hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性前立腺癌の進展に着目したAKT-MTORシグナル経路制御による新規治療戦略

本研究では、ドセタキセル抵抗性ヒト前立腺癌細胞株C4-2AT6を用いてAKT-mTORシグナル阻害剤の有効性について検討した。AKT-mTORシグナル阻害剤とドセタキセルの併用はC4-2AT6に対して高い殺細胞効果を示した。また、C4-2AT6を用いて作成したマウス皮下腫瘍モデルにおいてもドセタキセルとの併用によって高い抗腫瘍効果を示した。これらの結果は、AKT-mTOR阻害剤がドセタキセル抵抗性前立腺癌におけるドセタキセル抵抗性改善に寄与する可能性を示唆した。BALB-Cヌードマウスを用いてC4-2AT6皮下腫瘍モデルを作成し、1コントロール群、2DTX(4mg/kg)投与群、3NVP-BEZ235(40mg/kg)投与群、4DTX(4mg/kg)+NVP-BEZ235(40mg/kg)投与群の4群に分けて、NVP-BEZ235とDTX抗腫瘍効果を検討した(n=6)。コントロール群ではday0と比較してday15では腫瘍径が298%まで増大していた。BEZ235とDTX単独群ではそれぞれ103%、140%の増大であった。一方で、BEZ235とDTXの併用群では腫瘍径比は43.0%であり、有意な縮小を認めた(P<0.01)。摘出した皮下腫瘍に対してTUNEL法による免疫染色を行い、アポトーシスの誘導を評価した。NVP-BEZ235・DTX併用群では他群と比較して有意にアポトーシスの誘導の亢進を認めた。以上より、In vivoにおいてもDTXとNVP-BEZ235の併用はDTX抵抗性前立腺癌細胞株C4-2AT6に対して高い抗腫瘍効果を示した。ヒトCRPC株であるC4-2及びC4-2AT6に対してPI3K/Aktシグナル伝達阻害剤とドセタキセルの併用の効果をIn vivo及びIn vitroにおいて検討した。PI3K/Aktシグナル伝達阻害剤として、PI3K・mTORC1/2阻害剤であるBEZ235を使用した。まずはIn vivoにおいて、C4-2AT6に対するドセタキセル単独療法とドセタキセルとBEZ235の併用療法の抗腫瘍効果をWST assayを用いて評価した。ドセタキセルとBEZ235の併用は、ドセタキセル単独あるいはBEZ235単独群と比較し、有意に高い殺細胞効果を認めた。Combinationindexは0.31で、ドセタキセルとBEZ235の相乗効果が示唆された。続いて、In vivoにおいて検討を行った。C4-2AT6の皮下腫瘍モデルマウスを4群に分け、1.コントロール群、2.BEZ235単独群(40MG/KG/day)、3.ドセタキセル単独群(4MG/KG)、4.BEZ235及びドセタキセル併用群とし比較検討した。BEZ235とドセタキセル単独群ではそれぞれ103%、140%の増大であった。一方で、BEZ235とドセタキセルの併用群では腫瘍径比は43.0%であり、有意な縮小を認めた(P<0.01)。BEZ235とドセタキセルの併用はC4-2AT6に対して著明な抗腫瘍効果を示した。初年度はIn vitroの検討のみを予定していたが、一部In vivoの検討も行うことができた。当初の仮説通り、去勢抵抗性前立腺細胞株においてpAKTの活性化が認められており、In vitro、In vivoの両方においてPI3K-Akt阻害剤とドセタキセルの併用療法の有用性を示す知見を得られた。(1)去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)細胞株に対するmTOR阻害剤の効果を検討し、PI3K-AKT阻害剤との比較検討を行う。(2)各種CRPC細胞株を使用しPI3K-Aktの上流を評価することで、CRPC細胞株におけるPI3K-Aktシグナルの活性化の機序を解明する。(3)PI3K-Aktシグナル伝達経路を阻害した後に生じる新規シグナル伝達機構について検討する。動物実験が主体となるためほとんどが消耗品費となる。具体的にはヌードマウスBalb-cとその飼育費、各種試薬および抗体の購入費、免疫染色試薬購入費である。
神秘主義をめぐるプラトニズムの宗教思想史とその方法論

本研究は、新プラトン主義の宗教思想について、特に紀元5世紀のプロクロスを取り上げ、後世との比較を念頭に置きながら神秘主義を主な論点に研究を行った。その結果、プラトンにおける「神に似ること」というテーマが、「魂の乗り物」といった展開を見せつつ具体化されていることが明らかとなった。併せて、この研究に必要な方法論として、情報学の成果も導入し、宗教研究の新たな方法論の模索を行った。本年度は、本研究の第一年度として、西洋神秘主義に大きな影響を与えた新プラトン主義者であるプロクロスの著作『ティマイオス註解』を主に研究を進めることにした。しかし、同書は註解としての性格もあって余り体系的とは言えないにもかかわらず大部であるため、プロクロスにおける哲学的な骨格を押さえた上で箇所を絞り込む必要性が高いことが分かり、体系的に書かれた『神学綱要』の検討を先に行うことになった。これを踏まえ、宇宙と人間に交差した知的要素のうち「気息」(プネウマ)および「乗り物」(オケーマ)をめぐる問題圏を取り上げ、これについて「神に似ること」というプラトン以来のテーマを念頭に置きながら究明を進めた。また、申請者がこれまでに論じてきたプラトン『ティマイオス』に対する現代の宗教思想における反映についても、「創造」および「想像」という論点を設定し、改めて考察を加えた。こうした研究成果は、後者については8月にカナダのトロント大学にて開催された第20回国際宗教学宗教史会議にてパネル発表を行い、海外の研究者と意見交換を行った。前者については9月に東京の東洋大学にて開催された日本宗教学会第69回学術大会にて発表を行ったほか、年度内に図書(論文集)に論文を発表することになっていたが、震災の影響もあり目下の予定が繰り下げられている。また、本年度には、事典の執筆依頼を受け原稿を提出しているが、順調に進めば次年度に刊行される予定である。本研究では、西洋神秘主義に大きな影響を与えた新プラトン主義者であるプロクロスの著作『ティマイオス註解』に取り組んできたところであり、平成23年度はオケーマ(乗り物)という重要概念を中心として考察を進めるとともに、この問題の検討に相当な時間を要することもわかってきている。これにより、プロクロスはじめ古代末期の新プラトン主義者たちにとってのオケーマは、いわば心的作用の受容器官とされるように例えば認識論として哲学的側面において大きな意味を持つのみならず、「神に似ること」に焦点を結ぶ宗教思想的側面においても神的諸力の経由するところという極めて重い位置にあることが明らかになった。こうした研究の成果は、日本宗教学会第70回学術大会における「プロクロスにおけるオケーマをめぐって」と、筑波大学哲学・思想学会第32回学術大会における「宗教思想としての新プラトン主義をめぐる一考察」に分けて発表した。また、これらの内容は鶴岡賀雄・深澤英隆(編)『スピリチュアリティの宗教史(下巻)』に収載された論文「西洋古代の宗教思想と「スピリチュアリティ」の問題」にて活字化された。また、古典文献を基にした宗教思想研究へ情報学の成果を活用しうる方法論については、関連する国際シンポジウムおよびワークショップへの参加や、海外の大学から発表された研究に活用されうる新たなソフトウェアの検討などを進めた。これらの研究成果は、『筑波大学宗教学・比較思想学論集』第12号に「テクストのマークアップによる思想研究の試み-CATMAによるプロクロス『神学綱要』の分析-」というテーマで掲載され発表された。本年度は、本研究の最終年度としていっそうの研究推進を図り、特に人文情報学に関連しては世界的にも新しい手法の導入と成果発表を行うことができた。前者については、日本宗教学会第71回学術大会(於皇學館大学)にて「プロクロスにおける「神に似ること」の問題」として口頭発表を行い、『宗教研究』第86巻第4輯に掲載された。これは、従来明らかではなかった宗教思想としてのプロクロスの位置づけについて、プラトン以来の「神に似ること」に照らして検討し、偽ディオニュシオス・アレオパギテスら後世の神秘主義思想へつながる基盤を明らかにしたものである。後者については、「思想研究へのマークアップと視覚化の応用ープロクロス『ティマイオス註解』の分析と視覚化」として『宗教学・比較思想学論集』第13号、2013年3月に掲載・刊行された。これは、XMLを用いたマークアップをCATAMAというツールを用いて行った前年度発表の論文の内容を発展させ、d3.jsというソフトウェアライブラリにより思想の「可視化」を試みたものであり、思想研究においては世界初と思われる研究である。また、西洋古代の宗教思想に関するこれまでの研究に評価を頂いたことから、松村一男・平藤喜久子・山田仁史(編)『神の文化史事典』(白水社、2013年1月刊)では33項目の執筆依頼を受け、古代ギリシアを中心とする項目の担当を行った。この事典は一般読者にも好評を博し、刊行早々に重版となっている。

なお、本研究のうち、人文情報学を中心とする領域については、平成25年度より開始される若手研究(B)「西洋古代を中心とした宗教思想研究への人文情報学の応用」にて、引き続き研究を推進することとなる。成果発表が論文2本、学会発表2本となったとともに、宗教思想研究への新しい方法論の導入について、新しい成果を発表することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで取り組んできた西洋神秘主義に大きな影響を与えた新プラトン主義者であるプロクロスの著作『ティマイオス註解』であるが、同書は大部の著作であり、検討に時間を要しているため、引き続いて『ティマイオス註解』の宗教思想の解明にあたる。併せて、従来から取り組んでいる古典文献を基にした宗教思想研究への情報学の成果の活用についても、宗教思想の比較研究に対して新たな方法論を提示すべく、引き続いて研究を実施する。また、偽ディオニュシオス・アレオパギテス『天上位階論』については、神秘主義的な「神化」と「合一」について、上記の成果を取り込みつつ研究を行う。
球根類花卉の開花時期調節と種苗生産の技術を学習するための教材開発

球根花きであるオーニソガラム・シルソイデスの開花時期調節の技術を開発し、その成果を授業に導入するとともに、栽培中の成長の様子を観察するための遠隔観察システムを授業に導入することで、効果的な花き栽培に関する授業方法の構築を目指した。開花時期調節の技術開発に関しては、まず球根を冷蔵(2°C)貯蔵した後に植え付けることによって、開花時期を遅らせること(抑制栽培)が可能かどうか検討した。その結果、冷蔵した球根を植えると、開花時期は遅くなるが成長は抑制されること、および、冷蔵期間が長期間にわたると、開花率も低下することから、冷蔵によって球根内で何らかの変化が起きていると考えられた。そこで、冷蔵貯蔵中の球根内での炭水化物量の変化を調べたが、明瞭な結果は得られなかった。次に、開花時期を早める(促成栽培)可能性を検討した。その結果、休眠打破処理した球根を植え付けた場合、出芽時期は早まるが、開花時期は早まらなかった。一方、休眠打破処理後に低温処理(2025°Cに1か月間→10°Cに1か月間)した球根を植え付けると、開花時期が早まった。このことから、休眠打破された球根を低温下に置くことで花芽の分化と成長が促進され、促成栽培が可能になると考えられた。栽培植物の成長を観察するための遠隔観察システムに関しては、「植物をスマートフォンで撮影→画像をクラウドサーバーへアップロード→遠隔地にいる受講者同士あるいは受講者と指導者との間での情報共有」というシステムを試行した。すなわち、高大連携授業においてオーニソガラム・シルソイデスの組織培養を実施し、受講者には培養物を自宅に持ち帰ってもらい、スマートフォンに撮影した培養体の画像をアップロードしてもらった。同時に、大学の研究室での培養体の画像もアップロードした。その結果、各受講者と指導者おのおのの培養過程と培養結果を共有できた。抑制栽培技術については、開花時期をある程度遅らせることは可能であった。しかしその一方で、開花時期を遅らせるための球根の冷蔵貯蔵によって、成長抑制や開花率低下といった問題を招いていると考えられ、その原因究明も不十分であったことから、次年度も再検討を要する。したがって、やや遅れていると判断した。促成栽培技術については、開花時期を早めることが可能であり、促成栽培の可能性が示されたことから、おおむね順調である。遠隔観察システムについては、高大連携授業に試行的導入した。このことは、当初予定にはなかったことであるが、この試行によって、本システムを実際の授業へ導入することが可能であることが示されたので、おおむね順調であると判断した。以上から、全体的な進捗状況としては、おおむね順調に進展していると判断した。抑制栽培技術については、上記(現在までの進捗状況)にも記した通り、球根の冷蔵貯蔵が成長抑制や開花率低下を引き起こしている原因の究明と対策が必要となる。具体的には、冷蔵貯蔵の条件(温度や期間)を変えた際の、球根内での炭水化物等各成分の消長を検討し、その結果と植え付け後の成長との関係を調べる。促成栽培技術については、開花時期は早まったものの、切り花としての品質(草丈、茎の太さ、花穂の見栄え等)は不十分であったことから、品質改善をはかる。具体的には、球根植え付け前の低温処理が、花芽の分化と成長を誘導していると考えられることから、低温処理の条件(温度や期間)と開花状態との関係を調べる。遠隔観察システムについては、進捗状況に記した通り、本システムを授業へ導入することの可能性が示されたので、模擬的に授業への導入を行う。具体的には、促成栽培や抑制栽培の実験に本システムを導入して、学生が遠隔地(例えば就職活動先など)で実験の進行の様子を確認することが可能かどうか検討する。

すなわち、高大連携授業においてオーニソガラム・シルソイデスの組織培養を実施し、受講者には培養物を自宅に持ち帰ってもらい、スマートフォンに撮影した培養体の画像をアップロードしてもらった。同時に、大学の研究室での培養体の画像もアップロードした。その結果、各受講者と指導者おのおのの培養過程と培養結果を共有できた。抑制栽培技術については、開花時期をある程度遅らせることは可能であった。しかしその一方で、開花時期を遅らせるための球根の冷蔵貯蔵によって、成長抑制や開花率低下といった問題を招いていると考えられ、その原因究明も不十分であったことから、次年度も再検討を要する。したがって、やや遅れていると判断した。促成栽培技術については、開花時期を早めることが可能であり、促成栽培の可能性が示されたことから、おおむね順調である。遠隔観察システムについては、高大連携授業に試行的導入した。このことは、当初予定にはなかったことであるが、この試行によって、本システムを実際の授業へ導入することが可能であることが示されたので、おおむね順調であると判断した。以上から、全体的な進捗状況としては、おおむね順調に進展していると判断した。抑制栽培技術については、上記(現在までの進捗状況)にも記した通り、球根の冷蔵貯蔵が成長抑制や開花率低下を引き起こしている原因の究明と対策が必要となる。具体的には、冷蔵貯蔵の条件(温度や期間)を変えた際の、球根内での炭水化物等各成分の消長を検討し、その結果と植え付け後の成長との関係を調べる。促成栽培技術については、開花時期は早まったものの、切り花としての品質(草丈、茎の太さ、花穂の見栄え等)は不十分であったことから、品質改善をはかる。具体的には、球根植え付け前の低温処理が、花芽の分化と成長を誘導していると考えられることから、低温処理の条件(温度や期間)と開花状態との関係を調べる。遠隔観察システムについては、進捗状況に記した通り、本システムを授業へ導入することの可能性が示されたので、模擬的に授業への導入を行う。具体的には、促成栽培や抑制栽培の実験に本システムを導入して、学生が遠隔地(例えば就職活動先など)で実験の進行の様子を確認することが可能かどうか検討する。この金額は、主に抑制栽培技術に関して使用する予定であった。抑制栽培技術については、進捗状況にも記した通り、今年度の進捗に不十分な面があったため、次年度に再検討する必要が生じた。この金額は、来年度の再検討の際に使用する予定である。
心筋細胞の核型と増殖の運命決定機構と中心体制御

哺乳類心筋細胞は胎生期に活発に増殖し、心臓の形態形成に寄与するが、生後、その増殖を停止し、二度と増殖しない。また、多くの哺乳類では、この不可逆的な増殖停止の直前に、多数の単核の心筋細胞が二核細胞(細胞質分裂が起こらない)になり増殖停止し、残りの細胞も単核のまま増殖停止する。本研究は、心筋細胞が最終的に単核細胞、二核細胞になる運命および生後14日付近で増殖停止を起こす運命が、いつ、どのような仕組みで決定されるか、また、その仕組みと中心体制御との関連の解明を目的とする。本年度は、昨年発見した生後マウスの心筋細胞では中心体シグナル(γ-チューブリンシグナル)が増加することに注目し、研究を進め、以下を明らかにした。(1)増加した中心体シグナルは微小管形成中心として機能している可能性が高い。(2)中心体シグナルの増加とともに心筋細胞内の微小管構造が核周辺から筋繊維に添っての配向へと大きく変化する。(3) centrin-GFPトランスジェニックマウスを用いた解析により(1)での中心小体の個数は正常で、γ-チューブリンシグナルが中心小体と独立に増加することが判明した。(4) p21/p27ノックアウトマウス、または野生型で認められる二核細胞の分裂細胞の中には紡錘体が多極化しているもの、また、三核細胞や四核細胞の中に異常核(核のサイズなど)が見つかった。以上の結果から、中心体シグナルは生後、心筋細胞の微小管再構成のために増加すること、その結果、もし、二核細胞が新たな核分裂に入っても正常な核分裂が阻害される可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、まず、マウス心筋細胞の生後の増殖停止期の中心体の挙動を解析した。その結果、以下が観察された。1.二核化細胞になる直前の核分裂期において紡錘体極を形成していた中心体の一部は分裂期終期になるとmidzoneに移動した。このような挙動はいくつかの細胞種で観察されており、細胞質分裂に関わるとされている。従って、このことやAurora Bの発現パターンと併せ、二核化を起こす心筋細胞でも細胞質分裂の過程の一部は進行していることが示唆された。2.分裂期を終了した細胞では中心体構成蛋白質の一つであるγ-チューブリンの局在が通常の中心体様のパターン(1-4個の強い点状)とは異なり、より多くのシグナル(平均9個)が細胞質内に散在することが明らかとなった。さらにそのシグナル強度は発生とともに低下、最終的には検出限界以下となった。3.一方、サイクリンD1発現誘導により核分裂後にも細胞周期に進行できるマウスで解析したところ、シグナル強度は低下しなかったが、依然、散在していた。この状態ではたとえ分裂期に進行しても正常な核分裂ができない可能性を示している。以上の結果から、中心体が生後、心筋細胞の増殖停止機構の一つとして機能する可能性が示唆された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の大きな目的である増殖停止状態への運命決定と中心体との関連について、重要な成果を得ることができた。すなわち、核分裂以降に中心体の挙動が通常の分裂細胞と異なり、細胞質に分散し、さらにその構成分子のシグナル強度が低下した。また、サイクリンD1発現誘導により核分裂後にも細胞周期に進行できるマウスでの解析により、たとえ細胞周期に再進入しても通常の中心体の局在パターンに戻ることができないことも明らかとなった。これらのことから、発生の進行に従い、中心体の動態が大きく変化をし、心筋細胞の増殖停止状態とリンクすることが明らかとなった。おそらくは、この中心体の状態は心筋細胞の不可逆的な増殖停止機構の一端として働くことが示唆される。以上の成果より、上記の区分と判断した。上記の今年度の成果を受け、次年度は中心体の挙動と心筋細胞の増殖停止との関連をより詳細に検討したい。このために、微小管形成中心として働く中心体が核分裂後に分散してしまう影響を正常マウスやサイクリンD1発現誘導マウスで解析する。また、心臓傷害時に成体でも心筋細胞が増殖できるイモリの中心体の動態を傷害前後で検討する。これらの解析を通じて、中心体の動態と増殖停止機構、さらには心臓再生能との関連を明らかにする。
日本語を第一言語とする英語学習者の数素性表象の発達過程

本研究の目的は,以下の2つの研究課題を心理言語学実験によって明らかにすることであった。(a)第一言語では義務的に形態的数素性を標示しない日本語を第一言語とするEFL学習者にとって,英語の形態的数素性と概念的数素性を結びつけることは可能か。(b)第一言語では義務的に形態的数素性を標示しない日本語を第一言語とするEFL学習者にとって,英語の形態的数素性と文法的数素性を結びつけることは可能か。本研究では,数素性を形態的,文法的,概念的という3つのレイヤーに分類し,形態的なマーカーの有無が文法的・概念的数素性とマッピングされているかを明らかにする2種類の実験を行った。1つ目の実験は,画面上に提示される絵と英文が一致しているかを判断する課題であった。この課題では,英文中の名詞が単数形か複数形かという要因と,絵中のモノの数が単数か複数かという要因を操作した。名詞の数とモノの数の不一致が反応時間の遅れを生むかを分析した。2つ目の課題では,画面上に提示される1語または2語の英語の語数を判断させる課題であった。この課題では,1語であっても複数形の名詞(e.g., cats)や,2語であっても単数形の名詞(e.g., a cat)など,語数と数素性の不一致が反応時間の遅れを生むかを分析した。実験参加者は日本語を第一言語とする英語学習者96名と,英語母語話者32名が参加した。主な結果は次のようにまとめられる。文法的複数性については日本語を第一言語とするEFL学習者にとっても形態的複数性とのマッピングがなされていることが明らかになった。また,概念的複数性と文法的単数性については有標性によって習得が困難である可能性を指摘した。さらに,今後の研究においては有生性という観点も取り入れた研究が行われることによって,数素性のマッピングについてさらなる知見が得られる可能性を示唆した29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,日本語を第一言語とする英語学習者が,即時的な言語処理中にどのように数素性を表象し処理しているのかを明らかにすることである。これまでの第二言語習得研究では,主に数素性の処理は数の一致(number agreement)と呼ばれる文法的な操作について検討することが多かった。本研究では,英語の名詞がもつ数素性を英語学習者がどのように表象し,処理しているのかを明らかにするため,英語の名詞の単数形や複数形と,(a)文法的な単数性・複数性,(b)概念的な単数性・複数性,の2つの階層でのマッピング関係を明らかにすることで,英語を処理する際の学習者の心的プロセスを明らかにし,その知見を第二言語習得研究に還元することを目指す。本研究では,文法的な処理のレベルと概念的な処理のレベルという2つの階層を仮定し,それぞれのレベルにおける数素性表象を心理言語学実験を用いて検証する。研究課題の遂行にあたって,初年度は本実験の前段階として,次の2点の検討を行った。(1)複数形形態素の処理と頻度情報の影響(2)文処理中における等位接続句処理(1)については,名詞の複数形の頻度が,単数形の頻度よりも高い複数形優位名詞と,単数形の頻度が複数形の頻度よりも高い単数形優位名詞について,語彙性判断課題の反応時間の比較を行った。結果として,複数形の頻度の違いは語彙処理には大きな影響を与えておらず,複数形の名詞は語幹と屈折形態素に分けて処理されている可能性が示唆された。(2)については,等位接続句は文法的には複数として認識されていない可能性が高いが,より抽象的な概念レベルでは複数として認識されており,文処理に影響を与えている可能性が示唆された。これにより,本研究が仮定する文法的複数性と概念的複数性は文レベルの処理において区別することが可能であることが明らかとなった。今年度の研究は,本実験につながる予備的研究の位置づけであり,そこである一定の成果が得られたことは,本実験へとつながると考えられる。計画当初は,今年度中に本実験のデータ収集に着手する予定ではあったが,結果的に本実験を開始することができなかったという点で,上記の中から「やや遅れている」という評価を選択した。しかしながら,予備的な研究を着実に積み重ねながら,より精緻化された実験の計画と準備を着々と進めているため,最終的により質の高い研究成果を得るために必要なプロセスであったといえる。

この課題では,英文中の名詞が単数形か複数形かという要因と,絵中のモノの数が単数か複数かという要因を操作した。名詞の数とモノの数の不一致が反応時間の遅れを生むかを分析した。2つ目の課題では,画面上に提示される1語または2語の英語の語数を判断させる課題であった。この課題では,1語であっても複数形の名詞(e.g., cats)や,2語であっても単数形の名詞(e.g., a cat)など,語数と数素性の不一致が反応時間の遅れを生むかを分析した。実験参加者は日本語を第一言語とする英語学習者96名と,英語母語話者32名が参加した。主な結果は次のようにまとめられる。文法的複数性については日本語を第一言語とするEFL学習者にとっても形態的複数性とのマッピングがなされていることが明らかになった。また,概念的複数性と文法的単数性については有標性によって習得が困難である可能性を指摘した。さらに,今後の研究においては有生性という観点も取り入れた研究が行われることによって,数素性のマッピングについてさらなる知見が得られる可能性を示唆した予備的な実験の実施に当初の予想以上に時間がかかり,全体の計画がやや遅れているため,計画2年目の早い段階で実験を完了させ,年度内に成果を得られるようにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ラットの持続硬膜外・くも膜下投与モデルを用いた神経毒性の比較研究

脊髄レベルにおける鎮痛物質の神経毒性をくも膜下投与と硬膜外投与で比較検討することにより、脊髄鎮痛を得るためのより安全な薬物投与法を確立することを目的に研究を行った。我々はラットの硬膜外投与法を確立し、くも膜下投与法と同様に腰椎下部より投与を行い脊髄同レベルでの神経障害の程度を比較した。リドカイン2.5%、10%溶液および生理食塩水をくも膜下に20μl、硬膜外には100μl投与した。投与後4時間、その後4日間行動学的変化を調べるため、tail flick(TF)テスト、paw pressure(PP)テストおよびmotor function(MF)テストを行った。投与後4日目にラットをネンブタールで深麻酔し灌流固定後、脊髄を取り出した。エポキシ樹脂で包埋後、1μmの切片を作成し、トルイジンブルーで染色後、光学顕微鏡により観察した。くも膜下投与群、硬膜外投与群とも、2.5%リドカイン投与ではコントロール群と比較して鎮痛効果消失後の行動学的、および組織学的変化は認められなかった。10%リドカイン投与では、硬膜外投与群では全例にて行動学的異常は認められなかった。くも膜下投与群では6割のラットにおいて尾の熱刺激からの逃避反応時間は延長し、その後4日間にわたり知覚鈍麻を示した。組織学的には、くも膜下投与群では障害は馬尾から神経根、脊髄白質および灰白質に認められた。硬膜外投与群でも、神経組織の障害は認められたが馬尾への障害の程度はくも膜下に比較して低く、脊髄においても白質、神経根で認められたが灰白質への障害はなく、その程度はくも膜下投与より軽度であった。以上の実験結果により濃度依存的に局所麻酔薬には神経毒性があり、投与経路にかかわらず神経組織に障害を起こさせるが、硬膜外投与がくも膜下投与より神経毒性の発現が低いことが明らかになった。自由行動下での持続くも膜下腔および硬膜外腔注入モデルの確立と局所麻酔薬の持続くも膜下腔注入による神経障害の組織学的検討を目的に以下の実験を行った。Spurague-Dawlyラットを対象として、ペントバルビタール麻酔下に後頭環椎間膜からくも膜下腔カテーテルまたは硬膜外カテーテルの留置を行った。24時間の回復期間の後、自由に動き回れる大きさのアクリルケースにラットを入れ、くも膜下腔カテーテルまたは硬膜外カテーテルにシーベルを接続した。くも膜下腔カテーテルまたは硬膜外カテーテルの有効性を検討するため、微量持続注入器を用いて局所麻酔薬(リドカイン)の注入を24時間行った。くも膜下腔カテーテルモデルに比較し硬膜外カテーテルでは有効性が低かった。くも膜下腔カテーテルモデルにおいては、0.5%のリドカインを持続投与し神経障害を検討した。注入終了後、ラットをホルマリンで灌流固定し、脊髄を取り出し、脊髄円錐部から尾側の病理標本を作製した。トルイジンブルーで染色した標本を光学顕微鏡で観察し、神経軸索の脱髄変性の程度で神経組織の障害を評価した。生理食塩水を注入した群では神経軸索の変性や脱髄は認められなかったが、0.5%リドカインを持続注入した群では約5%の神経軸索に変性や脱髄が認められた。今回の初期実験により、自由行動下での持続くも膜下腔モデルを確立することができたが、カテーテル挿入部位を含めより有効性の高硬膜外腔注入モデルを検討する必要がある。

今後これらのモデルを用いて、リドカイン濃度の神経障害への影響ならびに他の局所麻酔薬の神経障害についての検討も行っていく。脊髄レベルにおける鎮痛物賛の神経毒性をくも膜下投与と硬膜外投与で比較検討することにより、脊髄鎮痛を得るためのより安全な薬物投与法を確立することを目的に研究を行った。今年度はラットの硬膜外投与法を確立し、くも膜下投与法と同様に腰椎下部より投与を行い脊髄同レベルでの神経障害の程度を比較した。リドカイン2.5%、10%溶液および生理食塩水をくも膜下には20μ1、硬膜外には100μ1投与した。投与後4時間、その後4日間行動学的変化を調べるため、tail flick(TF)テスト、およびpaw pressure(PP)テストを行った。投与後4日目にラットをネンブタールで深麻酔し灌流固定後、脊髄を取り出した。エポキシ樹脂で包埋後、1μmの切片を作成し、トルイジンブルーで染色後光学顕微鏡により観察した。くも膜下投与群、硬膜外投与群とも、2.5%リドカイン投与ではコントロール群と比較して鎮痛効果消失後の行動学的、および組織学的な変化は認められなかった。10%リドカイン投与では、硬膜外投与群では全例にて行動学的異常は認められなかった。くも膜下投与群では6割のラットにおいて尾の熱刺激からの逃避反応時間は延長し、その後4日間にわたり知覚鈍麻を示した。組織学的には、くも膜下投与群では、傷害は馬尾から神経根、脊髄白質および髄質に認められた。病理学的には、軸索の退行性変化、ミエリン構造の消失、遊走細胞の出現が認められた。硬膜外投与群でも、神経組織の傷害は認められたが、馬尾への傷害の程度はくも膜下投与に比較し低く、脊髄においても白質、神経根で認められたが髄質への傷害はなく、その程度はくも膜下投与よりも軽度であった。以上の実験結果により高濃度の局所麻酔薬には神経毒性があり、投与経路にかかわらず神経組織に傷害を起こさせるが、硬膜外投与がくも膜下投与より神経毒性の発現が低いことが明らかになった。
合成麻薬MDMAの分子毒性病態解析

MDMAを用いた細胞レベルと個体レベルにおける毒性発現解析において,マウス脳,心臓と肝臓における細胞内mRNA因子解析,血清学的解析及び法医中毒学的解析を合わせて複合的に解析された。MDMAによる行動毒性は細胞形態変化濃度より低濃度で示されることが再確認された。しかし細胞変形濃度と個体死亡時における血中濃度比はおおよそ2倍のレベルであることが示唆された。MDMA腹腔内40mg/kg投与時の肝臓mRNA因子解析と血清ALT値の解析から炎症反応の発症が示唆された。本研究において,合成麻薬MDMAによる毒性機序について,1)血管内皮細胞を用い,2)実験動物としてマウスを用いて主に脳,心臓と肝・腎臓に焦点をあて,細胞レベルと個体レベルの相同・相違や,個体レベルの毒性変化があるかどうかを含め詳細に検討することを目的とした。まず,合成麻薬MDMAの合成:Broun Uら(J Pharmaceu Sci, 69, 192, 1980)の方法で合成した。合成されたMDMA塩酸塩は融点測定した結果148°Cであり,これまでの報告と一致した。NMR法で合成されたMDMA塩酸塩はクロロホルムd1に溶解し測定したところこれまでの文献値と一致した。薄層クロマトグラフィーによる検査では,トキシラボAシステムによる分析結果においてRf値はMDMA(0.22),の単一スポットであり,発色は第1ステージ(コバルトブルー),第2ステージ(淡青色),第3ステージ蛍光(暗色)および第4ステージ(茶色)であった。DB-5カラムを用いたGC-MS法によるトリフルオロアセチル化MDMAはm/z154, 162, 135, 110,などのフラグメントイオンとm/z289の分子イオンが見られ,およびヘプタフルオロブチル化誘導体するとm/z254, 210, 162, 135などのフラグメントイオンとm/z389の分子イオンが見られ確認・同定された。この様に合成されたMDMAを用いて,現在血管内皮細胞を用い毒性機序について実験を進めている。合成されたMDMA塩酸塩はこれまでの報告と一致し,薄層クロマトグラフィーにより単一スポットであった。さらにDB-5カラムを用いたGC-MS法により確認・同定された。この様に合成されたMDMAを用いて,現在血管内皮細胞を用い毒性機序について実験を進めた。MDMAの一定濃度(0,1μM,10μM,100μM,1mM,10mM)を添加して1日後,細胞のmRNAをISOGEN試薬を用いて抽出し,逆転写酵素でcDNAを作製した。それをもとにPCR法により増幅し,各種のサイトカイン(IL-1β,TNFα,IFNγなど),ケモカイン(MIP1α,MCP1など)およびアポトーシス因子(Fas, FasLなど)の発現を行い電気泳動法にて検出した。得られたバンドは既存のバンド解析装置を用いて,それらの強度を数値化し,半定量化を行った。細胞の各種因子のmRNA量の半定量評価を経時的に比較検討した。さらにマウスを用いた動物実験により,MDMA塩酸塩のLD50値は75mg/kgであった。これらの詳細な結果は,学術論文および22年度の報告書にて報告する。今年度は血管内皮細胞毒性試験において、合成麻薬MDMAを10μMから20mM、即ち2.3μg/mLから4.6mg/mLまでの最終濃度になるよう培地に添加し、細胞の形態を1,4,24および48時間観察した。1時間では5mM(1.1mg/mL)濃度で形態に変化を起こし、10および20mMでは細胞は死滅した。さらに4時間以上では2mM(0.24mg/mL)でも細胞の形態に変化を起こした。しかし、それ以下の濃度では1時間から48時間の間細胞の形態に変化は起こらなかった。従って、細胞形態レベルでは0.24mg/mLまでのMDMA度まで毒性は示されなかった。一方マウス(BALB/C種)を用いたMDMA投与実験では体重kg当たり2,10および40mgを腹腔投与したところ、2mg投与の場合はやや普段よりは落ち着かない様態を約1時間後まで示した。10mg投与の場合は首を頻繁に動かすなどの落ち着かない様態を明確に示し4-6時間持続した。40mg投与の場合は激しく興奮し投与後約8時間までは持続していた。

この40mg投与時の血中MDMA濃度(μg/g)は103(0.5時間),72.2(1時間),68.6(2時間),6.53(6時間)であった。従って、MDMA投与の場合も行動毒性は細胞毒性より低濃度で示されることが改めて確認された。さらにMDMA40mg投与の場合炎症の目安となる血清ALT値を測定した。投与2時間後(114)、同8時間後(97)、同24時間後(268)となり、生食水を投与したブランクでは(38)であることから投与2時間後から軽い炎症反応が起きている可能性が示唆された。
印刷薄膜トランジスタ高性能化に向けた印刷電極の仕事関数制御

本研究では、電極化した後の仕事関数を制御できる、有機半導体デバイス高性能化のための新しい銀ナノ粒子インクを開発することを目的とする。銀ナノ粒子を被覆する有機保護分子に極性の大きい有機分子を意図的に導入し、焼成後もその分子だけを電極内に残存させることで、印刷された銀ナノ粒子電極の仕事関数を制御する。仕事関数制御によって、有機半導体とのエネルギー障壁を低減することができ、最終的には、有機トランジスタの低電圧動作や集積回路における寄生抵抗低減などデバイス高性能化につなげる。これまでの先行研究では、エネルギー障壁を低減するための蒸着電極の表面処理法(Nature Materials, 7, 216)や、エネルギー障壁が小さい電極材料や酸化物を蒸着積層する電極構造(Applied Physics Letters, 90, 073504)が報告されているものの、近年開発が進む、印刷可能な電極材料(例えば金属ナノ粒子インク等)を用いて有機半導体とのエネルギー障壁を低減できるような界面設計手法に関しては、研究が進んでいないのが現状である。本研究ではこれらの界面設計手法の確立を目的として研究を行った。平成27年度は、新規な銀ナノ粒子を合成し、電極化した後の電極組成や界面分析を詳細に行った。電極化後の仕事関数を測定した結果、4.2eV5.2eVの範囲で仕事関数を制御できる銀ナノ粒子インクの合成に成功した。さらに、合成した銀ナノ粒子をデバイス応用するため、インクジェット装置で塗布できるインクへ改良を試みた。銀ナノ粒子はコロイド状態で分散しているため、溶媒の極性に分散安定性が大きく左右される。合成した銀ナノ粒子と相溶性が高い溶媒を選定し分散安定性の改善を図った。その結果、インクジェット装置に適用できる銀ナノ粒子インクとすることができた。平成27年度は、主に、仕事関数制御できる銀ナノ粒子インクの合成に注力した。さまざまな保護分子を導入して銀ナノ粒子インクを合成し、スピンコート成膜後の膜の導電性の測定、平滑性の評価、仕事関数測定を行った。目的とする、仕事関数の制御範囲(4.2eV5.4eV)を達成できる銀ナノ粒子インクの合成に成功しており、今年度の目標はおおむね達成している。加えて、平成28年度以降で予定している、デバイス応用を見据え、デバイス作製するためのインクジェット装置などの印刷機に適用可能なインク特性へ改良する実験も行った。分散安定性が著しく低下する場合は、導入する保護分子の組成を最適化し、また、適用する溶媒も銀ナノ粒子と相溶性の高い溶媒に変更するなどした。H28年度は、新規に合成した銀ナノ粒子インクを用いて有機トランジスタを作製し、単独の有機TFTの特性評価及び性能改善を行い、その結果をフィードバックさせさらに銀ナノ粒子インクの改良を行った。開発した銀ナノ粒子インクを用いてP型有機TFTを作製した結果、従来の銀ナノ粒子インクを用いた場合と比べ、有機TFTの特性を大きく向上させることができた。種々のデバイス構造最適化を試みたところ、界面に存在する残存保護分子の影響で仕事関数を変化させていることが分かり、目的の効果が得られていることが確認できた。しかしながら、デバイス構造の最適化とインク改良にまだ改善の余地があり、今後はこれらをさらに最適化することでデバイス特性の改善を試みる予定である。平成28年度は、H27年度に合成した新規な銀ナノ粒子インクを用いて、実際の印刷型有機トランジスタを作製し、高性能化のためのデバイス構造最適化及びコンタクト抵抗の評価を行う。また、従来報告されている電極処理方法は、基板を電極処理剤の溶液に浸漬する手法のため、P型用の電極処理とN型用の電極処理を同一基板上で行うことが難しかった。

本銀ナノ粒子インクを用いることで、P型有機半導体とN型半導体のそれぞれに対して最適な電極を印刷装置で同一基板上に作り分け(パターン)できるため、P型とN型トランジスタを同一基板上に形成する必要がある相補型インバータ回路に応用できる。本銀ナノ粒子インクを相補型回路の高性能化に応用し、回路特性に対するコンタクト抵抗低減の効果を検証する。有機半導体デバイス
ミラーニューロン仮説の定量的検証とその拡張

他者の行動意図を認知すると言われるミラーニューロンの定量的検証作業はあまり行われていない。そこで、多次元生体情報記録手法を用いてこの問題に挑んだ。サルに上肢の到達運動課題と、他者サルがエサを取るビデオ映像を見せるという課題を行わせ、その時の脳活動をECoG電極で記録、解析した。その結果、既知の報告と同様に前頭前野、頭頂葉の一部、運動前野の一部、補足前野に従来通りのミラーニューロン反応を確認した。本研究計画では、社会環境の中で最も重要な他者の行動を、脳が如何に認知し、それに応じた社会的適応行動を実現しているかを、ニホンザルを用いて明らかにする。これまでの、他者認知は、ミラーニューロンと呼ばれる自己と他者の特定の意図的行動に反応する神経細胞活動を中心として、言語の進化や心の理論などと関連付けて議論されてきた。しかし、ミラーニューロン仮説には様々な疑問が投げかけられており、それに対する追試や検証作業は行われていない。特に、脳内のどの部位がどのように他者の意図認知に貢献しているのかの定量的検証は様々な技術的困難により不可能であった。そこで、この研究計画では、全く新しい多次元生体情報記録手法を用いて、この問題を明らかにすることとした。22年度は、2頭のサルに128チャンネルのECoG電極をインプラントした。この電極は、大脳皮質の外側面だけでなく、一次視覚野と前頭前野の内側壁からの同時記録を行う事ができる。これによって、覚醒状態の大脳皮質の広範囲からの慢性神経活動記録が可能となった。この神経活動記録手法は、非常に安定した信号記録が可能であり、数日間に渡って記録されたデータを連続して記録したデータとして扱う事ができる。この多次元生体情報記録データを元に、記録対象個体自身の運動と、目の前に座っている別個体の運動に関連する脳部位を同定する解析を始めた。1頭を用いた予備的な解析では、従来ミラーニューロンに関係すると言われていた部位に加えて、より広範な脳部位が、自他認知に関与するという結果が出てきた。現在は、この詳細について2頭目の結果についても検討を始めた。23年度は、記録可能なチャンネル数をさらに倍にし、256チャンネルのECoG電極を使って両半球からの同時記録を可能にした。これにより、両半球間の認知機能を検討することが可能となったミラーニューロン課題に関しては、2頭のサルを向かい合わせに座らせ、それぞれのサルが順番にエサを食べるという上肢の運動課題を行い、その時のサルの脳活動を記録した。その際の神経活動を解析すると、前年度の予備実験と同じように、広い範囲において、自己および他者の運動に同じように反応する部位があることが明らかになった。しかしながら、この課題では被観察対象であるサルの行動がコントロールできないという問題があり、それを解決するために様々な上肢運動を撮影したビデオを見せる課題を行わせることにし、準備を開始した。本研究計画では、社会環境の中で最も重要な他者の行動を、脳が如何に認知し、それに応じた社会的適応行動を実現しているかを、ニホンザルを用いて明らかにすることである。24年度は、記録可能なチャンネル数をさらに倍にし、256チャンネルのECoG電極を使っての記録を可能にした。ミラーニューロン課題に関しては、2頭のサルを向かい合わせに座らせ、それぞれのサルが順番にエサを食べるという上肢の到達運動課題を行い、その時のサルの脳活動をECoG電極を用いて記録した。その際の神経活動を解析すると、自己の運動に反応する運動関連領域が明らかにされた。

その運動関連領域のうち、運動前野に他者サルの運動が行われた時にも反応する電極が見られた。これは、ミラーニューロンの条件を満たすのだが、他者サルがエサを貰う時に、記録サルは実は自分にエサが来るのではないかと期待して多少腕を動かしていた。そのため、ミラーニューロンに見える神経活動が単なる運動関連反応なのか、ミラーニューロン反応なのかを区別することが難しかった。そこで、他者サルがエサを取る様子をビデオで撮影し、それをモニター越しに見せるという課題を行った。その結果、前頭前野、頭頂葉の一部、運動前野の一部、補足前野にミラーニューロン反応がみられた。初年度に実験のセットアップを行い、本年度は本実験を開始した。本実験を行った結果に見つかったいくつかの問題点に対しては対策済である。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である24年度は、23年度の結果を受け、より詳細な実験課題とデータ解析を行い、当初の目的を確実に達成できるようにする。23年度に見つかったサルの行動のコントロールの問題点は、ミラーニューロンを発見したパルマのグループからビデオ映像の提供を受けたので、それを用いることになっている。
木材多糖の熱分解による無水糖生成反応に関する量子化学研究

平成22年度は、セルロース結晶の熱分解におけるレボグルコサン生成機構の解明に取り組んだ。平成20年度にモデル系であるメチルグルコシドからのレボグルコサン生成機構を解明し、本成果はJournal of Organic Chemistry誌に掲載されているが、本研究ではその研究成果を基礎とし、より実際の系に近いグルコースオリゴマーをモデルとして使用した。その結果、分子間水素結合を含む巨大なセルロース結晶モデルを採用することにより、レボグルコサンの生成機構の大部分が解明された。すなわち、レボグルコサン生成における初期反応は、分子鎖の中間ユニットの反応によるレボグルコサン残基の生成であり、その後にレボグルコサン残基よりレボグルコサンが連続的に生成する機構が提案された。本反応の律速段階は、初期反応であるレボグルコサン残基生成反応であり、計算されたこの反応における活性障壁は56kccal/molと、実験値である4860kcal/molとよく一致する。さらに提案された本機構により、これまでに提案された機構では説明不能であった、高結晶化度のセルロースほどレボグルコサンを高収率で与える、熱分解中にセルロース結晶構造が維持されるなどの実験事実が合理的に説明可能になった。本結果はJournal of Organic Chemistry誌に投稿予定である。なお、昨年度の研究成果であるアルカリ条件でのレボグルコサン生成機構に関する研究成果はJournal of Organic Chemistry誌に掲載された。本研究の目的は、木質バイオマスの熱化学変換プロセスにおいて重要な反応の一つである、セルロースの熱分解によるレボグルコサンの生成機構を解明することである。平成20年度は、メチルb-D-グルコシドをセルロースのモデルとして採用し、メチルb-D-グルコシドからのレボグルコサン生成機構を検討した。レボグルコサン生成機構としては、以前よりラジカル機構とイオン機構の二種類が提案されていたが、実験的検討の困難さから、いずれが正しいのか明らかでなかった。本研究では、世界に先駆けて、理論計算を用いたレボグルコサン生成機構の解明に取り組み、イオン機構による反応の進行を明らかにした。なお、本結果は米国化学会のThe Journal of Organic Chemistry誌に投稿中である。次に、実際のセルロースの場合でも、同様の機構で反応が進行することを、セルロース2量体を用いた検討より確認した。さらに、高分子量のセルロース分子からのレボグルコサン生成機構について検討するため、複数の反応部位を有するセルロース6量体からのレボグルコサン反応についても検討した。その結果、中間ユニットが末端ユニットより反応が進行しやすいという、セルロースの熱分解機構を理解する上で重要な知見を得ることができた。平成21年度は、「塩基性条件におけるα-およびβ-グルコシドからのレボグルコサン生成機構」に取り組んだ。塩基性条件でのグルコシド類からのレボグルコサン生成反応は、熱分解ガス化プロセスにおいて、塩基性触媒を添加した際に進行するほか、工業的製紙過程においても重要かつ基礎的な反応である。この反応では、β-グルコシドがα-グルコシドより著しく高い反応性を有するという興味深い現象が見出されているが、その原因に関する理論的説明はなされていない。そこで本研究では、α-グルコシドとβ-グルコシドからのレボグルコサン生成反応の理論的解析を行った。その結果、β-グルコシドからのレボグルコサン生成反応では、その遷移状態がアノマー効果により著しく安定化されるが、α-グルコシドの場合は、このような安定化作用がほとんど存在しないことが明らかになった。また、この安定化作用は56kcal/molと見積もられ、α-グルコシドがβ-グルコシドの反応性の差の半分以上を占めることが明らかになった。本結果により、上述のα-グルコシドとβ-グルコシドの反応の相違を合理的に説明することが可能となった。以上の検討により得られた化学的知見は、木質バイオマスの熱分解ガス化および製紙過程におけるプロセス制御に有用であると期待される。なお、以上の結果は、アメリカ化学会のJournal of Organic Chemistry誌に平成22年5月中に投稿予定である。本結果はJournal of Organic Chemistry
家畜排泄物処理過程における微生物叢検索と分離微生物による環境浄化

動物生産にともなって排出されるふん尿(マニュア)は重大な環境汚染原因となっているが、その処理方法に関して科学的なアプローチはほとんど行われていない。本研究では、マニュアおよびマニュア浄化過程における微生物動態の観察、マニュア中およびマニュアのコンポスト化および畜舎汚水処理過程における微生物叢の検索を行い、マニュア浄化機能を持つ微生物の分離と機能解析を試みた。マニュアを室温に放置して7日間微生物叢の変化を観察したところ、ウシ、ブタの場合Enterobacteiaceaeが増殖して優占種となったが、嫌気性菌を含む他種の菌数に大きな増減はなかった。ニワトリではこれらと異なる特徴が示され、嫌気性菌が好気性菌より多いまま推移し、いずれの嫌気性菌属もEnterobacteiaceaeより多かった。コンポスト処理4施設の調査を行ったところ、発酵による温度上昇が認められ、温度の上昇に呼応して、微生物数が減少した。しかし、2次発酵時に放射菌や細菌の一部は減少せず、1次発酵時にこれらの微生物が選抜されていることが示唆された。一方、良好な施設ではこれらの過程でふん便由来微生物が殺滅されていた。畜舎汚水処理4施設の調査では、水質の浄化にともなって、ふん便由来の微生物が除去されていることが示された。悪臭原因物質であるアンモニア除去に焦点を当て、アンモニア同化微生物の分離・解析を試みたところ、コンポストから高濃度のアンモニアに耐性を持ち、窒素源としてアンモニアを利用できる放射菌10株が分離された。また、コンポスト化過程から好熱性真菌が分離され、キシランをはじめとする炭水化物の分解活性が高い上にアンモニア窒素の利用性が高い株を得ることに成功した。今後、これらの特徴を持つ微生物の性状解析を進めるとともに、マニュアへの接種実験などを通して、これらの微生物の現場での利用方法を模索して行きたい。
冠攣縮性狭心症の発症機構に関する分子生物学的研究

我々は冠攣縮性狭心症において、血管内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子に2つの重要な遺伝子変異(Glu298Asp,T-786→C)を見出し、それが冠攣縮と有意に連関していることを報告した。これらの遺伝子変異が単なるマーカーであるか否かは重要な検討課題であり、その解明に取り組んだ。この研究は、冠攣縮の病態解明の新たなる展開と、他の疾患の病態解析へと繋がる可能性を秘めている。Glu298Aspに関する機能解析では、変異蛋白の酵素学的な機能低下は認められなかったが、蛋白の細胞内での安定性に欠けることが示された。何らかの未知の酵素が変異蛋白に作用して、その分解を促進している可能性がある。GluからAspへの変異は、他の遺伝子にもかなり多く認められ、この変異が原因で蛋白の機能低下を引き起こす可能性は高く、種々の疾患の病態生理に関わってくるものと思われる。一方、T-786→Cに関しては、我々は既にLuciferase reporter gene assayにて変異遺伝子の転写活性が低下することを報告している。さらに、その変異部位に結合する蛋白が、転写因子replication protein A1(RPA1)であることを見出した。また、我々は、このRPA1が他の複数の遺伝子においても、eNOSと同様な遺伝子配列に結合することを見出している。RPA1はDNAのreplication、repair、recombinationに作用すると言われていたが、おそらく種々の遺伝子においてrepressorとして多彩な働きを有するものと想像される。我々は冠攣縮と連関する他の遺伝子変異の検索を進めている。特に酸化ストレスに関係すると言われているparaoxonase(PON)を中心に研究を進めている。PONにはGln192Argが存在し、その変異体は抗酸化ストレス作用が弱いと報告されている。我々は同変異と冠攣縮との関係を検討したが、その結果、有意の連関を認めた。冠攣縮の発症は、eNOS以外の酸化関連遺伝子にも強く関係していることが示され、冠攣縮の発症機構における遺伝的要因の存在の重要性が今後益々問われるものと思われる。我々は冠攣縮狭心症例において血管内皮型-酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子にミスセンスGlu298Asp変異を見出した。さらに、5'側非翻訳'領域に三つの連鎖する点変異群T-786→C,A-922→G,T-1468→Aを発見し、それぞれの変異が対照群より冠攣縮群に有意に多く認めることを明らかにした。luciferase reporter assayにより、5'側非翻訳'領域の3つの変異の内では、T-786→C変異型が転写を抑制していることが明らかとなった。核蛋白質を抽出しgel mobility shift assayを行ったところ、T-786→C変異プローブでのみシフトバンドを認め、同部位に負の転写抑制因子が結合することが示唆された。よって、この転写因子のクローニングを開始したが、その結果、この因子は、replication protein A-1(RPA-1)であることが判明した。ヒトの冠動脈の反応性に関しても、アセチルコリンやISDNに対する反応を比較すると、T-786→C変異の症例は野生型の症例に比較して反応性がより大きいことが判明した。以上より、我々が同定したeNOS遺伝子T-786→C変異は単なるマーカーではなく、eNOS活性に直接影響を及ぼしている可能性が極めて高い。