hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
項目反応理論を利用した新しい認知能力の測定法

本研究の目的は項目反応理論を利用したさまざまな認知能力測定法の開発である。本年度は項目反応理論を用いた表情認知能力測定と項目反応理論を利用したResilience能力尺度測定に関する研究を行った。実験1では,短時間呈示された表情(怒り36枚,喜び26枚,真顔20枚)に対するカテゴリー判断課題を72名の被験者に実施した。実験の後,個々の表情に対する判断の「難しさ」と「精度」の指標を項目反応理論によって算出し,それらを表情の物理的特徴から回帰的に予測した.その結果,怒り表情判断においては,(1)判断の難しさは顔の凝集性に規定されていること,(2)判断の精度は顔上部と下部に顕著な怒りの表出が認められる表情に対して向上すること,(3)判断は難しさ,精度共に顔上部の特徴の変化に主に影響を受けることが示された.実験2では,短時間呈示された表情(怒り80枚,喜び74枚,真顔55枚,恐れ33枚,悲しみ50枚,驚き29枚,嫌悪9枚)に対するカテゴリー判断課題を47名に実施した。被験者数を考慮し,怒り25枚,喜び25枚,悲しみ26,恐れ25枚の刺激データを分析した。その結果,怒り,喜び,悲しみ,恐れを刺激として1次元の認知能力を測定することが可能であることが分かった。ただし,喜びは正答率が全体にかなり高く,モデルへの適合度の悪い刺激が多い。また,困難度の高い刺激は恐れで,低い刺激は喜びであった。調査1では,Resilienceを「個人内資源の認知」「個人内資源の活用」「環境資源の認知」「環境資源の活用」の4側面からとらえる尺度を作成し,大学生447名に対して質問紙を実施した。高次因子分析を行った結果,4側面をとらえることが妥当であることが示された。また4側面ごとに項目反応理論を適用することも可能であり,これによって項目の困難度や識別力といった特徴を捉えることが可能となった。本研究では刺激の特性と被験者の能力を同時に測定することが可能な項目反応理論を利用し,実験的な手法によって研究されてきた認知機能を能力としてとらえ,学力と言った従来の枠組みにはとらわれない新しい能力の測定方法を提案することを目的に本年度は表情カテゴリー判断課題を用いた表情認知能力測定に関する研究を行った.実験1では,表情刺激として怒り,喜び,真顔の写真をそれぞれ25枚ずつ用意し,大学生181名に対して80msec刺激を呈示し表情カテゴリー判断を求めた.呈示した表情と一致した判断を正答として表情カテゴリー毎に2パラメタロジスティックモデルによる項目反応理論を適用した.その結果,怒り表情の25の刺激に関しては因子分析による1因子性も確認され,またモデルの適合にも問題がなく,怒り表情を用いた表情認知能力の測定が可能であることが示された.しかしながら,喜び表情に関しては多くの刺激において正答率が高く,現在の実験プロトコルでは喜び表情を用いた表情認知能力の測定は困難であることが分かった.また,怒り表情に関しその認知能力と性格5因子との関連を調べたところ情緒不安定性と有意な正の相関があることが分かった.実験2では表情刺激として怒り,恐れ,嫌悪,真顔の写真をそれぞれ25枚ずつ用意し,実験1と同じ手続きで実験を行った.被験者は189名である.怒り,恐れ,嫌悪の表情毎に分析したところ,3つ全ての表情において1因子性が確認され,全ての項目がモデルに適合した.このことから怒り,恐れ,嫌悪といったネガティブ表情を利用して表情認知能力を測定することが可能であることが示された.また,ネガティブ表情毎の認知能力と性格5因子との関連では怒りの表情と社会的外向性とに有意な負の相関が見られた.今後は呈示時間を工夫し全表情呈示による実験課題を開発し,総合的な表情認知能力の測定を試みる予定である.本研究の目的は項目反応理論を利用したさまざまな認知能力測定法の開発である。

調査1では,Resilienceを「個人内資源の認知」「個人内資源の活用」「環境資源の認知」「環境資源の活用」の4側面からとらえる尺度を作成し,大学生447名に対して質問紙を実施した。高次因子分析を行った結果,4側面をとらえることが妥当であることが示された。また4側面ごとに項目反応理論を適用することも可能であり,これによって項目の困難度や識別力といった特徴を捉えることが可能となった。
酸化グラフェンを用いた光化学反応の自在な制御と高感度遺伝子解析への応用

酸化グラフェン(GO)を消光剤として利用し、高感度DNA検出法の開発を試みた。5'末端に蛍光色素を修飾したプローブDNAと捕捉DNAとが形成する2本鎖をGO上に吸着させた。捕捉DNAは3'末端側に長い1本鎖領域を有しており、GOに強く吸着する。プローブの3'末端側にも1本鎖突出領域があり、標的DNAが添加されると、この領域をきっかけとして鎖交換が起こり、プローブが遊離する仕組みとした。プローブ遊離後は、捕捉DNAがGO上の吸着サイトを埋めることで、標的DNAの非特異的な吸着が抑制される。また、捕捉DNAによって非特異的なプローブの放出が抑制されており、高いシグナルコントラストを達成した。酸化グラフェン(GO)は水中で均一に分散し、広範囲な波長領域に対応可能な強力な消光剤として利用できることから、近年、バイオ分析への応用が期待されている。一本鎖DNAはその塩基部位とのπ- πスタッキングや疎水性相互作用により、GOに強く吸着するが、二本鎖を形成すると、塩基対となり塩基部位が構造内部に埋まってしまうため、親和力が大幅に低下することが知られている。しかし、その吸脱着挙動に関する知見は十分ではない。そこで本研究では、GOに対するDNAの吸脱着に関する基礎的な検討を行い、GOを基体とする高選択的、高感度なバイオ分析システムの構築を試みた。GOに強く結合可能な吸着末端(長い一本鎖DNA部位)を有する捕捉DNAを利用し、蛍光色素(FAM)修飾プローブをGO上に固定した。この状態で、FAMはGO近接に位置するため、その蛍光はほぼ完全に消光した。ここで、プローブが捕捉DNAと結合した際、プローブ側に一本鎖突出末端(toehold)が残るように設計した。標的DNAはこのtoeholdをきっかけとし、鎖交換反応によって、より安定な(長い)二本鎖を形成すると考えられる。実際、この複合体に標的DNAを添加すると、プローブをGOに直接吸脱着させる従来法より、高い発光強度が得られた。また、非相補鎖添加時における非特異的な脱着も、従来法より低く、高いシグナルコントラストを得た。本手法では、従来法と異なり、プローブ脱着によって空スペースが生成しないこと、また、プローブ脱着後、一本鎖となった捕捉DNAが空スペースを覆うことにより、プローブや標的DNAの非特異的な吸着が抑制された結果と考えられる。また、toeholdの根元にミスマッチ識別部位を配置した場合、高いコントラストで一塩基の違いを見分けることができた(約5倍)。高い確率(人口の1 %以上)で見られる遺伝子内での一塩基の個体差を一塩基多型(SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms)という。SNPsは個人の体質、疾病易罹患性、薬剤感受性等を識別する重要な遺伝子マーカーとして考えられている。現在、溶液ハイプリダイゼーション法をベースにした様々なSNPsのスクリーニング戦略が試みられているが、代表的な手法では、酵素反応(増幅、伸張、連結、切断)を利用しているため操作が煩雑である。また、マイクロアレイ、プレートリーダー、質量分析装置、PCR、シーケンサー等の分析装置は高価な上、熟練技術者による取り扱いおよび解析を必要としている。今後、“必要な患者に、必要な量の、必要な薬剤を"といった理念に基づく「個々人の身体的特徴に合わせた副作用のない医療」(テーラーメード医療)を展開するためには、SNPs塩基を簡便に判断し(SNPsタイピング)、個々人の遺伝子を次々に診断していく必要がある。よって、より安価で簡便なSNPsタイピング法の開発並びにそのハイスループット化は革新的課題である。そこで本研究では、膨大な遺伝情報を簡便かつ迅速に解析するために、「高感度、ハイスループットでかつ酵素フリーなSNPs解析システムの構築」を目的とする。酸化グラフェン(GO)のDNA吸着能、並びに高い消光能を積極的に活用し、システムの構築を行う。本研究では、DNA鎖交換反応によるGOからのDNA放出を利用し、高選択的な核酸検出法の開発を試みた。5'末端にFAMを修飾したプローブと捕捉DNAとが形成する2本鎖をGO上に吸着させた。プローブの3'末端側にも5塩基分の1本鎖突出領域があり、標的DNAが添加されると、この領域をきっかけ(toehold)として鎖交換が起こり、プローブが遊離する仕組みとした。同手法では、プローブ遊離後も捕捉DNAがGO上に留まり、吸着サイトを埋めることができるため、標的DNAの非特異的な吸着が抑制されることがわかった。また、従来法ではプローブが非特異的に脱着してしまうのに対し、同手法では、捕捉DNAを介してプローブが強くGOに固定されているため、非特異的なプローブの放出が抑制されていることがわかった。高いシグナルコントラストを得ることが可能となったが、同手法では原理的に標的DNAと同量以上のシグナルは得られない。

そこで、連鎖的に進行する鎖交換反応を利用し、標的DNAを再生させながらシグナルを増幅する仕組み(DNAサーキット)を新たに取り入れ、高選択的、高感度な核酸検出システムの構築を試みた。その結果、DNAサーキットを用いない場合と比較して、約17倍のシグナル強度を得ることができた酸化グラフェン(GO)を消光剤として利用し、高感度DNA検出法の開発を試みた。5'末端に蛍光色素を修飾したプローブDNAと捕捉DNAとが形成する2本鎖をGO上に吸着させた。捕捉DNAは3'末端側に長い1本鎖領域を有しており、GOに強く吸着する。プローブの3'末端側にも1本鎖突出領域があり、標的DNAが添加されると、この領域をきっかけとして鎖交換が起こり、プローブが遊離する仕組みとした。プローブ遊離後は、捕捉DNAがGO上の吸着サイトを埋めることで、標的DNAの非特異的な吸着が抑制される。また、捕捉DNAによって非特異的なプローブの放出が抑制されており、高いシグナルコントラストを達成した。酸化グラフェン上で特異的に起こる鎖交換反応を利用して新しいDNA検出システムとDNAサーキットを組み合わせたシグナル増幅型遺伝子検出システムの構築に成功した。また、エキソヌクレアーゼと組み合わせたシグナル増幅型遺伝子検出システムの構築にも成功した。分析化学酸化グラフェンやその他のナノシートとの複合体の構築を模索する。酸化グラフェン上で光化学反応の制御には至っていないが、代わりに酸化グラフェン上で特異的に起こる鎖交換反応を利用して新しいDNA検出システムを提案することができた。研究進行に合わせて支出のタイミングが若干変更されたため酸化グラフェン上で特異的に起こる鎖交換反応にDNAサーキットや酵素反応を組み合わせてより高感度なシステムの構築を目指す。購入予定だった消耗品などを購入する研究進行に合わせて支出のタイミングが変更されたため購入予定だった備品(8連セルチェンジャー付き市街化し分光光度計)などを購入する
咀嚼中に活動する大脳基底核ニューロンの特性

本研究では、口顎協調運動に関係のある咀嚼野からの投射を受けている線条体部位を同定し、その領域のニューロンの咀嚼中の活動様式を明らかにすることを目的とした。1.まず、ウサギ大脳皮質咀嚼野から線条体への投射をWGA-HRPを用いて解剖学的に検索するために、WGA-HRPを咀嚼野に注入すると、前交連より尾側の被殻に標識終末が認められた。2.無麻酔動物の咀嚼中にこの被殻尾側部からニューロン活動を筋電図活動、顎運動と同時に記録し、ニューロンの活動様式を分析した。さらに、同様に淡蒼球からもニューロン活動を記録、分析した。その結果、約60%のニューロンが咀嚼に関連した活動を示し、咀嚼のstageの変化に伴って活動が変化した。過去の研究から食物摂取から嚥下に至るまでの一連の咀嚼は咀嚼開始から取り込んだ食物を臼歯部に移送するstageI、食物を臼歯部で粉砕するstageIIa、咀嚼終了直前のstageIIbの3つの過程に区分されいる。記録されたニューロンの活動様式から2つのタイプが認められ、ひとつは一連の咀嚼中にstageの変化に伴って一度だけ活動を変化するもの(単純型)、もうひとつは一連の咀嚼中にstageの変化に伴って複数回活動を変化するもの(複雑型)であった。被殻から記録されたニューロンのほとんどは単純型であったのに対し、淡蒼球から記録されたニューロンの約30%は複雑型であった。3.これらの結果から被殻および淡蒼球は咀嚼の遂行、特に咀嚼のstageの変化に重要な役割を演じていることが示唆された。記録されたニューロンの活動様式には2つのタイプが認められ、一つはstageIにおいて活動を変化させ、もう一つのタイプは全咀嚼過程を通して活動を変化させた。3.これらの結果から被殻は咀嚼の遂行、特に咀嚼のstageの変化に重要な役割を演じていることが示唆された。
ＮＡＳＨを背景とした急性心筋梗塞発症への臓器間クロストークの影響

本研究では、法医解剖における死因診断精度を向上させるために肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎などのメタボリック症候群における病理学的診断方法の開発を目指すことを目的にしている。そのために、非アルコール性脂肪性肝炎を背景とした急性心筋梗塞発症への臓器間クロストークの影響を明らかにすることが重要と考えた。平成30年度は、以下のことを明らかにした。1NASH進展期病態に共通点の多い慢性胆汁うっ滞疾患モデルマウスにおいて、炎症反応を引き起こすキーとなるKupffer細胞が病態が進展するごとに質的にも量的にも病的変化が増悪することが分かった。2同モデルにおいて、Kupffer細胞の病的変化と病態進展に因果関係があるかどうかを調べるため、Kupffer細胞を枯渇化させる薬剤を投与しプラセボ群と比較、解析したところ、Kupffer細胞を枯渇化させると病態進展が緩やかになることが分かり、Kupffer細胞の病的変化が原因で病態進展を促進していることが分かった。3Kupffer細胞は炎症の誘導だけでなく、病原体などの外的要因や壊死した細胞由来の老廃物を取り除く作用もあるため、病態回復期には回復を促進させる働きがあると仮説を立て、同モデルの回復期にKupffer細胞を枯渇化させて解析を行った。すると、仮説通り、病態進展期とは逆に、枯渇化させた群ではプラセボ群と比較し病態回復が有意に遅延することが分かった。平成30年度の研究計画では、内皮細胞傷害がNASH病態にどの程度寄与するかを知るために、コリン欠乏食および高脂肪食投与モデルを異なる病期の病理組織学的解析を行い、ミトコンドリア障害などの酸化ストレス評価と細胞間シグナル伝達の変化を同定する予定であったが、実務を行う時間が増えたことと、本研究課題を発展させるための国際共同研究へのエフォートを増やしたため本研究の実験研究時間を充分に確保できなかった。平成30年度に行うことができなかったNASHにおける内皮傷害の役割を解明するため、コリン欠乏食モデルを作製し、病理組織学的解析を行う。平成29年度は、以下のことを明らかにした。平成29年の研究計画では、内皮細胞傷害がNASH病態にどの程度寄与するのかを知るために、コリン欠乏食および高脂肪食投与モデルを異なる病期の病理組織学的解析を行い、ミトコンドリア障害などの酸化ストレス評価と細胞間シグナル伝達の変化を同定する予定であったが、論文執筆と実務を行う時間が増えたため実験研究時間を充分に確保できなかった。そのため、平成30年に行うはずであった慢性肝疾患におけるクッパー細胞の役割を明らかにするための実験の一部と同実験成果のための論文執筆を行った。

平成30年度の研究計画では、内皮細胞傷害がNASH病態にどの程度寄与するかを知るために、コリン欠乏食および高脂肪食投与モデルを異なる病期の病理組織学的解析を行い、ミトコンドリア障害などの酸化ストレス評価と細胞間シグナル伝達の変化を同定する予定であったが、実務を行う時間が増えたことと、本研究課題を発展させるための国際共同研究へのエフォートを増やしたため本研究の実験研究時間を充分に確保できなかった。平成29年に行うことができなかったNASHにおける内皮傷害の役割を解明するため、高脂肪食モデルを作製し、病理組織学的解析を行う。また、当初は計画していなかったが、最近、脂肪織の炎症が肥満やNASHの病態に関連することが明らかにされはじめたため、内皮傷害と脂肪織の炎症との関連が病態進展に寄与することが考えられたため、内皮傷害のみに注目するのではなく、内皮傷害と脂肪織炎症の関連を病理学的解析で検討する。平成30年度に行うことができなかったNASHにおける内皮傷害の役割を解明するため、コリン欠乏食モデルを作製し、病理組織学的解析を行う。研究が当初の計画通りに進まなかったため次年度使用額が生じた。次年度の使用計画としては、行えなかった実験を次年度行う予定であり、実験研究に必要不可欠な消耗品を中心として使用する予定である。また、研究成果を海外の国際学会で発表する予定であり、交通費として使用する予定である。
シクロデキストリン誘導体の自己組織化超分子体の合成研究

シクロデキストリンの2級側水酸基をトシル化したものは、分子内エポキシ化を副反応として受けるために、機能性有機分子を修飾する事は一般的に困難である。しかし、メチル化シクロデキストリン2位モノトシル体の合成に成功すれば、続く求核置換反応で、このような副反応を防ぐ事が出来る。そこで、まず、完全メチル化α-シクロデキストリン2位モノトシル体の量産法を合成した。まず、2位トシル体合成の条件としては、トシルイミダゾールとα-シクロデキストリン50gをDMF中、活性モレキュラーシーブ存在下で攪拌し、溶媒を減圧留去で除去後、逆相カラム精製により2位モノトシル体20gを得た。続く、メチル化反応では、反応中での分子内エポキシ化を防ぐために、モノトシル体、ヨウ化メチル、水素化ナトリウムをDMF中で低温0-5°Cで1にtかん攪拌して、徐々にメチル化を進行させ、次いで、20°Cまで反応温度を上昇させて1日攪拌し、反応を完結させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製により、目的物20gを得る事に成功した。ここで確立した手法はβ、γ-CDにも適用する事ができた。以上、合成したメチル化CDを用いて、拡張π共役系を被覆した被覆型分子導線を合成する事にした。まず、脱気窒素置換した水中で、アリールジボラン酸エステル、アリールジヨージド、モノヨードエンドキャップ体を12:10:2の比率でまぜ、酢酸パラジウムを用いて室温で鈴木クロスカップリングさせた。得られた反応混合物から不溶性ポリマーを除去した後、限外濾過により低分子量オリゴマーを除去して、目的とする分子ワイヤを得た。この分子ワイヤはメチル化CDに被覆されることで、さまざまな有機溶媒にも可溶となり、さらに、包接される事で蛍光量子収率の大幅な改善に成功した。また、各種分光法の検討より、この分子ワイヤは会合体を形成しやすい事が明らかとなった。これまで我々の研究グループでは、完全メチル化α-シクロデキストリンとアゾベンゼンの相補性の良さを利用した自己組織化超分子体の合成を検討してきた。さらに我々は、光集光系モデルへの応用を志向した。このモデルは、可視光領域に強い吸収帯を持ち、様々な金属を取り込む事の出来るポルフィリンを組織化する事により実現出来ると考えた。ポルフィリンを自己組織化させる為には、完全メチル化α-シクロデキストリンを有するポルフィリンとアゾベンゼンを有するポルフィリンが必要である。まず前者は、ヒドロキシベンズアルデヒド、ピロールによるアドラー法によりポルフィリン骨格を合成し、BBr_3によるメトキシ開裂の後、完全メチル化α-シクロデキストリンモノトシル体との反応により合成した。一方、アゾベンゼンを有するポルフィリンは、アニスアルデヒド、アセトアミドベンズアルデヒド、ピロールを用いたアドラー法の後、アミド基の酸加水分解、BBr_3によるメトキシ開裂、ジアゾカップリングにより合成した。なお、このポルフィリンをエネルギードナーとする為に中心に亜鉛金属を導入した。これらを水-メタノール混合溶媒中で混ぜ合わせると包接錯体を形成した事がNMR, UV-Vis, CDスペクトルより明らかとなった。さらに蛍光スペクトル、励起スペクトルからアゾベンゼンを有するポルフィリンからシクロデキストリンを有するポルフィリンへのエネルギー移動が示唆される結果が得られた。以上により、シクロデキストリンの相互作用を利用してポルフィリンを自己組織化させ、エネルギー移動過程を示す事に成功した。さらに、このシクロデキストリンモノトシル体の完全メチル化法を確立する事にも成功した。
強酸イオン液体ハイブリッドによる次世代エネルギーのブレイクスルー

セルロースの分解反応に用いたSiO2/[C1C4-SAim][OTf]、SiO2-SO3H、SiO2-S-[C3C4-SAim][OTf]は、いずれもセルロースを分解してHMFを生成した。また、反応後のSiO2-S- [C3C4-SAim][OTf]は、吸引ろ過により簡単に回収でき、大きな収率の低下なく2回反応に使用することができた。これにより共有結合型の酸性イオン液体-シリカハイブリッドにはセルロースの効果的な分解能力があり、かつ簡単な方法で容易に再利用可能であることが明らかとなった。本研究で開発した手法が、世界のエネルギー問題の解決に寄与することを期待する。本研究は、シリカに強酸イオン液体を化学的に固定化した強酸イオン液体-シリカハイブリッドを用い、廃材に含まれるセルロースを原料として、次世代エネルギー(フラン化合物)を生産する手法を開発するものである。当該年度は強酸イオン液体ーシリカハイブリッドの開発と、作成したイオン液体ーシリカハイブリッドの酸触媒能評価、ならびに各種溶媒中での安定性の評価を行った。シリカ上に強酸イオン液体を固定化する手法としては、物理吸着による手法(物理吸着型)と共有結合を用いた手法(共有結合型)の二種を想定し実験を行った。物理吸着型は、ゾルーゲル法により調整した。また、共有結合型は表面にアルキルチオールが結合したシリカに段階的にアルキル基末端に二重結合部位を有するイオン液体部を段階的に結語させることで調整した。作成したイオン液体ーシリカハイブリッドの酸触媒としての性能を一般的な酢酸エチルの合成から評価した。どちらのタイプの触媒も硫酸を用いた場合と同じ位の性能を示し、酸触媒能が高いことが明らかとなった。また、強酸イオン液体ーシリカハイブリッドの各種溶媒に対する安定性を評価した。これはセルロースの次世代エネルギー変換に展開する場合の触媒の回収方法を検討する予備的知見として行ったものである。結果として、共有結合型は各種溶媒に対して安定であるが、物理吸着型は溶媒を加え、加熱すると、強酸イオン液体が一部脱離することがあきらかとなった。共有結合型はセルロースの次世代エネルギー変換に展開しても、高い回収効率、再利用反応が期待できると予想される。本研究は、シリカに強酸イオン液体を化学的に固定化した強酸イオン液体ーシリカハイブリッドを用い、廃材に含まれるセルロースを原料として、次世代エネルギー(フラン化合物)を生産する手法を開発するものである。25年度に、強酸イオン液体ーシリカハイブリッドの開発と、作成したイオン液体ーシリカハイブリッドの酸触媒能評価、ならびに各種溶媒中での安定性の評価まで評価できている。当該年度は、強酸イオン液体ーシリカハイブリッドをセルロースの次世代エネルギー変換への展開を開始した。具体的には、抽出溶媒にハイブリッド触媒とセルロースを懸濁した状態で反応を行い、同時に生成する生成物を溶媒中に抽出した。抽出溶媒には生成物(フラン化合物:HMF)を溶解しやすい1,2-ジクロロエタン、酢酸エチル、クロロホルム、THFなどを使用し、最適な反応条件を探索した。物理吸着型は一回目の反応は良好に行えるが、二回目以降、抽出溶媒中にイオン液体が流出し、反応が振興しないことが明らかとなった。一方、共有結合型は、再利用してもほとんど収率が低下せず、繰り返し利用できることが明らかとなった。また、添加物として、塩化アルミニウムの添加効果も調査した。塩化アルミニウムの添加は、セルロースが加水分解して得られるグルコースからフルクトースへの変換を促進する働きがある。SiO2-SO3Hに対して塩化アルミニウムを添加すると、HMFの収率は1.5倍に増加するが、酸性イオン液体-シリカハイブリッドの場合、ほとんど収率は変化しないことがわかった。イオン液体の水分により塩化アルミニウムが分解している可能性があると考えている。本研究は、シリカに強酸イオン液体を化学的に固定化した強酸イオン液体-シリカハイブリッドを用い、廃材に含まれるセルロースを原料として、次世代エネルギー(フルフラール、HMF)を生産する手法を開発するものである。26年度までに、強酸イオン液体-シリカハイブリッドの開発と、作成したイオン液体-シリカハイブリッドの酸触媒能評価、ならびに各種溶媒中での安定性の評価と強酸イオン液体-シリカハイブリッドをセルロースの次世代エネルギー変換反応へ展開し、化学吸着型ハイブリッドを用いることで、活性の低下無く、繰り返し反応が可能であることを明らかにしてきた。当該年度は、反応条件の最適化を行った。シリカゲルハイブリッドの最適量は、撹拌状態を維持できる最大量で効果的な反応が実現した。また、HMFの生成に適した反応温度は120ー130°Cであり、4時間の反応条件が最適であることが明らかとなった。これより低い温度では、反応が進むのに時間がかかり、また、収率も大幅に低下することが明らかとなった。これより高い温度では、収率の低下が認められ、HMFの分解が進むことが明らかとなった。また、反応(120ー130°C)に加熱撹拌ではなく、内部型ソニケーターを用いた超音波照射を行うと、より低い温度(87°C)で目的物が得られることが明らかとなった。また、反応後にHMFをイオン液体から抽出する必要性があるが、その抽出溶媒として最も適当なのは酢酸エチルであることが明らかとなった。セルロースの分解反応に用いたSiO2/[C1C4-SAim][OTf]、SiO2-SO3H、SiO2-S-[C3C4-SAim]

[OTf]は、いずれもセルロースを分解してHMFを生成した。また、反応後のSiO2-S- [C3C4-SAim][OTf]は、吸引ろ過により簡単に回収でき、大きな収率の低下なく2回反応に使用することができた。これにより共有結合型の酸性イオン液体-シリカハイブリッドにはセルロースの効果的な分解能力があり、かつ簡単な方法で容易に再利用可能であることが明らかとなった。本研究で開発した手法が、世界のエネルギー問題の解決に寄与することを期待する。当該年度は、強酸イオン液体ーシリカハイブリッドをセルロースの次世代エネルギー変換への展開を行った。酸性イオン液体-シリカハイブリッドとしては、25年度に合成した物理吸着型のものと共有結合型のものを用いた。物理吸着型のものを使用すると、抽出溶媒に酸性イオン液体が流出していき、繰り返し利用ができなかったが、共有結合型であれば、抽出溶媒への流出はなく、良好に再利用できることを確認しており、概ね当初の計画通り研究は進行していると考えている。有機化学26年度までに強酸イオン液体ーシリカハイブリッドを2種類作成して、セルロースの次世代エネルギー変換へ展開している。既に、共有結合型を用いると、セルロースのHMFへの変換反応において、ハイブリッド触媒を良好に再利用できることがわかっている。今後は、酸性イオン液体ーシリカハイブリッドを用いた反応をより効果的に進めるため、最適な反応条件の検討を行う予定である。最終的には、廃材を活用した次世代エネルギー変換を行う計画である。当該年度は強酸イオン液体ーシリカハイブリッドの開発と物性調査を行った。シリカ上に強酸イオン液体を固定化する手法としては、物理吸着による手法と共有結合を用いた結合の二種を想定し実験を行った。結果的に、二種類のイオン液体ーシリカハイブリッドともに作成でき、また、酸触媒能も保持していることが明らかとなっている。更には、各種溶媒に対する安定性も明らかとしており、概ね当初の計画通り進行していると考えている。一点だけ、物理吸着型は、溶媒を加え、加熱すると、強酸イオン液体が一部脱離することがわかったのが、不安材料であるが、共有結合型はいかなる溶媒中であっても安定であり、加水分解反応に応用可能であると考えている。25年度までに強酸イオン液体ーシリカハイブリッドを2種類作成しており、その酸触媒能、各種溶媒中での安定性を評価している。今後は強酸イオン液体ーシリカハイブリッドをセルロースの次世代エネルギー変換に展開する方針である。具体的には、物理吸着型、共有結合型の両触媒を次世代エネルギー変換反応に応用し、セルロースのフラン化合物への変換に適した触媒構造を絞り込む。また、再利用効率を評価する予定である。更には、紙ごみ、廃材等を原料とした実用性試験に移行する計画である。
地域活性化再構築につながる地域固有の文化活動の効果とその具体的展開に関する研究

2018年度は,延長した最後の1年間となった.そのため,地域の精神文化を活かした地域づくり,地域の経済成長の具体的展開方法の検討をはかるため,以下の件を行った.◎地域の精神文化を地域づくり,経済発展へ活かすための具体的な展開方策について検討した.◎地域の精神文化を活用した地域文化活動の重要性におき,地域の経済的な発展に結びつく精神文化による地域文化活動の必要性を探るとともに,具体的な地域づくりのあり方を検討した.◎地域づくり,まちづくりの参画主体となりうる活動団体に対して,地域の精神文化による地域づくり,まちづくりの重要性を周知した.また,現在,郡山,都城など実際に申請が行っている「地域塾」を活用・あるいはあらたに創成し,公・地・産連携の地域活性化・再構築の討議を行った.◎最奥地区域住民・公共これら活動団体が地域の精神文化を活かした地域づくり・まちづくりを進めていくための具体的な展開方策(活動指針)について検討を行ったほか,地域の精神文化を活かした今後の更なる地域の経済発展・展開方策等について検討を行った.その研究報告会を2018年9月11日から13日にかけて,下田市において,浅子和美浅子和美(一橋大学名誉教授,立正大学教授,経済学),安藤隆穂(名古屋大学名誉教授,経済思想史),池上淳(京都大学名誉教授,文化資本論財政学),清水裕之(名古屋大学名誉教授,岡崎市民会館芸術監督,建築家),高萩宏(夢の遊民社,池袋芸術劇場副館長)参加のもと行った.さらに,2019年3月1日から5日まで,台湾大学において,同様の研究成果を発表したほか,2018年10月7日に日本地域学会定期大会にて発表した.27年度は,調査内容と作業方針の確定を行った.具体的には,以下の通りである.I.全国の歴史・文化を活かした地域への愛着・地域づくりの現状に関する調査[1]歴史・文化資源(活動)及び経済活動指標の収集・整理◎既往資料等を用いて,全国各地域の文化資源(活動)及び職業等社会構造,経済状況の収集・整理を行う.※既往資料等・(財)地域創造資料・文化遺産インターネットデータ(文化庁)・各都道府県の文化財・観光データベース(パンフレットや地史などの既往資料)・必要に応じ補足調査として地方公共団体(都道府県)へのアンケート調査・必要に応じ補足調査として文化団体へのアンケート調査・各都道府県,関係市町村の経済活動指標データ[2]地域の精神文化を伝える文化資源(活動)の抽出・整理及び経済活動指標の整理◎上記の文化資源(活動)から地域の精神文化を伝える事業内容等を抽出する.※事業内容等神楽/祭事/イベント/映像(放送)/映画/演劇/音楽/絵画/美術/書籍/漫画・絵本/アニメ等その中から,とりあえずまとまった実演芸術(音楽,演劇),イベント等について,比較した結果を,27年10月の日本地域学会大会にて発表を行った.さらに,名古屋大学高等研究院主催のUBIASインターコンチネンタル・アカデミアにて,文化活動と空間・時間の関係について,彫刻家とカンファレンスを行い,単なる実証研究だけでなく,文化芸術のもつ時間性,空間性とのつながりについて,発表した.地域の文化資源のうち,実演芸術やイベントについては,その内容および地域経済に及ぼす影響並びに「地域活力」につながる方策について,まとめることができ,他の文化活動についても,その見通しが立ったので,「おおむね順調に進展している」とした.27年度の既往資料等を用いて,全国各地域の文化資源(活動)及び職業等社会構造,経済状況の収集・整理に引き続き,地域の精神文化の具体的な展開方策の検討調査を行った.具体的には,歴史・文化・民俗資源の整理と地域固有の精神文化の発掘並びに経済活動の状況の分析であり,それぞれのモデル地域で受け継がれてきた文化資源(活動)を抽出し,整理や発掘した文化資源(活動)を通じて,地域固有の精神文化を発掘した.そして,職種・経済活動状況について,上記の精神文化に基づく文化活動との関連整理を行った.作業方針として,1モデル地域の抽出地域の精神文化をもとにした文化活動の具体的な展開を検討する地域として,全国7地域を対象としたこと,2地域の歴史・文化・民俗資源の整理抽出した地域ごとに,現地調査やヒヤリング,既往資料等により,文化資源(活動)及び職種・経済活動指標を整理したこと,3地域の精神文化の発掘と経済活動との関連検討発掘した歴史・文化・民俗資源を通じて,その地域に根付く精神文化を発掘したことである.さらに,その精神文化と地域の経済活動(発展の過程や進捗状況)との連関を検討した.さらに29年度の研究に向け,他の科研メンバー等からの適切な助言を得て,京都大学,名古屋大学,勤務校(東京芸大)での研究会での発表や日本地域学会年次大会(新潟大学)で成果を発表した.29年度以降の研究予定の地域の精神文化による地域づくりへの取組みに関するヒヤリング調査に対する予備的な検討を行った.28年度は,27年度の既往の文献や資料等による予備調査が順調に行われたので,それを受けて,具体的地域調査が行えた.特に夏期休業中は,地域においても,歴史的・文化的行事が多く,その調査を行うことが時間的,時宜的にかなったためである.なお,成果を発表する学会,研究会等も十分時間的に余裕をもって参加でき,中間的な調査成果を含める発表も順調であった.また,他の科研による研究成果も当研究に反映することができ,内容が充実する結果となった.

本研究は,「地方再生」のため,地域文化活動(地域の創造的,精神文化からの発露が大きい)と地域の社会・経済活動との関係を地域活性化・再構築という観点から想起し,文化面から見た地域活性化・再構築の可能性を探り,地域政策の提言を行う.全国における文化・民俗等の文化資源(活動)を把握し,それが社会・経済的な観点から活性化・再構築に繋がっている地域やこれからの可能性がある地域等に着目し,地域に息づく古来の歴史・文化・民俗,さらには新規な創造行為として精神活動の発露である文化活動を発見し,それが当該地域での経済的な活性化・再構築に繋がるとの仮説を検証する.経済的に活性化に繋がるその地域に根付く「地域の精神文化」を基礎とした地域文化活動の発掘とこれら地域の文化活動による個性ある地域活性化への展開方策について検討することにあった.そのため,研究計画最終年度の29年度は,[1]地域の精神文化による地域づくりへの取組みに関するヒヤリング調査◎地域づくりの主体となる組織や情報の発信主体となる組織等を抽出し,これまでの取組み実態や地域の精神文化を活用した地域づくりのあり方,地域住民への発信方法,経済発展・地域開発などへ関するヒヤリング調査を実施すること,及び[2]地域の精神文化を活かした地域づくり,地域の経済成長の具体的展開方法の検討の2項目であった.しかし,29年度中において,眼病により手術と入院のため,[1]の一部しか行えず,[1]の残りと[2]については,30年度に繰り越した.29年度中に行った地域における文化事業の調査については,その得られた資料を基に,日本地域学会誌「地域学研究」に「地域社会の変化の中での有形民族文化財の保存の実態と地域的アイデンティへの役割((環日本海圏を中心として)」として掲載された.さらに.同学会の年次大会において「全国的な視点からの文化活動の状況とその評価ー特に県レベルでの文化予算との関係」として発表した.最終計画年度の29年度に,眼病を患い,手術・入院となり,退院後も医師より安静を指示され,海外渡航を始め国内調査旅行が十分できなかったことやPCへのデータ入力とデータの分析ができなかったことにより,当初の計画(現地調査と調査結果に基づく政策提言)の作業が遅れた.2018年度は,延長した最後の1年間となった.そのため,地域の精神文化を活かした地域づくり,地域の経済成長の具体的展開方法の検討をはかるため,以下の件を行った.◎地域の精神文化を地域づくり,経済発展へ活かすための具体的な展開方策について検討した.◎地域の精神文化を活用した地域文化活動の重要性におき,地域の経済的な発展に結びつく精神文化による地域文化活動の必要性を探るとともに,具体的な地域づくりのあり方を検討した.◎地域づくり,まちづくりの参画主体となりうる活動団体に対して,地域の精神文化による地域づくり,まちづくりの重要性を周知した.また,現在,郡山,都城など実際に申請が行っている「地域塾」を活用・あるいはあらたに創成し,公・地・産連携の地域活性化・再構築の討議を行った.◎最奥地区域住民・公共これら活動団体が地域の精神文化を活かした地域づくり・まちづくりを進めていくための具体的な展開方策(活動指針)について検討を行ったほか,地域の精神文化を活かした今後の更なる地域の経済発展・展開方策等について検討を行った.
甲状腺組織特異的転写調節因子の作用機構の研究

甲状腺組織特異的転写調節因子TTF-1、Pax-8はサイログロブリン(TG)遺伝子の組織特異的発現に関与する。本研究では、甲状腺刺激ホルモン(TSH)によるTG遺伝子転写促進にTTF-1、Pax-8がどのように関わっているのかを検討した。1.ラットTG遺伝子プロモーター+ルシフェラーゼ遺伝子プラスミドを導入した甲状腺細胞株FRTL-5にTSHを添加するとルシフェラーゼ活性が上昇し、内因性TG mRNAも増加した。したがって、単離したプロモーターはTG遺伝子にTSH応答性を賦与する領域であることが示された。2.プロモーターへのTTF-1、Pax-8の結合活性を検討したところ、TSHにより両者の結合活性は増加した。一方、これらのmRNAは増加しなかった。このことから、TSHは翻訳後の蛋白の修飾を介してTTF-1、Pax-8のDNA結合活性を増加することが示唆された。3.そこで、TTF-1、Pax-8のDNA結合能が酸化・還元制御を受けるか検討した。システイン残基の遊離のSH基を可逆的に酸化するdiamideで処理すると転写因子の結合能は低下した。Diamide処理後、還元剤DTTを添加すると結合能は回復した。この結果からTTF-1、Pax-8の結合能は酸化・還元制御を受けることが明らかになった。4. TSHによるPax-8の結合活性の増加における酸化・還元制御の関与をFRTL-5を用いて検討した。TSH刺激後、還元剤非存在下で調製した細胞抽出液を用いて検討した結果、TSHは酸化型Pax-8を還元し、Pax-8の結合活性を増加することが示唆された。以上の結果から、TSHによるTG遺伝子の転写促進に、酸化・還元制御を介した甲状腺組織特異的転写調節因子のDNA結合活性の増加が重要であることが示された。甲状腺組織特異的転写調節因子として同定されたTTF-1、Pax-8はそれぞれhomeobox遺伝子群、paired box遺伝子群に属するDNA結合蛋白であり、甲状腺組織特異的蛋白の1つであるサイログロブリン(TG)遺伝子の転写調節領域に結合することが知られている。甲状腺刺激ホルモン(TSH)およびインスリンによるTG遺伝子発現調節にTTF-1、Pax-8がどのように関わっているのか検討した。初めに、PCR法により単離したラットTG遺伝子の転写調節領域(-178から-3)をレポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に組み込み、これをラット培養甲状腺細胞株FRTL-5に導入した。この細胞にTSHおよびインスリンを添加したところ、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。また、これらのホルモンにより内因性のTGmRNAも増加し、単離した調節領域はTG遺伝子にTSH、インスリン応答性を賦与する領域であることが判明した。次に、これら転写因子のTG遺伝子調節領域DNAへの結合活性をelectrophoretic mobility shift assay法を用いて検討した。その結果、TSHおよびインスリン添加により、FRTL-5細胞のTTF-1、Pax-8の結合活性は増加した。しかしながら、FRTL-5細胞のTTF-1、Pax-8 mRNA量はTSH、インスリンで変化がなかった。以上の結果から、TSH、インスリンによるTG遺伝子の転写活性の増加にTTF-1、Pax-8の転写調節領域への結合の増加が重要であることが示唆された。またこれら甲状腺組織特異的転写調節因子の結合活性の増加は翻訳後の蛋白の修飾によることが示唆された。甲状腺組織特異的転写調節因子TTF-1、Pax-8はサイログロブリン(TG)遺伝子の転写調節領域に結合する。

我々はこれまでに甲状腺刺激ホルモン(TSH)によるTG遺伝子の転写活性の増加にTTF-1、Pax-8の転写調節領域への結合の増加が重要であること、またこの結合の増加は転写因子蛋白の翻訳後の修飾によることを示唆した。そこで、初めにTTF-1、Pax-8のDNA結合能が酸化・還元制御を受けるか否か検討した。システイン残基の遊離のSH基を可逆的に酸化するdiamideで転写因子を処理するとDNA結合能の低下が観察された。Diamide処理後、還元剤DTTを添加するとDNA結合能は回復した。この結果からTTF-1、Pax-8のDNA結合能は酸化・還元制御を受けることが明らかになった。次に、TSHによるPax-8のDNA結合活性の増加に対する酸化・還元制御の関与を、ラット甲状腺細胞株FRTL-5を用いて検討した。TSH刺激後の細胞抽出液を還元剤非存在下で調整した。この抽出液を用いて蛋白-DNA結合アッセイを行うと、TSH刺激によるPax-8のDNA結合活性の経時的増加が観察された。一方、細胞抽出液に還元剤DTTを添加すると、経時的なDNA結合活性の増加は消失し、変化の無い強い結合活性が全時間経過で観察された。さらに、細胞抽出液をdiamideで処理するとDNA結合活性は完全に消失した。こうした結果から、TSHは細胞内に存在する酸化型Pax-8を還元し、Pax-8のDNA結合活性を増加することが示唆された。以上の結果から、TSHによるTG遺伝子の転写増加に、酸化・還元制御を介したPax-8のDNA結合活性の増加が重要であることが示された。
高機能な培養肝細胞シート組織作製のための次世代型温度応答性培養システムの設計

肝特異的機能を維持したまま、移植可能な肝細胞シート組織を作製するために、生体内環境を模倣した温度応答性培養システムを構築した。具体的には、増殖因子などの基底膜成分をヘパリン固定化温度応答性培養表面上に導入し、肝細胞機能を維持したまま移植可能な肝細胞シートを作製することができた。また、細胞の受容体/増殖因子/ヘパリン修飾温度応答性表面の間に働く温度変化したアフィニティーを定量的に評価することができた。柔軟な基材やマイクロ流体デバイスと組み合わせることによって、より高度な肝細胞シート組織培養システムの構築が期待される。本研究では、ヘパリン修飾温度応答性表面に増殖因子や接着タンパク質など種々の基底膜成分を温度応答性培養表面上に導入することにより、基底膜を模倣した温度応答性培養表面を調製し、高機能な肝細胞シート作製をおこなう。当該年度は、基底膜を模倣した温度応答性培養表面の作製を行った。カルボキシル基を有する温度応答性表面にヘパリン分子を共有結合させ、ヘパリン修飾温度応答性培養表面を調製した。調製したヘパリン修飾温度応答性培養表面にアフィニティー結合でヘパリン結合性上皮細胞増殖因子様増殖因子(HB-EGF)を導入したのち、ラット初代肝細胞シートの培養およびその機能評価を行った。HB-EGFが培地中に含まれない場合、肝細胞は機能維持できず培養時間の経過にともなって肝細胞の接着細胞数が減少した。一方、HB-EGF結合ヘパリン修飾温度応答性培養表面を用いると、播種したほぼすべての肝細胞が接着し、培養4日後でも接着が維持された。また、温度を45分間20°Cに低下することにより、肝細胞シートを回収することができた。さらに、HB-EGF結合ヘパリン修飾温度応答性培養表面上でのアルブミン産生能は、HB-EGF培地添加に比べて約2倍であった。このことから、基底膜成分としてHB-EGFを導入したヘパリン修飾温度応答性表面は、肝細胞シートの機能維持と同時に、温度低下による肝細胞シート脱着を可能とすることがわかった。柔軟な温度応答性培養表面の作製については、電子線照射法によってPDMS上にpoly(N-isopropylacrylamide)を表面固定化する方法を用いた。シランカップリング剤による前処理を行い、PIPAAm固定化の最適条件を検討したところ、培養温度の37°Cにおける培養細胞の接着性を維持するとともに、温度を20°Cに低下させた際、培養細胞が脱着する条件を見出すことができた。基底膜を模倣した温度応答性培養表面の調製と細胞培養に関して概ね予定通り進んでいる。具体的には、基底膜成分としてHB-EGFを導入したヘパリン修飾温度応答性表面を用いて、肝細胞シートの機能維持と同時に、温度低下による肝細胞シートを脱着することができた。当該年度は、平成27年度に作製したヘパリン修飾温度応答性培養表面の特性解析を行った。具体的には、ヘパリン-ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子様増殖因子(HB-EGF)間のアフィニティーの強さを定量的に解析した。まず、温度が20°Cあるいは37°Cのとき、濃度の異なるHB-EGFをヘパリン修飾温度応答性培養表面上にアフィニティー結合し、結合量をELISA法によって検出した。濃度に対するHB-EGF結合量を非線形カーブフィッティングして解離定数を算出した。上述の方法で決定した解離定数は3.6 nM(20°C)、2.1 nM(37°C)であり、温度変化が解離定数に与える影響は小さいことがわかった。ヘパリン修飾温度応答性表面が20°Cのとき温度応答性高分子鎖は膨潤し、37°Cのときは収縮していると考えられるが、今回の結果は温度応答性高分子鎖の膨潤/収縮はHB-EGF-固定化ヘパリン鎖間のアフィニティー結合にほどんど影響を与えないことを示唆する。これは、温度応答性高分子鎖の膨潤/収縮に関わらず、HB-EGFは立体障害をほとんど受けずに温度応答性高分子鎖内部に拡散するためと考えられる。また、柔軟な基材表面上での肝細胞培養については、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いた肝細胞培養と肝特異的機能測定(アルブミン産生能)および免疫学的組織染色を行った。しかし、PDMSに対する肝細胞接着性が低く、肝特異的マーカーであるE-カドヘリンが検出されなかった。基底膜を模倣した温度応答性培養表面の解析については概ね予定通り進んでいる。基底膜を模倣した柔軟な温度応答性培養表面の作製については、肝細胞の接着性を向上させる必要がある。本研究は、ヘパリン修飾温度応答性表面に増殖因子や接着タンパク質など種々の基底膜成分を温度応答性培養表面上に導入することにより、基底膜を模倣した温度応答性培養表面の調製および高機能な肝細胞シートの作製を目標とする。今年度はまず、ポリスチレン製ヘパリン修飾温度応答性培養表面の特性解析を行った。水晶振動子マイクロバランス法およびELISA法を用いた解析により、20°Cおよび37°CにおけるHB-EGF/固定化ヘパリン間のアフィニティーはほとんど変わらず、温度変化の影響は小さいことがわかった。HB-EGF固定化ヘパリン修飾

温度応答性表面とEGF受容体間のアフィニティーを解析するために、温度を変えた時のラット肝細胞接着率を可溶EGF存在下で評価した。20°Cのとき肝細胞はHB-EGF固定化表面にほとんど接着しないのに対し、37°Cになると、接着率約6%の弱い初期接着を示すことがわかった。さらに、可溶EGF濃度の増加とともに細胞接着率が低下した。これは、37°Cでは固定化HB-EGFと肝細胞EGF受容体とのアフィニティーが働くことを示唆している。さらに、低温時の温度応答性高分子鎖の水和・膨潤に伴う立体障害増加の影響で、細胞との相互作用が減弱することがわかった。続いて、柔軟な温度応答性培養基材を作製するために、ポリジメチルシロキサン(PDMS)等のプラスチック製基材表面に共有結合で固定可能な、光反応性温度応答性高分子を作製した。具体的には、可視光反応性のカンファーキノンを側鎖に有する温度応答性高分子を合成した。本手法を用いることで、柔軟なPDMS表面上に温度応答性高分子層を形成することができ、培養肝細胞の機能を維持したまま、温度低下のみによる肝細胞シート回収への応用が期待される。肝特異的機能を維持したまま、移植可能な肝細胞シート組織を作製するために、生体内環境を模倣した温度応答性培養システムを構築した。具体的には、増殖因子などの基底膜成分をヘパリン固定化温度応答性培養表面上に導入し、肝細胞機能を維持したまま移植可能な肝細胞シートを作製することができた。また、細胞の受容体/増殖因子/ヘパリン修飾温度応答性表面の間に働く温度変化したアフィニティーを定量的に評価することができた。柔軟な基材やマイクロ流体デバイスと組み合わせることによって、より高度な肝細胞シート組織培養システムの構築が期待される。1.基底膜を模倣した柔軟な温度応答性培養表面の作製PDMSあるいは温度応答性ハイドロゲルなどの柔軟な基材表面にヘパリンを導入し、肝特異的機能維持する基底膜成分を導入した温度応答性培養表面を調製する。まず、培養温度37°Cにおける培養細胞の接着性および20°Cに低下させた際の細胞脱着性について評価を行う。また、ラット初代肝細胞を培養して肝細胞シート作製およびその機能評価を行う。具体的には、肝細胞培養期間中のアルブミン産生能等の肝特異的機能を測定することで、基材の弾性率が肝細胞に及ぼす影響を検討する。対照としての温度応答性高分子修飾ポリスチレン製基材(弾性率3 GPa)との比較検討もあわせて行う。さらに、コンフルエント濃度で肝細胞を培養表面上に播種し、単層状に培養した後、温度を20°Cに低下させることにより、高機能な肝細胞シート組織を作製、回収する。回収した肝細胞シートは、免疫学的組織染色によって解析を行う。2.温度応答性培養表面の特性解析上記1.で調製した温度応答性培養表面の特性解析を行う。具体的には、ヘパリン/基底膜成分間のアフィニティーの強さを定量的に解析する。また、柔軟な温度応答性培養基材表面の弾性率を実測する。3.マイクロ流体デバイスを用いた肝細胞シート培養システムマスクレス露光装置を利用したフォトリソグラフィーによりマイクロ流体デバイスを作製し、上記で作製した肝細胞シート組織の長期培養およびその評価を行う。具体的には、流体デバイス内部に肝細胞シート組織を留置し、培地を灌流することで、持続的に栄養成分および酸素を供給、老廃物を除去する。
初期胚発生システムを支配する母性RNAの局在化と翻訳の時空的制御機構

初期胚の極性は,しばしば母性RNAの局在化によって生み出される。これら母性RNAは,翻訳が抑制された状態で局在化し,局在化した領域でのみ翻訳される。このような輸送・局在化そして翻訳制御機構は,正常な胚発生に必須であるが,その分子機構については良くわかっていない。ショウジョウバエ卵形成過程におけるoskar RNAの卵母細胞後極への局在化,局在化過程における翻訳の抑制は,胚の腹部及び生殖細胞の形成に必須である。しかし,oskar mRNAの翻訳抑制機構については良くわかっていない。本研究では,oskar mRNAを含む母性RNP複合体を構成する新規タンパク質として,翻訳開始因子eIF4Eと分子機能未知のタンパク質であるCupを同定した。また,eIF4EとCupとが直接結合すること,cup突然変異体において,oskar mRNAの翻訳抑制が異常となっていることを明らかにした。さらに,Cupが,oskar RNAの3'UTRに結合する翻訳抑制因子として知られていたBrunoとRNA非依存的に会合することを明らかにした。以上の結果は,(1)Cupタンパク質が,oskar mRNAの新規翻訳抑制因子であること,(2)Cupタンパク質を介した翻訳抑制は,翻訳開始因子であるeIF4Eの機能を制御することにより行われていること,(3)CupはBrunoの'translational' co-repressorとして機能すること,(4)局在化過程においてoskar mRNAの翻訳は,mRNAの5'側と3'側の相互作用を介して抑制されていることを予想させた。胚発生の開始には,卵形成の過程で合成され卵内に貯蔵されている母性因子が重要である。これら母性因子の多くは,mRNAとして卵内の特定の領域に局在化し,局在化した領域でのみ時期特異的に翻訳され機能する。このような母性RNAの時間的・空間的制御には,母性RNAとRNP複合体を形成する蛋白質が重要である。私たちは,ショウジョウバエ卵形成過程において,Me31Bが母性RNAの輸送と翻訳とを連携させているRNP複合体の構成蛋白質であることを明らかにしてきた。本研究では,Me31B複合体の新規構成蛋白質として同定したCG10686蛋白質について,当該遺伝子の突然変異体の単離を行った。まず,CG10686遺伝子の3'側約7kbに位置するP因子系統出発点として,CG10686遺伝子領域に新たにP因子が挿入した系統をスクリーニングした。その結果,CG10686遺伝子の3'非翻訳領域にP因子が挿入した系統(#96)を単離した。#96ホモ個体では,CG10686蛋白質の発現が野生型の30%程度まで低下しており,#96ホモ雌成虫由来の胚は母性効果致死の表現型を示した。すなわちCG10686蛋白質は卵形成過程において必須の機能を持つことが明らかとなった。しかし,母性RNAの輸送・局在化あるいは翻訳に対する影響があるのかについては明確にできなかった。そこで次にCG10686遺伝子のnull突然変異体を単離する目的で,CG10686遺伝子の5'側上流にP因子が挿入した系統から,P因子が欠落した系統を作製し,スクリーニングした。その結果,CG10686遺伝子領域の欠失変異体を4系統単離した。これら4系統はすべて,ごくわずかな数のエスケーパを生じるものの劣勢致死の表現型を示した。すなわちCG10686は卵形成過程ばかりでなく,体細胞系列の発生・分化においても必須の機能を持っていることが明らかとなった。