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メタボロミクスで紐解く口腔バイオフィルムの病原活性～ｉｎ　ｖｉｖｏでの解明～

口腔バイオフィルム(OB)内の諸基質の代謝及び薬物や代用糖などによる実際の影響を、CE-TOFMSを用いたメタボローム解析手法でin vivoで解明することを試みた。その結果、OB中では、糖以外にグルタミン、グルタミン酸などが実際に基質として利用されること、また、各種アミノ酸は、各々特徴的な代謝で分解されることが示唆された。また、実際のOBにおいても、フッ化物は糖代謝(エノラーゼ阻害及び乳酸産生抑制)に影響することが観察され、さらに他の代謝反応にも影響することが示唆された。一方、キシリトールは、洗口後にキシリトール5リン酸の蓄積が見られたが、OB内の糖代謝はほとんど抑制しないことが示唆された。昨年度までに、実際のin vivoでの口腔バイオフィルムの代謝について、糖だけではなく、アミノ酸がなんらかのエネルギー源として活用されていることを明らかにしてきたが、本年度はさらにその点について追及し、より詳細なアミノ酸の代謝動態について検討した。口腔バイオフィルム中に存在するアミノ酸としては、グルタミン酸が最も多く、バリンやアスバラギン酸などが続いた。一方、検出された各種アミノ酸を、口腔バイオフィルムに添加したときのアンモニア産生量を測定したところ、グルタミンからが最も多く、アスパラギン、アルギニンと続き、これまでアルギニンが注目されることが多かったのに対し、グルタミンやアスパラギンもよく利用されることが示唆された。また、アンモニアの産生と共にグルタミンからグルタミン酸、グルタミン酸から2-オキソグルタル酸、システインからセリン、セリンからピルビン酸、アスパラギン酸からフマル酸、アルギニンからシトルリンやオルニチンと、各アミノ酸の代謝により、特徴的な物質の産生が観察され、各種アミノ酸が、口腔バイオフィルム中でそれぞれ特徴的な代謝によって分解・利用されていることが明らかとなった。口腔バイオフィルム内で機能している代謝経路、代謝酵素をより広範に検索・推定していくために、検出対象となる物質をより広げていくことが必要であり、各物質の標準試薬を用いて、必要なライブラリーデータ(各物質のCEによる検出時間並びにTOFMSによる精密質量(m/Z)を入力したデータベース)の整備も、順次進めているところである。得られたデータを基に、口腔バイオフィルムの代謝メカニズムの解明に引き続き取り組みたいと考えている。尚、以上の研究結果の一部を学術大会にて公表した。(国際歯科研究学会:IADR、歯科基礎医学会、日本歯科医学会総会など)Sorbitol(Sor)は、Xylitol(Xyl)と同じ糖アルコールであるが、一部の口腔細菌は代謝可能で酸が産生される。しかし、代謝速度が遅く、単菌での研究結果では嫌気的条件下での乳酸産生が少ないため、う蝕誘発性は低いと考えられてきた。そこでin vivoのヒトプラーク(HP)のSor代謝について、メタボロミクス的に比較検討した。被験者6名より、glucose(Glu)溶液、Sor溶液、Glu+Sor溶液及びXyl溶液の洗口前後でHPを採取し、糖代謝経路(解糖系、リン酸五炭糖回路、TCA回路)の代謝中間体・代謝産物、各種アミノ酸等を対象とし、CE-TOFMSによるメタボローム解析を行った。Sor洗口では、Sor6リン酸、各種糖代謝関連中間体が確認され、HPがSorを代謝することが示された。しかし、乳酸はごく僅かで、解糖系・リン酸五炭糖回路関連中間体はglu洗口時と比べ少なかった。一方、acetylCoAの検出量が比較的高く、pyruvateから乳酸への代謝ではなくacetylCoAを経由した代謝が主に行われている可能性が示唆された。さらに、ほとんどのアミノ酸はGlu洗口時に減少したのに対し、Sor洗口時には逆に増加する傾向を示したことから、解糖系は機能しても、gluのようにアミノ酸代謝は行われていないことが示唆された。一方、Xylでは解糖系がほとんど機能しないのに対し、アミノ酸はGlu同様の減少傾向が見られたことから、同じ糖アルコールでも傾向が異なった。これまで、糖やアミノ酸などの溶液を用いた洗口前後に微量(10mg程度)の口腔バイオフィルムを採取し、その代謝中間体および代謝産物の測定をCE-TOFMSを用いて試みた。すでに確立した一部の糖代謝関連代謝産物に加え、23年度はアミノ酸およびその代謝に関わる物質を中心にその代謝分析を試みたところ、口腔バイオフィルムに含まれる各アミノ酸および分解産物であるアンモニアなどの代謝産物量の変動が観察された。口腔バイオフィルム内で、糖だけでなくアミノ酸が何らかのエネルギー源として活用されていることが、改めて示唆された。

また、この代謝分析の際に検出対象となる各物質の同定・定量のため、それらの物質の標準試薬を用いて、必要なライブラリーデータ(各物質のCEによる検出時間ならびにTOFMSによる精密質量(m/Z)を入力したデータベース)の整備も、順次進めているところである。現在は引き続き口腔バイオフィルムに含まれるアミノ酸の代謝に関する分析を現在行っているが、今後はそれらの知見をもとに、口腔バイオフィルム内で機能している代謝経路・代謝酵素を検索・推定し、口腔バイオフィルムのアミノ酸代謝メカニズムの解明に引き続き取組みたいと考えている。なお、以上の研究成果の一部を、学術学会に公表予定である(2012年6月国際歯科研究学会:IADR)。唾液や食物由来の硝酸塩が口腔内細菌により還元され亜硝酸塩となり、Streptococcus mutans (Sm)やヒトプラークの酸産生を抑制することが報告されてきた。しかし、その抑制機構は不明であった。そこで本研究で我々が確立した細菌メタボローム解析法を用いて、プラークの酸産生に対する亜硝酸の抑制機構についても検討した。本実験は安全性の観点から、まずは培養したStreptococcus mutansを用いて、in vitroでの検証を行った。菌懸濁液を調整後、10 mM glucose及び10 mM亜硝酸カリウムを添加し、10分間37°Cでインキュベートし、最終pHを測定した。またインキュベート前後の菌体内及び上清成分を通法に従って抽出し、糖代謝経路(解糖系、リン酸五炭糖経路、クエン酸回路)の代謝中間体・代謝産物及びアミノ酸を主対象として、CE-TOFMSによるメタボローム解析を行った。その結果、亜硝酸塩の添加により、10分間のpH低下が有意に抑制され、乳酸産生量も約30%減少した。また、解糖系中間体では、グルコース6リン酸の蓄積、ホスホエノールピルビン酸と3-ホスホグリセリン酸の減少が観察され、糖は取込まれるが、複数の解糖系酵素の阻害により、酸産生が抑制されることが示唆された。また、リン酸五炭糖経路の一部の代謝中間体の増加やアセチルCoAの顕著な減少、各種アミノ酸の増減なども観察され、食物由来の亜硝酸がプラーク内細菌の代謝に様々な形で影響している可能性が示唆された。口腔生化学、予防歯科学研究実績欄に記載した通り、おおむね順調に進んでいると判断し、この区分といたしました。研究室の入っている建物の改修に伴い、数か月間の実験中断を余儀なくされたため。また、改修中は実験設備に一部制限があるため。途中測定機器の不具合などにより、一部遅れている部分があるが、研究実績欄に記載したとおり、おおむね順調に進展しているため、この区分とした。24年度に引き続き、1.微量の口腔バイオフィルムサンプルからのCE-TOFMSによるメタボローム解析技術の高度化、2.得られたデータの解析および口腔バイオフィルム内の代謝経路・代謝酵素の検索・推定のシステム化を進めていく予定である。特に25年度は、すでに先行して進めつつあるキシリトール・ソルビトールなどの代用糖やフッ化物などの薬物による代謝への影響の検討などを、in vivoの口腔バイオフィルムで検証していくほか、口腔内の代表的な細菌を用いた、培養単菌を用いても同様の検討も行っていきたい。さらに、昨年までに明らかにした口腔バイオフィルム内のアミノ酸代謝については、逆にin vivoでの検証及び代謝経路や代謝酵素も含めて詳細に検討し、その代謝メカニズムの全容解明を目指してきたいと考えている。
ソ連邦および連邦構成共和国の経済的連関にかんする基礎的研究

この間、8月「ク-デタ」事件ののちエリツィン=ロシヤの「逆ク-デタ」を経て12月ソ連邦そのものが崩壊するに至った。したがった、統計資料の収集など、当初の研究計画どおりには運ばなかった部分もあるが、概要次の如き研究実績を得ることができた。ー1)ソ連邦全体についてのマクロ的経済指標を、それが崩壊に至るまでの期間につき累四半期・累月ごとに収集し整理した。ロシアおよびラトビア両共和国の物価=貨銀水準にかかわる統計資料を収集し、その一部について比較検討した。2)旧ソ連・ロシヤ共和国・ラトビア共和国の「経済改革」に関する諸法規を収集し、相互に比較可能な形に整理して、税制・企業形態などその一部について一定の分析を試みた。3)バルト諸国の「経済自立構想」の出発点ないし中心がエストニアのそれにあることを突きとめ、エストニア構想の基本文献を収集した。4)旧ソ連邦全体と各構成共和国との経済連関を示す統計数値を集積し一部整理した。(上記の各種統計資料を含めて、さらに補助収集と整理をすゝめ、統一的なデ-タ処理が可能な形にすべく準備中である。)以上の、資料収集と整理およびその一部分析などをふまえ、これまでソ連邦に形成されてきた経済連関は、考えられた以上に極度の分業と専門化に基づくもので、構成共和国の経済発展を促す面を有すると同時に各国独自の経済構造を破壊する作用をもたらしたといえる。ソ連邦が崩壊した現在、それぞれの自立経済を求め構造的再編が必要となっているが、これまでの歴史的な構成ならびに現在の世界的生産力水準に照らしてみても、旧ソ連構成共和国間の経済的連関を完全に解体することは不可能で、この関連を土台とした再編成が行われざるをえないものと考えられる。
アジア長期経済統計の収集・推計とこれにもとづく比較アジア経済発展論の研究

平成8年度に収集・推計した東アジア各国の長期経済統計の項目は以下の通りである。人口(規模、密度、年齢、地域構成、出生・死亡率)第一次産業(生産、消費、投入、要素価格、交易条件、生産性、農地規模構成)第二次産業(生産、消費、投入、要素価格、生産性、企業規模構成、産業立地)第三次産業(生産、消費、投入、要素価格、生産性、企業規模構成)労働(規模、配分、参加率、移動、失業率)貿易(国際収支、規模、市場、輸出入価格、為替、交易条件)財政(歳出入構造、収支、税収構造)金融(金融構造、金利)海外直接投資、援助価格(卸売、小売物価)、分配(所得)技術(R&D、教育、産業別R&D)その他(運輸、通信、環境、観光)以上の収集・推計された整合的な統計を用いて、東アジア各国、すなわちNIEs(韓国、台湾、香港、シンガポール)、ASIAN諸国(タイ、マレーシア、インドネシア、フィリピン、ベトナム)、中国(ならびに中国30の一級行政単位)について以下の項目について、各国・地域の長期経済発展の特徴的パターンの析出につとめた。
生体内部位特異的マルチ遺伝子サイレンシング法の開発と概日時計分子基盤の解明

これまでに、概日リズム制御機構に関与すると考えられる複数の遺伝子候補の機能を生体内で明らかにするために、レンチウイルスベクターを用いてshRNAを発現させたノックダウンマウスの作製してきた。本研究では、この手法をさらに発展させ、複数の遺伝子を同時にノックダウンするマウスの作製を試みた。その結果、2種の遺伝子のshRNAを同時に発現するマウスの作製に成功した。一方、ノックダウン効率や世代間のノックダウン効果に著名な個体差を認めたため、日米欧でバンク化の進むノックアウトマウスを用いて、複数遺伝子ノックアウトマウス、あるいは、マウスの一部で観察された胎生致死を回避するべく細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスを作製することにした。その結果、注目された複数の遺伝子のノックアウト個体で行動リズムに異常を認め、新たな概日リズム制御の分子メカニズムの一端が明らかになった。これまで、概日時計関連の単一遺伝子ノックダウン(KD)マウスや過剰発現マウスの解析を行ってきた。しかし、一部のマウスでは、特に異常を認めないものもあり、その中には、同一組織で複数のファミリー遺伝子が発現しているものがあった。そこで、複数の遺伝子を生体内で同時に操作するために、レンチウイルスを用いてマルチ遺伝子KDマウスの作製を試みた。各遺伝子のshRNAを発現する2種のウイルスを同時に受精卵に感染したところ、両遺伝子が安定的に組み込まれたマウスを得た。しかし、両遺伝子の発現量の制御は困難であり、個体差も大きかった。そこで我々は、現在世界的なバンク化が進められているノックアウト(KO)マウス、特に時期、組織特異的に発現を制御可能なコンディショナルノックアウト(cKO)マウスに注目した。我々はまず、概日時計に必須であるBmall遺伝子のfloxマウスと、神経と同様に概日時計機構の中心的役割を担う可能性があるアストロサイトで特異的に相同組み換えを起こすGFAP-Creマウスを入手し、それらの交配により、アストロサイト特異的に時計遺伝子をKOしたマウスの作製に成功した。これは、概日時計中枢(視交叉上核)で、神経の概日時計は正常であるが、アストロサイトでは時計が機能しないマウスである。このマウスの行動リズムをはじめとした概日リズムの解析を行うことにより、体内時計におけるアストロサイトの機能がin vivoで証明できる可能性がある。このようなcKOマウスは、材料である2種のマウスが容易に入手可能になった今日では有効な手段である。また、我々がこれまで作製してきたマウスでは致死であったマウスでも、KOされる組織を限局することにより、解析が可能となると考えられる。更に、所期の目的である複数遺伝子のマルチサイレンシングには、2種のfloxマウスと1種のCreマウスとの交配で可能である。すでに報口したように、我々はレンチウイルスベクターを導入したノックダウンマウスを数作することに成功し、その成果の一部を今年度論文化した。当初の計画では、更に複数遺伝子を同時ノックダウンしたマウスを作成する計画で研究を進めてきたが、ノックダウン効率や世代を経たノックダウンマウスの維持等に問題を生じたため、ダブルノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスの作成により、計画していた研究を実施することにした。我々はまず、概日時計に必須であるBmal1遺伝子のfloxマウスと、神経と同様に概日時計機構の中心的役割を担う可能性があるアストロサイトで特異的に相同組み換えを起こすGFAP-Creマウスの交配により、アストロサイト特異的に時計遺伝子をKOしたマウス、即ち神経の概日時計は正常であるが、アストロサイトでは時計が機能しないマウスを作製した。このマウスの行動リズムを解析したところ、リズムの異常を見出した。このことから、体内時計において、神経以外に、アストロサイトの異常が示唆された。現在マウスからアストトサイトを採取して、in vitroでアストロサイトの時計関与に関してその分子メカニズムを明らかにするために解析を行っている。続いて、体内時計による行動や代謝を制御する新たな遺伝子候補として、SIK遺伝子ファミリーに注目した。このリン酸化酵素は、その機能がよく分かっていないが、脳内の体内時計中枢や肝臓などで24時間周期で発現が変動しており、体内時計との関連が注目された。そこで、SIK遺伝子のノックアウトマウスを用いて、活動リズム、代謝リズムその他の解析を行った結果、マウスにおいて、活動リズムに異常を見出すと共に、代謝の劇的な異常を観察した。更に、、SIKによるリン酸化の異常が,時計遺伝子の発現リズム異常と相関していることも見出した。来年度は、SIKのリン酸化標的を特定し、リズム異常に繋がる分子機構の解明を目指す。我々はレンチウイルスベクターを導入したノックダウンマウスを複数作成し、その成果の一部を論文化した(2011)。

当初は、複数遺伝子を同時ノックダウンしたマウスを作成する計画で研究を進めてきたが、ノックダウン効率や世代を経たノックダウンマウスの維持等に問題を生じたため、ダブルノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスの作成により、計画していた研究を実施することにした。我々はまず、概日時計に必須であるBmal1遺伝子のfloxマウスと、神経と同様に概日時計機構の中心的役割を担う可能性があるアストロサイトで特異的に相同組み換えを起こすGFAP-Creマウスの交配により、アストロサイト特異的に時計遺伝子をKOしたマウス、即ち神経の概日時計は正常であるが、アストロサイトでは時計が機能しないマウスを作製した。このマウスの行動リズムを解析したところ、リズム周期や光同調機構の異常を見出した。このことから、体内時計におけるアストロサイトの関与が示唆された。この成果は現在論文を投稿中であり、この成果を基に新たに提案したアストロサイとリズムに関する研究提案が今年度のJSTさきがけに採択された。続いて、体内時計による行動や代謝を制御する新たな遺伝子候補として、SIK遺伝子ファミリーに注目した。このリン酸化酵素は機能がよく分かっていないが、脳内の体内時計中枢や肝臓などで24時間周期で発現が変動しており、体内時計との関連が注目された。そこで、SIK遺伝子のノックアウトマウスを用いて、活動リズム、代謝リズムその他の解析を行った結果、マウスにおいて、活動や呼吸商のリズムに異常を見出すと共に、代謝の劇的な異常を観察した。更に、SIKによるリン酸化の異常が,時計遺伝子の発現リズム異常と相関していることも見出した。以上の成果を、2011年の解剖・生理学会合同シンポで発表し、また、2012年は、国際学会(SRBR)、神経科学学会等での発表、並びに、論文投稿を予定している。
耕作放棄地の畜産的利用と絶対地代形成に関する実証的研究

本研究では、第1に耕作放棄地を畜産農家が飼料生産基盤として活用しうる条件、及びその方法を明らかにするとともに、第2に耕作放棄地に形成される借地料、すなわち耕作限界地における純対地代(所有地代)形成の実証的研究を行なうことを目的とした。研究の結果は以下のように要約できる。耕作放棄地を採草地として利用するためには、機械の効率的利用を可能にする農地のまとまり(団地化)や傾斜が強くないこと(15度以下)、自宅から農地までの距確が近いこと(3km以内)、圃場に入るまでの道路条件(軽トラックやトラクターが入るような道幅)が必要となる。酪農家の場合、採草利用が中心となるため、そのような条件整備が必要になるが、肉用繁殖牛農家の場合には放牧利用が適し、放牧地としての一定のまとまり(団地化)のみが必須条件となり、他の土地条件は緩和される。耕種農家の耕作放棄地を畜産農家が借りる場合、そこには一定の借地料が形成される。一般には(全国平均)、10a当たりの借地料水準は採草放牧地が5千円、畑が9千円、田が1万6千円である。そのような絶対地代の形成に関する研究では、現在通説となっているマルクスの絶対地代論の成立条件を中心に検討し、「農産物の生産価格を超える価値との差領」という成立条件の不必要性を論証した。ただ残る「土地所有の独占」という成立条件のみが必須条件であることを明らかにし、新しい絶対地代(所有地代)の構築を行なった。今年度は調査研究の初年度であるため、テーマに関連した既存の統計資料の整理と、耕作放棄地の畜産的利用を行っている事例を取り上げて予備調査を行った。耕作放棄地及び不作付地は、全国で33万ha(平成7年)あり、経営耕地の約8%を占める。耕作放棄地の発生割合は中間・山間農業地域で多く、不作付地は都市的地域や平地農業地域がやや多い。全国農業会議所が平成9年度に実施した「畜産農家における土地集積の実態・意向調査」(1,402戸のアンケート結果)によると、耕作放棄地を含めた遊休農地の畜産的利用(自給飼料作)について、前向きの回答を示した畜産農家は約60%であるが、それには地域差がみられ、もっとも積極的な意向を示した地域は熊本県であり(約80%)、もっとも消極的な意向を示したのは岐阜県であった(約48%)。事例調査は岐阜県益田郡馬瀬村で行った。肉用繁殖牛飼養農家が周辺の農家の耕作放棄地を個人交渉で集め(1haは交換分合により集積し、牧草地として利用。2haは借地し、放牧場として利用)、畜産的利用を図っている。借地料金は1戸当たり酒一升程度という。一般には(全国平均)10a当たりの借地料は採草放牧地が約5千円、畑が9千円、田が1万6千円である。そのことから、馬瀬村の耕作放棄地は限界地に近い借地料金といえよう。来年度はそのような事例を対象に本調査を行なう。本年度は、(1)遊休農地の実態、(2)その畜産的利用(採草や放牧)の条件、(3)遊休農地の畜産的利用を促進する方法を明らかにすることを目的として、統計資料や既存の文献を収集・分析するとともに実態調査を行なった。その結果は、以下のように要約できる。(1)遊休農地(不作付地や耕作放棄地)は1985年を境に減少から増加に転じている。とくに耕作放棄地の増加が著しい。耕作放棄地は中山間農業地域に多い。その理由として、高齢化がより進んでいること、及び土地条件が悪いことがあげられる。(2)遊休農地の畜産的利用とその条件についていえば、大別すると土地条件と経済的条件がある。

前者の土地条件についていえば、採草地として利用するためには、機械の効率的利用を可能な遊休農地のまとまり(団地化)や傾斜が強くないこと(機械作業のためには15度以下)、遊休農地までの距離が近いこと(自宅から3km以内)、圃場に入るまでの道路条件(軽トラックやトラクターが入るような道幅)が必要となる。最後に、(3)の遊休農地の畜産的利用を促進する方法についていえば、酪農家の場合、採草地利用が中心となるため、(2)で述べたような土地条件(団地化や道路条件)の整備や経済的な援助(土地改良投資や飼料生産用機械投資に対する政策的援助)が必要である。肉用繁殖牛農家の場合は、中山間地域など土地条件の厳しいところに多く立地していることと、経営主の高齢化が進み、後継者もあまりみられないことから、遊休農地の採草利用よりも放牧利用が適している。本年度は、絶対地代形成に関する理論的研究を行った。すなわち、現在、通説となっているマルクスの絶対地代論の中に問題が残されているため、その検討を行い、新しい絶対地代論の構築(所有地代の形成)を行った。その結果は、以下の3点に要約される。第1点は、従来の(マルクスの)絶対地代論の欠陥を明らかにした。すなわち、その欠陥とは、絶対地代の概念の中に「農産物の生産価格を超える価値との差額」ということを取り入れたことである。それは「農業資本の有機的構成の低位性」という条件から導き出されている。しかし、「農業資本の回転期間の長期性」という条件を考慮に入れるとき、「農産物の生産価格を超える価値との差額」は必ずしも存在するとはいえない。したがって、従来の絶対地代の概念の中からその点を除去すると、ただ、「土地所有の独占が産む地代」ということのみが残る。それは「新しい絶対地代」である。第2点は、新しい絶対地代を「所有地代」と呼び、その地代範疇を確立した。すなわち、所有地代とは「土地所有の独占が産む地代」であり、その成立条件はただ「土地所有の独占」のみである。その地代の量的規定は「(調整的)市場価格-生産価格」である。第3点は、所有地代の価値実現過程について明らかにした。農産物の価値の範囲内で所有地代が実現される場合には、とくに問題はない。問題は農産物の価値を超えて実現される場合である。その場合、総資本の平均利潤部分を低めることによって、社会全体(全産業部門)の剰余価値の一部分が、所有地代として農業部門へもたらされることを明らかにした。
6自由度空間高精度ハイブリッドマニピュレータに関する機構学的研究

本研究は, 3自由度回転機構と3自由度並進機構からなる6自由度空間ハイブリッドマニピュレータを対象として,高精度運動を実現するための誤差鈍感化設計の指針を具体的に示すことを目的として機構学的研究を行った.3自由度回転機構について,機構パラメータ誤差による出力リンクの回転中心位置誤差に着目した誤差鈍感化設計法を開発し,これにより大作業領域を実現する機構の開発に成功した.また,3自由度並進機構については,機構パラメータ誤差によって生じる出力姿勢角誤差の有用な評価方法および特異点に着目した実用作業領域に基づく最適設計法を開発することができた.本研究は, 3自由度回転機構と3自由度並進機構からなる6自由度空間ハイブリッドマニピュレータを対象として,高精度運動を実現するための誤差鈍感化設計の指針を具体的に示すことを目的として機構学的研究を行った.3自由度回転機構について,機構パラメータ誤差による出力リンクの回転中心位置誤差に着目した誤差鈍感化設計法を開発し,これにより大作業領域を実現する機構の開発に成功した.また,3自由度並進機構については,機構パラメータ誤差によって生じる出力姿勢角誤差の有用な評価方法および特異点に着目した実用作業領域に基づく最適設計法を開発することができた.本研究は,出力リンクが姿勢変化を伴うことなく3次元空間内で並進運動を行う3自由度空間機構(並進機構)と,出力リンク上の特定の点の位置が変化することなく出力リンクがその点(回転中心)のまわりに任意の回転運動を行う3自由度空間機構(回転機構)とからなる6自由度空間ハイブリッドマニピュレータを対象として,高精度運動を実現するための誤差鈍感化設計の指針を具体的に示すことを目的としている.まず,並進機構および回転機構について,具体的に5つの回転対偶からなる連鎖を3つ有する機構をそれぞれ取り上げ,機構の設計変数を種々に変え作業領域内の特異点の分布を求め,機構の設計変数と特異点を考慮した実用作業領域の関係を明らかにし,実用作業領域が大きな機構の寸法を明らかにした.同時に,作業領域内の各点における特異点判定特性値から特異点を含まない領域の大きさを計算する手法を開発した.次に,回転機構について,機構内の寸法誤差による出力リンクの回転中心の位置誤差および姿勢誤差を解析する手法を開発するとともに,それに基づいて回転中心の位置誤差を最小とする機構の設計法を開発し,具体的に最適な機構の寸法を明らかにした.以上の結果に基づいて,並進機構および回転機構を設計・試作して駆動実験を行い,試作機が所期の作業領域を有することを確認するとともに,特異点における挙動を確認した.さらに,種々の位置・姿勢における位置・姿勢誤差を測定して理論値との比較を行い,高精度化への指針について検討を加えた.本研究は,出力リンクが姿勢変化を伴うことなく3次元空間内で並進運動を行う3自由度空間機構(並進機構)と,出力リンク上の特定の点の位置が変化することなく出力リンクがその点(回転中心)のまわりに任意の回転運動を行う3自由度空間機構(回転機構)とからなる6自由度空間ハイブリッドマニピュレータを対象として,高精度運動を実現するための誤差鈍感化設計の指針を具体的に示すことを目的としている.まず並進機構について,昨年度試作した機構とは異なる形式の機構を取り上げて,実用作業領域に基づく最適設計,試作および駆動実験を行い,変位に伴う出力姿勢角誤差を実測した.また,機構パラメータ誤差によって生じる出力姿勢角誤差の評価指標として,機構を構成する各連結連鎖によって加えられる拘束を表す行列に基づく評価指数を提案した.そして,実験により得られた出力姿勢角誤差の大きさが提案評価指数と強い相関があることを見出し,誤差鈍感化設計の指標として有用な指数を開発することができた.次に,回転機構について,設計作業領域(各軸まわりの姿勢角)と出力リンクの回転中心の位置およびその誤差を考慮した最適設計を行うとともに,試作機を製作した.そして,本試作機が非常に大きな姿勢角を全域で実現できることを実験により明らかにした.以上により,ハイブリッドマニピュレータを構成する並進機構および回転機構の作業領域および精度に着目した機構学的設計が可能となった.
Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ　ｈｅｎｓｅｌａｅを用いた重症虚血肢に対する治療法の確立

本実験には長期生存する重症虚血肢モデルが必須でありラットを使用し虚血肢モデル作成を試みた。大腿動脈を一定時間遮断し再灌流とする虚血にて下肢虚血モデルの作成を試みた。結果としてラットモデルはそのまま死亡するか、生存するものの後日犠死させ下肢の病理組織を観察すると組織障害はほとんど認められず回復しているかのどちらかであり重症虚血肢モデルの作成が不可能であった。本実験期間内に成果を上げることが不可能であった。本症例は、未だ確実な治療方法が確立していない予後不良な難治性の重症虚血肢に対し、血管新生作用を持つバルトネラ菌を用いることで感染症を用いた血管新生により重症虚血肢の治療法を確立することが目的である。昨年度は、本実験に必要な重症虚血肢の作成を試みた。家兎での実験の前にまずはラットモデルを使用し再現性にある下肢虚血モデルの作成を行った。犠死後の下肢血管を病理組織学的に診断し壊死組織と毛細血管レベルで血管消失を確認した。本年度は家兎を使用し同様のモデル作成を試みたが虚血作成時に死に至るモデルが多く再現性のあるモデル作成に苦慮している状態である。次年度はこの点を解明し再現性のモデルを作成しこれにBartonella henselaeを筋肉内投与し感染させ、下肢動脈造影および経皮酸素分圧(tcpO2)測定にて虚血改善を検証し、同時に病理学的に血管新生をみとめるか検証する予定である。本症例は、未だ確実な治療方法は確立していない予後不良な難治性の重症虚血肢に対し、血管新生作用を持つバルトネラ菌を用いることで感染症を用いた血管新生により重症虚血肢の治療法を確立することが目的である。本年度は、本実験にとって重要な虚血肢モデルの作成を試みた。家兎での実験の前に、まずはラット12週モデルを使用し下肢虚血モデル作成を行い、犠死後の下肢血管を病理組織学的に診断し壊死組織と毛細血管レベルの血管の消失を確認した。次年度は、家兎を使用し同様に下肢虚血モデルを作成し、これにBartonella henselaeを筋肉内投与し感染させ、下肢動脈造影および経皮酸素分圧(tcpO2)測定にて虚血改善を検証し、同時に病理組織学的に血管新生を認めるか検証する予定である。本症例は未だ確実な治療方法が確立していない予後不良な難治性重症虚血肢に対し、血管新生作用をもつバルトネラ菌を用いることで感染症を用いた血管新生により重症虚血肢の治療法を確立することが目的である。本実験には長期生存する重症虚血肢モデルが必須であるが以前、家兎を使用した研究(Local treatment of Dacron patch graft infected with biofilm-producing Staphylococcus epidermidis using antibiotic-releasing porous apatite ceramic: an experimental study in the rabbit . Shimabukuro K et,al. J Vasc Surg. 2004 Jun;39(6):1361)の際に施行したパイロットスタディーにて文献に準じた家兎の大腿動脈結紮による重症虚血肢モデル作成を試みたがモデルはすべて作成直後に死亡したため長期生存する重症虚血肢モデルの作成が不可能であった。そのため比較的実験規模として扱いやすいラットを使用し虚血肢モデル作成を試みた。ラットの大腿動脈を単純に結紮下のみのモデルではすべてのモデルが死亡した。このため大腿動脈を一定時間遮断し再灌流とする虚血にて下肢虚血モデルの作成を試みた。結果としてラットモデルはそのまま死亡するか、生存するものの後日犠死させ下肢の病理組織を観察すると組織障害はほとんど認められず回復しているかのどちらかであった。さまざまな遮断時間(30、60、90、120、150、180、210、240、270、300分)を試みて虚血肢モデルの作成を試みたが結果としては同様の結果しか得られず本実験に必要な下肢虚血を来すモデルの作成は不可能であった。そのため期限内において再現性のある下肢虚血モデルの作成が不可能でありBartonella henselaeの筋肉内投与感染モデル作成まで至ることができなかった。心臓血管外科学ラットで確認できた虚血肢モデルを今年度は家兎を使用し同様のモデル作成を試みたが虚血作成時に死に至るモデルが多く再現性のあるモデル作成が進んでいない状態である。場合によりラットモデルで本実験を進めることも視野に入れ、現在今後の実験方針について検討中である。本年度においては、Bartonella henselaeを培養することと、家兎の下肢虚血モデルにおいてコントロール群、感染群を作成し、下肢動脈造影および経皮酸素分圧(tcpO2)測定にて虚血の変化を評価する予定であった。しかしながら、動物実験に慣れていないことよりまずはラット12週モデルを使用し下肢虚血モデル作成を行い犠死後の下肢血管を病理組織学的に診断し壊死組織の確認を行ったのみであった。

ラットにて虚血肢モデルの作成は十分に再現可能であることが確認できたことより次年度は早い段階で家兎での下肢虚血モデルを作成し、コントロール群、感染群を作成する予定である。まずは当初計画の遅れを取り戻す必要があり、臨床活動を抑え研究活動に時間を割く予定である。一方で、今年度は関連学会の参加で重症虚血肢に対する知識をさらに得ることができたため今後の研究に大きく役立つものと考える。ラットモデルの作成は可能であり、モデルの変更で本実験を進めることを検討している。今後は当初の計画の遅れを取り戻す必要があり、臨床活動を抑え研究活動に時間を割く予定である。一方で、今年度は関連学会の参加し、重症虚血肢に対する知識を得ることができたため、今後の研究に大きく役立つものと考える。当初は、下肢動脈造影および経皮酸素分圧(tcpO2)測定にて側副血行路および下肢虚血変化を評価する予定であったが、病理による血管新生の評価を行うことでさらに客観的評価が可能になると考えられる。本実験の遅れからまずは実験モデル作成が先決と考え予定物品の購入は見送り次年度早期の購入予定とした。経皮酸素ガス分圧測定装置は他科の実験器具として用意されたため、次年度の研究費使用は動物、検査物品および実験方法のさらなる検討のため関連学会への参加、成果発表に使用する予定である。今年度は当初の計画が遅れマウスのみの試験的な実験を行ったため、検査項目や測定項目が当初の予定より簡便となり、次年度に繰越金が発生した。次年度の研究費の使用としては、側副血行路の評価や病理組織学的評価を行うための物品購入及び研究実験方法の更なる検討のため関連学会への参加、外国語論文の校閲、成果発表としての論文投稿および国際学会での成果発表などに使用する予定である。
三次元CT画像を用いた多様な肺疾患対応の統合型コンピュータ支援診断システムの開発

本研究の目的は,多様な肺疾患を対象として多列検出器型CT(MDCT)装置から得られる高精細な三次元画像データを利用した従来手法と比較して精度が高くロバストなコンピュータ支援診断(CAD)システムの開発をおこなうことである.このためには最近の人工知能研究で注目されているディープラーニング技術を用いてCADシステムの構築をおこなう.アルゴリズムの開発や評価のために,教師なし学習と半教師あり学習を用いた大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを整備する.さらに,実際の臨床現場での医師の容易な操作を想定してグラフィカル・ユーザインターフェースベースの肺疾患統合CADシステムを構築して臨床評価をおこない,アルゴリズム開発へフィードバックさせてシステムの性能向上をはかることを目的としている.本研究においては,ディープラーニングを用いるために大規模な画像症例データベースとそれに対するラベル付け作業が必要である.画像症例の収集に関しては複数の大学からの症例の収集をおこない,またラベル付けに関しては複数の放射線科医によるラベル付け作業をおこなっているが,教師無し学習や半教師あり学習によるラベル付け作業の自動化にも取り組んでいる.アルゴリズムの開発として,画像分類に関してはConvolutional Neural Network(CNN)に加えてNeuralNetwork Convolution(NNC)による評価をおこなった.さらに画像分類だけでなくConv-deconv net,Fully-convolutional network (FCN),U-net, N-Netを用いてびまん性肺疾患や肺結節の領域抽出をおこなった.またGenerative Adversarial Network (GAN)を用いたびまん性肺疾患や肺結節に対する水増しをおこなった.また, residual unitを用いて深い層における学習の問題を改善したResidual U-Netも用いた.われわれが対象とした陰影は浸潤影,すりガラス陰影,蜂巣肺,肺気腫,粒状影の5つの陰影と正常肺である.結果は放射線科医のアノテーションと良く一致しており,すべての陰影でのDice係数の平均はU-Netの場合0.848±0.071,Residual U-Netの場合0.872±0.053と良好な一致率がえられた.ディープラーニングにおいては,数万の学習データが必要となる場合もあり大変な労力が必要となる.このために正解ラベルをつける作業の必要のない教師なし学習とよばれる手法が提案されている.教師なし学習は教師あり学習に比べてより多くの計算機資源が必要となるが,コンピュータが自ら診断基準を設けて診断するため,現在の教師あり学習による機械学習より一歩進んでいる.高分解能CT(HRCT)画像のびまん性肺疾患陰影に対して,教師なし学習を用いて正常を含む6パターンに分類したわれわれの結果は72.8%であった.われわれは三次元画像を対象としてDeconvNetとV-Netを用いた肺結節の領域抽出をおこなった.学習用画像としては放射線科医の指導のもとにアノテーションされて画像を用い,入力としては肺結節を中心として128×128×64画素に切り出されたものを用いた.DeconvNetとV-Netの抽出結果は放射線科医によるアノテーションとよく一致し,Dice係数ではそれぞれ0.740±0.012,0.810±0.016であった.以上のとおり,現在までの達成度はおおむね順調に進展している.これからの研究の推進方策としては,まず今までのびまん性肺疾患や肺結節に対する抽出や分類の精度向上があげられるそのためには,大量のアノテーション画像が必要であり,放射線科医の作業負担を軽減するための手法の改良を試みる.その手法のひとつは教師無し学習と呼ばれる手法であり,コンピュータ自らが診断基準を定めて画像にラベル付けをすることが可能である.またこの手法の欠点を克服した半教師あり学習が提案されている.われわれはこのような教師なし学習と半教師あり学習を用いて大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを構築する.またGenerative Adversarial Network (GAN)を用いたびまん性肺疾患や肺結節に対する水増し手法を改良し大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを構築する.このようにして構築されたデータベースを用いて多様な肺疾患に対する支援診断を一元的に取り扱うために,われわれが既に着手している陰影パターン分類や類似画像検索を基盤としたコンピュータ支援診断技術にディープラーニングを適用する.これにより多様な肺疾患に対する診断精度をあげることができるだけではなく,医師が想定していなかった症例提示が可能になると期待される.また実際の臨床現場での医師の容易な操作を想定した肺疾患統合診断支援システムを構築して臨床評価をおこない,アルゴリズム開発へフィードバックさせて性能向上をはかる.本研究の目的は,多様な肺疾患を対象として多列検出器型CT(MDCT)装置から得られる高精細な三次元画像データを利用した従来手法と比較して精度が高くロバストなコンピュータ支援診断(Computer-aided Diagnosis: CAD)システムの開発をおこなうことである.このためには最近の人工知能研究で注目されているディープラーニング技術を用いてCADシステムの構築をおこなう.アルゴリズムの開発や評価のために,教師なし学習と半教師あり学習を用いた大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを整備する.さらに,実際の臨床現場での医師の容易な操作を想定してグラフィカル・ユーザインターフェースベースの肺疾患統合CADシステムを構築して臨床評価をおこない,アルゴリズム開発へフィードバックさせてシステムの性能向上をはかることを目的としている.本研究においては,ディープラーニングを用いるために大規模な画像症例データベースとそれに対するラベル付け作業が必要である.画像症例の収集に関しては複数の大学からの症例の収集をおこない,またラベル付けに関しては複数の放射線科医によるラベル付け作業をおこなっているが,教師無し学習や半教師あり学習によるラベル付け作業の自動化にも取り組んでいる.

アルゴリズムの開発として,画像分類に関してはConvolutional Neural Network(CNN)に加えてNeuralNetwork Convolution(NNC)による評価をおこなった.さらに画像分類だけでなくConv-deconv net,Fully-convolutional network (FCN)やU-netを用いてびまん性肺疾患や肺結節の領域抽出をおこなった.本研究においては,多様な肺疾患を含む大規模な高精細三次元CT画像症例が必要であるが,びまん性肺疾患に関しては,山口大学や大阪大学の大規模な症例を用いている.びまん性肺疾患画像を研究に用いるためには放射線科医によるラベル付け作業が必須であるが,それぞれ3人の放射線科医によるラベル付け作業をおこないデータベース化をおこなった.また肺結節に関しては名古屋大学の臨床症例を用いてデータベースを作成した.さらに肺結節に関しては米国のLIDCデータベースもデータとして追加した.機械学習においては一般に大量の正解ラベル付きの学習データが必要であり,医用画像の場合はこの作業を医師がおこなう必要がある.特にディープラーニングにおいては,数万の学習データが必要となる場合もあり大変な労力が必要となる.このために正解ラベルをつける作業の必要のない教師なし学習とよばれる手法が提案されている.教師なし学習は教師あり学習に比べてより多くの計算機資源が必要となるが,コンピュータが自ら診断基準を設けて診断するため,現在の教師あり学習による機械学習より一歩進んでいる.これらの手法を用いて大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを整備するために,高分解能CT(HRCT)画像のびまん性肺疾患陰影に対して,教師なし学習を用いて正常を含む6パターンに分類した.この結果72.8%とかなりよい結果が得られた.本研究の目的は,多様な肺疾患を対象として多列検出器型CT(MDCT)装置から得られる高精細な三次元画像データを利用した従来手法と比較して精度が高くロバストなコンピュータ支援診断(CAD)システムの開発をおこなうことである.このためには最近の人工知能研究で注目されているディープラーニング技術を用いてCADシステムの構築をおこなう.アルゴリズムの開発や評価のために,教師なし学習と半教師あり学習を用いた大規模な正解ラベル付きの画像症例データベースを整備する.
Er:YAGレーザー齲蝕治療歯に対する接着システムの開発

う蝕をエアタービン(ドリル)またはEr : YAGレーザーで最小限に除去し、コンポジットレジンを充填した場合において有意差は認められなかった。健康な歯をEr : YAGレーザーで削った場合、エアタービンに比べ接着力はかなり低下することから、う蝕を最小限に除去する場合においてはEr : YAGレーザー治療は有用である可能性が示唆された。また、Er : YAGレーザーを照射した歯の元素分析により結晶構造が変化していることが明らかとなった。平成19年度は基礎的な分析研究として、Er:YAGレーザー照射象牙質の元素解析・定量を行った。この実験により、Er:YAGレーザー照射象牙質は健全な象牙質に比べ、Ca,P,Nの結合エネルギーが有意に増加していること、元素の解析ピークが減少していることが明らかとなった。また、元素の定量結果より、Ca量が有意に低下していることが明らかとなった。その結果、Ca/P比が低下し、脱灰様の現症を示していることが認められた。現在、この研究結果は論文投稿中であり、学会でも発表予定である。さらに、Er:YAGレーザーを用いてう蝕細菌感染象牙質を除去し、コンポジットレジンを充填しコンポジットレジンの接着強度を測定した。Er:YAGレーザーで感桑歯質を除去し、う蝕影響象牙質を保存しコンポジットレジンを接着した場合の接着強度は、回転切削器具を用いて同様の処置をしたときと同じ程度の接着強度を示した。また、Er:YAGレーザーでう蝕を除去し、コンポジットレジンを充填した場合は、回転切削器具で除去した場合に比べ、比較的太く長いレジンタグが形成される傾向があった。しかしながら、う蝕影響象牙質に筆者が提唱しているグルタルアルデヒドによる前処理の効果は認められず、う蝕影響象牙質と健全象牙質に対するグルタルアルデヒドの影嘗は異なることが示唆された。この研究結果は第10回Er:YAGレーザー臨床研究記念大会で発表を行った。これらの結果を踏まえ、現在はEr:YAGレーザー照射象牙質に対するレジンモノマーの浸透性を検討を行っている。【平成20年度研究内容】本研究の目的はう蝕影響象象牙質に対するコンポジットレジンの接着性を明らかにすること、Er : YAGレーザーを照射したう蝕影響象牙質に対し有効な接着性示す象牙質システムを考案することおよびEr : YAGレーザー照射が象牙質に与える影響を分析することである。平成20年度はEr : YAGレーザーを照射したう蝕影響の接着強さと、う蝕の影響のない健全な象牙質との接着強さについて検討を行った。その結果、Er : YAGレーザーを照射した蝕影響象牙質は従来の回転切削器具と同等のコンポジットレジン接着強さを示すが、う蝕の影響のない健全な象牙質に比べるとかなり低い接着強さを示すことが明らかとなった。また、健全な象牙質はEr : YAGレーザーを照射すると接着強さが低下し、申請者が発見したグルタルアルデヒド法を用いれば接着強さは回復することが明らかなっている。しかしながら、このグルタルアルデヒド法はう蝕影響象牙質には有効でないことが本実験で確認された。グルタルアルデヒド法はEr : YAGレーザーにより低下したコンポジットレジンの接着性を改善する唯一の方法であるが、う蝕影響象牙質に対しては有効でないことが本実験で明らかとなった。一方で、Er : YAGレーザー照射象牙質の主要構成元素の分析をESCAにて行った。元素解析の結果、Er : YAGレーザー照射象牙質の主要構成元棄であるCa、P、Nの結合エネルギーが高エネルギー側ヘシフトしていることが明らかとなった。また、Cのピークは大きく変化することが確認された。さらに、Er : YAGレーザー照射象牙質のCa/P比は非照射象牙質に比べ有意に低下することが明らかとなった。これはEr : YAGレーザー照射により、主要元素の結晶構造が変化していることと、Caが喪失したことを示している。Er : YAGレーザーは組織為害性が少なく安全医療用レーザーであるが、象牙質の主要元素はEr : YAGレーザーにより影響を受けることが示さされた。
閉塞性動脈硬化症の診断治療の新パラダイム構築－エクソソームを用いた検査学的展開

閉塞性動脈硬化症(ASO)は、糖尿病などの基礎疾患により血管が障害され発症する。病初期には明確な自覚症状がないため、また早期の病変をキャッチする検査がないために、早期の診断治療が困難である。血管内皮細胞の機能評価が可能な血中バイオマーカーは、一酸化窒素、PGI2代謝産物などであるが、これらは血中で不安定なため、ASOのバイオマーカーの開発が望まれる。本研究では免疫学的側面と血栓止血学的側面の両法からASO病態の再構築を試みる。リンパ球や血小板が分泌する細胞外分泌小胞の基礎研究を行うことで、ASO発生進展の病態を統合する。さらには、ASOの基礎疾患や各病期に応じた臨床検査学的診断、治療法の開発につながる研究を継続する。血中エクソソームの内在蛋白質、核酸、表面糖鎖を網羅的にバイオインフォーマティクス的解析し、最新の知見と技術によるエクソソームの分泌取り込み機構開発・分子検査学的応用に展開する。I. ASO患者の血清中エクソソームの多角的解析を行っている。分泌小胞はサイズと分泌様式の違いにより分類され、その中でエクソソームは細胞が能動的に分泌する100 nm程の小胞であるが、超遠心法とポリマー沈殿法により、血清、血漿、培養上清中のエクソソームを採取、その品質と収量について検討を加えた。一方で、ASO患者の血清からRNAを抽出して、マイクロアレイを使用して網羅的解析を行った。II.エクソソームの分泌と取り込みの基礎的研究として、本年度は取り込みについて研究を行った。培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAを検討し、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる形質変化などの実験を行った。3年間の研究計画の中で、ASOの病態解明のためにASOの診断法開発研究とASOの治療応用研究の2つのパートについて実験を遂行中である。I. ASO患者の血清中エクソソームの多角的解析:血清、血漿、培養上清中のエクソソームを採取、その品質と収量について検討は順調に進行中。ASO患者の血清を使用したマイクロアレイの結果、いくつかのmiRNAに特有の動態がみられ、来年度以降の解析を必要とする。II.エクソソームの分泌制御機構解明:本年度は取り込みについて研究を行った。培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAを検討し、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる形質変化などの実験を行い、順調に進行中。どのmiRNAがどのように関与するかは現在進行中の研究である。本年度は、前年度に開始したプロジェクトをさらに膨らませてデータを得ることを目的とする。前年度同様に2つのパートに分けて実験を遂行する予定である。I. ASO患者の血清中エクソソームの多角的解析:前年度に検討したエクソソーム採取法により、培養細胞でその分泌小胞についての詳細な検討を行う。内在する核酸や表面糖蛋白質について現在の治験を元に未知の事実に関する実験を行う。また、昨年度行ったマイクロアレイデータを解析して、まずはPCRで確認後、ASOの病態に重要なmiRNAの一群を同定する予定である。同定されたmiRNAの詳細な検討は、今年度来年度を通じて行っていく。II.エクソソームの分泌制御機構解明:培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAの中でも、炎症に関連あるmiRNAをピックアップし、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる増殖系シグナル伝達の変化を検討する。また、分泌に重要な一群の分子についてエクソソームの形成、輸送、分泌を免疫染色法やウエスタンブロット法などで検討する。

培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAを検討し、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる形質変化などの実験を行った。3年間の研究計画の中で、ASOの病態解明のためにASOの診断法開発研究とASOの治療応用研究の2つのパートについて実験を遂行中である。I. ASO患者の血清中エクソソームの多角的解析:血清、血漿、培養上清中のエクソソームを採取、その品質と収量について検討は順調に進行中。ASO患者の血清を使用したマイクロアレイの結果、いくつかのmiRNAに特有の動態がみられ、来年度以降の解析を必要とする。II.エクソソームの分泌制御機構解明:本年度は取り込みについて研究を行った。培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAを検討し、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる形質変化などの実験を行い、順調に進行中。どのmiRNAがどのように関与するかは現在進行中の研究である。本年度は、前年度に開始したプロジェクトをさらに膨らませてデータを得ることを目的とする。前年度同様に2つのパートに分けて実験を遂行する予定である。I. ASO患者の血清中エクソソームの多角的解析:前年度に検討したエクソソーム採取法により、培養細胞でその分泌小胞についての詳細な検討を行う。内在する核酸や表面糖蛋白質について現在の治験を元に未知の事実に関する実験を行う。また、昨年度行ったマイクロアレイデータを解析して、まずはPCRで確認後、ASOの病態に重要なmiRNAの一群を同定する予定である。同定されたmiRNAの詳細な検討は、今年度来年度を通じて行っていく。II.エクソソームの分泌制御機構解明:培養細胞Meg01細胞、THP-1細胞からのエクソソームに含まれるmiRNAの中でも、炎症に関連あるmiRNAをピックアップし、これらが血管内皮細胞等に取り込まれることによる増殖系シグナル伝達の変化を検討する。また、分泌に重要な一群の分子についてエクソソームの形成、輸送、分泌を免疫染色法やウエスタンブロット法などで検討する。