hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢黄斑変性症における自己抗体バイオマーカーの探索と発症増悪機序の解明

加齢黄斑変性(AMD)は脈絡膜新生血管(CNV)からの滲出液や出血により、黄斑部網膜が不可逆的障害を受け視力低下をきたす疾患であり、その病態には自己抗体による局所炎症の関与が示唆されている。本研究では、マススペクトル解析によりpyruvate kinase M2(PKM2)やaldolase Cといった代謝酵素に対する新規自己抗体を同定し、さらに患者由来IgGがそれら酵素活性を濃度依存性に阻害することを確認した。また、マウスモデルもAMD患者同様の自己抗体プロファイルを呈し、CNV部位におけるPKM2の発現増強が認められたことより、PKM2はAMD治療の新たな分子標的になる可能性が示唆された。加齢黄斑変性(AMD)は、脈絡膜新生血管(CNV)からの滲出液や出血により黄斑部網膜が不可逆的障害を受け視力低下をきたす疾患であり、その病態の増悪には自己抗体の病変部への沈着による炎症の関与が示唆されている。本年度は当初予定していた患者血清の入手が困難であったため、dry型AMDの代表的なマウスモデルであるCcl2(-/-)/Cx3cr1(-/-)マウスの血清中抗網膜抗体プロファイルの解析を行った。10週齢の若齢マウスにおいては、Ccl2(-/-)/Cx3cr1(-/-)では野生型に比べ、C3・CFBといった補体や、aldolase・alpha-enolaseといった代謝酵素に対する有意な抗体価の上昇が認められ、40週齢の老齢マウスでは、C5・CFBといった補体や糖代謝産物であるAGE、また若齢マウスと同様にaldolase・alpha-enolaseに対する自己抗体が高値であった。なかでもaldolaseに対する抗体は、ヒトAMD患者やlaser inducedCNVマウス血清中でも高値を示しており、AMDのバイオマーカーとして利用できる可能性や、AMDの発症・増悪のメカニズムに関与している可能性が示唆された。加齢黄斑変性は脈絡膜新生血管(CNV)からの浸出液や出血により、黄斑部網膜が障害を受け不可逆的な視力低下をきたす疾患である。そこでlaser inducedCNVマウスモデルを用いて抗網膜抗体のCNV病変部への関与を検討し、老齢マウスを用いることにより加齢による抗網膜抗体の沈着の変化を検討した。Laser照射8週後のマウス血清をantigen microarray法においてスクリーニングしたところ、complement C3、PKM2、Aldolase, L-glutamine synthetase、annexin IIなどの多くの網膜内分子に対する有意な抗体価の上昇が確認され、それらの自己抗体プロファイルはAMD患者のものと類似していた。またマウスCNV周囲組織へはIgG抗体の沈着増強が認められ、一部はPKM2やALDOCの発現との共局在化が確認された。同様に、老齢マウス(18週齢)では若齢マウス(8週齢)に比べ、RPE組織への有意なIgG抗体の沈着増強が認められた。以上より、anti-PKM2やanti-ALDOC抗体はCNV発生に深く関与していると考えられ、ヒトAMD患者血清中でも高値を示していたことより、バイオマーカーとして応用できる可能性が示唆された。次にヒトAMD患者血清・laser inducedCNVマウスともに抗体価の高値が認められたL-glutamine synthetaseに着目し、その酵素活性に対する自己抗体の関与を検討したところ、いずれもその活性を減弱させる中和作用を有していることが確認された。この作用は神経毒性を示すglutamateの相対的増加を促すと考えられ、網膜・色素上皮の変性に関与していることが示唆された。加齢黄斑変性(AMD)は脈絡膜新生血管(CNV)からの滲出液や出血により、黄斑部網膜が不可逆的障害を受け視力低下をきたす疾患であり、その病態には自己抗体の病変部の沈着による炎症の関与が示唆されている。そこで、マイクロアレイ法にてヒトAMD患者血清中IgG・IgM抗体の網膜組織蛋白に対する反応性を網羅的に解析することにより、抗網膜自己抗体バイオマーカーを同定した。CNVを有するwetAMD患者は、pyruvate kinase M2(PKM2)、complement C4、C9、ApoE、グルタミン合成酵素などに対し、強い血清免疫反応を示した。中でもC4に対するIgG抗体を有する患者は、CNV発症に関して非常に高いリスクを示した(オッズ比44.3)。次に、CNV病変の主座である脈絡膜組織蛋白に対する血清免疫反応性を2次元電気泳動で確認し、自己抗原をマススペクトル解析にて同定したところ、wetAMD患者は、Krt15、emerinなどに対するIgG抗体を有していることが確認された。また、ヒトAMD患者血清とlaser inducedCNVマウスともに、PKM2に対する高いIgG抗体価が認められたため、その発現をマウスモデルにて検討したところ、mRNA・蛋白レベルともCNV部位における著明な発現増加が確認された。

その他、complement C3やIgGの沈着増強も認められたことより、自己免疫反応のCNV形成への関与が示唆された。しかしながら、PKM2を免疫し抗PKM2抗体を産生したマウスにおいて、局所炎症は認められたもののCNVは生じなかったことより、抗PKM2抗体はwetAMD発症後に生じた2次的産物である可能性や、発症における他因子の関与の必要性も考えられた。眼科学平成24年4月より、人事異動にて非常勤講師として大学外勤務となったため、主たる研究施設を有する大学内での研究業務が困難となり、当初の達成予定より大幅に遅れる結果となった。平成24年4月より非常勤講師として大学外勤務となったため、大学内での研究業務が困難となり、当初の達成予定より大幅に遅れる結果となった。今年度も人事により大学外勤務が決定したため、大学院生・実験助手を動員し人員不足を解消する。また、研究代表者の主たる勤務先である多摩北部医療センターの患者も対象に加えることにより、血清サンプル収集の遅れを取り戻す。今後もこれまで同様学外勤務が続くため、大学院生・実験助手を動員し人員不足を解消する。また、関連病院であり研究代表者の主たる勤務先である多摩北部医療センターの白内障手術患者を、コントロール群として加えることで血清サンプルの収集の遅れを取り戻す。大学外勤務によるエフォート(研究時間)の減少による研究計画の停滞したため、当初の予定使用額を大幅に下回った。網膜・色素上皮・脈絡膜蛋白とAMD患者血清由来IgG抗体を用いた2次元電気泳動後にマススペクトメトリーを行い、AMD患者血清中の眼組織由来抗原特異的な新規自己抗体同定を試みる(約60万円)。次にそこで同定された抗原を用いてAMD疾患特異的なantigen microarrayチップをデザインし、実際の患者血清を用いてAMDのスクリーニングの有用性を検討する(約120万円)。また動物実験として、上記で同定された抗原をマウスに免疫することにより、眼組織由来抗原に対する自己抗体を産生させ、AMDに類似した病態の誘導が可能であるか検討する(約80万円)。網膜・色素上皮・脈絡膜蛋白とAMD患者血清由来IgG抗体を用いた2次元電気泳動後にLC-MS/MSを行い、眼組織由来抗原に対するAMD患者血清中新規自己抗体の同定を行う(約40万円)。次にそこで同定された抗原を用いてAMD疾患特異的なantigen microarrayチップを作成し、実際の患者血清をもちいてAMDスクリーニングの効果を検討する(約120万円)。また動物実験として、上記で同定された抗原をマウスに免疫することにより、眼組織抗原に対する自己抗体を産生させ、AMDに類似した病態の誘導が可能であるか検討する(約80万円)。
格子整合系GaAs/AlGaAs自己形成量子ドットレーザの開発

高性能GaAs/AlGaAs系量子ドットレーザを実現する事を目的に、液滴エピタキシー法による量子ドット作製の高度化及びそのレーザ素子への応用に関する実験を行った。GaAs(311)A面を用いる手法を開発し、量子ドットの超高密度化・高均一化に成功した。また、アニール過程の最適化を行い、量子ドットの高品質化も実現した。これらの技術を組み合わせた結果、光励起に於いて室温レーザ発振を達成した。平成20年度は量子ドット作製技術の高度化に関する研究を主に行った。これまでは主にGaAs(100)基板を用いていたため、ピラミッド状量子ドットを作製すると、量子ドットの均一性が著しく劣化するという大きな問題があった。今回、Ga極性面であるGaAs(311)A面を使用する方法を新たに開発し、ガリウム液滴を非常に弱い強度の砒素照射で結晶化してもピラミッド型量子ドットが形成可能であることを見いだした。これにより、量子ドットのサイズ均一性が大幅に向上し、発光の半値幅を約1/3に低減することに成功した。結晶化後の構造の詳細な構造観察により、基板表面に於けるガリウムの拡散の抑制及び結晶方位の異方性により、形成機構は(100)面上の一重リング構造の形成と類似であるが実質的にピラミッド型の構造へ結晶化していることが明らかとなった。また、同面方位を用いることにより量子ドットの面密度を増加させることにも成功し、最大で10^<11>/cm^2を超える量子ドットの作製も実現した。続いてこのように作製した量子ドットを用いて光励起によりレ-ザ発振を試みた。量子ドットが均一化したことにより、低温から室温までの温度域でレーザ発振が得られた。これは、格子整合系のピラミッド型自己形成量子ドットとしては世界初である。量子ドットの密度を上昇させた試料に於いては、サイズが小さくなることにより、高温域での発振特性はキャリアの熱活性化により悪化するものの、低温域では温度特性が改善する様子が観察された。これらに関しては今後さらに研究を進める予定である。また、量子ドットの高密度化を目的にその他の面方位基板上に於ける液滴エピタキシー法を試みた結果、(110)面上で、ステップ端に起因する配列効果を実現した。これは、レーザとはあまり関連しないが、配列量子ドットは量子情報デバイスなどへの応用が期待されることから、今後の発展が期待される。GaAs/AlGaAs系量子ドットレーザの電流注入による発振を目指して、デバイス作製技術の確立および電流注入発光を実現した。パルス電源の容量不足の問題により残念ながらレーザ発振には至らなかったが、発光強度が非線形に増大する様子が観察された。今後導波路構造の最適化などを実現することにより、レーザ発振が得られると考えている。また、1E+11/cm2という超高密度量子ドットを積層した構造に関して、新たに光励起によるレーザ発振を試みたところ、閉じ込めエネルギーが小さいため室温付近の特性は良好でないものの、低温域でレーザ発振の特性温度の大幅な向上を実現した。格子整合系では、歪みによる制約が無いため、近接積層なども容易に行えることから今後さらなる発展が期待される。量子ドット構造の最適化に関しては、結晶化後の量子ドットのアニールとキャップ層成長の見直しを試みた。初めにキャップ層成長前の量子ドットのアニールに対する構造安定性を調査した結果、400度までの温度領域では量子ドットの形状がほぼ保たれる事が明らかとなった。これにより量子ドットをおよびAlGaAsキャップ層の品質が大幅な向上を実現した。さらに500度程度の高温でアニールする事により、量子ドットの異方性を促進できることも新たに見いだした。この時、発光強度もさらに増強される事が分かった。異方的な量子ドットは、直線偏光を必要とする通信デバイス応用などに非常に有用な技術である。以上のように、半導体量子ドットレーザの今後の発展に大きく貢献する成果が得ちれた。
シナプス形成・制御分子の解析

神経軸索の伸長とシナプス形成は神経回路網形成の最も重要な過程であり、我々はこの発生過程の現象とシナプスの可塑的変化の間に共通のメカニズムがあるものと考えている。そこで、本研究では、軸索伸長・シナプス形成・シナプスの可塑的変化における分子機構の解析を行った。除神経後筋細胞から放出される神経突起伸長因子活性を有するタンパク質の遺伝子をクローニングしたところ新規な分子であったためneurocrescinと命名した。しかし、そのアミノ酸配列には既存のシグナル配列は存在しなかったが、この因子が細胞外に提示されることが、生理的に神経突起伸長を担うことの必然条件であるため、細胞外提示法の検討を行った。その結果、この因子は活動依存的にシナプス後細胞から放出され、その際には調節を受け、細胞内に存在する時より小さい形で細胞外に放出されることを示唆する結果を得た。シナプス形成に関しては、昨年度に報告したサイレントシナプス形成のメカニズムを探究した。我々の培養系は胚齢等価日数(EEdays)に依存してシナプス形成が起こるが、EEdays11の神経細胞は機能的なAMPA受容体、NMDA受容体を細胞に発現しているにもかかわらず、機能的なNMDA受容体しかシナプス部位に持たないサイレントシナプスを形成することを、さらに成熟の進んだEEdays17の神経細胞では、NMDA受容体とAMPA受容体をともにもつシナプスを形成することを明らかにしていた。EEdays11と17の神経細胞に発現しているNMDA受容体の性質を比較したところ、平均コンダクタンスには差が無いが、開確率、平均開時間もしくはグルタミン酸に対する親和性が異なることが明らかになった。これらの性質とシナプスの成熟との関連を検討中である。
皮膚における、抗真菌薬の新しい抗炎症・レドックス制御作用に関する研究

今回の研究で、抗真菌薬であるケトコナゾールは、殺真菌効果だけではなく、ヒト皮膚の表皮細胞に対して抗炎症作用を発揮した。さらにその作用は、ダイオキシン受容体として知られているaryl hydrocarbon receptor (AhR)の活性化を介していることが判明した。AhRはNrf2、NQO1の発現を誘導し、活性酸素やIL-8産生、DNA障害を抑制することが明らかになったアゾール系抗真菌薬の中でもケトコナゾール(KCZ)は、培養ヒト表皮細胞(NHEK)におけるAhR、Nrf2の核内への移動を強く誘導した。またNrf2のmRNA、タンパクの発現、その下流となる解毒酵素、quinone oxidoreductase 1の発現も誘導された。TNFαにより誘導された活性酸素とIL-8産生は、KCZ投与により抑制された。この時に、AhRまたはNrf2のいずれかをsiRNAを用いてノックダウンすると、この抑制効果が失われた。また、Nrf2の活性化も、AhR依存性であった。一方、ベンゾピレンによるIL-8とDNA障害を反映する8-hydroxydeoxyguanosineの産生誘導は、KCZにより抑制された。これらの結果から、KCZはAhRに結合することで、Nrf2を活性化し、抗酸化、抗炎症効果を発揮することが示唆された。また、KCZは表皮細胞においてAhR依存性に長寿遺伝子Sirt1の発現を誘導し、さらにインボルクリンを誘導するなど角化を促す作用を明らかにした。さらに我々は、新たなAhRリガンドとして、シナロピクリンやビデンスピローサ茶抽出物を見いだし、KCZと同様の抗酸化作用を有することを明らかにした。マウスを用いたin vivo実験では、KCZを塗布しても、マウス皮膚におけるAhRの活性化やCYP1a1の誘導を検出することはできなかった。このため、NHEKにUV照射を行って、AhRリガンドの効果を検討するモデルを作成した。UV照射によりトリプトファンの代謝物として、内因性リガンドFICZが産生されることが知られている。シナロピクリンなどの外因性AhRリガンドを投与すると、UV照射あるいはFICZによる活性酸素やIL-6、IL-8産生などをAhR-Nrf2依存性に抑制することを明らかにした。AhRはNrf2、NQO1の発現を誘導し、活性酸素やIL-8産生、DNA障害を抑制することが明らかになった抗真菌薬(ケトコナゾール(KCZ)、ルリコナゾール、テルビナフィン)を培養ヒト表皮細胞に投与したところ、アゾール系では、AhR, Nrf2を活性化することが判明した。特にKCZは、Nrf2の核内への移動を強く誘導することが免疫染色で明らかとなった。またRT-PCRとウェスタンブロットによる解析で、Nrf2のmRNAおよびタンパクレペルで発現を惹起した。さらに、その下流となる解毒酵素の1つ、quinone oxidoreductase 1の発現をmRNAおよびタンパクレペルで発現を惹起した。次にKCZの抗炎症作用について検討するため、TNFα刺激下でKCZをヒト表皮細胞に投与した。その結果、TNFαにより活性酸素とIL-8産生が誘導されたが、KCZはそれらを抑制する結果が得られた。また、Nrf2の活性化は、AhRのノックダウンにより消失することもわかった。さらに、AhRの古典的リガンドの1つであるベンゾピレンは、ヒト表皮細胞からIL-8の産生とDNA障害を反映する8-hydroxydeoxyguanosineの産生を促したが、KCZはこれらも抑制することが明らかとなった。これは、これまでには解明されていなかった新しいメカニズムである。H23年度に計画していた実験については、順調にほぼ計画通りに遂行することができた。研究結果も、当初予想していた結果に反しないものであった。H24年度もさらに研究を発展させて行きたい。当初の研究実施計画に記した通り、H24年度にはアゾールのin vivoでの抗炎症作用を検討する計画である。実際に、マウスを用いた予備的なin vivo実験を行ったところ、KCZ塗布では、マウス皮膚におけるAhRの活性化やCYP1a1の誘導を検出することはできなかった。UV照射など、実験の条件を調整していく必要がある。UV照射により、トリプトファンの代謝物として、内因性リガンドFICZが産生されるので、UV照射下のヒト表皮細胞にKCZなどのAhRリガンドを加えて、その効果を検討したい。それと平行して、長寿遺伝子として知られるSirt1という分子に着目して、研究を広げて行きたいと考えている。Sirt1は、皮膚においても、酸化ストレスや細胞の分化などにも重要な役割を果たしていることが報告されるようになった。

ポリフェノールの一種であるレスベラトロールがSirt1を誘導することが知れられているので、我々は、表皮細胞においてAhRがSirt1を誘導するのではないかと考えている。予備実験において、KCZをヒト表皮細胞に投与したところ、KCZがSirt1の発現を誘導することがわかった。今後は、いくつかの他のAhRリガンドでSirt1を誘導するかどうか、またsiRNAを導入して、AhR依存性なのかどうかを明らかにしていきたい。表皮細胞の分化、すなわち角化のマーカー(インボルクリンなど)の発現への影響も検討する考えである。ヒト表皮細胞、RT-PCR、ウェスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリーなどに用いる抗体、試薬などの消耗品、マウスが、主な使用用途である。高額な実験機器に関しては、本研究費で購入する予定はない。研究がまとまれば、学会発表を行いたいので、参加費・旅費にも使用したい。
抗腫瘍免疫誘導におけるＳＴＡＴ３とヒストンアセチル化機構の解明

樹状細胞に代表される抗原提示細胞の抗腫瘍誘導について, STAT3欠損モデルを用いた抗腫瘍効果を,抗原提示細胞のエピジェネティック制御の点から分子レベルで解析した.本研究では,野生型担癌マウスに, STAT3欠損マウスから作成した骨髄由来樹状細胞を輸注すると,有意な抗腫瘍効果が得られることを示し, STAT3欠損モデルでは, HDAC7を介するヒストンアセチル化が関与している可能性を証明した. HDAC7と抗腫瘍サイトカイン産生メカニズムの可能性と他のHDACとの関わり, HDAC阻害薬を用いた治療応用の可能性について,次期研究で詳細な検討を進める予定である.樹状細胞に代表される抗原提示細胞は、サイトカイン(IL-12, IL-10等)を産生して、抗腫瘍免疫を誘導する。STAT3欠損樹状細胞は、野生型に比べて高い抗腫瘍免疫を誘導する。STAT3がどのようにサイトカイン産生調節を行っているか、ヒストンアセチル化(HDAC7、HDAC11)に着目し、エピジェネティックス制御の点から分子レベルで解明する。STAT3によるHDACsの発現調節を、STAT3欠損骨髄由来樹状細胞、STAT3 shRNA knockdownマクロファージ細胞株を用いて、RT-PCR法、ウェスタンブロット法で確認する。STAT3がHDACsの発現をどのように調節しているかをプロモーター解析で証明する。次に、STAT3欠損抗原提示細胞中のサイトカインの発現を野生型とともにELISA法で定量比較する。HDACSをSTAT3欠損細胞株にKnock inして、サイトカインが機能的に救済されるかをELISA法で検討する。サイトカインプロモーター領域、特にIL-12、IL-10のConserved noncodingsequenceのヒストンアセチル化をChIP法で検討する。STAT3欠損骨髄由来樹状細胞を誘導し、野生型と共に実験に供した。樹状細胞への分化はフローサイトメトリー法で確認した。また、STAT3 shRNA knockdownマクロファージ細胞株を樹立し、野生型(RAW264.7細胞株)と共に実験に供した。細胞株中のSTAT3発現はウェスタンブロット法で確認した。現在、これらの細胞株を用い、ヒストンアセチル化、特にHDAC7、HDAC11をどのように調節し、サイトカインの産生を調節しているかを解析していく予定である。樹状細胞に代表される抗原提示細胞は、サイトカイン(IL-12、IL-10)を産生して、抗腫瘍免疫を誘導する。STAT3欠損樹状細胞は、野生型に比べ高い抗腫瘍免疫を誘導する。STAT3がどのようにサイトカイン産生調節を行っているか、ヒストンアセチル化に着目し、エピジェネティックス制御の点から、分子レベルで解明することを目的として研究を遂行することを目的とする。STAT3によるHDACsの発現調節を、STAT3欠損骨髄由来樹状細胞、STAT3 shRNA knock downマクロファージ細胞株を用いて、RT-PCR法、ウェスタンブロット法で確認する。HDACsをSTAT3欠損細胞株にknock inして、サイトカインが機能的に救済されるかをELISA法で検討する。また、STAT3 shRNA knock downマクロファージ細胞株を樹立し、野生型(RAW264.7細胞株)と共に実験に供した。これらの細胞株を用い、ヒストンアセチル化、HDAC7、HDAC11の発現を検討、サイトカインの産生能を解析した。STAT3がどのようにサイトカイン産生調節を行っているか、ヒストンアセチル化(HDAC7、HDAC11)に着目し、エピジェネティクス制御の点から分子レベルで解明する。HDACsをSTAT

3欠損細胞株にknock inしてサイトカイン発現が機能的に救済されるかをELISA法で検討する。サイトカインプロモーター領域、特にIL-12、IL-10のConserved noncodingsequenceのヒストンアセチル化をChIP法で検討する。STAT3欠損骨髄由来樹状細胞を誘導し、野生型と共に実験に供した。樹状細胞への分化はフローサイトメトリーで確認した。また、STAT3 shRNA knockdownマクロファージ細胞株を樹立し、野生型(RAW264.7細胞株)と共に実験に供した。細胞株中のSTAT3発現はウェスタンブロット法で確認した。現在、これらの細胞株を用い、ヒストンアセチル化、特にHDAC7, HDAC11の発現をRT-PCR法、ウェスタンブロット法で確認し、サイトカインの発現解析を行っている。今後、STAT3がHDAC7, HDAC11をどのように調節し、サイトカインの産生を調節するかを解析していく予定である。抗原提示細胞として2つの細胞を用意した。1つは樹状細胞で、Inabaらの方法に準じて、STAT3コンディショナルノックアウトマウスからGM-CSFを用いて骨髄由来樹状細胞を誘導した。細胞の誘導は問題なく誘導でき、野生型骨髄由来樹状細胞とともに実験に供した。樹状細胞への分化はフローサイトメトリー法で確認した。もう一つは、マクロファージで、マクロファージ細胞株RAW264.7細胞を用意し、STAT3 shRNA knockdownマクロファージ細胞株を樹立し、野生型細胞株と共に実験に供した。細胞株中のSTAT3発現低下の確認は、RT-PCR法、ウェスタンブロット法で行った。このマクロファージ細胞株の細胞増殖能が不安定で、マクロファージ細胞株RAW264.7細胞のSTAT3欠損細胞株の樹立は予想を超え時間を要した。STAT3が細胞株の増殖に関与することが理由の一つと考えられた。これらの細胞株の樹立、維持に時間を要したために、遅れを生じているが、現在これらの細胞株を用い、ヒストンアセチル化特にHDAC7, HDAC11に着目し、その発現をRT-PCR法、ウェスタンブロット法で確認し、サイトカインの発現解析を行っている。尚、STAT3欠損抗原提示細胞中のHDAC7, HDAC11の発現パターンが、当初推定していた発現パターンと異なる可能性が出てきたため、当初の実験計画を変更し、実験手法を変えて再検討する必要があった。この結果は、本研究の根幹に関わるもので、非常に重要な意味を持つと考えられ、その検討に一定の期間を要した。
プレート境界の摩擦パラメター推定に関する研究

余震域拡大過程の数値シミュレーション:プレート境界型地震の余震域はしばしば時間とともに拡大することが知られている.これは,本震の発生による余効すべりが伝播し,その応力変化で余震を引き起こすためと考えられる.すべり速度・状態依存摩擦則を利用した数値シミュレーションにより余効すべりの伝播に伴う余震域の拡大が再現できたが,その拡大速度は本震のすべり速度や速度強化域の摩擦パラメターに依存することがわかった.この結果を用いれば,余震域の拡大速度から摩擦パラメターを推定することが可能になる.小繰り返し地震を用いた非地震性すべりの時空間変化の推定:小繰り返し地震のデータを用いて,宮城・福島沖の非地震性すべりの時空間変化を推定した.小繰り返し地震のデータからプレート境界面での非地震性すべり速度を推定するには,小繰り返し地震のすべり量を利用する.通常は,Nadeau and Johnson(1998)によるマグニチュードとすべり量の関係式を用いるが,この関係式は普通の地震について成立する,応力降下量一定の場合の関係と大きく異なり,物理的に理解しにくいものであった.本研究では,非地震性すべり域の中に円形の固着域(アスペリティ)を考え,そこでの応力集中を弾性論から計算し,アスペリティ破壊のための臨界応力拡大係数がアスペリティの大きさに依存しないと仮定することで,この関係式をほぼ説明することに成功した.GPSデータと小繰り返し地震から推定した非地震性すべりの違いについての考察:小アスペリティでのすべり様式は,摩擦の速度依存性・時間依存性のために,時間的に変化する.たとえば,地震の繰り返し間隔が短くなると,強度回復のための時間が不十分なため,アスペリティでの地震性すべり量が小さくなる可能性がある.すべり速度・状態依存摩擦則を用いた数値シミュレーションにより,このことを確認した.余震域拡大過程の数値シミュレーション:プレート境界型地震の余震域はしばしば時間とともに拡大することが知られている.これは,本震の発生による余効すべりが伝播し,その応力変化で余震を引き起こすためと考えられる.すべり速度・状態依存摩擦則を利用した数値シミュレーションにより余効すべりの伝播に伴う余震域の拡大が再現できたが,その拡大速度は本震のすべり速度や速度強化域の摩擦パラメターに依存することがわかった.この結果を用いれば,余震域の拡大速度から摩擦パラメターを推定することが可能になる.小繰り返し地震を用いた非地震性すべりの時空間変化の推定:小繰り返し地震のデータを用いて,宮城・福島沖の非地震性すべりの時空間変化を推定した.小繰り返し地震のデータからプレート境界面での非地震性すべり速度を推定するには,小繰り返し地震のすべり量を利用する.通常は,Nadeau and Johnson(1998)によるマグニチュードとすべり量の関係式を用いるが,この関係式は普通の地震について成立する,応力降下量一定の場合の関係と大きく異なり,物理的に理解しにくいものであった.本研究では,非地震性すべり域の中に円形の固着域(アスペリティ)を考え,そこでの応力集中を弾性論から計算し,アスペリティ破壊のための臨界応力拡大係数がアスペリティの大きさに依存しないと仮定することで,この関係式をほぼ説明することに成功した.GPSデータと小繰り返し地震から推定した非地震性すべりの違いについての考察:小アスペリティでのすべり様式は,摩擦の速度依存性・時間依存性のために,時間的に変化する.たとえば,地震の繰り返し間隔が短くなると,強度回復のための時間が不十分なため,アスペリティでの地震性すべり量が小さくなる可能性がある.すべり速度・状態依存摩擦則を用いた数値シミュレーションにより,このことを確認した.釜石沖の繰り返し地震のシミュレーションによる摩擦パラメターの推定:岩手県釜石沖では,M=4.7-4.9のプレート境界地震が平均5.5年間隔で繰り返し発生している.その周辺域には,M=2-3クラスの地震が発生するクラスターが3つ存在するが,その地震活動はM=4.7-4.9の地震サイクルの中で変動し,2つのクラスターについては地震サイクルの後半でのみ地震が発生する.プレート境界面の摩擦特性がすべり速度・状態依存摩擦法則に従うとした数値シミュレーションで,上のような特徴をもつ地震サイクルを再現することに成功した.余震域拡大・余効すべりの数値シミュレーション:サイスミックカップリングが小さい領域のプレート境界型地震については,余震域はしばしば時間とともに拡大することが知られている.これは,本震の発生による余効すべりが伝播し,小さな固着域のせん断応力を増大せしめ余震を引き起こすためと考えられる.このような現象を説明するために,モデル断層面上に摩擦特性が速度弱化の大パッチと多数の小パッチを配置して数値シミュレーションを行った.余効すべりの伝播に伴う余震域の拡大が再現できたが,その拡大速度は本震のすべり速度や速度強化域の摩擦パラメターに依存することがわかった.この結果を用いれば,余震域の拡大速度から摩擦パラメターを推定することが可能になる.

さらに,余効すべりの時間関数について調べた.1自由度のバネ-ブロックモデルについて理論的に得られているu(t)=u_0log(t/t_0+1)+V'tは現実的な3次元連続体モデルでの余効すべりについても成り立つことがわかった.ただし,余効すべりが上の式に従うのは摩擦がほぼ定常状態にあるときであり,定常状態に達するまでに過渡的な過程が存在する.過渡的な過程のすべり量は特徴的すべり量Lにほぼ一致するため,GPS観測から余効すべりの時間関数を精度良く決められれば,プレート境界面上のL値が推定できることがわかった.小繰り返し地震のスケーリング則について:小繰り返し地震のデータからプレート境界面での非地震性すべり速度を推定するには,小繰り返し地震のすべり量を推定しなければならない.多くの小地震について,地震波形解析からすべり量を推定するのは容易ではないため,通常は,マグニチュードとすべり量の関係式を利用する.良く用いられている関係式は,Nadeau and Johnson(1998)による米国San Andreas断層での小繰り返し地震について得られたものであるが,この関係式は普通の地震について成立する,応力降下量一定の場合のマグニチュードとすべり量の関係と大きく異なり,物理的に理解しにくいものであった.本研究では,非地震性すべり域の中に円形の固着域(アスペリティ)を考え,そこでの応力集中を弾性論から計算し,アスペリティ破壊のための臨界応力拡大係数がアスペリティの大きさに依存しないと仮定することで,Nadeau and Johnson(1998)の関係式をほぼ説明することに成功した.GPSデータから推定した非地震性すべりの時間変化と小繰り返し地震から推定した非地震性すべりの違いについての考察:小繰り返し地震が発生するアスペリティでのサイスミックカップリングが100%であれば,観測の誤差がなければ,2つの方法による非地震性すべりの時間変化の推定は一致すべきである.しかし,アスペリティでのすべり様式は,摩擦の速度依存性・時間依存性のために,時間的に変化する.たとえば,地震の繰り返し間隔が短くなると,強度回復のための時間が不十分なため,アスペリティでの地震性すべり量が小さくなる可能性がある.すべり速度・状態依存摩擦則を用いた数値シミュレーションにより,このことを確認した.比較的大きな地震による応力の擾乱があったときなどに,両者による非地震性すべりの推定に大きな違いが出てくる可能性が示された.
視覚障害児童の外国語活動のための二次元ドットコードを利用した教材の開発研究

平成23年度に必修科目化された小学校外国語活動の教材は次年度に『Hi, friends!』となった。本研究は新教材『Hi, friedns! 1, 2』の語彙と表現の分析を行った。特別支援教育、特に視覚障害児童には音声教材の整備充実が急務である。本研究では平成26年に「小学校外国語活動5年生用、Hi, friends!準拠音声ペン教材Hello English1」、平成28年に「小学校外国語活動6年生用、Hi, friends!2準拠音声ペン教材Hello English2」を作成した。工学機器と触図教材を活用した補助教材の使用により晴眼者と同等の教育情報が保障される。本研究は視覚障害児童のための特別支援学校教育における外国語活動での工学機器と触図の活用による学習指導方法の提示と学習プログラムの構築である。特に、本研究は「視覚障害児童の外国語活動における二次元ドットコードの活用と触図教材開発の研究」(平成23年度基盤研究(C))の継続研究である。特別支援教育では、共生社会の形成に向けたインクルーシブ教育システムの構築が推進され、今後はこれまでの取り組みを踏まえた「日本型インクルーシブ教育」が提言されるところである。教育現場においては障害種に応じた教材の開発、情報機器の整備と活用が求められているが、特に視覚障害児童には音声教材の整備充実が必要である。平成23年度に必修科目となった小学校外国語活動の教材「英語ノート」は平成24年度からは「Hi, friends!」に変更となった。本研究は、これまでの二次元コードと触図を活用した学習プログラムの研究成果を応用し、「Hi, friends!」に対応した新コンテンツの学習指導モデルの構築を、支援機器の汎用性とアクセシビリティの保障を視野に入れ、行うことにある。平成26年度の研究実績の概要と研究課題はこれまでの研究成果を踏まえ以下の枠組みとなる(1)特別支援学校における外国語活動の実態に関しては特に「英語ノート」から改訂された「Hi, friends!」の指導内容を把握し、障害種の実態にあった指導方法と言語教材を精選し、障害者一人一人に必要な援助を模索した。(2)音声教材としての二次元ドットコードによるコード読み取り機器に入力する情報を汎用性とアクセシビリティという観点も考慮しその作成を試みた。言語教材については構造化の観点から触図教材を作成した。そして、小学5年生用の教材「Hi, friends!1」の内容に準拠した音声ペン対応「Hello English」を作成した。本研究は「視覚障害児童の外国語活動における二次元ドットコードの活用と触図教材開発の研究」(平成23年度基盤研究(C))の継続研究となる。特に視覚障害児童には音声教材の整備充実が求められている。平成23年度に必修科目となった小学校外国語活動の副教材『英語ノート』は平成24年度からは『Hi, friends!』に変更となった。本研究は、これまでの二次元コードと触図を活用した学習プログラムの研究成果を応用し、『Hi, friends』に準拠した新コンテンツの学習指導モデルを、支援機器の汎用性とアクセシビリティの保障も視野に入れ、構築することにある。平成27年度の研究実績の概要はこれまでの研究の成果を踏まえ以下の枠組みでおこなった。(1)平成26年度に、小学校5年生用の外国語教材『Hi, friends!1』の内容に準拠し、二次元ドットコードを使用した音声ペン対応の教材『Hello English 1』を作成した。そして本年度は教材としての妥当性を検証した。(2)「日本型インクルーシブ教育」が提唱されるなか国内で出版されたインクルーシブ教育に関する書籍を収集した。(3)小学校外国語活動の副教材である『Hi, friends!1, 2』の語彙と表現についての分類を行い研究論文にまとめた。本研究の目的である特別支援学校教育における二次元ドットコードとドットコード読み取り機器、触図を活用した小学校外国語活動での指導方法の構築を達成するために、支援機器の汎用性とアクセシビリティの保障を視野に入れ以下の研究を平成27年度に行った。(1)小学校外国語の教材『Hi, friends!1, 2』の内容分析、特に使用語彙と表現(文型)を研究論文にまとめた。(2)日本型インクルーシブ教育の実体の把握のためにインクルーシブ教育に関しての国内で出版された文献の収集を行った。本研究は「視覚障害児童の外国語活動における二次元ドットコードの活用と触図教材開発の研究」(平成23年度基盤研究(C))の継続研究である。特別支援教育では、共生社会の形成に向けたインクルーシブ教育システムの構築が推進され、これまでの取組を踏まえた「日本型インクルーシブ教育」が提言されるところである。本研究は、これまでの二次元ドットコードと触図を活用した学習プログラムの研究成果を応用し、小学校外国語活動の新教材である「Hi, friends!」に対応した新コンテンツの学習モデルを、支援機器の汎用性とアクセシビリティの保証も視野にいれ、構築することにある。本研究のねらいは、日本型インクルーシブ教育に向けた資格障害児童への音声教材の充実を図るために、障害種に合った教材の提供にある。

必修科目となった小学校外国語活動は健常児への指導研究は行われているが、特別支援学校の児童には至っていない。本研究では補助教材としての工学機器と触図教材の活用で青眼者と同等の教育情報が保障されることである。本研究の実績として、平成26年度に「小学校外国語活動5年生用Hi, friends!準拠音声ペン教材Hello English1」を作成、平成28年度に「小学校外国語活動6年生用Hi, friends!準拠音声ペン教材Hello English 2」を作成した。完成した教材は、小学校外国語活動の副教材として利用してもらうために東北6県にある盲学校7校に配布した。平成23年度に必修科目化された小学校外国語活動の教材は次年度に『Hi, friends!』となった。本研究は新教材『Hi, friedns! 1, 2』の語彙と表現の分析を行った。特別支援教育、特に視覚障害児童には音声教材の整備充実が急務である。本研究では平成26年に「小学校外国語活動5年生用、Hi, friends!準拠音声ペン教材Hello English1」、平成28年に「小学校外国語活動6年生用、Hi, friends!2準拠音声ペン教材Hello English2」を作成した。工学機器と触図教材を活用した補助教材の使用により晴眼者と同等の教育情報が保障される。日本型インクルーシブ教育に向け視覚障害児童への音声教材の整備充実を図るために、障害種に合った教材の提供であるが、本研究の課題である必修科目の小学校英語は健常児童への指導研究は行われてはいるが特別支援学校までには至っていない。本研究の遂行が視覚障害児童に健常児と同等の教育機会を与えることを可能にする。そのために、補助教材としての工学機器と触図教材の活用で晴眼者と同等の教育情報が保障されることである。このために以下の研究計画を採用した。(1)資料収集・分析、科研費等の先行研究の整理、プレテスト、分析・検討の枠組みの設定:1実証調査実施のための情報収集と実態調査、2先行研究の検討と研究実行計画の立案、3プレテスト実施のための情報収集と調整、及び調査依頼、4プレテストの実施に対する検討会での意見交換(2)本調査計画の立案作成をめざしての基本会議、研究会の開催:1検討会議:年3回参加者3名、2実証調査研究デザインの構築;i先行研究の分析に基づく実証調査内容の検討、iiプレ調査活動の実施:国内、国外でのヒアリング・資料収集、国内調査地:先行研究のある協力施設、国外印刷障害者への教材等の標準規格化の視察(米国)、3データに基づく研究検討会の開催:i調査に対する意見交換と調査協力依頼ii実証調査における着眼点の特定(3)プレ調査データからの予想される調査内容項目の精選、1音声デバイス用入力データの選定、触図シートの作成、音声ペンの設定方法、2教材活用の成果、学習指導への応用、活動の様子。
索構造機械装置の波動制御

クレーンなどの懸垂索を用いた運搬機械の性能向上を図る新しい手法として、懸垂索自体の波動伝搬制御法と、質量を無視した索と荷質量で構成する単振子が多重単振子系に懸垂される場合の波動伝搬特性を利用した振れ止め制御法を開発した。懸垂索波動制御は、差分モデル制御則を用いた懸垂索支持点境界で波動無反射状態を生成する手法である。振子振れ止め制御は、制御対象振子が制御器内に構築する波動伝搬制御された多重単振子系に懸垂される状態を支持点の加速度制御によって実現し、振れ止めと目標位置への移動を統合した制御手法で、走行を伴うクレーン巻き上げ巻き下しに対応できることを実験的に検証した。本年度は,懸垂索横変位波動制御の制御法の開発,振子振れ角波動制御の制御法の開発と実験的検証を行った.懸垂索横変位波動制御では,差分制御則の導出,差分モデル及び分布定数系モデルによる差分制御則制御シミュレーションによる制御則の有効性の検証を行った.下端に集中質量を有する懸垂索運動方程式の差分近似波動伝搬解の提案とその精度検証を行い,さらに,上端固定境界節点に適用する制御則と差分境界の取り方を検討した.制御シミュレーションでは,差分モデル索でのシミュレーションに加えて,分布定数系の一般解が知られている下端に集中質量のない自由境界の場合と,一定張力が作用する水平ロープで近似できる十分大きな集中質量を下端に有する固定境界の場合について,解の固有モード展開を用いた分布定数系索のシミュレーションを行った.また,提案手法による固定境界近傍での波動吸収制御と系のエネルギー流れの関係を論じ,境界近傍制御変位は制御に制限を与えることで整定時間を犠牲にするが任意に調整できることを確認した.振子振れ角波動制御では,多重単振子仮想系について振子番号(位置)を重みとする振れ角を導入した波動伝搬解析解を求め,時間軸インパルス応答関数と制御対象懸垂系最上端振子振れ角との畳み込み積分による支持点横運動加速度制御則を導出した.振れ角制御として支持点横変位加速度を制御するため制御後の支持点の位置は保障されないため,支点位置と支点速度のフィードバック制御を加えた振れ角波動伝搬加速度を制御加速度とする制御法を検討した.フィードバック制御係数の推奨値をシミュレーションにより探索した.フィードバックにより振れ角制御と振子支点の任意位置への移動が同時に実現する制御則を実験検証した.実験結果をシミュレーションと比較し定性的に両者が一致することを確認した.本年度は,振子振れ角波動制御法に関してクレーン索荷系の制振制御特性を検討し,実用機への設計指針を明らかにした.本手法は,均質2自由度懸垂単振子系を制御器内に数学モデルとして構成し(仮想系と称す),その波動制御のオンライン演算によって,仮想系に懸垂された1自由度単振子系と見做すクレーン索荷系に波動伝搬性を支持点加速度として印可するものである.支持点位置を制御するため支持点位置のフィードバック制御を併用している.クレーン索荷系の索長は巻き上げ/下し機能のため可変である.クレーン制御性能に及ぼす基本パラメータは仮想系振子長とフィードバック係数であり,その特性を検討した.本研究では仮想系振子長さ(=lc)を一定としている.不等長仮想系の波動制御則を導出できないためコンパクトな仮想系設計には等長2自由度単振子系が最適である.クレーン索長(=l)と仮想系振子長の比(λ=lc/l)によって(仮想系+クレーン索荷系)の波動伝搬特性が変わる.多重単振子系では波動伝搬限界周波数が存在し,等長系ではλ>=5で波動伝搬が実現しなくなることが分かった.いわゆるモード局所化特性が存在し,自由振動制御を扱うクレーンの波動制御では全固有振動数が波動伝搬限界以下となるようにλを設計する必要があることが分かった.一方でλ<1では波動伝搬性がよくないことも明らかとなった.そこで,支持点のフィードバック係数と波動伝搬特性の関係を広範に調べた.その結果,支持点フィードバック係数を最適に選択することにより仮想系+索荷系の波動伝搬特性を根源的に変えることができ,λ>>1の場合でも安定に制御できるフィードバック係数が存在することが分かった.振子振れ角波動制御法に関してクレーン索荷系の制振制御特性を詳細に検討して実用機への設計指針を明らかにした.多重単振子系の波動伝搬限界特性の解明と,最下端振子(クレーン索荷系)支持点の速度と位置のフィードバック制御により多重単振子系の波動伝搬特性を根源的に変えることができることを見出した.波動制御とフィードバック制御の併用で可能となり,いずれか一方の制御では実現しない特性である.クレーン制御への適応をシミュレーションと部分実験により検証した.本年度は,クレーン索荷系と制御器内に構築する力学モデル振子系から成る多重懸垂単振子系が,クレーンの巻上げ巻下げに伴って非均質懸垂多重単振子系となることに対して,その非均質性と波動伝搬特性およびフィードバック制御の制振性に与える影響を解析し,巻上げ巻下し動作とトラバース動作の最適な制御系設計法を検討した.解析結果を実験により検証した.クレーン索長によってフィードバック係数の制振効果が大きく変わるが,クレーン索荷系に適用する場合は最大索長を基本に制御器の力学モデルを構築することが有利である.H26年度は,懸垂索横変位波動制御法の開発と振子振れ角波動制御法の開発および実験的検証を行った.

懸垂索横変位波動制御では,差分制御則の導出,差分モデル及び分布定数系モデルによる制御シミュレーションにより,制御則の有効性の検証を行った.振子振れ角波動制御では,多重単振子系について振子番号を重みとする振れ角を導入する波動伝搬解析解を求め,時間軸インパルス応答関数と制御対象懸垂系最上端振子振れ角との畳み込み積分による支持点横運動加速度制御則を導出した.支持点位置を制御するために支点の位置と速度のフィードバック制御を加えた振れ角波動伝搬加速度制御法を開発し,制御則を実験検証した.H27年度は,振子振れ角波動制御法に関してクレーン索荷系の制振制御特性を検討した.均質2自由度懸垂単振子系を制御器内に力学モデルとして構成し,その波動制御オンライン演算によって,クレーン索荷系に波動伝搬性を支持点加速度として印可する.クレーン索長と力学モデル振子長の比によっての波動伝搬特性が変わるが,多重単振子系で存在する波動伝搬限界について,支持点フィードバック係数を適切に選択することにより索荷系+力学モデル系での波動伝搬特性を根源的に変えることができることが分かった.クレーンなどの懸垂索を用いた運搬機械の性能向上を図る新しい手法として、懸垂索自体の波動伝搬制御法と、質量を無視した索と荷質量で構成する単振子が多重単振子系に懸垂される場合の波動伝搬特性を利用した振れ止め制御法を開発した。懸垂索波動制御は、差分モデル制御則を用いた懸垂索支持点境界で波動無反射状態を生成する手法である。振子振れ止め制御は、制御対象振子が制御器内に構築する波動伝搬制御された多重単振子系に懸垂される状態を支持点の加速度制御によって実現し、振れ止めと目標位置への移動を統合した制御手法で、走行を伴うクレーン巻き上げ巻き下しに対応できることを実験的に検証した。懸垂索横変位波動制御の制御法の開発では,懸垂索の振れ止め制御として差分モデルに基づく固定上端でのインピーダンス整合制御を行う波動制御法に関して,懸垂索分布定数系運動方程式の解析的な波動伝搬解は知られていないため差分波動伝搬近似解を導出した.下端自由境界に付加質量がない場合の境界値問題の一般解(0次第1種ベッセル関数)を用いて差分近似解の分布定数系での制御性を検証した.上端固定・下端付加質量無の自由端,上端固定・下端付加質量有の自由端,上端端固定・下端付加質量有の固定端の差分モデルシミュレーションによって周波数応答にほぼ一致する制御応答を確認した.上端固定・下端付加質量無の自由端の分布定数系シミュレーションによって差分モデルシミュレーションに近い制御応答を確認した.境界近傍制御変位は制御に制限を与えることで整定時間を犠牲にするが任意に調整できることを確認した.これらの検証より索構造機械装置の索波動制御への適用の可能性が確認できた.振子振れ角波動制御の制御法では,時間軸波動伝搬インパルス応答関数と懸垂系最上端振子振れ角との畳み込み積分による支持点横運動加速度制御則を導出した.支持点位置を制御するために支点位置と支点速度のフィードバック制御を導入し,振れ角波動伝搬加速度制御項にこれらのフィードバック項を付加する支持点加速度制御法を開発した.基礎実験を,3自由度懸垂振子系,2自由度懸垂振子下端に1自由度ロープ質量系を懸垂した3自由度懸垂振子系,ロープ質量系の1自由度振子系を対象として行った.1自由度ロープ質量系制御では制御器で2自由度単振子系の運動方程式をオンラインで演算した.
P-糖蛋白質の関与しない多剤耐性の機構と、その克服方法の開発

多くの抗癌剤に同時に耐性になった多剤耐性(MDR)癌細胞で過剰に発現するP-糖蛋白質が、エネルギー依存性の薬剤排出ポンプであることが明らかにされ、臨床での治療抵抗性腫瘍との関連性が報告されている。しかしながら、臨床でのMDRはP-糖蛋白質のみでは説明できないことが益々明瞭になってきた。さらに、P-糖蛋白質の発現が見られないにもかかわらずMDRの形質を獲得したヒト白血病細胞株(HL60/Adr)、肺小細胞癌株(H69AR)が分離されている。トポイソメラーゼIIの量的、質的変化によってMDR形質を獲得したatypical MDR細胞とは異なる交差耐性パターンを示す(ビンカアルカロイド系抗癌剤にも耐性である)これらの多剤耐性細胞はnon-P-glycoproteinmediated MDRと呼ばれ、その耐性機構の解明が競って行なわれはじめたところである。我々はP-糖蛋白質の関与しないMDRの機構を解明するために、ヒト癌KB細胞よりMDR克服薬剤であるセファランチン存在下に段階的に培地中のアドリアマイシンの濃度を上昇させ、アドリアマイシン耐性株(C-A90、C-A120、C-A500、CA-1)を分離した。さらにC-A500細胞より完全復帰変異株(CA-R)も分離した。C-A500はMDR形質を示したが、P-糖蛋白質は発現しておらず、200kDaの膜蛋白質の発現が増加していた。また、MDR-associated protein(MRP)遺伝子のmRNAが増加しており、MRP遺伝子の増幅が認められた。復帰変異株では200kDa蛋白質、MRPmRNAの発現、MRP遺伝子の増幅はともに認められなかった(Somat.Cell.Mol.Genet.,20,423-435,1994)。最近、JedlitschkyらはMRPが〔^3H〕ロイコトリエンC4(LTC4)でフォトラベルされることを見出した。我々もC-A120細胞から調整したmembrane vesicleが、KB-3-1細胞由来のmembrane vesicleより15倍も多くの〔^3H〕LTC4を取り込むことを確認し、この取り込みのほとんどがATP依存性の輸送によるものであることを明らかにした。