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X線構造による脳ミクログリア特異的タンパク質Iba1のF-アクチン架橋機構の解明

ミクログリア特異的カルシウム結合タンパク質Iba1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1)は,活性化ミクログリアで発現上昇する147アミノ酸からなる新規タンパク質である。Iba1は,ホスホリパーゼC-γ(PLCγ)を介した新規Racシグナル伝達系で機能することが現在までに明らかになっているが,同時に,Iba1がF-アクチンとともに集積することが観察され,Iba1のF-アクチンに対する直接の結合能・架橋能が示された。初年度において,ミクログリア活性化におけるIba1の役割について新たな知見を得るため,ヒトIba1およびマウスIba1のX線結晶解析を行った。その結果Ca^<2+>フリー型ヒトIba1およびCa^<2+>結合型マウスIba1のX線結晶解析に成功し,Iba1のCa^<2+>依存的コンフォメーション変化が,これまで報告されてきたEFハンドタンパク質とは全く異なったものであることを明らかにした。さらに,このコンフォメーション変化によって,Iba1がCa^<2+>依存的に単量体から2量体へと分子会合状態を変化させる可能性を示した。そこで,次年度は,水溶液中においても,IbalがCa^<2+>依存的に2量体を形成するかどうかを確かめるため,様々な化学架橋剤を用いたタンパク質間架橋実験を行った。その結果,Iba1の1部が,有意に,2量体を形成するというデータを得た。さらに,Biacoreシステムを用いて,Iba1とアクチン,あるいは他のターゲット分子との間のCa^<2+>依存的な相互作用について検討したが,2量体形成が,これらのターゲット分子との相互作用に関与しているというデータは,まだ得ていない。また,計算機化学の手法を用いて,Iba1のCa^<2+>依存的コンフォメーション変化を動的に解析することを試みた。Iba1は,ホスホリパーゼC-_Y(PLC_Y)を介した新規Racシグナル伝達系で機能することが現在までに明らかになっているが,同時に,Iba1がF-アクチンとともに集積することが観察され,Iba1のF-アクチンに対する直接の結合能・架橋能が示された。ミクログリア活性化におけるIba1の役割について新たな知見を得るため,ヒトIba1およびマウスIba1のX線結晶解析を行った。Iba1は,2つのCa^<2+>結合サイト(EFハンド)を持つ,EFハンドタンパク質である。今回決定した構造から,ヒトIba1はCa^<2+>フリーの状態,マウスIba1はCa^<2+>が結合した状態であり,Ca^<2+>は,Iba1の2つめのEFハンドにのみを結合すると考えられた。ヒトIba1とマウスIba1の両者の構造を比較すると,C末端側のα-ヘリックスの位置が大きく異なっており,Iba1は,Ca^<2+>依存的にC末端領域が分子から遊離するという,これまでのEFハンドタンパク質では報告されていない新規なコンフォメーション変化を起こすことが予想された。このことは,ミクログリアのCa^<2+>依存的膜ラッフリングの形成と密接に関係していると考えられる。これまで,Iba1のCa^<2+>依存的な機能調節の報告はされていないが,以上の構造情報を踏まえて,Biacoreシステムを用いて,Iba1とアクチン,あるいは他のターゲット分子との間にCa^<2+>

依存的な相互作用について検討した。ミクログリア特異的カルシウム結合タンパク質Iba1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1)は、活性化ミクログリアで発現上昇する147アミノ酸からなる新規タンパク質である。Iba1は、ホスホリパーゼC-γ(PLCγ)を介した新規Racシグナル伝達系で機能することが現在までに明らかになっているが、同時に、Iba1がF-アクチンとともに集積することが観察され、Iba1のF-アクチンに対する直接の結合能・架橋能が示された。前年度において、ミクログリア活性化におけるIba1の役割について新たな知見を得るため、ヒトIba1およびマウスIba1のX線結晶解析を行い、Iba1は、Ca^2+依存的にC末端領域に大きなコンフォメーション変化を起こし、2量体を形成する可能性が示唆された。そこで、今年度は、水溶液中においても、Iba1がCa^2+依存的に2量体を形成するかどうかを確かめるため、様々な化学架橋剤を用いたタンパク質問架橋実験を行った。その結果、Iba1の1部が、有意に、2量体を形成するというデータを得た。さらに、Biacoreシステムを用いて、Iba1とアクチン、あるいは他のターグット分子との間のCa^<2+>依存的な相互作用について検討したが、2量体形成が、これらのターゲット分子との相互作用に関与しているというデータは、まだ得ていない。また、計算機化学の手法を用いて、Iba1のCa^<2+>依存的コンフォメーション変化を動的に解析することを試みた。
微細血流構造と血管内皮形状の関連より見た動脈硬化発症進展過程の解析

本研究は微細な流れの構造や局所的な血行力学的因子を詳細に検討し、血管壁細胞の形態や機能などに与える影響を総合的に解析することによって、動脈硬化病変の局在化の機構、および進展の機序を解明することを目的とした。初年度は、本研究の特長である、Invivoにおける微細な血流構造の計測、血管形状計測と評価を主体として実験・解析システムを確立した。そして動脈硬化の初期病変が生じやすい腎動脈分枝入口頭側の局所血流動態はヒトにおいてもイヌ腎動脈の場合と同様に、相対的低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性が特徴的であることを示した。本年度は、大動脈一腎動脈血管分岐部における内皮細胞の形態的・機能的分布を共焦点型レーザ走査顕微鏡を用いて明らかするため、蛍光染色剤であるローダミン・ファロイディンによりFアクチンを染色し、細胞内ストレスファイバの3次元的構造評価を行なった。さらに、ビスベンジマイドにより細胞核内DNAの染色を行い、内皮細胞の核の形状、分布状況の計測評価を可能とした。その結果、動脈硬化の初期病変が生じやすい腎動脈分枝入口頭側、すなわち低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性が特徴的である部位においては、細胞形状は歪であり、核形状は円形に近く、その配置には秩序がなくランダムであり、かつ細胞内ストレスファイバの観測量は少なかった。一方、腎動脈分枝入口尾側あるいは腎動脈分岐末梢部などずり速度が大きい部位においては、細胞形状は流れに添って細長く配列し、核の形状は楕円形を呈してかつ流れの方向に添って配向していた。また、ストレスファイバも流れの方向に走行し、かつ細胞内にも多く存在していた。このように、局所的な血行力学的因子と内皮細胞の形態が密接に関連していることが明かとなり、局所血流動態が動脈硬化の局所的な発生・進展に密接に関連することが窺われた。本研究は微細な流れの構造や局所的な血行力学的因子を詳細に検討し、血管壁細胞の形態や機能などに与える影響を総合的に解析することによって、動脈硬化病変の局在化の機構、および進展の機序を解明することを目的とする。初年度は、本研究の特長である、In vivoにおける微細な血流構造の計測、血統形状計測と内皮細胞の形態・機能を評価する実験・解析システムの確立を主体とした。まず、麻酔開胸犬(10頭)の剥離・露出した大動脈ー腎動脈分岐部において血流速プロフィルと血管形状の測定を行った。大動脈ー腎動脈分岐角度は平均84°(60ー90°)で比較的固体差が大きかったが、血流速プロフィルはつぎのようにほぼ一定の傾向を示した。血流速プロフィルの方向は心周期に伴って変化し、平均して分枝尾側へ偏位した。また分枝頭側では収縮期に流れの剥離が生じその逆流成分は時間的に変動を示した。分岐部での血流ベクトルは分岐尾側へ向かい、分岐頭側は平均的低ずり速度であった。すなわち腎動脈分枝入口頭側の局所血流動態は、相対的低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性であった。さらにヒトにおいて、動脈硬化発生頻度が高い大動脈ー腎動脈分岐部における血管形状と血流プロフィルを詳細に計測した。動脈硬化の初期病変が生じやすい腎動脈分入口頭側の局所血流動態はイヌ腎動脈の場合と同様に、相対的低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性が徴的であった。これらの局所血流動態が内皮細胞の形態・配列または物質移送を介して動脈硬化発生・進展に密接に関連するものと推察された。

腎動脈分岐部での詳細な血流速プロフィルの計測は、我々が開発した計測システムによって初めて実現され、その有効性が確認された。さらに、内皮細胞の形態・機能の評価については、共焦点レ-ザスキャン顕微鏡の設置を終了して、最適な標本作成手法についても検討し、次年度に向けて準備を行った。本研究は微細な流れの構造や局所的な血行力学的因子を詳細に検討し、血管壁細胞の形態や機能などに与える影響を総合的に解析することによって、動脈硬化病変の局在化の機構、および進展の機序を解明することを目的とした。初年度は、動脈硬化の初期病変が生じやすい腎動脈分枝入口頭側の局所血流動態は、相対的低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性が特徴的であることを示した。それに続いて本年度は、大動脈ー腎動脈血管分岐部における内皮細胞の形態的・機能的分布を共焦点型レーザ走査顕微鏡を用いて明らかするため、蛍光染色剤であるローダミン・ファロイディンによりFアクチンを染色し、細胞内ストレスファイバの3次元的構造評価を行なった。さらに、ビスベンジマイドにより細胞核内DNAの染色を行い、内皮細胞の核の形状、分布状況の計測評価を行った。この2種類の蛍光色素による二重染色により、内皮細胞骨格の詳細な形状、機能評価が可能となった。その結果、動脈硬化の初期病変が生じやすい腎動脈分枝入口頭側、すなわち低ずり速度、流れの剥離と時間的振動性が特徴的である部位においては、細胞形状は歪であり、核形状は円形に近く、その配置には秩序がなくランダムであり、かつ細胞内ストレスファイバの観測量は少なかった。一方、腎動脈分枝入口尾側あるいは腎動脈分岐末梢部などずり速度が大きい部位においては、細胞形状は流れに添って細長く配列し、核の形状は楕円形を呈してかつ流れの方向に添って配向していた。また、ストレスファイバも流れの方向に走行し、かつ細胞内にも多く存在していた。このように、局所的な血行力学的因子と内皮細胞の形態が密接に関連していることが明かとなり、局所血流動態が動脈硬化の局所的な発生・進展に密接に関連することが窺われた。
ウナギ塩類細胞における浸透圧受容・シグナル伝達機構に関する研究

淡水と海水双方によく適応するメダカをモデルとして、ゲノムデータベースを用いて浸透圧に反応して鰓で発現が上昇するOsmotictranscription factor(Ostf)と、浸透圧ストレスに反応すると予想される細胞内情報伝達系に関わる分子を同定した。それらの分子のうち、メダカを淡水から海水に移行すると発現が上昇するものをスクリーニングした。次に、Ostfを過剰発現させると発現が変化する細胞内情報伝達系分子を同定し、それら分子のリン酸化の変化をウェスタンブロットにより調べた。さらに、Ostf遺伝子を生体内でノックダウンをして、それによりメダカを海水に移行した際に鯉で発現の上昇が抑制される輸送体遺伝子を調べたところ、いくつかの水チャネル、イオン輸送体およびイオンポンプを同定した。これまでは海水に移行させると発現が上昇する遺伝子はいくつか同定されていたが、どのような情報伝達系を介して調節されているかについて明らかにした最初の研究である。研究に集中する目的で学会で発表することを控えていたが、現在原著論文として書きあげて間もなく投稿する予定である。しかし、TSE博士は3月11日の東北大震災により急遽帰国をしてそのまま特別研究員を辞退したため、業績はその原著論文1報のみである。淡水と海水双方によく適応する広塩性魚は、海水に移動すると鰓の塩類細胞を発達させ、体内に流入するNaClを濃縮して排出することにより高い浸透圧環境に適応する。そのトリガーと考えられる環境浸透圧あるいはイオンの受容体、および受容体からさまざまな輸送体遺伝子の発現にいたる情報伝達系は海洋生物の浸透圧調節において最も興味深いテーマであるが、まだほとんどわかっていないのが現状である。そこで、ウナギの塩類細胞で浸透圧に反応して発現が上昇するOsmotic transcription factor 1(Ostf1)を同定したTse博士と共に、浸透圧受容体からOstf1の発現にいたる情報伝達経路を明らかにすることを試みている。本年度は、ゲノムデータベースが確立されており、淡水と海水双方によく適応するメダカを用いて、これまで浸透圧受容体として示唆されているCalcium-sensing receptor(CaSR)とTransient receptor potential vallinoidtype(TRPV)遺伝子をデータベースから同定した。また、浸透圧に反応して発現が上昇する転写調節因子であるOstf1とTonicity induced binding protein(ToniBP)のホモログを複数同定した。メダカではOstf1が2種類のパラログとして存在し、双方が浸透圧に反応するが、特にOstf1bと名付けた新しいパラログがメダカを海水に移すと数十倍にまで上昇した。また、これらの遺伝子は鰓で発現していることがわかった。そこでin situハイブリダイゼーションでこれらの遺伝子が鰓の塩類細胞で発現しているかどうかを調べ、鰓で局所的に遺伝子をノックダウンすると海水適応能が低下するかどうかを現在調べている。
セルラーゼ・ヘミセルラーゼにおける基質吸着ドメインの機能解析

EG IIIにセルロース吸着ドメイン(CBD)を付加したキメラ酵素の構築及びAFのC末端側に存在すると想定されるキシラン吸着ドメイン(XBD)の解析のためEG III及びAFの公募S.pombeでの発現系の改良を行った。EG IIIのシグナルペプチドをS.pombeで分泌量が多かった他のセルラーゼ・キシラナーゼのものと置換したところCBH IIのものと置換しS.pombeで分泌させたところ分泌量が約100倍増加した。T.reeseiのセルラーゼのうち、唯一CBDがなく触媒領域のみからなるEG IIIに他のセルラーゼの持つCBDを付加し、分解能力の差を見ることでCBDのセルロース分解における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。T.reeseiCBH IIのCBDをEG IIIのN末端側に、CBH IのCBDをC末端側に付加したキメラ遺伝子を構築し、これらをCBH IIシグナルペプチドを用いてS.pombeを宿主として分泌発現させた。いずれのキメラEG IIIも過剰糖付加が原因と思われる分子量の増加がみられたが比活性はCBD付加前後で変わらず、セルロースへの吸着実験によりキメラ酵素のCBDが機能していることが判明した。CBDを付加したEG IIIはBMCC(bacterial microcrystalline cellulose)に対する活性及び結晶性セルロース分解時のCBHとの相乗作用に上昇がみられた。糸状菌Trichoderma reeseiのセルラーゼのうち、エンドグルカナーゼ(EG)IIIは他のセルラーゼに存在するセルロース吸着ドメイン(CBD)がなく触媒領域のみからなることがわがっている。本研究ではEGIIIに他のセルラーゼの持つCBDを遺伝子操作の手法により付加し、分解能力の差を見ることで各酵素由来のCBDのセルロース分解における役割を明らかにすることを目的としている。1.セルロース吸着ドメイン(CBD)のEG IIIへの付加T.reeseiセルラーゼにはCBDをN末端側に持つものとC末端側に持つものがあり、これらのCBDをそれぞれ本来の酵素と同じ側に位置するようにEG IIIと結合させるため、CBDをN末端側に持つCBH IIの場合EG IIIのN末端側に、CBDをC末端側に持つCBH Iの場合はCBDをEG IIIのC末端側に付加することとした。本年度はこれらキメラ遺伝子の構築を試み、CBH IのCBDをEGIIIのN末端に付加したものを構築した。これを酵母Schizosaccharomyces pombeを宿主として発現させたところ、活性酵素として発現したものの、発現量が低下していた。2.シグナルペプチドの置換によるEG III発現量の改良EG IIIのS.pombeでの発現量を増加させるため、EG IIIシグナルぺプチドを他のセルラーゼのシグナルペプチドと置換したところ、CBH IIシグナルペプチドを用いた場合EG IIIの分泌量が約3倍に増加した。これらの結果から、今後はEGIIIとCBDのキメラ遺伝子の発現をCBH IIシグナルペプチドを用いて行うことにした。糸状菌Trichoderma reeseiのセルラーゼのうち、エンドグルカナーゼ(EG)IIIは他のセルラーゼに存在するセルロース吸着ドメイン(CBD)がなく触媒領域のみからなることがわかっている。そこでEG IIIに他のセルラーゼの持つCBDを付加し、分解能力の差を見ることで各酵素由来のCBDのセルロース分解における役割を明らかにすることを目的として研究を行った。T.reeseiセルラーゼのうちCBH IIのCBDをEG IIIのN末端側に、CBH IのCBDをC末端側に付加したキメラ遺伝子を構築し、これらを前年度の結果を基にCBH IIシグナルペプチドを用いて酵母Schizosaccharomycespombeを宿主として分泌発現させた。いずれのキメラEG IIIも過剰糖付加が原因と思われる分子量の増加がみられたが比活性はCBD付加前後で変わらなかった。またCBDを付加したEG IIIはセルロースヘの吸着が確認され発現させたキメラ酵素のCBDが機能していることが判明した。この酵素を用いて各種セルロース基質に対する活性を調べたところCBH IのCBDを付加したEG IIIにおいてBMCC(bacterial microcrystalline cellulose)に対する活性が他のEG IIIに比べて有意な上昇がみられた。

2.アラビノフラノシダーゼ(AF)のキシラン吸着ドメイン(XBD)の解析AFのC末端側に存在すると想定されるXBDの解析のためAFのS.pombeでの発現系の改良を行った。AFシグナルペプチドをCBH IIのシグナルペプチドと置換しS.pombeで分泌させたところ、CBH IIシグナルペプチドを用いた場合AFの分泌量が約100倍増加した。
カンボジア農村女性の出稼ぎによる乳幼児の栄養・健康と生計への影響調査

おおむね計画通り実施した。本研究により、母親の出稼ぎが乳幼児の成長に負の影響を与えることがわかった。最終年度に栄養・健康・有機農業研修を改めて実施し、乳幼児の食事を改善したり、家庭菜園を実践する者もいた。日本の保健NGO・SHAREを招き、研究協力者のCEDACスタッフ、農家リーダーに対し、乳幼児の栄養と離乳食調理のTraining of Trainers研修を実施した。その後、対象6村でCEDACスタッフと農家リーダーが研修を実施し、フォローアップを実施した。有機農業研修も行なった。前年度までに、体重が順調に増えていない乳幼児の家庭訪問、聞き取り調査から、収入も少なく、家庭菜園を実施していない家庭もあると判明したからである。生計記録は成人識字率が低いカンボジア農村では困難で、各村で1年以上、継続できた人数は1人数名だった。最終年度までほとんどの者が、毎日の収支は記録できたが、毎月の合計ができなかった。各月の項目別の合計を12か月の年表に記入した者は皆無に近かった。毎月の記録や合計の計算をCEDACスタッフが毎月、確認し、訂正をすることが最後まで続いた。そのため農家が1か月、1年の収支を把握し、翌月・翌年の予算を立てることはほぼできなかった。毎月の借金原本と利子返済、貯金の記録も促したが、ほとんど記録されなかった。栄養を知るため、月例会の前日1日に食べた物を記録してもらったが、実施した者は少なかった。そこで最終年度に収支のみを記録するシートを紹介した。数人の若い農家が記録を試み、節約を始めるなど変化がみられた。毎月、村人に収支記録を勧めたが、試みたのは数人のみだった。生計記録をつけ続けた模範的有機農家の農業収入が工場労働者の最低賃金・月170ドル・年2040ドルより多いことが確認された。この農家は、2017年の収入の65%は有機農業からで、2100ドル以上を得た。カンボジアのカンポット県、プレイヴェン県、タケオ県の計6村で、研究協力者のカンボジアNGO・CEDACと農家リーダーと協力し、乳幼児の体重測定と生計記録を行い、母親の出稼ぎによる乳幼児への影響の検証をめざした。CEDACスタッフが毎月、対象6村を訪れて、農家リーダーのボランティアによる乳幼児の体重測定と記録、生計記録を確認し、記録間違いは訂正し、改善に向けてアドバイスをした。毎月、乳幼児の保護者と会合をもち、離乳食、栄養などについて話しあい、改善を促し、アドバイスした。研究代表者は平成28年8月と平成29年3月に6村で家庭訪問をした。多くの村で母親が出稼ぎに行き、祖父母が乳幼児の世話をするケースが見られた。が、母親が出稼ぎに出ている家庭を選んで訪問するのではなく、成長に問題がある場合の理由を確認することにした。平成28年8月は体重が数カ月、あまり増えておらず問題が大きい子どもの家庭を選んで訪問した。主な原因は、1)不適切な薬:病気で飲んでいる薬を見せてもらったところ、無関係で不適切な薬を飲んでいた。2)下痢:不適切な粉ミルクの作り方のため母親の妊娠や出稼ぎで粉ミルクを飲ませて下痢になる、牛乳を飲むと下痢になるので豆乳に変え下痢しなくなったなど、3)栄養不良:朝ごはんに白粥に魚醤、白粥に塩・MSG、冷や飯に砂糖など。全般的に野菜不足。平成29年3月は体重が増えてはいるが順調ではなく、このままだと成長モニタリング曲線が黄や赤ゾーンになる子どもの家庭を訪れた。子どもの世話をしている人に会い、食事について訊いた。より記憶が正確と思われる面談の前日に子どもが何を飲食したか、を答えてもらい、次の傾向がみられた。母親の多くが出稼ぎに出て、祖父母が世話をしている。野菜不足。子どもにスナック、甘い飲み物を買い与え、食事を食べておらず栄養不足。保護者の栄養に関する知識不足。食費は有する。全体的に計画通り、順調に進展している。一点、生計記録シートはかなり簡略化したものの、やはり成人の識字率が7割のカンボジアで、農家リーダー以外の一般の農家が無理なく記録できるシートの作成は課題が多い。また出稼ぎに出た先でも収支を各自が把握することが重要だが、出稼ぎをすると記録を止めてしまい、親が生計記録をしている場合は、子どもからの収入として記録されている状態である。そこで農家女性の出稼ぎによる乳幼児の栄養・健康と生計への影響については、出稼ぎをする本人の収支と子どもの栄養・健康への影響よりも、出稼ぎ者の子どもを預かる祖父母が仕送りを受けて収入があがる一方、どのような影響が子どもの栄養・健康にあるかをみていく。カンボジアのカンポット県、プレイヴェン県、タケオ県の計6村で、研究協力者のカンボジアNGO・CEDACと農家リーダーと協力し、乳幼児の体重測定や生計記録を行い、母親の出稼ぎによる乳幼児への影響の検証をめざした。CEDACスタッフが毎月、対象6村を訪れ、農家リーダー有志による乳幼児の体重測定と記録、生計記録を確認し、助言した。毎月、乳幼児の保護者と会合を持ち、離乳食、栄養、健康などについて話し合い、助言した。有機農業研修を実施し、離乳食のための食材を自ら栽培するよう促した。プレイヴェン県では現地の有機農家をアシスタントとして雇用し、彼が3村の対象家族を家庭訪問して乳幼児の食事・栄養・家庭菜園などについてアドバイスをするフォローアップをした。

これにより家庭菜園実践者が増え、乳幼児の食事改善につながったケースもみられた。平成29年9月に家庭訪問調査を行なった。以下の傾向がみられた。1)母親が出稼ぎに出ていない乳幼児の体重が順調に増えている割合は、母親が出稼ぎに出ている乳幼児よりも少しだけ高かった。2)母親が出稼ぎに出ていない乳幼児が成長曲線の平均体重近辺(緑ゾーン)に位置する割合は、母親が出稼ぎに出ている乳幼児よりもかなり高かった。3)緑ゾーンの乳幼児の母親は出稼ぎに出ていないことがやや多く、ゆるやかな栄養不良(黄ゾーン)に位置する乳幼児の母親は出稼ぎに出ている割合が高かった。4)緑ゾーンの乳幼児でも、母親が出稼ぎに出ている場合、母親が出稼ぎに出ていない場合に比べ、乳幼児の体重が順調に増えていない割合が高かった。5)黄ゾーンの乳幼児の方が、緑ゾーンの乳幼児より、大量生産の袋入りスナック菓子を食べた割合が高かった。このような傾向の原因はまだ明らかではないが、出稼ぎ前のように自給作物が不足し収入もなくて食料が買えないための栄養不良とは限らないようである。全体的に計画通り、順調に進展している。生計記録シートは、成人識字率が7割のカンボジアでは記録をすることが困難なため、記録する人数は増えていない。そこで収支だけをつけるシートを新たに作成し、月例会で紹介したところ、若者で数人が記録を始めた。家庭訪問を行なったことで、母親が出稼ぎに行っている場合とそうでない場合の乳幼児の成長と離乳食などの様子がわかり、比較をすることができた。おおむね計画通り実施した。本研究により、母親の出稼ぎが乳幼児の成長に負の影響を与えることがわかった。最終年度に栄養・健康・有機農業研修を改めて実施し、乳幼児の食事を改善したり、家庭菜園を実践する者もいた。日本の保健NGO・SHAREを招き、研究協力者のCEDACスタッフ、農家リーダーに対し、乳幼児の栄養と離乳食調理のTraining of Trainers研修を実施した。その後、対象6村でCEDACスタッフと農家リーダーが研修を実施し、フォローアップを実施した。有機農業研修も行なった。前年度までに、体重が順調に増えていない乳幼児の家庭訪問、聞き取り調査から、収入も少なく、家庭菜園を実施していない家庭もあると判明したからである。生計記録は成人識字率が低いカンボジア農村では困難で、各村で1年以上、継続できた人数は1人数名だった。最終年度までほとんどの者が、毎日の収支は記録できたが、毎月の合計ができなかった。各月の項目別の合計を12か月の年表に記入した者は皆無に近かった。毎月の記録や合計の計算をCEDACスタッフが毎月、確認し、訂正をすることが最後まで続いた。そのため農家が1か月、1年の収支を把握し、翌月・翌年の予算を立てることはほぼできなかった。毎月の借金原本と利子返済、貯金の記録も促したが、ほとんど記録されなかった。栄養を知るため、月例会の前日1日に食べた物を記録してもらったが、実施した者は少なかった。そこで最終年度に収支のみを記録するシートを紹介した。数人の若い農家が記録を試み、節約を始めるなど変化がみられた。毎月、村人に収支記録を勧めたが、試みたのは数人のみだった。
肝炎誘発性口腔細菌の同定とそのメカニズムの解明

我々は肝炎を誘発する可能性のある口腔細菌、口腔細菌由来物質の同定と、そのメカニズムの解析を目的として研究を行った。この結果、P. gingivalisが高脂肪食負荷したマウスに脂肪性の肝炎を誘発することを見出した。更に脂肪食負荷を続けると、ヒトの非アルコール性脂肪肝炎と同様の病状を示すことを見出した。これらの病態は歯周病菌自体が肝臓に到達しなくても、歯周病菌の産生するエンドトキシン(LPS)自体によっても肝炎が起こることも見出した。これらのLPSによるNASH発症の分子メカニズムの解明も行い、多くの国際的学術雑誌に報告したほか、多数の学会でも報告した。我々は肝炎を誘発する可能性のある口腔細菌、あるいは口腔細菌由来物質の同定と、そのメカニズムの解析を目的として研究を進めてきた。この結果、歯周病菌のうちでPorphyromonas gingivalisが高脂肪食負荷したマウスに脂肪性の肝炎を誘発することを見出した。更に歯周病菌投与後、脂肪食負荷を続けると、ヒトの非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)と同様の病状を示すことを見出した。これらの病態は、歯周病菌自体が肝臓に到達しなくても、歯周病菌などの産生するエンドトキシン(Lipopolysaccharide、LPS)自体によっても肝炎が起こることも見出した。これらのLPSによるNASH発症の分子メカニズムの解明も行い、レプチンが肝臓でのLPSの感受性を大きく高めることをあきらかにし、学術論文として報告した。さらに研究を進めた結果、可溶性のCD14がNASH発症を予測する重要なマーカーとなりうることも見出した。これらの研究成果を多くの国際的学術雑誌に報告したほか、多数の学会でも報告した。これらのLPSによるNASH発症の分子メカニズムの解明も行い、レプチンが肝臓でのLPSの感受性を大きく高めることをあきらかにした。これらの成果を多くの外国雑誌に発表したが、そのうちの一つCell Metabolismにおいて、本研究の内容が大きく取り上げられ、その表紙を飾ることとなった。さらに現在では関連する多くの知見も見出しており、更なる研究成果が上がることが期待されている。研究実績の概要にも記載した通り、本研究において、本年度だけで3報の中心論文と、2報の派生する論文を発表した。これらはいずれもインパクトファクターを持つ国際雑誌であり、そのうちの一つは内分泌・代謝系の一流雑誌であるCell Metabolismに掲載されている。この内容は特に注目を集め、研究成果が雑誌の表紙を飾ることとなった。これらの客観的な事実から、本研究が当初の計画以上に進展しているのは明らかである。研究費の一部執行が遅れているが、計画の達成度は「成果から客観的に判断される」べきものであり、単に研究費の使用金額を持って測るのはナンセンスである。それ故に本研究が計画以上に進展していると考えている。研究計画にも記載した通り、本年度の研究では歯周病菌のうちでPorphyromonas gingivalisが顕著な肝炎症状を呈したが、その為にかえって他の口腔細菌に関する興味がやや薄れているのが実情である。口腔内には様々な細菌が生息しており、その他の口腔細菌に関するより詳細な検討を行う必要がある。25年度は、これら他の口腔細菌に関する検討も進める予定である。同時に、歯周病菌によるLPS以外の作用メカニズムについても、より詳細な検討を加えていく予定である。研究計画を進めていく上で、外注したDNA microarrayの結果が年度内に報告されなかったため、24年度の研究経費に一部未使用額が生じたが、次年度に納入されるため、今年度行う予定の研究計画と合わせて実施する。また、本年度の他の研究費は計画通り使用された。25年度は計画通り研究費を使用していく予定である。
分泌性シグナルタンパク質の細胞外環境における動態とその作用機構

動物の発生や恒常性の維持には、分泌性シグナルタンパク質は重要な働きをする。シグナルタンパク質により制御される現象が秩序正しく起きるためには、シグナルタンパク質の分泌と細胞外での拡散が精密にコントロールされる必要がある。本研究では、代表的なシグナルタンパク質であるWntに着目し、その分泌の関わる脂肪酸修飾機構について詳細に明らかにするとともに、経時的観察等によりWntの拡散の様子を明らかにした。分泌性シグナルタンパク質が細胞外環境へどのように分泌され、その環境下でどのようにその拡散が制御され、さらにその濃度情報を細胞がどのように認識していくのかという問題は、動物の発生メカニズムを理解する上でまさに不可欠なものであるが、その理解はまだほとんど進んでいない。そこで本研究では、尾芽で産生されるWntとFGFに着目し、(1)その分泌、拡散の機構と(2)その濃度情報認識機構に焦点を当てその解明を目的に研究を行う。今年度は、(1)に関しては、Wnt3aが脂質修飾されること、ならびに脂質修飾に必要なアミノ酸残基が分泌にも必要なこと、そしてこの過程には小胞体タンパク質porcupineが必要なことを明らかにした。次年度以降は、脂質修飾がWntタンパク質の分泌にどのように関わるのかを解明していく予定である。(2)に関しては、尾芽における体節形成過程においてFGFシグナルの濃度情報認識機構の解明に焦点を当てた。具体的には、FGFシグナルによる誘導機構に異常を示す体節形成変異体ゼブラフィッシュの原因遺伝子をポジショナルクローニングにより同定することを試みた。その結果、原因遺伝子の位置を第21番染色体上の約900kbの範囲内に絞り込んだ。この領域内には10個以上の遺伝子がマップされており、さらなる絞り込みを続ける予定でいる。一方、Wntシグナルの濃度情報認識機構については、Wnt受容体Frizzled10の機能阻害実験を試みた。今年度までに得られた結果から、Frizzled10は体節形成に必要であることを示唆するものの、機能阻害実験に特異性に問題の余地を残しており、次年度以降さらなる検討を行う予定でいる。本研究では尾芽で産生されるWntとFGFに着目し、(1)その分泌、拡散の機構と(2)その濃度情報認識機構に焦点を当てその解明を目的に研究を行う。(1)に関しては、前年度までの研究から、Wnt3aが脂質修飾がこのタンパク質の分泌と密接に関連しており、そしてその過程には小胞体タンパク質porcupineが必要なことを明らかにした。今年度は、この脂質修飾がWntの分泌過程のうち小胞体からの輸送に必須であることを明らかにした。さらにこの修飾される脂質の構造を質量分析法を用いて解析した結果、モノ不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸が付加されているということを突き止めた。前年度より行って来たポジショナルクローニングの結果、第21番染色体上に候補遺伝子を見いだすことができた。次年度以降は、この候補遺伝子が実際に表現型の原因遺伝子であるかどうかについて、遺伝子ノックダウン法などにより確認をする予定である。一方、Wntシグナルの濃度情報認識機構については、Wnt受容体Frizzled10の機能阻害実験については、機能阻害実験に特異性に問題があると判断し、当面は他の研究テーマ(上記の[1]と[2])に集中して研究を進展させて行くことにした。分泌性シグナルタンパク質が細胞外環境へどのように分泌され,その環境下でどのようにその拡散が制御され,さらにその濃度情報を細胞がどのように認識していくのかという問題は,動物の発生メカニズムを理解する上でまさに不可欠なものであるが,その理解はまだほとんど進んでいない。本研究では尾芽で産生されるWntとFGFに着目し,(1)その分泌,拡散の機構と(2)その濃度情報認識機構に焦点を当てその解明を目的に研究を行う。(1)に関しては,前年度までの研究から,Wnt3aはモノ不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸のより修飾されており,この修飾がWntタンパク質の分泌過程のうち小胞体からの輸送に必須であることを明らかにした。また,この修飾には小胞体タンパク質porcupineが必要なことを明らかにした。今年度は,細胞外環境に分泌されたWntタンパク質の拡散のメカニズムを理解するために,まず分泌されたWntタンパク質の高次構造を解析した。ゲル濾過法等によりその分子量を測定したところ,予想に反して5001500KDという巨大な複合体を形成することがわかった。この複合体はほとんどがWntタンパク質から成るホモオリゴマーであることを明らかにした。

(2)に関しては,尾芽における体節形成過程においてFGFシグナルの濃度情報認識機構の解明に焦点を当てた。具体的には,FGFシグナルによる誘導機構に異常を示す体節形成変異体ゼブラフィッシュの原因遺伝子をポジショナルクローニングにより同定することを試みた。前々年度より行って来たポジショナルクローニングの結果,ならびに遺伝子ノックダウン実験から候補遺伝子を特定することができた。次年度以降はその遺伝子産物の機能解析を行う予定である。本研究では、分泌性シグナルタンパク質が細胞外環境へどのように分泌され、そこでどのように拡散が制御され、さらにその濃度情報を細胞がどのように認識するのかという問題に取り組む。特に、尾芽で産生されるWntとFGFに着目し、(1)その分泌、拡散の機構と(2)その濃度情報認識機構に焦点を当てその解明を目的に研究を行う。(1)に関しては、前年度までの研究から、Wnt3aは小胞体タンパク質porcupineによってモノ不飽和脂肪酸により修飾されており、この修飾がWntタンパク質の分泌過程のうち小胞体からの輸送に必須であることを、さらに分泌されたWntタンパク質は高分子複合体を形成することを明らかにした。今年度は、脊椎動物の胚発生におけるporcupineの役割を解明するために機能阻害実験を行い、porcupineがゼブラフィッシュの初期発生、なかでも原腸陥入運動における収斂伸長に必要であることを明らかにした。収斂伸長はWntシグナル伝達経路のうちの非古典的経路で制御されていることから、porcupineは少なくとも非古典的経路を制御するWnt蛋白質の分泌に関わることが示唆された。一方、細胞外に分泌されたWnt-3aタンパク質の生化学的解析を進めた結果、ショウジョウバエでの報告とは異なりリポ蛋白質複合体は形成していないことが判明した。また、会合する他のタンパク質もほとんどなく、Wntタンパク質はホモ多量体として分泌されていることが明らかとなった。(2)に関しては、尾芽における体節形成過程においてFGFシグナルの濃度情報認識機構の解明に焦点を当て、FGFシグナルによる誘導機構に異常を示す変異体ゼブラフィッシュの原因遺伝子を同定した。同定された遺伝子はRNAの核外輸送因子をコードしており、FGFシグナルの濃度情報認識機構に関わる遺伝子のRNA輸送が選択的に制御されている可能性が示唆された。本研究では、分泌性シグナルタンパク質が細胞外環境へどのように分泌され、そこでどのように拡散が制御され、さらにその濃度情報を細胞がどのように認識するのかという問題に取り組んで来た。特に、尾芽で産生されるWntとFGFに着目し、その分泌、拡散の機構ならびに細胞外での動態について解析を進めた。前年度までの研究から、Wnt3aは小胞体タンパク質porcupineによってモノ不飽和脂肪酸により修飾されており、この修飾がWntタンパク質の分泌過程のうち小胞体からの輸送に必須であること、分泌されたWntタンパク質は高分子複合体を形成すること、また脂肪酸修飾を担う酵素であるporcupineが胚発生に担う役割をゼブラフィッシュを用いて明らかにした。
突然変異により誕生した新しい難聴マウスのゲノム解析

ns(niigata shaker)マウスはICRマウスから突然変異により誕生した聴覚・平衡感覚障害を示す新しい変異マウスである。我々はこの原因遺伝子のポジショナルクローニングを行った。まず、ホモのnsマウスを日本産野生マウスMSMに交配し、得られたF1個体をホモのnsマウスに戻し交配し、戻し交配個体1700個体が得られた。これらの個体についてマウス全染色体上のマーカーを用いて、連鎖解析を行った。その結果、第10番染色体上のD10Mit258付近にns遺伝子座が存在することが明らかとなった。さらに第10番染色体上のマーカーを用いて、遺伝地図の作成、連鎖解析を行ったところ、ns遺伝子座はD10Mit59からD10Mit258までの2.67cMの範囲に存在することが明らかとなった。この領域をカバーする物理地図をYAC,BACクローンを用いて作成した。BACクローンから得られたSTSマーカーを用いてさらに連鎖解析を行ったところ、非組換え領域はふたつのBACクローンで完全にカバーされていることがわかった。これらのふたつのクローンについてショットガン・セィークエンスィングを行った。その結果新しいカドヘリン、カドヘリン23が単離された。この遺伝子について変異の探索をcDNAで行ったところ、146番目のGがnsマウスにおいては欠失していることがわかった。そのためフレームシフトを起こし、ストップコドンが出現することにより、正常マウスに比べて遥かに短いタンパクしかできていないことがわかった。さらにゲノムDNAを調べたところ、この一塩基の欠失はイントロン2の一番3'側のGがAに置換することによりスプライシングが一塩基シフトし、エクソン3の一番5'側のGが削られてしまうことにより生ずることがわかった。これによりカドヘリン23がnsマウスの変異の原因遺伝子であることが示された。この難聴マウスをns(niigata shaker)マウスと命名し、ns遺伝子座近傍の遺伝地図の作成、連鎖解析、物理地図の作成を行った。まず、難聴の形質を示すホモのnsマウスを日本産野生マウスMSMに交配し、得られたF1マウスをホモのnsマウスに戻し交配した。現在までのところ、戻し交配個体1163個体が得られた。これらの個体について、マウス全染色体上のマーカーを用いて連鎖解析を行った。その結果、第10番染色体上のD10Mit258付近にns遣伝子座が存在することが明らかとなった。さらに、第10番染色体上のマーカーを用いて、詳細な遺伝地図の作成、および連鎖解析を行ったところ、ns遺伝子座はD10Mit59からD10Mit258までの2.7cMの範囲に存在することが明らかとなった。続いて、このふたつのマーカーを用いてYACライブラリーのスクリーニングを行い、D10Mit59で3クローン、D10Mit258で4クローンのYACクローンが得られた。これらのYACクローンの末端配列をSTS化し、YACコンティグの作成を行った。その結果、D10Mit59を含む2つのYACクローンと、D10Mit258を含む2つのYACクローンとがオーバーラップしていることが明らかとなった。しかも、このうち1つのYACクローンはD10Mit59とD10Mit258の両方を含む、すなわち、非組換え領域を完全に含んでいることがわかった。今後、これらのYACクローンからマーカーを単離して、さらに詳細な連鎖解析を行い、非組換え領域を狭めること、それと並行してBACクローンを単離してBACコンティグを作成し、それらのクローンの解析に入る予定である。
規則的な細孔構造をもつメソポーラスカーボンの鋳型合成

MCM-41に代表されるメソポーラスシリカは規則的なヘキサゴナル型細孔構造をしており、極めて均一な細孔をもっている。また、鋳型となるミセルの大きさを変化させることで細孔径を厳密に制御できる。カーボンも魅力ある材料であるが、MCM-41のような規則的な細孔構造をもつ多孔質カーボンはいまだかつて合成されたことはない。カーボンは材料として高い性能をもっており、MCM-41と同様な細孔構造をもつメソポーラスカーボンが合成できれば触媒、吸着、ガス分離、電気化学などさまざまな分野で画期的な材料になることは間違いがない。そこで、本研究では界面活性剤の棒状ミセルを鋳型とすることで規則的で均一な細孔をもつメソポーラスカーボンの合成を目指した。まず、界面活性剤として非イオン系のポリオキシエチレンオレイン酸エーテル(C_<17>H_<33>-(O-CH_2-CH_2)_n-OH)、炭素前駆体としてショ糖を用い、メソポーラスカーボンの合成を試みた。ショ糖は硫酸存在下で炭素化するので、上記の溶液に硫酸を加えて炭素化を進行させた。しかし、生成した炭素には規則的なミセル構造を反映した細孔構造が見られなかった。これは用いたポリオキシエチレンオレイン酸エーテルが硫酸と反応し分解するためであることがわかった。そこで、界面活性剤として陽イオン系のセチルトリメチルアンモニウム塩を用いた。この界面活性剤は硫酸に対して安定であり、高濃度の硫酸中でもミセルを形成した。界面活性剤とショ糖の混合比、それぞれの水溶液中の濃度、処理温度などを変化させ、ミセル構造に及ぼす影響調べ、目的とする棒状ミセル形成のための最適条件を探索した。その結果、それぞれ適当と思われる条件が見つかり、棒状ミセル構造をもった炭素/界面活性剤複合体を作成することができた。しかし、本条件で生成したものは炭素前駆体であり、今後はさらに炭化度を高める必要がある。また、複合体の段階では細孔構造は発達しておらず、界面活性剤を除去した段階で細孔構造の分析を行う予定である。塩酸の存在下で陽イオン界面活性剤(セチルトリメチルアンモニウム塩)とフルフリルアルコールを水溶液中で混合し、フルフリルアルコールを徐々に重合させた。この際の各成分の濃度、添加方法などを変化させた複合体を合成した。これらの複合体を不活性気体中で800°Cで加熱することで炭素化した。その後、既存の自動吸着装置にて生成した炭素のN_2吸着等温線を測定した。その結果、界面活性剤の添加の有無にかかわらず、炭素の表面積は低く、細孔構造が発達していないことが明らかとなった。

また、X線回折装置にて炭素の構造を調べたが、規則的なミセル構造を反映した回折ピークは見られなかった。今後は炭素化の前のポリマーの段階でのミセル構造の有無を調べる必要があると思われる。MCM-41に代表されるメソポーラスシリカは規則的なヘキサゴナル型細孔構造をしており、極めて均一な細孔をもっている。また、鋳型となるミセルの大きさを変化させることで細孔径を厳密に制御できる。カーボンも魅力ある材料であるが、MCM-41のような規則的な細孔構造をもつ多孔質カーボンはいまだかつて合成されたことはない。カーボンは材料として高い性能をもっており、MCM-41と同様な細孔構造をもつメソポーラスカーボンが合成できれば触媒、吸着、ガス分離、電気化学などさまざまな分野で画期的な材料になることは間違いがない。そこで、本研究では界面活性剤の棒状ミセルを鋳型とすることで規則的で均一な細孔をもつメソポーラスカーボンの合成を目指した。まず、界面活性剤として非イオン系のポリオキシエチレンオレイン酸エーテル(C_<17>H_<33>-(O-CH_2-CH_2)_n-OH)、炭素前駆体としてショ糖を用い、メソポーラスカーボンの合成を試みた。ショ糖は硫酸存在下で炭素化するので、上記の溶液に硫酸を加えて炭素化を進行させた。しかし、生成した炭素には規則的なミセル構造を反映した細孔構造が見られなかった。これは用いたポリオキシエチレンオレイン酸エーテルが硫酸と反応し分解するためであることがわかった。そこで、界面活性剤として陽イオン系のセチルトリメチルアンモニウム塩を用いた。この界面活性剤は硫酸に対して安定であり、高濃度の硫酸中でもミセルを形成した。界面活性剤とショ糖の混合比、それぞれの水溶液中の濃度、処理温度などを変化させ、ミセル構造に及ぼす影響調べ、目的とする棒状ミセル形成のための最適条件を探索した。その結果、それぞれ適当と思われる条件が見つかり、棒状ミセル構造をもった炭素/界面活性剤複合体を作成することができた。しかし、本条件で生成したものは炭素前駆体であり、今後はさらに炭化度を高める必要がある。また、複合体の段階では細孔構造は発達しておらず、界面活性剤を除去した段階で細孔構造の分析を行う予定である。
鉄鋼の包晶反応により形成されるγ結晶粒組織の予測と制御

鉄鋼の凝固中、初晶δ相と未凝固融液が包晶反応を起こし、両者の界面にγ相が生成する。このγ相は、液相からγ相を通ってδ相と流れる炭素の拡散により、液相側とδ相側に成長する。δ相は樹技状晶(デンドライト)形態の凝固組織を有するが、包晶反応後のγ相は亀甲状の結晶粒組織になる。このγ相組織は鉄鋼の製造中および製造後の諸性質に強く影響するので、この組織をいかに制御するかという問題は実用上きわめて重要である。それゆえ、本研究ではγ結晶粒組織の形成過程を調査した。以下に、研究結果をまとめる。γ結晶粒の形状と大きさは、冷却条件の影響を強く受ける。冷却速度が小さいとき、鋳片内の温度勾配も小さくなり、γ粒は大きく等軸的になる。一方、冷却速度が大きいとき、鋳片内の温度勾配も大きくなり、γ粒は柱状的になる。このとき、柱状γ粒の幅は前記の等軸粒の直径と比べて小さくなるが、その長さは等軸粒の直径より長くなる。いずれの冷却速度の場合においても、1つのγ粒の中には多数のデンドライトが含まれており、また粒界柱状γ粒組織が形成する。このとき、1つのγ粒の中にはいくつかのδ結晶粒が含まれ、両相の結晶粒界は無関係である。これらの結果から、包晶反応過程について、以下のように考察できる。包晶反応はδデンドライトと液相の界面で始まるが、反応前線はデンドライト間の境界をいくつも越えて移動する。反応前線の移動速度は、温度勾配の方向に速い。
TRIM-SUMO-プロテアソーム経路：新たな膜蛋白質異常認識・分解機構の実証

本研究の目的は、小胞体(ER)で作られたAE1アニオン交換輸送体変異体R664X AE1のUb非依存性ERQC/ERADの仕組みの解明である。平成30年度は、ERのトランスロコンであるDerlin-1、-2とRX AE1の相互作用に焦点をあて、EGFP-RX AE1、RX AE1-EGFP、ΔCD AE1などRX AE1の修飾体についてその構造/ERにおける膜トポロジーとDerlinsによる認識との関連を検討した。その結果、本来の細胞質ドメインをもつRX-AE1とRX AE1-EGFPはいずれもほぼ100%がERに分布し、プロテアソーム分解を阻害しても、その分布に変化は生じなかった。一方、細胞質ドメインのN末端側を修飾したEGFP-RX AE1は50%の細胞でERの複数箇所に大きな集積像を呈した。プロテアソームの阻害によりその割合は80%に増加し、Derlin-1、-2、あるいはその両者の発現を抑制すると、この細胞内分布自体は変化しないものの、細胞内含量に著しい増加がみられた。また、細胞質ドメインを欠くΔCD AE1はERには認められず細胞質に点状の分布を示し、一部の細胞ではアグリソーム様凝集塊を形成した。さらにDerlin-1、-2の発現を抑制すると凝集塊をもつ細胞の大幅な増加、細胞内含量の可溶性/非可溶性画分における著増が認められた。これらの結果から、RX AE1の逆行輸送にはDerlin-1とDerlin-2の両者が不可欠であること、ならびにRX AE1の細胞質ドメインが細胞質への逆行輸送/Ub非依存性のプロテアソーム分解に際して何らかの認識を受けることが判明した。なお、ER膜上での分解の直接的/特異的に実証するため、ER内の逆行輸送/分解中間産物を検出する実験系を新たに構築することとし、現在、必要な分子を安定に発現する細胞を作製している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。小胞体(ER)で合成された膜内在性蛋白質のユビキチン(Ub)非依存性の品質管理(ERQC)とプロテアソーム系蛋白質分解(ERAD)の仕組みは未だに謎である。本研究では、AE1アニオン交換輸送体変異体R664X AE1のUb非依存性ERQC/ERADについて、TRIM蛋白質/SUMO蛋白質が関与する分解機構の仮説を検証することを目的とする。平成29年度は、ERADにおけるR664X AE1のSUMO化とSUMOリガーゼであるTRIM28関与の有無の検証、ならびに初年度で示唆されたCLPTM1の作用を検討した。HEK293細胞に一過性発現させたR664X AE1は免疫ブロット法/免疫沈降法で抗SUMO抗体と反応せずSUMO付加によるサイズの変化も認められなかった。無細胞タンパク質合成系で合成したR664X AE1、ならびに赤血球膜のAE1をSUMO化酵素(Aos1/Uba2あるいはUbcH9)を用いて修飾することを試みたが、SUMO1、SUMO2、SUMO3のいずれについてもSUMO化は認められなかった。またSUMO化への関与を想定したTRIM28は核に限局した分布を示し、その一過性発現/発現抑制はR664X AE1含量に影響しないことが明らかになった。これらの結果から、TRIM-SUMO系はR664X AE1のERADに関与する可能性を否定するに至った。CLPTM1の一過性発現はR664X AE1含量をプロテアソーム阻害時のレベルに増加させる一方で野生型AE1の含量には影響せず、逆にその発現を抑制するとERADの亢進が生じた。また、CLPTM1はR664X AE1と結合し、その結合は糖鎖に非依存的であった。これらの結果は、機能未知のCLPTM1がR664X AE1のERADに抑制的に作用するERシャペロンであることを示唆する新しい知見である。本研究は、Ub非依存性であるR664X AE1のERADがUb/SUMOリガーゼとして知られるTRIM28とSUMO化によって生じることを当初の仮説としたものである。初年度の検討は、それに否定的なものであり、本年度は徹底的な検証をまず行い、TRIM-SUMO系の関与を否定するに至った。一方で、初年度の検討で新たに見出されたCLPTM1について、ERでR664X AE1と特異的に結合し、その分解に抑制的に作用するという新知見が得られた。当初仮説を否定するに至ったが、一方でR664X AE1のERADに影響する新たな分子が判明した。CLPTM1は遺伝性口蓋裂等疾患の原因遺伝子として知られるが、本来の機能はまったく未知である。CLPTM1によるERAD抑制という知見は、Derlins/Sec61トランスロコンやBap31、calnexin等、R664X AE1分解に影響する既知タンパク質との関連等を探ることにより、従来にない特徴をもつR664X AE1のERQC/ERADの仕組みを具体的に解明する有用な手掛かりとなることから上記のとおり判定した。本研究の目的は、小胞体(ER)で作られたAE1アニオン交換輸送体変異体R664X AE1のUb非依存性