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正倉院に伝来した写経所文書の復原的研究

1.昨年度は、山本・栄原が正集と続々修、森・宮崎が続修と続々修にそれぞれ収載される帳簿の内容を検討し、紙焼写責を観察して復原を試みたが、今年度は、山本・栄原が続修後集と続々集、森・宮崎が続修別集と続々修に収載される帳簿を昨年度と同様の手法を用いて考察し、復原を試みた。また、東京大学史料編纂所編纂『正倉院文書目録』4(続修別集)が刊行されたため、続修別集に収載される帳簿の復原結果が妥当であるかどうかの検証作業も同時に行った。2.今年度は、山本・栄原・森・宮崎が主催する写経所文書研究会を2回実施した。まず、1999年5月22日に森が「宝亀年間東大寺写経所の一切経書写事業」と題して発表し、先行研究を踏まえて、先一切経の帙構成のあり方とそこに含まれる注大品経の意味、十部一切経書写に先行する先一切経書写の目的などに考察を加えた。次いで、2000年3月24日に宮崎が「奈良時代の経典目録について」と題して発表し、年次不明とされる経典目録の断簡の整理検討を通して、当時の日本に伝来していた経典の様相について考察を加えた。3.1999年11月19日、山本は東京大学史料編纂所に出張し、「寧楽正倉院続修成巻文書目録」「続々修正倉院古文書目録」などを実見した。昨年度に続いて、続々修に編成される以前の帳簿の状態を調査したが、紙焼写真に見える2種類の付箋の持つ意味の解明が復原研究にとって重要であるとの認識を強くした。この他、編纂所が所蔵する正倉院関係の文献・史料(多くはマイクロフィルムの紙焼写真)の目録作りも試みた。1.本年度も分断された状態にある写経所文書(大半は帳簿)を復原するため、紙焼写真をもとに、続々修と塵芥の照合による接続関係の検証を行ない、あわせてこの3年間の作業結果を整理検討した。2.本年度は、写経所文書研究会を2回実施した。1回目は2000年9月15日に栄原が「食口案について」と題して宝亀年間の食口案を分析する方法を発表し、今後の写経所文書研究の進むべき方向を提示した。2回目は、12月22日に静岡県立美術館を訪れ、正倉院から流出した「天平勝宝4年東大寺写経所請経文」「天平4年山背国愛宕郡計帳断簡」(いずれも重要文化財)を実見し、写真からでは窺えない紙質、墨蹟、貼り継ぎ状態、表装の実状などについて精査した。3.報告書作成のための編集作業を行い、以下のように報告の分担を取り決めた。(1)山本:天平宝字68年の写経関係文書の整理検討結果を表示し、これらがどのような形をとって伝来するに至ったかをまとめる。(2)栄原:宝亀年間の食口案に盛られた大量の情報を読み取るための方法を提示し、そこから抽出しうる事実を試論的に展開する。(3)森:宝亀年間の一切経書写の関係史料をもとに一切経の一覧表を作成し、宝亀以前の一切経書写との比較を試みる。(4)宮崎:天平天平宝字期に見られる目録類を抽出し、それを表示するとともにその内実の考察を試みる。
農業環境工学と産業・技術教育を融合した新しい生物育成・情報学習システムの開発

生物育成・飼育の過程を温度・湿度・気圧・光・三軸加速度・磁気・GPSの各種センサとWebカメラで捉え,植物(あるいは動物)の育成情報を各種計測データと画像データにより多面的に解析することで育成環境の管理と適切な評価を行える学習システムを構築した。このように,生物育成(栽培)と情報(マルチメディアと計測・制御)を統合したシステムとして扱うという手法は,産業・技術教育分野において全く新しいアプローチである。さらに,産業・技術教育分野における小型無線センサネットワークを利用した生物育成評価法は,本研究課題(前述の先行研究を含む)固有のアプローチであり,極めて独創性に富む内容である。本研究課題は農業環境工学ー産業・技術教育の融合によって,科学技術に対する意識の涵養を担う中学校技術科教育に必要な生物育成・飼育と情報を網羅した従来類のない新規の学習システムの開発を目的としている。具体的には,以下の4段階からなる研究を相互に密接に関連させて実施することで,実用レベルの成果を得ることを目標としている。(1)生物育成・飼育に係る環境情報・画像データを自動計測する学習システムの研究開発,(2)自律ロボットを題材とした情報プログラム学習の研究開発,(3)上記(1)から(2)を産業・技術教育の現場で検証し,必要に応じて(1),(2)にフィードバックして完成度を高める。(4)中学校技術科教育における栽培ーマルチメディアー計測・制御に適用する新しい学習システムを完成させる。平成25年度は地理情報システムGISを活用し,新潟県三条市川通北地区の電子地図作成と営農情報の入力を行った。これら情報は,わが国を代表する食料である水稲栽培に係る篤農家の暗黙知を定量化することで地域の営農技術の継承と経営安定に貢献する点で重要な意義を持つ。さらに,圃場を利用した食料生産に欠かせない農業機械を利用した耕うんに係るエネルギー消費を定量化して評価するシステムの構築を行った。このシステムを水稲作,畑作などへ適用範囲を拡大することで,食料生産に係る温室効果ガス排出量を定量化でき,農業生産と地球温暖化を関連付けて学習することができる。申請者は農作業の省力化・自動化を目的として,不整地を走行する産業用車両である農用トラクタの自律走行に係わる走行制御技術の開発研究に従事してきた。その過程でGPS(全地球測位システム),ジャイロ(物体の角度や角速度を検出する計測器)などの各種センサ情報やカメラを入力とした画像処理プログラムの農業環境・情報工学分野への適用可能性について検討してきた。そして近年,本研究において計測・制御の根幹をなす小型無線センサネットワークの適用性を検討する過程で,これまでの自律走行車両に係わる研究蓄積を産業・技術教育の現場に適用できるのではないかとの考えに至った。今年度は,生物育成・飼育に係る環境情報を小型無線センサネットワークにより計測して評価する技術を開発した。ほ場に設置した無線センサネットワークノードから得られる温度,湿度,地温,土壌水分などの環境情報とWebカメラによる播種から収穫まで画像データを関連付けてコンピュータに保存する環境情報計測システムの研究開発を行った。生徒はこれらのデータをもとに育成条件と画像データを比較しながら育成技術の適切な評価が可能となる。不整地を走行する産業用機械である農用トラクタの自律走行制御技術の開発過程で蓄積した知見を生かして,産業・技術教育の現場に適用可能な工作可能な小形自律型ロボットを提案した。さらに,その自律型ロボットに無線センサネットワークノードを搭載し,コンピュータに接続した基地局からの遠隔操作が可能なプログラム学習教材としてまとめた。本研究課題は,農業環境工学ー産業・技術教育の融合によって,科学技術に対する意識の涵養を担う中学校技術科教育に必要な生物育成・飼育と情報を網羅した新規の学習システムの開発を目的としている。平成23年度は生物育成・飼育に係る環境情報計測システムとして,市販表計算ソフトを用いることで,生物育成・飼育を学ぶ上で基礎となる土壌中の水分について,パラメータを変えてシミュレーションしながら,その結果を可視化して理解するプログラム開発を行った。そして,開発したプログラムの妥当性を試作実験装置により検証した。さらに,生物育成・飼育に関連して土壌の耕うんに必要なエネルギーを評価するシステムの構築を行い,生徒が生育環境情報と生育状態の関係を後からでも視覚的に理解できる要素プログラムを開発した。自律型ロボットを活用した情報プログラム学習システムの研究開発については,教育現場の協力者とTV会議による打合せを行い,授業時間やカリキュラムとの関連から実現可能な実施プログラムの検討を行った。申請者は農作業の省力化・自動化を目的として,不整地を走行する産業用車両である農用トラクタの自律走行に係る走行制御技術の開発研究に従事した。その過程で,GPS(全地球測位システム),ジャイロ(物体の角度や角速度を検出する計測器)などの各種センサ情報やカメラを入力とした画像処理プログラムの農業環境・情報工学分野への適用可能性について検討してきた。

そして近年,本研究において計測・制御の根幹をなす小型無線センサネットワークの適用可能性を検討する過程で,これまでの自律走行車両に係る研究蓄積を産業・技術教育の現場に適用できるのではないかとの考えでに至った。今年度は,生物育成・飼育に係る環境情報を小型無線センサネットワークにより計測して評価するシステムを教育現場の教材として利用可能な状態に取りまとめた。本システムでは,ほ場に設置した無線センサネットワークノードから得られる温度,湿度,地温,土壌水分などの環境情報とWebカメラによる播種から収穫までの画像データを関連付けてコンピュータに保存することができる。しかし,本システムを生徒が教室で利用する場合,教師から生徒への一方通行の情報提示となりがちである。そのため,本システムを題材とした電子ペーパーとタブレットを使用した反転授業資料を作成し,生徒がこれらのデータをもとに育成条件と画像データから育成技術に関することを支援した。農業環境・情報工学研究目的の達成度という視点からは,教育現場での検証がやや不足している。そのため現場の研協力者と協議し,Skypeを活用した双方向の意見交換を行い,マルチメディア教材の実装に向けた打合せを拡充している。平成25年度に栽培ーマルチメディアー計測制御に適応可能な学習システムの開発を行った。産業技術教育の現職教員から,ほ場で発生する温室効果ガスを視覚化して生徒が理解を深める機能の付与は教育現場で革新的な役割を果たすとの提案があった。研究代表者は最終年度の計画を変更し,低濃度ガスをモニタリング可能な特注センサを関連企業の協力のもとに行うこととなった。本研究課題は,農業環境工学ー産業・技術教育の融合によって,科学技術に対する意識の涵養を担う中学校技術科教育に必要な生物育成・飼育と情報を網羅した従来類のない新規の学習システムの開発を目的としている。具体的には,以下の4階層からなる研究を相互に密接に関連させて実施することで,実用レベルの成果を得ることを目標としている。(1)生物育成・飼育に係る環境情報・画像データを自動計測する学習システムの研究開発。(2)自律型ロボットを題材とした情報プログラム学習の研究開発。(3)上記(1)(2)を産業・技術教育の現場で検証し,必要に応じて(1),(2)にフィードバックして完成度を高める。(4)中学校技術科教育における栽培ーマルチメディアー計測・制御に適用する新しい学習システムを完成させる。平成23年度は,上記の(1)と(2)について研究を実施した。その結果,生物育成・飼育の基礎となる土壌水分を理解できるシミュレーションプログラムと土壌を耕うんする際に必要となるエネルギーを算出するシステムの開発を行った。しかし,購入予定であったWebカメラが開発中止になったことと無線センサネットワークの仕様変更が重なり,環境情報の取得に関する要素プログラムの構築がやや遅れている。
Stevens転位は本当に[1,2]転位なのか?

Stevens転位はアンモニウムイリドの典型反応の一つであり,その反応機構は[1,2]ラジカル転位であると言われている.私は今までにN-benzyl-N,N-dimethyl-α-(trimethyl-silyl)alkylammonium halidesの脱シリル化によってN,N-dimethylbenzylammonium alkylidesを発生させその化学的挙動を研究し,Stevens転位はイリドよりの直接[1,2]転位ではなく,[2,3]->[1,3]の2段階転位反応であることを報告してきた.今回の研究ではStevens転位の機構をより明確にするため,[2,3]転位を起こさないN-alkyl-N,N-dimethylammonium N-benzylideをN-alkyl-N,N-dimethyl-α-(trimethyl-silyl)benzylammonium halideの脱シリル化によってイリドアニオンを位置特異的に生成させ,転位反応を調べた.転位基がメチル,エチルの場合は[1,2]転位,[2,3]転位とも起こらず,脱シリル化した所にプロトンが入ったアンモニウム塩を主生成物として得た.ところが転位基がシアノメチル基の時にはStevens転位体が主生成物として得られた.このことは[2,3]転位を起こすことが出来ない場合でも転位基がラジカルを安定化する時は,Stevens転位はイリドより直接[1,2]転位を起こすことを示した.Stevens転位では転位基の立体が保持されることが知られている.[2,3]転位を経由するStevens転位でも立体が保持されるかを調べた.S-(-)-N,N-dimethyl-1-phenethyl-amineより合成した光学活性なS-(-)-N,N-dimethyl-N-(trimethylsilyl)methyl-1-phenethylammonium iodideの脱シリル化反応で[2,3]転位によるイソトルエン化合物とし,これに紫外線を照射し,Stevens体を得た.得られた化合物は67%eeの光学純度を示し,立体が保持されたことが判明した.Stevens転位には2つの反応機構があることを明らかにした.Stevens転位はアンモニウムイリドの典型反応の一つであり,その反応機構は[1,2]ラジカル転位であると言われている.私は今までにN-benzyl-N,N-dimethyl-α-(trimethyl-silyl)alkylammonium halidesの脱シリル化によってN,N-dimethylbenzylammonium alkylidesを発生させその化学的挙動を研究し,Stevens転位はイリドよりの直接[1,2]転位ではなく,[2,3]->[1,3]の2段階転位反応であることを報告してきた.今回の研究ではStevens転位の機構をより明確にするため,[2,3]転位を起こさないN-alkyl-N,N-dimethylammonium N-benzylideをN-alkyl-N,N-dimethyl-α-(trimethyl-silyl)benzylammonium halideの脱シリル化によってイリドアニオンを位置特異的に生成させ,転位反応を調べた.転位基がメチル,エチルの場合は[1,2]転位,[2,3]転位とも起こらず,脱シリル化した所にプロトンが入ったアンモニウム塩を主生成物として得た.ところが転位基がシアノメチル基の時にはStevens転位体が主生成物として得られた.このことは[2,3]転位を起こすことが出来ない場合でも転位基がラジカルを安定化する時は,Stevens転位はイリドより直接[1,2]転位を起こすことを示した.Stevens転位では転位基の立体が保持されることが知られている.[2,3]転位を経由するStevens転位でも立体が保持されるかを調べた.S-(-)-N,N-dimethyl-1-phenethyl-amineより合成した光学活性なS-(-)-N,N-dimethyl-N-(trimethylsilyl)methyl-1-phenethylammonium iodideの脱シリル化反応で[2,3]転位によるイソトルエン化合物とし,これに紫外線を照射し,Stevens体を得た.得られた化合物は67%eeの光学純度を示し,立体が保持されたことが判明した.Stevens転位には2つの反応機構があることを明らかにした.2.Stevens転位と競合する[2,3]転位を起こさないと考えられるN,N,N-trimethylammonium N-benzylideをN,N,N-trimethyl-alpha-(trimethylsilyl)benzylammonium iodideの脱シリル化によって非塩基性条件下で生成させ,転位反応を調べた.Stevens転位([1,2]転位),Sommelet-Hauser転位([2,3]転位)ともに起こらず脱シリル化したアンモニウム塩のみを得た.この反応で1時間後にアルデヒドを加える実験を行なったところアルデヒド付加体が得られた.これはイリドが反応系内に少なくとも1時間は存在していることを示している.このようなことは今までに報告されていないことである.今後,更にStevens転位と競合する[2,3]転位を起こさないイリドを脱シリル化法および塩基を用いる方法で生成させ,「[2,3]転位中間体を経由しないとStevens転位は起こらない」という仮説を証明したいと考えている.

1.今までにStevens転位として報告されていた例を調べると,ほとんどの場合,転位基がベンジル基であり,アルキル基の例は少なく,あっても低収率であることが判った。これはStevens転位がイリドよりの直接[1,2]転位ではなく,[2,3]->[1,3]の2段階転位反応であることを示唆していた。[2,3]転位を起こさないN-alkyl-N,N-dimethylammonium N-benzylideをN-alkyl-N,N-dimethyl-α-(trimethylsilyl)benzylammonium halideの脱シリル化によってイリドアニオンを位置特異的に生成させ,転位反応を調べた。転位基がメチル,エチルの場合は[1,2]転位.[2,3]転位とも起こらず,脱シリル化した所にプロトンが入ったアンモニウム塩を主生成物として得た。ところが転位基がシアノメチル基の時にはStevens転位体が主生成物として得られた。このことは[2,3]転位を起こすことが出来ない場合でも転位基がラジカルを安定化する時は,Stevens転位はイリドより直接[1,2]転位を起こすことを示した。つまり,Stevens転位には2つの反応機構があることが明らかになった。2.[2,3]転位を経由するStevens転位でも立体が保持されるかを調べた。S-(-)-N,N-dimethyl-1-phenethylamineより合成した光学活性なS-(-)-N,N-dimethyl-N-N-(trimethylsilyl)methyl-1-phenethylammonium iodideの脱シリル化反応で[2,3]転位によるイソトルエン化合物を得た。これに紫外線を照射し,Stevens体を得た。得られた化合物は67%eeの光学純度を示し,立体が不完全ではあるが保持されたことが判明した。このキラリティートランスファーの機構は分子軌道法によって反応機構をシミュレーションすることにより考察した。
励起癌細胞の螢光スペクトル分析検診法の研究

本研究は、単色性に優れ高輝度のレーザーの特徴を利用し、これまでとほとんど試みられていない細胞レベルでの、従来の病理形態学的細胞診法に新たな分光計測学的検診法を提供することを目的としている。今年度は以下に示す研究を遂行し、今年度の当初の目的を達成することができた。まず、腫瘍親和性を示す各種の色素について分光学的測定を行ない、細胞内外における多くの基礎データを測定し得ることができた。これに先立って、本研究ではこれらの分光データを得るため、また実際に生きた細胞の分光学的検診法に適用できる「レーザー励起生体細胞差分蛍光分析検診システム」を試作完成させた。本システムは、レーザー励起法の特徴を生かし、従来にない高効率、高感度な極めて明るい分光システムで、しかも2波長同時測光可能な2チャンネル分光システムである。また、このシステムは全てマイクロコンピュータ制御であり、例えば細胞の塗沫標本を任意にレーザー走査し、癌性細胞の蛍光分布を瞬時にデスプレイでき、必要に応じ任意波長で、差分や微分スペクトル表示も可能な新システムである。また、本年度設備費で購入したコンピュータ用ビジコンカメラも装備し、分光蛍光像を直ちに表示し、癌性細胞の有無を判断できるようにした。この装備についてはまだ不完全な作動なので、今後次年度等に補助を受ければ、付属装置を加え、より完全なシステムにする予定である。今年度は、これらのシステムを用い、各種培養細胞についてレーザー励起蛍光スペクトルの多くの基礎データを集積した。その結果、生体細胞における癌性判断について極めて有意なスペクトル検診法が見い出された。次年度以降は、これらのシステムの充実を計ると共に、生検による細胞診のデータを集積し、臨床応用を試みる予定である。
広島原爆の中性子とガンマ線線量の実験的再評価に関する研究

本年度(平成13年度)まで過去3年間の研究は、今までの結果に基づき、アメリカ側と交渉する事が中心であった。平成12年12月と平成13年3月には広島で6月にクリーブランドで会議が開催され話し合いを持った。クリーブランドでは平成14年3月までに結論を出したいとの養成があった。しかしながら日本側としては今までも話し合いが十分でないとして、話し合いをもっと進めるべきであるとして注文を付けた。ここではドイツのリュームのCI-36のデータの発表が中心であった。このデータはユーロピウムと違い、1Km付近でDS86と一致している。その後平成14年3月1日にサンディエゴの近くのSAICで日米の会議がもたれた。ここでは、厚生省からもDOEも参加していた。科学者グループでは葉佐井と星。アメリカ側は代表のヤング、SAICからカウルとエグバート、クリスティ、サントロ、ストローメであった。話はヤングの説明と質疑応答であった。結論として、ソースタームはそのままで、高さは20m引き上げ600mとし、エネルギーは15ktとそのままであった。内容的には、直線距離で1km以遠はDS86と一緒である。内容としては、1.塩素は爆心付近でまたデータが低い、1km付近は合っている。2.ユーロピウムは爆心付近が一致しているが、1km付近で高い。3.コバルトなどは程々。4.燐のデータはやや計算が低めだが程々か。5.銅は程々に合っている。6.TLDはほとんど変わらないが近距離で少しだけ低いかどうかであった。それに対し質疑応答を進めたが、線源項の変更は、担当しているロスアラモスが変更はあり得ないといっているので無理であるとの説明であった。原爆の線源項を変更しない条件ではこの変更がベストであろう。ただ正解かどうかはわからない。現在、実際の被爆石を使った国際相互比較が進行中であるので、その結果がまたれる。広島長崎の線量評価体系(DS86)と測定データとの不一致の問題を解決するために、今年度は次のことに重点を置いて研究した。1上記不一致の問題が広島特有のものかどうかを調べるためには、同じ原爆にあった長崎のデータで確認することが重要なかぎとなることが判明した。そこですでに測定されている長崎のデータを調べると、遠距離のデータは少なく近距離でもばらつきが多い。そこで、我々は長崎の試料を集め直して静間らが測定を行った。現在爆央から1000m付近までのデータが揃いつつある。まだ確定的ではないがDS86の中性子で計算した長崎のEu-152の生成量と比較すると広島の場合と同じく測定データの方が高い値を示す傾向にある。このことはCo-60の橋詰データと傾向が一致するものの、ストローメのCl-36や中西のEu-152データの傾向とは一致しない。中性子の輸送計算に重要なヒントを与えるのでさらに検討が必要である。2被爆者の被爆線量は、速中性子により与えられる。そこで当然ながら速中性子で反応してできたNi-63も注目されている。そのため被爆した銅試料の提供を新聞で呼びかけ、数点の資料を集めた。日本では柴田らが液体シンチレータ法で有意義な計数は得られるものの、試料処理に問題が残っているため、目下再処理を続けている。加速器質量分析ではリバモアとミュンヘンで同じ試料を用いて測定されたが結果が食い違っている。

新たな試料を求め良いデータがでることが望まれる。3理論的には爆弾の高度の問題や爆発時点でのひび割れモデルなどを星らが提言し、その仮定の下に中性子の輸送計算を実行しかなり遠方(1Km)まで測定データを再現している。この研究班は広島・長崎の原爆線量評価体系(DS86)と残留放射能測定から推定した中性子線量の間に矛盾があることを指摘し、その事を立証し確認するため研究を進めてきた。その違いの原因を追及するために、今年度は次のことに重点を置いて研究してきた。1遠距離データの信頼性について広島の近距離におけるEu-152やCo-60のデータは試料の数も多く、又放射能強度も測定可能な量があるため問題にならない。遠距離データは放射能強度も少ないため、バックグランドの問題が浮かび上がってくる。その原因の一つである環境中の中性子については、遠藤らが数カ所の地点にAuを置き環境放射線の影響をしらべその影響はほとんどないことを示した。一方中西らはスペクトルの中に試料中に含まれている天然放射能の影響があることを指摘した。この事を一応考慮に入れても広島の場合、爆心地から1200mまでは影響がないと考えられる。2輪送計算に役立てるための測定中性子のデータは、主として熱中性子による誘導放射能の測定から得られているが、速中性子の直接反応^<63>Cu(n,p)^<63>Niにより生成された銅試料中のNi-63測定が注目されてきた。その基礎となる中性子による反応断面積を柴田らが実験からベータ線の測定限界を求めた。又静間らは逆同時計数による測定装置を試作し、広島の爆心から382mの地点の日本銀行の避雷針からNi-63を検出し、DS86より25%高い値を得ている。今後引き続き測定する。3爆発過程からのソーススペクトル爆発過程を星らがひび割れを仮定し、高度や出力の問題提起を行った。これにより米国側の回答を期待している。我々研究班は広島・長崎の原爆線量評価体系(DS86)と、残留放射能測定から推定した中性子線量の間に矛盾があることを指摘し、長年にわたり研究してきた。その結果、CS86による計算値と測定値を比べると、爆心地近傍では計算値が大きく、遠方では測定値が徐々に大きくなり、1400mで約10倍程度の違いが認められた。今年度は測定者間で測定データの相互比較を行い信頼性を高め、日米双方で議論を重ね次のような結果を得た。1 Eu-152の相互比較は静間の測定した試料を金沢大学の小村氏が再測定を行った。また、そのデータを今中も整理し比放射能を計算した。金沢のデータは分解能が悪いが、静間のデータを大きく動かすような結果は得られなかった。宇宙線の影響も見られなかった。1200mまでのデータの信頼性は高まった。2 CI-36については11月に日米独の会合を持ち説明を受けた。近距離ではDS86と比べ測定値が小さくEu-152と同じ傾向を示した。しかし遠方のデータはバックグランドの影響が大きくさらに検証が必要。また速中性子によるNi-63の紹介もあった。きんきょりではDS86に比較的一致している。しかし遠方では誤差が大きく信頼性に欠ける。3中性子スペクトルについては、6月の会議でロスアラモスグループが新スぺクトルを紹介した。
アンチＷａｃｋｅｒ型環化反応の機構解析および多環式生物活性物質合成への応用

筆者が開発したアンチWacker型環化反応における環化段階が,パラジウム触媒の単独作用,もしくは有機金属試薬との共同作用によって行われているのか明らかにすべく,本反応に対する有機金属試薬の影響を調査したところ,前者の機構を支持する結果が得られた.さらに,本反応の有用性を示す目的から,抗腫瘍活性を有するハオウアミン類の合成を行った.本反応と分子内Friedel-Crafts反応を用いたインデノーテトラヒドロピリジンの構築,鈴木-宮浦クロスカップリング反応,(シアノメチル)トリメチルホスホニウムヨージドを用いたマクロ環化反応を経て,ハオウアミンA, Bの形式合成を達成することができた.平成25年度は,平成24年度に引き続き,平成26年度に実施予定であった多環式生物活性物質の合成を行った.平成24年度においては,haouamine Bの初期提唱構造であったiso-haouamine Bの形式合成を行ったが,インデノテトラヒドロピリジンをラセミ体で合成していたため,平成25年度においてはその不斉合成を行った.丸岡らの手法によりフェニルアラニン誘導体を90%以上の光学純度で合成した後,数工程を経て,アンチWacker型環化反応に必要なアルデヒドを調製した.また,合成過程で選択的にラセミ体を結晶として取り除く手法を見出し,光学的に純粋なインデノテトラヒドロピリジンを10グラムスケールで得ることに成功した.さらに,本合成法はアザパラシクロファン前駆体を2グラムスケールで供給可能であった.しかしながら,文献既知法によるアザパラシクロファン構築の再現が困難であったため,別途合成法についても検討を行った.すなわち,アザパラシクロファンに含まれる2,5ー二置換フェノールを,2ーシクロへキセンー1ーオンの酸化ではなく,5ーアルコキシー2ーシクロへキセンー1ーオンの脱離によって構築しようと考えた.インデノテトラヒドロピリジンとのカップリングに必要なホウ素化合物をキナ酸より10グラムスケールで調製することに成功したものの,マクロ環化が現時点では進行していない,今後,文献既知法および別途合成法の両手法を検討し,iso-haouamine Bの不斉全合成を達成する.筆者が開発したアンチWacker型環化反応における環化段階が,パラジウム触媒の単独作用,もしくは有機金属試薬との共同作用によって行われているのか明らかにすべく,本反応に対する有機金属試薬の影響を調査したところ,前者の機構を支持する結果が得られた.さらに,本反応の有用性を示す目的から,抗腫瘍活性を有するハオウアミン類の合成を行った.本反応と分子内Friedel-Crafts反応を用いたインデノーテトラヒドロピリジンの構築,鈴木-宮浦クロスカップリング反応,(シアノメチル)トリメチルホスホニウムヨージドを用いたマクロ環化反応を経て,ハオウアミンA, Bの形式合成を達成することができた.平成24年度は,アンチWacker型環化反応における基礎的知見を得るため,アルキン上の置換基効果について検討した.水素,アルキル,アリール,アルケニル,アルキニル基について検討を行い,トリフェニルホスフィンを配位子として用いた際に末端アルキンでは6員環が,エンイン,ジインでは5員環のアリルアルコールが生成した.また,トリシクロヘキシルホスフィンを用いた際には,末端アルキン,エンインでは5員環が,アルキル,アリール,アルキニル置換体では6員環のアリルアルコールが優先的に得られた.また,これらの選択性は,求電子剤の種類によっても僅かながら変化し,用いる求核剤の種類によって大きく変化することはなかった.さらに,炭素原子をテザーに持つエンイン基質において,テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムのみを用いてメタノール溶媒中加熱・撹拌を行ったところ,アルデヒドに由来する水素が導入された環化体,およびそれとほぼ同量のメチルエステル体を得ることができた(Tishchenko型反応).したがって,少なくとも本基質においてはパラジウム触媒の単独作用によって環化が進行することを証明することができた.平成26年度に実施予定の多環式生物活性物質の合成についても既に着手した.当初予定していたNープロパルギルーαーアミノケトンのアンチWacker型環化反応によるHaouamine B骨格構築が,モデル基質を用いた実験から実現困難であることがわかった.そこで,求電子剤をアルデヒドとし,アミノ基の保護基としてトシル基もしくはBoc基を用いたところ,アンチWacker型環化反応が効率よく進行し,形式合成を達成することができた.

しかしながら,この合成過程において,Haouamine Bの提唱構造の訂正が報告されたため,現在その訂正構造の全合成に向けて研究を行っている.平成24・25年度において,多環式生物活性物質haouamine Bの初期提唱構造であったiso-haouamine Bの形式合成を達成したため,平成26年度は,標的天然物であるhaouamine A・Bおよびその類縁体の合成を検討した.対称構造を有する芳香族アルデヒドとアミノホスホノ酢酸エステルから得られたエナミドエステルの不斉還元によりフェニルアラニン誘導体を90%以上の光学純度で合成した後,数工程を経て,アンチWacker型環化反応に必要なアルデヒドを調製した.アリールボロン酸とパラジウム触媒を用いたアンチWacker型環化反応,酸化,Grignard試薬の1,2-付加,Friedel-Crafts型環化反応により,光学純度の低下を伴うことなく,インデノテトラヒドロピリジンを高収率で得ることに成功した.2ーシクロへキセンー1ーオンより8工程を経て得られた光学的に純粋なホウ素化合物との鈴木カップリング反応を行った後,インデノテトラヒドロピリジン上のフェノール性水酸基の位置選択的な還元,アミノアルコールへの変換,(シアノメチル)トリメチルホスホニウムヨージドを用いたマクロ環化反応により,haouamine A・Bの形式合成を達成した.さらに,合成中間体を利用したiso-haouamine Bの形式合成,デオキシ類縁体の合成中間体の調製にも成功した.本合成法においては,アリールボロン酸,Grignard試薬,フェノール性水酸基の変換反応の組み合わせによって,多様な類縁体が合成可能なため,それらの細胞毒性を評価し,構造-活性相関研究に発展させていく予定である.なお,当初予定していた分子内アンチWacker型環化反応によるアザ-パラシクロファン構築も試みたが,望む生成物を得ることはできなかった.有機合成化学アンチWacker型環化反応を利用した多環式生物活性物質の合成については,当初の計画よりも前倒しで検討を開始したため,平成26年度にhaouamine Bの訂正構造を合成できる目処が立った.ただし,当初予定していた合成計画とはルートが異なるため、当初の計画についても併せて検討する必要がある.一方,環化メカニズムの検証に関しては,未だ十分な状況証拠が揃っておらず,パラジウム触媒の単独作用もしくは有機金属試薬との協同作用のいずれによるものなのか明らかでない.しかしながら,「今後の研究の推進方策」に述べた実験によって,重要な情報が得られ,平成26年度中に環化メカニズムが明らかになるものと考えている.環化メカニズムの検証に関しては,パラジウム触媒の単独作用によって行われている結果が示唆されたものの,全ての基質およびホスフィン配位子に関して,同様の環化メカニズムで反応が進行しているとは限らない.したがって,その他の反応基質についても,引き続き十分な検討を行う必要がある.一方,アンチWacker型環化反応を利用した多環式生物活性物質の合成については,当初の計画よりも前倒しで検討を開始したが,標的化合物の提唱構造の訂正により,再度検討し直さなければならい点が増えた.パラジウム触媒の単独作用による環化メカニズムの検証に関しては,最も反応性の高い基質であるエンインーアルデヒドを用い,一酸化炭素やイソニトリル存在下での反応や,非金属性求核剤との反応を検討する.また,パラジウム触媒と有機金属試薬との協同作用による環化メカニズムの検証では,環化反応とプロパルギル基の脱離が競合する反応基質(トルエンスルホンアミドテザーを有するα置換ケトン)を用い,環化体と脱離体の比率が求核剤に依存するか検証する.さらに,電子供与性基および電子求引性基を有するアリールボロン酸を当量混合し反応を行うことで,それぞれのアリールボロン酸が導入された環化成績体の生成比が求電子剤に依存するか検証する.さらに,昨年度確立したiso-haouamine Bの合成法に基づき,haouamine Bの訂正構造の不斉全合成を行う.また,当初予定していた分子内求核剤を利用する合成法についても,求電子剤をアルデヒドとしたモデル基質を用いて,再度検討を行う.パラジウム触媒の単独作用による環化メカニズムの検証に関しては,プロパルギル基の脱離などの副反応が起こらない炭素原子をテザーに持つ基質を用いて,非金属性求核剤存在下,様々な反応条件を検討することにする.特に,エンインやジインなどはアンチWacker型環化反応において反応性が高く,有用な基質になるものと推測される.
糖尿病におけるプロレニンの尿細管再吸収と組織レニン・アンジオテンシン系の検討

微量アルブミン尿のみられる糖尿病性腎症ではアルブミンと同様にそれよりやや分子量のやや小さいプロレニンは糸球体で濾過が亢進しており,近位尿細管でプロレニとアンジノテンシノーゲンの再吸収が増加していた。そのことが腎組織レニン・アンジオテンシン系の亢進に関与していること示した。この再吸収を抑制すると糖尿病性腎症の進展が抑制され、新たな治療法の開発に繋がる。微量アルブミン尿期の糖尿病ラットにおける腎組織レニン・アンジオテンシン系の亢進の機序が尿細管でのプロレニン・アンジオテンシノーゲンのendocytosisの亢進によることを検討した。プロレニンは糖尿病では血中濃度が増加し、分子量が47kDとアルブミン68kDより小さいが、糸球体濾過係数は0.001前後で正常ラットではほとんど濾過されない。しかし、微量アルブミン尿のみられる糖尿病では糸球体で濾過され、podocyteや尿細管のプロレニン受容体を介してendocytosisされたものが、腎組織プロレニンであることを証明した。ヒトプロレニンを投与し、抗ヒトプロレニン抗体で免疫染色、25nmコロイドによるimmunogold EM法を行い、腎podocyte,尿細管、血管系などにendocytosisされたヒトプロレニンの局在を示した。endocytosisされるプロレニン量が糖尿病ではコントロールに比べ有意に多いことをWestern blotで示した。プロレニン受容体はH+-ATPase subunit ATP6ap2と相同性があり、集合尿細管間在細胞,podocyte,近位尿細管などH+-ATPaseの発現の多い部位でエンドソーム内にプロレニンが取り込まれた。アルブミンのエンドサイトーシスと同様にメガリンがアンジオテンシノーゲンとプロレニンの受容体となっておりプロレニンのエンドサイトーシスはネフロンの共通した部位でみられており、微量アルブミン尿が腎組織レニンアンジオテンシン系の亢進のマーカーになると考えられる。糖尿病ラットにおける腎組織レニン・アンジオテンシン系の由来とその亢進の機序を明らかにし、その抑制により新たな治療を開発することを目的とした。糖尿病では血中のレニン・アンジオテンシン系は抑制されているが,腎組織ではレニン・アンジオテンシン系が亢進しているとされるが,その由来や亢進の機序は十分に解明されていない。プロレニンは分子量47kDでアルブミン68kDより小さいが、糸球体濾過係数は0.001前後で正常ラットではほとんど濾過されない。しかし、微量アルブミン尿のみられる糖尿病ではプロレニンは糸球体で濾過され、podocyteや尿細管のプロレニン受容体を介してendocytosisされ、腎組織プロレニンの亢進の原因となり得ることを示した。H+-ATPaseの阻害薬がエンドサイトーシスの調節に関与し、新たな治療分子ターゲットになり得ることを次の研究への橋渡しとして本研究を終了した。ラット腎における標識ヒトプロレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲンの糸球体濾過と尿細管endocytosisの解明Evansblueで標識したヒトプロレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲンを正常およびSTZ糖尿病ラットに投与して,尿細管endocytosisを免疫電顕とEvans blue蛍光を蛍光顕微鏡でも観察した。抗ヒトプロレニン抗体による免疫染色を行い、電顕レベルで糖尿病ラットの近位尿細管、集合管、podocyteでendocytosisが確認された。微量アルブミン尿を呈する糖尿病ラットではヒトプロレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲン投与により有意な血圧上昇がみられた。糖尿病では腎尿細管でのレニンとアンジオテンシノーゲンのendocytosisが亢進し、腎でのアンジオテンシンII産生が増加し、血圧上昇に関与していることを示した。安価で大量投与が可能なEvans blue標識アルブミンでは光顕や電顕での観察が容易であったが、ヒトプロレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲンは高価で少量しか投与できず、endocytosisの可視化に難航した。腎動脈よりの局所投与とヒト抗プロレニン抗体による免疫染色と免疫電顕で対処して結果を得た。腎スライスでのendocytosisの検討では血流がないため十分なendocytosisは観察できなかった。

エンドサイトーシスされたヒトプロレニンとヒトアンジオテンシノーゲンからのアンジオテンシンIIの産生は、腎臓全体では総蛋白量が多く希釈され、糖尿病とコントロールで有意な差がみられず予想と反した。H+ATPaseを抑制することにより新たな発見があった。当初の予定では大量に投与できるEvans blue標識アルブミンでは近位尿細管、podocyteのendocytosisが光顕でも観察できたので、簡単であると推測された。しかし、ヒトプロレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲンは少量しか投与できず、光顕レベルでは明らかではなく、endocytosisの可視化に難航している。平成25年度はH+-ATPaseの抑制による糖尿病性腎症の治療について検討する。H+-ATPaseはendosome内のpHを酸性化してendocytosisで取り込んだ物質を分解するのみならず、receptorのmembrane recyclingの維持に重要である。H+-ATPaseの阻害薬を投与し、endocytosisのreceptorであるメガリンの発現の変化を検討し、endocytosisされるプロレニンやアンジオテンシノーゲンが減少し、腎組織アンジオテンシンの産生の減少、蛋白尿の減少、腎組織障害や腎糖新生の改善などの治療効果がみられるか検討する。プロレニンやアンジオテンシノーゲンのendocytosisの可視化を腎動脈よりの局所投与や、腎スライスでのendocytosisの検討など別の方法を試す。microdissectionした尿細管と糸球体でプロレニンやアンジオテンシノーゲンのendocytosisされる量が糖尿病とコントロールで差があるかmicrodissection Western blotで同定する。アンジオテンシンIIの産生量をこれらのsegmentで比較する。ヒトプロレニンの受容体の局在を検討する。プロレニン受容体はH+-ATPase subunit ATP6ap2と相同性があり、集合尿細管間在細胞,podocyteなどH+-ATPaseの発現の多い部位のエンドソームにプロレニンが取り込まれるか調べる。H+-ATPase阻害薬、抗体(プロレニン、アンジオテンシノーゲン、レニン受容体、G-6-Pase, PCK2, SGLT2),アンジオテンシン測定費用、糖新生代謝酵素活性測定キットの購入、免疫電顕関連の資料作成および標本プロセス費、STZ糖尿病動物の飼育費microdissection tubular segmentでのアンジオテンシンIIの測定。プロレニン受容体とH+-ATPaseの免疫電顕、ヒトプロレニン、アンジオテンシノーゲンの購入など
拡散誘起再結晶を利用した合金化・再結晶集合組織による合金設計法

(111)面を接合界面とする純Cu単結晶試料と初期厚さw_0=140μmのFe-4.8mass%Cu多結晶試料とを組合せたサンドイッチ状Cu/(Fe-4.8Cu)/Cu拡散対に1050°Cにおいて最長86400sの加熱処理を施すと,Fe相中のCuの体積拡散から予想されるよりも100倍程度速い速度でFe相板の中心部においてCuの拡散場の重なり合いが起こることを見いだした。このような特異な挙動は,拡散誘起再結晶(DIR)により合金化と再結晶とが同時に進行することに起因していることを明らかにした。上記の実験条件では,Fe相板の厚さw[μm]およびDIRによる合金領域の幅l[μm]は反応時間t[s]にともないw/w_0=1-5.0×10^<-5>t^<0.5>およびl=1.6t^<0.3>の関係に従い変化する。したがって,合金化領域は56hというかなり短い反応時間においてFe相板の中心部にまで達することになる。通常拡散律速型の反応は時間の平方根に比例して進行するが,上記のDIR領域の幅は反応時間の0.3乗に比例して増加している。このような時間依存性は,研究代表者らの提案したエネルギーバランスモデルを粒界拡散の拡散方程式と組み合わせ反応初期においてFe相中にすでにCuが固溶しているという初期条件の下で数値計算法を用いて解くことにより定量的に再現することができる。(111)面を接合界面とする純Cu単結晶試料と冷間強加工処理を施した純FeおよびFe-4.8mass%Cu多結晶試料とを組合せたサンドイッチ状Cu/Fe/CuおよびCu/(Fe-4.8Cu)/Cu拡散対に,Fcc-Fe相の安定温度である920および1050°Cにおいて最長86400sの加熱処理を施した。ここで,各試料の厚さはそれぞれ純Cu単結晶で2mm程度,純FeおよびFe-4.8Cu多結晶で150μm程度となっている。界面移動速度とfcc-Feおよびfcc-Cu各相における体積拡散とを関係付ける二元系拡散方程式の解析解を用いて1050°C,86400sの加熱処理条件に対する拡散濃度分布を求めると,界面からfcc-Fe相中へのCuの拡散浸透距離は15μm程度となる。一方,エネルギー分散型X線マイクロアナライザーを用いた定量分析の実測結果によると,厚さ150μmのfcc-Fe相の中心部においてそでにCuの拡散場の重なり合いが起こりほぼフラットな濃度分布となっている。このような特異な拡散挙動は,拡散誘起再結晶(DIR)に起因していることを初めて実験的に明らかにした。DIRの厚さdは,t=061200sの時間範囲ではd=1.6t^<0.3>[μm]により反応時間tとともに増加する。しかし,DIRの成長はt=6120086400sの時間範囲では短時間側におけるよりも加速する。(111)面を接合界面とする純Cu単結晶試料と初期厚さd_O=130μmのFe-4.8mass%Cu多結晶試料とを組合せたサンドイッチ状Cu/(Fe-4.8Cu)/Cu拡散対に1050°Cにおいて最長86400sの加熱処理を施すと,Fe中のCuの体積拡散から予想されるよりも100倍程度速い速度でFe相板の中心部においてCuの拡散場の重なり合いが起こることを見いだした。この様な特異な挙動は,拡散誘起再結晶(DIR)により合金化と再結晶とが同時に進行することに起因していることを明らかにした。上記の実験条件では,Fe相板の厚さd[μm]およびDIRによる合金領域の幅w[μm]は反応時間t[s]にともないd/d_O=1-5.0×10^<-5>t^<0.5>およびw=1.6t^<0.3>の関係に従い変化する。したがって,合金化領域はt=50hというかなり短い反応時間においてFe相板の中心部にまで達することになる。

通常拡散律速型の反応は時間の平方根に比例して進行するが,上記のDIR領域の幅は反応時間の0.3乗に比例して増加している。このような時間依存性は,研究代表者らの提案したエネルギーバランスモデルを粒界拡散の拡散方程式と組み合わせ反応初期においてFe相中にすでにCuが固溶しているという初期条件の下で数値計算法を用いて解くことにより定量的に再現することができる。
Ewing's/PNET腫瘍の分化傾向と予後との関係

我々は、Ewing's/PNET腫瘍(骨原発3例、骨外原発5例)を用いて、神経栄養因子に対するレセプター(trkA, trkB, trkC)および神経栄養因子(NGF, BPNF, NT-3)の発現をRT-PCR法で検討し、個々の腫瘍が各因子を様々な程度に発現していることを明らかにした。次いで、特異抗体を用いた免疫組織化学的染色で、腫瘍細胞がこれら因子を発現していることを確認した。免疫染色では、trkA, trkBが7/8例で陽性となり、NGFは(5/8)で陽性となった。trkAとNGFを共発現する5例では、autocrine loopを形成していることが強く示唆された。上記二つの実験結果には、ある程度の相関が認められたが、必ずしも一致しなかった。特に、原発部位(骨および骨外)の違いによるRT-PCR法と免疫染色の相違は大きく、部位の違いが各因子の発現に影響を及ぼしている可能性があると考えられた。そこで、発現量の差を明らかにするために、リアルタイムPCR法を用いた解析を試みたが、結果が不安定であったため、マイクロアレイ法を用いて解析することにした。骨原発5例、骨外原発6例を用いたクラスター解析の結果、2つのグループに分かれることが明らかになったが、原発部位の違いは、この2つの区分に関わっていなかった。また現在、我々が把握している臨床・病理学的なデータとの相関も認められなかった。神経栄養因子に対するレセプターおよび神経栄養因子の発現は全体的に低かったが、レセプターを比較的強く発現する症例では、神経栄養因子の発現は低く、神経栄養因子を強く発現する症例は、レセプターの発現が低い傾向にあった。その他の遺伝子に関しては、IGF1-R、ID2、CD99の有意な上昇とTGFB-R2の発現抑制が認められた。RT-PCRとマイクロアレイの結果は概ね相関したが、免疫染色との乖離は大きかった。更なる検討のためには、遺伝子の発現解析に使用できるサンプルが必要であると考えられた。1.研究の目的で、Ewing/PNE7腫瘍が神経系への分化傾向を示し、レセプターと神経栄養因子の両方を発現しautocrine loopを形成している可能性が高い、ことを指摘した。2.8症例(骨外腫瘍:5例および骨腫瘍:3例)に対し、神経栄養因子に対するレセプター(trkA, trkB, trkC)および神経栄養因子(NGF, BDNF, NT-3)に対する特異抗体を使用して免疫組繊化学染色を行った結果、当初の仮説通り症例により染色性に差が認められた。trkAおよびtrkBは、8症例中7例で陽性像を示したが、骨原発例ではtrkAの染色性が弱い傾向にあった。各抗体に対する陽性率は、trkC(5/8)、NGF(5/8),BDNF(3/8),NT-3(1/8)であり、個々の症例に着目すると、trkA, trkB, trkCおよびNGFの4種を発現する症例が4例あり、6種の抗体中4種で陰性を示す症例が3例あった。この結果は、症例により染色性にパターンが存在する可能性を示唆し、また、trkAとNGFの共発現は、autocrine loopの形成を強く示唆していた。総合的な解析は次年度の課題となるが、本検討で2つの問題点が明らかとなった。

骨原発例では、混在する骨に対する脱灰操作が染色性に影響している可能性があること、抗体の種類により核が陽性となる領域があり本来の局在と矛盾すること、である。染色に用いた病理組織は、当院における最初の生検組織を使用したが、非脱灰の組織や転移巣を使用した検討が必要と考えられる。3.融合遺伝子の検索に関しては、定法に従い腫瘍組織からのRNAの抽出と精製、RT-PCR、塩基配列の検索を行いデータを整理・蓄積しつつある。他施設からの症例の提供/収集については、体細胞遺伝子の解析(融合遺伝子の検索など)や臨床情報の利用等について、学内倫理審査委員会に提出する書類を準備中である。1.融合遺伝子の検索:16症例の凍結腫瘍組織からRNAを抽出し、融合遺伝子の検索を行った。Ewing/PNET腫瘍で最も頻度の高い融合遺伝子EWS-FLI-1が16例中12例で検出され、EWS-ERGが1例で検出された。しかし、3例で既知の融合遺伝子が検出されず、今後の詳細な検討が必要である。2免疫組織化学染色:Ewing/PNET腫瘍組織を用いた前年度の研究で、神経栄養因子(NGF, BDNF, NT-3)及び対応するレセプター(trkA, trkB, trkC)の中で、特にtrkAとNGFが共発現し、autocrine loopを形成している可能性が強く示唆された。現在、症例数を追加するため、他施設倫理委員会への提出書類を準備中である。3.マイクロアレイによる遺伝子発現解析:以下の理由によりマイクロアレイを用いた検討を実施した。(1)免疫組織化学的な検討で脱灰操作が染色性に悪影響を及ぼしている可能性が示唆されたことから、各因子の発現を他の方法で検討する必要性が生じた、(2)研究計画書に記載した遺伝子の発現量の検索がマイクロアレイで行えることがわかった、(3)マイクロアレイを用いることにより、すべての遺伝子の発現解析が可能である、ことを理由とする。骨原発腫瘍6例、軟部原発腫瘍9例(合計15症例)を用いて、マイクロアレイによる遺伝子発現研究を実施した。クラスター解析の結果、2つのグループに分かれることが明らかになったが、原発部位の違い(骨および軟部)は、この2つの区分け関わっていなかった。また、現在我々が把握している臨床・病理学的なデータとの相関も低い可能性が示唆されている。今後更なる情報の収集とそれら情報の再分類を考慮する必要がある。発現遺伝子の詳細な解析および多変量解析を実施する予定である。
破骨細胞の前駆細胞の表面マーカーの解析

骨髄細胞とPA6細胞との共培養下では、好中球、マクロファージ、破骨細胞の3者のすべての組み合わせのコロニーの中で、好中球と破骨細胞からなるコロニーだけが形成されなかった。従って、造血幹細胞からの分化の過程で、好中球への分化能を失った後に、マクロファージと破骨細胞の前駆細胞が分かれると考えられた。このようなマクロファージと破骨細胞の近縁関係はどちらも最終分化にM-CSFを必要とするということからも支持される。破骨細胞のみのコロニーは20個以下の細胞からなる小さなものしか形成されないことから、破骨細胞の前駆細胞は4回以下の分裂能しか持っていないと考えられた。さらに、破骨細胞のみのコロニーの出現頻度は低く、FACSによる破骨細胞の前駆細胞の分離を種々試みたが、再現性のある結果は得られず、その表面マーカーを明らかにすることが出来なかった。ただし興味深い知見は、M-CSFの受容体(c-Fms)を発現している細胞はほとんどの血球系前駆細胞が発現しているSCFの受容体(c-Kit)を発現していないことである。また、c-Fms陽性細胞を培養してもコロニーはほとんど形成されなかった。従って、マクロファージの前駆細胞は増殖能をほとんど失った後にc-Fmsを発現するようになると考えられた。さらに、活性を持ったM-CSFを産生しないOP9細胞との共培養下でも、マクロファージの前駆細胞が多数出現することもこのことを支持している。しかし、OP9細胞との共培養下では破骨細胞の前駆細胞は見い出されず、破骨細胞の前駆細胞のほうがマクロファージの前駆細胞よりもM-CSFへの依存性が高いように思われた。以上の結果をまとめると、c-Fmsはマクロファージと破骨細胞の前駆細胞が分かれてから後に発現されるようになると推察される。
バクテリア表層化学改変法を利用したドラッグデリバリーキャリアの開発

バクテリアの細胞壁を修飾する方法について研究した。バクテリア細胞壁前駆体を化学合成し、これに、バクテリア表面に提示させる分子を結合させておく。この前駆体誘導体をバクテリアの培養液に添加して培養することにより、生合成経路に取り込まれて、目的化合物を生きたバクテリア表面に提示させることが出来る。この手法を用いて、ケトン基を提示させた後に、さまざまな化合物を結合させることが可能となった。今年度は特に、前駆体としてこれまでよりシンプルな構造で合成容易な化合物を検討した。また、乳酸菌にロタウィルスエピトープペプチドを提示させ、腸管上皮細胞モデル系に及ぼす作用について研究した。ヒト腸管上皮細胞とエピトープ提示乳酸菌を共培養し、サイトカイン関連遺伝子の発現誘導についてリアルタイムRT-PCRで調べた。これらの結果について、2004年9月の高分子討論会および2005年12月のPacifichemにおいて発表した。バクテリア表層化学改変法によるドラッグテリバリーキャリア開発として、乳酸菌表面へのGb3糖鎖(病原性大腸菌O-157の毒素が認識する糖鎖)の提示を検討した。乳酸菌を人工的に化学合成したバクテリア細胞壁の前駆体(反応性のケトン基をもつもの)を加えた培地で培養した。このようにして乳酸菌表面に提示されたケトン基に対して、オキシルアミノ基をもつ化合物を水中で結合させることが出来る。オキシルアミノ基をもつリンカーを介してGb3糖鎖を提示させた乳酸菌を用意することができた。また、Gb3糖鎖をもつモノマーを合成し、これをオキシルアミノ基をもつ開始剤からリビング重合させることにより、線状のポリマーを用意し、乳酸菌表面へ結合させた。これらの乳酸菌について、毒素との結合能について表面プラズモン共鳴法により検討し、糖鎖単独で提示させるよりも糖鎖ポリマーとして提示させた場合のほうが、毒素との相互作用が強くなることが示唆された。この結果は、2004年9月の第53回高分子討論会および2005年2月の高分子北海道支部会において発表した。