hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細菌の生産するキチナーゼ、キトサナーゼ作用の解明と菌類プロトプラスト融合への応用

土壌から分離し、保存してあるAeromonas hydrophilasubsp.anaero-genesの生産するキチナーゼを、キチンを用いた吸着、CM-Sephadex C-50を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって均一なまでに精製した。本酵素の等電点は460、分子量は約105,000であると決定した。Bacillus circulans MH-K1の生産するキトサナーゼをその培養液からCM-セルローズを用いたイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過法によって均一なまでに精製した、本酵素の等電点は9.2分子量は約30,000、キトサンに対するkm値は0.63mg/mlであった。本酵素のキトサンを基質とした反応液中には、反応生成物として主にグルコサミンのダイマーならびにトライマーが検出された。反応の最小基質は、グルコサミンのテトラマーであった。本酵素のアミノ酸組成にはメチオニン残基が検出されなかった。N-末端アミノ酸配列はAla-Ser-Pro-Asp-Asp-Asn-Phe-Ser-Pro-Glu-Thr-Leu-Gln-Phe-Leu-Arg-Asn-Asn-Cys-Gly-Leu-Asp-であると推定した。上記のキチナーゼとキトサナーゼを用いて菌類のプロトプラスト調整について検討した結果、キチナーゼはAsperoillus usami Aspergillus awamoriのプロトプラスト化に、キトサナーゼはMucor javanicus,Rhizopus hangchaooのプロトプラスト化に有効であることが示された。キトサン1%を含む液体培地による集積培養と,同じくキトサン1%を含む寒天培地を用いるスクリーニングを組合せ,土壌試料中からキトサナーゼ生産微生物を検索した.キトサン寒天平板上に生ずる溶解斑の大きい菌株の中から適切な細菌1株を選定し,細菌学的固定を行ない,グラム陰性,好気性胞子形成〓菌をBacillus circulans MH-K1と命名した.この菌株によるキトサナーゼ生産の最適条件を設定し,キトサン1%を含む液体培地で3日間の振盪培養により培地中にキトサナーゼを生産させた.菌体を遠心分離により除去した上清を硫酸アンモニウム0.70.9飽和により酵素を分画沈でんさせた.この操作により,この菌の生成する粘質物を除去することができた.さらにイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフ法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一な標品にまで精製した.精製キトサナーゼは分子量約30000,キトサンに対するKmは0.63mg/ml,最大活性はpH65, 50゚Cで得られ, 040゚C, pH4.09.0の範囲で安定であった.この酵素はキトサン,グリコールキトサン, CM-キトサンには作用するが,同じβ-1.4-グルカンでもキチンとその誘導体やCM-セルロースには作用しなかった.キトサンの脱アセチル化度は酵素活性にいちじるしい影響を与え, 80%脱アセチル化度をピークとして,これより脱アセチル化度が高くても,低くても活性は低下した.このことはこのキトサナーゼが基質キトサンを認識するとき,キトサン分子中のN-アセチルグルコサミン残基の存在が重要な意味を持つことを示唆している.この酵素によるキトサンの最終分解生産物はセルロース薄層クロマトグラフ法の結果によれば,グルコサミンの2量体と3量体の混合物であり,単量体の生成は認められなかった.またグルコサミンの4量体以下のものは基質とはなり得ず,糖転位作用も認められなかった.作用型式はエンド型であった.

土壌から分離し同定して保存してあるBacillus circulans MH-KIの生産するキトサナーゼについて、すでに明らかにされている方法に従って硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を行い、ポリアクリルアミド電気泳動的に均一な標品を得た。この精製標品を用い、本酵素のアミノ酸組成とN末端アミノ酸配列について検討を加え次の結果を得た。本酵素のアミノ酸組成については、精製標品を塩酸-トリフルオロ酢酸ならびにメタンスルホン酸を用いて加水分解し、ヒスチジン量を1.0としアミノ酸のモル比を求めて決定した。本菌の酵素の特徴は、これまでにその組成が報告されている酵素と異なり、メチオニン残基を含まないことであった。N-末端アミノ酸配列は、エドマン法により分析した結果、Ala-Ser-Pro-Asp-Asp-Asn-Phe-Ser-Pro-Glu-Thr-Leu-Glm-Phe-Leu-Arg-Asn-Asn-Cys-Gly-Leu-Asp-であると推定した。これらの両酵素を用いて菌類のプロトプラストの調整について検討した結果、黒麹菌Aspergillus usami Aspergillus awamoriの場合には、市販のNovozymとZymolyaseに上述のキチナーゼを混合して使用することが、藻菌類Mucor jacanicus,Rhizopus hangchaooの場合には、キチナーゼとキトサナーゼを混合して使用することが有効であることを明らかにした。
コンポジットレジン修復における象牙質親和性接着法の試み

タンニン酸の幅広い生物学的な作用に着目し,接着処理材への応用を検索することを目的として,その作用時間や濃度の歯質や細菌に与える影響を基礎的に研究すると共に,ボンディング材に配合した場合の抗菌性や歯質接着性について検討した結果,タンニン酸はリン酸及びトリプシンによる象牙質コラーゲンの溶解を抑制し,その作用は処理時間と濃度に依存した。また,タンニン酸はリン酸処理によるコラーゲンの構造破壊を抑制する作用のあることがSEM観察像からも明らかとなった。タンニン酸の口腔レンサ球菌に対する最小発育阻止濃度はS.mutansで300μg/ml,その他の被験菌株では400μg/mlであり,う蝕原因菌として重要なS.mutansに対してタンニン酸は高い抗菌性を示した。また,タンニン酸の石炭酸係数は,S.mutans OMZ 175株で0.6あった。また,静止期にある細菌に対してタンニン酸300μg/mlを15分間作用させることにより,タンニン酸が最も高い殺菌力を示したS.mutans OMZ 175株の生存率は約2%に減少した。唾液処理,未処理の修復材料並びに歯質表面は,タンニン酸処理により負の荷電が増加すると共に,より親水性に変化し,これらの被着材料に対する付着菌数は減少した。未硬化あるいは硬化直後のボンディング材も特定の細菌に対して抗菌性を有していたが,ボンディング材ヘタンニン酸を配合することによりその抗菌性が強化されることが判明した。タンニン酸配合ボンディング材のエナメル質に対する適合性に優れ,特に象牙質との適合性は極めて優れていることが示された。以上のことから,タンニン酸は窩壁象牙質コラーゲンの抗酵素性を回復,向上させ,修復物表面あるいは歯質の抗菌性を高めることから,修復物中もしくは歯質との界面にタンニン酸が存在することにより二次う蝕の抑制に極めて有効であり,歯質強化,歯質保護の点で意義あるものと考えられる。コンポジットレジン修復において、象牙質とコンポジットレジンの接着は、象牙質のコラーゲン繊維の存在などにより未だ充分なものでなく、象牙質に対しても安全で、安定した接着性を有する前処理剤並びにボンデイング材の開発が強く望まれる。すなわち、接着性に優れる材料の開発や治療法の改善と同時に、う蝕や歯周疾患に対する予防的修復法の確立も重要な課題と考える。そこで、タンニン酸の有する蛋白収斂作用、抗菌作用、コラーゲンの抗酵素性を高める作用などに着目し、前処理剤としてタンニン酸を用いて、エッチングによるコラーゲンの侵襲を防止すると共にコラーゲンを強化し、ボンデイング材中にもタンニン酸を配合してコラーゲン繊維との親和性を持たせることにより、象牙質へのレジンの接着性を高めながらう蝕の再発を防止することを目的として、その有効濃度や作用時間の判定やその安全性を検討した。タンニン酸を象牙質前処理剤として使用した際のタンニン酸のコラーゲンの溶解性に及ぼす影響を調べるために、牛アキレス腱コラーゲンを用いて各種濃度、作用時間を変えた各種酸溶液で処理した状態を形態学的にSEM観察した結果、未処理コラーゲンでは、コラーゲンの繊維構造および横紋構造が観察されたが、リン酸、あるいはクエン酸処理を施すと、コラーゲンの繊維構造は失われ、無構造を呈した。タンニン酸処理では、コラーゲン繊維の補強効果が観察され、タンニン酸処理後にリン酸処理を行ったコラーゲンにおいてさえも、繊維構造が残ることが観察された。

一方、タンニン酸の口腔レンサ球菌に対する作用を、Streptococcus mutans,S.sobrinus,S.sanguis,S.salivariusを用いて検討した。抗菌性の検索として、最小発育阻止濃度(MIC)を測定した結果、いづれの菌株においても300400μg/mlであることが、また、殺菌力の検索として、石炭酸係数を測定した結果、S.mutansへの殺菌性が強いことが判明した。タンニン酸の幅広い生物学的な作用に着目し,接着処理材への応用を検索することを目的として,タンニン酸の歯質や修復材表面への細菌付着抑制効果を研究すると共に,ボンディング材に配合した場合の抗菌性や歯質接着性について検討した結果,唾液処理,未処理の修復材料及び歯質表面は,タンニン酸処理により負の電荷が増加すると共に,より親水性に変化し,これらの被着材料に対する付着菌数は減少した。また,付着菌数と被着体表面のζ-電位及び接触角との間にはそれぞれ相関が認められた。すなわち,タンニン酸処理による菌付着の抑制は,静電的相互作用の増大や疎水的相互作用の減少など非特異的因子の阻害によることが示唆された。一方,未硬化あるいは硬化直後のボンディング材も特定の細菌に対して抗菌性を有していたが,ボンディング材へタンニン酸を配合することによりその抗菌性が強化され,未配合のボンディング材は硬化24時間後にはいずれの細菌においても抗菌性が認められなかったのに対して配合されたものにはわずかながら抗菌性が認められることが判明した。タンニン酸配合ボンディング材のエナメル質に対する適合性に優れ,特に象牙質との適合性は極めて優れていることが示された。また,同材と象牙質との接着力はタンニン酸を配合しないものとに統計的な差は認められなかった。
2-チアゾロンを反応素子とする効率不斉合成

本研究では、これまでに当研究室により高効率反応素子としての有効性を明らかにしてきた単純複素五員環2-オキサゾロン、2-イミダゾロンの類似体である"2-チアゾロン"を構築材とした、様々な効率不斉合成プロセスの開発を目的としている。昨年度で明らかにした、2-チアゾロンニ重結合部位の付加反応活性(イオン反応、ラジカル反応、協奏反応)特性をもとに、これら付加体の高効率反応素子としての有効性を確立することに注力した。(1)新規キラル合成子を利用した光学活性2-アミノチオール類の合成:キラル2-チアゾロン二重結合部位への位置及びジアステレオ選択的付加反応により得られた5-プロモ-4-メトキシ体の4,5位反応性置換基を夫々イオン的に所要の置換基に完全な位置及び立体選択性で変換し、生理活性を有す水酸化アミノ酸の一種であるスタチンのアミノチオールアナログ中間体を合成し、本方法論の有効性を実証した。(2)2-チアゾリジノン系"屋根付き"人工不斉源の開発:2-チアゾロンと9,10-ジメチルアントラセンとの環化付加より得られる光学活性"屋根付き"付加体より誘導したキラル2-アミノチオール体やチアゾリン誘導体が不斉配位子として、パラジウムを利用したアリルアセテートの不斉アルキル化や不斉Diels-Alder反応において特徴ある反応挙動を示し、本不斉源の有効性を実証した。初年度では、2-チアゾロン二重結合部位の付加反応活性(イオン反応、ラジカル反応、協奏反応)について検討するとともに、これら付加体の効率不斉合成手法を確立することに注力した。(1)2-チアゾリジノン系新規キラル合成子の開発3位に不斉補助剤として2-apocamphanecarbonyl基を導入した2-チアゾロン二重結合部位へのジアステレオ選択的イオン的付加反応について検討し、5-ブロモ-4-メトキシ体及び5-フェニルセレノ-4-メトキシ体を互いに逆の立体選択住で高収率且つ高ジアステレオ選択性(95%de)で得た。(2)ラジカル付加反応活性の検討3位にペンダントグループとしてトリクロロアセチル基を有すキラル2-チアゾロンの分子内ラジカル環化反応について検討し、触媒量のLa(OTf)_3存在下短時間で中程度の収率ながら目的の12員環マクロライド体を完全なジアステレオ選択性で得た。(3)2-チアゾリジノン系"屋根付き"人工不斉源の開発2-チアゾロンと環状ジエン類(アントラセン、シクロペンタジエン等)との熱Diels-Alder反応について検討し、目的とする環化付加体を収率良く得た。更に、これら付加体のMAC acid(2-exo-methoxy-1-apocamphanecarboxylic acid)を利用した化学量論的光学分割手法及びオキサザポロジリン/ボランを用いる不斉脱アセチル化による触媒的光学分割プロセスを開発し、"屋根付き"人工不斉源の簡易合成プロセスの構築に成功した。
人工股関節置換術を受けた患者の日常生活の実態と退院指導に関する質的研究

【研究目的】昨年の面接調査をさらに進め,変形性股関節症(以下OA)で人工股関節全置換術(以下THA)を受ける患者が,手術療法前後の生活体験をどのように認識しているかを明らかにし,その変化プロセスを構造化する【研究方法】対象者が語った内容の逐語的な記述をデータとして,質的帰納的方法を用いて分析した。面接は一人につき15回で,片側,両側THA患者毎に類別した。【結果】片側THAの患者18人,両側THAの患者は4人で,女性が多かった。OAで両側THAを受けた患者の手術療法前後の体験を時系列に比較した結果,《制約される生活》から《折りあいをつけた生活》への変化の過程と変化に即した取り組みが見いだされた。手術を受ける前は「何をするにも痛い」と日常的に痛みが存在し,跛行により自尊感情が低下する《痛みにより制約される生活》から術後に痛みからの開放と歩行や歩容が改善し,《制約からの解放》を体験した。しかし,時が経つにつれ,股関節屈曲制限の不自由さは「何でもはできない」と機能回復の限界を感じさせ,人工関節による《障害と折りあいをつけた生活》へと変化した。また,両側THA患者では,術前の制約がより大きいため,術後は脱臼や転倒に不安はあるが,痛みのない生活に満足感を示した。脱臼や耐用年数等人工関節への不安はすべての患者が持っているが,再置換まで「元気に楽しく暮らせる」と肯定的に受けとめ,障害者になった自分を受けいれたり,人工関節を長く使う取り組みに意味を与えていた。以上の結果をTHAを受ける患者の生活体験として構造化した。【考察】THAを受ける患者の生活体験の過程を考慮して継続看護を行うことが重要であると示唆された。【看護実践への取り組みと今後の課題】結果を基に,整形外科の医師や看護師と退院指導の検討を行っている。今後さらに教育内容や方法について吟味した上で,評価することが必要である。【研究目的】人工股関節全置換術後患者の日常生活や心理的変化の過程を術前と比較して、術後の在宅生活の実態を明らかにする。【研究方法】人工股関節置換術を受け、研究に同意の得られた術後1ヵ月、6ヶ月、1年、2年後の外来通院患者27名に対し、半構成的な面接調査を実施し、遂語録を質的帰納的に分析した。【結果】ADLや身体機能については、術後全体としては疼痛や歩行障害の改善により多くの患者が、「トイレに間にあうようになった」「近所の人とのつきあいに行けるようになった」と生活行動の拡大に対する満足感を表していた。心理面では「前は死んだ方がましだと思っていたが、今は何にでも挑戦しようという気になった」「家族に迷惑をかけないですむのがうれしい」「痛みがなく気持ちが楽になった」と痛みがない喜びや将来への希望が示された一方で、「漠然とはずれそうで怖い」といった脱臼や再置換術への不安や「もっと日常生活に不自由ないと思っていた」「障害者になった自分がショック」と否定的な感情も示された。経過別にみると、術後1ヵ月の患者は「まだ不安で浴槽にはいったことはない。シャワーだけ」「靴下がはけない」「炊事だけはなんとかしている」と日常生活が完全に自立できていない場合があり、社会活動を始めている者は少なかった。また,在宅生活での様々な現実に試行錯誤で取り組んでいた。術後6ヶ月以降の患者は日常生活はほぼ自立しており、「人前に出ても恥ずかしくない」と歩容改善や除痛に対する満足が高いが、「頑張ってもこれ以上よくならない」「人工関節を長くもたせるために前のように動いていない」と個々の生活スタイルにあわせて在宅生活を行っていた。

以上の結果をTHAを受ける患者の生活体験として構造化した。【考察】THAを受ける患者の生活体験の過程を考慮して継続看護を行うことが重要であると示唆された。【看護実践への取り組みと今後の課題】結果を基に,整形外科の医師や看護師と退院指導の検討を行っている。今後さらに教育内容や方法について吟味した上で,評価することが必要である。
NRF2依存性がんの発症メカニズムの解明

転写因子NRF2は、酸化ストレス・親電子ストレス応答の鍵因子として生体防御において重要な役割を果たしている。一方、がん細胞では、アグレッシブな増殖を促進し治療抵抗性を増強する。NRF2が異常蓄積したがん細胞は、その生存・増殖や治療抵抗性をNRF2に大きく依存して、悪性度の高いがんを形成する。しかし、NRF2の活性化のみでは細胞のがん化には至らず、NRF2依存性がんの成立機構は不明である。また、NRF2阻害剤はNRF2依存性がんの有効な治療戦略になると期待されるが、生体防御におけるNRF2の重要な役割を考えれば、そこには種々のリスクが伴うと予想される。そこで、本研究では、NRF2依存性がんの成立機構の解明と、NRF2の下流でがんの悪性化をもたらす新たな治療標的の同定を目的とする。NRF2依存性がんの成立機構解明のためには、独自の新しいマウスモデルを作成し、環境化学物質との関係に着目して解析をすすめる。NRF2依存性がんの新たな治療標的としては、ミトコンドリアにおけるイオウ代謝制御因子を有力な候補として解析する。その目的で、親電子性ストレスに対する慢性的・反復性の曝露をモニタリングするマウスを作成するとともに、NRF2活性化がんにおけるイオウ代謝特性の解析を実施する。NRF2活性化をきっかけとして遺伝子改変を誘導するマウスとしてNeh2-Creマウスの作成に成功し、当該マウスを用いてNeh2-Cre:LSL-tdTomato:Keap1F/Fマウスの作成にすすむことができている。また、イオウ代謝とNRF2の関係についても、NRF2活性化がんの代謝特性としてイオウの酸化を利用して、格好の治療標的が明らかになりつつある。Neh2-Cre:LSL-tdTomato:Keap1F/Fマウスが得られ次第、Neh2-Cre:LSL-tdTomatoマウスをコントロールとして、4NQOによる食道がんの誘発実験を実施する。NRF2活性化がんのイオウ代謝特性を利用した治療標的の有効性を、遺伝子ノックダウン実験により検証をすすめ、その治療標的のタンパク質構造解析と阻害剤のスクリーニングの準備を開始する。
エキゾティックな相変化材料の非結晶構造と物性

申請者の研究プロジェクトは、優れたデータ保存デバイスの基礎物性を探求することを目的としている。レーザー励起による結晶ー非結晶相転移によって情報を記録する光学メディアDVDについて、新しい材料として期待されているGe-Cu-Te混合系半導体の相変化メカニズムを解明するために、放射光X線を用いたX線異常散乱(AXS)法によって非結晶状態(アモルファス相)の原子配列を、アモルファス相の構造を正確な3次元原子配列として導出する。特にGe原子が、DVDとしての速い相変化と長い記録保持性に大きく関わっていることがこれまでのGe-Sb-Te混合系における測定によりわかりつつあるので、光反射率の逆転などエキゾティックな物性と高温で高い安定性を示すなど実用面でも優れているGe-Cu-Te混合系の中距離原子構造と物性の深い関係を、Ge-Cu組成比をいくつか変化させたデータから明白にすることを試みた。Ge-Cu-Te混合系薄膜を、ドイツ・ダルムシュタット工科大学においてスパッター法によって作製した。試料はSPring-8においてGe、CuおよびTeそれぞれの元素のまわりの差構造因子を求めるAXS実験を行い、統計性の優れた結果を得た。差構造因子は元素によって異なった形状を持つ。得られた結果は、逆モンテカルロ法を用いて、原子配列を3次元的に導出した。特にGeのまわりの中距離構造に着目し、その配列からその電子状態との関係を導き出した。得られた結果はPhysical ReviewLettersに投稿準備をしている。また、AXS法の測定手段の大幅な改善については、6月に台北で行われる第13回放射光装置に関する国際会議で報告する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。実験に用いた薄膜試料は、ドイツ・ダルムシュタット工科大学において、新しいレーザー励起相変化材料Ge-Cu-Te混合系半導体の非結晶状態の、いくつかの組成比のものをスパッター法により作製した。使用したスパッター源は別予算で購入した。試料は、大型放射光施設であるSPring-8(兵庫県)やESRF(フランス)に持ち込み、いくつかの組成については既にX線異常散乱実験を室温で行い、Ge、CuおよびTe原子について差構造因子を導出した。ビームタイム申請はあらかじめ行っておいた。また、実験にはドイツ・マールブルク大学から大学院学生およびチェコ・パルドゥビチェ大学よりポスドクの協力を得た。3つの元素について実験が終了した組成について、データ駆動科学の一つである逆モンテカルロ計算を行い、既に論理性のある部分構造因子や部分動径分布関数、さらに部分配位数や個別原子間距離などの構造パラメータが導出された。また、得られた3次元構造からリング分布などの電子状態に深く関連すると思われる構造情報を、現在取得しようとしている。得られた結果については、特別研究員による口頭発表を国際シンポジウムおよび国内学会において行なっている。また、以前行ったGe-Sb-Te混合系の結果も含めて2編の論文を執筆中である。さらに、X線異常散乱実験を定常的に行うため、ややX線強度の低いSPring-8のビームライン、つくば市のPFあるいは鳥栖市の九州シンクロトロン光センターを利用することを計画し、現在実験条件の改良を行っている。既に必要試料の作成は終わった。SPring-8とESRFの2つの施設を用い、それぞれに優位性のある元素についての測定に成功した。さらに以前行ったGe-Sb-Te混合系の結果も含めて2編の論文を執筆中で、うち1編は受理の最終段階にある。大型放射光施設だけでなく、X線強度の劣る施設でのX線異常散乱実験を計画し、その装置開発に取り組んでいる。既に確保したESRFやこれから申請するSPring-8でのビームタイムを使って、Ge-Cu-Te混合系の4つの組成についてX線異常散乱実験を行う。そこから得られる差構造因子を用いて逆モンテカルロ計算により構造パラメータを導出し、電子状態との関連を明らかにする。

結果は、ヨーロッパで開催される国際会議で、特別研究員によって口頭発表されることが決まっているので、解析を十分に行う。さらに研究結果は、2-3編の論文としてまとめる。X線異常散乱実験を定常的に行うため、ややX線強度の低いSPring-8のビームライン、つくば市のPFあるいは鳥栖市の九州シンクロトロン光センターを利用するため、実験条件の改良を行っている。また、現在の装置を流用して、時間分割X線異常散乱実験も原理的に可能であるので、その具体的な手法を検討したい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞障害因子に対する細胞内受容体制御によるがん治療時の口内炎発症抑止の研究

がん治療時の口内炎は重篤だが発症は不可避で、対症療法で症状を軽減してきた。しかし口腔の「炎症防御機能を賦活化し、侵襲に対する抵抗性を高める」ことが本来最も効率的な戦略である。そこで基礎的研究を背景に口腔粘膜の炎症防御機構をコントロールし、口内炎発症を抑制することをめざした。本研究では、化学療法中に行う口腔ケアに相当する物理的刺激に対する口腔粘膜の特異的炎症反応を見出したので、その解析を中心に研究を進めた。すなわち、ラットを用い、in vivo実験でそれを再現したうえ、その機構には、従来知られている口腔粘膜上皮内機構のほかに、外的環境や、口腔粘膜上皮下組織の内的環境が関わることを示した。がん治療時の口内炎は重篤であるにもかかわらず、その発症は不可避で対症療法で症状を軽減するものと考えられてきた。そこで基礎的研究を背景に口腔粘膜の炎症防御機構をコントロールし、口内炎発症を抑制することが本研究の第一の目的である。また、複雑な炎症・免疫学的口腔環境を解析し、炎症コントロールキー分子を絞り込むことが本研究の第二の目的である。細胞障害因子としての物理的因子、化学的因子、生物的因子を共通して認識する細胞内炎症コントロールキー分子を同定することを進めており、現在かなり少数の分子を選定することができた。さらに、物理的因子に対する口腔粘膜の特異的反応に注目しており、研究を進めている。当初、炎症コントールキーとしてインフラマソームを最も有力な候補と考え、研究を進めていた。現在でもインフラマソームは最も有力な候補ではあるが、本分子一つに絞り込むことはやや困難で、他の細胞内受容体についても並行して研究を進めている。また、口腔粘膜は、物理的因子に対して特異的反応性を持つことが次第に明らかになり、他の粘膜などで報告されている炎症機序は必ずしも口腔粘膜に適応できないと思われた。この口腔粘膜炎症機序の複雑性のため、いろいろな新規知見が得られつつも、コントロールキー分子を絞り込めるところまでたどり着いていない。そこで基礎的研究を背景に口腔粘膜の炎症防御機構をコントロールし、口内炎発症を抑制することが本研究の主目的である。また、細胞障害因子としての物理的因子、化学的因子、生物的因子を共通して認識する細胞内炎症コントロールキー分子を絞り込むことが本研究の第二の目的である。口腔粘膜は重曹扁平上皮であり、大腸・小腸のような腺上皮を持つ組織とは異なる構造を持つ。粘膜免疫機構の解明は近年進んでいるが、口腔粘膜はこれら解明されている腺上皮の粘膜免疫機構とは異なることが予想される。今回、本研究を進めるうちに、化学療法中に行う口腔ケアに相当する物理的刺激に対する口腔粘膜の特異的炎症反応を見出した。そこでその解析を中心に研究を進めた。口腔粘膜が皮膚などの組織に比較して治癒が早いことは経験的に知られている。申請者は、ラットを用い、in vivo実験でそれを再現したうえ、その機構には、従来知られている口腔粘膜上皮内機構のほかに、外的環境や、口腔粘膜上皮下組織の内的環境が関わることを示した。そのコントロール因子の候補を複数検討したが、本研究期間内ではその候補を絞り切ることはできなかった。現在その結果をまとめ、公表予定である。現時点で口腔粘膜炎症コントロールキー分子を絞り込めていないが、一方口腔粘膜組織の炎症における特異的反応性は明らかになりつつある。口腔の「炎症防御機能を賦活化し、侵襲に対する抵抗性を高める」ためには、欠かせない知見が得られつつあるので、性急に分子特定を急がず、最終目的を達するために必要な知見の集約に努めたい。口腔外科学研究用サンプルの作成が年度末にかかり、相応した抗体等の納入時期が次年度にずれたため連続した研究のため、前年度に引き続き、主に、サンプル作成用試薬と抗体などの関連試薬・資料等の購入に使用する。
無機固体を触媒とする有機合成反応の開発に関する研究

本研究代表者はこれまでにシリカゲルやアルミナなどの無機固体を触媒として用いることにより高選択的な新規有機合成反応の数々を開発してきた。一方、この数年間にわたって「オレフィン炭素上での求電子的ならびに求核的置換反応」という有機合成の新領域の開発に取り組み、数々の成果を報告してきた。本研究ではこの両者を組合せ、多くの種類の含フッ素ヘテロ環化合物の合成法の開拓に成功した。なおこれらの化合物はいずれも他法では極めて合成困難な化合物であり、しかもその特異な生理活性の故に大きな注目が集められている化合物である。(1)エチルビニルエ-テルから出発し、β-位をトリフルオロアセチル化とした後、シリカゲルを触媒として用いることにより、アリルアルコ-ルとの反応で各種のアリルβ-トリフルオロアセチルビニルエ-テル類を簡便にかつ高収率で得ることができた。これは再びシリカゲル触媒により容易に3-アリル-1,1,1-トリフルオロアセチルアセトンヘ変換でき、これから各種の含フッ素ヘテロ環化合物の合成が可能となった。(2)各種アルデヒドヒドラゾンのアゾメチン炭素を収率よくトリフルオロアセチル化することに成功した。このものをシリカゲルを触媒として収率よく含フッ素オキサジアジンに変換でき、さらにこれから各種の含フッ素チアジアジン、イミダゾ-ル、ピラゾ-ル類を合成することができた。またその応用として、含フッ素キノキサリン、ピラジン、チオフェン、フラン、ピロ-ル類などの合成の方法も開拓することができた。(3)α-ジメチルアミノナフタレンから出発し、2,4-ビストリフルオロアセチル体に変換し、ついでシリカゲルを触媒として加熱することにより容易に含フッ素ナフト[1,2-d][1,3]オキサジン類を得ることができた。この反応の応用により他法では得難い多くのヘテロ環化合物合成の道が開かれた。1.各種芳香族アルデヒドのN、Nージメチルヒドラゾンはクロロホルムを溶媒に用いて、2、6ールチジン存在下、020°C、13時間無水トリフルオロ酢酸と反応させることにより、収率よくそのアゾメチン炭素上でトリフルオロアセチル化されることを見出した。脂肪族アルデヒドの場合にはNートリフルオロアセチル化が優先的におこるが、N、Nージイソプロピルヒドラゾンを用いると上の条件下でやはり収率よくCートリフルオロアセチル化のおこることがわかった。2.上で合成した各種のアルデヒドヒドラゾンのトリフルオロアセチル化物は塩化第2銅の存在下リン酸緩衝液中で加水分解すると収率よく含フッ素αージケトン類RCOCOCF_3へ変換できることがわかった。このαージケトンは例えば1チレンジアミンとの反応後脱水素により容易に含フッ素ピペラジンへ、Oーフェニレンジアミンとの反応では含フッ素キノキサリンへ、ビスフェナシルスルフィドとの反応では含フッ素チオフェン誘導体へ、いずれも高収率で変換でき他法では合成し難い含フッ素ヘテロ環化合物の簡便な合成法として今後有機合成に利用できよう。3.アルデヒドのジメチルヒドラゾンのトリフルオロアセチル化物はシリカゲル存在下室温で容易に興味ある環化反応をおこし、高収率で含フッ素オキサジアジン誘導体を与えることがわかった。一方、この反応をやはりシリカゲル存在下80°Cに加熱して行うと含フッ素イミダゾールを高収率で与えることもわかった。現在この反応の機構を検討中である。4.2、4ービストリフルオロアセチルーN、Nージメチルー1ー

ナフチルアミンはシリカゲル存在下に加熱すると興味ある環化反応をおこし、含フッ素ナフトオキサジン類に、かなりの立体選択性を示して、変換されることもわかった。この新しい環化反応の機構および立体選択性の向上さらにこの反応の応用について、現在検討中である。本研究代表者はこれまでにシリカゲルやアルミナなどの無機固体を触媒として用いることにより高選択的な新規有機合成反応の数々を開発してきた。一方、この数年間にわたって「オレフィン炭素上での求電子的ならびに求核的置換反応」という有機合成の新領域の開発にとり組み、数々の成果を報告してきた。本研究ではこの両者を組み合わせ、多くの種類の含フッ素ヘテロ環化合物の合成法の開拓に成功した。なおこれらの化合物はいずれも他法では極めて合成困難な化合物であり、しかもその特異な生理活性の故に大きな注目が集められている化合物である。(1)エチルビニルエ-テルから出発し、β-位をトリフルオロアセチル化した後、シリカゲルを触媒として用いることにより、アリルアルコ-ルとの反応で各種のアリルβ-トリフルオロアセチルビニルエ-テル類を簡便にかつ高収率で得ることができた。これは再びシリカゲル触媒により容易に3-アリル-1,1,1-トリフルオロアセチルアセトンへ変換でき、これから各種の含フッ素ヘテロ環化合物の合成が可能となった。(2)各種アルデヒドヒドラゾンのアゾメチン炭素を収率よくトリフルオロアセチル化することに成功した。このものをシリカゲルを触媒として収率よく含フッ素オキサジアジンに変換でき、さらにこれから各種の含フッ素チアジアジン、イミダゾ-ル、ピラゾ-ル類を合成することができた。またその応用として、含フッ素キノキサリン、ピラジン、チオフェン、フラン、ピロ-ル類などの合成の方法も開拓することができた。(3)α-ジメチルアミノナフタレンから出発し、2、4-ビストリフルオロアセチル体に変換し、ついでシリカゲルを触媒として加熱することにより容易に含フッ素ナフト〔1,2-d〕〔1,3〕オキサジン類を得ることができた。この反応の応用により他法では得難い多くのヘテロ環化合物合成の道が開かれた。
非直交アクセス方式に基づく高信頼・低遅延制御通信システムの創生

本研究では高速移動体のリアルタイム制御を実現すべく、低遅延かつ高信頼な無線通信システムの設計に取り組んだ。本年度の研究成果は以下のとおりである。1.超直交畳み込み符号とGolay系列の融合による新たな低レート符号化OFDM方式を提案し、OFDM信号のPAPRを3dBに抑えることで電力増幅器の増幅効率を低下させることなく高い信頼性を達成できることを示した。さらに当手法を、サブキャリアホッピングを介した上りリンク非直交アクセス方式へと拡張し、ホッピングパターンの最適化によって低遅延・高信頼・高周波数効率・高電力効率化を実現した。またLTE-Aなどで採用されている直交アクセス方式であるOFDMAと提案システムを比較し、計算機シミュレーションおよび理論解析によって提案システムの優位性を明らかにした。本研究成果はIEEE Transactions on Communicationsに本年度採択され、掲載される予定である。2.前項で提案したシステムを、受信機側である基地局に複数の受信アンテナが搭載されたいわゆるマルチユーザMIMO環境へと拡張し、演算量と信号分離性能の優れたトレードオフを達成する受信信号処理について検討した。またセルラネットワークの上りリンクにおいて非直交アクセス方式を用いる場合、ユーザごとに送信信号電力の減衰量が異なることに起因する遠近問題が特性を大きく劣化させる要因となる。本研究では超直交畳み込み符号の特性を活かして符号化率を適応的に変化させる手法を提案し、電力増幅効率の低下を招く従来の送信電力制御を行わずとも遠近問題を緩和することに成功した。本研究成果はIEEE Communications Society主催の国際会議IEEE International Conference on Communications 2018に採択され、発表される予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
化学的凝集法と磁気シード法を前処理とした汚濁物質の高勾配磁気分離処理

高勾配磁気分離法を用いて非磁性物質を除去する場合、必要に応じて各種化学的凝集法を併用するとともに、強磁性粒子を添加する磁気シード法により磁性沈殿を生成させ、これを分離する方法がとられる。本研究では、磁性沈殿の磁性線上への捕集、堆積に及ぼす操作因子の影響、磁気シード法の機構、添加強磁性体の回収方法とその条件について実験的な検討を加え、以下の成果を得た。1.磁性沈殿生成時に少量の鉄塩を添加すると、非磁性物質の強磁性体への付着効率が改善されるとともに飽和捕集量が増加する傾向がみられた。このような磁性沈殿の堆積断面積は、堆積部の先端までの長さを長軸とする楕円の面積によりかなり近似し得ることが明らかとなった。2.被処理液中の非磁性物質濃度に対する強磁性体濃度の比(α)が大きい方が磁性沈殿の飽和堆積断面積(Ss)が大きくなり、αとSs/So(So;磁性線断面積の1/2)の間には両対数上でほぼ直線の関係がみられた。また堆積断面積増加量は、通水速度の増加とともに両対数上でほぼ直線的に減少することが明らかになった。3.磁気シード法において非磁性粒子と強磁性粒子が結合する機構については、非磁性粒子除去率と粒子ζ電位とのpH依存性より、粒子間の界面化学的作用が大きく関与していることが明らかとなった。凝集剤を添加した場合は、その量により架橋作用あるいは形成された網目状構造への粒子捕捉が考えられた。4.添加強磁性体の回収については、凝集剤無添加で得た磁性沈殿ではpHを11以上に、凝集剤を添加して得た磁性沈殿ではpHを4以下とし、印加磁場を3KOe,7001500m/hrの高流速で高勾配磁気分離装置に通水することにより、回収率80100%、純度上昇率80%程度で強磁性体を回収しうることが判明した。
タンパク質の非天然構造の研究

1。x線溶液散乱等による蛋白質の変性状態の構造(赤坂、今野)(1)低温変性状態の構造x線小角散乱、円二色性(CD)、NMRの3つの方法を総合的に用いることにより、蛋白質SSIの低温変性構造(D′)を天然構造(N)、熱変性構造(D)と比較し、それぞれの構造の特徴を明らかにした。(2)蛋白質のメタノール変性状態の構造(赤坂、鎌足)Cytochrome c及びMyoglobinにおいて円二色性(CD)、蛍光、NMR、X線溶液散乱を用いて詳しく追跡し、一定のpHとメタノール濃度に依存してコンパクトな変性中間体(モルテングロビュール)が出現し、さらにメタノール濃度が上がると伸びた高ヘリックス状態が出現することを発見した。しかしLysozymeのように、コンパクトな変性中間体は出現せず、伸びた高ヘリックス状態のみが出現するものもあることも明らかとなった。ウレア濃度に依存して、変性状態の構造が段階的にに変化することを明らかにした。2。高圧下での蛋白質の立体構造及び圧力変性(赤坂)RibonucelaseAにおいて、高圧NMRの手法によって高圧下での変性に伴う熱力学関数の変化を算出した。これによって圧力変性における疎水効果が明らかになった。3。温度シャンプNMRによる蛋白質アンフォールディングの過程(赤坂)当研究室で開発したマイクロ波パルス温度ジャンプNMR装置を用いて、RibonucelaseAのアンフォールディングの中間体を検出した。4。蛋白質フォールディングにおけるS-S結合の役割(橘)遺伝子工学的手法により、4または2個のS-S結合を欠損した変異リゾチームを発現し、これを用いてフォールディング過程におけるS-S結合の役割について研究した。1。2。3。4。(1)低温変性状態でのSSI高分子鎖の全体的な形状に対する知見を得るために、小角x線散乱法を適用した(大阪大学理学部片岡助教授の協力を得た)。クラッツキープロットによれば、熱変性状態では分子はガウス鎖的な伸びた構造をとっているが、低温変性状態では期待通り部分的に球状性を示した。(2)SSIの人工変異体(P37G)を遺伝子工学と放線菌の培養により調整した(学習院大学三浦研究室の協力を得た)。これを用いる研究は次年度に行う。2。アポミオグロビンの低温変性状態での構造(赤坂、今野)二量体タンパク質であるSSIで得られた結果の一般性を検討するため、単一鎖ポリペプチドよりなり且つS-S結合をもたないよりウマアポミオグロビンを対象に、その変性構造について研究した。購入した円二色性(CD)分散計を用いて、pH4-4.5で無塩の水溶液中で温度を変数としてCDスペクトルを克明に測定した結果、天然構造-熱変性構造間の転移に対して等CD点は205.1±0.2nm、天然構造-冷変性構造間の転移に対して等CD点は203.4±0.2nmであり、両者は明らかに異なることが判明した。これは高温変性状態と低温変性状態とで二次構造が異なることを意味する。今後NMRを含む詳しい測定を行って、(1)どの程度構造が異なるのか?(2)低温変性と高温変性は熱力学的にも異なる相なのか?などについて明らかにする予定である。円二色分散計を用いて温度に対してS-S結合欠損したリゾチーム(Cys-Ala変異体)のCDスペクトルを測定し、各変異体での転移点を求めた。その結果はS-S結合欠損によるエントロピー変化を予測した計算とは合わないことが判明した。1。蛋白質の非天然状態での構造および安定性(赤坂、今野)

(1)Streptomyces Subtilisin Inhibitor(SSI)の熱変性状態、低温変性状態、ウレア変性状態の構造を小角x線散乱、円二色性(CD)、NMRを用いて詳しく研究した。(小角x線散乱では大阪大学理学部片岡助教授の協力を得た。)ウレア変性状態では二次構造は全くなく分子はほぼ完全ランダムな構造をとっているが、熱変性状態と低温変性状態では二次構造がそれぞれ約30%、50%存在し、且つ後者では鎖の約半分が球状性をもつことが明らかとなった。(2)リボヌクレアーゼAについて、高圧(1-2000気圧)下でのプロトンNMRスペクトルを温度の関数として測定し、これを熱力学的関係式によって解析した。リボヌクレアーゼA溶液は圧力変性によっ体積が減少するが、その減少度は高温程小さくなること、また変性に伴う定圧比熱の増加は圧力が増加すると減少することを初めて明らかにした。これらの結果は圧力による変性が疎水基周りの水の状態によって引き起こされることを示唆した。(3)Cytochrome cアルコール(TFE)添加による変性過程を、CDスペクトルを用いて詳しく追跡した。先に三次構造が崩壊してから二次構造が崩壊すること、またその中間にこれまで知られていない新しい変性中間体を発見した。(4)膜融合能をもつペプチドの水溶液において、CDおよびプロトンNMRによってTFEおよび脂質ミセル添加による構造形成について研究し、特に二次元NMRによってそれらの構造を詳しく明らかにした。S-S結合を一つ欠損した4種のリゾチーム(Cys-Ala変異体)の熱転移に伴う比熱変化を実測し、これに基づいて変性のエンタルピーおよびエントロピー変化を求め、それらが共に天然型に比べて減少していること、その減少量はS-S結合の位置に依存することを明らかにした。また二個のS-S結合を欠損したリゾチームの遺伝子を合成し、この変異リゾチームの発現に成功した。1。蛋白質の非天然状態での構造および安定性(1)アルコール添加によるCytochrome cの構造移転円二色性(CD)、蛍光、NMR、X線溶液散乱を用いて詳しく追跡し、pH2.5以上でpHに依存するメタノール濃度領域で、コンパクトな変性中間体(モルテングロビュール)が安定に出現することを発見した。x線小角散乱、円二色性(CD)、NMRの3つの方法を用いて、SSIの3状態、すなわち天然、熱変性および低温変性状態での構造を詳しく研究した。特にウレア添加がどういうこれらの構造にどういう変化をもたらすかについて詳しく研究し、構造変化が3段階を経て起こることを明らかにした。(3)蛋白質の圧力変性の機構リブヌクレアーゼAについて高圧NMRの手法を適用し、変性に伴う体積変化と熱容量の変化を明らかにし、圧力変性には疎水基水和状態の変化が重要であることを示した。(4)NMRによる蛋白質のアンフォールディング過程新しい方式のマイクロ波温度ジャンプNMR装置を開発し、これをリボヌクレアーゼに適用して、10ミリ秒以内の温度ジャンプでアンフォールドした中間体が形成されること、およびその構造について知見を得た。またリゾチームについてはアンフォールディングは遅いこと、およびその過程がおよそ協同的であることを明らかにした。
アミノ酸の皮膚透過機構の解明

1.アミノ酸の皮膚透過性の測定2-チャンバー拡散セルを用いたin vitro皮膚透過実験により、中性、塩基性及び酸性アミノ酸の種々pH緩衝溶液からのラット摘出皮膚透過性を測定した。中性アミノ酸は炭素数の多いものほど全てのpHで高い皮膚透過性を示した。また、どの中性アミノ酸の場合もその透過性は酸性側で高かった。これらのデータと解離定数から個々のイオン種の透過係数を算出したところ、カチオンの透過係数は両性イオンより高かく、また、両イオンとも炭素数の多いアミノ酸ほど高い透過係数を示した。塩基性アミノ酸のリジンと酸性アミノ酸のアスパラギン酸の皮膚透過もpHの低下と共に増加する傾向を示し、個々のイオンの透過性が異なることが明きらかとなった。2.アミノ酸の皮膚透過性と構造及び物性との関係の評価1.で得られた両性アミノ酸の各イオン種の透過係数と物性の関係について検討した。カチオン、両性イオンともその透過係数はアミノ酸のモル容積の増加にともない指数関数的に低下したが、オクタノール/水分配係数との間には明確な関係が認められなかった。これは細孔膜に特徴的な傾向であり、アミノ酸のイオンは皮膚のporeを透過することが示唆された。各イオン種の透過性をモル容積を補正して比較すると、2価のカチオン>1価のカチオン>正電荷の両性イオン>電荷のない両性イオン>負電荷の両性イオンの順であり、正電荷は透過に有利に負電荷は不利に働くことが明きらかとなった。カルボキシルイオンは水中で正の水和構造を、第1級アンモニウムイオンは負の水和構造をとることが知られており、この水和の違いが水中の拡散性、ひいては皮膚のpore中の拡散性の差の原因であることが推察された。
南極昭和基地周辺における土壌藻類群集の長期動態解析

形態分類平成29年度の形態観察及び遺伝子解析により、南極産の黄緑藻Botrydiopsisは、3種が存在することが明らかとなり、昨年はBotrydiopsis callosaを中心に形態観察を行った。平成30年度は残りの2種、Botrydiopsis cf. alpinaに同定された3株、B. cf. arhiza 2株を中心に形態観察を行った。B. cf. alpinaは、径が最大48 umで、葉緑体の側面観はひも状でピレノイドは無く、はしご状に2ー7枚重なり細胞中央部に陥入することが特徴であった。遊走子は紡錘形で細胞壁は無く、長短2本の鞭毛を有していた。B. cf. arhizaは前者に比べ細胞は小さく、径が最大で17 um、葉緑体はひも状でピレノイドは無く、縁辺部でのみ2ー3枚重なる場合があった。平成29年度に形態観察を行ったB. callosaを含め、本属は葉緑体の形、細胞内の分布パターン、ピレノイドの有無が有効な分類形質であった。遺伝子解析平成29,30年度は培養株の栄養細胞や不動胞子の形態観察と平行しながら、重要な分類形質である遊走子の鞭毛の観察方法の確立を目指してきた。平成29年度は,遊走子の放出方法が確立できたが、鞭毛を観察、撮影することが困難であった。平成30年度は、遊走子を含む試料にアルコールを除去したサフラニン液を滴下し遊走子を固定することにより、鞭毛を明瞭に観察、撮影することが可能となった。この方法を用いて、平成31年度は、属レベルで同定が留まっている培養株について栄養細胞、遊走子、不動胞子などの形態観察と遺伝子解析の結果をあわせながら分類学的研究を進めていく。遺伝子解析については,2株を除きrbcL遺伝子全長を決定でき、系統解析を行った。形態分類のみでは不透明だった種分類を行うことができた。また、これまでに登録されていなかった種を含む黄緑藻のrbcL塩基配列を明らかにできた。Botrydiopsis属、Xanthonema属は分類が混乱していることもあり、ドイツおよびチェコの培養株保存施設からヨーロッパや南極から分離されたBotrydiopsis属6株、Xanthonema属7株を取り寄せ、形態分類と遺伝子解析のために培養を開始した。遺伝子解析については,2株のrbcL遺伝子をPCR増幅できなかったことから,プライマーを変更するなどしてrbcL遺伝子の解析を進める。rbcLの遺伝子解析だけではどの既存の種に該当するか明らかにすることができない現状がある。そこで、18S rRNAやITS領域の塩基配列も分析して、それらを組み合わせた系統解析を行う。平成29、30年度に得られた成果をもとに,我々が分離した培養株に加え、培養株保存施設から取り寄せた培養株と形態および遺伝子の比較研究を行い,属で留まっている黄緑藻、緑藻の培養株について,同様の方法で研究を進める。形態分類今年度は黄緑藻のBotryiopsis callosaに同定された5株を中心に遊走子の放出を試み,遊走子の形態も分類形質として加え,生活環に基づく分類を行った。遊走子の観察のため寒天斜面培地で培養したB. callosa栄養細胞を,新鮮なBBM液体培地を含む小型シャーレに植えかえ15°C,約1500 lux,12時間,12時間明暗周期での条件で培養した。約1週間後,明期開始直後に遊走子を放出させることができた。本種は多核細胞で核の数は不明であったが,核をSYBR Goldで染色し,蛍光顕微鏡で焦点を変えて核の数を計測することが可能となった。葉緑体は紫外線励起すると輪郭が明瞭となり,葉緑体数を正確に数えることが可能となった。このように栄養細胞の形態的特徴に,葉緑体の正確な数,核の数,遊走子の形態を含めて分類学的研究を行う方法が確立できた。遺伝子解析平成29年度は,種の分類形質である遊走子の放出方法,撮影方法,葉緑体の輪郭を明瞭にする方法,核の染色方法など生活環に現れる形質を詳細に観察する方法を検討し,ほぼ確立することができた。この手法を用いて次年度以降,属でレベルで同定が留まっている培養株について形態と遺伝子解析の結果をあわせながら分類学的研究を進めていく。遺伝子解析については,25株のうち,5株のrbcL遺伝子をPCR増幅できなかったことから,DNA抽出方法を変更する,または,プライマーを変更するなどしてrbcL遺伝子の解析を進める。Xanthonema属はrbcLの塩基配列が99%一致する種類が複数有り,rbcLの遺伝子解析だけではどの既存の種に該当するか明らかにすることができない現状がある。そこで次年度は18S rRNAやITS領域の塩基配列も分析する。一部の菌類がコンタミネーションした株では18S rRNAが対象とする藻類とカビの両方が検出されるため,まず混入した菌類を除去する作業を行う。次年度は黄緑藻のBotrydiopsis属,Xanthonema属以外の黄緑藻について行う予定であったが,初年度にBotrydiopsis属,Xanthonema属の分類が終了しなかったことから,引き続き両属について形態と遺伝子解析からの分類学的研究をすすめる。形態分類

平成29年度の形態観察及び遺伝子解析により、南極産の黄緑藻Botrydiopsisは、3種が存在することが明らかとなり、昨年はBotrydiopsis callosaを中心に形態観察を行った。平成30年度は残りの2種、Botrydiopsis cf. alpinaに同定された3株、B. cf. arhiza 2株を中心に形態観察を行った。B. cf. alpinaは、径が最大48 umで、葉緑体の側面観はひも状でピレノイドは無く、はしご状に2ー7枚重なり細胞中央部に陥入することが特徴であった。遊走子は紡錘形で細胞壁は無く、長短2本の鞭毛を有していた。B. cf. arhizaは前者に比べ細胞は小さく、径が最大で17 um、葉緑体はひも状でピレノイドは無く、縁辺部でのみ2ー3枚重なる場合があった。平成29年度に形態観察を行ったB. callosaを含め、本属は葉緑体の形、細胞内の分布パターン、ピレノイドの有無が有効な分類形質であった。遺伝子解析平成29,30年度は培養株の栄養細胞や不動胞子の形態観察と平行しながら、重要な分類形質である遊走子の鞭毛の観察方法の確立を目指してきた。平成29年度は,遊走子の放出方法が確立できたが、鞭毛を観察、撮影することが困難であった。平成30年度は、遊走子を含む試料にアルコールを除去したサフラニン液を滴下し遊走子を固定することにより、鞭毛を明瞭に観察、撮影することが可能となった。この方法を用いて、平成31年度は、属レベルで同定が留まっている培養株について栄養細胞、遊走子、不動胞子などの形態観察と遺伝子解析の結果をあわせながら分類学的研究を進めていく。遺伝子解析については,2株を除きrbcL遺伝子全長を決定でき、系統解析を行った。形態分類のみでは不透明だった種分類を行うことができた。また、これまでに登録されていなかった種を含む黄緑藻のrbcL塩基配列を明らかにできた。平成29年度に得られた成果をもとに,黄緑藻のBotrydiopsis属,Xanthonema属の未同定の残りの培養株を中心に,昨年度と同様の方法で研究を行う。その後,黄緑藻のGloeobotrys, Heterococcusや緑藻についても同定が属で留まっている培養株があり,それらについても同様の方法で研究を進める。遺伝子解析では,DNA抽出およびプライマー選択を再考し,すべての株のrbcL遺伝子を解析できるようにする。平成29年度はrbcLを中心に遺伝子解析を行ったが,次年度は18S rRNA,ITS領域についても分析し,両方の塩基配列の結果を分類学的研究に用いる。Botrydiopsis属、Xanthonema属は分類が混乱していることもあり、ドイツおよびチェコの培養株保存施設からヨーロッパや南極から分離されたBotrydiopsis属6株、Xanthonema属7株を取り寄せ、形態分類と遺伝子解析のために培養を開始した。遺伝子解析については,2株のrbcL遺伝子をPCR増幅できなかったことから,プライマーを変更するなどしてrbcL遺伝子の解析を進める。rbcLの遺伝子解析だけではどの既存の種に該当するか明らかにすることができない現状がある。そこで、18S rRNAやITS領域の塩基配列も分析して、それらを組み合わせた系統解析を行う。平成29、30年度に得られた成果をもとに,我々が分離した培養株に加え、培養株保存施設から取り寄せた培養株と形態および遺伝子の比較研究を行い,属で留まっている黄緑藻、緑藻の培養株について,同様の方法で研究を進める。