hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体外受精系を用いた高等植物の受精および初期発生機構の顕微分子細胞学的解析

花粉管誘導機構の解析誘引物質の種特異性について、トレニア属3種と近縁のアゼトヴガラシ属2種を用いて明らかにした。これらの植物は胚嚢が裸出しており、レーザーアブレーションなどにより助細胞がin vitroで花粉管を誘引することを確認した。そこで異種の胚珠を混合して培養したところ、誘引活性に強い種特異性があることが明らかとなった。種特異性は用いる花柱組織の種には依存せず、またin vivoにおいて生殖隔離の要因となる可能性も示された。これまでに誘引物質の候補とされてきたCa^<2+>やGABAなどの低分子が助細胞由来の誘引物質ではないことも合わせて示された。さらに、胚珠の胞子体組織に由来し花粉管を活性化する分子を新たに発見してこれが糖タンパク質であることが示唆され、また誘引物質はこの活性化物質よりも種特異性が強いことが示唆されたため、誘引物質がペプチド性のものである可能性が高まった。また、活性化物質の解析を進める中で培地上のほぼ全ての花粉管を活性化させる(助細胞の誘引シグナルに反応できるようにする)ことが可能になり、今後花粉管誘引物質の解析を進めていく上で重要な実験系を開発できた。重複受精の動態解析生殖細胞の生体染色法および高感度顕微鏡システムの構築により、花粉管内での精細胞の動きなど、これまで未知だった動態が明らかとなった。また、より明るく無害に細胞をラベルするためにGFPを利用する準備を進めた。その結果、パーティクルガン法によりトレニアの雌性配偶体をトランジェントに形質転換することに成功した。シロイヌナズナの配偶体特異的アクチン遺伝子ACT11のプロモーターがトレニアの雌性配偶体で良好にはたらくことも明らかとなった。また特定の核や細胞に簡便に遺伝子導入できるマイクロインジェクション法の開発にも成功しており、受精の動態を解析していくための重要な基磐技術が開発できた。(1)花粉管誘導機構の解析助細胞が分泌するガイダンス分子の同定に向けて、誘引シグナルの化学的性質を明らかにすることを目指した。ガイダンス分子は、助細胞の成熟に伴い線形装置が明確になる頃から分泌されることが示唆される。従来提唱されていたカルシウムイオンは、少なくとも単独で働くガイダンス分子ではないことが示唆された。また、シダの精子の誘引物質であるリンゴ酸などもガイダンス分子ではないことが示唆された。また、近縁のアゼトウガラシ属アゼトウガラシを用いることによって、トレニアの花粉管はトレニアの雌性配偶体にのみ誘引され、アゼトウガラシの花粉管はアゼトウガラシの雌性配偶体にのみ誘引されることが明らかとなり、誘引活性に種特異性が存在することが明確に示された。さらに、花粉管を誘引している胚珠をマイクロマニピュレーションにより移動したところ、花粉管が雌性配偶体を追尾することがわかった。花粉管の前方30μm程度に雌性配偶体を置くと、花粉管は必ず誘引された。このことは30μm程度の距離であればガイダンスシグナルは数分で形成されること、誘引されている花粉管はガイダンスシグナルに対する反応性を維持しつづけることを示しており、マイクロピペット等によるアッセイが可能であることを示唆している。(2)重複受精機構の解析シグマ光機(株)と共同でタイムラプスシステムを構築し、雌性配偶体に影響なく受精過程を連続的に蛍光観察できるようになった。

また、雌性配偶体ではたらく可能性のあるプロモーターにGFPをつないだコンストラクトを作製するとともに、マイクロピペットによる遺伝子導入系を開発した。中央細胞のミトコンドリア等の可視化に成功し、受精過程の動態解析に道を拓いた。(3)個々の胚嚢細胞のEST解析細胞の回収・培養条件を決定するとともに、aRNA増幅、胚珠cDNAライブラリーの構築を進めた。花粉管誘導機構の解析誘引物質の種特異性について、トレニア属3種と近緑のアゼトウガラシ属2種を用いて明らかにした。これらの植物は胚嚢が裸出しており、レーザーアブレーションなどにより助細胞がin vitroで花粉管を誘引することを確認した。そこで異種の胚珠を混合して培養したところ、誘引活性に強い種特異性があることが明らかとなった。種特異性は用いる花柱組織の種には依存せず、またin vivoにおいて生殖隔離の要因となる可能性も示された。これまでに誘引物質の候補とされてきたCa^<2+>やGABAなどの低分子が助細胞由来の誘引物質ではないことも合わせて示された。さらに、胚珠の胞子体組織に由来し花粉管を活性化する分子を今年度新たに発見してこれが糖タンパク質であることが示唆され、また誘引物質はこの活性化物質よりも種特異性が強いことが示唆されたため、誘引物質がペプチド性のものである可能性が高まった。また、活性化物質の解析を進める中で培地上のほぼ全ての花粉管を活性化させる(助細胞の誘引シグナルに反応できるようにする)ことが可能になり、今後花粉管誘引物質の解析を進めていく上で重要な実験系を開発できた。重複受精の動態解析生殖細胞の生体染色法および高感度顕微鏡システムの構築により、花粉管内での精細胞の動きなど、これまで未知だった動態が明らかとなった。また、より明るく無害に細胞をラベルするためにGFPを利用する準備を進めた。その結果、パーティクルガン法によりトレニアの雌性配偶体をトランジェントに形質転換することに成功した。シロイヌナズナの配偶体特異的アクチン遺伝子ACT11のプロモーターかトレニアの雌性配偶体で良好にはたらくことも明らかとなった。また特定の核や細胞に簡便に遺伝子導入できるマイクロインジェクション法の開発にも成功しており、受精の動態を解析していくための重要な基盤技術が開発できたと言える。
DNA損傷応答におけるWip1による細胞周期チェックポイントの解除機構

DNA損傷応答は遺伝情報の保持の上で極めて重要な制御機構である。これまでDNA損傷の感受により細胞周期チェックポイント機構が作動し細胞周期停止の実行に至る過程、それに引き続く損傷したDNAの修復機構及び細胞死誘導機構については活発に解析が行われてきた。しかしながら、作動(活性化)したチェックポイント機構がどのような仕組みで解除(不活性化)されるかについては全く不明であった。我々は、DNA損傷時にp53依存的に発現誘導される核内Wip1ホスファターゼがチェックポイント制御に関わる一連の癌抑制遺伝子産物を脱リン酸化し、それらの機能を抑制するという新しい知見を得ているが、細胞周期チェックポイント機構のオン・オフのシグナル伝達機構に関しては未だ不明な点が多い。我々はこれまでに、DNA損傷応答におけるWip1によるチェックポイントキナーゼの脱リン酸化・不活化ならびにアポトーシスの制御についてCell Death Differ.誌、Mol Cell.誌に発表した。その後、昨年に続いて私は、Wip1の翻訳後修飾や細胞内動態制御についての解析を進めた。これまでに明らかにした、Wip1がChk2を直接脱リン酸化・機能抑制するという知見に加え、逆方向の反応としてWip1がChk2によって直接リン酸化されるという知見をin vitro kinase assayや細胞内強制発現系において明らかにした。また、このWip1のリン酸化部位の一つに14-3-3タンパク質が会合することを見出し、DNA損傷応答におけるWip1の細胞内局在変化を解析中である。これらより、Chk2とWip1がリン酸化・脱リン酸化制御により相互に作用し合うことが明らかとなった。しかしながら、作動(活性化)したチェックポイント機構がどのような仕組みで解除されるか、については全く不明であった。我々は、DNA損傷時にp53依存的に発現誘導される核内Wip1ホスファターゼがチェックポイント制御に関わる一連の癌抑制遺伝子産物を脱リン酸化し、それらの機能を抑制するという新しい知見を得ているが、細胞周期チェックポイント機構のオン・オフのシグナル伝達機構に関しては未だ不明の点が多い。最近、私は癌細胞にWip1を強制発現させることで、これまでに明らかとなっていたChk1,Chk2キナーゼと同様に放射線刺激によって引き起こされる内在性ATMキナーゼのリン酸化が抑制されことを見出した。また、免疫蛍光染色法によりWip1が発現している癌細胞において、放射線刺激後、リン酸化内在性ATM、リン酸化内在性Chk1によって形成される核内fociがWip1のホスファターゼ活性依存的に抑制されることを明らかにした。更に、リン酸化内在ATMがWip1によって直接脱リン酸化されることをin vitro phosphataseassayによって確認した。現在はWip1がATMを脱リン酸化することでATMのキナーゼ活性を制御し得るかどうかについてin vitro kinase assayを用いて解析中である。Wip1とATMの関係を更に詳細に調べていくことで、DNA損傷応答シグナルにおいて新たに重要な知見が得られることが期待される。しかしながら、作動(活性化)したチェックポイント機構がどのような仕組みで解除(不活性化)されるか、については全く不明であった。私はこれまでにCell Death Differ.誌に発表した核内Chk2キナーゼについての制御機構と同様に、Chk2の上流分子である核内ATMキナーゼがWip1によって直接脱リン酸化・機能抑制されることで、細胞周期チェックポイントが負に制御されることを明らかにした。この知見は、海外の研究室との共同研究でMol. Cell誌に発表した。続いて私は、Wip1のタンパク質発現制御や翻訳後修飾について検討するために、チェックポイントキナーゼとWip1の細胞内動態制御についての解析を進めた。また、Wip1のタンパク質量がChk2のキナーゼ活性依存的に安定化することを確認した。

我々は、DNA損傷時にp53依存的に発現誘導される核内Wip1ホスファターゼがチェックポイント制御に関わる一連の癌抑制遺伝子産物を脱リン酸化し、それらの機能を抑制するという新しい知見を得ているが、細胞周期チェックポイント機構のオン・オフのシグナル伝達機構に関しては未だ不明な点が多い。我々はこれまでに、DNA損傷応答におけるWip1によるチェックポイントキナーゼの脱リン酸化・不活化ならびにアポトーシスの制御についてCell Death Differ.誌、Mol Cell.誌に発表した。その後、昨年に続いて私は、Wip1の翻訳後修飾や細胞内動態制御についての解析を進めた。これまでに明らかにした、Wip1がChk2を直接脱リン酸化・機能抑制するという知見に加え、逆方向の反応としてWip1がChk2によって直接リン酸化されるという知見をin vitro kinase assayや細胞内強制発現系において明らかにした。また、このWip1のリン酸化部位の一つに14-3-3タンパク質が会合することを見出し、DNA損傷応答におけるWip1の細胞内局在変化を解析中である。これらより、Chk2とWip1がリン酸化・脱リン酸化制御により相互に作用し合うことが明らかとなった。
直売所における需要量把握と予測モデルの開発

本研究では、農産物直売所における需給ミスマッチを改善するため、定量的に需給の動向を把握し、需要予測を行うことを試みた。結果として、1.対象とした直売所では出荷点数の45%が残品となる一方で、平均25%の品目が欠品していた。2.欠品時の需要量は時間帯別販売点数に着目することで推測できる。3.需要量の日次変動は、(1)曜日などその日の特徴、(2)天候、(3)品目数、(4)経済指標などによって、ある程度説明可能であるといえる。1.研究の目的本研究の目的は、農産物直売所における需給ミスマッチを改善するため、定量的に需給の動向を把握し、需要予測を行うことである。本年度は、研究実施計画に基づき、大阪府泉南地域の中規模直売所Aのナス科野菜Bとトマトを対象として、残品(売れ残り)・欠品(売り切れ)の発生状況を定量的に把握し、欠品が生じた場合に需要量を推測する手法を開発した。2.本年度の研究内容(1)品目別のPOSデータと納品伝票を照合し、残品・欠品の発生状況を把握した。結果、対象品目の2005年から2007年における荷受数に占める残品数の割合は2237%であった。一方で、荷受があった日うちの1040%で欠品が発生していた。対象品目はあまり日持ちがしないため、多くの廃棄ロスが発生していることが示唆された。一方で、多くのチャンスロスも発生していることが明らかとなった。(2)時間帯別販売量を分析した結果、対象品目の欠品が発生しなかった日について、開店後一時間の販売数と一日の販売数の間に強い相関関係があることが明らかになった。この相関関係に着目して、欠品が発生した場合の需要量を推測する手法を開発した。この手法を用いて需要量を推測した結果、対象品目の2005年から2007年の出荷期間における需要量は、実際の販売数の103137%であったと推測された。3.成果の公表以上の本年度の研究成果は、関連学会で口頭報告を行った(第58回地域農林経済学会大会個別報告、2008年10月、神戸大学農学部)。本研究の目的は、農産物直売所における需給ミスマッチを改善するため、定量的に需給の動向を把握し、需要予測を行うことである。本年度は、前年度対象とした直売所AのPOSデータから、2004年から2007年の販売点数を日別に集計し、TCSI分解法を援用して日次系列モデルを推定した。なお、モデルは乗法モデルを採用し、日次データを分析するために、曜日変動を要素変動に加えて分析した。結果から次の点が指摘できる。1季節変動は、日帰りレジャー需要の変動と直売所Aにおいて人気がある品目の出荷時期・旬に影響されていることが示唆された。特に来店者数の変動は人気品目の旬に強く影響されているといえよう。一方、品揃え(品目数)の影響は、オープン当初は強かったが、近年弱まってきているといえる。2日々の需要量の変動は、(1)曜日、イベントなどその日の特徴、(2)天候、(3)品目数、(4)経済指標などによって、ある程度説明可能である。曜日変動と季節変動を除去した販売点数の変動について、次の点が指摘できる。第一に、品目数が多い日に販売点数が多い。第二に、祝日、イベント時に販売点数が非常に多い。ただし、祝日後2日間は販売点数が低迷する。第三に、販売点数は、上に凸の2次曲線を描きながら増加傾向にある。これは、オープン当初は順調に売上を伸ばしてきたが、近年伸び悩み傾向にあることを示している。第四に、天気が良い日に販売点数が多く、天気が悪い日に販売点数が少ない。第五に、ガソリン価格の高騰時に販売点数が少なく、一方、物価の上昇時や景気の悪化時には販売点数が多い。このことから、販売点数は、一般経済の動向に影響されるといえる。なお、本年度の研究成果は、関連学会にて口頭報告を行った(日本農業市場学会2009年度大会個別報告、2009年7月、三重大学)。
ミトコンドリアDNA突然変異の蓄積と長寿・老化との因果関係の解明

近年、老化の有力な原因の一つとして、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の障害が報告されている(Wallace, et. al. 1997)。また、このDNAが突然変異を起こすことによって、老化だけではなく、様々な疾病が起こるとも報告されている(Wallace, et. al. 1992., Kang, et. al. 2005.)。これらのことから、長寿とmtDNAの変異には強い関連があると考えられるが、ヒトにおいて長寿とmtDNAに関係した報告はほとんどみられない。本研究では、mtDNA突然変異率と長寿の関連を明らかにすることを目的とする。結果・mtDNA突然変異には点突然変異及び欠失(deletion)があるが、点突然変異を検出するためにA3243G突然変異率をTaqMan Probeを用いた定量PCRにて調べた。奄美地区の65歳以上から抽出したDNA129サンプルについて調べたところ、7サンプルでA3243G突然変異が見られた。しかしながら突然変異が検出されたのはいずれも100歳以下で、100歳以上から抽出したDNAではA3243G突然変異は検出されなかった。・mtDNA deletionを見るために、mtDNA全長を増幅するプライマーを用いて奄美地区の65歳以上から抽出したDNA46サンプルについてmtDNAを増幅し、サザンブロットによりmtDNA deletionがあるか調べた。その結果、16KのmtDNA全長以外のバンドは見られず、奄美地区の65歳以上から抽出したDNAからmtDNA deletionは検出されなかった。以上のことから調べたサンプルの中でのmtDNAの障害の蓄積は期待したものより少ない結果となった。近年、老化の有力な原因の一つとして、ミトコンドリDNA (mtDNA}の障害が報告されている(Wallace et al.1997.)。また、このDNAが突然変異を起こすことによって、老化だけではなく、様々な疾病が起こるとも報告されている(Wallace et al.1992.,Kang et al.2005.)。結果・mtDNA突然変異には点突然変異及び欠失(deletion)があるが、mtDNA点突然変異のスクリーニングを行うために、Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)法を試みた。A3243G変異をもつDNA及び野生型のDNAを用いて、PCRによりmtDNA断片を増幅した時に突然変異の位置が、中央、3'端、5'端、3'、5'端それぞれの1/5の位置にくるようにプライマーを設計し、突然変異がSSCP法により検出できるかを調べた。その結果、いずれの場合においても突然変異を検出することができ、これにより突然変異のスクリーニング法を確立することができた。・mtDNA deletionを見るためにmtDNA全長を増幅し、全長である16Kb以下に増幅されたDNA (mtDNA deletion)の本数を調べた。奄美地区の65歳以上から抽出したDNA129サンプルについて調べたところ、mtDNA deletionとみられるバンドが0本から6本まで検出された。
本邦における感染症の起炎菌の変貌と実体把握

本邦の18大学で分離される細菌を検体別に分類すると血液分離菌は黄色ブ菌、表皮ブ菌、カンジダ、ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の順であり、脳脊髄液の分離菌はブドウ球菌が4割を占め、脳室シャント留置による髄膜炎の多いことが覗れる。また膿汁分離菌は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、緑膿菌の順であり、喀痰分離菌は緑膿菌と黄色ブ菌が多い。この分離状況から、本邦の大学病院での主要な感染菌は黄色ブドウ球菌であり、1970年代に主要な病院内感染菌であったグラム陰性桿菌は緑膿菌を除けば減少していることが判明した。主要感染菌に対する薬剤感受性は、黄色ブドウ球菌の中のメチシリン耐性黄色ブ菌(MRSA)は年々増加して1988年度は50%を越え、これに対してはミノサイクリンとバンコマイシンのみが有効な抗菌薬である。緑膿菌に対してはアミノ配糖体系抗生物質ではトブラマイシンがβラクタム系抗生物質ではイミペネムの抗菌力が最も強く、イミペネムの場合イミペネム耐性緑膿菌の半数は他のβラクタム薬も交差耐性を示すが残りの半数は抗緑膿菌作用を持つペニシリン、セフェムに感受性を示し、イミペネムとペニシリン、ヤフェムの緑膿菌耐性機構は同一でないことが示唆された。また20年異常にわたり本邦の感受性検査のスタンダードであった日本化学療法学会標準法は寒天平板稀釈法であるが、世界の大勢はブイヨン稀釈法に移りつつあるので、化療標準法(10^6接短)とブイヨンのミクロダイリューション法を比較すると、菌や薬剤の組合せで多少のズレはあるが両者は比較的よく一致し、相関係数0.8以上の相関が得られた。2)19施設において、各収集期間の検体別細菌分離状況を調査用紙に記入しこれを年4回行うこととして、第1回目の集計作業に着手した。全国18大学・病院より蒐集した感染症原因菌の薬剤感受性について検討した.黄色ブドウ球菌ではメチシリン耐性菌MRSAが44%を占め,この耐性菌に各種βラクタム薬は無効であるが,ハベカシンのMIC_<50>が0.39μg/mlと最も抗菌活性が強く,オフロキサシン,ミノサイクリンのMIC_<80>が1.56μg/mlで,ミノサイクリンにやや耐性化傾向がみられている.呼吸器感染症の起点菌のなかでは, βラクタマーゼ産生性インフルエンザ菌が17%をしめ,アンピシリンの感受性が1.56μg/ml以上に上昇していた.グラム陰性桿菌の感受性検査も進行中である.大腸菌は広域ペニシリンでの耐性化傾向が顕著でピペラシリンのMIC_<80>は25μg/mlであるが,セフェム剤やアミノ酸糖体薬に対する感受性は良好であり,緑膿菌は各種第III世代セフェム系抗生物質にMIC_<80>が3.136.25μg/ml,MIC_<80>が6.2512.5μg/mlと半数近くが耐性菌であったが,アミノ酸糖体薬は抗菌活性を保持しており,トブラマイシンのMIC_<50>とMIC_<80>はそれぞれ0.78μg/ml,1.56μg/mlであった.感受性試験成績と,感染症原因菌の分離状況をコンピューターにin put中であり,本年は多角的な解析を行う予定である.本邦の18大学で分離される細菌を検体別に分類すると血液分離菌は黄色ブ菌、表皮ブ菌、カンジダ、ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の順であり、脳脊髄液の分離菌はブドウ球菌が4割を占め、脳室シャント留置による髄膜炎の多いことが覗れる。
医学生の長期的学修を支えるGritの役割 ― 統合的学修過程モデルの構築

本研究は医学生の学修過程におけるGritの役割を実証的に検討することを目的とする。長期の学修期間を要する医学教育では、学力のみならずやり抜く力(Grit)は重要な役割を果たすと考えられる。本研究では医学生のGritを定量的に測定し、(1)Gritが医学生の学習意欲・目標、学習行動、学業達成にどのような影響を及ぼすのかを検証する。そして(2)長期的な学修成果に対するGritの効果を検討する。さらに、(3)Gritがどのような過程で医学生の学修成果に影響を及ぼすのか、影響過程をモデル化する。医学生の学修過程に関する統合的モデルを構築し、効果的な教育支援や留年リスクの早期発見に役立てることを目指す。
リンゴ果樹及び果実に働く風による流体力の定量的把握と防風対策に関する研究

研究実績の概要は以下の通りである。1.現在普及している防風ネットは縦4.5m、横5.0mの4mm目のネットを高さ5.0mの支柱に地面から30.5mの隙間を開けて設置したものである。今回、3/(100)の縮尺で防風ネットの模型を作成し、網目の大きさが0.7mmと1.2mmの2種類のネットについて可視化と計測によって、ネットまわりの流れの特性を求めた。その結果、以下の知見を得た。(1)ネット上端で流れが剥離しているが、固体壁と異なりネットを通過する流れもあるため大きな剥離渦は生じていない。また、ネット上方から剥離した流れは加速され、この流れと後流域との境界でせん断層となっている。(2)ネット背後ではトレーサーの軌跡から減速され、計測結果から約1/2まで減少する。(3)ネットを通過した流れは、果樹があることにより更に減速される。(4)ネット上端から剥離した流れは、上部の加速された主流と剥離領域内で果樹の上端までの流れと果樹上端から底面近くの速い流れまでの間の流れと底面近くの速い流れの領域というように4つに区分される。(5)ネット背後では網目により乱れが減衰するが、流下するにつれ乱れが増加する。2.リンゴ落果被害状況が地域により異なることから、青森県の地形模型上の流れをスモ-クワイヤー法で可視化し、流況を求めた。(1)日本海からの風は白神山地で上昇して剥離し、八甲田山に到達している。岩木山では流れだ分離し、渦が形成されている。また、津軽半島の平地では地面に沿って流れている。(2)白神山地や十和田湖など谷部から津軽半島・八甲田山に向かう流れが見られる。台風9119号はこのような流況の風が津軽地方に吹き込み、リンゴ落果等の被害をもたらした。1.台風19号による落果、樹上損傷、樹体の倒木の被害総額は741億74万円に達するが、これによるリンゴ以外の農林業への影響を試算すると846億3600万円になる。青森県では農家人口の割合が約30%であることから、農業生産の底冷えは地域経済全体に波及し、青森県産業関連表から試算すると農業の生産が10%低下すると他の部門に与える減少額の影響を総計すると2.27倍の影響が出ることがわかった。また、台風による生産基盤の破壊は生産意欲をそぐ結果となり、出稼ぎ者の増加をもたらした。2.リンゴ園においてリンゴ果実に加速度計を埋め込んで測定した結果、平均加速度(a)は平均風速(V)の2乗で増加し、水平方向の加速度はa=0.002V^2+0.013Vとなった。鉛直方向の加速度は水平方向よりも小さい。また、最大加速度によって生じる力を求めると風速5.09,8.74,12.62m/sにおいて、それぞれ16.14,34.84,54,74grfとなった。3.風速とリンゴ果実の中心の風圧を測定した結果、平均風圧は風速の2乗で増加し、P(grf/cm^2)=0.004V^2+0.003Vとなった。4.リンゴ果実まわりの圧力分布測定は困難であるため、抗力測定器を試作し、ふじ,王林,ジョナゴールド,むつの4種類のリンゴの抗力係数(C_P)を求めた。その結果、Re数が少さいときは多少のばらつきがあるが、Re数が大きくなると品種に関係なくC_P=0.2前後の値となった。5.風によるリンゴの振動に起因する力や抗力はリンゴ落下をもたらす程の力でないことから、枝の揺れによって生じる力をマルバとわい化リンゴについて実測した。40cm引張ったときに、最大3.7kgfの力が働くことから、枝の揺れによって生じる慣性力で落下する確率は高い。6.マルバとわい化果樹モデルと果実まわりの可視化を行なった。7.LESモデルによるシミレーションプログラムは開発中である。1.強風時におけるリンゴ落果の主因は枝揺れによって生じる慣性力であることを昨年度の研究で解明した。従って、枝の揺れが枝の力学的特性に直接関係していることから、リンゴ果樹の枝の位置(上部か下部か)と状況(垂れ枝か立ち枝か)にある枝のヤング率をマルバ種とわい化種について求めた。(1)マルバ種では枝の位置が高くなるほどヤング率が若干大きくなる傾向があるがわい化種においては枝の高さに関係なくほぼ一定である。(2)マルバ種において枝の勾配が正・負とも大きくなるとヤング率が若干大きくなる傾向があるが、わい化種においては枝の勾配に関係なくほぼ一定となった。(3)マルバ種、わい化種とも枝の太さや枝の向いている方向に関してヤング率は変わらない。(4)ヤング率の平均値はマルバ種でE=3.27×10^7g/cm^2、わい化種でE=2.70×10^7g/cm^2となり、わい化種方が若干柔らかい。また、リンゴ果樹の枝のヤング率は柿の枝のE=3.3×10^7g/cm^2と同様な値である。

2.風によるリンゴの揺れについては、果樹全体を30m/sまでの風速で送風できる可変翼軸流送風機(phi1700)を使用し、2台のCCDカメラで撮影したリンゴの揺れの画像を処理して求め、その結果次のような知見を得た。(1)平均風速が25m/sの時はリンゴに5Nの力が働く。(2)リンゴの揺れの変動スペクトルは約5Hzを境として二重構造を持っている。3.青森県の地形模型を作成し、可視化実験をした結果、西風に対し岩木山後方でかなりスケールの大きい渦が発生している。4.シミレーションプログラムは開発中である。研究実績の概要は以下の通りである。1.現在普及している防風ネットは縦4.5m、横5.0mの4mm目のネットを高さ5.0mの支柱に地面から30.5mの隙間を開けて設置したものである。今回、3/(100)の縮尺で防風ネットの模型を作成し、網目の大きさが0.7mmと1.2mmの2種類のネットについて可視化と計測によって、ネットまわりの流れの特性を求めた。その結果、以下の知見を得た。(1)ネット上端で流れが剥離しているが、固体壁と異なりネットを通過する流れもあるため大きな剥離渦は生じていない。また、ネット上方から剥離した流れは加速され、この流れと後流域との境界でせん断層となっている。(2)ネット背後ではトレーサーの軌跡から減速され、計測結果から約1/2まで減少する。(3)ネットを通過した流れは、果樹があることにより更に減速される。(4)ネット上端から剥離した流れは、上部の加速された主流と剥離領域内で果樹の上端までの流れと果樹上端から底面近くの速い流れまでの間の流れと底面近くの速い流れの領域というように4つに区分される。(5)ネット背後では網目により乱れが減衰するが、流下するにつれ乱れが増加する。2.リンゴ落果被害状況が地域により異なることから、青森県の地形模型上の流れをスモ-クワイヤー法で可視化し、流況を求めた。(1)日本海からの風は白神山地で上昇して剥離し、八甲田山に到達している。岩木山では流れだ分離し、渦が形成されている。また、津軽半島の平地では地面に沿って流れている。(2)白神山地や十和田湖など谷部から津軽半島・八甲田山に向かう流れが見られる。台風9119号はこのような流況の風が津軽地方に吹き込み、リンゴ落果等の被害をもたらした。
K-Ras制御因子SCOPを中心にみた記憶形成のサーカディアン制御機構

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。1.記憶長期記憶形成とその時刻依存的変化におけるSCOPの機能を個体レベルで具体的に示すため、レンチウイルスを用いて海馬CA1領域特異的なSCOPノックダウンをおこなった。正常マウスにおいて長期記憶効率が良い時刻に、海馬依存的SCOPノックダウンマウスの長期記憶効率は顕著に減少した。SCOPノックダウンマウスの短期記憶形成効率は時刻に関わらず正常に形成される。以上のことから、記憶を長時間保持するための固定化に関わる経路にSCOPが時刻依存的に関与していることが考えられた。2.長期記憶の時刻依存性を引き起こす鍵が、SCOPの量によると考え、海馬内のSCOP蛋白質量の時刻変化を検討した。SCOP量は主観的夜に高く主観的昼に低い。特に、K-Rasとの結合がみられる膜ラフト内のSCOP量の経時変化は顕著であり、SCOPがK-Rasを負に制御することによる長期記憶形成の調節がおこなわれると考えられる。3.新潟大学脳研究所・崎村健司教授との共同研究で、SCOPのコンディショナルノックアウトマウス(海馬特異的ノックアウト)を作製した。このマウスを用いて、記憶形成機構および概日リズムへの影響を検討中である。以上のように個体レベルにおいて記憶形成と時刻依存性におけるSCOPの重要性を明らかにした。また、リズムの発振におけるSCOPの役割も明らかになりつつある。本研究課題により概日リズムがSCOPを介して記憶形成効率の概日変動を制御していることを強く示唆することができた。1.レンチウイルスの投与により海馬特異的SCOPノックダウンを実現した。ノックダウンは海馬の中でも記憶に関与することがわかっているCA1において強く効果が見られた。2.正常マウスにおいて長期記憶効率が良い時刻に、海馬依存的SCOPノックダウウンマウスの長期記憶を測定すると、記憶形成効率は顕著に減少した。3.正常マウスの長期記憶形成効率は活動期に高い概日変動があるが、概日リズムを示さないCry1/Cry2ダブルノックアウトマウスを用いて長期記憶を測定したところ、長期記憶形成効率の概日変動は見られなくなる傾向が得られた。4.培養細胞中のSCOPをノックダウンすることにより、細胞の概日リズムの振幅が小さくなり、SCOPが概日リズムのアウトプットにおいて増幅効果を持つことを見出した。5. SCOPのfloxマウスを作製した。今後は海馬特異的SCOPノックアウトマウスを作製し記憶形成および概日リズムにおけるSCOPの重要性をより詳細に示していく。以上の研究成果より、概日リズムが記憶形成効率の概日変動を制御していることが示唆され、さらにSCOPが概日時計からのを記憶形成機構につなげる「鍵」である可能性が強まった。
斜面上でのネガティブ密度噴流の挙動に関する研究

負の浮力をもって斜面上に表層放出される密度噴流の問題は周知のように環境水理学上の重要なテーマである。本研究は従来提案されている潜り点の水理条件や密度界面形状などの流れの諸量に関する結論が相違していることに着目し,その原因を流れのメカニズムの詳細な観察によって明らかにした上で新しい潜り点近傍の諸条件に関する知見を導くことを目的としている。本研究においては潜り点近傍の流動形態が放出密度フルード数:F_<d0>と斜面勺配:Sによって密度楔もしくは密度カレントの極めて大きく異なるいずれかの形態をとりうるという著者等に独自の概念に立って研究を進めた。以下に本研究の成果の主要な点を箇条書きにして示す。(1)潜り点における密度フルード数:F_<dp>はSおよびF_<dp>に応じて極めて大きく変化する。また,SがS=1/15程度を境にして挙動は大きく異なりS〓1/15ではF_<d0>が大きくなるほどF_<d0>の値は小さくなるが,S<1/15ではその定性的傾向が逆になる。(2)多くの実験結果よりF_<d0>-S平面上でのF_<dp>の値を三次元的にあらわした推定図表を提案した。その結果より過去に提案されてきたF_<dp>の推定式が相互に異なるのはそれぞれの研究者の実験装置・実験条件の範囲で提案されてきた為であることを明らかにした。(3)流動形態分類を実施し,F_<d0>-S平面上での出現位置を明らかにした。また,本研究によって提案する各種流動形態が現地データにも認められることを明らかにした。**本研究は著者等に独自の概念を基礎として本年度より実施されるものである。理論的検討のみならず実験的検討もまだ不十分である。研究期間を3年とし来年度も研究を継続する。なお,本年度の実験結果および知見については現在,論文投稿準備中である。
鎖状ポルプロピオニ-トの新しい立体制御法とその天然物合成への応用

メチル基と水酸基が交互にしかも連続的に結合したポリプロピオネ-トは重要な生理活性を有するマクロリド系抗生物質に多く見受けられる構造である。これらのポリプロピオネ-トを効率的かつ立体特異的に構築するため,新しくγ,δ-エポキシアクリル酸エステルを基質とし、トリメチルアルミニュウムを用いた位置選択的メチル化反応を開発した。すなわちE-エポキシアクリル酸エステル1からはアンチ体2が、またz-エポキシアクリル酸エステル3からはシン体4がそれぞれ100%のジアステレオ選択性で得られることを見出した。また、この反応を2回繰り返し用いることにより通常のアルド-ル反応では合成が困難なアンチ-トランス-アンチ型の4連続不斉中心も容易に合成できることを見出した。従って多連続のアンチ-トランス-アンチ型のポリプロピオネ-トの合成は、この方法により解決できたことになる。このようにγ,δ-エポキシアクリル酸エステルを基質として用いることにより、アンチ体,シン体いずれも立体特異的に合成できることがわかったので、本法の応用としてマイシナミシン系マクロリド、プロトマイシノリドIVの合成に着手した。5を出発原料に選び上記の方法によりC_1C_9に相当する6を立体選択的に合成したメチル基と水酸基が交互にしかも連続的に結合したポリプロピオネ-トは重要な生理活性を有するマクロリド系抗生物質に多く見受けられる構造である。5を出発原料に選び上記の方法によりC_1C_9に相当する6を立体選択的に合成した
In vivo検出可能な近赤外一酸化窒素感受性蛍光色素の開発研究

動的な生命現象を生きた状態でリアルタイムに観察することは生命科学研究の基本となる。私は多様な役割が報告され、真の生理作用が混沌としている一酸化窒素(NO)を高感度・特異的に測定できる新規蛍光色素であるジアミノフルオレセイン(DAF)類を創製し、NO生成の時空間解析を目的とした可視化(イメージング)法を開発してきた。生物個体レベルでのイメージングも重要であるが、励起光が蛍光色素に届くことが必要であることから、可視光励起であるDAFを用いるin vivo測定は体表面付近に限局されてしまう。そこで、生体組織透過性のよい近赤外領域で励起可能で蛍光を発するNO感受性蛍光色素を光誘起電子移動機構に則って分子設計し、有機合成した。合成されたジアミノシアニン(DAC)類はNOと反応することでトリアゾール体となり、790nmにおける蛍光強度が増大することから、当初計画通り、NO感受性近赤外蛍光色素創製が達成できている。DACにスルホン酸基を導入して水溶性を上げたDAC-Sとプロピル基を導入して脂溶性を上げたDAC-Pの二種を準備した。脂溶性の高いDAC-Pを利用することでラットの摘出腎臓の腎動脈からその溶液を灌流することで容易に摘出腎臓に負荷できることが判明した。その腎臓を実体蛍光顕微鏡下で近赤外蛍光観察し、NO放出剤であるNOC13を流すことで、期待通り、生体組織中でDAC-Pが捉えたNO由来の組織深部からの蛍光を画像化することに成功した。本結果より、創製に成功したNO感受性近赤外蛍光色素DAC類によるin vivo測定のポテンシャルを示すことができた。そこで、生体組織透過性のよい近赤外領域で励起可能で蛍光を発するNO感受性蛍光色素を次のように分子設計・有機合成した。近赤外光領域の蛍光団として知られているトリカルボシアニンの蛍光をPhotoinduced Electron Transfer(PET:ここでは光励起により空になったシアニンのHOMO軌道にelectron richな芳香族ジアミンから電子遷移が起き、励起電子が元の軌道に戻れず蛍光を発せなくなる現象。)により消光させておき、NOと反応することでPETの解除が起こり、近赤外蛍光が回復することを予測しつつ、NOセンサー部位であるジアミノベンゼンを導入した。そのようにして合成されたジアミノシアニン類はNOと反応することでトリアゾール体となり、790nmにおける蛍光強度が増大した。すなわち、近赤外光領域でのPETによる蛍光制御を当初の設計通りに達成できた。
外傷性因子存在下での歯周外科処置に関する研究-その治療と咬合治療の必要性の考察

歯周治療を進める上では,咬合調整や歯周外科処置など種々の処置が重複して行われることが多いが,それぞれの処置のかかわりについての報告は非常に少ない。本研究は骨縁下ポケットを有する辺縁性歯周炎の部位に歯周外科処置を行う場合にゆさぶり力による咬合性外傷の存在が残存するか否かによって,術後の治癒が影響を受けるかを検討することを目的に行った。1.カニクイザルの下顎大臼歯部に垂直性骨欠損をともなう歯周ポケットを形成する目的で,カニクイザル一頭の下顎左右第2大臼歯・第2小臼歯の計4歯を抜歯し,12週間の治癒期間をおいた後に第1次フラップオペを行った。手術は下顎左右第1大臼歯の近遠心の歯肉弁を剥離した後に歯根に面する歯槽骨を削除して垂直性骨欠損を作成し,歯根面をルートプレーニングした後プラークの沈着を促進させるためにモ-ルを巻つけたカッパーバンドを骨欠損内に挿入し,歯肉弁を閉じた。カッパーバンドは骨欠損内に6数巻放置した後に除去した。さらに2週間後にデンタルX線写真および臨床的ポケット測定により垂直性骨欠損を伴う歯周ポケットの確立を確認した。2.右側の第1大臼歯に咬合高径の高い鋳造冠とAlastikを装着してゆさぶり力による咬合性外傷を加えて被験歯の動揺度の増加を確認した。3.第2次の歯周外科処置としてオープンフラップキュレッテージを行い,12週後にサルをサクリファイスして病理組織学的な検討を行っている。
岡山市北西部、日近花崗閃緑岩体の希土類元素鉱物からみた形成過程

日近花崗閃緑岩体中は周縁部から中心部へとトーナル岩、花崗閃緑岩、角閃石黒雲母花崗岩、黒雲母花崗岩のように岩相が変化する。黒雲母花崗岩は角閃石黒雲母花崗岩に貫入するが、それ以外は漸移する(多賀ほか,2004)。今回、各岩相の鉱物のEPMAによる化学分析や、マフィック鉱物の鉱物学的特徴の記載を行った。その結果、岩体中の周縁部のトーナル岩から中心部の黒雲母花崗岩になるに従い、斜長石はAn成分に乏しくなり、単斜輝石はFeに乏しくなる。単斜輝石のMg/(Mg+Fe+Mn)値も乏しくなる。斜方輝石はトーナル岩と花崗閃緑岩にのみ見られEn50前後で、角閃石はferrohornblendeであることが明らかになった。希土類元素の岩体における分布を明らかにするために、本岩体の野外調査を行い、40以上の地点から岩石のサンプリングを行い、これらを粉末に処理した上でICP-MSで化学分析を行った。XRFによる全岩化学組成では、本岩体の周縁部から中心部に向けて主要元素、微量元素が同心円状のゾーニングを示すが(多賀ほか,2004)、今回の分析結果から、岩体内の希土類元素の含有量も同様に、岩体の中心部から周縁部に向かってゾーニングしていることが明らかになった。また、今回、日近花崗閃緑岩体の周辺に分布する岩相の異なる広島花崗岩類5つも分析を行った。これらの希土類元素パターンは本岩体のそれとほぼ重なる。本岩体東南部には、他の花崗岩類との貫入関係から時代的に古いと考えられる、桃色アルカリ長石をもつ粗粒等粒状黒雲母花崗岩が小規模に分布する。この花崗岩の希土類元素パターンは、他と大きく異なるフラットなパターンを示し、重希土類の含有量が多い。このことはこの花崗岩が広島花崗岩類や本岩体を形成するマグマと成因を異にすることを示している。
塩害の生じた鉄筋コンクリート構造物における部材毎の劣化速度比較とその対策

海岸部に立地する鉄筋コンクリート橋における上部工の形状が、飛来塩分の付着量に及ぼす影響を、実験的に検討した。すなわち、寸法および凹凸に相違を設けた4種類の供試体を、人工飛来塩分発生装置や人工降雨装置に暴露し、付着した塩分量を測定・比較した。その結果、上部工底面の凹部への巻き込み現象や上部工側面の雨水による洗浄効果に着目して、最も塩分が付着する部位を解明できた。これまで、既存鉄筋コンクリート構造物に対する点検調査は、学識者ではなく主として実務者により行われてきた。その結果、同一の構造物においても塩害による劣化速度は部材毎に異なることが知られている。しかしながら、上記は経験的な知見であり、研究として整理・評価した事例は少ない。すなわち、構造物周囲の海風の巻き込み現象や雨水による構造物の洗浄効果などに着目し、部材毎の付着塩分量を比較・考察した研究は不足しているのが現状である。上述の背景を踏まえて平成19年度の研究では、鉄筋コンクリート構造物における部材の凹凸などの形状に着目し、飛来塩分の巻き込み現象や雨による洗浄効果が塩分分布量に及ぼす影響を解明した。そのため、構造物の様々な断面形状を模擬するため、予め木材にて作製された4つの形状を成す土台に対して、モルタル板を張り付けた供試体を作製した。これらを、人工的に一定量の飛来塩分を発生できる装置に暴露し、任意の期間が経過後に可溶性塩化物イオンを測定した。また、雨水の洗浄効果に伴う飛来塩分の脱塩程度を検証するために、暴露された供試体の上面より水道水にて24時間洗い流した後にも、同様に可溶性塩化物イオンを測定した。その結果、(1)構造物の部位によって飛来する塩分の付着量に違いがあり、その量は飛来塩分発生側において高い、(2)塩分は凹凸部を含めた構造物全体に飛来するが、雨水による塩分の洗浄効果は凹部以外で高い、ことが明らかとなった。海岸沿いの鉄筋コンクリート構造物には,波しぶきに伴って塩分が飛来する.この塩分がコンクリート中に浸透することで,塩害が生じる.これは,鉄筋コンクリート構造物の主たる劣化要因のひとつである.従来,既存鉄筋コンクリート構造物に対する点検調査は,学識者ではなく主として実務者により行われてきた.その結果,同一の構造物においても,塩害による劣化速度は部材毎に異なることが知られている.例えば,Fig.1に示す通り,海岸沿いの鉄筋コンクリート橋においては,一般に山側の桁と比較して海側の桁が塩害により激しく劣化すると言われている.ただし,上記は経験的な知見であり,研究として整理・評価した事例は少ない.すなわち,構造物周囲の海風の巻き込み現象や雨水による洗浄効果などに着目し,部材毎の付着塩分量を比較・考察した研究は不足している.以上の背景を踏まえて本研究では,海岸部に立地する鉄筋コンクリート橋における上部工の形状が,飛来塩分の分布量に及ぼす影響を,上部工底面の凹部への巻き込み現象や上部工側面の雨水による洗浄効果に着目して解明した.その結果,次のととが明らかになった.1.真横から風が吹く場合,海側に近い面において,飛来塩分量は多かった.2.上部工底面の凹部にも飛来塩分は巻き込み,付着した.3.上記1と2の現象は,10cm程度の供試体では確認されず,一方1m程度の供試体では確認された.4.雨水が直接に掛かる面においてのみ,付着塩分は洗浄された.
回路/電磁界/機械混載システムの動作モデリング

17年度は非線形システムがA)非線形微分代数方程式,B)時系列データによって特性化さていると仮定し,その動作モデルを作成する方法について検討を行った.18年度では,それらのアルゴリズムの改良を行い,特に微分代数方程式の低次元化では,平衡化打切り法の改良を行った.本年度では,これらの方法を用いて動作モデルを自動的に作成するソフトウェアの開発を行った.開発したソフトウェアでは,非線形微分代数方程式,時系列データを入力とし,前年度までに開発したアルゴリズムに従って,その特性を低次元の方程式によって表現,Verilog-Aの書式に従って動作モデルを記述した.例題の検証では,UNIX上にCadenece社製のソフトウェアを,東京大学VDECセンターを介して導入し検証を行った.システムの縮退を行う前後において,精度,計算効率の観点から比較を行いその評価を行った.さらに,動作モデルの作成方法として,固有値分解法を提案した.その過程の中でRLCG-MNA法が動作モデルを効率良く作成することに有効であることを示したが,これは動作モデルの作成だけでなく直接シミュレーションを行う際にも有効であることを確認した.また,動作モデルを得る方法として,遺伝的アルゴリズムによる方法の検討を行った.遺伝的アルゴリズムではモデルを作成する際に大きな演算コストを必要とする.そこで,コンピュータネットワークを用いてこの演算コストを削減することについて検討を行った.標準のインターフェースであるMPIを用いてアルゴリズムの実装を行った.非線形システムがA)数万次元の非線形微分代数方程式,B)時系列データによって特性化さていると仮定し,その動作モデルを作成する方法について検討を行った.Aのモデリングでは,数万次元の非線形微分代数方程式そのものを動作モデルとして使用することは非現実的である.そこで,直流動作点を複数個考慮し方程式の線形化を行い,非線形システムを線形空間の集合として表した.しかしながら,システムは依然として大規模であり,その解析は計算コストが高い.そこで,状態方程式の可制御グラミアンと可観測グラミアンを等しくかつ対角にとり,対角要素であるハンケル特異値を有限個で打ち切った平衡化打切法の適用を行った.結果的に非線形システムは,数個から20個程度の数百次元での(線形)状態方程式によって表された.さらに,線形化が困難であった場合の対策として,近年,制御理論の分野で開発された非線形系の特異値解析の適用を行った.Bの時系列データのモデリングでは,ニューラルネットワークの有効性が知られている.そこで,時系列データをフーリエ級数で近似し,N次までの微分情報をネットワークに学習させる.これにより非線形システムのダイナミクスを近似した.さらに,パッケージの特性をモデル化するための低次元化法,VLSI配線,パッケージ,プリント基板の特性を解析するための高速シミュレーション手法の開発を行なった.これらの手法ではシミュレーションツールとして標準であるSPICEと比較して,101000倍の演算効率であるという特徴を有している.17年度では非線形システムが数万次元の非線形微分代数方程式あるいは時系列データによって特性化さていると仮定し,その動作モデルを作成する方法について検討を行った。18年度では17年度で開発したモデリング手法を,次年度のソフトウェア開発に向け,アルゴリズムの改良を行った。微分方程式の低次元手法,ニューラルネットワークを用いた非線形時系列解析のモデリング手法を精度,効率の観点から修正を行った。特に,微分方程式の低次元化手法における平衡化打切法では,効率良くモデルの抽出を行う方法について検討を行った。微分方程式の次元縮退には変換行列が必要となるが,これを得るためにリヤプノフの行列方程式を解く必要がある。この求解には特異値分解が必要であり,次元数が多くなった場合には非常に多くの計算コストが必要となる。そこで,リヤプノフの行列方程式の係数行列を,クライロフ部分空間法を用いて次元の縮小を行い,縮退されたリヤプノフの行列方程式を,特異値分解法を用いて解くことにより,モデリングに要する計算時間を短縮した。例題として,無線装置,簡易的なマイクロマシンのモデリングに適用し,その有効性を確認した。また,本手法は,パッケージ,集積回路,プリント配線のモデリングにも有効であることを確認した。対象となる配線を電磁界解析手法によってRLC回路に変換し,得られた線形回路網を提案手法によって次元縮退を行ったところ,効率良くモデルが抽出できることが確認できた。17年度は非線形システムがA)非線形微分代数方程式,B)時系列データによって特性化さていると仮定し,その動作モデルを作成する方法について検討を行った.18年度では,それらのアルゴリズムの改良を行い,特に微分代数方程式の低次元化では,平衡化打切り法の改良を行った.本年度では,これらの方法を用いて動作モデルを自動的に作成するソフトウェアの開発を行った.開発したソフトウェアでは,非線形微分代数方程式,時系列データを入力とし,前年度までに開発したアルゴリズムに従って,その特性を低次元の方程式によって表現,Verilog-Aの書式に従って動作モデルを記述した.例題の検証では,UNIX上にCadenece社製のソフトウェアを,東京大学VDECセンターを介して導入し検証を行った.システムの縮退を行う前後において,精度,計算効率の観点から比較を行いその評価を行った.さらに,動作モデルの作成方法として,固有値分解法を提案した.その過程の中でRLCG-MNA法が動作モデルを効率良く作成することに有効であることを示したが,これは動作モデルの作成だけでなく直接シミュレーションを行う際にも有効であることを確認した.また,動作モデルを得る方法として,遺伝的アルゴリズムによる方法の検討を行った.遺伝的アルゴリズムではモデルを作成する際に大きな演算コストを必要とする.
オメガ３脂肪酸代謝酵素は海産魚にとって本当に必要か？

海産魚への変異導入を実施するため、その準備から採卵、マイクロインジェクションによる第一世代の作出、およびその解析まで行った。実験魚には、ニベNibea mitsukuriiを用いた。まず、Crispr/Cas9システムを利用したゲノム編集に必要なガイドRNAのデザインを行った。不飽和化酵素遺伝子2(Fads2)をターゲットとし、3種のガイドRNAをデザインした。まず、これらガイドRNAをニベ受精卵にマイクロインジェクションし、得られた孵化仔魚に目的の変異が導入されているか確認した。その結果、75%の個体において予想した領域への変異導入が確認され、用いたガイドRNAの切断効率は良好であると判断された。その後、8月から9月にかけて親魚作出のためのインジェクションを連続して行った。この際のインジェクション翌日の浮上卵率は4060%であり、インジェクションを行わない卵(80%以上)と比較すると低下はするものの、浮上卵の孵化率は90%以上を維持したため、十分に生残させることが可能な水準であると判断した。得られた浮上卵は100 L水槽に収容し、EPA・DHA強化したワムシおよびアルテミアを順次給餌した。なおこの間、同ロット内においても大きな体長差が現れ始めたため、状況に応じて成長の遅れが激しい個体を別水槽に移動させるなどして対応した。体長が約20 mmを超え始めた段階で配合飼料への餌付けを行い、体長が30 mm程度を超えた段階で500 L水槽への移動を行った。ここまでの生残数は41尾であった。作出した第一世代の変異導入率を解析するため、胸鰭の一部から抽出したゲノムDNAを用いて、変異導入の有無を確認した。その結果、初期ロットでは56%(9/16)の個体で目的の箇所への変異導入が確認された。今後は初期ロット以降のロットも合わせて解析を続け、次世代を作出する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。長鎖多価不飽和脂肪酸(LC-PUFA)代謝経路を完全に明らかにすることは、ノックアウト魚の脂肪酸代謝系が実際に野生型と比較してどのように変化したのかを解釈する上で重要であると考えられるため、本研究においてはまずその経路における不飽和化酵素活性の強度を確認することとした。酵母発現系を用いた解析の結果、ゼブラフィッシュ不飽和化酵素は、18:3n-3に対するΔ6不飽和化活性と同程度の活性を24:5n-3にも示すことが明らかとなった。そのため、ゼブラフィッシュ不飽和化酵素遺伝子をノックアウトした場合、EPAからDHAを合成する経路も不全になると予測された。しかし、海産魚のニベにおいては18:3n-3に対するΔ6不飽和化活性のみしか検出されず、この種においては不飽和化酵素遺伝子をノックアウトしても、EPAからDHAへの合成系には影響がないと予想された。続いて、実際にゼブラフィッシュに対するノックアウト実験を行なった。まず、CRISPR-Cas9システムの作動性を確認するため、メラニン合成を行う黒色素胞のpH調整に重要な働きをするslc45a2遺伝子のノックアウトを試みた。ゲノム編集により得られた孵化仔魚のうち、42個体(87.5%)が白色化し、CRISPR-Cas9系によるノックアウトが正常に作動していることが確認された。さらに、実際に脂肪酸代謝酵素遺伝子のノックアウトを試みた。ゼブラフィッシュ脂肪酸代謝酵素のゲノム構造をNCBIから入手したのち、PAM配列、オフターゲット等を確認し、変異導入位置を決定した。合計83個の受精卵にガイドRNA、トレーサーRNAおよびCas9タンパク質を注入した結果、受精後1日目で生残卵が60個、2日目で49個(59%)であった。コントロール区における受精後2日目の生残率は81%であるため、インジェクション個体は生残率が低下することが強く示唆された。本年度はゲノム編集に用いる予定であるゼブラフィッシュおよびニベの不飽和化酵素の活性を解析した。また、実際にメラニン合成系に関わる遺伝子のノックアウト実験をゼブラフィッシュを用いて行った。ゲノム編集においては、色素欠損個体の作出が確認されたため、本研究室においてもゼブラフィッシュのゲノム編集系が動作するということが確認された。一方で、不飽和化酵素遺伝子のノックアウトにおいては、非インジェクション個体と比較して、生残率の低下が認められた。そのため、不飽和化酵素遺伝子ノックアウト個体と非ノックアウト個体の脂肪酸組成の比較等を行うことができず、当初の予定を半年ほどずらす必要が生じた。そこで、本年度の評価を(3)のやや遅れている、とした。しかし、この生残率の低下に関しては、技術的な改良により十分に改善できると予想しており、今後は細かい点を含めてマイクロインジェクションの工程を見直す予定である。また、繰り返しインジェクションを行うことで必要な個体数を確保することも可能であると考えられる。本年度は、前年度から引き続き、ゼブラフィッシュを用いた実験の最終段階として、ゲノム編集技術を用いた脂肪酸代謝酵素(不飽和化酵素)遺伝子への変異導入、その次世代作出および系統化を行った。変異導入法は基本的に前年度に確立した方法を踏襲したが、インジェクション技術の向上により、本年度は前年度と比べ比較的高い生残率が得られ、より多くの親魚を生残させることが可能であった。今年度マイクロインジェクションにより作出した変異導入世代(親世代)は44個体が成魚にまで成長した。