置換等を行い、良質の強誘電体薄膜を得るための条件を明らかにした。デバイスの微細化・高信頼性に必須の薄膜の低温成長をMOCVDでPZT薄膜および電極において成功し、MFM構造の作製、またナノ構造の制御に成功した。走査型非線形誘電率顕微鏡により強誘電体のナノドメイン構造の分極を制御し256x256の図を記録できた。さらに、次世代メモリデバイスのためのYMnO_3などの新強誘電体を用いたMFIS構造のリーク解析、PZTの配向性による電気的特性の違いを明らかにした。I層について検討しHfO_2薄膜の作製を行った。絶縁膜に窒化膜を用いたMFIS-FETを試作し電気的特性を調べた。今日、高度化されまた今後も拡大化の続く情報化社会を支えるのがまさにコンピュータと通信機器であるが、特に記憶を司るメモリデバイスが非常に重要である。この半導体メモリの中で電源を切っても忘れない不揮発性メモリとして強誘電体メモリ(FeRAM)があり、その研究開発が進められている。しかし、強誘電体薄膜を信頼性の高いメモリデバイスに応用するには、多くの問題点が存在する。高集積化に伴う超微細化によって数十nmの厚さの強誘電体薄膜における分極反転の反復による強誘電性の劣化、分極履歴のシフト、分極の時間的劣化、絶縁性の劣化などである。これらの問題点は、微細な強誘電体薄膜の特性評価をし、薄膜作製法の改良と最適化で克服されようと多くの努力が払われているが、表面的改良ではなく、強誘電体ならびにその薄膜に起こる現象を根本的に理解し、種々の物性や素子特性を根本的に解明、制御する必要がある。
第一原理分子動力学法による触媒援用表面加工法におけるエッチング過程の解明

触媒援用加工法はワイドバンドギャップ半導体などの難加工材料の加工法として注目されている。本研究では、加工法の実用化を目指した改良のための指針を与えることを目指し、エッチング反応のメカニズムを第一原理計算を用いて原子レベルで解明した。また固液界面反応をさらに詳細に調べるための手法の開発にも取り組んだ。従来成功しているSiCーHFーPt系ではなく水分子をエッチャントとして用いる反応系としてSiCーH2OーPtおよびGaNーH2OーPt系の解析を行い、水分子解離吸着に伴うSi-C、Ga-N結合の切断過程を明らかにするとともに、室温レベルで反応が進行しうる低い反応障壁を実現できることが明らかとなった。(1)新規メタダイナミックス法のプログラムを作成し、プログラム動作テストのために高速計算可能な古典分子動力学法のプログラムに組み込んだ。本手法は、分子動力学計算ごとに積算するペナルティポテンシャルの大きさと高さを同じ比率で当該反応座標方向の運動の大きさの程度に依存して制御する手法に基づいている。一次元の反応座標、全エネルギー一定の分子動力学計算の場合について基本的動作の確認を行うとともに、パラメータ調整を行うことにより、ポテンシャルの積算が適切に行われて最終的にフラットなポテンシャルを得ることができた。(2)加工における触媒の効果を解析した。(GaN、SiC)まず、原子レベルでの平坦表面が加工実験で得られていることからGaNについて表面キンク端でエッチングが起こっていると考えられることから、その構造モデルを作成した。Pt触媒が存在しなければ水分子のGaN表面への解離吸着には1eV程度の活性化障壁が存在するのに対しPt触媒の存在により水分子が自然に解離し吸着することが分かった。ただしエッチングに必要なGa-N結合の開裂には障壁が存在することも分かった。開裂反応は、Ptの安定点を超えた接近もしくはPtの分離の際の両方またはどちらかで起きうることが分かった。SiCについてはPtとSiCの相対位置関係の調査を行い、PtがSiC表面に接近することで障壁が下がるメカニズムが、反応点の五配位Siを終端するOHのOとPtに結合を生じて安定化し、反応全体(SiCバックボンドの開裂とそれによるダングリングボンドのHF解離吸着による終端化)の活性化障壁が下がることにあることが分かった。(1)新規メタダイナミックス法のプログラムが作成できた。今後次元の拡張や熱浴の導入が必要である。(2)GaNおよびSiCの双方について解析が進んだ。一つのエッチャント分子(H2OもしくはHF)が表面に解離吸着して材料のバックボンド一つが開裂する過程が明らかとなってきた。特にSiCについては一つめのエッチャント分子の解離吸着過程が明らかになったといえ、今後の周囲の水分子の効果を含めた解析の準備ができた。新規バリア計算法である改良メタダイナミックス法の確立に関して、第一原理計算において人工的追加ペナルティポテンシャルを全運動エネルギーに依存させる方法の検討を行ったが、ターゲットとする反応自由度に対する運動エネルギー成分の寄与が小さくうまく動作しなかった。このため、結合角などの一般化座標でも反応自由度の運動エネルギーのみを抽出できる計算アルゴリズムの開発を行った。現在その動作確認を進めている。第一原理分子動力学計算によりPt存在下での3C-GaN(111)表面キンク部へのH2O解離吸着過程の解析を行い、反応バリアをNEB法に基づいて解析した。Ptの接近により、水分子が自然にOHとHに分離して表面キンク部のGaと終端OHのOに解離吸着すること、解離吸着したOHがPtとも結合しつつ反応が進むことにより、Ga-N結合が切れ反応が進むことが分かった。またPtの存在によりバリアも低下し、室温下でも十分反応が進むことが分かった。このような計算を3種類存在するGaNバックボンドについて実施し、キンク部の外側に向いたGa-N結合が最初に切断されることが分かった。二つ目の水分子の解離吸着に関しても解析を進めている。実プロセスの反応解析に関しては、Ni等のこれまで用いられていない触媒材料についてその効果を解析する検討を行った。第一原理プログラムへの組み込みが進んでおりテスト中である。GaNの解析に関してはうまく解析が進んでおり、Ptの触媒効果の解析に成功した。他の触媒の検討も進めており、実験グループとの協働もできている。アプリケーションが多いのでマンパワー不足で遅れているターゲットもある。平成29年度は、SiCについては触媒作用による反応障壁低下メカニズムの詳細を解析し、化学結合による安定化と、SiC-Pt距離に依存した原子構造のひずみによる不安定化により説明できることを明らかにした。GaNについては、Pt高さ・位置の依存性の解析を行うとともに2つめの水分子の解離吸着過程を解析を行った。さらに、GaだけでなくNの除去過程の解析を開始した。固液界面反応解析は、液体側の原子構造がランダムであるため多くの構造をサンプルする必要がある。

効率的に反応経路を探索することのできるメタダイナミックス法において、本研究では人工的追加ペナルティポテンシャルをターゲットとする反応自由度に対する運動エネルギー成分に依存させる手法を提案した。本年度はプログラムの開発を行い、高速化の実現可能性を得た。触媒援用加工法はワイドバンドギャップ半導体などの難加工材料の加工法として注目されている。本研究では、加工法の実用化を目指した改良のための指針を与えることを目指し、エッチング反応のメカニズムを第一原理計算を用いて原子レベルで解明した。また固液界面反応をさらに詳細に調べるための手法の開発にも取り組んだ。従来成功しているSiCーHFーPt系ではなく水分子をエッチャントとして用いる反応系としてSiCーH2OーPtおよびGaNーH2OーPt系の解析を行い、水分子解離吸着に伴うSi-C、Ga-N結合の切断過程を明らかにするとともに、室温レベルで反応が進行しうる低い反応障壁を実現できることが明らかとなった。(1)新規メタダイナミックス法について、反応座標を2次元とした探索の評価を行う。評価のためには多くの分子動力学サンプリングを必要とするため、古典分子動力学法による計算を主に用いて評価を進める。有限温度の分子動力学計算による解析を行うため、能勢の熱浴法をプログラムに組み込む。(2)触媒効果の解析を進める。GaNについては、1つ目のGa-Nバックボンドの開裂障壁と終端化の反応障壁高さの解析を行い反応経路を明らかにする。SiCについては、二つめ以降のエッチャント分子が解離吸着・バックボンド開裂を解析しSi原子が表面上から分離・除去される過程を明らかにする。新規メタダイナミックス法のプログラム開発をさらに進める。GaNの解析に関しては解離吸着のPt触媒効果を論文にまとめる。2つめの水分子の解析を完成させる。他の触媒に関する検討を進める。SiO2の解析に関してはアプリケーションが多すぎるので見合わせることにする。表面反応第一原理シミュレーション学会発表出張旅費の確定が遅れたため、バックアップ用記憶媒体など少額消耗品の購入を延期した。前年度末の学会参加予定が取りやめとなったため。バックアップ用記憶媒体の購入等を計画。学会等での発表の追加を検討。
緊急災害対応における無人化施工のためのオペレータ支援システム

本研究では,災害対応における無人建機の投入・稼働を支援する目的で,建設ロボットの遠隔操作のための知能化システムの構築を目的とする.災害発生直後の無人建機投入のためのプロセスを【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに分割して,それぞれにおいてオペレータを支援する技術を研究開発する.今年度は,【1】についてドローンなどの移動体による測量において,環境中の異常発熱体および水分量を検出するための技術である,温度センサや近赤外線カメラと3次元測距センサを組み合わせたマルチモーダルセンシングシステムについて,センサ間の基本的なキャリブレーション手法を構築した.また【2】については,土砂崩れなどによる作業現場の地形の変化を伴う災害現場において災害規模を知るための技術として,ドローンなどにより複数視点から取得した3次元点群から土砂体積を推定する手法を提案した.基礎的な推定手法について日本機械学会関東支部講演会での発表を終え,多視点からの土砂体積推定手法のための点群の統合手法について2019年6月にロボティクス・メカトロニクス講演会(ROBOMECH2019)で発表予定である.【3】については,複数の移動体が協調してするための移動体同士の相対位置姿勢推定手法について,3次元特徴量Fast Point Feature Histogramsと3次元位置合わせ手法であるIterative Closest Pointを組み合わせた,高速かつ正確な位置姿勢推定法を構築し,日本機械学会関東支部講演会で報告した.また,不整地において建機を安全に操作するために,物理シミュレータを用いた地形の安定性評価手法を提案し,第19回計測自動制御学会システムインテグレーション部門講演会で報告した.さらに,安定度を増すための姿勢変化方向の提示手法についてROBOMECH2019で発表予定である.本年度は,建設ロボットの遠隔操作のための知能化システムの構築を機能分解し,各機能において必須となる要素技術の研究開発に注力してきた.具体的には,本研究における実施項目,【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに対して,全体的に計画通りの進捗を達成しており,学会発表などの成果報告も計画的に実施できている.結果として,初年度の成果に関しては,6件の口頭発表(内3本は次年度に発表予定)と,1件の雑誌論文(投稿中)としてまとめている.今年度の成果である各要素技術の統合やシステム化については既に検討を始めている.現在は,既存の最新の技術などの情報取集のための文献調査および学会参加などを行いながら,技術動向を踏まえた上で,本研究に必要な機材やソフトウェアの選定も進めている.以上のように,本研究の遂行については概ね順調であり,計画通りに進められていると判断する.次年度は,本研究における実施項目,【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに対して,本年度取り組んできた要素技術の研究開発を継続して行い発展させるとともに,新たな要素技術の研究開発にも取り組む.また,各要素技術の統合やシステム化についてもプロトタイプシステムの検討を行う.具体的には,温度センサや近赤外線カメラ,3次元測距画像センサ,Light Detection and Ranging(LiDAR),広角カメラ,音響センサなどの,異種複数センサを統合し,その結果を遠隔操作のオペレータに可視化するための映像提示手法の検討を開始する.例えば,本研究で用いている近赤外線カメラは可視光外の波長を撮影可能なセンサであり,一般的に異種材料や水分などの特定の物質の検出に利用されている.次年度以降は,近赤外線カメラのように通常のカメラのみでは利用が困難な情報を取得可能なセンサや,異なる性質の情報が取得可能な異種センサを複数組み合わせることで取得したマルチモーダル情報と機械学習技術を利用して,環境中の異常を検出し提示する手法に関して検討し,プロトタイプを作成する.また,研究室内などの屋内環境での検証実験を行い,その性能の評価を行い,次年度の課題を抽出する.本研究では,災害対応における無人建機の投入・稼働を支援する目的で,建設ロボットの遠隔操作のための知能化システムの構築を目的とする.災害発生直後の無人建機投入のためのプロセスを【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに分割して,それぞれにおいてオペレータを支援する技術を研究開発する.今年度は,【1】についてドローンなどの移動体による測量において,環境中の異常発熱体および水分量を検出するための技術である,温度センサや近赤外線カメラと3次元測距センサを組み合わせたマルチモーダルセンシングシステムについて,センサ間の基本的なキャリブレーション手法を構築した.また【2】については,土砂崩れなどによる作業現場の地形の変化を伴う災害現場において災害規模を知るための技術として,ドローンなどにより複数視点から取得した3次元点群から土砂体積を推定する手法を提案した.基礎的な推定手法について日本機械学会関東支部講演会での発表を終え,多視点からの土砂体積推定手法のための点群の統合手法について2019年6月にロボティクス・メカトロニクス講演会(ROBOMECH2019)で発表予定である.【3】については,複数の移動体が協調してするための移動体同士の相対位置姿勢推定手法について,3次元特徴量Fast Point Feature Histogramsと3次元位置合わせ手法であるIterative Closest Pointを組み合わせた,高速かつ正確な位置姿勢推定法を構築し,日本機械学会関東支部講演会で報告した.また,不整地において建機を安全に操作するために,物理シミュレータを用いた地形の安定性評価手法を提案し,第19回計測自動制御学会システムインテグレーション部門講演会で報告した.さらに,安定度を増すための姿勢変化方向の提示手法についてROBOMECH2019で発表予定である.

本年度は,建設ロボットの遠隔操作のための知能化システムの構築を機能分解し,各機能において必須となる要素技術の研究開発に注力してきた.具体的には,本研究における実施項目,【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに対して,全体的に計画通りの進捗を達成しており,学会発表などの成果報告も計画的に実施できている.結果として,初年度の成果に関しては,6件の口頭発表(内3本は次年度に発表予定)と,1件の雑誌論文(投稿中)としてまとめている.今年度の成果である各要素技術の統合やシステム化については既に検討を始めている.現在は,既存の最新の技術などの情報取集のための文献調査および学会参加などを行いながら,技術動向を踏まえた上で,本研究に必要な機材やソフトウェアの選定も進めている.以上のように,本研究の遂行については概ね順調であり,計画通りに進められていると判断する.次年度は,本研究における実施項目,【1】測量,【2】計画,【3】稼働の3つのフェーズに対して,本年度取り組んできた要素技術の研究開発を継続して行い発展させるとともに,新たな要素技術の研究開発にも取り組む.また,各要素技術の統合やシステム化についてもプロトタイプシステムの検討を行う.具体的には,温度センサや近赤外線カメラ,3次元測距画像センサ,Light Detection and Ranging(LiDAR),広角カメラ,音響センサなどの,異種複数センサを統合し,その結果を遠隔操作のオペレータに可視化するための映像提示手法の検討を開始する.例えば,本研究で用いている近赤外線カメラは可視光外の波長を撮影可能なセンサであり,一般的に異種材料や水分などの特定の物質の検出に利用されている.次年度以降は,近赤外線カメラのように通常のカメラのみでは利用が困難な情報を取得可能なセンサや,異なる性質の情報が取得可能な異種センサを複数組み合わせることで取得したマルチモーダル情報と機械学習技術を利用して,環境中の異常を検出し提示する手法に関して検討し,プロトタイプを作成する.また,研究室内などの屋内環境での検証実験を行い,その性能の評価を行い,次年度の課題を抽出する.研究予算に関しては,初年度では要素技術の主にアルゴリズム構築に注力したために,次年度の移動ロボット・ドローンなどの移動体や,センシングに用いる異種複数センサ,機械学習のためのGPU搭載の計算機などの高額な研究機材を導入するために繰り越しを行っている.これらの機材は技術的な進展が著しく早い製品であるため,実際に研究を実施する時期に合わせて導入することで,より性能が高い機材を用いて効率の高い研究を遂行することが可能である.これらの残額と2年目,3年目の予算については最終年度終了までに計画的に執行し,研究を遂行する予定である.
薬物依存動物モデルにおける脳内アミノ酸受容体の薬理学的分子生物学的研究

コカインによる常同行動や自発運動の亢進、或いはヒトにおける幻覚妄想の出現の背景には、コカインのドパミン神経系やセロトニン神経系の神経終末における再取り込み阻害作用が指摘されている。そして近年では、線条体のc-fosやJun B、zif268などのImmediate-early gene(IEG)の変化が報告され、細胞内セカンドメッセンジャー系や核内転写因子の異常が検討されている。我々はGABA_A-benzodiazepine(BZD)受容体複合体に注目し、コカインの急性および慢性投与による本受容体の結合量およびsubunit mRNA量の変化(α1、α6、β2、β3、γ2)について検討した。SD系雄性ラットにcocaine HCl(20mg/kg)を、腹腔内投与した。急性投与群は投与0.5、1、2、4、8、24時間後に断頭した。慢性投与群は、14日間の1日1回連日投与終了後1日後に断頭した。受容体subunit mRNA量は、in situ hybridization法によりα1、α6、β2、β3、γ2subunit mRNA量の変化を検討した。受容体結合量は、[^<35>S]TBPSを用いてautoradiography法により測定した。定量的解析には、storage phosphor imaging法によるBAS 5000((株)富士フィルム、東京)を用いた。測定は大脳皮質や海馬、視床、下丘、小脳で行った。その結果、塩酸コカイン(20mg/kg)投与後早期に、脳内の様々な部位でGABA_A受容体subunit mRNA量はsubunitにより異なる経時的変化を示した。これらの変化は、細胞内伝達系が関与しmRNAの核内転写速度に変化が生じたことによると思われた。第二に、受容体結合量は、大脳皮質と小脳において4時間後に低下していた。この所見は投与後早期のsubunit mRNA量の低下が受容体結合量に反映されたものと考えられた。第三に、ドパミンD1受容体拮抗薬SCH23390の投与によりsubunitのmRNA量の変化は抑制された。このことからコカインがGABA_A受容体に及ぼす影響にD1受容体の関与が示唆された。第四に、コカイン慢性投与後にβ3 subunit mRNA量の減少を線条体および大脳皮質で認めた。このことから、行動感作の形成に対する同subunitの関与が示唆された。コカインは常同行動や自発運動の光進を、ヒトで幻覚妄想や不安焦燥状態を惹起する。

その作用機序はドパミン神経系やセロトニン神経系の神経終末における再取り込み阻害作用が指摘されているが、これによってその他の神経伝達系の異常も生じる結果、投与後の変化や脳部位別の変化はより複雑である,近年では線条体のc-fosやJun B、zif268などのImmeadiate-early gene(IEG)の変化が報告され、細胞内セカンドメッセンジャー系や核内耘写因子の異常が検討されている。今回、我々はGABA_A-benzodiazepine(BZD)受容体複合体に注目し、コカインの急性および慢性投与による本受容体複合体の結合量を[^<35>S]TBPS結合の変化を用いて、またmRNA subunitsの変化(α1、α6、β2、β3、γ2)についても検討した。SD系雄性ラットにcocaine HCl(20mg/kg)を、1日1回腹腔内投与した。急性投与群は投与lhr後に断頭した。慢性投与群は、2群に分けた。第1群では14日間の連投終了24hr後に、第2群では連投終了1週間後に断頭した。断頭後12μmの脳切片を作成し-80°Cに凍結保存した。GABA_A-BZD受容体複合体mRNA量は、[a-^<35>S]dATPでラベルしたoligonucleotide probeを用い、In situ hybridization法によりal、a6、β2、β3、γ2subunit mRNAの変化を検討した。[^<35>S]TBPS結合能は、50mM Na/K phosphate bufferを用いてautoradiography法により行い、非特異的結合は10μMpicrotoxinにより総結合能の3-5%であった。定量的解析には、storage phosphor imaging法によるBAS 5000((株)富士フィルム、東京〉で用いた。測定は大脳皮質(帯状回、頭頂葉、側頭葉、)や海馬(CAl-3、歯状回)、視床、下丘、小脳で行った。急性投与群では、αl、β2 subunit mRNA量が大脳皮質、海馬、小脳で有意に低下していた。γ2 subunitmRNAは海馬で、さらにα6 subunits mRNAは小脳で低下していた。一方、β3 subunitは大脳皮質で低下し、海馬で増加していた。慢性投与でβ3 subunitが大脳皮質および線条体で有意に低下していた。一方、以上の状態では[^<35>S]TBPS結合能は著変を認めなかった。連日投与終了1週間後(離脱状態下)においては、α1およびβ3 mRNA量は大脳皮質と海馬で増加し、[^<35>S]TBPS結合能も有意な増加を認めた。しかし黒質ではいずれのmRNA量の変化を認めなかったが[^<35>S]TBPS結合能の有意な減少を認めた。以上から、コカイン急性投与後一過性のドパミン神経系の過活動状態に続きGABA神経系の機能亢進が生じ、それに対するNegative feedbackとしてsubunit mRNA量の減少が生じたと考えられた。さらに細胞内の一過性のCa2+濃度の増加により細胞内転写因子に異常が生じsubunit mRNAのdegradationなどのturnoverに変化が生じた可能性がある。今後subunit mRNAの経時的変化を検討する必要がある。コカインの慢性投与により生じる過感受性状態では、GABA_A-BZD受容体複合体の機能低下が生じ、離脱期においては逆に一過性の機能亢進が生じていることが示唆された。コカインによる常同行動や自発運動の亢進、或いはヒトにおける幻覚妄想の出現の背景には、コカインのドパミン神経系やセロトニン神経系の神経終末における再取り込み阻害作用が指摘されている。
新規自己免疫性難聴トランスジェニックマウスによる蝸牛イムノバイオロジーの新展開

当研究では自己免疫発症の実態である免疫寛容の破綻に焦点を当て、発生工学を駆使して新規自己免疫性難聴トランスジェニックマウス(Tg)モデルを樹立し解析している。内耳有毛細胞に外来抗原HAを強制発現するMath-HAを樹立し、さらにこのHA抗原を特異的に認識するCD4+ T細胞、CD8+T細胞を有するTg (6.5TCR,CL4-TCR)と交配させたところ、前者との二重Tgは一側性低音障害から始まる変動性進行性感音難聴を、後者との二重Tgは緩徐進行性両側性高音障害型難聴を呈した。また前者の一部に、難聴の進行に伴って姿勢障害、歩行障害を呈する個体が現れ、組織学的には内リンパ水腫を呈していた。内耳性難聴の原因のひとつに古くから自己免疫の関与が考えられており、自己抗体や標的タンパクの同定を中心に国内外で多くの基礎的・臨床的検討がされてきている。当研究では自己免疫発症の実態である免疫寛容の破綻に焦点を当て、発生工学を駆使して新規自己免疫性難聴トランスジェニックマウスモデルを樹立し解析することとした。すなわち内耳有毛細胞に外来抗原HA(Hemagglutinin)を強制発現するトランスジェニックマウス(Tg) Math-HAを樹立した。Math-HAマウス用の外挿遺伝子作製には、Hemagglutinin (A/PR/8 H1N1 (PR8), HA512-520ペプチド)遺伝子を米国カリフォルニア大学リバーサイド校スクリップス研究所(Monica Carlson博士)から供与を受け、内耳有毛細胞特異的遺伝子発現には過去に定評のあるMath1遺伝子J2X enhancerをUT Southwestern医学センター, Jane Johnson博士から供与を受けて用いた。さらにこのHA抗原を特異的に認識するCD4+ T細胞、CD8+T細胞を有するTg (6.5TCR,CL4-TCR)をそれぞれハーバード大学医学部のHarald von Boehmer研究室、ノースウェスタン大学Khashayarsha Khazaie博士より導入した。それぞれをMath-HAマウスと交配させたところ、前者との二重Tgは一側性低音障害から始まる変動性進行性感音難聴を、後者との二重Tgは緩徐進行性両側性高音障害型難聴を呈した。また、変動性難聴を呈する二重Tgを経時的に解析すると、難聴の進行に伴って姿勢障害、歩行障害を呈する個体が現れ、本モデルにおいては前庭機能障害を合併する可能性が示された。交配が想定外に進まない時期があり、その対処に時間を費やした。他方比較的高齢の二重Tgの中から前庭障害を来していると思われる個体を見出し、新たな研究の展開が期待される。内耳有毛細胞に外来抗原HA(Hemagglutinin)を強制発現するTgとしてMath-HAを樹立した。Math-HAマウス用の外挿遺伝子作製には、HA遺伝子(HA, A/PR/8 H1N1 (PR8), HA512-520ペプチド)を米国UCR, Scripps研究所(Carlson博士)から供与を受け、内耳有毛細胞特異的遺伝子発現には過去に定評のあるMath1遺伝子J2X enhancerをUT Southwestern医学センター, Johnson博士から供与を受けて用いた。さらにこのHA抗原を特異的に認識するCD4+ T細胞、CD8+T細胞を有するTg (6.5TCR,CL4-TCR)をそれぞれハーバード大学医学部のvon Boehmer研究室、Northwestern大学Khazaie博士より導入した。それぞれをMath-HAと交配させたところ、前者との二重Tgは一側性低音障害から始まる変動性進行性感音難聴を、後者との二重Tgは緩徐進行性両側性高音障害型難聴を呈した。組織学的解析から前庭障害を呈する個体の蝸牛において内リンパ水腫が認められ、内耳有毛細胞へのCD4陽性T細胞による自己免疫が内リンパ水腫を引き起こすことがprospectiveに示された。CD4陽性T細胞による内耳有毛細胞への自己免疫発動が、組織学的に内リンパ水腫を引き起こしながら、蝸牛障害、前庭障害の両方を引き起こすことを示した点については、一つの大きな知見と考えている。本研究では、原理的に、実験に用いるTgマウスの遺伝学的背景を、世界的に確立されているT細胞Tgに揃える必要がある。従って本研究の限界として、白色系のマウスでしか当該モデルの作成ができない。一般的に眼球運動の解析では虹彩の模様を認識しその移動量を定量するが、白色系のマウスでは虹彩が単色であるため、通常用いられている眼振解析による前庭機能評価が不可能だった。この部分についてH28年度に新規解析法の樹立を試みたが、技術的に困難であり、断念した。最終的には一側性鼓室内麻酔における前庭障害の運動評価を行うことで前庭障害の定量に成功したが、これらの技術開発に時間を費やしたため、研究の進展が遅れた。