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19世紀後半の英仏文学と戦争報道に関する比較研究

19世紀後半のイギリスとフランスにおける文学と大衆ジャーナリズムとの相関関係を、特に戦争報道という側面から比較検討することを目的とし、クリミア戦争期からボーア戦争期までを対象に、ヨーロッパ内部での戦争と植民地戦争とに分けて考察を加えた。その結果、この時期の両分野の関りは、帝国意識の高揚にあずかって、近代国民国家形成期における特異な現象のひとつとして、様々な「近代神話」形成に寄与したことが判明した19世紀後半のイギリスとフランスにおける文学と大衆ジャーナリズムとの相関関係を、特に戦争報道という側面から比較検討することを目的とし、クリミア戦争期からボーア戦争期までを対象に、ヨーロッパ内部での戦争と植民地戦争とに分けて考察を加えた。その結果、この時期の両分野の関りは、帝国意識の高揚にあずかって、近代国民国家形成期における特異な現象のひとつとして、様々な「近代神話」形成に寄与したことが判明した活字メディア発展期であるとともに国民国家形成期や植民地獲得競争の時代でもあった、19世紀後半の英仏における文学とジャーナリズムとの相関関係を、戦争報道という側面から比較検討するにあたり、本年度は研究実施のための基礎的資料の購入に努め、特に報道関連文献を中心に収集をはかった。具体的には、フランスの『プレス』、『シエークル』、『イリュストラシオン』、イギリスの『デイリー・グラフィック』、『グラフィック』、『ブラック・アンド・ホワイト』等のマイクロフィルムを購入した。さらに中島がフランス国立図書館にも出張し、『デバ』や『モニトゥール』など数紙を閲覧した。それらをもとに基礎的データの抽出範囲と整理方法について検討し、比較分析の指標をいずれに設定するかについて議論を重ね、近代国民国家の神話を軸に進めることとした。そこで第一段階として、ヨーロッパ大陸内部での戦争であり、はじめての「近代戦争」と呼ばれるクリミア戦争に焦点を当て、普仏戦争時やボーア戦争時との比較をも試みた。その際、当時の英仏両国における政治・社会的動向を視野におさめつつ、関連トピックスを新聞・雑誌等より抽出する方法を選び、そこから得た結果を文芸への影響という点から分析してみた。第二帝政初期の言論統制下にあったフランスでは、出版界における戦争特需的なとらえ方が顕著であり、行政改革の遅れに対する批判が表明されたイギリスとの落差が確認されたが、両国ともナポレオン神話復活や英雄的兵士像への賛美を通じて、後の国民国家ナショナリズムと結びついてゆく要素がうかがいとれた。その成果は学会発表や論文投稿の形で公表した。平成19年度には新たな資料を入手して対象の範囲を拡大し、普仏戦争についてのさらなる検討と、それ以後の植民地遠征を調査の対象とする予定である。活字メディア発展期であり国民国家形成期や植民地獲得競争の時代でもあった19世紀後半の英仏における文学とジャーナリズムとの相関関係を、戦争報道という側面から比較研究を行っており、完成年度である平成20年度での研究成果報告書作成を念頭に、研究のまとめを目指した。まずそのために、平成18年度に収集した基礎的文献に欠けていた資料の追加が必要となった。具体的にはフランスの『プチ・ジュルナル・イリュストレ』、『プチ・パリジャン』、『ジュルナル・イリュストレ』、イギリスの『イラストレイティド・ロンドン・ニューズ』のマイクロフィルムを購入した。さらに、必要不可欠でありながらも国内では入手困難な貴重な資料を補足するため、田中が大英図書館にも出張し、『ファン』、『グラフィック』、『ジュディ』など数紙を閲覧した。前年度に設定した比較分析の指標である「近代国民国家の神話」を軸に研究を進め、本研究の第一段階で行ったヨーロッパ内部の戦争から、第二段階としての植民地戦争に焦点を移した結果、英仏両国における兵隊募集制度および脅威の対象の差異が、戦争報道のありかたや文芸作品への影響を大きく左右するという事実を確認した。つまり、志願兵制度をとるイギリスに対して徴兵制度を採用するフランスでは、伝統的な「農民兵士の神話」の継承が植民地拡張政策を遂行した第三共和制の確立と平行して見出された。また、普仏戦争での敗戦以降、そのトラウマを抱え「ドイツの影」に怯え続けたフランスに対して、セポイの反乱以来、「逆侵略の不安」にさらされたイギリスにおける異人種観の特異さが浮き彫りとなった。今年度の成果は学会発表や論文投稿の形で公表しており、前年度と今年度の成果をもとに、次年度に研究成果報告書として完成させる予定である。本研究は、19世紀後半のイギリスとフランスにおける文学と大衆ジャーナリズムとの相関関係を、特に戦争報道という側面から比較検討することを目的とし、クリミア戦争期からボーア戦争期までを対象に考察した。今年度は、平成18年度以来の資料収集・調査に基づく分析結果をふまえ、英仏二カ国間での比較作業を経て総合的見地から研究完成に至った。この時期の文学と戦争報道との関わりは、近代国民国家形成期における特異な現象の一つであり、帝国意識の高揚にあずかって様々な「近代神話」形成に寄与したことが明らかとなった。ヨーロッパ大陸内での戦争の代表例として、フランスでは普仏戦争とその後の内乱が引き起こした深刻な後遺症への反動として、文化礼賛に大きく傾斜した点に、経済優先の英国との落差が垣間見られた。植民地戦争に関しては、英仏両国において西洋文明・人種の優位性誇示の姿勢とともに、時には逆侵略の恐怖も存在するようになる。これは特に「セポイの反乱」以降の特徴で、東洋に対して理解困難な神秘のイメージに発する「異国趣味」も強調されてゆく。そして、それらが報道や新聞広告を通して大衆層に浸透すると同時に、場合によっては国民国家形成という国家戦略を密かに蚕食してゆく事実を解明した。

また、これらの現象が文学分野にも色濃く投影され、それぞれ神話化されていっている点が、英仏文学のキプリングやヴェルヌはもとより、耽美主義的な文学者たちの作品に至るまで顕著に認められた。それらの豊富な具体例に基づいて検証を行った成果は、学会シンポジウムや論文投稿の形で公表しており、研究成果報皆書を作成したうえで、それをもとに著書としての刊行を目指している。
有限群の表現空間と指標を用いた群の構造の研究

本研究では、有限群の表現空間およびその指標に注目し、群の共役類と指標との関係、また、表現空間の中に群の作用の性質を反映した部分構造の構成し、それを用いた有限群の構造の研究を目的とする。特に(1)指標表に関連した予想である原田予想およびそこから派生する諸問題の研究、(2)表現空間の中に存在する、群の作用を反映した組合せ構造および代数構造の構成とその特徴けおよびそれを用いた群の構造の研究を中心に研究を行う。群の性質を指標を用いて明らかにすること、および各表現空間への群の作用の様子を調べることで群の構造を明らかにする。
微量不純物による結晶成長速度の低下-速度 モデルの提案とその実験的検討-

結晶成長速度に対する微量不純物の影響は、理論的には結晶成長の基本に関わる問題として興味ある問題である。また、工学的には結晶形状の制御に直接関わる問題として、興味を持たれている。そのような理由から従来から多くの研究がなされてきた。しかしながら、不明の部分が多い。例えば、微量不純物の効果は溶液の過飽和度、温度、不純物濃度によって著しく変わるがその変わり方を従来理論的に説明出来なかった。この問題は、工学的に結晶形状の制御を考える場合、先ず第1に知らなくてはならない問題であるにも関わらず、理解できていないのである。本研究では、先ず当研究室で平成5年度提案された不純物効果を説明する理論(N.Kubota and J.W.Mullin,Journal of Crystal Growth,149(1995)113-119)を再検討し、実験的に検証した。この理論によれば、不純物効果(純粋系に対する速度低下の比率)は過飽和度および絶対温度の逆数に比例して増大し、不純物濃度の増加に対して(低濃度では比例して)増加する。実験は、当初の計画では硫酸カリウム結晶について行う予定であったが、フタル酸水素カリウム結晶を用いて行った。不純物は当初の計画通りクロム(III)である。実験においては、不純物効果に対する過飽和度の影響および不純物濃度の影響を調べたが、その結果は理論的予測と全く一致した。さらに、過飽和度および温度の影響は、結局溶液と結晶のケミカルポテンシャル差に帰着することを指摘した。なお、クロム(III)の存在によって結晶成長が抑制されるどころか、(過飽和にも関わらず)結晶が溶ける場合があることを実験的に示した。この現象も不純物効果として興味ある問題である。今後は、結晶形状制御への応用を目的に、工学的立場から、不純物効果の検討を続けたい。
第16番染色体長腕に連鎖する優性遺伝性小脳変性症関連遺伝子の機能解析

本研究の目的は、第16番染色体長腕に連鎖する優性遺伝性小脳変性症の関連遺伝子について解析することである。本疾患は、我々がこれまで、原因遺伝子座の同定(Ishikawa Kら2000)、物理地図の作製、候補領域の限定化(Takashima Mら,2001;Li Mら2003}を行ってきた。さらに、puratrophin-1遺伝子内に、連鎖不平衡が高い変化を見出した。puratrophin-1に対する抗体を作製し患者脳で免疫組織化学的に解析すると、同蛋白は患者小脳Purkinje細胞で細胞骨格蛋白とともに凝集していた(Owada Kら2005)。これは患者に特有の唯一の変化であり、本疾患の発症の直接的原因であるか、もしくは極めて密接に関連した遺伝子変化である(Toru S, Ishikawa Kら2005)。以上の様な背景から、本変化が病因かどうかを検証した。puratrophin-1遺伝子の産物の特性を調べるために、この蛋白質に相互作用あるいは複合体を形成する蛋白質のcDNAをライブラリーからtwo-hybridsystem法を用いてクローニングした。puratrophin-1と酵母転写遺伝子含むbaitプラスミドを構築し、スクリーニングの対象となるヒト胎児脳cDNAライブラリーを酵母転写因子の転写活性化領域につないだものとともにホスト酵母に導入し、発現させた。培地上に生育してくる陽性コロニーをスクリーニングし、陽性クローンをもつ酵母細胞からプラスミドDNAの回収を行った。これを、ダイレクトシークエンス法で塩基配列解析を行い、蛋白を同定しているが、細胞骨格蛋白と関連するものは判明していない。現在、ポリクローナル抗体の作製、insituhybridizationを含めて検討中である。一方で、本疾患の原因遺伝子が他にもある可能性もあり、候補領域を詳細に検討し、その結果については投稿中である本研究の目的は、第16番染色体長腕に連鎖する優性遺伝性小脳変性症の関連遺伝子について解析することである。一方で、本疾患の原因遺伝子が他にもある可能性もあり、候補領域を詳細に検討し、その結果については投稿中である本研究の目的は、第16番染色体長腕に連鎖する常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症(16q-ADCA typeIII)の原因遺伝子について解析することである。16q-ADCA typeIIIは我々が発見・確立させた優性遺伝性脊髄小脳変性症で、これまで、原因遺伝子座の同定(Ishikawa K, et al. Neurology 2000)、物理地図の作製、候補領域の限定化(Takashima M, et al. J Hum Genet 2001 ; Li M, et al, J Hum Genet 2003)を行ってきた。その後、ある遺伝子内に、患者全員に存在し、健常者には認められない、きわめて連鎖不平衡が高い遺伝子のvariationを見出した。この遺伝子は機能も構造も余り知られていない新規遺伝子であるが、細胞骨格に関与することが想定される。このvariationを有する遺伝子の産物について、抗体を作製し患者脳で免疫組織化学的に解析すると、同蛋白は患者小脳Purkinje細胞で特異的に凝集していることが見出され、これを報告した(Owada K, et al, Neurology 2005)。このvariationは患者に特有の唯一の変化であり、16q-ADCA typeIIIの発症の直接的原因であるか、もしくは極めて密接に関連した遺伝子変化であることを報告した(Ishikawa K, Toru S, et al, Am J Hum Genet. 2005)。以上の様な背景から、本研究の交付期間中に本変化が病因であることを検証している。このvariationを有する遺伝子の産物の特性を調べるために、この蛋白質に相互作用あるいは複合体を形成する蛋白質のcDNAをライブラリーからtwo-hybrid system法を用いてローニングする。まず、この遺伝子を酵母転写遺伝子につなぎ、融合蛋白質として発現できるbaitプラスミドを構築した。

一方、スクリーニングの対象となるヒト胎児脳cDNAライブラリーを酵母転写因子の転写活性化領域につないだものを作成し、baitプラスミドとともにホスト酵母に導入し、発現させた。SD(-HIS)寒天培地上に生育してくる陽性コロニーをスクリーニングし、陽性クローンをもつ酵母細胞からプラスミドDNAの回収を行った。これを、ダイレクトシークエンス法(ABI3100,Applied Biosystem社)を用いて塩基配列解析を行い、この蛋白を同定している。本研究の目的は、第16番染色体長腕に連鎖する優性遺伝性小脳変性症の関連遺伝子について解析することである。本疾患は、我々がこれまで、原因遺伝子座の同定(Ishikawa Kら2000)、物理地図の作製、候補領域の限定化(Takashima Mら,2001;Li Mら2003)を行ってきた。さらに、puratrophin-1遺伝子内に、連鎖不平衡が高い変化を見出した。puratrophin-1に対する抗体を作製し患者脳で免疫組織化学的に解析すると、同蛋白は患者小脳Purkinje細胞で細胞骨格蛋白とともに凝集していた(Owada Kら2005)。これは患者に特有の唯一の変化であり、本疾患の発症の直接的原因であるか、もしくは極めて密接に関連した遺伝子変化である(Toru S, Ishikawa Kら2005)。以上の様な背景から、本変化が病因かどうかを検証した。puratrophin-1遺伝子の産物の特性を調べるために、この蛋白質に相互作用あるいは複合体を形成する蛋白質のcDNAをライブラリーからtwo-hybridsystem法を用いてクローニングした。puratrophin-1と酵母転写遺伝子含むbaitプラスミドを構築し、スクリーニングの対象となるヒト胎児脳cDNAライブラリーを酵母転写因子の転写活性化領域につないだものとともにホスト酵母に導入し、発現させた。培地上に生育してくる陽性コロニーをスクリーニングし、陽性クローンをもつ酵母細胞からプラスミドDNAの回収を行った。これを、ダイレクトシークエンス法で塩基配列解析を行い、蛋白を同定しているが、細胞骨格蛋白と関連するものは判明していない。現在、ポリクローナル抗体の作製、in situ hybridizationを含めて検討中である。一方で、本疾患の原因遺伝子が他にもある可能性もあり、候補領域を詳細に検討し、その結果については投稿中である。
無細胞翻訳系によるセレノメチオニン標識タンパク質の生産とX線結晶構造解析への応用

無細胞翻訳系によるセレノメチオニン(SeMet)標識を、クラゲ蛍光タンパク質(GFP)および菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として検討した。その結果、いずれのタク質も、メチオニン(Met)を用いた通常の合成量に匹敵する量で合成が可能であった。合成したパク質中のSeMet置換は、液体クロマトグラフィ-質量分析により確認した。全液体クロマトグを精査しても、内在性Metによる該当ペプチドを検出できなかったことから、SeMet置換量は100%に近いことが確認された。また、この過程でSeMet標識タンパク質を、-80°Cで6ヶ月間してもSeMet基が酸化を受けないことも確認された。GFPの発色団形成は、通常のメチオニン標識よりもややスローであったが、その蛍光スペクはSeMet-GFPとMet-GFP間でよい一致をしめした。この結果は、少なくとも発色団近傍のタク質立体構造形成にSeMet標識が何も影響を与えないことを示している。また、DHFRの場合、残基の位置が触媒機構上重要なMet20-ループに含まれることから、触媒活性への影響が懸念さが、これもほぼ同等の活性を有することが確認された。これら、モデルタンパク質による標識の検討を終え、X線構造解析に着手しているtRNA修飾のSeMet導入部位検索に利用した。現在、本酵素は1.5Å解像度で構造精密化を行なっている。よって、無細胞翻訳系により、高効率でSeMet標識が可能であることが確認され、x線結晶構造解析への応用が可能なものと考えている。本研究の一部は、日本生化学会および分子生物学会において発表し、解析中の遺伝子のクローニングおよびドメイン構造、活性に必須なアミノ酸残基についてはすでにいくつかの論文として公表した。構造解析の詳細については、平成15年度以降、順次、論文として発表する予定である。無細胞翻訳系によるセレノメチォニン(SeMet)標識を、クラゲ蛍光タンパク質(GFP)および大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として検討した。その結果、いずれのタンパク質も、メチオニン(Met)を用いた通常の合成量に匹敵する量で合成が可能であった。合成したタンパク質中のSeMet置換は、液体クロマトグラフィー質量分析により確認した。全液体クロマトグラムを精査しても、内在性Metによる該当ペプチドを検出できなかったことから、SeMet置換量はほぼ100%に近いことが確認された。また、この過程でSeMet標識タンパク質を、-80°Cで6ヶ月間保存してもSeMet基が酸化を受けないことも確認された。GFPの発色団形成は、通常のメチオニン標識よりもややスローであったが、その蛍光スペクトルはSeMet-GFPとMet-GFP間でよい一致をしめした。この結果は、少なくとも発色団近傍のタンパク質立体構造形成にSeMet標識が何も影響を与えないことを示している。また、DHFRの場合、Met残基の位置が触媒機構上重要なMet20-ループに含まれることから、触媒活性への影響が懸念されたが、これもぼぼ同等の活性を有することが確認された。これら、モデルタンパク質による標識の検討を終え、X線構造解析に着手しているtRNA修飾酵素のSeMet導入部位検索に利用した。現在、本酵素は3A解像度で構造精密化を行なっている。本研究の一部は、日本生化学会および分子生物学会において発表した。

無細胞翻訳系によるセレノメチオニン(SeMet)標識を、クラゲ蛍光タンパク質(GFP)および菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として検討した。その結果、いずれのタク質も、メチオニン(Met)を用いた通常の合成量に匹敵する量で合成が可能であった。合成したパク質中のSeMet置換は、液体クロマトグラフィー質量分析により確認した。全液体クロマトグを精査しても、内在性Metによる該当ペプチドを検出できなかったことから、SeMet置換量は100%に近いことが確認された。また、この過程でSeMet標識タンパク質を、-80°Cで6ヶ月間してもSeMet基が酸化を受けないことも確認された。GFPの発色団形成は、通常のメチオニン標識よりもややスローであったが、その蛍光スペクはSeMet-GFPとMet-GFP間でよい一致をしめした。この結果は、少なくとも発色団近傍のタク質立体構造形成にSeMet標識が何も影響を与えないことを示している。また、DHFRの場合、残基の位置が触媒機構上重要なMet20-ループに含まれることから、触媒活性への影響が懸念さが、これもほぼ同等の活性を有することが確認された。これら、モデルタンパク質による標識の検討を終え、X線構造解析に着手しているtRNA修飾のSeMet導入部位検索に利用した。現在、本酵素は1.5Å解像度で構造精密化を行なっている。よって、無細胞翻訳系により、高効率でSeMet標識が可能であることが確認され、x線結晶構造解析への応用が可能なものと考えている。本研究の一部は、日本生化学会および分子生物学会において発表し、解析中の遺伝子のクローニングおよびドメイン構造、活性に必須なアミノ酸残基についてはすでにい、くつかの論文として公表した。構造解析の詳細については、平成15年度以降、順次、論文として発表する予定である。
次世代シークエンサーによる骨巨細胞腫の病態解明と新規治療ターゲットの探索

骨巨細胞腫は良性悪性の中間病変であり、腫瘍に発現しているRANKLが巨細胞(破骨細胞)を誘導することによって、局所での骨破壊が生じる。RANKLは、骨粗鬆症、がんの骨転移での治療ターゲットとなっており、その発現メカニズムに関しては、不明な点が多い。本研究は、骨巨細胞腫のRANKL発現メカニズムについて次世代シーケンサーを用いて行っている。解析をさらに進め、治療ターゲットの探索につなげて行くことを目標としていく。骨巨細胞腫は、若年者に好発する良性骨腫瘍であるが、手術による掻爬術、切除術によっても、再発率は、1745%と高い。さらに脊椎、仙骨・骨盤発生など手術療法が困難な場合がある。骨巨細胞腫は、多核巨細胞と間質細胞、組織球からなり、間質細胞は、破骨細胞の強力な誘導因子であるRANKLを高発現している。RANKLをターゲットにした治療は、骨粗鬆症および骨転移の分野で発展し、ヒトモノクローナル抗体を用いた治療が確立しているが、骨巨細胞腫に対しても有効性が示唆されてきている。そこで、我々は、RANKLヒトモノクローナル抗体の作用メカニズムについて、および間質細胞のRANKL発現メカニズムを解明することを目的に解析を進めている。本年度は、骨巨細胞腫の症例の集積を進めているところである。うち1例は、自然消失を認め、非典型的な経過をたどったため、今回の解析には含めなかった。上記のため、シークエンサーによる解析はまだ行えていないが、基礎的検討として、採取された細胞を用いて、骨巨細胞腫の間質細胞に対する、抗RANKL抗体の抗腫瘍効果について検討した。抗RANKL抗体を細胞培養系に投与し、CCK-8, BrdUの取り込み率を解析したところ、細胞増殖能には明らかな影響を与えなかった。このことから、臨床的にみられる抗RANKL抗体の作用としては間質細胞に対する直接の抗腫瘍作用ではない可能性が示された。また、臨床的には、ヒトに抗RANKL抗体を投与すると、間質細胞が骨芽細胞系に分化し、骨を形成する傾向にあることが知られているが、細胞培養系では、細胞染色、遺伝子発現レベルで解析したところ抗RANKL抗体による間質細胞の骨芽細胞系への分化誘導はみられなかった。これらの実験は、上記で得られた腫瘍細胞の1つを用いた実験であり、今後も検討が必要である。昨年度と同様に、骨巨細胞腫におけるRANKL発現メカニズム、ヒトモノクローナル抗RANKL抗体の作用メカニズムについて解析を行った。昨年度から新たに2例症例が蓄積し、検体収集をした。現在も次世代シーケンサーを用いて解析を行っている。ヒトモノクローナル抗RANKL抗体投与前後の検体の解析も進めている。臨床情報と統合して解析中である。また、in vitroでRANKL発現メカニズムについて細胞株を用いて検討している。解析がまだ不十分であり、今後も継続して研究を行う予定である。整形外科本年度は、骨巨細胞腫の症例が少なく、採取された検体は3例のみであった。そのうち1例は、自然消失を認め、非典型的な経過をたどったため、今回の解析には含めなかった。手術によって得られた検体を、凍結保存し、さらに凍結切片用に包埋を行った。また初代培養により、腫瘍細胞を培養し保存した。これらの実験は、上記で得られた腫瘍細胞の1つを用いた実験であり、今後も他の検体を用いた解析が必要であり、今後予定している。本年度は、骨巨細胞腫の検体の収集が当初の予定よりも少なく、解析にたどり着けなかったため、今後は、腫瘍専門病院に協力を依頼し、検体数を増やしていく。腫瘍検体が集まった段階で、当初予定していた、エキソーム解析、遺伝子発現解析を行う予定である。さらに、RANKL発現メカニズムを解明するために、エピゲノム解析を追加で行う予定である。抗RANKL抗体の作用メカニズムの検討のため、本年度は、間質細胞のみを採取し、抗腫瘍効果の検討を行ったが、今後は、採取した腫瘍細胞を初期培養し、間質細胞と巨細胞が共存している状態での解析を進めていく予定である。症例が少ないために解析が思うように進まなかったが、次年度以降は専門病院に協力を依頼し、解析を進めていく。
歯根膜幹細胞誘導因子の同定と新規歯周組織再生療法の開発

我々は、歯根膜幹細胞を歯周組織再生療法に応用するため、歯根膜幹細胞特性に関与する因子の同定と、シグナル関連因子の探索を行った。特に今回は、歯根膜幹細胞様株である2-23細胞株(2-23)に強く発現する遺伝子MESTに着目した。幹細胞マーカーの発現が低く、多分化能を有さないヒト歯根膜細胞株(2-52細胞株)にMESTを過剰発現させた「2-52/MEST」ならびにコントロールベクターを導入した細胞「2-52/empty」を樹立して、これら2種の細胞について解析を行ったところ、2-52/emptyと比較して、2-52/MESTにおいて、間葉系幹細胞マーカーの発現上昇、多分化能の促進を認めた。次に、これら2-52/MESTと2-52/emptyの遺伝子発現値の変動が大きく、2-52/MESTにおいて発現が高い因子Xをマイクロアレイを用いてピックアップした。すると、この因子XのsiRNAを導入すると、2-23ならびに2-52MESTの骨芽細胞様分化を抑制することが明らかになった。さらに、2-52/MESTおよび2-52/emptyの細胞培養上清を初代培養ヒト歯根膜細胞(HPDLC)に添加したところ、骨芽細胞様分化ならびに細胞増殖能には影響を及ぼさなかった。しかし、細胞遊走能について検討したところ、2-52/emptyと比較して、2-52/MESTの上清を添加したHPDLCにおいて、遊走能が有意に促進した。今後は歯周組織傷害モデルに2-52MESTの培養上清を応用して、歯周組織再生への影響を解析する。また、MESTシグナル関連因子のさらなる解析を進める。本研究で得られた知見により、歯根膜幹細胞を獲得するために重要な幹細胞特性関連因子MESTと、その関連シグナルを応用した新規歯周組織再生療法開発に繋がるのではないかと期待している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。MESTを組み込んだプラスミドベクターを作製した。計画段階では、初代ヒト歯根膜細胞への遺伝子導入を検討していたが導入が困難であった。そこで、幹細胞マーカーの発現が低く、多分化能を有さないヒト歯根膜細胞株(2-52細胞株)に遺伝子導入し、MEST導入2-52細胞(2-52/MEST)を樹立し、さらに、2-52細胞株にコントロールベクターを導入した細胞(2-52/empty)を樹立した。これら2種の細胞における間葉系幹細胞マーカーの発現をフローサイトメトリー法で解析したところ、2ー52/emptyと比較して、2-52/MESTで間葉系幹細胞マーカーの発現が上昇していることを確認した。さらに、多分化能について解析するため、これら2種の細胞において、in vitroにて分化アッセイ系(骨芽細胞誘導、脂肪細胞誘導)を用いた検討を行った。まず、骨芽細胞誘導培地を用いて一定期間培養したところ、2-52/MESTにおいて、骨関連因子(ALP、BSP、OCN)の発現上昇を認め、石灰化形成能の上昇を認めた。さらに脂肪細胞分化培地を用いて培養したところ、脂肪関連因子(PPAR、LPLおよびCEBPA)の発現上昇を認めた。このことから、2-52/MESTが、幹細胞特性を獲得することを明らかにした。これら2-52/MESTと2-52/emptyの遺伝子発現量の差をcDNAマイクロアレイにて網羅的に解析した。その中で、発現値の変動が大きく、2-52/MESTにおいて発現が高い複数の因子をピックアップした。現在、その着目した因子のsiRNAをヒト歯根膜幹細胞株である2-23細胞株へ導入してその因子の発現を抑制し、2-23細胞株における幹細胞マーカーの発現および多分化能の解析を行っている。2-52/MESTと2-52/emptyの樹立に成功し、またこれらの遺伝子発現量の差をcDNAマイクロアレイにて網羅的に解析し、発現値の変動が大きい因子に着目することができた。MESTによる幹細胞特性の付与に主要なシグナル因子の解明には至っていないものの、着目した複数の因子のsiRNAを、ヒト歯根膜幹細胞株である2-23に導入し、幹細胞マーカーの発現と、多分化能について解析を行っている段階である。

さらに、2-52/MESTおよび2-52/emptyの細胞培養上清を初代培養ヒト歯根膜細胞(HPDLC)に添加したところ、骨芽細胞様分化ならびに細胞増殖能には影響を及ぼさなかった。しかし、細胞遊走能について検討したところ、2-52/emptyと比較して、2-52/MESTの上清を添加したHPDLCにおいて、遊走能が有意に促進した。今後は歯周組織傷害モデルに2-52MESTの培養上清を応用して、歯周組織再生への影響を解析する。また、MESTシグナル関連因子のさらなる解析を進める。本研究で得られた知見により、歯根膜幹細胞を獲得するために重要な幹細胞特性関連因子MESTと、その関連シグナルを応用した新規歯周組織再生療法開発に繋がるのではないかと期待している。MESTによる幹細胞特性の付与に主要なシグナル因子の解明を継続する。また、昨年度樹立した2-52/MESTならびに2-52/emptyを用いて以下の実験(1)(2)を行っていく。(1)in vivoにおいて、MEST導入ヒト歯根膜細胞が、歯根膜様組織形成能に及ぼす影響について検討するため、免疫不全マウスを用いた背部皮下移植モデルに、GFPを導入した(a)2-52/MESTと(b)2-52/emptyを足場材とともにそれぞれ移植する。手術から4週後に潅流固定を行い、移植を行った部位の切片を作製して組織学的に検証する。(2)MEST導入ヒト歯根膜細胞の培養上清中に含まれるエクソソームが、歯周組織再生に及ぼす影響を検討するため、まず2-52/MESTおよび2-52/emptyの細胞培養上清からエクソソーム(2-52/MESTのエクソソーム:MEST Exo、2-52/emptyのエクソソーム:empty Exo)を単離する。in vitroにおいて、ヒト歯根膜細胞の線維芽細胞分化の促進に及ぼす影響を検討するため、MEST Exoおよびempty Exoをヒト歯根膜細胞の培養培地にそれぞれ添加し、歯根膜関連因子の発現について比較検討する。また、培養上清中に分泌される可溶性コラーゲン量を解析する。2-52/MESTおよびMEST Exoがin vivoにおける歯根膜組織再生に及ぼす影響について検討するため、免疫不全ラットの歯周組織傷害モデルを樹立し、傷害部位にGFPを導入した(a)2-52/MEST、(b)2-52/empty、(c)MEST Exoおよび(d)empty Exoを足場材とともにそれぞれ移植する。手術から4週後に灌流固定を行い、移植部位を含めた下顎骨を摘出する。マイクロCT撮影にて組織再生を確認する。また、移植を行った部位の切片を作製して組織学的に検証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
重症急性呼吸器症候群の重症化機序の解明

老齢BALB/cマウスへのSARSコロナウイルス(SARS-CoV)の感染では、感染6日から9日後にかけて急激なウイルス排除と肺炎の発症が見られる。一方、免疫不全マウスであるSCIDマウスでは、肺炎を発症することなく、持続感染化した。よって、獲得免疫がウイルス排除とともに肺炎発症に寄与していることが示唆された。そこで、老齢BALB/cマウスへの特異的抗体投与によるCD4^+細胞及びCD8+細胞の枯渇実験とSCIDマウスへの老齢BALB/cマウスの脾細胞の養子移入実験を行ない、SARS-CoV感染後の肺炎への影響を解析した。その結果、肺炎発症には体細胞からのサイトカイン等の液性因子の産生とリンパ球以外の免疫担当細胞群が関与していることが示唆された。重症急性呼吸器症候群(SARS)は、SARSコロナウイルス(SARS-CoV)感染によって引き起こされる過剰な免疫応答を原因とした重篤な急性肺炎であるが、如何にして過剰な免疫応答が誘導されているのかについて、その機序は不明な点も多い。本研究では、SARS-CoV感染により肺炎を発症する老齢BALB/cマウスを用いて、ウイルス排除に関わる免疫応答と肺炎発症に至る機序との関係を解析し、SARS-CoV感染に対する免疫応答を介した肺炎の重症化機序の解明を目的とした。本年度は、まず、野生型マウスであるBALB/cマウス(7-8週齢、>6ヶ月齢)及び免疫不全マウスであるSCIDマウス(7-9週齢)へのSARSコロナウイルス感染による肺中ウイルス量の経日変化を解析した。その結果、BALB/cマウスでは、いずれの週齢においても感染後9日までには検出限界以下にまで肺中ウイルス量が減少していたのに対して、SCIDマウスでは感染21日後においてもウイルスは排除されず、持続感染化していることが判明した。更に、興味深いことに、重篤な肺炎を呈することなく、持続感染化しており、SARSの肺炎の重症化には獲得免疫応答の関与が強く示唆された。そこで、SCIDマウスへ老齢(>6ヶ月齢)BALB/cマウスの脾細胞を移入した後に、SARS-CoVを感染させたところ、BALB/cマウスと同様に感染9日後までに肺中ウイルス量は、検出限界以下にまで減少していた。しかしながら、移入した免疫担当細胞は、老齢マウス由来であるにも関わらず、顕著な肺炎像は認められなかった。以上の結果より、老齢マウスにおける体細胞からのサイトカイン等の液性因子の産生量が肺炎発症には関与している可能性が示唆されたことから、現在、種々の液性因子の産生量の解析を進めている。本研究では、SARS-CoV感染により肺炎を発症する老齢BALB/cマウスを用いて、ウイルス感染後に誘導される宿主免疫応答が肺炎発症に与える影響を解析し、SARS-CoV感染に対する免疫応答を介した肺炎の重症化機序の解明することを目的とした。これまでの研究結果から、免疫不全マウスであるSCIDマウスでは顕著な肺炎を呈することなく、SARSコロナウイルスが持続感染化を見出しており、SARSの肺炎の重症化には獲得免疫の関与が強く示唆された。そこで、獲得免疫に着目し、細胞性免疫と液性免疫のウイルス排除への関与と肺炎発症への影響を解析した。ウイルス排除には、細胞障害性T細胞(CTL)が重要であると考えられている。特異的抗体を用いてCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞の枯渇実験を行い、ウイルス排除への影響を解析した。興味深いことに、CD8陽性細胞枯渇群では、野生マウスと同様に感染9日後までに肺中ウイルス量は検出限界以下にまで低下していた。一方、CD4陽性細胞枯渇群では、ウイルス排除に失敗した。さらに、CD4陽性細胞をSCIDマウスに移入した場合には、SARS-CoVを排除できないが、T細胞欠損しているnudeマウスへのCD4陽性細胞移入した場合には、SARS-CoVが排除された。以上の結果より、SARS-CoV感染に対しては、何らかの原因によりCTLがうまく誘導されず、液性免疫がウイルス排除により高い寄与を果たしていることが明らかとなった。しかし、CD4陽性細胞枯渇老齢BALB/cマウス及びCD8陽性細胞枯渇老齢BALB/cマウスともに肺炎像は軽減されていないことから、肺炎発症には他の免疫担当細胞群が関与していることが示唆された。
徳川幕府御家人伊賀者の制度史的研究―関係史資料収集とその総合的把握―

この研究は、虚像に包まれてきた忍者(伊賀者)の史実を明らかにしようという目的がある。それには、まず、史料の収集と史料の翻刻が必要である。職場の三重大学国際忍者研究センターでは、徳川幕府御家人伊賀者松下家文書の寄託処理に成功し、写真撮影を行った。そのデータをもとに、松下家文書(総点数47)のうち、松下家歴代の系譜や履歴がわかる主な史料を選び、翻刻作業を行った(ここでいう「翻刻」とはくずし字を楷書に起こし、書籍化しやすい状態にすること)。「系譜一」「系譜二」「系譜三」など、5代目松下菊蔵が記した記録類が中心である。当初の方針である「(1)伊賀者のひとつである新発見史料松下家文書の全文翻刻・分析を行う。」という目的の第一段階を終えたということである。松下家文書については、すでに拙著『忍者の末裔江戸城に勤めた伊賀者たち』(角川書店)に内容を紹介をしている。しかし、だいたいのところを紹介したにとどまり、どこにどのようなことが書いてあるのかを、詳細に紹介したものではなかった。今回の作業によって、現在のところ、伊賀者史料のもっとも優秀である松下家文書の全体像を窺い知ることができるような状態となった。この翻刻の成果は、ワープロソフトWordのテキストにしてある。そのことによって、文字列を検索かけられるようになっており、研究の便が向上した。さらなる研究の進展が期待される。今後このデータを公開する予定である。徳川幕府伊賀者松下家文書の翻刻は、30万文字分を行うことができた。その分量は書籍として公開するのに充分な量といえる。徳川幕府伊賀者松下家文書の翻刻は、30万文字分を行うことができたが、誤字や文字配りなどがあると想定される。それは次年度、校正にかけることとする。さらに、松下家文書以外の史料も翻刻・調査をする予定である。(理由)予定していた翻刻者人数よりも、翻刻者人数が少なくなったため。(使用計画)2019年度に行う松下家文書の翻刻作業等に行う予定である。
癌はGlucose eaterか?-癌増殖におよぼす糖輸送蛋白の意義-

glucoseはエネルギー源として最も重要な物質であることは癌においても例外ではなく、或る種の実験癌は“glucose cater"として知られている。正常組織ではglucose transporterは細胞内から細胞膜上に移動し糖を能動的に細胞内に取り込ませる役割を担っているが、癌ではその所在、機能などの詳細はまったく解明されていない。本研究から以下の事実が判明してきた。insurin抵抗性担癌患者の多くでは早期よりインスリン抵抗性が発現、この発現とcirculating IL-6のレベルが関連することが明かとなった(投稿中)。Methylcholanthrene-induced sarcoma担がんFisher344ratを用いた検討では、cachexiaの状態では脂肪組織内のglucose transporterの蛋白量が有意に低下、そのためinsurin刺激時にも膜へtranslocationするGlut量が減少していることがinsulin resistanceのひとつのmechanisumであると考えられた(投稿中)。本研究の意義とまとめ胃癌ではinsulin responsive glucose transporter (Glut4)が高頻度に発現しておりまたその発現は担癌宿主、末梢組織でのinsulin resistance発現とは無関係であることより、この両者を術前に検討することで癌にではなく宿主に栄養補給が可能な患者群を選別することが可能になると思われる。担癌状態では単純な飢餓とは異なる癌に特異な代謝異常が引き起こされる。癌患者の死亡原因は、癌自体による物理的な影響より癌により引き起こされる癌悪液質によるものが多い。本研究では単癌時の代謝異常を1.各種癌組織におけるglucose transporterの解明(GLUT1-5)、2.insulin-dependent glucosetransporterのinsulinに対する感受性及び反応性、3.glucose transporterからみた術前高カロリー輸液の意義とこれに及ぼす各種hormoneの効果から検討することを目的し施行した。95年度の結果と96年度の発展2.MCA担がんFischer ratの脂肪組織のインスリン刺激時の糖輸送活性は著明に減少し又、細胞膜上のグルコーストランスポーターGLUT4)は悪液質状態では著明に減少している。この減少は細胞内プールの減少及び細胞内から細胞膜へのtranslocationでの障害によるもので、control ratではインスリン刺激により有意に増加するが担癌ratではこの上昇が抑制されていることがあらたに判明した(95年日本癌学会発表予定)。3.これまで約50例の担癌患者に対するeuglycemic hyperinsuincmic glucose clampの検討でほとんどの症例でインスリン抵抗性が存在すること、これは病態のstageとは相関しないこと、体重減少とも関連せず、腫瘍依存性の変化であることが判明した(95年日本外科学会採用発表予定)。インスリン抵抗性の顕著な例ではinterlcukin-6が上昇していたが、これは癌により産生されるものではなく、このcytokineがインスリン抵抗性発現と関連するか否かに関しては今後更に検討を中である(投稿中)。glucoseはエネルギー源として最も重要な物質であることは癌においても例外ではなく,或る種の実験癌は“glucose eater"として知られている。Glut1(erythrocyte type)の発現はリンパ管侵襲、血管侵襲の頻度と有意に相関し、Glut4は組織型と関連した。このようにある種のGlutは腫瘍の増殖進展と強く関わっていることが証明された。しかしこれら細胞内糖代謝とapoptosisの出現、bcl-2 gene productの発現との間には関連は見られなかった(投稿中)。

本研究の意義とまとめ胃癌ではinsulin responsive glucose transporter(Glut4)が高頻度に発現しておりまたその発現は担癌宿主、抹消組織でのinsulin resistance発現とは無関係であることより、この両者を術前に検討することで癌にではなく宿主に栄養補給が可能な患者群を選別することが可能になると思われる。
ナノ完全結晶粒子分散型Al基およびMg基微細組織超高強度材料の研究

商用材料の比非強度を上回る特性を有する新しいタイプの高比強度非磁性軽合金材料として、ナノ完全結晶粒子分散型アモルファス材料の開発研究を行った。その結果、二段ガス液体噴霧急冷法によって、Al-あるいはMg-基合金が[(fcc-Al or hcp-Mg)+(Amorphous-Al or-Mg)]のナノ結晶粒子分散型複相アモルファス粉末とすることが可能となり、得られた粉末を537623Kで短時間急速加熱後押出し成形することによって得たバルク材は、市販の超々ジュラルミンの約2.5倍の強度をもつことを観測した。この高強度は、1)ナノfcc-Alまたはhcp-Mg粒子が完全結晶を有していること、2)非晶質/fcc-Alまたはhcp-Mg粒子界面が高稠密界面構造をもち、クラック発生を抑えるとともに、応力伝播に好都合な状態にあること、および3)ナノfcc-Alまたはhcp-Mg粒子が35nmのナノ粒子であるために、約1020nmの厚さの原子集団で生じると考えられる非晶質合金の不均質変形を効果的に抑えること、などの3つの相乗効果に原因して発現することが明らかになった。これらの合金は、強度特性に優れ、軽量であり、非磁性であるとともに安価な合金であるため、自動車部品、各種機械構造部品、機械摺動部品、各種ばね材などとして好適である。Al-TM-LnおよびMg-TM-Ln系(TM=遷移金属、Ln=希土類金属)合金を急速凝固することによりアモルファス相が得られ、これらのアモルファス相を低温時効することにより約10nm直径以下のfcc-Alあるいはhcp-Mg粒子がアモルファス母相中に分散したナノ複相が得られる。これらのナノ結晶析出は微細粒のために転位を含むことが出来ず、完全結晶を有している。この完全結晶構造に由来する高強度を利用して、Al基およびMg基の超高強度材料を開発するための研究を本年度で行ってきた。得られた主な成果を列記すると以下のようになる。(1)Al-Ni-Nd系において、ナノ組織が得られる合金組成と共晶Nd組成とが一致するために、ナノfcc-Al粒子がより一層微細、均質化し、最大引張り強さが2000MPaを上回る超高強度が得られることを見出した。これは従来のAl基結晶合金の最高強度を約3.5倍も上回る高強度であることが特に注目される。(2)このAl-Ni-Nd系のアモルファス合金粉末を本研究経費で購入した主設備品である二段ガス液体急冷装置を用いて作製を試みた結果、ほぼ100%の収率で約30μm直径以下のアモルファス粉末を作製できることを確認している。(3)この粉末の熱的安定正と結晶化挙動を調べた結果、単ロール急冷薄帯と同じであり、ナノ完全結晶粒子を利用した超高強度バルクを開発するための基本材料として使用できることが判明した。現在、この粉末を用いて高強度バルク材を作製のための条件を探査している。本年度の研究計画・方法に従って研究を遂行し、得られた結果を下記に示す。1.非晶質とナノfcc-Alの複相を示す本開発アルミニウム合金は、商品のアルミニウム合金としては最高強度を示す超々ジュラルミン(7075-T6)の約2.5倍の強度を持っている。この強化は、1)ナノfcc-Al粒子は完全結晶を有している。2)非晶質/fcc-Al界面は過剰空孔を含まない高稠密界面構造を持ち、クラック発生を抑えると共に応力伝播に好都合な状態にある。および、3)ナノfcc-Al粒子は35nmのナノ粒径であるために、約1020nmの厚さの原子集団で生じると考えられる非晶質合金の不均質変形を効果的に抑える。このような3つの相乗効果に原因していることを、高分解能電子顕微鏡および走査トンネル顕微鏡などで明らかにした。

2.ガス噴霧法により作製した非晶質アルミニウム合金粉末を押出し成形することにより、約100200nm径のfcc-Al母相中に約50nm径の金属間化合物が均質に分散したナノ結晶バルク材の作製に成功した。このバルク材の引張強度、ヤング率、引張伸びおよび回転曲げ疲労強度はそれぞれ8001000MPa、90105GPa、110%、300360MPaであり、全ての特性で商用のアルミニウム合金よりも極めて優れていること見出した。3.本研究の知見に基づき、新奇なナノ準結晶とfcc-Alの複相をもち、1000MPaを越えるアルミニウム合金の開発に成功した。この合金に関しては次年度も引き続き研究を遂行する予定である。平成8年度において二段ガス噴霧法により作製した、ナノAlあるいはMg粒子分散アモルファス合金粉末を用いたバルク材が、高強度性および高靱性を示すことを明らかにしたので、平成9年度はその要因と熱的安定性を、熱測定および高分解能透過電子顕微鏡観察により、微細組織と相分解挙動との関係において調べた。次いで、バルク材として最高強度を得るための組織因子と強化機構を解明し、各種構造物への実用化の可能性を見極める研究を行った。得られた結果は以下の通りである。1.AlあるいはMgアモルファス地中に分散されたナノグラニュラーfcc-Alあるいはhcp-Mgを有するバルク材の相分解挙動をDSCあるいはTMAにより調べた結果、2つの発熱ピークあるいは熱転移点が観測され、この合金は2つのStageによって平衡相へ相転移することがわかった。すなわち、アモルファス地中では、急冷時から含まれるナノ粒子が加熱によって、アモルファス相から発生するナノ粒子との混合体となり、さらなる加熱により合金全体がナノ粒子に遷移するような挙動を示す。そのためこの合金は、熱的に極めて安定であることがわかった。2.平成7年度から平成9年度までの研究によって、ナノ準結晶とfcc-Alあるいはhcp-Mgの複相を持ち、1000MPaを越える新奇なアルミニウムあるいはマグネシウム基合金の開発に成功したが、これらの合金は強度特性に優れている他に軽量であり、非磁性であるとともに安価な合金であるため、自動車用部品、各種機械構造部品、機械摺動部品、各種ばね材などとして好適であることが明らかになった。
分子配向を利用したバイオミメティック・ファイバーの創成と組織構築への応用

3次元的な組織構築を可能としたナノファイバーをベースとした基材の基盤技術開発をめざし,ナノファイバー中のペプチドの分子配向と自己組織化の実証と,ナノファイバー技術の幹細胞培養への応用をおこなった。芯鞘ナノファイバーの利用により,水に不溶のゲル状のコラーゲンファイバーを得た。またナノファイバーを一定方向に配向させたシート状の構造体を作製し,これを積層することで,造血幹細胞の培養に適した「バイオミメティックファイバー」の創製をおこなうことができた。本研究は,3次元的な組織構築を可能としたナノファイバーをベースとした基材の基盤技術開発をめざし,以下の項目の研究をすすめている。(1)ナノファイバー上でのペプチドの分子配向と自己組織化の実証本項目では,コラーゲンを対象とし,ファイバー中のペプチドの分子配向と自己組織化を実証し,架橋なしでのナノファイバーの高強度化・不溶化をはかるべく,2層構造を有するコアキシャルナノファイバーに着目した。これまでにエレクトロスピニング法で,コラーゲンを内層,PLLAを外層としたコアキシャルナノファイバーを作製する条件を確立することに成功した。作製したナノファイバーについて内層のコラーゲン分子の配向状態の解析をすすめている。(2)生体組織を模倣した異方性の高い構造を模倣した新規な3次元ファイバー足場材料「バイオミメティック・ファイバー」の創製と機能評価本項目では,厚みのある3次元配向性ナノファイバー足場材料による3次元培養技術を検討した。当初血管構造類似の組織の構築を計画していたが,間葉系幹細胞の培養においてナノファイバーの配向性が分化挙動に影響を与えるという知見が得られたため,間葉系幹細胞と造血幹細胞の共培養を用いて,骨髄組織類似の構造を有する厚みのある高密度培養の可能性を検証することにした。多層に重ねたナノファイバーシート上で造血前駆細胞を間葉系幹細胞と共培養したところ,高密度で培養することに成功した。生体組織を模倣した配向性の高いナノファイバーシート上での造血前駆細胞の増幅数は,無配向のファイバー上での増幅数より高く,従来のディッシュ上での培養と比較して,高効率な増幅が可能であった。(1)ナノファイバー上でのペプチドの分子配向と自己組織化の実証本項目では,コラーゲンを対象とし,ファイバー中のペプチドの分子配向と自己組織化を実証し,架橋なしでのナノファイバーの高強度化・不溶化をはかるべく,エレクトロスピニング法によるナノファイバー製造方法に着目した。当該年度では,エレクトロスピニング条件の詳細な検討を重ねることで,架橋なしで不溶性のコラーゲンゲルファイバーを作製する条件を確立した。作製したナノファイバーについてコラーゲン分子のゲル化状態ならびに分子配向について,解析をすすめている。前年度に確立した共培養系を高密度培養デバイスに展開すべく,シート状のナノファイバーを積層可能な灌流型培養デバイスを考案,試作した。このデバイスは細胞の播種および回収が容易となるようその形状を工夫した。本デバイスでの培養可能な細胞数は,体積あたりの培地量で換算すると,従来のディッシュ上での培養と比較して,3倍以上と,高密度培養が可能であった。高密度化により培地供給が不足しないための灌流装置も同時に構築し,高密度培養システムを組んだ。3次元的な組織構築を可能としたナノファイバーをベースとした基材の基盤技術開発をめざし,ナノファイバー中のペプチドの分子配向と自己組織化の実証と,バイオミメティック・ファイバーの創成と機能評価をおこなった。コラーゲンを芯,ポリビニルピロリドンを鞘としたナノファイバーをエレクトロスピニング法により作成した。作成したナノファイバーをゲル化・洗浄することでゲル状のファイバーを得た。得られたファイバーは水には溶解しなかったが,酸性緩衝液には溶解した。この再溶解溶液について電気泳動により解析したところ,高分子バンドが明瞭に観察でき,コラーゲンゲルファイバーが形成されていることが見出された。得られたゲルファイバーのCDスペクトルを測定したところ,トリプルヘリックスに由来するコットン効果がもとのコラーゲンに対し70%程度維持されていることがわかった。このようにコラーゲン特有の高次構造を分子レベルで保持したままファイバー化することに成功した。次にナノファイバーを一定方向に配向させたシート状の構造体を作製し,この上で骨髄由来間葉系幹細胞を培養した。これを積層し,各シート間で造血幹細胞を培養した。その結果,未分化な造血幹細胞を効率的に増殖させることに成功した。ナノファイバーの幾何構造が間葉系幹細胞の機能に影響し,さらにそれが造血幹細胞の増殖に影響を与えたものと考えられた。以上より,幹細胞の生体環境を模倣した「バイオミメティックファイバー」の創製をおこない,基材側からの工学的アプローチによる細胞機能制御につながる可能性を見出した。

またナノファイバーを一定方向に配向させたシート状の構造体を作製し,これを積層することで,造血幹細胞の培養に適した「バイオミメティックファイバー」の創製をおこなうことができた。ナノファイバー中のペプチドの分子配向と自己組織化の実証においては,当初予定していた無架橋で不溶性のコラーゲンゲルファイバーの製造に成功した。この点をもって本項目は当初の目標を達成したが,特許出願による権利化をすすめるため,当初の予定を変更してさらに詳細に解析すべく研究期間を延長した。また「バイオミメティック・ファイバー」の創成と機能評価においては,骨髄類似の構造体を構築することに成功し,高密度培養が可能であることを示した。総合して,本研究は当初の計画以上に進行しているが,権利化の準備のために研究期間を延長した。バイオマテリアルナノファイバー中の分子配向化技術について,詳細の解析をおこない,特許による権利化をおこなう。分子配向のメカニズムについて,高分子構造解析技術を用い,さらに進展させる。高密度培養についても,並行して実験をすすめ,骨髄類似構造体としての展開の可能性を検討し,権利化の可否についても検討する。ペプチド分子配向と自己組織化の実証においては,エレクトロスピニング条件の検討はおおむね予定通り遂行しているが,分子配向の解析についてはやや遅れている。「バイオミメティック・ファイバー」の創製と機能評価については,血管壁類似構造を当初ターゲットにしていたが,別の研究で間葉系幹細胞を配向性により分化制御することに成功し,その成果を応用して,骨髄組織類似構造の作製を目指すように研究の方向性をシフトした。これにより3次元培養技術の開発については,当初の予定より進んでいる。総合して,おおむね研究は計画通り順調に進展している。特許出願のための試験検討のため。ペプチド分子配向と自己組織化の実証においては,ひきつづきナノファイバー作製条件の検討をおこない,本年度は構造解析を重点的に実施する。3次元組織の構築では,当初予定していた血管壁類似構造の構築ではなく,本年度成果のあった骨髄類似構造の構築をすすめていく予定である。特許出願にかかる試験検討の消耗品費用および学会発表にかかる旅費に充当する。