hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先天性魚鱗癬における自然治癒機構の解明

先天性魚鱗癬などの遺伝性角化症(ichthyosis with confettiなど)では、身体の一部において体細胞組換え(体細胞レベルでの相同組換え)により病因遺伝子変異が消失し、自然治癒する現象が知られており、これをrevertant mosaicism(復帰変異モザイク)と呼ぶ。本研究では、遺伝性角化症において体細胞組換えによる自然治癒部位が多発する機序を解明するために、変異タンパク質と野生型タンパク質を安定発現する細胞株をTet-On/Offシステムを用いてそれぞれ樹立した。まずはじめに、DNA double-strand breakの指標であるγH2AXを免疫染色とWestern blotを用いて解析し、変異タンパク質がDNA double-strand breakを引き起こすか検討したが、変異タンパク質発現による変化は認められなかった。しかし、変異タンパク質発現下でヒドロキシウレアを用いて複製ストレスを与えると複製ストレス応答に変化を生じ、DNA修復関連タンパク質(Rad51など)の発現に変化が見られることがわかった。現時点ではヒドロキシウレア投与以外の複製ストレスや、X線照射などによるDNA double strand breakに対する応答については検討できていないが、これらの結果は、変異タンパク質が発現すると複製ストレス応答の異常を介してbreak-induced repairが引き起こされ、相同組換えが誘導されている可能性を示唆するものである。また、ロリクリン角皮症という遺伝性角化症において体細胞組換えによるrevertant mosaicismが見られることを世界で初めて見出し、論文発表した(Suzuki et al. Life Sci Alliance 2019)。これまでの実験結果から、変異タンパク質が直接DNA double strand breakを引き起こし組換えを増加させるのではなく、複製ストレス応答の変化を介して組換えを増加させる可能性が示唆された。これは当初の仮説とは異なるものの、変異が組換えに与える影響と組換えを増加させる機序の方向性を確立することができたことから、研究計画は概ね順調に実施されていると判断した。DNA fiber assayを用いた複製フォーク解析を行い、変異タンパク質発現が複製ストレスを誘導するか検討する。また,変異タンパク質がDNA double strand breakの修復過程に影響を与えるか検討するために、安定発現細胞株にX線照射やエトポシド添加を行い、評価する。これまでヒドロキシウレアを用いて複製ストレス応答を検討しているが、ヒドロキシウレア以外の薬剤、例えばアフィディコリンの投与下でも同様の結果が再現されるか検討を行う。Array cardを用いて、変異タンパク質発現前後での遺伝子発現の違いを検討し、何が複製ストレス応答の変化に重要なのか明らかにする。変異が組換えにより消失した細胞が増殖し肉眼で確認できるサイズの正常皮膚を呈するためには、変異細胞との競合に打ち勝つ必要がある。正常化細胞と変異細胞を用いて、コロニー形性能や細胞増殖能を測定し、この点を解明する予定である。先天性魚鱗癬などの遺伝性角化症では、身体の一部において体細胞組換えにより病因遺伝子変異が消失し、自然治癒する現象が知られており、これをrevertant mosaicism(復帰変異モザイク)と呼ぶ。本研究では、遺伝性角化症において体細胞組換えが起こる機序の解明を目指した。本年度はまず、疾患で認められる変異タンパク質自体が組換えを誘導するか否かを検討するために、変異タンパク質を強制発現した細胞をフローサイトメトリー法や免疫染色を用いて解析した。結果、変異タンパク質を発現した細胞では細胞周期のS期においてRAD51(組換えにはRAD51のfoci形成が必要である)のfociが増加することがわかり、変異タンパク質が体細胞組換えを誘発している可能性を示すことができた。次に、変異タンパク質により誘導された組換えが、DNA複製ストレスに伴う複製フォークの停止に起因するものか調べるために、DNA fiber assayを用いて、複製フォークの解析を行った。結果、変異タンパク質の過剰発現により複製フォークのスピードが低下し、左右非対称なフォークの頻度が増加していた。これらの結果は、変異タンパク質によりDNA複製ストレスを引き起こしていることを示唆しており、現時点では、変異タンパク質がDNA複製ストレスおよびそれに引き続くbreak-induced repairを引き起こし、組換えを生じる可能性を第一に考えている。これらの結果をもとに、次年度以降の研究計画を進めていく予定である。研究初年度は当初の予定通り、変異が組換えに与える影響と組換えを増加させる機序の検討を行った。結果、変異タンパク質が組換えを誘導すること、ならびに、その機序がDNA複製ストレスおよびそれに引き続くbreak-induced repairであることを示すことができた。本研究の申請段階では、変異タンパク質がDNA double-strand breakを誘導する可能性を考えていたが、現在までに得られた結果からすると、変異タンパク質はむしろDNA複製ストレスおよびそれに引き続くbreak-induced repairを引き起こしているようであり、当初の仮説とは異なるものの、変異が組換えに与える影響と組換えを増加させる機序の検討を済ませることができ、概ね順調に経過していると判断した。

しかし、変異タンパク質発現下でヒドロキシウレアを用いて複製ストレスを与えると複製ストレス応答に変化を生じ、DNA修復関連タンパク質(Rad51など)の発現に変化が見られることがわかった。現時点ではヒドロキシウレア投与以外の複製ストレスや、X線照射などによるDNA double strand breakに対する応答については検討できていないが、これらの結果は、変異タンパク質が発現すると複製ストレス応答の異常を介してbreak-induced repairが引き起こされ、相同組換えが誘導されている可能性を示唆するものである。また、ロリクリン角皮症という遺伝性角化症において体細胞組換えによるrevertant mosaicismが見られることを世界で初めて見出し、論文発表した(Suzuki et al. Life Sci Alliance 2019)。これまでの実験結果から、変異タンパク質が直接DNA double strand breakを引き起こし組換えを増加させるのではなく、複製ストレス応答の変化を介して組換えを増加させる可能性が示唆された。これは当初の仮説とは異なるものの、変異が組換えに与える影響と組換えを増加させる機序の方向性を確立することができたことから、研究計画は概ね順調に実施されていると判断した。研究初年度に得られた「変異タンパク質がDNA複製ストレスおよびそれに引き続くbreak-induced repairを引き起こす」可能性をさらに検証するために、一本鎖DNAを標識する抗RPA抗体や抗BrdU抗体を用いた免疫染色、ならびに、DNA-end resectionの有無を評価するためのDNA fiber assayを実施する予定である。その後、当初の予定通り、RNA-seqを用いて変異タンパク質が遺伝子発現に与える影響を評価する。さらに、変異タンパク質が体細胞組換えを誘発する際の作用点を解明するべく、ChIP-Seq、共免疫沈降法、ツーハイブリッド法を用いて、変異タンパク質が結合する物質の特定を行う予定である。DNA fiber assayを用いた複製フォーク解析を行い、変異タンパク質発現が複製ストレスを誘導するか検討する。また,変異タンパク質がDNA double strand breakの修復過程に影響を与えるか検討するために、安定発現細胞株にX線照射やエトポシド添加を行い、評価する。これまでヒドロキシウレアを用いて複製ストレス応答を検討しているが、ヒドロキシウレア以外の薬剤、例えばアフィディコリンの投与下でも同様の結果が再現されるか検討を行う。
ＥＵにおける中等教育段階の早期離学に関する比較研究

EU(欧州連合)の新経済成長戦略である「欧州2020」の5つのヘッドライン指標に教育分野の「(中等教育)早期離学者比率の引き下げ」が含まれていることへの注目が本研究のスタート地点である。本年度は,まず,これまで継続して考察しているベンチマークの達成状況等を,毎年度発行されるモニタリング報告書の最新版をもとに,EU加盟国の達成状況,雇用状態別,国内格差(性別,出生地別,国内地域間格差)を分析検討した。分析にあたっては,過年度の研究成果およびヨーロッパで新たに出された早期離学の国際比較調査研究の成果を参照した。また,加盟各国の早期離学対策の状況を過去3年間のEurydice(EUの教育情報ネットワーク機関)によるデータ(構造的指標)からとりまとめ,考察をおこなった。最新版のデータでは,すべての方策(指標)に対応できているのは3ヵ国(ベルギーのフランス語圏,フランス,ポルトガル)であり,ほとんどの加盟国で対応できている方策は「オールタナティヴ教育・訓練の経路の提供」「異なる母語を持つ生徒のための言語支援方策」「セカンドチャンスの教育」であるなど,次年度の研究総括にむけていくつかの比較指標を得ることができた。以上の成果は研究論文にまとめ発表した。フランスについては,連携研究者(現・研究協力者)による現地調査等によりセカンドチャンスの教育ほか,早期離学対策の現状等を把握することができてきている。以上の得られた成果をもとに,イギリスや未調査の現地調査等,中等教育段階における早期離学に関わる対策の作用や学びのルート保障等の考察などが最終年度の研究総括にあたって残された課題となった。上記の研究実施においては,研究協力者との研究打ち合わせ,関連する先行研究や資料等の文献収集を並行しておこなっている。継続して取り組んできた,EUのモニタリング報告書等による早期離学に関する現状分析については,今年度はEU加盟国の達成状況の分析検討に加えて,加盟各国の早期離学対策の状況をEurydiceによる過去3年間のデータ(構造的指標)からとりまとめ考察をおこない,成果として雑誌論文にまとめることができた。これにより,今後の比較考察の指標をいくつか得ることもできた。また,研究協力者によるフランスの現地調査等からフランスの早期離学に係わる制度設計,対策等について把握ができた。一方で,イギリス(スコットランド)の早期離学に係るデータおよび過去の調査結果や新たにヨーロッパで出された早期離学に関する比較研究の検討など,現地調査の準備は進んだが,フランス以外での現地でのレビューや調査等が年度内に充分に実施できなかったことなどから,それらの実施と研究総括に向けた比較考察等をおこなうために補助事業期間延長申請を必要としたため。早期離学のモニタリング報告書等のデータ分析の総括とともに,得られた比較指標等をもとにしながら未実施の現地調査を実施する。そのうえで,比較考察・研究総括(残された課題の整理を含む)をおこない,中等教育段階の早期離学の背景および,おもに早期離学対策に係わる制度的ネットワーク形成とそのメカニズムを明らかにすることを試みる。そして,早期離学対策からみた中等教育の社会的意味の考察につなげていくことをめざして,あらたな研究課題を取り出すこととしたい。EU(欧州連合)の新経済成長戦略である「欧州2020」の5つのヘッドライン指標に教育分野の「(中等教育)早期離学者比率の引き下げ」が含まれていることに注目することを研究のスタート地点とし,本年度は,EUの政策文書,ワーキンググループ報告などから早期離学に関するEUのこれまでの政策・方針を振り返り,EUの経済戦略と教育政策(Education and Training 2020: ET2020)の連動を捉えながら,20092014年の指標達成状況の変化について,EUによる早期離学に関するモニタリング報告書ほかの分析を中心におこなった。ここでは,分析結果のひとつを挙げておく。最も達成の進展が見られない加盟国に共通している要因は国内地域間格差であった。そこには,加盟国間の差異だけではわからない,加盟国間に共通した早期離学要因が表出している場合があると推察される。また,早期離学率を下げる取り組み例としては,セカンドチャンスの学校や,EUのヨーロッパ社会投資基金(ESIF)の活用等が挙げられる。2014年のEU機関による報告書では,早期離学の3つの要因(「個人,家族,社会経済的状況,移民もしくはマイノリティの背景,ジェンダー」「教育制度(留年制度,社会経済的分離,早期のトラッキングなど)」「労働市場」)が提示されている。先述の要因については複数の要因からなる複合的なケースもあり,それら要因とともに,多層的・複層的であることが求められると推察される早期離学対策の実践例の考察は次年度以降の課題となった。さらに,早期離学が示すデータがヨーロッパ社会の貧困や社会問題を投影している点にも注目していく予定である。なお,上記の研究実施においては,連携研究者との研究打ち合わせ,フランスおよびイギリスの先行研究や関連資料等の文献収集を並行しておこなっている。予定していた研究計画のうち,EUの政策文書・ワーキンググループ報告などからの早期離学に関するEUのこれまでの政策・方針の再考,EUの早期離学に関するモニタリング報告書等の分析による全体の傾向および本研究の調査対象(および候補)国(イギリス,フランスほか)の位置づけ等の把握,フランスおよびイギリスを中心にした中等教育および早期離学に関するネットワークや制度,教育・社会問題等の先行研究・関連資料の収集等はおおむね進み,成果として雑誌論文にまとめることができた。

一方で,早期離学に関する現地でのレビューや調査等が,年度後半のヨーロッパ社会情勢ほかにより現地調査の設定が遅れ,次年度へと計画変更したことから,その点においてやや遅れが生じている。この点は次年度において補いたい。EU(欧州連合)の新経済成長戦略である「欧州2020」の5つのヘッドライン指標に教育分野の「(中等教育)早期離学者比率の引き下げ」が含まれていることへの注目が本研究のスタート地点である。本年度は,昨年度からの継続課題でもある,欧州委員会による早期離学に関する報告書(2014年)で提示された早期離学の3要因(「個人,家族,社会経済的状況,移民もしくはマイノリティの背景,ジェンダー」「教育制度(留年制度,社会経済的分離,早期のトラッキングなど)」「労働市場」)をさらに検討するにあたって,最新のモニタリング報告書等を用いて,2004年以降のEU新規加盟国に注目して基本的なデータを比較考察し,社会経済的背景等を加味しながら,特色の析出を試みた。この成果については論文投稿等を準備中である。また,この成果からイギリス,フランス以外に比較対象とする第3国を選定予定である。また,フランスについては,早期離学に関するフランスからの研究者による複数の来日セミナー等への参加において,学校での進路指導とともに,どのような背景の生徒がどのような進路を選択し(選択させられ),離学も含めたその後のルートを選びとっているのかについて,最新の研究調査動向および先行研究を得ることができた。この成果を次年度につなげていく予定である。以上から,上記にイギリスを含めて,早期離学の背景とともに,再び教育や訓練に戻るルートをいかに構築しているのか(できるのか)を描き出すことが次年度以降の課題となった。上記の研究実施においては,連携研究者との研究打ち合わせ,関連する先行研究や資料等の文献収集・考察・検討を並行しておこなっている。昨年度から継続して取り組んできた,EUのモニタリング報告書等による早期離学に関する背景分析についてさらに進めることができた。これにより,本研究の調査対象とする第3国の選定が進んだ。また本年度は,特にフランスについて研究者の来日セミナー等に複数回参加できたことにより,中等教育および早期離学に関する教育・社会問題等の最新研究の把握ができた。一方で,イギリスについては,早期離学に関する現地でのレビューや調査等の設定にはやや遅れが生じているが,この点は次年度において補いたい。本年度はまず,昨年度に引き続き最新のモニタリング報告書等から基本的なデータほかを用いて,2004年以降のEU新規加盟国(いわゆるEU10諸国)に注目して比較考察をおこなった。比較考察では,EU10諸国を早期離学のモニタリングのデータ(2004年加盟以降分)を基に,顕著に離学率の高い1国とそれ以外の2グループ(中間,低率)に分け,後者の2グループからは近年上昇傾向にある国を選び,早期離学の背景について先行研究を含めて考察した。
イオンビーム・固体相互作用

特定研究「イオンビーム・固体相互作用」発足に当り、昭和60年6月16日、班長会議を開き、研究運営方針および本年度における研究会開催等について討論を行った。それに従って9月9日および10日の二日間京大会館において、各計画研究分担者,公募研究担当者が一営に会して第一回研究会を開催した。そこでは各研究者の研究計画の説明を行い、相互の情報交換をはかった。また総括班会議を開いて横の連携の強化をはかる研究推進の方法について討議した。その総括班会議の結論をふまえに研究会が10月19日および11月25日に立案され昭和61年1月12日から15日までの4日間第2回の研究会を湯河原において開催こゝでは各人の研究の発表することよりもむしろ、研究を進める上での困難さ、同じような方法でやった場合の精度の比較的、講演者はむしろ話題の提供者として討論を主とし、時間もほゞ無制限で行なった。夕食後にはイオンビーム実験における超高真空槽およびそれに付属する各部品についてのワークショップおよびイオンビーム実験におけるレーザーの利用の効果、有用性についてのワークショプを開いた。このワークショップは非常に有意義であり、各部品作成についてのノー・ハウを知り、安価に作成してもらえる工場等、レーザーが原子のどのような状態観察に有効か等の知識を得ることが出来、今後の研究遂行に役立った。またこの研究会においては、特定研究外の他省庁の専問研究者に招待講演を依頼した。今後も外部からの招待講演やテーマを限ってのワークショップを積極的に開催して、特定研究の活性化につとめたい。今年度の研究の締括りとして2月17日と18日の両日、東京において報告会を開催し、すべての研究者による研究成果の発表を行われ、17日は総括班会議を開き、昭和60年度の研究活動の総括と昭和61年度の研究運営方針について討論し、その結果をふまえて3月1,2日に班長会議で具体的方針を確立した。
糖質単一原料からの側鎖分岐型ポリエステルの生合成

本研究課題では,バイオマス由来環境低負荷材料,ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)をターゲットとし,糖質単一原料から側鎖分岐型の第2モノマー成分を含むPHA共重合体を微生物合成する方法を確立することを目指した。本研究では分岐型モノマー成分の前駆体として分岐側鎖を有した菌体内代謝物に着目し,当該代謝物を経由した分岐型モノマー供給経路の構築を行った。第1年度目では,目的の側鎖分岐型モノマーの供給に適した外来遺伝子を導入した,新規な組換え大腸菌を構築し,糖質等を炭素源とした際に目的の側鎖分岐型モノマー成分を含むPHAを合成することに成功した。続く第2年度目では,炭素源を糖質のみとすべく, PHA合成宿主微生物の検討を行った。従来用いた大腸菌では,側鎖分岐型モノマー成分の前駆体合成量が限られていたことが課題だったが,当該分岐前駆体を過剰合成するように改変された大腸菌をPHA合成宿主に用いたところ,従来よりも高い分岐型モノマー分率を示すPHA共重合体を,糖質単一炭素源から得ることができた。また,得られたPHA共重合体をガスクロマトグラフ質量分析計,および核磁気共鳴分光計で分析したところ,本PHA共重合体は主モノマー,および分岐型モノマーの2成分のみからなる共重合体であることが分かった。組換え大腸菌を宿主とし,また炭素源に糖質のみを用いた条件での側鎖分岐型モノマー成分を含むPHA共重合体の例はこれまでになく,本研究が初の例となった。(抄録なし)本研究課題では,バイオマス由来で環境低負荷とされる微生物産生ポリエステル,ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)をターゲットとし,糖質単一原料から側鎖分岐型の第2モノマー成分を含むPHA共重合体を微生物合成する方法の確立を目指している。糖質単一原料から側鎖分岐型モノマーを供給するため,本研究では分岐側鎖を有した菌体内代謝物に着目し,当該代謝物を経由した分岐型モノマー供給経路を外来遺伝子の導入により構築することを試みる。第1年度目では,PHA生合成の宿主微生物に,目的の側鎖分岐型モノマーの供給に適した外来遺伝子を導入し,新規な組換え微生物を構築することを試みた。ゲノムDNAよりクローニングした外来遺伝子を,遺伝子発現ベクター上のプロモーター下流に組込むことで目的外来遺伝子をコードしたプラスミドを構築した。このプラスミドとPHA生合成関連遺伝子をコードしたプラスミドを宿主微生物に導入し,得られた組換え微生物を糖質等を炭素源とした条件下で培養した。培養の結果,新規組換え微生物は細胞内にPHAを蓄積することが分かった。蓄積されたPHAの組成をガスクロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィー/質量分析計で分析したところ,外来遺伝子を導入した組換え微生物を宿主とした場合に,目的の側鎖分岐型第2モノマー成分がPHAに導入されていることが分かった。側鎖分岐型モノマーの供給に適した外来遺伝子を導入していない組換え微生物においては,同一条件下での培養で側鎖分岐型モノマーが検出されなかったことから,導入した外来遺伝子が組換え微生物内で機能し,側鎖分岐型モノマーの供給経路が構築できたことが示唆された。本研究課題において重要な位置を占める,外来遺伝子を用いた側鎖分岐型モノマーの供給経路の構築に成功し,課題の最終的目標である糖質単一原料からの側鎖分岐型ポリエステルの生合成の実現につながる結果が得られたため。本研究課題はこれまでのところ当初の申請計画に即した形で進展している。次年度は計画の未達成部分である分岐側鎖ユニットを高分率に含む共重合体の糖質単一原料からの生合成と,得られた共重合体の分子量,物性の解析等を行い,糖質からの有用ポリマーの生合成経路の構築を完遂する。(抄録なし)
大腸菌のタンパク質分泌装置:膜内在性成分secYの機能

1.SecYタンパク質の過剰生産系を作成し、本タンパク質を単離・精製した。そのN末端配列を決定し、遺伝子上の翻訳開始部位を確定した。本タンパク質のN末端は、メチオニンの除去以外のプロセシングを受けないことを示した。2.SecYタンパク質の膜における配向を、プロテアーゼ感受性やアルカリ性フオスファターゼとの雑種タンパク質の局在性をしらべることにより解析した。本タンパク質が10ケ所の膜貫通配列により、深く膜に埋れていることを示した。3.MalE-LacZ雑種タンパク質が細胞に与える広範囲な影響について解析した。それが熱ショックタンパク質を誘導したり、secY変異株の分泌欠損を増強させることを示した。4.温度感受性secY変異株の、遺伝子外抑制変異を分離、解析した。抑制変異(ssy)を6種類同定し、その中にリボソームタンパク質Slや翻訳開始因子IF2の変異が含まれることを明らかにした。
野菜や果物のペクチンとテクスチャーの関係

野菜の煮熟による軟化の難易とペクチン質およびその他の細胞壁成分との関係についてダイコン、タケノコ、レンコン、ゴボウを用いて検討した。ダイコンの煮熟による軟化の難易には、煮汁のpHおよびペクチン質の組成の違いが大きな影響を及ぼすことが判明した。希塩酸可溶性ペクチン(pA:エステル化度の高いペクチン)を多く含むほど軟化しやすく、酢酸塩緩衝液可溶性ペクチン(pB:エステル化度の低いペクチン)を多く含むダイコンは軟化しにくかった。中性溶液中で加熱した場合、エステル化度の高いペクチンほどβー脱離により分解しやすいためと思われる。pBは煮熟後もある程度組織中に残存して煮崩れ防止に役立っている。ゴボウ、レンコンがダイコンより軟化しにくいのは、pAよりpBを多く含むためである。これらの野菜を35°Cの希塩酸、続いて酢酸塩緩衝液に浸すと、大部分のペクチン質が溶出し組織は軟化した。そのため、これらの野菜のペクチン質はヘミセルロースなどと共有結合により不溶化しているのでなく、おもにカルシウムなどの影響により不溶化していると考えられる。タケノコは煮熟により軟化しにくく、煮崩れを起こさない。タケノコにはpA、pBが少なく、ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液で加熱抽出サレルペクチンpCが約88%を占めていた。同溶液で90°C加熱抽出を3.5時間×14回しても相当硬く、続いて24時間×10回抽出して完全に軟化した。タケノコのpCのエステル化度は低く、中性糖を多く含んでいた。また、他の野菜に比べペクチン質量が少なく、ヘミセルロースを多量に含んでいた。以上の点から、タケノコが煮熟により軟化しにくい原因として、低エステル化度のpcが多いためβー脱離が起きにくいことと、キシロースやβ結合していると考えられるグルコースなどの不溶性の中性糖を多く含むため、pcが煮熟により溶出しにくいことなどが考えられる。野菜の煮熟による軟化の難易とペクチン質およびその他の細胞壁物質との関係についてダイコン,タケノコ,レンコンを用いて検討した.1.ダイコンの煮熟による軟化度が季節や部位により異なる原因について検討した.冬ダイコン(12月, 1月収穫)が夏ダイコン(7月, 8月収穫)より軟化しやすく上部が下部より軟化しやすかった.その原因は,冬ダイコンおよび上部に比較的エステル化度の高いペクチン質(PA)を多く含むため,ペクチンのβ-脱離が起こりやすく軟化しやすかったためと思われる.ダイコンの煮熟によるマセレーションには,煮汁のpHやペクチン質の組成やエステル化度が影響しているが,煮熟後のかたさにはヘミセルロースなどもある程度影響していることが考えられる.2.タケノコのペクチンを35°Cの希塩酸溶液(pH2.0),続いて酢酸塩緩衝液(pH4.0)で抽出(抽出液各々pH,pB)しても抽出量が少なく,抽出後も総統かたさを維持していた.最後にヘキサメタリン酸ナトリウム溶液で90°C, 3.5時間抽出(pC)を10回繰り返しても相当かたく,同溶液で90°C1日抽出を10回繰り返して完全に軟化した.ダイコン,レンコンなどの野菜は同溶液1回抽出で完全に軟化した.タケノコの軟化しにくさの原因は, pCの性質および細胞壁内での存在にあるように思われる. pCは低エステル化度で,タケノコ中に最も多く存在し,ヘミセルロースなどとの結合の仕方が他の野菜と異なり,より強固なため煮熟により抽出しにくく,そのため軟化しにくいものと思われる. pA,pB,pCのDEAEセルロースカラムクロマトグラム,セファロースCL-6Bによるゲル濾過の結果は各区分により異なった.3.レンコンのペクチンはpAが少なくpBが多かった.pCは収穫時期により異なり, 9月収穫の新レンコンには少なく, 12月, 1月収穫のレンコン中に多かった.野菜の煮熟による軟化の難易とペクチン質およびその他の細胞壁成分との関係についてダイコン、タケノコ、レンコン、ゴボウを用いて検討した。

同溶液で90°C加熱抽出を3.5時間×14回しても相当硬く、続いて24時間×10回抽出して完全に軟化した。タケノコのpCのエステル化度は低く、中性糖を多く含んでいた。また、他の野菜に比べペクチン質量が少なく、ヘミセルロースを多量に含んでいた。以上の点から、タケノコが煮熟により軟化しにくい原因として、低エステル化度のpcが多いためβー脱離が起きにくいことと、キシロースやβ結合していると考えられるグルコースなどの不溶性の中性糖を多く含むため、pcが煮熟により溶出しにくいことなどが考えられる。野菜の煮熟による軟化の難易とペクチン質およびその他の細胞壁物質との関係についてダイコン,タケノコ,レンコンを用いて検討を行った。1、ダイコン(n=39)の煮熟による軟化度と組織中のCa,Mg,Na,K,ヘミセルロース,セルロース,リグニン量の間に相関はみられず、煮汁のpHおよびペクチン質の組成の違いが軟化に大きな影響を及ぼすことが判明した。希塩酸可溶性ペクチン(pA;エステル化度の高いペクチン)を多く含むほど軟化しやすく、酢酸塩緩衝液可溶性ペクチン(pB:エステル化度の低いペクチン)を多く含むダイコンは軟化しにくかった。pA,pBはDEAEセルロースカラムクロマドグラフィーによる溶出パターンが異った。中性溶液中で煮熟した場合、エステル化度の高いペクチンほどβー脱離により分解しやすいため、pAを多く含むものほど軟化しやすかった。pBは煮熟後もある程度組織中に残存して煮くずれ防止に役立っていた。2、(1)タケノコをpH48またはシュウ酸ナトリウム溶液中で加熱すると他の野菜に比べて軟化しにくかった。(2)タケノコのペクチンはpA,pBが少なく、ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液中で加熱抽出されるペクチン(pC)および中性糖が多い点が他の野菜と異った。pH4で沈殿するヘミセルロースAにガラクツロン酸が約半量含まれており、その中性糖区分はキシロースが比較的多いのが特徴であった。(3)タケノコの食物繊維中にはヘミセルロースの占める割合が大であった。pCが比較的多い(ダイコンは約7%と少量)ことからも、タケノコのペクチンはヘミセルロースと共有結合していることも考えられ、そのため軟化しにくいと思われる。3、レンコンのpA,pB,pCについてDEAEセルロースカラムクロマトグラフィー、セファデックスGー100によるゲル濾過、ガスクロによる中性糖の組成の定量などを行った。ゴボウ、レンコンの煮熟により原化しにくい原因とペクチン質の性質との関係について検討し、タケノコ、ダイコンなどとの比較を行った。1.ゴボウはペクチン質含有量が多く(993.3mg/100g)、希塩酸抽出区分(pA)39.4%、酢酸塩緩衝液抽出区分(pB)53.9%、ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液抽出区分(pC)6.7%でpBを多く含んでいた。pBのエステル化度は38.3%と低値であり、塩化カルシウムにより沈殿した。pA、pB、pCのDEAEーセルロースカラムクロクトグラムは各々大きく異なった。pAの中性糖区分(I)はイヌリンが大部分を占め、弱酸性ペクチン質区分(II)よりペクチン酸区分(III)に多く溶出した。pBはIをほとんど含まずIIの後方、およびIIIに多く溶出したため低エステル化度であることが明らかになった。pCはIを多く含んでいる点を除きpBに類似していた。ごぼうのペクチン質の構成糖はアラビノース、ガラクトースを多く含んでいた。ごぼウのペクチン質の分子量をSepharoseCL=6Bによるゲル濾過で調べたところ、約54万200万の位置に溶出し、相当高分子であることが判明した。
エレクトロカタリストと過酸化水素を併用した難分解性物質処理技術的の創世

本研究では難分解性化学物質を効率よく処理できる新しい原理と発想に基づいた処理技術の開発を目的し、鉄電極を用いた電気分解と過酸化水素の併用による排水処理技術の開発を試みた。この方法では、有機物の電気分解と過酸化水素自身による酸化分解に加えて、陽極から溶出する第一鉄イオンと過酸化水素との反応により生成されるヒドロキシラジカルによる酸化分解との複合効果が期待され、有機物を効率よく分解できると考えられる。モデル排水としてフェノール水溶液を用い、鉄板を電極とした回分式直流電気分解装置を用いて実験を行い、フェノールの分解に対する電圧、電流および過酸化水素添加量の影響を解析し、以下の成果を得た。1.過酸化水素による分解処理および電気分解処理でのフェノール分解率と比較した結果、電気分解と過酸化水素を併用した処理技術の有効性が確認された。過酸化水素のみを用いた酸化分解処理でのフェノール無機化率(有機炭素除去率)は10%以下に留まった。また、電気分解処理では50%程度のCOD除去率が得られたものの、有機炭素が除去されず、フェノールの無機化がみられなかった。一方、電気分解と過酸化水素を組み合わせた処理では、電圧によって若干影響されるものの、最適操作条件では95%以上のCOD除去率と70%以上のDOC除去率が得られた。以上のことから、電気分解と過酸化水素の併用によって、フェノールの分解が大きく促進できることが明らかにされた。2.電気分解と過酸化水素を併用した処理での電流および過酸化水素利用効率を高く維持するためには、電極への印加電圧を5V以上にする必要があることがわかった。3.鉄電極を用いた電気分解と過酸化水素を併用した排水処理技術の有機物酸化分解能力が高く、難分解性物質を含む産業排水処理への適用の可能性が示された。
細胞融合法による単クローン抗体の作製と血液系遺伝標識の検出および法医学的応用

細胞融合によって、単クローン抗体を作製した。クローニングに成功した抗体は、抗A、抗B、抗H、抗M、抗N、抗L┣aD3(/)e┫D3、抗L┣bD3(/)e┫D3、抗グライコホリンA(抗GPA)、抗グライコホリンB(抗GPB)および抗グライコリピッド(抗GL)の10種類である。抗体の性状はIgG/ないしIgM/kであり、IgGクラスの抗体はクームス依存性であった。研究成果は以下のようである。(1)単クローン抗体は、いずれも特異性に優れ、血液型判定用抗体として極めて有用である。特に抗A、抗B、抗H(O)は、ポリクローナル抗体に比較して著しく優れた特異性を示し、動物血球との抗原関連性に関する研究では新しい情報をていきうしつつある。また、抗GPA、抗GPBおよび抗体GLもポリクローナル抗体に比較して優れた特異性を示し、今後の抗原解析に不可欠と思われる。(2)抗M、抗N、抗L┣aD3(/)e┫D3、抗L┣bD3(/)e┫D3も、ポリクローナル抗体に比較して遜色はなく、動物免疫抗体の非特異分画を吸収除去する必要はなく、血液型判定用として有用である。(3)法医学的応用としては、血痕や唾液斑の吸収試験および解離試験用として利用可能であるが、これらの単クローン抗体とフロー・サイトメトリーを併用した検出法の方が正確な血液型判定は可能である。また、特異性に優れているので種属鑑別も兼ねた血液型判定抗体として利用できる可能性もある。前述の単クローン抗体は、申請者らの研究室で作製、使用するのみならず、他の研究機関(東北大、独協医大、川崎医大、大分医大、佐賀医大など)にも提供している。(1)抗A、抗B、抗H(O)はいずれも、人由来の抗A、抗Bと比較して特異性に優れ、血液型判定用抗体として適格である。抗H(O)も植物性凝集素の比較して孫色はなく抗体価、凝集素価の点で優れていた。また、Flow cytometryを併用すると、血痕や唾液斑からの血液型判定用抗体としても有用である。(2)抗M、抗N抗体も特異性に優れ、血液型判定用抗体として適格である。動物血で識別されるものはchimpanzeeのM抗原のみであった。(3)抗L^a_e、抗L^b_eの特異性は高く、人のLewis抗原とchimpanzeeのLewis抗原以外は凝集しなかった。なお、血液型判定用抗体としても有用と考えられる。以上のように、申請者の作製したmonoclonal抗体は、血液判定用として有用であり、法医学領域における利用価値もある。同時に、赤血球膜抗原の新しい情報の提供にも貢献するものであった。
染色体不安定性の分子機構の解明-主に動原体構造異常の関与について-

大多数の固形癌で癌の早期から染色体異数性などの染色体の大きな構造異常が認められることから、癌細胞はこのような染色体の構造異常が起こりやすい状態(染色体不安定性)にあり、その不安定な状態を維持しながら増殖し続けられるという正常細胞にはない特徴を持つ。その原因やメカニズムを明らかにすることは、癌の新しい診断・治療法の開発に結びつくと考えられる。我々はこれまでこの染色体不安定性に関わるいくつかの因子について報告してきた。その一つは、セントロメアタンパク質CENP-AとCENP-Hである。これらのタンパク質は姉妹染色体均等分配に必須な因子でありその発現抑制が染色体不均等分配を引き起こすことはよく知られているが、我々はそれらのタンパク質の発現増大も、その局在の変化をもたらすことにより染色体異数性を引き起こすことを見出した。興味深いことにほとんどのヒトの大腸癌組織において、CENP-AとCENP-Hは非癌部に比べ癌部で発現増大しており、これらの因子の発現異常が発癌に何らかの関与をしている可能性が考えられた。今回、CENP-Hの発現増大がin vivoでの腫瘍形成に関わること、またその発現が前癌病変でも増大していることを示唆する結果が得られ、動原体構造や機能の異常による染色体不安定性が発癌の原因であることが示唆されたので報告する。現在これらの動原体タンパク質をターゲットとした癌治療の可能性について検討中である。我々はまた、核膜タンパク質の一つであるlamin B2の発現抑制が染色体不安定性に関与していること、その原因として微小管の形成異常が関わっていることを報告してきた。今回、lamin B2がヒト大腸癌組織特異的なリン酸化を受けている可能性があること、またそれに伴い局在が変化することを見出した。このlamin B2の癌組織での変化は、癌化と何らかの関係があることが示唆され、現在そのメカニズムについて検討中である。大多数の固形癌で癌の早期から染色体異数性などの染色体の大きな構造異常が認められることから、癌細胞はこのような構造異常が起こりやすい状態(染色体不安定性)にあると考えられる。しかも、癌細胞はその不安定な状態を維持しながら増殖し続けられるという正常細胞にはない特徴を持つ。従って、その原因やメカニズムを明らかにすることは、癌の画期的な治療法に結びつくと考えられる。染色体安定性の機序として、細胞分裂時における姉妹染色体分配を保証するメカニズムの破綻が関与していると考えられているが、最近我々は、染色体均等分配に必須なセントロメアタンパク質CENP-AとCENP-Hがほとんどの大腸癌組織で発現増大していること、また、これらのタンパク質の発現増大とその結果起こる局在の変化が染色体異数性を引き起こすことを見出した(Cancer Res.2003,2005)。このことから、染色体不安定性に動原体構造や機能の異常が関与していることが考えられ、現在種々の癌細胞の動原体構造について検討を行っている。一方、動原体以外に染色体不安定性を引き起こす原因となる因子を調べるために、染色体不安定性を示す大腸癌培養細胞株(CIN cell line)と示さない細胞株(MIN cell line)の核タンパク質を用いたプロテオーム解析を行っている。具体的には、CIN cell lineとしてCaco2、HT29、SW480、SW837、WiDr、MIN cell lineとしてHCT116、RKO、DLD1、SW48からそれぞれ核タンパク質を抽出し、蛍光標識二次元ディファレンス電気泳動法(2D-DIGE)を用いてそれぞれの細胞株の核タンパク質の発現を比較検討した。また、発現の違いがみられたタンパク質について、Western blotや免疫染色を用いて確認した。その結果、核膜タンパク質であるLaminB2の発現がMIN cell lineに比べCIN cell lineで低下していた。そこで、MIN cell lineでのLamin B2の発現をRNAiを用いて抑制したところ、染色体異数性をもつ細胞数が増加した。さらに、lamin B2の発現を抑制した細胞では微小管の形成異常が認められたことから、lamin B2の発現低下による微小管の形成異常が染色体異数性を引き起こしたと考えられた(論文投稿中)。

我々はまた、核膜タンパク質の一つであるlamin B2の発現抑制が染色体不安定性に関与していること、その原因として微小管の形成異常が関わっていることを報告してきた。今回、lamin B2がヒト大腸癌組織特異的なリン酸化を受けている可能性があること、またそれに伴い局在が変化することを見出した。このlamin B2の癌組織での変化は、癌化と何らかの関係があることが示唆され、現在そのメカニズムについて検討中である。
代用電荷法と積分方程式法による数値等角写像の方法

本研究に先立ち、代用電荷法に基づく研究を行い成果を得ている。その一つが、流体解析への等角写像の応用において重要な・平行・円弧・放射の3種の標準スリット領域への等角写像の問題の統一的定式化である。平成12年度の研究により・統一的定式化を代用電荷法に依らないものに一般化し、・代用電荷法・積分方程式法による数値等角写像の方法を一般化された定式化に基づいて実装した。平成13年度の研究では、これまでの研究成果に基づいて、1.標準スリット領域として円弧スリット単位円環領域を用いた場合の数値等角写像の方法、2.代用電荷法による曲線スリット領域から標準スリット領域への数値等角写像の方法を提案した。1の成果と既に提案済の円弧スリット単位円板領域の方法とにより得られる有界な標準スリット領域への統一的な取り扱いについて、国際会議第10回ICNACSAにて講演発表を行なった。また、平行・円弧・放射の非有界な標準スリット領域に関する成果と併せて多重連結領域の代表的な標準スリット領域の全てを代用電荷法による数値等角写像の方法で取り扱うことができることとなった。2は、代用電荷法と積分方程式法に関して、後者が優位とされる境界上に特異性のある写像関数の近似と、両者が不得意であるとされる非常に薄い問題領域という2つの困難を併せ持つ問題への代用電荷法による方法の適用である。2の成果に関しては国際会議ICRACM2001にて講演発表を行なった。さらに、2に用いた方法を発展、一般化させることで、・角点等の境界上に様々な特異性のある写像関数の問題、・標準スリット領域から一般の多重連結領域への逆等角写像の問題に代用電荷法を適用することが将来の成果として期待される。本研究に先だって、代用電荷法に基づく研究を行い成果を得ている。その一つが、流体解析への等角写像の応用において重要な、平行・円弧・放射の3種類の標準スリット領域の統一的定式化である。今年度の本研究により、・統一的定式化を代用電荷法によらないものに一般化し、・代用電荷法・積分方程式法による数値等角写像の方法を同じ定式化のもとに実装した。代用電荷法による数値等角写像の方法によるもう一つの成果は、滑らかな境界を持つ問題領域に対する高精度な近似である。そこで、新しい実装のもと、このような領域に対して、代用電荷法と積分方程式法による数値等角写像の方法の比較を行い、代用電荷法による数値等角写像の方法の有効性を確認した。また、統一的定式化の一般化において、これまで2種の標準スリット領域への等角写像の合成によって取り扱っていた平行スリット領域への等角写像の方法を一般化し、より自然な、合成によらない方法を得た。以上の成果については、国際会議ICCAM2000において講演発表を行った。さらに、合成によらない平行スリット領域の取り扱いに関連して、代用電荷法による半解析的な近似解という特徴を利用したポテンシャル流解析の方法の一例となる、代用電荷法による数値等角写像を利用したよどみ点計算の方法を提案した。
ゆらぎ撮像エリプソメトリによる超臨界流体薄膜プロセスのマルチスケール制御

本研究は、超臨界流体のマイクロ・ナノエレクトロニクス応用を念頭に、超臨界流体中のマルチスケール揺らぎを「測り」「手なづける」ための方法論を構築することが目的である。本研究で大きく分けて,(1)エリプソメーターのナノ測定技術を利用した基板表面(界面)の局所揺らぎの測定と新規プロセスの提案,(2)ゆらぎ高速撮像エリプソメータの開発、(3)弾性表面波の表面敏感性を利用したメゾバルクの流体揺らぎ測定技術開発を行った。超臨界流体は高密度な圧縮性流体で,微小な圧力や温度の変動によりその密度状態が大きく変化する。これは流れなどのマクロレベルの揺動,密度=溶解度の局所的揺動(形状敏感は溶解度に関連し,毛管凝集から結晶成長にうつるゆらぎ(動的課程))双方に影響する。本研究は,超臨界流体を利用したナノ堆積プロセスにおけるナノセンチのマルチスケールゆらぎを観測・制御し,現在基礎的知見にとどまっている当該技術を実用プロセスに脱皮させるための学術的基盤を構築することを目的とする。研究初年度の平成21年度は、一軸ホットウォール型フロー式堆積装置を用いたCu成膜特性の検討について、流速依存性、ミクロ的拡散挙動の把握を中心に行った。その結果、拡散境界層厚さが堆積特性に大きく影響し、均一な流量分配と反応による原料消費のトレードオフが重要であることが判明した。また、大面積チャンバの設計準備として、アクリル板を用いた水モデル実験FEMによる流体解析を行った。ゆらぎ撮像エリプソは、二つの位相変調器を用いてきわめて高速に複屈折測定を行うための「デュアル電気光学結晶位相変調器」の理論的検討を行った。位相変調器の周波数比、複屈折測定式、誤差、などの理論解析を行うとともに、透過系の試作を行った。以上、ほぼ所定の目標を達成した。本研究では,エリプソメーターのナノ測定技術を利用して基板表面(界面)の局所揺らぎを,弾性表面波の表面敏感性を利用してメゾバルクの流体揺らぎを,有限要素法流体解析を利用してマクロスケールのバルク揺らぎを解析し,薄膜堆積特性やその場測定結果と対比を図ることで,超臨界流体のマルチスケール揺らぎを「手なづける」ための方法論を構築することを目的としている。本年度は、以下の4点を中心に研究を実施した。1。実際の大面積化によるプロセスアプローチの検討:大面積チャンバを導入し,体積要素法を用いた容器内流動解析を実施した。また,境界層の不均一さの被覆特性への影響を検討し,流動が面内均一性すなわちcm級揺らぎに及ぼす影響を解析した。2。点計測による表面吸着ナノスケール表面ゆらぎ現象の解析。エリプソメトリを用いて,膜堆積のその場成長観察を行った。偏光パラメータの異常共同を発見,モデル解析から吸着層の存在を実証できた。3。高速撮像(2次元)エリプソメトリーの開発を目指し,YカットZ伝播のLiNbO_3(LN)電気光学結晶(4x8x40mm)を位相変調器とし,初期実験を行った。実験では,LN結晶のリターダンスが-90°から0°,90°,180°に変調されるときの,CCDから2次元画像からエリプソパラメータを得た。4。「CO_2密度ゆらぎセンサ」の実現を目指し,LiNbO_3等の圧電基板上に弾性表面波共振子を作製,高圧CO_2中の振舞いを測定した。気相/液相間の密度と粘度の急激な変化を反映した周波数とインピーダンスの変化が観測され,二つの相状態を明瞭にセンシングできた。また,非圧電基板上の微小電極のインピーダンス変化によっても相状態を検出可能であった。を行ない,プロセス・計測両面で所定の目標をほぼ達成した。本研究は、超臨界流体のマルチスケール揺らぎを「測り」「手なづける」ための方法論を構築することが目的である。本年度は,(1)エリプソメーターのナノ測定技術を利用した基板表面(界面)の局所揺らぎの測定、(2)ゆらぎ撮像用エリプソメータの開発、(3)弾性表面波の表面敏感性を利用したメゾバルクの流体揺らぎ測定技術開発を主に行なった。得られた成果は以下のとおりである。1.点計測による表面吸着ナノスケール表面ゆらぎ現象の解析→膜堆積のその場成長観察・吸着層の存在を実証、屈折率の分光特性に基づく物質同定(原料凝集相)を行った。また下地によりゆらぎ吸着層の厚さや成長過程が異なることを確認、密度ゆらぎの重要性を実証。特に貴金属下地を用いた場合に初期反応が促進することを確認した。2.リアルタイム撮像エリプソメトリによるmmスケールの表面揺らぎ解析の可能性検討→昨年度製作した光変調素子を用いた撮像エリプソメーターの撮像処理ソフトを開発、1cm角(140pixels^□)程度の高速面計測装置を完成させた。

絶対値精度も1°程度で面計測装置として満足のいくものであった。3.μmcmスケールバルクゆらぎセンサ→昨年度までに開発したレイリー共振器弾性表面波共振子に加えてSH-SAW共振器を開発した。いずれも高圧CO_2中の相状態の同定に成功し、0.5°C程度の温度変化に誘起される密度ゆらぎの測定に成功した。加えて、さらに簡便な微小電極型誘電率測定以上、プロセス・計測両面で所定の目標をほぼ達成した。
歯牙形態保持因子の解明および発現の解析と再生歯牙への応用

本研究では、歯牙の形態保持および間葉系幹細胞の分化においてParp-1の発現の関与を示唆する結果を得た。マウスの歯牙を経時的に解析した結果、Parp-1欠損と老化の2つの因子が組み合わさると、歯牙内部の形態異常を引き起こすことが分かった。さらに、in vitroにおいて、間葉系幹細胞を骨細胞へ分化誘導したところ、Parp活性を阻害した細胞群においては骨細胞への分化が認められなかった。申請者らのこれまでの解析から、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(Parp-1)遺伝子ノックアウトマウスでは、老化に伴い歯根形態の異常、象牙芽細胞・セメント芽細胞の配列不正、髄腔内の象牙芽粒などの歯牙異常を認めることが明らかとなった。本研究において同マウスの歯牙や歯周組織における遺伝子発現の網羅的検索を行うことにより、歯牙構造の形成・維持に関与する因子を同定することを目標にしている。まず本研究において、老化したParp-1^<-/->マウスに認められた歯牙形態異常や形成不全に着目し、三次元的な構造変化について精査を行った。方法:80週令、オスのParp-1^<+/+>マウスおよびParp-1^<-/->マウスに対し、マイクロCT撮影を行った。マウスはすべてオス、Parp-1の遺伝子型それぞれにおいて3匹ずつの解析を行った。CT装置はヤマト科学のTDM1000、断層間隔は9.6μmで行った。解析ソフトはラトック社の3D骨梁構造計測ソフトTRI/3D-BONを用い、解析画像解像度は19.2μm、マトリックスサイズは521x521x521とした。結果:歯牙における歯髄組織の占有する容積割合は、Parp-1^<+/+>では23.4±3.05%、Parp-1^<+/->では23.4±1.54%、Parp-1^<-/->では29.32±12.1%であり、統計学的有意差は認められなかった。しかし、歯牙内における歯髄の形態変化は顕著であった。Parp-1^<+/+>およびParp-1^<+/->マウスにおいては歯髄の形態の変化は認められなかったが、Parp-1^<-/->マウスの歯牙では、内部は数本の細い歯髄が形成されていた。考察:今回の結果よりParp-1および老化の2つの因子が加わることにより、歯牙内部の形態保持能力が破綻することが示唆された。これまでの解析から、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(Parp-1)遺伝子ノックアウトマウスでは、老化に伴い髄腔内の歯牙異常を認めることが明らかとなった。2009年度は、老化したParp-1^<-/->マウスに認められた歯牙形態異常や形成不全について三次元的な構造変化の解析を行い、Parp-1の欠損と老化の2つの因子が歯牙内部の形態保持能力の破綻に関与することが示唆された。このメカニズムを細胞レベルで解析するために、2010年度はmesenchymal stem cell(MSC)の増殖とodontoblastへの分化誘導を試みた。まずC57BL/6マウス・6週令・オスの大腿骨から骨髄を採取した。6-well dish上で20%FBS添加α-MEM培養液で培養し、順次35倍になるように継代を行った。Parp-1^<-/->マウスにおいても、同じC58BL/6系統で同様に行った。しかしParp-1^<-/->MSCでは、P4以降の継代で細胞増殖しないことから、Parp-1^<-/->MSCは何らかの理由で増殖能が乏しいと判断、wild typeのMSCに、Parp-1阻害剤のPJ34(Carbiochem、メルク社)を3μM添加した培養液を用いた。その結果、wild typeと同程度の細胞増殖が認められた。P3のMSCをSatomuraらの方法を用いてodontoblastへの分化誘導を行った(未発表のため培養液の内容は非公開とする)。細胞は7日毎に回収し通法どおりにRNAを精製した。また、MSCはP4, P5,・・・, P10の継代それぞれでodontoblastへ分化誘導を行い、同様に7日ごとに細胞を回収しRNAを精製した。今後は各ポイントでの分化マーカーの発現レベルを調べ、比較検討を行う予定である。C57BL/6マウス・6週令・オスの大腿骨から採取した骨髄由来のMSCを用いて、odontoblastへの分化誘導を試みていた。Parp-1^<-/->MSCでは細胞の増殖能が著しく低下していたことから、Parp-1阻害剤のPJ34を添加した培地を用いた。MSCをP3,P4,P5・・・・と継代して分化誘導を行ったところ、P15まで継代を行うと、Parp-1阻害剤添加培地で誘導した方の骨化が起こらないことが分かった。Von Kossa染色にて確認を行った。

次に、分化マーカーの発現を調べた。cDNAの発現の有無においては、Parp-1阻害剤添加培地で誘導を行った方が、DSPPは遅れて発現することが分かった。更に、リアルタイムPCRの結果でも、発現量が減少していることが分かり、Parp-1がMSCの分化に関与していることが示唆された。一方、Parp-1^<-/->マウスの歯牙に認められた形態異常の解析においては、HE染色に続いて抗Parp-1抗体で染色を行った。その結果、Parp-1^<-/->マウスでは発現が認められなかったが、wild-typeのマウスでは、歯牙の形態異常近辺にParp-1の集積が認められた。DSPPとBMPの免疫染色を行い、それぞれParp-1との重ね合わせを行ったところ、両者に有意な相関性は認められなかった。しかし、Parp-1^<-/->マウスでは、形態異常が強く認められている事、wild-typeにおいても認められる軽度の形態異常の周囲にParp-1の集積が認められることから、Parp-1の発現が上昇することによって、形態異常の進行が抑制されている可能性が示唆された。
癌細胞におけるLRP蛋白細胞外ドメインの糖鎖形成不全と細胞増殖抑制との関係

我々は培養フラスコ中でconfluentになった後、増殖を停止し、栄養飢餓状態で300日以上G0期で停止し得る癌細胞を用い、細胞増殖停止に伴うレセプター型プロテイン・チロシン・キナーゼの細胞外ドメイン糖鎖の変化について研究した。ところが、免疫沈降およびwestern blottingに用いたLRPやLARなどの抗体の条件が悪く、他にも適切な抗体を入手できなかったため、目的の蛋白が検出できず、これらについての結論はみちびきだせなかった。しかしながら、この実験の経過中、同時にこの細胞の細胞周期関連蛋白の動態を調べたところ、G0期静止に必要な条件はcdc2蛋白の消失とRb蛋白の脱燐酸化のみで、cdk2,cyclin-A,cyclin-D1,およびMAP kinaseが発現していも、細胞はG0期に移行し得ることが判明した。さらに、G0期より細胞周期に入るときのこれらの蛋白の発現を詳細に調べたところ、G1/S期のいわゆるStart pointでcdc2,cdk2,cyclin-D1の発現、Rbの燐酸化が一斉に起こるが、この変化に先行してそれまで発現していたcdk2とcyclin-D1がいったん消失し、再びRbの燐酸化と時期を一致して発現していることが分かった。これらの結果については、次項の雑誌にて発表予定である。今後の研究課題としては、このG1/Sのstart pointに先行した、cdk2とcyclin-D1の発現消失と関連する細胞周期関連因子間の相互作用があるかどうかを検証することである。すなわち、p15,p16,p21,p27などのcdk inhibitor(CKI)の発現状況、cdk kinase活性、cdk,cyclinとCKIの結合状態を解析した後,このG0/G1移行期を通過した細胞が、S期に移行せずに再びG0期に戻ることが可能かどうかを検索する予定である。