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連邦制国家内の課税調和・課税協調に関する国際比較

この利用税の課税要件に関しては、合衆国憲法上の制約(州際通商条項と正当手続条項)との関連で、議論の変遷が認められる。3.スイスにおいては、カントン(州政府)の課税立法権が保証されているため、カントン間二重課税が生じる可能性がある。しかし、この問題は、連邦裁判所め判例に基づく累進付き免除方式を適用することで排除されている。この場合、税額決定に対して他のカントンの税制の関与を受けないこと、課税所得の算出においてカントン固有の税法に基づくことができること等の点でカントンの課税自主権を発揮できる、という特徴がある。一、税制調和・協調を議論する場合、水平的な政府間関係の視点は欠かせない。ドイツにおいては州相互間の水平的財政調整という方式をとっているが、これが1950年度州間財政調整法によって誕生する迄の過程を検討した。その際、連邦政府と州の間に加え、「(財政調整による)受益(を受ける)」州と「負担」州の間の利害調整の過程であったことを明らかにした。二、州間の課税上の問題は、アメリカにおいても小売売上税の展開でみられる。販売と消費が異なる州で行われることによって生じる課税問題がそれで、これに対しては利用税が事実上の調整機能を期待されてきた経緯がある。これは、州外で購入され州内で利用される財に対して、小売売上税と同一の課税標準・税率で賦課される税である。ただし、この税の活用には、特に通信販売企業に対する課税権の行使をめぐって法律上の制限が課せられている点を明らかにした。三、国家間の税制調和問題として、EU内での付加価値税の調和の在り方が注目される。この方式は、税関の事務を一部企業内部に移転する「支払い繰延べ」方式として定着していることを明らかにした。また、この調和問題で提出されたクルアリング・ハウス・システムの考え方は、我が国の地方消費税の都道府県間配分という方式と同様に消費基準が採用されていることを示した。四、EUで展開されている国家間の税制調和の議論を、我が国の垂直的な中央-地方の政府間関係に適応してみた。この場合、中央政府と地方政府の間の特に所得税の税源配分の議論で示唆される点があることが判った。すなわち、中央と地方の間のパートナーシップの確立、補完性の原則に沿った政府間関係の再編成へと向かう議論の展開が求められることが示唆されている。
グレリンの神経性食欲不振症における栄養改善薬としての臨床的研究

グレリンを神経性食欲不振症患者の栄養改善薬として確立するために、摂食量増進作用のメカニズムを非侵襲的な検査である胃電図を用いて胃機能の面から検討した。神経性食欲不振症患者の空腹時の胃体・胃前庭部から得られた胃電図は、健常女性に比べて、% Normal powerが低下し、%Arrhythmiaが増加していた。グレリン分泌作用を有する5gの漢方薬TJ-43の1回投与では、%Arrhythmiaが有意に減少し、胃の電気運動のリズムの改善が認められた。グレリンにも胃の電気運動のリズムの改善効果がある可能性が考えられた。神経性食欲不振症患者の胃電図の検討では、20名の制限型(過食・嘔吐なし)と12名のむちゃ食い/排出型で検討した。自覚的消化器症状は出雲スケールでスコア化した。病型にかかわらず、半数の患者で健康人に見られる2.53.5c/sの通常波が主成分であった。その他、bradygastriaが増加し、電位が低下傾向にあった。報告は検索の限りでは3編で、罹病期間が短い症例では正常波型を示す、周波数解析では健常者と有意差を認めない、との一方で、bradygastriaが増加すること、bradygastriaとtachygastriaが混在するarrhythmiaを示すこと、健常者に比べて水を飲ませたときのbradygastriagaが有意に多いこと、が報告されており、自験例でそれらを確認した。また、制限型で自覚症状が多く、低年齢発症で罹病期間が長い患者で胃電図の異常が多く、グレリン治療の候補と考えられた。先行研究が少ないので、今年度は本症における胃電図の特徴の解析と、グレリン投与候補の選定ができた。神経性食欲不振症患者におけるアセトアミノフェンを用いた胃排出能の遅延はほぼ80%の症例で見られた。神経性食欲不振症患者におけるグレリンの胃電図への影響を検討する計画であったが、課題開始年の平成23年度に臨床研究施設を予定していた東京女子医科大学高血圧・内分泌内科の主任教授が代わり、グレリン投与試験の許可が得られなかったので、グレリン分泌刺激作用がすでに報告されている漢方エキス剤TJ-43(六君子湯)の短期、および、長期投与による胃電図の変化の検討試験に変更し、グレリンの胃の電気的活動を指標にした治療効果を探索した。1)29名の神経性食欲不振症患者(制限型21例、むちゃ食い/排出型8例)の質問紙(IZUMOスケール)による消化器自覚症状と、血中活性型グレリン濃度との関連を検討し、制限型はむちゃ食い/排出型より有意にIZUMOスケール総得点が高く、IZUMOスケール総得点や胃排出能に関する得点と血中の活性型グレリン値が負の相関を有することを明らかにした。2)29名の患者の空腹時の胃電図をMedtronic社のPolygraf ID(4チャンネル)で周波数解析を行い、制限型はむちゃ食い/排出型に比べて正常波の出現%が低く、IZUMOスケールで得点の高い制限型患者では空腹時と摂食後の正常波の減少を確認した。超低体重の制限型でIZUMOスケール得点が高い患者では、有効な胃電図波形が得られない症例が見られた。3)消化器自覚症状が強い慢性の制限型で胃電図で異常が認められる7例で、5gのTJ-43と水50mlの内服時における胃電図の変化について検討し、水50mlのみの摂取を対照とした。TJ-43は急性投与でも正常波を増加させた。7.5g/日のTJ-43を2週間継続内服時の胃電図のでは、正常波の増加と、食後の振幅の増加を認めた。TJ-43による胃電図の変化から、グレリンが急性、慢性に胃の電気的活動を改善することが示唆された。本研究の目的は、末梢投与で摂食促進効果を有し、現在、使用可能な唯一の生理活性物質であるグレリンを、急性期の低栄養状態の改善を目的とした薬物療法として確立するために、摂食量増進作用のメカニズムを消化機能の面から解析することである。消化機能、特に胃運動機能の評価には、患者にとって非侵襲的な方法である胃電図と、アセトアミノフェン内服後の血中濃度を測定する胃排出能の測定を用いることを計画した。平成23年度は、胃電図を用いて神経性食欲不振症患者のグレリンの胃の電気活動に及ぼす変化を検討することを計画した。実施医療機関である東京女子医科大学の倫理委員会の認可を得るために計画書を作成・申請した。合成ヒトグレリンを東京女子医科大学で製剤化し、日本食品分析センターでの発熱性物質試験とエンドトキシン試験を提出した。米国精神病学会と本邦の調査研究班の診断基準を満たす神経性食欲不振症、制限型の患者のリストアップをし、文書でインフォームドコンセントを得る準備をした。

現在、本邦で入手できる胃電図はPolygraph ID (ASAHI BIOMED)のみである。得られた胃電図の結果の解析のための専用ソフトは平成23年度の交付金ですでに購入済である。胃電図装置本体は他の研究費で購入予定で、研究費は十分にあるが、購入・搬入が遅延している。研究実施は今年度にずれ込んでいるが、24年度内に遂行可能である。国際学会での発表は該当年度は行わなかった。本臨床研究を実際に実施している東京女子医科大学、高血圧・内分泌内科は、本研究開始年の平成23年に教授が代わり、専門性や診療・研究体制が大きく変化した。講師以下の医局員が全員辞職し、摂食障害外来や診療を担当し、本研究の協力者であった摂食障害グループは解散した。このような状況下で、研究の進捗は非常に遅延した。現在、協力者を得て、遅延を取り戻すよう研究を再開している。本邦で入手できる胃電図測定装置ははPolygraph ID (ASAHI BIOMED)で、得られた胃電図の結果の解析のための専用ソフトは平成23年度交付金ですでに購入済である。胃電図装置本体は他の研究費で購入予定で、研究費の残高は十分にある。ただし、実施施設である東京女子医科大学での医療機器購入の許諾が得られず、手続きが遅延しているので、実施が遅延している。神経性食欲不振症患者の胃電図の変化を把握でき、当該研究に適切な患者の選定が可能になった。本研究が遂行できるように東京女子医科大学の協力を要請し、グレリンの効果の検討に入りたい。結果の解析には数日を要するが、1症例あたりのグレリン投与試験は1日で終了するので、今後、症例数の累積を迅速に行いたい。国際学会への発表はまだできず、国際学会渡航費をグレリンのペプチド購入費に充てたい。胃電図測定装置の購入・搬入が迅速に行われるようにし、到着次第、早急に平成23年度の計画を実施する。すなわち、被験患者として既にリストアップしている神経性食欲不振症患者からインフォームドコンセントを得て、生理食塩水やグレリンを静脈内投与して、投与後の胃電図を記録し、得られたデータを専用の解析ソフトで解析する。食欲はVisual analogue scales for appetite質問紙で主観的な食欲の評価を記入させる。採血をして得られた血液を用いて、intactグレリンとtotalグレリンなどを測定する。平成23年度の計画を実施しつつ、平成24年度の計画であるグレリンによるアセトアミノフェンによる胃排出時間へ及ぼす影響を検討する。平成23年度交付金の未使用分と平成24年度の交付金を合わせて使用する。平成24年度に使用しなかった研究費は、今後、グレリンのペプチド試薬購入代金、対象の健康人への謝礼,データ解析のための補助員の賃金に充てる予定である。グレリンなど血中ホルモン測定費用、結果の解析作業のため研究補助員1名(8時間/日)、被験者には2時間程度(2000円)の研究協力謝金に使用する予定である。また、得られた結果の処理について統計学の専門家にコンサルテーションや実際の解析を依頼する。
眼内血管形成における可溶型ＶＥＧＦ受容体の役割：個体レベルでの解明

血管新生抑制作用をもつ可溶型Flt-1産生が特異的に抑制されるメカニズムを明らかにした。RNA結合タンパク質であるhnRNP DがFlt-1 pre-mRNAのイントロン13にある制御配列に結合することによって、可溶型Flt-1産生を抑制していることが明らかとなった。レンチウイルスを精巣に打ち、精原細胞に感染させてトランスジェニックマウスを作製する方法では、精原細胞にレンチウイルスが感染できないことから方法として難しいことが明らかとなったことから、従来の方法を用いて作製したトランスジェニックマウスを解析することで、最終的に眼内血管形成における可溶型Flt-1の生体での役割を明らかにする。1.可溶型Flt-1産生制御タンパク質(群)の血管新生における役割平成23年度には可溶型Flt-1の産生を制御しているRNA結合タンパク質が単離できなかったので、引き続きRNA結合タンパク質の単離を行った。制御配列および3'端切断部位周辺に結合しうるタンパク質を9種類にしぼり、それぞれのタンパク質を血管内皮細胞に過剰発現させ、Flt-1の発現を解析したところ、hnRNPDタンパク質を過剰発現させた時にのみ、低酸素刺激で見られた可溶型Flt-1の減少、および膜型Flt-1の増加が観察された。そこで、hnRNP D遺伝子のshRNAをデザインし、血管内皮細胞でノックダウンしたところ、可溶型Flt-1の増加、膜型Flt-1の減少という、過剰発現とは逆の結果が得られた。したがって、hnRNP Dが可溶型Flt-1産生を制御しているタンパク質である可能性が示唆された。2.受精卵感染法によるトランスジェニックマウスの作製平成23年度にマウス可溶型Flt-1を特異的にノックダウンするレンチウイルスベクターを作製したこと受け、受精卵感染法によるトランスジェニックマウスの作製を行った。受精卵感染法は、受精後のマウスから受精卵を取り出すことが必要であるが、あまりうまく行かないため、代替えの方法として、精原細胞感染法によりトランスジェニックマウスを作製することにした。精原細胞感染法は煩雑な操作がなく、雄マウスの精巣にレンチウイルスをうつだけであるため、手技的な制限を受けない。麻酔下に精巣上体に色素を打って予備実験を行ったところ、精巣上体全体に即座に色素が拡散した。この方法では、マウスをほとんど傷つけることなく、またウイルスの漏れも最小限に抑えられることから、非常に安全かつ有効な方法であると考えられた。1.可溶型Flt-1産生制御タンパク質(群)の血管新生における役割平成24年度にhnRNP Dが可溶型Flt-1の産生を制御しているタンパク質である可能性を示したので、1) hnRNP DがFlt-1 pre-mRNAに結合していること、2)低酸素状態ではFlt-1 pre-mRNAに結合するhnRNP Dが増加することによって可溶型Flt-1産生が抑制されること、を検証した。RNA immunoprecipitation法によりhnRNP DとFlt-1 pre-mRNAが共沈してくることから、hnRNP DはFlt-1 pre mRNAに結合していることが明らかとなった。さらに、通常酸素濃度と低酸素濃度でhnRNP Dに結合するFlt-1 pre-mRNA量を定量したところ、通常酸素濃度に比べ低酸素濃度でのhnRNP Dと共沈してくるFlt-1 pre-mRNA量が多いことから、低酸素状態ではhnRNP DがFlt-1 pre-mRNAに結合することによって可溶型Flt-1産生を抑制していることが示唆された。2.精原細胞感染法によるトランスジェニックマウスの作製Sehgalら(PLoS ONE 6(7): e21975)の方法によりレンチウイルスを用いたトランスジェニックマウスの作製を行った。4週齢のマウス(13匹)の精巣にレンチウイルスを感染させ、生まれた子供のゲノミックDNAにウイルスDNAの挿入があるかどうかを調べたところ、165匹中0匹であった。さらに、生後2日のマウスを用いて同様の実験を行ったが、150匹中ウイルスDNAが検出されたマウスは0匹であった。レンチウイルスを感染させたマウスの精巣を蛍光顕微鏡で観察したところ、ウイルスが感染したことを示すGFP陽性の細胞は精細管の外(間質)にしか観察されず、精原細胞(精細管の中)でGFP陽性の細胞は観察されなかった。したがって、Sehgalらの方法ではレンチウイルスは精細管に侵入せず、トランスジェニックマウスの作製は難しいことが明らかになった。1.低酸素刺激が可溶型Flt-1産生を抑制するシグナル伝達経路の解明低酸素刺激による可溶型Flt-1産生の特異的な抑制が、選択的3'

端プロセシングを介して制御されていることを明らかにしてきたが、可溶型Flt-1 mRNAの分解が亢進しているかどうかは不明であった。そこで、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)を低酸素刺激下でactinomycin D処理し、膜型および可溶型Flt-1 mRNA量を定量的RT-PCRで測定したところ、両者に分解速度の差は認められなかった。したがって、可溶型Flt-1特異的な産生抑制は選択的3'端プロセシングを介していることが裏付けられた。さらに、通常酸素濃度と低酸素下でのmRNA発現変動を調べるためマイクロアレイ解析を行った。低酸素刺激で発現上昇しているRNA結合タンパク質(5種類)をHMVEC細胞に過剰発現させ、Flt-1の発現を定量したところ、可溶型Flt-1の特異的な抑制は認められなかった。2.可溶型Flt-1過剰発現およびノックダウンレンチウイルスベクターの作製内皮マーカーであるCD31およびFlk-1陽性細胞として単離したマウス血管内皮細胞からのRNAを用いて、可溶型Flt-1 cDNAを過剰発現用レンチウイルスベクター(System Biosciences)にクローニングした。可溶型Flt-1の発現を特異的に抑制するため、可溶型Flt-1にのみ存在するイントロン13の配列に結合するshRNAをデザインした。16種類のノックダウン用レンチウイルスベクターを過剰発現ベクターととともに293T細胞にトランスフェクションし、マウス可溶型Flt-1の発現を定量したところ、4種類の配列で60-70%の発現抑制が認められた。したがって、イントロン13の配列に対するshRNAが可溶型Flt-1発現の抑制に十分機能することが明らかとなった。可溶型Flt-1産生制御の分子メカニズムの解明については、可溶型Flt-1産生を制御するRNA結合タンパク質がhnRNP Dである可能性が示唆されたが、hnRNP Dが確かにFlt-1 pre-mRNAに結合しているかどうかが明らかになっていない。計画では可溶型Flt-1産生制御タンパク質の血管新生における役割をin vitroで解析している予定であったが、まだRNA結合タンパク質候補が絞られた段階であり、その役割を解析するところまでは行っておらず、やや遅れていると言える。可溶型Flt-1過剰発現およびノックダウンマウスの作製については、レンチウイルスベクターを作製しノックダウンマウスの作製まで進んだが、受精卵感染法がうまくいかないことが理由でやや遅れている。現在、受精卵感染法の代替法を検討中である。可溶型Flt-1産生制御の分子メカニズムの解明については、可溶型Flt-産生の抑制を選択的3'端プロセシングの段階で制御しているRNA結合タンパク質が単離できていない。RNA結合タンパク質の単離は制御メカニズム解明の第一段階であることから、平成23年度中を計画していたが、やや遅れているといわざるをえない。これについては、制御配列および3'端切断部位周辺に結合するタンパク質の種類が非常に多いと考えられ、なかなか絞り込むのが難しいことが原因であると考えており、単離方法の検討が必要である。可溶型Flt-1過剰発現およびノックダウンマウスの作製については、マウス作製まではできておらず、レンチ
粉粒体マイクロダイナミクスの国際共同研究に関する調査研究

標記研究課題を国際共同研究として実施する計画を各分担者が検討し、その結果を計6回に渡る研究調査会議に持ち寄り、討論を重ねた。1)各分野における研究の現状調査機械工学、化学工学、航空宇宙工学、原子炉工学での粉粒体研究の現状分析を行った。その結果、各分野との粉粒体流動の研究の歴史が長いにもかかわらず、経験的手法によって問題が処理されており、通常の流体力学や固体力学に比べると現象の予測方法が大きく遅れていることが明らかにされた。現象の理解を素過程に求めるマイクロダイナミクス手法は、微視的計測技術と計算機のめざましい進歩が背景として提案されており、科学的アプロ-チの適用を疑問視されてきた粉粒体流動の方法論に大きなインパクトを与えることが指摘された。2)研究者・研究機関調査本研究で重要な粒子・流体乱れ相互作用、粒子間相互作用などは、ようやく研究者の注目するところとなり、報告例が増えている。わが国は実験的研究については比較的、研究者が多くまた研究レベルも高い水準にある。一方、計算機使用環境の整った米国では早くから粒子を含め流れの大規模数値シミュレ-ションがなされており、分子動力学的手法、統計熱力学的手法に基づくシミュレ-ションの実績が比較的豊富である。欧州では古典的な手法が一般的で本研究の趣旨に合致する研究者は非常に少ない。本研究と並行して米国の研究者と連絡を取りあってきた。その取りまとめをCrowe教授(ワシントン州立大学)が引き受けている。度重なる連絡を通じ先方の研究組織も整備され、現在、国外研究者は、粉粒体流動の基礎の第一線で活躍中の10名の研究者に絞られた。また国外研究者からも共同研究実施に関する具体的な提案を多く受けている。
自治体における教育政策形成に関する実証研究-政策採用と地域間格差のメカニズム

昨年度は,自治体単位によって実施されている教育政策の導入や実されている政策の程度における格差がどのような要因によって規定されているのかを,少人数教育を事例として,政治的要因と財政的要因に着目して検証した。2年度目である今年度は,昨年度の結果を踏まえて,実施されている教育政策に対して,保護者や教員がどのような認識や評価を行っているのかを検証した。実施されている教育政策が継続されるためには保護者や教員の支持が重要である。特に,選挙での当選が必要不可欠である首長や議員にとっては,保護者や教員が実施されている教育政策を支持している必要があり,保護者や教員の実施されている教育政策に対する支持は教育政策の採用および継続が行われるか否かの重要な要因となる。こうした問題関心を踏まえて,本年度の研究では,品川区を事例として保護者および教員に対して行われたアンケート調査をもとに定量的に検討を行った。また方法論として,マルチレベルモデルについて検討した。このモデルは,本研究のように保護者や教員が学校にネストされたデータ(階層データ)における分析手法として着目されているものである。分析の結果は,日本教育学会第67回大会(「学校選択制下の学校改革に対する教員の認識と評価-品川区教員アンケート調査の計量分析-」)および日本教育行政学会第43回大会(「教育改革に対する保護者意識の実態-2007年度品川区保護者アンケート調査を基に-」)において報告を行った。また,小川正人(編集代表)・品川区教育政策研究会(編)『検証教育改革』の中で,「第I章2教育改革の成果と課題-教員・保護者アンケート調査から-」および「II章5学校選択制の成果と課題-教員・保護者アンケート調査から」を分担執筆した。今年度の研究では、マクロな視点から、地方分権改革下における自治体の政策採用のメカニズムを明らかにすることに焦点をおいて進められた。具体的には、全国の市レベルで実施されている少人数教育(少人数指導および少人数学級)の採用を分析対象として、少人数教育の採用に影響を及ぼす自治体の環境要因(政治的要因および財政的要因)を計量分析によって明らかにした。自治体レベルで実施される少人数教育の実施は、地方分権改革を背景として実施が可能になっている教育政策であり、地方分権改革における自治体レベルの政策過程を検証する分析対象として適しているため、本研究で設定している。実際の分析は、近年、時間的にも空間的にも広がりをもつ政策採用分析において多用されているイベント・ヒストリー分析を用いて行われた。分析の結果、政治的要因としては首長の任期数の影響が確認された。また財政的観点からは、財政力指数と、実質収支比率が影響を及ぼしていることが統計的には確認された。教育行政分野における地方分権改革の有効性については様々な議論がなされている。そうした状況下で、本研究は少人数教育という一つの教育政策を検証したものであるが、自治体の政治的要因や財政的要因が影響を及ぼして政策採用に至っていることを踏まえて、地方分権改革の効果がある一定程度見られることを示唆した。またより精緻な政策評価の方法論の検討を行うため、政策評価の研究事例として蓄積が豊富な米国の学級規模縮小の効果検証における方法論のレビューに着手した。
実験的肺動脈性高血圧症の細胞外スーパーオキシド・ディスムターゼによる抑制

肺高血圧症に対する新しい治療を検討するために、「細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ECSOD)の遺伝子導入が、モノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明した。方法は、SDラットにモノクロタリン皮下注射を行い,同時にAdenoウイルスに組み込んだECSODを経気管的に投与し、圧や組織を比較した。その結果ECSOD遺伝子治療群では,28日目の肺微小動脈のリモデリングを伴った右室収縮期圧上昇及び右室肥大や肺動脈血管平滑筋細胞増殖を有意に抑制した。「肺の主要な細胞外抗酸化酵素である細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ECSOD)の遺伝子導入が、肺高血圧症の動物モデルであるモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明し、肺高血圧症に対する新しい治療手段を提示することを目的とした。肺高血圧症は依然として有効な治療法が確立されていない難治性疾患である。本研究は、「肺の主要な細胞外抗酸化酵素である細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(Extracellular Superoxide Dismutase : ECSOD)の遺伝子導入が、肺高血圧症の動物モデルであるモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明し、肺高血圧症に対する新しい治療手段を提示することを目的とした。雄Sprague-Dawleyラット(8週齢,275-300g)にモノクロタリン皮下注射(40mg/kg)を行い,同時にvehicle(対照群)及びAdenoウイルスに組み込んだβ-galactosidase(ウイルス対照群)、ECSOD(ECSOD群)を経気管的に投与した。この方法により免疫染色で気道表皮細胞,肺胞表皮細胞での遺伝子発現を確認し,ELISA法で肺組織,気管支洗浄液,血漿での発現を証明した。両対照群では、28日目に肺微小動脈のリモデリングを伴った右室収縮期圧上昇及び右室肥大を認めた。一方、ECSOD遺伝子治療群では,血管リモデリング,右室収縮期圧上昇,右室肥大進展を統計学上有意に抑制した。また、本研究は、肺高血圧症の進展予防機序として,(1)肺動脈血管平滑筋細胞の増殖はECSDO治療群で有意に抑制されること、(2)モノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展初期に増加した肺組織中の活性酸素種(8-isoprostane)はECSOD治療群で有意に減少されることを示唆した。以上より,本研究はECSOD遺伝子治療が、ラットのモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防することを証明した。経気管ECSOD遺伝子治療が肺高血圧症に対する新しい治療手段となる可能性を示唆していると考えた。加えて,肺高血圧症と酸化ストレスの関係は十分な解明がなされていないのが、本研究は肺高血圧症進展過程で酸化ストレスが重要な役割を担っている可能性を証明していると考えられた。本研究は,「肺の主要な細胞外抗酸化酵素である細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ECSOD)の遺伝子導入が,肺高血圧症の動物モデルであるモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明し,肺高血圧症に対する新しい治療手段を提示することを目的とした。SDラットにモノクロタリン皮下注射を行い,同時にvehicle(対照群)及びAdenoウイルスに組み込んだβ-galactosidase(ウイルス対照群),ECSOD(ECSOD群)を経気管的に投与した。この方法により免疫染色で気道表皮細胞,肺胞表皮細胞での遺伝子発現を確認証明した。両対照群では,28日目に肺微小動脈のリモデリングを伴った右室収縮期圧上昇及び右室肥大を認めた。一方,ECSOD遺伝子治療群では,血管リモデリング,右室収縮期圧上昇,右室肥大進展を統計学上有意に抑制した。また,本研究は,肺高血圧症の進展予防機序として,(1)肺動脈血管平滑筋細胞の増殖はECSDO治療群で有意に抑制されること,(2)モノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展初期に増加した肺組織中の活性酸素種(8-isoprostane)はECSOD治療群で有意に減少されること,(3)eNOS発現が対照群では減少するが,ECSOD遺伝子治療群では減少しないことを示唆した。以上より,本研究は経気管ECSOD遺伝子治療が肺高血圧症に対する新しい治療手段となる可能性を示唆していると考えた。本研究は肺高血圧症進展過程で酸化ストレスが重要な役割を担っている可能性を証明していると考えられた。本研究は、「肺の主要な細胞外抗酸化酵素である細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ECSOD)の遺伝子導入が、肺高血圧症の動物モデルであるモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明し、肺高血圧症に対する新しい治療手段を提示することを目的とした。SDラットにモノクロタリン皮下注射を行い,同時にvehicle(対照群)及びAdenoウイルスに組み込んだβ-galactosidase(ウイルス対照群)、ECSOD(ECSOD群)を経気管的に投与した。この方法により免疫染色で気道表皮細胞、肺胞表皮細胞での遺伝子発現を確認証明した。

両対照群では、28日目に肺微小動脈のリモデリングを伴った右室収縮期圧上昇及び右室肥大を認めた。一方、ECSOD遺伝子治療群では,血管リモデリング、右室収縮期圧上昇、右室肥大進展を統計学上有意に抑制した。また、本研究は肺高血圧症の進展予防機序として、(1)肺動脈血管平滑筋細胞の増殖はECSDO治療群で有意に抑制されること、(2)モノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展初期に増加した肺組織中の活性酸素種(8-isoprostane)はECSOD治療群で有意に減少されること、(3)eNOS発現が対照群では減少するが、ECSOD遺伝子治療群では減少しないことを示唆した。以上の結果を主要雑誌の一つに投稿し、採択された。また、循環器関係の国内学会や国際学会、研究会にて発表している。最初のの2年間において「肺の主要な細胞外抗酸化酵素である細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(ECSOD)の遺伝子導入が、肺高血圧症の動物モデルであるモノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展を予防する」という仮説を証明し、肺高血圧症に対する新しい治療手段を提示することを目的とした実験的な研究を行った。方法としてSDラットにモノクロタリン皮下注射を行い、同時にvehicle(対照群)及びAdenoウイルスに組み込んだβ-galactosidase(ウイルス対照群)、ECSOD(ECSOD群)を経気管的に投与した。結果は免疫染色で気道表皮細胞,肺胞表皮細胞での遺伝子発現を確認証明した.両対照群では、28日目に肺微小動脈のリモデリングを伴った右室収縮期圧上昇及び右室肥大を認めた.一方、ECSOD遺伝子治療群では,血管リモデリング,右室収縮期圧上昇,右室肥大進展を統計学上有意に抑制した。また、本研究は、肺高血圧症の進展予防機序として,(1)肺動脈血管平滑筋細胞の増殖はECSDO治療群で有意に抑制されること、(2)モノクロタリン誘発性肺高血圧症の進展初期に増加した肺組織中の活性酸素種(8-isoprostane)はECSOD治療群で有意に減少されること,(3)eNOS発現が対照群では減少するが、ECSOD遺伝子治療群では減少しないことを示唆した。
文化技術の構造から言語進化を探る

ヒトの文化技術は、様々な細かい技術(小技術)が法則に従って組み合わされることで、より大きな役割を果たす技術(大技術)となるという構造をしている。これは様々な語句が文法に則って並べられることで1つの意味のある文になるという、ヒト言語の重要な特徴と類似する。このような構造は、他の動物の社会的に伝達される技術やコミュニケーション信号には見られないことから、ヒトの系統においてのみ進化した何らかの能力が双方に関与していると考えられる。そうであるならば、文化技術の構造性に着目することで、その担い手の言語能力を類推することができるはずである。そこでまず、数理モデルの解析によって文化技術の構造を操る能力(構成能力)が文化にどのような影響を与えるかを調べた。その結果、文化技術が構造化されても、段階的学習を必要とする文化技術は、たとえ複数の大技術に共通に使うことが可能な小技術が存在しても、高度化しないが、独立に学習可能な複数の小技術を組み合わせてできる大技術に関しては高度化することを明らかにした。そして、死亡率や負傷率などの生活史パラメータも文化進化に重要な影響を与えることを示した。古人類の生活史を調べた我々の研究から、新人以前の古人類は類人猿よりも寿命が短かったことが示されているが、それが彼らの文化発展を厳しく阻害していたと考えられ、これは新人期における文化発展を言語の出現と結びつけて考える視点に重大な疑問を投げかけるものである。また、言語能力に関係する、現生人類と類人猿や古人類との間の解剖学的相違点について調査を行った。これらの研究成果を、本研究が属する新学術領域「共創的コミュニケーションのための言語進化学」の開催した研究会議や、日本人類学会大会を始めとした一般の研究集会で発表した。また、査読付き国際誌に研究成果の一部をまとめた論文を投稿し、受理された。言語能力の出現を考古証拠から探るには、言語が文化技術の発展にどう影響するかを知ることが必要不可欠である。昨年度はまず、理論モデルによって、言語と類似した構造性を持つ文化技術をもたらす能力(構成能力)が文化進化に与える影響を示した。また、その研究によって、集団を構成する個体の生活史が文化に及ぼす影響が示されたが、化石証拠をもとに古人類の生活史を推定する研究もおこなったことで、寿命の延長が起きたことによって新人における文化発展がもたらされたという、今までにない視点を得ることに成功した。そして、これらの研究成果を査読付き国際誌や国際学会で発表したことによって、国際的な評価を得ることもできた。初年度の数理モデルを用いた研究によって、もし人類においてある段階で構成能力が生じたなら、積み上げ式の学習が必要な技術は変化しないが、並行学習可能な技術の組み合わせでできる技術はより高度になることが示された。一方で、単に学習・認知能力が上昇した場合や、社会交流範囲が広がった場合、寿命が延びた場合などは、どのようなタイプの文化も同様に高度になると予測される。つまり、複数の小技術で構成される大技術を見るとき、積み上げ学習が必要なのか、それとも並行学習可能なのかを検討することが重要である。以上の結果を利用し、本年度はまず考古証拠の文献調査を行い、並行学習可能な技術の組み合わせでできる技術と積み上げ学習が必要な技術がどのように文化進化してきたのかを調べ、人類進化のどの段階で言語が出現したと考えられるのかを探る。また、現生人類と類人猿や古人類との間の解剖学的相違点についても調査を行い、考古証拠と矛盾がないかを検証する。さらには、構成能力がどのような社会生態要因によって進化するのかを数理モデルによって調べ、言語進化の究極要因を検討する。

言語能力の出現を考古証拠から探るには、言語が文化技術の発展にどう影響するかを知ることが必要不可欠である。昨年度はまず、理論モデルによって、言語と類似した構造性を持つ文化技術をもたらす能力(構成能力)が文化進化に与える影響を示した。また、その研究によって、集団を構成する個体の生活史が文化に及ぼす影響が示されたが、化石証拠をもとに古人類の生活史を推定する研究もおこなったことで、寿命の延長が起きたことによって新人における文化発展がもたらされたという、今までにない視点を得ることに成功した。そして、これらの研究成果を査読付き国際誌や国際学会で発表したことによって、国際的な評価を得ることもできた。初年度の数理モデルを用いた研究によって、もし人類においてある段階で構成能力が生じたなら、積み上げ式の学習が必要な技術は変化しないが、並行学習可能な技術の組み合わせでできる技術はより高度になることが示された。一方で、単に学習・認知能力が上昇した場合や、社会交流範囲が広がった場合、寿命が延びた場合などは、どのようなタイプの文化も同様に高度になると予測される。つまり、複数の小技術で構成される大技術を見るとき、積み上げ学習が必要なのか、それとも並行学習可能なのかを検討することが重要である。以上の結果を利用し、本年度はまず考古証拠の文献調査を行い、並行学習可能な技術の組み合わせでできる技術と積み上げ学習が必要な技術がどのように文化進化してきたのかを調べ、人類進化のどの段階で言語が出現したと考えられるのかを探る。また、現生人類と類人猿や古人類との間の解剖学的相違点についても調査を行い、考古証拠と矛盾がないかを検証する。さらには、構成能力がどのような社会生態要因によって進化するのかを数理モデルによって調べ、言語進化の究極要因を検討する。
遍歴性ルテニウム酸化物の強磁性ゆらぎに起因する量子相転移の研究

層状ペロフスカイト構造を有するルテニウム酸化物は,ルテニウムの縮退したt_<2g>軌道に起因して,それぞれに磁性や超伝導など,多様な物性が見られる.本研究では,これらルテニウム酸化物の物性を明らかにすべく,特にカルシウム-ルテニウム酸化物に焦点を絞った研究をおこなった.とくに,二層系ルテニウム酸化物であるCa_3Ru_2O_7について,ルテニウム(Ru^<4+>)を同じ価数であり,非磁性と考えられるチタン(Ti^<4+>)に置換し,その金属-絶縁体転移を見いだし,その新規な磁場応答を観測した.層状ペロフスカイト構造を有するルテニウム酸化物は,ルテニウムの縮退したt_<2g>軌道に起因して,それぞれに磁性や超伝導など,多様な物性が見られる.本研究では,これらルテニウム酸化物の物性を明らかにすべく,特にカルシウム-ルテニウム酸化物に焦点を絞った研究をおこなった.とくに,二層系ルテニウム酸化物であるCa_3Ru_2O_7について,ルテニウム(Ru^<4+>)を同じ価数であり,非磁性と考えられるチタン(Ti^<4+>)に置換し,その金属-絶縁体転移を見いだし,その新規な磁場応答を観測した.層状ペロフスカイト構造をもつルテニウム酸化物は,スピン三重項超伝導や遍歴メタ磁性など,多様な基底状態に富む.物性を担うルテニウム(Ru)-酸素(O)から構成される平面(RuO_2面)の歪みや傾きが縮退した4d軌道と密接に関連していることが,これら多様な物性の本質である.今回,われわれはRuO_2面内に強磁性的相関をもつCa_3Ru_2O_7に着目した.これまで,この純良単結晶を用い,量子振動測定や角度分解光電子分光法により電子構造を決定した.つまり,この系が結晶構造の斜方晶性に起因する低キャリア性を有することを見出した.今回,RuO_2面の歪みと基底状態との関わりを調べた.具体的には,SrTiO_3基板上にCa_3Ru_2O_7薄膜をパルスレーザー法により作製し,その評価と輸送測定をおこなった.現在の最適化した条件下で,c軸方向に15nm(8ユニットセルに相当)からおよそ1000nmまでの様々な膜厚をもつ単結晶薄膜を作製できたことが電子顕微鏡にてわかった.ラマン散乱実験から,Ca_3Ru_2O_7薄膜の対称性はバルク単結晶のそれとは異なることがわかり,SrTiO_3基板の高対称性に影響されていることを示唆している.輸送測定では,その温度依存性が室温以下で半導体的振る舞いとなり,薄膜化になるほどその半導体的振る舞いが顕著になった.特に膜厚15nmの薄膜では,その温度依存性から,単純な熱活性型電気伝導のモデルから,約0.1eV程度のエネルギーギャップを持つ.最近,ナノレベルでの薄膜化誘起の半導体的電気伝導を示す物質が数多く見られている.本研究で特徴的なのは,Ca_3Ru_2O_7薄膜の半導体的振る舞いは,結晶の対称性も考慮する必要があることである.つまり,薄膜化により,より高対称性となった結果,本来の低キャリアを保証していたフェルミ面が消失し,電気抵抗が半導体的振る舞いになったと理解できる.これらの結果を踏まえ,薄膜の詳細な結晶対称性と磁気相関について調べる必要がある.層状ペロフスカイト構造をもつルテニウム酸化物は,スピン三重項超伝導や遍歴・局在メタ磁性,さらには遍歴強磁性など,多様な基底状態に富む.これらの新規現象は化学量論組成においてみられ,物性を担うルテニウム(Ru)-酸素(0)から構成される平面(RuO2面)の歪みや傾きが縮退したRuの4d軌道と密接に関連して多様な物性が発現する.今回,われわれはRuO2面内に強磁性的相関をもつルテニウム酸化物Ca3Ru2O7に着目し,Ru(S=1)を結晶中で同じ4価をもつ非磁性不純物チタン(Ti)で一部置換した.置換をしていないCa3Ru2O7の金属的基底状態から,わずか0.2%のTi置換により,低温での電気抵抗率が4桁以上も上昇する「金属-絶縁体転移」を見いだした.しかも,その転移温度はTi濃度とともに上昇する.さらに誘起した絶縁体状態は,磁場印可により金属状態になる,いわゆる巨大磁気抵抗効果もみいだした.これまで置換をしていないCa3Ru2O7では,伝導面に平行に磁場を印可した場合のみ,局在メタ磁性に関連した電気抵抗の変化が見えていた.これに対し今回の結果の特徴は,置換したCa3Ru2O7では磁場方向が伝導面に垂直方向であることを含め,どの方向に磁場を印可しても巨大磁気抵抗効果が見られたことである。さらに磁化測定の結果は,置換したCa3Ru2O7ではRuに起因する局在スピンが,伝導面間方向にも成分を持つことを強く示唆している.これは,置換をしていない系では伝導面内に張り付いた強磁性的スピン構造をもつこととはきわめて対照的である.一連の実験から,この系では磁場に敏感な系のスピン構造が伝導現象に極めて大きな影響を与えることを意味している.すなわち,磁性薄膜でみられるいわゆるスピンバルブ効果が,元素置換をしたバルクのCa3Ru2O7でも見られたことから,機能性材料としての可能性を持つことを示唆している.
高効率ダイヤモンド平面構造型電子エミッターの作製と電子特性解析

水素終端ダイヤモンド表面は負性電子親和力を示し,この特性が電子エミッター応用に重要であるが,大気中にさらすと表面にp形の導電性が生じる.昨年度の研究成果から,このp形の導電性は,電子エミッションにはむしろ不適であることが明らかとなった.本年度では,このp形導電性の制御に重点をおき,さらに,ドナーライクセンターの導入,電極構造の最適化を行った.1.水素終端ダイヤモンド表面の導電性制御水素終端表面の導電性を制御するために,これを誘起する起源が,ダイヤモンド表面への大気中からの吸着種である可能性に着目した.ダイヤモンド表面導電性の大気中での影響を詳細に調査し,in situプロセスによるダイヤモンド表面のパッシベーションを試みた.in situプロセスにより,PLD法によるアモルファスCaF_2をダイヤモンド表面に堆積させることにより,水素終端ダイヤモンド表面の導電性の発現機構検証ならびにその制御に成功した.2.サルファードープによるドナーライクセンターの導入SF_6ドープによるダイヤモンド薄膜のn形化を試みた結果,ドナーライクセンターの導入の可能性が明らかとなった.イオン注入によるサルファードープしたダイヤモンド薄膜のエミツション特性は,閾値電界はドープ量に依存しない一方,エミッション電流値は,ドープ量の増大に伴い増加した.サルファードープに伴いエミッションエリアが実効的に増大した可能性が考えられる.3.カソード構造を最適化することによるエミッション特性の改善従来の3極構造エミッターでは,カソード直前に存在する電位障壁が電子放出効率を抑制していた(約0.10.3%).この電位障壁を軽減させるために,カソード近傍に新しい電極を導入した.この4極構造により,ダイヤモンド電子エミッターを作製し,電子エミッション特性を測定した結果,電子放出効率の改善(1%以上)に成功した.本素子構造において,ダイヤモンド連続膜と孤立粒子の比較において,連続膜からの電子エミッション特性から,極めて低い閾値電圧(V_d=10V)の観測に成功している.このエミッション機構の相違を解明するために,走査型トンネル電子分光法(STS)による評価を行った.これは,局所的な表面電子状態を調べることが可能であるため,ダイヤモンド連続膜,孤立粒子における電子エミッションサイトの評価に有効である.測定評価試料は,アンドープ水素終端多結晶ダイヤモンド薄膜(Ti/石英基板)ならびにアンドープ水素終端ホモエピタキシャルダイヤモンド薄膜(高圧合成Ib基板)を用意した.ダイヤモンド多結晶連続膜のSTS像(dI/dV分布)から,状態密度はグレインバウンダリー部に多く存在することが明らかとなった.さらに,グレインバウンダリー部,グレイン中央部のトンネル電流-電圧特性の評価を行ったところ,グレイン中央部において,強いp形整流特性が観測された.一方グレインバウンダリー部においては,逆方向電流(サンプルバイアス負)が観察された.p形整流特性は,ホモエピタキシャルダイヤモンド薄膜にも同様に観測された.水素終端ダイヤモンド表面はp形半導体で界面準位が抑制されており,観測された整流特性はダイヤモンド表面のバンドベンディングにより生じたものと考えられる.以上,STS測定結果,トンネル電流-電圧特性結果から,電子エミッションサイトは,グレインバウンダリー部により多く存在することが明らかとなった.これにより,グレインバウンダリー部を多く含む多結晶連続膜が,本素子構造の電子エミッション特性において,より低い閾値電圧を示したものと考えられる.水素終端ダイヤモンド表面は負性電子親和力を示し,この特性が電子エミッター応用に重要であるが,大気中にさらすと表面にp形の導電性が生じる.昨年度の研究成果から,このp形の導電性は,電子エミッションにはむしろ不適であることが明らかとなった.本年度では,このp形導電性の制御に重点をおき,さらに,ドナーライクセンターの導入,電極構造の最適化を行った.1.水素終端ダイヤモンド表面の導電性制御水素終端表面の導電性を制御するために,これを誘起する起源が,ダイヤモンド表面への大気中からの吸着種である可能性に着目した.ダイヤモンド表面導電性の大気中での影響を詳細に調査し,in situプロセスによるダイヤモンド表面のパッシベーションを試みた.in situプロセスにより,PLD法によるアモルファスCaF_2をダイヤモンド表面に堆積させることにより,水素終端ダイヤモンド表面の導電性の発現機構検証ならびにその制御に成功した.2.サルファードープによるドナーライクセンターの導入SF_6ドープによるダイヤモンド薄膜のn形化を試みた結果,ドナーライクセンターの導入の可能性が明らかとなった.イオン注入によるサルファードープしたダイヤモンド薄膜のエミツション特性は,閾値電界はドープ量に依存しない一方,エミッション電流値は,ドープ量の増大に伴い増加した.サルファードープに伴いエミッションエリアが実効的に増大した可能性が考えられる.3.カソード構造を最適化することによるエミッション特性の改善従来の3極構造エミッターでは,カソード直前に存在する電位障壁が電子放出効率を抑制していた(約0.10.3%).この電位障壁を軽減させるために,カソード近傍に新しい電極を導入した.この4極構造により,ダイヤモンド電子エミッターを作製し,電子エミッション特性を測定した結果,電子放出効率の改善(1%以上)に成功した.
肺サーファクタント輸送異常による間質性肺炎の病態解明

肺サーファクタント輸送による間質性肺炎を発症するヘルマンスキー・パドラック症候群のモデルラットであるLong Evans Cinnamonラット肺を解析したところ、肺胞II型上皮細胞内に巨大な層状封入体と肺サーファクタント成分の著増がみられた。同細胞からの肺サーファクタントの基礎分泌は低下していたが、アゴニスト刺激分泌は逆に著明に増加していた。アデノベクターによるRab38遺伝子導入によりこれらの異常は改善された。同ラットの肺組織は予想に反して気腫性病変がみられた。同症候群での間質性肺炎の発症には基礎にある遺伝子異常に加え、感染・粉塵・加齢などが関与していることが推測された。ヘルマンスキー・パドラック症候群モデルラットでの肺病変および肺サーファクタント輸送・分泌を解析した。Rab38低分子量Gタンパク質を欠損し眼皮膚型白皮症と出血傾向を有するヘルマンスキー・パドラック症候群のモデルラットとして当初Fawn-hoodedラットの使用を予定していたが、より肺病変の強いLong Evans Cinnamon(LEC)ラットを使用した。同ラット肺には肺気腫様病変が起きていた。電顕で肺胞上皮細胞を観察したところII型上皮細胞は大型化し、著明に大型化した層状封入体を含有していた。気管支肺胞洗浄法にて気管支・肺胞内の炎症細胞を定量的に評価したところ、軽度の出血と好中球の増加、脂質の貪食により大型化した胞体を有する肺胞マクロファージがみられた。肺組織ホモジネート内、スクロース密度勾配超遠心法により単離した層状封入体(LB)小器官分画、および気管支肺胞洗浄液による肺胞内の肺サーファクタント量を測定したところ、肺サーファクタント脂質成分のフォスファチジルコリンは組織および層状封入体分画で著明に増加していたが、肺胞分画での増加はみられなかった。同様に疎水性肺サーファクタントタンパク質SP-Bも同じ傾向を示した。しかし親水性肺サーファクタントであるSP-AとSP-Dには明らかな変化はみられなかった。単離培養した肺胞II型上皮細胞からのフォスファチジルコリンの分泌活性をみたところ、無刺激状態での分泌は低下していたが、各種アゴニストによる分泌刺激では著明な分泌活性を示した。以上よりRab38の欠失により肺サーファクタントのII型細胞内での輸送・分泌に異常が起き、肺気腫様病変が引き起こされることを明らかにした。間質性肺炎を発症する遺伝性疾患であるヘルマンスキーパドラック症候群(HPS)のモデルラットでの肺病変および肺サーファクタント(LS)輸送・分泌を解析した。Rab38低分子量Gタンパク質を欠損し眼皮膚型白皮症と出血傾向を有するHPSのモデルラットとしてLong Evans Cinnamon(LEC)ラットを使用した。同ラット肺には間質性肺炎ではなく肺気腫様病変が起きていた。II型上皮細胞は大型化し、胞体内に著明に大型化した層状封入体を含有していた。気管支・肺胞内には、軽度の出血と好中球の増加、脂質の貪食により大型化した胞体を有する肺胞マクロファージがみられた。LS脂質成分のフォスファチジルコリン(PC)は組織および層状封入体分画で著明に増加していたが、肺胞腔内での増加はみられなかった。同様に疎水性LSタンパク質SP-Bも同じ傾向を示した。親水性LSであるSP-AとSP-Dには明らかな変化はみられなかった。単離培養したII型細胞からのPCの分泌活性をみたところ、無刺激状態での分泌は低下していたが、各種アゴニストによる分泌刺激では著明な分泌活性を示した。アデノベクターにRab38-cDNAを組み込み、初代培養II型肺胞上皮細胞およびLECラット肺へ経気道的に肺に感染させた。培養II型上皮細胞からの分泌活性は野生型ラットに近づくように改善された。またin vivoで経気道感染させた肺でのPCやSPーBの含有量にも野生型へ近づくような改善がみられた。以上よりRab38の欠失によりLSのII型細胞内での輸送・分泌に異常が起き、予想に反し間質性肺炎ではなく肺気腫様病変が引き起こされることが明らかにされた。他文献からの知見と合わせ考察すると、ヒトHPSでの間質性肺炎には1stヒットである遺伝子異常に加え、2ndヒットである呼吸器感染、加齢、粉じん吸入などの要因が関わっていると推測された。1)分化機能を維持した肺胞II型上皮細胞(II型細胞)初代培養系の確立。II型細胞株や培養ディッシュに培養した単離II型細胞は脱分化し、肺サーファクタントの研究には使用できない。そこでコントロールのSD,ヘルマンスキー・パドラック症候群モデルであるRab38低分子量Gタンパク質欠損FHラットからエラスターゼ消化およびメトリザマイド密度

勾配遠心法にてII型細胞を単離し、これをマトリゲル膜上に培養し、途中から上皮側を気相にして、II型細胞を培養する方法を確立した。II型細胞の分化機能はSP-A, SP-B, SP-Dの発現をリアルタイムPCRで確認し、SP-Aの発現はウェスターンブロットで確認した。2)II型細胞内肺サーファクタント輸送の解析。II型細胞内におけるサーファクタント輸送を小胞体からゴルジ装置)への小胞輸送をインヒビターであるブレフェルジンAを用いて解析した。また細胞分画法およびスクロース密度勾配遠心法により層状封入体を単離した。サーファクタント成分のうちPCは[3H]コリンでラベルしシリカゲル薄層クロマトグラフィー法で定量した。SP-AとSP-Bは[35S]メチオニンでアイソトープラベルし、特異抗体を用い免疫沈降法により新合成サーファクタント成分の輸送を解析した。これによりサーファクタントの層状封入体への輸送、細胞外への分泌を検討したところ各サーファクタント成分の細胞内輸送経路はいずれも異なった経路を取ることが明らかになった。3)ラットSP-C-cDNAの作成とアデノベクターへの組込み。SDラット単離II型細胞より総RNAを抽出し、RT-PCRを用いてSP-C-cDNAを作成した。リアルタイムPCR法によりSP-A, SP-B, SP-C, SP-Dの発現を解析した。アデノベクターに野生型Rab38および変異型Rab38を組み込みHEK293細胞で増幅させた。ヘルマンスキー・パドラック症候群モデルラットでRab38低分子量タンパク質の欠失により肺胞II型上皮細胞での肺サーファクタントの輸送・分泌異常が起きていることを発見したが、予想に反して間質性肺炎ではなく肺気腫病変が起きていた。この原因は今のところ不明である。交付申請書に記載した平成23年度計画の内容の約80%は達成した。一部肺サーファクタントプロテインC(SP-C)のクローニングと変異導入が予定よりやや遅れているが、まもなく達成予定である。Rab38低分子量タンパク質欠失による肺サーファクタント輸送・分泌異常から間質性肺炎ではなく肺気腫病変が起きる機序の解明を進める。また肺サーファクタントタンパク質SP-Cの輸送異常から間質性肺炎が発症することの機序も同時に進める。変異SP-Cのクローニングは次年度に持越し、まずこれを達成する。その上で同変異SP-Cを強制発現させたII型上皮細胞における肺サーファクタント輸送と遺伝子発現、およびヘルマンスキー・パドラック症候群モデルラット(Fown-hooded rat)での肺病変および肺サーファクタント輸送・分泌を研究計画書通りに検討する。該当なし次年度研究費は次年度研究計画書通り変異SP-C強制発現細胞での解析、Fown-hoodedラットでの解析に使用する。