hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳血管攣縮に対するプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の導入

遅発性脳血管攣縮はくも膜下出血後数日経過してから発生し約10日間持続する病態で遅発性脳虚血を生じ、脳動脈瘤破裂患者の予後を左右する。脳血管攣縮を生じた血管に於いて、内皮の機能が低下しており、血管の拡張性が障害されていることが原因の一つになっている。従って、内皮依存性の弛緩物質は脳血管攣縮の治療薬の候補となる。我々は内皮依存性弛緩物質としてprostacyclin(PGI2)に着目した。我々はadenovirus vectorあるいはcationic liposomeを用いたlipifection Methodを用いて髄液を媒体とし攣縮脳血管prostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子を導入することで、この内皮障害を機能的に復元し、病態を征圧することを目的として本研究を開始した。しかし、prostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子の導入を行う前に、まずPGI2製剤であるベラプロストナトリウムの脳血管に於ける血管拡張性について検討を行った。ベラプロストナトリウムは既に市販されている為、脳血管攣縮を改善する作用があれば直接臨床に役立ち、本研究の目的をより直接的に達成することが可能となる。ベラプロストナトリウムはisometric tension recordingに於いて、PGF2αによる血管の収縮を容量依存的に抑制した。しかし、今回の検討から我々は髄液を媒体とし攣縮脳血管にprostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子を導入することは可能であっても、合成されたプロスタサイクリンが脳血管攣縮によって狭小化した脳血管を強力に拡張することは困難であることが予想された。しかしながらベラプロストナトリウムのPGF2αに対する強い拮抗作用が証明され、脳血管攣縮の一つの治療薬剤となりうることが示唆された。以上より、プロスタサイクリンを用いた脳血管攣縮の治療について、部分的には、その有用性が示唆されたものの、今後のさらなる検討が必要であると思われた。脳血管攣縮はくも膜下出血後に生じる脳血管の異常な持続性の狭小化であり、後に大きな影響を与える。脳血管攣縮の治療として内皮依存性弛緩物質であるNOを産生するendothelial nitric oxide synthase (eNOS) geneの導入が、動物実験モデルに行われ、一定の効果を挙げている。我々は内皮由来血管弛緩因子(EDRF)としてNOよりも、古くからその存在が知られていたもう一つのEDRFであるprostacyclin(PGI2)に着目し、今回の実験を開始した。本研究のprostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子の導入については現在のところ基礎的実験遂行が滞っている為、まずPGI2製剤であるベラプロストナトリウムの脳血管に於ける血管拡張性について検討を開始している。ベラプロストナトリウムは既に慢性動脈閉塞性に伴う潰瘍、疼痛及び冷感の改善、原発性肺高血圧症に適応を有し市販されている為、脳血管攣縮を改善する作用があれば直接臨床に役立つprostacyclin(PGI2)製剤であり、本研究の目的をより直接的に達成することが可能となる。具体的にはisometric tension recordingを用いた方法により、KC1,PGF2aなどによる血管の収縮に対し、PGI2がどのような弛緩特性を示すか検討を行っている。十分な弛緩特性を示すようであれば、in vivoの環境に於ける有効性を検討したい。我々は内皮由来血管弛緩因子(EDRF)としてprostacyclinに着目した。

この平滑筋弛緩作用により脳血管攣縮によって狭小化した脳血管を拡張させ、脳血管攣縮の治療としてこれを用いるのが、実験の主たる目的である。本研究の当初の予定であるprostacyclin合成酵素遺伝子の導入については現在のところ基礎的実験の遂行が滞っている為、まずprostacyclin製剤であるベラプロストナトリウムの脳血管に於ける血管拡張性について薬理学的検討を行った。ラットaortaを用いたisometric tension recordingを行った。内皮を0.1% TritonXで1分間灌流して除去した4mm長のリング標本として実験を行った。(除去程度についてはsubstance Pによる弛緩程度が15%を超えないものとした。)ベラプロストナトリウムはプロスタグランジンF2alpha 10micro Mで収縮させたリング標本を弛緩させたが、10micro Mでは弛緩程度は十分でなく、100micro M,1m Mで明瞭な弛緩効果が得られた。我々の実験結果からはベラプロストの薬理学的血管弛緩効果は強いとは言えず。遺伝子の導入により発生するPGI2量がmM orderで必要とすると、弛緩効果を得ることは困難かもしれない。Prostacyclinのisometric tensionstudyでの薬理学的な弛緩特性について、さらに検討する必要があると思われた。遅発性脳血管攣縮はくも膜下出血後数日経過してから発生し約10日間持続する病態で遅発性脳虚血を生じ,脳動脈瘤破裂患者の予後を左右する。脳血管攣縮を生じた血管に於いて,内皮の機能が低下しており,血管の拡張性が障害されていることが原因の一つになっている。従って,内皮依存性の弛緩物質は脳血管攣縮の治療薬の候補となる。我々は内皮依存性弛緩物質としてprostacyclin(PGI2)に着目した。我々はadenovirus vectorあるいはcationic liposomeを用いたlipifection methodを用いて髄液を媒体とし攣縮脳血管prostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子を導入することで,この内皮障害を機能的に復元し,病態を征圧することを目的として本研究を開始した。しかし,prostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子の導入を行う前に,まずPGI2製剤であるベラプロストナトリウムの脳血管に於ける血管拡張性について検討を行った。ベラプロストナトリウムは既に市販されている為,脳血管攣縮を改善する作用があれば直接臨床に役立ち,本研究の目的をより直接的に達成することが可能となる。ベラプロストナトリウムはisometric tension recordingに於いて,PGF2αによる血管の収縮を容量依存的に抑制した。しかし,今回の検討から我々は髄液を媒体とし攣縮脳血管にprostacyclin合成酵素(PGIS)遺伝子を導入することは可能であっても,合成されたプロスタサイクリンが脳血管攣縮によって狭小化した脳血管を強力に拡張することは困難であることが予想された。しかしながらベラプロストナトリウムのPGF2αに対する強い拮抗作用が証明され,脳血管攣縮の一つの治療薬剤となりうることが示唆された。
身振りと音声の同期メカニズムの解明:健聴児と聴覚障害児の比較から

本研究では、これまで対象とされてこなかった聴覚障害児を対象に、指さしと発声との随伴関係を調べ、これを聴児のデータと比較した。研究対象となったのは、次の3つのグループである。各グループの子どもたちについて、月齢11ヶ月から16ヶ月の各月40-60分の録画ビデオデータを分析対象とし、時間軸上のどこでどのような発声、ジェスチャーが起こったのかをコーディングした。そして、各ジェスチャー(指さし含む)に音声が伴ったかどうかを詳細に見た。その結果、まず、指さしの生起頻度については、各グループのあいだに顕著な相違はなかった。次に、本研究で着目する、指さしと発声との同期的関係については、第1に、聴者の親をもつ聴覚障害児においては、指さしに頻繁に発声が伴っていた。指さしを発声の同期の程度は、先行研究で示された、聴者の親をもつ聴児における指さしに音声が伴う割合と同程度であった。第2に、聴覚障害者の親をもつ聴覚障害児および、聴覚障害者の親を持つ聴児においては、上記のグループに比べて、指さしに発声が伴う頻度は低かった。以上の結果から、生後11ヶ月から16ヶ月の段階の指さしと発声の同期的関係を見る限り、その子どもの親が聴者であるか聴覚障害者であるかという要因が強く関わっていることが示唆された。これらの結果は、指さしと音声との同期現象の成立には、これまで指摘されてきたような生得的な結びつきだけではなく、社会的フィードバックの有無が関与していることを示唆するものといえる。【研究目的】発達初期から見られる指さしと発声との結びつきは、遺伝的に定められた生得的なシステムによるのではないかと指摘されているものの、そこに環境要因も関与している可能性もある。たとえば指さしに、発声を伴わせることで、他者の注目や応答をより得やすくなるというように、他者からのフィードバックという外的環境もまた、発声を伴う指さしの生起に関連しているかもしれない。この問題を検討するため、本研究では聾児および健聴児を対象に、彼らの指さしと発声の関係を調べた。【方法】観察の対象となったのは、(1)聾の親をもつ聾児2名、(2)聴者の親をもつ聾児1名、(3)聾の親をもつ聴児1名の3グループである。各グループのそれぞれの子どもについて、月に1度の頻度で家庭を訪問し、母子の自然なコミュニケーション場面をビデオで収録した。これらの収録ビデオのうち、月齢11ヶ月から16ヶ月の各月40-60分前後を分析した。分析では時間単位軸上のどこで音声または指さしが生起したのか、また、それらが同期したのかどうかを調べた。【結果】分析の結果、まず、グループ2(聴者の親をもつ聾児)においては、指さしに頻繁に発声が伴っており、指さしを発声の同期の程度は、先行研究で示された、聴者の親をもつ聴児における指さしに音声が伴う割合と同程度であることが示された。また、グループ1(聾者の親をもつ聾児)および、グループ3(聾者の親を持つ聴児)においては、上記のグループに比べて、指さしに発声が伴う頻度は低かった。以上の結果から、生後1116ヶ月の段階の指さしと発声の同期的関係を見る限りにおいては、その子どもの親が聴者であるか聾者であるかという要因が強く関わっていることが示唆された。
DNAマイクロアレイを基盤とする神経疾患診療システムの構築

本研究の目的は,現在の分子遺伝学の最新の知見を診療に結びつける最善の方法を築きあげることにある.この課題を実現するために,次の3点を柱としている.1.遺伝性神経疾患の遺伝子診断をDNA microarrayを用いてハイスループットで行うシステムの構築,2.疾患関連遺伝子の体系的解析による孤発性神経疾患へのアプローチ,3.神経疾患の患者毎の臨床表現型の多様性の背景を探索する.この目的を効率よく達成する方法として,DNA microarrayを用いた疾患関連遺伝子のresequencingのシステムの構築を進めている.本年度の研究で,パーキンソン病,アルツハイマー病,筋萎縮性側索硬化症,副腎白質ジストロフィー,家族性痙性対麻痺などを対象としてresequencingを目的とした,DNAマイクロアレイを設計した.これまでに制作したDNA microarrayについて,塩基配列決定の精度が通常行われるdinucleotide chain terminator methodと同等であることを確認し,実際に,痙性対麻痺症例に対しての応用を行った.これまでに43例の痙性対麻痺症例に対し網羅的な解析を行い,7例のSPG4症例を見出し,日本人においては最も頻度の高い疾患であることが見出された.この他に,1例のSPG3A症例を見出した.SPG4症例の中で2例については,家族歴が認められず浸透率の低い変異の存在が示唆された.以上のように,DNA microarrayを用いたresequencingシステムは岩馬手効率のよい網羅的解析法であることが示され,アルツハイマー病,パーキンソン病,筋萎縮性側索硬化症,副腎白質シストロフィー,家族性痙性対麻痺に対する網羅的解析方法を確立することができた.本研究の目的は,現在の分子遺伝学の最新の知見を診療に結びつける最善の方法を築きあげることにある.この課題を実現するために,次の3点を柱としている.1.遺伝性神経疾患の遺伝子診断をDNA microarrayを用いてハイスループットで行うシステムの構築,2.疾患関連遺伝子の体系的解析による孤発性神経疾患へのアプローチ,3.神経疾患の患者毎の臨床表現型の多様性の背景を探索する.この目的を効率よく達成する方法として,DNA microarrayを用いた疾患関連遺伝子のresequencingのシステムの構築を進めている.本年度の研究で,パーキンソン病,アルツハイマー病,筋萎縮性側索硬化症,副腎白質ジストロフィー,家族性痙性対麻痺などを対象としてresequencingを目的とした,DNAマイクロアレイを設計した.これまでに制作したDNA microarrayについて,塩基配列決定の精度が通常行われるdinucleotide chain terminator methodと同等であることを確認し,実際に,痙性対麻痺症例に対しての応用を行った.これまでに43例の痙性対麻痺症例に対し網羅的な解析を行い,7例のSPG4症例を見出し,日本人においては最も頻度の高い疾患であることが見出された.この他に,1例のSPG3A症例を見出した.SPG4症例の中で2例については,家族歴が認められず浸透率の低い変異の存在が示唆された.以上のように,DNA microarrayを用いたresequencingシステムは岩馬手効率のよい網羅的解析法であることが示され,アルツハイマー病,パーキンソン病,筋萎縮性側索硬化症,副腎白質シストロフィー,家族性痙性対麻痺に対する網羅的解析方法を確立することができた.本研究の目的は,現在の分子遺伝学の最新の知見を診療に結びつける最善の方法を築きあげることにある.この課題を実現するために,次の3点を柱としている.1.遺伝性神経疾患の遺伝子診断をDNA microarrayを用いてハイスループットで行うシステムの構築,2.疾患関連遺伝子の体系的解析による孤発性神経疾患へのアプローチ,3.神経疾患の患者毎の臨床表現型の多様性の背景を探索する.この目的を効率よく達成する方法として,DNA microarrayを用いた疾患関連遺伝子のresequencingのシステムの構築を進めている.本年度の研究で,パーキンソン病,アルツハイマー病,筋萎縮性側索硬化症,副腎白質ジストロフィー,家族性痙性対麻痺などを対象としてresequencingを目的とした,DNAマイクロアレイを設計した.試作したDNA microarrayについて,副腎白質ジストロフィー遺伝子をモデルとして,予備的検討を加え,2647塩基中2645塩基について(99.2%)配列の決定が可能であり,十分実用性があることを検証した.ハイスループット化のためには,多数のゲノムDNAに対して,多種類のPCR primer,試薬の分注作業が必須であり,roboticsを導入し,PCR primerや試薬の分注を自動化するシステムの構築を進めている.できる限り同一のPCR条件を用いること,long range PCRを用いることなどを進めている.孤発性の神経疾患へのアプローチとしてはパーキンソン病をモデル系として,大規模resequencingを開始した.本研究の目的は,現在の分子遺伝学の最新の知見を診療に結びつける最善の方法を築きあげることにある.この課題を実現するために,次の3点を柱としている.1.遺伝性神経疾患の遺伝子診断をDNA microarrayを用いてハイスループットで行うシステムの構築,2.疾患関連遺伝子の体系的解析による孤発性神経疾患へのアプローチ,3.神経疾患の患者毎の臨床表現型の多様性の背景を探索する.この目的を効率よく達成する方法として,これまでに4つのDNA microarrayを制作した.具体的には,筋萎縮性側索硬化症を主な対象疾患としたTKYALS01,パーキンソン病を主な対象疾患としたTKYPD01,TKYPD02,アルツハイマー病を主な対象疾患としたTKYAD01であるこれらの疾患に加えて,家族性痙性対麻痺,副腎白質ジストロフィーなどの遺伝子もこれらのmicroarrayに含めた.

これまでに,筋萎縮性側索硬化症,家族性痙性対麻痺,常染色体優性遺伝性パーキンソン病,副腎白質ジストロフィーを対象とした網羅的DNA resequencingを実施した.家族性痙性対麻痺については,40例の痙性対麻痺症例についての網羅的解析を行い,spastin変異が30%に見られること,孤発性と考えられた症例においてもspastin変異が存在しうることを証明した.spastin変異を有する例は10歳前に発症する早期発症例の群と,30歳以降で発症する遅発例群の2群に分かれることを示した.筋萎縮性側索硬化症については,dynactin遺伝子に新たな変異を見出した.パーキンソン病については,LRRK2遺伝子の新たな変異例を見出し,大規模解析を進めている.副腎白質ジストロフィーについては,新に6例で変異を確定した.
食品の風味成分に関する化学的および官能的研究

ポーラスポリマービーズを充填したカラムを用いる食品の風味成分の直接カラム濃縮法を新たに開発し、従来法(減圧連続蒸留抽出法;SDE法)との比較しながら緑茶および醤油の風味成分の解析を行った。1.緑茶香気濃縮物の成分組成とその香りに及ぼす前処理法の影響直接カラム濃縮法により調製されたにおい濃縮物は、典型的な緑茶の風味を強く連想させるものであったのに対し、SDE法により得られたにおい濃縮物は苦みを強く連想させ木材様のにおいであった。同定された92成分中45成分は緑茶香気成分として始めて検出されたものである。92成分中30成分はSDE法において5倍以上の濃度を示したが、これは緑茶中に配糖体として存在する成分が蒸留中に加水分解したものと考えられる。一方、製茶工程の「火入れ」により生成したと考えられる3-ethyl-4-methyl-1H-pyrrole-2,5-dione,5,6,7,7a-trimethy1-2(4H)-benzofuranone,2H-1-benzopyran-2-oneneはSDE法で1/5以下に減少した。以上要するに、カラム濃縮法によると我々が通常緑茶を飲むときと同じ方法で風味成分を濃縮し得ることから、得られるにおい濃縮物は官脳的に非常に優れたものであった。2.醤油の特徴香特に塩辛味を連想させる風味成分に関する研究直接カラム濃縮法によるにおい濃縮物は、SDE法では得ることの出来ない強烈な塩辛い風味を有する典型的な醤油の香りであった。200個以上のピークが検出され、うち78成分を同定した。次に、種々のクロマトグラフィーにより塩辛い風味を呈する画分を絞り込み、これを分取ガスクロマトグラフィーに供し目的とする塩辛い風味成分を特定した。GC-MS分析によりfurfurylalcohol,4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanoneと同定された。そこでこれらの化合物に対して官能評価を行ったところ、両者の間にはにおいの質に関する明瞭な相乗効果が認められ、等量混合物で最も強く塩辛い風味が認められた。緑茶の風味成分に関する研究:(方法)1)ポラパックQ50mlを充填したカラムに緑茶抽出液(煎茶50g+80°C熱水1000ml、3分間抽出)を流し、樹脂に吸着された風味成分をエ-テルで抽出した。本操作を20回繰り返し風味濃縮物約0.5gを得た。2)従来から汎用されてきた減圧連続蒸留ー抽出装置を用いて、香気濃縮物を得た。(結果)1)及び2)の方法で調製された濃縮物をGC及びGCーMS分析に供したところ、両者には顕著な違いが認められた。すなわち、いずれのガスクロマトグラム上にも150以上のピ-クが認められたが、1)の濃縮物は2)のものに較べてKovats Index 12001800の化合物が少なく、1850以上の化合物は著しく多かった。このことは、1)の濃縮物が優れた緑茶様の風味を有したのに対し、2)は苦くて幾分焦げ臭い緑茶本来の風味とはまったく異なったことと一致した。

Kovats Index 1850以上の緑茶の風味に不可欠と考えられる成分として、3ーethylー4ーmethylー1Hーpyrroleー2,5ーdione、5,6,7,7aーTetrahydroー4,4,7aーtrimethylー2(4H)ーbenzofuranone,2Hー1ーBenzopyranー2ーoneが同定・定量された。結果として92成分が同定され、45成分は緑茶から初めて検出されたものである。醤油の特徴香ー塩辛い風味に関する研究:塩辛い風味成分は減圧蒸留法、液々抽出法では抽出されないが、カラム法では醤油に特徴的な優れた塩辛い風味が得られることが明かになった。醤油20リットルから得られたにおい濃縮物を順相および逆相TLCで分画すると共に、各画分のにおいを官能的に追跡した。その結果、単離が進と共に塩辛い風味が消失したことからこの風味は幾つかの成分の相乗効果により発現することが示唆された。事実、高沸点、極性成分の組合せにより塩辛い風味が生じることが明かとなった。現在、においの質に関して相互作用を起す2つの成分を単離し、その構造決定と官能的相乗作用について究明中である。ポーラスポリマービーズを充填したカラムを用いる食品の風味成分の直接カラム濃縮法を新たに開発し、従来法(減圧連続蒸留抽出法;SDE法)との比較しながら緑茶および醤油の風味成分の解析を行った。1.緑茶香気濃縮物の成分組成とその香りに及ぼす前処理法の影響直接カラム濃縮法により調製されたにおい濃縮物は、典型的な緑茶の風味を強く連想させるものであったのに対し、SDE法により得られたにおい農縮物は苦みを強く連想させ木材様のにおいであった。同定された92成分中45成分は緑茶香気成分として始めて検出されたものである。92成分中30成分はSDE法において5倍以上の濃度を示したが、これは緑茶中に配糖体として存在する成分が蒸留中に加水分解したものと考えられる。一方、製茶工程の「火入れ」により生成したと考えられる3-ethy1-4-methy1-1H-pyrrole-2,5-dione,5,6,7,7a-trimethy1-2(4H)-benzofuranone,2H-1-benzopyran-2-oneneはSDE法で1/5以下に減少した。以上要するに、カラム濃縮法によると我々が通常緑茶を飲むときと同じ方法で風味成分を濃縮し得ることから、得られるにおい濃縮物は官能的に非常に優れたものであった。2.醤油の特徴香特に塩辛味を連想させる風味成分に関する研究直接カラム濃縮法によるにおい濃縮物は、SDE法では得ることの出来ない強烈な塩辛い風味を有する典型的な醤油の香りであった。200個以上のピークが検出され、うち78成分を同定した。次に、種々のクロマトグラフィーにより塩辛い風味を呈する画分を絞り込み、これを分取ガスクロマトグラフィーに供し目的とする塩辛い風味成分を特定した。GC-MS分析によりfurfurylalcohol,4-hydroxy-2-ethy1-5-methy1-3(2H)-furanoneと同定された。そこでこれらの化合物に対して官能評価を行ったところ、両者の間にはにおいの質に関する明瞭な相乗効果が認められ、等量混合物で最も強く塩辛い風味が認められた。
急性内耳小胞体ストレスによる難聴の病態解析と新規治療法開発のための基礎的研究

ツニカマイシン(TM)投与ラットの聴力低下は比較的緩徐に進行し、回復しなかった。TM投与で外有毛細胞が変性し、続いてコルチ器が変性し。TM投与量依存的に傷害部位が拡大し、内耳細胞間でTM感受性の差が判明した。内有毛細胞、神経節の細胞内小器官に異常が認められ、TM投与の聴力低下に内有毛細胞も関与している可能性が示唆された。小胞体ストレス関連遺伝子の発現量を解析し、遺伝子発現上昇を確認した。内耳細胞の小胞体ストレスが難聴の病態に関与している可能性が推察された。これまでの研究成果で我々は、急性内耳エネルギー不全モデルの蝸牛外側壁の細胞死に小胞体(ER)ストレスの関与を示唆し、またERストレスを惹起するN型糖鎖修飾阻害剤Tunicamycin(TM)の内耳局所投与にて聴力が低下することを示している。今年度は感音性難聴の病態および治療法の解明のため、その発症機序として報告されていないERストレスに着目し、モデル動物の作成およびその病態解析を行った。TM 200ng投与では聴力閾値の上昇は3-7日かけて70-80dBまで比較的緩徐に進行した。一部を引き続き30日後まで経過観察したが聴力の回復は認められなかった。TM 200ngより多い投与量では、聴力閾値の上昇が早まり、ほとんどの個体がスケールアウトになった。TM 200ng未満の投与量または小胞体-ゴルジ体間輸送阻害剤Brefeldin Aや小胞体Ca^<2+>-ATPase阻害剤ThapsigarginなどのERストレス惹起薬物の投与では聴力閾値の上昇は起こらなかった。組織学的解析では、TM 200ng投与7日後で外有毛細胞の一部脱落を含む変性が見られた。また、投与量依存的に傷害部位が拡大し、各内耳細胞でTMによるERストレスの感受性に差があることが判明した。ERストレスの指標となる遺伝子の発現量をReal Time PCRにて解析し、上昇していることを確認した。以上の結果より、TMによるERストレスでの聴力閾値の上昇および聴力の固定は外有毛細胞の傷害に起因する可能性が示唆された。また、ERストレスは様々な外因性刺激によっても引き起こされることから、内耳細胞のERストレスは急性あるいは亜急性に発症し回復しない難聴の一部の病態に関与している可能性が推察される。来年度は、in vitroにおけるケミカルシャペロンの効果および浸透圧ポンプ留置による内耳局所への持続的投与の確立を試みる。これまでの研究成果で我々は、急性内耳エネルギー不全モデルの蝸牛外側壁の細胞死に小胞体(ER)ストレスの関与を報告している。昨年度の研究成果ではERストレスを惹起するN型糖鎖修飾阻害剤Tunicamych(TM)の内耳局所投与にて聴力が低下することを示し、またTMに対する感受性は外有毛細胞が最も高いことを示した。今年度はさらに詳細な蝸牛組織の解析、TMモデルと他のERストレス誘導薬投与による難聴との比較およびケミカルシャペロン投与による治療法の確立を目指した。外有毛細胞のみの傷害で70-80dBの聴力低下は考えにくいため、内有毛細胞および蝸牛神経節について電子顕微鏡解析を行った。TM200ng投与7日後では内有毛細胞、蝸牛神経節ともに細胞死は引き起こされていなかったが、ERやミトコンドリアなどの細胞内小器官は膨潤しているなど異常をきたしていた。TM200ng投与7日後での聴力閾値上昇に、外有毛細胞の細胞死の他に、内有毛細胞や蝸牛神経節の機能障害が関与している可能性が示唆された。次に、TMと同経路でのER-ゴルジ体間輸送阻害剤Brefeldin AやERCa^<2+>-ATPase阻害剤ThapsigarginといったERストレス誘導薬投与では聴力閾値の上昇は起こらなかった。TM以外のERストレス誘導薬では難聴にならなかったことから、内耳細胞はERストレスの中でもN型糖鎖修飾阻害による立体構造形成不良タンパク質の蓄積に特異的に脆弱である可能性が考えられた。浸透圧ポンプを使用した投与方法の確立では、半規管へのチューブの留置に成功した。治療薬投与を試みる前に、まず色素を持続投与し、蝸牛内への蝸牛頂回転までの色素到達を確認した。しかしながら、生理食塩水投与においても聴力閾値の低下が起きており、投与方法の改良あるいはさらに小流量の浸透圧ポンプが必要と考えられた。
化学感覚器の情報変換過程におけるGTP結合蛋白質の役割

グアニル酸シクラーゼは,味細胞のミクロビリ-膜に局在することが知られている.また,味覚器および嗅覚器においてセカンドメッセンジャーとしての役割を果している可能性がある.本研究では,ウシおよびラットの味覚および嗅覚組織からグアニル酸シクラーゼのクローニングを行った.その結果,3つの新しいクローンを同定した.このうち,2つは膜結合性であり,残りの1つは可溶型であった.これらのグアニル酸シクラーゼの生理的役割の検討を行っている.先に我々は,フォスファチジン酸とβ-ラクトグロブリンからなるリポ蛋白質が苦味を抑制することを見いだした.カエルの味覚器に各種の苦味物質を与え,リポ蛋白質の効果を味神経応答を測定することにより定量した.この結果,調べた疎水性苦味物質の応答はすべて抑制したが,塩化マグネシウムのような塩型の苦味物質の応答は抑制しなかった.すなわち,塩型の苦味物質の受容サイトは,通常の疎水性苦味物質の受容サイトと異なることが分かった.一個の嗅細胞が特定の匂いのみに応答するのか,多数の匂いに応答するかは,匂いの識別機構を解明する上で最も基本的な問題である.単一の嗅細胞から匂い応答を記録することは困難であるため,従来この問いに対する明解な答えは無かった.本研究では,カエルの嗅細胞を単離し,パッチクランプ法を適用し各種の匂いに対する応答を測定した.その結果,単一の嗅細胞は,多数の匂いに応答することが明らかになった.最近の分子生物学的研究によれば,一個の嗅細胞には一種類のG-蛋白質共役型受容体が存在することが知られている.したがって,一個の嗅細胞が多数の匂いに応答することは,匂いの受容がG-蛋白質共役型受容体以外の受容体をも介して行われていることを示唆した.グアニル酸シクラーゼは,味細胞のミクロビリ-膜に局在することが知られている.また,味覚器および嗅覚器においてセカンドメッセンジャーとしての役割を果している可能性がある.本研究では,ウシおよびラットの味覚および嗅覚組織からグアニル酸シクラーゼのクローニングを行った.その結果,3つの新しいクローンを同定した.このうち,2つは膜結合性であり,残りの1つは可溶型であった.これらのグアニル酸シクラーゼの生理的役割の検討を行っている.先に我々は,フォスファチジン酸とβ-ラクトグロブリンからなるリポ蛋白質が苦味を抑制することを見いだした.カエルの味覚器に各種の苦味物質を与え,リポ蛋白質の効果を味神経応答を測定することにより定量した.この結果,調べた疎水性苦味物質の応答はすべて抑制したが,塩化マグネシウムのような塩型の苦味物質の応答は抑制しなかった.すなわち,塩型の苦味物質の受容サイトは,通常の疎水性苦味物質の受容サイトと異なることが分かった.一個の嗅細胞が特定の匂いのみに応答するのか,多数の匂いに応答するかは,匂いの識別機構を解明する上で最も基本的な問題である.単一の嗅細胞から匂い応答を記録することは困難であるため,従来この問いに対する明解な答えは無かった.本研究では,カエルの嗅細胞を単離し,パッチクランプ法を適用し各種の匂いに対する応答を測定した.その結果,単一の嗅細胞は,多数の匂いに応答することが明らかになった.最近の分子生物学的研究によれば,一個の嗅細胞には一種類のG-蛋白質共役型受容体が存在することが知られている.したがって,一個の嗅細胞が多数の匂いに応答することは,匂いの受容がG-蛋白質共役型受容体以外の受容体をも介して行われていることを示唆した.
生物応答調節分子の設計と活性発現機構

1.サリドマイド関係サリドマイドのTNF-α生産調節作用を指標としてより活性に優れるニューサリドマイドとして、各種フタルイミド誘導体をデザインし、合成した。その中に、サリドマイドにはるかに優れたTNF-α生産調節活性を有するものを見いだし、その構造活性相関を解析した。得られたニューサリドマイドはいずれもサリドマイドと同様、2方向性のTNF-α生産調節活性を持つものであったが、電子状態の変化と光学活性が2方向性に大きく関与していることが構造活性相関から見てとれた。これを元に更なる構造展開を図り、2方向性を完全に分離すること、すなわち、純粋にTNF-αの生産抑制作用のみを示す化合物と、純粋にTNF-αの生産促進作用のみを示す化合物各々を創製することに成功した。これらの化合物をアフィニティゲルヘと展開し、当初想定していた複数種の薬物受容体の侯補蛋白としての規範を満足する蛋白の存在を確認することができた。分子作用機構解析の一環としてTNF-αmRNA量に及ぼす影響を解析しつつあるが、不思議なことに、TNF-αの生産抑制系でも促進系でも、いずれの場合にもmRNA量は増加していることを示す結果が得られつつある。ニューサリドマイドの更なる構造展開により、強力な非ステロイド型アンドロゲンアンタゴニストを創製することに成功した。2.レチノイド関係ジアゼピン安息香酸誘導体にレチノイドシナ-ジストとしての活性を見いだし、その構造活性相関を解析した。これらのシナ-ジストがRAR・RXRヘテロダイマー選択的なRXRアゴニストであることを示すことができた。また、カルギキシル基を有さないチアゾリン系のレチノイドを創製することに成功した。
TREX1遺伝子変異を用いたインターフェロン関連疾患の病態解析および治療法開発

また遺伝子検査で異常が同定されない患者に対して適宜エクソーム検査を追加しており、今後新たな疾患が判明する可能性を残している。レコンビナントTREX1ヘテロダイマーを用いた機能解析系の確立は、鋭意検討中である。第28回日本小児リウマチ学会のシンポジストとして招聘を受け、これまでの成果に関して発表を行った。AGSを含めた臨床的な相談・対応が多い。また検査遺伝子を13種類まで拡大させた事、対象疾患の稀少性のため遺伝子変異を認めた場合の確認(意味のある変異かどうか)に時間を要している。現状では両親や同胞の検査を適宜追加したり、機能解析を行ったりして対応しているが、今後データの集積が進めば検討に要する時間も短縮できると考えている。AGSを含めたInterferonopathyに関する遺伝子解析・相談を広く受け付けているのは本邦で我々だけであり、引きつづき疑い患者症例に関しての相談や遺伝子検査を積極的に行っていく。本邦における患者の臨床症状を含めて、情報を発信していく責務があると考えている。また本邦に多いTREX1ヘテロ遺伝子症例に関して、レコンビナントTREX1ヘテロダイマーを用いた機能解析系の確立に向けて、検討を続けていく。その上で低温培養下等での検討を重ねて、AGSでよく見られる凍瘡様皮疹の病態解析を進めていく予定である。これらの研究は稀少疾患の検討であるばかりではなく、同じインターフェロン関連疾患とされるSLEやシェーグレン症候群等、より患者数の多い疾患への応用が期待される。平成28年に新規患者6人、平成29年に入ってから現在まで更に2人の遺伝子検査を施行した。特記すべきことは対象患者年齢であり、4-40歳と幅広く以前より年長者の検査が増えている。これは小児科領域のみならず、成人領域にも疾患そのものや我々の取り組みが認知されてきていると思われた。その結果、現在までに判明している分までで、IFIH1遺伝子変異の患者(AGS7)を1名同定した。また平成27年に見つかったSAMHD1変異の患者(AGS5)に対して、両親の遺伝子検査を施行して原因遺伝子と確定した。AGSを含めた臨床的な相談・対応が増加した。検査遺伝子を10種類に拡大させた事、また対象疾患の稀少性のため、遺伝子変異を認めた場合の確認(意味のある変異かどうか)に時間がかかっている。場合により両親や同胞の検査を適宜追加して検討しているが、今後データの集積が進めば検討に要する時間も短縮できるのではないかと考えている。今年度、新規患者6人に対して遺伝子検査を施行した。対象としては成人領域にも疾患そのものや我々の取り組みが認知されてきている影響か、内科や皮膚科からの依頼が増加した。また結果解釈の難しいTREX1変異、RNASEH2B変異を各1名ずつ同定し、両親の遺伝子検査を追加検討している。また遺伝子検査で異常が同定されない患者に対して適宜エクソーム検査を追加しているが、今年度、CTC1遺伝子異常という頭蓋内石灰化を伴う疾患と判明した患者を同定した。AGSを含めた臨床的な相談・対応が引きつづき多く、また検査遺伝子を13種類まで拡大させた事、対象疾患の稀少性のため遺伝子変異を認めた場合の確認(意味のある変異かどうか)に時間がかかっている。AGSを含めたInterferonopathyに関する遺伝子解析を行っているのは我々だけであり、引きつづき疑い患者症例に関しての遺伝子検査を積極的に行っていく。本邦における全患者を把握しているので、その臨床症状を含めて情報を発信していく責務があると考えている。AGSを含めたInterferonopathyに関する遺伝子解析を行っているのは我々だけであり、引きつづき疑い患者症例に関しての相談や遺伝子検査を積極的に行っていく。

また本邦に多いTREX1ヘテロ遺伝子症例に関して、レコンビナントTREX1ヘテロダイマーを用いた機能解析系の確立に向けて、検討を続けていく。その上で低温培養下等での検討を重ねて、AGSでよく見られる凍瘡様皮疹の病態解析を進めていく予定である。これらの研究は稀少疾患の検討であるばかりではなく、同じインターフェロン関連疾患とされるSLEやシェーグレン症候群等、より患者数の多い疾患への応用が期待される。AGSを含めたInterferonopathyに関する遺伝子解析・相談を広く受け付けているのは本邦で我々だけであり、引きつづき疑い患者症例に関しての相談や遺伝子検査を積極的に行っていく。本邦における患者の臨床症状を含めて、情報を発信していく責務があると考えている。予定していた海外での国際学会に参加しなかった。遺伝子検査の継続に関しては、もともとある物品・試薬である程度賄えた事も影響したと考えられた。次年度への繰り越し理由としては、予定していた海外での国際学会に参加しなかった。遺伝子検査の継続に関しては、もともと研究室に残っている物品・試薬である程度は賄えた事も影響したと考えられた。使用計画としては、学会への参加と、増加している遺伝子検査に対する物品・試薬に充填する予定である。またその他研究計画に沿って、研究を進めていく予定である。次年度への繰り越し理由としては、予定していた海外での国際学会に参加しなかった影響が考えられた。学会への参加と、増加している遺伝子検査に対する物品・試薬に充填する予定である。
負パリティーラムダハイペロンに対するペンタクォーク模型の研究

本研究の目的は、負パリティーの∧ハイペロン∧(1405)等を、ペンタクォーク模型で説明する事が可能か否か明らかにする事である。その為に、具体的なペンタクォーク模型を構築し、物理量を計算した。模型の構築に関しては、ダイクォーク自由度を用いず、フルの5クォーク系とした。ダイナミクスを抜きにすると、クォークのフェルミ統計性とQCDのカラー閉じ込めから、∧(1405)に対応するJ^P=1/2^-の状態は、3重に縮退している事が解かった。ペンタクォーク中のクォークダイナミクスに関しては、何も情報がないので、核子を良く記述する核子中のクォークダイナミクスを使うことにした。それは準摂動的グルーオン交換力とカイラル対称性を回復する擬スカラーメソン交換力である。これを適用すると先の3つの状態は、ほぼ縮退した2つの状態と、ずっと上の1つの状態に分離することが解かった。ここで、次年度はアンケート結果の詳細な分析を行い、臨床および教育現場において診療補助業務の実施や教育を考えていく上での資料となるよう、実態の把握及び倫理・看護の独自性からの考察を行っていく予定である。(1405)が2つの状態から出来ている点は、出発点の全く異なる他の模型からも予言されており、興味深い。続いて、この模型におけるペンタクォークな∧(1/2^-)の性質を調べた。始めにσ-項を計算した。結果は、5155MeVと、両方とも、価クォークの数5個から推測される値に比べてずっと大きい。これは、状態が単純な5クォーク系ではなく、余剰なクォークを多く含む事を意味している。さらにスカラー形状因子を計算したところ、この余剰クォークは運動量移行が有限な領域で急激に消えることが解かった。約5GeV^2の所で価クォークの寄与だけになる。この特徴は実験での確認に使える。続いて、崩壊幅を計算した。非相対論の波動関数を借りて見積もったところ、実験値の倍から4倍大きい値が得られることが解かった。これは模型の致命的欠点であるかもしれない。しかし、上の見積りは非常にラフで問題がある事も解かった。最終的な結論にはさらに正確な計算が必要である。本年度は研究計画の通り、負パリティーラムダハイペロンに対するペンタクォーク模型を構築し、いくつかの解析を行った。模型の構築から述べる。4つのクォークと1つの反クォークで負パリティーのバリオンを作るため、全ての(反)クォークが基底S状態にあると仮定した。そのうえで、カラーによるクォーク閉じ込めとフェルミ統計性を考慮し、配位を決定した。その結果、Λ(1405)に対応する配位は3つ存在する事が判明した。S状態には、簡単のため、線形なスカラーポテンシャルを含むディラック方程式の基底解を用いた。これらの(反)クォークに残留相互作用を導入する。カイラル対称性を回復する事、基底バリオンのスペクトルを再現する事、を指標にして決定した。相互作用項は(反)クォークの、グルーオンと擬スカラーメソンの放出/吸収を記述する。相互作用の効果は摂動により見積もる。この相互作用により、ペンタクォーク内にクォーク相関と余剰クォーク(Seaクォーク)が導入される。次に、解析結果を述べる。初めにσ項を計算し、余剰クォークについて調べた。その結果、メソンの雲によるSeaクォークは価クォークよりも倍程度大きく寄与し重要である事がわかった。また、Seaクォークは有限の運動量移行で見ると消えていき、価クォークのみが残る事も分かった。これらの結果を、8月にブラジル・サントスで開かれた、18th, IUPAP国際会議、Few-Body Problem in Physicsにおいて発表した。次に、質量スペクトルを調べた。単純には縮退している3つの∧(1405)も、価クォークの質量差と相互作用の効果によって分裂する。調べた結果、3つの内の2つが近い質量を持ち、残りの1つはずっと大きい質量を持つ事が分かった。これは他の模型の結果と一致しており興味深い。これらの結果を、11月に京都で開かれた、Yukawa International Seminar(YKIS)2006,′′New frontiers in QCD′′において発表した。

ここで、次年度はアンケート結果の詳細な分析を行い、臨床および教育現場において診療補助業務の実施や教育を考えていく上での資料となるよう、実態の把握及び倫理・看護の独自性からの考察を行っていく予定である。(1405)が2つの状態から出来ている点は、出発点の全く異なる他の模型からも予言されており、興味深い。続いて、この模型におけるペンタクォークな∧(1/2^-)の性質を調べた。始めにσ-項を計算した。結果は、5155MeVと、両方とも、価クォークの数5個から推測される値に比べてずっと大きい。これは、状態が単純な5クォーク系ではなく、余剰なクォークを多く含む事を意味している。さらにスカラー形状因子を計算したところ、この余剰クォークは運動量移行が有限な領域で急激に消えることが解かった。約5GeV^2の所で価クォークの寄与だけになる。この特徴は実験での確認に使える。続いて、崩壊幅を計算した。非相対論の波動関数を借りて見積もったところ、実験値の倍から4倍大きい値が得られることが解かった。これは模型の致命的欠点であるかもしれない。しかし、上の見積りは非常にラフで問題がある事も解かった。最終的な結論にはさらに正確な計算が必要である。
極長鎖脂肪酸アシルCoA脱水素酵素欠損症患者の遺伝子解析

極長鎖脂肪酸アシルCoA脱水素酵素(VLCAD)欠損症患者に由来する8例の皮膚繊維芽細胞から総RNAを抽出し,RT-PCR法によりcDNAを調製した。10組のforward・reverseプライマーを合成し,各cDNA標品をPCRにて増幅させ,得られたcDNAフラグメントをシークエンスして変異解析結果を得た。VLCAD患者番号(18)の順に変異を記載する。1.309-310の2base,1435-1532の98baseと1606-1609の4baseから或るdouble deletion,heterozygous3.2と同一7.6と同一上述したように3種の変異は2人の患者に共通しているが,hot spotは存在しないようにである。これらの変異を持つDNAを発現プラスミド(pCXN_2)に入れ,各々をCHO細胞で発現させると,合成されたmRNA又は蛋白のいずれかが極度に不安定であり,これらの変異がdisease causing mutationであることが証明された。deletion変異が多いことから,ゲノムDNAレベルでの変異解析の重要性が示唆された。
陸上植物における光環境依存的な成長相転換機構の普遍性と多様性

陸上植物進化における長日および光質依存的な相転換制御機構の成立について分子系統学解析と分子遺伝学的解析により明らかにした。遺伝子の分布から概日時計の獲得は車軸藻類まで遡れることが示された。苔類ゼニゴケを用いた機能解析によって、概日時計を介して遺伝子発現が概日リズムを刻むこと、その下流にGI-FKFからなるタンパク質複合体が存在し配偶体世代における成長相転換を制御すること、1分子ずつ存在する赤色光受容体フィトクロムと相互作用因子PIFを介して多様な赤色光応答を制御することを明らかにした。これは、成長相転換制御の基本的機構が植物陸上進出の段階ですでに成立していたことを意味する。陸上植物進化の基部に位置する苔類ゼニゴケを用いた分子遺伝学的な解析によって配偶体世代(半数体)における栄養成長相から生殖成長相への転換機構を目指す。また、この制御と胞子体世代が優占的な維管束植物における相転換機構と比較することによって、陸上植物の相転換の共通性や多様性を明らかにする。配偶体世代における生長相転換において、シロイヌナズナで日長依存経路の因子として知られるGIおよびFKFの機能的保存性を調べた。ゼニゴケゲノムには、基本的なドメイン構造が保存されたGIおよびFKF1のオルソログMpGIとMpFKFが1コピーずつコードされていた。また、これらの遺伝子発現は概日リズムを示した。相同組換えによって、それぞれの遺伝子を破壊した変異体を作成した。これらの系統は、長日依存的な成長相転換が抑制された。また、GIおよびFKFを恒常的に発現する系統を作成したところ、短日条件でも成長相転換が観察された。ゼニゴケの成長相転換は長日条件と光質条件(実験室条件では遠赤色光の補光)によって促進される。遠赤色光の補光は、過剰発現株の短日条件での相転換表現型に必要であった。これらの結果から、GIおよびFKFが光周性相転換に必要かつ十分であること、ただし光質依存的な経路は独立に存在することが明らかになった。次に、酵母のTwo-hybridアッセイおよびin vivoの共免疫沈降実験によってGIとFKFが複合体を形成することが明らかになった。また、ゼニゴケGI遺伝子をシロイヌナズナのgi変異体に導入したところ、遅咲き表現型が部分的に相補され、GIタンパク質の機能が進化的に保存されていることが明らかになった。これらの結果から、GI-FKF1を介する相転換制御機構は、配偶体世代の相転換に機能すること、また、この制御が進化過程で胞子体世代の相転換に転用されたことが明らかになった。栄養成長相から生殖成長相への成長相の転換の制御機構は被子植物では花成と呼ばれ、シロイヌナズナをモデルとして研究が進められた。日長依存的な制御経路では、時計の出力系として、GIと呼ばれる核タンパク質と青色光吸収ドメインをもつユビキチンリガーゼであるFKF1が複合体を形成し転写抑制因子CDFを光周期依存的に分解することで、下流の転写因子COおよびフロリゲンFTを制御するモデルが提唱されている。また、花成制御には光質依存的制御経路も存在する。我々は苔類ゼニゴケを用いて、これらの経路を検証し、26年度までにGI-FKF複合体が、ゼニゴケの配偶体世代の成長相転換を制御することを示した。27年度は下流因子CDFおよび相転換の統合因子の解析を進めた。ゼニゴケにはCDFオルソログが1コピー存在し、CDFの遺伝子破壊株は短日条件でも成長相転換を示した。また、単独変異では相転換が観察されないgiやfkfとcdfの二重変異体が短日でも相転換するというcdf表現型を示すことから、CDFが下流因子であることがわかった。つまり、GI-FKF-CDFの制御モジュールは植物が陸上化した時点で成立しており、配偶体世代の成長相転換の制御に利用されていることがわかった。また、ゼニゴケの成長相転換には遠赤色光の存在が必要である。この経路にフィトクロムおよび下流の転写因子PIFが関与することも明らかにした。この光質経路と日長経路の統合因子についても解析を進め、新たな転写因子を同定した。この遺伝子は破壊すると相転換をまったく示さず、相転換に必要であることがわかった。一方、この遺伝子を構成的なプロモーター下で発現させると日長や光質条件に関わらず、成長相転換を誘導できることから、この因子は相転換に十分であり、成長相転換のマスター制御因子として機能することがわかった。現在、この因子を制御する分子機構の解明を進めている。基本的に計画通りに実験が進んだ。(1)光周性制御に関しては遺伝子の有無だけでなく、単独および多重突然変異体を用いた機能解析からGI-FKF-CDFの制御モジュールが進化的に保存されていることが明らかになった。(2)光質経路に関しても、突然変異体を用いた解析によって、光受容体の制御とその下流転写因子の相転換への関与が明らかにできた。特に単一分子種であるフィトクロムと同じく単一分子種であるフィトクロム相互作用因子PIFが、典型的なフィトクロム応答に加えて、光質依存的な相転換制御に関わっていることは興味深い。その分子機構の解明が期待される。(3)光周性や光質といった環境因子を統合するマスター制御因子の同定ができた。これらの結果は日本植物生理学会の年会において発表した。

今後は、光周性制御に関しては、上流と考えられる時計遺伝子との関連を明らかにすることが重要である。また、CDF下流の制御実体を明らかにする必要もある。これは、現在、RNA-seq解析およびChIP-seq解析の準備を進めており、次年度に実施予定である。本研究は、主として被子植物で研究されてきた成長相転換制御の知見に基づいて、ゼニゴケをモデルに基部陸上植物の成長相転換を調べることで、陸上植物の成長相転換機構の普遍性と多様性を探ることを目的とした。ゼニゴケの有性生殖プログラムは、長日条件および遠赤色光により誘導される。光質の情報は光受容体フィトクロムにより受容される。フィトクロムは、核内で転写因PIFと相互作用し、信号伝達が行われる。ゼニゴケには1分子種のフィトクロムと1分子種のPIFが存在した。ゼニゴケは赤色光で活性化され遠赤色光で不活化される低光量応答を示す。低光量応答には、無性芽の発芽や光合成関連遺伝子の発現制御がある。フィトクロム遺伝子やPIF遺伝子を破壊すると低光量応答(LFR)が行われなくなった。生理学的な実験からゼニゴケの有性生殖誘導は、LFRではなく、遠赤色光高照射応答(FR-HIR)であることがわかった。恒常活性型フィトクロム発現株や遺伝子破壊株の研究から、FR-HIRにも同じタンパク質が関わっていること、つまり1つのフィトクロム-PIFの発現制御モジュールがLFRおよびFR-HIRを制御していることが明らかになった。さらにフィトクロムやPIFの細胞内局在やタンパク質相互作用も明らかにして、これらの成果を論文としてまとめた(Inoue et al., Plant Cell, 2016)。日長感受性経路に関しては、GI-FKF1の下流に転写抑制因子CDFが存在する。CDFおよびPIFの下流因子に存在するマスター制御因子を同定した。これは、被子植物のようにCOやFTではなく、被子植物でも配偶体世代で機能する因子であった。つまり、陸上植物は進化の過程で、環境依存的な成長相転換を配偶体世代の現象とし花を発明したことで生殖プログラムを進化させたことが分子的な解析からも示された。陸上植物進化における長日および光質依存的な相転換制御機構の成立について分子系統学解析と分子遺伝学的解析により明らかにした。遺伝子の分布から概日時計の獲得は車軸藻類まで遡れることが示された。苔類ゼニゴケを用いた機能解析によって、概日時計を介して遺伝子発現が概日リズムを刻むこと、その下流にGI-FKFからなるタンパク質複合体が存在し配偶体世代における成長相転換を制御すること、1分子ずつ存在する赤色光受容体フィトクロムと相互作用因子PIFを介して多様な赤色光応答を制御することを明らかにした。これは、成長相転換制御の基本的機構が植物陸上進出の段階ですでに成立していたことを意味する。成長相転換における日長制御の部分に関していは論文として公表できた。また、光質制御の実体および入力系お統合因子の解析も着実に進展したため。27年度に得られた成果の取りまとめを進める。また、得られた成果に基づく研究を継続する。長日条件でも遠赤色光補光は必要でる。日長経路と光質経路の相互作用があるか、その場合の実体を明らかにすることが必要である。
抗酸化能、DNA修復能、DNA変異量の解析による胃がん発生の新規リスク因子の同定

胃内に慢性的に感染したピロリ菌は胃粘膜に炎症をもたらし、胃がん発生のリスクを増大させる。ピロリ菌は内服薬で除菌することが可能だが、除菌後も胃がん発生のリスクはゼロにならない。そこで、除菌後胃がんやピロリ菌未感染者の胃がんを管理するためには胃がんのリスクを客観的に評価する指標が必要となる。本研究ではがんの発生の原因となる酸化ストレスに着目し、酸化ストレスに対する防御能力(抗酸化能、DNA修復能)と、酸化ストレスに伴うダメージ(DNA損傷)の蓄積量を成人・小児、ピロリ菌感染者・非感染者で比較し、加齢やピロリ菌感染と酸化ストレス・胃がん発生との関係性から、胃がんのリスク因子の同定を目指す。
チトクロ-ムPー450の分子生物学:発現の分子機構

新たなPー450分子種の確認と構造決定、Pー450遺伝子の発現調節機構、Pー450の生合成と膜への組み込み機構、Pー450の構造と酵素活性の相関などの諸問題を研究班員が分担して研究を進めた。新たなPー450として、ラット肝のコレステロ-ル7α位を水酸化するPー450(奥田)、ラット腎臓の25ーヒドロキシビタミンD_3の24位を水酸化するPー450(奥田)、ラット肝細胞の初代培養で誘導されるPー450(大村)など数種類の一次構造を決定した。Pー450遺伝子の発現調節については、ラット肝臓においてのPー450aの発現が成長ホルモンにより調節されることを確かめ(加藤)、Pー450c遺伝子のTCDD誘導時に発現制御領域XREに結合する因子の精製を進め(船江)、BTEに働く新しい因子の構造を決定した(藤井)。また、ステロイドホルモン生合成に関与するPー450_<11>β(大村)、Pー450sccとPー450c_<21>(藤井)の転写調節領域を解析し、新しいエレメントの存在を確認した。ヒトについては、Pー450c遺伝子の多型と肺癌発生の間に有意の相関があることを見いだし(川尻)、胎児型Pー450の発現も検討した(鎌滝)。又、ハムスタ-の肺Pー450についても発現調節の研究を進めた(渡辺)。Pー450の生合成については、Pー450が生合成時に小胞体膜へ組み込まれる過程を解析し、組み込み時にシグナルとして機能するアミノ酸配列の構造要求性を検討した(大村)。また、肝細胞内においてのPー450の分解過程を免疫電顕法で解析した(田代)。Pー450の構造活性相関については、Pー450cam(堀内)、Pー450d(清水)、及びPー450IIC(今井)についてアミノ酸点変異の導入、キメラ蛋白質の作成などにより研究を進め、活性に必要ないくつかのアミノ酸残基を特定できた。