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吸収性胆管ステントによる胆管狭窄予防

胆道合併症は肝移植の予後を大きく左右する合併症である。今回バリウム含有の吸収性ステントを作製し、その安全性を検討した。ステントの作製は、Lーラクチドと、εーカプロラクトンとのランダム共重合体より合成し、さらにバリウムをcoatingし作製した。豚モデルは、吸収性カフを胆管内腔に挿入固定し吸収性カフによる胆管再建モデルを作成した。実験群はn=11で、術後1か月での豚の肝機能は正常範囲内であり、CT検査では胆管ステントは筒状の形態を保ち、術後6か月後では吸収性カフはすでに吸収され、胆管は開存していた。バリウム含有吸収性胆道ステントはCTでの確認が可能であり、肝機能においても良好に経過した。胆道合併症は肝移植のアキレス腱と呼ばれ、肝移植の予後を大きく左右する合併症の一つである。以前肝移植後の胆管合併症(特に胆管狭窄)の予防法の確立として、吸収性ステントを用いた胆管再建の有用性について報告した。しかしながら、この吸収性ステントではX線透過性のため体外からの観察は不可能であった。そこで、今回バリウム含有の吸収性ステントを作製し、その安全性に関して検討した。方法:バリウム含有吸収性胆管ステントの作製は、まずLーラクチドと、εーカプロラクトンとのランダム共重合体より合成し、さらにバリウムをcoatingし作製した。豚モデルは、約20kgの雌豚を、全身麻酔下のもと、開腹し、胆管を切開し、同切開部を6ー0PDS針で結節縫合し、吸収性カフを内腔に同PDSで固定し吸収性カフによる胆管再建モデルを作成した。胆管再建豚の術後の肝機能、CTでの撮影、さらに術後6ヶ月後に、胆管を採取し、縫合部の病理学的検を行い、吸収性ステントの安全性を検討した。結果:実験群はn=11で、術後1か月での豚は黄疸を認めず、T-Bilは正常範囲であり、またトランスアミナーゼも正常範囲内であった、CT検査では胆管ステントは筒状の形態を保ち、確認可能であった。術後6か月後に再建胆管を検討すると、吸収性カフはすでに吸収されカフの遺残を認めず、また胆管は開存していた。また、病理学的にも壁肥厚を認めなかった。結論:バリウム含有吸収性胆道ステントはCTでの確認が可能であり、肝機能においても良好に経過し、有意な有害事象を認めなかった。胆道外科(胆管再建)における吸収性胆管ステントの有用性を検討するため、豚吻合胆管に吸収性胆管ステントの埋没実験を行い検討した。吸収性胆管ステントは、乳酸ーカプロラクトン共重合体を管状に加工し作成した。この吸収性胆管ステントでは、X-RayやCTによる画像的な検出は不可能であり、そのためいつ胆管ステントが吸収されるのかなどの確定的な結果は得られていない。そこで本実験ではX線透視可能な硫酸バリウム含有の吸収性ステントを共同開発し、豚胆管に埋没し硫酸バリウム含有吸収性ステントの胆管内動態を、血液生化学的・病理検査およびCTにより経時的に観察し、術後胆汁ろうや胆管狭窄に対する有用性を検討した。現在まで、2種類の吸収性胆管ステントを作製した。すなわち吸収性ステントは乳酸ーカプロラクトン共重合体からなり、乳酸の組成比が高くなれば吸収過程が遅延することが知られており、現在乳酸含有率約70%と50%の組成比からなるステントを作製した。まず、乳酸を70%含有するステントでは、約4ヶ月までCTでステントの形状を保持し、約6ヶ月後にはステントが吸収されることが明らかになった(n=3)。また術後の肝機能では、軽度トランスアミナーゼの上昇は認めたものの、TーBilの上昇は認めなかった。一方、乳酸を50%含有する吸収ステントでは、約3ヶ月でCT上検出されず、3ヶ月以内に吸収されていた(n=2)。現在、この2種類のバリウム含有吸収性ステントは、CTで形状を確認でき、胆管ステントの開存性も良好であることが確認された。方法:バリウム含有

吸収性胆管ステントの作製は、まずLーラクチドと、εーカプロラクトンとのランダム共重合体より合成し、さらにバリウムをcoatingし作製した。豚モデルは、約20kgの雌豚を、全身麻酔下のもと、開腹し、胆管を切開し、同切開部を6ー0PDS針で結節縫合し、吸収性カフを内腔に同PDSで固定し吸収性カフによる胆管再建モデルを作成した。胆管再建豚の術後の肝機能、CTでの撮影、さらに術後6ヶ月後に、胆管を採取し、縫合部の病理学的検を行い、吸収性ステントの安全性を検討した。結果:実験群はn=11で、術後1か月での豚は黄疸を認めず、T-Bilは正常範囲であり、またトランスアミナーゼも正常範囲内であった、CT検査では胆管ステントは筒状の形態を保ち、確認可能であった。術後6か月後に再建胆管を検討すると、吸収性カフはすでに吸収されカフの遺残を認めず、また胆管は開存していた。また、病理学的にも壁肥厚を認めなかった。結論:バリウム含有吸収性胆道ステントはCTでの確認が可能であり、肝機能においても良好に経過し、有意な有害事象を認めなかった。消化器外科豚胆管内への吸収性ステントの実験は現在まで11頭の豚に行われ、CTで経過観察し、さらに肝機能検査など大きな遅れなしに進んでいる。24年度では、硫酸バリウム含有吸収性ステントの作製と豚胆管に埋没したバリウム含有吸収性胆管ステントをCTにてを検出できることを確認した。現在、さらに乳酸含有量を変えたステントを作製し、その吸収性の違いを検討している。今後、摘出された胆管の病理学的検討に加え、免疫組織学的検討を加える予定ある。25年度では、現在の豚埋没実験を継続させ、その再現性を確認する予定である。また、胆管狭窄モデルを作製し、吸収性ステントの有効性を同様に豚埋没実験で確認を行っていく予定である。胆管吻合部狭窄モデルは、胆管を全周に渡り約2cm遊離し(血流障害を誘導する)、その全周性に剥離された胆管を中ほどで完全に切断する。切断された胆管を6ー0PDS針で結節縫合(端々吻合)し胆管・胆管吻合再建モデルとする。この胆管・胆管吻合の際に、吸収性の胆管ステント(68mm径)を内腔に挿入し6-0PDSで固定する。)。術後、1ヶ月ごとにCT検査と肝機能検査を行い、さらに術後6または12ヶ月後に、胆管を採取し、縫合部の病理学的検討(胆管壁、実際の胆管上皮肥厚など)、さらに炎症・組織修復の関連蛋白(EGF,TGF-β、コラーゲン、matrix metalloproteinase)の発現を生化学的に蛋白レベルで検討し、吸収性ステントの吸収性と胆管の開存性を検討する。さらに、採取された胆管組織の免疫染色(CK7、19など)を行い吸収性ステントの裏打ちをする胆管上皮細胞の再生過程も研究する。概ね予定された額は遂行されているが、物品費に若干端数の未使用額が生じた。物品費に使用する予定である。25年度は、豚の購入に500,000また実験試薬に300,000などの予定である。
全身に発現する味覚受容体の分子・生理・病態機能の解明

味細胞に発現する味覚受容体は、全身の様々な臓器に発現し、体内のエネルギーおよび化学受容センサーとして生体恒常性の維持や生体防御に寄与することが示唆されている。これらのシステムの破綻は、生活習慣病やがんなどの病態と関連する可能性があり、その基礎として、味覚受容体とリガンドとの結合特性および受容体生理機能を解明することが必要不可欠である。甘味受容体は、クラスC GPCRに属している。クラスC GPCRにおいて各ドメインの構造は知られているが、受容体のフル構造および活性化時のドメイン間カップリング機構においては不明な点が多い。共同研究において、甘味受容体サブユニットTAS1R2の変異ライブラリーのスクリーニングによって、膜発現およびパートナーサブユニットTAS1R3との共輸送を調節する細胞内保持モチーフを同定した。高発現するTAS1R2変異体を用いて、TAS1R3との共輸送のための網羅的変異スキャンにより、全構造ドメイン内における全体のサブユニットにそった二量体化サイトを同定した。また、TAS1R2変異体は、強制発現系による機能解析により、甘味受容体として機能することを確認した。さらに、システインリッチドメインのC末端側が適切に折りたたまれることが、TAS1R3との二量体化および共輸送に必要であることが分かった。これらの結果は、クラスC GPCR内におけるドメイン間の構造変化および二量体化を含む全立体構造において重要な知見を与える。甘味受容体の膜発現および二量体化メカニズムにおいてより詳細な解析を行うことができた。クラスC GPCRの全立体構造においても重要な知見を与えており、おおむね計画通りに進んでいる。ある甘味物質においてpH低下により甘味感受性が変化することを認めており、分子動力学法を用いた分子シミュレーションおよび変異体を用いた甘味応答解析を用いることでその分子メカニズムの解明を目指す。(理由)消耗品が安く購入でき節約できたため。(使用計画)概ね順調に進んでいるので適宜執行する。
キラルな対アニオンを持つルテニウム触媒を用いた不斉炭素ー炭素結合形成反応の開発

光学活性な対アニオンを持つルテニウム触媒を用い、代表者が開発した1,7-アレンインの[2+2]環化反応をエナンチオ場選択的反応へと展開すべく研究を進めた。キラルアニオンとして、種々のホスフェートやスルフェート等を用いて反応条件を検討したが、満足できる結果を得ることはできなかった。一方、キラルアニオンとしてのアルコキシドイオンに着目したところ、メントールを用いたときに中程度のエナンチオ選択性で目的物が生成することが明らかになった。さらに、キラルアニオン源としてのイオン液体に着目し、アキラルなイオン液体中で上記[2+2]環化反応が進行するかについても検証を行った。プロキラルなアレンジインを用いたエナンチオ場選択的な不斉環化反応の開発を目指し研究を進めてきた。すなわち、7-benzyloxy-2-methyl-7-(prop-1-yn-1-yl)deca-2,3-diene-8-yneを基質とし、キラル触媒の前駆体であるCp*RuCl(cod)錯体とビナフチル骨格を持つリン酸銀との反応で生じる、キラルホスフェートを持つカチオン性ルテニウム錯体との反応を種々検討した。しかしながら、本系においては環化反応そのものが進行しにくく、また得られた環化体はいずれもラセミ体であった。一方、種々のキラルアルコールを添加剤としてカチオン性錯体を調製し反応させたところ、メントールを用いた場合に中程度のエナンチオ選択性で目的の環化体が得られることが明らかとなった。今後も同様の戦略で不斉環化反応の開発研究を進める予定である。一方代表者は最終年度において、キラルアニオン源としてイオン液体が利用可能かどうかを探るべく、イミダゾリウム塩を基盤とするイオン液体中での1,7-アレンインの[2+2]環化反応の検討を行った。すなわち、butylmethylimididzloiumをカチオンとして、種々の対アニオンを検討したところ、PF6を対アニオンとするイオン液体中にて環化反応が定量的に進行することが明らかとなった。また触媒リサイクルについても検討を行い、ルテニウム触媒を含むイオン液体が、最高10回のリサイクル能を有することも明らかにした。今後は、ホスフェート系キラルアニオンを持つイオン液体を調製し、不斉環化反応への適用へ向けさらなる検討を行う予定である。新しいタイプのキラル遷移金属触媒を用いた不斉合成反応の開発を目的とした研究を進めた。すなわち、従来のキラルな配位子を組み込んだ触媒による反応とは異なり、キラルなアニオンを対イオンに持つ光学活性遷移金属錯体を触媒とした、新しい不斉炭素-炭素結合形成反応の開発を目指した。1,3-ジ置換アレンは軸不斉を有することに着目し、速度論的分割による不斉環化反応への展開を目指し検討した。すなわち、ラセミ体の1,7-アレンインとキラルなカチオン性ルテニウム錯体を反応させれば、アレンインのエナンチオマーのうちいずれか一方のみから環化が進行し、環化体及びアレンインが光学活性体として得られると期待した。そこで、アレン及びアルキン上の置換基効果やリンカー長の効果について種々検討を行った。アレンの1位に2つの同じ置換基を持つアレンを基質とした場合、生成する炭素-炭素結合がsp2炭素同士、sp2炭素と4置換sp3炭素間での結合なので、本質的に不斉中心を生じにくい。そこで代表者は新たにアレン-ジインを基質としたエナンチオ場選択的な環化反応システムを設計した。すなわちプロキラルなアレン-ジインを基質としてキラルなアルコキシドイオンを持つルテニウム錯体存在下で反応を行えば、キラルなルテニウム触媒がいずれか一方のアルキン及びアレンの外側の二重結合と反応し、ジアステレオメリックなルテナサイクルを形成すると考えられる。最終的にルテナサイクルからの還元的脱離によってプロパルギル位に4置換炭素原子を持つ2環式化合物が光学活性体として生成すると考え検討を行った。プロキラルなアレンジインを基質としたエナンチオ場選択的環化反応について検討を行った。すなわち、7-benzyloxy-2-methyl-7-(prop-1-yn-1-yl)deca-2,3-dien-8-yneを基質とし、触媒前駆体であるCp*RuCl(cod)と、ビナフチル骨格を持つリン酸の銀塩との反応で生じる、キラルホスフェートを対アニオンとするカチオン性ルテニウム触媒による環化反応を試みた。キラルアニオンの芳香環上の置換基を種々検討したものの、エナンチオ選択性は殆ど発現せず、また環化成績体の収率も低収率に留まった。

代表者は触媒前駆体であるCp*RuCl(cod)をアルコール中で反応させるとアルコキシドアニオンを対イオンとするカチオン性ルテニウム錯体が形成されることを明らかにしている。そこで、キラルなアルコールを用いれば新しいカチオン性ルテニウム錯体が形成され、エナンチオ選択的な環化反応が進行することを期待し、種々の光学活性アルコール存在下で環化反応を検討した。その結果、メントールを添加剤として用いると中程度のエナンチオ選択性ながら目的とする環化成績体が生成することが明らかとなった。平成25年度も引き続きキラルな対アニオンを持つルテニウム触媒を利用した、不斉環化反応を検討する。平成24年度の検討において、光学活性アルコールの添加がエナンチオ選択性の発現に影響することが明らかになったことから、引き続き高いエナンチオ選択性を与えるアルコールの探索を行う。また本反応はカチオン性錯体が活性種であることから、電荷を持った反応場がエナンチオ選択性に強く影響する可能性がある。そこで、電荷を持った反応場として現在有機合成に用いられているイオン液体中での反応についても検討していく。また近年、イオン液体中での反応を触媒リサイクル反応へ展開している例が報告されている。そこで、触媒リサイクル型不斉環化反応への展開も視野に入れ、イオン液体中での環化反応の検討を進める。「次年度使用額(B-A)」の3,967円については3月に発注・納品が完了しており、4月に支払いされる。平成25年度の経費に使用計画は以下の通りである。物品費に1,500,000円を計上しているが、主に日常的な研究の推進に必要な有機合成試薬、有機溶媒、ガラス器具等の消耗品に使用する。国内の討論会に2回出席するためその旅費として150,000円を計上した。また、謝金・人件費として50,000円を計上しているが、これは学術論文誌に投稿する際の、英文校正等に使用することを目的としている。
非等方弾性体におけるレーリー波に関する解析の研究

等方性の弾性方程式のノイマン境界値問題に対してはレーリー波と呼ばれている表面を伝わる波が存在することが良く知られている。このレーリー波に対して、局所エネルギーの減衰の速さや、レゾルベントの極の位置について様々な角度からの研究がある。本研究では非等方性弾性方程式に対してもレーリー波が存在すれば等方性の場合と同様な結論が得られるかどうかについて調べた。結果としては等方性の場合と同様、次のような性質があることが判明した。(1)局所エネルギーは減衰するが、その速さは非常におそい。(2)レゾルベントの極(レゾナンスとも呼ばれている)の列で実軸に近づくものが存在する。非等方性弾性方程式は等方性の弾性方程式に比べて構造が複雑で、このため等方性の場合と同様に議論が出来ないところがある。主な問題点はこれらの点の克服にある。特に非等方性の場合には、扱う微分作用素の特性根の重複度が一定であるという仮定をおかないようにしてこの問題を扱う必要がある。(実際、この仮定を満たさない実例がある。)そのために、どうしても一般論的な取り扱いを行わないと非等方性の場合は扱えない。この研究でのもっとも重要な点は、大きなパラメーターを持った楕円形微分作用素の一般論的な取り扱いのみで、レーリー波のように境界に強く拘束される波の性質をある程度調べること、および物理的にも意味のある仮定のみで議論ができることを指摘したことにある。この研究の成果は既に論文投稿がなされており、掲載予定となっている。また、この研究に関連した研究が最近進んできている。これらのことを概観した講演を行った。今後の課題としては、異なる種類の弾性体がある面でたがいに接触している場合にもこの論法が適用できるかどうかについて調べることが考えられる。非等方性弾性方程式は等方性の弾性方程式に比べて構造が複雑で、その分一般的な取り扱いが必要となる。本年度はこの構造に関する理解、特に等方性弾性方程式に対する類似の問題に関する取り扱いでは困難と考えられる点の扱い方を考察することが大きな目標であった。具体的には次のことを考えた。1.楕円型方程式の一般論を用いたノイマン作用素の評価法2.楕円型領域でのポアッソン作用素の構成とそのパラメータ付き擬微分作用素による表示3.ポアッソン作用素のスペクトルパラメーターに関する解析接続の可能性4.ノイマン作用素のスペクトルパラメーターに関する解析接続とその漸近形等方性の場合は本質的には二つの速度の異なる波動方程式に分解できるので、2、3、4に相当するものを直接得ることが出来る。特に、4では楕円型領域においてはノイマン作用素が実主要形の擬微分作用素であり、その主シンボルの形も大域的に分かる。これより1の評価はすぐに得られる。しかし、非等方性の場合は等方性の場合ほど単純ではないので、別に1を考えた方が得策であることが判明した。2についても一般の楕円型境界値問題の扱いに準じて行う。しかしながら、この問題の場合は方程式系になっているのでその点に関する工夫が必要である。3は2の表示を下にして議論を進める。その際、スペクトルパラメーターを複素数に動かしたときにどこまで有効になるかを確認することが問題となる。これについては適当な変数変換によりある角領域内では有効な表示を得ることができた。また、4は3より明らかとなる。このように、今年度はほぼ当初の計画どうりに研究が進行した。これを下にして、レゾルベントの極の存在、及び局所エネルギーの減衰の速さに対する情報を得ることが次年度の課題である。
慢性虚血心筋における骨髄細胞移植療法の展開と臨床への応用

平成14年度は、家畜ブタを用いたアメロイドコンストリクターによる慢性虚血モデルを用い、骨髄穿刺により得られた自家骨髄細胞を虚血領域に移植し、その有効性と安全性を確認した。アメロイドコンストリクターを装着後4週間目には、局所心機能と局所心筋血流は有意に低下していたが骨髄細胞移植を行うことにより4週間後には安静時の心筋血流と心機能の改善を認めた。冠動脈造影検査では、明らかに側副血行路の発達を骨髄細胞移植郡において認められた。また、不整脈の発生や突然死も認めなかった。病理組織検査では、骨髄細胞移植により軟骨や骨などの異物の造成は認められなかった。これらの結果から骨髄細胞を虚血心筋に移植することで、大きな副作用を伴うことなく良好な結果が得られた。短期間の安全性はこの実験で確かめられたが、長期間にわたる安全性を確認するため骨髄細胞移植後に一年以上にわたり経過観察をした。その結果、突然死する動物は認めず、骨髄細胞の慢性虚血心への移植療法の長期間の安全性が確認された。これらの結果を踏まえ、アフェレーシスにより末梢血より採取したCD34陽性細胞を、重症な虚血性心臓病患者に心筋内注入をしたところ狭心症の改善が認められた。アメロイドコンストリクターを装着後4週間目には、局所心機能と局所心筋血流量は有意に低下していたが骨髄細胞移植を行うことにより4週間後には安静時の心筋血流と心機能の改善を認めた。また、ホルター心電図による解析では不整脈の発生や突然死も認めなかった。これらの結果から骨髄細胞を虚血心筋に移植することで、大きな副作用を伴うことなく良好な結果が得られたが。実験によると、運動負荷と同等のドブタミン負荷のもとでは、完全な心筋血流の改善と心機能の改善は得られなかったため、骨髄移植療法をより確実で強固なものにするため血管新生因子をコードしたレトロウイルスを用いた効果的な骨髄細胞への遺伝子導入法を開発すべく検討中である。平成15年度は、家畜ブタを用いたアメロイドコンストリクターによる慢性虚血モデルを用い、骨髄穿刺により得られた自家骨髄細胞を虚血領域に移植し、その有効性と安全性を確認した。
心筋単一細胞におけるCa^<2+>トランジェントの発生・伝播形態画像解析

心筋細胞内におこるCa^<2+>トランジェントは短時間内の出来事のためその発生および伝播様式の画像解析は非常に難しい。最近我々はそれを可能にする装置を入手した。その装置は倒立型蛍光顕微鏡を用いスリットスキャン法により4ミリ秒間隔で記録解析できる仕組みになっている。本実験にはラットおよびモルモット心室筋から得た単一細胞を用い、Ca^<2+>トランジェントの記録は蛍光色素、fura-2の使用により行った。本研究は平成4年度と5年度の2箇年にかけて行われた。結果は以下の通り。電気刺激により反復興奮している単一細胞において、Ca^<2+>トランジェントは細胞の1箇所、数箇所および全面に発生した。1箇所および数箇所に発生した例では、そこから比較的ゆっくりした速度で細胞全体に広がった。他端への到達には約30ミリ秒を要し、ピーク到達には約60ミリ秒要した。Ca^<2+>チャンネルを促進させると報告されているisoproterenolはその発生箇所を増加させ、反対にverapamil(Ca^<2+>チャンネルを抑制)は減少させた。Ca^<2+>チャンネルに影響することなく細胞内Ca^<2+>を増加させるouabainはその発生箇所には影響は与えなかった。また、心筋細胞筋小胞体からのCa^<2+>放出を抑制するdoxorubicinはピーク到達の時間を著明に延長したがCa^<2+>トランジェント発生箇所には影響を与えなかった。以上の結果は、Ca^<2+>トランジェントはCa^<2+>チャンネルを通るCa^<2+>により発生し、その伝播はCa^<2+>induced Ca^<2+>release機構のCa^<2+>によることを示唆する。また、Ca^<2+>トランジェントは常に決まった箇所から発生することを本実験結果は示す。結果は以下の通り。心筋細胞内に起こるCa^<2+>トランジェントの画像解析は装置の時間的制約から不可能であった。しかし、最近、我々はスリットスキャン方式を採用した4ミリ秒間隔ごとの記録可能な装置を開発することができた。本研究の目的は本装置使用により心筋単一細胞におけるCa^<2+>トランジェントの発生・伝播および消失の解析にある。実験に供した単一細胞はモルモット心室筋からcollagenase処理により得、電気的に反復刺激した。刺激電極はフィールド型を用いた。細胞内Ca^<2+>濃度変化は蛍光波長500nmを使用し、励起波長340nmと380nmで得られる輝度の比率から算出した。また、観察は、心筋細胞の興奮前、16ミリ秒から、興奮後、720ミリ秒まで行った。Ca^<2+>トランジェントは、細胞の限局した1箇所、2-3箇所あるいは数箇所から主に発生した。細胞の1箇所、特に1端に発生した例では、そこを基点として他端に向かって伝播(広がり)した。細胞全体への広がりは約40ミリ秒を要した。また、Ca^<2+>トランジェントのピークはその発生から約60ミリ秒後に観察された。本実験ではフィールド刺激を用いたことから、活動電位は細胞全体に同時に発生していると考えられる。それに比べるとCa^<2+>トランジェントの伝播は非常にゆっくりであった。これらの結果から、最初Ca^<2+>トランジェントの発生は流入Ca^<2+>によって起こり、その後の伝播はCa^<2+>-induced Ca^<2+> release機構によっていると思われた。心筋細胞内に起こるCa^<2+>トランジェントはあまりの瞬時の出来事のため画像解析に成功した例はない。

しかし我々はスリットスキャン方式採用により時間解像度を上げた装置を入手できた。この装置では4ミリ秒間隔の画像記録が可能であり、ほぼその時間的問題を解決できる。前年度(平成4年度)では主に正常な状態でのCa^<2+>トランジェントの発生・伝播形態の解析を行った。今年度はCa^<2+>トランジェントに影響を与えると思われる薬剤の存在下における解析を行った。研究にはモルモットおよびラット心室筋から得た単一細胞を用い、fura-2を負荷、Ca^<2+>濃度変化は励起波長340nm/380nm(500nmの蛍光波長)で得られた輝度の比率から算出した。また、単一細胞には電気的に反復刺激を加えた。Ca^<2+>トランジェント発生は、1箇所、数箇所あるいは細胞全体的に起こり、そこから比較的ゆっくり細胞全体に伝播した。isoproterenolはその発生箇所および伝播速度を増加させた。また、消失時間の短縮も発現した。一方、verapamilは発生箇所の減少、伝播速度の減少を引き起こした。ouabainおよびCaCl_2添加は初期発生および伝播様式には影響を与えることなくCa^<2+>トランジェントのピークのみを増加させた。抗癌剤として繁用されているdoxorubicinはピーク到達までの時間および消失速度の延長、そして、静止時のCa^2濃度の増加を発現した。以上の結果から以下のことが推察された。Ca^<2+>トランジェントの発生箇所は細胞により様々であるが、個々の細胞を考えた場合、必ず決まった箇所から発生する。また、発生は筋小胞体から放出したCa^<2+>により起こるが、そのきっかけはCa^<2+>チャンネルを通り流入したCa^<2+>による。伝播は次々に起こる筋小胞体からのCa^<2+>放出によりなされている。Ca^<2+>トランジェントのピーク到達時間はその発生箇所および伝播速度にも影響を受けている。
レーリー波の角における散乱のメカニズムの研究

弾性体の境界面に接する媒質が空気など弾性体境界に応力負荷が無いような境界(即ち自由境界)を、実体波(即ち弾性体内部を伝わる弾性波)より遅いスピードで伝播する亜音速Rayleigh波(以下単にRayleigh(レーリー)波と呼ぶ)が弾性体の角でどの様に反射、屈折されるかに関する数学的解明は、超音波を用いた弾性体境界面の非破壊検査法の基本的な未解決問題として知られている。本研究の目的は、Rayleigh波が角でどの様に反射・屈折・放射し、その一部が弾性体内部に特異性を放射するかを数学的に解明することである。まず本研究の研究到達点であるが、本研究に関連したもっとも重要な研究である角領域における定常自由境界値問題に対する外向きグリーン関数の高周波漸近挙動に関する研究(文献: V.V.Kamotski and G.Lebeau, Diffraction by an elastic wedge with stress-free boundary : existence and uniqueness, Proc. Royal Soc. A(2006)462, 289-317.)を徹底的に理解し、これを本研究に応用する土台を築くことが出来たが、まだ論文として発表できる形のものはない。しかし超音波を用いた残留応力の非破壊検査法として重要な深さ方向に非均質な半無限媒質中のRayleigh波の速度の分散公式を導くことが出来た。この研究成果は、既に国際的に著名な学術誌(IMA J. Applied Math.)に投稿し、査読者の改善要求を検討することを条件に論文掲載について肯定的な査読結果を得ている。この速度の分散公式は、高周波漸近局所表示可能なRayleigh波に対するものであるが、さらに高周波漸近大域表示可能なRayleigh波を考える場合には、前出文献の研究手法が必要なことが分かった。本研究の目的は、長年の未解決問題であるRayleigh波の弾性体の角における反射屈折について研究することである。即ち、弾性体の自由境界を伝搬するRayleigh波を高周波の振動或いは特異性伝播として捉え、超局所解析を用いてこの特異性が、弾性体の角でどの様に反射・屈折し、その一部が弾性体内部に特異性を放射するかについて研究することである。平成23年度の研究計画では、この研究に必要な関連先行結果であるV. Kamotski-G. Lebeauの論文(2006年)について詳細な検討を行うことを計画した。即ち、2次元等方均質弾性体が角領域をなす場合に、彼らが構成した定常問題に対する外向きGreen関数の構成法、その特性即ちその角以外の所での高周波漸近展開式、そしてこの漸近展開を用いてRayleigh波の角における反射係数と屈折係数を求め、既存の工学者による数値計算結果と比較することによりこれらの係数の正当性・有効性を検証することである。平成23年度に実施した研究により、V. Kamotski-G. Lebeauの外向きGreen関数構成法とその特性については十分な知見が得られた。しかしその知見を用いてRayleigh波の角における反射係数と屈折係数を求め、既存の工学者による数値計算結果と比較する所まで、研究は進展させる時間はなかった。このような既存結果との比較を行うことは、研究の意味を考える上で重要であるが、単なる理論研究とは違う側面を持つことも事実である。即ち、どの程度の高周波数域で数学で得られる定性的な反射・屈折係数と工学で知られている定量的な定性的な反射・屈折係数が符合するかという問題だからである。また、それを実際に実行するには数式処理、数値計算プログラムを作成する必要があり、かなり時間がかかるという問題もあり、実行に至らなかった。平成23年度の研究計画を完全には実施することは出来なかったが、この研究計画全体から見た重要な最初のステップが十分に達成できたからである。まず平成23年度に達成できなかったRayleigh波の角における反射係数と屈折係数を求め、既存の工学者による数値計算結果と比較する。

これは数式処理と数値計算プログラムの作成に時間がかかるので、その作成にはポストドクに謝金を払って行う。謝金は、平成23年度の未使用額を当てる。その結果得られる成果を研究発表する予定である。前年度に得られた知見をもとにして、解析的曲線がなす弾性体の角でRayleigh波がどのように散乱されるかについて研究する。連携研究者の川下氏と、解析的曲線がなす角における音波の散乱について論じたO. Lafitteの論文(2002年)を徹底的に解読する。そしてこれを我々の研究目的であるRayleigh波の角における散乱に適用する。23年度未使用額発生理由は、当該年度に予定していたポストドクに謝金を払って行う数式処理と数値計算プログラムを用いたRayleigh波の角における反射係数・屈折係数の計算の研究が実施できなかったことによる。24年度ではこの実行できなかった研究を実施し、その為に23年度未使用額を使用する。
高齢者と栄養支援をつなぐ看護師の調整機能－地理情報システムによる小地域空間分析－

高齢者の低栄養問題に対して、栄養サポートチーム(Nutrition Support Team、NST)による栄養介入組織活動が効果を上げており、医療施設のNST(病院NST)では拡充しつつある。低栄養問題の根本的な解決には、退院後の在宅医療のNST(在宅NST)が重要であるが、栄養支援に関わる人や機関は分散しており、効果的に繋がっていない地域が多い。また、客観的効果の測定と評価が不十分であることもあり普及には至っていない。本研究の目的は、在宅の低栄養高齢者の分布を地理情報システム上で可視化し、在宅NSTを構築する上で必要となる在宅栄養支援に関わる人や機関の特性別分布と空間集積性から、潜在的需要と充足状況を明らかにする。また在宅NSTの普及には、看護師が持つ卓越した調整機能が成功の鍵を握っていることが明らかにされていることから、看護師による在宅の栄養支援の実施状況を明らかにする。本研究を通じて、栄養支援情報の収集と伝達体制をふまえた栄養支援プログラムの構築を行い、在宅NSTの社会的認知の促進を通じて、活動の普及と発展を目指す。2018年度は、国内外の文献収集と会議の開催により診療録調査と地域栄養支援資源調査の検討を行った。本調査の倫理審査資料を作成中で、2019年度中に研究計画書等を倫理委員会に提出予定である。調査は二次医療圏を対象に行い、低栄養高齢者と在宅栄養支援資源の分布についてGISを用いて分析を行う予定である。地域栄養資源マップを作製し、特性別分布と空間集積性から潜在的需要を明らかにする。2018年度は、国内外の文献収集と会議の開催により診療録調査と地域栄養支援資源調査の検討を目的とした。実現可能な調査項目と調査地域を明確にできたが、倫理審査を受け調査開始をすることができなかった。2019年以降の計画として、1)研究倫理審査を受け調査を開始する2)低栄養高齢者と在宅栄養支援資源の分布についてGISを用いて分析を行う3)地域栄養資源マップを作製し、特性別分布と空間集積性から潜在的需要を明らかにする。4)2020年2月に日本静脈経腸栄養学会において上記成果を発表し、国内外の研究者との情報交換、意見交換を行う高齢者の低栄養問題に対して、栄養サポートチーム(Nutrition Support Team、NST)による栄養介入組織活動が効果を上げており、医療施設のNST(病院NST)では拡充しつつある。4)2020年2月に日本静脈経腸栄養学会において上記成果を発表し、国内外の研究者との情報交換、意見交換を行う調査の進行が遅れ、当初購入を予定していた、GIS分析に伴うソフトおよび備品の準備が不要となったため。また成果報告へ至らなかったため、学会参加費、旅費が不要であった。当初の計画よりは遅れているが、研究の方針は変更はせず実施していく予定であるため、調査および分析作業等に予算が必要となる。
歯周炎分子標的治療薬のスクリーニングに有効な三次元培養モデルの作成

初代培養歯肉上皮細胞と歯肉線維芽細胞を組み合わせて、コラーゲンゲル三次元培養法による「生体外歯周炎モデル」を確立した。このモデルをトランスクリプトーム解析することにより、歯周炎原因候補遺伝子をリストアップすることができた。さらに、歯周炎原因候補遺伝子産物のうちのひとつであるFLT-1の活性を、低分子キナーゼ阻害薬で抑制することによりコラーゲン分解が阻害できたことから、この阻害薬が歯周炎分子標的治療薬となり得ることが示された。歯周炎による歯周組織の破壊をin vitroでシミュレートするために,三次元培養法を用いて上皮と間葉との相互作用を調べる歯周炎の病態形成モデルを作製した。コラーゲンゲル内にヒト歯肉線維芽細胞(GF)を播種し,6穴プレート内で硬化させた後,ヒト歯肉上皮細胞(GE)を播種した。24時間後にゲルをプレートの底から浮かせ(floating culture)さらに5日間培養を継続した後,残存コラーゲン量を測定した。歯周炎罹患部位からのGFには,コラーゲンゲルの分解を極度に促進する"悪玉"線維芽細胞が含まれていた。また,歯周炎分子標的治療薬のスクリーニングのために,各種阻害剤を用いて,ゲル分解に及ぼす影響を調べた。MMP阻害剤,セリンプロテアーゼ阻害剤,TGFβRI阻害剤,JAK阻害剤または放線菌産物を加えておくと,コラーゲンゲルの分解が顕著に抑制されたが,これらの阻害剤は全身投与が難しい薬剤であるため,より安全な薬剤を模索した。その結果,狭心症の治療薬として長年使用されてきた「トラピジル」がコラーゲンゲルの分解を顕著に抑制することを見出した(「歯周炎治療薬」として特許出願済)。このゲル分解抑制の分子メカニズムは依然として不明であるため,"悪玉"および"善玉"線維芽細胞のクローニングを開始した。クローニング後に両細胞の遺伝子発現プロファイルを比較することにより,「トラピジル」の標的タンパクを同定できると考えている。また,天然物に由来する歯周炎に有効な分子標的治療薬のスクリーニングも行っている(特許出願準備中)。適切な動物モデルが作れない歯周炎において、生体外(in vitro)モデルを作製することは、歯周炎原因究明のために重要な意味を持つ。申請者らは、歯周組織の破壊をin vitroでシミュレートするために,三次元培養法を用いて上皮と間葉との相互作用を調べる歯周炎の病態形成モデルの作製を試みた。その結果、歯周炎罹患部位からの歯肉線維芽細胞には、コラーゲンゲルの分解を極度に促進する“悪玉"線維芽細胞が含まれていることがわかり、この細胞を用いることで、生体外歯周炎モデルの作成が可能となった。さらに、歯周炎分子標的治療薬のスクリーニングのために延べ60種類の生薬を用いてコラーゲンゲル分解に及ぼす影響を調べた結果、オウゴン、ケイヒ、ブクリョウを始めとする20種類の生薬によりコラーゲンゲルの分解が顕著に抑制されることが判明した(「コラーゲン分解阻害剤」として特許出願済)。また、3ペアのゲルからRNAを抽出しGene Chip解析を行ったところ、38,500遺伝子の中から歯周炎原因遺伝子の候補として45種類の遺伝子がリストアップできた。さらに“善玉"と“悪玉"両線維芽細胞のクローニングを行って生体外歯周炎モデルに適用し、同様にGeneChipで解析したところ、原因候補遺伝子を22種類まで絞り込むことができた。現在これらの遺伝子のValidationを行っており、現時点では2種類の原因候補遺伝子が浮上してきた。この遺伝子産物の阻害剤が、真の歯周炎分子標的治療薬の候補になると考えている。さらに、侵襲性歯周炎罹患歯肉からも、必ず“悪玉"線維芽細胞が得られることがわかり、歯周炎の「線維芽細胞原因説」が信愚性を増してきた。現在、成人性歯周炎と同様の解析を行っている。適切な動物実験モデルが作製不可能な歯周炎に関して、ヒトの初代培養細胞を用い、世界で初めて「生体外歯周炎モデル」を確立した。このモデルを用いてスクリーニングを行い、重度歯周炎罹患者の歯肉から"悪玉"線維芽細胞を分離し、GeneChipシステム(日本大学松戸歯学部・安孫子教授)を用いた解析で、悪玉歯肉線維芽細胞に高発現している歯周炎原因候補遺伝子を22個まで絞り込んだ(4ペア)。その後のreal-timePCRで、原因候補遺伝子を2個にまで絞ることができた。このうちの一つはチロシンキナーゼ受容体をコードする遺伝子であったため、低分子キナーゼ阻害剤の効果を試したところ、コラーゲンゲルの分解は顕著に抑制された。さらに、東大呼吸器内科との共同研究で、レンチウイルスベクターによって悪玉線維芽細胞に2種類のmiRNAを導入するRNAiを行って、その効果を検討したところ、コラーゲンゲルの分解は有意に抑制され、これらの遺伝子が歯周炎原因候補遺伝子である可能性が高くなった(1件は特許申請済み)。

これにより、世界初となる歯周炎分子標的治療薬の候補が誕生する。また、歯周病ゴードン会議における発表で、フォーサイス研究所教授の河井教授がたいへん興味を持ってくださり、共同研究を行う運びとなった。また、侵襲性歯周炎歯肉由来の悪玉線維芽細胞を用いて、GeneChipシステムを用いた生体外(侵襲性)歯周炎モデル3ペアの解析を行った。その結果、侵襲性歯周炎の"悪玉"歯肉線維芽細胞に共通して高発現(>1.5)している歯周炎原因候補遺伝子は、予想に反してわずか7遺伝子であった。逆に低発現(<0.7)のものが17遺伝子あり、侵襲性歯周炎は成人性歯周炎とは明らかに異なる遺伝子発現によって引き起こされる、異なった病気であるという可能性を示唆することができた。3月にはカロリンスカ研究所、ウプサラ大学、シャリテ、フリードリッヒ・シラー大学にてがんと歯周炎との類似性に関するディスカッションを行った。適切な動物実験モデルが作製不可能な歯周炎に関して、ヒトの初代培養細胞を用い、世界で初めて「生体外歯周炎モデル」を確立した。このモデルを用いて、重度歯周炎罹患者の歯肉からアグレッシブ線維芽細胞を分離し、GeneChipシステム(日本大学松戸歯学部)およびreal-time PCRを用いて解析した。その結果、歯周炎原因候補遺伝子を2個まで絞り込むことができた。うち一つはチロシンキナーゼ受容体FLT-1をコードする遺伝子であり、低分子キナーゼ阻害剤の効果を試したところ、コラーゲンゲルの分解は顕著に抑制された。さらに東大呼吸器内科との共同研究で、アグレッシブ線維芽細胞にFLT-1のmiRNAを導入するRNAiを行って、その効果を検討したところ、コラーゲンゲルの分解は有意に抑制され、これらの遺伝子が歯周炎原因候補遺伝子である可能性が高くなった。侵襲性歯周炎歯肉由来のアグレッシブ線維芽細胞を用いて、GeneChipシステムを用いた生体外(侵襲性)歯周炎モデル5ペアの解析を行った。その結果、侵襲性歯周炎のアグレッシブ歯肉線維芽細胞を含むゲルに3/5以上共通して高発現している遺伝子は69遺伝子、また、3/5以上共通して低発現の遺伝子が107あり、侵襲性歯周炎は成人性歯周炎とは明らかに異なる遺伝子発現パターンによって引き起こされる、異なった病気であるという可能性を示唆することができた。また農工大大学院との共同研究で、「生体外歯周炎モデル」の残存コラーゲン量だけではなく、コラーゲンゲルの硬さを押し込み試験によるYoung率で評価するシステムを構築した。アグレッシブ歯肉線維芽細胞と健常歯肉線維芽細胞の相違が、理化学研究所FANTOM5プロジェクトによって解析され、現在論文投稿中である。アグレッシブ線維芽細胞の成り立ち、すなわち歯周炎の原因究明に一歩近づくことができると考えている。歯周炎原因候補遺伝子のリストアップがスムーズに進展し、これに興味を持ったフォーサイス研究所の河井教授が動物実験を行ってくれることになった。さらに、東大呼吸器内科の先生もたいへん興味を持ってくださり、miRNAによるRNA干渉の実験を申し出てくれた。とくにmiRNAの実験は、原因候補遺伝子の作用を直接抑えることができるため、決定的な証拠となる。
血管内皮多様性・活性化原理解明による抗がん/抗血管疾患アプローチ

VEGF刺激を受けた内皮細胞は、エピゲノム制御を交えた、分岐や動脈化など内皮多様性に繋がる活性化を引き起こす。一方未分化幹細胞では、終末分化した内皮細胞とは全く異なるエピゲノム制御を受けることが想定されている。そこで、我々はマウスES細胞から内皮分化系を確立し、その分化時におけるダイナミックな遺伝子発現とそれに伴うヒストンプロファイルを包括的に時系列を追って解析した。その結果、パイオニア因子ETV2に続き、分化マスター転写因子群は全てその制御領域上で内皮分化のタイミングに合わせ、抑制ヒストンから活性化ヒストンマークに動的にスイッチして、全ての内皮マーカーの発現を制御していることが示された。VEGF活性化エピゲノムスイッチの同定と培養細胞での機能解析:培養血管内皮細胞にVEGF刺激を行い、迅速誘導される転写因子群の制御にはMLL3のアダプタータンパクPTIPが必要であり、PTIPのN末ドメインとNFATcが結合し、核内移行することでH3K4me3ヒストン修飾が増大し、転写が開始することが明らかとなった。またこれら急性期誘導転写因子の制御には、H3K27Acマークが入らず、H3K27me3とH3K4me3の抗体のChIP-reChIPアッセイからもbivalentであることが確認された。ES細胞内皮分化系を用いたエピゲノム制御と分化内皮からのreverse differentiationを用いた内皮規定性の同定:ES細胞ー内皮分化系においては、VEGF存在下における包括的遺伝子変動と内皮分化前後でのヒストンプロファイルを取得して、論文としてまとめている段階である。また、分化内皮に重要な転写因子GATA2と2つのETS因子については培養内皮細胞を用いたChIP-seqと全ゲノム発現アレイが完了し、エピゲノム変化について調べている段階である。この変動ががん微小環境で生じていることをin vivoにおいて解析することを計画している。ダウン症モデルマウス、がん移植マウスからの内皮細胞培養と臓器血管特異的機能解析:DSCR-1内皮特異的コンディショナルトランスジェニック(Tg)マウスは低発現のみ産まれること(ホモTgは産まれない)を交配を1年を超えるマウス総数で確認した。NFATのレギュレーターであるDSCR-1の発現量が厳密に制御される生物学的意義を調べるため、血管分岐パターンや腫瘍新生血管の精製度合いなどin vivo解析を続ける。ダウン症関連因子(DSCR)-1の内皮特異的コンディショナルトランスジェニック(Tg)マウスの表現型解析:熊本大学において新たにクリーンアップを行い、再度Tgラインを独立して3ライン、C57BL6とBalb/cのバックグラウンドに濃縮したもの合計6系統を樹立した。いずれにおいてもTgカセット(VE-cad-tTAとTRE-DSCR-1-IRES-lacZ)を両アレルにホモに有するものは産まれてこなく胎生致死となること、いずれの系統においてもDSCR-1の発現が高いほどマウスの成長遅延が生じ、胎仔が小さくなること、血管の分岐異常を呈し、部分的な出血も認められることを明らかにした。この分岐異常がDSCR-1の恒常的な発現によりNFAT活性が常に抑制されていることが主たる要因となっていることを、分岐シグナルNotchとの関連性から示すことが出来ており、その分子機構をin vitro培養系でも明らかにした。そのことから、NFATのフィードバック阻害作用を示すDSCR-1はフィードバックとして適切な場所に適度に制御されているときは優れた抗炎症・抗がん作用を示すが、構成的に常時内皮で発現維持させると、内皮の増殖・分岐異常を呈し、ダウン症の一部の病態を再現することが明らかとなった。臓器血管特異的な発現制御機構解明:肺血管内皮に加え、腎臓・肝臓・精巣での内皮単離と培養を行う系を確立した。これにより、病態モデルマウスでの臓器から血管内皮を採取し、発現プロファイルを作製することが可能になった。腫瘍環境下での血管表現型解析:がん微小環境下、腫瘍血管内皮が形質転換をおこすEndMTの事象に転写因子ERG/FLI1が関与していること、成熟血管内皮にERG/FLI1をノックダウンするだけでEndMTを引き起こすことを示した。さらに、ERG, FLI1の抗体を用いた内皮培養細胞でのChIP-seqデータを取得した。遺伝子改変マウスの熊本大学への異動のため、全てクリーンアップを行い、再稼働することができた。研究機関異動のため半年研究活動が停滞したが、モデルマウスの表現型を解析し、次年度の総括に向け準備する体制を整えることができた。血管内皮細胞がVEGF刺激を受けて活性化するとき、転写因子NFATの核内移行と転写活性化が早期に生じる。この内皮活性化調節を最適化するため、NFATのfeedback modulatorであるダウン症因子(DSCR-1)が誘導され、恒常性維持に大事な機能を果たしている。これまでにDSCR-1を一過性に過剰発現することで、病的な血管新生や過度の炎症を防護できることを明らかにしてきたが、発生期からDSCR-1がfeedback制御を超えて構成的に安定発現するとどのような影響が認められるか、内皮特異的かつdoxycyclin依存的なDSCR-1 transgenic (Tg)マウスを3系統樹立した。その結果、いずれの系統もDSCR-1の発現が高いものは内皮増殖やその後の血管リモデリングが障害を受け、早期に致死に至ること、部分的にダウン症の病態と類似した表現型をDSCR-1の1つの因子で再現出来ることが判明した。

一方、ダウン症患者が動脈硬化罹患率が低いことに関するDSCR-1の寄与を検討するため、DSCR-1TgマウスとApoE欠損マウスを掛け合わせ、高脂肪食付加したところ、ApoE欠損マウスでの動脈硬化病変形成がDSCR-1 Tgにより、強く阻害されることが明らかとなった。一方、DSCR-1欠損マウスとApoE欠損マウスを掛け合わせた場合では、ApoE欠損に比べ、さらに高コレステロール血症を示し、大血管の炎症よりも末梢の炎症が加齢に応じて進み、最終的に高度の確率で角膜混濁が生じることが明らかとなった。また、内皮細胞のVEGFシグナルでの分子機構を明らかにする目的で、ES細胞から内皮分化に至るトランスクリプトームやエピゲノミクスを統合し、システム解析を試みたところ、内皮分化に必須な転写ネットワークが存在し、その転写因子群の発現制御領域はいずれも分化前のブレーキヒストンマークからアクセルヒストンマークにスイッチし、正常に内皮分化が引き起こされる仕組みが明らかとなった。(NucleicAcids research. In press)DSCR-1 Tgマウスの表現型解析が地震後再開出来ていること、DSCR-1欠損マウスとApoE欠損マウスにおける病態観察から加齢に伴う新しい疾患のメカニズムが明らかになる道筋が立っていることから判断した。これらを論文化することで全て完結できるので、その研究体制をより強固にする必要がある。熊本地震からの復旧が進み、研究面ではスピードアップできるようになりつつある。血管内皮細胞をマウス各臓器から安定的に単離し、培養出来る技術が血管内皮マーカーとしてのCD31抗体を用いた磁気ビーズを基に完成し、主たる臓器で網羅的な発現アレイを取得した。その結果、がんの転移ニッチ環境を最も良く構成すると考えられた肺血管内皮細胞では再現性良く、VEGF-Aの転写発現量が最も高い事が判明した。この臓器多様性発現は培養時でも維持されることから、エピゲノムレベルで固定された結果であることが想定され、プロモーターのメチル化レベルの違いを解析する方針に繋がった。一方、内皮分化制御に繋がるマスター転写因子であるGATA2下流のETS因子FLI1とERG (Kanki and Minami, Nuc.Acids.Res. 2017)を共にノックダウンすると内皮ー間葉系転換(EndMT)を引き起こす事がゲノムワイドに証明され、このEndMT現象はB16メラノーマやLLCなどの腫瘍内血管内皮でも生じていることを明らかにした(Nagai and Minami, In revision status)。ただ、ERGを組織特異的なCreリコンビナーゼ発現マウスと掛け合わせることで発現できるconditional transgenicマウスをRosa-locusノックイン手法で樹立し、がん転移や担がんマウスでのがん増殖の度合いを解析したところ、有意差をもった転移やがん増殖抑制効果が認められなかった。これはEndMTをin vivoで阻害してもがんの増殖や転移に大きな抑制効果として反映されないのか、あるいは、ERGの発現
慢性潰瘍部での遊走表皮細胞インテグリン発現の変化,真皮細胞外基質蛋白の解析

慢性創傷(褥瘡)での再上皮化遅延の病態を明らかにするために,(1)褥瘡部遊走表皮細胞におけるα5β1,αvβ6インテグリン発現の変化を急性創傷(熱傷)(コントロール)でのそれらと比較して検索した。(2)また,α5β1,αvβ6インテグリン発現の変化と,遊走表皮の組織学的所見,ラミニン染色所見とを比較検討した。(3)さらに,リガンドである真皮内フィブロネクチン分布の変化を検索した。急性創傷(熱傷)(コントロール)6例と慢性創傷(褥瘡)11例について,α5β1,αvβ6,ラミニン,フィブロネクチンの発現を蛍光抗体法により観察した。組織学的所見はHE染色標本にて観察した。その結果,熱傷(コントロール)において,遊走表皮先端部のα5β1およびαvβ6発現は全例で強陽性から陽性であった。組織学的に遊走表皮は全例で延長(6例中4例で著明に延長)していた。表皮真皮接合部位でのラミニンは全例で陰性であった。真皮内フィブロネクチンは6例中3例で増加していた。これに対し,褥瘡では,α5β1は11例中8例で,αvβ6は11例中7例で弱陽性ないし陰性であった。組織学的に遊走表皮は中等度から軽度延長,ないしは肥厚,鈍化していた。ラミニンは11例中7例で先端部まで陽性か僅かに染色されなかった。フィブロネクチンは全例で弱陽性ないし陰性であった。加えて,表皮真皮接合部位におけるα5β1陽性部,ラミニン陰性部,フィブロネクチン陽性部の距離の測定結果において,熱傷(コントロール)および褥瘡ともに,α5β1陽性部の距離とラミニン陰性部の距離との間に統計学的に有意の相関性を認めた。しかし,α5β1陽性部の距離とフィブロネクチン陽性部の距離との間には熱傷,褥瘡ともに有意の相関性を認めなかった。結論として,(1)褥瘡部遊走表皮細胞におけるα5β1,αvβ6発現は熱傷(コントロール)と比較して滅弱ないし陰性化していた。(2)α5β1,αvβ6発現の減弱ないし陰性化は組織学的所見ならびにラミニン染色所見で表された表皮遊走の遅延と関連していた。α5β1陽性所見とラミニン陰性所見との間には熱傷,褥瘡ともに統計学的に有意の相関性が証明された。(3)リガンドである真皮内フィブロネクチン分布は褥瘡の全例で滅少していた。フィブロネクチン分布とα5β1陽性所見との間には熱傷,褥瘡ともに有意の相関性はなかった。以上より,α5β1,αvβ6インテグリン発現の陰性化が褥瘡の再上皮化遅延の要因になっている可能性が考えられた。また,真皮内フィブロネクチンの減少が再上皮化遅延に関与している可能性が推測された。本研究ではさらに,ラット急性創傷モデルを用いて,遊走表皮細胞でのα5β1発現の経時的変化を観察し,それらの所見とラミニンならびにフィブロネクチン染色所見との相関性を調べた。その結果,以下の点が明らかになった。16週齢(500g)ラットの急性創傷部遊走表皮細胞におけるα5β1発現は,潰瘍形成後4日目で最高であり,21日目の創閉鎖に伴い陰性化した。α5β1発現の経時的変化は,ラミニン染色所見で表される表皮遊走所見と相関していた。しかし,α5β1発現の経時的変化は真皮内フィブロネクチン分布とは統計学的に相関していなかった。また,8週齢(300g)と16週齢(500g)のラットでの創傷治癒過程およびα5β1発現の経時的変化を比較検討した。創閉鎖までの時間は8週齢のラットで著明に短縮した(8週齢:2週間,16週齢:3週間)。α5β1発現の経時的変化は,8週齢ラットでは,16週齢ラットに比べてより早期にその変化が出現した。真皮内