hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん細胞のX線及び炭素イオン線抵抗性における細胞膜修復能に関する研究

X線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞株X60は細胞あたりのリソソーム、ATP、ミトコンドリア、活性酸素種含有量が有意に多く、これらに関わるmTORシグナリングがX線及び炭素イオン線抵抗性に深く関与することが示された。また、X60細胞はストレプトリジンOによって生じる細胞膜損傷に対して抵抗性であること、脂質ラフトの制御や細胞膜修復過程で起こるエンドサイトーシスに関わるFlottilin-1の細胞膜上のドメインが、通常培養状態から多いことが示された。この研究により、がん細胞のX線や炭素イオン線抵抗性には、脂質ラフトの形成やエンドサイトーシスなど細胞膜の代謝が関わる可能性が示された。がん細胞の放射線抵抗性に対する細胞膜修復の関与を明らかにすることを目的とし、X線及び炭素イオン線を繰り返し照射して樹立した放射線抵抗性がん細胞株X60及びC30細胞を用いて、細胞膜修復を評価するための培養や機械的刺激条件について検討した。また、リソソームと細胞膜の融合を阻害する薬剤であるタンニン酸とVacuolin-1の細胞毒性を求め、測定時の使用濃度を至適化した。上記に加え、各細胞におけるリソソームの性状や含有量をはじめ、リソソームが関与する細胞学的機能や発現分子について解析した。この解析の結果、X60細胞におけるリソソームはC30細胞と親細胞株であるマウス扁平上皮がん細胞株NR-S1に比べて顕著に拡大しており、さらに含有量も著明に多いことが示された。また、X60細胞ではミトコンドリア、ATP(アデノシン三リン酸)、ROS(活性酸素種)含有量が他の細胞に比べて顕著に亢進していること、血清飢餓時に起こるオートファジーが他の細胞よりも早期に起こることが示された。さらにX60細胞では、これらに共通して関与するタンパク質であるmTORのリン酸化が他の細胞に比べて有意に亢進していること、mTORが関与する情報伝達経路の阻害剤であるラパマイシンの投与はX60及びC30細胞のX線と炭素イオン線抵抗性をNR-S1細胞と同等程度まで低下させることを示した。細胞膜修復能の評価のための実験条件は現在も検討している最中である。一方、平成27年度に得られた研究成果であるX線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞株X60におけるmTORリン酸化の亢進とラパマイシンによるX線及び炭素イオン線抵抗性の抑制について論文投稿の準備が進んでいる。さらに、本研究開始時に使用予定であったタンニン酸とVacuolin-1に加えてラパマイシンも細胞膜修復阻害剤の候補である可能性を示すことできたことから、研究目的の達成に向けて進展していると言える。マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1、NR-S1細胞由来の放射線抵抗性がん細胞株X60及びC30細胞における細胞膜修復能の違いを評価するため、各細胞に対しストレプトリジンO(SLO)を投与することで細胞膜穿孔を与え、Propidium Iodide(PI)陽性細胞数の経時的変化を計測した。その結果、どの細胞でもPI陽性細胞数は穿孔後の時間経過に伴い増加すること、X60細胞におけるPI陽性細胞数は、他の細胞よりも顕著に低いことが示された。次に穿孔に伴うリソソームの時間的変化を解析した。穿孔前のX60細胞のリソソーム含有量及びその蛍光強度は他の細胞より明らかに亢進していた。また、NR-S1細胞やC30細胞のリソソームの大きさは穿孔約3分後から増大する一方、X60細胞では穿孔前とほぼ同様であり、約20分後にその大きさが増大することが示された。これらの結果は、X60細胞は穿孔を受けにくく、かつ、エクソサイトーシス等が関わる細胞膜の代謝が基本的に活発であることを示唆している。そこで、Caイオンの細胞内流入に伴うエクソサイトーシスに必要とされているSynaptotagmin VIIと、SLOの標的であるコレステロールを多く含む脂質ラフトのマーカーの一種Flottilin-1の局在を免疫蛍光染色法により解析した。その結果、Synaptotagmin VIIの局在は、穿孔前後で細胞間に大きな差は見られなかった。一方、NR-S1細胞とC30細胞における細胞膜上のFlottilin-1ドメインは穿孔後に明確に確認されるが、X60細胞では穿孔前からFlottilin-1ドメインが確認でき、その様子は穿孔後もほぼ同様であった。以上から、X60細胞における細胞膜穿孔の抵抗性やその修復には、脂質ラフトの様な細胞膜構成成分の違いも関与する可能性が示された。平成28年度は、細胞膜修復能の評価のための培養条件と機械的刺激条件を定め、細胞膜修復能を細胞間で比較する。さらにタンニン酸、Vacuolin-1及びラパマイシンの投与後の細胞修復能も評価する。医歯薬学

平成27年度は実験の進捗に合わせて必要な物品を購入したが僅かに剰余額が生じた。しかし、この額は僅かであり、ほぼ予算額を使用できたと言える。平成27年度の剰余額はごく僅かであることから、平成28年度は引き続き実験の進捗に合わせ、予定額内で必要物品の購入するとともに、平成27年度よりもさらに計画的に使用する。
膵ラ氏島β細胞の容量を規定する因子群同定の試み

インスリンを分泌し、血糖値を保つ膵β細胞は、最終分化状態にあり、そのターンオーバーの割合は極めて低いと考えられている。しかし近年、膵β細胞の容量は成年後においてもダイナミックに変化するという知見が得られ、注目されている。たとえば肥満等インスリン抵抗性を主体とする糖尿病においては、膵β細胞が代償性に肥大・再生・増殖し、その容量増大の程度が糖尿病の発症や重症度に影響する可能性が示唆されている。しかし膵β細胞の増殖・分化に関わる因子の分子レベルでの同定はなされていない。我々は多くの組織の増殖・分化因子の受容体がチロシンキナーゼ活性を持つことをふまえて、膵ラ氏島に発現する受容体チロシンキナーゼを約1000個スクリーニングした。その結果、膵β細胞に特異的に発現の強い、リガンドが未知のオルファン受容体を見出した。本遺伝子の発現は、極めて少数の細胞に限局しており、その組織特異的な機能が予想される。現在この遺伝子の発現細胞、年齢・糖尿病状態・カロリー制限などによる発現レベルの変化を、RT-PCR法、Westermblot法、免疫染色法などで詳細に検討している。またリガンド既知のチロシン受容体の細胞外領域と、本受容体の細胞内キナーゼ領域とのキメラ受容体を膵β細胞株に発現させ、リガンド投与により、本受容体シグナル伝達系を賦活させ、膵β細胞株の増殖への効果を検討中である。さらに、本受容体のリガンドを発現している組織の同定を試みており、今後、本受容体系の膵β細胞の増殖・分化・再生などに関わる機能を明らかにしていきたい。膵β細胞は最終分化状態にあり、そのターンオーバの割合は極めて低いと考えられている。しかし、近年、その分化・増殖・老化などを通じて膵β細胞の容量もダイナミックに変化するという知見が得られ、糖尿病の発症や重症度に影響する可能性が注目されている。我々は多くの組織の増殖・分化因子の受容体がチロシンキナーゼ活性を持つことをふまえて、膵ラ氏島に発現する受容体チロシンキナーゼをスクリーニングした。膵β細胞の増殖・再生に関わる受容体を推定するために、膵ラ氏島が膵切片上1520%を占める程極度に肥大・増殖し,終生高インスリン血症を保つ、肥満・糖尿病TSODマウスと、対照TSNOマウスのラ氏島を用いた。両マウスラ氏島RNAより、受容体型チロシンキナーゼ・クローンを各々500個単離し、各受容体の発現頻度を比較した。その結果、19種類の受容体チロシンキナーゼが見出され、そのうち4種がTSNOに比し、TSODで発現頻度が有意に上昇していた。うち2種は細胞増殖に伴う血管増生によると思われる、血管内皮増殖因子VEGFの受容体Flt-1とFlk-1であった。他の2種のうち1つはIGF1Rで、IGF-1は以前より膵β細胞の増殖因子の候補としてあげられていたが、最近の知見で膵ラ氏島内の血管内皮細胞に限局しており、そのラ氏島細胞へのin vitroの増殖効果も大きくなく、少なくとも主たる増殖調節因子ではないと考えられている。残る受容体は、最も発現の強いもののひとつで、そのリガンドはわかっていないorphan受容体であった。現在この遺伝子の発現細胞、年齢・糖尿病状態による発現レベルの変化などを詳細に検討している。
脳動脈瘤ステントグラフト術の術前評価のための複合的力学シミュレーション手法の開発

計算流体力学に基づく血流シミュレーションにより,瘤を伴う脳動脈内にステントを留置した場合の血流阻害特性について,ステントの巻き数と留置時の回転角の観点から評価した.ステントの巻き数を増やすことによって流入流量は単調に減少する傾向となったが,流入最大速度については,逆に増加する場合もあり得ることがわかった.また留置時の回転角も,瘤への血液流入に対して無視できない影響を及ぼすことが示唆された.計算流体力学に基づく血流シミュレーションにより,瘤を伴う脳動脈内にステントを留置した場合の血流阻害特性について,ステントの巻き数と留置時の回転角の観点から評価した.ステントの巻き数を増やすことによって流入流量は単調に減少する傾向となったが,流入最大速度については,逆に増加する場合もあり得ることがわかった.また留置時の回転角も,瘤への血液流入に対して無視できない影響を及ぼすことが示唆された.近年,ステントグラフト(ステントの周りを薄い人工血管材料で被覆した治療デバイス.大動脈瘤治療に使用され威力を発揮している)を用いた脳動脈瘤治療が検討され始めている.本研究では,脳動脈瘤のステントグラフト留置術における術前評価,特に瘤内へのエンドリーク(血流漏れ)の定量評価に供することのできる力学シミュレーション手法の開発を目的としている,エンドリークの定量評価のためには,医用画像に基づく患者個別の三次元血管形状モデルの構築,血管内でのステントグラフト留置状態の再現,流体力学に基づく血流シミュレーション,の各ステップが必要となる.本年度はまず,患者個別の医用画像から構築した複数例の血管モデルを対象として,ステントグラフト留置前の状態における血流シミュレーションを行い,瘤内部および瘤頸部における血流動態の特徴,ならびに瘤の形成位置の違い(蛇行・屈曲を伴う親血管のどのような位置に瘤が形成されているか)が瘤内への血液流入量に及ぼす影響について調べた.なお,いずれも内頸動脈に発生した瘤を対象としている.脳動脈におけるWomersoey数はそれほど大きくないが,今回対象とした症例において,定常流を仮定した血流計算と拍動性を考慮した血流計算とでは,同一の瞬時Re数においても瘤内への血液流入量は有意に異なるものとなった.また今回対象とした実症例において,瘤内部および瘤頸部における血流パターン,ならびに瘤内への血液流入量は,瘤の形成位置に大きく影響された.このことは,今井ら(Imai, Sato, et aL, 2008)が理想形状モデルによるパラメトリックスタディで示しており,同様の結果が確認された.以上より今後エンドリークの定量評価を実現するためには,血流の拍動性を考慮すべきであり,また血管走行や瘤形成位置の個体差を適切に反映することが不可欠といえる.現在,脳動脈瘤に対する血管内治療の主流はコイル塞栓術であるが,近年では,ステントグラフト-ステントの周りを薄い膜材で被覆した医療デバイス-を用いた脳動脈瘤治療が検討され始めている.特に,コイル塞栓の困難な,頸部の広い瘤や巨大瘤に対する有用な治療法として期待されている.ステントグラフトによる瘤治療(親血管へのステントグラフト留置術)においては術前の力学的評価が重要であり,それを可能とする計算手法の開発が望まれる.平成22年度はまず,瘤を伴う脳動脈および,その治療デバイスとしてのステント(膜材で被覆する前のベアステント)を3D-CADを用いてそれぞれモデリングし,それらを合成することによって,血管内でのステント留置状態を計算機上に再現できるようにした.続いて,計算流体力学による血流シミュレーションの手法を用いて,ステントを構成するストラット(骨格要素)の巻き数が,瘤内への血液流入に及ぼす影響について調べるとともに,非構造格子上で壁面せん断応力及びその空間勾配量を評価できる解析プログラムを構築した.瘤内への血液流入の評価項目は流入流量および最大流入速度とし,ステントを留置しない場合と比較して,これらの量がどの程度減少するかに注目した.これは,ステントによる瘤治療が,瘤内への血液流入の阻害とそれに伴う瘤内流動の停滞を主に意図するためである.ストラットの巻き数を,0(ステントなし)から24本まで変化させて定常流の血流シミュレーションを行った結果,ストラットの巻き数を増やすことによって瘤内への流入流量は単調に減少した.その一方で,流入最大速度についてはかえって増加する,すなわち瘤内への流入が局所に集中する場合もあることが明らかとなった.加えて,瘤とストラットの位置関係によっては,ステントを留置しない場合と比較して瘤内の血流循環が逆回転となるなど,流動構浩も大きぐ変化し得ることが明らかとなった。
視運動行動に関わる脳幹―視床多重回路の形態学的研究

ネコ視床の内側外側核-膝上核(LM-Sg)における、脚橋被蓋核(PPT)からの直接経路と(上丘を介した)間接経路を検討し、さらに黒質網様部(SNr)からLM-Sgを介して線条体へ投射する経路を調査した。(I)PPTの単一細胞がLM-SgおよびSCへ同時に投射しているかを調べるため、LM-Sgと上丘にそれぞれ異なる逆行性蛍光色素を注入した結果、PPTの全標識細胞の35%が軸索分岐によってLM-Sgと上丘を支配していることがわかった。(II)上丘におけるLM-Sgへの投射細胞とPPTからの神経終末の分布を調べるため、LM-Sgに逆行性トレーサーWGA-HRPを、同側のPPTに順行性トレーサーbiocytinを注入した結果、1)HRP標識細胞は上丘の中間層に点在し、biocytin標識終末は中間層深層にパッチ状にあった。2)HRP標識細胞とbiocytin標識終末は一部で重複しており、PPTからの終末がLM-Sgへの投射細胞に直接結合している可能性が示唆される。(III)LM-SgにおけるPPT、上丘およびSNrからの終末分布を調べるため、これらの領域にbiocytinを注入した結果、1)PPTからの終末はLM-Sgの腹側部に多く、上丘からの終末は背側部に多かった。またSNrからの終末は腹内側部にあり、PPT、上丘、SNrからの終末はLM-Sg内の異なる領域に分布することが明らかになった。2)電顕による終末の形態は、PPTおよびSNrからの終末は小型と大型で、上丘からの終末は小型であった。また大部分の終末は単一にシナプス結合していたが、大型終末のいくつかはシナプス糸球体に関わっていた。(IV)LM-Sgにおける線条体への投射細胞の分布を調べるため、線条体(尾状核)にWGA-HRPを注入した結果、HRP標識細胞はLM-Sgの腹内側部にあり、SNrからの終末分布域と一致した。このことから、SNrからの終末が線条体への投射細胞に直接結合している可能性が示唆される。(V)これらの結果は平成14・15年に、日本解剖学会に発表し、論文投稿中である。ネコ脚橋被蓋核(PPT)はそのコリン作動性線維を内側外側核-膝上核(LM-Sgおよび上丘(SC)へ投射している。I)PPTの単一ニューロンがLM-SgおよびSCへ同時に投射しているかどうかを確認する目的で逆行性蛍光色素を用いて解析した。一側のLM-Sgにdextran tetramethylrhodamine(DR)を、それと同側のSCへdextran fluorescein(DF)を注入した。その結果、1)PPTのDR逆行性標識細胞(LM-Sgへの投射ニューロン)は小型で、PPTの吻側方に多く分布していた。2)DF標識細胞(SCへの投射ニューロン)は大型と小型細胞で、PPTのほぼ全域に分布していた。数の上では、DF標識細胞がDR標識細胞よりも多かった。

3)PPTにおける重標識細胞はすべて小型細胞であり、その数は全標識小型細胞の約30%であった。以上の結果から、LM-Sgへ投射している細胞の約30%がSCへも同時に投射していることが明らかになった。II)SCからLM-Sgへの投射ニューロンがPPTからの投射終末を直接受けるかどうかを確認する目的で、カイニン酸注入によりPPTを破壊し、逆行性トレーサーWGA-HRPをLM-Sgに注入した。その結果、SCにおけるPPTからの変性線維終末の分布はSCの中間層深層にパッチ状にあらわれた。一方、LM-Sgへ投射するHRPラベル細胞は中間層深層にまばらに存在していた。それらの分布は光顕レベルで一部重複していた。以上の結果から、PPTからの終末がLM-Sgへの投射細胞に直接結合している可能性が示唆される。III)これらの結果は平成14年に、日本解剖学会、日本神経科学会、などで発表し、論文投稿準備中である。ネコ視床の内側外側核-膝上核(LM-Sg)は脚橋被蓋核(PPT)、上丘深層および黒質網様部(SNr)から入力をうけ、線条体へ投射している。LM-Sgにおけるこれら入力線維終末の分布および線条体投射細胞の分布を検索した。(1)上丘におけるLM-Sgへの投射細胞とPPTからの神経終末の分布を調べるため、LM-Sgに逆行性トレーサーWGA-HRPを、PPTに順行性トレーサーbiocytinを注入した。その結果、1)HRP標識細胞は上丘の中間層に点在し、biocytin標識終末は中間層深層にパッチ状にあった。2)HRP標識細胞とbiocytin標識終末は一部で重複しており、PPTからの終末がLM-Sgへの投射細胞に直接結合している可能性が示唆される。(II)LM-SgにおけるPPT、上丘およぴSNrからの終末分布を調べるため、これらの領域にbiocytinを注入した。その結果、1)PPTからの終末はLM-Sgの腹側部に多く、上丘からの終末は背側部に多かった。またSNrからの終末は腹内側部にあった。2)電顕による終末の形態は、PPTおよびSNr終末は小型と大型で、丸いシナプス小胞を有し、大部分は小型で、単一シナプス結合していたが、大型終末のいくつかはシナプス糸球体に関わっていた。上丘からの終末は小型であった。以上のことから、ppT、上丘、SNrからの入力はLM-Sg内の異なる領域に分布することが明らかになった。(III)LM-Sgにおける線条体投射細胞の分布を調べるため、線条体(尾状核)にWGA-HRPを注入した。その結果、HRP標識細胞はLM-Sgの腹内側部にあり、SNrからの終末分布域と一致した。以上の結果から、SNrからの終末が線条体への投射細胞に直接結合している可能性が示唆される。(IV)これらの結果は平成14・15年に、日本解剖学会に発表し、論文投稿準備中である。
統合失調症患者における脳内コンドロイチン硫酸鎖とペリニューロナルネットの変化

統合失調症と脳内コンドロイチン硫酸鎖の関連を解明するため、統合失調症患者と正常対照者の死後脳組織を対象として、前頭前野、海馬、尾状核の各脳部位について発現変化をウエスタンブロット法を用いて解析した。結果として、海馬領域における一部のコンドロイチン硫酸鎖に変化を見出した。さらに、変化が認められた脳部位について、抗精神病薬を慢性投与されたラットの死後脳サンプルを用いて薬剤の影響を検討し、検出された変化が疾患に関連した変化である可能性が高いことを確認した。パルブアルブミン陽性抑制性GABA神経細胞の細胞体や軸索周囲に発達している網状の構造は、ペリニューロナルネット(perineuronal net:PNN)と呼ばれ、統合失調症をはじめとした精神疾患との関わりが注目されている。PNNの主要な構成成分であるコンドロチン硫酸プロテオグリカン(chondroitin sulfate proteoglycan:CSPG)と、その部分構造であるchondroitin sulfate(CS)鎖は神経可塑性の制御作用、神経保護作用、神経栄養作用などの重要な働きを持つことが知られており、これらの働きは統合失調症の病態生理と関わりが深いと考えられている。本研究は、統合失調症の病態生理と脳内CS鎖、PNNの関連を解明するため、統合失調症患者死後脳の前頭前野、海馬、尾状核領域におけるCS鎖の発現変化およびPNNの分布変化を明らかにすることを目的としている。当該年度は、ウエスタンブロット法を用いて、統合失調症患者と正常対照者の死後脳の、前頭前野、海馬、尾状核におけるCS鎖の発現変化を比較検討した。結果として、海馬において一部のCSPGのCS鎖シグナルに有意差を検出した。本研究により解明された統合失調症患者の海馬におけるCS鎖発現の変化に関する知見が端緒となり、今後、その変化の病理学的意義が動物実験などから解明され、統合失調症の診断および予防・治療に有用な知見が得られる可能性がある。ウエスタンブロット法を用いて、統合失調症患者と正常対照者の死後脳の、前頭前野、海馬、尾状核におけるCS鎖の発現変化を比較検討した。結果として海馬において一部のCSPGのCS鎖シグナルに有意差を検出した。パルブアルブミン陽性抑制性GABA神経細胞の細胞体や軸索周囲に発達している網状の構造は、ペリニューロナルネット(perineuronal net:PNN)と呼ばれ、統合失調症との関わりが注目されている。PNNの主要な構成成分であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(chondroitin sulfate proteoglycan:CSPG)と、その部分構造であるchondroitin sulfate(CS)鎖は神経可塑性の制御、神経保護、神経栄養などの重要な働きを持つことが知られている。CS鎖は硫酸基の結合部位の違いにより、主に4-硫酸化コンドロイチン(C4S)と6-硫酸化コンドロイチン(C6S)に分けられる。本研究では、統合失調症と脳内CS鎖の関連を解明するため、統合失調症患者と正常対照者の死後脳組織を対象として、前頭前野、海馬、尾状核の各脳部位についてC4SおよびC6Sの発現変化をウエスタンブロット法を用いて解析し、結果として、海馬領域における一部のC4Sに変化を見出した。海馬は統合失調症の病態生理との関連が繰り返し論じられてきた脳領域である。これらの結果については、現在論文投稿中であり、第41回日本神経科学大会で発表予定である。本研究で得られた知見が端緒となり、今後、その変化の病理学的意義が動物実験などから解明され、将来的に、CS鎖の発現やPNNの形成、分解を制御することにより、その生理活性を介して、統合失調症の予防や治癒につながる効果が得られることを期待したい。抗精神病薬を慢性投与した動物の死後脳を用いて、CS鎖の発現をウエスタンブロット法で解析し、ヒト死後脳でのデータと比較検討する。さらに、上述の半定量的神経化学的実験に加えて、統合失調症患者の固定死後脳や抗精神病薬を慢性投与した動物におけるCS鎖やPNNの分布変化を免疫組織化学的手法も用いて分析していく予定である。精神医学平成28年度の支出は、予定額よりも少ない支出になった。実験のための消耗品として、バッファー類作製試薬、ウエスタンブロット検出試薬、免疫組織化学染色試薬、酵素類、各種抗体、および多量のプラスチック類(チューブ類、チップ類など)が必要となり、それぞれ必要量を計上していた。概ね当初の予定どおりの支出であったが、消耗品類については、予定使用量と実際の使用量に誤差が生じたため、次年度使用額が生じた。平成29年度は、実験のための消耗品の購入に加え、国内学会での発表と研究成果の論文投稿を予定しており、旅費および英文校正費の使用も予定している。
動物細胞表面に存在するホスファチジルセリン-フリッパーゼの解析

フリッパーゼは脂質の膜を横切る移動(フリップ-フロップ)を触媒するタンパク質である.フリッパーゼの実体についてわからない点が多い.細胞はいくつかのフリッパーゼを持っていると考えられるが,このうち最も詳しく調べられているのは動物細胞形質膜のフリッパーゼである.このタンパク質はホスファチジルセリンに特異性が高く,ATP依存的に脂質の外層から内層への移動を触媒する.形質膜フリッパーゼの生体内での機能はわかっていないが,膜脂質の非対称分布の維持やエンドサイトーシスに重要な役割を果していると考えられている.我々は以前に細胞外のホスファチジルセリンは主としてフリップ-フロップによって細胞内へと取り込まれることを示唆する結果を得ている.(Kobayashi,T.and Arakawa,Y(1991)J.Cell.Biol.113,235-244).ホスファチジルセリンの細胞への取り込みを調べている過程で我々は不飽和脂肪酸を有するホスファチジルセリンには細胞毒性があることに気付いた.ホスファチジルセリン耐性の変異株では取り込みの最初の段階であるフリップ-フロップの活性が低下していると考え,突然変異を誘発したCHO細胞からホスファチジルセリン耐性株を取得した.得られた変異株について形質膜フリッパーゼの活性を測定したところ,ほぼ40%の株がホスファチジルセリンのフリップ-フロップ活性を欠損していた.このような変異株を用いて1)脂質の非対称性の測定,および2)(エンドサイトーシス活性,を測定した.その結果,脂質の非対称性は変異株と親株で変化がないことがわかった.一方ルシファーイエロ-および西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)の取り込みで見た変異株のエンドサイトーシス活性は親株の半分程度に減少していた.このことはエンドサイトーシスにリン脂質のフリップ-フロップが関与していることを示唆している.フリッパーゼは脂質の膜を横切る移動(フリップ-フロップ)を触媒するタンパク質である.フリッパーゼの実体についてわからない点が多い.細胞はいくつかのフリッパーゼを持っていると考えられるが,このうち最も詳しく調べられているのは動物細胞形質膜のフリッパーゼである.このタンパク質はホスファチジルセリンに特異性が高く,ATP依存的に脂質の外層から内層への移動を触媒する.形質膜フリッパーゼの生体内での機能はわかっていないが,膜脂質の非対称分布の維持やエンドサイトーシスに重要な役割を果していると考えられている.我々は以前に細胞外のホスファチジルセリンは主としてフリップ-フロップによって細胞内へと取り込まれることを示唆する結果を得ている.(Kobayashi,T.and Arakawa,Y(1991)J.Cell.Biol.113,235-244).ホスファチジルセリンの細胞への取り込みを調べている過程で我々は不飽和脂肪酸を有するホスファチジルセリンには細胞毒性があることに気付いた.ホスファチジルセリン耐性の変異株では取り込みの最初の段階であるフリップ-フロップの活性が低下していると考え,突然変異を誘発したCHO細胞からホスファチジルセリン耐性株を取得した.得られた変異株について形質膜フリッパーゼの活性を測定したところ,ほぼ40%の株がホスファチジルセリンのフリップ-フロップ活性を欠損していた.このような変異株を用いて1)脂質の非対称性の測定,および2)(エンドサイトーシス活性,を測定した.その結果,脂質の非対称性は変異株と親株で変化がないことがわかった.一方ルシファーイエロ-および西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)の取り込みで見た変異株のエンドサイトーシス活性は親株の半分程度に減少していた.このことはエンドサイトーシスにリン脂質のフリップ-フロップが関与していることを示唆している.ホスファチジルセリンの非対称分布は細胞膜に存在するリン脂質の膜を横切った移動(フリップフロップ)を触媒するタンパク質(フリッパーゼ)により維持されていると考えられているが、フリッパーゼの実体は明らかにされていない。本研究ではフリッパーゼを欠損した動物細胞変異株を取得し、フリッパーゼの生理的意義を知るとともに遺伝的手法を用いたフリッパーゼの同定の足掛かりを得ることを目的とした。フリッパーゼを欠損した動物細胞変異株を取得するにあたり、これまで遺伝的な解析が数多く行われているCHO細胞を親株として選んだ。培養動物細胞表面でのホスファチジルセリン-フリッパーゼの活性はこれまでV79細胞でしか報告がなかったため、まずCHO細胞形質膜でのエンドサイトーシスの起こらない10°Cにおけるフリッパーゼに依存した脂質の取り込みを測定した。その結果、ホスファチジルセリンは細胞内に取り込まれたが、ホスファチジルコリンの取り込みは観察されず、CHO細胞表面にホスファチジルセリンに特異的なフリッパーゼが存在することが示唆された。フリッパーゼ欠損変異株の取得は実験開始当初はピレン標識したホスファチジルセリン類似体を用い、ホスファチジルセリンの取り込み活性の低下した株を濃縮するという方法を計画していた。しかし研究を進める過程で不飽和脂肪酸を含むホスファチジルセリンには細胞毒性があることを見いだし、ホスファチジルセリン耐性というかたちでフリッパーゼ欠損変異株が濃縮できる可能性が示唆された。そこで変異剤処理したCHO細胞7,500万株からホスファチジルセリン耐性株を取得し、最終的に蛍光顕微鏡下での10°Cでのフリッパーゼ活性の測定によりフリッパーゼ活性が低下した変異株を取得した。フリッパーゼは脂質を横切る移動(フリップ-フロップ)を触媒するタンパク質である。その存在を示唆するデータは数多く提出されているが、実体はわかっていない。

細胞はいくつかのフリッパーゼを持っていると考えられるがこのうち最も詳しく調べられているのは動物細胞形質膜のフリッパーゼである。このタンパク質はホスファチジルセリンに特異性が高く、ATP依存的に脂質の外層から内層への移動を触媒する。形質膜フリッパーゼの生体内での機能はわかっていないが、脂質質の非対称性の維持やエンドサイトーシスに重要な役割を果たしていると考えられている。我々は以前に細胞外のホスファチジルセリンがフリップ-フロップによって細胞内へと取り込まれることを示唆する結果を得ている(Kobayash,T.,and Arakawa,Y.(1991)J.CellBiol.113,235-244)。ホスファチジルセリンの細胞への取り込みを調べている過程で我々は不飽和脂肪酸を有するホスファチジルセリンには細胞毒性があることに気付いた。ホルファジルセリンに耐性のCHO細胞の変異株を取得し、形質膜フリッパーゼの活性を測定したところほぼ40%の株がホスファチジルセリンのフリップ-フロップの活性を欠損していた。このような変異株を用いて1)脂質の非対称性の測定、および2)エンドサイトーシス活性、を測定した。その結果脂質の非対称性は変異株と親株で変化がないことがわかった。一方、ルシファーイエロ-および西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)の取り込みで見た変異株のエンドサイトーシス活性は親株の半分程度に減少していた。このことはエンドサイトーシスにリン脂質のフリップ-フロップが関与していることを示唆している。
遺伝子工学によるプロラクチン受容体の構造解析及び生理作用発現機構

ウサギの乳腺のミクロゾームに含まれているプロラチン受容体を界面活性剤(Chaps)を用いて可溶化した。この受容体の構造をゲルロ過・超遠心分折・イオン交換クロマト・電気泳動により解折した。プロラクチンと結合する蛋白に二種類あり、それぞれは独立して存在し、等電点も分子量も異なっていた。分子量83,000の受容体は分子量37,000の受容体に比較して約2.2倍多く存在していた。それぞれの精製にスーパーローズ12のゲルロ過が非常に有効であることを明らかにした。もう一段階クロマトフォーカシングで精製した後アフィニテークロマトを行なうと、ほぼ完全に精製される目度がたった。2.000倍に精製したプロラクチン受容体を抗原としてマウスを兎疫し脾臓細胞とミエローマ細胞を融合して、四種類のモノクローナル抗体を得た。いづれの抗体も分子量約15.000の1gGに属し、サブクラスは1gG1と1gG2bであった。この抗体は、受容体に結合してプロラクチンの結合を完全に阻止した。標識した抗体を使って可容化したプロラクチン受容体の性質を調べることは出来ない。そこで可容化した受容体をニトロセルロース膜に固定して用いた。ニトロセルロース膜に固定化された受容体は、ホルモンとの特異性・プロラクチンとの親和性に何の変化もなかった。抗体は、【10^(-9)】Mから【10^(-7)】Mの間で用量反応を示し、高い親和性を持っていた。【10^(-6)】Mで結合は飽和した。この用量反応曲線を用いてスカッチャードプロットにより更に解析を行なった。標識プロラクチン及び標識モノクローナル抗体を用いても、量をかえた非標識モノクローナル抗体により典型的な二相性の反応を示していた。この結果は、モノクロナール抗体を用いても二種類の異なるプロラクチン結合部位が存在することを示しており、生化学的に分析した結果と一致していた。
定性的推論に基づく線画の認知・理解の研究

人間は、線画を見ると、そこに描かれている世界を認知する。また、見た世界や考える世界を線画の形に表現して思索や通信に用いる。コンピュ-タが線画を認識する従来の研究は、カメラに写された物理世界の法則の利用を前提にしていた。しかし、人の描く線画は、イメ-ジの表現で物理世界の法則は必ずしも満足しない。本研究は、線画と人と同じように認知する人工知能の実現のため、局所的知見を定性的な推論で統合化する方式を確立することを目的とし、人間にとって最も馴染み深い図形である四辺形の認知に対象を限定して以下の研究を行なった。1.直行規則性人は描かれた四辺形を3次元世界の図形として認知するが、そのように解釈するには何らかの規則性を仮定して図形を認知すると考えられる。第1の規則性は、『四辺形の辺がいずれも直交』とする解釈である。これから、人が描く時に無意識に想定する撮像系のパラメ-タ、すなわち画像中心の位置と焦点距離が定まり、さらに四辺形の傾きも決定できる。2.曲率線規則性人間は、曲面を4本の辺で切断した形で図示することが多い。このような曲面上の四辺形の認知問題を研究し、曲率線の規則性を提案した。画像内の閉じた輪郭は、ある条件を満足すると輪郭から定まる面上の4本の3次元曲率線と解釈される。曲面を覆う網を輪郭から推定する方式を提案し、さらに面や網の3次元空間内の傾きを推論することが可能になった。3.直方体解釈四辺形を直方体の面として解釈する問題を検討し、幾何学的レベルと人の認知レベルとを比較し、どの範囲まで直方体と認知するかを明確にした。以上の研究により、人間とコンピュ-タの線画認知問題の基礎を確立した。
超音波とレーザー光による歯周組織の断層撮影

本研究による高周波超音波は、微細な解像度が求められる口腔領域における透視像の作製に道を拓く組織断層撮影技術である。これまでの我々の研究では拠れば、歯槽骨の喪失を顕す超音波エコーにより構成されるヒストグラム画像により、歯周病診断の主力であるX線診査に代わる透視診断手法を確立する可能性が示唆された。本年度はこれら聴音波エコーのヒストグラム像の取得を自動化すべく、探触子をX-Y駆動装置によって走査し、規格化された計測条件下にて、再現性を有するエコーを取得できるようシステムを構築した。すなわち超音波発信装置(パルサー:Model5077:パナメトリクス)および探触子(V208RM:パナメトリクス:20MH)を、回転駆動装置(コガネイ)およびエアシリンダー(CDJ2B10-100-A:SMC)に搭載し、回転-X軸駆動による走査ロボットを試作した。駆動制御はフィードバック機能を含むプログラマバルシーケンサー(KV-700:キーエンス)により行った。計測は前歯部に歯周疾患を有する被験協力者を対象とした。その結果、病態に依存したエコーヒストグラムが得られたけれども、被験者を長時間不働化することができなかったため、可視的な断層診断の根底となる再現性については安定した計測データを得るには至らなかった。これは探蝕子を走査する動作を完全に自動化する事により、正確で再現性の高い超音波エコーを得る事が可能に成るものと思われる。既に医療目的による放射線被ばくが日本と比べて半分に過ぎない米国においても、がん症例の0.9%が診断用X線に因るものと見積もられており、特に高エネルギーのX線を用いねばならない歯学領域では、従来のX線法に代わる透視診断システムを確立する事が急務である。本研究結果は生体に安全な超音波透視法を歯科領域においても、充分な実用性が担保されたことは意義深いと思われる。従来の5MHz帯における汎用医療超音波計測では、歯周組織の微細な構造を反映するには空間分解能が乏しかったけれども、今課題において採用した20MHz帯音波探触子を用いることでミリオーダーのピクセルによる解像度を有する超音波画像を実現でき、歯周組織に対する診断に応用することが可能となる。実験に用いた超音波発信装置(パルサー:Model5077:パナメトリクス)および探触子(V208RM:パナメトリクス)の公称周波数は20MHzであり、これにより生ずる超音波はディレイ材を介し、本実験への協力を承諾した被験者の歯肉に加えられた。得られた微弱なRFエコーをレシーバー(発信装置と同機)にて増幅(40dB)した後、同期モードにてデジタルオシロスコープ(DS4372 : Iwetsu-Recloy)にて計測した。その結果、遊離歯肉において照準方向に歯根ならびに歯槽骨の存在しない部位において取得したシグナルからは一様に近いノイズを含むエコーが得られた一方、歯槽骨に対する計測では歯肉厚さに相当すると思われる潜時を有する鋭いピークを有する信号が得られた。興味深いことはこれらのピークは探触子を微妙に揺らす操作に応じてピーク潜時は一定であるもののピーク値およびピーク幅は刻々と変化したことから、歯槽骨由来のエコーは表面の細かな凹凸を微妙に反映したシグナルを含む可能性が示されたことである。

従来、運動器系を中心とする硬組織をターゲットとした超音波計測では、5MHz帯のエコーが用いられ、骨折部位の同定など大まかな骨表面の凹凸が計測されるのに過ぎなかったけれども、今回用いた高周波超音波を用いることで骨表面のトポグラフィーの他、歯周病診断においてしばしばポイントとなる骨表面の粗造さが検知できたことは、本法がX線法などの他の透視法では得られない生体内部構造を検知できる可能性が示しており、これらが臨床において極めて有用な診断手法となることが期待できるだろう。来年度は探触子の走査をX-Y駆動操作によって自動化し、規格化された計測条件において、歯周組織の各々の構造に依存した再現性を有するエコーを取得できるようシステム構築を行った上、得られた信号よりエコー画像を再構成する可視化を実施する予定である。今課題において採用した20MHz帯音波探触子を用いることでミリオーダーのピクセルによる解像度を有する超音波画像を実現でき、歯周組織に対する診断に応用することが可能となる。実験に用いた超音波発信装置(パルサー:Model5077:パナメトリクス)および探触子(V208RM:パナメトリクス)の公称周波数は20MHzであり、これにより生ずる超音波はディレイ材を介し、本実験への協力を承諾した被験者の前歯部歯肉に加えられた。得られた微弱なRFエコーをレシーバー(発信装置と同機)にて増幅(40dB)した後、同期モードにてデジタルオシロスコープ(DS4372:Iwatsu-Recloy)にて計測した。微動装置を用いて探触子を30mmにわたり水平(歯軸に対しては垂直方向)移動しながら1mmステップ毎に得られた波形を、パーソナルコンピューター(IBM-PC互換機)を用いてX軸方向に整列しヒストグラムとした。その結果、遊離歯肉の位置においては格子状のトポグラフィーを示す画像が得られた一方、付着歯肉の位置では波状像が得られた。さらに根尖周囲の位置では緩やかな波状を示すものの、強い反射を示す壁状のトポグラフィーが得られた。これらは遊離歯肉の位置においては主として歯根、付着歯肉の位置からは辺縁歯槽骨、根尖周囲のポイントでは歯槽骨体由来の超音波界面反射が反映されたためと思われる。今回の結果より高周波超音波を用いることで歯槽骨表面のトポグラフィーを画像として検知できることが可能であることが示された。来年度は探触子の走査をX-Y駆動装置によって自動化し、規格化された計測条件下にて、歯周疾患の病態に依存した再現性を有するエコーを取得できるようシステム構築を行った上、得られた信号よりより精細なエコー画像を再構成し、歯周疾患の病態の可視化を実施する予定である。今年、英・オックスフォード大グループによる国際的な研究によれば、X線を用いた年間検査回数が15か国の平均の1.8倍と突出して高い我が国では、放射線診断による被ばくが原因と推定される発がん率が平均の2.7倍であるとの試算がなされ、X線診査を可能な限り超音波検査に置き換える必要性が提言されている。本研究による高周波超音波は、微細な解像度が求められる口腔領域における透視像の作製に道を拓く組織断層撮影技術である。これまでの我々の研究では拠れば、歯槽骨の喪失を顕す超音波エコーにより構成されるヒストグラム画像により、歯周病診断の主力であるX線診査に代わる透視診断手法を確立する可能性が示唆された。本年度はこれら聴音波エコーのヒストグラム像の取得を自動化すべく、探触子をX-Y駆動装置によって走査し、規格化された計測条件下にて、再現性を有するエコーを取得できるようシステムを構築した。
全球および日本列島を対象とした超高解像度陸上生態系モデルを用いた炭素収支解析

一昨年12月に京都で開かれたCOP3で合意されたことでも分かるように、陸上生態系のCO_2吸収能力定量的な評価が、国際的に大きな検討課題となってきた。このような国際情勢をふまえて、現在、私のところで開発しつつある全球の陸上生態系モデル(Sim-CYCLE)に基づいて、地球全体の陸上生態系、特に森林生態系が、光合成、呼吸、土壌有機物分解などの生物の生理生態過程を介して、大気中のCO_2濃度変動に対してどのように応答し、現在進行中の人間活動によるCO_2濃度上昇をどの程度まで抑制しうるかを、定量的に予測した。これまでに私が行ってきた植物の生理生態学過程に基礎をおいた炭素動態モデルをさらに拡張して、高解像度の全球陸上生態系モデル、および日本列島を対象とした超高解像度の陸上生態系モデルを開発した。
肺癌における変異ＫＲＡＳ制御末梢分泌型ｍｉｃｒｏＲＮＡの解析

MPPがみられる症例は細胞接着が弱く、転移を起こしやすいとされる。KRAS変異がある大腸癌細胞株で細胞接着が弱いことを証明し、肺癌細胞で同様の証明をするため、KRAS変異がある肺癌細胞株から変異KRASを抑制した細胞を作製している。また、変異KRASを抑えた肺癌細胞を用いて、培養液中のmiRNAを採取・解析することを予定している。肺癌患者で、変異KRAS制御末梢分泌型miRNAを、患者血清よりエクソソームの抽出により解析し、リンパ節での標的分子の発現も同時に解析することで、癌の早期発見、診断、予後予測、治療効果などに有用なバイオマーカーを探索することを目的として、研究計画を予定した。まず、術前の血液サンプルと腫瘍組織およびリンパ節サンプルの集積を行ない、現在で約120例のサンプルが集積した。本研究は、肺癌患者で、変異KRAS制御末梢分泌型miRNAを、患者血清よりエクソソームの抽出により解析し、リンパ節での標的分子の発現も同時に解析することで、癌の早期発見、診断、予後予測、治療効果などに有用なバイオマーカーを探索することを目的とするものである。しかし、膨大な数のmiRNAの中から標的となるmiRNAを特定するのは容易ではなく、効率的な標的遺伝子の検索法に工夫が必要となる。我々は、より標的を絞り込むために肺癌患者の25%程にみられる変異KRASの有無を比較要素に加えることで、より効率的に肺癌に関与する分泌型miRNAを検出できるのではないかと考えている。また、肺癌患者の採取した縦隔リンパ節で、変異KRASに発現制御されるmiRNAは、予後予測因子となり、縦隔リンパ節転移に関与するmiRNAを検出する事も本研究の重要な目的である。当初の予定通り、初めの1年間は学内倫理委員会の承認を得た上で、サンプルの収集を行なった。対象となる症例は、非小細胞肺癌患者で、手術により、リンパ節廓清が行なわれた症例。集まった症例数は40症例で、目標は80症例であるため、今後もサンプルの収集に努める予定である。本研究では、肺癌患者で、KRASが制御する末梢分泌型miRNAを、患者血清よりエクソソームを抽出・解析し、肺癌の有用なバイオマーカーを探索することを目的とした。術前の血清、病変部とリンパ節切除が行われた110症例の肺癌切除患者を対象とした。病理標本を用いて、Scorpion-ARMS法で腫瘍にKRAS変異が見られるかを解析した。110例中7例(6.3%)にKRAS変異がみられた。KRAS変異がある症例とない症例の病理学的特性を比較し、KRAS変異がある症例は全例腺癌、リンパ節転移はみられなかった。7例中5例が3cm以下の腫瘍径であり、KRAS変異がなく、3cm以下でリンパ節転移陰性腺癌の症例と比較した。その結果、micropapillary pattern(MPP)が見られる症例が、KRAS変異陽性症例で優位に多かった。MPP症例は、腫瘍細胞間の接着が弱く、転移が多いという報告があり、KRASの変異がMPPの発現に関与しているなら、新しい発見であり、臨床的に大きな意味を持つ。先行実験として大腸癌細胞株で、浮遊培養下に分散傾向を見る実験を施行。その結果、細胞間接着抑制する5%ETOHを加えると、活性化KRASが存在する細胞塊が分散傾向にある事を証明し、変異KRAS陽性細胞塊は細胞間接着が弱い事を示した。この特性は、MPPと類似する特性であり、KRAS変異有り無しの細胞を用いて、細胞塊の分散傾向を観察することで、基礎の方面から細胞接着にKRASが関与しているかを解明する実験になりえる。現在、KRAS変異がある肺癌細胞株から変異KRASを抑制した細胞を作製している。当初、患者血清を用いたエクソソームの解析を予定したが、KRAS変異症例が少なかった事、KRAS変異症例にリンパ節転移がなかった事より、KRAS変異が有る無しの細胞の培養液中のmiRNAを採取・解析する方針に変更した。呼吸器外科2013年6月より2014年1月まで海外留学をしたため、サンプル収集は他者に依頼し、継続していたが、それ以上の実験の進行ができなかった。学内のIRB承認が遅れた事と、予想より症例数が集まりにくい事より、進行状況はやや遅れている。しかし、予想を大きく逸脱したものではないため、研究計画を大きく変更する必要はないため、やや遅れているの評価にした。その後の流れとして、まず、変異KRASの確認が必要であり、変異KRASがみられた患者血清より血清中miRNAの抽出を行なう予定としている。その結果よりバイオマーカーとしての意義を持つものがあるかを検討する。サンプルの収集を行ないながら、初期研究として回収したmRNA中で、申請者らが候補に挙げているKRAS依存性miRNAの発現量を、Fluidigm. BioMark HD Real-Time PCR Systemや発現アレイで、KRAS変異陽性サンプルと陰性サンプル間に発現量の差がみられるmiRNAを検出および確認を行う方針としている。

KRAS変異症例が20症例以上集まった段階で、KRAS変異がある症例20例とない症例20例とで、発現アレイで比較検討する事とする。目標症例数80まで待たずに、KRAS変異を確認し、KRAS変異陽性例が20症例集まれば、発現アレイによる検討が行なえるため、早めの段階で、Scorpion-ARMS法によるKRAS変異の有無を確認する。2013年度内に留学をしたため、研究の進行が遅れたため、研究期間の延長を申請し、承認された上で、次年度に繰り越す事となった。KRAS変異有無の外注検査。KRAS変異の有無は、病理標本パラフィン切片を用いて、Scorpion-ARMS法で行う(外注委託、1本2万円、80本予定)予定。また、得られたデータの解析を行なうため、情報解析用PC等の経費がかかると考える。現段階ではサンプル収集をしているのみであり、研究費用はほとんどかかっていないため、H24年度分の繰越金が発生している。繰越金と請求したH25年度分の研究費で、上記の実験を行なう予定である。
RFIDの口腔内設置が連携する社会安全と健康増進のバリューチェーン

携帯電話の通話操作で口腔内にあるRFIDと連携でき,電子決済やエントランスゲートなど,高いセキュリティレベルを要求される本人確認に対応,しかも自然な操作で素早い認証手段となる.このRFIDに体温や血糖値を計測するセンサーを組み込み,生体情報をモニターするため, RFIDを膜状して歯周組織内に設置するためになくてはならない電子媒体基板として,厚さ10μmの純チタンマイクロ多孔版を開発に成功した.携帯電話の通話操作で口腔内にあるRFIDと連携でき,電子決済やエントランスゲートなど,高いセキュリティレベルを要求される本人確認に対応,しかも自然な操作で素早い認証手段となる.このRFIDに体温や血糖値を計測するセンサーを組み込み,生体情報をモニターするため, RFIDを膜状して歯周組織内に設置するためになくてはならない電子媒体基板として,厚さ10μmの純チタンマイクロ多孔版を開発に成功した.口腔内にRFIDを設置,携帯電話と連携し,電子決済など高いセキュリティを要求される局面でも確実で素早く認証,加えてRFIDに体温や血糖値を計測するセンサーを組み込み,生体情報をモニターして糖尿病などの生活習慣病の予防や治療を支援するシステムの基礎的実証を行う.本年度は血糖値計測を念頭としたRFID構築の前提条件として,その実質的なボリュームの大半を占め,形態・構造のメインと成るアンテナ部をチタニウム製にて試作することを試みた.このRFIDは歯周組織内部への設置が見込まれる事から,その形状を現在の歯周組織再生誘導膜(バリアメンブレン)に近似するのが適当と思われることから,アンテナとして薄膜チタニウムを成形することとした.その結果,バリアメンブレンをモデルとした薄膜チタニウムは,現状のポリマー製のものより大幅に菲薄化(400→50ミクロン)することが可能であり,これを歯周組織再生用として用いることで,歯周治療への効果も併せて実現することも着想した.そこで薄膜チタニウムによる薄型アンテナ形成とともに,バリアメンブレンとして必要な細胞隔壁フィルター機能を設けるため,純チタンを対象とした超精密試験加工を実施した.まずミクロンレベルの穿孔加工として,マイクロピアス穿孔加工を行い,φ20μm,ピッチ50μmにて2500穴の形成を試み,90%以上の歩留まりを達成した.次に,純チタニウム微粒子とつなぎ材による薄型コンパウンドに微細な硬針を用いて直径100ミクロン以下の貫通孔を形成,これを繰り返してメッシュ状とした上,つなぎ材の焼却と不活性ガス雰囲気下における純チタニウム微粒子の焼結形成を行った.これらの精密加工によっていずれも,微細なポアサイズの貫通孔が密に確保され,メッシュ状のフィルター構造が再現された純チタニウム薄膜フィルターが形成され,またこれらは細胞培養による検証により良好な生体親和性を有することが確認された.携帯電話を顔に寄せるタイミング,すなわち通話操作がそのまま口腔内にあるRFIDと連携できる機会となり,電子決済やエントランスゲートなどでの本人確認手段として素早い認証手段となり、加えてRFIDに体温や血糖値を計測するセンサーを組み込み,生体情報をモニターして糖尿病などの生活習慣病の予防や治療を支援するシステム開発を念頭に,生体親和性を施したRFIDと血糖値計測用電極を口腔内に設置し,RFIDとの通信,血糖値計測を実証する.歯周病治療における歯周組織再生手術の際に用いられる歯槽骨再生誘導メンブレンにRFIDを組み込む方法を考案,箔状のチタン製アンテナの設計シミュレーションを行い、生体の伸縮と屈曲に対応出来るクローバー状のループアンテナを考案した。このアンテナは純チタン製であることから、RFID端子との電気的接続という懸案については、チタンに親和性のあるNi(ニッケル)にて下メッキを行いその上に金メッキを施す方法により、良好な接合を達成、歯周組織埋込型RFIDの実現に向け大きく前進した。さらにアンテナループとなる純チタン箔の生体親和性を検証するために、歯根膜由来線維芽細胞による培養試験を行い、極めて良好な成績を得た。さらに、このようなチタン箔薄アンテナの生体親和性を向上するため、箔に50μm孔を無数に形成するメッシュか処理を行ったところ、培養細胞の付着と増殖はさらに良好になることが示された。生体内に埋め込み可能な電子媒体の安全性が実用レベルに達成されたことで、その臨床応用に大きく近づいたものと思われる。携帯電話を顔に寄せるタイミング,すなわち通話操作がそのまま口腔内にあるRFIDと連携できる機会となり,電子決済やエントランスゲートなどでの本人確認手段として素早い認証手段となり、加えてRFIDに体温や血糖値を計測するセンサーを組み込み,生体情報をモニターして糖尿病などの生活習慣病の予防や治療を支援するシステム開発を念頭に,生体親和性を施したRFIDと血糖値計測用電極を口腔内に設置し,RFIDとの通信,血糖値計測を実証する.歯周病治療における歯周組織再生手術の際に用いられる歯槽骨再生誘導メンブレンにRFIDを組み込む方法を考案した。これは歯槽骨再生用バリアメンブレン用のポリマー製フィルターを、純チタン製のミリポアフィルターに代えることで、GTRとGBR療法をRFID埋込の機会として利用するこれまでに無い方法である。歯周病で失われた歯槽骨、あるいはインプラント母床骨として顎骨骨梁高さを回復させる再生治療には、回復に長期を要する分、バリアメンブレンに長期耐久性が要求される課題に対応する方法であり、そのため本研究では10μm厚のチタン薄板に対し孔径20μm、ピッチ50μmにて無数の貫通孔アレイを形成したマイクロ多孔板による純チタン・フルメタルバリアメンブレンを創製した。

もともとRFIDを体内に埋め込む際に外部との通信に必要な箔状のチタン製アンテナは、ここで開発されたマイクロ多孔板を用いることが可能であるから、歯周組織埋込型飛FIDの実現に向け大きく前進したこととなる。今回開発されたマイクロ多孔板は、生体に電子媒体を導入する際の基盤としてはうってつけであり、埋め込み型人工臓器等にも利用できる汎用性の高い技術でもある。生体埋め込み電子媒体の具体的デザインとそれを実現する新素材が開発されたことで、その臨床応用に大きく近づいたものと思われる。
局所構造を利用した高速なアルゴリズムの開発

本研究では,局所的な離散構造を利用することで,効率的なアルゴリズム設計のための基礎理論の構築を目指す.具体的には,離散的な構造解析手法に基づく,(1)局所解改善の方法論,(2)局所解の列挙手法の研究を行う.離散アルゴリズムは情報化社会において極めて重要であるが,その計算量的な難しさから,メタ戦略など品質保証されない手法を用いて解かれることが多い.これらの手法の多くは局所探索法を発展させたものであり,局所解の離散構造の解析は非常に意義深く,チャレンジングな研究課題である.本研究では,局所的な離散構造を利用することで,効率的なアルゴリズム設計のための基礎理論の構築を目指す.具体的には,離散的な構造解析手法に基づく,(1)局所解改善の方法論,(2)局所解の列挙手法の研究を行う.離散アルゴリズムは情報化社会において極めて重要であるが,その計算量的な難しさから,メタ戦略など品質保証されない手法を用いて解かれることが多い.これらの手法の多くは局所探索法を発展させたものであり,局所解の離散構造の解析は非常に意義深く,チャレンジングな研究課題である.