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中脳ドパミンニューロンの障害における活性窒素種の複合的作用の解明

パーキンソン病に見られる中脳黒質ドパミンニューロンの選択的な変性誘導における酸化的ストレスの役割について、活性窒素種および関連化合物の作用を中心に解析した。1.リポ多糖刺激によって培養中脳切片のミクログリアを活性化すると、誘導型-酸化窒素(NO)合成酵素の発現増大とNO産生の増大を介してドパミンニューロン死が誘発された。スーパーオキシドの消去はこのニューロン死誘導を抑制しなかったが、JNK阻害薬やα-tocopherolはNO産生に影響を与えずにドパミンニューロン保護効果を示した。一方、培養中脳切片へのトロンビンの処置により誘導されるドパミンニューロンの変性は、複数のMAPキナーゼファミリーの活性化とその後のNO合成酵素の発現増大を伴っており、それらの阻害やミクログリアの除去はドパミンニューロン死を顕著に抑制した。したがって、トロンビンはミクログリアの活性化とNO産生増大を介してドパミンニューロンに対する選択的毒性を発現することが示唆された。2.チロシンとNO関連分子種との反応で生成する3-ニトロチロシン(3-NT)は、培養中脳ドパミンニューロンの変性を誘発した。この毒性発現にはアミノ酸トランスポータを介する3-NTの細胞内取込みが必須であり、また3-NTの処置はスーパーオキシド産生を促進することなどから、3-NTは細胞内でのスーパーオキシド発生源となってドパミンニューロンの変性誘導を促進することが示唆された。3.SH-SY5Y細胞において家族性パーキンソン病原因遺伝子産物の一つであるDJ-1の発現を抑制すると、6-OHDA、H_2O_2、NOドナー等の細胞毒性が増強された。またSH-SY5Y細胞やC6細胞にH_2O_2を処置するとDJ-1の発現が増大したことから、DJ-1が酸化的ストレスに対する内在性防御機構の一部として働いている可能性が示唆された。パーキンソン病において認められる中脳ドパミンニューロンの変性における活性窒素種および関連化合物の役割について検討した。1.リポ多糖処置によって培養中脳切片内のミクログリアを活性化すると、誘導型一酸化窒素(NO)合成酵素の発現増大とそれに伴うNO産生の増大を介してドパミンニューロン死が誘発された。この時、SODおよびcatalase、あるいはSOD/catalase様活性を有するEUK-134の処置はドパミンニューロンに対して保護効果を示さなかった。また、主要なsuperoxide発生源と考えられるNADPHoxidaseの阻害薬は高濃度で適用した場合にのみドパミンニューロンを保護したが、この時NO産生量も同時に減少していた。したがって、ミクログリア由来のNOはsuperoxideとの反応によるperoxynitriteの産生を介さずにドパミンニューロンの障害を誘発するものと結論された。2.チロシンとNO関連分子種との反応で生成することが知られる3-ニトロチロシン(3-NT)は、濃度および時間依存的に培養中脳切片内のドパミンニューロンの変性を誘発した。3-NTのドパミンニューロンに対する障害は、大過剰の中性アミノ酸(tyrosine、isoleucine)によって顕著に抑制されたことから、アミノ酸トランスポータを介する細胞内への取込みが3-NT毒性の発現に必須であることが示唆された。また、3-NTの処置は切片内のsuperoxide産生を促進すること、3-NT毒性がEUK-134、アスコルビン酸、および鉄キレータのdeferoxamineによって抑制されることも明らかになった。

したがって、3-NTは細胞内でのsuperoxide発生源となることによって、ドパミンニューロンの障害を増悪する要因として働く可能性が示された。炎症性応答を伴うミクログリアの活性化がパーキンソン病において認められる中脳ドパミンニューロンの変性に関与すること、および家族性パーキンソン病原因遺伝子産物の一つであるDJ-1が酸化的ストレス制御機能を有することが示唆されており、これらの点について活性窒素種の関与を中心に検討した。1.培養中脳切片にトロンビンを処置すると、切片内のドパミンニューロンに対して選択性を呈する神経毒性が発現した。トロンビン処置により誘導されるドパミンニューロンの変性は、MAPキナーゼファミリーの活性化とその後の誘導型一酸化窒素(NO)合成酵素の発現増大、NO産生の増大を伴っており、MAPキナーゼあるいはNO合成酵素の阻害はトロンビン誘発ドパミンニューロン死を顕著に抑制した。また、クロドロン酸を前処置することによって切片内のミクログリアを予め除去しておくと、トロンビンによるドパミンニューロンの変性誘導は妨げられた。一方、切片内のドパミンニューロン以外の細胞の障害に対して、NO合成酵素の阻害やミクログリアの除去は無効であった。以上のことから、トロンビンはミクログリアの活性化とNO産生増大を介してドパミンニューロンに対する選択的毒性を発現することが示唆された。2.SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞において内在性DJ-1の発現を抑制すると、6-ヒドロキシドパミン、過酸化水素、NOドナー等の細胞毒性が有意に増強された。またSH-SY5Y細胞やC6ラットグリオーマ細胞に低濃度の過酸化水素を処置するとDJ-1の発現が増大した。これらの結果は、DJ-1が酸化的ストレスに対する内在性防御機構の一部として働いており、活性窒素種により誘導される細胞障害の制御においても重要な役割を担っている可能性を示している。
吸入麻酔薬のポストコンディショニング効果におけるGLP-1受容体の役割

マウスの心筋虚血再灌流モデルを用いて,心筋梗塞サイズを測定することで,吸入麻酔薬イソフルラン・グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)にポストコンディショニング刺激による心筋保護作用が存在することを確かめた。また,この吸入麻酔薬の心筋保護作用にGLP-1受容体が関与していることを明らかにした。さらに,GLP-1受容体を介した吸入麻酔薬の心筋保護作用に関連する作用経路についての考察を加えた。マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定した。その後、心臓冠動脈左前下行枝を30分間閉塞し、2時間の再潅流を行った。虚血末期から再潅流早期にかけてイソフルランの吸入を5分間行い、再び冠動脈を閉塞、Evans Blueを注入し心臓を取り出す。心臓をスライスし、Triphenyltetrazolium chlorideにて再染色を行い心筋梗塞サイズを測定した。GLP-1誘導体であるExendin-4、GLP-1受容体拮抗薬Exendinをイソフルランのポストコンディショニング刺激に併用し、同様の虚血再潅流実験を行ない、GLP-1のAPostC作用に対する影響を明らかにした結果、イソフルランは心筋保護作用を有し、GLP-1受容体はその作用を増強、受容体拮抗剤では祖の心筋保護作用が棄却された。申請書記載の計画通り実験1が進行しているため。{マウスin vivo虚血再潅流モデルにおいて、APostC群(対照群)とAPostC+GLP-1受容体阻害薬投与群の心筋梗塞サイズを測定比較し、APostC作用の関与を明らかにした。}マウスの心臓の冠動脈を30分間虚血し、その後2時間再灌流を行う虚血再灌流実験を施行した。虚血再灌流の直後に、心筋保護作用を期待するポストコンディショニング刺激としてGLP-1 (グルカゴン様ペプチド)誘導体であるExendin-4を投与したGLP-1群、吸入麻酔薬のイソフルランを1MAC(Minimum Alveolar Concentration)で5分間投与した群の刺激を行った群を作成した。それらの心臓を取り出し、ホモジナイズし、タンパク定量を行い心筋保護ポストコンディショニング作用のメディエイターと考えられているタンパクが増加しているかどうかをイムノブロッティング法にて検討した。何も刺激をしていない虚血再灌流のみのコントロール群と比較した結果、Akt、GSK3β、PI3Kのタンパク発現がイソフルランおよびGLP-1によってポストコンディショニング刺激を行った場合に増加していることが明らかとなった。さらに、摘出心臓を用い組織切片を作成し、GLP-1受容体抗体とメディエイターの抗体とを共に蛍光抗体反応させ、共焦点顕微鏡を使用しタンパクの局在を同定した。その結果、イソフルランによるポストコンディショニング刺激を行うとGLP-1受容体抗体(赤色蛍光物質を結合)と上記タンパク質(緑色蛍光物質を結合)が共発現している黄色発光割合がコントロール群と比較して増加していることが共焦点顕微鏡にて認められた。これらの結果からイソフルランにおけるポストコンディショニング様心筋保護作用はAkt、GSK3β、PI3Kの経路を介し、それらの発現にはGLP-1受容体も重要な役割を演じていることが明らかになった。今後は、申請書記載の実験2を進めていくことで、イソフルランの心保護作用について明らかにする予定である。麻酔科学平成27年度3月納品となり、支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。平成28年4月に支払予定である。
樹状細胞を用いた選択的免疫応答の制御と免疫療法への応用

免疫担当細胞間の相互作用を人為的に操作し治療に応用するという免疫療法は従来の治療法で克服できない疾患に対する新たな試みとして注目されている。抗原提示細胞にひとつである樹状細胞(DC)は強力な抗原提示能を有し、生体内ではT細胞による獲得免疫の中心的役割を果たしている。DCの強力な抗原提示能を利用し、癌患者で癌細胞に特異的な免疫応答を誘導し、癌細胞を排除しようとする免疫療法が世界中で試みられている。一方、DCにはその表面マーカー、形態、分化過程などから数多くのサブセットが存在し、一部のサブセットはT細胞の免疫応答を抑制する作用を有することが知られている。本研究ではこの点に着目し、DCの中でT細胞の免疫応答を抑制するサブセットを同定し、それらを用いて自己免疫疾患に対する選択的な免疫療法を開発することを目的とした。まず、モデル抗原として破傷風トキソイドを用いて、末梢血中のHLA-DR^+CD4^+CD11b^-の形質細胞様DCまたはDC2の前駆細胞(pDC2)がT細胞の抗原特異的なアナジー(至適な抗原刺激を受けても反応しない状態)を誘導することを明らかにした。さらに、自己免疫疾患として強皮症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗リン脂質抗体症候群、重症筋無力症を対象疾患とし、それぞれの疾患において病因と関連する自己抗体の産生を誘導する自己反応性CD4^+T細胞を同定した。強皮症とITP患者では、自己抗原をパルスしたpDC2を用いて自己反応性T細胞のアナジーの誘導が可能であった。したがって、抗原をパルスした自己pDC2を投与することで自己反応性T細胞の選択的なアナジーが誘導できる可能性が示された。同様の手法はアレルギー性疾患や移植後の拒絶反応に対しても応用可能であり、今後倫理的な問題が解決されれば難治性患者に対するpDC2を用いた免疫療法を行う予定である。平成9年度は,樹状細胞(DC)を用いた免疫療法(特に自己反応性T細胞のanergyの誘導)についてのin vitroでの基礎的実験と対象疾患における抗原特異的な自己反応性T細胞または細胞障害性T細胞の検討を行った。DCの免疫調節機能を調べるため,まず強皮症患者からトポイソメラーゼI(トポI)を認識する自己反応性T細胞クローン株を樹立した。これらトポI反応性T細胞クローンをT細胞エピトープを含むペプチドとともに各種抗原提示細胞と培養し、自己反応性T細胞のanergyの誘導を検討した。抗原提示細胞として,自己末梢血より分離したDC,単球,B細胞,GM-CSFで活性化させたDCを用いた。その結果,HLA分子を発現するがcostimulatory分子を欠如する末梢血中の未熟なDCは,抗原存在下で抗原特異的なanergyを誘導することを確認した。対象疾患の中で,今年度は自己免疫性血小板減少性紫斑病(AITP)と多発性骨髄腫について検討した。AITP患者の抗血小板抗体の認識する主要な抗原である血小板膜表面糖蛋白GPIIb-IIIaをアフィニティーカラムで精製し,これら精製抗原を用いてAITP患者末梢血中にGPIIb-IIIaと反応するT細胞の検出に成功した。現在,GP-IIb-IIIa反応性T細胞クローン株の樹立とT細胞エピトープの同定を行っている。多発性骨髄腫では,患者骨髄から得られた骨髄腫細胞の免疫グロブリン遺伝子の解析を行い,リコンビナントの可溶性Fab鎖の発現に成功した。

骨髄腫細胞を標的としてT細胞の特異的増殖反応を確認しており,現在活性化DCとFab鎖を用いて細胞障害性T細胞の誘導を試みている。樹状細胞(DC)を用いた癌特異免疫の誘導は最近多くの研究施設で試みられているため、平成10年度は他施設で行われてないDCを用いた自己免疫応答の抑制に注目した。自己免疫疾患として免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)と抗リン脂質抗体症候群(APS)における病因的T細胞を解析し、さらに自己反応性T細胞のanergyの誘導についてのin vitroでの基礎的実験を行った。ITPでは抗血小板抗体の主要な抗原である血小板膜蛋白GPIIb-IIIaと反応するT細胞、APSでは抗リン脂質抗体の対応抗原であるβ2グリコプロテインIと反応するT細胞を検出するin vitroの系を確立した。現在、これら抗原特異的T細胞クローン株の樹立とT細胞エピトープの同定を行っている。強皮症患者から樹立したトポイソメラーゼI(トポI)を認識する自己反応性T細胞クローン株を用いてDCの免疫調節機能を調べた。トポI反応性T細胞クローンをT細胞エピトープを含むペプチドとともに各種抗原提示細胞と培養し、自己反応性T細胞のanergyの誘導を検討した。抗原提示細胞として自己末梢血より分離したDC、単球、B細胞、GM-CSFとIL-4で活性化させたDCを用いた。その結果、HLA分子を発現するがcostimulatory分子(CD80など)を欠如する末梢血DCは抗原存在下で抗原特異的なanergyを誘導することを確認した。本年度も樹状細胞(DC)を用いた抗原特異的な免疫抑制による自己免疫疾患の治療を中心に検討を進めた。免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗リン脂質抗体症候群(APS)、重症筋無力症(MG)を対象とし、各疾患における病因的T細胞の検出およびその解析を継続した。さらに、これまでの検討から末梢血中の未分化なDCが自己反応性T細胞の選択的anergyを誘導することが明らかになっており、免疫療法への応用を念頭におき今年度は未分化DCの効率のよい回収法についても検討した。ITPでは抗血小板抗体の主要な抗原である血小板膜蛋白GPIIb-IIIaと反応するT細胞、APSでは抗リン脂質抗体の対応抗原であるβ2グリコプロテインIと反応するT細胞、MGではアセチルコリン受容体と反応するT細胞を検出するin vitroの系を確立した。ITPとAPS患者からは抗原特異的T細胞クローン株の樹立に成功し、多くのT細胞株がB細胞からの自己抗体産生を誘導するヘルパー活性を有しており、病態と関連することを見出した。末梢血中の未分化DCは回収率が低く、10^7個の特異的T細胞のanergyを誘導するのに十分な数を得るのに末梢血200ml以上が必要であった。そこで、今年度はフローサイトメトリーによるソーティング、磁気結合モノクローナル抗体などを組み合わせて回収率の改善を試みたが、よりよい分離法は見いだせなかった。したがって、末梢血からの分離より造血幹細胞からの誘導について検討する必要があり、来年度への課題とした。免疫担当細胞間の相互作用を人為的に操作し疾患を治療するという免疫療法は、従来の治療法が無効の疾患に対する新たな試みとして注目されている。本研究の目的は抗原提示細胞にひとつである樹状細胞(DC)を用いて自己免疫疾患に対する新たな治療法を確立することである。これまでの3年間の研究成果により、末梢血中のHLA-DR^+CD4^+CD11b^-のplasmacytoid
オリエンテッドアタッチメントによる結晶成長の解明とナノ材料合成への応用

本研究では、多様な物質系を用いてナノスケールの矩形ユニット粒子のオリエンテッドアタッチメント現象を検討した。第1には、既存の酸化マンガン矩形ブロックにおいて、安定化分子や集積条件を最適化し、位置や配列を任意に制御した多様なオリエンテッドアタッチメントの方法を開発した。第2には、アナターゼ型二酸化チタン・水酸アパタイト・カルサイト型炭酸カルシウムの矩形ナノブロックの合成と配列に取り組み、多様な物質系におけるオリエンテッドアタッチメント現象を確認した。これらの結果より、ナノユニットを自在に連結させるオリエンテッドアタッチメントの技術的基盤の確立に成功した。数ナノメートルの小さなユニットが配向して連結していく「オリエンテッドアタッチメント」によって結晶が成長するという現象が報告されている。本研究では、ナノ粒子のオリエンテッドアタチメント現象を、特定の媒質系を用いて自在に発現・制御し、そのプロセスの詳細な観測から理論を構築するとともに、多様な物質系における任意のサイズ・形状・サイトのオリエンテッドアタッチメントによる結晶材料合成プロセスを発展させることを目的とする。平成27年度は以下の4点について取り組み、それぞれについて成果が得られている。(1)酸化マンガンナノブロックの安定化について媒質の種類や両親媒性分子の関与を検討した。その結果、オレイン酸によって被覆された疎水性ナノブロックの特定面(c面)のみを分子交換によって親水化し、これまで疎水媒質中でa軸方向に一次元配列する特性をもつナノブロックを、同じ媒質中でc軸方向の一次元に配列することが可能となった。(2)二酸化チタンのナノブロックの合成に取り組み、その配列制御を試みた。エタノール媒質中でオレイン酸およびオレイルアミンを添加剤とすることで矩形ナノブロックを合成し、媒質環境によってa軸一次元配列およびa軸二次元配列の作り分けを達成した。(3)水酸アパタイトのナノブロックを水熱合成し、オレイン酸およびテトラオクチルアンモニウムを添加してトルエンあるいはエタノール中に分散させた。媒質および分子の選択によって、a軸方向およびc軸方向の一次元配列を実現した。(4)カルサイト型炭酸カルシウムナノブロックを水酸化カルシウムの炭酸化によって合成し、pH条件および衝突頻度の増加によってc軸方向の一次元配列が生じることを見出した。前述のように、2種類の酸化物、リン酸塩、炭酸塩系結晶において、ほぼサイズと形状がそろったナノブロックの合成条件を明らかにするとともに、添加分子や媒質の環境設定によって配向性を制御した配列現象を見出した。これはナノブロックの合成とその秩序配列が普遍的に起こり得ることを示している。これは、当初に計画した多様な物質系におけるオリエントアタッチメント現象の解明と制御の大きな手がかりを提供するものである。したがって、本研究課題は、おおむね順調に進展していると言える。平成28年度は以下の3点について取り組み、成果が得られている。(1)オリエンテッドアタッチメント現象の制御性を発展させるために、酸化マンガンナノブロックの移流集積における集積速度の関与を検討した。ナノブロックの配列環境の制御によって集積速度を小さくすると、これまでよりもナノブロックが稠密に充填した2次元配列が得られた。これは、集積条件によって配列構造のコントロールが可能であることを示す知見である。(2)これまでに酸化マンガンと二酸化チタンのナノブロックの合成に成功しているが、本年度にはさらに多様な物質系への応用の一つとして、チタン酸バリウム、チタン酸ストロンチウム、ストロンチウムドープチタン酸バリウム、サマリウムドープ酸化セリウム、白金、パラジウムなどの矩形ナノブロックの効率的な合成に成功した。これによって、多様な集積構造の形成に向けて多種のナノブロックのライブラリーが構築できると考えられる。(3)これまでに、カルサイト型炭酸カルシウムナノブロックを水酸化カルシウムの炭酸化によって合成し、c軸方向の一次元配列が生じることを見出している。今年度は、配列環境の制御によって、カルサイトナノブロックの三次元的な配向集積が生じることを明らかにするとともに、新たに{104}面を介した配向集積と可逆的な開裂現象を見出した。平成28年度における成果とは、(1)ナノブロックの配列環境の制御によるオリエンテッドアタッチメントによる稠密に充填した2次元配列の形成、(2)多様な物質系(チタン酸バリウム、チタン酸ストロンチウム、ストロンチウムドープチタン酸バリウム、サマリウムドープ酸化セリウム、白金、パラジウム)の矩形ナノブロックの効率的な合成、(3)カルサイトナノブロックの三次元的な配向集積および{104}面を介した配向集積と可逆的な開裂現象の発見、という3点である。これらの成果は、集積条件によってオリエンテッドアタッチメントによる配列構造のコントロールが可能であること、多様な集積構造の形成に向けて多種のナノブロックのライブラリーが構築できることを示している。このような、酸化物・金属・炭酸塩系においてナノブロックの合成条件を明らかにすること、および環境設定によって配向した配列現象が普遍的に見出されることは、多様な物質系におけるオリエントアタッチメント現象の制御の進展に対して大きな知見を与えるものである。すなわち、これらの成果から、当初に計画した多様な物質系におけるオリエントアタッチメント現象の制御という目的に対して研究がおおむね順調に進展していると考えられる。

数ナノメートルの小さなユニットが配向して連結していく「オリエンテッドアタッチメント」によって結晶が成長するという現象が報告されている。本研究では、ナノ粒子のオリエンテッドアタチメント現象を、特定の媒質系を用いて自在に発現・制御し、そのプロセスの詳細な観測から理論を構築するとともに、多様な物質系における任意のサイズ・形状・サイトのオリエンテッドアタッチメントによる結晶材料合成プロセスを発展させることを目的とする。これまでの研究で、多様なナノブロックの合成条件を明らかにするとともに、環境設定によって配向した配列現象が普遍的に見出されることを示し、多様な物質系におけるオリエントアタッチメント現象が見出されている。平成29年度は、特に制御が容易であり、バイオミネラルとの関連性が深いカルサイト型炭酸カルシウムナノブロックに注目し、ナノブロックの形成過程とオリエンテッドアタッチメントによる集積過程およびその開裂過程を詳細に検討した。その結果、以下の2つの成果が得られている。(1)水酸化カルシウムの炭酸化によってカルサイト型炭酸カルシウムが合成される過程で、微小なナノロッドが形成し、それらがオリエントアタッチメントによって成長することを確認した。これは、バイオミネラルに多くみられる身近な無機結晶の水溶液中の形成・成長においても、オリエントアタッチメントが重要な役割をもつことを示唆している。(2)カルサイト型炭酸カルシウムのナノロッドを有機媒質に分散させ、その媒質の蒸発にともなって基板上に移流集積させることで、ナノロッドの伸長方向がそろって配列した膜状構造の形成に成功した。さらに、この配列時に強磁場は印可することで、ナノロッドは完全に結晶方位をそろえて配列して単結晶類似の構造体が得られた。これは、オリエンテッドアタッチメント現象を利用した結晶成長技術の基盤となる重要な知見である。本研究では、多様な物質系を用いてナノスケールの矩形ユニット粒子のオリエンテッドアタッチメント現象を検討した。第1には、既存の酸化マンガン矩形ブロックにおいて、安定化分子や集積条件を最適化し、位置や配列を任意に制御した多様なオリエンテッドアタッチメントの方法を開発した。第2には、アナターゼ型二酸化チタン・水酸アパタイト・カルサイト型炭酸カルシウムの矩形ナノブロックの合成と配列に取り組み、多様な物質系におけるオリエンテッドアタッチメント現象を確認した。これらの結果より、ナノユニットを自在に連結させるオリエンテッドアタッチメントの技術的基盤の確立に成功した。本研究の第二段階では構造構築に向けた物質選択をおこない、そのオリエンテッドアタッチメントによる結晶作製のための基本コンセプトと実際的な方法論の確立を目指す。
マイクロ光造形法を用いたマイクロ集積流体システムの研究

現在,バイオ,医療,生化学などの分野では,化学分析,合成装置のマイクロ化が期待されており,筆者らはマイクロ集積流体システム(Micro Integrated Fluid System:MIFS)を提案し,研究を行ってきた.MIFSの基本概念は,シリコンプロセスで製作するセンサ,演算回路を含む基盤上に,マイクロ光造形法を用いて立体的で広範な容量に対応した流体回路部を一体成型するものである.近年,MIFSの概念を一般化学反応からさらに広げて,生化学ICへと発展させている.今回,細胞を用いない無細胞タンパク合成を目的とした生化学反応の検出及び制御を行うため,光センサ,増幅回路を含むシリコン基盤上に,マイクロ光造形法を用いてリアクタ,流路を設計し,光センサ型マイクロリアクタを製作した.さらに,タンパクの合成検出を確立するため,同様の化学発光反応の1つであるルミノール反応を用いて,化学反応のリアルタイム制御実験を行った.この実験結果から,フィードバック制御システムの有効性を実証でき,光センサ型マイクロリアクタシステムでかなり広範囲な反応を制御できることを確認した.また細胞外タンパク合成の材料としてホタルの発光酵素であるルシフェラーゼを用いて検出実験を行った.この実験では,微小空間における生化学反応を実現でき,また,極微量の生化学反応を検出することに成功した.これより,フィードバック反応制御システムがタンパク合成などの生化学反応に対しても有効であることを確認できた.1.紫外線硬化ポリマーのマイクロ硬化過程の解明とモデル化これまでに生田らによって達成された分解能数μmを1μm以下へと大幅に向上させるため、紫外線レーザや光学系の改良および硬化過程の理論的解析、実験的検証を行い、紫外線硬化ポリマー特性と光学条件との関係を明らかにした。本来一品生産であるマイクロ光造形法を大量生産に対応させるため、4μm径の微細光ファイバー群を用いたシンプルではあるが高分解能を容易に得られるパラレルスキャン方式の考案を行い、光ファイバーアレイを試作して検証実験によりその有効性を確認した。この結果、将来集積流体回路(MIFS)を製作する際不可欠なシリコンプロセスとの生産工程上の整合性を得ることに成功した。申請者の開発した導電性紫外線硬化ポリマーの温度-抵抗値特性を測定し、マイクロ温度センサーとしての可能性を調べた。その結果、高感度なポリマーサーミスタとポリマー熱電対として利用できることを確認した。平成8年度は、平成7年度で得られた新しい知見をもとに、最も簡単な構成の集積流体回路を試作し、化学反応の実証と検出を行う予定である。現在,バイオ,医療,生化学などの分野では,化学分析,合成装置のマイクロ化が期待されており,筆者らはマイクロ集積流体システム(Micro Integrated Fluid System:MIFS)を提案し,研究を行ってきた.MIFSの基本概念は,シリコンプロセスで製作するセンサ,演算回路を含む基盤上に,マイクロ光造形法を用いて立体的で広範な容量に対応した流体回路部を一体成型するものである.近年,MIFSの概念を一般化学反応からさらに広げて,生化学ICへと発展させている.今回,細胞を用いない無細胞タンパク合成を目的とした生化学反応の検出及び制御を行うため,光センサ,増幅回路を含むシリコン基盤上に,マイクロ光造形法を用いてリアクタ,流路を設計し,光センサ型マイクロリアクタを製作した.さらに,タンパクの合成検出を確立するため,同様の化学発光反応の1つであるルミノール反応を用いて,化学反応のリアルタイム制御実験を行った.この実験結果から,フィードバック制御システムの有効性を実証でき,光センサ型マイクロリアクタシステムでかなり広範囲な反応を制御できることを確認した.また細胞外タンパク合成の材料としてホタルの発光酵素であるルシフェラーゼを用いて検出実験を行った.この実験では,微小空間における生化学反応を実現でき,また,極微量の生化学反応を検出することに成功した.これより,フィードバック反応制御システムがタンパク合成などの生化学反応に対しても有効であることを確認できた.前年度までに生田らによって達成された分解能を1μm以下へと大幅に向上させるため,紫外線レーザや光学系の改良及び硬化過程の理論的解析,実験的検証を行い,紫外線硬化ポリマー特性と光学条件との関係を解明した。本来一品生産であるマイクロ光造形法を大量生産に対応させるため,4μm径の微細光ファイバー群を用いたシンプルではあるが高分解能を容易に得られるパラレルスキャン方式の試作を行い,その有効性を確認した。この結果,マイクロ集積流体システム(MIFS)を製作する際に不可欠なシリコンプロセスとの整合性を得ることに成功した。また,本手法で製作したマイクロ流路に液体を注中して化学反応させ,その光学的変化を微小センサにて検出することに成功した。平成9年度は,8年度で得られた新たな知見をもとに,より複雑な構成のマイクロ集積流体システムを製作,検証を行う。光造形法は、光を照射することによって硬化する光硬化性樹脂を材料に用いて、3次元構造を形成する加工法である。具体的には、所望の3次元物体の2次元スライス形状に沿って、光硬化性樹脂の表面を選択的に硬化させ、硬化させた2次元構造を積層する行程を繰り返すことにより、3次元構造を形成する。筆者らはこれまで、この光造形法の原理を用いて、マイクロマシンなどの微細な3次元構造を形成する手法の開発を行ってきた。まず、1992年にマイクロ光造形法(IHプロセス)を提案し、5μmの加工分解能で3次元微細構造を形成することに成功した。さらに、1996年に内部硬化型マイクロ光造形法(Super-IH process)を開発し、1μm以上の高分解能を実現した。今回、スーパーIHプロセスを超高速化することにより、可動機構を有するマイクロ部品を作製する手法を開発した。

これにより、従来の光造形法では作製不可能な微小な可動機構の作製が可能となった。現在の試作システムの性能を以下にまとめる。1.1μm以上の高分解能2.サポート構造なしでマイクロ可動機構の造形が可能3.高速造形(35分でマイクロギアなどを作製可能)4.大量生産への適用5.高い歩留まり今後、樹脂の硬化特性、ビーム走査方法、露光条件などの改良を行い、さらに安定な造形システムの構築を確立し、各種マイクロマシンへ応用展開してゆきたい。
歯周ポケット底部を再現した3次元立体培養系の応用による歯周炎の病態解析

上皮細胞から上皮下の細胞への炎症波及機構を解明する事を目的に,上皮細胞内のシグナル伝達物質に着目し,歯周病患者より採取した歯肉組織片を用いて,主要な細胞内シグナル伝達物質であるphosphorylated Mitogen-Activated Proteinkinase(MAPK)に対するモノクローナル抗体で免疫染色を行った。その結果,主に上皮細胞および血管内皮細胞に特異的にMAPKのリン酸化が認められた。そこでヒト口腔由来上皮細胞ならびにヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた培養系に歯周病関連細菌Eikenellacorrodensの全菌体ならびに培養上清を添加・刺激して,上皮細胞および上皮下の細胞,特に血管内皮細胞に対する影響を調べた。上皮細胞にはMAPKの経時的なリン酸化(活性化)が認められ、さらに血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の産生増強がmRNAと分泌蛋白の両レベルで認められた。このVEGFのmRNA発現増強は、血管内皮細胞においても認められた。またE.corrodens培養上清で刺激すると、血管内皮細胞は細胞増殖促進効果を示した。血管内皮細胞に対しては、Inter Cellular Adhesion Molecule-1(ICAM-1),Vascular Cellular Adhesion Molecule-1(VCAM-1)のmRNA発現の増強も認められた。上皮細胞に認められたシグナル伝達物質(MAPKおよびp38)のリン酸化(活性化)を各特異的阻害剤(MEK-1 inhibitor,p38 inhibitor)で抑制すると、Interleukin-8およびICAM-1の発現が抑制された。また,Protein Kinase C阻害剤もICAM-1の発現誘導を抑制した。本研究により歯周病関連細菌で刺激された歯周ポケット上皮細胞から上皮下組織を構成する細胞への炎症波及は,上皮細胞内でシグナル伝達物質の活性化を介した様々な炎症性メディエーター・細胞増殖因子の産生が誘導され,上皮下の細胞に細胞増殖促進や接着分子の発現誘導が生じ,急性あるいは慢性的な炎症反応が増強される機構であることが示唆された。ヒト口腔由来上皮細胞培養系に歯周病関連細菌Eikenella corrodensを加えて刺激し,歯周病関連細菌の上皮細胞に対する侵襲機構を細胞生物学及び分子生物学的手法により解析を行った。すなわち細菌の刺激による上皮細胞の炎症性反応として,サイトカインやプロスタグランジンE_2(PGE_2)の産生量を定量し,さらにはサイトカインと,PGE_2の律速酵素であるシクロオキシゲナーゼ(COX)の発現をmRNAと蛋白の両レベルで経時的に解析を行った。その結果,上皮細胞からInterleukin(IL)-6,8の経時的な産生増強がmRNAと分泌蛋白の両レベルで認められ,さらにPGE_2とCOX-2の経時的な産生・発現増強も認められた。加えて,上皮細胞のサイトカイン・PGE_2産生ならびにCOX-2発現に対する細菌の付着因子の影響を検討するため,cell culture insertを挿入し,直接的に細胞と接触させない系を作製して同様に解析を行った。その結果,細胞と細菌が接触しない系においてもサイトカイン・PGE_2などの産生増強ならびにCOX-2の発現誘導が認められた。さらにE.corrodensの付着因子の1つであるレクチン様付着因子を有しない菌株でも同様な結果が得られた。以上から付着因子以外に,サイトカイン・PGE_2ならびにCOX-2の産生・発現を誘導する物質が,細菌から分泌されていることが示唆された。次に,DMEM中で培養した培養液のみで上皮細胞を刺激すると,上記と同様の産生・発現誘導が認められた。現在,細菌から分泌される誘導物質の特性を調べると同時に,歯周ポケット上皮細胞を培養して3次元立体培養系を確立し,歯周病関連細菌により惹起される上皮細胞の炎症性反応の上皮下への波及機構を解析することを試みている。

また,Protein Kinase C阻害剤もICAM-1の発現誘導を抑制した。本研究により歯周病関連細菌で刺激された歯周ポケット上皮細胞から上皮下組織を構成する細胞への炎症波及は,上皮細胞内でシグナル伝達物質の活性化を介した様々な炎症性メディエーター・細胞増殖因子の産生が誘導され,上皮下の細胞に細胞増殖促進や接着分子の発現誘導が生じ,急性あるいは慢性的な炎症反応が増強される機構であることが示唆された。
communionを基盤とした看護プログラムの開発

本研究は2部で構成し,研究1では,先行研究結果をもとに構成したプログラムを専門家会議を経て作成し,研究2では,臨床看護師を対象に本プログラムを実施し,これらのデータを質的帰納的に分析した後,プログラムの妥当性・明確性・実行可能性・有用性について検証し,プログラムを洗練することを計画している.平成29年度実施内容は以下であった.<communionに関する調査>研究代表者は共同研究者とともに英国の教会を訪問し,資料収集とholy communion見学を行った.宗教的・歴史的・文化的背景に関する知見を得た.<検討会議開催>全研究者間で研究計画案の確認をした.共同研究者より,評価ツールの検討案,プログラム内容の案に関する意見を得た.専門家の協力は,異動等の状況に伴い得られなかったが,今後協力者を募ることとしている.<分析方法の修得>分析方法に質的統合法(KJ法)を活用することを検討しており,研究代表者が研修参加を行った.<フィールド開拓・協力者獲得の準備>研究代表者は,平成30年1月「看護におけるcommunionの構造化(風間書房)」を出版した.今後本概念を用いて研究実施協力を募るにあたり,その説明資料として,本概念や本研究のねらいを説明する簡易な資料(A4サイズ10枚,図表入)を作成し準備した.今後は評価ツールとプログラム案を作成するとともに,研究フィールドの開拓と倫理審査承認を得ることを計画している.データ収集場所は,過去フィールドとした施設を計画していたが,平成30年4月1日付で異動することが平成29年度に決まったため,新たなデータ収集場所を確保する必要が生じたため.異動後,候補となるデータ収集場所に関する情報を取得し,当該施設の倫理審査委員会の承認を得る.本研究は2部で構成し,研究1では,先行研究結果をもとに構成したプログラムを専門家会議を経て作成し,研究2では,臨床看護師を対象に本プログラムを実施し,これらのデータを質的帰納的に分析した後,プログラムの妥当性・明確性・実行可能性・有用性について検証し,プログラムを洗練することを計画している.平成29年度実施内容は以下であった.<communionに関する調査>研究代表者は共同研究者とともに英国の教会を訪問し,資料収集とholy communion見学を行った.宗教的・歴史的・文化的背景に関する知見を得た.<検討会議開催>全研究者間で研究計画案の確認をした.共同研究者より,評価ツールの検討案,プログラム内容の案に関する意見を得た.専門家の協力は,異動等の状況に伴い得られなかったが,今後協力者を募ることとしている.<分析方法の修得>分析方法に質的統合法(KJ法)を活用することを検討しており,研究代表者が研修参加を行った.<フィールド開拓・協力者獲得の準備>研究代表者は,平成30年1月「看護におけるcommunionの構造化(風間書房)」を出版した.今後本概念を用いて研究実施協力を募るにあたり,その説明資料として,本概念や本研究のねらいを説明する簡易な資料(A4サイズ10枚,図表入)を作成し準備した.今後は評価ツールとプログラム案を作成するとともに,研究フィールドの開拓と倫理審査承認を得ることを計画している.データ収集場所は,過去フィールドとした施設を計画していたが,平成30年4月1日付で異動することが平成29年度に決まったため,新たなデータ収集場所を確保する必要が生じたため.異動後,候補となるデータ収集場所に関する情報を取得し,当該施設の倫理審査委員会の承認を得る.平成29年度はフィールド開拓やデータ収集における人件費・謝金の捻出が不要であり,平成30年度その経費として使用する.
運動による神経新生に報酬系が与える影響の解明

運動は身体活動レベルを保つのみならず、慢性疾患を抑え、更に、中枢神経系に対しても神経新生を促す効果があることが明らかになってきている。加えて、正常な運動の遂行には大脳基底核におけるドーパミンの働きが重要であることが明らかになってきている。またドーパミン放出には日内変動がある可能性が考えられている。そこで、運動による報酬系ドーパミンの働きと概日リズムが神経新生に影響するのか、トレッドミルを用いた自発運動神経新生の関係ならびにドーパミンの概日リズムによる調節の有無を調べた。自発的な運動量と神経新生の関係を免疫染色を用いて解析中である。またドーパミン放出には昼夜差がある傾向が見られた。様々な運動生理学的知見から、適度な有酸素運動は身体活動レベルを保つのみならず中枢神経系に対しても、神経新生などを促す効果があることが明らかになってきている。脳神経とくに運動に重要な大脳基底核や海馬における神経可塑性にはドーパミンが重要であることが知られている。一方、生体内の様々な恒常性はサーカディアンリズムに乗って保たれている。運動による神経新生にドーパミンやサーカディアンリズムがどのように関わっているかを調べることは、どのような時間帯に運動を行うと効果的な神経新生につながるかの理解につながり、ヒトの身体的健康のみならず脳機能の健康にも役立てる可能性があり、人類の福祉にとって意義のある研究となると考えている。神経新生に対するサーカディアンリズムとドーパミン放出の影響を明らかにすることを目指して当該年度は実験を進める予定であった。ドーパミン放出量を高速に計測するための実験装置の一部に不具合が生じ、期待していた解像度を得られず修理を必要とした。今後の研究の展開として、培養神経細胞を用い、当該装置により期待された性能が得られるかを第一に検討する予定である。同時にサーカディアンリズムと神経新生の関係について先に調べる。マウスを自発行動測定装置の設置されたケージ内で飼育し、行動のサーカディアンリズムを調べ、6時間毎にグループ分けし各サーカディアンタイムで新規の環境に暴露したあとBrduを注入し、新規環境曝露後に新生したニューロン数を免疫組織学的に定量化する。一方、生体内の様々な恒常性はサーカディアンリズムによって保たれている。長時間のドーパミン放出の計測を行う必要が有るため、麻酔下のマウスを用い、刺激などは行わずに、自発的なドーパミン放出の計測を試みた。線条体におけるドーパミン放出を計測したが、刺激を行わずに3時間の観察を行ったが、明らかなドーパミン放出の変化を捉えることができなかった。サーカディアンリズムに対応させるためにはより長時間の記録(24時間)が必要であると考えられる。そのためには、計測・記録を制御しているプログラムを改良することとや、昼夜の切り替わりを含んだ時間帯を重点的に計測することで対応を試みる。長時間の安定した記録および記録精度の向上が必要である。線条体におけるドーパミン放出を計測したが、明らかなドーパミン放出の変化を捉えることができなかった。実験機器の条件設定などを改良し、サーカディアンリズムに対応させるためにはより長時間の記録(24時間)が必要であると考えられた。また、長時間の連続測定は困難であるため、昼夜の切り替わりを含んだ時間帯を重点的に計測することでサーカディアンリズムの切り替えを含む時間帯を選ぶことでシグナル検出を行い、加えて線条体の背側部並びに腹側部と部位間におけるドーパミン放出の違いを考慮して記録を試みている。

またドーパミン放出には日内変動がある可能性が考えられている。そこで、運動による報酬系ドーパミンの働きと概日リズムが神経新生に影響するのか、トレッドミルを用いた自発運動神経新生の関係ならびにドーパミンの概日リズムによる調節の有無を調べた。自発的な運動量と神経新生の関係を免疫染色を用いて解析中である。またドーパミン放出には昼夜差がある傾向が見られた。酸化還元電位を計測するための増幅器に不備が見つかったため修理に時間を要した。長時間記録を可能とする制御プログラムを作成する。また、昼夜の切り替りを含めた時間帯を重点的に記録することで、サーカディアンリズムによるドーパミン放出の差を観察しやすくなると考えている。神経生理学ドーパミン放出濃度を期待した精度で計測できることを確認しつつ、サーカディアンリズムと神経新生の関係を免疫組織化学的手法により解析することを先に進める。
実験計算融合解析による血管壁近傍血流場が内皮細胞損傷に与える流体力学的影響の解明

血管表面の内皮細胞の損傷は、動脈硬化や動脈瘤などの血管病変の発症の引き金になることが指摘されているが、その機序は未だ十分に理解されていない。本研究は、超音波計測と数値計算の融合解析手法を用いて、内皮細胞を培養した実験流路内に血管疾患の好発部位である頸動脈の血管壁近傍流れ場と圧力場を再現し、内皮細胞の損傷実験と超音波計測融合血流解析を行って、これまで未知であった生体内の血流場が内皮細胞損傷に与える影響を解明するための研究を行って、多くの知見を得た。本研究で得られた成果は、血管疾患の発症に対する内皮細胞近傍場の流体力学的寄与の正確な理解に基づく診断法の確立に貢献するものである。本研究は、超音波計測と数値計算の融合解析手法を用いて、内皮細胞を培養した実験流路内に血管疾患の好発部位である頸動脈の血管壁近傍流れ場と圧力場を再現し、内皮細胞の損傷実験と超音波計測融合血流解析を行って、これまで未知であった生体内の血流場が内皮細胞損傷に与える影響を解明することにより、血管疾患の発症に対する内皮細胞近傍場の流体力学的寄与の正確な理解に基づく診断法の確立に貢献することを目的とする。平成27年度の研究では、臨床応用を考慮し、2次元超音波計測融合血流解析システムを用いて実験を行った。本システムにより、ヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場を解析した。計測は、大学内のボランティアを募り、東北大学流体科学研究所倫理委員会の承認を得た上で行った。超音波プローブにより2次元血管断面形状と血流の超音波ビーム方向速度成分の時空間分布が計測でき、これらを流体解析にフィードバックすることにより血流場を再現した。通常のシミュレーションとの比較により、超音波計測融合シミュレーションの優位性を定量的に明らかにすることができた。本システムにより超音波計測から求めた血管変形を高精度に再現可能であることが示された。本研究成果を基に最高血圧と最低血圧に対応する静圧の変化を再現するための予備的結果が得られた。動脈硬化や動脈瘤などの血管病変の発症の引き金になる血管表面の内皮細胞の損傷の機序は未だ十分に理解されていない。平成27年度の研究では、臨床応用を考慮し、2次元超音波計測融合血流解析システムを用いて実験を行い、ヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場の構造を明らかにした。本システムにより超音波計測から求めた血管変形をもとに最高血圧と最低血圧に対応する静圧の変化も再現するための予備的結果がえられたことから、2次元超音波計測融合血流解析システムによるヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場の解明に関しては、おおむね順調に進展していると判断できる。平成28年度は、臨床応用を考慮し、2次元超音波計測融合血流解析システムを用いて実験を行った。本システムにより超音波計測から求めた血管変形をもとに最高血圧と最低血圧に対応する静圧の変化も再現するための予備的結果を得た。また、頸動脈血管壁近傍の血流場を再現するための基礎として、実験流路内の血流による培養内皮細胞の損傷実験を行った。分岐や曲りなどの複雑な形状を有する頸動脈内の非定常血流場における血管壁近傍の流れ場を局所的に再現する実験流路を用いる実験の予備的検討として、平行平板流路による実験を行った。

実験に用いる作動流体は、液体の培地のみの場合と培地に赤血球を分散させた場合について行った。内皮細胞は市販のヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。赤血球はヤギの血液から採取し、東北大学動物実験倫理委員会の承認を得た上で行った。平成28年度は、臨床応用を考慮し、2次元超音波計測融合血流解析システムを用いて実験を行い、ヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場の構造を明らかにした。計測は、大学内のボランティアを募り、東北大学流体科学研究所倫理委員会の承認を得た上で行った。超音波プローブにより2次元血管断面形状と血流の超音波ビーム方向速度成分の時空間分布が計測でき、これらを流体解析にフィードバックすることにより血流場を再現した。通常のシミュレーションとの比較により、超音波計測融合シミュレーションの優位性を定量的に明らかにすることができた。本システムにより超音波計測から求めた血管変形をもとに最高血圧と最低血圧に対応する静圧の変化も再現するための予備的結果がえられたことから、2次元超音波計測融合血流解析システムによるヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場の解明に関しては、おおむね順調に進展していると判断できる。また、頸動脈血管壁近傍の血流場を再現するための基礎として、実験流路内の血流による培養内皮細胞の損傷実験を平行平板流路を用いて行った。内皮細胞は市販のヒト臍帯静脈内皮細胞を用い、赤血球はヤギの血液から採取した。実験の結果、培地のみの場合は、赤血球を分散させた培地の場合に比べて、より小さなせん断応力ではく離が生ずるとの新たな知見が得られた。分岐や曲りなどの複雑な形状を有する頸動脈内の非定常血流場における血管壁近傍の流れ場に対する予備的知見として有用な結果が得られたことから、実験流路内の血流による培養内皮細胞の損傷実験に関しても、おおむね順調に進展していると判断できる。血管表面の内皮細胞の損傷は、動脈硬化や動脈瘤などの血管病変の発症の引き金になることが指摘されているが、その機序は未だ十分に理解されていない。本研究は、超音波計測と数値計算の融合解析手法を用いて、内皮細胞を培養した実験流路内に血管疾患の好発部位である頸動脈の血管壁近傍流れ場と圧力場を再現し、内皮細胞の損傷実験と超音波計測融合血流解析を行って、これまで未知であった生体内の血流場が内皮細胞損傷に与える影響を解明することにより、血管疾患の発症に対する内皮細胞近傍場の流体力学的寄与の正確な理解に基づく診断法の確立に貢献することを目的とする。平成29年度は、臨床応用を考慮し、2次元超音波計測融合血流解析システムを用いて実験を行った。本システムにより、ヒト頸動脈血管壁近傍の血流速度場を解析した。超音波プローブにより2次元血管断面形状と血流の超音波ビーム方向速度成分の時空間分布が計測でき、これらを流体解析にフィードバックすることにより拍動に伴って血管壁が変形する場合の血流場を再現した。本システムにより血管変形を考慮した場合の血管壁に作用するせん断応力の変化に関する知見を得た。また、頸動脈血管壁近傍の血流場を再現するための基礎として、実験流路内の血流による培養内皮細胞の損傷実験を行った。分岐や曲りなどの複雑な形状を有する頸動脈内の非定常血流場における血管壁近傍の流れ場を局所的に再現するための実験として、平行平板流路に斜流を流入した場合の内皮細胞はく離実験を行った。
ラマンイメージングを用いて腸管虚血を診断する事は可能となるか？

本研究においてラマン分光法の腸管虚血域診断能を分子生物学的に検討する前に基礎的研究が必要となる。現在、ラット腸管虚血モデルとして1正常腸管、2虚血腸管モデル、3全層壊死腸管モデルを作成を試みている。モデル作成が起動に乗った段階で以下の検討を行う予定としている。今後、腸管健常粘膜部・虚血部・全層壊死部において、それぞれHIF-1α/VEGFの発現を組織免疫学的染色法により確認していく。研究の時間確保ができていないため。研究の時間を確保し、研究計画内のラット虚血モデルを用いた結果を出して行きたい。研究が遅れているため、次年度に繰り越さざるを得ないため。
災害看護を行う看護者への支援プログラムの開発

過去約10年間に災害看護を行った経験がある看護者に質問紙調査を行い、前回調査との比較、対象者の教育背景による比較を行った。赤十字教育施設の出身者が17.8%、赤十字以外の教育施設出身者が80.9%であった。看護者は前回調査同様な災害看護活動を行っていた。災害看護の体験は2項目、看護者が受けた影響は1項目、災害看護体験の意味づけは2項目、災害看護の経験は9項目、看護者が捉えた災害看護を行う看護者への支援は8項目の平均値が高かった。前回調査と比較した結果、平均値が高い項目がほぼ同様の結果であった。看護者の教育背景の違いと看護者に及ぼす影響及び影響要因を比較した結果、ほぼ同様の影響を受けていた。本研究の目的は、看護者が行っている災害看護活動、災害看護の体験、看護者が受けている影響および影響要因、看護体験の意味づけ、看護者の認識している経験を明らかにし、「看護者への支援プログラム」を開発することである。平成25年度の研究実施計画は、1文献検討、2質問紙調査、3研究論文発表で、主に質問紙によるデータ収集を計画していた。1については、文献検索および文献を収集し、検討する途中の段階にある。今後継続して文献検討を行っていく予定である。2については、本研究で用いる質問紙(前回の研究で活用した質問紙)の質問内容について検討したが、質問項目数が多く内容の熟考が必要なため現在も検討中である。今後、質問項目を洗練させて適切な内容とし、所属大学の倫理審査に提出する予定である。その後、この質問紙を活用して、データ収集を行っていく。3については、前回の研究成果の論文投稿の予定であったが、投稿に至っていないため、今後成果発表を行っていく。また、平成25年度は研究方法に関するセミナーへの参加することで、研究を遂行するための研究者自身の研究能力を高めることにつなげたことと、関連する学会に参加することで、新たな知見や情報を得て、本研究の内容に活用するようにした。平成26年度は、1文献検討、2本調査(質問紙調査)、3研究成果発表を計画した。1の文献検討は継続して実施している。2の質問紙調査については、平成25年度より継続して質問紙を作成した。そして、所属大学の倫理審査を受け承認を得ることができ、データ収集を実施した。現在、60施設に依頼し35施設からの承諾を得て、質問紙を842部発送し、データ回収しているところである。平成26年度に依頼した施設は赤十字関連の施設が主であったため、平成27年度は平成26年度とは異なる赤十字以外の施設に調査を依頼し、データ収集を継続して実施する予定である。3の研究成果発表を計画をしていたが、データ収集が遅れたため、まだ実施できていない。今後成果をまとめて発表していく予定である。平成27年度は、1質問紙調査(データ収集)の継続、2データ分析、3研究成果発表、4研究についての情報収集、文献検討を計画した。1について、平成26年度に依頼した質問紙調査について、527部回収できた(回収率59.1%)。回収したデータ入力を行い、現在、2のデータ分析中である。3については、データ分析がまだ不十分であるため、まだ実施できていない。4について、文献検討とともに、学会における研究についての情報収集、研究に関するセミナーへの参加を行い、研究者自身の研究能力の向上に努めた。平成27年度に質問紙調査を追加で実施予定であったが、年度末にかかる可能性があったため、施設の状況をふまえ、平成28年度に実施することとした。今後は、追加のデータ収集とデータ分析を行い、「災害看護を行う看護者への支援プログラム」の検討を行う。得られた研究成果について、専門職の集まる学会で研究発表を行い、広く意見を得て、内容の検討を行う。平成26年度から継続してデータ収集を実施予定であったが、所属する大学での業務との関係で、研究時間の確保が困難な状況があった。そのため、新たなデータ収集実施の目途が立たず、年度末でなければ実施できない状況となり、次年度実施に変更した。また、データ入力の協力を得られる人材の確保が困難であったため、業者に委託することで、データ入力を行い、少し遅れを取り戻した。平成28年度は、1質問紙調査(データ収集)の継続、2データ分析、3研究成果の発表、4研究についての情報収集を計画し、実施した。質問紙調査については、平成28年度に追加で調査を行うことができ、平成27年度までに収集したデータと合わせて、合計1,134部郵送し、678部回収することができた(回収率59.8%)。回収した質問紙について、データ入力および分析を行っている。