hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
覚醒剤精神病モデルにおけるアンチセンス核酸法を用いた神経回路網の研究

覚醒剤やPhencyclidineに対する行動感作形成過程に、これらの刺激薬によって誘発されるシナプス間隙でのglutamate濃度の遅発佐増加が、関与していると想定し、以下の実験を行った。1.METH(2.5mg/kg)投与2時間あるいは3時間後に、glutamate遊離抑制あるいは再取込み促進能を有するMS-153(25mg/kg)の投与をするという処置を5回反復すると、METH(1mg/kg)による移所運動促進効果に対する行動感作の成立が阻止された。さらに、METH(2.5mg/kg)投与140分後の時点から投与260分後の測定終了時点に至まで、側坐核での細胞外glutamate濃度が遅発性に増加した。MS-153(25mg/kg)をMETH(2.5mg/kg)投与の120分後に投与すると、METH(2.5mg/kg)投与後140分から180分における60分間のglutamate濃度の増加が阻止された。行動実験の結果と考え合わせると、覚醒剤により側坐核で遅発性に増加するglutamateが行動感作の形成過程に関与し、さらに、MS-153は覚醒剤によるこの遅発性のglutamate濃度の増加を阻止することで、行動感作の形成過程を阻止した可能性が考えられる。2.覚醒剤精神病においては、主に幻覚や妄想などが発現するのに対して、Phencyclidine(PCP)精神病では幻覚や妄想以外に、無為、自閉、感情鈍麻あるいは認知障害もが発現することから、より包括的な分裂病モデルと考えられる。本年度は、PCP(20mg/kg)を毎日、5日間反復投与し、4日間の断薬後にPCP(7.5mg/kg)を再投与するとPCPによる移所運動促進あるいは常同行動発現効果に対する行動感作が成立した。PCP投与により前頭前野や側坐核でglutamate濃度が増加し、60分から120分間程度維持されるという過去の知見から、MS-153をPCP(20mg/kg)投与の60分および120分の両時点で投与し、これらの処置を5日間反復し、行動感作形成への効果を検討した。その結果、MS-153はPCPに対する行動感作の成立を阻止した。以上より、PCPに対する行動感作の形成過程にはPCPによるシナプス間隙でのglutamate濃度の増加が関与し、MS-153はPCPによるこのglutamate濃度の増加を減少させることで、行動感作の形成を阻止した可能性が考えられる。覚醒剤に対する行動感作のメカニズム研究は覚醒精神病、ひいては精神分裂病の再発脆弱性、遷延性などの病態解明に有用である。我々は、行動感作形成あるいは発現過程におけるdopamine,glutamateおよびGABAなどからなる神経回路網の機能変化の重要性に着目し、本年度は以下の結果を得た。2.MS153のMETHに対する行動感作の形成過程に対する効果は現在検討中である。

3.II型代謝型glutamate受容体アゴニストであるLY354740の前処置は、METH(1mg/kg)による異所運動促進作用を用量依存性に抑制した。4.LY354740はMETHに対する行動感作の形成過程を阻止した。5.内側前頭前野のD1 dopamine受容体の刺激は同部位でのglutamate放出を抑制した。このD1受容体刺激の側坐核でのglutamate放出に対する影響については現在、検討中である。覚醒剤精神病の動物モデルである行動感作モデルは覚醒剤精神病の再発脆弱性、発症過程のメカニズム解明に有用であり、ひいては、精神分裂病の病態研究にも資するところが大きい。本年度は以下の結果を得た。以上の結果は、中枢におけるシナプス間隙でのglutamate濃度を減少させることで、覚醒剤の行動感作形成過程が阻止されることを示唆する。覚醒剤精神病やPhencyclidineに対する行動感作形成過程に、これらの刺激薬によって誘発されるシナプス間隙でのglutamate濃度の遅発性増加が、関与していると想定し、以下の実験を行った。1.前年度は、METH(2.5mg/kg)投与2時間あるいは3時間後に、glutamate遊離抑制あるいは再取込み促進能を有するMS-153(25mg/kg)の投与を5回反復すると、METH(1mg/kg)による移所運動促進効果に対する行動感作の成立が阻止されるという結果を得た。本年度は、MS-153が中枢におけるシナプス間隙でのglutamate濃度を減少させることで、覚醒剤の行動感作形成過程を阻止するという想定のもとで、以下の実験を行った。METH(2.5mg/kg)投与140分後の時点から投与260分後の測定終了時点に至まで、側坐核での細胞外glutamate濃度が遅発性に増加した。さらに、MS-153(25mg/kg)をMETH(2.5mg/kg)投与の120分後に投与すると、METH(2.5mg/kg)投与後140分から180分における60分間のglutamate濃度の増加が阻止された。行動実験の結果と考え合わせると、覚醒剤により側坐核で遅発性に増加するglutamateが行動感作の形成過程に関与し、さらに、MS-153は覚醒剤によるこの遅発性のglutamate濃度の増加を阻止することで、行動感作の形成過程を阻止した可能性が考えられる。2.覚醒剤精神病においては、主に幻覚や妄想などが発現するのに対して、Phencyclidine(PCP)精神病では幻覚や妄想以外に、無為、自閉、感情鈍麻あるいは認知障害もが発現することから、より包括的な分裂病モデルと考えられる。本年度は、PCP(20mg/kg)を毎日、5日間反復投与し、4日間の断薬後にPCP(7.5mg/kg)を再投与するとPCPによる移所運動促進あるいは常同行動発現効果に対する行動感作が成立した。PCP投与により前頭前野や側坐核でglutamate濃度が増加し、60分から120分間程度維持されるという過去の知見から、MS-153をPCP(20mg/kg)投与の60分および120分の両時点で投与し、これらの処置を5日間反復し、行動感作形成への効果を検討した。その結果、MS-153はPCPに対する行動感作の成立を阻止した。以上より、PCPに対する行動感作の形成過程にはPCPによるシナプス間隙でのglutamate濃度の増加が関与し、MS-153はPCPによるこのglutamate濃度の増加を減少させることで、行動感作の形成を阻止した可能性が考えられる。
ペルオキシソ-ム局在性β酸化系酵素の遺伝子の誘導に関与するDNA配列の解明

1.ラット肝アシルーCoAオキシダ-ゼの抗高脂血薬剤による誘導の分子機構を明らかにするため、トランスフェクション実験とタンパク質結合実験によって、この酸素の遺伝子の5'上流域に存在する転写調節DNA配列を同定することを試みた。2.まずラットヘパト-マH4IIEC3細胞の培養液に抗高脂血薬剤に一種シプロフィブレ-トを添加することによって本酵素がmRNAレベルで顕著に誘導されることを見いだし、この細胞がin vitroの誘導実験に有用であることを示した。3.オキシダ-ゼ遺伝子の5'上流域の種々の部分の配列をクロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ(CAT)遺伝子の上流につないだ組換えプラスミドを作成し、リン酸カルシウム法によってH4IIEC3細胞に導入した。培地にシプロフィブレ-トを添加した時および添加しない時のCATの発現量を測定することによって、誘導能および基礎発現活性をモニタ-した。その結果、本遺伝子の上流域には少なくとも3つの役割の異なる領域が存在することがわかった。そのうち転写開始点の上流639塩基から472塩基にかけての部分には、抗高脂血薬剤応答性エンハンサ-としての機能があることがわかった。4.このエンハンサ-領域の配列をプロ-ブとして、ラット肝臓核抽出液を用いたフットプリントアッセイ、およびゲルシフトアッセイを行い、2つのタンパク質結合部位を見いだした。5.上記の2つのタンパク質結合部位の配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、これを基礎プロモ-タ-と共にCAT遺伝子につないだものをH4IIEC3細胞にトランスフェクションして発現を調べた。その結果、1つの配列は強い転写促進活性をもつが誘導能は低いこと、もう一方は転写を抑制するが、2つの配列が共存することによって高い誘導能が得られることが明らかになった。
高性能ドリルインサイジングによるスギ耐火部材の開発とその実用化

林業・木材産業活性化にはスギの活用が不可欠で、その最有力候補が防火地域などでのオフィスや集合住宅である。この建設には最大3時間の耐火部材が必要なので、スギ2時間耐火集成材の開発を目指した。この集成材は、市販のスギ集成材を荷重支持部とし、ピンホールをあけて無害な難燃薬剤を注入したラミナ(小幅板)を集成化した燃止り部で覆う構造で、耐火1時間の認定品を用いた3棟他が建設されているが、2時間耐火の要求がある。2時間耐火の燃え止まり部を、接着ではなく、ネジ止めで荷重支持部に固定する耐火集成材の加熱試験を3回実施し、ほぼ性能が確認できたものの、大臣認定取得にはあと少しの改良が必要との成果を得た。大臣認定取得済みの耐火1時間スギ集成材を構成するラミナの製造工程における薬剤注入通路を確保するインサイジングに用いているCO2レーザに代わり、この集成材普及にはドリルインサイジング技術の開発が必要だが、達成度理由に示した通り、装置の納入が年度末となり、金沢の企業にドリルインサイジングを依頼し、得られたラミナで下記の結果を得た。・通直な円柱形状であるべき孔の木目による影響を東京都立産業技術研究センター所有の高性能マイクロX線CTスキャナーで撮影・解析したところ、孔の曲がる方向は繊維直行方向に顕著なこと、板目板よりも柾目板の方がまがりが顕著なこと、ドリルの直径が小さいほど、ドリルの回転数が低いほど、大きくなること、柾目板の方が大きくなること、一刃当たりの切り込み量が1mm程度までならドリル径につれて大きくなるが、それより切り込み量が大きくなっても、あまり変わらないこと、が分かった。・ドリルのインサイジング密度を変えて難燃薬剤を注入したところ、400孔/m2以上あれば注入量では問題ないこと、レーザインサイジングの場合と差がないことが分かった。・難燃薬剤のミクロな注入状況を都立産業技術研究センター所有の蛍光X線でリン原子を見る形で観察したところ、密度が400孔/m2では孔間の木理に沿って薬剤の抜けが目立つことが分かった。・インサイジング密度800孔/m2のラミナに難燃薬剤を所定量注入し集成接着した部材の加熱試験の結果は耐火1時間の要求性能を満たすものであったことから、ドリルインサイジングが使えることが分かった。・難燃薬剤の接着への影響について、メラミン樹脂・水性高分子イソシアネート・レゾルシノールを用い、未処理ラミナと難燃薬剤注入ラミナ同士を接着し、JASのブロックせん断試験を行ったところ、難燃薬剤による硬化阻害は見られないが、木部破断率から、レゾルシノールではやや硬化阻害が生じていることが示唆された。ドリル直径、回転数、孔あけ速度を変えて、柾目と板目のスギラミナに、繰り返しを10として、孔あけを行った。ラミナ内部の孔形状を、東京都産業技術研究センター(都産研、研究協力者である松原氏の所属機関)が所有する高性能マイクロフォーカスX線CTで撮影し、卒論で作成した市販ソフトを組み合わせた穴形状解析プログラムで解析した。その結果、板目板より柾目板にあけた孔の曲がりが顕著であること、一刃当たりの切り込み量が大きいほど曲がりが大きくなることが分かった。スギラミナ間の接着性能をブロックせん断試験で調べ、ブロックせん断強さと木部破断率で評価したところ、常温硬化型とされるレゾルシノール接着剤でも、接着後に十分加熱すると難燃薬剤による硬化阻害が軽減されることが分かった。難燃薬剤固定量はドリルとレーザによるインサイジングラミナ間で有意差はなく、薬剤注入処理直後の材内薬剤分布と乾燥後のそれを溶脱法にて計測し、乾燥中に薬剤が表面に集積すること、特に辺材においてその現象が顕著なことが分かった。密度800個/m2でドリル(直径2 mm)とレーザ(直径1.8 mm以下)でインサイジングした厚さ30 mmのスギラミナに難燃薬剤を注入し積層接着した難燃薬剤処理部を2面ずつ作成し、荷重指示部にネジ留めした集成材の2時間載荷加熱試験を建材試験センターで行った。加熱終了9時間後に燃え止まったと判断されたことから、脱炉し、木ネジを外して、荷重支持部4面全面を観察したところ、スギ集成材の一部で炭化が認められた。試験中の荷重支持部の最高温度はスギ集成材部で試験開始後406分に198.6°C、カラマツ集成材部で開始後386分に204.5°Cであった。難燃処理部の残存厚さはドリルインサイジング処理部で2535 mm、レーザインサイジング処理部で3343 mmとなり、レーザインサイジング処理部の方が多く燃え残った。ドリルの直径、回転数、孔あけ速度を変えて、柾目と板目のスギラミナに繰り返し10で孔をあけ、そのラミナをマイクロX線CTスキャナーで撮影し、孔の曲がりや曲がる原因を考察する実験について、撮影は終わったが、穴形状解析ソフトの開発遅れから、形状解析が遅れている。2時間耐火性能を担保できるように設計して、加熱試験を実施したが、一部で荷重支持部表面が炭化し、2時間耐火性能を満たさないと判定された。一面の難燃処理部を木ネジ数本だけで荷重支持部に固定する方法では、加熱試験中に千度前後の加熱により、難燃処理部間に若干の隙間が発生し、そこから燃え込み、2時間耐火が実現しなかった。

難燃処理部を簡単な方法で荷重支持部に固定する構造であったが、無理なことが分かり、一部の設計変更で2時間耐火性能が得られるとの開発者チームの見解が得られたことことから、次年度末の加熱試験では合格するものと予想している。我々が開発したスギ集成材をレーザ又はドリルでインサイジングしたラミナに難燃薬剤をむら無く加圧注入した燃え止まり部で被覆した耐火集成材は、耐火1時間の大臣認定は取得済みで、音ノ葉カフェ、長崎県庁の行政棟、平成30年11月に完成予定の多摩産材を用いた神田明神の交流会館などに使われてきているが、さらに大きな建物には耐火2時間が不可欠で、毎年設計に改良を加えて試作したスギ集成材を2時間加熱試験で性能評価を行ってきた。平成28年度の2時間加熱試験では、荷重支持部の集成材の表面の一部が僅かに変色・炭化するという耐火性能まで確立できたが、大臣認定試験の評価としては不合格となった。原因は、失火時に燃え止まり部のみ交換可能な耐火2時間仕様では厚さ30mmのラミナを3枚接着した燃え止まり部をネジ止めする構造を設計変更してネジ止め層を増やしたことにより、当該層間に火が入ったためと推察された。2時間耐火からさらに発展させて3時間耐火を達成しなければ、建設会社がプレス発表した高さ350mの超高層木造建築物のような建物を都会に建設することは出来ない。3時間の耐火集成材の大臣認定例はあるが、石膏ボードを大量に使うことで、純木造とは言えず、環境負荷も高いので、木造で建てる意味や価値がそれほど大きくない。最終年度に耐火2時間のスギ集成材を完成する予定であったが、多くの知見を得られたものの、開発は失敗に終わった。次の機会があれば、達成できる状況にはある。なお、平成28年度の繰越研究費については、次年度に当該年度の研究成果発表の旅費などに支出した。耐火集成材の加熱試験後の評価は、外観で激しく燃えたと見込まれる部位を鋸断し、荷重支持部の変色や炭化の程度で行われる。本研究で開発している2時間耐火集成材は、荷重支持部の周囲4面に燃え止まり部をネジ止めする構造であるため、加熱試験後に燃え止まり部のネジを外すことで、荷重支持部の4面全ての変色や炭化がチェックできる。その結果、1面の上部のほんの一部に炭化が認められたものの、その他の部位には一切変色が認められず、概ね2時間耐火性能があると判断されたため。政府が閣議決定した森林・林業再生プランにおける国産材自給率50%という目標設定、それを達成するための一政策として施工された通称木促法による公共建築物等の木造化の状況下で、国産材を非戸建て建築物に積極利用して行かなければならない状況にある。それには2時間耐火集成材の国土交通大臣認定を得なければならない。我々が開発したスギ集成材をレーザ又はドリルでインサイジングしたラミナに難燃薬剤をむら無く加圧注入した燃え止まり部で被覆した耐火集成材は、耐火1時間の大臣認定は取得済みで、音ノ葉カフェ、長崎県庁の行政棟、神田明神の交流会館などに使われてきているが、さらに大きな建物には耐火2時間が不可欠で、毎年設計に改良を加えて試作したスギ集成材を2時間加熱試験で性能評価を行ってきた。初年度と2年目の試験では、荷重支持部の集成材の表面の一部が僅かに変色するという耐火性能まで確立できたが、最終年度の加熱試験では荷重支持部に火が燃え込んで、不合格となった。2時間耐火からさらに発展させて3時間耐火を達成しなければ、建設会社がプレス発表した350mの超高層木造建築物のような建物を都下に建設することは出来ない。
ストレスとの関わりからみた顎機能異常の新しい治療法に関する検討

平成元年度は顎機能異常者に対する前頭筋EMGバイオフィ-ドバック療法(BFT)の評価に適したストレスに敏感に反応するパラメ-タを検討するため自律反応の分析システムを開発し、脳波、マイクロバイブレ-ション、心電図および指尖容積脈波の評価を行った。平成二年度はBETが咀嚼筋の機能時に及ぼす影響を評価するため咀嚼筋機能時の分析・評価システムを開発し、咬みしめ時とガム咀嚼時における筋電図の評価を行った。これらの分析・評価システムによりBFTによる全身的および局所的リラクセイション効果の評価が可能となった。平成三年度は確実にフィ-ドバック情報を認識するためのBFT訓練時間を再検討した。さらに、BFT前後における実験的ストレス負荷時の筋活動および自律反応の変化を検討し、BFTのストレス応答反応に及ぼす影響を評価した。被験者は健常者16名(男女各8名)とし,Cyborg社製Jー33を用いた聴覚バイオフィ-ドバックを行った。訓練効果は前頭筋、側頭筋、咬筋および胸鎖乳突筋の筋電図および自律反応として心電図、指尖脈波、呼吸曲線の経時的変化を分析することにより評価した。その結果、(1)前頭筋のリラクセイションを効果的に行うためには、7分前後の訓練時間が必要であること、(2)訓練の積み重ねにより前頭筋のリラクセイションの学習効果があること、(3)前頭筋のみならず周囲咀嚼筋群も弛緩が有効に行われること、(4)実験的ストレス負荷下では胸鎖乳突筋を除く筋群でBFTによる筋活動の抑制効果が認められたものの自律反応への顕著な影響は認められず、BFTは必ずしも筋活動と自律反応とを同時にコントロ-ルしないことなどが示唆された。今後、これらの点を踏まえ顎機能異常者に対するバイオフィ-ドバック療法を確立させ、臨床応用する予定である。3年計画のうち本年度は、自律反応と咬筋筋活動の分析システムを開発し、顎機能異常者に対するバイオフィ-ドバック療法の評価に適したパラメ-タについて検討した。自律反応の評価には、脳波(EEG)、マイクロバイブレ-ション(MV)、心電図(ECG)、指尖容積脈波(PTG)を選び、咬筋筋活動では積分値により評価した。本システムは、我々が独自に開発したものであり、平成元年度文部省科学研究費補助金で購入したデ-タレコ-ダ(XRー50)、シグナルプロセッサ用プログラムNo.201およびペ-ジプリンタPCPR602PSを構成要素に含んでいる。顎機能に異常のない成人男子11名を対象として、安静時とストレス負荷(光、音、咬みしめ)時の自律反応、咬筋筋活動を調べた。安静時と比較してストレス負荷時では(1)EEGのα帯域が減少しβ帯域が増加した。(2)ECGではRーR間隔の規則性が乱れた。(3)PTGでは振幅は減少し、基線の動揺が大きくなり、エリア(波形と変曲点を結ぶ線がなす包絡線)が小さくなった。(4)MVでは変化がなかった。(5)咬筋筋電図積分値はやや増加した。これらのパラメ-タのなかで反応が特に顕著だったものはPTGであった。以上のことから、本システムはバイオフィ-ドバック・トレ-ニングによるストレス&リラクセ-ションを客観的に調べることができ、しかも咬筋という局所の反応のみならず全身の反応をも把握できるものと考える。

上記の内容について、平成2年2月10日日本ME学会専門別研究会通会第33回顎口腔機能研究回(徳島)にて発表した。昨年度は自律反応と咬筋筋活動量の分析システムを開発し、顎機能異常者に対するバイオフィ-ドバック療法の評価に適したパラメ-タについて検討した。この方法を用いて顎機能異常者数名に対し評価をおこなったところ、バイオフィ-ドバック訓練を重ねるに従い(1)安静時の咀嚼筋筋活動量が減少する、(2)脳波のα帯域が増加しβ帯域が減少する、(3)指尖脈派は基線の動揺が小さくなる傾向を認めたが、パラメ-タの変化と臨床所見が必ずしも一致しなかった。このことから、安静時のみの評価法に加え、バイオフィ-ドバック療法が咀嚼筋の機能時に及ぼす影響を探る必要があると考え、本年度は咀嚼筋の機能時における評価を行う分析システムを作成した。これは咀嚼筋の咬みしめ時と咀嚼時の筋電図を解析するシステムで、コンピュ-タを用いて独自に開発した。このシステムを用いて顎機能に異常のない成人(男性10名、女性10名)と、バイオフィ-ドバック療法を施行していない顎機能異常者(男性12名、女性20名)に対して、咬みしめとガム咀嚼時における筋電図を解析、比較した。その結果、顎機能異常者は正常者と比較して(1)最大咬みしめの咀嚼筋筋活動が小さい、(2)パワ-スペクトル分析における平均パワ-周波数値が疲労により低域にシフトしずらい、(3)パワ-スペクトルの低域増加率が低い傾向にある、(4)筋放電リズムのばらつき(変異係数)が大きいことが分かり、治療前後の評価を行うに適していることが確認できた。今後、バイオフィ-ドバック施行前後の顎機能異常者に対し、咀嚼筋と全身的なリラクセイションを調べるとともに、咀嚼筋の機能時における評価を加え、最終的な治療効果を確認する予定である。平成元年度に開発した自律反応と筋活動の分析システムおよび平成二年度作成した咀囁筋機能時の分析・評価システムを応用し、顎機能異常者に対する前頭筋EMGバイフィ-ドバック療法(BFT)の治療効果を評価してきた。しかし、従来の方法では訓練時間が短くフィ-ドバック情報が認識できないという患者からの内省報告があり、筋の弛暖訓練効果が得られない症例もみられた。そこで今年度は、リラクセイションをより効果的に行うための訓練時間の再検討を行った。また、フィ-ドバック信号信体が訓練効果に影響することも懸念されるため、この点についても同時に検討した。さらに、BFT前後における実験的ストレス負荷時の筋活動および自律反応の変化を検討し、BFTのストレス応答反応に及ぼす影響を評価した。被験者は健常者16名(男女各ネ名)とし、Cyborg社製Jー33を用いた聴覚バイオフィ-ドバックを行った。訓練効果を評価するため前頭筋、側頭筋、咬筋および胸鎖乳突筋の筋電図および自律反応として心電図、指尖脈波、呼吸曲線を記録し、これらパラメ-タの経時的変化を分析・評価した。その結果、(1)前頭筋のリラクセイションを効果的に行うためには、7分前後の訓練時間が必要であると思われた。(2)バイオフィ-ドバックを重ねることによる前頭筋のリラクセイションの学習効果があること、前頭筋のみならずその周囲の咀嚼筋群も弛緩が有効に行われることが確認された。(3)Jー33から発生する音信号による自律神経系への影響は認められなかった。さらに(4)実験的ストレス負荷下では胸鎖乳突筋を除く筋群でBFTによる筋活動の抑制効果が認められたものの自律反応への顕著な影響は認められず、BFTは必ずしも筋活動と自律反応とを同時にコントロ-ルしないことが示唆された。
B リンパ球の生存・増殖における抗アポトーシス分子アナモルシンの役割の解析

アナモルシン(AM)トランスジェニック(Tg)マウスの脾臓からBリンパ球(B)を単離し、LPS刺激したところ、AM Tg Bの方がWT Bよりも細胞の増殖能が減弱していた。さらに、LPSにて刺激した際のシグナル伝達分子の活性化をウェスタンブロッティングによって解析したところ、ERK1/2およびIkBのリン酸化の低下を認めた。また、AM Tg BとWT Bの遺伝子発現をDNAアレイにて比較したところ、AM Tg BにおいてIL-1βの発現の低下を認めた。以上より、過剰発現のAMがBにおけるLPS刺激のシグナル伝達経路に作用していることが明らかとなった。アナモルシン(AM)の作用機序を解明する目的にて、Yeast-two-hybrid法を用いてAMと結合する分子として、PICOTという分子をクローニングした。AMのYeastホモログのDre2とPICOT、およびそのYeastホモログのGrx3/4が鉄・硫黄蛋白であることより、AMもPICOTと結合し、鉄・硫黄蛋白として機能していると考えられた。PICOT KOマウスの表現型はAMKOマウスの表現型と酷似しており、ともにKO胎児は身体が小さく、肝臓も小さく、胎生後期に致死となる。IL-3依存性マウス造血細胞株のBa/F3に、AMのN末端フラグメントを過剰発現させ、AMとPICOTの結合を阻害すると、Ba/F3の増殖が低下することから、AMとPICOTの結合は、細胞増殖に必須であることが予想された。また、AM KOマウスから作成したMEF細胞を用いて、AMの下流シグナルを検討したところ、AM KO MEF細胞では、PKCθ/δおよびP38MAPKが活性化されており、さらに細胞周期制御分子であるCyclinD1の発現の低下を認め、これらが原因となり、AM KO MEF細胞の細胞増殖が著明に遅延していることが示唆された。以上の結果から、AMはPICOTと結合し、鉄・硫黄クラスターを形成しPKC、P38MAPKの活性化を負に制御することで細胞増殖に関与している可能性が示唆された。AM TGマウスとPKCδKOマウスにおいて、Bリンパ球の増加がみられるのは、AMがPKCδを負に制御することで説明が可能と考えられた。アナモルシン(AM)は、抗アポトーシス分子としてBリンパ球の生存・増殖に関与している可能性がある。本研究では、AM遺伝子改変マウスを用いてAMのBリンパ球における機能を詳細に解析する。これによって得られる結果をもとに、将来的にはBリンパ球の関連する疾患(腫瘍性と非腫瘍性の両方)の病態にAMがどのような役割をはたしているか明らかにし、それらの疾患の診断・治療に、AMを応用していくことを考えている。AMの作用機序を解明する目的にて、Yeast-two-hybrid法を用いてAMと結合する分子として、PICOTをクローニングした。また、PICOTは、PKCθと結合する分子としてクローニングされ、PKCθを含むnovel PKCの活性を抑制することが知られている。そこで、AM KOマウスから作成したMEF細胞を用いて、AMの下流シグナルを検討したところ、AM KO MEF細胞では、novel PKCであるPKCθ/δおよびP38MAPKが活性化されておりさらに細胞周期制御分子であるCyclinD1の発現の低下を認め、これらが原因となり、AM KO MEF細胞の細胞増殖が著明に遅延していることが示唆された。これらの情報をもとに、AMトランスジェニック(Tg)マウスから得たBリンパ球を用いて、novel PKCのリン酸化を検討したところ、WT Bリンパ球と比較し、AM Tg Bリンパ球のPKCδの活性は抑制されていることをみいだした。また、LPSによりBリンパ球を刺激した際のリンパ球増殖については、AM Tg Bリンパ球の方が、WTよりも増殖力が低下しており、また、PKCδのリン酸化およびp38MAPKのリン酸化の低下を認めた。今後は、AM TgマウスにLPSを投与し、Bリンパ球の増殖などの変化も検討していく予定である。

AMトランスジェニック(Tg)マウスの脾臓からBリンパ球を単離し、in vitroでLPS刺激したところ、予想に反して、AMを過剰発現しているBリンパ球の方が、WT Bリンパ球よりも細胞の増殖能が減弱していた。また、in vivoにてLPSを投与したところ、in vitroと同様に、AM TgマウスのBリンパ球の増加反応がWTマウスと比較して減弱していた。その現象を詳細に解析するために、LPSにて刺激した際のシグナル伝達分子の活性化をウェスタンブロッティングによって解析したところ、AM Tg Bリンパ球において、ERK1/2およびIkBのリン酸化の低下を認め、LPS刺激のシグナルが減弱していることが明らかとなった。また、AM Tg Bリンパ球とWT Bリンパ球の遺伝子発現をDNAアレイを用いて比較したところ、発現に差がある遺伝子群の中でLPS刺激と関与する一つの分子として、AM Tg Bリンパ球において、IL-1βの発現の低下を認めた。この現象は、LPS刺激時にも同様の反応がみられ、過剰発現しているAMがBリンパ球におけるLPS刺激のシグナル伝達経路に作用していることが明らかとなった。アナモルシンKO ES細胞株を樹立し、in vitroにてBリンパ球へ分化させる実験系を計画していたが、技術的問題により、アナモルシンKO ES細胞株の樹立が困難であり、本実験系を用いたアナモルシンの機能評価ができていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。アナモルシントランスジェニックマウスを用いて、in vivoにて、LPSを投与する系において、Bリンパ球の生存・増殖および、その際のnovel PKCおよびp38MAPKを中心としたシグナル伝達について検討する。また、アナモルシン-PICOTの鉄・硫黄クラスター蛋白がシグナル伝達分子の活性を制御するという現象を正確に評価し、世界で初めて報告する予定である。
メッシュデータを活用したコンパクトシティの効果と政策手法の分析

平成30年度の本研究においては、第1に、都市のコンパクト化に資する公共施設の再編・統合や民間施設との合築を行うPPP事業等の取り組みに関して民間事業者等からのヒアリング等を行った。第2に、都市のコンパクト化に寄与する政策手法として、1都市計画法上の市街化区域など法令上市街化が可能な面積(市街化可能面積)を限定する方法、2公共交通の利用率を上げる方法、3市町村合併を推進する方法を掲げ、それぞれの政策手法によって都市のコンパクト化がどの程度進捗するかについて、クロスセクション、パネルデータによる固定効果分析を通じて試算した。この分析におけて都市のコンパクト化がどの程度進捗したかを示す指標として、従来は都市の中心部への近接性のみを対象とする「標準距離」を使用してきたが、コンパクト化のもう一つのメルクマールである都市の高い密度を加味した「基準化された標準距離」を用いた分析を行った。第3にその「基準化された標準距離」を用いて、都市のコンパクト化が財政支出の削減や都市経済の活性化といった便益にどのような影響を与えるかを分析した。第4に、東京都を例にして、コンパクト化の進行による土地利用の変化が住民の便益を示す住宅価格にどのような影響をもたらすかについてリピートセールス法による分析を行った。これらの分析の成果として、政策手法のうち、1市街化可能面積の限定や2公共交通の利用率増加が都市のコンパクト化に寄与していること、「基準化された標準距離」の減少、すなわち都市のコンパクト化が財政支出の抑制や経済の活性化に寄与していることはパネルデータ分析等を通じて明らかになった。また、都市中心部からのの距離の減少が住宅価格の上昇に寄与することもリピートセールス法を通じて示されている。当初の研究計画で示されていた民間事業者、有識者へのヒアリングの実施、政策手法ごとの都市のコンパクト化への効果の分析やそのコンパクト化が財政支出の抑制、経済活性化にどのような影響を与え、どの程度の便益をもたらしているかの分析については満足すべき成果が得られたと認識している。一方で、政策手法のうち、市町村合併については、パネルデータによる固定効果分析ではサンプルセレクションバイアスに起因すると予想される問題から、満足できる成果が得られなかった。また、東京都を例に取ったリピートセールスによる分析では、都市の中心部までの距離に関しては都市のコンパクト化と整合的な結論を得たが、土地利用の変化に関しては建物の高度利用に関するデータが説明変数に入っていなかったため、満足できる結果とならなかった。本年度は、昨年度の研究の課題として残された分析を実施し、最終的な結論を得る。第1には、都市のコンパクト化に向けた政策手法の1つである市町村合併について、サンプルセレクションバイアスの大きな要因となっている人口増減について、その変化率が一定の範囲に収まっているサンプル対象を抽出して分析するというプロペンシティ・スコア・マッチィング類似の手法を適用することにより、市町村合併が都市のコンパクト化を示す「基準化された標準距離」にどのような影響を与えるかについてパネルデータによる固定効果分析を行う。第2に、東京都を事例にとったリピートセール法の分析において、従来の土地利用の変化に代えて、建物床面積の変化による住宅価格への影響を分析し、都市のコンパクト化が不動産の資産価値に影響を与える程度について分析を行う。以上の分析を踏まえ、都市のコンパクト化の政策効果やコンパクト化がもたらす便益を明らかにし、本研究の最終的なとりまとめを行う。平成28年度は、コンパクトシティの進展の状況を指標化した「標準距離」(中心点から各メッシュまでの距離について人口で加重した標準偏差)をGISを活用することにより算出した。この標準距離の指標を説明変数として、1人当たり財政支出額の総額、性質別(建設事業、維持補修費、人件費など)、目的別(民生費、土木費、教育費など)の額をパネルデータ化し、さらに都市の集中度がこれらの1人当たりの財政支出額に与える影響を分析し、標準距離が10%縮減した場合に1人当たりの財政支出額が1.72.7%減少するとの結果を得た。さらに進んで、都市の集中度が進行すれば、土地の有効高度利用により地域の資産価値の上昇や固定資産税等の税収増が想定されることから、地価等の資産価値や税収に与える影響分析を行い、都市の集中度が資産価格を上昇させ、税収増の効果が生ずることが明らかとなった。CO2等の環境負荷の低減に与える影響として、都市の集中度が上昇した場合、都市の移動距離が短縮され、CO2等の温室効果ガスの排出量の削減等の効果が見込まれる。これを検証するため、CO2排出量に都市の集中度が与える影響について都市の集中度上昇による環境負荷の低下の効果を算出した。集中度の上昇は経済主体間の経済交流や取引の増加、経済成長に寄与することが先行研究で部分的に示されていることを踏まえ、包括的な検証のため、集中度が課税所得や都道府県の1人当たりの生産額に与える影響について検証した。併せて、平成28年度は、コンパクトシティに関する政策の認知度やその政策に対する地域住民の方の評価や協力意向を調査するため、インターネット調査を行い、次年度以降のコンパクトシティの形成のための効果的な政策の分析に必要な資料の整理を行った。当初は、平成28年度に実施する予定として、コンパクトシティ形成の指標となる全国の都市の標準距離の計測を行うこととその標準距離が1人当たりの財政支出額への影響を分析することを想定していた。

しかし、予想以上に早く標準距離の指標の作成や財政支出額への影響分析を行うことができたので、本来29年度に行う予定であった地域の資産価値の上昇やそれに伴う税収増加、温室効果ガスの排出量、1人当たりの課税所得への影響を分析するとともに、コンパクトシティについての住民の認知度や政策評価のためのインターネットによるアンケート調査を前倒しで行っており、当初の計画以上に研究は進展している。平成29年度の本研究においては、コンパクトシティを形成するために必要な施策やその効果の分析を行った。その手法は第1には、コンパクトシティの形成に有意義と考えられる現状の施策とその課題に関して、国土交通省などの関係省庁、URなどの関係機関、地方公共団体からヒアリングを行った。その中で、実際に講じられている取組みの中でどのようなものがコンパクトシティの形成に効果的であると考えられるかについての仮説の設定を行った。この結果、地方公共団体による立地適正化計画の推進や公共施設等の再配置に向けた取組のほか、市街化区域などの政策区域の設定や公共交通の整備の状況が都市のコンパクト化に影響を及ぼし得るとの知見を得た。第2に、都市のコンパクト化を示す指標として昨年度開発を行った「標準距離」について見直しを行った。すなわち、都市の人口増加に伴って、住民が居住する領域が広がる部分を補正するために、都市の重心から各人口メッシュまでの距離を人口の平方根で割る修正を加えて「基準化された標準距離」という指標を開発した。これによって、人口が大きな大都市において居住人口の大きさによって都市のコンパクト化が過小に評価されることが回避されることになった。第3に、都市のコンパクト化に向けた施策の効果を検証するために、パネルデータによる固定効果分析を行った。ここでは、第2の研究内容で説明した「基準化された標準距離」を説明変数とし、都市計画法等の土地利用規制からそれぞれの都市において市街化が可能な面積である「市街化可能面積」、公共交通を利用する居住者の割合を説明変数として、都市のコンパクト化を推進するためにそれぞれに自治体で進めてきた土地利用規制や公共交通の充実策がどの程度コンパクトシティ形成に貢献しうるかを算出した。この結果、これらの施策がコンパクトシティ形成に一定の成果を挙げていることが分かった。28年度の研究内容が当初の予測以上に進捗したことを踏まえ、29年度においては、前倒しで、国、地方自治体等へのヒアリングを実施し、都市のコンパクト化に関して効果的と考えられる施策の効果と課題に関して情報の収集と分析・整理を行うことができた。この過程で、29年度に主として取り組む分析である都市のコンパクト化に資すると考えられる要因について仮説を定立することが円滑に行えることが可能となった。これと併せて、都市のコンパクト化を示す指標である「標準距離」に関して、大都市の人口集積に起因するバイアスを補正する「基準化された標準距離」という指標を開発した上で都市のコンパクト化に貢献する「市街化可能面積」と「公共交通利用率」と説明変数とする固定効果分析を行うことができた。以上の分析を行うことにより、最終年度においては、都市のコンパクト化を実現させるための施策の取りまとめに十分な時間的余裕を持って専念できる状況にある。平成30年度の本研究においては、第1に、都市のコンパクト化に資する公共施設の再編・統合や民間施設との合築を行うPPP事業等の取り組みに関して民間事業者等からのヒアリング等を行った。
植物細胞エネルギー、代謝ネットワークを制御する分子マシナリー

植物は炭素、窒素等の無機物を還元同化して生体物質を合成する。この反応では、電子キャリアー蛋白質であるフェレドキシン(Fd)を電子供与体として、葉緑体でエネルギー・代謝のネットワークを形成する。このネットワークの分子装置の構造と作動原理を明らかにする目的で以下の3課題を設定した。(1)葉緑体や非光合成プラスチドでのFdを介したレドックスカスケードを明らかにする、(2)Fdとパートナー酵素との電子伝達複合体の構造を決定し、蛋白質問の相互作用の構造基盤を明らかにする、(3)Fdによる電子分配の切り口から、このエネルギー、代謝ネットワークの駆動原理を解明する。成果は以下の通りである。(1)トウモロコシの葉型Fd、根型Fd、葉型FNR、根型FNR、SiRの単体、及びFdとそれぞれの酵素との電子伝達複合体のX線結晶構造を決定した。3種類の酵素は複合体でそれぞれ別々にFdの表面構造を認識していること、Fd:FNRとFd:SiRの複合体では、電子移動の距離は異なるが共に電子の授受が直接行なわれる位置関係にあることを見出した。(2)溶液状態でのこれらの分子間相互作用をNMR法で解析し、相宜作用領域のマッピングを完成した。パートナーをFNRにするか、SiRにするかでFd相互作用領域が異なる二とを見出した。結晶状態と溶液状態に構造は両方で基本的には一致することを示した。(3)シロイヌナズナを用いて2分子種の葉型FNRのうち一方をノックアウト株と葉型Fd2のノックダウン株を選別した。これらの変異体ではFNRやFdの量的減少とチラコイド膜局在性が変化した結果、炭素と窒素への還元力配分が変化すること、および非循環的電子伝達が低下し、光化学系2が還元状態になることが分かった。FdとFNRの存在量や比率が電子伝達の効率や分配を決める要因であることがin vivoの実験系で示された。光合成で生じる強い還元力は、電子伝達系を介して炭素、窒素、硫黄等の無機物を還元同化し、糖、アミノ酸、脂肪酸、核酸等の生体物質の合成の代謝系の駆動力となる。電子キャリアー蛋白質と酵素群との間における還元力の分配機能という切り口から研究を行い、以下の成果を得た。1)Fdを電子供与体とする酵素群は、Fdと電子伝達複合体を形成する。酵素ごとにFdとの分子間の相互作用の様式が異なると考えられる。光合成器官と非光合成器官に特異的なFdとFNRのイソ蛋白質間の分子認識が、レドックスカスケードを規定する主要因であるので、それらの電子伝達複合体の精密構造を決定、比較した。その結果、葉と根由来のFd:FNR複合体は明確に異なり、葉ではFd→FNR→NADP^+、根ではNADPH→FNR→Fdへの電子移動に適した構造であるとの結論を得た。2)全ゲノム構造の判明しているシロイズナズナのFd全ての構造、機能解析をポストゲノムの蛋白質研究としての位置付けで行った。また、このFd依存性の酵素・蛋白質群を、Fd依存性酵素群のFdとの物理的な相互作用力を活用したプロテオーム解析によりそれらを探索同定し、ネットワークを形成する新しい分子装置の解明を開始した。3)Fdの葉緑体内濃度は数十μMから100μMであり、上記酵素群の合計濃度も同程度であるので、各酵素はFdをめぐって競合関係にある。この理解のためには、Fdと酵素の蛋白質・蛋白質の相互作用や電子伝達反応を詳細に解析することが必要であり、FNRや亜硫酸還元酵素を対象に蛋白質工学的手法で明らかにした。4)マラリア原虫は、植物プラスチドと類似したアピコプラストを持ち、植物Fdのホモログが存在する。Fdを介した代謝が駆動していると予想される。この実体を明らかにすべく、このFdの分子特性や電子授受相手の酸化環元酵素群の探索、同定を行なった。

(3)シロイヌナズナを用いて2分子種の葉型FNRのうち一方をノックアウト株と葉型Fd2のノックダウン株を選別した。これらの変異体ではFNRやFdの量的減少とチラコイド膜局在性が変化した結果、炭素と窒素への還元力配分が変化すること、および非循環的電子伝達が低下し、光化学系2が還元状態になることが分かった。FdとFNRの存在量や比率が電子伝達の効率や分配を決める要因であることがin vivoの実験系で示された。プラスチドのエネルギー・代謝ネットワークの中で、電子キャリアーとしてはたらくFdとの分子間相互作用を介して機能する酵素・蛋白質の探索と個々の分子マシナリーの構造生物学的解析を行った。1)葉緑体、非光合成プラスチドでの蛋白質相互作用の網羅的解析シロイヌナズナとトウモロコシを材料に、Fd分子種別、プラスチド別の相互作用蛋白質群のプロテオーム解析を行い、多くの蛋白質を同定した。2)光合成型、非光合成型Fd・FNRの分子マシナリーの解析Fd・FNR複合体の結晶構造解析結果に基づき、プラスチドでの還元力の分配に中心的役割を果たす分子装置の作動原理を明らかにするため、プラスチド内での局在化、イソ分子種ごとの相互作用様式、窒素栄養等の環境要因に対する応答を明らかにした。3)FdとSiR及びNiRの蛋白質相互作用の速度論的解析とNMR解析Fdと亜硫酸還元酵素(SiR)や亜硝酸還元酵素(SiR)の速度論的解析を部位特異的変異体を活用して系統的に行い、酵素の基質認識と蛋白質間の電子授受の詳細を明らかにした。^<15>N標識したFdを用いて、これら酵素との溶液状態での分子間相互作用をNMR法で解析し、相互作用領域のマッピングを開始した。これらの酵素の組換え分子の結晶化、構造解析を進めた。SiR及びグルタミン合成酵素については、原子構造がほぼ完成する段階に到達した。FdとSiRの電子伝達複合体の構造解析も進行中である。5)マラリア・アピコプラストのFd・FNRのレドックスカスケードの解析立体構造を決定したマラリアFdのNMR解析によるプロトンのHSQCシグナルの帰属を完成した。そして、マラリアFNRとの相互作用を解析し、植物酵素とは異なる認識領域が存在することを見出した。本研究は、葉緑体内での電子分配を司る分子マシナリーの全容を明らかにし、フェレドキシン(Fd)を要とした電子伝達の流れを統合的に解明しようとするものである。本年度はNMRとX線結晶構造解析を中心にして、以下の知見を得た。1)電子の大きな流れにはFd : NADPH還元酵素(FNR)が寄与すると考えられる。トウモロコシ葉緑体には3種類のFNR分子種が存在し、それらは葉緑体内のチラコイド膜に局在、可溶性画分のストロマに局在、これら両方に分布するものに明確に区別でき、プロテーム解析で遺伝子情報との対応を明確にした。2)溶液状態でのFdとFd依存性酵素群との蛋白質相互作用をNMR分光法で解析する実験系を新たに立ち上げた。FNRや亜流酸還元酵素(SiR)に加え、硝酸還元系で働く亜硝酸還元酵素とアンモニア同化系で働くグルタミン酸合成酵素についても新規の情報を得た。Fdの相互作用領域は鉄硫黄クラスター側の分子表面である点は酵素全般に共通であるが、相互作用残基は酵素毎に特有であることが判明した。3)SiR単体及びFdとの電子伝達複合体の構造解析を行った。L-
実世界環境下における遠隔発話の音声認識と話者認識およびインデックス化に関する研究

遠隔発話の音声認識に関しては、H20年度とH21年度に開発した話者の位置と発声方向の同定方法を用いた認識手法を開発した。つまり、音源位置の同定に基づいて、マイクロフォンアレイのビームフォーマーによって音声を強調し、発声方向の向きの同定によって、発声語彙を推定・制限する方法により認識率を高めた。さらに、残響補正の基本的な手法であるケプストラム平均正規化法を、短時間の発声によりオンラインで適用できる技術を開発した。これは、混合ガウス分布(GMM)モデルにより音声をモデル化しておき、入力音声の各フレームをGMMの要素に対応付け、その要素ごとにあらかじめ学習しておいたケプストラム平均正規化量を用いて正規化するもので、従来手法なら数単語の発声時間長を要していたものが、1単語の発声でも正規化の効果が確認できた。遠隔発話の話者認識に関しては、マイクロフォンアレイによる音声強調をした音声に対して、H20年度とH21年度に開発したスペクトル情報(MFCC)と位相情報の併用法を用いた認識手法を開発した。インデックス化に関しては、音声認識と話者認識結果の後処理として、認識結果からの場所とか人名、組織名などの固有名の抽出方法を開発した。テキスト入力ではかなり精度良く固有名を抽出できたが、遠隔発話の音声認識が非常に困難なため、満足のいく結果は得られなかった。ハンズフリーは,マイクから離れた位置での発話(遠隔発話)となり,残響などの影響により,伝達特性が異なってくるので,音声認識は難しくなる。そのため,伝達特性の正規化が必要になる。我々は,予め場所ごとの多人数の多くの発話によりケプストラム平均を求めておき,この値によって,任意の発話を正規化する方法を提案し,良好な結果を得ている。しかし、この方法は,発話場所(音源位置)が既知であるという前提があった。我々の実験では,40cm程度の推定誤差は,認識率の低下はしないことがわかっている。原理的には,4つのマイクロホンを用いると,マイクロホン対の音声の到達時間差(TDOA)を測定し,連立一次方程式の解から,正確に音源位置が同定できる。しかし,実際は,残響や雑音の影響によって,正確にTDOAを測定することは難しい。リビングルームを想定した比較的大きな部屋(5m×6.4m×2.65m)で,音源位置の同定実験を行った。T-型マイクロホンアレーを天井に4ケ所,壁に4ケ所設置(合計32個のマイクロホン)し,それぞれのマイクロホンアレーによって音源位置を推定し,得られた8個の推定位置を統合して,音源位置を推定する方法を検討した。話者の発声した向きによっても,推定の難しさが異なってくる。東西南北の4方向で発声した場合に,発話場所ごとの位置の推定誤差を求めた。いずれかのマイクロホンアレーの近くでの発話は,場所の推定精度は良いが,部屋の真ん中付近での発話の場所推定は,1mを越える推定誤差がある。全場所にわたる推定誤差の平均は,約76cmであった。また,発話場所を仮定しない残響特性の正規化法も検討した。平成19年度の成果をもとに、分散配置したマイクロフォンアレイを用いた遠隔発話の認識方法を検討した。リビングルームを想定した比較的大きな部屋(5m×6.4m×2.65m)で、マイクから離れた位置で発声した音源位置の同定実験を行なった。T-型マイクロフォンアレイを天井に4箇所、壁に4箇所設置(合計32個のマイクロフォン)し、それぞれのマイクロフォンアレイによってマイク間の到達時間差やパワー比をニューラルネットワークの入力として用いて、音源位置を推定し、得られた8個の推定位置を統合して、音源位置を推定する方法を検討した。推定された音源位置を利用し、マイク間の時間到達差を再推定し、ビームフォーマーにより音声を強調し、音声認識率を向上を図った。また、45度ごとの8方向で発声した音声の発声向きの同定実験を行なった。推定は、発話方向45度以内の推定誤差で約95%の精度の8方向の発声向きの同定ができた。これにより、発声方向に関連したリビングルーム内の機器を音声で制御できる見通しを得た。
高齢社会に要求される排尿反射強化薬の開発を指向した排尿反射の中枢機序の解明

我々はこれまでに,グリシン(Gly)受容体が排尿反射の中枢機序に関与する可能性を明らかにしてきた.本研究では,まず脳幹Gly受容体が排尿反射に如何に関与するか検討した.中脳水道中心灰白質(PAG)から、排尿期に発火が増加するI型と、逆に発火が減少するII型の2種類のニューロン活動を微小電極法により記録した。両タイプとも、ブレグマより-8000-8300μmの領域に多く、I型は腹側に、II型は背側に多い可能性が示された。これらを含む腹外側および背内側PAGよりニューロンを単離し、Gly誘発電流を記録した。検討した全例でGly応答が記録され、その特性は脊髄等での報告とほぼ一致した。GlyとGABAの電流比は約1であり、ニューロンの形態(錐体細胞、双極細胞、多極性細胞)に依存しなかった。無麻酔の中大脳動脈(MCA)梗塞モデルラットにおいて、膀胱容量、排尿閾値、尿流率および膀胱コンプライアンスの減少、排尿潜時の短縮と尿道抵抗の増加が、梗塞後24時間以上持続した。この時、PAGおよびLDT領域のGly受容体α_1サブユニットの発現は変化しなかった。ストリキニーネ(Str)はMCA梗塞による排尿反射障害に影響しなかった。デキストロメトルファン(DM)は梗塞24時間後の投与で膀胱容量と排尿潜時を改善した。膀胱内酢酸注入は、内側視索上核、PAG、バリントン核、腰仙髄の後角、副交感神経核など、多くの脊髄・脳幹部でFos蛋白質を増加させた。StrおよびDMはPAGやバリントン核など排尿関連核でFos蛋白質の発現を抑制した。マウスMCA梗塞モデルにおいて、クロペラスチン(CP)は尿流率の減少と尿道抵抗の増加を改善し、無排尿性収縮の発現回数を抑制した。CPは、選択的GIRK(チャネルブロッカーとは異なり、5-HT誘発シングルGIRKチャネル電流の開時間に影響せず、閉時間を延長させた。1.排尿中枢として近年注日されている中脳水道中心灰白質(PAG)とその周囲から微小電極法により2種類の排尿反射関連ニューロン活動を記録した。一つは排尿期に発火が増加し(Type I)、他方は排尿期に発火が減少した(Type II)。Type I、Type IIともに、ブレグマより-8000-8300μmの領域から多く記録され、Type IはPAGの腹側に、Type IIは背側に多い可能性が示された。2.ブレグマより-7500-9100μmの腹外側PAGと背内側PAGよりニューロンを急性単離し、グリシン応答を検討した。検討した74個全てのニューロンでグリシン誘発電流が観察された。腹外側PAGニューロンにおけるグリシン誘発電流の電気生理学的・薬理学的特性は、脊髄その他で報告されているものとほぼ同じであった。また、グリシンとGABAの電流比(I_<Gly>/I_<GABA>)はほぼ1であり、その比はニューロンの形態(錐体細胞、双極細胞、多極性細胞)に依存しなかった。

3.無麻酔の中大脳動脈(MCA)梗塞モデル動物において、膀胱容量、排尿閾値、尿流率および膀胱コンプライアンスの減少、排尿潜時の短縮と尿道抵抗の増加が、梗塞後24時間以上持続することを明らかにした。この時、PAGおよびLDT領域のグリシン受容体α1サブユニットの発現は変化しなかった。ストリキニーネはMCA梗塞による変化に影響を与えなかった。デキストロメトルファン(DM)は脳梗塞体積に影響しなかったが、梗塞24時間後の投与で膀胱容量と排尿潜時を改善した。4.膀胱内酢酸注入により、内側視索上核、PAG、バリントン核、腰仙髄の後角、副交感神経核などを含む多くの脊髄・脳幹部でFos蛋白質の発現が見られ、ストリキニーネおよびデキストロメトルファンがPAGやバリントン核など脊髄および脳幹の排尿関連核でFos蛋白質の発現を抑制した。Gタンパク質共役型内向き整流性K+(GIRK)チャネル活性化電流を抑制する物質は、脳梗塞に伴う過活動膀胱や排尿困難を改善することを明らかにした。そこで本研究ではGIRKチャネル活性化電流を抑制する物質の探索と作用メカニズム解明の一環として、δ-オピオイド受容体アンタゴニスト、ナルトリンドール(NTI)およびナルトリベン(MTB)の5-HTおよびNAdにより活性化されるGIRKチャネル活性化電流に対する作用を調べ、さらに、クロペラスチン(Clo)の5-HT活性化GIRKシングルチャネル電流に対する作用を解析した。加えて、マウス脳梗塞モデルを作成し、そのマウスの排尿反射機能に対するCloの作用を調べた。その結果、以下の成績を得た。1)NTIおよびNTBは単一背側縫線核ニューロンにおいて5-HT誘発GIRK活性化電流(I_<5-HT>)を、濃度依存的にかつ電位非依存的に抑制した。I_<5-HT>に対するIC_<50>はNTIが9.84×10^<-5>M、NTBが1.28×10^<-5>Mであった。これらの作用は選択的δ-受容体拮抗剤により抑制されなかった。2)細胞内をGTPγSで潅流したニューロンにおいて、NTIおよびNTBは、5-HTで不可逆的に活性化されたGIRK活性化電流を抑制した。3)これらの薬物は青斑核ニューロンにおいてNAdで活性化されたGIRK電流(I<NAd>)を濃度依存的に抑制した。4)I<NAd>に対するNTIのIC_<50>は8.44×10^<-5>Mで、I_<5-HT>に対するIC_<50>に近かった。5)Cloは、選択的GIRKチャネルブロッカーとは異なり、5-HTで活性化されたシングルGIRKチャネルの開時間には影響せず、閉時間を延長させた。6)マウスの脳梗塞モデルにおいて、Cloは、尿流率の減少および尿道抵抗の増加を改善し、過活動膀胱の指標を考えられる無排尿性収縮の発現回数を有意に抑制した。