hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Atg5非依存的オートファジー誘導活性化合物のマウス腸炎モデルに対する効果の検討

平成30年度研究実績1安全性の評価:薬剤性腸炎誘導マウスにおいて、サンプルAの投与による肝毒性および他臓器毒性を確認した。肝酵素(ALT)においてサンプルA投与群とコントロール群において有意な差は確認されなかった。また、各群の心臓、肝臓、腎臓、脾臓を摘出しHE染色後の組織を顕微鏡下で観察したところ、両群間に差は観察されなかった。よって、サンプルA投与による他臓器毒性は観察されなかった。2天然物の関与成分の同定と作用機序解明:サンプルAを用いてオートファジー誘導に関する検討を実施した。in vitroにおける検討として、腸管上皮由来細胞株Caco2細胞において、天然物サンプル添加によるオートファジー誘導効果を検討した。サンプルAの添加により、オートファジーの代表的なマーカーとして知られるLC3において、濃度依存的なオートファジー誘導効果を確認し、オートファジー阻害剤により、それらの効果が減弱したことから、サンプルAの添加によるLC3依存的なオートファジーが誘導が示唆された。また細胞免疫染色の検討においては、サンプルAの添加によりLC3-IIの発現増強が確認できた。in vivoにおける検討として、腸炎モデルマウスにおいてサンプルAの投与により、腸炎緩和効果がオートファジーを介した効果であることを確認する目的で、作用部位の探索を実施した。腸炎を誘導しない正常のマウス腸管を、セルソーターを用いて、上皮、間質系細胞、マクロファージ及び樹状細胞の大きく3つの分画に分け、WBにてオートファジー関連たんぱくの発現を確認した。結果、上皮においてLC3の発現が増強され、さらにはサンプルAの投与群で強い発現を認めた。また、炎症腸管上皮においても同様の結果を認めた。また腸管の免疫染色の結果より、LC3-IIの発現がサンプルA投与群で増強していることが確認できた。平成30年度は安全性評価のみを実施するつもりであったが、早期に安全性の確認が行えたため、平成31年度計画に記載していた2天然物の関与成分の同定と作用機序解明を前倒しにて実施した。それらのうち、in vitro並びにin vivoにおける検討において、SampleAが細胞株並びにマウス腸管上皮においてもオートファジーを誘導する可能性を示唆する結果を得た。またオートファジー以外を介してSampleAが作用している可能性についても模索した。腸炎モデルマウスにおいて、関連が示唆される以下の項目について非炎症時の腸管を検討した。1.上皮のバリア機能評価:FITCDextranを用いた検討により、SampleA投与によって腸管透過性がコントロールと比較して有意に低下した。このことから上皮のバリア機能がSampleAの投与によって維持できたことが示唆される。2.抗菌ペプチド産生:抗菌ペプチドを代表するマーカーであるmuc1-3, saa2,3などをqRT-PCRにて確認したところ、マウス腸管においてコントロール群と比較してSampleA投与による有意な差は観察されなかった。3.Tight Junctionの評価:Tight Junction代表するマーカーであるClaudin, βcateninなどをqRT-PCRにて確認したところ、マウス腸管上皮においてコントロール群と比較してSampleA投与による有意な差は観察されなかった。4.サイトカイン産生:粘膜固有層におけるサイトカイン産生を確認したところ、IL6の産生がSampleA投与群で有意に抑制された。その他代表的なサイトカイン(IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10など)においては群間で有意な差は観察されなかった。平成31年度は計画書にて予定していた残りのコンディショナルノックアウトを用いた検討、並びにKO細胞株を用いた検討を実施することとする。平成31年度の研究計画3天然物の関与成分の同定と作用機序解明の続き<KO細胞株を用いた作用点の同定>Sample Aのオートファジー活性化分子機構を解明する。マウス胎児由来線維芽細胞株(MEF)において、オートファジー関連経路(Atg5, Atg9など)をKOした6種類の細胞にSampleAを添加、オートリソソームの集積を指標にSampleAが調整に働くオートファジー作用点の探索を行う。<コンディショナルノックアウトマウス(Atg7F/F Villin-cre)を用いた検討>腸管上皮特異的にオートファジーを欠損させたコンディショナルノックアウトモデルを用いた実験を実施する。このマウスにおけるサンプルAの腸炎緩和効果を確認し、オートファジーを介した有効性の確認を行う。これまでの検討結果並びに本年度の結果をまとめ、オートファジー誘導天然物(SampleA)が腸炎緩和をもたらすメカニズムとオートファジーを介した腸炎治療の可能性についての結論を導き出し考察する予定である。近年、炎症性腸疾患におけるオートファジーの役割が注目されている。研究分担者は通常型のオートファジーの他に、世界に先駆けて新規オートファジー(Atg5非依存的)が存在することを発見した。この細胞機能とクローン病モデルマウスやクローン病のリスク遺伝子との関与も報告されている。我々はオートファジーを活性化できる天然物を持続慢性的に摂取することにより、炎症性腸疾患の寛解期の長期化、症状の軽症化ができるのではないかという点に着目した。本研究では強いオートファジー誘導活性のある天然物(すでに選定した86種類)の中から、炎症性腸疾患に有効な天然物をモデルマウスで同定し、その作用機序を明らかにすることを目的とする。本研究の成果は炎症性腸疾患の新規治療薬、機能性食品の開発に必ずつながると考える。平成29年度の研究実施計画炎症性腸疾患に有効な天然物を同定する。

具体的には、従来型オートファジーならびに新規オートファジーを協調して活性化できる天然物(86種類)を、炎症性腸疾患モデルマウスに投与して選定する。1炎症性腸疾患に有効な天然物の同定1、既に同定したオートファジー誘導天然物(86種類)を薬剤誘導性腸炎マウスに飲水投与し、マウスの腸炎を抑制できる天然物を同定する。具体的には、有効性の高い天然物を56種類選ぶ予定である。有効性の判断は、症状(血便、下痢、体重減少)、腸の病理組織から行う。2、有効性の認められた天然物に関して、類似構造の天然物を探索して、マウスレベルでより有効性の高い天然物23種類に絞り込む。炎症性腸疾患に有効な天然物の同定オートファジー誘導が示唆される天然物のうち、腸炎緩和効果を有するものの検討を行った。まず、腸炎モデルマウス作成にあたり予備検討を行いデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)2%濃度、6日間自由飲水により薬剤性腸炎を誘導した腸炎モデルマウスを用いた。研究分担者の清水が同定した、通常型オートファジー並びにAtg5非依存的オートファジー(新規オートファジー経路)を活性化させる86種類の天然成分のうち、活性の高い順に11種類を上記マウスに投与し腸炎緩和効果(体重減少抑制、下痢・血便の抑制、腸管長短縮抑制、組織における炎症所見の緩和)を確認した。その結果、3種類において有意な腸炎緩和効果を認めた。また、これらの内2種類の天然物(サンプルA、サンプルB)において、腸管上皮におけるオートファジー誘導効果を確認したところ、通常型オートファジーを誘導する可能性が示唆される結果を得た。そこで、腸管上皮由来細胞株Caco2細胞において、天然物サンプル添加による細胞毒性の有無について検討した。結果、低濃度から高濃度(10ug/ml-1000ug/ml)のいずれの濃度においても細胞毒性は観察されなかった。また、オートファジー誘導効果を検討するため、オートファジーフラックスアッセイを行った。結果、サンプルA及びサンプルBにおいて、濃度依存的なオートファジー誘導効果を確認し、オートファジー阻害剤により、それらの効果が減弱したことから、サンプルA、Bの添加によりオートファジーが誘導される可能性が示唆された。同定された2種類の天然物のうち、より強い有効性を示したサンプルAについて、分画物の作成を行った。来年度、この分画物を使用して分画ごとの有効性を確認(細胞株による実験を想定)することとする。有効性を示した分画物について、さらにカラム分離により有効成分の同定を行う予定である。平成30年度研究実績1安全性の評価:薬剤性腸炎誘導マウスにおいて、サンプルAの投与による肝毒性および他臓器毒性を確認した。肝酵素(ALT)においてサンプルA投与群とコントロール群において有意な差は確認されなかった。また、各群の心臓、肝臓、腎臓、脾臓を摘出しHE染色後の組織を顕微鏡下で観察したところ、両群間に差は観察されなかった。
寒冷地における都市施設内の空気環境汚染の測定とその改善計画に関する研究

高密度生活空間における環境質計測法の確立の一環として,昭和62年度は近年各都市に建設されている地下街を対象に,温熱環境因子と各種電気汚染成分の多元調査を行った.高密度空間の密度状態を把握するため通行人数の調査を行い,気温,ふく射温度,湿度および気流速度からなる温熱環境因子の測定を行った.その際温熱環境因子分析装置の開発と適用試験を試みた.空気汚染成分としては,一酸化炭素,二酸化炭素,浮遊粒子状物質の一般的な成分,ラドンおよびラドン娘核種の放射能,浮遊細菌,浮遊真菌の特別な成分を測定した.測定方法は従来の方法に基づいているが,ラドンおよびラドン娘核種については,簡便なフィルター法を用い,研究室の過去4年間の測定データから予測した推定式を用いている.昭和62年7月25日同26日の多元測定結果は次のとおりである.空気調和システム作動中の汚染物質濃度は,各成分とも比較的低レベルであり,問題は少なかった.その中で,通行人数のピーク時間帯に二酸化炭素が1150〔ppm〕に達し,空調時における平均濃度が837〔ppm〕に達することが問題である.従来の評価指標である二酸化炭素のみが高濃度を示したことにある.また,浮遊真菌濃度の外気導入口の値が地下街歩行路よりも大きく,外気導入口で最大1888個/m^3を示したことは,今後の課題として残された.温熱環境に関しては,非常に良好な環境でなることが分かった.また新しく開発した多次元温熱環境因子の分析装置は,現場測定に適していることが明らかになった.昭和63年度においては,住宅内の環境を多元測定し,地下街等の都市施設の環境と比較しながら,環境評価について検討を加える計画である.高密度生活空間における環境質計測法の確立の一環として,昭和62年度は近年各都市に建設されている地下街を対象に,温熱環境因子と各種電気汚染成分の多元調査を行った.高密度空間の密度状態を把握するため通行人数の調査を行い,気温,ふく射温度,湿度および気流速度からなる温熱環境因子の測定を行った.その際温熱環境因子分析装置の開発と適用試験を試みた.空気汚染成分としては,一酸化炭素,二酸化炭素,浮遊粒子状物質の一般的な成分,ラドンおよびラドン娘核種の放射能,浮遊細菌,浮遊真菌の特別な成分を測定した.測定方法は従来の方法に基づいているが,ラドンおよびラドン娘核種については,簡便なフィルター法を用い,研究室の過去4年間の測定データから予測した推定式を用いている.昭和62年7月25日同26日の多元測定結果は次のとおりである.空気調和システム作動中の汚染物質濃度は,各成分とも比較的低レベルであり,問題は少なかった.その中で,通行人数のピーク時間帯に二酸化炭素が1150〔ppm〕に達し,空調時における平均濃度が837〔ppm〕に達することが問題である.従来の評価指標である二酸化炭素のみが高濃度を示したことにある.また,浮遊真菌濃度の外気導入口の値が地下街歩行路よりも大きく,外気導入口で最大1888個/m^3を示したことは,今後の課題として残された.温熱環境に関しては,非常に良好な環境でなることが分かった.また新しく開発した多次元温熱環境因子の分析装置は,現場測定に適していることが明らかになった.昭和63年度においては,住宅内の環境を多元測定し,地下街等の都市施設の環境と比較しながら,環境評価について検討を加える計画である.
重要な食品衛生指標としての生菌数測定のための遺伝子検出による迅速定量法の新規開発

判定に数日を要する従来の培養法に比べ、迅速にready-to-eat野菜及び果物から汚染総菌数を定量できる新しいリアルタイムPCR法を開発することを目的とした。プライマーの設計に当たり、菌種間でコピー数などに違いがある16S rRNAに代わり、ほぼ全ての細菌に普遍的なRNAポリメラーゼのβサブユニットをコードするRpo B遺伝子を選択した。また、経済性のあるSYBRGreen色素を用いることとした。その結果、幅広い菌種においてrpoB遺伝子を特異的に増幅する系を作製した。次に、市販の野菜及び果物を購入し、開発されたリアルタイムPCR法にて汚染菌を検出すると同時に、その結果を培養法で確認された菌数と比較し、培養法による菌数と検出PCRサイクル数に相関が見られるか確認することを目的とした。34種のready-to-eat野菜及び果物の培養法による生菌数は3.68.6 log cfu/gだった。培養法による生菌数とリアルタイムPCR解析によるCt値で検量線を作成したところ、培養法による生菌数とCt値との相関は高かった。検量線の式はy=-2.99 log(x)+42.07であり、R^2は0.90であった。しかし、いくつかの検体では、培養法による生菌数とリアルタイムPCR解析での菌数に1 logのずれが見られた。これはサンプル中に存在する菌種の培養能力またはサンプルからのDNA抽出の影響によるものであると考えられる。しかし、迅速、単純、そして効果的なリアルタイムPCR法が開発され、全てのサンプルにおいて完璧ではないが、特に47logの一般生菌数の定量において十分に使用できると考えられた。前年度に迅速にready-to-eat野菜及び果物から汚染総菌数を定量できる新しいリアルタイムPCR法を開発した。今年度は、市販の野菜及び果物を購入し、開発されたリアルタイムPCR法にて汚染菌を検出すると同時に、その結果を培養法で確認された菌数と比較し、培養法による菌数と検出PCRサイクル数に相関が見られるか確認することを目的とした。市販されている34種のready-to-eat野菜及び果物の培養法による生菌数は3.68.6log cfu/gだった。培養法による生菌数とリアルタイムPCR解析によるCt値をグラフにプロットし、検量線を作成したところ、培養法による生菌数とCt値との相関は高かった。検量線の式はy=-2.99log(x)+42.07であり、R^2は0.90であった。しかし、いくつかの検体では、培養法による生菌数とリアルタイムPCR解析での菌数に1logのずれが見られた。検量線からのずれはサンプル中に存在する菌種の培養能力またはサンプルからのDNA抽出の影響によるものであると考えられる。しかし、迅速、単純、そして効果的なリアルタイムPCR法が開発され、全てのサンプルにおいて完壁ではないが、特に47logの一般生菌数の定量において十分に使用できると考えられた。以上のことから、本研究においてready-to-eatの野菜やフルーツ製品中の細菌を検出するための定量リアルタイムPCR法を開発され、実用的に使用できる可能性が示唆された。
広視野レーザ顕微鏡に適した位相シフト法のための疑似位相像出現メカニズムの解明

広視野レーザ走査干渉計で,レーザ干渉像を取得した場合,10mm四方の領域の高低差をナノレベルで計測できる.しかし,通常の干渉計測では位相シフト法を使用するために,参照板の高さ位置を変えながら同一箇所の画像を45枚取得しなければならず,計測時間が長くなる欠点を有していた.申請者は,参照板に特殊なコーティングを施すことにより,1回の画像取得で擬似的な位相シフト像が取得できる現象を発見した.本研究において疑似位相像が生じる原因は,参照板と観察物の多重反射であることを明らかにした.また,この疑似位相像を使うことで測定対象の形状が計算可能であることを示すと共に,そのための解析プログラムを開発した.広視野レーザ顕微鏡は,同じ倍率で比較すると光学顕微鏡の数百倍広い視野を持つレーザ走査型の新しい顕微鏡である.この顕微鏡を用いて,レーザ干渉像を取得した場合,10mm四方の領域の高低差をナノレベルで計測できる.しかし,通常の干渉計測では位相シフト法を使用するために,参照板の高さ位置を変えながら同一箇所の画像を45枚取得しなければならず,計測時間が長くなる欠点を有していた.申請者は,参照板に特殊なコーティングを施すことにより,1回の画像取得で擬似的な位相シフト像が取得できる現象を発見した.複数枚の干渉画像を演算することでしか求められない位相像が,なぜ一度の観察で求まるかは現在のところ不明である.本研究ではこの新規な現象がなぜ生じるかについて,その原理を解明することを研究目的とする.ガラスの参照板に,種々の金属を成膜した.成膜装置はECRスパッタ成膜装置を使用した.使用した金属は,Au,Cu,Ni,Ti,Fe,Crの6種類である.成膜時間は3種類に変えて,一つの金属薄膜に付き膜厚が異なる3枚の参照板を用意した.成膜した参照板の反射率と透過率を分光光度計により計測した.また,金属薄膜の膜厚測定には走査型プローブ顕微鏡と顕微エリプソメータを使用した.観察面はCu円板で,その直径は32mm,厚さは3mmであった.その表面性状は,表面粗さRa=90nm,PV=448nm(全面),反射率Rt=85%であった.観察Cu円板と参照板の間隔をnmで調整できる治具を作製した.すべての参照板で,正弦波状以外の強度分布を持つ干渉縞が観察された.干渉縞のパターンは,成膜した金属の種類に依存した.しかしながら,成膜する金属とその膜厚によって,明瞭な非正弦波状の干渉縞が生成することが分かった.各金属について,最適な膜厚を決める方法について考察した.以上のように,当初の計画通りの結果が得られた.広視野レーザ顕微鏡は,同じ倍率で比較すると光学顕微鏡の数百倍広い視野を持つレーザ走査型の新しい顕微鏡である.この顕微鏡を用いて,レーザ干渉像を取得した場合,10mm四方の領域の高低差をナノレベルで計測できる.しかし,通常の干渉計測では位相シフト法を使用するために,参照板の高さ位置を変えながら同一箇所の画像を45枚取得しなければならず,計測時間が長くなる欠点を有していた.申請者は,参照板に特殊なコーティングを施すことにより,1回の画像取得で擬似的な位相シフト像が取得できる現象を発見した.複数枚の干渉画像を演算することでしか求められない位相像が,なぜ一度の観察で求まるかは現在のところ不明である.本研究ではこの新規な現象がなぜ生じるかについて,その原理を解明することを研究目的とする.昨年度はガラスの参照板に,種々の金属をECRスパッタ成膜装置で成膜して,すべての参照板で,正弦波状以外の強度分布を持つ干渉縞が観察されることを確認した.使用した金属は,Au,Cu,Ni,Ti,Fe,Crの6種類である.本年度の目標は,この疑似位相像から,すきまの増減方向とすきま量が同時に決定できるかを調べた.昨年度に作製した,観察Cu円板と参照板の間隔をnmで調整できる治具により,既知のすきまを設定した.その上で,非正弦波状の干渉縞から,すきまの減少方向を決定した.干渉縞の輝度分布よりすきまを決定するために,非正弦波状に生じる干渉縞輝度分布を表す実験式を求めた.この実験式を基に輝度値からその場所のすきまを求めた.すきまは,直線的に変化するように調整されているので,このようにして求めたすきまと比較した所,両者はよく一致した.したがって,本年度の目的は達成された.以上のように,当初の計画通りの結果が得られた.広視野レーザ走査干渉計で,レーザ干渉像を取得した場合,10mm四方の領域の高低差をナノレベルで計測できる.しかし,通常の干渉計測では位相シフト法を使用するために,参照板の高さ位置を変えながら同一箇所の画像を45枚取得しなければならず,計測時間が長くなる欠点を有していた.申請者は,参照板に特殊なコーティングを施すことにより,1回の画像取得で擬似的な位相シフト像が取得できる現象を発見した.本研究において疑似位相像が生じる原因は,参照板と観察物の多重反射であることを明らかにした.また,この疑似位相像を使うことで測定対象の形状が計算可能であることを示すと共に,そのための解析プログラムを開発した.本研究では,これまで開発した広視野レーザ顕微鏡がレーザ走査干渉計として使用することの可能性を調べることが第一目標であった.参照板と観察Cuサンプルは一定の間隔を保ったまま固定され,直動ステージに取り付けられた.

レーザは回転ミラーにより走査され,走査レンズを通り,サンプル平面を横方向に走査する.直動ステージによりサンプル平面が縦方向に移動するので10mm×8mmの領域の画像が取得できる.本研究では,干渉縞を生成するのに適した光学系へと改良することを予定していたが,参照板に成膜することで明瞭な干渉縞が生成することが判明したので,第一目的は達成された.特殊なコーティング付参照板の効果については,参照板に金属薄膜コートを施すことにより,従来の位相シフト法では必要であった参照板の移動を不要とすることができた.したがって,この新規な技術を用いることで,広い視野において物体の高精度形状計測が短時間で行えることが確認できた.本研究では,なぜこのような現象が生じるかを明らかにすべく,参照板の表面にナノレベルでコートする材料をAu,Cu,Ni,Ti,Fe,Crなどに変えて画像を取得し,コーティング材料の屈折率などが干渉縞パターンに与える影響を調査した.このようなことを行い,疑似位相像が現れたり消えたりする原因が実験的に特定できた.高さ方向の計測ソフトウェアの開発については,疑似位相像が得られた場合,従来の位相像と同じようにそれらを積算することで,元の形状が得られるかを確認する必要がある.従来の位相像と同じような取り扱いができるかは,引き続きの調査が必要である.機械工学平成27年度も平成26年度と同様に下記2項目の研究を継続する.・金属薄膜を付与した参照板の光学特性の調査・特殊コートと疑似位相像の関係・研究成果のとりまとめ得られた知見やソフトウェアなどの研究成果を,分かり易い形となるようにまとめる.当該年度の3月に実施した出張旅費の支払いが,次年度4月となったため.「次年度使用額」となった12,860円は,すでに平成27年4月に支払い済みである.
認知症のアートセラピーに焦点を当てた日本語版評価尺度の開発と信頼性・妥当性の検証

わが国では、認知症に対するアートセラピーの効果検証に、心理社会的効果を測る適切な尺度がない。一方海外では、アートセラピーなどのアクティビティ介入の高齢者への心理社会的効果を評価できるものとして有用な「The Greater Cincinnati Chapter Well-Being Observation Tool」が開発されている。本研究では、この英語版オリジナル尺度を日本語に翻訳し日本語版尺度を開発して、日本語版尺度の信頼性・妥当性を検証する。この日本語版尺度を用いてアートセラピーなどのアクティビティ介入の心理社会的効果を評価することで、日本の高齢者ケアの質が更に高まることが期待される。
核酸導入によるアセチルコリンエステラーゼの抗心不全作用の増強と病態制御への応用

アセチルコリンエステラーゼ(AChE)はアセチルコリンを分解する酵素としての機能が広く知られているが、近年、神経伝達に関与しない組織や細胞でも発現していることが発見され、その機能の再考が求められている。申請者はAChEスプライシングバリアントのひとつであるReadthrough-AChE(AChE-R)の心臓における発現を見出し、虚血ストレスに応じた心臓AChE-Rの発現上昇を確認している。AChE-Rは抗アポトーシス作用および抗炎症作用を有することが報告されていることから、心臓AChE-Rの発現増加は虚血障害から心筋細胞を保護している可能性が示唆された。本研究では、AChE-Rの心筋保護作用の分子機序の解明とAChE-Rの心筋保護作用の増強による虚血性心疾患の制御を目的とした。まず、心臓AChE-Rの心筋保護作用の分子機序を解明するため、AChE-R過剰発現系の構築を行った。その結果、安定型AChE-R発現細胞株の樹立に成功した。次に、これらの細胞株を用いて虚血ストレス条件下で培養を行い、細胞の生存率を測定した。その結果、AChE-R発現細胞株はコントロール細胞株と比べ、虚血ストレスに対する生存率が高くなることが明らかとなった。また、AChE-Rのタンパク質レベルの解析を可能にするためAChE-Rのみを検出するAChE-R特異的抗体の作製を行い、その作製に成功した。加えて、生体におけるAChE-Rの抗心不全効果を明らかとするため、マウスの心臓特異的AChE-R発現系の構築を行った。本年度は、心臓AChE-Rの機能解析に重要なAChE-R過剰発現系の構築、および、AChE-Rのタンパク質レベルの解析に必要なAChE-R特異的抗体の作製に取り組んだ。その結果、AChE-R過剰発現系の構築および安定型AChE-R発現細胞株の樹立に成功、AChE-Rのみを検出する抗体の作製に成功した。これらを用いて、虚血ストレス条件下で安定型AChE-R発現細胞株を培養するとコントロール細胞株に比べ、細胞の生存率が上昇することが明らかとなった。この結果より、心臓AChE-Rは虚血ストレスに対して抵抗性を示すことが示唆された。AChE-R発現細胞株の虚血ストレス条件下の培養で細胞の生存率が上昇する分子機構を解明するため、以下の解析を行う。虚血ストレス条件下におけるAChE-R発現細胞株の1アポトーシス測定(TUNEL染色、Caspase assay)、2エネルギー代謝に関わる分子の機能解析(グルコース取り込み速度の測定)、3サイトカインおよびケモカイン産生量の測定(ELISA、RT-PCR)を行う。またマウスの心臓特異的なAChE-R発現系の構築を行い、生体レベルでのAChE-Rの機能を明らかにする予定である。これにより、虚血性心疾患におけるAChE-Rの心筋保護作用の全貌を明らかにできると考えている。

虚血ストレス条件下におけるAChE-R発現細胞株の1アポトーシス測定(TUNEL染色、Caspase assay)、2エネルギー代謝に関わる分子の機能解析(グルコース取り込み速度の測定)、3サイトカインおよびケモカイン産生量の測定(ELISA、RT-PCR)を行う。またマウスの心臓特異的なAChE-R発現系の構築を行い、生体レベルでのAChE-Rの機能を明らかにする予定である。これにより、虚血性心疾患におけるAChE-Rの心筋保護作用の全貌を明らかにできると考えている。安定型AChE-R発現細胞株の樹立およびAChE-R特異的抗体の作製に必要な試薬や消耗品は、教室現有のものを使用したため研究費の削減につながった。本年度は、虚血性心疾患モデル作製用動物の購入費、細胞培養に必要な消耗品の購入費、生化学的解析に必要な各種抗体やELISAキット、RT-PCRキットやmicroarray、遺伝子やタンパク質の単離・精製キット等の購入費としての使用を計画している。
鉄に耐酸化・耐食性のシリサイドを被覆するプロセス

腐食性環境における耐食性向上、および酸化性雰囲気中での耐高温酸化性向上のために、溶融塩を用いて、鉄の表面に鉄シリサイドFe_3Siを無電解でコーティングし、その後Fe_3Si表面をオゾンガスで低温酸化する方法により、平滑で安定なFe_3Si-SiO_2複合皮膜を形成させるプロセスを開発した。操業中の揮発や酸化が少なく、かつ大気中でも安定な溶融塩として数十グラム規模のKCl-NaCl-NaF-Si-SiO_2-Na_2SiF_6を用い、純鉄および普通鋼板に無電解めっきを行った。高温溶融塩と鉄は速やかに反応し厚さ100μm以上のFe_3Si皮膜を生じた。このような高速成膜時には皮膜と基板との界面に溶融塩の巻き込みがあるが、鉄シリコン合金を基板とした実験ではこのような欠陥がないことから、シリコンイオン供給源である純シリコンからシリコンイオンが過度に速やかに供給されることが原因であった。不均化反応と拡散反応からなる被膜機構を解明したので、純シリコンに代えてシリコン活量を制御したアルミーシリコン二元液体合金を用いたところ、鉄板表面はシリサイドではなくα-(Fe,Si)合金とすることができた。その後、溶融塩を通常のシリコンを含む塩に交換すると、内部に濃度勾配を有するシリサイド皮膜を得ることに成功し、欠陥のない良好な界面を得た。シリコンを合金化すること、もしくは溶融塩中のSi^<2+>の濃度を減少させること、で良好な界面を得ることに成功した。同様に鉄の他、高融点金属のモリブデンやニオブ、ニッケル等にも良好な耐酸化性皮膜を被覆できることを見出し、オゾンガスを用いた溶融CrO_3を用いたCr_2O_3皮膜生成についても新しい知見を得た。腐食性環境における耐食性向上、および酸化性雰囲気中での耐高温酸化性向上のために、溶融塩を用いて、鉄の表面に鉄シリサイドFe_3Siを無電解でコーティングし、その後Fe_3Si表面をオゾンガスで低温酸化する方法により、平滑で安定なFe_3Si-SiO_2複合皮膜を形成させるプロセスを開発する。まず、雰囲気ガス閉じこめ式の小型坩堝型電気炉で、操業中の揮発や酸化が少なく、かつ大気中でも安定な溶融塩としてKCl-NaCl-NaF-Si-SiO_2-Na_2SiF_6からなる塩組成を定めた。つぎに、純鉄および普通鋼板にシリサイド被覆を施せる大気開放型の溶融塩メッキ漕を新設した。塩の攪拌作用を検討するため試料回転装置を設け、数十グラム規模の定量的・実証的研究を行なった。高温溶融塩と鉄は速やかに反応し、埋め込みプレス機で試料断面を出して観察したところ、厚さ100μm以上のFe_3Si皮膜であった。塩を攪拌しない場合、皮膜厚さが数倍以上異なる部位が生じた。攪拌した場合は厚さは極めて均一となったこと、シリコンイオン供給源である純シリコンの粉末粒度が厚さに影響を与えること、等から、溶融塩中ヘシリコンイオンが速やかに供給されることが均一な皮膜生成に必要であるという、本プロセスの実操業最適条件設定と高速成長機構解明に関する重要な知見を得た。一方Fe_3Si皮膜のオゾン酸化実験のために高温X線回折装置でその場測定できるように改良が完成したので、Fe_3Si皮膜の上にさらにSiO_2皮膜を形成させる実験、および複合皮膜の酸化性雰囲気中での耐高温酸化性を検討する準備が整いつつある。

腐食性環境における耐食性向上、および酸化性雰囲気中での耐高温酸化性向上のために、溶融塩を用いて、鉄の表面に鉄シリサイドFe_3Siを無電解でコーティングし、その後Fe_3Si表面をオゾンガスで低温酸化する方法により、平滑で安定なFe_3Si-SiO_2複合皮膜を形成させるプロセスを開発した。まず、雰囲気ガス閉じこめ式の小型坩堝型電気炉で、操業中の揮発や酸化が少なく、かつ大気中でも安定な溶融塩としてKCl-NaCl-NaF-Si-SiO_2-Na_2SiF_6からなる塩組成を定めた。つぎに、純鉄および普通鋼板にシリサイド被覆を施せる大気開放型の溶融塩メッキ漕を新設し、試料回転装置で塩を攪拌しつつ、数十グラム規模の定量的・実証的研究を行なった。高温溶融塩と鉄は速やかに反応し厚さ100μm以上のFe_3Si皮膜を生じた。大気中操業にもかかわらず酸化皮膜はなく、シリサイド皮膜厚さは極めて均一で高い耐食性が期待できる。しかしながら皮膜と基板との界面に溶融塩の巻き込みがあることが、新設の薄膜X線回折装置で明らかになり、この難点の克服に挑戦した。シリコンイオン供給源である純シリコンからシリコンイオンが過度に速やかに供給されることが原因であった。シリコンを合金化すること、もしくは溶融塩中のSi^<2+>の濃度を減少させること、で良好な界面を得ることに成功した。昨年度までの成果に基づき操業中の揮発や酸化が少なく、かつ大気中でも安定な溶融塩として数十グラム規模のKCl-NaCl-NaF-Si-SiO_2-Na_2SiF_6を用い、普通鋼板に無電解めっきを行った。しかしながら皮膜と基板との界面に溶融塩の巻き込みがあることが明らかになり、シリコンイオン供給源である純シリコンからシリコンイオンが過度に速やかに供給されることが原因であった。純シリコンに代えてシリコン活量を制御したアルミーシリコン二元液体合金を用いたところ、鉄板表面はシリサイドではなくα-(Fe,Si)合金とすることができた。その後、溶融塩を通常のシリコンを含む塩に交換すると、内部に濃度勾配を有するシリサイド皮膜を得ることに成功し、欠陥のない良好な界面を得た。
唾液性状に応じた人工唾液および口腔湿潤剤の選択ガイドラインの確立

1.目的超高齢社会を目前に控えるわが国において,口腔乾燥症状を訴える高齢者が年々増えてきている.ドライマウスは治療薬剤,老化やストレスなど様々な要因によって誘発される.しかし,ドライマウス治療を行っても改善がみられず慢性的に口腔乾燥が続いている患者も多い.近年では,人工唾液および口腔湿潤剤に関して形状に変化をつけるなどの様々な工夫が試みられている.しかし,個々の患者に対して,どの人工唾液および口腔湿潤剤を選択すべきかという報告はほとんどされていない.そのため本研究では,ドライマウスに対する臨床効果を主観的および客観的に評価し,唾液性状に応じた人工唾液および口腔湿潤剤の選択ガイドラインを確立することを目的とする.これに先立ち,チェアーサイドで唾液の性状を瞬時に測定できる毛細管マイクロピペットを用いた方法を新たに開発し従来の方法と比較した.2.方法人工唾液にムチンを添加した試料の性状測定を行った.人工唾液は,無機成分の濃度を1,2,4倍に;変えたものと,有機成分"ムチン(ブタ胃由来)"の濃度を0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0 g/lに変1えて添加したものを製作し,これらを組み合わせて3グループ11種類の試料とした.測定は,曳糸性測定装置(NEVA METER^<【○!R】>)と超音波式粘度計(VISCOSTICK^<【○!R】>)を用い,2種類の毛細管マイクロピペットを使用し同様の測定を30秒後まで行った.3.結果・まとめ有機成分濃度が増加すると毛細管吸い上げ高さは減少し,曳糸性と粘度は上昇することが示された.また,無機成分濃度の増加による変化は小さい傾向にあった.さらに毛細管吸い上げ高さと粘度は強い負の相関を示した.(P<0.01)以上の結果から新しく開発した評価法と,唾液の性状の測定方法との関連性が明らかになり,簡便な唾液評価法が開発できる可能性が示唆された.1.目的超高齢社会を目前に控えるわが国において,口腔乾燥症状を訴える高齢者が年々増えてきている.ドライマウスは治療薬剤,老化やストレスなど様々な要因によって誘発される.しかし,ドライマウス治療を行っても改善がみられず慢性的に口腔乾燥が続いている患者も多い.近年では,人工唾液および口腔湿潤剤に関して形状に変化をつけるなどの様々な工夫が試みられている.しかし,個々の患者に対して,どの人工唾液および口腔湿潤剤を選択すべきかという報告はほとんどされていない.そのため本研究では,ドライマウスに対する臨床効果を主観的および客観的に評価し,唾液性状に応じた人工唾液および口腔湿潤剤の選択ガイドラインを確立することを目的とする.これに先立ち,チェアーサイドで唾液の性状を瞬時に測定できる毛細管マイクロピペットを用いた方法を新たに開発し従来の方法と比較した.2.方法人工唾液にムチンを添加した試料の性状測定を行った.人工唾液は,無機成分の濃度を1,2,4倍に;変えたものと,有機成分"ムチン(ブタ胃由来)"の濃度を0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0 g/lに変1えて添加したものを製作し,これらを組み合わせて3グループ11種類の試料とした.測定は,曳糸性測定装置(NEVA METER^<【○!R】>)と超音波式粘度計(VISCOSTICK^<【○!R】>)を用い,2種類の毛細管マイクロピペットを使用し同様の測定を30秒後まで行った.3.結果・まとめ有機成分濃度が増加すると毛細管吸い上げ高さは減少し,曳糸性と粘度は上昇することが示された.また,無機成分濃度の増加による変化は小さい傾向にあった.さらに毛細管吸い上げ高さと粘度は強い負の相関を示した.(P<0.01)以上の結果から新しく開発した評価法と,唾液の性状の測定方法との関連性が明らかになり,簡便な唾液評価法が開発できる可能性が示唆された.1.目的超高齢社会を目前に控えるわが国において,口腔乾燥症状を訴える高齢者が年々増えてきている.ドライマウスは治療薬剤,老化やストレスなど様々な要因によって誘発される.しかし,ドライマウス治療を行っても改善がみられず慢性的に口腔乾燥が続いている患者も多い.近年では,人工唾液および口腔湿潤剤に関して形状に変化をつけるなどの様々な工夫が試みられている.しかし,個々の患者に対して,どの人工唾液および口腔湿潤剤を選択すべきかという報告はほとんどされていない.そのため本研究では,ドライマウスに対する臨床効果を主観的および客観的に評価し,唾液性状に応じた人工唾液および口腔湿潤剤の選択ガイドラインを確立することを目的とする.これに先立ち,チェアーサイドで唾液の性状を瞬時に測定できる毛細管マクロピペット用いた方法を新たに開発し従来の方法と比較した.2.方法人工唾液にムチンを添加した試料の性状測定を行った.人工唾液は,無機成分の濃度を1,2,4倍に変えたものと,有機成分"ムチン(ブタ胃由来)"の濃度を0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0g/lに変えて添加したものを製作し,これらを組み合わせて3グループ11種類の試料とした.測定は,曳糸性測定装置(NEVE METER^<【○!R】>)と超音波式粘度計(VISCOSTIK^<【○!R】

>)を用い,2種類の毛細管マクロピペットを使用し同様の測定を30秒後まで行った.3.結果・まとめ有機成分濃度が増加すると毛細管吸い上げ高さは減少し,曳糸性と粘度は上昇することが示された.また,無機成分濃度の増加による変化は小さい傾向にあった.さらに毛細管吸い上げ高さと粘度は強い負の相関を示した.(P< 0.01)以上の結果から新しく開発した評価法と,唾液の性状の測定方法との関連性が明らかになり,簡便な唾液評価法が開発できる可能性が示唆された.1.目的超高齢社会を目前に控えるわが国において,口腔乾燥症状を訴える高齢者が年々増えてきている.ドライマウスは治療薬剤,老化やストレスなど様々な要因によって誘発される.しかし,ドライマウス治療を行っても改善がみられず慢性的に口腔乾燥が続いている患者も多い.近年では,人工唾液および口腔湿潤剤に関して形状に変化をつけるなどの様々な工夫が試みられている.しかし,個々の患者に対して,どの人工唾液および口腔湿潤剤を選択すべきかという報告はほとんどされていない.そのため本研究では,ドライマウスに対する臨床効果を主観的および客観的に評価し,唾液性状に応じた人工唾液および口腔湿潤剤の選択ガイドラインを確立することを目的とする.これに先立ち,チェアーサイドで唾液の性状を瞬時に測定できる毛細管マイクロピペット用いた方法を新たに開発し従来の方法と比較した.2.方法人工唾液にムチンを添加した試料の性状測定を行った.人工唾液は,無機成分の濃度を1,2,4倍に変えたものと,有機成分"ムチン(ブタ胃由来)"の濃度を0.5,1.0,2,0,4.0,8.0,16.0g/lに変えて添加したものを製作し,これらを組み合わせて3グループ11種類の試料とした.測定は,曳糸性測定装置(NEVE METER^<【○!R】>)と超音波式粘度計(VISCOSTIK^<【○!R】>)を用い,2種類の毛細管マイクロピペットを使用し同様の測定を30秒後まで行った.3.結果・まとめ有機成分濃度が増加すると毛細管吸い上げ高さは減少し,曳糸性と粘度は上昇することが示された.また,無機成分濃度の増加による変化は小さい傾向にあった.さらに毛細管吸い上げ高さと粘度は強い負の相関を示した.(P<0.01)以上の結果から新しく開発した評価法と,唾液の性状の測定方法との関連性が明らかになり,簡便な唾液評価法が開発できる可能性が示唆された.
脳の記憶状態のダイナミクス

本研究では、ラットの海馬におけるシナプス伝達効率の長期増強(LTP)とそれに伴う海馬の自発活動およぴ周期刺激k対する応答のダイナミカルな性質を調べ、次の点を明らかにした。(1)反回性興奮回路のLTPが自発活動の主たる原因である。(2)反回性興奮回路にLTPを起こしたCA3領野は、周期刺激に対して引込みやカオスなどのダイナミカルな応答を起こす。(3)CA3領野の局所領域でLTPを起こすことができる。LTPが亢進し自発活動が生じても、この局所領域は安定に保たれ、一つの記憶単位と考えることができる。(4)対側CA3領野からCA1領野への直接の興奮性投射は、対側CA3領野テタヌス刺激の影響をほとんど受けないが、同側CA3領野を経由した対側CA3領野からCA1領野への投射はテタヌス刺激で増強される。(5)同側CA3領野を周期刺激しCA1領野の表面から記録した電場電位応答は、周期刺激の周波数に大きく依存し、2040Hzの刺激に対してダイナミックに変化する。特に周期刺激を加え始めて数秒経過すると、負の応答の振幅が大きく揺らぐようになり、引込みやカオス応答が生じる。これはCA3領野のダイナミカルな性質によるものである。以上の結果を総合し、反回性興奮回路が発達しているCA3領野にLTPが生じると、入力信号に対して引込みやカオスなどのダイナミカルな応答を起こし、それらがシャファー側枝の興奮性結合と介在ニューロンを介した抑制性結合を通じてCA1領野に投射されることがわかった。本研究の目的は,シナプスの可塑的な変化を起こしたラット海馬CA1領野の活動のダイナミカルな性質を明らかにすることである。平成11年度の研究計画・方法に従って,麻酔をかけたラット(10週齢)を用い,新皮質を除いて露出させた海馬CA1領野からマルチ電極で電場電位を多点同時記録した。刺激位置としてはCA3領野を選び,20Hzの繰り返しパルス電流刺激を加えた。繰り返し刺激の最初のパルス刺激によってCA1領野表面に生じたシャッファーシナプスのpEPSPは空間的に一様であった。その後,数回数十回パルス刺激を繰り返すと,ある限られた領域でpEPSPが加重し,集合活動電位が生じた(A相)。さらに繰り返し刺激を続けると,pEPSPが減少し一時的に集合活動電位が生じなくなるが(B相),その後再び集合活動電位が生じるようになった(C相)。各相でのシナプスの可塑的な変化を調べると,A相ではpEPSPは変化していなかったが,B相でpEPSPのわずかな抑圧が起き,C相でpEPSPの大きな抑圧が起きた。この抑圧はCA1領野の反回性抑制の増強を反映したものだと推察される。すなわち,記憶の座としてのシナプスの可塑的な変化は,反回性興奮回路ではなく反回性抑制回路で生じている可能性がある。pEPSPの抑圧が起きたC相では,多シナプス回路が関与した活動であることやリバウンド興奮であることを反映し,複雑な応答を起こした。また,CA3を周期刺激する事の妥当性を示すため,CA3領野のLTPと周期的自発リズムに関しても新たな知見を得た。平成12年度は,研究計画・方法に従って,シナプスの可塑的変化が起きているC相の複雑な応答のダイナミカルな性質を明らかにする予定である。本研究課題に関する昨年の研究に続き,ラット海馬CA3領野をテタヌス刺激してCA1領野にLTPを起こし、LTPの空間分布とその周期刺激に対する応答の性質を調べた。昨年と同様,皮質を吸引して除き,露出した海馬のCA1領野からマルチ電極で電場電位を記録した。

CA1領野にLTPを起こすためのテタヌス刺激を対側または同側のCA3錐体細胞層の近傍(放線状層側)に加えた。CA3領野にテタヌス刺激を加えると,CA1領野の1ヵ所または2ヵ所でLTPが生じた。LTPが生じた領域の広さは直径約1mmであり,ラメラ構造仮説から推察される広さとほぼ合っている。CA1領野の2ヵ所でLTPが生じた場合,いずれもCA3テスト刺激に対する電場電位応答は23倍に増大した。しかし,それらの応答はCA3周期刺激の周波数に大きく依存した。すなわち,LTPを起こした一方の領域は5Hz以下の周期刺激に対して大きく応答し,もう一方の領域は5Hz以上の周期刺激に対して大きく応答した。2ヵ所で同様にLTPを起こしているように見えるが,周期刺激に対する応答の性質は異なる。CA1にパッチ状に生じた記憶の痕跡(LTPを起こした領域)が読み出し用の信号に対して強く反応し,LTPの空間パターンとして記憶情報が読み出されると考えられる。しかし,読み出されるかどうかは読み出し用の信号周波数に依存していることが示唆された。
造血細胞の生存と増殖・分化の制御機構に関する研究

1.KIT、FLT3を介する造血細胞の増殖・腫瘍化機構の解析野生型KIT、活性型変異KITによる細胞増殖にはチロシン719を介するPI3-Kの活性化が必須であること、野生型KITによる細胞遊走にはチロシン567と719を介するSrcファミリーチロシンキナーゼの活性化とPI3-Kの活性化が必要であることを明らかにした。更に、活性型変異FLT3は正常リガンドと比較して、細胞増殖を誘導するPim2の発現を強く誘導し、好中球分化を誘導するPU1、c/EBPaの発現を抑制することを明らかにした。2.細胞周期制御とアポトーシス感受性の関連についての解析c-MycやE2F1を過剰発現する細胞では活性酸素種が蓄積し、また、E2F1によって抗アポトーシス分子NF-kBの機能が損なわれ、アポトーシス感受性が高まっていることを明らかにした。3.新規抗アポトーシス分子Anamorsinの単離とノックアウトマウスの作製と解析IL-3依存性細胞株Ba/F3からIL-3非依存性の増殖・生存が可能なBa/F3-Adを樹立し、との亜株から発現ライブラリーを作製し、Ba/F3にIL-3非依存性の増殖・生存を可能にする遺伝子の発現クローニングを試みた。この結果、既知のアポトーシス関連分子とのホモロジーを示さない新規の抗アポトーシス分子を単離し、Anamorsinと命名した。Anamorsin^<+/->マウスは異常を示さなかったが、Anamorsin^<-/->マウスは胎生14日目以降に致死であった。Anamorsin^<-/->マウスは著明な貧血を呈し、胎児肝において赤芽球系の細胞がアポトーシスに陥っていた。マイクロアレイ解析の結果、Anamorsin^<-/->-マウスの胎児肝細胞では抗アポトーシス分子Bcl-XLやシグナル伝達分子JAK2の発現が低下していることが明らかとなった。造血因子受容体下流のJAK/STATs系は、造血細胞の生存と増殖・分化に重要な役割を担っている。一方、多くの急性骨髄性白血病細胞において恒常的に活性化されているが、白血病原因遺伝子との関係については十分に解析されていない。急性前骨髄球性白血病(APL)では15、17転座によりPML/RARαキメラ蛋白が産生される。RARαはレチノイン酸により骨髄球系細胞の分化誘導、PMLはpremature senescenceやアポトーシス誘導に関与しており、転座によりPML/RARαが形成されるとRARαとPMLの両機能が阻害されAPLが発症すると考えられる。また、PMLは種々の転写因子と核内のnuclear bodyで複合体を形成し、それらの機能を制御することが報告された。一方、骨髄球系細胞におけるG-CSFを介した増殖、分化にはSTAT3が重要な役割を果たすことが知られている。そこで、PML/RARαならびにPMLのSTAT3に及ぼす影響について検討した。Luciferase assayを用いた解析により、STAT3の転写能はPMLにより抑制され、逆にPML/RARαにより増強された。PMLはB-boxとCOOH-terminal領域を介してSTAT3と複合体を形成しSTAT3のDNA結合を阻害した。一方、PML/RARαはSTAT3と結合せず、STAT3からPMLを解離させることによりSTAT3の転写能を亢進させた。造血因子キメラ受容体(細胞外領域がG-CSF-R、細胞内がgp130)を発現させたIL-

3依存性細胞株Ba/F3では、G-CSF刺激によりSTAT3依存性に細胞増殖が認められる。この細胞にPMLあるいはPML/RARαを導入し、G-CSF(STAT3)依存性増殖能に及ぼす効果について検討した。PML導入細胞ではG-CSF(STAT3)による細胞増殖が抑制されたのに対し、PML/RARα導入細胞では増殖反応が亢進した。以上の事から、PML/RARαによるSTAT3活性化亢進がAPL細胞の過剰増殖や異常分化に関与していると考えられた。1.KIT、FLT3を介する造血細胞の増殖・腫瘍化機構の解析野生型KIT、活性型変異KITによる細胞増殖にはチロシン719を介するPI3-Kの活性化が必須であること、野生型KITによる細胞遊走にはチロシン567と719を介するSrcファミリーチロシンキナーゼの活性化とPI3-Kの活性化が必要であることを明らかにした。更に、活性型変異FLT3は正常リガンドと比較して、細胞増殖を誘導するPim2の発現を強く誘導し、好中球分化を誘導するPU.1、c/EBPαの発現を抑制することを明らかにした。2.細胞周期制御とアポトーシス感受性の関連についての解析c-MycやE2F1を過剰発現する細胞では活性酸素種が蓄積し、また、E2F1によって抗アポトーシス分子NF-kBの機能が損なわれ、アポトーシス感受性が高まっていることを明らかにした。3.新規抗アポトーシス分子Anamorsinの単離とノックアウトマウスの作製と解析IL-3依存性細胞株Ba/F3からIL-3非依存性の増殖・生存が可能なBa/F3-Adを樹立し、この亜株から発現ライブラリーを作製し、Ba/F3にIL-3非依存性の増殖・生存を可能にする遺伝子の発現クローニングを試みた。この結果、既知のアポトーシス関連分子とのホモロジーを示さない新規の抗アポトーシス分子を単離し、Anamorsinと命名した。Anamorsin^<+/->マウスは異常を示さなかったが、Anamorsin^<-/->マウスは胎生14日目以降に致死であった。Anamorsin^<-/->マウスは著明な貧血を呈し、胎児肝において赤芽球系の細胞がアポトーシスに陥っていた。マイクロアレイ解析の結果、Anamorsin^<-/->マウスの胎児肝細胞では抗アポトーシス分子Bcl-XLやシグナル伝達分子JAK2の発現が低下していることが明らかとなった。
学習時を境として時間的両方向性に記憶痕跡細胞の活性と変遷を追う新規技術の構築

本課題では、学習時と学習前・後の神経細胞活動の経時的観察と、学習後に活動依存的な遺伝子発現を示し記憶を獲得した細胞(記憶痕跡細胞)の同定を、同一個体内で両立できる新規技術の構築を目的とした。内視鏡用GRINレンズの慢性設置による超小型蛍光顕微鏡での海馬神経細胞の蛍光イメージング法を確立し、遺伝子改変マウスにおいて、400個の神経細胞のCa2+動態を指標とした活動様式の観察と、蛍光タンパク質を発現誘導した記憶痕跡細胞の同定を自由行動下で両立することに成功した。この独自技術は、記憶痕跡細胞に特有の学習前・学習時・学習後の活動様式の特性や変化を、それ以外の細胞と比較検討することを可能にする。本課題では、学習前・後の活性と学習・想起後の遺伝子発現を、数百個単位の海馬神経細胞から経時的イメージングにより同一個体内で観察できる新規技術を構築することを目的としている。平成26年度は、神経細胞の活性観察法に関し、内視鏡と超小型蛍光顕微鏡の慢性設置による、海馬神経細胞内のCa2+動態のイメージング法の確立を行った。当初、S/N比が高くCa2+濃度に対応したシグナルの変化率が高い最新のGCaMP6をレンチウイルス遺伝子導入法で海馬CA1領域に発現させる予定であったが、GCaMP6と同等のG-CaMP7を神経細胞に発現するThy1-G-CaMP7 Tgマウスの供与を受け、以降このマウスでCa2+イメージングの確立を行った。現在までに、Thy1-G-CaMP7 Tgマウスへの内視鏡と超小型蛍光顕微鏡の慢性設置により、200個の神経細胞のCa2+動態を自由行動下で観察できるようになった。学習時に活動した細胞の遺伝子発現観察による同定に関し、c-fos-tTA TgマウスでのOFF Doxおよび神経活動依存的KikGR蛍光タンパク質発現誘導法の確立を目指している。KiKGRは、超小型蛍光顕微鏡で検出可能な蛍光特性を持つが、UV照射により検出範囲外の蛍光特性に変化することが報告されている。この蛍光特性の制御により、Ca2+イメージングとKiKGRを指標とした学習関連遺伝子発現の同一個体の脳内からの観察の両立を目指している。c-fos-tTA Tgマウスでの学習時の活性化細胞の標識はGFPやYFPでは既に確立できているが、これまでKiKGRの脳内での発現や蛍光特性に関しての知見がないため、現在までにレンチウイルス遺伝子導入法で海馬CA1領域に恒常的に発現させ、内視鏡と超小型蛍光顕微鏡を介してUVの照射による蛍光特性の変化が可能か検討し確立できたことを確認している。本課題では、学習時と学習前・後の神経活動と、さらに学習後・想起後に神経活動依存的な遺伝子発現示す記憶を獲得した細胞(記憶痕跡細胞)の同定を、数百個単位の海馬神経細胞から経時的イメージングにより同一個体内で観察できる新規技術を構築することを目的とした。平成27年度は、Thy1-G-CaMP7×c-fos-tTAダブルTgマウスを作出し、平成26年度に確立した、G-CaMP7によるCa2+動態とKiKGRによる記憶痕跡の可視化の両立を図ったことで、本申請の目的であった、自由行動下でのCa2+動態で示される神経活動の観察と、記憶痕跡細胞の同定が同一個体内で可能となった。この独自技術の確立は、海馬依存的学習で出現する記憶痕跡細胞の同定を行い、これら記憶痕跡細胞に特有の学習前・学習時・学習後の神経活動パターンの特性や変化を、それ以外の細胞と比較検討することを可能にするものである。当初予定した、内視鏡と超小型蛍光顕微鏡の慢性設置による自由行動下マウスの海馬神経細胞内のCa2+動態のイメージング法が確立したとともに、学習時の活性化細胞の遺伝子発現をGFPの発現を指標としてc-fos-tTA Tgマウスで同定することはGFPやYFPで既に確立できている。続いて、KiKGR蛍光で学習時の活性化細胞の遺伝子発現を確認するが、KiKGRのin vivoでの内視鏡を介したUV照射による蛍光特性の制御も確認できたため。分子細胞神経科学c-fos-tTAマウスでの、学習・想起依存的KikGR緑蛍光発現細胞の同定法を確立し、Thy1-G-CaMP7xc-fos-tTAダブルTgマウスを作成し、平成26年度に確立した内視鏡と超小型蛍光顕微鏡による海馬神経細胞群のG-CaMP7を利用したCa2+動態解析法との両立を図る。G-CaMPシグナルを利用した数百個単位の海馬CA1細胞群のCa2+動態観察と2次元マッピングの後、学習にともなうKiKGR発現がどの細胞で起こるのかを同定する。これにより、KiKGR陽性細胞とそれ以外の細胞での学習前後の活性変化の解析が可能になる。

さらに、超小型蛍光顕微鏡は、頭蓋に固定したカニューレへの脱着が可能であるので、この超小型蛍光顕微鏡の内視鏡を介しUV照射を海馬に行い、学習依存的に発現したKiKGR緑蛍光のUV照射による赤蛍光への変換を誘導し、次の想起にともなう新たなKiKGR緑蛍光発現を確認することで、数回のイベント依存的な遺伝子発現が観察できるのかを確認する。