hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝疾患モデルブタを用いたiPS肝臓原基移植による新規治療法の開発

我々は胎児期の肝臓の発生過程を模倣してヒトiPS細胞由来肝細胞、血管内皮細胞、ヒト間葉系幹細胞を3次元培養したヒトiPSC肝芽を作製し、これを大量に製造して移植することで肝疾患を治療することを目指している。ブタは前臨床のモデルとして人間と同じ手技による治療法の検証を行うことが可能である。本研究ではブタ胎仔から作製した肝芽を門脈より同所性に移植し、移植の安全性と有効性を検討することを目的とする。ブタ胎仔由来肝芽での安全性を確認後、ヒトiPSC肝芽をブタに同所移植して安全性を検討する。前年度までのブタ胎仔由来肝芽の安全性の検討から、新生仔ブタの麻酔法、周術期管理、ブタ胎仔由来肝芽の作製法、臍静脈を経由して肝臓の特定の部位へ移植する手法が確立できた。今年度はヒトiPSC肝芽の安全性検討を行った。ヒトiPS細胞から内胚葉細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞に分化誘導させ、3次元混合培養を行うことによりヒトiPSC肝芽を作製した。前年度のブタ胎仔由来肝芽で安全性が確認された移植方法に従い、臍静脈を経由して肝左葉の門脈内にヒトiPSC肝芽を移植した。移植個数は1x10^8個肝内胚葉細胞/個体とした。新生仔ブタにおいては門脈臍部と下大静脈の間に静脈管の開存が見られることがあるため、全例結紮した。ヒトiPSC肝芽移植中の門脈分枝および門脈本幹の門脈圧変化を検討したところ、いずれも有意な門脈圧上昇は見られなかった。ヒトiPSC肝芽移植後の体内動態をヒトAlu配列のPCRおよび免疫染色にて検討したところ、肝臓以外の肺、心臓、脳、腎臓、脾臓等の臓器にヒト細胞の検出は認められなかった。このことから、ヒトiPSC肝芽の門脈内移植は他臓器移行の抑制効果という観点で非常に安全な手技であると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々は胎児期の肝臓の発生過程を模倣してiPS細胞を用いた肝臓原基(肝芽)を作製し、移植による肝疾患治療を目指している。ブタは前臨床試験のモデル動物として臨床と同じ手技による治療効果の検討を行うことが可能な有用なモデル動物である。本研究ではブタ胎児肝組織より採取した胎児肝細胞を3次元培養してブタ肝芽を作製し、肝臓に安全に移植する手技の確立と治療効果検討を目的とする。本年度は以下の検討を行った。1ブタ肝芽作製条件の検討:ブタは胎生114日程度で出生するが、何日齢のブタ胎児肝組織から肝芽を作製できるかは不明である。今年度は胎生30日のブタ胎児肝組織を用いて三次元培養を行い、ブタ肝芽を作製した。肝芽1個あたりの細胞数、培養期間による肝芽径の変化を測定した。また肝芽の培養期間によるアルブミンやHNF4などの肝臓関連遺伝子の変化やアンモニア代謝能を測定し、移植に適した肝芽を検討した。2ブタ肝芽移植:クサビラオレンジ陽性のブタ胎児肝組織を用いた肝芽を製造し、野生型のブタの門脈経由で肝臓内へ移植を行った。1週間の生存確認後、組織学的解析を行った。その結果15万個/kg程度肝芽を移植しても生存には影響せず、肝芽の肝臓内への生着が確認された。3ガラス化法による肝芽凍結保存法の開発:胎児肝組織より作製した肝芽をガラス化法とDMSOを用いた緩慢凍結法にて凍結保存を行ったところ、ガラス化保存がより肝芽の生存率が高いことが明らかになった。ガラス化によって凍結保存された肝芽は免疫不全動物に移植して生着することが確認され、今後の実験にも使用可能なことが示唆された。平成28年度の研究実施計画である1ブタ肝芽作製条件の検討、2ブタ肝芽移植条件の検討、3ガラス化法による肝芽凍結保存法の検討の3つの項目について、当初の予定通りの研究成果を達成したため、おおむね順調に進展していると考えられた。我々は胎児期の肝臓の発生過程を模倣してiPS細胞由来肝細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト間葉系幹細胞を3次元培養したヒトiPS細胞由来肝臓原基(肝芽)を作製し、これを大量に製造して移植することで肝疾患を治療することを目指している。ブタは前臨床のモデルとして臨床と同じ手技による治療法の検証を行うことが可能である。本研究ではブタ胎仔から作製した肝芽を門脈より同所性に移植し、移植の安全性と有効性を検討する事を目的とする。本年度は1ブタ肝疾患モデル治療のための免疫抑制剤の選択および2ブタ肝芽移植による経門脈的移植の安全性確認を行った。1ブタ肝疾患モデル治療のための免疫抑制剤の選択:健常の新生仔ブタの肝臓にブタ胎仔肝組織由来肝芽を生着させるための免疫抑制剤の選択を行った。その結果、FK506およびMMFを併用して経口投与することによって安定した血中濃度が維持され、ブタ胎仔肝組織由来肝芽が生着することが明らかとなった。2ブタ肝芽移植による経門脈的移植の安全性確認:クサビラオレンジを全身に発現するブタの胎仔肝組織より肝芽を作製し、クサビラオレンジ陰性のブタの門脈内に肝芽を移植した。

ブタの門脈左枝に選択的に移植する事により、肝左葉に限局して組織生着を確認した。ブタ体重当たり10万個/kg30万個/kgの肝芽を移植したところ門脈左枝圧の上昇が認められたが、門脈本幹圧は変化が見られなかった。移植施行したブタは全例生存し、肝組織の広範な壊死や門脈塞栓などの合併症は認められなかった。これらのことから肝芽の経門脈的移植は安全に実施可能な手技であることが示唆された。クサビラオレンジ陽性のブタ胎仔肝組織より10万個/kg, 30万個/kgの肝芽を作製し、移植後1週間の生存を確認出来た。このことから、肝芽の門脈内投与という手術手技の安全性がほぼ確認出来た。そのため、本計画はおおむね順調に進展していると考えられた。我々は胎児期の肝臓の発生過程を模倣してヒトiPS細胞由来肝細胞、血管内皮細胞、ヒト間葉系幹細胞を3次元培養したヒトiPSC肝芽を作製し、これを大量に製造して移植することで肝疾患を治療することを目指している。ブタは前臨床のモデルとして人間と同じ手技による治療法の検証を行うことが可能である。本研究ではブタ胎仔から作製した肝芽を門脈より同所性に移植し、移植の安全性と有効性を検討することを目的とする。ブタ胎仔由来肝芽での安全性を確認後、ヒトiPSC肝芽をブタに同所移植して安全性を検討する。前年度までのブタ胎仔由来肝芽の安全性の検討から、新生仔ブタの麻酔法、周術期管理、ブタ胎仔由来肝芽の作製法、臍静脈を経由して肝臓の特定の部位へ移植する手法が確立できた。今年度はヒトiPSC肝芽の安全性検討を行った。ヒトiPS細胞から内胚葉細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞に分化誘導させ、3次元混合培養を行うことによりヒトiPSC肝芽を作製した。前年度のブタ胎仔由来肝芽で安全性が確認された移植方法に従い、臍静脈を経由して肝左葉の門脈内にヒトiPSC肝芽を移植した。移植個数は1x10^8個肝内胚葉細胞/個体とした。新生仔ブタにおいては門脈臍部と下大静脈の間に静脈管の開存が見られることがあるため、全例結紮した。ヒトiPSC肝芽移植中の門脈分枝および門脈本幹の門脈圧変化を検討したところ、いずれも有意な門脈圧上昇は見られなかった。ヒトiPSC肝芽移植後の体内動態をヒトAlu配列のPCRおよび免疫染色にて検討したところ、肝臓以外の肺、心臓、脳、腎臓、脾臓等の臓器にヒト細胞の検出は認められなかった。このことから、ヒトiPSC肝芽の門脈内移植は他臓器移行の抑制効果という観点で非常に安全な手技であると考えられた。今後はブタ肝芽を安全に移植するための適切な免疫抑制剤の選択、経門脈的肝芽移植の安全性の更なる検討を行う。その後ブタ肝芽による疾患モデルブタの治療効果検討や、ヒトiPS細胞由来肝芽を免疫抑制剤使用下にブタに移植することも行っていきたいと考えている。これまで検討したブタ肝芽を用いた経門脈移植の安全性検討の結果をもとに、ヒトiPSC肝芽を臨床に即したデバイスで新生仔ブタに移植を試みる。移植操作中の循環動態や移植後のヒトiPSC肝芽の体内動態を詳しく検討し、ヒトiPSC肝芽の門脈内移植の安全性検討を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
無線環境におけるシームレスなインターネット接続に関する研究

無線通信環境で多数発生する伝送誤りをネットワークの輻輳とTCPは誤認識するため、無線通信環境でのTCPの特性は劣化することが知られている。このような問題に対して、エンド・エンド型、コネクション分離型、データリンク層型などの多数のTCPの特性改善手法が提案されている。しかし、これらの特性改善手法は、単一の無線通信路を利用した場合の検討である。本年度の検討では、TCPの修正を必要としない無線システムの提案として、複数の無線通信路を利用したTCPの特性改善手法の検討を行う。前年度までの研究で得られた結果より、無線通信環境で発生する伝送誤りの増加に対して、TCPの特性は急激に劣化することがわかった。このような特性を持つTCPを、既存の無線通信システムで利用した場合、無線基地局から離れた場所ではTCPの特性が非常に劣化することが予想される。このような問題は単一の無線通信路を利用した場合、送信電力を変動させることで対応することが可能であるが、システムが複雑化するという問題がある。本研究では、複数の無線基地局でサービスエリアを構成するセルラシステムにおいて、無線通信端末が複数の無線基地局と通信を行うことで、複数の無線通信路を利用するシステムの提案を行った。提案システムでは、無線通信端末の受信電力が低下する無線基地局から離れた場所で、無線通信端末は複数の無線基地局と通信を行うことで、無線通信路での伝送誤りの軽減を図り、結果としてTCPの特性を改善する。また、伝送誤りが極めて発生しない場合、TCPの特性は飽和する。そこで、無線通信端末が無線通信環境とTCPの特性を評価することで、接続する無線基地局を動的に決定する手法の提案も行った。提案システムを利用することにより、不必要な無線資源を利用することなく、サービスエリア全域でTCPの特性を良好に維持することが可能となることを示した。TCPの特性改善手法は大きく分けエンド・エンド型、コネクション分離型、データリンク層型に分けられる。本研究ではデータリンク層型の特性改善について検討を行っている。この手法を利用した場合、既存のTCPの実装を変更する必要がないため、既存のOS実装上においても特性改善が期待できる。データリンク層型の検討では有線ネットワークと無線ネットワークを接続する基地局で特性改善処理を行う。このようなデータリンク層型の既存の研究では、誤り訂正符号、再送制御などを利用することにより特性改善を行っている一方、どの程度の処理を行うべきかについては議論がなされていない。前年度の研究で得られた無線環境でのTCPの特性解析モデルから、特性に大きな影響を与えるTCPのタイムアウトの発生確率は同じ無線チャネル状況でも、送信側の輻輳ウィンドウサイズが変化すれば異なることがわかった。このことは、データリンク層での特性改善を行う場合には、すべてのパケットを同等に扱うのではなく、パケット毎に重み付けをした処理を行う必要があることを示している。そこで、本年度の研究では、各パケットをどのように重み付けをして扱うべきかについて検討を行った。具体的にはTCPは輻輳ウィンドウ内のパケットを連続して送信を行う。そのため、基地局において、各TCPコネクションのシーケンス番号と到着時間を確認することにより、TCPの輻輳ウィンドウサイズを特別な情報なしに推定することが可能となる。次に、各端末から得られるダウンリンクのチャネル情報を元に、タイムアウト発生確率を求めることで各パケットの重み付けを行う。その結果、特に輻輳ウィンドウサイズが小さい時にパケットの損失確率を下げることが重要であることを示した。
節足動物視細胞を用いた新規受容体輸送システムの探求

ショウジョウバエ視細胞における、ロドプシン輸送小胞の輸送経路を明らかにするため、抗オプシン抗体を用いた蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ロドプシンが微絨毛に運ばれる以前に、直径200nm以上あるより大きなベシクル(RLV)に濃縮されている事が分かった。このRLVには、微絨毛膜上のカルシウムチャネル蛋白質であるTRPも濃縮されるのに対し、細胞体ドメインの細胞膜に局在するNa^+-K^+ ATPaseは輸送されなかった。また、抗オプシン抗体による免疫電顕観察を行った結果、RLVの実態は多胞体(MVE)であることが明らかになった。更に、ロドプシンの輸送に関与すると考えられるRab11変異蛋白質による機能阻害実験を行った。その結果、変異体ではMVEの形成が阻害され、ロドプシンはMVEに集まることができず細胞質に散在する小胞に蓄積された。感桿の形成も阻害され、微絨毛膜への輸送がブロックされていることが明らかになった。同様の輸送阻害はTRPについても観察されたのに対し、Na^+-K^+ ATPaseは正常に細胞体膜へと局在化した。次に、ロドプシンの輸送小胞の単離を試みた。ショウジョウバエをカロテノイドおよびレチノイド非存在下で飼育し、オプシンの成熟を阻害した。このハエの網膜懸濁液に、抗オプシン抗体で被覆した磁気ビーズを加えてインキュベートし、ビーズに吸着した膜を回収した。得られた膜画分を、抗オプシン抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した結果、未成熟オプシンを含む膜が回収されていることが確認された。今後、これらの輸送小胞に含まれる蛋白質の解析を進める予定である。更に、より生化学的な取扱いが容易である甲殻類について、視細胞の基本的な構造と、昼夜変化について観察を行った結果、特定の光条件下で多量の多胞体の生成が見られ、ロドプシン輸送の研究材料として期待できることが分かった。ショウジョウバエ視細胞において、ロドプシンなどを含む小胞の新規輸送経路を明らかにする目的で、まず、その経路に含まれると考えられる輸送小胞、細胞小器官の単離を試みた。(1)未成熟のオプシンを含む小胞、小器官を得るために、ショウジョウバエをカロテノイドおよびレチノイド非存在下で飼育し、オプシンの成熟を阻害した。(2)オプシンが受容膜に輸送される経路の一部に、エンドサイトーシス経路が用いられていることが示唆されている。そこで、エンドソーム・リソソーム形成と関係が深いと考えられている色素顆粒についても、その精製を行った。網膜懸濁液を2ステップのショ糖密度勾配遠心により分画し、各画分に含まれる小器官を蛍光染色、酵素活性および分光測定により検討した。その結果、色素顆粒を豊富に含むと思われる画分を得ることに成功し、更にこの画分を電子顕微鏡により観察した結果、非常に高純度に色素顆粒が濃縮されていることが明らかになった。

現在これらの小胞、細胞器官に関して、2次元電気泳動などによる解析を進めており、各分画特異的で、かつ、比較的多量に存在する蛋白質から、配列解析などを行う予定である。ショウジョウバエ視細胞における小胞の輸送は、脊椎動物とは異なる「新規輸送システム」によって行われている可能性が高い。その分子機構を明らかにするために、異なった輸送経路や過程にある輸送小胞をショウジョウバエ視細胞から単離し、その蛋白質組成を比較することにより、新規輸送システムで機能する分子を同定することを試みた。視物質を含む小胞については、昨年度にその方法を確立したので、今年度は色素顆粒の精製を行った。ショウジョウバエ網膜のホモゲネートを繰り返し密度勾配遠心にかけ、色素顆粒を核やミトコンドリア、ラブドメアなどから分離することに成功した。次に精製した色素顆粒に含まれる蛋白質を2次元電気泳動によって分離し、得られた各蛋白質スポットを蛋白質分解酵素で処理して質量分析を行った。ペプチドの質量情報をもとにゲノムのデータベースを検索し、6種の蛋白質を同定した。現在、これら蛋白質の機能を調べるため、そのcDNAをクローニングして発現蛋白質による抗体の作成を行うとともに、その発現を、RNAi法を用いて阻害するためのベクターの作成を行っている。輸送小胞の生化学的な解析をより容易に行うための新しい実験系の開発も試みている。ある種の甲殻類はショウジョウバエよりも眼が大きく、また、概日リズムによりラブドームの合成・分解を繰り返すため、大量に輸送小胞を蓄積する時間帯がある。当初、視細胞の形態変化がはっきりと示されているイソガニを用いる予定であったが、より入手の容易なクルマエビに転換し、その基本的な構造と、網膜の昼夜変化について観察を行った。その結果、特定の光条件下で多量の多胞体の生成が見られ、色素顆粒と合わせて、エンドサイトーシス系の小胞輸送の研究材料として期待できる。
遺伝子改変マウスの上皮性腫瘍発生モデルを用いた新たな癌治療戦略の開発

十全大補湯・補中益気湯などの補剤である漢方薬が担癌マウスの寿命を統計学的に有意に延長した。またこれらの漢方薬は自然免疫を賦活する作用があり、担癌マウスの免疫を活性化した可能性がある。【目的】1.DNAウイルス癌蛋白により発生したマウス上皮性腫瘍に対する遺伝子治療との可能性を検討する。2.免疫賦活作用があると報告されている漢方が癌発生・増殖進展・転移を抑制できるか同発癌マウスを用いて検討した。【方法】我々は水晶体上皮にSV40T抗原を特異的に発現するαT3マウスを作製した。またヒト野生型p53遺伝子とヒト野生型pRB遺伝子を同様に水晶体上皮に過剰発現するW1とpRBマウスを作製した。αT3マウスとW1およびpRBマウスとの交配実験を行いαT3/W1、αT3/pRB、αT3/W1/pRBマウスを作製し、その腫瘍の発生・増殖・進展を観察した。十全大補湯、補中益気湯、小柴胡湯を用いて1.5%混飼を作製して各漢方薬をαT3マウスに長期間(1年間以上)投与した場合のαT3マウス腫瘍の増殖進展や担癌マウスの寿命について検討した。【成績】1)ヒト野生型p53を導入したαT3/W1マウスは腫瘍にアポトーシスを誘導してその増殖・進展を抑制したが、数ヶ月後に再発した。ヒト野生型pRB遺伝子を導入したαT3/pRBマウスの腫瘍進展はほとんど抑制できなかった。しかしヒト野生型p53とpRBの遺伝子同時導入したαT3/W1/pRBマウスは約1年間腫瘍の増殖・進展を抑制することができた。2)αT3マウスに漢方3剤の各混飼を生後4週より死亡するまで持続投与すると漢方3剤とも各投与群ではαT3マウス腫瘍の増殖進展は抑制され、810週間の延命効果もあった。【結論】DNAウイルスにて発生した腫瘍に対してp53遺伝子治療はある程度は期待できるが、正常細胞を破壊する量のp53遺伝子を導入しても腫瘍の再発を招く可能性がある。しかしp53とpRBの遺伝子同時導入は腫瘍発生、増殖および進展を長期にわたり抑制できる可能性がある。漢方3剤ともにマウス未分化癌の増殖進展の抑制効果があり、また延命効果も確認できた。これらの漢方3剤はそれぞれ異なった機構でNK細胞やマクロファージの抗腫瘍活性と腫瘍進展促進活性のバランスを微妙に調節して、担癌マウスに抗腫瘍効果を発揮している可能性を示唆した。【目的】1. SV40T抗原により発生した腫瘍に対する遺伝子治療の可能性を検討する。2.漢方治療が癌発生・増殖進展・転移に影響するか検討する。十全大補湯、補中益気湯、小柴胡湯を用いて1.5%混飼を作製して各漢方薬をαT3マウスに長期間投与した場合のαT3マウス腫瘍の増殖進展や担癌マウスの寿命について検討した。2)αT3マウスに漢方3剤の各混飼を生後4週より死亡するまで持続投与すると漢方3剤とも各投与群ではαT3マウス腫瘍の増殖進展は抑制され、810週間の延命効果があった。【結論】p53とpRBの遺伝子同時導入は腫瘍発生、増殖および進展を長期にわたり抑制できる可能性がある。漢方3剤ともにマウス未分化上皮性腫瘍の増殖進展の抑制効果があり、また延命効果も確認できた。【目的】SV40T抗原により発生した上皮性未分化腫瘍に対する漢方治療が癌発生・増殖進展・転移に影響するか検討する。さらに漢方薬による自然免疫賦活作用を検討する。自然免疫であるマクロファージの浸潤について組織学的に検討した。【成績】

1)αT3マウスは多段階発癌を示し、胎生期より水晶体上皮細胞に異形成を生じ始め、出生時期から約2ヶ月で上皮内癌にまでになり、生後数ヶ月で周囲組織を破壊する浸潤癌となり脳に浸潤する。さらに進行すると頚部のリンパ節や肺に転移する。αT3マウスは時間的、空間的に極めて均一な未分化上皮性腫瘍を発生するモデルマウスであり、HPVが子宮頸癌を発症する経過と病理学的に酷似していた。2)αT3マウスに漢方3剤の各混飼を生後4週より死亡するまで持続投与すると漢方3剤とも各投与群ではαT3マウス腫瘍の増殖進展は抑制され、810週間の延命効果があった。【結論】漢方3剤ともに担癌マウスの延命効果が確認できた。これらの漢方3剤はそれぞれ異なった機構でマクロファージの抗腫瘍活性と腫瘍進展促進活性のバランスを微妙に調節して、担癌マウスに抗腫瘍効果を発揮している可能性がある。
骨転移に放射線治療を受けるがん患者の至適生活を支援する看護プログラムの洗練

本年度は、開発した「骨転移に放射線治療を受けるがん患者の至適生活を支援する看護プログラム」を臨床現場の外来看護師が活用する際の課題を明らかにすることを目的とした。まず、研究分担者と会議を開催し、開発した看護プログラムについての説明および意見交換を行い、看護プログラムの内容について研究分担者全員が共通の認識をもてるようにした。また、臨床現場で看護プログラムを活用する際の課題を明らかにするためにインタビュー調査を行うこととし、その対象者と人数、依頼方法、質問項目の検討を行った。特に、外来看護師に対して前研究で開発したプログラムの内容をどのように開示するかについては、インタビュー前に事前に資料に目を通してもらい内容を吟味する時間を設けることや、前研究での看護プログラムの具体例を示すなどの工夫が必要であることが検討事項として挙がり、その資料の作成を行っている。また、看護プログラムを臨床適用した際の評価方法については、統計的に評価できるようにするために測定ツールの検討が必要となり、先行研究で用いられているツールや評価方法を参考にするため文献検討を行っている。研究分担者との会議開催が遅れたこと、またインタビュー調査を行うにあたり看護プログラムの開示方法について検討が必要となり時間を要した。看護プログラムを臨床適用するための課題に関するインタビュー調査を完了させる。また、プログラムの評価方法と患者用教材の検討も同時に行っていく。インタビューの実施まで至らなかったため、主にデータの収集・分析および謝礼に関する費用が必要となる。
シネモードMRI画像による眼窩吹き抜け骨折の病態生理の研究

眼窩吹抜け骨折の原因は、眼球に加わった外力が眼窩の骨壁を突き破り、外眼筋や眼窩内組織が上顎洞や鼻腔に嵌頓することによるとされる。画像診断法の進歩により骨折部位の特定は容易になったが、眼球運動の直接の原因とされる外眼筋の収縮不全、癒着の状態等の動的状態の把握はこれまでの静止画像からは困難であった。このため、MRIの動的画像の撮影、および症例により外眼筋筋電図を記録し、障害の動的状態を複合的に分析した。方法:MRIのガントリ-内に水平・垂直方向に各7カ所の固視目標を設定し、各店を固視させてGraduent Echo法にてsurface coilを用いて撮影した。その後MRIのモニターブラウン管をビデオ撮影装置にて録画した。症例:眼窩吹抜け骨折は年間約20例が当院を訪れるので、その中から選択した5例(7才23才)を対象とした。結果:5症例中4例では眼球運動制限は外眼筋のみにより生じていた。4症例とも、術後に衝動性眼球運動訓練、輻輳訓練などの視能訓練を開始した。1例で、外眼筋ではなく索状物により牽引されて生じており、手術により悪化する可能性があったので、訓練のみで治療した。5症例とも訓練前と比較して訓練後のシネモードMRIでは眼球運動障害の改善が観察された。また訓練により融像域の改善を認め、シネモードMRIにより訓練による効果が証明された。考按:今回、我々は眼窩吹抜け骨折の5例に対しシネモードMRIを使用して、治療の効果を他覚的に評価することができた。治療は従来、手術・視能訓練・強制的眼球運動が行われてきたが、手術の適応には諸説がある。この研究によりシネモードMRIの動的画像が、眼窩吹抜け骨折の治療方針の選択に補助的な役割を果たしうる事がわかった。
グループの意思決定の数理モデルとプロセスの記述

実際の意思決定のプロセスに関して,規範モデルと記述モデルの相互補完的関係についていくつかの研究を行った.集団の意思決定における数理的な意思決定ルールとより単純な多数決ルールとの効率の比較などを行っている.また、公共的決定において,一般の人々の本音を聞くことは特に大事であるが,そのための方法論として言語を介した主観確率の測定方法を検討した.実際の日常的意思決定においても,ある意味で,合理性を求めているという観点から,その合理性の根拠と,実際の意思決定においても,合理性に向かって向上する学習性があるかどうかを検討した.一つは,有名なWasonの4枚カード問題を題材にとり,典型的な被験者の反応パタンが,事前確率が小さい場合,また、ルール自体が蓋然的にしか成立していない場合に,数理的に正当化されることを示した.このことが,被験者の実際の反応においても,規範モデルが予測するように,すなわち,情報量の多い順にデータを取得しようとするかどうかも調べたが,この点に関しては,データからはまだ明確な傾向性は見出していない.また,別の研究として,"秘書問題"と呼ばれる系列的な意思決定問題において,被験者は,課題を解くごとに,規範モデルが指示する合理解に近づくことが実験的に確かめられた.ただし,各"秘書"の効用が,0-1的な構造をもっている場合と,線形的に適性の順位に比例している場合との弁別はできなかった.そのほか,Damasioのギャンブル課題において,合理解に近づく際に,皮膚コンダクタンス反応によって、感情を測定し,自分の行動に対する感情的反応と合理的な解との間の関係を調べた.実際の意思決定のプロセスに関して,規範モデルと記述モデルの相互補完的関係についていくつかの研究を行った.集団の意思決定における数理的な意思決定ルールとより単純な多数決ルールとの効率の比較などを行っている.また、公共的決定において,一般の人々の本音を聞くことは特に大事であるが,そのための方法論として言語を介した主観確率の測定方法を検討した.実際の日常的意思決定においても,ある意味で,合理性を求めているという観点から,その合理性の根拠と,実際の意思決定においても,合理性に向かって向上する学習性があるかどうかを検討した.一つは,有名なWasonの4枚カード問題を題材にとり,典型的な被験者の反応パタンが,事前確率が小さい場合,また、ルール自体が蓋然的にしか成立していない場合に,数理的に正当化されることを示した.このことが,被験者の実際の反応においても,規範モデルが予測するように,すなわち,情報量の多い順にデータを取得しようとするかどうかも調べたが,この点に関しては,データからはまだ明確な傾向性は見出していない.また,別の研究として,"秘書問題"と呼ばれる系列的な意思決定問題において,被験者は,課題を解くごとに,規範モデルが指示する合理解に近づくことが実験的に確かめられた.ただし,各"秘書"の効用が,0-1的な構造をもっている場合と,線形的に適性の順位に比例している場合との弁別はできなかった.そのほか,Damasioのギャンブル課題において,合理解に近づく際に,皮膚コンダクタンス反応によって、感情を測定し,自分の行動に対する感情的反応と合理的な解との間の関係を調べた.意思決定のプロセスを数理モデルによって表現した。数理モデルはともすれば入力と出力間の関数関係の表現にとどまりがちであるが、数理モデルのプロセスを3ステップに整理し、各ステップにおけるもっとも大きい特徴を数理モデルであらわすことによって、意思決定のプロセスをデータによって検証可能な形で表現することに成功し、かつ、実際にデータによって支持された。3ステップとは、直感的評価段階、合理的評価段階、総合的評価段階である。直感的評価段階ではすべての属性の性質を見るのではなく、もっともメリットの大きい属性ともっともデメリットの大きい属性に注目する(久保聖子、ランメルハートとの共同研究)。合理的評価段階では、全体的評価を志すとはいえ、決定のためには差別化の過程がある。しかし、決定状況、意思決定者の性格によっては、かえって、属性の効用値の平準化が見られることがあり、これが迷いの正体である。最後の総合的評価段階では多属性効用の統合を行い、ある閾値以上になると最終決定に至るが、それ以外は最初の直感的評価段階に戻る(久保聖子との共同研究)。現在は、複数のパソコンを結び、グループの決定における意思決定プロセスを検討中である。すなわち、直感的評価を各自で行った後で、合理的評価の材料として、他者の意思決定をフィードバックとする。グループとしての総合的判断にいたるためのルールを数理モデルで表現し、実際に課題を与えてグループ意思決定を行わせたデータによって集団の意思決定プロセスを解明することを目指している。グループの意思決定の過程を記述する数理モデルを定式化し、それをモンテカルロ法によって検証した.具体的には、グループの決定を、各成員の選好の分布を所与として、各成員の効用としてどのような代表値が選ばれるか、また、その代表値をグループの代表値とする場合にどのような集約メカニズムが働くかを明確にする.たとえば、選好分布の代表値として、平均、メディアンのいずれか、また、グループの代表値として多数決原理、ベストメンバー方略などである.このような決め方のいずれが、いろいろな状況でロバストであるかをシミュレーション的に検証した.また、瞬間的な各時点における最適化ではなく、時系列的な決定における最適化について実験的研究を行った.その結果、被験者は時系列的に意思決定実験を繰り返すと、合理的規範解に近づくことが示された.

今後は、この合理的解への近づきが、グループの意思決定とした場合に促進されるかどうかを検証したい.また、統計的仮説検定を各研究者が手許にあるデータによって、自分の仮説の信憑性を評価するプロセスとして考察する所論も発表した.系列的にギャンブル課題を解く際に、被験者はだんだんと合理的な選択をすることを確かめた。ただし、その傾向には個人差があり、しかも、その個人差を説明する指標として、皮膚コンダクダンス反応(SCR)が有効であった.具体的には、Becharaet al.(1994)の考案したギャンブル課題について、リスクの大きい系列2つ、リスクの小さい系列2つの4種類の課題の選択傾向を、被験者の予期的なSCR反応と評価的なSCR反応による相関的説明を試みた.予期的反応との関連は見出されなかったが、評価的反応との関連が見られた.合理的意思決定と生理的指標との関連は、合理的意思決定を目指すグループ意思決定において、個人差を前提とした意思決定の方略の統合が望まれるゆえに、役に立つ知見であると考える.また、Wasonの4枚カード問題について、被験者の大半が命題論理的に正しい答ができない理由として、日常的な意思決定場面における情報量から説明を試みた.情報量による説明事態は、Oaksford and Chater(1994)が、既に提案していることであり、事前確率によっては、被験者の"間違い"が正当化される.しかし、もし、伝統的な4枚カード問題の設定が、母集団からの標本であると混同するとするならば、そのルールも現実世界の不確定性を反映して例外を含むルールであると混同するであろう.我々は、ルールが確率的に成立するものという条件を入れて、彼らの理論を拡張して、各カードの情報量を算出し、4枚カード問題における"間違い"を説明しようとした.結果の一部は情報量の大きさによって説明できたが、説明できない部分も残っている.
相互結合網における効率的な経路選択アルゴリズムの開発

本年度は,超並列分散計算機の相互結合網に適したふたつの位相,バブルソートグラフ,焦げたパンケーキグラフにおける互いに素な経路問題,ハミルトン閉路・経路を解くアルゴリズムを開発した.以下にその詳細を記す.1バブルソートグラフにおける頂点から頂点集合への互いに素な経路問題バブルソートグラフにおいて,頂点から頂点集合への互いに素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-バブルソートグラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^5)である.電子情報通信学会論文誌にて発表した.2焦げたパンケーキグラフにおけるハミルトン閉路・経路問題焦げたパンケーキグラフにおいて,ハミルトン閉路および経路を生成するアルゴリズムを開発した.また,グラフ内にひとつの故障頂点が存在するときにもハミルトン閉路を生成するアルゴリズムも併せて提案した.並列分散計算システムに関する国際会議にて発表した.3焦げたパンケーキグラフにおける二頂点間の内素な経路問題焦げたパンケーキグラフにおいて,二頂点間の内素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-焦げたパンケーキグラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^3)である.電子情報通信学会技術研究報告および並列分散処理・応用に関する国際シンポジウム(ISPA '05)にて発表した.本年度は,みっつの相互結合網,バブルソートグラフ,パンケーキグラフ,ローテータグラフにおける互いに素な経路問題とトリバレントケイリーグラフにおける最小フィードバック頂点集合問題を効率的に解くアルゴリズムを開発した.以下にその詳細を記す.1相互結合網における互いに素な経路問題超並列分散計算機の相互結合網に適した位相であるバブルソートグラフ,パンケーキグラフ,ローテータグラフにおいて,相互結合網において重要である互いに素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリスムを開発した.n-バブルソートグラフ,n-パンケーキグラフ,(n, k)-ローテータグラフにおけるアルゴリズムの時間計算量はそれぞれO(n^3),O(n^5),O(n^4)である.2トリバレントケイリーグラフにおける最小フィードバック頂点集合問題超並列分散計算機の相互結合網に適した位相であるトリバレントケイリーグラフにおいて,相互結合網において重要である最小フィードバック頂点集合問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.ある頂点がその最小フィードバック頂点集合に含まれるかどうかは定数時間で判断することができる.本年度は,ケイリーグラフを中心に,超並列分散計算機の相互結合網に適した三つの位相,バブルソートグラフ,トランスポジショングラフ,バイローテータグラフにおける互いに素な経路問題を効率的に解くアルゴリズムを開発した.以下にその詳細を記す.1バブルソートグラフにおける頂点から頂点集合への互いに素な経路問題バブルソートグラフにおいて,頂点から頂点集合への互いに素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した。n-バブルソートグラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^5)である.電子情報通信学会技術研究報告会および同学会論文誌にて発表した.2トランスポジショングラフにおける頂点から頂点集合への互いに素な経路問題トランスポジショングラフにおいて,頂点から頂点集合への互いに素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-トランスポジショングラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^7)である.情報処理学会研究報告および並列分散処理,技術および応用に関する国際会議(PDPTA2004)にて発表した.3バイローテータグラフにおける二頂点間の内素な経路問題バイローテータグラフにおいて,二頂点間の内素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-バイローテータにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^4)である.並列分散計算,応用および技術に関する国際会議(PDCAT2004)にて発表した.本年度は,超並列分散計算機の相互結合網に適したふたつの位相,バブルソートグラフ,焦げたパンケーキグラフにおける互いに素な経路問題,ハミルトン閉路・経路を解くアルゴリズムを開発した.以下にその詳細を記す.1バブルソートグラフにおける頂点から頂点集合への互いに素な経路問題バブルソートグラフにおいて,頂点から頂点集合への互いに素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-バブルソートグラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^5)である.電子情報通信学会論文誌にて発表した.2焦げたパンケーキグラフにおけるハミルトン閉路・経路問題焦げたパンケーキグラフにおいて,ハミルトン閉路および経路を生成するアルゴリズムを開発した.また,グラフ内にひとつの故障頂点が存在するときにもハミルトン閉路を生成するアルゴリズムも併せて提案した.並列分散計算システムに関する国際会議にて発表した.3焦げたパンケーキグラフにおける二頂点間の内素な経路問題焦げたパンケーキグラフにおいて,二頂点間の内素な経路問題を多項式時間で解くアルゴリズムを開発した.n-焦げたパンケーキグラフにおける提案アルゴリズムの時間計算量はO(n^3)である.電子情報通信学会技術研究報告および並列分散処理・応用に関する国際シンポジウム(ISPA '05)にて発表した.
骨軟部腫瘍の診断、組織発生及び治療効果に関する病理学的及び分子病理学的研究

町並は、最近約30年間に自ら診断した骨悪性腫瘍生検・手術例745例及び良性骨腫瘍及び腫瘍様病変生検・手術例1,017例の病理診断を再検討し腫瘍別頻度を明らかにした。骨肉腫については組織学的悪性度分類を行い、悪性度1及び2度の症例11例の予後を、悪性度3及び4度の症例123例の予後と比較し、組織学的悪性度の低い症例の方が有意に予後良好であるという結果を得た。石田及び町並は、粘液型脂肪肉腫に見られるTLS/FUS-CHOP typeIIIキメラ蛋白の機能を、前脂肪肉腫の培養系を用いて検索し、このキメラ蛋白が粘液型脂肪肉腫の発生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。堀内、石田及び町並は、薬剤耐性に関与していると考えられるメタロチオネイン(MTs)、グルタチオントランスSフェレースπ(GSTπ)、熱ショック蛋白27(Hsp27)、及び肺抵抗性関連蛋白(LRP)を骨肉腫について免疫組織学的に検索した。Hsp27の過剰発現する症例の予後は悪く、GSTπ、Hsp27及びLRPが手術時に過剰発現している症例には術前化学療法が効かないことに関連していることを示した。骨肉腫の術前化学療法感受性とp53及びRb遺伝子の変異との関係を明らかにするために、32例の通常型骨肉腫の治療効果を病理組織学的に判定し、p53及びRb遺伝子の相同性の欠失(LOH)をPCR法を用いて調べた。p53のLOHは24例中13例(54%)、RbのLOHは24例中14例(58%)に認められた。p53 LOH陽性例の15%しか化学療法感受性を示さなかったが、LOH陰性例では64%が化学療法感受性を示した。一方、Rb LOH陽性例の14%しか化学療法感受性を示さなかったのに反し、Rb LOH陰性例では55%が感受性を示した。その他、軟骨肉腫との鑑別が問題となる軟骨腫、肉腫との鑑別が問題となるdecubital fibroplasia、胎児型横紋筋肉腫にみられた粗面小胞体内の微小管の集簇、平滑筋への分化を示す巨大大網腫瘍の症例報告、骨肉腫におけるOB-カドヘリン蛋白の発現、骨線維性異形成とアダマンチノーマの関係、粘液型脂肪肉腫の病理診断における分子生物学的手法の応用、色素性軟部腫瘍におけるc-met protooncogene産物の発現、ヒト消化管間質腫瘍の免疫組織化学、などについての報告も行った。

骨肉腫については組織学的悪性度分類を行い、悪性度1及び2度の症例11例の予後を、悪性度3及び4度の症例123例の予後と比較し、組織学的悪性度の低い症例の方が有意に予後良好であるという結果を得た。骨肉腫のp53及びRB遺伝子のLOHを分子生物学的に検索し、LOH陽性例は陰性例に比し化学療法抵抗性であることが判明した。また、骨肉腫ではOB-Cadherin遺伝子の変異型が検索した23例全例に陽性で骨肉腫の生物学的性状に変異型OBカドヘリンが関与していることが示唆された。さらに比較のため、印環細胞型の胃癌についてCadherin-11とCadherinの働きを助ける作用のあるCateninについて検索し、CadherinとCateninは腫瘍の組織型や浸潤・転移に関与していることを示す結果を得た。軟骨性腫瘍についてはモルフォメトリー、染色体分析、及びp53遺伝子の検索を行い、核面積、二核細胞、染色体分析が良悪の鑑別に有用であり、p53遺伝子の点突然変異が組織学的悪性度の高い症例に認められることを明らかにした。石田は、レックリングハウゼンの神経線維腫症に合併した多発性の小腸基質腫瘍及び関節内に発生した滑膜肉腫について検討し報告した。堀内は、骨巨細胞腫瘍における多核巨細胞の成り立ちについて、培養細胞を用い、蛍光色素で腫瘍細胞を標識し、単核の腫瘍細胞の融合によって多核巨細胞が生じることを明らかにした。また、骨肉腫のErbB-2の発現を分子生物学的に検索し、その発現は肺転移と相関することを明らかにした。元井は、滑膜肉腫について肝細胞増殖因子(HCG)とc-Metの発現を免疫組織化学的に検索し、上皮成分の発生にHCGとc-Metが関与していることを明らかにした。その他町並は、粘液型脂肪肉腫にVEGFが発現していることを報告した。石田及び町並は、粘液型脂肪肉腫に見られるTLS/FUS-CHOP type IIIキメラ蛋白の機能を、前脂肪肉腫の培養系を用いて検索し、このキメラ蛋白が粘液型脂肪肉腫の発生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。堀内、石田及び町並は、薬剤耐性に関与していると考えられるメタロチオネイン(MTs)、グルタチオントランスSフェレースπ(GSTπ)、熱ショック蛋白27(Hsp27)、及び肺抵抗性関連蛋白(LRP)を骨肉腫について免疫組織学的に検索した。Hsp27の過剰発現する症例の予後は悪く、GSTπ、Hsp27及びLRPが手術時に過剰発現している症例には術前化学療法が効かないことに関連していることを示した。石田及び町並は、極めて示唆に富む稀な脱分化型軟骨肉腫を経験し、症例報告を行った。57歳男性の肋骨に発生した分化型の軟骨肉腫が12年の経過の間に、血管肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫及び平滑筋肉腫への分化を示す脱分化を起こしたもので、脱分化部分は通常は悪性線維性組織球腫(MFH)の像を示すのに、悪性間葉腫の像を呈しており、MFHが多分化能をもった未熟な多形性の著明な肉腫であることが示唆された。堀内、石田及び町並は、骨肉腫に存在する正常及び変異型OBカドヘリン遺伝子をマウスL細胞にトランスフェクトし、変異型OBカドヘリン遺伝子が細胞の接着性を失わせることを明らかにした。石田及び町並は、11例の滑膜肉腫についてEカドヘリン(Ec)及びNカドヘリン(Nc)の発現を免疫組織化学的に検索し、Ecは二相型滑膜肉腫5例中2例に上皮成分のみ陽性、Ncは二相型滑膜肉腫全例に陽性所見を得て、滑膜肉腫の上皮様形態形成へのEcの関与は少ないことが示された。その他、石田、堀内及び町並は骨化を伴う悪性神経鞘腫瘍、下顎骨に発生した類上皮悪性末梢神経鞘腫瘍、intraosseous myofibromaなどに関する症例報告を行った。骨肉腫の術前化学療法感受性とp53及びRb遺伝子の変異との関係を明らかにするために、32例の通常型骨肉腫の治療効果を病理組織学的に判定し、p53及びRb遺伝子の相同性の欠失(LOH)をPCR法を用いて調べた。
因果学習における事象生起時間の効果と連合学習理論

本研究では、被験者に対して呈示される事象間の関係性および被験者自らの反応と結果との関係性から、どのような因果関係を学習するかに関しておもに古典的条件づけや道具的条件づけの理論に基づいて検討を行った。その結果、事象の生起に関して同時的である場合には双方向性の連合が形成されるが、時間的方向性が一方向的である場合には因果の検出が行われること、また自らの反応の結果として生じる事象が快刺激であるか不快刺激であるかによって獲得される知識が異なる可能性が示唆された。本研究の大きな目的は、ヒトを対象として因果推論課題を行わせ、その背後にあるメカニズムを主に連合学習理論の観点から解釈することを試みることである。本年度はまず、Waldmannらの先行研究で用いられている共通因果モデルや因果連鎖モデルに対して、双方向的な因果関係を導入することで実験事態に改変を加えた。因果モデルにおいて用いられる事象を連合学習理論における刺激呈示と読み替えた場合には、因果を示す矢印は双方向的になると考えられる。すなわち、双方向的な因果関係によって結ばれる事象においては相互に影響を与える循環構造となる。こうした因果モデルを用いた場合に、ある事象の生起を観察した場合と事象に対する人工的介入があった場合に、実験参加者がモデル内の別の事象に関して生起・非生起の予測をどのように行うかを検討した。具体的な手続きとしては、各事象を「ある動物の体内におけるホルモンの相互関係」とするカバーストーリーを作成し、実験参加者に対してこうした因果構造を仮説として呈示した。その後、過去の研究で用いられているような観察と介入によるモデル内の事象の生起・非生起に関して実験参加者に評定をさせたところ、双方向的な因果関係が存在する場合においては共通因果モデルとは異なり、因果連鎖モデルにおいて確認されたものと類似した結果が得られた。この結果は、連合学習理論において予測されるものと類似しており、ヒトの因果推論事態において確認されるような観察と介入では異なる判断を行うという結果が、原因から結果への単方向的な性質に依存している可能性を示唆している。昨年度に明らかになった、因果推論自体における事象問の単方向的性質への依存を踏まえ、今年度は新たに当初計画に加えて被験者に選択を要求するようなオペラント的要素を加えた実験を行った。元来、我々の研究(Blaisdell, et al.2006)において重要な問題となったのは、因果推論において観察による知識と介入に関する知識が、それぞれ古典的条件づけとオペラント条件づけに対応しているのではないかというものであった。そこで、その際に反応やそれに先立つ刺激状況を原因事象、反応の後に呈示される刺激を結果事象と捉えることで、単に刺激の生起・不生起を観察するのではなく、Waldmanらの研究においてカバーストーリーとしてのみ扱われていた介入に関する検討を加えた。その際に、反応に対する結果事象としてポジティブな結果とネガティブな結果が生起する場合を設け、結果事象のもつ情動的側面が、「結果を導く原因としての反応選択」にどのような影響を与えるのかを検討した。その結果、ポジティブ結果を得ることができる反応よりもむしろ、ネガティブ結果を避ける反応のほうが、後に同様の事態におかれた際に反応の転移が大きいことが示された。
メタボリック症候群の改善を評価するコレステロール合成・吸収・代謝マーカーの分析

本研究ではメタボリック症候群の改善を「生体内のコレステロール調節」という視点から評価することを目的とし、コレステロール前駆物質(スクアレン、ラソステロール)を合成マーカー、植物ステロール類(シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール)を吸収マーカー、ヒドロキシコレステロール類を代謝マーカーと位置づけ、これらを高感度かつ迅速に同時分析することによって治療薬やサプリメント成分の効果を評価する手法を確立する。平成21年度は、20年度に開発した合成・吸収マーカーのGC-MS一斉定量法にスクアレンとスティグマステロールを加えるとともに、対象物質の誘導体化に対する挙動の違いに着目してIS(内標準物質)を採択し、定量精度の向上を図った。その結果、夾物質が多い血漿においては、TMS誘導体化を受けないスクアレンは5α-コレスタンをISとし、TMS誘導体化を受けるラソステロール及び植物ステロール類はこれらと同様の挙動を示すエピコプロスタノールをISに用いることで、より良好な定量精度が得られた。さらに、ヒト肝癌由来HepG2細胞を用いた細胞培養系における、細胞内のコレステロール合成マーカー(スクアレンおよびラソステロール)の定量法を確立し、スタチン系治療薬ならびにポリフェノール化合物のコレステロール生合成抑制作用の評価を試みた。HepG2細胞内のコレステロール合成マーカーは、ジルコニアビーズを用いた細胞膜破砕、ケン化、溶媒抽出の後、GC-MS定量を行うことで良好な直線性と回収率が得られた。10%LPDS(リポタンパク欠乏ウシ血清)含有DMEM培地を用いてHepG2細胞を培養すると、FBS培地に比べてスクアレンは約2倍、ラソステロールは約10倍の合成亢進が認められた。一方、アトルバスタチンまたはプラバスタチン存在下では、Hep細胞内のスクアレンは約28%47%、ラソステロールは約70%減少し、治療薬の主作用であるコレステロール生合成の抑制が認められた。この系を用いてポリフェノールの一種である(-)エピカテキンを評価した結果、ラソステロールが約20%減少し、コレステロール生合成抑制効果が認められた。脂質異常症の治療においては、体内のコレステロールの調節・制御が重要である。しかし、個々の臨床検体について、コレステロール合成・吸収・代謝の状態を迅速に評価する手法はこれまでに報告されていない。そこで、本研究ではメタボリック症候群の改善を「生体内のコレステロール調節」という視点から評価することを目的とし、コレステロール前駆物質を合成マーカー、植物ステロール類を吸収マーカー、ヒドロキシコレステロール類を代謝マーカーと位置づけ、血液中のこれらのマーカーを高感度かつ迅速に同時分析することによって治療薬の効果を評価する手法を確立する。平成20年度は、コレステロールの合成マーカーとしてコレステロール前駆物質であるラソステロール、吸収マーカーとして植物ステロール類(シトステロールおよびカンペステロール)を対象物質とし、GC-MSを用いてこれらを微量濃度まで再現性良く分離定量するための同時分析法を検討した。対象物質は血漿中で大部分がエステル化体であることから、総量を定量するため、血漿50μLに5mol/LのKOHを1mL加えて60°Cで60分間反応させてケン化処理を行った。処理液を中和しヘキサン抽出後、トリメチルシリル誘導体化を行いGC-MSで定量した。この多検体簡易定量法により、血漿中に多量に含まれるコレステロールなどの夾雑物質の妨害を受けることなく対象物質の迅速な定量を可能とした。定量下限値は0.05mg/dL、血液を用いた添加回収試験では9395%と良好な回収率が得られた。さらに、本法を用いて健常人と高コレステロール血症患者の血漿中合成マーカーおよび吸収マーカーを定量し、治療薬の服用に伴う合成/吸収バランスの変化について解析を試みた結果、各マーカー/総コレステロールの比率を用いる評価の有用性が示唆された。

一方、アトルバスタチンまたはプラバスタチン存在下では、Hep細胞内のスクアレンは約28%47%、ラソステロールは約70%減少し、治療薬の主作用であるコレステロール生合成の抑制が認められた。この系を用いてポリフェノールの一種である(-)エピカテキンを評価した結果、ラソステロールが約20%減少し、コレステロール生合成抑制効果が認められた。
IL-27サブユニットEBI3による炎症誘導時の新しい蛋白質発現の増強機構

生合成された蛋白質は、小胞体で分子シャペロンであるカルネキシンに結合し、蛋白質の正しい高次構造が形成される。最近、我々は、炎症誘導時には、IL-12関連サイトカイの共通サブユニットEBI3が発現誘導され、カルネキシンを介し、腸炎などの炎症性疾患の発症に重要なIL-23Rα鎖の蛋白質レベルで発現増強することを見出した。そこで、本研究は、定常状態では、カルネキシンが蛋白質の正しい高次構造の形成に重要であるが、炎症誘導時には、さらに、EBI3発現が誘導されカルネキシンと共にその標的分子の発現を増強するというこれまで考えられなかった炎症誘導時での新しい蛋白質発現の増強機構を広く一般化することを目指す。
ファージディスプレイ法を用いた機能性分子複合型ハイドロキシアパタイトの創製

本年度は、昨年度に引き続きハイドロキシアパタイトに結合するペプチド配列を探索するために、ファージディスプレイ法を用いたペプチドライブラリーからのアフィニティセレクションを行った。ハイドロキシアパタイトは、焼結法により、形状の異なる2種類(ロッド状・球状)の粒子を調製した。これら2種類のハイドロキシアパタイト粒子それぞれを標的とし、M13バクテリオファージ上に提示されたランダムペプチドライブラリーを作用させ、特異的に結合するペプチドを提示したファージプールに濃縮する操作を行った。ペプチドライブラリーはランダムペプチド鎖長が7残基または12残基の直鎖ライブラリーおよびランダム領域が7残基の環状ライブラリーを主に使用した。濃縮操作では、1)ハイドロキシアパタイトとファージライブラリーのインキュベーション、2)特異性の低いファージの洗浄除去、3)特異性の高いファージの溶出回収、の各段階において、条件(反応時間、反応液量、バッファー種、イオン強度、温度)について検討した。その結果、環状7残基ペプチドライブラリーから、ロッド状粒子に選択的に結合するペプチド配列を3種類、直鎖12残基ライブラリーから球状粒子に強くかつ選択的に結合する配列を2種類同定した。配列間に強い相同性は存在しないが、いずれの配列においても、水酸基を側鎖に有するアミノ酸が顕著に見られた。このことから、各ペプチドは水素結合を主としてハイドロキシアパタイトに結合するが、ペプチドのコンホメーションはそれぞれ異なることが示唆された。ハイドロキシアパタイト結合ペプチドと、他の研究により同定されたビニルポリマー結合ペプチドとの融合ペプチドを調製し、ポリマー薄膜上でハイロドキシアパタイトの集積を試みたところ、調製条件の制御により様々な面密度でハイドロキシアパタイト粒子の集積が可能であることが明らかとなった。本年度は、ハイドロキシアパタイトに結合するペプチド配列を探索するために、ファージディスプレイ法を用いたペプチドライブラリーからのアフィニティセレクションを行った。焼結法により、形状の異なる2種類(ロッド状・球状)のハイドロキシアパタイト粒子を調製した。ペプチドライブラリーはNew England Biolabs社製のランダムペプチド鎖長が7残基または12残基のライブラリーを使用した。その結果ハイドロキシアパタイトに対し特異性の高いファージプールを得るための諸条件の絞込みができ、各条件で濃縮した約20種類のファージプール得た。しかしながらいずれのプールに関しても特異性は高いものの、結合の強さに関しては、今後の複合材料化に際し必ずしも十分であるとは言えない点もあり、引き続き濃縮操作における条件の改良を進める必要がある。現段階で特異性の確認されたファージプールをもとに、クローニングし遺伝子配列決定を行った。その結果、出現頻度の高いアミノ酸として水素結合におけるプロトンドナーとなりうる側鎖を有するアミノ酸が多く存在することがわかった。しかしながら配列としての相同性はほとんど見られないことが分かった。