hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
P型ATPアーゼの反応機構・細胞内輸送および生理機能

1)胃のプロトンポンプを安定発現させたCHO-K1細胞を構築し、ウアバイン存在下にプロトンポンプがナトリウムポンプの代わりに働きうることを示した。両ポンプの構造の類似性からも妥当な結果である。このような細胞は消化器潰瘍薬の評価系として利用でき、改良する余地はあるが意義深い結果である。2)胃に高発現するブタMat-8の一次構造を決定し、粘液分泌細胞に主に発現していることを示した。Mat-8は1回膜貫通型蛋白であり、胃における胃酸(塩酸)分泌時のCl^-輪送や粘液分泌に果たす役割が興味深い。ナトリウムポンプではMat-8に類似のサブユニットが細胞内ソーテイングや活性制御に関わっている。Mat-8のC末側に赤色蛍光蛋白を融合した形でCOS1細胞に導入した結果、小胞体及びそれとは別の細胞内小胞に発現が見られた。Mat-8は小胞輸送に関係する細胞内膜系に局在し、相互作用する分子や細胞内情報伝達系の作用により細胞膜へ移行し、イオン輸送の制御を行っている可能性がある。プロトンポンプがMat-8と似たどのような分子と相互作用しているのか、また、Mat-8がどのようなP型ATPアーゼと相互作用しているのかを解明するため、酵母ツーハイブリッド法による検討を進め、Mat-8の細胞内領域と相互作用するクローンを複数個得た。これらのcDNAがどのような蛋白をコードしているのかが大変興昧深い。3)プロトンポンプのK^+親和性について、ラットとブタのαとβサブユニットを用いハイブリッド解析を行った。昆虫細胞に発現させた酵素を用いて、リン酸化中間体(EP>の存在量とK^+濃度との関係を調べると、ラットβサブユニットを持つαβ複合体の場合に低濃度のK^+でEPが分解した。αサブユニットに比べβサブユニットは種間での保存性がやや低い。βサブユニットの種による配列の違いがK^+感受性の差を決定していることが示唆された。本課題においては、胃のプロトンポンプ(H^+/K^+-ATPase)およびホスファチジルセリン依存性P型ATPアーゼ(フリッパーゼ)に注目した目標を設定しているが、本年度は以下の二つの研究に進展が見られた。(1)これまで、プロトンポンプの高発現系構築を目指した研究は世界的に困難を極めている。その理由として考えるられるのは、胃酸であるHClの分泌がプロトンポンプとCl^-チャンネルの協調的な作用でおきていることである。そこで、胃に発現するCl^-チャンネルを同定し、その機能をプロトンポンプとの関連で捉える実験を計画した。最初の手掛かりとして、Na^+/K^+-ATPaseやCa^<2+>-ATPase(筋小胞体)で協調的な作用が提案されている、それぞれγサブユニットおよびphospholemanに類似の蛋白質(Cl^-チャンネル活性を持つ)をホモロジークローニングした。二つの蛋白質のアミノ末端側は相同性が高いので、この部位に着目しPCRプライマーを作成した。ブタの胃粘膜cDNAより特異的に増幅した300bP程のDNA断片配列決定を行った結果、88残基からなる1回膜貫通型ポリペプチドをコードしていることがわかった。このポリペプチドは乳癌細胞で見つけられたものと同じであったが、Cl^-チャンネル活性を持つため、胃粘膜でこのものがどのような役割を果たしているか興味深い。(2)プロトンポンプの高発現系構築がうまくいかない理由のもう一つの可能性として、壁細胞機能をもった細胞株を用いていないことがある。

種々特異的な細胞内要素が壁細胞に存在し、それらがプロトンポンプの高発現に役割を果たしている可能性は否定できない。これまで、壁細胞機能をもった細胞株は得られていない。そこで、SV40T抗原トランスジェニックマウスより胃粘膜上皮細胞を得て、壁細胞機能を有する、もしくは壁細胞に分化できるような細胞株を樹立することを計画した。現在までに、マウス反転胃を調製して粘膜細胞を培養する方法論を確立することができた。本年度は以下の二つの研究に進展が見られた。(1)昨年度、マウス反転胃を調製して粘膜細胞を培養する方法論を確立した。本年度は、さらにこの遊離胃粘膜細胞を分画することを考え、パーコールの密度勾配中で細胞を遠心分画した。その結果3層の細胞のバンドが形成した。各層の細胞を分取後mRNAを抽出し、それからcDNAを合成した。種々胃粘膜細胞に特異的に発現するmRNAが知られているが、分取した細胞にそれらが発現しているかどうかPCRにより調べた。その結果、上層にのみH^+/K^+-ATPase(プロトンポンプ)の発現が認められ、この層が壁細胞に富む細胞からなっていると結論した。中間の層では内因子やペプシノーゲン、ムチンが発現しており頚部粘液細胞や主細胞に富む細胞の層であることがわかった。下層にはムチンが発現し表層粘液細胞に富むと考えられた。また次に述べるMat-8も下層に特異的に発現していた。このような分画方法を導入することで、種々胃粘膜細胞の株細胞樹立に道が開けると考えられる。(2)Mat-8を導入したアフリカツメガエル卵母細胞には、Cl^-チャンネル活性が発現する。胃酸であるHClの分泌はプロトンポンプとCl^-チャンネルの協調的な作用でおきていることから、Mat-8の機能は興味深い。(1)の分画手法により、MAt-8はプロトンポンプを発現する壁細胞ではなく、表層粘液細胞で発現することが明らかになった。Mat-8が表層粘液細胞において、HClの分泌と関連してどのような形でCl^-チャンネル活性を示したり制御しているのかが興味深い。(1)昨年度、Mat-8が胃の壁細胞ではなく表層粘液細胞に発現していることを示した。本年度はMat-8の細胞内局在性について検討した。遺伝子操作により、Mat-8のカルボキシ末端側に赤色蛍光蛋白であるDs-Red(Mat8-DsRed)を融合した形で発現するよう、発現プラスミドを構築した。これをCos-1細胞に導入し融合蛋白を一過的に発現させた。蛍光顕微鏡下で融合蛋白質が細胞のどのような部位に存在するのかどうか観察した。その結果、小胞体とさらに小胞体とは別の細胞内小胞に発現が見られた。一方、小胞体に発現が観察されている緑色蛍光を発するTAPL-GFPを共に発現させ、赤と緑の蛍光の局在を比較したところ、明らかにMat8-DsRedは小胞体以外の部位にも発光が見られた。同様の結果は、マウス胃表層粘液細胞由来のGSMO6細胞を用いても得られた。これらの結果より、Mat-8は小胞輸送に関係する細胞内膜系に局在し、相互作用する分子が存在する場合、或いは何らかのシグナルに応答して細胞膜へ移行し、イオン輸送の制御を行っているのではないかと考えられる。
数論的多様体、保型形式の研究

多重ベルヌーイ多項式、荒川-金子ゼータ関数、および標数正のデデキント和の研究を行った。荒川-金子は、多重ゼータ値と多重ベルヌーイ数との関係を明らかにするために新しいタイプのゼータ(荒川-金子ゼータ関数)を導入した。A.Bayadと共同研究を行い、多重ベルヌーイ多項式、フルビッツ型の荒川-金子ゼータを導入してそれらの性質を調べた。この結果は、Kyushu Journal of Mathematicsに論文として発表された。引き続き共同研究を行い、我々の多重ベルヌーイ多項式、ゼータ関数を2種類のタイプに拡張してその性質を研究した。得られた結果は、ベルヌーイ多項式、ゼータ関数のもつ結果を一般化したものであり、様々な応用が期待できる。研究成果の一部は、平成22年10月に京都大学で開催された解析数論研究集会で公表された。次にデデキント和の研究成果について述べる。デデキント和は、デデキントのエータ関数の変換公式を記述するためにデデキントによって導入されて以来、数学の諸分野で利用されている。このデデキント和は、ザギエによって高次元化され、高次元多様体、格子点の研究に応用されている。平成20年度から標数正のデデキント和を研究してきた。我々は標数正の高次元デデキント和を導入して、相互法則、有理性、クノップ恒等式を証明した。さらに一般化高次元デデキント和の導入、およびL関数の特殊値の記述を行った。前年度は岡田の結果からヒントを得て、有限体上のDedekin和を導入して、その相互法則を証明した。また、岡田の結果を拡張して、関数体の格子に付随するDedekin和を導入してその相互法則を証明した。今年度は、それらの結果をいくつかの研究集会、セミナーにおいて公表した。詳細は次の通り。研究については、Dedekin和と保型形式との関係を調べた。その結果、関数体の格子に付随するDedekind和からレベル1のDrinfeld保型形式が得られることをがわかった。また、J.Yu, E.-U. Gekelerらと関数体に関する研究打合せを行った。準保型形式について資料・情報収集を行い、楕円、Drinfeld準保型形式の既知の結果を把握することができた。その他、Bernoulli多項式のq-類似、多重Bernoulli多項式を一般化した一般多重Bernoulli多項式などについても研究打ち合せを行った。今年度は多重ベルヌーイ多項式、荒川一金子ゼータ関数、および標数正のデデキント和の研究を行った。荒川一金子は、多重ゼータ値と多重ベルヌーイ数との関係を明らかにするために新しいタイプのゼータ(荒川一金子ゼータ関数)を導入した。前年度は、A.Bayadと共同研究を行い、多重ベルヌーイ多項式、フルビッツ型の荒川一金子ゼータを導入してそれらの性質を調べた。この結果は、平成23年にKyushu Journal of Mathematicsに論文として発表された。引き続き共同研究を行い、今年度は、我々の多重ベルヌーイ多項式、ゼータ関数を2種類のタイプに拡張してその性質を研究した。このデデキント和は、1970年代にザギエによって高次元化され、高次元多様体、格子点の研究に応用されている。今年度は標数正の高次元デデキント和を導入して、相互法則、有理性、クノップ恒等式を証明した。
接ぎ木と篩管長距離輸送ＲＮＡによる品種改良システムの再構築

申請者らのグループが開発した篩管長距離輸送性RNAを利用した接ぎ木相手へのエピゲノム編集誘導法であるGrIGS(Graft induced gene silencing)システムのアップデートならびに応用性の検証を行った。本システムを利用することで外来遺伝子を含まないエピゲノム編集体の獲得ができるため新規品種改良技術(NBT)の一つとなる。サイレンシングシグナルの一過的発現系の利用と輸送先でシグナルを増幅するシステムを導入することでより効率的にエピゲノム編集を誘導することができた。また、トマトやジャガイモといった作物の内生遺伝子をターゲットとしてエピゲノム編集を誘導することが可能であった。篩管長距離輸送性サイレンシングシグナルの一過的産生ならびにシグナル増幅システムの導入によるGrIGS(Graft induced Gene Silencing)システムのアップデートを目的としている。シグナル増幅システム導入の検証にあたり、まずsiRNAs産生タバコに対して増幅コンストラクトをアグロインフィルトレーションしたところ二次siRNAsの産生によりsiRNAs量の増加が確認された。輸送性については、改良版GrIGSシステムを用いてサイレンシングシグナルを産生し、輸送先と推定される組織(新しく形成されてきた腋芽)から低分子RNAを抽出し次世代シークエンサー解析を行ったところ、輸送先で増幅コンストラクトがサイレンシングシグナルにより分断され二次siRNAs産生へと働いたことが示唆された。そこで、35S:mGFP導入タバコを用いてモデル実験を行った。すなわち、穂木をWT、台木を35S:mGFP導入タバコとする接ぎ木個体を用いて改良版GrIGSシステムによりTGSを発動させ、UV照射によるGFP蛍光のモニタリングにより調査した。その結果、アグロインフィルトレーションによってもTGSを発動させることが可能であり、さらにシグナル増幅コンストラクトを利用することでより効率的になることが示唆された。次に改良版GrIGSシステムがどこまで応用可能か検証するためタバコとトマトの異種間接ぎ木個体を用いて調査を行った。実用化に向けて病原性RNAであるウイロイドの核移行に関わると示唆されるSlVirp1遺伝子を内生遺伝子のターゲットの一つとした。GrIGSシステムによるウイロイド抵抗性付与について検証しており、改良版GrIGSシステムによってもトマトの内生プロモーターにメチル化を誘導することが可能であった。今後、詳細な解析を行いGrIGSシステムの応用性を検証していく予定である。NBTと総称される遺伝子組換え農作物とは異なる育種技術の開発・活用ならびにそれにより作出された“もの"の取扱いについて世界的な興味の対象となっている。申請者らは、組換え体を用いた接ぎ木とRdDMによるエピジェネテッィクな変異(エピゲノム編集)という2つのNBT技術を利用したGrIGS(graft induced gene silencing)システムを開発してきた。本課題では、GrIGSシステムのアップデートとその応用性について検証した。形質転換が容易でありまた一過的発現系の利用が可能であるタバコと同じナス科であるトマトそしてジャガイモとの異種間接ぎ木によりそれぞれの作物にエピゲノム編集可能かどうか調査した。本システムはエピジェネティックな変化の安定・維持などの観点から栄養繁殖性作物への利用が期待されるため、特にジャガイモは最適であると思われる。トマトにおいては、内生遺伝子に対する効果についても評価するため、病原性RNAウイロイドが宿主植物内での核への移行に関わっていると示唆されるVirp1遺伝子についてそのプロモーター領域をターゲットの一つとした。トマト同士での接ぎ木により内生プロモーターへのメチル化誘導が確認されたため、タバコとの異種間接ぎ木個体に対し改良版GrIGSシステムを適用したところこの方法でもメチル化を誘導することが可能であった。ジャガイモにおいても35S:GFP導入個体を作出し、モデル実験としてターゲットである35SプロモーターのsiRNA産生タバコとの異種間接ぎ木を行ったところ、メチル化誘導ならびにmRNA量の減少とGFP蛍光の弱化が観察されたためエピゲノム編集可能であることが判明した。さらに、ジャガイモ側根からの再分化系も開発したため、今後内生遺伝子をターゲットとするエピゲノム編集体の獲得が期待される。当初の計画通り昨年度は、タバコを用いたモデル実験において予想された結果が得られ、さらに次世代シーケンサーによる解析もできたためより優れたデータを得ることができた。また、応用課題についても一定の成果が得られたためおおむね順調に研究は進展しているものと思われる。25年度が最終年度であるため、記入しない。タバコによるモデル実験を経て、トマトやリンゴといった作物に対して応用可能化か評価し応用可能作物種の範囲について検討していく。さらに、篩管長距離輸送シグナルによるエピ変異誘導という軸を中心として、シグナルの一過的産生・篩管長距離輸送RNAモチーフの利用によるにシグナルの増幅・エピ変異誘導メカニズムといったことを調査し、より簡便で効率的な品種改良システムの構築を目指していく。
広範囲小腸切除、小腸移植後の再生に関する研究(腸管上皮増殖因子グリセンチンの効果)

成長期における小腸広範切除術は小腸吸収面積の減少に起因する栄養障害、成長障害を来すため、残存小腸の機能代償を積極的に促す術後療法が望まれる。このような残存小腸の馴化過程に関与するhormonal factorとしては、腸管グルカゴンの主因子であるグリセシチンの効果が期待され、その増殖効果を昨年報告してきた。今回、我々は遺伝子工学的に精製されたヒトグリセシチンを用いて、そのヒト腸管上皮増殖促進効果を種々の条件下でin vitroにその増殖メカニズムを中心に検討した。その結果、1)プレグルカゴンから、プロセッシングを受けグルカゴン、GLP-1、GTP-2は生成される。これら3種のエンテログルカゴンの相乗効果を見ると、グリセシチンとグルカゴン様増殖因子(GLP-2)との細胞増殖相乗効果は認められるが弱いものであり、グリセシチンとGLP-2は異なったレセプタ-を介するが、細胞内で同一の情報系を一部共有し増殖促進効果を示すか、あるいは両者の情報伝達系の活性化がお互いをfeed backして抑制しあう可能性が想定された。2)同様にプレグルカゴンから生成されるグルカゴン様増殖因子(GLP-1)との相乗効果は全く認められず(グルカゴンとGLP-2を加えたものと、これらにさらにGLP-1を加えたものの間にも有意差は認められなかった。)、GTP-1は細胞増殖には関与していないことが想定された。3)増殖因子の差時的な効果からグリセンチンは、competence facorとして本細胞では作用し、G_0からG_1期への移行に関与していることが想定された。今後、グリセンチンのさらなる細胞内増殖情報伝達メカニズムを明らかにする事により臨床的に有用な投与法を検討していく予定である。このような残存小腸の馴化(粘膜上皮細胞増殖)過程に関与するhormonal factorとしては、腸管グルカゴンの主因子であるグリセンチンやEGF、IFG-Iの効果が期待されてきた。我々は遺伝子工学的に精製されたヒトグリセンチンを用いて、そのヒト腸管上皮増殖促進効果を種々の条件下にin vitroでELISA BrdU法による増殖因子添加後24時間のDNA合成量及び、MTT法による生細胞数を計測し検討した。その結果、1)グリセンチンには単独で増殖促進効果があり、その最大の効果は1μg/ml添加時に認められた。(10%胎児ウシ血清(FCS)添加時の約57%)2)EGF(1ng/ml)あるいは、IGF-I(100ng/ml)との相乗効果により10%FCS投与と同等の増殖促進効果が認められた。3)12-O-tetradecanoyl-phorbol(TPA)との相乗効果はないが、PGE1との相乗効果が認められた事から、グリセンチンの作用機序はプロテインキナーゼC(PKC)を介する細胞内情報伝達系での、DNA合成量促進であると推測した。今後、グリセンチンのさらなる細胞内増殖情報伝達メカニズムを明らかにする事により臨床的に有用な投与法を検討し、大量小腸切除による短小腸動物モデルあるいは、長期中心静脈投与により腸管上皮が萎縮した動物モデルに投与しその消化吸収実験を行っていく予定である。
生体関節と人工関節における潤滑機構の解明に関する共同研究

当初案に近い形で本研究を実施し,九州大学からは3名を派遣し,リ-ズ大学からは2名を招へいした.訪英と訪日の機会を有効に活かすために,7月に東京で開催された日本機械学会国際会議において,両大学の研究成果を発表し,9月には,ロンドンで開催された第1回世界トライボロジー会議でも相互の研究成果を発表できた.また,ひきつづきニ-スで開催された医用物理と生体工学に関する世界会議でも村上が成果発表を行った.本研究では,生体関節における潤滑機構の解明と,人工軟骨を有する次世代人工関節の設計指針の確立を主目的として,両大学の共同研究を進めてきた.まず,生体関節の潤滑機構に関しては,リ-ズ大学で進められた弾性流体潤滑の理論的研究や実験的研究と,九州大学における振子試験やラングミュアーブロジェット膜を含む摺動試験の実験的研究とを総括することにより,薄膜条件下の多モード適応潤滑機構の根幹を提示できた.また,歩行条件下における生体関節の潤滑膜の変化をEHL数値解析により求め,潤滑モードの変化を関節モデルのシミュレータ試験と対応づけた.さらに,境界潤滑の影響を摩擦実験と表面解析により評価し,薄膜潤滑時におけるリン脂質や蛋白成分の潤滑効果を実証できた.人工関節に関しては,ポリウレタンやシリコーンゴム,PVAおよびセミIPNハイドロゲル系人工軟骨の物性と歩行条件下における潤滑特性の関連を実験的に評価し,数値解析との対応をつけた.シミュレータ試験による人工関節・人工軟骨のトライボ性能を評価し,とくに人工軟骨については,両大学で共通材料を使用した試験を行い,材料特性や形状設計の影響とヒアルロン酸濃度や蛋白成分,リン脂質の潤滑効果を明らかにした.当初案に近い形で本研究を実施し,九州大学からは3名を派遣し,リ-ズ大学からは2名を招へいした.訪英と訪日の機会を有効に活かすために,7月に東京で開催された日本機械学会国際会議において,両大学の研究成果を発表し,9月には,ロンドンで開催された第1回世界トライボロジー会議でも相互の研究成果を発表できた.また,ひきつづきニ-スで開催された医用物理と生体工学に関する世界会議でも村上が成果発表を行った.本研究では,生体関節における潤滑機構の解明と,人工軟骨を有する次世代人工関節の設計指針の確立を主目的として,両大学の共同研究を進めてきた.まず,生体関節の潤滑機構に関しては,リ-ズ大学で進められた弾性流体潤滑の理論的研究や実験的研究と,九州大学における振子試験やラングミュアーブロジェット膜を含む摺動試験の実験的研究とを総括することにより,薄膜条件下の多モード適応潤滑機構の根幹を提示できた.また,歩行条件下における生体関節の潤滑膜の変化をEHL数値解析により求め,潤滑モードの変化を関節モデルのシミュレータ試験と対応づけた.さらに,境界潤滑の影響を摩擦実験と表面解析により評価し,薄膜潤滑時におけるリン脂質や蛋白成分の潤滑効果を実証できた.人工関節に関しては,ポリウレタンやシリコーンゴム,PVAおよびセミIPNハイドロゲル系人工軟骨の物性と歩行条件下における潤滑特性の関連を実験的に評価し,数値解析との対応をつけた.シミュレータ試験による人工関節・人工軟骨のトライボ性能を評価し,とくに人工軟骨については,両大学で共通材料を使用した試験を行い,材料特性や形状設計の影響とヒアルロン酸濃度や蛋白成分,リン脂質の潤滑効果を明らかにした.当初案に近い形で本研究を実施できたが,総予算や日程調整上の制限などにより,九州大学からは2名を派遣し,リ-ズ大学からは2名を招へいした.リ-ズ大学からは,分担者のフィッシャー教授と,人工関節の摩耗と生体反応を研究している研究協力者のインガム博士が来日した.相互訪問により密接な情報交換が出来たが,本研究では,生体関節における潤滑機構の解明と,人工軟骨を有する次世代人工関節の設計指針の確立を主目的として,両大学の共同研究に着手した.本年度の相互の訪問と討議において,両大学における潤滑機構関連の研究成果について理解を得るとともに,今後の共同研究の指針を協議できた.まず,生体関節の潤滑機構に関しては,リ-ズ大学で進められた弾性流体潤滑,とくにマイクロEHL (micro-elastohydrodynamic lubrication)の理論的研究と,九州大学における振子試験や摺動試験の実験的研究とを総括することにより,薄膜条件下の多モード適応潤滑機構の根幹を提示できた.まず,歩行条件下における生体関節の潤滑膜の変化をEHL数値解析により求め,潤滑モードの変化を関節モデルのシミュレータ試験と対応づけた.さらに,境界潤滑の影響を摩擦実験と表面解析により評価し,薄膜潤滑時における蛋白成分やリン脂質の潤滑効果を実証できた.人工関節に関しては,ポリウレタンやハイドロゲル系人工軟骨の物性と歩行条件下における潤滑特性の関連を実験的に評価し,有効性と問題点を把握した.シミュレータ試験による人工関節・人工軟骨のトライボ性能を評価し,材料特性や形状設計の影響とヒアルロン酸濃度や蛋白成分の潤滑効果を明らかにした.潤滑性能の向上に関して,両大学で共通材料や共通潤滑液を使用した試験を試みつつある.当初案に近い形で本研究を実施できたが,総予算や日程調整上の制限などにより,九州大学からは2名を派遣し,リ-ズ大学からは1名を招へいした.リ-ズ大学からは,分担者のジン講師が来日した.また,リ-ズ大学で開催された第23回トライボロジーに関するリ-ズ-リヨンシンポジウムでは,相互の研究成果を発表した.

本研究では,生体関節における潤滑機構の解明と,人工軟骨を有する次世代人工関節の設計指針の確立を主目的として,両大学の共同研究を進めている.本年度の相互の訪問と討議において,両大学における潤滑機構関連の研究成果について理解を得るとともに,今後の共同研究の指針を協議できた.まず,生体関節の潤滑機構に関しては,リ-ズ大学で進められた弾性流体潤滑の理論的研究や実験的研究と,九州大学における振子試験やラングミュアーブロジェット膜を含む摺動試験の実験的研究とを総括することにより,薄膜条件下の多モード適応潤滑機構の根幹を提示できた.まず,歩行条件下における生体関節の潤滑膜の変化をEHL数値解析により求め,潤滑モードの変化を関節モデルのシミュレータ試験と対応づけた.さらに,環境潤滑の影響を摩擦実験と表面解析により評価し,薄膜潤滑時におけるリン脂質や蛋白成分の潤滑効果を実証できた.人工関節に関しては,ポリウレタンやPVAおよびセミIPNハイドロゲル系人工軟骨の物性と歩行条件下における潤滑特性の関連を実験的に評価し,有効性と問題点を把握した.シミュレータ試験による人工関節・人工軟骨のトライボ性能を評価し,材料特性や形状設計の影響とヒアルロン酸濃度や蛋白成分,リン脂質の潤滑効果を明らかにした.潤滑性能の向上に関して,両大学で共通材料や共通潤滑液を使用した試験を試みつつある.当初案に近い形で本研究を実施し,九州大学からは3名を派遣し,リ-ズ大学からは2名を招へいした.訪英と訪日の機会を有効に活かすために,7月に東京で開催された日本機械学会国際会議において,両大学の研究成果を発表し,9月には,ロンドンで開催された第1回世界トライボロジー会議でも相互の研究成果を発表できた.また,ひきつづきニ-スで開催された医用物理と生体工学に関する世界会議でも村上が成果発表を行った.本研究では,生体関節における潤滑機能の解明と,人工軟骨を有する次世代人工関節の設計指針の確立を主目的として,両大学の共同研究を進めてきた.まず,生体関節の潤滑機構に関しては,リ-ズ大学で進められた弾性流体潤滑の理論的研究や実験的研究と,九州大学における振子試験やラングミュアーブロジェット膜を含む摺動試験の実験的研究とを総括することにより,薄膜条件下の多モード適応潤滑機構の根幹を提示できた.また,歩行条件下における生体関節の潤滑膜の変化をEHL数値解析により求め,潤滑モードの変化を関節モデルのシミュレータ試験と対応づけた.さらに,境界潤滑の影響を摩擦実験と表面解析により評価し,薄膜潤滑時におけるリン脂質や蛋白成分の潤滑効果を実証できた.人工関節に関しては,ポリウレタンやシリコーンゴム,PVAおよびセミIPNハイドロゲル系人工軟骨の物性と歩行条件下における潤滑特性の関連を実験的に評価し,数値解析との対応をつけた.シミュレータ試験による人工関節・人工軟骨のトライボ性能を評価し,とくに人工軟骨については,両大学で共通材料を使用した試験を行い,材料特性や形状設計の影響とヒアルロン酸濃度や蛋白成分,リン脂質の潤滑効果を明らかにした.
金融サービス業者に対する行為規制と民事責任

以下の二つの問題について研究に従事し、一定の成果を得た。(1)金融商品販売業者の説明義務と損害賠償責任を法定した金融商品販売法の問題点を解明した。具体的には、わが国における証券取引と変額保険に関する従来の裁判例ならびにドイツの法状況との比較を行い、以下の結論に達した。(1)業者には顧客の知識、経験、投資目的、財産状態に適した説明を義務付けるべきである。(2)説明義務違反以外の不当勧誘行為(断定的判断の提供、損失保証、強迫まがいの勧誘など)について行為ルールを法定すべきである。(3)適合性原則違反に基づく損害賠償責任を法定し、過失相殺の抑制による投資家保護を図るべきである。(4)説明義務と適合性原則の前提として業者に顧客情報収集義務を課すべきである。(5)説明義務の免除は顧客に説明の必要性がない場合に限定すべきであり、顧客の意思表明のみによる免除を認めるべきではない。研究成果として、「金融商品販売法における説明義務と適合性原則」を執筆した。(2)ドイツにおける節税目的の融資一体型不動産投資について、投資資金を融資した金融機関の民事責任に関する分析を行った。具体的内容は以下の通り。(1)金融機関に対して不動産投資に関する説明義務が課せられる例外的状況の類型化。(2)仲介業者を金融機関の履行補助者と位置付けることの可否。(3)投資事業が破綻した場合における抗弁接続の可否ならびに抗弁接続を否定する場合の法的根拠。(4)訪問販売形態の勧誘における撤回権(わが国におけるクーリングオフ)の可否ならびに撤回権を否定する場合の法的根拠。以上の点についてドイツの判例学説を考察し、わが国における法制度の不備を指摘した。研究成果として、「ドイツにおける融資一体型不動産投資と金融機関の民事責任」を執筆した。不当勧誘を行った金融商品販売業者(銀行・証券会社・保険会社など)の損害賠償責任について分析を試みた。特に、顧客の知識、経験、投資目的、財産状態などに適合した金融商品の勧誘を業者に要請する「適合性原則」についてアメリカ法とドイツ法との比較を行い、以下の成果を得た。1.説明義務との関係。説明義務は重要な事実を告知する義務であるが、適合性原則は特定の金融商品が顧客に適合するか否かを評価する義務である。アメリカでは「合理的根拠に基づく適合性判断義務」、ドイツでは「投資家に適した助言義務」が業者に課せられている。説明義務は情報収集力の格差を、適合性原則は情報分析力の格差をそれぞれ是正し、ともに自己責任原則の前提を確保するための制度であるが、義務の内容が異なる。2.顧客情報収集義務との関係。適合性判断は合理的根拠に基づくことを要する。そのために、顧客情報収集義務を業者に課すことが不可欠である。3.損害賠償責任の要件と効果。ドイツでは助言義務違反に基づく損害賠償責任が幅広く認められている。アメリカでは、「口座支配(業者の助言に顧客が無批判に追随する状態)」「適合性に関する不実告知あるいは不開示」「詐欺の故意」などの加重要件が課されているため、賠償責任の認定に消極的であるが、チャーニング(過当取引)の法理などによって賠償責任を肯定しているので弊害は少ない。わが国の判例も「明らかに不適合な勧誘」という加重要件を課し、賠償責任の認定に消極的であるが、アメリカとは異なり、他の違法性判断基準が未成熟であるため、被害者の保護に欠ける。4.金融商品販売法との関係。金融商品販売法は適合性原則について業者に勧誘方針の策定と公表を義務付けるに止まったが、取締規定違反による損害賠償責任を定めたドイツ民法823条2項のような規定を持たないわが国の法状況において、適合性原則の遵守と損害賠償責任の明文化が必要である。
ヌクレオチド結晶構造転移の結晶相反応への応用

効率よい反応場設計および、水蒸気圧による分子配列制御の実現のための要件を明らかにすることを目的とし、一連のヌクレオチド結晶構造転移の動的解析を進めてきた。平成8年度(最終年度)においては、1.シチジン5'ーリン酸二ナトリウム(Na_2CMP)結晶について、新たに6.5水和物の結晶構造を決定した。既に解析を終えている9水和物の結晶構造と比較すると、分子層間距離の減少とともに、分子層に数オングストロームオーダーのずれの変位が生じており、水蒸気圧による分子配列制御の可能性が示された。2.粉末結晶混合による固相反応進行の機構を考える上で、結晶への物質(本系では水分子)の侵入、離脱の経路は注目される。チミン2水和物(1)とアデノシン5'ーリン酸のナトリウム塩(Na1.5AMP・7H2O)(2)について、脱水に伴い結晶に生ずる亀裂の成長の時間経過を顕微鏡観察することにより、脱水反応の進行方向と結晶構造の対応を明らかにした。1では結晶構造から予測される通りc軸方向に脱水反応が進行することを確認した。一方、2では結晶構造からはa、b、c軸各方向へ水が抜ける可能性が考えうるが、顕微鏡観察の結果、変化はa軸方向に進行することが明らかになった。また、変化は結晶の欠陥部分から進行し始めることが確認された。3.平成7年度に引き続き、チミン結晶について固相内光反応制御を試みたが、紫外線照射に伴う熱効果による結晶水の離脱が無視できないことが明らかになった。低温実験を計画中である。
PD-1免疫チェックポイント抗体と相乗作用を示す細胞製剤および高低分子製剤の開発

PD-1分子がPD-L1分子と結合し、シグナルが伝達されるとPI3Kシグナルが遮断され、Bcl-XLの機能阻害が起こる。これが、PD-1シグナルの本質的な作用であるが、このPD-1シグナルをブロックすると逆にBcl-XLの機能が回復し、エフェクターT細胞が保護される。これによりエフェクターT細胞数が増加し、抗腫瘍作用が増大する。このメカニズムがPD-1免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果で大きな役割を持つならば、Bcl-XLの機能亢進作用を有する製剤と相乗効果を示すことになる。そこでBcl-XLの機能亢進剤とPD-1免疫チェックポイント阻害剤との相乗作用を検討した。Bcl-XLの機能亢進剤はミトコンドリアに作用し、Bcl-XLの発現を亢進し、細胞保護を行う分子である。このことから、Bcl-XLの機能亢進剤をPD-1免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせることにより、どの程度の抗腫瘍効果の亢進があるのか詳しく検討した。まず、in vitroの検討においては、成人T細胞白血病患者由来の末梢血単核球に第4世代ビスホスホン酸とIL-2/IL-18を作用させ、10日後にATL細胞がどの程度減少しているか検討を行った。次にin vivoの検討においては、担がんマウスに抗PD-1抗体あるいは抗PD-L1抗体を投与し、その際、IL-18投与により腫瘍増殖がどの程度遅延するか検討を行った。また、Bcl-XLの機能亢進剤の4量体の作成を行った。そして、この4量体を用いて、PD-1免疫チェックポイント阻害剤との相乗作用に関して検討を行った。平成29年度は、PD-1免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用を示す高分子製剤の探索を行った。PD-1免疫チェックポイント阻害剤は、Bcl-XLの機能阻害を解除する作用があるため、PD-1免疫チェックポイント阻害剤とBcl-XLの機能亢進剤を併用することにより、PD-1免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍作用が亢進することが予想される。実際、マウスの系においては、PD-1免疫チェックポイント阻害剤とBcl-XL機能亢進剤との併用効果が観察された。平成29年度は、Bcl-XL機能亢進剤の効果をさらに改善するため、Bcl-XL機能亢進剤の4量体化を行った。大腸菌での発現系においては、GGGGSの5xリンカーを用いることにより、4量体形成タンパク質のN末端側にBcl-XL機能亢進作用を有するタンパク質を結合させた。また、培養細胞系では、EBNAタンパク質を導入したエピソーマルベクターを用いて、Bcl-XL機能亢進作用を有する4量体タンパク質の調製を行った。このようにして調製したBcl-XL機能亢進剤4量体とPD-1免疫チェックポイント阻害剤の相乗効果をin vitroの系で検討したところ、T細胞の抗腫瘍作用の亢進が確認された。さらに、in vivoのマウスの系で検討した結果、有意な奏功性の亢進が見られた。以上のように、当初予定していた、Bcl-XL機能亢進剤を用いたPD-1免疫チェックポイント阻害剤の機能亢進に成功した。以上のことより、平成29年度の研究は当初予定していたとおりに進行し、自己評価として、予定通りの進行と判断した。平成30年度は、PD-1免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用を示す低分子製剤の探索を行う。まず、ヒト末梢血に第4世代ビスホスホン酸を作用させ、γδ型T細胞を増殖誘導し、エフェクター細胞として用いる。一方、PD-L1を強制発現させたヒトDaudiバーキットリンパ腫細胞に、テルピリジン誘導体を25μMで作用させ、RPMI1640培地で洗浄した細胞を標的細胞として用いる。アッセイ系としては、標的細胞105個に対して、エフェクター細胞105個を作用させ、60分後に細胞培養上清を回収する。ここに、ユーロピウムを添加することによりキレートを形成させる。このランタノイド系金属を含有するキレートは励起すると時間分解蛍光を発するためバックグラウンドの低い測定が可能になる。この系に低分子化合物ライブラリーを添加することにより、細胞障害性を亢進する化合物の探索を行う。具体的には、東京大学創薬機構の21万種の化合物、京都大学の3万種の化合物、大阪大学の6万種の化合物に加え、長崎大学に保有されている2万種の海洋微生物ライブラリーをスクリーニングすることにより、PD-1免疫チェックポイント阻害剤と併用効果が期待される化合物を取得する。この際、長崎大学に設置された大型創薬スクリーニング機器を用いて、効率的なスクリーニングを行う。このようにしてヒット化合物が得られた場合には、合成最適化を行い、さらに、安全薬理試験も行う。そこでBcl-XLの機能亢進

剤とPD-1免疫チェックポイント阻害剤との相乗作用を検討した。Bcl-XLの機能亢進剤はミトコンドリアに作用し、Bcl-XLの発現を亢進し、細胞保護を行う分子である。このことから、Bcl-XLの機能亢進剤をPD-1免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせることにより、どの程度の抗腫瘍効果の亢進があるのか詳しく検討した。まず、in vitroの検討においては、成人T細胞白血病患者由来の末梢血単核球に第4世代ビスホスホン酸とIL-2/IL-18を作用させ、10日後にATL細胞がどの程度減少しているか検討を行った。次にin vivoの検討においては、担がんマウスに抗PD-1抗体あるいは抗PD-L1抗体を投与し、その際、IL-18投与により腫瘍増殖がどの程度遅延するか検討を行った。また、Bcl-XLの機能亢進剤の4量体の作成を行った。そして、この4量体を用いて、PD-1免疫チェックポイント阻害剤との相乗作用に関して検討を行った。平成29年度は、PD-1免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用を示す高分子製剤の探索を行った。PD-1免疫チェックポイント阻害剤は、Bcl-XLの機能阻害を解除する作用があるため、PD-1免疫チェックポイント阻害剤とBcl-XLの機能亢進剤を併用することにより、PD-1免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍作用が亢進することが予想される。実際、マウスの系においては、PD-1免疫チェックポイント阻害剤とBcl-XL機能亢進剤との併用効果が観察された。平成29年度は、Bcl-XL機能亢進剤の効果をさらに改善するため、Bcl-XL機能亢進剤の4量体化を行った。大腸菌での発現系においては、GGGGSの5xリンカーを用いることにより、4量体形成タンパク質のN末端側にBcl-XL機能亢進作用を有するタンパク質を結合させた。また、培養細胞系では、EBNAタンパク質を導入したエピソーマルベクターを用いて、Bcl-XL機能亢進作用を有する4量体タンパク質の調製を行った。このようにして調製したBcl-XL機能亢進剤4量体とPD-1免疫チェックポイント阻害剤の相乗効果をin vitroの系で検討したところ、T細胞の抗腫瘍作用の亢進が確認された。さらに、in vivoのマウスの系で検討した結果、有意な奏功性の亢進が見られた。以上のように、当初予定していた、Bcl-XL機能亢進剤を用いたPD-1免疫チェックポイント阻害剤の機能亢進に成功した。以上のことより、平成29年度の研究は当初予定していたとおりに進行し、自己評価として、予定通りの進行と判断した。健常人、肺がん患者、成人T細胞白血病患者、乳がん患者から末梢血を取得し、フィコール濃度勾配遠心分離により単核球を調製した。これをYssel培地に懸濁し、PTA/IL-2/IL-18で増殖誘導した。11日間培養後、Vγ2Vδ2型のγδ型T細胞を回収し、細胞表面マーカーの検討を行った。具体的には、CD3、CD4、CD8、Vδ1、Vδ2、CD56、NKG2D、DNAM-1、FasL、TRAIL、CD16、PD-1、PD-L1抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリー解析を行った。次に、PD-L1を発現するDaudiバーキットリンパ腫細胞を用いて、PD-1発現γδ型T細胞の抗腫瘍効果を検討した。
日本列島沿岸域における放射性炭素年代値の海洋リザーバー効果の評価

大気圏内核実験による人為起源放射性炭素の付加によって、現代、炭素リザーバー間の同位体平衡は乱されている。そのため、海洋に溶存する無機炭酸(DIC)における放射性炭素の天然レベルを調べるには、核実験以前(1950年以前)の海洋試料における放射性炭素濃度を測定し、その見かけ上の炭素年代から地域的な補正地を評価する必要がある。このような放射性炭素年代の変動を「放射性炭素年代における海洋リザーバー効果」と呼び、海洋に由来する試料の正確な年代を決定するために、また人為起源放射性炭素をトレーサーとして用いる時の基礎データとして非常に重要である。その地域補正値(ΔR値)は世界中の海域において盛んに研究がなされているが、日本列島をふくむ西部北太平洋域では系統的な研究がされてこなかった。そこで本研究では、昨年度から戦前に採取された海洋生物試料の放射性炭素濃度を測定し、その値を決定することを試みた。さらに、本年度は北海道噴火湾沿岸の貝塚遺跡から出土した動物骨で大気・陸上リザーバーと海洋表層水リザーバーの放射性炭素年代を比較した。これによって過去のリザーバー効果の変遷が復元されると期待される。また、その変遷と地球環境との関連を検討することによって、海洋に関する新たな古環境プロキシとしての有効性を検討した。縄文時代から近世にいたる遺跡から出土したオットセイとシカの骨を比較した結果、一貫してオットセイにおける放射性炭素年代が800年程度古くなることが分かった。その変動の大きさは時代によって有意な相違を示しておらず、約4800年前から現在まで当海域における湧昇の強度は比較的安定であったことが明らかになった。そのため、海洋に溶存する無機炭素(DIC)がそもそも天然でどのような放射能を持っていたかを知るためには、核実験以前(1950年以前)の海洋生物における放射性炭素濃度を測定し、その見かけ上の炭素年代から地域的な補正地を評価する必要がある。海洋試料における放射性炭素年代の変動を、放射性炭素年代における海洋リザーバー効果と呼び、広く世界中の海域においてその地域的な補正値が報告されている。しかしながら、日本列島をふくむ西部北太平洋域ではその正確な補正値が研究されていないため、本研究では戦前に採取された海洋生物試料の放射性炭素濃度を測定することで、その値を決定することを試みた。京都大学地質学教室に保管されていた戦前貝殻コレクションから保存状態が良好で、採取年および採取地が特定できる試料40点を選び、国立環境研究所が所有する加速器質量分析施設を用いてその放射性炭素年代を測定した。その結果、北海道、極東ロシアなど亜寒帯フロント以北の試料ではΔR値で400年前後と大きな補正が必要であることが明らかになったが、本州から沖縄、あるいは赤道太平洋域の試料ではその値にばらつきが大きいことが示された。この結果は化石試料が混入している危険性を示唆しているため、間接が接合する二枚貝、あるいは蓋や軟部標本が伴う試料に限定して研究を進める必要性が明らかになった。
ピッチ/有機金属複合体を出発原料とするメソポア活性炭の開発と応用

希土類金属錯体に加えて他の金属錯体をも含むピッチを用いることにより,金属あるいは金属酸化物微粒子をメソポア中に均一に担持した活性炭の調製を試みた。イットリウムアセチルアセトナートおよび他の金属錯体を含有するピッチをTHFを溶媒として得、さらに水蒸気賦活により活性炭の調製した。イットリウム錯体を含有することによりメソポアが発達した活性炭が得られた。得られた活性炭のEPMA測定結果、イットリウムおよび他の金属種がいずれも均一に炭素中に分布していることが示された。この結果本研究で検討した方法により,メソポアが発達し,かつ貴金属等の金属種を均一に分散した活性炭が得られることが明らかになった。得られたメソポア活性炭の不飽和巨大分子(リノール酸メチルおよび1,3-オクタジエン)の水素添加に対する触媒活性を検討した。PtおよびRh微粒子分散メソポア活性炭は高い活性を示した。一方、市販の活性炭(比表面積が本研究における活性炭に比較して大きい)に貴金属を含浸担持させた活性炭よる触媒活性を調べた。いずれの貴金属においても市販の活性炭において高い触媒活性が認められ、表面積による影響が考えられた。今後本研究での方法による貴金属分散活性炭の調製においては、表面積の増大が重要であることが示唆された。
新しい生理機能を持つNADHoxidase遺伝子のクロ-ニングと機能的発現

NADHoxidaseはNADHを分子状酵素で酸化し、過酸化水素または水を生ずる酵素であるが、その機能及び微生物における生理的役割については不明な点が多い。我々はNmphibacillus xylanusのNADHoxidaseについて研究し、それが菌体内酸化還元バランスの維持、および酸素毒性防御へ直接関与することを明らかにしてきた。一方、本酵素が安定で強力なためバイオセンサ-、バイオリアクタ-への応用も期待され、本酵素反応機構解析と多量生産を図るため、当該酵素遺伝子のクロ-ニングと解析を試みた。今回はこれらについて得られた成果を報告する。1.NADHoxidase全構造遺伝子を含む9kbDNA断片を持つ、大腸菌のクロ-ンを得た。このクロ-ンの全菌体タンパクに対し抗NADHoxidase抗体を用いてMestern blottingを行ったところ、A.xylanusのNADHoxidaseと同じ分子量のバンドが確認された。またNADHoxidase活性の発現も観察された。2.9kb断片のうち、本酵素遺伝子が位置すると考えられる2kb断片の塩基配列を決定したところ、1527bpのOpen reading frameが確認され、A.xylanus NADHoxidaseと同じ分子量(55,000)のタンパクのコ-ドが推定された。3.親株のNADHoxidaseタンパクのN末端アミノ酸配列を16残基決定し、DNA配列より推定されるアミノ酸一次配列と比較した。両者は完全に一致し、全アミノ酸組成も一致した。4.推定された本酵素のアミノ酸一次配列は、BacillusのNADHehydrogenaseの配列と73%の相同性を示し、本NADHoxidaseがNADHdehydrogenase活性を推定されるシステイン残基も複数観察された。本酵素はNADHoxidase活性の他、peroxidase,dehydrogenase活性をも有することが明らかになっている。本酵素の多機能性と今回明らかになった複数の触媒部位について、今後さらに検討してゆきたい。
交尾か拒否かの性行動を選択する神経回路におけるドーパミン信号の分子制御機構の解明

メスは交尾の際、オスの求愛を判断して拒否か受容を決定する。脊椎動物の配偶者選択の場合、大脳基底核線条体のドーパミンシグナル調節がメスの交尾意思の決定に重要であることが知られている。しかし、当該脳領域の動作原理を分子・細胞レベルで理解するには至っていない。そこで我々は、配偶行動の選択判断に関与する脳神経機能を分子レベル・単一細胞レベルの解像度で詳細解析するためには、分子遺伝学的技術が適用可能で、単純な脳神経をもつモデル実験系が適していると考えた。昆虫モデル生物のショウジョウバエのメスは、明確な交尾拒否・受容行動を示し、行動制御の遺伝的な解析が可能である。さらに近年、脊椎動物の大脳基底核と昆虫の中心複合体で構造的、機能的な類似性が提唱されている(Strausfeld and Hirth、Science 2013)。これまでに我々は、中心複合体にメスの交尾判断を制御する神経回路(交尾判断回路)を新規に同定している。この回路についてドーパミンシグナルが神経制御に重要であるなど、脊椎動物の大脳基底核線条体と機能的な類似点も見出している。この神経回路は交尾拒否行動を誘導するR4d神経細胞群と、このR4d神経細胞群を抑制的に制御するR2/R4m神経細胞群で構成されている。したがって、これら2種類の神経細胞群の活性化の制御が、交尾判断機構の中核であると考えられる。本研究は、このR4d・R2/R4m神経細胞群の活動の制御機構を分子細胞レベル明らかにすることを目的とする。本年度は一酸化窒素(NO)を介する逆行性シナプス伝達制御に着目し、分子遺伝学的操作を加えたハエの行動を解析して当該神経回路の動作調節機構の一端を明らかにした。交尾判断回路には、グルタミン酸、NMDA受容体、一酸化窒素合成酵素(NOS)が発現している。交尾判断回路におけるこれら分子群の役割について、逆行性シナプス伝達制御が推察される。そこで、当該遺伝子発現を標的神経細胞群特異的に抑制して、メスの交尾行動を調べることにした。これまでR2/R4m神経細胞群に限局したGal4発現を示すGal4系統が得られていないため、本研究では、2種類のプロモータ活性の共通部分を取り出すSplit-Gal4系統群から目的系統を探索した。Gal4発現パターンを解剖学的に解析した結果、該当するSplit-Gal4系統を1系統得ることができた。既に得ているR4d特異的なGal4系統と上記のR2/R4m神経細胞群に限局したSplit-Gal4系統を標的遺伝子に対するUAS-shRNA系統と組み合わせた。前シナプス側のR2/R4m神経細胞群で小胞グルタミン酸トランスポーター(VGlut)、または、後シナプス側のR4d神経細胞群でNMDAR遺伝子発現を抑制した場合、メスの交尾拒否行動が強まった。さらにNMDA受容体の下流シグナル標的にNOSが知られていることから、(1)Nos遺伝子発現をR4d神経細胞群で抑制、(2)NOシグナルで活性化する水溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)遺伝子発現をR2/R4m神経細胞群で抑制したメスバエの配偶行動を解析した。その結果、(1)、(2)いずれの場合でも、メスの交尾拒否が強まり交尾率が低下した。これらの結果は、R4d神経細胞群のNO逆行性シナプス伝達によってR2/R4m神経細胞群のシナプス放出が促進される可能性を示していた。以上、本年度の成果は、事前の仮説を支持する結果であるとともに、交尾判断回路を構成する神経細胞種の活動に依存して交尾拒否と受容の判断が柔軟に制御される新たな交尾判断回路の分子制御機構が見出だせた意義は大きい。交尾判断回路は、オスのフェロモン情報などで活性化されるドーパミン神経細胞群の制御を受けることをこれまでに明らかにしている。本年度の研究成果で判明した逆行性シナプス伝達機構が、ドーパミン入力を受けた交尾判断回路の活動制御とどの様に相互作用するのか明らかにしたい。さらに上記ドーパミン神経細胞群の活動がペプチドホルモンによって制御されている、予備的な知見を得ている。環境と個体を繋ぐ内分泌因子によって、メスの交尾モチベーションや意思決定が、柔軟性をもって適応的に制御されている可能性が考えられる。そこで、交尾判断回路内部の分子制御機構の解明を進めると共に、ドーパミンを主軸とする回路への入力分子やホルモン等の修飾因子による回路動作制御の解明をすすめる。ドーパミンおよび逆行性シナプス伝達機構については、該当神経細胞群の生理応答をCa2+イメージング法を用いて解析する計画である。また、新規のペプチドホルモンによる回路制御については、遺伝子発現抑制やホルモン産生神経細胞群の分子遺伝学的操作を駆使して、メスの交尾行動解析と組み合わせて機能的に明らかにする計画である。

さらに近年、脊椎動物の大脳基底核と昆虫の中心複合体で構造的、機能的な類似性が提唱されている(Strausfeld and Hirth、Science 2013)。これまでに我々は、中心複合体にメスの交尾判断を制御する神経回路(交尾判断回路)を新規に同定している。この回路についてドーパミンシグナルが神経制御に重要であるなど、脊椎動物の大脳基底核線条体と機能的な類似点も見出している。この神経回路は交尾拒否行動を誘導するR4d神経細胞群と、このR4d神経細胞群を抑制的に制御するR2/R4m神経細胞群で構成されている。したがって、これら2種類の神経細胞群の活性化の制御が、交尾判断機構の中核であると考えられる。本研究は、このR4d・R2/R4m神経細胞群の活動の制御機構を分子細胞レベル明らかにすることを目的とする。本年度は一酸化窒素(NO)を介する逆行性シナプス伝達制御に着目し、分子遺伝学的操作を加えたハエの行動を解析して当該神経回路の動作調節機構の一端を明らかにした。交尾判断回路には、グルタミン酸、NMDA受容体、一酸化窒素合成酵素(NOS)が発現している。交尾判断回路におけるこれら分子群の役割について、逆行性シナプス伝達制御が推察される。そこで、当該遺伝子発現を標的神経細胞群特異的に抑制して、メスの交尾行動を調べることにした。これまでR2/R4m神経細胞群に限局したGal4発現を示すGal4系統が得られていないため、本研究では、2種類のプロモータ活性の共通部分を取り出すSplit-Gal4系統群から目的系統を探索した。Gal4発現パターンを解剖学的に解析した結果、該当するSplit-Gal4系統を1系統得ることができた。既に得ているR4d特異的なGal4系統と上記のR2/R4m神経細胞群に限局したSplit-Gal4系統を標的遺伝子に対するUAS-shRNA系統と組み合わせた。前シナプス側のR2/R4m神経細胞群で小胞グルタミン酸トランスポーター(VGlut)、または、後シナプス側のR4d神経細胞群でNMDAR遺伝子発現を抑制した場合、メスの交尾拒否行動が強まった。さらにNMDA受容体の下流シグナル標的にNOSが知られていることから、(1)Nos遺伝子発現をR4d神経細胞群で抑制、(2)NOシグナルで活性化する水溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)遺伝子発現をR2/R4m神経細胞群で抑制したメスバエの配偶行動を解析した。その結果、(1)、(2)いずれの場合でも、メスの交尾拒否が強まり交尾率が低下した。これらの結果は、R4d神経細胞群のNO逆行性シナプス伝達によってR2/R4m神経細胞群のシナプス放出が促進される可能性を示していた。以上、本年度の成果は、事前の仮説を支持する結果であるとともに、交尾判断回路を構成する神経細胞種の活動に依存して交尾拒否と受容の判断が柔軟に制御される新たな交尾判断回路の分子制御機構が見出だせた意義は大きい。交尾判断回路は、オスのフェロモン情報などで活性化されるドーパミン神経細胞群の制御を受けることをこれまでに明らかにしている。本年度の研究成果で判明した逆行性シナプス伝達機構が、ドーパミン入力を受けた交尾判断回路の活動制御とどの様に相互作用するのか明らかにしたい。さらに上記ドーパミン神経細胞群の活動がペプチドホルモンによって制御されている、予備的な知見を得ている。