hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写活性化因子PhoBの機能解析

大腸菌では培地中のリン酸欠乏によりPhoBに依存して転写誘導のおこる31個以上の遺伝子群があり、これらは総称してリン酸レギュロンと呼ばれている。これら遺伝子群のプロモーター領域には229個のアミノ酸から成る転写活性化因子PhoBのDNA結合認識配列であるリン酸ボックスが存在している。このリン酸レギュロンの発現を特異的に減少させるRNAポリメラーゼ変異体の分離に成功し、転写活性化におけるPhoBとRNAポリメラーゼの蛋白質-蛋白質の相互作用点を明らかにできた。その変異部位はRNAポリメラーゼのσ^<70>サブユニットのhelix-turn-helix上の第一helixにあった。また、σ^<70>サブユニットの第一helixに部位特異的変異の導入を行い、各種の変異型σ^<70>を分離精製しin vitro転写実験をおこなった結果もこの領域がPhoBとの相互作用点であることを支持した。つぎにリン酸レギュロンの転写促進因子PhoBについては、N-末端側(リン酸受容ドメイン)がC-末端側の転写活性化ドメインの機能を制御していること、またC-末端側の転写活性化ドメインにはDNA結合(リン酸ボックスとの結合)とRNAポリメラーゼとの相互作用という少なくとも2つのサブドメインがあること、DNA結合モチーフはHTHでありリン酸ボックス内のTGNCA配列を認識していること等を明らかにした。さらに、PhoBとRNAポリメラーゼとの相互作用には、PhoBのHTHモチーフのTurn構造とRNAポリメラーゼのシグマ70因子のHTHの第1 Helixが使われていることや、PhoBがリン酸ボックスに結合するとDNAは彎曲するすることを明らかにした。
電気化学センサのアレイとマイクロ流体容器を集積化したデバイスによる一分子酵素活性の観測

培養細胞の状態を計測するために、マクロスケールの培養液中の物質を採取する方法では、十分短い時間間隔で長時間にわたるデータを取ることは不可能である。このため、マイクロ流体容器の中で少数の細胞を培養し、そこにバイオ化学センサを集積化することで、細胞が放出・吸収する物質を連続的かつ高感度で分析する必要がある。本研究では、バイオ実験に適した化学センサとして電気化学センサを選定し、細胞の活動に重要なカルシウムイオン濃度の選択的な測定を目指した。ここでは膵島のベータ細胞(インシュリン分泌細胞)の活動に伴うカルシウム濃度変化の検出を目脂し、東京大学生産技術研究所藤井輝夫研究室のメンバーと共同で、マイクロマシン技術と半導体技術による電気化学センサの製作とその評価を行った。電気化学センサとして、イオン感受性電界効果トランジスター(ISFET)に着目し、半導体集積回路技術を用いたISFETアレイチップの作製を試みた。20x20のISFETのアレイを4組搭載し、各々のセンサを選択して読み出す回路を含めたチップを共同研究者と一緒に設計した。東大に付属する高密度集積回路設計教育センター(VDEC)のCMOS集積回路試作サービスを利用してチップを製作した。ISFETの感応膜を付加してセンサとして使用できるように、完成したチップに後処理を行うプロセスを考案した。現在までに、ISFETトランジスターが滴下したイオンを含む水(水道水)に反応すること、アレイ中の個別トランジスターを選択して読み出すことが可能なことを確認した。マイクロスケール、ナノスケールで生体反応を正確に理解するためには、特別な測定装置が必要である。特に、個別の生化学反応をモニターすることが必要であり、低濃度のさまざまな生成物や副産物を測定することが非常に興味深い。我々は、特別なイオン選択性電極と電界効果型トランジスタ(ISFET)のアレイを設計し、製作することを提案した。我々は、インスリンの精製能力を持つ膵臓細胞(β細胞)の活性について、特に注目することにした。インスリンはカルシウムを含むため、インスリンの濃度を測定するためにCa^+イオンの濃度を測定することが可能である。ISFETはSiO_2とSi_3N_4の薄膜状のものが主流で、pH測定に広く用いられている。特定のイオン種に対して正確で選択性に優れたISFETを作るためには、薄膜の組成やサイズが非常に重要である。低濃度Ca^+を測定するための薄膜を特性評価するために、我々はまずガラス基板上のPt電極を使うことにした。直径4μmから8μmの円形状のPt電極をアレイ状に作成することに成功した。作製にはガラス基板上へPtをスパッタし、その上にSiO_2をスパッタした。SiO_2レイヤはPtのエッチングマスクとして用いる。リソグラフィにより電極パターンを作製し、化学的かつ物理的な反応性イオンエッチング(RIE)を施すことで、Pt電極を作製する。そして、その電極の上にPVCと特殊なシリコンの膜を堆積させる。この2つの膜は、Ca^+測定において重要な役割を担うイオノファーETH1001を含む。こうして作製された薄膜の選択性は電位差測定装置を用いて、その精度とβ細胞のモニタリング中に現れるK^+やNa^+などの他のイオン種に対する選択性について測定中である。さらに、SN比を上げるため膜厚をサブマイクロオーダーまで薄くするための成膜プロセスのパラメーターについても模索中である。
水環境中における抗生物質および抗ウイルス剤の動態と薬剤耐性菌による水系汚染

河川流域における抗生物質および抗ウイルス剤の動態について,淀川支川や下水処理場放流水の分析結果から,医薬品類の多くは下水処理場経由で河川へ流入することが明らかとなった。また,水生生物に対する毒性影響について,抗生物質は藻類に対する毒性が大きいこと,抗ウイルス剤は水生生物に対する毒性は強くないことが分かった。薬剤耐性菌の動態については,河川水からは高い割合でアンピシリン耐性菌が検出され,アンピシリンやスルファメトキサゾール耐性菌は河川での流下過程で存在量を維持したまま流下することが示唆された。本研究では,水環境中における抗生物質および抗ウイルス剤の動態を明らかにするとともに,薬剤耐性菌による水系汚染を明らかにし,抗生物質濃度や下水処理水,畜産排水等の流入と薬剤耐性菌の存在との関連について考察することを目的とする。平成21年度は,抗生物質および抗ウイルス剤の分析万法を検討するとともに,水環境中における抗生物質および抗ウイルス剤の動態を把握することを目的に研究を実施した。抗生物質の分析方法の開発については,医療用として使用量が多いマクロライド系,ニューキノロン系等の抗生物質とともに,家畜用として使用量が多いテトラサイクリン系等の抗生物質を対象として,LC/MS/MS(高速液体クロマトグラフータンデム質量分析計)を用いて他の医薬品類とめ同時分析法を開発した。また,抗ウイルス剤については,A型インフルエンザ治療薬として,我が国において以前から使用されているアマンタジン(Amantadine)と,近年使用が急増しているタミフル(Oseltamivir)を対象として分析方法の開発を行った。河川流城における抗生物質および抗ウイルス剤の動態を明らかにすることを目的として,関西地域の重要な水源となっている淀川流域においてサンプリングを実施した。、その結果,淀川に流入する支川や下水処理場放流水について,抗生物質および抗ウイルス剤濃度が高い値が示されていること,淀川流域に流入する抗生物質および抗ウイルス剤の多くは,下水処理場経由で流入することが明らかとなった。また,下水処理場において抗生物質の挙動を調査したところ,我が国において使用量の多いニューキノロン系抗生物質のLevofloxacinは,下水処理場において高い除去率となっているのに対し,マクロライド系抗生物質のClarithromycinは,下水処理過程において十分に除去されずに河川流域に放流されていることが明らかとなった。水環境中における抗生物質等の医薬品類の存在は,人の健康問題と関係する薬剤耐性菌の発生にも関与することが懸念され,水環境中における医薬品類の動態や薬剤耐性菌による水系汚染の実態を明らかにすることは重要であると考えられる。そこで本研究では,水環境中における抗生物質および抗ウイルス剤の動態を明らかにするとともに,薬剤耐性菌による水系汚染を明らかにし,抗生物質濃度や下水処理水,畜産排水等の流入と薬剤耐性菌の存在との関連について考察することを目的とする。平成22年度は,抗生物質および抗ウイルス剤の水環境中での分解性を検討するとともに,抗生物質および抗ウイルス剤の水生生物に対する毒性影響の評価を行った。抗生物質および抗ウイルス剤の水環境中での分解性については,淀川流域にある支川の小区間で調査を行って医薬品類の分解速度を推定したところ,ニューキノロン系抗生物質であるCiprofloxacinやLevofloxacin,その他の抗生物質のTetracyclineやNalidixic acidについては,1次減少係数が0.1を上回る高い値が示された。これらは太陽光照射実験でも高い光分解性が見られた物質であり,分解には光分解が寄与している可能性が考えられた。また,水生生物に対する毒性影響について,藻類,ミジンコ,細菌を用いた生態毒性試験を行った結果,3種の生物の中では抗生物質は全体的に藻類に対する毒性が大きかった。しかし,Triclosanについては,藻類,ミジンコ,細菌の3種の生物全てに強い毒性が見られた。一方,タミフルなどの抗ウイルス剤について生態毒性試験を行った結果,抗生物質と比較すると,その水生生物へ対する毒性は強くないことが明らかとなった。そこで本研究では,水環境中における抗生物質および抗ウイルス剤の動態を明らかにするとともに,薬剤耐性菌による水系汚染を明らかにし,抗生物質濃度や下水処理水等の流入と薬剤耐性菌の存在との関連について考察することを目的とする。平成23年度は,水環境中における薬剤耐性大腸菌の存在実態を調査し,その分布を把握するとともに,河川および下水処理場等から単離した大腸菌に対して複数の薬剤の感受性を調べ,多剤耐性菌の割合を把握した。桂川を対象とした河川流域での調査では,アンピシリンとスルファメトキサゾールの耐性菌は河川水中でも流下過程において存在量を維持したまま流下することが示唆された。

これは,河川水から高い濃度でアンピシリン耐性菌が検出されていることと関係する可能性がある。また,下水処理場における調査結果から,下水処理過程において多剤耐性菌の割合が増加する傾向が見られた。病院排水を対象とした調査では,水域に直接放流されている病院排水は,環境中への薬剤耐性菌の排出源となっていることが示された。さらに,水環境中から単離した大腸菌についてβラクタマーゼの存在を調べたところ,河川水,下水処理水および病院排水から基質特異性拡張型βラクタマーゼ(ESBL)等を産出する菌が検出された。このことから種々のタイプのβラクタマーゼを生産する多剤耐性菌が環境中に広く分布していることが明らかとなった。
皮膚癌におけるデスモゾームカドヘリン結合蛋白の発現に関する研究

(1)正常皮膚と皮膚悪性腫瘍(BCC:11例、SCC:8例、Paget病:4例、Paget癌:4例、Bowen癌:3例、毛嚢癌:3例)の組織標本を材料とし、細胞接着分子(E-cadherin、desmoglein I、plakoglobin)の発現を各細胞接着分子のモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により検索した。その結果、それぞれの腫瘍で特徴的な発現パターンを示していた。一般に、浸潤および転移能が高いとされているSCC、Paget癌では、今回検索した細胞接着分子の発現はすべて減弱または消失しており、浸潤および転移能が低いとされているBCCではE-cadherin、desmoglein I、plakoglobinが正常皮膚とほぼ同様の発現を示していた。これらの結果から皮膚悪性腫瘍の浸潤および転移に、今回検索した細胞接着分子が関連していることが示唆された。
遺伝子ターゲティングによるFcγ受容体欠損マウスの作成およびその解析に関する研究

[目的]Fcγレセプター(FcγR)は、免疫担当細胞表面上に存在し、IgGのFc部分と結合することでエフェクター機能の発現の引金を引く重要な分子である。マウスII型FcγRは、ほとんど全ての血球系細胞に発現しており、B細胞では抗原レセプターを介する情報伝達に対して抑制的に作用することが示唆されているが、詳細は明かでない。今回我々は、FcγRIIの生理的機能を個体レベルで明らかにするために、胚性幹(ES)細胞での遺伝子ターゲティングによってFcγRII欠損マウスを作成した。[方法及び結果]マウスFcγRII遺伝子を単離し、Neo^R遺伝子及びヘルペス・TK遺伝子を組み込んだターゲティング・ベクターを構築した。これをES細胞J1及びE14にトランスフェクトし、G418とFIAU両耐性となったクローンの中から、サザンブロット法により相同組換え体を同定した。これらをマウス初期胚にマイクロインジェクションしてキメラ個体を得、これらと野生型マウスとの交配により、FcγRIIヘテロ欠損個体を得た。現在、ホモ欠損個体の作成を行っており、今後これらのマウスにおける各種免疫機能の解析を行う予定である。
熱性痙攣の実験的研究

(目的)今回我々は、中枢神経系におけるGABA神経系の活動の抑制あるいは亢進が、ラット熱性痙攣に及ぼす影響について検討した。(方法)GABA神経系の活動を低下させるためにGABA合成酵素の阻害剤Thiosemicarbazide(TSC)およびGABA antagonistのBicuculineを、GABA神経系の活動を亢進させるためにGABA agonistのMuscimolを使用した。生後2025日齢のルイスラットをそれぞれ8匹づつの4群に分け、各群にそれぞれTSC 140mg/kg,Bicuculine 3mg/kg,Muscimol 0.2mg/kg、コントロール群には生食を腹腔内投与した。ラットをpancronium bromide腹腔内投与で麻痺させ人工呼吸器で呼吸管理し、それぞれの薬剤を腹腔内投与した30分後に5分間過換気の状態にし赤外線にて頭部を加温し発作を誘発した。脳波上発作波が出現するまでの時間を痙攣閾値、発作波の持続時間を痙攣持続時間とした。(結果)Bicuculine投与群およびTSC投与群の痙攣閾値は、それぞれ35.9±9.9秒(mean±SD),34.0±8.2秒で、コントロール群の106.3±65.6秒に比し有意に低く(P<0.05)、Muscimol投与群の痙攣閾値216.3±67.2秒は、コントロール群の106.3±65.6秒に比し有意に高かった(P=0.001)。一方、痙攣持続時間では各薬剤投与群とコントロール群間に有意差はなかった。(考察)以前我々はGABA神経系の活動を亢進させるためにPiridoxineを使用したが、Piridoxineにはラット熱性痙攣に対しての予防効果は認められなかった。今回我々はGABA recepterのagonistおよびantagonistを使用し上記のような結果を得た。これらの結果は、LoscherやRating等の脳内GABAの低値が熱性痙攣の発現に関与しているとの推測を指示するものと思われた。(目的)我々はこれまで、ラットの体温を急激に上昇させると後頭部皮質より発作波が出現することを報告した。一方、表面から1000μmまでの後頭部皮質(24層)には温熱感受性を持つ神経細胞群が存在することを報告し、温度上昇によるこれら神経細胞の活動亢進が発作波の出現に関与していると考えた。今回我々は、中枢神経系におけるGABA神経系の活動の抑制あるいは亢進が、これらの神経細胞群にどのような影響を与えるかについて検討した。(方法)GABA神経系の活動を低下させるためにGABA antagonistのBicuculine(B群)を、GABA神経系の活動を亢進させるためのGABA agonistのMuscimol(M群)を使用した。生後2025日齢のルイスラットをそれぞれ8匹づつの3群に分け、各群にそれぞれBicuculine 3mg/kg、Muscimol 0.2mg/kg、コントロール群(C群)には生食を腹腔内投与した。ラットをpancronium bromideで麻痺させ人工換気し、ガラス微小電極で後頭部皮質の細胞外電位を記録した。各薬剤を腹腔内投与した30分後より、5分間隔でラット頭部に40秒間の赤外線照射を行った。照射前40秒および照射後40秒間で各部位の細胞外電位を記録し、温度上昇による神経発射の増加率を検討した。(結果)記録された神経の数は268個であった。皮質の深さ(硬膜よりの距離)が1000μmまでの神経では、B群(0.9,-1.0175.0)(median,range)はC群(0.2,-1.020.3)に比し有意に増加率が高く(P<0.025),M群(-0.3,-1.03.8)はC群に比し有意に低かった(P<0.025)。1000μmより深部では3群間に有意差を認めなかった。(考察)我々はこれまで、ラット熱性痙攣の発作閾値は脳内GABA神経系の活動状態に左右されると報告してきた。今回の結果より、GABA神経系は後頭部皮質24層に存在する神経細胞群の温熱感受性に関与し、発作閾値に影響を与えていると考えられた。(結果)

Bicuculine投与群およびTSC投与群の痙攣閾値は、それぞれ35.9±9.9秒(mean±SD),34.0±8.2秒で、コントロール群の106.3±65.6秒に比し有意に低く(P<0.05)、Muscimol投与群の痙攣閾値216.3±67.2秒は、コントロール群の106.3±65.6秒に比し有意に高かった(P=0.001)。一方、痙攣持続時間では各薬剤投与群とコントロール群間に有意差はなかった。(考察)以前我々はGABA神経系の活動を亢進させるためにPiridoxineを使用したが、Piridoxineにはラット熱性痙攣に対しての予防効果は認められなかった。今回我々はGABA recepterのagonistおよびantagonistを使用し上記のような結果を得た。これらの結果は、LoscherやRating等の脳内GABAの低値が熱性痙攣の発現に関与しているとの推測を指示するものと思われた。
金属触媒によるCO＿2の接触水素化反応の電子的メカニズムに関する理論的研究

本研究課題では、金属触媒によるCO_2の接触水素化反応の電子的メカニズムを理論的方法によって研究することである。平成9年度の研究成果は以下に具体的に述べる。(1)銅触媒上での水素、Formateの吸着状態及び水素とCO_2の共吸着の電子状態の解明銅系触媒はこの反応プロセスに実用されている触媒である。水素は銅表面上で解離吸着し、共吸着水素とCO_2の反応スタートからFormateを中間体として生成するという実験結果が示唆している。我々は、銅表面上での水素及びFormateの吸着構造や電子状態の研究を行った。いずれの場合、Bridge siteの吸着構造が安定であることが分かった。また、吸着Formateがanion状態であることを明らかにした。水素とCO_2の共吸着の場合、従来のクラス-モデルが無効であり、負吸着エネルギーしか出ない。しかし、Dipped Adcluster Modelにより、正しい共吸着電子状態を初めて報告した。(2)銅触媒上でのメタノール合成反応の電子的メカニズムの解明銅表面上でのCO_2の接触水素反応によるメタノールの合成反応プロセスに対して、全ての可能な反応中間体・遷移状態のエネルギー及び電子状態を計算し、この反応メカニズムを初めて理論的に解明した。このプロセスは五つのステップで構成し、Formate,Dioxomethylene,FormaldehayetoとMethoxyがこの反応の中間体であることが我々の研究結果から確認した。また、このプロセスの律速段階はFormateからDioxomethyleneへのステップであることがわかり、触媒設計の指針を与えた。これらの結果に基づいて、銅触媒に添加する助触媒の効果、他の金属による触媒反応の可能性などについて検討を進んでいる。
水銀,ニッケルアレルギーの新しい検査法の開発研究

水銀,ニッケルアレルギー患者のリンパ球増殖試験・金属アレルギーの予防および治療ではアレルゲンを特定,排除するためにパッチテストが広く用いられている.しかし,本法には,幾つかの欠点があり.新しいin vitro検査法の実施が可能になれば,その臨床的価値は低くない.現時点で臨床応用の可能性が高いと考えられる検査法の一つにリンパ球増殖試験法がある.しかし,金属イオンがハプテン(単純性化学物質)であること,またHg^<2+>などのいくつかの金属イオンはmitogen(リンパ球分裂促進因子)であることは,感作の有無の判定にリンパ球増殖試験法を応用することの障害となっている.計画の1年目にあたるH11年度は,水銀あるいはニッケルに感作したリンパ球を分離し,また,金属イオンのmitogen作用を抑制するためのキャリアー蛋白を調整した.H12年度は,得られた表皮細胞浮遊液を調整して,リンパ球増殖試験を実施した.方法は,通法に従った.96穴マイクロプレートにそれぞれ,感作リンパ球とコントロールリンパ球を150μlずつ分注し,同被験者から分離した表皮細胞浮遊液を50μlずつ添加し,37°Cで6日間培養した.リンパ球増殖の評価はMTT assayにより行った.培養終了6時間前に,MTT試薬を各well10μlずつ加え.培養終了後,形成されたMTT-ホルマザンをacid-isopropanolで溶解し,ELISA readerを用いて比色定量した.その結果,感作リンパ球の増殖と,コントロール(非感作)リンパ球の増殖の間には,統計学的に有意な差はみられなかった.おそらく,キャリアー蛋白として使用した表皮細胞浮遊液の精製度の不安定さが原因と思われる.今後は,これを解決するために,キャリアー蛋白として赤血球が利用できる可能性を探っていく予定である.水銀,ニッケルアレルギー患者のリンパ球の分離と,抗原調整・金属アレルギーの予防および治療ではアレルゲンを特定,排除するためにパッチテストが広く用いられている.しかし,本法には,幾つかの欠点があり,新しいin vitro検査法の実施が可能になれば,その臨床的価値は低くない.現時点で臨床応用の可能性が高いと考えられる検査法の一つにリンパ球増殖試験法がある.しかし,金属イオンがハプテン(単純性化学物質)であること,またHg^<2+>などのいくつかの金属イオンはmitogen(リンパ球分裂促進因子)であることは,感作の有無の判定にリンパ球増殖試験法を応用することの障害となっている.そこで,今年度は,まず水銀あるいはニッケルに感作したリンパ球を分離することから開始した.被験者は,受験内容,目的をよく理解してもらったボランティアに依頼した.通法通りに水銀とニッケルのパッチテストを行い,それぞれに感作しているものをスクリーニングした.それぞれ,水銀感作者群,ニッケル感作者群,とし,採血を行い,通法に従い,リンパ球を分離した.次に,金属イオンのmitogen作用を制御するためのキャリアー蛋白を調整した.方法は,まず,suction blister machineを使用し,被験者の前腕部から表皮を採取し,0.5%トリプシン中で37°C,30分培養する.この表皮を軽くガラス棒で真皮側からこするようにしたあと,さらにピペッティングを行う.こうして得られた表皮細胞浮遊液(ランゲルハンス細胞を25%含まれる)を調整して,H12年度に計画しているリンパ球増殖試験に供する予定である.尚,この結果は,平成12年度日本補綴歯科学会学術大会にて発表の予定である.水銀,ニッケルアレルギー患者のリンパ球増殖試験・金属アレルギーの予防および治療ではアレルゲンを特定,排除するためにパッチテストが広く用いられている.しかし,本法には,幾つかの欠点があり.新しいin vitro検査法の実施が可能になれば,その臨床的価値は低くない.現時点で臨床応用の可能性が高いと考えられる検査法の一つにリンパ球増殖試験法がある.しかし,金属イオンがハプテン(単純性化学物質)であること,またHg^<2+>などのいくつかの金属イオンはmitogen(リンパ球分裂促進因子)であることは,感作の有無の判定にリンパ球増殖試験法を応用することの障害となっている.計画の1年目にあたるH11年度は,水銀あるいはニッケルに感作したリンパ球を分離し,また,金属イオンのmitogen作用を抑制するためのキャリアー蛋白を調整した.H12年度は,得られた表皮細胞浮遊液を調整して,リンパ球増殖試験を実施した.方法は,通法に従った.96穴マイクロプレートにそれぞれ,感作リンパ球とコントロールリンパ球を150μlずつ分注し,同被験者から分離した表皮細胞浮遊液を50μlずつ添加し,37°Cで6日間培養した.リンパ球増殖の評価はMTT assayにより行った.培養終了6時間前に,MTT試薬を各well10μlずつ加え.培養終了後,形成されたMTT-ホルマザンをacid-isopropanolで溶解し,ELISA readerを用いて比色定量した.その結果,感作リンパ球の増殖と,コントロール(非感作)リンパ球の増殖の間には,統計学的に有意な差はみられなかった.おそらく,キャリアー蛋白として使用した表皮細胞浮遊液の精製度の不安定さが原因と思われる.今後は,これを解決するために,キャリアー蛋白として赤血球が利用できる可能性を探っていく予定である.
現代アメリカ思春期文学の研究

稲田は、1950年代以降のアメリカの社会的・文化的変化を扱った図書や男性学関連の図書を収集し、この時期にアメリカの思春期の男女がどのような社会的・文化的変化の中にあったかを把握することに努めた。ついで、J.D.SalingerのThe Catcher in the Rye (1951)とSylvia PlathのThe Bell Jar (1963)を「思春期文学」として取り上げ、両主人公の少年・少女の心理、ジェンダー、社会・文化的環境、社会化を比較することで、両者の類似点や相違点を考察した。稲田の研究結果は、現在論文として執筆中である。吉田は、インターネットを通じて学術情報センターのデータ・ベースに入り、国内外の関連研究機関からジェンダー学、思春期の心理学、アメリカの社会・文化研究に関する文献を収集した。また、緊急の場合は、関連の研究機関に出張して資料や文献の入手に努めた。1995年には、吉田は、思春期文学にみる変化を遂げる男性性に関する論文を2点発表して、知名度の高い思春期小説--The Man WithoutaFaceとThe Chocolate War--を男性学の観点から見直した。1996年から1997年には、「ポスト・コロニアリズム」の観点からジェンダー問題を扱った論文3点を発表したが、まもなく英語で書かれた論文2点も国際誌で発表の予定である。また、6月と8月に国際学会、International Children's Literature AssociationとInternational Research Society of Children's Literatureで口頭発表の予定である。当研究の今後の課題としては、小説の主人公たちの民族的な多様性や同性愛をふくめたセクシュアリティの問題により焦点を当てた研究が考えられる。稲田は、Boyhood,Growing Up Male(Franklin Abbott編)や『1960年代のアメリカ』『1970年代のアメリカ』などを計画通り購入し、現在シルヴィア・プラスの小説にみられる思春期の少女像の分析に入っている。吉田は、通信費を使って文部省学術情報センターのデータ・ベースに頻繁に入り、国内外の研究機関での資料の特定及び収集につとめてきた。また、緊急に必要な資料やアメリカ文化センターのCD-ROM利用による資料については、旅費を使って各研究機関に出張して収集した。男性学、男性心理学、思春期の心理学に関する書簡、思春期の男女像を描いた映画のビデオの購入も予定通り進み、作品の背景の研究に使用することができた。平成七年度に、吉田は、『欧米文化研究』第二号(広島大学大学院社会科学研究科紀要)に、「思春期小説The Man Without a Faceにおける『男らしさ』の研究」を、『人間文化研究』第四号(広島大学総合科学部紀要)に「思春期小説にみられる『男らしさ』と権力--Robert CormierのThe Chocolate Warの場合--」を発表した。また、『日本児童文学』(日本児童文学者協会・文溪堂)四月号に「老人と子どもが『森』で出会うとき」を発表予定である。大学院生も含めた毎月一回の研究会により、知見は深められたが、学術上の問題としては、アフリカ系、アジア系、白人の若者像にみられる人種的差異、さらには異性愛者、同性愛者の若者の性アイデンティティにおける心理学的・社会学的考察など、多様な文脈な中で作品分析をする必要性も感じられた。稲田は、1950年代以降のアメリカの社会的・文化的変化を扱った図書、たとえば『1960年代のアメリカ』などや、男性学に関する図書、たとえば『「男という病」の癒し方』などを収集し、アメリカの思春期の男女がどのような社会的・文化的変化の中にあったかを把握することにつとめた。

ついで、J. D. SalingerのThe Catcher in the Rye (1951)とSylvia PlathのThe Bell Jar (1963)を思春期文学として取り上げ、両主人公の少年・少女が、心理、性、環境、社会化等に関して、どのような類似点や相違点を示しているかを考察し、現在、その結果を論文として執筆中である。吉田は、インターネットを通じて、文部省学術情報センターのデータ・ベースに頻繁に入り、国内外の研究機関での資料収集につとめた。また、緊急に必要な資料や図書の収集や、アメリカ文化センターのCD-ROM利用による資料収集については、旅費を使って各研究機関に出張した。七年度には、専門誌や学内の紀要にそれぞれ論文を発表したが、八年度から九年度にかけては、学内の紀要論文が発表されたほかに、『英語青年』(研究社)、国際ジャーナルのBookbird (IBBY)及びChildren's Literature (Yale UP)にそれぞれ論文の掲載が決まっている。また、上記の論文発表のほか、六月にアメリカのOmahaで開催されるChildren's Literature Conferenceでの研究発表と、八月にイギリスのYorkで開催されるInternational Research Society of Children'sLiteratureでの研究発表が予定されている。七年度の課題であった思春期の若者像の人種的差異と同性愛者をふくむSexualityの問題は、今後も研究課題として継続して研究を続ける予定である。
Exosome 中の microRNA を標的とした消化器癌の新規診断・治療法の開発

近年、exosomeを介したmicroRNAの移動・運搬による細胞間および臓器間の機能制御といった新たなメカニズムが示唆されている。食道癌/非癌症例についてexosome中のmiR-21の発現を比較したところ、食道癌の群で発現が有意に高かった。また、進行度の高い症例でmiR-21の発現が高値であった。血清から抽出したexosome中のmiR-21の発現は食道癌において高く、この解析手法は食道癌の診断に応用できる可能性がある。これまで、我々は消化器癌に関連したmicroRNA発現を主に手術によって摘出された食道癌組織を用いて検証し、miR-21が食道癌の悪性化に関与することを明らかにした(CCR,2009)。ここ数年、血清や尿などの体液中からもmicroRNAの発現が報告されてきたが、その意義については不明である。我々の研究の目的は体液中のmicroRNAの意義を明らかにし、診断や治療などにmicroRNAが応用できるかどうかを検証することである。食道癌患者の化学療法の感受性のbiomarkerを検証するため、患者血清からmirVana(microRNA精製キット)にてmicroRNAを精製した。化学療法の感受性とmiR-21が負に相関していることが分かった。さらに、食道癌患者の手術前の血清中におけるmicroRNAを各種精製キットを利用し、血清全体やexosome(CD9,CD63発現にて確認済)のfractionにおけるmiR-21,miR-16の発現を主体に解析を行い、miR-21は主にexoxome中に存在していることが分かった。手術侵襲が少ない胆石やヘルニアの症例を対象として食道癌患者血清中におけるmiR-21発現を検証した所、食道癌においてmiR-21が有意に血清中に増加していた。miR-21は進行度(stage)などと相関傾向を示しているようなので、症例数を増やし検証していく。さらに、血清のexosome中のmicroRNAの網羅的発現解析のため、microarrayを行っている(sample調整中)。また、exosomeとmicroRNAのtumor microenvironmentにおける意義を明らかにするため、in-vitroにおいて食道癌細胞や間質系細胞(線維芽細胞など)からのexosomeを分離し添加実験を施行している。消化器癌の発育・進展の制御にmicroRNA発現がどのように関っているかを明らかにするため、手術によって摘出された消化器癌組織を用いて検証し、各種microRNAが消化器癌の悪性化に関与することをこれまでに明らかにした(CCR 2009, Br J Cancer 2012, Ann Surg Oncol 2012, Ann Surg Oncol in press)。ここ数年、血清や尿などの体液中からもmicroRNAの発現が報告されているため、我々の研究の目的は体液中のmicroRNAの意義を明らかにし、診断や治療などにmicroRNAが応用できるかどうかを検証することである。さらに、食道癌患者の手術前の血清中におけるmicroRNAを各種精製キットを利用し、血清全体やexosome(CD9,CD63発現にて確認済)のfractionにおけるmiR-21,miR-16の発現を主体に解析を行い、miR-21は主にexoxome中に存在していることが明らかになった。手術侵襲が少ない胆石やヘルニアの症例を対象群として50例の食道癌患者血清中におけるmiR-21発現を検証した所、食道癌においてmiR-21が有意に血清中に増加しており、T・M stageと相関を示していることが明らかとなった。さらに、血清のexosome中のmicroRNAの網羅的発現解析のため、microarrayを行った。また、exosomeとmicroRNAのtumor microenvironmentにおける意義を明らかにするため、in-vitroにおいて食道癌細胞や間質系細胞(線維芽細胞など)からのexosomeを分離し添加実験を現在進めている。食道癌患者におけるexsome中のmiRの発現意義の検討を行った。食道扁平上皮癌と診断された治療前の51例、および同時期の非癌症例(無症候性胆石症やヘルニアなどの良性疾患)41例を対象とし、2009年10月より収集した各血清からexosomeを抽出し、内包するmiRを抽出した。次に定量的RT-PCR(Taqman法)を用いて、食道癌における高発現が報告されているmiR-21の発現を解析した。食道癌/非癌症例についてmiR-21の発現を比較したところ、食道癌の群で発現が有意に高かった(P<0.001)。次に、exosomeの分泌や運搬に影響しうる炎症反応を除くため血液検査上CRP<0.3の症例のみを対象としたところ、食道癌症例30例/非癌症例30例においても食道癌の群で発現が有意に高いことが分かった(P<0.01)。

また、食道癌症例について年齢、性別、cT stage, cN stage, M stageをそれぞれ2群に分け検討を行ったところ、年齢、cT stage, M stageの高い群で有意にmiR-21高発現を認めた(いずれもp<0.05)。食道癌症例において、治療前の血清から抽出したexosomeが内包するmiR-21の発現が非癌症例と比べ高いことを示した。また、年齢、cT stage, M stageが高いほどmiR-21の発現が高いことを示した。Exosomeは、血液をはじめ臨床の現場で比較的容易に採取できる検体から分離することが可能である。Exosomeからより特異的で安定したmiRNAを抽出し、その発現を測定/解析することで食道癌をはじめとした消化器癌の診断に応用できる可能性があると考えられた。以上の結果を、癌研究分野の一流誌の1つである「Cancer」誌に報告した。現在、他のmiRに関する検討を継続しており興味深い結果が得られている。今年度は3年間の科研費の最終年度となるが、科研費申請時に予定していた内容に関し、ほぼdataがまとまったため、現在論文としてまとめ、CCRに投稿するところである。24年度が最終年度であるため、記入しない。血清のexosome中のmicroRNAの網羅的発現解析のため、microarrayを行い、正常組織と比較して、癌部でより高発現・低発現しているmicroRNAを明らかにする。また、exosomeとmicroRNAのtumor microenvironmentにおける意義を明らかにするため、in-vitroにおいて食道癌細胞や間質系細胞(線維芽細胞など)からのexosomeを分離し添加実験を現在進めており、増殖・浸潤への影響を明らかにする予定である。さらに、癌幹細胞マーカーの1つであるCD44発現細胞の発育進展に関与するmicroRNAを最近同定することができたため、現在癌幹細胞の制御に関わるmicroRNAの機能を詳細に検討している。
自然光照射下で有効に感応する二酸化チタン光殺菌システムの開発

近年,清潔な環境を維持するという観点から,高い酸化力を有する二酸化チタンを用いた光触媒反応システムが注目されているが,実使用環境を想定した場合,室内照明光照射下でいかに高い殺菌活性を発揮させるかが重要な課題となる.これまで,二酸化チタン光触媒の室内光照射下での低い殺菌効率を向上させるためには,銅成分添加によるフェントン様反応を組み合わせることが効果的であることを示してきた.光殺菌効率におよぼす環境因子について調べたところ,反応液中に含まれる無機塩が殺菌活性に大きな影響をおよぼすことが示されたため,ファージ不活性化における銅および無機塩の共同効果について検討した.白色蛍光灯照射下,10μMのCuCl_2およびNaCl 100mMをTiO_2薄膜上に添加し,ファージ不活性化実験を行った.TiO_2薄膜上にCuCl_2のみを添加した場合,添加しない場合と比べて活性が若干向上した.さらに,CuCl_2とNaClを同時に添加した場合,TiO_2薄膜の活性が著しく増加することが分かった.また,TiO_2薄膜の代わりにガラス面を用いた場合にはファージ不活性化効果は認められず,活性の向上はCuCl_2,NaCl, TiO_2および光の4要素が必要であることが示された.さらに,NaClのうちNa^+とCl^-のどちらかが活性向上に寄与しているかを検討するため,KClまたはNaNO_3と10μMのCuCl_2を添加してファージ不活性化実験を行った.KClを添加した場合,NaClを添加したときと同様の不活性化速度定数の向上が見られたが,NaNO_3を加えた場合,NaClやKClを添加したときにみられたような不活性化速度の増加は認められなかった.以上のことから,反応液中に塩化物イオンが存在することでCu^<2+>がCu^+に還元され,それによってフェントン様反応が促進された結果,高い不活性化効果が得られることが明らかになった.本年度は,酸化チタン薄膜を構成する酸化チタン粒子に銅成分を添加することによる光感応性の向上とその殺菌効果について検討した.まず酸化チタン薄膜上に塩化銅水溶液を置き,白色蛍光灯照射の下,水溶液中でCu^+に対して特異的に反応して発色するキレート剤であるバソキュプロインジスルホン酸塩(以下BC)を用いて,反応液中のCu^+濃度を測定したところ,暗条件下の酸化チタン薄膜上では,ほとんどCu(I)-BCは増加しなかったのに対し,白色蛍光灯照射下の酸化チタン薄膜上の反応液中のCu(I)-BCの濃度が増加した.このことから,白色蛍光灯のような近紫外光の微弱な光源によっても,酸化チタン薄膜表面でCu^<2+>がCu^+に還元されることが分かった.次に,ガラス板上では,大腸菌IM303株に対して直接作用しない濃度の塩化銅水溶液を投与し,酸化チタン薄膜上での殺菌活性を調べたところ,光殺菌活性の著しい向上が見られた.この結果をふまえ,溶液中ではなく,酸化チタン薄膜表面において固相のCu(I)とCu(II)を介した光殺菌機構を有する殺菌反応場の検討を行った.酸化チタン薄膜のコーティング液原料に銅塩を加えることにより,銅含有酸化チタン薄膜(以下Cu/Ti)を調製した.同様の光殺菌実験によって光殺菌活性を比較したところ,銅を含有しない酸化チタン薄膜に対して,Cu/Tiは光殺菌活性が著しく向上し,データより見かけの不活化速度定数k'の値を算出すると,約10倍の値となった.また,元素分析により6時間Cu/Ti上に静置した反応液中のCu^<2+>濃度を測定したところ,9μM程度のCu成分の溶出が認められたが,この濃度のCu^<2+>では,溶出した銅による直接的な不活化効果はないことが確認された.近年,清潔な環境を維持するという観点から,高い酸化力を有する二酸化チタンを用いた光触媒反応システムが注目されているが,実使用環境を想定した場合,室内照明光照射下でいかに高い殺菌活性を発揮させるかが重要な課題となる.これまで,二酸化チタン光触媒の室内光照射下での低い殺菌効率を向上させるためには,銅成分添加によるフェントン様反応を組み合わせることが効果的であることを示してきた.光殺菌効率におよぼす環境因子について調べたところ,反応液中に含まれる無機塩が殺菌活性に大きな影響をおよぼすことが示されたため,ファージ不活性化における銅および無機塩の共同効果について検討した.白色蛍光灯照射下,10μMのCuCl_2およびNaCl 100mMをTiO_2薄膜上に添加し,ファージ不活性化実験を行った.TiO_2薄膜上にCuCl_2のみを添加した場合,添加しない場合と比べて活性が若干向上した.さらに,CuCl_2とNaClを同時に添加した場合,TiO_2薄膜の活性が著しく増加することが分かった.また,TiO_2薄膜の代わりにガラス面を用いた場合にはファージ不活性化効果は認められず,活性の向上はCuCl_2,NaCl, TiO_2および光の4要素が必要であることが示された.

さらに,NaClのうちNa^+とCl^-のどちらかが活性向上に寄与しているかを検討するため,KClまたはNaNO_3と10μMのCuCl_2を添加してファージ不活性化実験を行った.KClを添加した場合,NaClを添加したときと同様の不活性化速度定数の向上が見られたが,NaNO_3を加えた場合,NaClやKClを添加したときにみられたような不活性化速度の増加は認められなかった.以上のことから,反応液中に塩化物イオンが存在することでCu^<2+>がCu^+に還元され,それによってフェントン様反応が促進された結果,高い不活性化効果が得られることが明らかになった.
博物館における哺乳類の３Ｄ資料の収集・保存の意義と活用：クジラを例に

現生哺乳類分野で3D技術を活用することで研究・教育に新たな効果をもたらす可能性があり、特にクジラはその効果が高く期待される。哺乳類は解体することで様々な標本を得るため、外部形態の情報は失われてしまう。さらに、クジラは超大型であるが故に、多くの標本を保管することができない上に、複数個体の同時観察も困難であった。本研究ではクジラを対象に、資料収集時点で消失してしまう外部形態などを3D化することで再現性のある立体情報を記録し、手に取っての観察や複数種の同時観察を可能にする縮小模型や教材として利用できる縮小模型の制作することで、哺乳類分野における3D技術の有用性について検証する。
２層渦あり流れ問題の数値解析的研究

水の波の分岐問題を数値解析的に研究する。非粘性・非圧縮流、重力・表面張力のみが働く、という条件のもとで考える。これは古典的な分岐問題であり、数学的にも、数値解析的にも多くの研究がなされている。何故なら、限られた条件下ですら様々な興味深い現象を示すことがわかっており、今なお多くの課題が残されている研究テーマだからである。この問題の難しさのひとつは自由境界問題であること、つまり境界形状が未知であることであり、それに対処する方法が様々研究されてきた。本研究では、2層の渦あり流れ(上層、下層の渦度は異なる定数)を考える。水底の近くでは摩擦により渦が発生する。また、自由境界付近では風により渦が発生する。つまり2層の渦あり流れを研究することで、より現実の水の波に近い現象を調べることができるはずである。しかし、数値計算は格段に難しくなる。2層渦あり流れ問題では関係するパラメータが多いため分岐解の様子や解構造の状況は非常に複雑である。したがって理論だけで解析することは極めて困難な問題であり、実際に解構造を具体的に示した例は理論的のみならず数値的にもまだ無い。そこで本研究で数値シミュレーションにより分岐の様子や分岐解の形状を明らかにすることは、今後の理論解析を進める上でも大変意義深いと考える。そして渦あり流れ問題を扱うとき、よどみ点発生の有無を調べることが重要なポイントとなる。したがってよどみ点に対応する計算アルゴリズムの考察が必須となる。また考察すべきパラメータが多いので、それぞれのパラメータの影響を調べるためには組織的かつ効率的な数値実験を行なわなくてはならない。上記目標にしたがって、表面張力波、重力・表面張力波、重力波、の3通りについて研究を遂行している。本研究の申請時には、計算アルゴリズムが正しく機能することを確認し、数値実験の見通しがたつ状況であった。しかしある条件下では分岐点近くの固有値・固有ベクトルを計算し、分岐の様子を詳細に調べる必要があるかもしれないという課題があった。しかし本年度研究遂行中、計算プログラム改良することによってその問題点は解決することができた。その修正版プログラムを使ってそれまでに行った数値計算をすべてやり直した。さらに表面張力が働く場合については、新たに必要なデータを揃えることができた。上層・下層の渦度や水の深さなどを様々に変えて、分岐構造・分岐解の様子がどのように変化するかを調べることができた。表面張力波、重力・表面張力波に関して、結果を整理し検討・分析を行った。その際に、1層流の表面張力波の数値計算結果を調べることで、2層流の場合のよどみ点の発生メカニズムの理解を深めることができた。このような1層流の渦あり流れに関する数値結果も他には示されていなかったものなので、それなりに意味ある結果であると考える。重力波の場合に同様の数値シミュレーションを行ったが、表面張力が関わる場合に比べて数値計算は遥かに困難であることがわかった。理由の一つとして、本研究で用いた計算アルゴリズムでは分割数不足ではないかと考えており、新たな計算アルゴリズムを構築する必要があるかもしれない。したがって今年度は、重力波の場合の詳細を調べることが主たる課題である。表面張力波が関わる場合については、ある程度のメカニズムを理解することができたと考える。しかし、解が存在する条件(パラメータの範囲)、よどみ点が現れる条件、規則性等について、さらに調べたいと考えている。これまでの数値実験、結果の整理・検討を行い、そこから次なる課題・目標を見つけていきたい。

しかしある条件下では分岐点近くの固有値・固有ベクトルを計算し、分岐の様子を詳細に調べる必要があるかもしれないという課題があった。しかし本年度研究遂行中、計算プログラム改良することによってその問題点は解決することができた。その修正版プログラムを使ってそれまでに行った数値計算をすべてやり直した。さらに表面張力が働く場合については、新たに必要なデータを揃えることができた。上層・下層の渦度や水の深さなどを様々に変えて、分岐構造・分岐解の様子がどのように変化するかを調べることができた。表面張力波、重力・表面張力波に関して、結果を整理し検討・分析を行った。その際に、1層流の表面張力波の数値計算結果を調べることで、2層流の場合のよどみ点の発生メカニズムの理解を深めることができた。このような1層流の渦あり流れに関する数値結果も他には示されていなかったものなので、それなりに意味ある結果であると考える。重力波の場合に同様の数値シミュレーションを行ったが、表面張力が関わる場合に比べて数値計算は遥かに困難であることがわかった。理由の一つとして、本研究で用いた計算アルゴリズムでは分割数不足ではないかと考えており、新たな計算アルゴリズムを構築する必要があるかもしれない。したがって今年度は、重力波の場合の詳細を調べることが主たる課題である。表面張力波が関わる場合については、ある程度のメカニズムを理解することができたと考える。しかし、解が存在する条件(パラメータの範囲)、よどみ点が現れる条件、規則性等について、さらに調べたいと考えている。これまでの数値実験、結果の整理・検討を行い、そこから次なる課題・目標を見つけていきたい。
ASK3を手がかりとした浸透圧受容、応答メカニズムの解析

本研究ではASK3という浸透圧ストレスに応答する分子に焦点を当て、生体がどのようにして外界の浸透圧ストレスを受容し応答するかについて解析を行った。ASK3の応答を指標にしたASK3制御因子の探索から、浸透圧受容に関わる新たなタンパク質を複数同定下と共に、ASK3の働きを解析することで、このタンパク質が個体レベルの血圧制御に関与することを明らかにした。本年度は、“ASK3活性を指標とした浸透圧ストレス受容分子群のゲノムワイドスクリーニング"に関し、3次スクリーニングによる候補遺伝子の絞り込み、および候補遺伝子の解析を行った。昨年度までの2次スクリーニングで既に高浸透圧におけるASK3制御遺伝子候補は約60遺伝子程度まで絞り込めていたが、イムノブロッットを利用した3次スクリーニングにより、このうち約10種程度の遺伝子が、ASK3の脱リン酸化を制御する分子として確実性が高いと判断できた。実際、そのうちの一つの分子に関しては、生化学的な解析からASK3との結合や、制御メカニズムの解析が進み、今回のゲノムワイドスクリーニングが、確かにASK3制御分子の同定に至ったことを実証できたと考えている。最も興味のある浸透圧センサーの同定までには至っていないが、今後、本研究のスクリーニングで得られた分子の解析を進めることで、同定できる可能性も十分あると考えている。“ASK3下流分子の解析"でも、昨年度見出したASK3とWNK1-SPAK/OSR1経路の関係性を更に解析し、浸透圧応答性キナーゼであるASK3が、WNK1-SPAK/OSR1経路を介して全身血圧の制御に関わるという論旨で論文をまとめた(Nat. Commn., 2012, Naguro et al.)。さらに、昨年度立ち上げた細胞体積をモニターする実験系を利用し、浸透圧ストレス時の細胞体積変化においてもASK3が関与する可能性があることを明らかにした。以上のように、研究期間全体を通じてASK3の担う浸透圧シグナル伝達において、上流(ストレス受容)と下流(ストレス応答)の様々な面が明らかになった。特に、ASK3が血圧制御に関わるという知見は、高血圧の病態の理解と治療に新しいアプローチを与えるものとして大きな意義があると考えられる。本年度は本研究の主要なテーマの一つである"ASK3活性を指標とした浸透圧ストレス受容分子群のゲノムワイドスクリーニング"のうち高浸透圧ストレスに対するASK3不活性化を指標としたスクリーニングを行なった。当初予定していたスクリーニング系が十分に働き、予定通りゲノムワイドのターゲット(18,000遺伝子)について探索を行ない、ASK3の不活性化に関与する候補分子が得られた。このスクリーニング系と方法論については『サーモサイエンティフィックライフサイエンスセミナー』および『第二回スクリーニング学研究会』の招待講演で発表した。これまで細胞レベルで明らかにしていたASK3とWNK1-SPAK/OSR1経路との関連を個体レベルで調べるため、腎臓の組織免疫染色を行ない、ASK3ノックアウトマウスの腎尿細管においてSPAK/OSR1のリン酸化レベルが高くなっていることを見出した。この結果は細胞レベルで示されたASK3によるWNK1の制御が実際のマウスの腎臓においても働いていることを示唆するものであり、ASK3が腎臓に起因する高血圧症の発症に関与する可能性を示している。また、高食塩負荷食を与えることにより、ASK3ノックアウトマウスの血圧がWTに比べ有為に上昇することも見出しており、このことはASK3が個体のイオンバランスや血圧の恒常性を保つために重要な働きをしていることを示唆していると考えられる。これらの結果を含めて本研究の内容を『第3回シグナルネットワーク研究会』で発表したところ、研究者部門・奨励賞を受賞した。"ASK3活性を指標とした浸透圧ストレス受容分子群のゲノムワイドスクリーニング"については、高浸透圧ストレス応答に対して、当初の予定通りゲノムワイド(18,000遺伝子)の1次スクリーニングを完遂した。さらに、次年度に予定していた1次スクリーニングで得られた候補遺伝子の2次スクリーニングによる絞り込みまで行なうことができ、非常に順調に研究が進んでいる。ゲノムワイドスクリーニングの行程が一通り完遂できたことから、今後予定している低浸透圧ストレス応答に対するスクリーニングもスムーズに行えると考えられる。"ASK3下流分子の解析"についても、細胞レベルで示していたASK3とWNK1-SPAK/OSR1経路との関連が個体レベル(マウス)でも働いていることが示唆される結果が得られ、ASK3-WNK1-SPAK/OSR1経路の血圧制御における重要性が伺える。今後、ASK3を介するWNK1のリン酸化部位の同定などを行い、この経路の実体を分子生物学的観点から検討する。また、ASK3の下流分子と考えられるWNK1とp38は浸透圧ストレス時の細胞体積調節に関わるという報告もあるため、本年度では細胞体積変化をモニターする実験系を立ち上げた。今後、この系を用いてASK3の細胞体積調節への関与について検討する。"ASK3ノックアウトマウスの解析"については、高食塩食で血圧上昇が亢進していることを見出した。想定されたように腎臓での水やイオンのバランス制御に不具合があることが示唆された。計画通り