hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
障害物による流れの遮蔽効果の解明：最適耐風設計を目指して

本研究では特に、そのレイノルズ数依存性に注目した検討を行い、得られた結果についていくつかの研究発表を行った。実用性の評価として、自由水面の変形を伴い、部分的・間欠的に水没する物体のある開水路乱流を、乱流予測ツールとして期待が高まっているラージ・エディ・シミュレーションにより再現し、物理的に妥当な結果が得られたことを確認した。河川中上流部によく見られる、大きな礫や石を含む河川流への実用も十分に期待できる。また、物体に作用する流体力の時々刻々の変化についても妥当な結果を得た。古典的抗力モデルを用いた数値シミュレーションは順調に行えた反面、円柱群の個々の円柱を解像するより高精度な数値シミュレーションの準備(コードの修正および高計算負荷に耐えるための高速化作業)に予定以上の時間を要したため、当初の計画よりやや遅れている。当初の研究計画では、障害物の配置や閉塞率を系統的に変化させた数値シミュレーションの一部も今年度に行う予定であったが、数値解析コードの検証に予想より時間を要したため、少し遅れている。円柱群の個々の円柱要素を直接解像した数値シミュレーションを実施する。個々の円柱要素に作用する流体力から抗力係数を算出し、抗力モデルの改良に供する知見を獲得する。本研究課題の核心である、障害物による流れの遮蔽効果(すなわち、流れ中に複数の障害物が存在するときの障害物間の相互作用)の解明を進める。障害物の配置や障害物による流れの閉塞率を系統的に変化させ、それらが遮蔽効果に及ぼす影響の理解を目指す。繰越が生じた理由は、今年度に獲得した他の科研費と研究費の支出用途が重なったためである。未使用額は主に数値解析プログラムの更なる高速化・並列化作業委託の経費に充てる予定である。本研究では、予算制約のため、これまで研究代表者がその能力の範囲内でプログラムの高速化・並列化を進めてきたが、その作業を専門家に委託することで、申請者は本研究の核心部分に集中できるようになり、研究のより効果的な遂行に寄与する。次年度の研究費の主な使用用途は、計算の高速化に必要な数値計算ライブラリの購入(物品費)、研究成果発表と情報収集のための国内外出張・会議参加経費、連携研究者との研究打合せ経費、を予定している。
多様な認知機能を統合的に扱うための認知特徴空間の同定およびその皮質寄与分布の解明

ヒトの自然な日常・社会生活は、複雑で多元的な認知機能に支えられている。本研究の目的は、これら多元的な認知機能の関連を一望することの出来る認知特徴空間を同定し、脳内寄与分布を明らかにすること、またそれにより知覚・認知を司る脳活動の定量的理解を促進することにある。申請者らはこれまでの研究において、自然な視知覚体験下における脳活動記録を通じ、大脳皮質における知覚特徴空間を同定する手法を開発した。本研究では、同様の手法を多様な認知タスク下における脳活動記録に応用する。これにより、ヒトの生活を支える多元的な認知機能の定量的な記述、およびそれを実現する神経基盤の理解促進を目指す。2013年度は情報通信研究機構への新規赴任および新規研究グループ立ち上げに伴い、実験および解析環境の整備を行った。また皮質全体を対象として脳活動計測を行うための予備実験を行い、解剖学的及び機能的撮像手法の最適化を行った。また合わせて高磁場環境下において知覚・認知神経科学実験を行うための周辺設備の動作確認・調整を行った。これらにより、脳情報通信融合研究センター(CiNet)の新規環境下において実験を遂行するための準備を進めることが出来た。また当該研究の前提となるモデリングアプローチについて招待講演を行い、研究推進に関する意見交換等を行った。主な講演先は以下の通り:大阪大学、京都大学、早稲田大学、脳と心のメカニズムワークショップ、理化学研究所、他。(なお、2014年度は別項目の科研費採択が決定したため、重複制限規則により本研究の継続申請は辞退する。短期間(2013年10月-2014年3月)であったが、本課題の採択により研究活動の円滑なスタートを行うことが出来た。本課題で提案した研究は今後も発展的に継続して行う。)翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
遺伝子情報の育種利用と畜産におけるバイオインフォマティクスの展開

分子生物学や遺伝学の発達により、経済的に重要な形質に関わる遺伝子の位置および効果に関する情報が明らかになってきている。このような遺伝子型情報を利用することは家畜の育種計画を決定する上で非常に有益である。1つめの研究では、家畜の育種および生産現場で、遺伝子型情報を利用したときの能力評価や経済効果を算出する方法についてこれまでの自身の研究や他の著者らの研究をまとめた。この成果は国内の雑誌に掲載された。家畜の経済的な形質は量的形質であることが多く、量的形質では、関連する遺伝子情報が完全ではなく、現状では遺伝子情報のみから遺伝的な能力の評価を行うのは困難である。それ問題を解決するために、近年、家畜の育種では、ゲノムワイドに存在する数万の一塩基多型からゲノム育種価を推定し、これを個体の遺伝的能力とするゲノミック評価が行われつつある。しかし、この評価法はゲノム育種価の正確度に大きく依存している。近年では、ゲノム育種価以外にも従来の表現型情報および血統情報を用いてゲノミック評価を行う必要性が議論されている。2つめの研究では、ゲノム育種価に加え、親の予測育種価、後代の表現型情報が利用できる場合を想定し、ゲノミック評価の有用性を検討した。本研究の研究成果は国内の学会で発表した。上記で述べたゲノミック評価の手法が適用できる場は、数万のSNPsのデータが利用できる場合に限られている。3つめの研究では、家畜の経済形質に関わる責任遺伝子がいくつか同定されつつある現状を想定して、それらの情報を用いて家畜の遺伝的能力を推定する簡便法を開発した。ここでは、シミュレーションデータに加え、マウスのデータを対象にすることにより、本方法の有用性を検討した。本研究の研究成果は国内の学会で発表し、現在、海外の論文に投稿中である。本年は3つの研究を行った。分子生物学や遺伝学の発達により、病気や経済的に重要な形質に関わる遺伝子の位置および効果に関する情報が明らかになってきている。特に、病気に関しては劣性遺伝子であるのもが多く、健常な個体でも病気の遺伝子を持っている可能性がある。このような個体を選抜してしまうと将来的に集団に病気の遺伝子が広まり経済的な損失が大きいと考えられる。1つめの研究では、病気の遺伝子の遺伝様式および集団での遺伝子頻度を考慮して、病気の遺伝子を持つ個体を選抜することによって生じる経済的な損失を試算した。近年では、育種計画において遺伝子情報を有効に利用する方法論が数多く研究されている。しかし、これらの研究では交配様式や世代の重複を考慮していないものがほとんどである。実際の育種システムを考えると、より正確な遺伝的改良量を予測する上で、交配様式や世代の重複を考慮することは重要である。それゆえ、2つめの研究では、世代重複および交配様式を考慮して遺伝子型情報を用いた選抜を最適化する方法を開発した。上記の2つの研究は遺伝子情報が既知であるという前提の基に行われているが、量的形質では、関連する遺伝子情報か完全ではなく、現状では遺伝子情報のみから遺伝的な能力の評価を行うのは困難である。従来から、量的形質においては遺伝子情報と表現型情報を組み合わせて組み合わせて選抜する方法が研究されてきた。3つめの研究では、量的形質に関与している遺伝子情報(マーカー情報)が公開されているマウスのデータベースから取り出し、実際に遺伝子情報と表現型情報を用いて遺伝的な能力の評価を行った。
分子ロボティクスのための動的DNAナノ構造の設計および作製

DNA分子自体が持つ柔軟性を活かした複数種類の構造を設計,作製した.これらの構造は一本のDNA二重らせんを組み合わせることで作製され,設計上,状態遷移が可能な機構を実装できることが特徴である.構造変化を検証する前段階として,設計手法の確立,およびそれぞれの状態で形作られる理想的な構造を作製した.原子間力顕微鏡,および透過型電子顕微鏡でこれらの構造を観察することで,本設計手法の実用性を確かめた.DNA分子自体が持つ柔軟性を活かした複数種類の構造を設計,作製した.これらの構造は一本のDNA二重らせんを組み合わせることで作製され,設計上,状態遷移が可能な機構を実装できることが特徴である.構造変化を検証する前段階として,設計手法の確立,およびそれぞれの状態で形作られる理想的な構造を作製した.原子間力顕微鏡,および透過型電子顕微鏡でこれらの構造を観察することで,本設計手法の実用性を確かめた.研究計画に基づき,本年度はDNA分子自体のもつ柔軟さをいかした構造設計・作製の指針を構築するため,ねじれ・曲げが可能なDNAナノ構造のプロトタイプの設計,作製を行った.具体的には,まず,T-モチーフとよばれる独自のDNAナノ構造設計手法を用いた梯子型構造を基本として,はしごの左右の「手すり」部分の長さを変更することで自在にねじれや曲げを制御する設計手法を考案した.はしごの両方の手すりを同じだけ長くすることにより,DNA自体が持つ二重らせんの位相ズレを利用した「構造のねじれ」を,また,らせんの位相を考慮した上で片方の手すりのみを長くすることで「構造の曲げ」を実現するというのが基本的な戦略である.この設計手法にはいくつかの利点がある.ひとつは,DNA二重らせんそのものが持つ構造特性を利用することで,基本設計から派生した変形構造を容易に設計しうるという点である.2つ目としては,二重らせんが密に並んでいないため,ストランド・ディスプレイスメント(DNA鎖の入れ替え)による構造制御が容易に行える点である.この2点の特長を活かすことで,将来的には可逆的な構造変化をおこす構造作製も可能であると考えられる.この「ねじれ・曲げ」がどの程度発生するか概算したうえで,いくつかの構造設計を行った.このうちねじれのプロトタイプ構造を実際に作製し原子間力顕微鏡で観察したところ,ねじれたはしご構造が裂けた状態で並ぶ2次元構造を得た.さらに,曲げのプロトタイプ構造についても同様に作製し観察したととろ,2次元の多角形構造が作製できた.また後者については,本来であれば正方形になるように設計したものが,実際の実験では五角形や六角形にもなる結果も得たことから,設計よりも曲率が少ない構造が形成されうるといったことが示唆された.この結果を踏まえ,望まない構造形成を防ぐような工夫を行い,ふたたび構造を設計・作製したところ,意図通りの二次元正方形構造が正方格子状に整列する現象が確認できた.これらの実験により,設計可能なねじれ・曲げ構造め原理と作製のための設計指針が明らかになった.昨年度に確立したはしご型構造の設計指針をもとに,引き続き「ねじれ・曲げ」の要素を持つ各種構造を作製した.具体的には,はしご型構造を曲げた概形を持つ「正方形構造」の作製,および,はしごの手すり部分に位置する二重らせんの位相差を利用してねじれを作る「らせん型構造」を複数作製した.昨年度,これらの構造を原子間力顕微鏡(AFM)で観察したところ,「らせん型構造」のほうは予想した形状とは異なるかたちで観察された.そこで,この結果がAFM観察手法の制約によるものか,それとも設計指針自体が不完全なものであったのかを確認するため,本年度は透過型電子顕微鏡(TEM)でこの「らせん型構造」の詳細な観察を行った.雲母基板上に静電的にDNA構造を吸着させることで観察を行うAFMと比較して,TEMによる観察では,三次元構造がより溶液中本来の形状で見えると予測された.米国バーバード大学による実験手法やノウハウの提供のもと観察をおこなった結果,設計どおりのらせん型構造が確認できた.このことから,設計自体に問題があるというよりも,基板上にサンプルを吸着させるAFMの観察プロセスが原因で構造が変化したことがわかっただけでなく,溶液中ではほぼ設計通りの構造が作製できていることが実証できた.しかしながら,さらにこのねじれの頻度を変更したサンプルも観察したところ,頻度が高い構造は電子顕微鏡の観察でもより裂けやすい傾向にあることがわかった.これが観察プロセスに依存するものなのか,それともこの設計指針に限界があることを示す結果なのかについてはまだ未解明である.今後はさらに異なる構造を観察することでこの原因を明らかにし,状態遷移前後での構造を確実に予測できるようにする.遷移前後の構造が観察できることを確認した上で,当初の計画にある状態遷移機構を今回の構造に実装していく予定である.研究計画に記述した項目のうち,平成23年度に実施するとした「形状変化構造のプロトタイプの設計・作製」については,その具体的な設計手法の考案,実際のプロトタイプ構造の設計および作製に成功し,さらにそこで得た知見を元に望みどおりの形状作製にも成功したことから,本年度の目標を達成し,研究計画に沿っておおむね順調に進行しているといえる.24年度が最終年度であるため、記入しない。

基本的には今後も当初の研究目的・研究計画に従って推進する.二次元的な曲げ構造については,既存の原子間力顕微鏡でも十分観察可能であることがわかったため,電子顕微鏡を用いた三次元構造観察は必ずしも必要ない.そのため,次年度の可逆的な曲げ構造については計画通り既存の設備で実施する予定である.一方で,ねじれ構造を原子間力顕微鏡で観察する場合,構造が裂けた状態となってしまう.本年度のプロトタイプ構造をみる場合では構造が間接的にでも観察できれば十分であったが,次年度これをさらに発展させることを考えると,設計によっては電子顕微鏡での観察を試みる必要があると思われる.既存の設備で対応しきれないと判断した場合,電顕でのDNAナノ構造観察の実績がすでにある研究機関に出向くことにより,これについては対応する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
淡水性微細藻類による二酸化炭素固定とクリーン・バイオガスの生産技術

大気中の二酸化炭素濃度が急増しており、その主要な発生源での二酸化炭素ガス除去技術の確立が、人類の直面する緊急課題の一つになっている。本研究は、温帯や熱帯の陸水圏に広く分布する多様な淡水性微細藻類を利用して、人為的発生源から放出される二酸化炭素ガスの固定化技術を確立する上で必要となる基礎的知見を集積することを目的として、特にラン藻類の二酸化炭素ガス固定能とそれに及ぼす各種の環境因子の影響を調べ、工業的利用の面を考慮した品種検定を行なった。また生成したバイオマスを原料として水素ガス生成へリンクさせる可能性を探り、その生成条件の検討を行うことによって、化石燃料の代替となる高性能藻株(高CO_2固定・高水素ガス産生藻株)を利用したクリーンなエネルギー源を開発する方向を模索した。2年間の研究期間内に得られた主な新しい知見は以下のように要約される。1.炭素ガス濃度の高い田面水や淡水湖沼の表層水を試水として、炭素源を含まぬ培地で通気集積培養を行った後、ラン藻類を新たに分離し、また約40株をフィリピンから分譲を受け、以下の主な実験試料とした。2.60%までの高CO_2濃度下での培養をCO_2インキュベータ-で行い、生育の良好な藻株をスクリーニングした。3.好気および嫌気条件下での水素ガス発生をガスクロマトグラフにより定量した。4.高CO_2固定能と高H_2生成能を持った藻株(高性能藻株)について、さらに温度・光量などの培養条件を詳しく調べた。また生育パターンを把握するため、増殖曲線を求めた。高CO_2になるほどH_2生成能は低下した。5.クロロフィル量を定量し、藻体の現存量と水素ガス発生量の関係を調べ、クロロフィル当たりの水素発生量は光量が変化してもほぼ一定であった。以上の結果から、今後さらに検討すべき点が明らかになった。大気中の二酸化炭素濃度が急増しており、その主要な発生源での二酸化炭素ガス除去技術の確立が課題となっている。本研究では、温帯や熱帯の陸水圏に広く分布する多様な淡水性微細藻類を利用して、二酸化炭素ガスの固定化技術を確立する上で必要となる基礎的知見を集積することを目的として、本年度は特に淡水性微細藻類の二酸化炭素ガス固定能とそれに及ぼす各種の環境因子の影響を調べ、品種検定に着手した。また生成したバイオマスを原料とした水素発生にリンクさせる可能性を探り、その条件検討を行うことによって、化石燃料の代替となる高性能藻株(高CO_2固定・高バイオガス産生藻株)によるクリーンなエネルギー源を開発する方向を模索した。1.炭酸ガス濃度の高い田面水などを試水として、炭素源を含まぬ培地で通気集積培養を行った後、微細藻類株約50株を分離した。またフィリピンから分離株の分譲も受け以下の実験に供試した。2.平板培地上、あるいは液体培地液中での肉眼および顕微鏡観察、生理試験などにより分離株の同定を試みた。3.藻類生育量の迅速かつ簡便な把握方法を検討した。4.高CO_2濃度下で生育の良好な藻株のスクリーニングに着手した。5.嫌気条件下での水素ガス発生をガスクロマトグラフにより調べた。以上の結果、日本在来およびフィリピンより導入した藻株の中から高CO_2固定能と高H_2生成能を持った株(高性能藻株)の数種が得られた。これらの高性能藻株について、次年度はさらにCO_2インキュベーターを用いて温度・光量・気相ガス組成などの培養条件を詳しく調べる予定である。

大気中の二酸化炭素濃度が急増しており、その主要な発生源での二酸化炭素ガス除去技術の確立が、人類の直面する緊急課題の一つになっている。本研究は、温帯や熱帯の陸水圏に広く分布する多様な淡水性微細藻類を利用して、人為的発生源から放出される二酸化炭素ガスの固定化技術を確立する上で必要となる基礎的知見を集積することを目的として、特に淡水性微細藻類の二酸化炭素ガス固定能とそれに及ぼす各種の環境因子の影響を調べ、工業的利用の面を考慮した品種検定を行なった。また生成したバイオマスを原料として水素ガス生成へリンクさせる可能性を探り、その生成条件の検討を行うことによって、化石燃料の代替となる高性能藻株(高CO_2固定・高水素ガス産生藻株)を利用したクリーンなエネルギー源を開発する方向を模索した。1.炭酸ガス濃度の高い田面水や淡水湖沼の表層水を試水として、炭素源を含まぬ培地で通気集積培養を行った後、分離した微細藻類株約40株をフィリピンから分譲を受け、以下の主な実験試料とした。2.高CO_2濃度下での培養をCO_2インキュベータ-で行い、生育の良好な藻株をスクリーニングした。3.好気および嫌気条件下での水素ガス発生をガスクロマトグラフにより定量した。4.高CO_2固定能と高H_2生成能を持った藻株(高性能藻株)について、さらに温度・光量などの培養条件を詳しく調べた。また生育パターンを把握するため、増殖曲線を求めた。5.クロロフィル量を定量し、藻体の現存量と水素ガス発生量の関係を調べた。6.研究成果の取りまとめと発表を行なった。
核内STAT3運命決定シグナルの同定

STAT3は、細胞質と核間を刺激と関係なくシャトルしているが、IL-6などで活性化されたJakキナーゼにより、Y705にリン酸化を受けるとpY705-SH2間の結合により安定化した平行型2量体となり、核内に滞在し、標的遺伝子群の転写を起こす。2018年度には、活性化を受けたSTAT3の非活性化機序を詳細に検討し、全体像の理解とpS727依存的な非活性化機序を明らかにした。野生型STAT3は刺激後60分から90分の間に脱リン酸化とCRM1-非依存的な核外輸送が起こり、再度活性化/非活性化のサイクルを起こす。NTD同士の結合とpS727依存的機序が非活性化の最初の引き金となる。特にY705以降P715までのCTT領域が自らのSH2と結合することと互いのCTT間での結合がpY705-SH2結合の安定化に必要であることを示した。pS727依存的にこの結合が弱まることが重要であった。この機序に基づく阻害剤開発方法について国内特許を出願した。論文は、改訂中である。STAT3がpS727依存的に非活性化を早めるという仕組みは、活性のある転写因子がその細胞の持つ環境への応答ということに有用であると考えられた。現在、刺激前後、および非活性化過程でのコンフォメーション変化についてのモデルを作りつつあり、STATという転写因子群に共通した活性化/非活性化過程の構造変化についての理解が進んできた。NTD-NTD間の結合とpS727依存的なCTT修飾がpY705-SH2結合を弱め、構造変化を招き、それ以降にどのような構造変化が起こっていくことがチロシン脱リン酸化とCRM1依存的や非依存的な核外輸送をもたらすのかを明らかにする。核内STAT3の運命決定の全体像の把握が済み、それらを実際に担っている構造変化についてもおおよその理解が進んできた。特段、問題はない。非刺激時に存在するSTAT3コンフォメーションを明らかにする。STAT3のN-terminal domain間の結合の種類とそれらの役割を明らかにする。機能的な役割と構造上の役割を同時に検討することで、刺激後の変化、非活性化過程での構造変化、チロシン脱リン酸化と2種類に核外輸送系の使い分けを明らかにしていく。NTD-NTDと結合に関わる修飾、特にリン酸化とそのキナーゼの同定、CRM1非依存的な核外輸送系の同定を行う。IL-6刺激により活性化されたSTAT3は、SH2ドメインが相手のpY705を認識することで、より安定な平行型二量体を形成し、核内移行後もしばらく核内に留まり遺伝子発現を起こす。その後、pY705チロシン脱リン酸化と核外輸送が起こり、細胞質での再活性化を受ける。先に、活性化により増加したSer727リン酸化がSTAT3pY705チロシン脱リン酸化を促進するとの報告をしていたが、今回、pY705と核外輸送は非活性化に伴って起こる別々の事象であって、pS727は、それらをもたらす非活性化過程を促進することを見出した。この非活性化過程には、pY705-SH2ドメインのタンパクタンパク相互作用が重要との考えから、相互作用接触面の構造解析と関与部分のSTAT3変異体の解析を行い、pY705よりC末tail(CTT)部分が自分のSH2 BGループに結合していることの意味を探った。CTT-SH2結合を緩める変異体STAT3 K709EやSTAT3 T714Aは、速やかなSTAT3非活性化を招き、CTT-SH2結合を強くする変異体(K657YとY640F)は、STAT3の非活性化を大きく遅れせることから、このCTT-SH2相互作用が、STAT3の非活性化の起こりやすさを決めると考えられた。pS727依存的にSTAT3非活性化が促進されるのも、このCTT-SH2相互作用を緩める機序が働くと想定され、pS727依存的な修飾がCTT部分に起こることで非活性化促進が起こると考えられた。最後の詰めをすませ次第、論文発表する予定である。制御キナーゼ群の同定を目指すスクリーニング系を稼働させ、キノームガイドRNAライブラリーの使用から、ノックアウトにより応答を低下させるキナーゼ群を求めつつある。また非活性化過程でのSTAT3二量体のコンフォメーショナル変化やN末ドメインの役割についての理解に大きな進展があり、STAT3非活性化機序のモデル形成が進んでいる。STAT3の細胞内分布を解析するため、当初STAT3のN末端にFlag-tagを用いていたが、2017年末にN-末tagが小さくともN-Terminal domainを介したダイマー形成に影響を与えることを見出した。STAT3非活性化過程でのNTDダイマー形成の仕方を含めたSTAT3二量体のコンフォメーショナル変化の問題を構造解析から行うことにした。その際、構造解析と変異体の機能解析を組み合わせ、STAT3二量体形成を緩めることに関わる非活性化過程の研究を進めた。結果としてダイマー形成に関わる接着面の構造問題を深く学ぶこととなり、研究がより進むこととなった。

STAT3は、細胞質と核間を刺激と関係なくシャトルしているが、IL-6などで活性化されたJakキナーゼにより、Y705にリン酸化を受けるとpY705-SH2間の結合により安定化した平行型2量体となり、核内に滞在し、標的遺伝子群の転写を起こす。2018年度には、活性化を受けたSTAT3の非活性化機序を詳細に検討し、全体像の理解とpS727依存的な非活性化機序を明らかにした。野生型STAT3は刺激後60分から90分の間に脱リン酸化とCRM1-非依存的な核外輸送が起こり、再度活性化/非活性化のサイクルを起こす。NTD同士の結合とpS727依存的機序が非活性化の最初の引き金となる。特にY705以降P715までのCTT領域が自らのSH2と結合することと互いのCTT間での結合がpY705-SH2結合の安定化に必要であることを示した。pS727依存的にこの結合が弱まることが重要であった。この機序に基づく阻害剤開発方法について国内特許を出願した。論文は、改訂中である。STAT3がpS727依存的に非活性化を早めるという仕組みは、活性のある転写因子がその細胞の持つ環境への応答ということに有用であると考えられた。現在、刺激前後、および非活性化過程でのコンフォメーション変化についてのモデルを作りつつあり、STATという転写因子群に共通した活性化/非活性化過程の構造変化についての理解が進んできた。NTD-NTD間の結合とpS727依存的なCTT修飾がpY705-SH2結合を弱め、構造変化を招き、それ以降にどのような構造変化が起こっていくことがチロシン脱リン酸化とCRM1依存的や非依存的な核外輸送をもたらすのかを明らかにする。核内STAT3の運命決定の全体像の把握が済み、それらを実際に担っている構造変化についてもおおよその理解が進んできた。特段、問題はない。構造解析と変異体の機能解析の組み合わせは非常に有効であり、STAT3に生じる活性型変異と優性抑制型変異のほとんどの作用機序が理解しうる段階に達している。DNA結合活性の低下や増強、非活性化過程の阻害と促進などが構造の理解から説明できると考えている。説明できない変異は、核外輸送に関わると予想していることから、あらたな核外輸送シグナルの同定へと向かうことが可能であろうし、これまで役割の明らかでないリン酸化などの修飾の意味を見出すことも可能となろう。様々なアッセイ系の構築と関与キナーゼ群の同定作業へと進む足がかりができつつある。非刺激時に存在するSTAT3コンフォメーションを明らかにする。STAT3のN-terminal domain間の結合の種類とそれらの役割を明らかにする。機能的な役割と構造上の役割を同時に検討することで、刺激後の変化、非活性化過程での構造変化、チロシン脱リン酸化と2種類に核外輸送系の使い分けを明らかにしていく。NTD-NTDと結合に関わる修飾、特にリン酸化とそのキナーゼの同定、CRM1非依存的な核外輸送系の同定を行う。少額であるため次年度に用いることにした。次年度は、核外輸送系の同定作業、核外輸送を阻害する化学物質探索系の確立、STAT3非活性化過程制御キナーゼの同定など最終年度としては大きな仕事が残っており、経費と時間が必要となった。
HIVキャリアのAIDS発症阻止に関する研究

HIV感染症はAIDS、痴呆という重大な結果をキャリアに及ぼす。しかし、一方ではHIV感染と発症までの期間の長いことを利用し、その間に発症阻止のための方策をたてることが可能かも知れない。そのために、発症時期の的確な予測方法を見出し、薬剤投与を行うことが望まれる。以上の目的に沿って研究を行った。CDCの方法に従って末消血単核細胞を用いてキャリア血液よりウイルス分離を行うと、ウイルス分離率は発症に近づくに従って上昇する。生体内でのウイルスの増量が発症のひき金となるという考え方と一致する。また血清中の抗原・抗体系についてみると従来いわれているp24抗原・抗体系よりも抗p17抗体の消失が発症と関連することがわかった。さらに、分離されたウイルスの性状をみると、発症者または発症が近づいたキャリアより分離されるウイルスはMTー4などの株化細胞でもよく増殖するようになっていることも判明した。これらの発症予測マ-カ-を併用すればかなりの確立で予測が可能となると思われ現在これを追跡中である。さらに、発症阻止には長期間の投薬(おそらく終生にわたる)が必要とされ、そのためには安価で経口投与でき、しかも副作用の少ない薬剤の開発ないしは発見が必要である。今までのところ試験管内ではあるがプロトポルフィリン、リグニンスルホン酸などこれまでに報告のなかった物質が抗HIV剤として有望であると思われる結果を得た。さらに、すでに市販されている経口投与剤の抗HIV活性についてスクリ-ニングを行っている。HIVキャリアーの発症阻止はHIV感染の防止,エイズ患者の治療と並んで現在の世界における大問題である.HIVキャリアーの発症阻止には種々の方策が考えられているが,われわれはキャリアーが発症に向っているか否かを如何に判定するか.さらにはインターフェロンが発症阻止に役立ちうるかに焦点をおいて研究を進めた.その結果としてエイズ患者より分離されたウィルスはMT-4細胞中で非常によく増殖し,近い将来発症することのないキャリアーより分離されたウィルスはMT-4の中での増殖は低く,末梢血リンパ球内でのみよく増殖することがわかった.このことより新鮮分離株の両細胞内での増殖をみることによりキャリアーがエイズ発症に向っているか否かがわかる可能性が大となった.またヒトインターフェロンαおよびβは種々のHIV分離株の増殖を効果的に抑制することがわかった.しかもHIV感染リンパ球に定期的にインターフェロンで前処理をしたリンパ球を加えることにより生体内の状況を再現した実験系で,長期間(40日)培養でHIVの増殖を抑制していることがわかり,周2回のインターフェロン投与がHIVキャリアーのエイズ発症を阻止する可能性を示唆する結果を得た.発症阻止には発症予測が重要である。これまでに種々の研究がなされてきたがHIV感染より発症までの潜伏期の長さのばらつきが大きいことの原因を知りAIDS発症のcofactor(s)を解明することも重要である。末消血単核細胞内でのHIVの増殖を感染性ウイルス産性、p24抗原量を中心に27人の健康人について3回くり返し実験を行った。その結果、この2つの指標を用いると各個人間で大きなばらつきがありウイルス産生量で100倍以上の差が起る場合もあることがわかった。さらに特定の個人の末消血単核細胞のみを用いてHIV分離株間(末消血単核球のみを用いて分離継代しているもの)で感染後ウイルスmRNA産生、ウイルス抗原の出現、p24抗原の放出、子孫感染性ウイルスについて調べたところ、これらの証明には株間で8時間以上の差がありウイルス産生量の大きく異なることをみつけた。このようにHIVによる宿主リンパ球の傷害度にはウイルス株間、宿主個体間で大きな差があり、これがAIDS発症に大きく関与している可能性が示唆された。従って発症予測には、その個体より分離されたウイルスがその個体由来の末消血単核細胞内でどのように増殖し、どのように細胞死を導くかを調べることが発症予測にとって重要であることがわかった。
高電圧微小放電溶接による高輝度フィラメントの作製

本研究では,高電圧微小放電溶接法により,線径50μmのタングステン及びタングステン合金細線を溶接し,熱電子放出フィラメントを作製することに成功した.このフィラメントは,走査電子顕微鏡(SEM)に一般に利用されているヘアピンフィラメントより先端半径が小さく,高輝度な電子線源となることが予想される.そこで,作製したフィラメントをフィラメント用台座に溶接し,SEMの電子線源とし,実際のSEMに取り付けて画像観察を行い,ヘアピンフィラメントを用いた場合との比較を行った.その結果,試作フィラメントで撮影するほうが良好で奥行きのはっきりした画像を得られることが示された.本研究では,高電圧微小放電溶接法により,線径50μmのタングステン及びタングステン合金細線を溶接し,熱電子放出フィラメントを作製することに成功した.このフィラメントは,走査電子顕微鏡(SEM)に一般に利用されているヘアピンフィラメントより先端半径が小さく,高輝度な電子線源となることが予想される.そこで,作製したフィラメントをフィラメント用台座に溶接し,SEMの電子線源とし,実際のSEMに取り付けて画像観察を行い,ヘアピンフィラメントを用いた場合との比較を行った.その結果,試作フィラメントで撮影するほうが良好で奥行きのはっきりした画像を得られることが示された.本研究は,汎用SEMのための高輝度な電子線源の作製とその評価を目的としている.そのために高融点金属極細線を,高電圧微小放電溶接法で接合して,ヘアピンフィラメントよりも先端半径が小さなフィラメントを形成し,その性能を評価する.初年度は1素線及び線径の選択,2溶接条件の検討,及び3汎用SEM中で市販のフィラメント画像の比較を実施した.素線は,融点や仕事関数などを考慮して純W線,3%Re-W合金線,26%Re-W合金線を候補とした.また線径はそれぞれ25, 50, 75μmの3種類を検討した.なお市販のフィラメンの線径は約200μmである.25μmの線材は細いために線自身の剛性がなく,また,線径75μmの線材は溶接ができなかった.このため,線径は50μmが適当であることがわかった.素線の材質に関しては,溶接性と剛性を考慮して3%Re-W合金線を選択した.純W線を接合するとその溶接部は,非常に小さく,さらに,溶接部近傍の素線が痩せる(縮径する)ことが認められた.一方,26%Re-W合金線では良好な接合ができた.しかし,高温での素線の剛性が弱くなり,フィラメントが動くために,きれいな画像を撮影することが困難であった.適切な溶接条件を得るため,金属針の先端形状,金属針と素線先端までの距離および放電時間についても検討した.金属針の先端半径が大きく,さらに,距離が短いと,溶接入熱が小さくなり,素線を溶かすまでに時間を要した.その逆では入熱が非常に大きく,制御性が難しくなった.さらに,放電時間が長くなると,素線の縮径傾向が強くなった.検討した1条件で溶接すると,溶接後の先端半径は20μm以下となり,ヘアピンフィラメントの1/10以下であることがわかった.SEM中で観察すると,画像のエッジが立ち,明暗や穴の輪郭等がはっきりした画像が得られた.本研究では,汎用走査電子顕微鏡(SEM)のための高輝度な熱電子放出型の電子線源の作製とその評価を目的としている.高融点金属極細線を高電圧微小放電溶接法で接合して,ヘアピンフィラメントよりも先端半径が小さなフィラメントを形成する.そのようなフィラメントは高輝度な電子線源となることが予想される.そこでまず,素線の材質及び線径の選択,溶接条件の検討を行った.その結果,線径50μmの3%Re-W合金極細線が試作フィラメント線材として適していることを見いだし,これを使い溶接後の先端半径を20μm以下と,ヘアピンフィラメントの10分の1以下にすることができた.次に,試作フィラメントの評価を目的とし,作製したフィラメントをフィラメント用台座に溶接し,実際のSEMに取り付けてSEMの電子線源とし,汎用SEM中で画像撮影を行う.ヘアピンフィラメントを用いた場合との画像の比較,ビーム電流値の比較を行い,フィラメントの寿命についても検討した.画像の比較を行うために標準試料を高倍率(10,000倍)で観察・撮影した結果,試作フィラメントで撮影するほうが良好で奥行きのはっきりした画像を得られることが示された.さらに,ウェーネルトの孔径を標準の2mmから1mmにすると,試作フィラメントに流れるビーム電流は,ヘアピンフィラメントを用いたビーム電流の約20分の1と非常に小さくなることを確認した.また,実使用環境を模した条件でフィラメントの寿命を調べて,ヘアピンフィラメントと同等であることが示されたが,これはビーム電流が小さいためと思われる.工学初年度は適切な素線の選択を行い,開き角60度での溶接条件を確立すること,また専門業者に依頼して台座に取り付けて交換用フィラメントを作製するまでを目標としていた.今年度はすでに上記の目標を達成しており,さらに実際に試作したフィラメントで標準試料のSEM画像を撮影した.同じ領域を市販のヘアピンフィラメントで同じ倍率で撮影し,両者の画像を比較して,試作品で撮影するほうが良好な画像を得られることが示された.当初計画に基づき,以下の内容ついて検討する.(1)試作フィラメントの特性(輝度,寿命等)について検討する,(2)試作フィラメントに適したウェーネルト径を見出す,

(3)試作フィラメントとヘアピンフィラメントによる画像について定量的な比較を行う.フィラメントの作製まで予定通りに進んでいるが,溶接完了までの放電回数が多く,予想していたよりも溶接が困難である.これは突き合せ角が60度と大きいことによる.60度にする理由は取り付ける台座が既存のものを使用するからである.台座の改良により突き合せ角を小さくできないかも検討する.
ABC輸送体の動作原理の解明と創薬への展開

代表的なABC輸送体であるP糖蛋白質はATPを駆動力として幅広い構造の多種類の薬物を認識し細胞や体内から排出している。P糖蛋白質が一体どのような仕組みで働いているのか、その詳細な分子メカニズムはこれまで未解明であり、その解明はABC蛋白質全般の機能を考える上で重要である。研究代表者らは世界に先駆けて同一のP糖蛋白質分子の「内向型」と「外向型」の双方の結晶構造をを高分解能で決定した。とりわけ「外向型」構造は、ABC輸送体の立体構造の中で最高分解能の1.9オングストロームで決定することに成功し、同輸送体の原子レベルでの動作原理の解明に繋がった。すなわち、両構造の比較により、1)ATPとMg2+イオンの結合により引き起こされるATP結合ドメインから膜貫通ドメインへの構造変化の伝達機構、2)膜貫通ドメイン中央の空間の収縮と弛緩によるダイナミックな変化、3)交互に開閉することで基質の逆流を防止している2つの排出弁、などの仕組みを初めて見いだした。また、P糖蛋白質には膜貫通ヘリックス1と3の間の強固な相互作用が認められたのに対し、脂質フロッパーゼであるバクテリアのホモログの構造にはそのような相互作用が認められなかったことから、この相互作用の有無が多剤輸送体とフロッパーゼを区別していることが明らかとなった。さらに、ATP結合ドメイン同士の二量体を安定化させる掛け金の役割を果たすアミノ酸残基のペアが輸送機能に不可欠であることを明らかにした。以上のように、ATPを駆動力として多様な薬物を絞り出すように排出するP糖蛋白質の動作原理を原子レベルで詳細に明らかにし、重要な役割を果たすアミノ酸残基については変異体の機能解析により上記の動作原理におけるその役割の正当性を証明した。得られた研究成果をとりまとめて論文として発表した。P糖蛋白質の動作原理の解明について、想定を上回る著しい理解の進展がみられ、得られた研究成果をとりまとめて論文として発表した。P糖蛋白質の立体構造研究で得られた知見を活用し、標的分子を他のヒトABC輸送体へと拡大し、メカニズム解明のための研究を推し進める。現在、構造解析に適したヒトABC輸送体試料の調製系を確立して結晶化とともに電子顕微鏡による解析を検討中であり、立体構造を原子レベルで決定する。ヒトの持つ48種類のABC蛋白質は生理的に重要な役割を負っており、それぞれの遺伝子の異常が様々な疾病(癌の薬剤耐性、糖尿病、動脈硬化、老人性の失明、アルツハイマー病など)と関連している。ABC輸送体とりわけP糖蛋白質がどのような仕組みで薬物を認識し輸送しているのか、その分子メカニズムの詳細な立体構造基盤は未だ不明であり、その解明はABC蛋白質全般の機能を考える上で重要である。現在、広く受け入れられているABC輸送体の輸送機構は、細胞膜を介して「内向型」と「外向型」の構造が相互変換し、それと同時に輸送薬物に対する親和性が逆転するというモデルである。これまでに「内向型」と「外向型」の双方の結晶構造を同一のP糖蛋白質で明らかにした例はなく、研究代表者らは世界に先駆けて同一の真核生物由来P糖蛋白質ホモログの両結晶構造を高分解能で決定することに成功し、両者を原子レベルで厳密に比較することにより新たな動作原理モデル導き出した。動作原理モデルの妥当性を検証するため、決定した結晶構造を基にデザインしたP糖蛋白質ホモログ変異体の生化学的および物理化学的解析をATPや様々な輸送薬物を加えた条件下で実施し、機能と構造の相関を解析した。同様の解析をヒトP糖蛋白質についても実施し、動作原理モデルの正当性を確認するとともに、脂質フロッパーゼなどの他のABC輸送体と機能の違いを生み出している仕組みを原子レベルで解明し、P糖蛋白質の多剤排出メカニズムについての理解を飛躍的に向上させることに成功したた。当初の計画で予定していたP糖蛋白質の動作原理の仮説モデルの正当性が検証できただけではなく、P糖蛋白質の働きにとって要となるアミノ酸残基を新たに同定するとともに、MgATPと基質の結合によって引き起こされるP糖蛋白質の分子全体に渡る構造変化の伝達機構の理解を飛躍的に向上させることに成功した。現在、得られた成果を論文にとりまとめ投稿中である。

さらに、ATP結合ドメイン同士の二量体を安定化させる掛け金の役割を果たすアミノ酸残基のペアが輸送機能に不可欠であることを明らかにした。以上のように、ATPを駆動力として多様な薬物を絞り出すように排出するP糖蛋白質の動作原理を原子レベルで詳細に明らかにし、重要な役割を果たすアミノ酸残基については変異体の機能解析により上記の動作原理におけるその役割の正当性を証明した。得られた研究成果をとりまとめて論文として発表した。P糖蛋白質の動作原理の解明について、想定を上回る著しい理解の進展がみられ、得られた研究成果をとりまとめて論文として発表した。P糖蛋白質の解析で得られた知見を活用し、今後、標的分子を他のABC輸送体にも拡大し、立体構造を原子レベルで決定することにより、それらの分子機構の構造基盤を解明する。すでに標的分子となるヒトABC輸送体をいくつか選定できており、タンパク質の大量発現、精製タンパク質の調製を行い、それらの構造解析を目指す。P糖蛋白質の立体構造研究で得られた知見を活用し、標的分子を他のヒトABC輸送体へと拡大し、メカニズム解明のための研究を推し進める。現在、構造解析に適したヒトABC輸送体試料の調製系を確立して結晶化とともに電子顕微鏡による解析を検討中であり、立体構造を原子レベルで決定する。得られた成果を投稿論文にとりまとめる過程において、当初の予定よりも多数の変異体を用いて、ATPや様々な薬剤存在下での生化学的解析による検証が必要となった。そのため、申請時に予定していた論文別刷料、研究成果発表費用の請求が次年度に持ち越された。現在、論文を投稿中であり、次年度に論文別刷料、研究成果発表費用として使用する予定である。本研究で対象とするABC輸送体を精製するためには、可溶化に適した界面活性剤が必須であるが、新たに適用することとした高額の界面活性剤が受注生産のため本年度中に納品がなされなかったため。次年度の早い時期に同界面活性剤を消耗品費としてし使用する予定である。
Ｔ２Ｋニュートリノ実験でのニュートリノＣＰ研究と新型測定器開発

本研究は「ニュートリノにおけるCP対称性の研究と、CP研究に向けた新型検出器の開発」の2本立てである。信号はミューオンニュートリノから電子ニュートリノへの振動で、ニュートリノと反ニュートリノの振動確率を比較することでCP対称性を測定する。これまで、ニュートリノビームで15E20陽子のデータを、反ニュートリノビームで7.5E20陽子のデータを収集に成功した。このデータの一部(7.5E20陽子のニュートリノデータ)を使って、ニュートリノと反ニュートリノ、電子ニュートリノとミューオンニュートリノ、の総合解析によるCPの測定を行った。ニュートリノ振動におけるCPの破れのパラメータδCPを世界最高精度で測定した。その結果は、90%の信頼度で-3.13<δCP (ラジアン)<-0.39 [ニュートリノ質量が順階層の場合]、-2.09<δCP (ラジアン)<-0.74 [逆階層の場合]で、CP対称性が破れている(δCP≠0)ことを示唆している。この結果は、英国ロンドンで開催されたニュートリノ国際会議NEUTRINO2016やシカゴで開催された高エネルギー物理学の国際会議ICHEP2016で発表し、素粒子物理学分野の2016年のハイライトとして取り上げられた。現在、系統誤差は6%であるが、将来さらに系統誤差を減らすために、(1)ニュートリノと原子核反応の精密測定、(2)系統誤差の少ない測定を可能とする新型測定器の開発を進めた。新型ニュートリノ測定器は水標的を含んだ3次元グリッドシンチレータ飛跡測定器である。第1モジュールを製作し、ニュートリノビームモニターINGRIDの前に設置し、測定を開始した。以上の成果により、今後もビームデータを増やすことでより高精度のCP測定が可能であり、ニュートリノでCPが本当に破れているのかどうか、近い将来確定することができる。28年度が最終年度であるため、記入しない。T2K実験のニュートリノ振動解析で、反ニュートリノビームにおける電子ニュートリノ出現事象の解析を進めている。同時に、T2K実験で最大の系統誤差となっているニュートリノ反応の不定性削減を目的に、前置ニュートリノ検出器INGRIDのデータを用いたニュートリノの荷電カレント準弾性散乱反応の断面積測定を進めている。Quilain氏は、T2K前置検出器の運転責任者としてJ-PARC(茨城県東海村)に滞在し、検出器全体の状況の把握、トラブルへの対応、運転スケジュールの決定を行い、高品質なデータ収集を実現した。また新型ニュートリノ検出器WAGASCIの建設の現場責任者を努め、WAGASCIのプロトタイプを制作した。当初の実施計画に加えて、Quilain氏がT2K前置検出器の運転責任者としての仕事を行ったため。T2K実験の2016年夏までのデータを用いて、反ニュートリノビームにおける電子ニュートリノ出現事象の観測を目指す。またニュートリノにおける粒子・反粒子対称性の破れの探索を行う。またINGRIDのデータを用いたニュートリノの荷電カレント準弾性散乱反応の断面積測定を論文にまとめる。Quilain氏は、引き続き、T2K前置検出器全体の運転責任者を続け、T2Kが安定して高品質なデータ収集を行えるように、前置検出器全体の状況の把握、トラブルへの対応、運転スケジュールの決定を行う。
歯周疾患特異的T細胞に発現する抗原受容体遺伝子の解析

慢性炎症性歯周疾患は歯周病原細菌により引き起こされる感染症であるが、これまでの我々の歯周炎局所に浸潤するリンパ球サブセット、T細胞レセプターのレパトア、in vivo、in vitroのサイトカインプロフィールの検索から、自己免疫的な反応が関与している可能性が強く示唆された。即ち、歯周ポケット内細菌叢の複雑さと比較して、浸潤T細胞クローンの種類が限定していること、それらのT細胞はすでに抗原に感作されたメモリーT細胞であること、in vitroで刺激培養したときにTh1サイトカインプロフィールを持つことなどがその理由である。特にRT-PCRとsingle strand-conformation polymorphism(SSCP)解析を用いた研究からは局所のT細胞のクローナリティはリウマチ性関節炎などの自己免疫疾患の炎症局所のそれとほぼ同じであることが明らかになった。そこで、体液性応答・細胞性応答のレベルで自己免疫応答の性状を明らかにするため熱ショックタンパク60(HSP60)を抗原として解析した。HSP60は歯周病原細菌を含む原核細胞から真核細胞まで相同性が高く、かつ免疫原性が高いという性質を持つ。また、炎症などで発現が増強され、歯周炎組織においても発現が確認されている。ヒトHSP60(hHSP60)、Porphyromonas gingivalisの相同分子であるGroEL様タンパク(pHSP60)に対する血清抗体価はいずれも健常者と比較して歯周炎患者において高く、また、それらの抗体は互いに交叉反応性を示すことが明らかになった。T細胞のレベルにおいても歯周炎患者において局所にhHSP60を認識するT細胞の集積が認められ、それらのT細胞はhHSP60刺激によりIFN-γを産生することが明らかになった。以上より、歯周炎組織では自己のHSP60に対する免疫応答が起こっており、これが、病態に関与していることが示唆された。これまでのRT-PCRとsingle strandconformation polymorphism(SSCP)解析を用いた研究から歯周炎組織に浸潤するT細胞は抗原特異的に集積していることを明らかにしてきた。TCR Vβ6は末梢血、炎症歯肉組織いずれにおいても発現細胞数が多く、歯肉組織でその割合がさらに上昇していることから歯周炎において重要な働きをしていると考えられる。そこでVβ6遺伝子発現T細胞について抗原認識の中心部位であるCDR3領域の塩基配列を解析した。歯周炎患者10名の炎症歯肉組織、末梢血より全RNAを抽出し、逆転写PCR法によりCDR3領域を含むVβ6遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動によりDNAを精製後、TAクローニングベクターによりサブクローニングを行い、各被験者につき30-40個のクローンをDNAシークエンシングに供した。その結果、Vβに共通のシステイン残基から数えて7番目のアミノ酸にグリシンが多用されていることが明らかになった。さらに歯肉組織において末梢血よりも有意に高い頻度で認められた。また集積したクローンにおいては集積の認められなかったクローンよりも2倍高い頻度であった。また、CDR3領域内のアミノ酸モチーフとしてはL-X-X-Gが全クロノタイプの26%、集積のあったクローンに限ると64%を占めていた。これらのことは、歯肉組織に浸潤しているvβ6陽性T細胞は比較的限定した抗原を認識しており、それらの抗原は共通のエピトープを持っている可能性が示唆された。昨年度までの結果より、歯周炎局所に浸潤しているT細胞レパトアは、末梢血と比較してクローナリティが高く、比較的限定した抗原を認識しており、それらの抗原は共通のエピトープを持っている可能性が示唆された。

そこで共通抗原の候補としてHeat Shock Protein(HSP)60ファミリーを想定し、以下の実験を行った。1.リコンビナントhuman HSP60(hHSP60)、Porphyromonas gingivalis GroELの作製:抗原として実験に供するhHSP60、P.Gingivalis GroELを得るために、それぞれの分子をコードするDNAを得て発現用ベクター(pRSET)に組み込み、大腸菌で発現させてヒスチジンタグの付加されたfusion proteinを合成し、精製した。2.抗HSP抗体の検索:1で精製した抗原に対して特異的免疫応答が認められるかを確かめるため、歯周炎患者の血清、歯肉中の抗hHSP60抗体、抗P.gingivalis GroEL抗体の存在をウエスタンブロッティングにより調べた。抗GroEL抗体はほとんど患者の血清、歯肉抽出液中で認められ、抗hHSP60抗体は血清に比べより多くの歯肉抽出液中から認められた。さらに、これらの抗体の交差反応性も確認した。3. HSP認識T細胞の検索:2で確認された特異的免疫応答を担うT細胞の存在を調べるために、1で得られたタンパクを抗原として歯周炎患者10名の末梢血単核細胞を刺激培養した結果、健常者に比べて高い増殖活性を示すケースが多かった。さらにこの刺激した細胞と、歯周炎歯肉のT細胞をRT-PCR-SSCP法によりクローナリティを比較したところ、数名の患者で歯肉、hHSP60刺激細胞、P. gingivalis GroEL刺激細胞で同一の位置のバンドが確認され、抗原受容体遺伝子TCR β鎖CDR3領域のシークエンス解析を行った結果、同一のクローンであることを確認した。以上の結果よりhHSP60とP. ginigivalis GroELの分子相同性に由来する交差免疫反応が、歯周炎の病態の一部であることが示唆された。これまでのRT-PCRとsingle strandconformation polymorphism(SSCP)解析を用いた研究から歯周炎組織に浸潤するT細胞のクローナリティは歯周ポケット内細菌叢の複雑さから考えると極めて限定したものであり、共通抗原あるいは分子相同性の関与が考えられた。そのような性質を満たす分子として熱ショックタンパク60(HSP60)を取り上げた。HSP60は歯周病原細菌を含む原核細胞から真核細胞まで相同性が高く、かつ免疫原性が高いという性質を持つ。また、炎症などで発現が増強され、歯周炎組織においても発現が確認されている。患者末梢血と健康な歯周組織を有する対照者の末梢血をヒトHSP60(hHSP60)とPorphyromonas gingivalisの相同分子であるGroEL様タンパク(pHSP60)で刺激し、T細胞受容体遺伝子をRT-PCR-SSCPで解析した。歯肉組織についても同様に解析した。さらに塩基配列を調べて共通のクローンの存在を確認した。その結果、重度歯周炎患者において炎症歯肉組織中にhHSP60、pHSP60を認識するT細胞が集積していることが明らかになった。