hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「ASEAN共同体」の拡大と深化－地域機構の展開とEU危機への新たな視座

本研究の目的は、ASEANを1拡大と深化の過程、2地域横断的イシューの展開、3域内各国の政治社会変動分析という観点から「国際・地域・国内」の3次元で捉え直すことである。2年目の平成30年度においては、本研究の中間的な成果をASEAN地域の研究者との会議や海外での国際シンポジウムの場で発表し、海外の研究者との議論や情報交換を通して新たな知見や情報を集積することにおいて大きな前進があった。特に、12月5日から7日にインドネシア(ジャカルタ)で開催された東南アジア日本研究学会の国際会議「Global Dynamics Impacts to JAPAN-ASEAN Relations」に、研究分担者・協力者10名を派遣して2つの分科会を主催し、ASEAN諸国から参加した多くの研究者や実務家を前にこれまでの研究内容を発表するとともに、それらをめぐって議論する機会を得ることができたのは大きな成果であった。また、本研究のもう一つの特徴である「ASEANとEUとの比較」という観点については、前年度に引き続いてEU研究者を招聘してシンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、EUとASEANの地域統合のあり方、ならびに米中「新冷戦」や国家の内向き化などが両組織に与える影響についてそれぞれの研究成果を持ち寄って比較・検討することにより、双方の研究にフィードバックさせることができた。このような国内外での組織的な研究交流を積極的に推進する一方、各研究分担者・協力者は、それぞれの担当分野の進捗状況を月例研究会にて逐次報告・議論し、また関連するテーマについて各所属学会での口頭発表、論文や書籍としての発表・刊行を行った。これらの事業や活動を通して、新たな情報や知見の獲得、研究成果の公表とフィードバック、国内外での研究人脈の形成と活動分野の拡大といった面で2年目の成果を積み重ねることができた。・月例研究会の開催:研究分担者・協力者および招聘した外部研究者を報告者として月例研究会を9回開催した。その中で、ASEAN諸国(特に、インドネシア、フィリピン、ミャンマー)の政治経済および関連する域外大国(中国、アメリカ)との関係などに関する分析結果が報告され、討論を通してさらに研究内容を深化させることができた。EUとの比較については、EU研究者を討論者に迎えて「ASEANとEUー理念・制度・主権」をテーマとする公開シンポジウムを開催し、2つの国際組織の類似点や相違点などについて議論した。・論文・図書の出版:「研究発表」の一覧に示したとおり、研究分担者・協力者は合計20点ほどの論文もしくは図書を掲載・出版して研究成果を公表した。学会やシンポジウムでの口頭発表も合わせて16回にのぼった。さらに、次年度に刊行予定の研究書についての編集会議を重ね、年度末には各自が原稿執筆を開始した。3年目(最終年)となる令和元年度には、研究成果の公表を目的とする幾つかの事業を実施する。第1に、本研究の成果をまとめ、学術書として刊行することである。具体的には、5月の月例研究会で各研究分担者・協力者が研究成果をまとめた論文のドラフトを持ち寄って相互に検討・評価した上で、その後の月例研究会で個々の論文内容について検討を加え、それらを踏まえて最終稿の執筆を進める。その上で10月までに『一帯一路時代のASEAN(仮)』(ミネルヴァ書房)と題する研究書を刊行することを目指す。第2に、関連学会での分科会や公開シンポジウムを開催し、研究成果を広く他の研究者や学生と共有し、さらに一般市民に対しても広く公表する。具体的には、6月開催のアジア政経学会春季研究大会(於:慶應義塾大学)で「一帯一路と東南アジア」をテーマとする分科会を主催する。また、年度後半には、EU研究者との共同プロジェクトとして、ASEANとEUの比較をテーマとする公開シンポジウム(一般市民も含めて公開)を開催する。その事前準備として、複数のEU研究者を分野ごとに数回に分けて月例研究会に招聘し、相互に両組織の理解を深めるとともに、比較内容のすり合わせや論点の整理を行う。これらの事業を進める中で、研究者ごとおよび組織として年度末の最終報告書作成に向けた取りまとめ作業を進め、同時に次年度以降のASEAN研究の方向性についても検討していく。さらに、令和元年度には本研究プロジェクトのホームページやFacebookをインターネット上に開設し、蓄積された研究成果を公表する場を広げるとともに、ASEAN関係の有用な資料を紹介もしくはダウンロードできるようなシステムを構築する。それらを通して、関連研究分野の検索や資料収集の環境向上に資するサイトを提供し、本研究プロジェクトの成果を広く一般に公開すると同時に、若手研究者の育成を後押しする。本研究のASEANを1拡大と深化の過程、2地域横断的イシューの展開、3域内各国の政治社会変動分析という観点から「国際・地域・国内」の3次元で捉え直すという目的に沿って、第1年目の平成29年度においては、各担当者が現地調査や文献調査を中心に国別、イシュー別の調査を進めた。また、本研究のもう一つの特徴である「ASEANとEUとの比較」という観点については、その第1歩としてEU研究者を報告者に招聘して研究会を複数回開催し、EUの組織や地域統合のあり方などについて研究分担者・協力者の理解を深める活動を行った。その際、ASEANとEUの両研究分野の相互交流や共同研究を今後進めていくことについても、その体制造りなどを含めて意見交換を行い、具体的な段階へと歩を進める準備を行った。

さらに、本研究の研究成果を逐次社会に公表していくという目的と、研究の新たな展開と蓄積のために他国や他分野の研究者との情報・意見交換を進めるという目的に沿って、国内の公開シンポジウムや学会ならびに他国開催の国際研究集会に研究分担者・協力者を派遣もしくは参加支援を行った。また、各研究分担者・協力者は、本研究のテーマもしくは関連テーマに関する論文および書籍の発表・刊行を積極的に行った。これらを通して、研究成果の公表とフィードバック、新たな研究知見の獲得、国内外での研究人脈の形成といった面でそれぞれに成果を得ることができた。上記のような諸活動を通して、1年目の目標であった本研究の基盤作りを着実に進めることができ、2年目以降のステップアップに向けた準備を整えることができた。・月例研究会の開催:研究分担者・協力者および招聘した外部研究者を報告者として月例研究会を9回開催した。その中で、ASEAN諸国(特に、タイ、ベトナム、東チモール)および関連する域外大国について、さらにEUを専門とする研究者によるEUの地域機構としての組織や統合について分析結果が報告され、それらをめぐって討論がなされた。EUとの比較については、EU研究者を講演者に「EUデモクラシーの危機」、「「EU拡大の国際関係」と題された研究報告会を開き、ASEANとの類似点・相違点などについて議論を交わした。・シンポジウム・学会分科会の開催:平成29年6月3日に一般公開の「ASEAN創設50周年シンポジウム」(拓殖大学)を開催し、研究分担者・協力者10名が、報告者、コメンテーターとして参加した。この内容は雑誌『海外事情』(平成29年10月号)に掲載された。同6月24日には、アジア政経学会春季大会(一橋大学)にて分科会「アジア太平洋秩序とチャイナ・ファクター」を開催し、研究分担者・協力者5名が報告と討論を行った。・論文・図書の出版:「研究発表」の一覧に示したとおり、研究分担者・協力者は合計20点ほどの論文もしくは図書を掲載・出版して研究成果を公表した。本研究の目的は、ASEANを1拡大と深化の過程、2地域横断的イシューの展開、3域内各国の政治社会変動分析という観点から「国際・地域・国内」の3次元で捉え直すことである。2年目の平成30年度においては、本研究の中間的な成果をASEAN地域の研究者との会議や海外での国際シンポジウムの場で発表し、海外の研究者との議論や情報交換を通して新たな知見や情報を集積することにおいて大きな前進があった。特に、12月5日から7日にインドネシア(ジャカルタ)で開催された東南アジア日本研究学会の国際会議「Global Dynamics Impacts to JAPAN-ASEAN Relations」に、研究分担者・協力者10名を派遣して2つの分科会を主催し、ASEAN諸国から参加した多くの研究者や実務家を前にこれまでの研究内容を発表するとともに、それらをめぐって議論する機会を得ることができたのは大きな成果であった。また、本研究のもう一つの特徴である「ASEANとEUとの比較」という観点については、前年度に引き続いてEU研究者を招聘してシンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、EUとASEANの地域統合のあり方、ならびに米中「新冷戦」や国家の内向き化などが両組織に与える影響についてそれぞれの研究成果を持ち寄って比較・検討することにより、双方の研究にフィードバックさせることができた。
細胞競合現象に基づく上咽頭癌発癌機構の解析と新規治療法の開発

癌組織は、少数の癌幹細胞と多数の分化細胞から構成される「癌幹細胞」理論が提唱された。我々は、Epstein-Barrウィルス(EBV)遺伝子を用い、上咽頭癌の癌幹細胞作成に成功した。他方、癌細胞増殖は、周囲の正常細胞との相互作用「細胞競合」により規定されることが報告された。本研究では、「正常細胞」「前癌病変細胞」「癌細胞」「癌幹細胞」を作成し、細胞競合現象を検討した。いずれの共培養でも細胞競合は起こった。上咽頭癌組織・細胞モデルにおいて、細胞競合マーカーのSparc発現低下と、周囲の正常組織でSparcの発現亢進を認めた。これらからSparcは細胞競合に強く関連していることが示唆された。平成24年度には、「正常上咽頭細胞」、「EBV感染前一前癌細胞」、「EBV感染一前癌細胞」、「EBV感染ー細胞」の各段階のモデル細胞を作成を開始した。2010年に同定された上咽頭前癌細胞の候補遺伝子、3pにコードされるMDS-EVI1, 9pにコードされるCDKN2,13pにコードされるTNFRS19をクローニングしこれらの遺伝子をレトロウィルスベクターに導入した。これらのウィルスベクターは、エストロゲン添加によって遺伝子発現が増加する。これらの3遺伝子を「正常上咽頭細胞」NP69およびAdAH、ならびにMDCK細胞に導入し発現させた。また、「EBV感染前ー前癌細胞」モデルにテトラサイクリンによりEBV癌遺伝子と考えられるLMP1, LMP2, EBNA1を発現誘導するウイルスベクターを各々導入し、「EBV感染ー癌細胞」および「EBV感染ー細胞」を作製した。各々のレトロウィルスベクターはPLAT-A細胞に、Fugene6を用いてトランスクフェクション後、トランスフェクション1日目に一度培地を交換、トランスフェクション後3日目に培養液を回収、遠心を行い上清を回収しウィルス保存液として上皮細胞への感染まで-80°Cで保存を行った。NP69, AdAH, MDCK細胞は感染前日に培養皿にまきその24時間後にウィルス保存液を培養液中に添加した。ウィルス感染後24時間で一度培養液を交換し、選択薬剤であるG418, puromycinを培養液に添加した。その後、低濃度で希釈した後に選択薬剤を用いてクローンを選択し、クローニングカップでシングルクローンを採取した。Western blot法およびRT-PCR法にて選択クローンの遺伝子発現を確認した。平成25年度には、平成24年度に作成した「正常上咽頭細胞」、「EBV感染前-前癌細胞」、「EBV感染-前癌細胞」、「EBV感染-癌細胞」の各モデル細胞を用いて、タイムラプス顕微鏡下に実際に細胞競合が起こるか否かを検討した。「正常上咽頭細胞」と「EBV感染-癌細胞」の間において、細胞競合現象においてかなりの頻度で起きていることが判明した。上咽頭細胞であるAdAH細胞、ならびにMDCK細胞を用いて実験を行ったところほぼ同様の実験を再現することができた。ガラスディッシュ上で、上記細胞を混合後24時間共培養後、細胞競合現象が生じている事を顕微鏡下に確認後細胞をパラホルムアルデヒドにて固定後、細胞競合の一つのマーカーであるSparcを蛍光免疫染色を行った。通常はSparc染色されてこない「正常上咽頭細胞」が「EBV感染ー癌細胞」との共培養によって強く染色されることが分かった。また、Sparcによって誘導される関連した下流の分子も染色されてくることが判明した。また、共培養後の細胞を、GFPをマーカーにしてフローサイトメーターで細胞分取しSparcの発現に変化があるかをリアルタイムPCRを用いて検討を行った。今回の検討ではセルソーティングによる細胞ダメージが大きく出てしまったためか、十分な有意差を持ってSparcの発現に有意差は認めなかった。今後はセルソーティング中の細胞ダメージを減らすようにして更に解析を予定している。平成25年度までに、「正常上咽頭細胞」、「EBV感染前-前癌細胞」、「EBV感染-前癌細胞」、「EBV感染-癌細胞」の各段階のモデル細胞を作成しタイムラプス顕微鏡下に細胞競合が起こるかを検討した。また、上咽頭癌病理組織標本における「細胞競合」関連分子の発現解析を行った。当科にて保存されている120例の上咽頭癌原発巣パラフィン包埋病理組織を用いた。Sparcは、ヒト組織において発現検討可能な細胞競合マーカー、すなわち、winnerとloserを規定するマーカーの中で最も解析が進んでいる。このSparc発現は癌の種類によって発現が低下するもの、上昇するものがある。上咽頭癌標本においてSparc発現を解析したところ、EBV陽性例における腫瘍部分でのSparc発現低下と、腫瘍と接する正常組織におけるSparcの著明な発現が認められた。また、上咽頭癌の病因として、EBVは極めて重要であるため、EBVの発現の有無を評価するためIn situ hybridization法を用いて、EBERの陽性率についても同時に検討を行った。EBERはEBVの潜伏感染の標準的な指標であると報告されており、EBVの存在が確認できるマーカーである。上記のEBERの陽性率とSparcの陽性率について病理学的に検討し統計学的に有意か検討した。平成26年度までに作成した「正常上咽頭細胞」、「EBV感染前-前癌細胞」、「EBV感染-癌細胞」の各段階のモデル細胞を用いて、引き続き平成27年度にはタイムラプス顕微鏡下に細胞競合が起こるかを検討した。

また、これらの細胞に種々のサイトカインやシスプラチンをはじめとした抗がん剤を添加し、細胞競合現象がどの程度変化するかを検討した。また、当科にて保存されている120例の上咽頭癌原発巣パラフィン包埋病理組織を用い、上咽頭癌病理組織標本における「細胞競合」関連分子の発現解析を行った。これまでの結果から、Sparcは、ヒト組織において発現検討可能な細胞競合マーカー、すなわち、winnerとloserを規定するマーカーの中で最も解析が進んでいる。このSparc発現は、癌の種類によって発現が低下するものと上昇するものがある。上咽頭癌標本においてはSparc発現を解析したところ、EBV陽性例における腫瘍部分でのSparc発現低下と、腫瘍と接する正常組織におけるSparcの著名な発現が認められた。また、上咽頭癌の病因として、EBVは極めて重要であるため、EBVの発現の有無を評価するため、In situ hybridization法を用いて、EBERの陽性率についても同時に検討を行った。EBERは、EBVの潜伏感染をの標準的な指標であると報告されており、EBVの存在が確認できるマーカーである。上記のEBERの陽性率とSparcの陽性率について病理学的に検討し統計学的に有意か検討を行った。これらに加えて、他の「細胞競合」関連分子の病理学的解析も行った。癌組織は、少数の癌幹細胞と多数の分化細胞から構成される「癌幹細胞」理論が提唱された。我々は、Epstein-Barrウィルス(EBV)遺伝子を用い、上咽頭癌の癌幹細胞作成に成功した。他方、癌細胞増殖は、周囲の正常細胞との相互作用「細胞競合」により規定されることが報告された。本研究では、「正常細胞」「前癌病変細胞」「癌細胞」「癌幹細胞」を作成し、細胞競合現象を検討した。いずれの共培養でも細胞競合は起こった。上咽頭癌組織・細胞モデルにおいて、細胞競合マーカーのSparc発現低下と、周囲の正常組織でSparcの発現亢進を認めた。これらからSparcは細胞競合に強く関連していることが示唆された。樹立細胞によりタイムラプス顕微鏡下における観察をおこなっており、また病理組織学的な検討も計画通り進んでおり、概ね当初の計画通りに研究は進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。耳鼻咽喉科樹立細胞株に抗がん剤やサイトカインなどを添加し、細胞競合現象が変化するかをタイムラプス顕微鏡下に観察する。また、上咽頭癌組織において「細胞競合」関連分子の病理学的解析を行う。本年度は当初予定していたプラスミドおよび細胞株の樹立を行い、おおむね当初の計画通りに研究は進んでいる。本年度は、前年度に樹立した細胞を用いてタイムラプス顕微鏡下における観察まで行うことができ、おおむね当初の計画通りに研究は進んでいる。また、この現象に関連する分子についてある程度同定するまでに至った。樹立した細胞株を用いて、実際の細胞競合現象が起こるかタイムラプス顕微鏡下に観察をする。
畜産廃水浄化のための機能性アノードを用いた電気化学プロセスの構築

畜産施設からの排水処理のために、小規模分散型処理が可能な電気化学的手法による水質浄化法の検討を行った。特に、排出量の多いとされる搾乳施設(ミルキングパーラ)排水を想定し、パーラ排水だけではなく、混入の可能性がある廃棄乳および動物用抗菌剤といった生物難分解成分に対し、金属酸化物アノードを用いた電解酸化法の適用可能性について検討した。廃棄乳に含有する乳脂肪、ラクトース、カゼインの各成分に対して、陽極材料(Ti/PbO_2,DSA)および支持電解質の影響を調べた。ラクトースは全般に分解性が良好であったのに対し、カゼインの分解速度はいずれの電解条件においてもやや低い傾向にあった。糞尿や洗浄剤を含むパーラ排水と比較すると、電気化学的手法は特に廃棄乳の分解に優れていることから、実際の酪農施設においては両者を混合することなく分別回収し、電解酸化処理を行うことが望ましいことが示唆された。動物用抗菌剤については、国内において販売量が多いテトラサイクリン系抗生物質および酪農において頻繁に使用されているセフェム系抗生物質の分解特性について検討した。いずれの抗生物質も電解酸化処理による分解性は良好であった。電気化学反応による抗生物質の分解処理においては、クロマトグラフィによる対象物質の定量分析に加えて、何らかのバイオアッセイを併用し抗菌性の抑止と無害化について評価する必要があると考えられた。本年度は畜産施設からの排水の中で、ミルキングパーラ排水を対象として研究を実施した。特に、生物学的処理が困難であるとされる廃棄乳成分(乳脂肪、ラクトース、カゼイン)および動物用抗菌剤に対し、貴金属アノードを用いた電解酸化法の有効性について検討をいった。廃棄乳については、各成分に対して分解特性を検討した結果、乳脂肪電極表面における酸化剤の吸着特性が異なるアノード材料で比較をした結果、DSAをアノードとして選択した電解酸化法は乳脂肪分の分解性が良好であった。廃棄乳の分解処理に対して電解酸化法を適用する場合、特にラクトースの分解性を改善させることが必要であると考えられた。また、動物用抗菌剤については、国内において販売最が多いテトラサイクリン系抗生物質について検討を行った。Ti/Ir02をアノードとして選択した場合、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリンは優れた分解性を示し、いずれも電極近傍での酸化反応が分解に寄与していることが示唆された。分解過程において中間生成物が観察されたが、数時間の電解後には検出限界以下になった。前述のテトラサイクリン系抗生物質と比較すると、クロルテトラサイクリンの分解性はやや低く、他のアノード材料の検討が必要である。本年度は畜産施設から排出される廃水成分の中で、生物難分解性である廃棄乳および動物用抗菌剤に対し、金属酸化物アノードを用いた電解酸化法の適用可能性について検討を行った。廃棄乳に含有する乳脂肪、ラクトース、カゼインの各成会に対して、陽極材料(Ti/PbO_2, DSA)および支持電解質の影響を調べた。生物難分解性とされる乳脂肪は、Ti/PbO_2をアノードとして使用した場合に分解速度が向上したことから、主として電極表面近傍での反応が効果的であることが判明した。糞尿や洗浄剤を含む搾乳施設排水と比較すると、電解酸化処理は特に廃棄乳の分解に優れていることから、実際の酪農施設においては両者を混合することなく分別回収し、浄化処理を行うことが望ましいと考えられる。動物用抗菌剤については、国内において販売量が多いテトラサイクリン系抗生物質およびセフェム系抗生物質の分解特性について検討した。しかし、活性電極を用いた場合に副生成物が蓄積する傾向が観察され、アノード材料の選択と投入電荷量が重要であることが判明した。
腸神経系が関与する消化管疾患時における薬物吸収挙動の解析

セロトニン(5-HT)は神経伝達物質、消化管ホルモンとして消化管機能制御に関わっており、5-HT代謝異常は過敏性腸症候群などの消化管疾患と関連している。本課題では、有機アニオンの吸収性を左右する小腸管腔中への分泌に及ぼす5-HT枯渇の影響を検討した。モデル薬物phenol red(PR)は、Caco-2細胞、ラット小腸において排出方向優位に輸送され、その輸送にMRP2、BCRPが寄与していることが示された。5-HT枯渇ラット小腸ではPRの分泌が亢進しており、それがMRP2及びBCRPの活性亢進によること、その亢進は、小腸上皮細胞刷子縁膜上のMRP2及びBCRPの発現亢進によることが示唆された。消化管は、中枢神経系とは独立した腸神経系(ENS)により、その運動・機能が制御されている。また、近年では、様々な消化器疾患にENSが関与していることが報告されており、病理学的、薬理学的観点からも、ENSと消化器疾患との関連性の解明が重要視されている。特に、ENSにおける神経伝達物質として、また消化管ホルモンとして消化管の機能制御に深く関わっているセロトニンは、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患では、粘膜中のセロトニン含量が少ないことが、逆にセリアック病やカルチノイド発症時やシスプラチン投与時に見られる消化器障害には粘膜中セロトニン含量が高いことが知られており、セロトニン異常と疾患の関係、更には疾患時の薬物吸収挙動の変化とその機構解明は、薬物治療の観点からも極めて重要となる。本年度は、作製したセロトニン枯渇ラットを用い、有機アニオン性化合物の吸収動態に及ぼすセロトニン枯渇の影響を検討した。実験は、セロトニン枯渇ラットより単離した小腸粘膜を用い、Ussing type chamberにより、モデル化合物phenol red (PR)の吸収性変化を検討することにより行った。その結果、セロトニン枯渇ラットでは、コントロールラットに比べて吸収方向の膜透過が減少し、分泌方向の膜透過に有意な増大が見られた。そこで、阻害剤を用いて、PRの分泌方向の輸送に関与する担体について検討を行った。Mrp2の基質であるプロベニシド、インドメタシン、BCRPの基質であるノボビオシン、ミトキサントロンを阻害剤として用いたところ、いずれもPRの分泌方向の輸送を有意に抑制することが明らかとなった。また、その阻害の程度は、コントロールラットの場合と比較し有意に大きく、これら輸送担体のPR分泌に対する寄与がコントロールに比し、セロトニン枯渇ラットにおいて有意に大きいことが示された。消化管は、中枢神経系と、中枢神経系とは独立した自律神経系である腸神経系(ENS)により、その運動・機能が制御されている。昨年度までに、作製したセロトニン枯渇ラットを用い、有機アニオン性化合物の吸収動態に及ぼすセロトニン枯渇の影響を検討したところ、モデル化合物phenol red (PR)の吸収方向の膜透過が減少し、分泌方向の膜透過に有意な増大が見られることが明らかとなっていた。本年度は、このPRの分泌増大の機構解明を目的として、PRの分泌方向の輸送への関与が示唆されたMrp2とBCRPの小腸上皮細胞の刷子縁膜上の発現量をWestern blot法により定量した。その結果、Mrp2は、セロトニン枯渇ラットにおいて、コントロールラットの23倍の有意に高い発現量を示すことが明らかとなった。一方、BCRPについても同様な傾向が見られ、セロトニン枯渇ラットにおいてコントロールラットの約1.5倍の有意に高い発現が認められた。これらの結果より、セロトニン枯渇ラットにおいて認められたPRの分泌方向輸送の有意な増大には、少なくともMrp2及びBCRPの発現増大が一因として関与しているものと考えられた。近年、様々な消化器疾患に腸神経系(ENS)が関与していることが報告されており、病理学的、薬理学的観点からも、ENSと消化器疾患との関連性の解明が重要視されている。薬物治療の観点からも、疾患時の薬物吸収挙動の変化とその機構解明は極めて重要となる。

本年度は、有機アニオン性化合物に着目し、その吸収性を左右していると考えられる小腸管腔中への分泌特性について評価を進めた。モデル化合物として、難吸収性の有機アニオン性色素phenol red (PR)を用いた。まず、ヒト大腸がん由来のCaco-2細胞を用いて、PRの膜透過の方向性を検討した。算出した見掛けの膜透過係数Pappは、分泌方向が吸収方向の約2.7倍を示し、分泌方向優位な輸送が明らかとなった。次に、この分泌方向優位なPRの輸送を担っている輸送担体について検討するため、種々の基質による阻害実験を行った。Mrp2の基質であるプロベニシド、インドメタシンを共存させたところ、PRのPappをいずれも約40%に有意に低下させることが明らかとなり、PRの分泌方向の輸送にMrp2が関与していることが示唆された。次に、BCRPの基質である、ノボビオシン、ミトキサントロンの影響を検討した。その結果、ノボビオシンはPRの分泌に影響を及ぼさなかったが、ミトキサントロンはPappを約60%にまで、有意に抑制することが明らかとなった。両基質による阻害効果の相違は、BCRPに対する親和性の差が原因であると考えられるが、PRの分泌方向の輸送にBCRPが関与していることが示唆されたと言える。これらの結果は、有機アニオン系薬物の小腸からの吸収に、Mrp2およびBCRPが抑制的に関与していることを示唆しており、有機アニオン系薬物の吸収性の変化を評価する上において、両輸送担体の活性変動を評価することが重要であることが示された。セロトニン枯渇ラットにおいて、有機アニオン系化合物の吸収方向の透過が有意に低下し、それが分泌方向の輸送の亢進によることを見出した。また、分泌方向の輸送亢進が、Mrp2およびBCRPの活性増大によることを明らかにできた。また、セロトニン症候群モデルラットにおいても基礎的な検討に着手した。難吸収性色素phenol red (PR)を有機アニオン性薬物のモデル化合物として、ヒト大腸がん由来のCaco-2細胞を用いて検討を行い、Mrp2及びBCRPを介した分泌が、PRの吸収に対して有意に影響していることを示すことに成功した。また、ラットの単離小腸粘膜を用いた検討においても、これら輸送担体の寄与を示唆するデータが得られており、有機アニオン性薬物の小腸からの吸収に、輸送担体を介した分泌が重要な影響を及ぼす可能性を示すことができた。また、セロトニン枯渇ラットにおける評価にも着手し、一部、結果が得られている。さらには、セロトニン症候群モデルラットの作製にも目処がたっているなど、全体的に、概ね、計画通りに進展している。セロトニン枯渇時における有機アニオン系化合物の経口吸収挙動について、phenol redをモデル化合物として、小腸の膜透過性、消化管内移行性等に焦点をあて検討を進める。また、Mrp2、BCRPのタンパク発現量についても定量的評価を行い、両タンパク質の機能亢進について検討を進める。また、セロトニン症候群モデルラットの作製に成功したので、同モデルラットを用いて、セロトニンレベル亢進時における種々の薬物の経口吸収挙動について、検討を進めていく予定である。近年、様々な消化器疾患に、ENS異常が関連していることが示唆されている。
顎下腺細胞におけるIP^産生の時空間パターンの蛍光分子センサーによる解析

細胞質発現型のIP^バイオセンサーcLIBRAvIIsのアデノウイルスベクターを作製した。ラット顎下腺開口部から逆行性にアデノウイルス粒子を注入し、顎下腺にcLIBRAvIIsの蛍光が発現することを確認した。cLIBRAvIIsを発現した顎下腺から単離腺房細胞を調製し、カルバコール刺激によって蛍光比が有意に上昇することが観察された。Ca^バイオセンサー(YC-Nano 50)を顎下腺に発現させ、[Ca^]_iのin vivoイメージングに成功した。1.作製済みであるLIBRAvIIs(IP_3結合ドメインの両端にECFPとVenus遺伝子を融合)を細胞質発現型に改変するため、LIBRAvIIsの膜結合ドメインを除き、さらにタンパク質精製用Histidin-tagをLIBRAvIIsのcDNAに導入し、細胞質発現型LIBRAvIIs(cLIBRAvIIs)ウイルスベクターを作製した。作製したウイルスベクターをHEK293細胞に感染させ、増殖後、培地中に放出したウイルス粒子を採取した。2.ウイルスベクターをCOS-7細胞に感染させ、細胞からcLIBRAvIIsを抽出後、Talonビーズを用いて精製した。様々な濃度のIP_3を付加し、精製cLIBRAvIIsの蛍光比の変化をマイクロプレートリーダーを使って調べた。IP_3は30nMから30μMの濃度で用量依存的にcLIBRAvIIsの蛍光比を上昇させた。この結果は、精製cLIBRAvIIsがIP_3に対する感受性を保持していることを示している。さらに精製cLIBRAvIIsを単離耳下腺細胞にin vitroで導入し、反応性を確認した。3.麻酔下のラットの開口部からアデノウイルス粒子を注入し、2日後に顎下腺を摘出して蛍光を観察した。ウイルスを注入した顎下腺組織でcLIBRAvIIsの蛍光が観察されたが、舌下腺では観察されなかった。4.単離した顎下腺細胞のcLIBRAvIIs蛍光は主に腺房細胞の細胞質に発現していた。100μMアセチルコリンで刺激し、蛍光比の変化を測定したが、有意な変化は観察できなかった。現在、細胞の調製法、測定法などの改良を試みている。1.細胞質発現型LIBRA(cLIBRAvIIs)のアデノウイルス発現ベクターを精製し、そのウイルス粒子をラット顎下腺の開口部から逆行性に注入した。注入後12日で顎下腺を摘出し、発現したcLIBRAvIIsの蛍光を蛍光実体顕微鏡と共焦点レーザー顕微競で観察した。顎下腺に強い蛍光が観察されたが、舌下線には蛍光発現はみられなかった。2.cLIBRAvIIsを発現した顎下腺の単離腺房細胞を調製し、3CCDイメージング装置を使って蛍光比の変化をモニターした。100μMカルバコールで刺激したところ、蛍光比の有意な上昇が観察された。3.顎下腺開口部から逆行性にStim1-mKO1のウイルスベクターを注入し、顎下腺にStim1-mKO1を発現させた。単離細胞にfura-2を取り込ませ、[Ca^<2+>]、の変化をモニターした。Stim1-mKO1発現細胞ではアゴニスト刺激によるCa^<2+>遊離とCa^<2+>流入が増加した。4.マイクロエレクトロポレーターを使って、精製したcLIBRAvIIsタンパク質の腺房細胞への導入を行った。cLIBRAvIIs蛍光を発現した細胞を100μMカルバコールで刺激すると蛍光比の上昇が観察された。また、βエスチン処理した穿孔細胞を10μM IP_3で刺激したところ同様の蛍光変化が観察された。この結果は、精製したcLIBRAvIIsタンパク質がIP_3プローブとして十分機能することを示している。IP_3バイオセンサー(cLIBRAvlls)のin vivoおよびin vitroによる発現方法を検討してきた。その結果、唾液腺腺房細胞におけるIP_3動態の解析が可能であることが明らかになった。1)IP3蛍光センサーである細胞質発現型LIBRA(cLLBRAvIIS)のin vivo発現実験を前年度に継続して行った。ラット顎下腺開口部からのアデノウイルス粒子を逆行性に注入し、顎下腺に蛍光が発現することを確認した。舌下腺には蛍光の発現は見られなかった。2) cLLBRAvIISを発現した顎下腺の単離細胞を調製し、アゴニスト刺激によるcLLBRAvIISの反応を調べた。ムスカリン受容体刺激による蛍光比の上昇が確認された。3)細胞膜発現型LIBRAおよびER発現型LIBRAのウイルスベクターを作成した。これらのベクターを培養細胞(COS-7)に導入し、LIBRA蛍光の発現を確認した。

4)細胞内Ca2+動態のin vivo測定を行うため、Ca2+蛍光バイオセンサー(YC-Nano50およびG-GECO)のアデノウイルスベクター粒子を顎下腺開口部から注入し、これらのバイオセンサーを顎下腺細胞に発現させることに成功した。5)YC-NanoあるいはG-GECOを顎下腺に発現したラットをウレタンで麻酔し、顎下腺を露出した。アセチルコリンを顎下腺に直接滴下、あるいはベタネコールを腹腔内注射し、CCDカメラを装着した蛍光イメージング装置を使って[Ca2+]iのin vivoイメージングを行った。6)アセチルコリンやベタネコールは顎下腺[Ca2+]iの上昇を起こした。生理的食塩水は無効であった。ムスカリンアゴニストによる[Ca2+]iの上昇はアトロピンで完全に抑制された。本実験によって、顎下腺における[Ca2+]i変化のin vivoイメージング、さらにはCa2+とIP3との同時測光が可能になった。ラット顎下腺腺房細胞へのLIBRAのin vivo発現に成功した。単離腺房細胞を使ったIP_3濃度の測定を行い、ほぼ期待した結果を得た。また、単離腺房細胞へのLIBRAタンパク質の導入にも成功した。しかし、Ca^<2+>との同時測定は未だ満足できる結果は得られていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。細胞質発現型LIBRA(cLIBRAvIIs)は蛍光比の変化率が小さく、[Ca^<2+>]iとの同時測定に用いるには難がある。細胞膜発現型のLIBRA(LIBRAvIIs)を作成し、それを使ってIP_3濃度と[Ca^<2+>]iとの同時測光を試みる。LIBRAを細胞膜に発現させることにより、IP_3濃度のより速い変化を検出することが可能であり、変化率の上昇も期待できる。.24年度が最終年度であるため、記入しない。
生体内代謝イメージング法の確立と代謝改善を介した革新的心不全創薬へ向けた基盤研究

研究代表者らは培養心筋細胞において低酸素刺激によって発現誘導され、酸化的リン酸化を正に調節する因子としてG0s2を同定した。G0s2はin vivoにおいてもATP産生増強を示したことから、本研究課題ではG0s2をターゲットとしたエネルギー代謝改善による創薬開発に向けて、MRIを用いた生体内エネルギー代謝イメージング法の開発と前臨床試験におけるin vivo POC獲得を目的とする。
イギリスロマン主義における文化概念の形成

イギリスロマン主義における文化概念の形成にかかわる問題を、そのイデオロギー的な側面から検討した。今回の研究においては、ロマン主義時代の詩人哲学者であるサミュエル・テイラー・コールリッジの散文作品に焦点を当て、彼が晩年に構想した文化の理論が、当時の政治的な力学によって決定されているものであることをあきらかにした。従来の研究においては、彼の詩学と政治理論は、まったく別個のものとしてあつかわれ、それらの相互の関係は十分な考察の対象にはなってこなかった。しかし、彼の政治的なテクストの修辞的な構造を綿密に分析することによって、彼の政治的な議論のなかで彼の詩的想像力の理論が、政治的な葛藤を和解させる力として介入していることが理解できるのである。政治理論家としてのコールリッジは、当時勃興しつつあった商業と、社会の伝統的な価値観をどう和解させるかという問題に取り組んでいた。この問題は、近代イギリス史における、商工業に基盤を持つ中産階級と大土地所有にその社会的、経済的な基盤をもつ貴族階級とのあいだの階級闘争と深い関係をもっていた。コールリッジは二つの極の対立を和解する詩的な想像力という彼の詩学の根本概念を歴史と社会の問題に援用することによって、現実の政治的な領域では解決不可能な問題をイデオロギー的に解決することを企てたのである。詩学が内包するイデオロギー的含意という視点からコールリッジのテクストを分析することによって、政治と経済の次元と切り離された、詩的な想像力が支配圏をもつ領域として構想されたものが文化の領域であることがあきらかになるのである。
細胞死誘導活性を示すヒト癌抗原分子(RCASI)とそのリガンドの機能解析

ヒト子宮癌特異的モノクローナル抗体(22-1-1)が認識する抗原(RCAS-1)をコードするcDNAをヒト子宮癌細胞株(Siso)のcDNAライブラリーより単離した。単離されたcDNAをもとにしたRCAS-1タンパクの解析により、RCAS1は213個にアミノ酸より成る全く新しいII型膜タンパクであることがわかった。その分子量は約40kDaである。RCAS1は上記のように子宮癌、卵巣癌のみならず大腸癌などの消化器癌あるいは骨髄球系及びリンパ球系白血病細胞株のいくつかにも強い発現が見られる膜タンパクであるが、正常造血系細胞、リンパ球には全く発現されていない。RCAS1-GST融合タンパクを赤芽球系細胞株K562に作用させるとRCAS1がK562細胞表面に結合することを見出し、RCAS1に対する受容体(RCAS1レセプター)の存在を見出した。RCAS1レセプターはヒトリンパ球系細胞にも発現している。RCAS1レセプターの分子量は約25kDaである。興味深いことにRCAS1レセプターは末梢血T細胞、B細胞、あるいはMK細胞の一部にも発現が認められ、さらにIL2刺激を受けたT細胞で強く発現されることがわかった。さらに驚くべきことに、RCAS1レセプター陽性のK562細胞にリコンビナントのRCAS1タンパクを加えると、K562細胞あるいは活性化ヒトリンパ球は強い細胞死に陥ることがわかった。即ち、癌関連抗原であるRCAS1タンパクは、RCAS1レセプターを発現している造血系細胞株あるいは正常細胞に対して細胞死を誘導することがわかった。この細胞死はカスパーゼ活性化によるアポトーシスであることを種々の方法で明らかにした。現在RCAS1レセプターをコードする遺伝子の単離を行っている。本研究は、癌の進展の機構に新しい知見を加えるものであり、RCAS1の活性に立脚した新しいガン治療法の開発につながる。
血液脳関門貫通型TAT蛋白融合インターフェロンβを用いた新規悪性グリオーマ治療法

TAT-PTDとヒト型インターフェロンβ(HuIFN-β)の融合タンパクを作成し、それが血液脳関門を貫通し脳実質内腫瘍細胞に直接到達することにより新規悪性グリオーマの治療法として成立するかどうかを検討した。まず、TAT-PTDならびにHis-tagがHuIFN-βのC末端に付加されるようにRT-PCRを行い、遺伝子配列が一致していることをシークエンスにより確認、それを大腸菌に形質転換させ遺伝子発現、大腸菌の大量培養により発現タンパク質を取得し、それを精製した。13種類の界面活性剤で比べるとSB3-14を持いた可溶化が効率よく、最終的にSB3-14を用いたカラム内リフォールディング、イミダゾールによる溶出を経てSDS-PAGEの結果より可溶化が確認された。すなわちSB3-14を用いたカラム法でのみTAT-PTDとHuIFN-βの融合タンパク(TAT-HuIFN-β)の可溶化が可能であった。コントロールとして、TAT-PTDをHAに融合させたものをラット腹腔内投与した後、その脳組織を免疫染色することにより高濃度でTAT-PTD-HA融合タンパクが脳組織内に移行することを検討し、TAT-PTDは融合タンパクの脳組織内移行手段として確実に有効であることを検証した。つぎにTAT-HuIFN-βの溶解物をラット腹腔内に注射し脳組織内に移行するか否かを検討した。しかしながら、脳組織内には免疫組織学的にあるいは免疫細胞学的に無投与脳とくらべ有意な差をもったHuIFN-βの移行が確認できず、濃度を変えても同様であった。よってTAT-HuIFN-βについては血液脳関門を貫通し脳実質内あるいは脳内腫瘍細胞に直接到達することは困難であり、脳腫瘍治療に応用することは難しいと考えられた。本研究ではTATペプチド融合インターフェロンβを開発し、それが血液脳関門を貫通し脳実質内腫瘍細胞に直接到達することにより新規悪性グリオーマの治療法として成立するかどうかを検討する。すなわち、TAT-PTDならびにHis-tagがHuIFN-βのC末端に付加されるようにRT-PCRを行い、遺伝子配列が一致していることをシークエンスにより確認、それを大腸菌に形質転換させ遺伝子発現させた。大腸菌の大量培養により発現タンパク質を取得し、それを精製した。精製はNi-NTA AgaroseにHisTagたんぱく質を吸着させた後、8M Ureaによる段階的な溶出を行い精製物を得た。まず、透析により標品中のUreaを段階的に除去することにより目的物の可溶化を行ったが不能であった。次に、各種界面活性剤を用いた可溶化を行った。13種類の界面活性剤で比べるとSB3-14を持いた可溶化が効率よく、SB3-14を用いた透析による可溶化を試みたがこれも不能であった。最終的にSB3-14を用いたカラム内でのクロマト可溶化試験を行い、カラム内リフォールディング、イミダゾールによる溶出を経てSDS-PAGEの結果より可溶化が確認された。また、並行した前実験として、TAT-PTDをHAに融合させたものをラット腹腔内投与した後、その脳組織を免疫染色することにより高濃度でTAT-PTD-HA融合タンパクが脳組織内に移行することを検討しTAT-PTDは融合タンパクの脳組織内移行手段として確実に有効であることを検証した。

昨年度に作成したTAT-PTDとヒト型インターフェロンβ(HuIFN-β)の融合タンパクを用いて、それが血液脳関門を貫通し脳実質内腫瘍細胞に直接到達することにより新規悪性グリオーマの治療法として成立するかどうかを本年度に検討した。すなわち、昨年度につづき大腸菌の大量培養により発現タンパク質を取得し、それを精製した。精製はNi-NTA AgaroseにHisTagたんぱく質を吸着させた後、8M Ureaにより段階的に溶出させ、精製物を得た。昨年度につづき各種界面活性剤を用いた可溶化を行った。最終的にSB3-14を用いたカラム内でのクロマト可溶化試験を行い、SB3-14を用いたカラム法でのみTAT-PTDとHuIFN-βの融合タンパク(TAT-HuIFN-β)の可溶化が可能であったことがわかり、TAT-PTDとヒト型インターフェロンβ(HuIFN-β)の融合タンパクの溶解物が作成できた。また、並行した前実験として、TAT-PTDをHAに融合させたものをラット腹腔内投与した後、その脳組織を免疫染色することにより高濃度でTAT-PTD-HA融合タンパクが脳組織内に移行することを検討しTAT-PTDは融合タンパクの脳組織内移行手段として確実に有効であることを検証した。つぎにTAT-PTDとヒト型インターフェロンβ(HuIFN-β)の融合タンパクの溶解物をラット腹腔内に注射し脳組織内に移行するか否かを検討した。しかしながら、脳組織内には免疫組織学的にあるいは免疫細胞学的に無投与脳とくらべ有意な差をもったヒト型インターのフェロンβ(HuIFN-β)移行が確認できず、濃度を変えても同様であった。よってTAT-PTDとヒト型インターフェロンβ(HuIFN-β)融合タンパクについては血液脳関門を貫通し脳実質内あるいは脳内腫瘍細胞に直接到達することは困難であることがわかった。
ナノ粒子曝露により次世代の神経幹細胞に生じる機能障害とマイクロRNA制御異常

本研究では、胎仔期のシリカナノ粒子曝露により神経幹細胞に生じるマイクロRNA発現の変動とそれによって生じる遺伝的・機能的異常について検討を行った。胎仔期にシリカナノ粒子を曝露したマウス(新生仔:1日齢)の神経幹細胞におけるマイクロRNA発現の網羅的解析を行った結果、神経幹細胞において多数のマイクロRNAに発現変動が認められた。そのうち1つのマイクロRNAについて標的遺伝子を検討した結果、神経系の発生・発達や機能の獲得に関与する遺伝子の制御に関与すると考えられた。以上より、シリカナノ粒子胎仔期曝露による神経系への影響に、神経幹細胞におけるマイクロRNA発現制御異常が関与すると考えられた。我々は、胎仔期のディーゼル排ガス(DE)曝露により、仔の学習記憶能力の低下など脳神経系機能障害が生じること、DE中に含まれる粒子状物質(特に粒径100 nm以下のナノ粒子)がこれらの障害の発症に関与することを明らかにしてきた。マイクロRNA(miRNA)は、様々な生命機能の発現のみならず胎仔の成長過程における発生・分化に重要な役割を果たす。したがって、胎仔期におけるナノ粒子の曝露によってmiRNA発現に異常が生じ、脳神経系の発達に影響が及ぶ可能性が高い。本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、ナノ粒子によりもたらされるmiRNA発現の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連を明らかにするとともに、脳機能障害との関連を明らかにすることを目的としている。妊娠マウスにシリカナノ粒子を曝露した後、新生仔(1日齢)から脳を採取し、神経幹細胞培養用の培地を用いて培養を行った。これまでに同様の方法で解析に十分な純度の神経幹細胞が得られている。なお、この際、新生仔の体重や性比については有意な差はないと考えられた。得られた神経幹細胞からゲノムDNAおよびmRNA、miRNAを含むtotal RNAを抽出・精製した。ゲノムDNAを用いてY染色体上のSRY遺伝子に対するPCRを行うことで、得られた神経幹細胞の雌雄を判定した。雄性産仔について、各個体から当量ずつmRNAを混和した後、精製を行った。このサンプルを用いてマイクロアレイ解析によるmiRNAの網羅的な解析を行う予定である。現在までに、シリカナノ粒子の胎仔期曝露および新生仔からの神経幹細胞の単離・培養を行い、解析用のゲノムDNA、Total RNA(miRNAを含む)を得ることができた。新生仔の雌雄別に解析を行うため、各個体から別々に神経幹細胞を単離・培養を行い、サンプルを得ている。このため、神経幹細胞の単離・培養およびサンプルの回収に予想以上の時間を要し、新生仔の性別の判定が終了し、miRNAの網羅的発現解析の準備が完了した段階である。以上より、当初の研究計画から若干の遅れはあるものの、研究の遂行に必要な実験系は十分に確立されているため、早急にmiRNA網羅的発現解析を行い、その結果がまとまり次第、計画どおりに研究を遂行できる状態である。研究はおおむね順調に進展していると考える。本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、ナノ粒子曝露によりもたらされるマイクロRNA(miRNA)発現の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連を明らかにするとともに、脳機能障害との関連を明らかにすることを目的としている。平成27年度に、妊娠マウスにシリカナノ粒子を曝露した後、新生仔(1日齢)から脳を採取し、神経幹細胞を単離した。平成28年度は雄性産仔および雌性産仔の各々について、各個体から当量ずつtotal RNAを混和した後、精製を行い、miRNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、雄性産仔由来の神経幹細胞では27のmiRNAが1.5倍以上の発現上昇を示し、60のmiRNAが0.67倍以下に発現低下を示していた。一方、雌性産仔由来の神経幹細胞では、1個のmiRNAが1.5倍以上の発現上昇を示し、303のmiRNAが0.67倍以下に発現低下を示していた。これらの発現変動が見られたmiRNAのうち、雄性産仔、雌性産仔のいずれにおいても2倍以上の発現低下を示すmiRNAが1つ見いだされた。このmiRNAの標的となるmRNAについてin silico解析を行った。3種類の異なる解析ツールを用いて解析を行い、全ての解析ツールに共通する標的候補mRNAを探索したところ、167のmRNAが標的候補として見いだされた。現在、これらの標的候補mRNAが担う機能の解析を進めており、miRNAの発現変動が神経幹細胞の機能に及ぼす影響について検討を行う予定である。現在までに、シリカナノ粒子の胎仔期曝露および新生仔からの神経幹細胞の単離・培養を行い、これらの細胞から得られたtotal RNAを用いてmiRNAマイクロアレイ解析を行った。雄性産仔由来の神経幹細胞、雌性産仔由来の神経幹細胞のいずれについても発現変動するmiRNAが多数見いだされ、特に1つのmiRNAについては雄性産仔、雌性産仔のいずれにおいても2倍以上の発現変動が認められ、シリカナノ粒子の胎仔期曝露による健康影響に関与することが予想される。現在、このmiRNAの発現変動が神経幹細胞の機能に及ぼす影響について解析を進めている。以上より、当初の研究計画から若干の遅れはあるものの、当初の計画にしたがって進行しており、おおむね順調に進展していると考える。

本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、ナノ粒子曝露によりもたらされるマイクロRNA(miRNA)発現の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連を明らかにするとともに、脳機能障害との関連を明らかにすることを目的としている。平成28年度までに、妊娠マウスにシリカナノ粒子を曝露した後、新生仔(1日齢)から神経幹細胞を単離し、得られた神経幹細胞からゲノムDNAおよびmRNA、miRNAを含むtotal RNAを抽出・精製してmiRNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、雄性産仔、雌性産仔のいずれにおいても2倍以上の発現低下を示すmiRNAが1つ見いだされた。このmiRNAの標的となるmRNAについてin silico解析を行った。3種類の異なる解析ツールを用いて解析を行い、全ての解析ツールに共通する標的候補mRNAを探索したところ、167のmRNAが標的候補として見いだされた。これらの標的候補mRNAが担う機能についてバイオインフォマティクスによる解析を行った。その結果、locomotory behavior、memoryといった脳神経機能やpostsynaptic density、nervous system developmentなどの脳神経系の発生・発達に関する機能が優位に検出された。このことから、胎仔期のシリカナノ粒子曝露により、胎仔の神経幹細胞の分化能に異常が生じ、各種神経系細胞の機能獲得に影響が生じることが推測された。今後、このmiRNAの発現変動が実際に神経幹細胞の分化や分化過程における機能獲得に影響を及ぼすか検討を行う必要がある。本研究では、胎仔期のシリカナノ粒子曝露により神経幹細胞に生じるマイクロRNA発現の変動とそれによって生じる遺伝的・機能的異常について検討を行った。胎仔期にシリカナノ粒子を曝露したマウス(新生仔:1日齢)の神経幹細胞におけるマイクロRNA発現の網羅的解析を行った結果、神経幹細胞において多数のマイクロRNAに発現変動が認められた。そのうち1つのマイクロRNAについて標的遺伝子を検討した結果、神経系の発生・発達や機能の獲得に関与する遺伝子の制御に関与すると考えられた。以上より、シリカナノ粒子胎仔期曝露による神経系への影響に、神経幹細胞におけるマイクロRNA発現制御異常が関与すると考えられた。得られた神経幹細胞について、miRNA発現レベルを網羅的に解析し、発現変動が認められたmiRNAについては、バイオインフォマティクスを用いたin silico解析手法を用いて標的候補遺伝子の探索を行う。見いだされたマイクロRNAの標的候補遺伝子について、RT-PCRおよびウェスタンブロット法によりmRNAレベル、タンパク質レベルでの発現量の変化を調べ、マイクロRNA発現変動との関連を検討する。神経幹細胞のマイクロRNA発現に大きな変化が認められない場合は、神経幹細胞に分化誘導を行った後の各種神経系細胞に注目し、そのマイクロRNA発現への影響を検討し、細胞の性状との関連を調べる。また、神経幹細胞について、ナノ粒子曝露が増殖能・分化能に及ぼす影響を検討する。神経幹細胞は、血清・分化誘導剤等を培地に添加することで種々の神経系細胞に分化を誘導することが可能である。
屋久島生物圏保護区の動態と管理に関する研究

〔経済〕島の経済が国有林経営に依存してきた過去からの脱却のため、多様な林産品の生産、共用林の活用などが試みられているが保護区が広がるにつれ、開発可能な場所が狹まるため、収入が減少する実体が明らかにされた。〔砂防〕小集水域に於いて土壌滞畄時間を推定すると、小揚子川流域で1000年、白谷川流域で1500年で、森林は平均的にどんなに長くても1500年周期で強制更新している事実が分った。土壌の流亡については結果がまだまとめっていない。〔植生〕伐採後の植生が非伐採地にどれだけ侵入するかを計ってみると、凡そ20mで、従来保護樹帯の幅が20mしか残されてこなかったのは狹すぎる。また狹い樹帯では林冠木、下生えの樹木ともに乾燥風の侵入によって枯死する例が多く観察された。森林の林冠欠所による更新速度は低い標高のイスノキ林で100年程度、スギ林では300年位であることが分り、年間気温の低い方が更新に長い時間を要することが推察された。〔ヤクタネゴヨウ〕絶滅に瀕しているといわれるヤクタネゴヨウの種子は発芽力のない粃が多く、充実種子でも発芽しない。一方、発芽し生長するような生息地がなく、遺伝学及び生態学的に問題があることが判明した。〔大型動物〕開発がすゝむにつれ森林に接している部分でシカとサルの加害が目立ち始め、現在有害鳥獣駆除による捕獲が進行している。サルについては総個体数が凡そ3000とされ、毎年1割程度の自然増に見合う駆除で均衡がとれていたが昨年は500頭がとられ、個体数が減少傾向にある。シカは個体数の推定すら行なわれておらず、現在生息域、生活行動、駆除数など基礎データを集めている。猿害の防止法についても考案中である。〔鳥類〕鳥類のセンサスは一応終了し、隔離された屋久島におけるカラ類の生活空間の拡大現象と多様性とを結びつけて一般原則を見出そうと試みている。来年度は補足調査と管理法の提言についてまとめたい。
野生ニホンザルとチンパンジーの瞬目に見る毛づくろいにおける戦術的欺きとその進化

野生ニホンザル及び野生チンパンジーの毛づくろい時に見られる優位個体へのアピール行動について調査する。具体的には、毛づくろい中の個体の瞬きの頻度と単位時間当たりの作業量を調べる。それによって、優位個体に対して特に集中して毛づくろいするわけではないものの、体毛をかき分ける頻度を高くすることで、自分の熱心さを相手にアピールし、優位個体から得られる利益である敵対的交渉時の支援などを引き出す戦術を用いているのか検証する。