hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高圧電子顕微鏡による脳腫瘍細胞の立体観察

実験脳腫瘍細胞並びにヒトグリオーマ培養細胞の微細形態を立体的に観察し特に細胞骨格の存在形式及び分布を詳細に検討することを目的として、ヒトグリオーマ細胞株KNS-42を中心に研究を行なった。細胞はフォルムバール膜をはったサーモノックス板上に培養し、中間系フィラメントを検討すべく一次抗体として抗GFAP、抗ビメンチン、抗ニューロフィラメント抗体、および抗アクチン抗体を用い、二次抗体は大きさの異なる金コロイド粒子を結合した抗IgG(兎及びマウス)、およびプロテインAゴールドを用いて免疫電顕染色を行なった。アクチンフィラメントは細胞核を中心に放射状に分布しており、細胞質全体に広がってnetworkを形成していた。中間系フィラメントのうちGFAPは束状に走行する傾向があり、特に細胞突起には多数のフィラメントが、マイクロチュブルスと共に走り、突起の骨格を形成していた。KNS細胞にはビメンチンフィラメントも多く認められたが、形態上はGFAPフィラメントとの鑑別は不可能であり、免疫電顕法により初めて同定可能であった。ビメンチンフィラメントはGFAPほど束状に走らず、細胞突起よりも細胞質の中心に近い部分に比較的多い傾向が認められた。金コロイドの大きさを変えることにより、GFAPとビメンチンフィラメントの二重標識が可能であり、検索した範囲では殆んどの中間系フィラメントは抗原性を異にしていた。しかし、ごく一部の10nmフィラメント上には、立体観察により、5nmと15nmの二種類の金コロイド粒子が認められた。これらの結果から、大きさの異なった金コロイドを用いる免疫二重標識により、形態学的には鑑別不可能な細胞骨格の抗原性の違いを同定することが可能であるが、同一フィラメントが抗原性を共有しているか否かに関しては、更に詳細な検討が必要である。
医療行為の自動記録システムの構築

執刀医の手の動きを備え付けのビデオカメラで撮影,術中映像をプログラムで画像処理して「執刀医の手の動きと位置」「使用している術具と握り方」の自動検出,手術手技の同定,時系列データとして記録の実現を目指し,術中使用型モーションキャプチャーグローブと,手術映像の処理解析アルゴリズムを開発した.すべてを統合したシステムの構築し,検証用に開発した医療機器を行いて実験を行い,同定精度を中心にシステムの評価を行った.執刀医の手の動きを備え付けのビデオカメラで撮影,術中映像をプログラムで画像処理して「執刀医の手の動きと位置」「使用している術具と握り方」の自動検出,手術手技の同定,時系列データとして記録の実現を目指し,術中使用型モーションキャプチャーグローブと,手術映像の処理解析アルゴリズムを開発した.すべてを統合したシステムの構築し,検証用に開発した医療機器を行いて実験を行い,同定精度を中心にシステムの評価を行った.術中使用型モーションキャプチャーグローブの開発:手術手袋へのマーキングは,指部と手の甲に行うこととした.指部分のマーキングパターン案として,骨に沿った直線状のものを数種考案した.指の根元から指先までを一本の直線のもの,第1と第2関節のところで分かれているもの,第2関節のみで分かれているものを用意し,ビデオカメラで撮影した.その結果,案1はマーキングの直線状態が維持しづらく,案3は曲げた時にすべてが隠れてしまう部分が多いことから,案2が最適であった.手の甲の2箇所には,指と区別でき,かつ向きの判定がしやすいものを検討した.結果,逆T字のものが適当であった.マーキングの記入は,外科手術時に皮膚に切開線を描く青系色ペン(AZWELL Inc.製NESCO DERMARK)で行った.無害であること,影や血液,臓器と異系色であることが,本使用に適していた.黒色だとエッジ抽出の段階でマーカーと影の境界が消えてしまった.これに対し青系色は,色相画像に変換して処理することで,マーカーのみを抽出することに成功した.しかしながら,手の向きや姿勢,手袋の伸びや歪みによっては,マーキングが検出されないこともあった.そこで,画像処理に適したマーキングとして,指関節部分に直径1cmの黒円(塗りつぶし,つやなし)を,手の甲に1辺3cmの正方形黒色樹脂製ボードを貼り付けたものを採用した.これにより,手の向きや姿勢,手袋の伸びや歪みに影響されないマーキング検出が可能になった.手術映像の処理解析アルゴリズムの開発:手術室照明による影や他の物体との重なりのあるビデオ映像から,目的のマーキングや術具を抽出し必要な情報を獲得するアルゴリズムを開発した.モーションキャプチャーグローブを装着した状態で数例の外科手術を実施し撮影した.術具を並べてあるトレイの撮影も行った.手術室の照明を変えたり,数種のマーキングパターンやマーキングカラーのグローブを用意したりして撮影を行った.また,画像処理解析プログラムを作成した.プログラムでは,取得画像のエッジ検出, 2値化,膨張収縮(欠損部の補間),雑音除去(手袋のシワなどの除去),ラベリング(各部の番号付け),輪郭抽出(塗りつぶしのため),塗りつぶし(特徴量算出のため),特徴量算出(向き,長さ,位置などの計算)を実施した.計算結果の精度などにより,プログラムの評価を行い,アルゴリズムを完成させた.同時に手術手技データベースの更新実験も行った。検証用医療機器の開発と検証:処理解析アルゴリズムの検証のために,腹腔鏡下手術機器やカテーテル鉗子を作成した.直径1-2mm,全長1m以上でありながら,「強い把持力」,「先端屈曲と回転自由度」を有するマイクロ鉗子の設計,製作,評価を行った.すべてを統合したシステムの構築と検証を行った.術中に撮影,画像処理,手技の同定を統合したシステムを構築し,検証した.同定精度を中心にシステムの評価を行った.
多発神経炎における糖鎖の役割

我々は軸索再生阻害因子であるケラタン硫酸(KSPG)に注目し、炎症性脱髄性ポリニューロパチーの代表であるギラン・バレー症候群の動物モデルであるexperimental autoimmune neuritis(EAN)において、何らかの関連があるか、またKSPGが治療のターゲットとなるかを検討した。EANラットの運動機能は感作後9日目より麻痺を発症し、14-18日目でピークを迎え、25日目で麻痺は改善した。controlとEANの脊髄でのKSPGの発現をwestern blotで解析したところcontrolとEAN発症前に認めたが、EAN発症後消失し、感作後90日で発現回復を認めた。坐骨神経はcontrol、EAN共に発現を認めず、脊髄ではどのレベルにおいてもEANで発現が消失した。また、EANはM1、M2ともに増加、5D4は消失し、controlで5D4はM2とmergeしていた。脊髄よりミクログリアを単離しFACSを用いて解析したところEANではミクログリア数の増加とミクログリア上のKSの消失が同様に確認された。サイトカインの変動を解析したところEANではIFN-γ, IL1-β, TNF-αの炎症性サイトカインが上昇しIL-4, IL-10の抗炎症性サイトカインは減少していた。以上の検討よりKSPGはミクログリア上に存在し、EAN発症でミクログリアがKSを失うと活性化し、M1型の形質を獲得することにより炎症性サイトカインを発し、悪化させることが考えられた。我々は軸索再生阻害因子であるケラタン硫酸(KSPG)に注目し、炎症性脱髄性ポリニューロパチーの代表であるギラン・バレー症候群の動物モデルであるexperimental autoimmune neuritis(EAN)において、何らかの関連があるかを検討し、KSPGが治療のターゲットとなるか検討を行っている。次に組織学的検討として5D4(KSPG), Iba1(microglia), CD68(M1 microglia), CD206(M2microglia)の各抗体を使用し脊髄の免疫染色したところcontrolでは前角、前索に5D4の発現をIba1と共に認め、EAN発症後では5D4の消失とともにIba1は後角に強く発現。また、EANはM1、M2ともに増加し、controlで5D4はM2とmergeし、EANでは5D4は消失しており、脊髄よりミクログリアを単離しFACSを用いそのphenotypeを解析したところ同様な結果であった。以上の検討よりケラタン硫酸はミクログリア上に存在し症状に寄与している事が示唆された。目的及び方法に記載された実験系にはおおむね遂行され、さらなる検討を行う予定である。ControlとEANラットにおけるKSPGの発現についてさらなる解析を行うためにニューロン、アストロサイトなどの他の細胞上での発現、RNAレベルでの解析、KSPGの経時的な変化を探る。また、KS変化に関連しているサイトカイン、KS合成酵素をPCR法などで同定しKSPG消失の機序を探る予定である。これらを基としさらに解析を進めるため、初代培養microgliaのKSPG発現を確認、ケラタナーゼ処理し、KSPGをdown regulateし炎症性サイトカインが上昇するかどうかを確認、またサイトカイン投与によるKSPGの変化、microgliaの形態変化を解析しmicroglia上のKSPGの役割を探るKSノックアウトマウスへのEAN感作を行ったモデルで運動機能、組織学的検討を行い、EANにおけるケラタン硫酸がneuroprotectiveに作用しているかどうかを検討する。最終的にはEANモデルにKSPGを投与することで治療効果が得られるかを検討する。実験動物、それらの餌、ペプチド、糖鎖関連、抗体などの試薬、培養に必要な試薬、器具など実験を進めるうえで重要で必要な物品類の購入を計画している。それらのデータを集積するためのパソコン解析ソフトや備品類、国内外で行われる研究会、学会などでの情報収集や成果発表のための旅費としての使用用途を計画している。
組織のオープン化が問題解決・意思決定に与える影響の理論的・実証的研究

日本企業を取り巻く環境が大きく変動する中、組織外部との連携をしながら、革新的な製品・サービスを素早く、確実に実現することがますます求められるようになっている。本研究は、こうした組織のオープン化の職場レベルでの実態を、質問紙調査だけでなくTime Study、Text Analysis、Social Network Analysisなどの定量化手法を用いた綿密なフィールド調査で明らかにした上で、これらの調査結果をもとにAgent Based Simulationなどのモデリング手法により理論化するものである。特に、問題解決と意思決定に関する1)確実性、2)迅速性、3)創造性の3つの統合的視点から新たな組織理論を構築し、これらの手法によって客観性と一般性の担保された知見を、学術界のみならず、効果的なイノベーションやそのための組織デザインに課題を持つ実業界に広く提示することを目的とするものである。最終年度となる2018年度には、ある企業のオフィスで働く全社員(300名程度)を対象に、センサーを用いた行動データの取得、日誌法に依拠した従業員態度や認識に関するデータの取得を行い、それらのデータをAgent Based Simulationのソフトウェア上に実装することを試みた。これにより、以上のデータを社会ネットワーク・データへと展開することが可能となり、どのような社内ネットワークを持つ人材が高いパフォーマンス(問題解決と意思決定に関する確実性、迅速性、創造性)を発揮するのかを一定程度明らかにすることができた。これらの研究成果は、フィンランドにおける研究機関で開催されたワークショップにて発表済みであり、高い評価を得ることに成功し、当該機関との共同研究の推進につながることにもなった。本研究は、組織のオープン化の職場レベルでの実態を、綿密なフィールド調査で明らかにした上で、これらの調査結果をもとにAgent Based Simulationなどのモデリング手法により理論化することを目的としている。特に、問題解決と意思決定に関する1)確実性、2)迅速性、3)創造性の3つの統合的視点から新たな組織理論を構築することを狙っている。平成28年度では、組織のオープン化が問題解決にどのような影響を与えているのかについて、組織理論の古典的なモデルであるゴミ箱モデルを基礎としたシミュレーションを実施するとともに、実際の職場から得られた質問紙調査のデータを用いた実証分析により、既存研究にない知見を明らかにすることができた。この結果は、経営学分野における国際的にもトップとされるAcademy of Managementでの年次大会に応募し採択され(査読付き)、報告を行った。現在、国際ジャーナルへの投稿に向け準備中である。加えて、組織のオープン化につながる職場の物理的環境(オフィス)についても、質問紙を設計し、大規模な調査及び特定企業を対象とした調査を実施し、分析を進めているところである。また、オープン化が創造性にどのような影響を与えているのかについて、組織論分野の網羅的なレビューを実施するとともに、仮説設定及び質問紙設計を行い、インターネット調査会社を通じた大規模調査を実施した(サンプル数は3000名超)。こうしたレビューの結果については、『一橋ビジネスレビュー』のコラムとして一般向けにわかりやすく解説するとともに、質問紙調査の結果については、国際学会での発表に向けて分析を進めているところである。さらに、組織メンバーの入退出が組織成果にどのようなダイナミックな影響をもたらすのかについて、シミュレーション・モデルを構築し、一部書籍にまとめて出版することも行った。平成28年度は、当該研究の初年度であったにもかかわらず、一定の成果を上げることができるとともに、次年度以降につながる調査フィールドの開拓も一定程度行うことができたため。平成29年度では、組織の物理環境がオープンになるにつれてワークエンゲイジメントにどのような影響があるのかについて、3000名を超える企業や職種横断的な質問紙調査のデータを用いて分析し、書籍の一部としてまとめた。また、職場レベルでのオープンなコミュニケーションの活性化が企業の新製品開発の導入とどのように関連しているのかについて、日本の電機産業の100拠点近くのデータを用いて分析し、英文ジャーナル(査読付き)に掲載することができた。さらに、今年度は、創造性(クリエイティビティ)に力点を置いて既存研究のレビューおよびフィールド調査を実施した。3000名近いサンプル数を集めた企業や職種横断的な質問紙調査を行い、その成果は、2018年6月の組織学会で報告すると共に、国際的なジャーナルの論文投稿に向けて準備中である。また、既存研究のレビューについては『一橋ビジネスレビュー』に解説記事を連載して一般向けにもわかりやすく紹介することに努めた。加えて、ある企業の協力で、職場の行動データをセンサー技術を用いて取得するとともに、毎日質問に回答してもらうパルスサーベイを組み合わせた大規模な実験を実施し、ここで得られたいわゆる職場ビッグデータをもとにAgent Based Simulationによるモデル化も視野に、解析を進めているところである。平成29年度は、一部の成果については論文や書籍として公刊できたとともに、最終年度である次年度に繋がる調査データの取得をある程度できたため。

本研究は、こうした組織のオープン化の職場レベルでの実態を、質問紙調査だけでなくTime Study、Text Analysis、Social Network Analysisなどの定量化手法を用いた綿密なフィールド調査で明らかにした上で、これらの調査結果をもとにAgent Based Simulationなどのモデリング手法により理論化するものである。特に、問題解決と意思決定に関する1)確実性、2)迅速性、3)創造性の3つの統合的視点から新たな組織理論を構築し、これらの手法によって客観性と一般性の担保された知見を、学術界のみならず、効果的なイノベーションやそのための組織デザインに課題を持つ実業界に広く提示することを目的とするものである。最終年度となる2018年度には、ある企業のオフィスで働く全社員(300名程度)を対象に、センサーを用いた行動データの取得、日誌法に依拠した従業員態度や認識に関するデータの取得を行い、それらのデータをAgent Based Simulationのソフトウェア上に実装することを試みた。これにより、以上のデータを社会ネットワーク・データへと展開することが可能となり、どのような社内ネットワークを持つ人材が高いパフォーマンス(問題解決と意思決定に関する確実性、迅速性、創造性)を発揮するのかを一定程度明らかにすることができた。これらの研究成果は、フィンランドにおける研究機関で開催されたワークショップにて発表済みであり、高い評価を得ることに成功し、当該機関との共同研究の推進につながることにもなった。日本の現場組織の強みは今尚世界から注目されているところでもあり、本研究は当該分野を国際的にも牽引できる可能性を秘めている。また、本研究において収集されたデータはあまり類を見ない貴重かつ独自のデータとなっている。そこで、平成29年度は、平成28年度に得られた調査結果を国際学会・ジャーナルでの発表に積極的に取り組む予定である。加えて、平成29年度以降は、質問紙調査に限定されないような、職場のメンバー一人一人の具体的な行動やコミュニケーション・パターンを計測し、職場での問題解決や創造性にどのような影響をもたらしているのかについて定量的に分析をしていく予定である。実は、平成28年度中に、調査先企業から行動調査等について協力を得られる見通しが立っており、実現に向けて準備中である。さらに、既存研究へのレビューを継続的に実施するとともに、フィールドから得られた結果を理論化(シミュレーションを用いたモデル化)することにも順次着手していく予定である。そこで、平成30年度は、これまでに得られた調査結果を国際学会・ジャーナルでの発表に積極的に取り組む予定である。
ネットワーク構造への空間の導入による機能性エポキシ樹脂の創成

(1)ネットワーク構造中の空間の定量的評価法の確立と(2)光学、誘電、耐熱、および力学特性と導入された空間との関係を検討した。その結果、コナリー表面に囲まれた領域の体積とVan der Waals体積の差から、網目鎖内部および網目鎖間の空間を定量的に評価する方法を提案した。この方法により、多面体シルセスキオキサンは内部空間をほとんど持たず、その外部の芳香環により大きな分子鎖間空間を有することを明らかにした。この空間の導入は、屈折率や誘電率に大きな影響を示した。また、ガラス転移温度や弾性率は主鎖骨格部の充填密度に比例するのに対して、屈折率や誘電率は側鎖部を含めた網目鎖全体の充填密度の関数となることも明らかにした。本研究の目的は、エポキシ樹脂硬化物の網目鎖内部あるいは網目鎖間に導入した空間が、硬化物の誘電特性および光学特性におよぼす影響を明らかにすることである。1年目は、ラダー状、ケージ状およびダブルデッカー状シルセスキオキサン骨格エポキシ樹脂を汎用のビスフェノールA型エポキシ樹脂に配合した硬化物について、網目構造中の空間の大きさを見積もる手法を確立し、硬化物の密度や屈折率、誘電率などの特性との関係について検討した。まず、網目鎖の最安定構造を"半経験的分子軌道法(MOPAC)"により決定した。この最安定構造のVan der Waals体積をBondiの式を用いて求めた。さらに、この最安定構造上をメチル基が転がる時の表面(コノリー表面)が形づくる立体の体積とVan der Waals体積との差を算出した。これにより、網目鎖構造中のメチル基が侵入できない空間を見積もり、これを網目鎖の立体構造中に生じた空間の大きさとした。さらに、シルセスキオキサン骨格を含む網目鎖の繰り返し単位全体に対してコノリー表面が囲む空間の大きさを求め、Van der Waals体積との差から網目鎖間の空間の大きさを算出した。その結果、いずれのシルセスキオキサン骨格を持つ硬化物でも網目鎖構造の内部に生じる空間は、1030Å^3程度の小さなものであるのに対して、網目鎖間の空間には一桁以上大きな空間の生じることが示された。特にケージ状およびダブルデッカー状シルセスキオキサンではその外周の8個のベンゼン環により非常に大きな空間が生じた。この網目鎖構造中に生じた空間は、硬化物の密度および屈折率と誘電率に大きな影響を及ぼし、網目鎖中のケージ状およびダブルデッカー状シルセスキオキサンの濃度増加に伴ってこれらの値の明瞭な低下が観察された。本報告は、研究の2年目の成果報告にあたる。昨年度の研究で網目鎖内部あるいは網目鎖内部の空間の見積もりを行ったラダー状、ケージ状およびダブルデッカー状シルセスキオキサン(SQ)骨格エポキシ樹脂について、その酸無水物硬化系のガラス転移温度、弾性率、強靱性、および誘電率などの物性評価を行い、網目構造中に導入した空間の大きさとの関係について検討した。まず、汎用のビスフェノールA型エポキシ樹脂に上記3種のSQ骨格エポキシ樹脂を配合した硬化物の動的粘弾性特性を評価した。その結果、SQ骨格樹脂の配合量の増加に伴ってガラス転移温度Tgの低下することが示された。これは、網目鎖間への空間の導入にともなってエポキシ基の開環によって生じたヒドロキシエーテル(-CH2-CH(OH)-CH2-O-)部分の分子運動が容易となったことによるものとして説明される。ガラス状領域の弾性率は、硬化物の網目鎖の充填密度と良い相間を示し、充填密度の小さな系ほど低い弾性率を示した。これも、網目鎖間の空間の大きな系ほど弾性率の低下することを示しているものと考えられる。次いで、これらの硬化物の誘電特性を測定した。ケージ状およびダブルデッカー状SQ骨格エポキシ樹脂は、汎用エポキシ樹脂の誘電率(ε=3.02)に対してそれぞれε=2.65および2.69とかなり小さな値を示した。これは、分極の小さなSiO2構造の導入と同時に、分子鎖間に大きな空間を導入したことによって硬化物の誘電率が低下したものと考えられる。一方、ラダー状SQ骨格エポキシ樹脂はこれらの硬化物に比べて大きな誘電率を示した。この系には極性の大きな合成触媒が残存しているためと考えられ、誘電特性の比較は困難と考えられた。

本研究は、ネットワークポリマーの屈折率や誘電率を、網目鎖自体の構造や特性を変化させるだけでなく,網目鎖に導入した空間の大きさを変化させることによって制御することを目的としている。平成24年度には、高純度の4官能性エポキシ樹脂を様々な硬化剤で硬化し、その硬化物のガラス状態およびゴム状態での自由体積分率を評価すると同時に、硬化物の力学特性や光学特性と網目鎖の自由体積分率(即ち、充填密度)との関係を検討した。その結果、ガラス状態では網目鎖の化学構造とは無関係に、硬化物の充填密度は0.69の一定値を持つことが示された。一方、ゴム状領域の充填密度は網目鎖への側鎖の導入にともなって低下することが示された。この結果から、ネットワークポリマーが冷却過程でゴム状態からガラス状態へ転移する際に、等しい自由体積分率(即ち、充填密度)を保持した状態で網目鎖の運動が凍結され、硬化物がガラス化する事が明らかになった。これは、古典高分子物理での等自由体積論が、ネットワークポリマーにも成立することを示している。また、硬化物のガラス状弾性率は網目鎖間への空間の導入にともなって低下したが、その値は側鎖部を除いた主査骨格部の充填密度と良好な直線関係を示した。これは、試料にかかった応力を主査骨格部が担うためと考えられる。一方、屈折率も空間の導入にともなって低下したが、その値は側鎖部を含めた網目鎖全体の充填密度の関数となることが明らかにされた。即ち、網目鎖構造への空間の導入が、硬化物の物性によって異なった影響を与えることが明らかとなった。平成22および23年度の研究結果を論文にまとめた。現在、欧文誌(J. Mater. Sci.)に投稿し、審査が進行中である。平成24年度の成果についても,すでに学会発表を終え、論文を執筆中である。3種のシルセスキオキサン骨格エポキシ樹脂の3D構造と網目鎖内部あるいは網目鎖間に導入した空間との関係、この導入した空間の大きさと屈折率、誘電率、弾性率、およびガラス転移温度との関連性の検討は計画通りに終了した。しかし、ここで行った研究手法をより多くのネットワークポリマー系に適用して、結論の普遍性を検討することがまだできていない。これは、他のネットワークポリマー系の選定に時間を必要としたためである。昨年度後半にエポキシ樹脂と硬化剤の3D構造が明確で、その構造変化により硬化物の自由体積を制御可能な硬化系の選択を終了できた。本年度(最終年度)の研究により、この一連の硬化系にこの研究で開発した研究手法を適用することにより、網目構造中に導入した空間と上記の物性の関係を検討し、当初の研究計画を予定通りに達成できると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究は、シルセスキオキサンを骨格とする特殊なエポキシ樹脂について実施してきた。本年度は3D構造の異なる芳香族、脂肪族あるいは脂環式エポキシ樹脂を、多官能カルボン酸あるいはチオール基化合物を硬化剤として3D構造の異なる(即ち、網目構造に導入した空間量の異なる)硬化系を調製する。この一連の硬化系について自由体積を一次近似的に見積もると同時に、屈折率やアッベ数、誘電率と誘電損失、動的粘弾性特性を評価しする。これらの物理特性と自由体積の関係を検討することによって、これまでの研究によって得られたシルセスキオキサン骨格エポキシ樹脂系についての結論が、普遍性を持ってより一般的なエポキシ樹脂ネットワークにも成立するか否かを検証する。
植物のDNA倍加誘導におけるエピジェネティック制御メカニズムの解明

細胞分裂を伴わずにDNA複製を繰り返し、核DNA量を増やす特殊な細胞周期様式であるDNA倍加は、植物に広く見られる現象である。DNA倍加を起こすと劇的な細胞成長が起こるため、植物が効率よく器官サイズを増大させるのにDNA倍加は有効な戦略であると考えられる。しかし、DNA倍加の分子メカニズムの全貌は殆ど分かっていない。研究代表者はこれまでにDNA倍加にはDNA複製後の特定のステージ(G2期)での染色体構造の緩和が必須であり、それが特定のエピジェネティック修飾を介して行われている可能性を示唆する結果を得ている。しかし、その制御系は未知であった。まず、G2期の進行に中心的な役割を持つCDKB1を欠損した変異体のG2期核のクロマチン動態を観察した。その結果、cdkb1変異体ではヘテロクロマチンが緩和していることが明らかになった。このことから、CDKB1がG2期にクロマチン凝縮を促進する働きを持つことが示唆された。次に、CDKB1がG2期にヘテロクロマチン化を促進するメカニズムの解析を行った。CDKB1のリン酸化基質の同定を進めた結果、当初予想していたATXR6ではなく、ATXR6と協働してヘテロクロマチン化を促進する働きを持つCAF-1複合体の構成因子であるFAS1およびFAS2がCDKB1によって直接リン酸化されることを見出した。さらに、CDKB1によるFAS1とFAS2のリン酸化部位を同定した。現在、このリン酸化部位に変異導入し、リン酸化の生理的意義を明らかにする準備を進めている。これらの結果から、植物にはCDKB1-CAF-1複合体経路が存在し、G2期にクロマチンを凝縮させることで、分裂からDNA倍加への移行を阻害している可能性が示唆された。申請者は、G2期にCDKB1が活性阻害されATXR6の活性が低下し、H3K27me1が消失することで「有糸分裂型染色体構造(凝縮型)」から「DNA倍加型染色体構造(脱凝縮型)」へ変換し、DNA倍加への移行が可能になるとの着想を得た。つまり、CDKB1によるATXR6の活性化の有無が有糸分裂・DNA倍加移行への決定要因のひとつであるという可能性が強く考えられる。この新規な概念を確証するため、研究期間内に以下の点を明らかにしたいと考えている。1)G2期のH3K27me1低下の染色体構造への影響の解析;特定の細胞周期ステージを可視化するマーカラインを用いてG2期細胞での染色体構造の観察を行った。本研究ではDAPI染色によりセントロメリックなヘテロクロマチンの観察を行った。その結果、DNA倍加へ移行する細胞のG2期核ではヘテロクロマチンの減少が観察された。特にcdkb1変異体では顕著な低下が見られたことから、CDKB1がクロマチン構造を凝縮させる働きがあることが示唆された。2)変異体の作出によるATXR6のDNA倍加における役割;既存のatxr6変異体は機能が完全に欠損していないためH3K27me1の低下が顕著でない。そこで、ゲノム編集技術を用いてatxr6機能欠損変異体の作出を試み、完全な機能欠損変異体を得ることができた。現在表現型の解析を進めている。3)CDKB1-ATXR6経路によるH3K27me1を倍加移行時に抑制する仕組み;in vitroリン酸化アッセイを行い、CDKB1がATXR6を直接リン酸化するかを検証した。その結果、ATXR6はCDKB1によるリン酸化を受けないことが明らかになった。一方、ATXR6と協調的に働き、H3K27me1を伴うヘテロクロマチン化を促進する働きを持つFAS1がCDKB1によるリン酸化を受けることが明らかになった。当初の計画通り、DNA倍加に移行する際に、G2期にクロマチンが緩和することを明らかにすることができた。また、cdkb1変異体を用いた解析により、CDKB1はG2期のクロマチン構造を促進することでDNA倍加への移行を阻害することを示唆する結果が得られた。計画通り、atxr6機能欠損変異体を単離することができ、ATXR6のDNA倍加に対する役割を解析する準備が整った。一方、期待された「CDKB1によるATXR6のリン酸化による活性制御」は検出されなかった。このことから、CDKB1はATXR6以外の因子の制御を行うことでクロマチン構造を制御することが示唆された。一方、ATXR6と協調的にクロマチン構造を制御することが知られているFAS1がCDKB1によりリン酸化されることを突き止めた。以上の結果から、当初の予想とは異なり、CDKB1-FAS1経路という新規な経路によるDNA倍加移行制御メカニズムの存在が示唆された。以上より、おおむね順調に進展していると考えている。

まず、G2期の進行に中心的な役割を持つCDKB1を欠損した変異体のG2期核のクロマチン動態を観察した。その結果、cdkb1変異体ではヘテロクロマチンが緩和していることが明らかになった。このことから、CDKB1がG2期にクロマチン凝縮を促進する働きを持つことが示唆された。次に、CDKB1がG2期にヘテロクロマチン化を促進するメカニズムの解析を行った。CDKB1のリン酸化基質の同定を進めた結果、当初予想していたATXR6ではなく、ATXR6と協働してヘテロクロマチン化を促進する働きを持つCAF-1複合体の構成因子であるFAS1およびFAS2がCDKB1によって直接リン酸化されることを見出した。さらに、CDKB1によるFAS1とFAS2のリン酸化部位を同定した。現在、このリン酸化部位に変異導入し、リン酸化の生理的意義を明らかにする準備を進めている。これらの結果から、植物にはCDKB1-CAF-1複合体経路が存在し、G2期にクロマチンを凝縮させることで、分裂からDNA倍加への移行を阻害している可能性が示唆された。CDKB1がFAS1を直接リン酸化することが明らかになったので、今後はCDKB1-FAS1経路のDNA倍加阻害における重要性の検証を進めていく。1. cdkb1変異体でのG2期細胞のクロマチン動態の詳細な観察;今年度、細胞周期マーカーを用いてG2期細胞を同定し、ヘテロクロマチンの状態を観察することができた。しかし、細胞周期マーカーではG2期の同定に不十分である可能性が考えられる為、セルソーターを用いてG2期細胞のみを単離し、DAPI染色や免疫染色を行い、クロマチンの凝縮状態をより正確に評価していく予定である。2. CDKB1によるFAS1のリン酸化部位の同定;CDKB1がFAS1のどの部位をリン酸化するか、質量分析装置を用いて解析する。具体的には、大腸菌で産生させたFAS1をCDKB1によりリン酸化させるin vitro解析と、植物体内で発現させたFAS1-RFPを免疫沈降により精製し、質量分析に供するin vivo解析の二点を行う。3. CDKB1によるFAS1のリン酸化がDNA倍加に与える影響の評価;CDKB1がFAS1をリン酸化することがDNA倍加にどのような役割を持つかを明らかにするため、1で同定したFAS1のリン酸化部位を非リン酸化型にした変異型FAS1をfas1変異体に導入し、高倍数性の表現型が抑圧されるかどうか解析する。また、リン酸化部位を恒常的リン酸化型にしたFAS1をcdkb1変異体に導入し、cdkb1変異体の高倍数性の表現型が抑圧されるかを解析する。今後これらの解析を通じて、「細胞周期の進行」と「クロマチンの構造変換」を同調させる仕組みを明らかにし、未だ不明な点の多いDNA倍加移行メカニズムの全貌解明に迫りたいと考えている。平成29年度奈良先端科学技術大学院大学支援財団支援事業の対象となった。本助成はイネでDNA倍加を起こすことを目的としており、本科研費とは目的が異なるが、協調的に研究を進めた結果、当初予定したよりも支出額が少なくなった。平成30年度に関しては、申請時の計画通りの予算遂行を行う。
Polo-like kinaseによるSlingshot活性制御・生理機能の解明

アクチン細胞骨格の主要な制御因子であるコフィリンは、細胞分裂への関与が示唆されている。コフィリンの活性はコフィリンフォスファターゼであるSSH-1Lによる脱リン酸化により制御されている。SSH-1L結合タンパク質として同定されたPolo-like Kinase(Plk)は細胞分裂の制御に重要なタンパク質であることが知られている。本研究ではおもにSSH-1LとPlkの相互作用について研究を行った。本研究によってPlkのC末端polo-box領域とSSH-1Lが結合すること、両者の結合にはSSH-1Lのリン酸化が必要であること、PlkがSSH-1Lをリン酸化することを明らかにした。これらの結果は、PlkとSSH-1Lの相互作用があることを示しており、両者の相互作用が細胞分裂において重要な働きをしていることを示唆している。このほか、SSH-1Lの細胞内機能を明らかにするためにSSH-1L結合タンパク質として同定された14-3-3タンパク質とSSH-1Lとの相互作用を解析した。SSH-1Lリン酸化酵素の探索を行った。SSH-1Lと14-3-3タンパク質の結合にはSSH-1Lの978番目のセリンのリン酸化が必須である。そこで、この978番目のセリンのリン酸化酵素を発現クローニングにより探索した。その結果、CAMK I, IIおよびMAR KinaseをSSH-1Lリン酸化酵素として同定した。培養細胞内においてこれらのリン酸化酵素はSSH-1Lをリン酸化し、14-3-3タンパク質との結合を促進した。14-3-3タンパク質はSSH-1Lの活性を負に制御していることが知られており、これらのリン酸化酵素もSSH-1Lと14-3-3タンパク質との結合を促進することでSSH-1Lの活性を負に制御していること明らかにした。これはSSH-1Lの活性制御機構を明らかにする上で重要な発見である。アクチン細胞骨格の主要な制御因子であるコフィリンは、細胞質分裂への関与が示唆されている。SSH-1L結合蛋白質として同定されたPolo-like kinase(Plk)は細胞分裂の制御に重要な蛋白質であることが知られている。私はこれまでにin vitroにおいてPlkのC末端polo-box領域とSSH-1Lが結合することを明らかにした。SSHも細胞分裂に関与していることが当研究室で明らかにされており、SSH-1Lの酵素活性のない変異体の強制発現により収縮環近辺にアクチンの異常な蓄積が生じ、その結果多核になることが明らかになっている。そこで私は分裂期におけるPlkとSSH-1Lの相互作用について解析した。SSH-1Lが分裂期で複数カ所のリン酸化による活性の制御を受けていること、またPlkはリン酸化により細胞分裂の進行に影響を与えていることが報告されているのでPlkがSSH-1Lをリン酸化するか検討し、in vitroでPlkにより、SSH-1Lが直接、複数カ所リン酸化されることを明らかにした。これらの結果はPlkとSSH-1Lの相互作用が細胞質分裂に重要であることを示唆している。このほかSSH-1Lの細胞内機能を明らかにするためSSH-1L結合蛋白質として同定された14-3-3蛋白質とSSH-1Lの相互作用の解析を行った。14-3-3蛋白質はin vivoおよびin vitroにおいてSSH-1Lの活性を抑制した。また、SSH-1Lはアクチン線維と結合し、活性化することが報告されているが14-3-3蛋白質はSSH-1Lのアクチン線維への結合を抑制した。これらの結果は14-3-3蛋白質がSSH-1Lの活性、局在の制御に重要な働きをしていることを示唆している。SSH-1L結合タンパク質として同定されたPolo-like kinase(Plk)は細胞分裂の制御に重要なタンパク質であることが知られている。これまでにin vitroにおいてPlkのC末端polo-box領域とSSH-1Lとの結合、SSH-1Lが分裂期で複数カ所のリン酸化による活性の制御を受けていること、in vitroにおいてPlkによりSSH-1Lが直接、複数カ所リン酸化されることを明らかにした。そこで私はPlkとSSH-1Lとの関係、生理的な意味をさらに解析した。PlkとSSH-1Lの両者をHEK293T細胞に過剰に発現させると両者の結合が確認された。また、細胞質分裂時にPlk、SSH-1Lともに収縮環での局在の一致を確認した。これらの結果は、PlkとSSH-1Lの相互作用が細胞質分裂に重要であることを示唆している。このほかSSH-1Lの細胞内機能を明らかにするためSSH-1L結合タンパク質として同定された14-3-3タンパク質の細胞運動への影響を解析した。14-3-3タンパク質の野生型あるいは変異型をJurkat T細胞に発現させると野生型あるいは変異型ともにJurkat T細胞の細胞遊走を阻害した。これらの結果は、14-3-3タンパク質の適切な発現量、活性がSSH-1Lの活性制御を通じてアクチン細胞骨格、細胞運動に影響を及ぼしていることを示唆している。

コフィリンの活性はコフィリンフォスファターゼであるSSH-1Lによる脱リン酸化により制御されている。SSH-1L結合タンパク質として同定されたPolo-like Kinase(Plk)は細胞分裂の制御に重要なタンパク質であることが知られている。本研究ではおもにSSH-1LとPlkの相互作用について研究を行った。本研究によってPlkのC末端polo-box領域とSSH-1Lが結合すること、両者の結合にはSSH-1Lのリン酸化が必要であること、PlkがSSH-1Lをリン酸化することを明らかにした。これらの結果は、PlkとSSH-1Lの相互作用があることを示しており、両者の相互作用が細胞分裂において重要な働きをしていることを示唆している。このほか、SSH-1Lの細胞内機能を明らかにするためにSSH-1L結合タンパク質として同定された14-3-3タンパク質とSSH-1Lとの相互作用を解析した。SSH-1Lリン酸化酵素の探索を行った。SSH-1Lと14-3-3タンパク質の結合にはSSH-1Lの978番目のセリンのリン酸化が必須である。そこで、この978番目のセリンのリン酸化酵素を発現クローニングにより探索した。その結果、CAMK I, IIおよびMAR KinaseをSSH-1Lリン酸化酵素として同定した。培養細胞内においてこれらのリン酸化酵素はSSH-1Lをリン酸化し、14-3-3タンパク質との結合を促進した。14-3-3タンパク質はSSH-1Lの活性を負に制御していることが知られており、これらのリン酸化酵素もSSH-1Lと14-3-3タンパク質との結合を促進することでSSH-1Lの活性を負に制御していること明らかにした。これはSSH-1Lの活性制御機構を明らかにする上で重要な発見である。
抗HIV活性を有する異常アミノ酸含有ペプチドの合成と阻害能に関する研究

カリペルチンAの固相全合成を目指し、まず予備実験を兼ねたカリペルチンBおよびカリペルチンEの固相全合成を行った。構成する異常アミノ酸の安全にかつグラムスケール合成に優れる方法を開発した。つぎに調製したFmoc-異常アミノ酸類と入手可能なFmoc-アミノ酸を用いて固相上でペプチドの伸長実験を行った。その結果、カリペルチンEならびにカリペルチンBの全合成に成功した。今後、環状化の条件検討を引き続き行いながら、アナログ体合成についても行い、CCR5とのアンタゴニスト活性の測定を行っていく。今回は申請書に従い,カリペルチンAの全合成に向けた取り組みを行った。カリペルチンAの固相全合成を行う目的で,構成される異常アミノ酸の合成ならびにFmoc-アミノ酸への誘導を行った。Fmoc-N-MeAla-OHならびにFmoc-N-Me-Glnについては入手可能なFmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OHからホルムアルデヒドを用いた環状アミノエーテルに導き,ついてトリエチルシランによる還元的開環反応によって,定量的に合成することができた。次にFmoc-Allo-D-Thr-OH,Fmoc-diMethyl-Gln-OHについて,LあるいはD-セリンを原料に合成を検討した。すなわち,セリンの不斉炭素を用いて,ジアステレオ制御下に,メチル基の導入を行うことに成功した。その後,各々数工程を経て,目的とするFmoc-アミノ酸を合成することが出来た。この方法を用いれば,これらのアミノ酸全立体異性体の作り分けを大量スケールで行うことが可能であり,今後異常アミノ酸類の合成に有用な方法であると思われる。さらに立体化学が明らかとされていなかったβMeOTyrの4つの異性体合成を行った。立体化学の作り分けについては,Sharplessの不斉ジヒドロキシル化,不斉アジノヒドロキシル化反応を使い分けることをよって行うことができた。カリペルチンを構成するβMeOTyrの周辺のアミノ酸を含んだトリペプチドGln-βMeOTyr-N-Me-Ala-OMeを合成し,NMRによる解析実験によってその不明であった立体化学をR,R体と決定することができた,合成化学的に証明したはじめての報告となった。現在,残りの異常アミノ酸部分の大量合成法の確立ならびに固相合成法への展開を行っている。さらにアナログ体合成についても行い,CCR5とのアンタゴニスト活性の測定を行って行く予定である。今回は本科研費最終年度(2年目)であったが申請書に従い、カリペルチンAの全合成に向けた取り組みを行った。構成する異常アミノ酸であるβメトキシチロシンの合成については前回の報告で述べた。しかしながら、アジリジンを開環させながらメトキシ基を導入する反応について完全に制御されておらず問題があった。多くの条件を検討した結果、メタノール溶媒中において、室温下ボロントリフレートを滴下することにより立体選択性、化学収率ともに満足のいく結果が得られた。また再現性に優れており、グラムスケールでの合成法に展開することに成功した。3、4-ジメチルピログルタミンの合成についても大量合成法を確立した。この合成はセリンを出発原料に用いることで、保護基を多く用いる必要性があり、工程数に問題があるものの、安全にかつグラムスケール合成に優れている。このようにして調製したFmoc-異常アミノ酸類と入手可能なFmoc-アミノ酸を用いて固相上でペプチドの伸長実験を行った。まずカリペルチンEの合成を検討した。樹脂には2-ルロロトリチルルロリド樹脂を用い、カップリングを検討した。その結果、アミン成分がN-メチルアミンの時にはHATU、HOAtを用いる時がカップリング効率が高く、通常のアミン成分の時にはD正PC、HOBtで十分に反応が進行することがわかった。切り出しにはHFIP/ジククロメタンによって定量的に行うことができ、さらにTFA処理によって保護基を安全に除去することができた。HPLCによる精製によって、カリペルチンEの合成に成功した。次にカリペルチンBの合成を検討した。条件は、先と同様に行った。樹脂から切り出された後に環状デプシ化に挑戦した。様々な条件を検討したものの満足のいく結果をえることができなかった。しかしながら、微量ではあるものの望む環状化体も得ることに成功している。ここに、カリペルチンBの全合成を達成することができた。今後、環状化の条件検討を引き続き行い、効率の良い条件を探索する予定である。さらにアナログ体合成についても行い、CCR5とのアンタゴニスト活性の測定を行って行く予定である。
可欠アミノ酸の代謝要求量とde novo合成に関する研究

可欠アミノ酸の代謝要求量とde novo合成の関係を明らかにする事を目的に、de novo合成の必須性が明らかにされているセリンに着目し、様々な臓器におけるセリン濃度とセリン合成の律速酵素であるPHGDHの発現を異なる栄養状態と糖尿病ラットにおいて解析した。その結果、セリン濃度に最も大きく影響するのはタンパク質栄養であることが示された。また、糖尿病ラットでは血漿、肝臓、腎臓のセリン濃度が顕著に減少した。一方、PHGDHは解析した全ての臓器で発現しており、肝臓、小腸、筋肉ではタンパク質栄養に応答し変動するが、PHGDHの発現量と臓器のセリン濃度との相関は見られなかった。成長期および成熟期ラットにそれぞれの必要量満たすタンパク質食を普通食として低タンパク質食および高タンパク質食を与えてセリン合成の律速酵素である3ーホスホグリセリン酸脱水素酵素(PHGDH)の脳、肝臓、心臓、脂肪組織、大腿筋、脾臓、膵臓、精巣、骨髄における発現をPCRとウェスタンブロット法を用いて比較した。その結果、成長期および成熟期ラットとも肝臓、脂肪組織、大腿筋での発現はタンパク質栄養に応答し、必要量以上のタンパク質食摂取で、その発現が抑制されることが明らかとなった。他の臓器では発現変動は見られなかったがその発現量は様々であった。このことから、臓器特異的にセリンの要求量が異なり、それに応答して代謝酵素の発現が臓器特異的に制御されることが示唆された。一方タイムコース実験から、肝臓におけるmRNA発現変動は摂食直後から始まるが、酵素タンパク質量に反映するには48時間要することが明らかとなった。つまりタンパク質栄養の情報は摂食毎に認識されるが、新しいタンパク質栄養の環境に適応するには同じ餌を継続して摂取する必要があると考えられた。これらの結果の一部はアミノ酸学会で発表した。本研究はセリン合成の律速酵素である、3ーホスホグリセリン酸脱水素酵素(PHGDH)の1組織分布、2栄養状態、加齢、病態での発現変動、3組織内および血中セリン濃度を解析し、これまでほとんど明らかにされていない可欠アミノ酸の組織における代謝要求量とde novo合成、食餌による供給量の関係を明らかにする事を目的としている。H27年度の実績は1)H26年度の継続としてタンパク質栄養の影響を検討した。成長期および成熟期ラット肝臓における3ーホスホグリセリン酸脱水素酵素(PHGDH)の発現は必要量を境に低タンパク質食で促進され、必要量以上では抑制される。このときの血中アミノ酸濃度の変化を測定したところ、セリンの濃度が最も顕著に変化し無タンパク質(高糖質)食で他のアミノ酸と比較しても最も高くなり、餌のタンパク質含量の増加とともに顕著に減少した。このとき、セリン分解の律速酵素であるセリン脱水酵素(SDH)の発現も合わせて測定したところ、PHGDHとは対照的に必要量以上で餌のタンパク質含量に応答してその発現が誘導された。このことから血中セリン濃度は肝臓における二つの酵素の対照的な発現によって制御されていることが考えられた。2)糖尿病ラットの各種臓器におけるPHGDHの発現を検討した。その結果、肝臓で発現は抑制され、腎臓と小腸では促進されること。脳や精巣など他の臓器での発現は変化しないことを見出した。このとき腎臓と小腸に過形成が見られることから、PHGDHの発現促進がこのことと関与する可能性が示唆された。3)Leu過剰摂取によるアミノ酸インバランスにおける遺伝子発現の変化をゲノミックスにより解析してきたが、PHGDHの発現との関連について詳細に検討した結果を論文として発表した。1)本研究ではウェスタンブロットにおける解析を主たる手法としているが、新たに抗体を購入したところ検出感度が著しく低下し、その原因が新たに購入した一次抗体だけでなく二次抗体にもあったため、実験系の正常化に時間を費やした。2)専攻長としての業務以外に、27年度に入ってから入試業務および組織改編の準備委員長に任命されたため、学生の指導が十分に出来なかった。本研究では、典型的な可欠アミノ酸であるセリンに着目し、セリン合成の律速酵素である、3ーホスホグリセリン酸脱水素酵素(PHGDH)の1組織分布、2栄養状態、加齢、病態での発現変動、3組織内および血中セリン濃度を解析し、これまでほとんど明らかにされていない可欠アミノ酸の組織における代謝要求量とde novo合成、食餌による供給量の関係を明らかにする事を目的としている。最終年度はセリンの炭素骨格が解糖系の中間代謝物である3-ホスホグリセリンから供給されることから、糖質摂取量が臓器(脳、肝臓、腎臓、膵臓、小腸、脾臓、脂肪組織、筋肉、精巣)におけるPHGDHの発現とセリン濃度に与える影響を5%と言う低糖質食を与えることで検討した。また、これまで未完であった血漿およびそれぞれの臓器におけるアミノ酸濃度の測定を前年度に引き続いて行い完成させた。最終年度とこれまでの結果から以下のことが明らかとなった。1調べたすべての臓器でPHGDHの発現を認めた。2加齢ラットとの比較から肝臓ではPHGDHの発現がタンパク質必要量を境に変化すること。また、低タンパク質栄養では増加し高タンパク質栄養ではその発現がほとんど見られなくなることを示した。3糖尿病において肝臓のPHGDの発現は減少するが糖質摂取量による影響は受けないことが明らかとなった。4他の臓器のPHGDHの発現は栄養条件や糖尿病による影響はほとんど見られなかった。4肝臓ではPHGDHの発現変動に伴いセリンの濃度が変化した。

5低タンパク質栄養で肝臓以外の臓器ではPHGDHの発現に変化が見られなかったが、殆どの臓器でセリン濃度が増加していた。以上のことから、肝臓におけるセリン濃度はPHGDHの発現と一致することが示されたが、他の臓器においてはそのような相関は認められなかった。しかし、少なくとも低栄養状態でもセリン濃度が維持されることが明らかとなった。可欠アミノ酸の代謝要求量とde novo合成の関係を明らかにする事を目的に、de novo合成の必須性が明らかにされているセリンに着目し、様々な臓器におけるセリン濃度とセリン合成の律速酵素であるPHGDHの発現を異なる栄養状態と糖尿病ラットにおいて解析した。その結果、セリン濃度に最も大きく影響するのはタンパク質栄養であることが示された。また、糖尿病ラットでは血漿、肝臓、腎臓のセリン濃度が顕著に減少した。一方、PHGDHは解析した全ての臓器で発現しており、肝臓、小腸、筋肉ではタンパク質栄養に応答し変動するが、PHGDHの発現量と臓器のセリン濃度との相関は見られなかった。当初、研究室分属の4回生1名と実施予定であったが、当人の事情で分属が取り下げられたため、予定していた研究組織を組むことが出来なくなった。そのため、1回の実験で全ての組織をとる予定であったが、それを2回に分けたため予想以上に時間を費やすこととなった。現在、各組織および血中のアミノ酸分析を実施中であるが、セリン投与の実験はまだ行っていない。1)タンパク質栄養実験で、各組織におけるアミノ酸組成の分析が分析途上で完了していないので、これを完了する。2)糖尿病ラットの各組織におけるアミノ酸組成の分析が分析途上で完了していないので、これを完了する。3)加齢実験では、飼育の開始が遅れ現在飼育中であるので、飼育が終了次第解析に移る。農学本年度は博士課程編入学の学生1名と共に前年度未達の実験と本年度予定の実感を以下のように行う。1)前年度に計画された実験で未達のものとして、(1)各臓器および血中アミノ酸分析を継続して行う。(2)セリン過剰投与の影響を検討する。ただし、当初全ての臓器を解析する予定であったが、肝臓、精巣、心筋など、発現応答や発現量が特徴的な臓器の解析に限定する。2)27年度に計画されている実験を予定通り実施する。具体的には(1)加齢による代謝要求量の変動を解析するため、長期飼育を開始する。(2)脂質栄養の影響を検討する。1)H27年度に予定外の本務業務が増え、十分に学生を指導出来なかったため。2)ルーチンで行っていたウェスタンブロットが購入した一次抗体、二次抗体が十分機能せず、ロット選択に時間を要したため。学生の分属取りやめにより当初予定の研究組織が組むことが出来ず、実験が遅延したため。博士課程2回生の学生1名とともに前年度未達の実験と本年度予定の実験を以下のように行う。1)ウェスタンブロットによる解析と各臓器のアミノ酸分析が解析途上にあるので、これを継続して行う。2)28年度に計画されていた糖尿病ラットの解析を27年度に開始したため、27年度に予定されていた脂質栄養の影響を検討を本年度に行う。