hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞がん化過程におけるCOP1によるエネルギー代謝機構のリプログラミング

E3ユビキチンリガーゼCOP1は、発がん・エネルギー代謝経路に関わる。細胞がん化過程で、がん細胞が如何にして増殖に必須の特異的エネルギー代謝機構を獲得するのかを、COP1の発がん・エネルギー代謝両経路を繋ぐ研究から解明することを目的とした。成果として、COP1の新規複合体・標的分解基質群を同定し、COP1が関与する発がん・エネルギー代謝ネットワーク予想図を作成した。さらに、骨髄性白血病関連因子MLF1は、COP1と直接結合しCOP1-Trib1複合体活性を阻害して、C/EBPαの安定化を促しAML発症を抑制することを見いだした。MLF1活性の誘導・安定化はがん治療での応用が見込める。E3ユビキチンリガーゼCOP1の研究から、1)白血病関連MLF1-COP1-p53がん抑制経路の破綻が細胞増殖を促すこと、2)COP1-Trib1複合体によるC/EBPαの分解促進が分化阻害を惹起し白血病発症の原因となること、3)COP1の標的分解因子群は、機能的に例外無く、発がん関連およびエネルギー代謝経路のどちらかあるいは両方に分類されることを見いだした。本研究では、細胞がん化の過程で、がん細胞が如何にして増殖に必須の特異的エネルギー代謝機構を獲得するのかを、COP1の発がん・エネルギー代謝両経路を繋ぐ研究から明らかにすることを目的とした。平成26年度は、COP1関連発がん・エネルギー代謝経路群のネットワークの網羅的検索ならびに解析条件の最適化を主体に研究を進めた。1)COP1の相互作用蛋白質群は共通のアミノ酸配列(COP1結合配列)を有する。この配列を持つ因子群について各種の蛋白質アミノ酸配列検索システムをもちいて網羅的に検索し、興味深い因子群を同定した。2)COP1経路に関与する蛋白質群ネットワークを網羅的に同定するため、さらに、COP1による発がん過程において影響を受ける代謝因子群を同定するため、プロテオーム解析・メタボローム解析を遂行している。解析のための培養系・マウスモデル実験系の最適化条件を設定した。平成26年度に進めたCOP1関連発がん・エネルギー代謝経路群のネットワークの網羅的検索から、多くの新規COP1相互作用蛋白質群と新規機能的COP1複合体群を同定した。平成27年度は、その中から特に興味深いCOP1相互作用蛋白質群と新規機能的COP1複合体群に焦点を絞り、生化学的解析・分子生物学的解析・遺伝子工学的解析(マウスモデル実験系)・各種データベースを用いた統計学的解析等、多方面からの解析方法を駆使して解析を進めている。交付申請書に記載した内容に基づいて、上記平成27年度研究実績の概要に記載した内容まで到達している。ほぼ予定どおりに進行し、おおむね順調に進展している。COP1 ( constitutive photomorphogenic 1 )は、高等植物から哺乳類に至るまで非常に良く保存されたE3ユビキチンリガーゼである。我々は、COP1の研究から、1)白血病関連MLF1-COP1-p53がん抑制経路の破綻が細胞増殖を促すこと、2)COP1-Trib1複合体によるC/EBPαの分解促進が分化阻害を惹起し白血病発症の原因となること、3)COP1の既知の標的分解因子群は、機能的に例外無く、発がん関連およびエネルギー代謝経路のどちらかあるいは両方に分類されることを見いだした。本研究課題により、蛋白質アミノ酸配列検索システム・プロテオーム解析・メタボローム解析等を組み合わせて解析し、COP1の新規複合体・標的分解基質群を同定した。これにより既知・新規関連因子群を俯瞰し、COP1が関与する発がん・エネルギー代謝ネットワーク予想図を作成した。現在、細胞培養系・マウスモデルを用いて解析中である。さらに、COP1上流に位置する骨髄性白血病関連因子MLF1は、COP1との直接結合によりCOP1-Trib1複合体活性を阻害し、C/EBPαの安定化を促しAML発症を抑制することをマウスモデルを用いて明らかにした。また、MLF1欠損マウス骨髄へのCOP1-Trib1複合体導入は、より未分化段階のAML発症を惹起した。このことは、MLF1欠損によるC/EBPαの早期不安定化を意味する。MLF1活性の誘導・安定化はがん治療での有効性が見込める。

成果として、COP1の新規複合体・標的分解基質群を同定し、COP1が関与する発がん・エネルギー代謝ネットワーク予想図を作成した。さらに、骨髄性白血病関連因子MLF1は、COP1と直接結合しCOP1-Trib1複合体活性を阻害して、C/EBPαの安定化を促しAML発症を抑制することを見いだした。MLF1活性の誘導・安定化はがん治療での応用が見込める。交付申請書に記載した内容に基づいて、上記平成26年度研究実績の概要に記載した内容まで到達している。ほぼ予定どおりに進行し、おおむね順調に進展している。計画した実験はほぼ予定どおり進行している。網羅的検索から得られた多くのCOP1相互作用蛋白質群と新規機能的COP1複合体群から、真に新規性・発展性のある因子群を選定した。詳細に検討し選定したことで、順調に進行中である。生物学計画した実験はほぼ予定どおり進行している。解析のための培養系・マウスモデル実験系の最適化条件の設定にやや時間を要したが、詳細に検討したことで、安定した最適化条件を得ることができた。網羅的検索から得られた多くのCOP1相互作用蛋白質群と新規機能的COP1複合体群から、真に新規性・発展性のある因子群を選定する実験にやや時間を必要としたため。解析のための培養系・マウスモデル実験系の最適化条件の設定に時間を要し、プロテオーム解析・メタボローム解析が遂行途上のため。特に興味深いCOP1相互作用蛋白質群と新規機能的COP1複合体群に焦点を絞り、多方面からの解析方法を用いて解析を進める。マウスモデル実験系の諸費用にかなりの額を計上予定。マウスモデル実験系の諸費用、プロテオーム解析・メタボローム解析の諸経費に計上予定。
高アンモニア血症における急性胃粘膜病変に関する研究

急性胃粘膜病変と高アンモニア血症との関係を検討するため以下の検討を施行した。Wistar系雄性ラット180gをネンブタール麻酔下に5M酢酸アンモニウム6mmol/kgを腹腔内投与の後、Alzetミニ浸透圧ポンプを皮下に埋め込み、ポンプよりポリエチレンチューブを腹腔内に誘導した後、これより10M酢酸アンモニウムを10mul/hで注入し、高アンモニア血症を作成した。その後、経時的に血液を採取するとともに、実験6日目にラットを屠殺し、胃を摘出した。[結果]1血中アンモニア濃度の検討:投与前2030mg/dlであったものが3日目には8090mg/dl、5日目には70mg/dlと正常の約3倍に上昇した。6日目の胃粘膜は正常であった。2水浸拘束ストレスモデルにおける高アンモニア血症の影響の検討:上記にて高アンモニア血症作成後、高木・岡部らの方法にて23度下に水浸拘束ストレスを4時間付加した。なお、対象として同ポンプをもちいて6日間生理食塩水を投与したものを用いた。その結果、アンモニア投与群における潰瘍形成が著明に抑制されていた。3アンモニアによる血中アミノ酸の変動に関する検討:アンモニア投与によりアルギニンの著明な上昇、グリシンの低下を認めた。以上より、本実験施行に際しては、高アンモニア血症が急性胃粘膜病変発生に悪影響を及ぼすのではないかと推察していたが、結果は逆となり、むしろ、粘膜保護作用を示した。現在、そ理由を検討続行中であるが、おそらく、血管拡張因子であるアルギニンの増加あるいはNの増加による、ストレス下の血流保持がこのような結果につながったのではないかと推察している。
物理的刺激による多能性幹細胞の精密分化制御法に関する基礎的研究

再生医療の実用化において,効率が良く,コストが低い分化誘導法の確立は不可欠である.従来手法では複数の分化誘導因子を組み合わせて用いるが,効率およびコストの両面から改善が求められている.以上の背景を基に,電気刺激などの物理的な刺激による分化制御法の確立を目指すのが本研究の立場である.計画最終年度にあたる本年度は,未分化状態のiPS細胞の電気刺激実験,およびヒトiPS細胞由来神経細胞の成熟過程の評価を行った.基板上でヒトiPS細胞を培養し,電気刺激を印加したところ,刺激に対する短期的応答として細胞内Ca2+濃度の上昇が起こることを発見した.さらに,細胞外液を変化させた実験,および薬理実験より,電気刺激によるiPS細胞の細胞内Ca2+濃度の上昇は,刺激がトリガーとなり,細胞外のCa2+が細胞内に流入し誘発されること,およびT型Ca2+チャネルは関与しないことが示された.次に,3日間持続的に刺激を続けることにより,ヒトiPS細胞の遺伝子発現量の変化が起こることを示す結果が得られた.以上から,電気刺激が未分化状態のヒトiPS細胞の分化方向に影響を与えることが示唆された.分化誘導した細胞が神経細胞としての機能を獲得したことを確認するため,微小電極アレイ法による活動計測を行った.分化誘導を行ってから50日目から,10日ごとに計測を行った.結果,ヒトiPS細胞由来神経細胞が分化誘導操作を行ってから,およそ90日後から神経回路網を形成したことが示された.さらに,活動パターンの変化は300日目程度まで持続することが示された.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では, iPS細胞に対して,従来の薬理的な手法ではなく物理的な刺激を与えることにより,分化誘導を行う手法の開発を目的とした.物理的な刺激として,刺激のパラメータを精密に制御可能な電気刺激を用いることを考えている.計画の初年度に当たる本年では,実験系の確立を目指し,未分化状態のiPS細胞の維持培養系の立ち上げと, iPS細胞が分化能を保持していることの確認のための分化誘導実験を行った.また,幹細胞が神経細胞へと分化していく過程を評価しながら電気刺激を行うことも重要な課題であると捉え,培養環境下で電気刺激するためのデバイスに関する検討を行った.(1) iPS細胞の維持培養系の構築と,従来手法を用いた分化誘導の再現iPS細胞を安定して培養する条件を確立するため,培養液およびフィーダー細胞について検討し,培養細胞の品質に関して評価を行った.さらに,従来手法を用いてiPS細胞を大脳皮質の神経細胞へと分化誘導した.以上より,培養条件の確立に成功し,分化実験が可能であることを確認できた.(2)培養デバイスを用いた電気活動の長期的評価と電気刺激についての検討分化過程を観察しながら電気刺激することも分化誘導法の開発にとって有用であるとの視点から,幹細胞が神経細胞へと分化していく過程を電気活動から評価可能なデバイスに関する検討を行った.実際に,神経細胞への分化途中の細胞をデバイス内で培養し,周囲の神経細胞との間に行われる信号の伝播を評価したところ,培養日数にしたがって活動が変化している様子の可視化に成功した.以上より,構築したデバイスは,神経細胞の電気活動の計測と,電気刺激の印加の両方が可能であることが示唆された.本研究では,再生医療への応用を目指し,多能性幹細胞の精密分化誘導法の開発を目的としている.未分化状態のiPS細胞に対して,従来用いられてきた薬理的な手法ではなく,電気刺激や磁気刺激といった物理的な刺激を印加することにより,特定の細胞種まで精密に分化誘導することを目指している.研究の2年目に当たる本年度は,前年度に確立した手法を用いて培養した未分化iPS細胞およびiPS細胞由来神経細胞の評価を行った.それぞれの項目の実施状況について詳細を述べる.1.未分化状態のヒトiPS細胞におけるCa振動の評価.本年度は,細胞周期と細胞内Caイオン濃度に着目した.細胞周期に着目した理由は,多能性幹細胞は細胞周期に応じて,外部刺激に対する応答が変化し,分化方向が変化するためである.また,細胞内Caイオン濃度は外部刺激による制御が容易であるため,制御法を確立するに当たっても適切なターゲットとなることが期待される.蛍光観察法および画像処理手法により,未分化状態iPS細胞のコロニーから,1000個以上の細胞の活動を同時取得し,個々の細胞の細胞周期のステージとCa振動を評価した.結果,ヒトのiPS細胞においても,マウスES細胞において報告されているCa振動が起こることが確認された.また,細胞周期との関連性を評価した結果,細胞周期のステージによってCa振動の頻度が変化することが示唆された.2.ヒトiPS細胞由来の神経細胞の評価.ヒトiPS細胞から分化誘導した神経細胞が機能を獲得したことを確認するため,微小電極アレイ法により,自発活動の計測を行った.分化誘導50日目から10日おきに計測したところ,およそ90日目から神経回路網が形成されたことが示唆された.再生医療の実用化において,効率が良く,コストが低い分化誘導法の確立は不可欠である.従来手法では複数の分化誘導因子を組み合わせて用いるが,効率およびコストの両面から改善が求められている.以上の背景を基に,電気刺激などの物理的な刺激による分化制御法の確立を目指すのが本研究の立場である.計画最終年度にあたる本年度は,未分化状態のiPS細胞の電気刺激実験,およびヒトiPS細胞由来神経細胞の成熟過程の評価を行った.

基板上でヒトiPS細胞を培養し,電気刺激を印加したところ,刺激に対する短期的応答として細胞内Ca2+濃度の上昇が起こることを発見した.さらに,細胞外液を変化させた実験,および薬理実験より,電気刺激によるiPS細胞の細胞内Ca2+濃度の上昇は,刺激がトリガーとなり,細胞外のCa2+が細胞内に流入し誘発されること,およびT型Ca2+チャネルは関与しないことが示された.次に,3日間持続的に刺激を続けることにより,ヒトiPS細胞の遺伝子発現量の変化が起こることを示す結果が得られた.以上から,電気刺激が未分化状態のヒトiPS細胞の分化方向に影響を与えることが示唆された.分化誘導した細胞が神経細胞としての機能を獲得したことを確認するため,微小電極アレイ法による活動計測を行った.分化誘導を行ってから50日目から,10日ごとに計測を行った.結果,ヒトiPS細胞由来神経細胞が分化誘導操作を行ってから,およそ90日後から神経回路網を形成したことが示された.さらに,活動パターンの変化は300日目程度まで持続することが示された.本年度は,昨年度開発したコア技術を活かし,未分化状態および神経分化した細胞の機能評価を行った.結果,それぞれの段階において,評価に有用な指標が抽出できることがわかった.今後,これらの指標をもとに,細胞の状態の推定や制御を行うことで,興味深い研究成果が得られることが期待できる.27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に得られた指標をもとに,分化の各段階における細胞の機能評価を継続する.さらに,外部刺激を用いて,未分化状態のiPS細胞に関してはCa振動を,iPS細胞由来の神経細胞に関しては自発活動を調節し,細胞が自発的に持っているリズムを乱すことが細胞の機能発現に与える影響を評価する.本年度は,集積化電極基板上でiPS細胞群を培養する安定条件の確立に注力した.結果, (1) iPS細胞群を基板上で長期間安定して培養する条件の探索, (2)標準的な手法による神経細胞への分化過程の観測, (3)分化誘導細胞群-初代培養系間の結合形成過程観測用デバイスの設計製作など,コア技術において顕著な進捗があった.初年度に確立した要素技術に基づき,次年度以降,興味深い研究成果が得られることが期待できる.27年度が最終年度であるため、記入しない。初年度でiPS細胞の安定した培養条件の確立を行った.今後は,培養したiPS細胞群に対して刺激を行い,電気刺激が多能性幹細胞の分化方向に与える影響を評価する.また,分化した細胞の成熟過程を可視化することも重要であるとの観点から,本年度構築した結合形成過程の評価用デバイスを用いて計測を行う.
人工エナメル質の創製と機能評価

脱灰象牙質のモノマー透過性を左右する因子を明確にするため、無添加、NaCl、CaCl_2,FeCl_3を溶かした10%リン酸で、スミヤーを除去した湿潤象牙質に5%4-METAのアセトンプライマーを使い、MMA-TBBレジンを接着させた。得られた試料の接着強さをダンベル型試料で計測した。その接着強さは10.7±4.5(無添加)、15.0±7.0(NaCl),19.5±5.5(CaCl_2),27.8±8.1MPa(FeCl_3)とカルシウムと鉄塩を溶かしたときに有意に向上した。破断面はどちらもレジンの凝集破壊であった。1価のナトリウムイオンと無添加の時は他の2群より有意に接着強さは低かったが、この2群間では有意差はなかった。どちらも残留脱灰象牙質での破断が観察された。元々10%リン酸エッチングは象牙質接着にはあまり有効ではなかったが、これは高分子電解質を可溶化させること、象牙質コラーゲンを一部可溶化するためであることが分かった。コラーゲンの可溶化防止にはグルタルアルデヒドなどでコラーゲンを架橋する必要がある。高分子電解質については、2価のカルシウムイオンあるいは3価の鉄イオンは高分子電解質を不溶化して、モノマーの拡散性を改善するとともに、脱灰象牙質から水を除去しやすくする上で効果があることを明らかにできた。これによって、樹脂含浸象牙質のポリマー含量が増加し、樹脂含浸象牙質と健全象牙質の間に加水分解されやすい脱灰象牙質の残留を阻止し、接着の長期安定性が期待できる事が分かった。そして良質の人工エナメル質を拡散能に乏しいMMA-TBBレジンでも作れることができた。MMA-TBBレジンは合着用レジンセメントとして利用できる脱灰象牙質のモノマー透過性を左右する因子を明確にするため、無添加、NaCl、CaCl_2,FeCl_3を溶かした10%リン酸で、スミヤーを除去した湿潤象牙質に5%4-METAのアセトンプライマーを使い、MMA-TBBレジンを接着させた。MMA-TBBレジンは合着用レジンセメントとして利用できる本研究ではこれまで研究代表者が行ってきたレジンの象牙質への接着メカニズム(樹脂含浸象牙質の性質と機能の解析)を基盤として、象牙質表層部を耐酸性に改変し、外来刺激が歯髄に到達することを防止できる人工エナメル質を創成することを目的として企画された。以下の項目について新たに実験を行った。1)研削象牙質面上にあるスミヤー層の除去方法りん酸、クエン酸、塩化第二鉄入りクエン酸、EDTAなどを使用し、脱灰剤の濃度、作用時間の影響を調べた。脱灰後の象牙質試料は原子間力顕微鏡(AFM、現有)で表面を観察し、脱灰操作中における象牙質の変化を調べた。2)湿潤又は乾燥被着面に適用するプライマー・ボンディング材の検討脱灰剤によっては乾燥すると接着できなくなることがあり、プライマー・ボンディング材の組成物を変化させて、人工エナメル質の厚さと耐酸性を調べて、その結果と試料のSEM、TEM、AFM(いずれも現有)観察結果と合わせて、最高品質の人工エナメル質を合成する条件を決めた。3)重合開始剤と重合方法の検討光照射による重合を重点的に検討するが、トリーnーブチルボランも利用した。4)残留脱灰象牙質の有無の解析残留脱灰象牙質の有無を中林らが開発した試験法(科研費基礎研究B2、08457503「改善された象牙質引張試験法の確立」)により判定すると共に残留を確実に防止する条件を見出し(引張試験機は現有)、2)の結果と比較した。

5)象牙質全表面を人工エナメル質で被覆し、その試料を酸に浸漬し、表面と内部を観察(SEM現有)し、人工エナメル質は酸によって冒されないことを確認した。これを通して良質の人工エナメル質は耐酸性があり(表面が変化しない)、酸を透過させない緻密な組成物(人工エナメル質の内部にある健全象牙質が脱灰されていない)であることを実証した。前年までの実績を踏まえ、脱灰象牙質のモノマー透過性を左右する因子を明確にするため、無添加、NaCl、CaCl_22,FeCl_3を溶かした10%リン酸で、スミヤーを除去した湿潤象牙質に5%4-METAのアセトンプライマーを使い、MMA-TBBレジンを接着させた。得られた試料の接着強さをダンベル型試料で計測した。その接着強さは10.7±4.5(無添加)、15.0±7.0(NaCl),19.5±5.5(CaCl_2),27.8±8.1MPa(FeCl_3)とカルシウムと鉄塩を溶かしたときに有意に向上した。破断面はどちらもレジンの凝集破壊であった。1価のナトリウムイオンと無添加の時は他の2群より有意に接着強さは低かったが、この2群間では有意差はなかった。どちらも残留脱灰象牙質での破断が観察された。元々10%リン酸エッチングは象牙質接着にはあまり有効ではなかったが、これは高分子電解質を可溶化させること、象牙質コラーゲンを一部可溶化するためであることが分かった。コラーゲンの可溶化防止にはグルタルアルデヒドなどでコラーゲンを架橋する必要がある。高分子電解質については、2価のカルシウムイオンあるいは3価の鉄イオンは高分子電解質を不溶化して、モノマーの拡散性を改善するとともに、脱灰象牙質から水を除去しやすくする上で効果があることを明らかにできた。これによって、樹脂含浸象牙質のポリマー含量が増加し、樹脂含浸象牙質と健全象牙質の間に加水分解されやすい脱灰象牙質の残留を阻止し、接着の長期安定性が期待できる事が分かった。そして良質の人工エナメル質を拡散能に乏しいMMA-TBBレジンでも作れることができた。MMA-TBBレジンは合着用レジンセメントとして利用できる
トラフグの抗原提示細胞

トラフグの貪食細胞である単球はその細胞表面にB7という共刺激分子を発現しており、このB7を介して獲得免疫系を制御する重要な細胞であるT細胞の活性を制御していることを明らかにした。さらに、B7陽性単球は、抗原提示に関わるMHCクラスIIを発現していることから、魚類では単球が抗原提示細胞として中心的な役割を担っていると考えられる。また、B7陽性単球は、複数の細胞集団から構成されており、獲得免疫活性化が複雑に制御されていることが示唆された。ほ乳類では獲得免疫系の活性化はT細胞が活性化されることにより始まる。そのT細胞を活性化する役割を担っているのが抗原提示細胞である。これらは、主に樹状細胞、フマクロファージ、B細胞からなることが知られている。しかし、魚類では獲得免疫系の活性化機構は長らくブラックボックスであった。最近のゲノム情報を利用した研究などによりT細胞に関する情報は蓄積されつつあるが、抗原提示細胞については不明である。本研究ではAPCの同定とその機能解析を通して、獲得免疫系の活性化機構に迫る。トラフグゲノムデータベースを利用して、抗原提示細胞のマーカーとなる共刺激分子B7ファミリー分子のcDNAクローニングを行った。トラフグでは少なくとも3種類のB7ファミリー分子が存在していた。さらに、ほ乳類では抗原提示細胞の中でも最もT細胞活性化能の高いことが知られている樹状細胞のマーカー分子のcDNAクローニングをトラフグで試みた。魚類ではいまだ樹状細胞といえる細胞は同定されていないが、樹状細胞のマーカー分子の、cDNAクローニングに成功した。さらに、これらの抗原提示細胞ヤーガーの遺伝子は免疫応答の中心となる2次リンパ器官で発現しているととが明らかになった。次に、B7分子の配列情報をもとに組み換え体とそれを抗原とした抗体を作製した。これらを使用して、B7分子が活性化したT細胞に結合すること、抗B7抗体が活性化したマクロファージに結合するが、リンパ球には結合しないことを明らかにした。これらの結果はマクロファージ上のB7分子が活性化したT細胞上の受容体に結合することを示唆するものである。ほ乳類ではCD8陽性の貪食細胞が抗原提示細胞であることがわかっている。そこで、抗CD8抗体を使用したFACS解析やMACS解析を行い、ドラフグにもCD8陽性の貪食細胞が存在することを明らかにした。昨年度までに魚類でも補助刺激分子、B7を介した補助刺激によりT細胞の増殖が制御されることを明らかにした。ほ乳類ではB7により刺激を受けたT細胞は様々なサイトカインの産生を制御することにより、T細胞自身の増殖の制御を行っている。そこで、本研究では同定した3種類のトラフグB7によりサイトカイン産生が制御されているかどうかを定量的PCRにより調べた。その結果、抑制的に作用するB7では免疫系を抑制的に制御すると考えられているサイトカインであるIL-10の発現が増加した。一方で、促進的に作用するB7はT細胞によるIL-10の産生を抑制すると同時に、T細胞増殖を促進すると考えられているIL-2の発現を増加させた。これらのことから魚類においてもB7がT細胞のサイトカイン産生を制御することによりT細胞の増殖を調節していることが示された。昨年度までの結果と考え合わせると、魚類の活性化された単球上に発現するB7はT細胞のサイトカイン産生を制御することにより、獲得免疫系の制御において中心的な役割を担うT細胞の増殖を制御していることが明らかになった。これらの結果は魚類にも機能的な抗原提示細胞が存在することを示した初めての成果であり、Journal of Immunology誌に掲載予定である。本研究ではトラフグにはCD8陽性単球が存在することを見いだしているが、本年度はこの細胞を単離し、その性状を解析した。この細胞は活性化によりCD8を表出し、樹状細胞マーカーとして知られているCD83やCD205遺伝子や抗原提示に関わるMHC class IIα遺伝子を発現するようになること、またラテックスビーズを貪食する能力演あることが示された。また、蛍光染色により、樹状の突起を有していることが示された。これらの結果は本細胞が魚類の樹状細胞であることを示唆するものである。
インプランタブルオプティカルデバイスを用いた光線力学免疫療法による難治性がん治療

低出力の光線力学治療において、光増感物質の投与量と光照射条件(照射強度、照射時間)を変えることで、直接的な抗腫瘍効果を高められることを示した。また間接効果(抗腫瘍免疫)を増強させるプロトコールの道筋をつけることができた。(特許出願予定のため概略のみ提示した。)【目的】膵がんなど深部の難治性悪性腫瘍に対する新しい治療法を開発する。体内に薄膜LEDを埋め込み、光増感剤を投与したのち持続的に低強度光を照射することで光線力学的に免疫を賦活し、腫瘍縮退を誘導する。【方法と結果】H27年度では以下の成果が得られた。1.低強度光照射のための光源デバイス構築1-1.ポルフィリン系光増感剤を励起するための赤色光(630nm)を面均質照射できるパネルLED光源(20×30 cm)(パネル光源)を作製した。1-2.体部に装着して腫瘍のみに装着できる円形小型LED光源(φ20 mm)(小型光源)を開発した。2.がん細胞(Colon26)をBALB/cマウスの皮下に移植して担がん動物モデルを作製した。マウスに光増感剤(フォトフリン)を経静脈投与した後、低強度長時間光照射(1 mW/cm2, 24 hrs以上)によって誘発される腫瘍増殖抑制効果を検証した。2-1.移植腫瘍が単一の場合:パネル光源を用いた場合、腫瘍増殖抑制効果が認められた。小型光源を用いた場合、腫瘍増殖抑制傾向が見られた。2-2.移植腫瘍が2つの場合:フラット光源を用いて、片側の腫瘍にのみ光があたるように処置したところ(他側腫瘍には光を遮蔽するキャップを装着した)、光が照射された腫瘍と照射されない腫瘍ともに腫瘍増殖抑制傾向が見られた。2-2の結果より、一つの腫瘍のみに対する低強度光PDTは、非照射側の腫瘍の縮退も誘発でき、これは光線力学反応によって免疫反応が誘導されている可能性が高いことがわかった。本研究開発を遂行する上での基本的な実験環境を構築できた。さらに、本研究開発の基盤的な仮説である、低強度光線力学的反応による免疫効果を惹起させ腫瘍増殖抑制を誘導できた。この結果はH28年度以降の研究開発を大いに推進する。体内に薄膜LEDを埋め込み、光増感剤を投与したのち持続的に低強度光を照射することで光線力学的に免疫を賦活し、腫瘍縮退を誘導することを目指す。【方法と結果】H28年度では以下の成果が得られた。1.低強度光照射のための光源デバイスの改良:H27年度に、体部に装着して腫瘍のみに装着できる円形小型LED光源(φ20 mm)(小型光源)を構築したが、1配線が外部に露出しており頻回に断線すること、2動物にいったん装着すると電池交換ができなかったこと、などの理由により光照射を確実に行えているとは言いがたい状況であった。H28年度にはこれらの欠点を改良して、長時間(3日間以上)安定して光照射できるようになった。2.腫瘍増殖抑制効果:H27年度に確立した皮下担がんマウスモデル(がん細胞(Colon26)をBALB/cマウスの皮下に移植)に上述の円形小型LED光源を装着して、光増感剤(フォトフリン)を経静脈投与した後、低強度長時間光照射(0.1 mW/cm2, 24 hrs以上)によって誘発される腫瘍増殖抑制効果を検証した。2-1.移植腫瘍が単一の場合:腫瘍増殖を抑制した。2-2.移植腫瘍が2つの場合:片側の腫瘍にのみ光があたるように処置したところ、光が照射された腫瘍の増殖を抑制したが、照射されない腫瘍には腫瘍増殖抑制が見られなかった。【結論】円形小型LED光源による低強度光長時間照射によるPDTは、照射側の腫瘍を縮退させたが、非照射側の腫瘍の縮退は誘発できなかった。今後、非照射側の腫瘍の縮退は誘発できる条件を探索する。H28年度においては、免疫反応を起こすのに最適な光照射条件や光増感剤投与濃度等を探索する。あわせて、免疫担当細胞とくに好中球に注目して動態解析も行う。申請者らはこれまでに、PDTの効果メカニズムに自然免疫である好中球が重要な役割を果たすことを明らかにしてきた(PloS one (2012) 7:e39823) (Lasers Surg Med (2011) 43:221)。そこで本研究では、lys-EGFPマウス(蛍光タンパクを発現する好中球を産生するマウス)を使用し、これにがん細胞を移植して、PDI後の好中球集積を生体イメージング装置(IVIS)にて解析する。好中球走化因子(MIP-2など)などの免疫組織染色も行い、好中球遊走・集積にかかわるシグナルを追跡する。肝胆膵外科学

平成28年度開始時点までに、本研究開発の基盤的な仮説である、低強度光線力学的反応による免疫効果を惹起させ腫瘍増殖抑制を誘導できた。この成果を残せたのは平成27年度に作製した2つの光照射デバイスである。これらは本研究の協力者の厚意により構築することが出来た。本申請では研究開始当初、これらデバイス製作に関係する費用を計上したいたが、結果として使用することがなくなった。実験遂行の迅速化を図るため、実験支援員を雇用する。この費用を次年度使用額に計上する。
インターフェロン(IFN)耐性Dandi亜株を用いたIFN耐性機構の解明 特に転写因子IRF-1の役割について

(1)IFN反応性分子の発現と機能についての検討:Daudi-SとDaudi-Rの間で、IFNのシグナル伝達に関与する分子群(IFN受容体、STAT-1.STAT-2など)、IFN反応性分子(2'-5'AS、RNaseLなど)の発現に差はなく、耐性化の原因はIFNによって発現が修飾される核内遺伝子群にあると推定された。その一つとしてアポトーシス誘導因子であるICEの発現が、Daudi-Rにおいて特異的に欠損していることがわかった。そこでまずICE遺伝子の転写調節機序について検討し、ICE発現はinitiatorelementへのIRF・1の結合により制御されることを明らかにした。Daudi-Rにおいては親株に比べ、IFNによるIRF-1の誘導性が低下していた(FEBS letters投稿中)。一方、久留米大学の吉村教授と共同研究を行い、Daudi-R細胞においては、STATの活性化を特異的に阻害する因子であるJABの発現が亢進していることを見い出した(Blood 92:1668-1676、1998)。このようにIFN耐性の機構には種々のタイプがあり、その解明にはさらなる研究が必要と思われる。(2)IFNによる転写因子E2Fの抑制とその機構:IFNが、種々の増殖関連遺伝子の発現を促進する転写因子であるE2Fの活性を抑制することを明らかにした(J.Biol.Chem.272:12406-12414,1997)。さらにその機序として、IFNがE2Fのサブユニットの一つであるE2F-1の転写を抑制することを見い出し、その際、IFNによってプロモーター上に転写抑制性複合体であるE2F-4/pRB、E2F-4/p130の形成が誘導されることがわかった(Oncogene誌4月号に掲載予定)。インターフェロン(IFN)の細胞増殖抑制の分子機構を明らかにするため、IFN感受性Daudi細胞株(Daudi-S)より耐性亜株(Daudi-R)を樹立し、以下の研究を行った。(1)IFN反応性分子の発現と機能についての検討:Daudi-SとDaudi-Rの間で、IFNのシグナル伝達に関与する分子群(IFN受容体、STAT-1、ATAT-2など)、IFN反応性分子(2'-5'AS、RNaseLなど)の発現に差はなく、耐性化の原因はIFNによって発現が修飾される核内遺伝子群にあると推定された。そこでまずICE遺伝子の転写調節機序について検討し、ICE発現はinitiatorelementへのIRF-1の結合により制御されていることを明らかにした。Daudi-Rにおいては親株に比べ、IFNによるIRF-1の誘導性が低下していた(Mol.Cell.Biol.投稿中)。一方、久留米大学の吉村教授と共同研究を行い、Daudi-R細胞においては、STATの活性化を特異的に阻止する因子であるJABの発現が異常に亢進していることを見い出した(Blood投稿中)。このようにIFN耐性の機構には種々のタイプがあり、さらなる研究が必要と考えられる。

さらにその機序として、IFNがE2Fのサブユニットの一つであるE2F-1の転写を抑制することを見い出し、その際、IFNによって転写抑制性複合体であるE2F-4/pRB、E2F-4/p130の形成が誘導されることがわかった(J.Biol.Chem.投稿中)。インターフェロン(IFN)の細胞増殖抑制の分子機構を明らかにするため、IFN感受性Daudi細胞株(Daudi-S)より耐性亜株,(Daudi-R)を樹立し、以下の研究を行った。(1) IFN反応性分子の発現と機能についての検討:Daudi-SとDaudi-Rの間で,IFNのシグナル伝達に関与する分子群(IFN受容体、STAT-1、STAT-2など)、IFN反応性分子(2'-5'AS、RNaseLなど)の発現に差はなく、耐性化の原因はIFNによって発現が修飾される核内遺伝子群にあると推定された。その一つとしてアポトーシス誘導因子であるICEの発現が、Daudi-Rにおいて特異的に欠損していることがわかった。そこでまずICE遺伝子の転写調節機序について検討し、ICE発現はinitiatorelementへのIRF-1の結合により制御されることを明らかにした。Daudi-Rにおいては親株に比べ、IFNによるIRF-1の誘導性が低下していた(FEBS letters投稿中)。一方、久留米大学の吉村教授と共向研究を行い、Daudi-R細胞においては、STATの活性化を特異的に阻害する因子であるJABの発現が亢進していることを見い出した(Blood92:1668-1676,1998)。このようにIFN耐性の機構には種々のタイプがあり、その解明にはさらなる研究が必要と思われる。(2) IFNによる転写因子E2Fの抑制とその機構:IFNが、種々の増殖関連遺伝子の発現を促進する転写因子であるE2Fの活性を抑制することを明らかにした(J.Biol.Chem.272:12406-12414,1997)。さらにその機序として、IFNがE2Fのサブユニットの一つであるE2F-1の転写を抑制することを見い出し、その際、IFNによってプロモーター上に転写抑制性複合体であるE2F-4/pRB、E2F-4/p130の形成が誘導されることがわかった(Oncogene誌4月号に掲載予定)。
酸化物高温超伝導体の電子状態に関する計算物理学的研究

銅酸化物高温超伝導体の発見は、強く相互作用する多電子系の示す物性の理解という物理学の基本問題に対して新たな視点を提供した。発現機構は依然として未解明であり、多くの研究者によって集中的に研究が進められている。本研究では、CuO面の電子構造を記述する幾つかの強相関電子模型(例えば、d-p模型、ハバード模型、t-j模型)に対して、計算物理学的手法、特に厳密対角化法、変分モンテカルロ法、及び多体強束縛法を適用することによって、その電子状態への理解を深め、さらの発現機構の解明を目指している。平成4年度に得られた代表的な研待成果は以下の通りである。(1)d-p模型およびハバード模型に対して有限サイズクラスターの厳密対角化の手法を用い、一粒子励起スペクトルの波数依存性を計算し、強相関絶縁体のドーピングによるいわゆるギャップ内状態の形成についた調べた。(2)ハバード模型に近接サイト間斥力をつけ加えた拡張ハバード模型の相図を調べ、ドーピングによる金属-絶縁体転移とそれに伴う大きなフェルミ面から小さなフェルミ面への変化を、銅酸化物との対比において考察した。(3)銅酸化物の絶縁体相における弱強磁性の起源を明らかにした。また導出されたハミルトニアンスピン波理論を適用し、スピン波励起ギャップの形成機構を明らかにした。(4)d-p模型の電子状態を、グッツウィラー型変分関数を用いた変分モンテカルロ法に基づいて調べた。スピン相関関数および密度相関関数のパラメータ依存性が計算された。(5)銅酸化物の電子状態の温度依存性を調べるため、厳密対角化の手法をt-j模型に適用し、比熱、帯磁率、スピン相関関数、動的スピン相関関数などの計算を行った。
環境教育における評価システムの開発

1.環境教育の新たな枠組みの考案当補助金で購入したEnvironmental Education誌をはじめ、既存の文献、および国内の実践事例の報告などを概観した結果、現在の環境教育、とくに国内の実践者たちの多くが自らの位置を見失いがちな実状と、それに付随する問題が明らかになった。その解決に向けて、環境教育において、自然科学・技術、個人、社会の3つの分野を想定する新たな枠組み(NIS)を考案した。これは、3分野相互のつながりやかかわりを重視するホリスティックな教育の枠組みという点で独自であり、当補助金による成果として、もっとも重要なものと考える。2.新たな枠組みの提示・試行、考察環境教育プログラム作成や環境教育プロジェクトの計画など、環境教育の諸現場でこの新たな枠組みを元に評価した結果、この枠組みが「客観的な」評価に有効であるとともに、評価する/される関係を越えて、実践者が自らの実践をふりかえるといった「自己評価」のための枠組みとしても活用できることがわかった。3.今後の展開・展望NISという、この新たな枠組みに一定の有効性があることは確認されたが、枠組みの内部構造、また他の枠組みとの相互関係など、明らかにすべき問題が山積している。特に、従来表面的には受け入れられてきた環境教育の国際的な枠組み、たとえばベオグラード憲章、トビリシ会議、モスクワ会議、地球サミットなどが、相互にどのような関係にあるのかの比較研究は、今後の環境教育の分析・評価に大きな示唆を提供するだろう。
各種接着性材料の歯質への接着強化法に関する研究

コンポジットレジンは多くのすぐれた性質を有しているために,保存修復の分野における役割はきわて大きい.しかし一方,コンポジットレジン自体には歯質とくに象牙質に対する接着性がないことが,もっともおおきい未解決の問題点となっており,修復に先立って歯質の前処理や接着剤を介しての接着強化法が不可決の術式となっている.本研究の第1年次では,まず低濃度の各種の酸処理剤による象牙質面のスメア層処理硬化を走査電顕で評価した結果,リン酸,クエン酸,アスコルビン酸などの310%水溶液で十分な処理効果のあることが認められた.そこで,処理剤の歯髄への影響を配慮し,象牙細管の封鎖性を期待できる乳酸アルミニウムを0.5%あるいは1.0%配合した低濃度クエン酸処理剤を考案し,成犬を用いての歯髄の病理組織学的研究を行なって良好な結果を得た.しかし,牛歯の全象牙質窩洞への処理効果を辺縁封鎖性の評価によって検討した結果,どのような処理剤を用しても歯頚側窩縁からの微小漏洩を完全には阻止することができないこともあきらかになった.そこで第2年次では,歯質への接着を阻害する因子と考えられている窩壁象牙質面上に付着しているスメア層の処理のために, Nd-YAGあるいはCO_2レーザーの照射を試み,スメア層の処理効果と象牙細管封鎖効果のあることをあきらかにした.さらに,レーザー照射による象牙質表面特性に及ぼす効果を検討した結果,レーザー照射によって接触角は著しく低下し, "ぬれ性"の改善されることがあきらかになった.また,レーザー照射によって,コンポジットレジンの象牙質面への接着性も向上する可能性も示唆された.コンポジットレジンは多くのすぐれた性質を有しているために,保存修復の分野における役割はきわて大きい.しかし一方,コンポジットレジン自体には歯質とくに象牙質に対する接着性がないことが,もっともおおきい未解決の問題点となっており,修復に先立って歯質の前処理や接着剤を介しての接着強化法が不可決の術式となっている.本研究の第1年次では,まず低濃度の各種の酸処理剤による象牙質面のスメア層処理硬化を走査電顕で評価した結果,リン酸,クエン酸,アスコルビン酸などの310%水溶液で十分な処理効果のあることが認められた.そこで,処理剤の歯髄への影響を配慮し,象牙細管の封鎖性を期待できる乳酸アルミニウムを0.5%あるいは1.0%配合した低濃度クエン酸処理剤を考案し,成犬を用いての歯髄の病理組織学的研究を行なって良好な結果を得た.しかし,牛歯の全象牙質窩洞への処理効果を辺縁封鎖性の評価によって検討した結果,どのような処理剤を用しても歯頚側窩縁からの微小漏洩を完全には阻止することができないこともあきらかになった.そこで第2年次では,歯質への接着を阻害する因子と考えられている窩壁象牙質面上に付着しているスメア層の処理のために, Nd-YAGあるいはCO_2レーザーの照射を試み,スメア層の処理効果と象牙細管封鎖効果のあることをあきらかにした.さらに,レーザー照射による象牙質表面特性に及ぼす効果を検討した結果,レーザー照射によって接触角は著しく低下し, "ぬれ性"の改善されることがあきらかになった.また,レーザー照射によって,コンポジットレジンの象牙質面への接着性も向上する可能性も示唆された.コンポジットレジンは多くのすぐれた性質を有しているために、保存修復の分野における役割はきわめて大きい。しかし一方、コンポジットレジン自体には歯質とくに象牙質に対する接着性がないことが、もっとも大きい未解決の問題点となっており、修復に先立って歯質の前処理や接着材を介しての接着強化法が不可決の術式となっている。本研究の第1年次では、まず低濃度の各種の酸処理剤による象牙質面のスメア層処理効果を走査電顕で評価した結果、リン酸.クエン酸.アスコルビン酸などの310%水溶液で十分な処理効果のあることが認められた。そこで、処理剤の歯髄への影響を配慮し、象牙細管の封鎖性を期待できる乳酸アルミニウムを0.5%あるいは1.0%配合した低濃度クエン酸処理剤を考案し、成犬を用いての歯髄の病理組織学的研究を行なって良好な結果を得た。一方、接着性材料自体の重合収縮が歯質接着性を阻害する重要な因子として指適されており、修復物辺縁部のギャップの測定が必要となる。従来から、辺縁部のギャップや修復材の摩耗の評価法としては、二次元的測定以外に方法がなかったが、合回、購入した設備品(ミクロン深さ・高さ測定機)によって、三次元的測定が可能になり、新しい知見が得られている。本装置による測定は二年次も引続いて継続する予定である。さらに、歯質への接着を阻害する因子と考えられている窩壁象牙質面上に付着しているスメア層の処理のために、Nd-YAGあるいはC【O_2】レーザーの照射を試みており、スメア層の蒸散と象牙細管封鎖効果、歯面の"ぬれ性"の向上が認められている。
EGFR阻害剤とDNA二重鎖切断修復に関する基礎的研究

Gefitinib存在下におけるMTTアッセイでは、Gefitinibの濃度依存性に細胞生存曲線が低下することが確認された。放射線照射とGefitinibの併用によるColony formingアッセイを行ったが、Gefitinibによる放射線照射との併用効果は明らかでなかった。癌種によるEGFRの発現に変化が大きいことが予想され、EGFR発現ライブラリーの作成を行った。EGFRは細胞腫により発現が大きく異なり、EGFR阻害とDNA二重鎖切断との関係の解明にはより複雑な実験系での検討が必要と考えられた。本研究の目的は、上皮成長因子受容体(EGFR)およびその下流に存在するシグナル伝達と、放射線照射によるDNA二重鎖切断修復との関係を解明し、抗EGFR抗体やEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)と放射線照射における併用効果の機序解明と新たな適応の拡大や薬剤の組み合わせの開発の基礎となる研究を行うことにある。抗EGFR抗体やEGFR-TKIは単独で使用した場合の抗腫瘍効果は限定されているものの、頭頸部癌等において放射線治療との併用でより高い抗腫瘍効果が得られることが示されている。これは、単に腫瘍に強発現したEGFRを阻害することにより腫瘍の分化・増殖・浸潤を抑えるのみならず、DNA損傷修復の阻害等の機序により放射線治療との相乗効果が得られている可能性が考えられる。本年度は、培養細胞を用いて抗EGFR抗体・EGFR-TKI処理をし、EGFR以下のシグナル伝達からDAN二重鎖切断修復に関連するタンパクの発現量や活性の変化と、放射線感受性・DNA二重鎖切断修復機能の変化の観察を行った。まず、EGFR-TKIとしてGefitinibを使用した。Gefitinib反応下によるMTTアッセイでは、Gefitinibの濃度依存性に細胞生存曲線が低下することが確認された。MTTアッセイの結果を基に、放射線照射とGefitinibの併用によるColony formingアッセイを行い照射とGefitinibの併用効果による細胞障害性の確認を行なった。また、ピストンH2Xを用いた免疫蛍光染色を行い、Gefitinib存在下での放射線照射によるDNA二重鎖切断修復阻害の観察を行った。現在、これらの結果をもとに、抗EGFR抗体であるCetuximabを用いて同様の実験を行い、さらにGefitinibとCetuximabの両薬剤と照射の同時併用による細胞障害を研究中である。GefitinibとCetuximabは異なる経路でのEGFR阻害を行うため、これらの経路の違いによるDNA二重鎖切断修復阻害が両存することにより相乗的な抗腫瘍効果が得られないかを研究中である。EGFRは上皮成長因子(EGF)のチロシンキナーゼ型受容体で、細胞膜を貫通して存在する膜タンパクである。細胞膜上にあるこの受容体にEGFが結合すると受容体は活性化し、各経路のシグナル伝達を介して細胞を分化、増殖させる。本研究の目的はEGFRおよびその下流に存在するシグナル伝達と、放射線照射によるDNA二重鎖切断修復との関係を解明し、抗EGFR抗体やEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)と放射線照射における併用効果の機序解明と新たな適応の拡大や薬剤の組み合わせの開発の基礎となる研究を行うことにある。H21年度はEGFR-TKIとしてGefitinibを使用し、Gefitinib反応下によるMTTアッセイでは、Gefitinibの濃度依存性に細胞生存曲線が低下することが確認された。H22年度はMTTアッセイの結果を基に、放射線照射とGefitinibの併用によるColony formingアッセイを行い照射とGefitinibの併用効果による細胞障害性の確認を行なった。この結果からはGefitinibによる放射線照射との併用効果が明らかでなかった。この原因は現時点で明らかでないが、細胞腫によって放射線との併用効果に差が出ることが示された。また、癌種によるEGFRの発現に変化が大きいため細胞種ごとの発現ライブラリーの作成を行った。使用した細胞種はA431、BxPC3、MIApaca2、Panc1、Hela、MCF7であり、細胞ごとのEGFRの発現量の比較を行った。EGFRの発現量と抗EGFR抗体・EGFR-TKIとの感受性との相関があることが予想された。また放射線治療との併用における抗腫瘍効果の増強に関しても、細胞種ごとのEGFRの発現量との相関が予想された。
動的ゲームアプローチによるディスクリプタシステムにおけるH_∞制御問題に関する研究

本研究では、動的ゲーム理論的アプローチによってディスクリプタシステムにおけるH_∞最適制御理論について研究しました。研究成果として、次の結果が得られました。まず、ティスクリプタシステムにおけるH_∞最適制御問題に対して一般化リカッチ微分方程式が重要な役割を果たしています。以前、この方程式について、解の存在の十分条件しか与えられなかった。本研究によって、一般化リカッチ微分方程式の解の存在の必要十分条件が得られました。結論として、一般化リカッチ微分方程式の解が二つの普通リカッチ微分と代数方程式に依存します。ですから、一般化リカッチ微分方程式の解の存在の必要十分条件は二つの普通リカッチ微分と代数方程式の解が存在することです。次に2次項の重み行列が不定の一般化リカッチ方程式の可解性について研究しました。十分大きな重み係数に対して、不定の一般化リカッチ方程式の解が必ず存在するが、重み係数が小さくなると不定の一般化リカッチ方程式の解が複素数解になることが明らかにしました。更に、ディスクリプタシステムにおけるH_∞最適制御問題を“軟拘束"(Soft-Constrained)動的ゲーム問題として定式化しました。以上の研究成果を用いて、状態フィードバックH_∞準最適制御を求めました。状態空間システムにおいて、状態フィードバックH_∞準最適制御が唯一であるが、ディスクリプタシステムにおいて、状態フィードバック準最適制御がたくさん存在することが分かりました。今後の課題として、状態フィードバックH_∞準最適制御が存在する時の重み係数の敷き値を調べます。もし敷き値が分かれば、この敷き値より大きな任意な重み係数に対して、状態フィードバックH_∞準最適制御が必ず存在します。
CPTIIの脳内局在解析と脳型CPTII欠損症の遺伝子診断

1中枢神経系CPTIIが肝由来と異なる脳型isoformであるかどうかの検討。ヒト肝から分離・精製した酵素CPTII(信州大学生化学教室、橋本隆教授から供与)をウサギに免疫後、CPTII抗体を作成した。免疫組織化学染色では、ヒト肝でペルオキシダーゼ法によってCPTIIが確認された。一方、中枢神経組織(大脳・小脳)および骨格筋では、CPTII抗体量を増やしてもCPTIIを確認できなかった。またimmunoblottingを用いても反応するバンドは得られなかった。中枢神経組織・骨格筋のCPTIIは肝由来とは異なるisoformと思われた。2脳型CPTII抗体の作成と脳内におけるCPTIIの分布・局在解析。(1)脳型CPTIIの分離・精製Miyazawaらの方法(J.Biochem.94:529-542,1983)に準じて、ヒト剖検脳からCPTIIの分離・精製を試みたが、脳では肝組織と比べミトコンドリア含有量が少なく、また単一の蛋白としてCPTIIを分離・精製できなかった。(2)脳内におけるCPTIIの分布・局在解析は、脳型CPTIIの精製ができなかったため脳型CPTII抗体の作成に至らず分布・局在解析は検討できなかった。3脳型CPTII欠損症における遺伝子異常の解析。筋型の変異(Ser-113-Leu)は、脳型CPTII欠損症の2家系には存在しなかった。検討した2家系のうち1家系に(Val-368-Ile)の変異を認めた。この遺伝子変異はReye様症候群をきたした症例の遺伝子変異としてTaroniらにより報告済であった。残る1家系で(Phe-352-Cys)の変異を認め、有意な遺伝子変異と考え報告したい。1中枢神経系のCPTIIが肝由来と異なる脳型isoformであるかの検討。(1)肝CPTII抗体作成ヒト肝から分離・精製した酵素CPTII(信州大学生化学教室、橋本隆教授から供与)をウサギに免疫後、CPTII抗体を作成した。(2)肝CPTII抗体の免疫反応性の検討免疫組織化学染色では、ヒト肝でペルオキシダーゼ法によってCPTIIが確認されたがヒト骨格筋、および中枢神経系組織(大脳・小脳)では確認できなかった。さらに抗体使用量を増やしimmunoblottingも用いて検討をすすめる。(1)脳型CPTIIの分離・精製信州大学生化学教室、橋本隆教授に指導を受けながらMiyazawaらの方法(J.Biochem.94:529-542,1983)に準じて、まずラット脳組織を使って研究を開始したところである。ヒト剖検脳が得られ次第、平行してすすめる。(2)脳内におけるCPTIIの分布・局在解析は(1)ができしだい実施する。(1)遺伝子異常の解析筋型の変異(Ser-113-Leu)は、脳型CPTII欠損症の2家系には存在しなかった。今後、Reye様症候群の症例でみられた変異(Arg-631-Cys)、(Val-368-Ile)の有無についても検討し、中枢神経障害を特徴とする遺伝子異常の発見につとめる。

しかし、抗体使用量を増やしても中枢神経系組織(大脳・小脳)と骨格筋ではCPTIIは確認できず、またimmunoblottingを用いても反応するバンドは得られなかった。中枢神経系のcptIIは肝由来と異なるisoformであるかもしれない。2脳型CPTII抗体の作成と脳内におけるCPTIIの分布・局在解析。(1)脳型CPTIIの分離・精製信州大学生化学教室、橋本隆教授に指導を受けながらMiyazawaらの方法(J.Biochem.94 : 529-542, 1983)に準じて、ヒト剖検脳を使ってCPTIIの分離・精製中である。脳では肝組織と比べミトコンドリア含有量が少ない問題点がある。(2)脳内におけるCPTIIの分布・局在解析は(1)ができしだい、脳型CPTII抗体を作成後実施する計画である。3脳型cptII欠損症における遺伝子異常の解析。筋型の変異(Ser-113-Leu)は、脳型CPTII欠損症の2家系には存在しなかった。現在、我々の2症例においてReye様症候群の症例でみられた変異(Arg-631-Cys)、あるいは(Val-368-Ile)の有無について検討中である。これ以外にも中枢神経障害を特徴とする遺伝子異常の発見につとめる。1中枢神経系のCPTIIが肝由来と異なる脳型isoformであるかどうかの検討。ヒト肝から分離・精製した酵素CPTII(信州大学生化学教室、橋本隆教授から供与)をウサギに免疫後、CPTII抗体を作成した。免疫組織化学染色では、ヒト肝でペルオキシダーゼ法によってCPTIIが確認された。一方、中枢神経組織(大脳・小脳)および骨格筋では、CPTII抗体量を増やしてもCPTIIを確認できなかった。またimmunoblottingを用いても反応するバンドは得られなかった。中枢神経組織・骨格筋のCPTIIは肝由来とは異なるisoformと思われた。(1)脳型CPTIIの分離・精製Miyazawaらの方法(J.Biochem.94:529-542,1983)に準じて、ヒト剖検脳からCPTIIの分離・精製を試みたが、脳では肝組織と比べミトコンドリア含有量が少なく、また単一の蛋白としてCPTIIを分離・精製できなかった。(2)脳内におけるCPTIIの分布・局在解析は、脳型CPTIIの精製ができなかったため脳型CPTII抗体の作成に至らず分布・局在解析は検討できなかった。3脳型CPTII欠損症における遺伝子異常の解析。検討した2家系のうち1家系に(Val-368-Ile)の変異を認めた。この遺伝子変異はReye様症候群をきたした症例の遺伝子変異としてTaroniらにより報告済であった。残る1家系で(Phe-352-Cys)の変異を認め、有意な遺伝子変異と考え報告したい。