hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオプラズマの創生

昨年度までの研究によって放電プラズマが生菌数の減少に寄与することを明らかにした。そこで今年度はこの解析をさらに詳細に進めた。ウイルス・細菌の不活化メカニズムは、放電空間内に発生する電位差による細胞壁の破壊や電流による細胞変性が考えられているが、推測の部分も多く、どの程度それぞれの要素が影響を与えているか未だ明らかにはなっていない。そこで不活化機構の解明に最も適した材料はDNA及びタンパク質のみで構成されるバクテリオファージであると考え、大気圧下での誘電体バリア放電を用いてλファージを検体とし、その不活化メカニズムの解析を行った。λファージはDNAとそれを取り囲むキャプシドと呼ばれるコートタンパク質からなっている。これにより生菌数の減少がタンパク質へのダメージによるものか、あるいはゲノムDNAへのダメージによるものかを明らかにすることを目指した。具体的には以下のような手順で実験を行った。まずλファージを誘電体バリア放電に曝露することによりコートタンパクおよびDNAに損傷を導入する。次にこれからDNAを抽出し、新しいコートタンパクでパッケージングする。このようにしてできたλファージはDNAのみに損傷を有していることになる。放電に曝露したλファージとそれを新しいコートタンパクでパッケージングしたものを大腸菌に感染させ、その感染能力を比較した。放電に曝露したλファージではプラズマへの曝露時間の増加に伴って感染能力が速やかに低下した。一方、放電に曝露したサンプルを新しいコートタンパクで再パッケージングした場合、放電への曝露量が小さい場合には感染能力がほぼ完全に放電プラズマに暴露していないものと同程度まで回復する結果となった。この結果は、この実験系では放電プラズマによるλファージの不活化に寄与する要因としてはコートタンパク質の損傷が支配的であるということを示唆している。本研究ではタンパク質や核酸等の生体高分子を不必要な水分子が無い状態で反応させることにより反応速度の高速化を図ることが可能であるか実験的に検討を行うことを目的としている。そのためには生体高分子と水分子の複合体を真空中あるいは大気圧下で発生させる方法を見出すことが必要であり,本年度はDNA分子の真空中へ取り出す方法を検討した。DNAを金属電極に固定し,真空中あるいは大気圧下で高電圧パルスを印加することによって,電界蒸発によりDNAを1塩基ずつ気相へ取り出すことが可能であるか検討した。電極とDNAとの結合には金とチオール基との特異的結合を利用した。電解研磨により先端の曲率半径を100nm程度とした金線をチオール基で片末端を修飾したDNA溶液中に保持し,交流高電圧を印加する事によってDNA分子を電極先端の高電界部分へ誘電泳動し,結合させたものをサンプルとした。このサンプルを蛍光標識した後に蛍光顕微鏡で観察することにより,電極先端にDNAが結合していることを確認した。また同様の手法を用いて,金よりも機械的強度が強く取扱いの簡単なタングステン電極上にDNAを固定することができるか検討を行った。その結果,誘電泳動は生じるが,結合操作後に純水でウォッシュしたサンプルからは蛍光像は見られず,極めて弱い結合しか形成していないことが明らかになった。本研究ではタンパク質や核酸等の生体高分子を本来は不必要な過剰な水分子が無い状態で反応させることにより反応速度の高速化を図ることが可能であるか実験的に検討を行うことを目的としている。そのために本研究では生体高分子を帯電させることによって電界を用いて空間中に保持すること、特にプラズマ中における生体高分子の保持と反応が可能であるかを検討する。今年度はタンパク質や核酸等の生体高分子と放電プラズマとの相互作用を実験的に調べるため、大腸菌を大気圧下での誘電体バリア放電に曝露した場合の生菌数の変化、DNAおよびタンパク質の電気泳動による解析を行った。その結果、放電電圧の上昇および放電時間に伴ってGFP産生大腸菌の生存数が減少することが確認された。またバリア放電への曝露によって細胞を破壊し、DNAおよびタンパク質が細胞外へ漏出することがわかった。放電への長時間の曝露によってDNAおよびタンパク質の両方が損傷を受けることが分かった。またタンパク質の損傷は放電への曝露量に伴って、修飾・変性→切断・分解の順で生じていると考えられる。放電に曝露したλ

ファージとそれを新しいコートタンパクでパッケージングしたものを大腸菌に感染させ、その感染能力を比較した。放電に曝露したλファージではプラズマへの曝露時間の増加に伴って感染能力が速やかに低下した。一方、放電に曝露したサンプルを新しいコートタンパクで再パッケージングした場合、放電への曝露量が小さい場合には感染能力がほぼ完全に放電プラズマに暴露していないものと同程度まで回復する結果となった。この結果は、この実験系では放電プラズマによるλファージの不活化に寄与する要因としてはコートタンパク質の損傷が支配的であるということを示唆している。
乳歯列反対咬合における咬合彎曲と顎顔面形態との関連性について

1.資料は、下顎乳犬歯間と上顎乳側切歯間で左右対称的に逆被蓋が見られ、齲蝕、形成不全等の大きな実質欠損、咬頭頂を含む歯冠修復等を認めない、男女児19名(平均年齢4歳9ヶ月)から得られた上下顎歯列石膏模型および、同時期に撮影された側貌頭部X線規格写真である。2.東京精密社製三次元座標測定器XYZAX上に歯列模型を固定し、計測基準面、計測点を設定の上、基準平面の原点から垂直水平距離(Z・Y軸座標値)を日を変えて3回計測し、平均値を算出した。側貌頭部X線規格写真については、Ricketts分析法に従いトレースを行い、各計測点をパーソナルコンピューター,CRTディスプレイ,デジタイザーを用いて計測し、分析用プログラムにより,各計測項目の分析を行った。3.歯列模型より得られた各計測点のZ値およびY値(座標値)の平均、標準偏差を求め、左右の有意差検定を行った。男女児とも上下顎Z軸、Y軸座標軸ともに左右差は認められなかった。側貌頭部X線規格写真より得られた各計測項目について,それぞれ平均値および標準偏差を求めた。これにより本資料は歯性反対咬合の傾向であると考えられた。歯列模型より得られた各計測点のZ値と側貌頭部X線規格写真より得られた各計測値との相関係数を算出した。4.本研究における乳歯列反対咬合の咬合湾曲と顎顔面頭蓋形態との関連性は、歯列に関する項目では、被蓋の深さと咬合湾曲の深さに、骨格系に対する歯列の位置に関する項目では、上顎乳側切歯と多くの項目で有意な相関関係を示した。頭蓋を顔面の関係に関する項目では、有意な相関関係は上顎にのみ見られ、内部構造に関する項目では、上顎よりも下顎に多く見られた。
ゆらぎ解析法による造船所の歩行路環境の安全性評価に関する研究

造船所の重大危惧災害である墜落・転落災害の要因となる身体バランスの崩壊を誘発する歩行路環境について、ゆらぎ解析法による安全性評価の検討を行った。スラットコンベアを用いたNC切断工程では、切断部材の寸法からスラット間隔が幅広く取られることが多い。このスラット上を作業者が移動、作業することがあるが、バランスを取りにくい所を歩行するため、身体バランスを崩す恐れがある。スラット上の歩行移動について歩行実験を行い、歩行路環境が歩行時の身体バランスに与える影響を調査した。現状では、造船所の労働安全の管理者やスタッフは災害の事後対処に翻弄されており、リスクアセスメントによる災害の事前対処への転換が課題である。作業および作業環境の合理的な安全改善を目標とするリスクアセスメントにおいて、安全の改善対策実施における工場長等の意志決定者と対策実行者の間で合意し易くするために、改善対策の安全性を定量的に評価することを目的とする。本研究では、造船所の重大危惧災害である墜落・転落災害の要因となる身体バランスの崩壊を誘発する歩行路環境について、ゆらぎ解析法による安全性の定量的な評価の検討を行った。労働災害の発生リスクの軽減を図るためには、事故発生のメカニズムを明らかにして予防策を講じる必要がある。スラットコンベアを用いた造船工場のNC切断工程では、多くの切断部材の寸法からスラット間隔が150mm程度と広く取られることが多い。このコンベア上を作業者が端材処理、部材消し込み作業のための移動、クレーン作業することがあるが、バランスを取りにくい所を歩行するため、身体バランスを崩す恐れがある。本研究では、スラットコンベア上の歩行移動について、スラット間隔を変えられるモックアップおよび実際の造船工場で使われている間隔が異なるコンベアにおいて歩行実験を行った。実験の比較から歩行路環境が歩行時の身体バランスに与える影響を調査した。足裏にスラット面から働く足底圧分布のデータの特徴を抽出し、これを基にして、歩行路環境の安全性評価の検討を行った。スラットの間隔が大きいときは身体バランスが安定した歩行が出来ずに、バランスのゆらぎが大きく、スラット間隔がある値より小さくなると、ゆらぎの減少が見られることから、安定した歩行を保てるスラット間隔の上限について検討した。以上から、身体バランスが安定した歩行を保つにはスラットの間隔や歩行角度は歩行路検討の重要な要素であることが分かった。現状では、造船所の労働安全の管理者およびスタッフは災害の事後対処に翻弄されており、リスクアセスメントによる災害の事前対処への転換が課題となっている。作業および作業環境の合理的な安全改善を目標とするリスクアセスメントにおいて、安全の改善対策実施の合意形成において所長等の意志決定者と対策実行者の間で合意し易くするために、改善対策の安全性を定量的に評価することを目的とする。本研究では、造船所の重大危惧災害である墜落・転落災害の要因となる身体バランスの崩壊を誘発する歩行路環境について、ゆらぎ解析法による安全性の定量的な評価の検討を行う。また、労働災害の発生リスクの軽減を図るためには、事故発生のメカニズムを明らかにして、予防策を講じる必要がある。スラットコンベアを用いた造船工場のNC切断工程では、多くの切断部材の寸法からスラット間隔が150mm程度と幅広く取られることが多い。このスラット定盤上を作業者が端材処理、部材消し込み作業のための移動、クレーン作業することがあるが、バランスを取りにくい所を歩行するため、身体バランスを崩す恐れがある。本研究では、NC定盤のスラットコンベア上の歩行移動について、スラット間隔を変えられるモックアップおよび実際の造船工場で使われている間隔が異なるコンベアにおいて歩行実験を行った。スラットの間隔が大きいときは身体バランスが安定した歩行が出来ずに、バランスのゆらぎが大きく、スラット間隔がある値より小さくなると、ゆらぎの全体的な減少が見られることがわかり、身体バランスが安定した歩行を保つにはスラットの間隔や歩行角度は歩行路検討の重要な要素であることが分かった。今年度は、安全性評価の対象とする造船所の歩行路環境をスラットコンベアに集中し、モックアップだけでなく、実際の造船工場で使われているスラット間隔が異なる複数のコンベアにおいて、実際の作業者による歩行実験を行い、検討した。ここでは、スラットの間隔と歩行の角度により足底にかかる支持点が異なることから、歩行時の身体バランスに影響を及ぼすと考えられる歩行路の環境の要因として、スラットの間隔とスラットに対する歩行角度を実験条件として設定して行った。スラットの間隔が大きいときは身体バランスが安定した歩行が出来ずに、ゆらぎが大きく、スラット間隔がある値より小さくなると、ゆらぎの全体的な減少が見られることがわかった。また、歩行角度が斜め45度と60度では、ゆらぎが概ね極小になることが分かった。

これらは、被験者の歩行時の歩行しやすさの印象と一致することを確認した。以上のことから、身体バランスが安定した歩行を保つにはスラットの間隔と歩行角度は歩行路検討の重要な要素であることが分かった。また、身体バランスのゆらぎの抽出方法の検討では、足底に働く力の作用点に相当する、足底圧分布の荷重中心点の軌跡のゆらぎによる評価を検討した。今年度は、安全性評価の対象とする造船所の歩行路環境はスラットコンベアに絞り、モックアップだけでなく、実際の造船工場で使われている複数のスラットコンベアでも行い、バランスを取りにくいスラットコンベア上を歩行中の身体バランスのデータを収集した。次年度は、収集したデータを元に、ゆらぎの抽出方法の改善の検討を行う。足底圧分布の荷重中心点の軌跡のゆらぎについては、今年度は足の長さ方向における先端の位置の標準偏差について検討したが、次年度は、実際の歩行中の身体バランスの変化と足底圧分布の相関を調べ、他の特徴量を検討する。また、カオス理論を応用したリカレンスプロットを用いたゆらぎ解析法についても検討を続ける。歩行中は、足底が設置していない状態があるため、足底圧の時系列データは正弦波のような対称性が弱く、パルス波形に近い。このような時系列データに適したリカレンスプロットの検討を行う。以上の検討から、スラットコンベアの歩行路環境のリスク軽減対策について検討を行う。さらに、作業者が歩行状態から災害の発生に至る可能性のある他の歩行路環境の安全性評価についても検討を行う。今年度は、安全性評価の対象とする造船所の歩行路環境はスラットコンベアに絞り歩行実験を行ったが、次年度は、他の歩行路環境の安全性評価についても歩行実験による検討を予定している。歩行実験は、実際の造船所の歩行路環境やモックアップにおいて行う予定である。実際の造船所の歩行路環境については、実験環境を提供頂ける造船所の作業現場に赴いて行い、モックアップにおける実験では、必要に応じて、歩行路環境を模したモックアップを製作する。さらに、歩行路実験では、インナーソール型の足底圧センサー・シートを用いて足底圧を計るとともに、歩行状態をビデオカメラで撮影する。ゆらぎの抽出の検討では、計測された時系列データの変化と歩行状態の相関を調べる。リカレンスプロットによるゆらぎ解析の検討では、足底圧分布は1000以上のセンサ・セルで構成されるセンサー・シートを使って、高速で(100Hz)計測され、非常に大きな時系列データを扱うため、大容量のメモリと高速な演算装置を持つコンピュータで解析を行う。
配糖体合成における新規グルコース縮合酵素の探索と有用配糖体の生産研究

本研究では、微生物酵素を用いた配糖体の新規合成方法に関する研究を行った。Xanthomonas campestris WU-9701はα-アノマー選択的にグルコース転移を行う新規な酵素を生産する。当該酵素を利用して、アルコール性およびフェノール性の-OH基のグルコシル化を行った。また、これまでに報告のないチオール基のα-グルコシル化が可能であることも明らかにした。当該酵素の精製および諸性質の検討を行い、当該酵素の反応特性を明らかにした。また、当該酵素遺伝子(xgtA)をクローニングし、決定した塩基配列情報を他の類似酵素のものと比較解析し、相同性や当該酵素機能の特徴を考察するとともに、立体構造を推定するに至った。xgtAの大腸菌での高発現にも成功し、組換え酵素を利用したα-グルコシドの効率的な生産プロセスを構築した。また、グルコース縮合によるグルコシド生産方法を確立するため、市販酵素および縮合活性を有する微生物のスクリーニングを検討した。市販酵素では、Aspergillus niger由来のグルコシダーゼを用いた場合、グルコースとヒドロキノンからのアルブチン合成を確認することができた。グルコースを糖基質とするとマルトースを生成し、かつ本酵素はマルトースを糖基質とした反応によってもアルブチンを合成した。したがって、グルコース縮合反応でマルトースが生成し、そのマルトースを糖基質としてグルコース転移が起こり、その結果、アルブチンが生成するものと予想された。また微生物スクリーニングでは、目的酵素の生産候補株であるYS003株を単離した。YS003株は、グルコース縮合活性を有してはいなかったが、炭素源をセロビオースにした場合、ヒドロキノンをβ-アノマー選択的にグルコシル化する酵素活性を有していることを確認できた。また、市販のマルトースホスホリラーゼ(EC2.4.1.8,MPase)にα-グルコシド合成活性を初めて見出した。本反応はリン酸依存型の不可逆反応であり、マルトースを糖基質としてアルコール性-OH基を効率的にα-グルコシル化した。微生物酵素を用いた有用配糖体の効率的生産系の構築と配糖化による有用物質の物性安定化の検討を実施。マルトースを糖基質としてグルコース転移活性を有する当研究室保有のXanthomonas campestris WU-9701は、抗酸化作用を有するポリフェノール化合物で1分子内に5個の-OH基を有するカテキンに対してもα-アノマー選択的位置特異的にグルコシル化して(+)-catechin 3'-O-α-D-glucopyranoside(α-C-G)のみを生成した。配糖化により呈味性の改善、水に対する溶解性の向上、さらに物性安定化も示された。反応諸条件の検討によりα-C-G合成収率は対カテキン57%に達した。またフェノール性-OH基を有するヒドロキノンに対しても効率的な配糖化能を示した。生成物hydroquinone-O-α-D-glucopyranosideは美白活性を有する化粧品素材として広く使用されているアルブチン(β-グルコシド)の異性体で類似の生理活性が報告されている。凍結乾燥菌体を用いた条件での最適化により、40°C,36hrの反応で42mMのα-アルブチンが生成(対ヒドロキノンモル収率93%)。

酵素量を高めることで収量増も可能であったが、ヒドロキノンやα-グルコースが本転移反応を阻害することを明かにしており、今後遺伝子組換え技術を適用した酵素活性の増強や阻害の解除を計画・検討中。一方、種々の生理活性を有する天然型グルコシドの多くはβ-グルコシドであることに着目し、β-グルコシド生成型グルコース転移酵素やグルコース縮合酵素の探索を開始。Aspergillusniger由来のβ-グルコシダーゼを用いてグルコースとヒドロキノンからのアルブチン合成に成功(対ヒドロキノン収率0.3%)。この反応で二糖生成を確認し、グルコースからセロビオースを経て糖転移活性によりアルブチンが合成されている可能性を示した。グルコースあるいはセロビオースを糖基質としたアルブチン合成活性を有する微生物スクリーニング系を構築した。微生物酵素を用いた有用配糖体の効率的生産系の構築を目的に、遺伝子工学的手法も取り入れ検討を実施。マルトースを糖基質として特異的なグルコース転移活性を示す当研究室保有のXanthomonas campestris WU-9701の培養菌体から当該酵素活性を有するタンパク質の精製を実施。マルトース培養菌体の粗酵素抽出液から、硫安分画と一連のカラム操作を実施しSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一バンドとなるまで精製した。当該酵素の分子量はSDS-PAGEで57,000Da、ゲルろ過では59,000Daと概算された。さらに精製酵素を用いて酵素の特性解析も実施し、転移活性を与える最適pH8.5と最適温度40°Cも決定した。また、当該酵素は-OH基だけでなく-SH基に対してもグルコシル化する活性を有していることが明らかとなり、本酵素の有用性が広がった。さらに、精製酵素の内部およびN末端アミノ酸配列情報をもとに作成したプローブと別途構築した部分ゲノムライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法により当該酵素遺伝子のクローニングを実施した。取得遺伝子断片を解析した結果、当該酵素をコードする領域は1,617bpで、従来のα-アミラーゼファミリーに属する加水分解酵素との相同性は3040%と低かった。また形質転換株E.coliJM109/pUGTF-7の無細胞抽出液では比活性2.35nkat/mgとWU-9701の約10倍の活性を示した。また前年度に引き続きヒドロキノン配糖体であるα-アルブチンの生産詳細条件を検討した。凍結乾燥菌体のみならず培養菌体でも高活性を示し、実用プロセス構築において本酵素の有用性が示された。さらに、カテコール、レゾルシノール、o-,m-,p-クレゾールに対する配糖化活性も確認された。一方、β-グルコシド生成型グルコース転移活性を有する微生物を新たに分離した。本菌株はセロビオースを糖基質としたアルブチン合成活性を有し、詳細検討中。マルトースを糖基質としてβ-グルコシド生成を触媒するマルトースフォスフォリラーゼに着目し、当該酵素を用いた効率的配糖体生産プロセスの検討にも着手。前年度取得したXanthomonas campestris WU-9701由来のα-グルコース転移酵素遺伝子(xgtAと命名)の解析ならびに大腸菌における高発現を検討し、工業的利用可能なα-アルブチンの効率的な生産プロセスを構築した。xgtAを高発現プラスミドpKK223-3のtac
仮想物理空間の基礎となる連成解析手法の開発

高度なマルチフィジックスシミュレーションを行う汎用的なシステムを,各現象に対して開発された高性能なシミュレータの統合により実現することが望まれている。本研究課題は,このようなシミュレータの統合するために仮想物理空間と呼ぶ空間・時間に広がる物理量を各シミュレータが共有,操作するプラットホームを構築することを目指し,そのための理論的な基礎として,領域分割型重合メッシュ法を開発した.高度なマルチフィジックスシミュレーションを行う汎用的なシステムを,各現象に対して開発された高性能なシミュレータの統合により実現することが望まれている。本研究課題は,このようなシミュレータの統合するために仮想物理空間と呼ぶ空間・時間に広がる物理量を各シミュレータが共有,操作するプラットホームを構築することを目指し,そのための理論的な基礎として,領域分割型重合メッシュ法を開発した.コンピュータの高性能化にともない,大規模な数値計算が可能になり,機器,構造物の全体に対する「まるごとシミュレーション」を実行することが可能となってきている.まるごとシミュレーションにおいては,機器,構造物に影響を与えるさまざまな物理現象の相互作用を考慮するマルチフィジックスシミュレーションが重要であり,その高度化,汎用化を行うためには,各現象に対して開発された高性能なシミュレータの統合が必要となる.このようなシミュレータの統合化を実現するため,本研究課題では,仮想物理空間と名付ける空間・時間に広がる物理量を各シミュレータが共有,操作するプラットホームを提唱する.本研究課題は,この仮想物理空間を実現するための数値計算技術の理論的な基礎を確立することを目的とするものである.平成21年度の研究では,マルチフィジックスシミュレーションにおける数値解の解像度に対して柔軟な制御を行うための手法として,複数の計算格子(メッシュ)を自由に重ね合わせるいわゆる重合格子法に注目し,検討を行った.重合格子では,計算領域内で計算格子が重ね合わせられるが,そこで同時に複数の未知変数が定義されることは数学的に許容されない.従来の重合格子では,未知変数も和として重ね合わせる手法が用いられていたが,このような方法では,複数の格子で定義された問題は一体として解かなければならない.平成21年度の研究成果として,仮想物理空間を独立な格子として利用することで,重ね合わされた格子とそれぞれが分担する問題を分離する境界を設定し,分離された問題の境界における接合条件は基本的に仮想物理空間で評価する計算手法の可能性が見いだされた.コンピュータの高性能化にともない,大規模な数値計算が可能になり,機器,構造物の全体に対する「まるごとシミュレーション」を実行することが可能となってきている.まるごとシミュレーションにおいては,機器,構造物に影響を与えるさまざまな物理現象の相互作用を考慮するマルチフィジックスシミュレーションが重要であり,その高度化,汎用化を行うためには,各現象に対して開発された高性能なシミュレータの統合が必要となる.このようなシミュレータの統合化を実現するため,本研究課題では,仮想物理空間と名付ける空間・時間に広がる物理量を各シミュレータが共有,操作するプラットホームを提唱する.本研究課題は,この仮想物理空間を実現するための数値計算技術の理論的な基礎を確立することを目的とするものである.平成22年度の研究では,領域分割型の重合メッシュ法に対して,解の接続と積分の評価に背景直交格子を用いた有限要素解析手法を2次元ポアソン方程式の境界値問題に対して提案した.提案した手法はNitscheの方法により拡張されたLagrange未定乗数法に基づく方法であり,領域分割された各メッシュの有限要素解析は,領域間境界のフラックスに対応するLagrange未定乗数と領域間境界における剛性を考慮した方程式として,独立に計算が可能であり,Lagrange未定乗数に関しては共役勾配法に基づく反復法で解を求めるアルゴリズムを構築することができた.この手法は,重合メッシュ法を分割された問題の連成として取り扱うアルゴリズムであり,マルチフィジックスシミュレーションのための仮想物理空間の実現に向けた技術基盤のひとつとなると考える.高度なマルチフィジックスシミュレーションを行う汎用的なシステムを,各現象に対して開発された高性能なシミュレータの統合により実現することが望まれている.本研究課題では,このようなシミュレータの統合するために仮想物理空間と呼ぶ空間・時間に広がる物理量を各シミュレータが共有,操作するプラットホームを構築することを目指し,そのための理論的な基礎を確立することを目的としている.平成21,22年度までの研究では,直交格子を背景格子とし,Nitscheの方法により拡張されたLagrange未定乗数法によって格子を柔軟に設定することを可能とする重合格子法を開発した.これは,仮想物理空間を実現するための基盤技術となる.平成23年度においては,平成22年度に開発した重合格子法をマルチフィジックスシミュレーションの一つである流体構造連成問題に適用し,提案する手法の実問題への適用性を検討することを目指した.そのために,まず高精度な流体計算法としてスプライン関数を基底とした特性ガラーキン法に基づく計算手法を開発した.開発された流体計算法は精度の高いものとなったが,流体構造連成解析を行うために重合格子法を導入するには到らなかった.また,Nitscheの方法に基づく領域分割型の重合格子法において,反復型連成解法に対するアルゴリズムの検討と数値安定性の評価を行った.Nitscheの方法では,従来の手法と比べ安定性と収束性は向上するが,剛体変位についての拘束が依然として必要であることが分かり,今後の技術的課題が残る結果となった.
ハンチントン病による記憶障害に対する動物モデル作製の試み

脳内の興奮性アミノ酸が神経変性疾患において重要な役割を果たしていることが報告された。その中でキノリン酸は、トルプトファンの代謝物であり、N-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体サブタイプに作用する内因性の興奮性アミノ酸であること、老化や病的な状態によりその脳内含量が増加することから、種々の神経変性疾患の原因となっている可能性が示唆されている。特にキノリン酸とハンチントン舞踏病との関連性が示唆され、キノリン酸の脳内投与による神経化学的な変化については多くの報告がなされているが、学習・記憶障害については詳細な検討はされていない。そこで、ハンチントン舞踏病患者において細胞障害のみられる線条体および前皮質にキノリン酸をラットに投与したときの学習・記憶障害について検討し以下のような結果を得た。1.放射状迷路学習法において、キノリン酸を線条体および前皮質に注入した群で、エラー数の増加が認められた。2.受動的回避学習法において、キノリン酸を線条体及び前皮質に注入した群で、ステップスルー潜時が短縮する傾向が見られた。3.水迷路学習法において、キノリン酸を線条体または線条体と前皮質に注入した群で、遊泳時間が有意に長く、有意な学習・記憶障害が認められた。また、プラットホームを除いた偽試行において、プラットホームのあった位置を泳いだ回数は、キノリン酸を線条体に注入した群で有意に少なかった。4.線条体または線条体と前皮質にキノリン酸を注入すると、線条体においてのみコリン合成酵素およびGABA合成酵素が減少した。5.キノリン酸の注入部位を組織学的に検討したところ、線条体への注入では線条体の広い範囲が破壊されていたが、前皮質では、投与部位でのみ細胞が障害を受けていた。以上の結果より、キノリン酸を線条体に注入することにより、神経化学的および組織学的変化のみならず、学習・記憶も障害されることが明かとなった。しかし、前皮質への注入ではそのような変化は認められなかった。前皮質では破壊された部位が限局していたこと、神経変性疾患は進行性であるが、今回キノリン酸は急性投与していることなどから、より臨床に近いモデルを開発する必要性があると思われる。
レーザ加熱火炎面曲率制御法によるＧＴ燃焼器の不安定振動燃焼トリガー機構の研究

ガスタービン燃焼器等で生じる不安定振動燃焼に関する基礎研究として、内径50mmの片側開放直管に予混合気を封入しその一端に着火した後に生じる燃焼振動現象の実験的観察を行った。管内を伝播する火炎は、混合気の燃料組成、燃焼速度、当量比、不活性ガス成分、Leにより種々の不安定モードを示すことがわかった。特に燃焼速度が増大すると火炎先端に規則的なセル構造が現れ、同時に急激な圧力振動を引き起こすことがわかった。この現象は、それに先だって生じる管内の圧力変動(主にPressure couplingによる)に誘起される音響速度のもとで火炎先端形状が特定の変形を示すことがきっかけとなって進展することが示された。管内伝播予混合火炎の不安定振動燃焼のトリガーとなる機構の研究について、以下の項目を実施した。1.実験装置の構築:管内伝播火炎の不安定振動燃焼への遷移を観察する装置の構築を行った。本装置は、伝播管の管長、伝播方向(上方伝播、下方伝播)、混合気組成、レーザー強度、照射時間などを任意に変化させられるものである。また、開放型火炎を用いた実験装置も制作を進めている。これは、燃料空気混合気を平板に衝突させることで平面火炎を形成し、これにレーザーを照射することで任意の変形を与え、その非定常挙動を観察するためのものである。これにより音響振動の影響を切り離した、火炎自身の不安定性の発達挙動を取得することができる。2.管内伝播火炎の不安定領域の特定:管長45cmおよび70cmの伝播管に種々の組成の予混合ガスを封入し、その一端に着火した後の火炎形状の不安定性に関する観察を行った。火炎は、着火直後緩やかな曲率を持つなめらかな表面形状を示し、その後、平面火炎、波状火炎(Corrugated structure)を示した後、乱流状態の激しい燃焼へと至る。このような遷移過程が生じる限界条件を、混合気の当量比を固定した上で燃焼速度を変えることで調べた。この結果、遷移現象については燃焼速度が重要な変数であり、これが臨界値を越えると遷移が生じることがわかった。さらに、この臨界値が不活性ガス成分やルイス数、火炎の伝播方向(上方伝播および下方伝播)によりどのように変化するかを調べた。この結果、遷移は混合気のゼルドビッチ数(無次元活性化エネルギー)の増加、温度伝導率および動粘性係数の低下、ルイス数の低下、などによってより小さな燃焼速度で生じることがわかった。火炎の伝播方向の影響については、必ずしも下方伝播がより大きな不安定性を示すとは限らないことがわかった。管内伝播火炎の不安定振動現象のトリガーとなる機構の研究について、以下の3点について成果が得られた。(1)管内伝播火炎のトリガー機構理解の進展:前年度の研究により構築した伝播管実験装置を用いて管内伝播火炎に音響振動が生じる条件を実験的に明らかにした。本年度は前年度からの継続実験において、各変数を詳細に変化させることで、管内に形成される音響振動振幅が、Coupling constant (=βM, β:ゼルドビッチ数、M:無次元燃焼速度)に対しリニアな依存性を示すこと、さらにLe(ルイス数)によりその直線関係の切片が明確に変化することを示した(Pressure couplingと呼ぶ)。一方、変形した火炎面(レーザ照射法により任意に変化させる)が音響振動にさらされることによる火炎面積の時間変動は、相対的に音響振動の拡大要因になりにくいことを示した。(2)火炎の伝播方向による不安定性が生じる臨界条件の違いの検討:伝播管内での火炎の上方伝播と下方伝播の比較を行い、上方伝播の方が不安定振動燃焼が生じにくいことを示した。その要因として、上方伝播の方が伝播速度が大きく相対的に熱損失が小さいことから、管内の音響周波数が増加し、その結果としてエネルギー減衰が生じやすいことが考えられることを示した。(3)開放型火炎の装置の構築と予備的検討の実施:開放型平面火炎バーナを制作し、平面火炎を形成することに成功した。これらの一連の成果は、ICDERS2015やPRTEC2016などの国際会議や多くの国内会議で発表したほか、2016年度に開催される国際燃焼シンポジウムの口頭発表論文としても採択されている。研究はほぼ順調に推移している。研究推進にあたり中心的な役割を担う伝播管実験装置では順調に成果が得られており、学会発表や研究論文の提出も行われている。一方開放型火炎を用いた実験では、装置製作が完了しデータ取得を開始した段階であるが、本格的な成果取得は次年度となる。管内伝播火炎の不安定振動現象のトリガーとなる機構の研究について、以下のような成果が得られた。(1)管内火炎伝播火炎のトリガー機構理解の進展:昨年度の研究より、火炎の不安定現象がCoupling Constant(=βM,β:ゼルドビッチ数、M:無次元燃焼速度)により整理できるという知見が得られているが、本年度はこの知見に基づいて、燃料混合気の組成や燃焼管長さなど種々の変数を変化させた実験にまで範囲を拡張し不安定現象へ遷移するβMの値を求めた。さらに、外部レーザ照射により火炎面積の変化を与えたときの遷移限界の変化をβMを用いて評価した。この結果、このβMを用いて火炎の不安定性を系統的に評価できること、火炎の不安定性には圧力変動による生じる火炎温度の微小な温度変動に伴う発熱変動が重要な不安定機構になっていること、などを示した。一方、今回実験で与えたレーザによる火炎曲率の範囲では、火炎表面積変動にともなう発熱変動は不安定性発現の機構とはなっていないことが示された。

これらの実験に基づく成果は、Combustion and Flame, Proceedings of the Combustion Instituteといった燃焼科学の代表的ジャーナルに掲載されるに至っている。(2)管内伝播方向の不安定限界に対する影響の検討:本研究も昨年からの継続実験として実施した。上方伝播と下方伝播の2つの場合について、管内火炎の温度履歴を実際に測定し、管内の火炎伝播速度の違いが管内平均温度の違いにつながることを示し、これが管内の振動周波数の違いを引き起こし、不安定限界の違いを与えることを示した。この成果は、国内の燃焼関連学会および国際燃焼シンポジウムのポスター講演により公表された。研究はほぼ順調に進展している。研究実績の概要にも述べたように、管内伝播火炎における不安定現象への遷移に対してはCoupling Constantで評価できるPressure Couplingが支配的機構になるという重要な知見が得られており、この成果が燃焼科学の代表的ジャーナルに掲載されるに至っている。管内伝播火炎の不安定振動現象のトリガーとなる機構の研究を行い以下のような成果を得た。不安定ダイアグラムの安定限界条件におよぼす各実験変数(混合気組成・燃焼速度・伝播管アスペクト比等)の影響を検討した。前年度まで実施した実験に加え不足していた条件での実験を実施することで、伝播管のアスペクト比(管長/管直径)に対するPrimary InstabilityおよびSecondary Instabilityの発生条件マップ(不安定ダイアグラム)を取得した。この結果伝播火炎の不安定性は、アスペクト比が大きくなるほど増大することが示された。生じている現象を詳細に観察すると、火炎伝播の初期段階で管長に対応する固有の周波数を持つ圧力振動が生じ(Primary instability)、これが徐々に増幅されその圧力振幅が臨界値を超えると火炎面に規則的なセル構造が発生し、これがきっかけとなって極めて急激な圧力増幅(Secondary Instability)が生じることがわかった。ガスタービン燃焼器等で生じる不安定振動燃焼に関する基礎研究として、内径50mmの片側開放直管に予混合気を封入しその一端に着火した後に生じる燃焼振動現象の実験的観察を行った。管内を伝播する火炎は、混合気の燃料組成、燃焼速度、当量比、不活性ガス成分、Leにより種々の不安定モードを示すことがわかった。特に燃焼速度が増大すると火炎先端に規則的なセル構造が現れ、同時に急激な圧力振動を引き起こすことがわかった。この現象は、それに先だって生じる管内の圧力変動(主にPressure couplingによる)に誘起される音響速度のもとで火炎先端形状が特定の変形を示すことがきっかけとなって進展することが示された。研究はほぼ順調に推移している。研究推進に当たり中心的な役割をになう伝播管実験実験装置はほぼ計画どおり制作が完了し、データの取得を開始している。一方、開放型火炎を用いた実験に関しては一部装置制作が完了しておらず、27年度の早い段階で完成させ実験に着手する計画である。伝播管実験に関してはこれまで多くの実験データが取得できており、今後は理論的検討と実験を並行して進める。
野生型マウス顎下腺由来培養上皮細胞株を用いた唾液腺組織再生に向けたシステム構築

唾液は口腔の健康を維持するために必要不可欠な体液であり、失われた唾液腺組織再生を試みる研究は多数報告されているが、これらの研究で用いられる細胞源は腫瘍細胞由来あるいは遺伝子改変によって樹立されており、マウスにおける自然発生的な細胞株の報告はなかった。そこで研究代表者(池浦一裕)は野生型マウス顎下腺由来導管上皮基底細胞群を初代培養の表現型を保ちながら安定的に長期培養する方法を2016年にPLoS ONEに報告した。本研究の目的は研究代表者が樹立した安全かつ安定供給が可能な野生型マウス顎下腺由来培養上皮細胞株を用いて、多分化能解析と腺組織分泌機能評価が可能なシステム構築を行うことである。樹立した細胞株は0.1%ゼラチンコートを行った接着培養系にて低カルシウム、無血清、コレラトキシン含有のCnT-07培地を用いて継代培養を行い、100継代を超えてからも免疫組織化学染色ではkeratin-14、keratin-18、p63陽性であり唾液腺導管上皮基底細胞と同様の表現型を維持している。導管上皮基底細胞群には増殖能が高い細胞が多いと報告されており(Sarah Pringle etal: STEM CELLS.2012)、当該年度は培養条件を変更することで筋上皮細胞・腺房細胞への分化誘導を検討した。1mMカルシウムおよび5%血清、さらに5ng/mlのTGF-β1添加刺激により筋上皮細胞マーカーであるα-SMA陽性細胞が得られ、すなわち筋上皮細胞様細胞の分化誘導が可能となったが、安定供給が可能な培地を引き続き検討中である。腺房細胞への分化誘導は、三次元培養法が主軸である。コラーゲンゲル上では管腔構造細胞塊(Cyst)、コラーゲンゲル内では細胞塊(Salivary Sphere)が形成できており、免疫組織化学染色ではAQP5陽性であることから、引き続き遺伝子発現量解析を行う。本研究課題は以下のAからFの順番で研究を進める研究計画としている。A)樹立した細胞株の筋上皮細胞への分化誘導能の検討、B)樹立した細胞株の腺房細胞への分化誘導能の検討, C)三次元培養を用いた細胞塊(Salivary Sphere)および管腔構造細胞塊(Cyst)の作製、D)核型解析、E)幹細胞、前駆細胞マーカーの発現確認、F)CARS顕微鏡を用いた腺組織分泌機能評価アッセイ系の確立当該年度はA,B,Cまでの研究計画手順を遂行することができた。一方で2019年4月から人事異動に伴い所属研究機関を変更、また学術研究助成基金助成金の移管に伴い、約4か月程度の研究中段を余儀なくされたがおおむね順調に進展していると判断した。今後の研究の推進方策としては、先に示した研究計画手順AからFについて下記の通り実施していく方針である。A)樹立した細胞株の筋上皮細胞への分化誘導能の検討、B)樹立した細胞株の腺房細胞への分化誘導能の検討、C)三次元培養を用いた細胞塊(Salivary Sphere)および管腔構造細胞塊(Cyst)の作製これら3項目は達成したが、その再現性と質については定期的に評価を繰り返していく必要がある。そのため、今後の研究を進めて行く中でも培養条件の検討を行っていく方針である。次にDからFの3項目については、次に示す通りである。D)核型解析:G-band法、Q-band法、FISH解析を検討しているが、まずはFISH解析を行う予定である。E)幹細胞、前駆細胞マーカーの発現確認:唾液腺における幹細胞マーカーは未だ同定されていないが、文献上では導管周囲に存在する未分化な細胞はCD117、CD24、CD29、CD49f、Sca-1、Musashi-1、CD44などの細胞表面抗原を発現していることが報告されており(Sarah Pringle etal: STEMCELLS. 2012)既報を参考に樹立した細胞株での発現を解析する方針である。F)CARS顕微鏡を用いた腺組織分泌機能評価アッセイ系の確立:管腔構造を有したCystを用いて、ピロカルピン塩酸塩やカルバコール刺激に対する水分泌動態をCARS顕微鏡で観察し、微小管腔の分泌機能評価アッセイ系の確立を目指す方針であるが、まずは予備実験として細胞内カルシウムイオン測定を行う予定である。樹立した細胞株は0.1%

ゼラチンコートを行った接着培養系にて低カルシウム、無血清、コレラトキシン含有のCnT-07培地を用いて継代培養を行い、100継代を超えてからも免疫組織化学染色ではkeratin-14、keratin-18、p63陽性であり唾液腺導管上皮基底細胞と同様の表現型を維持している。導管上皮基底細胞群には増殖能が高い細胞が多いと報告されており(Sarah Pringle etal: STEM CELLS.2012)、当該年度は培養条件を変更することで筋上皮細胞・腺房細胞への分化誘導を検討した。1mMカルシウムおよび5%血清、さらに5ng/mlのTGF-β1添加刺激により筋上皮細胞マーカーであるα-SMA陽性細胞が得られ、すなわち筋上皮細胞様細胞の分化誘導が可能となったが、安定供給が可能な培地を引き続き検討中である。腺房細胞への分化誘導は、三次元培養法が主軸である。コラーゲンゲル上では管腔構造細胞塊(Cyst)、コラーゲンゲル内では細胞塊(Salivary Sphere)が形成できており、免疫組織化学染色ではAQP5陽性であることから、引き続き遺伝子発現量解析を行う。本研究課題は以下のAからFの順番で研究を進める研究計画としている。A)樹立した細胞株の筋上皮細胞への分化誘導能の検討、B)樹立した細胞株の腺房細胞への分化誘導能の検討, C)三次元培養を用いた細胞塊(Salivary Sphere)および管腔構造細胞塊(Cyst)の作製、D)核型解析、E)幹細胞、前駆細胞マーカーの発現確認、F)CARS顕微鏡を用いた腺組織分泌機能評価アッセイ系の確立当該年度はA,B,Cまでの研究計画手順を遂行することができた。一方で2019年4月から人事異動に伴い所属研究機関を変更、また学術研究助成基金助成金の移管に伴い、約4か月程度の研究中段を余儀なくされたがおおむね順調に進展していると判断した。今後の研究の推進方策としては、先に示した研究計画手順AからFについて下記の通り実施していく方針である。A)樹立した細胞株の筋上皮細胞への分化誘導能の検討、B)樹立した細胞株の腺房細胞への分化誘導能の検討、C)三次元培養を用いた細胞塊(Salivary Sphere)および管腔構造細胞塊(Cyst)の作製これら3項目は達成したが、その再現性と質については定期的に評価を繰り返していく必要がある。そのため、今後の研究を進めて行く中でも培養条件の検討を行っていく方針である。次にDからFの3項目については、次に示す通りである。D)核型解析:G-band法、Q-band法、FISH解析を検討しているが、まずはFISH解析を行う予定である。E)幹細胞、前駆細胞マーカーの発現確認:唾液腺における幹細胞マーカーは未だ同定されていないが、文献上では導管周囲に存在する未分化な細胞はCD117、CD24、CD29、CD49f、Sca-1、Musashi-1、CD44などの細胞表面抗原を発現していることが報告されており(Sarah Pringle etal: STEMCELLS. 2012)既報を参考に樹立した細胞株での発現を解析する方針である。F)CARS顕微鏡を用いた腺組織分泌機能評価アッセイ系の確立:管腔構造を有したCystを用いて、ピロカルピン塩酸塩やカルバコール刺激に対する水分泌動態をCARS顕微鏡で観察し、微小管腔の分泌機能評価アッセイ系の確立を目指す方針であるが、まずは予備実験として細胞内カルシウムイオン測定を行う予定である。
人工細胞膜を用いる難治性疾患ナノ治療システムの展開 -がん治療を中心に-

研究代表者らが創製したハイブリッドリポソーム(HL)は、有機溶媒を用いることなく、緩衝溶液中でベシクル分子(リン脂質)とミセル分子を超音波照射するだけで調製できるナノ粒子であり、「素材や組成比の選択によって膜直径や相転移温度、流動性といった物性を制御できる」特徴がある。本研究では、HLのがん治療に関する以下の興味深い知見が得られた。(A)電子顕微鏡観察および動的光散乱法により、リン脂質(DMPC)とPEG系界面活性剤(C12(EO)n:n=2125)からなるHLの膜直径は、調製直後から1ヶ月以上、約80nmの膜直径を維持することが明らかになった。(B)in vitroにおいて,薬物を含有させずに種々のがん細胞に対する顕著な増殖抑制効果が明らかになった。(C)HLは、がん細胞へ特異的に融合・蓄積し、ミトコンドリアへシグナルが伝達され、カスパーゼを活性化し、最終的に核内におけるDNAを断片化するという、アポトーシス誘導経路が明らかになった。(D)HLの膜流動性とがん増殖抑制効果の間に良好な相関関係が観測され、HLの流動性が高いほど制がん効果が大きいことを初めて明らかにした。(E)in vivoでは、種々の担がんモデルマウスを用いた治療実験において、顕著な延命効果が得られた。(F)生命倫理委員会の承認後、悪性リンパ腫の患者に対する臨床試験において、高い安全性及び固形リンパ腫瘍の顕著な縮小効果が得られた。HLは、がん細胞膜をターゲットとする新しいがん化学療法の可能性が高い。多価不飽和脂肪酸(PUFA)の制がん効果に注目し、リン脂質(DMPC)と非イオン性ミセル界面活性剤(Tween 80)からなるハイブリッドリポソームにPUFAを含有させ、肺腺がん細胞、大腸がん細胞および胃がん細胞に対する増殖抑制効果を検討した。PUFA含有ハイブリッドリポソームは、すべてのがん細胞に対して増殖抑制効果を示したが、n-6系のリノール酸は脂質過酸化反応による細胞傷害でネクローシスを誘導し、n-3系のドコサヘキサエン酸では細胞のプログラム死であるアポトーシスを誘導していることが明らかになった。ハイブリッドリポソームに多価不飽和脂肪酸を含有させることで、がん細胞に対して異なる細胞死(ネクローシスとアポトーシス)を誘導できることをはじめて明らかにした。(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 18 (6), 1880-1883 (2008))ハイブリッドリポソーム(HL)の「流動性」が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染細胞の増殖抑制と深く関係していることをin vitroで初めて明らかとした。すなわち、リン脂質(DMPC)及びPEG系界面活性剤(C_<12>(EO)_n: n=425)から成るHLのHIV慢性感染(MOLT-4/IIIB)細胞に対する50%細胞増殖抑制濃度(IC_<50>)とHLの膜流動性との間に良好な相関性を明らかにした。さらに、HLは、HIV潜伏感染(J22-HL-60)細胞に対して、ウイルス産生を増大する結果を得た。ウイルスを産生した細胞は、同時に死滅していることも分かった。これらの知見は、エイズの治療をサポートする新しい薬剤となる可能性を示唆する。(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 18 (16), 4578-4580 (2008))。リン脂質(DMPC)およびPEG系界面活性剤(C_<12>(EO)_<21>)からなるハイブリッドリポソーム(HL-21)は、乳がんモデルマウスに対する治療実験において、治療開始時と腫瘍容積が変わらず顕著な腫瘍の腫瘍抑制効果が確認された。一方、DMPCリポソーム治療群では腫瘍縮小効果は見られなかった。次に、TUNEL法によりアポトーシス誘導を検討したところ、固形腫瘍の抑制効果を示したHL-21治療群において、アポトーシス細胞が多く観察された。

以上の結果から、in vivoにおいて、HL-21は乳がんモデルマウスに対してアポトーシス誘導による抗腫瘍効果を示すことが今回初めて明らかになった。(Chemistry Letters,38,134(2009).)HLの大腸がんの肝転移抑制に関する基礎研究から以下のような興味深い知見が得られた。(a)HLは、マウス大腸がん(Colon26)細胞に対し、細胞膜に融合蓄積後、アポトーシス誘導により増殖抑制効果を示すことを明らかにした。(b)蛍光染色したColon26細胞の肝転移を視覚的に確認した。(c)HL投与群において、肝臓および脾臓の体重比器官重量の減少が確認された。(d)HE染色による切片観察より、HL投与群が正常群と同様の組織の状態に回復した。(e)TUNEL法による観察より、HL投与群においてアポトーシス誘導が確認された。(f)HLを静脈投与した肝転移モデルマウスにおいて血液毒性がなく、高い安全性が示唆された。薬剤を含まないHLは、大腸がん肝転移モデルマウスに対して、アポトーシス誘導により治療効果を示すことが示唆され、臨床への応用が期待できる。(薬学雑誌,129,465(2009).)リン脂質(DMPC)およびPEG系界面活性剤(C_<12>(EO)_<21>)から成るハイブリッドリポソーム(HL-21)のエイズ関連悪性リンパ腫の一種であるPrimary Effusion Lymphoma(PEL)に対する細胞増殖抑制効果とアポトーシス誘導について検討した。HL-21は、PEL細胞に対して顕著な細胞増殖抑制効果を示し、カスペースの活性化を経てアポトーシスを誘導することがin vitroで明らかとなった。また、HL-21は正常細胞への融合蓄積量が低く、PEL細胞特異的に融合蓄積し、膜の流動性を増加させた。PELのマウスモデルに対するHL-21の治療効果を検討した。HL-21は、PELモデルマウスにおいて明らかな腹水の蓄積抑制効果を示し、副作用もなかった。以上の結果より、HL-21が正常細胞には影響を与えず、腫瘍細胞特異的に融合蓄積し、細胞増殖を抑制することが明らかになった。(Leukemia Res.,34,906-911(2010))DMPCおよびC_<12>(EO)_<23>から成るHL-23のヒト肺非小細胞がん(NSCLC)に対する細胞増殖抑制効果についてin vitroで検討した。HL-23は、がん細胞の増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導した。さらに、蛍光脂質含有HL-23は、正常肺細胞と比較して、膜の揺らぎの大きなヒト肺非小がん細胞のみに融合蓄積した。ハイブリッドリポソームは、現在まで有効な治療法が確立していない、ヒト肺非小細胞がんに対する新規治療薬としての可能性が期待できる。(薬学雑誌,130,1581-1587(2010))
糖尿病網膜症における筋繊維芽細胞増殖の分子機作

糖尿病性血管病変を代表する疾患である糖尿病網膜症において、新生血管が重要な因子であることは周知の事実であるが、その詳細な病態は今もって不明な点が多い。また、進行した糖尿病網膜症においてなぜ牽引性網膜剥離が生じるのか、その分子機作は明らかになっていない。増殖性網膜症における索引性網膜剥離は、従来線維芽細胞が産生する細胞外マトリクスの蓄積に基づくと考えられてきたが、申請者は筋線維芽細胞などの平滑筋様細胞が積極的に張力を発生した結果であると考えている。事実、同様の現象は動脈硬化・肺線維症・肝線維症・糸球体腎炎でも観察されている。それぞれの病態では平滑筋様細胞の遊走・増殖が主要原因と考えられているが、進行病変では組織の過収縮を伴う。申請者と祖父江らはこれらの病態を包括してMyofibroblastosis(筋線維芽細胞症)として捉えることを提唱してきた。本研究は、新たに糖尿病網膜症を筋線維芽細胞症の一疾患として捉え、その発症機序を明らかにすることを目的として立案した。我々は平滑筋細胞初代培養系を用いて、不飽和リゾフォスファチジン酸(LPA)が強力な脱分化・増殖作用を有していることを確認し、動物実験モデルにおいても、in vivoで不飽和LPAが筋繊維芽細胞の増殖を引き起こすことを確認した(Circulation 108:1746,2003)。また、conditioned medium中に含まれる脱分化誘導因子の検索をおこなったところ、EGFファミリーのひとつであるEpiregulinがERKおよびp38MAPKの活性化を介して、平滑筋様細胞の形質転換を惹起することを明らかにした(Circulation 108:2524,2003)。糖尿病網膜症患者の増殖膜中においても、EGFファミリーの発現と筋繊維芽細胞の増殖を認め、動脈硬化病変と糖尿病網膜症は、極めて類似した病態に基づいていていることが明らかになった。平成15年度は、糖尿病網膜症患者の組織病変解析を行うために、具体的な解析方法について様々な検討を行った。最初は、手術中に切除された組織片をその場で急速凍結し、クリオスタットで作成した新鮮凍結切片に対して、組織染色を行った。しかしながら、組織が微量である上に、急速凍結では組織崩壊が著しく、解析には使用できなかった。そこで、パラホルムアルデヒドによる固定を行った後に、パラフィン包埋を行い、ミクロトームで切片を切り出した。結果、組織崩壊は認められず、良好な組織像を得た。ただし、通常の免疫染色では、各種細胞や微細構造の同定が難しかったため、さらに電子顕微鏡による解析を行うこととした。当初、様々な固定方法を試みたが、固定が不十分であるなど問題が多発。最終的には、1%パラホルムアルデヒド/0.2%グルタラールアルデヒドによる短時間の固定の後、LR White Resinによる包埋を行うことで、良好な電子顕微鏡像を得ることができた。既に、Post-embedding法により、αsmooth muscle actin, von Willebrand factor抗体を用いた二重染色に成功し、現在患者組織を解析している最中である。組織学的アプローチと同時に、切除組織を用いた組織培養も施行中である。術後切除された増殖膜を細片化し、10%FCS下でExpalnt法を用いて、増殖細胞を得ている。さらに、増殖した細胞を継代し、無血清培地にVEGFなどの各種増殖因子を加えることで、その反応性を検討し、同時に細胞内の組織構造を電子顕微鏡にて解析し、組織中の細胞形態との比較検討を行っている。