hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性化アデニル酸シクラーゼの活性化機構の解明

本研究は、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにするとともに、その細胞工学的応用を発展させるべく企画されたものである。本研究において、硫黄細菌Beggiatoaが持つ類似タンパク質(BsPAC)が大腸菌において機能発現することが示され、アミノ酸置換変異体の解析により光シグナル伝達に重要なアミノ酸残基の幾つかが特定された本研究は、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにするとともに、その細胞工学的応用を発展させるべく企画されたものである。本研究において、硫黄細菌Beggiatoaが持つ類似タンパク質(BsPAC)が大腸菌において機能発現することが示され、アミノ酸置換変異体の解析により光シグナル伝達に重要なアミノ酸残基の幾つかが特定された本研究は、光で活性化されてcAMPを産生するユニークな光センサータンパク質、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにするとともに、その細胞工学的応用を発展させるべく企画したものである。今年度は、PACの祖先型と考えられる、硫黄細菌Beggiatoaが持つ類似タンパク質(BsPAC)を用いて大量発現・精製を行うとともに、大腸菌における機能発現を試みた。(1)大腸菌におけるBsPACの大量発現・精製人工合成したBsPACの遺伝子を大腸菌の発現ベクターに組み込み、大量発現を試みた。pETベクターに組み込んで37°Cで発現させた場合、殆どのBsPACタンパク質は不溶性の封入体として回収された。封入体標品を調整し、グアニジン塩酸塩で可溶化させた後、FAD存在下で希釈法により巻き戻しを行うと、FADを結合した可溶性のタンパク質が得られた。この試料は光照射によりBLUFドメインタンパク質に特徴的な吸収スペクトルのレッドシフトを示したが、残念ながらアデニル酸シクラーゼ活性は検出されなかった。一方、pColdベクターに組み込んで15°Cで発現させた場合は、BsPACは可溶性タンパク質として回収され、FADの結合量は少ないものの、光で亢進されるアデニル酸シクラーゼ活性を示した。(2)大腸菌におけるBsPACの機能発現前項で作成したBsPACの発現ベクター(pColdBsPAC4)をアデニル酸シクラーゼ欠損変異株(E.coli MK1010)に導入し、MacConkey agar平板に接種したところ、培養時間24時間において、光照射した場合にのみcAMP産生を示す赤いコロニーが形成された。すなわち、BsPACは大腸菌細胞内においてもその活性を発揮できることが示された。本研究は、光で活性化されてcAMPを産生するユニークな光センサータンパク質、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにするとともに、その細胞工学的応用を発展させるべく企画したものである。今年度は、PACの祖先型と考えられる、硫黄細菌Beggiatoaが持つ類似タンパク質(BsPAC)に変異導入を行い、大腸菌における機能発現を試みるとともに、それらの紫外/可視分光分析を行った。(1)大腸菌における変異導入BsPACの機能発現昨年度の研究において、BsPAC遺伝子を大腸菌のアデニル酸シクラーゼ欠損変異株に導入することにより、ラクトース代謝の機能相補を光依存的に行うことに成功した。本年度は、BsPAC遺伝子に変異を導入し、光依存的機能相補に及ぼす効果を調べた。結果として、多数の光活性化に異常を持つBsPAC変異体を得ることに成功し、さらに部位特異的変異導入を組み合わせて表現型の確認を行い、複数の重要なアミノ酸残基を特定した。(2)BsPACの紫外/可視分光分析と酵素活性の測定BLUFタンパク質の光応答は、青色光照射による吸収スペクトルの僅かな長波長シフトで特徴づけられる。そこで、前項で得られたBsPAC変異体を試料として、青色光照射時の吸収スペクトル変化を調べるとともに、エンザイムイムノアッセイにより酵素活性の測定を試みた。結果として49番目のグルタミン、113番目のロイシンが分子内光シグナル伝達に重要な役割を果たしていることが示された。今年度は、PACの祖先型と考えられる、硫黄細菌Beggiatoaが持つ類似タンパク質(BsPAC)に変異導入を行い、アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補による解析を行うとともに、大量発現系の構築を試みた。1.大腸菌における変異導入BsPACの機能発現昨年度の研究において、BsPAC遺伝子に変異を導入し、光依存的機能相補に及ぼす効果をアデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補により幾つかの機能上重要なアミノ酸残基を特定した。本年度はさらに多くの変異体を作成し、解析を行ったところ、フラビンを結合するBLUFドメインとアデニル酸シクラーゼ触媒ドメインをつなぐループ部分に相当する複数のアミノ酸残基が機能発現に欠かせないことが分かった。2.大腸菌におけるBsPACの大量発現昨年度までに、分子シャペロンとの共発現を行うことにより比較的良好な可溶性試料が得られることが判明していたので、本年度は発現条件の検討をさらに進めるとともに、新しい発現用宿主大腸菌の検討を行った。その結果、現状では好冷温細菌由来のシャペロニンを用いた系が最善であると判断された。本年度初頭に東邦大学へ異動となったため、新しい研究環境の整備に手間取ったことによる。しかしながら、後半は比較的順調に進んだ。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後はさらに精力的にBsPAC変異体の機能解析を進め、できるだけ早くデータを取りまとめて論文化する。また、構造生物学研究者との連携を深め、光活性化に関する機能構造連関の解明を目指す。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ゲルロボットの研究

[研究目的]本研究は、機能性高分子ゲルを用いてアクチュエータとセンサが連続的に分布し、全体が生体のような物理的柔軟性を持つロボットの設計や制御手法の基礎を確立することを目的とする。ゲル材料としてアクチュエータ機能を持つPAMPSゲル(アクリルアミド系高分子ゲル)をとりあげ、「ゲルロボット」を実現することを目指して研究を行なった。ゲルをシステム全体に用いて具体的な機械を設計し、制御するという総合的な立場からの研究は世界的にも例のない、独創的なものである。[研究成果]形状設計・形状制御という2つのサブテーマに分けて研究を進め、統合実験として軟体動物型ゲルロボットを製作し、評価を行なった。(1)形状設計:ゲルロボットの設計法を明らかにするために、ゲルの動特性と材料特性の測定を行い、変形とゲルの形状、特に厚さと変形特性の関係を明らかにした。この測定に基づき、厚い部分を構造支持部として、薄い部分をアクチュエータとしての役割を持たせる、低ヤング率の人工筋肉素材に適用可能な設計手法を提案した。(2)形状制御:PAMPSゲルの屈曲はゲル表面への分子の吸着と吸着した分子どうしの凝集に基づくとするゲルの化学反応の理論と前項の測定結果にもとづいて、ゲルの変形応答機能の基礎的な関係をモデル化した。ゲルを駆動する電場に着目し、これを空間的に分布させることでゲルの曲率を局所的に変化させる新しい駆動電場構成法を提案した。(3)統合実験:以上の形状設計・形状制御手法に基づいて、印加する電圧の極性に応じて伸縮する方向の変化する面型ロボットを製作し、その形状を制御した。全身が変形しながら移動するしゃくとり虫運動、大変形により表裏が反転するヒトデの裏返り運動、指向性を持つ変形運動などを実験により示した。
乳癌に対するアンチセンスBcl-2を用いた抗癌剤耐性克服に関する研究

固形癌における抗癌剤耐性機序の1つであるBcl-2蛋白に対するアンチセンス(AS)を用いた抗癌剤感受性の増強に関する前臨床試験で以下の結果を得た。3.ヌードマウス可移植乳癌細胞を用いたin vivoの実験系では、in vitroと同様に抗腫瘍効果の増強がみられた。AS Bcl-2 5mg/kgの5日間腹腔内投与につづく抗癌剤投与により、MMC, TXL, TXTのいずれに対してもAS Bcl-2併用による抗腫瘍効果の増強が認められた。Bcl-2蛋白の発現は投与4日目には消失し、14日目でもBcl-2蛋白の発現はみられなかった。4.以上から、抗アポトーシス蛋白Bcl-2の対するAS Bcl-2療法は、乳癌を含む固形癌に対してBcl-2蛋白の減少を介したアポトーシス誘導経路の修飾により抗癌剤感受性が増強されることが示され、臨床における抗癌剤併用による効果増強の可能性が示唆された。1.Bcl-2蛋白に対するphosphorothioate oligonucleotide(18-mer)処理により、乳癌、胃癌、甲状腺未分化細胞に対して1μMで最大60-70%の蛋白発現の抑制効果が得られた。1μMでの細胞毒性は10%程度であり、それ以上では細胞毒性のみが増強された。Bcl-2蛋白の抗癌剤耐性への関与はすでに報告されているが、ホルモン受容体陽性乳癌患者に対する術後補助療法での抗癌剤とホルモン剤の併用療法では、特に閉経前患者では抗エスロゲン剤の投与により、エストラジオール(E2)の上昇がみられている。E2の上昇は、Bcl-2蛋白の発現を誘導し、抗癌剤耐性の関与することが示唆されている。乳癌に対する抗癌剤感受性増強を目的として、Bcl-2蛋白を標的としたアンチセンスBcl-2による効果増強の可能性とその機序について検討を行い、以下の結果を得た。1)ヒト乳癌細胞MDA-MB-231に対するアンチセンスBcl-2の効果は、用量依存性であり、1uMで最大60%程度の蛋白抑制効果がみられた。2)抗癌剤との併用効果では、Mitomycin, Paclitaxelに対する感受性がそれぞれ1.9倍、1.5倍に効果増強が認められた。3)感受性増強はアポトーシス誘導に一致し、Bax, cytochrome c, capase-3の活性化が認められた。以上の結果から、乳癌に対するアンチセンスBcl-2を標的とした癌化学療法の効果増強の可能性が示唆された。一方、BT-474乳癌細胞を用いたHER-2を標的としたアンチセンスHER-2の実験系では、HER-2の蛋白発現抑制と同時にBcl-2蛋白の発現抑制が認められ、抗癌剤Adriamycin(20.8倍),Mitomycin(5.6倍),Docetaxel(4.0倍),Paclitaxel(10.8倍)に対する感受性の増強がみられた。アポトーシス誘導による抗癌剤感受性増強の機序として、抗アポトーシス蛋白Bcl-2の抑制、Bax, cytochrome c, capase-3の活性化、さらに抗アポトーシス因子であるAkt活性化の抑制が認められた。したがって、乳癌に対する抗癌剤感受性の増強には、アポトース誘導シグナル伝達経路の修飾が重要であり、Bcl-2蛋白の発現抑制は効果増強に中枢的役割を担っていることが示唆された。現在、アンチセンスBcl-2によるin vivoでの効果、さらに臨床応用に関して検討を進めている。

4.以上から、抗アポトーシス蛋白Bcl-2の対するAS BCl-2療法は、乳癌を含む固形癌に対してBcl-2蛋白の減少を介したアポトーシス誘導経路の修飾により抗癌剤感受性が増強されることが示され、臨床における抗癌剤併用による効果増強の可能性が示唆された。
幅広い年代と体力レベルに実施可能な、走っても歩いてもよい簡便な持久性テストの開発

本研究では、広範囲な年齢層や様々な体力レベルに適用できる簡便な全身持久力評価方法、「走っても歩いてもよいシャトルテスト(新SST)」の開発・提案を目的に、3年間の研究期間内に、以下について検討する。1)新SSTの妥当性・安全性の検討(2018年度から2019年度):幅広い年齢で、様々な体力レベルにある男女各50名について、新SSTの妥当性と安全性について検討する。妥当性の検討はVO2MAXの測定と新SSTの成績との相関の高さで評価し、安全性については、新SSTの測定中の心拍応答(ポラール)や主観的運動強度、体への負担度等によって評価する。なお、これら安全性に関する検討は、多人数を同時に行う測定時にも、心拍応答は一部対象者で、他は全ての対象者にて実施する。2)多人数による新SSTと体格(筋量)、他の体力要素、生活要因の調査(2018年度から2020年度):多人数(男女各750名)の測定を実施して、新SSTと体格(筋量)や他の体力要素との関連、生活要因との関連からデータベースの特性を明らかにする。3)上記に基づき、新SSTの性別・年齢階級別標準値を作成(2020年度)する。2018年度は、上記に示す課題1)については、運動を実施することに支障のない65歳から88歳の138名(男性51名:、女性81名)を対象に運動負荷試験が実施できた。また多人数を対象にした安全性検討(主観的運動強度・体への負担度等による評価)については、2018年度以前の収集データを含めると、健康に大きな問題のない17歳から93歳の年齢幅で、1216名(男性344名、女性872名)を対象にしたデータを収得した。課題2)についても、高齢者測定会の中で、調査をスタートさせた所である。2018年度に予定していた、課題1)新SSTの妥当性・安全性の検討、については、、計画通りか、それ以上の内容で進行している。課題2)多人数による新SSTと体格(筋量)、他の体力要素、生活要因の調査、については、ほぼ計画通りの内容で進行している。本研究の課題1)新SSTの妥当性・安全性の検討(2018年度から2019年度)については、妥当性検証のための運動負荷試験として、若年層のデータを中心に追加する。加えて、安全性の検討(主観的運動強度・体への負担度等による評価)として、性・年齢階級別に不足しているデータを補完しながら、多人数の測定を実施し、課題2)新SSTと体格(筋量)、他の体力要素、生活要因の関連について検討できるよう、こちらの対象者も増やす。そして、最終年度(2020年度)の課題3)新SSTの性別・年齢階級別標準値の作成、に繋がるよう、研究計画を遂行する。なお、取得したデータは、順次、学会で口頭発表したり、論文として公表する。

加えて、安全性の検討(主観的運動強度・体への負担度等による評価)として、性・年齢階級別に不足しているデータを補完しながら、多人数の測定を実施し、課題2)新SSTと体格(筋量)、他の体力要素、生活要因の関連について検討できるよう、こちらの対象者も増やす。そして、最終年度(2020年度)の課題3)新SSTの性別・年齢階級別標準値の作成、に繋がるよう、研究計画を遂行する。なお、取得したデータは、順次、学会で口頭発表したり、論文として公表する。最も予算額が大きかった多周波インピーダンス分析装置『Impedimed SFB7(ImpediMed社:予算額120万)の件で:骨格筋量測定のために、従来の研究でも用いてきた多周波インピーダンス分析装置『Impedimed SFB7(ImpediMed社)』を本研究でも使用している。2018年度の測定では、研究分担者(山田陽介氏)が保有する装置を用いたが、申請者の所属する研究機関にはないため、近く購入予定である。
日米加3か国における人口移動の転換の同時性に関する要因分析

1970年代の先進諸国では、中心部の純移動の大幅な減少、周辺部の純移動の顕著な回復を主たる内容とする人口移動転換が広く観察された。この共時的な転換の原因を、日本・米国・カナダの三カ国を事例に探った。分析方法としては、Plane(1992)によって開発されたシフトシェアー法を利用した。日本のデータは国勢調査報告から得、カナダのデータはStatistics Canadaより購入した。米国のデータは、予算不足から購入を断念したが、類似の分析を行っている先行研究を参考とした。得られた知見を要約すれば、以下のようになる。まず、労働市場の供給側に注目すれば、米国・カナダの人口転換を引き起こした最大の原因は、1970年代において中心部で若年労働力の供給圧力が高まった事によって生じた、周辺部への人の再分布であった。一方、わが国では1970年代に、周辺部における若年人口の激減が見られ、そのために中心部へと向かう移動がおおいに少なくなった。移動転換の内容に関するこのような内外の差異をもたらしたのは、1940年代の中期に始まったベビーブーム、およびその後の出生率の低下という人口学的傾向であったと言える。当初予定していた労働市場の需要性の動向、具体的には産業構造の転換に伴う就業者分布の変動の問題は、予算の不足からなし得なかったが、それは今後の課題としたい。
先鋭化ファイバープローブヘッドの開発とナノサイズ磁気記録への応用

本研究は先端径がナノメータオーダーの磁性針を先鋭化したファイバープローブ上に形成し、垂直磁気記録用ヘッドとして使用することで超高密度の磁気記録再生用ヘッドとすることを目的としたものである。これを作製するために、光ファイバーをNH_4FとHFの混合液でエッチングすることにより、コアとクラッド部分のエッチング速度の違いを利用してコア部分を選択的に取り出し、これを先鋭化したものを用いる。光ファイバーは直径約125μm程度のクラッド領域の内部に内径2μm程度のコアが存在し、NH_4FとHFの混合液の混合比を変えることで、コア部の先鋭化度やプローブ長、クラッド部分の外径などを制御できる技術を開発した。この技術により光ファイバー先鋭化の最適化と磁性層堆積の最適化を行なった。二段階エッチング法により、コアを選択的に尖鋭化することに成功した。この先鋭化光ファイバーに、対向ターゲット式スパッタ装置を用いて磁性膜を均一に堆積させることにより所望のファイバープローブヘッドを形成することに成功した。このファイバープローブヘッドを用いた新しい記録システムと再生システムを提案した。記録ヘッドとして先鋭化プローブ表面に軟磁性層を堆積させ励磁を行う方式を有限積分要素法にて電磁界解析を行った結果、プローブヘッド直下の微小領域に記録できることを確認した。さらに軟磁性補助磁極を用いることにより約8倍の記録磁界が得られることを見出した。再生方式として記録磁化により先鋭化プローブ表面に堆積させた磁気転写層を磁化させ、この転写磁化情報をプローブの後方から入射した光の偏光面の回転を利用して検出する機構を考案した。有限積分要素法による性能の解析の結果、面記録密度にて約39Gbits/inch^2という高密度で記録ビットからの磁化情報の転写ができることを見出した。実際に光ファイバーでの偏光特性を評価したところ、直線光ファイバーでは入射直線偏光を保存したまま検出することができた。また実際に、磁気転写層としてGd-Co膜とGd-Fe膜を検討し、Gd-Fe膜においてFe濃度87%程度で、Kerr回転角が0.3°以上、且つ垂直保磁力Hc_1が50Oe程度と、本ヘッドの磁気転写層に必要とされる磁気特性が得られることを確認した。以上、本ヘッドは磁化状態を直接検出する点が大きなメリットであると共に、極めて高密度における記録・再生の可能性を有しており、将来の垂直磁気記録用ヘッドとして有望であることが確認できた。(1)光ファイバプローブの先鋭化条件の最適化本研究では先端径がナノメータオーダーの磁性針を垂直磁気記録用ヘッドとして使用するが、これを作製するために、光ファイバーをNH_4FとHFの混合液でエッチングすることにより、コアとクラッド部分のエッチング速度の違いを利用してコア部分を選択的に取り出し、これを先鋭化したものを用いる。

光ファイバーは直径約125mm程度のクラッド領域の内部に内径2mm程度のコアが存在し、NH_4FとHFの混合液の混合比を変えることで、コア部の先鋭化度やブロープ長、クラッド部分の外径などを制御できる技術を開発した。(2)先鋭化光ファイバープローブへの軟磁性層のスパッタ被覆上記で作製された先鋭化光ファイバープローブに、対向ターゲット式スパッタ法を用いてNi-FeやFe-Cu-Nb-Si-B等の軟磁性層を購入したスパッタ電源を用いてスパッタ被覆した。対向ターゲット式スパッタ装置は2枚のターゲットを有しているため、スパッタ粒子が主として2方向から飛来するため、ファイバープローブ上には、均一でしかも段差被覆性の良好な軟磁性層を得ることができた。(3)先鋭化単磁極へッドの磁場解析シミュレーション磁性層を被覆した先鋭化プローブにコイルを巻き単磁極形状のヘッドとした場合の磁場解析を、二次元軸対称モデルによる有限要素磁場解析を行い、プローブ直下や媒体層中での磁場強度や磁界分布の急峻さなどに付いて評価した。この結果、十分な磁界強度と急峻な磁界分布が得られることを確認し、適当な磁束のリターンパスを設けることでさらに書き込み電流効率が向上することなどがわかった。次年度以降はさらにファイバープローブの作製条件の最適化を行い、ピエゾ駆動ステージにマウントすることで実際の書き込み動作を行い、記録磁化状態を解析して本研究の目的を達成する予定である。本研究では新しい記録・再生システムを提案しその基礎特性の評価を行なった。昨年度に引き続き、光ファイバー先鋭化の最適化と磁性層堆積の最適化を行なった。二段階エッチング法により、コアを選択的に尖鋭化することに成功した。この先鋭化光ファイバーに、対向ターゲット式スパッタ装置を用いて磁性膜を均一に堆積させることができた。新しい記録システムと再生システムを提案した。記録ヘッドとして先鋭化プローブ表面に軟磁性層を堆積させ励磁を行う方式を有限積分要素法にて電磁界解析を行った結果、プローブヘッド直下の微小領域に記録できることを確認した。さらに軟磁性補助磁極を用いることにより約8倍の記録磁界が得られることを見出した。再生方式として記録磁化により先鋭化プローブ表面に堆積させた磁気転写層を磁化させ、この転写磁化情報をプローブの後方から入射した光の偏光面の回転を利用して検出する機構を考案した。有限積分要素法による性能の解析の結果、面記録密度にて約39Gbits/inch^2という高密度で記録ビットからの磁化情報の転写ができることを見出した。実際に光ファイバーでの偏光特性を評価するために、直線偏光を直線光ファイバーと曲線光ファイバーに入射した場合の偏光特性を測定した。直線光ファイバーでは入射直線偏光を保存したまま検出することができた。この結果は今後プローブをヘッドとして使用していく際には十分な結果である。また実際に、磁気転写層としてGd-Co膜とGd-Fe膜を検討し、Gd-Fe膜においてFe濃度87%程度で、Kerr回転角が0.3゚以上、且つ垂直保磁力Hc_1が500c程度と、本ヘッドの磁気転写層に必要とされる磁気特性が得られることを確認した。以上、本ヘッドは磁化状態を直接検出する点が大きなメリットであると共に、極めて高密度における記録・再生の可能性を有しており、将来の垂直磁気記録用ヘッドとして有望であることが確認できた。
コモンモード伝送と自己給電によるグリーンＰＬＣのための基礎研究

漏電ブレーカの誤動作問題と従来のN-L (コンセントのN (Neutral)とL (Live)端子を用いる)伝送時の信号減衰問題の両方を回避できる方式として、PE端子(Protective Earth,コンセントの3番目のアース端子)とN端子間に信号を注入するN-PE伝送方式をまず提案した。しかしこのN-PE方式でも、ビルのフロア間通信は困難であった。そこで、フロア間を縦断するケーブル(1線のみでよく、信号の帰路は大地を用いる)をインダクティブカプラでクランプして、PLC信号をシングルエンド型で伝送する一線式PLC伝送方式も開発した。(1)一線式PLC伝送方式の開発:2012年度には、漏電ブレーカの誤動作問題と従来のDifferential-mode伝送時の信号減衰問題の両方を回避できる方式として、PE線(Protective Earth,コンセントの3番目のアース端子)とN(Neutral)線間に信号を注入するN-PE方式が最良であることを見出した。2013年度は、研究室以外に、一戸建て家屋、商用ビル、大学の講義棟、研究棟、ハワイのホテルで提案方式を検証したところ、ノイズ環境が劣悪な講義棟以外で提案方式が有用であることを明らかにした。またN-PE方式でも、ビルのフロア間での通信は困難であったが、フロア間を縦断するケーブルを用いて(1線のみでよく、信号の帰路は大地を用いるシングルエンド型伝送方式)インダクティブカプラでPLC信号の注入抽出を行う一線式PLC伝送方式を開発した。(2)(1)の方式はDiff-modeとは直交しないためCommon-modeではないが、伝搬路は同じ大地をとおるため、不要輻射問題を起こす可能性がある。筆者らが従来から取り組んでいるPLC信号の漏えい検出法の一つであるPPS(Periodic Packet sound)法に関する研究成果を論文発表した。(3)自己給電:市販されているクランプ型電流センサ(コアはフェライト)、および自作の非接触給電トランス(コアは珪素鋼板)による、商用周波数で20アンペア流れている電力線からの自己給電の可能性を検討した。前者は400mW(3kΩ)まで給電可能であったが、負荷インピーダンスを大きくする必要があるため,低インピーダンスのDC-DCコンバータへの給電が難しい。一方後者は5W(1.5kΩ)まで給電可能であり、本研究の目的(所望のマイコンに給電)の場合には、0.8A以上商用電流が流れていれば自己給電できることが明らかになった。(1)N-PE伝送方式の開発:従来のkHz帯PLC(10k-450kHzの帯域を用いる電力線通信)は、Live線とNeutral(N)線の間にPLC信号を注入するディファレンシャルモード(Diff-mode)信号伝送方式を用いている。しかし、同じ線に接続される家電機器の入力インピーダンスは、この周波数帯では数Ω程度しかないため、PLC信号は2030dB減衰するという問題があった。交付申請時点では、コモンモード(Com-mode)伝送を採用する予定であったが、本研究の結果、漏電ブレーカの誤動作問題とDiff-mode伝送時の信号減衰問題の両方を回避できる方式として、PE線(Protective Earth,コンセントの3番目のアース端子)とN線間に信号を注入するN-PE方式が最良であることを見出した。研究室以外に、一戸建て家屋、商用ビル、大学の講義棟で提案方式を適用したところ、ノイズ環境が劣悪な講義棟以外で提案方式が有用であることを実験的に示した。(2)(1)の方式はDiff-modeとは直交しないためCom-modeではないが、伝搬路は同じ大地をとおるため、不要輻射問題を起こす可能性がある。筆者らが従来から取り組んでいるPLC信号の漏えい検出法の一つであるPPS(Periodic Packet sound)法の問題であった、背景パケットによる検出精度の劣化度を明らかにした。(3)自己給電の場合、低消費電力であることが重要であるため、ワンチップマイコンで変復調機能を実現する必要がある。本年度は、2値FSK変復調方式(f0=250kHz, f1=300kHz)をARM社Cortex-M3 32bitマイコン(mbedマイコンボードを使用)に実装した。太陽光発電パネルを8枚直列にした線路に適用したところ、1200bpsで誤りなく通信できることを実験的に明らかにした。2013年度は、研究室以外に、一戸建て家屋、商用ビル、大学の講義棟、研究棟、ハワイのホテルで提案方式を検証し提案方式が有用であることを論文にまとめた(2015年採録決定)。

またN-PE方式でも、ビルのフロア間での通信は困難であったが、フロア間を縦断するケーブルを用いて(1線のみでよく、信号の帰路は大地を用いるシングルエンド型伝送方式)インダクティブカプラでPLC信号の注入抽出を行う一線式PLC伝送方式を開発した。2014年度は、信号の帰路として大地を用いることが困難な架空線路においても、L線をクランプすることによって、N線を帰路とする方式を開発した(2015年国際会議発表済み)。(2)インダクティブカプラによる非接触給電:自作のトランス(コアは珪素鋼板)による、商用周波数で20アンペア流れている電力線からの非接触給電の可能性を検討した。その結果5W(1.5kΩ)まで給電可能であり、本研究で目標とした5mWのマイコンへの給電の場合には、1.7A以上商用電流が流れていれば自己給電できることを実験的に明らかにした。(3)ワイヤレス給電による非接触給電:磁気共鳴型のワイヤレス給電用アンテナ(自作)を用いて、20cm離れた場所に給電しながらPLCも行えることを実験的に明らかにした。論文のリスト等通信工学(1)家電機器の消費電流を測定しかつ、カレントトランス(CT)による誘導電流を用いて自己給電しながらPLCを行うSelf-Powered PLC(SP-PLC)の実現:商用電源電流を電磁誘導で取り出してモデムに給電する方法の目途はついている。(2)コモンモードを利用したPLC通信品質の改善:検討の結果、提案時とは異なる手法となったが、N-PE伝送方式および一線式PLCの開発に成功したため、計画どおりの進捗である。(3)PLCの変復調を2値FSKとし、その機能の大半をマイコンに取り込むことによって、省電力・低コスト・小型化を図る:マイコンにFSK機能を実装できたので、小型化の目途はついている。ただし32ビットマイコンを使っているため、今後はこれを8ビットマイコンに移植して、より低消費電力化・低コスト化を図る。(4)商用電源からの給電を全く使わないSP-PLCシステムによるユーザ認証:PLC信号のみで給電を行うSP用電源回路の開発は未着手である。ただし予備実験として、より難易度の低いワイヤレス給電(20MHz帯)用の電源回路の開発を先行して行った。試作機の変換損失は8dBだったが、主な損失要因であった初段の全波整流用ダイオードおよび整流後のLPF用コンデンサの再選定を行い改善できた。これらの成果を本研究に適用してゆく予定である。(5)スマート分電盤、HEMS、およびBEMSへの適用: EV用ガレージ充電システムの開発はほぼ終わっている。今後放電制御も行えるようになる見込みである。従ってSP-PLCが開発できればこれを適用実験の準備はできている。(1)使用する信号伝送方式:当初コモンモードを用いる予定であったが、漏電ブレーカの誤動作問題の解決のためには上記N-PE伝送方式のほうが優れていることが実験の結果分かった。ただし、本質的には当初の想定からの変更ではなく、むしろ改善できると考えている。(2)PLC信号のみで給電を行う自己給電(SP)型用電源回路の開発:予備実験として、より難易度の低いワイヤレス給電(20MHz帯)用の電源回路の開発を先行して行っている。
アジア圏における安全・安心な資源循環システムの構築

本研究は大連国家生態工業モデル園と連携し、日本静脈産業の海外展開に必要な相手国での社会システムや政策の実態調査を行った。未利用資源の固形燃料化技術と古紙プレス機の導入を具体例として取り上げ、それぞれのビジネスモデルの構築を通して新たな循環システム構築のモデリング方法論の検討を行った。また地域性や時代の変化、国際間認識の違いを反映可能なLCA・LCCを包含したBAS(Best Available System)手法の高度化を行い、検討ケースの評価を行った。さらに安全安心な国際資源循環システムの実現に向けて大連モデル園を対象に事故事例DBや安全設計解析手法等のリスクマネジメント手法の提案を行った。本研究では、1)国際資源循環システムの環境負荷・経済性の実効性評価手法の高度化、2)中国大連国家生態工業モデル園を拠点とした国際資源循環システムの検討、3)中国大連国家生態工業モデル園をモデルとした安全安心な静脈システムの検討、3つの項目を通し、国際資源循環システムを構築する際のモデリング方法論の一般化を図りながら、海外静脈施設におけるリスクマネジメント手法の検討を行い、アジア圏における安全安心な資源循環システムモデルの形成を目的とする。2013年度では上記項目に対応し、1)LCAにおけるカテゴリー重要度の推定手法について、従来のアンケート法に加え、新聞記事によるテキストマイニング手法の適用を検討し、その有効性を検証できた。これによりWEB検索エンジンの活用により効率的な情報収集を実現でき、さらに中国におけるLCI(Life Cycle inventory)データ収集を行い、統合化指標ELP(Environmental Load Point)の中国版の高度化を行った。2)古紙を例に取り上げ、大連庄河市における古紙の発生量、収集回収等の実態を現地行政、資源回収業者、製紙会社へのヒアリングを通して調査し、その現状と傾向分析を行った。さらにアジア圏の古紙状況を鑑み、共同研究先である松本光春商店、大連モデル園区と共同で大連古紙リサイクルシステムの構想を立て、現地行政への提案を行った。またマテリアルリサイクルが困難な劣化古紙、プラを対象に、燃料化事業の可能性分析を行い、日本技術導入に向けた検討を行った。3)中国全国の静脈関係者に安全安心に関するヒアリングを行った結果、安全配慮への意識はあるが、事業面でのシステム効率性、費用対効果、普及可能性等の指摘を受け、これまで日本で開発した情報収集システム、リスク評価手法等をパッケージ化し、クラウド型リスクマネジメントシステムを提案した。本研究は、まず、中国の都市鉱産モデル基地である大連国家生態工業モデル園と連携し、日本静脈産業の海外展開に必要な相手国での社会システムや政策の実態調査を行った。未利用資源の固形燃料化技術と古紙プレス機の導入を例に取り上げ、実際に大連に進出する第一線の企業と連携して事業に参画し、協議の現場で情報収集を行った。それぞれのビジネスモデルの構築を通して、新たな循環システムを構築する際のモデリング方法論を現地商習慣、技術面、制度面、環境面において検討を行った。つぎに、地域性や時代の変化、国際間の認識の違いを反映可能なLCA・LCCを包含したBAS(Best Available System)評価手法を開発し、検討ケースの評価と考察を行った。LCAについては統合化指標ELP(Environmental Load Point)の中国への適用性の検討を行った。具体的には、複数のインパクトカテゴリーを統合化するカテゴリー重要度の決定方法論について、テキストマイニング、クラスター分析を用いて、百度指数等を導入する際の検討を行った。またLCIデータベースを拡充し、ELP手法の高度化を図った。さらに、安全安心な国際資源循環システムの実現に向けて、現在まで日本で開発してきた安全設計解析手法、リスクマネジメント手法および先進ICTを活用した事故情報収集システム等の安全安心システムを大連国家生態工業モデル園区に提案を行った。大連国家生態工業モデル園はアジアにおいて資源循環の重要な拠点である。本研究は、モデル園区をフィールドとし、具体的な進出事業に参画し、ビジネスモデルの構築、LCAおよび安全安心の観点から研究開発を行った。「国際資源循環」は長期的な研究テーマであり、今後進出事業の展開に伴い、継続的に企業と産学連携で共同研究を行っていく所存である。リサイクル工学当初の研究計画をおおむね順調に進めていると評価し、その理由を以下に示す。本研究は3つの研究項目に分けて研究を進めている。1)国際資源循環システムの環境負荷・経済性の実効性評価手法の高度化について、テキストマイニング手法を適用し、カテゴリー重要度の推定手法の高度化、およびLCIデータ収集を行い、中国版統合化指標ELPの高度化を図った。2)中国大連国家生態工業モデル園を拠点とした国際資源循環システムの検討について、協力会社と連携して古紙、廃プラを中心にリサイクルシステムの検討やシステムの構築、さらに現地行政機関への提案を行った。また現地における生活ごみの処理実態も調査し、適正な処理システムの検討を行った。また危険廃棄物である電炉ダストの処理実態に関する企業情報の収集を行った。

3)中国大連国家生態工業モデル園をモデルとした安全安心な静脈システムの検討について、現地のニーズを把握することが重要であり、大連のみではなく、中国全国の静脈関係者へヒアリング調査を行った。その結果を受け、中国において効率的な安全安心システムの導入、意識高めるために広範囲への普及効果を考慮し、クラウド型の安全安心システムの構想を立てた。また現地クラウドシステムの構築に関して、中国科学院の協力を得ながら研究を進めている。今後の推進方策についてを研究項目ごとに述べる。1)国際資源循環システムの環境負荷・経済性の実効性評価手法の高度化について、アンケート法およびテキストマイニング手法の高度化を図りつつ、これ以外の手法の検討を行う。本研究項目は文献調査と分析を中心に行っていく。2)中国大連国家生態工業モデル園を拠点とした国際資源循環システムの検討について、企業の観点から海外進出あるいは国際資源循環に携わる新たなビジネスモデルの構築に関する研究であり、企業と一体化した研究体制が必要である。これについては当方が大連国家生態工業モデル園、株式会社松本光春商店、株式会社扇谷と連携体制を構築できており、共同研究を進めている。今後はもっと連携を強化し、中国オンサイトで企業の動きを観察し、その考え方を理解しながら、第三者の視点で国際資源循環システムのモデルの研究を進めていく。3)中国大連国家生態工業モデル園をモデルとした安全安心な静脈システムの検討について、中国では静脈施設における安全安心対応策の検討自体が斬新な考え方であり、新規性のある研究データである。一方で、民間企業におけるその考え方の受入が第一の課題である。これについては、現地関係者と共同で対策を検討していく。また安全安心システムの普及や構築に向けたコンセプトの確立が必要であり、現地企業と連携し、企業の視点に立ったシステムの概念作りを行っていく。本研究は企業と連携して共同で進める研究であり、研究目的を達成させるためには企業の視点や考え方を理解する必要がある。そこで、次年度の経費は企業と連携を図るために、現場での打ち合わせや協議等に発生する日本国内および海外出張の旅費が中心となる。本研究は旅費を中心となり、その計画を以下に述べる。まず次年度は中国現地企業と連携するための出張がある。中国大連、広州、上海をはじめとする関係都市の企業への出張が10回ほど発生する。次に、日本国内においては、株式会社エコクリーン(RPF製造業者、工場は福井)、株式会社松本光春商店(本社高松)をはじめ、関係企業への出張が数回想定される。そして、海外国際会議および国内の学会への論文発表するための旅費が計画されている。
長距離移動する海鳥を汚染トレーサーとした物質輸送の解明

本研究の目的は、海鳥類を介した汚染物質輸送が陸上生態系に及ぼす影響を評価することである。海洋生態系の高次捕食者である海鳥類は、高濃度に汚染物質を蓄積していることで知られている。そして、体内に蓄積した汚染物質を繁殖行動(自身と子への餌獲得のために餌場である海域と繁殖地を往復する)や渡り行動(繁殖地越冬海域の長距離移動)を通じて海域から陸上へ輸送している。海鳥類は特に移動性が高く、長距離輸送をしている可能性が指摘されているが、これに関する知見や情報が乏しいため、どの海域からどの経路で汚染物質が陸上に持ち込まれているかは不明のままである。2018年度は5月末から6月上旬にかけては北海道天売島で、5月末から8月上旬にかけてはアラスカ州ミドルトン島で野外調査を実施した。それぞれの島で繁殖するウミスズメ科鳥類のウトウにジオロケーター(小型位置記録計)を装着および回収して放鳥し、ジオロケーターを装着しない個体から安定同位体比分析用と汚染物質濃度分析用の血液、羽根、糞のサンプルを採取した。化学分析およびジオロケーターデータの解析は順調に勧められた。その結果、利用した越冬海域によってウトウの羽根中の汚染物質濃度が異なるが、汚染物質蓄積濃度は天売個体とアラスカ個体では同程度であることがわかった。天売島でのジオロケーターの回収は繁殖状況が悪かったことから予想よりも低かったが、アラスカ側では期待通りに回収できた。一方、化学分析は予定通り順調に実施することができ、完了することができた。2019年度は、ジオロケーターの回収を両調査地で実施するとともに、物質輸送経路をさらに詳細に調べるため、海鳥の餌を採取・化学分析を実施する。本年度はとりまとめの年となるため、関連学会で結果を発表するとともに学術誌に論文を投稿することで成果発表とする。そして、体内に蓄積した汚染物質を繁殖行動(自身と子への餌獲得のために餌場である海域と繁殖地を往復する)や渡り行動(通常春秋に見られる繁殖地越冬海域の長距離移動)を通じて海域から陸上へ輸送している。2017年は本研究の初年度にあたり、4月末から7月上旬にかけては北海道天売島で、5月末から8月上旬にかけてはアラスカ州ミドルトン島で野外調査を実施した。それぞれの島で繁殖するウミスズメ科鳥類のウトウにジオロケーター(小型位置記録計)を装着して放鳥し、ジオロケーターを装着しない個体から安定同位体比分析用と汚染物質濃度分析用の血液、羽根、糞のサンプルを採取した。また、陸上生態系への影響を評価するため、営巣場所内及び隣接する非営巣場所において土壌と植物、コアサンプル(堆積物、直径3cmの円筒状に土壌表層から20cmを採取)を採取した。その結果、利用した越冬海域によってウトウの羽根中の汚染物質濃度が異なり、非繁殖期(越冬期)の行動が汚染物質暴露に影響を及ぼしていることが示された。予定通り野外調査を実施して記録計の装着やサンプル採取を実施し、データ解析を進めることができた。しかし、ミドルトンで採集したサンプルについては化学分析の実施が予定よりも遅れているが、2018年4ー5月に実施予定であある。野外調査によるサンプル収集およびデータ解析は順調に進展しているので、引き続き行い、2018年度はデータロガーの回収につとめる。また、化学分析も実施する。

本年度はとりまとめの年となるため、関連学会で結果を発表するとともに学術誌に論文を投稿することで成果発表とする。2017年度中に行う予定だった汚染物質分析が2018年度に行うこととなったため。2018年度に予定していたアラスカ現地調査のうち一部が2019年度に実施することとなった。そのため、予算を次年度に繰越して使用する。
嗅細胞膜のIP_3感受性イオンチャンネル

脊椎動物嗅覚トランスダクションがcAMP-経路ばかりでなくIP_3-経路も加えた複数経路によりなされるかどうかを明らかにすることを目的として、両棲類動物カエル及び哺乳類動物ラット、マウスを材料とし、それらの嗅細胞膜に分布するIP_3-感受性イオンチャンネル(以後IP_3-チャンネル)の諸特性1)IP_3応答の潜時2)嗅細胞各部の膜での分布3)順応現象4)嗅細胞間での分布などをcAMP-感受性イオンチャンネル(以後cAMP-チャンネル)の特性と比較しながらパッチクランプ法により調べ、IP_3-経路の脊椎動物嗅覚トランスダクションにおける役割を検討した。その結果以下の諸点が明らかになった。1)IP_3-チャンネルのIP_3に対する応答潜時は、cAMP-チャンネルのそれと同様に十分短く(IP_3-チャンネル24msec、cAMP-チャンネル5msec)、cAMP-チャンネルと同様に原形質膜に存在し、IP_3が直接、膜の内側から作用し、開口させられる。2)IP_3-チャンネルの嗅細胞膜での分布密度は、cAMP-チャンネルの分布密度よりも低かったが、嗅受容部位である嗅細胞先端膜での分布密度は他の部位におけるよりも高かった。3)IP_3-チャンネルの中には、cAMP-チャンネルには見られない順応現象を示すものが発見された。4)ラット嗅細胞では、IP_3-チャンネルが分布する嗅細胞は、cAMP-チャンネルが分布する嗅細胞より少ない。以上の結果から、IP_3-チャンネルは、cAMP-チャンネルと同様に、嗅覚トランスダクションチャンネルとして動作し得る事が明らかになり、脊椎動物嗅覚のトランスダクションは、cAMP-経路ばかりでなくIP_3-経路の複数経路によりなされることが実証された。しかし、IP_3-、cAMP-経路の両方が、ある脊椎動物種の全ての嗅細胞に共存するのではなく、それぞれの経路は別々の嗅細胞に付与されていること、又cAMP-、IP_3-経路のいずれがその動物で優位であるかは、脊椎動物種間で異なるものと推定された。脊椎動物嗅覚トランスダクションがCAMPー経路ばかりでなく第二の経路であるIP_3をセカンドメッセンジャーとして産生する酵素反応経路(IP_3ー経路)も加えた複数経路によりなされるとする仮説の上に立って,本年度は両棲類動物カエルを材料とし、その嗅細胞膜に分布するIP_3ー感受性イオンチャンネル(以後IP_3チャンネル)について、1)IP_3応答の潜時2)嗅細胞膜各部での分布3)順応現象などをCAMPー感受性イオンチャンネル(以後CAMPーチャンネル)の活動と比較しながらパッチクランプ法により調べ、IP_3ーチャンネルのカエル嗅覚トランスダクションにおける役割を検討した。1)IP_3ーチャンネルのIP_3に対する応答潜時はCAMPーチャンネルのそれと同様に十分短く(IP_3ーチャンネル24msec、CAMPーチャンネル5msec)CAMPーチャンネルと同様にIP_3が直接細胞内側から作用し、開口させている。2)IP_3ーチャンネルは嗅受容部位である嗅受容器先端膜での分布密度が他の膜部位における分布密度よりも高い。3)IP_3ーチャンネルの中にはCAMPーチャンネルには見られない順応現象を示すものが発見された。以上の結果から、IP_3ーチャンネルはCAMPーチャンネルに較べ、より複雑な機構ではあるがCAMPチャンネルと同様に脊椎動物の嗅覚トランスダクションチャンネルとして動作しうると結論した。

しかし、IP_3ーチャンネルの実際の分布密度は嗅細胞体膜でCAMPーチャンネルの分布密度525μm^<-2>よりも低い事も本年の研究が示しており、同様なことは嗅細胞先端膜におけるIP_3ーチャンネルの分布密度についても言えるので、IP_3ーチャンネルとCAMPーチャンネルの嗅細胞先端膜における分布密度の比較ではIP_3ーチャンネルは、カエルでの嗅覚トランスダクションに、CAMPーチャンネルに較べ補助的役割を果すと考えられる。又その役割の重要度は、脊椎動物種間で異っているものと推定された。脊椎動物嗅覚トランスダクションがcAMP-経路ばかりでなくIP_3-経路も加えた複数経路によりなされるかどうかを明らかにすることを目的として、両棲類動物カエル及び哺乳類動物ラット、マウスを材料とし、それらの嗅細胞膜に分布するIP_3-感受性イオンチャンネル(以後IP_3-チャンネル)の諸特性1)IP_3応答の潜時2)嗅細胞各部の膜での分布3)順応現象4)嗅細胞間のでの分布などをcAMP-感受性イオンチャンネル(以後cAMP-チャンネル)の特性と比較しながらパッチクランプ法により調べ、IP_3-経路の脊椎動物嗅覚トランスダクションにおける役割を検討した。その結果以下の諸点が明らかになった。1)IP_3-チャンネルのIP_3に対する応答潜時は、cAMP-チャンネルのそれと同様に十分短く(IP_3-チャンネル24msec、cAMP-チャンネル5msec)、cAMP-チャンネルと同様に原形質膜に存在し、IP_3が直接、膜の内側から作用し、開口させられる。2)IP_3-チャンネルの嗅細胞膜での分布密度は、cAMP-チャンネルの分布密度よりも低くかったが、嗅受容部位である嗅細胞先端膜での分布密度は他の部位におけるよりも高かった。3)IP_3-チャンネルの中には、cAMP-チャンネルには見られない順応現象を示すものが発見された。4)ラット嗅細胞では、IP_3-チャンネルが分布する嗅細胞は、cAMP-チャンネルが分布する嗅細胞より少ない。以上の結果から、IP_3-チャンネルは、cAMP-チャンネルと同様に、嗅覚トランスダクションチャンネルとして動作し得る事が明らかになり、脊椎動物嗅覚のトランスダクションは、cAMP-経路ばかりでなくIP_3-経路の複数経路によりなされることが実証された。しかし、IP_3-、cAMP-経路の両方が、ある脊椎動物種の全ての嗅細胞に共存するのではなく、それぞれの経路は別々の嗅細胞に付与されていること、又cAMP-、IP_3-経路のいずれがその動物で優位であるかは、脊椎動物種間で異なるものと推定された。
シナプス形成におけるアファディンとネクチンの機能の解析

海馬苔状線維シナプスの形成と機能発現におけるアファディンの機能を解析した。アファディンは、シナプスのプンクタアドヘレンシアジャンクションを構成するネクチンやカドヘリンなどの分子や、シナプス前部を構成するバスーンやVGLUT1などの分子の集積に必要であり、興奮性シナプスのシナプス前性と後性の機能を制御していることを明らかにした。さらに、発生期の脳においては、アファディンは中脳水道の形態形成と、幹細胞から新しく生成された神経細胞の遊走や大脳新皮質の層形成に必要であることを明らかにした。一方、嗅球の僧帽細胞の樹状突起がネクチンー1を介した新しい接着装置によって接着していることを明らかにした。シナプスは神経細胞間の特殊な接着であり、神経伝達の場として神経回路の機能の発現に必須の役割を果しているがその形成の機構は充分には解明されていない。研究代表者は細胞間の接着装置、ネクチン-アファディン系を見出し、その機能を主に上皮細胞において解析してきた。その結果、細胞接着関連分子アファディンが上皮細胞における細胞間接着と極性の形成に不可欠な機能を果たしていることを明らかにしている。本研究では、アファディンによる細胞間接着形成の制御に着目して、シナプスの形成における本分子の機能を解析した。アファディン条件付き欠損マウス(Afadin f/f;nestin-Cre)の海馬においては、上皮細胞のアドへレンスジャンクションに相当するプンクタアドヘレンシアジャンクションを形成する細胞接着関連分子である、カドヘリン、ネクチン、β-カテニンなどのシグナルの集積はほぼ完全に消失していたが、シナプス前膜の構成分子のバスーンやVGLUT1といった分子の集積は、完全に消失してはいなかったが明らかに低下していた。さらに、アファディン欠損培養海馬神経細胞では、シナプス前性・後性にシナプス機能が低下していることを明らかにした(Toyoshima et al., 2014)。このように、アファディンはシナプス分子の集積、シナプスの形態形成と機能を制御する重要な分子であると考えられる。また、シナプス形成のシグナルにはアファディン依存性・非依存性の最低2種類のシグナルが存在することが示唆され、現在、人工シナプスの実験系を用いて、それぞれのシグナルに関与する接着分子の同定を試みている。アファディンの機能を解析することにより、少なくとも海馬の苔状線維ーCA3錐体細胞シナプスの形成の分子機構の詳細が解明される可能性があると考えている。シナプスは神経細胞間の特殊な接着であり、神経伝達の場として神経回路の機能に必須の役割を果しているがその形成の機構は充分には解明されていない。そこで、アファディンによる細胞間接着形成の制御に着目して、シナプスの形成における本分子の機能を解析した。その結果、アファディン欠損マウス(Afadin f/f;nestin-Cre)の海馬や培養海馬神経細胞のシナプスにおいては、カドヘリン、ネクチン、β-カテニンなどの細胞接着関連分子や、バスーンやVGLUT1といったシナプス前膜の構成分子の集積が著しく低下していることを見出した。さらに、アファディン欠損培養神経細胞では、グルタミン酸の放出確率とシナプス小胞のリサイクリングが著しく低下していることを明らかにした。以上の結果は、アファディンはシナプスにおいて、細胞接着因子、アクティブゾーンとシナプス小胞を構成する分子を集積させることにより前シナプスの形成を促進する分子であることを示唆している。そこで、シナプス後膜に発現する膜貫通タンパク質を線維芽細胞に発現させ、アファディン欠損または野生型培養海馬神経細胞との間に人工シナプスを誘導し、その性状を解析した。その結果、特定のシナプス誘導膜タンパク質はアファディン依存性に前シナプスを誘導することが解った。以上の研究成果から、アファディンが前シナプス形成において中核的な機能を果たしていることが明らかにされた。したがって、アファディンの機能を解析することにより、シナプス形成の分子機構の詳細が解明される可能性がある。さらに、アファディンは統合性失調症の脳でその発現が低下していると報告されているように、精神疾患の発症機序の理解に貢献する可能性があり、臨床への橋渡し研究としても今後の研究の進展が期待される。本年度の成果の一部は既に論文としてまとめ、投稿準備中である。脳の海馬は学習と記憶の要となる領域であるが、この領域での神経回路とシナプスの形成機構や機能の発現機構は依然として不明な点が多い。海馬のCA3野では、歯状回顆粒細胞の苔状線維が錐体細胞の樹状突起と巨大シナプスを形成する。このシナプスのシナプス前部は伝達物質の放出部位を数多く有し、錐体細胞の樹状突起のスパインを包みこむ特徴的な構造を呈している。

しかし、苔状線維がCA3野錐体細胞とシナプスを形成する機構、および記憶と学習に伴ったシナプスの可塑性の機構は充分には理解されていない。一方、ネクチンとアファディンは、上皮細胞の細胞間の接着装置として研究代表者らによって見いだされ、カドヘリン依存性のアドヘレンスジャンクションの形成に不可欠な機能を果している。研究代表者らは、海馬苔状線維の巨大シナプスのプンクタアドヘレンシアジャンクション(PAJ)に、ネクチンとアファディンがカドヘリンと共局在し、シナプスの形成と維持に機能していることをこれまでに明らかにしてきた。本年度は、海馬苔状線維巨大シナプスの走査電子顕微鏡画像の三次元再構築法による解析を行い、アファディンを欠損したマウスではPAJがほぼ消失し、前シナプスのアクティブゾーンと後シナプスのシナプス後肥厚部も断片化して小型化していること、また、放出可能プールのシナプス小胞の数も減少していることを明らかにした。培養海馬切片における苔状線維単位シナプス伝達の電気生理学的解析では、興奮性シナプス後電流の振幅が減少し、ペアパルス比率が増加していた。これらの結果から、アファディンは苔状線維巨大シナプスの構造形成とシナプス前性とシナプス後性の機能を制御していることが明らかになった(論文準備中)。さらに本研究の過程で、アファディンが大脳新皮質の層形成に重要な機能を果していること、ネクチンー1が嗅球において新しい接着装置を形成していることを明らかにした。分子神経生物学平成25年度は、アファディン条件付き欠損マウス(Afadin f/f; nestin-Cre)の脳の海馬と、そのマウスから得た海馬神経細胞の分散培養から得た知見に基づき、人工シナプスによる細胞生物学的解析と、シナプス形成におけるアファディンの制御における分子機構を解析することを計画していた。これらの目標に関して、おおむね計画通りの研究の進展を得ることができた。人工シナプスの実験では候補となる細胞接着分子の前シナプスの形成における機能解析を中心に行い、アファディン依存性・非依存性のシグナルに関与する細胞接着分子の候補の絞り込みを行いつつある。アファディン結合タンパク質の同定に関しては、免疫沈降法によって得たサンプルを質量分析に供し、結合タンパク質の候補のリストを、平成24年度に得ている。25年度は、候補となる分子の2次スクリーニングを行い、シナプス後肥厚部に局在する分子Cnksr2について詳細に解析した。現在、生体内での機能を明らかにするため、ミュータントマウスの作成を行っており、今年度末にはそのマウスを使った実験が開始できると考えている。平成24年度は、アファディンコンディショナルノックアウトマウス(Afadin f/f; nestin-Cre)の脳の海馬のシナプスと、そのミュータントマウスから得た海馬神経細胞の分散培養で形成されるシナプスのフェノタイプの解析を詳細に行うことを研究の基盤としていた。さらに、それによって得た知見に基づき、人工シナプスの形成などの細胞生物学的、また、電気生理学的解析を行うことにより、シナプス形成におけるアファディンの機能を詳細に解析することを計画していた。今年度はこれらの目標に関して前シナプスの形成における機能解析を中心に行い、その目的はほぼ達成した。しかし、同様に計画していた後シナプスの形成における機能の解析は充分ではない。