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十九世紀琉球王国をめぐる国際情勢

本年度の研究実績は大きく以下の二点ある。第一に、琉球西洋間交渉における通事の働きを分析した前年度の研究実績を、投稿論文の形に結実させた。その上で、上記課題をさらに発展させ、同時期の長崎オランダ通詞との比較を加えて、近世から近代への時代転換期における東アジアというより広い舞台において、通事が果たした役割を特に前近代との比較を通して検討し、国際シンポジウムにおいて英語発表を行った。第二に、琉球西洋関係に続いて、同時期の琉球-中国関係の研究に入った。その中でも、琉球から清に対して行われた「逗留西洋人退去請願運動」を取り上げた。これは、道光24年(1844年)仏アルクメーヌ号の来航と宣教師フォルカードの逗留を嚆矢として、彼の後継者であるルテュルデ,アドネ、道光26年(1846年)イギリス人宣教師ベッテルハイム一家が逗留したこと、更には仏提督セシルによる和親・通商要求などを受けて、宣教師たちの退去及び交渉取りやめを、清の力に頼って果たそうと琉球側が複数回、あるいは通常の進貢使節に言付けて、あるいは特使を仕立てて派遣し、清に働きかけた一連の動きである。従来の研究が「王府」「福建当局」「皇帝」間の文書のやり取りを中心に、国家間の大きな枠組みでこの問題を論じてきたのに対し、本研究では、請願運動が主に行われた場であり、琉清間交渉の主たる場であった福州に注目し、実際に派遣された琉球側の使者と、福州において彼らに対応した清朝側諸衙門の役人(胥吏・幕友)たちの働きの実態とその意義を中心に考察した。これを通して、第一に、伝統的な朝貢関係の下で、琉球がいかなる手段を用いて自らの願いを通したのかを解明するとともに、第二に、福州駐在イギリス領事の存在が琉清双方に与えた影響を考察することで、「伝統」と「近代」の交錯する場としての福州を提示し、そこにおける琉球の主体的な働きを明らかにすることが期待される。本年度の主要研究課題である琉球-中国関係について、本来目標としていた年度内の論文投稿には至らなかった。しかしながら、未刊行史料『尚家文書』をはじめ、史料の読解は順調に進みつつある。特に、当該時期の琉球史を研究するにあたり、最重要史料と目される『尚家文書』は、刊行されている『琉球王国評定所文書』中には未収録の史料が多く、様々な新史実を発掘できている。例えば、尚家文書六二〇号「異國一件唐より御問合抜書」は、1843年(道光23年)から1852年(咸豊2年)の時期に、福州あるいは北京における琉球使節が本国へ送った業務報告の一部であり、そのほとんどが西洋人退去請願に関わるものである。同史料中には全23件の報告が含まれており、そこには各使節の福州における交渉過程が極めて詳細に記されている。研究を進めるにあたり、沖縄において尚家文書等の史料収集を行い、また国立国会図書館で史料・文献調査を数ヶ月に一度の頻度で行った。本年度も引き続き、若手琉球史研究者の会合に定期的に参加し、情報交換や自らの研究に対する助言を得た。東洋史研究会大会、東方学会大会等全国規模の学会、シンポジウムへも積極的に参加した。引き続き、琉球・清(中国)・薩摩(日本)・西洋の各者の関係性を探っていく。特に、琉球-薩摩間の関係性を対象とする。これまで検討してきた琉球-西洋、琉球-清朝の関係において、申請者は実際に接触・交渉が行われた「場」とそれを担った「人員」に着目し、琉西関係においては琉球側の通事係を、琉清関係においては福州における琉球使節と河口通事、中国側の胥吏・幕友といった人員に着目してきた。本年度の研究もこれにならい、1当該時期における鹿児島琉球館の役割を、特にそこに駐在した琉球役人たちの側面から検討するほか、2薩摩の琉球における出先機関である在番奉行についても、従来の研究が見出した課題を展開させ、薩摩藩の影響力を正しく把握した上で、琉球が発揮し得た主体性について考える。これまでの研究を統合するにあたって、3通事係を輩出した首里の中下級士族、存留通事ら渡唐使節として中国へ渡った久米村人、鹿児島琉球館に派遣される役人たちが、琉球国内において、どのように相互に位置付けられていたかを分析する。史料については、前年度に引き継づき、未刊行史料である尚家文書の利用を中心に据える。現在尚家文書は沖縄県内のみにて入手が可能なため、沖縄への史料調査は複数回必要となると見込まれる。合わせて、鹿児島における現地調査も不可欠である。琉薩関係史は重厚な先行研究の蓄積を有する分野であり、関連書籍も膨大であるため、引き続き必要な資料収集につとめていきたい。また、申請者の本年度のテーマについて、沖縄県内では数多くのシンポジウムや学会が開催されており、これらに積極的に参加し、自らも発表を行う。同時に、申請者の研究は常に東アジア地域という広がりを意識したものであって、東洋史やグローバルヒストリーなどを冠した学術交流についても、積極的に参加していきたい。本研究は「十九世紀琉球国をめぐる国際情勢」を主題とし、東アジアが近世・近代転換期にあった当該時期の琉球に焦点をあて、琉球をめぐる国際情勢を包括的に把握することで、「東アジアの近代」を再構築、評価するための視座を獲得することを目指す。本研究は十九世紀前中期に琉球が構築・維持した様々な関係性に着目し、これを解き明かす。

具体的には、琉球と西洋諸国・琉球と清・琉球と薩摩、という三つの関係性(一対一ではなく、四者が絡み合う場合も当然ありうる)を丁寧に検証し統合して、一つの時代像を提示することが重要となる。本年度は、琉球-西洋関係を主に取り扱った。研究方法としては、第一に、琉球側の根本資料である『琉球王国評定所文書』を精読し、その中に見える西洋船の来航・西洋人滞在関連史料は全て目を通し、整理した。第二に、西洋側の史料として艦隊の航海記、逗留宣教師の日記、新聞等の出版物を収集し、精読して整理した。第三に、琉球側が要請した英語・仏語を操る通事の存在に焦点をあて、通事が果たした役割の大きさを主題とすることで翻って琉球-西洋交渉の特徴、意義を垣間見ようと試みた。以上、本年度の研究を通して、従来顧みられることの少なかったこれら「通事」職の役割を解明し、彼らが十九世紀琉球の西洋船(人)対応において中心的な役割を果たしていたことを示し、この時代に構築された琉球西洋関係の一端を窺い知れた。研究成果は、まず10月に京都大学人文研究所「転換期中国における社会経済制度」共同研究班において発表した。続いて研究班での指摘をもとに論文の執筆を進め、既に最後の微修正を経て投稿を待つ段階である。上記の琉球と西洋諸国・琉球と清・琉球と薩摩、という三つの関係性のうち、琉球ー西洋関係について網羅的に史料を入手・精読し、その全体像を把握することができた。また、本年度中の公刊に至らなかったものの、論文化の作業も進んでいる。研究のかたわら、本年度は東洋史研究会大会、東方学会大会、明清史夏合宿といった全国規模の学会、シンポジウムに参加し、東アジア史という大きなフィールドでの研究の最前線を常に把握しようとつとめた。本年度の研究実績は大きく以下の二点ある。第一に、琉球西洋間交渉における通事の働きを分析した前年度の研究実績を、投稿論文の形に結実させた。その上で、上記課題をさらに発展させ、同時期の長崎オランダ通詞との比較を加えて、近世から近代への時代転換期における東アジアというより広い舞台において、通事が果たした役割を特に前近代との比較を通して検討し、国際シンポジウムにおいて英語発表を行った。第二に、琉球西洋関係に続いて、同時期の琉球-中国関係の研究に入った。その中でも、琉球から清に対して行われた「逗留西洋人退去請願運動」を取り上げた。これは、道光24年(1844年)仏アルクメーヌ号の来航と宣教師フォルカードの逗留を嚆矢として、彼の後継者であるルテュルデ,アドネ、道光26年(1846年)イギリス人宣教師ベッテルハイム一家が逗留したこと、更には仏提督セシルによる和親・通商要求などを受けて、宣教師たちの退去及び交渉取りやめを、清の力に頼って果たそうと琉球側が複数回、あるいは通常の進貢使節に言付けて、あるいは特使を仕立てて派遣し、清に働きかけた一連の動きである。従来の研究が「王府」「福建当局」「皇帝」間の文書のやり取りを中心に、国家間の大きな枠組みでこの問題を論じてきたのに対し、本研究では、請願運動が主に行われた場であり、琉清間交渉の主たる場であった福州に注目し、実際に派遣された琉球側の使者と、福州において彼らに対応した清朝側諸衙門の役人(胥吏・幕友)たちの働きの実態とその意義を中心に考察した。
加齢に伴う老化細胞に対する免疫応答システムの変化とその意義の解明

本研究課題では、生体内で老化細胞が蓄積すると加齢性疾患を発症するのか、老化細胞の誘導方法が異なると生体内での機能や免疫系との相互作用が異なるのか、について研究を行った。タモキシフェン(TM)投与によって、機能的マーカーであるp16Ink4aの発現を全身で誘導できるマウス(p16-Tgマウス)は、誘導後脱毛や筋力低下、さらには骨量の低下など個体老化で見られる変化が観察された。また、TM投与によって、発がんストレスにより細胞老化を誘導するHRASV12の発現を全身で誘導できるマウス(HRAS-Tgマウス)では、誘導後3-4週間で衰弱死することが判明した。血清検査の結果、HRASを誘導したマウスでは腎不全を示唆するBUN,クレアチニンの増加がみられた。また、p16-Tgマウスでは、上記の腎不全のマーカーには変化はみられず、腎臓は細胞老化の質の違いを観察するのに適した臓器である可能性が高い。また、4-OHTを皮膚塗布することによって、p16Ink4aとHRASを誘導する組織を皮膚上皮細胞のみに限定し観察することにした場合、短期的にはp16過剰発現細胞が減少しないのに比べ、RAS過剰発現細胞は誘導後1-2週間程度で半減する。長期的に観察すると、4-OHT塗布後の皮膚はp16-Tgマウスは毛周期が停止し体毛が生えてこないのに対し、HRAS-Tgマウスは皮膚が肥厚し腫瘍が発生する。腫瘍内部にはHRAS誘導細胞がクラスターを形成しており、初期に除去されなかったHRAS誘導細胞が増殖したことが想定されるが、腫瘍内のHRAS誘導細胞は細胞増殖のマーカーKi67陰性でありその周囲の細胞がKi67陽性であった。さらには、HRAS誘導細胞はDNAダメージマーカーが陽性であることからも、細胞老化により増殖停止している可能性が高い。老化細胞が周囲の細胞をがん化させる可能性について現在調査中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。In vitroにおいて研究が進められてきた細胞老化は、in vivoにおいても細胞老化を起こした細胞(老化細胞)が加齢に伴い蓄積していることが明らかにされ、老化細胞の蓄積が加齢性疾患の原因の一つではないかと考えられるようになってきている。また、発がんストレスにより細胞老化が引き起こされた場合、老化細胞に対する免疫応答の存在を示唆する研究が報告されてきている。本研究課題では、1老齢の個体において老化細胞が除去されることが加齢やそれに伴う疾患に影響を及ぼすのか、2免疫細胞はどのように老化細胞を認識・除去しているのか、3なぜ加齢に伴い免疫系の攻撃を回避した老化細胞が蓄積するのか、以上3点の解明に取り組んでいる。1老齢マウスにおける老化細胞除去の実験系構築のため、前年度に老化細胞の蛍光標識及び薬剤投与による除去を目的とし作製したp16DTR-GFPマウスの解析を行った。しかしながら、マウス個体において加齢に伴うGFP蛍光の増強は見られず、DTRの発現も確認できなかった。p16DTR-GFPマウスでは当初の実験計画を遂行できないと判断し、計画を変更した。2で作製予定であったin vivoで細胞老化を誘導できるトランスジェニックマウス(Tgマウス)と、1の老化細胞を除去できるマウスを組み合わせたTgマウスを作製することにした。このマウスは細胞老化を誘導するHRASV12またはp16をin vivoで過剰発現できることに加え、p16DTR-GFPと同様にGFPとDTRも同時に発現するように設計し作製した。p16とp21のin vivo imagingから、腫瘍により誘導されたmyeloid-derived suppressor cellにおいてp16とp21が発現していることを突き止めた。腫瘍の進展に対し、この細胞種におけるp16/p21の発現が関与していることを示唆するデータも得られている。In vitroにおいて、正常な体細胞はDNAダメージを受けると細胞老化を起こすことが知られている。近年、in vivoにおいても細胞老化を起こした細胞(老化細胞)が加齢に伴い蓄積していることが明らかにされ、老化細胞の蓄積が加齢性疾患の原因の一つではないかと考えられるようになってきている。また、発がんストレスにより細胞老化が引き起こされると、老化細胞に対する免疫応答の存在を示唆する研究が報告されてきている。そこで、本研究課題では、加齢に伴う様々な難治疾患の予防・克服を最終目的とし、生体内で老化細胞が蓄積すると加齢性疾患を発症するのか、免疫細胞はどのように老化細胞を認識・除去しているのか、なぜ加齢に伴い免疫系の攻撃を回避した老化細胞が蓄積するのか、の解明に取り組んでいる。免疫系における老化細胞の除去・認識メカニズムを探るため、まずは、生体内で誘導された老化細胞がどのようなタイミングで減少するのか、または維持されるのか、を継時的に観察した。p16-Tgマウスにおいて、GFPをもとに、末梢血中にどれだけ老化細胞が存在するかモニターした。TM投与によって誘導された老化細胞の割合は、誘導直後から23週後には半減してしまったが、その後は15週後まで老化細胞が維持されていた。本研究課題の肝にあたるp16-TgマウスとHRAS-Tgマウスが完成し、生体内での細胞老化誘導とそれに伴う個体の表現型が観察できたことは大きい。生体内で急激に誘導された老化細胞の挙動についても、実験系が固まり、老化細胞が免疫系により除去されるのか、そのまま維持されるのかについて観察できるようになったことは進展である。

また、昨年度から引き続き、本研究課題のin vivo imagingのデータから派生して、担がんマウスにおいてmyeloid-derived suppressor cell (MDSC)が細胞老化の機能的マーカーであるp16Ink4a及びp21Cip1/Waf1を発現しており、がんの進展を促進する機能を持っていることを発見し、そのメカニズムを探った。これによりMDSCのがん部への遊走能にp16Ink4a及びp21Cip1/Waf1が関与しており、腫瘍の進展に影響していることが判明した。この結果は現在投稿準備中であり、一つの大きな成果である。本研究課題では、生体内で老化細胞が蓄積すると加齢性疾患を発症するのか、老化細胞の誘導方法が異なると生体内での機能や免疫系との相互作用が異なるのか、について研究を行った。タモキシフェン(TM)投与によって、機能的マーカーであるp16Ink4aの発現を全身で誘導できるマウス(p16-Tgマウス)は、誘導後脱毛や筋力低下、さらには骨量の低下など個体老化で見られる変化が観察された。また、TM投与によって、発がんストレスにより細胞老化を誘導するHRASV12の発現を全身で誘導できるマウス(HRAS-Tgマウス)では、誘導後3-4週間で衰弱死することが判明した。血清検査の結果、HRASを誘導したマウスでは腎不全を示唆するBUN,クレアチニンの増加がみられた。また、p16-Tgマウスでは、上記の腎不全のマーカーには変化はみられず、腎臓は細胞老化の質の違いを観察するのに適した臓器である可能性が高い。また、4-OHTを皮膚塗布することによって、p16Ink4aとHRASを誘導する組織を皮膚上皮細胞のみに限定し観察することにした場合、短期的にはp16過剰発現細胞が減少しないのに比べ、RAS過剰発現細胞は誘導後1-2週間程度で半減する。長期的に観察すると、4-OHT塗布後の皮膚はp16-Tgマウスは毛周期が停止し体毛が生えてこないのに対し、HRAS-Tgマウスは皮膚が肥厚し腫瘍が発生する。腫瘍内部にはHRAS誘導細胞がクラスターを形成しており、初期に除去されなかったHRAS誘導細胞が増殖したことが想定されるが、腫瘍内のHRAS誘導細胞は細胞増殖のマーカーKi67陰性でありその周囲の細胞がKi67陽性であった。さらには、HRAS誘導細胞はDNAダメージマーカーが陽性であることからも、細胞老化により増殖停止している可能性が高い。老化細胞が周囲の細胞をがん化させる可能性について現在調査中である。老齢マウスにおける老化細胞除去の実験系のために作製したp16DTR-GFPマウスにおいて、蛍光タンパク質のGFPと老化細胞除去のためのdiphtheria toxin receptor (DTR)の発現量はともに著しく低く、このマウスでは目的を果てせないことが判明した。この結果は本研究課題の達成度の観点において大きなマイナスポイントである。そこで、当初予定していた、マウスの生体内で細胞老化を誘導するトランスジェニックマウス作製において、DTRも同時に発現し人為的に老化細胞を除去できるように変更した。これにより、老齢個体における実験系は不可能であるものの、生体内で老化細胞を誘導・除去できるため、本研究目的の主要な部分は解析可能になった。
居住環境における微量化学物質の生物学的モニタリング

研究目的新築建造物内に居住・就労する人々に様々な健康障害が発生する「シックハウス症候群」が問題となっている。本研究は、居住環境に存在する化学物質の健康影響を予知し、予防対策を立案するための一助とすることを目的とする。今年度はトルエン、キシレン、スチレン等芳香族の揮発性有機化合物(VOC)の尿中代謝物を対象として、GC/MSによる微量定量法を検討した。実験方法測定対象とした尿中代謝物は、馬尿酸(HA):トルエン、o-,m-,p-メチル馬尿酸(o-,m-,p-MHA):キシレン、マンデル酸(MA)およびフェニルグリオキシル酸(PGA):スチレンとした。試料尿に内部標準(I.S.)としてベンゾイルロイシンを添加し、酸性条件下でジエチルエーテルで抽出した。溶媒留去後、塩酸-メタノール法でメチルエステル誘導体化を行い、ペンタンで抽出・溶媒留去した。その残渣を酢酸エチルに溶解し、DB-1キャピラリーカラム付きGC/MSを用いて、カラム温度150°Cから250°Cまで10°C/minで昇温分析した。SIMモード分析は、m/z=105(HA)、m/z=119(MHA)、m/z=107(MA)、m/z=105(PGA)を選択した。また気中濃度との対応を検討するために、アクティブ法により活性炭チューブエアーサンプラーを用いてVOCを捕集し、二硫化炭素で溶出してGC/MS法で分離定量を行なった。結果と考察GC/MS法により、尿中代謝物6種及びI.S.は良好なピークとして分離溶出した。SIMモードでの検出限界は注入量として40450pgであり、検量線は良好な直線性を示した。次にトルエン、キシレン、スチレンなどのVOCが高濃度に検出された新築建物に就労する人の尿中から、HA、MHA、MA、PGAの全てが検出された。HAは食事に由来する量も多く微量のトルエン曝露の指標とはなり得ないが、低濃度のキシレン及びスチレンの曝露評価は可能となる。まとめ今回開発したGC/MS法は高感度であり、動物およびヒトにおける室内VOCに対する生物学的曝露モニタリングとしての有効性が確認できた。13年度は3年計画の初年度であり、既存の方法を文献検索するとともに一部の追試を行った。またアルデヒド類については、その生物学的曝露モニタリングの可能性について検討し、以下の結果を得た。1試料濃縮法は固相マイクロ抽出法(SPME)を検討した。多環化合物の一部については良好な結果を得たが、トルエン、キシレンについてはなお検討が必要である。2尿中の化学物質と代謝産物の微量定量法については、アルデヒド類はホルムアルデヒド、芳香族ではキシレンをモデル化合物として検討した。(1)ホルムアルデヒドの測定方法は、DNPH誘導体としたHPLC-UV法とアンピシリン誘導体とした蛍光検出-HPLC法を検討した。蛍光検出器による方法は感度と特異性で優れていたが低濃度(1μg/mL以下)では安定せず、定量性が十分とは言えない結果となった。

なおこれらの測定法で、1-5ppmのホルムアルデヒドに曝露した解剖実習生の尿を測定したところ1.5-49.3μg/mLのホルムアルデヒドが検出された。今後は、曝露モニタリングに適切な採尿時期と曝露濃度との対応を検討する予定にしている。(2)キシレンに由来する尿中メチル馬尿酸については、当初の予定通りメチル化後のGC-FIDとGCMS法を検討した。しかしながら通常の居住環境で遭遇するキシレン濃度に対応すると思われる推定値(1-10μg/mL)付近では、感度とともに分離能の点で十分な結果は得られていない。そこで次年度以降は代謝産物に含まれる窒素(N)に着目したGC-NPD法、あるいは塩素を含有するエステル化剤での誘導体をGC-ECDで分離定量する方法等、更に高感度で特異性の高い方法を検討する予定にしている。3上記のうちHPLCを用いた研究には、本年度予算で購入したセミミクロUV-VIS検出器を用いた。今年度は、居住環境汚染で問題となっているフタル酸化合物を対象とした分析方法と、昨年度に引き続きアルデヒド類の蛍光検出法を検討した。生体試料中フタル酸の分析には、新たにインチューブ固相マイクロ抽出/高速液体クロマトグラフィー(インチューブSPME/HPLC)による全自動オンライン分析システムの開発し、以下の成績を得た。1私達が開発したインチューブSPME/HPLC法を用いて、生体試料のモデルとした輸液および液体医薬品中のフタル酸エステル類を分析した。プラスチック製容器中の輸液からフタル酸ジ-n-ブチル(DBP)が検出され、バッグやボトル容器の印字インクおよびラベル紙接着剤中のDBPがプラスチック容器を透過して輸液を汚染している可能性が示された。またポリ塩化ビニル製の点滴用チューブを通過した液体中からフタル酸-2-エチルヘキシル(DEHP)が検出された。人の生体試料からの検出と生物学的モニタリングへの応用は次年度以降の課題である。2昨年に引き続き尿試料からのアルデヒド類を蛍光検出器付きHPLC法で定量する方法を検討した。この方法の問題点は、検出感度は向上するが低濃度域で安定性が悪くなることである。比較的高濃度と予測した解剖実習生のホルムアルデヒド曝露後尿を、従来法のUV検出器HPLCによる方法とともに蛍光法でも測定し、曝露濃度との関連を調べたが明確な量一影響関係は見いだせなかった。アルデヒド類のような水溶性の化学物質を生物学的モニタリングの対象とする場合は、試料採取と保存する場所の空気中に対象物質含まれていると、採取後に混入して測定値に影響する可能性があることが示唆された。研究目的新築建造物内に居住・就労する人々に様々な健康障害が発生する「シックハウス症候群」が問題となっている。今年度はトルエン、キシレン、スチレン等芳香族の揮発性有機化合物(VOC)の尿中代謝物を対象として、GC/MSによる微量定量法を検討した。実験方法測定対象とした尿中代謝物は、馬尿酸(HA):トルエン、o-,m-,p-メチル馬尿酸.(o-,m-,p-MHA):キシレン・マンデル酸(MA)およびフェニルグリオキシル酸(PGA):スチレンとした。試料尿に内部標準(I.S.)としてベンゾイルロイシンを添加し、酸性条件下でジエチルエーテルで抽出した溶媒留去後、塩酸-メタノール法でメチルエステル誘導体化を行い、ペンタンで抽出・溶媒留去した。その残渣を酢酸エチルに溶解し、DB-1キャピラリーカラム付きGC/MSを用いて、カラム温度150°Cから250°Cまで10°C/minで昇温分析した。SIMモード分析は、m/z=105(HA)、m/z=119(MHA)、m/z=107(MA)、m/z=105(PGA)を選択した。
腸管NAMPT-NAD合成系を標的としたNMNによるインスリン抵抗性予防法の開発

哺乳類NAD+合成系の鍵酵素であるNAMPT(nicotinamide phosphoribosyltransferase)は環境・栄養状態に応答することでNAD+量を調節し、サーチュインに代表されるNAD+消費酵素を介して代謝疾患などにおいて重要な役割を果たすことが明らかにされてきた。さらに、インスリン抵抗性、2型糖尿病などにおいてNAMPTの酵素反応産物であるNMN(nicotinamide mononucleotide)や、NR(nicotinamide riboside)などのNAD+中間代謝産物がNAD+量を増加させ、病態を改善することも報告されている。近年、加齢により小腸のNAD+量が低下することも報告され、平成30年度より腸管NAMPT-NAD+合成系の糖代謝およびインスリン抵抗性発症制御における役割の検討を目指して研究を開始した。第一に、高脂肪食負荷による全身のインスリン抵抗性発症の過程で、主要代謝臓器に先行して炎症を生じる腸管におけるNAMPT-NAD+合成系を、C57BL/6マウスを用いて評価した。高脂肪食負荷早期より大腸のNamptが低下し、続いて小腸のNamptが低下した。このような腸管におけるNampt発現量の低下の意義を検討するため、腸管上皮細胞特異的Namptノックアウトマウスを新規に作成した。通常食投与では、コントロールマウスとノックアウトマウスの2群間で、3-4か月齢までは有意な体重差は認めなかった。今後、腹腔内インスリン負荷試験、腹腔内ブドウ糖負荷試験、経口ブドウ糖負荷試験を行い、腸管NAMPT-NAD+合成系の糖代謝およびインスリン抵抗性発症制御における役割の検討をすすめる。本研究により、加齢および高脂肪食負荷による肥満に伴う、糖代謝障害およびインスリン抵抗性発症における腸管NAD+量の低下の意義を明らかとする。平成30年度に申請者は腸管上皮細胞特異的Namptノックアウト(Intestinal epithelial cells-specific Nampt knockout)マウスを作成に成功した。平成31年度は、まず第一に、腸管上皮細胞でのNAD+の枯渇が、全身の糖代謝やインスリン抵抗性を制御するかを検討するべく、腹腔内インスリン負荷試験、腹腔内ブドウ糖負荷試験、経口ブドウ糖負荷試験を行う。さらに、腸管NAMPT-NAD+合成系の障害が、腸管構造に与える影響を検討するために、小腸・大腸の長さ、H.E染色での絨毛長、陰窩長、炎症細胞の浸潤などを評価する。これらのパラメーターに変化を認めた際には、腸内細菌叢の変化の関与も検討する。最終的には、NAD+中間代謝産物であるNMN(nicotinamide mononucleotide)を経口投与し、腸管上皮細胞のNAD+量を回復させた際に、糖代謝障害、インスリン抵抗性、腸管構造変化が正常に復するかを評価する。

購入予定であったNMNについては、腸管上皮細胞特異的Namptノックアウトマウスを作成し、表現型を確認した後に投与期間・投与量を決める必要があると考え、翌年度に購入することとした。
強力な抗腫瘍活性を有するヘテロ環系天然物の合成化学的研究

(1)抗腫瘍活性バンレイシアセトゲニン類の合成研究を行い、構造未定であったモンタナシンD, Eの合成を達成した。また、ピラニシンがDNAポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等の酵素の強力な阻害剤になることを見出した。(2)腫瘍血管新生を阻害するテルペノイド(オバリシン、フマジリン)の効率的合成法を検討し、Sharpless不斉酸化反応と分子内メタセシス反応を鍵段階とする短段階合成ルートを開発した。強力な抗腫瘍作用を有するバンレイシアセトゲニン類の全合成を達成し、構造活性相関研究を通してその標的分子の探索等を行うことを主な目的としている。まず、立体化学が未だ不明であるモンタナシンDやカムバリニンの構造決定に有用なテトラヒドロピランユニットの効率的合成法を開発した。分子内付加反応を基盤としたこの環状エーテル合成法は、近傍水酸基が遊離であっても高選択的に進行するため、種々の誘導体の合成が可能であった。この反応を活用してモンタナシンDの右半分に相当するラクトン部分を構築した。また、シャープレスの不斉酸化反応等を利用してモンタナシンDの左半分テトラヒドロフラン誘導体を合成した。当初の予定であったこれら2つのセグメントの分子間メタセシス反応によるカップリングは、いくつか条件を検討したにもかかわらず不成功に終わった。一方、スペーサーを介して両分子をつなぎ、分子内でカップリングさせたところ高收率でモンタナシンDの全炭素骨格を構築することに成功した。バンレイシアセトゲニン類は細胞毒性や数種のcancer cell lineに対する阻害作用の報告はあるものの、DNAポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等の酵素に対する作用は報告されていなかった。こういった酵素の阻害剤は有望な抗腫瘍剤になる可能性が高いため、合成品並びにそれらの立体異性体を用いて、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼおよびhuman cancer cell line、HL-60に対する阻害作用を調べた。その結果、モノテトラヒドロピランアセトゲニンであるピラニシンが強力な阻害作用を示した。詳細なバイオアッセイを行ったところ、ピラニシンは哺乳類のポリメラーゼに特異的に作用し、植物ポリメラーゼや微生物起源の酵素等には効果が少ないことを見いだした。また、humanトポイソメラーゼI,IIにも効果的であった。これまでに多数知られている抗腫瘍活性バンレイシアセトゲニンの中でも、カムバリニンD(1)は4位水酸基が環状エーテルを形成し、他のアセトゲニン類とは大きく異なる構造化学的特徴を有している。このエーテル環の存在は、分子のコンホメーション自由度を大きく規制し、活性発現に重要な影響を及ぼすことが予想される。よって、1は作用機作を調べる上での重要なモデルになると考えられたが、天然からはごく微量しか得られていなかったため立体化学の一部が不明であるばかりでなく、活性の評価もなされていなかった。そこで、この天然物の絶対構造をも決定する目的で合成法の開発を行った。まず、未決定である分子右半分コアに相当する2種のラクトンを、生合成ルートを考慮に入れてデザインし、分子間アルキル化を利用して合成した。一方分子左半分は分子内エーテル化により合成した。両者のカップリングは分子間メタセシスによりスムーズに進行し、脱保護を経て2種のジアステレオマーを合成した。合成品のスペクトルデータを天然物のものと詳細に比較すると、一方の異性体が天然物のものと一致することがわかり、天然物の絶対構造を合成化学的に明らかにすることに成功した。腫瘍血管新生を阻害するテルペノイド(オバリシン、フマジリン)の短段階合成ルートを検討し、新規誘導体創製も可能な効率的合成法を開発した。まず、市販のアルコール誘導体からSharplessの不斉酸化反応を利用して数段階で鎖状オレフィン化合物を合成した。次いで分子内メタセシス反応によってシクロヘキセン誘導体を構築した。ここで酸化を行うと反応は立体選択的に進行し、望むジオールを与えた。エポキシ環の構築を経てシクロヘキサノン誘導体とし、側鎖部を導入するとオバリシンの第二世代合成が達成できた。また、シクロヘキセン誘導体から数段階で、文献既知のフマジリン合成中間体へも変換できた。
エナメル上皮腫による新しい直接的骨溶解機構の解明

エナメル上皮腫は日本で最も多い歯原性腫瘍であり、顎骨内での増殖・拡大は、腫瘍が放出するRANKLにより周囲の破骨細胞を活性化することにより起きると考えられてきた。しかしながら我々は、エナメル上皮腫自身が破骨細胞と同様にV-ATPase及びCLC-7を細胞膜表面に有し、それらを活性化することにより周囲骨組織を直接溶解し増殖・拡大していくことを、培養細胞(AM-1)を用いた各種実験手法及びエナメル上皮種の亜型である叢状型、濾胞型及び基底細胞型の各摘出病理組織切片を用いて明らかにした。昨年度の結果からAM-1は細胞表面にV-ATPaseおよびCLC-7を有し、破骨細胞と同様にリン酸カルシウムを溶解すること、V-ATPaseの選択的阻害薬であるbafilomycinによりその溶解は抑制されること、骨粗鬆症薬であり破骨細胞の活性を抑制するalendronateやethidronateには感受性を示さなかったこと、自らRANKLを放出するだけでなく、破骨細胞と同様にRANKを有することを示したことなどが挙げられるが、本年度は1)の更なる検討として、RANKシグナル下流の機構に焦点を絞って実験を行った。AM-1は細胞外Ca負荷およびRANKL刺激により、細胞融合を引き起こすが、この機構は破骨細胞様のRANKの活性化によるTRAF6の亢進からc-fosのリン酸化や細胞内Ca上昇を経て、NFATc1の脱リン酸化(亢進)するだけでなく、細胞外Ca負荷(1mM Ca)によりNFATc2の亢進という2つの経路により活性されることが明らかとなった。さらに、摘出組織を用いてV-ATPaseおよびCLC-7の局在を組織免染にて検討したところ、AM-1のoriginであるplexiform型はもちろんのこと、follicular型およびbasal cell型においても細胞膜近辺に両者の局在を認めた。以上の結果から、エナメル上皮腫は破骨細胞と同様に細胞表面にV-ATPaseおよびCLC-7を有し骨融解を引き起こすこと、また骨融解において発生した局所の細胞外Caおよび自らも放出するRANKLをRANKにて受容することによりNFATc1およびNFATc2を活性化させることで破骨細胞と同様に細胞融合を引き起こしていることが明らかとなった。本研究の目的は、エナメル上皮腫細胞による新しい直接骨吸収とその機構の解明と現在まで広く行われてきた外科的治療の補助もしくはそれに代わる新たな内科的治療法の開発である。研究計画として、1) AM-1の骨無基質溶解(骨吸収)のメカニズムの解明と選択的阻害薬の検索、2)他のエナメル上皮種の亜型や他の腫瘍細胞(悪性も含む)での骨溶解・浸潤におけるV-ATPaseおよびCLC-7の関与の検討、という二大テーマを掲げ、本年度は主に1)に重点を置き実験を遂行した。詳細としては、bafilomycinやconcanamycinといったV-ATPase阻害薬によりエナメル上皮腫細胞であるAM-1による骨溶解が抑制されるものの、etidronateやalendronateといった破骨細胞の活性を抑制するbisphoshonatesの投与では、骨溶解は阻害されなかった。一方でAM-1は、自らの細胞膜上に存在するV-ATPaseやCLC-7によって放出されるH+やCl-により骨溶解を引き起こすだけでなく、骨有機質を溶解させるcathepsin Kをも有していることがウエスタンブロットにて明らかとなった。またAM-1は、破骨細胞の分化を促進する物質であるRANKLを放出し周囲の破骨細胞をだけでなく、自らもRANKL受容体であるRANKを有していることが明らかとなった。さらにAM-1は、自らが溶解した骨基質からの細胞外Caにより形態が変化し、破骨細胞様に融合・多核化・巨大化し、がん細胞の転移時に観察される上皮間葉転換の指標となる間葉系マーカーが発現するだけでなく、破骨細胞分化のマーカーやマクロファージのマーカーをも発現していることが明らかとなった。以上の結果から、AM-1は上皮間葉転換だけでなく、一部マクロファージ様に転換し、形態変化及び骨溶解を引き起こしている可能性が示唆された。本研究はエナメル上皮腫細胞による新しい直接骨吸収とその機構を解明することである。これまで、エナメル上皮腫細胞は、骨転移したがん細胞と同様にRANKLを放出し、それにより腫瘍周囲の破骨細胞を活性化し、骨吸収・腫瘍増大を引き起こしていると考えられてきた。しかしながらエナメル上皮腫と骨転移したがんの浸潤様式は臨床的なX線像としても全く異なる形式であり、またその浸潤・腫瘍増大のスピードも全く異なっている。以上の事実を踏まえ、我々はエナメル上皮腫細胞(AM-1)および高浸潤性・高転移性である舌がん細胞のHST-3を用いて、破骨前駆細胞であるマウス・マクロファージ(RAW246.7)との共培養、擬似骨プレートを用いた実験、ウエスタンブロット、免疫蛍光染色、TRAP染色、各種チャネル阻害薬などの様々な手法により、エナメル上皮腫は破骨細胞を活性化させるほどのRANKLを発現していないこと、エナメル上皮腫自体の細胞膜上に破骨細胞と同様にプロトンポンプであるV-ATPase、塩素トランスポーターであるCLC-7を発現し、エナメル上皮腫自身が骨を溶解していることが明らかにした。加えて、その溶解効率は、破骨細胞に比して約60倍低く、また細胞増殖の速度も約5倍遅かった。以上の結果は、エナメル上皮腫の臨床的背景とほぼ一致しており、今後のエナメル上皮腫の治療への新たなるアプローチの一つとなった。

尚、この研究成果は現在、国際歯科研究雑誌に投稿中である。本研究ではエナメル上皮腫による新しい骨吸収機構の解明を目的とした。エナメル上皮腫は本邦における良性歯原性腫瘍の中で最も頻度の高い疾患であり、顎骨内で悪性腫瘍細胞と同様にRANKLを発現し、破骨細胞を活性化させることにより骨吸収を行い増大していくと考えられていた。しかし本研究の結果、エナメル上皮腫細胞株(AM-1)におけるRANKL蛋白質の発現量は高転移性の舌癌由来口腔扁平上皮癌細胞株(HSC-3)に比べて極めて少ないことが、ウエスタンブロッティング法にて確認された。マウスマクロファージ細胞株(RAW 264.7)とAM-1およびHSC-3との共培養実験において、TRAP陽性多核細胞の計測により破骨細胞形性能を調べるとHSC-3との共培養では多くのTRAP陽性多核細胞を認めたのに対し、AM-1との共培養ではTRAP陽性多核細胞は殆ど認められなかった。このことは、低いRANKL産生によるものと考えられた。そこで、エナメル上皮腫による直接的な骨吸収の可能性を検討した。AM-1をリン酸カルシウムのコーティングされたプレート上で培養すると多くの吸収窩が形成された。この吸収窩は、vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase)の阻害剤添加により抑制された。さらに、AM-1の細胞膜上へのV-ATPaseとH+/Clーexchangetransporter 7 (CLC-7)の発現が膜蛋白質のビオチン化標識実験及び免疫蛍光染色にて認められた。エナメル上皮腫の病理組織切片を免疫蛍光染色法にて観察すると培養細胞での所見と同様にV-ATPaseとCLC-7の細胞膜への局在が、叢状型、濾胞型、基底細胞型の組織切片において観察された。しかし、AM-1の骨基質溶解活性は破骨細胞に比して60分の1程度であり、細胞増殖率も皮膚正常細胞株のHaCaTおよびHSC-3に比して5分の1程度であった。以上の結果よりエナメル上皮腫の顎骨内での緩やかな進展は、緩徐な細胞増殖と骨基質溶解によりもたらされることが示唆された。以上の研究結果を国際雑誌で報告した。エナメル上皮腫は日本で最も多い歯原性腫瘍であり、顎骨内での増殖・拡大は、腫瘍が放出するRANKLにより周囲の破骨細胞を活性化することにより起きると考えられてきた。しかしながら我々は、エナメル上皮腫自身が破骨細胞と同様にV-ATPase及びCLC-7を細胞膜表面に有し、それらを活性化することにより周囲骨組織を直接溶解し増殖・拡大していくことを、培養細胞(AM-1)を用いた各種実験手法及びエナメル上皮種の亜型である叢状型、濾胞型及び基底細胞型の各摘出病理組織切片を用いて明らかにした。本研究は、年度内に論文に仕上げる予定であったが、計画が遅れてしまい、現在投稿中である。そのため、H27年度まで研究期間を延長し、論文を受理されるまで実験を続けることとした。イオンチャネル病態生理学現在、論文投稿中であることから、今後、リバイスとなれば追加実験を行い、論文受理に漕ぎつける予定である。今年度までの成果としては、エナメル上皮腫細胞であるAM-1の骨溶解に関する細胞膜上のイオンチャネル/トランスポーターの発現のみに焦点を当ており、その点に関しては予想通りに結果が出ている。
ナノ構造における電子系量子凝縮相の微視的理論に基づく研究

本研究は、電子を主体とする量子凝縮相のナノ構造における物性の解明を目指して、(1)高温超伝導体に見られる超伝導2次元層の積層構造(2)NbSe3等のリング状微小結晶の電荷密度波秩序(3)グラフェン等炭素系化合物と超伝導体の接合系に関して、微視的理論に基づく研究を展開し、新奇現象に関する知見を得た。また、走査型SQUID顕微鏡の画像解析技術についても研究を行い、新規技術の開発に成功した。本年度はナノ構造における諸物性の解明を目指して次の各研究を行った。(1)多重ジョセフソン接合系のダイナミクスの数値シミュレーションに基づく研究高温超伝導体に見られるような多重ジョセフソン接合系に関して、その各接合の位相差の時間発展を記述する微分方程式を数値的に解く事によって、定電流下および電流を変化させた場合などにおける発生電圧の振る舞いを明らかにした。特に、非線形方程式に特有のブリーザー・モードという解が、電圧の発生および超伝導状態から抵抗状態への遷移において重要な役割を果たしている事を見出し、日本物理学会および論文として発表した。(2)リング状微小結晶の位相欠陥の分布に関する研究NbSe3等のリング状のトポロジカル結晶における位相欠陥の分布を、線形弾性論の範囲内で考察し、リングの周長と厚さの関係によって、いくつかの位相欠陥分布の状態が可能である事を明らかにした。それによると、1ミクロン以上の周長の結晶の場合、(数ナノ・メートルといった極端に薄い結晶を除き)位相欠陥はほぼ一様に分布する事が分かった。また、周長が1ミクロン以下になると位相欠陥が動径方向の弾性的結合を壊してしまうような状況も実現する事が分かった。これらの結果は論文として発表した。(3)走査型SQUID顕微鏡(SSM)の画像SSMの画像の高解像度化を目指して、画像処理の応用による解像度改善の可能性について研究を行った。本年度は、数値的なシミュレーションを用いて、我々が従来から提案している方法の有効性を検証した。さらに、観測領域の周辺に磁場がゼロでない領域が存在する画像に逆変換を施すと、画像全体においてノイズが増強されてしまうという現象を確認した。この現象を克服するための改良法については現在検討中である。これらの結果は日本物理学会において発表した。(1)近年実験的にも作成が可能となってきた微小なリング状の電荷密度波の相転移について、Ginzburg-Landau理論に基づく解析を行い、これまでに知られている実験結果との比較を行った。その結果、1ミクロン程度より大きな半径を持つリング状電荷密度波の場合には、リング化伴うストレスによる転移温度の低下は無視出来るほど小さいことが分かった。このことは、実験的にはリング状電荷密度波においても目立った転移温度の低下が起きていないことと対応している。この結果は論文として発表した。さらに、Bogoliubov-de Gennes理論による電荷密度波のダイナミクスを記述する方法についても検討を行い、特に位相欠陥の周辺での準粒子の非平衡状態を記述する数学的な枠組みについて一定の結果を得た。(2)微小なリング状超伝導体の動的特性について、時間に依存するギンツブルグ・ランダウ方程式に基づく数値シミュレーションによって解析を行った。特に、定電流下での解析を可能にするために超伝導電極から一定の電流が流れ込んでいる状況を仮定し、それを数値的に表現出来るモデルを構築した。本年度は最も簡単なリング構造の場合に、磁場下での電気抵抗の振る舞い(Little-Parks効果)を解析し、特に外部ノイズとして交流電流を当てたときには、シャピロ・ステップ的な奇妙な振る舞いをすることを明らかにした。このことについては発表準備中である。また、この結果をBogoliubov-de Gennes理論を用いたミクロな理論に拡張する可能性についても検討を行った。(1)前年度からBogoliubov-de Gennes理論に基づき電荷密度波のダイナミクスを記述する方法について検討を行ってきた。今年度は、これらの成果をふまえ、準粒子の自由度をあらわに考慮した形の、時間に依存するギンツブルグ・ランダウ方程式を半現象論的に導出し、その妥当性について数値計算によって確認した。この方程式は準粒子のマクロな自由度(密度および流れ)を変数として含むので、位相欠陥の運動に伴う準粒子-凝縮体間の電荷のやり取りを記述できる。この方程式に基づき、数値シミュレーションによって1次元の電荷密度波における滑り伝導を解析し、電極付近での準粒子の非平衡分布やその付近での位相欠陥の生成が再現できることを確認した。(2)グラフェンは近年新しい物性研究の対象として注目されているが、本研究では超伝導との接合系について、特に準粒子による近接効果の特性に着目して研究を行った。具体的には超伝導体の間に単層または多層のグラフェンを挟んで接合系を作ったときに、超伝導電極間に流れる超伝導電流の大きさを温度および接合館距離の関数として計算した。なお、計算には電子のミクロな自由度を記述できる温度グリーン関数法を用いた。

その結果、単層の場合には近接効果の特性は常伝導金属の場合と定性的に変わらないが、2層系の場合には準粒子の干渉効果による振動が現れることが分かった。今後はこれらの現象の実験的な検証可能性についてざらに考察をすすめたい。
中国における飲料水を介した砒素、フッ素への複合曝露による健康障害の解明

中国内モンゴル農村部の砒素汚染地区の深井戸水に高濃度の砒素(As)が検出され、同時にフッ素(F)も高濃度に検出された。汚染地域住民で尿中Asが高く砒素曝露が確認され男女差は無かった。尿中Fも同傾向だった。皮膚および頭髪の元素定性分析で汚染地域住民にAsのピークが検出され、Asの生体組織沈着が確認された。汚染地域住民に手掌・足底の角化症、皮膚色素異常が見られ、一部には歯牙フッ素症も観察された。砒素皮膚病変および歯牙フッ素症ともに男性に発症が多かった。動物実験で、雄雌のC57BL/6Nマウスに50、100日間に飲料水としてAs(10ppm)、F(1または5ppm)を単独およびAs・Fを混合で投与した。大腿骨断面積は雌性50日曝露のF群およびAs群で大きかった。雄性50日曝露では実験群で断面積が大きかったが100日曝露では差が無かった。骨密度に関して50日曝露の雄雌ともにAs群で高値を示したが、100日曝露では各群間に差がなかった。骨強度は50日曝露で雄雌共に各群間に差がなかったが、100日曝露の雄ではF群とAs・F群で低値、雌のF群で低値であった。以上よりFとAsはそれぞれ濃度や曝露期間毎に結果が異なるものの、骨の発育、密度や強度に影響を及ぼし、影響には性差があることがわかった。血清中GM-CSFは雄雌共に50、100日曝露で各群間に一定傾向はなかった。AsおよびFに同時に曝露する集団の砒素中毒症状がAsの濃度や曝露期間だけで説明できないことから、汚染物質につき生体影響を評価するには複合曝露する物質の相互作用につき考慮する必要が示された。特にF曝露による骨影響は知られているが、Asによる骨への影響を報告した例は無く、慢性砒素中毒発生地域において骨に関する健康調査も実施する必要があると思われる。我々のフィールド調査により、中国で飲料水を介した砒素およびフッ素への複合曝露により健康障害が発生していることが明らかとなっている。そこで今回の初年度は、動物実験により慢性砒素中毒がフッ素への複合曝露により受ける修飾について検討した。雄・雌の4週齢のC57BL/6Nマウスに、50および100日間にわたり飲料水として、砒素、フッ素および砒素フッ素を混合で投与した。砒素投与は亜砒酸ナトリウムを砒素として1ppm(1m9/L)および10ppm(10m9/L)、フッ素投与はフッ化ナトリウムをフッ素として1ppm(1m9/L)、混合投与は砒素・フッ素それぞれ1ppm(1m9/L)に蒸留水で調整して給水瓶にて自由に飲水させた。対照群には蒸留水を与えた。給水瓶は1週間に2度調整し、投与前・後の給水瓶の重量を測定し飲水量を求めた。雄では、高濃度砒素群、フッ素群、フッ素砒素混合群に飲水量の低下が見られた。雌ではフッ素群の飲水量が増加した。曝露終了後、炭酸ガス過麻酔にてマウスを安楽死させる。

それぞれの曝露量の評価は、砒素について尿中・血中砒素量の測定、フッ素について尿中フッ素量の測定で行った。左下腹部の皮膚を外側下方の方向に切りだし10%ホルマリンPBS溶液にて固定後に顕微鏡組織標本を作成した。また、およそ1cm平方の腹部皮膚および脾臓のおよそ半分からmRNAを抽出し、GM-CSFおよびTGFαのmRNA発現量を観察した。さらに脊柱および大腿骨の骨強度および骨密度を測定した。砒素の曝露により皮膚の硬化が起こり組織学的にも真皮層のコラーゲン線維束の太化が観察された。これらの変化にGM-CSFの関与が示唆された。一方、フッ素の混合曝露が砒素による硬化を抑制する可能性がある。フッ素曝露のみならず砒素単独曝露によっても骨の脆弱化が観察された。現在、これらの可能性につき検索中である。In vivo実験:C57B/6Nマウスに対して10ppmの亜砒酸ナトリウムと1ppmのフッ化ナトリウムを50日あるいは100日間、飲料水として自由に摂取させた。尿中に排泄される砒素あるいはフッ素の量は互いに影響を及ぼさなかった。砒素曝露によってもたらされる躯幹部皮膚の硬化はフッ素の混合曝露によってやや軽減された。砒素曝露マウスにおいて骨の脆弱性が観察されたが、これに対するフッ素混合曝露の影響は現在のところ明らかではない。In vitro実験:ヒト正常肝細胞株を用いて、in vitro培養系に10μMの亜砒酸ナトリウムを添加し、さらにフッ化ナトリウムを10から100μM添加し、細胞増殖活性を指標として細胞毒性を観察した。亜砒酸ナトリウム添加により60%の増殖の抑制が見られた。一方、フッ化ナトリウム単独の添加では細胞毒性が見られなかったが、混合添加によって亜砒酸ナトリウム添加時に見られる細胞毒性の減弱化が見られた。In vivo、in vitro両方の実験から、砒素の中毒症状発現に対してフッ素が同時に存在する場合に影響を及ぼすことがわかった。現在、中国において我々が行っているフィールド調査において、住民が砒素とフッ素の両方に曝露されていることから、砒素中毒症状を判断するさいにはフッ素の曝露量ついても考慮に入れる必要性が示唆された。中国内モンゴル農村部の砒素汚染地区の深井戸水に高濃度の砒素(As)が検出され、同時にフッ素(F)も高濃度に検出された。汚染地域住民で尿中Asが高く砒素曝露が確認され男女差は無かった。尿中Fも同傾向だった。皮膚および頭髪の元素定性分析で汚染地域住民にAsのピークが検出され、Asの生体組織沈着が確認された。汚染地域住民に手掌・足底の角化症、皮膚色素異常が見られ、一部には歯牙フッ素症も観察された。砒素皮膚病変および歯牙フッ素症ともに男性に発症が多かった。動物実験で、雄雌のC57BL/6Nマウスに50、100日間に飲料水としてAs(10ppm)、F(1または5ppm)を単独およびAs・Fを混合で投与した。大腿骨断面積は雌性50日曝露のF群およびAs群で大きかった。雄性50日曝露では実験群で断面積が大きかったが100日曝露では差が無かった。骨密度に関して50日曝露の雄雌ともにAs群で高値を示したが、100日曝露では各群間に差がなかった。骨強度は50日曝露で雄雌共に各群間に差がなかったが、100日曝露の雄ではF群とAs・F群で低値、雌のF群で低値であった。以上よりFとAsはそれぞれ濃度や曝露期間毎に結果が異なるものの、骨の発育、密度や強度に影響を及ぼし、影響には性差があることがわかった。血清中GM-CSFは雄雌共に50、100日曝露で各群間に一定傾向はなかった。AsおよびFに同時に曝露する集団の砒素中毒症状がAsの濃度や曝露期間だけで説明できないことから、汚染物質につき生体影響を評価するには複合曝露する物質の相互作用につき考慮する必要が示された。