hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線条体ドーパミンシナプス接着分子の機能形態解析

中脳ドーパミンニューロンは線条体においてドーパミンシナプスを多数形成し、運動調節や認知行動において不可欠な役割を担っているが、その基盤となるドーパミンシナプスを構成する分子は不明であった。本研究はドーパミンシナプスがドーパミン作動性のシナプス前部とGABA作動性のシナプス後部により構成されるユニークな接着構造であることを突き止め、さらにこの接着構造の形成にシナプス接着分子であるニューロリギン2が関与することを明らかにした。随意運動や報酬行動に関与する線条体は、中脳黒質から豊富なドーパミン投射を受けることによってその機能が制御される。黒質ドーパミンニューロンは線条体ニューロンに対してドーパミンシナプスと呼ばれる電子顕微鏡的にGABAシナプスと相同な構造を形成することが知られるが、その分子基盤が明らかにされていないことから実質的なシナプスと呼べる構造であるかどうかは不明である。本研究は線条体ドーパミンシナプスの分子形態学的基盤を解析することでドーパミン神経伝達におけるドーパミンシナプスの役割を解明することを目的としている。平成25年度はドーパミンシナプスがグルタミン酸シナプスやGABAシナプスと同様のシナプス接着分子によって誘導されるかどうかを検討するため、ドーパミンニューロンと非ニューロン細胞を用いた共培養系を確立した。これを用いることにより、ドーパミンシナプスは他のシナプスと同じようにニューロリジンによって誘導可能であることを明らかにした。さらに、マウス組織を用いた蛍光多重染色法および包埋後免疫電子顕微鏡法により、ドーパミンシナプスのシナプス後膜ではGABAシナプス選択的な発現が知られるニューロリジン2が検出され、その発現強度もGABAシナプスとほぼ同等であった。以上から、ドーパミンシナプスはGABAシナプス形成に関与するニューロリジン2を介して形成され、GABAシナプスと共通の分子基盤を有している可能性が考えられる。今後はニューロリジン2の足場となる分子やドーパミン放出に関連する分子発現の検討を進め、ドーパミンシナプスの構成分子を明らかにする予定である。まず、包埋後免疫電子顕微鏡法を用いてマウス線条体ドーパミンシナプスにおける分子発現解析を行った。ドーパミンシナプスのポストシナプスでは、前年度に報告した抑制性シナプス選択的なシナプス接着分子であるニューロリジン2に加え、GABAA受容体やその足場タンパクであるゲフィリンが検出されたが、ドーパミン受容体の集積傾向は認められなかった。一方、そのプレシナプスではドーパミン放出に必要な分子機構は整っていたがGABAはほとんど検出されず、ドーパミンシナプスは受容体と伝達物質が一致しない特殊な接着構造を形成していることが示唆された。次に、レンチウイルスベクターを用いた単一線条体ニューロン標識と蛍光免疫染色を組み合わせることによってドーパミンシナプスの標的ニューロンの検討を行ったところ、ドーパミンシナプスはドーパミン受容体を豊富に発現する線条体投射型ニューロンの樹状突起やスパインに多く形成される傾向を認めた。さらに、線条体投射型ニューロンにおいてレンチウイルスベクターを介してニューロリジン2をノックダウンさせると、ドーパミンシナプスの数が減少することを見出した。以上のことから、ドーパミンシナプスはドーパミン受容体を豊富に備えた標的ニューロンに対してGABAシナプスと共通の分子を介してドーパミンの放出部位を係留させることにより、ドーパミン伝達に強度と選択性を与える分子装置であり、この形成にニューロリジン2が重要な役割を担っていることが明らかになった。神経解剖学平成25年度は本研究課題の最も鍵となるドーパミンシナプスのシナプス接着に関連する分子を機能および局在の両側面から同定することができており、順調な進展と考えている。平成25年度に同定したドーパミンシナプス分子と関連する分子に着目しながら主に免疫組織化学的手法を用いてドーパミンシナプスの分子構成を明らかにする予定である。輸入マウスを平成25年度中に発注したが年度内に納品されなかったため、その費用の一部を次年度へと持ち越したため。輸入マウスの購入費用に充てる予定である。
肝樹状細胞の性状と機能の解析

本研究は、非リンパ系器官の内特に肝臓に分布する樹状細胞の表現型や機能等の性状解析を目的としたものである。既知の樹状細胞の性状をそのまま肝臓に当てはめると、非常に僅かしか樹状細胞が存在しないことになる。しかし、より未熟な細胞が存在するために異なる表現型を呈する可能性が考えらため、骨髄由来樹状細胞の分化成熟度と細胞表面マーカーの発現様態との関連を明らかにすることが先決であると考え、それをもとに肝樹状細胞の性状解析をリンパ系器官樹状細胞と比較しつつ進めることにした。肝組織をコラゲナーゼ処理により得られる白血球分画を細胞のサイズと、CD11c抗体と種々の抗体で二重染色し表現型を検討したところ、以下のような分化成熟程度の異なる少なくとも3種の樹状細胞が存在していることが示された。先ず、小型のCD11c陽性細胞は、リンパ球マーカーを発現しておらず、多くがMHCクラスII陰性であった。しかし、中型の細胞ではMHCクラスIIの発現がやや高まると同時に、HSAの発現強度も増しており、2.4G2(FcRII)やMac-1(CD11b/CD18)も検出された。一方、大型のCD11c陽性細胞はMHCクラスII強陽性でしかもB7-2(CD86)も弱陽性であった。そこで、これらの細胞を2-3日間GM-CSF存在下で培養したところ、小型のCD11c陽性細胞は消失し、大型のCD11c陽性細胞比率の上昇と共に、MHCクラスIIならびにB7-2(CD86)の発現増強が認められた。さらに、固定透過処理により大型の細胞中にDEC-205陽性細胞の存在が確認された。一方、組織学的には、CD11c陽性細胞は門脈三分岐域以外に肝実質部や胆管上皮下などに存在することが確認された。しかし、MHCクラスII陽性細胞は、門脈三分岐近傍には認められたが、肝実質部には少なく、MHCクラスIIの発現程度も微弱であった。DEC-205を発現する細胞は門脈三分岐近傍に僅かに認められただけであった。マウスの肝臓を門脈より37°Cに加温したリン酸緩衝生理食塩水とコラゲナーゼ液により灌流した後、組織をほぐして得られる細胞より白血球分画を精製し、CD11c陽性細胞を樹状細胞とみなすと、その割合はおよそ1%程度と算定された。これらの細胞を種々の抗体と二重染色したところ、MHCクラスII抗原の発現が他の組織由来の培養樹状細胞に比べ微弱であることが示された。また、このMHCクラスII抗原の発現においても、中程度もののとほとんど陰性の2種の集団の存在が示された。そして、F4/80,Mac-1,FA11,CD14等マクロファージ同定の指標とされる種々の分子に関しては微量ではあるが検出された。一方、ICAM-1,B7-1,B7-2,VLA-4等の、細胞接着・共刺激分子の発現についても検討したが、これらのいずれの発現も非常に弱くしか認められなかった。これらの結果は、他の組織から調製される新鮮な樹状細胞と同様の表現型あるいはより未成熟な細胞が含まれる可能性を示唆している。

脾樹状細胞に比べより未成熟と考えられるランゲルハンス細胞に貪食能が認められるとの報告を考慮し、ラッテクス粒子や特異抗体被覆ヒツジ赤血球を用いて貪食能の有無を検討してみたが、結果はネガティブであった。ランゲルハンス細胞を代表例とし、脾樹状細胞なども培養することにより、MHCクラスII抗原のみならず種々の細胞接着・共刺激分子の発現量が著名に増加し、強力なT細胞活性化機能を獲得することが知られている。そこで、先の方法で調製した白血球画分の細胞を培養して、その表現型の変化を検討したが、これら分子の発現増加はそれほど顕著ではなかった。そこで、培養にGM-CSFを添加してみたが、大きな改善は認められなかった。この結果は、肝白血球分画に樹状細胞の成熟を抑制する細胞の存在を示唆するものかもしれない。肝組織をコラゲナーゼ処理により得られる白血球分画を細胞のサイズをFSCとSSCで検討すると同時に、CD11c抗体と種々の抗体で二重染色し、樹状細胞の性状を検討した。その結果、小リンパ球とほぼ同じサイズのCD11c陽性細胞では、それらの60-70%の細胞はMHCクラスII陰性であり、残りも弱陽性にすぎなかった。また、MHCクラスII陰性細胞では他の細胞表面マーカーもほとんど検出されなかった。しかし、中型の細胞ではMHCクラスIIの発現がやや高まると同時に、HSAの発現強度も増しており、2.4G2(FcRII)やMac-1(CD11b/CD18)だけでなく、c-fmsの発現も検出された。一方、大型の細胞分画はほとんどがCD11c陽性であり、MHCクラスII強陽性でしかもB7-2(CD86)も程度は低いが発現されていることが明らかになった。さらに、これらの細胞を2-3日間GM-CSF存在下で培養することにより、小型のCD11c陽性細胞はほとんど認められなくなり、大型のCD11c陽性細胞比率の上昇と共に、MHCクラスIIならびにB7-2(CD86)も増強されていることが示された。また、これらの細胞表面にはほとんどDEC-205の発現は検出されなかった。しかし、固定透過処理により大型の細胞の多くがDEC-205陽性であることが明らかになった。実際に、組織において樹状細胞の分布を検討すると、CD11c陽性細胞は門脈三分岐域以外に肝実質部や胆管上皮下などに存在することが確認された。しかし、DEC-205を発現する細胞は門脈三分岐近傍に僅かに認められただけである。一方、MHCクラスIIの発現を指標にすると、門脈三分岐近傍では比較的陽性度の高い細胞が多く認められたが、肝実質部には少なく、MHCクラスIIの発現程度も微弱であった。以上の結果より、肝臓には分化成熟程度の異なる少なくとも3種の樹状細胞が存在していることが明らかである。
p53とAMPKが織りなす多階層的ながん抑制システムの統合解析

近年、転写因子p53による代謝制御が、がんを抑制する上で重要な役割を担っていることが明らかにされている。このp53による代謝制御を介したがん抑制メカニズムでは、がん治療上の標的分子の1つである5'-AMP-activated protein kinase (AMPK)の時空間的な活性制御を適切にコントロールする必要がある。しかし、p53がどういったストレス情報に対して、約20あるp53標的代謝関連遺伝子の内、どの代謝関連遺伝子の発現を同時に調節するのか、そして様々な代謝関連遺伝子の協奏的発現調節によって創り出される「細胞内の栄養環境の変化」という情報が、AMPKの活性レベルを時空間的にどのように変化させていくのかは十分に理解されていない。またAMPK活性レベルの細胞内における時空間的な変化がp53からのインプットによってどのように変化するのかについても十分に明らかにされていない。本年度はAMPKの活性レベルを時空間的に評価可能にするために、AMPK特異的なgenetically-encoded FRET-basedbiosensorをオルガネラ膜上に発現させ、それをモニタリングするための技術開発を進めた。その結果、これまでと比べてはるかに空間分解能の高い活性評価システムを確立することに成功した。またその結果、ミトコンドリア膜上において、AMPKの活性レベルは不均一であることも明らかにした。これは従来、細胞質に面しているミトコンドリア膜上は細胞質にあるAMPKによって均一に活性化される可能性が指摘されていたが、そうではなく、同一膜上において活性レベルが厳密に制御されていることを示す新しい解釈を提供するものである。本研究において重要となるAMPKの活性レベルを時空間的に評価できるシステムの確立に成功しているため、おおむね順調に進展していると考えている。今後はAMPKの活性レベルを時空間的に評価する技術をさらに進めると共に、p53による代謝制御がAMPKの時空間的な活性ダイナミクスをどのように変化させるのかを詳細に検討する予定である。
健忘作用獲得のための新しい精神鎮静法の確立

記憶に強く関与するとされているシナプス外に存在するGABAA受容体の1つである、α5β3γ2GABAA受容体をアフリカツメガエル卵母細胞膜上に発現させ、静脈内鎮静法に頻用されているミダゾラムとプロポフォールを作用させその反応について検討した。その結果、ミダゾラムとプロポフォールはα5β3γ2GABAA受容体のGABAによる反応を増強したが、その増強はミダゾラムの方がプロポフォールよりも大きかった。また、ミダゾラムとプロポフォールを同時投与した反応は、ミダゾラム単独およびプロポフォール単独の反応を加算した反応よりも大きく相乗作用がみられた。健忘作用に強く関与すると言われているα5サブユニットを含有するGABAA受容体をアフリカツメガエル卵母細胞膜上に発現させ、各種麻酔薬のα5GABAA受容体に対する作用を電気生理学的手法(voltage clamp法)を用いて検討するための準備をおこなった。これまで我々は、voltage clamp法を用いて得られたデータをアナログでペンレコーダーに記録させ、記録紙の波形データを手作業にて計測解析を行ってきた。本研究では、データ解析をより精密なものにするため、現有のアンプ(Warner社製OC-725C)にPowerLabを接続し得られたアナログデータを、新たに購入したソフトウエアLabChartを用いてデジタル化し解析できるように設定した。一方、GABAA受容体を構成するサブユニットのcDNAは当初依頼した施設から得ることができず、最終的にデンマークのコペンハーゲン大学から11種類のサブユニットプラスミドDNA(α1-6, β1-3, γ2s, δ)を入手できた。現在、これらプラスミドDNAからcRNA作成の実験を急いでいる。つまり、プラスミドDNAをcompetent cellにtransformationさせた後、それぞれのベクターの耐性抗生物質が入ったプレートで培養し、得られたコロニーからplasmid DNAを精製した後シークエンスを行い確認する。これらプラスミドDNAに問題がなければ、プラスミドDNAからin vitroでcRNAを作成する。その後、それぞれのサブユニットcRNAを組み合わせアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションし、voltage clamp法を用いてデータを獲得し解析を行う予定である。入手した11種類のGABAA受容体サブユニットのプラスミドDNA(α1-6, β1-3, γ2s, δ)からそれぞれのcRNAの生成をおこなった。つまり、プラスミドDNAをcompetent cellにtransformationさせた後、それぞれのベクター(pcDNA3.1、pCDM8)の耐性抗生物質が入ったプレートで培養し、得られたコロニーからプラスミドDNAを精製した。プラスミドDNAを制限酵素にて切断した後、in vitrotranscription kitを用いてcRNAを作成した。作成したcRNAを目的とするGABAA受容体であるα5GABA受容体を構築するため、α5、β3、γ2のcRNAを混合したものをアフリカツメガエル卵母細胞内にマイクロインジェクションし、卵母細胞膜上にα5GABA受容体を発現させる。つまり、cRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞を23日間低温(18度)培養し、膜上に発現したGABA受容体蛋白を発現させる。現在、α5GABAA受容体の発現を確認している。発現が確認されれば電気生理学的手法(voltage clamp法)を用いてGABA電流を測定する。つまり、現有するアンプ(Warner社製OC-725C)で電流を測定しソフトウエアLabChartで解析を行っていく予定である。ミダゾラムとプロポフォール同時投与によりどの程度の相乗作用が得られるかについて詳細に検討を行っていく。GABAA受容体を構成する各サブユニットを含むプラスミドDNAよりin vitro transcriptionにより各サブユニットのcRNAを作製した。アフリカツメガエル卵母細胞に各サブユニットのcRNAを組合せ配合したものをマイクロインジェクションし、2日間培養後目的のGABAA受容体を卵母細胞膜上に発現させた。その後、voltage-clamp法によりGABAA受容体の機能を解析した。今回は、記憶に強く関与するとされているシナプス外に存在するGABAA受容体の1つである、α5β3γ2GABAA受容体について検討した。静脈内鎮静法において頻用されているベンゾジアゼピン系薬剤であるミダゾラムと全身麻酔薬であるプロポフォールが、このα5β3γ2GABAA受容体に対してどのように作用するかについて調べた。その結果、α5β3γ2GABAA受容体はGABA(1μM1 mM)に対して濃度依存性に反応した。そのGABAによる反応は、拮抗薬であるピクロトキシン(10 μM)により抑制された。ミダゾラム(110μM)とプロポフォール(10100μM)はα5β3γ2GABAA受容体のGABAによる反応を増強したが、その増強はミダゾラムの方がプロポフォールよりも大きかった。

また、ミダゾラムとプロポフォールを同時投与した反応は、ミダゾラム単独およびプロポフォール単独の反応を加算した反応よりも大きく相乗作用がみられた。GABAA受容体サブユニットプラスミドDNAの入手が予定よりも半年間以上遅れたことが主原因である。しかしながら、電気生理学的解析法voltage clamp法に用いる機器、データ解析手段およびアフリカツメガエルの準備はできているため、卵母細胞膜上にα5GABAA受容体の発現が確認さえできればデータ取得まで時間は要しないと考えている。医歯薬学(歯学)アフリカツメガエル卵母細胞を用いた蛋白機能解析方法は、voltage clamp法によるデータ取得よりも卵母細胞膜上に目的とする蛋白を発現させるまでの実験過程が最も大切で時間もかかる。この過程の中で失敗があるとデータを得ることが全くできない。したがって、現在行っているそれぞれのGABAA受容体サブユニットのプラスミドDNAからcRNA合成までの過程、および卵母細胞から実際にGABA刺激による電流が正しく取得できることの確認をしっかり行うことが本研究を早くかつ正確におこなう要点であると認識している。一方で、GABA受容体の研究を行っている研究者から情報交換をおこない、本研究ができるだけ早く進むよう準備を怠らないようにしたい。予定していたGABAA受容体サブユニットプラスミドDNAの入手が遅れたことが原因である。複数の海外施設にGABAA受容体を構成する11種類のサブユニットプラスミドDNAを依頼したが送付を拒否されたためである。現在はプラスミドDNAからcRNA作成までの分子生物学的実験が終了した段階であり、今後シークエンスなど最も費用がかかる実験が残っており、次年度使用額が生じた。今回使用するプラスミドDNAは11種類と多いためcRNAを作成するまでに多くの時間を要することが予想されるため、入手したプラスミドDNAからcRNA作成する分子生物実験を急ぐ必要があると考えている。電気生理学的手法についての準備はすでに整っているので、作成したcRNAに問題さえなければデータ取得までの時間はそれほどかからないと考えている。もしアフリカツメガエル卵母細胞への各種GABA受容体蛋白の発現に問題が生じた場合には、他施設に新たにプラスミドDNAの手配ができるよう準備を怠らないようにしたいと考えている。プラスミドDNAからcRNA作成までに必要な試薬類(制限酵素含む)、シークエンス解析および電気生理学的実験に関する試薬類などに多くの予算を使用する予定である。また、興味ある実験結果が得られれば学会等での発表にも経費を使用する予定である。プラスミドDNAからcRNA作成までの分子生物実験には様々な試薬(制限酵素など)を必要とするが、DNAがどのようなベクターに入っているかなどの情報によって購入する試薬は異なってくる。プラスミドDNAの入手が遅れベクターなどの情報がなく試薬の購入ができなかったため、次年度使用額が生じた。
製品開発活動における顧客インタフェース・プロセスの研究:携帯端末開発の日米比較

本研究では、日本と米国をはじめとした海外との携帯電話端末開発の比較により、顧客企業(通信事業者)向けのインタフェース・プロセスが、国内外間で異なることを示した。そのなかで、顧客の通信事業者の知識に依存しない汎用的な開発プロセスと、顧客に固有の知識とは明確に区別できることが明らかとなった。さらに、国内外間で違いはあるものの、顧客インタフェース・プロセスは、開発プロセスそのものではなく、むしろ戦略的な自社開発領域の設定と仕組み作りに求められるようになっていることが示された。平成18年度は、日米中韓において、携帯電話端末メーカー、通信事業者、小売/卸業者、デザインハウス、チップ/ソフトウェア・ベンダーに対してインタビュー調査を行った。同時に、関連する資料やコンファレンスを通じ、基本的な情報収集を進めた。こうした調査を通じて、日米中韓の携帯電話産業における端末の開発活動や端末流通のパターンを相互に対比させ、端末開発活動について検討を行った。その結果、地域間でコア部品(チップセット)から端末流通に至るまでのサプライ・チェーンの相違とともに、地域間にわたって共通の動向も確認できた。日本国内と比べ、とくに米・中においては、企画や開発のプロセスが特定の通信事業者に依存する傾向はほぼ見られず、様々な通信事業者向けに汎用性の高い端末が開発されている。一方、これらの地域においても、一部の日本メーカーや米中韓メーカー(とくに韓国メーカー)が、通信事業者の要望によりカスタマイズした端末(operator-branded phone)を供給しつつある。顧客の通信事業者を製品企画プロセスに巻き込みながら、顧客に特有の仕様(例えばアプリケーションやインタフェース)の端末を開発するケースが出てきているのである。ただし、これらの企業では、顧客の通信事業者に関わらず、一定の企画・開発プロセスが採用される傾向にある。こうした汎用的なプロセスを通じて、上流段階の企画プロセスで顧客に固有の仕様要求に関する知識を吸収する一方で、製品設計以降のプロセスでは企業・機種間に共通の通信コアや製品設計(技術/製品プラットフォーム)を活用して開発が行われる傾向にある。こうした開発活動において顧客に固有の知識を吸収する領域や技術/製品プラットフォームとして共通化されている範囲に違いがあるという点で、日・米間では端末開発活動に違いが生じている可能性が高いことが、ある程度確認できた。平成19年度は、日米中台において携帯電話端末メーカー、通信事業者、デザインハウス、ODMベンダー、チップ/ソフトウェア・ベンダーに対して、インタビュー調査を行った。同時に、関連する資料やコンファレンスを通じ、産業構造、業界動向、技術についてのより詳細な情報の収集を進めた。こうした調査の成果を総合し、顧客通信事業者に特有の知識と関連したプラットフォーム(コア・チップと関連ソフト・サービス)活用について検討した。日米と比べ、中国においては、企画や開発のプロセスが特定の通信事業者固有の知識に依存する傾向は皆無に近く、標準プラットフォームを土台に汎用性の高い端末が開発されている。一方、日米では顧客通信事業者への対応やプラットフォーム開発におけるメーカーのシステム知識活用については共通性があるものの、明確な相違が存在する。日本では共通プラットフォームが、大手2通信事業者、ベンダー、メーカー間で共同開発・導入されており、顧客固有の基本的な技術要件は開発上流のプラットフォーム開発において反映されている。これに対し、米国では、こうした共同開発プラットフォームは皆無である。メーカーはベンダーの標準プラットフォーム開発に協力することはあるが、顧客に特有の仕様は案件に応じて開発中流以降のプロセスで作りこんでいる。いずれの地域においても、開発効率向上のため共通プラットフォーム活用によって、開発におけるシステム統合の多くが代替されている。しかし、顧客に特殊な知識が活かされる領域の違いにより、プラットフォームの範囲/汎用性、それに応じたメーカー側のシステム知識活用の範囲、対顧客インタフェースのあり方には相違が生じている。このように、顧客に特殊な知識を吸収する領域やそれに応じたプラットフォームの範囲/汎用性が、開発におけるシステム統合や関連する企業間関係に影響していることが、明らかにされた。(794字)平成20年度は、インタビュー調査、資料収集、コンファレンス参加、学会・論文発表を実施し、以下の点を明らかにした。2000年代以降、世界的に、通信サービスと結びついた機能の拡張にともない開発を効率化する必要が高まった。こうして、とくにソフトウェアやICのレベルでは、特定の通信事業者固有のローカル知識に依存する部分、業界で標準化されたプラットフォーム部分、そしてメーカー固有のシステム知識に関わる部分が分離され、企業間ネットワークのなかで別々に開発されるようになった。例えば、米国では、メーカー間で共通化できる部分は業界で標準化し、それをもとに各メーカーが自社プラットフォームを築いたうえで、アプリケーションやサービス運用といった通信事業者に固有の部分を限定して搭載してきた。しかしながら、いち早く高機能化の進んだ日本では、通信事業者の主導のもと、通信事業者に固有のソフトウェアが標準化されパッケージ化されてきた。このため、通信事業者固有のローカル知識に依存する部分と標準化されたプラットフォーム部分は分離されず、メーカーは結局は通信事業者毎にシステム知識を発達させ端末を開発せざるをえなかった。だが、国際化の必要に迫られ、日本でも同様に通信事業者部分を限定するようになった。

以上の国際的な流れのなかで、日米はじめ世界の携帯電話メーカーは、業界標準部分を組み込んで自社のシステム知識を活かした固有部分を作り込んでおき、そのうえでなるべく下流の開発プロセスでアプリケーションやサービス運用といった顧客に特殊なローカル知識を作り込むようになってきた。このように、それぞれの開発を分離可能とするモジュール構造のインタフェースが業界レベルでも企業のレベルでも階層的に整備されることで、顧客に特殊な知識に製品開発が左右される範囲は限定されるに至り、製品開発のオープン化が進んだことが、明らかとなった。
協調作業を考慮した自律走行クレーンのリアルタイム搬送制御システムの開発

FMS(Flexible Manufacturing System)の運用を考える際、各種生産工程間における搬送システムは重要な要素であり、これらのシステムに関し、国内外で多くの研究、開発が行われている。しかし、それらの研究では、2次元平面を移動する自律搬送システムに関する研究が主であり、3次元空間を移動する自律走行クレーンに関する報告はされていないのが現状である。天井クレーンは、(1)敷地内の上下方向を移動することにより、敷地面積をとらない、(2)3次元空間を自由に移動することで敷地内に置かれた障害物を回避するなどのフレキシビリティがある、(3)搬送システムを構築する際のコストが少なくてすむなど、2次元の搬送システムに比べてその利点は多く、応用範囲も広いと考えられ、FMSの運用の自由度を高めるためにも、その自動化が望まれる。そこで本研究では、I)移動障害物のリアルタイムでの認識と回避、II)地上を移動する搬送車との協調作業が行える自律走行天井クレーンシステムの開発を行った。まず、(a)レーザーラインマーカーとCCDカメラを用い光切断法によりオフラインでの障害物の認識を行い、それによって得られた画像データから障害物の位置と高さの情報をもつ環境地図を自動生成するシステム。(b)環境地図から分枝限定法を用い、任意のスタートからゴールに至る最短距離経路や最小エネルギー経路の条件を満たす最適経路を自動生成するシステム。(c)荷位置の情報に着目したモデルの導出およびそのモデルに基づいた搬送制御系を最適サーボ系を適用し、(b)で生成された経路に追従し、搬送中や搬送終了時の荷振れを抑制する搬送制御システムを構築し、これらを統合した自律走行クレーンシステムの開発を行った。また、リアルタイムでの障害物回避経路の探索をポテンシャル法で行い、地上の移動障害物との協調作業を行えるシステムの構築を行った。しかし、それらの研究では、2次元平面を移動する自律搬送システム(自律走行車等)に関する研究が主であり、3次元空間を移動する自律走行クレーンに関する報告はされていないのが現状である。(c)荷位置の情報に着目したモデルの導出およびそのモデルに基づいた搬送制御系を最適サーボ系を適用し、(b)で生成された経路に追従し、搬送中や搬送終了時の荷振れを制御する搬送制御システムを構築し、これらを統合した自律走行クレーンシステムの開発を行った。今後は、リアルタイムでの障害物回避経路の探索をポテンシャル法で行い、地上の移動障害物との協調作業を行えるシステムの構築をファジイ制御などを用いて行う計画である。
リスク規制における政治と行政：比較政策分析の視点から

本研究の目的は、日本における環境や健康に関するリスク規制を政策領域横断的に比較分析することで、規制内容に影響を与える要因を多角的に分析することである。本研究ではこれまでの研究に基づき、リスク規制の内容に違いが生じる要因について、政治制度が規制主体に与える権限によって生じるものと考えることに加え、リスク規制に対する社会的関心が高いかそうでないかによって、規制主体の権限行使の態様も変化すると考える。このため、社会的関心の高低にも着目することより、規制内容に違いが生じるメカニズムを明らかにすることを目指す。2018年度は、主に文献調査を行うことで分析枠組みの見直しや再構築を行った。具体的な理論的課題はリスク規制に関わる制度配置をめぐる歴史的発展分析であった。これまで用いた分析枠組みをさらに発展させて、規制主体の権限、および政治的影響が生じる場合における行政組織の自律性が規制内容に与える影響について規制主体の多様性に対応できるようにこれまでより踏み込んだ分析枠組みの構築を目指した。具体的な事例として、日本の自動車の排気ガス規制と食品安全規制について取り上げ、その歴史的経緯について文献調査を行った。また、環境省の組織の権限や自律性については、内容の一部について学会報告を行った。今後は、こうした内容を理論面・実証面でさらに発展させ、事例分析を踏み込んで行うことにより成果の公表に努める予定である。2018年度は理論的な枠組み構築のために文献調査を中心に行ったため、おおむね計画通りに進展した。2018年度の取り組みを踏まえ、2019年度は事例分析にも踏み込んで分析を行う予定である。分析枠組みを発展させると同時に、事例についても内容がまとまり次第公表に努める。具体的な課題として、第一にリスク規制に関わる制度配置をめぐる歴史的発展分析が挙げられる。これについては、文献調査と事例分析を同時並行ですすめることで、分析枠組みをさらに発展させる。また、第二の課題として社会的な関心の高さ/低さと規制者(行政組織)の政策形成メカニズムの解明であるが挙げられる。規制者の有する権限が社会的な関心の高さ/低さによってどのように規制内容に影響を与えるのかを具体的な事例を用いて分析する予定である。文献調査を中心に行ったことや、海外での学会発表については旅費助成などほかの助成金により執行したため、科研費に次年度使用額が生じた。次年度使用額は、文献の追加購入や資料収集やインタビュー調査を行う際の出張費用として用いる。
種々の培養株化骨芽細胞の樹立とそれらを応用した骨芽細胞の健能の解析法の確立

本研究では独自にいくつかの骨芽細胞様細胞株を樹立し、それらを応用して骨芽細胞の性状と分化過程を解析できる実験系を確立することを目的とし、種々の実験を行い、以下の結果を得た。1.骨芽細胞様細胞株の樹立と性状の解析1)ラット頭蓋冠由来細胞株:1日齢ラット頭蓋冠より5種類のクロ-ン化細胞株(ROBーC8a, C11, C20 C23,C26)を樹立した。各々の細胞株の性状を解析した結果、C11, C20, C23細胞はより成熟した骨芽細胞様細胞で、C26細胞はより味熟な骨芽細胞様細胞と考えられた。また、C8a細胞の分化程度は両者細胞群の中間に位置すると考えられた。興味あることに、C26細胞は細芽細胞以外に筋細胞、脂肪細胞への分化能も持っていたため、未分化間葉系細胞から骨芽細胞、筋細胞、骨髄脂肪細胞への分化過程を検索するのに有用な細胞株であることが明かとなった。2)ヒト骨肉腫由来細胞株:ヒト骨肉腫より2種類のクロ-ン化細胞株(YRー2, YRー6)を樹立し、それらの表現形質をすでに樹立されているヒト骨肉腫細胞株(HOS, SAOSー2, Mg63)の性状と比較した。その結果、各細胞株の表現形質は多様であったため、ヒト骨肉腫細胞を用いて骨芽細胞の研究を行う場合には、各々の細胞株の性状を充分把握しておくことが重要であると考えられた。2.骨芽細胞の分化調節機構の解析骨芽細胞の分化過程で骨誘導因子(BMP)とレチノイン酸が重要であることを明らかにした。1)味熟な骨芽細胞様細胞であるC26にrecombinant human BMPー2(rhBMPー2:Genetics Institute社のWozney博士より供与)を添加すると、C26細胞における骨芽細胞の表現形質が強力に促進され、筋細胞への分化が抑制されることを明らかにした。また、rhBMPー2はマウス胎児由来の線維芽細胞であるC3H10T1/2細胞も骨芽細胞へ分化させることも明らかとなったため、rhBMPー2は未分化間葉系細胞から骨芽細胞への分化過程で重要な役割を担っていると考えられた。2)レチノイン酸はC26細胞のALP活性とPTH応答性を促進し、筋細胞、脂肪細胞への分化を抑制した。そのためレチノイン酸は未分化間葉系細胞から骨芽細胞、骨髄脂肪細胞への分化の振り分けの過程で重要な役割をしていることが示唆された。

本研究では独自にいくつかの株化骨芽細胞を樹立し、それらの性状を検討することにより培養骨芽細胞の性状と機能の多様性を解析する方法を確立するために初年度に種々の実験を行い、以下の結果を得た。(1)ラット頭蓋冠由来のクロ-ン化骨芽細胞様細胞の性状の解析:1日齢ラット頭蓋冠より細胞株を樹立し、それより5種類のクロ-ン化細胞株(ROB-C8a、C11、C20、C23、C26)を樹立した。C11、C20、C23はALPase活性が高く、PTH依存性cAMP産生量も高く、さらにin vitroでの石灰化能も持っており、骨芽細胞の表現形質が強いことが明かとなった。一方、C26はこれらの表現形質が弱く、骨芽細胞への分化度が低く、C8aの骨芽細胞への分化度は中程度であった。興味あることに、C26では骨芽細胞以外に筋細胞、脂肪細胞への強い分化能を持っていた。そのため、これらの細胞は、未分化間葉系細胞から骨芽細胞、筋細胞、骨髄脂肪細胞への分化の振り分けの機構を解析するのに非常に有効な系であると考えられていた。(2)ヒト骨肉腫由来細胞株の樹立と性状の解析:71歳の白人女性の骨肉腫より2種類のクロ-ン化細胞株(YR-2、YR-6)を樹立した。YR-2は高いALPase活性とPTH応答生を持っていたが、osteocalcinの産性能はなかった。一方、YR-6のALPase活性とPTH応答性は低かったが、この細胞株はosteocalcin産性能を有していた。以上のように今回樹立したYR-2とYR-6はヒト骨芽細胞の性状を解析するのに有用な系と考えられた。また、すでに樹立されたヒト骨肉腫由来の細胞株であるHOS、SAOS-2、Mg63の性状を検索した結果、各々の細胞株間で骨芽細胞の表現形質の発現程度に差が有ることも明らかとなった。(3)ヌ-ドマウスへの移植実験:(1)のラット骨芽細胞様細胞をヌ-ドマウス皮下に移植したが、腫瘤形成が見られなかった。(2)のヒト骨肉細胞では、クロ-ニング前の母細胞を移植したところ、皮下に骨肉腫を形成したが、クロ-ニング後のYR-2とYR-6では腫瘍形成が見られなかった。(4)Diffusion Chamber移植実験:DiffusionChamber内に種々の骨芽細胞様細胞を入れ、ヌ-ドマウスの腹腔内に移植し、骨形成能を検討中である。本研究では独自にいくつかの骨芽細胞様細胞株を樹立し、それらを応用して骨芽細胞の性状と分化過程を解析できる実験系を確立することを目的とし、種々の実験を行い、以下の結果を得た。1.骨芽細胞様細胞株の樹立と性状の解析1)ラット頭蓋冠より5種類のクロ-ン化細胞株(ROBーC8a,C11,C20 C23,C26)を樹立した。各々の細胞株の性状を解析した結果、C11,C20,C23細胞はより成熟した骨芽細胞様細胞で、C26細胞はより未熟な骨芽細胞様細胞と考えられた。また、C8a細胞の分化程度は両者細胞群の中間に位置すると考えられた。興味あることに、C26細胞は骨芽細胞以外に筋細胞、脂肪細胞への分化能も持っていたため、未分化間葉系細胞から骨芽細胞、筋細胞、骨髄脂肪細胞への分化過程を検索するのに有用な細胞株であることが明かとなった。2)ヒト骨肉腫由来細胞株:ヒト骨肉腫より2種類のクロ-ン化細胞株(YRー2,YRー6)を樹立し、それらの表現形質をすでに樹立されているヒト骨肉腫細胞株(HOS,SAOSー2,Mg63)の性状と比較した。その結果、各細胞株の表現形質は多様であったため、ヒト骨肉腫細胞を用いて骨芽細胞の研究を行う場合には、各々の細胞株の性状を充分把握しておくことが重要であると考えられた。2.骨芽細胞の分化調節機構の解析骨芽細胞の分化過程で骨誘導因子(BMP)とレチノイン酸が重要であることを明らかにした。
CD4陽性T細胞のスーパーエンハンサー異常に起因する画期的な関節リウマチ病態形成

関節リウマチ(RA)は滑膜炎症等を主病態とする。我々は、RA病態と関連し、CD4T細胞にてスーパーエンハンサー(SE;クラスターエンハンサーのため強力な転写活性を示す)制御を受け、高い発現を示す遺伝子UBASH3Aを見出した。しかし、T細胞受容体(TCR)シグナルの抑制因子UBASH3Aの発現制御機構、本病態形成への関与については不明である。本研究では、1RA患者群と対照群のCD4T細胞間においてUBASH3A発現量の比較、2エピジェネティック機構を介したSEによるUBASH3A発現制御、3UBASH3Aによる影響が強いCD4T細胞サブセットの特定等を行う。新規RA治療応用への展開を目指す。
プロテオミクスにより見出した新規抗がん剤反応性予測タンパク質のバイオマーカー開発

抗がん剤治療の個別化には個々の患者の薬剤反応性を治療開始前に見極めるバイオマーカーの確立が必須である。本研究では、研究代表者が大腸がんにおけるオキサリプラチン感受性予測候補タンパク質として見出した細胞内タンパク質S100A10の機能解析と臨床応用に向けた基礎的検討を行った。その結果、ヒト大腸がん細胞株においてS100A10発現上昇はオキサリプラチン感受性を低下させ、大腸がん臨床組織検体においてはS100A10発現陰性の場合に比べてS100A10発現陽性である場合に腫瘍縮小効果が低い傾向が認められたことから、S100A10がオキサリプラチン感受性予測タンパク質となる可能性が示された。本研究では、研究代表者が平成2123年度基盤研究(C)「プロテオーム解析による抗がん剤反応性関連タンパク質の解明とバイオマーカーへの応用」において新規に見出した抗がん剤感受性関連タンパク質S100A10について、その臨床応用に向けた研究を行う。1. S100A10ELISA測定系の構築:先行研究において得られた複数の候補抗体を用いて、FDAガイドラインGuidance for Industry, Bioanalytical Method Validation (2001)等にもとづき最適化条件の検討を行なった。他のS100ファミリータンパク質との交差耐性はなく、ウエスタンブロット法による分析結果および質量分析SELDI-TOF MSのピーク強度との相関性が確認され、検出限界および定量限界について結果が得られた。2.ヒト大腸癌組織アレイを用いた免疫学的組織染色:ヒト大腸癌組織アレイについて、S100A10抗体、およびS100A10の結合タンパク質であるannexin A2の抗体を用いた免疫組織化学染色の条件検討および染色を行なった。用いたヒト大腸癌組織アレイは、化学療法治療歴および予後に関する情報を付帯している全300スポット(=300症例)からなり、S100A10抗体およびannexin A2抗体を用いて、それぞれ全300スポットの染色作業を終了した。次年度以降は、大腸癌以外のがん種の各種ヒトがん細胞株を用いて抗がん剤感受性バイオマーカーとしての普遍性および適応拡大の可能性について検討するとともに、免疫組織化学染色の終了したヒト大腸がん組織アレイ全300スポットについて解析を行ない臨床検体による検証を実施する予定である。本研究では、研究代表者が平成2123年度基盤研究(C)「プロテオーム解析による抗がん剤反応性関連タンパク質の解明とバイオマーカーへの応用」において新規に見出した抗がん剤感受性関連タンパク質S100A10について、その臨床応用に向けた研究を展開させる。初年度である平成24年度は、1)臨床保存血液検体の測定を目的としたS100A10ELISA測定系構築、2)S100A10低発現であるヒト大腸癌細胞株COLO-320を用いたS100A10安定(過剰)発現株の作製と抗がん剤感受性の評価、3)ヒト大腸癌組織アレイを用いた免疫学的組織染色による検証に向けた準備に取り組んだ。2.S100A10安定発現株の作製と抗がん剤感受性評価:HaloTagシステムを用いて、S100A10低発現COLO-320細胞のS100A10安定(過剰)発現株を作製し、オキサリプラチン(L-OHP)感受性を検討したところ、S100A10発現によりL-OHP感受性が有意に低下した。3.ヒト大腸癌組織アレイを用いた免疫学的組織染色:化学療法治療歴および予後に関する情報が付帯されているヒト大腸癌組織アレイを平成24年度末に入手し、現在、先行研究にて検討した染色条件の確認作業を行っている。次年度以降は、免疫組織学的検証、ELISA測定系構築と臨床血液検体の測定を行う予定である。本研究では、研究代表者が平成2123年度基盤研究(C)「プロテオーム解析による抗がん剤反応性関連タンパク質の解明とバイオマーカーへの応用」において新規に見出した抗がん剤感受性関連タンパク質S100A10について、その臨床応用に向けた研究を行った。1.大腸がん以外のがん種における抗がん剤感受性バイオマーカーとしての可能性についての検討:胆道がん細胞株2種類、膵臓がん細胞株2種類、胃がん細胞株2種類、卵巣がん細胞株2種類(親株およびそのシスプラチン耐性株)を用いてオキサリプラチン(L-OHP)感受性とS100A10および結合パートナーであるannexinA2遺伝子発現量との関係を検討した結果、胆道がん細胞株と卵巣がん細胞株では高感受性細胞よりも低感受性細胞におけるS100A10遺伝子発現量が高い傾向が認められ、annexin A2では、これらに加えて膵臓がん細胞株でも発現量が高い傾向が認められた。

これにより、S100A10およびannexin A2は胆道がん、膵臓がんにおいてもL-OHP感受性を反映する可能性が示唆された。2.臨床検体による検証:臨床検体としてヒト大腸癌組織アレイを用いた免疫学的組織染色によりS100A10およびannexin A2のタンパク質発現量と予後(腫瘍縮小効果)との関係について検討を行なった。その結果、S100A10発現量およびannexin A2発現量と腫瘍縮小効果(PR, SD, PD)との間に統計学的に有意な関連は認められなかったものの、S100A10陰性の場合に比べて、S100A10陽性である場合に腫瘍縮小効果が低い傾向が認められ、また腫瘍縮小効果が低いほど、S100A10発現量が増強している傾向が認められた。平成2426年度に行った研究結果により、S100A10は大腸がんにおけるL-OHP感受性予測マーカー候補物質となり得ることに加え、胆道がん、膵臓がんにおいてもL-OHP感受性と関連する可能性が示唆された。医歯薬学本年度までの達成度についてはおおむね順調である。本研究では、研究代表者が平成2123年度基盤研究(C)「プロテオーム解析による抗がん剤反応性関連タンパク質の解明とバイオマーカーへの応用」において新規に見出した抗がん剤感受性関連タンパク質S100A10について、その臨床応用に向けた研究を展開させることを目的としている。平成25年度は、S100A10ELISA測定系の構築に向けた最適化条件の検討を行い、検出限界、定量限界等の結果が得られた。臨床検体を用いた検証作業として、化学療法治療歴および予後に関する情報を付帯しているヒト大腸癌組織アレイを用いた免疫組織学的検証を実施する予定であり、染色条件の確定および染色作業までを終えた。本年度までの達成度については、おおむね順調に進展していると考える。平成24年度は、臨床保存血液検体の測定を目的としたS100A10ELISA測定系の構築に向けた最適化条件の検討を行いながら、並行してS100A10安定(過剰)発現系の作製と薬剤感受性評価を進めた。S100A10ELISA測定系構築については、血清成分による測定系への妨害・干渉等により最適化条件の検討にやや時間を要している。安定発現株の作製と評価は平成26年度の予定としていたが、安定発現株の作製には時間を要すること、S100A10結合タンパク質であるannexin A2との共発現細胞株作製にあたりまずは単独発現系における導入条件等を決定しておくことが必要と考えたため、初年度より準備を進めS100A10低発現細胞COLO-320を用いたS100A10安定発現株を作製してオキサリプラチン(L-OHP)感受性の評価を行なった。
栄養カスケードと温暖化に抵抗力をもつ藻場の形成に関する研究

ウニが優占し、その過剰摂食により海藻が生育できない磯焼け場が国内外に拡大しているが、その主因として海外で指摘されているウニの捕食者の乱獲であることを、温暖化が進み、ウニの磯焼け場が蔓延化した高知県沿岸で国内初の事例として示した。対象海域は、古くから禁漁区に設定されている小湾とその隣接漁業区の小湾で、禁漁区には大型のイセエビが多く生息し、その捕食によりウニの密度が特にイセエビの隠れ場の近くで低く、大型海藻が繁茂することを明らかにした。またイセエビがウニを捕食する際の種とサイズの影響を実験的に解明し、その選択的捕食が現場でのウニのサイズと種組成に影響していることを示唆した。ウニが優占する磯焼け場が全国各地の沿岸で拡大し、その原因として温暖化が挙げられているが、ウニの捕食者の乱獲がウニの大量発生を招き、海藻の摂食を引き起こすという海外では既知の因果性が我が国ではこれまで検討されてこなかった。本研究では、温暖化が進み、ウニの磯焼け状態が蔓延化した高知県沿岸で、禁漁区に設定され、深所まで広がる特異な藻場が維持される小湾を対象とし、その近隣の漁業が行われている小湾(対照区)との比較研究を行い、イセエビはウニの重要な捕食者で、その密度は禁漁区で増加するが、行動域は隠れ家となるサンゴ礁域(R1)に限られ、ウニの減少と藻場の形成もその周辺に限られるという仮説を検証する。その検証のため、R1と禁漁区内でイセエビの隠れ家のない巨礫場(R3)及び対照区内でR1と同様に発達したサンゴ礁の場(F1)において、ウニ類とイセエビの密度を調べるとともに、R1とその周辺部(サンゴ礁縁辺から3m離れた所)R1C及びR3とF1で、ウニ(ツマジロナガウニ)30個体を重りに係留し、その生残を調べた。その結果、(1)F1とR3では比較的高い密度(>13個/m2)で生息していたウニ類が、イセエビが特異的に観察されたR1ではほとんど出現しなかったこと、(2)係留ウニの生残率が、F1とR3に比べてR1で約1/4の低水準で、またR1CでもR1と同程度に低かったこと、及び(3)F1とR3でも、係留ウニにイセエビ特有の食痕のある個体がみられたこと、が示され、上記仮説が支持されるとともに、新たにイセエビの行動域がかなり広いことを示唆した。また、イセエビによるツマジロナガウニの捕食に関する水槽実験を行い、イセエビは、頭胸甲長が少なくとも64mm以上では磯焼け地帯に出現する最大級(長径約50mm)のツマジロナガウニまで捕食できることを明らかにした。ウニが優占する磯焼け場が国内外の沿岸で拡大している。その原因として、海外ではウニの捕食者の乱獲がウニの大量発生を招き、その結果海藻の過剰摂食を起こすという栄養カスケード仮説が全面禁漁区での研究により検証され、広く受け入れつつあるが、我が国では温暖化の影響のみが指摘され、栄養カスケードについては検討事例がない。本研究では温暖化が進み、ウニの磯焼け状態が蔓延化した高知県沿岸で、特異的に大規模な藻場が維持されている禁漁区とその周辺域を対象としてイセエビを主要なウニの捕食者に想定した栄養カスケード仮説を検証するため、今年度はイセエビがどのくらいのサイズのウニまで捕食するかを、対象海域に優占的に出現するウニ(ツマジロナガウニとムラサキウニ)を用いて実験水槽で調べた。その結果、イセエビ最小個体群(頭胸甲長CL<52mm)による捕食はツマジロナガウニでは最大個体群(殻径TD>40mm)に及んだのに対してムラサキウニでは概ねTD<35mmの小型個体に留まり、また前者のウニは後者よりも捕食されやすいことが明らかになった。巣穴に隠れているイセエビのCLをステレオカメラを用いて捕獲せずに推定する手法を確立し、禁漁区内でイセエビの隠れ場となっているサンゴ群集域と投石礁にイセエビが>3個体/25m2以上の密度で生息し、その大半がCL>65mmの大型個体であることを明らかにした。またそれらの隠れ場からの距離別のウニの密度とサイズ組成を調べ、(1)隠れ場からの距離が近いほどウニ密度が減少し、特に1020mで少なくなること、(2)ナガウニ類では隠れ場から離れた場所では小型個体も出現するが、近くでは大型個体のみになること、(3)ムラサキウニでは隠れ場の近くでも小型個体が出現することを明らかにし、イセエビの捕食圧が隠れ場に近いほど高くなるが、移動量と被食のされ難さがウニの種によって異なることが示唆された。年度当初に計画した水槽実験と野外調査を実施し、期待された成果が得られたことと、前年度実施した研究成果の一部を論文にまとめ、発表することができたことから。その原因として、海外ではウニの捕食者の乱獲がウニの大量発生を招き、その結果海藻の過剰摂食を引き起こすという栄養カスケード仮説が全面禁漁区での研究により検証され、広く受け入れつつあるが、国内ではそのような報告事例はない。

本研究では温暖化が進み、ウニの磯焼け状態が蔓延化している高知県沿岸で特異的に大規模な藻場が維持されている禁漁区とその周辺対照区との比較研究により栄養カスケードによる藻場形成・維持効果を明らかにする。昨年度までの研究により係留ウニ(重りに釣り糸で繋ぎ止めたウニ)の死亡率が、イセエビの隠れ場となっている禁漁区内の造礁サンゴとその近傍で、他の場所に比較して顕著に高くなることを示したが、死亡の原因がイセエビの捕食によるものかは明らかにできていなかった。本年度は禁漁区と対照区でウニ(ツマジロナガウニとムラサキウニ各2サイズ群2個体ずつ、合計8個)の係留実験を行い、係留ウニは禁漁区でのみ捕食され、また新たに開発した比較的広い面積(1×0.7m)を昼夜連続インターバル撮影できる装置を用いて、禁漁区での係留ウニのすべてがイセエビによって捕食されたことを確認した。禁漁区と対照区との底生生物相の差を明らかにするため、禁漁区と東西両側の対照区でも側線調査を行い、禁漁区内では特にイセエビの隠れ場の近くでウニの密度が低く、ホンダワラ類などの大型海藻が深所(6m)まで比較的高い被度で生育していたのに対して、対照区ではウニの密度(特に浅所ではムラサキウニ、また深所ではナガウニ類)が全体的に高く、大型海藻の分布は大部分の側線でほぼ1m以浅に限られることを確認した。ウニは禁漁区内で大型化する傾向があり、特にイセエビの隠れ場の近くでは大型のムラサキウニが比較的多く見られ、イセエビによるウニ捕食に関する水槽実験の結果に一致した。ウニが優占し、その過剰摂食により海藻が生育できない磯焼け場が国内外に拡大しているが、その主因として海外で指摘されているウニの捕食者の乱獲であることを、温暖化が進み、ウニの磯焼け場が蔓延化した高知県沿岸で国内初の事例として示した。対象海域は、古くから禁漁区に設定されている小湾とその隣接漁業区の小湾で、禁漁区には大型のイセエビが多く生息し、その捕食によりウニの密度が特にイセエビの隠れ場の近くで低く、大型海藻が繁茂することを明らかにした。またイセエビがウニを捕食する際の種とサイズの影響を実験的に解明し、その選択的捕食が現場でのウニのサイズと種組成に影響していることを示唆した。当初計画していた野外研究と水槽実験を実施し、ほぼ期待される成果が得られたことから。禁漁区内のイセエビの隠れ場周辺でウニの密度がイセエビの捕食により減少していることを支持するいくつか証拠が得られつつあるが、ウニがイセエビに捕食されていることを示す確証はまだ得られていない。今年度はウニの捕食者を特定するための、インターバルカメラを用いた映像記録調査を実施するとともに、補足的調査を実施し、研究のとりまとめを行う。岩礁生態イセエビによるウニの捕食に関する水槽実験では、入手可能なサイズ(頭胸甲長5993mm)のイセエビと、磯焼け地帯で優占するウニ類としてツマジロナガウニ(殻長1050mm)を用いたが、実験結果から、最大級(殻長約50mm)のウニを消費できなくなるイセエビのサイズは、60mm以下になることが予想された。本実験は、ウニの種類を変えて繰り返すことを計画していたが、ツマジロナガウニの方がムラサキウニよりも全体的に生息密度が高く、まずは、ツマジロナガウニに対するイセエビの捕食可能なサイズを確定することが重要と考え、本年度は、より小型のイセエビを用いて本実験を再度実施する。野外研究では、イセエビの夜間の索餌が予想よりも広範囲に及ぶことが推察された。そこで、イセエビの隠れ家となっているサンゴ礁と隠れ家になっていると予想される防波堤からの距離に応じて、ウニの密度と生残率がどのように変化するを調べ、影響範囲を明らかにする。26年度実施のウニの係留実験により、ウニの捕食による死亡が、イセエビの生息していない近隣漁業区のサンゴ群集域でも確認され、その死亡率は予想に反して禁漁区内より1/5程度に減少するものの、無視できない水準であった。このため、27年度の調査では、ウニの魚類による捕食の可能性も考えて、禁漁区と漁業区のサンゴ
肪胱癌における抗癌剤耐性の発現機序の解析

本研究では、予防的腔内注入化学療法が広く行われ、しかも経時的に組織生検試料が得られる膀胱癌を対象として、膀胱癌における薬剤耐性獲得機序の解析を試み次のような知見を得た。膀胱尿路上皮癌における多剤耐性遺伝子産物Pーglycoprotein(PーGP)の発現を本遺伝子産物に対するモノクロ-ナル抗体であるMRKー16を用いた免疫組織診断法により検討してみた。その結果、正常膀胱粘膜はMRKー16陰性であったが、膀胱癌未治療例31例中11例(35%)がMRKー16陽性と判定された。細胞異型度が高い腫瘍にMRKー16陽性率が高い傾向みられたが、推計学的有意差はなかった。膀胱癌でのMRKー16陽性率は、腎細胞癌未治療例の陽性率(20例中6例、30%)とほぼ同様であった。一方、再発性膀胱癌では、抗癌剤投与例での陽性率が初発例ならびに抗癌剤非投与例より有意に高値を示した。これらの事実は、腎癌のみならず膀胱癌の一部では内因性にPーGPが発現しており、このような膀胱癌ではアンスラサイクリン系抗癌剤ならびにビンカアルカロイド系抗癌剤に自然耐性を持つことを示唆している。また、膀胱癌では抗癌剤投与があらたにPーGP発現を誘導する可能性が示唆される。これらの知見は、膀胱癌における個々の腫瘍の抗癌剤耐性の多様性と薬剤耐性獲得機序の一面を明らかにしたもので、薬剤耐性を回避する効率的な化学療法の開発・導入の基礎資料になると考えれる。