hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温超伝導マグネットのキーテクノロジーとなる革新的即時遮断・保護技術の開発

以上により、当初の期待通りに、順調に成果が得られているものと考えている。平成30年度の成果により、巻線の設計と制御手法の開発を行うことができた。平成31年度は、作製中の巻線を完成させ、実験的に本成果を実証することを目指す。具体的には、その高い特性から高磁界マグネット応用に期待されているものの遅いクエンチ伝搬特性から早急な保護の必要な希土類系高温超伝導線材を用い、設計した巻線構造のコイルを作製する。補助巻線を加え、電流の即時遮断試験を行い、電圧の制限の観点からこれまでに困難であった保護技術として実証する予定である。今年度末に購入予定の超伝導線材の購入を次年度に延期したため。ただし、これによる研究の遅延はない。平成31年度文部科学大臣表彰若手科学者賞受賞
脊索動物の形態進化におけるレチノイン酸シグナル経路獲得の意義

脊索動物あるいは脊椎動物に特徴的な多くの構造(たとえば中枢神経系の前後軸に沿ったパターン,咽頭鰓裂,神経堤細胞など)は,レチノイン酸依存的に形成される。レチノイン酸の合成酵素・分解酵素・受容体の遺伝子は脊索動物からのみ報告されているので,これらの遺伝子を獲得したことが,脊索動物特有の形態が進化するために重要なステップであったと考えられる。本研究では以下のことを明らかにした。(1)レチノイン酸合成酵素(Raldh2)・分解酵素(Cyp26)および受容体(RAR)を同定した。また正常胚とレチノイン酸処理胚における発現を解析した。Raldh2は尾の付根の3個の筋肉細胞で,Cyp26は脳の一部の細胞で発現しており,これらの遺伝子の発現領域の間にはギャップが存在した。この発現パターンは脊椎動物のものと非常によく似ており,これらの酵素が作り出すレチノイン酸の偏った分布がホヤの形態形成においても重要であることが示唆された。(2)RARのエンハンサーを単離し,中枢神経,表皮,筋肉のエンハンサーエレメントを同定した。(3)レチノイン酸標的遺伝子のcDNAマイクロアレイ解析およびオリゴチップ解析を行った。チップ解析で候補となった150以上の遺伝子についてin situ解析を行い,レチノイン酸に対する応答性を確認した。また,ピューロマイシン存在下でも応答する遺伝子は,RARによって直接活性化される第一次の標的遺伝子と考えられる。このような遺伝子として,脊椎動物においても知られている標的遺伝子(Hox1やCyp26など)の他に,新規の機能未知の遺伝子などを含む多数の標的遺伝子を同定した。(4)上記の研究成果を2報の英文総説にまとめ,国際誌に発表した。(5)ホヤ胚を用いたRNAi法の確立を試みた。ホヤゲノムから単離したU6 snRNAプロモーターを用いてヘアピン型のsiRNAを発現させる方法を開発した。この方法を用いて,標的遺伝子の機能阻害実験を行った。今年度は、当初の申請書に書いた計画をすべて実現した。その概略は以下のとおりである。2.オリゴチップ解析(北大・安住薫博士と共同)を行い、cDNAマイクロアレイの結果の再現性を確認した。オリゴチップは、私たちのcDNAチップの2倍以上の遺伝子をカバーしているので、さらに多数の標的遺伝子を発見できた。現在、レチノイン酸処理+翻訳阻害剤処理を施した胚のRNAを用いて、このオリゴチップからレチノイン酸に"直接"応答する遺伝子を絞り込む実験を実施中である。3.レチノイン酸合成酵素(Raldh)、分解酵素(Cyp26)、受容体(RARとRXR)、また、レチノイン酸による形態形成制御に関与するさまざまな因子(Hox、Cdx、Meis、FGF、FGFRなど)のcDNAを同定し、正常胚とレチノイン酸処理胚における発現を調べた。4.Cyp26、RAR、cdx、Hox1の上流配列をゲノムDNAより単離し、lacZレポーター遺伝子を作製した。これをホヤ胚に導入し、正常胚やレチノイン酸処理胚におけるレポーター遺伝子の発現を観察した。現在、それぞれの調節領域について多数のdeletionや点変異を作って、組織特異的エンハンサーエレメントの同定やレチノイン酸応答エレメントの同定を試みている。これは現在進行中であり、来年度には完成させて論文として発表したい。5.RARのエンハンサーを利用してcdxを異所的に発現させるプラスミドを作製した。

この異所的発現の結果解析は来年度の課題とする。レチノイン酸は,脊索動物特有の体の構造(背側の中枢神経系の前後軸に沿ったパターン形成,神経堤細胞の分化など)の形成に重要である。レチノイン酸の合成酵素,分解酵素,受容体などの遺伝子は脊索動物においてのみ同定されているので,これらの遺伝子の獲得と,標的遺伝子のレパートリーの変化が脊索動物・脊椎動物の進化の原動力になったと思われる。本研究では,cDNAマイクロアレイによってホヤ胚における標的遺伝子を多数同定したが,今年度は,以下の研究を行った。(1)約20000のスポットを載せたカタユウレイボヤのオリゴヌクレオチド・マイクロアレイを用いて,さらに多数の標的遺伝子を同定した。そのほとんどの遺伝子についてin situハイブリダイゼーションを行って,正常胚における組織特異的発現パターンとレチノイン酸に対する応答を確認した。(2)さらに,レチノイン酸と翻訳阻害剤(ピューロマイシン)で同時に処理した胚から蛍光プローブを作製してオリゴチップ解析を行い,レチノイン酸に直接応答する標的遺伝子を同定した。ここまでの成果は論文として投稿中である。(3)直接の標的遺伝子のうち」Hox1,Cyp26,機能のわからないring-fingerタンパクをコードする遺伝子の上流およびイントロン配列を単離し,レポーター解析を行って,組織特異的な転写調節に関与する領域やレチノイン酸に対する応答に必要な領域を同定した。(4)Hox1遺伝子のイントロン中のエンハンサーにレチノイン酸応答エレメントと思われる配列を発見し,ゲルシフト解析を行って,カタユウレイボヤのレチノイン酸受容体がその配列に結合することを確認した。レチノイン酸は,脊索動物に特徴的な体の構造を形づくるために重要なシグナル分子である。本研究では,レチノイン酸の合成酵素,分解酵素,受容体の遺伝子(これらの遺伝子は脊索動物からしか発見されていない)の発現と機能を解析した。また,マイクロアレイを用いてレチノイン酸標的遺伝子を多数同定し,その発現・機能解析をすることによって,脊索動物の形態進化の分子メカニズムを解明することを目指した。今年度は,以下の研究を行った。1.レチノイン酸受容体(Ci-RAR)遺伝子のプロモーター解析と,レチノイン酸処理胚のオリゴチップ解析の成果を論文として公表した。また,内在性のレチノイン酸の発生における必要性を検証するため,以下の3つの研究を行った。2.レチノイン酸分解酵素(Ci-Cyp26)は,初期胚の脳で発現しており,この領域でレチノイン酸の効果を抑制して正常なパターン形成に貢献していると考えられる。Ci-Cyp26遺伝子のcDNAを,Ci-RAR遺伝子のエンハンサー/プロモーター領域の下流に連結して胚に導入し,異所的に発現させたときに,胚の形態や下流遺伝子の発現を見る実験系を構築した。3.レチノイン酸のアンタゴニストであるBMS009で胚を処理して形態と遺伝子発現を観察した。他の動物ではアンタゴニストとして機能するBMS009は,ホヤ胚においては,弱いアゴニストとして働くことを示唆する結果を得た。4.ドミナントネガティブ型のCi-RARを発現させるためのプラスミドコンストラクトを作製した。
ヘテロLB膜の熱刺激電流の機構解明と応用研究

分子内に双極子能率の大きい極性基を有する両親媒性物質と長鎖脂肪酸などを交互累積して得られるへテロLB膜(ラングミュアー・ブロジェット膜)は双極子が一方向を向いた非対称構造をとり、自然界には存在しない形の高次組織体を形成し、焦電素子や圧電素子などの機能性材料として利用できる可能性を有する。特に温度を瞬間的に変えたときに流れる熱刺激電流は、これを高感度赤外線検知器(センサー)として利用できることから注目を浴びている。この熱刺激電流と総称される誘導電流を与える原因は一つではなく、双極子が熱的擾乱を受けたときに生じる焦電流や、炭化水素鎖が無秩序に乱れる際に生じる電流などがある。後者の電流は前者の焦電流に比べて桁違いに大きく、実用的にはむしろこれを利用したほうが有利であると考えられた。3年間に渉り、フェニルピラジン長鎖誘導体と直鎖脂肪酸の交互ヘテロLB膜の分子鎖が乱れる際に流れる熱刺激電流について、詳しく検討したが、同一物質から作成した試料でも、調整の度ごとに、検出される電流の符号が、正になったり、負になったりすることが明らかとなった。これは試料調整の際、過剰な電荷が取り込まれ、その符号が正であったり、負であったりするものと思われる。したがって、これを利用するには電流の絶対値を使う必要があることが分かった。一方、低温における焦電流を昇温・降温の繰り返し測定により詳細に検討した結果、-60°C付近の低温では焦電係数が常に正であるが、-200°Cからは、負の焦電係数をもつことが明らかとなった。また、カチオン性の水溶性ポリマーとのポリイオンコンプレックスLB膜においては、フェニルピラジン環の運動の自由度が増す分だけ焦電係数が増えるが、平均分子配向の低下のため、減る効果もあって、トータルとしては余り増大が見られないという結果を得ている。分子内に双極子能率の大きい極性基を有する両親媒性物質と長鎖脂肪酸などを交互に累積して得られるヘテロLB膜(ラングミュア-・ブロジェッ膜)は双極子が一方向を向いた非対称構造をとり、自然界には存在しない形の高次組織体を形成し、焦電素子や圧電素子などの機能性材料として利用できる可能性を有する。特に温度を瞬間的に変えたときに流れる熱刺激電流は、これを高感度赤外線検知器(センサ-)として利用できることから注目を浴びている。この熱刺激電流と総称される誘導電流を与える原因は一つではなく、双極子が熱的擾乱をうけて生ずる焦電流や、炭化水素鎖が無秩序に乱れる際に生ずる電流などがある。後者の電流はその詳細な機構が未だに不明であるが、前者の焦電流に比べると桁違いに大きく、実用的には寧ろこれを利用したほうが、はるかに有利であると考えられる。本年度はまず,その基礎的デ-タ-である脂肪酸およびその金属塩のLB膜の炭化水素鎖が乱れる温度(相転移温度)を補助金で購入したラウダ社製循環恒温水層とFTーIR反射吸収測光を用いて行った。脂肪酸としてはステアリン酸を,金属としてはCdとCaを選び,まずLB膜の層数を121層と変化させたときに相転移温度がどう変わるかを検討したところ,Cd塩では1層膜の102°Cを除き,ほぼ108°Cと一定であるのに対して,ステアリン酸およびそのCa塩では,層数の増加と共に,それぞれ5867 °Cあるいは102129°Cと変化することが明らかとなった。また,転移温度以上での分子鎖の乱れの程度は,層数が多いほど大きかった。

さらに,CdおよびCa塩の9層LB膜において,第1,5,および9層目を同位体置換して調べたところ,単分子膜の層位置を変えても,転移温度は変わらないことも明らかとなった。次年度以降は,脂肪酸の種類を変えて測定を継続すると共に,熱刺激電流との関連についても調べる予定である。分子内に双極子能率の大きい極性基を有する両親媒性物質と長鎖脂肪酸などを交互に累積して得られるヘテロLB膜(ラングミュアー・ブロジェット膜)は双極子が一方向を向いた非対称構造をとり、自然界には存在しない形の高次組織体を形成し、焦電素子や圧電素子などの機能性材料として利用できる可能性を有する。特に温度を瞬間的に変えたときに流れる熱刺激電流は、これを高感度赤外線検知器(センサー)として利用できることから注目を浴びている。この熱刺激電流と総称される誘導電流を与える原因は一つではなく、双極子が熱的擾乱をうけて生ずる焦電流や、炭化水素鎖が無秩序に乱れる際に生ずる電流などがある。後者の電流はその詳細な機構が末だに不明であるが、前者の焦電流に比ベると桁違いに大きく、実用的には寧ろこれを利用したほうが、はるかに有利であると考えられる。本年度は、昨年度に引き続き、基礎的データーである脂肪酸およびその金属塩のLB膜の炭化水素鎖が乱れる温度(相転移温度)を補助金で購入したラウダ社製循環恒温水層とFT-IR反射吸収測光を用いて行った。脂肪酸としてはステアリン酸を、金属としてはCdとCaを選び、LB膜の層数を変化させたときの相転移温度の変化を検討した。その過程で、銀を蒸着したガラス基板上のステアリン酸LB膜の反射吸収スペクトル測定において、一層目の単分子層のステアリン酸のC=O伸縮振動が見当たらないことを見出した。その原因としては、イメージ・ダイポールによる物理的効果か,銀塩形成による化学的効果が考えられたが,重水素化ステアリン酸を用いた実験から,その原因は銀塩形成による化学的効果であることが明らかとなった。それと同時に、フェニルピラジン長鎖誘導体とステアリン酸などの直鎖脂肪酸との組合せのヘテロLB膜の熱刺激電流の測定も開始している。分子内に双極子能率の大きい極性基を有する両親媒性物質と長鎖脂肪酸などを交互累積して得られるヘテロLB膜(ラングミュアー・プロジェット膜)は双極子が一方向を向いた非対称構造をとり、自然界には存在しない形の高次組織体を形成し、焦電素子や圧電素子などの機能性材料として利用できる可能性を有する。この熱刺激電流と総称される誘導電流を与える原因は一つではなく、双極子が熱的擾乱を受けたときに生じる焦電流や、炭化水素鎖が無秩序に乱れる際に生じる電流などがある。後者の電流はその詳細な機構がいまだに不明であるが、前者の焦電流に比べて桁違いに大きく、実用的にはむしろこれを利用したほうが有利であると考えられる。本年度は、フェニルピラジン長鎖誘導体と直鎖脂肪酸の交互ヘテロLB膜の分子鎖が乱れる際に流れる熱刺激電流について、詳しく検討したが、同一物質から作成した試料でも、調整の度ごとに、検出される電流の符号が、正になったり、負になったりすることが明らかとなった。これは試料調整の際、過剰な電荷が取り込まれ、その符号が正であったり、負であったりするものと思われる。一方、低温における焦電流を昇温・降温の繰り返し測定により詳細に検討した結果、-60°C付近の低温では焦電係数が常に正であるが、-200°Cからは、負の焦電係数をもつことが明らかとなった。
法学部における理論教育と実務教育18世紀から現在に至るドイツの歴史的経験と比較

(1)18世紀から19世紀への転換期に、ドイツでは、大学における法学教育と裁判所における実務修習の分離、国家試験による成績コントロールという二段階の法曹養成課程が成立し、制度化された。それに対応して、法学のあり方が基本的に変化した。学問としての法学(具体的には歴史法学)成立である。まずRechtsencyklopaedieという種類の文献を手がかりに、法学の諸科目が他の学科(哲学、倫理学)から分離し、相互の有機的関連をもった体系として成立し、自立した法学の体系が形成される過程を考察した。つぎに、ベルリン大学の法学教育において、現行法であるプロイセン法とローマ法がどのような関係にあったかを、大学、裁判所、学生、文部省・司法省のアクターによる理念と実行の交錯のなかで、法学がどのような形態をとるに至ったかを明らかにした(学会報告)。(2)18世紀まで大学ではRelatinstechnikのような実務科目も教えられていたが、これが法学から排除された。しかし、それは実務修習の課程に定着し、現在にいたっている。それがドイツの大学教育に取り入れられ、20世紀後半には「練習」におけるGutachtenmethodeとして、広く実施されている。わが国の司法研修所および法科大学院における要件事実教育と比較してみることが重要であり、さらにこの点につきドイツ、オーストリア、スイスを調査したうえ報告書を作成し、かつオーバーハンマー教授に依頼した原稿を翻訳紹介した。(3)明治期以来日本法学がヨーロッパ・ドイツ法学をどのように受容したか、穂積陳重を中心に民法と比較法について、またドイツ近代法史という科目について考察し、外国に紹介した。(4)法科大学院における理論教育と実務教育にっき基礎法学の所見を述べ、基礎法学の重要性を強調した。また「法曹倫理」という科目の教科内容にっき具体的な提言をおこなった。2.ベルリン自由大学、ゲッティンゲン大学およびブツエリウス・ロースクールを訪問し、現在ドイツの法曹養成の改革について、資料を収集し、聞き取り調査をした。3.2004年12月8日、大阪日独協会において、「法学者の留学日独交流史」と題する講演をおこなった。4.2004年12月17日、関西学院大学法科大学院の研究会において、「ドイツにおける法曹養成制度の改革」について報告した。4.創価大学法科大学院の要件事実教育研究所の特別客員研究員の委嘱を受け、2005年3月12日および13日の開所シンポジウムに出席した。5.3月19日、関西学院大学法科大学院主催の国際シンポジウム「正義は教えられるか法曹倫理と社会的責任」にパネリストとして参加した。6.3月26日国際高等研究所およびフンボルト財団の共済になるシンポジウム「日本にとってドイツ法学とは民事法の場合」に発言者として参加した。7.別紙に記した研究成果が発表され、一部はすでに公刊され、また他は近く公刊予定である。2005年3月には、三つのシンポジウムに参加した。その一つは法科大学院要件事実教育研究所主催の『要件事実教育のあり方』に特別客員研究員として参加した。その二は、関西学院大学法科大学院主催の『正義は教えられるか』にパネリストとして参加し、「法科大学院と法曹倫理」と題して報告した。前者の記録は上記研究所報題巻に掲載されており、後者については、まもなく報告書が刊行される予定である。その三は、国際高等学術研究所主催シンポジウム『日本にとってのドイツ法学とは』に参加し、法制史の立場からコメントをおこなった。その記録は別記の研究発表欄(2)に公表されている。4月には、星野英一氏を囲む座談会に参加したが、座談会の記録は、別記研究発表欄(4)の付録として収められている。なお独文による論文で、ZNR誌に、「日本における近代ドイツ法史」が発表された。

ドイツのみならずスイス、オーストリア、ハンガリーからも反響があったことが注目される。8・9月には、渡独して、フランクフルトおよびベルリンで、18世紀から19世紀の転換の時期におけるは法曹養成と法学教育について直接史料にあたって研究した。その成果は、科研費による研究会を開催し報告するとともに、桐蔭学園横浜大学大学院において、集中講義の際に披露した。論文としては、近く公刊される『原島重義先生・傘寿記念論文集』に掲載される予定である。ドイツ滞在中各地の大学を訪問し、約20名の教授たちと懇談し、ドイツの法学教育の改革の実情について調査した。その成果の一部は、法科大学院要件事実研究所報の海外調査特別号に発表される。秋には私法学会の要件事実教育にかんするシンポジウムに参加し、同問題についての知見を深めた。(1)2006年8月に公刊された『市民法学の歴史的思想的展開』に「啓蒙期自然法学から歴史法学へ」と題してこれまでにおこった研究成果を発表した。これは18世紀後半から普及した『法学エンチュクロペディー』を手がかりに、混乱した法素材を、大学の法学の科目としていかにその領域を確定し相互に関連付け、法学の体系を構築したか、を明らかにしょうとしたものである。ゲッティンゲンのピュッター,ライテマイアー,フーゴーを中心としたが、これらの法理論は、19世紀歴史法学を生み出す準備作業であったが、両者の基本的相違をも確認した。(2)8月にはまたベルリンのGeheimes Staatsarchivの官庁文書の解読に従事した。それは文部省、司法省、大学、教授と学生の相互の関係を通じて大学の法学教育がどのように変化するかを示したもので、普通法とプロイセンー般ラント法との関係を明らかにする。2007年4月日本法制史学会において報告する予定となっている。(3)チューリヒ大学民事訴訟法の教授に論文執筆を依頼して,その成稿を翻訳して寄稿した。「ドイツ法圏における司法試験』として2007年3月に刊行された。これはドイツ、オーストリアおよびスイスにおける司法試験制度とその実情、法学教育の方法、とくに事例研究法についての興味ある比較考察である。
新しい発現調節遺伝子の開発と利用

1.広宿主域プラスミドRSF1010の複製開始因子が複製開始領域内の繰り返し配列に特異的に結合し、AT含量の高い領域で二本鎖DNAの解裂を引き起こす。複製開始因子自体に二量体状態から単量体状態への変換による転写翻訳後の活性調節機構が存在し、その過程が熱ショック因子(分子シャペロン)の機能を介して行われていた。プラスミドColIb-P9からも同様なプライミングシグナル(ssiシグナル)を単離した。一連のプライマー依存型プライミングシグナルは、プラスミド相互間で交換可能であった。2.Bacillus thuringiensis(BT)の亜種israelensis(BTI)のプラスミドより、殺虫性タンパク質をコードするcryIVA,cryIVBの二種類の遺伝子を単離し、これらの遺伝子の上流364bp及び312bpにプロモーター配列を確認した。これらプロモーターの上流にσ^<35>が認識する部位が存在していたことから、BTIのプロモーターが細胞サイクルに依存して発現していることを明らかにした。また殺虫性タンパク質の殺虫活性中心の一つの同定に成功した。3.多剤耐性遺伝子(MDR)の上流に二つのプロモーターが存在し、通常は下流のプロモーターから転写が開始されており、この転写活性はヒ素により、またプロモーター領域内に存在するストレス応答エレメントによっても増大した。しかしこの活性増大はケルセチンにより抑制された。薬剤に対する耐性はMDRの生産物であるP-糖タンパク質によって薬剤を細胞外へ排出することにより達成されるが、薬剤の排出を解析する経細胞系を確立し、その機構を調べたところ、エネルギー依存型から単純拡散系まで種々存在することが確認された。4.糖鎖工学による活性タンパク質の生成、分泌を可能にするためにN-アセチルグルコサミニル転移酵素(GnT1)をラット肝臓より分離・同定した。GnT1遺伝子を酵母で発現させるための組換え体を構築し、その発現に成功した。1.DNAの合成開始を指令する領域は本質的に1.DNA巻きもどしタンパク質結合部位,2.DNA合成酵素が結合することに先立って認識されるRNA合成酵素(RNAプライマ-ゼ)結合部位からなっている。1.の部位はレプリコンの種類によって特徴的であるが、2.の部位は多くのレプリコンでよく保存されている。この保存領域の特性を解明するため、G4のプライマ-ゼ結合部位を遺伝子工学的に種々改変し、活性を明らかにした。すなわち、G4のDNA合成開始領域のステム・ル-プIからの5'ーCTGー3'配列までの距離が重要であるとともに、この5'ーCTGー3'配列もまた必須であることが明らかとなった。2.遺伝子が発現する際に必須としている領域、すなわちプロモ-タ-領域は構造遺伝子の上流に位置し、RNA合成酵素の結合を可能にしているが、さらにその上流に、しばしばCRP結合部位が存在していて遺伝子発現を調節している。大腸菌の<glpR>___ー<glpD>___ー領域の遺伝子には<glpR>___ー,<glpG>___ー,<glpE>___ー,及び<glpD>___ーの十種類が存在していることが確認された。これらの構造を明らかにするとともに、<glpD>___ー遺伝子の発現がcAMPーCRPによる正の調節を受けていることが解明された。<glpD>___ー及び<glpE>___ー

遺伝子は互に逆向きに転写され、それぞれのプロモ-タ-の上流にCRP結合部位が存在した。このCRP結合部位により<glpD>___ー遺伝子は上の調節を受けたが、<glpE>___ー遺伝子は未だどのような遺伝子をコ-ドしているか不明であるため、プロモ-タ-領域を単離してlac融合用ベクタ-に挿入し、<glpD>___ー<lac>___ーと<glpE>___ー<lac>___ー融合遺伝子を作製した。これらの融合遺伝子は共にcAMPーCRPにより正の調節を受けた。またCRP結合部位5'ーTGTGAー3'を部位特異的突然変異により変異株を作製してcAMPーCRPにより同時に調節を受けるか否かを調べたところ、2つの遺伝子が同時に発現調節を受けることが明らかとなった。1.DNAの合成開始反応は、最初に2重鎖の巻き戻しがあり、次にプライマ-RNA合成が起こり、このRNAにDNAが結合する形で子供のDNAの合成が行なわれる。巻き戻されたDNAは必ず1重鎖となりプライマ-の結合を可能にする。プライマ-ゼは生物種により異なり、またDNA上の認識部位も異なるが、認識部位には特徴的な立体構造が存在する。これがssiシグナルで、プラスミドRSF1010には異なるDNA鎖上に1個ずつ2個が逆向に存在し、ColIbには1個しか存在しなかった。これは前者が広宿主域であるのに対し、後者は限定された宿主においてのみしか増殖し得ないことの原因であると考えられる。2.多くの遺伝子の発現はcAMPーCRPの制御下にあるが、CRPの変異したCRP^※はcAMPばかりでなくcGMPでも発現制御する。このCRP^※を用いて発現する遺伝子の検索をしたところ、マンノ-スの代謝を盛んにするsfs1遺伝子の存在することを見い出した。大腸菌の細胞分裂の制御がcAMPによって行なわれているという実験結果を得ているが、遺伝子発現調節と細胞の生理作用との関連性の解明に役立つと考えられる。3.高等生物の遺伝子の発現は原核生物のそれに比べて、はるかに複雑である。複雑な要因の1つが遺伝子の構造そのものであり、他はプロモ-タ-領域にある。動物の細胞や個体の成長に不可欠な成長ホルモンの遺伝子をヤギより分離・精製することに成功し、その構造を解析した。成長ホルモン遺伝子は3種類存在しており、そのうちの1つは実際に発現していない凝似遺伝子であった。各遺伝子の上流及び下流には特徴的なくり返し配列が存在しており、これらの配列はそれぞれ極めて相同性が高かった。進化学的に見て極めて意義深いものと考えられる。ヤギ成長ホルモン遺伝子は4つのエキソンと5つのイントロンからなり、エキソンはヒトなどの遺伝子とのホモロジ-は極めて高かった。1.Bacillus thuringiensis(Bt)の大きいプラスミドにコードされている殺虫性タンパク質のプロモーター領域を解析したところ、枯草菌の胞子形成期に使用されるのと同じプロモーターの塩基配列がRNA合成開始部位の上流約400塩基対のところに存在していた。このプロモーター構造を含む殺虫性タンパク質遺伝子を枯草菌に形質転換して発現の様相を調べたところ、胞子形成期に多発現することが確認されたことから、Btと枯草菌とでは、胞子形成期に発現する共通の強力なプロモーターが存在することが明らかになった。
小腸粘膜上皮の再生・分化・増殖調節因子の解析

消化管上皮細胞における正常な分化・再生・増殖機構の解明は、移植医療、様々な腸疾患の病態、治療を行う上で非常に重要な鍵を握っていると考えられる。申請者らは、亜鉛キレート剤であるジチゾンをラットに1回静脈内投与することにより、その細胞質内に亜鉛を多く含む小腸パネート細胞を選択的に除去し、引き続いて小腸粘膜全層にわたる細胞増殖活性が促進する実験系を確立し、すでに報告した。本実験系では、パネート細胞以外の粘膜障害を引き起こすことなくジチゾン投与後12時間という短時間で、小腸全層にわたる増殖活性を促進する事ができる。この実験系を用いて、小腸の増殖に特異的な未知・既知の増殖因子、転写因子をクローニングするために、増殖因子に多く見られるチロシンキナーゼ相同領域を標的にしたプライマーを設定し、ヒト胎児小腸上皮細胞株I407より採取したRNAを用いてPCRを行った。クローニングした遺伝子は、DNAシークエンスにより、ヒトfibroblast growth factor receptor(FGFR)4のsplice variantであることが判明した。このvaliantは、膜貫通ドメインのエクソン9が、イントロン9に置き換わっており、FGFR4の可溶型レセプターとして存在していると考えられる。また、実際に発現ベクターに組み込んだこのFGFR4のvariantをCOS7細胞に遺伝子導入すると、細胞培養液中に蛋白の分泌が見られることが確認された。すでに、FGFR1、2、3についてはすでに可溶型のレセプターの存在が報告されているが、FGFR4については初めての報告である。ラット胎児小腸上皮細胞株IEC6より採取したRNAを用いたPCRでは、このsplice variantは認められず、ヒトにのみ特異的に発現している可能性が考えられる。さらにノーザンブロッティングにより、ヒト消化管粘膜上皮、膵ならびに胃・大腸・膵癌の細胞株においてその発現がみられることが分かるとともに、single cell RT-PCRによって膜貫通型のFGFR4と可溶型のFGFR4の2つのmRNAが単一細胞に同時に存在していることが分かった。膜貫通型のレセプターでは、他にもEGFレセプター、IL-4レセプター、Fasなどに可溶型レセプターの存在が知られている。続いて、ラット小腸より作製したcDNAライブラリーをCaCO2細胞に遺伝子導入して、1%血清含有培地で培養し、増殖能を有するクローンから導入された遺伝子をPCRで増幅し、その遺伝子がラットチオレドキシンであることが分かった。再度、チオレドキシンの消化管粘膜上皮細胞に対する増殖促進作用を確認するために、発現ベクターに組み込んだヒトチオレドキシンをCaCO2細胞に導入し、低血清、ジアミド、H2O2存在下で培養し、対照郡に比べて有意に増殖能に差が出ることが分かった。またsingle cell RT-PCRによってVilliの上皮、パネート細胞ともに発現が見られることが分かった。以上の結果より、すでに私達が報告した活性酸素産生能を有するxanthine dehydrogenaseがパネート細胞に存在することを併せて考えると、チオレドキシンは、消化管における増殖促進因子としての働きとレッドクス制御による粘膜再生に関与している可能性が持たれた。

続いて、ラット小腸より作製したcDNAライブラリーをCaCO2細胞に遺伝子導入して、1%血清含有培地で培養し、増殖能を有するクローンから導入された遺伝子をPCRで増幅し、その遺伝子がラットチオレドキシンであることが分かった。再度、チオレドキシンの消化管粘膜上皮細胞に対する増殖促進作用を確認するために、発現ベクターに組み込んだヒトチオレドキシンをCaCO2細胞に導入し、低血清、ジアミド、H2O2存在下で培養し、対照郡に比べて有意に増殖能に差が出ることが分かった。またsingle cell RT-PCRによってVilliの上皮、パネート細胞ともに発現が見られることが分かった。以上の結果より、すでに私達が報告した活性酸素産生能を有するxanthine dehydrogenaseがパネート細胞に存在することを併せて考えると、チオレドキシンは、消化管における増殖促進因子としての働きとレッドクス制御による粘膜再生に関与している可能性が持たれた。今回私達は、小腸粘膜上皮の増殖に関与する因子をクローニングするために、増殖因子に多く見られるチロシンキナーゼ相同領域を標的にしたプライマーを設定し、ヒト胎児小腸上皮細胞株I407より採取したRNAを用いてPCRを行った。クローニングした遺伝子は、DNAシークエンスにより、ヒトfibroblast growth factor receptor(FGFR)4のsplice variantであることが判明した。このvaliantは、膜貫通ドメインのエクソン9が、イントロン9に置き換わっており、FGFR4の可溶型レセプターとして存在していると考えられる。また、実際に発現ベクターに組み込んだこのFGFR4のvariantをCOS7系細胞に遺伝子導入すると、細胞培養液中に蛋白の分泌が見られることが確認された。すでに、FGFR1、2、3についてはすでに可溶型のレセプターの存在が報告されているが、FGFR4については初めての報告である。ラット胎児小腸上皮細胞株IEC6より採種したRNAを用いたPCRでは、このsplice variantは認めらず、ヒトにのみ特異的に発現している可能性が考えられる。さらにノーザンブロッティングにより、ヒト消化管粘膜上皮、膵ならびに胃・大腸・膵癌の細胞株においてその発現がみられることが分かるとともに、single cell RT-PCRによって膜貫通型のFGFR4と可溶型のFGFR4の2つのmRNAが単一細胞に同時に存在していることが分かった。膜貫通型のレセプターでは、他にもEGFレセプター、IL-4レセプター、Fasなどに可溶型レセプターの存在が知られている。今後、臨床検体を用いて疾病との関わりなど可溶性FGFR4の役割についてさらに検討を勧める予定である。消化管上皮細胞における正常な分化・再生・増殖機構の解明は、移植医療、様々な腸疾患の病態、治療を行う上で非常に重要な鍵を握っていると考えられる。申請者らは、亜鉛キレート剤であるジチゾンをラットに1回静脈内投与することにより、その細胞質内に亜鉛を多く含む小腸パネート細胞を選択的に除去し、引き続いて小腸粘膜全層にわたる細胞増殖活性が促進する実験系を確立し、すでに報告した。
仮想現実感技術を用いた物体運動の認知予測特性と捕捉失敗の因果関係に関する研究

本研究は,仮想環境において運動物体の遮蔽後位置予測課題を用いて実施した.その結果,被験者は,遮蔽された運動物体の速度(予測速度)を実速度より遅く見積もった(予測速度低下現象).このことは運動物体に対応した動作に影響する重要な要因となることから,この現象が生起する原因および予測特性について検討した.眼球運動の解析から,予測速度の低下は遮蔽によって生じること,位置を回答するための情報処理が影響する可能性が示唆された.400回の学習課題の結果から,予測特性に関する学習過程は,位置エラー修正から速度エラーの修正段階へと変化することが明らかになった.このことから予測特性に対する反復訓練によって予測スキル向上の可能性が示唆された.本研究は,仮想環境において運動物体の遮蔽後位置予測課題を用いて実施した.その結果,被験者は,遮蔽された運動物体の速度(予測速度)を実速度より遅く見積もった(予測速度低下現象).このことは運動物体に対応した動作に影響する重要な要因となることから,この現象が生起する原因および予測特性について検討した.眼球運動の解析から,予測速度の低下は遮蔽によって生じること,位置を回答するための情報処理が影響する可能性が示唆された.400回の学習課題の結果から,予測特性に関する学習過程は,位置エラー修正から速度エラーの修正段階へと変化することが明らかになった.このことから予測特性に対する反復訓練によって予測スキル向上の可能性が示唆された.本研究では、捕捉運動を取り上げ、その動作失敗の要因について検討するために、認知・予測・運動制御という一連の動作において、認知・予測能力に着目し、その能力について評価を行った。平成19年度は、運動物体の認知予測特性の評価実験について主に実施した。認知予測タスクと捕捉タスクの検討、仮想環境画像構築、構築システム評価実験については、十分に実施できなかった。これらについては、平成20年度に再度計画することとした。本研究では、物体運動の位置予測タスクを設定し、遮蔽された運動物体の位置予測特性について検討した。遮蔽後の運動物体の予測位置を過小評価することから、遮蔽物体の運動速度(予測速度)は、実際よりも遅く見積もられることが既に判明している。しかし、なぜ遮蔽後は実速度より低下するのか、予測特性における大きな疑問であった。この原因解明のため様々な条件下で実験を行った結果、原因が脳内における運動モデル、すなわち遮蔽後の速度表象にある可能性が見いだされた。Steinbach(1976)は、眼球運動は脳内モデルを反映すると報告しており、このことからタスク中の眼球運動を測定し解析することとした。等速1m/sの運動物体では、遮蔽前は正確に位置の認知が可能であるが、遮蔽後は移動距離を過小評価し、速度を遅く見積もった。眼球運動の速度を視点の移動距離と時間から求め、遮蔽前、遮蔽後について解析すると、遮蔽前は実速度と同じ速度で、遮蔽後は実速度の50%程度で、かつ予測速度と同じ速度を示した。このことから遮蔽後の物体速度の低下は、遮蔽により速度表象が低下することに起因することがわかった。これは予測エラーが、物理的環境ではなく、脳内において構築される心理的運動モデルに影響されるという、ヒトの予測特性を示唆するものである。これは、動作の結果を左右する重用な要素であることから、今後の研究にとって重要な意義を有する。平成19年度における眼球運動の解析によって、遮蔽物体の位置予測課題における遮蔽後の物体速度の低下、すなわち遮蔽物体の予測位置は実際の位置よりも進行方向手前に予測するのは、脳内で作られる遮蔽物体運動速度のモデル(速度表象)が、遮蔽により低下することに起因することが判明した。平成20年度は、前年度に判明した予測特性について更に検討するために、眼球運動の速度表象低下に与える影響、および低下した速度表象に関する学習効果について検討した。速度表象の低下が、眼球運動速度(視点の移動速度)の低下によるものかを検討するために、視点を固定した条件(固視条件)と視点を固定しない条件(自由条件)において、位置予測課題を実施した。その結果、固視条件と自由条件の両条件下において、予測速度(遮蔽物体速度)は、ほぼ同じ速度であった。視点の移動速度は、速度表象を反映するものの視点移動速度、および眼球運動速度の低下により速度表象の低下が生起される者ではないことが明らかになった。一方、遮蔽物体の実速度から大幅に低下した速度表象が、反復練習(学習)により、速度表象がどのように変化するのか、その過程について検討した。実験では、被験者に課題1回ごとに、その時の正解位置をフィードバックする位置予測課題を400回実施した。課題を100回、200回、300回、400回終了した時に、位置予測課題(フィードバック無し)を行い、予測速度を求めた。その結果から速度表象の学習過程は、初期(100回後)において位置の誤差を修正する過程が観察され、その後速度の誤差を修正する傾向が観察された。また、標的速度も通常(15deg/s)、低速(7.5deg/s)、高速(15deg/s)においても同様の傾向を示すこと、その学習効果は、数ヶ月にわたり維持されることが明らかになった。本研究では、捕捉運動を取り上げ、その動作失敗の要因について検討するために、認知・予測・運動制御という一連の動作において、認知・予測能力に着目し、その能力について評価を行った。運動物体を途中で遮蔽し、刺激提示時点における位置を予測する課題によって、認知・予測能力について評価した。

位置予測課題の解析結果から、被験者は遮蔽から刺激提示時までの物体移動距離を過小評価することが明らかになった。平成20年度では、この原因について様々な角度から検討した結果、遮蔽により脳内の運動モデルの速度表象が低下することに起因するとの知見が得られた。平成21年度は、眼球運動の解析から遮蔽がもたらす予測特性への影響について、位置予測課題における回答の有無に着目し、更に検討した。前述の課題において位置予測の回答を要求した場合,視線移動速度に大幅な低下が見られた。回答を要求しなかった場合、視線移動速度の低下は見られなかった。課題における追視条件と固視条件の両条件でも遮蔽から刺激提示時までの物体移動距離の過小評価が見られたことから,追視による眼球運動が予測距離の過小評価の原因である可能性は否定された.したがって,運動物体の遮蔽後位置予測の回答を要求することが、物体移動距離を過小評価する原因である可能性を示唆する新たな知見が得られた。位置予測課題における1タスク(回答)の要求が脳内の運動モデルに影響することは、運動物体に対応する動作を左右する重要な要素であることから、今後の研究において重要な意義を有する。また位置予測課題における回答要求条件(86.3%)が回答要求無し条件(65%)よりも、遮蔽時に視線が先行する試行の出現率が高いという結果が得られた。このことから物体移動距離が過小評価されるメカニズムとして、運動物体から遮蔽板の目盛りへ注意の移動により運動物体の速度表象が失われたとする仮説と、運動物体と板の目盛り両者への注意分割により運動物体の時間表象が失われたとする仮説が考えられた。
遷移金属イオンの生体防御系細胞内での輸送システムの解明と生体安全性との関連評価

マクロファージを銅イオン配合培養液で培養し、定量PCRで調べたところ、細胞膜トランスポーターSLC31A1遺伝子と小胞体トランスポーターATP7A/7B遺伝子及び銅輸送シャペロンATOX1遺伝子の発現は、いずれも銅イオン濃度が200μmol/L以上では低下した。高濃度の細胞内銅イオンが十分排出(輸送)されないと、過剰銅イオンによるDNA傷害(DNA鎖切断)を生じ、細胞死に繋がると考えられた。ヒト単球様細胞THP-1(理研細胞銀行)をフォルボースエステル誘導することによってマクロファージに分化させ遷移金属イオンとチタン粒子を配合する細胞培養液で培養し、生じる細胞傷害を多面的に評価した。具体的な研究成果は下記の通りであった。(1) IC10%濃度の銅イオンを配合する試験培地で培養したマクロファージでは2種類の炎症性サイトカイン(TNF-αとIL-1β)と活性酸素除去酵素(SOD)の産生量に有意な増加が認められた。IC10%濃度の銅イオンはDAPI蛍光染色から核に膨潤、断片化等の障害を生じさせ、8-OHdG免疫染色から遺伝子に酸化的損傷を生じさせ、HEL免疫染色からLOOH・による脂質損傷を生じさせることが示唆された。TEM観察から、IC10%濃度の銅イオンはマクロファージを泡沫化し、核に退行性変化を生じさせることが判明した。銅イオンの細胞内の有意な局在は認められなかった。(2)異なる濃度の銅イオンを配合する試験培地で培養したマクロファージからtotal RNAを採取し定量PCRによって遺伝子発現を調べたところ、銅イオンのメンブレントラフィッキング輸送に関係する複数遺伝子(ATOX1,ATP7A,SLC31A1等)の発現が銅イオン濃度依存的に増加することが確認された。(3) IC90%濃度の銅イオンを配合する試験培地で培養したマクロファージから可溶蛋白質を採取しMALDIToff-mass質量分析を行ったところ、銅イオンが細胞内で蛋白質を変性させ、同時に変性蛋白質の修復を促すHSP70系蛋白の発現を増加させることが確認された。(4)マクロファージはサブミクロンサイズのチタン微粒子を貪食しファゴゾーム内で微細化することが確認された。この時、多量の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6とIL-1β)を産生し周囲組織や遠隔臟器に傷害を及ぼすことが示唆された。ヒト単球様細胞THP-1(理研細胞銀行)をフォルボースエステル誘導することによってマクロファージに分化させ、銅イオンによる細胞傷害を多面的に評価した。(1)銅イオンがマクロファージの3つの銅イオン輸送蛋白質(チャンネルとトランスポーター)の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。細胞膜に存在し細胞外から細胞内へと銅イオンを導入するトランスポーターのSLC31Al遺伝子(CTRI遺伝子)、細胞膜から小胞体(ER)へ銅を輸送するシャペロンATOX1の遺伝子と銅イオンをER内に導入するトランスポーターATP7Bの遺伝子の発現はいずれも銅イオン量の増加に律い一旦増加し,100micro-mol/L以上では低下した。銅イオンが十分排出されないと酸化ストレスが増大し濃度依存的に細胞生存率を低下させると考えられた。(2)IC90濃度銅イオンによって5つの蛋白スポットが有意に発現増加した。質量分析の結果、そのうち4つの蛋白スポットがHeat Shock 70kDa Protein(HSP70)1A/1Bに起因することが確認された。IC90濃度銅イオンはマクロファージ内で蛋白質を変性(架橋、フォールディング妨害)するため、HSP70が多量に産生され蛋白質の変性による悪影響を防ぐ働き(防御)が生じたと考えられた。定量PCR実験結果でもHSP70の合成を誘導するHSP1A/1B遺伝子の発現が50倍程度増加することが確認された。MT1A遺伝子とHMOX1遺伝子の有意な発現増加とRAD51遺伝子の発現低下も観察された。IC90濃度銅イオンは金属イオン解毒蛋白と酸化ストレス緩和蛋白の発現増加を誘導するものの、DNA傷害(DNA strand break)修復酵素の産生低下をもたらすと考えられた。ヒト単球様細胞THP-1(理研細胞銀行)をフォルボースエステル誘導することによってマクロファージに分化させ、銅イオンやTEGDMAモノマーによる細胞傷害性を多面的に評価した。(1)50-500μM塩化銅(II)を培地中へ添加し、経時的にMTSアッセイを行って細胞生存率を調べるとともに、24時間後には透過型電子顕微鏡による観察とCaspase3の活性測定を行った。1時間後と3時間後には、マイクロアレイによってmicroRNAの発現を解析した。その結果、300μM以上の塩化銅(II)存在下では、細胞生存率が有意に低下したが、Caspase3活性の有意な上昇はなかった。

この時、細胞突起は消失して小胞体が膨張し、ミトコンドリアが破壊される水腫様変性像が多数認められた。塩化銅(II)添加3時間後には、let-7a,let-7b,let-7e,let-7f,miR-1等32のmicroRNAが1.5倍以上発現上昇した。300μM以上の塩化銅(II)では、let-7ファミリーをはじめとする多くのmicroRNAが関与して、マクロファージはネクローシスへ向かう可能性が示唆された。これらのmicroRNAは銅イオンの細胞内輸送に深く関与していると類推された。(2)異物代謝酵素遺伝子はIC50濃度(500μM)のTEGDMAモノマーを分解し、アルデヒドを介してアルコール分解物の生成にまで至ったと考えられた。TEGDMAとグルタチオンの抱合も考えられた。抗酸化ストレス遺伝子は過酸化脂質の還元等を行うと考えられた。グルタチオンの欠乏は抗酸化ストレス能力を低下させ、細胞障害に繋がると考えられた。TEGDMAの小さな起炎性はNF-κB経路ではなくMAPK経路によると考えられた。これらの酸化ストレスは遷移金属イオンに暴露されたマクロファージにも生じていると類推された。
18世紀フランスの建築教育におけるデッサンの位置づけに関する研究

本研究は,建築の設計における「デッサン」とは何か,「デッサン」が建築理論や建築家の職能意識のなかで,いかに捉えられていたかについて考察したものである。このテーマのもと,16年度は18世紀フランス王立建築アカデミーの図面を対象とし,デッサンの描き方の変化と建築教育の中でのデッサンの位置づけについて分析した。17年度はより一般的な意味での「デッサン」の意義を検証した。つまり近代以降の西洋建築史において,デッサンのとらえられ方の変容を,建築デッサンの実例や理論書から吟味し考察した。資料はフランスで調査し,文献を収集した。また調査の際18世紀を専門とするパリ第一大学の研究者と意見交換を行ない,さらにパリのInstitute nationaled'histoire d'artにおける国際学会に参加し見知を深めた。本年度の研究でまず,「デッサン」という言葉によって示される図面の範囲についてまとめた。デッサンには建築家の創造した過程が現れているみならず,その描き方や道具から「どのように建築をとらえていたか」さらには,「建築家の職能がどのようなものか」という点と深く関係していることが確認された。描く道具や表現方法は,図面の使用目的に応じたものが選択される。そこで多様な建築家によるデッサンの例から,その表現を比較し,建築のとらえ方の相違を示した。特に17,18世紀に描かれたデッサンからは,建築家の職能の変化を見いだした。建てることと,表現することの違いである。建てることを主としたデッサンと,描くことを主としたデッサンの相違を指摘した。今後の展開としては,例えば19世紀の英国における建築家のデッサンを分析することで,18世紀との比較研究が可能となろう。さらには,19世紀のデッサンから,科学技術の発展とデッサンとの関係を調べ,近代建築における技術と芸術の関係に光を当てる。本年度は,フランス18世紀の建築アカデミーの教育において,設計競技(コンクール)で描かれた図面を対象に,主としてその描き方がどのように変化していったかについてを調査した。海外での調査のための時間がとれなかったため,基本的には,日本で入手可能な資料,主に出版された図集および既往研究書にもとづく分析をおこなった。一次資料の調査と分析は次年度の作業となる。先達の研究をもとにした対象時期の歴史的状況の把握と,次年度の分析の基礎となる基本データの整理をおこない,次年度の調査の方向性を定めた。フランス18世紀の建築アカデミーの教育において1720年より始まったいわゆる「コンクール」は,1793年まで引き続き行なわれ,当時を代表する建築家の登竜門として機能してきた。本年度の調査の分析対象としたのは,これらのコンクールで描かれた図面の内,首席,あるいは2等を得た作品である。そのいくつかは作品集等で出版され見ることができる。これらの図面の描かれ方を比較分析し,その手法の変化を観察した。デッサンに現れた表現方法の変化から読み取れることは,制作の意図が,初期においては建てる技術や建築的寓意の正しい使用を表現するという観点から,後期になるにつれて,新しい建築のイメージを作り上げる創造の観点へと変わっていったという点である。こうした違いは,指導的な建築学校教授であり,また影響力のあった建築家による言説にも現れていた。デッサンの目的が,伝統的に正しい設計図を描くことから,新しい建築のイメージを造り出すことへと変化したのである。今後は,フランスでの一次資料の調査をもとに,描き方の変化のさらに詳細な分析を行なうとともに,先述したデッサンの表現の違いから,建築家の職能としての領域においても,大きな変化が生じてきたことを具体的に明証したい。

今後の展開としては,例えば19世紀の英国における建築家のデッサンを分析することで,18世紀との比較研究が可能となろう。さらには,19世紀のデッサンから,科学技術の発展とデッサンとの関係を調べ,近代建築における技術と芸術の関係に光を当てる。
枯草菌一般ストレス応答システムの構造生物学

本研究では原核生物の一般ストレス応答について、未知のシグナル分子の探索と構造に基づく遺伝子改変を表現型で観察するための分子基盤の構築を目標として、枯草菌の情報伝達機構に関わる蛋白質群の構造機能解析を目的とし、次の2点の研究を進めた。1)ストレス応答にかかわる分子複合体構造:環境応答ストレス情報伝達の巨大ハブ分子であるStressosomeを中心とした結晶構造解析による分子活性制御機構,2)栄養飢餓ストレス分子の同定とその作用機序:未知の飢餓シグナル分子のリレーによる情報伝達機構につき、分子同定と構造に基づくマルチドメインタンパク質の活性化機構.「1)ストレス応答に関わる分子複合体構造の解明」について、Stressosomeを構成するキナーゼRsbTとその基質でSTASファミリに属するRsbSの機能解析と結晶化を行った。その結果、RsbTだけでなくRsbSの機能としてNTP分解活性を有することが明らかとなり、これを受けてRsbS-NTP複合体の結晶化を進めた結果、従来の六方晶系の結晶に加え、新たに斜方晶系で3.0Aの回折能をもつ結晶を得た。現在、ハロゲンで修飾したNTPなどを用いた誘導体結晶の回折データ測定と位相決定に取り組んでおり、並行して得られたNTP活性測定の結果と合わせて、RsbSの構造機能相関の解明を進めている。一方「2)栄養飢餓ストレス分子の同定とその作用機序の解明」については、RsbPの活性化機構を構造の見地から解明するため、我々が解析した非活性型のホスファターゼドメイン構造に基づき、活性化に関与することが報告されているN末端部のヘリックスを伸長した活性型タンパク質の発現系の構築と結晶化を進めた。得られたタンパク質は活性を持たず、また結晶は得られたものが十分な回折能を与えず、解析には至らなかった。活性化に関わる部位の厳密な同定が必要と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。細胞の増殖と代謝を抑制し定常期に移行するストレス応答の機構は微生物に普遍的であり、環境適応に加え毒性発現や二次代謝物生産に関与し微生物の生活環制御に基本的な役割を担っている。本研究では原核生物の一般ストレス応答系について、構造に基づいた遺伝子改変による表現型への影響を直接観察するための分子基盤の構築を目標として、遺伝子改変が容易な枯草菌の情報伝達機構を蛋白質の構造解析と機能解析を組み合わせて解明することを目的とする。このため、以下の二点に着目して研究を進めており、今年度の実績について以下に述べる。1.ストレス応答にかかわる分子複合体構造:ストレス応答を促すキナーゼRsbTについては今年度初めて回折実験可能な結晶が得られた。分解能はまだ低く解析には至っていない。その基質RsbSの結晶化は条件検討を行ってきたものの依然として分解能が不足している。2.栄養飢餓ストレス分子の同定とその作用機序:RsbQ・RsbPは栄養飢餓シグナル分子を受容するタンパク質である。まずRsbQについては、昨年度までに得られた高分解能構造に基づいて、新たに変異体を作成してその反応機序を詳細に解明した。その結果、3つあるチャンネル構造の機能的意義を確認することができた。また、RsbPについては、現在得られている非活性型のホスファターゼドメイン構造に基づき、N末端部を伸長させた活性型タンパク質の発現・精製に成功した。現在結晶化を進めており、すでに得られている他のドメイン構造と溶液散乱構造から、全体構造と活性制御機構を明らかにしたい。また、未知の受容分子を特定するため、定常期枯草菌の細胞抽出液による酵素活性測定を行ってきた。活性画分は得られたものの、再現性に乏しく、分子同定には至っていない。

活性化に関わる部位の厳密な同定が必要と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。上述の2.のテーマのうち、RsbPQと相互作用する栄養ストレスシグナル物質の同定を目指し、定常期枯草菌の細胞抽出液による酵素活性測定を行った。その結果を受けて、候補分子を絞り込んで実施してきたが、さまざまな手法で評価したところ、シグナル伝達には寄与しない可能性が高いことが明らかとなった。活性測定実験は再現性に乏しい問題があり、現在対応を検討している。現在進めている2種のタンパク質(RsbT/RsbS)について、アミノ酸修飾や活性測定などを行って構造機能解析をさらに進める。また、RsbPQと相互作用する栄養ストレスシグナル物質の探索については、蛋白質発現系を大腸菌のみから枯草菌の系にも広げ、枯草菌由来物質を結合した状態でのタンパク質生産とそれによる同定を試みる。また、今年度に導入した培養装置を活用して、構造解析の対象を拡大し、結晶化スクリーニングを効率化する。特に、転写制御に重要な分子の分子間相互作用を解明する目的で、Rsb系によって制御を受ける酵素RNA polymeraseの発現精製系を立ち上げ、結晶化を試みる。