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抗腫瘍活性海洋天然物を創薬シードとする合成研究と新規医薬品の創製

東南アジアに生息する海洋生物が生産する抗腫瘍活性イソキノリン天然物をリード化合物として、新規微量天然物の探索、構造解析と化学誘導を行い、さらにレニエラマイシンGとクリブロスタチン4の全合成を達成した。次に天然物およびその各種誘導体に全合成中間体を加え、ヒト実験腫瘍細胞に対する殺細胞活性を検定し、生物活性発現に必須な官能基を選定した。一方、天然物の左半部モデル化合物を合成し、創薬開発候補化合物として有望な化合物群を見出した。なお、以上の研究成果は学術専門誌(14)と国内外学会やセミナーにおいて発表した。1.エクチナサイジンを創薬シードとする医薬品開発研究:(1)これまでの研究から活性の増強に効果的であったN-2'-アシル誘導体に着目し、特に電子求引基を持つ誘導体の合成をおこなった。その結果、ピコグラム単位でがん細胞の増殖抑制効果を示す化合物の創製に成功した。これまでの細胞毒性試験結果から、構造活性相関における重要な情報を提供することができた。(2)本系天然物を生産する群体ホヤの極微量二次代謝物としてシンプルイソキノリンアルカロイドの単離に成功し、その純合成による構造決定を行った。2.レニエラマイシンを創薬シードとする医薬品開発研究:(1)最近達成したレニエラマイシンGの全合成経路をブラシュアップして工程の短縮化などにより総収率の大幅な向上に成功した。(2)フィリピンに生息する青色海綿の二次代謝物として既知レニエラマイシン類とともに新規極微量天然物レニエラマイシンW-Y (RW-RY)の単離・構造解析に成功した。なかでもRYは本系天然物の生合成前駆体とみなすことができる注目すべき構造を有していることが明らかとなった。3.本系天然物の活性発現に必要な構造単位として三環系ラクタムを想定し、各種C6-C11aシン体とアンチ体の合成をおこなった。さらに、この研究を展開する中で、C3-C4脱水素反応を伴う1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5,8-ジオンのヒドロキノンジアセタートへのユニークな変換反応を見出した。1.エクチナサイジンを創薬シードとする医薬品開発研究:各種2'-N-α、β-不飽和アミド誘導体とフッ素原子を導入した誘導体を合成し、その細胞毒性試験を実施した。その結果、生物活性の向上に成功した。2.レニエラマイシンを創薬シードとする医薬品開発研究:(1)タイ側協力研究者に依頼して青色海綿Xestospongia sp.を採集し、レニエラマイシンM(3グラム)を新たに獲得し、新たな誘導体約20個を合成した。現在、生物活性試験を実施している。(2)本系天然物の生物活性に関する新たな知見を得るために、2つのパラキノン部が還元された化合物を合成し、この化合物が肺がん細胞のアポトーシス誘導活性を示すことを見出した。3.本系天然物の部分合成単位の合成と生物活性に関する研究:前年度、合成した左半部ラクタム誘導体がまったく生物活性を示さないことが明らかとなった。そこで、ラクタムを還元的にα-アミノニトリルの替えたモデル化合物を合成し、その細胞毒性を検定したところ、優位に活性を示す化合物を見出した。4.これまでの研究成果をいくつかの学術雑誌に報告するとともに、昨年10月に台湾で開催されたAIMECS13で報告し、アジア圏の海洋生物が生産するイソキノリン化合物が新規制癌剤の開発候補化合物であることを強くアピールした。1.エクチナサイジンを創薬シードとする医薬品開発研究:タイに生息する群体ホヤの二次代謝物として得られるエクチナサイジン(Et)743の安定誘導体として得たEt 770に存在する2つのフェノール性水酸基を保護、第2級アミンをアシル化、脱保護して様々な2'-N-アシル誘導体を合成し、ヒト実験腫瘍細胞に対する増殖抑制活性を指標として検定した。その結果、これまでで最強の活性を示す化合物を見出すことに成功した。2.レニエラマイシンを創薬シードとする医薬品開発研究:(1)レニエラマイシン系海洋天然物のうち、21位にラクタムカルボニル基を持つレニエラマイシンGとクリブロスタチン4の全合成に成功した。さらに、前者においては、合成工程の短縮による収率改善に成功した。いずれの合成も基本骨格を構築後、1位側鎖の立体を反転させる独自の経路であり、大量合成に適した特徴を持つ。(2)タイの青色海綿について、二次代謝物の探索研究を展開したところ、新規極微量天然物としてレニエラマイシンV (RV)の単離に成功し、各種機器スペクトルの詳細な解析によりその構造を提出した。本品はレニエラマイシンMの14位にコレステロールの3位水酸基がエーテル結合した斬新な構造を有している。なお、本品は抗腫瘍活性を全く示さない点は興味深い。

(3)RVの合成を目的として、右半部モデル化合物14位への立体選択的アルコールの導入による一般的エーテル結合形成反応の開発に成功した。3.本系天然物の活性発現に必要な構造単位の解明:本系天然物の活性発現に必須な構造単位を含む左半部モデル化合物およびそのアナログを合成し、ヒト実験腫瘍細胞に対する細胞毒性試験を実施した。1.エクチナサイジンを創薬シードとする医薬品の開発:1制がん作用を増強するために修飾すべき構造部分を特定できた。引き続き新たな誘導体を合成し、開発候補化合物を選定し、in vivo試験の実施に向けてその大量合成する計画である。2研究の継続的な展開に必要な海洋天然物の新たな採集が必要となっている。2.レニエラマイシンを創薬シードとする医薬品の開発:レニエラマイシンGとクリブロスタチン4の全合成経路の開発を行い、C-21位にラクタムカルボニル基を持つ本系天然物を入手することができた。そのin vitro生物活性試験結果からいずれもほとんど制がん活性を示さないことを確認できた。2前者の合成経路を検証し、工程の短縮に成功し、実用的な合成経路を構築することができた。3.部分構造の合成と新規合成医薬品の開発:1各種三環系ラクタムおよびそのジアステレオマーの一般的合成法を開発した。これらの生物活性試験を展開し、その結果から、研究の進むべき方向性を探りたい。1.エクチナサイジンを創薬シードとする医薬品開発研究において、(1)Et770に含まれる官能基のうち、2'-NHの化学修飾が活性増強に必須であること、(2)18-OHを修飾すると活性が劇的に低下することを明らかにすることができたことは、ひとつの壁を乗り越え、本研究が新たなステップに到達できたと考える。2.21位にラクタムカルボニル基を持つレニエラマイシン系海洋天然物の全合成に成功したことは、(1)本系天然物の恒久的な供給手段を構築した、(2)キラル合成への展開を可能とする、(3)天然から得られない本系天然物のアナログの合成による広範な構造活性相関研究の実施、に貢献できたと考える。3.左半部および右半部モデル化合物の合成と新規反応の開発は合成化学の発展に多大な貢献をもたらした。1.エクチナサイジンの活性増強とともに選択毒性の向上による副作用の軽減を目指していきたい。2.レニエラマイシンGの合成経路を基軸としてレニエラマイシンMの合成により、本化合物の恒久的な供給手段を確立する。すでに予備的な合成経路の開発を達成できたので、本年度はそれぞれの工程を最適化して実用的な供給す段の確立をめざす。3.フィリピンに生息する青色海綿Xestospongia sp.の極微量二次代謝物として得られた新たなレニエラマイシン類の中に、本系天然物の生合成前駆体と想定可能なものを見出した。これら天然物としての再検索と純合成による安定供給手段の確立と取り込み実験を推進し、生合成経路の解明をめざす。1.エクチナサイジン770の活性増強を目指した誘導化は修飾すべき位置がほぼ確定しているので、継続して研究を展開する。ただし、次のステップでは正常細胞に影響を与えずがん細胞に選択毒性を示す化合物の探索が求められるので、その点も意識しながら適切に研究が向かうべき方向を見極めていきたい。2.前年度に達成したレニエラマイシンGの全合成経路を基軸として、本系天然物の一般的合成経路を開発する。
マイクロサテライトDNAマーカーによるスギ採種園の花粉動態の把握とその効率的活用

昨年度に行った5採種園における遺伝子流動の解析の結果、自殖率は採種園の構成クローン数を多くすることで山出し時の苗木に含まれる自殖苗を著しく少なくすることができると考えられ、園外からの花粉混入率は採種園のまわりに存在するスギ林の面積が影響を及ぼしていることが明らかとなった。しかし、調査採種園すべてで検出された父親としての貢献度の偏りについては、具体的な貢献度に影響を及ぼす要因は解明されておらず、有効な改善策は未だ見出されていなかった。そこで本年度は、父親としての貢献度と着花量、開花期、距離などのデータとの間の関係を評価した。採種園内から任意に選んだ9母樹から母樹あたり100種子を採取し、6座のマイクロサテライトマーカーを用いて解析を行った。調査したミニチュア採種園における平均混入率は38.7%で、平均自殖率は1.7%であった。構成クローンの父親としての貢献度にはクローン間で有意な差があった。最も高い貢献度を示す5クローンは、混入を除いた種子の約30%を占めた。開花期の一致度および着花量は構成クローン間で大きな差があった。目的変数を解析種子のうち父親と判断された種子数で表される「父親としての貢献度」とし、説明変数を「総雄花量」と「開花期の一致度」として行った重回帰分析の結果、父親としての貢献度には、総雄花量が著しい影響を及ぼすが、開花期の一致度の及ぼす影響は小さかったことが明らかになった。この結果は、珠孔液を分泌した時に空中花粉密度の高い花粉が優先的に受粉することに起因していると考えられた。開花期を3つの開花型(早期、中期、後期)に分けて解析を行ったが、開花型の違いによる影響は見出せなかった。父親としての貢献度に最も影響を及ぼす要因は総雄花量であると考えられるが、距離も父親としての貢献度に影響を与えていることが示唆された。昨年度開発した34マイクロサテライトマーカーおよび森林総研の谷らが開発したマイクロサテライトマーカーから多型性が高い7マーカーを選び、遺伝子流動を解析した。調査採種園はAEの5箇所で、採種園A,B,Cは従来型採種園、D,Eはミニチュア採種園である。従来型採種園は樹高約4m、植栽間隔約4×4m、ミニチュア採種園は樹高約1m、植栽間隔約1×1mと設計様式の違いによる採種園内環境は大きく異なる。また、それぞれの採種園は立地環境、すなわち周辺に存在するスギ林の面積が異なる。本年度は、この立地環境および設計様式の異なるスギ採種園における遺伝子流動の比較を行った。採種園A、Bについては報告済みである。解析は採種園あたり12母樹、1母樹あたり30の種子を対象に行った。すべての採種園おいて用いたマイクロサテライトマーカーの総父性排斥率は0.999と父親を十分に特定できうる値を示した。解析の結果、平均区画外混入率はAで65.8%、Bで35.0%、Cで47.8%、Dで40.8%、Eで50.0%であった。これらの混入率は採種園周辺のスギ林の面積と関係があり、採種園の造成場所の選定が重要であることが示唆された。混入率の違いは採種園のタイプ間では観察されなかった。平均自殖率はAで1.4%、Bで4.4%、Cで2.2%、Dで1.7%、Eで4.4%であった。これらの値は海外の他の針葉樹種とほぼ変わらない。自殖率は、1ラメットあたりの着花量が異なるのでタイプ別に考えなければいけないが、採種園に導入されているクローン数と関係があるのではないかと考えられた。また、園内の構成クローンの父親としての貢献度は、全ての採種園で大きな偏りがあり、貢献度の高い構成木上位3クローンで生産種子全体の約25.1-46.5%を占めた。園内の遺伝子流動は、各クローンの相対的な花粉量や開花フェノロジーの影響をうけると考えられた。

目的変数を解析種子のうち父親と判断された種子数で表される「父親としての貢献度」とし、説明変数を「総雄花量」と「開花期の一致度」として行った重回帰分析の結果、父親としての貢献度には、総雄花量が著しい影響を及ぼすが、開花期の一致度の及ぼす影響は小さかったことが明らかになった。この結果は、珠孔液を分泌した時に空中花粉密度の高い花粉が優先的に受粉することに起因していると考えられた。開花期を3つの開花型(早期、中期、後期)に分けて解析を行ったが、開花型の違いによる影響は見出せなかった。父親としての貢献度に最も影響を及ぼす要因は総雄花量であると考えられるが、距離も父親としての貢献度に影響を与えていることが示唆された。
Strip-Hippoシグナル経路を軸とした神経シナプス制御の分子基盤

本研究では、がん抑制シグナル経路として知られるHippoシグナル経路による神経機能調節メカニズムの解明を目指した。ショウジョウバエ神経系におけるHippoシグナル経路に関わる因子の遺伝学的探索を行い、進化的に保存されたアミノ酸トランスポーターHiAT (Hippo-interacting Amino acid Transporter)を見出した。また、HippoキナーゼおよびHiATは、シナプス形成および個体活動量に影響を与えることも明らかにした。ガン抑制効果を持つHippoシグナル経路は、細胞増殖、細胞死、細胞分化を制御する。これまでHippoシグナル経路は、細胞増殖との関係について盛んに研究されてきたが、細胞分裂後の細胞、特に神経細胞における昨日に関しては殆ど研究が進んでいない。一方、私は、神経細胞の形態形成を研究する過程で「進化的に保存された分子Strip」を独自に単離・解析してきた。その過程で「StripがHippoシグナル経路の活性を調節し、神経シナプス形成を制御すること」を見出している。よって本研究では、この研究成果を更に発展させる目的で、ショウジョウバエの遺伝学、ゲノム編集技術、光遺伝学的手法を活用することで生体内における「Strip-Hippoシグナル経路を軸とした神経シナプス制御の分子基盤解明」を目指した。平成27年度は、特に「神経シナプス形成過程においてStrip-Hippo経路を制御する因子群の遺伝学的探索」を行った。StripはHippoシグナル経路を負に制御する。また、Stripを運動神経特異的Gal4ドライバーOK6-Gal4でノックダウンした際、個体は致死となる。この時、運動神経では、Hippoシグナル経路が過剰に活性化していることが予想される。事実、Stripノックダウンと同時に、Hippo遺伝子の量を半分にすることでこの個体致死性は救済される。私は、このStripとHippoシグナル経路の個体致死性に関する遺伝学的相互作用を利用して、ゲノムワイドなモディファイヤースクリーニングを行った。具体的には京都ストックセンターで管理されているDrolDel deficiency kitを用いて、Stripノックダウンによる個体致死性を救済できるかどうかを判定するスクリーニングを行った。その結果、Strip-Hippoシグナル経路と遺伝学的に相互作用する候補遺伝子を10個単離することに成功した。上記研究概要に記したように、Strip-Hippoシグナル経路を制御する因子のゲノムサイドスクリーニングを行い、既に10個の遺伝子を単離することに成功している。このスクリーニングには、1年以上の時間が掛かると思われたが、意外にも1年未満で最終的な候補遺伝子群に辿り着くことができた。これら遺伝子群の中には、全く予想されなかったものも含まれており、今後の更なる遺伝子機能解析により、神経シナプス制御過程におけるStrip-Hippoシグナル経路の新たな制御機構や作動様式が明らかになると期待できる。ガン抑制効果をもつHippoシグナル経路は、細胞増殖、細胞死、細胞分化を制御する。これまでHippoシグナル経路は、細胞増殖との関係について盛んに研究されてきたが、細胞分裂後の細胞、特に神経細胞における機能に関しては殆ど研究が進んでいない。一方、私は、神経細胞の形態形成を研究する過程で、「進化的に保存された分子Strip」を独自に単離・解析してきた(N atCommun 5, 5180, 2014)。その過程で、「StripがHippoシグナル経路の活性を調節し、神経シナプス形成を制御すること」を見出してきた。よって本研究では、この研究成果を更に発展させる目的で、ショウジョウバエの遺伝学、ゲノム編集技術、光遺伝学的手法などを最大限に駆使し、生体内における「Strip-Hippoシグナル経路を軸とした神経シナプス制御の分子基盤解明」を目指した。平成28年度は、これまでに得られた結果を整理・検証して、それら結果を研究論文として公表することができた(Cell Rep16: 2289-97, 2016)。本論文では、Strip-Hippoシグナルが細胞内アクチン骨格系を制御する事で、シナプス構造と機能を制御することを示している。さらに平成27年度に行った遺伝学的スクリーニングによって得られた「神経系でStrip-Hippoシグナルと相互作用する因子」に関しても実験を進めた。その結果、一種のアミノ酸トランスポーターが神経系におけるStrip-Hippoシグナルと強く遺伝学的相互作用を示すことを見出した。今後は、このアミノ酸トランスポーターを軸に、どのようにして神経系におけるStrip-Hippoシグナルが制御されているかを解析する予定である。これまでの研究結果を論文として発表できている(Cell Rep 16: 2289-97, 2016)。その結果を更に展開するための遺伝学的スクリーニングも予想通りに進んでおり、事実、Strip-Hippoシグナルと強く相互作用するアミノ酸トランスポーターの同定に成功している。研究計画書に記載した事項に関して概ね予定通りに進んでいる。一方、申請者は、神経細胞の形態形成を研究する過程で、「進化的に保存された分子Strip」を独自に単離・解析してきた(NatCommun 5, 5180, 2014)。その過程で、「StripがHippoシグナル経路の活性を調節し、神経シナプス形成を制御すること」を見出している(Cell Rep 16: 2289-2297, 2016)。

よって本研究では、この研究成果を更に発展させる目的で、ショウジョウバエの遺伝学、ゲノム編集技術、光遺伝学的手法などを最大限に駆使し、生体内における「Strip-Hippoシグナル経路を軸とした神経シナプス制御の分子基盤解明」を目指した。平成27,28年度の期間中に、神経におけるHippo機能にかかわる因子の遺伝学的スクリーニングを行い、特定のアミノ酸トランスポーターを見出すことに成功している。平成29年度はこのアミノ酸トランスポーターの機能解析を行った。Hippoシグナルの解析に適したショウジョウバエ翅を用いて当該アミノ酸トランスポーターの機能を解析を行った。その結果、アミノ酸トランスポーターのノックダウンで翅の拡大、一方、アミノ酸トランスポーターの過剰発現で翅の消失が観察された。更にHippoとのエピスタシス解析を行ったところ、当該アミノ酸トランスポーターはHippoの下流に位置することが明らかになった。現在、本知見を基に、神経系(ニューロン形態形成、シナプス可塑性、個体行動)におけるHippoとアミノ酸トランスポーターの関係について解析を進めている。本研究では、がん抑制シグナル経路として知られるHippoシグナル経路による神経機能調節メカニズムの解明を目指した。ショウジョウバエ神経系におけるHippoシグナル経路に関わる因子の遺伝学的探索を行い、進化的に保存されたアミノ酸トランスポーターHiAT (Hippo-interacting Amino acid Transporter)を見出した。また、HippoキナーゼおよびHiATは、シナプス形成および個体活動量に影響を与えることも明らかにした。本研究は、おおむね順調に進んでいるので、予定通り、得られた候補遺伝子群の機能解析を進める。また、個体内におけるStrip-Hippoシグナル経路の活性をモニターできるような「生体内Hippo活性測定法」の開発にも着手する。今後は、同定したアミノ酸トランスポーターを軸に、個体の栄養状態、飼育環境と神経系におけるStrip-Hippoシグナル経路の関係を明らかにする。また、神経機能を個体レベルで解析するために、新たに様々な行動アッセイ系(概日リズム、生得的誘因行動、活動量など)も取り入れて「神経系におけるStrip-Hippoシグナル経路の生理機能」を体型的に理解していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。発生生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
肺高血圧症の閉塞性病変進展における炎症誘導機構の解明および新規治療法の開発

肺動脈性肺高血圧症の閉塞性血管病変の進展・維持には、腫瘍様異常細胞の増殖が主で、血行動態ストレスの病態的役割は非常に少ないと考えられていた。一方、申請者は、自身が開発した新生内膜・叢状病変など閉塞性病変を示す疾患モデル(Abe K, et al. Circulation 2010)に、片肺動脈縮窄により血行動態ストレスを軽減すると、炎症が抑制され閉塞性病変が退縮することを報告した(Abe K, et al. Cardiovasc Res. 2016)。本研究は、血行動態ストレスが炎症を介し肺血管閉塞性病変の進展・維持するという新たなパラダイムのもと、炎症と閉塞性肺血管病変の進展・維持機構を解明し、新たな難治性肺高血圧症の治療戦略の確立を目的とする。これまで肺高血圧症ラットモデルにおける血行動態ストレスを起点として誘導されるtoll-like receptor 9 (TLR9)を介した無菌性炎症と閉塞性肺血管病変の進展を明らかにした。また、TLR9阻害薬の慢性投与により炎症の抑制および肺高血圧症の治療効果を認めた。これらの結果は、TLR9新たな肺高血圧症の治療標的になる可能性を示唆するものである。TLR9阻害薬の慢性投与により炎症の抑制および肺高血圧症の治療効果を認めており、おおむね仮説通りの結果が得られている。当初の予定を変更する必要はなく、今年中に結果をまとめる予定。一方、申請者は、自身が開発した新生内膜・叢状病変(plexiform lesion)など閉塞性病変を示す疾患モデル(Abe K, et al. Circulation 2010)に、片肺動脈縮窄により血行動態ストレスを軽減すると、炎症が抑制され閉塞性病変が退縮することを報告した(Abe K, et al. Cardiovasc Res. 2016)。肺高血圧症ラットモデル(Su/Hx/Nxモデル)における血行動態ストレスを起点として誘導されるtoll-like receptor 9 (TLR9)の活性化、および無菌性炎症と閉塞性肺血管病変の進展・増悪機構を解明し、新たな難治性肺高血圧症の治療戦略を確立することを目的とする。当初の予定通り。肺高血圧症モデル動物に対して閉塞性血管病変の進展におけるサイトカイ、特にIL6の測定とその上流シグナルの解析を行った。研究成果は、国内外の主要学会のシンポジウム等で口述発表に採択された。TLR9活性化を介した閉塞性血管病変の進展における炎症誘導機構の解明を行う。重症化した肺高血圧モデルに対して、TLR9阻害剤を投与し、血漿・肺組織におけるサイトカインを測定し、無菌性炎症にミトコンドリア障害とTLR9活性化が直接的に関わっていることを明らかにする。現時点で研究計画遂行における問題点は特にない。
乳癌における細胞運動調節機構の分子機序解明と新規治療法への応用

【背景】ROCK蛋白は、細胞運動調節機構に必須とされるRhoのeffecterとして知られ、活性型Rhoによってリン酸化されて活性型ROCK(p-ROCK)となる。Rho/ROCK経路が癌細胞の浸潤・転移に強く関与することは既に分っているが、ROCK蛋白の発現及び活性化の臨床病理学的意義についての報告はない。【目的】乳癌組織におけるROCK/p-ROCK発現意義について臨床病理学的に検討する。【対象と方法】原発性乳癌手術症例220例(平均観察期間; 3.96年)を対象とし、ROCK、p-ROCKの発現について免疫組織染色を用いて評価した。【結果】浸潤性乳管癌において、ROCKは細胞質に発現しており、67.3%(148/220)に強陽性であった。また活性型のp-ROCKは核に発現しており46.8%(103/220)に強陽性で、興味深ことに、浸潤部で強発現している特徴があった。正常乳腺組織、線維腺腫、DCISでの発現は亢進していなかった。臨床病理学的検討では、活性型であるp-ROCKの発現はリンパ節転移(p<0.0001)、リンパ管侵襲(p<0.05)と有意な相関を認め、p-ROCK陽性例で有意に予後が不良であった(p=0.014)。【考察】活性型ROCK(p-ROCK)は乳癌の進展、特にリンパ節転移と強く関与し、予後とも強い相関を示した。ROCK特異的阻害剤の中には既に臨床応用可能な薬剤もある。これらを用いてROCK蛋白の活性化を制御することにより乳癌の予後が改善できる可能性があることが明らかとなった。ROCK特異的阻害剤は今後の乳癌薬物治療における新たな分子標的として期待できる【背景】ROCK蛋白は、細胞運動調節機構に必須とされるRhoのeffecterとして知られ、活性型Rhoによってリン酸化されて活性型ROCK(p-ROCK)となる。ROCK特異的阻害剤は今後の乳癌薬物治療における新たな分子標的として期待できる【目的】ER、PgR、HER2陰性であるいわゆるtriple negative乳癌症例は、内分泌療法や、HER2分子標的治療薬のtrastuzumabの適応外であり、標準的な化学療法にも難治性であり、新たな治療法の開発が必要である。癌細胞においてアクトミオシン系を介した細胞運動調節機構にRho-kinase(ROCK2)が関与することが近年明らかにされた。今回、乳癌症例の中で、特に新規治療法の開発が急務なtriple negative乳癌における発現の意義について検討した。【対象、方法、結果】2000-2006年において手術を施行した原発性乳癌症例231例中、triple negative乳癌26症例(11.3%)に認め、その中で解析可能な16例について、抗ヒトROCK2抗体を用いて免疫組織化学染色(SAB法)にて評価した。ROCK2の発現は、強発現群12例(75%)、中程度発現4例(19%)、無発現1例(6%)であった。【考察】新規治療法の開発が急務なtriple negative乳癌症例の75%と比較的高い頻度でROCK2の強発現が認められたことから、ROCK2阻害剤による分子標的治療の可能性が示された。より多くの症例について検討するとともに、triple negative以外の症例についても解析を加え、乳癌における細胞運動調節機構の分子機序解明と新規治療法の開発について検討する。【対象と方法】

原発性乳癌手術症例220例(平均観察期間;3.96年)を対象とし、ROCK、p-ROCKの発現について免疫組織染色を用いて評価した。【結果】浸潤性乳管癌において、ROGKは細胞質に発現しており、67.3%(148/220)に強陽性であった。また活性型のp-ROCKは核に発現しており46.8%(103/220)に強陽性で、興味深ことに、浸潤部で強発現している特徴があった。正常乳腺組織、線維腺腫、DCISでの発現は亢進していなかった。臨床病理学的検討では、活性型であるp-ROCKの発現はリンパ節転移(p〈0.0001)、リンパ管侵襲(p〈0.05)と有意な相関を認め、p-ROCK陽性例で有意に予後が不良であった(p=0.014)。【考察】活性型ROCK(p-ROGK)は乳癌の進展、特にリンパ節転移と強く関与し、予後とも強い相関を示した。ROCK特異的阻害剤の中には既に臨床応用可能な薬剤もある。これらを用いてROCK蛋白の活性化を制御することにより乳癌の予後が改善できる可能性がある。ROCK特異的阻害剤は今後の乳癌薬物治療における新たな分子標的として期待できる。(690字)
ホスホリパーゼA_2の構造化学的研究と特異的阻害剤の開発

本年度は,外分泌型ホスホリパーゼA2,(PLA2)の中でも,牛膵臓より得られるPLA_2に着目した.本酵素は,N-末端が7残基長い前駆体酵素(pro-PLA2)として膵臓より発現され,トリプシンによってその7残基が限定分解を受け活性型酵素となる.前駆体酵素と活性型酵素では,ミセル状の基質に対して全く異なった活性力を示す.そこでこの機能発現機構を分子レベルで解明するため、牛膵臓由来pro-PLA2とtrypsinとの複合体のX線結晶構造解析を目的とし、複合体結晶の作成を試みた。まず複合体の調製は、pro-PLA2がtrypsinにより分解されずに両蛋白質が結合出来ることを考慮し、反応溶液のpHを中性から酸性側に選択し、更にPLA2の活性発現に必須であるCa^<2+>を添加した。複合体の形成は、Sephadex G-50カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した。複合体の結晶化条件の検討は,室温において蒸気拡散平衡法により行った。沈殿剤としては作用の異なる代表的な3種である、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール4000、2-メチル2-4-ペンタンジオールを用い、これらの濃度および溶液のpHを7.0から4.0まで変化させた。様々な条件検討の結果、1015%濃度のポリエチレングリコールを用い、pH6.5の条件において板状の結晶を得ることが出来た。しかし、この結晶では充分なX線回折データを得ることが出来なかったため、現在、構造解析に使用可能な良質の結晶を得るべく結晶化条件の精密化を行っている。本年度は、外分泌型ホスホリパーゼA_2(PLA_2)の中でも、牛膵臓より得られるPLA_2に着目した。本酵素はN-末端が7残基長い前駆体酵素(pro-PLA_2)として膵臓より発現され、トリプシンによってその7残基が限定分解を受け活性型酵素となる。前駆体酵素と活性型酵素では、ミセル状の基質に対して全く異なった活性力を示す。そこで、この機能発現機構を分子レベルで解明するため、牛膵臓由来pro-PLA_2と、トリプシンとの複合体のX線結晶構造解析を目的とし、複合体結晶の作成を試みた。まず複合体の調製は、pro-PLA_2がトリプシンにより分解されずに両蛋白質が結合し得る条件を考慮し、反応溶液の液性を中性から酸性側に選択し、さらにPLA_2の活性発現に必須であるCa^<2+>を添加した。複合体の結晶化条件の検討は、室温において蒸気拡散平衡法により行った。沈殿剤としては、作用の異なる代表的なものである、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール4000、2-メチル-2,4-ペンタジオールを用い、これらの濃度、及び溶液のpHを7.0から4.0まで変化させた。さまざまな条件検討の結果、1015%濃度のポリエチレングリコールを用い、pH6.5の条件において板状の結晶を得ることができた。しかしこの結晶では充分なX線回折データを得ることができなかったため、現在結晶構造解析に使用可能な良質の結晶を得るべく、結晶化条件の精密化を行っている。
神経アクチン細胞骨格制御に関わるRhoならびにCa2+シグナル伝達機構の解明

1.我々は、小脳顆粒細胞という、神経細胞の中でももっとも数が多い細胞種を材料に、Rhoの上流と下流のシグナル伝達系を解明することを試みた。SDF-1α/CXCR4による小脳顆粒細胞の形態制御とRho情報伝達系の関与について検討した結果、SDF-1α/CXCR4/Rho/mDia1経路が小脳顆粒細胞の軸索伸展を制御していることが明らかとなった。具体的には、軸索伸展の正の制御にmDia1が必須であることが証明された。すなわち、Rhoは、2つの標的分子ROCKとmDia1を協調的に制御することにより、軸索突起形成・伸展がバランスよく生じ、回路網形成のために最適な条件を生み出している可能性を示唆するものである。2.我々は、これまで海馬錐体細胞において、カルシウム依存的に樹状突起へのアクチン集積が起こることを見出している。しかしながら、アクチン集積からスパイン形態変化へ確実に移行するのか、そのときにカルシウムの下流で作用するシグナル伝達系は何か、RhoGTPaseファミリーは関与するのか、といった点については、全く未解明である。我々は、CREB kinase候補遺伝子CLICK (CaMK-like CREB kinase)-IIIを、中枢神経系では初の膜結合型キナーゼとして単離同定した。さらなる解析の結果、C末端CAAXモチーフを介してprenyl化修飾を受けること、またCaMKKによる活性化制御を受けることを明らかにした。引き続き、本キナーゼの解析を行い、PC-12にてCaMKK/CLICK-III経路が突起形成に関与すること、またその下流で特定のG蛋白の活性が増大することなどが明らかになった。我々は、小脳顆粒細胞という、神経細胞の中でももっとも数が多い細胞種を材料に、Rhoの上流と下流のシグナル伝達系を解明することを試みた。SDF-1α/CXCR4による小脳顆粒細胞の形態制御とRho情報伝達系の関与について検討した。まずマウス生後一日齢初代培養小脳顆粒細胞の初期軸索形成・伸展という視点で観察すると、SDF-1αは低濃度で軸索伸展を増強し、高濃度で軸索形成を抑制することが明らかとなった。この際、SDF-1αが低濃度、高濃度においてRho活性を上昇させていることが明らかになった。この実験系でRhoの標的分子の一つであるp160ROCKを阻害すると、SDF-1αによる軸索形成抑制が解除された。また軸索伸展が著しく増強したが、この作用はC3菌体外酵素処理によりなくなることから、Rhoの下流に軸索伸展作用を示す標的分子の存在が推定された。Rho下流分子の候補として、mDia1に着目した。mDia1の中枢神経系における発現部位を検討すると、マウス生後一日齢で小脳の外顆粒層や大脳皮質に多く認められた。さまざまな変異体を用い、リポフェクション法にてmDia1およびその変異体を過剰発現し、その表現型を観察した。その結果、SDF-1α/ CXCR4/Rho/mDia1経路が小脳顆粒細胞の軸索伸展を制御していることが明らかとなった。以上より、軸索伸展の正の制御にmDia1が必須であることが証明された。我々は、これまで、カルシウム依存的に樹状突起へのアクチン集積が起こることを見出している。

引き続き、本キナーゼの活性化により、どのような表現型が現れるか、また細胞内情報伝達系が活性化されるかを焦点に解析を続けた。その結果、1)PC-12にてCaMMK/CLICK-III経路を活性化すると、突起数の増大を生じること、またこの表現型がdominant CREB発現によって阻害されないこと、2)この際、低分子量G蛋白質群の中の特定のものの活性上昇が伴うこと、またそのG蛋白のdominant negative体により、突起数増大の表現型が消失すること、などが明らかになった。
ハドロン同時計測法を用いた陽子と中性子のスピン構造の研究-DESYにおける偏極深非弾性散乱実験-

本研究では、東工大において1)実験データ解析と2)測定器開発とを行った。研究のテーマは陽子と中性子のスピンのクォーク・グルーオン構造の研究である。核子のスピンは1/2であるが、そのうちクォークが担う部分が少ないことは1988年のEMCの結果により知られている。我々は、ドイツ・ハンブルクのDESY(ドイツ電子シンクロトロン研究所)のHERMES実験に参加しており、その高エネルギー偏極電子ビームと偏極核子標的の散乱から得られる実験データは逐次東工大に送られる。この散乱は深非弾性散乱と呼ばれる。この実験の特徴は、散乱する電子を測定するだけでなく、発生するハドロン(中間子、核子、Λ粒子など)も同時計測することである。そのために、リングイメージングチェレンコフ検出器(RICH)を開発し、HERMES実験に組み込んだ。それにより、パイ中間子、K中間子、陽子、反陽子が2-20GeV/cの領域で完全に識別できるようになった。核子の中の偏極したu,d,sクォークの分布が解明できるようになった。更に、「横偏極」についての研究がなされたことは大きな成果である。これは、核子スピンと直角方向にスピンが向いているクォークの分布を研究するものである。実験では、電子散乱の散乱平面とパイ中間子の発生方向とのなす角が、標的の核子のスピンを反転したときにどう変わるかに着目して観測した。そして有意なAsymmetryがあることを検出した。横偏極のクォークの物理は今後の研究分野を開くものである。陽子や中性子(総称して核子)はスピン1/2を持つが,このスピンが,核子の構成要素であるクォークやグル-オンのスピンからどのようにつくられているか,は近年の素粒子物理の重要な問題の一つである。東工大の研究グループは,この問題を新技術によって解決するため'HERMES'実験を行った。パイ中間子などのハドロン生成物を,散乱電子と同時に計測し,粒子識別をする方法を開発した。これが本研究第1年目の最大の成果である。この方法は,リングイメージチェレンコフ検出器を用いるもので,その発光体のエアロジェルの性能が格段に良くなったことが要点である。核子のスピン構造を研究するため電子と核子(陽子と中性子)の深非弾性散乱実験を行なった。この実験はHERMESと呼ばれている。特に平成10年度は,深非弾性散乱に伴い発生するハドロン(π,κ,p)を識別するためのリングイメージチェレンコフ検出器を開発し,測定器に組み込むことができ,データをとり始めた。シリコン・エアロジェルをリングイメージチェレンコフ検出器に用いたのは世界で初めてである。これにより2-20GeV/cの運動量領域のπ,κ,pが完全に識別できるようになった。この装置を用いて核子のスピン構造を研究した。「陽子のスピン構造」を解明することは、量子色力学の分野で現在最も興味をもたれている問題である。そのために偏極深非弾性散乱を電子と陽子で起こさせ、散乱された電子とともに発生したハドロンを検出し、識別した。特に、シリカエアロジェルを発光体とするリングイメージチェレンコフ検出器によりK^±中間子を識別し、ストレンジクォーク、seaクォークについて研究した。有意なsingle spin asymmetryが発見されたことも成果の1つである。このようにHERMES実験は新しい手法により未開の領域を探っている。
短期呼吸停止とニューロンの構造変化

中枢神経系は酸素欠乏に弱い組織である。しかし、数分間の呼吸停止は日常生活でも経験するところであり、機能的にも構造的にもニューロンになんらの変化も引き起こすものではない、と一般に信じられてきた。それが呼吸停止と同時に、ラット小脳のプルキンエ細胞では、樹状突起内に管状をなし全体に網目状に広がる滑面小胞体の網目が崩れ、扁平な有窓小胞体を経て、層板が重なったあった層板小体へと構造を変えていく。その変化は呼吸停止直後から始まり、3分後では層板小体が全体を占め、5分後にはさらに層板の数が増える。これらの変化を経時的に電顕連続切片で明らかにし報告した(Bannno & Kohno,J.C.N.'96)。これらの虚血変化は人工呼吸開始とともに消失する。同様の層板形成はグルタメイトの脳室内投与によっても起こることを明らかにし、更に4種類あるグルタメイト受容体の中で層板形成に直接関与するのはどれか、それぞれのアゴニストを投与して検討した。イオントロピック型受容体の、NMDAは特に変化なく、AMPAとkainateは強い細胞質の萎縮とグリア細胞の細胞質の膨化を引き起こした。代謝型の受容体のアゴニストt-ACPDは強い層板形成能を示し濃度依存性に層板の数は増加した。この層板形成能はアゴニストであるL-AP3により濃度依存性に抑制された。t-ACPDにより形成される層板小体は大型で層板同士の配列は整然としておりその間をつなぐ顆粒も25nmの間隔で規則正しく並ぶ。強拡大で見ると、この顆粒は層板間を結ぶ長さ15nmの短い管で、傾斜装置で90°回転させると中空の内腔が見えた。これは4量体のIP-3受容体そのもので、小胞体に蓄えたCa^<2+>が小胞体外に大量に放出されて異常興奮が起こらないように、互いの内腔を繋ぎ生体防御反応をなす。現在J.C.N.に投稿すべく準備中である。今後はこの仮説を培養系で検証してみたく準備を進めている。
難治性消化管間葉系腫瘍に対する新規ワクチン療法の開発

難治性消化管間葉系腫瘍(GIST)は、既存の治療では十分な効果が得られず新たな治療法が待たれる。腫瘍血管を標的とした免疫治療の誘導では、安定した、強い抗腫瘍免疫誘導が期待される。我々の基礎実験で腫瘍血管周細胞上に発現するHBB1へのワクチン治療の有用性を報告してきた。免疫組織化学染色を用いた検討では、ヒト胃GIST腫瘍血管上にはHBB1の発現が認められた。免疫二重染色を用いた検討で、GIST組織で周細胞マーカーとHBB1の共染色陽性であり周細胞上にHBB1の発現が示唆された。腫瘍血管周細胞に発現するHBB1に対する抗腫瘍免疫誘導によりGISTへの強い抗腫瘍効果が期待される。ヘモグロビンベータ1(HBB1)は腫瘍血管の周細胞に特異的に発現して独自の抗原性を示すため腫瘍血管を標的としたがんワクチン療法において良好な標的抗原となりうることが基礎研究により示された。本研究では難治性消化管間葉系腫瘍であるGISTの治療を目的としてHBB1に対するワクチンの開発を進めている。本年度はヒトGISTの腫瘍血管細胞におけるHBB1の発現を免疫組織化学的手法で検討した。検討したGIST症例は10例で、男性8例、女性2例、平均年齢は63.5歳、組織学的に悪性3例、境界6例、良性1例で、すべてCD117の発現を認めた。典型的な周細胞におけるHBB発現陽性像では、腫瘍の毛細血管壁は赤血球より強くHBBに染色され、毛細血管壁は部分的に外側に紡錘状に肥厚してHBB陽性を示した。腫瘍血管壁は部分的に肥厚するような形でHBB陽性を示したが、腫瘍周囲正常胃粘膜の毛細血管壁はHBB陽性の所見に乏しく、腫瘍組織の毛細血管壁は正常組織毛細血管壁に比較し強くHBB染色陽性を示した。HBBの発現を蛍光抗体法により観察すると、血管壁を構成する紡錘形の有核細胞にHBBの発現が認められ、HBB陽性細胞はスキップして存在することから、血管内皮細胞というよりは、血管外側をサポートする周細胞である可能性が高いと考えられた。今回検討した10例の胃GISTにおいて、一例の判定不能例を除く9例に周細胞におけるHBBの陽性所見が認められた。しかし、その発現頻度は症例ごとに差がみられ、症例2,3,8では高頻度、症例6,9においては低頻度であった。一方、GISTの対象として9例の大腸癌組織(高分化型3例、中分化型3例、低分化型3例)で周細胞のHBB発現を検討したところ、全例においてGISTで認められた毛細血管壁のHBB陽性所見は認めなかった。難治性消化管間葉系腫瘍(GIST)は、既存の治療では千分な効果が得られず、新たな治療開発が待たれる。我々の基礎研究によれば腫瘍血管の支持細胞である周細胞を標的とするがんワクチン療法は、腫瘍細胞のMHC class Iの消失などもなく、また腫瘍抗原の多様性もないためがん免疫療法の重要な標的になりうる。その腫瘍間質に発現している標的抗原としてヘモグロビンβ1を基礎的研究で同定し、報告してきた。去年までの研究では胃GIST、大腸癌の手術摘出標本を用いた検討で、胃GISTにおいて腫瘍血管周細胞上にHBBの発現を10例中9例で認められるのを報告した。一方で、胃の非癌部の正常胃粘膜毛細血管では、HBB発現は認められず、また大腸癌手術摘出標本10例でも全例でHBBの発現は認められなかった。今年度は、周細胞上に発現している免疫療法のHBB以外の標的抗原をコンピュウーター解析や過去の論文報告をもとに同定、解析した。周細胞上の抗原として、数種類の標的抗原の候補を同定した。これらを用いて、HHDマウスにB16腫瘍移植モデルを用いて治療した検討では、CD8+Tce11による抗腫瘍免疫を誘導するのにDLK1,HBB,NRP1,PDGFRβ,TEM1ペプチドなどが有効な抗原と考えられた。in vitro assayであるが、正常健常人、メラノーマ患者血清からのCD8+T細胞の上記ペプチドへの反応性も強く認められ、固形腫瘍(GISTを含む)の腫瘍血管周細胞の標的抗原として非常に有望である可能性が示唆された。難治性消化管間葉系腫瘍(GIST)は、既存の治療では十分効果が得られず新たな治療法が待たれる。腫瘍排除に腫瘍特異抗原を標的とするのは効率が良い治療と考えられる。が、腫瘍細胞の免疫学的逃避機構、腫瘍抗原やHLA class I発現低下があり,十分な特異的免疫誘導がされない可能性がある。

一方で腫瘍血管を標的とした特異抗原の免疫誘導では、抗原の発現も安定し、HLA class Iの発現低下もなく強い抗腫瘍効果が期待出来る。我々は基礎実験において腫瘍血管周細胞にHBB1,TEM1, RGS5, PDGFRβなどの抗原の発現、エピトープ同定、腫瘍血管を標的とした免疫治療の可能性を報告してきた。(Komita H. Can Res. 2008. Zhao X.J Immunol. 2012.)GIST症例では腫瘍血管にHBB1の発現が9割近く認められたが、大腸癌腫瘍血管や正常胃血管ではHBB1の発現はみられなかった。免疫染色により、胃GIST腫瘍血管にEphA2の発現確認、TEM1は発現の可能性が示唆され、NRP1, DLK1などは発現頻度が低く、再検査が必要と考えている。GIST胃におけるHBB1の発現の局在を知る目的で免疫二重染色を行ったところ、腫瘍血管周細胞マーカーαSMAとHBB1の染色はほぼ重なって存在しており周細胞上にHBB1の発現が示唆された。今後他の周細胞マーカーなどを使用して免疫染色によりHBB1の発現を確定する。さらに、電子顕微鏡やin situ hybridizationによるHBB1発現同定の精査も検討する。腫瘍血管にHBB1が発現する原因として、腫瘍組織でのHIF-1αの発現増強にともない赤血球造成erythropoiesis、血管新生angiogenesisを引き起こした可能性があり腫瘍血管でのHBB1発現のメカニズムに関しても研究継続する。研究計画書提出時の目標の通り、腫瘍血管周細胞を標的とした免疫療法のためのCD8+T細胞誘導を引き起こす可能性のある数種類のペプチドを同定した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はGISTモデルマウスなどを用いてCTL誘導を引き起こすペプチドを用いて、sunitinibとの併用により抗腫瘍効果の増強の有無などを検討する。
HMGboxのDNA結合機構および転写反応における役割の研究

高等動植物の細胞核に存在する核タンパク質HMG1およびHMG2(以下HMG1/2と略)は、DNA結合性である。そのDNA結合モチーフ(HMG-box)は、多くの転写因子に存在し、そのDNA認識と結合の機構、転写における係わりあいが注目されつつある。本研究では、HMG-boxを高発現、精製後、高次構造を明らかにし、HMG-boxのDNAの認識と結合機構について解明することを目的とした。HMG1/2に2つずつ含まれるHMG-box(ドメインA、ドメインB)をコードするcDNAを発現プラスミドに挿入し、T7システムをもちいて大腸菌内で高発現させた。菌体より、各HMG-boxを均一になるまで精製し、現在大阪大学蛋白質研究所の協力のもと、NMRによる高次構造解析を行なっている。次に、各HMG-boxとDNAとの結合機構について、ゲルシフトアッセイをもちいて解析した。その結果、各ドメイン単独ではDNA結合性は持つものの、HMG1/2で認められるDNA高次構造に対する優先的結合、および協同的結合性は認められなかった。また、DNAの巻戻し活性を調べたところ、各HMG-boxでは、ほとんど活性が認められなかったが、両HMG-boxをもつ構成物では巻戻し活性が認められた。以上のことから、HMG1/2の2つのHMG-boxは、DNA結合性を持つが、DNA構造に対する特異性および強力な結合性を示すには、両HMG-boxがタンデムに結合していることが必要であることが示唆された。
靭帯骨化症の分子基盤-Runx3遺伝子欠損マウスを用いた検討-

我々はRunx3欠損マウスを用いた個体レベルの検討において、Runx3が骨芽細胞の増殖に重要であることを見出した。また、Runx3は靭帯の骨化には直接的には影響を及ぼさないことを初めて明らかにした。我々はRunx3欠損マウスの骨・軟骨組織を予備的に解析し、Runx3欠損マウスの体長の短縮を見出した。この知見に基づき、本研究では、Runx3欠損マウスの解析を通じて、Runx3の骨代謝における作用を分子生物学的に明らかにしようとした。また、靭帯骨化症モデルマウスとRunx3欠損マウスおよびRunx2欠損マウスに交配により得た2重、3重変異マウスを組織学的、分子生物学的に解析し、靭帯骨化症におけるRunx3の病態生理的意義を解明しようとした。既報ではRunx3欠損マウスには明らかな異常がないとされているが、我々の検討ではRunx3欠損マウスは出生直後より野生型マウスに比べて約30%体長が短く、成長とともにその程度が増悪した。また、Dexa法による骨密度測定ではRunx3欠損マウスは骨密度が低下する傾向にあった。組織学的に検討するため、4、12週齢のマウスの骨を樹脂包埋し非脱灰切片を作成し、骨形態計測を行った。その結果、Runx3欠損マウスでは骨量の低下とともに、骨形成率の著明な低下が認められ、Runx3が骨形成に関わることが初めて明らかとなった。また、現在、靭帯骨化症におけるRunx3の意義を解明すべく、ttwマウスとRunx3欠損マウスを交配し二重遺伝子変異マウス(Runx3-/-/ttwマウス)を作成している。靭帯の肥厚、石灰化が認められる8週齢、12週齢において石灰化部位をμCTを用いて三次元的に再構築し、定量する予定である。すでに我々は、Runx3欠損マウスの骨・軟骨組織を解析し、Runx3欠損マウスでは長管骨の長さの短縮、著明な骨形成率の低下を見出している。本年度はこの知見に基づき、Runx3の骨代謝における作用を分子生物学的に明らかにしようとした。Runx3欠損マウスから得た骨芽細胞を培養したところ、その増殖は極めて遅かった。一方、骨芽細胞の分化には大きな異常は認められなかった。そこで、骨芽細胞分化、増殖のマーカーの発現を検討している。Runx2は骨芽細胞分化のマスター因子として、Runx1は間葉系細胞から軟骨へのカギ分子としてよく知られているため、Runx1/Runx2/Runx3欠損ヘテロマウスを作製したが、大きな骨格系の異常は認められなかった。そのため、現在、Runx1/Runx2/Runx3三重欠損ホモマウスを作成し、骨格系の形成におけるRunx1,2,3の協調的な作用について検討を進めている。今後、靭帯の肥厚、石灰化が認められる8週齢、12週齢において石灰化部位をμCTを用いて三次元的に再構築し、定量する予定である。以上のように、実験は当初計画通り、順調に進行している。これまでに我々は、Runx3欠損マウスの骨・軟骨組織を解析し、Runx3欠損マウスでは長管骨の長さの短縮、著明な骨形成率の低下を見出している。また、共同研究者により樹立された骨芽細胞特異的Runx3欠損マウスでは骨量の著しい低下を認めた。したがって、軟骨ではなく、骨で発現するRunx3が骨形成において重要な作用を持つことが明らかになった。Runx2は骨芽細胞分化のマスター因子として、Runx1は間葉系細胞から軟骨への重要な分子として知られているため、昨年度Runx1/Runx2/Runx3三重ヘテロ欠損マウスを作製したが、大きな骨格系の異常は認められなかった。骨におけるRunx3とRunx2の協調的作用を解明するため、現在Runx2/Runx3二重ホモ欠損マウスを作成すると同時に、Runx1/Runx2/Runx3三重欠損ホモマウスも作成中である。現在、Runx1ホモ欠損、Runx2/Runx3ヘテロ欠損マウスの作成まで順調に進んだ。さらに、靭帯骨化症におけるRunx3の意義を解明すべく、ttwマウスとRunx/3欠損マウスを交配し二重遺伝子変異マウス(Runx3-/-/ttwマウス)を作成したがRunx3の明らかな靭帯骨化症に及ぼす影響はμCTを用いた三次元的な再構築や組織学的な解析からは同定することが認められなかった。