hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓組織におけるストレスホルモン様化学物質評価系の構築

(参考図右段の真ん中)、他の生体イメージングや専用のスライド式発光計測装置の開発にも成功した。(5)これらの一連の研究成果を踏まえ、本技術の普及のために多数の原著論文、レビューや進歩総説を発表した。これらの研究成果は、大局的には、人への生体影響の作用機序の解明、個人の感受性の差に基づく評価、動物個体に苦痛を与えない化学物質評価法の構築などに貢献する。また、波及効果としては、化学物質の安全性評価だけでなく、創薬分野への応用も強く期待できる当該研究計画書で定めた目的として「ストレスホルモンプローブの開発と高輝度化、及び生物発光顕微鏡による時空間的な分解能の向上」を掲げたことから、新たな生物発光酵素を樹立し、ストレスホルモンプローブに適用することによって、プローブの高輝度化・高感度化を図った。そのために、深海発光プランクトン由来の生物発光酵素にポイント変異を導入することにより、従来酵素より10倍程度明るくて、発光安定性の優れた生物発光酵素を樹立できた(Kim et al. Anal. Chem., 2011, 83, 8732-8740)。また、このプランクトン由来の発光酵素を搭載した新規ストレスホルモン可視化プローブを開発した。この新規可視化プローブは、分子内構造を最適化したものであり、以前当該研究者が開発したストレスホルモンプローブに比べて約10倍程度検出感度を向上できた。この高感度性を用いて約15人の健常人の唾液からストレスホルモンを計測することに成功した。この結果をアメリカ化学会(ACS)のBioconjugate Chemistryに報告した(Kim et al. Bioconju. Chem., 2011, 22, 1835-1841)。また、前記ストレスホルモンプローブの分子設計に関する当該研究から得た新しい知見を元に、分子設計手法に関する論文を発表した(Kim, Protein Eng. Design Sel., 2012,印刷中; DOI: 10.1093/ protein/ gzs016)。この一連の研究から、ストレスホルモンを高感度で検出する材料、プローブ設計、手法に関する新たな研究成果を対外に発信できた。ストレスホルモン可視化プローブの性能の高輝度化・高感度化に成功した。また、分子設計を改良することによって検出感度を10倍まで改善した。この可視化プローブを癌細胞に導入し、その発光特性を計測できた。論文の質・数からも当初想定した以上の成果を得ることができた。今までの研究から、極めて高感度のストレスホルモン可視化プローブを開発できたことから、この新規プローブを生体組織へ適用する実験を推進する。具体的には、未分化細胞に生物発光プローブ遺伝子を導入した後、分化誘導後の臓器組織で、プローブの性能(応答性、発光強度等)を評価する。これから臓器組織イメージングを行うことから、基質などの試薬も一段と多く使用するであろうと予測される。研究計画の最終年度であることから、研究成果の発信にも一部の予算を使用する予定である。
細胞生物学を応用した糖尿病再生医療の研究

糖尿病患者数は世界的に著しい増加傾向を示し、腎症や網膜症などの合併症も明らかに増加しているが、重症糖尿病に対する膵臓移植や膵島移植はドナー不足や免疫抑制の副作用などの問題解決が困難な状況が続いている。本研究では、このような問題を解決する新しい治療法への基礎的研究として、免疫抑制を行う事無く同種あるいは異種の膵島移植を可能にするバイオ人工膵、中でも、臨床応用への可能性が高いマクロカプセル化膵島を、ポリビニルアルコール(PVA)を用いた全く新しい方法で作成し、その有用性や作製法の改善などを検討した。また、これを皮下移植で使用するためにフィブリンなどを用いて新しい皮下血管新生誘導法を検討した。さらに、膵島と間葉系幹細胞の細胞融合などの実験により、膵島に代わる新しい細胞資源を探求した。ポリビニルアルコール(PVA)マクロカプセル化膵島は、PVAを溶解した膵島保存液にラット膵島を浮遊させ、これをシート状に成形して、膵島凍結保存用のプログラムフリーザを用いて凍結させ、一夜-80°Cで保存した後再解凍、さらに4°CのUniversity of Wisconsin液中で1日保存して実験に供した。本研究では糖尿病のマウスあるいはラットに対する移植実験を行った。糖尿病マウスに対するマクロカプセル化ラット膵島移植により、重症糖尿病による代謝異常が改善され、延命効果とともに腎機能障害に対する有為の軽快効果を確認した。糖尿病ラットに対する同種同系と同種異系移植の比較を行ったところ、いずれの場合も数週間にわたって高血糖の是正効果が確認されたが、血糖調節効果は両者間で著明な差を認めなかった。この結果から、PVAマクロカプセル化は異種あるいは異種移植免疫に対して良好な免疫隔離機能を有する一方、膵島機能を長期にわたり発揮させるためには、作成方法などに今後の改良が必要と考えられた。バイオ人工膵作成では、ポリビニルアルコール(PVA)マクロカプセル化膵島の作成方法に若干の改良を加えた。3%PVAを溶解した膵島保存液にラット膵島を浮遊させ、これをシート状に成形して、膵島凍結保存用のプログラムフリーザを用いて凍結させ、一夜一80°Cで保存した後再解凍、さらに4°CのUniversity of Wisconsin液中で1日保存して実験に供した。本年度は糖尿病ラットに対する移植実験を行うため、従来作成していたマウス用から若干の大型化をはかり、凍結方法にも改良を加えた。バイオ人工膵のin vivo移植実験では、従来の糖尿病マウスに代えて糖尿病ラットに対する同種移植実験を行った。レシピエントをストレプトゾトシンで糖尿病としたLewisラットを用い、腎皮膜下に分離膵島をそのまま移植した場合、同種異系のWistar系ラット膵島(3匹分、約1,500個)では移植後早期に拒絶されて血糖値が上昇したが、同種同系のLewis系ラットをドナーとした場合には数か月にわたって正常血糖を維持した。同数のWistar系ラット膵島をPVAマクロカプセル化して腹腔内へ移植したところ、数週間にわたって高血糖の是正効果が確認されたが、長期わたる効果は得られなかった。その後、当該バイオ人工膵の移植効果が部分的で長時間維持できない原因として、同種移植免疫隔離効果の不足・移植膵島数の不足・マクロカプセル化操作による避け難い膵島障害などを念頭において、その機序を究明する実験を継続している。膵管上皮分化誘導実験では、膵島分離後に得られる主に膵外分泌組織からなる細胞塊を無血清培地で培養して、幹細胞と考えられる上皮様細胞の初代培養系を作成する実験を続けているが、なお、安定した結果を得るに至っていない。ヒト由来膵島細胞は、特許の権利関係等の調整が必要で、詳細な検討は次年度に持ち越した。

糖尿病治療に応用可能な細胞資源を探求する研究の一環として、通常はin vitroでは増殖しない膵島細胞が未分化細胞との細胞融合によるリプログラミングを通して増殖能を獲得する可能性について検討する目的で、ラットの膵島細胞と間葉系幹細胞との電気的細胞融合の実験を行い、基礎的な細胞融合技術を確立した。今後は、in vitroでの増殖・インスリン分泌動態や、移植時の機能・増殖等の評価を進める。膵島移植に代わるバイオ人工膵の開発研究では、膵島凍結保存液にポリビニルアルコール(PVA)を溶解した溶液に膵島を浮遊させ、これをシート状に成形してメッシュで補強した後、凍結・溶解してゲル状のマクロカプセル化バイオ人工膵シートを作成する方法を研究した。この方法によれば、デバイスの面積や厚さを自由にコントロールすることが可能で、将来の大型化に大きく道を拓くものと考えている。本年は、このバイオ人工膵を用いてラットから重症糖尿病ラットへの同種同系および同種異系膵島移植実験を行って、デバイスの効果と問題点を明らかにすることを試みた。その結果、単純な膵島移植では拒絶されるウイスター系からルイス系への移植であっても、比較的長期の血糖低下が得られることを確認している。一方、ルイス系からルイス系への膵島移植は拒絶されることなく長期にわたり機能するが、この系で膵島をマクロカプセル化した場合は、異系の場合と類似した経過で機能が廃絶することが示された。今後は、カプセル化膵島のより長期の機能維持を目指して、カプセル化法の改善を課題として取り組んでいる。また、バイオ人工膵の皮下移植や、閉塞性動脈硬化症など虚血性疾患の治療に応用するための血管新生誘導の基礎的研究では、昨年度に引き続き、ラット背部の虚血皮弁モデルを用いて、皮弁皮下へのフィブリン塗布が虚血性皮弁の血流を改善し、壊死を抑制することを報告した。
歯胚形成期の上皮－間葉相互作用における基底膜分子の新たな役割

上皮ー間葉相互作用は、歯、毛、唾液腺、肺及びおよび腎臓など、様々な器官において共通しておこる現象として知られており、上皮細胞が間葉細胞に陥入することで開始される。それぞれの細胞は、足場因子として、上皮細胞と間葉細胞の間に介在する基底膜を介して細胞間シグナルの受け渡しを行っている可能性が考えられる。本研究では、歯の発生期に強く発現する基底膜分子Nephronectin (Npnt)に着目し、研究を開始した。Npntはその分子構造としてEGF like repert領域とインテグリン結合配列であるRGD領域を持つことがわかっている。本年度は、RGD領域の機能解析を主に行った。Npntを培養皿にコーティングし、RGDペプチドを添加後、歯原性上皮細胞株M3H1を播種したところ、RGDペプチド濃度依存的に細胞接着能が低下した。以上の結果からNpntの細胞接着活性部位はRGD領域であることが示唆された。そこで、RGD領域が歯原性上皮細胞の分化に与える影響を解析するため、M3H1に全長NpntおよびRGD領域を欠損させたNpnt-ΔRGDの遺伝子導入を行った。エナメル芽細胞の分化マーカーであるAmeloblastin (Ambn)の発現を確認したところ、全長Npnt遺伝子導入群ではAmbnの上昇を認めたが、Npnt-ΔRGD遺伝子導入群では変化が認められなかった。これらの結果からNpntのRGD領域はエナメル芽細胞分化に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。上皮ー間葉相互作用は様々な器官の発生において重要な役割を担っており、それぞれの細胞の足場因子として、上皮と間葉細胞の間に介在する基底膜分子が細胞間シグナルの制御を行っている可能性が考えられる。本研究では、歯の発生時期に強く発現するNephronectin (Npnt)に着目し、研究を開始した。本年度は、Npntの発現パターンと歯原性上皮幹細胞に与える影響の解析を行った。まず、胎生期マウスの様々な臓器よりmRNAを抽出し、Npntの発現を比較検討したところ、Npntは歯、肺および腎臓に強く発現し、上皮ー間葉相互作用により形成される臓器に強い発現を認めることが判明した。歯の発生時期における発現パターンの検討により、Npntは歯原性上皮幹細胞マーカーであるSox2と対照的な発現パターンを示し、Npntが発現するとSox2の発現が抑制される可能性が示唆された。これは、Npntが細胞外マトリックス因子として、歯原性上皮幹細胞の分化制御を担っている可能性が考えられる。そこで、Npntリコンビナントタンパクを培養皿にコーティングし、歯原性上皮幹細胞株を播種したところ、Sox2の発現抑制と細胞増殖の上昇が認められた。Npntはその分子構造としてEGF like repeat領域とインテグリン結合配列であるRGD領域をもつ。そこで、どちらの構造がSox2の発現制御に重要であるか、確認するために、それぞれの領域を欠損させた発現ベクターを作製し、検討を行った。その結果、EGF like repeat領域を欠損させると、NpntのSox2発現抑制能が低下することがわかった。初年度の予定であった、Npntの細胞増殖に与える影響の検討は終了し、現在は機能領域の解析を行っている。上皮ー間葉相互作用は、歯、唾液腺、肺、腎臓、および毛など様々な器官の発生において重要な役割を担っている。それぞれの細胞は、足場因子として、上皮と間葉細胞の間に介在する基底膜分子が細胞間シグナルの受け渡しに重要な役割を担っている可能性が考えられる。本研究では、歯の発生時期に強く発現するネフロネクチンに着目し研究を開始した。ネフロネクチンはその分子構造としてEGF like repeat領域とインテグリン結合配列であるRGD領域を持つ。昨年度発見した、歯原性上皮幹細胞の幹細胞マーカーであるSox2発現を制御すると考えられる、ネフロネクチンのEGF like repeat領域の詳細な解析を行った。まず、EGF like repeat領域を欠失させた発現ベクターを作製し、解析を行った。ネフロネクチン全長発現ベクターを遺伝子導入し、Sox2陽性細胞数を計測したところ、Sox2陽性細胞の減少と細胞増殖の上昇が認められた。そこで、EGF領域欠失発現ベクターを遺伝子導入すると、Sox2陽性細胞数の減少は認められなかった。以上から、EGF like repeat領域がSox2発現に重要な役割を担っている可能性が考えられた。さらに、EGF like repeat領域はEGFRに結合することが知られている。そこで、Egfr siRNAを遺伝子導入することでEgfrを抑制し、Sox2発現を確認したところ、ネフロネクチン全長発現ベクターによるSox2陽性細胞数の減少は認められなかった。以上の結果からネフロネクチンのEGF like repeat領域は歯原性上皮細胞に発現するEGFRを介してSox2の発現制御を行っている可能性が考えられた。本年度の予定であった、ネフロネクチンの機能領域としてEGF like repeat領域を同定に成功したため、概ね順調に進展していると考えられる。

Npntはその分子構造としてEGF like repert領域とインテグリン結合配列であるRGD領域を持つことがわかっている。本年度は、RGD領域の機能解析を主に行った。Npntを培養皿にコーティングし、RGDペプチドを添加後、歯原性上皮細胞株M3H1を播種したところ、RGDペプチド濃度依存的に細胞接着能が低下した。以上の結果からNpntの細胞接着活性部位はRGD領域であることが示唆された。そこで、RGD領域が歯原性上皮細胞の分化に与える影響を解析するため、M3H1に全長NpntおよびRGD領域を欠損させたNpnt-ΔRGDの遺伝子導入を行った。エナメル芽細胞の分化マーカーであるAmeloblastin (Ambn)の発現を確認したところ、全長Npnt遺伝子導入群ではAmbnの上昇を認めたが、Npnt-ΔRGD遺伝子導入群では変化が認められなかった。これらの結果からNpntのRGD領域はエナメル芽細胞分化に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。NpntのSox2制御における機能領域を同定し、歯原性上皮幹細胞分化制御因子としての可能性を探る。今後は、EGFRを介したSox2発現制御のメカニズムの解明を行う。Npntの機能解明が効率的の行えたため、当初予定より、分子生物学実験用試薬の消耗品費を節約して使うことができた。ネフロネクチンの機能領域の同定が当初計画していたより、短期間に同定することができた。そのため、分子生物学実験用試薬の消耗品費を節約して使うことができた。次年度は機能領域の歯原性上皮細胞における役割を詳細に解析するため、機能領域をより細かく細分化し、発現ベクター作製を行う予定である。次年度にマイクロアレイ法による網羅的な解析を予定しているため、検討するサンプル数を増やし、より詳細に解析する予定である。
大学生のスティグマ体験への対処に関する臨床心理学的研究

他者からの拒絶体験をもつ学生の対処過程とアイデンティティとの関連を、大学生活における体験と心理検査を指標に縦断的に検討することが研究の目的である。平成10年7,12月大学生278名(男184名・女94名,平均18.6歳)に質問紙を施行、内52名の1年生(男女各26名)に対して半構造化面接、Rorschach Testと箱庭制作を行った。結果は以下の通り;1.拒絶体験ありとした学生は120名(男52名・女68名)であり、女性が有意に多く「あり」と回答した(p<.05)。その内容は、(1)揶揄されるラベル(優等生・いい子など)の押しつけ、(2)仲間・友人グループからの排除、(3)権力をもつ者(教師や部活の先輩)による不合理な扱い、(4)個性や存在の否定(行動が変だ・周囲の人と考え方が違う)に分類され、これらをふまえて男女差について検討した。2.内容自体は必ずしもネガティヴとは言えない(1)を拒絶と位置づけ、葛藤を引き起こすに至る自我異和的なプロセスとして;a.「優等生」等のラベルが結果として集団からの排除を導くために、拒絶されて嫌だったと感じられる場合、b.自分の中で生起した「本当の姿はそんなではないのに」という気持ちが自我異和的に体験される場合、について面接による情報をもとに考察を加えた。3.対人関係尺度の第I因子「同調強迫」、II「内面の隠蔽」、III「他者への配慮」のうち第II因子について、拒絶された体験をもつ学生の方が「内面の隠蔽」が高い傾向にあった(p<.10)。拒絶をされたことがあるという自己認知が、他者との深い関わりを恐れる傾向へと結びつくことを示唆する結果である。また拒絶された体験をもつ学生の自尊感情得点は、なし群に比べて有意に低く、スティグマを負う人の自尊感情は低くないという先行研究のレヴューとは異なる結果となった点について、大学生の特質に照らして検討した。今後、心理検査データと対処過程との関連の分析と、52名についてのフォローアップ調査を行う。
未来を生きる女子の生命観と自己決定力を育む生命科学教育研究～私立学校を事例として

昨年度中に行った現代の日本の女子学生の特徴やそこに見られる課題に関する実態把握のためのアンケート調査についてデータをとりまとめ、日本理科教育学会全国大会にて発表した(北村・大貫, 2018)。また、理論的背景を整理する目的で行ってきた国内外の生命科学教育に関する訪問調査や文献調査についての取りまとめを進めており、一部は2018 International Conference of East-Asian Association for Science Educationなどでの口頭発表(Miyake and Ohnuki, 2018など)や、論文(加藤, 2019)として取りまとめてきた。また、学童期以降の各発達段階にある市民のヘルスリテラシー(主担当:西垣)等についての調査や人間学的見地からの文献研究(主担当:走井)等を進めてきており、次年度の日本理科教育学会全国大会においても引き続き発表を予定している。昨年度中の研究協議をふまえてコア・プログラムとして立案した死に際する自己決定に関するグループ・ディスカッションについて白百合女子大学にて事例研究を行い、日本カトリック教育学会での学会発表を行った(大貫, 2018)。また、他の2つの私立女子大学においても実践を進めている。さらに、人体構造に関する科学的理解を目的とした教材としての模型の特性等についての調査を進めてきている。「心臓のつくり」に関する学びの構築についての実践的研究を日本理科教育学会にて口頭発表した(加藤・大貫, 2018)。また、「投げる」能力を育むための教科横断的学びを支える教材等について論文発表を行った(石沢・大貫・椎橋・宮下, 2019)。当初の研究計画に従って、昨年度中に検討を進めた「コア・カリキュラム」を基に作成した「実践プログラム」について、複数の私立女子大学にて実践的研究を進めつつある。研究分担者に異動等があり、実践や成果発表が当初の予定通りに行われていない部分があるが、次年度中にそれらの取りまとめと成果発表を進めることで、当初の研究計画に沿うようにすることは可能であると考えられる。今年度までに行われており、まだ成果発表ができていないヘルス・リテラシーや人間学的見地からみたコア・プログラムの位置づけについて、日本科学教育学会年会及び日本理科教育学会全国大会等にて共同発表することを予定している。また、昨年度に実施を始めている「実践プログラム」について、今年度も各大学において実践的研究を行い、検証を進めていくこととする。まず、現代の日本の女子大学生の特徴や、そこに見られる課題についての実態把握を試みるために、アンケート調査等を行った。調査内容は学生のもつ科学観に関することや、生命科学に関する諸課題についての学んだ時期や場についてである。現在、調査結果の分析を進めており、2018年度夏にある日本理科教育学会全国大会にて発表する予定である。さらに、得られた知見をふまえた研究協議を行い、コア・プログラムの検討を進め、各大学の建学の精神や授業の位置づけ等に呼応した実行可能な実践プログラムの開発を進めている。一部の実践プログラムについては試行にも着手し、成果や課題を分析している。得られた知見や研究成果、今後の展望等についての学会発表等も進めており、本年度内には学会発表2件、論文発表2件を行った。当初の計画どおり、国内外における生命科学教育に関する調査を行い理論的背景の整理を進め、「コア・カリキュラム」の検討に着手している。また、その「コア・カリキュラム」を基にしながら、各大学の建学の精神や授業の位置づけ等に呼応し、実行可能な「実践プログラム」の開発も並行して進められている。次年度中に複数の「実践プログラム」の実践的研究を進められる状況にあると考えられる。

昨年度中に行った国内外での調査成果をとりまとめ、理論的背景の整理を行うとともに、検討してきたコア・プログラムについて、扱う生命科学の諸課題に関する専門家による助言を得ながら、具体的な教材開発、授業展開の構想等を進めていく。また、そのコア・プログラムに基づきながら、調査対象者が所属する大学の建学の精神や授業の位置づけ等に呼応する形での改変を行った「実施プログラム」について、実践を進める。その実践事例の分析から、実施プログラムの有効性を検証する。加えて、複数クラスや複数大学での実施を試み、再現性の確認や改変による成果の差異等も検討する予定である。これらの研究成果等については、順次、学会発表等を進めていく。また、こうした研究成果をふまえ、再度「コア・カリキュラム」や「実施プログラム」の検討を行い、次年度以降の調査に備えていく。今年度までに行われており、まだ成果発表ができていないヘルス・リテラシーや人間学的見地からみたコア・プログラムの位置づけについて、日本科学教育学会年会及び日本理科教育学会全国大会等にて共同発表することを予定している。また、昨年度に実施を始めている「実践プログラム」について、今年度も各大学において実践的研究を行い、検証を進めていくこととする。
遺伝子増幅法を利用した抗がん剤スクリーニング法の開発

DNAと結合する化合物は、遺伝子の増幅ないしは発現に関わり、がんなどの遺伝病のシーズになりうる事が知られている.化合物とDNAとの結合性を正確に評価する事は、創薬において、重要な要素である.本研究では、リアルタイムPCRを用いたプライマーダイマーを鋳型とする化合物のDNA相互作用性を評価するためのシステムを構築した.本システムは、DNA相互作用分子を含むPCR溶液中でも、非意図的PCR産物の増幅が見られず、DNA結合性を正確かつ高感度に評価できる事がわかった.また、本システムを金ナノ粒子の呈色反応を加えることで、DNA相互作用分子性を色で判断する事が可能となった.DNAと結合する化合物は、遺伝子の増幅ないしは発現に関わり、がんなどの遺伝病のシーズになりうる事が知られている.化合物とDNAとの結合性を正確に評価する事は、創薬において、重要な要素である.本研究では、リアルタイムPCRを用いたプライマーダイマーを鋳型とする化合物のDNA相互作用性を評価するためのシステムを構築した.本システムは、DNA相互作用分子を含むPCR溶液中でも、非意図的PCR産物の増幅が見られず、DNA結合性を正確かつ高感度に評価できる事がわかった.また、本システムを金ナノ粒子の呈色反応を加えることで、DNA相互作用分子性を色で判断する事が可能となった.創薬の分野において、コンビナトリアルケミストリーにより得られた化合物の中から、有用な薬剤候補を迅速かつ簡便にスクリーニングする事は重要である。特に、DNAなどの生体分子と結合する化合物は、人体の機能を制御しうるため、抗がん剤を開発する際の重要なバイオマーカーとなっている。本研究では、遺伝子増幅法を利用した新たな抗がん剤候補をスクリーニングするための技術を開発する事を目的とする。抗がん剤の多くは、2本鎖DNAの間に入り込み、2本鎖DNAの安定性に寄与する。そのため、分析対象物をPCR溶液に加えて遺伝子増幅をおこなえば、分析対象物にDNA結合性がある場合、遺伝子増幅の効率が下がる。結果として、目的遺伝子の増幅効率から分析対象物のDNA結合性を評価できる。本年度は、DNA結合分子のモデル薬物としてDAPI、アドリアマイシン、ダウノルビシンを用いて本手法の妥当性を検討した。適用したすべての薬剤においてマイクロオーダー単位で目的遺伝子の増幅阻害が見られ、原理の妥当性を立証できた。また、鋳型DNAのTm付近に変性温度を設定することで、微量な濃度においてもDNA結合性を評価できることがわかった。具体的には、10nMのDAPIを含む溶液とコントロール溶液の遺伝子増幅効率において、顕著な差が見られた。また、従来の融解曲線を利用したDNA結合性分子を評価するための手法では、100nMのDAPIを必要とすることを考慮に入れると、本手法は新たなDNA相互作用分子を検出するための有力な手法になるうることがわかった。本研究の目的は、遺伝子増幅法を利用した新たな抗がん剤候補をスクリーニングするための技術を開発することである。以下の3点の知見が得られた。1.フォーワードプライマーとリバースプライマーから調製したプライマーダイマーを鋳型とすることで、非意図的なPCR産物の増幅を助長することなく、目的PCR産物で化合物のDNA相互作用性の有無を判断できることが分かった。この結果は、蛍光指示薬であるSYBRGreen 1を用いたリアルタイムPCR装置での化合物のDNA相互作用性の有無を正確に分析する可能することを示唆する。2.プライマーダイマーを鋳型に用いて、4種類の化合物(DAPI、ダウノルビシン、アクチノマイシン、塩酸ベラパミル)のDNAへの相対結合力の相対評価をおこなった。一般に結合力が高いとされる化合物ほど、鋳型DNAと相互作用し、鋳型DNAの解離を抑制して遺伝子増幅効率を悪化させた。また、化合物を含んだPCR産物をマイクロチップ電気泳動装置で確認したところ、非意図的PCR産物が増幅されていないことがわかった。3.高感度分析を行うために、PCR条件の変性温度条件の検討をおこなった。鋳型DNAの融解温度付近にすることで、化合物のDNA相互作用性の有無を高感度に測定できることが分かった。また、変性温度を鋳型DNAの変性温度よりも低い温度に設定した場合、遺伝子の増幅が見られないことが分かった。DNA相互作用分子のモデルとしてDAPIを使用したところ、50nMでも遺伝子の増幅効率阻害が見られた。現在、知られているあらゆるDNA相互作用分子検出方法よりも高感度に検出できることがわかった。化合物のDNA結合性を正確に評価する事は、がんなどの遺伝病の創薬化合物のシーズの探索を行なううえで重要である.研究代表者は、微小なDNA結合性を有する化合物ないしは可逆的に結合する化合物を高感度かつ正確にスクリーニングするための方法論の開発を目的として実験をおこなってきた.本年度は、特に(1)金ナノ粒子を用いたDNA結合分子の可視化評価法の構築(申請書記載事項)と、(2)昨年度に偶然に発見した、2種類のプライマーから作製したプライマーダイマー(PDs)を鋳型としたDNA結合分子の評価システム(申請書記載事項外)の汎用性の検討を行なった.(1)金ナノ粒子を利用したDNA結合分子評価システムでは、DNA結合分子のDAPIを利用して、呈色によりDNA結合分子を評価できるか確認した.DAPIの濃度に依存して、塩による金ナノ粒子の凝集が抑制され、溶液の変化がおこらなかった.

これは、DNA結合分子がDNA増幅を阻害したため、残存したプライマーが金ナノ粒子の表面に吸着し、塩による金ナノ粒子の凝集を抑制したためである.以上により、金ナノ粒子と遺伝子増幅法を利用した評価方法は、DNA結合分子の呈色評価法として有用である事が示唆された.(2)昨年度偶然に発見したPDsによるDNA結合分子評価システムの汎用性を立証するために、様々なプライマーを購入しPDsの構築を試みたが、すべて失敗に終わった.原因を探るために、プライマー受託会社の変更(2社)、PCR装置の変更(3社)、dNTPs製造会社の変更(4社)を行なったが、PDsを調製できなかった.さらに、ゲノムDNAを鋳型とした通常の遺伝子増幅を試みたが、PDsと同様に目的遺伝子の増幅が確認できなかった.結果的に1年間、遺伝子増幅関連の実験を行なう事が出来ずに、本研究の新規性の汎用性の確認までには至らなかった.
金属考古遺物の高速脱塩・安定化処理システムの開発

私達は金属遺物に浸入した塩類を除去するための新しい方法を提案した。この方法は腐蝕抑制剤を添加した高温高圧状態の脱酸素水を使って金属遺物を洗浄する方法である。この方法は従来と比較して処理期間の大幅な短縮を可能にする。しかも、廃液処理や金属に残存する薬品の除去を必要としない。さらに、この方法は多種の金属遺物に対して洗浄が可能である。また、この方法を使って実際の遺物から溶出した可溶性の塩類を定量的に測定した。その結果、遺物から溶けだした可溶性の塩化物イオンと硫化物イオンに大きな差があることが判明した。新たに開発した脱塩システムの特徴は以下のように要約することができる。1.高温高圧の脱酸素水が、表面張力や粘度の低下によって錆の微細な隙間まで到達し、遺物の内部に分布する可溶性の塩類を溶出させる。2.高温水を使用するために、樹脂処置した遺物もそのままで脱塩処理が可能であり、以前に処理せずに樹脂含浸した遺物の再処理にも有効である。3.洗浄時間が従来よりも大幅に短縮できる。そのために保存処理全体の期間が短縮できる。4.BTAなどの腐食抑制剤は乾燥後も錆の安定化剤として働くことが期待される。5.BTAは比較的安全な腐蝕抑制剤(LD50=560mg)であり銅・銀・鉄などに対して防錆効果がある。金属遺物中に残存する可溶性塩類の除去について、最も効果のある方法を比較検討しながら、新しい脱塩処理システムを構築する事を目的として研究を開始した。先ず、脱塩処理の既存システムを改良して脱塩処理を実施した。また、脱塩効果の評価に必要な塩類の測定方法として、イオンクロマトグラフ、蛍光X線分析装置による方法を検討し、イオンクロマトグラフ法による分析手段を確立した。金属の溶液中における腐蝕は、金属原子のイオン化反応速度と酸素などの溶液中の物質の還元反応速度(カソード反応)との組み合わせとして理解できるので、主にカソード反応を抑制することを目的として、脱酸素状態の高温水や腐食抑制剤を用いて錆を抑制し、効率的に金属遺物に含まれる可溶性の塩類を除去する方法を開発した。本年度は以下の事項について具体的に検討した。1、可溶性塩類の除去に最も効果のある方法について検討した。その結果、従来の方法と比較して脱酸素水を溶媒とした高温高圧水による方法が最も効果的であるとの結果を得た。2、最も簡単で効果のある脱塩処理システムを構築した。その結果、準備段階で購入した医療用の高温高圧処理システムを改良して新システムを構築した。3、腐食抑制剤を用いた錆の安定化処理の方法について検討した。その結果、ベンゾトリアゾールとホウ砂からなる混合インヒビターを開発した。なお、今後は遺物の埋蔵環境と脱塩効果に注目して、各種条件の異なる遺物に対して脱塩処理を実施する予定である。金属遺物中に残存する可溶性塩類の除去について、新しい脱塩処理システムを構築しながら、実際の金属遺物の脱塩処理を実施した。脱塩処理の評価方法として、イオンクロマトグラフを用いて金属遺物から溶出した可溶性塩類を定量化する方法を確立した。また、蛍光X線分析装置による実際の遺物の元素マッピングによって金属遺物に侵入した塩類の分布を測定した。金属の溶液中における腐蝕は、金属原子のイオン化反応速度と酸素などの溶液中の物質の還元反応速度(カソード反応)との組み合わせとして理解できるので、主にカソード反応を抑制することを目的として、脱酸素状態の高温水や腐食抑制剤を用いて錆を抑制し、効率的に金属遺物に含まれる可溶性の塩類を除去する方法を開発し、多くの出土遺物に適用し実用化を進めた。多くの遺物にこの脱塩方法を適用した結果、遺物の埋蔵環境の違いと遺物の崩壊に関する多くの知見を得た。また、これまで注目されていた塩化物以外にも硫化物が遺物に与える影響についても検討した。その結果、これまでに開発した脱塩方法が硫化物の除去に最も効果のあることが判明した。
アトピー性皮膚炎における知覚神経線維の基底膜侵入メカニズムの解明と治療への応用

本研究(1)では、基底膜成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)に着眼し、神経線維の基底膜侵入メカニズムの解明を目指した。我々が考案したユニークなボイデンチャンバーを用いた後根神経節(DRG)細胞培養系により、NGF誘導性膜結合型MMP-2が微小ドリルとして機能することで基底膜を局所的に分解し、ADにおける神経線維の基底膜侵入を可能にすることが示唆された。本研究(2)では、上述したDRG細胞培養系により、間質コラーゲンを分解するMMPsに着眼し、知覚神経線維の真皮内伸長・増生機序の解明を目指した。その結果、MMP-8が神経線維から分泌され、真皮の主要マトリックス成分であるコラーゲン分子を分解し、ADにおける真皮内神経線維の増生に関与することが示唆された。アトピー性皮膚炎(AD)の痒みは、一般に抗ヒスタミン薬に抵抗性を示す。この原因の1つに、表皮内へ侵入した知覚神経線維が外部刺激によって直接活性化され、痒みが生じることが推定される。しかし、神経線維が表皮内へ侵入するためには、表皮-真皮境界部に位置する基底膜を何らかの方法で通過する必要がある。本研究では細胞外マトリックス(特に基底膜成分)を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)に注目し、神経線維の基底膜侵入におけるMMPsの関与について検討を行った。我々が考案したユニークなボイデンチャンバーを用いた後根神経節(DRG)細胞培養系により、NGFがDRG細胞に作用することでMMP-2遺伝子の発現が誘導されること、MMP-2蛋白及びその活性が神経線維の成長円錐の細胞膜上に局在することが明らかとなった。一方、神経伸長作用を発揮し、AD皮膚で発現増加するamphiregulinは、DRG神経線維の基底膜侵入を誘導しなかった。これは、amphiregulinのNGFとは異なる神経伸長メカニズムの存在を示唆していた。以上の結果から、本年度の成果として、NGF誘導性膜結合型MMP-2が微小ドリルとして機能することで基底膜を局所的に分解し、ADにおける神経線維の基底膜侵入を可能にすることが明らかとなった。本研究成果は、表皮内神経線維が関与する難治性痒みの分子メカニズムの一端を明らかにし、新たな難治性痒みの治療法開発に向け、大変意義がある。この原因の1つに、表皮内神経線維の増生による痒み閾値の低下が推定される。しかし、神経線維が表皮内へ侵入するためには、表皮-真皮境界部に位置する基底膜を通過する必要がある。本研究では、基底膜成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)に着眼し、神経線維の基底膜侵入メカニズムの解明を目指した。さらに、proMMP-2の活性化には、MT5-MMP、TIMP-2が関与することが示唆された。また、MMP-2発現は、Sema3AおよびMMP-2自身のECM基質成分によって変調した。このような複雑な制御下で、NGF誘導性膜結合型MMP-2が微小ドリルとして機能することで基底膜を局所的に分解し、ADにおける神経線維の基底膜侵入を可能にすることが示唆された。本年度は、アトピー性皮膚炎における真皮内神経線維の増生機序の解明を目指した。アトピー性皮膚炎では、NGFの作用による真皮内知覚神経線維の増生が報告されている。真皮で神経線維が伸長し、増生するためには、主にI型、III型コラーゲンで構成されている真皮細胞外マトリックスを分解する必要がある。本研究ではボイデンチヤンバーを用いたユニークな後根神経節(DRG)細胞培養系により、細胞外マトリックス(特に、間質コラーゲン)を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)に着眼し、知覚神経線維の真皮内伸長・増生機序の解明を目指した。その結果、NGFはDRG細胞での分泌型MMP-8の発現を増加させ、I型コラーゲンゲル内への神経線維の侵入を可能にすることが示唆された。さらに、DRG細胞培養系にNGFと共に神経反発因子であるSemaphorin 3A(Sema3A)を添加すると、NGF誘導性MMP-8の発現が抑制された。

また、MMP-8の発現はそれ自身の細胞外マトリックス(ECM)基質成分で亢進した。このような複雑な制御下で、NGF誘導性MMP-8が神経線維から分泌され、真皮の主要マトリックス成分であるコラーゲン分子を分解することで、アトピー性皮膚炎における真皮内神経線維の増生に関与することが示唆された。
イスラ-ム都市解析作業

過去3年間の総括として本年度はまとめの作業を行った。大きく三つの成果に分けられる。第一はイスラ-ム圏の都市図に関する資料の収集と都市図リストの作成である。1190葉約300都市の地図についてその属性が記録された。これら対象とした都市図の年代、制作年、用語、版形、所有者等がデ-タ・ベ-スとして整理された。パ-ソナルコンピュ-タ-をハ-ドウェア-とし、市販のソフトウェア-により収録している。フロッピ-・ディスクをコピ-することにより公開を想定している。第二は都市図そのものの収録を行った。今回は彩色の有無にかかわらずすべてモノクロ-ムで記録している。ベクタ-スキャナ-を用いてデ-タ-化、市販の図形情報処理ソフトウェア-を利用して、光ディスクに保管している。図形情報の処理として、不要な文字等の除去が行え他用語の変更も容易である。同時に数値処理も行える。第三はマルチメディアシステムと読んでいる。地図、文字、映像をひとつのデ-タファイルにまとめたもので、ひとつの表示された情報から複数の情報へアクセスすることができる。例えば、地図の上にスライドを撮影した地点をプロットして、それぞれの都市景観のスライドを呼出し、さらにそのスライドから関連した情報を取り出すネットワ-クが構成される。文字情報は画像情報として読みとっている。モロッコのフェズ、エジプトのカイロについて実際に現地で撮影された200枚のスライドを用いて作成した。今年度は以上の資料収集整理の他、他の研究グル-プとの共同作業を行い、これまでに蓄積した情報処理の手法の実用化を試みた。地図と手書きのフィ-ルドスケッチとの比較、面積測定による人口密度の街区ごとの推計など細目にわたる検討が容易になった。
管内強制流動沸騰限界熱流束に対する流路形状及び圧力の効果の系統的研究

平成元年度は、円管流路で半周のみ加熱の試験部及び高転換軽水炉の稠密格子炉心を模擬した異形流路の試験部を用いて実験を行った。半周加熱円管流路の実験では、円管(全周加熱)と異り、限界熱流束はややクォリティが低いところで起こった。これは加熱面がドライアウトした状態でも、非加熱面には液膜が残っているためと推測された。この考えに基づいて冷壁効果を考慮し限界クォリティを算出し、これと実験デ-タとを比較したところ、ほぼ両者は一致することが分かった。しかし、微少流量あるいは高流量においては一致は悪くなる。その原因は微少流量ではフラッディングによる限界熱流束に、高流量ではドライアウトより、むしろDNB型の限界熱流束に近づくためと考えられる。これらの結果は従来のデ-タと矛盾しない。異形流路の試験部は、ヒ-タと絶縁体とをセラミックボンドで接合していたが、この接合状態が悪く、漏水があったため、十分なデ-タは得られなかった。現在、この試験部は補修しており、これと並行して新たに設計改良した試験部を製作した。実験計画が大幅に遅れたために、長方形流路及び円環状流路は今後引き続き実施する予定である。また、フロンを用いた実験は、フロンと水との切り換えの際のフロンと水の混合物の処分の問題があり、水による一連の実験が終了後に実施することにした。これらの実験に並行して、二相流モデルによるドライアウトの予想の作業も進めた。昨年度一応まとまったドライアウト・モデルができたが今年度はよりモデルの精度を向上させるため、二流体モデルを用いた計算コ-ドを使用し、これに適当なエントレインメント-デポジションの相関式を組み込んで、ドライアウトの予測を試みた。しかし、現時点では細部にわたって実験デ-タに一致する結果は得られていない。昭和62年度はフロンー113を作動流体とする実験ループを製作した.ループは循環ポンプ,流量計,予熱器,試験部,凝縮器及びそれらを継ぐ配管,弁類より構成され,これに凝縮器二次側の冷却水を供給する冷水供給装置,フロン貯蔵タンク等が接続される.試験部は,円管,二重管,稠密格子炉心流路を模擬した異形管, 3本バンドル流路,半周加熱円管の5種類である.今年度はこのループについては機器の製作,据付,試験運転を行った.フロンー113実験に先立ち,今年度は,垂直円管内大気圧水の限界熱流束の実験も並行して行った.これより,大気圧水の限界熱流束に対する流量,入口温度および加熱部入口弁の絞りの効果が明らかになった.加熱部入口弁の効果については,絞りが十分大きければ(本実験では上流側圧力1.5気圧以上)流れは安定になり限界熱流来は絞りの影響を受けないことを確認した.しかし,本実験における有効発熱長と加熱等価直径との比の値が小さいために,限界熱流束は従束の相関式による値よりも低くなった.つぎに,大気圧水の限界熱流束の発生メカニズムを調べるために,二相流モデルを用いて限界熱流束を予測し,実験結果と比較した.低流量,高クオリティ域では液滴発生と付着および蒸発による液膜消滅モデルは実験結果とほぼ一致するものの,流量が増すにつれ,また,有効発熱長が短かい場合にも一致は悪くなる.その場合には,液膜破断あるいは剥離によりドライアウトが起こるものと推察される.今後,同様の実験を,水およびフロンー113を作動流体として,種々の流路形状を用いて実施し,併せて理論モデルによる解析を行い,限界熱流束に対する流路形状および圧力の効果を系統的に調べる予定である.昭和62年度に実験ループの製作が遅れたために、昭和63年度に調整運転がずれ込み、実験予定は大幅に遅れている。しかしながら、当初予定していた試験部の製作は終了した。フロン-113を作動流体とする実験に先立ち実施する大気圧水の実験のうち、円管試験部ま実験は一応終了した。現在、稠密格子炉心流路を模擬した異形流路の限界熱流束実験に取りかかっている。これと並行して、円管内大気圧水の実験結果の解析を行った。従来の高圧水、高クオリティ域の限界熱流束のモデルは、沸騰環状二相流の液膜の蒸発と液膜からの液滴エントレインメント及び液膜への液滴デポジションによる液膜消滅モデルが一般的であり、実験結果とも良く一致することが報告されている。しかしながら、このモデルによれば、大気圧水の場合、流路発熱長対直径比(L/D)が小さいとき、あるいは貭量速度の大きいときには実験結果をうまく再現できないことが分かった。貭量速度が大きいときには液膜ドライアウトよりも、むしろDNB型の限界熱流束への移行が考えられる。流速が小さくかつL/Dが小さいときには、液膜内の沸騰の影響が考えられ、その効果を考慮した新しいモデルにより解析して結果、実験結果と良く一致する結果が得られた。これは、大気圧近傍では高圧水に比べて水と蒸気の密度比が大きく、そのために液膜内沸騰の影響が大きいことを示している。今後は、円管以外の試験部を用いた実験によりデータを蓄積し、また作動流体にフロン-113を用いた実験を行い、これと水を作動流体とする実験結果とを比較することにより、限界熱流束に対する流路形状及び圧力の効果を系統的に究明していく予定である。

平成元年度は、円管流路で半周のみ加熱の試験部及び高転換軽水炉の稠密格子炉心を模擬した異形流路の試験部を用いて実験を行った。半周加熱円管流路の実験では、円管(全周加熱)と異り、限界熱流束はややクォリティが低いところで起こった。これは加熱面がドライアウトした状態でも、非加熱面には液膜が残っているためと推測された。この考えに基づいて冷壁効果を考慮し限界クォリティを算出し、これと実験デ-タとを比較したところ、ほぼ両者は一致することが分かった。しかし、微少流量あるいは高流量においては一致は悪くなる。その原因は微少流量ではフラッディングによる限界熱流束に、高流量ではドライアウトより、むしろDNB型の限界熱流束に近づくためと考えられる。これらの結果は従来のデ-タと矛盾しない。異形流路の試験部は、ヒ-タと絶縁体とをセラミックボンドで接合していたが、この接合状態が悪く、漏水があったため、十分なデ-タは得られなかった。現在、この試験部は補修しており、これと並行して新たに設計改良した試験部を製作した。実験計画が大幅に遅れたために、長方形流路及び円環状流路は今後引き続き実施する予定である。また、フロンを用いた実験は、フロンと水との切り換えの際のフロンと水の混合物の処分の問題があり、水による一連の実験が終了後に実施することにした。これらの実験に並行して、二相流モデルによるドライアウトの予想の作業も進めた。昨年度一応まとまったドライアウト・モデルができたが今年度はよりモデルの精度を向上させるため、二流体モデルを用いた計算コ-ドを使用し、これに適当なエントレインメント-デポジションの相関式を組み込んで、ドライアウトの予測を試みた。しかし、現時点では細部にわたって実験デ-タに一致する結果は得られていない。
ナス科植物に特異的な病害抵抗性誘導ペプチドSAR8.2の機能解析

本研究では、ナス科のモデル植物であるベンサミアナを用いて、ジャガイモ疫病菌抵抗性に関与する植物の抵抗性機構に関与する遺伝子群の探索を行った。その結果、これまでに機能解析例のないナス科特異的な低分子量の分泌タンパク質SAR8.2mが抵抗性に必須であることが示された。SAR8.2mサイレンシング株にジャガイモ疫病菌を接種すると、病原菌の感染が植物体全身に蔓延してしまう極めて重篤な病徴が認められる一方で、他の病原菌に対する抵抗性に影響は認められなかった。解析の結果、SAR8.2には植物の抵抗性を誘導する活性があること、ジャガイモ疫病菌感染時に病原菌の感染行動を抑制する活性があることが示唆された。ジャガイモ疫病菌は、世界4大作物の1つであるジャガイモの難防除病原菌である。これまでにジャガイモ野生種由来の抵抗性遺伝子が単離され、疫病菌のエフェクター認識に関わるレセプターをコードすることが報告されている。しかし、抵抗性遺伝子は、対応するエフェクター遺伝子を失った菌株の出現により効力を失うことから、持続的な疫病菌抵抗性ジャガイモ品種の作出には利用できない。タバコ野生種であるベンサミアナの成熟個体は全ての疫病菌レースに抵抗性であり、その解析により恒久的なジャガイモ疫病菌抵抗性機構が明らかに出来ると考えられた。TRVを介したベンサミアナのランダムな遺伝子をサイレンシングした株群を作出し、疫病菌抵抗性が低下する株の選抜により、分泌ペプチド(SAR8.2m)遺伝子を単離した。SAR8.2mの発現を抑制した株では、疫病菌が植物個体全体に進展する。本研究では、この機能未知のSAR8.2mのジャガイモ疫病菌に対する抵抗性における機能を明らかにするために、まず様々な病原菌におけるSAR8.2mの役割を調査した。SAR8.2mサイレンシング株のダイズ茎疫病菌、灰色かび病菌、ウリ類炭疽病菌および青枯病菌に対する抵抗性は対照株と同等であり、SAR8.2mが疫病菌抵抗性に極めて特異的に働いていることが示された。SAR8.2mを処理すると、ファイトアレキシン生合成遺伝子EASなどの発現が誘導されることより、SAR8.2mは内生エリシターとして作用することが示されている。疫病菌抵抗性に関連する情報伝達因子の遺伝子であるSGT1、WIPK/SIPK、EIN2などをサイレンシングし、SAR8.2mによる抵抗性誘導への影響について解析を行なったところ、これら遺伝子のサイレンシング株でEASの発現が若干抑制されていたことから、これら情報伝達因子が、NbSAR8.2mのエリシター活性による抵抗性誘導に機能していることが示された。本研究では、昨年度まで様々な病原菌におけるSAR8.2mの役割を調査し、SAR8.2mサイレンシング株においてダイズ茎疫病菌、灰色かび病菌、ウリ類炭疽病菌および青枯病菌に対する抵抗性は対照株と同等であることを示した。本年度は、さらにジャガイモ疫病菌の近縁種である、タバコ疫病菌、ツノナス疫病菌などについて調査したところ、やはりSAR8.2mサイレンシング株における病徴への影響は認められなかった。この結果から、SAR8.2mが疫病菌抵抗性に極めて特異的に働いていることがさらに示された。これまでに、SAR8.2mを処理すると、ファイトアレキシン生合成遺伝子EASなどの発現が誘導されることより、SAR8.2mは内生エリシターとして作用することを推定して研究を進めてきた。しかし、SAR8.2mの働きがジャガイモ疫病菌に対して極めて特異的であることから、内生エリシターとして以外の役割を担っていることが推定された。そこで、ベンサミアナにエリシターの処理および病原菌の接種を行い、抵抗性応答を比較した。その結果、SAR8.2mサイレンシング株ではエリシター誘導性の抵抗性応答は対照株と同等であったのに対して、ジャガイモ疫病菌に対する抵抗性誘導は顕著に抑制されていた。この結果は、SAR8.2mがジャガイモ疫病菌の病原力に作用している可能性を示した。平成27年度は、よりジャガイモ疫病菌に近縁な病原菌にたいする抵抗性にSAR8.2mが関与しないことが明らかとなった。また、ベンサミアナにエリシターの処理および病原菌の接種を行った際の抵抗性応答を比較し、SAR8.2mがジャガイモ疫病菌の病原力に作用している可能性を示した。SAR8.2mの機能が本研究の開始時の推定とは全く異なる可能性が出てきており、SAR8.2mが病害抵抗性により高度な役割を担っていることが示されつつある。このように、今年度は今後SAR8.2mの役割を解明するための画期的な知見が得られたことから、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。

その結果、これまでに機能解析例のないナス科特異的な低分子量の分泌タンパク質SAR8.2mが抵抗性に必須であることが示された。SAR8.2mサイレンシング株にジャガイモ疫病菌を接種すると、病原菌の感染が植物体全身に蔓延してしまう極めて重篤な病徴が認められる一方で、他の病原菌に対する抵抗性に影響は認められなかった。解析の結果、SAR8.2には植物の抵抗性を誘導する活性があること、ジャガイモ疫病菌感染時に病原菌の感染行動を抑制する活性があることが示唆された。平成26年度は、SAR8.2mのサイレンシング株が様々な病原菌への抵抗性に必要でないことが明確に示され、その機能がジャガイモ疫病菌に対して極めて特異的であることが見出された。またSAR8.2mの内生エリシターとしての活性に、SGT1、WIPK/SIPK、EIN2などのエチレン情報伝達系の活性化に関与する因子が必須であることが示された。以上の結果は、SAR8.2mがエリシターとして機能すると同時に、ジャガイモ疫病菌に特異的に作用する異なる活性を持つことを示唆した。さらに、SAR8.2m-GFPをベンサミアナに発現させ、ジャガイモ疫病菌を接種すると、SAR8.2m-GFPが病原菌の菌糸に移行することを示す予備的結果が得られており、この結果もSAR8.2mがジャガイモ疫病菌に直接作用することでベンサミアナの抵抗性に寄与しているという推測を支持している。このように、今年度は今後の解析に必要な新たな知見が順調に得られたことより、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。これまでの解析を踏まえて、今後はベンサミアナが生産したSAR8.2mがジャガイモ疫病菌にどのように作用するかを中心に解析を進める。2) 1の結果をもとに合成した成熟型SAR8.2mをジャガイモ疫病菌に処理し、生育、タンパク質の分泌機構への影響について調査する。3)ジャガイモ疫病菌の形質転換系を確立し、SAR8.2mを発現した菌株を作出する。この菌株の病原性、エフェクターの生産能などを対照株と比較し、SAR8.2mの機能を明らかとする。植物病理学これまでの結果を踏まえて、今後はベンサミアに生産されたSAR8.2mのジャガイモ疫病菌菌糸への移行機構、およびその作用機構の解析を中心に進める。1) SAR8.2m各ドメインのジャガイモ疫病菌への移行への役割の解析SAR8.2mは、N末端から、シグナルペプチド、SAR8.2ファミリーに保存されている領域(Conserved region)および可変領域(Variable region)に分けられる。そこで、これらドメインを欠損した変異SAR8.2m-GFPを作出し、アグロバクテリウムを介した一過的発現により、細胞外への移行およびジャガイモ疫病菌菌糸への移行におけるこれら領域の役割を調査する。2)成熟型SAR8.2mの構造解析上記SAR8.2m-GFPを発現したベンサミアナ葉から、GFP抗体を用いたアフィニティー生成により、成熟型SAR8.2mのN末端を特定する。また野生株およびSAR8.2mサイレンシング株の細胞間隙のペプチドを回収し、質量分析により、成熟型SAR8.2mのアミノ酸配列を特定する。3) SAR8.2m相互作用因子の単離ジャガイモ疫病菌を接種したベンサミアナのcDNAから作製したライブラリーを用いて、SAR8.2mと相互作用するジャガイモ疫病菌の因子を探索する。
出芽酵母の細胞周期特異的に発現する新規キナーゼ遺伝子PAK1の解析

出芽酵母遺伝子NIK1(PAK1より変更)は、分裂酵母の細胞周期変異株(cdc2,cdc13)の温度感受性変異(ts)を相補する出芽酵母由来の未知のマルチコピーサプレッサーである。本年度の研究では以下の様な実験を行い、結果を得た。NIK1(nim1-KIN1,2 like kinase)遺伝子の塩基配列を決定したところ、1518アミノ酸の遺伝子産物をコードし、分裂酵母のnim1^+遺伝子や出芽酵母のKIN1、KIN2遺伝子と類似性を示すSer/ThrタイプのカイネースモチーフをN末端付近に持っていた。ノーザン解析から、長さ約5kbのNIK1mRNAはDNA polymeraseαとほぼ同じ時期をピークとして周期的に転写量が増減しており、また、NIK1 ORFの上流には、酵母のG1/S期の調節配列として知られているMCB、SCB配列や哺乳類で見つかっている転写因子であるE2F結合部位ともよく似た配列が複数存在していることが分かった。常法にしたがってNIK1遺伝子破壊を行ったところ、破壊株は致死ではないものの、G2/M期の細胞の割合が増加細胞が野性株よりも増加しており、細胞が増殖し定常期にはいっていくにつれて細胞が異常にのびた奇妙な形態を示した。その形態は、出芽酵母中で分裂酵母のcdc2阻害因子であるwee1^+遺伝子を強制発現させた時に観察されるものと類似していた。これらの細胞では、核は正常に分裂しておらず、短いスピンドルを持つ細胞が多く観察された。以上のことから、NIK1が分裂酵母以外で見つかっていなかったnim1^+遺伝子の出芽酵母ホモログである可能性が示唆された。さらに、出芽酵母のCDKであるCDC28のts変異とNIK1欠損の二重変異株は、cdc28^<ts>単独よりもより低い温度でのtsを示し、FLAG-tagを付けて強制発現させたNIK1産物は、p13^<SUC1>ビーズと共沈した。p13^<SUC1>は分裂酵母Cdc2-cyclin複合体に含まれるサブユニットである。また、実際にNIK1産物がkinase活性を持つことも確認した。これらのことから、NIK1が未知の細胞周期の進行の制御を行っていると考えて解析を進めている。