hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規高マンノース結合性レクチンによる抗ウイルス、抗菌、抗腫瘍活性の分子機構の解明

細菌Pseudomonas fluorescens PfO-1レクチン(PFL)の遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させたリコンビナントレクチンの糖鎖結合性および生物活性を調べた。PFLは高マンノース型糖鎖の分岐構造を特異的に認識し、インフルエンザウイルスの表面に存在するHA糖タンパク質に直接結合することで、顕著なウイルス感染阻害活性を示した。また、PFLは、がん細胞の表面に存在するインテグリン/EGFRに糖鎖を介して結合し、同分子の内在化をトリガーとするオートファジー性がん細胞死を誘導する新規の抗がんメカニズムを示すことが明らかとなった。本年度は、細菌由来レクチン(PFL)を大腸菌で発現させたリコンビナントレクチンを用いて、抗がん活性の分子機序について検討した。先に、PFLにより誘導されるがん細胞死には、PFLがインテグリンα2に高マンノース型糖鎖を介して結合することをトリガーとした細胞接着障害が関与することを明らかにしている。PFL処理による胃がん由来MKN28細胞の細胞外マトリックス(ECM)結合性を調べたところ、コラーゲンIおよびIVなどに対する結合性の喪失が確認された。また、PFLと結合するMKN28細胞表面レセプター分子として新たにEGFレセプター(EGFR)を同定した。EGFRは、インテグリンα2と同様にPFL処理により細胞表面から細胞内へと局在変化を起こすこと、さらには内在化されたEGFRは、時間経過とともにタンパク質レベルが減少することが明らかとなった。また、PFL処理MKN28細胞においてBeclin-1、Atg3、Atg5、Atg9、Atg12、LC3IIなどのオートファジー関連因子の発現が経時的に増加したことより、インテグリン/EGFRの内在化により、オートファジー系が活性化されることがわかった。DNAマイクロアレイによりPFL処理MKN28細胞における遺伝子発現変動を調べたところ、オートファジー関連遺伝子の発現亢進が確認された。さらに、PFL処理MKN28細胞においては、ゲフィチニブのようなEGFR分子標的薬を始めとする抗がん剤に対する感受性が高くなることがわかった。したがって、PFLおよび分子標的薬を併用することにより、抗がん作用の相乗効果ならびに副作用の軽減が期待される。PFLをin vivoにおいて皮下腫瘍マウスモデルに直接投与したところ、腫瘍増殖が有意に抑制されたことから、本レクチンの抗がん剤あるいは抗がん剤アジュバントとしての潜在的な有用性が示された。細菌Pseudomonasfluorescens PfO-1レクチン(PFL)の遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させたリコンビナントレクチンの糖鎖結合性および生物活性を調べた。申請者らは、細菌Pseudomonas fluorescens PfO-1より新規の糖結合蛋白質であるレクチン(PFL)の遺伝子をクローニングし、大腸菌でのリコンビナント蛋白質の発現および大量精製に成功した。Alexa488-PFLを用いたグリカンアレイ解析により、本レクチンは供試610糖鎖のうち、6種の高マンノース型糖鎖にのみ特異的に結合することが判明した。PFLの抗インフルエンザウイルス活性は、MDCK細胞に対する細胞障害(cytopathic effect: CPE)抑制効果により調べ、H3N2およびH1N1の亜型に対し、ナノモルオーダーで感染を阻害することを明らかにした。また、免疫蛍光抗体染色法により、PFL存在下においてはウイルス抗原が細胞内に局在しないこと、またELISA法によりPFLはウイルスのHAタンパク質へ直接結合することが明らかとなった。他方、PFLのクラミジアトラコマチスに対する効果は、クラミジアの標準測定法であるMIC測定法ならびにMLC測定法に準拠してHeLa229細胞を用いて調べたが、顕著な感染阻害効果は観察されなかった。PFLのin vitroにおける抗がん活性は、胃がん由来MKN28細胞を用い、細胞増殖抑制を指標に検討した。MKN28細胞上におけるPFLのターゲット分子を単離し、MALDI-TOF MSによるペプチドマスフィンガープリント(PMF)法により調べた結果、インテグリンα2であると同定された。興味深いことに、通常細胞表面に高発現しているインテグリンα2分子は、PFL処理後速やかに細胞内へとソーティングされ、再び細胞表面に現れることはなかった。また、蛍光標識PFLの挙動は完全にインテグリンα2の挙動と一致し、両者は細胞核周辺領域に共局在した。これらの結果は、PFLが細胞接着障害によるがん細胞死を誘導することを示すものである。当初の計画では、1年目には新規レクチン(PFL)遺伝子のクローニングと発現タンパク質の大量精製ならびに糖鎖結合性を調べることとしていたが、研究が順調に進捗したことから、次年度に計画していた抗ウイルス活性、抗クラミジア活性、抗がん活性について前倒しで研究を行った。また、PFLによる抗がん活性は、インテグリンを介したアノイキス様細胞死の誘導に起因するという興味深い知見が得られており、これらの結果を学会ならびに学術論文として発表した。

当初の予測とは異なり、本レクチンの抗がん活性はアポトーシスの誘導や小胞体ストレスが主たる要因ではなく、インテグリン糖鎖との直接の相互作用により誘導されるインテグリン-レクチン複合体の内在化をトリガーとした、細胞接着障害に起因する細胞死(アノイキス様細胞死)によることが判明した。今後は、このがん細胞死の分子メカニズムについて、オートファジーなどとの関連も明らかにしつつ、さらに詳細に検討することとしている。また、従来の計画どおり、蛍光標識がん細胞系列を用いて、マウスの胃がんおよび大腸がんなどのモデル系を作製し、局所投与および経口投与によるレクチンの腫瘍抑制効果についてin vivoイメージングシステムにより解析する。該当なし
キノン縮環エポキシケトンの転位に基づく新規多環状化合物の合成法の開発

キノンとジアリールジアゾメタンの1,3-双極子付加反応によりホモキノンを合成し、さらにエポキシ化することによって表題の高歪みキノン縮環エポキシケトンを合成した。この化合物の酸触媒転位反応を行ったところ、エポキシ環の酸開裂反応と連動したendo-アリール基の隣接基関与によって分子内渡環反応、およびシクロプロパン環の開裂が起こり、幾つかの新規多環状化合物が生成した。この手法は、キノンに小員環を縮環したエポキシケトンに適応することにより広範な多環状化合物のライブラリーを作成する上で有効であることがわかる。多環状化合物は、自然界にもアルカロイド等として広く存在し、その生物作用や神経作用、薬理効果に関する研究が精力的に行われている。しかし、有機合成化学的にこのような化合物を合成することは一般に困難であり、多段階の合成操作を必要とする。このような状況を踏まえ、本研究では、電子受容性の共役分子であるキノンに着目し、シクロプロパン環、シクロブテン環、オキシラン環などの小員環合成ブロックを縮環させた多官能性高歪化合物を設計合成し、酸触媒による転位反応を行い新規多環状化合物の簡便な合成法の開発を目的とした。具体的化合物として、ジベンゾシクロヘプテン環をスピロ結合で縮環したホモキノンエポキシドを合成し、BF_3・OEt_2触媒によるエポキシドの酸触媒分解を行い、分子内渡環環化反応による新規多環化合物を高収率で得た。また、その反応速度解析からジベンゾシクロヘプテン環のコンホメーションが反応性に大きく影響することを明らかにした。この理由として、遠隔π-アリール基の関与によりエポィシドの開裂が促進されることが明らかとなった。また、ジアリール基を有するホモベンゾキノンエポキシドのアリール基に各種置換基を導入した場合は、やはり遠隔π-アリール基の関与が認められ、エンド側のパラ位に電子供与性置換基が存在すると数千倍も反応が加速されることがわかった。しかし、エキソ側の置換基の加速効果は小さく2倍程度であった。これらの知見は、エポキシドの合成化学的利用をはかる上で重要な知見を与える。さらに、今後、シクロプロパン環の替わりにシクロブタン環を縮環したキノンのエポキシドに反応を展開したい。この化合物では、キノンカルボニル酸素原子への酸触媒の配位も重要となり反応のスキームが大きく異なる可能性がある。したがって、系統的な研究によって新たな骨格変換反応の開発とキノン骨格を有する新規多環状化合物のライブラリーの構築が期待される。自然界には、テトロドトキシンや種々のアルカロイドなどの生理活性をしめす多環状化合物が存在し、その神経作用、薬理効果等の作用機構に関する研究が精力的に行われている。しかし、合成化学的にこのような複雑な骨格を有する化合物を段階的に構築することは大変困難で非常にチャレンジングなテーマある。このような背景に鑑み、本研究では、予め歪をもつ合成ブロックを基本骨格に複数縮環結合した多官能性高歪化合物を設計合成し、熱、光および酸塩基触媒作用による骨格転位反応を行い新規多環状化合物の簡便な合成法の開発を目的とした。合成基本骨格として、共役分子であるキノンに着目し、シクロプロパン環、シクロブテン環、オキシラン環などの高歪小員環化合物を縮環させ出発基質とした。具体的化合物として、ジベンゾシクロヘプテン環をスピロ結合で縮環したホモキノンエポキシドを合成し、BF3・OEt2触媒によるエポキシドの酸触媒分解を行い、分子内環化反応が起こることを見出し、新規多環化合物を高収率で得た。また、その反応速度論的解析からジベンゾシクロヘプテン環のコンポメーションが大きく影響することを示し、遠隔π-アリール基の関与によりエポィシドの開裂が促進されることが明らかとなった。同時に、従来、考察されてこなかったエポキシドの反結合Walsh軌道が重要な役割を果たすことを明らかにした。また、ジアリール基を有するホモベンゾキノンエポキシドのアリール基に一連の各種置換基を導入した場合も、同様に遠隔π-アリール基の関与が認められ、エンド側のパラ位に電子供与性置換基が存在すると何千倍も反応が加速されることを示し、一方、エキソ側の置換基の加速効果は僅かであった。この置換基効果のハッメト式に基づく定量的解釈により、この遠隔π-アリール基はη-タイプの相互作用をしていることを証明した。これらの結果は、エポキシドの酸職場反応の機構および合成化学的利用を図る上で貴重な知見である。自然界には、生物が産生する複雑な多環状骨格を有する有機化合物が数多く存在する。それらの天然物には、ステロイド、アルカロイド、環状テルペンのように生理活性をしめす場合があり、その神経作用、薬理効果等の作用機構に関する研究が精力的に行われている。しかし、天然物からこれら化合物を単離精製するには莫大な費用がかかる。

一方、このような複雑な骨格化合物を合成化学的に段階的に構築することは大変困難である。したがって、本研究では、シクロプロパン、エポキシドなどの合成ビルディングブロックを、あらかじめ基本骨格となる炭素骨格に縮環あるいは組み込んだ高歪化合物を設計構築し、この化合物の塩基性官能基に対する酸触媒の作用による骨格転位反応を利用した新規多環状化合物の簡便な合成法の開発を目的とした。ここでは2組のC=0とC=C二重結合が共役した6員環分子であるキノンを基本骨格とし、まず、ジフェニルジアゾメタンを双極子付加させ、脱窒素後ホモベンゾキノンを得た。さらにH_2O_2酸化することによってホモベンゾキノンエポキシドを合成した。この化合物に対して、ルイス酸であるBF_3より強力であるプロトン酸CF_3SO_3Hによる酸触媒転位反応を行ったところ、endo-フェニル基の隣接基関与に連動してエポキシド環の開裂と分子内環化反応、さらに継続するシクロプロパン環の開裂あるいは6員環キノン部位の環縮小反応によりインデノキノン、2H-クロメン誘導体、フラノン誘導体生成などの新たな反応が見出され新規生成物が生成した。これらの生成機構についても考察した(未発表)。これらの結果は、多環状化合物およびエポキシド環ひずみに基づく酸触媒反応の合成化学的利用を指向する上で重要な発見であり、その反応機構の解明は、今後、酸触媒転位反応の展開を図る上で重要な知見である。
階層的スペクトルによる多重モード・スパイラル渦クラスター構造の研究

乱流場のDNSと実験計測データを用いて階層性を有する非平衡エネルギースペクトルの抽出を行い、平衡なKolmogorov -5/3乗成分に加えて非平衡-7/3乗と-9/3乗成分が存在する事、-9/3乗成分には代数的な対数補正が付随する事をを明らかにし、非平衡スペクトルの非定常なエネルギーカスケード生成における役割を示した.さらに、DNSデータの解析から3モードのスパイラル渦の存在を示し、カスケード過程とinstability cascadeによるスパイラル渦クラスター形成過程との相関を示した.乱流場のDNSと実験計測データを用いて階層性を有する非平衡エネルギースペクトルの抽出を行い、平衡なKolmogorov -5/3乗成分に加えて非平衡-7/3乗と-9/3乗成分が存在する事、-9/3乗成分には代数的な対数補正が付随する事をを明らかにし、非平衡スペクトルの非定常なエネルギーカスケード生成における役割を示した.さらに、DNSデータの解析から3モードのスパイラル渦の存在を示し、カスケード過程とinstability cascadeによるスパイラル渦クラスター形成過程との相関を示した.本年度は、高レイノルズ数における検証を目指し、先ず、一様等方乱流および一様せん断乱流の高レイノルズ数DNSデータの作成を行った.一様等方乱流では、外力の低波数成分への注入により統計的に定常な状態を実現し、格子点数を最大1024^3、レイノルズ数R_λを256とした.ランダムな位相をもった外力とlinear forcingによる外力の2種類の外力注入法を比較した.せん断乱流では、体積力の印加により定常状態を維持し、格子点数を512x512x129、R_λを150とした.次に、このデータを用いたエネルギースペクトルの非平衡成分の分析を行い、一様等方乱流においてKolmogorovの-5/3乗スペクトルに加えて、約2オクターブに渡る-7/3乗成分を抽出し、この結果が外力の注入法に依存しない事を示した.せん断乱流においても-7/3乗成分が抽出され、-7/3乗スペクトルの存在が強固である事を明らかにした.次に、この非平衡スペクトルとエネルギーカスケードの相関を解析し、低レイノルズ数の場合と同様に、-7/3乗成分は散逸率が極小値から増加する時間帯においては低波数成分が正値を取るが、極大値から減少する時間帯で負値に転じて高波数成分に伝達されてカスケードが起き、この遷移過程で生成される多重モードspiral vortexが誘発するスペクトルと整合している事を示した.更に、-5/3乗則スペクトルを定常基本解とした摂動展開の高次項を導出して-9/3乗成分の存在を予測し、その抽出を試みた.そして、-9/3乗成分が実際に存在する事を示し、この成分が散逸率が極値を取る時間帯で出現し、-7/3乗成分の符号変換に重要な役割を果たす事を明らかにした.本年度は、先ず、平成20年度に抽出されたエネルギースペクトルの非平衡成分の、定常な乱流状態を維持するために低波数帯に注入する外力の印加法に対する依存性を検証した.格子点数を512^3、レイノルズ数R_λを120として、ランダムな位相をもった外力とlinear forcingによる外力2種を比較し、何れの場合においても、平衡成分のKolmogorovの-5/3乗則に加えて、-7/3乗と-9/3乗スペクトルが得られる事を示した。しかしながら、-9/3乗成分は、平均としてはおおむね-9/3乗を示すものの無視できない分散を伴う事を明らかにした.このため、平成20年度に用いたKovasznayのスペクトルモデルに加えて、Heizenburgモデルを用いた摂動展開を行い、前者の解が-7/3・-9/3・-11/3乗といった冪を持つ無限次展開となるのに対し、後者では-9/3乗に代数的な対数補正が付随する事を示した.この解析解は、スペクトルの時間変動が、散逸率が増加する時間帯(Phase 1)、減少する時間帯(Phase 2)、両者間の遷移期(Phase T)の3 Phaseから成る事を予測するが、実際、-7/3乗はPhase 1と2、-9/3乗はPhase Tにおける条件付平均から抽出された.次に、非平衡成分のエネルギー・カスケードの形成過程における役割をエネルギー伝達関数を用いて解析し、Phase 1では-7/3乗成分による順方向のカスケードが生成されるのに対し、Phase Tでは-9/3乗成分により、またPhase 2では-7/3乗成分によって逆方向のカスケードが生成され、概周期的な乱流変動が形成される事を明らかにした.次に、粘弾性一様等方乱流と円管内乱流のDNSを行い、非平衡スペクトルに対する粘弾性効果を示し、乱流抵抗の削減機構を明らかにした.本年度は、その存在が実証されたエネルギースペクトルの非平衡成分の、実験計測データおよび高レイノルズ数DNSデータにおける検証を行った.実験計測データとしては、混合層における時系列データの供与を受け、Taylor仮説に基づく空間データへの変換を行ってスペクトルを算出した.DNSでは、格子点数を2048^3、レイノルズ数R_λを400とした強制一様等方乱流のDNSデータの作成を行った.このため、複数node上で並列計算を行うコードを開発した.そして、両データにおいて、平衡成分のKolmogorovの-5/3乗則に加えて、広波数帯にわたる-7/3乗と-9/3乗

スペクトルが抽出される事を示した.更に、昨年度指摘した-9/3乗成分における代数的な対数補正が付随する事を明らかにした.次に、一様せん断流のDNSデータを用いて、ストリークにより形成されるスパイラル渦のモードと非平衡スペクトルとの相関を解析した.ストリークによって循環流が形成される時間帯においては、-7/3乗スペクトルを生成するモードのスパイラル渦が形成されるのに対し、ストリークが消失する時間帯においては、-5/3乗スペクトルを生成するモードのスパイラル渦が多く形成され、これらの渦がクラスターを形成してエネルギーのカスケードが起きる事を示し、強制一様等方乱流においても同様な形成が起きる事を示した.次に、スパイラル渦形成に対する粘弾性効果を、一様等方乱流と円管内乱流において、高分子応力は非affine性を考慮した構成方程式により与えるDNSにより検証した.法線応力差の正確な算出法を新たに開発して高分子の分布領域を特定し、スパイラル渦形成の抑制と乱流抵抗低減機構を明らかにし、非平衡スペクトルに対する非affine粘弾性効果を示した.
新規エナンチオ選択的触媒反応を基盤とする高効率カスケード型反応の開発

申請者の開発したPd-SPRIX触媒を用いるとアルケニルアルコールの不斉カスケード型環化反応が進行し、一段階で光学活性二環式化合物が得られる。また、スルホニルアミドおよびスルホニルウレアを基質とする不斉アミノカルボニル化反応を促進する。興味深いことに、これら不斉カスケード型反応は、現在までのところ申請者の開発した配位子以外では反応が進行しないか、進行してもエナンチオ選択性が見られない。特異な本カスケード型反応を基盤に、複雑な骨格の天然物及びその類縁体となる多環式複素環化合物の効率的不斉合成研究を行った。1.ザラゴジン酸骨格の一段階合成研究ザラゴジン酸類は、ピコグラムでスクワレン合成酵素を阻害する真菌代謝産物である。ザラゴジン酸誘導体の一段階合成に向け、鍵となる不斉カスケード型環化反応を効率的に促進する新規光学活性スピロ型配位子をコンビナトリアル合成し、その触媒活性を評価した。その結果、既に報告しているPd-i-Pr-SPRIX触謀よりも高選択的にタンデム境化体を与える新規光学活性スピロ型配位子の開発に成功した。2.(+)-カスタノスペルミン骨格の一段階合成(+)-カスタノスペルミン類は、αおよびβ-D-グリコシターゼに対して強い阻害作用を示す。効率的不斉合成の鍵となるPd-SPRIX触媒によるアミノカルボニル化反応は定量的に進行するものの、不斉収率は最高60%eeであった。効果的な不斉合成反応系の構築を目指して条件の最適化を検討した結果、[Pd(CH_3CN)_4](BF_4)_2とi-PrSRPIXから調製したルイス酸性の高い不斉Pd触媒を用いることで化学収率92%、不斉収率86%eeで二環式含窒素化合物が合成できた。尚、本生成物は一回の再結晶するだけで99%ee以上の純度で単離可能であった。X線結晶構造解析およびNMR実験から、反応系内では、まずPd:SPRIX=1:2の錯体が生成するものの、COのPd金属への配位でPd:SPRIX=1:1錯体が発生し、この1:1錯体が反応活性性種であることが示唆された。
プロセス下にある表面のミクロ性状の熱ふく射診断法

この研究課題は,工業装置の実環境下あるいは表面のミクロ加工プロセス下にあってそのミクロ構造を時々刻々にも変化しつつある固体の実在表面の温度・ミクロ構造(被膜の厚さや表面あらさ)を,熱ふく射スペクトルの測定を通じて非接触・実時間的に診断する新しいスペクトル診断法を提案し,その有効性を検証するものであり,熱工学の側からインプロセス表面診断法の進展に寄与するものである.この研究では,研究代表者・研究分担者らがさきに開発した近紫外赤外域のふく射の反射・放射スペクトルを2sのサイクル時間で測定する広波長域高速ふく射スペクトル測定装置をハードウェアの基礎とした.表面温度の診断では,ふく射の波長と方向についてKirchhoffの法則を厳密に考え,同時測定される反射・放射スペクトルを解析するアクティブな温度診断法を導入し,放射率などのふく射性質が未知で時々刻々にも変化する1000Kレベルの高温の実在表面の温度を,10K以内の不正確さをもって非接触・実時間診断することを可能にした.表面のミクロ構造の診断では,ふく射の薄膜干渉と表面散乱・回折に注目する電磁波動論とふく射伝熱学の診断アルゴリズ厶を提案して,成長しつつある表面被膜の厚さとあらさを非接触・実時間診断することを可能にした.高温大気酸化過程にある金属表面を対象とする検証実験では,この方法が0.14μmの平均被膜厚さ,10700nmの平方根平均2乗あらさについて有効であることが例証された.この広い診断の大きさ領域は,広波長域スペクトル測定によって可能になったものである.工業装置の実環境下にある表面は,実験室の清浄な光学鉄面とは異なり,ミクロにあらくなんらかの被膜に覆われている.また,表面加工プロセスでは,積極的に表面にミクロ形状を実現し被膜を成長させる.すなわち,表面性状は,実環境下であるいはプロセス下で時々刻々にも変化する.本研究は,分光学的なハード・ソフト手法によって,このような表面の熱ふく射特性を伝熱評価のために明らかにし,また,熱ふく射を用いる表面のミクロ性状診断法を開発することをめざすものである:平成15年度には,以前から研究代表者らが開発してきた広波長域高速ふく射スペクトル測定装置を基礎として,時々刻々に測定される表面の放射と反射のスペクトルを解析して,時々刻々の表面の温度・あらさ・被膜厚さを診断する方法のアルゴリズムを提案し,検証実験を行ってその性能を例証した.そのアルゴリズムの温度診断部は,表面状態の変化にともなう放射率の変動の知見なしに温度を推定する強力なものである.そのミクロ性状診断部は,鏡面反射に注目するとふく射の散乱反射性表面におけるrmsあらさが自己相関長さとは独立に推定できるというアイディアに基づくものである.この方法は,表面の温度・ミクロ性状の非接触インプロセス診断の強力な手法となりうる.さらに,その実験では,表面に被膜をもつ金属表面(薄膜系)が反射波のみならず放射波にも明瞭な干渉の挙動を示すことに注目した.この発見は,熱ふく射をより有効なエネルギーとして利用する技術に繋がりうる.そこで,この薄膜系と,さらに,反射ふく射に強い干渉を起こす周期的なミクロ構造をもつ回折格子状の表面(格子系)をも対象として,実験とモデル計算を行って,それらにより放射される熱ふく射球面波の干渉挙動を検討した.この研究課題は,工業装置の実環境下あるいは表面のミクロ加工プロセス下にあってそのミクロ構造を時々刻々にも変化しつつある固体の実在表面の温度・ミクロ構造(被膜の厚さや表面あらさ)を,熱ふく射スペクトルの測定を通じて非接触・実時間的に診断する新しいスペクトル診断法を提案し,その有効性を検証するものであり,熱工学の側からインプロセス表面診断法の進展に寄与するものである.この研究では,研究代表者・研究分担者らがさきに開発した近紫外赤外域のふく射の反射・放射スペクトルを2sのサイクル時間で測定する広波長域高速ふく射スペクトル測定装置をハードウェアの基礎とした.表面温度の診断では,ふく射の波長と方向についてKirchhoffの法則を厳密に考え,同時測定される反射・放射スペクトルを解析するアクティブな温度診断法を導入し,放射率などのふく射性質が未知で時々刻々にも変化する1000Kレベルの高温の実在表面の温度を,10K以内の不正確さをもって非接触・実時間診断することを可能にした.表面のミクロ構造の診断では,ふく射の薄膜干渉と表面散乱・回折に注目する電磁波動論とふく射伝熱学の診断アルゴリズ厶を提案して,成長しつつある表面被膜の厚さとあらさを非接触・実時間診断することを可能にした.高温大気酸化過程にある金属表面を対象とする検証実験では,この方法が0.14μmの平均被膜厚さ,10700nmの平方根平均2乗あらさについて有効であることが例証された.この広い診断の大きさ領域は,広波長域スペクトル測定によって可能になったものである.
へリックス構造を有する光学活性ポリマーリガンドの合成

2,6-ナフトジオールが1,5位で結合した多軸不斉の化合物を合成した。3量体に相当するTERNOLは、2,4-ペンタンジオール架橋反応により(R,R)体および(S,S)体の不斉合成に成功した。また、ラセミ混合の分割によっても合成した。この際、分割剤であるスルフォン酸エステルの新しい脱離法を開発し利用した。4両体であるQUANOLは光学活性BINOL(2量体に相当)を原料として(R,S,R)体、(R,R,R)体(S,R,S)体、(S,S,S)体、の4つの立体異性体をそれぞれ光学的に純粋に合成した。これらのリガンドは予想通り,多くの有機溶媒性が低く、不均一系リガンドとして利用可能なことが分かった。現在までにいくつかのルイス酸触媒を調製し、反応を試みたが触媒活性自体が低く、現在までに実用性の高い反応を行うに至っていない。一方、これらのリガンドのもう一つの特長である酸化還元性は種々の新しい可能性を示している。今後、反応中の異性化の問題が解決できれば有効な新規リガンドとして期待できる。以上、この研究を通して新規不斉反応の開発、新規光学分割手法の開発、軸不斉円ニ色性の加算性、軸異性化条件の解明などの成果を挙げることができた。触媒リガンドとしての性能の改善は置換基の導入やさらなる反応の検索により達成できると考えられる。光学活性2,4-ペンタンジオール(PD)を架橋に用いるナフチル基のカプリングによる軸不斉の立体制御はすでにナフトールの2量体に相当するビナフトールの高立体区別合成で実証しているが、本年度は3量体に相当するテルナフトテトラオール(TERNOL)の合成を行った。3つのナフチル基が2つのPDで架橋した基質を4段階、総収率45.6%で合成した。反応にはいずれも光延反転によるエーテル化を用いたが、対応する立体異性体は全く生成しなかった。次に、2カ所所のカプリングを同時に行ったところ、62%の収率でTERNOL誘導体が単一異性体として得られた。PD部をBBr3により脱離することにより89%の収率で光学活性TERNOLが得られた。また、光学活性ビナフトールから誘導して、同様に光学活性TERNOLを5段階、総収率8%で合成した。なお、後者の反応では非立体区別過程を含むため現在精製過程の効率化を試みている。本年度の研究から本研究課題を達成するための合成手法に関する基本的な知見が得られた。すなわち、ナフトジオールは直接PDへの導入が困難だが、保護基を用いて2段階で反応することにより、カプリング反応の前駆体が高収率で得られる、カプリング反応は2カ所同時に行っても収率が低下しない、合成中間体の有機溶媒への難溶性は保護基の選択によって解決できる、光学活性TERNOLとBINOLの比較から、CDが立体構造決定に利用できる、ことが判明した。なお、本結果は3月の化学会春季年会で発表する予定である。平成9年度に行った光学活性2,4-ペンタンジオール(PD)を架橋に用いるテルナフトテトラオール(TERNOL、3量体に相当)の合成を完成し、テトラヘドロンレターズ誌に発表した。また、TERNOLの大量合成法を行った。最近発表された文献(1996年)の手法に従いラセミ混合物を合成し、カンファースルフォニル化した。2種のジアステレオマーは再結晶により極めて効率的に分割でき、カンファースルフォニル基の還元的脱離により、TERNOLの両鏡像体が光学的に純粋に得られた。ラセミ混合物からの総収率は(R,R)体、(S,S)体それぞれ35%、40%であった。本結果は本年度の化学会春季年会で発表を行う。また、効率的なポリマー化へのモデル実験として、4量体である光学活性QUANOLの合成をBINOLから行った。

光学活性BINOLの6位をブロム化した後、ヒドロキシル基を保護して6-ブロム基を6-ヒドロキシル基に変換した。酸化カプリングにより4量体が得られるが、その構造や収率は保護基や酸化条件に依存し、その詳細は現在検討中である。これらの合成と平行して、光学活性TERNOLを用いてその安定性、還元性の検討を行った。その結果、BINOLと比べて塩基性条件下での異性化が速いこと、塩基性条件下で比較的高い還元能を有すること、キラルカラム分離において異常な旋光を起こすことを見いだした。これらの研究も現在継続して行っている。2,6-ナフトジオールが1,5位で結合した多軸不斉の化合物を合成した。3量体に相当するTERNOLは、2,4-ペンタンジオール架橋反応により(R,R)体および(S,S)体の不斉合成に成功した。また、ラセミ混合物の分割によっても合成した。この際、分割剤であるスルフォン酸エステルの新しい脱離法を開発し利用した。4両体であるQUANOLは光学活性BINOL(2量体に相当)を原料として(R,S,R)体、(R,R,R)体、(S,R,S)体、(S,S,S)体、の4つの立体異性体をそれぞれ光学的に純粋に合成した。これらのリガンドは予想通り、多くの有機溶媒に対して溶解性が低く、不均一系リガンドとして利用可能なことが分かった。現在までにいくつかのルイス酸触媒を調整し、反応を試みたが触媒活性自体が低く、現在までに実用性の高い反応を行うに至っていない。一方、これらのリガンドのもう一つの特長である酸化還元性は種々の新しい可能性を示している。今後、反応中の異性化の問題が解決できれば有効な新規リガンドとして期待できる。以上、この研究を通して新規不斉反応の開発、新規光学分割手法の開発、軸不斉円二色性の加算性、軸異性化条件の解明などの成果を挙げることができた。触媒リガンドとしての性能の改善は置換基の導入やさらなる反応の検索により達成できると考えられる。
シェーグレン症候群動物モデルの開発と疾患感受性遺伝子の解析

本研究の目的は,シェーグレン症候群に類似した唾液腺炎を含めた膠原病疾患群を発症するマウスの背景遺伝子群を再構成したマウスを作出し,そのマウスの唾液腺炎の疾患感受性遺伝子を同定し,シェーグレン症候群の疾患感受性遺伝子の遺伝子座を同定することである.これまでの我々の研究の結果,膠原病疾患郡のモデルマウスであるMRL系マウスの唾液腺炎をきたす疾患感受性遺伝子座が第1、10、18染色体上に,雌の場合はさらに第4染色体上に劣性遺伝形式を示す遺伝子座がマップされることが明らかとなった.一方,ポリジーン遺伝は環境の影響を受け易いとされることから感染等の外的因子は膠原病の病像を修飾することが考えられる.そこで,我々は,ウィルス感染等により誘導されるインターフェロン転写活性化因子IRF-1の遺伝子をMRL/MpJ-lpr/lprマウスに導入し,IRF-1を強制発現させることで膠原病に対する環境因子の作用をシュミレートした.その結果,唾液腺炎の病像は憎悪する一方,腎炎,関節炎,血管炎等の他病像は顕著に抑制された.以上の知見は,シェーグレン症候群のモデルとされるMRL系マウスの唾液腺炎の発症がポリジーン系の遺伝子要因に規定され,しかも,IRF-1の強制発現という環境要因により,他の膠原病の秒像から独立して発症し得ることを示すものである.これまでの研究により,このMRL/MpJ-lpr/lprマウスにIRF-1を強制発現させた新しい唾液腺炎発症モデルであるMRL/Mn-IRF1-lpr/lprマウスの系統樹立をほぼ達成することができた.本研究の目的は,シェーグレン症候群に類似した唾液腺炎を含めた膠原病疾患群を発症するマウスの背景遺伝子群を再構成したマウスを作出し,そのマウスの唾液腺炎の疾患感受性遺伝子を同定し,シェーグレン症候群の疾患感受性遺伝子の遺伝子座を同定することである.これまでの我々の研究の結果,膠原病疾患郡のモデルマウスであるMRL系マウスの唾液腺炎をきたす疾患感受性遺伝子座が第1、10、18染色体上に,雌の場合はさらに第4染色体上に劣性遺伝形式を示す遺伝子座がマップされることが明らかとなった.一方,ポリジーン遺伝は環境の影響を受け易いとされることから感染等の外的因子は膠原病の病像を修飾することが考えられる.そこで,我々は,ウィルス感染等により誘導されるインターフェロン転写活性化因子IRF-1の遺伝子をMRL/MpJ-lpr/lprマウスに導入し,IRF-1を強制発現させることで膠原病に対する環境因子の作用をシュミレートした.その結果,唾液腺炎の病像は憎悪する一方,腎炎,関節炎,血管炎等の他病像は顕著に抑制された.以上の知見は,シェーグレン症候群のモデルとされるMRL系マウスの唾液腺炎の発症がポリジーン系の遺伝子要因に規定され,しかも,IRF-1の強制発現という環境要因により,他の膠原病の秒像から独立して発症し得ることを示すものである.これまでの研究により,このMRL/MpJ-lpr/lprマウスにIRF-1を強制発現させた新しい唾液腺炎発症モデルであるMRL/Mn-IRF1-lpr/lprマウスの系統樹立をほぼ達成することができた.本研究の目的は,シェーグレン症候群に類似した唾液腺炎を含めた膠原病疾患群を発症するマウスの背景遺伝子群を再構成したマウスを作出し,そのマウスの唾液腺炎の疾患感受性遺伝子を同定し,シェーグレン症候群の疾患感受性遺伝子の遺伝子座を同定することである.現在,マウスのゲノム解析において,約7,400の遺伝子マーカーが明らかにされている.この数字は各マーカー間の平均距離が0.2cMあるいは400kBに達するもので疾患感受性遺伝子の同定が可能な状態にある.そこで,シェーグレン症候群に類似した唾液腺炎を含めた膠原病疾患群を発症するMRL/lprマウスと発症しないC3H/lprマウスとの交配により背景遺伝子を再構成したマウス,MRL/lpr x(MRL/lpr X C3H/lpr)F1や(MRL/lpr X C3H/lpr)F2マウス群に,唾液腺炎,関節炎,血管炎等をランダムに発症するマウスが存在することを利用して,まず,これらの唾液腺炎の病態,病理形質のマイクロサテライトマーカーを利用したDNA多型とのリンケージ解析を行い,唾液腺炎に関わる感受性遺伝子座を同定する.これまでの解析の結果、唾液腺炎をきたす疾患感受性遺伝子座が第1,第10,第18染色体上に,雌の場合にはさらに第4染色体上に劣性遺伝形式を示す遺伝子座がマップされた.また,雄雌両方,あるいは雌のみの場合ではこれらの遺伝子座がMRLホモ接合体のものが組合わさると発症率は高くなり,これらの遺伝子は相加的な関係を示していた.一方,雄のみをでは,遺伝子マーカーのD18Mit227,D1Mit494の一方,あるいは両方がMRLホモ接合体であってもAsm1遺伝子座がMRLホモ接合体でなければ発症せず,これらは階層的な関係を示した.このことは,MRL/lprマウスにおける唾液腺炎は個々の遺伝子だけでは効果が弱いが,いくつか組合わさっていくことにより相加的に,かつ階層性をもって発症に寄与するポリジーン系疾患であることを明らかにしている.

本研究の目的は,シェーグレン症候群に類似した唾液腺炎を含めた膠原病疾患群を発症するマウスの背景遺伝子群を再構成したマウスを作出し,そのマウスの唾液腺炎の疾患感受性遺伝子を同定し,シェーグレン症候群の疾患感受性遺伝子の遺伝子座を同定することである.これまでの我々の研究の結果,膠原病疾患群のモデルマウスであるMRL系マウスの唾液腺炎をきたす疾患感受性遺伝子座が第1、10、18染色体上に,雌の場合にはさらに第4染色体上に劣性遺伝形式を示す遺伝子座がマップされることが明らかとなった.一方,ポリジーン遺伝は環境の影響を受け易いとされることから感染等の外的因子は膠原病の病像を修飾することが考えられる.そこで,我々は,ウィルス感染等により誘導されるインターフェロン転写活性化因子IRF-1の遺伝子をMRL/MpJ-lpr/lprマウスに導入し,IRF-1を強制発現させることで膠原病に対する環境因子の作用をシュミレートした.その結果,唾液腺炎の病像は憎悪する一方,腎炎,関節炎,血管炎等の他病像は顕著に抑制された.以上の知見は,シェーグレン症候群のモデルとされるMRL系マウスの唾液腺炎の発症がポリジーン系の遺伝子要因に規定され,しかも,1RF-1の強制発現という環境要因により,他の膠原病の病像から独立して発症し得ることを示すものである.平成13年度においては,このMRL/MpJ-lpr/lprマウスにIRF-1を強制発現させた新しい唾液腺炎発症モデルであるMRL/Mn-IRF1-lpr/lprマウスの系統樹立をほぼ達成することができた.
アディポカインとケモカインの特性を併せ持つケマリンの代謝と炎症調節機構の解明

私たちは新規アディポカインとしてケマリンを同定した。ケマリンはChemR23のリガンドで炎症を制御するケモカインとしての働きがあることが明らかになっている。一方アディポカインとしての代謝調節作用もあり、代謝と炎症を結びつける因子として注目を集めている。ノックアウトマウスの解析から、ケマリンが膵β細胞におけるグルコース依存性インスリン分泌、肝臓・筋組織におけるインスリン感受性、脂肪組織における炎症を調節することにより糖代謝において重要な役割を果たしていること、さらに日本人糖尿病患者において血中濃度が低下しており、ヒトにおいても糖尿病の発症に関連している可能性を報告してきた。本研究ではまず、ケマリンノックアウトマウスを用いて代謝と炎症の調節機構を探求してきた。ケマリンの受容体であるChemR23を共通の受容体としているレゾルビンE1をはじめとする脂質メディエーターをガスクロマトグラフ質量分析装置(島図製作所QP2010Ultra)を用いて測定・解析したところ、ノックアウトマウスの血中及び白色脂肪組織中には炎症性のプロスタグラン人D2とE2が上昇し、白色脂肪組織において高炎症性のレゾルビンD1が低下していることが明らかとなった。次の段階として敗血症患者など炎症性疾患の検体を用いてケマリンと脂質メディエーターとの関連、またすでに敗血症のバイオマーカーとして位置付けられているプロカルシトニンやプレセプシンとの関連をみることにより、耐糖能異常の有無も考慮したケマリンの代謝と炎症の調節機構の解明を進めている。本研究はfrom bench-to-bedsideを目標に、臨床業務の中で臨床研究を遂行している状況であるが、昨今の臨床業務が多忙を極めており研究の進捗に影響してしまったため、1年間の延長を申請させていただいた。ケマリンの代謝と炎症を結びつける因子としての役割を明らかにするため、敗血症患者など炎症性疾患の検体を用いてケマリンと脂質メディエーターとの関連、またすでに敗血症のバイオマーカーとして位置付けられているプロカルシトニンやプレセプシンとの関連をみることにより耐糖能異常の有無も考慮した、ケマリンの代謝と炎症の調節機構の解明を進める。この研究結果によりケマリンが敗血症のバイオマーカーとなり得れば、早期診断により敗血症患者の救命率を上げ治療に貢献する可能性が期待されている。ケマリンはケモカイン受容体であるChemR23のリガンドで炎症を制御するケモカインであることが明らかにされている。本研究では主にケマリンノックアウトマウスを用いて代謝と炎症の調節機構を解明するとともに、患者検体を用いて炎症性疾患における脂質メディエーターとの関連および炎症の収束機転におけるケマリンの役割を明らかにすることを目的とする。ケマリンKOマウスおよびTgマウス各臓器のマイクロアレイ解析とともに、ケマリンの受容体であるChemR23を共通の受容体としているレゾルビンE1をはじめとする脂質メディエーターの解析を行い、ケマリンの代謝および炎症調節機構における作用部位、基質、標的分子の解明を行っているところである。私たちが作成樹立したケマリンKOマウスおよびTgマウスの各臓器のマイクロアレイによる結果は既に入手している。脂質メディエーター解析は、神戸大学質量分析総合センターの液体クロマトグラフ質量分析システム(Sciex 6500Qtrap)や脂肪酸の分離に優れた極性の高いカラム(SIGMA-ALDRICH SP2560カラム)を実装したガスクロマトグラフ質量分析装置(島津製作所QP2010Ultra)を用いて、血漿や各臓器におけるレゾルビンE1をはじめとする脂質メディエーターの解析を行った。次にザイモサン誘発腹膜炎や敗血症を誘発することによって炎症状態となったマウスの血漿、各臓器についても解析することにより、ケマリンの代謝および炎症調節機構における作用部位、基質、標的分子を明らかにしていく予定である。通常飼育状態でのケマリンKOマウスおよびTgマウス各臓器の脂質メディエーターの解析を行った。次にザイモサン誘発腹膜炎や敗血症を誘発することによって炎症状態となったマウスの血漿、各臓器についても脂質メディエーター解析を行う予定である。マウスの飼育状況により当初の予定よりも進捗がやや遅れているが近々進めていく予定である。ケマリンはChemR23のリガンドで炎症を制御するケモカインでもあることが明らかにされている。ノックアウト(KO)マウスの解析から、ケマリンが膵β細胞におけるグルコース依存性インスリン分泌、肝臓、筋組織におけるインスリン感受性、脂肪組織における炎症を調節することにより糖代謝において重要な役割を果たしていること、さらに日本人糖尿病患者において血中濃度が低下しており、ヒトにおいても糖尿病発症に関連している可能性を報告してきた。本研究では主にケマリンKOマウスを用いて代謝と炎症の調節機構を解明するとともに、患者検体を用いて炎症性疾患における脂質メディエーターとの関連および炎症の収束機転におけるケマリンの役割を明らかにすることを目的とする。ケマリンの受容体であるChemR23を共通の受容体としているレゾルビンE1をはじめとする脂質メディエーター等を神戸大学質量分析総合センターの液体クロマトグラフ質量分析システム(Sciex 6500Qtrap)や脂肪酸の分離に優れた極性の高いカラム(SIGMA-ALDRICH SP2560カラム)を実装したガスクロマトグラフ質量分析装置(島津製作所QP2010Ultra)を用いて測定、解析している。

その結果、ノックアウトマウスの血中、白色脂肪組織中には炎症性のプロスタグランジンD2とE2が上昇し、白色脂肪組織において抗炎症性のレゾルビンD1が低下していることが明らかとなった。現在はヒトにおいてもケマリンの代謝、炎症性疾患における脂質メディエーターとの関連および炎症の収束機転におけるケマリンの役割について解明をすすめている。マウスの実験で得られた結果を踏まえて、重症患者における急性および慢性炎症疾患(胸腹膜炎、敗血症や重症ウイルス感染、真菌感染そしてbacterial translocation:重症患者の腸管粘膜バリアの破錠によって、本来消化管の中にとどまるべき腸内細菌が血流を介して体内に移行し感染を引き起こす状態)症例の炎症極期と、治癒中、治療後または背景因子を揃えた炎症を認めない症例を対象(propensity score matching)について、血中ケマリン濃度の測定と炎症指標、脂質メディエーター解析を行うため、順次症例を選定し、臨床研究へのエントリー、サンプル回収に努めているところである。私たちは新規アディポカインとしてケマリンを同定した。ケマリンはChemR23のリガンドで炎症を制御するケモカインとしての働きがあることが明らかになっている。一方アディポカインとしての代謝調節作用もあり、代謝と炎症を結びつける因子として注目を集めている。ノックアウトマウスの解析から、ケマリンが膵β細胞におけるグルコース依存性インスリン分泌、肝臓・筋組織におけるインスリン感受性、脂肪組織における炎症を調節することにより糖代謝において重要な役割を果たしていること、さらに日本人糖尿病患者において血中濃度が低下しており、ヒトにおいても糖尿病の発症に関連している可能性を報告してきた。本研究ではまず、ケマリンノックアウトマウスを用いて代謝と炎症の調節機構を探求してきた。ケマリンの受容体であるChemR23を共通の受容体としているレゾルビンE1をはじめとする脂質メディエーターをガスクロマトグラフ質量分析装置(島図製作所QP2010Ultra)を用いて測定・解析したところ、ノックアウトマウスの血中及び白色脂肪組織中には炎症性のプロスタグラン人D2とE2が上昇し、白色脂肪組織において高炎症性のレゾルビンD1が低下していることが明らかとなった。次の段階として敗血症患者など炎症性疾患の検体を用いてケマリンと脂質メディエーターとの関連、またすでに敗血症のバイオマーカーとして位置付けられているプロカルシトニンやプレセプシンとの関連をみることにより、耐糖能異常の有無も考慮したケマリンの代謝と炎症の調節機構の解明を進めている。本研究はfrom bench-to-bedsideを目標に、臨床業務の中で臨床研究を遂行している状況であるが、昨今の臨床業務が多忙を極めており研究の進捗に影響してしまったため、1年間の延長を申請させていただいた。臨床研究に向けて準備中の書類が倫理委員会の承認された後、同意取得患者を対象に臨床研究を行う予定である。
物理化学的安定性が高度に向上した蛋白質分子間ジスルフィド架橋結晶の創製

結晶中に存在する蛋白質をそのまますべてつなぎ止める(架橋する)ことができれば、結晶場での更なる安定化効果によって、結晶の著しい安定化が期待できる。研究1年目に相当する昨年度は、T4リゾチームを題材として分子間架橋領域にシステイン残基を変異導入し、分子間架橋結晶を作成することに成功した。そして2年目に相当する平成18年度は、架橋結晶を用いて様々な溶媒環境での立体構造解析を実施し、次のような結果を得た。1)架橋した変異体の立体構造決定:T4ファージリゾチーム(T4L)において分子間架橋構造を形成させた結晶を用いて、立体構造解析を実施した。その結果、導入したCys残基を介して分子間のジスルフィド結合の形成を電子密度として確認できた。2)低イオン強度水溶液における構造解析:架橋結晶は、沈殿剤溶液から純水に移してもその外形を保っていた。そこで水中に保持した架橋結晶にX線を照射し、結晶に含まれるタンパク質の立体構造を解析した。架橋結晶中のタンパク質構造は、沈殿剤溶液中とほぼ同一であった。3)有機溶媒中における立体構造解析:架橋結晶を低濃度の有機溶媒に移した場合もその結晶外形は変わらなかった。しかしながらX線を照射しても回折像は全く得られなかった。4)様々なpHにおける立体構造解析:調製した架橋結晶を様々なpHの緩衝液に移し、その立体構造を解析した。pH4から10までの広い範囲で回折像が得られた。各pHで得た回折データから立体構造を解析したところ、驚くべきことにこれらの範囲ではアミノ酸側鎖に至るまで立体構造は極めて類似していた。タンパク質を架橋して結晶場に封じ込めることによって、タンパク質の総電荷に制限が発生している可能性がある。この研究によって、様々な環境におけるタンパク質表面の水和状態を観測することに成功した。蛋白質の結晶は高濃度の蛋白質試料を用い、種々の沈殿剤存在下で析出するが、一般に崩壊しやすく不安定であるため、結晶化に用いた母液の組成を大きく変更することは困難である。このような蛋白質結晶場の性質から、結晶中に存在する蛋白質をそのまますべてつなぎ止める(架橋する)ことができれば、結晶場での更なる安定化効果によって、結晶の著しい安定化が期待できる。そこでその目標を達成するため、平成17年度はT4リゾチームを題材として分子間架橋領域にシステイン残基を変異導入し、分子間架橋結晶を作成することを目標とした。そのために本研究を進め、次のような結果を得た。1)架橋構造の分子設計:すでに立体構造がわかったT4ファージリゾチーム(T4L)を題材として、分子間架橋構造を形成するようにシステイン残基の位置を設計した。2)変異体遺伝子の構築:選択された残基のシステイン残基への置換を実施した。3)変異体の大腸菌での組換え発現:大腸菌を宿主とする組換え発現を実施し、変異タンパク質の調製を行った。調製された蛋白質は自然に酸化されるため、還元条件での精製が必要であった。4)変異体の結晶化:調製した変異体の結晶化を様々な酸化還元条件で検討し、最適な結晶化条件と架橋条件を決定した。一旦還元条件で結晶化した後、参加条件に置くことで架橋構造を形成させることができた。5)架橋結晶の評価:変異体の結晶を用いて有機溶媒耐性やX線結晶回折能を測定した。X線の回折能を指標に最適な結晶化条件の探索を実施した。6)変異体の立体構造決定:X線回折法による結晶構造の決定を行った。

この成果によって、従来では高濃度の沈殿剤溶液中でしか測定されていなかった蛋白質の水和状況について、新しい知見が得られる可能性がある。次年度は様々な環境における蛋白質表面の水和状態の観測を試みる。結晶中に存在する蛋白質をそのまますべてつなぎ止める(架橋する)ことができれば、結晶場での更なる安定化効果によって、結晶の著しい安定化が期待できる。研究1年目に相当する昨年度は、T4リゾチームを題材として分子間架橋領域にシステイン残基を変異導入し、分子間架橋結晶を作成することに成功した。そして2年目に相当する平成18年度は、架橋結晶を用いて様々な溶媒環境での立体構造解析を実施し、次のような結果を得た。1)架橋した変異体の立体構造決定:T4ファージリゾチーム(T4L)において分子間架橋構造を形成させた結晶を用いて、立体構造解析を実施した。その結果、導入したCys残基を介して分子間のジスルフィド結合の形成を電子密度として確認できた。2)低イオン強度水溶液における構造解析:架橋結晶は、沈殿剤溶液から純水に移してもその外形を保っていた。そこで水中に保持した架橋結晶にX線を照射し、結晶に含まれるタンパク質の立体構造を解析した。架橋結晶中のタンパク質構造は、沈殿剤溶液中とほぼ同一であった。3)有機溶媒中における立体構造解析:架橋結晶を低濃度の有機溶媒に移した場合もその結晶外形は変わらなかった。しかしながらX線を照射しても回折像は全く得られなかった。4)様々なpHにおける立体構造解析:調製した架橋結晶を様々なpHの緩衝液に移し、その立体構造を解析した。pH4から10までの広い範囲で回折像が得られた。各pHで得た回折データから立体構造を解析したところ、驚くべきことにこれらの範囲ではアミノ酸側鎖に至るまで立体構造は極めて類似していた。タンパク質を架橋して結晶場に封じ込めることによって、タンパク質の総電荷に制限が発生している可能性がある。この研究によって、様々な環境におけるタンパク質表面の水和状態を観測することに成功した。