hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「スーパー抗体酵素」を用いた新型バイオセンサの開発と実用化

EDTAの添加時期の影響を調べると、誘導期に添加したものは100%の抑制効果を示したが、活性期に添加した場合は抑制効果がかなり減少する事。などが判明し、金属イオンは「スーパー抗体酵素」の活性サイトを構成しているのではなく、「スーパー抗体酵素」が酵素活性を持つような構造変化を促進する役割を担っているものと推定された。2)についてはアミノ酸とやペプチドとRu錯体との反応により発光する事を利用した新しいセンシングシステムの原理を確立したところである。3)についてはH.pyloriに対する抗体の遺伝子解析および立体構造解析から1クローンが有望な「スーパー抗体酵素」となる可能性があることを突き止めた。4)についてはPDBに登録されている抗体のアミノ酸配列をランダムに分子モデリングを行っている。これまで50数種類の抗体についてその立体構造を構築しているが、それほど低くない確率で触媒三つ組み残基様構造が抗体に現れる事が分かった。1)数十の抗体遺伝子の解析と、その抗体サブユニットの酵素的反応性を徹底的に調べた。その結果、酵素活性を示した抗体には触媒三ツ組残基様構造があるという特徴が認められたことから、この構造を有する抗体の割合を検索した。PDBに登録されているモノクローナル抗体、および我々の所有するモノクローナル抗体、計91株について可変領域の立体構造を解析したところ、約30%もの割合で触媒三ツ組残基様構造が認められた。これは、遺伝子レベルで酵素活性が用意された抗体の存在を示唆する重要な知見である。これを検証する目的で、立体構造解析の結果から触媒三ツ組残基様構造を持つと推定されたモノクローナル抗体について酵素活性の有無を検討し結果、いくつかの抗体においてペプチダーゼ活性が認められ、触媒三ツ組残基様構造と酵素活性の関係を裏付ける結果となった。2)3年間研究でいくつかの新しい天然型抗体酵素(「スーパー抗体酵素」はこの中に含まれる)を見出す事ができた。i41SL1-2抗体L鎖およびi41SL1-2抗体H鎖は、共に、短い「誘導期」とこれに続く活性期の二相性を示しながら抗原ペプチドを分解しており、中間分解産物を解析した結果、セリンプロテアーゼと同様の挙動を示した。trypsinと比較すると、親和性においてはtrypsinより高い値を示し、kcatは逆に低い値を示した。触媒効率(kcat/Km値)はほぼ同様であった。即ち、抗原認識において天然型抗体酵素は抗体の性質をそのまま残し、ゆっくりと抗原を分解しており抗体と酵素の中間に位置する分子であることが判った。i41-7抗体L鎖は各種の短鎖ペプチドをほぼ完全に分解し、しかも、抗原タンパク質をある程度特異的に分解し、また、一般的なペプチドを非特異的に分解する新たな天然型抗体酵素である事が判明した。3)Ru錯体がアミノ酸やペプチドと反応する事により発光する現象を利用した新しいセンシングシステムを構築している段階であるが、抗原や抗体の検出に応用するための適切な電極と測定の最適条件を探索した。その結果、電極にはAuが最適であり、これを使ってペプチドが10^<-6>/Mの感度で検出できる事が判った。また、N末にプロリンを付加することによりセンサとしての実用化が現実的になった。本年度の研究計画は1)「スーパー抗体酵素」の性質をさらに深く究明する。2)新しい「スーパー抗体酵素」の開発のために多数の抗体遺伝子の解析を行いその中から原理・原則を導き出す。
ある地域集団における循環器疾患の発症率とその関連要因

1)急性循環器疾患の発症登録研究急性循環器疾患発症登録を実施している滋賀県高島市において、1990年2001年の脳卒中の年齢調整発症率の推移を検討した。男性の脳梗塞は1990代中期に顕著な減少を示したが出血性脳卒中(脳出血およびくも膜下出血)はほとんど変化(やや上昇傾向)が認めらなかった。脳梗塞の傾向は女性でも認められた。一方、急性心筋梗塞は、男性および女性ともに顕著な上昇を認めた。2)循環器疾患のコホート研究滋賀県高島市の住民健診受診者を対象とするコホート研究において、動脈硬化指標として測定した上腕動脈-足首動脈間脈波伝播速度が生命予後との関連について検討した。baPWVは血圧脈波検査装置(フォルムPWV/ABI)を用い測定した。解析対象はbaPWVの測定者2642名のうち、調整変数がそろう2480名(男性839名,平均年齢61.0±12.4歳、女性1641名,平均年齢57.1±12.8歳)である。現在までに65名の死亡を確認しており、平均追跡期間は6.5年であった。上記対象者をbaPWV値で低値(<13.36m/sec)、中位(<16.22m/sec)、高値群(16.22m/sec〓)の3群に分け、Cox比例ハザードモデルを用いて低値群を基準群とする総死亡ハザード比を算出した。調整変数は年齢、性別、BMI、HDLコレステロール値、LDLコレステロール値、血清中性脂肪値、HbAlc値、収縮期血圧値、糖尿病・高血圧治療歴、喫煙飲酒歴であった。baPWVの多重調整ハザード比は、中位群で2.1(95%CI:0.4-10.2)倍、高値群で6.8(95%CI:1.4-32.8)倍となり、総死亡リスクの上昇を認めたbaPWVの上昇は一般住民においては年齢、血圧等を調整しても総死亡の独立した予測因子であることが示唆された。循環器疾患の発症率の推移と発症者の生命および身体機能に及ぼす予後の実態を明らかにする目的で、滋賀県高島市(人口約5万5千人)において循環器疾患の地域悉皆登録を実施している。1988年から2009年3月現在までに悉皆登録において脳卒中初発例2686例、急性心筋梗塞初発例691例を登録した。登録症例のうち1990年から2001年までの症例を用いて1990年代の循環器疾患発症率の推移を観察したところ、出血性脳卒中(脳出血およびくも膜下出血)は依然減少傾向にあるものの脳梗塞は微増傾向にあることが認められた(Kita Y,et al. Int J Stroke.In press)。また、急性心筋梗塞は男性で有意な増加傾向を示していることが認められた(Rumana N,Kita Y,et al.Am J Epidemiol.2008)。また、我々の研究において、脳卒中の発症に季節的な変動が認められたのと同様に(Turin TC,et al.Stroke.2008)急性心筋梗塞においても認められるかどうかについて検討したところ、脳卒中と同様に春季の発症が最も多く、夏季で最も低くなるという傾向が認められた(Rumana N,et al.Am J Rpidemiol.2008)。今後も高島市における循環器疾患の悉皆登録を継続実施するとともに、登録患者の予後(死亡および身体機能)について追跡調査を行う予定である。baPWVの多重調整

ハザード比は、中位群で2.1(95%CI:0.4-10.2)倍、高値群で6.8(95%CI:1.4-32.8)倍となり、総死亡リスクの上昇を認めたbaPWVの上昇は一般住民においては年齢、血圧等を調整しても総死亡の独立した予測因子であることが示唆された。
スピン系の多体現象に対する量子性とランダムネスの効果に関する研究

1]ハイゼンベルグ反強磁性(HAF)模型について連続虚時間・ループアルゴリズムの量子モンテカルロ法シミュレーションを行い、この模型で記述される、以下のような新奇な量子磁性現象の出現機構を明らかにした。1)量子的非磁性基底状態をもつ2次元HAF模型のサイトまたはボンドをランダムに希釈したときに出現する非磁性不純物誘起ネール長距離秩序、2)ボンド交替鎖がn本結合したn足HAF梯子模型における量子相転移、3)鎖(層)間相互作用が小さい擬1(2)次元HAF模型のネール温度の鎖(層)間相互作用依存性とその自己無撞着RPA理論による解釈、4)S=1ランダムボンド交替鎖HAF模型の基底状態相図の、「ひねり秩序変数」に基づく決定(3,4は論文投稿中)。2]ランダムネスとフラストレーションが共存するスピングラス(SG)におけるエイジング現象の解明のため、古典スピン系SGに対するモンテカルロ法シミュレーションを行い、以下のような新たな知見を得た。1)4次元イジングEA-SG模型のエイジング現象におけるスピン緩和が示す、臨界領域から熱活性化過程領域へのクロスオーバー、2)3次元イジングEA-SG模型の温度シフトエイジング過程におけるスピン緩和は、温度シフト幅が小さいと累加的記憶効果を示すだけだが、シフト幅がある程度大きくなるとSG相に固有な温度カオス特性が反映された振舞を示すこと・、3)前項と同じ模型における磁場シフトエイジング現象の解析から、SG研究の当初から論争が続いてきた、SG相の磁場中安定性の問題に対して、「不安定」を強く示唆する結果を得た。量子的非磁性基底状態をもつ、ポンド交替鎖が結合した2次元反強磁性ハイゼンベル模型におけるランダムネスの効果について量子モンテカルロ法による大規模シミュレーションを行い、1)サイト希釈の場合は無限小の希釈濃度で古典的ネール状態が出現するのに対して、ボンド希釈の場合は有限の臨界濃度以上でのみネール状態が出現すること(非磁性不非物誘起ネール長距離秩序)、2)両者のネール秩序は、主に、希釈サイト・ボンドに隣接したサイトに生じる'自由スピン'が担うこと、等を明らかにした。ランダムネスとフラストレーションが共存するスピングラス(古典スピン系)におけるエイジング現象の解明を目指して、モンテカルロ法による大規模シミュレーションを行い、以下のような新たな知見を得た。1)4次元イジングEAスピングラス模型のエイジング現象を詳しく解析し、これが、拡張された液滴描像で理解できることを検証した。特に,等温エイジング過程におけるスピングラスドメインの成長則に対するスケーリング解析により、スピンのダイナミックスが転移温度近くの臨界領域からより低温側の熱活性化過程の領域へクロスオーバーする様子を捉えることに初めて成功した。2>3次元イジングEA模型の温度シフトエイジング過程における複素交流磁化率を調べることにより、温度シフト幅が小さい場合、スピングラスドメインサイズは温度シフトでも不連続なとびはなく、シフト後の温度における成長則に従って成長を続ける(累加的記憶効果)のに対して、シフト幅がある程度大きいとこの累加的記憶効果が成立しないことを明らかにした。後者は、スピングラス相のもつ温度カオス効果を強く示唆する、初めてのシミュレーション結果である。3)3次元ハイゼンベルグスピングラス模型におけるエイジング現象を解析ずる準備として、転移温度より高温側のスローダイナミックスを解析し、異方性エネルギーがない模型における、絶対零度の転移温度へ向かう動的臨界特性を明らかにした。1]ランダムネスとフラストレーションが共存するスピングラス(古典スピン系)における低温スピングラス相が一様磁場に対して安定か否かの問題は、スピングラス研究の当初から議論が続いていて、未だに決着が付いていない。この基本的な問題に対して、3次元イジングEAスピングラス模型の磁場シフトエイジング現象(非平衡ダイナミックス)をモンテカルロ法による大規模シミュレーションで詳しく解析した。

その際、磁場のシフト幅hを系統的に変えて調べることにより、磁場シフト直前までに成長したスピングラスドメインの平均サイズと磁場シフト後に磁場中で新たに成長するスピングラスドメインの平均サイズとの間に、hを介したスケーリング則を見出し、これが、液滴描像から導かれるところの、スピングラス相の磁場中不安定性を意味するものであることを検証した(磁気国際会議2003招待講演;論文投稿中)。2-a]量子性効果の著しいスピン系である、ボンド交替鎖がn本結合したn足反強磁性ハイゼンベルグ梯子模型に関して量子モンテカルロ法による大規模シミュレーションを行い、その基底状態が、n足上から一つずつスピンを取り出して構成した合成スピンからなる1次元鎖に対するValence-Bond-Solid描像で理解できることを示した。2-b]鎖(層)間相互作用が小さい擬1(2)次元反強磁性ハイゼンベルグ模型のネール温度を量子モンテカルロ法で系統的に調べ、ネール温度の鎖(層)間相互作用依存性が、RPA近似より高次のスピンゆらぎ補正を取り込んだ自己無撞着理論とよく一致することを検証した(論文投稿中)。3]量子性とランダムネスが共存するS=1ランダムボンド交替鎖(ボンド強度がランダム、かつ、偶奇のボンドに関するその平均値が異なる反強磁性ハイゼンベルグ模型)について、「ひねり秩序変数」を新たに導入して解析し、ランダムなボンド強度がべき分布で与えられるとき、べき指数とボンド交替の強度とを変数とする空間で、3重臨界点を含む相図を決定した(投稿論文準備中)。
光受容体型タンパク質リン酸化酵素遺伝子の機能解析

平成11年度の研究計画に従い、以下の3点の研究を行った。1. PHY3遺伝子の大量発現系の確立バキュロウイルス・昆虫細胞系での発現用組換えウイルスを用い、PHY3組換えタンパク質を発現させたが、その大部分が不溶性画分に蓄積することが明らかになった。可溶化した不溶性画分、およびわずかにPHY3組換えタンパク質が存在する可溶性画分の双方を用いてアフィニティークロマトグラフィーによる精製を試みたが、160kDaという高分子量のためかリガンドに対する吸着性が低く、本法における精製は困難であった。2.光依存タンパク質リン酸化能の検証上記組換えPHY3タンパク質(可溶化した不溶性画分・可溶性画分)を用いて、光依存(明所下と暗所下で)の自己リン酸化能があるかどうかを実験した。現在までのところ、明暗に関わらず自己リン酸化能があることが示されている。光依存性については明瞭な差が検出されていない。3. PHY3遺伝子の植物体における過剰発現CaMV35Sプロモーター制御下のPHY3発現ベクターを導入した形質転換体4系統において、薬剤耐性マーカーのホモの系統を確立した。これらを抗PHY3ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行い、PHY3タンパク質の発現を調べたところ、2系統において発現が確認された。これら2系統を中心に赤色光による光屈性反応を調べている。平成10年度の研究計画に従い、以下の2点の研究を行った。1. PHY3遺伝子の大量発現系の確立パキュロウイルス・昆虫細胞(Sf9)系での発現用組換えウイルスの作製を行い、高感染率のウイルス液を得た。このウイルス液を用いてPHY3タンパク質の発現誘導を行い、目的タンパク質がCBB染色で確認できる程度に高発現していること、およびウエスタン分析によりその分解が比較的軽微であることを確認した。さらに目的タンパク質の発現量の経時変化の測定とMOIの至適化を行い、PHY3タンパク質の発現に関する条件の至適化を完了した。2. PHY3遺伝子の植物体における過剰発現植物体内での発現用にカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターで制御されるPHY3遺伝子発現用ベクターを構築し、シロイヌナズナに減圧浸潤法を用いて形質転換を行い形質転換植物体の選抜をした。最終的に23系統の形質転換体を得、自家受粉により薬剤耐性選抜によるホモの系統の作出を行っている。現在までに得られたホモの系統を用いて、赤色光および青色光による胚軸の光屈性現象を解析しているが、遺伝子導入による表現型の変化はいまのところ確認されていない。ホウライシダにもパーティクルポンパートメント法を用いて遺伝子導入を行っており、現在形質転換体を選抜中である。
日本の労使関係のミクロ統計データに基づく数量的分析・労働組合の経済効果を中心に

(1) 1990年代初頭以降,日本の雇用システムは,バブル崩壊後の不況と経済の急速な国際化のもとで,大きな変更圧力を受けてきた.雇用システムを構成する諸要因のうち,長期雇用慣行と年功的賃金構造に関しては,それが変化してきたのか否か,今後どのように変容しうるのかに関する数量的分析と将来展望が精力的に行われている.だが,これに対して,雇用システムのいまひとつの構成要素である労使関係については,数量的に分析されることはほとんどなかったといってよい.こうした状況をもたらした原因の一端は,労働省「賃金構造基本統計調査報告」の調査票に労働組合やその他の人事制度の有無に関する質問がないというデータ側の事情にある.(2)こうした状況を踏まえて,本研究では,労働省「賃金構造基本統計調査報告」と,労働組合などの有無を識別するその他の統計調査,すなわち「賃金労働時間制度等総合調査報告」と「労使コミュニケーション調査報告」を個票レベルでマッチングさせ,労働組合やその他の制度が賃金水準や賃金構造に対して及ぼす効果を分析することを試みた.(3)まず,「賃金労働時間制度等総合調査報告」とのマッチング・データの分析は次のことを明らかにしている.第1に,職能資格制度の有無別,および基本給に占める職能給比率段階別賃金関数の推定結果によれば,男性の場合には,職能資格制度の有無や職能給比率よりも組合の有無のほうが賃金構造に与える影響が大きい.第2に,これに対して,女性の場合には,職能資格制度の有無や職能給比率の相違が勤続の効果を高めるという結果になっている.次に,「労使コミュニケーション調査報告」とのマッチング・データの分析は次のことを明らかにしている.第1に,労働組合のない企業でも,社員会などの従業員組織が存在しており,賃金や福利厚生以外の経営事項を中心に労働者の発言を促している.第2に,従業員組織があると労働組合のニーズを減少させる.(1) 1990年代初頭以降,日本の雇用システムは,バブル崩壊後の不況と経済の急速な国際化のもとで,大きな変更圧力を受けてきた.雇用システムを構成する諸要因のうち,長期雇用慣行と年功的賃金構造に関しては,それが変化してきたのか否か,今後どのように変容しうるのかに関する数量的分析と将来展望が精力的に行われている.だが,これに対して,雇用システムのいまひとつの構成要素である労使関係については,数量的に分析されることはほとんどなかったといってよい.こうした状況をもたらした原因の一端は,労働省「賃金構造基本統計調査報告」の調査票に労働組合やその他の人事制度の有無に関する質問がないというデータ側の事情にある.(2)こうした状況を踏まえて,本研究では,労働省「賃金構造基本統計調査報告」と,労働組合などの有無を識別するその他の統計調査,すなわち「賃金労働時間制度等総合調査報告」と「労使コミュニケーション調査報告」を個票レベルでマッチングさせ,労働組合やその他の制度が賃金水準や賃金構造に対して及ぼす効果を分析することを試みた.(3)まず,「賃金労働時間制度等総合調査報告」とのマッチング・データの分析は次のことを明らかにしている.第1に,職能資格制度の有無別,および基本給に占める職能給比率段階別賃金関数の推定結果によれば,男性の場合には,職能資格制度の有無や職能給比率よりも組合の有無のほうが賃金構造に与える影響が大きい.第2に,これに対して,女性の場合には,職能資格制度の有無や職能給比率の相違が勤続の効果を高めるという結果になっている.次に,「労使コミュニケーション調査報告」とのマッチング・データの分析は次のことを明らかにしている.第1に,労働組合のない企業でも,社員会などの従業員組織が存在しており,賃金や福利厚生以外の経営事項を中心に労働者の発言を促している.第2に,従業員組織があると労働組合のニーズを減少させる.
脊髄髄内および頭蓋内グリオーマの生物学的悪性度の差異についての分子病態解析

本研究の目的は脊髄グリオーマと頭蓋内グリオーマにおいて組織像は同じであっても、生物学的悪性度の異なる群を層別化し、各群での分子病態の差異を検索し、悪性度の差に伴って異なる分子病態はなにかを明らかにすることにある。本研究により,以下の成果を得た.1)1300遺伝子を厳選し、スポットした、独自のアレイをGeneticLab社と共同開発、119種の癌細胞株のRNAサンプルにてそのアレイによる遺伝子発現プロフィールを検討し、良好な成績を得た。3)脊髄・頭蓋内ependymomaはこのようなDNAアレイデータをもとにクラスター分析およびサポートベクターマシンにてよく分離され、遺伝子発現はそれぞれ異なったプロフィールを持っていることが判明した。4)さらに症例を増やし,詳細に検討したところ,脊髄ependymomaと頭蓋内ependymomaはSTAT1、MIP-3alpha(LARC, Exodus)の発現により,サポートベクターマシンを使ってよく識別できることが判明した.現在これらの分子の分子病態上の意義を解析中である.本研究の目的は脊髄グリオーマと頭蓋内グリオーマにおいて組織像は同じであっても、生物学的悪性度の異なる群を層別化し、各群での分子病態の差異を検索し、悪性度の差に伴って異なる分子病態はなにかを明らかにすることにある。本年度は以下の成果を得た.1)脊髄ependymomaと頭蓋内ependymomaの増殖能をMIB-1染色で比較したところ,脊髄ependymomaに比べ,頭蓋内ependymomaではMIB-1 indexが有意に高く,増殖能に差があることが判明した(Br J Neurosurg,2000).2)15例のependymomaのp53変異を酵母機能アッセイにて検討した結果,頭蓋内,脊髄ependymomaともp53の変異がないことが判明した.ただし,grade III頭蓋内1例にcodon 259GAC(Asp)→GTC(Val)の変異が見いだされた.次年度はastrocytomaについても解析を行い,DNAアレイ解析をすすめ,脊髄グリオーマと頭蓋内グリオーマにおける遺伝子発現パターンを明らかにし,それら遺伝子につき機能的解析を進める予定である.本研究の目的は脊髄グリオーマと頭蓋内グリオーマにおいて組織像は同じであっても、生物学的悪性度の異なる群を層別化し、各群での分子病態の差異を検索し、悪性度の差に伴って異なる分子病態はなにかを明らかにすることにある。本年度は以下の成果を得た.1)1300遺伝子を厳選し、スポットした、独自のアレイをGeneticLab社と共同開発、119種の癌細胞株のRNAサンプルにてそのアレイによる遺伝子発現プロフィールを検討し、良好な成績を得た。3)脊髄・頭蓋内ependymomaはこのようなDNAアレイデータをもとにクラスター分析にてよく分離され、遺伝子発現はそれぞれ異なったプロフィールを持っていることが判明した。次年度は症例を増やしてDNAアレイ解析をすすめ、脊髄と頭蓋内グリオーマにおける遺伝子発現パターンを明らかにし、MDM2など興味深い遺伝子を中心に機能的解析を進める。4)さらに症例を増やし,詳細に検討したところ,脊髄ependymomaと頭蓋内ependymomaはSTAT1、MIP-3alpha(LARC, Exodus)の発現により,サポートベクターマシンを使ってよく識別できることが判明した.現在これらの分子の分子病態上の意義を解析中である.
電子スピン共鳴分光による悪性腫瘍の酸素及びpHの三次元イメージング法の開発

本研究の目的は、腫瘍組織における酸素分圧pO2および細胞外pHを定量的に可視化する先端的な計測手法・イメージング技術を構築することである。がん腫瘍の生物学的なメカニズムに関係する機能的情報(例えば生体組織中の酸素輸送や細胞の代謝変化)の可視化手法は未だ限られており、新規な可視化技術の開発が必要とされている。本研究では、電子スピン共鳴(ESR)分光を用いて、腫瘍組織の酸素分圧pO2と細胞外pHを三次元的に可視化するイメージング法を開発する。酸素およびpHを同時に測定可能な分子プローブの提供を受け、酸素分圧および細胞外pHを同時に可視化するイメージング法の実現を目指す。
遺伝性多動・内耳形態異常マウス(BUS)の病態発現に関与する因子の特定

遺伝性多動マウス(BUN/Idr)は、旋回、多動を主徴とする行動異常マウスである。その病態が単一の常染色体性劣性遺伝子の支配下にあることが知られていたが、我々は、BUSホモ固体が内耳聴覚器・平衡器いずれにも著明な病変をもつ"waltzer-shaker"ミュータントに属することを病理組織学的に明らかにした。また、末梢平衡器の機能障害と行動異常との因果関係を調べるために行った迷路機能破壊マウスの運動機能に関する調査結果は、迷路破壊マウスとBUSホモ固体との運動異常性が極めて酷似していることを示した。このミュータントは、中枢に多数の液胞状病変(スポンジ状病変)をもつが、遺伝的交雑実験の結果から、この病変は行動異常と関連のない病態であることがわかった。胎生後期のBUSマウス中枢脳幹部に死細胞塊が頻繁に出現する事実が認められたが、ヘテロ個体の中枢にも低頻度ながら死細胞塊が観られた事から、この現象も行動異常の原因因子とはならないものと考えられた。さらに、中枢でのタンパク質過リン酸化との関連から、プロトオンコジーンc-mosのBUSマウスにおける異常発現の可能性をリボヌクレアーゼプテクションアッセイ法により検索した。その結果、ホモ・ヘテロ個体間で発生のどの時期においても、中枢でのc-mos転写産物の量的違いはみられなかった。これまでのところ、行動異常と直接結び付く中枢における形態的、物質的異常は認められていない。責任因子を物質レベルで検索する一環として、内耳の組織発生・分化の異常解析に有用な単クローン抗体の作製を行い、これまでに平衡器、聴覚器の細胞・組織を特異的に認識し、BUSあるいは他の"waltzer-shaker"ミュータントの解析に有用と思われる抗体を産生する3種のハイブリドーマをクローニングした。遺伝子レベルでの調査として、生後7日齢ホモ・ヘテロ個体の分離膜迷路よりRNAを調製し、mRNA differential disply法により責任因子遺伝子を直接同定する方向性を模索した。これまで、ホモ・ヘテロ間で数種のmRNA発現量の違いを認めており、northern解析による確認分析作業に入っているが、補助金交付年度内に責任因子遺伝子を特定するまでには至らなかった。BUSマウスの内耳および中枢の病理組織学的検索をほぼ完了した。内耳聴覚器の発生分化は光顕レベルでは正常にみえるが走査電顕による観察により感覚細胞の聴毛の配列に明瞭な不正常な攪乱があることがわかった。この感覚細胞にみられる病変はコルチ器退化に先行し、生後1日令ですでに認められる。bus/busホモ個体は生後どのステージにおいても脳性聴覚応答を示さないが、その原因はこの感覚細胞の異常に依っているものと考えられた。BUSマウス中枢には多数の液胞様のスポンジ状病変がみられる。電顕観察の結果、この病変はオリゴデンドログリアの関与した病態である可能性が示唆された。しかし、スポンジ状病変と行動異常との因果関係を調べるために行ったBALB/c系マウスとbus/busとの交配実験の結果、F1,F2における行動異常と中枢スポンジ状病変発現あは相関せず、これら病態には直接的な関連はないものと結論された。c-mosを導入したトランスジェニックマウスにBUSマウス類似の聴覚障害・行動異常が現れることが知られている。

BUSマウスの病態に対するc-mosの関与を調べるため、ホモおよびヘテロ個体の胎仔期、幼若期、成体脳におけるc-mos transcriptをリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法により調べた。その結果、BUSホモ個体とヘテロ個体の間に発現の量的相違はないことがわかった。これまでの調査結果からは、BUSマウスが内耳の特に聴覚器に明瞭な病変をもつものの、その物質的背景については未だ不明である。聴覚器に現れる病態から、本マウスはAmes waltzer,Jerler,Shaker-2などと類似の行動異常マウスとして分類されるものと思われ、今後は、内耳を対象としてその責任因子の同定を試みる。遺伝性多動マウス(BUS/Idr)は、旋回、頭部の不自然な上下左右運動、多動を主徴とする行動異常マウスであり、その病態は単一の常染色体性劣性遺伝子により支配されている。これまでの調査から、BUSマウスホモ個体は内耳聴覚器に著明な病変をもつことから、"waltzer-shaker"ミユ-タントに属することが示唆されてきた。本年度は内耳平衡器に焦点を当て、形態レベル、物質レベル、遺伝子レベルから因子特定へ向けて追究した。電顕観察から、生後3週齢、6週齢のホモ個体において、平衡器I型感覚細胞の萎縮・変性、および杯様神経終末の異常な膨潤が観察された。また、出生直後の平衡器官におけるII型からI型への感覚細胞分化過程において、異常な細胞間隙の拡張が認められた。遺伝子レベルでの調査として、生後7日齢のホモ・ヘテロ個体の内耳膨大部稜を含む膜迷路標品よりRNAを調製し、mRNA differential display法を用いて責任因子遺伝子を直接同定する方向性を模索した。これまで、数種のmRNA発現量の違いを認めており、northern解析による確認分析作業に入っている。責任因子を物質レベルで探索する一環として、内耳の組織発生・分化の異常の解析に有用な単クローン抗体作製を試みた。これまでに、平衡器支持細胞を特異的に認識する抗体産生ハイブリドーマを2種、聴覚器の支持細胞を特異的に認識する応体産生ハイブリドーマを1種確立した。これらを用いて内耳発生過程を解析したところ、胎生期15-17日でY10F2抗体による平衡器支持細胞からのシグナルに違いがみられ、今後の物質レベル、遺伝子レベルでの研究の足場としての重要な知見が与えられた。行動異常の責任病巣としての末梢平衡器系の関与を査定するため、内耳平衡器破壊マウスを作製し、その行動を調べた。その結果、化学的迷路除去マウスは、旋回、頭部の振せん、多動を示し、その行動異常性はBUSマウスホモ個体のそれと極めて酷似していることがわかった。聴覚障害に関する調査結果をもあわせ総合的に判断すると、内耳器官感覚細胞の分化不全を行動異常発症の主要因と位置づけることができるものと考える。
成長因子徐放ゼラチンシートを用いた肺胞再生

我々は動物実験において、FGF(fibroblast growth factor:線維芽細胞増殖因子)を徐放するゼラチンマイクロスフェアを肺動脈末梢に塞栓させることにより微小血管、肺胞上皮様細胞を誘導し、気腫肺の酸素化能を改善させることに成功した。しかし肺動脈内への異物(ゼラチンマイクロスフェア)、薬剤(FGF)の投与を臨床で行うことは極めて困難である。本研究の目的は、FGFを徐放するゼラチンシートを気腫が強い肺表面に貼付することにより、胸膜面のリンパ網から微小血管、肺胞上皮細胞を誘導させ、酸素化能の改善を図ることである。
ナノポーラス複合材料における新奇光化学反応の開発

本研究では、単分散ナノポーラス球表面に金ナノ構造を作製することで、局シプラズモン共鳴により光を細孔の開口部分に集中させて、ナノポーラス細孔内に吸着した分子を効率良く反応させることが出来る反応場の構築を目的とした。研究計画に従い、多フッ素化アルキルアゾベンゼン誘導体を細孔内に吸着させ、単粒子状にガラス基板に製膜した後、イオンスパッタリングにより球表面に金ナノ構造を作製したアゾベンゼンが吸収を持たない波長532nmのCWレーザー光を照射すると、金ナノ構造があるときのみアゾベンゼンが光反応することが明らかになった。これはナノポーラス球上の金ナノ構造に基づく局在プラズモン共鳴により光が集中し、効率良く分子と相互作用することで二光子反応していること示唆している。また、ナノポーラス内に高密度に吸着させることで、局在プラズモンと分子が相互作用するだけでなく、その反応がナノポーラス内へ伝搬し、協同的に反応することを見出した。ナノポーラス構造により光と分子が強結合することにより誘起された結果であると考えられる。本研究成果は、特定領域研究「光-分子強結合反応場」の目指す局在プラズモンによる多光子反応を実現した一例であり、ナノポーラス構造のような反応場が光と分子を強結合させるために極めて重要であり、ナノ構造を制御することにより新奇な反応が可能であることを意味している。これまでの光化学反応の研究目指してきた高効率、高選択的な光反応を実現する新しい光化学反応場として大いに期待出来き、光科学技術を支える基盤的研究としても大変意義がある。本研究では、単分散ナノポーラスシリカ球とアゾベンゼン誘導体を複合化し、さらに球表面に局在プラズモンを誘起できる金ナノ構造を形成させた光反応場の構築を目的とした。研究実施計画に従い、複合体作製に必要な材料となるナノポーラス球と多フッ素化アルキルアゾベンゼン誘導体を合成し、これらを複合化してナノポーラス球への分子の高密度吸着法や細孔内環境の評価により細孔内に2種類の極性環境が存在することなどを見出した。また多フッ素化アルキルアゾベンゼン誘導体を複合化させたナノポーラスハイブリッド球を効率良く光反応させ、反応とともに細孔径が変化することを気体吸着測定により見出した。これは光を照射することにより、非接触かつ必要なタイミングで細孔径を制御可能であることを示唆しており、新しい光機能性ナノポーラス材料作製が可能であると期待できる。さらにナノポーラスハイブリッド球表面にイオンスパッタリングにより金ナノ構造を作製することで、球表面に数ナノメートル程度の微細なホール構造を作製が可能であることを明らかにした、現在、作製した金ナノ構造で誘起される局在プラズモンにより二光子励起反応を検討している。本研究成果は、特定領域研究「光-分子強結合反応場」の目指す局在プラズモンによる多光子反応を実現する反応場構築として重要であり、これまでの光化学反応の研究で目指してきた高効率、高選択的な光反応を実現する新しい化学反応場として大いに期待出来き、21世紀の光科学技術を支える基盤的研究としてもその意義は大きい。
クロスバリデーション尤度を用いた統計的パターン分類器学習アルゴリズムの研究

モデル選択手法として用いられているクロスバリデーション的手法を繰り返し最尤パラメタ推定法の内部に効果的に組み込むことで、少ないデータから精密かつ一般性の高い統計モデルを学習するための手法を提案した。具体的には期待値最大化学習法にクロスバリデーションを組み込んだ手法の提案を行い、さらに教師なし適応への応用も行った。提案手法を音声認識で用いる統計モデルの学習に応用し、認識性能の向上に非常に効果的であることを示した。統計的手法を用いたパターン認識は、現実世界の不確かな現象をコンピュータで取り扱う有効な方法であり、音声認識など様々な分野で有効な方法として用いられている。この枠組みでは学習用のデータから確率モデルを推定し、そのモデルをもとに新たな入力データに対し確率推論を行うことが基本となる。そこで、よりよい性能を得るためには限られた学習データからできる限り精密かつ汎化性のあるモデルを学習することが非常に重要となる。本研究ではモデル学習の際の目的関数を従来の自己尤度からクロスバリデーション尤度に置き換えることで、学習アルゴリズムの汎化性能を強化し、複雑なモデルを少ないデータから精度良く推定することを目的としている。このような目的のもと今年度においては、モデルパラメタ最適化法としてAggregatedEM法の提案の提案を行った。Aggregated EM法は従来提案したCV-EM法の拡張で、アンサンブル手法をEM法の繰り返しアルゴリズム内部に取り入れることで、複数のモデルの結果を総合・平滑化し、モデル推定精度の向上を図る手法である。また、モデル構造最適化法としてクロスバリデーション尤度に基づく混合ガウス分布の最適化手法、およびそれを発展させた、Aggregated cross-validation尤度を用いた混合ガウス分有最適化アルゴリズムの提案の提案を行った。従来クロスバリデーション尤度は計算量が多く応用が限られていたが、これら提案手法は十分統計量を用いることで効率的に動作し、大規模なモデルに対して現実的な計算量で適用が可能である特徴がある。大語彙連続音声認識に用いる大規模な隠れマルコフモデル(HMM)へこれら提案手法を適用し、モデル良能向上に有効であることを示した。様々な応用をもつ混合ガウス分布の新しい最適化手法である効率的なクロスバリデーション(CV)を用いた最適化法法の提案を行った。提案アルゴリズムは十分統計量を用いることで効率的に動作し、大規模なモデルに適用可能である特徴がある。さらに、CV手法を拡張したAggregated CV(AgCV)法およびAgCV法を混合ガウス分布の最適化に応用する手法の提案を行なった。AgCV最適化法も十分統計量を用いることで高速に動作する。日本語話し言葉コーパスを用いた大語彙連続音声認識実験において、CV法およびAgCV法どちらを用いた場合もモデルサイズを自動決定しつつ認識性能が向上すること、CV法よりもAgCV法の方がより高い認識率得られることを示した。また、教師無し適応における適応化性能を向上させる目的で、CVおよびバギングに似た手法を教師無しバッチ適応の枠組に組み込んだ教師無しCV適応法および教師無し集合適応法の提案を行なった。教師なしバッチ適応ではアルゴリズム内部で認識器を動作させることで認識仮説を生成し、それをもとにモデルパラメタの適応化を行うが、仮説に含まれる認識誤りによる適応化性能の低下が問題であった。提案手法ではデータ駆動的手法によりその影響を大幅に低減することができる。また、提案アルゴリズムはMLLR音響モデル適応化手法のような一般的な適応化技術の適用方法に関するものであり、それら元とする適応手法の詳細には基本的に依存しない一般性がある。実験では、提案する教師無しCV適応法および教師無し集合適応法を日本語話し言葉コーパスの学会講演音声認識に適用し、従来適応法と比較して大幅に適応化性能が向上することを示した。
子宮内膜症におけるNK細胞と関連因子-異所性子宮内膜の増殖と卵巣機能への関与-

前年度のマウス子宮内膜症モデルからのDNA microarray解析によって検出された、子宮内膜症関連因子の有用性をヒト病理組織で検索した。その結果、CXCL10ケモカイン、macrophage-colony stimulatingfactor (M-CSF)が、正常組織に比べ、腺筋症組織の腺上皮において強く発現していた。カルシウム代謝に関わるcalbindin-28Kについては、マウスモデルでは発現増強が見られたが、ヒト腺筋症組織では変化が認められなかった。一方、アロマターゼ活性を抑制し、子宮内膜細胞の増殖を制御しているといわれるProstaglandin E2 receptor subtype EP3 (EP3)は、マウスモデルと同様に腺筋症組織でその発現が低下していた。これらの因子の発現量が子宮内膜の異所性増殖に伴い、どのように変化するのかを調べるために、培養系で実験を行った。マウス子宮から上皮細胞を分離し、体外培養を続けると、増殖するとともに管腔様の構造を形成した。この上皮細胞を経時的に回収し、RNAを抽出してリアルタイムPCR解析を行うと、細胞増殖と管腔形成の時期に合わせてM-CSFの発現が亢進していた。本研究では、マウスの病態モデルより、子宮内膜症に関連する新たな候補遺伝子を検出し、それらがヒト病理組織へ適用できることを確認した。特に、M-CSFは腺上皮の異所性増殖、管腔構造の形成、つまり嚢胞性の子宮内膜症病変の形成に関連していることが示唆された。しかしながら、本来、このマウスモデルは外性の子宮内膜症を反映するものであり、厳密に分類すると、腺筋症はこのモデルの外挿対象としては不十分な病変である。そのため、現在、卵巣周囲の子宮内膜症病変について追加解析を行い、更なる分析を行っている。BALB/cマウスにおいて子宮片を腹膜上に自家移植すると、70%の移植片が生着し、6週後には約4倍の体積に成長した。この移植片を実験的異所性子宮内膜とし、子宮内膜症のモデルとして解析した。移植片では上皮組織の増生が見られ、複数の管腔を形成した。DNA microarray法で移植片中の遺伝子を検索したところ、正所性子宮と比べて2倍以上の頻度で発現変化が認められた遺伝子が約750個検出された。子宮内膜症発症因子の候補となる遺伝子は多岐に渡っていた。発現が亢進していた遺伝子については、免疫系因子が多種類存在し、CXCL10などのケモカインや、macrophage-colony stimulatingfactor (M-CSF)などのサイトカインに強い発現が認められた。また、killer cell lectin-like receptorなどのNK細胞関連因子も高発現していた。他に、アポトーシス抑制性遺伝子であるBcl2a1、コレステロール25-水酸化酵素などの酵素系、白血病の発症に関与するmyeloid leukemia factor-1、カルシウム結合蛋白であるcalbindin-28Kなど、今まで子宮内膜症との関連性があまり報告されていない因子が多数見いだされた。一方、発現低下が見られた遺伝子では、prostaglandin E2 receptor subtype EP3 (EP3)、prostaglandin I2 synthaseなど、prostaglandin関連のものが共通して検出された。EP3はアロマターゼ活性の抑制に関与しており、子宮内膜症の増殖を抑制する因子として臨床的にも最近注目されている。ヒト腺筋症の病理標本で解析すると、正常部位より病変部位において上皮内EP3の発現が低下していた。今後は各因子の子宮内局在および発現強度を調べ、子宮内膜症発症因子についてより信頼度の高い実証を得るため、遺伝子改変マウスを用いた解析を行う予定である。
近接場光によるシグナル伝達の定量解析 テーラーメード治療への細胞アレイの展開

本研究では、二分子膜に細胞から抽出した膜蛋白質(レセプター)を導入し再構成した模擬細胞チップを作製し、近接場光(表面プラズモン共鳴、光導波路)を利用して非標識かつリアルタイムにてレセプター上で起きる反応(薬物のリン酸化阻害反応など)あるいは細胞内の活性化マーカーを計測し、創薬スクリーニングへ応用展開することを目的としている。昨年度では、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、金薄膜表面上でおきる反応(抗原・抗体反応を中心に)を効果的に検出できるシステムの構築に取り組み、シグナル増幅が可能になる手法の開発に成功した。本年度では、フォトリソグラフィー技術を用いて、細胞を模倣した空間を作成することを目指し、マイクロ流路あるいはチップの作成に取り組んだ。ネガ型エポキシ樹脂ベースのフォトレジストを利用し、紫外線照射装置(現有)により金蒸着基板上に様々なパターンを形成させた。露出している金蒸着表面上へ末端にカルボン酸を有する自己組織化単分子(SAM)膜を形成させ、活性化エステル化法により抗体を固定化した。金蒸着基板としては、あらかじめフォトマスクによりパターン化した金基板も作成し、比較した。パターン化した金蒸着表面では、金表面でのプラズモン共鳴が起こりにくく、シグナルのS/N比が低いことが分かった。これは、フォトレジストと組み合わせることで、パターン化した金の膜厚が変化し、最適膜厚である49nmよりも小さくなるためであった。また、細胞の脂質二重層を模倣するために、金表面に平面二分子膜を形成させた。卵黄レシチンからなるリポソームをそのまま基板上へ添加し、吸着させて崩壊させることで平面二分子膜形成させ、模擬細胞アレイの作製を行った。SPRシグナルからおよそ5nmの有機層が形成できたことから、平面二分子膜の形成が確認でき、細胞模倣基板を作成することができた。本研究では、二分子膜に細細胞から柚出した膜蛋白質(レセプター)を導入し再構成した模擬細胞チップを作製し、近接場光(表面プラズモン共鳴、光導波路)を利用して非標識かつリアルタイムにてレセプター上で起きる反応(薬物のリン酸化阻害反応など)あるいは細胞内の活性化マーカーを計測し、創薬スクリーニングへ応用展開することを目的としている。本年度では、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、金薄膜表面上でおきる反応(抗原・抗体反応を中心に)を効果的に検出できるシステムの構築に取り組んだ。金薄膜表面上(49nm)に末端にカルボン酸基を有するアルカンチオールからなる自己組織化単分子膜(SAM)を作製し、活性化エステル法によりモノクローナル抗体を固定化した。非特異的な吸着を抑制するもの目的(ブロッキング)で、アルブミンを吸着させた後、マーカー物質として、α-フェトプロテイン(分子量:65kDa)と脳由来利尿ペプチド(分子量:3.5kDa)を反応させた。SPRシグナル上では、マーカー物質と固定化されている一次抗体との結合に伴う殆ど変化が見られなかったことから、SPRシグナルを増幅させるためにマーカー物質に対する二次抗体を反応させたところ、シグナル増加がみられた。このシグナル変化は、マーカー物質の溶液濃度と相関していることから、本手法による定量が可能であることを示している。また、二次抗体を利用することで、数十ng/mLから数百ng/mL程度のマーカー物質の検出ができることがわかった。さらに、ナノビーズを利用して、さらなるシグナル増幅を試みたところ、数十pg/mL程度のマーカー物質を検出できることがわかった。
核酸修飾酵素を用いた新規原理によるＲＮＡ結合タンパク質ターゲットの網羅的同定

本研究においてはRNA内のシトシンを位置特異的に5-メチル化する酵素の酵素活性部位を任意のRNA結合タンパク質に結合することでRNA特異性を与え、bisulfite法により非メチル化シトシンと区別することにより、5-メチル化されたRNAの同定を通してRNA結合タンパク質のターゲットを同定することを目指した。反応条件、酵素発現系の至適化により、一部の培養細胞過剰発現系において本手法が実施可能であることが示唆された。初代培養細胞等においても適用できる修飾酵素の同定を引き続き実施するとともに、当初目標を修正し過剰発現系を用いて種々のRNA結合タンパク質のターゲットの同定を実施している。本研究は核酸修飾酵素を用い、それとRNA結合タンパク質の融合タンパク質を作製、発現させることにより、RNA結合タンパク質のターゲットを網羅的に同定することを目指したものである。本年度は前年度までのスクリーニングを踏まえ、いくつかのRNA修飾酵素にターゲットを絞り酵素と反応条件の最適化を企図した。まず、RNA修飾酵素とTTP/Zfp36融合タンパク質の発現系を構築し、それをHEK293細胞に導入し、TNF由来3'UTRを結合したluciferase遺伝子のmRNAにおけるシトシンメチル化をbisulfite法で確認した。MS2 capsid protein融合RNA修飾酵素によるMS2 stem loopを持つmRNAに対する修飾効率に比べて大きく劣るものの、修飾は見られた。次に、この融合タンパク質をマウス胚性線維芽細胞(MEF)に導入し、endogenous mRNAの修飾を確認することを試みたが、修飾が見られなかった。MS2システムを用いたpositive control実験においても修飾が見られなかったことから、Western blottingによって発現の確認を行ったところ、修飾酵素自体が発現していなかった。luciferase遺伝子または内部コントロールとして用いた遺伝子についてはタンパク質の発現が見られたことから、RNA修飾酵素の発現がMEFでは起こらないことが示唆された。現在、遺伝子導入方法の検討とコドン最適化などを試みている。次世代シーケンサを用いた網羅的同定には、修飾を受けたRNAを識別するアルゴリズムが必要となる。前年度に引き続きCLIP-seqなどに使われているアルゴリズムを検討し、人工的に作製したデータ群を用いて、その応用を試みた。現在のところ低速ながらも修飾をうけたRNAを選択するプログラムを構築することができた。本年度は核酸を修飾する酵素のスクリーニングと反応条件の最適化を行った。まず、RNA結合タンパク質としてMS2 capsid proteinを用いて各酵素との融合タンパク質発現系を作製した。また、そのターゲットとしてMS2 stem loopを持ったルシフェラーゼ遺伝子を作製し、これらをHEK293細胞に導入、修飾の有無をbisulfite sequencingによって確認する、酵素と反応条件を最適化するコントロール実験系を確立した。大腸菌由来のRNA修飾酵素を用いて予備実験を行った結果、最適なbisulfite反応条件を確立した。一方、酵素による修飾の効率が最適でないとの結論に至った。そこで、種々の細胞由来のRNA修飾酵素を用いてスクリーニングを行なった。一方、次世代シーケンサを用いた網羅的同定には、修飾を受けたRNAを識別するアルゴリズムが必要となる。本年度はCLIP-seqなどに使われているアルゴリズムを検討し、人工的に作製したデータ群を用いて、その応用を試みた。本年度は前年度に引き続き反応条件の最適化等を試みた。まず、前年度のRNA修飾酵素の発現がマウス胚性繊維芽細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)では起こらないという結果を受けて、遺伝子導入方法の検討とコドン最適化などを試みた。MEFにおいてリポフェクション法、エレクトロポレーション法、レトロウイルスを用いた導入を試み、Western blottingによりタンパク質の発現を確認したが、発現が見られなかった。そこで、大腸菌由来のRNA修飾酵素に対してコドン最適化を行い、再びRNA結合タンパク質としてMS2 capsid proteinを用いて酵素との融合タンパク質発現系を作製した。MS2 stem loopを持ったルシフェラーゼ遺伝子とともにMEF細胞に導入、RNA修飾の有無をbisulfite sequencingによって確認した。しかしながら、いずれの酵素においても発現が見られない、または修飾が十分でなかった。そこで修飾酵素の探索範囲を拡大し、HEK293細胞でのコントロール実験系を用いて至適な酵素を探しつつ、当初計画を修正し、HEK293細胞における過剰発現系においては少なくともMS2を用いたポジティブコントロールは機能するという結果に基づき、HEK293細胞においてRNA結合タンパク質のターゲット遺伝子同定を試み、継続して研究を行うこととした。免疫学使用する酵素およびbisulfite反応条件の最適化を行うコントロール実験系の確立、bisulfite反応の最適化、および使用する酵素の選別に成功した。

また、過剰発現系においては低効率ながらも融合タンパク質によるターゲットmRNAの修飾を観測することができた。しかしながら、ターゲットとする細胞株において融合酵素の発現系を構築することに未だ成功しておらず、大規模な実験を行うのは尚早である段階に留まっている。一方、プログラム開発はほぼ終了しており、次世代シーケンサによる大規模データを処理する基盤は整っている。使用する酵素のおよびbisulfite反応条件の最適化を行うコントロール実験系を確立することが出来、bisulfite反応の最適化に成功した。また、使用する酵素を選択する段階に入っているが、未だ実際に興味あるRNA結合タンパク質を用い、次世代シーケンサを用いた大規模な実験を行うのは尚早である段階に留まっている。コントロール実験系を用い、遺伝子導入法の最適化、コドン最適化などにより、ターゲットとするMEF,やマクロファージ細胞株等での発現系を確立し、確立後早急に、HuR, Zfp36, Regnase-1などのRNA結合タンパク質との融合タンパク質発現系を構築し、全RNAを調製後、次世代シーケンサを用いてbisulfite sequencingを行い、修飾されているRNA、すなわちRNA結合タンパク質のターゲットと、修飾されていないRNAとを区別し、ターゲットを同定する。引き続きコントロール実験系を用いて、修飾効率のよいRNA修飾酵素の選定を行う。選定された酵素を用い、HuR, Zfp36, Regnase-1などのRNA結合タンパク質との融合タンパク質発現系を構築し、HeLa細胞、RAW細胞などの細胞株に導入する。全RNAを調製後、次世代シーケンサを用いてbisulfite sequencingを行い、修飾されているRNA、すなわちRNA結合タンパク質のターゲットと、修飾されていないRNAとを区別し、ターゲットを同定する。また、前年度に引き続き、修飾されているRNAを区別するアルゴリズムを実装する。当初計画では本年度までに、RNA修飾酵素で計画に使用可能なものを同定し、数種類のタンパク質との融合タンパク質を作製、マクロファージ細胞などで発現させ、RNA-seqに供する予定であったが、RNA修飾酵素の最適条件の検討に時間がかかったために次世代シーケンサ試薬に使用する予定の費用に未使用が発生した。次世代シーケンサを行うためのライブラリ調製用試薬や逆転写酵素、抗体などに関しては購入済みであるため、細胞培養、RNA抽出、RNAのメチル化、および次世代シーケンサ用のシーケンシング試薬の購入に未使用分を当てることを予定している。
毒クラゲに刺されるとナゼ痛い？海洋危険生物による刺傷時の痛みの本質の解明

海洋生物には、毒クラゲのようにヒトとのコンタクトにより痛みを生じる被害を与えるものが数多く存在する。しかし、残念なことにいままでこの痛みがなぜ生じるかということについて科学的な検証がなされることはほとんど無かった。そこで今回、海洋生物でヒトに対して痛みの被害を与える種を中心に痛みを生じさせる物質本体の検索を行おうというものである。痛み物質の検出にはバイオアッセイを指標として用いて、痛み惹起物質本体の単離・精製を行っている。単離された化合物については分光学的手法を用いて詳細な構造解析を行う。また、各種生物活性試験を行い、この痛みを引き起こすメカニズムについて解明を行っていく。