hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ES細胞由来内耳細胞の効率的誘導 -細胞移植による聴覚機能回復にむけて-

本研究計画では、内耳難聴疾患のキーとなる内耳有毛細胞に焦点を当て、多分化能を有する胚性幹細胞(ES細胞)より有毛細胞を調製し、それらを用いた細胞移植治療を目的とした。ES細胞から内耳有毛細胞への効率的な分化誘導をスクリーニングし、あるストローマ細胞の培養上清を用いると効率よく分化誘導が可能であることを発見した。これをHIST2法と命名した。HIST2法によって得られた有毛細胞様細胞は、トリ胚あるいは難聴マウス内耳への移植により生着を認め、移植細胞のソースとなり得ることが示唆された。本研究計画では、内耳難聴疾患のキーとなる内耳有毛細胞に焦点を当て、多分化能を有する胚性幹細胞(ES細胞)より有毛細胞を調製し、それらを用いた細胞移植治療を目的とする。本年度、ES細胞から内耳有毛細胞への効率的な分化誘導をスクリーニングし、それらの細胞のキャラクタリゼーションを行うため、まずはマウスES細胞を用いた基礎的検討を行った。マウスES細胞からhanging drop法により胚様体を形成させ、その後、種々の細胞株(主にマウス由来ストローマ細胞)と共培養または隔離培養、あるいは培養上清を用いることで分化誘導を試みた。その結果、ある種のストローマ細胞の培養上清を用いた場合、分化培養3週間後より内耳有毛細胞のマーカー(Math1、Myosin Vllaなど)の遺伝子およびタンパク質発現を認めた。さらに、この効率的に分化誘導した有毛細胞様細胞の形態学的な解析(走査線電子顕微鏡による観察)を行った結果、聴毛と思われる特徴的な形態を有することが明らかとなった。平成23年度以降、さらにこれらの細胞を解析し、分化誘導に有効な液性因子の同定することで、ES細胞から有毛細胞への分化誘導メカニズムを解明し、また、電気生理学的解析により有毛細胞様細胞の機能解析を、さらにトリ胚への細胞移植実験を行うことで、in vivoへの検討を行う予定である。初年度(平成22年度)は、ES細胞から内耳有毛細胞への効率的な分化誘導をスクリーニングし、ある種のストローマ細胞の培養上清が有毛細胞様細胞への特異的分化を高効率に誘導することを明らかにした。そこで、平成23年度は、ストローマ細胞の培養上清を解析し、分化誘導に有効な液性因子の同定、また、有毛細胞様細胞の詳細な機能解析を行った。まず、培養上清の濃度依存的な分化誘導が認められたことから、ストローマ細胞株由来の液性因子によることを確認し、ストローマ細胞より分泌される骨形成タンパク質BMPファミリーが細胞の分化には重要であると考えた。また、誘導した有毛細胞様細胞は、FM1-43FX色素によりmechanotransductionを有する細胞であることが判明した。さらに、これらES細胞より分化誘導を行った有毛細胞様細胞のトリ胚への移植実験を行い、内耳(蝸牛管および半規管)への生着、および有毛細胞のマーカーの発現を確認した。平成24年度では、これまでのマウスES細胞での検討と同時に、同法によりサル(カニクイザル)ES細胞での分化誘導も検討する。さらに、難聴モデルマウスへの移植を行い、生着の確認および移植細胞の動態を詳細に調べることで、in vivoにおける移植治療の基礎的解析を行う。本研究計画では、内耳難聴疾患のキーとなる内耳有毛細胞に焦点を当て、多分化能を有する胚性幹細胞(ES細胞)より有毛細胞を作成し、それらを用いた細胞移植治療を目的とした。初年度(平成22年度)から平成23年度にかけて、ES細胞から内耳有毛細胞への効率的な分化誘導を開発した。ある種のストローマ細胞(ST2)の培養上清が有毛細胞様細胞への特異的分化を高効率に誘導することを明らかにし(HIST2法)、分化誘導後の有毛細胞様細胞のキャラクタリゼーションを行った。そこで、本最終年度(平成24年度)では、細胞移植治療を目指したin vivo移植実験とHIST2法における分化メカニズムの解明を試みた。まず、ES細胞より分化誘導を行った有毛細胞様細胞のトリ胚への移植実験を行い、内耳への生着、および有毛細胞のマーカー(Brn3c、Myosin6)の発現を確認することができた。さらに、難聴モデルマウス蝸牛への移植を行った結果、細胞生着を認め、それらの細胞は有毛細胞のマーカーを発現維持していることが明らかとなり、in vivoにおける移植治療の基盤的知見を得ることができた。

また、HIST2法によって分化誘導する際に有毛細胞の分化に必須の転写因子Math1に着目し、Math1遺伝子導入による分化効率の変化を詳細に解析した結果、Math1はES細胞から有毛細胞への分化誘導に効果的な因子であることが実証され、さらにHIST2法によって分化誘導された有毛様細胞は、Math1依存的に誘導することが明らかとなった。さらに現在、霊長類ES細胞を用いて有毛細胞の作製を試みており、分化誘導効率の算出および分化メカニズムの解明を進めている。研究計画に基づき、期待した実験成果が得られており、学会発表および論文発表での成果報告を行っているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本法を用いることで、難聴治療のための移植材料のソースを創生し、更に移植における問題点(生着率やテラトーマ)にも注意を払い、移植治療の基盤を築く予定である。
動脈若返りのために複数薬剤徐放と分解をタイムプログラムした高分子材料創製

動脈硬化の治療において、最先端の生体吸収性ステントでさえも血栓症リスクは否めない。循環器ステント治療革新のためには、新しい生分解性ポリマー開発が必須である。研究代表者は、分解しても酸性有機化合物を生成しない感熱応答性生分解性ポリマーを合成した。これを利用して本研究では、フランス国研究者が有するピンサー型触媒の技術と連携して、新しい高分子材料を創る。ここでは抗がん剤と血流改善剤の2種類を、分解速度の異なる高分子を組み合わせることで薬物をタイムプログラミングで放出制御することを目指す。動脈硬化を完治させた後、若返り(アンチエイジング)を可能とする、処方を順序立てた高分子材料の創製に挑戦する。
ガロア表現の多面的研究

ガロア表現について幾つかの有用な結果を得た。特に、剰余体が完全とは限らない完備離散附値体の幾何学的ガロア表現は、適当な状況の下、「大きい」クンマー拡大上の固定部分空間が自明になる事を証明し、これを岩澤理論に応用した。また、ガロア表現の合同について研究し、Rasmussen-玉川予想の一般化についての結果を得た。(1)ガロア表現の合同について研究し、一定の成果を得た(部分的に小関祥康氏との共同研究)。局所体の二つの不分岐l-進表現が適当な条件を満たすとき、mod lで合同ならもともと合同、という型の定理を示す事が出来る。これ自体は簡単な事だが、これを大域体のガロア表現の合同に応用する事が出来る。即ち、大域体の、二つの幾何学的なl-進ガロア表現が「異なる重さを持つ」とき、十分大きいlに対しては、mod lで合同になり得ない事が示せた。これはRasmussen-玉川の予想に応用がある。また、Rasmussen-玉川予想のDrinfeld加群版を考察し、その場合にも上の結果を適用する事に依り、半安定の場合には肯定的に解決した。これらの結果は、本研究の大域的な目標である「ガロア表現のモジュライ空間の中で、どこにどの様な表現がどれくらい存在しているのかを究明する事」に寄与する、重要な意味のある結果である。(2)頂切離散附値環の分岐理論の研究に於いて、可換環論に関係する事で一箇所解決されていない問題があり、これに取り組んだ。問題は、高次元の局所環上の剛解析空間のファイバーの連結成分の個数が考えている状況下では変化しない事を示す事である。これは大変難しい問題であると思われ、完全解決には至ってないが、来年度中の解決を目指して鋭意努力中である。(3)l-進ガロア表現の「係数体」が、一つの素点kに於けるFrobeniusの像のtraceで生成される様なkの密度が(適当な条件の下)1となる事を示すべく、予備的な考察をした。(1)函数体のガロア表現の合同について、前年度から研究を継続し、Drinfeld加群のRasmussen-玉川予想を部分的に証明した。この結果はLondonにおける研究集会で発表した。これは、この予想がAbel多様体だけでなくt-motiveについても成り立つことを予期させる点で重要である。またこれは、本研究の大域的な目標である「ガロア表現のモジュライ空間の中で、どこにどの様な表現がどれくらい存在しているのかを究明する事」に寄与する、重要な意味のある結果である。(2)局所体A上のAbel多様体Aの、Kの或る無限次拡大体L上のMordell-Weil群の捩れ部分が有限である、といふ今井の定理を、多方面に一般化した。即ち、Kは剰余体が一般の完備離散附値体でよく、また、Abel多様体の等分点の代りに(Q/Z)-係数のetale cohomologyを考へる事によりpotentially good reductionを持つ一般のprojective smooth varietyであつて一定の条件を満たすものに対して、一般化する事が出来た。証明には、局所モノドロミー定理の証明に似た議論と、p進Hodge理論とによる。この結果の応用として、岩澤理論で重要な幾つかの定理の仮定を弱められる事が分かつた。(3)l-進ガロア表現の「係数体」が、一つの素点kに於けるFrobeniusの像のtraceで生成される様なkの密度が(適当な条件の下)1となる事を近々証明出来る予定であるが、これと関連して、SL(2,Z)のHecke体のガロア群の構造及び判別式についての前田予想について考察した。今のところまだ数値実験に留まつてゐるが、この予想は確かに成り立つてゐる様子であり、来年度の研究でも引き続き取り組んで行きたい。(1)今井の定理の一般化とその岩澤理論への応用(久保裕介氏との共同研究)。混標数(0,p)の局所体K上のpotentiallygood reductionを持つAbel多様体Aについて、Kのある種の無限次拡大体L上のMordell-Weil群の捻じれ部分A(L)_torsが有限である事を証明し、論文に纏めた(より一般に、proper smoothな代数多様体について同様の結果が示せる)。これは今井秀雄氏による古典的な定理の一般化になつてをり、久保裕介氏の修士論文で示された様に、岩澤理論に応用がある。主定理を一般的な形で述べれば次の通り: Kを混標数(0,p)の完備離散附値体で剰余体が本質的に有限型のものとする。(2)ガロア表現の合同(小関祥康氏との共同研究)。代数体の二つの「幾何的な」ガロア表現がmod pで合同なときそれらは局所的には元々合同か、という問題を研究し、適当な条件の下、この種の命題を証明した。

これはRasmussen-Tamagawa予想に応用がある。結果自体はおおむね順調に出てゐるのだが、それを論文に書き下すための時間が足りない。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画は基本的に今のままでよいが、結果(今井の定理の一般化、Hecke体のFrobeniusu固有値a_pによる生成、Drinfeld加群のRasmussen-玉川予想、等)を書き下すためにもつと時間を獲得する必要がある。これらの論文が完成したら、さらに、高次元schemeに対するある種のSelberg型zetaの定義をする、といふ興味深い課題が最近見えてきたので、これに取り組みたい。
国際労働移動が産業間国内労働移動と世代別失業に与える影響の理論的分析

本研究においては、国際的要素移動が国内の労働市場に及ぼす効果について、主に二つの点に注目し研究を行った。まず、合法的および非合法的な国際的労働移動(移民)について、失業の可能性を考慮し、不法移民の取締りを強化したとき経済にどのような影響を及ぼすかについて分析を行った。つぎに、途上国における失業の問題を、先進国内の産業部門間の労働移動と失業に応用し研究を行った。たとえば、途上国において、インフォーマル・セクターと呼ばれている部門は、先進国においても広範に存在するパート・タイム労働者やフリーターとみなすことができ、農村農業部門は産業にかかわらず雇用は保証されるが低賃金などにより魅力のない部門と置き換えられる。さらに、途上国でいうところの都市工業部門は、若者が失業のリスクを犯しても将来就職したいと思う部門と看做される。このような観点から、本研究では従来の研究成果を十分に活用することにより、先進国の若年非熟練労働者層の失業問題を、国際貿易と国際的要素移動の枠組みの中で分析を行った。さらに、若年層を中心とする非熟練労働と中高年を中心とする熟練労働の区別、またわが国の若年層の失業の特殊性、つまり、半ば自発的でありそしてそのことは両親等からの所得移転に大きく依存していることに注目して、失業の減少と経済厚生の向上を図るための諸政策の有効性を検討した。その結果、熟練・非熟練労働の流入はそれぞれの失業を増加させるものの、非熟練労働の流入は熟練労働の失業を減少させ得るなど興味深い結果が得られている。国際労働移動と国内労働市場の関係を貿易理論を応用して考察するという一応の目的は達成されたと考えられる。国内の労働移動が、何らかの理由で制限されている経済について、政策や国際的な資本移動が国内経済に及ぼす効果について、様々な角度から分析を行った。まず、国内にインフォーマル部門が存在する場合について、外国投資が国内の労働移動と失業および所得分配に及ぼす効果について分析を行った。ついで、国内の労働移動が、労働者の特定の産業への選好により不完全である場合に注目し、賃金補助金政策、生産要素の拡大、さらに労働移動の不完全性の程度の変化が失業や国民所得にどのような効果を及ぼすかについて考察した。一方、生産要素の異質性、とりわけ労働について熟練労働と非熟練労働の違いに注目し、資本を加えた2財3要素モデルを構築し、特定の産業への生産補助金や国際的要素移動(資本と労働)が国内の労働移動や失業に及ぼす効果について検討した。その結果、農業部門への補助金は非熟練労働の失業率を低下させるなどいくつかの興味深い結果が得られている。2要素1財2国のハリス・トダロモデルにおいて、両国はそれぞれ所与の労働と資本を用いて財を生産する経済を考え,資本は国際間移動できる場合と出来ない場合について国際間労働移動の分析を行った。資本移動がある場合での分析では、一つの注目すべき結果として不法移民の取締り強化は不法移民を増加させるというパラドックシカルな結果が得られた。また、受入国の査察強化政策の代替案として、不法移民を雇用していた企業に課す罰金を引き上げることは経済厚生により望ましいことや、送出国の経済厚生にとっては最低賃金のレベルを上げることが望ましいことが明らかにされた。国際的な労働移動の問題に加えて、日本国内の地域経済の分析も行った。特に東海地域の経済に焦点をあて、東海経済のクラスターの分析を行った。前年度に引き続き、国内の労働移動が、何らかの理由で制限されている経済について、政策や国際的な要素移動が国内経済に及ぼす効果について、様々な角度から分析を行った。本年は特に、熟練労働と非熟練労働が同時に存在する経済に注目し、若年の非熟練労働者が職業選択の過程で高望みをすることによる失業の存在と、その解決策について検討した。特に先進国において見られるこの現象は、比較的富裕な両親や祖父母からの援助によって助長されていること、また後進国に見られる農村から都市への移動との類似性に注目して分析を行った。

その結果は、分析の枠組みとして、前年より改良された形でまとめられ、Review of Development Economicsに受理されている。また、このモデルを拡張し、先進国の失業と両親等からの援助の関係の分析に応用した論文、"Someday My Prince WillCome"は、ダブリンで開かれた第7回European Trade Study Group学会で報告された。一方、国内にインフォーマル部門が存在する場合について、外国投資が国内の労働移動と失業および所得分配に及ぼす効果について分析を行った。その結果は、Pacific Economic Reviewの論文としてまとめられている。また、労働組合が存在する状況の下で、労働移動が熟練労働と非熟練労働の国際移動が賃金格差や技術の形成にどのような影響を持つかを検討した。その結果、熟練労働者の移民が賃金格差を拡大し、技術の形成に関しては、非熟練労働の移民は技術の獲得を助長する一方で、熟練労働の移民はそれを抑制するといった結果が得られている。この結果は、日本大学で行われた第19回Pacific Regional Science Conferenceで報告を行った。さらに、不法移民の規制政策が、受入国の要素価格、失業および厚生水準に与える効果について分析を行い、その結果はPapers in Regional Scienceで公刊予定となっている。前年度に引き続き、国際的労働移動が国内の労働市場に及ぼす効果について様々な角度から分析を行った。本年は特に、熟練労働と非熟練労働が同時に存在する経済に注目し、若年の非熟練労働者が職業選択の過程で高望みをすることによる失業と、中高年の高賃金による伝統的なタイプの失業が同時に存在する状況に注目し、その解決策について検討した。その成果は、論文"Someday My Prince Will Come"としてまとめられ、Asia-Pacific Journal of Accounting & Economicsに掲載された。さらに、パートタイム労働者やフリーターのような「偽装失業者」の存在も考慮し、国際労働移動がこれらの失業にどのような影響を及ぼすかについて検討を行った。その結果は、シドニーで開かれたM.C.ケンプ教授記念国際学会(2006年8月)とウィーンで開かれた第8回ETSG学会(2006年9月)において報告された。一方、途上国における労働移動のモデルとして知られているハリス=トダロー・モデルに環境変数を組み込んだ場合において、環境汚染削減技術の向上が途上国経済にどのような影響を与えるかについて分析をした。均衡への調整過程の分析において、環境が時間とともに調整される場合の均衡の安定条件は、従来の環境変数のない場合のモデルにおいて要素の部門間移動が時間とともに調整される場合の安定条件とは逆になるこが明らかとなった。また、環境汚染削減技術の改善は都市の失業を増加させて、経済厚生を低下させる可能性があることを明らかにした。
高次構造を有するナノ／マイクロエマルションの精密調製技術の開発

本研究は,マイクロフルイディクス技術の1つであるガラスキャピラリーデバイスを用いた単分散ダブルエマルション調製手法と,膜を用いたエマルションプロセッシング技術を融合することで,粒径がシングルミクロンオーダーのダブルエマルションを調製することを目指した.本技術はWater-in-Oil-in-Water (W/O/W)型,Oil-in-Water-in-Oil (O/W/O)型のいずれのダブルエマルションに対して有効であり,膜を透過させるときのフラックス,および膜の細孔径により,エマルション粒径を制御できることを明らかにした.さらに得られるエマルションの構造上の特徴を明らかにした.本研究は,マイクロフルイディクス技術の1つであるガラスキャピラリーデバイスを用いた単分散ダブルエマルション調製手法と,膜を用いたエマルションプロセッシング技術を融合することで,粒径がシングルミクロンオーダーのダブルエマルションを調製することを目指した.本技術はWater-in-Oil-in-Water (W/O/W)型,Oil-in-Water-in-Oil (O/W/O)型のいずれのダブルエマルションに対して有効であり,膜を透過させるときのフラックス,および膜の細孔径により,エマルション粒径を制御できることを明らかにした.さらに得られるエマルションの構造上の特徴を明らかにした.今年度は従来のglass capillary deviceにShirasu Porous Glass (SPG)膜を組み合わせた新しいデバイスを作製し、Water-in-Oil-in-Water (W/O/W)エマルションがglass capillary deviceで調製された後すぐにSPG膜を透過するシステムを構築することができた。また実際に新しいデバイスを用いてW/O/Wエマルションを調製後にSPG膜を透過させる実験を様々な条件で行った。Glass capillary deviceで調製されるW/O/Wエマルションは300ミクロン程度の粒径を有し、エマルションの安定性は極めて高い。しかし膜透過の運転条件によっては、透過後のエマルションの構造や安定性は劇的に変わってくることが明らかとなった。ただし、適切な条件の下で膜を透過することができる場合は、エマルションのサイズダウンを達成することができた。Glass capillary deviceによるW/O/Wエマルション調製は直接観察が可能で、調製のダイナミクスを追跡することができるため、膜透過のダイナミクスも同時に追跡すべく、様々な観察条件の下で、W/O/WエマルションがSPG膜を透過する様子を直接観察することを試みた。しかし現時点ではクリアに観察するには至っていない。現在も検討を進めている段階である。平成25年度中には論文発表・学会発表までには至らなかったが、これらの成果は平成26年度に発表する予定である。W/O/Wエマルションの膜透過の直接観察に当たっては,光学顕微鏡で観察可能な膜デバイスを開発することに成功し,ハイスピードカメラを用いて観察したところ,以下の3つの現象が確認された.第1に中間相の油が膜透過の際にせん断力で剥ぎ取られ,中間相の薄いダブルエマルションが調製される現象である.これは膜面にエマルションが滞留する際に起きる現象である.第2にダブルエマルションが2つ以上に分裂し,小さなダブルエマルションが調製される現象である.これは膜骨格にダブルエマルションが衝突した際に起きる現象である.第3にダブルエマルションが崩壊する現象である.これは避けたい現象であるが,現時点でこれを完全に避ける術はない.膜透過の際にこれらの3つの現象が並行して起きており,膜透過により小さなダブルエマルションを得ることができることを明らかにした.さらにO/W/O系でも同様にGlass capillary deviceと膜を組み合わせた複合デバイスを開発し,サイズの小さなダブルエマルション調製を試みた.ハイスピードカメラを用いた膜透過の直接観察結果も行い,現象はW/O/W系と同様であることを確認した.すなわち本研究で開発した複合デバイスは,エマルション系に依らず,W/O/W系でもO/W/O系でも適用可能であることを示した.現在これらの成果を学術論文誌に投稿中である.膜工学交付申請書に記載した研究計画通り、概ね順調に研究を推進している。交付申請書に記載載した研究計画通り研究を推進する。具体的には、最内相を2つ有するダブルエマルションの膜透過試験を行い、膜透過現象を解明する。O/W/Oエマルションの調製に手間取ったため、膜透過試験が一部実施できなかった。そのため試薬やSPG膜の購入予定金額が小さくなった。既にこの点は解決済みで、平成26年度はこれをカバーし、これらの検討も行うことができる。上記のように、次年度使用額として繰り越す金額は、O/W/O系の実験を行うために使用する。平成26年度予算は計画通り執行する予定である。
ヒッポ仮説とアレルゲン性の由来に関する構造生物学的研究

ダニアレルゲンDer f 2は、立体構造が類似している先天性免疫分子MD-2と同様に、リポ多糖を結合することが、核磁気共鳴法やゲルろ過、蛍光測定などによって示された。化学シフト摂動法などの結果から、Der f 2は2枚の大きなβシートの間でリポ多糖の疎水部位(ヒッポ)を捉え、MD-2-リポ多糖複合体に似た構造を作ることが示唆された。これらの結果は、Der f 2がMD-2の代わりに先天性免疫系を活性化することでアレルゲン性を獲得したとする考えと合致する。ダニアレルゲンDer f 2の脂質リガンドの同定については、核磁気共鳴法(NMR)を中心にした各種の方法によって進められた。まず、大腸菌破砕物中から脂質リガンドを同定する試みについては、炭素13と窒素15で標識した破砕物を精製タグ付きDer f 2と混合した後にタグ精製された試料を用いて各種三重共鳴NMRを測定したところ、Der f 2に結合した大腸菌由来のシグナルは(→4 GlcNAc β1→3 Fuc4NAc α1→4 ManNAcA β1→)という三糖の繰り返し構造に合致することがわかった。これは腸内細菌共通抗原の糖部分にあたり、この菌株においては複数候補の脂質部分構造が考えられた。その候補の一つリピドAを脂質部分に持つリポ多糖については、その市販品をDer f 2と混合するとゲルろ過クロマトグラフィーの流出パターンが変化することが共同研究者によりわかったため、さらに結合をNMRの化学シフト摂動法によって確認した。以上の結果を受けて、Der f 2の脂質との相互作用様式を知る目的で、Der f 2とリピドAの混合物の結晶化を行ったところ、Der f 2単体試料では結晶化しない多数の溶液条件で結晶が得られた。現在1.5オングストロームを超える分解能を持つ結晶が得られており、分子置換法によって解析を行ったところ、リガンドと考えられる電子密度が観察されている。しかし回折データの質がまだ不十分であるため、現在結晶化条件の最適化を進めている。ダニアレルゲンDer f2の脂質リガンド複合体の結晶解析については、結晶化条件の最適化を進め結晶の質を改善できたが、位相情報が得られなかったため最終構造を得ることができなかった。その代わりに核磁気共鳴法の化学シフト摂動法を進め、リポ多糖の結合様式を詳細に調べた。その結果、Der f2は2枚のβシートの間の疎水的なポケットを開き、リポ多糖の脂肪酸部分を取り込んで結合することが明らかになった。Der f2の脂質リガンドの検討については、平成19年度の報告書で述べた三糖の繰り返し構造を持つ物質(腸内細菌共通抗原)は複合体の精製を進めることで除去され、大腸菌破砕物中のリガンドはリポ多糖と共通の特徴を持つ糖脂質であることがわかった。一方、市販リポ多糖の結合について解析を進め、数十nMの解離定数を持つ十分強い結合であること、1対1の結合であることがわかった。それに加え、海外からDer p2はリポ多糖だけでなくToll-like receptor4(TLR4)と結合しMD-2の代わりにリポ多糖のシグナルを伝達しうることが報告され、本研究で提唱した仮説が実証された。MD-2のリピドA複合体については、大量発現と精製を進めていたが、海外のグループでTLR4・MD-2・リポ多糖の三者複合体の二量体の結晶構造が得られ、リポ多糖のリピドA部分の脂肪酸はMD-2の構造を変えることなく6本ともタンパク質内部の疎水的空間に納まっていた。今後は他のアレルゲンに関しても同様の仮説を裏付ける生化学的・構造生物学的知見の有無を検討していく必要がある。
肥満の病態形成におけるBDNFの関与；脂肪組織内BDNFシグナル仮説の検証

ノックアウトマウスなどを用いた研究より、記憶や学習などの高次脳機能の発現に必須の分子であるBDNFは、肥満と関連することが指摘されている。これは、BDNFの摂食中枢、すなわち中枢神経系を介した作用によることが指摘されている。一方、研究代表者は最近、高脂肪食により作成した肥満モデルマウスの脂肪組織においてBDNFが体重増加と相関して高発現することを見出した。そこで本研究では、脂肪組織に高発現したBDNFが、病的な肥満の形成に関与するのではないか、という新たな仮説を立て、この仮説の検証を行うことで、将来的に、肥満の新たな治療戦略を構築する。
造血支持細胞株及び幹細胞に発現される機能分子の解析

1)in vitroにおける造血支持能の解析:造血支持能を有しない非造血組織由来の間質細胞にマウスCD34を発現させる。CD34を発現しているクローンと、造血細胞を共培養し、脾コロニー形成細胞(CFU-S)を測定する。この実験では、CD34を発現するクローンが有意にCFU-Sの数を維持し得た。今後、抗体による阻外等の特異性の検討を行う予定である。Wnt遺伝子は、ショウジョウバエの体節形成に係わる遺伝子として同定されたWinglessと構造的に相同性を有する遺伝子である。今回我々が同定した遺伝子はWnt10Bであることがわかった。この蛋白の精製は従来困難であるとされてきたが、バキュロウイルスの系を用いることで、可溶性蛋白として培養上清中に検出された。この蛋白を抗体カラムを用いることで精製を行った。このWnt蛋白は、リガンドとして作用する可能性があることより、その結合蛋白の同定が、作用機序の解明に有用であろうと考えられる。そこでWnt蛋白と各種培養細胞を反応させ、特異的に結合する細胞株の同定を試みた。次いで、このWnt蛋白をヨード評議することにより、結合蛋白の同定を行った。in vitroでの作用を解明する目的で、このWnt蛋白を用いて、骨髄細胞のコロニーアッセイを行った。Wnt蛋白は用量依存性にコロニー形成を阻害した。これらの結果は、Wnt蛋白が造血細胞の分化・増殖に何らかの作用を持つ可能性を示しており、現在実験中である。
ロケット燃焼室の極低サイクル疲労とクリープ相乗による急速損傷蓄積機構の全容解明

液酸液水ロケットエンジンの高信頼化・繰り返し運用の最大の課題は、燃焼室内壁銅合金のクリープ疲労である。着火・停止による大ひずみ振幅の極低サイクル疲労と定常燃焼中の定応力クリープ変形という、発電プラント等ではあり得ない条件が重畳し、線形損傷則よりもはるかに急速な損傷蓄積が生じる。本研究では、クリープ疲労変形中の劣化損傷プロセスを定量的にモデル化し、広い条件範囲での定量的な寿命予測を行い、最終的には累積する損傷度を非破壊検査により定量的に評価することを目的とした。析出硬化した銅合金と焼鈍した銅合金のどちらにおいても、燃焼サイクルを模擬したクリープ疲労試験において、単純クリープ試験・単純疲労試験と比較し大きな寿命低下が見られた。その原因として、クリープ疲労の各サイクル毎に、大塑性疲労変形の導入により、ひずみの蓄積が大きい遷移クリープが発現することと、クリープ疲労寿命の後期に、疲労亀裂とクリープボイドが合体・連結することで損傷が一気に加速する、という二つの要因がわかった。特に焼鈍合金においては、逆遷移クリープが出現することが観察され、その原因として、大きな圧縮応力の負荷による転位導入に伴い加工硬化が生じると,直後のクリープ開始時のひずみ速度は低下するが,クリープ中に転位が回復し変形が容易になり逆遷移クリープが発現する、ということがわかった。累積損傷度を定量的に評価する技術確立のため、途中止めクリープ疲労試験で損傷度のわかった試験片を準備し、1渦電流探傷法、2非線形超音波法、3陽電子消滅法、4レプリカ法の各種非破壊検査手法により欠陥と信号との対応関係を明らかにし、それを基に燃焼室の損傷度を推定した。この中で、渦電流探傷法および陽電子消滅法において寿命推定の可能性が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。液酸液水ロケットエンジンの高信頼化・繰り返し運用を目指す宇宙先進国に共通する最大の課題は、燃焼室内壁銅合金のクリープ疲労寿命である。着火・停止による大ひずみ振幅の極低サイクル疲労と定常燃焼中の定応力クリープ変形という、発電プラント等ではあり得ない条件が重畳し、線形損傷則よりもはるかに急な損傷蓄積が生じる。本研究では、クリープ疲労変形中の劣化損傷プロセスを定量的にモデル化し、広い条件範囲での定量的な寿命予測を行うことを目的とし、以下の成果を得た。クリープ疲労試験では,毎サイクルの応力保持時に遷移クリープが発現し、サイクルの進行に伴ってクリープひずみが増大した。引張時の最大応力は、サイクルの進行に伴い徐々に減少し、15サイクル後からは急激に減少した。また、クリープ疲労試験における破断までの時間(4,900秒)・サイクル数(19サイクル)は、それぞれ単純クリープ試験(58,000秒)・単純疲労試験(42サイクル)と比較し1/10、1/2未満であり、大きな寿命低下が見られた。SEM観察では、15サイクル後に、疲労クラックの先端と、成長したクリープボイドとが粒界において連結し始め、クラック進展が加速することが,ロケットエンジン銅合金の低サイクルクリープ疲労における劣化促進機構であることがわかった。このことは、疲労分野に新しい損傷機構の存在の知見をもたらしたことになると共に、今後、次世代ロケットエンジンの根本的な信頼性向上に寄与すると期待される。本研究結果の最も大きな特徴は、クラック進展経路が終始粒界を選択すること、遷移クリープの発現により積算クリープひずみが、単純クリープに比べ非常に早く蓄積すること、および粒界クリープボイドが進展してきた疲労クラックと連結することである。クリープ疲労試験では,この連結が起こると、わずか数サイクル後に試料が破断した。実機における非破壊検査で必要な、これらの劣化損傷の度合いを正確に検出することが可能となった。析出硬化された銅合金と十分に焼鈍された銅合金のどちらにおいても、燃焼サイクルを模擬したクリープ疲労試験において、単純クリープ試験・単純疲労試験と比較し大きな寿命低下が見られた。その原因として、クリープ疲労の各サイクル毎に、大塑性疲労変形の導入により、ひずみの蓄積が大きい遷移クリープが発現することと、クリープ疲労寿命の後期に、疲労亀裂とクリープボイドが合体・連結することで損傷が一気に加速し、破断に至る、ということがわかった。特に焼鈍合金においては、各サイクル毎の大塑性疲労変形の変形応力が大きい場合に、逆遷移クリープが出現することが観察された。その原因として、大きな圧縮応力の負荷による転位導入に伴い加工硬化が生じると,直後のクリープ開始時のひずみ速度は低下するが,クリープ中に転位が回復し変形が容易になり逆遷移クリープが発現する、ということがわかった。

以上より、ロケットエンジン銅合金のクリープ疲労における劣化促進機構が解明され、疲労分野に新しい損傷機構の存在の知見をもたらしたことになると共に、今後、次世代ロケットエンジンの根本的な信頼性向上に寄与すると期待される。析出硬化および焼鈍銅合金のクリープ疲労における変形・損傷蓄積挙動と、その劣化促進機構の解明については、研究実績の概要に述べたとおりである。この劣化促進機構に基づいて、定量的な寿命予測を行うために、対称三角波形(純粋疲労)と引張ひずみ保持台形波形(クリープ疲労)による低サイクル疲労試験を実施し、ひずみ範囲分割法によるクリープ疲労寿命の予測が可能であることを示した。また、累積する損傷度を非破壊検査により定量的に評価する技術確立のため、クリープ疲労試験を途中で止めて累積損傷度のわかった試験片を準備し、複数の非破壊検査手法により欠陥と信号との対応関係を明らかにし、それを基に燃焼室の損傷度を推測する共同研究を実施している。液酸液水ロケットエンジンの高信頼化・繰り返し運用の最大の課題は、燃焼室内壁銅合金のクリープ疲労である。着火・停止による大ひずみ振幅の極低サイクル疲労と定常燃焼中の定応力クリープ変形という、発電プラント等ではあり得ない条件が重畳し、線形損傷則よりもはるかに急速な損傷蓄積が生じる。本研究では、クリープ疲労変形中の劣化損傷プロセスを定量的にモデル化し、広い条件範囲での定量的な寿命予測を行い、最終的には累積する損傷度を非破壊検査により定量的に評価することを目的とした。析出硬化した銅合金と焼鈍した銅合金のどちらにおいても、燃焼サイクルを模擬したクリープ疲労試験において、単純クリープ試験・単純疲労試験と比較し大きな寿命低下が見られた。その原因として、クリープ疲労の各サイクル毎に、大塑性疲労変形の導入により、ひずみの蓄積が大きい遷移クリープが発現することと、クリープ疲労寿命の後期に、疲労亀裂とクリープボイドが合体・連結することで損傷が一気に加速する、という二つの要因がわかった。特に焼鈍合金においては、逆遷移クリープが出現することが観察され、その原因として、大きな圧縮応力の負荷による転位導入に伴い加工硬化が生じると,直後のクリープ開始時のひずみ速度は低下するが,クリープ中に転位が回復し変形が容易になり逆遷移クリープが発現する、ということがわかった。累積損傷度を定量的に評価する技術確立のため、途中止めクリープ疲労試験で損傷度のわかった試験片を準備し、1渦電流探傷法、2非線形超音波法、3陽電子消滅法、4レプリカ法の各種非破壊検査手法により欠陥と信号との対応関係を明らかにし、それを基に燃焼室の損傷度を推定した。この中で、渦電流探傷法および陽電子消滅法において寿命推定の可能性が示された。これまでは、クラック発生が確認された温度である480°Cにおいてのみ、クリープ疲労試験を実施してきた。今後は、これまでよりも低い温度での試験も含め、高温(750°C)・中温(480°C)・低温(350°C)でのクリープ損傷・疲労損傷の寄与を調査し、各温度域における損傷進展過程を解明することで、劣化促進機構の全体像を把握する。また、転位セル組織の有無については、EBSD解析やECC観察の他に、XRD測定を用いたCMWP(Convolutional Multiple Whole Profile)法が有効であるとの報告から、EBSD解析、ECC観察とともにCMWP法を実施することで、本研究で提案された遷移クリープ発現機構の更なる検討を実施する。
潜在的致死性遺伝子の進化を用いた蛋白質間高次相互作用の解析

ヌクレアーゼ様E群コリシンはプラスミドによりSOS誘発合成され,感受性大腸菌表層のレセプターに結合したあと,最終的には. DNase活性(E2, E8)あるいはDNase活性(E3, E6)により菌を殺す.酵素活性はC末端の"T2A"領域に局在しており,各T2Aに特異的なインヒビターImm蛋白質により生産菌は致死とならない.一次構造の比較から,各プラスミドはT2A-Imm遺伝子領域を変化させて, E2【tautomer】d8→E3→E6と進化したと推定したが, T2AとImm領域には各結合特異性を反影した特殊な共進化が働いたと推定された. 1.上記の共進化モデルをもとに, CQZE3-immE6ハイブリッドプラスミドを作製して,コリシン発現条件で致死とならないプラスミド変異を分離することにより, T2AとImm間の相互作用を遺伝子側から解析しようとした.前年度は,この方法でImmE3上の84アミノ酸中, Cys-48がE3特異性に決定的に重要であることを示したが,今年度はコリシン側の変異を求めた.しかし得られた三つの変異体はナンセンス変異か,ミスセンスでコリシン活性そのものが低下する変異で, Immとの相互作用が変化したものは得られなかった.Cys-48と相互作用するアミノ酸は, COZE6-immE3プラスミドを出発としてimmE3株を殺せなくなったコリシンE6変異体として固定されるものと思われる.2.前年度, immE3とimmE6の間で6種のキメラimm遺伝子を作製したが,今年度はそれらのE3, E6に対する耐性度を定量化して,各アミノ酸の寄与を評価した.即ち, ImmE3ではCys-48が,他のE3型アミノ酸すべてを結合したものよりE3特異性への寄与が大きいことを確認し,更にImmE3ではGlu-20が,またImmE6ではHis-6とTrp-48が,相乗的に働いて各結合特異性を決定していることが示唆された.今後,これらキメラ蛋白質や野生型のT2A及びImm蛋白質を精製して, NMR等により物理化学的にT2AとImmとの相互作用を解析していく予定である.ヌクレアーゼ様E群コリシンはプラスミドによりSOS誘発合成され,感受性大腸菌表層のレセプターに結合したあと,最終的には. DNase活性(E2, E8)あるいはDNase活性(E3, E6)により菌を殺す.酵素活性はC末端の"T2A"領域に局在しており,各T2Aに特異的なインヒビターImm蛋白質により生産菌は致死とならない.一次構造の比較から,各プラスミドはT2A-Imm遺伝子領域を変化させて, E2【tautomer】d8→E3→E6と進化したと推定したが, T2AとImm領域には各結合特異性を反影した特殊な共進化が働いたと推定された. 1.上記の共進化モデルをもとに, CQZE3-immE6ハイブリッドプラスミドを作製して,コリシン発現条件で致死とならないプラスミド変異を分離することにより, T2AとImm間の相互作用を遺伝子側から解析しようとした.前年度は,この方法でImmE3上の84アミノ酸中, Cys-48がE3特異性に決定的に重要であることを示したが,今年度はコリシン側の変異を求めた.しかし得られた三つの変異体はナンセンス変異か,ミスセンスでコリシン活性そのものが低下する変異で, Immとの相互作用が変化したものは得られなかった.Cys-48と相互作用するアミノ酸は, COZE6-immE3プラスミドを出発としてimmE3株を殺せなくなったコリシンE6変異体として固定されるものと思われる.2.前年度, immE3とimmE6の間で6種のキメラimm遺伝子を作製したが,今年度はそれらのE3, E6に対する耐性度を定量化して,各アミノ酸の寄与を評価した.即ち, ImmE3ではCys-48が,他のE3型アミノ酸すべてを結合したものよりE3特異性への寄与が大きいことを確認し,更にImmE3ではGlu-20が,またImmE6ではHis-6とTrp-48が,相乗的に働いて各結合特異性を決定していることが示唆された.今後,これらキメラ蛋白質や野生型のT2A及びImm蛋白質を精製して, NMR等により物理化学的にT2AとImmとの相互作用を解析していく予定である.
非線型拡散方程式における特異極限と界面現象の研究

非線型反応拡散方程式系において,拡散係数を非常に小さくすると,"内部遷移層"をもつ解が現れる.内部遷移層とは,空間内のある曲面を境に,解の値がほとんど不連続にみえるほど急激に変化している部分のことである.拡散係数を0に近づけた特異極限下では,この内部遷移層は厚さが0の曲面"界面"に収束し,もとの非線型拡散方程式系に対する解析はこの界面の挙動を記述する方程式の解析に帰着される.本年度は数理生態学に現れる競争系とよばれる連立系について研究を進めた.この方程式系は同じ領域内で相争って生息する2種の生物の個体数密度を記述したものである.2種の生物の競争が比較的激しい場合には,競争系はいわゆる双安定型のシステムになる.本研究では競争系の界面方程式を導出し,解が形成した遷移層の動きが導出された界面方程式に支配されることを数学的に厳密に証明することができた.特異極限における界面方程式を厳密に導出する作業は,通例,優解劣解を構成する手法を用いる.本研究もその手法に従っている.ただ,この方法の難点は優解と劣解の間隔が拡散係数を0に近づけると共に急速に狭くなっていき,そのため優解劣解ではさまれる初期値のクラスが非常に制限されてしまう点にある.本研究では,非常に広いクラスの初期値から出発した解が,きわめて短時間の間に遷移層を形成することを証明し(generation of interface),その結果,解が優解劣解に挟まれる狭い領域に入ることを示すことで上記の困難を克服する.この成果について2002年7月に研究集会「界面ダイナミクスを再現する数値解析法の開発と実験分野への応用についてII」において,また2003年3月に日本数学会年会において発表した.ある種の非線型反応拡散方程式系では,拡散係数が極端に小さいと,いわゆる"内部遷移層"をもつ解が現れる.内部遷移層とは,空間内のある曲面を境に,解の値がほとんど不連続にみえるほど急激に変化している部分のことである.本研究では,物理学や数理生態学にあらわれる双安定型とよばれる反応拡散方程式を扱う.この方程式は特に物理学における相転移現象を既述するモデルとして古くから知られている.本研究の目的は,この方程式の内部遷移層をもつ定常解の存在,形状や安定性などの詳しい性質を明らかにすることである.本年度の研究の成果は次のようである.(1)任意の数の遷移層をもつ定常解をすべてみつけ,その存在を証明した.(2)それぞれの解のモース指数(安定度をはかる指数)は,定常解がもつ遷移層の位置と数により,完全に決定されることを証明した.非線型力学系の分野においてよく知られていることであるが、すべての定常解を発見し,そのモース指数を調べる操作は,拡散反応方程式の解全体のダイナミクスを明らかにするための重要な鍵である.本研究では,ある指定した(しかし任意の)数の遷移層をもつ定常解をすべて発見することができ,その形状,安定性に関する詳しい結果がえられた.これは拡散方程式の解全体のダイナミクスを示唆するものである.実際この結果により,任意の初期データにたいするこの方程式の解が,どのような振る舞いをするか,かなり詳しく予想することができるようになった.これらの成果を国内外で発表し,他の研究者らと研究連絡をおこなうため,研究費のほとんどを旅費として使用した.また海外の研究者と研究連絡をおこなうため通信費(郵便代)を使用した.非線型反応拡散方程式系において,拡散係数を非常に小さくすると,"内部遷移層"をもつ解が現れる.内部遷移層とは,空間内のある曲面を境に,解の値がほとんど不連続にみえるほど急激に変化している部分のことである.拡散係数を0に近づけた特異極限下では,この内部遷移層は厚さが0の曲面"界面"に収束し,もとの非線型拡散方程式系に対する解析はこの界面の挙動を記述する方程式の解析に帰着される.本年度は数理生態学に現れる競争系とよばれる連立系について研究を進めた.この方程式系は同じ領域内で相争って生息する2種の生物の個体数密度を記述したものである.2種の生物の競争が比較的激しい場合には,競争系はいわゆる双安定型のシステムになる.本研究では競争系の界面方程式を導出し,解が形成した遷移層の動きが導出された界面方程式に支配されることを数学的に厳密に証明することができた.特異極限における界面方程式を厳密に導出する作業は,通例,優解劣解を構成する手法を用いる.本研究もその手法に従っている.ただ,この方法の難点は優解と劣解の間隔が拡散係数を0に近づけると共に急速に狭くなっていき,そのため優解劣解ではさまれる初期値のクラスが非常に制限されてしまう点にある.本研究では,非常に広いクラスの初期値から出発した解が,きわめて短時間の間に遷移層を形成することを証明し(generation of interface),その結果,解が優解劣解に挟まれる狭い領域に入ることを示すことで上記の困難を克服する.この成果について2002年7月に研究集会「界面ダイナミクスを再現する数値解析法の開発と実験分野への応用についてII」において,また2003年3月に日本数学会年会において発表した.
3 テスラMRI から探る白質病変ドライバの交通事故メカニズム

健常者の脳組織に高頻度で認められる大脳白質病変(LA)が、交差点交通事故に有意に相関することを既に報告している。LAが関与する交通事故メカニズム探索として、MRIによる神経繊維束解析を行った。第一次視覚領野から前頭前野に投射している前頭後頭神経束を標的にしてFAを計測した。LAの無いコントロール群(1)とLAを有し過去10年間で交差点事故を経験した群と比較した。さらに、この群はLAを有するが運転能力が高い群(2)、運転能力が低い群(3)に分けた。左右の前頭後頭神経束とも(1)(2)(3)の順でFA平均値が有意に低下した。LAが関与する交通事故メカニズムは、FA値で評価される情報処理ネットワークの器質的ダメージが関与していると示唆された。脳ドック受診者の脳MRIデータと過去10年間の事故歴聞き取り調査結果との照合から、健常ドライバに高頻度で見られる無症候性大脳皮質下白質病変(白質病変)と交通事故(特に交差点事故)との有意の関連性を認めた。事故原因は白質病変が脳内情報伝達メカニズムに影響したためと考えられる一方、白質病変ドライバが全て事故と関連性があるわけでない。そこで、白質病変周辺部の神経繊維束解析(脳内情報伝達路の評価)を白質病変ドライバで事故歴の有無でグループ分けした被験者対象に行った。前頭前野皮質下の大脳白質に存在する白質病変を含む神経繊維束の評価パラメータであるFA (fractional anisotropy)値とADC (apparent diffusion coefficience)値を事故歴の有無で比較した。事故あり群10名、事故なし群10名からFA値・ADC値を求め各々の平均値をt検定した。事故有り群は事故なし群に較べて有意にFA値は低く、ADC値は高かった。白質病変ドライバでは、白質病変周辺部の神経繊維束解析を行うことで、事故リスクを予測できる可能性が示唆された。サンプル数を増やして、さらに検証を進めている。
サル頭頂連合野および海馬系における認知地図の神経機構の解明

今年度は、前年度までに学習させた仮想空間でのナビゲーション課題を遂行しているサルの頭頂連合野からニューロン活動を記録した.用いたナビゲーション課題は,サルの前に配置した100インチの大型スクリーン上に,コンピュータ・グラフィックスによる立体的な仮想空間を作り出し,その空間内のある地点から別の地点までジョイスティックを使って移動するというものであった.具体的には,各試行のはじめに目的地の画像を手がかりとして呈示し,約1秒間の間隔の後にスタート地点から指示した目的地まで移動することを課題とした.課題遂行時のサルの頭頂葉内側壁(領野としては、7m野,後部帯状回,脳梁膨大後部皮質)のニューロン活動を記録・解析した結果,仮想空間内の特定の場所において活動性を上昇させるニューロンが見受けられた.定量的な解析の結果,記録した361個のニューロンの内,ある場所に対して反応していたものは179(50%)で,場所によって活動性を変化させた,つまりある特定の場所に対して選択的に応答していたものは141(39%)であった.さらに,ある場所で右に旋回したときに活動性を上昇させるというような,特定の場所での特定の行動に反応しているニューロンも見受けられた.このようなニューロンは、ある特定のルートを辿ることに関係していると思われる.以上のような結果は,頭頂葉内側壁にはナビゲーションをおこなうことに関係したニューロンが存在することを示唆している.今年度は、前年度までに学習させた仮想空間でのナビゲーション課題を遂行しているサルの頭頂連合野からニューロン活動を記録した.用いたナビゲーション課題は,サルの前に配置した100インチの大型スクリーン上に,コンピュータ・グラフィックスによる立体的な仮想空間を作り出し,その空間内のある地点から別の地点までジョイスティックを使って移動するというものであった.具体的には,各試行のはじめに目的地の画像を手がかりとして呈示し,約1秒間の間隔の後にスタート地点から指示した目的地まで移動することを課題とした.課題遂行時のサルの頭頂葉内側壁(領野としては、7m野,後部帯状回,脳梁膨大後部皮質)のニューロン活動を記録・解析した結果,仮想空間内の特定の場所において活動性を上昇させるニューロンが見受けられた.定量的な解析の結果,記録した361個のニューロンの内,ある場所に対して反応していたものは179(50%)で,場所によって活動性を変化させた,つまりある特定の場所に対して選択的に応答していたものは141(39%)であった.さらに,ある場所で右に旋回したときに活動性を上昇させるというような,特定の場所での特定の行動に反応しているニューロンも見受けられた.このようなニューロンは、ある特定のルートを辿ることに関係していると思われる.以上のような結果は,頭頂葉内側壁にはナビゲーションをおこなうことに関係したニューロンが存在することを示唆している.