hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞シート工学を応用した乳歯歯髄幹細胞による唇顎口蓋裂患者の新規顎裂治療法の開発

そのため、当該年度は骨形成細胞シートと人工骨を組み合わせた移植法や、成長因子を用いた培養法などについて検討を行った。更に、「顎裂モデル」のみならず、他の骨欠損モデルにおいても検討を行った。その結果、抜歯後欠損モデルにて成長因子を用いた手法が骨形成細胞シートを用いる移植方法より良好な骨形成がみられた。そこで、成長因子の影響を調べるため、in vitro研究にて成長因子の至適濃度や組み合わせる担体について検討を行った。徐放製剤であるハイドロゲルとの組み合わせにおいて良好な骨形成を示すことが判明した。そこで、コントロールを設定しin vivoでの比較検討を行った。定量評価は組織学的、マイクロCTによるエックス線学的に行った。組織学的検査では実験群は旺盛な骨形成を認めたが、コントロール群では骨形成はみられず、壊死骨形成や著明な炎症細胞浸潤を伴っていた。エックス線学的検査でも実験群は旺盛な骨形成を認めたが、コントロール群でははっきりとした骨形成はみられず、腐骨と思われる不透過像がみられた。統計学的に実験群は有意に骨形成を認めた。骨形成細胞シートを用いる移植方法より成長因子を用いる手法の方が骨形成能が高い可能性が示された。現在、経時的な変化を確認するため、移植実験を継続中である。当初は動物モデルにて骨形成細胞シートによる顎裂治療の可能性を経時的に検証する予定であったが思わしい結果が得られなかった。そのため、他の再生医学的なアプローチによる顎裂治療の可能性について検証を行ったところ、成長因子を用いた手法にて一定の成果が得られた。しかし、経時的な変化を検証するところまで研究を進捗することができなかった。現在、当該研究を行っている最中であり、当初の予定よりやや遅れている状況である。乳歯MSCを使用した「顎裂モデル」への移植実験が進行中である。今回の実験でわずかではあるが、骨形成を認めたため、同一個体で同一継代数の細胞を使用し、複数のヌードラットへ移植し、骨形成の有効性を継時的に評価する。現在、in vivoで良好な骨形成能を得ることができるよう、前回確立した培養条件に追加し検討している。その条件で作製した細胞シートの移植実験も同時に行っていく。当初予期していなかった方法ではあるものの、成長因子を用いた手法による顎裂治療の可能性を見出すことができた。我々の最終目標は再生医学的アプローチを用いることで自家骨移植に寄らない顎裂治療法の開発であり、今後は骨形成細胞シートを用いた方法から成長因子を用いた手法へと研究を発展的に移行し、更に推進していく予定である。乳歯MSCを用いた骨形成細胞シート作製について、最適な作製方法を確定することが出来た。よって、29年度に行う予定であった「顎裂モデル」への移植実験を本年度より開始し、後年度の動物購入費を前倒しした。しかし、日程が間に合わず、予定していた全ての動物実験を行う事が出来なかったため、次年度使用額が生じた。前年度に発生した未使用額を全て使い切ることが出来なかった。次年度に実験器具や動物購入費に充てる予定である。当初の予定は骨形成細胞シートを用いてin vivo研究を進め、各種解析を行う予定であったが、想定していた結果が得られなかった。そのため、異なる材料や培養方法などを用いた手法などによる骨再生について検討を行った。今後は当初計画していたin vivo研究を行い、解析を進める予定である。
光ヘテロダイン法による液体表面リプロンの超広帯域スペクトロスコピ-

液体の表面・界面における構造・物性、及びそれにともなう反応性は、液体内部のそれとは大きく異なっている。液体表面物性については従来より基礎物性研究の立場から多くの研究がなされてきた。最近では、機能性分子薄膜としてのLB膜の形成等、液体表面をデバイスとして積極的に利用する試みが行なわれるようになり、工学的にも強い関心が持たれている。液体表面物性の研究手段としては表面張力測定があるが、分子レベルの液体の動的物性研究という観点からは10MHz程度の時間分解能を有する測定手段の開発が強く望まれている。最近、液体表面に熱的に励起された表面張力波(リプロン)が伝搬する様子を光散乱を用いて調べる試みがなされている。しかし技術的な制約によりその周波数域は数10kHz程度に制限されていた。本研究は、MHz域のリプロン測定が可能な広帯域リプロン光散乱法を開発すること、ならびにこれを用いて、液体表面の動的な物性の研究を行なうことを目的とした。研究成果を以下にまとめる。1)新しい光散乱系を用いた広帯域リプロン光散乱法を開発した。従来の測定周波数限界を2桁拡張し6MHzまでの測定が可能になった。2)水、低級アルコ-ルをはじめとする純粋液体における6MHzまでの広帯域表面物性の研究を行った。3)液体表面に展開されたラングミュア膜の動的物性を測定し、表面粘弾性についての考察を行った。4)高分子のゲル化に伴う表面張力波から表面弾性波へのモ-ド変化を観察し、表面における相転移過程の研究を行なった。液体の表面・界面における構造・物性、およびそれに伴う反応性は液体内部とは大きく異なっている。液体表面物性については基礎物性研究の立場からこれまで多くの研究がなされてきた。最近では、LB膜の形成等、液体表面をデバイスとして利用する試みも行なわれ、工学的な見地からも関心が高まっている。しかしながら、液体表面物性を分子のレベルから研究するために必要な、高時間分解能を有する液体表面測定手段はこれまで存在しなかった。本研究は、光散乱法を用いた、高周波液体表面物性の測定手段を開発すること、およびこれを用いて分子レベルからその物性を研究することである。本年度の研究実績の内容を以下にまとめる。液体表面を伝搬する熱的表面張力波(リプロン)を広帯域で測定することができる広帯域リプロン光散乱法を開発した。光学系の改良などを重ね、現在周波数にして6MHzまでの測定が可能となっている。これは従来の測定域を二桁拡張するものである。水などの純粋液体について、高周波数域のリプロンを観察した結果、その挙動は古典的な流体力学理論による予想とよく一致し、これらの液体の表面が、10^<-8>秒の時間領域では流体と見なせることを明らかにした。また、液体表面に展開された単分子膜の高周波力学物性を、広帯域リプロン光散乱によって測定する技術を開発した。ミリスチン酸についての測定の結果、ミリスチン酸単分子膜の表面粘弾性が数100kHz域で異常を示すことが明らかになった。さらにゼラチン水溶液のゾル-ゲル転移前後でリプロンの伝搬を測定した。その結果、一見固体に見えるゲルの表面に表面張力が存在することがわかった。また広帯域リプロン光散乱法が、kHzMHz域での粘性測定に有効であることが確認できた。

液体表面物性の研究手段としては表面張力測定があるが、分子レベルの液体の動的物性研究という観点からは10MHz程度の時間分解能を有する測定手段の開発が強く望まれている。最近、液体表面に熱的に励起された表面張力波(リプロン)が伝搬する様子を光散乱を用いて使べる試みがなされている。しかし技術的な制約によりその周波数域は数10kHz程度に制限されていた。我々は昨年度の研究で、MHz域のリプロン測定が可能な広帯域リプロン光散乱法を開発し、これを純粋単純液体に応用してその高周波表面物性の研究を行った。本年度は、更に装置に改良を加えて多くの表面の系についての測定、研究を行った。本年度の研究成果を以下にまとめる。1)液体表面に展開された不溶性界面活性剤の形成する単分子膜(ラングミュア膜)は、LB膜の前駆体として工業的に重要である。このラングミュア膜の動的物性を光散乱法で測定し、表面粘弾性についての考察を行った。2)ゼラチン、アガロ-ス水溶液など高分子溶液のゲル化に伴う表面張力波から表面弾性液へのモ-ド変化を観察し、表面における相転移過程の研究を行なった。
磁場による結晶核制御

芳香環をもつ有機分子の磁気配向について検討を行ってきた.磁気異方性の大きな有機分子は微小サイズの段階(微結晶段階については不明)から,磁場による配向の可能性が高い.また,微小領域の段階では,結晶面と液体の間の境界面の磁化率勾配に対する磁場効果,対流への磁場効果によるモルフォロジー変化など,配向以外の効果が期待できる.これら現象の機構は、結晶核が形成されて結晶成長の初期段階で磁気エネルギーが熱エネルギーを超えたとき磁場配向を示すと考えられている。本研究では,無置換の芳香族類について,結晶の磁場配向が始まる大きさ(臨界長)の測定および見積もりを試みた.多環芳香族化合物であるコロネンは針状結晶をつくり,磁化率の異方性に従って磁場印加方向に対して垂直に磁場配向を示すことが報告されている.この針状結晶について、磁場配向の程度を様々な大きさの結晶について検討を行った.マイクロメートルオーダーの結晶を作成して偏光顕微鏡を用いた解析において,1.2 T程度の磁場でもわずかながら配向していることがわかったが,解析は困難であった.このため,磁場強度を上げ,5 Tの磁場強度で,300マイクロメートル以上の長さを持つ針状結晶が配向を示していることがわかった.また,芳香族蛍光性物質としてピレンを用いたベシクル構造の評価,多くの芳香族化合物を含む石炭ピッチの磁場効果の研究も行った.磁場によるベシクルの変形がピレンモノマー蛍光寿命の変化を引き起こしていることがわかった.有機分子,特に芳香環をもつ分子は比較的大きな磁化率異方性を持つため,微小サイズの段階(微結晶段階については不明)から,磁場による配向の可能性が高い.磁気配向は結晶核から,また途中の中間状態での結晶成長に影響を与えると予想される.また,配向以外の磁場効果,固体と液体の間の境界面の磁化率勾配に対する磁場効果,対流への磁場効果が期待できる.そこで,本研究では,芳香環をもつ有機分子として,ピレン誘導体を用いた.これは,置換基によって明確な色を呈するものがあること,蛍光を発するもの(特に蛍光顕微鏡観察で細胞内の特定部位につくプローブとして,多数開発されている),また,多形を示す結晶も報告されていることから,適切であると判断した.できるだけ単純な系である方が発展性があるため,置換基として,アルキル基,アミノ基,ヒドロキシ基,カルボン酸等の比較的単純なものを選び,結晶条件等を検討した.現在のところ,アミノピレン誘導体またはヒドロキシピレン誘導体が比較的結晶成長観測に適していることがわかった.磁場装置の方は,電磁石固定用の台車,電源用の台を作成し,据え付けているところである.現存の電源が,まだ使えない状況であり,再設定が必要である.これについては次年度に購入する新しい電源で使用できるよう,準備をしているところである.今回,理論面で,磁気配向と深い関係があるエントロピーの結果を図書として発行することができた.当初,金属樹の結晶成長について検討していたが,金属イオンへのローレンツ力による磁場効果が大きいため,イオン種ではない有機化合物に展開している.有機結晶の作成条件については,ピレン誘導体を中心に実験がある程度進行しているが,磁石の設定,および観測システムの組立てが,耐震工事後の再レイアウト設定に時間がとられていることもあり,想定よりも遅れている.これについては,次年度の購入予定の電源と組み合わせることで検討している.芳香環をもつ有機分子の磁気配向について検討を行ってきた.磁気異方性の大きな有機分子は微小サイズの段階(微結晶段階については不明)から,磁場による配向の可能性が高い.また,配向以外の磁場効果として結晶面と液体の間の境界面の磁化率勾配に対する磁場効果,対流への磁場効果によるモルフォロジーが期待できる.アミノピレン誘導体のような芳香環を持つ蛍光性物質と並行して,無置換の芳香族類を芳香環のサイズを変えながら系統的に比較検討することを進めている.多環式芳香族であるコロネンについて,不純物の影響を取り除くために,複数回の昇華精製を行い,マイクロメートルオーダーの結晶を作成した.この結晶については,今回購入した電源装置を用いて電磁石の磁場内でも作成に成功している.1.2 T程度の磁場でも配向していることがわかった.現在,様々な実験条件でできるよう,実験条件の検討および測定系の構築を進めているところである.磁場装置の方は,ようやく電源装置と接続し,20 Aで約1.2 Tの磁場強度が得られることを確認したところである.まだ再設定に時間がかかっている段階である.観測システムの方は,顕微鏡に接触式の変位計を組み合わせたものを作成し,分解能として0.5マイクロメートルオーダーを得ることができた.これにより,結晶の奥行方向の長さを測ることができるため,微小サイズの結晶の体積の見積もりができるようになった.サイズによる配向性の違い,磁場強度による違いの比較検討を進めている.耐震工事後の大まかな再レイアウト設定は終了したが,電磁石用の電源接続後の設定に時間がとられている.顕微観察において,奥行き方向の変位を観測するための装置を組み立てているが,0.5マイクロメートルまでが限界のようである.このため,当初の想定よりも遅れている.これについては,次年度の購入予定の電源と組み合わせることで検討している.また,他の公務にとられる時間が増え,昨年度は学会出席ができず,論文作成ができなかった.昨年度に予定していた分も含めて,実験を展開する必要がある.芳香環をもつ有機分子の磁気配向について検討を行ってきた.

磁気異方性の大きな有機分子は微小サイズの段階(微結晶段階については不明)から,磁場による配向の可能性が高い.また,微小領域の段階では,結晶面と液体の間の境界面の磁化率勾配に対する磁場効果,対流への磁場効果によるモルフォロジー変化など,配向以外の効果が期待できる.これら現象の機構は、結晶核が形成されて結晶成長の初期段階で磁気エネルギーが熱エネルギーを超えたとき磁場配向を示すと考えられている。本研究では,無置換の芳香族類について,結晶の磁場配向が始まる大きさ(臨界長)の測定および見積もりを試みた.多環芳香族化合物であるコロネンは針状結晶をつくり,磁化率の異方性に従って磁場印加方向に対して垂直に磁場配向を示すことが報告されている.この針状結晶について、磁場配向の程度を様々な大きさの結晶について検討を行った.マイクロメートルオーダーの結晶を作成して偏光顕微鏡を用いた解析において,1.2 T程度の磁場でもわずかながら配向していることがわかったが,解析は困難であった.このため,磁場強度を上げ,5 Tの磁場強度で,300マイクロメートル以上の長さを持つ針状結晶が配向を示していることがわかった.また,芳香族蛍光性物質としてピレンを用いたベシクル構造の評価,多くの芳香族化合物を含む石炭ピッチの磁場効果の研究も行った.磁場によるベシクルの変形がピレンモノマー蛍光寿命の変化を引き起こしていることがわかった.有機結晶成長への磁場効果,特に微小スケールへの影響を観測するために,電磁石,電源,および観測システムの構築を進める.観測試料として,電荷移動錯体等の磁気異方性が高い結晶が成長する条件の検討,呈色している試料あるいは,蛍光性の試料を用いることで,現在検討を進めている.また,無機結晶の成長条件を再検討する.特に,形状が比較的異方的な結晶ができる条件を探索し,形状異方性による磁場効果の可能性についても検討する.有機結晶成長への磁場効果,特に微小スケールへの影響を観測するための電磁石,電源,および観測システムの構築を平成30年度も引き続き進める.観測試料として,無置換の多環式芳香族を中心に電荷移動錯体等の磁気異方性が高い結晶が成長する条件の検討,呈色している試料あるいは,蛍光性の試料を用いることで,現在検討を進めている.また,形状異方性による磁場効果についても検討する.当初,銀化合物等の無機化合物も含めて実験を行う予定であったが,実験条件の設定段階で,有機化合物のみを行うことになったため,試薬代が当初の予定よりも少なくなったことによる.次年度請求分とあわせて,無機化合物に再度実験条件を確認するための試薬代および実験装置の改良にあてる.
連結グラフの誘導部分グラフとn-拡張可能性について

1-因子をもつグラフGがn-拡張可能であるとは、G内にn本の独立辺を任意に指定するとき、これらを含む1-因子に拡張できるときのことをいう.グラフ内に1-因子が存在するための十分条件は19世紀からかなり多数の研究がなされて今日に至っている.その中の古典的な定理に次のようなものがある:位数2pの連結グラフG内の位数2q(p>q>1)の任意の連結誘導部かグラフが1-因子をもつならば、グラフGも1-因子をもつ.これは1974年にSUMNERによって証明されたものであり、グラフの誘導部分グラフによる再帰的条件による定理となっている.この定理をもとに、1993年にNISHIMURAは、n-拡張可能性について類似の定理:Gを位数2p(p【greater than or equal】3)の連結グラフ,q,nを1【less thanor equal】n<q<pをみたす整数とする.ある整数qが存在して、Gの位数2qの任意の連結誘導部分グラフがn-拡張可能であれば、このときG自身もn-拡張可能である.を導き、組合せ系学術誌Ars Conbinatoria(CANADA)に発表された.この定理では、位数2qの誘導部分グラフに連結性を仮定し、Gからこの部分グラフを残すように除かれる位数2(p-q)の部分グラフについては、その連結性には条件が入れられていないことがわかる.ここでの研究では、逆に連結グラフGから除いてしまう部分グラフに連結性を仮定することによって新しい結果を作ることを目的としGを位数2pの連結グラフとし、a,nをp-a≧n+1をみたす正整数とする.あるaが存在して、1-因子をもつグラフGがn-拡張可能であるとは、G内にn本の独立辺を任意に指定するとき、これらを含む1-因子に拡張できるときのことをいう.グラフ内に1-因子が存在するための十分条件は19世紀からかなり多数の研究がなされて今日に至っている.その中の古典的な定理に次のようなものがある:位数2pの連結グラフG内の位数2q(p>q>1)の任意の連結誘導部かグラフが1-因子をもつならば、グラフGも1-因子をもつ.これは1974年にSUMNERによって証明されたものであり、グラフの誘導部分グラフによる再帰的条件による定理となっている.この定理をもとに、1993年にNISHIMURAは、n-拡張可能性について類似の定理:Gを位数2p(p【greater than or equal】3)の連結グラフ,q,nを1【less thanor equal】n<q<pをみたす整数とする.ある整数qが存在して、Gの位数2qの任意の連結誘導部分グラフがn-拡張可能であれば、このときG自身もn-拡張可能である.を導き、組合せ系学術誌Ars Conbinatoria(CANADA)に発表された.この定理では、位数2qの誘導部分グラフに連結性を仮定し、Gからこの部分グラフを残すように除かれる位数2(p-q)の部分グラフについては、その連結性には条件が入れられていないことがわかる.ここでの研究では、逆に連結グラフGから除いてしまう部分グラフに連結性を仮定することによって新しい結果を作ることを目的としGを位数2pの連結グラフとし、a,nをp-a≧n+1をみたす正整数とする.あるaが存在して、
有機分子のSTM観測・凝集構造シミュレーションおよびトンネル物性に関する研究

本年度は、種々の有機分子(超薄膜)の凝集構造の直接観測を行う事により、有機分子における核・結晶構造形成過程、および極性有機分子の凝集構造形成に対する電気的相互作用の寄与の解明を試みることを第一の目的として研究を遂行した。また、真空低温型STM装置の試作にも取り組んだ。得られた主な成果は以下の通りである。まず、HOPG等の基板上のn-パラフィン系試料蒸着膜のSTM観測を行い、蒸着条件、基板の種類の違いによる変化などに関するデータを集積した。その結果、n-パラフィン(C_<33>H_<68>)の基板上での核形成、成長し、および二次元結晶への成長過程に関する原子・分子レベルで解明する糸口が得られた。また、基板結晶とのエピタクシャル成長に関する情報も得られた。次に、極性有機分子における凝集構造形成に対する電気的相互作用の寄与の解明を試みた。具体的には、二種類の新規合成有極性試料の蒸着膜のSTM観測を行った結果、これらの分子の凝集形態は分子内の電気的双極子間の相互作用が大きく影響すること、また分子と基板原子とのエピタクシーも関与することが判明した。更に、多極子-多極子相互作用を考慮したコンピュータシュミレーションは観測されたSTM像と良い対応を示すことも判明した。また、真空低温型STM装置の試作にも取り組み、真空下で熱絶縁性に優れたSTMセル作製の見通しを得た。更に、有機分子を対象に、電解印可による個別分子制御の可能性、および電子物性計測(トンネルスペクトロスコピー)に関しても検討を行った。
胸腺上皮幹細胞の活性制御機構の解明とその応用

胸腺は、獲得免疫応答の司令塔となるT細胞の産生と自己寛容の確立を司る中枢免疫器官である。申請者はこれまでに、中枢性自己寛容の成立を担う胸腺髄質上皮細の産生を生涯維持する髄質上皮幹細胞の同定を行ってきた。本研究の目的は、この髄質上皮幹細胞の活性を制御するメカニズムを明らかにすることにある。これまでに、WTマウスでは幹細胞活性を反映するとおもわれる上皮コロニー形成能が生後直ぐに顕著に低下すること、T細胞産生がDN3で停止するRag2KOマウスでは成獣でも高く保たれることが明らかになっている。今年度は、前年度までに改良を重ね確立した成獣胸腺からのコロニーが検出可能な新たなアッセイ法を用いて、様々な遺伝子mutantマウスのコロニー形成能を調べることで、幹細胞活性の分子メカニズムとそれに関与する細胞群を明らかにすることを目指した。まず、胸腺髄質上皮細胞の発生や分化に重要な役割を果たすNFkB関連シグナルにdefectのあるnik-mutantマウス(aly/aly)について検討したところ、WTとほぼ同等のコロニー形成能を示す頃が明らかとなった。以上の結果から、Nfkbシグナルは幹細胞から成熟した髄質上皮を産生するには必要なシグナルであるが、幹細胞の維持への寄与は少ないと考えられた。一方、T細胞分化が上皮側(I-Ab, B2m KOマウス)、リンパ球側(TCRa KO)の要因によりDPで停止するいずれのマウスにおいてもWTと同程度のコロニー形成能を示したことから、胸腺上皮幹細胞のコロニー形成能の低下に関わるのはDP細胞である可能性が強く示唆された。現在その具体的な分子メカニズムについて検討を行っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまでに、中枢性自己寛容の成立を担う胸腺髄質上皮細の発生機構の解明とその産生を生涯維持する髄質上皮幹細胞の同定を行ってきた。本研究ではこの髄質上皮幹細胞の活性を制御するメカニズムを明らかにすることによって、胸腺退縮機構の解明につなげるとともに、自己免疫疾患モデルマウスに認められる髄質上皮細胞の分化異常と髄質上皮幹細胞活性との関連を明らかにすることを目的とする。本年度は、髄質上皮幹細胞の同定とその活性を評価することに大きな役割を果たしたコロニーアッセイシステムの感度の改良を行った。その結果、いくつかの培養添加物を添加するタイミングを変更することにより、コロニー形成能の効率を大きく上昇させることができた。これにより、これまで活性の評価が困難であった成獣マウスのコロニー形成能についても定量的評価が可能となった。そこでこの新しいコロニーアッセイシステムを用いて、胸腺髄質に異常があり自己免疫疾患を起こす遺伝子改変マウスの胸腺のコロニー形成能の評価を行った。その結果、全身性自己免疫疾患モデルマウスであるNZBW/F1マウスは、B6マウスと比較して明らかにコロニー形成能が低いことが明らかとなり、T細胞の分化選択に関わる胸腺上皮細胞の幹細胞レベルで何らかの異常を有する可能性が示唆された。本研究の目的は、髄質上皮幹細胞の活性を制御するメカニズムを明らかにし胸腺退縮のメカニズムを理解すること、またその異常が自己免疫疾患などを誘導要因の一つとなりうる可能性について検証することにある。しかしながら、これまで幹細胞活性の指標としてきたコロニーアッセイ法では、胎生期・生後すぐの非常に活性の高い時期のコロニーは検出できても、成獣胸腺では全体的にコロニーが小さく少なくなるため、遺伝子ノックアウトマウスの成獣胸腺における活性をWTと定量的に比較することが困難であった。今回の改良によって、4週齢のマウスからもvisibleなコロニーが得られるようになった。また、全胸腺から(すなわち髄質幹細胞分画を純化せず)形成したコロニーをすべてin vivoに移植すると、髄質・皮質両方の上皮細胞に分化した。すなわち、本コロニーアッセイコロニーを形成できる上皮細胞は、髄質・皮質両方のポテンシャルを有する前駆細胞、あるいはその両方を含むことが明らかとなった。この新たなコロニーアッセイ法を用いて、上述した全身性自己免疫疾患モデルマウスで髄質上皮の異常を呈するNZBW/F1マウスのコロニー形成能を成獣マウスと比較すると、生後直ぐの時点ですでに顕著に活性が低いことが明らかになった。まず、胸腺髄質上皮細胞の発生や分化に重要な役割を果たすNFkB

関連シグナルにdefectのあるnik-mutantマウス(aly/aly)について検討したところ、WTとほぼ同等のコロニー形成能を示す頃が明らかとなった。以上の結果から、Nfkbシグナルは幹細胞から成熟した髄質上皮を産生するには必要なシグナルであるが、幹細胞の維持への寄与は少ないと考えられた。一方、T細胞分化が上皮側(I-Ab, B2m KOマウス)、リンパ球側(TCRa KO)の要因によりDPで停止するいずれのマウスにおいてもWTと同程度のコロニー形成能を示したことから、胸腺上皮幹細胞のコロニー形成能の低下に関わるのはDP細胞である可能性が強く示唆された。現在その具体的な分子メカニズムについて検討を行っている。これまでの結果を受けて、今度主に以下に焦点を当てて研究を進める。1.胸腺髄質上皮細胞の発生や分化は、NFkB関連シグナルが大きく寄与している。そこで、これらのmutantマウスの胸腺を用いてそのコロニー形成能をWTと比較する。これにより、胸腺上皮幹細胞の活性制御や維持におけるこれらのシグナルの関与を明らかにする。2.髄質上皮細胞の分化異常と幹細胞活性の低いNZBW/F1マウスを用いて、幹細胞活性と髄質上皮分化異常の関連を明らかにする。まず、WTマウスとNZBW/F1マウスから形成させたコロニー間で発現に違いのある遺伝子を網羅的に解析する。この知見を元に、NZBW/F1マウスが有する遺伝子発現・シグナルの異常を同定する。胸腺上皮細胞の分化は胸腺細胞からもたらされるシグナルによって活性化されることから、この異常が血球側の以上によってもたらされたのか否かを骨髄キメラ実験を用いて明らかにする。また、先天的な遺伝子異常によるものである可能性が示唆された場合は、NZBW/F1マウスがSLEを発症するのに重要な遺伝子座の中に髄質上皮細胞の分化異常に関わりうる遺伝子がないか、検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
レトロウイルスライブラリーを利用した新しい発現クローニング法の開発とその応用

研究代表者らが開発し、1995年に発表したレトロウイルスライブラリーを利用した発現クローニング法は、応用範囲が広く種々の実験に利用できる。今回のプロジェクトでは、1)GFPとのcDNAの融合ライブラリーを作成し、蛋白質の細胞内局在によって遺伝子を同定する方法(FL-REX)および2)レトロウイルスcDNAライブラリーを利用したシグナルシークエンストラップ法(SST-REX)を開発して新規遺伝子をスクリーニングしている。FL-REX法では主に転写因子、SST-RE法ではサイトカインおよびサイトカインレセプターを探索している。現在までのところ、FL-REX法により胎児肝細胞からZnk Finger型の新規転写因子を1つ、SST-REX法により、T細胞から新規サイトカインレセプター、神経細胞から新規TNFレセプター、脂肪細胞から増殖因子様分子cDNAを同定し、現在解析中である。今後レセプターのリガンドのクローニングを行いレセプターの細胞内での作用を明らかにしていきたい。今回のプロジュクトでは、1)GFPとのcDNAの融合ライブラリーを作成し、蛋白質の細胞内局在によって遺伝子を同定する方法(FL-REX)および2)レトロウイルスcDNAライブラリーを利用したシグナルシークエンストラップ法(SST-REX)を開発して新規遺伝子をスクリーニングしている。FL-REX法では主に転写因子、SST-REX法ではサイトカインおよびサイトカインレセプターを探索してる。現在までのところ、FL-REX法により胎児肝細胞からZinc Finger型の新規転写因子を1つ、SST-REX法により、TH2細胞から新規サイトカインレセプター、神経細胞から新規TNFレセプター、胎生期AGM領域(Aorta gonado mesonephros)からサイトカイン様分子cDNAを同定し、現在解析中である。新規サイトカインレセプターδ1、AGM由来のサイトカイン様分子TSGに関してはノックアウトマウスも併せて作成中である。
新規な光学活性π共役高分子の合成と不斉識別に関する研究

側鎖に光学不活性なオキサゾリン残基を有する立体規則性ポリチオフェン誘導体、ポリ[3-{4-(4,4-ジメチル-2-オキサゾリン-2-イル)フェニル}チオフェン](poly-1)に様々なキラル配位子および金属塩を添加し、ポリマーが形成する凝集体にキラリティーを誘起できるかどうか円二色性(CD)及び吸収スペクトル等を用いて検討した。以下にその詳細を示す。1.側鎖に光学活性なオキサゾリン残異を有するキラルなポリチオフェン誘導体(poly-2)が、クロロホルム中Cu(OTf)_2等の金属イオン存在下、キラルな分子集合体を形成し、ポリマーの主鎖領域に特徴的な誘起CDを示すことを見い出している。そこで、任意の割合で混合したpoly-1とpoly-2の溶液へCu(OTf)_2やAg(OTf)等の金属塩を添加し、キラル共凝集体の光学特性をCDスペクトルを用いて調べたところ、誘起CDの符号および強度が、用いる金属塩の種類に依存して大きく変化することを見い出した。例えば、Ag(OTf)は、ポリマーの混合比に関係なくいずれも同符号のCDパターンおよび僅かな不斉増幅(正の非線形効果)を示したのに対し、Cu(OTf)_2を用いた場合、ポリマーの混合比に応答してCDの符号が途中で反転し、さらにCD強度は約4倍([poly-1]:[poly-2]=0.4:0.6)に増加することが分かった。2.1の結果を踏まえ、poly-2のモデル化合物としてキラルな単座あるいは二座配位子(3-8)を用いて同様の検討を行った。Poly-1と1-アミノ-2-インダノール(3)のような光学活性アミンの溶液にAg(OTf)を添加したところ、溶液の色は黄橙色から赤橙色へ変化し、ポリマー主鎖の吸収領域に特徴的な誘起CDを示した。また、(1R,2S)-3および(1S,2R)-3のアミンを加えた場合、CDパターンは鏡像関係になった。このポリマー主鎖の吸収領域(400-700nm)は、用いた金属塩(Ag(OTf))や配位子(3)の吸収領域と重なり合わないことから、ポリマー主鎖あるいはポリマーが形成した超分子集合体にキラルな構造、例えばらせんのような構造が形成されたことを示唆している。さらに、誘起CDの符号および強度は、用いる金属塩(金属イオンや対アニオン)や配位子(配位数や嵩高さ、絶対配置)の種類に大きく依存することも明らかとなった。
ヒトの体内で増殖不可能なヒトサイトメガロウイルスワクチンの作成

ウィルス複製が進行するにも関わらず、宿主のヒトサイトメガロウィルス(HCMV)に対する細胞障害性T細胞(CTL)が誘導できる弱毒HCMVであり、体内では増殖が不可能なDisabled Infectous Single Cycle(DISC)ワクチンとしての応用が期待できる。このDISCワクチンは、体内で増殖しないために安全性が高く、宿主麺免疫の誘導効率が高いという特徴を有するものである。1. DISCワクチンの安全性の検討DISCワクチンがどうしてDNA複製が進行するにも関わらず、後期遺伝子は発現しないのか、その分子基盤は依然明らかでない。そこで、UL79, 87,及び95が感染細胞内でそれぞれ、相互作用し、複合体を形成しているかどうか検討した。これまでに作成したUL79, 87,及び95にflag, myc,及びHAエピトープをin frameに挿入したTowne株由来の組換えHCMV BACDNAにUL79, 87,あるいは95を欠損した組換えウイルスをすでに私達が確立した方法を用いて作成した。UL79, 87,及び95は核内でウイルス複製の場“Replication compartments (RCs)"にリクルートされることを既に見いだしているため、それぞれの因子を欠損した組換えウイルスで他の2つの因子がRCsにリクルートされるかどうかを検討した。その結果、UL87と95がRCsにリクルートされるためにはUL79が必須であることがわかった。そこで、DISCワクチンは生ワクチンと比較しても安全性が高く、免疫不全のヒトでも使用可能であると考えられるが、その中でもUL79欠損のDISCワクチンが最も安全性が高いのではないかと考えられた。2.DISCワクチンの安全性の検討-DISCワクチン株は宿主ストレス応答を惹起するのか。HCMVは他のウイルスやヘルペスウイルスとは異なり、宿主の翻訳を停止して宿主翻訳因子をウイルスの遺伝子の翻訳のために使用するというシステムを持たない。その代わりに、宿主の翻訳因子を宿主とウイルス両方の蛋白の合成に効率良く利用する分子機構が存在すると考えられる。さまざまなストレス刺激によって翻訳が不活化したmRNAは翻訳抑制に関わる様々なRNA結合蛋白とともに、stress granule (SG)やprocessing body (P-body, PB)といった細胞質内顆粒状構造にとりこまれ、ポリソームとの間を一時的かつ可逆的に移動していることが知られている。我々はHCMVが自身の遺伝子の効率的な翻訳のためにSGやPBを利用している可能性を考え研究を進めている。HCMV感染後SGの形成は全く認められない一方で、PBは感染早期(6時間)から後期(48時間)にかけて著名に増加した。またCHX処理によって蛋白合成を停止した細胞でも感染後PBは著明に増加した。酸化ストレス刺激によって形成されるPBの構成因子でmRNAの分解に関わるAgo2は、感染によって形成されるPBにはリクルートされてこなかった。PB形成をノックダウンすると、IE蛋白だけでなく、感染後発現が上昇することが知られている宿主、サイクリンE、CDC6やCdh1蛋白の発現量も顕著に減少したが、各々のmRNAの発現量には変化を認めなかった。という結果を得た。IEのmRNAsがPBの形成を促進することが明らかとなった。また感染によって形成されるPBは酸化ストレス刺激で形成されるそれとは異なり、ウイルスやウイルス増殖に必要な宿主遺伝子の翻訳の維持に機能していると考えられた。現在PBが限られた宿主翻訳因子を効率良く使用するために、mRNAと一部の翻訳開始因子を一時的に貯蔵する場として機能する可能性を考え、さらなる検討を行っているところである。上記研究を行なうために、抗体等の購入を逐次行なっていく予定である。
探求と知の共有化のための授業実践とこれを支援する分散協調学習環境の開発

本研究では,子どもが自ら探求して共同で知識を創り出していける新しい授業づくりと学習指導法を明らかにした。この授業で用いる学習環境システムの開発に関しては,動的リンク機構のWeb上への拡張,タグづけによる柔軟なWeb-DB連携学習環境システム構築の方法論と,学校教育に有効なシステム開発のあり方を示した。開発した学習環境システムを活用した新しい授業方法を提案し,小・中高等学校の総合的な学習の時間や既存教科で探求と知の共有化のための授業を実践し,次のような成果を得た。1ヴィゴツキーの最近接発達領域論の考え方に基づいて,学習を人と人の間あるいは人と学習環境との間のコミュニケーションや相互作用によって言語や学習環境上の情報を媒介にして協調関係を構築していく過程と考え,コミュニケーションによる知の共有化を支援する機能と学習環境との関係を明らかにし,学習指導と授業設計の方法を確立した。2情報社会における学習環境に求められる知の共有化と協調活動を支え,学習者どうしならびに学習者と教師とのコミュニケーションを支援するために,学習過程において学習環境システム内に生成される情報への意味付与に関して,タグづけによる新しい方法を開発した。また,この方法により可能になる新しいコミュニケーションの形を明らかにした。3コミュニケーシヨン機能の開発について,ハイパーリンクによる意味表現機構を用いた「複数の表示切り替え機能」,「コミュニケーション機能」,「他の学習者とのマッチング機能」,および「思考の可視化機能」をネットワーク学習環境システム上に実装した。4平成14年度および平成15年度の授業実践について授業の展開と成果をまとめ,データベース用にディジタル化した。1探求と創造のための学習環境と指導法の解明児童生徒の学校教育における学習者の最近接発達領域の場の設定の在り方と、そこで必要となるネットワーク学習環境に支援された「足場」について明らかにし、学習指導の方法と授業設計の指針について考察した。とくに最近注目されている電子ポートフォリオによる評価に着目し、現状における2つの問題点として(1)「子どもの認識の問題」(2)「可視化の問題」を指摘するとともに、電子ポートフォリオの子どもの学習活動における「足場」とは、子どもの学習経験や体験を基にした言語を媒介としたコミュニケーション活動の場と、そこにおける子どもの相互評価(吟味・検証)や自己評価(新しい知識の獲得・再検証)を支援する、子どもの認識が再形成されるような学習環境であることを明らかにした。2学習環境の教育的機能と意味表現機構の設計課題解決型学習における学習者の「足場作り」として機能するネットワーク学習環境のインタフェースとして、コミュニケーションの履歴を可視化するインタフェースを専用XMLタグを設計することによりプロトタイプを開発した。また、学習者のリフレクションのために学習者自身が評価規準・基準を設定し、積極的な自己評価あるいは相互評価を行うためのインタフェースをWeb-DBを連携させることで実現をめざした。3意味表現機構を有する学習環境の開発・実装コミュニケーション支援サーバと、実践事例データベースを開発し、可視化インタフェースを実装・稼働させた。また、分散したマルチメディア学習資源の意味を表現するためのいくつかの手法を検討した。平成15年度は新システムの開発と授業設計の方法に基づいて探求と知の共有化のための授業を実践し、以下のように成果を得た。・教科の学習や問題解決的な学習,ポートフォリオ学習など様々な学習方法を検討し、これに基づき、子どもが自ら探求して共同で知識を創り出していける授業設計の方法を明らかにした。また、コミュニケーションや相互作用によって言語や学習環境上の情報を媒介にして協調関係を構築するため、タグづけによる新しい意味付与の方法を組み込んだ学習環境システムを開発した。・上の成果を基に、小学校5年「理科、もののつりあい」単元、中学校「社会科、地誌学習」の「世界の国々の調査」単元、高等学校「工業科、機械実習」の「品質管理」単元での授業設計を行い、それぞれの授業に適応した学習環境システムを用いて授業を実施した。小学校5年「理科、もののつりあい」単元では、システムとワークシートによって,児童一人ひとりに主体的な学習の参加を促し,コミュニケーションを活性化させることができた。

中学校「社会科、地誌学習」では、生徒は静態的地誌アプローチと動態的地誌アプローチにより、地理的分野の「学び方」を学び、教師は本システムにより生徒を容易に把握でき、効果的に指導できた。高等学校「工業科、機械実習」では、チェックシートにより、生徒自身や教師が無理なく効果的な評価をすることができ、生徒は自他のコンピテンシを認識し、より良い方向を探す傾向が見られた。・平成14年度および平成15年度の授業実践について授業の展開と成果をまとめ、データベース用にディジタル化した。
新規なアニオン受容体・大環状ピリミジニウムクラウンの合成と分子認識に関する研究

1.チアミン塩酸塩の熱分解反応により数種類のピリミジウム多量体を得た(HPLCにより確認)。カラムクロマトグラフィによりこれらのピリミジニウム多量体の分離精製に成功したが、単離には現在のところ成功しておらず今後更に検討する。2.チアミンから(ピリミジニウム2量体)^+-C10_4^-塩を合成し、これを出発物質として(pyrimidinium dimer)_2^<2+>-[Hg_2I_6]^<2->塩および(pyrimidinium dimer)_2^<2+>-[Co(SCN)_4]^<2->塩を得た。4.上記3.の結果から、チアミン単量体-アニオン塩においても、同様のホストーゲスト様相互作用が期待されたので、アニオン=[PtCl_6]^<2->,[PtCl_6]_<0.5>^-.Cl^-,[Pt(SCN)_4]^<2->,[Pt(SCN)_6]^<2->,[Hg(SCN)_4]^<2->塩の合成とX線結晶構造解析を行い、いずれにおいても上記3.と同様のカチオン-アニオン相互作用を見出した。6.上記3.、4.、5.より、分子認識様式としての、(i)C-H(芳香環)...アニオン水素結合および(ii)アニオン...芳香環静電気的相互作用の一般性を明かにした。1.チアミン塩酸塩およびチアミン硝酸塩の熱分解反応を行い、数種類のピリミジニウム多量体の生成をHPLCで確認した。現在、これらのピリミジウム多量体を分離精製すべく分離製条件を検討中である。2.チアミン-I^-塩とCdI_2との反応からピリミジニウム4量体-I^-塩を得た。現在、X線結晶構造解析を行うべく単結晶の作製を行っている。3.チアミン-Br^-塩とHgBr_2との反応からピリミジニウム6量体-Br^-塩を得た。4.チアミンからピリミジニウム2量体-ClO_4^-塩を合成し、これを出発物質として(pyrimidinium dimer)-(HgI_3)^-塩および(pyrimidinium dimer)_2-[Co(SCN)_4]^<2->塩を得た。1.チアミン塩酸塩の熱分解反応により数種類のピリミジニウム多量体を得た(HPLCにより確認)。これらのピリミジニウム多量体の分離精製の条件を種々検討したが、現在のところ成功しておらず今後更に検討する。2.チアミンから(ピリミジニウム2量体)^+-ClO_4^-塩を合成し、これを出発物質として(pyrimidinium dimer)_2^<2+>-[Hg_2I_6]^<2->塩および(pyrimidinium dimer)_2^<2+>-[Co(SCN)_4]^<2->塩を得た。4.上記3.の結果から、チアミン単量体-アニオン塩においても、同様のホスト-ゲスト様相互作用が期待されたので、アニオン=[PtCl_6]^<2->,[PtCl_6]^<2->.Cl^-,[Pt(SCN)_4]^<2->,[Pt(SCN)_6]^<2->,[Hg(SCN)_4]^<2->,[HgCl_3-(SCN)]

^<2->,[Co(SCN)_4]^<2->,2I_3^-塩の合成とX線結晶構造解析を行い、いずれにおいても上記3.と同様のカチオン-アニオン相互作用を見出した。6.上記3.、4.、5.より、分子認識様式としての、(i)C-H(芳香環)...アニオン水素結合および(ii)アニオン...芳香環静電気的相互作用の一般性を明かにした。
パルス中性子源における中性子共鳴スピンエコー分光器の開発と高分解能化に関する研究

茨城県東海村にある大強度陽子加速器施設J-PARCの物質・生命科学実験施設MLFが有する中性子ビームラインのひとつBL06では,新しい中性子共鳴スピンエコー分光器が建設されている.本研究では,MLF BL06において中性子スーパーミラー導管の性能評価測定および数値シミュレーションとの比較検討を行い,分光器建設に重要なビームラインの基礎的データを得た.その後,分光器体系を構築し,広い波長帯でパルスビームに対応したスピン制御に成功し,分光器として実用レベルである200 kHzの実効振動数をもつ飛行時間法と組み合わせた時間振動型スピンエコー(TOF-MIEZE)シグナルをコントラスト良く観測することができた.これに加えて,フランス,グルノーブルにある研究用原子炉ILLにおいて,極冷中性子を用いたTOF-MIEZE分光器のテスト実験を行った.MLF BL06での実験とは異なる,パルスビームのパルス幅の変化という観点からTOF-MIEZE法の特徴を示す実験結果を得た.これまで明らかでなかったTOF-MIEZE法の定式化とその特徴を提示し,上に挙げたパルス中性子ビームを用いた複数の実験によってそれらを定量的に検証することができた.これらの研究成果は,今後のパルス中性子ビームを用いた共鳴スピンエコー分光法の方法論確立と利用の高度化につながる基礎的な知見となる.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。京都大学とKEKの連携の下,茨城県東海村にある大強度陽子加速器施設(J-PARC)内の物質生命科学研究施設のパルス中性子源のビームラインの一つBL06に中性子導管が建設され,2014年4月22日にBL06に最初の中性子ビームが受け入れられた.BL06には2本の中性子導管があり,それぞれにMIEZEとNRSEと呼ばれる中性子共鳴スピンエコー分光器が設置される.パルス中性子に対応した共鳴スピンエコー分光法では,一度に広い時空間領域にわたる物質のダイナミクスに関する情報(中間散乱関数)を得ることができる.偏極ビームラインの整備とパルス対応共鳴スピンフリップの調整を成功裡に行うことができた.これによりBL06におけるスピン偏極・制御デバイスがパルス中性子に対応して充分機能していることが確認できた.これは目的である共鳴スピンエコー分光器建設のための重要な第一歩であると同時に,J-PARCの世界最高クラスのパルス中性子源で飛行時間法を用いながらスピンコントロール実験が本格的に行えるようになったことで,フリッパーの調整方法やフリップ率の高周波コイル形状依存性,静磁場形状依存性について調べるためのデータが定常中性子源と比べて格段に容易に,かつこれまでになく詳細に得られるようになった.このようにして得られた基礎的データは,今後のスピン制御デバイスの改良と分光器全体の高性能化に重要となる.さらに,ラウエランジュバン研究所(フランス)の研究用原子炉にある極冷中性子実験孔において,極冷中性子を用いたMIEZE型スピンエコー装置の構築を目指した実験を行った.この実験には,高分解能MIEZE分光器の実現と,BL06で長波長中性子を用いる際の問題点を明らかにする目的がある.これまで例のない波長50Åの長波長中性子を用いて,実効振動数50 kHzのMIEZEシグナルを観測することができた.茨城県東海村にある大強度陽子加速器施設J-PARCの物質・生命科学実験施設MLFが有する中性子ビームラインのひとつBL06では,新しい中性子共鳴スピンエコー分光器が建設されている.本研究では,MLF BL06において中性子スーパーミラー導管の性能評価測定および数値シミュレーションとの比較検討を行い,分光器建設に重要なビームラインの基礎的データを得た.その後,分光器体系を構築し,広い波長帯でパルスビームに対応したスピン制御に成功し,分光器として実用レベルである200 kHzの実効振動数をもつ飛行時間法と組み合わせた時間振動型スピンエコー(TOF-MIEZE)シグナルをコントラスト良く観測することができた.これに加えて,フランス,グルノーブルにある研究用原子炉ILLにおいて,極冷中性子を用いたTOF-MIEZE分光器のテスト実験を行った.MLF BL06での実験とは異なる,パルスビームのパルス幅の変化という観点からTOF-MIEZE法の特徴を示す実験結果を得た.これまで明らかでなかったTOF-MIEZE法の定式化とその特徴を提示し,上に挙げたパルス中性子ビームを用いた複数の実験によってそれらを定量的に検証することができた.これらの研究成果は,今後のパルス中性子ビームを用いた共鳴スピンエコー分光法の方法論確立と利用の高度化につながる基礎的な知見となる.J-PARC MLF BL06に中性子スーパーミラー導管が設置され,4月に初めて中性子ビームを受け入れた.6月上旬まで中性子導管の性能評価,ビーム特性の測定を行い,BL06中性子ビームラインの性能を評価することができた.その後スピン偏極スーパーミラーや偏極を保つためのガイド磁場コイル,共鳴スピンフリッパーを設置した.運転休止期間を挟み,11月からBL06での偏極ビームラインの構築と共鳴スピンフリッパーの設置を行い,MIEZE分光器体系を組みあげた.パルス中性子に対応した共鳴スピンフリップの調整をすることで,波長3.5Åから12Åの中性子に対して,平均90%のフリップ率が得られた.これにより,BL06に設置した偏極スーパーミラーやガイド磁場が十分機能し,偏極ビームラインでのパルス対応スピン制御が可能になったことが確認された.

初テストとして単純な配置を試したところ,実効振動数100 kHzのTOF-MIEZEスピンエコーシグナルが得られた.ビーム受入れ,偏極ビームライン整備,スピンエコーシグナル観測という一連の実験が行えたことで,今後共鳴スピンエコー分光器を本格的に設置,調整していく筋道が立ったと言える.現状では,BL06に2つある導管のうち,一方(MIEZE)でスピンエコー体系が整備されており,今後さらに高周波数,高コントラストのMIEZEシグナルを得て,物性試料の測定が行えるように調整を続けている.もう一方の導管(NRSE)についてはビーム取り出しが可能になっており,今後偏極ビームラインの整備と分光器体系の組立てを進めていく必要がある.27年度が最終年度であるため、記入しない。MIEZE分光器については,今後さらに高周波数,高コントラストのMIEZEシグナルを得られるよう,共鳴フリッパーのパラメータや各デバイス配置の調整を行っていく.また,実際の試料測定時における検出器の配置の検討を進め,標準試料を用いた装置分解能関数の評価を行う.物性試料の散乱実験が行えるよう分光器としての整備を進めていきたい.NRSE分光器についても偏極ビームラインの整備と分光器体系の組み立てを行う.NRSE分光器のさらなる高分解能化のためには,回転楕円形集光ミラーを用いた中性子ビームの軌跡制御による位相補正が必要であり,集光ミラーの制作を北海道大学・理研グループとの共同研究として進めている.集光ミラーの利点を最大化するためにはそれと同時に,集光された発散角の大きいビームに対応した共鳴スピンフリッパーも必要となる.高輝度パルス中性子源では格段に容易に共鳴スピンフリッパーに関する詳細な基礎データを得ることが可能になったため,スピンフリッパーの調整手順の確立や新しいフリッパーの設計にこれらのデータを活用していく予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。
ES細胞の分化環境の作製と免疫隔離膜を用いた分化細胞の移植

胚性幹細胞(ES細胞)からのインスリン産生細胞の分化誘導:マウスまたカニクイザルのES細胞から米国NIHのMcKayらの報告した分化誘導法を基本に研究を進めてきた。インスリン陽性細胞には2種類のタイプが存在し、一つはインスリン染色で細胞全体が強く染色される小さな細胞、他はインスリン染色で細胞質のみ染色される比較的大きな細胞であった。また、サブカルチャーを行っても常にインスリンの免疫染色が陽性になる細胞が存在した。さほど高効率ではないが、間違いなくインスリン産生細胞へと分化誘導できていると考えている。高効率にインスリン分泌細胞を分化誘導するために、Tet systemを利用してカニクイザルサルES細胞内でPDX-1遺伝子発現を制御することによりインスリン分泌細胞へと分化誘導する方系を作成した。ES細胞からのドーパミン産生細胞の分化誘導:PA6細胞のConditioned Medium中の成分とポリイオンコンプレックス形成法を用いて表面を試作し、この表面上でES細胞をドーパミン産生細胞へと分化誘導した。また、PA6細胞のConditioned Mediumを用いてES細胞を浮遊培養しドーパミン分泌細胞への分化誘導を行った。培養30日後においてもドーパミンの検出ができた。中空糸内にカニクイザルES細胞を封入した後、PA6細胞の順化培地中で培養を行ったところ、効率よく神経細胞へと分化した。免疫隔離膜:PEG脂質を用いて細胞表面を細胞に障害を与えることなく極めて薄い層で覆うことができた。カプセル化による体積増加が極めて小さい生細胞マイクロカプセル化法として極めて有力であると考える。ヒトES細胞:ヒトES細胞使用許可の取得が諸般の事情で遅れ、平成18年3月10日付けでヒトES使用計画の大臣確認書が交付された。このため大部分の仕事はマウスES細胞とカニクイザルのES細胞を用いて研究を行った。胚性幹細胞(ES細胞)からのインスリン産生細胞の分化誘導米国NIHのMcKayらの報告した分化誘導法を基本に研究を進めてきた。我々の得た結果は、分化誘導した細胞のインスリン分泌能は彼らの報告値の数分の1程度、PCRではインスリンIIのメッセンジャーの発現は見られるものの、インスリンIの発現は見られなかった。最近、ハーバード大のMeltonらはMcKayら方法を追試し、免疫染色でインスリン産生細胞と同定された細胞の多くは培養液中のインスリンが死細胞へ吸着された結果であると注意を呼びかけている。現在、種々の条件下で行ってきた分化誘導実験のデータの見直しと、cDNAサンプルの残っているものについてPCRを同一条件下で行うことで実験結果の洗い出しを行っている。また、C-ペプチドとグルカゴンの免疫染色を追加した。それらの結果より、McKayらの報告ほど高効率でインスリン産生細胞へと分化誘導されないが、一部の細胞はほぼ間違いなくインスリン産生細胞へと分化誘導できていると考えている。ES細胞からのドーパミン産生細胞の分化誘導PA6細胞をフィーダーレイヤーとしてES細胞からのドーパミン産生細胞の分化誘導法(Kawasaki, et al., Neuron, 28, 31-49(2000))を基に研究を進めてきた。PA6細胞細胞を種々の溶液で洗浄することで、ES細胞をドーパミン産生細胞へと分化誘導する活性(SDIA活性)を有する溶液を採取した。SDIA活性を有する溶液とポリイオンコンプレックス形成法を用いてSDIA活性を有する表面を試作し、ES細胞をドーパミン産生細胞へと分化誘導した。SDIA活性を有する溶液を培養液を分析したところ、その活性をになっているものがWntシグナルの阻害剤であることを示唆する結果を得ている。ES細胞