hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クリティカルメタルのハイスループット分離を可能にする高分子配位子導入キレート樹脂

貴金属元素,希土類元素,インジウムなどクリティカルメタルを選択的かつ迅速に分離できるキレート樹脂について研究した。元素捕捉基として分子量の大きなポリエチレンイミンの一部をN-アセチル化,ホスホメチル化,カルボキシメチル化した高分子配位子を用い,それらの有用性について評価した。N-アセチル化したものは貴金属元素,特に金(III)の捕捉に,ホスホメチル化したものは希土類元素の捕捉に有用であったが,カルボキシメチル化したものは選択性,迅速性の観点から優れていた。メタクリル酸グリシジルとエチレングリコールジメタクリレートとを共重合して多孔性樹脂を合成した。また,クロロメチルスチレンとジビニルベンゼンとを共重合して同様に多孔性樹脂を合成した。得られた樹脂を分級し,粒径,比表面積,細孔径,細孔容量などの樹脂特性を測定した。この樹脂にポリエチレンイミン600など種々の分子量を持つポリアミンをそれぞれ導入した。得られた樹脂の一部を元素分析し,窒素含有率を決定した。また,得られた樹脂を脱プロトン化し,次いで塩酸溶液中でプロトン化させ,この塩酸溶液を自動滴定装置で酸塩基滴定して樹脂中の窒素含有率を見積もる方法についても検討した。次いで,樹脂に導入したポリアミンに無水酢酸を作用させ,N-アセチル化ポリアミン型樹脂を合成した。得られた樹脂において,24種類の元素の捕捉能力を検討したところ,これらの樹脂が金(III),白金(IV)およびパラジウム(II)に対し優れた捕捉能力を有することを明らかにした。なお, N-アセチル化時の無水酢酸量を増加させることにより,白金(IV)およびパラジウム(II)の捕捉は阻害される傾向にあったが,金(III)の捕捉は顕著な影響を受けなかった。一方,導入したポリアミンの分子量の違いについては,顕著な影響を見いだすに至らなかった。さらに,樹脂に導入したポリアミンに塩酸共存下でパラホルムアルデヒドと亜リン酸とを作用させ,ホスホメチル化ポリアミン型樹脂を合成した。樹脂に導入されたポリアミンの窒素量に対し,パラホルムアルデヒドおよび亜リン酸の当量を変化させてホスホメチル化を行い,得られた樹脂をマイクロウエーブ分解してICP発光分光分析にてリンを定量したところ,当量の増加とともに樹脂中のリン量が増大していることを認めた。なお,カルボキシメチル化ポリアミン型樹脂について,その元素捕捉能力を市販樹脂と比較評価した。N-アセチル化ポリアミン型樹脂による貴金属元素の分離に関する研究においては,樹脂に捕捉された貴金属元素の脱離条件について詳細に検討した。金(III),白金(IV),パラジウム(II)においては,塩酸,硝酸では脱離は不十分であったが,チオ尿素/塩酸を用いることにより定量的に脱離させることができた。樹脂の繰り返し利用性について検討したところ,少なくとも5回までの使用が可能であった。N-アセチル化ポリアミン型樹脂を実廃液からの金(III),白金(IV),パラジウム(II)の分離回収に適用し,好結果を得た。ホスホメチル化ポリアミン型樹脂による希土類元素・インジウムの分離に関する研究においては,樹脂に導入するポリアミン分子量,ホスホメチル化率と各元素の捕捉能力との関係について検討した。分子量の異なるポリエチレンイミンを基材樹脂に導入し,元素分析で求めた樹脂上の窒素量に対して種々の量のホスホメチル化試薬を添加して調製した樹脂において,分子量ならびにホスホメチル化試薬量の増大とともに希土類元素を定量的に捕捉できるpH範囲が酸性側にシフトして広がった。インジウムについても同様の傾向が認められた。なお,この樹脂は,コバルト,銅,ガリウム,モリブデン,ニッケル,バナジウムなども定量的に捕捉するが,マグネシウム,カルシウム,ストロンチウムなども捕捉してしまうことが明らかとなった。樹脂を固相抽出カートリッジに充填し,希土類元素を含む溶液を通易させた場合,希土類元素の捕捉は少なくとも9 mL/minまでの流量では影響を受けなかったが,それ以上の流量では重希土類元素の捕捉率が低下した。また,粒子状樹脂の工業利用のための形態に関する研究の一環として,既存の焼結体製造技術を応用し,樹脂を含む焼結体の調製についても検討した。ホスホメチル(PM)化ポリアミン型樹脂による希土類元素・インジウムの分離に関する研究においては,溶離液について検討した。3 mol/Lの硝酸を用いた場合塩基性条件下で捕捉させた軽希土類元素は高い脱離率を得ることができたが,重希土類元素の溶出は困難であった。また,カドミウム,銅,マンガン,ニッケル,鉛,亜鉛などは定量的な脱離が可能であったが,インジウムはほとんど脱離しなかった。一方,0.2 mol/L EDTA溶液を用いた場合,スカンジウムを除く希土類元素はほぼ定量的に脱離可能であった。しかし,インジウムの脱離率は不十分であった。なお,pH 2で捕捉し,EDTA溶液,次いで硝酸で脱離させる実験を繰り返したところ,少なくとも10回までは定量的な希土類元素の回収が達成された。一連の研究により得られた知見にもとづき,キレート樹脂用高分子配位子について考察した。カルボキシメチル化ポリエチレンイミン(CM-PEI)型配位子の場合,CM化率が大きくなると同様に捕捉能力も大きくなるが元素捕捉選択性は乏しくなる傾向を有していた。PM-PEI型配位子も同様の傾向を有していた。

これはアミノカルボン酸基,アミノホスホン酸基が錯形成に寄与し,その挙動がアミノ基のそれとは異なることに起因するためであると推測される。N-アセチル化ポリエチレンイミン(Ac-PEI)型配位子はAc化率の上昇とともに金以外の元素の捕捉を阻害する傾向にあり,これはAc部位が捕捉を阻害しているためであると推測された。なお,ポリアミン分子量においては,大きい分子を用いた場合に捕捉能力の若干の向上が認められた。また,粒子状樹脂の工業利用のため,樹脂を含む焼結体を調製し,元素分離材として機能するか検討した。貴金属元素,希土類元素,インジウムなどクリティカルメタルを選択的かつ迅速に分離できるキレート樹脂について研究した。元素捕捉基として分子量の大きなポリエチレンイミンの一部をN-アセチル化,ホスホメチル化,カルボキシメチル化した高分子配位子を用い,それらの有用性について評価した。N-アセチル化したものは貴金属元素,特に金(III)の捕捉に,ホスホメチル化したものは希土類元素の捕捉に有用であったが,カルボキシメチル化したものは選択性,迅速性の観点から優れていた。交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画におおむね従い研究が進んでいるため。固相抽出剤の開発とその元素分離技術への応用ホスホメチル化ポリアミン型樹脂については,捕捉した希土類元素・インジウムの定量的な脱離のために,酸,塩基,錯形成剤などの適用を試み,最適な溶離液について検討する。また,実用性を明らかにするため,元素の捕捉におよぼす共存成分の影響についても検討する。また,すでに明らかになっているカルボキシメチル化ポリエチレンイミン型配位子に関する知見と,本研究で明らかになってきているN-アセチル化およびホスホメチル化ポリアミン型高分子配位子に関する知見を整理し,高分子配位子の設計指針構築に向けて検討する。これらに加え,粒子状樹脂の工業利用のための形態に関する研究も引き続き進める。交付申請書に記載した平成25年度の研究実施計画におおむね従い研究が進んでいるため。N-アセチル化型樹脂については,捕捉した金(III),白金(IV),パラジウム(II)の溶出条件について検討するとともに,実廃液からのこれら元素の回収を試みる。ホスホメチル化ポリアミン型樹脂については,元素捕捉挙動について詳細に検討する。これらに加え,粒子状樹脂の工業利用のための形態に関する研究も進める。
ヒトES細胞由来血管前駆細胞と血管ホルモンを用いた虚血脳再生医療の開発

本年度の研究では、我々が血管-神経再生作用を見出した血管拡張ホルモンであるアドレノメデュリン(AM)の虚血脳再生機序を検討した。また下肢虚血モデルにおいてヒトES細胞移植での示適分化段階を検討し、ヒトES細胞由来細胞と血管ホルモンを用いた虚血脳再生医療の実現に向けた研究を推進した。AMは心血管障害因子として現在注目されているアルドステロン(Aldo)の分泌を抑制する事が知られている。そこで中大脳動脈20分閉塞(20m-MCAO)脳梗塞モデルマウスにアルドステロン(Aldo)プロッカーであるスピロノラクトンを投与することでAMによるAldo産生抑制を模倣し、bFGFなど虚血脳再生因子の発現や梗塞域の大きさを評価した。また、大腿動脈結紮下肢虚血モデルマウスにヒトES細胞由来血管内皮細胞(VPC-EC)ならびに、壁細胞(VPC-MC)を移植し、血管再生効果を検討した。マウスに20m-MCAOを施行することにより、Aldo受容体であるミネラルコルチコイドレセプターの発現が主に虚血局所のグリア細胞で増加した。20m-MCAOを施行したマウスにスピロノラクトンを投与すると、虚血脳再生促進因子であるbFGFやVEGFの発現が増加し、梗塞域が縮小した。大腿動脈結紮下肢虚血モデルマウスへのES由来細胞移植後の虚血下腿筋における血管密度と血流は、VPC-EC,VPC-MC単独移植よりも両者の混合移植において顕著に増加した。これらの結果は、ヒトES細胞と虚血脳再生ホルモンを用いた新規再生医療の有用性を示唆する重要な成果である。本年度はマウス脳梗塞モデルにおいて、ES細胞から誘導した分化段階の異なる複数の血管前駆細胞(VPC)由来細胞の移植実験を行い、血管-神経再生療法に用いる細胞製剤ソースとして好適な分化段階を検討した。移植実験の比較対象として(1)VPC(2)VPC由来内皮細胞(VPC-EC)(3)VPC由来血管壁細胞(VPC-MC)(4)(2)と(3)の混合群(VPC-EC+MC)、対照群として(5)ヒト末梢血をフィコール分離することによって得られた単核球細胞(MNC)(6)生理食塩水を準備した。塞栓子を総頚動脈より挿入し、中大脳動脈を20分間閉塞することで脳梗塞モデルを作成し(20m-MCAO)、その直後に総頚動脈からマイクロチューブを用いてVPC由来細胞を3×10^5個(/50μl/body)注入した。第28病日まで、レーザードップラー血流計を用いて局所脳血流を定量し、ニューロンマーカーNeuN免疫染色で梗塞域の大きさを、ロータロッド法で運動機能を評価した。その結果、(2)VPC-ECならびに(3)VPC-MC移植群は、(5)NNC群ないし(6)生理食塩水群と比較して有意な血流増加と梗塞域の縮小、さらには運動機能回復の促進を認め、(4)VPC-EC+MC移植群においては、なお一層の改善効果を認めた。これらの結果より、ES細胞由来VPCは虚血脳における血管-神経再生療法の有力な材料となる可能性が示唆され、VPC-ECとVPC-MCの混合細胞製剤が移植治療により好適である可能性が明らかとなった。
プロスタグランジンE受容体の精製とその性質に関する研究

プロスタグランジン(PG)E受容体は、牛副腎髄質のクロマフィン細胞ではアデニレ-トシクラ-ゼ抑制系とイノシト-ルリン脂質(PI)代謝系の両方にカップルしており、後者はPGE_2のクロマフィン細胞からのカテコ-ルアミン遊離に関与していることを明らかにしてきた。本年度はこの研究をさらにおしすすめ、(1)G蛋白を直接活性化するフッ化ナトリウムを用いて、PGE_2のPI代謝系とのカップルにG蛋白を介していること、(2)PI代謝の亢進は、ジアシルグリセロ-ルとIP_3の2つのセカンドメッセンジャ-を産生し、前者はプロティンキナ-ゼC(PKC)の活性化、後者は細胞内Ca^<2+>濃度(〔Ca^<2+>〕i)の上昇をひきおこす。〔Ca^<2+>〕i上昇は、細胞内Ca^<2+>ストアからの遊離と細胞外からのCa^<2+>の流入が関与し、後者はPGE_2のCa^<2+>チャンネルの活性化によること、(3)PGE_2のカテコ-ルアミン遊離作用がPI代謝系の2経路のうち、主としてPKCの活性化を介していること、(4)さらにPKCの活性化は細胞膜上のNa^+、H^+-アンチポ-トを活性化して、二次的に〔Ca^<2+>〕iを持続的に上昇させ、遊離を促進させることを明らかにした。63年度の実験計画に挙げたPGE受容体の性質とその情報伝達機構は、予想以上に進展し、カテコ-ルアミン遊離という細胞応答に至る過程まで詳細に解明できた。一方、64年度研究計画に従ってPGE_2-ビオチン誘導体を合成して、ビオチン-受容体-G蛋白複合体(HRG複合体)の精製を試みた。このビオチン誘導体はPGE_2より2オ-ダ-親和性が悪かった。HRG複合体を可溶化して、WGAカラム、アビジンカラムで精製した後、SDS電気泳動を行った。幅広いバンドが分子量10万前後に、シャ-プなバンドが4万前後に認められた。現在この蛋白バンドの同定を試みているが、PGE受容体の蛋白含量が少ないため精製は困難である。今後、クロ-ニングなど他の手法を含めてPGE受容体の蛋白化学的性質を解明したい。63年度は牛副腎髄質のPGE受容体を精製するため、その性質の解明に主眼をおいたが、以下に述べる成果が得られている。1.可溶化PGE受容体と精製G蛋白のリポソーム膜上での機能的再構成受容体の情報伝達機構はカップルするG蛋白に規定されるので、牛副腎髄質(adrenal medulla)よりG蛋白の精製を行った。脳よりすでに均一に精製されているGi、Goとは異なる新しい百日咳菌毒素感受性G蛋白を単離してGamと名づけた。さらに精製したGi、Gam、Goと可溶化したPGE受容体とリポソーム膜上で機能的再構成に成功した。

WGAレクチンカラムに吸着させてG蛋白を除去したPGE受容体にGi、Go、Gamを添加すると用量依存的に〔^3H〕PGE_2の結合活性の回復が認められ、GTP_γS共存下ではその回復が阻害された。一方、PGE受容体と会合したG蛋白はPGE_2によりG蛋白が持つ内因性GTPase活性の増加が認められた。以上の結果は、リポソーム膜上でPGE受容体とG蛋白の機能的会合に成功した最初の報告である。しかしながら、Gi、Gam、Go間の選択性は認められなかった。2.PGE受容体のGiを介するアデニレートシクラーゼ系との連関これまで牛副腎髄質PGE受容体は、百日咳菌毒素非感受性にイノシトールリン脂質代謝系とカップルしていると報告されたが、1.の結果をもとに再検討した結果、PGE受容体はGiを介してアデニレートシクラーゼにも抑制的に作用することを明らかにした。一方、G蛋白を直接活性化させるNaFを用いて、PGE受容体がG蛋白を介してイノシトールリン脂質代謝を亢進させることを確認した。以上の結果は、PGE受容体がG蛋白を介して2つの異なる情報伝達系とカップルしていることを示唆しているが、Scatchard解析では牛副腎髄質PGE受容体は単一である。PGEのアゴニストを用いても両者を区別することはできない。64年度は、これらの成果をさらに発展させると共に、PGE受容体の単離精製を試みる。プロスタグランジン(PG)E受容体は、牛副腎髄質のクロマフィン細胞ではアデニレ-トシクラ-ゼ抑制とイノシト-ルリン脂質(PI)代謝系の両方にカップルしており、後者はPGE_2のクロマフィン細胞からのカテコ-ルアミン遊離に関与していることを明らかにしてきた。本年度はこの研究をさらにおしすすめ、(1)G蛋白を直接活性化するフッ化ナトリウムを用いて、PGE_2のPI代謝系とのカップルにG蛋白を介していること、(2)PI代謝の亢進は、ジアシルグリセロ-ルIP_3の2つのセカンドメッセンジャ-を産生し、前者はプロティンキナ-ゼC(PKC)の活性化、後者は細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の上昇をひきおこす。[Ca^<2+>]i上昇は、細胞内Ca^<2+>ストアからの遊離と細胞外からのCa^<2+>の流入が関与し、後者はPGE_2のCa^<2+>チャンネルの活性化によること、(3)PGE_2のカテコ-ルアミン遊離作用がPI代謝系の2経路のうち、主としてPKCの活性化を介していること、(4)さらにPKCの活性化は細胞膜上のNa^+,H^+-アンチポ-トを活性化して、二次的に[Ca^<2+>]iを持続的に上昇させ、遊離を促進させることを明らかにした。63年度の実験計画に挙げたPGE受容体の性質とその情報伝達機構は、予想以上に進展し、カテコ-ルアミン遊離という細胞応答に至る過程まで詳細に解明できた。一方、64年度研究計画に従ってPGE_2ービオチン誘導体を合成して、ビオチンー受容体ーG蛋白複合体(HRG複合体)の精製を試みた。このビオチン誘導体はPGE_2より2オ-ダ-親和性が悪かった。HRG複合体を可溶化して、WGAカラム、アビジンカラムで精製した後、SDS電気泳動を行った。幅広いバンドが分子量10万前後に、シャ-プなバンドが4万前後に認められた。現在この蛋白バンドの同定を試みているがPGE受容体の蛋白含量が少ないため精製は困難である。今後、クロ-ニングなど他の手法を含めてPGE受容体の蛋白化学的性質を解明したい。
アルツハイマー脳におけるMAPIBの異常なリン酸化と微小管の機能異常

アルツハイマー病の脳において、未成熟神経突起の異常な伸展が起きているという考えを支持する証拠が蓄積してきている。その主な生化学的証拠は、この脳の蓄積物質PHFの主成分が未成熟神経突起の微小管に特異的に存在する胎児型リン酸化タウであることである。また、本研究代表者らにより報告された「PHFには胎児型リン酸化を受けた未成熟神経突起微小管に多いMAP1Bも存在する」という結果も、この証拠の1つとなっている。本年度は、PHFに存在するMAP1Bの異なるリン酸化部位を特異的に認識する複数の抗体をもちいて、これらの部位がラット脳の生後発達の過程で受ける脱リン酸化について調べた。また、これらの抗体のエピトープの同定を行なうことにより、これらの部位のリン酸化の役割について推定した。本年度得られた結果を、以下にまとめる。1.ラット脳MAP1Bのリン酸化には、幼若期特異的なものと成熟後にもみられるものとがある。3種類の抗リン酸化部位抗体の1つは成熟脳MAP1Bとも反応したが、他の2種はそれぞれ7日目以前と14日目以前の脳に特異的に存在するMAP1Bとのみ反応した。2.MAP1Bの一次構造上の特徴より、塩基性領域(558788)、酸性領域(831-1150)、SP配列に富む領域(1247-1794)、17アミノ酸配列の14回の不完全繰り返し領域(1848-2098)、Pに富む領域(2099-2200)、塩基性の軽鎖領域(2201以降)に分類した。リン酸化部位抗体を含む4種の抗PHF抗体のエピトープは酸性領域近傍に、PHFと反応しない抗体のエピトープはそれよりC端に存在した。3.以上のことから、PHF中のMAP1Bは、シナプスを形成していない未成熟な神経起に由来することが明らかとなった。また、このMAP1Bのリン酸化は、酸性領域と軽鎖との結合に影響を与えることにより、MAP1Bとチューブリンとの相互作用を制御するものと推定された。
合弁花の三次元形態の定量的評価とその多様性を形成する花弁細胞の成長パターンの解析

トルコギキョウ花弁の成長と花冠の3次元形態との関係を調査した.花冠先端が外側に反る品種では,開花後半に花弁先端部の横方法への成長が大きかった.コップ型の品種では花弁中間部や基部での横幅の著しい拡大がみられた.湾曲の少ない漏斗型の花では,花弁の部位間における成長の差は小さかった.これらのことから、花冠の立体的な形態は、花弁の細胞の成長パターンに由来する花弁内の領域的な成長の差によって生じていることが推定された.トルコギキョウ花弁の成長と花冠の3次元形態との関係を調査した.花冠先端が外側に反る品種では,開花後半に花弁先端部の横方法への成長が大きかった.コップ型の品種では花弁中間部や基部での横幅の著しい拡大がみられた.湾曲の少ない漏斗型の花では,花弁の部位間における成長の差は小さかった.これらのことから、花冠の立体的な形態は、花弁の細胞の成長パターンに由来する花弁内の領域的な成長の差によって生じていることが推定された.1.花弁立体形状の形成と局所的な花弁の肥大成長の関係の解析トルコギキョウの花弁の平面形状および花を真横から見たときの花弁の湾曲の定量的な解析を行った結果,花冠先端部に反りがある花型では花弁が細長く,花冠中基部に膨らみがある花型では,花弁の横幅が広い傾向があった.つぎに典型的な花型を示す品種について,蕾期の花弁の背軸側に2mmメッシュのドットをマークして,蕾期から開花期までの花弁の局所的な成長の違いを比較するとともに,開花各ステージにおける表皮細胞の長さと幅を計測して細胞肥大の経時的変化を調査した.その結果,縦方向への花弁成長率には,異なる花型間に明らかな差は認められなかった.一方,コップ型では花弁の横方向の成長が特に高く,ベル型では花弁先端部の横方向への成長が基部よりも高かった.花弁表皮細胞の観察においては,コップ型の品種において開花初期より横方向への成長が著しかったのに対し,ベル型の品種では,開花の後期に縦方向への急速な成長がみられた.以上の結果より,コップ型でみられる花冠の膨らみは,細胞の横方向への成長による花弁横幅の急速な拡大によって起こり,花冠の外側への反りは,花弁先端部の細胞の縦方向への成長によって花弁先端部が扇形に拡大し結果として横幅が広がることにより起こると考えられた.2.トルコギキョウ花弁において発現する遺伝子のEST解析トルコギキョウ花弁から抽出したRNAをもとに,標準化ライブラリーを作製するとともに,次世代シークエンサーを用いてその塩基配列を決定した.合計64万リードが得られ,その平均長は298bp、総塩基数は190Mbpであった。これをアセンブリングした結果、63,401コンティグ(2以上のリードからなる)が得られ、1Kbp以上のコンティグは3,688個存在した.1.トルコギキョウ花冠形態の定量化野生種含めた合計122系統・品種のトルコギキョウにおいて,花弁の湾曲と二次元形状を定量的に評価した.花弁の湾曲は,花弁を側面から見た花弁中央脈の背軸面に沿った曲線をトレースし,得られたカーブの輪郭をフーリエ係数に変換して,これらを主成分分析により解析した.花弁湾曲に関する第1,2主成分は,それぞれ花の開き,花弁中間部の内側へのカーブを評価していた.花弁形状に関する第1,2主成分は,それぞれ,花弁の横幅,花弁の重心を評価していた.さらに,花弁湾曲を表す主成分,および花弁形状を表す主成分を用いて,自己組織マップによって全品種・系統のクラスタリングを行った.その結果,4つの典型的なグループ,トールカップ型,ボウル型,ロート型,トランペット型が見出された.花弁湾曲の第2主成分は,花弁形状の第1主成分と高い相関があり,トールカップ型とボウル型の花冠の花弁湾曲形成は,横幅の広い花弁と関連が認められた.2.マイクロアレイによる遺伝子発現解析トルコギキョウの花弁から抽出したRNAを次世代シークエンサーにより解析し,約6万コンティグからなる転写産物配列データを得た.得られた配列データをもとにマイクロアレイを作成して,トルコギキョウの花弁の発達にともなう遺伝子発現の変化を調査した.マイクロアレイ上に載せた全遺伝子の約20%において,FDR5%水準で有意な発現の変化が認められた。発現の変化が認められた遺伝子について,GSEA (GeneSetEnrichmentAnalysis)により解析した結果,ステージ後半で発現が高い遺伝子セットには,オーキシン応答,ジャスモン酸応答,細胞壁,アントシアニン代謝,テルペノイド代謝,脂質代謝に関連する遺伝子が多く含まれ,発現が低下する遺伝子セットには,フラボノイド代謝,細胞壁関連の遺伝子が多く含まれた.1.コンピュータシミュレーションによる花弁立体形態形成機構の解析花の立体的な形態と各花弁の平面的な形態との関係を,CGを用いてシミュレーションすることを試みた.花弁の平面形態をスキャナーで取り込み,その形態を格子状の質点-バネモデルで表した.バネの伸長速度を場所により異なるように設定し,経時的な立体形態の変化をシミュレーションした.現段階のシミュレーションでは,成長の早い部分に皺ができるなどするため,パラメータの設定を改良する必要があるが,成長の早い部分が湾曲をする様子が再現された.2.遺伝子発現の花弁内における空間的分布の解析これまでの実験の結果,花弁が湾曲する部分は,その周囲と比べて伸長速度が速いことが明らかとなった.

このような花弁内における不均一な成長の原因となっている遺伝子の発現パターンの特徴を明らかにするため,トルコギキョウ花弁から細胞壁の伸展に関与する酵素の遺伝子のDNA塩基配列を多数決定することを試みた.細胞壁の伸展の制御に関与するとされるエクスパンシン遺伝子のファミリーを,縮重プライマーを利用したPCRにより増幅し,そのDNA塩基配列を決定した.決定した数十配列をアセンブルした結果,合計5種類のエクスパンシン遺伝子の配列が得られた.また,前年度に作成したトルコギキョウ花弁におけるESTデータベースを基に,XTHなど多数の細胞壁修飾酵素のDNA塩基配列を決定した.また,ゲノム配列から遺伝子情報を得るため,自家交配を繰り返した2系統のトルコギキョウについて,ゲノム配列のショットガンシークエンシングを行った.それぞれの系統について,40Gbの塩基配列を決定した.これらについて,アセンブルを行っている.これまでの研究の結果,花冠の立体的な形態は,花弁の成長が領域間で不均一であることと関係していることが明らかとなった.このことは,花弁成長に関連する遺伝子の発現が空間的に不均一に配置されていることを意味する.植物細胞の成長に関連する遺伝子として,細胞壁のキシログルカンポリマーの分解,再配置をするXTH(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase)やエクスパンシンが知られている.そこで,これら遺伝子の単離と発現解析を行った.自家交配を繰り返した2系統のトルコギキョウについて,ゲノム配列のショットガンシークエンシングを行った.それぞれの系統について,40Gbの塩基配列を決定し,アセンブルを行ったところ総塩基長1.5Gbずつのscaffoldを得た.この配列データをも元に細胞成長関連遺伝子を検索し,特にエクスパンシンに着目して発現解析を行った.シロイヌナズナの36個のエクスパンシンのうち5種類が計8個のトルコギキョウscaffoldにヒットした.また,エクスパンシン特異的な縮重PCRプライマーを用いて増幅して得られたエクスパンシン5種類は,計10個のトルコギキョウscaffoldにヒットした.花弁での発現が高かった3種類のエクスパン(EXP1,3,5)について花冠形態の異なる品種で花弁内の部位別発現解析を行ったところ,もっとも発現の高いエクスパンシンが品種により異なるとともに,それぞれ品種ごとに固有の発現パターンを示した.ロート型の`マイテレディ'は開花後半にEXP3の発現が著しく高まったのに対し,コップ型の`バルカンイエロー'は,EXP5の発現が開花前半,後半いずれでも高く,特に開花後半には花弁基部側で発現が高まった.この発現パターンはコップ型で予想された花弁基部での発現促進と一致し,コップ型の形成にEXP5が関与する可能性を示した.遺伝子ファミリーの解析が必要であるが,トルコギキョウではゲノム情報がこれまで利用できず,解析する遺伝子を得ることが難しかった.しかし,次世代シークエンサが利用できるようになったため,ESTデータベースおよびゲノム配列情報を得ることができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。
高原子価典型元素ポルフィリン錯体による水分子の多電子酸化活性化反応系の開発

軸配位水酸基を持つゲルマニウムポルフィリン錯体(Getpp)が、水分子の過酸化水素への二電子酸化反応において、反応効率の向上が課題となっている。前年度からの継続で、次の2つの観点から高効率化へのアプローチをしている。(1)鍵中間体であるGe-オキシル錯体の生成に必要な軸配位水酸基のプロトン解離過程の促進(2)TiO2表面におけるGetppに対する光捕集色素との共吸着系の構築による駆動波長の広領域化本年度の研究では、上記の2つの戦略の実験計画に基づいて、以下の研究成果を得ることができた。まず、pH=12の塩基性条件下で、過酸化水素をファラデー効率100%にて得ることに成功した。しかし、塩基性によって、TiO2の伝導帯電位が卑側へシフトするため、Getppからの電子移動効率が低下し、全体の生成効率が向上しない課題があった。そこで、外部電圧(200 mV)を印加した結果、過酸化水素の生成量を2倍に向上させることに成功した。さらに、Getppのフェニル基へ電子供与性置換基(メチル基およびt-ブチル基)を導入したGetpp誘導体を用いることで、TiO2への電子移動を促進し、過酸化水素の生成量を増加させることにも成功した。次に、フルオレセイン(CF)等の光捕集色素との共吸着系において、これまでTiO2電極系での反応を検討してきたが、今回、TiO2粉末系において、電極系と同様にCFとGetppを共吸着させた触媒粉末を調製し、光照射した結果、過酸化水素の生成が認められ、そのターンオーバー数(TON)は、Getpp単独吸着の時(TON=4)よりも、CFとの共吸着によって飛躍的に向上する(TON=216)ことを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。前年度では、酸化チタン(TiO2)で修飾されたITOガラス電極表面上に、軸配位水酸基および側鎖にカルボキシル基を持つゲルマニウムポルフィリン錯体(1)を吸着させた複合電極(1/TiO2/ITO)(陰極)と白金電極(陽極)および電解質水溶液から構成される電池において、陰極側へ可視光照射すると、水の二電子酸化生成物である過酸化水素が生成することを見いだしている。本反応は、過酸化水素の生成に対するターンオーバー数が9であることから、触媒的に反応が進行し、さらにファラデー効率が90%であり、ほぼ定量的に進行することがわかった。しかし、過酸化水素の発生効率が依然として低いことが問題であった。本年度の研究では、本反応の高効率化を目指すために、以下の2つの戦略で実験計画を立てて、次のような成果を得た。(1)これまでの研究から、過酸化水素の生成には、1の軸配位水酸基がプロトン解離することによって生成するGeーオキシル錯体が水の酸化の鍵中間体になることがわかっているので、高効率化のためには、塩基性条件下で反応する必要がある。そこで、TiO2との吸着力が塩基性条件下でも強いボロン酸基を導入した1を新たに合成することに成功し、pH=12においても反応が進行し、100%のファラデー効率にて過酸化水素が得られた。(2)本反応の駆動波長の広領域化によって、過酸化水素の生成効率の向上を目指した。1への励起エネルギーが可能なフルオレセイン色素およびBDPY色素を、1と共にTiO2表面上へ共吸着させた電極を調整し、色素のみが吸収できる波長の光を照射すると、過酸化水素の生成が認められた。これは、色素から1への励起ネネルギー移動が進行し、1が増感されたためと考えている。さらに、疑似太陽光を照射すると、色素を導入することによって、約3倍過酸化水素生成量が増加することもわかった。塩基性条件下において、TiO2への吸着力が弱いカルボキシル基に代わって、吸着力の強いボロン酸基を導入した1の合成に成功し、塩基性条件下での過酸化水素の発生を確認している。また、別の有機色素を導入することによる駆動波長の広領域化についても、1と有機色素をTiO2表面上へ共吸着させることで達成することができた。したがって、当初の研究実施計画で記載した内容は、ほぼ達成されていると考えている。

さらに、Getppのフェニル基へ電子供与性置換基(メチル基およびt-ブチル基)を導入したGetpp誘導体を用いることで、TiO2への電子移動を促進し、過酸化水素の生成量を増加させることにも成功した。次に、フルオレセイン(CF)等の光捕集色素との共吸着系において、これまでTiO2電極系での反応を検討してきたが、今回、TiO2粉末系において、電極系と同様にCFとGetppを共吸着させた触媒粉末を調製し、光照射した結果、過酸化水素の生成が認められ、そのターンオーバー数(TON)は、Getpp単独吸着の時(TON=4)よりも、CFとの共吸着によって飛躍的に向上する(TON=216)ことを明らかにした。これまでの反応系では、外部印加電圧(バイアス)はゼロにして行ってきたが、過酸化水素の生成効率の向上のために、バイアスをかけた実験を計画している。電極系に加えて、TiO2粉末系での水の酸化反応を検討する。駆動波長の広領域化においては、有機色素と1の吸着量の制御等、定量的な扱いをして、疑似太陽光下での過酸化水素の生成効率の向上を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ドイツにおける「新しい社会運動」と市民社会 「新しい」市民社会論の視点から

本研究では,1970年代以降西ドイツ社会において徐々に成立するに至った,いわゆる「新しい社会運動」と呼ばれる,市民による非営利的・非国家的な自発的組織を通して政治参画を求める動きを歴史的に再構成することを目指した.具体的には,史料上の制約から,当初の計画を若干変更して,ニーダーザクセン地域の事例を検討し,それを研究論文としてまとめ,国家と市場から区別された「社会」領域における,こうした運動の歴史的な位相を明らかにした.本研究では,1970年代以降西ドイツ社会において徐々に成立するに至った,いわゆる「新しい社会運動」と呼ばれる,市民による非営利的・非国家的な自発的組織を通して政治参画を求める動きを歴史的に再構成することを目指した.具体的には,史料上の制約から,当初の計画を若干変更して,ニーダーザクセン地域の事例を検討し,それを研究論文としてまとめ,国家と市場から区別された「社会」領域における,こうした運動の歴史的な位相を明らかにした.本年の研究実績は2つに大別される.「新しい社会運動は,財政的,行政的な観点,討議デモクラシー論に代表されるようなデモクラシー論の観点,ドイツ史における市民層(Burgertum)をめぐる議論,ならびに主として彼らを担い手とする様々な協会組織との連続性・断絶性の観点,さらにはこうした議論から当然導きだされてくる歴史的な概念としてのBurgerliche GesellschaftとZivilgesellschaftの関係に関する議論などの極めて異なる(研究)関心から議論されている対象である.そこでその先行研究の整理という目的でサーベイ論文「新しい市民社会論とは?」を執筆した.第2点目は,夏期休業期間中に行った4週間の調査旅行であった.この調査旅行では「ハンブルク・ハールブルク工科大学建設によって影響を被る市民の会」の市民運動の側・行政側の史料収集を主としてハンブルク州立文書館において行った.この市民運動はハールブルク市街中心部に工科大学を立地することに対して,地価・家賃の高騰および託児所,高校,難民収容施設等の市民関連施設の大学用地確保のための強制的な移転に反対して1978年に結成された市民運動であったが,運動の組織構造・主張の骨子・運動の展開等に関する詳細な史料を収集することができた.現在これらの分析・検討を実施中である.本年の研究実績は2つに大別される.第1点目は,夏期休業期間中に行った4週間の調査旅行であった.この調査旅行では「ハンブルク・ハールブルク工科大学建設によって影響を被る市民の会」に関する資料収集を行った.本研究は,研究の目的にも記されるように,メディア(史)研究の側面における寄与も念頭に置いている.そこで,上記の市民運動に関して継続的に報道を行っていた,die Welt Tageszeitung,Bildなどの全国紙からHamburger Abendblattなどの全ハンブルクレベルの地方紙,Harburger Wochenblattなどの州内の区レベルを対象とした新聞を収集した.こうしたメディア報道を利用することによって,公共圏形成においてメディアの果たす役割に関する分析が可能であると考えている.現在これらの分析・検討を実施中である.第2点目は,研究のタイムスパンを若干拡大し,「新しい社会運動」がその成立期より変化を遂げなが航現在いかなる形態として具現化しているのかという関心から新たな事例研究を行った.具体的にはエネルギー問題を関心の中心において活動するユーンデ村をとりあげ,「バイオエネルギー村ユーンデ生活環境再編に向けた討議民主主義の可能性」として発表した.本年の研究実績は2つに大別される.第1点目は,夏期休業期間中に行った4週間の調査旅行であった.この調査旅行では「ハンブルク・ハールブルク工科大学建設によって影響を被る市民の会」に関する資料収集を引き続き行った.本研究は,研究の目的にも記されるように,メディア(史)研究の側面における寄与も念頭に置いている.そこで,上記の市民運動に関して継続的に報道を行っていた,die Welt Tageszeitung,Bildなどの全国紙からHamburger Abendblattなどの全ハンブルクレベルの地方紙,Harburger Wochenblattなどの州内の区レベルを対象とした新聞を引き続き閲覧した.こうしたメディア報道を利用することによって,公共圏形成においてメディアの果たす役割に関する分析が可能であると考えている.現在これらの分析・検討中である.第2点目は,研究のタイムスパンを若干拡大し,「新しい社会運動」がその成立期より変化を遂げながら,現在いかなる形態として具現化しているのかという関心から新たな事例研究を行った.具体的にはエネルギー問題を関心の中心において活動するユーンデ村をとりあげ,昨年発表した「バイオエネルギー村ユーンデ生活環境再編に向けた討議民主主義の可能性」を発展させるべく,プロジェクトに住民コンセンサス形成の側面において中心的な役割を果たしたゲッティンゲン大学の研究者や住民に聞き取りを行った.本年度は2本の論考を発表することができ,かつ史料収集も予定通り行うことができた.史料収集について予定されていたものの一部が収集できていないが,本年度も調査を行うため,所期の目的を達成することは充分可能である.24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画に従って,本年度もハンブルク州立中央文書館ならびに州立図書館において「ハンブルク・ハールブルク工科大学建設によって影響を被る市民の会」ならびに「シュネールゼン・ブンダーブルネン市民の会」という2つの市民運動に関する史料収集を夏休み期間中に行う予定である.また本年度はこれらに関する研究成果発表を学術誌の場で行う予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
植物ポリフェノールのう蝕抑制効果に関する分子生物学的解明

現在,様々な植物中に含まれているポリフェノールがう蝕の発生を抑制することがいわれている。また,う蝕病原細菌Streptococcusmutans表層には様々なタンパクが存在している。我々はこのうちグルカン合成酵素(Glucosylltransferase:GTF)の機能ドメインにどのように作用することにより,ポリフェノールがう蝕抑制効果を発揮するか調べた。ウーロン茶ポリフェノールはGTFのブルカン結合領域に結合し,グルコースの転移を阻害することにより,う蝕抑制効果を発揮することが明らかとなった。
siRNAライブラリーを用いた海馬長期増強発現に必須なPDZ蛋白質の網羅的な探索

本研究の目的は、海馬神経細胞の長期増強に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定することである。昨年度、構築した96ウェルを用いたアッセイ系の安定化を図るために、培養条件と、遺伝子導入法の更なる最適化を行った。次に最適化したハイスループット神経機能解析法の評価を2つの方法で行った。まず、形質膜上のGluR1量を制御していることが知られているStargazinを利用し評価を行った。Stargazinを強制発現した神経細胞において、形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認し、さらにウェル間のばらつきを低減することも確認した。2つ目に、神経細胞へのTTX処理によるsynaptic scalingの評価を行った。TTX処理した神経細胞では形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認した。また、ウェル間のばらつきも小さく再現性が高いことが示された。2つのアッセイ系の評価により、ハイスループット神経機能解析法の有用性が実証された。また、昨年度に引き続き、プログラムの改変により、顕微鏡観察および解析の高速化を行った。本研究では、EPRIL法で作成したshRNAライブラリーを用いて、蛋白質の機能を評価する。EPRIL法はcDNAを多段階酵素処理することにより、shRNAを得る方法である。そのため、調べる対象となる遺伝子のcDNAが必要となる。そこで、マウスの大脳からcDNAライブラリーを構築し、対象となる遺伝子群のクローニングを行った。さらに、単離したcDNAをEPRIL法で処理し、shRNAライブラリーを作成した。今後、ハイスループット神経機能解析法とshRNAライブラリーを組み合わせることで、海馬神経細胞の長期増強発現に必須な分子を同定することが期待できる。長期増強に代表されるシナプス可塑性は中枢神経系における記憶学習制御の基礎過程と考えられており、その分子基盤の解明がまたれている。神経シナプス前部からの情報入力に対して神経シナプス後部が応答性を変化させる際、情報を処理するのに必要なタンパク質群の位置や機能の再編成が必要である。神経シナプス後部に存在するいくつかのPDZドメイン含有タンパク質がシナプス可塑性に関与していることがすでに示唆されており、その他の未解析なPDZタンパク質群についても再編成への関与が推測されている。本研究の目的は、神経細胞の長期増強発現に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定することである。そのために、改変型GluR1を利用したスクリーニング法の構築を行った。数種類のタグの中から、最適なタグを探索し、スクリーニング用改変型GluR1を作成した。本研究に使用するEPRIL法によって作成したsiRNAを神経細胞に導入し、高効率に遺伝子発現を抑制することも確認した。また、神経細胞は、一般に遺伝子導入効率が低いことが知られているが、遺伝子導入効率を改善することに成功しており、少量の神経細胞での解析が可能になった。さらに、神経細胞のイメージングを用いた機能的スクリーニングのために、顕微鏡による観察の自動化をはかり、勧擦をハイスループット化した。本研究にとどまらす、神経細胞におけるsiRNAライブラリーを用いた分子スクリーニングに大きなインパクトを与えると考えられる。今後、構築したハイスループット神経細胞機能解析を用いて、神経細胞の長期増強発現に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定したいと考えている。本研究の目的は、海馬神経細胞の長期増強発現に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定することである。昨年度、イメージングによって構築したハイスループット神経機能解析法を改良した。100以上の遺伝子の機能解析を行うため、スクリーニングのスモールスケール化が必要となるが、そのネックとなっていた1遺伝子当たり使用する神経細胞数の更なる減量に成功した。これにより、96ウェルを用いたアッセイ系の構築が可能になった。また、スクリーニングに用いる改変型GluR1のタグの位置、数を変えることで最適化した。さらに、昨年度の顕微鏡観察の自動化に引き続き、解析の自動化も行った。次に、改良したハイスループット神経機能解析法の評価を行った。そのために、形質膜上のGluR1量を制御していることが知られているStargazinを利用した。Stargazinを強制発現した神経細胞において、形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認することができた。これにより、ハイスループット神経機能解析法の有用性が実証された。本研究では、EPRIL法で作成したshRNAライブラリーを用いて、PDZ蛋白質の機能を評価する。そこで、EPRIL法で作成したshRNAが、海馬神経細胞の内在性遺伝子の発現を抑制するか検証した。発現抑制の標的としては、PDZ蛋白質の1つであるPSD95を選択した。PSD95を標的としたshRNA(以下shPSD95)は、PSD95蛋白質の発現を抑制することを免疫染色法で確認した。同時に、shPSD95はGFPの発現を抑制しないことも確認した。このことから、EPRIL法で作成したshPSD95の遺伝子発現を抑制する効果は特異性が高いことが示された。今後、ハイスループット神経機能解析法とshRNAライブラリーを祖み合わせることで、海馬神経細胞の長期増強発現に必須な分子を同定することが期待できる。

次に最適化したハイスループット神経機能解析法の評価を2つの方法で行った。まず、形質膜上のGluR1量を制御していることが知られているStargazinを利用し評価を行った。Stargazinを強制発現した神経細胞において、形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認し、さらにウェル間のばらつきを低減することも確認した。2つ目に、神経細胞へのTTX処理によるsynaptic scalingの評価を行った。TTX処理した神経細胞では形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認した。また、ウェル間のばらつきも小さく再現性が高いことが示された。2つのアッセイ系の評価により、ハイスループット神経機能解析法の有用性が実証された。また、昨年度に引き続き、プログラムの改変により、顕微鏡観察および解析の高速化を行った。本研究では、EPRIL法で作成したshRNAライブラリーを用いて、蛋白質の機能を評価する。EPRIL法はcDNAを多段階酵素処理することにより、shRNAを得る方法である。そのため、調べる対象となる遺伝子のcDNAが必要となる。そこで、マウスの大脳からcDNAライブラリーを構築し、対象となる遺伝子群のクローニングを行った。さらに、単離したcDNAをEPRIL法で処理し、shRNAライブラリーを作成した。今後、ハイスループット神経機能解析法とshRNAライブラリーを組み合わせることで、海馬神経細胞の長期増強発現に必須な分子を同定することが期待できる。
ヒト胎盤LDL レセプター発現と制禦因子解明による妊婦高脂血および妊娠中毒症の治療

1.胎盤におけるLDLレセプターmRNAの発現と局在について解明した。(3)妊娠中毒症患者の胎盤において上記(1)、(2)の結果と比較検討中である。2.胎盤におけるLDLレセプター蛋白の発現と局在について明らかにした。(1)LDLレセプターに対するモノクローナル抗体を用いて、間接蛍光抗体法にて各週胎盤を染色したところ、絨毛細胞表面にpositive signalを認めた。(2)妊娠中毒症患者の胎盤について、正常例と比較検討中である。3.Primarycultureしたtrophoblastの系での各種ホルモンによるLDLレセプターの蛋白レベルの発現の調節について検討した。(1)LDL-Rの発現量は、LDL添加により抑制された。(2)種ホルモン(妊娠中に特有なもの、具体的にエストロゲン、プロゲステロン、hCG、insulin etc)の添加により、LDLレセプター発現量の量的変動を検討したところ、各々がLDLレセプターの発現量を変化させることが判明した。以上の結果より、胎盤でのLDLレセプターの存在が明らかとなり、その発現量が各種ホルモンにより、調節をうけることが示唆され、妊娠中の脂質代謝及び、胎盤の脂質取り込みについての解明の糸口となった。現在、これらの成果について、投稿中である。4.上記3の各々の実験系のなかで、HMG CoA reductase活性を測定し、Trophoblastにおけるコレステロール合成能の変動について検討中である。5.上記3の各々の実験系のなかで、Trophoblastにて産生されたステロイドを定量し、LDLレセプターの発現量との相関を検討中である。
ゲノム編集昆虫細胞による迅速なVLPワクチン大量生産法の開発

蚊が媒介するウイルスによる感染症は、地球温暖化により先進国でもパンデミックが生じる可能性が高まる一方で、その多くにワクチンが存在しない。ウイルス構造タンパク質から構成されるウイルス様粒子Virus-like particle (VLP)は、これらのウイルスに対するワクチンとして期待されている。バキュロウイルス昆虫細胞発現系はVLP生産に広く用いられているが、バキュロウイルス粒子の混入が避けられず、精製方法が煩雑になることが問題である。本研究ではバキュロウイルスを用いず、高効率な一過性トランスフェクション法を昆虫細胞の大量振盪培養へ応用し、バキュロウイルス関連因子の混入のない迅速なVLP生産系を構築する。さらに、混入しやすい内在性因子を同定し、それらをCRISPR-Cas9によるゲノム編集にてノックアウトすることで新規な昆虫細胞株を樹立し、精製の容易なVLPの大量生産法の開発を目標としている。本年度は、その第一歩として振盪培養中の昆虫細胞に対するDNA導入方法の最適条件の検討、またVLPのモデルタンパク質として日本脳炎ウイルスのprMとEタンパク質の発現系の構築を行った。DNA導入方法には、Polyethyleneimine (PEI)を用いた。この手法では無血清培地条件で振盪培養中の昆虫細胞に対して効率よくDNAを導入することが可能である。一方で、細胞に対する毒性が認められることから、適切なPEI量、DNA量、PEI/DNA比で用いることが重要である。蛍光タンパク質EGFPの発現量を指標として細胞内に導入されたDNA量を推定し、最適条件を検討した。また、日本脳炎ウイルスのprM-Eを効率よく発現するための発現コンストラクトを作製し、これにより昆虫培養細胞にてprM、Eタンパク質がそれぞれ発現していることを確認した。まず初年度として、安定的に細胞培養が可能な環境の構築を目指し、機器、試薬等を準備した。その結果、静置培養、振盪培養ともに問題なく行う環境が整った。研究の進捗状況としては以下のとおりである。まず、日本脳炎ウイルスのprM-Eタンパク質の発現用コンストラクトを予定通り作製した。このコンストラクトは、pr-Mの切断部位に変異を入れる、昆虫細胞に対するコドン最適化を行うなどの理由から、3本の合成遺伝子を連結することによって作製した。昆虫細胞へのDNA導入手法として、PEIを用いたトランスフェクション条件の最適化を行った。振盪培養中の細胞に安定的にDNAを導入することが可能となったが、残念ながら当初予定していたトランスフェクション効率は達成できていない。この点は更なる改善が必要である。作製したprM-E発現コンストラクトによりタンパク質発現が可能であるかを一過性発現後の培養液を用いたWestern blotにて検証した。その結果、抗prMタンパク質、抗Eタンパク質の抗体それぞれによって想定されたサイズにタンパク質の存在を確認することができた。まず、PEIを用いたトランスフェクションであるが、培養液の種類による効率の違い、またDNAの調整方法による差異など、未検討項目について追加検討を行う。prM-Eタンパク質については、それぞれのタンパク質が発現していることは確認できたので、これらが予定通りVLPを形成していることを確認する。まずは分子サイズによる分画によってVLP形成を確認する予定である。その後、サイズ分画によって精製されたVLPとコントロールを比較し、VLPに付随して混入してくるタンパク質群を同定する予定である。

昆虫細胞へのDNA導入手法として、PEIを用いたトランスフェクション条件の最適化を行った。振盪培養中の細胞に安定的にDNAを導入することが可能となったが、残念ながら当初予定していたトランスフェクション効率は達成できていない。この点は更なる改善が必要である。作製したprM-E発現コンストラクトによりタンパク質発現が可能であるかを一過性発現後の培養液を用いたWestern blotにて検証した。その結果、抗prMタンパク質、抗Eタンパク質の抗体それぞれによって想定されたサイズにタンパク質の存在を確認することができた。まず、PEIを用いたトランスフェクションであるが、培養液の種類による効率の違い、またDNAの調整方法による差異など、未検討項目について追加検討を行う。prM-Eタンパク質については、それぞれのタンパク質が発現していることは確認できたので、これらが予定通りVLPを形成していることを確認する。まずは分子サイズによる分画によってVLP形成を確認する予定である。その後、サイズ分画によって精製されたVLPとコントロールを比較し、VLPに付随して混入してくるタンパク質群を同定する予定である。
GDNFによる運動ニューロンサブタイプの発生制御

グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)は脊髄運動ニューロンの培養下において強力な生存因子として働く。GDNFのノックアウトマウスでは運動ニューロンの数が約40%減少することから、GDNFは生理的に運動ニューロンの生存に関わっていることが知られていた。しかし、GDNFが運動ニューロンの特定のサブセットの生存に関わっているのか、あるいは運動ニューロン全般の生存に関与しているのかは明らかでなかった。申請者は、GDNFの受容体であるRetおよびGFRa1の遺伝子座にGFPやtaulacZ遺伝子をレポーターとして挿入し運動ニューロンの投射を可視化したノックアウトマウスや、Ret, GFRal遺伝子機能を生後または運動ニューロンで特異的に破壊した条件付ノックアウトマウスを用い、腰部運動ニューロン発生におけるRet,GFRalの機能を詳細に解析した。RetやGFRalを運動ニューロンで特異的に欠損させたマウスでは、一部の筋群で運動神経投射異常を起こし、それに対応してごく限られた数のα運動ニューロンの消失が起こることを認めた。これに対し、γ運動ニューロンは脊髄腰部のほぼ全てのレベルで大部分消失していた。一方、生後になってRet, GFRalの機能破壊を起こしたマウスではこのようなγ運動ニューロンの消失は認められなかった。これらの結果は、GDNFシグナルの運動ニューロン生存因子としての作用がγ運動ニューロンにほぼ限定されており、その作用時期は発生過程であることを示していた。これらのデータはGDNFの生理機能、運動ニューロン発生、神経栄養因子の作用の特異性の観点から注目すべき結果であり、近く投稿を予定している。グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)とその受容体複合体であるGFRα1とRETは、全体のうちの30%以下の運動神経の生存に必須であることがわかっているが、それらがどのような運動神経であるかはまだ不明な点が多い。さらにGDNF-RETシグナル伝達系の欠損マウスは生後すぐに致死するため、生後における運動神経に対するGDNFの役割もまだ解明されていない。そこで、GFRα1もしくはRETの条件的ノックアウトマウスと発生初期に運動神経特異的にCre組み換え酵素を発現させるHB9-Creマウスを用いて、運動神経特異的にGFRα1もしくはRETを欠損したマウスをつくり、運動神経の発生過程および、生後におけるGDNF-RETシグナルの役割について解析を進めている。これまでに、欠損マウスにおいて浸透率50%で下肢腓骨神経が欠損することを見出し、GDNF-RETシグナルがこの神経の生存に必須であることを明らかにした。さらに脊髄から骨格筋に至る運動神経線維において直径の細いγ繊維が90%近く減少していることを見出した。γ線維は筋紡錘の錘内筋線維にシナプスを持ち、筋紡錘自体の筋線維(錘内筋線維)を調節している。GDNFがこのγ線維の発生、維持に特異的にはたらいているのかどうかをより詳しく解析するために、現在、錘内筋線維に投射する運動神経だけが蛍光標識されるマウスの作製を目指している。このマウスができれば、γ運動神経を選択的に単離することも可能になり、より分子レベルの解析も可能になると期待している。