hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強風による飛来物に対する板ガラスの耐衝撃安全性能評価に関する研究

申請時に予定していた、1.強風下と同等の風圧力を試験体(板ガラス)に加えた状態で飛来物を模擬した加撃体を衝突させ、その破壊性状を記録・解析する装置と、加撃体を所定の速度で射出する実験システムを制作する。2.制作された試験装置の性能評価・検定を行い、試験体の破壊に関する予備実験を行う。3.試験体の種類、飛来物の形状、重さ、速度など種々の条件を変えて実験を行い、破壊特性を明らかにする。また、実験条件が破壊特性に及ぼす影響を調べ、ISO基準との整合性の検討を行う。さらに、実際の飛来物と、性能評価試験に用いられる加撃体のもつ衝撃特性との比較を行う。について、ほぼ予定通りに研究を進めることができ、必要なデータも得ることができた。平成23年度に製作した強風下と同等の風圧力を試験体(板ガラス)に加えた状態で飛来物を模擬した加撃体を衝突させる装置を用いて実験を行い,これまで実施した風圧力を負荷しない場合の実験結果との違いを検討し,強風によって生じる風圧力が試験体の耐衝撃性能と破壊性状にどのような影響を及ぼすかを調べる予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。最終(平成25)年度では、引き続き破壊実験を行い、種々の条件下における破壊特性のデータを蓄積する。それらの結果および前年度までの結果をもとに、強風下において飛来物が衝突する際の板ガラスがもつ衝撃破壊性能を明らかにする。また、ガラスが割れた場合の“割れ方(ガラス片の形状)"や“飛散しにくさ(ガラス片の飛び散り方)"などを安全評価基準の検討も行い、評価方法の確立を試みる。これにより、板ガラスの安全性能の評価の検討を行い、板ガラスの耐衝撃安全性能評価方法の確立を目指す。
ベトナム・中国間境域における協力／対立と国家関係の連動性に関する研究

ベトナム・中国関係は,1991年の正常化以降,それ以前の境域(陸上部・海洋部)が国家関係を反映する鏡となってきた状況から脱却し,境域における対立や紛争が存在していても,国家関係を正常に維持することが可能となるような質的に新しい段階に移行したといえる。その要因として,両国の共産党間の意思疎通,両国間での人的・物的な相互往来の増大に伴う相互依存関係の深化などを挙げることができる。ベトナム国家第3文書館における史料収集(2015年8月・11月)及び,『ニャンザン』や『人民日報』などベトナムと中国の党機関紙に依拠しながら,1970年代後半の両国の関係悪化の過程と2009年以降の南シナ海問題の展開過程の比較分析を行った。その結果,1970年代後半には陸上国境をめぐる両国政府間の交渉が断続的に開かれたものの,基本的に両国間の人と物の移動は断絶状態にあったのに対し,南シナ海問題をめぐっては,対立の一方で,習近平国家主席のベトナム訪問(2015年11月)に象徴される首脳間の交流や国民間の往来,経済協力関係などが維持されている点が大きな特徴として指摘できる。これは両国関係が1991年の正常化以降,それ以前の「対立」や「危機回避」を前提としない関係から質的な変化を遂げてきたことを示している。しかし,それと同時にベトナム社会科学アカデミー中国研究所やベトナム外交学院南シナ海研究センターでの学術交流(2015年8月)を通じて,諸懸案は解決されたと思われた陸上国境についても近年国境碑の摩耗や損傷が目立つほか,土地の交換なども順調に進んでいないなど不安要因があることや,ベトナム政府内には南シナ海問題とクリミア問題を同一視する意見があり,中国やロシアなど域内大国に対する不信感が存在することもわかった。また,2015年11月には,ベトナム外交学院の主催のもと,ヴンタウで開催された第7回南シナ海国際ワークショップに参加し,ベトナムや中国,オーストラリアなどからの参加者と交流するとともに,南シナ海における中国の行動(人工島・飛行場建設など)やその正当性の論理が孤立したものであるかが浮き彫りになった点で,南シナ海問題の現状を把握する上で有益であった。2015年度は,公刊された資料による中越戦争に至る過程(1976年79年)と南シナ海問題の展開過程(2009年現在)の第一段階として,1970年代後半の関係悪化の争点と南シナ海問題に関するベトナム・中国双方の主張を整理するという最も重要かつ基本的な目標は達成することができたものの,国境地帯における経済協力や人間・商品・貨物・車両等の交通往来の現状に関する調査を実施するまでには至らなかった。ランソン省とラオカイ省における国境地帯の現状調査は2016年度に延期せざるをえないものの,文献資料の分析や南シナ海国際ワークショップ参加と学術交流を通じて,南シナ海問題をめぐってはベトナム・中国それぞれの識者の中に異なる観点が存在し,決して一枚岩の「国論」のようなものがあるわけではないという新たな視点を獲得することができた。例えば,前述のワークショップに参加していたベトナムの元外交官は,ベトナム共産党指導部や外務省が1991年の両国関係正常化後,対中国宥和政策をとってきたとして批判し,両国関係の指針を見直すよう主張していた。また,中国の元外交官の中にも,南シナ海の岩礁に対する領有権を主張することはできるが,南シナ海は国際公海である以上,退役軍人のようにそこが中国の「核心的利益」であると考えるのは誤りだとする識者もいる[陳健編著『外交,譲世界走向和諧』中国人民大学出版社,北京,2012年,157頁158頁]。こうした状況に配慮するならば,境域における対立/協力の並存状況の考察にあたっては,両国首脳の会談やその結果としての共同声明のような党・国家の最高レベルの見解にのみとらわれることなく,両国国内に存在する多様な意見の動向を把握していく必要がある。第一に,ホアンサ諸島を管轄するダナン市と,チュオンサ諸島を管轄するカインホア省(ニャチャン)を訪問し(2016年9月・12月),ホアンサ県人民委員会主席(知事),チュオンサ県人民委員会主席に面会し,両諸島地域の現状について把握することができた。現在,中国の実効支配下にあるホアンサ諸島(中国名:西沙)と異なり,チュオンサ諸島(中国名:南沙)海域においてベトナムはいくつかの比較的大きな島嶼を実効支配し,行政機関や議会を設置している。そこには漁民も生活しているという。中国は同じ海域で人工島の建設を進めているが,1974年のホアンサ海戦のように,ベトナムの実効支配下にある島嶼を武力で奪取するような行動に出ることはなさそうである。第二には,ランソン市での調査(2016年7月)を国境地帯でのベトナム・中国両国による共同開発計画が一向に進展をみせていないことと,近年の新しい現象として,ベトナム側国境地帯で新たに仏教寺院が建立されてこと,しかも寺社内では伝統的な漢字表記が姿を消し,ローマ字のみとなっていることが判明した。仏教寺院を通じて国境地帯がベトナムと中国の相違を際立たせる場に変化しつつあることが推測される。以上二つの点に関し,中国がベトナムとの人的な往来・交流を制限していないことを考慮すると,中国はベトナムに対し,境域における軍事力や経済力の行使よりもソフトパワー重視の方向にシフトしつつあるのではないかという仮説が成り立つ。

最後に第三の成果として,台湾の国家発展委員会档案管理局及び中央研究院近代史研究所档案館,ニャチャン海洋学研究所(ベトナム)での文献資料調査を通じて(2016年8月・12月),中国が南シナ海に対する排他的な関与を主張するための歴史的根拠は極めて薄弱であり,南シナ海の特質として歴史的に多くの国々が関わってきたという事実を把握することができた。2016年度の調査研究を通じて,ベトナム・中国間境域においては陸上国境地帯での経済協力の停滞やホアンサ諸島・チュオンサ諸島の領有をめぐる対立が観察されるものの,それらをもって両国関係全般を判断することが困難になりつつあるという状況がはっきりしてきたといえる。境域が両国関係の実態を反映する鏡となっていた時代はもはや終焉を迎えつつあるともいえる。両国関係が断絶状態にあった1970年代末80年代と異なり,中国側は多様なレベルでのベトナムとの人的な往来・交流,貿易,文化交流や投資などを積極的に進めており,これらを遮断しようとする気配がない。さらに,中国側は両国の共産党間関係や政府間関係と,アジアインフラ投資銀行(AIIB)や「一帯一路」構想などの多国間組織やプロジェクトを巧みに併用しながらベトナムを自らの軌道に取り込もうとしているようにみえる。こうした中国側の「攻勢」に対し,ベトナム側も行政的対抗措置を講じることよりも,境域における寺院の建立が示すように,中国とは異なる自らのアイデンティティの追求過程に入ったというのが現状であろう。このように,両国関係が質的に新たな段階に入ったことは確かであるが,その特質として,1地理的な境域が両国関係を象徴する場としての意義を失い,境域が可変的なものとなりつつある2中国は境域(南シナ海)における軍事的なデモンストレーションは行うものの,ソフトパワーをより重視する方向へと戦略をシフトさせ,両国間にソフトパワー競合の時代が到来したなどの点を想定することができるが,本年度の調査研究からは確定的な結論を提示するまでに至らなかった。今後はより精緻な結論を求めるべく,両国間の地理的な境域のみならず,ベトナム,ダナン,ホーチミン市など境域から離れた地域における中国の動向も視野に入れながら調査研究を進める必要がある。平成29年度(本研究最終年度)の,カオバン省における調査を通じて,ベトナム側が中国との国境地帯で仏教寺院を新たに建立し,内部装飾に伝統的な漢字ではなく,ローマ字(クオックグー)のみを使用していることから,新たなアイデンティティの拠り所として仏教とクオックグーを利用しようとしていることがわかった。また,南シナ海問題に関しては,ベトナム社会科学アカデミー中国研究所,ベトナム外交学院での学術交流を通じて,中国が近年「九段線」に言及するのを控え,四沙(東沙・中沙・西沙・南沙各群島)が中国領であると主張するようになっているとの情報を得た。「九段線」に関しては,研究代表者の中央研究院近代史档案館(台北),フランス外務省外交史料館(パリ)における調査研究によっても南シナ海の領有に関する中国の主張を正当化するようないかなる根拠も見出すことはできなかった。研究期間全体を通じての研究成果としては,以下の各点を指摘することができる。
爬虫類全科間の系統関係と分岐年代の推定:ミトコンドリアゲノミクスによるアプローチ

平成14年度からの3カ年間で、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の全塩基配列を30種以上の爬虫類から決定し、それらmtDNAゲノムの遺伝子配置や制御領域の構造の特徴づけを行つた。その結果多くの爬虫類のmtDNAは一定の37コの遺伝子をよく保存された順序でコードしているが、ヘビ類、アガマ類、カメレオン類、オオトカゲ類、ヨロイトカゲ類などにおいては、典型的な脊椎動物の遺伝子配置と異なる配置を持つ例もあることが示された、次に、mtDNAにコードされる37コの遺伝子ごとに既知の相同遺伝子の塩基配列とアラインメントを行い、最尤法、ベイズ法などを用いて分子系統樹の作成を行った。さらに、系統ごとの分子進化速度の可変性を前提とするソーンらの方法を用いて、爬虫類の系統間の分岐年代を推定した。その結果以下のことが示唆された。1)トカゲ亜目は、ヤモリ下目、イグアナ下目、スキンク下目、アンギストカゲ下目に大別できる、2)これらの4下目の中では、ヤモリ下目が最も初期に分岐した、3)現在の分類では独立した亜目に立置づけられているミミズトカゲ類は、トカゲ類の内部(恐らくカナヘビ類に非常に近縁な系統)から派生した、4)ヘビ類はオオトカゲ類の近縁系統から進化したのではなく、現生のトカゲ類の基部系統ないしはトカゲ類全体との姉妹系統から派生した可能性が高い、5)真性ヘビ類の主要な科は新世代第三紀に分岐したと思われるが、トカゲ類の主要な科は三畳紀からジュラ紀にかけての非常に古い時代に分岐したらしい。哺乳類や鳥類では、目レベルの系統分岐が白亜紀の大規模な大陸の分断によって促進されたことが、これまでの研究で示唆されている。トカゲ類の場合、このような白亜紀の大陸分断は科内の亜科あるいは属レベルの分岐に関わった可能性がある。以上のようなアプローチで爬虫類の科間の系統関係と分岐年代の問題を整理し、順次論文化を進めている。爬虫類を構成するワニ類、トカゲ類、ヘビ類、カメ類の各科より代表種のサンプルを収集した。その結果、現時点までにヘビ類・トカゲ類の数科とカメ類の1科を除いて、全ての科の代表種を揃えることができた。収集したサンプルより全DNAを抽出し、ロングPCRによってミトコンドリアDNAの全長(約17キロ塩基対)を数断片に分けて増幅した。その産物を鋳型にして多数の爬虫類特異的プライマーの組み合わせによる増幅を行い、それらの塩基配列を決定した。その配列をアセンブルすることで、本年度は7種の爬虫類について(制御領域の一部が未解読のものを含む)、ミトコンドリアDNAの全長配列を得ることができた。得られた塩基配列の中にコードされる遺伝子を同定し、既知の遺伝子配列と整列させることで分子系統解析に必要なデータセットを構築した。系統解析は現時点において進行中であり結論をはっきり述べることはできないが、現生のヘビ類がトカゲ類と別系統である可能性を示す予備的データが得られている。また、有鱗類のタクサ間に大きな分子進化速度の違いがあることも示されている。今後は、ミトコンドリアDNAの全塩基配列の決定をさらに強力に推進し、目標とする50科に早く近付けるとともに、得られた大きなデータセットから信頼できる系統関係と分岐年代を推定する作業を行いたい。その結果を化石記録や形態分析によって得られた仮説と比較検討することで、爬虫類の高次系統関係の解明に貢献するつもりである。

爬虫類のサンプル収集を昨年度より継続して行ない、DNA抽出を行なった後、標本を冷凍保存した。本年度はトカゲ類7科、ヘビ類6科の代表種からミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定した。制御領域内部に大規模な繰り返し構造やヘテロプラズミーがあるものは制御領域以外の全コード領域を配列決定した。分子系統解析を行なった結果、以下の結論が強く示唆された。1)ヘビ類はオオトカゲ類の近縁系統から進化したのではなく、現生のヘビ類とトカゲ類はそれぞれ単系統群を成す。2)トカゲ類内部で、イグアナ下目(アガマ科、カメレオン科、イグアナ科)よりも、ヤモリ下目(ヤモリ科、トカゲモドキ科)の方が先に分岐する。3)ヘビ類内部で、パイソン類はボア類よりもサンビームヘビ類やパイプヘビ類により近縁である。すなわちサンビームヘビ類やパイプヘビ類は原始的なヘビ類系統の子孫であるとは言えない。以上の結果は、形態情報に基づく従来の有鱗類の系統進化仮説と異なっており、豊富な分子データに基いて爬虫類の高次系統関係を再検討することの重要性を示している。今後は、ミトコンドリアDNAの全塩基配列の決定をさらに強力に推進し、信頼できる系統関係の解明を行なうとともに、分子データから分岐年代を推定する作業を行いたい。その結果を化石記録や形態分析によって得られた仮説と比較検討することで、爬虫類進化の総合的解明に貢献するつもりである。昨年度に引き続き爬虫類ミトコンドリアDNA全塩基配列の解読を行い、約10種からミトコンドリアDNAの全塩基配列(一部の種は制御領域内の塩基配列解読が不完全)を新たに決定した。37コの遺伝子ごとに既存の相同遺伝子の塩基配列とアラインメントを行い、最尤法、ベイズ法などを用いて分子系統樹の作成を行った。また、系統ごとの分子進化速度の可変性を前提とするソーンらの方法を用いて、爬虫類の系統間の分岐年代を推定した。その結果以下のことが示唆された。1)トカゲ亜目は、ヤモリ下目、イグアナ下目、スキンク下目、アンギストカゲ下目に大別できる、2)これらの4下目の中では、ヤモリ下目が最も初期に分岐した、3)現在の分類では独立した亜目に位置づけられているミミズトカゲ類は、トカゲ類の内部(恐らくカナヘビ類に非常に近縁な系統)から派生した、4)ヘビ類はオオトカゲ類の近縁系統から進化したのではなく、現生のトカゲ類の基部系統ないしはトカゲ類全体との姉妹系統から派生した可能性が高い、5)真性ヘビ類の主要な科は新世代第三紀に分岐したと思われるが、トカゲ類の主要な科は三畳紀からジュラ紀にかけての非常に古い時代に分岐したらしい。哺乳類や鳥類では、目レベルの系統分岐が白亜紀の大規模な大陸の分断によって促進されたことが、これまでの研究で示唆されている。トカゲ類の場合、このような白亜紀の大陸分断は科内の亜科あるいは属レベルの分岐に関わった可能性がある。以上のようなアプローチで爬虫類の科間の系統関係と分岐年代の問題を整理し、順次論文化を進めている。
内分泌器官としての骨組織

骨組織から分泌されるホルモン様分子を網羅的にスクリーニングした結果、骨細胞から分泌される因子として、GDF15を同定した。さらに、GDF15が破骨細胞の分化・成熟化を促進すること、また、その中和抗体が虚血性骨粗鬆症の発症を予防することが明らかとなった。本研究により、虚血や低酸素等の病態生理学的条件下において骨細胞から分泌されるGDF15が、破骨細胞へ作用し骨代謝を制御していることが判明した。本研究では、我々が提唱する全く新しい概念「内分泌器官としての骨組織」を基盤として、骨組織から分泌されるホルモン様分子を網羅的にスクリーニングし、かつ同定することを目的とした。本年度はまず、骨組織から分泌される分子を網羅的に探索する目的で、マウス頭頂骨よリコラゲナーゼを用いて初代培養骨芽細胞を単離培養した。また、同時にマウス骨髄よりficollを用いた密度勾配遠心分離法により単球マクロファージ系細胞画分を単離後、macrophage colony-stimulating factorおよびreceptor activator of nuclear factor-κB ligandを用いて初代培養破骨細胞を培養した。調製した骨芽細胞および破骨細胞ともに無血清培養液中で培養し、その培養上清から分泌因子の同定を試みた。回収した培養上清をレクチン親和性クロマトグラフィー(Concanavalin A affinity chromatography)にかけ、同クロマトグラフィーから溶出した糖たんぱく質を濃縮後に二次元電気泳動しゲル上に展開した。現在は、そのゲルからスポットを切り出しトリプシン消化後にペプチドを抽出し、質量分析装置(MALDI-TOF/MS)で解析を行っている。来年度は分泌因子を網羅的に同定し、それら同定因子について、大腸菌や酵母等を用いて組み換えたんぱく質を作製する。そして、これらの同定因子について、in vivoおよびin vitroの両面から糖脂質代謝に対する機能的役割を調べ、その機能解析をすすめることにより、骨組織に作用点をもつ肥満や糖尿病等のメタボリックシンドロームに対する新たな治療法開発の可能性を追求する。初年度に、骨細胞から分泌される因子として、growth differentiation factor 15 (GDF15)を同定した。そこで本年度はGDF15の生理学的役割を検討するために、まず最初に骨代謝に与える影響について検討した。その結果、マウスに大腿動脈結紮を施し、骨組織を虚血・低酸素状態にしたときに、骨細胞からのGDF15の分泌が著明に上昇することを見出した。さらにGDF15の中和抗体を投与することにより、大腿動脈結紮により誘導される骨密度低下が著明に抑制されることを見出した。またin vitro実験により、GDF15は骨芽細胞の機能には影響を与えないが、破骨細胞の分化・成熟化を強力に誘導することも明らかとなった。以上の結果により、虚血や低酸素等の病態生理学的条件下において骨細胞から分泌されるGDF15が、破骨細胞の分化・成熟化を調節することにより、骨代謝を制御していることが明らかとなった。さらに現在はこのGDF15について、in vivoおよびin vitroの両面から糖脂質代謝に対する機能的役割を調べており、骨組織に作用点をもつ肥満や糖尿病等のメタボリックシンドロームに対する新たな治療法開発の可能性の追求を行っている。
画像情報を用いた推論・探索処理に関する研究(遺跡物復元システムの開発)

本研究では,画像情報を用いた推論・探索処理に関する研究として「遺跡物復元システム」を開発することを目的としている.平成13年度では,12年度の研究で実施した遺跡物復元システム実現のための基本技術の研究成果を三次元上での復元処理へ拡張するため,以下の研究を行った.1.三次元形状を認識・分析するための要素技術の確立(1)特徴面の抽出方法の考案物体を特徴づけている輪郭を形成する閉曲線を取り出すための三次元画像認識手法を提案した.本遺跡物復元システムでは,取り出された閉曲線で囲まれた領域を接合面の候補(特徴面)としている.特徴面の自動抽出を実現するために,破片形状を構成する個々の三角パッチの法線ベクトルの解析方法を提案した.(2)三次元形状の類似度判別処理の実現破片群の中から最も類似する特徴面を持つ破片の組を自動選出するための技術について検討した.具体的には,(a)特徴面を構成する法線ベクトルの方向分布を分析する方法,(b)射影面を変化させながら2次元上での形状比較を反復することによる候補の絞り込み,(c)P形フーリエ記述子の3次元形状への拡張,に基づいた自動判別手法をそれぞれ提案した.2.三次元上で復元処理を行う遺跡物復元システムの実装12年度に試作システム上で実現した高速化技術と1.の研究結果を統合し,遺跡物復元システムを実装した.そして,遺跡発掘現場から出土した土器破片を用いてシステムの性能を評価し,システムの動作や復元性能を改良した.以上の研究成果として,本年度では,国際会議にて6編,雑誌論文にて5編の論文を公表(掲載決定を含む)した.本研究では,画像情報を用いた推論・探索処理に関する研究として「遺跡物復元システム」を開発することを目的としている.平成12年度においては,遺跡物復元システム実現のための基本技術について以下のとおり研究を行なった.・要素技術の考案まず,システム中枢部の処理として,以下の4つを実現する画像処理プログラミング技法を確立した.1.破片の輪郭線の検出入力された複数の破片の濃淡画像に対して,輪郭形状をそれぞれ自動的に取り出す技術.2.輪郭の分割輪郭線をいくつかの適切な開曲線(部分輪郭)に分割する技術.3.形状特徴量の計算法部分輪郭を形成する輪郭点の全曲率関数に対するP形フーリエ記述子を用いて,輪郭形状の評価量を自動算出する技術.4.接合箇所を特定する接合判別処理3.の処理で求められる評価量を用いて形状の類似度を計算する技術.・2次元形状での遺跡物復元システムの試作および処理の高速化次に,復元の対象を皿や蓋など平面的な形状を持つ土器破片に限定することにより,二次元上で遺跡物を復元するシステムを試作した.そして,試作システム上で復元性能の向上や処理の高速化を実現した.1.判別の難易度を考慮に入れた効率化入力された破片群に対して.最も形状の類似する部分輪郭を持つ組を選出するための最適な計算精度を考案し,部分輪郭の組合せ数が増大した場合でも,類似度評価の計算コストを極力抑えるアルゴリズムを提案した.2.ヒューリスティック探索制御の導入接合箇所における表面模様の整合性に着目した接合の効率化および精度の向上を実現した.輪郭近傍の破片表面の輝度変化を抽出し,これを探索のヒューリスティックとした接合判別手法を提案した.以上の研究成果として,本年度では,国際会議にて4編,雑誌論文にて3編の論文を公表(掲載決定を含む)した.本研究では,画像情報を用いた推論・探索処理に関する研究として「遺跡物復元システム」を開発することを目的としている.平成13年度では,12年度の研究で実施した遺跡物復元システム実現のための基本技術の研究成果を三次元上での復元処理へ拡張するため,以下の研究を行った.1.三次元形状を認識・分析するための要素技術の確立(1)特徴面の抽出方法の考案物体を特徴づけている輪郭を形成する閉曲線を取り出すための三次元画像認識手法を提案した.本遺跡物復元システムでは,取り出された閉曲線で囲まれた領域を接合面の候補(特徴面)としている.特徴面の自動抽出を実現するために,破片形状を構成する個々の三角パッチの法線ベクトルの解析方法を提案した.(2)三次元形状の類似度判別処理の実現破片群の中から最も類似する特徴面を持つ破片の組を自動選出するための技術について検討した.具体的には,(a)特徴面を構成する法線ベクトルの方向分布を分析する方法,(b)射影面を変化させながら2次元上での形状比較を反復することによる候補の絞り込み,(c)P形フーリエ記述子の3次元形状への拡張,に基づいた自動判別手法をそれぞれ提案した.2.三次元上で復元処理を行う遺跡物復元システムの実装12年度に試作システム上で実現した高速化技術と1.の研究結果を統合し,遺跡物復元システムを実装した.そして,遺跡発掘現場から出土した土器破片を用いてシステムの性能を評価し,システムの動作や復元性能を改良した.以上の研究成果として,本年度では,国際会議にて6編,雑誌論文にて5編の論文を公表(掲載決定を含む)した.
時間分解赤外分光法によるロドプシンの内部結合水の構造解析

研究代表者はこれまでに低温赤外分光法を用いて、分子ポンプであるバクテリオロドプシンに結合した内部結合水の性質を明らかにしてきた。本研究はこれを蛋白質が実際に機能する室温でも起こるのかどうか明らかにするため、室温での時間分解赤外分光による解析を行うことを計画した。研究分担者は、研究代表者の研究室に既設のステップスキャン時間分解フーリエ変換赤外分光装置およびナノ秒レーザーを用いて、時間分解赤外分解計測系を構築した。得られたデータを参考にして、分担者が得意とする数学的手法を使った原著論文をApplied spectroscopy誌に発表することができた。その解析をさらに深めた次の論文も最近、Applied spectroscopy誌にアクセプトされ、2007年に出版される予定である。さらに、バクテリオロドプシンの水和フィルムに対して水分子の信号を得ることに成功し、低温分光法によって得た水の信号と異なる信号を得た。この成果は、低温と室温での光反応ダイナミクスの違いを直接的に示すデータである。現在、原著論文を作成しているところであり、分担者はこの成果を中国での国際会議で招待講演として発表した(2006年11月)。研究代表者は上記、示した研究成果の他にも、研究発表に記した種々の成果を、主に赤外分光法により得ることができた。これまで研究代表者は低温赤外分光法を用いて、分子ポンプ蛋白質であるバクテリオロドプシンに結合した内部結合水の性質を明らかにしてきた。本研究では、これを蛋白質が実際に機能する室温でも起こるのかどうか明らかにするため、室温での時間分解赤外分光法による解析を行う。研究分担者が学振の外国人特別研究員として平成16年10月に研究グループに加わった時点から研究を開始し、本年度は時間分解赤外分光測定系の構築を行った。そして、十分な精度でレチナールや蛋白質骨格の信号を得る系を構築した。今後は、水分子の信号というチャレンジングな目標に向かって研究を遂行する。本年度はこのような研究の立ち上げの他に、分子ポンプに関する以下の研究成果を得ている。1.バクテリオロドプシンのシッフ塩基領域に存在し、内部結合水と水素結合を形成すると考えられているArg82の伸縮振動を帰属することに成功した。その結果、光異性化により水分子を含む水素結合ネットワークに摂動が生じてArg82の水素結合変化が起こること、その摂動がL中間体で緩和する一方、Arg82が動くM中間体では振動数は同じであるものの双極子モーメントが変化することを偏光赤外分光により明らかにした。また共同研究として、異性化前後での水分子の基準振動解析を量子化学計算により行い、実験とのよい一致を示す結果を得た。2.ハロロドプシンは、プロトンではなく塩素イオンを輸送する光駆動ポンプ蛋白質である。ハロロドプシンの内部結合水を低温赤外分光によって解析した結果、バクテリオロドプシンのような水素結合の強い水分子が存在しないことを見出した。ハロロドプシン中の塩素イオンは、プロトンポンプとは異なる機構で水和されていることが明らかになった。3.バクテリオロドプシンと同じファミリーに属しながら、プロトンをポンプしないアカパンカビロドプシンには水素結合の強い水分子が存在しないことがわかった。我々が見出した水素結合の強い水分子の存在は、プロトンポンプ機能と密接な相関をもつことが示唆された。研究分担者が学振の外国人特別研究員として平成16年10月に研究グループに加わった時点から研究を開始し、本年度の前半までに時間分解赤外分光測定系を構築した。そして後半には、水分子の信号というチャレンジングな目標に向かって研究を行った結果、室温における水分子の信号を捉えることに成功した。この成果は現在、原著論文を作成中である。それ以外にも、本年度は以下の研究成果を得ることができた。1.系統的な変異蛋白質を用いた赤外分光解析により、バクテリオロドプシン中で水素結合ネットワークを形成する水分子の振動を帰属することができた。我々が見出した水素結合の強い水分子は、予想通りレチナールシッフ塩基部位に存在することが明らかになった。2.バクテリオロドプシンの変異体および種々のロドプシン(ppR,HR,ASR,NR,LR)に対する赤外分光実験から、ロドプシンがプロトンポンプ機能をもつためには、水素結合の強い水分子の存在が必要であるという経験則が得られた。光駆動プロトンポンプという機能は、1個の水分子の水素結合によって決定されるのかもしれない。3.ハロロドプシンは、プロトンではなくクロライドイオンを輸送する光駆動ポンプ蛋白質である。ハロロドプシンの低温赤外分光による研究の結果、クロライドの輸送を引き起こす段階でレチナールシッフ塩基はクロライドではなく、水分子と相互作用することがわかった。これをもとに、全く新しいクロライド輸送機構のモデルを提唱することができた。

本研究はこれを蛋白質が実際に機能する室温でも起こるのかどうか明らかにするため、室温での時間分解赤外分光による解析を行うことを計画した。研究分担者は、研究代表者の研究室に既設のステップスキャン時間分解フーリエ変換赤外分光装置およびナノ秒レーザーを用いて、時間分解赤外分解計測系を構築した。得られたデータを参考にして、分担者が得意とする数学的手法を使った原著論文をApplied spectroscopy誌に発表することができた。その解析をさらに深めた次の論文も最近、Applied spectroscopy誌にアクセプトされ、2007年に出版される予定である。さらに、バクテリオロドプシンの水和フィルムに対して水分子の信号を得ることに成功し、低温分光法によって得た水の信号と異なる信号を得た。この成果は、低温と室温での光反応ダイナミクスの違いを直接的に示すデータである。現在、原著論文を作成しているところであり、分担者はこの成果を中国での国際会議で招待講演として発表した(2006年11月)。研究代表者は上記、示した研究成果の他にも、研究発表に記した種々の成果を、主に赤外分光法により得ることができた。
転写因子予測に基づく遺伝子発現制御メカニズムの解析

遺伝子発現の制御は膨大な転写因子とそのターゲット遺伝子の複雑なネットワークで実現される。本研究では、転写因子とターゲット予測に基づく機能解析を行い、以下のような成果を得た。(1)転写因子の予測:ゲノム解析からもたらされる多くの機能未知遺伝子から転写因子かどうかを予測するため、まず蛋白質がDNAに結合するかどうかを、配列情報、アラインメントを用いた進化的な情報、構造情報を用いる3種類の方法を組み合わせて予測した。配列アラインメントを用いる方法では、配列情報のみを用いる場合よりも予測精度が大幅に改善されることを示した。また、これらの方法を用いて酵母ゲノムについてゲノムスケールで網羅的に予測を行った。(2)転写因子のターゲット予測:蛋白質・DNA複合体の構造情報に基づくターゲット予測法をさらに改良するため、蛋白質・DNA複合体の構造データベースを更新し、塩基とアミノ酸の相互作用および配列依存のDNA構造に関する統計ポテンシャルを更新した。この統計ポテンシャルを用いて、蛋白質・DNA相互作用のエネルギー、蛋白質・DNA認識の特異性の計算などを行った。一方、DNAの構造や物性をとおして配列を認識する間接認識のメカニズムをさらに詳しく解析するため、さまざまなDNAの計算機シミュレーションを行った。転写因子のターゲット予測をゲノムスケールで行うため、酵母についてターゲットの予測を開始した。(3)データベース・ツールの開発と公開蛋白質・核酸認識や転写因子予測に関係したデータベース・解析技術を開発しインターネットで公開した。蛋白質・核酸相互作用熱力学データベースと翻訳シグナルデータベースのデータの追加と更新を行った。また、酵母の転写因子データベースの開発を行い、転写因子と転写因子のターゲットを予測するサーバもいくつか公開した。
受容体トラフィッキングのキネティック解析によるシナプス可塑性分子機構の解明

運動学習の基礎となる小脳プルキンエ細胞シナプスの長期抑圧の分子機構として、定量的な検証が全くなかった。本研究では受容体の安定化プールサイズ、受容体エンドサイトーシス反応速度を測定し、受容体の細胞内リサイクリングプールがLTDの際、減少することを発見した。グルタミン酸受容体に蛍光蛋白質のタグをつけ、画像解析したところ、受容体がLTDに際し、樹状突起スパイン内からシャフト部へ移動することが観察された。平成24年度は、AMPA型グルタミン酸受容体のエキソサイトーシスに対するケージ化阻害ペプチドを用いて、AMPA受容体のエンドサイトーシス反応速度が、シナプス可塑性の誘導、発現に伴い、どのように変化するのかについて調べた。ラット小脳スライスを用いて、プルキンエ細胞に1Hz, 300発の平行線維刺激と細胞体脱分極を同時に与えることにより、平行線維-プルキンエ細胞間のシナプス伝達の長期抑圧LTDを引き起こした。平行線維刺激に対する興奮性シナプス電流EPSCの振幅をもってシナプス膜におけるAMPA受容体の密度の指標とした。あらかじめ、ケージ化阻害ペプチドをホールセルパッチ電極より細胞内に投与し、LTD誘導後、紫外線照射によりアンケージすることにより瞬時に受容体エキソサイトーシスを阻害し、平衡していたエンドサイトーシスを単離し、AMPA受容体エンドサイトーシス反応速度をもとめた。その結果、予想に反し、AMPA受容体のエンドサイトーシス反応速度には、LTD誘導の有無によらず、有意差は見られなかった。AMPA受容体のエキソサイトーシスの単離には膜透過型ダイナミン阻害剤を用いた。平常時、ダイナミン阻害剤によりシナプス膜におけるAMPA受容体の密度はベーサルレベルの1.7倍に増加した。しかしLTD誘導後ではこのダイナミン阻害剤によって単離されたエキソサイトーシスによるAMPA受容体シナプス密度の増加は阻害された。この結果から、LTDの分子メカニズムとして、従来から知られていたAMPA受容体のシナプス膜からの脱安定化による内在化の他に、AMPA受容体トラフィッキングにおける内部プールの減少という新たなメカニズムが発見された。この発見は記憶学習の分子機構に新たな視点を提供すると同時に、今後、記憶学習障害の薬物治療開発に重要な貢献をすると考えられる。脳の記憶・学習は、シナプス伝達効率の可塑的変化(シナプス可塑性)によって生じる。小脳は運動学習の中枢と考えられ、その基礎に小脳の平行線維-プルキンエ細胞間シナプスの伝達効率の長期抑制LTDがあると考えられてきた。即ち、誤った運動に関与した平行線維シナプスは登上線維活動により、減弱されるというものであり、LTDの分子機構としては、登上線維、平行線維の同時発火により、プルキンエ細胞内のCa2+濃度が大きく上昇し、C型蛋白質キナーゼPKCの活性化を介し、シナプスに存在するAMPA型グルタミン酸受容体のC末端をリン酸化し、足場蛋白質から遊離させ、脱安定化した受容体はエンドサイトーシスにより細胞内に内在化されシナプス膜表面から除去される、という仮説が提案されている。しかしこの仮説は定量的に検討されておらず、充分であるか不明であった。そこで、1テタヌス毒素などを用いシナプス膜におけるAMPA受容体の安定化プールサイズ、可動プールサイズを計測し、LTD前後での変化を検討した。2光分解により瞬時にエキソサイトーシスによる受容体挿入を阻害できるケージドペプチドを開発し、これを用いて受容体エンドサイトーシスの反応速度を測定し、LTD前後での変化を検討した。3ウイルスベクターを用いて赤色蛍光蛋白質mCherryのタグをつけたAMPA受容体を培養プルキンエ細胞(緑色蛍光蛋白質を発現)に発現させ、LTD前後のAMPA受容体の分布の変化、移動の様子を画像解析した。4以上の結果を統合したAMPA受容体トラフィッキングの数学モデルを構築した。この結果、小脳LTDの分子機構として、新たにAMPA受容体の細胞内プールが、LTDに伴い、樹状突起スパイン内から樹状突起シャフト部に移動し、受容体リサイクルに関与するAMPA受容体の総量が減少することがLTDの基礎機構に含まれていることを発見した。小脳は運動学習の中心であるが、運動学習の分子メカニズムは必ずしも充分理解されておらず、論争が生じている。この問題の解決の糸口を探るべく、23年度は小脳運動学習のメカニズムである神経細胞間のシナプス伝達の可塑性、特にシナプス伝達の長期抑制の分子メカニズムについて研究し、大きな進展が得られた。定説では、小脳の唯一の出力細胞であるプルキンエ細胞と、この細胞への入力である平行線維の間にあるシナプス伝達が、間違った運動に際して抑圧され、これを繰り返すことで正しい運動が学習されると考えられている。

間違った運動に際し、強力な誤差信号の入力系である登上線維も平行線維と同時にシグナルをプルキンエ細胞に送り、細胞内カルシウムイオンを上昇させ、プルキンエ細胞シナプス膜に繋ぎとめられていたアンパ型グルタミン酸受容体をシナプス膜から解き放ち、その結果、アンパ受容体はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、シナプス膜のアンパ受容体は減少し、長期可塑性LTDが生じるという仮説である。しかし、この脱安定化の生じない突然変異マウスでも運動学習が正常に獲得されることが本年度中に外国から発表された。私はケージ化阻害剤の光分解によるアンケージング等の手法を用いて、アンパ受容体が細胞内とシナプス膜表面を往来(トラフィッキング)する速度を求めることに成功し、この結果を取り入れた数理的モデルから、従来とは異なる分子メカニズムがあることを予測した。そして培養プルキンエ細胞に赤色蛍光蛋白質でラベルしたアンパ受容体と緑色蛋白質をウイルスベクターを用いて同時に発現させることにより、学習刺激に伴い、アンパ受容体の細胞内の配置が変わることを見出した。これは数理モデルの予測とよく合う現象である。この新たに発見されたシナプス可塑性の分子メカニズムは論争解決の糸口を与えるものである。記憶学習の基礎メカニズムの一つとして、シナプス後膜における受容体密度の増減調節が知られている。この増減は受容体エキソサイトーシスとエンドサイトーシスのバランスによって調節されていることが知られているが、定量的な検討、特に実測に基づくキネティックアナリシスによる検討はなされていなかった。平成23年度の研究で、ケージ化阻害ペプチドを用いて瞬時にAMPA受容体エキソサイトーシスを阻害し、受容体エンドサイトーシスの経過を単離測定知ることに成功し、平成24年度の研究において、この受容体エンドサイトーシスの反応速度が、シナプス伝達の長期抑圧LTDにともない、どのように変化するのか、ケージ化阻害ペプチドを初めて適用することにより調べた結果、予想に反してエンドサイトーシス反応速度に差は見られなかった。一方、膜透過型ダイナミン阻害剤の投与により受容体エンドサイトーシスを阻害し、受容体エキソサイトーシスを単離測定することにより、LTD誘導に伴い、AMPA受容体エキソサイトーシスが抑圧されていることを発見した。これらの成果により、当初予定していた研究目標は90%、達成されたと考えられる。残された問題は受容体エキソサイトーシスの時間経過の測定であるが、これにはアンケージングにより受容体エンドサイトーシスを瞬時に阻害するケージ化エキソサイトーシス阻害ペプチドが必要であり、いくつかのペプチドについてケージ化を試みたが、まだ開発に成功していない。しかし、受容体エキソサイトーシスが定常状態に達した段階でも差が生じているため、本質的な目標は達成されたと考えている。ラット小脳スライスを用いて行った実験において、ケージ化阻害剤のアンケージングにより、アンパ受容体のエンドサイトーシス速度を物理化学的に正確に測定することが可能となった。このため、学習の前後でのエンドサイトーシス速度の測定も疑いなく比較することができた。数理モデルの構築が理論的な矛盾もなく、順調に進んだ。その結果、通常時のアンパ受容体のシナプス膜へのトラフィッキングを世界で始めて、速度定数を用いてモデル化することに成功した。従来の阻害剤による時間応答も、この新のエンドサイトーシス速度定数と、阻害剤拡散時間経過にデコンボリューションすることに成功した。
αーリポ酸及びその類似化合物による金属の分離に関する基礎的研究

リポ酸は、ジスルフィド基とカルボキシル基の2つの官能基を有し、生体内では酵素と結合して存在し、生体のエネルギー交換における重要な中間代謝物質であるαーケト酸の酸化的脱炭酸反応の補酵素として働くことが知られており、生体内での反応に関心の持たれているカルボン酸である。そこで、生体内の反応ではないが、水溶液の反応、有機相の反応、水相ー有機相間の分配平衡を含む液ー液抽出系において、銅(II)とリポ酸の反応を研究し、ジスルフィド基の硫黄原子は銅(II)との結合には関与せず、ジチオラン環の影響はほとんどなく、リポ酸は他の直鎖脂肪族カルボン酸に準じた挙動をすることを明らかにした。すなわち、ジチオラン環とカルボキシル基の間の4個のメチレン基が、ジチオラン環の効果を遮蔽してしまうと考えられる。次に、硫黄原子を含む5員環である、チエニル基に直接カルボキシル基が結合した、2ーチオフェンカルボン酸を抽出試薬として、銅(II)の抽出を行った。硫黄原子が銅(II)との結合に直接関与しない点は、リポ酸と同じであるが、抽出平衡に関しては、銅(II)錯体の2量体は認められず、むしろ芳香族カルボン酸である安息香酸と類似することが分かった。2ーチオフェンカルボン酸は、非ベンゼン系芳香族カルボン酸であり、共役系が存在することを考慮すれば、共役系がカルボン酸銅(II)の2量体生成に何らかの影響を与えていると考えられる。また、安息香酸は、「オオウキクサ」の開花ホルモンとしても知られるように、リポ酸と同様に生体関連物質としても興味が持たれている。これらの点を考慮して、リポ酸、2ーチオフェンカルボン酸、安息香酸およびその誘導体による銅(II)の抽出を行い、抽出平衡を詳細に比較検討した。非ベンゼン系芳香族カルボカ酸である, 2-チオフェンカルボン酸による銅(II)イオンの抽出を行ったところ,非溶媒和性溶媒であるベンゼンにはほとんど抽出出来なかったが,溶媒和性溶媒である1-オクタノールには,抽出率が50%に達するところまでは,エマルジョンの生成もなく抽出出来ることが分かった.抽出種は, CuA_2のみであり,その抽出定数はlogKox=-7.14である.しかし,このような領域では,水相における銅(II)のチオフェンカルボン酸錯体の濃度がなかり高く, Cu^<2+>イオンの濃度に比べて無視できないほどであり,抽出率の低下を引き起こしている.抽出平衡の解析によりもとめた,水相におけるチオフェンカルボン酸錯体(CuA^+とCuA_2)の全生成定数は,それぞれlogβ_1=1.24, logβ_2=1.99である.本抽出系とは異なり,他のカルボン酸による抽出系では,銅(II)のカルボン酸錯体が,水相において感知するほどに存在することはなかった.これは, 2-チオフェンカルボン酸の場合には, CuA_2の分配定数が酸自身の分配定数から,理論的に予想される値よりもかなり小さいために,水相に存在する銅(II)カルボン酸錯体の濃度が高くなり,銅(II)の水和イオンの濃度に比べて無視出来なくなることに起因している.

このことは,銅(II)のチオフェンカルボン酸錯体に,有機相への親和性を抑制するような力が働いていることを示唆している.リポ酸の場合には,銅(II)は2量体として抽出されており,その挙動は脂肪族カルボン酸と類似していたが,チオフェンカルボン酸の場合は,脂肪族カルボン酸の場合のように,銅(II)の2量体は生成せず,ベンゼンには抽出されないなど抽出挙動は,安息香酸の場合と同じであり,共役系がカルボン酸銅(II)の2量化に何らかの影響を与えていると思われるが,これらの点に関してはいろいろの方向から,さらに詳しい研究を続けて行かなければならないと考えている.液-液抽出系の研究において、リポ酸ではジチオラン環とカルボキシル基をつなぐ4個のメチレン基によりジチオラン環の効果が、ほとんど遮蔽されてしまうためとおもれわるが、銅(II)の抽出に関して、脂肪族ガルボン酸に準じた抽出平衡が得られた。そこで、やはり硫黄原子を含む5員環であるチエニル基に、リポ酸とは異なりメチレン基を挟まず、直接カルボキシル基が結合した。2-チオフェンカルボン酸を選んで銅(II)の抽出を行った。リポ酸同様、5員環の硫黄原子は銅(II)との結合に直接関与しないが、抽出平衡に関してはリポ酸や脂肪族カルボン酸のように2量体の生成は感知するほどには認められず、芳香族カルボン酸である安息香酸と非常によく似ていることを明らかにすることが出来た。2-チオフェンカルボン酸は、非ベンゼン系芳香族カルボン酸であることを考慮すれば、カルボン酸銅(II)錯体の生成に対して共役系が何らかの影響を与えていると考えられる。そこで、この影響について検討するために安息香酸の1つの水素原子をメトキシ基で置換した、メトキシ安息香酸と銅(II)との反応を液-液抽出系で研究することにした。安息香酸は「オオウキクサ」の開花ホルモンとしても知られており、リポ酸同様に生体内での反応に興味が持たれていることもあるので、この観点からも置換安息香酸に関する研究を行うことにした。その結果、パラメトキシ安息香酸では銅(II)をほとんど抽出することが出来ず、オルトおよびメタ置換体でも銅(II)は単量体としてのみ抽出され、すでに明らかにしているメチル安息香り酸の場合(パラ置換体では、銅(II)の抽出種は単量体のみであったが、オルトおよびメタ置換体では一部2量体の生成も認められ、抽出性も向上した)とは、顕著な違いを示し、置換基自身や、置換基による共役系の変化がカルボン酸銅(II)錯体の生成に何らかの影響を与えることが分かった。
卵子バンクの安全性向上にむけたヒト白血病発症NOGマウスでの腫瘍細胞の挙動の検討

担癌女性患者などの卵巣組織を治療前に採取、保存して原疾患治療後に凍結融解後の卵巣より何らかの方法で卵子を回収するシステムが「卵子バンク」である。卵子バンクは若年がん患者などの妊孕性を担保する新しい技術として期待されている。しかし、担癌状態の治療前の卵巣組織を保存しておき治療後に使用することに関しての安全性の検証が未だなされていない。本研究では以下の検討を行い、上記の課題に関する検討を行った。ヒト白血病モデル免疫抑制マウスの作成:ヒト白血病細胞へのGFP遺伝子導入とモデルマウスへの白血病細胞の移植生着の確認をした。GFP導入効率は極めて低値で細胞群ごとに差が見られた。導入を確認できた白血病細胞を幼弱免疫抑制マウスに投与したが、その生着率も細胞群毎に差異がみとめられた。モデルマウス体内での白血病細胞の挙動の検討:組織学的な方法と他免疫抑制マウスへの移植による生存性の検討によりモデルマウス卵巣へのヒト白血病細胞の混入を検証した。細胞群ごとに生着率が大きく異なり現在までに卵巣にどの程度の確率で白血病細胞が混入するかのデータに関しては明確な結論は得られなかった。生殖補助技術シミュレーションによる白血病細胞混入の検討:モデルマウスの卵子、卵丘塊を用いて生殖補助技術のシミュレーションを施行した。シミュレーションで得られた卵子を移植したマウス骨髄での腫瘍細胞の有無を検討したが明らかな腫瘍細胞はみとめられなかった。各血液悪性疾患のヒト白血病モデルNOGマウスの作成・本研究に供されるヒト白血病細胞、あるいは免疫抑制マウスは極めて稀少かつ貴重である。すなわち、本年度は研究の基盤となる、NOGマウス卵巣、卵子、またヒト白血病細胞の取り扱いに関しての基本的トレーニングを念入りにおこなった。NOGマウスは本学動物実験施設の無菌培養質(SP3)で管理される。ヒト白血病細胞幹細胞の移植前に、ヒト子宮筋腫組織の移植実験(本学倫理員会の承認の上患者同意所得すみ)を行い我々の移植系、動物管理にてマウスへのヒト組織、細胞の移植の状況が良好であることが確認できた。また、通常のマウスを過排卵誘発ホルモン処理(PMSG-hCG)して、卵子、卵丘細胞の採取マウス骨髄細胞の採取およびその処理などのトレーニングを行った。さらに、幼弱マウスに細胞を静脈投与するシミュレーションを何度も行った。・モデルマウスを作成する血液疾患としては、対象となる生殖年齢女性に発症する頻度を考慮して、急性骨髄性白血病の諸病型、急性リンパ性白血病の3病型と対象とする。これらの血液疾患患者骨髄生検時の余剰骨髄よりヒト白血病幹細胞(hCD34^+CD38^-細胞)をfluorescein activated cell sorting(FACS)にて分離、選別を試みた。分離された細胞は白血病幹細胞にはレトロウイルスを用いてGreen Fluorescein Protein(GFP)遺伝子の導入を試みた。GFP導入後放射線照射を行った幼弱雌NOGマウスに白血病幹細胞を静脈内投与を試みた。16週の生着期間ののち、モデルマウスへの白血病細胞の生着の確認を試みた。○各血液悪性疾患のヒト白血病モデルNOGマウスの作成・本研究に供されるヒト白血病細胞、あるいは免疫抑制マウスは極めて稀少かつ貴重である。NOGマウスは動物実験施設の無菌培養質(SP2)で管理される。また、通常のマウスを過排卵誘発ホルモン処理(PMSG-hCG)して、卵子、卵丘細胞の採取マウス骨髄細胞の採取およびその処理などのトレーニングを継続しておこなった。さらに、幼弱マウスに細胞を静脈投与するシミュレーションを何度も行いその技術を確立した。

・モデルマウスを作成する血液疾患としては、対象となる生殖年齢女性に発症する頻度を考慮して、急性骨髄性白血病の諸病型、急性リンパ性白血病の3病型と対象とした。これらの血液疾患患者骨髄生検時の余剰骨髄よりヒト白血病幹細胞(hCD34^+CD38^-細胞)をfluorescein activated cell sorting(EACS)にて分離、選別を試みた。分離された細胞は白血病幹細胞にはレトロウイルスを用いてGreen Fluorescein Protein(GFP)遺伝子の導入を試みた。この段階で組織培養上の問題よりその導入に何回かの実験の試行錯誤を要した。GFP導入後放射線照射を行った幼弱雌NOGマウスに白血病幹細胞を静脈内投与を行った。16週の生着期間ののち、モデルマウスへの白血病細胞の生着の確認を検証した。●各血液悪性疾患のヒト白血病モデルNOGマウスの作成昨年度に引き続き白血病細胞へのGFP導入とモデルマウスへの白血病細胞の移植生着の確認をした。GFP導入効率は極めて低値で患者ごとにも差が見られた。導入を確認できた白血病細胞を幼弱NOGマウスに投与したが、その生着率も患者(細胞群)ごとに差異がみとめられた。●モデルマウス体内での白血病細胞の挙動の検討組織学的な検証と他NOGマウスへの移植による生存性の検証によりモデルマウス卵巣へのヒト白血病細胞の混入を検討した。具体的には採取卵巣のstep serial sectionを作成の上、移植前標識したGFPをターゲットとした蛍光励起下観察、免疫組織化学法、ISH法にて移植腫瘍細胞の存在を同定をこころみた。しかし、上述のように、患者ごとに定着率が大きく異なり現在までに卵巣にどの程度のリスク(確率)で白血病細胞が混入するかのデータはまだでていない。生存性の検証法としてモデルマウス卵巣を別のNOGマウスに移植、6週間の生着期間のちホストマウス骨髄を採取して疾患発症の有無を検討しているがこの件に関しても、いまだ明らかな知見は得られていないので次年度以降実験を積み重ねてゆく予定である。●生殖補助技術シミュレーションによる白血病細胞混入の検討現在、モデルマウスの卵子、卵丘塊を用いて体外受精のシミュレーション、ICSIのシミュレーションを施行している。受精卵は別のホストNOGマウスに移植される。16週ののちマウス骨髄での腫瘍細胞の有無を検討している。●各血液悪性疾患のヒト白血病モデルNOGマウスの作成平成24年度に引き続き白血病細胞へのGFP導入とモデルマウスへの白血病細胞の移植生着の確認をした。