hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アセトラクテート合成酵素阻害を指標とした低毒性・強力券草剤開発に関する研究

この阻害について、その阻害様式をLineweaver-Burkのプロットにより求めた結果、グリオキシル酸はALSの基質であるピルビン酸と拮抗してその作用を阻害することが判明した。以上のことから、ALS阻害を指標としてその阻害剤(除草剤)を見出すためには、至適pH8のタイプのALS(イネ,ムギ類)を用いて実施し、保存にあたってはpH7.0,-20°Cあるいはより低温(-80°C)とすること、またピルビン酸と拮抗するような構造類似の化合物を阻害剤候補とすることも一案であると判断された。アセトラクテート合成酵素(ALS)の活性の測定は,反応生成物であるアセトラクテートを脱炭酸してアセトインとして比色定量してきたが,この場合アセトインそのものが直接生成しても酵素活性の計算に入ってくるので,正確には生成するアセトラクテート自身を定量する必要がある.本年度は,アセトラクテートを化学合成したあと,(1)イオン交換カラム付HPLCによるアセトラクテートとアセトインとの分別定量,および(2)アセトラクテートおよびαーアセトーαーヒドロキシ酪酸(ALSによりケト酪酸を基質として生成しイソロイシン生合成前駆体となる)を酸性条件下,金属触媒とともに80°Cに加熱してジケトン化合物とし,空気蒸溜後メタノールに吸収してガスクロマトグラフィ(ECD)定量する方法により酵素反応の本質を明らかにしてきた.昨年度報告したクロルスルクロンによって阻害されないALSでは,ピルビン酸からアセトラクテートが検出されず,またアセトラクテートを基質としてアセトインを生成する反応もなく,この酵素はピルビン酸からアセトインを直接生成しているものと推定される.また,クロルスルクロンにより阻害される真のALSでは,アセトラクテートのみでなく,αーアセトーαーヒドロキシ酪酸の生成も阻害され,その50%阻害濃度もほぼ同様で,ALSがバリンとイソロイシンの両者の生合成に関与していることを伺わせた.酵素試料作製保存には,オオムギ葉を液体窒素中で磨砕したあと,緩衝液で抽出した液の50%硫安塩析物を再び液体窒素で凍結させたものを-20°Cで保存すると安定であることが判明した.一方,候補化合物探索では,グリオキシル酸がALSの阻害作用をもつことを見出したが,微生物分解のためか土壌処理剤としての除草活性は見られなかった.(1)アセトラクテート合成酵素(ALS)原材料としての最適植物の選抜本研究の目標としているALSを阻害する化合物(除草剤)をスクリーニングするためには、まずALS抽出に適当な植物を選抜する必要がある。本年度は、種子の入手や栽培が容易であること、磨碎が容易で他の共存物質の妨害が少いこと、調製したALSの保存性が良好であること、品種・生育ステージ・採取時期による活性変動の少いこと、アセトインの直接生成量が少いこと、クロルスルフロンに対する感受性が高いことなどの条件を買たす植物の採索を行った。自家栽培の作物21種および自然発生雑草4種合計25種の植物材料について、アセトイン直接生成能を含めた酵素活性やクロルスルフロン阻害率等を求め、春初夏期にはオオムギ・コマツナ・サントウサイ・ホウレンソウ、夏期にはハクサイおよびイネ、秋期にはホウレンソウおよびオオムギを好適な材料として選抜した。市販ホウレンソウは購入後、冷蔵庫内保存で3日目までは使用できる。(2)ALSに対する各種化合物の阻害作用いままでに検討してきた手法の有効性を検討する目的で、市販試薬36種および部分合成化合物3種について、それらのALS阻害活性を測定した。
虚血肢において二酸化炭素分圧の変動が組織血流量に及ぼす影響

基礎実験として、水溶液中の炭酸ガス濃度測定を行った。測定に用いた機器はイオン濃度計(東亜電波工業社製,IM-40S)で電極はCE-235を用いた。30°Cの温水で0.76mmHgであり、これに炭酸水素ナトリウム(花王株式会社製,バブ)25gを投与したところ、5分後1269.2mmHg,10分後1474.4mmHg,15分後1520mmHgに上昇し、高濃度のの二酸化炭素溶液の得られることが判明した。次いでレーザードプラ血流計(ADVANCE社製,ALF2100)および経皮O_2/CO_2モニター(NOVAMETRIX社製,840)を用い計測を行った。レーザードプラプローブは第1足趾裏面に貼りつけ、O_2/CO_2プローブは足関節の内顆上方やや前方に貼付した。最初に健常者での測定を行った。安静時では組織血流17.7ml/min/100g,pCO_257.3mmHg,pO_284.7mmHgで、30°Cの温水浴では組織血流量20.0ml/min/100g,pCO_255.3mmHg,pO_290.7mmHgであった。二酸化炭素負荷では組織血流量19.0ml/min/100g,pCO_256.0mmHg,pO_297.0mmHgで組織血流量の増加がみられないにも関わらず、組織酸素分圧は12.3mmHg上昇していた。下肢虚血症例では、安静時の組織血流量5ml/min/100g,pCO_248mmHg,pO_260.3mmHgで、30°Cの温水浴では組織血流量7ml/min/100g,pCO_249mmHg,pO_258.3mmHgであった。二酸化炭素負荷では、組織血流量6ml/min/100g,pCO_247.3mmHg,pC_259.6mmHgであった。組織血流量、組織酸素分圧ともに有意の変動はみられなかった。健常者群では二酸化炭素負荷により組織酸素分圧の上昇が得られたのに対し、虚血肢例では有意の変動がみられなかった。この原因として虚血例では、症例により酸素分圧の上昇するものと減少するものがみられたことが挙げられる。これが虚血の程度によるものか、閉塞部位によるものかはまだ不明であるが、症例によって二酸化炭素投与による反応の異なることが考えられ、今後症例を増やしさらに検討を続ける予定である。
NF-κB結合因子53BP2/ASPP2によるアポトーシス誘導作用と発がん

NF-κBは発がんからその進展に至る様々な段階で促進的に作用することから、がん治療の有望な標的として注目されている。とりわけ、ある種の腫瘍細胞ではNF-κBを恒常的に活性化することによって細胞死を免れ、また化学療法や放射線療法などに対する抵抗性賦与にも関与していることからNF-κB阻害剤もしくはその活性化過程の抑制剤の抗がん効果が期待される。そこで我々はその妥当性と蓋然性を確認するために、NF-κBが恒常的に活性化していることで知られるふたつの血液腫瘍、多発性骨髄腫(MM)と成人T細胞白血病(ATL)、に由来する細胞株や患者より採取した白血病細胞に対する新たに見いだされたIKK阻害剤ACHPによる細胞死誘導効果を調べた。その結果、いずれの悪性腫瘍細胞においてもACHPの比較的低濃度で細胞周期停止とアポトーシス誘導が引き起こされることが確認された。また、既知の抗がん化学療法との相乗作用も観察された。他方、我々はNF-κBのp65サブユニットとの相互作用から見出した53BP2/ASPP2によるアポトーシス誘導機構を解明した。53BP2はミトコンドリアに局在し、ミトコンドリア膜電位の低下が起こり、その結果カスパーゼ9に依存するアポトーシスカスケードが活性化され、アポトーシスが引き起こされるという一連の過程が明らかになった。また、IL-1β刺激でNF-κBの活性化を誘導した細胞では53BP2によるアポトーシスは阻害された。さらに、Bcl-2やBCL-xLを共発現させると53BP2によるアポトーシスは阻害された。以上のことより、ミトコンドリア経路を介した53BP2のアポトーシスは、アポトーシス抑制作用のあるNF-κBやBcl-2あるいはBcl-xLによって阻害されること、がん治療のためにはNF-κBやBcl-2等に対する阻害剤が有効であることが明らかになった。
地域医療再構築のための公営病院の財務および組織研究

本研究は、地方自治体が運営する公営病院事業の脆弱な経営基盤を、経営体質の改善により強化する方法を研究した。多くの公立病院は、公立病院改革プランにより、累積欠損金を削減しつつある。これまで見過ごしてきた経営意識の欠如、利用者側からの視点により経営は改善している。そして、全国の自治体が運営している公立病院の状況、公立病院同士でネットワークを再構築したり、地域資源の有効活用を促進することにより、稼働率の改善や経営基盤を強化出来ることを明らかにした。平成24年度の研究計画は、公営病院間の経営資源の共有化を可能にし、経営基盤を安定化するには何が必要かを明らかにすることにあった。調査として、全国の公営病院を訪問しての実態調査を行った。公営病院同士の経営資源の共有化、障害者福祉、介護の実態を調査した。また、改革プランにつき、公営病院の累積欠損金状況を把握するため大きい都道府県を重点的に視察を調査に加えその組織運営の変化を調査した。研究の成果は、「日本医療・病院管理学会」、「日本経営学会」の2学会において学会発表の機会を与えられ公表した。『訪問看護ステーションにおける連携戦略の実態と課題』日本医療・病院管理学会、2012年10月、川村文子・磯山優・王麗華・中嶋隆一(共同発表)医療での在宅看護の状況につきアンケート調査を実施した。アンケート調査では、今回は訪問看護のサービス提供の地理的範囲を限定し、実行可能な戦略を設定した。そこから経営基盤強化目的実現の課題について明らかにし、医療経営再構築について発表した。『訪問看護ステーションにおける情報活用の実態に関する研究』日本医療・病院管理学会、2012年10月、川村文子・王麗華・磯山優・中嶋隆一(共同発表)、地方都市部の訪問看護ステーションでのデータ収集を用いて分析をした。在宅医療の道筋として、訪問看護ステーションの活用の方法として、いかなる情報ツールを用いることが必要なのか、地域医療の経営手法を発表した。『公営病院の現状と経営破綻問題』日本経営学会関東部会、2013年1月、川村文子(単独発表)分析対象は、経営主体別分類基準による都道府県立病院199を悉皆調査し、公営病院経営の実態を発表した。本研究の目的は、全国自治体が運営する公営病院が地域医療の中心となり、医療の新体制を再構築させるために必要な、「医療・障害者福祉・介護情報管理体制」の構築について明らかにすることである。自治体が運営している公営病院事業(公立病院)の存在は、地域住民が平等に医療を受けるため、医療の最後の砦として必要不可欠の存在である。しかし現状では、公立病院の75%が赤字経営に陥り、2009年度累積欠損金総額は2兆1571億円に至った。調査結果として、累積欠損金200億円を超える公立病院は地方自治体10団体、累積欠損金100億円を超える公立病院は、地方自治体8団体であった。これは都道府県別の38%を占める結果である。地域医療の再構築は、累積欠損金を減少させるか、公立病院を減少させるか、喫緊の課題でもある。「医療・障害者福祉・介護情報管理体制」の構築とは、自治体公営病院間での経営資源および障害者福祉・介護情報の共有化を推進すること、現公営病院の経営基盤の強化を以下の点から検討した。(1)公営病院の経営状況および障害者福祉・在宅支援の現状を、実態調査により明らかにした。1設置主体別分類による公営病院経営状況の全数調査2日本や海外における医療・障害者福祉・介護の連携調査調査により明らかにした研究成果は、これまで問題とされてきたが手つかずだった公的医療経営の可視化や他の自治体病院との運用比較を可能にした。平成25年度の研究は、これまでの調査データを処理整理し、検証のため各地域の視察を実施した。また、科研の研究成果は、研究成果の一部ではあるが論文(1)・学会発表(4)により公表した。地域住民が平等に医療を受けるため、公営病院の存在は医療の最後の砦として必要不可欠の存在である。しかし、現状の自治体が運営する公営病院の75%が、赤字に陥り、2009年度累積欠損金は2兆1571億円に至っている。公営病院の再構築には、公営病院間での経営資源、障害者福祉介護情報の共有化を推進すること及び経営基盤の強化にある。全国自治体の公営病院が平成20年度内に策定した「公立病院改革プラン」は、総務省「公立病院改革ガイドライン」により各自治体病院の地域医療の在り方を「公立病院改革ガイドライン」に沿って公営病院事業の経営改革に取り組むため策定させた経営計画である。自治体による経営計画策定は100%実施され総務省に提出されている。計画は、数値目標の設定がなされ、これまで問題とされてきたが手つかずだった公的医療に対する経営の健全性や数値による運用の見直しが行なわれている。公営病院の経営改革は、改革プラン策定2年以降、実施状況の点検・評価が求められている。

研究で企業経営上用いられている財務管理手法が、「地方公営事業法」の公営病院においてどこまで有効かについて明らかにしてきた。また、学識経験を改革プラン作成において公営病院の問題点を提言してきた。それは、次の2点を明らかにした。(1)地域医療において、経営組織形態が指定管理者制であれ独立行政法人制であれ、組織再編は厳しい状況下でも選択を早急に行うべきである。(2)経営基盤強化のための経営数値化は、資金繰りの悪化を示す不良債務化を明らかにし、何に使われなければならないかの重要な指標になっている。研究の成果は、「日本医療・病院管理学会」、「日本経営学会」の2学会において学会発表の機会を与えられ公表した。『訪問看護ステーションにおける連携戦略の実態と課題』日本医療・病院管理学会、2012年10月、川村文子・磯山優・王麗華・中嶋隆一(共同発表)医療での在宅看護の状況につきアンケート調査を実施した。アンケート調査では、今回は訪問看護のサービス提供の地理的範囲を限定し、実行可能な戦略を設定した。そこから経営基盤強化目的実現の課題について明らかにし、医療経営再構築について発表した。『訪問看護ステーションにおける情報活用の実態に関する研究』日本医療・病院管理学会、2012年10月、川村文子・王麗華・磯山優・中嶋隆一(共同発表)、地方都市部の訪問看護ステーションでのデータ収集を用いて分析をした。在宅医療の道筋として、訪問看護ステーションの活用の方法として、いかなる情報ツールを用いることが必要なのか、地域医療の経営手法を発表した。『公営病院の現状と経営破綻問題』日本経営学会関東部会、2013年1月、川村文子(単独発表)分析対象は、経営主体別分類基準による都道府県立病院199を悉皆調査し、公営病院経営の実態を発表した。本研究は、経営学と会計学および医療福祉学というこれまで共同研究することがない複合型研究である。公的医療は、金銭提供の有無よりも、患者の存在により医療サービスは、発生する。特に、地域医療について、障害者福祉・介護を含む一体となった医療システムの構築は、公営病院にしかできない。公営病院の整備とその経営基盤強化は、この新しい視点から医療の問題に取り組む特色と独創性を有している。そのため、多くの問題点は、医療現場の問題だけでなく設置主体や経営財務の問題にまで踏み込んで研究することに意義がある。計画の進捗に若干の遅れを感じたのは、東日本震災の影響である。科研費の使用および調査につき、多くの制約があった。前年度の研究推進方策に沿って進めていく。公営病院を中心とする障害者福祉・在宅療養支援との連動による医療福祉情報管理体制の構築は、以下の点を重点的に進める。1.公営病院間の経営資源共有化による医療障害者福祉介護情報管理体制の基盤づくり2.地域医療の再生のための公営病院の経営基盤安定化3.医療費抑制のための障害者福祉・在宅支援の基盤づくり医療・障害者福祉介護情報管理体制の構築化、公営病院間の経営資源の共有化、安定化について、地域企業との異業種交流や中小企業間ネットワークも含め、諸外国における障害者福祉、介護実例等を参考にしながら具体的方法を検討する。前年度同様、研究の成果は学会発表、学術論文にて行っていく。
結晶成長の数理と微分方程式

結晶成長現象を記述する偏微分方程式を中心に、その可解性を中心にいくつかの新しい成果を挙げた。まず、雪結晶のような気相成長の場合、準定常型のステファン型の自由境界問題により、結晶面の成長を記述することも多い。ここでは結晶の形を円柱とし、その外側で過飽和度についてのラプラス方程式を仮定し、また空間無限遠でも過飽和度は既知とする。結晶面では、その外向きの成長速度が過飽和度の勾配に比例するという、ステファン条件を仮定する。また、結晶面での過飽和度は、動的効果も考慮したギブス・トムソン効果も考慮する。このような状況では過飽和度は、円柱のふちにくらべ、中心部の方が大きいという現象がベルグ効果として知られていたが、その厳密な数学的証明は、結晶形が正多角形の場合に関数論を用いたものだけしがなかった。ここでは円柱の場合、成長速度が定数の場合にベルグ効果を数学的に厳密に示した。この問題の難点は、領域にカドがあり、過飽和度が、境界付近で滑らかかどうかわからないことであった。ここでは、問題の軸対称性から、長方形の問題に帰着し、過飽和度の連続微分可能性を示した。その上で、その導関数に対して最大値原理を巧みに用いて、ベルグ効果を示した。この問題は、カドのある領域の外部でのラプラス方程式の解の性質という古典的な問題であり、既にさまざまな研究があったが、上の状況に適用できるものはなかった。したがって応用面のみならず、数学解析としても重要である。本研究では、さらに詰晶成長の仕組みのひとつである、うず巻成長について、そのモデル方程式の異方性が考慮されていても、等方的な場合に近い限り、うず巻型の解が存在し、安定であることをも示した。結晶成長現象には、さまざまな効果の面による異方性が反映している。界面支配モデルで記述できるような単純な場合でも、そのモデルには、表面エネルギーの異方性のほか、動的係数の異方性が含まれている。研究代表者は分担者の小林亮氏とともに、成長現象のうち、動的係数の異方性を反映したものか、表面エネルギーによる異方性を反映したものかを、区別することを提言し、さまざまな例でふたつの異方性の効果のちがいを説明した。また一方で、表面エネルギーの面の法ベクトル依存性が滑らかでなく、微分もできないような場合は、界面支配モデルは、偏微分方程式としての意味を失う。直感的には平滑化効果が強すぎて、平滑化が非局所的になってしまうことによる。幸い空間2次元の場合は研究代表者らのいままでの研究で、適切な解の概念を得られていて、解の存在、一意性また時間無限大での漸近形成、粘性解理論に基づく等高面の方法を拡張することによって示されている。しかし、空間3次元の場合は、このようなことは未だほとんど研究されていなかった。そこで研究代表者は変分原理を反映した劣微分作用素を用いて、解の概念をつくり、その解の成長速度が、従来予想されていたものに等しいことを示した。さらにカーン・ホッフマンベクトル場はいつもポテンシャルを平らな面でもつであろうとしたカーン・ホッフマン予想を否定的に解決した。空間3次元の場合の特異表面エネルギーによる運動については、その初期値問題の時間局所的可解性さえ未解決であることを考えると、これらの結果も自明ではなく、さらなる進歩に役だつはずである。結晶成長モデルのうち、結晶界面の運動がその形状のみにより、バルクの物理量の変化によらないモデルを界面支配モデルという。金属の粒界や、ヘリウムの結晶成長のように凝固時の潜熱が無視できる場合に、このモデルが妥当とされる。このような比較的簡単な場合を考えても、成長速度には、動的な異方性、表面エネルギーの異方性が反映し、さまざまな形状を呈する。しばしばふたつの異方性の効果が混同されて議論されていることが多い。ここでは、まず、このふたつの異方性がどのように形状に反映されていくのかを明確に説明しようとした。例えば結晶の成長形の概形は動的異方性によりきまるが、より小さいスケールでは、表面エネルギー密度の異方性がきいてくることを、さまざまな例で明らかにした。また、表面エネルギーの異方性が強く特異であると、それに対応して安定した平らな面(ファセット)が現れることも明らかにした。以上はすべて結晶面が曲線であるという場合に説明したが、表面エネルギー密度に特異性が現れる状況以外は、高次元でも同様である。表面エネルギー密度に特異性がある場合、結晶界面が曲線である場合を除き、その運動方程式の解の合理的概念は確立されておらずその解の存在も不明である。そこで、この解の概念の定式化およぴ、その解の速度が予想されているものになっていることを示した。一方、結晶面が円柱面で、平衡形も円柱の場合に界面モデルではなく、準定常のステファン型問題を扱った。円柱形を保つという仮定のもと時間局所解の存在を示した。しかし、円柱形を保つと仮定してよいかどうかは今度の課題である。

ここでは結晶の形を円柱とし、その外側で過飽和度についてのラプラス方程式を仮定し、また空間無限遠でも過飽和度は既知とする。結晶面では、その外向きの成長速度が過飽和度の勾配に比例するという、ステファン条件を仮定する。また、結晶面での過飽和度は、動的効果も考慮したギブス・トムソン効果も考慮する。このような状況では過飽和度は、円柱のふちにくらべ、中心部の方が大きいという現象がベルグ効果として知られていたが、その厳密な数学的証明は、結晶形が正多角形の場合に関数論を用いたものだけしがなかった。ここでは円柱の場合、成長速度が定数の場合にベルグ効果を数学的に厳密に示した。この問題の難点は、領域にカドがあり、過飽和度が、境界付近で滑らかかどうかわからないことであった。ここでは、問題の軸対称性から、長方形の問題に帰着し、過飽和度の連続微分可能性を示した。その上で、その導関数に対して最大値原理を巧みに用いて、ベルグ効果を示した。この問題は、カドのある領域の外部でのラプラス方程式の解の性質という古典的な問題であり、既にさまざまな研究があったが、上の状況に適用できるものはなかった。したがって応用面のみならず、数学解析としても重要である。本研究では、さらに詰晶成長の仕組みのひとつである、うず巻成長について、そのモデル方程式の異方性が考慮されていても、等方的な場合に近い限り、うず巻型の解が存在し、安定であることをも示した。
免疫寛容離脱を目的とした腎癌治療における脾臓摘除の可能性

腫瘍随伴性マクロファージは腎細胞癌細胞との相互作用によりサイトカインシグナルを活性化し、そのシグナルがさらに腫瘍随伴性マクロファージ自体の活性化と骨髄由来サプレッサー細胞の活性化をもたらす可能性が示唆された。進行腎細胞癌患者の血中制御性T細胞数は比較的多かったが、症例毎のばらつきが多いことが明らかになった。骨髄由来サプレッサー細胞も進行癌患者では末梢血中で増加する可能性が示唆された。分子標的薬は骨髄由来サプレッサー細胞の作用を減弱することによる抗腫瘍効果が報告されているが、骨髄由来サプレッサー細胞がすでに分子標的薬で抑制されたあとにIL-2療法を行っても意義が少ないことが示唆された。転移性腎細胞癌の予後は改善しつつあるが薬物療法の奏効期間が限られており、満足のいく予後の改善は得られていないのが現状である。近年、がん細胞が発現しているT細胞の活性を抑制する分子を標的とした治療薬、すなわち免疫チェックポイント阻害薬と呼ばれる、新たな機序による治療法が台頭し、良好な成績が報告されている。腎細胞癌の進展は免疫寛容によるところが大きいためこのような免疫活性化を促すような治療法は極めて有効であると考えられる。我々の研究も腎細胞癌の進展が免疫の状態に依存していることに立脚している。まず、腎細胞癌細胞株Caki-1、Caki-2、ACHNを用いて、入手及び培養法が比較的容易な免疫系細胞としてヒトマクロファージ様細胞株THP-1、U937との共培養を行い、増殖や浸潤・転移能の変化を検証した。共培養は6-well transwell plate (BD Biosciences)を用いて行なった。細胞増殖は自動計測器にて測定した。遊走能assayは、24-well transwell plate (BD Biosciences)を用いて行なった。腎細胞癌細胞株はマクロファージ様細胞との共培養で遊走能が亢進するものも認められた。また、マクロファージ様細胞の遊走能についても検討したところ、腎細胞癌細胞株との共培養ののち、遊走能が亢進していることがわかった。これらのマクロファージ様細胞をさらに免疫抑制系のいわゆるM2タイプへと分化させ、腎細胞癌細胞との相互作用を検討する目的で、U937にPMAを添加しその変化を検証した。ウェスタンブロットによりU937はM2マーカーであるCD206が増加し、M1マーカーであるCCR7が減少した。今後、このM2タイプU937を用い実験を進める予定である。予定されていた実験の中で、一部未だ評価されていないものもあるものの、大筋の実験の流れは順調に進んでいると考えられるため。転移性腎細胞癌に対して、2016年には免疫チェックポイント阻害薬ニボルマブの適応が承認されるなど、腎細胞癌自体の免疫寛容を介した癌進展機構がますます注目されている。腫瘍随伴性マクロファージ、制御性T細胞、骨髄由来サプレッサー細胞など、さまざまな免疫抑制細胞の働きが抑制あるいは活性化することにより腎細胞癌細胞自体が活性化される可能性が高いが、活性化機序は未だ明らかにされていない。ヒト単球様細胞株THP-1、U937をPMA処理しマクロファージに分化させた後、腎細胞癌細胞株ACHNと共培養させたところ、M1タイプからM2タイプ(腫瘍随伴性マクロファージ)へと分化した。さらに、これらM2タイプマクロファージは腎細胞癌細胞の遊走能を劇的に亢進させた。この遊走能亢進にはマクロファージと腎細胞癌細胞両方から分泌されるケモカインが重要な役割を果たしており、ケモカインの中和抗体で遊走能が抑制されることが分かった。またこれらのケモカインのうち、CCL22は制御性T細胞の活性化因子であり、腫瘍随伴性マクロファージと腎細胞癌細胞との相互作用が、引き続いて制御性T細胞を活性化することが明らかとなった。脾臓はこれら免疫抑制系細胞の貯蔵庫となっている可能性があることから、腎摘除術を行った進行腎細胞癌患者のうち、脾臓摘出術を行った3症例について予後の解析を行った。非常に興味深いことに肉腫様成分を含んでいるにもかかわらずその予後は非常に良好であった。さらにヒト組織を用いた免疫組織学的な検討と、マウスを用いたin vivoの実験も行う予定である。泌尿器腫瘍学マクロファージ以外の免疫細胞の実験も一部行う予定であったができなかったため多少の残額が生じている。すでに使用する免疫細胞も決まっているので、必要な消耗品を購入することになると考えている。
臨床応用に向けた大腰筋および腸骨筋筋張力の非侵襲的評価方法の開発

大腰筋及び腸骨筋の筋収縮時の筋張力をせん断波エラストグラフィー機能により非侵襲的に評価できる可能性が示唆された。ただし、低い運動強度でのみ可能であり、健常若年者やスポーツ選手などの最大能力を評価するためには、測定方法の改良が必要であり、今後の課題である。また、腸骨筋に関しては、表面筋電図により筋活動を非侵襲的に評価することが可能であることが示された。本方法を用いることにより、被験者を問わず歩行など動的な運動時にも評価が可能であると思われ、今後の応用が期待される。研究計画に基づき、組織の弾性率を測定することができる超音波診断装置のせん断波エラストグラフィー機能を用いて、股関節運動時および体幹運動時の腸骨筋及び大腰筋の筋張力測定を行った。まず、健常若年者19名に対して、股関節屈曲45°位での等尺性股関節屈曲運動時の大腰筋の筋張力を測定した。負荷量は、股関節屈曲最大筋力の0%(負荷なし自重のみ)、10%、20%、30%とした。その結果、安静時に比べて030%負荷で筋張力が有意に増加し、0%に対して1030%負荷でも有意に筋張力は増加した。しかし、10%と20,30%の間では有意差を認めなかった。なお、この結果については、The 25th Congress of the International Society of Biomechanics(2015年7月1216日)で発表予定である。また、体幹運動については、健常若年者19名に対して、等尺性股関節屈曲運動(負荷0%、10%)と座位での体幹前屈、後屈、側屈の等尺性運動(負荷は体重の10%)を行い、大腰筋の筋張力を測定した。その結果、股関節屈曲0%に対して股関節屈曲10%および体幹側屈で有意に筋張力が増加した。この結果は、第50回日本理学療法学術大会(2015年6月57日)で発表予定である。腸骨筋の筋活動量について、表面筋電図を用いて股関節屈曲運動時の負荷量が筋活動量に与える影響、ならびに、股関節運動方向の違いが筋活動量に与える影響を検証した。健常若年者17名に対して、最大股関節屈曲筋力の10%から50%の負荷量において筋力を発揮した際の股関節屈曲筋群(腸骨筋、大腿直筋、大腿筋膜張筋、長内転筋、縫工筋)の筋活動量を分析した。その結果、比較的低負荷の運動において他の屈筋群に対して腸骨筋の活動比率が高くなる傾向にあることが明らかとなった。この結果については、第51回日本理学療法学術大会(2016年5月27日29日)において発表予定である。さらに、健常若年者20名に対して、股関節の各運動方向(屈曲、屈曲・外転、屈曲・内転、屈曲・外旋、屈曲・内旋)における腸骨筋の筋活動量を分析した結果、屈曲あるいは屈曲・外転がほかの屈筋群に対して腸骨筋の活動比率が高くなる傾向にあった。超音波せん断波エラストグラフィー機能により、大腰筋の筋張力を測定することが可能であることを確認したが、その負荷量は最大筋力の10%程度であり、臨床応用に向けて測定肢位や測定課題を工夫する必要がある。また、腸骨筋に関しては、表面筋電図による筋活動の分析を行うことができたが、当初の予想に反して超音波せん断波エラストグラフィーによる測定が困難であったため、測定方法を再検討する必要が生じた。最終年度には、超音波せん断波エラストグラフィー機能を用いて大腰筋に加えて腸骨筋の運動時の筋張力を非侵襲的に測定した。実験では、健常若年者16名について、股関節屈曲0度、30度、60度での等尺性股関節屈曲運動を最大筋力の0%、10%、20%、30%で実施した。その際の腸骨筋の筋張力(弾性率)を超音波せん断波エラストグラフィー機能を用いて測定した。その結果、0度では安静時と比べ10%、20%、30%が有意に高値を示したが、それ以外には有意差が無かった。30度および60度では安静と比べ、10%、20%、30%が有意に高値を示した、10%に比べ20%が有意に高値を示した。すなわち、股関節軽度屈曲位では、最大筋力のおよそ20%程度までの強度であれば、腸骨筋の筋張力を非侵襲的に測定可能であることを示唆された。研究期間全体を通じて、大腰筋および腸骨筋の非侵襲的測定を試みた。大腰筋については、深部に位置し体表に表出している部位がないため表面筋電図では測定が不可能である。しかし、超音波せん断波エラストグラフィー機能を用いることで、低負荷であれば筋張力を測定することができる可能性が示された。腸骨筋については、鼠径靭帯の直下でわずかに表出している部位があるため、表面筋電図での測定が可能と思われる。また、エラストグラフィー機能を用いることで、腸骨筋の筋張力も低負荷であれば測定が可能でることが示された。

大腰筋及び腸骨筋の筋収縮時の筋張力をせん断波エラストグラフィー機能により非侵襲的に評価できる可能性が示唆された。ただし、低い運動強度でのみ可能であり、健常若年者やスポーツ選手などの最大能力を評価するためには、測定方法の改良が必要であり、今後の課題である。また、腸骨筋に関しては、表面筋電図により筋活動を非侵襲的に評価することが可能であることが示された。本方法を用いることにより、被験者を問わず歩行など動的な運動時にも評価が可能であると思われ、今後の応用が期待される。エラストグラフィー機能により大腰筋の筋張力を測定することが可能であることは確認できたが、その負荷量は最大筋力の10%程度までとかなり低負荷であり、今後さらに実験方法を工夫してさらに高負荷での測定も試みる必要がある。また、腸骨筋の筋張力は未だ十分に測定できておらず、この点についても今後研究の継続が必要である。大腰筋に関しては、さらに高負荷での測定を可能とするため、測定肢位や測定課題の検討を続ける必要がある。また、腸骨筋に関しては、表面筋電図による測定で、負荷量や運動方向の違いによる筋活動量の変化をとらえることはできたため、今後、超音波せん断波エラストグラフィーを用いた測定を実施する必要がある。運動器リハビリテーション、整形外科学大腰筋および腸骨筋の筋張力を低負荷のみならず高負荷の領域でも測定可能とするために、測定肢位や測定部位の工夫、また、超音波プローブの設定変更など、実験方法の細部について改良を加え実験を継続する。実験の進行に伴い、実験方法の改良が必要なことが明らかとなり、異なる方法及び異なる機器を用いた実験が必要になったため。実験の進行に伴い実験方法の改良が必要なことが明らかとなり、改めて実験が必要になったため。実験補助者への謝金や研究内容に関する成果報告及び情報収集(学会参加)。実験補助者への謝金や研究内容に関する成果報告および情報収集(学会参加)。
岩石―流体反応の力学応答と流路発展から探る沈み込み帯の透水性と流路連結度

本年度は,高温高圧吸水反応浸透率測定装置を立上げ,高温高圧下での吸水反応による浸透率の時間発展の測定に成功し,その温度・封圧・流体圧依存性について明らかにしつつある.また,前年度に開発したその場観察応力測定装置を改良し,高精度流量計を導入することで,その場観察応力測定と反応率・反応速度測定の同時測定が可能となり,応力発展と反応速度の関係を経時計測することができた.吸水反応における浸透率測定では,ペリクレース焼結体に対して150300°C,封圧1045 MPaで流通式反応試験をおこない,その浸透率変化を測定した.その結果,吸水反応の進行とともに急激な空隙閉塞と浸透率低下がみられること,また,浸透率低下率は封圧とともに増大すること,体積膨張によるスリーブSUS管の破壊がおこること,SUS管の破壊は反応速度の早い高温側で早く起こることが明らかになった.スリーブSUS管の破壊は意図したものではなかったが,吸水反応による急速な応力発生をあらわしている.均質なペリクレース出発物質では,期待されていたような浸透率の増加は確認されなかったものの,供試体の外側に対して顕著な応力発生が起きていたことが確認され,流体供給や反応物質の不均質な分布が,浸透率の増加に重要であることが示唆された.また,テフロンスリーブを用い,局所的な流体供給を行った実験では,反応の進行とともに浸透率の変動が確認され,亀裂生成による浸透率上昇が確認された.上記の結果より,吸水反応による流路発展には,反応速度と変形速度の競合のみならず,流体・反応物質の不均質性が重要であることが示唆された.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,独自に開発したその場観察応力測定装置により,任意の温度・流体圧条件下における吸水反応の反応誘起応力の測定に成功し,その温度依存性を明らかにすることができた.反応誘起応力測定の再現性は天然サンプル・アナログ物質を用いた様々な先行研究で困難とされてきたが,本研究では装置の歪みを最小限にまで抑える設計により,封圧化での反応誘起応力の系統的な測定に初めて成功した.具体的には,ペリクレースとH2Oからブルース石を生成する吸水反応[MgO + H2O →Mg(OH)2]における反応誘起応力の温度依存性を調査した.ペリークレース粉末を加圧整形したペレットを出発物質とした実験では,発生した反応誘起応力は40 MPaを越える高応力であり,反応誘起応力が岩石の破壊強度を超えうることを実験的に示すことが出来た.また,反応誘起応力には温度依存性があり,高温ほど高い最高応力値を示す.高温ほど誘起応力の駆動力であるギブス自由エネルギー変化は低くなる一方,反応速度は早くなるため,反応誘起応力は反応速度に強く依存することが明らかになった.ペリクレース焼結体を出発物質とした実験では,60 MPaを越える高圧力が発生し,焼結体が粒界沿いに破壊したことが確認された.すなわち,反応誘起応力により多結晶焼結体が破壊することを示した.焼結体の反応誘起応力による破壊実験は継続中である.また,本研究で開発されたその場観察応力測定装置により2011年東北地方太平洋沖地震の震源断層の貴重な断層粘土試料の『膨潤圧』を測定する実験が行われ,膨潤圧の断層強度への影響が明らかになりつつある.これは,本研究から発展したものであり,研究の裾野が広がりつつある.独自装置の開発により,反応誘起応力の温度依存性を明らかにすることが出来た.また,反応誘起応力による,多結晶焼結体の破壊に実験的に成功している.さらには,本研究で開発したその場観察応力測定装置は,断層粘土の膨潤圧の研究へと発展している.本年度は,高温高圧吸水反応浸透率測定装置を立上げ,高温高圧下での吸水反応による浸透率の時間発展の測定に成功し,その温度・封圧・流体圧依存性について明らかにしつつある.また,前年度に開発したその場観察応力測定装置を改良し,高精度流量計を導入することで,その場観察応力測定と反応率・反応速度測定の同時測定が可能となり,応力発展と反応速度の関係を経時計測することができた.吸水反応における浸透率測定では,ペリクレース焼結体に対して150300°C,封圧1045 MPaで流通式反応試験をおこない,その浸透率変化を測定した.その結果,吸水反応の進行とともに急激な空隙閉塞と浸透率低下がみられること,また,浸透率低下率は封圧とともに増大すること,体積膨張によるスリーブSUS管の破壊がおこること,SUS管の破壊は反応速度の早い高温側で早く起こることが明らかになった.スリーブSUS管の破壊は意図したものではなかったが,吸水反応による急速な応力発生をあらわしている.均質なペリクレース出発物質では,期待されていたような浸透率の増加は確認されなかったものの,供試体の外側に対して顕著な応力発生が起きていたことが確認され,流体供給や反応物質の不均質な分布が,浸透率の増加に重要であることが示唆された.

また,テフロンスリーブを用い,局所的な流体供給を行った実験では,反応の進行とともに浸透率の変動が確認され,亀裂生成による浸透率上昇が確認された.上記の結果より,吸水反応による流路発展には,反応速度と変形速度の競合のみならず,流体・反応物質の不均質性が重要であることが示唆された.本年度は,反応誘起応力の温度依存性・反応速度依存性と,多結晶焼結体の破壊に実験的に成功した.来年度は,本研究で開発したその場観察応力測定装置を改良することで,反応誘起応力発生時の透水係数変化を測定する.特に,多結晶焼結体の反応誘起割れによる透水係数変化を観測し,その温度依存性を測定することで,吸水反応の反応速度が流路形成に与える影響を明らかにする.また,個別要素法(DEM)による反応誘起割れの数値計算を行い,実験生成物の亀裂・透水係数と比較する.このモデルを沈み込み帯に適用することで,沈み込み帯における反応誘起割れに伴う流路形成過程を明らかにする.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
連続地震波形記録を用いた準リアルタイム余震活動予測手法の開発

本年度は、本研究課題で最も重要な地震活動の予測法の開発に取り組んだ。昨年度までの研究で、観測点配置が悪い場合にエネルギー輻射量位置を誤って推定することが分かっていた。この結果を受けて、本年度はこれまでの手法を大幅に変更し、各観測点での地震動振幅のみから同じ観測点での将来の地震動予測を行う方法を開発した。具体的には、極値統計理論に基づき、各観測点で記録された一定時間毎(例えば1分間)の最大振幅が非定常Frechet分布に従うことを導き、防災科学技術研究所のHi-netで取得された連続地震動記録でこのことを確認した。非定常Frechet分布は、大振幅の発生頻度がべき乗則に従いかつ経過時間のべき乗で減衰する特徴を備えた関数形となっている。この分布は、中規模以上の地震や地震計で記録できないほどの大振幅では適用できないものの、余震の大部分を占める中規模以下の地震については良い精度で適用できる。次に、最尤法に基づき非定常Frechet分布を特徴づける3個のパラメータを推定し、得られたパラメータをもとに将来の地震発生数と地震による最大地震動を予測する手法を開発した。この手法を熊本地震の本震発生後3時間のデータに適用して、3-27時間後までの地震発生数を予測した結果、使用した25観測点のうち19観測点で、実際の地震発生数と予測数の比が0.5-2の範囲に収まった。一方、同じ時間帯について予測した最大地震動は多くの観測点で過大評価されたものの、95%信頼区間の範囲に入るものが大部分であった。本年度は、本研究で最も重要な余震活動の「予測」に向けた具体的な課題を、ほぼすべて解決できる見込みが立った。当初の計画では余震による地震波エネルギー輻射量を予測することを考えていたが、地震動記録からエネルギー輻射量を推定する段階でそれなりの推定誤差が生じる。また、エネルギー輻射量の将来予測を正確に行えたとしても、それを地震動の予測につなげるためには、正確なエネルギー輻射位置推定法と適切な地震動予測式とを開発する必要があり、これにも大きな誤差が生じうる。本年度はこの研究計画を大きく変更し、エネルギー輻射量を求めることなく、各観測点での地震動記録のみから今後の地震動の推移を予測する手法を開発した。この手法を開発するにあたり、極値統計理論と呼ばれる、標本集団の最大値がしたがう分布を扱う理論が非常に役に立った。熊本地震発生後の連続地震動記録にこの理論が適用でき、地震発生後数時間のデータから地震動発生の将来予測を精度よく行えることを示した。この手法の開発により、エネルギー輻射量推定の誤差と、エネルギー輻射量から地震動を予測する際に伴う誤差の両方を考慮する必要がなくなり、推定手法が当初想定していたものよりも大幅に単純化され、かつ実用性の高いものとなった。以上の状況を踏まえて、本年度は当初の計画以上に進展していると判断する。本年度開発した地震動予測法は、1観測点での地震動記録を統計処理することで、その観測点での将来の地震動予測を行うことができる。そのため、地震計のネットワークを必要とせず、現在観測点がない場所でも比較的安価にこのシステムを導入することができる。逆に言えば、観測点がない場所での予測については、基本的に周囲の観測点での推定結果から内挿・外挿するしかない。また、地震動記録が飽和することなく連続的に取得できることが前提であり、これらの条件を満たさない観測点では予測の精度が落ちる。実際、現在使用しているHi-net観測点は大きな地震動のときに飽和が生じるため、飽和記録をどのように補正するかは今後の課題である。また、Hi-netは地中に設置されている地震計であるため、これが地表で記録される最大振幅または震度とどのような対応関係にあるかを、経験的に確かめる必要がある。また、今のところ1分毎の最大振幅を用いて極値統計解析を行っているが、最大値をとる時間間隔がどのようであれば理想的かを示す明確な基準はない。この基準は観測点が設置されている地盤の状態や地震活動の活発さなどに依存する。明確な基準を示さなければ実用上混乱を生じる恐れがあるため、この点について調査を進める必要がある。さらに、数値実験により、この手法がどのようなタイプの地震活動に有効か、有効でないかを明らかにする必要もある。現時点では、推定した統計パラメータを真のパラメータとみなして予測を行っているが、実際にはパラメータ推定そのものに誤差が含まれるため、パラメータ推定の不確定性を考慮した予測を今後行っていきたい。以上のように、この手法を実用化する上で様々な考慮すべき事項が残っており、今後はこれらの点を調査、改善していきたい。当該年度は、日本周辺で発生した10個の大・中規模地震を対象に、余震によるエネルギー輻射過程の統計を調べた。本震発生後1週間以内に発生した全ての余震によるエネルギー輻射量のうち、平均して約40%が最初の1時間以内に発生していることが分かった。この1時間以内のエネルギー輻射量は、1時間後から1週間後までの余震によるエネルギー輻射量と高い相関(対数軸上で85%)を示した。一方、本震によるエネルギー輻射量と本震後1週間後までの全ての余震によるエネルギー輻射量との相関は、対数軸上で72%と低かった。

本震によるエネルギー輻射量がほぼ同じでも、余震によるエネルギー輻射量が100倍近く異なる事例もあった。これらの結果は、本震の大きさのみから余震活動予測を行うことの限界を示すものであり、同時に、最初の1時間以内の余震活動の傾向からその後の余震活動を予測できる可能性を示唆するものである。本震直後の震源位置が不明な状況下でエネルギー輻射位置を推定する手法の開発に取り組んだ。最初の試みとして、地震観測点で記録された地震波形エンベロープを逆伝播させることによりエネルギー輻射位置を推定するエンベロープ逆伝播法を考案し、2016年熊本地震に対してこの手法を適用した。その結果、地震観測点が震源の周囲を均等に囲む場合には、エネルギー輻射位置・輻射量とも正確に推定することができた。しかし、使用観測点が震源に対して偏っている場合は、真の震源を挟んで観測点から遠い位置にエネルギー輻射位置を決める傾向が見られた。その理由は、実際の地震発生時刻よりも前の時刻に実際の震源位置よりも観測点から遠い場所に震源を決めても、観測された地震波形エンベロープの振幅分布を説明できてしまうためと考えられる。したがってこの手法は現段階ではエネルギー輻射位置の推定に用いることはできず、改善が必要であることが分かった。当該年度の研究により、最も重要な「本震後最初の数時間からその後の余震活動を予測できる可能性」を明らかにしたことは、本研究を行う意義を示せたという点で、大きな進展があったといえる。一方で、余震活動予測の具体的な方法を確立するためには、まず連続的に得られるエネルギー輻射量の統計的特徴をどのように抽出するかを検討する必要があり、次年度以降の課題である。エネルギー輻射位置の即時推定については、観測点分布が偏る場合にエネルギー輻射位置の推定にどのような推定誤差が生じるかを示すことができ、本手法の適用範囲をどのように設定するかの指針をある程度得ることができた。一方で、エネルギー輻射位置の推定法はほかにもいくつか考えられ、より高度な推定法も現在検討中である。以上の状況を総合的に判断し、研究はおおむね順調に進展していると判断する。本年度は、本研究課題で最も重要な地震活動の予測法の開発に取り組んだ。昨年度までの研究で、観測点配置が悪い場合にエネルギー輻射量位置を誤って推定することが分かっていた。この結果を受けて、本年度はこれまでの手法を大幅に変更し、各観測点での地震動振幅のみから同じ観測点での将来の地震動予測を行う方法を開発した。具体的には、極値統計理論に基づき、各観測点で記録された一定時間毎(例えば1分間)の最大振幅が非定常Frechet分布に従うことを導き、防災科学技術研究所のHi-netで取得された連続地震動記録でこのことを確認した。非定常Frechet分布は、大振幅の発生頻度がべき乗則に従いかつ経過時間のべき乗で減衰する特徴を備えた関数形となっている。この分布は、中規模以上の地震や地震計で記録できないほどの大振幅では適用できないものの、余震の大部分を占める中規模以下の地震については良い精度で適用できる。次に、最尤法に基づき非定常Frechet分布を特徴づける3個のパラメータを推定し、得られたパラメータをもとに将来の地震発生数と地震による最大地震動を予測する手法を開発した。この手法を熊本地震の本震発生後3時間のデータに適用して、3-27時間後までの地震発生数を予測した結果、使用した25観測点のうち19観測点で、実際の地震発生数と予測数の比が0.5-2の範囲に収まった。
肥満に伴う雄性不妊の機構解明と不妊を改善する栄養成分の探索

肥満は不妊の一要因である。本研究では、高脂肪食マウス肥満モデルにおける雄性不妊の機構を解析した。また、雄性不妊の改善に効果が期待されている栄養素L-カルニチンの効果についても調べた。肥満に伴って、精子運動能の低下と交配させた雌マウスの妊娠率の低下が見られた。L-カルニチンによる肥満雄マウスの妊孕能改善はみられなかった。精巣上体尾部の遺伝子発現解析の結果、肥満マウスでは精子成熟の過程でDNA損傷が引き起こされていること、その一部にpiRNAが関与していることが示唆さされた。今年度は、昨年度の遺伝子マイクロアレイの結果を評価するためのmRNA定量PCR解析(Q-PCR)を中心に行った。標準食、高脂肪食、および高脂肪食+成分Aで25週間飼育したマウス精巣よりRNAを調製し(n=4)、一本鎖cDNAを合成した。アレイ解析で標準食群と高脂肪食群の間で変化が示唆されたが、高脂肪食群と(高脂肪食+成分A)群で変化のない遺伝子のうち、精子形成に関与すると思われる遺伝子15種類についてQ-PCRを行った。その結果、ステロイドホルモン生合成に関わる遺伝子や精子の成熟に関与する遺伝子など3種類の遺伝子で再現性を得た。その他の遺伝子は、偽陽性または組織切除の段階における他組織の混入に伴う人工的な陽性で再現性が無かった。また、加えて、肥満で発現が変化することが報告されている精子形成関連遺伝子(Pparg、Crem、Sh2b3、Dhh、Igf1、Lepr)についてもQ-PCR解析を行ったが、本実験系においては、いずれの遺伝子の発現も群間において有意な差が認められなかった。マイクロRNA解析の結果、高脂肪食投与により発現量の低下が予測される1種類のマイクロRNAが見出された。しかし、精子形成に関与が予測される標的遺伝子の候補が見つかっていないため、その先については行っていない。昨年度までの結果より、高脂肪食(60%エネルギーが脂肪由来)投与肥満モデルマウス精巣においては、標準食(10%エネルギーが脂肪由来)投与マウスの精巣と比較して、脂質代謝に関与する遺伝子発現の上昇が見られたが、精子の形成に関わる遺伝子の発現に差が見られなかった。また、精巣上体尾部より取り出した精子数も変化が無かった。これより、肥満マウスにおいては精子形成過程に加えて精巣上体や輸精管における精子成熟の過程が上手くいかないために、精子運動能が低下する可能性も予測された。そこで本年度は肥満モデルマウスを作成し直し、精子が濃縮されている精巣上体の遺伝子発現を調査した。精巣上体尾部より全RNAを抽出し、雄性不妊に関連している84遺伝子についてPCR-Array解析を行った。その結果、DNA組換え修復に関わる一遺伝子の発現量上昇とpiRNA産生に関わる一遺伝子の発現量低下、およびヌクレオソーム構成タンパク質のヒストンからプロタミン置換に関与する一遺伝子の発現量低下を見いだした。また有意差は見られなかったが、SOD1およびSOD2遺伝子の発現量の上昇傾向が観察された。これらの結果より、肥満に伴って活性酸素ストレス状態に有ること、piRNA産生量の低下に伴ってクロマチン凝集度やプロタミンタンパク質へのクロマチンの置換が正常に進んでいないこと、その結果精子染色体DNAの損傷が引き起こされ、DNA組換え修復に関わる遺伝子が増加していることが示唆された。piRNAの産生低下はエピジェネティックにトランスポゾン遺伝子を活性化させる。今後、肥満に伴う精子クロマチンの損傷との関連を調べる予定である。今年度は、高脂肪食(60%エネルギーが脂肪由来)投与が及ぼすマウス雄性不妊への影響と、肥満に効果があるとされる一栄養成分が不妊を解消させる能力があるか検証した。5週齢雄マウスを標準食(10%エネルギーが脂肪由来)、高脂肪食で25週間飼育した。また、高脂肪食投与マウスのうち、半数を18週齢より、抗肥満効果を示す一栄養成分(成分A)を同時に投与した。飼育終了後、雌マウスとの交配により、妊娠させる能力を調査した。また、安楽死させた後、マウスより精巣及び精巣上体を摘出し、造成された精子の質や精巣の遺伝子発現を調査した。高脂肪食投与群の体重は、標準食投与群の約1.6倍であった。成分Aを投与した高脂肪食群の体重は、高脂肪食投与マウスの約95%(p<0.05)であった。高脂肪食投与は、血清グルコース値およびコレステロール値を上昇させた。成分Aの投与は、両値を改善させた(p<0.01)が、標準食のレベルまでは低下させなかった。標準食投与雄マウスの妊娠させる能力は100%(5/5)であったが、高脂肪食投与群では、0%(0/5)であった。

成分A投与群は20%(1/5)であった。一腹あたりの胎児数は標準食投与群と同じであった。妊娠させる能力のある成分A投与マウスは、他の同群のマウスよりも(内臓脂肪/体重)比がやや小さめで、且つ肝臓重量も小さかった。前進運動する精子の割合は、高脂肪食投与によって50%低下した。成分Aの投与による有意な改善は見られなかった。妊娠させる能力を持った成分A投与マウスの前進運動精子の割合は、同じ群の平均値に近い値であった。精巣より抽出したRNAサンプルを用いて、遺伝子マイクロアレイを行ったところ、高脂肪食投与で変動する遺伝子のうち、一部の遺伝子が成分A投与により、標準食と同様のレベルに戻ることが示された。詳細な解析は現在進行中である。精子形成に関わる遺伝子発現に着目して調査したが、遺伝子アレイの結果では多くの精子形成関連遺伝子の発現は、一部のステロイドホルモン合成関連遺伝子や精子成熟遺伝子を除き、高脂肪食投与によって変化しなかった。さらにマイクロアレイのデータのPathway解析の結果、高脂肪食投与によって脂質代謝関連遺伝子(Lpl, Fabp4, Pck1)およびシャペロンタンパク質Hspa12bの発現上昇が確認されたが、これら遺伝子は高脂肪食+成分A投与群では標準食と同じレベルにまで低下していた。昨年度の実験結果より、高脂肪食投与によって精子の運動能は低下したが、高脂肪食投与群マウスでも精子はつくられている。これらの結果を総合して考えると、精子形成の場である精巣に加え、精子の成熟を担う精巣上体においても調査する必要があると考えている。2011年3月に生じた東日本大震災により、計画停電の可能性が7月まで続いた。本研究は実験動物を使用すること、本学の実験動物施設は地下1階にあることから、空調設備の運転の支障がなくなるまで開始を控えた。そのため、実験動物の飼育開始が、当初予定していた時期より3か月遅れた、8月中旬からとなった。第一ステップとなる実験動物飼育は6か月の期間を要した。したがって、交配・妊娠の評価の時期が2月下旬から3月上旬と時期が繰り下げになった。次年度計画への影響が最小限となるよう、努力している。昨年度の研究においては、精巣上体は精子運動能を調べるために使用したため、臓器サンプルを保存していない。そこで、もう一度肥満モデルマウスを作成し、精巣および精巣上体サンプルの採取と遺伝子発現解析を行う。さらに、精巣上体培養細胞を用いたin vitro系を用い、脂肪酸処理に伴って精子成熟関連遺伝子の発現が変化するか、およびその上流の情報伝達経路について、阻害剤またはsiRNAを用いたノックダウン解析により調査する。遺伝子マイクロアレイの実験データを得たので、解析・評価を行う。別個体の凍結保存した精巣よりRNAを抽出し、定量RT-PCR法などにより、遺伝子発現の再現性確認を行う。遺伝子発現解析の結果をもとに、培養細胞系を用いた評価系を構築する。精原細胞を用いて、精子形成に関わる遺伝子発現や、セルトリ細胞を用いた精子形成に必要な情報伝達分子や接着分子の発現に及ぼす脂肪酸の影響について調べる。高脂肪食投与時に、抗肥満効果を示す成分Aの投与により、通常食と同じレベルに戻った遺伝子と戻らなかった遺伝子がある。成分Aは、生殖能力の改善効果が見られない、または低かった。