hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重金属による骨代謝障害に関する研究

従来から、重金属投与時だけでなく寒冷・拘束などの各種生理的ストレスにより「金属結合蛋白質」が、ラット肝臓に誘導合成されることが知られている。ところで、我々は低Ca食飼育下のラットにおいて、短期間で骨吸収が進み骨代謝が活性化されることを明らかにした(歯科基礎誌34,595-611,1992)。今年度はこの低Ca食飼育下のラット肝臓において「亜鉛結合蛋白質」が誘導合成される知見を得たのでこれを報告する。方法:Wistar系雄性ラットの加齢群(28ヶ月齢)と若年群(4週齢)に対Ca食として0.05%Caを含むエサを与え、正常Ca食として0.5%Caを含むエサを与えて飼育した。ラットは6日間飼育後屠殺し、肝臓・腎臓を摘出した。この標本の細胞質分画をゲルろ過し原子吸光分光光度計にて金属濃度を測定後、さらに電気泳動を行なった。結果:低Ca食群の若年ラット肝臓において亜鉛結合蛋白質の誘導が認められたが、腎臓では変化が見られなかった。一方、対照群と加齢ラットの肝臓・腎臓では認められなかった。電気泳動の結果、この亜鉛結合蛋白質は分子量3万であった。各種ストレスにより誘導されることが知られている金属結合蛋白質(metallothionein)は、分子量1万以下の蛋白質であることからmetallothioneinとは異なる蛋白質が、低Ca食飼育により肝臓に誘導合成されることが示された。静岡大学の山口らは亜鉛投与により、骨DNA量およびアルカリフォスファターゼ活性の増大を報告している。従って低Ca食群若年ラットは、Ca代謝の変化に伴い生体内亜鉛と結合した蛋白質が肝臓に誘導され、これが骨代謝の活性化と関連している可能性が示唆された。結論:低Ca食飼育により骨代謝が活性化された若年ラット肝臓において、亜鉛結合蛋白質が誘導合成されることが証明された。今後はこの蛋白質と骨吸収の関連性を追究し、骨代謝制御因子の解明を行う予定である。
土偶情報の高次学術応用に関する実証的研究

本研究は正式には平成6年11月からの開始であり、全体研究計画と年次計画、そして研究組織体制の再編成を緊急に行い、3年度に渡る研究活動を鋭意遂行した。平成7年度に代表者の八重樫純樹が国立歴史民俗博物館より、静岡大学情報学部に転勤したが、両機関の事務官諸氏の支援により研究活動に支障無く、予定計画以上の成果を得る事ができた。以下、概要を示す。(1)土偶シンポジウム活動:年1回、計3回に渡る公開学術土偶シンポジウムを開催・(平成6年度)土偶シンポジウム3栃木大会-関東地方後期の土偶-・(平成7年度)土偶シンポジウム4長野大会-中部高地をとりまく中期の土偶-・(平成8年度)土偶シンポジウム5宮城大会-亀岡文化の土偶-各シンポジウムにおいて、資料集・発表要旨集として刊行し、膨大な学術情報の刊行公開をおこなった。(2)平成6年度から平成7年度にかけて、第一版土偶データベースを、国立歴史民俗博物館の公開データベースシステムの一部として公開した(画像データは技術上の問題から館内公開)。また、これらデータベース利用をもととして、個人有効活用のためのフロントエンドシステムを開発、考古学学術データ利用システムとしてのプロトタイプを提示。(3)考古学資料情報化モデルの研究については、福岡県の関係機関、関係者の協力をえて、平成7年度を中心に活動し、情報化分析を行い、考古学資料情報化モデルを構築した。(4)上記(1)シンポジウム活動等により、得られた新たな知見を学術研究書としてまとめ、情報公開を行うため、刊行活動を行い、平成6年度『土偶研究の地平-土偶とその情報研究論集(1)』として、勉誠社より出版した。また、これら研究成果と文脈をもとに、新たな研究活動を計画・開始した。本年度の本格研究活動は11月からであり、これまでの準備状況と3月までの時限、今後の計画等の見通しから、全体の基本活動は以下のように行った。1.研究の設定:研究・協力組織の整備と目標設定。なお、月例会として、毎月、研究会・打合せ会を遂行。考古学系として「土偶とその情報」研究会の拡充と整備、平成7-8年度活動の目標設定。情報学系は基本設定・整備と今後の実験・基礎情報論研究の目標設定。2.シンポジウム活動:情報公開と、土偶基礎情報の整理・分析活動として、以下を遂行。(1)平成7年2月25-26日に宇都宮市にて、栃木県考古学会との共催で関東地方後期土偶を中心に、「土偶シンポジウム3栃木大会」を遂行(参加、約220名)。成果としては資料集(280頁)、発表要旨集(90頁)を刊行。主にハート形土偶、筒形土偶、山形土偶の系譜、分布、諸問題を明らかにした。(2)平成7-8年度の今後の研究会・シンポジウム活動の計画を進めた。3.情報システム系:全体として、準備活動を遂行。これらを通して、情報システムモデル論の実験、これらを通して、基礎情報論の分析・整理を進める予定。(1)第一版土偶データベース(文字系)をバックエンドシステムとして歴博公開データベースシステムにて3月末公開予定。(2)フロントエンド系システムの設備導入と整備を行った。4.その他、第二版としてのデータの補完、拡充収集の計画。また、シンポジウム活動を遂行しつつ、海外土偶も含め、各種、新たな研究展開の可能性を模索。平成7年度は国学院大学教授、小林達雄が英国より帰国するので、分担者として参加予定本研究は正式には平成6年11月からの開始であり、全体研究計画と年次計画、そして研究組織体制の再編成を緊急に行い、3年度に渡る研究活動を鋭意遂行した。以下、概要を示す。

本年度は10月に国立歴史民俗博物館より、静岡大学情報学部への転勤もあり、10月の前後は転勤に伴う諸雑務、整理、事務慣行への対応等に時間をとられ、多少の変更等はあったが、ほぼ目標の計画は達成された。以下、概要を示す。1.研究活動の設定:「土偶とその情報」研究会を中心としたシンポジウム活動計画を、転勤が10月であるため、早期に設定する必要があり、月例会等、4月から開始した。また、情報システム系も、その事から、早期に活動を開始した。2.シンポジウム活動:情報公開・土偶基礎情報の組織的整理・分析として、以下を遂行(1)平成8年2月3日4日に長野県松本市において、長野県考古学会の共催として、中部地方中期土偶を中心に「土偶シンポジウム4長野大会」を遂行(約230名参加)、成果として資料集(A4版416頁)、発表要旨集(A4版130頁)を刊行。累々たる中部地方中期土偶の分布と系譜を明らかにするとともに、今後の課題として、この時期の中部地方縄文文化、並びに全国の土偶との本質的関係問題がいくつか提起された。(2)平成8年度開催予定の「土偶シンポジウム5」宮城大会の準備活動を遂行した。3.情報システム系:平成7年3月に国立歴史民俗博物館公開データベースシステムにて、第一版土偶データベースを公開した。今年度はその利用状況の調査を行うとともに、パーソナル系にて、画像データを作成試験(CD-ROM)、その実験を行った。これらの評価は平成8年度予定。4.その他:シンポジウム活動は今年度で4回を迎え、その累積成果は膨大であり、今後の研究可能性がはっきり見えてきた。また、情報公開方法も多様化し、その具体的対応試験も迫られているように考える。来年度は、本研究をまとめるだけでなく、今後の展開についても研究資料の公開刊行、考古学、情報学両面からの活動設定を具体化する。静岡大学に赴任し、約半年。前期間とは状況や環境も変わったが、本研究に関する限り、情報学部-工学部事務官諸氏の支援も大きく、なんとか軌道に乗せ、計画通りの活動を遂行できた。以下概要を示す。1.研究活動の設定:今年度開催予定の土偶シンポジウム5宮城大会と、最後の土偶シンポジウム6の基本設定を行い、基本案を作成した。また、最終年度であり、本研究の評価・反省をもとに今後の研究の進め方、方針等を設定した。2.シンポジウム活動:情報公開・土偶基礎情報の組織的整理・分析として、以下を遂行(1)平成8年11月23日24日、宮城県多賀城市にて東北歴史資料館との共催として、東北・北海道を中心とした亀ヶ岡文化の土偶について「土偶シンポジウム5宮城大会を開催(約250名参加)。成果として、資料集(A4版、266頁)と発表要旨集(A4版、81頁)を刊行。亀ヶ岡文化土偶の特徴、地域的推移・変遷・分布、特に終末期の様相が明瞭になった。しかし、出土量の地域差の意味について大きな課題が残された。(2)平成9年度開催予定の「土偶シンポジウム6」奈良大会の計画を策定した。本科学研究費交付が終了した後なので、資金的問題が残された。3.情報システム系:画像等の情報システム評価を行った。類似機能の市販システムとの比較も試みたが、はるかに柔軟性とデータ適合性において優れていた。4.その他:土偶シンポジウム6は本科学研究費交付終了に開催予定であり、資金問題が残された。
顎関接培養滑膜細胞のPGE2産生に関する研究

今年度は顎間接内障、顎間接強直症、滑膜軟骨腫症の手術症例から得られた8例の顎関節滑膜培養細胞を用いた。方法は昨年度と同様、培養細胞のPGE_2産生に作用するIL-1β・3種類の抗炎症薬の効果を検討するため、培養液に添加し上清中に産生されたPGE_2をEnzyme immunosorbent assay(EIA)を用いて測定した。8穴チャンバースライドを用いて1x10^4個/wellの濃度で細胞培養し、IL-1β(1ng/ml)、さらにDexamethasone(DEX 1x10^<-7>M)、Indomethacin(INDO 1x10^<-6>M)、Etodolac(HYPEN 1x10^<-6>M:日本新薬(株)から提供)を加えた。いずれの薬剤も加えない細胞をコントロールとした。薬剤を作用させた後、1、2、6、24、48時間後に上清をとり測定サンプルとした。結果は、コントロールの上清には全くPGE_2は産生されなかった。IL-1βを添加した場合、1、2時間後ではほとんど産生が認められず、6時間後に少量の産生が確認された。さらに24時間、48時間後には高い産生量を示した。8例の細胞のいずれにも、IL-1βを添加すると、PGE_2の産生が認められたが、症例間に有意差はなかった。IL-1βに加え、それぞれDEX、INDO、HYPENを添加するとPGE_2は産生されず、これらの薬剤は有意にPGE_2産生を抑制した。チャンバースライドを坑Cyclo-oxygenase-2(COX-2)抗体で免疫染色すると、IL-1βを添加した細胞はコントロールと比較し、COX-2の存在が確認できた。以上のことから、培養滑膜細胞は、IL-1βの刺激でCOX-2が誘導されPGE_2を産生したと考えられ、上記3種類の抗炎症薬はCOX-2の産生抑制或いは阻害作用でPGE_2産生を制御したと考えられた。予備実験として、関節円板切除症例、顎関節強直症、滑膜軟骨腫症の手術症例から得られた各培養細胞(1×10^5個/well)に対して、IL-1β(1ng/ml)、TNF-α(6ng/ml)、TGF-β_1(2ng/ml)を加え培養した。78時間後の細胞培養液を採取し、上清中のPGE_2をEIA kitを用いて測定したところ、IL-1β(1ng/ml)を加えたものは、いずれの細胞にもPGE_2の産生が認められたが、TNF-α、TGF-β_1を加えたものでは、PGE_2の産生が認められなかった。また、基本培地のみではPGE_2の産生は認められなかった。結果は、lL-1β(1ng/ml)を加えたもので時間経過を追って、PGE_2の産生を測定したところ、1、2時間後ではほとんど産生が認められず、6時間後にようやく産生が確認された。細胞のいずれにも、IL-1β(1ng/ml)を加えたものでは、PGE_2の産生か認められたが、疾患の症例による差はなかった。24時間後の上清を測定すると、DEX、INDO.HYPENを加えた細胞の上清中のPGE_2は測定限界以下で、これらの薬剤は明らかにPGE_2の産生を抑制した。8穴チャンバースライドを染色すると、培養細胞は滑膜B型細胞様の線維芽細胞の形態に類似していた。

以上のことから、培養滑膜細胞は、IL-1βの刺激でCOX-2が誘導されPGE_2を産生したと考えられ、上記3種類の抗炎症薬はCOX-2の産生抑制或いは阻害作用でPGE_2産生を制御したと考えられた。
20世紀初頭における歴史意識の転換と研究者ネットワーク―日本歴史地理学会を中心に

本研究は、20世紀初頭に形成された全国的な歴史研究者ネットワークの実態と、その活動がアカデミズム史学と地域の歴史意識の双方に与えた影響を考察するものである。近年、地域史研究の領域で、20世紀転換期に地域の歴史意識が質的に転換したとする分析が相次いで発表されている。それらの成果を踏まえつつ、本研究では、この転換の背景に歴史研究者ネットワークの形成が関係しているとの見通しのもと、その実態を多面的に検討することで、近代歴史学の発達と社会への浸透が日本社会に歴史意識の転換をもたらすプロセスを構造的かつ具体的に解明することを目指す。
ＡＴＬ既感染者に生じた菌状息肉症と、皮膚型ＡＴＬの鑑別アルゴリズムの開発

HTLV1既感染者に生じた菌状息肉症と皮膚型ATLの病理学的な鑑別を目標とした。T細胞膜抗原、FoxP3、RNA編集酵素群、CXCR4等ケモカイン受容体群などの、ATLの発癌機序に直接関係のない蛋白の発現では、両者の鑑別は困難であると結論した。そこで各リンパ腫に必須のマイクロRNAを発見し、その下流に制御される蛋白群の解析を目指した。皮膚型ATLにはmicroRNA -146b,-5p -451を、菌状息肉症には- 20a, 29a, 30b, 31, 181a, 222, 320aを選別した。抗CCR4抗体による治療前後の発現を比較することで、より特異的なマイクロRNAの選別を進めている。沖縄・八重山地方は、成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-1)への感染率が非常に高い地域である。これら高感染地域では、従来のCD4陽性T細胞へのHTLV-1プロウイルスのモノクローナルな組み込みにより、皮膚型の成人T細胞リンパ腫(ATL)であると臨床診断する手法はほぼ無効である。HTLV-1既感染者のCD4陽性T細胞が菌状息肉症の機序により腫瘍化したのであれ、血清中のHTLV-1への抗体価は陽性でありT細胞受容体の遺伝子組換えとHTLV-1プロウイルスの組み込みは単クローン性の腫瘍としてサザンブロット法にて確認され、HTLV-1既感染者は全て菌状息肉症であっても、皮膚型のATLであると判断されてしまう。成人T細胞白血病ウイルス既感染者(HTLV-1キャリアー)に生じた皮膚リンパ腫を、古典的な菌状息肉症であるのか、あるいはHTLV-1の発癌機序に依存性の皮膚型ATLであるのか、臨床現場における簡便な鑑別手法を開発することを目標とした。昨年度は、T細胞分化の系譜である、CD25, OX40, FoxP3、さらにATLが長期の感染期間の後に腫瘍化することより慢性炎症により誘導される遺伝子改変酵素であるAIDを始め、APOBEC酵素群の蛋白発現を皮膚型ATLと菌状息肉症の病理切片において行った。CD25, FoxP3に関しては、大部分の両者に陽性に発現し、OX40は菌状息肉症には発現は乏しいが、皮膚型ATLで半数以下の症例では陰性と臨床上鑑別には不十分であり、さらにAID, POBEC蛋白群の発現解析を進めた。しかしながら、これらのmRNAおよび遺伝子改変酵素の発現も両皮膚リンパ腫間に特異的とまでは言い難い結果となり、厳密な差別化の必要な臨床鑑別のアルゴリズムとしては使用が難しいかとの印象を受け、次にマイクロRNAの発現による鑑別の可能性を考え候補遺伝子の選定行った。成人T細胞白血病ウイルス既感染者(HTLV-1キャリアー)に生じた皮膚リンパ腫を、古典的な菌状息肉症であるのか、あるいはHTLV-1の発癌機序に依存性の皮膚型ATLであるのか、臨床現場における簡便な鑑別手法の開発を目標とした。これまでにT細胞分化の系譜である、CD4, CD25, OX40, FoxP3、さらにATLが長期の感染期間の後に腫瘍化することより慢性炎症により誘導される遺伝子改変酵素であるAIDを始め、APOBEC酵素群の蛋白発現を皮膚型ATLと菌状息肉症の病理切片において行った。しかしながら、これらのmRNAおよび遺伝子改変酵素の発現も両皮膚リンパ腫間に特異的とまでは言い難い結果となり、厳密な差別化の必要な臨床鑑別のアルゴリズムとしては使用が難しいかとの印象を受けた。

成人T細胞白血病ウイルスの感染者は、全世界・日本全国に広く存在し、その感染者中より毎年、少数の割合ではあるが急性白血病、リンパ腫、慢性型、くすぶり型、あるいは皮膚型の成人T細胞リンパ腫の各型として発症する。日本全国に散らばるこの成人T細胞白血病ウイルス感染者であるが、沖縄・八重山地方では、特にその感染頻度が高く、沖縄県内の特定地域出身の健常な中高齢者では、その感染率、即ち、抗HTLV-1抗体陽性者は、30%以上にも達する。この成人T細胞リンパ腫は、しばしば皮膚型のATLとしての症状を呈する。一方、皮膚リンパ腫の中には、菌状息肉症とよばれる、非常に経過の長い慢性型の皮膚リンパ腫が存在する。勿論、この菌状息肉症の発症には成人T細胞白血病ウイルスの関与はなく、HTLV-1感染の有無を問わず、一定の割合で罹患し、その発症は全世界にわたり地域性は見られない。これら皮膚型ATLとHTLV-1の関与のない菌状息肉症は、非常に類似した病理的な形態を呈する。しかしそれらの臨床的予後、治療への感受性は非常に大きく異なる。近年は、皮膚リンパ腫の確定診断の一助として、T細胞受容体の単クローン性の遺伝子組換えの有無の確認と、ATLとしての証明に末梢血中の抗HTLV-1抗体の有無と、HTLV-1プロウイルスの単クローン性の組み込みを、サザンブロット法にて確認する。サザン法により単クローン性の組換えが確認されると、腫瘍性のT細胞の増殖であると判断する。HTLV-1ウイルスの高感染地域以外では、現実的な問題として、この手法を菌状息肉症と皮膚型ATLの鑑別手法として問題は少ないが、沖縄諸島の健常な中高齢者の中で、HTLV-1既感染者が30%にも及ぶとされる高率な感染率を勘案すると、臨床的にも必ずしも完全に満足できる手法ではない。まずFoxP3に代表される制御性T細胞マーカー蛋白、AID蛋白、APOBEC1-4蛋白群などmRNA編集酵素群、CXCR4等ケモカイン受容体群や、ATLウイルス由来の転写因子であるHBZを指標に、免疫組織学的な解析を行った。しかし皮膚型ATLあるいは菌状息肉症の患者間、病期間の違いによる、脱分化や蛋白発現脱落により、これらの蛋白発現が一定せず、特定の蛋白発現を選択しての鑑別は困難であると感じた。また感染細胞と腫瘍細胞の染色強度の違いに、臨床現場で使用可能なほどの強弱は得られなかった。従来のCD膜抗原、腫瘍マーカーによる免疫組織学的なカンバ悦では限界があると最終的には判断した。そこで、各リンパ腫瘍の形成・維持において必須の特異的マイクロRNAを文献上、網羅的に拾い上げ、その下流に制御される蛋白群の発現をも解析することで、初期病変における両皮膚リンパ腫の病理学的な鑑別アルゴリズムの確立を目指した。皮膚型ATLにはmicroRNA-146b-5p, -451を、菌状息肉症にはmicro RNA- 20a, 29a, 30b, 31, 181a, 222, 320aを選別した。これらマイクロRNAのin situハイブリをプローベ毎に条件設定し、その発現プロファイルの決定を進めている。特異的なマイクロRNAの組み合わせを決定し、その下流に支配され、皮膚型ATLと菌状息肉症とでは違った発現調節を受けるT細胞での発現蛋白の探索を続けている。沖縄・八重山地方は、成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-1)への感染率が非常に高い地域である。これら高感染地域では、従来のCD4陽性T細胞へのHTLV-
肝障害抑制因子としての一酸化窒素の役割に関する研究

病態時の肝臓では、炎症性サイトカインによる様々な遺伝子の発現誘導がその機能不全と深く関連している。インターロイキン1β(IL-1β)などにより誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)は、多量の一酸化窒素(NO)を産生する。NOは肝障害そのものを引き起こしさらに悪化させる作用と逆にその障害を減弱化する相反する2つの作用をもつ。しかしながら転写因子NF-κBを介したiNOS誘導の制御メカニズムの詳細は不明な点が多い。本研究では動物モデルと初代培養肝細胞を用いて、IL-1βのiNOS/NO誘導をコントロールする内因性、外因性物質の作用機構を明らかにした。iNOSプロモーターのκB部位へのNF-κBの結合にはC/EBPβの関与が示唆された。さちにNF-κBのvicinalthiol残基が、DNA結合に重要な働きをしている事が明らかになった。一方、低酸素によるiNOS誘導の抑制はNF-κBの活性化(核移行とDNA結合)にはまったく影響を与えないことより、iNOS誘導にはNF-κBの活性化に加えてIL-1βから同時に立ちあがるシグナル(因子)の存在が必須であることが予想された。この未知シグナルを解明することが、iNOS誘導のメカニズムを明らかにする近道と考える。多くの内外の因子がそのシグナルを介して、実際にNO産生の誘導をコントロールしている可能性が高い。病態下において、肝細胞で産生誘導された一酸化窒素(NO)が肝障害の促進あるいは保護のいずれの方向に働いているかは不明である。しかし、肝臓に加えられた障害因子(酸化ストレス、出血性ショック、エンドトキシンショック、四塩化炭素、エタノール)によって、NO効果は細胞毒性、細胞保護のいずれかに向かうものと考えられている。私達は肝細胞の初代培養系を用いて、インターロイキ1β(IL-1β)誘導性の誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)に影響を与える因子の研究を行い、今年度は以下の成果を得た。1.肝部分切除後の残存肝におけるiNOS/NO産生誘導は肝障害を促進する(J Hepatol 1999;30:944)。肝切除は肝細胞のNO産生誘導を正常時の2倍以上に促進するとともに、そのミトコンドリアのredox state(NAD+/NADH)を減少させた。その結果、細胞内のATPレベルは著しく減少した。このNO産生誘導の促進によるミトコンドリア機能障害は術後感染などによる肝機能不全の一因と考えられる。肝臓の障害時に誘導される一酸化窒素合成酵素(iNOS)の役割は従来からその二面性が報告されている。障害を引き起こす要因(酸化ストレス、アルコール、熱、肝毒物)によって、産生される一酸化窒素(NO)は細胞保護あるいは逆に細胞毒性に働く。しかし、その産生制御や作用のメカニズムに関しては不明な点が多い。炎症性サイトカインのインターロイキン1β(IL-1β)により発現誘導するiNOSに関して以下のような知見を得た。1.低酸素は肝細胞のIL-1β/iNOSの誘導をその転写レベルで抑制する(Hepatology2000;32:1037-1044)。一般にiNOS誘導は低酸素により活性化されることが報告(マウスマクロファージ)されている。低酸素は肝細胞では逆にiNOSプロモーター/ルシフェラーゼ(1.4 kbase)のtransactivation活性を抑制しNO産生を阻害した。この阻害は転写因子NF-κBの活性化(核移行およびDNA結合)やプロモーター領域に存在するhypoxia-response elementには無関係であった。低酸素を介したiNOS誘導抑制の新しいメカニズムの存在が考えられる。2.NF-κBのvicinal dithiol残基はプロモーターのκB部位への結合に必須である(J Biol Chem 2000;275:4369-4373)。IL-1βのiNOS誘導にはNF-κBの活性化が必須であるが、十分ではない事が良く知られている。

Vicinal dithiolに特異的に結合する酸化フェニルアルシンを用いて、NF-κBはiNOSプロモーターのκB部位への結合に隣接するチオール残基の存在が重要な役割をはたしていることを明らかにした。このチオール残基の作用を制御する因子が上述の十分条件に関与する可能性がある。肝臓の障害時に産生される一酸化窒素(NO)はその障害の進行および修復のいずれにも関与することが報告されている。.NOの合成酵素には3種類のアイソザイムが存在するが、誘導型のiNOSが病態時のNO産生の誘導に関与している。lL-1βのiNOS誘導には転写因子NF-κBの関与が良く知られているが、その誘導メカニズムの詳細に関しては不明な点が多い。lL-1βのiNOS誘導に影響を与える内因性および外因性物質の作用機作を明らかにしたので報告する。1.高濃度グルコースはiNOS誘導を抑制する。糖尿病では血管拡張因子としてのNOに対するグルコースの阻害効果が報告されている。血糖を支配する肝臓でのグルコースの影響を検討したところ、高濃度グルコース(15mM以上)は濃度依存性にNO産生を阻害した。転写レベルでの阻害が明らかとなったが、IκBの分解やNF-κBの活性化(核移行とDNA結合)には影響を与えていなかった。NF-κB活性化以降での未知の因子(シグナル)の関与が示唆された。2.Pfdは肝細胞のiNOS誘導を抑制する。Pirfenidone(抗繊維化試薬、Pfd)が肝不全ラットモデルにおいて死亡率を低下させたことより、肝細胞のiNOS誘導に対する効果をみた。Pfd(1mg/ml)はlL-1βのiNOSmRNAおよび蛋白質の誘導を完全に阻害した。さらにいNF-κBのDNA bindingを阻害することも明らかとなった。しかし、核内p65(NF-κBのサブユニット)の免疫沈降実験より、NF-κBの核移行には影響を与えていなかった。PfdはNF-κBのiNOS promoterのkB siteに結合するために必要なシグナルをブロックしていると考えられる。3.cPrGは肝細胞のiNOS誘導を促進する。以上より、IL-1βのiNOS promoterの活性化にはNF-κBの活性化に加えて、IL-1βから同時に立ちあがるシグナルの存在が必須であることが予想される。今後、この未知シグナルを解明することが、iNOS誘導のメカニズムを明らかにする近道と考える。多くの内外の因子がそのシグナルを介して、実際にNO産生の誘導をコントロールしている可能性が高い。
フランス啓蒙期諸思想に対するジェンダー論的分析

平成12年度は、現在出版されている関連図書と並んで、特にフランス啓蒙期に出版された女性に関する自然誌的・道徳的諸文献や女子教育に関する文献等をマイクロフィルムを活用して多数収集した。初年度として、これら資料の整理に当たるとともに、フランス啓蒙期のジェンダーに関わる諸思想を検討したが、とりわけシャトレ夫人、デピネ夫人、コンドルセ夫人など、同時期に活躍した女性思想家たちの動向を調査した。平成13年度は、前年度に行なった女性思想家たちの動向の調査を続行するとともに、対極的な立場を取ったルソー、コンドルセを中心に、同時期のディドロ等のジェンダー思想に対する分析を行なった。ルソーに関しては、教育論『エミール』の女性教育の項をはじめとする彼の議論を検討し、性別身体の二元論の生成期においてルソーが時代の思潮の中で、自由と平等の両立可能な社会の原理を構想する一方で、いかに男女の補完的機能に関し立論したかを跡付けた。コンドルセに関しては、革命期におけるコンドルセの言説を検討し、コンドルセが女性と男性の平等を説いて、女性の市民権付与に向けて論陣を張る一方で、性差に関わらない公教育の推進を唱えるなど、革命の理念である人間の平等という原理に最も忠実な論者であったことを確かめた。これらの研究成果は、まだ公表するに至っていないが、平成12年度に、現代哲学・倫理学の分野としてジェンダーに関わる問題領域の重要性を論じた論考を発表し、学会報告を行なった他、本年度作成した研究報告書を基にして、研究成果を学術論文にまとめて発表すべく準備中である。本年度は、ジェンダーに関わるフランス啓蒙期諸思想の資料収集に努めるとともに、次年度に向けた基礎的研究を行なった。資料収集に関しては、現代出版されている諸文献と並んで、フランス啓蒙期の文献の収集に努め、同時期に出版された女性に関する自然誌的・道徳的諸文献や女子教育に関する文献等を、マイクロフィルムにより多数収集するなど、大きな成果をあげることができた。基礎的研究としては、上記資料の整理を行ないながら、フランス啓蒙期のジェンダーに関わる諸思想の検討を進める一方で、シャトレ夫人、デピネ夫人、コンドルセ夫人など、同時期に活躍した女性思想家たちの動向を調査し、男性側からでなく女性たち自身によって語られ、行なわれたことをも検討した。これらの資料収集と基礎的研究によって、次年度に行なわれるルソーとコンドルセを中心としたフランス啓蒙期思想のジェンダー論的分析のための、準備作業を行なうことができた。これらの成果はまだ公表するに至っていないが、本年度は、現代哲学・倫理学の分野としてジェンダーに関わる問題領域の重要性を論じた論考を発表し、学会報告を行なうことができた。本年度は、昨年度に引き続き、フランス啓蒙期諸思想の文献を中心にジェンダーに関わる資料を収集するとともに、本研究の完成に努めた。昨年度に行ったデピネ夫人等のフランス啓蒙期の女性思想家たちの動向の調査を続行するとともに、対極的な立場を取ったルソー、コンドルセを中心として、同時期のジェンダー思想に対する分析を行った。デピネ夫人に関しては、彼女の教育論や書簡を検討し、プーラン・ド・ラ・バールの論点を展開した形で、デピネ夫人が女性の知的能力の開発に関する先駆的理論家であることを確証し得た。ルソーに関しては、教育論『エミール』の女性教育の項をはじめとする彼の議論を検討し、性別身体の二元論の生成期においてルソーが時代の思潮の中で、自由と平等が両立可能な社会の原理を構想する一方で、いかに男女の補完的機能に関して立論したかを跡付け得た。コンドルセに関しては,革命期におけるコンドルセの言説を検討し、コンドルセが、ユダヤ人への市民権付与や奴隷制の廃止を説いたのと同様に、女性と男性との平等を説き、女性の市民権からの排除に論駁を加え、また貧富の差と同様に性別にも関わらない公教育の推進を唱え、革命の理念である人間の平等という原理に最も忠実な論者であったことを確かめ得た。

これらの研究によって、19世紀におけるジェンダーに関する論争の起源となる諸思想に関する調査を、相当程度に達成することができ、近代全般におけるジェンダー思想の系譜の検討の基盤を形成することができた。本年度は本研究を基に公表した成果はまだないが、提出される研究成果報告書を踏まえて研究成果を学術論文にまとめて発表すべく準備中である。
声帯麻痺後の再運動化による喉頭機能の再生

本研究の目的は、麻痺している喉頭の筋に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、機能的な声帯運動を回復させることである。まず、声門閉鎖筋である甲状披裂筋を刺激するための埋め込み型電極を設計した。電極は縦8mm、横12mm、厚さ0.8mmのシリコンシートに直径3mmの電極を縦に2個、横に3個で計6個配置し、これとは別に不関電極を設置して単極刺激と双極刺激の異なる刺激モードが使えるようにした。この電極で実際に声門閉鎖運動が誘発できるのか検討するために、イヌの声帯麻痺モデルを作成した。モデル動物は反回神経を切断した後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと、反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群にわけ、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。喉頭筋再支配モデルの動物では、小さな電気刺激でも大きな声門閉鎖運動が効率的に誘発され、その運動量の調節も非常に容易であった。一方、喉頭筋脱神経モデルの動物では、電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することは可能であるが、より強力な電気刺激が必要であった。このシステムが臨床応用されるためには、人工内耳のように刺激発生装置と電極を完全埋め込み型とし、体外からこれを駆動する方式が理想的である。その前段階として、この刺激発生装置を経皮的に作動させることができるか確認した。イヌの前胸部皮下にコイルを埋め込み、バッテリーに接続した体外部のコイルを埋め込み部分の皮膚の上にかざすことで、皮膚を通して刺激発生装置を駆動できることができ、喉頭に留置した電極によって声帯の内転運動が誘発された。この結果に基づき、完全埋め込み型の刺激発生装置の試作器が完成した。前胸部に埋め込まれる刺激発生装置は、体表にコイルを置くことによって駆動されるだけではなく、タブレットのアプリケーションを使用して使用電極や刺激強度の調整が可能になっている。まず、声門閉鎖筋である甲状披裂筋を長期間刺激するための埋め込み型電極を用意した。電極は縦8mm、横12mm、厚さ0.8mmのシリコンシートに直径1mmの電極を2列に6個配置した。モデル動物は反回神経を切断した直後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群にわけ、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。神経切断から3ヶ月後に声帯が固定していることを確認して、麻痺側の甲状披裂筋の表面に埋め込み型電極を留置した。経口的に硬性内視鏡を挿入し、電気刺激で誘発される声門閉鎖運動をビデオに記録して解析した。切断後に神経吻合をおこなった動物では、反回神経の電気刺激によって喉頭筋に筋活動が誘発され、喉頭筋に神経再支配がおこっていることが確認された。そのような動物では小さな電気刺激で効率的に大きな声門閉鎖運動が誘発され、その運動量の調節も非常に容易であった。一方、神経吻合をおこなわなかった再支配群の動物でも電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することはできるが、より強力な電気刺激が必要であった。この機能的電気刺激による声帯運動の誘発に関する長期間の有効性と安全性を検討するために、体内に埋め込まれた電極が損傷されることなく、有効に作用し続けるのか確認した。その結果、埋込期間が1ヶ月以上になると電極の損傷が多く、電極の形状や留置する位置についてはさらなる改良と工夫が必要であると思われた。電極は縦8mm、横12mm、厚さ0.8mmのシリコンシートに直径1mmの電極を縦に2個、横に3個で計6個配置した。甲状披裂筋に対して単極刺激と双極刺激の異なる刺激モードが使えるように、不関電極を刺激する筋から離れた部位に設置できるようにした。切断後に神経吻合をおこなった動物では、小さな電気刺激でも大きな声門閉鎖運動が効率的に誘発され、その運動量の調節も非常に容易であった。一方、神経吻合をおこなわなかった再支配群の動物では、電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することは可能であるが、より強力な電気刺激が必要であった。さらに、体内に埋め込まれた電極が損傷されることなく、有効に作用し続けるのか確認した。

その結果、埋込期間が1ヶ月以上になると電極の損傷が多く、電極の形状や留置する位置についてはさらなる改良と工夫が必要であると思われた。電気刺激による声帯運動の回復を臨床応用するためには、長期間にわたって体内に留置可能な電極と刺激発生装置が必要である。我々は、人工内耳のシステムのように、刺激発生装置そのものは体外にあり、経皮的に体内の電極を駆動するシステムが理想的であると考えている。このシステムは刺激発生装置が対外にあるため、心臓ペースメーカーのように入れ替えを必要としない。さらに、患者はその必要性に応じ使用状況を容易に変更することもできる。このシステムの開発には電気機器専門メーカーの協力が不可欠であり、現在我々は地元企業との共同開発をすすめている。まずは埋め込み電極の長期間留置に問題ないことを確認してから、刺激装置とどのように接続していくのか検討をすすめていく計画であった。しかし、これまで試した電極には長期間の留置による破損が多く認められている。そのために、経皮的刺激発生装置の開発にも遅れが生じている。長期間の体内留置によって破損がおこらないような電極の改良や埋込方法の工夫が急務である。本研究の目的は、麻痺している喉頭の筋に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、機能的な声帯運動を回復させることである。まず、声門閉鎖筋である甲状披裂筋を刺激するための埋め込み型電極を設計した。電極は縦8mm、横12mm、厚さ0.8mmのシリコンシートに直径3mmの電極を縦に2個、横に3個で計6個配置した。甲状披裂筋に対して単極刺激と双極刺激の異なる刺激モードが使えるように、不関電極を刺激する筋から離れた部位に設置できるようにした。この電極で実際に声門閉鎖運動が誘発できるのか検討するために、イヌの声帯麻痺モデルを作成した。モデル動物は反回神経を切断した後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと、反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群にわけ、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。神経切断から3ヶ月後に声帯が固定していることを確認して、麻痺側の甲状披裂筋の表面に埋め込み型電極を留置した。経口的に硬性内視鏡を挿入し、電気刺激で誘発される声門閉鎖運動をビデオに記録して解析した。喉頭筋再支配モデルの動物では、小さな電気刺激でも大きな声門閉鎖運動が効率的に誘発され、その運動量の調節も非常に容易であった。一方、喉頭筋脱神経モデルの動物では、電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することは可能であるが、より強力な電気刺激が必要であった。このシステムが臨床応用されるためには、人工内耳のように刺激発生装置と電極を完全埋め込み型とし、体外からこれを駆動する方式が理想的である。その前段階として、この刺激発生装置を経皮的に作動させることができるか確認した。イヌの前胸部皮下にコイルを埋め込み、バッテリーに接続した体外部のコイルを埋め込み部分の皮膚の上にかざすことで、皮膚を通して刺激発生装置を駆動できることができ、喉頭に留置した電極によって声帯の内転運動が誘発された。我々は、人工内耳のように電力供給源と刺激発生装置のコントローラーは体外にあり、皮膚を通して体内の電極を駆動するシステムが理想的であると考えている。このようなシステムの開発には電気機器専門メーカーの協力が不可欠であり、現在我々は地元企業との共同開発をすすめている。
微細加工シリコンチップに基づく人工細胞膜を用いた高効率薬物副作用検査系の構築

昨年度までの研究成果によって、脂質膜の安定性を大きく向上させることに成功したが、本研究の目的である高効率な薬物副作用のためには、複数の薬物の副作用を同時に測定することができる系の構築が必要である。本研究では、そのための系として、上述のシリコン基板を多数保持でき、一度に複数の膜を同時に形成することができるマルチウェル型チャンバーの構築に取り組んだ。マルチウェル型のアレイチャンバーに関しては、すでに本研究室での先行研究において9ウェル型のチャンバーの設計・製作を行っていたが、測定中に水漏れが起こってしまうことや、測定に必要とするタンパク質の量が多い、作業性が悪いなどの様々な欠点を抱えていた。本研究では、これらの欠点を克服した上でのウェル数の拡張を目指し、16ウェル型のアレイチャンバーの設計・製作を行った。このチャンバーは9ウェル型アレイチャンバーで問題となっていた、必要なタンパク質量や測定中の水漏れ等の問題をほぼ解決しており、これによって高効率な薬物副作用検査系構築のための基盤技術を確立することができたといえる。また、上記以外にも、窓を開けたチャンバーを用いて、脂質膜内部に半導体ナノ材料(PCBM: [6,6]-Phenyl-C61-Butyric Acid Methyl Ester)を包埋し、その光応答を見るという研究も並列して行った。その結果、光が膜に照射されている間のみ電流値が変動するという現象を発見した。この技術は液中で動作する光センサへの応用を期待することができる。以上により、本研究によって培われた技術は将来的に、創薬費用の低減につながるだけでなく、各種バイオセンサや、生体内で働くタンパク質の機能調査を効率的に行うデバイス、新しい動作原理を持つ光デバイスの創製などの様々な用途への応用が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は細胞膜を人工的に再現した系を用いた高効率な薬物副作用デバイスの構築である。この系には安定性が低いという欠点があり、本研究では、孔縁部がナノテーパー状になった微細な孔をもつSi基板を脂質膜の保持体にすることでその安定性を向上させてきた。しかし、この系を構築するためには脂質膜を形成した後に膜タンパク質包埋する必要があり、包埋促進のために遠心力を印加しているが、この遠心力によって破れてしまう膜があるなど、安定性は未だ十分とは言えない。そこで今年度は、Siチップのエッジ構造と支持体表面の修飾剤を検討することによるさらなる安定性向上を目指した。まず、Siチップについては3種類の構造を作製し、これらのチップの安定性を遠心力耐性や溶液交換耐性の観点から比べた結果、先端だけでなく、孔の周辺もテーパー構造になっているものの方が、脂質膜の安定性が高くなっているということが分かった。次に修飾剤については多数の表面修飾剤を用いて、それぞれの特性を比較・検討した。まず、フラットな基板表面を種々の修飾剤によってそれぞれ修飾し、その基板上に脂質膜を展開してその流動性を測定した。その結果、主にフッ素系の修飾剤で修飾された表面において、脂質膜の流動性が高くなることが分かった。次に、脂質膜の流動性に最も差異があった2つの修飾剤で上述の微細孔を持つSi基板を修飾し、その上に形成した脂質膜の安定性を評価した。その結果、脂質膜の流動性が大きくなる修飾剤を用いることによって、大幅に安定性を向上させられることが分かった。これは、高い流動性によって外力がかかった際に膜が滑ることでそのストレスを軽減し、結果的に膜へのダメージが少なくなるからだと考えられる。今後は上記の知見を活かしつつ、これらを多数並べたアレイ系を作り、高効率な薬物福井作用検査系の構築を目指していく。Siチップの形状や、表面修飾技術によって、最大の課題であった脂質膜の安定性について大幅な向上が見られたため、高効率な薬物副作用検査系の構築に向けて大きな弾みがついたと考えられる。また、高効率化のために多くのSiチップを並べたアレイについても着手し始め、その指針がほぼ明らかになったため、全体的に考えて、概ね順調に進展していると判断した。

この技術は液中で動作する光センサへの応用を期待することができる。以上により、本研究によって培われた技術は将来的に、創薬費用の低減につながるだけでなく、各種バイオセンサや、生体内で働くタンパク質の機能調査を効率的に行うデバイス、新しい動作原理を持つ光デバイスの創製などの様々な用途への応用が期待できる。上述のように、脂質膜の安定性については大幅に改善することができたため、高効率化に向けてアレイ構造の構築・拡大を行っていく。また、人工活動電位の発現についてもチャレンジしていく予定である。アレイ構造を作ることによって、薬物副作用のスクリーニングだけでなく、イオンチャネルを用いた様々な実験のスループットが向上することが考えられるため、活動電位の実験はアレイと並行して行っていくが、アレイ構造の完成によって、活動電位実験のスループットが上がり、こちらの実現可能性も大幅に上がると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(2)のタイトルについて、入力できなかったのでこちらに入力します平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Ni-Cr乳歯用既製冠からの組成元素の溶出と細胞毒性に関する実験的研究

本年度は乳歯用既製金属冠の地金であるNi-Cr合金からの組成元素の溶出挙動に対する動的因子(旋回条件),浸漬期間およびろ過の影響について検討を行った.すなわち,人工唾液を用いた様々な口腔内擬似環境下(旋回速度:0rpm,80rpm,160rpm,240rpm)で得られた抽出液およびろ液中の微量元素(Ni,Cr,Cu)を誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)を用いて定量分析し,磨耗粉の観察ならびにその定性分析も同時に行った.また,各抽出条件下で得られた抽出液およびろ液の生体への影響をin vitroの細胞毒性試験で評価した.その結果,各組成元素の溶出は静置環境下では認められなかったが,旋回速度および浸漬時間を増すとともにその溶出量が増加した.中でもNiの溶出量はCr,Cuに比べてきわめて多く,240rpmの旋回条件下においてはその溶出量がCr,Cuの100倍以上にも及んだ.また,静置環境下を除く他の全ての旋回条件下における各組成元素の溶出量は,抽出液>ろ液であった.一方,磨耗粉をX線マイクロアナライザーで定性分析した結果,Ni,Cr,CuおよびZrを検出した.二次電子像からその形状は薄片状を呈し,大きさは数μmから数十μmに及んでいることが確認された.抽出液およびろ液をヒト歯肉由来線維芽細胞とL929細胞へ一定期間作用させた結果,その細胞生存率は作用24時間後において生存率50%以下を示し,作用時間の増加にともない生存率は低下する傾向を認めた.また,抽出液とろ液の生存率の比較では,抽出液中の磨耗粉の存在が確認されたにもかかわらず各作用時間におけるそれは同程度であり両者間に有意差は認められなかった.実験材料には,乳歯用既成金属冠の地金であるNi-Cr合金(Ni-89,Cr-6,Cu-4,others-1%)を用いた。合金を円盤状に成形後,一定の重量になるよう順次研磨し,洗浄した後,実験試料とした。その後,実験試料を人工唾液による動的抽出条件下(210rpm,室温下)で3weeks抽出し,抽出した液(抽出液)を0.22μmのメンブレンフィルターでろ過し,ろ液とした。ろ液中に存在する組成元素(Ni,Cr,Cr)の定量はICP-MS質量分析装置にて行った。また,抽出液およびろ液による細胞毒性試験も併せて行った。その結果,ろ液中に存在する組成元素の中ではNiの溶出量が極めて多く認められた。Cu,Crの溶出も認められたが,Niに比べると極めて少なかった。また,抽出液をろ過したフィルター表面の二次電子像から磨耗粉の存在も確認できた。磨耗粉の形状は,塊状と薄片状を呈し,薄片状の磨耗粉の大きさは,数μm数十μmの範囲であった。一方,抽出液およびろ液をヒト歯肉由来の線維芽細胞に作用させた結果,作用24時間後にすでに細胞生存率は約30%に減少した。その後,24時間間隔で細胞生存率を測定したが,緩やかな減少傾向が認められ,作用96時間後には20%を下回る生存率を示し,作用時間の増大に伴い細胞生存率は減少する傾向を示した。抽出液とろ液の細胞生存率を比較すると,抽出液中には磨耗粉の存在が認められたにもかかわらず,抽出液とろ液間の細胞生存率に差異を認めなかった。また,作用96時間後の細胞形態像を観察した結果,細胞は萎縮する傾向を示し,核の濃染および球状化した細胞,さらには細胞の破片像なども観察された。本年度は乳歯用既製金属冠の地金であるNi-Cr合金からの組成元素の溶出挙動に対する動的因子(旋回条件),浸漬期間およびろ過の影響について検討を行った.すなわち,人工唾液を用いた様々な口腔内擬似環境下(旋回速度:0rpm,80rpm,160rpm,240rpm)で得られた抽出液およびろ液中の微量元素(Ni,Cr,Cu)を誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)を用いて定量分析し,磨耗粉の観察ならびにその定性分析も同時に行った.また,各抽出条件下で得られた抽出液およびろ液の生体への影響をin vitroの細胞毒性試験で評価した.その結果,各組成元素の溶出は静置環境下では認められなかったが,旋回速度および浸漬時間を増すとともにその溶出量が増加した.中でもNiの溶出量はCr,Cuに比べてきわめて多く,240rpmの旋回条件下においてはその溶出量がCr,Cuの100倍以上にも及んだ.また,静置環境下を除く他の全ての旋回条件下における各組成元素の溶出量は,抽出液>ろ液であった.一方,磨耗粉をX線マイクロアナライザーで定性分析した結果,Ni,Cr,CuおよびZrを検出した.二次電子像からその形状は薄片状を呈し,大きさは数μmから数十μmに及んでいることが確認された.抽出液およびろ液をヒト歯肉由来線維芽細胞とL929細胞へ一定期間作用させた結果,その細胞生存率は作用24時間後において生存率50%以下を示し,作用時間の増加にともない生存率は低下する傾向を認めた.また,抽出液とろ液の生存率の比較では,抽出液中の磨耗粉の存在が確認されたにもかかわらず各作用時間におけるそれは同程度であり両者間に有意差は認められなかった.
乳癌細胞の転移能を亢進させるFOXC2遺伝子とその臨床的意義に関する研究

マウス乳癌EpRas細胞にFoxc2発現ベクターを遺伝子導入し高発現永久株を樹立した。親株のEpRas細胞やFoxc2高発現株細胞をマウス乳腺皮下の脂肪組織に移植した。そして、約6週後に原発巣および肺転移の癌を検討した。原発巣の腫瘍サイズや数は親株と高発現株の間に差はなかった。しかし、肺への転移巣の数は親株を移植した場合10個であるのに対し、Foxc2高発現株では40個と4倍になっていた。また、転移巣の癌細胞はFoxc2高発現が持続していた。転移亢進とFoxc2遺伝子発現との関係を今年度は検討した。まず、。Foxc2高発現細胞では、TGFbが高地を示すことが明らかになった。次に、上皮-間葉転換をおこすTwist高発現細胞、Snail高発現細胞、そして癌遺伝子Ras高発現細胞におけるFoxC2遺伝子の発現レベルを検討したところ、Ras, Twist, Snail高発現細胞では、Foxc2 mRNAが増加していることが明らかになった。また、昨年度から行ってきた、癌細胞の浸潤メカニズムについては、Boydenチャンバーを用いて、Foxc2高発現細胞は膜面を通過できる細胞数が増加し、逆にsiRNAで内因性にFOXC2発現の高い乳癌細胞のFOXC2 mRNAをノックダウンすると、膜面を通過できる細胞数が減少した。また、上皮細胞が周りの間質に侵入する時にはメタロプロテアーゼが重要な役割を果たすことが知られているが、Foxc2高発現細胞では、MMP-2やMMP-9の活性が増加していることも明らかになった。以上のデータは、乳癌細胞にFOXC2遺伝子が高発現すると、上皮細胞の性質から間葉細胞の性格に変身して、運動性や浸潤性を獲得し、転移能が亢進したと考えられる。中胚葉発生制御遺伝子Twistが上皮-間葉転換を介して、乳癌細胞の転換脳を増加させる事実からヒントを得て、従来研究してきたFoxc2遺伝子について同様な機能があるのではないかと考えて研究をスタートさせた。Foxc2遺伝子は、多くの中胚葉由来組織の発生を制御していることが以前の我々のノックアウトマウスを用いた研究からわかっていた。例えば、体節は最初上皮様構造をとっているが、その後中胚葉細胞に変換し、硬節を経て骨格系の前駆細胞になる。まず、マウス乳癌EpRas細胞にFoxc2発現ベクターを遺伝子導入し高発現永久株を樹立した。約6週後に、原発巣および肺転移の癌を検討した。そこで、Foxc2遺伝子による転移能亢進の分子メカニズムとして上皮?間葉転換がおこっている可能性を明らかにするために、上皮細胞MDCKにFoxc2発現ベクターを遺伝子導入し、永久株を得た。Foxc2高発現細胞における上皮マーカー、間葉マーカーの変化を検討した結果、Foxc2高発現細胞株では、上皮マーカーのE-cadherin, cateninが減少し、間葉マーカーであるVimentin, Fibronectin, N-cadherin, smooth muscle actinが増加していた。また、細胞の運動能を測定するためにBoydenチャンバー法にて細胞の移動を検討したところ、親株に比し、細胞移動能が亢進していた。まず、。

以上のデータは、乳癌細胞にFOXC2遺伝子が高発現すると、上皮細胞の性質から間葉細胞の性格に変身して、運動性や浸潤性を獲得し、転移能が亢進したと考えられる。
駿河湾における「有効拡散」の定量化とその湾内深層循環に与える影響の評価

地球の長期気候変動を強くコントロールする深層海洋循環は、海洋中で観測された乱流混合強度分布をモデルに組み込むという従来の方法では再現できないことが近年明らかになっている(Missing Mixing)。本研究では、この乱流拡散よりも大きな空間スケールで遥かに効率よく海水を混合する有効拡散に注目し、その実態解明/定式化、および深層循環への影響の評価を、比較的スケールが小さく、深層循環と潮汐混合が共存する駿河湾を対象とした数値実験/現場観測を通じて行う。
ラットインスリン様成長因子I(IGF-I)遺伝子の転写制御機構の解析

本研究では、体タンパク質代謝において重要なホルモンであるIGF-I遺伝子の転写制御機構を解明する目的で、すでに我々が検出に成功しているラット肝臓の核内因子(AJ)の遺伝子のクローニングを、South western法およびOne Hybrid Systemの2種の方法を用いて行った。1)South western法AJの因子の結合配列のオリゴヌクレオチドを512回タンデムに連結し(A^<tan>J^<tan>)、単独の場合より核内因子との結合活性が上昇していることを確認した。続いて、このA^<tan>J^<tan>の配列をプローブとしてラット肝臓cDNAの発現ライブラリーをスクリーニングし、A^<tan>J^<tan>の配列と結合する因子の検索を行った。2)One Hybrid System A^<tan>J^<tan>の配列をレポーター遺伝子(ヒスチジン合成酵素およびβ-ガラクトシダーゼ)の上流に連結した後、酵母のゲノムDNAに組み込み、レポーター遺伝子の発現のバックグラウンドが十分に低いことを確認した。この系を用いて、レポーター遺伝子の発現を指標としてエフェクター遺伝子(GAL4)の下流に挿入したラット肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングし、A^<tan>J^<tan>の配列と結合する因子の検索を行った。現在One Hybrid Systemにより5つのクローンを取得しており、その塩基配列の決定を行っているところである。本研究では、IGF-I遺伝子の5'上流領域と結合してその転写を制御する新規の因子のcDNAが取得できる可能性が高く、IGF-Iの生体における多様な作用を考えるとその重要性は非常に大きい。