hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波によるf電子の研究

私達は、1980年代当初から「位相比較法による超音波測定装置」の開発を進めており、現在では世界最高水準の音速分解能Δu/U=10^<ー7>を達成している。本研究でもこの超音波測定装置を用い、f電子係とくに希土類化合物の弾性的性質の研究を系統的に進めてきた。希士類化合物の4f電子は内殻に位置するため一般にま局在する傾向が強い。しかし、4f電子と伝導電子との混成効果が顕著となる系では、重い電子や価数揺動と呼ばれる特異な多体電子状態が出現する。超音波で見ることのできる希士類化合物の弾性的性質は、その物質中の4f電子が局在状態にあるか、重い電子もしくは価数揺動にあるかに従って、それぞれ固性的な振舞を示す。本研究においても理解が深まり、とくに、SmB_6,CeNiSnにおけるエネルギ-ギャップが超音波によって確認された意義は大きい。超音波による希士類化合物の音響的dHVA効果の研究も本研究の重要深題であった。本研究において、低温生成技術の大きな進歩があった。循環方談の^3Heクライオスタットを完成させ、循環方式で0.4kを、またOneshot方式で、0.32Kを10時間以上保持しながらの実験が同能となった。YCu_2,UB_<12>,Lasb,LaSn_3,CeSn_3などの音響的dHVA効果の観測に成功している。とくに、YCu_2,LaSn_3においては、断面積が10^8Oe台の大きなファルミ面も観測し,通常の帯磁率によるdHVA効果と同等の実験が可能であることを改めて実証した意義は大きい。また、この間、東北大科研附属工場では、重い電子の音響的dHVA効果の研究を目的とした大型希釈冷凍機の開発製作がおこなわれ、8mkの極低温を達成した。典型的な重い電子系であるCeB_6において音響的dHVA効果の観測に成功し、今後における極抵温での重い電子系の研究の推進が可能となった意義は大きい。希土類化合物の磁性を荷担っている4f電子は内殻に位置しているために、一般には局在する。しかし、Ce,Yb,Smを含む化合物では4f電子が伝導電子と混合し、高密度近藤、価数揺動と呼ばれる異常現象が出現し、広く関心を集めている。またウランを含むアクチナイド化合物の5f電子系でも類似した現象が見出されている。最近とくに注目を集めているのがセリウム化合物などの高密度近藤物質に見られる重い電子状態である。これらの現象は本質的に多体効果であるため、充分な理解に到達するには広範な実験的研究が必要とされている。日本における超音波による希土類化合物の4f電子系の研究は、主として東北大科研の後藤を中心に行われてきた。超音波でみることができる希土類化合物の弾性的性質は、その物質中の4f電子が局在状態にあるかもしくは、価数揺動状態にあるかに従って、それぞれ個性的な振舞を示す。また、後藤等によって開発されてきた「位相比較法による超音波測定装置」を用いた高感度超音波計測技術によって、音響的ドハ-ス=ファンアルフェン効果(dHVA効果)の観測が可能となり、重い電子系のフェルミ面の研究が行われてきた。

本年度は、「位相比較法による超音波測定装置」の測定周波数を高周波領域に拡張することを重点目標とし、標準信号発生器(1.3GH_3,ラカルダナ社)を設備品として購入し、周辺整備をおこなってきた。また、高周波超音波の発生に必要であるZnO圧電素子のスパッタ技術の開発にも力を注ぎ、500MHzの超音波計測がおこなえるようになった。この技術を価数揺動物質SmBcの弾性定数の精密測定に応用し、4fバンドギャップに関する新しい知見を得ることができた。重い電子系の音響的dHvA効果の研究は最も重要な課題であったが、希釈冷凍機の立ち上げに遅れが生じ、本格的な成果は次年度に期待することとなった。私達は,1980年代当初から「位相比較法による超音波測定装置」の開発を進めており,現在では世界最高水準の音速分解能△v/v=10^<-7>を達成している。本研究でもこの超音波測定装置を用い,f電子系とくに希土類化合物の弾性的性質の研究を系統的に進めてきた。希土類化合物の4f電子は内殻に位置するため一般には局在する傾向が強い。しかし,4f電子と伝導電子との混合効果が顕著となる系では,重い電子や価数揺動と呼ばれる特異な多体電子状態が出現する。超音波で見ることのできる希土類化合物の弾性的性質は,その物質中の4f電子が局在状態にあるか,重い電子もしくは価数揺動にあるかに従って,それぞれ個性的な振舞を示す。本研究においても理解が深まり,とくに,SmB_6,CeNiSnにおけるエネルギ-ギャップが超音波によって確認された意義は大きい。超音波による希土類化合物の音響的dHVA効果の研究も本研究の重要課題であった。本研究において,低温生成技術の大きな進歩があった。循環方式の^3Heクライオスタットを完成させ,循環方式で0.4Kを,またOne Shot方式で0.32Kを10時間以上保持しながらの実験が可能となった。YCu_2,CeCu_2,UB_<12>,LaSb,CeSb,LaSn_3,CeSn_3などの音響的dHVA効果の観測に成功している。とくに,YCu_2,LaSn_3においては,断面積が10^8Oe台の大きなフェルミ面も観測し,通常の帯磁率によるdHVA効果と同等の実験が可能であることを改めて実証した意義は大きい。また,この間,東北大科研附属工場では,重い電子の音響的dHVA効果の研究を目的とした大型希釈冷凍機の開発製作がおこなわれ,8mKの極低温を達成した。典型的な重い電子系であるCeB_6において音響的dHVA効果の観測に成功し,今後における極低温での重い電子系の研究の推進が可能となった意義は大きい。
桜島周辺に生息する藻類共生腔腸動物群集の環境海水浄化に関する基礎的研究

本研究は、桜島周辺に夛数生息する腔腸動物、タコクラゲ,サカサクラゲ,サンゴイソギンチャクの藻類共生種において、これらの種の生活環境に対する物質的出入力をモデル実験により測定、環境形成能力を把握し、生態サイクルの中での機能的役割について検討することを目的とした。実験の結果、浮遊生活のタコクラゲは、環境水中の無機懸濁物を自ら分泌する粘液に絡めて、更に植物及び動物プランクトンを抱含し懸濁物を肥大させ、懸濁物沈降促進効果をもたらすこと、一方、底生生活のサカサクラゲは、すでに沈降している懸濁物を有機物塊として底質に不均一な構造を形成し、これを底生生物の餌として生態系の食物連鎖の中に組み込む機能的役割をもつことなど、二種水母が生態系における懸濁物の浄化と維持機構の重要な役割をもつことが明らかにされた。更にサンゴイソギンチャクを加えた3種の共生藻類腔腸動物の有機態窒素,無機態窒素,亜硝酸窒素,硝酸態窒素,有機態燐,無機態燐,溶存酸素量及び水素イオン濃度等の生活による水質変動を測定した結果、窒素や燐など生物種による明らかな相違がみられ、環境形成能力の相違が示唆された。また、水質測定と平行して検討した体内共生藻の形態と挙動により、種による環境形成能力の相違のみならず、藻類の共生の状態や共生機構の種特性としての生物学的重要性が今後の課題として残された。本研究結果の特記すべきことは、三種共生動物が環境に対し著しい溶存酸素量を上昇させ、これらの動物群が生態系の中で第一次生産者として働いている事だけでなく、今日行われている水質浄化の活性汚泥法と同等の工業的システム効果を示唆し、加えて懸濁物を淨化し、海域の水質を淨化する一種の汚水処理場であるという驚くに値する事を表している。今後、更に実験を重ね、詳細に追求することが海洋生態系の物質循環とそこに生息する生物との関りについて考察を深めるものであろう。
ソフトマターの亀裂進展における速度ジャンプのメカニズムの解明

ソフトマターの破壊において、亀裂進展の速度が1 mm/sec未満の低速から1000 mm/sec以上に数千倍も高速化する相転移現象「速度ジャンプ」の物理を解明する。速度ジャンプは、多くのソフトマターで起こる普遍的な現象であるが、その原理は未解明である。申請者は最近、速度ジャンプを起こすシンプルな可解モデルの構築に成功し、数学的な解析解に基づいて、ゴムにおいて速度ジャンプが起こるための最小限の要件を明らかにした。この可解モデルを拡張・改良することにより、ゴム以外の物質や様々な破壊モードも含めて速度ジャンプを系統的に解析し、実験や数値計算と比較することでその物理を解明する。
幹細胞多様性形成機構

胎生期の神経幹細胞は、まず多様なニューロンを産生し、最後にグリア細胞を産生する。したがって、胎生期の神経幹細胞は経時的に分化能を変化させているが、この分子機構の詳細は不明である。多分化能を持った神経幹細胞では、多種類の分化決定因子の発現が振動すること、またニューロンやグリアの遺伝子発現を制御するヒストンメチル化酵素ESETの発現が発生の進行とともに減少することがわかった。ESET遺伝子の上流には分化決定因子の1つであるHes1の結合配列が多数存在することから、Hes1の発現振動がESETの発現制御を介して神経幹細胞の分化能の経時的変化に関わることが示唆された。神経幹細胞は、初めに盛んに増殖して細胞数を増やすが、やがて非対称分裂を繰り返していろいろな種類のニューロンを産生する。ニューロンの産生が終わると、神経幹細胞は最後にアストロサイトのようなグリア細胞に分化する。このように、神経幹細胞は時間とともに性質を変えて多彩な細胞を産生して脳神経系の多様性形成に大きく貢献するが、この経時的変化を制御する分子機構はよくわかっていない。今までに、神経幹細胞の維持に必須な転写抑制因子Hes1の発現が約23時間周期でオシレーションすること、このオシレーションによって増殖や分化能が変化することを示してきた。これらの成果から、Hes1オシレーションによって下流遺伝子の発現が経時的に変化して、分化能が変化することが示唆された。今回、ヒストンメチル化酵素ESETに注目して発現をしらべたところ、発生の進行とともに発現量が減少した。次に、ESETの機能を明らかにするために前脳特異的ESET欠損マウス(ESET cKOマウス)を作製した。このマウスでは、多くの遺伝子発現が乱れ、神経発生に大きな異常が見られ、出生後10日以内に致死となった。神経発生過程を組織学的に解析したところ、発生初期に分化するニューロンの形成が十分に起こらないうちに、発生後期に分化するニューロンの形成が開始していた。さらに、ニューロン分化が正常よりも早く終了し、アストロサイトの形成が早期に起こることがわかった。これらの結果から、ESETは神経幹細胞の分化能の経時的変化を制御することが明らかになった。今後は、Hes1オシレーションとESETの発現低下とにどのような関係があるのかを探る予定である。ニューロン産生が終わると、神経幹細胞は最後にアストロサイトに分化する。このように、神経幹細胞は時間とともに性質を変えて多彩な細胞を産生し、脳神経系の多様性形成に大きく貢献するが、この経時的変化を制御する分子機構はよく1わかっていない。発生の進行とともに発現が変化する遺伝子を探索した結果、ピストンH3K7メチル化酵素であるESETを同定した。この因子は、9.5日胚の神経幹細胞に強く発現するが、発生の進行とともに減少し、17.5胚の神経幹細胞にはきわめて少量しか発現していなかった。ESETのプロモーターを解析したところ、Hes1の結合部位が多数あり、Hes1によって発現が徐々に低下することが示唆された。神経発生におけるESETの機能を調べるために、ESET floxマウスとEmx2-creマウスを交配して前脳特異的ESET欠損マウス(ESET cKOマウス)を作製した。マイクロアレー解析から、ESET欠損によって、多くの遺伝子発現に変化が見られた。特に、ニューロンの分化に関わる多くの遺伝子発現が低下しているのに対して、グリア細胞分化に関わる多くの遺伝子発現が増加した。また、本来、脳に発現しない遺伝子群が強く発現していた。神経発生におけるESET欠損の影響を調べたところ、初期に分化するニューロンの形成が強く阻害されていたが、後期に分化するニューロンの形成には大きな影響は見られなかった。しかし、アストロサイトの形成が正常よりも早く起こり、正常よりも増加していた。以上から、ESETは徐々に発現低下することによって、ニューロン形成からアストロサイト形成への移行のタイミングを制御すると考えられた。神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出す多分化能を持つ。3種類のbHLH型転写因子Ascl1, Hes1, Olig2は、それぞれニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの分化決定を制御する。しかし、プロニューラル因子Ascl1は、細胞周期の制御に関わる遺伝子群の発現を活性化して神経幹細胞の増殖を促進することが知られている。同様に、Hes1やOlig2はアストロサイトやオリゴデンドロサイトの分化制御以外に、神経幹細胞の増殖・維持にも働くことが知られている。しかし、これら分化決定因子として働くbHLH因子がこの相反する機能をどのように制御しているのかはよくわかっていない。

本研究では、ルシフェラーゼとbHLH型転写因子の融合蛋白質を発現する遺伝子改変マウスを作製し、bHLH型転写因子の発現動態を解析した。その結果、神経幹細胞においてHes1、Ascl1蛋白質は23時間周期で、Olig2蛋白質は58時間周期で発現が増減(発現振動)していることが明らかになった。一方、ニューロン分化の際にはAscl1が、アストロサイト分化の際にはHes1が、オリゴデンドロサイト分化の際にはOlig2がそれぞれ持続発現していた。したがって、同一因子が発現動態を変えることによって神経幹細胞の増殖を活性化したり、特定の種類の細胞に分化誘導することが示唆された。これらの結果から、多分化能の分子実体は複数の分化決定因子がお互いに拮抗しながら発現が振動する状態であることが示された。今までの解析から、神経幹細胞ではHes1やMash1の発現が数時間周期で振動すること、この発現振動によって神経幹細胞の増殖能が活性化されることを明らかにしてきた。さらに、発現振動の意義を探るために、Hes1とMash1の下流遺伝子であるDeltalike1 (Dll1)に注目して解析を行った。Dll1 mRNAおよびDll1タンパク質の発現をモニターできるレポーターマウスを開発した。特に、後者のマウスはDll1遺伝子座にルシフェラーゼcDNAをノックインしてDll1との融合タンパク質ができるようにしたところ、ルシフェラーゼ活性によって正確にDll1タンパク質の発現動態をモニターすることに成功した。これらのマウスを使ってDll1の発現解析を行った結果、神経幹細胞や未分節中胚葉においてDll1のmRNAおよびタンパク質量は振動することがわかった。Dll1の発現は、Hes1によって抑制され、Mash1によって活性化されることから、Hes1とMash1依存性に発現振動すると考えられた。また、Dll1の発現振動の意義を明らかにするために、Dll1を定常発現するマウスの作製を試みた。この新たなDll1変異マウスでは、Dll1がほぼ定常発現し、発生過程に大きな異常が起こることが明らかになった。今後、その詳細な表現型解析を行うことによって、遺伝子発現振動の重要性がさらに明らかになることが期待される。神経幹細胞は、初めに盛んに増殖して細胞数を増やすが、やがて非対称分裂を繰り返していろいろな種類のニューロンを産生する。ニューロン産生が終わると、神経幹細胞は最後にグリア細胞に分化する。このように、神経幹細胞は時間とともに性質を変えて多彩な細胞を産生し、脳神経系の多様性形成に大きく貢献するが、この経時的変化を制御する分子機構はよくわかっていない。我々は、転写抑制因子Hes1が神経幹細胞の維持に必須であること、神経幹細胞ではHes1の発現が約23時間周期で振動すること、Hes1の発現振動によって神経分化を誘導するプロニューラル遺伝子Neurogenin2の発現も振動することを明らかにした。発生過程の神経幹細胞において経時的に発現が変化する遺伝子を探索した結果、ヒストンメチル化修飾酵素ESETを同定した。
東洋的/西洋的ものの考え方が科学的概念の理解に及ぼす影響についての比較研究

本研究は、当初の3年計画を2年間に短縮して行ったため、具体的には以下のような研究の流れに従って研究を実施した。1)第一回全体会議(ドイツ)にて、全体的な研究計画の検討と調査研究における役割分担について討議した。2)両国において概念調査を計画し実施した。(平成9年2月6月)私、化学、環境、情報の4つの概念についてそれぞれ50人以上の高校生を調査対象とした。結果の一次分析をそれぞれで行った。3)第二回全体会議(日本)において、調査結果の中間報告を行い。研究結果の公開について議論した。また、追加の分析及び調査について討議した。4)第三回全体会議(日本)に合わせて、学会での中間報告を行った。その後の会議において、最終報告書の内容及び形式と、その他の研究成果の公開方法について議論した。5)第四回全体会議(ドイツ)に合わせて、追加の調査として面接方式の調査を行い調査方法の検討を行った。その後の会議においては、最終報告書の内容と執筆分担及び、研究発表のスケジュールを確定した。本研究は、当初の3年計画を2年間に短縮して行うため、本年度は、以下のように具体的に研究計画を進めた。1)全体的な研究計画検討ドイツにおいて全体会議を催し、何をどこまで明らかにするについて討議した。2)既にドイツにおいて実施されている概念研究のサマライズドイツにおいて既に研究結果が得られている概念調査について、わが国での比較調査が可能となるよう研究結果をサマライズし、分析の方針を決定する資料とした。3)日独における調査の企画日独において同じ調査問題を同様の被験者を対象として実施し、結果を比較考察することを目的して、調査問題と調査時期について討議し11月末までに問題を作成し、12月に調査を行うこととした。実際にはドイツ側は予定どうりであったが、日本側の調査時期は3月となった。5)調査結果の比較検討日本において全体会を開き、調査結果の日独比較を行った。6)次年度の研究計画の策定平成9年度の研究計画について討議した。また、9年度夏に中間発表会を行うことを決定した。
心筋症ハムスターの分子生物学的解析

申請者らはこれまでに、心筋症の代表的モデル動物であるハムスターは肥大型と予後のより悪い拡張型が共に同一遺伝子の異常を有することを証明した。このことは、心肥大など心機能維持に必須な他の遺伝子にも拡張型では異常が存在すること、言い換えれば、心機能維持に必須な遺伝子を拡張型心筋症ハムスターの第二の異常遺伝子として同定できることを意味する。まず、拡張型では代償性心肥大機構にも異常があるのではないかと考えた。心肥大の分子機構に関する研究は1980年代後半から盛んに行われれ、肥大に伴い発現が増加する遺伝子と細胞表面から核内に至る情報伝達路がある程度解明されてきた。現時点における一応の理解は、圧力などの負荷→アンギオテンシンIIやエンドセリンなどのオートクリン/パラクリン物質の分泌一細胞表面受容体→Cキナーゼ→Ras/Raf前癌遺伝子-MAPキナーゼ→Myc/Maxなどの前癌遺伝子→ミオシンなど心筋特異的遺伝子の発現増加、である。肥大型と拡張型心筋症ハムスターにおけるこれら心肥大関連遺伝子の発現レベルを半走量的なRT-PCRで検討した。意外なことに、骨格筋型アルファアクチン、ミオシン重鎮など肥大心筋の主要構成成分を含み、心肥大関連遺伝子はいずれも拡張型では肥大型よりも亢進していた。そこで次に、心筋細胞死が何らかの要因で亢進しでいるのではないかと考え、肥大型と拡張型心筋症ハムスターにおけるアポトーシス関連遺伝子の発現レベルを検討した。その結果、Fasなといくつかのアポトーシス関連遺伝子の発現が拡張型で有意に亢進していることを見い出した。以上のことから、拡張型心筋症ハムスターでは、心肥大機構の異常よりはアポトーシスの亢進がその発症機構にあるのではないかとの手応えを得た。
ラオスタイ国境を結ぶ陸路交通路の整備に伴う結核罹患リスクの増大とその制御

ラオス都市部での急速な人口増加と、経済活動の変化に伴う国外からの生活物資の急激な増加は、貨幣価値に換算した経済水準の向上をもたらす一方、市場経済開発に遅れをとった貧困村落集団において感染症リスクが増大したり、若者のライフスタイルの変化と繁華街の増加に伴って性行為感染症が増加している。特に、経済物資の輸送を担う交通網の発達と、生活の変容、環境変化と、都市部における健康リスクの増大が危惧されている。本研究では、インドシナ半島において経済活動と人口の変化が顕著に認められる、「ビエンチャン-ノンカイ」「バンコク-プノンペン-ホーチミン-フエ」の陸路交通路沿いにおいて、結核ならびにその他の感染症罹患調査、衛生環境調査、衛生習慣調査と、流通物資の調査を実施した。結核罹患ならびに健康プロフィールと、交通量変化、市場経済活性化、都市基盤整備、衛生環境、人口密集度、社会経済状況の変化との関連性を、健康決定多要因複合モデルにより解析した。ビエンチャン都市住民の都市交通網へのアクセスが薬物乱用のリスクの拡大をもたらしていること、水上交通と陸路交通との交錯がおこる人口密集地域におい居住稠密が結核伝播を惹起すること、交通路の整備に伴って都市化が進展しても家畜と近接して居住している生活様式が人畜共通感染症リスクを増大させていること、を明らかにした。インドシナ半島における都市化は、急速な交通網の発達をみる一方で、特定地域における稠密居住、家畜と近接した居住といった生活様式が残されている。交通量が増大することにより感染伝播の機会が増大する一方、感染を制御する環境条件の整備が対応していないことが示唆された。交通網の急速な発展に伴う人の移動ならびに家畜と食用動物の移動、居住地域ならびに商業地域における衛生環境、人々の衛生習慣と疾病予防技量の条件が、疾病罹患リスクと多様な相互関連性を示すことを明らかにした。本研究の目的は、インドシナ半島における国境を結ぶ陸路交通路の整備が、住民の生活様式の変化と、結核ならびにその他の感染症罹患リスクの増大にもたらす影響を明らかにすることである。本年度は、(1)ビェンチャン市1497世帯調査に基づく健康プロフィールの分析、(2)チャンパサック県のベースラインデータ分析、(3)フエ市の疾病統計調査を実施した。さらに、(4)インドシナ半島諸地域の地域健康プロフィール構築にあたり、生活環境の変動の影響を最も受けやすい子どもの栄養状態と疾病罹患状況の総合的評価手法を検討した。出生から5歳までの健康状態を反映する皮質骨超音波伝播速度により指標化する方法を検討し、フィールドで簡便に計測可能なシステムを開発し測定精度を検討した。以下の結果を得た。(a)ビェンチャン市17村落の健康プロフィール解析により1266ヶ月の子どものunderweightと衛生環境指標の相互関連性を示した。(b)ビェンチャン市世帯調査により得た世帯の移動交通手段、農業機械所有、家畜所有、衛生知識、衛生行動、就業経験、衛生設備、電気製品所有のデータに基づき、都市部村落の健康プロフィール指標を作成した。(c)薬物乱用は都市化が進んだ地域に広く確認された。特に、人ならびに物資の運搬を業とする者が多数生活する村落において薬物乱用の確認率が高く、陸路交通路の整備と住民の生活様式の変化が認められた。(d)地域健康プロフィール指標と地理情報に基づき地域健康ニーズを地理情報システムにより分析する手法を示した。(e)地域健康増進活動が住民のヘルスリテラシーを高めることを明らかにした。(f)脛骨皮質および橈骨皮質骨の超音波伝播速度を計測する手法により、CV=0.6%の精度で6歳から10歳の子どもの骨密度の計測が可能であることを確認した。

(g)ビエンチャン市、チャンパサック県、フエ市の基礎データを総合的に検討し、インドシナ半島都市部村落の地域健康水準プロフィールを作成する調査票を開発した。本研究の目的は、インドシナ半島における国境を結ぶ陸路交通路の整備が、住民の生活様式の変化と、結核ならびにその他の感染症罹患リスクの増大にもたらす影響を明らかにすることである。本年度は、(1)ビエンチャン市の疾病罹患調査データに基づき、世帯調査結果に基づく、都市衛生環境調査、薬物乱用、子どもの感染症、栄養調査、人口移動、社会経済状況、生業の関連性の解析、(2)バンコク-プノンペン-ホーチミン-フエルートの、プノンペン市」および「フェ市」の交通路の調査と、各都市の人口密集地域の住民の健康プロフィール調査を実施した。以下の結果を得た。(a)ビエンチャン市の経済活動と人口変化と、都市衛生環境、感染症の発症、子どもの栄養状態、薬物使用の相互関連性について、多要因間の相互関連性を明らかにした。都市化に伴って、都市インフラストラクチャーの整備が不連続に発達する様相、交通量の増大、廃棄物処理問題の顕在化、住民の衛生習慣の改善が認められた。(b)ラオスの都市村落の健康プロフィールに基づき、交通量と感染症発症の関連性の季節変動、年次変動を分析するモデルを作成した。(c)陸路交通網と水域交通網の両者が発達する都市であるベトナムのフエ市において、人類学的計測、肝炎ウイルス抗体保有率、脛骨超音波伝播速度の計測を行い健康プロフィールを作成した。子どものA型肝炎抗体保有率は、陸路交通網と水域交通網との接点と、明確な関連性を示した。水上生活者の高い感染症リスクの存在を明らかにした。(d)プノンペン市における陸路交通路の発達は、繊維産業の発達、労働力である若年者の人口移動、リスクを伴う妊娠の増加と関連することが示唆された。交通路の発達と発症機序が異なる疾病や病的状態との関連性を検討し、開発途上国の急速な都市化に伴う疾病流行のモデル構築の要件を検討した。ラオス都市部での急速な人口増加と、経済活動の変化に伴う国外からの生活物資の急激な増加は、貨幣価値に換算した経済水準の向上をもたらしているが、一方で市場経済開発に遅れをとった貧困村落集団において感染症リスクが増大したり、若者のライフスタイルの変化と繁華街の増加に伴って性行為感染症が増加している。特に、経済物資の輸送を担う交通網の発達と、生活の変容、環境変化と、都市部における健康リスクの増大が危惧されている。本研究では、インドシナ半島において経済活動と人口の変化が顕著に認められる、「ビエンチャン-ノンカイ」「バンコク-プノンペン-ホーチミン-フエ」の陸路交通路沿いにおいて、結核ならびにその他の感染症罹患調査、衛生環境調査、衛生習慣調査と、流通物資の調査を実施した。結核罹患ならびに健康プロフィールと、交通量変化、市場経済活性化、都市基盤整備、衛生環境、人口密集度、社会経済状況の変化との関連性を、健康決定多要因複合モデルにより解析した。
円偏波ＥＳＲ法の開拓とキラル磁気化学の創成

スピン集合系のキラリティを評価する新しい測定手法として,円偏光(円偏波)を用いた磁気分光法が重要である.円偏波マイクロ波を用いたESRは過去にいくつかの試みがなされている.それらに対して本研究では,汎用のSQUID磁束計に円偏波マイクロ波を導入して,定常的な縦磁化を検出することで円偏波ESRを測定する装置系を設計・試作した.電磁場シミュレーションに基づいて製作した円筒導波管を,汎用のSQUID磁束計に組み込んだ.アキラルな有機ラジカルを標準試料として,円偏波マイクロ波によるESR信号を観測することに成功した.ただし,信号強度から,だ円成分の混入(円偏波への直線偏波の混入)が認められた.スピン集合系のキラリティを評価する新しい測定手法として,円偏光(円偏波)を用いた磁気分光法が重要である.円偏波マイクロ波を用いたESRは過去にいくつかの試みがなされている.それらに対して本研究では,汎用のSQUID磁束計に円偏波マイクロ波を導入して,定常的な縦磁化を検出することで円偏波ESRを測定する装置系を設計・試作した.電磁場シミュレーションに基づいて製作した円筒導波管を,汎用のSQUID磁束計に組み込んだ.アキラルな有機ラジカルを標準試料として,円偏波マイクロ波によるESR信号を観測することに成功した.ただし,信号強度から,だ円成分の混入(円偏波への直線偏波の混入)が認められた.キラリティをもつ磁性体には,特異な磁気キラル効果が期待される.従来のキラル磁性研究は,もっぱら光学遷移に現れる効果ー磁気光学効果ーを期待あるいは指向して調べられてきたが,本研究ではスピンを直接捉えつつキラリティを磁気分光学的に評価できる,実用レベルでのキラルな電子スピン共鳴(ESR)法を初めて提案する.マイクロ波を円偏波化しその共鳴信号を検出するには,これまで技術的な困難があったが,マイクロ波照射下で定常的な縦磁化を検出するという方法を立案した.円偏波を縦磁化検出系に送り込める導波管システムを設計し,試作した.通常の磁化測定では,試料に静磁場B0をかけて,コイルの中をくぐらせた際に生じる誘導起電力をSQUID(超伝導量子干渉素子)で検出する.現有のSQUID磁束計では,通常,試料を入れたポリプロピレン製ストローをロッド(ステンレスと銅シリコン合金)の先端に固定し,装置内に吊り下げ,コイルをくぐるよう上下させる.マイクロ波を導入する場合,ロッドを円筒導波管におき換えることにした.円筒の内部に試料を固定し,上部からマイクロ波を導入することにし,導波管全体を上下させることで,静磁場B0と振動磁場B1が印加された定常状態での磁化を測定した.試料は導波管の外に置く方法もあり得るが,円偏波の純度の維持を第一に考え,試料は管内に完浴させることにした.初年度は下記の1から3を計画し,この計画のとおり装置を立ち上げた.1電磁場シミュレーションにより,円筒導波管の形状を設計した.2Vバンド円偏波導波管を製作した.3アキラルな基準物質での円偏波ESRを測定した.スピン集合系のキラリティを直接評価できる新しい測定手法として,円偏光(円偏波)を用いた磁気分光法が重要と考えられる.円偏波マイクロ波を用いたESRは過去にいくつかの試みがなされている.それらに対して本研究では,汎用のSQUID磁束計に円偏波マイクロ波を導入して,定常的な縦磁化を検出することで円偏波ESRを測定する装置系を設計・試作した.まず,導波管とクライオスタットの最適形状を求めるために,電磁場シミュレーションを行なった.マイクロ波の波長と同程度の曲率半径をもつ曲面構造と,金属部品の全長が波長の数十倍程度という実際の装置系でのスケールを考慮して計算した.この計算に基づいて製作した円筒導波管を,汎用のSQUID磁束計に組み込み,V帯のマイクロ波照射時でも試料部温度がマイクロ波非照射時と同様の2 Kに保たれることを確認した.次に,アキラルな有機ラジカルを標準試料として,円偏波マイクロ波を照射しつつ磁化曲線を測定した結果,共鳴条件を満足する磁場領域で磁化の減少すなわちESR信号を観測した.静磁場の印加方向の反転,すなわちラーモア歳差運動の回転方向の反転の効果のみが現れる条件下で,ポーラライザーの有無(それぞれ左右円偏波,直線偏波の照射に対応する)による磁化曲線の変化を調べた結果,ESR信号の強度は,円偏波の左右旋性に応じた傾向は示したものの,だ円率Ψ(左右円偏波でtanΨ=±1,直線偏波でtanΨ=0)を反映したものから若干ずれていることがわかった.これは,円偏波に直線偏波成分が混入していることを示しており,今後の課題として,クライオスタット内での反射波に由来する逆旋偏波成分の除去が必要である.物理化学・磁気化学円偏波導波管の試作機を完成させ,SQUID磁束計への組み込みを完了した.ガン発振器とポーラライザーからなる円偏波導入系の導波管への接続も完了し,液体ヘリウム温度での安定動作も確認できた.アキラルな基準物質(固体ラジカル試料)を用いて,直線偏波と円偏波をそれぞれ用いて,ESRの共鳴信号を観測することができた.しかし,円偏波による測定では,試料位置でだ円成分の混入がかなり大きいことが明らかになった.

だ円成分の混入,すなわち円偏波への直線偏波成分の混入は,偏波ESRをキラル磁性体に適用していく上で分光法としてのクオリティに重大な影響を及ぼすことになり,円偏波導波管の試作機の改良を要することがわかった.試料位置でマイクロ波偏波のだ円成分がかなり混入している原因としては,SQUID磁束計内部での反射波に由来する逆旋円偏波による部分がかなり大きいと考えられる.そこで,今後は,この反射マイクロ波の寄与を低減させるための改良を施すことにする.ひとつの方法として,方向性カップラー等のマイクロ波素子を用いることが考えられるが,液体ヘリウムレベルの極低温環境下で安定に動作し,かつコンパクトなものにする必要がある.また,より簡便な改良として,導波管の先端に電波吸収材または無反射終端を置いて,反射波を消去することも試みる.液体ヘリウムの使用量が,当初の計画よりも若干少なくなり,液体ヘリウムの購入に充てる金額が減少した.また,マイクロ波回路の素子(アッテネーターなど)について,当初予定していたものよりも安価なものが見つかったため,その購入に充てる金額が減少した.SQUID磁束計の内部でのマイクロ波の反射波を制御する必要があることがわかった.次年度は,反射波の強度を制御するための素子や電波吸収材等を新たに導入する予定である.上記の次年度使用額は,これらの素子・吸収材の購入に充てる.また,マイクロ波の反射波を最小化するための条件を探索するために,低温環境下での測定時間が当初の計画よりも長くなると予想される.そのための液体ヘリウムの追加購入にも充てる.
細胞特異的・可逆的摂動系を用いた個体行動を司る脳内の階層的細胞ネットワークの理解

昨年度までに薬理学実験によって概日リズムおよび睡眠覚醒の細胞間情報伝達を担う新規因子(遺伝子)の候補を挙げた。本年度は遺伝学的検証を行った。[1] CRISPR/Cas9を用いて候補因子をノックアウトしたマウスを作製し、概日リズムおよび睡眠覚醒状態を観察したところ、野生型と比べて睡眠時間・概日睡眠パターンが有意に異なる表現型が得られた。また、候補因子から推察した他の関連遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、野生型と有意に異なる睡眠時間・概日睡眠パターンをもつ、いくつかの遺伝子が得られた。[2]候補因子およびその発現細胞の役割を理解するために、この因子を発現する細胞特異的にDREADD(hM3Dq)を発現する遺伝子改変マウスを作製した。CNOによる細胞の人為的な活性化を行うと、野生型とは異なる睡眠時間・パターンが得られた。また、候補因子発現細胞の神経活動の経時変化を蛍光in situ hybridizationにて観察を行った。これらの個体を用いた実験により、本因子が概日リズムおよび睡眠覚醒の細胞間情報伝達に寄与すること示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は主に[1] ex vivo表現型解析方法の開発として、脳スライスの長期培養方法の開発および、[2]特異的かっ可逆的に細胞に摂動を与える遺伝子改変マウスの作製の2点を行った。[1]脳スライスの長期培養を達成する基盤技術として、メンブレン上に組織を培養する培養法(従来法)とマイクロ流路による培地灌流を組み合わせたデバイスを開発した。本デバイスの有用性をPer2::LUCマウスの視交叉上核(体内時計の中枢)を用いで連続観察可能日数(発光の減衰度合い)を評価したところ、従来法では半減期が4.7日であったのに対して本デバイスでは100日以上にまで延長した。さらに培養25日目においても発光・概日振動が観察できた。本研究成果は国際学会(MicroTAS2013)にて発表し、査読付きProceedingsとして出版した。[2] Tet systemやDREADDsを用いて様々な摂動因子を可逆的に発現させるための遺伝子改変マウス作製の準備を行った。また、全脳イメージングを用いてSCNマーカー遺伝子の脳内の発現部位を三次元的に同定し、そのマーカー遺伝子がSCN特異性を遺伝学的に担保できるか否かを確認した。遺伝子改変マウスの作製とEx vivo表現型解析用基盤技術の確立は当初の予定通りの進捗である。来年度は本年度に確立した技術を用いて、作製した遺伝子改変マウスのIn vivo表現型解析およびEx vivo表現型解析を行う。
植物の新規窒素代謝制御機構の解明とその応用

窒素は植物の主要な栄養素であり、その利用効率の向上は持続可能な農業生産のために重要である。植物は体内の窒素量をモニターし、それに応答して様々な酵素の活性を調節していると考えられていたが、その機構の解明は十分ではなかった。私たちは、窒素代謝の新しい調節因子としてACR11タンパク質を見出した。さらなる研究により、ACR11は、窒素量に応答して、アンモニアや硝酸からアミノ酸を合成する経路の活性を制御していることが明らかになった。これらの結果は、植物の窒素代謝の調節機構を理解する上で重要な知見である。本研究の目的はシロイヌナズナ葉緑体のプロテオーム解析から見出した、植物窒素代謝の新規制御因子であるNmr1の生理的機能と制御機構を明らかにすることにある。今年度は、まずシロイヌナズナのNmr1欠損株と野生株についてFd-GOGATタンパク質の蓄積量の日周変化を調べたところ、野生株では昼と夜で蓄積量の日周変化が見られた。しかし、Nmr1欠損株ではその変化は見られなかった。同様に、通常のCO2濃度で栽培した植物体を高CO2条件(0.3% CO2)に24時間移した後、元のCO2濃度に戻したところ、野生株ではそのCO2変化に伴ってFd-GOGATタンパク質の蓄積量がダイナミックに変化した。同時に、Nmr1の蓄積量も類似した変化のパターンを示した。そして、やはり、Nmr1欠損株ではその変化は見られなかった。これら実験の結果から、Nmr1は葉緑体内への窒素の流入に応答してFd-GOGATタンパク質の蓄積量を制御する機能を有していることが強く示唆された。次に、Nmr1による制御機構をタンパク質レベルで調べるための材料として、Nmr1変異株にNmr1-FLAGタンパク質を導入した植物体を作製した結果、Nmr1変異株の表現型が相補された。また大腸菌の発現系を利用したGST-Nmr1タンパク質の可溶性画分での発現とその精製に成功した。今後、これら材料を利用して、Nmr1タンパク質によるFd-GOGATタンパク質量の制御機構を調べる予定である。本研究の目的は植物窒素代謝の新規制御因子であるNmr1の生理的機能と制御機構を明らかにすることにある。本年度は、主に野生株とNmr1変異株における窒素応答について解析した。まず、1/2MS培地で生育させた植物体を窒素制限培地に3日間移植し、その後窒素の再投与を行ったところ、野生株では窒素投与に伴って、速やかに(2時間以内に)フェレドキシン依存的なグルタミン酸合成酵素の蓄積量が上昇し、グルタミン酸量も上昇した。一方、Nmr1変異株ではグルタミン酸合成酵素の蓄積量、グルタミン酸量の蓄積量ともに速やかな上昇は見られなかった。両植物体において葉内のグルタミン量は同程度に上昇していたことから、この結果は窒素の取り込み速度の違いを反映していたわけではないと考えられる。また、窒素の再投与に応答したフェレドキシン依存的なグルタミン酸合成酵素の転写量の変化に関しては野生株及びNmr1変異株で有意な差が見られなかった。これらの結果を従来の結果と合わせて考えると、Nmr1は細胞内窒素濃度に応答して転写後制御でフェレドキシン依存的なグルタミン酸合成酵素の蓄積量/活性を制御することが明らかになった。次に、Nmr1変異株にシアノバクテリアのフェレドキシン依存的なグルタミン酸合成酵素(Cyano Fd-GOGAT)を導入した結果、弱光下では野生株よりも生育が良くなる傾向を示したが、十分な光の下では差が見られなかった。このシステムを利用して窒素の利用効率を上昇させられる可能性は示したが、さらなる応用のためには、Cyano Fd-GOGATの発現時期や発現量をより厳密に調節することが必要と考えている。野生株とNmr1変異株の生理学的な解析により、Nmr1がフェレドキシン依存的なグルタミン酸合成酵素を介して、植物の窒素代謝をタンパク質レベルで制御していることを明らかにした。このことは植物の窒素代謝を理解するうえで重要な知見であると考えている。一方で、分子レベルでの制御機構の詳細やその構造については今後の重要な課題であり、現在解析中である。ACR11は緑色植物に広く保存されている葉緑体タンパク質で、ACTドメインというアミノ酸結合ドメインを有している。これまでの研究から窒素同化の制御に重要な役割を担っていることが明らかになってきた。acr11変異株においてはFd-GOGATタンパク質の顕著な減少が見られるが、シロイヌナズナではFd-GOGATタンパク質はglu1とglu2の2つの遺伝子にコードされている。ACR11はFd-GOGATタンパク質を翻訳後に制御していることが明らかになっていたが、どちらの遺伝子にコードされているFd-GOGATを制御しているのかについては明らかでなかった。一般的には、緑葉ではglu1が主要なアイソザイムであると考えられているが、acr11変異株においても同様にglu1が(常に)主要なアイソザイムであるかどうかは明らかでないためである。そこで、本年度はacr11におけるmRNAレベルでのglu1とglu2の比率をqPCRによって見積もった。その結果、野生型同様、acr11においてもglu1はglu2に対して510倍発現量が高いことが明らかになった。また、葉緑体タンパク質の質量分析の結果、Glu1由来のペプチドは(Glu2由来のペプチドと比べて)非常に多く検出されていた。

これまでのデータと合わせて考えると、この結果は、ACR11が少なくともGLU1がコードしているFd-GOGATに関しては、タンパク質レベルで制御していることを意味している。GLU1とGLU2の非常に高い相同性を考えると、おそらくは両方ともに制御しているのではないかと考えている。また、glu1変異株においてFd-GOGATタンパク質と同時にACR11も顕著に減少していたが、これは両タンパク質が結合して複合体を形成することでお互いを安定化しているからであろうと考えられた。窒素は植物の主要な栄養素であり、その利用効率の向上は持続可能な農業生産のために重要である。植物は体内の窒素量をモニターし、それに応答して様々な酵素の活性を調節していると考えられていたが、その機構の解明は十分ではなかった。私たちは、窒素代謝の新しい調節因子としてACR11タンパク質を見出した。さらなる研究により、ACR11は、窒素量に応答して、アンモニアや硝酸からアミノ酸を合成する経路の活性を制御していることが明らかになった。これらの結果は、植物の窒素代謝の調節機構を理解する上で重要な知見である。当初の計画と比べ、ほぼ予定通りの進捗である。また、今年度にHPLCを用いたアミノ酸分析系の確立に成功したことは、今後の研究の進展にとって重要な技術的基盤であると考えている。野生株とNmr1変異株の生理学的な解析をさらに進め、Nmr1による植物の窒素代謝の全体像を明らかにしていく予定である。また、Nmr1タンパク質複合体の構造を予測するため、単粒子解析を行い、その大まかな構造を明らかにする予定である。また、Nmr1タンパク質複合体の保存性と多様性を調べるため、様々な緑藻類や陸上植物でその構造を比較したいと考えている。植物生理学今年度は、寒天培地での生育比較実験に加えて、シロイヌナズナの水耕栽培を試みることで、栄養条件を変化させた際の応答を調べていきたいと考えている。また、実験材料の準備が順調に進んでいることから、これからタンパク質レベルでの制御機構を明らかにするための研究を進めていきたい。一部の物品が3月に納品され、その支払いが4月になったため。電気泳動用のリード線が3月納品のため、支払いが4月になったため。上記理由と金額のため、次年度使用計画への影響はありません。
血液脳関門の加齢変化と薬物の中核移行性

1.パラコートの中枢移行性とその能動輸送系の研究ラット線条体においてマイクロダイアリシスを行った。本法の妥当性を確認するため、MPP+を同様に投与した。また、パラコート投与後にMPP+を投与し、パラコートの血液脳関門に与える影響を観察した。細胞外液中濃度は、用量依存的であった。マイクロダイアリシス法による薬物の血液脳関門透過性の研究は、MPP+の非透過性から妥当な手段と考えられる。この透過機構は、パラコートによる血液脳関門の器質的障害に基づくものではなく、能動輸送系を介するものと考えられる。バリンによってパラコートの血液脳関門透過が阻害されたことから、中性型アミノ酸輸送系の関与がパラコートの血液脳関門透過に関与していることが示唆された。2.セフォリス〔ウィンセフ)の血液脳関門透過性と腎障害の影響セフォセリスでは、透析患者や腎不全患者において中枢神経障害の発症例が多く報告されている。しかし、β-ラクタム系抗生物質の血液胞関門透過性を評価した報告は少ない。そこで、血液脳関門透過性を、ブレインマイクロダイアリシス法を用いて評価を行った。更に、腎不全モデルラットを作成し、腎不全時のセフォセリスの血液脳関門透過性に与える影響について検討を行なった。ラット線条体においてマイクロダイアリシスを行った。腎不全モデルラットは、硝酸ウラニルによって作成した。セフォセリスは、用量依存的に投与後、速やかに潅流液中に検出された。血中/脳内細胞外液濃度の比較から、セフォセリスの血液脳関門透過性は高い値であった。腎不全モデルラットでは、血液中濃度、脳内細胞外液濃度ともに上昇した。これは、腎機能の低下に伴う、セフォセリスの血漿中濃度半減期の延長によるものであることが示唆された。薬物の血液脳関門透過性をブレインマイクロダイアリシス法で評価する方法を確立するために,下記の実験を行った。Wistarラット線条体にカニューレを植え込み,3日以上経過してから膜長3mmのプローブを挿入しRinger′s液を潅流した。潅流開始5時間後にパラコートをラット背部皮下に投与した。比較として,パラコートに化学構造の極めて類似したMPP^+を同様に投与した。投与後、1時間毎に潅流液をサンプリングし,3時間後に心臓より血液を採取した。更に,パラコート投与1時間後にMPP+を投与し,パラコートの血液脳関門に与える影響を観察した。能動輸送系の関与について,アミノ酸輸送系基質であるバリンを腹腔内に投与することによって血液脳関門透過性への影響を観察した。パラコートは,投与量依存的に投与後速やかに潅流液中に検出された。一方,MPP^+は,その血液中濃度はパラコートより高いにもかかわらず,潅流液中には全く検出することが出来なかった。この結果は,マイクロダイアリシスによる血液脳関門透過性実験は妥当で良い方法であることを示す。パラコート投与後にMPP^+を投与しても,MPP^+は潅流液中に検出することが出来なかった。このことは,パラコートの透過性は,パラコートがラジカル等によって血液脳関門を破壊することによるものではないと考えられる。バリンによって,パラコートの血液脳関門透過性は著名に低下した。従って,パラコートは,アミノ酸輸送系によって血液脳関門を透過するものと考えられた。現在、最近重篤な脳障害を起こすことで問題となっているβ-ラクタム系抗生物質の血液脳関門透過性に対して,能動輸送系の解明・加齢及び腎機能の及ぼす影響について,研究を進めている。

1.パラコートの中枢移行性とその能動輸送系の研究ラット線条体においてマイクロダイアリシスを行った。本法の妥当性を確認するため、MPP+を同様に投与した。また、パラコート投与後にMPP+を投与し、パラコートの血液脳関門に与える影響を観察した。細胞外液中濃度は、用量依存的であった。マイクロダイアリシス法による薬物の血液脳関門透過性の研究は、MPP+の非透過性から妥当な手段と考えられる。この透過機構は、パラコートによる血液脳関門の器質的障害に基づくものではなく、能動輸送系を介するものと考えられる。バリンによってパラコートの血液脳関門透過が阻害されたことから、中性型アミノ酸輸送系の関与がパラコートの血液脳関門透過に関与していることが示唆された。2.セフォリス〔ウィンセフ〕の血液脳関門透過性と腎障害の影響セフォセリスでは、透析患者や腎不全患者において中枢神経障害の発症例が多く報告されている。しかし、β-ラクタム系抗生物質の血液脳関門透過性を評価した報告は少ない。そこで、血液脳関門透過性を、ブレインマイクロダイアリシス法を用いて評価を行った。更に、腎不全モデルラットを作成し、腎不全時のセフォセリスの血液脳関門透過性に与える影響について検討を行なった。ラット線条体においてマイクロダイアリシスを行った。腎不全モデルラットは、硝酸ウラニルによって作成した。セフォセリスは、用量依存的に投与後、速やかに潅流液中に検出された。血中/脳内細胞外液濃度の比較から、セフォセリスの血液脳関門透過性は高い値であった。腎不全モデルラットでは、血液中濃度、脳内細胞外液濃度ともに上昇した。これは、腎機能の低下に伴う、セフォセリスの血漿中濃度半減期の延長によるものであることが示唆された。
新規プロテアソーム阻害化合物の探策を目指すオキサゾロマイシンの全合成研究

オキサゾロマイシンAコア部合成にあたり、(S)-3-ヒドロキシイソ酪酸メチルより導いたホモプロパルギルアルコール誘導体を用い、白金触媒下の分子内ヒドロシリル化を経る位置および立体選択的ヨウ素化を試みたところ、反応はスムーズに進行し、望む不斉を持つビニルヨウ素体を良好な収率で得ることに成功した。この化合物から誘導したビニルアルコール体に置換アミノ酸構築法を適用し、未だ収率は低いものの目的とするアミノ酸単位へ導いた。これによりオキサゾロマイシンAコア部の全炭素骨格の導入を達成したことになる。現在、コア部合成の最終段階である五員環ラクタムおよび四員環ラクトンの形成を検討している。別途、上述のビニルヨウ素体からパラジウム触媒下の分子内エノラート化に基づくラクタム構築を検討した。その結果、良好な収率で望むラクタム体が生成することを見出した。この化合物から四酸化オスミウムによる立体選択的ジヒドロキシル化、それに続くラクトン形成を行い、オキサゾロマイシンAの類縁体であるネオオキサゾロマイシンコア部を高収率で合成することに成功した。現在、ネオオキサゾロマイシン全合成に向けて、コア部と他セグメントとのカップリングを検討中である。また、このコア部はラクトン環部の開裂、再環化によりオキサゾロマイシンAコア部へ変換でき、オキサゾロマイシンAコア部合成が可能であることを示す端緒をつかむことができた。一方、当初計画していたエンイン閉環メタセシスに基づくアプローチでは、オキサゾロマイシンAコア部合成において、よい結果を得ることはできなかった。しかし、同様のストラテジーをエリスリナアルカロイドのテトラヒドロインドール核形成に応用したところ、完全な位置選択性で望む環化体を得ることに成功した。これにより非芳香族型エリスリナアルカロイドβ-エリスロイジンの初の不斉全合成を達成した。オキサゾロマイシンAのコア部合成にあたり、(2S)-3-ヒドロキシイソ酪酸メチルからそれぞれ合成したカルボン酸セグメントとアルコールセグメントをカップリングし良好な収率でエンイン体を得た。この基質をもとに本合成の鍵反応であるエンイン閉環メタセシスを行ったところ、未だ収率は低いものの目的とする八員環ラクトンを得ることに成功した。この化合物は置換アミノ酸構築における重要中間体と位置付けられ、閉環メタセシスを鍵反応とする本合成ルートによって、オキサゾロマイシンAコア部合成が可能であることを示す端緒をつかむことができた。現在、Sharpless不斉エポキシ化それに続く置換アミノ酸構築を検討中である。一方、セリン単位構築の足場となるアリルアルコール単位の導入にキレーションコントロールによる立体選択的アルケニル化を用いる別ルートについても検討した。(2R)-3-ヒドロキシイソ酪酸メチルから短段階で合成可能なケトンを基質とし、2-ブロモ-2-プロペノールを用いた立体選択的アルケニル化を試みたところ、反応はスムーズに進行し、望む不斉を持つアリルアルコールを良好な収率で得ることに成功した。この化合物に置換アミノ酸構築法を適用し、アミノ酸単位を形成した。これによりオキサゾロマイシンAコア部の全炭素骨格の導入に成功したことになる。現在、コア部合成の最終段階である五員環ラクタム及び四員環ラクトンの形成を検討している。
新規血小板凝集促進因子Aggrusの機能解析

血小板凝集は心筋梗塞、脳梗塞、動脈硬化、慢性頭痛、片頭痛、回転性めまいなど様々な疾患の発症に関与している。がんの転移においても血小板凝集の関与が知られている。研究代表者は、がん細胞膜上に発現している新規血小板凝集促進因子(Aggrus)の遺伝子クローニングに世界で初めて成功していた。1.ヒトAggrus上の血小板凝集に関わるドメインの同定Aggrus変異タンパク質を恒常的に発現するCHO細胞株を多種類作製し、血小板凝集誘導活性との相関を検討した。その結果、ヒトAggrus上の血小板凝集誘導活性・転移誘導活性に必須な部位として34番目と52番目のスレオニン残基を同定し、これら部位に付加している糖鎖が血小板凝集誘導活性の本体であることを同定した。これら部位をアラニンに置換して糖鎖が付加されない状態にしたT34A、T52Aでは、血小板凝集活性が全く認められないだけでなく、in vivoにおける肺転移も全く起こらなくなることが明らかとなり、Aggrusを標的にした抗転移剤開発の際の分子標的として、この糖鎖付加機構が標的となることが示唆された。2.Aggrus結合分子の探索Aggrus結合分子の探索を行ない、膜4回貫通型タンパク質であるTetraspaninファミリー遺伝子の1つであるCD9を同定した。CD9を過剰発現させたがん細胞では、肺転移が抑制されていることが確認された。AggrusとCD9の結合にはCD9上の膜貫通ドメイン1と2が関与しており、この部位を欠失したCD9には血小板凝集抑制活性が認められず、転移抑制効果も認められなかった。以上よりCD9は、Aggrusの血小板凝集誘導活性を中和することによりその転移抑制機能を発揮していることが明らかとなり、CD9を介した間接的なAggrusの制御も可能であることが示唆された。実際に高転移性がん細胞は血小板凝集能を有することが多く、できあがった大きな凝集塊が腫瘍塞栓を形成することにより転移形成を助長するとされる。しかし、がん細胞膜上に発現している血小板凝集促進因子は同定されていなかった。研究代表者は、がん細胞膜上に発現している新規血小板凝集促進因子の遺伝子クローニングに成功し、この分子をAggrusと命名した。本申請課題では、Aggrus変異タンパク質を恒常的に発現するCHO細胞株を多種類作製し、血小板凝集活性との相関を検討した。その結果、ヒトAggrus上の血小板凝集誘導活性に必須な部位として34番目と52番目のスレオニン残基を同定した。これら部位をアラニンに置換して糖鎖が付加されない状態にしたT34A、T52Aでは血小板凝集活性が全く認められないことから、これら部位に付加している糖鎖が血小板凝集誘導活性に深く関与していることが示唆された。さらにこのT34A、T52A-Aggrus発現細胞株の、in vivoにおける転移能を検討した結果、野生型Aggrusを発現させて起こる肺転移が、T34AとT52Aでは全く起こらなくなることが明らかとなった。さらに、T34A、T52A-Aggrus発現細胞株を移植したマウスは、野生型Aggrus発現細胞株移植の際に観察される生存率減少が起こらないことも確認された。細胞を蛍光ラベルすることにより、in vivoでの肺における腫瘍塞栓形成を検討した結果、T34AとT52Aは肺における腫瘍塞栓形成数が有意に減少していた。