hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属文化財の腐食挙動と新防食法の開発

人類の貴重な文化財を環境から守るためには文化財を形作る材料の視点から文化財や美術工芸品として用いられているCuおよびCu合金を取上げ、金属・合金の腐食や防食のメカニズムを明らかにするとともに新防食法の検討を行なうことが目的である。1)煮色着色したCu-30mass%Zn合金の表面層は最表面が極薄いCuO、その下がCu_2Oである。煮色着色した合金の酸化電位は、未着色の合金より高く、煮色着色した合金が高耐食性を有している。2)煮色着色法により着色したAu濃度が0.510.0mass%のCu-Au合金では腐食層の形成により酸化電位が250350mV高電位側へ移動し耐食性が向上するが、その効果はAu濃度に依存せずほぼ一定である。3)入浴剤の"ムトウハップ"を用いて処理した銅の着色層の微細構造はCu_2O、CuS、Cu_7S_4、他のCuの硫化物で、着色層厚は約0.25μmである。4)Sb_2S_5を塗布したCuの表面層はCu_2OおよびCuOの酸化物およびCu_2S_7などの硫化銅の混合層である。この試料はpHに依存しないで未処理のCuより低い電位から酸化電流が流れ始める。表面の着色層が酸化し、地金は変化していない。5)Au濃度が33.391.7mass%のAu-Ag合金をAu富化処理により吸収端波長は長波長側へ移動する。Au濃度が58.3mass%付近で、Auの富化効果が最も大きいことをEPMA法による深さ方向の分析により調べた。TEM観察及びEPMAによる二次元の元素分布測定から、表面近傍には空洞が存在し、その周囲のAu濃度が高い。色揚げはカーケンダール効果により進行する。6)発掘品及び伝世品の和同開弥の表面に形成されている腐食層は伝世品が亜酸化銅、発掘品が岩群青およびマラカイトと酸化銅である。透過型電子顕微鏡観察から発掘品の和同開弥の腐食層は針状の組織の層と微細組織の集合体の2層である。代表的な美術工芸材料であるCu合金を中心に基礎的な腐食挙動を明らかにし、その知見をもとに色彩と防食効果を兼ね備えた新規な防食皮膜について探索を行なうことを目的とする。CuをベースにCu-Zn合金およびCu-Au合金を地金に用い、表面に酸化皮膜を形成した試料の電気化学特性を測定した。pHを014まで変化させると、pHが311の間で分解電圧は地金より70150mV高く耐食性が向上した。皮膜中にZnなどのイオン化しやすい元素を含むと耐食性が劣り、Auのような電気化学的に貴な元素を含むと耐食性が向上する。この傾向は塩素イオンを含む環境中で顕著である。現在、光電流の測定により皮膜中でのAuやZnの挙動を調べ、防食効果のメカニズムを検討している。伝世品の江戸時代の豆板銀(Cu-Ag合金)を試料として表面の腐食層をエネルギー分散型X線分計により解析した。Cu濃度の増大により表面のCl濃度が高くなり、塩化銅皮膜が厚く形成されていると推定される。同時代の純銀では表面に酸化物と塩化物とが混在し、色が黒化している。

環境中のClイオンとCuが選択的反応して表面に形成したCuCl_2層が耐食性に影響していると考えられる。金属表面近傍に不活性金属の富化層を設けた試料の耐食性の検討に先立ち、表面にAu富化層を形成したAu-Ag合金の色彩を分光反射率により検討した。地金のAu濃度を変化させると吸収端波長はAu濃度の増加に伴い長波長にシフトした。これに対して、Au富化層を形成すると吸収端波長は地金より長波長へ移動するとともに、Au濃度の増大に対する変化が緩やかになる。富化層の形成は地金のAu濃度が3060mass%付近で顕著である。Cu表面に燐酸やクエン酸存在下で電気化学的に分極による表面の不働態化を試みた。形成した皮膜は堅牢ではなく、十分な耐食性が得られない。現在、形成条件を最適化している。1)わが国の伝統金属工芸における着色技法の1つである「色揚げ」処理は、金属腐食の積極的な利用法のひとつである。この処理をAg-Au合金に施し、合金の表面に形成される着色層の色および表面の元素組成と地金組成の関係について調べ、Au濃度が低いほどAu表面への濃縮が大きい(着色効果が大きいことに相当)ことを見出した。また、形成されたAu富化層を透過型電子顕微鏡、高分解能走査型電子顕微鏡、EPMA、電子線回折などで詳細に調べた。その結果、処理により表面に空洞が形成され、Agが空孔拡散により合金表面から溶出することによりAu富化層が形成されることを示唆する結果を得た。2)新防食法として、防食処理を施したい金属表面にAuのような貴金属箔を貼り、熱処理を施し接着させる技法について基礎的な観点から検討した。金属としてAgを用いその表面に24Kおよび22KのAu合金箔を貼り熱処理後の界面を走査型電子顕微鏡およびEPMA上より分析を行った。界面には多くの空洞が存在していた。また、熱処理によりAuと地金のAgとの間に相互拡散層が形成され接着が起こっていることがわかった。また、空洞は両層の緩衝的な役割があると推定した。3)わが国の伝統金属工芸における着色技法の1つである「煮色着色」法は、金属への着色と同時に防食効果や表面効果作用などを付与するものとして知られている。今回はAu濃度の異なるCu-Au合金に煮色着色処理を施し、色、表面腐食層の結晶構造、元素組成を分光光度計、EDX、薄膜X線回折法などにより検討した。その結果、表面にはCu_2Oが形成され、その厚さはAu濃度が高くなるほど薄くなる。また、電気化学的手法により弱酸性近傍の耐食性について検討中である。(1)煮色着色したCu-30mass%Zn合金の表面層の構造および電気化学特性について検討した。煮色着色により表面に形成した腐食層の構造は化学的に2層からなる。最表面が極薄いCuO、その下がCu_2Oである。表面近傍のCuの組成はZnの溶出で地金よりCuに富んでいる。煮色着色したCu-Zn合金の酸化電位は未着色の合金より高い。この結果は煮色着色により耐食性が向上することを示している。353K-90%RHの加速腐食試験でも腐食層の防食効果が観測される。この結果は電気化学特性の結果と一致する。(2)入浴剤(ムトウハップ)を使って着色した銅の着色層構造を明らかにするため、オージェ電子分光、透過電子顕微鏡などで調べた。着色層の主要成分はCu、SおよびOで、Sは着色層の中心部で濃度の極大を示し、Oは深さの向きに単調に減少する。着色層は酸化物結晶のCu_20と、Cu_2S、Cu_7S_4などの硫化物結晶が混合した構造である。表面層は粒径が10nm以下の微細な結晶からなり、Cu_2Oに富む。中心層は粒径が50100nmの結晶からなり、Cu_2SおよびCu_7S_4に富む。
ｉＰＳ細胞による臓器肺再生の試み

マウス肺スキャフォールドに、肺胞上皮細胞へと分化させたiPS細胞を移植したところ、肺胞構造の再構築が認められ、肺胞II型細胞マーカーSP-Cおよび肺胞I型細胞マーカーT1aの発現が確認された。次にブレオマイシンによる肺傷害モデルマウスに分化iPS細胞を移入してその効果を解析した。気管支肺胞洗浄ではTNF-aやIL-6が正常肺レベルまで減少していた。組織学的にも肺の線維化の抑制が確認された。一方、PKH26でラベルした分化iPS細胞が移入12日後には少数の分化iPS細胞が肺胞上皮細胞として生存していることが確認された。前年に引き続き、マウスiPS細胞をin vitroにおいて肺胞上皮細胞へと分化させ、この分化細胞を用いて実験を継続した。マウス摘出肺より作成した肺スキャフォールドに、肺胞上皮細胞へと分化させたiPS細胞を移植し、12日間培養を行い、解析した。その結果、肺胞構造の再構築が認められ、肺胞II型細胞マーカーSP-Cおよび肺胞I型細胞マーカーT1aの発現が確認された。一方、線維芽細胞移植群では、細胞は肺胞の間質に存在し、肺胞上皮細胞マーカーSP-CとT1aの発現は全く認めなかった。また未分化iPS細胞移植群では、極めて少数の細胞が肺胞上皮細胞マーカーSP-CとT1aを発現していたのみであった。次にブレオマイシンによる肺傷害モデルマウスにこの分化iPS細胞を移入してその効果を解析した。ブレオマイシン投与翌日に、経気道的に細胞を移入した。移入後12日後に気管支肺胞洗浄を行ったところ、分化iPS細胞投与群でのみTNF-aやIL-6といった炎症性サイトカインが正常肺レベルまで減少していることを確認した。更に、組織学的および肺に含まれるハイドロキシプロリンの定量からも肺の線維化の抑制が確認された。一方、PKH26でラベルした分化iPS細胞が移入12日後も、肺胞上皮として移植されてるかどうか確認したが、少数の分化iPS細胞が肺胞上皮細胞として生存していることが確認されたのみであった。このことは、ブレオマイシン肺障害における肺再生効果は、分化iPS細胞が肺胞上皮として機能すると共に、分化iPS細胞が分泌している増殖因子が肺再生に関与していることを示唆する。先ず、iPS細胞をBasic DM培地にActivinとWntを加えることにより7日間培養し内胚葉系へと分化させた結果、内胚葉系マーカーであるSox17とFOXa2の発現増強をリアルタイムPCRで確認した。次に、培地をSABMに変えFGF2を加えて5日間培養を継続し肺上皮細胞への分化誘導を試みた。その結果、TTF-1およびSP-A,B,C.Dの発現上昇をmRNAレベルで確認した。違う培地を検討した結果、上述の培地が最も分化することが判明し以降の実験を行った。更に、SP-Cの発現を免疫蛍光染色およびフローサイトメーターで確認したところ、8%以上の細胞でSP-C蛋白の発現が確認された。違う培地を検討した結果、一方、Air-liquid interface cultureをこの分化実験のあとに引き続き行ったが、これ以上の分化率の向上は認めなかった。次に、in vivo実験の準備として、マウス肺から細胞成分を除いた構造物スキャフォールドの作製を試みた。マウス肺と心を一塊として摘出し、気道および動脈からSDSとTritonXを含む溶液を注入して一晩静置して洗浄した。その結果、細胞成分は除去されたが細胞外基質が保持された構造を作ることができ、マウス肺スキャフォールドの作製に成功した。このスキャフォールドに未分化iPS、線維芽細胞、分化iPS細胞を気道より注入し、肺スキャフォールドを薄切して3次元培養を12日間行った。その結果、分化iPS細胞でのみ、肺胞構造の再構築が確認された。今後、この3次元培養の組織を肺胞II型マーカーSP-Cおよび肺胞I型マーカーT1aで染色し、分化を確認する計画である。H24年度の計画は1各種因子を用いたiPS細胞の肺上皮への分化誘導、2Air-liquid interface cultureによる分化効率向上の有無、3肺胞上皮の分化の確認、4摘出肺からのスキャフォールドの作成であるが、全ての実験を行い、有望な結果を得た。更には肺スキャフォールドにiPS細胞を移入して3次元培養を前倒しで実験することができた。肺スキャフォールドに移入した分化iPS細胞が正常な肺胞構造を再構築しているか、肺胞II型細胞やI型細胞に分化しているか免疫蛍光染色法を用いて検討する。また、ブレオマイシン肺障害マウスに分化iPS細胞を移植しえ肺障害の軽減の有無を検討する。次年度使用額なし。
光増感反応の高効率化のための反応設計-ラジカルイオンの反応性を支配する因子の解漫

(1)金属イオンを用いる光レドックス反応の有機合成反応への利用アルコール溶液中のEu(【III】)/Eu(【II】)の光レドックス系は種々の有機合成に利用できる興味深い系であることを見い出した。すなわち、この系に不飽和化合物を添加すると、そのヒドロキシアルキル化生成物が高収率で得られた。電子求引性置換基を持つα,β-不飽和化合物では反応が位置選択的に進行し、単一の生成物が純度よく得られた。反応機構を検討した結果、Eu(【III】)の存在下、光によりアルコールが酸化されて生じたヒドロキシアルキルラジカルが不飽和結合に、anti-Markovnikoff型に付加し、生じたラジカル中間体はEu(【II】)により直ちに還元されカルバニオンとなり、Eu(【II】)は酸化される。このためEu(【II】)による水素ラジカルの生成が抑えられ、反応の選択性が増大することが分かった。この反応はマロン酸ジアルキルなどの活性メチレンを有する分子のヒドロキシアルキル化にも用いられることも見い出した。(2)置換ベンジルホスホン酸のC-P結合の光分解反応とそれを利用するリン酸エステルの合成P-ニトロベンジルホスホン酸はアルカリ性溶媒中、光を照射すると、高効率でC-P結合が切れ、p-ニトロベンジルアニオンとメタリン酸モノマーアニオンを生じることを見出した。この反応は、光照射によりホスホン酸基からP-ニトロ芳香環への分子内電子移動を経て、中間にラジカルアニオンを生成し、C-P結合の解裂が進むことをレーザー閃光光分解法によって明らかにした。この反応を、DBUあるいはテトラメチルピペリジンなど塩基の存在下、無水アルコール溶液中で行うことによって、容易にリン酸モノエステルの合成が出来ることを見い出した。これは、熱,酸に不安定なアルコールのリン酸モノエステルの合成方法として有効な手段となるものと考えられる。また、このC-P結合解裂に及ぼす反応因子についても明らかにした。
口腔癌に対する特異的かつ至適な血管新生阻害療法の確立

低酸素環境下で発現亢進してくる遺伝子を網羅的に探索し、低酸素環境下での口腔癌細胞の生存と増殖を可能にしている遺伝子としてアドレノメジュリン遺伝子とがん遺伝子pim-1の発現を同定とした。マウスモデルでの腫瘍増殖とアドレノメジュリンによって刺激される血管新生が、アドレノメジュリン阻害ペプチドによって抑制された。ラットに移植したヒト腎癌細胞株の生着を確認後、アドレノメジュリンアンタゴニスト発現ベクターを筋肉内に投与し、空ベクターをコントロールとして抗腫瘍効果を検討した。その結果、筋肉内にadrenomedullin antagonist発現ベクターを投与した群では、腫瘍増殖の抑制、生存期間の延長が得られ、病理学的には腫瘍内の血管新生が抑制されていた。膵がん細胞株のヌードマウスモデルや食道がん細胞株のSCIDマウスモデルにおいてもadrenomedullin antagonist発現ベクターの筋肉内投与群ではからベクター投与グンと比較して腫瘍増殖が抑制され、生存期間が延長することが確認されており、病理所見上も血管新生が抑制されることやGlut-1発現の抑制が認められることが確認されている。血中のadrenomedullinn antagonistペプチド濃度の測定は測定限界以下のためか検出できなかったが、腫瘍組織中でのadrenomedullin antagonistの存在はimmunohistochemistryにて確認されており、筋肉内で発現するadrenomedullin antagonist発現ベクターによって産生されたadrenomedullin antagonistが血液を介して主要組織に運ばれて効果を示している可能性が示されている。この結果は筋肉内へのadrenomedullin antagonist発現ベクターの投与という遺伝子治療の有効性を示唆している。今後別の腫瘍を用いた検討を行う予定である。低酸素環境下で発現亢進してくる遺伝子を網羅的に探索し、低酸素環境下での口腔癌細胞の生存と増殖を可能にしている遺伝子の同定を試みた。DNA microarray法にて、1%酸素濃度の低酸素環境下で培養した口腔癌細胞からRMAを抽出して、正常酸素分圧化で培養した細胞のRNAと比較した。その結果、pim-1と呼ばれるセリンスレオニンカイネースの発現が、低酸素下で亢進していた。pim-1は白血病細胞において発現亢進していることが報告されていたが、固形癌での報告はなかったため、まずRNAレベルでの発現、蛋白レベルでの発現をいくつかの癌細胞株を用いて検討した。正常酸素分圧下でのpim-1の発現は、RNAレベルでも蛋白レベルでも認められなかったが、低酸素分圧下ではほとんどの癌細胞が発現していた。低酸素環境下でのpim-1の発現の意義を検討するために、pim-1の強制発現株の樹立とsiRNAによる発現抑制を試みた。その結果、pim-1の強制発現株では低酸素・低グルコース下で誘導されるアポトーシスが抑制されること、抗癌剤で誘導されるアポトーシスが抑制されることから、pim-1の発現がアポトーシス抑制に働いている可能性が示唆された。siRNAによってpim-1発現を抑制すると、低酸素・低グルコース下で誘導されるアポトーシスや抗癌剤によるアポトーシスに対する感受性が亢進した。以上の結果より、低酸素環境下ではpim-1セリンスレオニンカイネースが誘導されてアポトーシスに大勢となることが示唆された。現在、pim-1の下流にて働く遺伝子を探索している。これらの結果から、癌細胞に特異的に発言するpim-1発現を抑制できれば、抗癌剤や血管新生阻害剤の効果を増幅できる可能性が示された。その結果、アドレノメジュリン遺伝子の発現が亢進していた。アドレノメジュリンは52個のアミノ酸からなるペプチドで、血管内皮細胞の増殖を刺激することが既に報告されている分子であった。アドレノメジュリン阻害ペプチドがアドレノメジュリンの血管内皮細胞増殖効果を抑制すること、血管内皮細胞増殖抑制を介して膵癌細胞の生体内増殖を抑制することを見いだしていたので、口腔がん細胞の生体内増殖に対する効果を検討した。まず、アドレノメジュリン阻害ペプチド発現ベクターを構築して口腔がん細胞に導入したところ、アドレノメジュリン阻害ペプチド発現ベクター導入口腔がん細胞の生体内増殖は抑制された。この抑制効果のメカニズムを確認するために、口腔がん細胞移植マウスから腫瘍組織特異的血管内皮細胞株を樹立した,腫瘍組織特異的血管内皮細胞株はアドレノメジュリンの存在下で増殖が刺激され、アドレノメジュリン阻害ペプチドによって抑制された。さらに、腫瘍組織特異的血管内皮細胞株の遊走が刺激され、アドレノメジュリン阻害ペプチドによって遊走が阻害された。

これらの結果は、アドレノメジュリンが低酸素環境下で産生されて血管内皮細胞の遊走と増殖が刺激され、血管新生がおこることを示唆し、アドレノメジュリンによって刺激される血管新生が、アドレノメジュリン阻害ペプチドによって抑制されることを示唆する。
ミトコンドリア由来スーパーオキサイド産生制御による糖尿病性血管合併症の抑制

申請者らは糖尿病血管合併発症機序として「高血糖によるミトコンドリア電子伝達系からのスーパーオキサイド過剰産生」の意義を提唱しているが、この仮説を生体内で証明すること、また、この仮説に基づく治療の可能性を検討することを目的として、以下の1,2を行った。1.糖尿病患者における合併症進展度と細胞内酸化ストレスの関連の検討:細胞内酸化ストレスマーカーである尿中8-ハイドロキシデオキシグアノシン(U8-OHdG)はヘモグロビンA1c高値群、糖尿病性網膜症を有する群、尿中アルブミン排泄量高値群、平均頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(mean IMT)高値群、フラミンガムリスクスコア高値群でいずれも高値であった。さらに、長期の厳格な血糖コントロールによる酸化ストレス抑制効果を検討する目的で熊本スタディ患者において検討したが、スタディ10年後には従来インスリン療法群では強化インスリン療法群に比し、mean IMT、U8-OHdGは高値であった。結論として糖尿病性大血管および細小血管合併症の発症と細胞内酸化ストレスの関連が示され、細胞内酸化ストレス増加の糖尿病性血管合併症発症・進展における意義が示唆された。2.マンガネーゼスーパーオキサイドジスムターゼ(MnSOD)トランスジェニックマウス開発:内皮細胞に特異的に発現しているアンギオポイエチン受容体のプロモーターであるTIE-2プロモーター、およびヒトMnSOD遺伝子を組み込んだコンストラクトを作製した。TIE2プロモーターはThe University of Texas Southwestern Medical CenterのThomas N.Sato教授より提供いただいた。このコンストラクトを発現させた細胞においてはMnSODの過剰発現が確認された。現在、このコンストラクトを導入したMnSODトランスジェニックマウスの作製を行っている。完成後は、MnSODトランスジェニック糖尿病マウスおよび対照糖尿病マウスで、リアルタイムRT-PCR法により糖尿病性合併症での増加が予想される細胞外基質の4型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンB1、B2mRNAの組織での発現量を解析する予定である。申請者らは糖尿病血管合併症発症機序として「高血糖によるミトコンドリア電子伝達系からのスーパーオキサイド過剰産生」の意義を提唱しているが、この仮説を生体内で証明する事、また、この仮説に基づく治療の可能性を検討することを目的として、本年度は以下の1,2を行った。1.MnSODトランスジェニックマウス開発(ヒトMnSOD遺伝子発現ベクターの作成)ヒトMnSOD特異的なプライマーを作成し、cDNAライブラリーよりMnSOD遺伝子の全長をクローニングした。得られたMnSOD遺伝子に標識用Tagを付加して発現ベクターへ組み込み、この発現ベクターを培養細胞へ導入した。活性のあるMnSOD蛋白が発現することをwestern blot法およびMnSOD活性測定にて確認した。2.糖尿病の導入と糖尿病マウスでの細胞外気質蛋白遺伝子の発現量解析CDIマウスへのストレプトゾシン0.1mg/g BWの2回腹腔投与により、血糖値約400mg/dlと糖尿病の発症を確認した。4週間飼育し、定期的な血糖、体重測定を行った。血糖値は期間中持続して高値であった。次に糖尿病で増加が報告されている細胞外気質蛋白である4型コラーゲン、ファイブロネクチンのmRNA発現量を糖尿病血管合併症発症・進展の指標として、リアルタイムPCR法にて測定する系を構築した。糖尿病マウスにおいてコントロールマウスに比し、腎糸球体組織中の4型コラーゲンmRNAは約2倍、ファイブロネクチンmRNAは約1.5倍高値であることを確認した。

本法は非常に少量のサンプルで、また、簡便にその発言量を定量することが可能であり、MnSODトランスジェニックマウス作成後の合併症進展度評価のためにも非常に有用と考えられた。申請者らは糖尿病血管合併症発症機序として「高血糖によるミトコンドリア電子伝達系からのスーパーオキサイド過剰産生」の意義を提唱しているが、この仮説を生体内で証明すること、また、この仮説に基づく治療の可能性を検討することを目的として、本年度は以下の1,2を行った。1.マンガネーゼスーパーオキサイドジスムターゼ(MnSOD)トランスジェニックマウス開発:内皮細胞に特異的に発現しているアンギオポイエチン受容体のプロモーターであるTIE-2プロモーター、およびヒトMnSOD遺伝子を組み込んだコンストラクトを作製した。TIE-2プロモーターはThe University of Texas Southwestern Medical CenterのThomas N. Sato教授より提供いただいた。このコンストラクトを発現させた細胞においてはMnSODの過剰発現が確認された。現在、このコンストラクトを導入したMnSODトランスジェニックマウスの作製を行っている。完成後は、MnSODトランスジェニック糖尿病マウスおよび対照糖尿病マウスで、リアルタイムRT-PCR法により糖尿病性合併症での増加が予想される細胞外基質の4型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンB1、B2 mRNAの組織での発現量を解析する予定である。2.糖尿病患者における合併症進展度と細胞内酸化ストレスの関連の検討:細胞内酸化ストレスマーカーである尿中8-ハイドロキシデオキシグアノシン(U8-OHdG)はヘモグロビンAlc高値群、糖尿病性網膜症を有する群、尿中アルブミン排泄量高値群、平均頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(mean IMT)高値群、フラミンガムリスクスコア高値群でいずれも高値であった。さらに、長期の厳格な血糖コントロールによる酸化ストレス抑制効果を検討する目的で熊本スタディ患者において検討したが、スタディ10年後には従来インスリン療法群では強化インスリン療法群に比し、mean IMT、U8-OHdGは高値であった。結論として糖尿病性大血管および細小血管合併症の発症と細胞内酸化ストレスの関連が示され、細胞内酸化ストレス増加の糖尿病性血管合併症発症・進展における意義が示唆された。
オートファジーを介したスタチン依存的な横紋筋細胞障害の抑制法の開発

本研究は、コレステロールが高値となる脂質代謝異常症の治療薬スタチンによる、筋細胞障害を伴う副作用の発症機構の解明と抑制法の確立を目的としている。これまでに培養細胞を用いた実験で、スタチンは細胞種依存的な機構でオートファジーを誘導し、細胞死を起こすことを見出した。そこで、スタチン依存的なオートファジー誘導を抑制する化合物を探索することで、副作用の抑制法の確立を目指した。本研究期間においては有力な化合物の同定に至らなかったが、その過程でスタチン依存的なオートファジー誘導機構に低分子量Gタンパク質の関与を示唆する結果を得た。今後、さらなる分子機構の解明により副作用抑制法への応用が期待される。本研究は、脂質代謝異常症治療薬であるスタチンが引き起こす横紋筋融解症などの筋細胞障害の抑制・改善方法の確立を目的として、筋細胞障害の原因と考えているスタチン依存的なオートファジー誘導の分子機構について研究を進めている。スタチン依存的なオートファジー誘導を抑制する因子の探索を行うために、ヒト横紋筋肉腫由来細胞にオートファジーマーカーであるLC3にGFPを融合したタンパク質(GFP-LC3)を発現させて、GFPの輝点の増加をオートファジー誘導の指標とするアッセイ系を構築することとした。当該年度では、GFP-LC3発現細胞でのアッセイ系のバリデーションを中心に進めた。また、スタチン依存的なオートファジー誘導がmechanistic target of rapamycin複合体1(mTORC1)の経路を介していることについても、より詳細なデータを解析した。アッセイ系のバリデーションでは、オートファジー誘導を起こす濃度、時間などを解析して、In Cell Analyzerでの多検体解析のアッセイポイントの設定を行った。これまでの結果から、スタチン依存的なオートファジー誘導によるGFP-LC3の輝点の増加と、Geranylgeranyl pyrophosphate添加による誘導の抑制が見られる条件として、セリバスタチン1 μMで12 hr18 hr処理することとした。mTORC1経路に対する解析は、S6Kのリン酸化状態をウェスタンブロッティングで解析し、スタチン依存的なオートファジー誘導よりも、mTORC1の活性の抑制が早期に起きていることが明らかとなった。このことから、スタチン依存的なオートファジー誘導はmTORC1を介した経路で調節されていることが示唆された。本研究課題のスクリーニング系の構築は概ね完了しており、薬剤ライブラリーを用いたアッセイを進行するところである。当初、gene trap法を用いた遺伝子破壊細胞ライブラリーでスクリーニングを行うことも計画していたが、相同遺伝子もノックアウトして完全に発現を消失させることが困難なこともあり、並行して準備していた薬剤ライブラリーを用いた方法を中心とした。また、これまで不十分であったスタチン依存的なmTORC1の活性変動についても解析が進み、誘導にかかる時間や細胞腫特異性からもmTORC1を介したオートファジー誘導機構であることを示唆する結果が得られている。スクリーニングを薬剤ライブラリー中心に進めることとなったが、計画は概ね順調に進行していると評価できる。本研究は、HMG-CoA還元酵素阻害剤であり脂質代謝異常症治療薬のスタチンが引き起こす、横紋筋融解症などの筋細胞障害の抑制・改善方法の確立を目的として、副作用とオートファジー誘導との関連性について研究を行った。本年度は、スタチン依存的なオートファジー誘導を抑制する因子の探索のために、既知化合物のセットを利用してスタチン誘導性オートファジーを抑制する化合物のスクリーニングを行った。その結果、数十の既知化合物の解析であったが、候補となる化合物は得られなかった。引き続き、別の化合物ライブラリーを使用するなどして、スクリーニングを進めていく予定である。また、スタチン誘導性オートファジーのmaster regulatorとして考えているmechanistic target of rapamycin complex 1(mTORC1)の活性調節についてS6、S6Kのリン酸化状態で評価した。これまでに観察されていたmTORC1の早期の抑制も、オートファジーと同様に細胞種によって異なることが明らかとなった。特に横紋筋由来細胞では、それぞれの現象が、S6K、S6のリン酸化抑制、オートファジーの誘導、細胞死の順で起きていることが明らかとなった。この結果は、これまで考えていた誘導機構を支持するデータであり、GGPPによるmTORC1の調節機構が重要であることを示唆している。またmTORC1の活性化に必要と考えられているRheb非依存的にmTORC1の活性が調節されていることを示唆する結果もあり、今後の研究が期待される。今後の研究計画としては、レトロウイルスのgene trap法を用いたスクリーニングよりも薬剤ライブラリーを用いたスクリーニングを中心に行う。これまでに構築してきたオートファジーの活性評価系を用いて、化合物ライブラリーからスタチン依存的なオートファジー誘導を抑制する化合物のスクリーニングを進めていく。

ヒットした化合物については、2次スクリーニングとしてLC3のウェスタンブロッティングを行い、スタチン以外のオートファジー誘導への影響も解析し、特異性について明らかにしていく。また、mTORC1の活性についても解析し、候補化合物がスタチンによるシグナルのどの部分に作用しているのかを解明する。薬学
30T級超伝導マグネット用Bi系超伝導テープにおける高電磁力状態の研究

高電磁応力状態は、大口径ダブルパンケーキコイルに強磁場中で電流を通電する事によって実現できる。代表者の研究の狙いは、約300MPaに耐える補強法としてAgシースBi2212テープを反応後に高強度のCu-50Agテープまたはハステロイテープと共巻きすることで、大口径コイルを作製することである。強磁場マグネットの機械的特性を評価するために、歪ゲージによって測定して高電磁応力状態の解析を行った。銀シースBi2212テープと補強材CU-50Agテープまたはハステロイテープの共巻きでφ280mm直径、11ターンのR&Wダブルパンケーキコイルを2種類作製した。10Tの磁場下、4.2Kの液体ヘリウム中において、I_c=350Aを越えてI=500Aまで通電した。この時の歪はCu-50Agテープ補強ではI=350Aで0.25%ほどであったが、ハステロイテープ補強ではI=500Aで0.22%であった。I=500Aでのフープ力は262MPaに相当している。歪0.16%までは臨界電流の劣化がないことがわかった。この歪に相当する電磁応力に対してはハステロイテープで150MPaほどの電磁力を抑えることができる。Cu-50Agテープで補強のための供巻きをしたAgシースBi_2Sr_2CaCu_2O_8(Bi2212)テープを用いて、評価試験用のダブルパンケーキ型大口径コイルを作製した。液体ヘリウムの蒸発速度を低減するためにコイルの吊下装置として、代表者が同様に開発し実証してきた強磁場用のYBa_2Cu_3O_7電流リ-ドを使用し、ダブルパンケーキをシリーズに接続したコイル試験装置を完成させた。高電磁応力状態は、この大口径ダブルパンケーキコイルに強磁場中で電流を通電することによって実現できる。代表者の研究のねらいは、約300MPaに耐える補強法としてAgシースBi2212テープを反応後に高強度のCu-50Agテープまたはハステロイテープと供巻きすることで、大口径コイルを作製することである。強磁場マグネットの機械的特性を評価するために、歪ゲージによって測定できるデータロガーを購入して高電磁応力状態の解析をおこなう。またその際、ヒーターによる熱擾乱を入れてBi-2212超伝導体の熱的安定性と常伝導伝播速度の測定をおこない、安定性の評価が高電磁応力状態で得られる計画である。設計作製した試験用テストコイルを用いて、バックアップ磁場10Tを印可しコイルの通電特性と歪特性を測定した。電磁力としては280MPaまでの印加に対して、ハステロイ補強テープは耐えることが判明した。銀シースBi2212テープと補強材Cu-50Agテープまたはハステロイテープの共巻きでφ280mm直径、11ターンのR&Wダブルパンケーキコイルを2種類作製した。この歪に相当する電磁応力に対してはハステロイテープで150MPaほでの電磁力を抑えることができる。
聖興寺伽藍再建に見る近代寺院建築技術の継承と地方伝播に関する研究

白山市にある浄土真宗寺院聖興寺は、明治24年に堂宇を焼失した後、東本願寺本堂再建棟梁の木子棟斎が棟梁を務めて、明治31年に本堂が再建された。木子は再建中に亡くなったため、その後を木子のもとで東本願寺に関わった、荒木保太郎が棟梁を引き継いだ。その後、客殿、庫裏などの再建が、大正7年まで続けられた。これら一連の建築の実測図面を作成し、関係資料の収集、分析を行い、建築の特徴と価値および荒木の履歴について明らかにした。荒木保太郎の履歴について調査を行い、彼が3040代前半に東本願寺造営に関わった後、聖興寺再建に関わったことが明らかになった。東本願寺明治度造営は、明治13年10月釿始、明治22年5月大師堂上棟、明治25年11月本堂上棟、明治28年遷仏式である。荒木の名前は、『東本願寺明治造営百年』(真宗大谷派本廟維持財団、1978)によると、「両堂釿始式次第」(明治13年10月)に加賀・荒木保太良とあるのが最も早い。「両堂係大工姓名簿職人部(明治十七年度)」には「荒木保太郎(三十五年)石川県金沢区玉川町」とあることから、荒木の生年は嘉永3年(1850)頃と考えられる。また、荒木は明治24年1月に造家学会(現在の日本建築学会)に準員として入会した。入会時の住所は「西京下京区不明門通五條南木子方」で、同住所・同時入会が荒木のほかに20名いた。いずれも、木子棟斎の元で東本願寺造営に関わった大工とみられる。同年7月建築雑誌55号に、荒木が投稿した寄書「琴堂」が掲載。明治27年12月、学会を除名となった。聖興寺火災の翌25年8月までに木子は聖興寺本堂の設計を終え、9月に本堂の釿始が行われた。釿始では大番匠が柴田匠之介、武田弥平で、荒木は次席だったが、木子の死後、棟梁代勤に昇格した。聖興寺本堂竣工後の明治33年、松任金剣宮(白山市西新町)の本殿屋根葺替えの棟札に「棟梁荒木保太郎」の名前を確認できた。これより後の荒木の活動については明らかにできなかった。一方、聖興寺再建の後、荒木から聖興寺に関する書類一式を託された喜多家では、二代・喜多源右衛門(嘉永4年生)、三代・治三郎(明治15年生)、四代・栄吉(明治36年生)が聖興寺に代々携わってきた。喜多家では聖興寺のほか、北陸企業銀行松任支店、松任警察署、若宮八幡神社神輿ほか、地元の数多くの神社、寺院建築を手がけたことが判明した。本年度の研究目的である、建築の実測調査を行った。平成23年6月から7月にかけて、聖興寺本堂、客殿、庫裏の実測調査を行い、正面・側面立面図、梁間断面図、および、客殿・庫裏の正面立面図を作成した。あわせて建物の写真撮影と、三次元レーザー計測による本堂の立面画像を作成した。同じく、6月から7月にかけて、喜多卓郎家に残されていた図面資料一式を借り受け、スキャナーとデジタルカメラにより、電子画像化した。対象となる資料は523点あり、うち聖興寺に関する図面・資料と確認できたものは17点あった。8月から翌24年2月にかけて、すべての画像について基本情報を整理したカルテを作成した。建築実測調査の結果と聖興寺関係図面とを照らし合わせて分析を行ったところ、図面と実際の建物の差異を確認でき、設計変更があったことが明らかになった。本堂軒廻りについて垂木の本数に変更があり、木子棟斎による当初設計図面では広縁の柱間が正面側面とも12枝で計画されていたのに対し、現状の建物では13枝となっている。また、図面にはその変更の旨を記した付箋が付けられ、かつその箇所には「あらき」と記された印鑑も捺されていることから、荒木保太郎による設計変更であることが明らかになった。一方、その点を除いては、木子の当初設計の寸法計画に忠実に従って、本堂が建てられたことも確認できた。東本願寺阿弥陀堂の細部意匠との比較分析からも、虹梁、蟇股、木鼻装飾などにおいて共通する特徴が確認でき、設計における木子の強い関与が確認できた。本研究の目的は二つあり、一つは聖興寺の建築遺構の詳細な記録を作成し、その結果に基づき復原考察と技術分析を行うことであり、もう一つは聖興寺の建築に関する資料を収集、分析し、技術的背景を明らかにすることである。このうち、前者については聖興寺本堂、客殿、庫裏の実測調査を実施し、詳細実測図面の作成と写真撮影を行った。

また、三次元レーザー計測により、本堂の三次元測量データと本堂の立面画像を得ることができ、これらをもって詳細な記録の作成について成果を得ることができた。また、実測調査の結果を踏まえ、東本願寺阿弥陀堂の細部意匠との比較分析を行い、棟梁・木子棟斎の設計の関係性を伺わせる、共通する特徴を明らかにするなど、技術分析についても一定の成果を得た。今後、その他の設計変更や竣工後の改変について、さらに調査をして復原考察を進める予定である。後者については、喜多卓郎家に残されていた図面資料一式を借り受け、スキャナーとデジタルカメラにより、電子画像化したうえで、基本情報を整理したカルテを作成した。現在の所、聖興寺に関する図面・資料と確認できたものは17点あり、実測調査の結果との比較により、荒木による設計変更があったことを明らかにした。残る500点余りの資料についても、聖興寺に関するものがまだ含まれている可能性もあり、改めて内容の分析を進める。これらの資料に見られる聖興寺以外の建築との比較による、技術・意匠上の特徴分析、さらに木子の跡を継いだ荒木保太郎に関する情報収集については、今後の課題である。以上の成果を踏まえ、現在までの達成度はおおむね順調に進展している。当初の予定通り、実測調査の成果と収集資料を対象として、以下の二点を中心に分析を進める。一点目は木子棟斎の仕事に関する分析として、東本願寺阿弥陀堂の細部意匠との比較分析をさらに進めるとともに、木子に関する情報、資料の収集に努める。木子が設計したとされる建築で現存するものは、現在のところ、東本願寺阿弥陀堂と聖興寺本堂しか確認されていない。新たな遺構の発見は困難と考えられることから、木子の周辺からの資料調査(東京都立中央図書館木子文庫、日本建築学会伊東忠太資料など)から、情報収集を図る。二点目は荒木保太郎の仕事に関する分析である。木子の死後、その仕事を継いだ荒木保太郎については、その活躍がこれまで全く知られていない。これまでの周辺調査により、東本願寺阿弥陀堂の再建を木子の元で手伝い、棟札にその名が記されていること、聖興寺近隣の願成寺本堂再建の棟梁を務めたこと、などが分かってきている。また、石川県立歴史博物館に所蔵されている、加賀堂宮大工・荒木家文書との関係についても、引き続き調査を行う予定である。喜多卓郎家の文書についても、聖興寺関係図面の他に、荒木の名前が記された木割書を含む荒木関係の資料と、地元の大工であった喜多家自身の資料とが混在しており、これらを整理することで荒木の仕事に関する分析をさらに進められるものと考えている。実測調査については、図面を整理してさらに精度を上げるとともに、客殿・庫裏などについても追加調査を実施する。次年度の研究においては、これまで収集した資料データの整理と分析が中心的な作業となる。初年度において、図面作成の進捗状況とソフトの最新バージョンへの更新スケジュールとの関係から、パソコンソフトの購入予定を次年度に先送りしたこと、および比較調査を東本願寺で行うための京都への国内旅費を使用せず、資料のみを用いて比較分析を行ったことから、約55万円の次年度使用額が生じた。そこで今年度は、購入を先送りした実測調査の図面作成を行うために必要なパソコンソフト、および建築写真の画像処理を行うソフトの購入をまず行う。また、収集資料のデジタル化作業を効率的に進めるために、新たなスキャナーを必要とする。こうしたパソコンソフト・周辺用品の購入費用として、約60万円を見込んでいる。また、これらの作業を行う学生への謝金として、時給880円、2名が5時間×20日の100時間おこなうとして、約18万円を見込んでいる。また、資料調査のための国内旅費として、東京往復を3回、京都往復を2回で約21万円、聖興寺での追加調査のための交通費を約1万円の、合計約22万円を見込んでいる。その他に、論文投稿費や雑費として約5万円を見込んでいる。
頭頸部癌におけるIV型コラーゲンの発現と転移との関連

組織学的に扁平上皮癌と診断された頭頚部癌のうち未治療症例の原発巣からの生検組織あるいは手術時採取組織を対象とした。85%エタノール固定のパラフィン切片(4μm厚)作成し、1枚は比較検討のためHE染色をし、残りは抗IV型コラゲンモノクローナル抗体を用いてABC法で免疫組織染色をした。癌巣周囲膜の連続性をIV型コラゲンの発現から免疫組織学的に観察した。その連続性をHavenithらの基準を参考にして、癌巣周囲膜が癌巣を取り囲んで連続している所見が全視野の75%以上を占めるものを「連続」、癌巣周囲膜が断続的に認められるものや連続してはいるが全視野の75%に満たないものを「断続」、発現性を全く認めないものを「消失」とそれぞれ分類定義した。癌巣周囲膜の性状、すなわちIV型コラーゲンで見た連続性(連続しているか、或いは断続または消失しているか。)と頚部リンパ節転移の有無・T分類、M分類(遠隔転移)・分化度との相関を検討した。この結果、リンパ節転移の頻度は、連続例で低く、断続または消失例で高い傾向があった。T分類に関しては、明らかな相関は見られなかった。分化度に関しては、高分化癌では連続例が多く、低分化癌には不連続例が多かった。これらのことより、IV型コラゲンの発現から見た癌巣周囲膜の連続性は、腫瘍の悪性度をある程度予測するのに役立つものと思われた。また、さらにIV型コラゲナーゼ活性と頚部リンパ節転移の有無・T分類・M分類(遠隔転移)・分化度との相関を検討する予定であったが、こちらの方は現在進行中である。
低温トンネル分光法を用いた導電性有機錯体表面の電子構造の解明

低次元電子構造をもつ有機錯体は低温においてパイエルス転移に関連する金属-絶縁体などの相転移を示すことは広く知られている。本研究の目的は相転移そのものについて実空間で局所的な知見を得ることである。測定方法としては、原子レベルでの電気的な測定が可能である走査トンネル顕微鏡(STM)/トンネル分光法(STS)を用い、低温下において相転移中の構造を直接プローブする。試料として薄膜化が比較的容易であるTTF-TCNQを用いた。TTF-TCNQは53Kで金属-絶縁体転移を生じることはよく知られている。また、低温下での導電性を保持する目的でマイカ基板に金をコートしてその上にTTF-TCNQを蒸着した。本薄膜試料を室温で観察したところ、大気中で観察されるものと同様の分子構造が観察された。しかし、測定を続けると徐々に像が変化していく現象が発生し、これは試料が真空中に昇華したためだと思われる。この温度でトンネル分光を行ったところ測定ポイントのほとんどで金属的な特性が得られた。次に77Kで測定を行ったところ、絶縁体的特性を示すギャップが試料の一部の測定点において観察され、これは絶縁体転移が一部の領域で生じていることを示す。これは以前観察された(BEDT-TTF)_2I_3と同じく、転移温度以上であるがすでに一部の領域では相転移が開始していることを示唆するものである。さらに10Kまで冷却すると非金属的な相が支配的となり、STM像も室温の場合とは異なるものが得られ、a軸方向に2倍、b軸方向に2.4倍であった。これらの超構造は2kFCDWに関連すると思われるが、詳細、解釈については現在検討中である。
軟骨分化に関与する遺伝子群による身長の規定

身長発育は極めて遺伝的に規定されている過程で、長管骨の内軟骨骨化により身長発育の60%がなされる。これは軟骨細胞の増殖・分化・細胞死・石灰化を伴う厳格に設定されている過程である。1)ビタミンD受容体遺伝子の転写開始点の遺伝子多型によりAC/CG(CC), AC/TG(C/T), AT/TG(T/T)の3型に分けられる。ACG alleleはATG alleleと比し3個アミノ酸の数が少ないビタミンD受容体蛋白をコードすると考えられる。18-20歳の健常女性で,身長とこの遺伝子多型の関係はC/Tの遺伝子型が有意に高身長であった(他の遺伝子型より95%信頼区間で2-5.6cm高値)。2)PTH/PTHrP受容体ヒト腎臓・骨で有力なP3 promoterのArich領域にAAAG反復配列多型を発見した。反復配列は3-8回に及び,アリル頻度は5回,6回の順で,遺伝型は5回/6回,5回/5回頻度が多かった。反復配列数が増すとpromoter活性が低下した。頻度の多い遺伝型で検討すると、AAAG反復配列の増加とともに身長が高い傾向を示した(p<0.05).3)骨長を測定する事による日本人上節・下節比の正常値を設定した.年齢と上節下節比は2次回帰を示すと考えられた。男児の重相関は0.6468,女児は0.4769であった。上節下節比は加齢とともに低下し最終的に一定となる傾向があり,特に女児では12才以降はあまり変化しなかった.また,男児ではおおむね1.1から0.85まで変化するのに対し、女児ではおおむね1.1から0.9と,男児の方が上節下節比の変化の幅が大きかった。従って男女の身長差の一部は下肢長増加差による。今後遺伝子多型との関係で検討する.身長発育は極めて遺伝的に規定されている過程で、長管骨の内軟骨骨化により身長発育の60%がなされる。今後遺伝子多型との関係で検討する.身長発育は、極めて遺伝的に規定されているprocessであるが、遺伝子多型と身長の規定に関する研究は少ない。ビタミンD受容体のexon2多型(AT/CG)多型はアミノ酸配列の長さに差が生じ、ACG群がビタミンD受容体DNA結合部位に当たる部分のアミノ酸が3個短いビタミンD受容体をコードすると考えられる。遺伝子変異(Exon2多型)と骨密度・身長・の関媒について検討した。さらに成長板軟骨に発現している遺伝子群で軟骨分化に関係すると考えられる、成長板軟骨移行帯に発現するPTHrPならびにその受容体であるPTH/PTHrP受容体についても遺伝子多型・後者についてはその機能を検討した。18-20歳の健康女性において、Exon2多型ATG/ACG群の身長が他の2群と比し有意に身長が高かった。この傾向は思春期においても認められた。RT/PCR法ではATG alleleの発現がACGに比し2-3倍であった。PTH/PTHrP受容体については腎臓ならびに骨に発現されるP3promoterのArich領域にAAAGの反復配列(通常は5個であるが6-7個となる)の多い例を認めた。この過剰配列はLuciferse法でプロモーター活性を滅弱する事を認めた。さらに正確に下肢長を測定し,上節下節比で表きれるプロ歩ーションを示す本邦正常値がないため現在正常値を設定中である。

これは軟骨細胞の増殖・分化・細胞死・石灰化を伴う厳格に設定されている過程である。本年度は従来のビタミンD受容体遺伝子の転写開始点の遺伝子多型に加え、PTH/PTHrP受容体ヒト腎臓・骨で有力なP3 promoterの新たに見出したAAAG反復配列多型と、骨長を測定することによる体プロポーションについて報告する。(1)PTH/PTHrP受容体ヒト腎臓・骨で有力なP3 promoterのArich領域にAAAG反復配列多型を発見した。反復配列は3-8回に及び,アリル頻度は5回,6回の順で,遺伝型は5回/6回,5回/5回頻度が多くかった.反復配列数が増すとpromoter活性が低下した。頻度の多い遺伝型で検討すると、AAAG反復配列の増加とともに身長が高い傾向を示した(p<0.05)。(2)骨長を測定する事による日本人上節・下節比の正常値を設定した.年齢と上節下節比は2次回帰を示すと考えられた。男児の重相関は0.6468,女児は0.4769であった。上節下節比は加齢とともに低下し最終的に一定となる傾向があり,特に女児では12才以降はあまり変化しなかった.また,男児ではおおむね1.1から0.85まで変化するのに対し,女児ではおおむね1.1から0.9と,男児の方が上節下節比の変化の幅が大ききかった.従って男女の身長差の1/2は下肢長増加差による。
HDAC阻害薬による白血病治療のメカニズム解析と有効性の確立

遺伝子転写は、ヒストンアセチル化酵素(HAT)とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)のバランスで成立している。HDAC阻害薬はHDAC活性を阻害し、遺伝子の転写を促進させる薬剤であるが、HDAC阻害薬のひとつである、depsipeptide (FK228)による慢性骨髄性白血病(CML)に対する抗腫瘍効果を検討した。FK228はCML細胞株、TF-1 BCR/ABL、K562、H7 BCR/ABL細胞にアポトーシスを誘導し、TF-1 BCR/ABLでは親細胞株のTF-1と比較して有意にアポトーシスが増加した。FK228により、ヒストンのアセチル化が時間、濃度依存性に認められた。AntibodyArrayを使用し、アセチル化タンパクをスクリーニングしたところ、細胞周期関連タンパクや細胞接着因子のアセチル化が認められた、特にBCR/ABL、HSP90、paxillin、Rb、Fak及びp53のアセチル化が確認された。BCR/ABLはFK228により時間依存性に減少した。細胞周期の解析では、G2/M期で停止した。またMAPKの活性化は抑制され、p38MAPKの活性化がみられたがJNKの活性化は認めなかった。アポトーシス関連分子ではCaspase3、Caspase9、PARPが活性化した。またinhibitor of apoptosis (IAP)のmRNAの減少がみられた。FK228によりp38MAPKは活性化したが、p38のinhibitor処理でも細胞周期、アポトーシス、caspaseの活性化に変化がみられなかった。FK228はimatinib耐性症例の細胞に対しても抗腫瘍効果がみられた。hTERT (human telomerase reverse transcriptase)はテロメラーゼ活性と一致し、またHAT及びHDACがhTERTの発現に関与しているが、hTERTのshRNAをCML細胞株に導入し、hTERTとFK228における役割を検討した。hTERTのshRNAを導入すると、親株と比較して、アポトーシスが増加した。次に、FK228投与では、ヒストンのアセチル化に変化はなかったが、FK228によるアポトーシスは抑制された。以上より、FK228はBCR/ABL融合蛋白をアセチル化し、そして崩壊することによりアポトーシス誘導をもたらすと考えられ、imatinib耐性化症例に対するFK228の有用性が明らかとなり、上記の内容について現在投稿中である。多くの遺伝子の転写制御は、ヒストンアセチル化酵素(HAT)とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)のバランスの上に成立している。特にヒストンのアセチル化はDNA複製、転写、DNA再配列などクロマチン構造の変化を伴うさまざまな生物反応に関わっている。HDAC阻害薬はヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害することによって、ヒストンもしくは非ヒストンタンパクをアセチル化し、遺伝子の転写を促進させる薬剤である。今回われわれは、ヒストン脱アセチル化酵素を標的にし、その阻害によって、特に慢性骨髄性白血病(CML)に対する抗腫瘍効果をもたらすメカニズムを解析した。はじめにHDAC阻害薬のひとつであるdepsipeptide(FK228)のBCR/ABL発現TF-1-BCR/ABL細胞のアポトーシス誘導効果についてAPO2.7を用いて解析した。親細胞株のTF-1と比較してTF-1 BCR/ABL細胞では有意なアポトーシス誘導効果の増加が確認された。FK228の投与により、ヒストンのアセチル化が時間、濃度依存性に認められ、さらにBCR/ABL融合蛋白、HSP90、STAT5及びP53のアセチル化が確認された。さらにBCR/ABL融合蛋白はFK228による時間依存性のdegradeが確認された。細胞周期の解析では、G2/M期で停止が認められた。またsrc、MAPKの活性化はFK228の投与により抑制されたが、p38MAPKの活性化が認められ、またJNKの活性化はみられなかった。アポトーシス関連分子に関してはCaspase3、Caspase9、PARPの活性化が確認された。FK228の投与によりp38MAPKの活性化が認められたが、p38のinhibitor処理においても細胞周期、アポトーシス、caspaseの活性化に変化がみられなかったことから、p38はFK228作用に直接関与していないことが示唆された。FK228はimatinib耐性症例の細胞に対しても抗腫瘍効果があることを確認した。以上より、FK228はBCR/ABL融合蛋白をアセチル化し、BCR/ABL融合蛋白を崩壊することによりBCR/ABL発現細胞における有意なアポトーシス誘導をもたらすと考えられ、imatinib耐性化症例に対するFK228の有用性が示唆された。AntibodyArrayを使用し、アセチル化タンパクをスクリーニングしたところ、細胞周期

関連タンパクや細胞接着因子のアセチル化が認められた、特にBCR/ABL、HSP90、paxillin、Rb、Fak及びp53のアセチル化が確認された。BCR/ABLはFK228により時間依存性に減少した。細胞周期の解析では、G2/M期で停止した。またMAPKの活性化は抑制され、p38MAPKの活性化がみられたがJNKの活性化は認めなかった。アポトーシス関連分子ではCaspase3、Caspase9、PARPが活性化した。またinhibitor of apoptosis (IAP)のmRNAの減少がみられた。FK228によりp38MAPKは活性化したが、p38のinhibitor処理でも細胞周期、アポトーシス、caspaseの活性化に変化がみられなかった。FK228はimatinib耐性症例の細胞に対しても抗腫瘍効果がみられた。hTERT (human telomerase reverse transcriptase)はテロメラーゼ活性と一致し、またHAT及びHDACがhTERTの発現に関与しているが、hTERTのshRNAをCML細胞株に導入し、hTERTとFK228における役割を検討した。hTERTのshRNAを導入すると、親株と比較して、アポトーシスが増加した。次に、FK228投与では、ヒストンのアセチル化に変化はなかったが、FK228によるアポトーシスは抑制された。以上より、FK228はBCR/ABL融合蛋白をアセチル化し、そして崩壊することによりアポトーシス誘導をもたらすと考えられ、imatinib耐性化症例に対するFK228の有用性が明らかとなり、上記の内容について現在投稿中である。