hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経性糖脂質分子種とミエリンタンパクの遺伝子クローニングとその系統発生的解析

このウイルスをNIH-3T3細胞に感染させてG-418培地で選択する.得られたコロニーからのフレノシン発現細胞の選別に時間を要し,本実験は当初の予定より進行が遅れている.ミエリンタンパク実験も進行中である.1.培養神経細胞の分化と腫瘍原性および糖脂質組成の変化について。グルココルチコイド(デキサメサゾン、DX)によって発現を制御出来るベクターにras遺伝子を組み込み、ラット褐色細胞腫由来の株細胞PC12に遺伝子移入し、神経突起のでる直前のprimed cellである株細胞MR31を確立した。MR31は培地へのDX添加によって24時間で突起の成長が始まり、カテコールアミン含量の増加、アセチルコリンエステラーゼ活性の上昇が確認された。PC12のヌードマウスに対する高い腫瘍原性が、MR31では激減した。さらに、ガングリオシドの一部と極性の高い中性糖脂質組成が、PC12とMR31では異なっていた。しかし、MR31とDXで突起の出たMR31-DXでは糖脂質組成は変わらず、細胞分化の段階に関わる糖脂質の発現にある示唆を与えるものと考えられた(63年度生化学会発表、論文投稿準備中)。63年度の交付科研費は主として細胞培養関係のプラスチック器具等の購入にあてた。2. αーヒドロキシ酸含有セレブロシド(フレノシン)を培養細胞で発現できる系の確立について。前年度のフレノシン発現細胞の選別を再度やり直した。ミエリン形成期のマウス脳から総RNAを抽出後、oligo-(dT)カラムに通してm-RNAを調製した。Amershamのc-DNA合成キットによりc-DNAを合成、その後c-DNAクローニングシステムを使ってλgt10ライブラリーとした。次に(1)他のベクター(pMSG,pZIPneoSV(X))につなぎ直して、(2)NIH3T3細胞ヘリン酸カルシウム法にて遺伝子導入し、選択培地で培養した後、(3)生じたコロニーを増やして脂質の抽出を行う、のが手順である。プローブ、抗体等がないため、DNAの二次産物である脂質の分析に頼らざるを得ないのが難点であるが、平成元年度中にめどをつけたい。
Ｐｄ系金属ガラスの相分離組織に関する微視的観察

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は金属ガラスの局所配列、構造ゆらぎ、ナノ相分離構造等を調べるためのオングストロームビーム電子回折を用いた実験手法を検討した。Pd基バルク金属ガラス試料を薄膜化したサンプルに対し、走査型透過電子顕微鏡を用いて約0.4nmに集束させた電子線をスキャンし、位置情報つきの一連の電子回折パターン(電子回折マップ)を取得した。マップはおよそ8nm四方であり、ビームステップは0.2nmと設定した。得られた電子回折の任意の逆空間領域を用いて像を再構成することが可能であるが、透過波を用いて結像したところナノスケールの濃淡コントラストが得られた。このコントラストは構造不均一性に由来するものであることが期待されるが、薄膜作製によるアーティファクトである可能性もあるため、それらの構造の違いを電子回折により明らかにすることは重要である。そこで、濃淡のそれぞれのナノ領域から得た多くの電子回折パターンの強度を重ね合わせることにより、それぞれの領域からの1次元平均回折強度を得た。両者の第1、第2ピークにはシフトが見られ、何らかの構造的相違がある可能性が示唆された。現段階ではこれが何を意味するのかは明らかではなく更なる検討が必要であるが、金属ガラス構造のナノスケールでの局所構造の違いを定量的に検出する手法として非常に有益なものであることがわかった。明瞭な相分離金属ガラスであれば構造の違いはより明確に検出できると考えられ、その界面構造も明らかにできるものと期待される。金属ガラスのナノ不均一構造を調べるための電子回折手法の開発が予定通り行われており、順調に進展していると思われる。前年度は、金属ガラスに内在するナノレベルの構造ゆらぎについてオングストロームビーム電子回折法を用いて調べた。具体的には、0.4nm程度に集束させた電子線を0.2nm程度のステップ幅で試料上を走査し、一連の電子回折パターンを電子回折マップとして得た。そこで本年度は、得られた実験結果を解釈するために分子動力学法などにより作製した金属ガラス構造モデルに対しコンピュータ上で仮想的に集束電子線を当て、ビーム位置を変えながらオングストロームビーム電子回折パターンを連続的に計算する仕組みを構築した。実際にシミュレーションを行った系は単純な2元系Pd-Si合金である。まず原子数12,000のPd-20at.%Si組成の初期構造を立方体セルに作製し、分子動力学シミュレーションで2500Kの高温で溶解後、種々の冷却速度で室温まで冷却させた構造モデルを作製した。最終的な構造モデルから得られたX線構造因子S(Q)は過去の文献で報告されているものと大きな差異はなかった。この構造モデルに対して上述のオングストロームビーム電子回折パターンを、場所を変えながら連続的に計算したところ、各局所領域から得た電子回折パターンにはガラス特有のハローリングパターンではなく回折スポットからなるパターンがどの場所からも見られた。また、パターンの中には結晶のような高散乱角側まで続く周期的なスポットパターンが見られるものもあり、これに対応する構造を調べるとガラス構造の一部でありながら比較的秩序度の高い領域であることが明らかとなった。このような回折パターンは実験でも観察されるが、これが不均一構造とどのような関係にあるかはまだ不明である。当初想定していた金属ガラスの相分離組織よりもさらにスケールの小さい構造ゆらぎを対象に研究を進めている。当初と研究の方向性は少し変わったが、順調に進展している。今後は金属ガラスのナノ不均一構造や相分離構造に対して、現在開発中の電子回折手法を適用することで構造的特徴を明らかにし、最終的には構造と物性の相関の理解を目指す。今後は実験結果とシミュレーションによる結果を比較検討し、金属ガラスの構造ゆらぎに関して明らかにしていく予定である。合金系としては単純なPd-Siに着目して行う。
反すうに着目した新しい認知行動療法プログラムの開発と効果の検討

抑うつ気分の原因は、「認知」(物事の受け取り方)と、「反すう」(失敗や心配事をくり返し考え続けること)にある。さらに、「反すう」は、「認知」よりも抑うつ気分の維持要因に影響を与えており、精神的QOLの低下を引き起こす。抑うつの「認知」改善に、認知行動療法が功奏しているが、「反すう」に対する対処は確立されていない。そこで申請者は、これまでの「認知」の修正技法(認知行動療法)に、「反すう」から離れる技法を取り入れた「反すうに着目した新しい認知行動療法プログラム」の開発を行い、効果の検討に着手した(20152018年:若手B)。本課題では、プログラムの有用性・実用性の検討を行う。
市販鶏肉の表面で繰り広げられる細菌と原生動物の相互作用の可視化と応用

1.市販鶏肉上で生じている細菌と原生動物の相互作用を可視化するという当初計画に基づき、予備試験、鶏肉サンプルの採材、微生物叢解析、原生動物の分離培養を実施した。2.鶏肉とアメーバまたはアメーバDNAを用いた予備試験により、鶏肉からの原生動物の検出限界は、培養法で1,000cell/g、遺伝子検出法(PCR)で0.1cell/gであると求められた。3.市販鶏肉を購入し、(1)当日(2)4°C2days (3)4°C7days (4)15°C2days (5)15°C7daysの条件で静置後にDNAを抽出し、微生物叢解析を行なった。16S rDNAに基づく細菌叢解析の結果、当日サンプルではガンマプロテオバクテリアやバシルスなどが多く、細菌叢に多様性がみられたのに対し、4°C静置サンプルではガンマプロテオバクテリアが圧倒的多数となっていた。属レベルで見た場合、こうしたガンマプロテオバクテリアの多くはエロモナス、シュードモナスなどの水系細菌・低温発育菌であったことから、こうした細菌は冷蔵した鶏肉の上で増殖し続けていたと考えられた。一方、15°C静置サンプルにおいては、2days時点ではガンマプロテオバクテリアが優占化したが、7days時点ではバクテロイデスの大幅な増加がみられた。これは好気性菌の増殖によって鶏肉表面の酸素が消費されたことによるものと考えられる。5.鶏肉表面で生じている細菌叢構成の劇的な変化、および鶏肉に付着する鞭毛虫を検出した。今回は食中毒菌と相互作用する原生動物は得られなかったが、今後の調査により細菌の生存性や病原性に影響する微生物の検出につなげたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞内Ca濃度増加によるCa電流の調節機構

心筋のL型Ca電流は膜電位にみならず細胞内外の様々な因子による調節を受け細胞機能の発現に重要な働きを果たしている。これらのうち細胞内Ca濃度([Ca]i)の増加はL型Ca電流を不流を不活性化させる一方,[Ca]iの少量の増加は逆にCa電流の増強をもたらし得ることが示されている。しかしどのような[Ca]iのレベルでこれら2つの相反する効果が発現するかは不明であり,両者の相互関係やその機序についても不明な点が多い。そこで本研究ではコラゲナーゼ処理によるモルモット単離心室筋胞を用し,fura2による[Ca]測定と同時にBa^<2+>をcharge carrierとしてcell attatch法によりL型Ca電流のsinale channel currentを記録し,[Ca]iによるL型Ca電流の調節の詳細を検討した。140mM-K^+の灌流液で細胞を脱分極させ,細胞外液のCa濃度を調節することで[Ca]iを可逆的にコントロールすることが可能であった。[Ca]iが静止時の約2倍を越えるレベル(R340/3800.4,1.8mMのCa^<2+>を含むTyrode液で40mMのKC1により細胞を脱分極させた時の[Ca]iに相当)に上昇させるとCaチャネルのconductanceは不変のまま開口確率の増加が認められ,活性化閾値付近の電位ではその増加率は数倍に及んだ。更に[Ca]iを増加させ細胞収縮の閾値より僅かに低いレベル(R340/3801)に至るとチャネル開口は逆に抑制された(Ca^<2+>-dependent inactivation)。[Ca]i軽度増加によるチャネル活性の増強効果は一旦成立すると[Ca]iをコントロール値に再度低下させても数分間は持続する性質をもち,また一過性に不活性化を引き起こすような[Ca]iの上昇があってもなお持続し得た(memory効果)。single channel currentのkineeticsの分析では[Ca]i増加による開口確率の増大には1.開口時定数の増大,2.閉口時定数の減少,3.null sweepの減少,4.mode-2-sweepの増大など複数の機序が関与しておりこれらの相対的寄与は電位により異なっていた。本研究はL型Ca電流の[Ca]i依存性を初めて直接,かつ定量的に示したものである。1.これまで用いてきたpatch clamp装置と新しい分光蛍光測定装置により膜電位・膜電流の測定と蛍光色素(Furaー2)を用いた細胞内Ca濃度(〔Ca〕i)の測定が同一標本から行いうるシステムが完成した。まがwhole cell recordingにより活動電位の発生やvoltage clamp下でのCa電流活性化に伴う細胞内Ca濃度の変化について基礎的なデ-タを得る事ができた。平成3年9月からは〔Ca〕iとsingle channel currentの同時連続記録も可能となり,現在順調に稼動している。2.〔Ca〕iの増加に伴うCa電流の調節機構をsingle channelのレベルで検討するために〔Ca〕iを安定してコントロ-ルしうる条件を検索した。

細胞灌流液を140mM K+とし膜電位をほぼOmVに脱分極させた上でCa^<2+>とEGTAの量を調節することにより50nMから1μM程度までの〔Ca〕iの値が記録された。3.この方法により〔Ca〕iをコントロ-ルしながらcell attach法によりLーtype Ca single channel currentの記録を行うと,〔Ca〕iが数100nM程度に上昇する条件下でchannelの開口確率の可逆的な上昇が観察された。この〔Ca〕i値は1.8mM Caのnormal Tyrode液でKーdepolarizationにより-20mV付近へ細胞を脱分極させた際の〔Ca〕iに対応し生理的にも十分な意義を持ち得ると考えられる。4.この際のCaチャネルの開口確率の上昇の機序としてはチャネル蛋白の燐酸化の関与が示唆されるため,Caーcalmodulin dependent kinase2やAーkinaseについての検討を開始した。5.なお2.で述べた〔Ca〕iの制御を検討している段階でジギタリスが〔Ca〕i変動とは独立に直接Ca電流を増強させる効果を持つ可能性が示唆された。この点も本研究より派生した主題として検討を加えて行きたい。昨年度までの研究により(1)[Ca]i測定のためのfura2蛍光比とCa single channel currentの同時連続記録が可能となり,(2)Caチャネルの活性を増強もしくは不活性化させるそれぞれの[Ca]iのレベルを評価することができた。本年度は[Ca]i上昇に伴うCa電流増強の機序をsingle channelのレベルで明かにすることを目的とし,Ca電流のkineticsの変化を中心に詳細な検討を行って次のような成果が得られた。(1)[Ca]iが数100nM程度に上昇する条件下でCaチャネルの開口確率の増加が認められるが,この際チャネルのopen channel currentlevelないしconductanceは不変であった。このことは[Ca]iによるCa電流増強効果が表面電荷の変動によるvoltageシフトなどの2次的な効果ではなくチャネル蛋白自体への効果によるものである事を示唆する。(2)チャネル開口確率の増大には1.開口時定数の増大,2.閉口時定数の減少,3.null sweepの減少,4.mode-2 sweepの増大など複数の機序が関与しており,これらの相対的寄与は電位により異なっていた。これらの所見はprotein kinase AによるCaチャネル蛋白燐酸化に際して見られるkineticsの変化と類似しており,[Ca]iによるCa電流増強についてもチャネル蛋白燐酸化の関与が考えられた。(3)[Ca]i高度上昇によるチャネルの不活性化が速い時間経過を示すのに対し,[Ca]i軽度増加によるCaチャネル活性の増強効果は一旦成立すると[Ca]iをコントロール値に戻してもなお数分間は持続する性質を持ち,また一過性に不活性化を引き起こすような[Ca]iの上昇があってもなお存続しえた。phosphorylation仮説の上からはこのことはCaチャネルの機能が複数の燐酸化部位で制御されていることを示唆する。こうした特性や今回明かにされた増強・抑制作用の認められるそれぞれの[Ca]
「史料」としての教育関係映画フィルムの調査・分析・利用に関する基礎的研究

本研究の目的は,歴史的価値の高い教育,文化,学術関係の映画フィルムを文書資料と並び教育研究の基本素材となし活用するための調査,研究及び利用方法の開発にあった.この趣旨に則して,本年度は,第二次世界大戦期にいたるまでに製作公開されたニュース映画,記録映画,ドキュメンタリー映画,教材映画,激映画(児童劇を含む)の中からとくに史料的価値の高い作品として選び出したフィルムに関する総合的な所在調査を実施し,収集整理して内容の分析を進めるとともに,映画製作の社会的背景,ねらい・意図を知る上で重要なシナリオ,関係者の手記,回顧録,談話など周辺資料の収集にも力を注いだ.同時に,素材フィルに関する教育研究機関相互の共同利用体制について具体的施行を含めて検討を進めた.当該時期に製作された関係フィルムの中には,既に製作を担当した事業体が存在しない場合も少なくなく,所在確認に相当の困難が伴ったが,諸外国の映画記録保存機関を含め各方面の協力を得て,予想以上の成果をあげることができた.これまで,類似の調査研究がなく,その欠落部分を補いフィルム保存の実態と問題および利用上の意義と展望を明らかにしたことは,今後の同様の調査研究に少なからざる便宜と刺激を付与するものとなろう.しかし,映画史料の急速な散逸という緊急性と,文書と映像との併用による調査研究方法の開発という重要性をふまえ,なお継続して調査研究を進める必要がある.本研究の目的は,歴史的価値の高い教育,文化,学術関係の映画フィルムを文書資料と並び教育研究の基本素材となし活用するための調査,研究及び利用方法の開発にあった.この趣旨に則して,本年度は,第二次世界大戦期にいたるまでに製作公開されたニュース映画,記録映画,ドキュメンタリー映画,教材映画,激映画(児童劇を含む)の中からとくに史料的価値の高い作品として選び出したフィルムに関する総合的な所在調査を実施し,収集整理して内容の分析を進めるとともに,映画製作の社会的背景,ねらい・意図を知る上で重要なシナリオ,関係者の手記,回顧録,談話など周辺資料の収集にも力を注いだ.同時に,素材フィルに関する教育研究機関相互の共同利用体制について具体的施行を含めて検討を進めた.当該時期に製作された関係フィルムの中には,既に製作を担当した事業体が存在しない場合も少なくなく,所在確認に相当の困難が伴ったが,諸外国の映画記録保存機関を含め各方面の協力を得て,予想以上の成果をあげることができた.これまで,類似の調査研究がなく,その欠落部分を補いフィルム保存の実態と問題および利用上の意義と展望を明らかにしたことは,今後の同様の調査研究に少なからざる便宜と刺激を付与するものとなろう.しかし,映画史料の急速な散逸という緊急性と,文書と映像との併用による調査研究方法の開発という重要性をふまえ,なお継続して調査研究を進める必要がある.
Endiyne系抗腫瘍抗生物質クロモフォアの生合成の解析

エスペラミシン、カリケアミシン、ダイネミシンAは、近年相次いで発見され、いわゆるビシクロジイネン部分構造を持つ、放線菌の代謝する抗腫瘍抗生物質で、今までに例を見ない特異な構造、強力な生物活性および、特徴的なDNA切断機構を伴う作用機構のため、世界中の注目を集めている。特に、ダイネミシンAは、ジイネンとアントラサイクリン型のハイブリッド構造を有し、生合成的にも最も興味を持たれている化合物である。我々は、その生合成機構を明らかにする目的で、(1)生産菌培養液より、関連化合物、特に生合成前駆体、の単離による生合成経路の推定;(2)生産菌培養中に、各種安定同位元素標識前駆体を添加し、その取込みパターンからの経路の解析;(3)培養液中に代謝制御物質(P450阻害剤)の添加による代謝の制御;の3点から研究を行った。(1)については、ダイナミシンAより1酸素原子のみ少ない化合物を単離した。この化合物は、ジイネン部分およびアントラキノン部分構造はダイネミシンAと同様と推定され、従って、エポキシ部分が2重結合である前駆体と推定しているが、決定には至っていない。(2)について本年は、Nの由来がアンモニウム塩であることを、^<15>N標識硫酸アンモイウムの取込により確認し、また、CD_3COOHの添加によるC(25)への重水素の取込によりC(24)-C(25)エン部分が三重結合の還元により生成したものではないことを明らかにしたが、ヘプタケタイドから成るアントラキノン部分生合成機構について、そのスターター部分を同定する試みは成功していない。エスペラミシン、カリケアミシン、ダイネミシンAは、近年相次いでその発見と構造が発表された抗生物質であるが、いわゆるビシクロジイネン・クロモフォアを持つ、嘗て例を見ない特異な構造、強力な活性および特微的なDNA切断機構を伴う作用機構により、世界の注目を集めている一連の化合物である。特に、ダイネミシンAは、ジイネンとアントラキノン部分のハイブリッド型構造は、生合成的にも、最も興味を持たれている化合物である。我々は、その生合成機構を明らかにする目的で、(1)生産菌培養液より、関連化合物、特に、成合成前駆体の単離による経路の推定;(2)生産菌培養液中への各種アイソト-プ標識前駆体の添加による、生合成経路の解析;の2点から研究を遂行し以下の成果を得た。(1)関連化合物の探索においては、ダイネミシンAの直接の前駆体を示唆するものは得られなかったが、ダイネミシンAに存在するエポキシ基が開環し、ジイネン部分の芳香環化したダイネミシンO,P,Qを得た。これらは、また、ダインエミシンAにあるカルボキシル基も欠いていることは、後の前駆体取込み実験の結果と考え合わせて興味ある。(2) ^<13>C標識前駆体のダイネミシンAへの取込みパタ-ンから、夫々炭素14個から成るアントラキノンとジイネンの部分が別々に生合成されて後、その両部分が結合すること、および、カルボキシル基は、ジイネン部分炭素鎖に、更に1個の酢酸ユニットが結合し、1炭素脱落したC(2)由来であることが明らかになった。
知的財産高等裁判所の功罪と多元分散志向の可能性－大合議判決をキーワードとして－

知的財産高等裁判所の功罪を研究するため、裁判例・学説を中心に、理論的側面と実務的側面から研究を行い、16本の論文・評釈を発表した。中でも、中心的成果は、1プロダクト・バイ・プロセス・クレイムに関する研究、2職務発明に関する研究、3特許性に関する実務的な課題の研究であった。また特徴的な研究として、4特許発明の技術的範囲と要旨認定の関係に関する現代的変容を研究した。論文を4本、投稿・発表した。昨年発表した、プロダクト・バイ・プロセス・クレイム大合議判決に関する研究をフォローする判例評釈を発表した(『特許管理』誌)。このテーマは、本研究の骨格をなすため、論文化したもの以外にも研究を進めている。また本年は、これも別の角度から本研究の骨格の一部をなす、クレイム解釈に関する論説を発表した(『知財研フォーラム』誌)。わが国におけるクレイム解釈は、主に審査過程で行われる「発明の要旨認定」と、権利解釈過程で行われる「特許発明の技術的範囲」とがあるが、この両者の関係について、近年ではシングルスタンダード(統一的解釈)論が勢いを増し、かつての最高裁判決との関係が取りざたされている。この点について、これまでの学説には見られない新たな切り口から試論を提示した。この他、先使用権をテーマとした判例評釈を発表した(『新・判例解説Watch』誌)。裁判例で先使用権が主張されることは珍しいために論説は少ないが、過去の研究蓄積を生かした評釈である。同じく、職務発明に関する判例評釈を発表した(『新・判例解説Watch』誌)。職務発明の対価の算定ベースとなる「受けるべき利益」に絞って解説した。論説としてまとまるには至っていないが、審査過程における実験成績証明書の提出の可否に関する論文を執筆中である。非常に実務的な論点であるが、これまで研究者による調査がほとんど行われていないテーマであり、平成26年度中には発表できる予定である。論文を4本投稿・発表した。そのうち1つは、本研究研究の主要部分を構成する事になる、プロダクト・バイ・プロセス・クレイムに関する知的財産高等裁判所大合議判決(知財高判平成24年1月27日・プラバスタチンナトリウム事件)の研究(判例時報誌)である。この論説では、過去の関連裁判例と今回の大合議判決との関係性を重視した。また、過去の最高裁判決(リパーゼ事件)との関係についても詳しく研究した。判決は、従来見られなかった新たな解釈手法を打ち出したため、それについて重点的に研究を行った。この研究に基づいて、日本弁理士会主催の公開フォーラム(2回、東京及び大阪)で研究発表を行い、成果を実務家に還元するとともに、多くの実務家から意見聴取・議論を行うことができた。また、同志社大学研究会でも報告し、多くの研究者と意見交換を行った。この論説および研究発表は、本研究課題の大きな柱として位置付けられる。この先もフォローする。その他、出願に係る発明についての補償金請求権について、過去の最高裁判決で未解決とされた論点に言及した判決(知財高判平成22年5月27日ゴルフクラブ事件)について、判旨を批判する論文(新・判例解説Watch誌)を発表した。補正却下手続きに関する判決(知財高判平成23年10月4日逆転洗濯方法事件)について判例評釈(新・判例解説Watch誌)を発表するとともに、過去の裁判例・学説との関係を調べ、解釈論ではあまり活用されていなかった条文に着目した新たな学説を打ち出した論文を発表した(特許研究誌)。研究論文を3本執筆・投稿した(うち1本は7月公刊予定)。本年は、特許審査過程において出願後に提出した技術的資料が、審査にどのような影響を与えているかについて研究した(「事後的に提出した技術的資料(実験証明書)と特許性判断の問題」『別冊パテント』)。この問題は、従来の研究がほとんどなく、また従来の研究者が苦手とする論点だっため苦労が多かったが、発表にこぎつけることができた。また、この問題に関して東京と大阪で開催された日本弁理士会公開フォーラムで研究発表することができた(来場者は合計700名超)。本論文で取り扱った問題は、特許法の論点の中でも根幹に関わる「クレイム解釈」について大きな影響を与えるため、今後の本研究に大きく寄与することが期待できる。また、従来の研究蓄積を生かして、職務発明の対価の算定について判例評釈を発表した(『新・判例解説Watch』)。これは、使用者が従業者から承継した考案・意匠について、使用者が実施した期間のうち権利化前については、対価算定のベースとならないとした事案である。判決の根拠は、考案・意匠については発明と異なり出願公開に基づく対価請求権がない点にあるが、他の裁判例を根拠にこの点を批判する論考である。同じく職務発明に関し、2015年にも改正が予定されている論点についてすでに研究を投稿済みである(『(仮)飯村敏明裁判官退官記念論文集』、7月刊行予定)。これは、平成16年改正法が適用される実質的に初の裁判例であり、現在国会審議中の再改正案にも影響を及ぼす点で注目度が高い事案である。2014年はやや研究が低調だったため、研究最終年度である本年度は心して取り組みたい。本年度は研究論文を7本執筆した(投稿済のもの。うち5本は刊行済、2本は2016年上半期中に刊行予定)。

本年度は、6月5日に出されたプロダクト・バイ・プロセス・クレイムに関する最高裁判決(以下、平成27年最判)を中心に研究した。平成27年最判の原審は、平成24年の知財高裁大合議判決であり、本研究の中核である知的財産高等裁判所大合議判決の意義についての重要な検討対象である。このテーマに関しては、関心を同じくする他の研究者と意見交換を重ねた上で、判例評釈を1本発表した。また、この判例評釈を膨らませる形でより詳細な論考を現在執筆中である。執筆中の論文では、判決の射程や今後の実務に対する影響といった主要論点のみならず、知財高裁大合議判決と最高裁判決の関係性の在り方について論じている。プロダクト・バイ・プロセス・クレイムに関しては、実務家向けのセミナーで成果発表する予定である。また、昨年から引き続いて平成16年改正法が初めて適用された職務発明に関する論考を発表した。職務発明規定はさらに平成27年に法改正がなされたため(平成28年4月1日から施行)、改正法にまつわる問題点をまとめた論文を学会誌に投稿した(2016年5月出版予定)。このほか、用途発明の特許性に関する論説を発表した。これまで問題として意識されてはいたがほとんど研究がなされていなかった、「内在的同一、内在的実施」について切り込んだものであり、実務的な価値が高い論説となった。これも実務家向けのセミナーで成果発表する予定である。知的財産高等裁判所の功罪を研究するため、裁判例・学説を中心に、理論的側面と実務的側面から研究を行い、16本の論文・評釈を発表した。中でも、中心的成果は、1プロダクト・バイ・プロセス・クレイムに関する研究、2職務発明に関する研究、3特許性に関する実務的な課題の研究であった。また特徴的な研究として、4特許発明の技術的範囲と要旨認定の関係に関する現代的変容を研究した。従来の研究をフォローできた。特に昨年度悩んでいた研究について一定の成果を出すことができた。また、クレイム解釈について、研究の蓄積を深めることができた。知的財産法2015年度は、研究最終年となる。重要な研究対象たるテーマの最高裁判決が6月に予定されており、こちらの研究の準備を進めるとともに、総まとめとなる構想についても組み立てる。平成24年度の研究成果をフォローすることができた。また、本研究の根底となるクレイム解釈論について新たな見解を示すことができたため。新しい大合議判決(平成24年1月27日)の研究を行い、論説を発表した。また、この論説を基礎にして、実務家対象のフォーラムや、研究発表会を行った。これは当初の研究計画通りの進行である。2014年4月に事故で足を骨折し、予定していた学会出張(2回)を欠席せざるを得なかったために、消化予定の旅費宿泊費が支出できなかった。平成26年は、本研究の題材となる知的財産高等裁判所大合議判決が2件判決される見込みであり、本研究もすぐにフォローする。研究対象が増えたため、方針や注力するポイントを見直す。上記の平成24年大合議判決の影響についてさらに研究を進める。また、新しい大合議判決(平成25年2月1日)が出されたのでこの研究を進める。過去の大合議判決については、順次、近年の裁判例に対する影響力を調査していく。旅費・宿泊費として使用予定。年度末に使用する予定だった旅費(出張)が中止となってしまったため。
生体分子キラリティ可視化のための非線形光学顕微鏡

非線形光学過程における電子共鳴、分子振動共鳴などの効果を駆使する、新しい顕微イメージング手法を創出することに成功した。具体的には、超短パルスレーザーを用い、(a)誘導パラメトリック発光顕微鏡を用いた赤血球や花弁における二光子吸収の可視化手法、(b)誘導ラマン散乱を用いた分子振動のバックグラウンドフリーイメージング手法を実証した。ポストゲノム時代に入り、生命機能の物質的基盤であるタンパク質の機能とその発現メカニズム、タンパク質分子間の相互作用、ネットワークの解析に関する研究が注目を集めている。本研究では、超短パルスレーザーを用いる新しいタイプの四光波混合非線形光学顕微鏡の開発を進めた。当初、キラル成分由来の四光波混合光の検出に取り組んだが、アキラル成分の抑圧の困難性のために、未だ信号検出には至っていない。研究の進展に伴い、誘導ラマン散乱(SRS)を用いる新規顕微鏡の着想に至った。SRSは2色の光パルスと物質との非線形相互作用により,一方のパルスのエネルギーが他方のパルスに移る現象である.SRSはラマン共鳴のみを反映し,非共鳴相互作用に影響されないため、高コントラストなラマン顕微法を実現できると考えられる.我々は、SRS顕微法が原理的に高感度かつ高コントラストを有する強力な新規顕微鏡手法になりうることを提案し、生物観察の実証実験に成功した。この結果を日本光学会年次大会で発表し、ベストプレゼンテーション賞を受賞した。また、理論限界感度までく15dBに迫る高感度性を達成し,SRS顕微法の高感度性を定量的に実証し、その結果をOptics Expressに発表した.ポストゲノム時代に入り、生命機能の物質的基盤であるタンパク質の機能とその発現メカニズム、タンパク質分子間の相互作用、ネットワークの解析に関する研究が注目を集めている。本研究では、超短パルスレーザーを用いる新しいタイプの四光波混合非線形光学顕微鏡の研究を進めた。本年度は特に、誘導パラメトリック発光(stimulated parmetric emission, SPE)顕微鏡のアプリケーション探索と誘導ラマン散乱(stimulated Raman scattering, SRS)顕微鏡の改良に注力して研究を進めた。SPE顕微鏡では、生体試料において強い紫外・可視吸収を持つ部位を3次元的に可視化できることが期待される。そこで、観察対象とする生体試料を、培養細胞から様々な組織に広げた。その結果,無染色の赤血球からSPE信号の強いコントラストが得られることを見出した。そこで、様々な条件の赤血球の観察を進めたところ、赤血球の固定・非固定試料の違いが顕著に現れることがわかった。また、脳組織等の観察を行ったところ、主に密度の違いに由来するコントラストによって、脳組織内部の3次元可視化ができることも実証した。SRS顕微鏡に対しては、光パラメトリック発振器をファイバーレーザーに置き換えることによって、光源の波長可変性の拡大を試み、観測可能なラマンシフトを従来の29003800cm^<-1>から20003100cm^<-1>に変更し、よりクリアな脂質イメージングが可能になった。以上を通じて、SPE・SRS顕微鏡のバイオイメージングにおける有用性を向上させたと考えている。本研究では、超短パルスレーザーを用いる新しいタイプの四光波混合非線形光学顕微鏡の研究を進め、究極的には生体分子のキラリティを検出し、タンパク質のコンフォメーション変化等を高感度に検出する手法の開発を目指している。これまで、誘導パラメトリック発光顕微鏡のアプリケーション探索と誘導ラマン散乱顕微鏡の改良を進めてきた。本年度は、誘導ラマン散乱顕微鏡において高調波同期法という独自方式を適用することでショット雑音限界に1.6dBまで迫る高感度性を実証した。本方式では、繰り返しが2倍異なるパルスレーザーを同期させて試料に集光することで、誘導ラマン散乱を最高のロックイン周波数で検出し、低周波数のレーザー雑音を回避することができる。また、フェムト秒レーザーからピコ秒レーザーへの置き換えを行い、スペクトル分解能向上を図った。スペクトル分解能は5/cm以下であると予想している。レーザーの改造やレーザー同期用の電子回路の製作に時間を要したが、100fs程度の低ジッタ性をもって同期させることができ、細胞イメージングにも成功している。本研究成果により、誘導ラマン散乱分光をラマン光学活性分光に適用し、生体分子のキラリティ分光を行うための重要なステップを超えることができた。
果実害虫ミバエ類における誘引物質の化学受容および代謝機構の解明

Bactrocera属の果実害虫ミバエ3種について、化学感覚受容体をコードする遺伝子配列を同定した。そのうちミカンコミバエの10種類の嗅覚受容体について、アフリカツメガエル卵母細胞を用いて、ミバエ類の生活環に関わる化合物への応答を解析した。その結果、2種類の受容体が植物に含まれる揮発成分に応答することを明らかにした。嗅覚受容体に応答する4種類の化合物について、室内行動試験を行った。その結果、交尾後の雌成虫が1-octen-3-ol、geranyl acetate、farneseneに有意に誘引された。Bactrocera属のミカンコミバエ,ウリミバエ,ナスミバエは果実類の重要害虫である.同属ミバエでは,雄成虫が特定の匂い物質に誘引された後,これらの物質を摂取し性フェロモン合成の原料として利用することが知られている。そこで、化学受容機構を解明するため,ミバエ類の誘引・摂食物質の受容体遺伝子の特定を試みた。3種ミバエの雌雄それぞれから採取した触角及び唇弁からtotal RNAの抽出、mRNAの精製,シークエンスライブラリを調製した後,次世代シーケンサーによる解析を行った。ミカンコミバエでは味覚感覚器である唇弁で30種類もの嗅覚受容体(Or)が発現していた。ウリミバエの触角は,3個のエキソン部位を選択的にスプライシングした結果,8種類ものmRNAを産するOr配列を有していることが分かった。ナスミバエでは触角でCO2や糖の受容体以外にも6種類の味覚受容体(Gr)が発現していることが明らかとなった。受容体発現におけるこれらの違いは,3種ミバエがそれぞれ異なる機構を介して誘引物質を受容している可能性を示唆している。また同定されたOrタンパク質を配列の相同性から系統解析した結果,ミカンコミバエとナスミバエでは,配列の相同性が高いことが分かった。このようなミバエ内でよく保存された受容体は,環境中の一般の匂いを受容していると考えられる。その一方で,それぞれの種で配列特異性の高いOr配列を見出した。これらのOrが誘引物質や性フェロモンのような,そのミバエ種に特有な匂い受容に関与している可能性が考えられた。果実類の重要害虫ミカンコミバエ、ウリミバエ、ナスミバエの触覚で発現する遺伝子を網羅的に解析して、化学感覚受容体を同定した。そのうち、発現量の大きい嗅覚受容体を誘引物質や性フェロモンの受容体の候補と考えて、全長クローニングを行った。嗅覚受容体をアフリカツメガエルの卵母細胞で発現させて機能解析を行うために、クローニングした遺伝子を発現ベクターに組み込んだ。現在、発現用のcRNA合成を進めている。また、モデル生物のミバエであるショウジョウバエについて、翻訳制御因子が脱皮ホルモンの生産の制御に関わっていることを明らかにした。同定した誘引候補物質の全長配列決定および発現ベクターにクローニングすることができ、機能解析に取り組む用意ができた。昨年度までに、果実類の重要害虫であるBactrocera属ミバエ3種、ミカンコミバエ、ウリミバエ、ナスミバエの化学感覚器官において発現している受容体の遺伝子配列を網羅的に解析して、化学感覚受容体を同定した。本年度は発現量の大きい嗅覚受容体について、発現量の解析と機能解析を試みた。ミバエの誘引物質に対する行動は雄のみが強く誘引されるため、化学受容関連遺伝子の発現量が雌雄で異なることが期待された.しかし発現量の大きな嗅覚受容体について、定量RT-PCRにより雌雄の発現量を比較したが有意差は認められなかった。次に、ミカンコミバエの発現量の大きな嗅覚受容体11種について機能解析を行った。アフリカツメガエル卵母細胞で嗅覚受容体を発現させ、Bactrocera属ミバエに対して誘引活性や電気生理応答を示す21種類の化合物への応答を計測した。その結果、2種類の嗅覚受容体に関して、植物に含まれる揮発性の化合物に応答することを明らかにした。重要害虫を多く含むミバエ科の昆虫について、初めて嗅覚受容体の機能を解明することができた。昆虫のステロイドホルモンのエクダイソンの生合成経路については、反応経路が未解明のブラックボックスとなっている。そのため、モデル生物のミバエであるショウジョウバエを用いて、エクダイソン生合成過程の解明を試みた。エクダイソン生合成に関与するCyp6t3の遺伝子発現をノックダウンしたショウジョウバエ幼虫を用いて、この遺伝子の機能の解析を試みた。その結果、ショウジョウバエでは、CYP6T3の機能が欠損すると微量のEしか生合成できなくなるため、1齢から2齢へ脱皮できても3齢へ脱皮できなくなると考えられた。3齢脱皮に必要な量のEを生合成するために、CYP6T3がエクダイソンへと変換されやすい中間体を供給していることが示唆された。ミバエ科の昆虫は重要害虫を多く含むが、これまで嗅覚受容体の機能を解析した報告例はない。今回、ミカンコミバエについて2種類の嗅覚受容体の機能を明らかにした。そのため、ミバエ科の昆虫での初めての嗅覚受容体の機能の解明となる。昨年度までに、Bactrocera属の果実害虫ミバエ3種について、化学感覚受容体をコードする遺伝子配列を同定した。さらに、アフリカツメガエル卵母細胞を用いて、ミカンコミバエの2種類の受容体の機能解析に成功した。

今年度は、これら2種類の受容体について、寄主果実から報告されている揮発成分への応答を詳細に解析した。その結果、BdorOR13aが1-octen-3-olに濃度依存的に強い応答を示した。また、BdorOR82aがgeranyl acetateに濃度依存的に強い応答を示すと同時に、farneseneとlinalyl acetateに弱い応答を示した。さらに、新たにミバエ類の直腸フェロモン腺に含まれるマイナー成分に応答する受容体を特定した。応答の認められた4種化合物について室内行動試験を行った。ミカンコミバエ成虫がこれらの化合物を含ませた濾紙に誘引されるか調べたところ、誘引活性はほとんど認められなかった。しかし、白色あるいは緑色のボールを置いたところ、交尾後の雌成虫が1-octen-3-ol、geranyl acetate、farneseneに有意に誘引された。その一方で、これらの化合物は未交尾のメス成虫の行動に対して影響を及ぼさなかったため、交尾の前後で揮発性物質への応答が変わると考えられる。さらに、雄成虫は1-octen-3-olとfarneseneに対して有意に忌避行動を示した。同一の化合物に対して雌雄で引き起こされる行動が異なることが示唆された。本研究によって、受容体の機能を解析することで、ミバエ類の行動に影響を及ぼす化合物の同定につながることが示された。ミバエ類には検疫対象の害虫、飼育法が確立されていない種、年に一度しか発生しない種もいるため、飼育虫を用いずに実験室内で誘引候補物質を同定することが可能になることが期待される。Bactrocera属の果実害虫ミバエ3種について、化学感覚受容体をコードする遺伝子配列を同定した。そのうちミカンコミバエの10種類の嗅覚受容体について、アフリカツメガエル卵母細胞を用いて、ミバエ類の生活環に関わる化合物への応答を解析した。その結果、2種類の受容体が植物に含まれる揮発成分に応答することを明らかにした。嗅覚受容体に応答する4種類の化合物について、室内行動試験を行った。その結果、交尾後の雌成虫が1-octen-3-ol、geranyl acetate、farneseneに有意に誘引された。目的としていた受容体の網羅的な同定に成功した。さらに、系統解析により、候補となる誘引物質やフェロモンの受容体を絞り込むことができた。予定通り受容体の機能解析を行う。さらに、研究期間の後半時期に計画していた、ミカンコミバエの性フェロモン生合成機構の解明に着手する。このたび、機能を明らかにした嗅覚受容体のリガンドがBactrocera属ミバエに対して、どのように行動に影響を与えるかを明らかにする予定である。機能を明らかにした受容体は同定した嗅覚受容体の一部にすぎない。このたび、ミバエ科の嗅覚受容体の機能解析の方法を確立することができたので、今後、機能未知の受容体について、さらに解析を進めていく予定である。昆虫生理学同定した誘引物質候補受容体の全長配列を決定する。その後、受容体をアフリカツメガエルの卵母細胞で発現させて、機能解析を進める計画である。前年度に購入した高価な分子生物実験用のキットが残っていたため、消耗品費の使用が抑えられた。また、オリゴDNAの購入先を安価な業者に依頼したり、PCR酵素を自作したりして、消耗品費を抑制することができた。
肝がん発生のリスク要因に関する計量的研究

昭和63年4月以降平成2年12月末日までに、久留米大学病院に入院した肝がん患者は654名で、このうち症例としての適格条件(原発、年齢40ー69才、福岡または佐賀県在住など)を満たした者は191名、さらに、面接調査と医歴調査が終りフロッピ-への入力が完了した症例対照組(1:1)は133組(男110組、女23組)となった。年齢は男では55ー59才、女では60ー64才の者が最も多かった。症例の約8割は組織診断を受け、また、約9割が肝硬変を合併していた。対照の入院時疾患はがんや消化器潰瘍が多かった。HBs抗原は男の症例の10%、女の17%が陽性で、対照はそれぞれ1%、4%が陽性を示し、10年以上前の輸血歴は男の症例の19%、女の26%、対照のそれぞれ7%、4%が有していた。飲酒量の単位としてエタノ-ル換算量23mlを1drinkとする、「drink数×飲酒年数」のdrinkーyearsを用いて、40才までの飲酒量をみると、男の症例の74%、対照の60%は1drinkーyears以上の飲酒者であり、多量飲酒者は症例に多かった。女は症例対照とも大半が1drinkーyears未満の飲酒者であった。男ではこれらの3要因はlogistic regression modelを用いて単変量解析すると、いずれも有意のオッズ比を示したが、女では皆無であった。これら3要因は相互には無相関であった(x^2検定)。これら3要因を同時に用いての多変量解析の結果は、それぞれの要因を持たない者に比べて、HBs抗原陽性者は11.8倍、10年以上前の輸血歴保有者は3.0倍、40才までの飲酒量60drinkーyears以上の者は5.6倍、いずれも有意に肝がん罹患のリスクが高いことが判明した。男の40才までの飲酒量と肝がん罹患との間には、有意(x^2=9.0)の量・反応関係が観察された。これらの知見は過去11年間の疫学的研究報告結果と類似していた。昭和63年4月以降平成元年1月末日までに、原発性肝がんの症例と性・年令・居住地の対応した対照の両者への面接調査と医歴調査が終了し、情報収集状況のチェックとコーディングも終了し、フロッピーディスクに入力を完了したのは、症例25名(男20、女5)とその対照25名であった。この25症例・対照組でみると、男では年令5559才に、また、女では6064才に属する者が最も多かった。輸血歴は男女あわせて症例は28%、対照の20%にみられた。B型肝炎S抗原(HBsAg)は症例の12%、対照の4%が陽性であった。飲酒習慣では、面接時点で飲酒習慣を有していた者は症例・対照ともに52%で差はみられなかったが、過去に飲酒習慣があったがその後は飲酒を止め、面接時点では禁酒者であった者の割合は、症例で24%なのに対し、対照では4%であった。

喫煙習慣については、元喫煙者の割合は症例・対照ともに24%であったが、症例では喫煙者が64%、非喫煙者が12%なのに対し、対照ではそれぞれ52%、24%であった。職業歴については、面接時点までの就業期間が最も長かった職業に基づいて12の職業歴構成をみると、比較的多い職業として、農林・漁業と技能工・生産工程作業者及び労務作業者があるが、症例と対照間に職業歴構成の大きな差はみられなかった。初年度であり収集した例数がきわめて少く、本格的な解析や解釈には堪えない。関連機関の研究協力体勢はほぼ満足できる状況であり、また、研究対象者の協力状況も良く、輸血歴、HBsAg保有状況、飲酒歴、喫煙歴、職業歴などの項目における不明回答は皆無で推移している。来年度も研究継続が可能であり、そうすることが望ましいとみなされる。昭和63年4月以降平成2年1月末日までに、原発生肝がんの症例と性・年令・居住地の対応した1対1の対照の、両者への面接調査と直歴調査が終了し、コ-ディングとフロッピ-ディスクへの入力を完了したのは症例103名(男85、女18)と、その対照103名となった。この103症例対照組でみると、男では年令5559才に、また、女では6064才に属する者が最も多かった。輸血歴は男女あわせて症例の28%、対照の18%にみられた。B型肝炎s抗原(HBsAg)は症例の13%、対照の2%が陽性者であった。飲酒習慣では、面接調査時点で飲酒習慣を有していた者は症例で45%、対照で64%であった。過去に飲酒習慣があったがその後は飲酒を止めて、面接時点では非飲酒であった者は症例で29%、対照で7%であった。面接時点での喫煙習慣は喫煙者、禁煙者、非喫煙者であった者が、症例ではそれぞれ48%、33%、19%、対照ではそれぞれ53%、24%、22%であった。職業歴については、面接時点までの就業期間が最も長かった職業に基いて12の職業歴構成をみると、比較的多い職業として、技能工・生産工程作業者及び労務作業者、農林漁業作業者、事務従事者などがあったが、症例と対照の間に職業構成の大きな差はみられなかった。例数が少ないので男のみについて各要因と肝がんリスクとの関連をX^2検定で調べると、HBsAgによるオッズ比は9.8(95%信頼区間;1.7ー55.7)で有意の関連を示した。他の要因についてはこれまでのところ有意の関連を示したものはなかった。今年度は精力的に症例収集に努めたが来年度もこれを一層おし進めて例数の増加を企り、来年度末には充分な解析を行う予定である。昭和63年4月以降平成2年12月末日までに、久留米大学病院に入院した肝がん患者は654名で、このうち症例としての適格条件(原発、年齢40ー69才、福岡または佐賀県在住など)を満たした者は191名、さらに面接調査と医歴調査が終りフロッピ-への入力が完了した症例対照組(1:1)は133組(男110組、女23組)となった。年齢は男では55ー59才、女では60ー64才の者が最も多かった。症例の約8割は組織診断を受け、また、約9割が肝硬変を合併していた。対照の入院時疾患はがんや消化器潰痛が多かった。HBs抗原は男の症例の10%、女の17%が陽性で、対照ではそれぞれ1%、4%が陽性を示し、logistic regression modelを用いた単変量解析による肝がん罹患のオッズ比は、男では有意の11.0となった。10年以上前の輸血歴は男の症例の19%、女の26%、対照のそれぞれ7%、4%が有しており、男でのオッズ比は有意の3.3となった。飲酒量の単位として、エタノ-ル換算量23mlを1drinkとする、「drink数×飲酒年数」のdrinkーyearsを用いて、40才までの飲酒量をみると、男の症例の74%、対照の60%は1drinkーyears以上の飲酒者であり、多量飲酒者は症例に多かった。女は症例対照とも大半が1drinkーyears未満の飲酒者であった。男では40才までの飲酒量が60drinkーyears以上の者は、そうでない者に比べて4.8倍、有意に肝がんに罹患し易かった。
膵β細胞インクレチンホルモン依存性チャネルの制御機構解明に関する研究

Glucagon-like peptide 1 (GLP-1)は、cAMP産生を介して膵β細胞グルコース刺激時のインスリン分泌を増強することが知られているが、その機序は明らかではない。本研究において我々は、生理的濃度のGLP-1が、膵β細胞の背景電流の一種であるtransmembrane receptor potential melastatin 2 (Trpm2)チャネルを直接刺激し、インスリン分泌を増強することを発見した。GLP-1はcAMP-EPAC2を介してTrpm2チャネルを直接制御し、静止膜電位を脱分極させることでグルコース感受性を改善すると考えられた。本研究はGLP-1(glucagon-like peptide 1)の膵β細胞に対する作用機序解明を目的に立案した。平成24年度は13の実験を実施した。1Trpm2チャネル(Trpm2)のノックアウトマウス(KO)から採取された膵β細胞に対するexendin-4 (EX-4)刺激の効果の検討。2SUR1KOから採取された膵β細胞に対するEX-4刺激の効果の検討。3膵島還流実験によるインスリン分泌測定。1の結果:野生型マウスでは100 pM EX-4刺激にて有意な背景電流の増加が観察されたが、Trpm2KOではその効果は消失した。この結果より、EX-4依存性に制御される背景電流はTrpm2であることが明らかになった。2の結果:SUR1KOから採取された膵β細胞ではEX-4刺激による背景電流の増加が観察されなかった。EX-4刺激によるTrpm2電流の増加はcAMP-EPAC2経路が関与するが、SURはEPAC2のアンカータンパクとして知られていることから、その消失によりEPAC2の機能が低下したのではないかと予測された。3に代わり、膵β細胞内カルシウム測定実験を実施した。野生型マウスにおいて100 pM EX-4刺激によりグルコース刺激時の細胞内カルシウム濃度の全体的な上昇が観察された。このことから、生理的濃度のEX-4刺激によりインスリン分泌が増加することが示唆された。13に追加し、EPACインヒビターの効果の検討を行った。EPACインヒビター使用にて膵β細胞のTrpm2電流におけるEX-4効果は消失し、グルコース刺激時の脱分極も有意に抑制した。以上の結果から、生理的濃度のGLP-1はEPAC2を介してTrpm2を活性化し、膜電位脱分極およびインスリン分泌増強に寄与していることが明らかになった。生理的濃度のGLP-1の効果に対する報告はまだ無く、今回の発見の意義は大きい。本研究はGLP-1(glucagon-like peptide 1)等のインクレチンホルモンの、膵β細胞に対する作用機序解明を目的に立案した。14の結果:野生型マウスでは、GIP刺激にて有意な背景電流の増加が観察されたが、Trpm2KOマウスではその効果は消失した。GIPの作用は1 pMより観察され、100 pMで最大となり、それ以上の濃度では効果は減弱した。2の結果:100 pMPACAPにより有意な背景電流の増加が観察された。3の結果:16.6 mMG刺激により有意な背景電流の増加が観察され、電子伝達系ブロッカー併用、EPACインヒビター併用、およびTrpm2KOマウスではその効果は消失した。浸透圧の関与は否定的であった。5の結果:Trpm2チャネルに対するGLP-1およびGIP同時投与による影響は観察されなかった。6の結果:100 pM GLP-1投与により膵β細胞グルコース刺激インスリン分泌における第1相が増加することが明らかとなった。7に代わり、Rap1インヒビター(GGTI298)のTrpm2電流に与える影響を検討した。GGTI298はGおよびインクレチンホルモンのTrpm2電流増加作用を打ち消した。グルコース代謝および生理的濃度のインクレチンホルモンは、EPACーRap1を介してTrpm2電流を増加させ、インスリン分泌を増加させることが明らかとなった。グルコース刺激インスリン分泌の新たな機序、生理的濃度のGLP-1の作用機序を解明した点で、今回の発見の意義は大きい。平成24年度計画した実験計画は、一部変更はあったもののほぼ全て実施することができた。得られた結果も意義のあるものであった。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は1Trpm21チャネルのイオン透過性の検討、細胞内カルシウム濃度測定とTrpm2電流の同時測定によるTrpm2チャネル透過Ca2+の生理的意義の検討を行う。2Trpm2チャネル以外にも背景電流は存在し、それがどのようなタイプのチャネルかどうかをTrpチャネルの各種ブロッカーを使用して確認する。受容体刺激で活性化されるTrpチャネルにm2以外にどのようなものがあるかも検討する。3グルコース刺激インスリン分泌において背景電流の意義を検討する。

4単一β細胞とisletでの背景電流の機能的相違を検討する。以上の研究テーマに対して、平成25年度は主に消耗品を計上する。備品は現有機器を用いる。以上の目的が達成されれば、インスリン分泌機構におけるTrpチャネルの意義がさらに明らかになり、今後の糖尿病治療への展開へとつなげることができる。また、GLP-1の意義としてグルコース刺激インスリン分泌の増強作用が指摘されてきたが、本研究では分泌の第1相に重要な働きをすることが明らかになることから、従来のインスリン分泌機構の機序を再検討するという画期的提案がなされることになる。低濃度のGLP-1(サブナノモラーレベル)で効果が発現するという本研究結果はインクレチン作用によるインスリン分泌刺激の増強効果を示すもので、学術的特徴がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。