hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様体の構造とホモロジー代数

研究は多方面にわたっているので,項目別に整理する.第1のグループで多様対の代数的,位相的研究(佐久間,吉田,岩上,加藤)を行い次の結果をえた.(1)準ピタゴラス体の付値を研究し,次数付ヴイツト環がk-群と同型になる為の條件を与えた(岩上)(2)n次元多様体Mを境界とするn+1次元多様体が存在する為の條件をMのWi-数を用いて表わし,普遍Wu-類についても研究(吉田)(3)イデアルの整閉包についてのアルチンーリース型の定理について研究(佐久間)(4)ウイツト=一連続体についての研究(加藤).第2の多様体の微分構造の研究のグループ(田代,板野,水本ほか)では(1)ファイバーをもつリーマン空間の概複数,概接触構造の研究(田代)(2)複素射影空間のユークリッド空間への局所等長埋込み可能な次元の評価式の改良(阿賀岡)(3)非可換ニュートリック程について(板野)(4)グリーンポテンシャルの境界地について(水田)(4)リーマン面上の詞和微分の有限要素近似について(水本)などについて研究を行った.第3のグループでは形式体系の基礎理論についての研究を行っている(久保,小野ほか)このグループでは, (1)論理の補間定理とロビンソン性の関係について,ピアノの自然数論の部分体系における反射原理について(小野)(2)ガウス型,ポアソン型の白色雑音についての計算(久保)などの研究を行っている.何れのグループについてのものも詳細は各論文について参照されることを希望する.その他幾つかのものについては,発表準備中のものもあることを附記する.研究は多方面にわたっているので,項目別に整理する.第1のグループで多様対の代数的,位相的研究(佐久間,吉田,岩上,加藤)を行い次の結果をえた.(1)準ピタゴラス体の付値を研究し,次数付ヴイツト環がk-群と同型になる為の條件を与えた(岩上)(2)n次元多様体Mを境界とするn+1次元多様体が存在する為の條件をMのWi-数を用いて表わし,普遍Wu-類についても研究(吉田)(3)イデアルの整閉包についてのアルチンーリース型の定理について研究(佐久間)(4)ウイツト=一連続体についての研究(加藤).第2の多様体の微分構造の研究のグループ(田代,板野,水本ほか)では(1)ファイバーをもつリーマン空間の概複数,概接触構造の研究(田代)(2)複素射影空間のユークリッド空間への局所等長埋込み可能な次元の評価式の改良(阿賀岡)(3)非可換ニュートリック程について(板野)(4)グリーンポテンシャルの境界地について(水田)(4)リーマン面上の詞和微分の有限要素近似について(水本)などについて研究を行った.第3のグループでは形式体系の基礎理論についての研究を行っている(久保,小野ほか)このグループでは, (1)論理の補間定理とロビンソン性の関係について,ピアノの自然数論の部分体系における反射原理について(小野)(2)ガウス型,ポアソン型の白色雑音についての計算(久保)などの研究を行っている.何れのグループについてのものも詳細は各論文について参照されることを希望する.その他幾つかのものについては,発表準備中のものもあることを附記する.
全部床義歯装着者用咀嚼機能評価システムの確立

咬合・咀嚼機能に関与する患者側の因子の一つである神経筋制御能力の客観的評価法を確立するために,まず,下顎運動の巧緻性についての検討を行った.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,2Hzの音刺激に対して可及的に同調した下顎タッピング運動を行わせ,下顎運動軌跡と咀嚼筋筋電図を記録し,下顎運動の巧緻性を評価するためのパラメータを検索した.その結果,下顎運動周期時間と側頭筋筋活動周期時間の被験者間におけるバラツキが著しく小さいこと,第1ストロークから第10ストロークまでの周期時間のストロークごとによる変動は小さいことが判明した.さらに.50μmの垂直的咬合干渉を付与した実験用クラウンを装着した被験者の測定結果と正常有歯顎者のそれらとを比較したところ,下顎運動周期時間のバラツキが下顎運動制御能力の評価の一助となり得ることが示唆された.次に,下顎運動機能,舌運動機能と咀嚼機能との関連について検討した.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,習慣性咀嚼側における3gのピーナッツ咀嚼時の下顎運動軌跡,舌運動軌跡および咀嚼効率を測定・記録した.記録に際し,被験者には全部床義歯の舌側床翼を想定した実験床を製作し,本装置の装着前,装着直後,1,3,6,12,24.48時間後の8時点での記録を行った.その結果,実験床装着早期の咀嚼効率は顕著に低下し,実験床の装着時間の経過とともに速やかに回復することを確認した.また,舌の上下的,左右的運動量も咀嚼効率と同様の経時的な推移を辿った.しかし,下顎の上下的,左右的,前後的運動量は咀嚼効率,舌運動ほどの顕著な変化を示さなかった.以上の結果から,良好な咀嚼機能を営むためには,舌運動と下顎運動の協調性が必要であること,また,客観的咀嚼機能評価法の一つとして,上下的舌運動距離の咀嚼ストロークの進行に伴う変化を表示するパラメータが有効であることが示唆された.咬合・咀嚼機能に関与する患者側の因子の一つである神経筋制御能力の客観的評価法を確立するために,まず,下顎運動の巧緻性についての検討を行った.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,2Hzの音刺激に対して可及的に同調した下顎タッピング運動を行わせ,下顎運動軌跡と咀嚼筋筋電図を記録し,下顎運動の巧緻性を評価するためのパラメータを検索した.その結果,下顎運動周期時間と側頭筋筋活動周期時間の被験者間におけるバラツキが著しく小さいこと,第1ストロークから第10ストロークまでの周期時間のストロークごとによる変動は小さいことが判明した.さらに.50μmの垂直的咬合干渉を付与した実験用クラウンを装着した被験者の測定結果と正常有歯顎者のそれらとを比較したところ,下顎運動周期時間のバラツキが下顎運動制御能力の評価の一助となり得ることが示唆された.次に,下顎運動機能,舌運動機能と咀嚼機能との関連について検討した.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,習慣性咀嚼側における3gのピーナッツ咀嚼時の下顎運動軌跡,舌運動軌跡および咀嚼効率を測定・記録した.記録に際し,被験者には全部床義歯の舌側床翼を想定した実験床を製作し,本装置の装着前,装着直後,1,3,6,12,24.48時間後の8時点での記録を行った.その結果,実験床装着早期の咀嚼効率は顕著に低下し,実験床の装着時間の経過とともに速やかに回復することを確認した.また,舌の上下的,左右的運動量も咀嚼効率と同様の経時的な推移を辿った.しかし,下顎の上下的,左右的,前後的運動量は咀嚼効率,舌運動ほどの顕著な変化を示さなかった.以上の結果から,良好な咀嚼機能を営むためには,舌運動と下顎運動の協調性が必要であること,また,客観的咀嚼機能評価法の一つとして,上下的舌運動距離の咀嚼ストロークの進行に伴う変化を表示するパラメータが有効であることが示唆された.顎口腔系の健全性と正常な機能の維持が高齢者のQOLを確保するための基本的因子であることの報告が多くなされており,咬合・咀嚼機能の維持が重要視されている.さらに,確実なインフォームド・コンセントの必要性が強調されており,咬合治療や義歯補綴治療を行う場合においても,その効果と限界を患者に対して十分に説明する義務が生じている.

このためには,咬合・咀嚼機能を客観的に評価し得る方法と基準の確立が不可欠でり,顎口腔系を歯(顎粘膜),筋,顎関節,中枢神経系(大脳皮質,脳幹など)からなる「機能的咬合(咀嚼)系」として捉らえなければならない.本研究においては,咀嚼機能に関与する生物学的因子の一つである患者自身の有する神経筋制御能力の客観的評価法を確立するために,顎口腔系に自覚的および他覚的な異常の認められない正常有歯顎者を被験者として,ファンクションジェネレータにより2Hzに規制した音刺激に対して可及的に同調した下顎タッピング運動を行わせ,三次元的な下顎運動軌跡と咀嚼筋筋電図を記録し,下顎運動の巧緻性を評価するために有効なパラメータについて検討した.本研究結果から,正常者においては下顎運動周期時間と側頭筋筋活動周期時間の被験者間のバラツキが著しく小さいこと,第1ストロークから第10ストロークまでの周期時間ストロークごとによる変動は小さいことが判明した.さらに,50μmの垂直的咬合干渉を付与した実験用クラウンを装着した患者の咬合接触状態を厚さが25μmの咬合紙とデンタルプレスケールを用いた一般的な咬合診査法と,今回の下顎運動軌跡と咀嚼筋筋電図によるそれとを比較したところ,本法の臨床的有用性が示唆された.また,本法が下顎運動制御能の評価の一助となり得ることが示唆された.顎口腔系の健全性と正常な機能の維持が高齢者のQOLを確保するための基本的因子であることの報告が多くなされており,咬合・咀嚼機能の維持が重要視されている.さらに,確実なインフォームド・コンセントの必要性が強調されており,咬合治療や義歯補綴治療を行う場合においても,その効果と限界を患者に対して十分に説明する義務が生じている.このためには,咬合・咀嚼機能を客観的に評価し得る方法と基準の確立が不可欠でり,顎口腔系を歯(顎粘膜),筋,顎関節,中枢神経系(大脳皮質,脳幹など)からなる「機能的咬合(咀嚼)系」として捉らえなければならない.本研究においては,咀嚼機能に関与する生物学的因子の一つである患者自身の有する神経筋制御能力の客観的評価法を確立するために,顎口腔系に自覚的および他覚的な異常の認められない正常有歯顎者を被験者として,習慣性咀嚼側における3gのピ-ナッツ咀嚼を行わせ,三次元的な下顎運動軌跡,二次元的な舌運動軌跡および篩分法による咀嚼効率を測定・記録した.なお,記録に際し,被験者には全部床義歯の舌側末翼を想定した実験床を製作し,本装置の装着前,装着直後,1,3,6,12,24,48時間後における8時点での記録を,デンタルプレスケールによる最大咬合力および咬合接触面積の測定と併せて行った.本研究結果から,正常者においては実験床装着により咀嚼効率は顕著に低下し,実験床の装着時間の経過とともに速やかな回復が認められた.舌運動の上下的,左右的移動量も咀嚼効率同様の経時的な推移を辿ったが,下顎運動の上下的,左右的,前後的移動量は減少するものの,咀嚼効率,舌運動ほど顕著な変化ではなかった.これらの結果および平成8年度の結果から,舌運動能力は咀嚼効率に大きく影響し,下顎運動能力は咬合の安定に大きく影響することが示唆された.咬合・咀嚼機能に関与する患者側の因子の一つである神経筋制御能力の客観的評価法を確立するために,まず,下顎運動の巧緻性についての検討を行った.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,2Hzの音刺激に対して可及的に同調した下顎タッピング運動を行わせ,下顎運動軌跡と咀嚼筋筋電図を記録し,下顎運動の巧緻性を評価するためのパラメータを検索した.その結果,下顎運動周期時間と側頭筋筋活動周期時間の被験者間におけるバラツキが著しく小さいこと,第1ストロークから第10ストロークまでの周期時間のストロークごとによる変動は小さいことが判明した.さらに,50μmの垂直的咬合干渉を付与した実験用クラウンを装着した被験者の測定結果と正常有歯顎者のそれらとを比較したところ,下顎運動周期時間のバラツキが下顎運動制御能力の評価の一助となり得ることが示唆された.次に,下顎運動機能,舌運動機能と咀嚼機能との関連について検討した.すなわち,正常有歯顎者を被験者として,習慣性咀嚼側における3gのピーナッツ咀嚼時の下顎運動軌跡,舌運動軌跡および咀嚼効率を測定・記録した.記録に際し,被験者には全部床義歯の舌側床翼を想定した実験床を製作し,本装置の装着前,装着直後,1,3,6,12,24,48時間後の8時点での記録を行った.

その結果,実験床装着早期の咀嚼効率は顕著に低下し,実験床の装着時間の経過とともに速やかに回復することを確認した.また,舌の上下的,左右的運動量も咀嚼効率と同様の経時的な推移を辿った.しかし,下顎の上下的,左右的,前後的運動量は咀嚼効率,舌運動ほどの顕著な変化を示さなかった.以上の結果から,良好な咀嚼機能を営むためには,舌運動と下顎運動の協調性が必要であること,また,客観的咀嚼機能評価法の一つとして,上下的舌運動距離の咀嚼ストロークの進行に伴う変化を表示するパラメータが有効であることが示唆された.
異種-脱細胞化組織骨格の再細胞化による、再生気管、再生肺の移植研究

下記の研究成果を国内外で報告し、一部を論文化した。I)ラット再生肺は移植後数時間でその機能を廃絶してしまい、その原因として、血管の未熟さが考えられている。ラット脱細胞化肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させ、より成熟した血管網を持つ肺を作成した。ラット脱細胞化肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させたところ、脂肪由来幹細胞は、生着後周皮細胞への分化を示した。またその再生肺をラットに同所移植したところ、移植後の肺胞内出血は減少した。また、脂肪由来幹細胞群では、内皮細胞のみで再細胞化した群に比べ、培養16日目での内皮細胞の減少は優位に軽減していた(Doi e al. Scientific Rep. 2017)。II)一般に動物が持つマトリックス内糖蛋白のα-galは、ヒトへの移植後に免疫反応を引き起こすことが知られている。このα-galの脱細胞化組織での減少、およびヒト細胞による再細胞化によってα-galがさらに減少するかを確認した。ラット脱細胞化組織骨格内では、ECMを構成するGAGはほぼ消失するが、再細胞化によって増加し、特に脂肪由来幹細胞を投与した群で増加した。Western blotによる肺内糖鎖抗原α-gal抗原は脱細胞化によって著明に減少し、ブタ脱細胞化組織骨格内では明らかに残存していた(論文投稿中)。III)異種組織骨格-気管移植;ブタから採取した異種脱細胞化組織骨格をラットの自己間葉系幹細胞で再細胞化し、ラットへ気管移植し、その免疫反応を解析した。ブタ脱細胞気管支骨格自体の免疫反応は、脱細胞を行っていないブタ気管支にくらべ、肉眼的に有意に免疫反応は少なかった。また脂肪由来幹細胞投与群において、CD8陽性T細胞が減少し、免疫抑制系に作用するCD163陽性M2マクロファージが増加していた(論文作成中)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。家畜豚の両肺を全身麻酔下に摘出し、脱細胞化した。また、F344ラットから皮下脂肪組織を採取し、脂肪由来幹細胞を抽出、培養した。7mmの気管支リング状に切離した豚脱細胞気管支上に脂肪幹細胞を1週間培養した後、F344ラットに気管移植した。ラットは平均20日、生存した。死亡したラットの病理を確認したところ、移植気管周囲に炎症細胞浸潤、特にリンパ球浸潤を認め、脱細胞化し、脂肪幹細胞で再細胞化した気管でも強い拒絶状態で、脱細胞化マトリックスに対し免疫反応が起こることが確認された。対策として、脂肪由来幹細胞をフィブロネクチン、TNIIIAとという接着因子下で気管支により接着させること、免疫抑制剤を使用することを考えている。現在、豚気管支に同接着因子で脂肪幹細胞を接着させる、基礎研究を行っている。異種組織骨格-気管移植については、手技も安定し、移植後20日程度の予後が認められるが、接着している脂肪肝細胞が少ないため、これを改善する改善策を試している段階である。また、ブタ気管支に接着しない場合は、ラット気管支に戻って接着実験を行う必要がある。異種組織骨格-肺移植については、細胞数に関わる研究に取り掛かっている所である。脱細胞化、再細胞化の技術を使った再生臓器は、心臓、肝臓、肺等で、一時的に機能を持つことが証明され、将来の移植医療への応用が期待されている。この研究の最終目的は、異種の臓器を使ってヒト臓器を創出することであるが、異種の組織骨格を利用した移植研究はなされておらず、生着するか否かも全く分かっていない。本研究は、1)異種の肺、気管脱細胞化骨格の再細胞化、及び移植技術を確立することを主目的とする。そのため、同種の組織骨格の結果と比較検討する。また、2)気管に関しては、異種の組織骨格と自己の細胞を使用した再生気管の、臨床応用への可能性を探ることを目的とする。そのために、基礎研究として、I)脂肪幹細胞による血管内皮再細胞化肺の成熟、II)組織マトリックス内の糖蛋白α-galの脱細胞化による影響を測定した。また、本研究としてI)異種組織骨格-肺移植(ドナー肺の脱細胞化とレシピエント細胞による再細胞化)、II)異種組織骨格-気管移植(ドナー気管の脱細胞化とレシピエント細胞による再細胞化)を行った。結果として、基礎的研究では、ラット肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させたところ、脂肪由来幹細胞は、生着後周皮細胞への分化を示し、移植後の肺胞内出血は減少した。また、脂肪由来幹細胞群では、内皮細胞のみで再細胞化した群に比べ、培養16日目での内皮細胞の減少は優位に軽減していた。ラット脱細胞化組織骨格内では、α-galは著明に減少していたが、ブタ脱細胞化組織骨格内では明らかに残存していた。本研究では、モルモット脱細胞化組織骨格をラットの肺上皮細胞で再細胞化し、ラットへ同所性肺移植を行った。免疫抑制下にラットは生存し、組織を採取して検討中である。またブタ脱細胞化気管支組織骨格をラットの同系間葉系幹細胞で再細胞化し、ラットへ気管移植。ラット脱細胞化気管組織骨格との比較検討を行っている異種器官を移植する場合、組織のサイズや位置のずれによって、移植手技が難しい。

脱細胞化、再細胞化の技術を使った再生臓器は、心臓、肝臓、肺等で、一時的に機能を持つことが証明され、将来の移植医療への応用が期待されている。この研究の最終目的は、異種の臓器を使ってヒト臓器を創出することであるが、異種の組織骨格を利用した移植研究はなされておらず、生着するか否かも全く分かっていない。本研究は、1)異種の肺、気管脱細胞化骨格の再細胞化、及び移植技術を確立することを主目的とする。基礎研究として、I)脂肪幹細胞による血管内皮再細胞化肺の成熟、II)組織マトリックス内の糖蛋白α-galの脱細胞化による影響を測定した。また、本研究としてI)異種組織骨格-肺移植(ドナー肺の脱細胞化とレシピエント細胞による再細胞化)、II)異種組織骨格-気管移植(ドナー気管の脱細胞化とレシピエント細胞による再細胞化)を行った。結果として、基礎的研究では、I)ラット肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させたところ、脂肪由来幹細胞は、生着後周皮細胞への分化を示し、移植後の肺胞内出血は減少した。また、脂肪由来幹細胞群では、内皮細胞のみで再細胞化した群に比べ、培養16日目での内皮細胞の減少は優位に軽減していた。II)ラット脱細胞化組織骨格内では、α-galは免疫染色でほぼ消失し、組織内GAGは、脱細胞肺群で有意に減少したが、ヒト脂肪由来幹細胞で再細胞化した群で組織内GAGは再増加し、ラットECMがヒトECMに置き換わっていることが示唆された。本研究では、I)モルモット脱細胞化組織骨格をラットの肺上皮細胞で再細胞化し、ラットへ同所性肺移植を行った。免疫抑制下にラットは生存し、組織を採取して検討中である。II)ブタ脱細胞化気管組織骨格の移植は、組織内に炎症反応を引き起こしたが、ラット脂肪由来幹細胞を静脈内注射したところ、免疫抑制効果によって炎症反応は抑制され、組織内への生着を促した。再生肺の移植に関して、モルモット脱細胞化肺をラットに移植する場合、肺の構造に違いがあるため、手技が高度になるため。下記の研究成果を国内外で報告し、一部を論文化した。I)ラット再生肺は移植後数時間でその機能を廃絶してしまい、その原因として、血管の未熟さが考えられている。ラット脱細胞化肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させ、より成熟した血管網を持つ肺を作成した。ラット脱細胞化肺に脂肪由来幹細胞と血管内皮細胞を生着させたところ、脂肪由来幹細胞は、生着後周皮細胞への分化を示した。またその再生肺をラットに同所移植したところ、移植後の肺胞内出血は減少した。また、脂肪由来幹細胞群では、内皮細胞のみで再細胞化した群に比べ、培養16日目での内皮細胞の減少は優位に軽減していた(Doi e al. Scientific Rep. 2017)。II)一般に動物が持つマトリックス内糖蛋白のα-galは、ヒトへの移植後に免疫反応を引き起こすことが知られている。このα-galの脱細胞化組織での減少、およびヒト細胞による再細胞化によってα-galがさらに減少するかを確認した。ラット脱細胞化組織骨格内では、ECMを構成するGAGはほぼ消失するが、再細胞化によって増加し、特に脂肪由来幹細胞を投与した群で増加した。Western blotによる肺内糖鎖抗原α-gal抗原は脱細胞化によって著明に減少し、ブタ脱細胞化組織骨格内では明らかに残存していた(論文投稿中)。
浸透圧負荷に対する血管内皮細胞の応答のバイオメカニクス

本研究では,高張液・低張液による浸透圧負荷が,血管内皮細胞のF-アクチン/ストレスファイバー構造および力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。1)低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンに及ぼす影響:ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を培地中で24時間静置培養した後に,前年度に作製した平行平板型流れ負荷装置を用いて,この細胞に等張液,高張液,または低張液によって4時間の流れ負荷(せん断応力= 2 Pa)を作用させた。その後, F-アクチンを蛍光染色してその状態を共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ,高張液を作用させた場合には等張液の場合と同様にほとんどの細胞に明瞭なストレスファイバーが観察されたが,低張液を作用させた場合にはストレスファイバーが減少している細胞がみられた。2)低張液が培養内皮細胞の力学的特性に及ぼす影響: HUVECsを培地中で24時間静置培養した後に,平行平板型流れ負荷装置を用いて,この細胞に等張液または低張液によって4時間の流れ負荷(せん断応力= 2 Pa)を作用させた。その後,トリプシン処理で剥がした細胞のマイクロピペット吸引試験を行った。しかし,流れを作用させた部分のみからの細胞の回収が難しく,さらに細胞数が少ないため試験チャンバー内で状態の良い細胞を見つけるのに時間を要し,流れ負荷終了から力学試験開始までに30分程度経過してしまった。そのため,現段階で得ているデータには信頼性がないものと考えている。当初の計画では,細胞のF-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子を導入してライブイメージングを行う予定であったが, F-アクチンを経時的に観察するのに適切な蛍光強度を得るための遺伝子導入条件はまだ確立できていない。エレクトロポレーション法とリポフェクション法を試しているが,使用しているDsRed-monomerアクチンベクターをHUVECに導入する条件はかなりシビアなようである。また,流れ負荷終了からマイクロピペット吸引試験開始までに30分程度要しているため,この時間を大幅に短縮して一連の手順を確立する必要がある。平成30年6月18日に発生した大阪府北部地震により建物および顕微鏡やマイクロマニピュレータを含む実験機器が損傷を受け,復旧に時間を要したため,条件出しの予備実験を含む実験実施が大幅に遅れたことが大きい。また,実験を進めていく中で,低張液の調製方法や保温環境が結果に影響を及ぼすような所見がみられ,そのことについて検証を行っているため,当初の計画よりも遅れている。F-アクチンの変化を詳細に調べるためには,同じ細胞で細胞底部から上部までを経時的に繰り返しライブイメージングによって観察できることが望ましい。そのため,引き続き蛍光標識アクチン遺伝子の導入条件の確立を進めるが,HUVECよりも遺伝子導入を行いやすい種類の内皮細胞を実験に使用することも考える。今後は,さらに,低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンおよび力学的特性に及ぼす影響を調べていく予定であるが,溶液の調製方法や細胞に浸透圧を負荷している際の保温環境が結果に影響を及ぼす可能性があるため,先これらの点の検証を進める必要がある。また,流れ負荷終了からマイクロピペット吸引試験開始までの一連の手順を確立した後に,力学試験を行う。1)低張液・高張液が培養内皮細胞のF-アクチンに及ぼす影響:ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を培地中で24時間静置培養した後に,培地を等張液,高張液,または低張液と入れ替えて所定の時間37°Cに保温した。F-アクチンを蛍光染色してその状態を共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ,等張液と高張液を作用させた場合には大きな変化は見られなかったが,低張液を作用させると時間とともにF-アクチン/ストレスファイバー構造が大きく変化する結果を得た。溶液の浸透圧測定には,購入した自動浸透圧計を用いた。F-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子の導入を行う予定であったが,観察するのに適切な導入効率と蛍光強度を得られなかったため,今年度は細胞を所定の時間だけ溶液に曝した後にホルマリン固定してF-アクチンの蛍光染色と観察を行った。2)平行平板型流れ負荷装置の作製:培養細胞に流れせん断応力を負荷することのできる平行平板型流れ負荷装置を作製した。装置は,細胞を培養したガラスボトムディッシュと組み合わせて形成される平行平板型フローチャンバー,ローラーポンプ,リザーバー,ダンピングチャンバー,チューブ回路からなり,フローチャンバーは顕微鏡ステージ上に設置することが可能である。培養HUVECsに37°Cの溶液を循環させて1 Paの流れせん断応力を負荷したところ,チャンバー内の流れは層流とみなせ,6時間にわたって同じ細胞の形態を経時的に観察することが可能であった。細胞のF-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子を導入してライブイメージングを行う予定であった。しかし,細胞全体にわたってF-アクチンを経時的に観察するのに適切な蛍光強度を得るための遺伝子導入条件を確立することができなかった。この点は遅れているが,ホルマリン固定した細胞の観察によって低張・高張液の作用によるF-アクチンの変化は観察できており,また,平行平板型流れ負荷装置の作製と性能確認も概ね終了している。

本研究では,高張液・低張液による浸透圧負荷が,血管内皮細胞のF-アクチン/ストレスファイバー構造および力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。1)低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンに及ぼす影響:ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を培地中で24時間静置培養した後に,前年度に作製した平行平板型流れ負荷装置を用いて,この細胞に等張液,高張液,または低張液によって4時間の流れ負荷(せん断応力= 2 Pa)を作用させた。その後, F-アクチンを蛍光染色してその状態を共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ,高張液を作用させた場合には等張液の場合と同様にほとんどの細胞に明瞭なストレスファイバーが観察されたが,低張液を作用させた場合にはストレスファイバーが減少している細胞がみられた。2)低張液が培養内皮細胞の力学的特性に及ぼす影響: HUVECsを培地中で24時間静置培養した後に,平行平板型流れ負荷装置を用いて,この細胞に等張液または低張液によって4時間の流れ負荷(せん断応力= 2 Pa)を作用させた。その後,トリプシン処理で剥がした細胞のマイクロピペット吸引試験を行った。しかし,流れを作用させた部分のみからの細胞の回収が難しく,さらに細胞数が少ないため試験チャンバー内で状態の良い細胞を見つけるのに時間を要し,流れ負荷終了から力学試験開始までに30分程度経過してしまった。そのため,現段階で得ているデータには信頼性がないものと考えている。当初の計画では,細胞のF-アクチンを観察するために蛍光標識アクチン遺伝子を導入してライブイメージングを行う予定であったが, F-アクチンを経時的に観察するのに適切な蛍光強度を得るための遺伝子導入条件はまだ確立できていない。エレクトロポレーション法とリポフェクション法を試しているが,使用しているDsRed-monomerアクチンベクターをHUVECに導入する条件はかなりシビアなようである。また,流れ負荷終了からマイクロピペット吸引試験開始までに30分程度要しているため,この時間を大幅に短縮して一連の手順を確立する必要がある。平成30年6月18日に発生した大阪府北部地震により建物および顕微鏡やマイクロマニピュレータを含む実験機器が損傷を受け,復旧に時間を要したため,条件出しの予備実験を含む実験実施が大幅に遅れたことが大きい。また,実験を進めていく中で,低張液の調製方法や保温環境が結果に影響を及ぼすような所見がみられ,そのことについて検証を行っているため,当初の計画よりも遅れている。F-アクチンの変化を詳細に調べるためには,同じ細胞で細胞底部から上部までを経時的に繰り返しライブイメージングによって観察できることが望ましい。そのため,引き続き蛍光標識アクチン遺伝子の導入条件の確立を行い,低張液がF-アクチン/ストレスファイバー構造に及ぼす影響を詳細に調べる。今後は,さらに,低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンおよび力学的特性に及ぼす影響を調べていく予定であるが,フローチャンバーを顕微鏡ステージ上に固定するためのホルダーをアルミニウムで製作したため底面の強度が低く,変形により対物レンズと干渉するため観察可能領域が限定されてしまっていた。そのため,チャンバーホルダーの材質をステンレス鋼に変更して作製し直して観察領域の選択の幅を拡げるようにする。
（Ｃｕ，Ｃ）系積層構造を用いた高臨界温度・レアアースレス超伝導薄膜材料の創成

独自に見出した低成長温度・レアアースレス等の特徴を持つ(Cu, C)-1201極薄膜の超伝導発現機構を検討し、ヘテロ界面歪効果が重要なことを確定するとともに、歪みエピタキシャル成長する類縁物質を1201層の上下に挿入し両界面の格子不整合を制御することで特性向上を達成した。この積層の人為的繰り返しは単位幅当たりの臨界電流密度向上の有望な手法として位置づけられる。また、全元素同時堆積法による薄膜においても超伝導発現に成功し、実用的作成法の端緒を開くことに成功した。以上より、人工積層構造の制御により、無毒性元素・レアアースレス高温超伝導薄膜材料の創成、形成基盤技術確立という目的を達成したと考える。(Cu,C)1201相薄膜を基幹とする積層構造・人工格子におけるヘテロ界面精密制御による超伝導特性の極限追求、構成元素同時供給による形成技術の開発を目標として、今年度は第一段階として(Cu,C)-1201層/無限層構造SrCuO_2バッファ層界面の歪みが伝導特性・超伝導発現に及ぼす効果を検討し、[1]SrCuO_2層がSrTiO_3(100)面上に層厚10nm程度まで歪格子としてエピタキシャル成長し、その面内格子定数が層厚とともに伸長すること、[2]SrCuO_2層厚により(Cu,C)-1201/SrCuO_2界面ミスマッチ率を制御できることを見出した。この成果を利用して、界面格子ミスマッチ率が(CuC)-1201層の伝導特性に及ぼす影響を調べたところ、同一条件で成長した1201層に関して[3]過大なミスマッチ率により積層欠陥が発生した場合、超伝導性を有さない半導体的抵抗率-温度依存性となること、界面格子ミスマッチ起源の圧縮歪が印加されている場合、50K級の超伝導特性が発現すること、圧縮歪の減少により超伝導特性が劣nm以下の極薄状態で超伝導発現を実現するとともに、[(Cu,C)-1201/CaCuO_2]N積層構造(N:積層繰返し回数)の同一条件下でのエピタキシャル成長を実現し、顕著な超伝導臨界温度の向上すること等の成果を得た。これらは界面歪、歪エピタキシャル成長がこの系の超伝導特性の重要な支配因子であることを示しており、1201層厚変化、挿入層物質制御よる界面効果の最適化、歪分布制御による高Tc発現領域の広域化が期待できることを意味している。また、伝導度向上のもう一つの鍵である高酸化度の実現に適する、高酸化雰囲気での成膜に特化したPLDシステムを開発した。独自に見出した(Cu, C)-1201レアアース・レス超伝導薄膜を基幹する系に注目し、その構造制御・人工積層化により高特性化し、その極限特性を見極めること及び多層型(Cu, C)系の実用的作製技術を開発することを主要課題として、今年度は、昨年度までに1201層が500 °C程度の低い成長温度、厚さ数nmで超伝導発現するように下地バッファとの下部界面の歪みを最適化した1201/SrCuO2バッファ構造の上部に無限層構造Sr1-xCaxO2層を堆積することによる、上部界面における歪み効果の付加、(1201/Sr1-xCaxO2)構造の繰り返し効果及び、Ba-Ca-Cu-O単一ターゲットを用いた多層型(Cu, C)系薄膜の作製を行った。その結果、500 °C程度と1201薄膜と同程度の低い成長温度で上部Sr1-xCaxO2層を1201層上にエピタキシャル成長させることに成功し、このとき、混晶比xの最適化により試料の電気伝導度の向上、即ち、ホールドーピングの促進が可能であることが見出された。また、この構造を複数回繰り返すことで臨界温度が70 K以上に上昇するとを見出し、1201層/無限層構造挿入層の人工繰り返し積層構造の電子構造・超伝導特性が構造内へテロ界面の歪みにより制御されること、その最適化により優れた超伝導特性を実現可能であることを明らかにした。また、単一ターゲットを用いた形成では、超伝導性発現のための許容条件範囲が狭いものの、1201構造と同程度の超伝導性を達成し、レアアース・レス超伝導薄膜の実用的作成法開発のための端緒を開くことに成功した。(Cu, C)1201相薄膜を基幹とする人工積層構造におけるヘテロ界面制御による超伝導特性の極限追求、構成元素同時供給による多層型(Cu, C)系超伝導薄膜形成技術の開発を目標として、今年度は(Cu, C)-1201相極薄膜の伝導性・超伝導発現の支配要因である(Cu, C)-1201

層/無限層構造SrCuO2バッファ層界面における歪効果の最適化、多層型薄膜作成に必要な、高酸素圧力での再現性良い成膜実現のための装置の改良を行った。その結果、[1] SrTiO3(001)面上に歪成長するSrCuO2層の層厚が8 12 nmのとき、1201層のホール濃度・電気伝導度が最大、28 K以上のゼロ抵抗温度が得られること、[2]圧縮性歪みが弱化するSrCuO2層厚12 nm以上では金属的伝導が維持されるものの超伝導特性が劣化し、一方、格子ミスマッチが大きい層厚8 nm以下では常伝導特性が半導体化、超伝導転移が消失した、SrTiO3 (001)面に直接堆積した極薄層と類似の特性となること、これらから[1]の良好な超伝導特性の発現が圧縮性界面歪誘起ホールドープに起因すること、印可可能な歪みに上限が存在することが明らかとなった。続いて、[3]界面歪を上記の範囲とした繰り返し積層構造を作製したところ,超伝導特性の向上が見られ、界面歪の最適化が超伝導発現領域を複数の層厚方向に拡大・均一化会うることに有望なことが明らかとなった。また、昨年度立ち上げたPLD装置の基盤加熱、排気機構を改良することにより、成膜時の酸素圧力> 60 Pa、成長温度> 650 °C、炭酸ガス分圧精度を10^-4 Pa以上での繰り返し成膜を可能とした。これを(AE)-Cu-O系膜の成長に適用したところ,(Cu, C)系関連構造の成長が確認され、同装置が多層型(Cu, C)系の薄膜化に適することが確認された。本研究の主要課題は、独自に見出した(Cu,C)1201レアアース・レス超伝導薄膜を基幹する系に注目し、その構造制御・人工積層化により高特性化を図ることにある。本年度の成果は、この系における超伝導発現に重要な因子の解明・その制御手法の開発、及び計画した人工積層手法による特性向上のフィージビリティーの確認と位置づけられる。これらから、順調に進展していると判断される。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の主要課題は、独自に見出した(Cu, C)1201レアアース・レス超伝導薄膜を基幹する系に注目し、その構造制御・人工積層化により高特性化し、その極限特性を見極めること及び多層型(Cu, C)系の実用的作製技術を開発することにある。本年度の成果は、この系における超伝導発現に非超伝導(電荷供給)層と超伝導層間の界面歪が重要な因子となっていること,それの最適化により極薄層における超伝導特性の向上が達成されること、難合成な本系における超伝導発現部位を下地との界面近傍の局所領域から積層構造全体に拡大可能であることを明らかにしている。また、多層型(Cu, C)系の同時堆積による成長に向けた装置改造に成功し、高酸素圧雰囲気・精密ガス種制御下での成長により関連構造の成長に成功している。1)(Cu,C)-1201層との界面歪みの連続変化が可能な無限層構造:MCuO_2(M:アルカリ土類)挿入層を導入し、界面歪効果を最適化した上で積層構造を作成し、並行してin-situ低温光電子分光測定、ホール係数の温度依存性等を行い、得られる電子構造情報、輸送特性を作成にフィードバックすることにより、多層型中1系で見出した高船c(133K)の発現機構[単位胞内電位分布制御による高酸化状態電荷供給層からCuO_2面へのホール再分配;(Cu,C)系も類似の始状態を持つ]を(Cu,C)系での発現に向けた構造制御を実施する。これらにより(Cu,C)系の超伝導特性の極限を明らかにする。2)前年度に開発した高酸素圧力下での成膜に特化したPLDシステムを用いて全構成元素を同時供給する手法による高Tc-(Cu,C)系薄膜作成を行い、特性発現のための必要条件を検討し、この系の簡便かつ実用的な成長技術の基盤を確立する。
てんかんマウス脳におけるカルシウム依存性細胞内情報伝達機構の解析

実験動物は生後75日の発作履歴のないElマウスとddYマウスを使用した。海馬、扁桃核、大脳皮質を摘出し、その1、000g上清を100、000g、1時間の遠心にて可溶画分と顆粒画分に調整した。(1)SDS-PAGE施行後、ウサギ抗PKC抗体を用いてWesternblotを行い、cPKC発現量を検討した。両マウスにおいて大脳皮質、海馬での免疫活性は高く、扁桃核では他2部位に比べ免疫活性は低かった。(2)Histon lllを外因性の基質として、大脳皮質、海馬から調整した可溶画分と顆粒画分でPKC活性を測定した。大脳皮質、海馬とも全活性の約60%が可溶画分に、約40%が顆粒画分に存在していた。この比率はElマウスとddYマウスの間で差はなかった。今後、扁桃核についても同様に活性を測定し、その分布を検討する。またPKCに対するspecific inhibitorであるPKC_<19-36>による抑制効果も検討する予定である。(1)当初予定していた抗CaM kinase抗体の入手ができなかったため、Western blotによる酵素発現の検討は行なえなかった。今後、抗体の作成を含め入手方法を検討している。以上の様にCaM kinaseについては抗体に入手できなかったため十分な検討はできなかったが、PKCについては現段階ではElマウスの発作感受性とCa^<2+>依存性の情報伝達系の関連についての新たな知見は未だ見いだされていない。今後発育期や痙攣発作の影響などに検討を進めていく予定である。
外洋型大規模浮体と係留システムの開発に関する研究

大規模浮体は環境への負荷を大きくすることなく、広大な海上空間を各種社会施設に提供できることから、埋め立てに代わる優れた特徴を有している。本研究ではこのような大規模浮体のうち、検討の進んでいない外洋型の耐波構造形式である大規模半潜水式構造について解析法と設計法について検討を加えた。まず、半潜水式超大型浮体の応答特性を支配する因子を明らかに、望ましい応答特性を実現するための浮体形式の決定法について検討を加えた。さらに、与えられた環境条件下で成立する浮体を設計し、解析を行いその有効性を明らかにした。ついで、多数のコラムにより支持された大規模半潜水式構造の波荷重および応答の解析法を開発した。従来、3次元特異点分布法、相互干渉理論、有限要素法を組み合わせてもコラム数が100200までが解析可能の上限であったが、相互干渉理論を多段で用いることによりコラム数10002000個の浮体についても解析を可能とする手法を開発した。さらに、弾性模型を用いた実験により、解析法の精度が十分高いことを確認した。大型浮体に加わる荷重のうち、半潜水式構造のデッキに作用する風揚力は重要であるにも拘わらず検討が不十であることに着目し、船舶技術研究所の新実験施設である風水洞に風荷重実験模型を設置して、台風と波が同時に襲来する状態を模擬して発生する揚力と抗力を計測を行い特性を把握するとともに、開発した数値計算法を援用して設計に利用できる形に加工した。また、係留方式のうち動揺を抑える能力の高い傾斜テンションレグ係留方式に着目して、浮体の運動と弾性挙動により最大張力が発生する位置が異なることを明らかにするとともに、破断挙動の複雑な様相を実験と解析で明らかにした。大規模浮体は環境への負荷を大きくすることなく、埋め立てに代わって海上空間を利用できる特徴を有している。本研究ではこのような大規模浮体のうち、外洋型耐波構造である大規模半潜水式構造について、1)波荷重および応答の評価法を確立し、2)風荷重評価のための数値計算法を開発するとともに実験を実施して特性を把握して設計に利用できる形に加工し、3)全体をまとめて安全性、機能性、環境影響の観点から望ましい構造形式と係留方式を選択または開発する設計手順と手段を確立することを目標とする。まず、多数のコラムにより支持された大規模半潜水構造の波荷重および応答の解析法を開発した。従来、3次元特異点分布法、相互干渉理論、有限要素法を組み合わせてもコラム数が100200までが解析可能の上限であったものを、相互干渉理論を多段で用いることによりコラム数10002000個の浮体についても解析を可能とする手法を開発した。さらに、解析法の精度を検証する実験に向けて、実験模型の計測素子、機構を計画した。また、船舶技術研究所の新しい実験施設である風水洞に風荷重実験模型を設置して、台風と高波高の波が同時に襲う状態を模擬して、発生する揚力と抗力を計測し、従来情報の少なかった揚力成分について計測を行い、設計に利用できる形に加工した。さらに、浮体構造形式、係留方式について分類と特徴の把握をより合理化するとともに、適切な表現方法を考案して基本コンセプトの構想と計画に有効な資料とする作業に取りかかった。

さらに、与えられた環境条件下で成立する浮体を設計し、解析を行いその有効性を明らかにした。ついで、多数のコラムにより支持された大規模半潜水式構造の波荷重および応答の解析法を開発した。従来、3次元特異点分布法、相互干渉理論、有限要素法を組み合わせてもコラム数が100200までが解析可能の上限であったが、相互干渉理論を多段で用いることによりコラム数10002000個の浮体についても解析が可能となった。さらに、弾性模型を用いた実験により、解析法の精度が十分高いことを確認した。大型浮体に加わる荷重のうち、半潜水式構造のデッキに作用する風揚力は重要であるにも拘わらず検討が不十であることに着目し、船舶技術研究所の新実験施設である風水洞に風荷重実験模型を設置して、台風と波が同時に襲来する状態を模擬して発生する揚力と抗力の計測を行い特性を把握するとともに、開発した数値計算法を援用して設計に利用できる形に加工した。また、係留方式のうち動揺を抑える能力の高い傾斜テンションレグ係留方式に着目して、浮体の運動と弾性挙動により最大張力が発生する位置が異なることを明らかにするとともに、係留の破断挙動の複雑な様相を実験と解析で明らかにした。
ポリグルタミン病態における核ストレスの解析と治療応用

ポリグルタミン病は遺伝子変異によって生じる異常なポリグルタミンタンパクが、様々な正常タンパクと結合することが知られ、この結合を介して、転写、スプライシング、軸索輸送、シナプス伝達、ミトコンドリア膜電位など様々な細胞機能の障害が報告されてきている。しかし、この中で、どの機能異常が病態の上で最も重要なのかは明らかではない。一方で、変異タンパクが核内部に移行することが病態発現の上で必須であることが、複数のグループの実験結果から証明されている。私たちは、核内に移行した変異タンパクが如何なる核タンパクの機能障害をもたらすかを明らかにするために、Ataxin-1あるいはhuntingtinを発現する初代培養神経細胞(大脳、小脳、線条体)から抽出した可溶性核タンパクのプロテオーム解析を行い、結果として、複数疾患の病態に共通してDNA修復に必須なHMGBタンパクが減少すること、DNA損傷シグナルが神経細胞において亢進することを明らかにした(Qi, et. al., Nature Cell Biology)。また、ショウジョウバエモデルにおいてHMGBタンパクを補正すると、変異ポリグルタミンタンパクによる複眼の神経変性を抑制できることを明らかにした。これらの結果は、神経変性が老化と同様なDNA損傷蓄積を主要な病態としていること、さらにある年齢からは、早老症などと同様な分子背景を持つことを示唆している。ポリグルタミン病は神経細胞の核内部に異常タンパク蓄積による封入体形成がおきる。この過程で、どのような機能異常が核の内部で起きるかは明らかではない。私たちはポリグルタミン蛋白が核に引き起こす異常の一つとして、核ストレスシグナル(genotoxic stress signa1)があると考えている。その理由は、ポリグルタミン病態としてほぼコンセンサスを得ている転写障害を神経細胞に誘発させると、核ストレスの下流分子p73の活性化が観察されるからである(Hoshino et al.,JCB 2006)。同様にハンチントン病態でp53の活性化が報告されている。そこで、私たちは核ストレスシグナルカスケードにおいて、より上流の分子の活性化について検討を行った。その結果、複数の核ストレス分子がDNA損傷と類似した活性化を示すことが明らかになった。さらに、並行して行った核プロテオミクス解析から、DNA損傷修復分子であるHMGB蛋白の異常、すなわち脆弱な神経細胞ではポリグルタミン病の種類を問わず共通してHMGB蛋白量が減少すること、を確認した。このことは、ポリグルタミン蛋白に寄り、あるいは自然界の放射線粒子により引き起こされたDNA損傷が修復できない可能性があることを示唆している。以上のごとく、ポリグルタミン病の新規病態として核ストレスの存在が示された。現在はさらに核ストレスシグナルの最上流のイベントを解析すると共に、核ストレスシグナルをどこでブロックすると細胞の機能障害あるいは細胞死を防ぐことができるかを検討中である。
間質応答を利用したホルモン受容体陽性乳がんの治療戦略の構築

現在の乳がんの治療戦略は、がん細胞のみの性質に基づいて決定されており、間質細胞に対する生物学的評価は利用されていない。しかし、間質の状態により予後や治療反応性が異なることより、間質反応を含めた治療戦略が必要である。我々が確立した三次元共培養系を用い、エストロゲン涸渇下やシクロホスファミド、CDK4/6阻害薬添加条件で、親細胞と内分泌耐性細胞を比較することにより、各間質細胞の治療反応性や耐性に関与する候補分子を同定する。さらに血液検体を用いた免疫応答、遺伝子変異と治療反応性について検討を行い、AIとバイオインフォーマティクスを用いて統合的に解析し、間質特性に基づいた治療戦略を提案する。
抗体クラス変換の調節とアレルギー

本研究では生理的クラススイッチ誘導刺激であるCD40からの信号が、トランス・スプライシングによって産生されると考えられるtrans-mRNAの発現を誘導しうるかを検討した。TG.SA系統マウスの脾臓細胞をリコンビナント可溶化CD40ligandとIL-4によって刺激すると、細胞のblast化と増殖が観察されたが、その程度はLPSとIL-4によって刺激したものに比して低かった。これに対応して、可溶化CD40ligandとIL-4の刺激によるγ1およびε鎖の非組換え型定常部遺伝子転写物の産生誘導はLPSとIL-4による刺激に比べやや弱かった。しかしながら、この刺激によって、γ1鎖ならびにε鎖trans-mRNAの産生が強力に誘導された。このtrans-mRNAの産生誘導は、LPSのそれに匹敵するかむしろ強力であった。今回の結果はtrans-mRNAの発現が人工的刺激のみならず、より生理的なクラススイッチ誘導刺激によっても誘導できることを示している。この事実を、我々がこれまでに示してきた結果と総合すれば、trans-mRNAの産生が生理的条件下でも起こりうる普遍的機構であることが極めて強く示唆される。可溶化CD40ligandによる刺激がLPSより強力にtrans-mRNAの産生を誘導したことは、CD40を介する刺激が生体内においてtrans-mRNAの産生を誘導するために本来的なものであることを想定させ、興味深い。今回の結果をこれまでのものと総合するとtrans-mRNAの産生は、生理的なものをはじめとする多様な刺激により、正と負の両方向に制御することが可能であると判明した。この点は、この過程がクラススイッチを検証的に制御するための中間過程であるとの仮説を支持している。
ベントDNAによる低温依存性転写促進機構の構造生物学的研究

本研究の目的は、ウェルシュ菌α毒素(ホスホリパーゼC)遺伝子プロモーター上流のベントDNA (phased A-tracts)とRNAポリメラーゼ(RNAP)αサブユニット(315aa)がそのC末端ドメイン(αCTD,79aa)を介してどのように結合しているのか立体構造を明らかにすることである。そのためには、phased A-tracts DNA断片(33bp)とRNAPαサブユニットまたはαCTDとの共結晶が必要となる。まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットとαCTDのN末端にHis-tagを付加し、大腸菌内で大量合成させ、His-tagを用いて精製した。両タンパク質とも結晶化できるほど精製できたが、最終精製量は、1リットル当たり数mgと少なく、結晶化に必要な50mgには及ばなかった。Joshua Sakon博士(米国:University of Arkansas)らとの討論で、phased A-tracts DNAとαサブユニットまたはαCTDの結合体が共結晶化できるほど低温(25°C)で安定した構造を保っているか調べる必要があることを指摘された。この問題点の解消や大量精製系の確立が進まず残念ながら結晶化までは至らなかった。Phased A-tractsとαCTDとの相互作用に関与するアミノ酸の同定するために、RNAP(α2、β、β'、σ)の再構成系の確立を試みた。封入体となったβ、β'サブユニットを尿素で、σ因子を塩酸グアニジンで可溶化し再構成すると、わずかながら転写活性がある標品が得られた。αサブユニットN末端ドメインを用いた時にも同様の活性が認められた。このことは、αCTDにアミノ酸置換を施した場合でも再構成が可能であることを示唆している。このRNAPの再構成法により、αCTDを介した転写調節メカニズムの研究が飛躍的に進展することが期待される。ウェルシユ菌ホスホリパーゼC遺伝子のプロモーター上流に存在する3つのphased A-tractsがRNAポリメラーゼ(RNAP)のαサブユニットのC末端ドメイン(αCTD)とどのように結合するのか明らかにするためには、phased A-tractsとαCTDの共結晶を作成し、構造生物学的な解析を進める必要がある。平成15年度は、αCTDとαサブユニットの大量精製系の確立を試みた。まずウェルシュ菌RNAPαサブユニット(α,315aa)をコードするrpoA遺伝子とphased A-tractsに結合するC末端ドメイン(αCTD,79aa)のみをコードする遺伝子を大腸菌pET発現系ベクターのpET16bに挿入した。これによりHis-tagをN末端に持つαサブユニットとαCTDを大腸菌を用いて大量合成することが可能となった。実際にそれぞれの蛋白質を大量合成させ、His-tagを利用して精製したところ、1リットル培養液当たり、His-tagged αサブユニットは、27mg、His-tagged αCTDは、7mg程度得られた。標品中には、いくつかの別のタンパクが混在していたため、Mono Qでさらに精製したところ、His-tagged αサブユニット、His-tagged αCTDは結晶化に耐えうるほど精製できたが、最終精製量は、His-tagged αサブユニットは3.3mg、His-taggedαCTDは、2.0mgと少なかった。今後、大量精製法の改良を加える必要がある。そしてphased A-tracts DNA断片(33bp)と25°Cで結合させて、その結合体が共結晶化できるほど、安定した構造を保っているか調べ、共結晶化を共同研究者であるJoshua Sakon博士ら(米国:University of Arkansas)に依頼する予定である。

結晶化のために作製したウェルシュ菌RNAポリメラーゼの10×His-αサブユニットは24残基ものアミノ酸をN末端に付加している。この長いポリペプチドが立体構造に影響を及ぼす可能性が考えられたので、N末端にMet-6×Hisの7残基のアミノ酸のみを付加させた6×His-αサブユニットを作製し、大量精製を試みた。その精製量は、1リットル培養液当たり、11mgで目標としていた50mgには及ばなかった。Joshua Sakon博士(米国:University of Arkansas)との討論では、phased A-tracts DNA断片(33bp)とHis-αサブユニットあるいはHis-αCTD(C末端ドメイン)と25°Cで結合させ、その結合体が共結晶化できるほど、安定した構造を保っているか調べる必要があると指摘された。この辺の問題点が残されているので共結晶化までは残念ながら至らなかった。Phased A-tractsDNA断片(33bp)とαCTDとの低温依存性相互作用に関与するアミノ酸の同定には、RNAポリメラーゼ(RNAP:α2、β、β'、σ)の再構成実験が欠かせない。この考えから、ウェルシュ菌におけるRNAポリメラーゼの再構成法の確立をめざして研究を進めた。封入体となったβ、β'サブユニットを尿素で、σサブユニットを塩酸グアニジンで可溶化し、再構成したところ、わずかながら転写活性がある標品が得られた。(精製標品の数百分の一程度)さらにαサブユニットの代わりにαNTD(N末端ドメイン)を用いた場合でも同程度の転写活性がみられた。このことは、アミノ酸置換を行ったαCTDでも再構成が可能であることを示唆している。RNAPの再構成系を用いることにより、phased A-tracts DNAあるいは転写因子によるαCTDを介した転写調節メカニズムの研究が将来飛躍的に進展することが期待される。
ケトン食が抗腫瘍免疫能を賦活化し、腫瘍の成長・予後を改善するメカニズム

研究代表者は、癌モデル動物を作出する。さらに本研究では、これらのモデル動物において、腺腫発症や転移巣での腫瘍成長を、ケトン食が抑制するかどうかを検討する。具体的には、ケトン食による大腸腺腫発症抑制作用や大腸癌転移巣腫瘍成長抑制作用について検討する。また、これらの癌モデル動物を用いて、腫瘍局所および全身免疫能との関係を調べ、そのメカニズムを明らかにする。さらに、ケトン食によって癌患者の腫瘍局所や全身免疫能を変化させることで、予後を改善する新規治療法開拓の可能性を探る。