hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゾルーゲル法によるセラミックス原料粉体の調製温度のさらなる低減化

ゾル-ゲル反応条件を選択することにより、金属アルコキシドからシリカ及びα-アルミナを可能なかぎり低い温度で調製することを目的として研究を進め、以下の成果が得られた。(1)アルミニウムアルコキシドを塩酸、コランダムシード共存下、0°Cで注意深く加水分解することによって得られるゲルは500°Cで4050%α化することが分かった。(2)アルミノキサンオリゴマーをClが橋かけしている構造単位が、ゲルの低温α化と関係していると考えられた。(3)AlCl_3またはAlを原料として得られるゲルも500°C前後でα化することが分かった。(4)加水分解触媒としてHNO_3を用いるとゲルは800°Cで完全にα化した。(5)生物由来のアモルファスシリカの構造解析を行い、それは常温で生成したにもかかわらず、すでに溶融ガラスとほぼ同じ構造をもつことがわかった。(6)酒石酸共存下でTEOSを加水分解して得られるシリカは、ガラスと類似の構造をもつことが分かり、シリカの常温調製の可能性が示唆された。1.Al(O・secC_4H_9)_3(ASB)/H_2O/C_2H_5OH/HCl溶液を用い、0°CでASBをゆっくりとゾルーゲル反応させて得られるアルミナゲルから、500°C付近でα-Al_2O_3が析出(α化)するという発見をベースに、溶液組成、シード添加、原料種の影響を調べ以下の結果を得た。・ASBに対するH_2Oのモル比50、HClのモル比0.81.0が低温α化に適していることがわかった。・コランダム微粒子をシードとして添加する効果は顕著であり、ゲルの4050%が500600°Cでα化した。・Al(OC_2H_5)_3,Al(O・isoC_3H_7)_3から得られるゲルもASBからのものと殆ど同じ結晶化挙動を示した。また、Al/AlCl_3を原料とした場合にも低温α化及びシード添加効果が認められ、反応途上Al(OC_2H_5)_3が生成するためと考えられた。2.低温でα化するゲルとしないゲルについてX線動径分布解析を行った。その結果、0.30.5mmの中距離範囲の構造、つまりAl-O(OH)多面体のつながり方にわずかな差が認められた。3.シリカガラスを室温付近で得るための参考として、生物体中のシリカの構造をX線解析した。その結果生物シリカはゾルーゲル法で得られるシリカゲルとは異なり常温生成にも関わらずシリカガラス類似の原子スケール構造をもつことが分かった。ゾルーゲル反応条件を選択することにより、金属アルコキシドからシリカ及びα-アルミナを可能なかぎり低い温度で調製することを目的として研究を進め、以下の成果が得られた。(2)アルミノキサンオリゴマーをCl^-が橋かけしている構造単位が、ゲルの低温α化と関係していると考えられた。
高専の特色と目的にかなった英語教育のための教材とカリキュラムに関する研究

本研究は、平成13年度に行った科学研究費補助金による企画調査「高等専門学校の特色を生かした英語教育カリキュラム作成に向けての企画調査(課題番号:13898006)」の成果を受け、高専における英語教育の改善を目指して行うものである。本研究の具体的な目標および実績は、以下の通りである。1.「高専生のための必修英単語リスト」の作成と、これに基づく高専生英単語学習教材の出版2.本研究で開発した教材を利用した、岐阜高専におけるパイロットクラズめ実施3.本研究で開発した教材を利用した、外部からのアクセスが訂能な公開サーバーの設置4.高専IT教育コンソーシァムおよびメディア教育開発センターとの共同による語彙学習用WEBアプリケーションの開発本研究における実践から、本研究で開発中の教材は高専における学生の興味を喚起し、継続的な学習を可能にするものであることがわかった。特に、これらをサーバー上に置いてコンピュータネットワーク上のアプリケーションとして利用するとき、高専の学習環境が利点となって高い効果を発揮することが期待されるということがわかった。特に、本研究の成果として作成・改良された高専生のための必修英単語リストおよびこれを利用したWEBアプリケーションのプロトタイプが高専ITコンソーシアムおよびメディア教育開発センターに評価され、全国の高専、大学をはじめとする英語学習者のためのWEBアプリケーションサーバーとして設置されるという成果を見たことは特筆すべきであると言える。また、平成17年度高等専門学校教員研究集会において、この成果を発表した論文が文部科学大臣賞を受賞したことからも、その価値が認められたと言って良いだろう。平成15年度における主な成果は、以下の通りである。1.「高専生のための必修英単語リスト」の作成2.本研究で開発した教材を利用した、岐阜高専におけるパイロットクラスの実施3.実験教材を利用した、外部からのアクセスが可能な公開サーバーの設置上記の実践から、本研究で開発中の教材は高専における学生の興味を喚起し、継続的な学習を可能にするものであることがわかった。なお、これらの成果については、研究代表者および分担者が、全国英語教育学会、全国高等専門学校英語教育学会等で発表し、一定の評価を受けることができた。平成16年度における主な成果は、以下の通りである。1.前年度に作成した「高専生のための必修英単語リスト」の拡充2.本研究で開発した教材を利用し、岐阜高専に於ける英語授業の本格展開3.上記教材を利用した、公開サーバーの設置と、多高専からの利用の促進4.高専ITコンソーシアムおよびメディア教育開発センターとの共同による語彙学習用WEBアプリケーションの開発上記のように本研究は、前年度の成果を実用に向けて利用、また改良する段階に入ったといえる。特に本研究の成果として作成・改良された高専生のための必修英単語リストおよびこれを利用したWEBアプリケーションのプロトタイプが高専ITコンソーシアムおよびメディア教育開発センターに評価され、全国の高専、大学をはじめとする英語学習者のためのWEBアプリケーションサーバーとして設置されるという成果を見たことは特筆すべきであると言える。

本研究は、平成13年度に行った科学研究費補助金による企画調査『高等専門学校の特色を生かした英語教育カリキュラム作成に向けての企画調査(課題番号:13898006)』の成果を受け、高専における英語教育の改善を目指して行ったものである。平成17年度における主な成果は、以下の通りである。1.本研究で作成した「高専生のための必修英単語リスト」の完成および出版2.本研究で開発した教材を利用し、岐阜高専に於ける英語授業の本格展開3.上記教材を利用した、公開サーバーの設置と、他高専からの利用の促進4.高専ITコンソーシアムおよびメディア教育開発センターとの共同による語彙学習用WEBアプリケーションの開発本研究は、これまでの成果の一部を実用化することができた。特に本研究の成果として作成・改良された高専生のための必修英単語リストおよびこれを利用したWEBアプリケーションがメディア教育開発センターおよび出版者の手を経て広く公開され、全国の高専生の英語学習の助けになることは、本研究者の大きな成果といえる。また、平成17年度高等専門学校教員研究集会において、この成果を発表した論文が文部科学大臣賞を受賞したことからも、その価値が認められたと言って良いだろう。
ヨ-ド造影剤のリスク因子に関する研究

本研究が始った平成元年度は、わが国のヨ-ド造影剤の副作用に関する特筆すべき年であった。それは35万例にも及ぶ症例を用い、イオン性高浸透圧ヨ-ド造影剤と非イオン性低浸透圧ヨ-ド造影剤の副作用の比較検討の日本製のデ-タが世界に認められたからである。このような大規模な比較調査は、この時期をはずして、この種の調査は不可能であったと考えられる。平成元年度は更にデ-タを整理し、綿密な統計処理を行い、世界的著明な学術誌であるRadiologyに発表した(Radiology 175:621ー628,1990)。この論文は現在でも“片山レポ-ト"として国際的に利用されている。平成元年度は、更に低浸透圧造影剤のみに限った小規模な調査に着手した。平成元年度後半以降、米国FDAをはじめ多くの問い合わせが集中したので、平成2年度においては、更にデ-タの統計的分析を行った。特に造影剤の副作用に対するリスク因子を、オッズ比で表わすべく努力を行った。この解析は平成3年度まで継続し、国際的舞台で発表することができた。これはまた高い評価を受け、内容は国際的研究誌に発表した(Investigative Radiology 26(Suppl.1):s33ーs36,1991)。一方、平成元年度に着手した低浸透圧造影剤に限った小規模な調査の結果は、平成2年度に第1報を、更に症例を重ねて第2報を発表することができた(日本医報会誌51(6):632ー642,1991.第2報は同会誌印刷中)。平成元年度平成3年度に至った本研究は、学問的のみならず、臨床面において、更に医療経済の面においても、大きなインパクトを与えるものとして完結した。この他、3年間に本研究の代表者ならびに分担者が関係した論文は16編に及んでいる。ヨ-ド造影剤の副作用のリスク因子をイオン性造影剤169,284例、非イオン性造影剤168,363例を用いて解析した。副作用の全体の発現率はイオン性造影剤で12.66%、非イオン性造影剤で3.13%であった。重篤な副作用はイオン性で0.22%、非イオン性で0.04%であった。症例の背景因子による副作用発現率の解析結果、(1)性差:イオン性造影剤;男性で12.65%、女性で12.61%。非イオン性造影剤;男性で2.93%、女性で3.35%であった。(2)年齢:副作用全体をみると2つの造影剤とも2029歳の年齢層で副作用の発現が最も高かった。重篤な副作用ではイオン性造影剤では1019歳で最も高く、非イオン性造影剤では年齢による差はなかった。(3)副作用歴:イオン性造影剤では副作用歴があるもので44.04%、非イオン性造影剤で11.24%の発現率であった。重篤な副作用では夫々0.73%および0.18%であった。非イオン性造影剤においてはイオン性造影剤の約1/4の副作用発現率である。(4)アレルギ-歴:アレルギ-歴有りの症例ではイオン性造影剤23.35%、非イオン性造影剤で6.85%であった。重篤な副作用でみると前者で0.53%、後者で0.10%であった。

これに対しアレルギ-歴無しのグル-プではイオン性で11.72%、非イオンで0.18%であった。重篤副作用は喘息例で目立った。(5)基礎疾患:重篤副作用は心疾患で目立った。(イオン性造影剤0.53%。非イオン性造影剤0.10%)。(6)造影剤の選択:リスク患者のイオン性造影剤に対するOdds ratioは0.707であった。各リスク因子にOdds ratioはアレルギ-歴0.789、副作用歴0.503、心疾患0.766であった。(7)リスク因子の重なりの影響:副作用歴の有無に影響されている傾向があった。リスク因子には患者のリスク、検査手技のリスク、および造影剤のリスクがある。今回の調査は造影剤の静脈内投与に限って調査したものであり、リスク因子として副作用歴アレルギ-歴、および心疾患を客観的に示し得たものと考えている。今年度は、造影剤の副作用のリスク因子を、更に多数例を使って解析する一方、低浸塔圧造影剤の副作用の発現率について、関連三施設で調査を行い、その安全性を再確認した。リスク因子の統計解析には、337,647例を使ってロジスティック解析法を使った。まず、患者の背景因子についてマ-ジングを行い。夫々のリスクをオッズ比で出した。1.何が重要なリスク因子か?オッズ比で示すと次のとおりであった。非イオン性造影剤は、従来のイオン性造影剤に比べと5.6倍安全である。造影剤副作用の既住のある者は4.7倍、喘息患者では10倍、心疾患を有する者は3倍であった。2.リスク因子が重なった場合の副作用発現率はどうなるか?副作用歴を有する者で、喘息と心疾患があるものでは、イオン性造影剤で12.13%、非イオン性造影剤で2.40%である。副作用歴がない者で、喘息と心疾患を有するものは、イオン性で2.87%、非イオン性で0.52%の副作用発現率である。造影剤使用歴がない者で、喘息・心疾患を有する場合は、イオン性で5.29%、非イオン性で0.99%である。副作用歴有,喘息・心疾患者有の群では、副作用歴無,喘息・心疾患無の群に比べて副作用の発現は120倍である。3.非イオン性造影剤使用で副作用症状がどの程度軽減されるか?急激な血圧低下8.3倍、意識消失7.5倍、心停止7.0倍、呼吸困難4.6倍、以上が主だった結果である。来年度は論文にまとめる予定である。関連三施設での再調査は、すべて低浸透圧造影剤使用であったが、副作用全体の発現率は6.6%であった。重篤な副作用は0であった。詳しいデ-タは既に日医放会誌に投稿、印刷中である。平成2年度までに得られたデ-タの論文掲載と、新しいデ-タの分析、ならびにその論文制作を行った。前者に対しては1991年Contrast Media Research(英国ケンブリッジ市)において発表し、大きな反響を呼んだ。その内容はInvestigative Radiology21巻追補1,S33ー36 1991年11月に掲載された。その内容の概略は以下のごとくである。(1)何が重要なリスク因子か?ヨ-ド造影剤に対する重篤な副作用に対するイオン性高浸透圧造影剤の、非イオン性低浸透圧造影剤のオッズ比は5.61(4.137.63)であった。以下、重篤な副作用に対するLogistic regression Modelで推定されたパラメ-タのオッズ比は、ぜン息/アレルギ-無し;10.09、造影剤に対する副作用歴有り/副作用歴無し;4.68、心疾患/他の疾患;3.02、予備テスト陽性群/陰性群;1.63、造影歴なし/造影剤歴あり、副作用なし;1.89が主なものであった。(2)リスク因子の副作用はどう変わるか?
電子・陽子衝突による素粒子構造の研究の総括

本研究は特定領域研究「電子・陽子衝突による素粒子構造の研究」研究期間終了後の取りまとめであり、成果発表のためのシンポジウムの企画と、研究のまとめの報告書作成が主な研究活動であった。平成16年11月4-6日、栃木県日光霧降高原の「メルモンテ日光霧降」に於いて「物質の創生と発展」と題してシンポジウムを開催した。国内外から研究者55名の参加があった。本研究の無偏極のデータから得られた多くの物理成果と、本研究の最終段階で始まった偏極陽電子・陽子衝突の暫定的な結果を発表した。シンポジウムではこれらの成果発表に加えて、宇宙開闢時の現象論から生物内での「陽子=水素イオン」の役割まで、陽子が役割を握る幅広い研究に関して、最前線の講師により講演をしてもらい、陽子の構造に関してさらに広い領域での研究協力の可能性もあることを確認した。シンポジウムの内容をWeb上に公表した。(http://research.kek.jp/group/zeus/nikko/index-f.htm)特定領域の研究期間を過ぎてから発表した研究論文も含め、昨年末までに作成できなかった報告書の2分冊を作成した。第一分冊では、研究全体の概要と研究の最終年度に達成できた偏極衝突の成果を述べた。もう一冊(第五分冊)には、ジェット生成に関する研究を網羅し、素粒子の標準模型の重要な部分である量子色力学の検証に、我々の電子・陽子衝突実験が大きく貢献してきたことを示した。特に強い相互作用の結合定数の精度よい測定に関して詳細に報告した。ドイツ電子シンクロトロン研究所(DESY)に建設された電子・陽子衝突型加速器HERAを用いて、電子陽子間の相互作用を精密に測定し、新粒子の探索と陽子構造を測定するのがこの研究の目的である。測定に用いるZEUS実験装置は、我々を含む12カ国の国際共同により建設され、順調に稼動中であり、さらなる改良が進められている。平成10年までに収集した陽電子・陽子衝突反応での中性流及び荷電流反応の2階微分断面積を論文として完成した。得られた結果は、標準模型の予想とよく一致し、そこから、新相互作用等の模型に制限を加えることができた。また荷電流反応の結果から、今までのモデルより高い運動量を持つdクォークが多く存在することが示唆された。過去の測定は低エネルギーで原子核を用いたデータであり、核内フェルミ運動の効果を見積もる上で、大きな不安定性がある。我々の結果は、陽子構造を探る上で、高エネルギーの衝突が重要であることをあらためて明らかにし、我々が進めている、高輝度での実験に多くの期待がかかった。ZEUS測定器改良の一環として、我々は高精度シリコン飛跡検出器を平成12年度に設置する。我々は、この測定器の読み出し回路の開発と製作を担当している。試作機の性能検査を年度前半で行い、所定の性能が得られたため実機の開発と製作を開始した。平成12年2月に5台の実機を製作し、その性能検査を進めた。総数40台分の実機製作に必要な、基板製作と部品調達を行い、来年度前半で全数の製作を完了させる目途がついた。ドイツ電子シンクロトロン研究所(DESY)に建設された電子・陽子衝突型加速器HERAを用いて、レプトンとクォーク間の相互作用を精密に測定することがこの研究の目的である。測定に用いる実験装置は、我々を含む12カ国の国際共同実験グループZEUSにより建設し運転中であり、さらなる改良が進められている。今年度は、陽電子・電子衝突の実験を年度当初より9月までほぼ連続して行なった。これに合わせて実験の遂行とデータの解析に必要な人員をDESYに派遣した。データ収集は順調に進み、この2年間で積算ルミノシティ67pb^<-1>を得た。陽子ビームのエネルギーを以前の820GeVから920GeVに上げることで、より高エネルギーの衝突が可能となり、新粒子探索等の感度を上げることができた。今回取得したデータと平成10年度までに収集した陽電子・陽子及び電子・陽子の衝突データをもとに解析を進めており、既に暫定的な結果を6件の国際会議で発表している。前年度に公表した高い運動量移行領域の中性流及び荷電流深非弾性散乱反応の断面積のデータと標準模型との比較から、未知の相互作用に対してどの程度の制限を加えるかを議論した論文を発表するとともに、その結果から、陽子構造を探り内部クォーク・グルーオンの分布を定める作業を進めている。研究を拡張して、より広い運動量移行領域での断面積測定を進め、現在論文を準備している。また、電子・陽子散乱で生成される多くの生成粒子の相関、多重ジェット生成、回折反応などの現象を調べ、量子色力学のモデルとの比較を行った。平成13年度から始まる縦偏極電子と陽子との散乱の準備として、電子偏極度の測定装置の開発を進めるとともに、偏極衝突により、超対称性粒子の検出感度がどう変わるかを理論的に定量的に検討できた。電子・陽子散乱用の事象生成プログラムの作成も進み、ベクター中間子生成に関するプログラムを公表できた。測定に用いるZEUS実験装置は、我々を含む12ヵ国の国際共同実験グループで建設し、さらなる改良が進められている。

今年度は、加速器の高輝度改造に時間がかかり、実験を行わなかったが、高輝度化にあわせて測定器を改良するためと、これまでに収集したデータの解析のために、必要な人員をDESYに派遣した。今までに収集した陽電子・陽子及び電子・陽子の衝突データをもとに解析を進めており、9編の論文を発表した。前年度までに公表した後半な運動量移行領域の中性流及び荷電流深非弾性散乱反応の断面積のデータと標準模型との比較から、陽子構造を探り内部クォーク・グルーオンの分布を定める作業を進めている。陽子内のグルーオン分布をよい精度で求め、低い運動量を担うグルーオンは急激の増加していることを示した。この解析を通して、強い相互作用の結合定数が精度よく求まった。電子・陽子散乱で生成される多くの生成粒子の相関、多重ジェット生成、回折反応などの現象を調べ、量子色力学のモデルとの比較を行った。平成14年春から始まる縦偏極電子と陽子との散乱の準備として、電子偏極度の測定装画の開発、飛跡測定器の新設、トリガー論理の改善を進めるとともに、理論的に、偏極衝突により超対称性粒子の検出感度がどう変わるかを定量的に検討した。電子・陽子散乱用の事象生成プログラムの作成も進み、レプトン対生成に関するプログラムを公表した。ドイツ電子シンクロトロン研究所(DESY)の電子・陽子衝突型加速器HERAを用いて、レプトンとクォーク間の相互作用の精密測定がこの研究の目的である。測定に用いるZEUS実験装置は、我々を含む14カ国の国際共同実験グループで建設し、改良を進めている。加速器の高輝度化改造が完了し、4月より陽電子・陽子衝突を始めたが、バックグランドが多く実験不能の事態が生じた。加速器と実験グループの共同作業で原因の究明にかかり、陽電子からの放射光が多重反射していることが主な原因であることがわかった。このため衝突地点付近のビームライン改造が必要となり、平成15年3月から4ヶ月にわたって実験を中断し改造を行う事となった。今年度の実験はこの調査に時間がかかったのと、低いビーム電流でしか実験ができなかったことで、積算ルミノシティは約1pb^<-1>と予定の0.5%しか得られなかった。このため後半に予定していた研究会の企画は延期した。しかしこのデータは、我々が新しく設置した高精度シリコン飛跡検出器の性能検査、および新しいトリガーシステム、偏極測定装置の調整には十分な量になり、それぞれ設計通りの動作を確認できた。また2月には電子の縦偏極のテストを行い、即座に50%以上の偏極度を達成できたので、改造以後速やかに高輝度偏極実験を始められると期待している。平成12年度までに収集したデータをもとにした物理の解析は順調に進み、17編の論文を発表した。主な成果としては、測定した深非弾性散乱反応の断面積のデータと標準模型との比較から、陽子構造を探り、内部クォーク・グルーオンの分布を精度よく定めたことが上げられる。低い運動量を担うグルーオン分布のQ^2依存性を精度よく求めた。この解析や、多重ジェット生成事象を通して、強い相互作用の結合定数をそれぞれ独立に精度よく求めることができ、普遍性を示した。理論研究班は、量子色力学の高次の効果を含めた事象生成プログラムの開発が進んだ。ドイツ電子シンクロトロン研究所(DESY)の電子・陽子衝突型加速器HERAを用いて、レプトンとクォーク間の相互作用を精密に測定することが、この研究の目的である。
ナノスフィアのゲル化速度最適化の分子設計による非生体材料由来組織接着剤の開発

【方法】1)接着剤の概要:ポリエチレングリコール(PEG)とポリD,L乳酸からなるブロックコポリマーでPEG側末端がアルデヒド基の高分子ミセル(分子量9500)を作成。この高分子ミセルと反応させゲルを形成する塩基性高分子として一級アミノ基を有するポリアリルアミンあるいはポリ(L-リシン)を用いた。2)in vitro試験:両者を37度でマグネチックスターラーで攪拌混合し凝固速度と硬さを観察。高分子ミセル溶液濃度(5,10%),塩基性高分子の分子量(ポリアリルアミン:0.5,1.5,6,15万,ポリ(L-リシン):3,70万),溶液の濃度(0.5,1.0,2.0%),pHを変動させ至適条件を求めた。3)in vivo試験:マウスの肝刺創面及び腹膜面における止血有効性をフィブリン接着剤を対照とし比較。【結果】1)in vitro試験:至適pHはポリアリルアミンでは7.09.6でこれより高いと反応性が高すぎ沈殿は形成するがゲル化しなかった。ポリリシンでは9.010.0が至適であった。分子量はポリアリルアミンでは15万と大きいほど強固なゲルを形成し,ポリリシンでは3万ではゲルを形成せず70万の時にすばやくゲル化することがわかった。粘度はゲルが形成される条件では全て測定限界の40mPas以上を示し,粘度30mPasに到達する時間は凝固実験での至適条件でポリアリルアミンでは2秒以内であったが,ポリリシンでは38秒とやや長時間を要した。至適条件は高分子ミセル濃度10%,ポリアリルアミン分子量15万,濃度1.0%,pH8.0で約1秒でゲルが形成された。ポリ(L-リシシ)を用いても同様なゲル形成挙動を観察した。2)in vitro実験:市販のフィブリン接着剤とほぼ同等の接着性とゲル形成性が確認された。【結論】末端アルデヒド高分子ミセル溶液とアミノ基を有するポリマーによる合成接着剤の有用性が確認された。ポリエチレングリコール(PEG)を主体とした高分子ミセルの溶解液を作成するにあたり、現在臨床で用いられているフィブリン接着剤の粘度に近い溶解液を作成することが、application時の操作性の観点から重要と考えられた。そこで、まず本年度はポリマーの設計に着手する前の基礎評価として、各社のフィブリン接着剤の粘度を計測し、対照としたPEG溶液と比較する実験を行った。山一電機(株)製振動式粘度計ビスコメイトVM-1Gを用いて、サンプル温度は25°Cに設定統一した。対照は、PEG溶液9.0%(w/w)リン酸等量緩衝液中と、高分子ミセル溶液3.8%(w/w)リン酸等量緩衝液である。後者においてミセルを構成するポリマーは、PEGポリ(β-ベンジルL-アスパルテート)ブロックコポリマーである。分子量はPEG部分が12,000で、ポリ(β-ベンジルL-アスパルテート)部分が4,500であり、ブロックコポリマーとしての合計は16,500となる。このブロックコポリマーから有機溶媒DMFを用いた蒸留水への透析によってミセルを形成させた。粒径は測定していないが、50nm付近と思われる。各フィブリン接着剤の粘度は下記のごとくであった。以上の結果より、粘度を規定する会合数(何個の高分子鎖が集まってミセルを形成するか)と臨界ミセル濃度(ミセルを形成し始める濃度)を調節する予定である。ただし、本用途の場合、用いるミセル濃度が比較的高いので臨界ミセル濃度は大きな問題にはならないと考えられる。またミセルを架橋する高分子(1級アミンを多く有する高分子)の量の調節も必要と考えている。

至適条件は高分子ミセル濃度10%,ポリアリルアミン分子量15万,濃度1.0%,pH8.0で約1秒でゲルが形成された。ポリ(L-リシシ)を用いても同様なゲル形成挙動を観察した。2)in vitro実験:市販のフィブリン接着剤とほぼ同等の接着性とゲル形成性が確認された。【結論】末端アルデヒド高分子ミセル溶液とアミノ基を有するポリマーによる合成接着剤の有用性が確認された。
リコモジュリンの抗炎症効果による重症敗血症抑制効果の解析

敗血症時には過剰炎症により全身の血管内皮障害が引き起こされ、多臓器不全が進行する。リコンビナントトロンボモジュリン(rTM)は抗凝固作用に加えて抗炎症作用を有することが知られている。本検討により敗血症マウスと比較しrTM投与マウスでは、LPS投与48時間後の生存率が有意に改善し、心臓、肺、肝臓、腎臓の臓器障害も有意に抑制された。各臓器の微小血管の超微形態を観察すると、敗血症マウスでみられた血管内皮内腔構造の破綻やその表面にある血管内皮グリコカリックスの逸脱がrTM投与マウスで抑制されていた。以上より、rTMを投与することで血管内皮傷害から保護し、生存率の改善に寄与する可能性が示唆された。平成28年度は、まず先行してrTM(リコンビナントトロンボモジュリン)の至適投与量を検討した。すでに確立しているLPS20mg/kgを腹腔内投与して得られる敗血症モデルマウスを用いて、LPS投与後3、24時間後に10mg/kg、30mg/kg、100mg/kgのrTMを投与し、48時間後の生存率を確認した。結果、非治療群の生存率がが25.8%であったことと比較して、各々の生存率が33.3%、66.7%、0%であったことから、rTM30mg/kg投与群で有意に生存率が改善し、さらに高用量のrTMは生存率が低下することが分かった。よってrTMの至適投与量を30mg/kg/回とした。次いで、敗血症群とrTM治療群における多臓器不全の病態解析を行った。LPS投与後48時間で血清を採取し、生化学検査を施行した。血清AST、ALT、BUN、Cre値いずれも敗血症群と比較してrTM治療群は有意に低下していた。また血管内皮傷害のマーカーである血清トロンボモジュリン(TM)と血清HMGB1についても検討し、rTM治療群では敗血症群と比較していずれも有意に低下していた。またTMについては肺、腎臓、肝臓の各臓器で免疫染色を行い、敗血症群と比較して血管内皮にTMが残存していることがわかった。さらに各群の肺、腎臓、肝臓における血管内皮を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。いずれの臓器においても、rTM治療群では敗血症群の血管内皮と比較して、内皮構造が保たれていた。以上より、敗血症時にrTM投与することで内皮傷害を抑制し、生存率の改善に寄与することが示唆された。平成28年度に計画していた内容に加え、一部平成29年度に予定していた内容も含め、計画を推進することができた。本研究の目的は、リコンビナントトロンボモジュリン(以下rTM)の抗炎症作用に着目し、敗血症モデルマウスを用いてrTMが敗血症により生じた臓器不全を抑制することを超微形態を用いて形態学的に検証したうえで、そのメカニズムを分子生物学的に解明することであった。平成28年度はrTMの至適投与量を検討し、研究モデルの検討を行った。LPS20mg/kgを腹腔内投与して得られる敗血症モデルマウスに、rTM治療群にはLPS投与後3、24時間後に30mg/kgのrTMを投与し、48時間後に検討する実験系を確立した。結果、rTM治療群では生存率の改善、血管内皮傷害の抑制、各臓器不全抑制を確認した。平成29年度は、当研究室ですでに確立している血管内皮上に存在する血管内皮グリコカリックスの形態学的観察を用いて、rTMの治療効果を中心として検討した。血管内皮グリコカリックスは血管内皮細胞表面を覆うように多糖類や糖たんぱく質で構成されている層である。この血管内皮グリコカリックスは透過性の調節や微小血管のトーヌスの調節など多岐にわたっており、重要な役割を果たしている。我々は血管内皮グリコカリックスは構造的に不安定であるが、硝酸ランタンを用いた電子染色を行い走査型、透過型電子顕微鏡で描出する手技を確立している。平成28年度と同様の実験系でLPS投与後48時間後に肺、肝臓、腎臓とさらに心臓を加えた血管内皮グリコカリックスを評価した。その結果、各臓器の血管内皮グリコカリックスは敗血症群では脱落していたが、rTM治療群ではその構造は保たれていた。以上より、本研究によってrTMが血管内皮グリコカリックスの傷害を抑制し、さらに生存率の改善に寄与している可能性を見出すことができた。敗血症に対するrTMの治療効果の検討は順調に行うことができた。平成29年度は臓器の血管鋳型サンプルの作製、透過型電子顕微鏡による観察を進めていく。

さらに今後はrTMの作用機序について検討を行っていく予定である。救急医学概ね計画通りの額面を使用できたが、上記額の助成金が余剰となった。次年度に繰り越し、引き続き研究課題の遂行に使用させていただきたい。
悪性脳腫瘍のリボザイムを用いた薬剤耐性克服に関する分子生物学的研究

脳腫瘍細胞のニトロソウレア剤に対する耐性の主因をなす0^6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT)の遺伝子発現を制御する目的で,mRNAの切断作用を有するリボザイムを作成した.対象とした遺伝子配列は,MGMTの遺伝子転写開始部位部位,第4エクソン開始部位,MGMT活性の中心をなす145番目のシステイン塩基近傍の計3カ所であり,それぞれに対する特異的配列を持つリボザイムを5052merのサイズで設計し,pBlueScript IIのMCS(EcoR I site)に導入してin vitro transcriptionを行い,Rz1,Rz2,Rz3を作成した.Cell freesystemの実験系として,MGMT遺伝子のcDNAを組み込んだρKT107(Dr.Mitraより譲渡)からin vitro taranscriptionを行い合成したMGMT mRNA(^<32>P標識)をMgcl_2存在下で,同一モル数のRZ1,Rz2,Rz3のそれぞれと反応させたところ,37°Cの条件下では120minを経過しても明瞭な切断反応は観察されなかったが,温度を60°Cまで上昇させた条件下で反応させると,Rz1,Rz2,Rz3ともにMGMT mRNAに対する特異的切断反応を示し,いずれのリボザイムも反応時間に応じて効率が上昇した.現在,各リボザイム間の切断効率の差を各種条件(温度,濃度,時間,等)を変えて検討している.また,生理的条件である37°Cで反応するリボザイムの設計を新たに行っており,最も切断効率の高いリボザイムが得られた段階で,MGMTが高発現している腫瘍細胞(SF-188,HeLa S3等ニトロソウレア剤に耐性を示す細胞)に導入し,培養細胞系におけるHGMT遺伝子発現抑制によるニトロソウレア剤耐性克服の可能性について検討する予定である.脳腫瘍細胞のニトロソウレア剤に対する耐性の主因をなす0^6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT)の遺伝子発現を制御する目的で,mRNAの切断作用を有するリボザイムを作成した.対象とした遺伝子配列は,MGMTの遺伝子転写開始部位部位,第4エクソン開始部位,MGMT活性の中心をなす145番目のシステイン塩基近傍の計3カ所であり,それぞれに対する特異的配列を持つリボザイムを5052merのサイズで設計し,pBlueScript IIのMCS(EcoR I site)に導入してin vitro transcriptionを行い,Rz1,Rz2,Rz3を作成した.Cell freesystemの実験系として,MGMT遺伝子のcDNAを組み込んだρKT107(Dr.Mitraより譲渡)からin vitro taranscriptionを行い合成したMGMT mRNA(^<32>P標識)をMgcl_2存在下で,同一モル数のRZ1,Rz2,Rz3のそれぞれと反応させたところ,37°Cの条件下では120minを経過しても明瞭な切断反応は観察されなかったが,温度を60°Cまで上昇させた条件下で反応させると,Rz1,Rz2,Rz3ともにMGMT mRNAに対する特異的切断反応を示し,いずれのリボザイムも反応時間に応じて効率が上昇した.現在,各リボザイム間の切断効率の差を各種条件(温度,濃度,時間,等)を変えて検討している.また,生理的条件である37°Cで反応するリボザイムの設計を新たに行っており,最も切断効率の高いリボザイムが得られた段階で,MGMTが高発現している腫瘍細胞(SF-188,HeLa S3等ニトロソウレア剤に耐性を示す細胞)に導入し,培養細胞系におけるHGMT遺伝子発現抑制によるニトロソウレア剤耐性克服の可能性について検討する予定である.
現代教員養成改革の組織文化論的アプローチ研究

現在進行中の教員養成改革において、各教員養成学部・大学がカリキュラム・組織面でいかなる改革を進めようとしてきており、どのような教職専門性等が培われようとしているのかについて、国内外の他大学の動向や勤務校での取り組みをもとに考察した。全体として、教員としての具体的な職務遂行能力の向上を目指す「教職」指向の強まりが指摘でき、カリキュラム面では教員の資質能力指標の開発や教育実習関連科目の充実が見られ、組織面では教員養成を学部全体で推進するセンターの設立等がみられる。ただし、「教職」と「教科」、「研究」と「実践」等をめぐる葛藤を抱えている。2007年度に予定されていた海外調査を、2008年9月に実施した。スウェーデンにおける改革の経緯や教員養成制度の実態などについての資料収集、及び教員養成学部担当者からの聞き取り、実際の授業見学などをおこなった。また、教員養成改革に関する文献収集もあわせておこなった。なお、当初予定されていた教育行政担当者に対する聞き取りについては、対応者との日程調整が難しかったため、次年度以降の課題となった。スウェーデン調査において明らかになったことは、(1)教員養成における研究志向の強まり(ただし、学位を有するスタッフの少なさの問題が一方で指摘されていた)。実際、教育実習とセットになった形で、文献購読などのセミナーが設定されていた。(2)「教科」による規制の強さに起因する教育養成・教員養成学部存立の難しさ。すなわち、既存のアカデミックな学問を前提とした「教科」となっているため、ぺダゴジ-の固有性・独自性が認められにくいこと。(3)ボローニャ協定の影響により、スウェーデンの教員養瑛の在り方に変更を求められており、その改革の最中にあること。などが挙げられる。今回は、予備調査の段階であるため、スウェーデンの教員養成の概況把握にとどまった。今後は、これらの改革がいかなる教員の専門性・専門職性を形成することになるのかなどを考えていきたい。平成20年度は、教員養成の評価(質保証)と組織という点から研究を進めた。国内の動向について、勤務校における教員養成改革の検証などに関わる一方、他のプロジェクトとも関連させながら、教員養成学部としての質保証の観点と組織について検討した。そこでは、学士レベルに共通に求められる水準を基本にしながらも、一定水準の教員の養成をどのようにおこなっていくのか、また教員養成において、理論と実践、教科内容と教科教育法などの往還をどのように図っていくのか、そのための組織をどのように考えていくのかについて検討した。また、平成20年度に予定された海外調査を平成21年に実施した。学士号取得者を対象として教員養成をおこなうことが多いカナダ(トロント大学教育研究院とブリティッシュ・コロンビア大学)を対象として、教員養成カリキュラムとその組織のあり方について調査した。以下の諸点が特に日本の教員養成を考える上で示唆的と思われた。(1)教員養成と教員に関する事項は、大学研究者や学校教員などが関わる独立法人的な機関がおこなっていること。(2)教員養成に携わる組織と研究組織とは相対的に独立しており、前者には少なくとも修士号以上の学位をもった現職教員経験者が多く関わっていること。(3)また教員養成組織そのものの、カリキュラムや教育実習プログラムを企画・管理することに特化したスタッフと、実際の教員養成プログラムや教育実習指導に携わるスタッフとが分化していること。(4)大学と学校との交流があること。たとえば、教員の昇進と大学院プログラム履修との関連性、大学と学校との人事交流(前項(3)の後者のスタッフとして)など。少なくとも、教員養成のあり方を考えていく場合に、組織体制のあり方が、そのカリキュラムの問題とともに重要であり、学校/大学との様々な形での「繋ぎ」が必要と考える。本年度は、カナダ及び国内の教員養成改革に関する調査と、勤務校の教員養成改革をめぐる状況について検討を主としておこなった。前者については、教員養成改革がそれほど声高に叫ばれていないカナダに注目し、現在どのような教員養成カリキュラムと組織のもとでおこなわれているのかについて検討した。カナダの教員養成は、専門学位を有する者に対して、教員免許取得のためのプログラムを12年間おこなうものである。それゆえ、プログラムは教育学・方法的なものが中心で、教科専門等の科目はない。また長期間にわたる教育実習において、段階的に実習生が責任を負う部分を増やす形でおこなわれている。都市部の2大学においては、教員養成に特化したセンターが設立され、実習校や教育委員会等の外部との連携をおこなう等の機能的分化が進んでいる。また教員養成、教員免許、教員研修についても第三者的機関が責任をもち、そこに大学、教育委員会、学校らがかかわる形となっている。一方、東海岸の地方都市に位置する二つの大学においては、前者のような機能分化や第三者的機関は見られず、基本的には大学や教育委員会等の当事者間の関係によっている。

両者の違いは、都市部か否か、それと関連した管理統制を指向する教育改革の経験の有無等に規定されているように思われるが、その違いが教員養成機関に対する信頼の制度化の有無や、教員に求められる専門性の細分化の有無等に影響を及ぼしているように思われる。後者については、この間の勤務校の教員養成改革について、4年次学生に対するアンケートを中心に分析し、教員養成カリキュラムが一定の効果を上げているとともに、さらなる発展のために、より学生たちの教育実習体験を重視した演習中心の授業などを充実させる必要があることを指摘した。それに対応して、教育実習や教職実践演習などを体系的に実施するための専門組織が必要であり、その実施に向かっていることを明らかにした。
重力ストレスで誘発されるラット海馬シナプスの可塑性変化のメカニズム

2G高重力によるラット海馬CA1シナプス可塑性のメカニズムを明らかにする。平成16年度では、脳スライスでホールセルパッチクランプによるEPSC(興奮性シナプス後電流)記録を試みた。パッチ電極を介してシナプス電流の振幅の差を比較解析する予定であったが、スライスでは錐体細胞への焦点調節が困難であり、EPSCを記録することができなかった。平成17年度ではラット個体を用いる方法へ転換し、高重力曝露中の慢性電極ラットの海馬ニューロン活動を記録するテレメトリックシステムを構築した。2G高重力では、1G対照の約3倍にニューロン発火頻度が上昇した。遠心機回転中においてもラット海馬Schaffer側枝への低刺激(1Hz)および高頻度(100Hz)刺激を加え、2G高重力曝露時の海馬CA1シナプス伝達効率のリアルタイム測定に成功した。2G高重力では1Hz刺激時の活動電位振幅-0.9μVに対して100Hz刺激時の活動電位振幅-1.4μVとなり、振幅レベルで160%上昇するearly-phase LTP(長期増強)が発生した(Kumei et al.,2005)。1Gで瞬時周波数が最大2050Hz、平均15Hzであったのに対して2G高重力曝露中は瞬時周波数が最大70100Hz、平均1030Hzに上昇した。2G高重力により、海馬CA1での興奮性シナプス入力が増加したと考えられる。ラット個体を2G高重力に曝露した時のみシナプス伝達効率が上昇し、頭部のみ、あるいは脳スライスだけでは2G高重力による海馬CA1シナプスにLTPが発現せず、シナプス可塑性には下位からの上行性入力が必要であることが示された。メチセルジド投与ラットでは、2G高重力によるシナプス可塑性が増強された。重力情報の記憶・学習に必須の海馬シナプス可塑性は、セロトニン作動性ニューロンによる制御が考えられた。本研究の目的は、2G高重力刺激によるラット海馬シナプスでの長期増強(LTP)の原因が、シナプス前性の変化であるのか、シナプス後性の変化であるのかを区別し、重力ストレスによるラット海馬CA1領域でのシナプス可塑性変化のメカニズムを明らかにすることである。今年度は、タングステン電極をラット海馬CA1に埋入し、この状態でラットを動物遠心機に搭載し、2G高重力に短時間(5分間)曝露した。海馬CA1でのニューロンの発火頻度を遠隔操作によりアンテナ受信し、デジタル変換して記録保存した。その結果、高重力負荷前の1G状態(平静時)に比較して、高重力暴露中は約3倍ニューロンの発火頻度が上昇し、高重力暴露終了とともに直ちにニューロンの発火頻度は平静時の値に復帰することが確認された。重力変化にともなうニューロンの活動性の変化を世界で初めて解析することに成功した。次にラットを屠殺し、直ちに脳スライスを作製し、2G高重力に5分間暴露した。CA1領域シナプスにおいて、錐体細胞のホールセルパッチクランプ法により膜電位固定下にEPSC(興奮性シナプス後電流)を記録した。パッチ電極を介してシナプス後細胞から電位固定条件下で記録し、高重力曝露の有無による、シナプス電流の振幅の差を比較解析する予定であったが、目的とする変化を検出することができず、次年度の課題として残された。

海馬CA1野シナプスにはNMDA受容体とAMPA受容体が共存するが、Schaffer側枝-CA1錐体細胞間では主としてNMDA受容体に依存するLTPが誘導される可能性が高い。次年度では、NMDA受容体イオンチャネルの不可逆的オープンチャネル阻害剤MK-801を用い、開いた受容体チャネルプールが不可逆的に阻害される経過からグルタミン酸放出量を推定する実験を行う計画である。本研究の目的は、2G高重力刺激によるラット海馬CA1領域でのシナプス可塑性変化のメカニズムを明らかにすることである。平成16年度では、海馬を含む脳スライスで、CA1領域シナプスにおける錐体細胞のホールセルパッチクランプ法によるEPSC(興奮性シナプス後電流)記録を試みた。パッチ電極を介してシナプス後細胞から電位固定条件下で記録し、シナプス電流の振幅の差を比較解析する予定であったが、厚さ1.5mmのスライスでは錐体細胞への焦点調節が困難であり、EPSCを記録することができなかった。そこで平成17年度ではラット個体を用いる方法へ転換し、まずラット海馬でのニューロン活動の記録、発信器による無線送信、近傍に設置したアンテナでの受信、アンプ増幅、インタフェースによるアナログ・デジタル変換、ハードディスクへの記録保存、というテレメトリックシステムを構築した。この状態でラットを遠心機に搭載し、2G高重力に曝露した場合、平常時(1G状態)の約3倍にニューロンの発火頻度が上昇することを発見した(Kumei et al.,2005)。次に遠心機回転中においても刺激装置によるラット海馬Schaffer側枝への低刺激(1Hz)および高頻度(100Hz)刺激を1秒間行う方法を開発し、2G高重力曝露中のラット海馬でのLTP(長期増強)を観察した結果、2G高重力曝露10秒後には1Hz刺激時の活動電位振幅平均-0.9μVに対して100Hz刺激時の活動電位振幅平均-1.4μVとなり、振幅レベルで160%上昇するearly-phase LTPが発生した。また2G高重力5分間曝露終了直後では振幅レベルで180%上昇するearly-phase LTPが観察され(Kumei et al.,2005)、重力変化時のニューロン活動のリアルタイム記録に初めて成功し、シナプス可塑性のメカニズムの一部を明らかにした。
Ancrene Wisse英仏電子パラレル版作製と英仏版の語彙比較研究

13世紀の作品であるAncrene Wisseのフランス語版写本であるBritishLibrary, Cotton Vitellius F.viiとTrinity College, Cambridge MS 883 (R.14.7)の、特に誘惑についての章であるPart 4のテキストに関して、その標準版であるEarly English Text Society (EETS)の校訂本をスキャナによりイメージ画像化し、その上で光学的文字認識(OCR)ソフトにより電子テキスト化し、さらに既に入手しているCorpus, Cleopatra, Nero, Vernonの4写本の英語版の電子テキストに対応箇所を並べる作業(alignment)を行ない、パラレルテキストを途中まで作成することが2018年度の予定であった(パラレルテキスト自体は2019年に完成の計画)。計画通り、上記2写本の標準校訂版テキストであるEETS o.s. 219とEETS o.s. 240を使用して、(1)Part 4のテキストをスキャナにより画像化し、さらに、(2)OCRソフトを用いて電子テキスト化する作業を完了した。その上で、作成したフランス語の電子テキストを元々のフランス語校訂版と照合してOCRの読み取りミス等を手作業により修正する作業を行なつつ、そのテキストを英語版の4写本の該当箇所に並べるalignmentの作業を開始、作業を進めている途中であり、Vitellius F.viiについては、約1/3は完了している。本年度の予定ではフランス語版電子テキストと英語4写本の電子テキストの該当箇所を対応させた(aligment)パラレルテキストの作成を途中まで行ない、2019年度にパラレルテキストを完成させる予定であった。電子テキストの作成自体は完了したものの、OCRソフトにより完成した電子テキストと校訂版との照合・修正作業と、また、特にalignmentの作業が計画していたよりも時間を要したため、パラレルテキスト作成は途中までできているものの、当初計画よりもパラレルコーパス作成の進捗が遅れた。Vitellius F.vii.のalignmentの作業(および照合・修正作業)も遅れているが、特に、Trinity College, Cambridge MS 883 (R.14.7)のalignment作業(および照合・修正作業)が遅れている。これは後者の写本の英語テキストとの対応箇所が色々な箇所に分散しているためである。フランス語版の該当箇所の電子テキスト自体は完成しているが、alignmentの作業に予想外の時間を取られており、2019年度のパラレルコーパス完成と、英仏語彙比較研究に支障をきたす状況を避けるための方策として、次の2つの推進方針を考えている。2019年後半以降の語彙研究を円滑に進めるために、まずはVitellius F.vii.のalignment作業に集中し、2019年度途中で同テキストを含むパラレルコーパスを完成させることである。この理由は、Dobson (1962)による写本間の関係を示すstemmaによれば、2写本中Vitellius写本の方が、高い位置を占めており、英語版写本との関係が深いことが知られているためである。これにより、2019年度の後半に行う英仏語彙比較の遂行を確実にしたい。次にTrinity College, Cambridge MS 883 (R.14.7)のテキストのパラレルコーパス化については、同テキストを副次的なものとして扱い、上記のVitellius F.vii.の作業終了後の語彙研究の合間に徐々に進めていくことを計画している。ただし、語彙研究との関係で時間的制約が大きい場合は、同テキストのalignment自体を諦め、パラレルコーパスにしない可能性も残しておく。

これは後者の写本の英語テキストとの対応箇所が色々な箇所に分散しているためである。フランス語版の該当箇所の電子テキスト自体は完成しているが、alignmentの作業に予想外の時間を取られており、2019年度のパラレルコーパス完成と、英仏語彙比較研究に支障をきたす状況を避けるための方策として、次の2つの推進方針を考えている。2019年後半以降の語彙研究を円滑に進めるために、まずはVitellius F.vii.のalignment作業に集中し、2019年度途中で同テキストを含むパラレルコーパスを完成させることである。この理由は、Dobson (1962)による写本間の関係を示すstemmaによれば、2写本中Vitellius写本の方が、高い位置を占めており、英語版写本との関係が深いことが知られているためである。これにより、2019年度の後半に行う英仏語彙比較の遂行を確実にしたい。次にTrinity College, Cambridge MS 883 (R.14.7)のテキストのパラレルコーパス化については、同テキストを副次的なものとして扱い、上記のVitellius F.vii.の作業終了後の語彙研究の合間に徐々に進めていくことを計画している。ただし、語彙研究との関係で時間的制約が大きい場合は、同テキストのalignment自体を諦め、パラレルコーパスにしない可能性も残しておく。校訂本と電子版の照合作業に想定以上の時間を要したために、校訂本と写本の写真版との照合までの作業に移る余裕がなく、写本の写真版の入手にまで手が回らなかった。そのため、写本の写真版購入のために取っておいた費用が残った。
PMA試薬と分子生物学的手法による水系細菌感染リスクの再評価に関する研究

メンブレンフィルタにろ過濃縮した大腸菌にハロゲン光源を使用したPMA-qPCR法を適用する場合の最適条件は、PMA添加濃度50μM、PMA処理時間5分間、ハロゲン光照射時間5分間であった。八戸市周辺の6つの水域の調査では、水環境中で多くの大腸菌がVBNC状態で存在していることが示され、VBNC状態の大腸菌が全大腸菌数に占める割合は2.387.9%となった。LED光源を使用したPMA- qPCR法では、浮遊状態で15分間、メンブレンフィルターにろ過濃縮した場合で40分間の照射時間が必要であり、熱処理した大腸菌が無処理大腸菌濃度の10倍以内であればPMAの分別効果が得られることが分かった。平成25年度は、不活性な大腸菌が大多数を占め濃度も低い水環境試料でも生理的活性のある大腸菌のみを定量できる高感度のPMA-PCR検出法を開発するため、メンブレンフィルタでろ過濃縮した大腸菌にPMA-PCR法を適用して、水環境中に存在するVBNC状態を含む活性のある大腸菌を定量し、従来法と比較しながら大腸菌の挙動を調査した。先ずPMA処理条件を検討した結果、PMA添加濃度50μM、PMA処理時間5分間、ハロゲン光照射時間5分間及びPMA添加回数1回とする方法がPMA処理の最適条件であると判明した。これらの条件を用いてPMA-PCR法をメンブレンフィルタ法に適用した場合の検出感度について検討した結果、無処理大腸菌濃度の100倍まで熱処理した大腸菌が存在してもPMA-PCR法を適用可能なことが分かり従来方法より大幅に感度が改善された。メンブレンフィルタを用いたPMA-PCR法を八戸市周辺の6つの水域サンプルに適用し、水環境中の大腸菌数を計測して従来法の計数結果と比較した。PMA-PCR法の計数値は、PCR法とMPN法の大腸菌数及び糞便性大腸菌群数の中間に位置し、水環境中では多くの大腸菌がVBNC状態で存在していることが示された。PCR法、PMA-PCR法およびMPN法にて計測された大腸菌数を使用してVBNC状態の全大腸菌数に占める割合を計算した結果、2.33%87.9%となった。またPMA-PCR法による大腸菌の計数値は、MPN法とPCR法によって計数された大腸菌数との間にそれぞれ高い相関性が認められた。DNA染色試薬PMAとリアルタイムPCRを組み合わせたPMA-PCR法により生存可能な細菌のみを計数することが可能となったので、平成26年度には、サンプルのPMA処理に従来用いられていたハロゲン光源の代わりにLED光源を使用してPMA処理を行い、リアルタイムPCRと組み合わせてPMA-PCR法の最適条件を検討した。LED光源を使用することで、サンプルの温度上昇が抑えられる。先ず、PMA-PCR法の検出感度に対する増幅対象塩基長の影響を検討するため、遺伝子コピー数と閾値サイクル数の関係を求め、さらに無処理の大腸菌と熱処理した大腸菌の混合比率を変えてPMAーPCR法の効果を検証する実験を行った。また最適なLED光照射時間を決定するためLED光照射時間実験を行った。大腸菌uidA遺伝子について、3種類のプライマーセットの遺伝子コピー数と閾値サイクル数の関係を検討した結果、増幅対象塩基長126bpのプライマーセットが検出に最も適していた。LED光源を用いた場合、PMAーPCR法の最適なLED光照射時間を検討した結果、照射時間15分間が最適であった。この条件を用いてPMAーPCR法の検出感度を検討し、無処理大腸菌濃度の10倍まで熱処理した大腸菌が存在してもPMAの効果があることがわかった。またPCR反応試薬、サルコシル酸塩の添加などについても検討したが感度の改善につながる効果は認められなかった。平成26年度LED光源(白色光)を用いることによってサンプルの劣化が抑えられ、PMA-PCR法の分別効果が確認できたので、平成27年度はPMA試薬に吸収されやすい460470nmの波長を持つ青色LEDを利用したPMA-PCR法の研究開発を行った。河川水など大腸菌濃度が低い場合でも適用可能なように、ろ過濃縮したサンプルを対象に青色LED光照射時間、熱処理菌体濃度、PMA濃度を検討した。最適な青色LED光照射時間は40分間であることが分かり、また熱処理菌体が無処理菌体の100倍以上存在する状態ではPMAの分別効果が限界を示していることが知られた。しかしPMA試薬の添加濃度を検討した実験では、PMA処理を行ったサンプルの閾値サイクル数が無処理菌体と熱処理菌体の間に差がなく同程度の値を示した。これは、無処理菌体がろ過やPMA処理の影響などにより死滅しPMAの分別効果により閾値サイクル数が高く検出されている可能性があることを示している。そこで無処理の大腸菌サンプルに対するPMA処理方法やろ過濃縮方法の影響についてさらに検討した結果、青色LED光照射による影響はなかったが、フィルターによるろ過濃縮が無処理菌体を死滅させている可能性が示された。