hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In situ oxidation複合材料における界面反応の解析

金属基粒子分散複合材料の製造法は大別して、粉末冶金法および溶湯撹拌法を挙げることができる。粉末冶金法によれば高品質な材料が得られるが、コストが高い欠点がある。一方、溶湯撹拌法は簡単であるが、微細粒子を均一に分散することが難しい。そこで、酸化物の標準生成自由エネルギーがAl_2O_3に比べて大きい不安定な酸化物を溶融Al中に添加し、溶湯中にてAl_2P_3を形成させるin situ生成法を取り入れることにした。この不安定な添加酸化物としてはCuO(平均径45μm)、SnO(平均径74μm)、ZnO(平均径1μm)の各粒子を用いた。まず、1273Kの溶湯中にCuo粒子を添加した結果、1μm程度の微細なAl_2O_3粒子が溶湯中でin situ生成・分散していることを確認した。この結果は、溶融純Al中にAl_2O_3粒子を直接添加・分散することが難しいことを考えれば、注目される。また、Al-3%Mg合金中ではMgAl_2O_4粒子のin situ生成・分散が見られた。次いで、溶融純Al中へのSnO_2粒子の添加を試みたが、SnO_2粒子/溶融純Al間の濡れ性が悪く、SnO_2粒子自身の溶湯中への分散が難しいため、Al-3%Mg系合金にSnO_2を添加した。その結果、Mg-Sn-O系あるいはMg-Sn-Al-O系酸化物粒子およびSn-Mg系金属間化合物の形成があった。また、ZnO粒子についても、SnO_2粒子と同様に溶融純Alとの濡れ性が悪いため、Al-3%Mg合金中に添加した結果、微細なMgAl_2O_4粒子の形成が見られた。しかも、この粒子はこれまで以上に微細であった。これは添加したZnO粒子自身が微細なこと、およびZnOの標準生成自由エネルギーがCuOあるいはSnO_2よりもAl_2O_3に近いことによる。しかしながら、粒子の分散状態は必ずしも良好でなく、クラスターを形成していた。そこで、次にAl粉末とZnO粉末からなる混合粉末を坩堝底に装填し、その上でAl-5%Mg合金を窒素雰囲気下にて溶解した。その結果、Al-Mg合金は混合粉末中に浸透し、微細な酸化物を均一に分散した複合材料を得ることができた。
口臭簡易検出キットの開発

口臭は成人のおよそ4人に1人に認められ、舌背に生息している細菌が産生する揮発性硫黄化合物が主に原因となる。そこで本研究は、口臭原因物質の産生メカニズムに着目し、細菌学的手法を利用した簡易でコストパフォーマンスに優れ、さらには多数の検体を同時に検査することが可能な口臭検出キットの開発を行うことを目的としている本研究は本学部倫理審査委員会に承認を得て実施された。本研究で開発した口臭簡易検出キットは、臨床の場で応用可能であり、口臭診断において大いに貢献できることが示唆された。また、口臭に関わる口腔細菌を培養法を用いて調査したところ、Veillonella属菌が最も関与することが示唆された。口腔に対する美意識が高まってきている近年、口臭を社会的醜悪と考えて、フレッシュできれいな息を求める人々が増えている。そこで本研究は、口臭原因物質の産生メカニズムに着目し、細菌学的手法を利用した簡易でコストパフォーマンスに優れ、さらには多数の検体を同時に検査することが可能な口臭検出キットの開発を行うことを目的としている。平成26年度は研究実施計画通り、口臭簡易検出キットの試作品の開発に着手した。本研究はヒト舌背試料を対象としているために、本学部倫理委員会に本研究の申請を速やかに行い、承認を得た。また、本キットの有用性の検討、ならびに本キットにおける基準値に設定を定めるために優れた性能を有する口臭測定器が必要であったため、平成26年度の設備備品費で購入予定であった簡易ガスクロ方式を採用した口臭測定器を購入した。これを使用することにより、口臭の主たる原因である硫化水素などの濃度測定が可能で、口臭の有無の判別や口臭原因の特定が容易にできるようになった。本年度は計画通り、口臭簡易検出キットの試作品を作製することに成功した。キットの詳細は、容量5mlの滅菌バイアル瓶にシステイン加液体培地1mlを注入し、瓶キャップに長さ3cmのプラスチック板を取り付け、板面に酢酸鉛紙を張り付けた。そして被験者の舌背試料を瓶内の液体培地に漬け、プラスチック板を固定したキャップで瓶を固く閉める。その後、インキュベーターにて37°Cで培養を行うと24時間程で酢酸鉛紙が黒変する量と時間で判定する。予備実験において、口臭測定器によって口臭群と無口臭群でグループ分けした被験者間では、有意に酢酸鉛紙が完全に黒変するまでに要する時間が異なり、口臭群では顕著に短時間で黒変した。今年度以降、本検出キットの有用性が示され、臨床の場で応用可能であるならば、口臭診断における質の向上と補助に大いに貢献できると考えられる。平成27年度は、前年度に開発した口臭簡易検出キットを用い、臨床の場で応用可能であるかの確認を行った。ヒトから採取した試料を対象としているために、前年度に本学部倫理委員会に本研究の承認を既に得ており、本研究の被験者は本研究の目的と概要を説明し、同意者とした。前年度に購入した口臭測定器センサーガスクロマトグラフODSA-P2を用いて被験者の口腔気体中のVSCを測定し、口臭を有する群と無口臭群に分類した。本検出キットの結果と比較検討することにより本検出キットの有用性の確認および基準値の設定を試みた。被験者40名から得られた試料を用いて、本検出キットでの応用を試みたところ、口臭群と無口臭群でグループ分けした被験者間では、有意に酢酸鉛紙が完全に黒変するまでに要する時間が異なり、口臭群では顕著に短時間で黒変した。次に本検出キットの基準値を設定するために、両群間において最も短時間の培養で有意な差が認められる条件を検討した。その結果、口臭群は培養3時間後に、酢酸鉛紙の下部から2cmまで完全に黒変するのに対し、無口臭群では5時間以上の時間を要した。そのため、本検出キットの基準値は、試料を挿入してから培養後3時間で下部から黒変する距離が2cm未満とし、2cm以上黒変した場合は口臭を有する者と判定するように決定した。今年度以降、被験者数を増やすことにより本検出キットのさらなる有用性が示され、臨床の場で応用可能であるならば、口臭診断における質の向上と補助に大いに貢献できると考えられる。現在の研究の進行状況は、概ね予定通り進行している。理由の一つとして、平成26年度の設備備品費で購入した簡易ガスクロ方式を採用した口臭測定器センサーガスクロマトグラフODSA-P2の測定制度が高く、また簡便であることから円滑に計画が実行可能であったことが挙げられる。また、昨年度に開発した口臭簡易検出キットの試作品で得られた結果が、臨床試料から得られた口臭測定器の測定値との相同性が得られたために、当初の計画通りに円滑に進行することが可能であった。そして、本簡易キットは、ヒト口臭の主たる原因ガスであるVSC(硫化水素、メチルメルカプタンおよびジメチルサルファイド)のうち、硫化水素を検出する原理を採用している。これまでに行った実験において、口臭群の全被験者が口臭測定器による硫化水素濃度の測定値が無口臭群と比較して有意に高かった。

この結果は、申請時に仮定していた通りであり、本研究課題の進捗状況が順調に進展している最大の要因であると考えられる。口腔に対する美意識が高まってきている近年、口臭を社会的醜悪と考えて、フレッシュできれいな息を求める人々が増えている。そこで本研究は、口臭原因物質の産生メカニズムに着目し、細菌学的手法を利用した簡易でコストパフォーマンスに優れ、さらには多数の検体を同時に検査することが可能な口臭検出キットの開発を行うことを目的としている。平成28年度は、前々年度に開発した口臭簡易検出キットを用い、臨床に場で応用可能であるかの最終確認を行った。ヒトから採取した試料を対象としているために、初年度に本学部倫理審査委員会に本研究の承認を既に得ており、本研究の被験者は本研究の目的と概要を説明後、同意を得た者を対象とした。初年度に購入した口臭測定器センサーガスクロマトグラフODSA-P2を用いて被験者の口腔気体中のVSCを測定し、口臭を有する群と無口臭群に分類した。前年度、被験者40名(口臭群20名、無口臭群20名)から得られた試料を用いて、本検出キットの結果と比較検討することにより本検出キットの有用性の確認と基準値の設定を試みたところ、口臭群では顕著に短時間で酢酸鉛紙が黒変した。本検出キットの基準値は、試料を挿入してから培養後3時間で下部から黒変する距離が2cm未満とし、2cm以上黒変した場合は口臭を有する者と判定するように決定した。最終年度である平成28年度では、さらに被験者数を増やし、総被験者数80名(口臭群40名、無口臭群40名)分のデータを得ることが出来た。口臭測定器の結果と比較検討したところ、有意に相関が認められたために、本口臭簡易検出キットは臨床の場で応用可能であり、口臭診断における質の向上と補助に大いに貢献できることが示唆された。また、口臭に関わる口腔細菌を、培養法を用いて調査したところ、無口臭群と比較して口臭群の舌背では顕著にVeillonella属菌が優勢であることが判明した。口臭は成人のおよそ4人に1人に認められ、舌背に生息している細菌が産生する揮発性硫黄化合物が主に原因となる。そこで本研究は、口臭原因物質の産生メカニズムに着目し、細菌学的手法を利用した簡易でコストパフォーマンスに優れ、さらには多数の検体を同時に検査することが可能な口臭検出キットの開発を行うことを目的としている本研究は本学部倫理審査委員会に承認を得て実施された。本研究で開発した口臭簡易検出キットは、臨床の場で応用可能であり、口臭診断において大いに貢献できることが示唆された。また、口臭に関わる口腔細菌を培養法を用いて調査したところ、Veillonella属菌が最も関与することが示唆された。現在の研究の進行状況は、概ね予定通り進行している。申請以前に予備実験にて、口臭簡易検出キット試作品の概要は練られていたために、問題なく簡便でかつ精度の高い測定が可能なキットを作製することが可能であった。また、平成26年度の設備備品費で購入した簡易ガスクロ方式を採用した口臭測定器センサーガスクロマトグラフODSA-P2の測定精度が高く、また簡便であることから円滑に計画が実行可能であった。平成28年度では、さらに試料数を増やすことによって蓄積された臨床データを分析し、口臭診断における本検出キットの有用性の確認および歯周病の診断にも有用であるか否かを慎重に検討する。
20世紀にかけての非可逆過程の熱力学の発展

非可逆過程の熱力学(あるいは,非平衡熱力学)の端緒的な発展段階については,未だ詳細な科学史的研究はなされていない。この発展の一つの源流は、R.クラウジウスによる非補償変換なる概念の導入(185465年)であるが、非可逆過程の熱力学的定式化の試みは,187080年代における熱力学的平衡(化学平衡を含む)に関する理論体系、すなわち化学熱力学の成立以後に本格的に開始された,とみられる。つまり,平衡状態にある物質系の理論的取り扱いが十全な発展段階に達して初めて、それを基礎に,熱力学的平衡に対象を限定していた古典熱力学の適用限界の認識と,熱力学の非平衝系への拡張・発展という基本的な課題が前面に現われれてくる。われわれは,以上のことをフランスのベルトラン,ポアンカレ,デュエムの諸著作,並びにマックス・プランクの諸論文・著作,ポ-ランドのナタンソンの論文の検討を通して確認することができた。ベルトランとポアンカレについては,以前に発表した拙稿「非可逆過程の熱力学的認識の発展ー19世紀終わり20世紀初めー」(1988年)で論じた内容以上の新たな資料の検討には至らなかったが,デュエムについては,従来から非可逆過程の熱力学の端緒的成果とされてきた1911年の著作『エネルギ-論』以前の著作で,流体の粘性の効果や温度の非一様な系の熱力学的定式化の試みがなされていることを明らかにすることができた。また,交付申請書には記載しなかったが,プランクも化学熱力学に関する基本的な成果を出した後で,それの適用限界を問題にし,非平衡熱力学への方向性を1890年代に示唆していたことが明らかになった。だが,プランクはデュエムと違って1900年以降はボルツマンの統計力学的取り扱いに基本的な意義を与えることになった。なお,ヤウマンについては上記拙稿をさらに展開すること,オンサ-ガ-の線型熱力学の形成については諸文献の検討を一層進める必要がある。
植物の新規有害金属トランスポーターの同定

植物の有害金属(カドミウム、ヒ素、アルミニウム)の集積及び耐性に関わるトランスポーター遺伝子の同定を行った。カドミウムの超集積植物からカドミウムの無毒化に必要なTcHMA3、イネのカドミウムの集積に関わるOsHMA3をそれぞれ同定した。イネの内向きケイ酸トランスポーターLsi1はメチル化されたヒ素(MMAとDMA)をも輸送することを明らかにした。さらにソバ、シロイヌナズナ及びイネからアルミニウムの耐性に関わるいくつかの新規トランスポーター遺伝子を同定した。1.ソバのアルミニウム耐性関連遺伝子の綱羅的解析20μMのA1を6時間で処理したソバの根から、RNAを調製し、トランスクリプトームの配列解析を行った。配列を読んだ4万程度のcontigからアルミニウム耐性関連の遺伝子を選抜して、定量的RT-PCRで組織別の発現とアルミニウム誘導性を調べた。その結果、いくつかの遺伝子が根特異的でアルミニウムによって誘導されることが明らかとなった。そのほか、アルミニウム耐性品種と感受性品種から作成したマッピング集団を用いて、アルミニウム耐性に関与するQTL解析を行った結果、QTLが三つ検出された。2.ヒ素トランスポーターイネの内向きケイ酸トランスポーターLsi1はメチル化されたヒ素(MMAとDMA)をも輸送することを明らかにした。しかし、ケイ酸外向きトランスポーターLsi2はMMAとDMAの吸収に関与しなかった。またLsi1は亜ヒ酸の根圏への排出の一部にも関与していることをつきとめた。さらにLsi1はイネのセレン吸収にも関与し、亜セレン酸に対する輸送活性を示し、セレン酸に対する輸送活性を示さないことを明らかにした。また高ヒ素集積イネ品種と低ヒ素集積イネ品種とのマッピング集団を作成した。3.カドミウム集積遺伝子Thlaspi caerulescens(エコタイプGanges)から単離したカドミウムの超集積に関与する遺伝子TcHMA3 (Heavy Metal ATPase 3)の輸送基質について酵母を用いて調べた。その結果、TcHMA3は他の植物種のHMA3とは異なり、ZnとCoを輸送せず、Cdを特異的に輸送することがわかった。またThlaspi caerulescensの非カドミウム集積エコタイプ(Prayon)のHMA3のプロモーター領域と比較すると、Gangesのほうが特異的な配列を有していることがわかった。この特異的配列はGangesでのHMA3の高発現と関係している可能性がある。1.カドミウム吸収に関与するトランスポーターの解析重金属超集積植物として知られているThlaspi caerulescensのカドミウムの高吸収に関与する遺伝子TcNranplの機能解析を行った。この遺伝子はカドミウムを集積しない植物と比べると、根で高発現していた。またその発現量はカドミウムや亜鉛の処理の影響を受けなかった。抗体染色でこの遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞局在性を調べたところ、内皮細胞に局在していた。またwestern blotでこのタンパク質は細胞膜に局在していることを明らかにした。イネの種子へのカドミウム蓄積を抑制する遺伝子OsHMA3も同定した。2.ヒ素の集積に関与する遺伝子のマッピングと解析ヒ素高集積と低集積イネ品種から作出したF2集団を用いて、ヒ素の集積に関与する遺伝子のマッピングを行った。F2集団をヒ素汚染土壌に栽培し、種子中のヒ素濃度を測定し、様々なマーカーでマッピングした結果、ヒ素の集積に関与する遺伝子は8番染色体に座乗している可能性を示した。3.アルミニウム耐性・集積に関わる遺伝子の機能解析シロイヌナズナでのイネのアルミニウム耐性遺伝子STAR1の相同遺伝子AtSTAR1について更なる解析を行った。AtSTAR1はOsSTAR1と同様にアルミニウム耐性に関与していたが、その以外に開花の時期にも関与していた。またOsSTAR1とは異なり、その発現はアルミニウムによって誘導されない。しかし、OsSTAR1はAtSTARIの変異体を相補できる。これらのことはAtSTAR1はアルミニウム耐性以外に、他の機能にも関与している可能性がある。1.重金属超集積植物として知られているThlaspi caerulescensのカドミウムの高吸収に関与する遺伝子TcNramp1の発現解析を行った。その結果、TcNramp1は根と地上部の両方で発現し、その発現量は亜鉛欠乏や過剰処理、カドミウム処理に影響されなかった。またカドミウム集積の異なるエコタイプGangesとPrayonを比較すると、集積タイプのGangesでの発現が常に高かった。このことはTcNramp1がカドミウムの超集積に関与していることを示している。一方、イネの根において主なカドミウム吸収トランスポーターがOsNramp5であることを突き止めた。さらにOsHMA2が根から地上部へのカドミウムの輸送に関わっていることを明らかにした。

2.世界のイネコアコレクション123品種を用いてケイ酸の吸収と亜ヒ酸、メチルヒ素の集積の品種間差を調べた。その結果、品種によってケイ酸の吸収能力は6倍、亜ヒ酸集積は3.2倍、メチルヒ素集積は7.0倍の差が見られた。またジャポニカ品種はインディカ品種よりケイ酸と亜ヒ酸の集積量が多い傾向を示した。メチルヒ素の集積には亜種間に差がなかった。ケイ酸吸収量と亜ヒ酸集積量の間に全品種を通じての相関は示されなかったが、ケイ酸吸収量の多い品種は地上部のヒ素濃度も高い傾向があった。ケイ酸吸収量とメチルヒ素の集積量との間にも相関は見られなかった。これらのことは地上部のヒ素の集積量はケイ酸吸収能力のみによって規定されず、他の因子も関与していることを示唆している。3.A1で処理したソバの根のEST解析から、発現量の高いトランスポーターの1つであるFelREG2について解析を行った。FeIREG2は鉄欠乏で誘導されず、Alによって発現が誘導された。また他の金属(Cd,La,Ni)には応答を示さなかった。この遺伝子は主に根で発現していた。FelREG2とGFPの融合遺伝子をタマネギ表皮細胞に発現させたところ、液胞膜に局在していた。FelREG2はA1や他の金属(Cd,Ni)の液胞への隔離に関与している可能性が考えられる。
定在波分光法による埋もれた界面の価電子帯評価法の開発

Fe/Si多層膜の界面層の電子状態を知るために、位相制御をした定在波法と発光分光法を組み合わせて、Fe/Si界面の深さ方向の電子状態の変化を調べた。得られたFe L_(2, 3)発光スペクトルのスペクトル形状は、ほぼFe金属のスペクトル形状に類似して、Fe 3d→Fe 2p_(3/2)遷移による強度の強いL_3発光と、禁制遷移である強度の弱いFe 3d→Fe 2p_(1/2)遷移によるL_2発光を示した。Fe L_3発光スペクトルのピーク位置は、表面側Fe層から基板側Fe層に向って高エネルギー側にシフトした。これは発光点が表面側から基板側に移動するに従って、フェルミ準位近傍のFe 3d電子の状態密度が多い状態から少ない状態に変化していると考えられる。以上により、定在波法を用いた埋もれた界面の価電子帯の評価法が確立された。本年度は、表面に露出していない"埋もれた"薄膜界面の価電子帯構造を評価するために、軟X線反射多層膜内部に発生する定在波の位相を入射角や波長により変化させ、その変化させた位相を実験的に決定する手段を開発した。引き続き、求めた定在波の位相情報を基に軟X線を照射した際に放出される光電子或いは軟X線の探査深さを求め、得られた探査深さとそれらの信号が反映する価電子帯構造を計測し、埋もれた界面層の価電子帯構造を評価した。具体的には、まず位相評価のための多層膜の作製を行った。実験は、まず人為的に最上層の膜厚変化により位相変化を起こした反射多層膜を作製し、その反射率と収量測定から位相変化を求めた。求めた位相変化から評価した最上層の膜厚が蒸着レートから求めた膜厚に一致したため、反射率と収量測定から膜厚を評価することが可能になった。一方で、試料運搬時の試料保護のために評価層の上に保護層を蒸着するが、測定の際には、その保護層を取り去る必要があり、そのため市販のイオンビーム装置を改良し、保護層除去のための可搬型のAr^+スパッタ装置を作製した。これは予定通り動作した。以上から、最上層の膜厚を評価しつつ、スパッタにより最上層の厚さと波長を掃引することで、深さ方向のFe/Si界面の価電子帯測定を行ったところ、試料作製時のSi層の膜厚変化に応じて、Si層が薄いときのFe/Si界面は金属的な電子状態を示し、厚いときの界面は半導体的な様相を示すことが明らかとなった。今年度は、前年度に明らかになった多層膜の位相評価法を元に、Fe/Si磁性多層膜界面の価電子帯構造を評価した。まず定在波生成層となる、0.75keV付近で反射強度を持つように設計した反射多層膜を作製し、その上に評価層となるFe/Si層を蒸着した。このときの定在波の位相は反射多層膜の周期構造によって決まり、その位相は反射スペクトルと全光電子収量(TEY)スペクトルにより求めることができる。予め反射スペクトルを分子科学研究所UVSOR施設BL5Bにて評価し、発光スペクトルと同時にTEYスペクトルを測定し定在波の位相を求めつつ、Fe L_<2, 3>内殻発光による価電子帯構造の評価実験を行った。測定はSpring-8のBL27XUを使用した。得られたFe L_<2, 3>内殻発光スペクトルは、その形状がFe金属のスペクトル形状とよく似ており、Fe/Si磁性多層膜の磁性を担うと考えられるFe 3d部分状態密度を強く反映していると考えられる。その上で、次の2つの特徴が得られた。(1)定在波の位相変化にしたがって、Fe L_<2, 3>内殻の発光強度が変化した。発光強度の変化と位相変化から求めた発光の中心位置の対応を調べたところ、名目的な膜厚変化と発光強度の変化がよく対応した。これは深さ方向の測定がその場で可能になったことを示している。(2)位相制御によりFe L_<2, 3>発光の発光中心をFe/Si磁性多層膜の表面側から基盤側に移動させたのに従って、Fe L発光の発光スペクトルのスペクトル形状が変化した。同様の実験条件で測定した光電子分光スペクトルの結果と併せて考えると、深さ方向の価電子状態の変化と同時に深さ方向のケミカルシフトが合わせて現れたと考えられる。
エンドサイトーシスによる細胞外シグナルの下方制御機構の解析

エンドサイトーシスにおける細胞外シグナルの下方制御機構について、出芽酵母の接合フェロモンの受容体シグナルをモデルとして用いて研究を行った。本研究では、受容体のリン酸およびユビキチン化が、受容体をエンドサイトーシスの部位へと効率的に輸送するために重要であることを明らかにした。本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「リガンドに結合した受容体のエンドサイトーシス部位への輸送機構の解析」については、蛍光標識した出芽酵母の接合フェロモン(α-factor)に結合した受容体のエンドサイトーシス部位への移動を解析する実験系について、再現性の高い実験系の確立に成功した。この実験系を用いて野生型細胞でα-factorが受容体(Ste2p)に結合した後のエンドサイトーシス部位への輸送時間を調べたところ、約10分で80%のSte2p受容体がエンドサイトーシスの部位に輸送されることが明らかになった。次に、Ste2pのリン酸化、ユビキチン化変異体を作成し、α-factorが受容体に結合した後のエンドサイトーシス部位への輸送時間を調べたところ、ユビキチン化変異体ではほとんど影響が見られないのに対して、リン酸化変異体ではその輸送が著しく抑制された。この結果はリガンドに結合した受容体のエンドサイトーシス部位への輸送には受容体の細胞内ドメインのリン酸化が重要であることを示唆している。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構」については、クラスリン小胞とアクチンケーブルの時間的空間的局在の解析を行った。エンドサイトーシス部位に局在する蛋白質を赤の蛍光蛋白質(RFP)で、アクチンケーブルを緑の蛍光蛋白質(GFP)で標識し、リアルタイム蛍光顕微鏡解析を行い、アクチンケーブルがエンドサイトーシスの部位に現れる時期を調べた。この結果、アクチンケーブルはクラスリンがエンドサイトーシスに現れた後にエンドサイトーシスの部位にリクルートされ、その後エンドサイトーシス小胞の形成が起こることが明らかになった。このことは、アクチンケーブルのリクルートにはクラスリン蛋白質の後にエンドサイトーシスの部位に現れる蛋白質が関与していることが示唆された。現在、酵母の遺伝子欠損ライブラリーを用いて、アクチンケーブルがエンドサイトーシスの部位へのリクルートされるために必要な蛋白質の同定を試みている。1つ目の研究課題である「リガンドに結合した受容体のエンドサイトーシス部位への輸送機構の解析」については、受容体のリン酸化、ユビキチン化変異体の解析を行なった。H19年度の研究において、私達は野生型のSte2受容体がリガンドであるα-factorに結合した際、約10分でエンドサイトーシスの部位に輸送されることを明らかにした。これに対して、Ste2受容体の細胞内ドメインの6カ所のリン酸化部位をAlaに置換した変異体を用いた場合、Ste2受容体のエンドサイトーシスの部位への輸送は著しく抑制された。受容体のリン酸化は、その後の受容体のユビキチン化に必要であることから、次に私達はSte2受容体のユビキチン化部位の変異体を作成し、同様の実験を行なった。この結果、リン酸化変異体と同様に、ユビキチン化部位の変異体もエンドサイトーシス部位への輸送が抑制されていることが明らかになった。これらの結果は受容体のエンドサイトーシス部位への輸送には受容体の細胞内ドメインのリン酸化およびユビキチン化が重要であることを示唆している。さらに、私達はユビキチンの結合タンパク質であるEntタンパク質の変異体についても解析を行ない、Entの機能が受容体の輸送には必要であることを明らかにした。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構」については、クラスリン小胞がアクチン骨格上をどのように移動するかについて解析を進めた。この結果、アクチンフィラメントはクラスリン小胞が細胞内に輸送される直前にエンドサイトーシス部位へとリクルートされることが明らかになった。次に、アクチンフィラメントを介してクラスリン小胞の細胞内への取り込みを調節しているタンパク質を同定するために、エンドサイトーシス関連、およびエンドソーム関連の約300種類のタンパク質について、その遺伝子欠損変異体を作成した。これらの変異体にアクチンフィラメントの蛍光標識を行ない、各変異体におけるアクチンフィラメントの動態を網羅的に解析した。この結果、現在までに5種類の遺伝子欠損変異体で顕著なアクチンフィラメントの異常が認められている。現在これら異常が認められた変異体についてさらに詳細な解析を行うとともに、残りの変異体について順次解析を進めている。1つ目の研究課題である「リガンドに結合した受容体のエンドサイトーシス部位への輸送機構の解析」については、リガンド-受容体の移動を制御する蛋白質の同定を試みた。H20年度までの研究において、私達は野生型のSte2受容体がリガンドであるα-factorに結合した際、約10分でエンドサイトーシスの部位に輸送されること、さらに、受容体のエンドサイトーシス部位への輸送には受容体の細胞内ドメインのリン酸化およびユビキチン化が重要であることを明らかにした。

今回、私達はリン酸化したSte2受容体に結合する同定するため、Ste2受容体の細胞内ドメインのリン酸化型変異体をベイトとして用い、酵母ハイブリッドスクリーニングを行った。この結果、哺乳類14-3-3蛋白質の酵母ホモログであるBmh2pを新規結合蛋白質として同定した。14-3-3蛋白質は標的蛋白質とリン酸化Ser/Thrを介して結合するアダプター蛋白質であるが、Bmh2pのSte2pへの結合もリン酸化依存的であることを明らかにした。また、Bmh2pのN末端領域の過剰発現はSte2pのエンドサイトーシスにも抑制的に働くことを見出した。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構」については、クラスリン小胞とエンドソームの会合メカニズムを明らかにするために、クラスリン小胞から細胞内エンドソームへの積み荷の輸送に異常がある変異体の同定を試みた。エンドソーム局在蛋白質やエンドサイトーシス関連蛋白質の遺伝子欠損変異体を約300種類作製し、これらの変異体における蛍光標識したα-factorのクラスリン小胞を介したエンドサイトーシスへの輸送効率を調べた。これまでに、α-factorの輸送に異常が見られる遺伝子欠損変異体を13種類同定しており、現在、これらの変異体におけるクラスリン小胞の輸送を詳細に解析している。
長期的にPMTCを施術した高齢者のう蝕予防効果

被験者はカリエスリスクが高く1年間PMTCを行った処置群20名, PMTCを行わない観察群14名であった.観察群では,全ての症例で1年間ハイリスクのままであった.処置群では1名のみlactobacilliの数が減少したが,それ以外はハイリスクのままであった.また,年齢と共に唾液量が減少してきた者が10名認められた.観察群において根面または二次齲蝕の発生が認められた者が13名いた.「う蝕の発生」に関わる口腔内環境因子をCHAID分析にて調べた結果,う蝕の発生の有無に関わる因子「PMTCの有無」を見いだした.さらにう蝕の発生に関わる因子は「刺激唾液の量(0.5ml/min以下)」であった.被験者はカリエスリスクが高く1年間PMTCを行った処置群20名, PMTCを行わない観察群14名であった.観察群では,全ての症例で1年間ハイリスクのままであった.処置群では1名のみlactobacilliの数が減少したが,それ以外はハイリスクのままであった.また,年齢と共に唾液量が減少してきた者が10名認められた.観察群において根面または二次齲蝕の発生が認められた者が13名いた.「う蝕の発生」に関わる口腔内環境因子をCHAID分析にて調べた結果,う蝕の発生の有無に関わる因子「PMTCの有無」を見いだした.さらにう蝕の発生に関わる因子は「刺激唾液の量(0.5ml/min以下)」であった.固定性補綴装置が装着されているう蝕のハイリスクな高齢患者に,定期的にプロフェッショナルケアを行い,う蝕に関する口腔内環境因子を経時的に比較検討した.本年度は,本学附属病院に通院し,PMTCを1ヵ月に1回,4年間行っている(H17年から継続中)カリエスリスクの高い処置群の6名と,過去4年間術後管理のないカリエスリスクの高い観察群の5名とした.彼らには本研究に協力してもらうにあたり,十分なインフォームドコンセントを行い納得した上で,大阪歯科大学医の倫理委員会の承認を得た同意書に署名してもらった.両群にメディカルインタビュー(ブラッシングの回数,常用薬剤の服用の有無,喫煙の有無,食事回数,PMTCの有無),口腔内検査(唾液の粘調度,プラークの量(PII),床義歯の有無),唾液検査(刺激唾液の量,刺激唾液の緩衝能,mutans streptococciの数,lactobacilliの数)を行い,これら12因子を口腔内環境因子として調べた.唾液検査は,Orion社製デントカルトシリーズを用いた.カリエスリスクレベルの高い観察群は,全ての症例でハイリスクのままである.しかし,PMTCを行っている処置群に1名,lactobacilliの数が減少したものが認められた.それ以外の処置群ではハイリスクのままである.また,年齢と共に唾液量が減少してきた被検者も2名認められる.また,齲蝕の発生も認められた.次年度も引き続いて実験を行う予定である.固定性補綴装置が装着されているう蝕のハイリスクな高齢患者に,定期的にプロフェッショナルケアを行い,う蝕に関する口腔内環境因子を経時的に比較検討した本年度は,本学附属病院に通院し,PMTCを1ヵ月に1回,4年間行っている(H18年から継続中)カリエスリスクの高い処置群の6名と,過去4年間術後管理のないカリエスリスクの高い観察群の4名とした.彼らには本研究に協力してもらうにあたり,十分なインフォームドコンセントを行い納得した上で,大阪歯科大学医の倫理委員会の承認を得た同意書に署名してもらった両群にメディカルインタビュー(ブラッシングの回数,常用薬剤の服用の有無,喫煙の有無,食事回数,PMTCの有無),口腔内検査(唾液の粘調度,プラークの量(PlI),床義歯の有無),唾液検査(刺激唾液の量,刺激唾液の緩衝能,mutans streptococciの数,lactobacilliの数)を行い,これら12因子を口腔内環境因子として調べた.唾液検査は,Orion社製デントカルトシリーズを用いたカリエスリスクレベルの高い観察群は,全ての症例でハイリスクのままであるPMTCを行っている処置群でも,ハイリスクがロウリスクに移行したものは認められなかった.昨年度と同様で,唾液量が減少してきた被検者が両群において2名認められる.また,彼らにPlIの増加と根面齲蝕の発生が認められた.次年度も引き続いて実験を行う予定である本年度は,昨年度から本研究に参加している被験者のへの検査,術後管理を継続して実施した.被験者はカリエスリスクの高い高齢者20名を選択した.しかし,途中でリタイアした者もがいたため13名が研究に参加した.彼らは平成18年度からPMTCを1ヵ月に1回,4年間行っている処置群と,4年間術後管理のない観察群である.両群にメディカルインタビュー(ブラッシングの回数,常用薬剤の服用の有無,喫煙の有無,食事回数,PMTCの有無),口腔内検査(唾液の粘調度,プラークの量(PII),床義歯の有無),唾液検査(刺激唾液の量,刺激唾液の緩衝能,mutans streptococciの数,lactobacilliの数)を行い,12因子の口腔内環境因子を調べた.(1)処置群の8名は,1ヵ月に1回,1年間来院してもらい,PMTCと唾液検査を行った.(2)観察群の5名は,平成18年に補綴修復処置と唾液検査を行い終診したカリエスリスクの高い者である.

本研究に同意を得たのち来院してもらい,メディカルインタビュー,口腔内検査,唾液検査を行った.(3)唾液検査は,Orion社製Dentocult^[〇!R]シリーズを用いる.刺激唾液量,刺激唾液の緩衝能とう蝕原性細菌(mutans streptococciとlactobacilli)の数を,モデルチャートを用いて測定した.得られた結果をCHAID分析にて「う蝕の発生の有無」に最も強く関わる口腔内環境因子は何か12因子から解析した.樹形図から,う蝕の発生の有無に関わる因子(PMTCの有無)を見いだした.さらにう蝕の発生に関わる因子は刺激唾液の量(0.5ml/min以下)であった.以上のことから「う蝕の発生」に最も強く関わる口腔内環境因子は,PMTCを行わず,刺激唾液量の少ない症例であることがわかった.
衛星データを利用した中央アジア・西アジアにおける歴史的集落の立地と形態の研究

本研究では,ユーラシア(および北アフリカ)の歴史的集落(都市および村落)を,それらの立地および形態の側面から類型化し,系譜とすることを目指した。具体的には中央アジア・西アジア地域からウズベキスタン,キプロス,ヨルダンを対象地域として取り上げ,集落遺構の立地と形態について研究を行った。これらの地域では地形図などが入手しがたく,そのことが考古・歴史地理学的研究を妨げてきたが,衛星画像や衛星観測に基づく地形データを利用することにより,研究を進展させることができた。あらかじめ衛星画像などを入手し,検討した上で,現地調査を行った。本年度は,ヨルダンおよびキプロスのの都市・集落遺跡を調査した。ヨルダンについては2014年10月に現地調査を行い,アンマン,ジェラシュ,ウンム・アル・ラサース,エル・レジューンなどを訪れた。アンマンとジェラシュは,ヘレニズム・ローマ世界の都市であり,神殿や劇場などが残る。ウンム・アル・ラサースとエル・レジューンは,古代ローマが辺境に設置した軍事拠点であり,長方形の城壁を持つ。その形態や材質について,現地で観察した。ウンム・アル・ラサースと帰りに立ち寄ったマダバでは,教会の床に描かれた地図や都市図を実見し,地理学の観点から興味深いものと思われた。キプロスでは予備的調査のため,京都大学総合生存学館の大学院生,早川尚志を2014年8月に派遣し,資料を収集して持ち帰った。これを踏まえて,2015年3月に,小方がキプロスの調査を行った。キプロスは,古代ギリシア・ヘレニズム・ローマ世界で,アフロディテ祭祀の中心とされたところである。キプロスでは,アマトゥス,クリオン,パレパフォス,パフォス,キティオンの都市遺跡を踏査した。特にアマトゥスでは,丘の上に立地し,アフロディテ神域のあるアクロポリスと,低地に立地するアゴラの対比を興味深く観察した。アマトゥスには,古代の波止場である海岸沿いのくぼみのほか,沿岸の海底に突堤の遺構が視認できた。クリオンは,劇場などのある市街地とアポロンの神域,スタディオン(競技場)が,互いに離れて存在するところに特徴があった。古代キプロスでは,銅の採掘が経済を支えたが,トロードス山地の銅山も視察した。古代の遺構は残っていなかったが,鉱滓の堆積を観察することができた。このように現地で得た知見を,CORONAをはじめとする衛星画像やDEMと比較し,西アジア古代都市・集落の立地やプランについて,本年度は特に古代ギリシア・ヘレニズム・ローマ世界のものとしての位置づけから,検討を行った。まず,2015年7月7日に,英国・ロンドンで開催されたInternational Conference of Historical Geographers 2015において,Study of the location and plan of Hellenistic and Roman cities in the Near Eastという表題でポスター発表を行った。そこでは,セレウキア・ピエリアやアパメアといった西アジアのヘレニズム・ローマ時代の植民都市について,衛星画像やDEM(数値標高モデル)を用い,立地とプランを検討した。次に,9月20日28日の間,ウズベキスタンにおいてフィールドワークを行った。あらかじめ衛星画像上で都市以降の存在を予測し,現地で確認するという方法をとった。調査はゼラフシャン川地域(サマルカンド周辺)とカシュカダリヤ地域(カルシおよびシャフリサブズ周辺)で行い,ウズベキスタン考古研究所のRaimkulov Abdusabir氏に同行していただいた。エル・クルガンという都市遺跡は衛星画像上では五角形の城壁であるが,現地で確認したところでも遺存状態は良好であり,紀元前7世紀にさかのぼるという重要な遺跡であった。さらに衛星画像を検討すると,城壁の外側にも濠や外側の城壁などの痕跡が見られた。オディルマ・シャフルという都市遺跡は,2013年の調査でも訪れたが,今回重ねて調査を行った。衛星画像上では三重の長方形の囲郭が確認できるが,現地の地表に散在する陶片からは,ヘレニズム時代にさかのぼる重要な遺跡であるという。現地の農民がここの地下に水道管があると教えてくれたが,実際,穴の側面に土管が埋まっていることを確認した。この遺跡はウズベキスタンの考古学者にも知られておらず,衛星画像による遺跡探査の成果であるといえる。さらに2016年3月13日に東京で行われたフェニキア・カルタゴ研究会で,衛星画像と地形データでみるフェニキア・カルタゴの都市の立地という表題で発表を行った。ロンドンでの国際歴史地理学会で行ったポスター発表は,衛星画像やDEMの分析結果をグラフィカルに掲示したが,参加者の反応は今ひとつであったかと思う。ウズベキスタンでの調査では,衛星画像上で特定した都市遺跡を現地で確認した。エル・クルガンは巨大で重要な遺跡であるにもかかわらず,日本ではほとんど知られておらず,これを実見したことは意義が大きい。オディルマ・シャフルは,ヘレニズム時代までさかのぼる重要な遺跡であることが分かり,地下の水道管の存在も実見した。現地の考古学者にも知られていないことから,事実上の新発見ということができ,予想以上の大きな成果であるといえる。フェニキア・カルタゴ研究会の発表では,参加者の多くが歴史学に属し,衛星画像やDEMを利用した地理学的アプローチの意義をアピールすることができた。本研究では,衛星画像と衛星観測による地形データを利用して,中央アジアおよび西アジア地域における歴史的集落の立地と形態を明らかにした。

当該年度においては,2014年10月のヨルダンでの調査,2015年3月のキプロスでの調査,2015年9月のウズベキスタンでの調査の総括を行った。ウズベキスタンでの調査では2013年11月の調査に引き続き,カシュカダリヤ川流域を重点的に踏査した。衛星画像に見える巨大で明瞭な城壁遺構は,エル・クルガンと呼ばれるもので,紀元前7世紀にさかのぼる重要なものであった。衛星画像や地形データのより詳細な検討を経て,多重の囲郭を持つ複雑な構造の都市遺跡であることが判明した。三重の方形囲郭を持つオディルマ・シャフルは,表面に散乱する陶片などからヘレニズム時代(紀元前4世紀)にさかのぼることが分かり,さらに地下の上水道の存在も確認した。この都市遺跡は地元の考古学者も知らないもので,重要な発見であった。そのほかにも多くのテパ(丘状遺跡)を衛星画像と現地で確認・検討し,ユーラシアの歴史的都市を体系づける有力な素材を得た。成果の一部は『地域と環境』14号(2016年)に論文として掲載した。以下にその摘要を掲載する。「本稿では,前稿(小方2014)の方法を踏襲しつつウズベキスタンのカシュカダリヤ川沿いに分布する都市・集落遺跡について,その分布・立地および形態を明らかにした。衛星写真上で遺跡と思われる地物を特定し,現地調査で確認した。その多くは「テパ」と呼ばれる丘状遺跡であり,それらの形態から共通する要素を抽出して,一般化を試みた。今回調査した中では,エル・クルガンとオディルマ・シャフルという多重の囲郭からなる遺跡が,従来の都城系譜研究にない知見を与える重要なものであった。」本研究では,ユーラシア(および北アフリカ)の歴史的集落(都市および村落)を,それらの立地および形態の側面から類型化し,系譜とすることを目指した。具体的には中央アジア・西アジア地域からウズベキスタン,キプロス,ヨルダンを対象地域として取り上げ,集落遺構の立地と形態について研究を行った。これらの地域では地形図などが入手しがたく,そのことが考古・歴史地理学的研究を妨げてきたが,衛星画像や衛星観測に基づく地形データを利用することにより,研究を進展させることができた。あらかじめ衛星画像などを入手し,検討した上で,現地調査を行った。2回の現地調査を行い,また衛星画像・DEMの分析を進めており,研究はおおむね順調に進展している。西アジアは政情不安が続いており,フィールドワークを行うことには困難が予想されるので,慎重に検討する。今後は衛星データの分析を中心に研究を進め,研究成果を取りまとめる。衛星画像についてはすでに十分に保有しているので,DEM(数値標高モデル)を重点的に入手・分析する。リモート・センシング技術センターから提供されるAW3Dは,解像度と品質が非常に優れたDEMであるので,これを重点的に購入し,研究の素材とする。人文地理学本年度の研究で得た知見をまとめ,研究報告や論文とする。衛星観測に基づくDEM(数値標高モデル)として,リモート・センシング技術センターからAW3Dが提供されるようになった。
新規がん細胞遊走調節因子TRPV2チャネルを標的とした転移阻止法の確立

我々はTRPV2が正常細胞のみならず、メラノーマを始めとする様々な悪性腫瘍細胞に高発現していることを見いだした。メラノーマは転移を起こしやすい癌細胞の代表である。そこで我々はメラノーマを実験モデルとし、癌細胞の転移におけるTRPV2の病態生理学的意義を明らかにするとともに、TRPV2を癌細胞の転移を阻止する分子標的とするための研究を行った。第一にメラノーマにおけるTRPV2チャネルの発現、調節機構を明らかにし、細胞遊走における意義を明らかにした。具体的にはyeast two-hybrid法によりTRPV2と相互作用する蛋白を単離した。これにより得られた候補蛋白MAEAは赤血球の脱核の際赤血球とマクロファージとをつなぐために関与する因子であった。in vitroでTRPV2とMAEAが相互作用することを証明した。第二にTRPV2チャネルの有効な抑制法を確立し、それを用いてin vitroでの遊走、さらにはin vivoでの転移を阻止する方法の確立を行った。予備実験としてTRPV2の阻害薬であるルテニウムレッドによりメラノーマ細胞の遊走能が低下することを確認した。次にドミナントネガティブ型TRPV2をメラノーマ細胞に導入し、遊走能の検討を行った。ドミナントネガティブ型TRPV2は正常型TRPV2と同様に細胞膜に局在した。しかし、wound healing assayにより両者に優位差は見られなかった。そこで我々はメラノーマを実験モデルとし、癌細胞の転移におけるTRPV2の病態生理学的意義を明らかにするとともに、TRPV2を癌細胞の転移を阻止する分子標的とするための研究を開始した。まず第一にTRPV2.チャネルがHGFによって細胞膜へ移行しインテグレートされるというユニークな調節を受けるというデータを取得した。またこの移行は可逆的で培地から血清を除いた状態では細胞内のオルガネラに局在することを明らかにした。第二にTRPV2チャネルと相互作用する蛋白を明らかにする目的で、酵母two-hybrid systemにより細胞接着に関与する膜蛋白を一つ同定した。現在この蛋白がTRPV2チャネルの形質膜への局在および細胞遊走に関与するかを検討している。第三にTRPV2チャネルの阻害剤として知られるrutheniumred (RR)がメラノーマ細胞の遊走を抑制することやドミナントネガティーブ型変異TRPV2 (dnTRPV2)の導入によりTRPV2チャネルの細胞膜への移行を阻害することを明らかにした。第四に、申請者らはTRPV2チャネルの阻害剤として現在知られているRR、La^<3+>、SKF96365の他に、新たにtranilastを同定した。tranilastはTRPV2を介して起こるCa^<2+>流入を阻害する。そこで本年度TRPV2を介して起こるCa^<2+>流入を特異的に阻害するtranilastアナログの探索を行う。現在、TRPV2高発現細胞を樹立し、細胞内Ca^<2+>膿度の上昇を指標としたハイスループットのアッセイ系を構築している。第二にTRPV

2チャネルの有効な抑制法を確立し、それを用いてin vitroでの遊走、さらにはin vivoでの転移を阻止する方法の確立を行った。予備実験としてTRPV2の阻害薬であるルテニウムレッドによりメラノーマ細胞の遊走能が低下することを確認した。次にドミナントネガティブ型TRPV2をメラノーマ細胞に導入し、遊走能の検討を行った。ドミナントネガティブ型TRPV2は正常型TRPV2と同様に細胞膜に局在した。しかし、wound healing assayにより両者に優位差は見られなかった。今後、新たなTRPV2チャネルの有効な抑制法を確立し、メラノーマ細胞の遊走を抑制する機構を明らかにする。
小胞体ネットワークにおけるチューブ伸長機構の解析

シロイヌナズナ培養細胞MM2dを用いて、小胞体チューブ形成に関与すると考えられているレティキュロン様タンパク質(AtRTN)とアトラスチンGTPaseのホモログであるRHD3が、植物細胞においても小胞体チューブ形成に関与していることを明らかにした。そして、RHD3がGTPに結合すること。チューブ形成条件下で、会合体を形成することを示した。またタンパク質リン酸化によって、チューブ形成が調節される知見を得た。シロイヌナズナのレティキュロン様タンパク質(AtRTN17と18)と相互作用する成分を同定する目的で、N端にGFPを結合させたそれらのタンパク質を培養細胞内に発現きせた。AtRTN17は、主に細胞表層の小胞体ネットワークに取り込まれた。この局在は、このタンパク質に対する抗体を用いた免疫蛍光染色法による染色パターンと一致していた。一方AtRTN18を発現させると、小胞体の形態が太いチューブあるいは袋状の形態に変化した。現在抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によって得られた、これらのレティキュロン様タンパク質と相互作用している成分を同定しているところである。一方アメリカのグループが、ダイナミンGTPアーゼの一つであるアトラスチンが、レティキュロンと複合体を形成して小胞体チューブ形成に関与していることを報告した。シロイヌナズナでは、そのホモログであるRHD3が同定させている。このタンパク質のチューブ形成における役割を調べるために、特定領域に対する抗体を作製した。免疫蛍光染色法では、小胞体の表層チューブ状構浩とRHD3の局在は完全には一致していなかった。また細胞内部にも局在が観察されたが、小胞体膜が融合していると考えられている核膜外膜には存在していなかった。現在更にRHD3の局在を詳細に検討しているところであり、同時に小胞体チューブ再形成系を用いて、抗RHD3抗体によるチューブ形成における効果を調べているところである。なお抗AtRTN17抗体によって、チューブ形成が阻害きれることは既に確認しており、この系を用いることによって、他の成分の小胞体チューブ形成における関与を明らかにすることが出来ると期待される。シロイヌナズナのレティキュロンであるAtRTN3とAtRIN17に対する抗体を用いた免疫沈降法によって、これらの成分と相互作用する小胞体(ER)成分の同定を試みたが、他のAtRTNやRHD3などは検出できなかった。AtRTN17に関しては、N端あるいはC端にGFPを連結させたタンパク質を発現させ抗GFP抗体によって免疫沈降を行ったが、やはり他の成分を検出することができなかった。また抗RHD3抗体による免疫沈降でも、AtRTNなどの成分は検出されなかった。現在免疫沈降に用いるERを可溶化するための条件、例えばディタージェントの種類などを検討しているところである。多くのAtRTNのN端、RHD3のC端にはセリン残基のクラスターが存在することから、これらのタンパク質がリン酸化されている可能性が示唆された。そこでリン酸化タンパク質吸着カラムを用いてその可能性を確かめたところ、少なくともAtRTN1、3、4、5、6、17とRHD3が抗体を用いたイムノブロットやMS解析によって検出された。そこで、まず細胞内におけるERチューブ形成におけるリン酸化の役割を、タバコ培養細胞BY-2を用いて検討した。カルシウムイオン存在下でカルシウムイオノフォアを加えると、BY-2細胞の表層ERネットワークは大きな袋状の構造に変化する。そしてカルシウムイオンなどを除くことによってチューブ構造が再生されるが、この再構成はタンパク質リン酸化阻害剤により抑制された。つまり脱リン酸化によってERチューブ形成が阻害されたことになる。このリン酸化によるチューブ形成機構における役割を更に解明するために、現在単離したERを用いたチューブ再構成系を用いて解析を行っているところである。植物小胞体チューブ形成には、RHD3GTPaseが関与している。まずシロイヌナズナ培養細胞から単離した小胞体を用いたin vitroチューブ形成系により、RHD3の会合体形成を検討した。チューブ伸長条件下(GTP存在下)と伸長を誘発しない条件下(GTP非存在下)で化学架橋剤EGSで処理し、抗RHD3抗体によるイムノブロットによってRHD3の分子量変化を調べたところ、チューブ伸長が起る条件下では大きな複合体が形成されることが明らかになった。RHD3はGTPが存在すると2量体を形成することが推測されていたが、架橋成分の分子量はRHD3ホモ会合体の分子量とは一致しない。このことから他の成分とヘテロな会合体を形成している可能性が示唆され、現在会合体に含まれる成分をMS解析などによって同定を試みている。次にin vitroチューブ形成系を用いてキナーゼやフォスファターゼのチューブ形成に及ぼす効果を検討した。その結果、セリン/スレオニンキナーゼであるA-キナーゼやカゼインキナーゼによりチューブ形成が促進された。それと同時に、RHD3やレティキュロンなどのチューブ形成に関与する成分がリン酸化されていた。

しかし、フォスファターゼ1、カルシニウリン、ラムダフォスファターゼなどのフォスファターゼによる影響は、現時点では確認できなかった。このような結果から、過剰のリン酸化によってチューブ形成が促進される可能性が考えられた。おもしろいことに、RHD3が属しているダイナミンGTPaseの阻害剤であるダイナソーによって、チューブ形成、それに伴うGTP加水分解が阻害された。またこの阻害剤によって、培養細胞内の表層小胞体ネットワークが、大きな袋状に変化することを見出した。これらの結果は、ダイナソーがRHD3の活性も阻害すること。そして細胞内におけるRHD3の機能を解析するツールとして、この阻害剤を用いることが可能であることを明らかにした。