hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
伝統パッケージの多様性から考える持続可能性とソーシャルデザイン・プログラムの展開

一部の老舗は伝統の継承者であるとともに革新的な新たな取り組みをおこなっている。これらの調査・分析を踏まえ、二方向から研究対象の絞り込みをおこなった。一つは包みの「素材」を切り口にして、山形県最上地方の稲藁と、奈良県吉野地方の杉の樽材を取り上げた。もう一方は、神道や武家の折形にみる文化的背景から発展した和紙を使用した包みに着目した。明治時代の近代的洋紙技術の導入によって、それまで全国各地でおこなわれていた紙漉きが廃業に追い込まれたが、現代に受け継がれる伝統包みには、未だに和紙が使用されている。コミュニケーションデザインの観点から、日本の「包みの文化」起源/卵の藁苞/折形/菰樽/暖簾(ブランド)/風呂敷の6つのテーマを設定し、本学の学生と各方面の専門家との協働でソーシャルデザイン・プログラムを立ち上げた。伝統パッケージの持続性の知恵や精神性から学んだことを、いかに現代のグローバル社会に対して示唆を与えうるような社会的プロジェクトとして実現していくか、また「包みの文化」の保持の方法について参加者との議論をおこなっている。現在、各方面の若手専門家とともに研究を進めている。日本の伝統パッケージや贈答の習慣において、日本人の精神文化に深く根ざした神道が反映されてきた。日本人の信仰における根本思想である「産霊(むすひ)」や、贈答文化の起源である神への捧げものとして「祭祀にまつわる奉納」と「贈る調え」について、現代の生活者の視点から研究を行う専門家に協力を仰ぎ、現代の贈答との関係性や包みの変容について知見を深めている。長年、藁細工を通して郷土の文化と手業を次世代に引き継ぐ活動をおこなってきた、山形県最上地方の民族文化伝承者の長老を師匠とする専門家に協力いただき、藁苞のワークショックをとおして研究を展開している。実践を通して「守り伝える伝承ではなく、新たな伝統を作る」ことを目指す、折形(おりかた)の研究者でデザイナーの協力者とともに、和の作法や時代を経て変容してきた折形について学ぶワークショップをおこなった。また、和紙問屋業を営む専門家の協力を得て、手漉き和紙の産地である阿波、因州、越前の紙漉き職人と家内工業について聞き取りをおこない、和紙を用いた新たな提案を進めている。6月に山形県を訪れ、五代続く農家で農業を継ぎながら藁細工の継承活動をおこなう若手を取材した。また、新庄民話の会の語り部で先の継承活動者の師である長老に会い、当時どのように藁が生活に活かされていたか取材した。米を収穫した後の稲藁は、余すところなくさまざまな用途に使用された。かつて日本各地で行われた藁編みは、冬の農閑期に農民の創意工夫によって生み出される愉悦を伴う手仕事であった。地元のデザイナーやプロデューサーにも会い、地域の自然遺産や伝統文化を積極的に活用・再生する動きが若い世代によって行われていることがわかった。灘五郷は江戸時代に酒造りで発展し、樽廻船で江戸に酒を輸送するための菰樽づくりも盛んであったが、現在は樽づくりや菰づくりをおこなう企業は数件のみで、藁菰に関しては全国でも兵庫県のわずか2カ所を残すのみになっている。1月にそのうちの1社を取材し、菰づくりの工程と現状を調査し、職人にインタビューをおこなった。樽を包む藁菰(わらごも)は、印菰(しるしごも)と呼び、商標や酒質など表示している。もともと酒を輸送する際に木樽を保護する目的で、藁を編んだ筵(むしろ)に屋号のしるしを刷り込んだものを巻いたりしていた。それが次第に装飾性を帯びるようになった。
学習につまずきのある子どもへの多層指導モデル(MIM)開発に関する研究

本研究では,通常の学級における学習につまずきのある子どもへの多層指導モデル(Multilayer Instruction Model : MIM【ミム】)を開発した。このモデルは,通常の学級において,異なる学力層の子どものニーズに対応した指導・支援を提供していこうとするモデルである。特に,子どもが学習につまずく前に,また,つまずきが深刻化する前の指導・支援の提供をめざした。結果,指導領域として取り上げた特殊音節に留まらず,読み書き全般において,効果がみられた。また,この傾向は,MIMが特に焦点を当てた読み書きにつまずく危険性のある子どもの群だけでなく,読み書きが得意と評価できる群も含め,異なる学力層においても同様にみられた。こうした効果の背景には,MIMの一貫で行われる定期的なプログレスモニタリング(Multilayer Instruction Model-Progress Monitoring : MIM-PM)の開発・実施によって,教員が客観的な視点を取り入れながら,子どもに対してより早く,かつ,深く,正確な状態像の把握を遂げたこと,更には,MIMというフレームワークや方法論の導入により,教員による指導形態の柔軟化や指導内容,教材の多様化が進んだこと,MIM-PMの結果を鑑みながら,体系的に指導を組み立てていったことが要因として挙げられる。小学校1,2年生を対象に,学習面でのっまずきが重篤化する前の段階で,子どもの教育的ニーズを把握し,速やかな支援へつなげるためのアセスメントのプロトタイプを開発した。このアセスメントは,ターゲットを読み,特に特殊音節の読みに絞り,通常の学級内で,一斉に,2分間で実施できる簡便なものである。また,一度のみのアセスメントではなく,継続して行うものとなっている。こうすることで,子どもの伸びが把握できるとともに,より妥当性,信頼性のある子どもの状態像を反映し得るものとなっている。今年度は,1年生206名(7クラス),2年生140名(4クラス)が1年間,継続的に参加し,アセスメントデータを取った。あわせて,特殊音節の読みに関する指導方法の開発も行った。まずは,全体の授業で,MIMの方法論を用いた授業が展開された。また,授業のみでは習得が完全に達成されなかった児童に対しては,第2段階目の指導として小集団での指導を授業時,または朝学習,給食準備時に実施した。更に,それでも尚,習得が難しい場合には,第3段階目の指導として,放課後に小集団,または個別の指導を行った。特に,第3段階目の指導を児童5人に対して実施した結果,4回(1回の指導は40分)の指導で,全ての児童が特殊音節の読みのテストで,指導前と比較して,統計的に有意に高い得点を挙げた。さらに,開発したアセスメントが一般化できるかを検証するため,年度の終わりには,統制群を募り,1年生約700名,2年生650名の参加を得た。1年間,研究に参加した児童と,統制群とで比較を行うことで,指導の効果,アセスメント自体の効果についても,今後検証する予定である。学習が進んでいくにつれ,つまずきが顕在化する子どもを,つまずく前の段階で把握するためのアセスメントMultilayer Instruction Model-Progress Monitoring(以下MIM-PMとする)の開発を行った。これは,全ての学習領域に影響し得る早期の読み能力,特に特殊音節の正確で素速い読みに焦点を当て,計2分で実施するテストである。また,一度でなく,継続的に実施することで,真の能力を発揮する機会が多く得られるとともに,子どもの伸びについても把握できる。1年間を通じて参加したのは初年度は,小学1年7クラス計208名,2年生4クラス計144名,比較のための統制群が1年生31クラス790名,2年生30クラス759名であった。MIM-PMと標準化されている読書力検査の得点との相関を調べた結果,rs≧.50の値がみられた(ps<.01)。また,参加群の1学期中盤のMIM-PMの結果と3学期の結果との間にはrs≧.60の値がみられ(ps<.01),1学期中盤という早期の時点で,学年末の読み能力の状態を予測できる可能性が示された。参加した担任に行った質問紙調査では,82%の教員がMIM-PMの結果を指導に活かすことができるものだったと回答した。

さらに,通常の学級における学習につまずきのある子どもへの多層指導モデル(MIM)を用いて小学1年生7クラス計208名に行った特殊音節の指導の効果が,学習につまずく危険性のある子どもをはじめ,その他の異なる学力層の子どもにおいてもみられるかを統制群小学1年生31クラス計790名との比較により行った。年度末に,参加群,統制群に対して,読み書きに関する諸検査を実施した結果,参加群が高く,有意差がみられた。あわせて,参加群の担任教員が行った授業の変容を複数観察者により評価・分析した結果,MIM導入後では,指導形態や内容,教材の多様化がみられ,クラス内で約90%の子どもが取り組んでいると評定された割合がMIMによる指導前と比較して,2倍近くにまで上昇していた。通常の学級において,特殊音節に関する多層指導モデル,Multilayer Instruction Model(MIM:海津,田沼,平木,伊藤,Vaughn,2008)を実施した。多層指導モデル(MIM)は,まずは通常の学級において全ての子どもに対し,効果的な指導が実施される1stステージ,1stステージ指導のみでは伸びが十分でない子どもに対する通常の学級内での補足的な指導である2ndステージ,それでも依然,伸びが乏しい子どもに対し,より柔軟な形態で集中的な指導として実施される3rdステージで構成される。ここでは,3rdステージ指導に進んだ9名の子ども(平均年齢7.2歳,標準偏差0.24)への指導効果を評価した。3rdステージ指導は,3学期1月以降に週1度,給食の準備時間や放課後に一回20分から40分,小集団(5名以下)にてMIM特殊音節指導パッケージを用いて行った。このパッケージでは,(a)視覚化や動作化を通じた特殊音節の音節構造の理解,(b)日頃よく用いる語を逐字でなく,視覚的なかたまりとして捉えることによる読みの速度の向上,(c)日常語彙の拡大と使用を焦点においた。指導前後の効果測定には,特殊音節の読みのアセスメント,MIM-Progress Monitoring(MIM-PM;海津・平木・田沼・伊藤・Vaushn,2008)を用いた。結果,指導後に得点の上昇が有意にみられ,さらに読みに対する子どもの捉え方も肯定的なものへ変化した。
先進的リアルタイムイメージング法によるクオラムセンシング阻害剤の作用機序の解析

多剤耐性菌に対する新規治療法の開発は喫緊の課題となっている。そこで、新規化合物である緑膿菌クオラムセンシングのオートインデューサーアナログの効果について、先進的実験方法を用いて検討を行い、その作用機序の解析を行った。その結果、このアナログは抗菌薬と併用することにより抗菌薬の殺菌作用を増強する効果があることを見出した。また、この作用機序は、クオラムセンシング抑制効果ではなく、ストレス応答に重要なrpoS遺伝子の発現を抑制し、抗菌薬抵抗性を低下させているためであることが明らかとなった。本研究で用いたアナログは、新たな感染症治療法の開発につながるリード化合物になることが期待される。多剤耐性菌に対する新規治療薬の開発は喫緊の課題となっており、細菌クオラムセンシング(QS:細胞密度依存的)機構を阻害するQS阻害剤が注目されている。本研究課題では、先進的リアルタイムイメージング法による実験モデル系と分子生物学的手法を駆使して、QS阻害剤の作用機序解明を目指す。1)リアルタイムイメージングのための発光性緑膿菌の作製と新規マウス薬効評価系の作製:IVIS Luminaを用いるリアルタイムイメージング法を活用するために、緑膿菌PAO1株由来の各種発光性緑膿菌を作製した。新たに作製した発光性緑膿菌をマウス大腿部感染モデルにおいて評価し、発光性の改良を重ねた。一方で、QS阻害剤と各種抗菌薬との併用効果の検討に有用であると考えられる尿路バイオフィルム感染症モデルの作製に着手した。2)QS阻害剤による抗菌薬感受性化メカニズムの検討:in vitroで殺菌試験を行い、QS阻害剤の抗菌薬抵抗性に及ぼす影響について検討を行った。その結果、PAO1株に対してQS阻害剤を添加することで、抗菌薬添加後の生存率が抗菌薬のみ添加した場合に比べて大きく低下したことから、QS阻害剤が抗菌薬抵抗性に影響を与えていることが示唆された。3)プロモーター活性測定用緑膿菌の作製:QS阻害剤添加による緑膿菌遺伝子発現の影響を検討するため、lasB、rhlA遺伝子のプロモーターにGFPを連結したプロモーター活性測定用の菌株を作製した。1QS阻害剤(QSI-1)のQSシステムに対する効果の検討:QSI-1添加による緑膿菌遺伝子発現の影響を検討するため、lasB、rhlA遺伝子発現の経時的な解析を行った。また、lasI、rhlI遺伝子欠損株を作製し、殺菌試験を行った。その結果、QSI-1はQSシステムとは異なるメカニズムで、抗菌薬感受性を増強している可能性が強く示唆された。2QS阻害剤(QSI-1)による抗菌薬抵抗性への影響:これまでに、in vivoリアルタイムイメージング法により、QSI-1がカルバペネム抗菌薬であるビアペネムだけでなく、キノロン系、アミノグリコシド系抗菌薬に対しても併用効果があることを見出している。in vitroの殺菌試験においても、QSI-1はこれらの抗菌薬との併用効果があることを明らかにした。3QS阻害剤(QSI-1)による抗菌薬耐性菌への効果の検討:in vitroでの殺菌試験において、標準株(PAO1株)由来および臨床分離株由来の抗菌薬耐性菌に対して、抗菌薬の濃度を増加することにより、QSI-1との併用効果が発揮され、QSI-1が耐性菌に対しても有効であることを明らかとした。4in vivo実験:新規マウス薬効評価系である発光性緑膿菌による尿路感染症モデルを再現性のある実験モデルとして確立した。マウス大腿部感染モデルでは、外膜透過孔蛋白質(OprD)が欠損したビアペネム中等度耐性菌に対しても、ビアペネムとQSI-1との併用効果が確認された。1)薬剤耐性菌に対するQS阻害剤(QSI-1)の影響について:これまでに、PAO1株において、QSI-1が抗菌薬(ビアペネム)の殺菌効果を増強させる効果があることを、マウスを用いた感染モデルで、リアルタイムイメージング法により明らかにしてきた。一方、in vitroの殺菌試験において、その効果を確認することができた。さらに、作用機序の異なるカルバペネム系、キノロン系、アミノグリコシド系抗菌薬が、同様の効果を発揮することを明らかにした。また、薬剤耐性菌やバイオフィルム形成菌に対しても殺菌効果を増強することが確認された。2) QS阻害剤(QSI-1)による作用メカニズムの検討:これまでに、QSI-1はQS阻害効果がそれ程強くなく、殺菌効果の増強はQS阻害以外のメカニズムによるためであることが示唆された。そこで、QSI-1の緑膿菌に対する影響を検討するため、マイクロアレイを用いてQSI-1添加による遺伝子発現の変動を検討したところ、QSI-1が2成分制御系や転写調節因子など多くの遺伝子発現に影響を与えていることが確認された。1) QS阻害剤(QSI-1)の薬剤耐性菌への効果:in vitro殺菌試験において、薬剤耐性菌への効果を検討するため、PAO1株の外膜タンパクOprD

欠損株を作製した。ビアペネムに耐性を示すこの株に対して、QSI-1を添加することで、殺菌効果が発揮された。さらに臨床分離株を用いた検討において、排出タンパク過剰産生によるカルバペネム系およびキノロン系抗菌薬の2剤耐性菌に対して、QSI-1を添加することで、ビアペネム、レボフロキサシンそれぞれの薬剤添加後の生存率が抗菌薬のみ添加した場合に比べて大きく低下したことから、QSI-1が抗菌薬抵抗性に影響を与えていることが明らかとなった。2) QS阻害剤(QSI-1)によるバイオフィルム形成菌への効果の検討:ペグバイオフィルムシステムを用いてバイオフィルムを形成させた後、QSI-1を作用させ,その後抗菌薬で処理してバイオフィルムを剥離し生菌数を測定したところ、QSI-1を作用させていない群に比較して、併用では生菌数が有意に低下していることを確認した。3) QS阻害剤(QSI-1)による遺伝子発現への影響の検討:マイクロアレイを用いて、QSI-1添加による遺伝子発現の変動を検討したところ、2成分制御系や様々な転写因子の発現が上昇、または低下しており、QSI-1が多くの遺伝子発現に影響を与えていることが確認された。多剤耐性菌に対する新規治療薬の開発は喫緊の課題となっており、細菌クオラムセンシング(QS:細胞密度依存的)機構を阻害するQS阻害剤が注目されている。本研究課題では、先進的リアルタイムイメージング法による実験モデル系と分子生物学的手法を駆使して、QS阻害剤の作用機序解明を目指し研究を行った。QS阻害剤として見出された新規化合物は、異なったメカニズムにより耐性を示す緑膿菌臨床分離株3株に対し、カルバペネム系抗菌薬のビアペネム、キノロン系のレボフロキサシン、アミノグリコシド系のトブラマイシンを併用することで、それぞれの抗菌薬による殺菌効果の増強に寄与していることが確認された。さらにこの作用メカニズムを明らかにするためにRT-PCRにより遺伝子発現の変動を解析したところ、この化合物はQSのオートインデューサーのアナログではあるが、QS阻害効果はほとんど無いことが確認された。しかし、RNAポリメラーゼσ因子の1つであるrpoS遺伝子を有意に抑制していることが明らかになった。ウェスタンブロットによる解析でもRpoSタンパク質を明らかに抑制していた。そこで、rpoS遺伝子の欠損株やプラスミドによる過剰発現株を作製し、殺菌試験を行ったところ、rpoS遺伝子は抗菌薬抵抗性に関与していることが確認された。本研究により、緑膿菌QSオートインデューサーの新規アナログは、rpoS遺伝子を抑制することにより、抗菌薬の殺菌効果を高めていることが判明し、新たな感染症治療薬のリード化合物になる可能性を秘めていることが明らかとなった。多剤耐性菌に対する新規治療法の開発は喫緊の課題となっている。そこで、新規化合物である緑膿菌クオラムセンシングのオートインデューサーアナログの効果について、先進的実験方法を用いて検討を行い、その作用機序の解析を行った。その結果、このアナログは抗菌薬と併用することにより抗菌薬の殺菌作用を増強する効果があることを見出した。
知識集約型ビジネスのグローバル経営の理論化

知識集約型ビジネス(経営コンサルティング・ファーム)は、ローカルな競争優位性を基盤とした集合体に制限されるものではなく、多様な形態のグローバル経営(戦略)を遂行できることが理論的・実証的に示された。その鍵となるのは、プロフェッショナル・サービスを提供しつつも、「知識」を「収益化」するというビジネスモデルを構築し、かつそのビジネスモデルがグローバルな競争優位性と一体化することを志向することにある。本研究は、平成20年度から平成22年度までの3カ年にわたる研究期間を想定している。平成20年度は、その初年度に該当し、研究計画に則り、次年度以降の実証的考察に必要となる分析フレームワークの構築を試みた。実施した研究内容は、以下の通りである。第1に、先行研究のレビューである。レビューの対象となる文献は、グローバル経営に関する文献と知識集約型ビジネスに関する文献の大きく2つの領域に分けられる。前者については、本研究の相対的な位置づけを明らかにするという狙いもあり、対象を広くとり、サービス企業の国際化、グローバル化に関する先行研究に関して、ジャーナル論文を中心にレビューを実施した。後者については、文献の絶対的な分量という点で、ジャーナル論文だけでは十分ではないと判断したため、書籍、論文集(いずれも洋文献)も対象に含めてレビューを行った。第2に、これまでの研究成果の整理である。筆者は、本研究に関連した研究をこれまでも継続して行ってきているが、その研究成果について再検討を行った。知識集約型ビジネス、とりわけ、本研究で直接的な研究対象としている経営コンサルティング・ビジネスは、エンロン事件が発生した2000年前後から急速な業界再編が進んでいる。加えて、ICTの進歩により既に上梓している研究内容の陳腐化も少なからず発生している。そのため、現在の最新の業界状況を踏まえながら、これまでの研究成果の位置づけを確認することを行った。以上の考察の結果、知識集約型ビジネスのグローバル経営については、大枠の戦略の類型化という点においては、サービス企業、特にプロフェッショナル・サービス・ファームの分析フレームワークが援用できるものの、実証的考察という点においては、ローカル市場(日本市場)におけるコンサルティング方法論の活用の実態といった戦略の内容分析が不可欠であることが示された。本研究は、平成20年度から平成22年度までの3ヵ年にわたる研究期間を想定している。平成21年度は、その中間年度に該当し、研究計画に則り、初年度の研究成果において構築した知識集約型ビジネスにおけるグローバルな競争優位性に関する分析フレームワーク(仮説モデル)を活用し、本研究の目的である知識集約型ビジネスのグローバル経営の理論化を進展させるべく実証的考察を試みた。第1に、分析フレームワーク(仮説モデル)の内的妥当性の検証である。これまで行ってきた量的調査(2003年度のアンケート調査)・質的調査(20数社に及ぶインタビュー調査)の成果に対して、実際に、分析フレームワーク(仮説モデル)を用いた分析を実施した。その結果、十分な内的妥当性を持つと判断できる分析結果を得ることができた。第2に、主として質的調査にもとづいた単一事例研究、比較事例研究の実施である。上述の分析結果から、分析フレームワーク(仮説モデル)を用いた分析が有効であると想定し、加えて外的妥当性を担保できるような幾つかの事例研究に着手した。最初に、分析フレームワーク(仮説モデル)から理論的に導出できる複数の戦略類型を提示し、次に、それらの戦略類型と適合性の高い事例を抽出し、各戦略類型の成功要因、ビジネスモデル等に関する考察、インプリケーションの導出を行った。以上の考察の結果、知識集約型ビジネスのグローバル経営とは、先行研究によって指摘されていたマルチドメスティックな経営モデルによる地域的な集合体に留まるものではなく、グローバルに適用可能な知識を活用することで、多様な形態でのグローバルな競争優位性、グローバル戦略を構築することが可能であることが実証的に示された。平成22年度は、その最終年度にあたり、主として研究成果全体のとりまとめと今後新たに取り組むべき課題の特定を試みた。第1に、昨年度、博士論文として上梓した研究成果の精査を行った。博士論文では、本研究の具体的な対象である外資系の経営コンサルティング・ファームのグローバル戦略に関し、理論的及び実証的考察を展開した。その中で、幾つかの課題が明らかとなっていた。課題の一つである知識集約型ビジネスのグローバル化の理論的骨子となる経営知識のグローバル化の現象については、加筆修正を行い、著書として刊行した。同様に、本研究における分析フレームワークの考察で構成概念の規定に関して不十分な点があったため、その精緻化に努めた。第2に、共同研究及びアクションリサーチによる新たな課題の特定である。本研究において、主要なケーススタディとして、ケンブリッジ・テクノロジー・パートナーズ株式会社をとりあげているが、このケースを更に深掘りするため、笠原民子氏(四国大学)と共同研究を行った(学会報告及びディスカッションペーパーの執筆)。

加えて、知識集約型ビジネスのビジネスモデル、ビジネスモデルのイノベーションに関して、より実践的な状況での検討が必要であると判断したため、探索的ではあるがアクションリサーチに着手した。対象は、筆者の勤務地に近い、神戸市内のメディア関係のコンサルティング・ファームである。同社の協力を得て、ビジネスモデルの再構築に関する会議等ヘオブザーバーとして参加することができた。その成果については、平成23年度において公表する予定である。以上の考察により、本研究の目的である知識集約型ビジネスのグローバル経営の理論化に関して、学術・実践の両両側面において、大きな成果をあげることができた。
結晶スポンジ法によるゲノムマイニングのワークフロー刷新

生体から化合物を探索し構造決定することは、化学ばかりでなく創薬の観点からも意義深い。ゲノムマイニングは化合物を合成するタンパク質をゲノム情報から探索できるため、新規化合物を供給する強力な手法になることが期待されている。しかしながら、確度高く化合物の構造を求めるため大スケールでの培養実験が必要とされることが実験者の負担となっており、化合物の探索速度を制限する原因となっている。結晶スポンジ法は近年開発された分子構造解析手法であり、わずかな試料から化合物の三次元構造を与える。本研究では、ゲノムマイニングのワークフローに結晶スポンジ法を導入し、実験系の省スケール化・高速化を実現する。
次世代In vivoオートファジー測定系開発とその応用

オートファジーの様々な疾患への強い関与が示唆されており、その効率的な測定系の開発が待ち望まれている。本研究ではHalotag-LC3を用いた効率的なオートファジーの測定を可能にする新しい測定系を樹立し、in vivoへの応用の礎とすることを目標とする。Halotag融合LC3タンパク質を発現する細胞を作成し、ビオチンリガンドを用いたLC3のpulse-chase実験系と、複数の蛍光リガンドを同時に用いたオートファゴソーム標識によるオートファジー活性の測定系を樹立した。本研究より、Halotag-LC3の実験系が目的によってカスタマイズ可能な自由度が高いオートファジー測定系である事が示された。オートファジーは、饑餓時に細胞が生存に必要な最小限のエネルギーとタンパク質合成に必要なアミノ酸を確保するために自己成分を非選択的に分解する経路として知られる。それに加え、近年の研究によりオートファジーは、特定のタンパク質を選択性をもって分解する事が明らかとなりつつあり、異常ミトコンドリアや細胞内に侵入した細菌などを分解する選択的オートファジーが様々な疾患を予防する生体防御機構として注目されている。それゆえ、オートファジーの活性をin vivoでモニターする手法の開発が待望されている。細胞レベルでは様々な手法が開発されている。所属研究室で開発されたGFP-RFPのタンデムタグをオートファゴソームのマーカーであるLC3に付加したtfLC3システム(tandem-fluorescent-tagged LC3)はオートファゴソームの数だけでなく、その内容物の分解過程までをモニターできるため、しばしば見られるオートファジーの阻害によるオートファゴソームの蓄積による解釈の誤りを回避できる。私は、これをin vivoに応用するために、そのままではRFPシグナルが蓄積するという問題を回避するため、Haloタグというリガンド結合性のタグをLC3に付加したタンパク質を利用する。本年度はHalo-LC3コンストラクトの作成およびモニター系としての細胞レベルの評価、また既存のシステムとの比較検討を行った。また、Halo-GFP-LC3というタンデムタグの評価を行った。これより、効率的なin vivoオートファジー測定系を構築するための後ろ盾となる知見が得られた。Halo-LC3およびHalo-GFP-LC3の実験系および評価系の構築が進んでおり、現在既存のシステムとの比較を行っている。近年、オートファジーの様々な疾患を予防する生体防御機構としての機能が大きく注目されている。GFP-RFPのタンデムタグをオートファゴソームのマーカーであるLC3に付加したtfLC3システム(tandem-fluorescent-tagged LC3)はオートファゴソームの数だけでなく、その内容物の分解過程までをモニターできるため、しばしば見られるオートファジーの阻害によるオートファゴソームの蓄積による解釈の誤りを回避できる。本研究ではこれをin vivoに応用するために、Haloタグというリガンド結合性のタグをLC3に付加したタンパク質を利用する。前年度までに研究代表者はHalo-LC3コンストラクトの作成およびモニター系としての細胞レベルの評価、また既存のシステムとの比較検討を行った。また、Halo-GFP-LC3というタンデムタグの評価を行い、効率的なin vivoオートファジー測定系を構築するための後ろ盾となる知見が得られた。本年度はさらにin vivoへの応用を鑑み、複数の異なるリガンドのコンビネーションおよび至適濃度の設定によるコストの削減を試み、おおよそ1/10の負担でも効率的にオートファジーをモニターする方法を開発した。現在、さらに広く用いられるモデルの作成のため、アフィニティーの高いHaloタグを用いた実験系を構築しており、マウス、線虫、イモリ等の複数のモデル生物による検証を行う予定である。立ち上げた測定系を用い、培養細胞を用いたオートファジーの誘導もしくは阻害剤の検証を進める。Haloタグはリガンドを変える事で自在に測定系を改変できる。しかし、リガンドが比較的高価であるため、効率的にオートファジーを測定できる系の構築を模索する。さらに、in vivo測定系の構築と検証を進める。細胞生物学、遺伝学
東南アジア諸語版「ラーマーヤナ」の比較研究

平成9年から11年までの3年間に亙る「東南アジア諸語版ラ-マ-ヤナの研究」は各年度毎に次のような形で研究を推進した。(1)研究期間の初年度には第14回国際ラ-マ-ヤナ学会(開催地・米国フ-ストン市・5月)に参加して、ビルマ語版ラ-マ物語とラオス語版、雲南省のタイ語版ラ-マ物語との比較研究の結果を発表した。同年9月にはジャワのプランバナン及びパナタラン両遺跡のラ-マ-ヤナ浮き彫りに関する調査結果をジャカルタ大学の考古学科及びジャワ語学科で発表し、インドネシア研究者との間で討議を行なった。(2)第2年度目初頭には南インドの国際タミ-ル研究所に客員教授として3か月間招聘されたため専らインド国内のラ-マ-ヤナ一次資料の蒐集とその内容分析とに従事した。同年8月には第15回国際ラ-マ-ヤナ学会(開催地・トリニダド・トバゴ)に出席して北部タイ版ラ-マ物語とラオス語版ラ-マ物語との共通性を明らかにした。(3)第3年度目の10月には第1回国際ラ-マ-ヤナ・マハ-バ-ラタ学会(開催地・マレ-シア大学)に出席してスンダ語版ラ-マ物語の内容について、同年12月には第16回国際ラ-マ-ヤナ学会(開催地・ニュ-デリ-)に参加してランナ-語版ラ-マ物語について、それぞれその構成及び特徴に関して発表を行なった。1.1996年11月に慶應大学で開催された「アジア・ルネサンス・フォーラム」で発表した「ビルマ語版ラ-マ-ヤナの特徴」の原稿を,金子量重編『ラ-マ-ヤナの伝播』(春秋社,1998)に掲載したいとの要請を受けたので,新たに手を加えて増補した内容を,「ビルマのラ-マ-ヤナ」と改題の上寄稿,掲載(pp.166-199)された。2.1997年5月23日から25日間で3日間に亘って米国ヒューストン市で開催された第14回国際ラ-マ-ヤナ学会に出席し,ビルマのラ-マ-ヤナとラオス,雲南のラ-マ-ヤナ3版の比較研究を発表した。3.1997年9月23日から29日間で1週間インドネシアへ出張,中部ジャワのプランバナン及び東ジャワのパナタラン両遺跡のラ-マ-ヤナ・レリーフに関する研究成果をジャカルタのインドネシア大学文学部考古学科およびジャワ語学科において発表し,インドネシア人研究者との間で討議を行なった。考古学科ではテイテイ・スルティー・ナステイテイ(Titi Surti Nastiti)助教授,ジャワ語学科ではワフヤテイ・プラデイプタ(Wahyati Pradipta)教授が,それぞれ座長役を努めてくれた。ジャワの遺跡に残るラ-マ-ヤナ・レリーフとジャワ語のラ-マ-ヤナ文献とは基本的に共通しているが,レリーフには文献には見られない幾つかの要素が見られ,ジャワ文化の多重性が窺われる。研究期間の第2年目に当る平成10年度には南インドの国際タミール研究所に各員教授として招聘(1998.1月-3月)された事もあり、インド諸語版ラーマーヤナの内容精査に専念した。その結果、次のような事実が判明した。1、インド国内にはヴァールミーキ版の流れを汲むラーマーヤナの系列がある。例えば、タミール語版、ベンガル語版、アッサム語版、オリヤ語版、テルグ語版等である。2、同じサンスクリット語で編纂されたとは言うもののその内容がヴァールミーキ版よりは簡縮化された形のものとして15世紀に成立したアドヤートマ・ラーマーヤナがある。現代インド諸語版の中には、このアドヤートマ版の流れを汲むものもある。ヒンデー語版、マラヤーラム語版等がそうである。この系列に属するラーマーヤナの特徴は、ヴィシュヌ神への信仰、帰依がヴァールミーキ版以上に強烈に表現されている事である。

3、ヒンドウー教を背景に成立した上記1、2とは別に、ジャイナ教を背景とするラーマーヤナの一群がある。プラークリット語によるパウマ・チャリヤやヴァースデーヴァ・ヒンデイ、及びカンナダ語版等がそうである。これらの版の特徴は、主要登場人物の全てが熱心なジャイナ教徒だとされている点である。4、インド諸語版ラーマーヤナの中にはその独特のエピソードから見て東南アジアのラーマーヤナに直接影響を与えたと考えられる版がある。テルグ語版からマラヤ版ヒカヤット・スリ・ラーマヘ、タミール語版からタイ語版ラーマキエンへ、ベンガル語版からビルマ語版へと言った複数の交錯した関係が窺われる。研究期間の最終年度に当る平成11年には、次の3項目を中心に研究を行なった。(1)わが国では従来その内容が明らかでなかったインドネシア語版のラーマ物語(スナルデイ編「ラーマーヤナ」)、影絵の脚本として国内で広く使用されているマレーシアのラーマ物語「チェリタ・マハラジャ・ワナ」、ポルポト政権以前のカンボジアで使われていた口承のラーマ物語「レアムケー」等、ラーマーヤナ研究では未開拓であった分野を中心にその内容および特徴を分析した。(2)マレーシア大学で10月に開催された第l回国際ラーマーヤナ・マハーバーラタ学会及びニューデリーで12月に開かれた第16回国際ラ-マーヤナ学会に出席して研究発表を行なった。前者ではスンダ語版ラーマ物語、後者では北部タイのランナ一語版ラーマ物語について、それぞれその特徴を指摘し周辺諸版との関係を明らかにした。(3)初年度および第2年度に行なった東南アジア諸国のラーマ物語(ジャワ語版、スンダ語版、タイ語版、ラオス語版、ビルマ語版、モン語版、フィリピン版、雲南省のタイ語版等)及びインド諸語版ラーマーヤナ(梵語のヴァールミーキ版、タミール語のカンパン版、テルグ語のランガナ一タ版、ベンガル語のクリッテイヴァサ版及びジャイナ教のラーマーヤナ等)の研究で解明した内容を整理して最終報告書の原稿執筆を行なった。
オーロラキナーゼ制御システムの破綻による染色体不安定性獲得機構の解明

HP1は染色体パッセンジャー複合体(CPC; Chromosomal Passenger Complex)に結合しCPCの活性を増強する。がん細胞ではこのHP1のCPCに結合する量が低下していることが分かったが、HP1によるCPC活性の減少がどのように「染色体不安定性」を発生させ、いかにがんの悪性化に寄与しうるのかは未だに不明である。本研究では、異数体細胞の導入とncRNAの関与を見いだして、染色体不安定性とCPC機能との関係、がん細胞でHP1の結合量が減少する原因を明らかにする。続いてがん幹細胞系列でCPCシステムの破綻とがんの悪性化の関連性を検討し染色体不安定性の病理機構を明らかにしたい。
超離散可積分系の等位集合の大域構造

周期的可積分セルオートマトンの等位集合に関する分配関数のフェルミ型公式と呼ばれる、組合せ論の分野における新しい数学公式を発見し証明した。また、古典可積分系として有名な戸田格子の特殊な離散化であるトロピカル周期戸田格子に対して、二色の帯によるセルオートマトン的な記述を考案し、それを用いてこの力学系の相空間構造の決定に重要な可換なフェイズフロー(一般化された時間発展)を構成することに成功した。1.周期的可積分セルオートマトン(CA)の分配関数に対するフェルミ型の公式を得たことが主な研究実績である。以下にその内容を説明する。(1)本研究はアフィン・リー代数に関連した周期的可積分CAを研究対象とする。それはソリトンと呼ばれる孤立波が相互作用しながら伝播する1次元CAであり、古典可積分系と量子可積分系を橋渡しする系の実現という点で重要な意義を持つ。(2)可積分CAは古典力学における完全積分可能系と同様に時間発展のもとで変化しない物理量の組である保存量をもつ。今の場合それは各振幅を持つソリトンの個数というデータである。与えられた保存量をもつような系の状態全体からなる集合を等位集合とよぶ。その構造を調べることが本研究の課題であった。(3)一方、統計力学の2次元可解格子模型では、角転送行列の方法により分配関数および1点関数が1次元状態和として計算され、ある場合にはそれはq二項係数をもちいた具体的公式(フェルミ型公式)として求められる。周期的可積分CAの状態に対しても、角転送行列に相当するエネルギーを用いた一種の分配関数を定義することができる。A型ランク1の場合に、等位集合上において定義されるその分配関数がフェルミ型公式で書き表せるという予想が得られていた。(4)計算機実験による予想のチェックを経て、様々な試行錯誤の末に予想を証明することができた。結果は論文にまとめ、専門誌において発表するとともに学会講演などでも解説した。この結果は「X=M予想」と呼ばれる良く知られた予想のある種の精密化を与えているという点で重要である。2.一方、ランク一般の場合の等位集合の構造の解明については計画通りの進展は見られなかった。原因は主として第1項の予想の証明を行うのに時間を大幅に費やしてしまったことにある。今年度はこちらの課題に取り組む予定で準備を進めている。本研究の目的はアフィン・リー代数に関連した周期的可積分セルオートマトンを構成し、その等位集合の構造を解明することである。平成23年度の研究成果は以下のとおりである。1.可積分セルオートマトン(箱玉系)の過去10年間の研究結果を詳しく調べ直し、記号や用語の不統一などを修正し、現在の視点から見てその内容がより明確になるような定式化を行った。その結果をレビュー論文として出版した。2.可積分系の文脈における超離散化の概念の精密化を得た。すなわち「トロピカル化」と「(狭義の)超離散化」の区別を明確化した。前者は必ずしも従属変数の離散化を意味せず、有理写像を区分的線形写像に変えるものである。この精密化は超離散周期戸田格子と呼ばれている力学系(トロピカル周期戸田格子)と周期箱玉系との区別を明確化し、前者については可換なフェイズフローの構成がいまだに成されていないという事実を明らかにしたという点で重要であると考えられる。3.前項の帰結として、超離散可積分系をトロピカル可積分系の特殊化とみなす視点が本研究の目的遂行のために有望であるという考察に到達した。4.トロピカル周期戸田格子の可換なフェイズフローを、周期箱玉系の場合の構成法および量子群の結晶基底の概念の一般化により構成可能であるという予想を得た。ハミルトン系におけるアーノルド・リウビルの定理の証明から推測されるように、フェイズフローは等位集合の構造の解明につながる重要な鍵であると考えられる。平成24年度の研究成果は以下のとおりである。1.トロピカル周期戸田格子(超離散周期戸田格子)の可換なフェイズフローを、周期箱玉系の場合の構成法の一般化および量子群の結晶基底に対する纏絡写像の一般化により構成することに成功した。この力学系については、ラックス形式に基づく離散周期戸田方程式の保存量のトロピカル化を使って定義される「スペクトル曲線」の滑らかさ(ソリトンの振幅に重複がないこと)の仮定のもとに、ヤコビ多様体のトロピカル化として等位集合を記述するという先行研究があるが、可換なフェイズフローの構成法については知られていなかった。本研究ではまずこの力学系を2色の帯により「セルのないセルオートマトン」として実現した。量子群の結晶基底を幾何学化した幾何クリスタルの理論において双有理的な纏絡写像が構成されており、その超離散化としてクリスタルの組合せ論的な纏絡写像が得られることが知られていた。

本研究では超離散化(従属変数を含む全変数離散化)はせずにトロピカル化(方程式の区分線形化)のみを行なって得られる纏絡写像の満たすヤン・バクスター関係式を用いるというアイデアにより、上述の2色の帯による記述と合わせて可換なフェイズフローの構成を行なった。結果は論文として出版し、国外および国内学会において発表した。この結果を基にして、スペクトル曲線の滑らかさを仮定しない場合の等位集合の構造に関して研究が進展中である。2.等位集合の構造を反映する概念として、周期的可積分セルオートマトンのエルゴード性を考察し、素数の性質と関連したいくつかの興味深い観察を得た。学術上の新たな知見となりうるか現在検証中である。ランクが高い場合のアフィン・リー代数に関連した周期的可積分セルオートマトンはその構造が複雑であり、さまざまな解析を試みたもののその等位集合に関する予想の証明を完成させることはできなかった。使える手法がないか、いくつかの研究会に参加して他の研究者との研究情報の交換を行ったが、あまり良いアイデアが見つかっていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績に述べたように、超離散化の概念が精密化された。これにより、問題は超離散可積分系を特殊ケースとして含む「トロピカル可積分系」の等位集合の大域構造を解明することに帰着されたように思われる。少なくともA型と呼ばれる場合については、アフィン・リー代数に関連した周期的可積分セルオートマトンを(ランクについて一般化された)トロピカル周期戸田格子の特殊ケースとして取り扱うという方針が有望であると考えられる。そのため、当初の研究計画は変更し、まずは(ランク1の)トロピカル周期戸田格子について、その等位集合の大域構造解明につながると考えられる可換なフェイズフローの構成法を完成させることをめざして研究を推進したい。
擬似乱数のための代数と統計の応用

擬似乱数生成法に対する統計的評価法として、NIST SP800-22およびTestU01は最も有名な検定パッケージである。本研究では、奥富秀俊氏・中村勝洋氏の提唱した三重検定を用いて、統計的検定が適切な精度でp値を出力できているか、実験的に評価する手法の開発とその妥当性を検証し、SP800-22およびTestU01に適用し具体的な改善方法を提唱した。とくにSP800-22は15種類すべての検定について、個々の検定に対する最新の改善手法が有効であることをシミュレーションによって示すことができた。TestU01に関しては、この研究により初めて本格的な信頼性調査を実施することができ、これまで未発見であった8つの検定法の誤りを発見し、そのうち4つの検定法については数学的・実用的観点から修正を施すことができた。これらの研究成果について広島大学の松本眞教授と共著論文を作成したところ、査読付き論文誌Mathematics and Computers in Simulationに採録された。また、本研究を基として、64ビット擬似乱数生成法に対応するTestU01の後継パッケージの開発を、提唱者のカナダモントリオール大学の研究チームと開始することとなった。さらに、2017年度に実施した、NIST SP800-22の二重検定における第2段階のサンプルサイズ上限の決定に関する研究の続きとして、これまで研究を行なった3種類の検定に加えて、新たに6種類の検定法についても上限を与えることができた。特に総当たり法では上限計算が不可能なものに対しては、モンテカルロ法による近似計算により、比較的小さいサンプルサイズで実用上十分な精度の上限を与えることができた。NISTSP800-22についてはすべての検定について、その検定の妥当性を検証することができた。特にRandom Excursions検定およびRandom Excursions Variant検定については三重検定による解析の結果、NISTが推奨するサイクル数の最小値500では検定結果のp値に偏りが見られることと、その最小値を2000程度まで大きくすれば十分な精度でp値の計算が可能であることを実験的に示すことができた。また離散フーリエ変換検定も、様々な指標で提唱された改善案を統一した尺度によよって評価し、最新の研究成果が最もよいパラメータを与えていることが判明した。TestU01についても100種類中70種類の検定法について評価が完了したことで、64ビット対応にむけての契機となる研究が実施できた。当初計画していた三重検定プログラムのコード公開については遅れているものの、二重検定のサンプルサイズに関して、これまで本研究課題で対象とした3種類の検定に加えて新たに6種類の検定について適切な上限を与えることに成功した。またモンテカルロ法を用いたp値の分布計算によってサンプルサイズの上限を近似計算しても、実用上十分な値を与えることができた。2019年度は、TestU01の64ビット版の開発、およびNISTの二重検定のサンプルサイズ上限に関する研究を行う。前者に関してはモントリオール大学を3週間程度訪問して開発を行うことと、現在未検証の離散型確率分布に従う統計量を用いた検定の三重検定による実験的評価を行う。後者に関しては7月にシドニー工科大学で開催される国際研究集会MCM 2019の擬似乱数分科会において口頭発表を行う。さらに、現時点で上限計算を実施していない6つの検定についても、数値実験を試みる予定である。また、時間的余裕があれば、物理・化学シミュレーションで用いられるソフトウェアに実装されている擬似乱数生成法について、高速化・高精度化・並列化という観点から高性能化を実現するためのプログラム開発を行う。擬似乱数生成法を評価する際、アメリカ国立標準技術研究所(NIST)の統計的検定パッケージが広く用いられている。このパッケージに含まれるいくつかの検定法に対し、二重検定時に第1段階の近似誤差が第2段階の検定に与える影響をカイ二乗食い違い量を用いて評価し、第2段階のサンプルサイズの上界を与えた。特にPareschi, Rovatti, Settiの連検定に対する効率的なp値の近似計算方法を利用して、頻度検定と階数検定と合わせ3種類の検定に対しての上界を得ることができた。これにより、これまでのサンプルサイズでは棄却できなかった線形合同法による擬似乱数生成法を頻度検定でも棄却できるなど、検出力を向上させることが可能となった。この結果に関して広島大学の松本眞教授と共著論文を作成し、査読付き報告集Proceedings of MCQMC2016での掲載が決定した。さらに、検定パッケージに含まれる個々の検定について、奥富秀俊氏・中村勝洋氏の提唱した三重検定を利用し、検定統計量の計算誤差や近似精度が適切であるかを実験的に判断する手法の確立に取り組んだ。これは第2段階の検定として計算誤差を含まないものを選択し、サンプルサイズを向上させつつ全体の近似誤差の累積を二重検定程度に抑えることで、p値の経験分布と理論的な分布の乖離をより精密に測る方法である。本年度は、NISTの最新版パッケージに含まれる13種の検定の再検証に加えて、TestU01に含まれる検定群Crushに対する健全性評価を行い、モンテカルロ法・準モンテカルロ法に関する国際研究集会MCM2017にて口頭発表を行った。NISTの二重検定に対して、平成28年度までの成果に加えて連検定に関しても適切なサンプルサイズの上界を与えることが可能となった。また、実験的にはよく知られている、第2段階のサンプルサイズが極端に大きいとどんな擬似乱数でも棄却してしまう現象について、カイ二乗食い違い量からの説明を与えることができた。

さらに、これまでは本格的な調査が行われていなかったTestU01に含まれる個々の検定の信頼性について、いくつかの理論上・実装上の誤りを具体的に指摘し、適切な改善を提案することができた。さらに離散フーリエ変換検定についても様々なパラメータが異なる視点から提唱されている状況に対して、統一的に比較する実験結果を提示した。擬似乱数生成法に対する統計的評価法として、NIST SP800-22およびTestU01は最も有名な検定パッケージである。本研究では、奥富秀俊氏・中村勝洋氏の提唱した三重検定を用いて、統計的検定が適切な精度でp値を出力できているか、実験的に評価する手法の開発とその妥当性を検証し、SP800-22およびTestU01に適用し具体的な改善方法を提唱した。とくにSP800-22は15種類すべての検定について、個々の検定に対する最新の改善手法が有効であることをシミュレーションによって示すことができた。TestU01に関しては、この研究により初めて本格的な信頼性調査を実施することができ、これまで未発見であった8つの検定法の誤りを発見し、そのうち4つの検定法については数学的・実用的観点から修正を施すことができた。これらの研究成果について広島大学の松本眞教授と共著論文を作成したところ、査読付き論文誌Mathematics and Computers in Simulationに採録された。また、本研究を基として、64ビット擬似乱数生成法に対応するTestU01の後継パッケージの開発を、提唱者のカナダモントリオール大学の研究チームと開始することとなった。さらに、2017年度に実施した、NIST SP800-22の二重検定における第2段階のサンプルサイズ上限の決定に関する研究の続きとして、これまで研究を行なった3種類の検定に加えて、新たに6種類の検定法についても上限を与えることができた。特に総当たり法では上限計算が不可能なものに対しては、モンテカルロ法による近似計算により、比較的小さいサンプルサイズで実用上十分な精度の上限を与えることができた。NISTSP800-22についてはすべての検定について、その検定の妥当性を検証することができた。特にRandom Excursions検定およびRandom Excursions Variant検定については三重検定による解析の結果、NISTが推奨するサイクル数の最小値500では検定結果のp値に偏りが見られることと、その最小値を2000程度まで大きくすれば十分な精度でp値の計算が可能であることを実験的に示すことができた。また離散フーリエ変換検定も、様々な指標で提唱された改善案を統一した尺度によよって評価し、最新の研究成果が最もよいパラメータを与えていることが判明した。TestU01についても100種類中70種類の検定法について評価が完了したことで、64ビット対応にむけての契機となる研究が実施できた。当初計画していた三重検定プログラムのコード公開については遅れているものの、二重検定のサンプルサイズに関して、これまで本研究課題で対象とした3種類の検定に加えて新たに6種類の検定について適切な上限を与えることに成功した。
体幹部組織群の配置転換現象におけるファイブロネクチンダイナミクスの役割

組織群の形態形成機構を細胞挙動とその足場(細胞外基質)制御の観点から理解する為、体節ー内胚葉ー脊索間隙に特徴的な蓄積パターンを示すフィブロネクチン(FN)繊維に注目し、その蓄積パターンが細胞挙動に果たす特異的役割、蓄積パターンができる仕組み、足場情報を細胞内へ伝える分子機構をタイムラプス観察解析により明らかにした。発生初期の平面的な組織配置パターンから立体的なからだの構造ができる際、各組織の相対的な位置関係が大きく変化する。この現象がどのような細胞生物学的なメカニズムにより制御されているのかは、謎である。このしくみを理解する手がかりとして、本研究では体節ー内胚葉ー脊索の間隙に分布する、長いファイブロネクチン繊維のパターニングに注目した。前年度までの実験で、モデル動物として用いるウズラ胚の体節・内胚葉の各細胞挙動のタイムラプス観察を行う実験系を確立し、また、ウズラのフィブロネクチン1遺伝子(全長)の単離を行い、ドミナントネガティブ型フィブロネクチンとshRNAコンストラクトを作製した。さらに、EGFP融合フィブロネクチンおよびAlexa488融合フィブロネクチンを作製し、これらをそれぞれウズラ胚内に発現または注入して、体節ー内胚葉ー脊索の間隙におけるフィブロネクチンの分布パターン変化のタイムラプス観察に成功した。平成25年度は、前年度に作製した上記ツールを用いて、ウズラ胚の体節ー内胚葉ー脊索間隙のフィブロネクチンがどの組織に由来し、どのようにして分布パターンを形成するのかを検証した。その結果、(1)フィブロネクチンは内胚葉と体節から供給されること。(2)フィブロネクチンの正常な分布には、体節上皮細胞が基底膜側に伸びる糸状仮足が関わっていること。(3)糸状仮足でのインテグリン受容体、タリンを介したアクチン細胞骨格との相互作用がフィブロネクチンパターンを制御すること。(4)糸状仮足とフィブロネクチン間の相互作用は、体節上皮細胞の伸長に重要な役割を担っていること。以上が明らかになった。1.体節・内胚葉の各細胞挙動の可視化と定量背側大動脈が側方から脊索近傍へたどり着くまでに、隣接する体節と内胚葉の細胞がどう動くのかをタイムラプス観察により詳細にするため、ウズラ胚の体節および内胚葉細胞の核をH2B-mCherryで標識し、タイムラプス観察を行った。画像解析技術をもとに、細胞群の移動速度・方向の計測、空間面積の自動抽出などの方法論を確立した。2.ウズラファイブロネクチン1遺伝子の単離とshRNA法によるノックダウン解析ファイブロネクチン遺伝子全長(7.5kb)をウズラcDNAライブラリーから単離した。機能的なフィブロネクチンであることを培養細胞を用い、確認した。また、この配列をもとにshRNA法によるノックダウンコンストラクションとドミナントネガティブ型分子を作製した。これを用い、フィブロネクチンの発現を体節近傍で局所的に阻害する実験に成功した。3.ファイブロネクチン繊維束のアッセンブル・ディスアッセンブル過程の観察ファイブロネクチンがアッセンブルする際に、外から加えたファイブロネクチンが取り込まれる性質を利用し、ウズラ胚のファイブロネクチン繊維束を以下の方法で可視化した。(1)細胞培養用のファイブロネクチンを蛍光標識。(2)作製した蛍光標識ファイブロネクチンを、ウズラ胚へマイクロインジェクションし、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタイムラプス観察した。これにより、ファイブロネクチン繊維束が、背側大動脈トランスポジションの時期に体節ー背側大動脈ー内胚葉ー脊索間にアッセンブルされ、やがて消失する現象がどのようにして起こるのかをタイムラプス観察に成功した。また、同時進行で、GFP融合型ファイブロネクチンも作製した。これも予想通りに機能することが、検証済みである。7.5kbほどの長さのウズラファイブロネクチン1遺伝子を、スムーズに単離することができた為、その後の機能解析の為の遺伝子改変(shRNAやドミナントネガティブ型、GFP融合型等の作製)が順調に進み、それらが予想どおりに機能することも確かめることができた。実験材料作りをゼロから始めたにも関わらず、すでに実験・解析の段階に進んでおり、順調である。1.ファイブロネクチン繊維束の欠損が、体節・背側大動脈・内胚葉細胞の挙動へ及ぼす影響ファイブロネクチン繊維束が、細胞群の動きに対してにどのような役割を果たしているのかを明らかにするため、ファイブロネクチンの繊維化を阻害する70kDaファイブロネクチンを局所的に発現させ、各細胞の挙動の変化をタイムラプス観察解析する。2.背側大動脈へのVEGF伝播とファイブロネクチン繊維束の分布パターンとの関わり脊索や内胚葉の中軸部で発現するVEGFは、背側大動脈のトランスポジションに必要であることがすでに知られている。VEGFアイソフォームのVEGF164は、細胞外基質への親和性が高い為、中軸組織から分泌されるVEGFがファイブロネクチンに依存して拡散し、受容体VEGFR2を発現する背側大動脈に作用すると考えられる。