hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
補体C1qを介した化膿レンサ球菌の補体免疫回避機構の解明

本研究では,化膿レンサ球菌のエンドペプチダーゼPepOと補体C1qとの相互作用と,PepOが補体免疫回避や菌の病原性に及ぼす影響を検討した.ELISAの結果より,PepOはC1qと濃度依存的に結合した.さらに,低pH条件下においてPepOはIgGとC1qとの結合を阻害した.また,低pH条件においてはPepOはヒト血清中における化膿レンサ球菌の殺菌回避に寄与した.マウス皮膚感染モデルにおいて,野生株感染病巣はpepO欠失株感染病巣より大きく,かつ病巣における補体活性は低下した.以上の結果より,化膿レンサ球菌のPepOは補体免疫回避に寄与することで,病原性を発揮することが示された.化膿レンサ球菌は様々な病原因子を発現し,宿主補体免疫系を回避する.肺炎球菌ではendopeptidase O(PepO)が補体C1qと結合し,菌自身のオプソニン化を阻害することが報告されている.一方,化膿レンサ球菌のPepOホモログと補体免疫回避の関連は明らかにされていない.そこで,本研究では化膿レンサ球菌のPepOとC1qの相互作用を解析し,補体系を介した殺菌への影響を検討した.抗C1q抗体を用いたELISAにより,PepO組換え体(rPepO)がヒトC1qと濃度依存的に結合することを明らかにした.rPepOとC1qの分子間相互作用を表面プラズモン共鳴装置を用いて評価したところ,解離定数(KD)は5.88×10-8 Mであった.古典経路の開始において,C1qの球状ヘッドはIgG Fc領域に表在するリジン残基と静電気的相互作用で結合するため,NaCl濃度の上昇に伴いその結合が減弱することが知られている.一方,rPepOとC1qの結合は,生理条件下より高いNaCl濃度において抑制された.次に,ヒト血清と野生株もしくはpepO欠失株(ΔpepO株)を反応させたところ,血清中におけるΔpepO株の菌数増加率は野生株と比較して低下した.ヒト血清と反応させた野生株およびΔpepO株の表層構造を経時的に電子顕微鏡で観察した結果,ΔpepO株では,野生株と比較して反応後30分より著明な表層構造の破壊が認められた.以上の結果から,化膿レンサ球菌のPepOはC1qとの会合により補体古典経路を阻害し,後期補体経路における溶菌を回避する可能性が示唆された.補体C1qを介した化膿レンサ球菌の補体免疫回避メカニズムについて,当初化膿レンサ球菌の菌体表層タンパクであるヒアルロン酸ならびにエンドペプチダーゼOが関連すると予測し,研究を遂行した.現在化膿エンドペプチダーゼOが補体免疫系におよぼす影響については解析がほぼ終了し,菌体表層に存在するヒアルロン酸についての解析に着手し始めている.以上より,2カ年計画においてほぼ当初の予定通りのペースで順調に進展していると言える.化膿レンサ球菌は様々な病原因子を発現し,宿主補体免疫を回避する.肺炎球菌ではendopeptidase O (PepO)が補体C1qと結合し,オプソニン化を阻害することが報告されている.一方,化膿レンサ球菌のPepOホモログと補体免疫回避の関連は明らかにされていない.そこで,本研究では化膿レンサ球菌のPepOとC1qの相互作用を解析し,補体系を介した殺菌への影響を検討した.抗C1q抗体を用いたELISAにより,組換えPepO(rPepO)がヒトC1qと濃度依存的に結合することを明らかにした.rPepOとC1qとの分子間相互作用を表面プラズモン共鳴装置を用いて評価したところ,IgGとC1q間と同等の高い親和性を示した.続いて,PepOとC1qとの結合にNaClおよびpHが及ぼす影響を検討したところ,生理条件より高いNaCl濃度において結合が抑制された.さらに、低いpH条件下において,PepOとC1qとは高い結合性を示した.次に,ヒト血清と野生株もしくはpepO欠失株(ΔpepO)を反応させたところ,血清中におけるΔpepOの菌数増加率は野生株と比較して低下した.ヒト血清と反応させた野生株およびΔpepOの表層構造を電子顕微鏡で観察した結果,ΔpepOでは,野生株と比較して著明な表層構造の破壊が認められた.さらに,野生株もしくはΔpepOをマウス背部に皮内投与し,病巣サイズを計測した.その結果,野生株感染病巣がΔpepO感染病巣と比較して大きなサイズであった.各病巣における補体活性を計測したところ,ΔpepO感染病巣の方が高い補体活性を示した.同病巣におけるC1q量については,野生株感染病巣の方が多量であった.以上の結果より,化膿レンサ球菌のPepOはC1qとの会合により補体古典経路を阻害し,後期補体経路における溶菌を回避するとともに、病原性に寄与することが示唆された.本研究では,化膿レンサ球菌のエンドペプチダーゼPepOと補体C1qとの相互作用と,PepOが補体免疫回避や菌の病原性に及ぼす影響を検討した.ELISAの結果より,PepOはC1qと濃度依存的に結合した.さらに,低pH条件下においてPepOはIgGとC1qとの結合を阻害した.

また,低pH条件においてはPepOはヒト血清中における化膿レンサ球菌の殺菌回避に寄与した.マウス皮膚感染モデルにおいて,野生株感染病巣はpepO欠失株感染病巣より大きく,かつ病巣における補体活性は低下した.以上の結果より,化膿レンサ球菌のPepOは補体免疫回避に寄与することで,病原性を発揮することが示された.化膿レンサ球菌の因子エンドペプチダーゼO(PepO)と補体C1qの相互作用,ならびにその相互作用が補体免疫回避におよぼす影響については現在論文を執筆中であり,近日中に投稿予定である.同菌の菌体表層に発現するヒアルロン酸が補体免疫系におよぼす影響に関しては,ヒアルロン酸をコードする遺伝子の欠失株ならびに相補株の作製を完了した.今後,菌体と血清中のC1qとの相互作用についてはenzyme-llinked immunosorbent assayおよびWestern blot法を用いて直接的な作用を検討する.さらに,ヒアルロン酸を介した宿主細胞への付着侵入への影響についても解析を行っていく.また,補体系路活性化への影響は,作製した欠失株ならびに相補株を用いた血清中での生存率比較試験を用いて検討する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。口腔細菌学28年度が最終年度であるため、記入しない。
短いペプチドオリゴマーを用いた、水中での強固な規則構造の構築と制御

アミノ酸を連結したペプチドオリゴマーは、その構造の柔軟性や周囲の溶媒との水素結合により、安定な規則構造をとりにくいことが多い。ゆえに環境に依存しない、高度に制御された構造を予測の通りに作り出すことは重要な課題である。本課題では、コンホメーションを制御したプロリン型βーアミノ酸のオリゴマーを合成し、アミド結合のシスートランス平衡をトランスアミドに完全に偏らせた、堅牢なトランスアミド体ヘリックス構造の創製を行った。本構造は溶媒や温度に関わらず安定であった。また、置換基を導入したオリゴマーのアミド結合の異性化平衡に関する基礎的な検討を行った。本年度は、主に以下の3つの課題について検討を行った。(1)堅牢なトランスアミド体ヘリックス構造の創製:橋頭位の片方に置換基を導入したβーアミノ酸の2量体から8量体までのオリゴマーを合成した。X線結晶構造解析および溶液中のNMR解析の結果、橋頭位置換基の立体反発により全てのアミド結合がトランス体に偏ったヘリックス構造を創製した。また、αープロリンオリゴマーのトランスアミド体ヘリックス構造(polyproline II)と類似した構造を取ることが示唆された。ポリプロリンヘリックスは溶媒によってトランスアミド体とシスアミド体の変換が起こるが、本研究で得られた構造は溶媒や温度にかかわらず安定であった。(2)閉環メタセシス反応を用いたシスアミド体ヘリックスの詳細構造の決定:モデルであるシスアミド2量体について、隣接残基の橋頭位同士を閉環メタセシス反応により分子内架橋したところ、非常に安定であると予想されていたシスアミド体からトランスアミド体への変換が起こった。架橋側鎖の長さに依存して、トランス体への変換比が変化することが分かった。(3)二環性オリゴマーの鎖長依存的な構造誘起の計算化学的解明:橋頭位に置換基を持たない二環性オリゴマーは、シスアミドートランスアミドの平衡混合物として存在する。規則構造化の可能性について調査するため、2量体から8量体までのMDシミュレーションを行ったところ、オリゴマーが長くなるにつれてトランスアミド体を多く含むコンホマーの存在比が高くなる傾向が見られた。また、実験的に鎖長依存的に円二色性(CD)スペクトルの強度が見られていたが、今回、MD計算により得られたコンホマーの分布とTDDFT法によるCD予測計算を組み合わせてスペクトルのシミュレーションを行った。その結果、実験で見られた鎖長依存性を定性的に再現することができた。現在までに、以下の成果を得ている。(1)堅牢なトランスアミド体ヘリックス構造の創製:橋頭位の片側に置換基を導入した二環性βーアミノ酸(βープロリン誘導体)をデザイン、合成し、2量体から8量体までのオリゴマーを合成した。X線結晶構造解析および溶液中のNMR解析の結果、橋頭位置換基の立体効果により全てのアミド結合がトランス体に偏ったヘリックス構造を創製した。天然に存在するαープロリンペプチドは、シスアミドからなるヘリックス(polyproline I)とトランスアミドからなるヘリックス(polyproline II)が溶媒によって変換するが、本研究で得られた構造は溶媒や温度にかかわらず安定であった。(2)閉環メタセシス反応を用いたシスアミド体ヘリックスの詳細構造の決定:シスアミド体のみを取る二環性βーアミノ酸の2量体モデル化合物について、隣接残基の側鎖同士を閉環メタセシス反応により架橋したところ、シスアミド体からトランスアミド体への変換が起こり、そのシス/トランス比やアミド結合の回転速度は架橋側鎖の長さに依存して変化することが分かった。(3)二環性オリゴマーの鎖長依存的な構造誘起の計算化学的解明:橋頭位に置換基を持たない二環性オリゴマーは、アミドのシスートランス平衡混合物で存在する。規則構造化の可能性について調査するため、2量体から8量体までのMDシミュレーションを行ったところ、オリゴマーが長くなるにつれてトランスアミド体を多く含むコンホマーの存在比が高くなる傾向が示唆された。(4)二環性βープロリンミミックを用いてタンパク質ータンパク質相互作用を制御する化合物を創製し、タンパク質ータンパク質相互作用の阻害活性を評価したところ、活性のある化合物が得られた。本研究課題では、プロリン型の3級アミド結合を持つ二環性βープロリンミミックを用いた機能性物質創製のための構造化学の基礎および応用研究を行うことを目的とした。3級アミドはシスアミド体とトランスアミド体の平衡混合物になることが多く、規則構造の創製にはアミド平衡の制御が必須である。アミド平衡をシス・トランスどちらか一方に完全に制御したプロリン誘導体の報告は少ない。3年間の研究期間を通じて、二環性骨格の橋頭位に1個置換基を導入したβーアミノ酸を創製し、アミド平衡をシスあるいはトランス一方に完全に偏らせることに成功した。また、このようなβーアミノ酸を2個連結させ、閉環メタセシス反応を用いて橋頭位置換基同士を結んだ環化モデルペプチドのアミド結合の溶液構造解析を行ったところ、環化前はシスアミド体のみを取っていたが、環化によりシス/トランス比や回転障壁が変化し、環を作るリンカー長が短いほどトランス体の割合が増え、回転障壁も低下することを見出した。トランスアミド体をとるβーアミノ酸を2個から8個連結させたペプチドオリゴマーを創製し、溶液構造解析や短い(2ー3量体)オリゴマーのX線結晶構造解析を行った結果、安定なヘリックス構造をとることを示した。

これは生体にない構造規則性を持つ伸長型ヘリックス構造であり、人工アミノ酸であるため生体内での酵素消化に対する安定性をもつと予想される。このペプチドオリゴマーのうちのいくつかが、あるタンパク質ータンパク質相互作用を阻害することを見出した。今後は阻害活性を改善すると同時に、タンパク質への作用部位等を明らかにしたい。アミノ酸を連結したペプチドオリゴマーは、その構造の柔軟性や周囲の溶媒との水素結合により、安定な規則構造をとりにくいことが多い。ゆえに環境に依存しない、高度に制御された構造を予測の通りに作り出すことは重要な課題である。本課題では、コンホメーションを制御したプロリン型βーアミノ酸のオリゴマーを合成し、アミド結合のシスートランス平衡をトランスアミドに完全に偏らせた、堅牢なトランスアミド体ヘリックス構造の創製を行った。本構造は溶媒や温度に関わらず安定であった。また、置換基を導入したオリゴマーのアミド結合の異性化平衡に関する基礎的な検討を行った。(1)2つある橋頭位(1位、4位)のうち1位に置換基を入れるとトランスアミド体をとり、4位に置換基を入れるとシスアミド体を取ることが分かり、両者はそれぞれ異なるヘリックス構造をとることが示唆された。これらの結果により、二環性βーアミノ酸のアミド平衡の効果的な固定法が確立された。橋頭位の置換基を分子内水素結合可能なアルコールに変化させた二環性オリゴマーも合成した結果、トランスアミド体をとることに変わりはないことを見出した。一方で、主鎖の構造が従来のオリゴマーと少し異なることが分かった。種々のスペクトル的手法を用いてこの構造変化を調査する予定である。(2)シスアミド体が安定であるβーアミノ酸の2量体モデルにおいて、側鎖同士を架橋することにより、トランスアミド体へと変換が起こるという興味深い現象が見出された。そこで、この現象についての理解を深めるために種々の長さの架橋側鎖を持つ分子を合成し、アミドのシス/トランス比や回転速度に関する知見を得た。従来の目的の一つであった、架橋により長鎖のオリゴマーのヘリックス構造を安定化し詳細構造を解明することについては、2量体の研究がまとまり次第開始したい。(3)おおむね当初の予定を達成した。計算との比較に必要な実験データをそろえ、計算手法も確立した。しかしながら、分子動力学計算のパラメータ設定法について改善の余地があることが判明した。(4)βーアミノ酸オリゴマーについてタンパク質ータンパク質相互作用活性を調べたところ、弱い活性があることが分かった。今後は活性増強に向けて、置換基の変換や天然アミノ酸の導入を検討して行きたい。有機化学(1)分子内水素結合を導入したトランスアミドオリゴマーの詳細構造について考察予定である。また、トランスアミドを誘起する本アミノ酸を天然のαーアミノ酸と結合させた場合も、トランスアミドへの固定化と規則構造誘起が起こるか調査し、ヘリックスミミックとしての応用につなげたい。(2)現在までに、温度可変動的NMRの手法を用いてアミド平衡の異性化速度が架橋側鎖の長さに依存するかについて初期の知見を得たが、今年度は全ての化合物についてアミドの異性化障壁(活性化自由エネルギー)を求め、定量的な評価を行いたい。(3)論文化を視野に、種々の計算化学的検討を行いたい。
中央構造線に沿う和泉層群堆積盆の形成過程の研究

中生代後期古第三紀前半の中央構造線は左横ずれ変位で特徴づけられている。この中央構造線の北側に沿って、白亜紀末期の和泉層群が四国西部から近畿西部にかけて帯状(以下、和泉帯という)に分布する。その分布特性から、和泉帯(近畿東部以東を除く)を東西にADの【^-4】域に地域区分すると、中央構造線システムの実態が明らかになっているのはD域(和泉山脈淡路島東部)なので、本研究ではここを調査・研究した。この研究で明らかになった点及び試みを以下に述べる。1.和泉層群堆積盆の海底古斜面:和泉層群中のスランプ褶曲を解析し、海底古斜面図の一部を作成した。それが示す古斜面の向きは大局的に東であり、和泉層群の地層の若化方向・向斜構造のプランジ方向とは調和するが、古流向の示す堆積時のほぼ西向きの古斜面とは逆のセンスである。このような古斜面の違いについては、堆積後、地層の東への傾動が考えられる。(1986年秋に口頭発表、日本地質学会関西支部報、No.102,p.6,合併号)2.中央構造線のpull-apartbasinとしての和泉層群堆積盆:本研究ではこれを作業仮説(モデル)とした。これをサポートする地質情報として、中央構造線システム及び背斜・向斜を示す地質構造図・地質断面図を作成した。中央構造線は東西に並走する2枚の主断層とその間の東北-西南性の分岐断層群からなる。これらに境される基盤はほぼ平行四辺形の地塊をなす。D域では74Ma以降中央構造線システムの左横ずれ運動に伴い、基盤にほぼ平行四辺形の堆積盆が東へ段階的に形成され、そこに和泉層群が段階的に堆積・傾動していったと考えられる。(1987年春の日本地質学会で口頭発表する)3.今後の展望:中央構造線は日本列島(域)の形成論において重要であり、そのモデルの可能性を和泉帯のAC域(四国西部淡路島西部)においても今後検討する必要がある。
わが国における「高等教育界」の権力構造と政策過程に関する定量的・定性的分析

本研究では、「高等教育界」を高等教育に関与する多様な「参加者」が様々な「問題群」の中からある選択肢をめぐって葛藤、調整、妥協を展開する政治的領域であると措定し、この問題群(重要問題としてイシュー)と参加者群(その中核に主要アクター)の両者、また各々の内部ならびに相互の関係を包括的に把握し、この界に独自の政策形成・決定のメカニズムを定量的・定性的(計量テキスト分析、ネットワーク分析、インタビューなどによる方法)に解明した。その成果の一部として、『高等教育の政策過程』(玉川大学出版部、2014年)を上梓した。本研究は、「高等教育界」における問題群(重要問題としてイシュー)と参加者群(その中核に主要アクター)の関係性を分析し、この界に独自の政策形成・決定のメカニズムを定量的・定性的に解明することを目的としている。具体的には、1計量テキスト分析:様々な政策・行政・学会における文書・データをテキスト化し、計量テキスト分析のソフトを使ってその内容分析からイシューとアクターの抽出・分析を行う、2ネットワーク分析:高等教育関係の資料・雑誌・新聞記事などに現れた個人・中間団体・諸機関とそれらが関わる問題群を、ネットワーク分析のソフトを利用して分析を行いその関係性を解明する、3インタビュー:主要アクターに政策過程の実態をインタビューして権力関係を明らかにする、という定量的・定性的な方法論を混合的に用いながら、「高等教育界」における問題群と参加者群の関係性を分析し、この界に独自の政策形成・決定のメカニズムを解明することを目的としている。2年目に当たる平成25年度の実績としては、24年度に整備を進めた資料渉猟とデータベースの構築という基礎的作業を踏まえ、それらを利用した分析的作業と理論研究のとりまとめを中心に進めた。上記3課題に関していえば、1個別の大学における政策対応の資料を補充しつながら、いくつかのイシュー・政策を取り上げ、その実施段階に焦点を絞りつつ論考を進めた、2国内外のネットワーク分析関係書籍・論文に依拠しながら、高等教育関連3学会の会員の学会発表などのデータ化・コード化・入力を行って高等教育界における問題群と参加者群の抽出・リスト化を行った、3社会学・政治学の権力構造論に関する日本と米国における2000年代半ば以降の研究をレビューしつつ、24年度にラポール形成した関係者へのインタビューと、彼らからの資料収集を行った。まず定量的な分析での今年度の実績としては、戦後わが国の高等教育において重要な役割を果たしてきた政治家(国会議員)を同定し、彼らの社会的特徴とその発言量・内容を考察することによって、高等教育をとりまく政治構造と政策形成・決定における影響力パターンを解明した。具体的には、戦後19452012年までの国会「文教関連委員会」において、「高等教育」に関して発言した国会議員376名を同定し、その発言量の順に「コア」、「中間」、「周辺」というグループに分割して、彼らの社会的属性と発言量の推移およびその内容の変容を考察した。分析の結果、戦後の高等教育政策に関与する政治アクターの属性は一枚岩ではなく、政策形成・決定において様々な発想様式や議論の様式が存在してきたこと、またグループ間ならびにコアグループでは衆参議院間でそれぞれその発言活動に大きな差異が見られること、1960年代から70年代前半期が最も高等教育関連の審議が活発でその後は低調になっていくこと、2000年代後半からは教育や学生に関するテーマへとシフトしていくこと、などを明らかにした。次に、定性的な分析での実績としては、社会学・政治学の権力構造論に関する先行関連研究をレビューしつつ、上記の量的な分析結果を参考にして、1960年代から高等教育関連の審議会委員などを長く務めた関係者とラポール形成を行った。そして、インテンシヴなインタビューを実施して、高等教育界における公式的な場には現れないアクターらの解明を進めた。これらの分析結果は、査読論文・大学紀要などにまとめ、学会発表などを行うことができた。これまで高等教育の政策研究の蓄積は少なくない。しかしそれらの研究は政府・文科省の施政方針や審議会答申の紹介・解説の色合いが濃く、政策過程論に基づいた政策形成・決定に関する研究は、きわめて少なかった。そこで本研究では、「高等教育界」を高等教育に関与する多様な「参加者」(例えば文教関連議員、文部官僚、学者、教育ジャーナリズムなど)が様々な「問題群」(カリキュラムや教科書といったミクロから制度設計などマクロに至る諸問題)の中からある選択肢をめぐって葛藤、調整、妥協を展開する政治的領域であると措定し、この問題群(重要問題としてイシュー)と参加者群(その中核に主要アクター)の両者、また各々の内部ならびに相互の関係を包括的に把握し、この界に独自の政策形成・決定のメカニズムを定量的・定性的に解明することを目的とした。

具体的には、計量テキスト分析の手法を用い、様々な政策・行政・学会における文書・データをテキスト化し、計量テキスト分析のソフトを使ってその内容分析からイシューとアクターの抽出・分析を行った。またネットワーク分析のアプローチから、高等教育関係の諸学会を中心として、その資料・データなどに現れた個人・中間団体・諸機関とそれらが関わる問題群(テーマ)の分析を行い、その関係性を解明した。さらに質的調査として、主要アクターに政策過程の実態をインタビューし、政策形成・決定に関わる権力関係の一端を明らかにした。これらの成果の一部として、『高等教育の政策過程』(玉川大学出版部、2014年)を上梓することが出来た。教育社会学計画期間の2年目である25年度は、24年度の作業を引き継ぎ、データベース整備と分析準備作業という基礎的な作業と、それを利用したデータ分析の作業を手がけ、中間的な研究成果のとりまとめを行いつつ、それらを統合する作業を進めることを目標としていた。上記3課題についての具体的な進捗状況は以下の通りである。1計量テキスト分析:前年度に完成させたデータベースをもとに計量テキスト分析を試み、さらに具体的なイシュー・政策についてその知見をもとにプロセス分析を進めた。2ネットワーク分析:上記同様に各アクター間のデータベースを完成させ、高等教育界のネットワーク分析を試み、その構造を解明した。3インタビュー:24年度にラポールを形成した関係者を介して、様々な資料提供を受けた。また研究成果として、学会査読誌など複数の論文に結実した。以上のように、年度当初の目標は、ほぼ25年度内中に達成できたと思われる。本研究は3年間の研究期間内に、1計量テキスト分析:国会会議録などの公式の政策・行政文書をテキスト化し、さらに計量テキスト分析のソフトを使ってその内容分析からイシューとアクターの抽出・分析を行う(計量テキスト分析)、2ネットワーク分析:高等教育関係の雑誌・新聞記事に現れた個人・中間団体・諸機関とそれらが関わる問題群を、ネットワーク分析のソフトを利用して分析を行い、その関係性を解明する、3インタビュー:主要アクターに政策過程の実態をインタビューするとともに、芋づる式に影響力のあるアクターは誰かを尋ねる「声価法」を用いて権力関係を明らかにする、という定量的・定性的な方法論を混合的に用いながら、「高等教育界」における問題群と参加者群の関係性を分析し、この界に独自の政策形成・決定のメカニズムを解明することを目的としている。計画の初年度である24年度は、資料渉猟と理論研究ならびにデータベースの構築という基礎的作業と、それを利用した分析的作業を手がけることを目標とした。上記3課題について、具体的には、1個別の大学・高等教育政策に関する論文を渉猟しつつ、国会会議録をテキストベース化し、そこに表れたアクターとイシューの抽出・リスト化を行う、2国内外のネットワーク分析関係書籍・論文の購読し、雑誌・新聞記事をもとに、それらのデータ化・コード化・入力を行い、問題群と参加者群の抽出・リスト化を行う、3社会学・政治学の権力構造論に関する先行関連研究をレビューし、主要アクター数名へのコンタクトを開始し関係者へのインタビューの準備を行う、などを掲げていた。これらの目標は、「研究実績の概要」に記したように、ほぼ24年度内中に達成できたと思われる。
硫黄同化系を高効率化したトランスジェニック植物によるファイトリメディエイション

セリンアセチル転移酵素(SATase)は硫黄同化系の重要な中間体O-アセチルセリン(OAS)を供給する鍵酵素である。植物を用いた環境汚染物質の除去(ファイトリメディエイション)を目的として、システインによるフィードバック阻害を受けないように点変異したSATase遺伝子を高発現させたトランスジェニックシロイヌナズナを作製し、その硫黄同化能の向上とカドミウム耐性を検討した。1.点変異SATase遺伝子を高発現するトランスジェニックシロイヌナズナの解析システインによるフィードバック阻害を受けないSATaseを細胞質、あるいは葉緑体に局在させたトランスジェニックシロイヌナズナを作製し、SATaseにより生合成されるOASを定量したところ、トランスジェニック植物では野生型シロイヌナズナの数十倍に増加していた。それに伴い、システイン、グルタチオン量も野生型の数倍に増加していた。このことから変異SATase遺伝子を高発現させた植物では硫黄同化能の向上が確かめられ、含硫黄環境汚染物質や重金属に対する耐性が期待された。2.トランスジェニック植物におけるカドミウム耐性作製したトランスジェニックシロイヌナズナについて200μMカドミウムを含む培地で生育させカドミウムに対する抵抗性を検討した。その結果、葉緑体で高いSATase活性を持つトランスジェニックシロイヌナズナは野生型のものに比べカドミウムに対して著しい抵抗性を示した。一方細胞質で高いSATase活性を持つトランスジェニックシロイヌナズナのカドミウムに対する耐性は野生型と同程度であった。今後カドミウム添加時に生成される植物のファイトケラチン量の測定や、植物中に取り込まれたカドミウム量を測定することで、トランスジェニックシロイヌナズナにおけるカドミウム耐性機構を解明し、土壌からの有害重金属の除去への応用の可能性について検討する。1.セリンアセチル転移酵素遺伝子を高発現するトランスジェニック植物の作出植物のセリンアセチル転移酵素には複数のアイソザイムが存在し、細胞内の主要なコンパートメント(細胞質、葉緑体、ミトコンドリア)にそれぞれ局在することが明らかになっている。今回、システインによるフィードバック阻害を受けないようにエンジニアリングした改良セリンアセチル転移酵素遺伝子をタバコおよびシロイヌナズナに導入し高発現させた。2.セリンアセチル転移酵素遺伝子を高発現するトランスジェニックシロイヌナズナの解析野生型のセリンアセチル転移酵素および改良セリンアセチル転移酵素を細胞質、あるいは葉緑体に局在させたトランスジェニックシロイヌナズナについて、セリンアセチル転移酵素により生合成されるO-アセチルセリンを定量したところ、改良セリンアセチル転移酵素が蓄積したトランスジェニック植物ではO-アセチルセリンの量が野生型シロイヌナズナの数十倍に増加していた。このことから改良セリンアセチル転移酵素遺伝子を高発現させた植物では硫黄同化能が高まっていると考えられ、含硫黄環境汚染物質や重金属に対する耐性が期待される。3.システイン合成酵素高発現タバコの二酸化硫黄に対する耐性ホウレンソウのシステイン合成酵素を細胞質と葉緑体の両方で高蓄積するトランスジェニックタバコについて解析したところ、二酸化硫黄に対して強い耐性を持つことが確認された。これは高い硫黄同化能と、それに伴い増加したグルタチオンによる活性酸素の除去によるもの推測された。
１分子解像度でＲＮＡ－タンパク質複合体の細胞内分布を一斉計測する新テクノロジー

本研究は、In situ RNAシーケンシング法およびRNA結合タンパク質の網羅的な解析により、一細胞レベルでRNA分子、RNA結合タンパク質との相互作用の同時検出技術の開発を目的としている。一細胞レベルでのRNA-タンパク質相互作用の計測は、アデニンの脱アミノ化反応によるA-to-I RNA編集等のRNA修飾、またそれによる細胞内局在の変化を明らかにできる可能性がある。今年度は特にIn situ RNAシーケンシング法の確立に加えて、マイクロRNAにおけるA-to-I RNA編集の超並列シーケンサーを用いた同定、さらにADARタンパク質と相互作用するマイクロRNAの情報学的解析を実施した。これにより、mature miRNA(成熟型)に加えて、pre-miRNA(前駆体)は、ADAR1-p110あるいはADAR2と特異的に結合することが示唆された。このADARアイソフォーム特異的に結合するマイクロRNAを用いたRNA二次構造解析より、マイクロRNAのポジション毎の塩基対合確率の比較を一塩基毎に行った。その結果から、ADARアイソフォーム特異的に結合するマイクロRNA群は異なる二次構造的な特徴を有し、その相互作用パタンによってRNA編集や局在が制御されうる可能性を示唆した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、一細胞レベルで細胞内におけるRNA分子の多重的計測およびRNA-タンパク質間相互作用イベントを一斉同定するための基盤技術を開発している。本技術は、一細胞ごとのRNA分子やそれらと相互作用するタンパク質群の不均一性、細胞内局在などの解析に広く利用されることが期待される。今年度は主に、(1)アクチンを対象にRNA分子イメージングの系を構築、(2)イメージングデータの解析パイプラインの構築、(3)一細胞を標識するためのRNAバーコードを発現させる実験系を構築、の主に3点について取り組んだ。HeLa細胞で高発現のmRNAとして知られるACTB mRNAを対象とし、in situ cDNA合成と環状型プローブのライゲーションと増幅、蛍光プローブのハイブリダイゼーションを行った。その後に、共焦点レーザー顕微鏡により増幅シグナルを観察したところ、一細胞の解像度でヒトACTB mRNA由来の増幅シグナルを検出することに成功した。更に、得られた顕微鏡画像データから一細胞毎にシグナルを画像解析パイプラインにより定量した。定量されたシグナルは、先行研究とも概ね一致することが確かめられた。これらの知見は、細胞内におけるmRNA分子の特異的増幅とその検出が可能であることを示している。また、本システムによる応用を探るため、細胞毎にランダムなバーコードを恒常的に発現させる培養細胞株を樹立した。このように細胞毎にランダムに標識されたバーコードを細胞内で検出することで、細胞間コミュニケーションや不均一な細胞集団の動態解析に貢献できると考えている。当初から目的としていた細胞内におけるcDNA合成、padlockプローブのハイブリダイゼーション、Phi29ポリメラーゼによるcDNA増幅と蛍光シグナルの検出を実証することができたため。本研究は、In situ RNAシーケンシング、一細胞トランスクリプトーム解析、転写型バーコード法を組み合せることにより、一細胞レベルでRNA分子、RNA結合タンパク質との相互作用の同時検出技術を開発することを目的としている。一細胞レベルでのRNA-タンパク質相互作用の計測は、転写後に観察される多様なRNA修飾や細胞内局在の細胞内動態、細胞毎の不均質性の一端を明らかにする可能性を持つ。また、本課題の要素技術の一つである転写型バーコード法は、一細胞レベルで、がん細胞や造血幹細胞等の細胞集団のクローン動態とトランスクリプトームの同時計測を可能にするものであり、In situ RNAシーケンシング法との技術的な親和性が高い。本年度は、miRNA二次構造とRNA結合タンパク質ADARの情報学的解析、複雑度の高い転写型バーコードライブラリーの作成と評価、一細胞トランスクリプトームと転写バーコードの同時計測に関する要素技術の開発と応用を多角的に検討した。(1) miRNA二次構造とRNA結合タンパク質ADARの情報学的解析を行い、論文発表を行った。(2)複雑度の高い転写型バーコードライブラリーの作成と評価し、(3)一細胞トランスクリプトームと転写バーコードの同時計測に成功したため。今後は、ガラススライド上に固定された細胞内でcDNA合成を行ったのち、in situ RNAシーケンシングを行う。

また、ランダムなバーコードが発現する細胞を用いて、任意のRNA分子が検出できるかを検討し、任意の遺伝子の摂動解析やがん細胞集団の不均一性の解析への応用可能性を探る。転写されたバーコードmRNA分子は、既存のIn situ RNAシーケンス法によるcDNA合成および蛍光標識プローブが結合できるように設計されている。このため、転写型バーコードを一細胞レベルで空間情報とともに計測できる系へと更に拡張する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
社会的欲求の生成と変容の脳内機構

社会的欲求の脳内機構を解明するためには、非社会的欲求の脳内機構との比較が必須である。外発的な金銭報酬が内発的動機を低下させる際、前頭前野と線条体とを含む皮質-基底核ループが重要な役割を果たしていることを昨年度明らかにしたことを受けて、今年度は社会的文脈の違いが、内発的動機にどのように影響するかを調べるため、競争群と非競争群との間で、動機づけに関わる前頭葉や線条体の脳活動がどのように異なるかを検討した。大学生男女43名の実験参加者を、非競争群(N=15)、競争群(N=14)、コントロール群(N=14)の3群に分け、内発的動機の神経基盤を調べるのに適していることが昨年度明らかになったストップウォッチ課題を2セッションずつ行って貰い、その際の脳活動をfMRIにより計測した。質問紙による内発的動機づけのスコアは、非競争群、競争群共にコントロール群よりも有意に高かったが、競争群のみにおいて、内発的動機づけスコアと有能感との間に有意な正の相関が見られ、他の2群においては、そのような有意な相関は見られなかった。腹側淡蒼球/腹側線条体における成功vs.失敗の脳活動コントラストは、内発的動機づけスコアと同様に、有能感の行動指標との間に有意な正の相関が競争群のみにおいて見られた。また、前頭前野外側部におけるストップウォッチ課題vs.コントロール課題の脳活動コントラストも、内発的動機づけスコアと同様に、有能感の行動指標との間に有意な正の相関が競争群のみにおいて見られた。これらの結果は、昨年度までの研究成果と併せて考えると、前頭前野と線条体とを含む皮質-基底核ループが、内発的動機づけの、社会的な文脈による変容にも関与していることを示唆している。社会的欲求も非社会的欲求も、内発的な動機に基づく欲求と外発的な動機に基づく欲求とがあると考えられるが、内発的動機の脳内機構については全く未知である。そこでまず非社会的欲求に焦点を絞り、内発的と外発的の動機とを区別し、それらがどのように脳内で相互作用しているかについて調べた。その結果、線条体が、外発的動機を起こす外的報酬にも、内発的動機を起こす内的達成感にも反応することが明らかになった。また、両者が併存する際には、前者が後者を抑制することを行動実験によって明らかにした。つまり、成功のみでは、内的達成感を得られなくなってしまったことを意味する。それに対応して、線条体も、課題への成功のみでは、反応しなくなった。このことは、課題自体の内的な価値が、外的な価値との比較によって、変容することを示唆する。自分の好きな物を諦めざるを得ないという事態に直面すると、人はそこに矛盾(認知的不協和)を感じ、諦めた物の価値を低めることがある。これも、認知的に価値を変容する一例である。この認知的不協和による価値変容については、最近、その存否が疑われていたが、自己報告と、それを裏付けるfMRI実験とによって実証した。認知的不協和の強さに相関して、帯状回前部と前頭前野背外側部が活動し、線条体は、価値の変容に従って、活動の大きさを変化させた。これらの結果は、価値が行動を決定するばかりでなく、逆に行動が価値表現を変容させ得ること、その神経基盤として、前頭葉と線条体が重要な役割を果たしていることを示した。
フラビン蛋白蛍光イメージング法を用いた疼痛評価系の確立

生体を用いた疼痛研究は臨床と同じ投与経路での鎮痛薬の作用機序を探索するうえで重要である。今回、内因性のフラビン蛋白の性質を利用したフラビン蛋白蛍光イメージング法を用いて一次体性感覚野の応答を観察することで痛みを評価できるか検討した。カラゲニンを投与後し疼痛モデルを作成した。投与後30分よりvon Freytestによる後肢逃避閾値は有意に低下し、同時期に左後肢振動刺激に対する一次体性感覚野の応答は増強した。同モデルに鎮痛薬であるケトプロフェンを投与すると、後肢逃避閾値は有意に上昇し、同時に一次体性感覚野の応答は減弱した。同方法を用いることで生体の痛みを測定できることが示唆された。痛みの評価系の確立を目標として、カプサイシンの発痛効果、オピオイド(モルヒネ)の鎮痛効果をフラビン蛋白蛍光イメージング法により観察している。本研究のためにフラビン蛋白蛍光イメージングを行うための装置の新規セットアップを行い完了した。カプサイシン投与時には体性感覚野におけるフラビン応答の増強が、モルヒネ投与時にはフラビン応答の減弱が得られた。これらの応答の変化から、痛みはフラビン応答の増強を、鎮痛はフラビン応答の減弱として評価できることが推測される。フラビン蛋白蛍光イメージングを行うための装置の予算は確保されていたが、そのセットアップに予定よりも時間がかかってしまった。前年度にカプサイシンの発痛効果、オピオイド(モルヒネ)の鎮痛効果をフラビン蛋白蛍光イメージング法により観察した。しかし、行動実験を行うにあたり、モルヒネでは異常行動が見られた。von Frey testが適切に施行できないと判断し、使用薬剤を変更した。発痛物質としてはカラゲニンを使用し、炎症性疼痛モデルを作成した。鎮痛薬にはケトプロフェン(非ステロイド性抗炎症薬:NSAID)を使用した。まずカラゲニンの発痛効果をvon Frey testで確認した。カラゲニン投与後、30分から後肢逃避閾値は低下し、180分までは閾値の低下が持続した。これをフラビン蛋白蛍光イメージング法で測定すると右体性感覚野の応答は増強し、行動実験と同様に180分まで持続した。炎症性モデルでは後肢逃避閾値の低下に一致したフラビン応答の増強を認めた。次にケトプロフェンによる鎮痛効果をvon Freytestで観察した。カラゲニンを投与し後肢逃避閾値が低下したマウスにケトプロフェン100mg/kg皮下投与した。30分後、60分後では有意な後肢逃避閾値の上昇を認め、その後後肢逃避閾値は再度低下した。これをフラビン蛋白蛍光イメージング法で観察すると行動実験と同様に30分後、60分後でフラビン応答の減弱を認めた。行動実験で効果が認められなくなる90分後、120分後では再度応答の増強を認め、ケトプロフェン投与後後肢逃避閾値の低下に一致したフラビン応答の減弱を認めた。これらのことから発痛・鎮痛はフラビン蛋白蛍光イメージングを用いてそれぞれ応答の増強・減弱として測定することができ、マウスの痛みを可視化することができる可能性が示唆された。研究計画に示したように行動実験を行い、フラビン蛋白の応答と行動学的な評価に相関があるか否かを検討する。また、脊髄でのフラビン蛋白の応答を測定することで、鎮痛薬の作用部位を検討する予定である。疼痛学年度内に追加購入を予定していた薬品を購入する必要がなくなったため。計画の予定通り、動物・薬品の購入、研究成果発表等に使用する予定である。
ニューラルネットワークによる翼型性能推定法の開発とプロペラ設計支援ツールへの応用

原型プロペラの幾何形状およびその他幾つかの設計パラメータを入力するだけでキャビテーション等の制約を考慮しつつプロペラ性能が最高となるようなプロペラ幾何形状を自動的に求めようとする設計支援ツールに、様々な翼型の境界層計算結果を学習させたニューラルネットワークにより翼型の粘性抗力係数を短時間に推定できるような翼型性能の簡易推定法を組み込んで、計算時間の増大を招くことなくツールの信頼性を高めた。まず、2次元翼型まわりの粘性流れ計算法として、境界層の積分型解法のコンピュータプログラムを作成した。境界層の積分型解法においては、境界層外端の流速分布が必要であるので、九州大学で開発したパネル法SQCMを使用した。Abbott著のTheory of Wing Sectionsに示されている幾つかの翼型の抗力係数の実験結果と比較して、作成した粘性流れ計算法の妥当性を確認した。次に、翼厚分布をNACA66、キャンパー形状をNACA a=0.8Mean Lineとした基本翼型について、迎角、最大翼厚およびレイノルズ数を固定して最大キャンパーの値をランダムに変化させ、粘性流れ計算法によって抗力係数を求めて学習データと。した。このとき、粘性計算の前段階としてポテンシャル計算も行い、揚力係数も求めておいた。学習データの個数は2,000個とした。そして、最大キャンパーと揚力係数を入力、抗力係数を出力とするニューラルネットワークのコンピュータプログラムを作成した。なお、本研究においては誤差逆伝播法を採用した。2,000個の学習データでニューラルネットの学習を行い、結合荷重を求めた。構築されたニューラルネットワークの妥当性を確認するために、最大キャンパーの値をランダムに変化させ、再度2,000個の翼型を生成し、上記と同様に揚力係数および抗力係数を求めておいた。一方、学習によって得られた結合荷重を用いて、再度生成した2,000個の翼型の最大キャンパーおよび揚力係数を入力として抗力係数を求めた。両方の抗力係数を比較したところ良く一致しており、ここで構築したニューラルネットの妥当性が確認できた。結合荷重さえ求めておけば、抗力係数は瞬時に求まるため、プロペラ設計支援ツールのプロペラ性能評価計算法と組み合わせても計算時間の増大は招かず、粘性の影響まで考慮した信頼性の高いツールとなることが期待できる。平成19年度に開発したニューラルネットワークによる翼型の粘性抗力係数推定システムをプロペラ性能計算法に組み込んで幾つかのプロペラの性能を計算し、実験値と比較して妥当性を確認した。このようにして高度化したプロペラ性能計算法をプロペラ設計支援ツールに組み込んだ。さらに、計算時間は長大となることが予想されるが、プロペラ設計支援ツールに境界層計算法を直接組み込んだ計算プログラムも作成した。両者を用いてプロペラの改良を行った結果、ほぼ同程度性能が向上した改良プロペラが得られた。計算時間はニューラルネットワークによる翼型の粘性抗力係数推定システムを組み込んだ方が格段に短く、本研究の目的は達成された。次に、プロペラ設計支援ツールの信頼性をさらに高めるため、プロペラ設計における制約条件として重要な、船尾伴流中でのキャビテーション発生範囲を考慮できるようにした。そのためには非定常キャビテーション計算法を開発する必要があるが、キャビテーションモデルを用いた計算法は計算時間が長大となるので、最適化計算の中に組み込むのは現実的ではない。そこで、簡易的な非定常キャビテーション性能推定法を開発した。すなわち、パネル法に基づいたキャビテーションを発生していない非定常プロペラ性能計算法により翼表面の圧力分布を計算し、飽和蒸気圧より低いところにキャビテーションが発生しているとする簡易的な計算法である。さらに、計算時間を短縮するため、1枚の翼だけ細かくパネル分割し、他の翼は粗いパネル分割としたが、翼表面圧力分布の計算結果には僅かしか差が生じないことが分かった。このような簡易計算法をプロペラ設計支援ツールに組み込むことで、船尾伴流中のキャビテーションの発生範囲を制約条件として考慮することが現実的となり、プロペラの改良においてキャビテーションの発生範囲のコントロールが可能な、実用的なツールが開発できた。
エバネッセント干渉場の位相シフトによる高精度ナノアクチュエータの開発

近年、光の波長以下のサイズにおける光と物質との相互作用を利用する近接場光学の大きな進展に伴い、高分解能光学顕微鏡の実現やナノサイズ光加工、高密度メモリの研究等が活発に行われている。この中で、光学界面に局在するエバネッセント波(全反射界面における指数関数的減衰を伴う不均質な場)のフォトン力を利用した微小物体の駆動が提案されている。しかし、移動物体の位置情報を顕微鏡によって獲得するため、精度、移動速度および装置構成などに問題がある。そこで、本研究は、エバネッセント干渉場の強度勾配によってナノ物体を捕捉すると共に、干渉位相を連続的に変化させることで干渉場を移動させてナノ物体の移動を行う高精度なアクチュエータの実現を目的とした。実際に、互いに対向する二つのレーザービーム(波長1.06μm)によってプリズム表面上に生成されたエバネッセント波を干渉させて、光学界面上に干渉場を生成させた。さらに片方のビームを偏光素子からなるQHQ位相シフターを通して干渉位相を変えることで、エバネッセント干渉場がシフトすることを、近接場光学プローブで観測することに成功した。さらにエバネッセント干渉場による駆動力を推定するために、レイリーおよびミー散乱理論に基づく数値解析を行い、エバネッセント干渉場によって微粒子を駆動できる見通しを得た。そこで、実験を行った結果、粒子群の捕捉に成功したが、使用した粒子の直径が1μm以下であったため、ブラウン運動の影響が強く、完全に駆動実験は成功に至らなかったものの、対向ビームによる微粒子の直列配列という新たな現象を見いだし、さらなる研究の推進が期待される。本研究は、エバネッセント干渉場の強度勾配によってナノ物体を捕捉すると共に、干渉位相を連続的に変化させることで干渉場を移動させてナノ物体の移動を行う高精度なアクチュエータの実現を目的とする。具体的には、互いに対向する二つのビームによって生成されたエバネッセント波を干渉させて、光学界面上に干渉場を生成する。その強度勾配によってナノスライダーを捕捉すると共に、干渉場を作るための光束の光学的位相を連続的に変化させることで位相シフトを与えて干渉場を移動させ、ナノスライダーの移動制御を行う。これによって光波長を基準とする高精度なアクチュエータを実現できる。本研究の特徴は、位相シフト量の制御によりエバネッセント干渉場を2次元面内で定量的に移動できる手法を構築することにある。これによって干渉場に捕捉されたナノ物体は、波長によって完全に校正された変位量だけ移動できることになる。この特徴を実証するため、今年度は以下のことを明らかにした。1)エバネッセント干渉場の基礎特性プリズムに全反射角で対向するように2本のYAGレーザー(現有設備)ビームを入射させ、プリズム表面にエバネッセント干渉場が形成した。界面の上方から収集型近接場光学顕微鏡(SNOM)の光プローブおよび高感度CCDを用いた光学顕微鏡によってその干渉強度分布を観察し、よりコントラストの高い入射角やビーム強度を明らかにした。2)エバネッセント干渉場の位相シフトによる移動干渉場を形成するための2本の光束のうちの一方の光学的位相を変化させることで位相シフトを与えて、干渉場がプリズム面内で移動することを確認した。位相シフトを与える方法として、2π以上の連続的な位相変化を作るために、偏光光学系を用いた幾何学的位相に基づく位相シフト法を導入し、これによって干渉場を高精度にかつ連続的にプリズム平面内で移動出来ることを明らかにした。
Ras/ERK制御因子Spred/Sproutyファミリーの生理機能と癌への寄与

Ras-Raf-ERK経路の正および負の制御因子は多数知られているが、我々のグループが発見したSprouty/Spredファミリーもそのひとつである。我々はSpred1、Spred2それぞれの単独欠損マウスを作製し、頭蓋の形成異常や造血系の亢進が認められるが、ともに出生、生殖は可能であることを報告した。今回Spred1/Spred2両ホモ欠損(DKO)胎仔を作製したところ、著明な出血、浮腫を認め、胎生12.515.5日に100%致死であった。出血は主に頸部、腎臓周囲を中心にみられ、リンパ管あるいは血管の異常が予想された。そこでリンパ管内皮細胞マーカーであるLYVE-1および血管内皮細胞マーカーであるPECAM-1/CD31のwhole mountの免疫染色を行なった。その結果、血管はほぼ正常であるが、拡張した不整な管腔はLYVE-1陽性であり、拡張した管腔はリンパ管であると考えられた。またリンパ管の数自体も増加していた。驚いたことに、正常な胎仔では見られないLYVE-1、CD31両陽性の管腔がSpred1/Spred2 DKO胎仔の頸部において認められた。さらに生化学的な機能解析の結果より、SpredはVEGF-C/VEGFR-3シグナルの生理的な負の制御因子として機能しており、リンパ管発生、特に静脈からの適切な分離に必須の分子であると報告した。またSpred1に関してベルギー、フランス、アメリカとの国際共同研究によって神経繊維腫(NF)1型患者で変異を認めた。カフェオレ斑を持つが、NF1遺伝子に変異を認めない家族性優性遺伝のNF1様患者、5家系について第15番染色体上のSPRED1遺伝子に変異が発見された。ほとんどはナンセンス変異によるC末側欠失変異である。SPRED1に変異を持つ患者は、カフェオレ斑、腋窩の雀卵斑、ヌーナン症候群様顔貌(眼間開離・眼瞼下垂)、巨頭症、注意欠陥障害・学習障害を示した。またこれらの表現型はSpred1欠損マウスの表現型ともよく一致した。SpredがRas/ERK経路の抑制因子であることが遺伝学的にも証明された。Spred/Sproutyファミリー分子はRas/Rafに結合して、ERK/MAP kinase経路を抑制する調節因子である。Spredは哺乳類では3種類報告されており、我々はSpred1,Spred2それぞれのノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。Spred1はマスト細胞や好酸球などの末梢血液細胞の増殖を、Spred2は胎児期の血球発生を負に制御することを示した。Spredはもともと造血組織に多く発現し、Spred-1,Spred-2それぞれの単独KOマウスも好酸球、マスト細胞、赤血球などの産生亢進が認められた。Spred1/Spred-2のDouble-KO(DKO)マウスはリンパ管の過形成によりE1214に死亡する。SpredはVEGF-Cのシグナルをリンパ管内皮細胞内で制御するのか、あるいは血球細胞と血管/リンパ管前駆細胞との相互作用を調節するか、いずれかの作用があるものと考えられる。現在DKOマウスの解析をすすめている。Sprouty2-KOマウスを用いた解析からSprouty2はGDNFシグナルを負に制御し消化管神経の生存や神経ネットワーク形成を統御する重要な分子であることを示した。ショウジョウバエの表現型とあわせて考察すればSproutyは気管系や神経系などネットワーク構造の正確なリモデリングに重要な役割を担っていると思われる。今日までSprouty4欠損マウスの詳細な解析はまだ報告されていない。そこで今回の研究ではSprouty4欠損マウスを作製し、特徴付けを行った。Sprouty4欠損マウスの大部分は生直後に下顎欠損のため死亡するが、残りは生存可能で生殖能力があった。大部分のSprouty4欠損マウスは発育遅延を呈し、ほぼ全てに合指症・多指症がみられた。Sprouty4欠損胎仔線維芽細胞(MEFs)において、FGFに対するERK活性化は遷延したが、EGFに対するERK活性化の遷延はみられなかった。Sprouty2とSprouty4の2重欠損マウスは胎生致死であり、頭蓋顔面、肢、肺の形態形成に重篤な異常を認めた。これらの知見は胚発生とFGFシグナルにおける、Sprouty2とSprouty4の機能が重複的であるとともに非重複的でもあることを示唆している。

またリンパ管の数自体も増加していた。驚いたことに、正常な胎仔では見られないLYVE-1、CD31両陽性の管腔がSpred1/Spred2 DKO胎仔の頸部において認められた。さらに生化学的な機能解析の結果より、SpredはVEGF-C/VEGFR-3シグナルの生理的な負の制御因子として機能しており、リンパ管発生、特に静脈からの適切な分離に必須の分子であると報告した。またSpred1に関してベルギー、フランス、アメリカとの国際共同研究によって神経繊維腫(NF)1型患者で変異を認めた。カフェオレ斑を持つが、NF1遺伝子に変異を認めない家族性優性遺伝のNF1様患者、5家系について第15番染色体上のSPRED1遺伝子に変異が発見された。ほとんどはナンセンス変異によるC末側欠失変異である。SPRED1に変異を持つ患者は、カフェオレ斑、腋窩の雀卵斑、ヌーナン症候群様顔貌(眼間開離・眼瞼下垂)、巨頭症、注意欠陥障害・学習障害を示した。またこれらの表現型はSpred1欠損マウスの表現型ともよく一致した。SpredがRas/ERK経路の抑制因子であることが遺伝学的にも証明された。