hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
置換活性遷移金属錯体と有機典型元素配位子とから構成される新構造ハイブリッド多核錯体

前二年度で研究したPd4Si3型の平面四核錯体およびこれに対するヨウ化銀等の付加反応の成果を新しい方向に展開させる目的で、異種金属混合平面四核錯体を合成し、そのヨウ化銅、ヨウ化銀との反応を行って、以下の新しい成果を得た。橋かけシリル配位子を有する二核パラジウム(I)錯体と単核ジシリル白金(II)錯体との反応によってトルエン可溶の生成物を得た。X線結晶構造解析の結果より、単結晶中にPd4Si3型錯体とPd3PtSi3型錯体の1:3の割合で含む混合物として結晶化していることがわかった。一方橋かけシリル配位子を有する二核パラジウム(I)および二核白金(I)錯体とを適切な条件で反応させると、Pd3PtSi3型錯体を生成した。いずれの方法で得られた混合金属錯体でも含まれる白金は平面多核コアの中心部にあり、周辺部に白金が位置することはないことがわかった。Pd3PtSi3型錯体とヨウ化銅、ヨウ化銀との反応によって、これらの化合物が付加したPd3PtSi3Cu(Ag)型の錯体を生成した。この五核錯体は、いずれも溶液中で動的な構造変化をおこすことがわかった。詳しい解析の結果、銅または銀が四核平面上を円滑に移動し、Pd-Ag及びPt-Ag結合をどちらも保ちつつ、NMR時間スケールでの構造変換を起こしていることを明らかにできた。パラジウム四核錯体に比較して、パラジウム、白金混合平面錯体は、基本的に類似の構造、電子状態を有し、反応性も共通点が多く、本研究の成果が一般性にとむことがわかった。前年度、Pd4Si3型の平面四核錯体の合成と構造解析及びヨウ化銅の付加体である五核錯体の生成について成果を得た。この錯体の温度可変^1HNMRスペクトルから銅が平面上で結合を保ちながら旋回する、という運動をNMRタイムスケールでおこなっていることがわかった。一方、五核錯体の溶液を60°C以上に加熱するとヨウ化銅が解離し、平面型四核錯体が再生した。NMRによりこの反応を追跡すると副生成物のない定量的な反応であることがわかった。五核錯体からの熱的なヨウ化銅解離反応の速度を測定したところ、反応は錯体に一次であるが、低温では誘導期を有することがわかった。反応の活性化パラメーターはΔH^≠=99.6kJmol^<-1>,ΔG^≠=109.0kJmol^<-1>, ΔS^≠=-31.5Jmol^<-1>deg^<-1>であり、活性化エントロピーが負の値をもつことから、単純な解離反応ではなく、何らかの中間体を経由する反応であると理解される。ジフェニルゲルミレン配位子を有する四核錯体を合成する過程で、ゲルマパラダサイクルの生成をみいだし、その構造や反応性を明らかにした。ビスゲルミルパラジウム錯体に過剰のジフェニルゲルマンを添加して加熱すると二核環状錯体と単核ゲルマパラダシクロペンタンとが生成し、両者の生成は反応の条件によって制御することができた(式2)。ジフェニルゲルマンの脱水素縮合反応が環状中間体を経由する可能性を示すもので興味深い。今後、四核錯体とあわせて研究を進める予定である前二年度で研究したPd4Si3型の平面四核錯体およびこれに対するヨウ化銀等の付加反応の成果を新しい方向に展開させる目的で、異種金属混合平面四核錯体を合成し、そのヨウ化銅、ヨウ化銀との反応を行って、以下の新しい成果を得た。
水平的競争制限の経済政策

主要なテーマとして,(1)課徴金のカルテル抑止に対して持つ効果と,カルテル抑止を目的としたときの望ましい課徴金制度の研究,(2)市場のグローバル化を反映した,諸産業の世界的な寡占化の実態の調査,(3)'さまざまな企業の競争戦略が市場集中と経済厚生にもたらす影響に関する研究,をとりあげた。(1)については,課徴金額の算定方法のもととなる課徴金ベースと課徴金レートがカルテル抑止と経済厚生にどのように影響するかについて分析し,望ましい課徴金制度を考察した。損害賠償ベースの課徴金制度だけが,たとえ課徴金制度がカルテルを抑止できない場合でも,企業の生産水準をより競争的水準に近づけることを示した。(2)については,90年代後半以降,合併・買収により主要な産業で市場集中が進んでいるが,80年代以後という長い期間で見ると必ずしも集中が大きく進んでいるわけではないこと,しかし,資本提携によりグループ化が大きく進展しており,グループ単位の集中度は90年代後半から急速に高まっていることがわかった。(3)については,まず,日本航空と日本エアシステムの統合について,両社の羽田空港発着枠が不十分ではなかったかと考えられること,理論的には1先導者と2追随者からなる市場より,対等な2社からなる市場の方が協調を生み出しやすいこと,今後競争が抑制されるなら新幹線との競合が弱い路線となるであろうことを指摘した。次に,航空産業における,既存大手航空会社の新規参入会社に対する略奪価格の問題を考察した。アメリカやドイツでの事例を検討した後に,日本の直近の事例について考察した。日本での公正取引委員会の対応は,複占に近い航空市場での競争を長期的に維持するために必要な措置であったが,ドイツ連邦カルテル庁の対応と比較すると,価格と費用の関係の考慮,および下限価格制限の範囲と期間の明示で不十分な点が残ったと結論付けた。我々は,今回の研究方針として,実態調査のなかから新たな事実や理論的な疑問点を見出し,それについて現実的で緻密な経済学研究を行うとともに,現実的で建設的な政策的提言を行うことを重視している。まず,(1)価格カルテルの研究については,(i)事例研究として,水道メータの入札談合の事例を扱い,いくつかの地方公共団体等へのヒアリング結果と政府統計資料により,カルテルのもたらした価格変化と損害額を推計した。(ii)カルテルに対する現行政策の有効性については,課徴金制度のカルテル抑止効果についての理論研究を行った。この論文のレフェリーからは,「本論文は制度を反映したモデルを組み立て,そこから興味深い結論を導いているという点で高く評価できる。」というコメントをいただいた。(iii)カルテルに対する政策提言としては,望ましい課徴金制度の理論的研究を行った。次に,(2)合併・買収と提携の研究については,(i)主要産業における実態調査として,世界における主要な合併・買収や提携および世界的な市場集中について調査・資料収集を行った。これまでに取り上げた産業は,自動車産業,鉄鋼産業,航空輸送産業,二輪車産業,自動車部品産業,航空機産業,および,IT産業,特に半導体デバイス,半導体製造装置,パーソナル・コンピュータ,ソフトウェア,モバイル機器であった。さらに現在,機械産業,電気機器産業へと対象を広げているところである。(ii)企業合併に対する規制の問題として特に注目すべき事例として,日本の航空輸送産業の再編となる日本航空と日本エアシステムの統合をとりあげ,その評価についての研究を現在行っているところである。これまでの研究は,ヒアリングによる実態の調査と整理の段階であり,この作業を今後も継続する必要があると同時に,次の段階として,確認された事実の経済学的理解,また,そこから得られる政策上の含意ついて研究を進める段階に来ている。

我々は,今回の研究方針として,実態調査のなかから問題点を見出し,それについて経済分析を行うとともに,現実的で建設的な政策の評価・提言を行うことをめざしている。本年度も,そうした目的意識のもとで,水平的競争制限の経済政策に関して以下のような調査・研究を行った。合併・買収の研究については,2001(平成13)年11月の発表以来世間の関心を集めた日本航空(株)と(株)日本エアシステムの経営統合についての調査・研究を行った。関係者に対するヒアリングと各種資料にもとづき,競争政策上の問題点を整理・指摘する論文を発表した。航空市場の水平的競争制限についてはさらに,諸外国の興味深い政策的対応を参考にするべく,ドイツにおけるルフトハンザとユーロウィングスの合併,および,ルフトハンザのゲルマニア航空に対する略奪的価格設定,といった事例についての競争政策当局の対応,および航空市場の競争促進に関する航空政策当局と競争政策当局の対応について,それぞれの政策担当者からヒアリング調査を行った。来年度はさらに他国での事例調査を積み重ねる予定で,それらと比較して日本の航空産業に対する産業政策・競争政策を分析する論文を準備中である。昨年度,世界的な市場集中の調査・研究を行ったが,そこで市場集中が進んでいるとされた二輪車市場について,主要メーカーの一つである川崎重工業(株)をとりあげ,ヒアリングと各種資料にもとづいて,その歴史を分析する論文を発表した。価格カルテルの研究については,昨年度に調査した水道メーター市場についてヒアリング調査による追跡調査を行った。我々は,入手したデータから再度談合を行っているかもしれないという懸念を抱いていたところ,公正取引委員会は調査に乗り出した。この事件に関する公取委の調査結果を待ちながら,市場集中とカルテルに関する論文を準備中である。本年度は,第一に,水平的競争制限に対する具体的な政策問題として,最近の日欧米における航空産業で生じた略奪価格問題に対する政策の整理と検討を行った.これは,柳川隆著「航空運賃自由化後の運賃介入」と題する論文となった.第二に,水平的競争制限の政策の理論的分析として,課徴金制度のカルテル抑止効果と望ましい課徴金制度について研究を行った.これは,柳川隆,吉野一郎著"Surcharge and Cartel Deterrence,"という論題として,Second International Conference of the Japan Economic Policy Associationで学会報告された。第三に,水平的競争制限に対する政策の基礎理論として,競争と市場構造(特に,市場占有率)との関係について研究を行い,柳川隆著「競争と構造・成果」という論文となった。さらに,その理論を水道メータ市場に具体的に適応した研究として,柳川隆著「市場占有率と市場における競争状態」という論文となった。第四に,水平的競争制限の元となりうる市場集中について,DRAM市場の継続的調査を行ったのが,吉野一郎著「DRAM市場における世界的な寡占の動向」である。
メディシナルフラワーを素材とした抗老化関連物質の探索

メディシナルフラワー(薬用花)に着目し、抗老化関連物質の開拓を志向した探索研究を実施した。その結果、椿花、蓮花、白梅花、イランイランノキ(Cananga odorata)花部およびヘンナ(Lawsonia inermis)花部から得られたオレアナン型トリテルペンサポニン、ベンジルイソキノリンアルカロイド、アシル化キナ酸、リグナン、フラボノイドなどが有意なメラニン生成抑制作用などを示すことを明らかにするとともに構造と活性に関する知見を得た。また、蓮花主要成分nuciferinなどのアポルフィン型アルカロイドのメラニン生成抑制作用について一部作用メカニズムを解明することができた。本研究は、メディシナルフラワー(薬用花)に着目し、抗老化関連物質の開拓を志向した探索研究を実施する。すなわち、食経験があるなど安全性が確立している薬用花を厳選・探索資源とし、抗老化関連物質を効率よく探索する。今年度は,日本などにおいて解毒薬などとして利用されているウメ(Prunus mume)の花部(白梅花)のエキスの生物活性評価を行ったところ,メラニン生成抑制およびアルドース還元酵素の阻害作用を見出した.そこで、中国産白梅花の活性成分の探索を行ったところ,15種の新規ポリアシル化ショ糖mumeose AーO, mumeic acid Aを含む3種の新規アシル化キナ酸および1種の新規フラボノール配糖体mumeflavonoside Aを単離した.白梅花の主要成分であるアシル化キナ酸は,細胞毒性を示すことなく有意なメラニン生成抑制作用を示した.特に,5-O-(E)-feruloylquinic acid methyl esterは強いメラニン生成抑制作用を示すことが明らかになるとともに構造と活性に関する知見が得られた.この実験結果は,白梅花の伝承薬効の一つである美顔効果を支持すると考えられる.また,昨年度に引き続き,中国産および韓国産椿花の活性成分の探索を行ったところ,10種の新規オレアナン型トリテルペンサポニンsanchakasaponin AーHおよびcamellioside E, Fを見出すとともに,得られたsanchakasaponin類に強いメラニン生成抑制活性を見出した.日本産椿花に含有されるcamellioside類にも有意なメラニン生成抑制活性と細胞毒性が認められる一方で,繊維芽細胞増殖促進作用を示すことが明らかとなった.この細胞選択性は,皮膚疾患の治療薬の開発において重要であると考えられる.本研究は.メディシナルフラワー(薬用花)に着目し.抗老化関連物質の開拓を志向した探索研究を実施する.すなわち.食経験があるなど安全性が確立している薬用花を厳選・探索資源とし.抗老化関連物質を効率よく探索する.最終年度は,古来より東南アジア諸国において,降圧,鎮静薬等に用いられてきたタイ産バンレイシ科植物イランイランノキ(Cananga odorata)花部のエキスにマウスメラノーマ由来B16 melanoma 4A5細胞におけるメラニン生成抑制作用を見出したことからその活性成分の探索を行った.その結果,15種の既知成分とともに,2種の新規リグナンcanangalignan I, IIおよび3種の新規テルペンcanangaterpenes I, II, IIIを単離した.次に,得られた成分のメラニン生成抑制作用について検討を行ったところ,数種のモノテルペン,セスキテルペン類が細胞毒性を示すことなく有意なメラニン生成抑制作用を示すことが明らかとなった.特に,canangaterpene I [IC50: 3.6 μM]には,ポジティブコントロールとして用いたアルブチンと比べ,強い抑制作用が認められた.また,得られた成分において,種々の構造活性相関を明らかとした.さらに,ヘンナ(ヘナ,指甲花, Lawsonia inermis)花部のトリテルペン類が抗AGEs作用を,フラボノイド成分がメラニン生成抑制作用やプラスミン阻害作用を示すことを明らかにした.加えて,昨年度に引き続きアジサイ属植物アマチャ(Hydrangea macrophylla var. thunbergii)の花部の含有成分の探索を行ったところ,ジヒドロイソクマリン配糖体などを得ることができた.また,これまでに蓮花から得られたnuciferinなどのアポルフィン型アルカロイドのメラニン生成抑制作用について一部作用メカニズムを明らかにした.メディシナルフラワー(薬用花)に着目し、抗老化関連物質の開拓を志向した探索研究を実施した。本研究は、メディシナルフラワー(薬用花)に着目し、抗老化関連物質の開拓を志向した探索研究を実施することを目的とする。今年度は、ツバキ(Camellia japonica)花部およびハス(Nelumbo nucifera)花部のエキスに有意なマウスメラノーマ由来B16-4A5細胞におけるメラニン生成抑制作用を見出したことから、その活性成分の探索を行った。すなわち、ツバキ科植物ツバキ(C. japonica)花部は古来より日本、中国おいて、抗炎症薬、吐血および出血時の治療薬等に用いられている.中国雲南省産ツバキ(C. japonica)

花部のエキスにメラニン生成抑制活性を見出したことから、そのメタノール抽出エキスを、溶媒分配し、活性の集約していた1-ブタノール移行部を各種クロマトグラフィーにて繰り返し分離精製した。その結果、既知サポニン成分とともに4種のアシル化された新規オレアナン型トリテルペン配糖体を単離した。また、サポニン成分がメラニン生成抑制活性を有することを見出し、アシル基の有無やアグリコン部への結合位置が活性に重要であることを明らかにした。一方、ハス(N. nucifera)はインド、中国原産の大型多年生水生草本である。その根茎は食用にされる他、花部は東南アジア地域で飲料素材として広く利用されている。タイ産ハス花部抽出エキスにメラニン生成抑制活性を見出したことから、その活性成分の探索を行ったところ、6種のアルカロイドを含む計10種の既知成分を単離することができ、nuciferineなどアポロフィン型アルカロイドに有意な活性を見出した。また、N位のメチル基が強い活性の発現に必須であるなど構造と活性に関する知見が得られた。白梅花や椿花などの種々のメディシナルフラワー(薬用花)のエキスおよびトリテルペン配糖体,アシル化キナ酸誘導体などの含有成分に皮膚の老化の観点などにおいて重要だと考えられるメラニン生成抑制作用・繊維芽細胞増殖促進作用を見出すとともに、構造活性相関および一部の作用様式に関する知見を得る事ができた。特に,椿花から得られたcamellioside類が細胞選択性を示すことなど興味深い知見を明らかにすることができた.平成24年度の当初計画をほぼ達成したものと考える.種々のメディシナルフラワー(薬用花)のエキスおよび含有成分に皮膚の老化の観点などにおいて重要だと考えられるメラニン生成抑制作用を見出すとともに、構造活性相関における知見を得る事ができた。平成23年度の当初計画をほぼ達成したものと考える。引き続き,甘茶の花部などを含めた種々のメディシナルフラワー(薬用花)から抗老化関連物質の探索を行うとともに,昨年度までに得られたアシル化キナ酸などの有望な成分については活性発現の必須構造など構造上の特徴と薬理活性との関連性を検討する.また,有望な成分の作用メカニズムの解明研究を行い,新しい抗老化関連物質および機能性素材の開発を目指す.引き続き、食経験があるなど安全性が確立している種々のメディシナルフラワー(薬用花)から抗老化関連物質の探索を行うとともに、有望な成分については活性発現の必須構造など構造上の特徴と薬理活性との関連性を検討する。また、有望な成分の作用メカニズムの解明研究を行い、新しい抗老化関連物質および機能性素材の開発を目指す。平成25年度は,有機溶媒,シリカゲル等の抽出分離用試薬,細胞培養用試薬,測定用試薬等のバイオアッセイ用試薬,フラスコ等のガラス器具,細胞培用プラスチック器具.マウス等の実験動物を購入する予定である.
新規相同組換え因子の探索と組換え反応機構の解析

相同組換えは、DNAの二重鎖切断修復と遺伝的組換えに働く必須の生命反応である。ヒトにおける相同組換え経路では多数のタンパク質が働いているが、現在解明されているタンパク質群のみでは、その反応機構を部分的にしか説明することができない。本研究では、相同組換えにおいて働く新規のタンパク質として、GEMIN2、EVL、PSFなどを同定し、それらの相同組換え素過程における役割を明らかにした。また、既知の組換え修復タンパク質FANCD2のユビキチン化に、DNAとFANCIが重要であることを見いだした。相同組換えは、DNAの二重鎖切断修復と遺伝的組換えに働く、ゲノムDNAの安定維持において重要な生命反応である。相同組換えの破綻は、細胞において染色体異常を引き起こすことが知られており、二重鎖切断によって誘起される発がんや、遺伝的組換え異常による不妊症発症の原因となる。ヒトにおける相同組換え経路では多数のタンパク質が働いていると考えられているが、いまだ多くの未同定な因子群が存在している。そこで本研究では、相同組換えにおいて働く新規のタンパク質を同定し、その生化学的機能および立体構造を明らかにすることで、相同組換え素過程の反応機構の解明を目指す。本年度では、まず、先行研究により得ている相同組換え因子候補群の情報から解析対象としてヒトEVL、GEMIN2、およびSPF45などを選定し、それら相同組換え因子候補をリコンビナントタンパク質として精製した。そして、それらの機能を生化学的解析によって検討した結果、以下のことが明らかになった。まずEVLに関して、これまで当研究グループによって明らかにされていた、相同組換え中心酵素RAD51のDNA組換え反応の活性化機能に加えて、EVLがトポイソメラーゼと直接相互作用し、環状単鎖DNAをカテネーションする活性を有することを発見した。次に、ヒトGEMIN2がRAD51と直接相互作用して、相同組換え修復を活性化する新規の因子であることを明らかにした。さらに、ショウジョウバエやアラビドプシスにおいて相同組換えへの関与が指摘されていたSPF45のヒトホモログを精製し、ヒトSPF45が組換え中間体であるHolliday構造特異的に結合するDNA結合タンパク質であることを明らかにした。これらの結果は、相同組換え反応の分子機構解明のための重要な知見を与えた。本研究では相同組換えの分子機構の理解を目的として、その過程で働く未知の因子を同定し、それらの機能を分子レベルで解明することを目的としている。相同組換えの破綻は染色体異常の直接原因となり、発がんや不妊症発症の原因となる。本年度では、我々の先行研究により同定しているヒトEVL,GEMIN2およびPSFに着目した。ヒトEVL、GEMIN2およびPSFをリコンビナントタンバク質として精製し、それらの相同組換えにおける役割を生化学的解析によって検討した。まずEVLのパラログであるMENAおよびVASPの精製系を確立し、それら3種のタンパク質の相同組換え活性の比較を行った。そして、それら3種類のタンパク質のいずれも同様にRAD51依存的および非依存的な相同組換え反応を活性化できることが明らかになった。GEMIN2については、SMNとの複合体として精製する系を確率し、SMN-GEMIN2複合体の生化学的解析を行った。その結果、SMN-GEMIN2複合体は、GEMIN2単独と比較して飛躍的にRAD51依存的な相同組換え反応を活性化することが明らかになった。また、GEMIN2はDNAに結合する活性を持たないが、SMNはそれ自身でDNAと結合するサブユニットであることなども分かった。そしてPSFについては、精巣でのPSFの高発現を見いだし、減数分裂期特異的な相同組換え酵素であるDMC1の相同組換え活性は顕著に増大する活性を有することを発見した。これらの結果は我々が独自に発見した新規相同組換えタンパク質EVL、GEMIN2およびPSFおよびそれらの関連因子が相同組換え反応に重要であることを示しており、相同組換え分子機構の理解ための重要な新知見を与えたと考えられる。加えて、本年度では、新規RAD51阻害剤として、ハレナキノンを海綿抽出液より同定した。本研究では相同組換えの分子機構の理解を目的として、相同組換え関連因子群の機能を分子レベルで解明することを目的としている。相同組換えの破綻は染色体異常につながり、発がんや不妊症発症などの原因となることが知られている。これまでに我々は、相同組換えに関わる新規タンパク質としてヒトPSFを同定している。PSFは精巣で高発現しており、減数分裂期特異的相同組換え酵素であるDMC1の相同組換え活性を顕著に促進する活性を有することを既に見出している。本年度は、PSFによるDMC1の相同組換え活性の促進メカニズムについて詳細に解析を行った。

その結果、DMC1が相同組換え活性を示すためには、単鎖DNAおよび二重鎖DNAと同時に結合し三者複合体を形成する必要があるが、PSFはDMC1の三者複合体形成を促進することを明らかにした。また、PSFは単鎖および二重鎖DNAを凝集させDNA分子ネットワークを形成させることにより、DMC1が三者複合体形成を促進しやすい場を提供していることが示唆された。また、相同組換えにおいて重要な役割を担う、FANCD2およびFANCIの活性化機構についての解析を行った。FANCD2は、ユビキチン化されることによって活性化されることが知られている。そこで、FANCD2およびFANCIをリコンビナントとして精製する系を確立し、試験管内でのユビキチン化の解析を行った。その結果、FANCD2のユビキチン化には、ユビキチン化酵素であるE1、E2、およびE3に加え、FANCIが必須であることが明らかになった。加えて、FANCD2のユビキチン化は、DNAが存在することで100倍近く活性化されることを発見した。これらの結果は、相同組換え分子機構の理解ための重要な新知見を与えたと考えられる。研究代表者らが独自に同定した、新規相同組換え関連タンパク質候補である、EVLおよびそのパラログ、SMN-GEMIN2複合体、およびPSFの生化学的解析によって、これらの相同組換えにおける機能を提案することができた。これは当初の目標に準じた成果であった。これらの成果に加えて、相同組換えを調節する低分子化合物の同定に成功したことにより、本年度の研究は計画以上に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者らが既に同定している新規相同組換え関連タンパク質候補群の機能、構造解析を引き続き行い、これまで未知であった相同組換えのステップの分子機構の解明を目指す。
市販抗血清とカラム凝集法を組み合わせた血液型抗原検査の簡便法の開発

【目的】検査過誤防止のためにABO,Rho(D)血液型検査には、カラム凝集法を用いた自動化法が導入されている.ABO,Rho(D)血液型以外の血液型抗原検査も骨髄移植の生着判定や不規則抗体保有患者の血液型抗原を検査することがある.しかし抗血清は高価で,検査する患者も輸血を実施している場合が多く,判定が困難な場合がある.そこで,希釈した市販の試験管法検査用抗血清(抗C,c,E,e,M,N,Pl,Le^a,Le^b,Fy^a,Fy^b,Jk^a,Jk^b,S,s血清)25μlと被検血球50μlをゲルカラムカード上で最も良好な条件を設定して,安価で判定が容易な方法の開発を行なった.【方法】1%アルブミン生理食塩水で100倍希釈した抗C,c,E,e,血清は,オリンパス社NaCl/Enzymeカードで37°C15分,1%アルブミン生理食塩水で10倍希釈した抗Fy^a,Fy^b,Jk^a,Jk^b,S,s血清は,IgGカードで37°C15分,また1%アルブミン生理食塩水で10倍希釈レた抗M,N,Pl,Le^a,Le^b血清は,抗Pl,Le^a,Le^b血清には反応増強剤としてブロメリンを添加してNaCl/Enzymeカードで室温15分反応後,900g,10分の遠心判定した.【結果】希釈した抗血清は,抗Jk^aおよび抗e血清で,わずかな劣化がみられたが,他の抗血清は6ケ月間は安定であった.また骨髄移植前後に血液型抗原検査依頼のあった患者検体10本について,試験管法とゲルカード法の結果の一致率は,Rh血液型100%,MNSs血液型98%,kidd血液型100%,Duffy血液型85%,Le血液型93%,Pl血液型100%と良好であった.また輸血を実施した患者の血液型は,試験管法では輸血による影響で判定が困難であるが,ゲル・カラム法ではダブル・ポピュレーションを示すので判定が容易であった.【考察】市販の抗血清の使用量を少なくしてABO型以外の血液型抗原検査をゲル・カラム法で検査することで,検査費用も約3分の1程度で可能であった.【目的】検査過誤防止のためにABO,Rho(D)血液型検査には、カラム凝集法を用いた自動化法が導入されている.ABO,Rho(D)血液型以外の血液型抗原検査も骨髄移植の生着判定や不規則抗体保有患者の血液型抗原を検査することがある.しかし抗血清は高価で,検査する患者も輸血を実施している場合が多く,判定が困難な場合がある.そこで,希釈した市販の試験管法検査用抗血清(抗C,c,E,e,M,N,Pl,Le^a,Le^b,Fy^a,Fy^b,Jk^a,Jk^b,S,s血清)25μlと被検血球50μlをゲルカラムカード上で最も良好な条件を設定して,安価で判定が容易な方法の開発を行なった.【方法】1%アルブミン生理食塩水で100倍希釈した抗C,c,E,e,血清は,オリンパス社NaCl/Enzymeカードで37°C15分,1%アルブミン生理食塩水で10倍希釈した抗Fy^a,Fy^b,Jk^a,Jk^b,S,s血清は,IgGカードで37°C15分,また1%アルブミン生理食塩水で10倍希釈レた抗M,N,Pl,Le^a,Le^b血清は,抗Pl,Le^a,Le^b血清には反応増強剤としてブロメリンを添加してNaCl/Enzymeカードで室温15分反応後,900g,10分の遠心判定した.【結果】希釈した抗血清は,抗Jk^aおよび抗e血清で,わずかな劣化がみられたが,他の抗血清は6ケ月間は安定であった.また骨髄移植前後に血液型抗原検査依頼のあった患者検体10本について,試験管法とゲルカード法の結果の一致率は,Rh血液型100%,MNSs血液型98%,kidd血液型100%,Duffy血液型85%,Le血液型93%,Pl血液型100%と良好であった.また輸血を実施した患者の血液型は,試験管法では輸血による影響で判定が困難であるが,ゲル・カラム法ではダブル・ポピュレーションを示すので判定が容易であった.【考察】市販の抗血清の使用量を少なくしてABO型以外の血液型抗原検査をゲル・カラム法で検査することで,検査費用も約3分の1程度で可能であった.
複製フォーク複合体の構築、維持、変換の研究

DNA複製にともなって染色体構造の基盤が構築される。その中心的役割を持つ複製フォーク複合体の構築原理、機能動態の解明をヒト細胞および古細菌(アーキア)を材料にして行った。その結果、ヒト細胞の複製クランプPCNA、そのローダー因子RFC、およびそれらのパラログ複合体の相互作用因子を同定し、複製と染色体恒常性維持機構との共役機構について新しい知見を得た。またアーキアの特性を活用し、アーキア由来の複製関連因子の生化学的、構造生物学的研究を行い、複製フォークの進行時と異常時の修復の分子集合を明らかにした。複製フォーク複合体を染色体サイクルでの複製と染色体恒常性維持との共役点としてとらえ、ヒトおよび古細菌の複製因子PCNAを中心とする機能的複製フォーク複合体の構築原理の解明を進め、次の研究成果を得た。1.染色体接着に関与するヒトPCNAの新規ローダー、Ctf18-RFCの標的因子検索を目的として、Ctf18-RFCとPCNAによって特異的に活性促進を受けるDNAポリメラーゼの精製を行った。その結果、DNA損傷乗り越え合成を行うpolηを同定した。さらに、polηがCtf18-RFCと相互作用することを明かにした(釣本)。2.PCNAユビキチン化による複製と修復の機能連係の解析のため、in vitroのPCNAユビキチン化反応系を構築し、PCNAローディング反応をユビキチン化反応と連動させることで、高効率のPCNAユビキチン化が起きることを明かにした。さらにユビキチン化PCNAによりDNA損傷乗り越え合成酵素polηの活性を促進することを明かにした(釣本)。3.染色体安定性維持に関わる新規PCNAローダー、ヒトElg1複合体の昆虫細胞を用いた発現系を作成し、RFC小サブユニットと共発現することでローダー型複合体が再構築できることを明かにした(釣本)。4.超好熱古細菌Pyrococcus furiosus由来の蛋白質因子を用いて、クランプローディング、ラギング鎖プロセシング、組換え修復過程に相当するPCNA-RFC複合体,DNALIgase-PCNA-DNA複合体、Hjm-PCNA複合体を再構築し、その構造と機能についての解析を行った(石野)。5.ファンコニ貧血症の原因遺伝子のホモログで、石野が古細菌から発見した組換え修復関連タンパク質Hefの複製フォーク停止修復過程における働きの解明を進めた。さらに釣本と協力してヒト細胞におけるFLAG-Hef発現細胞を構築した(石野)。1.染色体接着に関与するヒトPCNAの第2のローダー複合体Ctf18-RFCおよびPCNAによって特異的に活性促進を受けるDNAポリメラーゼとしてpolηを同定した。さらに、polηがCtf18-RFCと直接相互作用し、活性促進を受けることを明かにした(釣本)。2.polηとCtf18-RFCの関係に引き続き、他のDNAポリメラーゼとローダーの相互作用を解析したところ、RFCやDNAポリメラーゼεにも特異的相互作用があり、DNAポリメラーゼーローダー間の相互作用が多岐にわたり存在し、複製フォークでの機能制御に重要な役割を果たしていることを示した(釣本)。3.チェックポイント応答系のクランプRad9-Hus1-Rad1複合体のRad9タンパク質がCKIIキナーゼと相互作用し、そのC末端の標的部位が特異的にリン酸化されることを明かにした(釣本)。4.古細菌のDNA複製フォーク進行機構に関する研究で、ラギング合成時のDNAリガーゼによる連結反応について、成果が上がった。DNAリガーゼ全分子の結晶構造解析の結果、この酵素が基質を認識して結合する機構に対する理解が深まったのに加えて、PCNAがDNA鎖連結反応を促進すること、そして、リガーゼ-PCNAの相互作用について、新規の様式を発見した。さらに、DNAリガーゼ-PCNA-DNA、DNAポリメラーゼ-PCNA-DNAなどの三者複合体の構造解析を進めるための基礎実験を進めた。フォーク停止修復に関わるHef蛋白質については、ヒトホモログ(hHef)の遺伝子をクローニングし、発現系を構築して、蛋白質解析のための基盤を作った。(石野)。複製フォーク複合体を染色体サイクルでの複製と染色体恒常性維持との共役点としてとらえ、ヒトおよび古細菌の複製因子PCNAを中心とする機能的複製フオーク複合体の構築原理の解明を進め、次の研究成果を得た。1. Ctf18複合体によって特異的に促進されるDNAポリメラーゼとしてヒトPol etaを同定した。さらに、pol etaはCtf18-RFCだけでなくRFC複合体とも物理的に相互作用する事を明らかにした。このことからクラプだけでなくローダーP複合体もDNAポリメラーゼの機能制御因子である事を示した。2.複数のローダー相互作用

困子の網羅的解析をしたところ、RFC複和体、Ctf18複合体およびチェックポイント因子Rad17複合体がいくつかの複製因子と共通の相互作用を持つ事を明らかにした。つまりローダー複合体はいくつもの複製因子の機能制御に関わる中心的因子であることを示唆している。3.チェックポイントクランプRad9-Hus1-Rad1複合体のRad9タンパク質のC末端がCKIIキナーゼにより特異的にリン酸化され、その変異がDNA損傷応答に重要であることを明らかにした(釣本)。4.古細菌DNAリガーゼ全分子の結晶構造を解明し、DNAリガーゼ活性がPCNAによって促進されること、両蛋白質間の新しい相互作用様式があることを発見した。またこのDNAリガーゼが岡崎フラグメントを連結する過程の複合体の電子顕微鏡による単粒子解析を行った(石野)。5.古細菌の修復系因子Hef蛋白質のヒトオルソログでファゴニ貧血症の原因遺伝子(FANGM)であるヒトHef(hHef)の発現系を構築しその機能解析を行った。またHef以外にもフォーク構造特異的なヘリカーゼを古細菌から発見し、Hjmと名付けて、その性質解析を行った(石野)。複製フォーク複合体を染色体サイクルでの複製と染色体恒常性維持との共役点としてとらえ、ヒトおよび古細菌の複製因子による機能的複製フォーク複合体の構築原理の解明を進め、次の研究成果を得た。1.ヒト細胞でローダー複合体と相互作用する因子を網羅的解析し、RFC、Ctf18、Rad17などのローダー複合体がRPA、MCM、DNAポリメラーゼ等の複製因子と共通の相互作用を持つ事を明らかにした。(釣本)2.ヒト細胞でMCM複合体と特異的に相互作用する因子を網羅的に解析し、RFC複合体構成サブユニットを見だした。さらに組換えタンパク質を用いてこれらが直接結合していることを明らかにした。(釣本)3.染色体接着ローダーCtf18複合体とDNAポリメラーゼεの直接の相互作用の詳細を解析し、結合に関与するサブユニットを明らかにした。(釣本)4.チェックポイントクランプRad9-Hus1-Rad1複合体のRad9タンパク質のC末端の2個のセリンがCKIIキナーゼにより特異的にリン酸化され、それらの変異によりヒト細胞がDNA傷害に対して高感受性になることを明らかにした。(釣本)6.古細菌からGINS複合体を同定し、その機能解析を行った。その結果、古細菌のGINSはin vitroにおいてMCMヘリカーゼの活性を促進することを明らかにした。(J. Biol. Chem. 283, 1601-1609 :石野)ヒトおよび古細菌による機能的複製フォーク複合体の構築原理の解明を進め、以下の研究成果を得た。1. polεとCtf18-RFC間の結合に必要なpolεp260の領域を解析し、N末端側メインが関与することを示した。また、Ctf18-RFCのサブ複合体、18-1-8が結合に必要であることを明らかにした。
20世紀日本のビジネスエリート輩出システムに関する歴史・実証分析

戦前のマネジメント系高等教育機関、特に、高等商業学校(又は経済専門学校)を中心とした教育理念と方針、教科内容と制度、卒業生と就職経路の関連性を明らかにする資料収集に専念し、全国12高等商業学校とその関連した商業学校と商科大学の資料収集で成果を上げることが出来た。資料は印刷されたものだけでなく、教職員や同窓生などのヒアリングによっても収集した。戦前と戦後の資料を収集し、多面的な比較分析を進めている。本研究は、日本の経済発展を担ってきたビジネスエリート養成機関(特に、高等教育機関)に焦点を当て、経営教育の重要性を見出し、ビジネスエリート輩出のメカニズムを探ろうとするものである。本研究は、明治期から戦後の高度成長期に至るビジネスエリート教育機関の役割について、どのような理念の下に1どのような教育を行い、卒業生は如何なる活動を展開しながらビジネスエリートとしての役割を担ったかという問題に対して、戦前・戦後の連続性と不連続性を歴史的・実証的に研究し、経営教育のあり方を導き出すものである。まず研究チーム内での役割分担を決め、精力的に基礎資料を集めてきた。収集した資料を整理・分類し、毎週ミニ研究会・毎月研究会を行い、メンバー間の情報の共有化を計ると共に、意思統一を図った。それらの研究会には外部の研究者が参加したことも何度かあり、多くの刺激を受けた。収集したデータは、戦前期の各高等教育機関創立時から現在に至るまで、地域は、関西を中心とした大学.(戦前の)専門学校を中心に、関西と競合関係にあった中部地方、北陸地方、中・四国地方、九州地方に及んだ。収集した資料は刊行物を中心として(デジタルカメラで)複写し、一部は、その関係者からのヒアリングによって補強した。初年度として、それらの資料の中から、明治・大正期のビジネスエリートの動向について、全体的な把握を試みてきたが、まだ有効な結論までは至っていない。共同研究の初年度であったため、本研究では基礎的資料の収集が最大の研究実績であった。当然、刊行物を中心とした各種資料の調査に重点を置いてきたが、その都度、出来るだけ関係者とのヒアリングを合わせて行い、それが研究に対して、非常に重要な示唆を与える資料となった。その点を踏まえて、今後は、各高等教育機関の関係者の生の声を聴く必要性を痛感しており、証言的オーラルヒストリーも収集していくように決定した。収集した資料は、誰もが使えるように整理して、電子ファイルで保存していく。本研究は、明治期から戦後の高度成長期に至る1世紀間のビジネスエリート(幹部社員)を養成してきた高等教育機関の役割について、理念・教育内容・卒業生の活躍の相関性を時系列的に分析し、戦前・戦後のビジネスエリート簡素の連続性と不連続性、経営教育の実熊とあり方を歴史的・実証的に研究していこうとするものである。そのために、初年度に引き続き本エンドも、各役割分担者はそれぞれの担当分野の基礎資料を精力的に収集した。収集した資料の主なものとしては、教育制度、高等教育機関の校史、講義要綱、卒業者名簿、同窓会誌などであった。これ等収集した資料を整理・分類し、ミニ・ミーティング、外部研究者との交流、研究会を開催して、情報の共有化を図り、また、学会の報告などを通じて外部への情報発も行った。収集した基礎資料は、期間は高等教育機関の戦前の創立期から現在まで、範囲は関西を中心に、一部は北海道から九州まで全国に及んだ。さらに、収集資料の内容補強を含めて原田敏丸氏、山本長次氏、末田智樹氏を個別に招いて研究会を行い滋賀大学・大阪大学・佐賀大学・福岡大学などの変遷についての情報交換を行った。また、北海道大学大学文書館、小樽商科大学百年史編纂室、広島修道大学50年史編纂室などで、ヒヤリング調査と資料収集を行って成果を得た。初年度では、明治・大正期のビジネスエリートの動向について全体的な分析を試みたが、19年度では、分析範囲を戦前期から、戦後の教育改革期にまでに広げて分析を試みた。まだ、有効な結諭にまでは至っていないが、戦前までは明確な教育理念とエリートに対する教育が、戦後は、高等教育の総合化と大衆化の中でエリート教育が希薄になりつつあると考えられる。本研究は、明治期から戦後の高度成長期までの約1世紀間のビジネスエリート(企業のキーマンとしての幹部社員)を養成してきた高等教育機関の教育理念・制度・教育内容と卒業生の活躍動向などについて時系列的に分析し、戦前・戦後の経営教育の連続性と不連続性、経営教育の実態とあり方を歴史的・実証的に研究しようというものである。そのために、本年度も前2年間に引き続き資料収集に力を注いだ。収集した資料の主なものは、教育制度、高等教育機関の校史、講義要綱、同窓会誌などであった。これ等の収集した資料を各分担者が分類・分析を行い、検討会を開き、外部関係者の意見も求めた。

本年度の資料収集の主なものとしては、文献収集が多く、その収集資料の内容を補強するために、三島康雄氏、市川文彦氏から東京水産大学、甲南大学、奈良県立大学、早稲田大学、富山大学、関西学院大学などの教育理念と教育についての情報交換を行った。愛媛県松山市で、愛媛大学と松山大学をヒアリング調査及び資料収集を行い、地域に密着しながら分野の棲み分けを行い、地域から高い評価を受けている実態を良く知った。初年度は明治・大正期を、次年度では昭和初期から戦前期まで、本年度は戦後期の教育大改革から高度成長期にまで対象範囲を拡大して分析を試みた。これでほぼ当初の予定していた期間の概要を網羅出来た。戦前までの高等教育機関は、明確な教育理念とそれを実現する強い意志を持ち、エリート人材を生み出すのに貢献してきたが、前後は教育の多様化・総合化と大衆化の中で、規模競争に重点が置かれ、エリート教育が希薄になっている事実を確信するようになった。本研究は、明治期から戦後の高度成長期までの約1世紀間のビジネスエリート(企業の幹部社員・キーマン)を養成してきたシステムを分析するものである。今年度は科学研究費補助金交付の最終年度に当たり、これまで収集してきた各種データの補足に最重点をおいた。とれまで3年間で、相当量の近代日本設立後の学制・戦前の高等教育機関の創立から現代に至るまでの校史および関係資料・同窓会関連資料・創業経営者の伝記などの文献の収集に努力し、他の研究者から資料の閲覧を要求されるまでに充実してきた。それをさらに詳細データに近づけるための努力を行い、そめ結果、書籍関係の費用が当初計画より大幅に増えることになった。最終年度として、資料収集を完了させると共に、そのデータベース化と資料の分析結果のまとめを計画してきた。しかし、この点については、計画通りに進行しなかった。現在もディスカッション・ペーパーを作成中であり、それによって同じような研究を行っている諸学との議論を発展させたいと考えている。収集資料のデータベース化については、収集資料の整理を進めている状態であり、完成していないのは遺憾である。ただし、収集した資料の中には同窓会名簿などが含まれており、個人情報の問題等から公開資料とすることには問題があり、十分注意した取り扱いが必要となっている。当初の計画では戦前からの高等教育機関を主たる対象として研究を続けていたが、われわれ共同研究者が所属する戦後創設された帝塚山大学の資料収集と卒業生(同窓会)とのヒアリング調査を行った。大学教育の大衆化が顕著となった高度成長期に設立された後発大学と戦前からの高等教育機関であった大学との対比により、大学の大衆化と総合化の中で、ビジネスエリート教育の希薄化が鮮明となった。当初の計画が完全に達成できたとはいえないが、基礎資料の収集が略完了したので、これから息の長い研究が続けられる基盤が確立できたと期待している。
科学技術の醸成に寄与し「理数教育の充実」をはかる学習デザインの構築

資源の乏しい日本にとって,国の将来を左右するのは科学技術であり「理数教育の充実」は喫緊の課題であり,両教科の関連性を実感できるようなクロスカリキュラム的な教材の開発と指導を行う必要がある。本研究の目的は,わが国の科学技術の醸成に寄与する「理数教育の充実」を目指すことで,以下の3点である。(1)理科と数学の関連性を実感できる教材や指導プログラムを考案し,中等教育における「理数教育の充実」につながる学習デザインを構築する。(2)学習デザインに基づき,中学や高校で授業実践を行い,その教育的効果を検証する。(3)「理数教育の充実」に向け,理科と数学の最適な連携を育むための条件を明らかにする。
F-box DNAヘリケースの組換え修復における機能とその欠損の分子病態

分裂酵母から新規の組換え修復遺伝子として同定されたfbh1遺伝子のコードするタンパクは,SCFユビキチンリガーゼ複合体の基質サブユニットの特徴であるF-boxモチーフを持ち,同時にヘリケースの活性をもつユニークなタンパクである。酵母を用いて,fbh1タンパクの機能ドメインについて解析した結果,F-boxに突然変異を導入したもの(Fbh1-fb)では,このタンパクの核への移行が阻害され,その機能を完全に喪失した。一方,ヘリケースドメインに変異を導入したもの(fbh1-hl)では,DNA損傷なしでもフォーカス形成がみられ,DNA損傷により野生型よりもさらに強くフォーカス形成が誘導されることが明らかになった。これらのことは,それぞれのドメインが別の機能をもつとともに,SCFFbh1の複合体形成が核への移行とDNA損傷に依存するフォーカス形成に重要であることを示している(Sakaguchi, et. al.BMC Mol Biol.2008,9,27)。哺乳動物にも,Fbh1遺伝子がホモログとして存在する。その発現は,ユビキタスであり,種々の細胞に発現している。われわれは,この遺伝子をクローニングし,ノックアウトマウスを作成した。その結果,この遺伝子欠損によってもマウスは致死ではなく,正常に誕生し発育,繁殖も可能であることが分かった。このマウスの個体と細胞について,X線照射したが,感受性は野生型と同様であり,DNA二重鎖切断損傷の修復に欠陥があるとはいえなかった。この遺伝子のDNA修復に対する機能を他のDNA損傷あるいは別のストレスを与え,長期間観察による発がんなどへの影響を明らかにすることが必要である。本年度の主要な研究実績1.Fbh1タンパク質の機能ドメインの解析分裂酵母のfbh1遺伝子の各種のF-boxのミュータントを用いて、in vivoではDNA修復能、Skp1タンパク質との結合能、損傷後のfoci形成能などを調べた。F-boxのミュータントはDNA修復能が欠損変異と同等に下がり、Skp1タンパク質と結合できなくなっていた。また損傷後のfoci形成能も失われていた。この結果はFbh1が損傷DNA部位に移動して作用するためにskp1と結合して、その助けが必要であることを示している。Fbh1-SCF複合体はリン酸化タンパク質をユビキチン化すると考えられている。Rad55が出芽酵母でリン酸化されるので、ターゲット候補としてinvitroでのRhp55のユビキチン化を検証するために抗体によるRhp55を検出するシステムを構築した。3.FBH1ノックアウト細胞の作成とその病態の解析遺伝子ノックアウトが容易なニワトリDT40細胞を用いて、fbh1のノックアウト細胞を作成して、放射線感受性、発がん剤に対する感受性を調べた。酵母で調べた染色体分離分配の異常がみられたが、放射線には感受性が増加しなかった。高発がん性の遺伝病の原因遺伝子Bloomと二重変異にすると、ゲノム分離異常が単独のミュータントより増加し、DNA鎖に切断をいれるCamptohtecinに感受性が高くなった。此れ等の結果は、Fbh-1とBloomタンパク質はDNAヘリカーゼとして、ゲノム安定性の維持と修復において一部重複した機能を有していることを示している。
枯草菌胞子を用いた有用多糖類合成系の確立に向けての基礎研究

枯草菌の胞子は、多糖類を主成分とした外層に包まれている。胞子表層の性質は外環境との相互作用において重要な因子である。本研究は、この多糖類層の形成過程の解明を目指した。本研究により、胞子多糖類層の形成に関与する遺伝子として、spsM、spsABCDEFGIJKL、cgeAB, cgeCDE, cotVWXYZと、これらの遺伝子の発現に必要な転写因子をコードするgerEを同定した。Sps及びCgeタンパク質群が多糖類合成を担い、胞子タンパク質の内、特にCotW, CotXとCotZは多糖類成分の胞子表層への付着に重要な役割を果たすことが明らかとなった。枯草菌の胞子は、ペプチドグリカンや胞子コートタンパク質を主成分とする多層構造から成り、最外は多糖類層であることがわかっている。本研究は、枯草菌の胞子の最外層構造とその合成過程の解明を目的とする。H27年度は、胞子多糖類合成遺伝子spsMの活性化機構の解明と胞子多糖類合成に関わるspsM以外の遺伝子の検索を行った。これまでの研究から、spsMは、栄養増殖細胞の染色体では2つに分断され不活性化されているが、胞子形成期になるとSPβファージ由来のDNA組換え酵素の作用により、1つの遺伝子に再構築されることが示唆されていた。H27年度の研究によりin vitroにおいてspsM遺伝子再編成を証明することができた。また、spsMは胞子形成期母細胞特異的な転写因子のGerEによって正に転写が制御されることが明らかとなった。そこで、GerEによって正に制御される遺伝子群の欠損株を作製し、胞子多糖類合成に関与するかを調べた結果、spsABCDEFGIJKL、cgeAB、およびcgeCDEオペロンが胞子最外層多糖類合成に関与することがわかった。各遺伝子にコードされるアミノ酸配列情報から、spsA、spsB、cgeB、cgeDが多糖類合成のための糖転移酵素をコードし、その他の遺伝子は主に多糖類の基質の生合成に関与することが推測された。興味深いことに、cgeAはBacillus属細菌でのみ見られるユニークな遺伝子であり、胞子多糖類層の形成に必須であった。CgeAタンパク質は胞子表層に局在するが、その局在には胞子のタンパク質表層に存在するCotX、CotY、およびCotZの3つのコートタンパク質が特に重要であることが示唆された。また、cgeCDEは多糖類合成には必須ではないが、cgeD変異体胞子では多糖類鎖長が異常に長くなることから、CgeDは多糖類伸長の制御を行う可能性が示唆された。当初の計画どおり研究を進め、胞子最外層多糖類の合成に関わる遺伝子群を同定することができた。さらに、多糖類の合成や胞子表層への付加には胞子コートタンパク質が関与することも新たに見出すことができたため、研究は順調に進展していると言える。枯草菌胞子最外層多糖類合成に関与するspsMはSPβプロファージの挿入により2つに分断されていることが明らかとなっている。胞子形成期になると、SPβプロファージにコードされるSprAが、プロファージ領域末端に位置する特定の塩基配列間(attLおよびattR)で部位特異的DNA組換えを引き起こすことによって、spsMが1つの遺伝子に再構築されることが報告されている。本年度は、この切り出し反応の詳細を分子レベルで明らかにすることが出来た。SprAは、SPβファージとspsM内の特定の塩基配列(attPおよびattB)を認識し、部位特異的DNA組換え反応を触媒した。SprAはファージDNAの挿入反応を単独で触媒するが、切り出し反応には補助因子としてSprBを必要とした。原子間力顕微鏡を用いることにより、attLとattRの各々に結合したSprA-SprB複合体同士が会合し、DNA組換えが起こる様子が観察できた。また、SprBは、切り出し反応を促進する一方、attP-SprAとattB-SprAの会合を阻害することにより、挿入反応を抑制することが明らかとなった。SPβ溶原菌において、SprAは対数増殖期に最も発現し、胞子形成が進むと発現が減少するが、SprBは胞子形成期中期から終期に至るまで発現する。したがって、胞子形成期ではSprBが過剰量存在することになり、切り出されたSPβファージDNAのspsMへの再挿入が阻害されるため、充分な量のSpsMが発現されることが示された。この原理を利用して、枯草菌ゲノム上の任意の場所にattLとattRを挿入し、SprAとSprBを発現誘導した結果、数十kb程度のDNA領域であれば容易に染色体から欠損できた。これらの知見は、枯草菌多糖類遺伝子群の欠損や別種由来の有用多糖類合成遺伝子群の導入を行うための技術に応用できると期待される。H28年度の研究から、spsM遺伝子活性化の分子的なメカニズムが明らかとなり、その成果を投稿論文にまとめることが出来た(現在、査読中)。また、今回得られた知見は、最終年度に行う予定である異種生物の多糖類合成遺伝子群の導入に用いるための新技術として利用できると期待されるため。本年度は、胞子表層タンパク質をコードするcotVWXYZが胞子の最外にある多糖類層の形成に果たす役割に注目し、研究を行った。

遺伝子欠損株及びGFPとの融合タンパク質発現株を用いた解析から、これらのタンパク質が多糖類の胞子表層への付着に必要であり、特にCotZと胞子アウターコートタンパク質CotEとの相互作用が多糖類層と胞子本体を結びつけていることが示された。また、CotXは、多糖類層の形成に必須なCgeAを胞子表層への局在化させる働きがあることが分かった。CotYは多糖類層形成には必須でなかったが、CotXやCotZの胞子表層への定着を強固にさせた。CotVは、欠損させてもほとんど胞子表層多糖類層の形成に影響がなかった。一方、CotWを欠損した枯草菌胞子では、多糖類層がほぼ完全に消失したことから、胞子表面への多糖類の付着に極めて重要であることがわかった。今回の結果から、CotWそれ自身か、あるいはCotWと直接結合する因子が胞子表層多糖類のアンカーとなっている可能性が考えられた。また、本年度では、部位特異的なDNA組換え酵素SprAを介したspsMの遺伝子再編成の分子メカニズムの解析を同時に進め、SprAのC末端にその補助因子であるSprBが結合することで、SprAの活性を制御することを明らかとした。さらに、枯草菌類縁種において、gerE遺伝子が介在配列Gin (gerE-intervening element)によって分断されており、Ginにコードされる部位特異的DNA組換え酵素GirCとその補助因子GirXによって再構築されることが明らかとなった。枯草菌の胞子は、多糖類を主成分とした外層に包まれている。胞子表層の性質は外環境との相互作用において重要な因子である。本研究は、この多糖類層の形成過程の解明を目指した。本研究により、胞子多糖類層の形成に関与する遺伝子として、spsM、spsABCDEFGIJKL、cgeAB, cgeCDE, cotVWXYZと、これらの遺伝子の発現に必要な転写因子をコードするgerEを同定した。Sps及びCgeタンパク質群が多糖類合成を担い、胞子タンパク質の内、特にCotW, CotXとCotZは多糖類成分の胞子表層への付着に重要な役割を果たすことが明らかとなった。同定した各多糖類合成酵素の活性を調べるとともに、胞子コートタンパク質と多糖類合成酵素の働きの関連性を明らかにすることで、胞子最外層の形成過程の全貌の解明を目指す。枯草菌胞子最外層の多糖類の形成と付着には、胞子コートタンパク質が必要である。本研究課題進行中に、胞子から多糖類を含む最外層を精製する技術が既に確立できている。今後は、多糖類層がどのように胞子最外層に結合しているかを明らかにするために、最外多糖類層に含まれる多糖類の付着に必要な胞子コートタンパク質を同定する。また、H28年度に得られた知見をもとに枯草菌多糖類合成遺伝子群の欠失と異種由来の多糖類合成遺伝子群の導入方法についての検討を行う。農芸化学H28年度に予定していた出張(学会出席)の1つを見送ったため。前年度の未使用額は、本研究の成果を論文出版や学会で発表するの為の経費として使用する。