hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質のC-マンノシル化糖修飾が関わる上皮細胞接着制御機構の解明

C-マンノシル(C-Man)化は、タンパク質中のトリプトファン特異的な糖修飾である。我々は化学合成C-Man化ペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trp)が上皮系A549細胞のアドヘレンス-ジャンクション形成を抑制することを見出した。C-Man化ペプチド存在下ではE-カドヘリンの細胞内分解が促進された。C-Man化ペプチドはE-カドヘリンと直接作用せず、α-アクチニン-4やミオシン-1Cへの作用を介して、E-カドヘリンとβ-カテニンの複合体形成を阻害することが考えられた。本研究はC-Man化ペプチドが生理活性糖ペプチドとして上皮細胞接着の新たな制御機構に関与することを明らかにした。C-マンノシル(C-Man)化は、タンパク質のトリプトファンに特異的な翻訳後の糖修飾である。C-Man化は、細胞外マトリックスに存在するThrombospondin Type I repeat (TSR)スーパーファミリーやサイトカインファミリーなどのタンパク質に多く見られる糖修飾であるが、その生体における生理的役割はいまだ不明な点が多い。本研究では、我々が発見した、C-Man化ペプチドによる上皮系細胞の細胞間接着やアドヘレンス・ジャンクション構造形成の抑制と、E-カドヘリン分子の発現レベル抑制の知見をもとに、C-Man化ペプチドの新たな生理作用の分子機構に関する解析を進める。これまでの研究で、肺上皮由来A549細胞の系において、C-Man化ペプチドによるE-カドヘリン発現の抑制が観察され、その分子機構としてE-カドヘリン発現制御に重要なSmadシグナル経路やE-カドヘリン遺伝子リプレッサーSnailを介した転写レベルでの制御が主ではないことが明らかとなった。そこで、E-カドヘリン発現の制御機構としてC-Man化ペプチドによる細胞内分解系や分子のターンオーバーへの影響の可能性を考え、これらの観点から細胞生物学的アプローチの解析を進める予定である。さらに、細胞におけるC-Man化ペプチドの結合標的タンパク質の解析と同定を進めることでその分子機構を明らかにする。また、本研究は上皮細胞接着異常が関わるがん細胞の転移・浸潤などの病態に関するC-Man化糖修飾の生理的役割の解析へと発展させることで、C-Man化糖タンパク質あるいは生理活性糖ペプチドとしてのC-Man化ペプチドがもつ新たな上皮細胞接着制御機構の解明を目指す。平成27年度は、(1)ヒトThrombospondin-1のTSR2に由来するC-Man化TSRペプチドに加え、TSR配列に含まれるTrp-X-X-Trpモチーフ周辺のアミノ酸変異型を合成した。また、ビオチン化標識したC-Man化ペプチドを合成し、標的結合分子の探索に利用した。抗C-Man-Trp抗体については、さらに特異性や反応性の高い抗体の作製のため、新たな抗原エピトープの設計と合成をスタートした。一部のC-Man-Trpを多量体化したナノアフィニティー粒子などの合成は若干遅れている。(2) C-Man化ペプチドの、上皮系細胞間接着への影響を解析するため、A549細胞を用いて、C-Man化ペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trpなど)が、アドヘレンス・ジャンクション構造の形成に与える影響について検討した。その結果、C-Man化ペプチドにより細胞間接着が阻害と、E-カドヘリンの発現レベルの減少が観察された。一方、E-カドヘリン遺伝子リプレッサーであるSnailの発現に大きな変化は無く、その上流にあるSmadシグナルの活性化は見られず、むしろ抑制されていた。さらに本事象の分子機構を明らかにするため、(3)C-Man化ペプチド結合標的分子の探索と同定を進めた。ビオチン化したC-Man化ペプチドをプローブとし、アガロースビーズ/カラムなどを用いる手法によるタンパク質精製を試み、分子量の3つの候補タンパク質を見出している。今後、この標的タンパク質のマスフィンガープリンティングによる同定や詳細な解析を進めていく予定である。C-マンノシル(C-Man)化は、細胞外マトリックスに存在するThrombospondin Type I repeat (TSR)スーパーファミリーやサイトカインファミリーなどのタンパク質の糖付加修飾であり、近年C-Man化を受ける新たなタンパク質の報告が続いている。C-Man化の機能については、修飾分子の分泌制御への関与が知られているが、生体における生理的役割はいまだ不明な点が多い。これまでの研究で、肺上皮由来A549細胞の系において、C-Man化ペプチドによるE-カドヘリン発現の抑制が観察されたが、その分子機構としてE-カドヘリンの遺伝子転写制御や、E-カドヘリンのタンパク質分解あるいはターンオーバーの関与については否定的なデータが得られ、異なる分子機構の存在が強く示唆された。細胞におけるC-Man化ペプチドの結合標的タンパク質の解析の結果、Hsc70、ミオシン-1c、α-アクチニン-4が候補分子として同定された。これらのC-Man化ペプチドの結合分子が、C-Man化ペプチドによるE-カドヘリン発現抑制の制御にいかに関わるのかその分子機構を明らかにする。

また、本研究は上皮細胞接着異常が関わるがん細胞の転移・浸潤などの病態に関するC-Man化糖修飾の生理的役割の解析へと発展させることで、C-Man化糖タンパク質あるいは生理活性糖ペプチドとしてのC-Man化ペプチドがもつ新たな上皮細胞接着制御機構の解明を目指す。平成28年度は、(1)肺上皮系A549細胞におけるC-Man化ペプチド結合標的分子の探索と同定を進めた。ビオチン化したC-Man化ペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trp)をプローブとし、アガロースビーズ/カラムなどを用いる手法によるタンパク質精製を試み、3つの候補タンパク質を見出し、これらの標的タンパク質のマスフィンガープリンティングによる解析を進めたところ、熱ショックタンパク質のHsc70,ミオシン-1c, α-アクチニン-4が同定された。(2) C-Man化ペプチドの、上皮系細胞間接着への影響(E-カドヘリン発現量の減少とアドヘレンス・ジャンクション構造の形成阻害)について検討した。C-Man化ペプチドの影響としてE-カドヘリンのタンパク質レベルの減少は見られたものの、転写レベルに変化が見られなかったことから、細胞内のタンパク質分解系(リソソーム、プロテアソーム)の関与について、種々のタンパク質分解阻害剤の作用を解析した。リソソーム(阻害剤:バフィロマイシンA1、コンカナマイシンA、クロロキン)あるいはプロテアソーム(阻害剤:ラクタシスチン、MG132)の機能を抑制した条件で、C-Man化ペプチドによるE-カドヘリン発現減少への影響について解析したところ、いずれの条件でもE-カドヘリンの発現減少を抑制することはできなかった。このことから、E-カドヘリンの細胞内分解機構による関与は否定された。一方、組織内可視化A549-GFP細胞を用いたIn vivo細胞転移・浸潤モデルによるC-Man化ペプチド機能の解析は、遺伝子発現ベクターの準備や細胞株の調整などに若干の遅れが生じ、年度内での遂行に間に合わなかったC-マンノシル(C-Man)化は、タンパク質中のトリプトファン残基に対する特異的な翻訳後修飾である。C-Man化修飾は、標的タンパク質の機能に影響することで細胞生物機能を発揮するものと考えられるが、生体における生理的役割は不明な点が多い。本研究では、我々が発見した、C-Man化ペプチドによる上皮系細胞間接着の抑制現象の分子機構の解明を目指した。これまでの研究で、肺胞上皮系由来A549細胞において、C-Man化ペプチドによる細胞間接着の抑制とE-カドヘリン発現の抑制が観察されたが、その分子機構としてE-カドヘリンの転写制御への影響については否定的であり、異なる制御機構の存在が考えられた。最終年度は、C-Man化ペプチドの結合標的タンパク質として同定された、Hsc70、ミオシン-1c、α-アクチニン-4とE-カドヘリン複合体形成の関与について、RNAiによる発現抑制実験系を用いて解析を行った。その結果、Hsc70、ミオシン-1c、α-アクチニン-4の発現抑制で、いずれの場合もE-カドヘリンの発現レベルの上昇することが明らかとなり、これらの分子がE-カドヘリン発現量の調節に関与することが示唆された。
ヒドラ神経細胞の分化パタ-ン形成機構の解析

ヒドラの神経細胞は体幹中、主として頭部と足部で分化する(これを位置依存の分化と呼ぶ)。位置依存の分化の生成機構に関して2つの可能性が示唆されている:(1)体幹中にほぼ均一に存在する間細胞が自らの位置を規定する情報を認識して神経に分化する。(2)神経分化へ決定を受けた間細胞が選択的に頭、足部へ移動し、分化する。本研究では上記(2)の可能性について詳細に分析した。1.正常ヒドラを用いて^3Hーチミヂン標識した下半部と非標識の上半部を接合し標識間細胞の下半部から上半部への移動と神経への分化を調べた。その結果、間細胞は接合後24時間以内では移動をするが、それ以降移動は起こらない。従って、標識された神経細胞の分化も24ー48時間にかけて起こるがその後は停止する。2.正常ヒドラの下半部と間細胞が温度感受性である突然変異系統(sfー1)の上半部(または逆の組合せ)を接合後、経時的に、高温処理でsfー1間細胞を殺すことによって正常間細胞の分布を調べた。その結果、正常間細胞はsfー1組織の中に浸透せず、明確な境界を形成して徐々に下部へ退行(または移行)した。以上の結果は、正常ヒドラでは間細胞のアクティブな移動は通常起こらず、従って、神経分化へ決定した間細胞の選択的移動による位置依存の分化生成機構(上記(2))の可能性は否定された。間細胞は体幹中での自らの位置を認識して分化運命を決定すると考えられる。尚、短期的な間細胞移動が認められる理由は接合時の傷の効果によると推測される。
脳血管障害の一次予防を目指したリスク診断システムの開発

公的データベースを用いて血管壁因子(高血圧・動脈硬化・血管攣縮・動脈瘤など)、血液因子(凝固線溶系、血小板機能など)、代謝因子(糖尿病・高脂血症・高ホモシステイン血症など)、神経因子(循環・血圧調節、内分泌機能など)を中心として包括的・総合的に脳血栓または脳出血発症との関連が推定される200候補遺伝子を抜粋し、それらの遺伝子に存在する多型群の中で遺伝子発現またはタンパク質の構造・機能変化が推定される300多型を選択した。また研究参加施設である岐阜県立3病院(県立岐阜病院、県立多治見病院、県立下呂温泉病院)および弘前大学病院とその関連病院(黎明郷リハビリテーション病院)でDNAサンプルおよび詳細な臨床情報を収集し、平成16年度に収集したサンプルと既に収集したものを合わせ、3,300例(脳梗塞800例、脳出血500例、対照2,000例)のサンプルを収集した。本研究は、三重大学医学部、財団法人岐阜県国際バイオ研究所、県立岐阜病院、県立多治見病院、県立下呂温泉病院、弘前大学医学部の倫理委員会の承認を得ており、対象者からは書面でインフォームドコンセントを得た後に採血を行った。さらに3,300サンプルについては140多型(合計462,000多型)の解析を完了し、データベース化した。多型情報と臨床情報による関連解析を行い、脳梗塞および脳出血発症と関連する多型をそれぞれ数個確定し、現在さらに詳細な解析を行っている。今後は、脳梗塞および脳出血発症に関してさらに多くの候補遺伝子多型群を解析し、発症と強い関連を示す多型群を同定すると共に、選択された多型群の組み合わせによる遺伝子リスク診断システムを開発する予定である。
壁面ディスプレイを用いた遠隔協調型ソフトウェア開発環境に関する研究

研究期間中に主に行ったのは,(1)大型ディスプレイを複数ユーザが共有しながら協調的な作業を行う環境に適したインタラクション技法に関する研究と(2)テスティングやセキュアなコンポーネント開発を指向した新しいソフトウェア開発環境に関する研究である.以下に概要を述べる.1.起立した状態で大型ディスプレイの表示を見ながら協調的な設計・編集作業を行う場合,通常のマウスやキーボードは入力デバイスとして使いづらい.そこで,ペンや音声による入力方式に関する研究を行った.主な成果は,(1)2次元入力デバイスであるペンを用いた3次元形状(自由曲線や自由局面)の入力,(2)同じくペンを用いたアニメーションの動作指定,(3)音声を用いたカーソル移動の方式などである.ペンを用いる方式は,ホワイトボードサイズの大型ディスプレイを想定したものであり,主として3次元モデルやアニメーション作品などのコンテンツを共同作成する場面を対象としている.一方,音声を用いる方式は,上端までは人間の手が届かない程度に大きなディスプレイを想定したものである.なお,この最後の手法は肢体不自由者によるGUI操作の手法としても利用可能であることがわかった.また,この研究過程で得た知見は,マルチディスプレイ向けカーソル操作手法に適用する可能性もあり,今後研究を進めていく予定である.2.ソフトウェア開発環境を高度化する研究を行った.主な成果は,(1)階層的プラグイン構造のコンポーネントモデルを対象に,プログラムの静的および動的解析に基づき,セキュアなソフトウェア構築を可能とする方式と(2)突発的に発生しうる入出力例外のもとでの再現性のあるテスティング方式の研究およびツールの開発である.研究期間中に主に行ったのは,(1)大型ディスプレイを複数ユーザが共有しながら協調的な作業を行う環境に適したインタラクション技法に関する研究と(2)テスティングやセキュアなコンポーネント開発を指向した新しいソフトウェア開発環境に関する研究である.以下に概要を述べる.1.起立した状態で大型ディスプレイの表示を見ながら協調的な設計・編集作業を行う場合,通常のマウスやキーボードは入力デバイスとして使いづらい.そこで,ペンや音声による入力方式に関する研究を行った.主な成果は,(1)2次元入力デバイスであるペンを用いた3次元形状(自由曲線や自由局面)の入力,(2)同じくペンを用いたアニメーションの動作指定,(3)音声を用いたカーソル移動の方式などである.ペンを用いる方式は,ホワイトボードサイズの大型ディスプレイを想定したものであり,主として3次元モデルやアニメーション作品などのコンテンツを共同作成する場面を対象としている.一方,音声を用いる方式は,上端までは人間の手が届かない程度に大きなディスプレイを想定したものである.なお,この最後の手法は肢体不自由者によるGUI操作の手法としても利用可能であることがわかった.また,この研究過程で得た知見は,マルチディスプレイ向けカーソル操作手法に適用する可能性もあり,今後研究を進めていく予定である.2.ソフトウェア開発環境を高度化する研究を行った.主な成果は,(1)階層的プラグイン構造のコンポーネントモデルを対象に,プログラムの静的および動的解析に基づき,セキュアなソフトウェア構築を可能とする方式と(2)突発的に発生しうる入出力例外のもとでの再現性のあるテスティング方式の研究およびツールの開発である.今年度は,ユーザインターフェイスの要素技術として制約の可視化とペン入力方式などの研究を行った.また,安定した通信の基盤技術に関する研究として,TCPセッションの透過的かつポータブルな移送方式に関する研究を行った.具体的内容は以下の通りである.1.制約の可視化方式高度なGUIを構成するために制約指向の考え方が良く用いられる.しかし,複雑な制約を有するGUIのデバッグ作業は必ずしも容易ではない.そこで,今年度は,制約のネットワーク構造の可視化と各描画対象の自由度の可視化を組み合わせたデバッグ向け可視化方式を提案し,プロトタイプの実装を行った.この方式により,来年度以降構築するシステムのデバッグ作業の手間を軽減できるものと期待される.2.ペン入力インターフェース壁面ディスプレイに表示されたイメージを見ながら起立した状態で協調的な設計・編集作業を行う場合,ペンを用いたスケッチインタフェースは有望な入力方式である.今年度は,2次元入力デパイスであるペンを用いて,3次元の自由曲線および自由局面を容易に入力するためのインタフェースを提案し、プロトタイプの実装を行った.3.セッション移動方式遠隔地に離れて配備されたサーバとクライアントの間でTCP/IPのセッションが既に確立されている状況で,このセッションを維持したままサーバを移動するための方式を提案し,プロトタイプ実装を行った.この方式は,既存の方式に比べ,ポータビリティの高さに特徴がある.通常のデスクトップ環境で入力デバイスとして利用されるキーボードやマウスは,ユーザが起立した状態では使いづらいため,壁面型インタフェースには向いていない.そこで,今年度は壁面型インタフェースを構築するための要素技術として,ペンや音声による入力方式を中心に研究を行った.具体的内容は以下の通りである.1.ペンによる3次元入力2次元入力デバイスであるペンを用いて,3次元の自由曲線および自由局面を容易に入力するためのインタフェースに関する研究を,昨年度に引き続き行った.さらに,プロトタイプ実装にも改良を加えた.ユーザテストの結果,植物のようなかなり複雑な形状を入力する場合にも,この方式が利用可能であることがわかった.2.ペンによるアニメーション入力前項が,2次元入力デバイスを用いた奥行き方向の情報入力に関するものであるのに対し,この項目は,2次元入力デバイスによる時間軸方向の情報入力に関するものである.漫画などの静止画上で動作を表現するために利用されることが多い効果線の考え方を活用し,2次元図形に対して簡易アニメーション効果を与える方式を考案するとともに,プロトタイプ実装を行った.3.音声入力によるカーソルの操作ホワイトボードサイズの壁面インタフェースでは,ペンによるポインティングが可能である.

しかし,200インチ程度のサイズになるとユーザの手が届かない箇所が増えてくる.そこで,このような場合にも対応するために,音声によるポインティングデバイスの操作に関する予備実験を行った.カーソル移動の選択肢を複数同時表示し,それを音声により選択することで,比較的円滑にポインティングが行えることがわかった.この方式は,肢体障害者の助けにもなることが期待される.今日のGUI環境は,入力のためにポインティングデバイスを必要とする.しかし,デスクトップ環境向けに設計されたマウスは,ユーザが起立した状態では使いづらく,また大画面で問題となる長距離移動にも向いていない.そこで,壁面型インタフェースを構築するための要素技術として,昨年度に続き,ペンや音声による入力方式の研究を行った.また,壁面以外の大画面の可能性として,マルチディスプレイ環境におけるポインティング方式の研究も行った.具体的内容は以下の通りである.1.ペンによるアニメーション入力ホワイトボード程度のサイズの大画面ディスプレイの場合,ペンによる直接操作が可能であり,ユーザにとっての学習負荷も低い.そこで,ペンによる表現力の高い入力を実現するために,制約を用いた方式の提案を行った.これは,昨年度提案した効果線方式の改良版として位置づけることができる.2.音声入力によるカーソルの操作壁面ディスプレイでも,表示画面サイズが200インチ程度以上になると,物理的に手が届かなくなる.そのため,ペンによる直接ポインティングは非現実的となる.このような場合にも対応するために,音声によるポインティングデバイスの操作に関する新しい方式を提案した.これは言葉による離散的な移動と音声による連続的移動を組み合わせた方式である.3.マルチディスプレイ環境のためのハイブリッド型カーソル移動これは広大なデスクトップ環境でのカーソル方式に関する新しい提案である.腕の動作と指の動作により2種類の異なる移動を指定できるマウスを試作し,高速で大雑把な移動と低速で精密な移動を組み合わせることにより,大画面上でのポインティングを円滑に行えるようにした.
盛土を併用した真空圧密を受ける泥炭の強度および剛性の発現過程の解明に関する研究

盛土併用真空圧密下にある泥炭の応力状態を三軸試験装置内で模擬し,盛土併用真空圧密中の泥炭の非排水強度および剛性の発現過程について検討した。盛土併用真空圧密によって非排水強度は著しく増加したが,盛土載荷速度が大きい場合,発生する過剰間隙水圧によって一時的に非排水強度が減少する可能性が示唆された。このような非排水強度の発現は実務で用いられる強度推定式から求められる強度増加とは異なるものであった。剛性の発現にも同様の挙動が確認された。載荷後の剛性はおおむね圧密応力増分に対応して増加するが,急速な盛土載荷を行うと,過剰間隙水圧によって応力比が減少し,地盤の剛性が一時的に減少する可能性が示唆された。申請者はこれまでに盛土を併用した真空圧密工法をシミュレートした三軸試験から,負圧および軸応力載荷を複合的に受ける泥炭の側方ひずみが軸応力の載荷条件によって圧縮側から引張側まで幅広い範囲で制御可能であることを示した。平成27年度はこれまでの実験結果を受け,代表的な載荷条件2ケースについて,負圧および軸応力載荷過程において,泥炭の変形特性や強度特性がどのように変化(増加)していくかを確かめた。強度特性は負圧および軸応力載荷を途中で中断し,そのまま供試体を非排水せん断することで評価し,変形特性は大ひずみ域においては非排水せん断時のE50によって,微小ひずみ域においてはベンダーエレメント試験を用いてせん断弾性係数によって評価した。一連の実験結果から,以下のことが明らかとなった。1負圧および軸応力載荷過程の泥炭の非排水強度の変化は軸応力載荷速度によって大きく異なる。すなわち,軸応力載荷速度が小さい場合,非排水強度は圧密度とともに単調に増加するが,軸応力載荷速度が大きい場合,圧密度が増加しているにもかかわらず,いったん大きく減少する。これは載荷速度が大きい場合,負の側方ひずみが生じて泥炭供試体がつづみ型に変形し,せん断変形が卓越するため,沈下量から算出される圧密度が圧密の進行程度を適切に表現していないためだと考えられる。この点は過去の研究成果である側方ひずみの発生量と深く関係するものと考えられ,平成28年度に検証する予定である。2変形特性についてもほぼ同様の傾向が確認された。すなわち,軸応力載荷速度が大きい場合には載荷によって圧密有効応力が増加しているにもかかわらず,剛性の増加がほとんど見られないか,あるいは減少する傾向が観察された。以上のように,平成27年度は負圧および軸応力載荷過程における泥炭の強度・変形特性の挙動を実験によって求め,両者の間におおむね正の相関があることを確かめた。当初の研究計画通り,おおむね進んでいる。ただし,当初計画していた改良効果を確かめるための原位置サンプリングから一軸圧縮試験をシミュレートした試験シリーズについてはサクション測定が思うように実施できず,現在保留している。申請者はこれまでに盛土を併用した真空圧密工法をシミュレートした三軸試験から,負圧および軸応力載荷を複合的に受ける泥炭の側方ひずみが軸応力の載荷条件によって圧縮側から引張側まで幅広い範囲で制御可能であることを示し,平成27年度には代表的な載荷条件2ケースについて,負圧および軸応力載荷過程において,泥炭の変形特性や強度特性がどのように変化(増加)していくかを確かめる一連の実験を計画・実施した。平成28年度は引き続き前年度の継続実験を実施・完了した。また,新たに真空圧密を用いない通常の異方圧密非排水三軸試験を実施し,強度変化を比較した。さらに,一連の実験結果の再現性を確かめるため,いくつかの代表的な構成モデルを用いて強度・変形特性の比較に着手した。平成27,28年の研究から,以下のことが明らかとなった。1負圧および軸応力載荷過程の泥炭の非排水せん断強度の変化は軸応力載荷速度によって大きく異なる。すなわち,軸応力載荷速度が小さい場合,非排水せん断強度は圧密度とともに単調に増加するが,軸応力載荷速度が大きいきい場合,圧密度が増加しているにもかかわらず,いったん大きく減少する。また,変形特性についてもほぼ同様の傾向を示す。2負圧を受けた泥炭は等方的な応力変化にも関わらず,その変形は軸ひずみに比べ側方ひずみの発生量はかなり小さく,顕著な異方性を示す。これは泥炭を形成する植物遺骸の配向に起因する構造異方性によると考えられる。このような変形の異方性は既往の代表的な構成モデルでは考慮することが出来ず,特に,降伏曲面を楕円形で規定している修正カムクレイモデルでは側方ひずみをかなり過大評価することが明らかになった。H29年度は強度特性について,実験結果と構成モデルとの比較を行い,カムクレイ以外の構成モデルについても検証する。申請時に記載した下記の研究目的のうち,1,2について,ほぼ完了し,5について着手・実施中である。1.盛土併用真空圧密工法をシミュレートした室内三軸試験を実施し,盛土荷重と真空圧を複合的に受ける泥炭の強度の発現過程を明らかにする。2.上記試験中,連続的にS波速度を測定することにより,強度に加え,剛性の発現過程も明らかにする。3.真空圧および盛土荷重を複合的に受ける土の強度とS波速度の関係を明らかにし, S波速度から強度変化を推定可能であることを示す。4.実施工の現場で得られた強度-S波速度関係から原位置での整合性を検証する

5.各種構成モデルの強度と比較し,モデルの再現性を検証する。前年度までの研究結果から,(1)負圧および軸応力を複合的に受ける泥炭の非排水強度は,軸応力載荷速度が大きくなるほど応力経路上の応力点が破壊線に近づくため,必ずしも圧密の進行とともに増加しないこと,(2)せん断弾性係数もほぼ同様の傾向を示すこと,が明らかとなった。この中で,(1)は実務で用いられている圧密度にもとづく強度増加の推定式が実際の強度変化よりも過大評価する可能性を示唆している。同時に,関連して実施した負圧のみを載荷した等方圧密試験の結果から,軸ひずみに比べ側方ひずみの発生量はかなり小さく,泥炭の変形が予想以上に著しい異方性を有することが確認された。このような変形の異方性は既存の構成モデルでは考慮されていないため,実験で得られたひずみとの間に大きな差異が生じることが明らかとなった。本研究では非排水強度を既存のモデルと比較する予定であったが,それ以前に,既存の構成モデルの適用性を吟味する必要があると判断し,まず,泥炭の変形の異方性について明らかにすることを優先することとした。泥炭の変形の異方性は堆積した植物遺骸の配向に起因すると考えられるため,堆積面に対し,垂直,および水平に切出した供試体を用意し,大ひずみ域での変形を念頭に置いた圧密試験,微小ひずみ域での変形を念頭に置いた室内弾性波試験を実施して異方性を評価した。その結果,微小ひずみ域ではせん断弾性係数で3倍程度の大きな差が認められた。また大ひずみにおいても類似の傾向が見られたが,圧密変形においては粘性の影響が無視できないほど大きいことがわかったため,粘性を評価するための基礎的な実験として三軸等方圧密試験によって泥炭の排水クリープ挙動を確認した。盛土併用真空圧密下にある泥炭の応力状態を三軸試験装置内で模擬し,盛土併用真空圧密中の泥炭の非排水強度および剛性の発現過程について検討した。盛土併用真空圧密によって非排水強度は著しく増加したが,盛土載荷速度が大きい場合,発生する過剰間隙水圧によって一時的に非排水強度が減少する可能性が示唆された。このような非排水強度の発現は実務で用いられる強度推定式から求められる強度増加とは異なるものであった。剛性の発現にも同様の挙動が確認された。載荷後の剛性はおおむね圧密応力増分に対応して増加するが,急速な盛土載荷を行うと,過剰間隙水圧によって応力比が減少し,地盤の剛性が一時的に減少する可能性が示唆された。平成28年度,引き続きサクション測定を試みるが,この試験は研究目的の中心的位置づけではないため,難しい場合は,試験計画を修正する。一方で,平成27年度の研究から,載荷中の泥炭の非排水強度は必ずしも圧密度に比例して増加せず,その原因が発生する側方ひずみ量に関係しているということがわかってきた。実務では真空圧密にともなう非排水強度の増加は圧密度に比例して計算されるため,場合によっては実際の強度を過大評価している可能性がある。そのため,この点の検証を新たに研究計画に加えることを視野に入れて,平成28年度の計画を微修正する予定である。H28年度の研究の進捗によって,泥炭の構造異方性が当初想定していた以上に変形特性に大きな影響をおよぼすことが明らかになった。泥炭の組成を考えれば,構造異方性が強度特性にも強い影響をおよぼすことは容易に想像される。
樹状細胞膜表面におけるＨｓｐ９０分子の分子生物学的意義

Hsp90は細胞質に存在し、正常な三次元構造をとれず凝集したタンパク質分子を認識して正しい構造を取れるようrefoldingを助ける、シャペロンと呼ばれる分子群の一員である。本研究課題において、Hsp90の機能を解析するために作製したモノクローナル抗体を用いた解析により、樹状細胞膜表面にHsp90が存在することが確認された。また、この抗体はHsp90依存的に樹状細胞内にエンドサイトーシスされることが明らかとなった。当初,当研究室で作製された抗Hsp90モノクローナル抗体が樹状細胞様細胞株DC2.4の細胞膜表面を染色することから,樹状細胞膜表面にはHsp90が存在するとしてその生理的存在意義,またHsp90を含む細胞膜上の複合体の解析を試みた.しかしその後の解析により, DC2.4にはFcγRI (CD64)が強発現していることが判明し,解析に使用してきた抗Hsp90モノクローナル抗体6H8のサブクラスがIgG2aであったため, 6H8はHsp90への結合以外にFcRを介して結合していることが強く示唆された.サブクラスがIgG1である別の抗Hsp90抗体(5H12)を用いて再度解析を行ったところ,それでもなおDC2.4は染色されたがその蛍光強度は弱く,膜表面にHsp90は存在するものの微量であることが確認された.また,より生理的条件に近い樹状細胞としてマウス骨髄由来樹状細胞を染色したところ,やはり非常に弱いが細胞膜表面でのHsp90の発現は認められた.膜表面Hsp90を免疫沈降,会合しているタンパクを質量分析とウェスタンブロットを用いて解析したところ,この複合体には少なくともHsp90/Hop/Hsc70/FcRγが含まれていることが判明した. shRNAを用いてFcRγをノックダウンしたところ,膜表面Hsp90の発現が低下した.このことから,膜表面Hsp90の発現にはFcRγが必須であることが明らかとなった.更なる実験計画の遂行のためにはよりアフィニティーが高く解析に使用しやすい抗体の作製が必要であった.CDRが6H8と同一でサブクラスがIgG1である抗体(6H8-IgG1)について,遺伝子組換えによって作製を試みたが,期間中に6H8-IgG1を高効率で産生する細胞の取得には至らなかった.Hsp90は細胞質に存在し、正常な三次元構造をとれず凝集したタンパク質分子を認識して正しい構造を取れるようrefoldingを助ける、シャペロンと呼ばれる分子群の一員である。当初,当研究室で作製された抗Hsp90モノクローナル抗体が樹状細胞様細胞株DC2.4の細胞膜表面を染色することから,樹状細胞膜表面にはHsp90が存在するとしてその生理的存在意義,またHsp90を含む細胞膜上の複合体の解析を試みてきた.しかしその後の解析により, DC2.4にはFcγRI (CD64)が強発現していることが判明し,解析に使用してきた抗Hsp90モノクローナル抗体6H8のサブクラスがIgG2aであったため, 6H8はHsp90への結合以外にFcRを介して結合していることが強く示唆された.サブクラスがIgG1である別の抗Hsp90抗体(5H12)を用いて再度解析を行ったところ,それでもなおDC2.4は染色されたがその蛍光強度は弱く,膜表面にHsp90は存在するものの微量であることが確認された.また,より生理的条件に近い樹状細胞としてマウス骨髄由来樹状細胞を染色したところ,やはり非常に弱いが細胞膜表面でのHsp90の発現は認められた.5H12がDC2.4にエンドサイトーシスされるかについて, FACSを用いて解析を行ったところ,コントロール(IgG1)に比べて効率よく細胞内へ取り込まれていることが認められ, 5H12の取込みはHsp90依存的であることが示唆された.以上より,本研究の基盤となる樹状細胞膜表面上のHsp90の存在は確認されており,樹状細胞膜表面にHsp90が存在するメカニズムの解明と樹状細胞の機能に及ぼす影響の検証という本研究課題のコンセプトは継続可能であるが,実験計画の遂行のためにはより解析に使用しやすい抗体の作製が必要となっている.Hsp90を含む複合体の全容解明について本研究の予備的検討の時点で,樹状細胞膜表面Hsp90複合体の免疫沈降を行う際に6H8抗体とコントロール(IgG2a)を用いており,この際にHsp90/Hop/Hsc70/FcRγを含む複合体を得ている.しかしながら, 6H8抗体がもつFcRへの結合の影響を極力排除するため,サブクラスがIgG1である5H12抗体を用いて同様の解析を行ったところ,認識エピトープ部位が6H8抗体と異なるためか,細胞膜表面のHsp90複合体を効率よく免疫沈降することができず,正確な解析ができていない.

この問題を解決するため, CDRが6H8と同一でサブクラスがIgG1である抗体(6H8-IgG1)を遺伝子組換えによって作製中である.膜表面Hsp90が関与するエンドサイトーシスの分子メカニズムの解明についてDC2.4細胞膜上のHsp90依存性に5H12抗体がエンドサイトーシスされることが確認された.このメカニズムとして当初予想されたFcRγからのシグナルの関与について, FcRγからのシグナルを伝える分子であるSykの阻害剤を用いて検証したところ, 5H12抗体のエンドサイトーシスは阻害されなかった.この他Hsp90, Hsp70阻害剤もエンドサイトーシスを阻害しなかった.現時点でエンドサイトーシスを起こす際に必須の分子は見つかっていないが,上述のHsp90複合体の解析を進め,新たな分子が同定されればその分子に焦点を当て解析する.Hsp90ノックアウトマウスを用いた解析についてHsp90βコンディショナルノックアウトマウスの作製にあたり,組換えES細胞の作製を試みているが,現在までに約400コロニーを解析して相同組換体が得られていない.ベクターの再構築も含めて対応中である.6H8抗体のサブクラスがIgG2aであることにより, FcRを介した強い結合が無視できず, FACS等の解析には使用できない.また,サブクラスがIgG1である他の抗Hsp90抗体は認識エピトープ部位が6H8抗体と異なるためか,細胞膜表面のHsp90を効率よく免疫沈降することができていない.これらの問題を解決するため, CDRが6H8と同一でサブクラスがIgG1である抗体(6H8-IgG1)を遺伝子組換えによって作製中である.現時点では当該抗体を産生するHEK293細胞株が得られたところまで確認しており,大量産生を試みている段階である.6H8-IgG1を用いて,予備的検討の結果を含め,当初の実験計画を遂行する.特に,本研究の着想の基となったin vivoの実験系(卵白アルブミン(OVA)抗原を結合させたIgG2a-OVAと6H8の同時投与ではIgG2a-OVA単独投与よりも著しくクロスプレゼンテーション効率が高くなる)を6H8-IgG1で再現できるかを早急に確認する.同時に,サブクラスがIgG1である他の抗Hsp90抗体でも効果が認められるかの検証を行う.並行して,樹状細胞膜表面Hsp90複合体の免疫沈降,抗体のエンドサイトーシス解析を行う.当初の予定より使用するマウスの数が減ったため,マウスの購入・維持管理費が減少した.次年度使用額については,実験計画の修正に伴い抗体精製に費用がかかるため,平成25年度請求分の研究費と併せて生化学実験購入に充てる予定である.
妊娠・養育に関する心理社会的ハイリスク妊婦チェックシートの開発

産後うつや虐待の予防についての研究や取り組みが多々行われている中、本研究は、健やかな妊娠生活と児の安全な養育環境の確保を目指し、心理社会的ハイリスク妊婦を早期から効率よく把握するため、妊婦自己記入式質問紙と医療者用チェックリストの開発を試みた。本年度(平成30年度)の研究成果は、以下の通りである。1日本おける産褥うつの予測因子を検討することを目的に、2施設において222名の妊婦を対象にエジンバラ産後うつ病質問票、自己記入式質問紙を用いて実施した。結果として、ソーシャルサポートの低さ、育児環境への不満足、婚姻状況(シングルマザー)が産褥うつに関連している可能性が示唆され(p<0.05)、メンタルヘルス、経済状態、妊娠中のうつ兆候との関連は認められなかった。2心理社会的ハイリスク妊婦を早期から効率よく把握するための助産師の視点とケアを明らかにすることを目的に、助産師計6名を対象にフォーカス・グループ・インタビューを実施した。その結果、助産師が心理社会的ハイリスク妊婦の可能性を効率よく把握する視点は、【年齢差のあるパートナー】【妊娠中の姓の変化】【母子手帳の記入文字】【不妊治療後】【この人気になる】【上の子への態度や上の子の様子】【受付スタッフへの態度】の7カテゴリーであった。また、ケアとしては【疑わしきは面談】【赤ちゃんの受け入れの査定】【家族の育児支援の受け入れの査定】【キーパーソンを含めた指導】【地域保健師との連携】【ソーシャルワーカーとの連携】【児童相談所との連携】の7カテゴリーが抽出された。サブカテゴリーとして、【この人気になる】は<違和感><受け答えがかみ合わない><直観><経験知>の5つ、【疑わしきは面談】は<話してみてわかる><細かく聞いて初めて話す><初期は本当のことを言わないことがある><話しているうちに心を許して語ってくれる>の6つがそれぞれ見出された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の課題「妊娠・養育に関する心理社会的ハイリスク妊婦チェックシートの開発」の目的は、妥当性・信頼性を明らかにし、心理社会的ハイリスク妊婦を早期から効率よく把握するための妊婦自己記入式質問紙及び医療者用チェックリストを開発することである。それらを活用することで、妊娠早期から母児やその家族への適切な介入を行うことができ、健やかな妊娠生活と児の安全な養育環境の確保を目指すことができる。平成28年度は、調査依頼、妊婦対象の質問紙調査、助産師対象のインタビュー調査を予定しており、進歩状況としては、おおむね順調に進展している。調査依頼、助産師対象のインタビュー調査については予定通り実施した。妊婦対象の質問紙調査については、712月を予定していたが、必要サンプル数の確保のため3月まで期間を3か月延長して実施している。質問項目の精選のための妊婦を対象とした質問紙調査は、計125名を想定していたが、現在までに213名の妊婦に質問紙調査の協力依頼を行い、妊娠期に関しては約95%の質問紙回収率である。また、質問紙・チェックリストの妥当性検証、介入の質検討のため助産師を対象としたインタビュー調査は、1施設35名、計10名程度を想定していたが、実際には1施設3名ずつ、計6名を対象に半構成的面接を実施した。データの分析については、研究代表者および研究協力者は、質問紙調査のデータ分析を開始し、インタビューデータの内容整理・分類・カテゴリー化を予定通り実施した。研究実施施設は、予定通り、医療法人青葉会神野レディスクリニック、大学近隣施設の社会医療法人愛仁会千船病院で、ケアの質の一定化のため母性看護専門看護師の勤務する施設2施設で調査を実施している。1.質問紙調査:質問項目の精選のために、研究協力施設に来院した妊婦に対して、質問紙調査を実施した。医療者用チェックリストについては母性看護専門看護師(以下CNS)である研究代表者、もしくはその施設の産科エキスパートスタッフが妊娠中にチェックを行った。妊婦の調査対象は、妊娠末期で妊婦健康診査または出産前教室のために研究協力施設に来院した妊婦、計125名を想定していた。実際には、現在までに213名の妊婦に質問紙調査の協力依頼を行い、妊娠期に関しては約95%の質問紙回収率である。また、研究代表者は対象者へのケア介入についてカルテ、及び母子手帳、必要時には施設医療スタッフより情報収集も行った。2.インタビュー調査:質問紙・チェックリストの妥当性検証、介入の質検討のため助産師を対象として、インタビュー調査を行った。インタビュー対象者は、臨床経験5年以上、そのうち産科看護3年以上の臨床経験をもつ助産師、1施設35名を対象に計10名程度を想定していた。実際には1施設3名ずつ、計6名を対象に40分程度の半構成的面接を実施した。平成28年度56月に調査依頼、712月に妊婦対象の質問紙調査、13月に助産師対象のインタビュー調査を予定していた。実際には、調査依頼、助産師対象のインタビュー調査については予定通り実施した。妊婦対象の質問紙調査については、必要サンプル数の確保のため3月まで延長して実施している。研究代表者および研究協力者は、質問紙調査のデータ分析を開始し、インタビューデータの内容整理・分類・カテゴリー化を実施した。

産後うつや虐待の予防についての研究や取り組みが多々行われている中、本研究は、健やかな妊娠生活と児の安全な養育環境の確保を目指し、心理社会的ハイリスク妊婦を早期から効率よく把握するため、妊婦自己記入式質問紙と医療者用チェックリストの開発を試みた。本年度(平成30年度)の研究成果は、以下の通りである。1日本おける産褥うつの予測因子を検討することを目的に、2施設において222名の妊婦を対象にエジンバラ産後うつ病質問票、自己記入式質問紙を用いて実施した。結果として、ソーシャルサポートの低さ、育児環境への不満足、婚姻状況(シングルマザー)が産褥うつに関連している可能性が示唆され(p<0.05)、メンタルヘルス、経済状態、妊娠中のうつ兆候との関連は認められなかった。2心理社会的ハイリスク妊婦を早期から効率よく把握するための助産師の視点とケアを明らかにすることを目的に、助産師計6名を対象にフォーカス・グループ・インタビューを実施した。その結果、助産師が心理社会的ハイリスク妊婦の可能性を効率よく把握する視点は、【年齢差のあるパートナー】【妊娠中の姓の変化】【母子手帳の記入文字】【不妊治療後】【この人気になる】【上の子への態度や上の子の様子】【受付スタッフへの態度】の7カテゴリーであった。また、ケアとしては【疑わしきは面談】【赤ちゃんの受け入れの査定】【家族の育児支援の受け入れの査定】【キーパーソンを含めた指導】【地域保健師との連携】【ソーシャルワーカーとの連携】【児童相談所との連携】の7カテゴリーが抽出された。サブカテゴリーとして、【この人気になる】は<違和感><受け答えがかみ合わない><直観><経験知>の5つ、【疑わしきは面談】は<話してみてわかる><細かく聞いて初めて話す><初期は本当のことを言わないことがある><話しているうちに心を許して語ってくれる>の6つがそれぞれ見出された。平成29年度は産前産後休暇・育児休暇のため、平成30年度に29年度実施予定であった分析、質問紙Ver.3の作成、学会発表、論文執筆を行う予定である。また、リマインダーなどを活用し、産褥期の質問紙の回収率向上に努めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
各種の直交関数展開にかかわる調和解析

当該研究課題に関する研究実績の概要は次の通りであり,成果は学術雑誌等に発表された.研究代表者堪甚は,解析関数の作る古典的なハーディー空間に対して成り立つ,いわゆるペーリーの不等式を,ヤコビ多項式の作る直交系に対して証明した.証明の鍵は,近時調和解析において得られた,実ハーディー空間の双対空間がBMO空間となると言う定理である.この定理によって,これまで複素解析的手法によって証明されていた定理が実解析的手法で解析出来るようになった.我々は,この考えを直交関数系の調和解析に有効と見て取り前述の定理を得た.上述の双対定理は,言い換えると実ハーディー空間のアトム分解である.このアトム分解を使って,古典的なハーディー空間に対して成り立つもうひとつの不等式,ハーディーの不等式をヤコビ多項式の作る直交関数系へと一般化した.更に代表者は,チェザロ作用素,一般にハウスドルフ作用素を研究した.そして,ある種の条件の下でハウスドルフ作用素が,1より小さい指数を持つ実ハーディー空間上で,有界な作用素となることを示した.また,研究分担者は各々の立場から以下の成果を得た.土谷は拡散過程のディリクレ形式の収束性を,基礎となる測度を固定せずに論じた.一瀬は,作用素ノルムでの自己共役トロッター・加藤積公式に関して,以前に得ていた結果に,更に新しい結果を加えた.また,極座標表示のディラック方程式の基本解を構成し経路積分の問題を考察した.佐藤は,積分核に単位球面上でLlog L条件を仮定すると,これにより定義されるマルチンキービィッツ関数がweak(1,1)評価を満足することを示した.藤解は,特殊ワイエルシュトラス・ピー関数に係数を持つリッカチ微分方程式を研究し,その解が有理型である事を示した.当該研究課題に関する研究実績の概要は次の通りであり,成果は学術雑誌等に発表された.研究代表者堪甚は,解析関数の作る古典的なハーディー空間に対して成り立つ,いわゆるペーリーの不等式を,ヤコビ多項式の作る直交系に対して証明した.証明の鍵は,近時調和解析において得られた,実ハーディー空間の双対空間がBMO空間となると言う定理である.この定理によって,これまで複素解析的手法によって証明されていた定理が実解析的手法で解析出来るようになった.我々は,この考えを直交関数系の調和解析に有効と見て取り前述の定理を得た.上述の双対定理は,言い換えると実ハーディー空間のアトム分解である.このアトム分解を使って,古典的なハーディー空間に対して成り立つもうひとつの不等式,ハーディーの不等式をヤコビ多項式の作る直交関数系へと一般化した.更に代表者は,チェザロ作用素,一般にハウスドルフ作用素を研究した.そして,ある種の条件の下でハウスドルフ作用素が,1より小さい指数を持つ実ハーディー空間上で,有界な作用素となることを示した.また,研究分担者は各々の立場から以下の成果を得た.土谷は拡散過程のディリクレ形式の収束性を,基礎となる測度を固定せずに論じた.一瀬は,作用素ノルムでの自己共役トロッター・加藤積公式に関して,以前に得ていた結果に,更に新しい結果を加えた.また,極座標表示のディラック方程式の基本解を構成し経路積分の問題を考察した.佐藤は,積分核に単位球面上でLlog L条件を仮定すると,これにより定義されるマルチンキービィッツ関数がweak(1,1)評価を満足することを示した.藤解は,特殊ワイエルシュトラス・ピー関数に係数を持つリッカチ微分方程式を研究し,その解が有理型である事を示した.当該研究課題に関する平成13年度の研究実績の概要は、次の通りであり、成果は学術雑誌等で発表された。円環上の実ハーディー空間に属する関数のフーリエ級数展開を考える。その、フーリエ係数の絶対自乗和をアダマール間隙に渡って取った総和は収束し、その和は元の関数の実ハーディー空間のノルマで押さえられる。これは、ペーリーの不等式として知られるものである。我々は、この不等式をヤコビ多項式の作る直交関数系へ一般化した。つまり、円環上の実ハーディー空間に属する関数のうち偶関数からなる空間を考える。この空間に属する関数を、正規化して普通のルベーグ測度に関し正規直交系としたヤコビ多項式から作られる関数系に関しフーリエ展開する。このとき、この係数の絶対自乗和をアダマール間隙に渡って取った総和は収束し、その和は元の関数の実ハーディー空間のノルムで押さえられる。我々が得た定理は、古典的なペーリーの不等式を含むものである。さらに、次の成果を得た。関数に対し、そのフーリエ変換を総和核を使って総和した物の逆フーリエ変数を対応させる作用素を、その総和核を持つハウスドルフ作用素と言う。我々が示した結果は、その総和核にいくつかの条件を置く事によって、ハウスドルフ作用素が指数を0と1との間に持つ実ハーディー空間上で有界となることである。この結果は、チェザロ作用素の同様な有界性を導くものとなっている。当該研究課題に関する平成14年度の研究実績の概要は,次の通りである.円環上の実ハーディー空間に属する関数のフーリエ級数展開を考える.その,フーリエ係数の絶対自乗和をアダマール間隙に渡って取った総和は収束し,その和は元の関数の実ハーディー空間のノルムで押さえられる.これは,ペーリーの不等式として知られるものである.

我々は,平成13年度の成果として,この不等式をヤコビ多項式の作る直交関数系へ一般化した.そこで得たヤコビ多項式に関するリプシッツ型の評価が,古典的なハーディーの不等式をヤコビ多項式展開へ拡張することを許す事が分かった.つまり,円環上の実ハーディー空間に属する関数のうち偶関数からなる空間を考える.この空間に属する関数を,正規化して普通のルベーグ測度に関し正規直交系としたヤコビ多項式から作られる関数系に関しフーリエ展開する.このとき,このn番目の係数をnで除した値の全てのnに渡る総和は収束し,その和は元の関数の実ハーディー空間のノルムで押さえられる.我々が得た定理は,古典的なハーディーの不等式を含むものである.この成果は学術雑誌に投稿中である.さらに,関数に対しそのフーリエ変換を総和核を使って総和した物の逆フーリエ変換を対応させる作用素を,その総和核を持つハウスドルフ作用素と言う,我々はすでに,その総和核にいくつかの条件を置く事によって,ハウスドルフ作用素が指数を0と1との間に持つ実ハーディー空間上で有界となることを示している.この結果をフーリエ変換の代わりにハンケル変換を使う事により一般化することを研究中であり,成果が得られるのも間近と考えている.
ユビキチンを利用したインフルエンザウイルス脱殻の分子機構解明

ヒストン脱アセチル化酵素HDAC6のC末端のユビキチン結合ドメイン(ZnF)を哺乳類細胞HEK293Tで発現、精製した。精製ZnFとウイルスの破砕液を混合し、ZnFに結合しているユビキチン鎖の詳細な解析を行った。特定のリンケージを認識する特異的抗体を用いた結果、K48及びK63に反応するユビキチン鎖の存在が明らかとなったが、その量はわずかであった。この実験方法の詳細をMethods in Molecular BiologyのInfluenza Virus特集号に掲載した。また、Priming処理(エンドソーム内部の環境を模倣する低pH)を行ったウイルス抽出液を用いた場合、ポリユビキチン鎖が優位にZnFに結合することを見出した。これはエンドソーム内でPrimingによりユビキチン化酵素または脱ユビキチン化酵素の活性が影響していることが示唆された。後期エンドソームにおいて、ウイルス内部のユビキチンタンパク質の性状を変化させることで、宿主細胞内のHDAC6との結合を促進し、ウイルスの殻をuncoatingしていると考察された。さらに、インフルエンザウイルスゲノム(vRNP)の核輸送に関与する宿主因子を同定するため、核輸送タンパク質のsiRNAによるスクリーニングを行った。その結果、TNPO1タンパク質をノックダウンするとインフルエンザウイルスの形態によらず、ウイルス感染の効率が低下することが明らかとなった。さらにTNPO1はインフルエンザウイルスの殻を構成するM1マトリクスタンパク質と相互作用することで、インフルエンザウイルスの8本のvRNPをuncoating後に、細胞質内で個々に分散させていることを明らかにした。TNPO1はM1タンパク質のN末端のPY-NLS配列を認識して結合していることを明らかにした。HDAC6に結合するインフルエンザウイルス内のユビキチン鎖の詳細な解析を行った。また、ZnFドメインに結合させたウイルス由来のユビキチンをトリプシンで消化後、di-Glycyl-Lys(anti-GGK)抗体で精製し、質量分析で解析することで、ユビキチンのリンケージの同定を試みた。しかし、ウイルス試料の絶対量が不足していたため、質量分析で目的のペプチドを検出することは困難であった。HDAC6のZnFを標的とするNanobodyがインフルエンザウイルスの感染を抑えていることを示した。なかでもウイルスの感染抑制に効果のあった二つのNanobodyをHEK293T細胞内で発現させ、タグに対する抗体で精製を試みた。その結果、これらのNanobodyにはより多くのHEK293T細胞由来のHDAC6タンパク質が結合していたことから、これらのNanobodyはより強力に結合し、感染を抑制していることを見出した。インフルエンザウイルスゲノムは後期エンドソームでHDAC6によるuncoatingの後、細胞質内に放出され、核に移行する。そこで核輸送タンパク質のsiRNAによるスクリーニングを行った。その結果、TNPO1タンパク質をノックダウンするとウイルスの形態によらず、ウイルス感染の効率が低下することが明らかとなった。さらにTNPO1はインフルエンザウイルスのキャプシドを構成するM1マトリクスタンパク質と相互作用することで、インフルエンザウイルスの8本のvRNPをuncoating後に、細胞質内で個々に分散させていることを明らかにした。Van der Walらによると、diGlyペプチドの検出効率は4mgの細胞抽出液から10,000ペプチドを検出した(van der Wal et al.,2018 J.Proteomics)。今回、実験に用いた現実使用可能なウイルス量はその約1/1000量であり、さらにHDAC6タンパク質のZnFに結合した分子のみを標的にしているため、その検出効率はさらに低いと考察された。そこで今後は、ユビキチン活性化反応が実際にウイルス内で起こっているかどうかをin vitroの系で確認する。スイスETH Jeffrey Bode教授らと人工的に合成したユビキチンを用いた共同研究を行う。蛍光標識した人工合成ユビキチンをウイルス抽出液と反応させ、そのユビキチン鎖の挙動を調べる。インフルエンザの感染抑制をするHDAC6に対するNanobodyにGFPなどの蛍光標識を結合させ、細胞内での挙動を観察するためのツールを開発する。また、これらのNanobodyを用いて、HDAC6タンパク質の全体構造をCryo-EMで観察するため、タンパク質精製を行い、条件検討をする。これらのNanobodyのHDAC6への結合を抑える低分子化合物を探索することで、宿主を対象とした新たな抗ウイルス薬につながることが期待される。さらに、このNanobodyがZnFのどこに結合しているのか、結晶構造解析も試みる。昨年度、インフルエンザウイルスのゲノムが細胞質に放出されたのちに、TNPO1タンパク質がウイルスのM1タンパク質と結合することによって、8本のインフルエンザウイルスゲノムが個々のウイルスゲノム(分節segment)に分かれ(debundling)、核内に侵入する分子メカニズムを明らかにした。TNPO1およびM1タンパク質の複合体の構造解析を通じて、より詳細なウイルスゲノムの核内侵入メカニズムを明らかにする。