hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テロメア短縮は個体老化の原因か

1.早老症の患者より培養した繊維芽細胞を培養しく経代を行った。これら細胞をサザン解析によってテロメア長を調べたところ、非常に早いテロメアの短縮が見られた。健常人からの繊維芽細胞でもテロメアの短縮がみられたが、HPA法によってテロメアのシグナルを定量したところテロメアの短縮率は、早老症由来の繊維芽細胞の方が優位に高かった。2.テロメアの短縮が、個体の老化に重要であると考えると、テロメア短縮率の高い早老症由来の繊維芽細胞においてテロメアを延長することによって早老症由来の細胞の分裂寿命が延長できる可能性が考えられた。テロメラーゼを強制発現させてテロメアを延長させることによる分裂寿命への効果をみた。テロメラーゼ遺伝子hTERTの導入によって細胞の分裂寿命が飛躍的に延び、細胞の形態も若い正常細胞に非常によく似ており、テロメラーゼの発現によるテロメアの延長は、早老症の患者由来の繊維芽細胞の寿命を延ばすことに成功した。3.早老症以外の健常人由来の肝細胞、子宮頸部平滑筋細胞、胎児および成人由来の繊維芽細胞について由来年齢とテロメア長の相関をHPA法により調べたが、優位な相関性は見いだせなかった。しかし、hyperplasiaのような一種の前ガン病変で細胞増殖の盛んなところでは、正常組織に比べて優位にテロメアが短縮しているものがあり、染色体の不安定化による遺伝子変異の引き金にテロメアが重要である可能性が考えられた。以上の本研究の成果をまとめると、テロメア長の減少が個体の老化とともに減少している組織はあるが、それが個体の老化の性質をすべて説明できるだけの結果は見いだせなかった。しかし、早老症患者由来の細胞は、強制的にテロメアを延長させることによって早老患者由来の細胞の性質が健常人様に変化し、その分裂寿命の延長がみられたことから、少なくともテロメアは、個体の老化にも重要である可能性が考えられた。1.いろいろな癌細胞株でのテロメア長を調べたところ、正常細胞よりも短いテロメア長を持つものが80%以上であった。2.上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞をin vitroで培養すると一定の分裂回数の後増殖停止するが、いずれの細胞も増殖停止にいたるまでにテロメアの短縮が見られ、いずれの細胞でもテロメラーゼ活性の持たない細胞ではテロメアが短縮することが明らかになった。3.テロメアの短縮が見られた上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞にテロメラーゼ遺伝子であるhTERT遺伝子をレトロウイルス法により導入するとテロメア長の正常細胞で見られるテロメアの短縮が阻止され、テロメアの延長が見られた。4.hTERT遺伝子を導入した細胞は、正常細胞に比べて分裂できる回数が増加したもの(延命効果)、無限に増殖できるようになったもの(不死化)が多数えられた。5.早老症の一種であるウエルナー患者から細胞を採取し、in vitroで培養を行うと健常人から取ってきた細胞にくらべて早く分裂停止を起こすことがわかった。以上の結果を総合して考えると、テロメアの長さと細胞が分裂できる回数は相関間関係が見られた。テロメラーゼ遺伝子の導入によって細胞分裂できる回数が飛躍的に延びたものが多数あったことからもテロメア長が重要な役割を果たしていることがわかった。細胞が分裂できるかできないかは、組織を支配している細胞が機能できるかどうか一つに重要な判断材料と考えられることから、テロメア長が個体の老化においても重要であるものと考えられる。1.早老症の患者より培養した繊維芽細胞を培養して経代を行った。健常人からの繊維芽

細胞でもテロメアの短縮がみられたが、HPA法によってテロメアのシグナルを定量したところテロメアの短縮率は、早老症由来の繊維芽細胞の方が優位に高かった。2,.テロメアの短縮が、個体の老化に重要であると考えると、テロメア短縮率の高い早老症由来の繊維芽細胞においてテロメアを延長することによって早老症由来の細胞の分裂寿命が延長できる可能性が考えられた。テロメラーゼを強制発現させてテロメアを延長させることによる分裂寿命への効果をみた。テロメラーゼ遺伝子hTERTの導入によって細胞の分裂寿命が飛躍的に延び、細胞の形態も若い正常細胞に非常によく似ており、テロメラーゼの発現によるテロメアの延長は、早老症の患者由来の繊維芽細胞の寿命を延ばすことに成功した。3.早老症以外の健常人由来の肝細胞、子宮頸部平滑筋細胞、胎児および成人由来の繊維芽細胞について由来年齢とテロメア長の相関をHPA法により調べたが、優位な相関性は見いだせなかった。しかし、hyperplasiaのような一種の前ガン病変で細胞増殖の盛んなところでは、正常組織に比べて優位にテロメアが短縮しているものがあり、染色体の不安定化による遺伝子変異の引き金にテロメアが重要である可能性が考えられた。以上の本研究の成果をまとめると、テロメア長の減少が個体の老化とともに減少している組織はあるが、それが個体の老化の性質をすべて説明できるだけの結果は見いだせなかった。しかし、早老症患者由来の細胞は、強制的にテロメアを延長させることによって早老患者由来の細胞の性質が健常人様に変化し、その分裂寿命の延長がみられたことから、少なくともテロメアは、個体の老化にも重要である可能性が考えられた。
ユビキチン様蛋白質修飾システムによる生体機能制御

ユビキチン(Ub)は標的蛋白質に共有結合して,蛋白質の分解を指令する.ごく最近Ub以外に様々なUb様(Ub-like : UBL)蛋白質が生体内に存在する事が明らかとなり,それがUbと同様にE1様酵素,E2様酵素を介して標的蛋白質に共有結合する事が明らかとなった.細胞周期やシグナル伝達そして形態形成の制御因子がこのUb/UBLシステムによって修飾されることが次々と明らかとなっているが,その生理的役割は不明であり,その解明が大きな課題となっている.私はこれまでにUBL蛋白質の一つであるNEDD8がCullinファミリータンパク質からなる多様な複合体型ユビキチンリガーゼを翻訳後修飾し,そのユビキチンリガーゼ活性を促進することを報告してきた(EMBO J.,20,4003-4012).また本修飾システムは分裂酵母ならびに哺乳動物において必須であった(EMBO J.,19,3475-3484;J.Cell Biol.,155,571-579).さらに酸化ストレス応答やDNA損傷修復に関わる因子がCullinファミリータンパク質と複合体を形成してユビキチンリガーゼとして機能することを明らかにした(Mol.Cell Biol.,24,7130-139;DNA repair in press).真核生物ではその他に様々なUBL蛋白質が保存されており,Ub修飾系と連携して生体機能を制御していると考えられる.本研究ではさらにその他の様々なUBL修飾システムについても解析を行ない,新たなユビキチン様修飾機構Ufm1修飾系の同定と(EMBO J.,23,1977-1986),ノックアウトマウス解析を行った.また自食作用(オートファジー)に必須なUBL修飾系のコンディショナルノックアウトマウスを作製し,オートファジーはユビキチン化タンパク質の分解にも重要な役割を果たすことを明らかにした(J.Cell Biol.,in press).I型に属するユビキチン様蛋白質はユビキチンシステムと類似した独自の酵素系で標的蛋白質に共有結合する.ユビキチンと最も相同性の高いRub1/NEDD8はCullinファミリー蛋白を修飾し,そのユビキチンリガーゼ活性を促進する.その生理学的意義を明らかにする目的で,NEDD8のE1様酵素であるUba3のノックアウトマウスを作製した.Uba3欠損マウスは早期胎生致死であり,NEDD8修飾系はホ乳動物の細胞周期制御や形態形成シグナルの制御に必須であることが判明した.本年度はさらにコンディショナルノックアウトマウスの作製を行っている.次にオートファジー経路に必須であるユビキチン様のAPG修飾系についても,そのE1様酵素であるAPG7のコンディショナルノックアウトマウスとE2様酵素APG3のノックアウトマウスを作製した.これらの表現型は現在解析中である.これらの成果に加えて,本年度は,(1)プロテアソームサブユニットZのコンディショナルノックアウト細胞を作製し,プロテアソーム依存性タンパク質分解の生理的意義を解析した.また,(2)Fbx2がN型糖鎖を認識するF-box蛋白質であり,小胞体関連蛋白質分解に関与するユビキチンリガーゼであることを明らかにした.そして(3)脱ユビキチン化酵素UBP69とUBP45がmRNAの選択的スプライシングによって合成され,その発現制御が筋分化を制御することを明らかにした.最後に,(4)プロテアソーム活性化因子PA28のノックアウトマウスを用いて,Hsp9OがPA28非依存性の抗原提示に必須であることを明らかにした.I型に属するユビキチン様蛋白質はユビキチンシステムと類似した独自の酵素系で標的蛋白質に共有結合する.オートファジー経路に必須であるユビキチン様蛋白質APG8およびAPG12はE1様酵素APG7によって活性化される.このAPG7のコンディショナルノックアウトマウスを作製し,Cre発現トランスジェニックマウスと交配することによって肝臓におけるAPG修飾系の生理機能を解析した.その結果APG修飾経路は哺乳動物においても飢餓時のオートファジーに必須であることを明らかにした.オートファジーはオルガネラの新陳代謝に関与しており,APG7遺伝子欠損肝では異常なオルガネラやユビキチン様性の凝集体が蓄積することを発見した.またAPG8修飾系特異的なE2様酵素APG3のノックアウトマウスを作製したので,APG7遺伝子欠損マウスとあわせて胚発生における表現型を解析している.またその他にユビキチンと構造的に類似した新規蛋白質Ufm1 (Ubiquitin Fold Modifier1)を同定し,それが新規E1様酵素Uba5,新規E2様酵素Ufc1を介して標的蛋白質に共有結合することを明らかにした.Ufm修飾系のノックアウトマウスについても現在作製中である.昨年に,N型糖鎖を認識するユビキチンリガーゼFbs1/Fbx2を同定し報告したが,本年度はその結晶構造解析から糖鎖認識機構が明らかになったので報告した.またFbs1と相同性の高いFbs2も糖鎖を認識するユビキチンリガーゼであることを報告した.最後にプロテアソームの条件的遺伝子欠損細胞を用いて,プロテソームが脊椎動物細胞のG2/M期進行に必須であることを明らかにした。その表現型も詳細に解析中である.ユビキチン(Ub)は標的蛋白質に共有結合して,蛋白質の分解を指令する.ごく最近Ub以外に様々なUb様(Ub-like : UBL)蛋白質が

生体内に存在する事が明らかとなり,それがUbと同様にE1様酵素,E2様酵素を介して標的蛋白質に共有結合する事が明らかとなった.細胞周期やシグナル伝達そして形態形成の制御因子がこのUb/UBLシステムによって修飾されることが次々と明らかとなっているが,その生理的役割は不明であり,その解明が大きな課題となっている.私はこれまでにUBL蛋白質の一つであるNEDD8がCullinファミリータンパク質からなる多様な複合体型ユビキチンリガーゼを翻訳後修飾し,そのユビキチンリガーゼ活性を促進することを報告してきた(EMBO J.,20,4003-4012).また本修飾システムは分裂酵母ならびに哺乳動物において必須であった(EMBO J.,19,3475-3484;J.Cell Biol.,155,571-579).さらに酸化ストレス応答やDNA損傷修復に関わる因子がCullinファミリータンパク質と複合体を形成してユビキチンリガーゼとして機能することを明らかにした(Mol.Cell Biol.,24,7130-139;DNA repair in press).真核生物ではその他に様々なUBL蛋白質が保存されており,Ub修飾系と連携して生体機能を制御していると考えられる.本研究ではさらにその他の様々なUBL修飾システムについても解析を行ない,新たなユビキチン様修飾機構Ufm1修飾系の同定と(EMBO J.,23,1977-1986),ノックアウトマウス解析を行った.また自食作用(オートファジー)に必須なUBL修飾系のコンディショナルノックアウトマウスを作製し,オートファジーはユビキチン化タンパク質の分解にも重要な役割を果たすことを明らかにした(J.Cell Biol.,in press).
病気からみたヒト集団の遺伝的分化

ヒト集団は、アフリカ、アジア、ヨーロッパの各集団に別れるが、それぞれの集団はそれぞれに異なった環境への適応を果たして来たと考えられる。しかし、その遺伝的基盤ははっきりと知られていないので、それを知るためにヒトの遺伝病の原因になる突然変異の情報を用いてヒト集団を比較した。その結果、病気になりやすい突然変異の分布は各集団で大きな違いが見られず、特にヨーロッパ集団以外の集団の遺伝病のデータが必要であることが示唆された。本研究では、ヒトのアフリカ集団、アジア集団、ヨーロッパ集団における1塩基多型(SNP)の集団毎の頻度データと、病原となるアミノ酸変異のデータが主に必要となるので、本年度はまずこれらのデータを収集した。1.ヒトの集団別の1塩基多型の頻度データは、国際HapMap計画により利用可能となっているデータを使用した。HapMapのデータからは常染色体のデータ、およびアミノ酸配列をコードする領域に見られる1塩基多型のデータのみ抽出した。2.ヒトの病原となるアミノ酸変異のデータは、タンパク質データベースであるSwiss-Protより抽出した。Swiss-Protからはヒトの遺伝子についてアミノ酸の多型が見られるものを抽出し、さらにそれぞれのアミノ酸多型について病気の原因となる多型とそうではない多型を区別した。190通りのアミノ酸変異のうち、1塩基の変異のみで起こる75種類のアミノ酸変異を考え、上記2の結果から75種類のアミノ酸変異のそれぞれについて、病気のなりやすさの指標(Disease Index)を与える事が出来た。今後このDisease Indexに対して、上記1の結果からヒトのアフリカ集団、アジア集団、ヨーロッパ集団における出現頻度を比べ、病気に主眼を置いたヒト集団の適応の違いを議論する事を目標とする。昨年度までにヒトのアフリカ集団、アジア集団、ヨーロッパ集団における1塩基多型(SNP)の集団毎の頻度データと病原となるアミノ酸変異のデータを、それぞれHapMapプロジェクトとSwiss-Protから収集した。このデータから190通りのアミノ酸変異のうち、1塩基の変異のみで起こる75種類のアミノ酸変異を考え、それぞれのアミノ酸変異について、病気のなりやすさの指標(Disease Index)を与える事が出来た。75種類のアミノ酸変異についてこのDisease Indexと、どれだけ集団中に変異となりやすいかの指標Polymorphism Indexとどれだけ集団中に固定しやすいかの指標Fixation Indexの相関を調べた。Disease Indexとこれら2つのIndexの間に有意な相関は見られなかった。これはDisease Indexの計算に用いた病原となるSwiss-Protのアミノ酸変異のデータがマーカーSNP(病気の遺伝的な原因でない変異)を多量に含むためと思われるので、これに用いるデータをNCBIのOMIMに変更した方が良いと判断した。また、Disease Indexの他に、タンパク質の立体構造に影響を与えるアミノ酸変異を集めたデータベースが公開されたので、これを利用しタンパク質の立体構造への影響の大きさを75種類のアミノ酸変異別に指標として与え、Damaging Indexを開発した。本研究では、75種類のアミノ酸変異について、どれだけその変異が病気になりやすいか、タンパク質の機能や構造に影響を与えるかの指標をそれぞれIndexの型で与える事に成功した。また、これらの指標にヒトの集団間で差があるかどうかは、まだ議論しなければならない事が明らかになった。
低出生体重児における母乳栄養と精神運動発達との関連に関する縦断研究

1.母乳投与と3歳時の発達予後との関連について97名を対象に後方視的に検討した.その結果、退院時母乳投与のあった児は90例、人工栄養の児は7例であった。両群間の臨床像を比較すると母乳投与のあった児で有意に院内出生の児が多く、出生5分後のApgar scoreが高く、退院時体重が少なかった。3歳時の全領域の発達指数(中央値(四分位範囲))は母乳投与のあった児は84(76-92)、人工栄養の児は88(69-89)で有意差がなかった。2.早産児,低出生体重児についてNICU退院後1か月での母乳投与の実態とそれに関連する因子について検討した。退院時に母乳投与のあったことが退院後1か月で混合栄養を含め母乳投与があったことに有意に関連し,退院時母乳のみ投与であったことと退院日齢が早いことが退院後1か月で母乳のみの投与であったことと有意に関連していた。3.出生体重1500g未満の新生児の乳汁栄養開始からNICU退院までの母乳量と対児感情、乳房のセルフケアとの関連を明らかにした。その結果、対象者は20名で乳汁栄養開始からNICU退院までの総乳汁量の50%以上が母乳であった児は7名(50%以上群)で、このうち1名は100%母乳であり、母乳が50%未満は13名(50%未満群)であった。50%以上群と母乳50%未満群の在胎週数、出生体重、Apgar score、人工換気日数、経腸栄養100ml/kg/d、対児感情尺度の回避得点、接近得点には有意差はなかった。母乳50%以上群は、乳房マッサージ、水分摂取量を増やす、和食を食べるなどのセルフケアを実施していた。一方母乳50%未満群では、完全に母乳でなくてもよい、母乳量を増やす努力はしないなどセルフケアをしていなかった。前方視的にデータを収集している対象児は、出生月齢では3歳を迎えているが一部の対象児が修正月齢で3歳となっていないためにK式発達検査が実施できていない。早産児の割合が多かったと考えられる。対象児が修正月齢で3歳時のK式発達検査を実施し、分析して結果を出し終了する予定である。1合併症のない早産児あるいは低出生体重児(いずれも出生体重1500g以下)と母乳摂取の効果に関する文献検討を実施した。その結果、主に国外の文献から、運動発達・認知発達が促進する、知能指数がよい、壊死性腸炎のリスクが軽減することに関連していることが明らかになった。特に、早産児あるいは低出生体重児における人工乳とドナー母乳の比較ランダム化比較試験(RCT:Randomized Controlled Trial)によると、人工乳は短期的な成長率(体重増加率)は増加するが、NECのリスクが高いことが明らかになっていた。しかし、わが国では、ドナー母乳を使用していないことから、母親自身の母乳との関連を明らかにしたい。また人工呼吸管理を施行している極低出生体重児の口腔ケアに対する初乳の塗布は、感染症(免疫の獲得)に関連していた。2後方視的(retrospective Study)に、特別な合併症がある低出生体重児を除外し、現在3歳になっている子どもの乳汁栄養開始時、生後1ヵ月、退院時、修正月齢3ヶ月時の栄養を母乳群、人工乳群に分け、入院中の児の合併症および1歳6ヶ月と3歳児のK式発達検査との関連をあきらかにするために、データを収集した。今後は後方視的に収集した2施設のデータを合わせ母乳群、人工乳群に分け、入院中の児の合併症および1歳6ヶ月と3歳児の発達検査との関連を統計学的に解析する予定である。3児の合併症(感染症、壊死性腸炎など)と母乳摂取との関連を明らかにするために、特別な合併症がある低出生体重児を除外し、本年度出生した1500g未満の低出生体重児でデータ収集を開始した。後方視的(retrospective Study)調査は、母乳摂取と認知発達との関連について統計解析までする予定であったが、まだ統計解析が済んでいない。後方視的のため電子カルテからテータを収集しているが、施設によりデータの記入方法が異なり、合わせるのに時間を要しているためである。1.後方視的(Retrospective Study)データは、2013年以降に出生した子どもが3歳になり、K式発達検査を実施できた児のみ、出生から3歳までデータを結合し分析した。その結果、1NICU退院まで母乳を継続できた極低出生体重児は91.7%で、超低出生体重児は86.2%で、高率で母乳継続していた。2NICU退院まで母乳を継続した症例で壊死性腸炎になったのは1例だけであった。1例のため母乳継続と壊死性腸炎の因果関係を統計的に解析することは出来ないが、NICU退院まで母乳栄養の継続率が高いことが考えられた。また、1歳6ヶ月時の(修正年齢数値)K式発達検査総合点数を従属変数とし、出生体重、経管栄養開始日齢(母乳)、NICU退院までの母乳継続を独立変数として、重回帰分析を実施した。K式発達検査(修正年齢数値)と経管栄養(母乳)開始日齢、NICU退院までの母乳継続に有意差は認められなかった。これは、後方視データのため児が摂取した母乳の量ではなく、退院までの母乳継続の有無で解析しているためだと考えられる。

そのため、現在実施している前方視的データでは、NICU退院までの母乳量を収集し解析する。また、児の発達に影響する両親の健康、教育暦、経済、家庭環境などを交絡因子にして解析をする。2.前方視的(Prospective Study)データは、2015年2016年の出生児のデータ収集を行った。これらの児が1歳6ヶ月時点でK式発達検査を随時実施する。さらに、対児感情尺度と母乳に関する母親が行うセルフケアの質問紙の解析を実施する。後方視データは、3歳児のK式発達検査のデータ収集が遅れ(対象児が体調不良、家事都合などの理由により発達検査日に実施できなかったため)、対象者数が少なく詳細の解析がまだである。1.NICU退院まで母乳継続できた出生体重1500g未満の子どもを生んだ母親のセルフケア母親は母乳分泌を良好にするため【自分に適した搾乳の時間の工夫】【母乳によい飲食の工夫】【子どもを感じながらの搾乳】【乳房ケアとマッサージ】など、自分に適したセルフケアを調べ実施していた。看護ケアとして母親の意向を尊重し、ストレスにならないように夜間の搾乳を強制しないこと、子どもと面会しながら施設内で搾乳できる環境を整えることなどが示唆された。2.1500g未満の新生児に対する母乳栄養と発達との関連総合周産期母子医療センターNICUに入院した1500g未満の新生児で、染色体異常や神経発達に影響する先天性奇形がなく、18ヶ月時にKyoto Scale of Psychological Development(以下、KSPD)を受けた102名のデータと3歳児にKSPDを受けた94名(追跡率92.1%)を対象に調査した。その結果、NICU退院まで継続した母乳栄養および経管栄養(母乳)開始日齢との関連が認められなかった。1歳6ヶ月時の神経発達に影響していたのは、人工呼吸器の期間が短い、5分後のアプガールスコアーが高いであった。3歳児では性別(女児)、母親の教育暦(高校よりの進学あり)であった。したがって、成長に伴い家庭環境がより神経学的発達に影響することが示唆された。3.早産児、低出生体重児のNICU退院時の母乳投与の実態とそれに関連する因子NICU退院時、母乳のみとそれ以外の児では、母親の不妊治療、妊娠高血圧症候群、児の授乳開始日齢、退院日齢等で有意差を認めた。出生体重で調整した多変量解析では不妊治療が退院時母乳のみと関連する有意な因子として見出された。今回の検討で明らかになった因子を考慮して母乳育児支援を行うことが望まれる。調査対象施設で先天奇形や社会的養護を必要とする新生児の出生が多かったため、対象者数は少ないが、おおむね計画書どおりに院展している。1.母乳投与と3歳時の発達予後との関連について97名を対象に後方視的に検討した.その結果、退院時母乳投与のあった児は90例、人工栄養の児は7例であった。両群間の臨床像を比較すると母乳投与のあった児で有意に院内出生の児が多く、出生5分後のApgar scoreが高く、退院時体重が少なかった。3歳時の全領域の発達指数(中央値(四分位範囲))は母乳投与のあった児は84(76-92)、人工栄養の児は88(69-89)で有意差がなかった。2.早産児,低出生体重児についてNICU退院後1か月での母乳投与の実態とそれに関連する因子について検討した。退院時に母乳投与のあったことが退院後1か月で混合栄養を含め母乳投与があったことに有意に関連し,退院時母乳のみ投与であったことと退院日齢が早いことが退院後1か月で母乳のみの投与であったことと有意に関連していた。
近世における町家大工の営業形態に関する研究-田中家文書「大福工数帳」を中心に-

故田中吉太郎家は代々「近江屋吉兵衛」を襲名してきた大工の家系である。田中家に多数所蔵されている普請関係文書のうち、文化・文政年間から明治初年にいたる約80年間にわたる「大福工数帳」約20冊には、出入り先と仕事の内容、職人の名前と出面、材料の種類・数量・規格などが記録されており、主として町場を仕事場としていた近江屋の営業活動の実態を明らかにすることができる。また約100点の町家古図は、間取りのほかに、構造、各種の寸法、大工の人工数などが記載されている。またあらたに約120点の「工数日記帳」を見出すことができた。マス目を切った用紙に記された大工の出面表で、年紀が確かなものは天保7年(1836)、安政5年(1856)、明治29年(1896)、明治30年(1897)のみであるが、他も幕末から明治にかけてのものと思われる。「大福工数帳」と照合することによって近江屋の営業形態がより明らかにすることができる史料であるが、調査期間の終了間際に発掘されたため、分析作業は今後の課題である。調査研究の成果を公表するにはいたっていないが、『近世京都の町・町屋・町屋大工』(仮題、思文閣出版)を刊行する予定で準備を進めている。主な内容は、近世町屋の形成過程、近世町屋の建築構成、町屋大工の営業形態、町屋の生産システム、町屋大工の組織と技術、などについてであり、このほかに資料編として本研究によって翻刻した町屋古図を原図写真とともに掲載し、それぞれに解説を加える予定である。なお、調査報告書は資料は中心として編集した。また約60点の町屋古図は、間取りのほかに、構造、各種の寸法、大工の人工数などが記載されている。それらのうち半数は18世紀半ばに作成されたもので、天明8年(1788)の京都大火によって遺構が存在市内時期における京都町屋の建築的構成を復原的に考察することができる貴重な素材である。本年度の数点の「大福工数帳」と町屋古図のほぼすべてを翻刻した。その成果を公表するにはいたっていないが、平成7年度中にはこれまでの調査研究によって得られた成果を公刊する予定-『近世京都の町・町屋・町屋大工』(仮題)、思文閣出版-で、引き続き作業を継続している。田中家に多数所蔵されている普請関係文書のうち、文化・分政年間から明治初年にいたる約80年間にわたる「大福工数帳」約20冊には、出入り先と仕事の内容、職人の名前と出面、材料の種類・数量・規格などが記録されており、主として町場を仕事場としていた近江屋の営業活動の実態を明らかにすることができる。

また約100点の町家古図は、間取りのほかに、構造、各種の寸法、大工の人工数などが記載されている。またあらたに約120点の「工数日記帳」を見出すことができた。マス目を切った用紙に記された大工の出面表で、年紀が確かなものは天保7年(1836)、安政5年(1856)、明治明治29年(1896)、明治30年(1897)のみであるが、他の幕末から明治にかけてのものと思われる。「大福工数帳」と照合することによって近江屋の営業形態がより明らかにすることができる史料であるが、調査期間の終了間際に発掘されたため、分析作業は今後の課題である。調査研究の成果を公表するにはいたっていないが、『近世京都の町・町屋・町屋大工』(仮題、思文閣出版)を刊行する予定で準備を進めている。主な内容は、近世町屋の形成過程、近世町屋の建築構成、町屋大工の営業形態、町屋の生産システム、町屋大工の組織と技術、などについてであり、このほかに資料編として本研究によって翻刻した町屋古図を原図写真とともに掲載し、それぞれに解説を加える予定である。なお、調査報告書は資料を中心として編集した。
低原子価チタンを含むバリウムチタン酸化物の合成と結晶構造、物性

低原子価チタンを含むバリウムチタン酸化物として、Ba_2Ti_6O_<13>の単結晶試料を還元雰囲気下で合成を行った。その結果、既報と同様な結晶であることが、単結晶X線構造解析の結果明らかとなった。そこでこのBa_2Ti_6O_<13>と同構造を有する化合物に着目した。これまでにA_2Ti_6O_<13>(Aはアルカリ金属、アルカリ土類金属)はNa_2Ti_6O_<13>、Ka_2Ti_6O_<13>、Sr_2Ti_6O_<13>、Ba_2Ti_6O_<13>の4種類が報告されていた。本実験では、前駆体としてNa_2Ti_6O_<13>を用い、イオン交換法によりナトリウムイオンをリチウムイオンに交換することで、新規化合物Li_2Ti_6O_<13>の合成に着手した。粉末未知構造解析を行った結果、骨格構造は予想通りNa_2Ti_6O_<13>やBa_2Ti_6O_<13>と同様であった。一方でLiイオンはこれまで報告されているアルカリ金属イオンやアルカリ土類金属イオンとは異なる座標に占有していることがわかった。以上の結果より新規化合物Li_2Ti_6O_<13>を合成し、結晶構造を明らかとした。これらの結果は国際学会で発表を行った。低原子価チタンを含むBa_2Ti_<13>O_<22>多結晶試料をB_2O_3とBaCO_3の混合フラックス材と混合し、Moルツボに充填、還元雰囲気中で加熱することにより、今まで知られていなかったMoがTiサイトに固溶したペロブスカイト型BaMo_xTi_<1-x>O_3の単結晶試料の合成に成功した。単結晶X線構造解析の結果、組成はBaMo_<0.175>Ti_<0.825>O_3であることがわかった。これらの結果は論文として発表を行った。またBa_2Ti_<13>O_<22>およびBa_4Ti_<12>O_<27>の単結晶試料および多結晶試料の合成、結晶構造解析、電気、磁気物性の測定を行った。これらの結果は論文に登校中である。低原子価チタンを含むバリウムチタン酸化物として、Ba_2Ti_<13>O_<22>多結晶試料、ならびにBa_4Ti_<12>O_<27>多結晶試料を還元雰囲気下で合成を行い、両物質の磁化率をSQUIDにより測定した。その結果、両物質とも室温付近から50K付近では伝導電子に伴うパウリ常磁性的な挙動を示し、50K以下では一般的なキュリー常磁性的な挙動を示した。これは一般的な磁化率の挙動とは異なる結果である。これは以前に測定を行った電気抵抗率測定においてホッピング伝導を示すことと関係があると考えられる。低原子価チタンを含むアルカリおよびアルカリ土類チタン酸化物は特異な物性を示す例が報告されているが、本系においても、同様に特異な物性を示した。これは、低原子価チタンを含むバリウムチタン酸化物としては、初めての物性データであり、その物性が特異的であることから、材料研究の観点から非常に興味深いものであると考えられる。またバンド計算を行った結果、これらの物性はバンド構造からは説明できないものであると考えられる。単結晶合成では、Ba_2Ti_<13>O_<22>多結晶試料を原料として、ホランダイト型Ba_xTi_8O_<16>とヘキサゴナル型BaTiO_<3-x>の合成に成功した。ホランダイト型Ba_xTi_8O_<16>では電子線回折パターンの測定から、想定されていたincommensurate構造的な回折パターンが見られた。既報にならいcommensurate構造として結晶構造解析を行うと、晶系はtetragonalでc軸方向に5倍周期を持つ結晶構造であった。これまでにcommensurate構造として結晶構造解析を行った結果、このような例はない。また、結晶構造解析の結果Baの組成が1.149であった。またc軸に9倍周期でも結晶構造解析が行えた。これは結晶学的には非常に興味深いものであり、incommensurate構造として結晶構造を明らかにする手がかりになるものと考えられる。

粉末未知構造解析を行った結果、骨格構造は予想通りNa_2Ti_6O_<13>やBa_2Ti_6O_<13>と同様であった。一方でLiイオンはこれまで報告されているアルカリ金属イオンやアルカリ土類金属イオンとは異なる座標に占有していることがわかった。以上の結果より新規化合物Li_2Ti_6O_<13>を合成し、結晶構造を明らかとした。これらの結果は国際学会で発表を行った。低原子価チタンを含むBa_2Ti_<13>O_<22>多結晶試料をB_2O_3とBaCO_3の混合フラックス材と混合し、Moルツボに充填、還元雰囲気中で加熱することにより、今まで知られていなかったMoがTiサイトに固溶したペロブスカイト型BaMo_xTi_<1-x>O_3の単結晶試料の合成に成功した。単結晶X線構造解析の結果、組成はBaMo_<0.175>Ti_<0.825>O_3であることがわかった。これらの結果は論文として発表を行った。またBa_2Ti_<13>O_<22>およびBa_4Ti_<12>O_<27>の単結晶試料および多結晶試料の合成、結晶構造解析、電気、磁気物性の測定を行った。これらの結果は論文に登校中である。
ランダム環境下の確率成長とその相転移

a)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域(例えば0,1以外の全ての人口密度)で、総人口の増大は、その平均値に比べ真に遅い(非正規成長)更にこの収束の速さが指数的である(Lyapunov指数}の正値性).また,全ての非自明なパラメーター領域で、局在が観測される。すなわち、人口は均等に拡散するのではなく特定の狭い領域に密集する.b)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて人口増大の速さに関する相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると,確率正で正規成長である.一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様に非正規成長する.更にパラメーターに応じて局在/拡散の相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると人口の拡散は均等である一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様な局在が発生する。以下の事柄について検証を進めた:a1)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域(例えば0, 1以外の全ての人口密度)で、総人口の増大は、その平均値に比べ真に遅い(非正規成長)更にこの収束の速さが指数的である(Lyapunov指数の正値性).a2)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域で、局在が観測される。すなわち、人口は均等に拡散するのではなく特定の狭い領域に密集する.b1)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて人口増大の速さに関する相転移が起る.例えば一定以上の入口密度を仮定すると,確率正で正規成長である.一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様に非正規成長する.b2)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて局在/拡散の相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると人口の拡散は均等である-より数学的には,人口の分布に関する中心極限定理が成立する。一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様な局在が発生する以下の事柄について検証を進めた:a1)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域(例えば0, 1以外の全ての人口密度)で、総人口の増大は、その平均値に比べ真に遅い(非正規成長)更にこの収束の速さが指数的である(Lyapunov指数}の正値性).a2)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域で、局在が観測される。すなわち、人口は均等に拡散するのではなく特定の狭い領域に密集する.b1)}空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて人口増大の速さに関する相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると,確率正で正規成長である.一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様に非正規成長する.b2)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて局在/拡散の相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると人口の拡散は均等である-より数学的には,人口の分布に関する中心極限定理が成立する。一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様な局在が発生する。以下の事柄について検証を進めた:a1)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域(例えば0,1以外の全ての人口密度)で、総人口の増大は、その平均値に比べ真に遅い(非正規成長)更にこの収束の速さが指数的である(Lyapunov指数}の正値性).a2)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域で、局在が観測される。すなわち、人口は均等に拡散するのではなく特定の狭い領域に密集する.b1)}空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて人口増大の速さに関する相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると,確率正で正規成長である.一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様に非正規成長する.b2)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて局在/拡散の相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると人口の拡散は均等である一より数学的には,人口の分布に関する中心極限定理が成立する。以下の事柄について検証を進めた:(a1)空間が1次元,または2次元なら全ての非自なパラメーター領域(例えば0,1以外の全ての人口密度)で、総人口の増大は,その平均値に比べ真に遅い(非正規成長)

更にこの収束の速さが指数的である(Lyapunov指数の正値性).(a2)空間が1次元,または2次元なら全ての非自明なパラメーター領域で局在観測される。すなわち、人口は均等に拡散するのではなく特定の狭い領域に密集する(b1)空間が3次元以上の場合,パラメーターに応じて人口増大の速さに関する相転移がる.例えば一定以上の人口密度を仮定すると,確率正で正規成長である.一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様に非正規成長する.(b2)空間が3次元以上の合,パラメーターに応じて局在/拡散の相転移が起る.例えば一定以上の人口密度を仮定すると人口の拡は均等である--より数学的には,人口の分布に関する中心極限定理が成立する。一方,一定以下の人口密度では低次元の場合と同様な局在が発生する.一方,研究対象をランダムな外力項を含む流体方程式にも広げた.ランダムな外力項を含む流体方程式としてSNSが近年盛んに研究されている.SNSはニュートン流体を記述するが,この期間内の研究でSNSに対する解の存在・一意性定理を非ニュートン流体(shear thickening, shear thinning)まで含む枠組みに拡張した.困難はあったが,克服可能範囲内だった.24年度が最終年度であるため、記入しない。総人口が死滅しうる場合も含めたリャプノフ指数の存在,更にランダム環境中の分枝ランダムウォークを,生存事象に条件づけたとき,常に指数増大することの証明等が今後の自然な研究課題となりうる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
有機高分子材料の太陽光による促進分解

使用済み高分子の分解方法を開発することを目的として太陽光による有機高分子材料の促進分解法を検討した。高分子材料として、ポリメチルメタクリレート(PMMA)およびポリ塩化ビニル(PVC)を用い、太陽光の持つ波長領域に添加剤または、異種結合としてchromophoreを導入し、太陽光波長下での高分子の促進光分解について検討した。PMMAには、添加物としてβ-caroteneを、PVCには短波長紫外線を前照射することによって、長波長側にchromophoreとして共役2重結合を導入した。いずれの場合も太陽光の波長領域(290nm<)に新しくchromophoreが導入されたことが紫外可視吸収スペクトルによって確認された。このようにして得られた試料に岡崎基礎生物学研究所に設置された大型スペクトログラフ(OLS)を用いて、260-500nmの単色光を照射し、chromophore導入により高分子光分解のしきい値が、長波長側にシフトするか、短波長においても促進分解が起こるかを、紫外可視吸収スペクトル、FTIRスペクトル、ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC)を用いて評価を行った。その結果、次のような実験結果を得た。PMMA-β-carotene系、前照射したPVCいずれの場合も光分解(主鎖切断)のしきい値は、明らかに長波長側に移動した。これらの結果は、太陽光の下で、chromophoreを導入した有機高分子材料は、光分解が可能であることを示す。この方法は、今後さらに発展させ使用済み高分子材料に太陽光の波長領域にchromophoreを持つ添加物または、異種結合を導入し太陽光の下に曝しておけば自然に分解するための最適条件を求めることの可能性を示唆している。
マクロファージにおける生体防御の分子機構：標的物の違いによる膜輸送制御機構の解明

人体は、自身の細胞や組織以外の異物を排除し、生体に危害を加えるものから防御する免疫機能を有している。この生体防御においては、食細胞が活躍する。食細胞は体内に侵入した異物を貪食し、殺菌・分解して処理する。この一連の反応をファゴサイトーシスといい、遂行には膜融合が必須である。この分子機構には不明な点が多いが、これまでに申請者は、SNAP-23がこの過程の膜融合に機能することを報告した。体内に侵入した異物は受容体により認識されるが、受容体とSNAP-23との相関はわかっていない。そこで本研究では異物応答について、SNAP-23のリン酸化に着目し受容体依存的なファゴサイトーシスの分子機構を解明する。
医療診断のための光変調超音波パルスエコーによる光トモグラフィ

光照射による超音波パルスの速度変化を検出することで、従来の光診断機では不可能であった生体深部の光吸収領域を測定可能な医療診断装置実現のための研究を行った。(1)生体組織内の吸収分布の測定超音波トランスデューサー(5MHz)を走査し、超音波パルスエコーの到達時間と光照射による時間変化を2次元的に測定し、画像化する装置を試作した。光源として生体の吸収の少ない波長の半導体レーザーを用いた。犬の胃の内部に黒インキを入れた小型容器を入れたものを試料として測定したところ、超音波速度変化の領域は光吸収領域を表していることを示した。(2)空間分解能の改善空間分解能を向上させるために、20MHzのトランスデューサーを用いた。まず、ラマンナス回折によって水中における超音波の形状を測定した。生体擬似試料を作製し、表面から特定の深さにおける光照射による温度変化のプロフィールを測定した。その結果、装置の空間分解能が改善されていることが確認された。空間分解能は、超音波の幅だけでなく、吸収体の境界における熱拡散によって支配されている。そこでパルス光による熱拡散の影響の抑制を試みた。波長可変パルスレーザーを用いて疑似試料を照射し、抑制効果を確認した。(3)高速データー収集光照射による超音波速度変化を高速で測定するために、アレイトランスデューサーの適用を検討した。超音波診断装置の実機に半導体レーザーの光源と信号処理回路を付加した。この装置によって、30mmx40mmの領域でアレイトランスデューサーによって詳細な断層画像(横345ライン、縦1570サンプル)を7フレーム/秒で得ることができた。得られた速度変化画像は、動物組織内の吸収領域を詳細に示していた。しかし、実用装置とするには、データを高速で処理し、超音波速度変化をリアルタイムで画像表示する専用信号回路とソフトウェアーの開発が必要である。近赤外光をプローブとして生体の断層画像を計測すれば、生体物質の光吸収特性を利用することができ、生体の形態に関する情報だけでなく、代謝情報や病変部位に関する情報が得られるため、新しい医療診断の方法として期待されている。しかし、生体は光に対して強散乱体であり、現在までに実用的な光断層画像測定法は開発されていない。本研究では、光散乱の影響を受けない方法として、光吸収により生じる温度変化を超音波パルスの速度変化として検出する方法を提案し、測定装置を試作し、方式の有効性の実証と実用装置の開発のための実験を行った。まず、寒天などを用いて以下の2種類の生体擬似試料を作製し、吸収分布を求める実験を行った。1.吸収領域が組織境界を持つ試料:医療診断に用いられている超音波エコー装置と同様の構成で、一方向から超音波反射パルスを送信し、反射パルスとそれらの光照射によるパルスシフトから、境界間の光照射による温度変化を求め、吸収分布を得た。サーモカメラによる温度分布とよく一致していることを示した。2.吸収領域が組織境界を持たない試料:装置の構成を一部変更し、直交する二方向から超音波パルスを送信し、試料背面からの反射パルスと光照射によるパルスシフトを測定した。これらのパルスシフトを投影データとし、重ね合わせ法によって試料の超音波速度画像を求め、吸収分布を得た。次に、動物組織として成犬の胃を用い、内部に吸収物質を挿入して実験を行った。予め生体組織の分光特性を測定し、組織による吸収の少ない波長のレーザーを用いた。得られた超音波速度画像は、光照射による温度分布を反映しており、動物組織内の吸収分布を示していた。

以上の測定結果から、本方式が悪性腫瘍などの空間情報検出の新しい方法としての有効性が示され、実用装置を目指した装置構造、信号処理のための知見が得られた。本年度は、前年度の研究成果を発展させ、さらに実用的な方式とするために、超音波速度変化画像の高速測定と空間分解能の改善のための研究を行った。まず、光照射による超音波速度変化を瞬時に測定するために、アレイトランスデューサーの適用を検討した。超音波診断装置に半導体レーザーの光源と信号処理回路を付加し、動物組織の中に吸収体を挿入したものを試料として用いた。その結果、約30mmx40mmの領域でアレイトランスデューサーによって詳細な断層画像(横345ライン、縦1570サンプル)を1秒間に数フレームの速度で得ることができた。光照射の前と後で345ラインの波形を検出し、送信波形との相関をとることで速度変化量を求めた。得られた速度変化画像は、動物組織内の吸収領域を詳細に示していた。アレイトランスデューサーの適用によって画像データは高速で得られるようになったが、実用装置とするには、データを高速で処理し、超音波速度変化をリアルタイムで画像表示することが必要である。次に、空間分解能を向上させるために、今まで用いていた5MHzのトランスデューサーの代わりに20MHzのトランスデューサーを用いた。まず、ラマンナス回折によって水中における超音波の形状を測定した。生体擬似試料を作製し、表面から特定の深さにおける光照射による温度変化のプロフィールを測定した。その結果、装置の空間分解能が改善されていることが確認された。空間分解能は、超音波の幅だけではなく、吸収体の境界における熱拡散によって支配されている。そこでパルス光を用いることで熱拡散の影響を抑制する方式を試みた。波長可変パルスレーザーを用いて生体擬似試料を照射した。皮膚表面の安全基準内のピーク強度のパルス光を用いて、超音波の位相変化の検出が可能であることを示した。
気管支喘息における単球/マクロファージのロイコトリエン受容体機能に関する研究

【目的】cysteinyl leukotriene(cysLT)は気管支平滑筋収縮作用を有する。しかし、cysLT1受容体を有するCD14+単球への作用はいまだ明らかではない。cysLT1受容体拮抗薬の気管支喘息に対する有用性は気管支平滑筋収縮抑制作用だけではないと考えられている。CysLT(LTC4,LTD4,LTE4)刺激によりCD14+単球からのサイトカイン産生を検討し、さらにその変化に対するcysLT1受容体拮抗薬の抑制効果も検討した。【成績】LTC4、LTD4、LTE4を添加により、THP-1細胞及びCD14+単球よりMCP-1およびMIP-1βが産生されることが明らかになった。またプランルカスト水和物はこの作用を抑制した。MCP-1およびMIP-1β以外のサイトカインの有意な産生や表面抗原の変化はなかった。【考察】cysLT1は単球からMCP-1およびMIP-1βを産生し、プランルカスト水和物がこれを抑制することから、アレルギー疾患における単球の重要性が示唆された。CysLT(LTC4,LTD4,LTE4)刺激によりCD14+単球からのサイトカイン産生及び表面抗原の変化を検討し、さらにその変化に対するcysLT1受容体拮抗薬の抑制効果も検討したので報告する。【成績】LTC4、LTD4、LTE4を添加により、THP-1細胞及びCD14+単球よりMCP-1が産生されることが明らかになった。MCP-1以外のサイトカインの有意な産生や表面抗原の変化はなかった。【考察】cysLT1は単球からMCP-1を産生し、プランルカスト水和物がこれを抑制することから、アレルギー疾患における単球の重要性が示唆された。【目的】cysteinyl leukotriene (cysLT)は気管支平滑筋収縮作用を有する。CysLT(LTC4,LTD4,LTE4)刺激によりCD14+単球からのサイトカイン産生及び表面抗原の変化を検討し、さらにその変化に対するcysLT1受容体拮抗薬の抑制効果も検討し、平成15年度はcysLT1が単球からMCP-1を産生し、プランルカスト水和物がこれを抑制することを明らかにしたが、平成16年度はcysLT1が単球からMIP-1βを産生し、プランルカスト水和物がこれを抑制することので報告する。【成績】LTC4、LTD4、LTE4を添加により、THP-1細胞及びCD14+単球よりMIP-1βが産生されることが明らかになった。MIP-1β以外のサイトカインの有意な産生や表面抗原の変化はなかった。【考察】cySLT1は単球からMIP-1βを産生し、プランルカスト水和物がこれを抑制することから、アレルギー疾患における単球の重要性が示唆された。
プロチアーゼの特異性の系統的検索法の開発と応用

タンパク質分解酵素(エンドペプチダーゼ)の基質特異性を系統的かつ網羅的に検索する簡便な方法を開発する目的で、樹脂結合ペプチドライブラリー(特定の1箇所のみランダムなアミノ酸残基からなるペプチド混合物)を基質として用い、分解産物をエドマン分解法によるアミノ酸配列分析により定量分析する新方法を考案し、その基礎的諸条件を検討し、有用性を示した。1.ペプチド固定化用樹脂を種々検討し、アミノメチル樹脂が最適であることを示した。次いで、樹脂結合ペプチドの酵素による切断効率を検討し、ペプチドと樹脂の間に適当なスペーサーを挿入することにより、切断効率を少くとも30倍程度上昇させうることを明らかにし、当面ペンタブリシンをスペーサーとして用いることが適切であることを示した。2.Fmoc法による樹脂結合ペプチドライブラリーの合成において、各ペプチドの合成収率の均一化条件を検討した。この結果、反応速度の遅いFmocアミノ酸を相対的に増量して用いることにより、各ペプチドの合成量比をほゞ3倍以内におさめることを可能とした。3.本方法をα-キモトリプシンのサブサイト特異性の検索に適用し、その有用性を示した。すなわち、モデルペプチドライブラリーとして、RPXFSPR(G)_5-樹脂,Ac-RPGFXPR(G)_5-樹脂,Ac-RPGFSXR(G)_5-樹脂(Xはアミノ酸混合物)を合成し、α-キモトリプシンにより加水分解し、分解物をエドマン分解法により定量分析した。この結果、P_2,P_1′,P_2′サブサイトに関する特異性について興味ある新知見を得た。5.上記研究と関連して、特異性未知の数種の新規エンドペプチダーゼを生体組織中より精製,性状解明し、特異性の予備的探索を種々のペプチドを用いて行った。化学合成ペプチドライブラリーによるプロテアーゼの基質特異性決定法の確立に関する基礎的な研究を行った.この方法は樹脂に固定したペプチドを化学合成する際に特定の位置を多種のアミノ酸の混合物で作製し,プロテアーゼで切断されたものを分離し,分析することにより基質特異性を明らかするものである.まず,樹脂に結合したままの状態のペプチドライブラリーを作製するためには合成時の各種アミノ酸の保護基の除去反応によりペプチドが樹脂より分離しないようにする必要がある.これには通常Boc法で用いられるクロロメチル樹脂を用いFmoc法で合成を行った.プロテアーゼとしてはキモトリプシンをモデル酵素として用い切断反応を調べたところ低い反応性しか示さなかった.そこで樹脂とペプチドの結合部分の間にポリエチレングリコールのスペーサーが挿入されているTenta Gel Resin S Type(Shimazu)を用いたが反応性は上がらなかった.そこで,樹脂と反応性のペプチドの間にグリシンのテトラマ-をスペーサーとして入れるデザインにしたところ反応性が30倍に上昇した.グリシンは天然にも存在するアミノ酸なので他のプロテアーゼを用いた場合には切断される可能性もあるため,スペーサーに関してはさらに検討の必要がある.つぎに特定の位置にアミノ酸をランダムにもつペプチドを作製するために各種アミノ酸の混合比を変えてペプチド合成をし,アミノ酸配列分析を行うことにより,Thr,Lys,Asp,Asn,Glu,Gln,Tyr,Phe,Ile,Leu,Val,Alaの12種のアミノ酸残基の存在比が3倍の範囲内におさまるように作製することに成功した.P1,P1′,P2部位がそれぞれランダムなペプチドライブラリーを作製し,キモトリプシンの基質特異性が従来の報告と一致することを確認している.タンパク質分解酵素(エンドペプチダーゼ)の基質特異性を系統的かつ網羅的に検索する簡便な方法を開発する目的で、樹脂結合ペプチドライブラリー^*を基質として用いる新方法を考案し、その諸条件と有用性を検討した。(^*特定の1箇所のみランダムなアミノ酸残基からなるペプチド混合物)

1.ペプチド固定化用樹脂を検討し、アミノメチル樹脂が最適であることが判明した。2.アミノメチル樹脂結合ペプチドの酵素による切断効率を検討し、ペプチドと樹脂の間に適当なスペーサーを挿入することにより、切断効率が少くとも30倍程度上昇させうることを明らかにし、当面ペンタグリシンをスペーサーとして用いることが適切であるとの結果を得た。3.Fmoc法による樹脂結合ペプチドライブラリーの合成において、各種ペプチドの合成収率の均一化条件を検討した。この結果、反応速度の遅いFmocアミノ酸を相対的に増量して用いることにより、各ペプチドの合成量比をほゞ3倍以内におさめることが可能となった。4.本方法をα-キモトリプシンのサブサイト特異性検索に適用し、その有用性を示した。すなわち、モデルペプチドライブラリーとして、RPXF・SPR(G)_5-樹脂,Ac-RPGFXPR(G)_5-樹脂,AcRPGFSXR(G)_5-樹脂(Xはアミノ酸混合物)を合成し、α-キモトリプシンにより加水分解し、分解産物をエドマン分解法により定量分析した。この結果、P_2,P_1′,P_2′サブサイトに関する特異性に関して、興味ある新知見を得た。5.上記研究と関連して、特異性未知の数種の新規エンドペプチダーゼ^*を生体組織中より精製,性状解明し、予備的な特異性検索を進めた。(^*ブタ小腸粘膜ミクロソーム膜画分由来膜結合性セリンプロテアーゼ,ブタ胃粘膜由来膜結合性VIP特異的セリンプロテアーゼおよび細胞内膜結合トリプシン,ブタ卵巣セリンプロテアーゼFollipsin,クロコウシンカビ非ペプシン型酸性プロテアーゼA)。