hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高速ラマンイメージング技術の開発と生細胞への応用

本研究の目的は、ラマン顕微分光法をイメージング手法として成熟させ、ラマン・イメージの取得時間を著しく短縮することである。平成23年度における、本研究の成果としては、次のとおりである。1.CARS分光顕微鏡の生細胞への応用。動物細胞への界面活性剤の作用について、時間分解測定を行い、ラマン分光イメージとしてそれらの動的挙動の追跡を行った。それにより、界面活性剤が細胞内に数10mMの濃度で蓄積していることが示唆された。さらに、細胞内膜輸送に関係する微小管の生成を阻害する薬剤を滴下し、同様の実験を行った。薬剤を滴下しない場合と比較して、有意に界面活性剤の蓄積速度が減衰した。これにより、界面活性剤の細胞内への取り込みに、細胞内膜輸送が関係していることが示唆された。これは、従来の顕微鏡技術では観測できなかった分子のダイナミクスであり、本研究で製作した広帯域のラマンスペクトルを高速で取得できる装置によって、はじめて明らかになった。また、本研究で開発した、CARS分光顕微鏡と最大エントロピー法を組み合わせる技術によって、細胞内の分子濃度を定量的に見積もることに成功した。2.ラマン分光イメージングの絶対定量化の試み。前年度の研究をさらに発展させ、さまざまな生体分子について、それらのラマンバンドの絶対ラマン散乱断面積を求め、それを用いることで、生体分子の生体中濃度を見積もった。シトクロムbおよびc、フェニルアラニン残基、核酸(DNAおよびRNA)、脂質分子の濃度を見積もった。また、生体中の脂質分子の不飽和度をレーザー焦点中の平均値として見積もることに成功した。これは、従来の蛍光顕微鏡などの方法では得ることのできない情報である。また、2つの国際会議、及び2つの国内会議に出席、発表を行い、他の研究者との交流を深め、研究に関する示唆を得た。本研究の目的はラマン顕微分光法の成熟であり、高速化に主眼を置いてきた。本研究ではそれにとどまらず、生細胞内の生体分子濃度を非染色で見積もる、絶対定量分子イメージングを行った。これは、他手法では得られなかった情報であり、本研究で新たに提案された手法である。本研究では顕微ラマン分光法の高速化、および顕微ラマン分光法による絶対定量分子イメージングを行った。これらを組み合わせることによって、高速かつ絶対定量的な分子イメージング手法が達成されると期待される。そのためには、次のような課題がある。1.多焦点共焦点顕微ラマン分光法については、各焦点の体積を正確に見積もる必要がある。2.CARS顕微ラマン分光法については、コヒーレンス長の見積もり、および位相整合条件の検討、分子の非線形感受率の決定などがあげられる。平成21年度における、本研究の成果としては、次の3つがあげられる。1.CARS分光顕微鏡の継続的開発。さまざまな光学部品を細部まで検討した結果、生細胞における10um四方の領域を、およそ20秒程度で明瞭なイメージを得ることに成功した。特に、CARS顕微鏡において懸案であった、信号が微弱かつ形状が複雑な指紋領域の信号を明瞭に取得し、イメージを得ることに成功した。2.CARS分光顕微鏡の定量化。最大エントロピー法及び特異値解析法という、統計的、情報的手法を用いることで、ラマンスペクトル中の信号・ノイズ比を大幅に改善した。また、物質濃度に比例した、定量的な情報を得ることに成功した。3.直接ラマンイメージング技術の継続的開発、多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の開発に向けた基礎的な実験。自発ラマン散乱を用いた直接ラマンイメージング技術を進展させ、信号強度の強いCH伸縮振動領域において、1秒程度で生細胞の明瞭なラマン・イメージを得ることに成功した。また、平成22年度予定の多焦点焦点ラマン分光顕微鏡の開発のために、共焦点効果の評価や多焦点化の方法について、大きな知見を得た。多焦点化し、さらに共焦点効果を用いることで、生細胞の指紋領域の信号が明瞭に得られることがわかった。また、2つの国際会議、及び1つの国内会議に出席、発表を行い、他の研究者との交流を深め、研究に関する示唆を得た。平成22年度における、本研究の成果としては、次のとおりである。1.CARS分光顕微鏡の継続的開発および生細胞への応用。生細胞における10um四方の領域を、およそ10秒程度で明瞭なイメージを得ることに成功した。それにより、酵母細胞のレーザー照射の影響による死過程、また、動物細胞への界面活性剤の作用について、時間分解測定を行い、ラマン分光イメージとしてそれらの動的挙動の追跡を行った。2.多焦点共焦点顕微ラマン分光法の開発。さまざまな技術的困難を克服し、多焦点照射を行い、各焦点について共焦点効果を用い、かつそれぞれの焦点からのラマン散乱光を分光して別々にスペクトルを得ることに成功した。これにより、48点の同時ラマンスペクトル測定が可能となった。この装置を出芽酵母細胞に対して応用し、指紋領域において10数秒にて32x24um四方の領域のラマン分光イメージングを達成した。3.ラマン分光イメージングの絶対定量化の試み。

さまざまな生体分子について、それらのラマンバンドの絶対ラマン散乱断面積を求めた。それを用いることで、生細胞中に含まれる、シトクロム類やアミノ酸など、さまざまな生体分子の絶対数、濃度を決定することに成功した。また、2つの国際会議、及び2つの国内会議に出席、発表を行い、他の研究者との交流を深め、研究に関する示唆を得た。本研究の目的は、ラマン顕微分光法をイメージング手法として成熟させ、ラマン・イメージの取得時間を著しく短縮することである。平成23年度における、本研究の成果としては、次のとおりである。1.CARS分光顕微鏡の生細胞への応用。動物細胞への界面活性剤の作用について、時間分解測定を行い、ラマン分光イメージとしてそれらの動的挙動の追跡を行った。それにより、界面活性剤が細胞内に数10mMの濃度で蓄積していることが示唆された。さらに、細胞内膜輸送に関係する微小管の生成を阻害する薬剤を滴下し、同様の実験を行った。薬剤を滴下しない場合と比較して、有意に界面活性剤の蓄積速度が減衰した。これにより、界面活性剤の細胞内への取り込みに、細胞内膜輸送が関係していることが示唆された。これは、従来の顕微鏡技術では観測できなかった分子のダイナミクスであり、本研究で製作した広帯域のラマンスペクトルを高速で取得できる装置によって、はじめて明らかになった。また、本研究で開発した、CARS分光顕微鏡と最大エントロピー法を組み合わせる技術によって、細胞内の分子濃度を定量的に見積もることに成功した。2.ラマン分光イメージングの絶対定量化の試み。前年度の研究をさらに発展させ、さまざまな生体分子について、それらのラマンバンドの絶対ラマン散乱断面積を求め、それを用いることで、生体分子の生体中濃度を見積もった。シトクロムbおよびc、フェニルアラニン残基、核酸(DNAおよびRNA)、脂質分子の濃度を見積もった。また、生体中の脂質分子の不飽和度をレーザー焦点中の平均値として見積もることに成功した。これは、従来の蛍光顕微鏡などの方法では得ることのできない情報である。本研究の目的はラマン顕微分光法の成熟であり、高速化に主眼を置いてきた。本研究ではそれにとどまらず、生細胞内の生体分子濃度を非染色で見積もる、絶対定量分子イメージングを行った。これは、他手法では得られなかった情報であり、本研究で新たに提案された手法である。本研究では顕微ラマン分光法の高速化、および顕微ラマン分光法による絶対定量分子イメージングを行った。これらを組み合わせることによって、高速かつ絶対定量的な分子イメージング手法が達成されると期待される。そのためには、次のような課題がある。1.多焦点共焦点顕微ラマン分光法については、各焦点の体積を正確に見積もる必要がある。2.CARS顕微ラマン分光法については、コヒーレンス長の見積もり、および位相整合条件の検討、分子の非線形感受率の決定などがあげられる。
極小曲面による3次元アレクサンドロフ空間の分類理論の創始

今年度の研究の結果,次の点が明らかとなった.・曲率が下に有界な3次元コンパクト・アレクサンドロフ空間において極小曲面を構成するためには,そのような空間にリプシッツ構造を構成する必要があった.これに関して,一点からの距離関数の一般化された意味の積分曲線のリプシッツ性が得られた.とくに,2次元の場合には距離球にリプシッツ構造が入るので,アレクサンドロフ曲面にはリプシッツ構造が入ることが分かった.3次元において問題となるのは,距離球にリプシッツ構造を構成する点である.これは2次元の場合の結果を拡張することで実現出来そうである.従って,これまでの研究の結果により,3次元アレクサンドロフ空間にリプシッツ構造を構成する問題は,かなり現実的に解決可能な問題となってきた.・上記問題と少し関連して,絶対全曲率が押さえられた曲面が,測度つきグロモフハウスドルフ収束に関する収束,崩壊の具体的な記述が可能となった(堀敦彦氏との共同研究).来年度中に論文を完成させる予定である.・最大の頂点数をもつコンパクト非負曲率アレクサンドロフ空間の等長類の分類については,数学的には出来ているのだが,本年度は論文を完成する時間的余裕がなかった.来年度中に完成させる予定である.コンパクト非負曲率アレクサンドロフ空間の頂点(尖った本質的特異点)の数の精密な評価は,本研究計画の一つであった.これについて,6月のOberwolfach研究集会において,Guijaro氏(Madrid)からの指摘で,既にPerelman氏(St.Petersburg)が結果を得ていることが分かった.しかしこれを大きな契機として,最大の頂点数をもつコンパクト非負曲率アレクサンドロフ空間の等長類の分類が得られた.来年度中に論文を完成する予定である.この結果に関連して,正曲率をもつコンパクト・アレクサンドロフ空間の頂点数の精密評価,また最大頂点をもつそのような空間の分類などが次の課題となった.曲率が下に有界な3次元コンパクト・アレクサンドロフ空間において極小曲面を構成することを今年度の第一目的としていたが,6月のグロモフ氏(IHES)との議論により,当初研究計画通りアレクサンドロフ空間のリプシッツ同相写像の変形理論を少なくとも3次元において構築することが必要である,との確信をもつに至った.古典的プラトー問題に対するDouglas-Morreyの解法が,どの程度アレクサンドロフ空間に対して適用可能かを探求したが,この問題は出発点において上記のリプシッツ同相写像の変形理論と密接に関係するため,来年度以降の地道な研究計画の継続が必要である.●昨年度までの研究により,曲率が下に有界な3次元コンパクト・アレクサンドロフ空間において極小曲面を構成するためには,まずアレクサンドロフ空間のリプシッツ同相写像の変形理論を少なくとも3次元において構築することが必要であることが判明していた.これに関して,アレクサンドロフ空間の一点からの距離関数の一般化された意味の積分曲線のリプシッツ性に関するヒントが得られた.とくに,距離球にリプシッツ構造が入り,リプシッツ同相写像の変形理論がリプシッツ多様体に対して適用出来ればアレクサンドロフ空間のリプシッツ同相写像の変形理論を確立することが可能となる.更に低次元のアレクサンドロフ空間にリプシッツ構造を入れる方法について,明確で実現可能と思われる手法を見つけることができた.来年度これらの具体的に実現可能となった問題に着手したい.●最大の頂点数をもつコンパクト非負曲率アレクサンドロフ空間の等長類の分類が,実質的には昨年度の研究により得られていたが,本年度は論文を完成する時間的余裕がなく,来年度中に完成させる予定である.正曲率をもつコンパクト・アレクサンドロフ空間の頂点数の精密評価,また最大頂点をもつそのような空間の分類なども解明したい.今年度の研究の結果,次の点が明らかとなった.・曲率が下に有界な3次元コンパクト・アレクサンドロフ空間において極小曲面を構成するためには,そのような空間にリプシッツ構造を構成する必要があった.これに関して,一点からの距離関数の一般化された意味の積分曲線のリプシッツ性が得られた.とくに,2次元の場合には距離球にリプシッツ構造が入るので,アレクサンドロフ曲面にはリプシッツ構造が入ることが分かった.3次元において問題となるのは,距離球にリプシッツ構造を構成する点である.これは2次元の場合の結果を拡張することで実現出来そうである.従って,これまでの研究の結果により,3次元アレクサンドロフ空間にリプシッツ構造を構成する問題は,かなり現実的に解決可能な問題となってきた.・上記問題と少し関連して,絶対全曲率が押さえられた曲面が,測度つきグロモフハウスドルフ収束に関する収束,崩壊の具体的な記述が可能となった(堀敦彦氏との共同研究).来年度中に論文を完成させる予定である.・最大の頂点数をもつコンパクト非負曲率アレクサンドロフ空間の等長類の分類については,数学的には出来ているのだが,本年度は論文を完成する時間的余裕がなかった.来年度中に完成させる予定である.
中国現代詩における詩意生成のメカニズム

1.「中国現代詩国際学術シンポジウム及び朗誦会」の開催(2006年11月)2006年11月18日、駒澤大学において中国から詩人2名及び学者・詩歌評論家1名を招聘して、標記シンポジウム(第一部)と朗誦会(第二部)を行った。「詩意」をキーワードに行われた各氏報告について、中国現代詩を専門とする学者四氏が論評を加えた。同シンポジウムを通して中国同時代詩歌の状況が浮き彫りにされた他、民国期の新詩における審美意識(=詩意)の変遷、現代旧体詩が提起する複雑な問題等が提起され、有意義な討論が行われた。また、第二部朗誦会において、詩人の肉声による近作自作詩の朗誦は大いに好評を博した。2.定例研究会活動の充実と会誌『九葉読詩会』第3号の刊行(2007年11月)現代詩を読む定例研究会では、北京大学中文系副教授王風氏に参加を依頼し、主に1940年代昆明の西南聯合大学を拠点に活動した詩人「九葉派」の作品を読んだ。これは、日中の研究者が共同して中国現代詩の読解にあたり、テーマを深めつつ共有する絶好の場となった。平成19年11月には、「九葉派」の代表的詩人穆旦について、上海復旦大学中文系教授張新頴氏に関係論文の執筆を依頼し、穆旦特集を組む研究会誌『九葉読詩会』第3号を刊行した。同誌は、論文・箋注・エッセイ・翻訳等多岐にわたる研究スタイルにより、従来の中国現代詩研究にはない新たな視座を提供するものとして多くの現代文学研究者の好評を得た。今後も中国人研究者を交えた研究会活動及び研究会誌の刊行を継続したい。1.「中国現代詩国際学術シンポジウム及び朗誦会」の開催。2006年11月18日、駒澤大学において、中国から詩人2名(王家新、孫文波)及び学者・詩歌評論家1名(呉思敬)を招聘して、標記シンポジウム(第一部)と朗誦会(第二部)を行った。「詩意」をキーワードに報告を行ったのは、前記三氏の他、現在東京大学駒場で教鞭をとる詩人臧棣(北京大学)と坂井洋史(一橋大学)の二氏。各氏の報告に対しては、中国現代詩を専門とする学者四氏(是永駿、加藤三由紀、林少陽、蘭明)が論評を加えた。同シンポジウムを通して中国同時代詩歌の状況が浮き彫りにされた他、民国期の新詩(口語自由詩)における審美意識(=詩意)の変遷、現代旧体詩が提起する複雑な問題等が提起された。また、第二部朗誦会の詩人の肉声による近作詩の朗誦は、日本ではほとんど聞く機会がないため、シンポジウム参加者から大いに好評を博した。2.「九葉読詩会」(中国現代詩を読む研究会)の定例活動の充実。中国現代詩の展開にエポックを作った民国期の学者・詩人の一人兪平伯の著『読詞偶得』(1934年初版、1947年修訂版)を標記研究会で輪読した。1920年代「新詩」を積極的に提唱し、自らも実践した文学者が、古典詩歌の名篇である旧体詩詞をどのように読んでいるかを通して、その審美意識の根底にあるものを考察しようと試みた。

また、9月の例会では同時代詩壇をリードする詩人・評論家である臧棣氏(北京大学)を招き、その現代詩歌観と創作態度について語ってもらい、あわせて具体的作品についての質疑も行った。1.定例研究会活動の充実と会誌『九葉読詩会』第3号の刊行現代詩を読む定例研究会では、北京大学中文系副教授王風氏(金沢大学が外国人教師として招聰中)に参加を依頼し、主に1940年代昆明の西南聯合大学を拠点に活動した詩人(後に「九葉派」とよばれる)の作品を読んだ。これは、日中の研究者が共同して中国現代詩の読解にあたり、テーマを深めつつ共有する絶好の場となった。平成19年11,月には、「九葉派」の代表的詩人穆旦について、上海復旦大学中文系教授張新頴氏に関係論文の執筆を依頼し、穆旦特集を組む研究会誌『九葉読詩会』第3号を刊行した。同誌は、論文・箋注・エッセイ・翻訳等多岐にわたる研究スタイルにより、従来の中国現代詩研究にはない新たな視座を提供するものとして多くの現代文学研究者の好評を得た。今後も中国人研究者を交えた研究会活動及び研究会誌の刊行を継続したい。2.民国期(19201930年代)の新聞副刊の調査平成19年9月、関係資料(文学雑誌及び新聞の文芸欄)の調査・収集のため、主に北京の諸研究機関-北京大学図書館、北京国家図書館、首都師範大学新詩研究中心を利用した。その際、北京大学中文系高遠東副教授他関係者より研究指導及び専門知識の供与を受けた。特に1920年代末の『華北日報』副刊の現物閲覧により、主編楊晦を要とする文学サークルが20年代北京文壇(「京派」)の形成に大きな役割を果たしていることが明らかになった。
低分子バイオプローブの開発とそれを用いた細胞内情報伝達因子のプロテオーム解析

生物の機能を解明するためには、ゲノム科学研究と構造生物学研究に代表されるような生物を構造の面から解析する方法と、生化学的手法(阻害剤)を用いて機能発現に必要な蛋白質を同定解析する方法が存在する。本課題研究では、有機化学的手法で生命現象を解き明かすために、細胞内情報伝達系の新しい調節物質(バイオプローブ)を創製すること、さらに化学生物学的手法によりその細胞内標的分子(ターゲット)を明らかにすることを目的として研究を行った。得られた主な成果を以下にまとめた。1.細胞内分子標的の同定・プロテオーム解析(1)細胞内情報伝達阻害剤と標的蛋白質の相互作用を明らかにするために、標的蛋白質を精製して、低分子化合物との相互作用を解析する低分子マイクロアレー法を開発した。(2)Phoslactomycinと標的蛋白質(セリンスレオニンホスファターゼ2A ; PP2A)の結合部位(アミノ酸残基)を決定した。(3)ミトコンドリアに局在する熱ショック蛋白質Hsp60とその阻害剤epolactaeneとの相互作用を分子レベルで明らかにした。2.細胞内情報伝達阻害剤の探索(1)放線菌におけるPhoslactomycinの生合成経路を明らかにし、目的とする誘導体を創出する技術を確立した。(2)血管内皮細胞をモデル系として増殖因子(VEGF)阻害剤を探索して、新規化合物RK-805やepoxytwinolなどを見出した。3.標的分子の分子遺伝学的解析(1)細胞周期の調節酵素WeelAが、細胞周期依存的に特定のアミノ酸残基のリン酸化を受け、それを認識するユビキチンリガーゼ(SCF6-TrCP複合体)によってユビキチン化された後、プロテアソーム依存分解されることを明らかにした。プロテインキナーゼWee1は、細胞分裂期(M期)の開始・進行に中心的に働くCdc2を、M期開始の準備が整うまでリン酸化により不活性化状態に保つ役割を有する。M期開始時にヒト体細胞型Wee1(Wee1Hu/Wee1A)は、タンパク質リン酸化および分解によって不活性化されることが知られている。我々は、出芽酵母およびヒト培養細胞を用いた解析により、Wee1はユビキチンリガーゼSCF^<β-TrCP>でユビキチン化され、プロテアソーム依存に分解されることを明らかにした。Wee1AにはIκB、βカテニンなどに知られるβ-TrCPの結合コンセンサス配列(D(p)SGXX(p)S)は存在しないが、β-TrCP結合のコンセンサス配列と類似した複数の領域が結合に関与しており、領域中のセリンのリン酸化が結合に必須であることを明らかにした。さらにM期開始時に活性化されるCdc2およびPlkl(Polo like kinase 1)がこの結合に必要なセリンをリン酸化すること、これらのリン酸化酵素が実際にWee1Aとβ-TrCPの結合を促進することを確認した。低分子バイオプローブおよびRNAiを用いた実験から、Wee1Aのユビキチン化依存的な分解がM期開始に必須であることも明らかになった。また、細胞内情報伝達を制御するバイオプローブ(エポキシキノールB)をヒト血管内皮細胞に処理した際に変化する遺伝子およびタンパク質をcDNAマイクロアレイと2次元電気泳動により解析を行った。いくつかの遺伝子発現に変動が見られたので、今後、その評価を行う。生物の機能を解明するためには、阻害剤を用いて機能発現に必要な蛋白質を同定解析するケミカルバイオロジーの方法が存在する。

本課題研究では、有機化学的手法で生命現象を解き明かすために、細胞内情報伝達系の新しい調節物質(バイオプローブ)を創製すること、さらに化学生物学的手法によりその細胞内標的分子(ターゲット)を明らかにすることを目的とし、有機化学と化学生物学を融合したメタボロームおよびプロテオーム解析により以下の研究を行った。1.標的タンパク質と薬剤との相互作用解析細胞周期調節タンパク質Weelおよびその部位特異的変異遺伝子を大腸菌で大量発現させ、Weelタンパク質の立体構造解析を行った(継続中)。また、Weelタンパク質の分解には、特定のアミノ酸配列を認識してユビキチン化するSCF複合体が結合することが必要である。SCF複合体が結合するために必要なアミノ酸配列を決定し、さらに、そのアミノ酸部位を細胞周期の進行と連動してリン酸化する酵素としてCDK1、PLK、CKを同定した。これらの酵素によってリン酸化されたWeelがユビキチン化酵素と結合し、その後プロテアソーム依存的に分解されることを明らかにした。2.タンパク質構造に基づく阻害剤のデザインこれまでの研究で、我々はホスファターゼ阻害剤としてRK-682を見出していたが、今回ヘパラナーゼも阻害することを見出した。ホスファターゼとヘパラナーゼの活性中心の構造を比較検討することにより、RK-682の4位を化学修飾するとヘパラナーゼ特異的阻害剤となることが予測された。実際に、4位にベンジル基を導入した類縁体を合成し阻害活性を測定した結果、Bz-RK-682はヘパラナーゼ阻害剤として優れた特異性を示すことを明らかにした。
レポーター遺伝子導入マウスを用いた間葉系幹細胞の発生系譜に関する検討

胎生期の原腸陥入の時期における初期の中胚葉由来の細胞をトレース可能となったMesp1-cre/CAG-EGFPマウスの骨髄をフローサイトメーターにて解析した結果、Mesp1+,Mesp1-どちらの分画にもPDGFRα+/Sca-1+の間葉系幹細胞(MSCs)集団が存在していることが分かった。そしてどちらの分画からも分化誘導実験及び遺伝子発現解析から、脂肪・軟骨・骨へ分化するMSCsをクローナルに分離することが可能であった。以上より、中胚葉由来の細胞中に、MSCsの性質を有する細胞が存在していることが確認できた。またMesp1-cre/CAG-EGFPマウスの骨髄細胞を用いて、神経堤系細胞への分化能解析を行った結果、中胚葉由来であるはずのMesp1-分画の細胞は、神経堤細胞の分化条件下でMesp1-分画の細胞(神経堤由来幹細胞を含む)と同様に神経・グリア・平滑筋という神経堤系統への分化能を有しており、分化誘導前の状態で、神経堤幹細胞マーカーとして知られるP75,Snail,Sox9を発現していることが分かった。Mesp1陽性細胞は神経堤幹細胞マーカーとして知られるPOの発現とは発生の段階で重ならないことが分かっており、Mesp1陽性の中胚葉由来MSCsは、神経堤由来では無いにも関らず、神経堤系統への分化能を有していたこととなる。これまでの研究で、MSCsの一部の供給源は神経堤幹細胞(NCSCs)であると言われていたが、我々の解析の結果、中胚葉由来の細胞中にも間葉系及び神経堤系という2種類の系列への細胞に分化する能力を有する細胞が存在していることが分かった。いまだにMSCs及びNCSCsの生体内での局在や全ての起源が明らかとなった訳ではないが、我々の研究によりMSCsと定義される細胞の発生学的起源やin vivoでの局在、振る舞いが明らかになり、再生医療の細胞供給源をより安全で確実なものにできると期待している。これまでの研究で、神経堤由来細胞を標識するPO-cre/CAG-EGFPマウスより分離したPO+,PO-両方の分画に存在するMSCs集団はどちらも間葉系細胞への分化能を有する他、末梢神経、グリア、平滑筋への分化能を有していることが分かった。また、Mesp1-cre/CAG-EGFPマウスをフローサイトメーターにて解析した結果、Mesp1+,Mesp1-どちらの分画にもMSCs集団が存在していることが分かった。そして同じ様にどちらの分画からも脂肪、軟骨、骨へ分化する間葉系幹細胞をクローナルに分離することが可能であった。以上より、中胚葉由来の細胞中及び神経堤由来の細胞両方に、MSCsの性質を有する細胞が存在していることが確認できた。現在、Mesp1-cre/CAG-EGFPマウスを用いて、同様に神経堤系細胞への分化能有無の解析を行っている。しかし、Mesp1-cre/CAG-EGFPマウスには、予想に反しMSCs細胞集団が少なく、Mesp1が中胚葉系細胞のマーカーとして適しているのかは議論の余地があり現在、より中胚葉系の細胞をトレースできる遺伝子群を探索中である。いまだにMSCs、神経堤幹細胞の生体内での局在や起源は不明なままである。我々の研究でMSCsと定義される細胞の発生学的起源やin vivoでの局在、振る舞いが明らかになり、再生医療の細胞供給源をより安全で確実なものとすると考えられる。中胚葉系の細胞をトレース可能なMesp1-cre/CAG-EGFPマウスをフローサイトメーターにて解析した結果、Mesp1+, Mesp1-どちらの分画にもMSCs集団が存在していることが分かった。そしてどちらの分画からも脂肪、軟骨、骨へ分化する間葉系幹細胞をクローナルに分離することが可能であった。以上より、中胚葉由来の細胞中にMSCsの性質を有する細胞が存在していることが確認できた。しかし、Mesp1-cre/CAG-EGFPマウスには、予想に反しMSCs細胞集団が少なく、Mesp1が中胚葉系細胞のマーカーとして適しているのかは議論の余地があり、現在より中胚葉系の細胞をトレースできる遺伝子群を探索中である。現在、サブプロジェクトも進行中である。再生医療の細胞供給源をより安全なものとする目的として、induced Pluripotent Stem(iPS)細胞に焦点をあてた。iPS細胞はマウス線維芽細胞に特定因子を導入することによって、ES細胞様の3胚葉系への分化を示す。この技術は受精卵などを使わずにES細胞様の性質を持った細胞を得ることができる画期的な方法である。しかしながらマウス線維芽細胞からのiPS細胞の誘導率は0.05%程度と非常に低い。そこで、このように誘導率が低い理由として、線維芽細胞集団の中にごく少量含まれる体性幹細胞のみが、遺伝子導入により多分化能を獲得したという可能性も十分に考えられる。我々は、マウス骨髄中に存在するMSCsを用い、高効率にiPS細胞を樹立することが可能となっている。現在、樹立したiPS細胞の品質評価を行っている。

胎生期の原腸陥入の時期における初期の中胚葉由来の細胞をトレース可能となったMesp1-cre/CAG-EGFPマウスの骨髄をフローサイトメーターにて解析した結果、Mesp1+,Mesp1-どちらの分画にもPDGFRα+/Sca-1+の間葉系幹細胞(MSCs)集団が存在していることが分かった。そしてどちらの分画からも分化誘導実験及び遺伝子発現解析から、脂肪・軟骨・骨へ分化するMSCsをクローナルに分離することが可能であった。以上より、中胚葉由来の細胞中に、MSCsの性質を有する細胞が存在していることが確認できた。またMesp1-cre/CAG-EGFPマウスの骨髄細胞を用いて、神経堤系細胞への分化能解析を行った結果、中胚葉由来であるはずのMesp1-分画の細胞は、神経堤細胞の分化条件下でMesp1-分画の細胞(神経堤由来幹細胞を含む)と同様に神経・グリア・平滑筋という神経堤系統への分化能を有しており、分化誘導前の状態で、神経堤幹細胞マーカーとして知られるP75,Snail,Sox9を発現していることが分かった。Mesp1陽性細胞は神経堤幹細胞マーカーとして知られるPOの発現とは発生の段階で重ならないことが分かっており、Mesp1陽性の中胚葉由来MSCsは、神経堤由来では無いにも関らず、神経堤系統への分化能を有していたこととなる。これまでの研究で、MSCsの一部の供給源は神経堤幹細胞(NCSCs)であると言われていたが、我々の解析の結果、中胚葉由来の細胞中にも間葉系及び神経堤系という2種類の系列への細胞に分化する能力を有する細胞が存在していることが分かった。いまだにMSCs及びNCSCsの生体内での局在や全ての起源が明らかとなった訳ではないが、我々の研究によりMSCsと定義される細胞の発生学的起源やin vivoでの局在、振る舞いが明らかになり、再生医療の細胞供給源をより安全で確実なものにできると期待している。
ヒューマノイドロボットにおける複数の制御手法の特徴を活用した歩行・走行制御の統一

ヒューマノイドロボットの2足歩行・走行の運動制御を統一するために,まず,歩行・走行を両立し得るダイナミクスモデルであるマス・バネモデルに減衰成分を加えたD-SLIPモデルを提案した.このD-SLIPモデルを仮想拘束を用いた運動制御手法へと適用し,D-SLIPモデルの特性を有した仮想拘束の設計に成功した.この結果,ロボットは移動中に減衰比を調整することで歩行・走行間を自然と切り替える能力を獲得した.この能力を最大限有効活用するため,エネルギー効率を最大化するような移動速度に応じた減衰比を設計した.すなわち,低速時には高減衰比で歩行を,高速時には低減衰比で走行を発現するよう,連続的な速度の関数として与えた.この結果,歩行・走行が得意とする速度領域で発現されることとなり,それぞれの性能を最大限発揮することに成功した.次に,ロボットが自律的に目的地まで到達できるように移動速度の目標設計について着手した.ここではロボットが目的地から仮想的なダイナミクスによって加減速するようにし,そのダイナミクスの影響度をロボットの転倒リスクと効率から実時間で調整するものとした.この結果,ロボットは歩行・走行を切り替えながら,安定かつ素早く目的地まで到達することを可能にした.これらの成果によって,従来では目的地までの移動には局所安定性の保証された効率の悪い歩行のみが用いられてきたものが,移動速度の調整で十分な比較的シンプルな環境下では本成果の効率を重視した歩行・走行が利用可能となった.ヒューマノイドロボットの移動範囲を大幅に広げることに繋がる成果である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
血管リモデリングにおけるマトリックス・メタロプロテアーゼの役割に関する研究

我々はMMP-2(gelatinase A)遺伝子欠損変異マウス(MMP-2 KO)を用い、頚動脈内膜肥厚に対するMMP-2の役割を明らかにした。すなわち、遺伝子背景を同一にした野生型マウスは左総頚動脈の内頚動脈、外頚動脈分岐部を糸で結紮することにより、経時的に総頚動脈に内膜肥厚がおこるが、MMP-2KOではその内膜肥厚が著しく抑制されていた。総頚動脈結紮後、経時的に頚動脈を取り出し、蛋白抽出を行い、ゲラチン・ザイモグラムを行ったところ、MMP-9は結紮早期(結紮後1,3日)に増加するが、それ以後減少し、4週後にはほぼ結紮前のレベルに回復していた。一方MMP-2は結紮1週後より増強し4週後にもなお増加を認めた。免疫染色による観察では、MMP-9の増加は主に結紮後外膜側に集まるCD45-positiveな白血球によるものであった。一方、MMP-2は結紮1週後より中膜の平滑筋層に主に発現を認め、4週後では肥厚した内膜にもっとも多く認めた。以上の結果より、マウス内膜肥厚モデルにおいてMMP-2は重要な役割を果たしていることが明らかとなった。野生型とMMP-2 KOでは内膜ならびに中膜の細胞増殖には差を認めなかったため、平滑筋細胞の中膜から内膜への遊走にMMP-2は関与している可能性が高いと思われた。この仮説をさらに明らかにするため、野生型ならびにMMP-2 KOマウス胸部大動脈をティシュー・チョッパーにより1mm×1mmの組織片を作成し、96-well plateに移し、血清(-)、増殖因子(+)の条件で、組織片からの平滑筋細胞の遊走を観察したところ、野生型に比較し、MMP-2 KOの組織片では平滑筋細胞の遊走能が低下していることがわかった。さらに上記の胸部大動脈由来の培養平滑筋細胞を使用し、trans-wellを使用した遊走能、さらにtrans-wellの膜上に基底膜モデルであるMatrigelをゲル化し、浸潤能について検討した。遊走能は野生型由来平滑筋細胞とMMP-2KO由来との間に大きな差は認めなかった。しかし、Matrigelを使用した浸潤能はMMP-2欠損平滑筋細胞で著しい低下を観察した。以上よりMMP-2欠損は平滑筋細胞のmotility自体には影響を与えず、マトリックス蛋白を溶かしながら遊走する必要がある浸潤を著しく抑制することが明らかとなった。この結果は動物実験での我々の結果を支持するものである。1.内皮障害モデルの作成

(1)マウス(C57BL/6)の血管内膜肥厚に関し、種々のモデル(左総頚動脈結紮モデル、大腿動脈カフモデル、大腿動脈スプリング・ワイアーによる障害モデル)を作成し、評価したところ、左総頚動脈結紮モデルが最も一定した内膜肥厚を簡便に作成できることが判明し、以後このモデルを使用し評価した。(2)MMP-2遺伝子欠損変異マウスでは左総頚動脈結紮後2週、4週後ともに野生型マウスに比較し、有意に内膜肥厚の形成が抑制されることが明らかとなった。2.マウス大動脈エクスプラントモデルの作成マウス胸部大動脈を取り出し、外膜剥離後、切開しtissue chopperを用い一辺1mmの正方形の大動脈切片を作成する。その後コラーゲンでコーティングされた丸底96-well plateに上記の組織を一切片づつ移し、血清を含まないメディウム内(PDGF-BB, FGF-2を混入)で培養した。組織より平滑筋細胞が遊走してくる状況を定量化したところ、MMP-2遺伝子欠損変異マウス由来の大動脈切片は野生型由来に比較し、有意に切片からの平滑筋細胞の遊走が低下していることが明らかとなった。なお、大動脈切片から遊走してきた細胞は全てα-smooth muscle actin positiveであった。さらに、組織の上清を採取し、ゼラチン・ザイモグラムを行ったところ、野生型マウス切片の組織上清にはMMP-2ならびにMMP-9が認められたが、MMP-2遺伝子欠損変異マウスでの切片上清にはMMP-9のみが観察された。以上より、MMP-2は中膜平滑筋細胞の細胞外マトリックス蛋白を介する遊走(浸潤)、ならびに血管内膜肥厚に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。1.動物モデルでの検討前年度MMP-2遺伝子欠損マウス(MMP-2 KO)において野生型と比較し総頚動脈結紮モデルにおいて内膜肥厚が抑制されることを報告した。H14年度は以下の事項を明らかにした。(1)総頚動脈結紮後、経時的に頚動脈でMMP-9,MMP-2の発現が増加した。(MMP-9は結紮後3日目にピークを認めた後経時敵に減少した。MMP-2は結紮後1週間後に増強し、以後4週まで発現が増加し続けた。)(2)免疫組織学的検討ではMMP-9の発現は主に血管外膜のCD-45 positiveな白血球に認められ、MMP-2は初期には血管中膜、内膜肥厚組織では内膜肥厚部に発現を認めた。野生型、MMP-2 KO大動脈より血管平滑筋細胞を培養系に移し、遊走、浸潤、増殖に関して比較した。(1)両平滑筋細胞の遊走能には差を認めなかった。(2)マトリゲルを介した浸潤能はMMP-2欠損平滑筋細胞において野生型由来平滑筋細胞に比較し著しく低下していた。(3)増殖能は両平滑筋細胞に差を認めなかった。昨年度の成果と今年度の結果より、MMP-2は中膜平滑筋細胞の内膜への浸潤を抑制し、内皮障害後の内膜肥厚(血管リモデリング)に重要な役割を果たすことが明らかとなった。
自己評価維持に対する親密関係のバッファ効果―親密対人関係が自己評価に及ぼす影響―

さまざまな対人関係的文脈が自己評価にどのような影響を及ぼすのかを明らかにし、より具体的には、親密な関係が自己評価の極端な低下を防御する効果を有するという仮設を検証することを本年度の目的とした。そのために自伝的記憶にあらわれる実際の体験の中の他者がどのような機能を果たしているかを解明せんと試みた。まず各自の成功体験・失敗体験を各1つずつ選択肢、それについて1000字から1500時前後でことの始まりから終わりまでを自由に記述してもらった。これにより、記憶は検索され、再度内的経験として利用されうるものとなった。その時点で、質問紙を配布し、自尊感情の変化、その時の他者の反応(言動)、自己による帰属など多方面に渡る質問に回答を求めた。米国の大学生にも同様の手続きの調査を実施し、比較対象とした。質問紙の分析の結果、日本は成功経験を他者と共有する程度が米国に比べて有意に少なく、失敗経験では違いは見られなかった。これは、親密関係にある者といえども、必ずしも失敗経験が共有されていないこと、また共有されていても、言動によって必ずしも反応を明白な形で示すわけではないことが推測される。次ぎに、成功経験では米国において親密他者との喜びの共有が著しく、ほめられた経験は、自分の有能さの認知と関連し、ひいては自尊感情を高めていた。しかし、我が国ではほめられ体験は一般に乏しく、経験があってもそれは努力認知と関連し、自尊感情には結びついていなかった。このことから、特に失敗において親密関係が自己評価維持のバッファとして機能していることは確認されえなかったが、親密他者との交流が自己評価に影響していることは見出された。さまざまな対人関係的文脈が自己評価にどのような影響を及ぼすのかを明らかにし、より具体的には、親密な関係が、自己評価の極端な低下を防御する効果するという仮説を検証することを本年度の目的とした。そこで、親密な親友同士ないし非親密関係(未知)他者2名を1組として、協同課題に従事させ、成功・失敗を操作した。その後、自己および他者評価を行わせ、初期段階に比較して、その変動を測定した。親密関係にある実験参加者ペアでは、そうでない参加者ペアの場合に比較して、たとえある課題における自分の失敗が友人に露呈しても、それまでの友好的な関係の中で、自分が十分に相手から肯定的にみなされていることを確信しているために、言い換えれば、自分と友人である他者との間で、自己の価値が共通実感(shared reality)として確定しているために、ある課題での失敗による自己評価低下が少ないであろうと予測された。奈良大学において、学生2名をペアとして、親密群17組、非親密群18組を参加者に実験を行った。しかしながら、全組に対する実験が終了した後、各組に対しての実験終了時におこなう「デブリーフ」の内容が、密かに、参加者プールである心理学受講生間に流布し、実験参加者の間に知れ渡っていた可能性のあることが判明した。したがって、実験データの信頼性が低く、また今年度中は同じ学生プールから参加者を募集しても実験は無効になるだろうと判断された。来年度、デブリーフは全実験終了後とするなどの方法的改善を加え、改めて新しい実験参加者を対象として、おこなうこととした。それを検討するための方法として、今年度は当初の予定を少し修正し、自伝的記憶に表れる実際の体験の中の他者がどのような機能をはたしているのかを明かにすることにした。

まず各自の成功体験・失敗体験を各1つ選択し、それについて10001500字前後で事の始まりから終わりまでを自由に記述してもらった。次に、集まった自由記述全体に研究者が目を通し、評定枠組みを作成した。枠組みないし評定の観点は、経験における他者の位置づけ、課題志向性、原因帰属、経験した感情、自尊感情などに関するものであり、成功体験に42項目、失敗体験については46項目が作成された。次に、これらの枠組みを用いて、別の判定者に、個々の記述を評定してもらった。なお、参考として、米国の大学生にも同様の手続きの調査を実施し、比較対象とした。本研究の結果から見出されたことを簡潔に述べる。成功体験:米国では、成功は他者に開示され、他者に対しても影響、とくに肯定的な影響があるものと考えられているのに対して、日本のデータからは、そのような他者との「喜びの共有」みたいな傾向は認められなった。すなわち、成功が他者に伝えられ、その他者からの肯定的フィードバックによって、自尊感情が影響されるとはいえなかった。失敗体験:成功体験では、さまざまな観点において文化的な違いが認められているのに大して、失敗体験ではそれは著しく少ない。すなわち、失敗体験においては重要な他者が登場し、自尊感情維持を促進するような機能を果たすものと考えられたが、今回の自由記述にはそのような傾向はほとんど認められなかった。むしろ、失敗は他者にはあまり語られず、自己の中にとどめ置かれる傾向が見られた。それと同時に、失敗時に経験する感情は長期化する傾向が見られた。その2つの現象の間の因果関係は直接には検討できないが、本研究の仮説をまさに逆方向から検証しているという考えも成立する。次年度に詳細に検討したい。さまざまな対人関係的文脈が自己評価にどのような影響を及ぼすのかを明らかにし、より具体的には、親密な関係が自己評価の極端な低下を防御する効果を有するという仮設を検証することを本年度の目的とした。そのために自伝的記憶にあらわれる実際の体験の中の他者がどのような機能を果たしているかを解明せんと試み.た。まず各自の成功体験・失敗体験を各1つずつ選択肢、それについて1000字か.ら1500字前後でことの始まりから終わりまでを自由に記述してもらった。これにより、記憶は検索され、再度内的経験として利用されうるものとなった。その時点で、質問紙を配布し、自尊感情の変化、その時の他者の反応(言動)、自己による帰属など多方面に渡る質問に回答を求めた。米国の大学生にも同様の手続きの調査を実施し、比較対象とした。質問紙の分析の結果、日本は成功経験を他者と共有する程度が米国に比べて有意に少なく、失敗経験では違いは見られなかった。これは、親密関係にある者といえども、必ずしも失敗経験が共有されていないこと、また共有されていても、言動によって必ずしも反応を明白な形で示すわけではないことが推測される。次ぎに、成功経験では米国において親密他者との喜びの共有が著しく、ほめられた経験は、自分の有能さの認知と関連し、ひいては自尊感情を高めていた。しかし、我が国ではほめられ体験は一般に乏しく、経験があってもそれは努力認知と関連し、自尊感情には結びついていなかった。このことから、特に失敗において親密関係が自己評価維持のバッファとして機能していることは確認されえなかったが、親密他者との交流が自己評価に影響していることは見出された。
セリンプロテアーゼを介した食塩感受性高血圧発症に関する分子機序の解明

上皮型Naチャネル(ENaC)は腎臓に存在し、Naの再吸収を行うことで体液量や血圧を調節している。SDラットにアルドステロン(Aldo)を投与すると、γENaCの85→70kDaへの分子量の変化を認める。これまで生体においてγENaCの切断・活性化に対するセリンプロテアーゼ(SP)の関与を検討した報告はなく、今回SP阻害薬メシル酸カモスタット(CM)を用いてin vivoにおけるγENaCの切断・活性化に対するSPの関与を検討した結果、CMによりγENaCの分子量の変化が抑制された。CMがSPを阻害し、γENaCの切断・活性化を抑制したと考えられ、CMが新規降圧利尿薬となる可能性が示唆された。II.プロスタシン過剰発現マウスにおいてCM投与時の腎臓でのENaCγサブユニットのmolecular weight shiftの解析プロスタシン過剰発現マウスにまずG群(6匹)コントロールから腎臓から蛋白を回収し、回収した腎臓の蛋白からENaCγサブユニットのmolecular weight shiftの変化をウエスタンブロット法により評価したが、変化は観察されなかった。プロスタシン過剰発現マウスは腎臓におけるプロスタシンの発現量が約1.5倍程度と対照と比較して発現量が多くないことがENaCγサブユニットのcleaveの変化として捉えられなかった原因と考えられた。III.当初、DSラットおよびアルドステロン投与ラットにおいてDNAマイクロアレイ解析を用いて発現が亢進しているSPを同定しようと考えていたが、重要なのはmRNAレベルで発現が亢進しているSPではなく、蛋白レベルで発現が亢進しているSPであるため、実験IVを優先し、行った。Lys-His-Tyr-Arg (KHYR)-MCAおよびGln-Ala-Arg (QAR)-MCAを基質としたDouble-layer fluorescent zymography法を用い、DSおよびアルドステロン投与ラットより回収した腎組織の蛋白と尿から基質と反応するバンドを同定した。DSおよびアルドステロン投与ラットの腎と尿で80、40、25kDaに活性が亢進したSPのバンドが確認された。80kDaのバンドの活性が一番強いため、現在このバンドをゲルから切り出して、蛋白のN末端アミノ酸解析や液体クロマトグラフ・質量分析(LC/MS)にかけて蛋白を同定中である。I.アルドステロン投与ラットにおいてメシル酸カモスタット(CM)投与時の腎臓でのENaCγサブユニットのmolecular weight shiftの解析8週齢のSDラットにA群(6匹)コントロール(浸透圧ポンプ+DMSO投与)、B群(6匹)浸透圧ポンプを用いてDMSOに溶解したアルドステロン(200μg/日)を10日間皮下投与、C群(6匹)アルドステロン+CMペレット(14mg/日)を10日間皮下投与したころ、B群で有意な血清K濃度(2.6±0.1mEq/L)と尿中Na/K比(0.43±0.05)の低下を認め、C群でB群と比較すると有意な血清K濃度(3.1±0.2mEq/L)と尿中Na/K比(0.50±0.03)の改善を認めた。また、B群とC群で血圧、血清Cr、尿蛋白量に有意差は認めなかった。回収した腎臓のmRNAからプロスタシンおよびENaC各サブユニットのmRNAの発現量をreal time PCRにて検討したところ、B群とC群でαENaCの増加を認めたが、βγENaCは変化がなかった。γENaCをウエスタンブロット法により解析し、B群で85→70、C群で85→75kDaのmolecular weight shiftが確認された。II.プロスタシン過剰発現マウスにおいてCM投与時の腎臓でのγENaCのmolecular weight shiftの解析プロスタシン過剰発現マウスの表現型を解析するため、10週齢のプロスタシン過剰発現マウスの血圧、血清BUN、Crおよび尿蛋白量、尿中Na、K排泄量をコントロールマウスと比較検討したが、いずれのパラメーターに関しても有意差はなかった。腎臓におけるプロスタシンのmRNA発現量を検討したところコントロールマウスと比較し、1.52倍弱の発現量の増加を認めるのみであった。腎臓のγENaCのウエスタンブロットに関しては現在検討中である。IV. zymography法を用いたDSラットおよびアルドステロン投与ラットにおける腎および尿中での活性が亢進しているセリンプロテアーゼ(SP)の同定をIIIのDNAマイクロアレイ解析よりも優先し、検討した。昨年までの検討でDSおよびアルドステロン投与ラットの腎で80kDaのSPについて、蛋白のN末端アミノ酸解析や液体クロマトグラフ・質量分析(LC/MS)を施行し、蛋白を同定したところ80kDaのSPはプラスミンであることが判明した。

III.DNAマイクロアレイ解析を用いたDSラットおよびアルドステロン投与ラットにおける発現亢進SPの同定に関しては、当初、DNAマイクロアレイ解析を施行することにより発現が亢進しているSPを同定しようと考えていたが、重要なのはmRNAレベルで発現が亢進しているSPではなく、蛋白レベルで発現が亢進しているSPであるため、まず実験IVを行った。その結果、発現が亢進したSPとしてプラスミンを同定できたため、DNAマイクロアレイ解析は施行しなかった。V. In vitroでの同定したSPによるENaCの活性化についての検討に関しては、同定したSPがプラスミンであり、プラスミンはγENaCのK194を切断することによってENaCを活性化することが既に報告されているため、この検討は行わなかった。VI.健常者と未治療本態性高血圧患者における尿中SP活性と血圧値との相関関係の検討尿蛋白を有する患者で尿蛋白中に含まれているプラスミンが、ENaCを活性化することによって浮腫を生じることが既に報告されているため、この検討を保留とし、現在、動物実験に立ち返り、プラスミンノックアウトマウスを作製し、血圧とENaCの活性化に関してコントロールマウスと比較することによってプラスミンの血圧上昇およびENaC活性化における意義を明らかにしているところである。腎臓内科学検出されたセリンプロテアーゼの同定に時間を要しているため、実験計画より多少の遅れを生じている。研究計画に従って研究を遂行しており、概ね順調に進展している。当初計画していたDahl食塩感受性ラットにメシル酸カモスタットのペレットを投与する計画はメシル酸カモスタットペレット作製の費用が高いため、アルドステロン投与ラットモデルに絞って研究を進める予定である。検出されたセリンプロテアーゼの同定を最優先し、今後の実験を進めて行く。アルドステロン投与ラットにおいてメシル酸カモスタット(CM)投与時に腎臓でののmolecular weight shiftが通常アルドステロン投与群で85→70kDaに変化するところがCM投与群で85→75kDaに変化することが証明されたため、今後はこの変化に関与するセリンプロテアーゼがプロスタシンであるのか、他のセリンプロテアーゼであるのかを中心にmRNAレベルまたは蛋白レベルで解析を進めていく。1.DSおよびアルドステロン投与ラットの腎臓より回収したmRNAを用い、Ambion®WT Expression KitによりcRNAを作製し、作製したcRNAを精製した後、cRNAから2nd-cycle cDNAを合成する。RNase Hを用い、cRNAを加水分解した後、2nd-cycle cDNAを精製し、cDNA産生量とサイズ分布の評価を行う。精製したcDNAをフラグメント化し、DNAの3'末端をビオチン標識する。標識化したフラグメントcDNAをFluidics Station 450/250とGeneChip®Hybridization, Wash and Stain Kitを使用し、GeneChip®Rat Gene 1.0 ST Arrayにハイブリダイズ後、Affymetrix GeneChip®Scanner 3000で蛍光強度をスキャンする。解析ソフトGeneSprig GXを用い、各モデルラットで発現が亢進しているSPを解析する。
細胞障害性Tリンパ球による肝細胞癌特異抗原の認識機構について

【腫瘍抗原ペプチドの解析】1腫瘍細胞表面に提示されているペプチドの分画現在、培養肝癌株を低いpHの条件で処理しMHCクラスI分子とともに癌細胞表面から剥がれてくる雑多な抗原ペプチドを回収しHPLCカラムを用いて各分画を解析中である。下記のアッセイによる分析が可能となる分画が得られる処理条件が得られるまで反復する必要があろう。またこれまでに試していない培養株を用いて抗原ペプチドを採取する予定である。2-(1)細胞障害活性測定によるアッセイMHCの一致したB細胞株を^<51>Crで標識して標的細胞とし、得られた分画と混合してB細胞上のMHC分子とペプチドを結合させ、対応するCTLによる細胞障害活性を測定した。これまでの所、混合した標的細胞がCTL,により壊されるような特定の分画は得られていない。抗原提示細胞として用いるB細胞株にペプチドを表出させる条件設定が重要であると考えられる。さらに標的細胞となるB細胞株としてこれまでとは異なるものを試みる予定である。2-(2)サイトカイン産生誘導によるアッセイB-1と同様にMHCの一致したB細胞株に各分画を加えてMHC分子にペプチドを結合させ、CTLと混合培養し培養液中のサイトカイン濃度を測定した。この実験においても、これまでの解析ではサイトカイン産生を誘導するような特定の分画は確認されていない。B-1同様MHC分子にペプチドをローディングさせる条件を様々に変えて反復する必要がある。肝細胞癌患者の手術材料を用いた肝細胞癌株の樹立は機会あるごとに試行中である。一般に肝細胞癌の細胞株化は必ずしも容易ではなく、今後も反復して試みる必要があると思われる。また原発病変からのみでなく、転移巣や腹水なども材料とするなどの工夫をしてより多くの肝癌培養細胞株の樹立を試みる予定である。さらにすでに樹立された肝癌培養細胞株を用いて、HLAの一致したヒト末梢血よりCTLの誘導を試みている。いくつかのCTLが樹立されたが、癌細胞に対する傷害活性が十分強いCTLはいまだ得られておらず、今後は添加するサイトカイン濃度や刺激に用いる腫瘍細胞の濃度など培養の条件を検討し直して実験を繰り返す予定である。2肝細胞癌患者末梢血中の樹状細胞の解析肝細胞癌患者の末梢血からFicollを用いてリンパ球分画を採取し、このうち最も主要な抗原提示細胞と考えられる樹状細胞を分離した。現在樹状細胞の数、リンパ球分画中にしめる割合、表面マーカーなどの解析中であるが、今後は肝硬変や慢性肝炎患者との違いがあるかどうか等についても検討する予定である。この樹状細胞を用いることにより、より効率的に肝細胞癌の腫瘍抗原ペプチドをTリンパ球に提示することが出来ると考えられ、腫瘍抗原の解析には重要な役割を果たすことが期待される。