hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NFkB制御と抗EGFR抗体によるKRAS変異子宮内膜癌治療戦略に関する基礎研究

子宮内膜癌における抗EGFR抗体療法は、KRAS変異子宮内膜癌において無効である。KRAS変異の下流にて活性化される主要シグナル経路としてNFkB経路をターゲットとすることで抗腫瘍効果を示す可能性がある子宮内膜癌における抗EGFR抗体療法は、KRAS変異子宮内膜癌において無効である。KRAS変異の下流にて活性化される主要シグナル経路としてNFkB経路をターゲットとすることで抗腫瘍効果を示す可能性がある子宮内膜癌における癌遺伝子KRASの変異は20%前後に認められる。EGFRを介したシグナル伝達系が各種癌の治療戦略の中心となってきており、抗EGFR抗体はすでに実地臨床にて使用されている。将来的に子宮内膜癌における抗EGFR抗体を用いた治療戦略を検討する際、KRAS変異子宮内膜癌は抗EGFR抗体抵抗性を示す可能性がある。本研究は、KRAS変異の下流の責任因子を抑制することで、KRAS変異子宮内膜癌に対する抗EGFR抗体の感受性を増強する可能性を検討する基礎的研究である。これまでの研究により我々はNFkBが責任因子であると仮説を立て、実験を計画している。これまでに入手した子宮内膜癌細胞株におけるKRAS遺伝子変異の有無を確認した。KRAS変異の有無による抗EGFR抗体による増殖抑制効果をIn vitro実験系にて確認したところ、変異株において有意に増殖抑制効果が低いことが示された。KRAS変異により活性化するシグナル伝達系の中でNFkB経路が責任経路であるとの仮定の元、NFkBを抑制すべく、抑制因子である変異型IkB(SR-IkB)をKRAS変異細胞株にレトロウイルスベクター導入し、その表現形を現在評価しているところである。子宮内膜癌における癌遺伝子KRASの変異は20%前後に認められる。これまでの研究により我々はNFkBが責任因子であると仮説を立て、実験を行った。作成したKRAS変異子宮内膜癌モデルにおいてKRAS変異の有無による抗EGFR抗体による増殖抑制効果をIn vitro実験系にて確認したところ、変異株において有意に増殖抑制効果が低いことが示された。KRAS変異により活性化するシグナル伝達系の中でNFkB経路が責任経路であるとの仮定の元、NFkBを抑制すべく、抑制因子である変異型IkB(SR-IkB)をKRAS変異細胞株にレトロウイルスベクター導入し、その表現形を評価したところSR-IkB導入によってKRAS変異細胞株の足場非依存性増殖能、免疫抑制マウスにおける腫瘍像形成能の低下を認めた。野生型KRASを有する子宮内膜癌細胞株に対し抗EGFR抗体を作用させ,増殖抑制効果を確認できる条件下にてNFkBの転写活性をLuciferase reporter assayにて確認したが、低下を認めなかった。KRAS変異子宮内膜癌に対する抗NFkB療法は有効な可能性が示された。抗EGFR抗体療法は単剤では有効性を示さなかったが、野生型KRAS内膜癌細胞の検討からNFkB非依存性の抑制効果が期待されるため、併用療法による上乗せ効果に関して検討する必要があると考えられる。
Wntシグナルネットワークを基盤とした歯槽骨代謝回転制御法の開発

1)Sfrp5による骨量増加作用の解明:骨芽細胞の培養にリコンビナントSfrp5を添加したところ、石灰化結節形成の亢進と骨芽細胞マーカー遺伝子の発現亢進が認められた。そこで、RNAシークエンス法を用いて、Sfrp5添加によって発現が上昇する遺伝子を網羅的に解析した。パスウェイ解析の結果、Hhシグナルが亢進することが明らかになった。さらに、リアルタイムPCR解析を行った。その結果Sfrp5の添加によって、Ihhの発現が促進し、Hhの標的遺伝子の発現亢進が認められた。免疫沈降法と質量分析を用いて、Sfrp5と結合するタンパク質の同定を試みたが、同定には至らなかった。2)Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性化機構の解明:Pkn3阻害剤の探索。破骨細胞の培養において、Pkn3阻害剤Xの効果を検討した。Xは、用量依存的に破骨細胞のアクチンリングの形成および吸収窩形成を抑制した。つまり、破骨細胞の骨吸収活性を抑制した。3)破骨細胞によるスクレロスチン発現抑制機構:破骨細胞特異的Wnt5aコンディショナルノックアウトマウス(Wnt5a-cKO)の解析を行った。メスのWnt5a-cKOマウスは、骨量減少を示した。骨形態計測の結果、骨形成と骨吸収がともに低下した低回転型骨量減少を示した。Wnt5a-cKOマウスの骨組織では、beta-catenin陽性細胞が減少しておりWnt/beta-cateninシグナルが低下していた。さらに、海綿骨においてSostの発現が上昇していた。この結果は、破骨細胞のWnt5aがスクレロスチンの発現を抑制する可能性を示す。Sfrp5による骨量増加作用の解明では、sfrp5が骨芽細胞分化を促進する機構の一端が明らかになりつつある。しかし、Sfrp5がどの分子と結合するかが明らかになっていない。培養実験の結果、Xは破骨細胞による骨吸収を抑制することが示された。しかし、生体内での効果は未知である。1)Sfrp5が結合する分子を明らかにし、どのようにIhhの発現を誘導するかを解明する。卵巣摘出モデルなどを用いて、骨代謝に対するXの効果を生体内で検討する。さらに、Sfrp5の下流でHhシグナルが石灰化に関与するか?ShRNAを用いたノックダウン法やHh阻害剤を用いて検討する。2)骨粗鬆症モデルにおいて、阻害剤Xの効果を検証する。3)Wnt関連遺伝子の発現を解析し、Wnt5acKOの骨形成が低下した機構を明らかにする。1.骨髄細胞由来骨代謝回転促進因子の同定[小林,山下,溝口(連携研究者)]:若齢と老齢マウスとの併体結合における骨代謝回転の解析:全身性に赤色蛍光蛋白質DsRedを発現するマウスと野生型マウスを併体結合した.併体結合した野生型マウスの抹消血を採取し,FACSで解析したところ,33%の細胞がDsRed陽性であった.すなわち,併体結合が成功したことを意味する.2.Wnt阻害因子Aによる骨量増加作用の解明[小林、中村(信州大学整形外科、研究協力者)]:Sfrp5による骨芽細胞分化促進作用の解析:リコンビナントSfrp5を骨芽細胞の培養系に添加し,石灰化を促進することを確認した.Sfrp5がどのようなシグナル系を活性化するか,Real-time PCR法で解析した.その結果,遺伝子Xの発現が上昇していることが明らかになった.3.Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性化機構の解明(上原、小林): Wnt5a-Ror2-Rhoシグナルの下流で機能する可能性のあるPkn3の遺伝子欠損(KO)マウスの骨を解析した.microCTを用いて,大腿骨の骨量を解析した結果,8週齢Pkn3 KOマウスは,骨量増加を呈した.また、骨形態計測および血中骨代謝マーカーの測定を行ったところ,骨吸収不全による骨量増加を示すことを明らかにした.4.Sclerostinの発現を抑制する破骨細胞由来因子の同定(山下,小林):破骨細胞の培養上清を骨細胞およびSclerostinを恒常的に発現するUMR106細胞の培養に添加した.ウェスタンブロット法でSclerostinの発現を検討した.その結果,破骨細胞の培養上清中には,sclerostinの発現を抑制する因子が含まれることを見出した.平成28年度は,以下の項目を実施する計画を立てた.1.骨髄細胞由来骨代謝回転促進因子の同定1若齢と老齢マウスとの併体結合における骨代謝回転の解析.2. Sfrp5による骨量増加作用の解明1Sfrp5による骨芽細胞分化促進作用の解析. 2Sfrp5受容体の解析. 3. Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性化機構の解明1Pkn3 KOマウスの解析.4. Sclerostinの発現を抑制する破骨細胞由来因子の同定.1.の併体結合マウスの解析は難航することが予想された.しかし,併体結合が成功したので,今後実施数を増やすことが可能である.その他の解析は,おおむね予定どおりに進行している.1)Sfrp5による骨量増加作用の解明:骨芽細胞の培養にSfrp5を添加すると、BMP2誘導性の骨芽細胞分化が促進される。

そこで、リアルタイムPCRを用いて骨芽細胞マーカーの遺伝子発現を調べた。Sfrp5の添加により、Osterix, Alpl, Bglapの発現が亢進した。Wnt-beta-cateninシグナルの標的遺伝子であるAxin2およびLef1の発現は、Sfrp5の添加により変化しなかった。この結果は、Sfrp5がWnt-beta-cateninシグナル以外のシグナルを活性化し、石灰化を亢進していることを示唆する。2)Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性機構の解明: Wnt5a-Ror2シグナルの下流で活性化されるRhoエフェクター分子Pkn3の骨吸収における役割を明らかにするため、Pkn3ノックアウトマウス(KO)の大腿骨を解析した。microCT解析では、野生型にくらべ、Pkn3KOの大腿骨の海綿骨量は増加した。骨形態計測の結果、Pkn3KOの骨芽細胞数、石灰化速度など骨形成パラメーターは、野生型と変わりなかった。一方、破骨細胞数に変化を認めなかったものの、Pkn3KOの骨吸収面は、顕著に低下した。また、骨吸収マーカーである血清CTXのPkn3KOで、顕著に減少した。これらの結果は、Pkn3KOマウスでは、破骨細胞の骨吸収機能の低下による骨吸収不全を呈することが明らかになった。破骨細胞前駆細胞を象牙切片上で、RANKLとM-CSF存在下で培養し、破骨細胞形成を誘導した。Pkn3KO由来の破骨細胞前駆細は、野生型と同様に破骨細胞に分化した。一方、骨吸収窩数は、Pkn3KO由来の破骨細胞の培養で、顕著に減少した。以上から、Pkn3は、破骨細胞の骨吸収機能に重要であることが明らかになった。1)Sfrp5による骨量増加作用の解明および2)Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性機構の解明ともにおおむね順調に進行している。1)に関して、Sfrp5の抗体を用いた免疫沈降法で、Sfrp5に結合する分子の同定を試みている。しかし、免疫沈降物のSDS-PAGE解析において、Sfrp5に結合する特異的なバンドが得られていない。1)Sfrp5による骨量増加作用の解明:骨芽細胞の培養にリコンビナントSfrp5を添加したところ、石灰化結節形成の亢進と骨芽細胞マーカー遺伝子の発現亢進が認められた。そこで、RNAシークエンス法を用いて、Sfrp5添加によって発現が上昇する遺伝子を網羅的に解析した。パスウェイ解析の結果、Hhシグナルが亢進することが明らかになった。さらに、リアルタイムPCR解析を行った。その結果Sfrp5の添加によって、Ihhの発現が促進し、Hhの標的遺伝子の発現亢進が認められた。免疫沈降法と質量分析を用いて、Sfrp5と結合するタンパク質の同定を試みたが、同定には至らなかった。2)Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性化機構の解明:Pkn3阻害剤の探索。破骨細胞の培養において、Pkn3阻害剤Xの効果を検討した。Xは、用量依存的に破骨細胞のアクチンリングの形成および吸収窩形成を抑制した。つまり、破骨細胞の骨吸収活性を抑制した。3)破骨細胞によるスクレロスチン発現抑制機構:破骨細胞特異的Wnt5aコンディショナルノックアウトマウス(Wnt5a-cKO)の解析を行った。メスのWnt5a-cKOマウスは、骨量減少を示した。骨形態計測の結果、骨形成と骨吸収がともに低下した低回転型骨量減少を示した。
高精度３次元画像変位計測を用いた橋梁の変形モニタリング

本研究は,橋梁に代表される実大構造物の変形モニタリングの可能性を追求することにあり,具体的には,計測手法および解析コードの開発を行い,さらに実大の橋梁の計測およびモニタリングを実施する.得られた結果は橋梁の強度計算や劣化診断のために提供することを目的とする.平成2325年度において,(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発,(2)実物構造物(鉄橋)の高精度2次元変位計測,(3)高速度カメラ画像のリアルタイム2次元解析,(4)橋梁の長期変形モニタリング,の4項目を実施した.3つの道路橋と1つの鉄道橋の変位を画像計測で計測した.長期モニタリング装置は開発中である.本研究は,橋梁に代表される実大構造物の変形モニタリングの可能性を追求することにあり,具体的には,そのための機器,計測手法および解析コードの開発を行い,さらに実大の橋梁の計測およびモニタリングを実施する.得られた測定結果は基礎データとしてデータベース化し橋梁の強度計算や劣化診断を必要とする技術者・研究者に提供することを目的とする.平成24年度は,23年度の研究にひき続き,橋梁に代表される剛構造建造物の風や地震などによる変形をモニタリングするために以下の3項目の開発と実験研究を行った.(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発(平成2324年度):本計測法の開発とそのソフトウエア開発は平成23度中に動作するものを開発し,24年度は改良を進めた.現在GPUを使用した高速画像相関処理の実現を目指して開発を進めている.(2)実物構造物(鉄橋)の高精度疑似3次元変位計測(平成2324年度):(1)および下記(3)で開発したソフトウエアを使い,バッテリ駆動で動作できる短時間(3時間程度)のモニタリングを実施した.対象は竣工後40年を経過した利根川にかかる栄橋(印西市ー利根町間道路橋)である.重量物の通過に伴う変位を計測できることを確認した.(3)高速度カメラ画像のリアルタイム変位計測(平成2325年度):(1)のリアルタイム画像変位計測のプログラム開発は,高速処理を可能にするGPUのプログラム開発環境を構築し試験プログラムを開発した段階である.本研究は,橋梁に代表される実大構造物の変形モニタリングの可能性を追求することにあり,具体的には,そのための機器,計測手法および解析コードの開発を行い,さらに実大の橋梁の計測およびモニタリングを実施する.得られた測定結果は基礎データとしてデータベース化し橋梁の強度計算や劣化診断のために提供することを目的とする.橋梁に代表される剛構造建造物の風や地震などによる変形をモニタリングするために以下の4項目の開発と実験研究を行った.なお,長期のモニタリングについてはまだ実現しておらず,橋梁の橋桁変位をモニタリングするための小型コンピュータシステムを現在開発している.平成26年6月の完成を目指しており,完成後は橋梁の研究者と協力して計測実験を進めていく.(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発:デジタル相関法を用いたサブピクセル画像追跡コードを作成し,高い分解能で画像追跡が可能なことを確認した.(2)鉄橋の高精度2次元変位計測:高速高精度デジタルカメラを購入した.(1)のソフトウエアを用いて高速度カメラで撮影したビデオ映像を解析することで,画像変位計測の可能性を確認した.(3)高速度カメラ画像のリアルタイム2次元解析:(2)のリアルタイム画像変位計測システムを使って,利根川に架かる栄橋,鉄道橋と100m級の小さな橋の振動変位を計測した.マーカー等を設置せずに橋桁の変位を高精度に計測できることができた.その結果から,通過するペイロードによる橋の特徴的な変形挙動を捉えることに成功した.特に中央に一か所の橋脚がある100m級橋の変位計測では,トラックが橋に乗ると同時に橋全体が変形し振動していることが観測された.(4)橋梁の長期間変形モニタリング:これまでは日中の計測を行った.長期変形モニタリングは,開発中の小型コンピュータの計測システムを用いて,今後,橋梁の専門家の大学教員を協力して実施する予定である.本研究は,橋梁に代表される実大構造物の変形モニタリングの可能性を追求することにあり,具体的には,計測手法および解析コードの開発を行い,さらに実大の橋梁の計測およびモニタリングを実施する.得られた結果は橋梁の強度計算や劣化診断のために提供することを目的とする.平成2325年度において,(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発,(2)実物構造物(鉄橋)の高精度2次元変位計測,(3)高速度カメラ画像のリアルタイム2次元解析,(4)橋梁の長期変形モニタリング,の4項目を実施した.3つの道路橋と1つの鉄道橋の変位を画像計測で計測した.長期モニタリング装置は開発中である.本研究は,橋梁に代表される実大構造物の変形モニタリングの可能性を追求することにあり,具体的には,そのための機器,計測手法および解析コードの開発を行い,さらに実大の橋梁の計測およびモニタリングを実施する.得られた測定結果は基礎データとしてデータベース化し橋梁の強度計算や劣化診断を必要とする技術者・研究者に提供することを目的とする.平成23年度は,橋梁に代表される剛構造建造物の風や地震などによる変形をモニタリングするために以下の3項目の開発と実験研究を行った.3項目とも次年度に継続して開発・改良と実験を進めていく.

(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発(平成2324年度):本計測法の開発とそのソフトウエア開発は平成23年度中に動作するものを開発し,その後改良を進める予定である.平成23年度末の時点で,デジタル相関法を用いたサブピクセル画像追跡のプログラムを作成し,10分の1ピクセル以上の分解能で画像追跡が可能なことを確認した.(2)実物構造物(鉄橋)の高精度疑似3次元変位計測(平成2324年度):本項目のために高速高精度デジタルカメラを購入した.短時間の計測作業を平成23年度は従来の技術により行う予定であったが,計測対象にマーカーを設置することが困難であったため,(1)のソフトウエアを用いて高速度カメラで撮影したビデオ映像を解析することで,画像変位計測の可能性を確認した.(3)高速度カメラ画像のリアルタイム3次元解析(平成2325年度):(1)のリアルタイム画像変位計測のプログラム開発は,高速処理を可能にするGPUのプログラム開発環境を構築し試験プログラムを開発した段階である.現時点では,通常のCプログラムで(1)のリアルタイム処理プログラムが開発できており,100分の1秒ごとに4点の追跡できている.プログラム開発,装置の準備は順調に進展している.実構造物の計測実績はやや遅れているが,現在,利根川にかかる栄橋(築40年経過)を測定対象に選び,バッテリーで駆動できる短時間のモニタリングを行った.当初は数箇所の橋梁についての計測と12時間程度の連続計測は行う予定であったが、現在は栄橋に絞っている.20km程度の範囲で測定対象を探している段階である。また,電源確保の問題があり,連続計測は困難なことがわかった.研究発表については,国際会議での発表を2件,国内講演会での発表を4件行った.(理由)プログラム開発,装置の準備は順調に進展している.実構造物の計測実績はやや遅れているが,現在,利根川にかかる栄橋(築40年経過)を測定対象に選び,計4回の計測を行ったが,当初予定したマーカー設置が困難なため,高速度カメラで撮影できる30秒程度の短時間の計測を多数回行った.当初予定していた数箇所の橋梁についての計測と12時間程度の連続計測は行っていない.また,電源確保の問題もあって,連続計測は困難なことがわかった.次年度は,現有のバッテリー電源を増強する必要がある.研究発表については,国際会議での発表を2件,国内講演会での発表を5件行った.計測手法とプログラム開発については順調に進展しており,予定通り引き続き開発を進めていく.実構造物(橋梁)の計測は鉄道橋を測定対象として追加する予定である.さらに関東圏にある大型の橋の計測も試みる予定である.研究計画書の「(1)パターン認識による高精度・高分解能変位計測法の開発」はほぼ完成しており,次年度からは下記の3項目を推進していく.次年度に項目(3)を実現する計画でプログラム開発を進めている.計測実験は次年度に短時間のモニタリングを実施し,電源の問題が解決ししだい,長期のモニタリングの準備を進めていく.困難な問題としては,長期のモニタリングでは電源の確保と同時に夜間の計測方法を考案する必要がある.マーカー設置が困難な場合は,夜間の計測ができない可能性がある.(3)高速度カメラ画像のリアルタイム変位計測(平成2324年度):現在の開発を継続して進める.
グリーンビルドアッププロセスによる高機能性ナノ結晶表面の創成

本研究では,フラックス概念を導入したグリーンビルドアッププロセスによる高機能性ナノ結晶表面の創成技術の確立を目的とした。平成24年度は,フラックスコーティング法によるNaTaO_3およびTa_3N_5結晶層の作製に取り組んだ。NaTaO_3結晶層の作製では,結晶層の形成メカニズムの解明をめざし,Ta基板表面とNaNO_3の反応によるNaTaO_3、結晶層形成の過程をレーザー顕微鏡およびXRDを用いてIn-situ観察した。2つのIn-situ観察より,昇温過程である435475°CでNaTaO_3結晶が生成していることが明らかとなり,結晶の生成・成長の主な駆動力はNaNO_3、の蒸発であると結論付けた。次に,NaTaO_3結晶の配向制御に注力した。配向を制御するために,基板として特定面をもつ単結晶基板(SrTiO_3)を使用し,Ta源にはスパッタリング法にて基板表面に成膜したTaO_N層を用いた。Na源兼フラックスとしてNaNO_3をTaO_N/SrTiO_3の上に塗布して加熱すると,400nm程度の立方体状NaTaO_3結晶が生成した。結晶は,平坦な結晶面が基板表面と平行になるように成長し,それらの稜の向きはそろっていた。断面TEM観察より,斜方晶NaTaO_3相が立方晶SrTiO_3相(基板)に対して高い整合性をもつことがわかった。Ta_3N_5結晶層の作製では,NH_3気流下でのフラックスコーティング法により,Ta基板表面にTa_3N_5結晶層を形成することを目的とした。NaCl-Na_2CO_3(フラックス)をTa基板表面に塗布してNH_3気流下で加熱すると,平坦な結晶面で囲まれた四角柱状Ta_3N_5結晶からなる結晶層が得られた。結晶層の可視光照射下での光電気化学測定では,約0.4Vからアノード応答が確認され,可視光応答光触媒電極に応用できる可能性が示された。本研究では,フラックス概念を導入したグリーンビルドアッププロセスによる高機能性ナノ結晶表面の創成技術の確立を目的とする。平成23年度は,NaYF_4:Ln(Ln=Yb,Er,Tm)およびNaTaO_3の2種類の結晶層をフラックスコーティング法により作製することをめざした。NaYF_4:Ln結晶層の作製では,溶質としてNaFおよびYF_3を,フラックスとしてNaNO_3およびNaFを,ドーパントとしてYbF_3,ErF_3およびTmF_3を用いた。これらの出発原料に蒸留水を加えてペースト化し,ガラス基板表面に塗布した後,電気炉内で加熱した。その結果,350°Cという比較的低温で高品質な六角柱状のNaYF_4:Ln結晶からなる結晶層を作製できた。980nmのレーザーをNaYF_4:Yb,Er結晶層に照射すると緑色に発光する様子を確認した(蛍光スペクトルからも観察)。このような結晶層で赤外光を可視光に変換できれば,太陽電池の光電変換効率の増加が期待できる。NaTaO_3結晶層に関しては,目的結晶のTa成分を基板から供給する新規フラックスコーティング法にて結晶層形成を試みた。溶質(Na源)兼フラックスとしてNaNO_3,NaOH,Na_2CO_3あるいはNaClを用い,Na源の各試薬の水溶液をTa基板表面に滴下し,電気炉内で加熱した。その結果,Na源にNaNO_3を用い,450700°Cで加熱したとき,高品質な立方体結晶からなるNaTaO_3結晶層を作製できた。Na源や加熱雰囲気が結晶成長に大きく影響することが明らかとなった。また,レーザー顕微鏡を用いた結晶層形成過程のIn-situ観察やビルドアップ形成のメカニズム解明の端緒となる結晶層-基板界面のTEM観察も実施した。

Ta_3N_5結晶層の作製では,NH_3気流下でのフラックスコーティング法により,Ta基板表面にTa_3N_5結晶層を形成することを目的とした。NaCl-Na_2CO_3(フラックス)をTa基板表面に塗布してNH_3気流下で加熱すると,平坦な結晶面で囲まれた四角柱状Ta_3N_5結晶からなる結晶層が得られた。結晶層の可視光照射下での光電気化学測定では,約0.4Vからアノード応答が確認され,可視光応答光触媒電極に応用できる可能性が示された。本研究で目標とした「最低3種類の結晶層の形成」を達成できた。いずれも最先端・次世代デバイスを見据えたターゲット基板上およびその基板の性状を維持できる条件での結晶層の形成に成功している。また,結晶層の形成メカニズム解明や配向制御に向けたIn-situ観察や結晶層-基板界面の観察も実施し,他の結晶層のビルドアップ形成にも応用できる知見が得られた。(1)結晶層形成メカニズムの解明とそれを応用した結晶成長自由制御および(2)最先端・次世代デバイスへの応用と産業化を見据えた課題抽出を進める。結晶層形成過程のIn-situ観察に加え,結晶層を形成する基板種や加熱雰囲気の変更あるいは結晶層形成前・形成途中の基板表面の分析など,間接的な観察・分析から結晶層形成メカニズムを調査する。これらの結果をもとに,結晶形状やそれらの配向制御を試みる。また,作製した結晶層の特性を評価し,基板-結晶(層)界面状態の制御による性能向上や新規特性獲得の可能性を探る。
超低体温法における血管内皮細胞障害の発生機構と対策

超低体温法における血管内皮細胞障害について、血管内皮由来の物質(NOx、エンドセリン(ET)等)測定を行い、低体温の程度による影響について評価を行った。低体温体外循環下に心臓・大血管手術を受ける予定手術患者を対象とし、3436°Cをmildhypothermia群、2530°Cをmoderate hypothermia群、1520°Cをdeephypothermia群と三群に分けた。各々の各ポイントで採血を行いNOx、ET測定を行った。また血管内皮機能検査のため、人工心肺中、大動脈遮断後に潅流圧が安定した時点(低体温時)でアセチルコリン負荷テストを行い、皮膚血流量及び灌流圧を連続的に測定し、比較検討した。現在までの対象症例は50名で、各群において患者の特性、及び循環動態に差はなかった。麻酔導入後の血中NOx、ET濃度を100%としその経過を比較した。体外循環中においては全例血中NOx、ET濃度は有意に減少を示し、回復過程においては低体温の程度が強い症例ほど減少は持続した。アセチルコリン負荷テストでは、低体温の程度が強いほど血管拡張反応が減少し、回復に要する時間は長く経過した。皮膚血流量の減少量と回復過程も同様の結果となった。これらの結果より、低体温体外循環は血管内皮細胞障害を発生させ、内皮機能を有する基礎吋の放出およびETの放出が抑制され、血管緊張度を調節する機能に重大な影響を与えているものと考えられる。この血管内皮細胞障害により、血栓形成や血管彎縮などにより微小循環障害が起こることが推測された。術中の超低体温により血管内皮細胞は障害を受け、血管内皮由来の物質であるNOやET濃度は減少し、血管緊張度を調節する機能が障害された。低体温時に行われた血管内皮に対するアセチルコリン負荷テストにおいても、その反応性は減弱し、機能的内皮障害の存在を示唆した。研究1-超低体温法における血管内皮細胞障害の発生機構と対策において、血管内皮由来の物質測定を行い、低体温の程度による影響について評価を行った。低体温体外循環下に心臓・大血管手術を受ける予定手術患者を対象とし、3436°Cをmild hypothermia群、2530°Cをmoderate hypothermia群、1520°Cをdeep hypothermia群と三群に分けた。各々の各ポイントで採血を行い血管内皮由来の物質(NOx、エンドセリン等)測定を行った。また血管内皮機能検査のため、人工心肺中、大動脈遮断後に潅流圧が安定した時点(低体温時)でアセチルコリン負荷テストを行い、皮膚血流量及び潅流圧を連続的に測定し、比較検討した。現在までの対象症例は27名で、各群において患者の特性、及び循環動態に差はなかった。麻酔導入後の血中NOx濃度をコントロールとすると、体外循環中において、低体温の程度に関係なく全例血中NOx濃度は有意に減少を示した。また、一酸化窒素の代謝産物であるNOxは、尿中NOx濃度においても減少を示した。体外循環離脱後においてもNOx濃度の増加は認められず、減少を示したままであった。現在までの症例では翌日においても変化は認められていない。また、アセチルコリン負荷テストにおいては、低体温の程度が強いほど反応性が少ない傾向になっている。現在までの結果においては、低体温体外循環は血管内皮細胞障害を発生させ、内皮機能を有する基礎的NO放出が抑制されていることが考えられる。また、その障害の程度は一過性の状態ではなく、手術翌日においても持続していることが明らかになった。研究2-研究1の結果より、血管内皮細胞に保護効果のある薬剤を投与し、測定評価をする予定である。

術中の超低体温により血管内皮細胞は障害を受け、血管内皮由来の物質であるNOやET濃度は減少し、血管緊張度を調節する機能が障害された。低体温時に行われた血管内皮に対するアセチルコリン負荷テストにおいても、その反応性は減弱し、機能的内皮障害の存在を示唆した。
検証者限定署名の楕円曲線暗号による実現と高速化に関する研究

初年度、Nyberg-Rueppelメッセージ復元型署名を基本アルゴリズムとする確認者を制限した3つの署名(否認不可署名・確認者指定署名・署名者制限署名)を提案し、一般的なディジタル署名を含む4つの署名のいずれかをパラメータの一つを変更するだけで生成できるプロトコルを示した。この場合、一つのパラメータを変更しただけで得られるディジタル署名がどの方式のものなのか区別がつかないため、複数のメッセージを含むNyberg-Rueppelメッセージ復元型署名を示した上で、それぞれのメッセージにどの署名方式であるかの情報を付加したディジタル署名を与えた。本年度は、Koblitzの提案した楕円ElGamal暗号を基本アルゴリズムとして、Nyberg-Rueppelメッセージ復元型署名と3つの拡張した署名プロトコルへの適応を検討した。また、既に発表されている楕円暗号に対する高速アルゴリズムについても適応性について考察を行なった。Nyberg-Rueppelメッセージ復元型署名を基本アルゴリズムとする確認者を制限した3つの署名(否認不可署名・確認者指定署名・署名者制限署名)を提案し、一般的なディジタル署名を含む4つの署名のいずれかをパラメータの一つを変更するだけで生成できるプロトコルを示した。この場合、一つのパラメータを変更しただけなので、得られるディジタル署名がどの方式のものなのか区別がつかない。そこで、複数のメッセージを含むNyberg-Rueppelメッセージ復元型署名を示した上で、一つのメッセージにどの署名方式であるかの情報を付加したディジタル署名を与えた。
偏光分解分光イメージングによる原子層局所形態・光物性相関の研究

本研究で構築した偏光分解分光イメージング装置を用いて様々な原子層試料の計測を進め、機械剥離法によって準備した原子層物質上の位置に応じた発光強度やバレー分極度を含む光物性の不均一性についての検討を進めた。低温条件下において、単層MoS2の荷電励起子発光の強度とバレー分極の相関について偏光分解分光イメージング測定による検討を行った。データ解析の結果、荷電励起子発光の強度とバレー分極度の間にはほとんど相関が見られないことが明らかとなった。一方、単層WSe2においてバレー分極度と励起子発光強度の相関を検討したところ、単層MoS2の荷電励起子の場合と異なり、場所ごとのバレー分極度と発光強度の間に一定の相関が見出された。さらに検討を進めたところ、これらの結果の違いは、それぞれの原子層物質中の励起子または荷電励起子のバレー緩和時間と、それらの発光寿命の比を通じて理解できることがわかった。単層WSe2試料中で局所ひずみの影響が見られる場所が低いバレー分極度を示すことなど、原子層局所形態・構造とバレー分極度の関連を示唆する結果も得られた。また、バレー分極マッピング測定を、場所による不均一性が小さく明瞭な励起子スペクトルを示す試料上の位置を選び出すことに応用することで、原子層物質の励起子スペクトル、バレー分極度、励起子発光減衰の温度依存性などを再現性よく測定できるようになった。これにより、単層WSe2において、バレー分極マッピングの結果を解釈する上で重要となる弱励起条件下でのバレー分極緩和時間を、様々な温度条件のもとで見積もることができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、遷移金属ダイカルコゲナイド原子層固有の物性の制約を超える光機能の実現に向けて、原子層固有の2次元結晶部分とは質的に異なる人工的な「局所」形態・構造を原子層上に導入する新手法の開拓と、原子層局所形態・構造と光物性の相関を解明することを目指している。28年度は、遷移金属ダイカルコゲナイド原子層の局所形態とバレー分極光物性の相関を明らかにするため、励起波長可変、極低温のもとで、2次元面内の各座標における偏光分解分光スペクトルの測定を行うことができる実験系の構築を進め、左右円偏光発光成分の同時検出による高感度なバレー分極度2次元マッピング(イメージング)測定が可能となった。バレー分極度の2次元マッピングを、単層MoS2や単層WSe2などの原子層半導体材料に適用し、同試料の原子間力顕微鏡像と比較することで、バレー分極度が、原子層半導体上に偶然形成された皺の部分とその他の部分で異なっている様子などを確認することができた。キャリア密度や励起子寿命のばらつきを反映した局所ごとの励起子発光強度とバレー分極度に一定の相関があることを示唆する結果を得た。また、バレー分極マッピングの手法が、試料の均一性などの品質評価にも利用できることを確認できた。励起波長可変のバレー分極度測定からは、励起子と荷電励起子でバレー分極度の励起波長依存性が異なるという、バレー分極の生成と緩和のメカニズムを考える上で重要な結果を得た。バレー分極度の人工的な局所形態・構造の導入については、ナノ粒子を用いた人工的な局所歪みの導入を試みたほか、原子層ヘテロ構造化の技術の高度化についての検討も進めた。28年度には、当初計画の通り、励起波長可変、極低温のもとで、2次元面内の各座標における偏光分解分光スペクトルの測定を行うことができる実験系を構築し、高感度なバレー分極度2次元マッピング(イメージング)測定が可能となった。また、原子間力顕微鏡像(AFM)との比較によって、1マイクロメートル程度(AFMの空間分解能はナノメートルオーダーだが、光の回折限界によりマイクロメートルオーダー程度に制限)の解像度で、バレー分極度の空間依存性と試料上の局所形態の相関を調べることができることを確認できた。これらの実験は、研究計画に照らしてほぼ予定通りに進んでいるため、おおむね順調に進展している、とした。

これにより、単層WSe2において、バレー分極マッピングの結果を解釈する上で重要となる弱励起条件下でのバレー分極緩和時間を、様々な温度条件のもとで見積もることができた。本年度は、昨年度までに構築した偏光分解分光イメージング装置を用いて、様々な原子層試料の計測を行っていく予定である。試料については、原子層科学領域内外でのコラボレーションにより、多種多様な試料を調達し、測定を進める。また、昨年度に引き続き、局所歪みの導入や原子層ヘテロ構造化の技術の高度化を進め、様々な局所形態・構造を有する試料に本測定手法を適用していくことで、原子層局所形態・構造と光物性の相関に関する系統的な知見を得たい。場所ごとに異なる発光スペクトル構造と励起子バレー分極度の相関、及び原子間力顕微鏡像と分光画像の相関の2点に着目して、上記研究を進めていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
湛水条件下でのイネ幼苗の生育向上に寄与する代謝系遺伝子の機能解析

湛水条件下でイネ種子を播種すると、胚乳内のデンプンが糖に変換される。さらに解糖系・エタノール発酵系を活性化させてATPなどのエネルギーを得ることにより、イネは発芽することができる。しかし、芽生えの形態は好気条件下でのものとは異なり、子葉鞘と呼ばれる器官だけが伸長する。湛水条件下での子葉鞘の伸長に、解糖系・エタノール発酵系が必要であることが知られている。本研究ではさらに、エタノール発酵の中間産物であるアセトアルデヒドを酢酸に変換するアルデヒド脱水素酵素(ALDH2)と、酢酸をアセチルCoAに変換するアセチルCoA合成酵素(ACS)の経路も重要であることを明らかにした。これらの経路はイネ発芽時の脂肪酸合成・アミノ酸合成に寄与していることが示唆された。ALDH2とACSをコードする遺伝子は、イネゲノム中にそれぞれ2コピーずつ存在しており、そのうちの1つの遺伝子(ALDH2a, ACS1)の発現は、湛水条件下で発芽させたイネ芽生えの子葉鞘で増大していた。湛水条件下におけるイネの発芽・出芽性と,ALDH/ACSの経路の関係について理解を深めるために、DEX誘導性プロモーターの下流にALDH2a, ACS1 cDNAをアンチセンスの向きにつないだプラスミドを導入した形質転換イネを作出した。現在、T2固定系統を作製中である。本研究期間内に形質転換植物の形質を評価できなかったが、今後、湛水条件下におけるイネの発芽・出芽性を詳細に調査する。本研究により、湛水条件下のイネの発芽・出芽性にエタノール発酵から分岐する新しい代謝経路が車要である可能性を示すことができた。湛水条件下でのイネの発芽、幼苗の生育に重要だと考えられるアルデヒド脱水素酵素遺伝子ALDH2とアセチルCoA合成酵素遺伝子ACSのcDNAクローンを単離し、その一次配列を決定した。その結果、ALDH2、ACSともにイネゲノム中に2個ずつ遺伝子が存在した。さらに個々の遺伝子発現の器官特異性および低酸素条件下での反応性等を調査したところ、ALDH2aとACS1,ACS2が湛水条件下で発芽させたイネ幼苗内で働くと考えられた。ACSの経路によって生成されたアセチルCoAが脂肪酸合成に使用されている可能性が考えられたので、脂肪酸合成部位であるプラスチドにACSが局在するかどうかを解析した。ACS1,ACS2遺伝子のN末端側と緑色蛍光タンパク質GFPの融合遺伝子を作製し、その融合遺伝子をイネ緑葉で一過的に発現させたときのGFPの局在部位を調べたところ、ACS1はプラスチド、ACS2は細胞質に局在するという結果を得た。この結果からACS1が脂肪酸合成に関与している可能性が考えられた。湛水条件下でのイネの発芽、幼苗の生育へのALDH2aとACS1,ACS2の機能を明らかにするために、現在、dexamethazone(DEX)誘導性のプロモーターを用いたALDH2a, ACS1,ACS2のセンス、アンチセンス、RNAiのプラスミドを作製し、イネに形質転換している。今後、これらの形質転換イネを湛水条件下で発芽させ、初期生育を調査する。湛水条件下でのイネの発芽、幼苗の生育へのALDH2aとACS1,ACS2の機能を明らかにするために、dexamethazone (DEX)誘導性のプロモーターを用いたALDH2a, ACS1, ACS2のセンス、アンチセンス、RNAiのプラスミドを作製し、イネに形質転換した。ASC1,ACS2のセンス、アンチセンス、RNAiの形質転換体を用いた予備実験では、ACS1,ACS2と湛水条件下でのイネの発芽、幼苗の生育との間の関連を示すことができなかった。これはACS1とACS2はお互い"redundant"な関係にあるということが原因の一つとして考えられた。

今後、ACS1,ACS2の両方の発現を抑制させた形質転換イネを作製し、ACS遺伝子の機能を調査する必要があると考えられた。また、ALDH2についてはセンス、アンチセンス、RNAiの形質転換体がまだ実験に供試できる段階に至っていないが、ALDHの特異的な阻害剤であるジスルフェラム等でイネ幼苗を処理すると、子葉鞘の伸長が著しく阻害されたことから、ALDH2の発現抑制形質転換イネを用いた湛水条件下におけるイネの発芽、幼苗の生育の調査でも同様の結果が得られると期待される。
針葉樹更新初期に顕在化する近交弱勢遺伝子のゲノムワイド探索

針葉樹の近交弱勢に関連する遺伝子を探索するため、エゾマツ天然木2個体から種子を採取して制御環境下で育成した。親2個体をリファレンスにしてRAD-seq解析を行った結果、4,666座24,276SNPsが得られた。各実生の内的近縁度(IR)と成長に有意な関係はなかったが、IRが高い実生は成長が遅かった。遺伝子座ごとに遺伝子型と成長の関係を調べた結果、96座133SNPの遺伝子型で有意な違いがあった。トドマツのアルビノ黄色個体と健全緑色個体でRNA-seq解析を行った結果、黄色個体の遺伝子発現が緑色個体の30倍以上であった遺伝子のうち、フラボノイド生合成系に関連する遺伝子が有意に高かった。・北海道富良野市岩魚沢保存林の倒木上に成立したエゾマツ実生の樹齢と生残を調べるとともに、11の核マイクロサテライトマーカーで遺伝子型を調べた結果、ヘテロ型の割合が高い実生ほど長く生存することが明らかになった。この結果はOpen J Forestry誌に掲載された。・これらは近親交配の影響と考えられたが、親子解析の結果、自殖のものは存在せず、二親性近交弱勢が関与することにより、近交係数が生育ステージが上がるにつれて低くなるとともに、遺伝構造が弱くなる傾向があることが判明した。この結果は、日本森林学会で発表し、論文として取りまとめる準備をしているところである。・上記と同じ森林のエゾマツ4母樹から種子を精選し、ビニール温室内で120mlコンテナに播種し、その後の成長を調査した。環境条件を排除した状態で、同様にマイクロサテライト遺伝子型と実生の生残、成長を調べた。有意な相関はなかったものの、ヘテロ型の割合が大きいものにサイズの大きな実生が存在する一方、ホモ型の割合が大きいものはサイズが小さいところに集中していた。・同じ富良野市で異なる森林からエゾマツ15母樹の種子を採取し、充実しているが発芽しない種子について、発芽しない理由を調べた。エタノール選抜は精度よく充実種子を選抜できていた。発芽しない理由としては、休眠していること、近交弱勢の両方の影響が考えられたが、これらを分離することは難しかった。・ビニール温室内で環境を制御した中で、母樹を固定した材料を確保でき、すでにマイクロサテライトマーカーでタイピングができている。今後、実生によるサイズの差が大きくなり、近交弱勢が顕在化してくると思われる。成長とマイクロサテライトマーカーによる近交度を検討して、近親交配で成長が減退している実生と他殖で健全な実生を選抜し、RADseqでゲノムワイドに調べることにより、近交弱勢関連遺伝子が探索可能になると思われる。1.エゾマツ天然母樹家系の近交度と成長の関係解明:平成28年度は、平成27年まで育成したエゾマツ天然母樹家系の実生苗について、冬芽形成のデータを得るとともに、樹高、直径などのサイズを測定した。また、各個体から針葉を採取してDNAを抽出し、10個のSSRマーカーでジェノタイピングを行った。母樹と子供群のジェノタイプデータを比較して他殖率を求めたところ、2家系ともに97%を超える値であった。また、成長と近交度の関係を調べた結果、近交度が高い個体で成長が良い個体はなかったものの、近交度が低くても成長が悪い個体と良い個体があり、近交度と成長の間には有意な相関がみられなかった。2.エゾマツddRADリファレンスの作成:ddRADで断片長が長く、デプスが深い良質なデータを取るために、GCリッチな制限酵素を用いた結果、リードの7割以上をマップできることが分かった。これにより、リファレンスに貼り付けたRADのみで解析することで、デプスが深く、得られる配列長が長い、信頼性の高いSNPデータが得られるようになる。現在、天然母樹家系の親であるIW-1とIW-3を対象として、次世代シーケンサーMiseqを用いた解析を行っている。子供群については、同じ制限酵素を用いて、ddRADを行うことで近交度と成長の関係、近交弱勢に関わる遺伝子の探索が可能となる。3.トドマツ自殖系統の作出:平成28年4月に北海道支所構内のトドマツ1個体に袋掛けを行い、高所作業車を用いて自殖花粉を用いた人工交配を行った。軟X線装置を用いて充実種子の選別を行った結果、自殖種子(1500種子)と自然交配種子(400種子)を得ることができた。これらは、2017年春に苗畑に播種して、自殖種子と自然交配種子での発芽率、形態異常、色素異常(アルビノ)、初期成長などの形質を調べる。特に、アルビノではクロロフィル生合成に関わる遺伝子に何らかの異常が起きていることが予想される。エゾマツでは詳細な成長、フェノロジーのデータが得られた。また、エゾマツのゲノムワイドSNP解析をするためのリファレンスゲノムを作成することに成功した。さらに、トドマツの自殖家系を作出することに成功した。針葉樹などの他殖性の植物で近親交配が生じると、普段はヘテロ型で保有されている有害遺伝子がホモ型になって近交弱勢が顕在化し、近親個体が更新初期に消失すると考えられている。本研究では、母樹別に採取した実生個体群を弱ストレス条件下で育成することで近交弱勢を顕在化させ、近交弱勢に関与する遺伝子の特定を目指した。

エゾマツでは、岩魚沢試験地の5個体から母樹別種子を採取し、ハウス内でフェノロジーや成長を調査した。発芽後に針葉を採取してDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカーとRAD-seq法によるSNPマーカーでジェノタイピングを行い、成長データ取得後に乾燥重量を測定した。IW1とIW3を母樹とする実生を対象に、親のRAD-seqデータの7644コンティグをアセンブルした。親データをリファレンスして、IW1とIW3の実生をマッピングしてSNPコールした結果、7387遺伝子座が得られた。座当たり1SNPsのみのデータを使い、内的近縁度(IR)を算出した結果、ほとんどの個体で内的近縁度は高くないことが分かった。内的近縁度が高い3個体は全て樹高が低かったが、IRが低くても樹高の低いものも多くあり、内的近縁度と樹高に有意な関係は見られなかった。次いで、SNPs(各locus1つ)ごとに遺伝子型と全乾重量の関係をクラスカル・ウォリス検定でp < 0.01以下の検定結果となったSNPsを検出した。4958遺伝子のうち、202遺伝子で有意な結果となった。トドマツでは、札幌市内のトドマツ1個体に袋をかけて、自殖種子を作出した。自殖種子を苗畑で育ともにRNAを抽出し、RNA-seqから遺伝子発現解析を行った。遺伝子のデータ健全個体で数リード以下の発現レベルに対して黄色個体での発現が30倍以上の遺伝子セットの中に、フラボノイド生合成系の遺伝子が中立で期待される以上の頻度で出現していることが示唆された。針葉樹の近交弱勢に関連する遺伝子を探索するため、エゾマツ天然木2個体から種子を採取して制御環境下で育成した。親2個体をリファレンスにしてRAD-seq解析を行った結果、4,666座24,276SNPsが得られた。各実生の内的近縁度(IR)と成長に有意な関係はなかったが、IRが高い実生は成長が遅かった。遺伝子座ごとに遺伝子型と成長の関係を調べた結果、96座133SNPの遺伝子型で有意な違いがあった。トドマツのアルビノ黄色個体と健全緑色個体でRNA-seq解析を行った結果、黄色個体の遺伝子発現が緑色個体の30倍以上であった遺伝子のうち、フラボノイド生合成系に関連する遺伝子が有意に高かった。・現在は、8座のマイクロサテライトマーカーでヘテロ接合の割合を調査しているが、近交度を精度よく推定するには、さらに多くの座で調べた方がよい。そこで、実生数が多く得られた2母樹を中心に、さらに7座のマイクロサテライトマーカーで遺伝子型を決定し、近交度を推定する。また、RADseqでSNPタイピングをする際、従来の方法では解読する塩基配列の長さが短いために、近交弱勢関連遺伝子の探索が難しいことが予想される。そこで、まず2母樹についてRADseqをMiseqでより長い断片の塩基配列を解読し、リファレンスを作ることにした。その後、対象の実生について、RADseqを100bpペアエンドで外注する予定である。エゾマツについて、成長の良い個体と悪い個体を選び、ddRADによるゲノムワイドSNP解析を行い、両者で差があるSNPを探索する。さらに、該当SNPを含む塩基配列をベースにして、近交弱勢に関連する遺伝子の探索を行う。トドマツでは、自殖家系と自然交配家系を比較して、自殖家系で見られるであろう色素異常や形態異常の個体について着目し、特にアルビノ個体と健全個体の遺伝子発現解析を行い、近交弱勢によって引き起こされる色素異常に関する遺伝子ネットワークを探索する。
α_1受容体サブタイプ別細胞内局在の細胞虚血時における機能的意義の解析

生細胞でのpH可視化測定今回改良したプローブ遺伝子を生細胞に導入し、可視化測定を試みた。イオノフォア存在下、外液pH変化に依存して蛍光比は変化し、そのpKaは合成蛋白と同様であり、in vitroの結果と同様にS/N比が増大していた。pHプローブ融合α_1受容体の細胞内局在とリガンドによる移動α_<1A>とα_<1B>受容体は膜近傍に集積が認められ、膜近傍に受容体が存在していた。しかし、α_<1D>受容体は細胞膜内側に受容体が存在し、膜への局在は認められなかった。pHの分布を見ると、膜内側のpHはα_<1B>>α_<1A>となっており、受容体の局在部位が異なる可能性がしめされた。またα_<1D>受容体の細胞質中のpHはα_<1A>受容体とα_<1B>受容体の中間の値を示した。NE10^<-7>Mの刺激によりα_<1A>ではpHが低下し、α_<1B>のpHは直ちに上昇し、内側への受容体の有意な集積を認めた。α_<1A>では細胞内への有意な集積は認められなかった。また、α_<1D>は、pHの変化並びに局在の変化は認められなかった。水素イオン濃度による受容体局在変化膜型であるα_<1B>と膜・細胞質型であるα_<1A>、細胞質型α_<1D>受容体局在へのpHの影響を解析するため、細胞外液にNH_4Cl 10mM並びに乳酸1mMを加えることによりpHを変化させた。NH_4Clの投与により、細胞内pHは上昇し、α_<1B>・α_<1A>受容体はpHの上昇に引き続き細胞内移行を示した。移行の程度は、α_<1B>ではNE刺激により軽度であった。一方、α_<1D>受容体では局在の変化は認められなかった。乳酸1mMの投与により、細胞内pHは直ちに低下し、α_<1B>・α_<1A>受容体はpHの低下に引き続き、膜への移行を示した。α_<1D>受容体は細胞内pHの低下による局在の変化は認められなかった。細胞内pHを変えることにより、局在がpHにより制御され、制御機構がサブタイプ毎に異なる事が示された。免疫電顕法による細胞内局在の決定これまでの実験により、α_1受容体サブタイプ毎に、pHからみた局在部位が異なり、その局在の制御メカニズムが異なることが示唆される。細胞内局在部位が不明であり、制御機構の理解は光顕レベルでは困難である。このため、局在マーカーとの共発現実験と平行して、免疫電顕を行い現在より仔細な局在部位の決定を行っている。免疫電顕法による細胞内局在の決定

これまでの実験により、α_1受容体サブタイプ毎に、pHからみた局在部位が異なり、その局在の制御メカニズムが異なることが示唆される。細胞内局在部位が不明であり、制御機構の理解は光顕レベルでは困難である。このため、局在マーカーとの共発現実験と平行して、免疫電顕を行い現在より仔細な局在部位の決定を行っている。細胞虚血時における細胞内局在の機能的意義を解析するため本年度以下の実験を行った。1.生細胞でのPH可視化測定改良したプローブ遺伝子を培養細胞に導入し生細胞レベルでの可視化測定を試みた細胞外液のpHを変えた場合、外液pHの変化に依存してその蛍光強度比は変化し、そのpKaはリコンビナント蛋白と同様であった。今回改良を行ったGFP利用pHプローブは、in vitroの結果と同様に蛍光強度並びに変化の程度が増大しており、S/Nの改善並びに検出力の改善が認められた。2.α1受容体融合pHプローブ安定発現細胞の作出発現量による影響を排除するため、今回Flp-in systemを利用し、CHO細胞に一遺伝子導入された各α1受容体サブタイプ融合PHプローブ安定発現細胞を作成した。3.pHプローブ融合α1受容体の細胞内局在とリガンドによる移動α1A受容体とα1B受容体は細胞膜近傍の蛍光の集積が認められ、細胞膜近傍に受容体が存在していることが示唆された。しかし、α1D受容体はほとんどの蛍光が細胞膜内側からのみ認められ細胞膜への受容体の集積はほとんど認められなかった。一方、pHの分布を見ると、膜近傍のpHは大きな差が見いだされなかったがα1B>α1Aとなっていた、細胞膜内側のpHはα1B>α1Aとなっており、細胞膜内側での受容体の局在部位が異なる可能性がしめされた。またα1D受容体近傍の細胞質中のpHはα1A受容体とα1B受容体の中間の値を示した。NE10-7Mの刺激によりα1Aおよびα1Bの細胞ではpHが低下した。α1A受容体はNE存在下ではPHは低下したままであった。しかし、α1B受容体のpHの低下は一過性であり直ちにpHは上昇に転じ、細胞内への受容体の有意な集積を認めた。pHの上昇を示さないα1A受容体では1時間観察しても細胞内への有意な集積は認められなかった。また、α1D受容体は、有意なpHの変化並びに局在の変化は認められなかった。本年度の成果をもとに、次年度は細胞内pH変化によるHによる局在変化と機能の関連について検討を行い虚血モデルヘの適応を目指す。細胞虚血時におけるα1アドレナリン受容体の細胞内局在の機能的意義を解析するため本年度以下の実験を行った。1.細胞内イオン濃度による受容体局在変化細胞膜局在型受容体であるα1B・細胞膜・細胞質局在型であるα1A・細胞質局在型α1D受容体それぞれの局在調節に関わる細胞内pHの影響を解析するため、細胞外液にNH4Cl 10mM並びに乳酸1mMを加えることにより細胞内pHを変化させた。NH4Clの投与により、細胞内pHは直ちに上昇し、ほぼ一定のpHを観察時間維持していた。α1B・α1A受容体はpHの上昇に引き続き細胞内への移行を示した。またその細胞内移行の程度は、α1B受容体ではリガンド刺激による移行に比べて軽度(40%)であったが、α1A受容体では受容体刺激による細胞内移行は認められ無かったが、pH上昇により細胞内移行を認め、異なるメカニズムにより局在が制御されていることが示唆された。一方、α1D受容体はpHの上昇による細胞内局在の明らかな変化は受容体刺激の時と同様に認められなかった。また、乳酸1mMの投与により、細胞内pHは直ちに低下し、ほぼ一定のpHを観察時間維持していた。α1B・α1A受容体はpHの低下に引き続き、細胞内から細胞膜への移行を示した。α1D受容体は細胞内pHの低下による細胞内局在の明らかな変化はpH上昇時と同様に認められなかった。
無限記号列の変換理論研究

研究代表者らは、無限の(計算)過程を解析するための基本的枠組みや、最近活発に研究されている力学系やフラクタル理論において、無限記号列が重要な役割を果たしているのに注目し、本研究課題のもとで、無限記号列の構造や有限状態機械による変換の理論、またそれに関連する問題について研究を進めてきた。研究代表者や分担者らの研究効果の主なものとしては、次のようなものがある。1.無限記号列の集合(ω言語)がリテラルシャッフルのもとで閉じているか否かの必要十分条件を示し、有限状態機械で受理される無限記号列の集合(ω正則言語)のリテラルシャッフルのもとでの閉包性を明らかにした。2.ゲーム理論の数理論理学への応用のための、ゲーム論理を構築し、そのモデルについての研究を進めている。3.また各研究分担者は、それぞれの専門分野を活かし、別表のような成果を得ている。この結果、無限記号列の研究のゲーム理論への応用など、研究の新たな広がりも見られた。また、無限記号列の構造や変換の理論的研究には、解決しなければならない問題が多く、これからの研究に残された部分の多いことも明らかになった。研究代表者らは引き続き、本研究に関連する課題での研究を継続していく予定である。