hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高強度高靭性セメント複合体の基本特性とその実用化に関する研究

コンクリートの靭性を改善した様々な短繊維補強コンクリートが開発され実用化されている。本研究では、更なる高強度高靭性能を付与するために補強用繊維に高強度・高弾性ポリエチレン繊維を選定した。このポリエチレン繊維補強モルタルは高引張強度と高靭性、優れた変形性能を有していることが基礎物性試験により確認された。次に、ポリエチレン繊維補強モルタルの埋設型枠および断面修復材への適用性について鉄筋コンクリートはり部材を用いた載荷試験により評価した。その結果、ポリエチレン繊維補強モルタルを埋設型枠、断面補修材としてRCはり下面(引張部位)に用いた場合、断面形状・寸法および鉄筋量が同一の一体打ちのはりと同等以上の耐荷性能を示し、ひび割れの分散性も良好で優れたひび割れ幅抑制効果が得られることがわかった。高いひび割れ抵抗性と高じん性を有する短繊維補強モルタルは吹付け工など幾つかの用途に使用されている。本研究では、埋設型枠としてハーフプレキャスト構造へ適用することを念頭に、汎用的に入手可能なコンクリート用細骨材を用い実験を行った。補強用繊維は高強度・高弾性であるポリエチレン繊維を選定し、現在わが国で比較的多く使用されているビニロン繊維との比較で繊維補強モルタルの配合試験、圧縮強度および引張性能試験を環境温度20°Cで実施し、その基礎的性状について検討した。その結果、以下の知見が得られた。(1)ポリエチレン繊維補強モルタルの細骨材としてコンクリート用の海砂を使用しても珪砂を用いた場合と同等の引張性能が得られる。(2)ポリエチレン繊維で補強した繊維補強モルタルは、ビニロン繊維で補強したものに比べ、高強度領域において優れた引張性能を発揮する。しかし、低強度領域になるとビニロン繊維の方が引張性能は優れている。これは、親水性を有するビニロン繊維の方がマトリックスとの付着強度がポリエチレン繊維より高いためであると推察できる。(3)水セメント比が30%のポリエチレン繊維補強モルタルは、繊維混入率2.0%でも大きなじん性能を示す。ただし、繊維混入率1.5%の場合よりじん性能は低下する傾向が窺え、モルタル中の繊維の増加による施工性の低下を考えても繊維混入率は1.5%の方が適当である。(4)環境温度を5°C、35°Cと変化させた場合の性状については在確認中である。本研究では、短繊維補強モルタルの埋設型枠およびコテ塗り断面修復材への適用を念頭に実験を行った。補強用繊維は高強度・高弾性であるポリエチレン繊維を選定し、使用実績の多いビニロン繊維との比較で繊維補強モルタルの配合試験を行い、施工性および力学特性を把握した。その後、最適配合のポリエチレン繊維補強モルタルの埋設型枠および断面修復材への適用性を検討するために鉄筋コンクリートはり部材を用いた載荷試験を実施した。(1)細骨材に容易に入手できるコンクリート用細骨材を用いたポリエチレン繊維補強モルタルは、ビニロン繊維で補強したものに比べ、高強度領域において優れた引張性能を発揮する。(4)環境温度が5°Cまで下がると、材齢7日ではポリエチレン繊維補強モルタルの引張性能は20°C、35°Cの場合よりも低下すことがわかった。したがって、低温時に施工した場合は、設計材齢を長くする必要がある。(5)ポリエチレン繊維補強モルタルを埋設型枠、断面補修材としてRCはり下面に用いた場合、断面形状・寸法および鉄筋量が同一の一体打ちのはりと同等以上の耐荷性能を示し、ひび割れの分散性も良好で、優れたひび割れ幅抑制効果が得られることがわかった。
PI3K-p38MAPK経路による樹状細胞機能の制御機構

PI3K経路が、マウス樹状細胞において、mTOR経路・GSK3経路・p38 MAPK経路の少なくとも3つの経路を介して、IL-12産生をはじめとする免疫調整能の制御を行っていることを明らかにした。これまで他の細胞で得られてきた結果と異なり、PI3Kはp38MAPKの活性化を負に制御していることから、樹状細胞においては全く新規のMAPK制御機構が機能するものと推測される。免疫糸は、微生物をはじめとした種々の異物の侵入・増殖の危機がら個体を守るために、様々な免疫担当細胞からなる協調的なネットワークを形成している。中でも自然免疫系と獲得免疫系の橋渡し的存在である樹状細胞は、免疫系の司令塔であるT細胞に抗原を提示すると同時に種々のサイトカインを生産することで、免疫系がTh1反応(細胞性免疫反応)を示すか、Th2反応(液性免疫反応)を示すかを規定する役割を担っている。Th1/Th2バランスに影響を与えるサイトカインの一つとして樹状細胞の生産するIL-12が挙げられるが、申請者は、PI3K経路が樹状細胞において1L-12生産を負に制御している事を明らかにしてきた。本年度は、特に11L-12の遺伝子発現に必須と考えられているp38MAPK経路に着目し、PI3K経路によるp38MAPK経路の制御機構に重点を置いた解析を行った。PI3Kの活性化は、セリン/スレオニンキナーゼであるAktの活性化を介して、mTORの活性化やGSK3Rの不活性化等、各種シグナル伝達分子の活性制御を引き起こす。そこで、PI3K1経路によるp38 MAPK経路の活性制御機構に、これら既知の分子が関与するか否かの解析を行った。PI3K経路の阻害剤であるwortmanninでマウス樹状細胞を処理した上でLPS刺激を行った際には、p38MAPK経路の活性の亢進が認められるのに対し、mTORの阻害剤であるrapamaycinやGSK3の阻害剤であるSB216763で樹状細胞を前処理した場合には、p38MAPK経路の活性化レベルに有意な変化は認められなかった。PI3Kによって生産されるPIP3がAkt非依存的にp38MAPK経路を制御している可能性と、Aktが未知の分子の活性制御を介している可能性とを区別すべく、現在Aktの優性不能型変異体の遺伝子導入を試みている。免疫系は、微生物をはじめとした種々の異物の侵入・増殖の危機から個体を守るために、様々な免疫担当細胞からなる協調的なネットワークを形成している。Th1/Th2バランスに影響を与えるサイトカインの一つとして樹状細胞の生産するIL-12が挙げられ、申請者はPI3K経路が樹状細胞においてIL-12生産を負に制御している事を明らかにしている。本年度は、PI3K経路によるIL-12発現の負の調節機構の分子基盤解明を目指し、網羅的な解析を行った。PI3Kの活性化は、Aktの活性化を介して、mTORの活性化やGSK3βの不活性化等、各種シグナル伝達分子の活性制御を引き起こす。一方、遺伝子改変マウスの解析からp38MAPK経路がIL-12の生産を正に調節していることが明らかとなっている。各種の阻害剤を用いた解析の結果、mTOR経路が抑制性サイトカインであるIL-10の発現を介してIL-12生産を負に制御するのに対し、GSK3経路ならびにp38MAPK経路はIL-12の遺伝子発現を直接正に制御していることが明らかとなった。PI3K経路は、mTOR経路・GSK3経路非依存的にp38 MAPK経路の活性を負に制御することから、これら3つのシグナル伝達経路を介して、複合的にIL-12生産制御に関わることが示された。PI3K経路はRhoファミリー分子を介してp38 MAPKの活性化を正に制御するものと考えられているが、われわれのデータは、樹状細胞に全く新規のMAPK活性制御機構経路が存在することを強く示唆している。
前立腺がん鑑別および悪性度評価に有用な糖鎖性マーカーアレイの開発

前立腺がんは本邦で2015年に部位別罹患率が1位となり、今後さらに増加すると考えられる。過剰治療が問題となっており、前立腺がん鑑別だけでなく悪性度を正確に反映するバイオマーカーの必要性が高まっている。近年、尿中の糖転移酵素の発現検出やレクチン-抗体法による血清PSAのがん性糖鎖変異の特異的検出法が前立腺がんの鑑別および悪性度評価に寄与する可能性が示されている。本研究では、糖転移酵素GCNT1と疾患特異的な組み換えレクチンをプリントしたハイブリッドアレイパネルの樹立し、前立腺がんの鑑別と悪性度を同時評価可能な新たなバイオマーカーとなりうるかを検証することを目的とする。平成29年度の研究から前立腺圧出尿中のPSA糖鎖変異を組み換えレクチンアレイで検出することが可能となり、前立腺癌診断およびの悪性度評価に有用なレクチンの組み合わせを発見した。本年度は、さらに解析検体数を増やし前立腺癌の鑑別および悪性度評価に関するROC解析を行った。これらの研究成果を今後日本、欧州、および米国の各泌尿器科学会で発表を検討している。H29年度に確立した組換えレクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法を用いて、H30年度以降の計画である臨床検体による評価を行った。当初の予定通り、前立腺癌の鑑別、悪性度評価に関連する糖鎖プロファイルを得た。今後は、前立腺圧出尿を検体とし、レクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法による前立腺癌の鑑別および悪性度を評価する方法の開発を進めるため、解析臨床検体の数を増やす。本研究では、糖転移酵素GCNT1と疾患特異的な組換えレクチンをプリントしたハイブリッドアレイパネルを樹立し、前立腺がんの鑑別と悪性度を同時評価可能な新たなバイオマーカーとなりうるかを検証することを目的とする。平成29年度は、抗GCNT1モノクローナル抗体を固定化したアレイによる前立腺圧出尿中のGCNT1の検出法の構築および組換えレクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法の構築を試みたが、現時点で抗GCNT1モノクローナル抗体固定化アレイの確立には至っていない。また組換えレクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法に関して、高濃度(50 ng/mL)の血清糖鎖変異PSAを検出可能であったが、グレーゾーン(PSA 4-10 ng/mL)の濃度域では、レクチンアレイ装置の最低検出感度以下であり、検出できなかった。装置の検出感度の問題を克服するため、よりPSAが多く含まれている前立腺圧出尿中を検体として用いた結果、前立腺圧出尿中のPSA糖鎖変異を組換えレクチンアレイで検出することが可能となり、前立腺癌診断およびの悪性度評価に有用なレクチンの組み合わせを発見した。H29年度の研究実施計画である1.抗GCNT1モノクローナル抗体を固定化したアレイによる前立腺圧出尿中のGCNT1の検出法の構築2.組換えレクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法の構築上記の計画のうち、1が当初の予定通り進捗していない。2については、検体の対象を前立腺圧出尿中のPSAとすることで目的とする検出法の構築の目処がたったため、概ね順調に進展していると判断する。当初の予定通り、順調に進んだどちらか一方を選択することから、今後は、2の計画を中心に検討を進め、前立腺圧出尿を検体としレクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法により、前立腺癌の鑑別および悪性度を評価する方法の開発を進める。

今後は、前立腺圧出尿を検体とし、レクチンアレイによるPSAのがん性糖鎖構造変異の検出法による前立腺癌の鑑別および悪性度を評価する方法の開発を進めるため、解析臨床検体の数を増やす。
固体NMRによる非晶性高分子の原子レベルでの構造決定

本研究の目的は、非晶性高分子について、原子レベルでの構造解析を行うことのできる新しい固体NMRの手法を開発・提案することであった。本科学研究費のサポートによって、局所的に配向しているが、従来のX線回折による方法では非晶パターンを与える繊維状高分子、あるいは、延伸高分子膜について、局所的配向構造の解析法を同位体ラベル法と固体CP NMR法を用いて提案することができた。それは^<15>Nならびに^<13>C化学シフトテンソルが、配向軸と分子軸のなす角度に著しく依存するという原理を基礎にした。さらに、非晶である粉末試料について、異核種同位体ラベル核間の原子間距離の精密決定を通して局所構造を解析する方法(REDOR法)の開発を、フロリダ州立大学のギャリオン助教授と共同研究によって行った。以上の成果は、論文として絹関係をPolymer J.(高分子学会)、Chemistry Letters(日本化学会)、Sen-i Gakkaishi(繊維学会)に、又、ポリアミド関係をSolid state NMR、Polymer J.、Macromol.Chem.Phys.に発表した。また、総説として、新高分子実験学5巻(高分子の構造(1)-磁気共鳴、高分子学会)、高分子材料の機器分析事例集(技術情報協会)ならびにACS Symposium.Silk(アメリカ化学会)に発表した。
助産実践能力習熟レベルⅢに相応する助産師の経験学習と他者支援

【目的】助産実践能力習熟段階レベルIIIに相応する実践能力をもつ助産師(以下アドバンス助産師)の経験学習と他者支援を明らかにする。【方法】中原らが検証した経験学習尺度16項目、他者支援尺度14項目を5件のリッカート法として設定し、定量的記述分析を行った。北海道内のアドバンス助産師が所属する施設の看護部長に依頼し、了承を得た後、自記式無記名調査票を郵送し回収は個別に行った。研究者の所属する倫理委員会の承認を受け実施した。【結果】37名から回答を得た(回収率67%)。対象者の平均年齢は45.9歳、助産師としての平均経験年数19.1年であった。経験学習尺度の平均は「具体的経験」: 3.7、「内省的観察」: 4.0、「抽象的概念化」: 3.8、「能動的実験」: 3.9であり、年齢、経験年数に相関は認めなかった。支援を受けている他者は、妊産褥婦78%、先輩助産師76%、医師51%、職場以外の助産師35%、同僚35%、上司14%の順であった。内省を支援している他者は、上司: 4.3、先輩助産師: 4.4、職場外の助産師: 4.3、医師4.1、同僚4.1、妊産婦3.7であった。精神的支援の平均は、同僚4.2、先輩助産師3.6、職場以外の助産師3.5、上司3.3、医師2.6であった。業務支援の平均は、上司4.3、先輩助産師4.1、医師3.8、同僚3.7の順であった。【考察】アドバンス助産師は、恒常的に妊産褥婦からのフィードバックを受けとめ、多くの他者から内省に関わる支援を受けているという認識が明らかになった。特に内省に関しては、職場内にとどまらず、職場以外の助産師からも支援を受けていることが特徴的であり、助産師の専門職意識に起因すると考えられ、専門職の学習という見地から職場学習を捉え直す可能性が示唆された。
マメ科植物とその寄生/共生生物における共進化の系統対応解析

嶋田と伊藤は院生の加藤を指導して、毎年12月3月にメキシコ調査を行った。メキシコ産Mimosestes属のマメゾウムシの分子系統解析を行い、寄主植物の単食化・広食化の進化の方向性を解析した。一般に植食性昆虫は、寄主植物への適応が進むにつれ、広食性から単食性に進化が進むと考えられている。しかし、分子系統樹と寄主植物の多様度を照合すると、Mimosae種群(M.amicus, M.insularis, M. mimosae)は逆方向の単食性から広食性に多様度が広がっていることが分かった。また、嶋田と日詰は、アズキゾウムシのX染色体に遺伝子水平転移したWolbachiaの遺伝子断片をゲノム解析した。津田は、植食性昆虫の寄主植物シフト過程を分析した。セコブマメゾウムシ(Callosobruchus)属では、乾燥マメを利用する食性が、乾季の長さに伴い進化したことを、分子系統樹を用いた最尤推定法によって示した。Bruchus属やBruchidius属では、利用する寄主マメ群がさまざまな系統レベルで保存的であることを確かめ、これを応用して側系統的なAcacia属マメの系統関係を示唆した。また、ハンガリーの海外協力者と共同して、近年寄主植物の解明が進んだ狭食性の東欧産マメゾウムシBruchus属12種とその寄主マメ科草本(ソラマメ連)の組み合わせについて、ハンガリーにて野外調査を行い、マメゾウムシ分子系統樹と各寄主形質との一致度を比較した。その結果、最も一致したのは(有意ではないが)化学組成であった。徳永は、毎年2月3月に中国調査を行い、現地で出回っている豆類を食害しているマメゾウムシの採集を行った。ヨツモンマメゾウムシにおけるコンテスト型からスクランブル型への競争型の進化を決定する要因として、幼虫期の壁作り行動を取り上げ、その系統間・系統内変異と遺伝的基盤についての研究を行った。さらに、先行文献で示唆されたヨツモンマメゾウムシとアカイロマメゾウムシの掛け合わせ可能性の真偽を明かにするために、英国の海外協力者を訪問し、保管されているヨツモンマメゾウムシなどの系統を分譲を受け、以後の分析に用いた。本研究では、マメ科の寄生生物(種子捕食性昆虫であるマメゾウムシ科)と共生生物(根粒菌)を対象に、「利用し利用される関係」の相互作用ネットワークが、どのような進化的過程を経て成立したかを、海外調査と分子系統解析により解明した。(1)マメ科-マメゾウムシ科の系統対応(A)メキシコの野生マメ科-マメゾウムシ科について(嶋田)嶋田と院生の加藤はメキシコのベラクルス州、サン・ルイ・ポトシ州、ケルタロ州で、野生マメ科の寄主植物の豆果を採集し、羽化するマメゾウムシ科昆虫の系統対応を調べた。その結果、Acacia属-Mimosestes属やSennna属-Senius属、Convolvulce亜科-Megacerus属など、寄主植物の上位分類群とマメゾウムシの属とでおおまかな対応が見られた。これらを、産卵ギルドの特性を分子系統の上に乗せて種間比較している。(B)アジアの栽培マメ-マメゾウムシ科について(津田、徳永)

津田はセコブマメゾウムシ属における乾燥豆利用を維持させた候補要因(気候、寄主植物、共生菌、系統)について分子系統樹の枝長を考慮して検定した結果、祖先形質の乾燥豆利用特性が、乾燥地でインゲンマメ亜連の利用によって維持されたことが示された。徳永は中国の成都と西昌を訪れ、穀物貯蔵庫や地方の市場をめぐり、マメゾウムシ群集を採集し、現在各地域系統事に実験個体群を確立している。特に西昌では、通常成育できないはずの大豆で生活環を閉じているアズキゾウムシの採集に成功した。(2)マメ科-根粒菌の系統対応(伊藤、青木)マメ科と根粒菌共生系における宿主特異性進化機構を分子生物学的に解析した。根粒菌の持つ根粒形成(nodulation)に必須な遺伝子群(nod遺伝子群)のうち、宿主特異性決定に重要なnodD遺伝子の野生植物からの単離に成功している。ゲノム読了した原核生物3百種の全遺伝子配列を用いマメ-根粒菌共生関連遺伝子の網羅的解析プログラムを開発、根粒形成システムが現在主流にあるリゾビア以外に起源することを示し、同時に多数の新規共生遺伝子の共生アイランド外における存在を推定した。嶋田は博士課程院生の加藤俊英を指導して、11月末12月上旬、1月末2月上旬、3月中旬下旬の3回、メキシコ調査として派遣させた。採集したサヤは東大の特別許可付きの飼育室で羽化した種を記録し、柴尾とともにデジタルマイクロスコープで形態測定および交尾器の計測を行なった。さらに、加藤は伊藤とともに、標本をDNA分析して分子系統樹を解析した。また、嶋田と日詰は、アズキゾウムシ(Callosobruchus chinensis)の染色体のFISH分析を行い、その成果は、PLoS Biologyに投稿し審査中である。徳永は、2月下旬3月上旬に昆明(中国)にて調査を行い、現地で出回っている豆類を食害しているマメゾウムシの採集を行った。持ち帰ったサンプルを現在恒温室中で培養中である。また、ヨツモンマメゾウムシにおける、コンテスト型からスクランブル型への競争型の進化を決定する要因として、幼虫期の壁作り行動を取り上げ、その系統間・系統内変異と遺伝的基盤についての研究を行った。津田は、6月中旬8月上旬にハンガリーのマメゾウムシ研究者の機関に出張した。セコブマメゾウムシ(Callosobruchus)属では、乾燥マメを利用する食性が、乾季の長さに伴い進化したことを、分子系統樹を用いた最尤推定法によって示した。Bruchus属やBruchidius属では、利用する寄主マメ群がさまざまな系統レベルで保存的であることを確かめ、これを応用して側系統的な.Acacia属マメの系統関係を示唆した。嶋田と伊藤は院生の加藤を指導して,メキシコ産Mimosestes属のマメゾウムシの分子系統解析を行い,寄主植物の単食化,広食化の進化の方向性を解析した。一般に植食性昆虫は,寄主植物への適応が進むにつれ,広食性から単食性に進化が進むと考えられている。しかし,分子系統樹と寄主植物の多様度を照合すると,Mirnosae種群(M.amicus,M.insularis,)M.mimosae)は逆方向の単食性から広食性に多様度が広がっていることが分かった。また,嶋田と日詰は,アズキゾウムシのX染色体に遣伝子水平転移したWolbachiaの遺伝子断片をゲノム解析した。津田は,植食性昆虫の寄主植物シフト過程を分析した。近年寄主植物の解明が進んだ狭食性の東欧産マメゾウムシBruchus属12種とその寄主
食品タンパク質の多糖修飾による安全な抗菌・抗ウィルス性食品素材の開発

本研究では、ラクトフェリンおよびシスタチンを化学的あるいは遺伝子工学的に多糖修飾することによって、安全な抗菌・抗ウィルス性食品素材を開発することを目指した。化学的多糖修飾は、65°C、相対湿度79%でガラクトマンナンとメイラード反応を起こさせることによって行なった。また、遺伝子工学的多糖修飾は、Pichia pastorisをホストに用いた酵母発現系によって行なった。ラクトフェリンおよびシスタチンのいずれについても多糖修飾すると分子表面特性が改良され、また構造安定性が飛躍的に上昇することが明らかにされた。抗菌・抗ウィルス性については、多糖修飾シスタチンは、非修飾タンパク質に比べ、ネズミチフス菌に対して強い抗侵襲性効果を示すことが、またロタウィルスに対しても強い抗ウィルス効果を示すことが明らかにされた。一方、変異原性および急性毒性試験を行なったところ、多糖修飾ラクトフェリンおよびシスタチンのいずれについても、コントロール区との間に有意差は見出されなかった。こうして、多糖修飾食品タンパク質の食品衛生学的な安全性が確認されたので、安全な食品素材として応用することの可能性が示唆された。そこで、遺伝子工学的手法によって調製された多糖修飾シスタチンを10μg/gの濃度で子持ちニシンから調製されたスリミに加えたところ、40°C30分の予備加熱を含む90°C20分の加熱加工によってより食感の高いかまぼこゲルを調製することに成功した。また、この多糖修飾シスタチン含有かまぼこゲルは、室温保存で悪臭発生までに5日(コントロール区は2日)を要し、日保ちが向上していることも明らかにされた。これらのことから、多糖修飾シスタチンは、直接的な製品の品質改良だけでなく、製品化後の品質保持の目的でも有効であることが明らかにされた。本年度は、まず可溶性食物繊維の一つであるガラクトマンナンを用いて牛乳製ラクトフェリンおよび卵白製シスタチンの多糖修飾を行った。多糖糖鎖の結合にはヒートパック法によるメイラード反応を利用した。次ぎにポリマンノシル化シスタチンの大量生産を行なった。ポリマンノシル化タンパク質の分離精製にはイオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーを用いた。精製された多糖修飾タンパク質については、両親媒性、プロテアーゼ耐性および耐熱性を調べた。その結果、ラクトフェリンおよびシスタチンのいずれについても多糖修飾すると分子表面特性が改良され、また構造安定性が飛躍的に上昇することが明らかにされた。また、これらの多糖修飾タンパク質については、食品衛生学的安全性の評価を行なった。すなわち、復帰変異テストとしてサルモネラ菌を用いたエイムズテストおよび枯草菌を用いたレックアッセイによって,変異原性を調べた。さらに,ラットを用し、た急性毒性試験,(単回投与試験)を実施した。データの統計処理を行なった結果、多糖修飾ラクトフェリンおよびシスタチンのいずれについても、コントロール区との間に有意差がないことが明らかにされた。次年度は、これらの多糖修飾タンパク質を抗菌・抗ウイルス剤として実用化するために,実際に畜肉製品や魚肉製品の製造過程でこれらを加えてその効果を測定する。特に抗ウイルス剤としては生食用カキを製品化する際,洗浄用水あるいは充てん用水として使用する可能性について検討を加える。また研究のとりまとめの際には,多糖修飾ラクトフェリンおよびシスタチンの特性を生かした食生活への利用形態について検討を加え,考察する。本年度は、典型的なシステインプロテアーゼ阻害タンパク質であるシスタチンを中心に研究を進めた。化学的多糖修飾は、65°C、相対湿度79%でメイラード反応を起こさせることによって行なった。

得られた多糖修飾シスタチンは、非修飾タンパク質に比べ、ネズミチフス菌に対しての強い抗侵襲性効果を示した。また、シスタチンは多糖修飾によって、ロタウィルスに対する抗ウィルス効果も著しく上昇させることが明らかにされた。加えて、シスタチンの構造安定性は、いずれの多糖修飾法によっても著しく上昇することが明らかにされた。多糖修飾は、シスタチンのキモトリプシンに対する感受性を著しく低下させ、分解性は10%以下となった。耐熱性もまた、多糖修飾によって著しく強化され、1%のタンパク質溶液を95°Cに加熱しても凝集が起こらなかった。これらの多糖修飾シスタチンについては、変異原性試験とラットに対する亜急性毒性試験に基づいて、すでに食品衛生学的な安全性が確認されているので、安全な食品素材として応用することの可能性が示唆された。そこで、遺伝子工学的手法によって調製された多糖修飾シスタチンを10μg/gの濃度で子持ちニシンから調製されたスリミに加えたところ、40°C30分の予備加熱を含む90°C20分の加熱加工によってより食感の高いかまぼこゲルを調製することに成功した。また、この多糖修飾シスタチン含有かまぼこゲルは、室温保存で悪臭発生までに5日(コントロール区は2日)を要し、日保ちが向上していることも明らかにされた。以上のように、多糖修飾シスタチンは、直接的な製品の品質改良だけでなく、製品化後の品質保持の目的でも有効であることが明らかにされた。
クラッシュ症候群に対する骨髄間葉系細胞移植法の確立とメカニズム解明

本研究の目的は、クラッシュ症候群ラットモデルに対しヒト骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性を評価し、臓器障害進行のメカニズムを解析することである。本研究において、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を移植によるクラッシュ症候群ラットモデルに対する抗炎症作用、組織修復作用は認められなかった。今後、更なる検討が必要と考えられた。本研究はクラッシュ症候群に特徴的な血管内皮細胞障害、全身性炎症による多臓器不全に対して、骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性を判定し、どのようなメカニズムで臓器障害を軽減させ、組織損傷を修復するかを解明することで、再生療法による新規治療法の開発を目指す。研究の焦点は、以下の4つである。(1)クラッシュ症候群ラットモデルにおける、骨髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果を評価する。(2)代表的なELISA法やWB法、Real-time PCR法、組織標本などの検査手法に加えて、in vivo生体蛍光イメージング法、マイクロアレー法を用いて、幹細胞移植の多臓器障害への効果を評価する。(3)骨髄由来マクロファージを用いたin vitro研究における評価を行う。(4)上記研究結果を踏まえて、当科で確立しているその他のSIRSモデル(敗血症、腸管虚血再灌流、熱傷、熱中症)に対して骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性と臓器障害軽減のメカニズムを解析する。これによりSIRS病態における幅広い応用の可能性を検証する。ラットクラッシュ症候群モデルは確立しており、現在上記の検討を順次進めている。本研究の目的は、クラッシュ症候群ラットモデルに対し骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性を評価し、臓器障害進行のメカニズムを解析することである。これが明らかとなれば、クラッシュ症候群に対する骨髄由来間葉系幹細胞移植による新たな治療の道が拓ける。研究の焦点を、以下の4つに絞り実施している。(1)クラッシュ症候群ラットモデルにおける、骨髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果の評価:クラッシュ症候群ラットモデルで、クラッシュ損傷後に骨髄由来間葉系幹細胞移植を行い、臓器障害および生存率の改善が得られるか評価する。(2)骨髄由来間葉系幹細胞移植療法の治療効果のメカニズム評価:シャム群、非治療群、治療群において、クラッシュ損傷後の血中の炎症性メディエーターの動態を経時的、定量的に測定する。HE染色法、免疫染色法などで評価する。これらの結果を群間解析し、治療効果のメカニズムを明らかにする。(3)骨髄由来マクロファージを用いたin vitro研究における評価(4)確立したSIRSモデルにおける評価。現在まで、おおむね順調に進展している。本研究はクラッシュ症候群における、血管皮細胞障害/全身性炎症から生じる多臓器不全に対し、骨髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果を判定し、そのメカニズムを解明することで、再生療法による新たな治療法の開発を目指す。以下の4つに焦点をあてる。最初にラットを、シャム群、非治療群、治療群の3群にランダムに割り当て、治療群において生存率の改善が得られるか評価する。(2)シャム群、非治療群、治療群の3群に対し、クラッシュ損傷後の血中炎症性サイトカインや損傷関連分子パターン(DAMPs)の動態を経時的、定量的に測定する。またウエスタンプロット法、Real-time PCR法による細胞内シグナルの評価、各組織標本を用いたHE法や免疫染色法による評価を行う。さらにin vivo生体光イメージング法による経時的/可視的に評価や、マイクロアレー法を用いた網羅的遺伝子解析を行うことで、幹細胞移植の多臓器障害への効果を解明する。(4)上記研究結果を踏まえて、当科で確立しているその他の身性炎症反応症候群モデル(敗血症、腸管虚血再灌流、熱傷、熱中症)に対して骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性と臓器障害改善のメカニズムを解析する。これによりSIRS病態における幅広い応用の可能性を評価する。現在、(2)まで評価が終了し、解析中である。今後の研究として、以下を順次進める。骨髄由来間葉系幹細胞移植療法の治療効果のメカニズム評価として、詳細な組織評価、細胞内シグナル評価(ウエスタンブロット法、Real-time PCR法)や、in vivo生体蛍光イメージング法、マイクロアレー法を進めていく。また、骨髄由来マクロファージを用いたin vitro研究として、シャム群、非治療群、治療群から骨髄由来マクロファージを抽出し、再生関連遺伝子発現の変化を評価する。これから、骨髄細胞レベルで髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果のメカニズムを解明する。さらに、確立している感染性SIRSモデル(敗血症)、非感染性SIRSモデル(腸管虚血再灌流、熱傷、熱中症)においても同様に髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果を評価し、SIRS病態における臨床応用の可能性を探る。医歯学平成28年度は研究計画が予定より早く進展することができたため、研究進展目的で前倒し支払い請求を行った。予定より少ない支出で研究を進展することができたため、次年度使用額が生じた。

骨髄由来間葉系幹細胞移植療法の治療効果を明らかにするために、詳細な組織評価、細胞内シグナル評価、in vivo生体蛍光イメージングやマイクロアレー法による評価を進めていく。また骨髄由来マクロファージを用いたin vitro研究で、再生関連遺伝子発現の有無を評価する。さらに当科において既に確立している感染性SIRSモデル、非感染性SIRSモデルにおいても髄由来間葉系幹細胞移植の治療効果を明らかにし、SIRS病態において幅広く評価を行う。
シスプラチンと血管・リンパ管新生に対する分子標的療法の併用による口腔癌治療の研究

F9細胞にシスプラチンを作用させると分化が誘導されると共に、細胞周期のG2-M期に細胞の貯留が認められる。今回、その分化誘導の過程で、細胞周期を制御するサイクリンの1つであるp34^<cdc2>の関与を検討し、以下の結果を得た。1.F9細胞において、シスプラチンによる分化誘導に際して、形態学的、DNA断片化からアポトーシスに至ることが明らかとなった。2.アポトーシスに至る前に分化誘導されたが、その際、細胞周期は、G2-M期で停止し、その過程でp53の発現は変化せず、cdc2の発現の変化が関与していた。3.F9細胞にシスプラチンを作用させた時のp34^<cdc2>の発現をWestern blotにて検討すると、約36時間後には、その発現の低下を認めた。4.しかし、その際のcdc2 mRNAの発現をNorthern blotにて検討すると、経時的な変化は認められず、転写段階での制御はなく安定していた。5.p34^<cdc2>の半減期をmetabolic labelingにて検討すると、F9細胞の分化誘導には、p34^<cdc2>の半減期が延長することが関与し、G2-M期に細胞が貯留するのは、p3^<cdc2>の半減期が短縮し、不安定化するためであることが明らかとなった。5.p34^<cdc2>の半減期をmetabolic labelingにて検討すると、F9細胞の分化誘導には、p34^<cdc2>の半減期が延長することが関与し、G2-M期に細胞が貯留するのは、p34^<cdc2>の半減期が短縮し、不安定化するためであることが明らかとなった。5.p34^<cdc2>の半減期をmetabolic labelingにて検討すると、F9細胞の分化誘導には、p34^<cdc2>の半減期が延長することが関与し、G2-M期に細胞が貯留するのは、p34^<cdc2>の半減期が短縮し、不安定化するためであlることが明らかとなった。
直腸脱の運動生理学的および動態解剖学的成因の解明と外科的治療への応用

直腸脱の発生機序あるいは病態生理に関しては多くの説があり未だ明らかなものはない。発生機序を解明する一つの方法として注腸造影法が行なわれているが、排便機能をみるためには排便運動が動的であることから、これを動的に記録する必要がある。本研究では、排便を動的に観察記録する簡単な方法を考案し、直腸内超音波検査をこれに併用することによって直腸脱の発生機序を検討した結果以下の知見を得た。直腸脱22例(Tuttle分類I度4例、II度13例、III度5例)を研究対象とした。直腸内超音波検査はAloka製超音波診断装置SSDー650、経直腸探触子USTー657を用い、安静時、努責時の画像を観察した。注腸造影検査は東芝製BVーSystemを用い、造影剤の注腸法にておこない、排便造影をおこなった。またこれらの検査はいずれもビデオ装置で記録し、コマ送り再生にて検討した。直腸脱のTuttleI度では、安静時直腸肛門角は鋭角に保たれ、排便時消失したが、画像上明らかな直腸の脱出は認めなかった。直腸内超音波検査ではダグラス窩は深くなく、直腸壁の滑りを認めた。TuttleII、III度の排便造影では、直腸が前壁を主に全周性に直腸内へ嵌入し、III度では直腸内直腸脱として直腸内に留り、遠位直腸が盃状に造影され、II度では直腸の肛門外への脱出が認められた。直腸内超音波検査ではダグラス窩はいずれも深くcul de sac化し、努責につれて腸管が深く入り込み、直腸壁の滑りが明瞭に認められた。以上より完全直腸脱、不顕性直腸脱ではcul de sac化した深いダグラス窩に腹圧がかかり直腸腸重積を起こすことが発生機序として重要と考えられた。直腸脱の成因が直腸肛門内圧測定,注腸排便造影,直腸内超音波検査の結果から,盲嚢化した深いダグラス窩に努責時,排便時に腹圧がかかり,直腸壁が前壁を主に直腸腔内へ陥入することにより,直腸腸重積をきたすことにあることを確認した.誘発電位測定では成人例において外肛門括約筋の活動減弱を認めたが,小児例ではこれを認めなかった.組織学的検索では一部の例においてfibromuscular obliterationを認め,ムチン染色においても殊に成人例においてシアロムチン優位のムチン産生の異常を認めた.保存療法に反応しない例に外科的治療を行った結果,いずれの例のダグラス窩は深く盲嚢化していた.小児例では直腸肛門括約能が正常であり,外肛門括約筋機能不全を認めないことから,手術術成は深いダグラス窩を浅くし,直腸を仙骨前面に固定するSudeck変法を用いた.成人例では外肛門括約筋機能不全を認める例にはSudeck変法に挙肛筋縫縮術を併せ行った.外科治療後の検討では直腸肛門内圧は小児例では肛門括約不全の例は認めず,成人例では括約不全状態の改善を認めた.注腸排便造影では直腸の脱出を認めず再発なく,直腸内超音波検査においてもダグラス窩は浅く保たれ直腸壁の滑りも認めなくなっていた.誘発電位では術前機能不全を認めた成人例において改善傾向を認めた.直腸脱類似疾患(直腸粘膜脱症候群,直腸孤立性潰瘍症候群)についても検討を加えた.

注腸排便造影では直腸前壁の下垂を認め,直腸内超音波検査ではダグラス窩は深くないが,前壁の滑りと直腸内への陥入を認めた.組織学的には前壁にシアロムチン,fibromuscular obliterationを認めたが,後壁は正常であった.これらの所見は直腸脱の例で得られた結果と類似性を認め,直腸脱類似疾患の外科的治療方針の根拠の得られつつある.直腸脱の発生機序あるいは病態生理に関しては多くの説があり未だ明らかなものはない。発生機序を解明する一つの方法として注腸造影法が行なわれているが、排便機能をみるためには排便運動が動的であることから、これを動的に記録する必要がある。本研究では、排便を動的に観察記録する簡単な方法を考案し、直腸内超音波検査をこれに併用することによって直腸脱の発生機序を検討した結果以下の知見を得た。直腸脱22例(Tuttle分類I度4例、II度13例、III度5例)を研究対象とした。直腸内超音波検査はAloka製超音波診断装置SSDー650、経直腸探触子USTー657を用い、安静時、努責時の画像を観察した。注腸造影検査は東芝製BVーSystemを用い、造影剤の注腸法にておこない、排便造影をおこなった。またこれらの検査はいずれもビデオ装置で記録し、コマ送り再生にて検討した。直腸脱のTuttleI度では、安静時直腸肛門角は鋭角に保たれ、排便時消失したが、画像上明らかな直腸の脱出は認めなかった。直腸内超音波検査ではダグラス窩は深くなく、直腸壁の滑りを認めた。TuttleII、III度の排便造影では、直腸が前壁を主に全周性に直腸内へ嵌入し、III度では直腸内直腸脱として直腸内に留り、遠位直腸が盃状に造影され、II度では直腸の肛門外への脱出が認められた。直腸内超音波検査ではダグラス窩はいずれも深くcul de sac化し、努責につれて腸管が深く入り込み、直腸壁の滑りが明瞭に認められた。以上より完全直腸脱、不顕性直腸脱ではcul de sac化した深いダグラス窩に腹圧がかかり直腸腸重積を起こすことが発生機序として重要と考えられた。
窒素安定同位体比を用いたPCBs及びPBDEsの各異性体毎の生物濃縮特性の解析

日本近海の浅海域生態系におけるPCBs及びPBDEsの異性体レベルの生物濃縮特性を窒素安定同位体比分析により解析した。西日本各地の浅海域生態系より採集した生物試料の半数以上から約130155のPCBs異性体が検出された。これらの異性体の湿重量ベースの生物濃縮特性は脂肪重量ベースよりも高かった。また、各異性体の生物濃縮特性は塩素数の増加に従い6塩素化PCBs付近まで増加したが、それより高塩素の異性体では鈍化した。一方、PBDEs異性体は脂溶性がほぼ同じPCBs異性体より生物濃縮特性が低かった。東京湾の湾奥部に位置する京浜運河から採集した二枚貝、カニ類、魚類等の各種の生物をガスクロマトグラフ電子捕獲型検出器およびガスクロマトグラフ-質量分析計や同位体比質量分析計(ANCA-SL)等によりPBDEs(臭素化ジフェニルエーテル)、PCBs(ポリ塩化ビフェニール)及び炭素・窒素安定同位体比を分析し、BDE3209の13種のPBDEs異性体と5種のPCBs異性体の生物濃縮特性を解析した。PBDEs及びPCBsの各異性体毎の湿重量、乾重量及び脂肪重量あたりの濃度を対数変換し、窒素安定同位体比(δ^<15>N)との間の一次相関式を求めたところ、大部分のPBDEs異性体は正の相関が得られた。この相開式の「傾き」は食物連鎖の上昇に伴う生物濃縮の指標として用いられている。PBDEsの各異性体の「傾き」はオクタノール・水分配係数が増加するにつれ、PCBsよりも低いものの、増加することが明らかになった。PBDEsはPCBsよりも代謝されやすいために生物濃縮は低くなる可能性が推察された。また、伊勢湾の湾奥部より採集した植物プランクトンや魚類等の各種の生物を基に高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計等を用いPCBsの各異性体レベルでの予備的な分析を実施し、上記の研究と同様の解析方法により塩素数が5及び6の59種のPCBs異性体の生物濃縮特性を解析した。その結果、PCBsも大部分の異性体の相関式の「傾き」は正であり生物濃縮が起こっていることが明らかになった。塩素数が5のP_5CBs及び6のH_6CBs内でコプラナーPCBsと非コプラナ-PCBsとの間では「傾き」の有意な差は認められなかった。以上のように、本年度の研究により窒素安定同位体比を用いたPCBs及びPBDEsの異性体レベルでの生物濃縮特性を解析する研究手法の基礎を確立することができた。本年度は、PCBs(ポリ塩化ビフェニール)に関しては伊勢湾および瀬戸内海より採集した植物プランクトンや魚類等の各種の生物を基に1?8塩素化PCBsの205異性体に関する異性体レベルでの分析等を行った。140?155のPCB異性体が伊勢湾および瀬戸内海の半数以上の生物試料から検出された。また、窒素安定同位体比(δN^<15>)と各PCBs異性体濃度を対数値間の一次相関式を求めた。この相関式の「傾き」は食物連鎖の上昇に伴う生物濃縮の指標として用いられている。その結果、どちらの海域でも湿重量ベースでは多くの異性体が有意な増加を示したが、脂肪重量ベースの「傾き」は湿重量ベースよりもいずれの海域でも0.1程減少した。脂肪含有量は栄養段階が上昇に従い増加するため、湿重量ベースでは高い生物濃縮がおこらないことが明らかになった。また、各異性体の「傾き」は塩素数の上昇に伴って16塩素化PCBsまで増加したが、78塩素化PCBsでは鈍化した。このことは分子サイズの増加による膜透過速度の低下等に起因すると考えられた。PBDEs(臭素化ジフェニルエーテル)に関しては、昨年度に引き続き、東京湾湾奥部から採集された生物試料を基に、今年度は、#3?#209の20のPBDEs異性体の分析を行った。分析結果を基に、上記のPCBsと同様の解析を食物連鎖中比較的低次に位置する貝類から甲殻類(あるいは魚類)間を中心に行った。その結果、PBDEsは、いずれもlog Kow(オクタノール・水分配係数)がほぼ同じ値のPCBs異性体よりも「傾き」が小さく、PBDEsはPCBsよりも生物濃度増幅が起こりにくいことがより明確になった。このことはPBDEsがPCBsよりも代謝を受けやすいためと考えられた。以上のように、本年度の研究は計画通り進行し得られた研究成果を国際シンポジウム等で公表した。本年度は、PCBs(ポリ塩化ビフェニール)に関しては、九州西岸の天草諸島北部の浅海域生態系より海藻、甲殻類、魚類等の各種の生物を採集し、PCBsの全209異性体濃度及び炭素・窒素安定同位体比を測定した。

その結果、全209異性体中、半数以上の生物から約140異性体が検出された。食物連鎖の高次の生物のΣPCBs濃度は工業地帯に隣接した浅海域生態系の約1/10であった。窒素安定同位体比(δ^<15>N)と各PCB異性体濃度を対数値間の一次相関式を求めた。この相関式の「傾き」は食物連鎖の上昇に伴う生物濃縮の指標として用いられている。いずれの各PCB異性体でも、脂肪重量ベースの「傾き」は湿重量ベースの「傾き」よりも減少した。各PCB異性体の「傾き」は、湿重量ベース、脂肪重量ベースともに、17塩素化PCBsでは塩素数の上昇に伴い直線的に増加したが、810塩素化PCBsでは鈍化した。以上のPCBs各異性体毎の生物濃縮特性は、ΣPCBs濃度が高い工業地帯に隣接した浅海域生態系とほぼ同様であった。PBDEs(臭素化ジフェニルエーテル)に関しては、沿岸底生魚への暴露実験を行った。予備的な結果ではあるが、PCBsに比べてPBDEsは生物濃縮が起こりにくいというこれまでの野外観測を支持する結果が得られた。また、2010年1月に愛媛大学農学部附属環境先端技術センターで開催された「第四回環境先端技術セミナー安定同位体比分析によるPCB及びPBDEの生物濃縮過程の解析」にて本年度までの本研究成果を総括して発表した。
可塑性関連プロテアーゼ・ニューロトリプシンによる痛覚・痒み感覚の修飾

本年度はin situ hybridizationと免疫組織化学の二重標識を行い、脊髄後角ニューロトリプシン陽性ニューロンがGABA、glycine、パルブアルブミン等の抑制性ニューロンのマーカーであるpax2,興奮性ニューロンのマーカーであるlmx1bとの共存を確認することで興奮・抑制のどちらに関与しているのかを検討した。統計的な処理が終わっていないが、ほぼ興奮性のニューロンでの特異的な発現が推測できた。痒み処理系の脊髄後角ニューロンでの検討は難航しており、マーカーとなる物質の局在が現在入手可能な抗体では確認できていない。このため、痒み系のニューロンとの検討はmRNAレベルで行う事となり、本年度はガストリン分泌ペプチド陽性ニューロンの標識に使用するin situ hybridizationの条件を確認した。投射ニューロンでの発現についてはSubstance Pの受容体であるNK-1の発現がマーカーとなり得たが、細胞体の染色が乏しく突起上の発現のみが確認されたため、ニューロトリプシンmRNAとの二重標識は評価が難しい結果となった。このため、痒み系のニューロン群と同様にmRNAレベルでの発現確認による二重標識を行う事となり、NK-1 mRNAの標識を確認することとなった。NK-1 mRNA発現細胞の脊髄後角での可視化はニューロトリプシンとの共発現を検討するのに十分な感度が得られたため、これに使用するサンプルを調整している。従って、本年度はマーカー類の可視化とニューロトリプシン発現細胞を同定する事に多くの時間を要した事で計画の遅延を生じたが、これらは次年度早々に結果を得られる予定である。脊髄後角以外のニューロンからの投射によるニューロトリプシンの発現を脊髄後角に認めたため、主要な投射をもつ後根神経節ニューロンでの発現確認を行ったところ、脊髄後角以上の転写活性を認めた。この成分を可視化して脊髄後角のニューロトリプシンと弁別するために様々なマーカータンパクとの共存関係を検討する必要に迫られた。このマーカータンパクの抗体による染色は抗体の購入から条件設定をする必要があったため、サンプルの作製と併せて3ヶ月程度の遅延を生む結果となった。脊髄後角でのニューロトリプシンの発現細胞の確認の後、その細胞種に応じた適刺激を行う。カプサイシン、ピンチ、痒み物質の投与を行って誘導されたc-fosとの二重標識を行いニューロトリプシンの発現が刺激に応答した成分で認められるかどうかを検討する。報告されている基質であるagrinの断片化を検討し、ニューロトリプシンの活性が変化しているかどうかを上記の刺激後に検討する。ニューロトリプシンの活性阻害を行い、適刺激反応への行動を検討する。ニューロトリプシン発現細胞の特徴を決定する事に集中した実験を行った。そのためにラット腰髄を用いてニューロトリプシンのin situ hybridization(ISH)法を行った。定量的な解析を行うための条件検討を確定させた。この結果、後角ニューロンの一部でのニューロトリプシン発現が明らかとなった。脊髄後角への投射元である後根神経節にもこのニューロトリプシンを検出したため、ISH法を行ったところ、一部のニューロンでの発現を新たに確認した。予備実験的に神経傷害性モデルの後根神経節を使用したところ、ニューロトリプシンの発現増加を認めた。これにより本研究課題のターゲットである後角のタンパク分解候補因子として検討する対象である事がわかった。則ち脊髄のニューロトリプシンと後根神経節からのニューロトリプシンを同様に検討しなければならないことが解った。また脊髄のニューロトリプシンは一部のニューロンでの発現である事がわかり、定量的なデータを得ることができた。予想外の部位に本研究課題のターゲット因子であるニューロトリプシンの発現を検出し、本課題のテーマのタンパク分解の因子として候補因子として加えるという必要性が生じた。また脊髄後角での定量に要するサンプルの準備や免疫染色・ISH法の二重標識の至適条件の決定に時間を要した。

従って、本年度はマーカー類の可視化とニューロトリプシン発現細胞を同定する事に多くの時間を要した事で計画の遅延を生じたが、これらは次年度早々に結果を得られる予定である。脊髄後角以外のニューロンからの投射によるニューロトリプシンの発現を脊髄後角に認めたため、主要な投射をもつ後根神経節ニューロンでの発現確認を行ったところ、脊髄後角以上の転写活性を認めた。この成分を可視化して脊髄後角のニューロトリプシンと弁別するために様々なマーカータンパクとの共存関係を検討する必要に迫られた。このマーカータンパクの抗体による染色は抗体の購入から条件設定をする必要があったため、サンプルの作製と併せて3ヶ月程度の遅延を生む結果となった。今年度の遅れた部分をフォローし、次年度前半に脊髄後角での定量的解析を終える。各種疼痛モデルにてニューロトリプシンの発現変動を確認する脊髄後角でのニューロトリプシンの発現細胞の確認の後、その細胞種に応じた適刺激を行う。カプサイシン、ピンチ、痒み物質の投与を行って誘導されたc-fosとの二重標識を行いニューロトリプシンの発現が刺激に応答した成分で認められるかどうかを検討する。報告されている基質であるagrinの断片化を検討し、ニューロトリプシンの活性が変化しているかどうかを上記の刺激後に検討する。ニューロトリプシンの活性阻害を行い、適刺激反応への行動を検討する。脊髄後角でのニューロトリプシン活性の意義を検討する本研究課題において、脊髄後角の主要投射元である後根神経節でのニューロトリプシンの発現が関わらない事を示す除外実験において予想外に多い後根神経節でのニューロトリプシンの発現を認めた。これが本研究に関わる可能性を検討するために後根神経節での発現細胞を確定させる必要が生じた。このため後根神経節のサンプルを別途準備し、組織学的検討を行う事に時間を要した。これが脊髄後角での解析を遅らせる原因となった。次年度において今年度に予定していた定性的解析に用いるマーカー抗体を使用した実験に必要となる消耗品の購入等に使用する予定である。最終年度において予定した実験を行うため必要な物品を購入するため、未使用額を次年度に使用する予定である。
樹木バイオマス相対成長式の統合と生態系純生産量の試算

本研究では、季節変化や空間変動を考慮した地下部バイオマスの推定と生態系純生産量の年次変動を明らかにすることを目的とした。岐阜県高山市荘川町六厩の地下部細根量を把握するため、5m×5mの調査地に、30cm間隔の格子をとり、2週間毎にランダム地点20箇所で、土壌コアにより細根と土壌を採取した。2mm以下の根を細根とした。研究室に土壌コアの内容物を持ち帰り、肉眼で生根と死根を選別し、それらの乾燥重量を測定した。以上の研究期間のデータより、一次純生産量NPPを最終的に推定した。2000年から2004年の5年間の平均値で、この110年生落葉広葉樹二次林では、地上部についてNPP=9.96t/ha/yr、これに地下部細根のNPP=0.97t/ha/yrを加えて、NPP=10.93t/ha/yrを得た。一方、生態系純生産量NEPは、一次純生産量NPPから異化呼吸量HRを差し引いた値として求めた。異化呼吸量を土壌呼吸量の50%(小泉,2001)と仮定し、樹体やリターに含まれる炭素含有率を50%と仮定して求めた。すなわち、NEP=NPP-HR=4.98-3.71=1.27tC/ha/yrを得た。調査期間5年間を平均すると、この森林は年間あたり1.27トンの炭素を吸収しているという目下の結論を得た。本研究では、落葉広葉樹林の炭素固定機能評価を目的とし、NEPを求めた。調査地は岐阜県荘川村六厩の110年生の落葉広葉樹二次林とした。NEPの推定に必要な成長量は毎木調査結果と相対成長関係式より求めたバイオマスの量から枯死量は落葉落枝の量から、被食量は消化効率で割った虫糞の量からそれぞれ求めた。また、土壌呼吸量を測定し、同時に土壌呼吸量に影響を与える環境要因と考えられる地温(地表下5cm、10cm)、土壌水分、リター厚を2003年5月12月にかけて25地点で測定した。また、調査区内の2地点で1時間毎の地温を連続測定した。土壌呼吸量のうち、根の呼吸量が占める割合については、45.9%(小泉2001)と仮定した。2003年の成長量、枯死量、被食量は、それぞれ1.13、1.50、0.01ton C ha^<-1>yr^<-1>となり、森林の純生産量は2.63ton C ha^<-1>yr^<-1>であった。なお、2003年の現存量は66.61ton C ha^<-1>だった。各地点間の地温は、各月毎では1°C前後の差異しかみられず、場所による変動は小さかった。地表下5cmの地温から土壌呼吸速度を求める回帰式を得ることができた。土壌水分やリター厚の環境要因との間には相関関係は認められなかった。推定された年間土壌呼吸量は、6.92ton C ha^<-1>yr^<-1>であった。年間土壌呼吸量より根の呼吸量を推定した場合、3.18ton C ha^<-1>yr^<-1>となった。よって、NEPは、-1.10ton C ha-^<-1>yr^<-1>と推定された。月別の土壌呼吸速度と地温・5cm下の関係は、ほぼ同じ地温をもつ地点間においても土壌呼吸速度の値は大きく変動し、とくに地温が高い時ほどその変動は大きかった。従って、土壌呼吸速度の季節変化と空間変動の要因は、それぞれ別に存在し、単一の要因によるものではないと考えられる。現在、地球環境問題との関係で、森林生態系における炭素収支である生態系純生産量の研究が盛んに行われている。