hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イギリス・メディア教育学における思想と実践の発展史研究

今年度は,次の2点の研究に取り組んできた。第1の研究は,日本の現在のメディア教育実践を,イギリスとカナダにおけるメディア教育の発展史を参照しながら検証したものである。日本においてメディア教育は,英語科の中で行われてきたカナダ・オンタリオ州での実践に影響を強く受けているため,国語科の中で進められることが多い。また,オンタリオでは民間放送局がメディア教育に協力しているという情報がもたらされたことにより,日本のテレビ局もそれに積極的に関与するようになってきている。こうした特徴を持つ日本の事例に具体的に迫るために,小学校から高校までの国語科教科書と,民放局の教育活動の分析を行った。その結果,日本ではマスメディアの商業主義に対する批判的な思考が教材の中で十分に機能していないことが明らかにされた。この原因は,日本の政治的な環境や教育風土に見出すこともできるが,それだけでなく,イギリスやオンタリオのメディア教育に内在する,商業主義の問題を軽視する考え方が存在しているという点も指摘した。第2の研究が注目したのは,学校の市場化という問題と,それに批判的に取り組む北米のメディア教育である。学校の市場化は,北米において民間企業が教育活動に進出することによって既成事実化されつつあり,日本も例外ではない。しかし,北米では日本と異なり,研究者と教師の多くがこの動きに反対の姿勢を取っている。まず,研究の基礎作業として,企業の学校への関与の是非をめぐる論点を整理し,その上で,北米のメディア科教科書で展開されている,企業の教育活動批判の論理を確認した。これらの作業から,企業の教育活動は宣伝に過ぎず,同時に公的セクターの無力化を図る目的が隠されているという視点を提示することができた。上記の研究の成果は,カナダ教育学会第34回年次大会(ヨーク大学)と日本教育方法学会第42回大会(福島大学)にてそれぞれ発表済みである。本年度は,おもに2つの研究課題に取り組んだ。第1点目は,イギリスにおけるメディア教育の歴史および理論に関する研究である。この課題に取り組むために,まず昨年6月に,イギリス・ロンドンに所在する英国映画協会(BFI)とロンドン大学教育学研究所を訪問し,1960年代の映画教育から現在のメディア教育に到るまでの教育課程,教材,メディア教育学者の主要論考,教師による実践報告などの資料収集をおこなった。また,現在のイギリスのメディア教育界において影響力を持っているBFI教育部門のバザルジェット氏と,ロンドン大学のバッキンガム教授に対するインタビューを実施した。その結果,60年代の識別アプローチによる映画教育を経て,イデオロギー論の導入などにより社会批判的な性格を強めたイギリスのメディア教育が,80年代以降,BFIが推し進めたメディア教育のナショナル・カリキュラムへの導入と同時に,新自由主義政策のもとで産業振興策に取り込まれ,批判的な分析よりもメディア作品の制作をとおした表現力の育成が重視されるようになったという歴史的経緯が明らかになった。第2点目の課題は,カナダ・オンタリオ州のメディア・リテラシー教育の発展史の解明である。これは,本研究がオンタリオとイギリスの歴史・実践との比較を最終目的としていることから,必要な作業である。この研究では,メディア・リテラシー教育の目的が教材の中でどのように実現されているのかに注目し,さらにその目的論を,同時代におけるメディア理論と政治的環境に関連づけて分析した。その結果,社会批判的な教育内容として成立したメディア・リテラシー教育が,いったんは保守政権下で存廃の危機に晒されたものの,教師たちの努力によってその場所と批判性を維持していることが明らかになった。この研究成果については,『教育学研究』誌上で昨年10月に発表済みである。本年度の主要な研究実績としては,カナダ・オンタリオ州のメディア教育の歴史的な展開とその問題点を分析した博士学位論文「カナダ・オンタリオ州におけるメディア・リテラシー教育の研究-メディア社会と学校教育の課題」を完成し,学位を取得したことが挙げられる。その他,現在のイギリスとオンタリオ州におけるメディア教育に対する考え方と取り組みの比較検討を進めてきた。具体的には,大学の研究者や政府関係機関が理論と実践を牽引してきたイギリスについては,主要な論者の考え方の対立に注目した。この対立は,(1)メディア教育の目的を社会に対する批判的認識の獲得と,メディアと関わる主体的な態度の育成のどちらに据えるべきか,(2)映像制作活動を授業の中で最重視するか,社会批判性を身につけるための一手段として位置づけるか,という2点に見られた。加えて一連の議論からは,英国映画インスティテュートのイニシアチブによって,メディア教育が映像産業の振興という国家目標に絡め取られている様子もうかがえた。このようにイギリスでは,本来備わっていた批判性を後退させる言説が力を持ちつつあることが明らかにされた。他方,学校の教師による推進を特徴とするオンタリオ州は,最近になって研究機関との連携に着手し,実践の発展を図ろうとしている。2005年6月には,メディア・リテラシー協会とトロント大学オンタリオ教育学研究所のメディア・文化教育研究センターの合同ミーティングに参加し,メンバーへのインタビューをおこなった。そこから明らかになったのは,(1)メディア教育が政治的な環境の変化にも耐えられるだけの基盤を獲得するには研究者との連携が必要,(2)政治・経済的な観点からのメディア分析の実践を深化させるためには社会学者との緊密な関係が不可欠,という戦略であった。以上の研究成果の一部は,日本カリキュラム学会第16回大会(東京学芸大学,2005年6月)にて発表済みである。

第1の研究は,日本の現在のメディア教育実践を,イギリスとカナダにおけるメディア教育の発展史を参照しながら検証したものである。日本においてメディア教育は,英語科の中で行われてきたカナダ・オンタリオ州での実践に影響を強く受けているため,国語科の中で進められることが多い。また,オンタリオでは民間放送局がメディア教育に協力しているという情報がもたらされたことにより,日本のテレビ局もそれに積極的に関与するようになってきている。こうした特徴を持つ日本の事例に具体的に迫るために,小学校から高校までの国語科教科書と,民放局の教育活動の分析を行った。その結果,日本ではマスメディアの商業主義に対する批判的な思考が教材の中で十分に機能していないことが明らかにされた。この原因は,日本の政治的な環境や教育風土に見出すこともできるが,それだけでなく,イギリスやオンタリオのメディア教育に内在する,商業主義の問題を軽視する考え方が存在しているという点も指摘した。第2の研究が注目したのは,学校の市場化という問題と,それに批判的に取り組む北米のメディア教育である。学校の市場化は,北米において民間企業が教育活動に進出することによって既成事実化されつつあり,日本も例外ではない。しかし,北米では日本と異なり,研究者と教師の多くがこの動きに反対の姿勢を取っている。まず,研究の基礎作業として,企業の学校への関与の是非をめぐる論点を整理し,その上で,北米のメディア科教科書で展開されている,企業の教育活動批判の論理を確認した。これらの作業から,企業の教育活動は宣伝に過ぎず,同時に公的セクターの無力化を図る目的が隠されているという視点を提示することができた。上記の研究の成果は,カナダ教育学会第34回年次大会(ヨーク大学)と日本教育方法学会第42回大会(福島大学)にてそれぞれ発表済みである。
高齢者の特性を活かした学習支援に関する実証的研究

高齢者の特性を活かした学習支援の方法を探るため、欧米の教育老年学と第三期の大学に関する文献からの知見の整理、および内外の先進的な高齢者大学などの訪問ののちに、兵庫県西宮市高齢者大学にて受講者全員に対する質問紙調査を実施した。その結果、1.高齢者大学が老後の人間関係再構築の場として機能していること、2.60代から70代にかけて上昇する学習ニーズが存在すること、3.継続受講者には独自の学習スタイルがあることなどが示された。本年度は、高齢者の学習支援に関する研究を理論研究と実証研究の2つの角度から研究を進めた。1.理論研究においては、エイジングの概念のなかでもとくに「ポジティヴ・エイジング」の問題を焦点化し、主にアメリカの文献を中心にその意味するものとその理念にもとづく具体的な支援のあり方を整理した。また一方で高齢者の社会参加と老人大学に関する文献を収集・整理し、その意義と課題、これまでの実践例を整理した。この成果は『教育老年学の展開』に収められている。2.実証研究においては、まず大阪府老人大学修了者に対する調査結果を再分析し、高齢者の老人大学への評価と社会参加活動との関連についての分析を深めた。また主に都道府県レベルの老人大学(沖縄県、兵庫県、愛知県など)の視察とその職員や受講者へのインタビュー調査を実施し、明るい福祉行政系の老人大学と教育行政系の老人大学(長寿学園)との機能の対比を行い、今後の調査への仮説を導いた。さらに台湾での老人大学調査のコンタクトも深め、国際比較研究を進める準備をした。これらの成果は『教育老年学の展開』や「高齢者の社会参加活動と生涯学習活動の関連に関する一考察」のほかに、大阪教育大学生涯教育計画論研究室編『老人大学修了者の老人大学への評価に関する調査研究』(2006)という報告書にも収められている。1.理論研究においては、(1)欧米のエイジング教育および高齢者教育の文献を中心に、とくに高齢者への学習支援方法のあり方の整理、(2)欧米および日本の高齢者やシニア向けの大学開放の実践とその理論的根拠の考察、(3)1990年代以降の成人発達論の新展開の整理という3点から研究を進めた。2.実証研究および実践研究においては、まず大阪府老人大学修了者調査結果をもとに、高齢者の老人大学への評価と社会参加活動との関連などの関する論文を日本老年科学会や大阪教育大学の紀要にまとめる作業を行った。一方でそこでの論点を軸にした質問紙調査を台湾で行うため、中国語に翻訳したうえで中正大学高齢者教育研究所に、質問紙を送り調査を進めている段階である。一方で日本の先進的な老人大学などの訪問調査を実施したが、本年度は東京都世田谷区の老人大学や愛知県の老人大学などの実践を参照している。さらに国際調査では、5月にスコットランド・グラスゴーのStrathclyde大学の世界高齢者教育会議に参加し、世界的にみた第三期の大学の発展の可能性を検討した。あわせてロンドン郊外のSuurey大学での大学開放への視察や2007年12月にアメリカ・フロリダのEckert Collegeで開催された世界Positive Aging会議の資料の収集などを行った。1.理論研究においては、(1)欧米の第三期の大学論に関する文献を中心に、とくにそこでの高齢者への学習支援方法とプログラムの整理、(2)日本の高齢者やシニア向けの学習機会、とくに高齢者大学と大学開放の理論的根拠の考察、(3)ポール・バルテスやシェリー・ウィリスらの2000年代以降の生涯発達論の論の内容の整理という3点から研究を進めた。2.実証研究および実践研究においては、まずこれまでの知見をふまえて、高齢者学習支援に関する仮説を立てて、先進的な実践が行われているとされる兵庫県西宮市宮水学園の受講者2000名ていどに対する質間紙調査を実施した。そこでは高齢者大学への参加の理由、学習要求、学習方法への希望、他の学習機会などが調査され、10年前に同高齢者大学で行った調査結果との対比を試みた。この調査結果は、大阪教育大学生涯教育計画論研究室編『高齢者への学習支援に関する調査研究:西宮市宮水学園の事例を中心に』としてまとめている。一方で日本の先進的な高齢者大学などの訪問調査・電話調査なども実施したが、本年度は、熊本県県民カレッジや兵庫県いなみ野学園などの実践を訪問し資料収集とインタビュー調査を行った。さらに日本教育心理学会や日本発達心理学会において、生涯発達心理学の動向に関する資料やコメントなどをも収集した。この結果は、上記報告書や小池・手打編『生涯学習社会の構図』福村出版、2009年4月刊行などに部分的に掲載してい。
緑茶成分エピガロカテキンガレートの結合するアミノ酸配列と抗ガン作用の解析

多くの抗ガン剤が癌細胞にアポトーシスを誘導することが知られているおり、アポトーシス誘導物質には抗癌作用があると期待される。これまでに、緑茶の主要なカテキンであるエピガロカテキンガレート(EGCG)のアポトーシス誘導活性およびそのシグナル伝達を明らかにした。このEGCGによるアポトーシス誘導は白血病U937細胞においてEGCG結合タンパク質であるフィブロネクチンおよびその分解物によって阻害される。そこでEGCG結合カラムを用いてEGCGと結合することが明らかとなったフィブロネクチンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク(HRG)をリジルエンドペプチダーゼによって分解し、マルチプルアライメントすることにより、フィブロネクチンのEGCG結合アミノ酸配列を絞り込んだ。この配列はフィブロネクチンの14番目のIII型リピート内にあるインテグリン機能調節部位に相当し、このドメインのみを293細胞に発現させると、その細胞破砕液はEGCGカラムに結合することが明らかとなった。同様にEGCGの結合が報告されているラミニンレセプター(67LR)においてもEGCG結合配列が予測され、293細胞に発現させた67LRのEGCG結合配列欠失変異体はEGCGカラムに対する結合が抑えられた。以上のように、EGCG結合アミノ酸配列が予測され、その欠失変異体ではEGCGに対する結合が抑えられることから、EGCGとその受容体を介した抗ガン作用のメカニズムを解明する上で重要な情報が得られた。本研究では、フィブロネクチンおよびHRGのEGCG結合アミノ酸配列を同定することによって得られたEGCG結合アミノ酸配列予測法により、EGCGによる抗ガン作用に関与している分子のEGCG結合部位を同定し、その作用機構の一端を明らかにすることを目的とする。フィブロネクチンおよびHRGのEGCG結合アミノ酸配列より得られた情報から、マルチプルアライメントを用いて、フィブロネクチンにおけるEGCG結合アミノ酸配列を絞り込むことに成功した。得られたアミノ酸配列情報に基づき、フィブロネクチンの組換え体を293細胞に発現させ、細胞破砕液に含まれるフィブロネクチンの組換え体がEGCG固定化カラムに結合することをウエスタンブロット法により証明した。この成果は2005年12月に行われた第28回日本分子生物学会年会において発表を行った。ラミニンレセプターを発現させたA549肺ガン細胞において、EGCG刺激による増殖抑制、およびラミニンレセプターとEGCGの結合が報告されている。EGCG結合アミノ酸配列予測法を用いると、確かにEGCG結合アミノ酸配が存在した。しかし、結合予測部位は複数存在し、1つはラミニンレセプターのN末端側細胞内ドメインに存在した。この細胞内ドメインを欠失させたラミニンレセプターを293細胞に発現させ、EGCG固定化カラムを用いてEGCGに対する結合能を野生型のラミニンレセプターと比較したところ、欠失変異体ではEGCGに対する結合能は低下した。現在、ラミニンレセプターに複数存在するEGCG結合部位の欠失箇所を組み合わせた変異体を作製し、EGCG結合部位の同定を試みている。
アフリカトリパノソーマの薬剤標的「シアン耐性酸化酵素」の酵素反応機構の解明

本研究では、アフリカ睡眠病の薬剤標的タンパク質であるトリパノソーマのシアン耐性酸化酵素(TAO)の構造を阻害剤との複合体構造を含む様々な状態で明らかにすることによって、実用的な薬剤候補となる強力な阻害剤の開発を目的としており、以下の成果を上げることができた。TAOの酸化型とアスコフラノン誘導体であるAF2779OHとの複合体構造の構造精密化を終了し、それぞれ2.85, 2.6Å分解能で明らかにすることができた。このTAOの構造は、膜結合型の二核非ヘム鉄タンパク質としては初めての例である(Shiba T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013)。本研究では、アフリカ睡眠病の薬剤標的タンパク質であるトリパノソーマのシアン耐性酸化酵素(TAO)の構造を阻害剤との複合体構造を含む様々な状態で明らかにすることによって、実用的な薬剤候補となる強力な阻害剤の開発を目的としている。以下に本件度の成果を示す。・TAOの酸化型とアスコフラノン誘導体であるAF2779OHとの複合体構造の構造精密化を終了し、それぞれ2.85, 2.6Å分解能で明らかにすることができた。このTAOの構造は、膜結合型のdiironタンパク質としては初めての例である。・TAOと別の阻害剤であるコレトクロリンBとの複合体の構造を2.3Å分解能で明らかにすることができた。これにより、より詳細なTAOと阻害剤の相互作用が明らかになった。これらの構造を比較することにより、阻害剤が結合する前は4つのグルタミン酸残基のみがdiironに配位しており、阻害剤が結合すると1つのヒスチジン残基(His165)がdiironに配位し、大きな構造変化を引き起こすということが明らかになった。また、今回使用した阻害剤AF2779OHは、トリパノソーマに感染させたマウスを完全に治癒することができることを確認しており、実用的な薬剤の候補化合物である。また、アスコフラノンと比較して、より全合成が簡単で安価に合成できる化合物がTAOの酵素活性ををアスコフラノンと同程度阻害することをを明らかにすることができた。また、その化合物とTAOの複合体の構造を2.9Å分解能で解明することができた。これらの構造情報を手掛かりとして、より安価な薬剤の開発を推進することができると考えている。本研究は、アフリカ睡眠病の薬剤標的タンパク質であるトリパノソーマのシアン耐性酸化酵素(TAO)の結晶構造、及びTAOと薬剤のリード化合物である阻害剤との複合体の結晶構造を明らかにすることによって、実用的な薬剤候補となる阻害剤の開発を目的としている。TAOは膜表在型の二核鉄を有するユニークな特徴をもつタンパク質であり、これまでに構造解析の例はない。以下に、本年度及び研究期間全体の成果を示す。・研究期間全体を通じて、TAOの酸化型、TAOとアスコフラノン誘導体であるAF2779OHとの複合体及び別のアフコフラノン誘導体であるコレトクロリンBとの複合体の結晶構造をそれぞれ2.85, 2.6, 2.3Å分解能で結晶構造を決定し、それらの成果をまとめて論文にすることができた(Shiba T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110,4580)。これは、膜表在型の二核鉄タンパク質の構造としては初めての報告である。また、AF2779OHは、トリパノソーマに感染させたマウスを完全に治癒することを確認しているので、実用的な薬剤開発を進める上での重要な成果である。本研究では、アフリカ睡眠病の標的タンパク質であるトリパノソーマのシアン耐性酸化酵素(TAO)の構造を様々な状態で明らかにすることによって、TAOの酵素反応メカニズムを解明して、さらに薬剤の候補となる強力な阻害剤の開発を目的としている。以下に本年度の成果を示す。・TAOの酸化型の結晶構造を鉄の異常分散効果を用いたFe-SAD法により決定し、分解能2.85オングストロームで明らかにすることができた。TAOの構造は、膜結合型のdiironタンパク質としては初めて報告である。TAOは6本のヘリックスから構成されており、結晶中で強固な二量体を形成していた。また、疎水性アミノ酸残基の分布より、2本のヘリックスで構成される膜結合領域を推定できた。さらに、他の水溶性のdiironタンパク質と比較して、TAOは4つのグルタミン酸残基のみがdiironの配位に関与しており、2つのヒスチジン残基は配位結合を形成していないことが分かった。

・TAOとその強力な阻害剤であるアスコフラノン誘導体との複合体の結晶構造を2.6オングストロームで明らかにすることができた。用いたアスコフラノン誘導体は、トリパノソーマを感染させたマウスを完治できるということを確認している。アフコフラノン誘導体はdiiron近傍の疎水性ポケットに結合していることが明らかになった。アスコフラノン誘導体の6員環の部分は、4つの疎水性残基により強固に認識されていることが分かった。また、誘導体の疎水性-tailの領域の認識には、アルギニン118、グルタミン酸215、スレオニン219が主に関与していることが明らかになった。さらに、阻害剤が結合することにより、ヒスチジン165がdiironに配位し、大きな構造の変化が生じていることが分かった。結晶化が成功した当初は分解能が悪く結晶構造解析に難航するかと考えられたが、タンパク質の精製法と結晶化の手法を改良することにより鉄原子の異常分散効果を利用して構造解析に成功することができた。また、コレトクロリンBとの複合体の構造をより精度の高い2.3Å分解能で明らかにすることができた。このことにより、TAOと阻害剤とのより詳細な相互作用様式の情報を得ることができ、より強力な阻害剤の開発のための重要な知見を得ることができた。また、アスコフラノンとは別の骨格をもつ化合物がTAOの酵素活性を効果的に阻害することを見出し、その化合物との複合体の結晶構造も2.9Å分解能で明らかにすることができた。計画では、TAOの酸化型と阻害剤との複合体の構造を明らかにすることを目標としていたが、その両方の構造を分解能3オングストローム以上で明らかにすることができた。その結果、TAOは6本のヘリックスから構成されており、疎水性アミノ酸残基の分布より、2本のヘリックスで構成される膜結合領域などの有益な情報を得ることができた。また、アスコフラノン誘導体との複合体の結晶構造を2.6オングストロームで明らかにすることができ、詳細な阻害剤の認識様式を明らかにすることができ、より強力な阻害剤の開発に重要な知見を得ることができた。今後、以下のような研究を計画している。・得られている多数の複合体との構造情報をもとにインシリコスクリーニングを用いてより強力な抗トリパノソーマ薬の候補化合物を決定する。インシリコスクリーニングの精度を上げるために結晶の分解能の向上にも取り組む。・TAOの酵素反応メカニズムの解明のため、TAOの還元型の結晶構造を明らかにする。また、酸素結合部位を決定するためにアジド化合物との複合体の構造を明らかにする。・得られた多数の阻害剤複合体の構造とインシリコスクリーニングを用いて、より強力な抗トリパノソーマ薬の候補を決定する。インシリコスクリーンの精度を上げるためにも分解能の向上を試みる。・還元型の構造を明らかにする。また、酸素の結合部位を決定するために、アジド化合物との複合体の構造を明らかにする。反応機構の解明のためにも還元型や酸素結合型の結晶構造を明らかにする。・他のアスコフラノン誘導体との複合体の構造を明らかにする。アスコフラノンとは異なる骨格を持つ阻害剤が明らかになり、その阻害剤の認識機構解明のためにも複合体構造を明らかにする。該当なし平成23年度の研究費の繰越すことになった理由は、所属が6月に変わったために、予定していた研究費が使用できるようになったのは9月からで、研究環境を整備するために時間を費やしたために当初の計画より使用した金額は少なくなった。
創傷治癒過程における免疫系細胞の役割についての包括的研究：「創傷免疫学」の確立

前年度までの成果で,単球・マクロファージ系細胞が線維芽細胞による線維化を抑制すること,その抑制作用にはinterleukin-6 (IL-6)が関与していることが示唆されていた。そこで,線維芽細胞に直接IL-6を添加する実験を行った。その結果,IL-6が濃度依存的に線維芽細胞における1型コラーゲンや3型コラーゲン、alpha smooth muscle actin (aSMA)、connective tissuegrowthfactor (CTGF)の発現を抑制する一方、matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)の発現を亢進することが確認された。これは単球・マクロファージ系細胞と線維芽細胞との共培養で認められた現象と同様であり,単球・マクロファージ系細胞がIL-6の分泌を介して線維芽細胞による線維化を抑制しているという機序を支持するものである。さらに,実際の創傷治癒過程における免疫系細胞の関与を調べるため,倫理委員会の承認を得た後,手術時に廃棄される創部肉芽組織をフローサイトメトリーで解析する実験を行った。その結果,肉芽組織中の免疫系細胞の中で単球・マクロファージ系細胞(CD11b陽性,CD14陽性)の占める割合が末梢血と比較して高いこと,また,末梢血中には見られないCD206陽性マクロファージが多く存在していることが確認できた。創傷治癒過程におけるCD206陽性マクロファージの重要性を示唆する結果である。単球・マクロファージ系細胞がIL-6の分泌を介して線維芽細胞による線維化を抑制しているという機序を詳細に解明することができている。また,実際の創傷部位における単球・マクロファージ系細胞の存在をフローサイトメトリーで確認できた意義も大きい。創傷部位に存在し,末梢血中には存在しないCD206陽性マクロファージに注目し,創傷治癒に関連した機能(サイトカイン分泌や遊走能など)についてより詳細な解析を行う予定である。さらに、他の免疫系細胞についても、線維芽細胞や表皮角化細胞との共培養実験を行い、その相互作用を明らかにしていく予定である。創傷治癒過程における単球・マクロファージ系細胞の役割を調べるため、単球・マクロファージ系細胞と線維芽細胞との共培養を行った。単球・マクロファージ系細胞は、過去に当研究室で確立した温度応答性ディッシュを用いた継代培養法を用いて必要な細胞数を得た。その結果、単球・マクロファージ系細胞の存在下では、線維芽細胞における1型コラーゲンや3型コラーゲン、alpha smooth muscle actin (aSMA)、connective tissuegrowthfactor (CTGF)の発現が抑制される一方、matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)の発現は亢進しており、全体として線維化が抑制されていることが判明した。次に、単球・マクロファージ系細胞の培養上清に含まれるサイトカインをサイトカインアレイを用いて網羅的に解析したところ、その培養上清にはinterleukin-6 (IL-6)やmonocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)、growth-related oncogene (GRO)など、多くのサイトカインが含まれていた。その中で、IL-6を線維芽細胞に投与したところ、共培養で見られた線維化抑制と同様の変化が認められた。以上の結果から、単球・マクロファージ系細胞は、IL-6を分泌することにより、線維芽細胞に対して線維化を抑制する働きがあることが示唆された。免疫細胞の中で単球・マクロファージ系細胞が線維化を抑制する働きがあること、さらに、それはIL-6の分泌を介していることが判明した。創傷治癒過程における免疫細胞の役割について、その一部の機序を明らかにできた意義は大きい。

IL-6を介した単球・マクロファージ系細胞による線維化抑制について、阻害実験などを通じてさらにその詳細を明らかにしていく予定である。また、実際の創傷治癒過程におけるIL-6の重要性を確かめるため、マウスを用いたin vivoの実験においてもIL-6の投与や阻害を行い、創傷治癒への影響を確かめる予定である。さらに、他の免疫系細胞についても、線維芽細胞や表皮角化細胞との共培養実験を行い、その相互作用を明らかにしていく予定である。創傷部位に存在し,末梢血中には存在しないCD206陽性マクロファージに注目し,創傷治癒に関連した機能(サイトカイン分泌や遊走能など)についてより詳細な解析を行う予定である。順調に実験が進み、予定より物品の購入が少なく済んだため。また、予定していた旅費の支出がなかったため。今後は、さらに実験を進めていく上で必要な物品の購入や、学会発表、論文投稿の費用に充てる予定である。
生体触媒による反応を利用した生物活性物質の合成研究

種々の生体触媒を用いた反応段階を基盤とし、生物活性物質の合成研究を行った。1)ピルビン酸脱炭酸酵素を用いた炭素-炭素結合形成反応の高効率で行なうためのバイオリアクターの設計、および生成物の光学活性出発原料としての利用:ピルビン酸脱炭酸酵素による反応の際に生じる脱炭酸中間体は,種々のアルデヒドに対し求核付加反応をし、光学活性なケトールが生成する。菌体内では、これがさらに還元された光学活性ジオールが最終生成物となる。しかし、この反応の主生成物は直接の還元体であり、目的化合物との比が2:1程度にしかならないという点に問題があった。この問題に対し、まず1)ピルビン酸を加えて炭素-炭素結合形成を優先的に行なわせ、ついで、2)原料であるアルデヒドが消失した後に糖類を加えてケトールの還元を行なう、という2段階改良法を構築した。2)界面バイオリアクターを利用する単純ケトンの不斉還元を用いた、光学活性アルコールの合成と生物活性物質合成への応用:カルボニル基の両側に非極性のアルキル鎖を有するケトオンオの生物的不斉還元は有用な反応であるが、しかし、基質となる底分子で揮発性が高いケトンは、微生物にとって有害である。今回、寒天培地表面に微生物を繁殖させ、低毒性有機溶媒に溶解したケトンを重層し、菌体内での実質濃度を上げずに反応を行なう界面バイオリアクチタ-を用いる還元について検討した。この方法によって、基質および生成物の毒性を顕著に低下させることに成功した。本反応を鍵段階として、抗菌性を有する微生物代謝産物であるピレノホリンの光学活性体合成に成功した。
新規スレオニン含有リン脂質のマスト細胞における機能と産生機構の解明

マスト細胞は、細胞表面のIgE受容体に結合したIgEが抗原により架橋されると脱顆粒し、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターを放出することにより、様々なアレルギー疾患に関与している。リゾリン脂質の一種であるリゾホスファチジルセリン(lysoPS)はラット腹腔マスト細胞(RPMC)のIgEと抗原により惹起される脱顆粒反応を著しく促進する作用を有することが知られているが、その作用機構については不明な点が多く残されている。我々はこれまでに様々なlysoPS誘導体を有機化学的に作製合成し、マスト細胞上に存在するlysoPS受容体のリガンド認識性について検討した結果、極性頭部にスレオニンを持つリゾリン脂質、リゾホスファチジルスレオニン(lysoPT)がlysoPSよりも十数十倍強い脱顆粒促進活性を有することリゾホスファチジルスレオニン(lysoPT)を見出した。一方、マスト細胞上にはlysoPSに反応性を示すGタンパク質共役型受容体GPR34が発現していることが最近報告され、たが、lysoPSによる脱顆粒促進作用がGPR34を介しているかについては不明であった可能性が示唆された。そこで今回、GPR34のlysoPT応答性を調べたところlysoPTはGPR34に一切反応しなかった。このことから、lysoPSによる脱顆粒促進作用にはGPR34が関与しないこと、マスト細胞にはGPR34と異なるもう一つの未知lysoPS受容体の少なくとも二つのlysoPS受容体が存在することがわかった。GPR34に対するKOマウスの作製に成功した。マスト細胞におけるGPR34の機能については現在解析中である。また、ラット血清中におけるlysoPTの検出に成功し、lysoPTがマスト細胞の脱顆粒促進活性を有する、新規リゾリン脂質性メディエーターである可能性がを示唆されした。
幹細胞間相互作用システムを応用した骨芽細胞ゲルおよび疑似骨髄モデルによる骨再生

マウス皮質骨から間葉系幹細胞(MSCs)を単離し軟骨、骨、脂肪への分化能と長期培養を確認した。さらに皮質骨は骨髄より良好なMSCsの供給源であることおよびプラスチック容器での培養により効率的に造血幹細胞(HSCs)を除去できることを証明した。また塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した培地でMSCsが長期培養できることと、この細胞の移植により生体内で骨再生が可能であることを証明した。本研究は、(I)歯周疾患など小型骨欠損に対する骨芽細胞ゲルによる骨再生システムの開発および(II)腫瘍、外傷などの大型骨欠損に対する新規開発ハニカムBeta-TCP疑似骨髄モデルを応用した大型骨再生システムの開発を目的としている。平成21年度は研究実施計画に従い下記研究を行った。(1)間葉系幹細胞の候補となる細胞の分取および培養。GFPマウス♂5週齢大腿骨、脛骨より骨髄細胞および粉砕骨をコラゲナーゼ酵素処理し得られた細胞を培養した。増殖培地は検討の結果、FBS20%含有alpha-MEM:NIH3T3培養上清=1:1としたものにBasic-FGF, Lifを添加因子として加えたものとした。これによりプラスチックフラスコにて10代以上の継代が可能となった。増殖させた細胞はフローサイトメーターによる解析により、CD29, CD34, CD44, CD45, CD105, Cd117, Scal, Nanogの発現解析をおこない間葉系幹細胞の候補となる細胞を自動細胞分取装置にて分取した。(2)間葉系幹細胞の骨誘導培地での分化誘導および骨関連タンパクの発現の確認上記で得られた細胞をアスコルビン酸、デキサメタゾン、ベータグリセロフォスフェート含有の骨誘導培地にて骨芽細胞へ分化誘導し骨関連タンパクの発現を確認した。骨関連タンパクの発現は、ALP、Type I collagen, Osteocalcin,の免疫組織染色とELIZAにより確認した。こられの結果から、(a)マウスの間葉系幹細胞は骨髄細胞よりも、粉砕骨を酵素処理して得る方が効率的であること。(c)こうしてえられた細胞は骨誘導培地にて骨芽細胞へ分化することが確認された。本研究は、成体幹細胞を用い(I)歯周疾患など小型骨欠損に対する骨芽細胞ゲルによる骨再生システムの開発および(II)腫瘍、外傷などの大型骨欠損に対する新規開発ハニカムBeta-TCP疑似骨髄モデルを応用した大型骨再生システムの開発を目的としている。平成22年度は研究実施計画に従い下記研究を行った。(1)成体間葉系幹細胞のクローニング(2)間葉系幹細胞の骨分化、軟骨分化、脂肪分化の確認上記で得られた5種類の細胞を骨誘導培地、軟骨誘導培地、脂肪分化培地で培養しそれぞれへの分化を確認した。(3)骨再生実験上記で得られた各細胞を骨分化培地で誘導の後、細胞外マトリックス由来ゲル+betaTCPにてペレットを作成し免疫不全マウス皮下に移植すると骨再生を確認した。(4)腫瘍化リスクES細胞や、iPS細胞に比較して癌化のリスクが低いはずの上記5種類の成体幹細胞の癌化実験をおこなった。単純に継代を重ねた細胞を免疫不全マウスの皮下に移植したところクローンによっては癌化が確認された。これらの結果から(a)成体幹細胞の供給源として粉砕骨が有効であること(b)クローンにより骨分化、軟骨分化、脂肪分化へそれぞれ特徴的な分化をしめすこと(c)成体幹細胞といえどもえられたクローンによっては容易に癌化してくることなどが確認された。生体細胞を用いた細胞治療が一部で実用化しているが骨再生に関しては未だ実用化されるものはない.本研究ではマウスより間葉系幹細胞(MSC)を単離しin vitroで増殖後生体へもどし骨再生をはかる骨再生モデルの検討をおこなった.これらの検討から皮質骨は骨髄よりも多くのMSCを供給すること,培地にbFGFを添加することにより有意にMSCの増殖能が上昇することがわかった.しかし得られたMSCを骨誘導培地にて骨芽細胞lineageへ分化させ生体由来ゲルと混和しマウス皮下へ移植した移植実験では骨再生は認めなかった.一方βTCP顆粒と混和した疑似骨髄モデルによる移植実験では骨再生をみとめた.GFPによる解析よりこの再生骨では骨細胞,骨芽細胞はドナー細胞由来であるが,破骨細胞,血管内皮はレシピエント由来であることがわかった.これらの方法と結果はMSCの理解と骨再生へのMSC利用に役立つものと思われる.
時間分解振動分光法による膜蛋白質プロトン輸送ダイナミクスの解明

チトクロムc酸化酵素(CcO)の酸素の水への還元反応とプロトンプロトンポンプの共役機構を解明するため、反応が観測できるフローシステムを開発した。その結果反応初期過程において、ヘムa3とHisの蛋白質ー反応サイト間の相互作用が迅速に変化して酸素親和性を調整するとともに、プロトンポンプ経路上のゲートの開閉を同期して行っていることがわかった。これは実時間で共役機構が実験的に観測された初めての例である。また、酸素がヘムa3に配位する前にCuBに配位して、反応開始のタイミングを調整していることも明らかになった。これらのことは酸素還元反応自体がプロトンポンプ機構を制御していることを示している。チトクロムc酸化酵素(CcO)はミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖末端酵素で、酸素を水にまで還元することでプロトンを膜間輸送しプロトン勾配をつくる機能をもつ。ごく最近申請者らは新規にフェムト秒レーザの超高輝度の赤外パルスを光源として、分散型でマルチチャンネル検出をおこなう赤外分光システムを開発し、水溶液中での蛋白質反応を時間分解測定することに成功した。そこでこのシステムを用いてCcOの酸素還元反応を測定し、それと共役した(この酵素の機能である)プロトンポンプ反応における蛋白質構造ダイナミクスを調べてその詳細の解明を試みた。また、同時に赤外分光と相補的な手段である時間分解共鳴ラマン分光法を用いてCc OのCO光解離反応を測定してヘム近傍の反応の素過程に相当する時間での反応のダイナミクスを調べた。まず赤外吸収スペクトルであるが反応は酸素飽和した緩衝溶液とCO型のCcOを混合した後、レーザパルスでCOの光解離を起こして酸素との反応を開始させ、遅延時間をおいた赤外パルス光で構造ダイナミクスを観測する。このためには、蛋白質溶液をフローさせなければならず、赤外で観測可能なフローシステムを開発する必要がある。可視領域の場合と異なり、赤外領域でのフローセルの作製はいくつかの困難な問題点があったが、HPLCの技術などを応用して自家製で目的とする条件を満たすものを完成させた。このセルでは50um厚で、1kHzの繰り返しに耐えうる流速(1ml/min)で、非常に粘度の高い高濃度の蛋白溶液(500uM)をフルーさせることに成功した。さらに酸素還元反応の観測のため光励起による反応開始前に溶液内に酸素を充填してかつごく短時間で測定点に輸送する必要があるが、このようなことを可能にする酸素肺システムの作製と評価を行った。また、同時に赤外分光と相補的な手段である時間分解共鳴ラマン分光法を用いてCcOのCO光解離反応を測定してヘム近傍の反応の素過程に相当する時間での反応のダイナミクスを調べた。可視領域の場合と異なり、赤外領域でのフローセルの作製はいくつかの困難な問題点があったが、さまざまな技術などを応用して自家製で目的とする条件を満たすものを完成させた。このようにして完成した酸素肺フローシステムを用いて実際のCcOの酸素還元反応の測定を行った。この結果、反応中間体R,A,P,F,Oの各段階を精密に測定して、そのスペクトルを同定することに成功した。

ごく最近申請者らは新規にフェムト秒レーザの超高輝度の赤外パルスを光源として、分散型でマルチチャンネル検出をおこなう赤外分光システムを開発し、水溶液中での蛋白質反応を時間分解測定することに成功した。そこでこのシステムを用いてCcOの酸素還元反応を測定し、それと共役した(この酵素の機能である)プロトンポンプ反応における蛋白質構造ダイナミクスを調べてその詳細の解明を試みた。また、同時に赤外分光と相補的な手段である時間分解共鳴ラマン分光法を用いてCcOのCO光解離反応を測定してヘム近傍の反応の素過程に相当する時間での反応のダイナミクスを調べた。まず赤外吸収スペクトルであるが反応は酸素飽和した緩衝溶液とCO型のCcOを混合した後、レーザパルスでCOの光解離を起こして酸素との反応を開始させ、遅延時間をおいた赤外パルス光で構造ダイナミクスを観測する。このためには、蛋白質溶液をフローさせなければならず、赤外で観測可能なフローシステムを開発する必要がある。可視領域の場合と異なり、赤外領域でのフローセルの作製はいくつかの困難な問題点があったが、HPLCの技術などを応用して自家製で目的とする条件を満たすものを完成させた。このセルでは50um厚で、1kHzの繰り返しに耐えうる流速(1ml/min)で、非常に粘度の高い高濃度の蛋白溶液(500uM)をフルーさせることに成功した。またこのセルの前段に酸素を供給しうる肺を設置することも行い、かつ再現よく繰り返し測定できる系を設計した。時間分解共鳴ラマン測定では初期過程におけるヘム側鎖や配位子の挙動に興味深い点を見いだした。チトクロムc酸化酵素(CcO)はミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖末端酵素で、酸素を水にまで還元することでプロトンを膜間輸送しプロトン勾配をつくる機能をもつ。ごく最近我々は新規時間分解赤外分光システムを開発し、水溶液中でのCcO反応を時間分解測定することに成功した。そこで2つの相補的な振動分光法であるこの新システムと時間分解共鳴ラマン分光法を駆使してCcOの酸素還元反応の経時変化を調べ、それと共役した(この酵素の機能である)プロトンポンプにおける蛋白質構ダイナミクスの詳細を解明することを目的として研究を行った。まず、酸素還元反応が起こっている状態を実時間の赤外測定ができるように、専用のフローセルの開発を行った。赤外が測定可能なように透過厚が50μmの非常に薄いセルに粘性の高い膜蛋白質を充分迅速にフローさせることに成功し、さらに酸素を系に供給できるシステムも導入して酸素還元反応を観測できることを示した。ラマンと赤外の時間分解測定の結果を総合すると、反応初期過程において、ヘムa3とHisの蛋白質ー反応サイト間の相互作用が迅速(< 1μs)に変化して酸素親和性を調整するとともに、プロトンポンプ経路上のゲートの開閉を同期して行っていることがわかった。これは実時間で共役機構が実験的に観測された初めての例である。また、フローシステムを用いて初期過程を測定したところ酸素がヘムa3に配位する前にCuBに配位して、反応開始のタイミングを調整していることも明らかになった。これらのことは、CuBからヘムa3-Hisを経てhelix Xと呼ばれるα-helixからプロトンポンプのゲートに至るまでに状況をタイミング良く伝えるリレーシステムが存在し、それらが時事刻々の状況を感知した上で適切に電子状態や構造を制御していることを示している。
き裂を有するパネルの圧壊挙動メカニズムの解明

通常のシェル要素では考慮できないき裂部での接触や局所変形を考慮したFEMモデルを構築し、座屈・最終強度解析を行った。さらに、構築したFEMモデルを用いて、き裂面の接触、繰返し荷重、矩形板のアスペクト比、板厚が最終強度に与える影響について明らかにした。主な知見としては、き裂面の接触を考慮することで、圧縮最終強度は無き裂の場合と同程度となることを示したが、座屈変形が生じやすい薄板の場合は、最終強度後の荷重低下はパネルのアスペクト比が大きくなるほど顕著になることが分かった.繰り返し荷重を受ける場合、き裂の存在により引張荷重時に応力集中、開口の開きが影響し、剛性が低下することが分かった。平成27年度には,1)「き裂を有するパネルのシェルーソリッドモデル化」2)「平面シェルのフリーメッシュ法適用」を行った.3)「シェルーソリッドモデルの線形座屈解析を行い,き裂長さの座屈強度におよぼす影響」及び4)「き裂接触や開閉口挙動がパネルの曲げ変形,および座屈・最終強度に及ぼす影響」について調査するとともに,本アプローチの有効性を確認した.また,検証実験のために試実験用試験体の設計を行った.き裂面の接触を考慮しない場合,パネルの座屈荷重はき裂長さに従って大きくなることが分かった.しかしながら,実現象に即して接触を考慮したパネルでは,き裂面での荷重の伝播により無き裂のパネルと同等の座屈荷重となることがわかった.き裂面の接触を考慮しない場合,き裂の存在により最終強度は大幅に低下するが,接触を考慮することで無き裂パネルと同等の最終強度が得られた.よって,従来のShellモデルによる最終強度解析では,過度に安全側の評価を与えている可能性がある.また,これらの挙動はき裂面の接触如何で大きく変化するため,存在するき裂幅の把握が最終強度の評価には重要となることがわかった.上記の内容を国内学会における講演論文にまとめ,雑誌論文に1件(査読中),学会発表に2件を投稿し研究成果の公表に努めた.接触を考慮できるシェルーソリッドを材料および幾何学的非線形を含む問題に適用し,その検証及び現象の把握を行い,効果的な試実験用試験体の設計に時間を要したため,試実験の実施には至らなかった.H28年度は,前年度に弾性解析への有用性を確認したシェルーソリッドモデルを適用し,き裂を有するパネルの弾塑性崩壊解析への適用を可能にした.これにより,き裂面が接触する解析が可能となり,板厚,き裂の長さ・位置をパラメータとしシリーズ計算を実施し,き裂が最終強度の低下へ及ぼす影響を明らかにした.主な知見としては,従来のシェルモデルによるき裂面の接触を考慮しない解析では,最終強度を過度に低く(安全側に)評価している場合があるとことが分かった.また,き裂の位置がパネルの端部に近づくほど,き裂接触面のズレよい大きくなることにより,荷重伝播面積が小さくなることが,最終強度を低下させることが分かった.次に,1/2+1+1/2スパン,1/2+1+1/2ガーダースペースの連続防撓パネルを対象に板厚,き裂の長さ・向きをパラメータとし,弾塑性崩崩壊解析を実施した.主な知見としては,幅方向のき裂では,き裂による最終強度の低下率は,き裂による断面積の低下率とほぼ等価となる.一方,長さ方向のき裂では,最終強度の低下率は,き裂の長さにより一割程度の低下はするが,ある一定の長さになると,頭打ちになることがわかった.最後に,開孔などの不連続を有するパネルを対象に平面シェルのフリーメッシュ法の適用が可能でることを確認した。上記の内容を基に,試験体の設計を行うとともに,講演・論文にまとめ、国内・国外の学会誌論文に4件(査読中),学会発表2件に投稿し、成果の普及に努めた.当初は想定していなかった連続防撓パネルでの崩壊現象までの知見の必要性,メッシュフリー法の有効性の確認をすることができた.数値解析と実現現象のギャップを解消する手法になり得ることを確認できた.平成29年度は、これまでに弾塑性崩壊解析への有用性を確認したシェルーソリッドモデルを適用し、き裂面の接触、繰返し荷重、矩形板のアスペクト比、板厚が最終強度に与える影響について明らかにした。主な知見としては、き裂面の接触を考慮することで、圧縮最終強度は無き裂の場合と同程度となることを示したが、座屈変形が生じやすい薄板の場合は、最終強度後の荷重低下はパネルのアスペクト比が大きくなるほど顕著になることが分かった.次に、繰り返し荷重を想定し、き裂を有するパネルが一定量の引張ひずみを受けた後の圧縮崩壊挙動を解析した.アスペクト比が小さい場合、き裂の存在により引張荷重時に応力集中が生じて剛性は低下し、続く圧縮荷重時にもこの影響が見られる.しかしながら一定の圧縮ひずみの後にはき裂面の接触が発生することで剛性は回復し、圧縮のみの最終強度と同程度となる.一方、アスペクト比が大きい場合には、き裂近傍での変形の局所化が見られ、特に薄板のパネルではき裂面の接触が発生せずに最終強度を迎え、その低下量は顕著になることが分かった.併せて、前年度に設計を行った試験体及び試験治具の製作を行い、代表的なケースを対象にき裂を有する矩形板が受けるき裂長さ、繰返し荷重の影響を実験により検証し、数値解析の有用性の確認を行った。

また、講演・論文にまとめ、国内・国外の学会誌論文に3件、学会発表2件に投稿し、成果の普及に努めた。通常のシェル要素では考慮できないき裂部での接触や局所変形を考慮したFEMモデルを構築し、座屈・最終強度解析を行った。さらに、構築したFEMモデルを用いて、き裂面の接触、繰返し荷重、矩形板のアスペクト比、板厚が最終強度に与える影響について明らかにした。主な知見としては、き裂面の接触を考慮することで、圧縮最終強度は無き裂の場合と同程度となることを示したが、座屈変形が生じやすい薄板の場合は、最終強度後の荷重低下はパネルのアスペクト比が大きくなるほど顕著になることが分かった.繰り返し荷重を受ける場合、き裂の存在により引張荷重時に応力集中、開口の開きが影響し、剛性が低下することが分かった。出来るだけ早い段階で試実験用試験を製作し,試実験を実施することとする.また,試実験により,試験体の設計が適切であることが確認されたら,速やかに本実験用試験体の製作にとりかかる.数値解析で得た知見を確認できる試験体をできるだけ早く製作するとともに,実験を実施する.更に,数値解析上でき裂幅が最終強度へ及ぼす影響を実験により確認する,.船舶海洋工学接触を考慮できるシェルーソリッドを材料および幾何学的非線形を含む問題に適用し,その検証及び現象の把握を行い,効果的な試実験用試験体の設計に時間を要したため,試実験の実施には至らなかった.そのため,試実験用試験体の製作費が未使用となった.1/2+1+1/2スパン,1/2+1+1/2ガーダースペースの連続防撓パネルを対象に板厚,き裂の長さ・向きをパラメータとし,弾塑性崩崩壊解析を実施した結果,実船殻構造でのき裂の影響を把握するためには,試験体は連続防撓パネルとする必要性が出てきたため,試験体の設計を再検討する必要性がでてきた.そのため,試験体製を次年度に見送った.出来るだけ早い段階で試実験用試験を製作し,試実験を実施することとする.また,試実験により,試験体の設計が適切であることが確認されたら,速やかに本実験用試験体の製作にとりかかる.H29年度に入ったら,できるだけ早い段階で,試験体製作及び試験を実施する.
付着細菌における抗菌薬抵抗性のメカニズムの解明

慢性難治性感染症の発症に関与していると考えられる付着細菌の抗菌薬抵抗性のメカニズムを解明する目的で緑膿菌を用いて、関与する遺伝子およびストレス応答系の影響について検討し以下の成果が得られた。1.ストレス応答系の抗菌薬抵抗性に及ぼす影響・緑膿菌PAO1株の付着系及び浮遊系細菌に対するカルバペネム系抗菌薬のMICおよびMBCを測定した結果、付着細菌に対するMBCは浮遊菌に比べ高い抵抗性を示した。また浮遊系においては、定常期の菌は対数増殖期に比べ高い抵抗性を示し、定常期蛋白の発現誘導に関与するrpoS変異株はこの抵抗性を示さないことから、緑膿菌におけるカルバペネム抵抗性にはrpoS遺伝子が何らかの関与をしていることが明らかになった。2.抗菌薬抵抗性に関与する遺伝子について・緑膿菌PAO1株由来のSM7株およびSM21株の染色体上にTn1737KHを挿入した種々の変異株を作成し、その中から浮遊系において親株に比べカルバペネム系抗菌薬添加後の生存率の高い変異株KMX7803株を分離した。この変異は1150kbのORFないに存在しておりこの遺伝子をtcpと命名し、ノックアウト変異株および相補性試験により、確かに本遺伝子の欠失によってカルバペネム抵抗性が上昇することが明らかになった。・緑膿菌SM7株にTn1737KH挿入変異株ライブラリーの中から付着系において親株よりカルバペネム系抗菌薬biapenemに対する抵抗性が低下した変異株を分離した。この変異遺伝子をbtaと命名し、その塩基配列を解析した。現在その発現調節機構について検討している。慢性難治性感染症の発症に関与していると考えられる付着細菌の抗菌薬抵抗性のメカニズムの解明を目的として,本年度は緑膿菌におけるストレス応答系の薬剤抵抗性におよぼす影響について検討し,以下の結果が得られた.1.緑膿菌PAO1株の付着系および浮遊系細菌に対するカルバペネム系抗菌薬bia-penem(BIPM)のMICおよびMBCを測定した.MICは付着系と浮遊系において差は認められなかったが,付着細菌に対するMBC^<AD>は浮遊菌に比べ128倍の高い抵抗性を示した.2.浮遊系において,定常期の菌は対数増殖期に比べBIPMに対し高い抵抗性を示した.さらに,定常期蛋白の誘導に関与するrpoS遺伝子の変異株ではこの抵抗性を示さないことから,緑膿菌におけるBIPM抵抗性にはrpoS遺伝子が何らかの関与をしていることが示唆された.3.浮遊系における熱ショックの抗菌薬感受性におよぼす影響について検討した結果,30°Cで培養した菌に比べ43°C培養菌はBIPM添加後の集落形成能が高く,BIPM抵抗性にはheat shock遺伝子が関与していると推察された.浮遊細菌が固相表面に付着すると菌体内および表層において生理的変化が認められることから,付着時には何らかの遺伝子発現の誘導が起こり,抗菌薬抵抗性にも影響を及ぼしている可能性が考えられる.現在,付着時の抗菌薬抵抗性の低下したbta変異株を分離し,付着とbta遺伝子の発現誘導との関連性について検討中である.慢性難治性感染症の発症に関与していると考えられる付着細菌の抗菌薬抵抗性のメカニズムを解明する目的で緑膿菌を用いて、関与する遺伝子およびストレス応答系の影響について検討し以下の成果が得られた。本年度は緑膿菌における抗菌薬抵抗性に関与する遺伝子を明らかにするためTn挿入変異株を作成し、βラクタム系およびニューキノロン系の抗菌薬に対する感受性について、浮遊細菌および付着細菌を用いて検討を行い以下の成果を得た。1.Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のSM7株およびSM21株を親株としてTn1737KHを接合伝達によって導入した、Tn挿入変異株ライブラリーの中から、浮遊系においてbiapenem添加後MIC値に差は認められないが生存率が親株に比べ低い値を示す変異株KMX50を得た。この変異をbtaと命名した。bta変異株は付着系においても親株に比ベカルバペネム系抗菌薬に対し抵抗性が低下していた。

2.通常、緑膿菌は浮遊細菌ではMBCはMICと殆ど差は認められないが、Tn挿入変異株ライブラリーの中から、浮遊系においてbiapenem添加後のMBCが高い変異株KMX7803を検出した。この菌株におけるTn挿入部位を含むDNAの塩基配列を決定し、P. aeruginosa PAO1株ゲノムデータベース解析により変異遺伝子と推測されるORFを検出し、この変異遺伝子をtcpと命名した。tcpノックアウト変異株を相同組換えによって作成しTKP011株を得た。この変異株はTn挿入変異株KMX7803と同様の高いMBC値を示し、他のカルバペネム系抗菌薬に対してもbiapenemと同様の抵抗性を示した。また相補性試験によってこのtcp遺伝子が付着細菌に対するMBC値に影響を及ぼしていることが明らかになった。本研究によって緑膿菌における抗菌薬抵抗性に関与している2種の新しい遺伝子btaおよびtcpを見いだした。