hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
僧帽弁複合体のねじれ運動から見た虚血性僧帽弁逆流発症メカニズムの解明

虚血性僧帽弁逆流は、左室の形態的変化によって引き起こされる機能的逆流である。我々は、3次元心エコーと2D speckle trackingを用いて、左室の捻れ運動と機能的僧帽弁逆流の関係を明らかにした。[データ解析環境の整備]:既存の設備に加え、データ解析に必要なPCおよび解析ソフトウエアを設置した。[症例の登録、心エコー画像記録]:当施設の入院、外来患者から症例の登録、画像データの収集を開始した。現時点で、虚血性心筋症7例の他、比較対象のための正常例6例、非虚血性拡張型心筋症12例を登録した。今後順次症例を増やしていく予定である。[画像の解析]:現在まで正常例6例(平均43±15歳)、機能的僧帽弁逆流12例(平均68±18歳)の解析を終了し、以下の項目について検討した。(1)僧帽弁輪部レベルと乳頭筋レベルの二つの左室短軸像において、TDI法を用いて心内膜面の捻れ角度を定量的に解析し、僧帽弁複合体のねじれ運動の指標とした。(2)3次元心エコーを用いて機能的僧帽弁逆流の発症機序と関係があるtethering distanceなどの指標とともに、左室容量、球状化などについても検討した。[これまでの結果]:正常例では、僧帽弁複合体は弁輪レベルと乳頭筋レベルにおいて左室収縮期に7.2±2.3度の捻れを生じていた。これに対して機能的僧帽弁逆流症例では、1.5±2.9度と有意に僧帽弁複合体の捻れは減少していた(p<0.05)。僧帽弁複合体の捻れ角度と左室駆出率には有意な相関はなく、この僧帽弁複合体の捻れ運動の低下には、左室全体の収縮能低下よりも左室局所の異常が関連している可能性が示唆された。僧帽弁の捻れが小さい方が、僧帽弁逆流を大きくなる傾向はあったが(r=0.3)、有意な相関は認めなかった。[研究方法の妥当性の検討]:これまでの検討で僧帽弁複合体の捻れ運動を定量的に確認でき、機能的僧帽弁逆流ではそれが低下していることが明らかとなった。今後は、乳頭筋や弁輪部に直接関心領域を設定した方が、その捻れ運動を正確に評価できる可能性があり、検討を要する。[症例の登録]現在まで、正常例14例、虚血性心筋症32例、拡張型心筋症30例の症例登録を行った。[画像の解析]現在まで正常例14例、機能的僧帽弁逆流(MR)17例について、3次元心エコー法と組織ドプラ法(TDI)による解析を終了し、以下の項目について検討した。(1)僧帽弁輪部レベルと乳頭筋レベルの二つの左室短軸像において、TDI法を用いて心内膜面の捻れ角度を定量的に解析(僧帽弁複合体のねじれ運動の指標)、(2)3次元心エコー法を用いて収縮末期および拡張末期の僧帽弁輪部と乳頭筋の捻れ位置関係、(3) MR重症度、左室容量や駆出率、tethering distanceなど。[これまでの結果]TDI法による検討で、正常例では僧帽弁複合体は弁輪レベルと乳頭筋レベルにおいて心周期に7.2±2.3度の捻れを生じているのに対して、機能的MR例では、1.5±2.9度と有意に僧帽弁複合体の捻れは減少していた(p<0.05)。しかし、その捻れ角度と左室駆出率やMRの重症度には有意な相関はなかった。特に機能的MR例において僧帽弁の捻れのピークの時相は一定でなく、収縮中期や拡張期に認めるものがあった。3次元心エコーでの検討では、正常例において拡張末期から収縮末期にかけて、僧帽弁複合体捻れ角は7.3±4.4°変化していたが、機能的MR群では、ばらつきが大きく平均値は有意に低かった(0.5±10.9°、p<0.05)。また、機能的MR群においては、拡張末期の捻れ角度とMRの重症度EROに負の相関関係を認めた(r=-0.52,p<0.05)。[今後の予定]これまでの検これまでの結果より、左室の捻れに伴い僧帽弁複合体も捻れ運動をしていることが明らかとなった。また、捻れの程度よりも拡張末期の乳頭筋と弁輪部の捻れ位置関係が逆流の重症度と関連していることが明らかとなった。今後は症例数を増やして更に詳細な検討をする予定である。[症例の登録]現在まで、正常例16例、虚血性心筋症32例、拡張型心筋症30例の症例登録を行った。(1)僧帽弁輪部レベルと乳頭筋レベルの二つの左室短軸像において、TDI法を用いて心内膜面の捻れ角度を定量的に解析(僧帽弁複合体のねじれ運動の指標)、

(2)3次元心エコー法を用いて収縮末期および拡張末期の僧帽弁輪部と乳頭筋の捻れ位置関係、(3)MR重症度、左室容量や駆出率、tethering distanceなど。[これまでの結果]TDI法による検討で、正常例では僧帽弁複合体は弁輪レベルと乳頭筋レベルにおいて心周期に7.2±2.3度の捻れを生じているのに対して、機能的MR例では、1.5±2.9度と有意に僧帽弁複合体の捻れは減少していた(p<0.05)。しかし、その捻れ角度と左室駆出率やMRの重症度には有意な相関はなかった。特に機能的MR例において僧帽弁の捻れのピークの時相は一定でなく、収縮中期や拡張期に認めるものがあった。3次元心エコーでの検討では、正常例において拡張末期から収縮末期にかけて、僧帽弁複合体捻れ角は7.3±4.4°変化していたが、機能的MR群では、ばらつきが大きく平均値は有意に低かった(0.5±10.9°、p<0.05)。また、機能的MR群においては、拡張末期の捻れ角度とMRの重症度EROに負の相関関係を認めた(r=-0.52,p<0.05)。[現在の状況]これまでの検これまでの結果より、左室の捻れに伴い僧帽弁複合体も捻れ運動をしていることが明らかとなった。また、捻れの程度よりも拡張末期の乳頭筋と弁輪部の捻れ位置関係が逆流の重症度と関連していることが明らかとなった。以上の結果はAmerican Heart Association 2010annual meeting (2010 Nov, Chicago, U.S.A)などで発表した。現在論文投稿準備中である。
低線量、低濃度における低分子有機化合物の放射線応答に関する基礎的研究

低分子有機化合物の放射線応答性に関する詳細なデータを蓄積、体系化して、放射線応答性の理解を深める。これにより、これまで着目されなかった低濃度、低線量における低分子有機化合物の放射線応答を利用した放射線増感剤の可能性を示す。将来的には、現在の放射線治療効果を凌駕する放射線力学療法の開発につなげる。
光応答性機能物質の開発とその応用

14族元素を含む光応答性機能物質および光応答性機能高分子化合物の開発を目的として、Me_3Si基を置換基としてもつ芳香族炭化水素、14族元素をスピロ原子とするスピロ型化合物ならびに14族元素を側鎖にもつポリスチレン誘導体を合成し、その光物理的および光化学的特性について検討し、以下の知見を得た。1.芳香環にMe_3Si基が置換したピレン、アントラセン、フェナントレンなどの芳香族炭化水素の蛍光に量子収量が母核の芳香族炭化水素の蛍光の量子収量よりもはるかに大きいことを明らかにした。2.スピロ型に固定した2つの芳香環の軌道相互作用におけるスピロ原子の役割りを明らかにするため、ケイ素、ゲルマニウムをスピロ原子とする芳香族化合物ならびにその関連化合物を合成し、それらの物理的および化学的特性について比較検討した。その結果、UVスペクトル、蛍光スペクトル、X線構造解析の結果から2つの芳香環は完全に直交しており、お互いに相互作用していないことを明らかにした。3.p-位トリメチルシリルメチル基をもつポリスチレンのフィルムにフォトマスクを通してレーザー光を照射し、数マイクロメートルの空間分解能でフィルム表面にパターンを形成することに成功した。また、照射後のフィルムをキシレンにより現象するとポリマーの不溶化によりネガ型パターンを形成することが可能になった。4.ケイ素の代わりにスズで置換されたポリマーを用いて同様にレーザー光照射で慣れるネガ型パターンを空気中、500°Cで加熱処理すると、SnO_2薄膜のパターンが得られることを明らかにした。14族元素を含む光応答性機能物質および光応答性機能高分子化合物の開発を目的として、14族元素をスピロ原子とするスピロ型化合物ならびに14族元素を側鎖を含むポリスチレン誘導体を合成し、その光物理的および光化学的特性について検討し、以下の知見を得た。1.スピロ型に固定した2つの芳香環の軌道相互作用におけるスピロ原子の役割を明らかにするため、ケイ素、ゲルマニウムなどの14族元素をスピロ原子とする芳香族化合物およびその関連化合物を合成し、それらの物理的および化学的特性について比較検討した。その結果、UVスペクトル、蛍光スペクトル、ならびに蛍光寿命の測定から、2つの芳香環がともにベンゼン環およびナフタレン環である場合、励起状態において2つの芳香環は直交しており、互いに相互作用していないことが明らかとなった。2.ポリ(4-トリメチルシリルメチルスチレン)(RTMSMS)フィルムへの254nmの紫外光照射を行ったところ、トリメチルシリル基の炭素-ケイ素結合切断によりアリールメチルラジカルが発生し、フィルム表面では酸素酸化反応によるカルボキシル基生成が、フィルム内部では架橋反応が進行した。また、PTMSMSフィルムをフォトマスクを通じて光照射後、ロ-ダミン6Gによる染色もしくはキシレンによる現像を行ったところ、それぞれポジ型およびネガ型のパターンが数マイクロメートルの空間分解能で形成することが明らかとなった。光応答性機能物質の開発とその応用の目的としてR_3M基(R=アルキル、M=Si,Ge,Sn)を置換基としてもつ芳香族炭化水素ならびにジヒドロフェナジン誘導体を合成するとともに、その光物理的および光化学的特性について検討し、以下の知見を得た。1.芳香環にトリメチルシリル基が直接置換したピレン、アントラセン、フェナントン、ナフタレンなどの芳香族炭化水素のシクロヘキサン中における蛍光の量子収量は母体の芳香族炭化水素の蛍光の量子収量よりも大きい。特に、9-トリメチルシリルフェナントレンの蛍光は無置換のフェナントレンの蛍光の約4倍に増大する。2.置換基の種類がケイ素、ゲルマニウム、スズの順に蛍光の量子収量は小さくなり、その蛍光寿命は短くなる。これはゲルマニウムおよびスズの重原子効果に帰因する。

3. 1-トリメチルシリルピレンとケイ皮酸メチルまたはα-シアノスチルベンのような電子不足型芳香族アルケンとの光反応によって、ピレン環の4,5-位で(2π+2π)光環化付加体が効率よく生成する。これらの光環化付加反応では、アルケンのフェニル基がピレン環上に重なったエンド型付加体が優先的に生成する。4.分子内に電子受容性基として3,5-ジニトロフェニル基と長鎖アルキル基を併せもつ1,5-ジヒドロフェナジン誘導体は、その単分子LB膜が光電変換用分子デバイスとして機能する。また、その単分子膜をマイカ板上に移すと、AFMによって分子像を得ることができる。14族元素を含む光応答性機能物質および光応答性機能高分子化合物の開発を目的として、14族元素をスピロ原子とするスピロ型化合物ならびに14族元素を側鎖にもつポリスチレン誘導体を合成し、その光物理的および光化学的特性について検討し、以下の知見を得た。1.スピロ型に固定した2つの芳香環の軌道相互作用におけるスピロ原子の役割りを明らかにするため、ケイ素、ゲルマニウムをスピロ原子とする芳香族化合物ならびにその関連化合物を合成し、それらの物理的および化学的特性について比較検討した。その結果、UVスペクトル、蛍光スペクトル、X線構造解析の結果から2つの芳香環は完全に直交しており、お互いに相互作用していないことが明らかになった。2.p-位にトリメチルシリルメチル基をもつポリスチレンのフイルムにフォトマスクを通してレーザー光を照射すると、数マイクロメートルの空間分解能でパターンがフィルム表面に形成されることがわかった。また、照射後のフィルムをキシレンにより現像するとポリマーの不溶化によりネガ型パターンが形成された。3.ケイ素の代わりにスズで置換されたポリマーを用いて同様にレーザー光照射で得られるネガ型パターンを空気中、500°Cで加熱処理すると、SnO_2薄膜のパターンが得られることが明らかになった。
元朝探馬赤軍団の研究

オゴデイ・ハンの治世初期に帝国辺境に派遣された探馬赤軍団を既に明かとしている河南淮北蒙古軍団の研究を基礎に推進した。(1)東部方面軍として遼東高麗辺境派遣軍、(2)中国西部方面軍の1つとして陝西南部派遣軍の2つについて各軍団の成立と構成および軍事活動の実態について考察した。遼東高麗軍団の構成として、指揮官サリクタイ・コルチは、チンギス・ハン時代に遼東を征服したムカリの権限を継承し、その称号「権皇帝」は、ムカリの三個の称号のひとつであり、配下の軍団は遼東の契丹軍団が中心であって、これもムカリの軍団を引き継いだものである。副長官のテゲは遼東の女真軍閥蒲鮮万奴の子で女真系の兵員の参加も考えられる。ムカリの別の称号「都行省」とムカリ配下の五部族は河南淮北蒙古軍団の指揮官テムテイに引き継がれていたから河南淮北蒙古軍と遼東麗軍団はいずれもムカリ軍団を分割して受け継ぐものであってことが明かとなった。(2)の陝西南部の軍団としては、チャガタイ家の千戸で河西の山丹のチャガタイ家分地をベ-ス・キャンプとしたアンチュル軍団を中心に考察を進めた。この軍団はチャガタイ家の指令のもとにあったためチャガタイ家諸王のモンゴル内部での政治的立場に左右されて四川辺境での活動には消長があるが、元朝末期まで極めて高い独立性を与えられていた。この軍団は四川での南宋国境線を守備にあたり、契丹などの千戸長を配下に編入して増強された。アンチュル軍団の守備地域の東隣の興元に女真の夾谷マングタイが駐屯し、また、遼東高麗軍団の副長官テゲは京兆に移り、四川辺境で活動したように陝西には女真系の兵員の配備も見られる。2つの軍団に見られるような探馬赤軍団編成の際の契丹・女真兵員の規模と機能は今後解明すべき課題である。
多価不飽和脂肪酸によるマイクロドメイン形成と消化管薬物吸収促進作用との関連性

様々な生理活性作用が知られる多価不飽和脂肪酸を食品や製剤添加物として消化管に適用すると、細胞膜マイクロドメインの形成変化が起こり、それによって薬物吸収性などの膜機能が変化するとの仮説を立て、モデル膜や培養細胞を用いた検討を行った。まず、組成の異なるモデル膜に各種脂肪酸を適用し、界面活性剤不溶性膜画分量や蛍光異方性などの測定を行った。その結果、ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)の多価不飽和脂肪酸は、コレステロールを含まない膜に対しては非常に強力な膜流動化作用を示すものの、コレステロールを含む膜に対しては、その作用が著しく減弱することが明らかになった。さらに、オレイン酸のような不飽和脂肪酸と作用を比較したところ、両者の膜への作用様式は異なっていた。以上の結果から、多価不飽和脂肪酸がマイクロドメインの形成を促進させる可能性を見出した。すなわち、多価不飽和脂肪酸はコレステロールが豊富に含まれる膜領域(マイクロドメイン)には作用せず、膜に対して不均一に作用するため、結果として流動性の高い膜領域と低い膜領域の相分離を助長して、マイクロドメインの形成を促進する可能性が考えられる。続いて、この考察をもとに培養細胞(Caco-2)を用いて検討を行った。検討として、多価不飽和脂肪酸を適用した細胞から、界面活性剤不溶性膜画分と可溶性膜画分を分画し、それぞれのフラクションに含まれる膜タンパク量を評価した。なお、本研究では対象とする膜タンパクに、マイクロドメインへの分布が報告されているP糖タンパク(P-gp)を選択した。その結果、多価不飽和脂肪酸を適用しても、各フラクションのP-gp量に目立った変化は認められなかった。したがって、現在までのところ、モデル膜での結果を支持するような結果は得られていない。今後は条件を変えてさらに検討を進める予定である。ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸のような多価不飽和脂肪酸は、様々な生理活性作用を有する機能性脂質として知られている。近年、こうした多価不飽和脂肪酸が脂質二重膜中に存在することで、細胞膜上のシグナル伝達に深く関与するマイクロドメインの形成が促進される可能性が報告されている。このようなマイクロドメイン形成促進は、経口摂取などにより多価不飽和脂肪酸が外来から細胞膜に取り込まれた場合でも引き起こされると考えられる。そこで本研究では、脂質二重膜モデルであるリポソームに、様々な脂肪酸を取り込ませたときのordered lipid domains量及び膜流動性の変化を評価し、上記の仮説の妥当性について検討した。実験としては、リン脂質およびコレステロールの組成を任意に調節したリポソームに、脂肪酸懸濁液を加え、インキュベーションを行い、リポソーム膜に脂肪酸を取り込ませた。その後、Triton X-100溶液を添加し、膜流動性が増大している膜画分を可溶化してordered lipid domainsを分取し、これを定量した。また、膜流動性を評価するため、リポソーム膜中に標識した蛍光プローブの蛍光異方性を測定した。結果より、多価不飽和脂肪酸適用群では、ordered lipid domains量は膜中のコレステロール含量の増大によって著しく増加した。また、多価不飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸のオレイン酸とでは脂質二重膜への作用様式が異なる傾向が認められた。コレステロールはマイクロドメインの主要な構成成分であり、適用した多価不飽和脂肪酸の作用は膜中のコレステロールに大きく影響を受けることから、外来より取り込まれる多価不飽和脂肪酸によっても、マイクロドメインの形成が促進される可能性が示唆された。
重要熱帯病マラリア制圧に向けた分子生物学的研究

本研究は最も重要な熱帯病であるマラリアの制圧を目標として、マラリアの分子生物学的、細胞生物学的研究から得られる知見を融合し、“新時代のマラリア制圧学構築"ともいうべき新領域を開拓する事を基本的な研究方針とするものである。当初の研究計画においては、1.宿主としてのヒト、ベクターとしての蚊におけるマラリアの寄生現象の分子レベルでの理解2.新しい抗マラリア剤の創製3.新しい診断法の開発と分子疫学への適用4.ワクチンの開発の4つの基本的目標を設定し、日本国内のマラリア研究者を組織化し、合理的かつ効率の良い研究体制を作りあげる事を目標としていた。実際には重点領域研究「マラリア制圧の分子論的展開」が採択され、平成8年度より開始される事となった結果、その準備としての企画調査、シンポジウムも含む合同班会議を中心とした活動を行った。まず平成7年11月28日、名古屋国際センター(名古屋市)において“マラリアシンポジウム"を開催した。本シンポジウムにおいては、研究代表者である小島(東大・医科研)の基調講演に引き続き、田辺(大阪工大)、堀井(阪大・微研)、綿矢(岡山大)、板井(北里大)、平山(埼玉医大)、小林(杏林大)らにより、マラリア原虫の分子生物学、抗マラリア剤の開発、宿主免疫応答についてこれまでの研究成果が報告され、解決すべき問題点が指摘された。総合討論の後、相川(東海大)が特別講演を行い、マラリア制圧にはマラリアの生物学の深い理解が必要であると論じた。シンポジウム終了後、直ちに全体班会議を開き、今後のマラリア研究の方向性に関する考え方について討議を行った。この第1回班会議での議論をふまえ、平成8年1月26日、大阪工業大学創立60周年記念館において、重点領域研究で計画研究が予定されている研究者も参加し第2回班会議を開催した。ここでは各自が具体的な研究計画と将来への抱負を発表し互いに意見を交換した。以上の2回の班会議および小グループによる討議により、共同研究の企画などを含め実際に“マラリア制圧の分子論的展開"を推進するために必要でしかも充分な研究体制を構築する事ができたと考えられる。
緑内障における視神経軸索輸送障害の機序

サル眼については、急速凍結・ディープエッチング法を用いて視神経篩状板内の微細構造を観察する事が出来た。篩状板を構成する神経膠細胞、コラーゲン、血管、基底膜の微細構造はこれまで超薄切片を用いた電顕組織しかなく、これらの微細構造についてはあまり論じられてこなかったが、本研究により視神経篩状板を通過する神経線維に対してこれらの成分が、眼圧に抗して物理的にも神経線維を保護するような構造を有している事が分かった。眼圧上昇における視神経篩状板を通過する神経線維内の微細構造の変化については、モルモットを用いて行った。モルモットを麻酔して眼球を生理食塩水で高圧下で4時間カニュレーションすることで、高眼圧に対して神経軸索内組織に変化が認められた。電顕超薄片組織の検討では、これまでのサル、兎などの実験的高眼圧視神経組織と同様、軸索内小器管が蓄積し、dense bodyの集積も認められ、これらは眼圧によって視神経軸索輸送が障害されたことを証明するものであり、今後の実験的緑内障モデルとして有用な結果と思われる。この組織を急速凍結・ディープエッチング法による観察では、まずコントロールとして正常視神経篩状板部軸索内構造の組織を検討した。固定操作が不十分と思われたが、軸索内ニューロフィラメントは良く描出されたものの微小管は変性してその形態が把握出来なかった。軸索内微小管は軸索輸送に重要な役割を担っているために、現在この形態保存のために、固定液を替えたり、Taxolを加えるなど検討中であり、本研究の今後の課題となった。本年度は、急速凍結、ディープエッチング法を用いて、モルモット及び猿の視神経乳頭部の神経軸索、グリア細胞及び篩板細胞外マトリックス成分の超微細構造の研究をした。神経軸索内の微細構造については、マイクロチューブル、ニューロフィラメントの同定は出来るようになったが、細かいクロスリンカーについては末だ十分把握出来ていない。組織の固定やエッチング時間の検討が必要である事が分かった。またタイプIコラーゲンの免疫組織化学をこの急速凍結、ディープエッチング法に応用し、タイプIコラーゲンの篩板細胞外マトリックス中での分布、同定を試みた。更にタイプIIIコラーゲンに対する抗体を使い、タイプI及びIII型コラーゲンの篩板細胞外マトリックスでの分布差について検討していく予定である。電顕超薄切片組織の検討では、これまでのサル、兎などの実験的高眼圧視神経組織と同様、軸索内小器官が蓄積し、dense bodyの集積も認められ、これらは眼圧によって視神経軸索輸送が障害されたことを証明するものであり、今後の実験的緑内障モデルとして有用な結果と思われる。

固定操作が不十分と思われたが、軸索内ニューロフィラメントは良く描出されたものの微小管は変性してその形態が把握出来なかった。軸索内微小管は軸索輸送に重要な役割を担っているために、現在この形態保存のために、固定液を替えたり、Taxolを加えるなど検討中であり、本研究の今後の課題となった。
Thrombopasを用いた新生児PC制御機構の解明と新たな治療法の開発

新生児は、小児期を通じて容易に播種性血管内凝固(DIC)や血栓症を発症する。新生児の止血機構に関与する因子の中で、フィブリノゲンと凝固促進作用を有する第V因子、第VIII因子は出生時既に成人量に達している。一方、他の艦由来の凝固・線溶因子やその抗凝固因子は新生児肝の未熟性からその産生量は成人量の約1/2であり、新生児は成人と異なる止血バランスを維持しつつ成長する。我々は新生児DICと血栓症の発症と病態に活性化第V因子と活性化第VIII因子を不活化するプロテインC制御機構が重要と考えている。特に低出生体重児や病的新生児のPC制御機構全体の予備能をHemosilTMThrombopasを用い測定することでPC制御機構の低下例を予知し、新鮮凍結血漿の他に治療法の開発やTM製剤の治療効果をin Vitroで検証する。HemosilTMThrombopasの試薬が製造中止となり、試薬が残り少ないため、慎重に症例を集めているところであるが、新生児であるため、採血量も含め、なかなか検体が集まらない状況である。在胎週数(正期産、後期早産児、早産児;28週以上)および出生体重(2500g以上、2500g未満1500g以上)でのHemosilTM ThrombopathでのPICI%の基準値の作成を行う。検査結果から、AGA児とSGA児との比較を行う。またハイリスク妊婦から出生した新生児、新生児仮死や感染症罹患時ののPC制御機構の特徴を明らかにする。HemosilTM Thrombopathでの新生児DICのPICI%やPC活性、PS活性(平成30年度も継続)とTMを含めた抗DIC治療法との関連を明らかにする。新生児DICでの活性型プロテインC(APC)製剤あるいは非活性型プロテインC(PC)試薬の比較を行う。ハイリスク妊婦から出生した新生児や新生児仮死、感染症などの新生児疾患患者でのPC制御機構の特徴を明らかにするため、PICI%の測定およびPC活性、PS活性、AT活性を行いつつ、症例数を増やしているところである。科研の開始が後期からであったため、現在半年での進展状況であるため、当初の28年度で行う予定の研究が遅れてきている。また思った以上に検体収集が困難であり、当初予定していた症例数に到達できていないことも大きな理由の一つである。た。またPC活性、PS活性、AT活性を並行して測定した。AT欠乏血漿や患者検体にATIII製剤を添加し、ATのトロンビン生成や抑制への関与をHemosilTM Thrombopathにて検討した。特に低出生体重児や病的

新生児のPC制御機構全体の予備能をHemosilTMThrombopasを用い測定することでPC制御機構の低下例を予知し、新鮮凍結血漿の他に治療法の開発やTM製剤の治療効果をin Vitroで検証する。HemosilTMThrombopasの試薬が製造中止となり、試薬が残り少ないため、慎重に症例を集めているところであるが、新生児であるため、採血量も含め、なかなか検体が集まらない状況である。在胎週数(正期産、後期早産児、早産児;28週以上)および出生体重(2500g以上、2500g未満1500g以上)でのHemosilTM ThrombopathでのPICI%の基準値の作成を行う。検査結果から、AGA児とSGA児との比較を行う。またハイリスク妊婦から出生した新生児、新生児仮死や感染症罹患時ののPC制御機構の特徴を明らかにする。PC制御機構の総和を示すPICI%と下記のPC活性との比較を行い、基礎疾患によりPC活性低下に起因するのか、Free PS低下に起因するかを判別する。HemosilTM Thrombopathでの新生児DICのPICI%やPC活性、PS活性(平成30年度も継続)とTMを含めた抗DIC治療法との関連を明らかにする。新鮮凍結血漿製剤あるいはTM製剤の投与前の効果検証を、HemosilTM Thrombopathの測定原理の希釈液40μLの部位で添加し、両製剤の有効性の検証に保存被検検体を用いて使用可能かを検討する。AT欠乏血漿や患者検体にATIII製剤を添加し、ATのトロンビン生成や抑制への関与をHemosilTM Thrombopathにて検討する。新生児DICでの活性型プロテインC(APC)製剤あるいは非活性型プロテインC(PC)試薬の比較を行う。平成28年度の科研費採用が後期からであり、半年間での研究費用しか必要でなかったこと、そして、思ったほど検体数が集まらなかったため、試薬にかかる費用が少なく、また研究成果を発表する学会参加がなかったため、次年度使用額が生じた。
がんの骨転移に対して画期的な治療効果をもたらすエピゲノム創薬の研究

本研究では、筆者らが発見したDNAメチル基転移酵素に対する阻害剤TF3を活用することで、がん細胞の骨転移に対する抑制効果を解析することを目的とする。これら治療実験を端緒に、破骨細胞のエピジェネティック制御を標的とした骨転移治療の有効性を明らかにすることで、破骨細胞のエピゲノム創薬をがん治療のための新たな基盤研究として発展させることを目標に掲げる。本研究は、がんの骨転移を抑えるための新たな創薬標的として破骨細胞に注目する。近年、我々は、破骨細胞制御におけるエピジェネティクスの重要性を見出し、さらに新たに探索した当該制御に対する阻害化合物を用いることで、破骨細胞形成を直接的に抑制し、骨粗鬆症治療を可能にすることを実証した(Nature Medicine 2015)。そこで、本研究では、がんの骨転移治療に対する本薬剤の有効性を明らかにすることを目的とする。これによって、『破骨細胞のエピゲノム創薬』をがん治療薬開発における新たな基盤研究として発展させることを目標に掲げる。本年度は、マウス悪性黒色腫細胞(B16BL6細胞)を用いた骨転移モデルの作出を行い、がん細胞の骨転移を再現できる動物モデルを確立した。即ち、B16BL6細胞を左心室に105細胞移植すると、移植後2週間で悪性黒色腫細胞が骨に生着した病態が観察された。骨転移したがん細胞を定量的に評価するために、マイクロCT(μCT)解析や脱灰骨の病理組織標本を用いる方法を立ち上げた。μCT解析においては、がん細胞、骨髄細胞と骨が、それぞれ異なるCT値を示すことを利用し、CT画像を3次元構築し、がん細胞の体積や骨髄腔内の占有率などを算出した。本年度では、骨転移モデルの作出に加えて、骨転移したがん細胞の定量解析法も立ち上げており、おおむね順調に進展していると考えられる。本年度は、昨年度に樹立したがんの骨転移モデルを用いて、DNAメチル化制御の阻害剤TF3によるがんの骨転移抑制の是非を検討した。マウス悪性黒色腫細胞(B16BL6細胞)を左心室に移植後、当該マウスに対してTF3を経日投与したところ、骨組織内に生着するB16BL6細胞がTF3非投与群と比べて減少することが明らかとなった。以上の結果から、TF3はB16BL6細胞の骨転移を抑制する効果があることが示唆される。近年、がんの発症には、異常なDNAメチル化が関係することが知られている。実際、B16BL6細胞に対してTF3を処理したところ、B16BL6細胞の細胞増殖能が有意に抑えられることが明らかとなった。そこで、TF3がもつB16BL6細胞の骨転移抑制効果が、B16BL6細胞に対する増殖抑制能を介しているかどうかを生体レベルで明らかにするために、TF3の抗腫瘍活性を検討した。マウスの皮下にB16BL6細胞を移植し、TF3を経日投与したところ、腫瘍に対する増殖抑制効果は観察されなかった。以上の結果からTF3がもつ骨転移抑制効果は、破骨細胞抑制を介して発揮されることが考えられる。今後は、がん細胞の移植後、DNAメチル基転移酵素の新規阻害剤TF3を経日投与することで、B16BL6細胞の骨転移能に及ぼす影響について検討することで、がんの骨転移に対する破骨細胞のエピゲノム創薬の有効性を明らかにしていく。生化学当初の計画より骨転移モデルの作出に時間を要したために、化合物を用いた治療実験を次年度に遂行することになったために、これに要する費用が次年度繰り越しとなった。しかし、がん細胞の骨転移を定量的に解析する方法の確立など、進展した内容もあるために、全体的に研究は順調に進行していると考えられる。作出した病態モデルを用いて、当初の研究計画内容に従って治療実験に取り組む。
Arl4cを標的とした核酸医薬による口腔がんの新規分子標的治療法の開発

本研究ではWntシグナル関連遺伝子Arl4cの扁平上皮癌をはじめとする口腔癌の腫瘍形成における役割とWntシグナルを標的とした口腔癌の新規分子標的治療法の確立を目的としている。平成30年度は以下の研究結果を得た。1歯原性腫瘍病理標本において歯原性上皮細胞特異的に約80%の高頻度でArl4cが高発現していた。またその細胞株において、Arl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存しておりβ-カテニンには依存していなかった。また、その発現はこの細胞株の運動能を制御することを見出した。そこで、この細胞株においてCRISPR/Cas9法を用いてArl4cをノックアウトしたところ、タンパクレベルで発現が消失し、増殖能は抑制された。2免疫組織学的に、β-cateninがヒト歯牙腫症例において歯原性上皮細胞の核および細胞質に高頻度に発現しており、Wntシグナルの活性化が示唆された。また、正常歯原性上皮細胞において、Wntシグナルの活性化によってその増殖能が抑制された。そこで、マイクロアレイ法を用いて、歯原性上皮細胞におけるWntの活性化により発現が抑制される因子として軸索伸張制御因子(Sema3A)を同定した。歯原性上皮細胞においてWntシグナル依存的にSema3AのmRNAおよびタンパク発現が抑制された。また、Sema3Aの発現が歯原性上皮細胞の増殖に必要であることを見出した。一方、歯胚器官培養法におけるWntシグナルの活性化による歯胚上皮細胞の増殖抑制はSema3A刺激により回復された。さらに歯胚上皮培養法を確立し、Wntシグナルの活性化によってbudding形成が促進することを見出した。これらの結果から、歯原性上皮においてWntシグナル依存的なSema3Aの発現を介する増殖の制御が歯牙腫の発生に関与している可能性が示唆された。本研究ではArl4cの口腔癌をはじめとする扁平上皮癌の腫瘍形成における役割の解明とArl4cを標的とした口腔癌の新規分子標的治療法の確立を目的としている。平成28年度は以下の研究結果を得た。1ヒト肺扁平上皮癌病理標本において50/62(80.6%)および舌扁平上皮癌病理標本において42/57(73.7%)の高頻度にて腫瘍細胞においてArl4cの発現が認められた。また、いずれの症例においても非腫瘍部においてArl4cは発現していなかった。2肺および舌扁平上皮癌細胞株においてArl4cをノックダウンすると運動能が抑制されたが、Arl4cの過剰発現によりその抑制効果は回復された。また、Arl4cをCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトすると運動能が抑制され、その細胞株にCRISPR/Cas9システムのPAM配列に相当する塩基に変異を有するArl4cを過剰発現するとその抑制効果は回復した。3舌扁平上皮癌細胞株ではArl4cの発現はβ-カテニンには依存しないが、MEK/MAPKシグナルに依存していた。一方、肺扁平上皮癌細胞株ではこれらのシグナルに依存していなかった。4肺扁平上皮癌病理標本および肺扁平上皮癌細胞株から得られたDNAにおいてArl4cの3'非転写領域が脱メチル化状態であった。5肺扁平上皮癌細胞株において脱メチル化酵素(TET1, TET2, TET3)の発現が高く、それらの発現をノックアウトするとArl4cの3'非転写領域がメチル化され、Arl4cのmRNAおよびタンパクレベルで発現が抑制された。6癌ゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)を用いたヒト肺扁平上皮癌379症例の解析結果から、腫瘍部においてArl4cが高発現し、Arl4c DNAの3'非翻訳領域が低メチル化状態であることが明らかとなった。平成28年度の研究結果から肺および舌扁平上皮癌細胞においてArl4cは高発現し、その発現は腫瘍形成に必要であること、Arl4cがヒト扁平上皮癌において増殖因子シグナルに加えてDNAのメチル化により発現制御されていることが明らかとなった。これらに関して、当初想定した(遺伝子変異によりβ-カテニンおよびMEK/MAPKシグナルが異常活性化している癌腫)以外に多種の癌腫(β-カテニンおよびMEK/MAPKシグナルの遺伝子変異の報告が少ない癌腫)においても腫瘍細胞においてArl4cが発現するという結果であった。また、CRISPR/Cas9システムを用いて、肺扁平上皮癌におけるArl4cの発現がTET1-3を介したDNAの脱メチル化機構に依存していることを見出したため、当初の計画以上に進展していると考えている。本研究ではArl4cの扁平上皮癌をはじめとする口腔癌の腫瘍形成における役割とArl4cを標的とした口腔癌の新規分子標的治療法の確立を目的としている。平成29年度は以下の研究結果を得た。13種類の口腔扁平上皮癌細胞株においてArl4cが高発現していた。また、これらの細胞株において、Arl4cの発現はMEK/MAPKシグナルに依存していたが、その上流因子(EGFRやRAS等)には依存していなかった。2歯原性腫瘍においてArl4cが高発現していた。またその細胞株において、Arl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存しており、その発現はこの細胞株の増殖能および運動能を制御することを見出した。そこで、この細胞株においてCRISPR/Cas9法を用いてArl4cをノックアウトしたところ、タンパクレベルで発現が消失していた。

3Arl4cを高発現していた口腔扁平上皮癌の症例からDNAを抽出し、MEK/MAPKシグナル上流シグナル(EGFRやKRAS)、APC、β-カテニンおよびPIK3CAの遺伝子変異について検討した。4予後不良の口腔扁平上皮癌症例において、転移巣ではArl4c陽性腫瘍細胞数が増加すること、そしてArl4c発現腫瘍細胞ではDNAが脱メチル化状態であることを免疫組織学的に明らかにした。加えて、DNAの脱メチル化が口腔扁平上皮癌細胞株の遺伝子発現および運動能に与える影響について検討した。平成29年度の研究結果から複数の口腔扁平上皮癌細胞株においてArl4cを高発現していることが明らかとなった。また、これらの細胞株においてArl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存していた。口腔扁平上皮癌の発生機序は未だ明らかになっておらず、本研究結果からMEK/MAPKシグナルの異常活性化がこのメカニズムの一因である可能性が示唆された。加えて、Arl4cは歯原性腫瘍においても免疫組織学的に高発現しており、また、その細胞株において高発現していた。歯原性腫瘍の発生機序は不明であり、Arl4cを基盤としてそのメカニズムを明らかにすることができるだけでなく、Arl4cが治療の標的となりうることが示唆された。予後不良の口腔扁平上皮癌症例において、転移巣ではDNAの低メチル化に伴ってArl4c陽性腫瘍細胞数の頻度が増加することから、Arl4cとDNAの低メチル化を指標とする新規診断法へと応用できる可能性が示唆された。本研究ではWntシグナル関連遺伝子Arl4cの扁平上皮癌をはじめとする口腔癌の腫瘍形成における役割とWntシグナルを標的とした口腔癌の新規分子標的治療法の確立を目的としている。平成30年度は以下の研究結果を得た。1歯原性腫瘍病理標本において歯原性上皮細胞特異的に約80%の高頻度でArl4cが高発現していた。またその細胞株において、Arl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存しておりβ-カテニンには依存していなかった。また、その発現はこの細胞株の運動能を制御することを見出した。そこで、この細胞株においてCRISPR/Cas9法を用いてArl4cをノックアウトしたところ、タンパクレベルで発現が消失し、増殖能は抑制された。2免疫組織学的に、β-cateninがヒト歯牙腫症例において歯原性上皮細胞の核および細胞質に高頻度に発現しており、Wntシグナルの活性化が示唆された。また、正常歯原性上皮細胞において、Wntシグナルの活性化によってその増殖能が抑制された。そこで、マイクロアレイ法を用いて、歯原性上皮細胞におけるWntの活性化により発現が抑制される因子として軸索伸張制御因子(Sema3A)を同定した。歯原性上皮細胞においてWntシグナル依存的にSema3AのmRNAおよびタンパク発現が抑制された。また、Sema3Aの発現が歯原性上皮細胞の増殖に必要であることを見出した。一方、歯胚器官培養法におけるWntシグナルの活性化による歯胚上皮細胞の増殖抑制はSema3A刺激により回復された。さらに歯胚上皮培養法を確立し、Wntシグナルの活性化によってbudding形成が促進することを見出した。これらの結果から、歯原性上皮においてWntシグナル依存的なSema3Aの発現を介する増殖の制御が歯牙腫の発生に関与している可能性が示唆された。
LPXNのサイトカイン反応性シグナルとETV6-LPXNにおける過剰反応性の解析

LPXNは細胞外からのシグナルを細胞内で伝えるアダプター分子である。ETV6-LPXNは急性骨髄性白血病の再発時に付加的に生じた融合遺伝子として同定され、白血病進行に関与したと推察される。ETV6-LPXNでは、分化の抑制は見られなかったが、G-CSFに対する増殖反応が亢進し、CXCL12に対して細胞遊走能の亢進が認められた。また、LPXNが細胞質に均一な分布を示すのに対しETV6-LPXNでは多量体化により点状の分布へと変化が見られた。ETV6-LPXNによりGーCSFに対する増殖性が亢進し、CXCL12に対する遊走能亢進による白血病ニッチへの関与の増強が、白血病悪化の機序と考えられた。ETV6-LPXNはNUP98-HOXA9を有する急性骨髄性白血病の経過中に付加的に生じた融合遺伝子で、白血病の悪化に関与したと推察される。LPXNはパキシリンファミリーに属し、外部からのシグナルを細胞内で伝達するアダプター分子である。LPXN、ETV6-LPXNおよびETV6のPNT領域を欠失したΔETV6-LPXNをマウスIL-3依存性白血病細胞株32Dに導入した32D/ LPXN,32D/ETV6-LPXN,32D/ΔETV6-LPXNとベクターのみを導入した32D/mockを作製し、サイトカイン反応性増殖とGーCSFによる顆粒球分化への影響について解析した。どの細胞も、IL-3非存在下では増殖を維持できなかった。そこで、低濃度のIL-3存在下での各種サイトカインによる増殖効果を調べたところ、G-CSFで32D/ETV6-LPXNに最も強い増殖が認められた。このことから、ETV6-LPXNはG-CSFに対する過剰反応性を生じている可能性が考えられた。G-CSFによる顆粒球への分化を、Gr-1発現の変化と形態変化で解析した。32DはG-CSFにより顆粒球へ分化しGr-1の発現が増加するが、分化細胞の割合は、32D/ETV6-LPXNにおいて増加した。ETV6-LPXNでは、Gr-1陽性細胞は増加するものの、2週間目以降は逆に生細胞は減少した。G-CSFの作用による細胞増殖と分化が促進された結果、早期に細胞の死滅が生じたものと考えられる。ETV6-LPXNは顆粒球への分化阻害なくG-CSFに対する過剰反応を引き起こすと考えられた。細胞内での局在を調べると、LPXNとΔETV6-LPXNは細胞質を中心に均一な局在を示すのに対し、ETV6-LPXNは細胞質に数個のスポットとして局在が認められ、ETV6を介した多量体化により局在が変化していると考えられた。ETV6-LPXN(EL)とNUP98-HOXA9(NH)との相互作用を調べるため、NHおよび両遺伝子をIL-3依存性白血病細胞株32Dに導入し32D/NH,32D/EL/NHを新たに作製し、サイトカイン反応性と顆粒球分化能を調べた。どの細胞もサイトカイン非依存性の増殖は得られなかったが、低濃度のIL-3存在下にてG-CSFに対し32D/NHでは増殖の増強が認められ、32D/EL/NHにおいて最も強い細胞増殖効果が得られた。ELはNHと協調して、より強い細胞増殖を引き起こすと考えられた。また、GーCSFによる顆粒球分化への影響に関しては、32D/NHにおいても分化細胞は増加し、32D/EL/NHではさらに増加した。NHが分化抑制、ELが増殖という単純な図式ではなく、増殖については相乗効果が認められた。次に細胞遊走への影響を調べるため、EL、ETV6のPNT領域を除いたΔELおよびLPXNを遺伝子導入した32D/EL,32D/ΔELおよび32D/LPXNにおいて、CXCR4のリガンドであるSDF1(CXCL12)に対する遊走能を解析したところ、32D/ELにおいてIL-3がない状態でもSDF1に対し最も強い細胞遊走が認められた。ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株NKM-1およびヒト赤白血病由来細胞株TF1においてもELを遺伝子導入することでSDF1に対する遊走能の増強が認められた。ELによる遺伝子発現の変化を網羅的に調べるため、初診時と再発時の患者検体を用いてRNA-seq解析を行った。発現の増加する遺伝子として、CCL1,CCL2,CCL5などのケモカインの他、IL2RA,IL9RなどT細胞系に見られる遺伝子の発現増加が認められた。こうしたケモカインやサイトカインレセプター発現の変化が、G-CSFやCXCR4に対する反応性の違いとして現れた可能性が考えられる。ETV6-LPXN(EL)はNUP98-HOXA9を有する急性骨髄性白血病の再発時に付加的に生じた融合遺伝子で、白血病の悪化に関与する。LPXNはパキシリンファミリーに属し、インテグリンやサイトカインレセプターなどからのシグナルを細胞内に伝えるアダプター分子である。ELを遺伝子導入したマウスIL-3依存性白血病細胞株32Dは、サイトカイン非依存性の増殖は得られなかったが、G-CSFに対しより強い増殖が認められた。また、CXCL12に対して、より強い細胞遊走性が誘導された。

これらの下流のシグナル分子の違いを解析するため、GCSF,CXCL12添加後、経時的に細胞タンパクを抽出し、リン酸化チロシン、リン酸化LPXN,ERK,PYK2,STATs,JAKs等についてリン酸化シグナルを調べたが明らかな違いは得られなかった。チロシン以外のリン酸化シグナルが関与する可能性が考えられた。マウスB細胞性白血病細胞株Ba/F3、ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株NKM-1、ヒト赤白血病由来サイトカイン依存性細胞株TF-1にELを遺伝子導入しCXCL12に対する過剰反応性を調べたところ、いずれの細胞においてもコントロール細胞に比べ、より強い細胞遊走性が認められた。ELによる遺伝子発現の変化を網羅的に調べるため、初診時と再発時の患者検体によりRNA-seq解析を行い遺伝子発現の変化を解析した。発現の増加した遺伝子として、ケモカイン(CCL2,CCL5,CCL22,CCL1,CXCR)、抗アポトーシス分子(PIM-1,MYC)白血球走化性因子(IL-8)などが認められた。CXCR4の発現は1.4倍に増加していた。発現の減少した遺伝子としては、腫瘍抑制遺伝子(TP53,PTEN)、顆粒球分化関連分子(MPO,CD36,MMP8)などが認められた。抗アポトーシス遺伝子の減少と腫瘍抑制遺伝子の増加は、白血病の進行と密接に関わっていると考えられる。また、ケモカイン遺伝子の発現増加は、EL融合遺伝子との関連性が疑われた。さらに、再発時に新たに生じた遺伝子変異について解析を進めている。LPXNは細胞外からのシグナルを細胞内で伝えるアダプター分子である。ETV6-LPXNは急性骨髄性白血病の再発時に付加的に生じた融合遺伝子として同定され、白血病進行に関与したと推察される。ETV6-LPXNでは、分化の抑制は見られなかったが、G-CSFに対する増殖反応が亢進し、CXCL12に対して細胞遊走能の亢進が認められた。また、LPXNが細胞質に均一な分布を示すのに対しETV6-LPXNでは多量体化により点状の分布へと変化が見られた。ETV6-LPXNによりGーCSFに対する増殖性が亢進し、CXCL12に対する遊走能亢進による白血病ニッチへの関与の増強が、白血病悪化の機序と考えられた。これまで、急性骨髄性白血病患者の初発時に認められたNUP98-HOXA9融合遺伝子と、再発時に新たに付加したETV6-LPXN融合遺伝子との相互作用について、IL-3依存性細胞株32Dへ遺伝子導入して解析を行ってきた。細胞増殖に関しては、期待されたデータを得ることができた。細胞分化に関しては、NUP98-HOXA9が分化阻害に働く可能性を考えていたが、32DとG-CSFを用いた系では、分化阻害は少なく細胞を増やす方向に働くことがわかった。分化阻害は少ないものの、未分化細胞も数的には増加していると考えられた。また、増殖に関与するシグナル分子、MEK,ERK,AKTやSTAT,さらにはチロシンリン酸化パターンを調べたが、G-CSFに対するシグナル分子の反応の違いが明らかにできなかった。このため二つのアプローチを計画した。一つは、細胞接着や細胞遊走の違いにより増殖刺激を受ける可能性で、もう一つは、ETV6-LPXN発現による他の遺伝子の発現変化が白血病の悪化を招いた可能性である。サイトカインやケモカインに対する細胞遊走の違いについて調べたところ、ETV6-LPXN導入細胞においてSDF-1に対する細胞遊走能の増強が認められ、少量のIL-3で増強した。
温熱感受性リポソームを用いた臓器選択的遺伝子導入法による癌治療の基礎的研究

リポソーム構成脂質としてDPPC9、DSPC1に加え、陽性加電を有するTMAGを種々の割合で混合したリポソームを作製し、相転移温度、粒子径を観察した後、PMIWZを封入し、sendai virusをリポソーム表面に融合し、neo STD liposomeを作製※2)neoSTD liposomeを用い、LLCPK-I、ACHNともにガラクトシダーゼの発現が観察できた。ガラクトシダーゼの確認にはXgalを用いた蛋白発現を観察し、さらにsonthern blot,Northa blotを用いてDNA RNAの確認も行った。<方法>1.sendai virus融合DNA含有温熱感受性リポソーム(SDTリポソーム)の作製。DPPC、DSPCを重量比9:1で混合したリポソームを作製し相転移温度、リポソーム粒子径を観察、封入遺伝子にpmiwzを用い、リポソームに封入させた後sendai virusをリポソーム表面に融合しSDTリポソームを作製した。2.ヒト正常尿細管上皮株LLCPK-I、腎細胞瘻株ACHNを継代培養し以下の方法にてpmiwzのtransfectionを試みた。A.リポソーム法、B.リン酸Ca共沈法。DNA transfectionを確認するためpmiwzの産生するガラクトシダーゼの発現を観察した。<結果>1.DPPCDSPC9:1のLUVは相転移温度4041°C、粒子径200300mmでありpmiwz封入効率も15%と良好であった。DNA封入、Sendai virus融合後も相転移温度に変化は認められず、当初目的としたリポソームができた。2.従来の直接的なtransfection methodであるBではLLCPK-I、ACHNともにガラクトラダーゼの発現が認められた。本実験の目的であるAにおいてはリポソームあたりの遺伝子封入率を増加させるとBと同様にガラクトシターゼの発現が観察できた。ガラクトシダーゼの確認にはxgal、抗betaガラクトシダーゼ抗体を用いた蛋白発現を観察しさらにsouthern blotおよびNorthan blot法を用いてDNA、RNAの確認も行った。【方法】ラットを開腹し、一側腎動脈にカテーテルを挿入し、STD liposomeを動注後、経日的にラットをsacrificeし、注入側腎、およびliposome貧食能の強い、肝、脾、肺などを中心に諸臓器におけるDNA transferを検討した。【結果】ラットモデルにおいては注入側腎、および諸臓器からのDNA発現は不充分であった。この原因としてSTD liposomeは調整後の膜の安定性が悪いこと、また表面荷電がないため細胞膜との親和性が弱いこと、ラットの体温が高いこと、などが考えられた。以上の結果をふまえ、リポソーム膜の安定性および標的細胞(表面荷電が陰性)に対する親和性を高める目的でDPPC、DSPCと、さらにTMAG(陽性荷電を有する)を加えたneo STD liposomeを作成した。このliposomeは従来のliposomeに比べ荷電を有するため膜安定性が高く、調整後、数時間を経過してもliposome構築は保たれている。現在、neo STD liposomeを用い、in vitroにおけるDNA transfectionの有無を検討中である。
脂質代謝と硬化関連サイトカインからみた糖尿病性腎症における内皮細胞障害機序の検討

高血糖による糸球体内皮細胞および尿細管細胞障害を、脂質および硬化関連因子の観点から検討した。糖尿病を発症したマウス腎では、糸球体内皮細胞でのPPARgの減弱とメサンギウム細胞でのTGF-b1蛋白の増加がみられた。また尿細管細胞では脂質過酸化物の増加がみられた。Methylglyoxalで培養した内皮細胞ではPPARgは減弱し、TGF-b1は有意に高値を示した。また尿細管細胞では、活性酸素種の増加とアポトーシス細胞の増加を認めた。以上より、糖尿病性腎症の発症機序に、脂質および硬化関連因子が強く関連していると示唆された。高血糖による糸球体内皮細胞障害をVivoとVitroの両面より検討した。まずCD1マウスにストレプトゾトシンを腹腔内投与して糖尿病を発症させ、投与後2週と4週にと殺した。経過中血糖値は400台、尿糖4+を呈し、対象群に比べ体重減少を認めた。尿中アルブミンは2週の時点では陰性であったが、4週の時点で対象群に比べて高値を示した。組織学的に4週の時点で、光顕上で糸球体の腫大と軽度の間質の障害が見られた。今後電顕で糸球体内皮細胞障害の程度を確認予定である。また、免疫組織学的に、糸球体内皮細胞におけるPPARgammaはわずかに減弱し、TGF-b1は軽度にメサンギウムでの増加を認めたものの、内皮細胞では著変を認めなかった。現在糖尿病発症マウスに対して、PPARgamma agonist含む脂質代謝に影響のある薬剤を投薬し、その影響を検討中である。次にラットの糸球体内皮細胞を高血糖下(5mM,30mM,50mMの糖濃度で、各1日、3日、5日間培養)あるいはmethylglyoxa1(MG)(OnM,40mMで2日間,400mMで4時間)で培養した。RT-PCRでPPARgammaとTGF-b1のmRNA発現を比較したところ、高血糖下では、両者はほとんど変わらなかった。一方でMG投与下では、対象群に比べ、PPARgammaは減弱し、TGF-b1は有意に高値を示した。今後はこれらの変化をmRNAや蛋白レベルで検討し、内皮障害の機序を検討する予定である。糖尿病性腎症の初期変化として、糸球体内皮細胞腫大・変性があるが、最近では高血糖に起因する尿細管障害も糸球体病変を増悪させている可能性が示唆されている。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)は糖・脂質代謝に関与する種々の標的遺伝子を調節している転写因子で、糖尿病の糸球体硬化進展に関与しているのが知られているが、これらの糸球体内皮細胞障害の進展に関しては明らかでない。また、脂質代謝改善薬(eicosapentanoic acid : EPA)が腎病変に与える影響もほとんど検討されていない。申請者は糖尿病の腎病変の進展機序に関し、PPAR・とTGF・・1、アポトーシスに注目し、糖尿病性腎症の初期症状である糸球体内皮細胞障害や尿細管傷害においてこれらの関与をVivoとVitroの両面より検討した。STZ投与で糖尿病を発症させた群(DM群)と、上記に加えEPAを同時に投与した群(EPA群)を作製し、2週間後、western blottingや免疫組織学的手法で脂質過酸化物、TGF-・1、PPAR・を検討した。また、ラットの糸球体内皮細胞および尿細管上皮細胞をmethylglyoxalで培養し、糸球体内皮細胞ではPPAR・とTGF・・1の発現を、尿細管上皮細胞では、活性酸素種(ROS)とアポトーシスの発現を検討した。DM群では、多量の尿中アルブミンを示し、組織学的には、軽度の糸球体の腫大と高度の尿細管上皮傷害が見られた。免疫組織学的には、糸球体内皮細胞におけるPPAR・はわずかに減弱し、TGF・・1は軽度にメサンギウムでの増加を認めたものの、内皮細胞では著変を認めなかった。また、尿細管上皮細胞での脂質過酸化物の有意な上昇がみられた。-方EPA投与群では、尿中アルブミンが減少し、組織学的に尿細管病変の改善が見られた。免疫組織学的にも、脂質過酸化物の減少やアポトーシス細胞の減少がみられた。同様の所見はin vitroでも確認された。今回の研究によって、糖尿病腎症でのPPAR・や硬化関連因子、ROSの関与が明らかになり、今後の病状進展を阻止しうると思われる。