hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ca^<2+>・リン脂質結合領域(C2様領域)を有する新しい蛋白質の機能と作用機構

私共が見い出したRabphilin-3AとDoc2は、リン脂質依存性にCa^<2+>と結合するC2様領域を有することから、Ca^<2+>センサーとして神経伝達物質の放出を制御している可能性がでてきている。本研究では、Rabphilin-3AとDoc2の機能と作用機構を明らかにすることによって、神経伝達物質の放出機構の全貌を分子レベルで解明することを目的としており、2年間の研究期間において以下の成果を得た。1) Rabphilin-3Aの機能と作用機構:ヤリイカの巨大シナプスの系を用いてRabphilin-3Aが実際に神経伝達物質の放出を制御していることを明らかにした。さらに、Rabphilin-3Aは、ジナプス小胞のプレシナプス膜へのドッキング過程と神経伝達物質放出後の小胞のエンドサイトーシス過程に機能していること、および、エンドサイトーシス過程では、Rabphilin-3Aは、エンドサイトーシスを制御しているRab5の標的蛋白質Rabaptin-5に直接結合して作用していることを明らかにした。2) Doc2の機能と作用機構:シナプス小胞に局在するDoc2がプレシナプス膜に局在するMunc13に結合することを明らかにした。さらに、神経細胞を用いた実験系により、この結合がシナプス小胞のプレシナプス膜へのドッキング過程の制御に関与することを明らかにした。また、Doc2のノックアウトマウスを作製して海馬のシャッファー側枝のシナプスにおける神経生理学的解析を行ない、Doc2がshort-term plasticityとlong-term potentiationの形成に機能していることを明らかにした。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成することができた。神経伝達物質の放出には、プレシナプス内へのCa^<2+>の流入が必要であるが、私共が見い出したRabphilin-3AやDoc2は、リン脂質依存性にCa^<2+>と結合するC2様領域を有することから、私共は、これらのタンパク質がCa^<2+>センサーとして神経伝達物質の放出を制御していると考えている。本研究では、Rabphilin-3AやDoc2の機能と作用機構を明らかにすることによって、神経伝達物質の放出機構の全貌を分子レベルで解明することを目的としており、本年度は以下の成果を得た。1)Rabphilin-3Aの機能と作用機構:ヤリイカの巨大シナプスの系を用いてRabphilin-3Aが実際に神経伝達物質の放出を制御していることを明らかにした。さらに、その際、Rabphilin-3Aは、シナプス小胞のプレシナプス膜へのドッキングと神経伝達物質の放出後のシナプス小胞の取り込みに機能していることが明らかになった。2)Doc2の機能と作用機構:シナプス小胞に局在するDoc2がプレシナプス膜に局在するMunc13に結合することを見い出した。さらに、Doc2のMunc13結合領域のペプチドを用いた細胞生物学的解析により、Doc2とMunc13の結合が神経伝達物質の放出において機能していることを明らかにした。また、Doc2のノックアウトマウスを作製して神経生理学的解析を行ない、Doc2がシナプス小胞のreadily releasable poolからの放出を阻害すると共に、シナプス小胞のreserve poolからreadily releasable poolへの移動を促進するのに機能していること、さらには、海馬のシャッファー側枝のシナプスにおけるLong-Term Potentiationにも関与していることを明らかにした。このように、本年度の研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成することができた。

本研究では、Rabphilin-3AとDoc2の機能と作用機構を明らかにすることによって、神経伝達物質の放出機構の全貌を分子レベルで解明することを目的としており、本年度は以下の成果を得た。1) Rabphilin-3Aの機能と作用機構:連続した刺激に反応して神経伝達物質が放出されるためには、シナプス小胞がプレシナプス膜に融合直後にエンドサイトーシスされる必要がある。私共はRabphilin-3Aがエンドサイトーシスを制御しているRab5の標的蛋白質Rabaptin-5に結合し、エンドサイトーシスの制御にも関与していることを明らかにした。2) Doc2の機能と作用機構:神経細胞を用いた実験系により、Doc2αはMunc13と結合してシナプス小胞のプレシナプス膜へのdockingの過程を制御することにより神経伝達物質の放出に機能していることを明らかにした。また、Doc2αのノックアウトマウスを作製して海馬のシャッファ一側技のシナブスにおける神経生理学的解析を行ない、Doc2αがshort-term plasticityとlong-term potenti一ationの形成に機能していることを明らかにした。さらに、Doc2βは微小管モーターであるダイニンの軽鎖tctex-1に結合して、微小管依存性の小胞輸送の制御に関与することを明らかにした。このように、本年度の研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成することができた。
高温・室温強度に優れるアルミナ粒子分散Ti-Al/チタン複合調和組織材料の開発

ネットワーク領域にアルミナ分散Ti-Al合金および分散領域に純Tiを有する複合調和組織材料を作製した。室温ビッカース硬さ試験により、複合調和組織材料の分散領域の硬さは207 HV、ネットワーク領域の硬さは845 HV、全体の硬さは234 HVであることが明らかとなった。高温ビッカース硬さ試験により、873 Kおよび1073 Kではそれぞれ102、81 HVを示した。ビッカース圧子の押し込みにより発生したクラックの進展を分散配置領域が抑制していることから、複合調和組織材料は室温において強度と延性を両立することが示唆される。作製した焼結体の期待される使用環境温度は873 Kまでである。Ti-Al合金の室温高温における機械的特性を改善するために,複合調和組織制御および燃焼反応プロセスを利用し,アルミナ分散TiAl合金/と純チタンによる複合調和組織材料を作製し,その機械的特性を評価した。純アルミ粉末とチタニア粉末を混合しメカニカルミリング処理を施すことで混合粉末作製後に熱処理を施すことにより,燃焼反応が起き,アルミナ粒子分散TiAl粉末を作製することができる.そして,このアルミナ分散TiAl粉末と純チタン粉末と混合し,再びメカニカルミリング処理を施すことにより,純チタンの外殻部にアルミナ分散TiAl粉末がコーティングされた複合化粉末を作製することができ,さらに放電プラズマ焼結することにより,本研究の目的の一つであるアルミナ粒子分散Ti-Al/チタン複合調和組織材料を作製することができる.ビッカース硬さ試験により,アルミナ粒子分散Ti-Al/チタン複合調和組織材料の硬さは従来のTi-Al合金/純Ti複合調和組織材料よりも大きく増加しており,組織全域の硬さも改善され,580 HVとなった.高温環境下におけるビッカース硬さ試験より,本研究で作製した複合調和組織材料は873 K以上の環境下では硬さが著しく低下することが明らかとなった.これは高温では小型の圧子のためネットワーク領域による塑性変形抑制効果が十分に働かなかったためであると考えられる.次年度は,より低温かつ大荷重で焼結することができるように超硬型による放電プラズマ焼結を試み,高温環境下においても高い硬さを期待できる複合調和組織材料を作製する予定である.また,ビッカース圧子の押し込みにより発生したクラックの進展をネットワーク領域が抑制していることから,本研究で作製した複合調和組織材料は高温環境下で強度と延性を両立することが示唆される.昨年度に引き続き,Ti-Al合金の室温や高温における機械的特性を改善するため,複合調和組織制御および燃焼反応プロセスを利用して,アルミナ分散TiAl合金/純チタン複合調和組織材料の作製および機械的特性の評価を試みた.昨年度の問題点であった焼結性の問題は,超鋼製のパンチとダイスを用い,下記の手順で焼結することにより改善することができた.Al粉末とTiO2粉末をモル比7:3の割合で,300 rpm,180 ksのメカニカルミリング処理を行い,Al/TiO2混合粉末を作製し,その後,Al/TiO2混合粉末を1073K,Ar雰囲気で燃焼反応処理を行うことにより,Al2O3分散TiーAl合金粉末を作製した.純TiとAl2O3分散TiーAl合金粉末を体積比9:1 7:1となるように混合し,200 rpm,72 ksでメカニカルミリング処理を行うことで得られた複合粉末を放電プラズマ焼結装置により,真空雰囲気中で1023 K, 200 MPa,保持時間1.8 ksの条件で超鋼製のダイスとパンチを用いて焼結した.作製した焼結体は純Ti,TiAl,Ti3Al,Al2O3で構成されており,ネットワーク領域はTi-Al合金(TiAl,Ti3Al)の母相にAl2O3粒子が分散した組織,分散領域は純Tiであることが明らかとなった.作製した焼結体の硬さは234HVとなっており,従来のTi-Al合金/純Ti複合調和組織材料と比較しても同程度であった.またネットワーク領域ではAl2O3粒子が分散しているため,硬さは845HVと非常に高い.引張試験結果では,破断面は延性を示す断面であったが,いずれの焼結体も弾性域で破断した.これはネットワーク領域が低密度であるためであると考えられる.ネットワークを高密度化すればAl2O3分散Ti-Al合金/純Ti複合調和組織材料はさらなる延性を示すことが期待される.調和組織制御および燃焼反応プロセスを利用して,超鋼ダイスと超鋼パンチの導入により,低温で高圧での放電プラズマ焼結が可能となり,さらなる機械的特性改善の可能性を示すことができたためAl2O3分散Ti-Al合金複合材料および純Tiによる複合調和組織材料を作製し,その組織と機械的特性を評価した.純Al粉末とTiO2粉末をモル比7:3の割合で混合し300 rpm,180 ksの条件でメカニカルミリング(MM)処理を施すことで混合粉末を作製した.その混合粉末に1073 Kで熱処理を施すことにより,TiAlの母相に200nmのAl2O3粒子が分散した複合粉末を作製できる.そのAl2O3分散Ti-Al合金複合粉末を30 vol%の割合で純Ti粉末と混合し,200 rpm,36 ksの条件でMM処理を施すことにより,純Tiの外殻部にTiAl/Al2O3複合粉末がコーティングされた複合化粉末を作製することができた.その複合化

粉末をSPSにより焼結することにより,複合調和組織材料を作製できる.作製した複合調和組織材料は, Al2O3分散Ti-Al合金複合材料のネットワーク領域と純Tiによる分散配置領域によって構成されている.ネットワーク領域は平均粒子径200 nmのAl2O3粒子がTiAlに分散した組織であり,分散配置領域は平均結晶粒径が40 μmの均一粗大粒組織である.ビッカース硬さ試験により,複合調和組織材料の分散配置領域の硬さは209 HV,ネットワーク領域の硬さは846 HV,全体の硬さは234 HVであることが明らかとなった.ネットワーク領域の硬さは従来のTi-Al合金/純Ti複合調和組織材料よりも大きく増加している一方,分散領域の硬さは同程度に抑えることができる.高温ビッカース硬さは、873 Kで102 HV,1073 Kで81 HVであった.293,873 KにおいてTi領域へのクラックの進展は確認できず,1073 Kの環境下においてTiへのクラックの進展が確認できた.このことより本研究で作製した焼結体の想定される使用環境温度は873 K程度である.ネットワーク領域にアルミナ分散Ti-Al合金および分散領域に純Tiを有する複合調和組織材料を作製した。室温ビッカース硬さ試験により、複合調和組織材料の分散領域の硬さは207 HV、ネットワーク領域の硬さは845 HV、全体の硬さは234 HVであることが明らかとなった。高温ビッカース硬さ試験により、873 Kおよび1073 Kではそれぞれ102、81 HVを示した。ビッカース圧子の押し込みにより発生したクラックの進展を分散配置領域が抑制していることから、複合調和組織材料は室温において強度と延性を両立することが示唆される。作製した焼結体の期待される使用環境温度は873 Kまでである。十分な機械的特性を未だ示さないが、複合調和組織制御と燃焼反応プロセスを利用したアルミナ分散Ti-Al/純チタン複合調和組織材料の作製に成功したため。引き続き、アルミナ分散TiAl合金/純チタン複合調和組織材料創製プロセスの改良を検討し、得られた材料の機械的特性を評価する。特に、高温強度特性を評価する予定である。これらの結果を考慮し、優れた機械的特性の発現メカニズムを検討し、研究統括を行う予定である。材料工学アルミナ分散Ti-Al/純チタン複合調和組織材料の作製において、複合化粉末の時点では期待通りの強度を有する材料作製が可能である。しかしながら,高温で焼結することで拡散が進行し、焼結体では期待通りの機械的特性を示さない。これは焼結温度が高すぎることが原因であるが、焼結温度を下げると密度が十分ではなくやはり機械的特性は劣る。そこで、今後は高圧に耐えうる超硬型を導入し、低温かつ高圧での焼結体の作製を試みる予定である。以上のように、問題点はおおむね明らかであるので、アルミナ分散Ti-Al/純チタン複合調和組織材料創製プロセスの改善を行い、それらの材料の室温および高温の機械的特性評価を行う予定である。本研究に関連する学会発表や情報収集のための旅費において、比較的近隣地域での開催が多く、他の研究予算などの支出もあり差額が生じた。また、電子顕微鏡試料作製用装置は、当初の予算よりも安価なものを購入できたため差額が生じた。
遷移金属触媒の精密制御を基軸とする多環性高次構造アルカロイドの革新的合成

近年の医薬リード化合物の枯渇問題を受け、特異かつ複雑な骨格を有する生物活性天然物に注目が集まっている。しかし、高度に官能基化した天然物の合成は、現代の精密有機化学をもってしても容易ではなく、目的化合物の満足のいく量的供給や構造活性相関研究を視野に入れた誘導体合成は困難である。このような背景のもと、本研究課題では、高機能性金属触媒を用いたタンデム触媒反応や高活性金属触媒を用いた酸素酸化触媒反応の開発を基盤とし、高次構造多環性アルカロイドの革新的全合成に取り組んでいる。1)タンデム触媒反応を基軸とする多環性含窒素の迅速合成において、本年度は以下の成果を得た。昨年度確立したカチオン性金触媒によるオートタンデム触媒機構を経るピロロピリミジン合成法を基軸とし、グアニジンを有する多環性アルカロイド、デヒドロバツェラジンCの不斉全合成を達成した。さらに、確立した合成経路をもとに、鍵工程に用いるアルキンの炭素数や合成終盤でのアシル化の炭素数を調整することで、側鎖の異なるバツェラジンEの全合成研究にも取り組み、主骨格の形成に成功した。2)生体触媒を模倣した高活性酸化触媒を基軸とする二量体型天然物の収束的合成において、本年度は以下の成果を得た。アルストニアアルカロイドを母骨格とする高度に縮環した二量体型天然物ビプレイオフィリンの合成研究に取り組んだ。これまで申請者らは、鉄フタロシアニンを用いたインドールの酸素酸化による触媒的二量化反応を開発している。独自に開発した本酸素酸化を、インドールとカテコールとのヘテロカップリングに応用し、ビプレイオフィリンの部分骨格の構築に成功した。酸素を利用した本条件は、高い化学選択的を有しており、合成終盤での酸化的カップリングによるビプレイオフィリンの収束的全合成の達成が期待される。昨年度確立したカチオン性金触媒によるオートタンデム触媒反応を活用し、グアニジンを有する多環性アルカロイド、デヒドロバツェラジンCのラセミ合成および不斉合成の合成経路を確立した。さらに、確立した合成経路の多様性合成への有用性を立証すべく側鎖の異なるバツェラジンEの合成研究に取り組み、側鎖導入とグアニジンを含む3環性主骨格を合成に成功した。さらに二量体型天然物ビプレイオフィリンの合成研究においては、独自に開発した鉄触媒によるアミンの酸素酸化反応を応用し、インドールとカテコール誘導体とのヘテロカップリングに成功した。1)タンデム触媒反応を基軸とする多環性含窒素の迅速合成においては、本年度確立したデヒドロバツェラジンCの不斉全合成を基盤とし、その類縁体化合物であるバツェラジンEの不斉全合成を達成する。これにより、オートタンデム触媒を用いた本合成経路の多様性合成としての有用性を実証する。また、2)生体触媒を模倣した高活性酸化触媒を基軸とする二量体型天然物の収束的合成において、本年度取り組んだトリプトファン誘導体の酸化的二量化を経るメリナシディンIVの全合成研究を継続して実施する。さらに、本年度確立したインドールとカテコール誘導体の酸素酸化を経る新規ヘテロカップリング反応を応用し、モノテルペンインドール由来二量体型生物活性天然物、ビプレイオフィリンの収束的全合成を達成する。本年度は、多くの医薬品の基本骨格をなし、さらには農薬や染料、有機ELなどの機能性分子においても見られる含窒素芳香族環に着目し、酸素を化学因子とするGrubbs触媒を用いた新たなアシスト型タンデム反応の開発に成功した。すなわち、アリル側鎖を有するインドリンに、Grubbs型触媒を用いた閉環メタセシスを行なった後、酸素添加によるRu触媒の構造変化を伴った触媒機能のスイッチングを行ない、アミンの酸素酸化反応が進行した非対称性カルバゾールの合成に成功した。さらに本手法は、フェナジンやアクリジン等の様々な含窒素複素芳香族化合物の合成にも応用可能であり、天然物ピオシアニンの全合成を達成した。また、カチオン性金触媒がアルキンの求核性と求電子性の向上に働く、触媒の二元的性質に着目し、新規オートタンデム触媒反応の開発にも取り組んだ。その結果、三成分より収束的に合成可能なアセタールを有するウレアに対し、アルキンと独自に開発したカチオン性金錯体の添加により、鎖状の基質からのカスケード型連続環化反応が進行し、二環性のピロロピリミジン骨格が一挙に得られることを見出した。本手法は、基質合成における各成分やアルキン部を適宜変更することで、多様性合成へと展開可能である。Grubbs触媒を用いた新たなアシスト型タンデム反応を確立しただけでなく、カルバゾールやフェナジン、アクリジン等の様々な含窒素複素芳香族化合物の合成にも応用した。さらに天然物ピオシアニンの全合成を達成し、本手法の有用性を実証した。

カチオン性金触媒によるオートタンデム触媒反応の開発においては、新たなカチオン性金触媒の創製に成功し、カスケード型連続環化反応によるピロロピリミジン骨格の迅速合成法を確立に成功した。近年の医薬リード化合物の枯渇問題を受け、特異かつ複雑な骨格を有する生物活性天然物に注目が集まっている。しかし、高度に官能基化した天然物の合成は、現代の精密有機化学をもってしても容易ではなく、目的化合物の満足のいく量的供給や構造活性相関研究を視野に入れた誘導体合成は困難である。このような背景のもと、本研究課題では、高機能性金属触媒を用いたタンデム触媒反応や高活性金属触媒を用いた酸素酸化触媒反応の開発を基盤とし、高次構造多環性アルカロイドの革新的全合成に取り組んでいる。1)タンデム触媒反応を基軸とする多環性含窒素の迅速合成において、本年度は以下の成果を得た。昨年度確立したカチオン性金触媒によるオートタンデム触媒機構を経るピロロピリミジン合成法を基軸とし、グアニジンを有する多環性アルカロイド、デヒドロバツェラジンCの不斉全合成を達成した。さらに、確立した合成経路をもとに、鍵工程に用いるアルキンの炭素数や合成終盤でのアシル化の炭素数を調整することで、側鎖の異なるバツェラジンEの全合成研究にも取り組み、主骨格の形成に成功した。2)生体触媒を模倣した高活性酸化触媒を基軸とする二量体型天然物の収束的合成において、本年度は以下の成果を得た。アルストニアアルカロイドを母骨格とする高度に縮環した二量体型天然物ビプレイオフィリンの合成研究に取り組んだ。これまで申請者らは、鉄フタロシアニンを用いたインドールの酸素酸化による触媒的二量化反応を開発している。独自に開発した本酸素酸化を、インドールとカテコールとのヘテロカップリングに応用し、ビプレイオフィリンの部分骨格の構築に成功した。酸素を利用した本条件は、高い化学選択的を有しており、合成終盤での酸化的カップリングによるビプレイオフィリンの収束的全合成の達成が期待される。昨年度確立したカチオン性金触媒によるオートタンデム触媒反応を活用し、グアニジンを有する多環性アルカロイド、デヒドロバツェラジンCのラセミ合成および不斉合成の合成経路を確立した。さらに、確立した合成経路の多様性合成への有用性を立証すべく側鎖の異なるバツェラジンEの合成研究に取り組み、側鎖導入とグアニジンを含む3環性主骨格を合成に成功した。さらに二量体型天然物ビプレイオフィリンの合成研究においては、独自に開発した鉄触媒によるアミンの酸素酸化反応を応用し、インドールとカテコール誘導体とのヘテロカップリングに成功した。本年度確立したカチオン性金触媒によるオートタンデム触媒反応を基盤とし、用いる基質やアルキン構造を調整し、クランベシジン類やサキシトキシンの全合成研究を展開する。また、高活性金属触媒を用いた酸素酸化触媒反応の開発を基盤とし、トリプトファン誘導体の酸化的二量化を経るメリナシディンIVの全合成研究を行なう。1)タンデム触媒反応を基軸とする多環性含窒素の迅速合成においては、本年度確立したデヒドロバツェラジンCの不斉全合成を基盤とし、その類縁体化合物であるバツェラジンEの不斉全合成を達成する。これにより、オートタンデム触媒を用いた本合成経路の多様性合成としての有用性を実証する。
形態の非対称性の起源

私たちの体は、頭尾・背腹・左右という3つの極性(体軸)を持っている。このような形態の非対称性は、発生のどの時期において、どのような仕組みで生じるのか?本研究では,マウスの胚発生において、左右と頭尾の極性の起源を解明する。左右の極性については、対称性を破る働きをする繊毛の形成・運動動態の制御の機構と,繊毛運動が作り出す水流シグナルが受容される機構を明らかにしようとした。当該年度において、以下の研究成果を得た。1)繊毛形成に必須なCluap1, Ift46, Ift88因子が、繊毛形成が誘導されると細胞質内にSpot状に集積すること、2)繊毛の運動性に必要な因子であるCfap53(Ccdc11)は、軸糸内で微小管やdocking complexにタイトに結合した状態で存在し,ダイニン外腕を安定に微小管へ結合させていること、3)ノード脇の不動繊毛は、水流を感知するとCa2+の流入を促すこと、4)水流を感知してCa+2が流入すると、RNA蛋白質Bicc1などを介してCerl2 mRNAが崩壊すること。一方、頭尾の極性や着床前胚における細胞分化の非対称性の起源については、卵細胞で発現する母性因子に注目した。とくに、70種類のEpigeneticsを制御する因子の卵巣内での発現を調べた結果、その半数以上が卵細胞や顆粒膜細胞で発現することがわかった。そのうちで、卵細胞に特異的に発現する因子(5つ)について、母性因子としての役割の有無を調べるために、卵細胞特異的な遺伝子欠損マウスを作成した。研究は概ね順調に進んだが,2つの研究計画は、当初の予想よりも遅れた。1)ノード脇に存在する水流を感知している不動繊毛は、機械刺激に反応しているのか?:光ピンセットを使ってこの問題に取り組んでいた共同研究者は、当初は2018年4月に理研のラボに合流して、この問題に取り組む予定であったが、本人が事故に会い怪我をしたために、合流が1年遅れた。2)卵巣から作った切片を用いたin situ hybridizationで、卵細胞で発現するepigenetic制御因子を探索したが,切片のin situ hybridizationに技術的な問題が生じ、その解決に半年を要した。1)ノード繊毛の形成と運動性獲得の機構:Cluap1, Ift46, Ift88が集積することの繊毛形成に置ける意義・役割を明らかにする。Ccdc11(Cfap53)が、なぜノード繊毛の運動性だけに必要なのか(他の繊毛の運動性には必要とされない)を解明する。2)ノード脇の不動繊毛が水流を感知する際のCa2+の役割:水流に反応して繊毛から流入すると思われるCa2+の、左右非対称性における役割を調べる。4)ノード脇に存在する水流を感知している不動繊毛は、機械刺激に反応しているのか?:光ピンセットの実験系を立ち上げ、ノードの不動繊毛が機械刺激に反するか否かを明らかにする。もし機械刺激に反応するなら、なぜ左側の不動繊毛だけが反応するのかを調べる。5)Epigeneticsを制御する因子の母性因子としての役割:5種類の卵細胞特異的な変異マウスのPhenotypeを調べ、母性因子としの役割を持つか否かを明らかにする。母性因子として働く因子については、ゲノム中の標的部位、制御される遺伝子を同定する。1)ノード脇に存在する水流を感知している不動繊毛は、機械刺激に反応しているのか?

:光ピンセットを使ってこの問題に取り組んでいた共同研究者は、当初は2018年4月に理研のラボに合流して、この問題に取り組む予定であったが、本人が事故に会い怪我をしたために、合流が1年遅れた。2)卵巣から作った切片を用いたin situ hybridizationで、卵細胞で発現するepigenetic制御因子を探索したが,切片のin situ hybridizationに技術的な問題が生じ、その解決に半年を要した。1)ノード繊毛の形成と運動性獲得の機構:Cluap1, Ift46, Ift88が集積することの繊毛形成に置ける意義・役割を明らかにする。Ccdc11(Cfap53)が、なぜノード繊毛の運動性だけに必要なのか(他の繊毛の運動性には必要とされない)を解明する。2)ノード脇の不動繊毛が水流を感知する際のCa2+の役割:水流に反応して繊毛から流入すると思われるCa2+の、左右非対称性における役割を調べる。4)ノード脇に存在する水流を感知している不動繊毛は、機械刺激に反応しているのか?:光ピンセットの実験系を立ち上げ、ノードの不動繊毛が機械刺激に反するか否かを明らかにする。もし機械刺激に反応するなら、なぜ左側の不動繊毛だけが反応するのかを調べる。5)Epigeneticsを制御する因子の母性因子としての役割:5種類の卵細胞特異的な変異マウスのPhenotypeを調べ、母性因子としの役割を持つか否かを明らかにする。母性因子として働く因子については、ゲノム中の標的部位、制御される遺伝子を同定する。
HER2新規結合分子サイトケラチン19に着目したHER2活性癌の新規治療法

HER2蛋白は、肺癌・乳癌などの腫瘍で活性化している。既存のHER2分子標的薬は効果や薬剤耐性の問題があり、HER2活性化腫瘍への新しい治療戦略が求められている。申請者らは、細胞骨格の中間フィラメントの一つであるサイトケラチン19(CK19)がHER2蛋白に細胞内で直接結合し、HER2蛋白・下流シグナルを活性化することを見出しており、本研究は、HER2-CK19相互結合に注目したHER2活性化腫瘍の治療戦略を開発することを目的とした。2年間で、肺癌におけるHER2-CK19の細胞内局在、HER2-CK19相互活性に関連する遺伝子群の同定を行い、RNA干渉を用いたCK19抑制実験をin vitroで行い、肺癌において一定の腫瘍増殖抑制効果を認めた。パスウエイ解析・Gene Set Enrichment解析によりHER2-CK19共発現の関連経路として同定したRAS-Erk経路の抑制実験を、Erk活性化を認めるEGFR-TKI耐性株で行った。派生的な研究として、HER2活性腫瘍に対する新規TKIの治療効果を検討した(1RAS-Erk経路に着目し、Erk活性化を示したEGFR-TKI耐性株に対し、MEK阻害剤Trametinibの効果を検討し、MEK/PI3Kを同時阻害するcombination療法が有効であることを同定2HER2分子標的薬(Afatinib)の治療効果を胃癌細胞株でin vitro・in vivoに検討3Afatinibの適応を有しない腫瘍において網羅的遺伝子解析によりHER2変異を同定し、その臨床効果を報告)。今年度は、さらには派生的な研究を進め、HER2活性型肺癌に対して、汎HER阻害剤Neratinibが有効であることをin vitro・in vivoに検討し、報告した。HER2蛋白は、肺癌・乳癌・胃がんなど多くの腫瘍で活性化している。一方、既存のHER2分子標的薬は効果や薬剤耐性の問題があり、HER2活性化腫瘍への新たな治療戦略が求められている。申請者らは、細胞骨格の中間フィラメントであるサイトケラチン19(CK19)が、HER2に直接結合してその活性化に関与していることをこれまでに新たに発見しており、今回HER2-CK19相互結合に着目したHER2活性化腫瘍の新たな治療戦略を開発することを本研究の目的とした。初年度は、「HER2-CK19の細胞内局在診断」と「HER-CK19相互活性に関連する遺伝子群やパスウエイの発現アレイデータを用いた同定」を行うことで、HER2-CK19活性化腫瘍の病態解明を目指した。1)細胞内局在診断では、in vitroとin vivoに、免疫沈降法と免疫染色法を用いて、肺癌細胞株と肺癌臨床検体(n=86)に関して検討し、CK19高発現例では、HER2も高発現していることが有意に多く、かつ、いずれも細胞表面に共発現している(すなわち、細胞膜近傍で結合している可能性)ことを見い出した。初年度の計画は前述のように、研究実施計画書に記載した通り進んでいる。すでに、次年度のRNA干渉を用いたCK19発現抑制実験も肺癌に限って終了している。初年度は、肺癌におけるHER2-CK19の細胞内局在、HER2-CK19相互活性に関連する遺伝子群の同定を行い、RNA干渉を用いたCK19抑制実験をin vitroで行い、肺癌において一定の腫瘍増殖抑制効果を認めた。今年度は、パスウエイ解析・Gene Set Enrichment解析によりHER2-CK19共発現の関連経路として同定したRAS-Erk経路の抑制実験を、Erk活性化を認めるEGFR-TKI耐性株で行った。また、派生的な研究として、HER2活性腫瘍に対する新規TKIの治療効果を検討した。2)HER2分子標的薬(Afatinib)の治療効果を胃癌細胞株でin vitro・in vivoに検討して報告した。さらにAfatinibの適応を有しない腫瘍において網羅的遺伝子解析によりHER2変異を同定し、その臨床効果を報告した。HER2-CK19共発現に関連するパスウェイとして、RAS-Erk経路・炭素代謝経路を同定し、RAS-Erk経路阻害剤であるMEK阻害とPI3K阻害のcombination療法が、EGFR-TKI耐性株に対して、有効であることを同定した(現在、投稿中)。また、HER2活性型腫瘍に対する新規HER2阻害の治療効果と耐性化について検討し、HER2活性型腫瘍に関する研究を進めることはできたが、HER2-CK19活性に特化した有用な阻害療法の同定までは至っていないため。今後は、さらにドラッグリポジショニング解析を行い、HER2-CK19阻害効果を示す新規薬剤の同定とその効果の検討を試みる。

申請者らは、細胞骨格の中間フィラメントの一つであるサイトケラチン19(CK19)がHER2蛋白に細胞内で直接結合し、HER2蛋白・下流シグナルを活性化することを見出しており、本研究は、HER2-CK19相互結合に注目したHER2活性化腫瘍の治療戦略を開発することを目的とした。2年間で、肺癌におけるHER2-CK19の細胞内局在、HER2-CK19相互活性に関連する遺伝子群の同定を行い、RNA干渉を用いたCK19抑制実験をin vitroで行い、肺癌において一定の腫瘍増殖抑制効果を認めた。パスウエイ解析・Gene Set Enrichment解析によりHER2-CK19共発現の関連経路として同定したRAS-Erk経路の抑制実験を、Erk活性化を認めるEGFR-TKI耐性株で行った。派生的な研究として、HER2活性腫瘍に対する新規TKIの治療効果を検討した(1RAS-Erk経路に着目し、Erk活性化を示したEGFR-TKI耐性株に対し、MEK阻害剤Trametinibの効果を検討し、MEK/PI3Kを同時阻害するcombination療法が有効であることを同定2HER2分子標的薬(Afatinib)の治療効果を胃癌細胞株でin vitro・in vivoに検討3Afatinibの適応を有しない腫瘍において網羅的遺伝子解析によりHER2変異を同定し、その臨床効果を報告)。今年度は、さらには派生的な研究を進め、HER2活性型肺癌に対して、汎HER阻害剤Neratinibが有効であることをin vitro・in vivoに検討し、報告した。平成29年度と30年度は、RNA干渉を用いたCK19発現抑制の、in vitro & in vivoでの抗腫瘍効果の検討を行うとともに、ドラッグリポジショニング解析法を活用して、新たなHER2-CK19相互作用阻害剤の同定を試みることを計画している。すでに、RNA干渉を用いたCK19抑制実験は、in vitroに開始し、肺癌では主だった結果がでており、今後乳癌・胃癌において同様の検討をしていく予定である。本抑制実験の正常組織への影響や、小ヘアピンRNAによるCK19発現抑制ヌードマウスXenograftモデルを作成して、in vivoでの抗腫瘍効果の検討を、今後視野に入れている。HER2-CK19活性化腫瘍に対する治療戦略の樹立が上記アプローチで困難な場合は、HER2-CK19活性化細胞株の発現プロファイルを、ドラッグリポジショニング手法を用いて解析し、候補薬物を抽出して、前述のアッセイにより抗腫瘍効果や正常組織への影響を検討して、HER2-CK19活性化阻害の早期臨床応用の可能性を探る。可能であれば、既存のHER2分子標的薬との相加相乗効果の評価も行う。申請者らの既報でも、HER2-CK19活性型腫瘍ではErk活性が認められるため、MEK阻害剤および他の阻害剤(PI3K阻害など)とのCombination療法について、EGFR-TKI耐性株のみならず、HER2-CK19活性化腫瘍に対して、その可能性を検討する。また、HER2活性型腫瘍におけるHER2阻害剤に対する薬剤耐性克服に対する取り組みも考慮する。ドラッグリポジショニング解析・発現解析よりHER2-CK19活性阻害作用に特化した新規候補薬が同定できれば、単剤およびCombination療法を試みて、その効果を検討する。額に制限があり、適切な使途で使用することが当時できませんでした。
高齢者のセルフ・ネグレクトに影響を及ぼす要因に関する日韓比較研究

セルフ・ネグレクトは,自分自身の健康と安全を自ら放任・放置する行為であり,支援や治療の拒否・放棄のみならず,責任を果たせない多頭飼育や不用品の収集からゴミ屋敷の状態に至る場合もあり,その状態が続くと誰にも看取られずに自宅で死亡する孤立死に至るリスクが高まるとされている.しかし,セルフ・ネグレクトに予防的介入が求められる今日,セルフ・ネグレクトがどのような要因により生じるのか,その因果関係に対する検討が十分に行われていない.本研究では,日韓両国においてセルフ・ネグレクトとそれに影響する要因との因果関係を実証的に検討し,高齢者のセルフ・ネグレクトを断ち切る予防・支援モデルを構築することを目指す.セルフ・ネグレクトは,自分自身の健康と安全を自ら放任・放置する行為であり,支援や治療の拒否・放棄のみならず,責任を果たせない多頭飼育や不用品の収集からゴミ屋敷の状態に至る場合もあり,その状態が続くと誰にも看取られずに自宅で死亡する孤立死に至るリスクが高まるとされている.しかし,セルフ・ネグレクトに予防的介入が求められる今日,セルフ・ネグレクトがどのような要因により生じるのか,その因果関係に対する検討が十分に行われていない.本研究では,日韓両国においてセルフ・ネグレクトとそれに影響する要因との因果関係を実証的に検討し,高齢者のセルフ・ネグレクトを断ち切る予防・支援モデルを構築することを目指す.
食品の非熱的処理における細菌死滅挙動の変動要因の解明と高精度予測モデルの開発

非熱処理の一つである高圧処理における殺菌効果に及ぼす種々の環境要因を定量的に評価して,従来の死滅曲線を求めるモデル化手法とは異なる殺菌効果予測モデルを実際の食品系において開発した。また,高圧処理によって生ずる損傷菌の回復を制御するために,高圧処理後に温和な加熱処理を施す手法を開発した。さらに,損傷回復制御条件の最適化のための数理モデルを開発し,必要に応じた処理条件の選定を可能とした。平成18年度は、超高圧処理および電解水処理の殺菌効果に及ぼす細菌側の変動要因の影響解明を目的として研究を推進した結果、以下の知見を得た。1.菌株の違い超高圧処理および電解水処理による複数の菌株(6株ずつ)に対する病原性細菌(対象にはグラム陽性菌としてListeria monocytogenes、グラム陰性菌としてSalmonella spp)の死滅条件の違いを検討した。その結果、菌株によって圧力耐性あるいは薬剤耐性に大きな違いがあることが見出された。この結果から、最も抵抗性の強い菌株を殺菌モデル開発の対象菌に選抜した。2.生育ステージ(対数増殖期、定常期)の違い生育ステージの異なる細菌に対する超高圧処理および電解水処理による殺菌効果を検討した。一般に対数増殖期の細菌は各種ストレスに対して感受性が高いため、殺菌されやすいと考えられている。一方、定常期の細菌は比較的ストレスに対して抵抗性を示すと考えられている。しかし、実際にどの程度の殺菌効果の違いとして現れるかについての定量的な検討はないなかったことから、生育ステージを6時間毎に区分して、殺菌処理を施した結果、培養18時間程度までは抵抗性が低いが、2436時間の培養細胞は殺菌処理に対して高い抵抗性を示した。一方、48時間まで培養時間を延長すると、抵抗性は低くなることが明らかとなった。3.存在形態(単体か菌塊またはバイオフィルム)の違い固体表面上にバイオフィルムを作成して、その状態での超高圧処理および電解水処理による殺菌効果を検討した。固体表面(ステンレス片)にバイオフィルムを形成した場合にも、各種の処理に対して抵抗性が高まることが明らかとなった。以上の結果を考慮して、適切なモデル開発のための実験データ取得計画の策定につなげた。平成19年度は、昨年度の結果,すなわち非熱処理における殺菌効果に及ぼす種々の環境要因を定量的に評価して,高圧処理における殺菌効果の予測を可能とすると数理モデルの開発に従事した。その結果,以下の速度論的モデルと確率論的モデルとを開発した。1.非熱的処理の速度論的なモデルの開発超高圧処理あるいは電解水処理による細菌死滅の経時変化はWeibull frequency distributionに従うことが近年報告されている。そこで、19年度ではまず経時変化について基本モデルにWeibull関数を用いて、死滅経時変化予測モデルを構築した。さらに,これまでの曲線回帰手法ではない,微分方程式を基本モデルとする新たな殺菌予測モデルを構築した。本モデルは変動する圧力条件下での殺菌効果(細菌数の減少)を高い精度でシミュレートすることを可能とした。2.非熱的処理の確率論的殺菌予測モデルの開発従来の死滅曲線を求めるモデル化手法とは異なる殺菌効果予測モデルを開発した。本モデルでは殺菌処理による細菌の挙動を死滅可能性として捉えることで,食品加工において必要とする殺菌効果(対数減少量)を的確にかつ容易に推定可能となった。さらに,その効果の確実性(確率)をも同時に推定できることから,新たな殺菌効果指標モデルとして発展することが期待できる。平成20年度は、昨年度の結果,すなわち非熱処理における殺菌効果に及ぼす種々の環境要因を定量的に評価して,高圧処理における実際の食品系における殺菌効果の予測を可能とすると数理モデルの開発に従事した。その結果,以下の確率論的モデルを開発した。1.高圧処理後の損傷菌回復制御手法およびその予測モデル開発高圧処理によって生ずる損傷菌の回復を制御するために,高圧処理後に温和な加熱処理を施す手法を開発した。本手法によれば,高圧処理後の保存中に損傷回復してくる細菌の制御を可能とした。2.非熱的処理の確率論的殺菌予測モデルの開発従来の死滅曲線を求めるモデル化手法とは異なる殺菌効果予測モデルを実際の食品系において開発した。さらに,本年度は圧力の他に温度の要因も加えたモデルを開発した。本モデルでは効果の確実性(確率)をも同時に推定できることから,新たな殺菌効果指標モデルとして発展することが期待できる。
経口糖負荷試験によるメタボリックフレキシビリティー測定法の開発

高インスリン時に脂質代謝から糖質代謝へと大きく変化する。その程度をmetabolic flexibility (MF)というが、経口糖負荷試験によりMFを評価する方法(MF(oral gucose load)法)を新たに開発することを目的とした研究を立案した。本研究により、高インスリン正常血糖クランプにおけるRQの変化は、経口糖負荷試験のRQの変化と同様であることが示唆された。しかしながら、MFについては、経口糖負荷試験での再現は難しいことが明らかとなった。(方法)本研究への協力に文書同意の得られた者を登録し、早朝空腹時の条件下で、下肢専用の表面コイルを使用した^1H-MRS(東芝VISART EX V4.40)により、前脛骨筋、ヒラメ筋のIMCLを測定する。その後、人工膵臓(STZ-22、日機装)を用いて、インスリン注入量100mU/m^2/minの条件下で2時間正常血糖クランプ検査を行い、最後の15分の糖注入率を計算し、インスリン感受性の指標とする。その際、基礎状態、高インスリン状態における呼気ガス分析を行い、それぞれのエネルギー代謝量、呼吸商を計測する。高インスリン正常血糖クランプが終了した1か月以内に、同様の条件下で75g経口糖負荷試験を行う。経口糖負荷前とその1,2,3時間後に呼気ガス分析を行い、それぞれのエネルギー代謝量、呼吸商を計測する。これらの結果から、MF(oral glucose load)とMF(clamp)の関連性について検討を行う。(結果と考察)MF(clamp)の値は個人差があるものの、おおよそ0.1程度であった。MF(oral glucose load)についても、同様の程度であったが、負荷後の時間により大きな個人差を認めた。MF(oral glucose load)とMF(clamp)の関連性については、有意では無いものの関連する傾向を認めた。現在少数例での検討であるため、今後症例数を増やして再検討を要すると考えられた。これらの結果から、MF (oral glucose load)とMF (clamp)の関連性について検討を行う。(結果と考察)MF (clamp)の値は個人差があるものの、おおよそ0.1程度であった。MF (oral glucose load)についても、同様の程度であったが、負荷後の時間により大きな個人差を認めた。MF (oral glucose load)とMF (clamp)の関連性については、有意では無いものの糖負荷後90分値で関連する傾向を認めた。今後症例数を増やして更なる検討を要すると考えられた。
環境・資源問題に関する社会的意思決定の研究

来たるべき21世紀の高度技術社会において、人類は、地球規模の環境・資源問題に直面すると予想される。これを解決するためには、社会の成員による自発的努力だけでなく、社会全体(国家あるいは世界)の意思決定に基づく諸政策が実行される必要がある。また、環境・資源問題を解決するためには、国あるいは世界全体にわたる巨大規模の経済活動や複雑な経済制度の「転換」を必要とする。本研究では、環境・資源問題に関する知識・情報の生成・伝達・使用について過去のケースを調査し、問題解決の方策が実行に移されるために必要な知的フローの水準がどのように決まるかを分析することを目的とした。また、本研究では、環境・資源問題の解決に必要な経済活動・制度の「転換」という観点から、既存の産業組織、規制政策、新技術開発のための制度の問題点を発見し、若干のケースについて同問題解決に適する組織・制度・政策の設計を試みることを目的とした。(1)環境・資源問題に関する知識・情報の生産・流通フロー量の計測と分析。本研究では、知識・情報ストックがどの程度社会の各個人に「体化」されたかを示す同「フロー」量を計測し、同問題に関する知識・情報のフローが社会全体の意思決定に与えた影響を統計データをもって検証した。(a)環境・資源問題に関する情報伝達「フロー」を、諸情報手段(新聞雑誌記事、テレビプログラム、学校教育用教科書、広告など)につき、データベースを使用して計測した。(b)環境・資源問題に関して作成された法令・制令数、条例数のデータを収集した。(c)上記2種のデータについて、時系列的に、また地域別(国・都道府県別)に関連の有無を調べた。(2)環境・資源問題の解決に資する新技術の生成を円滑化するための制度・政策の考察。(a)1960年代末-70年代に実施された自動車排気ガス規制を満たすための技術開発の跡づけ--同開発に投入された投資額の統計資料を収集した。(b)同開発投資の社会的見地からの評価--同排気ガス規制が1960年代末-70年代でなく、自動車の大量生産が始まる以前からすでに課せられていた場合におこなわれたであろう開発投資額を推定し、実際の開発投資額と比較した。(c)上記のケースを一般化して考え、環境・資源問題関連の新技術開発に関する制度、とりわけ知的所有権制度の問題点を分析した。
東日本における積石塚古墳の群構成とその歴史的性格について

本研究は、日本における積石塚古墳の歴史的な性格を解明することを究極の目的とし、調査対象として日本最大の積石塚古墳群である長野市大室古墳群を選定した。調査は、分布調査・墳丘と石室の実測・発掘調査から成り、今次調査は次の三点を実施した。【◯!1】.分布調査は栗林紀道氏や駒沢大学の成果をもとに、現状確認とともに墳丘の構築法や石室の構造を調べて略測・写真撮映し、【◯!2】・【◯!3】の基礎資料とするとともに、群構成解明資料とする。大室古墳群中の大室谷支群は、1040基の単位群からなり、さらに各単位群は数種の石室をもつことが明解になった。【◯!2】.古墳間の位置関係を正確に計測すると共に、墳丘と石室が良く遺存する例はこれを実測して単位群の成り立ちを知る資料とした。大室谷支群中の村東単位群12基についてこれを実施した。【◯!3】.大室谷支群の盟主的古墳第244号墳と、小形の第220号墳の2基を発掘した。いずれも主体部中心の部分的調査であるが、馬具・鉄製武器・玉類・須恵器・土師器が発見され、石室構造を仔細に把握できたとともに古墳の性格や年代観を知る手懸りが得られた。第244号墳は6世紀後半、第220号は不詳ながら7世紀に下るらしい。古墳の分布・測量・実測・発掘という一連の調査によって大室古墳群の形成過程や性格を知る基礎資料が得られたものの、今次調査分は分布調査で大室谷支群全体の1/4、実測・測量で1/10といまだ一部分に限られている。発掘資料も2基のみで、各単位群を構成する原理を知るには程遠いのが実情である。今後とも継続的に調査を実施して資料の蓄積をはかった上で、検討を重ねることがもっとも肝要である。なお積石塚という古墳構築と共に朝鮮半島との関連が説かれる合掌形石室については、分布調査で2基、実測調査が1基を把握したのみで、具体的に検討するまでには至っていない。
緑藻Botryococcus brauniiの炭化水素生成に関する細胞学的研究

単細胞緑藻Botryococcusbrauniiは、乾燥重量の3060%もの多量の炭化水素を細胞壁表面に分泌する。この炭化水素生成機構を細胞学的観点から解析した。ガスクロマトグラフィーで解析した結果、本実験に用いたB.brauniiの生成する炭化水素は、炭素数29または31で、二重結合を二個有する直鎖不飽和型であった。アミノウラシルを用いてB.brauniiを同調培養し、^<14>C-酢酸を用いたオートラジオグラフィー法で解析した結果、炭化水素生成は細胞分裂直後に起こることが判った。電子顕微鏡の急速凍結置換法で細胞周期を通したゴルジ体とtrans-Gologi-networkの構造変化を調べた結果、炭化水素生成は細胞分裂後のプロトプラスト表面で細胞壁形成に先だって起ること、この時期にはtrans-Golgi-networkが発達し、大型の小胞を特異的に形成することが明らかになった。^<14>C-酢酸を用いた電子顕微鏡オートラジオグラフィーでも、炭化水素の前駆体がtrans-Golgi-networkを経由して細胞表面に運ばれる可能性を示唆できた。そこで、炭化水素前駆体の細胞内輸送経路を実証する目的で、炭化水素のポリクロナール抗体の作製を試みたが、現段階では成功していない。炭化水素をバクテリアにコートして免疫するなど、今後も工夫を続ける。炭化水素生成の生化学的な解析には、高率に同調した細胞質分裂直後の細胞群が必要であった。しかし、B.brauniiの同調培養は経験と技術を要し、容易でなかったため、interphaseの細胞に炭化水素生成を誘導する系の開発を始めた。現時点で、interphaseの細胞をスフェロプラスト処理し、処理前に比べて1015倍量の炭化水素生成を比較的容易に誘導できるようになった。ガスクロマトグラフィーとNMR解析から、本実験に用いたB.Brauinii株は、炭素数29または31で二重結合を二つ有する直鎖型不飽和炭化水素を生成することが分かった。電子顕微鏡の急速凍結置換法や^<14>C-酢酸を用いたオートラジオグラフィー法で解析した結果、炭化水素生成は細胞分裂直後で細胞壁形成前に起こることが明らかになった。また、その前駆体はtrans-Golginetworkを経由して細胞表面に運ばれる可能性が示唆された。そこで、炭化水素のポリクローナル抗体の作製を試みたが、現段階では成功していない。炭化水素(脂質)は血清に溶解せず、抗体ができにくいと考えられる。抗原の炭化水素に付加するキャリアータンパク質の選択等を今後検討する。また、細胞壁形成直前に炭化水素生成が起こることに着目し、通常は炭化水素生成の活発でない間期の細胞をスフェロプラストにし、炭化水素生成を誘導する系を開発した。スフェロプラスト作製に当り、細胞壁多糖組成を調べた結果、ペクチン:ヘミセルロース:セルロースは6:5:10の割合で存在した。また、ガスクロマトグラフィー法で単糖組成を調べた結果、マンノースとキシロースが多量に存在した。間期の細胞をスフェロプラストにし、約10倍の炭化水素生成を誘導できた。この系を用いて、原形質膜上の炭化水素合成酵素の探索をアビジン-ビオチン法で始めている。スフェロプラストの原形質膜に約50kDのタンパク質が特異的に出現する。このタンパク質の解析を進める。単細胞緑藻Botryococcus

brauniiは、乾燥重量の3060%もの多量の炭化水素を細胞壁表面に分泌する。この炭化水素生成機構を細胞学的観点から解析した。ガスクロマトグラフィーとNMRで解析した結果、本実験に用いたB.brauniiの生成する炭化水素は、炭素数29または31で、二重結合を二個有する直鎖不飽和型であった。アミノウラシルを用いてB.brauniiを同調培養し、^<14>C-酢酸を用いたオートラジオグラフィー法で解析した結果、炭化水素生成は細胞分裂直後に起こることが判った。電子顕微鏡の急速凍結置換法で細胞周期を通したゴルジ体とtrans-Golgi-networkの構造変化を調べた結果、炭化水素生成は細胞分裂後のプロトプラスト表面で細胞壁形成に先だって起ること、この時期にはtrans-Golgi-networkが発達し、大型の小胞を特異的に形成することが明らかになった。^<14>C-酢酸を用いた電子顕微鏡オートラジオグラフィーでも、炭化水素の前駆体がtrans-Golgi-networkを経由して細胞表面に運ばれる可能性を示唆できた。そこで、炭化水素前駆体の細胞内輸送経路を実証する目的で、炭化水素のポリクロナール抗体の作製を試みたが、現段階では成功していない。炭化水素をバクテリアにコートして免疫するなど、今後も工夫を続ける。炭化水素生成の生化学的な解析には、高率に同調した細胞質分裂直後の細胞群が必要であった。しかし、B.brauniiの同調培養は経験と技術を要し、容易でなかったため、interphaseの細胞に炭化水素生成を誘導する系の開発を始めた。現時点で、interphaseの細胞をスフェロプラスト処理し、処理前に比べて1015倍量の炭化水素生成を比較的容易に誘導できるようになった。