hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
常緑性Ｃ４植物トキワススキの耐冷性に関する基礎的研究

本年度は、これまでに得られたトキワススキの生理生態学的特性に関する知見を確認するとともに、耐冷性に関する生化学的および分子生物学的実験を進めた。東京大学弥生キャンパス内の圃場にてトキワススキ(3系統)およびススキ(1系統)を栽培し、年間を通して生育状況を比較することによって、トキワススキの高いバイオマス生産能や耐冷性が確認された。研究例が非常に少ないトキワススキを近縁種であるススキと同条件で栽培・比較して得た知見は、今後、研究を進める上で重要な基本情報になると考える。前年度に引き続き、グロースチャンバー内での冷温処理実験を行った。生育条件(ポットの大きさ、温度、日長)および冷温処理条件を変えて葉色の変化や生育を観察したが、いずれの実験においてもススキよりトキワススキの方が葉におけるアントシアニンに蓄積が顕著で、生育が明らかに悪くなった。圃場にみられたトキワススキの耐冷性がグロースチャンバー内では再現できなかったことにより、代謝レベルや分子レベルでの特徴を明らかにするための生化学的・分子生物学的解析に遅れが生じた。現在は、圃場で栽培した株から今年度の冬期にサンプリングした葉を用いて、メタボライトおよび酵素活性の解析を進めている。また、同サンプルからmRNAを調整し次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析を予定している。今後は、これまでに得られているトキワススキの形態・生理・生態学的特徴をHP等を通じて積極的に公表するとともに、今後得られる生化学的・分子生物学的解析データを加えて英文原著論文として発表する予定である。植物生理学トキワススキは研究例が非常に少ない植物種であり、これまでに他の近縁種と同条件化で栽培し生育等を比較した報告すらなかったが、2年間の研究によって、トキワススキの高いバイオマス生産能の一端が明らかになった。今後、研究成果を発信する上で重要な基本情報が得られたことは評価できると考える。一方で、圃場でみられたトキワススキの耐冷性がグロースチャンバー内では再現できず、代謝レベルや遺伝子レベルでの特徴を明らかにするための生化学的・分子生物学的な解析に遅れが生じている。トキワススキは研究例が非常に少ない植物種であり、これまでに他の近縁種と同条件化で栽培し生育等を比較した報告すらなかったが、本年度の研究によって、トキワススキの高いバイオマス生産能の一端が明らかになった。また、初年度の重要課題であった実験系の確立に目処が立ち、両種の葉サンプルを用いた光合成関連酵素活性やメタボライトの定量解析も順調に進んでいると考える。これまでに得られているトキワススキとススキを形態・生理・生態学的に比較したデータをまとめ、本年度(最終年度)中に原著論文を発表する。投稿先は植物学(Botany)系の国際誌を予定している。平行して、2種の違いを代謝レベルおよび遺伝子レベルで明らかにするために、路地栽培した植物体を用いて、7月から1月にかけて1か月ごとに葉のサンプリングを行い、代謝物(糖、アミノ酸、カルボン酸など)や光合成および糖・アミノ酸代謝関連酵素の活性および遺伝子発現の推移を調べる。また、グロースチャンバー内での低温処理試験については、ポットの大きさや低温処理の程度を変えるなどトキワススキとススキの間で生育に差が生じる実験条件を検討する。
日本人スペイン語学習者の作文に含まれる誤りの自動検出

この研究は、日本人スペイン語学習者の作文に見られる文法的エラーを自動検出する分析器の開発を目的とする。そのため10,000語のコーパスに対してエラー情報のアノテーションを手動で行い、そして、制約文法の形式化に基づいて一致のエラーを自動的に検出するための規則を記述した。このような分析器およびタグ付きコーパスの評価により、数の一致のエラー検出については、言語の習熟度が上がるにつれて、句レベルより節レベルにおいてそれが頻繁に起こることから、性の一致のエラー検出よりも深い言語分析が必要とされることが明らかになった。本研究は、外国語、特にスペイン語の効率的な教育法を向上させ、第二言語習得の科学的研究を促進することを目的とする。Karlssonらの制約文法を発展させ、それを用いて日本人学習者のスペイン語作文に含まれる誤りの一般化を試み、特に、統語情報に関連する誤りに着目することで、そうしたデータを制約文法の規則として体系化することを目指す。本年度は、日本人スペイン語学習者の作文例を収録した小規模なコーパスに含まれるエラーを精査し、また、5000語余りの品詞タグ付けを実際に行うことで、以下の点を確認、検証した。1.品詞タグ付け、統語解析の主要ソフトの当該データに対する動作パフォーマンス2.誤りを含んだ学習者コーパスに対する自動品詞タグ付けの効能これらの結果、コーパスには冠詞-名詞、名詞-形容詞、主語-主語補語、目的語-目的語補語という文法対象の間に必要な一致(agreement)に関する誤りが、多数含まれていることがわかった。(この研究成果は国際会議CICLing2011で発表し、論文も収録された)そして、研究の次のステップとして、こうした学習者の構文誤りを自動的に検出する制約文法システムを構築するため、その解析器が必要とする規則の記述を開始し、また研究経過の報告を国際会議Learner Corpus Research 2011で発表するべく投稿した。本年度は、日本人スペイン語学習者の作文例を収録した小規模なコーパスに含まれる5000語余りの語に関し、昨年度行った品詞タグ付けを精査することで、以下の点を確認検証した。1.誤りを含んだ学習者コーパスに関する自動品詞タグ付けの効能(継続)2.数・性の一致(agreement)に関する学習者が起こしやすい誤りの精査これらの結果、学習者コーパスには冠詞-名詞、名詞-形容詞、主語-主語補語、目的語-目的語補語という文法対象の間に必要な一致に関する誤りが、多数含まれていることがわかった。そして、研究の次のステップとして、こうした学習者の構文誤りを自動的に検出する制約文法システムを構築するため、その解析器が必要とする規則の記述を行い、また研究経過の報告を国際会議Learner Corpus Research 2011で発表するべく投稿し、受諾された。日本人スぺイン語学習者の典型的な誤りは、名詞の性・数や冠詞の定・不定の使用に多く見受けられる。そのような傾向が、日本語がそうした概念を欠いていることと関連しているのは、直観レベルの説明とはいえほぼ間違いないと思われる。しかしながら、全ての日本人が全く同じ誤りを犯しているわけでもないことから、誤りの原因の実質は、言語間の違いというよりは、それに根付く不完全な言語習得によって引き起こされていると捉え直すべきである。またそうすることで、学習者コーパスといった客観的データを対象とした科学的検討が可能になると申請者は主張し続けてきた。本年度は、こうした過年度の準備、進捗に基づき、(1)日本人スペイン語学習者のエラーコーパスの整備、データの検討、(2)エラーの収集・分類(先行研究を参考にした分類および独自データからの知見の統合)、(3)上位にランクされるエラーの自動抽出、原因の一般化を行った。また、外国語の学習において母語である日本語の影響を受ける日本人が犯すような誤りの傾向や原因を深く追求するという目的から、日本語とスペイン語に特徴的な難易構文に関する研究も行った。計画当初の見込み通り、作業及びそれに基づいた考察も進展している。成果の対外発表も行ってきているが、産休に入ったため、行動に制限が生じてしまい、区分(1)と評価できるほど活動はできていない。しかしながら、作業や文献調査は行ってきているので、(3)よりは進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。スペイン語学習者コーパスを利用、分析することで、当該言語の特徴である性と数の一致に関し、学習者が引き起こしている文法誤りを(半)自動的に検出する規則を、制約文法の枠組みに基づいて記述する。

こうした一致に関する誤りは、冠詞と名詞、名詞と形容詞補語、名詞と名詞補語、主語と動詞等といったさまざまな統語的なユニットにおいて見られるので、それらを一つずつ確認しながら、学習者の抱える問題点を抽出していく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
重症ウイルス感染症における高次エピゲノム作動原理の解明と新規治療基盤の確立

本研究計画では、ウイルス感染に伴う宿主高次エピゲノムの変動、ウイルスと宿主エピゲノムの相互作用を解析し、高次エピゲノム作動原理を明らかにし、これらを基に遺伝子欠損細胞・マウス、変異ウイルスなどを駆使して、高次エピゲノム変化がウイルス感染症の病態形成や重症化につながる分子基盤を解明する。次いで、重症化につながるエピゲノム修飾を同定し、早期診断・先制医療への応用の可能性を探る。さらに病態形成に関与するエピゲノム修飾に関しては、これを標的とした抗インフルエンザ薬の候補化合物の探索を行う。以上を通して、未だ救命に繋がる有効な治療法のない重症ウイルス感染症に対する新規治療戦略確立のための学術的基盤情報の獲得を目指す。当該年度は、前年度の研究成果を発展させて、インフルエンザウイルス感染に伴った宿主細胞のヒストン修飾変化を質量分析法で解析した。その結果、ヘテロクロマチンに結合している抑制性のヒストンメチル化修飾が感染に伴って変化することを見出した。それを基に、ウイルス感染によるヒストン修飾変化に関わるヒストンメチル化酵素を同定した。さらに質量分析法で同酵素が結合する核内タンパク質ならびにウイルスタンパク質を同定した。さらにこれらの複合体の立体構造解析行う準備を進めた。また、前年度の研究成果を発展させて、欠損細胞を用いた染色体高次構造の解析から、同酵素は染色体の構造に関与するコヒーシンを介して、染色体の高次構造変化に関与していることがわかった。当該年度は、ウイルス感染によるヒストン修飾状態の変化を解析し、そこに関わるヒストンメチル化酵素を同定することができた。さらに、同遺伝子の欠損細胞や欠損マウスを用いた解析から、同酵素が宿主染色体の高次構造変化やインフルエンザの重症化に関わっていることを示唆する結果を得ることができた。同ヒストンメチル化酵素と相互作用する、ウイルスタンパク質や宿主タンパク質を解析する。また、ウイルス感染に伴った宿主染色体の高次構造変化のメカニズムを解析する。さらに、同メチル化酵素活性活性を制御する化合物につて、マウスモデル等でインフルエンザの病態に及ぼす影響を検討する。当該年度は、核内で増殖するインフルエンザウイルス(RNAウイルス)をモデルとして、H1N1(PR8)株を用いて、培養感染細胞系で、クロマチン免疫沈降(ChIP)、染色体高次構造に関する4C, Hi-Cなどの解析を行い、得られたデータを統合的に分析するパイプラインを確立した。また遺伝子欠損マウスから単離した細胞を用いた、高次エピゲノム解析系、免疫反応の解析系を確立した。さらに、培養感染細胞系を用いて、エピゲノム関連化合物のライブラリーを用いて、インフルエンザの増殖をスクリーニングするアッセイ系を立ち上げ、解析を開始した。当該年度は、インルエンザウイルスの増殖を強く抑制する複数の化合物を見出した。当該年度は、染色体高次構造に関するデータを統合的に解析するパイプラインを確立し、さらにエピゲノム修飾を制御する化合物を用いたインフルエンザのスクリーニング系を樹立することができた。

さらに、同メチル化酵素活性活性を制御する化合物につて、マウスモデル等でインフルエンザの病態に及ぼす影響を検討する。ウイルス感染に伴ったヒストン修飾変化を解析して、それに関わる修飾酵素に着目して、同酵素と染色体高次構造変化の関わりを検討する。また、エピゲノム修飾を制御する化合物を用いたインフルエンザのスクリーニングを進めて、増殖を抑える化合物を同定し、マウスモデル等でその効果を検証する。
東アジアにおける都市型中小企業と農村工業化に関する比較研究

東アジアにおける地域工業化の特性と問題点を探るために、多くの研究機関との共同調査を行い、その成果を発表、翻訳出版するまでになっている。共同研究を行った相手側機関は、中国の場合、上海社会科学院、江蘇省社会科学院、四川省社会科学院、折江大学、東華大学、であり、他に5地域8研究機関との共同研究を行った。その成果の一部は7分冊の報告書として纏め上げられている。その詳細には立ち入らないが、次のような研究課題についての中間総括を得ている。(1)アジアだけをとってみても、中小企業の成立しやすい国や地域と、そうではない国や地域が存在すること。(2)同じ国や地域をだけ取り上げてみても、その内部で中小企業の形成力に地域間格差が認められること。(3)中小企業の大規模な形成過程が見られる地域の社会経済的分析に寄れば、資本の導入や労働力の吸収条件だけでなく、地域内部の行商の伝統や、先進地域との結びつき方の特性などによって、大きな較差が生じていること。(4)そのような差異は、地域における中小企業家層の経営行動様式の違いとしても把握できること。(5)所謂「社会主義的規制」は総じて負の要員が多いものの、社会的制度形成においては積極的な要因となっている場合も認められること。(6)海外との結びつきが容易な地域とそうでない地域の格差が顕著であるが、その核心には人的な結びつきの要素が強いこと。といった実証事例を把握することができた。報告できた内容は調査研究の一部であり、これから本格的な整理執筆活動に入る予定である。東アジア諸国の都市型中小企業の発展と農村工業化の形態についての比較研究を進めるため.日本.韓国.台湾.中国.ベトナム.タイ.ミャンマーに調査協力を依頼し.フィールド調査を進めている.日本では戦前期の農村工業化政策や都市型の中小企業の発展過程についての研究活動を進めている.韓国では忠南大学や慶北大学との協力で中小企業の現状調査を進めている.中国では上海社会科学院.江蘇省社会科学院.四川省社会科学院.浙江大学.東華大学との協力協定を結び調査を進めている.ベトナムではフエ大学.タイではコンケン大学.ミャンマーではヤンゴン経済大学との協力による地域工業化事例の調査を行っている.各調査はアンケート調査を実施し.それを基にして個別訪問を重ねながら各地の特性と問題点を明らかにしていくものである.アンケート調査は2001年7月以降実施に入り.既に一部の協力機関からはデータの整理に入っているとの連絡が入っている.それらの成果とは別に.名古屋大学のメンバーを中心に「東アジア工業化研究会」を組織し.これまで8回の研究会を行ってきた.調査結果の本格的整理は2002年夏以降の課題である.昨年度は研究の初年度として、国内での研究会を中心に組織し、個別の研究関心を提示しながら、研究課題を設定し、研究課題や海外での調査課題を鮮明にすることに集中した。今年度は海外での調査(委託調査を含む)を中心に、海外の研究機関での研究会や、調査方針の策定会議を中心に組織し、現地調査の推進を図った。直接間接を含め、海外での調査活動は、中国、台湾、韓国、ヴェトナム、タイ、ミャンマーの6カ国10地域に及んでいる。共同研究や委託研究を行った機関は、上海社会科学院、江蘇省社会科学院、四川省社会科学院、セッコウ大学、東華大学、フエ大学、コンケン大学、ヤンゴン大学の8機関である。このうち、ヤンゴン大学は時間・資金とも不足で大きな前進を図れなかったが、他の機関との調査は順調で、それぞれ1-3回の中間発表会や研究会を開くことが出来た。主な調査内容は、農村の工業化、農村出稼ぎ労働力、都市の中小企業、大企業と中小企業との企業間関係、等に関わるものである。

調査協力機関から提供された資料については、ほとんどが現地語で、一部の研究協力者しか利用できないため、現在、翻訳作業を進めている。また、調査の不備な点については、補足調査を進める必要があり、現在、そのことについては交渉中である。集められた調査内容については、国内の研究動向を意識しながら、それらの成果を報告書に纏め、総括的な国際シンポジウムを来年には組織したいと考えている。年度の初めを除き、今年度は国内での研究会を2回しか組織してこなかった。しかし、一部の研究が纏めの段階に入ったこともあり、年度末に向かって幾つかの研究会を組織する予定にしている。東アジアにおける地域工業化の特性と問題点についての比較研究を進めるために、多くの研究機関との共同研究を行い、その成果を翻訳出版するまでになっている。共同研究を行った相手側機関は、中国の場合、上海社会科学院、江蘇省社会科学院、四川省社会科学院、折江大学、東華大学であり、他に5地域8機関との共同研究を行った。調査にあたり、名古屋大学の研究者を中心に基本的な問題関心を示し、その了解の上で、地域別の調査対象と調査項目を設定した。基本的な課題として掲げたことは、(1)中小企業の育ち易い国と、そうでない国があることについて学術的な根拠を明らかにすること、(2)同じ国の内部でも、それが育ち易い地域と、そうではない地域の存在していることについて明らかにすること、(3)特定産業が集中して発展してくる地域と、各種産業が入り乱れて拡大してくる地域があることについて社会経済的な根拠を示すこと、(4)中小企業の企業家に地域別の特性が窺われるかどうかについて注意する必要があること、(5)現代的な技術が地域経済の発展にどのように寄与しているのか明らかにすること、(6)インフラの整備や産業政策の寄与が明らかな場合は、それが企業経営にどのように寄与できたのかを示すこと、等々である。共同調査の結果、中国沿岸部の一部では歴史的中小商工業の伝統が「社会主義的規制」によって大きな阻害要因を抱えていたこと、規制の後退とともに特異な発展が顕在化したことを確認した。東南アジア地域でも、国別の差異や地域別の特異性の大きなことが確認され、そこでは経営環境以外に歴史的な要因や社会的な慣習の意味も大きいこと、海外との経済的あるいは経営的な直接の接触がますます大きな役割を果たしつつあること、それが必ずしも地域の長期的な成長と結びつくものではないことを明らかにした。検討課題が残されているが、所期の目的は果たされたものと考えている。
セラミックスおよび金属間化合物粒子を分散させたAl-Li系P/M合金に関する研究

溶解鋳造すること無しに合金化することが可能なメカニカルアロイング法によって、AL-Li系合金中に微細なセラミックス粒子の分散を図った。試料はAL-LiとAL-Li-Cu-Mg合金ベースとし、これにAl_2O_3、T.C.,AL_4C_3の各セラミック粒子を2および6vol%添加した。メカニカルアロイング処理した粉末を圧縮成形、熱間押出によりP/M材とした。活性元素であるLiの酸化防止のため、P/M材とするまでの工程はすべてアルゴン雰囲気中で取扱った。得られたP/M材の材料評価は、組織観察、引張特性、時効硬化挙動などにより行った。メカニカルアロイング法によりAL-Li系合金中にセラミックス粒子を微細均一に分散させることができた。セラミック粒子の分散により、P/M材は高い硬度を示した。しかし、ベース合金のI/M材に比べて時効硬化能が著しく低下した。メカニカルアロイング法によるP/M材では、転位、亜結晶粒界、結晶粒界異相界面などの不均一析出サイトが著しく増加しているため、均一析出による時効硬化が抑えられるものと考えられるものと考えられる。なお、Liの添加の無いAL-CuやAL-Cu-Mg系合金においても同様な時効硬化能の著しい低下が認められた。しかしそれでもなお、セラミックス粒子分散P/M材は高い強度を示しており、AL_2O_3やTiCを2vol%添加したAL-Li-Cu-Mg合金P/M材は、押出しのままの状態で約600MPaの引張強さを示した。セラミックス粒子の添加量が6vol%に増加するとますます延性が低下し、引張強さも若干低下した。これらのP/M材では、硬度値から換算して求めた引張強さより低い値を示すので、金属よりむしろセラミックスに近い機械的性質を示す。P/M材の比弾性率は約30GPa、比強度は225MPaに達しており、7075合金と比較してすぐれた特性値が得られた。引張強さは200°Cで250MPa程度になり、300°Cではベース合金と同程度に低下した。溶解・鋳造することなしに合金化することが可能なメカニカルアロイング法によって, Al-Li合金に微細なセラミックス粒子の分散を図った.試料はAl-2.5wt%Li合金をベースとし,これにAl_2O_3, TiC, Al_4C_3の各セラミックス粉末を2vol%添加した.メカニカルアロイング処理した粉末を冷間プレス,真空加熱脱ガス,熱間押出の工程を経て直径7mmのP/M材とした.活性元素であるLiの酸化防止のため, P/Mとするまでの工程はすべてアルゴン雰囲気中で取扱った.得られたP/M材の材料評価は,組織観察,引張特性,時効硬化挙動などにより行った.

なお,溶体化処理によって試料表面に脱Li層が形成されたので,これを研磨によって取除いてから時効による硬度変化を測定した.メカニカルアロイング法により, Al-Li合金中にセラミックス粒子を微細に分散した組織が得られた.セラミックス粒子による分散強化によりP/M材は高い硬度を示した.しかし,溶解鋳造法により製造されたベース合金に比べて時効硬化能が著しく低下した.メカニカルアロイング法によるP/M材では,結晶粒界,亜粒界,転位,異相界面などの不均一析出サイトが著しく増加するため,均一析出による時効硬化が抑えられるものと考えられるが,その詳細は現在検討中である.しかし,得られたセラミックス粒子分散P/M材は,時効硬化能の低下を補って余りある強度増加を示しており, Al_2O_3添加P/M材のT6状態での常温引張強度は520Mpaに達していた. Al_2O_3添加材に次いでTiC添加材, AC_<42>C_3添加材の順に強度が低くなっており,セラミックス粒子無添加の同一製法のP/M材では350Mpaであった.高温ではこれらP/M材の強度は低下し, 200°CではAl_2O_3添加材で250MPa程度になり,セラミックス粒子の分散強化の硬化は300°Cではほとんど消失した.前年度に引続いてメカニカルアロイング法によりAl-Li系合金に微細なセラミックス粒子の分散を図った。今年度は、Al-2.5%Li合金に6vol%のセラミックス粒子を添加した場合と、Al-2.5%Li-1.2%Cu-0.7%Mg合金に2および6vol%のセラミックス粒子を添加した場合について実験を行った。メカニカルアロイン処理により得られた粉末を冷間プレス、真空過熱脱ガス、熱間押出の工程を経て、直径7mmのP/M材とした。活性元素であるLiの酸化防止のためP/M材とするまでの工程はすべてアルゴン雰囲気中で取扱った。得られたP/M材の材料評価を行い、セラミックス粒子分散の効果を検討した。メカニカルアロイング法によって、Al-Li系合金中に6vol%までのセラミックス粒子を微細均一に分散した組織が得られた。セラミックス粒子の分散によりP/M材は高い硬度を示した。しかし、溶解鋳造法によって製造されたベース合金に比べて著しく低い時効硬化能を示した。このようなP/M材においては、転位、亜結晶粒界、異相界面などの不均一析出サイトが著しく増大するため、均一析出による時効硬化が抑えられるものと考えられるが、その詳細は今なお検討中である。なお、Li添加の無いAl-CuやAl-Cu-Mg系合金においても同様な時効硬化能の著しい低下が認められた。得られたP/M材は高い強度を示しており、Al_2O_3やTicを2vol%添加したAl-Li-Cu-Mg合金P/M材は押出しのままの状態で約600MPaの引張強さを示した。セラミック粒子の添加量が6vol%と増加するとますます延性が低下し、引張強さも若干低下した。したがってこれらのP/M材では、硬度値から換算して求めた引張強さよりも低い値となり、金属よりむしろセラミックスに近い機械的性質を示した。これらのP/M材の比弾性率は約30GPa、比強度は225MPa達しており、7075合金と比較してすぐれた特性値が得られた。
心不全における腎髄質循環とNa貯留メカニズムの解明

腎臓は体液・ミネラルの恒常性維持を介して循環血漿量を調節し、心臓は腎臓により調節された血漿量を血液として拍出することから、心機能と腎機能は互いに影響しあっている。従って、心機能の低下は腎機能を低下させ、腎機能の低下は心機能を低下させることとなり、結果として心腎症候群を形成する場合がある。我々は心腎症候群モデル動物として脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHR-SP)ならびにDahl食塩感受性高血圧(DahlS)ラットを対象として、体液貯留の改善される薬剤数種類を投与して心腎症候群の発症機序解明を試みるべく、検討を行った。心機能の低下は腎機能を低下させ、腎機能の低下は心機能を低下させることから、心機能と腎機能は互いに影響しあっている。一方の機能低下は他方の機能低下を引き起こし、心腎症候群を形成する。この機序に関わる要因は多数あるが、その一つにはナトリウム貯留を介した体液量増加がある。ネプリライシン阻害薬(NEPi)はネプリライシンによるナトリウム利尿ペプチド分解を抑制することから、ナトリウム利尿効果を介した心腎症候群の病態緩和が期待される。平成27年度は心腎症候群モデルであるDahl食塩感受性高血圧(DahlS)ラットと、脳卒中易発性高血圧自然発症ラットであるSHR-SPに対するNEPiの効果について検討を行った。DahlSラットならびにSHR-SPに8%高食塩飼料を給餌し、アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)ならびにARB+NEPiを投与した。DahlSラットにおいては薬剤投与による血圧、ならびに腎障害マーカーである尿タンパク排泄量の有意な変化は認められなかった。一方で、SHR-SPではARBならびにARB+NEPi投与は収縮期血圧ならびに尿タンパク排泄量を有意に低下させた。さらに、ARBならびにARB+NEPi投与群は非投与群と比較して腎臓皮質領域ならびに髄質外層領域において腎尿細管障害マーカーであるosteopontin mRNA発現量を有意に低下させた。以上の結果より、ARBならびにARB+NEPiは高食塩給餌下においてDahlSラットに対しては有意な影響を認めなかったが、SHR-SPにおいては血圧ならびに腎障害を有意に改善した。心腎症候群モデルであるDahl食塩感受性高血圧(DahlS)ラットと、脳卒中易発性高血圧自然発症ラットであるSHR-SPを対象として検討を行ない、ARBならびにARB+NEPiがSHR-SPにおいて有意な血圧降下作用と腎障害低下作用を認めることができた。心腎症候群に寄与する因子はいくつかあり、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)を分解するネプリライシン(NEP)もその一つである。我々は昨年度、高食塩飼料を給餌した脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHR-SP)においてNEP阻害薬(NEPi)の投与が腎保護効果を示すことを見出しており、本年度はその機序解明を試みた。また、心不全時の腎機能悪化(WRF)は患者の予後に影響することが報告されており、WRFと体液貯留の指標であるCVPが関連することから、うっ血による心腎症候群の悪化が推察されている。我々が開発した片側腎静脈狭窄による腎うっ血モデルラットにおいて、グルコース・ナトリウム共輸送体2阻害薬(SGLT2i)による尿中へのナトリウム排泄量増加を介した体液貯留の改善を介したうっ血改善効果が期待されたが、今回の予備的検討においてはSGLT2i投与による著名な改善効果は認められなかった。心腎症候群モデルである脳卒中易発性高血圧自然発症ラットであるSHR-SPを対象として、高食塩飼料を給餌して検討を行ない、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)を分解する酵素であるネプリライシンの阻害薬の投与による腎障害低減メカニズムには、炎症の抑制一因となることを明らかにした。腎臓は体液・ミネラルの恒常性維持を介して循環血漿量を調節し、心臓は腎臓でろ過するための血液を拍出することから、心機能と腎機能は互いに影響しあっている。心機能の低下は腎機能を低下させ、腎機能の低下は心機能を低下させて心腎症候群を形成する。心機能低下に伴う腎うっ血は腎機能低下を引き起こしてナトリウムの貯留を促進させ、増加した体液量増加がさらなる心負荷を引き起こして心腎症候群の悪循環を引き起こす機序が推察されている。腎うっ血は腎臓総血流量を低下させることが報告されている。このうち腎臓髄質領域の血流量は腎臓全体のおよそ10%程度に過ぎないが、圧-ナトリウム利尿機構を介したナトリウムならびに体液の恒常性に関わるなど重要な役割を果たしている。一方で、酸素濃度の低い腎臓髄質領域では能動輸送により盛んにナトリウム再吸収を行って酸素を消費していることから虚血に弱く、障害を受けやすい構造となっている。我々は下大静脈の左右腎静脈間を結紮することにより新規に腎うっ血モデルを作出した。このモデルでは腎臓髄質領域の血流低下を伴う腎組織障害が観察され、特に腎臓間質線維化並びに尿細管障害マーカーの上昇が認められた。マイクロアレイ法を用いた遺伝子発現の網羅的解析法を用いてうっ血に誘導される遺伝子種の検索を行ったところ、多数の線維化に関連するmRNA発現の上昇が検出された。

また、動静脈シャントによる心機能低下モデルを作出し、このラット片側腎静脈を狭窄させることにより心腎連関モデルを作出して検討を行った。動静脈シャントによる心肥大は認められたが、今回検討した条件下においては顕著な腎組織障害ならびに腎機能の低下は認められなかった。腎臓は体液・ミネラルの恒常性維持を介して循環血漿量を調節し、心臓は腎臓により調節された血漿量を血液として拍出することから、心機能と腎機能は互いに影響しあっている。従って、心機能の低下は腎機能を低下させ、腎機能の低下は心機能を低下させることとなり、結果として心腎症候群を形成する場合がある。我々は心腎症候群モデル動物として脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHR-SP)ならびにDahl食塩感受性高血圧(DahlS)ラットを対象として、体液貯留の改善される薬剤数種類を投与して心腎症候群の発症機序解明を試みるべく、検討を行った。昨年度の検討において、ARBならびにARB+NEPi投与はSHR-SPにおける血圧降下作用と腎障害抑制効果が認められた。本年度では、組織の病理学的・免疫組織学的解析ならびに腎組織の遺伝子発現量をRT-PCR法などにより尿細管障害(osteopontin, KIM-1など)、間質線維化(fibronectin, α-SMAなど)ならびに炎症関連(MCP-1, TNF-αなど)マーカー類の解析を行う。また上皮間質形質転換(EMT)に関わる分子も解析に加えることにより、ARBならびにARB+NEPi投与による腎障害低下作用機序についての検討を行う。これと並行して、心腎症候群モデルとして我々が近年開発した腎うっ血ラットモデルを用いた検討も行う。心不全時の腎機能悪化(WRF)は患者の予後に影響することが報告されている。WRFと体液貯留の指標であるCVPが関連することからうっ血による心腎症候群の悪化が推察されている。SGLT2阻害薬はグルコース・ナトリウム共輸送体を阻害することから尿中へのナトリウム排泄量増加を介した体液貯留の改善を介したうっ血改善効果が期待される。そこで、麻酔下にてSprague-Dawleyラットの左腎静脈にシルバークリップを留置して片側腎静脈狭窄を作出し、回復後にSGLT2阻害薬を投与しながら一定期間の飼育を行い、腎組織評価ならびにRT-PCR法によって尿細管障害・間質線維化ならびに炎症関連マーカー類の遺伝子発現量の変化を検討することにより、SGLT2阻害薬がうっ血による腎障害に与える影響について解析する。昨年度の検討において、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)を分解するネプリライシン(NEP)阻害薬の投与は、高食塩飼料を給餌した脳卒中易発性高血圧自然発症ラット(SHR-SP)において腎障害を改善することが明らかとされ、その機序の一部として腎臓における炎症反応の抑制が関わる可能性が示された。酸化ストレス産生の上昇が炎症を惹起することが報告されていることに加えて、腎臓髄質領域の血流量を低下させることが報告されている。腎臓髄質領域の血流量は腎臓全体のおよそ10%程度に過ぎないが、圧-ナトリウム利尿を介したナトリウム・体液恒常性に関わるなど重要な役割を果たしている。一方で腎臓髄質領域では能動輸送によりナトリウム再吸収を行っていることから虚血に弱く、障害されやすい構造となっている。
原子層積層構造の空間反転対称性の制御によるスピン流の生成

(1) DNAやオリゴペプチドなどの螺旋状の有機分子において観測されているスピン選択性(chiral induced spin selectivity)の機構を解明することを目的として、モデル系として採用した螺旋状原子鎖における電流によって誘起されるスピン偏極および軌道角運動量偏極の計算を行った。その結果、電流によって時間反転対称性が破れたときに発生する軌道角運動量偏極は原子鎖の曲率が小さい領域において曲率に比例することを明らかにし、電流誘起軌道角運動量偏極が曲率の存在が原因で生じること、曲率によって制御可能であることを示した。一方電流誘起スピン偏極は、曲率とスピン軌道相互作用(原子内LS結合)強度の両方に比例することを明らかにした。この研究成果は有機分子のようにスピン軌道相互作用が小さい軽元素からなる物質でも曲率を大きくすることで十分大きいスピン偏極を生成することが可能であることを示唆している。(2)ジグザグ原子鎖-A-B-A-B-の電流誘起スピン偏極を計算した。単位胞中の2原子A,Bが同じ元素である場合、空間反転対称性より電流誘起スピン偏極の単位胞内の総和は消失するが、各原子のまわりで局所的には空間反転対称性が破れているため局所スピン密度が電流印加により発生する。この局所的スピン偏極の大きさはA=B=Snの場合、空間反転対称性が破れているA=In, B=Sbの場合のスピン偏極と同程度であることを明らかにした。(3)原子リングがスピンフィルターとして働き、80%以上のスピン偏極率を達成できることを示した。またスピン偏極率100%を達成するための必要条件を導いた。(4)逆向きのスピン流が生じる二重量子井戸の外因性スピンホール流および逆向きの有効磁場が生じる二重量子井戸の局所的電流誘起スピン偏極について、Hanle効果との関連を明らかにした。(1)交付申請書に記載の平成30年度の研究実施計画[グラフェンの回転2層構造(twisted bilayer graphene)]に関しては有効ハミルトニアンの構築がほぼ完了したが、スピンや擬スピンの輸送特性の計算は次年度に実施することになった。このように平成30年度の研究実施計画は半分ほどの達成度である一方、平成29年度の研究実施計画[螺旋状原子鎖の電流誘起スピン偏極]の機構をさらに深く理解することができたため今後の研究を格段に推進できると期待している。なぜなら、螺旋状原子鎖の電流誘起スピン偏極において明らかになった「軌道角運動量偏極を通して原子鎖の曲率によってスピン偏極が発生する」という機構は、様々な系の電流誘起スピン偏極とそれに伴うスピン流を説明すると期待される重要な成果であると捉えているからである。平成32年度(令和2年度)の研究実施計画[グラフェンの螺旋構造][遷移金属ダイカルコゲナイドの螺旋構造]のスピン偏極やスピン流だけでなく、最近注目されている「螺旋状有機分子のスピン選択性」を解明する重要な手がかりになると考えている。このように平成30年度は当初予期していなかった成果が得られた。(2)当初の研究実施計画には入っていないが強く関連する課題である二重量子井戸のスピン物性に関して顕著な成果が得られ、国際会議において成果発表を行った。これらの成果は原子層積層構造のスピン物性への波及効果が顕著であるため、本研究課題の成果と捉えている。以上の理由により、本研究課題は当初の計画以上に進展していると評価した。交付申請書に記載の研究実施計画では、今後「原子層の回転2層構造」と「原子層の螺旋構造」におけるスピン偏極とスピン流の研究を実施する計画であるが、最近のこの研究分野の速い進展に鑑みて、次の2点に関しても研究を行うことを検討し今後の研究を推進する。(1)螺旋状原子鎖において明らかになった「軌道角運動量偏極を通して原子鎖の曲率によってスピン偏極が発生する」という機構を基にして、原子層2層構造だけでなく螺旋状有機分子の電流誘起スピン偏極とそれに伴うスピン流を解明する。螺旋状有機分子の中でもヘリセンは「原子層の螺旋構造」と基本的に同じ構造をもつので、平成32年度(令和2年度)の研究実施計画[原子層の螺旋構造]として実施する。(2)バレーや層を記述する擬スピン自由度がもたらす現象の発見や解明が最近進展している。代表的な例はグラフェンにおけるバレーホール効果の観測とバレーフィルターの提案である。擬スピンもスピンと同様に情報処理に用いることが期待されているので、擬スピン偏極や擬スピン流に関する研究計画も検討する。(1)電流を流すことによりスピン偏極が誘起される現象(エーデルシュタイン効果)をカーボンナノチューブ中のヨウ素原子からなる螺旋状原子鎖において理論的に研究した。エネルギーバンドのスピン分裂と電流誘起スピン偏極(z方向)を強束縛近似に基づきヨウ素原子p軌道内のスピン軌道相互作用を取り入れて計算し、螺旋構造の半径やピッチを変えることによりスピン偏極を大きく制御できることを明らかにした。半径とピッチがある関係を満たす螺旋構造では、絶対零度でp軌道を電子が1/2の割合で占有するフェルミエネルギーにおいて、(スピン偏極)/(電流)が無限大になることを見いだした。さらに軌道角運動量の偏極(z方向)の計算も行い、同じフェルミエネルギーにおいて無限大になることを明らかにした。エーデルシュタイン効果によるスピン偏極から生成されるスピン流は、磁化を効率的に制御することができるため応用上注目されている。我々の研究成果はスピン偏極を格段に増大させることにより磁化制御効率をさらに向上させる方法を示唆していると考えられる。

(2)面方位が(111)のInGaAs/AlGaAsSb量子井戸では障壁層の組成を調節することによりRashbaとDresselhausスピン軌道相互作用の和を(面に垂直な電場の値によらず)ゼロにできることを示した。この成果を用いることによりスピン緩和を格段に低減できる。また、3重量子井戸におけるスピン緩和率のON-OFF比が100Kにおいても1000を越えることを示した。(3)外因性スピンホール効果において逆向きのスピン流が生じる2つの量子井戸を強く結合させるとスピン流が各層でゼロとなるが、この結合状態から逆向きのスピン流をもつ非結合状態へのクロスオーバーが運動量緩和により起こることを示した。また、エーデルシュタイン効果においても同様のクロスオーバーが起こることを示した。(1)螺旋状原子鎖に関して、交付申請書の研究実施計画に記載した電流誘起スピン偏極の計算を完了し、螺旋構造とフェルミエネルギーを調節することでスピン偏極を格段に大きくできるという顕著な成果を得た。また、当初の研究実施計画には入っていなかった「軌道角運動量の偏極」の計算も実施し、スピン偏極が増大する条件のもとで軌道角運動量の偏極も増大することを明らかにした。(2)当初の研究実施計画には入っていないが強く関連する課題であるスピン緩和の制御について研究を実施し、「研究実績の概要」に記載したとおり「スピン緩和の低減」と「スピン緩和率のON-OFF比の改善」という成果を得た。(3)研究実施計画を作成した後に着想した「2層系の結合状態から非結合状態へのクロスオーバー」について研究を実施し、「研究実績の概要」に記述したように運動量緩和を考慮するだけでクロスオーバーが起きることを外因性スピンホール効果とエーデルシュタイン効果に対して明らかにした。(1) DNAやオリゴペプチドなどの螺旋状の有機分子において観測されているスピン選択性(chiral induced spin selectivity)の機構を解明することを目的として、モデル系として採用した螺旋状原子鎖における電流によって誘起されるスピン偏極および軌道角運動量偏極の計算を行った。その結果、電流によって時間反転対称性が破れたときに発生する軌道角運動量偏極は原子鎖の曲率が小さい領域において曲率に比例することを明らかにし、電流誘起軌道角運動量偏極が曲率の存在が原因で生じること、曲率によって制御可能であることを示した。一方電流誘起スピン偏極は、曲率とスピン軌道相互作用(原子内LS結合)強度の両方に比例することを明らかにした。この研究成果は有機分子のようにスピン軌道相互作用が小さい軽元素からなる物質でも曲率を大きくすることで十分大きいスピン偏極を生成することが可能であることを示唆している。(2)ジグザグ原子鎖-A-B-A-B-の電流誘起スピン偏極を計算した。単位胞中の2原子A,Bが同じ元素である場合、空間反転対称性より電流誘起スピン偏極の単位胞内の総和は消失するが、各原子のまわりで局所的には空間反転対称性が破れているため局所スピン密度が電流印加により発生する。この局所的スピン偏極の大きさはA=B=Snの場合、空間反転対称性が破れているA=In, B=Sbの場合のスピン偏極と同程度であることを明らかにした。
植物ウイルス病における病徴制御法の開発～アブラナ科植物とカブモザイクウイルス～

カブモザイクウイルスに感染したハクサイ・カブにおける病徴は、宿主・ウイルス双方の遺伝子の組合わせによって決定される。本研究では、ウイルスに対する抵抗性反応並びに感染後の病徴である全身えそ、葉の奇形及びモザイクが宿主のRnt1遺伝子座とウイルスのCI遺伝子における遺伝子型の組合せによってそれぞれ決定されることを明らかにした。カブモザイクウイルスに感染したアラビドプシスで誘導されるえそ病徴はTuNI遺伝子によって制御されている。互いに配列相同性の高い3種類のCC-NBS-LRRタイプのR gene(RGA,B,C)がTuNI候補遺伝子であると考えられたことから、これらのうちいずれがTuNIであるか特定するため、それぞれ発現ベクターに組み込んだ上でプロトプラストに導入しカブモザイクウイルスを感染させた。その結果、RGCを組み込んだ場合にのみ細胞死の誘導能が増大することが観察された。また、プロトプラストレベルでPRgeneの発現増大も確認された。次に、植物体レベルでも同様な細胞死(えそ)誘導が生じるかどうか確かめるため、3種類のR geneをそれぞれモザイク系統のCol-0に導入した。その結果、プロトプラストの結果同様、RGCを導入した場合にのみえそが誘導され、PR geneの顕著な発現も確認された。以上の結果に基づいて、RGCがTuNI遺伝子であると特定した。TuNI遺伝子の配列が明らかになったことから、この配列情報に基づいて今後同じアブラナ科のハクサイなどからTuNIホモログを単離し、えそ誘導能をもたないハクサイ品種の選抜に利用する。ハクサイTuNIホモログの単離を目的に、アラビドプシスTuNI遺伝子(R gene)の配列を基に設計したプライマーを用いてハクサイ及びカブ品種のゲノムDNAからTuNIホモログを増幅、クローニングした。各クローンの配列を比較した結果、少なくとも9種類のホモログが存在し、そのうちY7クローンがもっともTuNIと配列相同性が高かった。ハクサイ・カブ11品種についてこの遺伝子の配列をシークエンスしたところ7種類のハプロタイプに分類された。一方、TuMV系統6系統に対する抵抗性及び感受性の場合の病徴のパターンは5種類に分類された。Y7のハプロタイプ及びTuMV系統に対する病徴パターンの間のアソシエーションを見たところ、カブ品種耐病ひかりにおいて両者のアソシエーションが示唆された。ハクサイ品種「秋まさり」由来のS_2系統が示すTuMV-UK1系統に対する抵抗性はウイルスの変異(UK1m)によって打破され全身えそを示すようになった。UK1mのゲノム配列をUK1と比較してみるとP3,CI及びCP遺伝子に1箇所ずつ非同義置換が検出されたため、各変異を導入した感染性クローンを作成し抵抗性S_2系統に接種したところ、CIの変異により抵抗性が打破されることが明らかとなった。さらに、このCIにおける1塩基置換によって「優春」の病徴はえそモザイクからマイルドなモザイクへと変化し、「はやひかり」が示す弱いえそと葉の奇形は消失した。また、カブ品種「早生大蕪」の示すモザイク症状も軽減した。UK1に対する抵抗性や感染時に示す多様な病徴は宿主の系統・品種に特異的であり、またこれらの反応の誘導にCIの共通部位が関係していることから、CIは同じ部位で宿主側の複数の因子と相互作用し、抵抗性だけでなく感染時の多様な病徴も誘導しているものと考えられた。TuMVに感染したハクサイで生じるえそ病徴について遺伝解析を行ったところ、えそは抵抗性遺伝子と同じ遺伝子座の複対立遺伝子によって引き起こされることが明らかとなった。この遺伝子座をRnt1(Resistance and necrosis to TuMV 1)とした。このRnt1についてSSRマーカーを用いた連鎖解析を行ったところ、Rnt1は染色体R6上に座乗することが示された。Rnt1の座乗領域をさらに絞り込むため、R6上のSSRマーカーの配列情報を利用してRnt1を含む可能性のあるScaffold配列をハクサイゲノムデータベースBRADで検索したところ、Scaffold9(約4.7Mb)と129(約0.5Mb)の配列を得た。このうち129内に作成した2つのマーカーでRnt1を挟むことができた。この約300kbに渡る領域内にはR geneクラスターが一カ所存在しており、このクラスター内のR geneのいずれかがRnt1であると考えられた。一方、ウイルス側に存在するえそ誘導遺伝子はウイルスの突然変異系統を用いた解析によりCI遺伝子であることが明らかとなった。また、このCI遺伝子は非病原性遺伝子であるとともに奇形やモザイクなどの病徴誘導にも関わっていることが示された。このように、TuMVに感染したハクサイで生じる病徴はRnt1座とTuMVのCI間における相互作用によって複雑な制御を受けていることが明らかとなった。
インスリンレセプター遺伝子異常と糖尿病

我が国には約500万人のインスリン非依存性(成人型)糖尿病患者がおり、人類がかかえる最も頻度の高い遺伝病の1つであると考えられる。この糖尿病は、細胞のインスリンに対する応答に主な障害があると考えられている。インスリンは細胞表面上にあるインスリンレセプターと結合することにより作用を発現するため、遺伝因子としてまず第一にこのインスリンレセプターの質および量の異常を検討する必要がある。最近次々とインスリンレセプター遺伝子異常による糖尿病が発見され、その症状は多彩であることが明らかになってきた。従ってインスリン非依存性糖尿病の中に遺伝要因としてインスリンレセプター遺伝子異常が存在することが十分考えられるので、インスリン非依存性(成人型)糖尿病患者の中に発症の遺伝要因として、どれほどの頻度でインスリンレセプター遺伝子異常が存在するのかを検討した。遺伝子増幅法(PCR)により、インスリンレセプター全エクソンを増幅し、DNAシーケンスする方法を確立した。典型的なインスリン非依存性(成人型)糖尿病50例について、インスリンレセプター遺伝子異常の存在を検討した結果、βサブユニット中に、4人の患者において2ケ所にアミノ酸置換が発見された。これらアミノ酸変異に関して、レセプターの機能障害をもたらしてくるものなのか検討するため、cDNA上でPCR法を用い同じ変異を作製し、動物細胞発現ベクターに組み込み、動物細胞で発現させ、そのレセプターへのインスリン結合能、インスリン結合によるβサブユニットのチロシンキナーゼ活性化、インスリンによる糖取り込み促進能などを検討し、そのアミノ酸変異がインスリンレセプターの機能低下を示すかどうか解析しており、また家系調査も行ないこれら変異がNIDDM発症と関係するか否か検討を進めている。
犬の骨髄間質細胞を用いた軟骨再生医療の確立

本研究では、骨髄間質細胞を用いた軟骨再生医療を行うことにより変形性関節症の根治を目指した研究を行った。犬の骨髄間質細胞は、軟骨分化誘導培地を用いて軟骨様組織へと分化することができた。また、無血清培地を用いて犬の骨髄間質細胞を増殖させ軟骨への分化誘導を試みたところ、従来の分化培地よりも増殖能は優れていたものの、軟骨分化能に関しては議論の余地が残った。軟骨細胞の定着に適した足場基材について検討したところ、犬の培養軟骨の素材として、メビオールジェルが最も有用である可能性が示唆された。最終的に、犬で軟骨再生医療を実現化するために、非侵襲的で最適な関節鏡視鏡手技を確立し、臨床応用の礎を築いた。今年度は、まず犬の骨髄間質細胞(BMSCs)の軟骨分化に最適なscaffoldを検討した。今回の検討では、scaffoldとして、低抗原性typeIコラーゲンである3%アテロコラーゲン、新規素材で生体由来物質を含まないメビオールジェル、温度反応性ゼラチンを用いた。犬BMSCsを培養および軟骨へ分化誘導させた後に、細胞の定着能や得られた細胞塊の大きさを比較した。3%アテロコラーゲン群では、細胞の生存率がきわめて低かった。温度反応性ゼラチン群では、形態が崩れ組織塊を得ることができなかった。メビオールジェル群は、得られた軟骨様組織が最も大きくかつ細胞の生存生が最も優れていた。さらに、メビオールジェル群で得られた組織は、トルイジンブルー染色で異染性を示した。これらの検討結果から、犬BMSCsの軟骨分化にとってメビオールジェルが最も優れたscaffoldであることが示唆された。次いで、犬の膝関節を用いた軟骨欠損モデルにおける軟骨再生能を関節鏡視下で評価する方法を検討した。犬の膝関節の軟骨全層欠損モデルを用い、理想的な関節内手術器具の操作用の孔の部位を検討した。全身麻酔下で膝関節の関節鏡検査を行い、理想的な軟骨欠損の作成部位や操作孔の作成部位そして記録方法を確立した。さらに、超音波検査やMRI検査(T1WI、T2※、T2WI、STIR)を同時に行い、これらの撮像条件についても検討しより臨床的な再生軟骨の評価法を確立した。上記の研究成果の一部は、平成26年3月に行われた第13回日本再生医療学会にて公表した。また、本研究助成金の一部で行われた研究成果は、第156回日本獣医学会、International Society for Stem Cell Research 11th Annual Meeting、第65回細胞生物学会等で発表した。また、今回の研究内容で韓国・建国大学とMOUを締結した。今年度は、犬の軟骨の幹細胞源として、骨髄間質細胞(BMSC)、滑膜細胞由来間質細胞(SDSC)、膝蓋下脂肪体から分離した脱分化脂肪細胞(DFAT)または脂肪組織由来間質細胞(ADSC)のいずれが最も有用かを検討した。臨床上健康と認めた犬の上腕骨から骨髄を抜去しBMSCを分離した。同一犬から滑膜と膝蓋下脂肪体を採材した後にコラゲナーゼで修理し、得られた細胞を静置培養することによりSDSCとADSCを、天井培養することによってDFATを分離した。各群ともに10日間培養し、形態や増殖能を検討した。その後、各群の軟骨分化能を検討し、形成された細胞塊の大きさとトルイジン青染色の染色性を検討した。BMSC群、SDSC群、ADSC群のいずれも、線維芽細胞様の形態を呈しながら比較的均一に増殖していった。DFAT群においては、培養翌日から球形細胞が培養フラスコの天井へと付着し、次第に線維芽細胞様の形態へと変化していった。培養10日後に得られた細胞数は、ADSC群が最も多い傾向が認められた。軟骨へと分化誘導したところ、ADSC群が最も大きい軟骨様細胞塊が形成された。いずれの軟骨様細胞塊も、トルイジン青染色で異染色性を示した。本研究においては、犬のSDSC、DFAT、ADSCのいずれも培養および増殖が可能であった。SDSC、DFAT、ADSCの形態はBMSCときわめて類似しており、これらの細胞はBMSCより増殖が旺盛であった。これらの細胞の中で、ADSC群が最も得られた細胞数が多く、また軟骨へと分化誘導した時に最も高率でかつ大きい軟骨様球形細胞塊を形成した。これらの結果から、犬の軟骨再生のための幹細胞としてADSCが最も優れている可能性が示唆された。本年度は、骨髄間質細胞を用いた軟骨再生医療の臨床応用を目指し、無血清培地を用いた時の軟骨への分化能について検討した。

全身麻酔下で正常犬から骨髄液を抜去し、比重遠心分離した後に単核球を分離した。この時に得られた単核球を、従来から使用されてきた10%FBS添加αMEMで培養した群(従来群)と無血清培地を用いて培養した群(無血清群)の2群に分け検討を行った。無血清培地としては、初代培養時にSTK1、継代後の増殖培地にはSTK2を用いた。犬BMSCsの増殖能を確認した後に、ペレット培養にて軟骨へと分化誘導した。軟骨への分化誘導には、Dexamethasone、L-Ascorbic acid 2-phosphate、Pyruvate、Linoleic acid、ITS-G、hTGF-β3を含むαMEMを用いた。無血清群において、STK1を用いて初代培養を行ったところ、犬BMSCsはより早期に接着する傾向があり、培養3日目には従来群よりも多い細胞数が得られた。また、無血清群は従来群に比べて増殖能が優れており、培養14日目には従来群の約3倍の細胞数が得られた。この傾向は、STK2を用いた第1継代細胞の培養時にも同様の傾向が認められた。犬BMSCsをペレット培養して軟骨へと分化誘導したところ、両群ともに分化誘導4日目には白色で球形の細胞塊を形成した。無血清群における分化誘導28日後に得られた細胞塊の大きさは741.0±132.5μmであった。得られた細胞塊をトルイジン青染色したところ、一部において異調性を示した。本研究では、得られた細胞塊において、collagenII、SOX9、aggrecanといった軟骨マーカーのmRNAの一部で発現が認められた。獣医外科学本年度は2つの実験を行った。まず、犬の骨髄間質細胞(BMSCs)の軟骨分化に最適なscaffoldの検討を行い、メビオールジェルが最も優れたscaffoldであることが明らかとなった。次いで、犬の膝関節を用いた軟骨欠損モデルにおける軟骨再生能を関節鏡視下で評価する方法を検討した。今回の検討にて、犬における理想的な軟骨欠損作成部位や操作孔作成部位そして記録方法を確立しただけでなく、超音波検査やMRI検査の撮像条件も検討することができた。これらは、次年度以降の研究につながる成果であり、当初の実験計画と照らし合わせると大方計画通りに遂行した。当該年度では、申請の段階で、「犬骨髄間質細胞の軟骨への分化誘導条件の検討」と「再生軟骨の培養環境に関する検討」を行う予定であった。前述の実績概要にもあるように、前者の検討については順調に行うことができ結果も公表することができたが、後者についてはやや進捗が遅れている。しかし、独立行政法人物質材料研究機構や韓国の建国大学との情報交換も積極的に行い、一部の実験は既に開始している。次年度の早期には、これらの結果が出ることが予想され、研究を達成できる見通しが十分に立っている。次年度では、下記の研究計画も同時に行っていく予定であり、それらが達成できれば当初の研究計画が達成できる。1軟骨損傷実験モデルにおける移植効果の検討犬の膝関節に軟骨損傷モデルを作成した後に、GFPでラベルした犬骨髄間質細胞を用いた種々の人工培養軟骨を移植し、その効果や硝子軟骨への再生能を比較することを目的とする。動物に対する侵襲を最小限に抑える目的で、荷重部位に軟骨半層欠損を作成する。Scaffoldは、本年度の研究成果から得られた最も優れていた材質を用いる。