hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質の高次構造情報に基づく医薬分子設計に向けた基盤的技術の創出

本研究は新規抗炭疽ワクチンの開発に結実させることを最終目的とする。そこで、既に明らかになっている炭疽菌毒素タンパク質複合体の四次構造を標的とし、計算科学的手法により毒素複合体上の任意の領域と一致する分子表面形状を呈示する人工タンパク質を設計するための理論の構築を行った。研究期間内には少なくとも3分子の構造設計を行い、実際に作出して構造解析ならびに生化学的解析を行うことで分子設計手法の理論の妥当性を評価した。また、新学術領域「ゲノム支援」の2015年度の支援課題に採択され、国内外で深刻なアウトブレイクを引き起こした炭疽菌株ならびに炭疽菌に近縁のセレウス菌強毒株の全ゲノム情報を得た。炭疽は細菌のなかでも最も毒性の強い炭疽菌による急性感染症であり、そのワクチン開発に関しては、これまでに多角的な研究が行われてきた。しかし、これまでの抗炭疽生ワクチン及び成分ワクチンの試みはいずれも副作用が強く、有効性と安全性を兼ね備えた抗炭疽ワクチンの開発は未だ達成されていない。これまでの検討において、複合体を形成した炭疽菌毒素タンパク質の表面構造上に、防御効果の高い抗体産生を誘導する抗原領域が存在することが示されているが、複合体を形成したタンパク質の四次構造情報に基づく分子設計の手法や理論については未だブレイクスルーが見られない。本研究では、タンパク質の分子間相互作用部位を含む四次構造上の領域を標的とし、標的領域と一致した分子表面形状を示す新規人工タンパク質の設計方法を構築する。平成25年度は、初期段階として、炭疽菌毒素タンパク質複合体上における分子設計の標的領域を探索した。特に、本研究計画の根幹となる「分子間相互作用部位を含めた多分子間にわたる領域」の抽出に注力した。我々が作出した人工分子の一つは、in silico分子シミュレーションの結果、水溶液中で安定な構造を維持することが示された。また、大腸菌を用いた異所性発現系において可溶性画分に発現することを見いだし、目的分子の高純度精製系の構築に成功していることから、この人工分子の構造解析及び機能解析を遂行する準備が整っている。現在、この人工設計分子の詳細な生理的機能を検討するとともに、ワクチン抗原としての有効性を評価するための動物実験を遂行している。本研究は、臨床応用に向けた新規抗炭疽ワクチンの開発に結実させることを最終目的とする。本研究課題では特に、炭疽菌の毒素タンパク質複合体をモデルとし、タンパク質の四次構造情報に基づいた新規人工タンパク質の設計に向けた基盤的技術を創出することに挑む。具体的には、複合体を形成したタンパク質の分子間相互作用部位を含む四次構造上の任意の領域を標的とし、計算科学的アプローチから、標的領域と一致した分子表面形状からなる分子を設計し、かつ任意の分子特性を持つ人工タンパク質を設計する手法を開発する。さらに、本研究計画では、理論的に設計した人工タンパク質を実際に作出して分子設計手法の精度と理論の妥当性を評価するとともに、実験動物を用いて作出したタンパク質の生理的機能を検証するところまでを目的とする。平成26年度は当初の計画どおり、実験動物を用いた人工設計分子の機能解析を行った。前年度までに構築したタンパク質発現系、高純度精製系を用いて目的分子を大量精製した後、実験動物(マウス)に接種した。ELISAによりその抗体産生能を検討するとともに、宿主における免疫応答及び毒性発現の観点から、人工タンパク質の生理的機能を検討した。培養細胞を用いた毒素中和試験の結果、作出した人工設計分子を接種したマウスから得られた血清は、コントロール群と比較して高い毒素中和能を示すことを見いだした。しかし、人工設計分子の立体構造は生体内で不安定であることを示唆する結果が得られており、今後は人工分子の安定性向上に向けた改変を加えていくことを予定している。本研究は新規抗炭疽ワクチンの開発に結実させることを最終目的とし、抗原候補分子を新規人工タンパク質として設計のするための基盤的技術を創出することを目的として遂行された。具体的には、炭疽菌毒素タンパク質複合体(約500kDa)をモデルとし、構造生物学的およびデータベースを活用した計算科学的手法を総合的に用いて得られる分子表面上の形状と物性上の特徴情報に基づき、標的領域と一致した分子表面形状を示す新規人工タンパク質の設計方法を構築する。研究期間内には少なくとも3分子の設計を試みたが、これまでのところ2種類の人工タンパク質の大量精製法の確立に時間を要し、作出した分子の結晶構造解析には至らなかった。代替策として計画していたNMR法などによる構造解析については準備が進んでおり、次の段階へ進むことが期待される。しかし、当初の目標を達成するためには、結晶構造解析による高分解能での解析が必須であり、タンパク質の精製プロトコル、保存方法のさらなる検討を要すると考えている。尚、本研究の2015年度の計画に基づく炭疽菌ゲノムの大規模シーケンス解析について、新学術領域「ゲノム支援」の2015年度の支援課題に応募して採択され、国内外でアウトブレイクを引き起こした炭疽菌株ならびに炭疽菌に近縁のセレウス菌強毒株の全ゲノム解析を行った。その結果、2012年に東京都内の病院で発生した敗血症セレウス菌アウトブレイク株、及び岐阜県内の病院で発生したアウトブレイク株合計35株の全ゲノム配列を取得することに成功し、我が国に蔓延するセレウス菌の炭疽様病態を引き起こすという重要な表現型を決定づけるゲノム上の特性について解析を開始することができた。

本研究から得られた知見を総合し、今なお世界各地で流行する炭疽の克服戦略の一環として重要な進捗があったと考えている。本研究は新規抗炭疽ワクチンの開発に結実させることを最終目的とする。そこで、既に明らかになっている炭疽菌毒素タンパク質複合体の四次構造を標的とし、計算科学的手法により毒素複合体上の任意の領域と一致する分子表面形状を呈示する人工タンパク質を設計するための理論の構築を行った。研究期間内には少なくとも3分子の構造設計を行い、実際に作出して構造解析ならびに生化学的解析を行うことで分子設計手法の理論の妥当性を評価した。また、新学術領域「ゲノム支援」の2015年度の支援課題に採択され、国内外で深刻なアウトブレイクを引き起こした炭疽菌株ならびに炭疽菌に近縁のセレウス菌強毒株の全ゲノム情報を得た。新規人工設計分子の立体構造解析と機能解析に想定以上の時間がかかっている。達成度はやや遅れている。細菌学本年度は、生体内における安定性向上を目指し設計方法に改変を加える。人工分子設計手法の精度と理論の妥当性を議論できるよう、できるだけ多くの知見を蓄積することを目指す。本課題は申請段階において十分な予備的検討を行っていた結果、研究計画は当初の実験計画通り順調に進展している。今後も研究計画に沿い研究を遂行していく。新規人工設計分子の立体構造解析と機能解析に当初の予定以上の時間を要したため未使用額が生じた。平成26年度は、当初の計画通り、実験動物を用いた人工設計分子の機能解析を行う。前年度までに構築したタンパク質発現系、高純度精製系を用いて目的分子を大量精製した後、実験動物(マウス)に接種する。ELISA等の手法によりその抗体産生能を検討するとともに、宿主における免疫応答および毒性発現の観点から、人工タンパク質の詳細な生理的機能を明らかにする。将来的には、北海道大学人獣共通感染症リサーチセンターザンビア拠点のP3実験施設を利用した炭疽菌感染実験により、個体レベルにおける抗炭疽防御効果の検討を行う。さらに、結晶構造解析、NMR解析を利用した立体構造解析を行い、その結果を理論的な人工分子構造と比較することにより設計手法の精度と理論の妥当性を評価していく。当初の研究実施計画に基づき、平成26年度の研究が実施され、同年度に計上された経費として速やかに使用される予定である。本研究推進のために雇用した実験補助員の給与支払いのため年度末の給与を4月中に支払う。
第２言語ライティング行動の長期的発達：ダイナミックシステム理論からのアプローチ

本研究は、日本人学習者が3年半の観察期間で、どのように日英作文力を変化させるかと、その変化にどのような要因が最も影響力を持つかを調査したものである。参与者は、中級程度の英語力を持つ英語専攻の大学生22人であり、観察開始時は全員18歳だった。彼らは、4年間、年1回、一般英語力、日英作文力と、日英作文学習歴等に関する90分程度のインタビューを受けた。さらに大学4年次の最後には、自分の3年半のそれらの能力の変化についての30分程度のインタビューに答えた。分析の枠組みとしては当初予定したダイナミックシステム理論より包括的な生態学的アプローチを使い、4年間の変化での共通の傾向と個人差の両方を調査した。本研究は、日本人大学生の英語力、日英作文力、日英語のライティング知識や方略が、3年半の間にどのように変化し相互に影響しあうかを、現在応用言語学の分野で最も注目されているDynamic Systems Theory Approach(DST:ダイナミックシステム理論アプローチ)の視点から明らかにすることを目的にしている。人間の言語発達を「様々な要素が相互に関係しあい、直線的でない発達をとげる複雑なシステム」と捉えるDSTを研究枠とすることは、従来別々のものとされてきた第1言語と第2言語の作文力をひとつの「多機能言語能力」として観察するのに有効である。4年間の研究の2年目である平成25年度は、何人かの学生が中期・長期の留学に出発する直前の7月に、初年度と同じように、以下のように研究参与者25名からデータ採取を行った。(1)参与者に個別に設備のある研究室に来て英語説明文を書いてもらい、書き終わった直後に書いている時の様子を録画したビデオテープを見ながら、書いている最中に何を考えていたかを逐次話してもらい、ICレコーダーに録音した。採取したデータは、直後に転記した。(2)国語作文も似たような題で書いてもらい方略について聞いた。日英の作文の題はランダムに毎年違うものがあたるようにした。(3)標準英語力測定テストを用いて、一般的な英語力も測定した。(4)上記量的データとは別に、ケーススタディの手法を使って被験者に個別にインタビューを行い、日英語で『書く』ことについての知識や心象モデル、現在までの学習経験や、英語一般や英作文に対する自信や動機付けなどについても調査した。さらに、留学する学生の中で同意した被験者3名に、留学中に「英語を書くこと」に対して感じた事、考えた事を記した日記を書いてもらい、"insider view"データとして提出してもらうよう依頼した。本研究は、日本人大学生の英語力、日英作文力、日英語のライティング知識や方略が、3年半の間にどのようにDST:ダイナミックシステム理論アプローチ)の視点から明らかにすることを目的にしている。初年度の平成24年度は、以下のように大学新1年生からデータ採取を行った。(1)日本の中学・高校で6年間英語を勉強してきた大学1年生25名に個別に設備のある研究室に来て英語説明文を書いてもらい、書き終わった直後に書いている時の様子を録画したビデオテープを見ながら、書いている最中に何を考えていたかを逐次話してもらい、ICレコーダーに録音した。作文の題はランダムに毎年違うものがあたるようにした。(4)上記量的データとは別に、ケーススタディの手法を使って参与者に個別にインタビューを行い、日英語で『書く』ことについての知識や心象モデル、現在までの学習経験や、英語一般や英作文に対する自信や動機付けなどについても調査した。(5)上記のデータのうち、国語作文は国語作文の専門家2人に、英語作文は英語作文の専門家2人にそれぞれ、妥当性の高い(国語は第1言語としての、英語は第2言語としての)評価基準を用いて採点してもらった。4年間の研究の3年目である平成26年度は、10名の学生が中期・長期の留学から帰国した後であり、4名の学生が今後の中期・長期の留学を計画している直前の7月に、初年度と同じように、(1)から(4)のように、研究参与者24名からデータ採取を行った。参与者25名のうち1名は、連絡が取れずデータが採取できなかった。

(1)参与者に個別に設備のある研究室に来て英語説明文を書いてもらい、書き終わった直後に書いている時の様子を録画したビデオテープを見ながら、書いている最中に何を考えていたかを逐次話してもらい、ICレコーダーに録音した。採取したデータは、直後に転記した。(2)国語作文も似たような題で書いてもらい方略について聞いた。日英の作文の題はランダムに毎年違うものがあたるようにした。(3)標準英語力測定テストを用いて、一般的な英語力も測定した。(4)上記量的データとは別に、ケーススタディの手法を使って被験者に個別にインタビューを行い、日英語で「書く」ことについての知識や心象モデル、現在までの学習経験や、英語一般や英作文に対する自信や動機付けなどについても調査した。本研究は、日本人大学生の英語力、日英作文力、日英語のライティング知識や方略が、3年半の間にどのように変化し相互に影響しあうかを、現在応用言語学の分野で最も注目されているDynamic Systems Theory Approach(DST:ダイナミックシステム理論アプローチ)の視点から明らかにすることを目的にしている。4年間の研究の最終年度となる平成27年度は、4名の学生が中期・長期の留学から帰国した直後の7月に、(1)から(4)のように、研究参与者22名からデータ採取を行った(前年度は24名だった参与者のうち2名は研究参加をやめることになり、最終年度までに全てのデータを提供してくれた参与者は22名となった)。(1)個別に設備のある研究室に来て英語説明文を書いてもらい、書き終わった直後に書いている時の様子を録画したビデオテープを見ながら、書いている最中に何を考えていたかを逐次話してもらい、ICレコーダーに録音した。(2)国語作文も似たような題で書いてもらい方略について聞iいた。(3)標準英語力測定テストを用いて、一般的な英語力を測定した。(4)ケーススタディの手法を使って被験者に個別にインタビューを行い、日英語で『書く』ことについての知識や心象モデル、現在までの学習経験や、英語一般や英作文に対する自信や動機付けなどについて調査した。さらに、上記(1)から(4)を含む参与者の一年生の時から採取したデータ全てを整理して各自の量的データの変化のプロフィールを作り、11月と12月に、そのプロフィールを見せながら、それぞれの変数(例:日英作文力、書く方略)について「3年半で変化したと思うか。又それはなぜか」についてインタビューし、変化に影響を与えた社会文化的要因について語ってもらった。本研究は、日本人学習者が3年半の観察期間で、どのように日英作文力を変化させるかと、その変化にどのような要因が最も影響力を持つかを調査したものである。参与者は、中級程度の英語力を持つ英語専攻の大学生22人であり、観察開始時は全員18歳だった。彼らは、4年間、年1回、一般英語力、日英作文力と、日英作文学習歴等に関する90分程度のインタビューを受けた。さらに大学4年次の最後には、自分の3年半のそれらの能力の変化についての30分程度のインタビューに答えた。分析の枠組みとしては当初予定したダイナミックシステム理論より包括的な生態学的アプローチを使い、4年間の変化での共通の傾向と個人差の両方を調査した。2年目となる平成24年度までは25名いた研究参与者のうち、1名と連絡が取れず、データが採取できなかった。
上野英信の「筑豊文庫」と旧産炭地における教育・文化運動に関する歴史実証的研究

本研究は旧産炭地・筑豊地域に暮らした記録文学者・上野英信の「筑豊文庫」の取り組みと地域における教育・文化運動の関係性を明らかにするものである。検討対象とする時期は1960年代から1980年代にかけてである。本研究の特色は、一人の鍵となる人物の定住した地域の近隣関係に着目し、その人物による活動の地域社会における意味と価値とはいったいなんだったのかを考察する点にある。上野自身、地域での地道な教育・文化活動についてたびたび言及しているが、それらの活動の地域住民にとっての意味やその他の地域における教育・文化運動とのかかわりの有無を問われたことはこれまでほとんどないことから、ここに本研究の意義がある。
実物大・実操作可能な3Dスケッチに基づくデザイン環境の実証的研究

我々はバーチャルリアリティ技術を用いて目の前の3次元空間に直接スケッチする一連の3Dスケッチシステムを開発してきた.しかしながら,3次元表示は新しいメディアであるため,当初,デザイナを惹き付けるが,すぐに利用されなくなってしまう.つまり,3次元表示は一種の単なるアトラクションであり,デザインには不要である.本研究では,根本的な問題は3次元空間を必須とする機能の欠如にあることを指摘し,新コンセプト「実物大+実操作可能」に基づく3Dスケッチシステムを提案し実証評価を行った.我々はバーチャルリアリティ技術を用いて目の前の3次元空間に直接スケッチする一連の3Dスケッチシステムを開発してきた.しかしながら,3次元表示は新しいメディアであるため,当初,デザイナを惹き付けるが,すぐに利用されなくなってしまう.つまり,3次元表示は一種の単なるアトラクションであり,デザインには不要である.本研究では,根本的な問題は3次元空間を必須とする機能の欠如にあることを指摘し,新コンセプト「実物大+実操作可能」に基づく3Dスケッチシステムを提案し実証評価を行った.3次元空間に実物大にスケッチすることによりデザインし,さらにその実物大のスケッチを3次元空間で人間が体を屈めたりしながら操作・評価・修正できるデザイン空間を設計した.実物大スケッチUI,スケッチの選択UI(移動,コピー,動きの定義に選択が必要),動き方の定義UI,操作するUIが重要であり,自然なユーザインタフェースを設計した.デザイン環境の実現としては,表示デバイスとしてシースルー型の立体視HMDを用い,3D位置センサをスタイラスペンとユーザの視点,および向きを測るため頭に取り付ける構成とした.視野角が広く高精細で安価な市販品のシースルー型立体視HMD用いて試作した.また,高精度な広域位置センサを試作し,4m×6mで高さ3m程度の空間のどこでも描画可能とした.複数人のデザイナがいろいろな向きからスケッチに回りこんでデザインでき,さらに,デザイナ自身の腕や手が見え,また実世界との対応ができることで,デザイナが身体性を用いて協調できるデザイン空間を実現した.平成23年度は、まず、平成22年度に構築した「シースルー型立体視HMDと超音波に基づく広域位置センサ」システムを基本に、さらに、高精度、多人数対応にするために拡張を行った。具体的には、広領域対応の磁気センサを追加し、超音波に基づく広域位距センサと相互補完するシステム構成とすることにより、精度の向上を行った。また、大画面を3分割し、分割した画像をシースルー型立体視HMDに対応付け動作可能とする構成を考案し、その結果、1台のPCで、6台のシースルー型立体視HMDの同時描画・制御を可能とし、6人での協調的デザインを可能とした。次に、(ii)複数人で協調的に行うデザインを対象に、プロのデザイナにより行う実験の検討を行った。デザイナの行動分析(試行錯誤)、デザイン結果の質の評価(従来のデザインと比べて向上したか)、「抽象性と実体性の融合」の効果について、実験方法を検討した。具体的には、デザイン課題として、大規模プラント(発電所を想定)のオペレータルームのデザインへの適用を考案した。情報機器の進展により、プラントルームの設計は自由度が大きいものの、実際にモックアップを作ることは困難であるため、現在のところ頭の中で想像しながらレバー、ボタン、警報機器等の配置を決めているのが実情である。十分な検討がされておらず、社会的な安心・安全に直結する重要な問題であると判断した。以上の平成23年度の実施事項により、平成24年度に行う総合評価の準備が完了した。本年度では、実デザイン現場での応用性確認を行った。具体的にはプロの建築家に本システムの説明・デモを行い適用可能性を評価した。(i)単独で行うデザイン,(ii)複数人で協調的に行うデザインにおいても本システムが有効であり、さらに、デザインの正否が社会的な安心・安全に直結する大規模規模プラント(発電所など)のオペレータルームのデザインなどにおいては、実際にモックアップを作ることは困難であるため,現在のところ頭の中で想像しながらレバー,ボタン,警報機器等の配置を決めているのが実情であり、本システムにより,スケッチによりデザインを繰り返して吟味することが可能となるとともに,操作しやすいか(レバーまで手が届くか),緊急停止ボタンを押す時に,警報パネルが見えるかなど,操作についても確認することが可能となり,安全なシステムの実現をもたらすとの評価が得られた.一方で、本システムは3D位置計測装置が環境設置型であるため、特定の実験環境でしか動作しない点がデメリットとして浮かび上がった。そこで、昨年設置した超音波と磁気による3D位置計測ではなく、UbiC3D(An Architecture for Ubiquitous and Collaborative 3D Position Sensing)と呼ぶ視覚特徴量だけに依存する3D位置計測手法の基本アーキテクチャを考案した。本システムをUbiC3Dアーキテクチャ上で実現すると、既設の建物内などどのような場所においても、本システムを稼働させることができる。今後、実現を進め、プロの建築家と共働していく予定である。「9.研究実績の概要」に記載したように、まず、平成22年度のシステムの高精度化、多人数化等の改良に時間を要したので、実験に関しては、実験手法の検討に留まった。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、「(C)実デザイン現場での応用性確認」を実施する。評価は、平成23年度実施した(i)単独で行うデザインに引き続き、(ii)複数人で協調的に行うデザインを対象に、プロのデザイナにより行う。

デザイナの行動分析(試行錯誤)、デザイン結果の質の評価(従来のデザインと比べて向上したか)、「抽象性と実体性の融合」の効果について、ビデオ分析等の評価を行う。特に、「(ii)複数人で協調的に行うデザイン」に関しては、大勢でデザインを行うことが多く、さらに、そのデザインの成否が社会的な安心・安全に直結する大規模プラント(発電所を想定している)のオペレータルームのデザインに適用する。情報機器の進展により、プラントルームの設計は自由度が大きいものの、実際にモックアップを作ることは困難であるため、現在のところ頭の中で創造しながらレバー、ボタン、警報機等の配置を決めているのが実情である。本システムにより、スケッチによりデザインを繰り返して吟味することが可能となるとともに、操作しやすいか(レバーまで手が届くか)、緊急停止ボタンを押す時に、警報パネルが見えるかなど、操作についても確認することが可能となり、安全なシステムの実現をもたらすと期待している。その後、研究課題に対する3年間のまとめや総合評価を行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
共犯における「共同責任」の再構築―現代型犯罪における新展開―

本研究は、製造物責任や医療過誤といった分野で問題となる過失不作為の共働を念頭に置きつつ、不作為形態という観点から、不作為犯の共同正犯について考察し、不作為犯の共同行為における共同性の根拠ならびに作為義務の法的性質および射程を明らかにすることを目的とする。本年度の研究成果は、先行研究の「過失犯の共同正犯」に関する研究で明らかにされた研究成果をもとに、「不作為」という行為態様の観点から、共同正犯における「共同性」の根拠および成立範囲を明らかにしたことにある。従来、わが国における不作為共同正犯は、「意思の疎通」を共同責任の根拠とした、故意作為犯を前提とする共同性理論であった。しかし、従来の理論によれば、例えば、リコールの権限をもつ複数人が欠陥商品のリコールを怠った際、(意図的・不注意を問わず)「リコールをしない」という意思の疎通がなければ、刑事責任を問えないという問題点が生じることになる。それゆえ、上記のような場合でも刑事責任を問いうる新たな「共同責任」の理論を明らかにする必要がある。かかる問題点を克服するために、不作為共犯についてもっとも影響を受けているドイツの議論を比較対象とし、不作為犯における共同性の根拠を明らかにするという手法を採用した。そして、ドイツにおける「不作為による共同正犯」に関する議論の変遷過程を分析する中で、我が国における先行研究の不十分性を指摘するとともに、「共同正犯」の根拠として「共同義務の共同違反」を提示し、規範的側面から基礎づける共同性理論を明らかにした。このような新たな「共同性」理論を採用することにより、行為者間に「現実の」意思の疎通がない場合にも共同責任を問うことが可能となると同時に、単なる「事実的な」競合では因果関係が認められえないが、共働によってはじめて結果が回避されうる場合に構成要件の実現を阻止すべき保障人的地位という観点から刑法上の共同責任を認めうるようになる。本年度中に、研究目的である、不作為犯の共同正犯の根拠を提示するとともに、共同正犯の範囲を一定程度明らかにしたため。今後の研究課題として、刑法上の「共同責任」の在り方を明らかにしていくうえで、「共同正犯の範囲の具体化」が挙げられる。具体的には、不作為犯の共同正犯における成立範囲に限らず、「支配犯と義務犯という観点からの共同性の問題」や「犯行の途中から関与する承継的共犯の問題」といった様々な観点から分析をする必要がある。
ゲノムDNAメチル化解析による子宮内膜癌発生機構の解明

本研究費により平成14年度までに明らかとなった成果は以下の4点である。1.子宮内膜癌の約40%にhMLH1プロモーターのメチル化されている。2.hMLH1のメチル化に伴い蛋白発現が低下する。3.子宮内膜癌に近接する正常子宮内膜においてすでにhMLH1はメチル化される。4.子宮内膜癌のみならず正常内膜でもhMLH1のメチル化に伴う遺伝子不安定性を認める。以上の成果を踏まえ、15年度に明らかとなった成果を以下に示す。1.hMLH1プロモーターのメチル化質的解析メチル化解析法として一般的に用いられているのはMethylation specific PCR(MSP)と呼ばれる定性的な解析法であるが、今回hMLH1プロモーターの質的なメチル化解析を目的として用いた方法がBisulfite sequencingであり、プロモーター領域約700bpをsequencingすることによってメチル化の領域と頻度を直接確認した。その結果、子宮内膜癌症例56例のうち、16例(29%)がプロモーターのほぼ全領域がメチル化され、14(25%)が部分的なメチル化、26(46%)がメチル化されていない症例であった。癌抑制遺伝子PTENは、子宮内膜癌の早期に変異を受けることが報告されている。同様に発癌の早期に認められるhMLH1のメチル化との関連を調べた結果、PTEN mutationは子宮内膜癌の約40%に認められ、特にPTEN frameshift mutationはhMLH1プロモーター全体がメチル化された症例に多く、有意な相関を認めた。本研究では癌病変と正常組織、前癌病変などを顕微鏡下に厳密に区別するため、LCMを用いている。これにより得られた極微量のDNAよりメチル化解析を行うことはこれまで技術的に困難であったが、我々はPCRとメチル化感受性制限酵素を組み合わせることによりこの問題を解決した。その結果、子宮内膜癌の前癌病変である子宮内膜増殖症でのメチル化頻度は、癌とほぼ同等であることを確認しており、現在症例を追加して検討を進めている。以上の結果を踏まえ、発癌の初期イベントに注目した子宮内膜癌発癌機構の解明と、スクリーニングにおける発癌リスクの高い症例を識別する臨床応用について、今後研究をさらに進める予定である。これまでの研究による成果は以下の4点に集約される。(1)子宮内膜癌組織におけるhMLH1プロモーター領域のメチル化頻度:解析を行った56例の子宮内膜癌組織において、Methylation specific PCR(MSP)と、Bisulfite sequece法を用いてメチル化を確認した。メチル化された症例はMSPでは37.5%、Bisulfite sequeceでは全メチル化が29%、部分的メチル化が25%であった。(2)hMLH1メチル化に伴う蛋白発現の低下:免疫組織染色を用いた解析により、メチル化を受けた子宮内膜癌症例では、hMLH1の発現は有意に低下していた。(3)正常子宮内膜におけるメチル化解析:子宮内膜癌症例において、近接する正常内膜部分におけるメチル化は30%に認められたが、子宮筋腫等の良性疾患における正常子宮内膜では3%にメチル化を認めたのみであった。

(4)癌および正常内膜における遺伝子不安定性:これまでにも癌組織における遺伝子の不安定性がMicrosatellite instability(MSI)として数多く報告されてきたが、我々の解析ではhMLH1のメチル化がMSIと深く関与し、癌組織のみならず近接した正常内膜でもMSIを認め、発癌過程においてDNA修復遺伝子のメチル化と遺伝子不安定性が初期の変化であることを確認した。今後は当初の計画を進め、子宮内膜癌発癌の早期に変異を受けるとされているPTENと、hMLH1メチル化とがどのように関与しているかについて現在解析中であり、発癌の初期イベントにスポットを当てて新たなる知見を検索する。また、細胞・組織診由来の検体やMicrodissectionによるごく微量の検体からメチル化や遺伝子変異の解析を行うことにより、発癌リスクの高い症例の識別などに臨床応用が可能かどうかについても検討を加えていく。本研究費により平成14年度までに、子宮内膜癌と正常子宮内膜におけるhMLH1のメチル化に伴う蛋白発現の低下、および遺伝子不安定性について確認した。それらを踏まえて、15年度に明らかとなった成果を以下に示す。1.hMLH1プロモーターのメチル化質的解析メチル化解析法として一般的に用いられているのはMethylation specific PCR(MSP)と呼ばれる定性的な解析法であるが、今回hMLH1プロモーターの質的なメチル化解析を目的として用いた方法はBisulfite sequencingであり、メチル化の領域と頻度を直接確認した。その結果、子宮内膜癌症例56例のうち、16例(29%)がプロモーターのほぼ全領域がメチル化され、14(25%)が部分的なメチル化、26(46%)がメチル化されていない症例であった。癌抑制遺伝子PTENは、子宮内膜癌の早期に変異を受けることが報告されている。同様に発癌の早期に関与するhMLH1のメチル化との関連を調べた結果、PTEN mutationは子宮内膜癌の約40%に認められ、特にPTEN frameshift mutationはhMLH1のメチル化との有意な相関が認められた。癌病変と正常組織、前癌病変などを顕微鏡下に厳密に区別することを目的として、LCMを用いた解析も進めている。極微量のDNAにおいてメチル化解析を行うことはこれまで技術的に困難であったが、我々はPCRとメチル化感受性制限酵素を組み合わせることでこの問題を解決した。その結果、子宮内膜癌の前癌病変である子宮内膜増殖症でのメチル化頻度は、癌とほぼ同等であることを確認しており、現在症例を追加して検討を進めている。以上の結果を踏まえ、発癌の初期イベントに注目した子宮内膜癌発癌機構の解明と、スクリーニングにおける発癌リスクの高い症例を識別する臨床応用について、今後研究をさらに進める予定である。
戦後オーストリアにおける戦争犠牲者援護法の制定過程と国民福祉に関する研究

研究課題終了予定年度であった2017年度中に完了できなかった史料調査を今年度も継続して進めた結果、1945年から1948年までの史料の収集と分析作業を完了した。また、これらの史料解析ならびに全研究実施期間を通じて収集した史料データの総合を行なった。これらの調査結果を踏まえて、戦争犠牲者への保障の枠組みとその条件が国民化の進展に伴って確定されていく様子を検討した。その際、犠牲者意識は人種や出自などが理由で迫害された人々らの社会的位置づけを「援用」(あるいは「簒奪」)する一方で、戦争とナチズム体制を差別化することによる戦争犠牲者の特権化が進んでいく政策実態の特徴を解明し、犠牲者化する国民の論理に関する批判的な分析を行った。なかでも第一次、第二次世界大戦を区別せずに犠牲者を統合することが強く求められた社会的状況に着目し、両次大戦の違いや政治体制の違いを克服する試みがみられた点を明らかにした。一方、女性および孤児を戦争犠牲者として包摂するメカニズムや心身に障害を負った元兵士らへの社会復帰支援など多岐に及ぶ論点のより詳細な分析が必要であることもわかった。そのため、今後は、1949年以後1960年代までの史料をさらに収集し、オーストリア型の福祉社会の原型ともいわれる戦争福祉の実体と犠牲者国民意識の関連性を検証する本格的な研究へのステップアップにつなげていくつもりである。そしてさらには、他国、他地域との比較研究を進める必要もあると考えている。なお、現在、当該研究課題の成果の一部を含む成果公開準備を進めているところである(投稿中)。本研究の目的は、戦時中ナチ体制下に置かれ、戦争経済システムへと統合されていたオーストリアが、国家再建・国民統合を進める際にどのような戦後補償制度を整備したかを明らかにすることにある。とくに、戦争時の爆撃や出兵によって被害を受けた者とその遺族など国民の大部分を包含する立法であった「戦争犠牲者援護法」の制定過程に着目し、「戦時福祉体制(Warfare System)」から「国民福祉体制(National Welfare System)」へと転換する筋道とその論理を探究する。また、同法によって創られた「戦争犠牲者=犠牲者国民」像が、1970年代以降に確立するオーストリア国民のための一国社会福祉国家体制の中にどう位置づけられるかを考察する。以上のような研究計画のもと、27年度は、主に二つのサブテーマについて研究を進めた。<1>赤いウィーン」期からナチ期に続く戦後福祉の特徴をとらえなおし、第一次世界大戦の「戦争犠牲者」(戦争未亡人や傷痍軍人などを含む)に対する補償政策の実態を調査した。また、同様の枠組みにおいてロマの人々に対する補償の問題も調査し、2015年12月に開催された駿台史学会大会シンポジウムでその成果の一部を研究発表した(明治大学開催)。<2>戦争犠牲者援護法の制定過程について、関連する法文書や関連団体発行の新聞のほか、議会議事録等の調査のため、オーストリア国立図書館およびオーストリア国家文書館において史料収集を行った。とくにオーストリア国家文書館では関連する一次史料の所在を確認するとともに、1945年から1947年頃までの文書を閲覧、調査した。これらの史料に基づき、大部分の国民に関わりのあった「戦争犠牲者援護法」がどのような論理と思想のもとに制定されたかについて、同法の制定及びその政治的議論に着目して検討を進めた。戦間期オーストリアにおける戦争福祉/国民福祉の概要を調査するとともに、第二次世界大戦後から1947年頃までの戦争犠牲者援護法の制定にかかる一次史料の収集を行った。また、並行して関連する法文書や関連諸団体の新聞の収集も実施し解析した結果、地域や団体の性格によって異なる論調の違いなどについても一部踏み込んで検討にあたることができた。その成果の一部は2016年6月開催のオーストリア現代史学会(グラーツ大学開催、採択済み)において発表予定であり、調査ならびに史料分析の進捗状況は順調であるといえる。2年目の28年度は、以下の通り研究を進めた。1. 2016年6月に開催されたオーストリア現代史学会(グラーツ大学にて実施)でこれまでの研究をベースとした中間発表を行い、外部評価を受けた。2.上記の学会で発表し、議論した成果を受けて、28年度の後半期はさらに、とくに以下のサブテーマについて考察を進めた。<1>国民福祉の確立に至る国内の歴史的過程を特に戦後初期の時期を中心に明らかにし、戦時福祉が戦争犠牲者援護法を媒介にして国民福祉へと転換するための諸条件の解明に努めた。とりわけ1945年から55年までの四か国占領期に社会統合が促進される過程で国民的妥協が進められたことを明らかにした。その際、次の2点目とも関連する重要な成果として、戦争犠牲者というカテゴリーが、人種的理由で迫害された人びとへの補償の形態と一部連動して形成されていったことを突き止めた。<2>オーストリアの戦後補償制度の構築とその実施状況についての史料収集を継続し、データ分析と論点の整理・蓄積を行った。とくにバイラー、シュトゥルツらによる人種的理由で迫害された人々への戦後補償研究と歴史家委員会による調査報告書集、及び申請者自身が進めてきた元ナチ・元戦犯への補償研究とを比較検証した。その結果、戦争未亡人や傷痍軍人らを包摂する戦争犠牲者援護法が、迫害の犠牲者らが体現したはずの「犠牲者」像を「簒奪」することで、犠牲者イメージを強化していったことを明らかにした。

関連省庁の文書(一次未公刊史料)が大部であり、しかも未整理の状態で閲覧可能になるまでに時間がかかることから、29年度もオーストリア国立図書館、オーストリア国家文書館等において3週間程度現地史料調査を行う。オーストリア現代史学会において研究の中間報告を行い、さまざまな研究者との議論を行うことができた。また、29年度には日本西洋史学会においても研究報告を行う予定であり(発表確定済み)、順調に成果報告を行ってきている。史料の収集状況については、先行研究及び公刊史料の収集が順調に進んだ一方、未公刊史料の方は当初予定していたよりも時間がかかると判断した。その理由は、当該テーマに重要な未公刊史料のほとんどが手つかずで未整理のままの状態にあること、またその量が膨大な量にのぼることがわかったためである。今年度は、主にこれまでに調査した史料の解析を進め、その解析結果を一部踏まえた学会報告及び論文執筆を行った。1)まず、2017年5月に一橋大学で開催された日本西洋史学会において、本科研テーマにかかる自由論題報告を行い、司会者の小沢弘明氏をはじめ、フロアーとのディスカッションを通して、批判的な討論を行うことができた。その際、戦争犠牲者のための補償政策として、「援護」という概念と「扶助」という概念をどのように使い分けるべきかを論じた。また、ユダヤ系の人びとの間にも第一次世界大戦に従軍した経験を持つ人びとが、1945年以後も戦争犠牲者援護政策の対象となった一方で、ナチ期に迫害を受けた人びとの場合は、抵抗運動の犠牲者の中で消極的な立ち位置を与えられたにすぎず、別途、被迫害者のための、しかし極めて不十分な支援政策の範疇となったため、戦争犠牲者援護政策には大きな矛盾が生じていたことが具体的な史料の解析を通して明らかとなった。2)学会報告での成果を踏まえて、「戦争犠牲者」というカテゴリーが人種や出自や宗教などを理由に迫害の犠牲となった人びとへの補償の問題とどのような形で関連していたのかを史料解析に基づく具体的な事例をもとに検討し、論文執筆を行った。3)2016年度中に招へいしたアンドレア・シュトゥルッツ氏の講演原稿を出版用に整備、脱稿した。刊行は2018年度中をめどに行う予定である。以上のように、2017年度は、2015年度、2016年度中にすでに収集した史料解析を急ぎ、その研究成果を公表する作業に力点をおいたため、現地の文書館における史料収集作業を終了することができなかった。そのため、本課題の実施期間を延長し、2018年度には史料収集の一定のめどをつけ、最終的な成果発表に向けた準備を進めるつもりである。本研究にかかる史料が当初の予想を大幅に上回って膨大な量に上っていたため、一部の史料収集を研究プロジェクトの最初の2年間で行い、まずはその解析成果を公表する作業を優先した。そのため、国内外での学会発表及び論文執筆の方は順調に進めることができた。一方、最終年度の2017年度中に史料収集を完了させるには至らなかったため、もう一年、プロジェクト実施期間を延長したことから、全体としてはやや遅れていると評価した。研究課題終了予定年度であった2017年度中に完了できなかった史料調査を今年度も継続して進めた結果、1945年から1948年までの史料の収集と分析作業を完了した。また、これらの史料解析ならびに全研究実施期間を通じて収集した史料データの総合を行なった。
発達期の脳組織バンキングによる脳障害の分子発生病理学的研究

胎児から小児脳の組織バンクは10施設以上の協力をえて、着実に増加し、1000例を越した。これらを利用して、脳の正常発達と発達障害を系統的に検討した。正常脳では、遺伝性疾患の遺伝子蛋白の抗体を作成し、その局在と機能を発達的に検討した。Miller-Dieker症候群や結節性硬化症の遺伝子蛋白であるLIS-1やtuberinは胎児期早期から脳の神経細胞やグリアに出現し、脳の形成や分化に関与していることが分かった。染色体21番に遺伝子があるプリン合成控訴(GART,GARS)やd-serineを生化学的、組織化学的に発達を観察し、異常発達研究の基礎とした。また、ヒト脳の神経細胞にあるN-acetyl-L-aspartic acidをNMRで測定し、正常脳における年齢的変化と局在を明確にした。グルタミン酸受容体、グルタミン酸トランスポーターの局在と機能を検討し、神経細胞とグリアの発達的および機能的相互関係の緊密さを認めた。proteolipidなどを用いて、髄鞘形成の過程で、蛋白と脂質の微妙な発達相違を認めた。これらのことは発達障害や機能障害の発生機序の解明へ応用できる。異常例では、神経細胞移動異常、ダウン症候群のシナプス発達遅滞と早発老化、結節生硬化症などの神経皮膚症候群、胎児・新生児脳循環障害、乳幼児突然死症候群の発生機序が検討された。滑脳症の原因となるLIS-1、結節生硬化症のtuberinは疾患脳には、発現の減少があり、免疫組織化学的な診断に用いられることが分かった。ダウン症候群では、小児機にアミロイド前体蛋白や転写因子Etz遺伝子などの過剰発現があり、早発老化の発生との関連が示唆され、治療の可能性が提唱された。新生児では、特異な神経細胞死が海馬支脚と橋核に限局して生じ、アポトーシスに類似した特徴を持っていた。脳室周囲白軟化(PVL)は超低出生体重児でも生じ、軸索障害が意外に多く、グリア活性化されて、PVL形成に関与していた。乳幼児突然死症候群は新生児期から発生し、死亡前に虚血をきたす機序があることが証明されると共に、カテコラミン作動性神経の減少が示唆された。新生児の脳室周囲白質軟化では、発生機序について血管とグリアの発達が成因に関与することをリビューし、アミロイド前駆体蛋白の免疫組織化学的染色で軟化巣の軸索変性が証明され、軟化巣が容易に早期診断されるようになった。白質軟化は小脳半球にも発見され、新知見として報告した。Pontosubicular neuron necrosisでは、在胎30週以上の新生児では核崩壊は橋核と海馬支脚に限局するが、超未熟児ではそれ以外の部位にも認められ、より広範に発生していた。この疾患では、ferritinやapolipoprotein Eがグリアや神経細胞に一時的に増加し、細胞の抵抗性あるいは修復を反映していると考えられた。新生児頭蓋内出血後水頭症の発生機序について検討し、予防対策を考えた。

ペルオキソーム病、福山型先天性筋ジストロフィー、ダウン症候群、滑脳症、レックリング・ハウゼン病などの疾患についても、保存資料は免疫組織化学的、生化学的および遺伝生物学的な研究に利用された。1.発達期脳組織バンキングの進歩胎児・新生児・小児の脳組織を診断・保存し、1000例を越した。これを用いて、神経病理学的、分子生化学的研究を行うことができた。2.発達期脳の生化学的、分子生物学的ならびに免疫組織化学的研究の成果細胞接着分子L1の発現について、ヒト脳の発生・発達の過程で観察した。L1は神経突起発生の初期に強く発現し、正常な神経細胞移動、神経突起の伸展および軸索の発達に関連し、正常指標となった。また、知能障害や難治性てんかんを呈する結節性硬化症の遺伝子蛋白tuberinの抗体を作製し、免疫化学的に検討し、腫瘍組織で低下し、腫瘍発生に関与していることを証明した。脳性麻痺の原因となる脳室周囲白質軟化は脳低灌流によって起こり、サイトカインの一種であるTNFαは病巣部および周辺に増加し、ミクログリアを介して壊死の発生に関与していた。また、pontosubicular neuron necrosisは胎児・新生児に特有な神経細胞死であり、核崩壊像やグリアの反応の状態からアポトーシスに類似する形態を示した。この神経細胞死の初期にアポEが一時的に発現し、細胞死の防御に関与していると考えられた。新生児期の乳幼児突然死症候群は1ケ月以上の例と同じように、サブスタンスPと反応性アストロサイトの増加があり、出生前あるいは後の死亡前に慢性低酸素症があったことが考えられた。胎児から小児脳の組織バンクは着実に増加し、1000例を越した。これらを利用して、脳の正常発達と発達障害を系統的に検討した。ヒト脳の神経細胞にあるN-acetyl-L-aspartic acidをNMRで測定し、正常脳における年齢的変化と局在を明確にした。グルタミン酸受容体は新生児過ぎに一時的に強くなり、神経細胞の脆弱性とも関連すると思われた。グルタミン酸トランスポーターEAAT4は小脳のプルキンエ細胞にあり、年齢とともに胞体からシナプス後突起へと発現し、増加していた。小脳虫部は自閉症などで、低形成がみられ、注目されるが、プルキンエ細胞などの部位別発達特異性を明らかにした。proteolipidは髄鞘形成の前から発達していた。これらのことは発達障害や機能障害の発生機序の解明へ応用できる。新生児では、特異な神経細胞死が海馬支脚と橋核に限局して生じ、superoxide dismutaseが一時的に減弱しし、フリーラジカルがその発生と修復に関与していた。脳室周囲白質軟化(PVL)は超低出生体重児でも生じ、軸策障害が意外に多く、ミクリグリアや反応性アストロサイトが多く活性化されて、PVL形成に関与していた。神経細胞移動異常の脳では、接着蛋白質L1の発現をみることによって、皮質の形成機序が新たに推察できた。結節性硬化症の脳には、大きな細胞の結節があり、未熟な性質のみならず、特異な細胞分化の異常を伴っていた。ダウン症候群脳におけるamyloid precursor proteinの過剰発現や部位特異の早期発現を認め、早発痴呆の発生と関与していた。ダウン症候群では、小児期に成長抑制因子の発達が悪く、成人で早発する老人斑周辺にも成長抑制因子が減少し、老人斑の早期形成に重要であると考えられた。ダウン症候群では、神経原線維変化出現の前から神経細胞にcyclo-oxygenase 2増加することを発見し、フリーラジカルの関与と治療の可能性を提唱した。
リグナンの生合成機構とその酵素系の解明

本研究では、リグナン生合成の代謝制御とその反応機構を明らかにするため、樹木の代表的なリグナンの生成に関する立体化学的制御機構を検討するとともに、O-メチルトランスフェラーゼやメチレンジオキシ基生成酵素等のリグナンの官能基変換に関与する酵素系についての知見を得ることを目的とした。本年度は、植物材料としてキタコブシを用い、リグナンの芳香核官能基変換に関与するO-メチルトランスフェラーゼやメチレンジオキシ基生成酵素系を検討した。まず、十数種のラセミ体リグナンを化学的または酵素的に合成し、キタコブシ含有リグナンのエナンチオマー組成を精査した。キタコブシの非フェノール性フロフラン型リグナンはすべて光学的に純粋な(+)-体のみであったのに対し、pinoresinolやsyringaresinolなどのフェノール性フロフラン型リグナンは、(+)-体が優先的であったが光学的に純粋ではなかった。次に、キタコブシの非フェノール性フロフラン型リグナンの生成をセルフリー系で検討した。その結果、キタコブシ若枝から調製された粗酵素溶液は、S-アデノシルメチオニン存在下、種々のフェノール性フロフラン型リグナンのパラ位水酸基のメチル化反応を触媒すること、さらに、エナンチオ選択的なO-メチルトランスフェラーゼが関与すると考えられる数種の新規生合成経路を明らかにした。これらの酵素の精製及びキャラクタリゼーションは、今後の課題である。次に、リグナンの生成に関与するメチレンジオキシ基生成酵素系を検討するため、放射性同位体標識のリグナンを合成した。現在、粗酵素抽出液を用いるトレーサー実験によりメチレンジオキシ基生成酵素のアッセイ条件を検討している。本研究は、リグナン生合成の代謝制御とその反応機構を明らかにするため、樹木の代表的なリグナンの生成に関する立体化学的制御機構を検討するとともに、O-メチルトランスフェラーゼやメチレンジオキシ基生成酵素等のリグナンの官能基変換に関与する酵素系について知見を得ることを目的としている。今年度は、キタコブシのリグナンを対象に、標識モノリグノールを用いたフィーディング実験及び粗酵素抽出液によるメチル化変換反応を検討した。まず、重水素標識coniferyl alcoholをキタコブシ若枝に投与し、主要なフロフラン型リグナンへの取り込みを検討した結果、標識coniferyl alcoholのpinoresinolへのインタクトな取り込みが確認された。しかしながら、eudesmin、kobusin、phillygenin,及びfargesinについては、その取り込みを確認することはできなかった。次に、キタコブシの非フェノール性フロフラン型リグナンの生成に関与すると考えられるメチル化変換反応について無細胞抽出液を用いて検討したところ、キタコブシから調製した無細胞抽出液は、pinoresinolからeudesmin、syringaresinolからyangambin、及びpiperitolからkobusinへのメチル化変換反応を触媒することを示した。これらのメチル化反応は、(+)-体を優先的に生成させたものの、高度なエナンチオ選択性は見られなかった。これらの事からキタコブシのリグナン生合成では、2分子のシンナミルアルコール類の立体選択的カップリングによるフェノール性フロフラン型リグナンの生成、次いでこれが非エナンチオ選択的なメチル化を受け非フェノール性フロフラン型リグナンが生成するものと考えられた。現在、これらの反応に関与する酵素の精製及びキャラクタリゼーションを検討中である。
リボヌクレアーゼを介した成熟リボソーム排除機構の解明

出芽酵母において、栄養飢餓に誘導される成熟リボソーム分解の分子機構解明を目指した。出芽酵母に対し、栄養飢餓を誘導する抗生物質であるラパマイシンを作用させると、生物に高度に保存されたRNase T2型リボヌクレアーゼであるRny1pによりrRNAが分解された。また、同条件でリボソームタンパクが分解されることも確認された。そして、このリボソーム分解を通して酵母は栄養飢餓に適応する。ここで観察されたリボソーム分解のうち、一部は非選択的オートファジーにより液胞で起こるが、大部分のリボソームは液胞外で分解されると考えられた。本研究の目的は、出芽酵母がストレスに曝された際に、RNase T2ファミリーに属するRny1pがrRNAを分解して、余剰リボソームの排除を分担することを実証し、その分子機構を明らかにすることである。本年度は、Rny1pによる「rRNA分解を介した成熟リボソーム除去」を実証することを中心に実験を行った。飢餓応答を誘導するラパマイシンを作用させた出芽酵母で、rRNA量が減少することが報告されたが、これにはRny1pによるrRNA分解が関与すると考えた。また、ラパマイシンを作用させた野生株では、生育速度が低下するものの増殖が継続されるのに対し、RNY1破壊株は生育を完全に停止した。このことから、Rny1pは栄養飢餓条件に生育を適応させることが分かった。このRny1pによる生育適応化に際して、細胞内でRny1p依存的に起こる遺伝子の発現変動を、DNAマイクロアレイを用いて経時的かつ網羅的に解析した。その結果、野生株では、培養を継続するにつれてリボソームの生合成に関わる遺伝子セットの発現が上昇した。一方、こうした発現は、RNY1破壊株では見られなかったことから、Rny1pに依存した現象であると考えられた。これら遺伝子セットから無作為に抽出した遺伝子の発現変動を、リアルタイムPCRを用いて測定した。野生株、破壊株共、これら遺伝子の発現がラパマイシン添加後、急速に低下した。これは、ラパマイシンの作用により新規リボソーム合成が抑制されるためと考えられる。その後、野生株では再び発現が上昇したが、破壊株ではこれが見られず、マイクロアレイの結果が再現された。本年度は、課題1の「Rny1pのrRNA分解を介した成熟リボソーム除去の実証」、および課題3の「リボソーム排除機構の遺伝学的解析」を中心に研究を進めた。課題1に関して、昨年度は未達成であった「Rny1pによるrRNAの分解の定量的解析」を行った。野生株およびRNY1破壊株にラパマイシンを作用させた後、経時的に全RNAを調製した。18S, 25S rRNAを逆転写し、リアルタイムPCRを用いてそれぞれのrRNAを定量した。その結果、破壊株において18S, 25S rRNAの蓄積が見られた。このことから、ラパマイシンの作用に応答してRny1pが18S, 25S rRNAを分解する様子が定量的に証明された。更に、リボソーム量を定量するために、特定のリボソームタンパクにエピトープタグを付加した。これを用いてウエスタンブロッティングを行うことで、リボソームタンパク質の検出に成功した。これより、リボソーム量を定量化する実験手法が確立出来た。また、RNY1遺伝子破壊株では、液胞内に核酸の蓄積が観察されることから、液胞内でrRNAが分解されると考えた。課題3に関して、既知のリボソーム分解系として(1)ユビキチン-プロテアソーム系(2)選択的オートファジー(リボファジー)が知られている。本研究で注目するリボソーム分解が、これらの系に依存するかを検討した。そこで、これらの経路に関与する因子の遺伝子を破壊した株において、Rny1pによるrRNA分解が起こるかを調べた。しかし、いずれの遺伝子を破壊してもrRNAの分解には影響しなかったことから、Rny1pが関与するリボソーム分解は、これら既知の経路とは異なることが示唆された。本研究は、栄養飢餓を誘導するラパマイシンを作用させた出芽酵母において、余剰となった成熟リボソームが分解されることを、主にrRNA分解の方向から観察し、その分子機構・生理学的意義を明らかにすることを目的とする。本年度は、ラパマイシンに応答したリボソーム分解を、リボソームタンパク分解の側から検証した。昨年度に行った、エピトープタグを付加したリボソームタンパクに加え、特定のリボソームタンパクに対する特異抗体を用いたウエスタンブロッティングによる定量を行った。いずれの場合においても、ラパマイシンに応答したリボソームタンパク分解が確認された。しかし、その分解の程度はrRNA分解に比べて低く、リボソームタンパク分解とrRNA分解とは独立的であることが示唆された。また、窒素飢餓に応答してリボソームが非選択的オートファジー依存的に分解されるとの報告があった。そこで、本研究で注目するリボソーム分解がこれに依存するかを調べた。しかし、非選択的オートファジーが起こらない株であっても、野生株と同様にリボソームタンパク分解が観察された。これより、ラパマイシンに応答したリボソーム分解は、非選択的オートファジーに依存しないと考えた。以上も含め、本研究全体から得られた成果は以下の通りである。ラパマイシンを作用させた出芽酵母では成熟リボソームが分解されるが、このうちrRNAはリボヌクレアーゼRny1pにより分解される。