hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糸球体硬化・間質繊維化阻止:新しいコラーゲン合成律速蛋白アンチセンス導入

進行性腎障害は、原疾患の如何を問わず共通の病理組織学的帰結である糸球体硬化と尿細管間質の線維化によって成立する事は良く知られている。本研究はこのような線維化のメカニズムの解明を目的に企画した。当初、本研究で我々は、共同研究者の尾形がクローニングし、肝伊東細胞で強く発現し、type Iprocollgenの産生を増強することが確認された蛋白質(type Iprocollagen C-proteinaseenhnacer protein,PCPE)に着目し、腎糸球体、尿細管の線維化との関連の解明を試みた。まず、我々はPCPEが腎に発現しているかを検討するため、Western blotおよび、Nortern blotによる検討を行った。培養メサンギウム細胞を用いて抗PCPE抗体でWestern blotを行ったところ、PCPEと思われるバンドが検出された。また同様に正常腎および慢性腎不全モデルである5/6腎摘ラット腎でも同様のバンドが検出された。しかし、その後の詳細な検討で、これらのバンドは抗体の特異性に問題があり、他の蛋白のバンドであることが確認された。また、培養メサンギウム細胞、正常腎、5/6腎摘ラット腎でNorthern blotをおこなったが、PCPEのmRNAは検出されなかった。これらの結果よりPCPEが腎において線維化に関与している可能性をこれ以上追求することを断念した。新たな目標として腎障害の進行に関するleukotrieneB4(LTB4)の果たす役割の検討を行った。まず、LTB4の拮抗薬が高脂血症による腎障害を抑制することを報告した。また、その産生酵素であるleukotrieneA4hydraseのmRNAの腎内分布を検討し報告した。正常糸球体では、基底膜collagenであるtypeIV collagenのみが存在しているが、硬化した糸球体では、硬化部位に一致してtype I collagenが発現する。一方、尿細管間質の線維化はヒトの糸球体腎炎で長期予後を規定する重要な組織学的所見の一である。すなわち、腎生検で既に尿細管間質に線維化が認められる患者は、たとえ糸球体病変が軽度であっても進行性に腎機能が低下する可能性が高い。このように、線維化は糸球体硬化、尿細管間質硬化と密接に関っており、線維化のメカニズムの解明は進行性腎障害の阻止に重要な役割を有している。我々は共同研究者の尾形がクローニングした新たな蛋白質(type I procollagen C-proteinaseenhnacer protein,PCPE)が、形質転換した肝伊東細胞で強く発現し、type I procollagenの産生を増強することに着目し、腎糸球体、尿細管の線維化との関連の解明を試みた。先ず、培養腎メサンギウム細胞はtypeIV collagenの他に、正常では産生されないtypeI collagenを産生することが知られており、このことは、培養に移すことでメサンギウム細胞が形質転換を起こしていることを示し、PCPEが発現している可能性を示唆していると考えた。そこで培養メサンギウム細胞を用いて抗PCPE抗体でwestem blotを行ったところ予想通りPCPEの発現が認められた。また同様に慢性腎不全モデルである5/6腎摘ラット腎でも発現が認められた。現在この発現の上流にあるシグナルの候補としてTGF-βなどのサイトカイン、growthfactorを検討中である。また、antisenceの導入で病的collagenの産生が抑制されるかどうか検討中である。

本研究はこのような線維化のメカニズムの解明を目的に企画した。当初、本研究で我々は、共同研究者の尾形がクローニングし、肝伊東細胞で強く発現し、type I proodigenの産生を増強することが確認された蛋白質(type I proodioagen C-proteinaseenhnacer protein,PCPE)に着目し、腎糸球体、尿細管の線維化との関連の解明を試みた。まず、我々はPCPEが腎に発現しているかを検討するため、Westem blotおよび、Nortemblotによる検討を行った。培養メサンギウム細胞を用いて拐PCPE抗体でWestem blotを行ったところ、RCPEと思われるバンドが検出された。また同様に正常腎および慢性腎不全モデルである5/6腎摘ラット腎でも同様のバンドが検出された。しかし、その後の詳細な検討で、これらのバンドは抗体の特異性に問題があり、他の蛋白のバンドであることが確認された。また、培養メサンギウム細胞、正常腎、5/6腎摘ラット腎でNorthem blotをおこなったが、RCPEのmRNAは検出されなかった。これらの結果よりPCPEが腎において線維化に関与している可能性をこれ以上追求することを断念した。新たな目標として腎障害の進行に関するleukotriene B4(LTB4)の果たす役割の検討を行った。まず、LTB4の拮抗薬が高脂血症による腎障害を抑制することを報告した。また、その産生酵素であるleukotriene A4hydraseのmRNAの腎内分布を検討し報告した。
細胞接着システムを利用した歯根形成メカニズムの解明

歯数や歯の形態異常を観察することは、時にさまざまな症候群を含む全身疾患の有無を見分ける為の有益な情報をもたらす。フィラミンーAは、細胞骨格の再編成を行うのを調節しているタンパク質である。また、フィラミンーAの遺伝子異常を伴うMelnick-Needles症候群患児では、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めた。歯根形成に関するメカニズム解明のため、shRNA-フィラミンーAを過剰発現させ、内因性フィラミンーA遺伝子発現を抑制したSF2細胞を作成し、スクラッチアッセイを行い、細胞移動の遅延を認めた。細胞外マトリックスは、インテグリンを始めとする細胞接着分子と、フィラミン-Aなどの細胞内アダプター分子を介して、アクチンなどの細胞骨格分子に結合し、細胞の機能や形態を制御すると考えられていた。本研究では、現在まで報告が皆無であった細胞内アダプター分子であるフィラミン-Aに着目し、マウスの各発生段階における凍結切片を用いた免疫色法および当研究室で保有しているラット由来歯原性上皮細胞株SF2細胞のmRNAを用いたRT-PCRにより、フィラミン-Aの発現を確認した。また、F-アクチンと結合するファロイジンを用いた二重染色において、フィラミン-Aは、細胞骨格タンパク質であるF-アクチンの細胞膜側で重なり、特徴的な細胞局在を示すことを明らかにした。さらに現在まで、フィラミン-Aの遺伝子異常を伴うMelnick-Needles症候群患児において、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めていることから、フィラミン-Aの歯根形成に関するメカニズム解析のため、SF2にshRNA-フィラミン-Aを過剰発現させ、内因性のフィラミン-A遺伝子を発現抑制したSF2細胞を作成し、細胞の移動能を検討するためスクラッチアッセイを行った。その結果、フィラミン- A発現抑制細胞において、スクラッチ部分の閉鎖が認められず、有意な細胞移動の遅延を認めた。そこで、細胞内のアクチン線維の動態をより詳細に観察するため、GFPラベルしたF-アクチンを強制発現した細胞を作製し、共焦点レーザー顕微鏡にてリアルタイム観察を行った。その結果、細胞内のアクチンの重合とアクチン線維の細胞周囲から核への移動が阻害されており、単位時間におけるアクチン線維の移動距離は遅延しているが明らかとなった。これらのことより、ヘルトビッヒ上皮小鞘の細胞増殖低下、または本上皮細胞の根尖方向への細胞移動の障害が生じていることが示唆された。本研究は、アクチンなどの細胞骨格分子に結合し、細胞の機能や形態を制御すると考えられている細胞内アダプター分子であるフィラミンーAに着目し、マウスの各発生段階における凍結切片を用いた免疫染色法および、当研究室で保有しているラット由来歯原性上皮細胞のmRNAを用いたRT-PCRにより、フィラミンーAの発現を確認している。ファロイジンを用いた二重染色においては、フィラミンーAは細胞骨格タンパク質であるF-アクチンの細胞膜側で重なり、特徴的な細胞局在を示すことを明らかにした。フィラミンーAの遺伝子異常を伴うMelnick-Needles症候群患児においては、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めていることから、歯根形成に関するメカニズム解析のため、SF2にshRNA-フィラミンーAを過剰発現させ、内因性のフィラミンーA遺伝子の発現を抑制したSF2細胞を作成し、細胞の移動能をけんとうするためスクラッチアッセイを行った。その結果、フィラミンーA発現抑制細胞において、スクラッチ部分の閉鎖が認められず、有意な細胞移動の遅延を認めた。そこで、細胞内のアクチン線維の動態をより詳細に観察するため、GPFラベルしたF-アクチンを強制発現させた細胞を作成し、共焦点レーザー顕微鏡にてリアルタイム観察を行った。その結果、細胞内のアクチンの重合とアクチン線維の細胞周囲から核への移動が障害されており、短時間におけるアクチン線維の移動距離は遅延していることが分かった。これらにより、ヘルトビッヒ上皮鞘の細胞増殖低下、または本上皮細胞の根尖方向への細胞移動の障害が生じていると示唆された。さらに、インテグリンβ1ノックアウト由来歯原性上皮細胞、shRNA-フィラミンーA遺伝子導入によるフィラミンーA発現抑制細胞より抽出したmRNAを用いて、マイクロアレーを使用して遺伝子スクリーニングを行った。フィラミン-Aの各歯胚発生過程における発現から、フィラミン-Aが発生段階初期よりエナメル質、象牙質、歯根の形成に関与していることは明らかで、また、フィラミン-Aの発現低下が細胞内におけるアクチン線維の再構成や局在に影響を及ぼし、細胞遊走能が遅延すると考えられる。このメカニズムが歯根形成時に働き、結果として短根になる可能性が示唆された。また、フィラミン-Aの上流分子である細胞接着分子、インテグリンβ1を欠損するコンディショナルノックアウトマウスは、毛の形成異常とともに歯の形成遅延を生じている。このように、これまでの研究成果で、それぞれの分子が歯の形成に重要な役割を演じていることがわかっており、今後はインテグリンβ1を始めとするフィラミン-A

周囲の分子との関連をも含めた、より詳細な解析を行っていく。25年度が最終年度であるため、記入しない。インテグリンβ1ノックアウト由来歯原性上皮細胞株、shRNA-フィラミン-A遺伝子導入によるフィラミン-A発現抑制細胞より抽出したmRNAを用いて、マイクロアレーを使用した包括的な遺伝子スクリーニングを行い、フィラミン-Aの発現低下によって生じる細胞内遺伝子発現の変化について検討する。また、これらのマイクロアレーの解析データより、遺伝子、タンパク、代謝産物リストの解析が行えるIPA(Ingenuity Pathways analysis)を用いて、関連深い生物学的機能、疾患情報等を取得し、さらに新しい歯根形成メカニズムの解析を進めていく。
昼光を有効に利用するための昼光と日射に関する標準資料の作成および測定装置の開発

快適で省エネルギ-に叶う建築環境を計画し構成するためには、昼光と日射を有効に利用しなければならない。そのためには、昼光と日射の実態の諸様相をを的確に示し、実際の設計に有用な標準資料が必要である。しかし、現在、このような資料は皆無である。また、その測定すら満足に行われていない。適正な測定機器を欠くものもある。本研究は、このような現状に鑑み、昼光と日射の諸様相を長期間連続想定を可能とする測定システムを構築し、本邦各地、及び世界各地で、長期間の実測デ-タを収集し、さらに、それを標準化し、建築の光環境と温熱環境に有用な資料を作成提示することを目的とする。そのために必要な測定機器を開発、あるいは、既製の機器を改造し、それらを組み合わせて、昼光と日射の常時測定が可能な総合的なシステムを完成した。これを京都大学と北海道大学に設置した。また、別途の研究助成金で、全く同様のシステムを九州大学に完成した。また、全国の関係研究者に、この研究に参加することを求めた。その結果、現在、完成した測定所、建設途上のもの、計画中のものなど、全国各地に15ケ所を数えるに到っている。本研究の次の課題は、これらの測定所の組織化とそこで取得するデ-タの収集、整理、分配である。本研究では、上記の3ヶ所の測定所で取得したデ-タの自動品質管理を試みた。また、その統計的要約も試みている。国際照明委員会では、1983年以来、昼光と日射の収集と整理、交換を世界的な規模で行うことを計画している。本研究は、この計画にも呼応するものである。本研究は、世界各国に先駆けて卓越した測定機器を開発し、有用なシステムを完成した。これは、世界各国の研究者が注目するところで、本研究で開発した機器を用い、全く同じシステムの構築を計画している国もある。本年度の本研究の計画に伴う第一の必須の作業は、主として、ロ-デ-タとしての測定結果を出力する昼光の長期連続測定装置の開発と設置である。そのために必要なおよその基礎的検討事項を列記すると、1.基礎的な昼光資料として必要とする測定項目の選定、2.その測定のための機器の検討と選定、あるいは、開発、3.長期連続測定の実際的システムの構成、4.長期連続測定装置の設置、5.これによる試験的測定の実施である。次いで、明年度以後の研究に大きく関連するが、本研究が最終目的の一つとする昼光と日射の標準デ-タの作成のためには、6.我国に適する標準的な昼光照明法の検討、7.この設計方法に有用な標準デ-タの最適フォ-マットの検討、8.昼光と日射の関連、および、その検討方法に対する考察、また、9.長期連続測定装置が出力するロ-デ-タを有用で実際的な昼光と日射に関する建築環境の有用な標準設計資料に変換するシステムの開発、などである、以上に関連して、太陽の視赤緯、近似差など関連資料の検討が必要である、さらに、本研究は、CIEの技術委員会TC307の国際昼光測定年に呼応するものである。従って、10.CIE TC307の活動と常に歩調を合わせる必要がある。研究代表者松浦邦男は、現在、京都大学に、昼光と日射の長期連続測定装置を完成しつつある。この装置は、本年度中に、ロ-デ-タを出力する筈である。

さらに、以上の項目のそれぞれについて、研究分担者と常時密接な連絡を保ち、それぞれの進捗を計り、また、その総括をしている。また、1989年10月にハンガリ-のブタペストと西ドイツのベルリンで開催されたCIE TC307の技術委員会に出席して、長期連続測定装置を実際に設置しつつある者としての見解を表明するとともに、同委員会の討議に参加し、その動向を調査検討した。平成2年度の研究は研究の実施計画に沿ってほぼ完全に遂行出来た。平成元年度に完成した京都大学の研究クラスの測定装置は、本年度、試験測定を開始した。その取得デ-タを精査し、また、装置の設置状況を詳細に検討した結果、設定方位などに若干の誤謬が発見された。これは、直ちに修正した。その結果、現在は試験的な連続測定が可能となり、これを行っている。取得デ-タを国内配布や国際交換する最終的なフォ-マットに加工する段階に到っていないが、取得デ-タを自動的に品質管理するコンピュ-タプログラムを作成し、試験測定のデ-タを用いて、これを試みた。その結果、ほとんどの測定値は許容誤差以内に納まっていると判定できたが、直射照度の測定値に若干の疑問が生じた。現在、この測定機器、及び、その変換係数などを検討中である。また、平成2年度は、試験的に取得したデ-タに基づき、直射照度、天空光照度、昼光照度と直達日射量、天空日射量、全天日射量の関係を示す発光効率の簡単な検討の試みを開始した。平成2年度に、北海道大学に予定した研究クラスの測定装置は設置を完了した。現在、試験測定を開始している。しかし、依然として防雪のための対策が立たない。悪戦苦闘しているのが現況である。降雪期はデ-タの取得を見合わせるか、あるいは、新規開発研究を試み適切な防雪対策を立てる必要があると考えている。別途、開発研究を試みている走査型の天空輝度分布の測定装置も完成した。さらに、これに天空放射輝度分布の測定装置を付加するように改造を試みた。これもほぼ完成している。平成3年度の本研究では、この装置を完全にし、京都大学と北海道大学に設置する予定である。研究代表者の中村は、研究分担者の松浦、沖と1990年10月にモスクワで開催された昼光照明関係のシンポジウムを機に開かれたCIEのTC307の委員会に出席して、委員長や各国の委員と討論や意見の交換を行った。平成3年度の研究実績は以下のようである。1.京都大学と北海道大学の測定システムによる昼光と日射の長期間にわたる本格的な連続測定の開始2.測定開始に伴う両大学の測定システムの改良と調整:平成2年度までに両大学に設置したシステムの本格的な稼動を開始し、それによって測定機器、コンピュ-タ・プログラムなどを調整した。また若干の瑕疵を修正、あるいは、改良した。3.昼光と日射の総合長期測定システムの完成:測定機器の設置の完了、測定デ-タ取得、保存システムの完成と、システム稼動プログラムの完成により、現在、支障なく連続測定を続けている。4.天空輝度分布測定装置の設置:別途開発した天空輝度分布測定装置とその稼動プログラム、モニタ-・プログラムを完成し、両大学に設置し、測定を開始した。なお、この装置は、現在、天空放射輝度も同時測定が可能なように改良を試み、実験中である。5.デ-タの標準フォ-マットの決定とデ-タ整理の試み:日々産出される膨大なデ-タの標準フォ-マットを決定し、1991年度1年分のデ-タの整理を試みた。6.1991年CIEメルボルン大会を機に開催された国際昼光測定プログラムの委員会に、中村、沖、松浦が出席し、本邦の測定システムに完成状況を報告した。
高齢木ヒメコマツの高芽接ぎによる天然更新の試み

【はじめに】千葉県房総半島の房総丘陵には山地性針葉樹ヒメコマツが天然に隔離分布するが, 1970年以降に急激に個体数が減少し,房総丘陵に位置する東京大学千葉演習林内では, 1970年代には天然個体が200本以上あったが,現在では, 20本以下にまで減少している。房総丘陵のヒメコマツは奥山に小集団化し,各集団の距離が数百m以上で離れ各々の集団が隔離され,花粉流動が悪い。一方,人工交配で強制他家受粉を行った場合,種子の充実率が向上することが明らかになっており,いかにして他家受粉率を向上させるかが課題である。これまで申請者は,約20年生ヒメコマツの高芽接ぎでは,既に適用の可能性を示している。そこで本研究では,これまでに得られた知見を利用して異なるクローンを100年以上の高齢木に接ぎ木し,早期に種子を得る高芽接ぎを現地で試みる。【方法】高芽接ぎは冬季におこなった。使用する台木は,千葉演習林内に生残する天然性の高齢木の2個体とし, 30枝/家系(合計60本)で高芽接ぎする。通常の接ぎ木であれば何らかの処理の必要性があるが高芽接ぎにおいては無処理でも活着の可能性を示したことから接ぎ穂の処理はおこなわなかった。供試する穂木は, 2家系とし,集植所にクローン保存してある約20年生木と100年生以上の高齢木の同家系から約半分ずつとした。接ぎ方は,台木の樹冠外縁部の1年生枝に穂木を枝ごと割接ぎし,接ぎ木テープで縛り固定した。活着調査を5月, 8月, 12月でおこない成否を判断した。【結果と考察】8月の段階では,台木2本とも集植所個体の接ぎ穂で高い活着率を示した。しかし, 12月の調査ではほとんどが枯死し差が見られなかった。20年生のヒメコマツを用いた高芽接ぎでは,活着の成否が概ね夏季で判断できるが,高齢木台木を用いた場合では,冬季まで判断がつかなかった。100年生の台木を用いた場合, 20年生の台木と違う処理をおこなわないと活着が困難でると言えよう。
下垂体腺腫の血管新生に関するPETを用いたmRNA発現の生体画像化法の研究

下垂体腺腫は類洞構造を持つ血管豊富な腫瘍で,血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)の発現も亢進していることから,血管新生能(angiogenesis)の高い腫瘍と言われている。18F-10B-fluoroboronophenylalanine(FBPA)はアミノ酸輸送のindicatorとして知られており,治療前にFBPA-PETを行って血管新生能を画像化し,治療後の腫瘍の再発や増大との相関を解析・評価することにより,下垂体腺腫の病態解明に大きく貢献するとともに,本法が治療方針決定のための機能的画像診断法となりうるか否かを検討することを本研究の目的とした。平成1718年度で,術前に下垂体腺腫と診断された3症例に対し,FBPA-PET撮影を行った。PETの撮像装置は西陣病院の現有の装置(HEADTOME III,島津製作所製)を使用し,FBPAは同施設にて独自に合成する。FBPA静注後ダイナミック撮影を行い,腫瘍への平均集積カウントを健常灰白質のそれで除した腫瘍灰白質比(T/N)を測定し,腫瘍へのFBPA集積度の指標とする。MRI撮像を行った後,専用のsoftwareを用いて腫瘍体積の計測を行う。手術で摘出した腫瘍組織を対象に,formalin固定後paraffin包埋した標本に対し,免疫組織化学的手法を用いてMIB-1 indexおよびVEGF発現度を測定する。さらにわれわれの開発したVEGF/HCGのポジトロン標識antisense probeを用いて,脳腫瘍切除切片におけるVEGF/HGF mRNA発現を画像化する。3例中2例では腺腫内にFBPAの集積を認め,他の1例では集積はみられなかった。上記3例に対するMRI画像上の変化についての検討では,全例で腫瘍再増大は観察されず,本研究期間内でFBPA-PET所見と臨床的腫瘍増大の有意な相関は認めなかった。免疫組織化学的変化およびin situ hybridizationの結果とFBPA-PETとの相関については現在解析中である。下垂体腺腫は類洞構造を持つ血管豊富な腫瘍で,血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor : VEGF)の発現も亢進していることから,血管新生能(angiogenesis)の高い腫瘍と言われている.18F-10B-fluoroboronophenylalanine(FBPA)はアミノ酸輸送のindicatorとしで知られており,治療前にFBPA-PETを行って血管新生能を画像化し,治療後の腫瘍の再発や増大との相関を解析・評価することにより,下垂体腺腫の病態解明に大きく貢献するとともに,本法が治療方針決定のための機能的画像診断法となりうるか否かを検討することを本研究の目的とした.本年度は,術前に下垂体腺腫と診断された2症例に対し,FBPA-PET撮影を行った.PETの撮像装置は西陣病院の現有の装置(HEADTOME III,島津製作所製)を使用し,FBPAは同施設にて独自に合成する.FBPA静注後ダイナミック撮影を行い,腫瘍への平均集積カウントを健常灰白質のそれで除した腫瘍灰白質比(T/N)を測定し,腫瘍へのFBPA集積度の指標とする.MRI撮像を行った後、専用のsoftwareを用いて腫瘍体積の計測を行う.手術で摘出した腫瘍組織を対象に,formalin固定後paraffin包埋した標本に対し,免疫組織化学的手法を用いてMIB-1 indexおよびVEGF発現度を測定する.さらにわれわれの開発したVEGF/HCGのポジトロン標識antisense probeを用いて、脳腫瘍切除切片におけるVEGF/HGF mRNA発現を画像化する.2例中1例では腺腫内にFBPAの集積を認め,他の1例では集積はみられなかった.今後はMRI上の画像的変化,免疫組織化学的変化およびin situ hybridizationの結果とFBPA-PETとの相関につき検討を進める.下垂体腺腫は類洞構造を持つ血管豊富な腫瘍で,血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor : VEGF)の発現も亢進していることから,血管新生能(angiogenesis)の高い腫瘍と言われている.18F-10B-fluoroboronophenylalanine(FBPA)はアミノ酸輸送のindicatorとして知られており,治療前にFBPA-PETを行って血管新生能を画像化し,治療後の腫瘍の再発や増大との相関を解析・評価することにより,下垂体腺腫の病態解明に大きく貢献するとともに,本法が治療方針決定のための機能的画像診断法となりうるか否かを検討することを本研究の目的とした.昨年度本年度で,術前に下垂体腺腫と診断された3症例に対し,FBPA-PETを行った.PETの撮像装置は西陣病院の現有の装置(HEADTOME III,島津製作所製)を使用し,FBPAは同施設にて独自に合成する.FBPA静注後ダイナミック撮影を行い,腫瘍への平均集積カウントを健常灰白質のそれで除した腫瘍灰白質比(T/N)を測定し,腫瘍へのFBPA集積度の指標とする.MRI撮像を行った後、専用のsoftwareを用いて腫瘍体積の計測を行う.手術で摘出した腫瘍組織を対象に,formalin固定後paraffin包埋した標本に対し,免疫組織化学的手法を用いてMIB-1 indexおよびVEGFを測定する.さらにわれわれの開発したVEGF/HCGのポジトロン標識antisense probeを用いて、脳腫瘍切除切片におけるVEGF/HGF mRNA発現を画像化する.3例中2例では腺腫内にFBPAの集積を認め,他の1例では集積はみられなかった.

今後はMRI上の画像的変化,免疫組織化学的変化およびinsitu hybridizationの結果とFBPA-PETとの相関につき検討を進める.下垂体腺腫は類洞構造を持つ血管豊富な腫瘍で,血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)の発現も亢進していることから,血管新生能(angiogenesis)の高い腫瘍と言われている。18F-10B-fluoroboronophenylalanine(FBPA)はアミノ酸輸送のindicatorとして知られており,治療前にFBPA-PETを行って血管新生能を画像化し,治療後の腫瘍の再発や増大との相関を解析・評価することにより,下垂体腺腫の病態解明に大きく貢献するとともに,本法が治療方針決定のための機能的画像診断法となりうるか否かを検討することを本研究の目的とした。平成1718年度で,術前に下垂体腺腫と診断された3症例に対し,FBPA-PET撮影を行った。PETの撮像装置は西陣病院の現有の装置(HEADTOME III,島津製作所製)を使用し,FBPAは同施設にて独自に合成する。FBPA静注後ダイナミック撮影を行い,腫瘍への平均集積カウントを健常灰白質のそれで除した腫瘍灰白質比(T/N)を測定し,腫瘍へのFBPA集積度の指標とする。MRI撮像を行った後,専用のsoftwareを用いて腫瘍体積の計測を行う。手術で摘出した腫瘍組織を対象に,formalin固定後paraffin包埋した標本に対し,免疫組織化学的手法を用いてMIB-1 indexおよびVEGF発現度を測定する。さらにわれわれの開発したVEGF/HCGのポジトロン標識antisense probeを用いて,脳腫瘍切除切片におけるVEGF/HGF mRNA発現を画像化する。3例中2例では腺腫内にFBPAの集積を認め,他の1例では集積はみられなかった。上記3例に対するMRI画像上の変化についての検討では,全例で腫瘍再増大は観察されず,本研究期間内でFBPA-PET所見と臨床的腫瘍増大の有意な相関は認めなかった。免疫組織化学的変化およびin situ hybridizationの結果とFBPA-PETとの相関については現在解析中である。
軌道秩序が引き起こす巨大正方晶歪ペロブスカイトの薄膜合成

高圧合成法により得られる準安定相の立方晶ペロブスカイトバナジウム化合物BaVO3ならびにSr1-xBaxVO3薄膜のパルスレーザー堆積法による合成と物性評価に取り組んだ。還元ガスである水素混合アルゴンガスを導入した成膜により、副生成物を抑制できることを見出した。面直-面内格子定数比c/aはBa置換量に対して低温において絶縁体化し、c/aが1.04の薄膜が得られた。d電子をひとつだけ持つバナジウム4価のピラミッド配位化による巨大正方晶相の存在を確認するため、上記の薄膜について第二次高調波発生測定を測定した。強誘電体であるBi(Fe,Co)O3薄膜と比較すると、Sr1-xBaxVO3薄膜は有意な強度を示さなかった。正方晶化している領域の厚さが小さいことが問題と考えられるので、これを増大させることで改善が可能であると考えられる。また、Sr1-xBaxVO3薄膜と接合する電極として利用できる材料として、格子定数の小さい四重ペロブスカイト化合物RCu3Mn4O12に着目した。この物質は合成に高圧印可が必要な準安定相であるが、代わりにYAlO3基板との格子整合による安定化によってエピタキシャル薄膜化させることに成功した。昨年度に記載した検討課題であった、Baの置換量が大きくなるほど高酸化数側の不純物が生成しやすくなりプロセスウインドウが狭くなる問題点について、アルゴン水素ガスの導入により薄膜の品質を上昇させることができた。これをふまえて、薄膜の特性評価にも着手することができるようになったので、物性評価をまとめあげて成果発表へとつなげる予定である。これまでの検討より、Sr1-xBaxVO3薄膜の作製性を概ね確保することができるようになったので、電気伝導特性などの評価を行い、成果発表へとまとめ上げる。また、四重ペロブスカイト酸化物では、高圧での安定相をエピタキシャル薄膜化によって安定化する指針を新たに見出すことができたので、その成果について外部発表できるようにまとめ上げるとともに、高圧相の安定化を他物質に検討できるかどうか検討を進める。パルスレーザー堆積法を用いて、単結晶ペロブスカイトSrTiO3基板上にBaVO3、ならびにSr置換したSr1-xBaxVO3薄膜を作製した。高圧合成法により得られる立方晶ペロブスカイトBaVO3では、上記の基板上には成長が確認できなかった。そこで、SrVO3からBa置換量を増やして製膜条件を探索したところ、Ba置換量が増えるほど、バナジウムの高酸化数の不純物が生成しやすいことが明らかになった。この不純物は、還元雰囲気下の製膜によって低減できる傾向も見出された。上記の製膜条件の検討を踏まえて、より格子定数が小さなペロブスカイトを基板に用いることで、格子整合による圧縮歪みを印加し、Sr1-xBaxVO3薄膜をより正方晶化することを試みた。さまざまな単結晶基板上にSr1-xBaxVO3薄膜を作製したところ、SrTiO3よりも格子定数が小さいLSAT基板上に、基板と面内格子定数が整合したSr1-xBaxVO3薄膜が得られた。面直-面内格子定数比c/aはBa置換量に対して増加し、x=0.6では1.04に達した。また、Ba置換量のことなる薄膜において、電気抵抗率の温度依存性を調べたところ、Ba置換量の増大に伴って電気抵抗率の値が上昇し、低温において絶縁体化する傾向が確認された。一方、LSATよりもさらに格子定数の小さいLAO基板にSr1-xBaxVO3薄膜を作製した場合は、薄膜が完全に緩和しており、エピタキシャル応力によるc/a比の増大は生じなかった。パルスレーザー堆積法による製膜の結果、Aサイトが完全にBaであるBaVO3の薄膜は得られなかったが、AサイトにBaが置換されたSr1-xBaxVO3薄膜を得ることができ、エピタキシャル応力による圧縮歪みを利用して、c/a比が1より大きい薄膜を実現することができた。しかしながら、Baの置換量が大きくなるほど高酸化数側の不純物が生成しやすくなり、プロセスウインドウが狭くなった。また、Ba置換量が多い試料では、臨界膜厚が小さくなる傾向が示唆された。このため、正方晶相の物性評価方法が計画当初よりもそれほど容易でない可能性が予想されるため、実験方法を検討する。

この物質は合成に高圧印可が必要な準安定相であるが、代わりにYAlO3基板との格子整合による安定化によってエピタキシャル薄膜化させることに成功した。昨年度に記載した検討課題であった、Baの置換量が大きくなるほど高酸化数側の不純物が生成しやすくなりプロセスウインドウが狭くなる問題点について、アルゴン水素ガスの導入により薄膜の品質を上昇させることができた。これをふまえて、薄膜の特性評価にも着手することができるようになったので、物性評価をまとめあげて成果発表へとつなげる予定である。パルスレーザー堆積法によるBaxSr1-xVO3薄膜の合成条件はおおむね確立したが、Ba置換量のより大きな試料における条件の最適化、あるいは臨界厚さ程度の薄膜の作製を検討する。また、現在得られている試料は、低温においてc/aの増大に伴う電気抵抗の絶縁体化が見られているが、室温では以前金属的な挙動である。低温における物性評価の方法を検討する。これまでの検討より、Sr1-xBaxVO3薄膜の作製性を概ね確保することができるようになったので、電気伝導特性などの評価を行い、成果発表へとまとめ上げる。また、四重ペロブスカイト酸化物では、高圧での安定相をエピタキシャル薄膜化によって安定化する指針を新たに見出すことができたので、その成果について外部発表できるようにまとめ上げるとともに、高圧相の安定化を他物質に検討できるかどうか検討を進める。次年度使用額のうち主な用途は、薄膜作製用パルスレーザー堆積装置ならびに薄膜試料評価装置の不良に対応するための修理費・部品費である。修理の一部が年度内に終了しないため、次年度への繰越しが発生した。研究進捗のうち、薄膜の合成条件確立に遅れが生じたため、外部発表のとりまとめが後ろ倒しになってしまった。次年度の残額は主に資料の基板と外部発表成果に使用予定である。
胎児期の内分泌かく乱物質への曝露が性分化・性腺機能に及ぼす影響に関する研究

環境省「子供の健康と環境に関する全国調査(エコチル調査)」に参加している対象者のうち、平成24年から我々の行っている追加調査に同意した約1600組の母児を対象に3歳時調査を行い、986組より回収が可能であった(回収率:65.6%)。回収したアンケートをもとに3歳時点における脳の性分化を反映する性役割傾向調査の結果と排泄の自立の関連について解析を行った。日中の排尿の確立については、男児は女児よりも確立している割合が少なかった(20.8% vs 30.7%)。また性役割傾向スコアは男児で女児よりも有意に高かった(30.2±8.5 vs 27.9±8.7)。排尿確立の有無と性役割傾向スコアの関係を見てみると、男児では差は見られなかったが、女児では確立していない児の方が性役割傾向調査スコアが高かった。1週間の頻度を見てみると、男児では関連は見られなかったものの女児では失禁の頻度と性役割傾向調査の間に相関がみられた。環境化学物質曝露の影響が遺伝子多型の修飾を受ける可能性を探索するため、北海道大学環境健康科学研究教育センターが施行している出生コホート“北海道スタディ"への参加者を対象に、臍帯血を用いてエストロゲンレセプター1(ESR1)遺伝子の遺伝子多型と胎児期の性ホルモン環境を反映するとされる第2指/第4指の関連を検討した。ESR1遺伝子一塩基多型としてPvuII (rs2234693)、XbaI (rs9340799)、rs2077647についての解析を行った。その結果、男児においてXbaI (rs9340799)の多型が第2指/第4指に影響を与えていることが判明した。3歳時調査の回収が終了し、第2誌指/第4指の測定、排泄確立に関するアンケートや性役割傾向調査の解析、環境化学物質の測定も終了している。しかしながら3歳時調査の対象となる児の遺伝子多型の解析や臍帯血中の性ホルモンの測定がやや遅れている。3歳時調査を行った児は出生時の身体所見のデータも回収されており、3歳時の身体所見や脳の性分化との関連と環境化学物質との関連の解析が途中であることもやや遅れているとした理由である。脳の性分化と排泄の確立の関連が明らかとなったため、これまで測定が終了した胎児期の性ホルモンに影響を与えると考えられている妊娠初期母体尿の化学物質(フタル酸エステル類10化合物:MEHP/MEHHP/MEOHP/MiBP/MECPP/MBzP/MiNP/cx-MiNP/OH-MiNP、ビスフェノール類3化合物:BPA/BPF/BPS)の514検体を用いて、臍帯血中の性ホルモンへの影響、出生時および3歳時に測定を行った身体的性分化への影響、3歳時の性役割傾向調査の結果に対する影響、および排泄確立に与える影響を解析する予定である。北海道大学環境健康科学研究教育センターが施行している出生コホート“北海道スタディ"を対象とした研究では遺伝子多型が身体的性分化に影響を与えることが明らかとなったため、性ホルモンに影響を与えるとされる環境化学物質の身体的性分化への影響が遺伝子多型によりいかに修飾されるかについて検討を行う。環境省「子供の健康と環境に関する全国調査(エコチル調査)」に参加している対象者のうち、平成24年から行って我々の行っている追加調査に同意し、出生時調査として母体尿・出生時の臍帯血・入院中の母体血の採血・出生時の肛門性器間距離、第2指・第4指の長さ、男児の陰茎長、精巣容積の測定を行った母児約1600組に対して3歳時調査を行った。3歳時調査は、両手のコピー・アンケートによる性役割行動調査・3歳時点での化学物質曝露評価のため尿の採取を行った。現時点で986組より回収が可能であり、回収率は65.6%であった。さらに、追加調査の出生時調査のデータが揃いおよび3歳時調査の回収が可能であった対象者の妊娠初期の環境化学物質曝露測定を目的に、妊娠初期母体尿の化学物質(フタル酸エステル類10化合物:MEHP/MEHHP/MEOHP/MiBP/MECPP/MBzP/MiNP/cx-MiNP/OH-MiNP、ビスフェノール類3化合物:BPA/BPF/BPS)の測定を232検体で行った。以前に測定した282検体と合わせて、計514検体の測定が終了した。現在出生時調査における身体所見と3歳時調査における身体所見や性役割行動調査の関係や化学物質曝露と3歳時調査で得られた所見の関連を検討中である。環境化学物質曝露の影響が遺伝子多型の修飾を受ける可能性を探索するため、北海道大学環境健康科学研究教育センターが施行している出生コホート“北海道スタディ"への参加者を対象に、臍帯血を用いてエストロゲンレセプター1(ESR1)遺伝子の遺伝子多型を調査した。3歳時調査の回収や化学物質の測定、遺伝子多型の解析などを施行しており、おおむね順調に進行していると考えられる。環境省

「子供の健康と環境に関する全国調査(エコチル調査)」に参加している対象者のうち、平成24年から我々の行っている追加調査に同意した約1600組の母児を対象に3歳時調査を行い、986組より回収が可能であった(回収率:65.6%)。回収したアンケートをもとに3歳時点における脳の性分化を反映する性役割傾向調査の結果と排泄の自立の関連について解析を行った。日中の排尿の確立については、男児は女児よりも確立している割合が少なかった(20.8% vs 30.7%)。また性役割傾向スコアは男児で女児よりも有意に高かった(30.2±8.5 vs 27.9±8.7)。排尿確立の有無と性役割傾向スコアの関係を見てみると、男児では差は見られなかったが、女児では確立していない児の方が性役割傾向調査スコアが高かった。1週間の頻度を見てみると、男児では関連は見られなかったものの女児では失禁の頻度と性役割傾向調査の間に相関がみられた。環境化学物質曝露の影響が遺伝子多型の修飾を受ける可能性を探索するため、北海道大学環境健康科学研究教育センターが施行している出生コホート“北海道スタディ"への参加者を対象に、臍帯血を用いてエストロゲンレセプター1(ESR1)遺伝子の遺伝子多型と胎児期の性ホルモン環境を反映するとされる第2指/第4指の関連を検討した。ESR1遺伝子一塩基多型としてPvuII (rs2234693)、XbaI (rs9340799)、rs2077647についての解析を行った。その結果、男児においてXbaI (rs9340799)の多型が第2指/第4指に影響を与えていることが判明した。3歳時調査の回収が終了し、第2誌指/第4指の測定、排泄確立に関するアンケートや性役割傾向調査の解析、環境化学物質の測定も終了している。しかしながら3歳時調査の対象となる児の遺伝子多型の解析や臍帯血中の性ホルモンの測定がやや遅れている。3歳時調査を行った児は出生時の身体所見のデータも回収されており、3歳時の身体所見や脳の性分化との関連と環境化学物質との関連の解析が途中であることもやや遅れているとした理由である。今後、現在出生時調査における身体所見と3歳時調査における身体所見や性役割行動調査の関係や化学物質曝露と3歳時調査で得られた所見の関連を検討するとともに、臍帯血中の性ホルモン濃度の測定・遺伝子多型の検討を行い、胎児期の環境化学物質曝露が身体所見・性役割行動・性ホルモン能動に与える影響を検討するとともに、遺伝子多型による修飾の可能性を検討する。脳の性分化と排泄の確立の関連が明らかとなったため、これまで測定が終了した胎児期の性ホルモンに影響を与えると考えられている妊娠初期母体尿の化学物質(フタル酸エステル類10化合物:MEHP/MEHHP/MEOHP/MiBP/MECPP/MBzP/MiNP/cx-MiNP/OH-MiNP、ビスフェノール類3化合物:BPA/BPF/BPS)の514検体を用いて、臍帯血中の性ホルモンへの影響、出生時および3歳時に測定を行った身体的性分化への影響、3歳時の性役割傾向調査の結果に対する影響、および排泄確立に与える影響を解析する予定である。北海道大学環境健康科学研究教育センターが施行している出生コホート“北海道スタディ"を対象とした研究では遺伝子多型が身体的性分化に影響を与えることが明らかとなったため、性ホルモンに影響を与えるとされる環境化学物質の身体的性分化への影響が遺伝子多型によりいかに修飾されるかについて検討を行う。3歳時調査の回収が65%程度であったことから予定より低額で進んでおり、次年度使用額が生じた。繰越金は次年度の性ホルモン測定や遺伝子多型の解析に使用する予定である。研究成果が出始めているものの伝子多型の解析や臍帯血中の性ホルモンの測定がやや遅れていることから次年度使用額が生じた。
阿武隈山地渓流魚の放射性Cs移行メカニズムと渓流魚体内のCs低減化に関する研究

浪江町の避難指示難区域において3年間にわたり渓流魚(ヤマメ・イワナ)の137Cs濃度の推移を調べた。その結果、2魚種ともに環境中の放射能強度が高い河川ほど有意に高かった。調査期間内で、いずれの地点・魚種ともに137Cs濃度の明瞭な減少傾向は認められず、福島第一原発事故から約7年が経過した現在では2魚種のCs濃度はほぼ平衡状態に達しているものと推測された。ヤマメとイワナのCs低減化実験の結果、ゼオライト混合飼料投与区で飼育した魚の生物学的半減期は、固形飼料投与区で飼育した場合と比較して,ヤマメとイワナでそれぞれ約4050%短くなった。ゼオライト混合飼料は137Csを低減させるのに有効であった。本研究の目的の一つは、福島県浪江町を流れる空間線量強度の異なる渓流において、放射性セシウム(以降Cs)を含まない魚を標識放流し、標識魚の再捕獲とそのCs濃度のモニタリングを実施することで、放流魚へのCs移行メカニズム解明やCs移行速度を推測すること。また渓流間でそれらの値が異なる場合には、天然魚、生息環境の底質・河川流下物および餌生物に含まれるCsの分析結果を総合し、その差異をもたらす機構を解明することである。27年度は、空間線量の異なる3渓流ABC(計画では2渓流であったが台風による大水等に備えて予備を設けた)で5月下旬に魚種Iと魚種IIの標識放流をした。放流後、合計7回の再捕獲調査と同時に天然魚、環境試料および餌生物の採取をした。また餌を食べないように魚を篭に入れて渓流内に設置し、えらを通過した水からのCs移行量を調べる実験を行った(in situ実験)。環境調査の結果、空間線量率は渓流A、B、Cの順に高い値であった。河川近傍の山土、渓流の堆積物、川底落葉および渓流水のCs濃度は全て渓流A、B、Cの順に高かった。水生昆虫および天然魚のCs濃度も渓流A、B、Cの順に高く、河川環境中のCs濃度が高い渓流ほど、生息する生物が高濃度に汚染されていることが分かった。放流実験の結果、渓流Aに放流した魚のCsの移行速度が渓流Cのそれよりも57倍速く、河川環境中の放射性Cs濃度が高い渓流ほど魚体への放射性Cs移行速度が速かった。また、魚種IのCs移行速度は魚種IIの約2倍程度と大きな差があった。胃内容物の解析から両種の食性は類似しており、この差は代謝量やCs排出速度などの違いによって生じたと推測された。in situ実験の結果、水経由での魚へのCs移行はほとんどないことが明らかとなった。上記のことから、魚類への放射性Cs移行の要因は水生昆虫等の餌経由が主であると推測された。3年間の全体計画では、研究実績の概要で述べた計画以外に、サケ科である渓流魚のイワナ・ヤマメ類の一部個体群が降海する性質を応用し、体内からのCsの排出を促す目的で海水と同程度までカリウム濃度を調整した水や、基礎代謝を高める微細気泡発生装置を装備した水槽内でイワナ・ヤマメを飼育するなどの手法による魚体内のCs低減化方法の開発を計画している。27年度計画では、食品基準値を大きく上回る天然イワナ・ヤマメ個体を選択してCs低減化実験に供するために、捕獲された魚のCs濃度を生きたまま速やかに測定する技術の開発を行うこと、さらにイワナ・ヤマメの高い生存率が維持できる範囲での高いカリウム濃度条件を見つける飼育実験を予定していた。今年度は、研究実績の概要で述べた野外放流実験が予想以上の成果が得られたため、野外調査の回数を当初の予定よりも増やした。これによって、予定していた飼育実験のすべてを実施することができなかったが、捕獲された魚のCs濃度を生きたまま速やかに測定する技術についてはおおよその目処がついたこと、飼育室を低温に維持するためのエアコン装備などハードウエアの整備など実験の下準備が整った。1、阿武隈山地渓流魚の放射性Cs移行メカニズム解明に関する研究昨年度に引き続き避難指示区域内の空間線量率の異なる複数の森林河川において以下の研究をした。1魚を含めた生物群集と生息環境中の放射性Cs(以降Cs)の現状を把握するための、生物および環境試料のCsのモニタリング。渓流魚の主要な餌資源を明らかにするための捕獲した魚の胃内容物分析2異なる空間線量環境下における魚へのCs蓄積速度の差異の有無を明らかにするための、放射性Csを含まない養殖イワナ・ヤマメを河川に放流する「標識放流実験」3渓流魚へのCs移行経路を明らかにするため、餌経由からの推定のほかに、河川水の溶存態Csからの移行の有無を検証するための「無給餌飼育実験(インサイト実験)」。その結果、河川環境中の放射能強度が高い河川ほど生息する魚・水生昆虫のCs濃度は高く、放流魚へのCs蓄積速度は速かった。また、同一場所で採取したイワナとヤマメのCs濃度には差がなかった。胃内容物調査と現場無給餌実験から、渓流魚2種へのCs移行経路は水生昆虫経由が主体と推測されたが、一部は水経由の可能性も示唆された。

2、魚体内のCs低減化に関する研究同一個体におけるCs濃度モニタリングを可能とするための活魚状態でのCs測定方法の開発およびゼオライトを活用したヤマメとイワナ体内のCs低減化実験をした。その結果、適切な麻酔処理と測定容器内での曝気処理によって活魚状態での測定が実現できた。これにより長期間での同一個体のCsモニタリングが可能となった。ゼオライトを活用したCs低減化実験では、高濃度のCsを示すヤマメとイワナを約50日間無給餌で飼育し、その後ゼオライト混合餌を投与して飼育を継続した。2魚種とも魚体内のセシウム総量は、無給餌直後の数日間で減少した後に平衡状態となったが、ゼオライト投与後は、13日間でセシウム総量が約10%減少した。本研究課題は阿武隈山地渓流魚の放射性Cs移行メカニズム解明と魚体内のCs低減化に関する研究の二本立てで実施している。前者については、きわめて順調に進行しており、こちらの期待以上の成果が得られた。その一方で、魚体内のCs低減化に関する研究については、同一個体におけるCs濃度モニタリングを可能とするための活魚状態でのCs測定方法の開発に時間がかかってしまった。また、一つの飼育実験には50日以上の日数がかかるため、一定の成果を得らためには時間を要したが、ゼオライト混合餌を投与して飼育することで魚体内のCsが低減化できるという目途が立ったことは大きい成果と考えられる。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。福島県双葉郡浪江町は現在でも多くの面積が帰還困難区域に指定されている。本研究は当該区域にある森林河川に生息する渓流魚であるイワナとヤマメへの放射性Cs移行メカニズムや137Csの今後の推移を予測するために,空間線量率の異なる4地点で3年間にわたり当該魚種,周辺環境,渓流魚の食物源となる水生昆虫の137Cs濃度を調べた。また魚の標識放流や現場でのケージ飼育実験によって137Csの移行速度や餌以外からの移行量を推測した。最終年度には流魚体内のCs低減化するための基礎実験として,同一個体の137Csモニタリングが可能となる活魚測定法を開発し,ゼオライト投与によるCs低減の効果について検証した。ヤマメとイワナに含まれる137Cs濃度は、2魚種ともに環境中の放射能強度が高い河川ほど有意に高かった。空間線量率のもっとも低い地点で採捕した2魚種の137Cs濃度は2015年2017年度までの3年間でヤマメおよびイワナでそれぞれ102-3,829 Bq/kgと73-2,260 Bq/kgの範囲にあった。線量率の最も高い地点で採捕した137Cs濃度はヤマメとイワナで855-27,738 Bq/kgと651-18,865 Bq/kgの範囲にあった。魚種による137Cs濃度の平均値に統計的な有意差は見られなかった。本研究での調査期間内で、いずれの地点・魚種ともに137Cs濃度の明瞭な減少傾向は認められず、福島第一原発事故から約7年が経過した現在では2魚種のCs濃度はほぼ平衡状態に達しているものと推測された。活魚測定法を活用したCs低減化実験の結果、ゼオライト混合飼料投与区で飼育した魚の生物学的半減期は、固形飼料投与区で飼育した場合と比較して,ヤマメとイワナでそれぞれ約4050%短くなった。このことから,ゼオライト混合飼料を用いた飼育は、137Csを低減させるのに有効であることが示唆された。浪江町の避難指示難区域において3年間にわたり渓流魚(ヤマメ・イワナ)の137Cs濃度の推移を調べた。その結果、2魚種ともに環境中の放射能強度が高い河川ほど有意に高かった。調査期間内で、いずれの地点・魚種ともに137Cs濃度の明瞭な減少傾向は認められず、福島第一原発事故から約7年が経過した現在では2魚種のCs濃度はほぼ平衡状態に達しているものと推測された。
エピゲノム情報を用いた拡張型心筋症と拡張相肥大型心筋症の鑑別法に関する研究

拡張型心筋症(DCM)と拡張相肥大型心筋症(dHCM)は、類似した重症心不全の症状を示すが、突然死のリスクなどが異なり、治療方針の決定のためには両者の鑑別診断が不可欠である。本研究では、「DCMとdHCMを生体分子量により明確に区分し、確定診断に利用可能な新規バイオマーカーを確立すること」を目的として、左心室組織のエピゲノム解析(DNAメチル化)より見出したDCM/dHCM鑑別診断用のマーカー候補遺伝子について、個々のメチル化サイト(CpGサイト)のメチル化率を高精度・高感度に定量し、判別法を作成した。最終年度は、DCM/dHCMの比較で有意差のあった18個のCpGサイトについて、前年度未作成分を含めてパイロシークエンス法用のプライマーの設計を完了した。電気泳動による確認の結果、一部のプライマーでは標的配列の増幅が見られなかったため、充分な増幅が確認された標的のみを測定することとした。また、これらのCpGサイトの近傍に位置し、エピゲノム制御により発現が調節されている可能性の高い遺伝子のmRNAを定量するため、デジタルPCR用のプライマーを作成した。DCMおよびdHCMの患者の移植摘出心もしくは剖検心より抽出したDNA、RNA試料を用いて標的CpGサイトのメチル化率ならびに標的遺伝子のmRNA量の測定を実施した。一部のmRNAでは心筋組織での発現量が低値であったため、比較的発現量の多い標的mRNAのみを使用することとした。これらのデータを用いてDCMとdHCMが区別可能であるかをROC解析により評価した。その結果、CpGサイトのメチル化率の差DCM/dHCMでの差は想定異常に小さく、単独での区分は困難であることが明らかになった。そこで、複数のCpGサイトとmRNA発現情報より判別分析を行うことで、DCM/dHCMの区分が可能になると考えられた。本研究では、「DCMとdHCMを生体分子量により明確に区分し、確定診断に利用可能な新規バイオマーカーを確立すること」を目的として、左心室組織のエピゲノム解析(DNAメチル化)より見出したDCM/dHCM鑑別診断用のマーカー候補遺伝子について、個々のメチル化サイト(CpGサイト)のメチル化率を高精度・高感度に定量し、判別法を作成する。DCM/dHCMの比較で有意差のあった18個のCpGサイトのメチル化率を個々に測定するため、パイロシークエンス法による測定系の構築を実施した。まず、バイサルファイト(BS)処理したDNAを鋳型として標的配列をPCRにより増幅するためのプライマーを各々、設計した。BS変換後のDNAはPCR効率が悪い場合が多いが、プライマー配列や濃度、PCR時のアニーリング温度を各標的CpGサイトについて最適化した結果、8個のCpGサイトで充分な増幅が可能となった。そこで、これらのプライマーを用いたパイロシークエンスを実施し、各CpGサイトのメチル化率の定量性を評価した。さらに、メチル化率が最も高精度に定量可能であった標的CpGサイトについて、DCMおよびdHCM患者の心筋組織より抽出したDNAを用いて測定を実施し、各検体でDNAメチル化率の定量が可能であることを確認した。次年度では残りの標的CpGサイトについても実試料での測定を行い、得られたDNAメチル化情報の統計解析を実施し、DCM/dHCMの鑑別診断法の開発を進める。本研究では、左心室組織のDNAで標的CpGサイトのメチル化率を高精度・高感度に定量することで、DCMとdHCMを判別する方法を作成することを目的としている。標的となる18個のCpGサイトのうち、8個のCpGサイトでは測定系の構築が概ね終了している。判別はこれらのうち、3-5箇所のCpGサイトの定量値を用いて実施する予定であるが、より精度の高い組み合わせを検討するため、測定系が未構築のCpGサイトについても継続して構築を続ける。次年度には、上記の鑑別法の作成に加えて、関連遺伝子の生理的意義の解明を推進する。肥大型心筋症の拡張相への移行のメカニズム解明や予測マーカーの同定は臨床的意義が非常に大きい。本研究のマーカー候補遺伝子はdHCMで特異的に変動するパスウェイより見出されたものであるため、これらの機能解析がdHCMの予防法・治療法開発のための研究基盤となると考えられる。関連遺伝子の機能解析ではラット新生仔の心臓より調製した心筋細胞(MC)および心臓線維芽細胞(CF)の初代培養細胞を用いる。マーカー候補遺伝子の発現細胞の確認やMC、CFに細胞障害性の刺激を与えた場合のマーカー候補遺伝子・タンパク質の発現量を測定し、これらの遺伝子の発現変動を誘発する刺激を探索する。さらに、薬剤等によりマーカー候補遺伝子やその関連パスウェイを活性化・不活性化し、細胞傷害や心機能に対する作用の評価を実施する。本年度は先行してMC、CFの培養を実施し、約40種類のDCM関連遺伝子の発現細胞、発現量の情報を取得しており、機能解析に向けた準備を進めている。以上の内容を踏まえて、本研究は、おおむね順調に進んでいると判断された。拡張型心筋症(DCM)と拡張