hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストンH3K27メチル化脱制御による骨髄異形成症候群発症機構の解析

マウスとUtx cKOマウスの作製を行なっている。すでに各々のcKOマウス作製のための相同組み替えES細胞が得られており、今後キメラマウスおよびヘテロマウスの作製を予定している。Eedコンディショナルノックアウトヘテロ(Eed+/Δ)マウスを長期飼育し、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome, MDS)様の造血形態異常を認めた。また、ヒト臍帯血CD34+造血幹細胞にEED siRNAを導入し、EEDのノックダウンに伴い様々な形態異常を認めた。これらの結果は、マウスのみならずヒト造血幹細胞でもEEDの発現低下はMDSを誘導することを示している。また、造血幹細胞を用いた競合的骨髄移植において、Eed+/Δ造血幹細胞はコントロール造血幹細胞に比べて有意に高いキメラ率を示した。さらにレトロウイルスを用いたinsertional mutagenesisで、Eed+/Δマウスはコントロールマウスに比較して有意に高い率で白血病を発症した。ウイルス挿入箇所として転写因子Evi1(Ecotropic virus integration 1)が同定され、Evi1を導入したEed+/Δ造血幹細胞を移植したマウスはコントロール造血幹細胞の移植マウスに比べてはるかに高い確率で白血病を発症し、Eedへテロ状態とEvi1高発現との協調作用が確認された。上記の結果は、Eedへテロ状態はMDSを誘導すると共に白血病感受性を亢進させることを示している。この分子機構を明らかにする目的で、我々はコントロールマウスとEed+/Δマウスの造血幹細胞からRNAを抽出してトランスクリプトーム解析を行なった。パスウェイ解析では有意な集積は認めなかったが、Junb, Bcl11b, Tcf3 (E2A), and Sfpi1 (PU.1)など白血病で発現低下が報告されている遺伝子群の発現がEed+/Δ造血幹細胞で有意に低下しており、これらの遺伝子群の発現抑制がMDSおよび白血病感受性亢進に関与している可能性が示唆された。EEDはポリコーム複合体2の構成要素であり、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome, MDS)で変異を認める。我々はEedコンディショナルノックアウトヘテロ(Eed+/Δ)マウスを作製し、MDS様の造血形態異常を認めた。また、競合的骨髄移植でEed+/Δ造血幹細胞はコントロール細胞に比べて高いキメラ率を示し、レトロウイルス用いた挿入変異でEed+/Δマウスはコントロールマウスに比較して高い白血病発症率を示した。これらの結果は、Eedへテロ状態はMDSを誘導すると共に、造血幹細胞の増殖能を亢進させ白血病感受性を亢進させることを示している。我々は、今年度の研究計画として、1)EED cKOヘテロマウスにおける造血器腫瘍発症の検討,2)EEDヘテロによる造血幹細胞における遺伝子発現変化の解析,3)EEDと直接結合する標的遺伝子の同定、の3項目を挙げた。1)については、EED cKOヘテロマウスを用いて、EEDヘテロ状態は単独では造血器腫瘍発症には十分では無いが、2次的遺伝子異常と協調して白血病に関与することを見出した。さらに、白血病を発症したEED cKOヘテロ
バイオミメティックなアプローチによる高次機能触媒の精密設計

酸・塩基複合化学を基盤とし,弱い二次的相互作用や酸・塩基二重活性化などという生体内酵素の触媒作用を手本とした触媒設計により,高選択的合成プロセスを開発した。具体的には,水中で機能するエステル脱水縮合触媒の開発,エナンチオ選択的炭素ー炭素結合形成反応(Diels-Alder反応,ポリエン環化反応,ヨードラクトン化反応)の開発,酸・塩基二重活性化機構を鍵とする高機能アシル化反応(イサチン類のエナンチオ選択的シアノエトキシカルボニル化反応,α-ヒドロキシカルボン酸のアミド脱水縮合反応)を達成した。1.優れた疎水機能を持つ分子カプセル型アンモニウム塩触媒を用いた脱水縮合反応の開発嵩高く疎水的なN,N-ジアリールアミンを精密に設計することにより,硫酸とから調製されるアンモニウム塩触媒を用いて,水中でエステル脱水縮合を促進することに成功した。本触媒は,比較的親水的な基質のエステル脱水縮合も効率よく促進できることが特長であり,界面活性剤型触媒であるDBSAに比べても活性が高い。また,本触媒について詳細に検討した結果,ピロ硫酸アンモニム塩が活性種であることを明らかにした。2.キラルポスホニウム塩触媒を用いたバイオミメティックポリエン環化反応の開発生合成経路に倣ったプロトン付加型不斉ポリエン環化に有効な新規ブレンステッド酸触媒として,キラルリン(III)化合物と強ブレンステッド酸からなるホスホニウム塩を開発することに成功した。本触媒は,2-ゲラニルフェノール類のポリエン環化反応を効率よく促進することができ,対応する三環性化合物を高ジアステレオ選択的,高エナンチオ選択的に合成することができる。また,本反応を利用して4a-epi-ウゴンスチルベンBの不斉合成を達成した。3.バイオミメティックな酸・塩基二重活性化機構を利用した不斉アシル化反応の開発独自に開発したL-ヒスチジンを基本骨格とするスルホンアミド触媒を用いることにより,グリセロール誘導体の不斉アシル化による非対称化に成功した。これまでにグリセロール誘導体の非対称化に成功した例はほとんどない。本反応はキラルビルディングブロックの合成に極めて有効である。1.酸・塩基複合型有機分子触媒を用いたイサチン類のエナンチオ選択的シアノエトキシカルボニル化一般的なカルボニル化合物とは異なり,イサチン類のシアノエトキシカルボニル化は,中間体のシアノアルコキシドイオンが不安定であるため,その促進が極めて困難である。本研究では,シアノ化を促進するルイス塩基部位と中間体のシアノアルコキシドイオンを安定化するブレンステッド酸部位とを組み合わせた新規酸塩基複合型有機分子触媒を設計することにより,イサチン類のエナンチオ選択的シアノエトキシカルボニル化に初めて成功した。本研究の成功の鍵は,キラルな三塩基酸部位を適切に設計することにより,中間体のシアノアルコキシドイオンの一方のエナンチオマーを選択的に安定化し,続くエトキシカルボニル化を効率よく促進した点にある。2.ホスファイト-ウレア複合型有機分子触媒を用いるバイオミメティックな高選択的ブロモ環化反応イソプレノイドのバイオミメティックなブロモ環化反応は古くから研究されているが,選択的に促進することは未だ困難である。本研究では,ホモゲラニルアレーンのブロモ環化反応を高選択的に促進する触媒として,亜リン酸エステル-ウレア複合型有機分子触媒を設計した。亜リン酸エステルは,ルイス塩基として働いてブロモ化剤を活性化する。亜リン酸エステル部位を立体的に嵩高くすることにより,ホモゲラニルアレーンの末端アルケンに選択的に反応することを見出した。さらに,ウレア部位を結合させることにより,活性種として生成するブロモホスホニウムイオンの分解に由来する副反応をほとんど抑えることにも成功した。これは,活性種の対アニオンであるコハク酸イミドアニオンをウレアが補足することにより実現できたものである。1.優れた疎水機能を持つアンモニウム塩触媒を用いたエステル加水分解法の開発これまでに水中で機能するブレンステッド酸として嵩高く疎水的なN,N-ジアリールアンモニウム塩を開発している。本触媒を用いることにより,穏和な条件下での水中エステル加水分解法の開発に成功した。水酸化ナトリウムなどの塩基を用いる従来法では,塩基が生成物であるカルボン酸と塩を作ってしまうため,塩基を化学量論量使用する必要があるが,本アンモニウム塩は酸触媒であるため,触媒量で反応を促進することができる。さらには従来法ではアミノ酸エステルの加水分解においてラセミ化を引き起こしてしまうという深刻な問題があったが,本アンモニウム塩触媒を用いればラセミ化を全く引き起こすことなく光学的に純品のカルボン酸を高収率で得ることができた。2. α-ヘテロ原子置換型β-アルキルアクロレインの不斉Diels-Alder反応の開発

α-ヘテロ原子置換型アクロレインの一つとして,α-(アシルチオ)アクロレインを合成し,その高エナンチオ選択的Diels-Alder反応の開発に成功した。本反応は,レイナマイシンなどの生物活性物質の骨格構築法として有効である。さらに,多置換型ジエノフィルとして,α-ヘテロ原子置換型β-アルキルアクロレインを設計し,その合成法の開発に成功した。研究代表者らが開発したキラルトリアンモニウム塩触媒を利用して,そのエナンチオ選択的Diels-Alder反応の検討を行い,Diels-Alder付加体を高収率,高エナンチオ選択的に得ることができた。これらの付加体は,複数の置換基を持つ生物活性物質の短工程骨格構築法として有効である。疎水性アンモニウム塩触媒については,当初計画していた硫酸塩触媒の設計から大きく発展し,ピロ硫酸塩触媒という前例のない新規触媒野開発に成功した。また,不斉アシル化についても,従来極めて困難であったグリセロール誘導体の非対称化に成功した。これらの結果から,今後の研究のさらなる発展も期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。疎水性アンモニウム塩触媒については,高効率加水分解法の開発へと発展させることができた。また,キラルアンモニウム塩触媒を用いる不斉合成法として,新規ジエノフィルを用いるDiels-Alder反応の開発を開発することもできた。これまでの研究を継続し,さらに発展的に研究を遂行する。具体的には,昨年度開発することに成功したピロ硫酸塩触媒を活用し,新たな高効率合成プロセスの開発を目指す。また,バイオミメティックな酸・塩基二重活性化機構を利用した不斉アシル化触媒についても,新たな合成プロセスへの応用を検討する。新たな研究として,弱い二次的相互作用を基盤とするキラルルイス酸触媒の精密設計と新規環化付加反応の開発に取り組む。具体的には,これまでの研究成果を基盤としてキラルピロリン酸エステル触媒や弱い二次的相互作用を基盤とするキラルルイス酸触媒を精密設計することにより,新しい不斉炭素ー炭素結合形成反応の開発を進める。さらには,これまでに開発した高機能触媒やそれを用いた高選択的合成反応を利用して,複雑な骨格をもつ生物活性物質の高効率合成法の開発にも取り組む。
真菌の消毒薬耐性機構の解析

出芽酵母の消毒薬(塩化ベンザルコニウム・グルコン酸クロルヘキシジン)耐性に関与する因子の検索を行った。これまでに本研究代表者は、トランスポーターのひとつSge1を過剰発現させた場合に、酵母が塩化ベンザルコニウムおよびグルコン酸クロルヘキシジンに対し、ともに耐性を示すことを明らかにしている。そこでSge1に構造上近いAzr1,Vba3,Vba5の過剰発現が、これら消毒薬の耐性に関与するかどうかを調べたところ、いずれも野生株と同程度であった。また、Sge1,Azr1,Vba3,Vba5の遺伝子欠損酵母もこれら消毒薬に耐性を示さなかった。一方、出芽酵母株の遺伝子欠損酵母株ライブラリーを用いて塩化ベンザルコニウム感受性に関与する因子のスクリーニングを行い、候補となる遺伝子欠損株を、耐性株に、感受性株ともに多数得た。真菌のモデル生物である出芽酵母を用いて、汎用消毒剤である逆性石けん(塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン)に対する耐性機構を解析した。これまでに本研究代表者は、トランスポーターのひとつSge1を過剰発現させた場合に、酵母が逆性石けんに耐性を示すことを明らかにしている。本年度は、まずSge1に構造上近い3個のタンパク質Azr1,Vba3,Vba5が、Sge1同様に酵母の逆性石けん耐性に関与しているかどうかを調べた。ちなみに、Azr1はアゾール系の抗真菌薬に対する耐性を変化させる因子であり、逆性石けん耐性との関連が興味深い。その結果、これらいずれのタンパク質を過剰発現させた場合にも、酵母の逆性石けん耐性度は野生株と同程度であった。したがって、Sge1類似分子のうち逆性石けん耐性に関与し,おそらく逆性石けんの排出を行うのは、Sge1のみであると考えられる。また、Sge1およびその類似分子の遺伝子欠損株についても、逆性石けん耐性に及ぼす影響を調べた。その結果、Sge1,Azr1,Vba3,Vba5について、いずれの遺伝子欠損株も逆性石けん感受性が野生株よりも高くなることは無かった。この結果から、逆性石けん排出に関与する因子がSge1以外にも存在し、Sge1遺伝子欠損株では、その因子がSgelの機能を補うため、逆性石けん耐性度が野生株と変わらないと考えられる。真菌のモデル生物である出芽酵母を用いて、汎用消毒剤である逆性石けん(塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン)に対する耐性機構を解析した結果、これまでに本研究代表者は、トランスポーターのひとつSge1を過剰発現させた場合に、酵母が逆性石けんに耐性を示すことを明らかにしている。病原性真菌であるCandidaalbicansは、ヒトでは、免疫力が低下した際にカンジダ症を引き起こし、そのうち深在性カンジダ症は致死的となる場合もある。そこで、Candida albicansにおけるSge1の機能ホモログを、塩化ベンザルコニウム耐性という観点から同定しようと試みた。Sge1と類似の構造をもつ塩基配列のクローニングを試みたところ、得られた配列は、データベース上の配列と比較すると、かなりの塩基置換が入ったもののみしか得られなかった。複数回の実験(独立に行った複数回のPCRによる増幅)でも、同じ結果しか得られなかったため、用いたCandida albicans株と、データベースの元となった株での塩基配列の違いであると考えられる。今後、得られたDNA配列を出芽酵母発現ベクターに組込み、出芽酵母の逆性石けん耐性に及ぼす影響を調べる予定である。また、出芽酵母では、ゲノム上の全遺伝子5000個について、それぞれの遺伝子をノックアウトした、遺伝子ノックアウト酵母株ライブラリーが利用可能である(致死となる遺伝子は除く)。そこで引き続き、酵母遺伝子欠損株ライブラリーを用いて遺伝子欠損により消毒薬感受性に影響を及ぼす出芽酵母株のスクリーニングを行う。具体的には、培地に塩化ベンザルコニウム、およびグルコン酸クロルヘキシジンを添加した条件で、各遺伝子の欠損株ごとに培養を行い、コントロールである出芽酵母野生株よりも増殖を示すものを耐性株、野生株よりも増殖が遅いものを感受性株として同定する。真菌のモデル生物である出芽酵母を用いて、汎用消毒剤である逆性石けん(塩化ベンザルコニウム)に対する感受性を左右する因子のスクリーニングを行った。出芽酵母では、ゲノム上の全遺伝子約5000個について、それぞれの遺伝子をノックアウトした遺伝子ノックアウト酵母株ライブラリーが利用可能である(致死となる遺伝子は除く)。そこで、欠損により酵母の塩化ベンザルコニウム感受性が変化する遺伝子を検索する目的で、出芽酵母株の酵母遺伝子欠損株ライブラリーを用いて塩化ベンザルコニウム感受性スクリーニングを行った。

方法は、培地に塩化ベンザルコニウム(3×104%,4×104%)を添加した条件で、各遺伝子の欠損株ごとに96穴プレートを用いて培養を行い、コントロールである出芽酵母野生株よりも早い増殖を示すものを耐性株、野生株よりも増殖が遅いものを感受性株とした。現在までに、約1500株についてスクリーニングを終え、候補となる遺伝子欠損株を、耐性株については46株、感受性株については227株を得た。一方、今回のスクリーニングでは、操作ごとに菌量にぶれが出てしまっている可能性や、そもそも遺伝子欠損により細胞増殖が非常に遅くなっている欠損株も含まれていることが考えられるため、得られた薬剤感受性候補欠損株については再度、薬剤感受性を確認する必要があると考えられる。
Apc変異腸管腫瘍におけるMyD88経路の役割解明と治療標的の探索

本研究は、MyD88の機能欠損によるApc変異大腸がん細胞の合成致死誘導のメカニズムに関与する因子や経路を同定し、同定された関連因子や経路の大腸がん予防・治療標的としての有用性についてApc変異マウスを用いて明らかにすることを目的としている。3カ年の研究計画の中で、平成30年度はまず計画していたTMTプロテオーム解析を実施した。MyD88F/F;Villin-CreERT2変異マウスの腸管正常部位と、MyD88F/F;Apc;Villin-CreERT2変異マウスの腸管腫瘍より作成したオルガノイドをタモキシフェンで処理し、in vitroでMyD88の欠失を引き起こしたオルガノイドサンプルを解析に用いた。この時、時間的変化も見られるように、欠失誘導後2つのタイムポイントでサンプリングを行った。また、in vivoとの共通変化を見出すため、MyD88F/F;Villin-CreERT2変異マウスの腸管正常部位およびMyD88F/F;Apc;Villin-CreERT2変異マウスの腫瘍組織サンプルも同様にTMTプロテオーム解析に用いた。TMTプロテオーム解析の結果をもとに、MyD88の機能欠損によるApc変異大腸がん細胞の合成致死誘導のメカニズムに関与する候補因子の探索をパスウェイ解析等により行っている。なお、平成30年度に予定していたマイクロアレイ解析については、費用の面から実施できていない。MyD88の欠失とApc変異の有無により影響を受けている因子や経路を探索するため、TMTプロテオーム解析を実施した。この解析結果をもとに、MyD88の機能欠損によるApc変異大腸がん細胞の合成致死誘導のメカニズムに関与する候補因子の検討および同定を平成30年度中に終えることを目指していたが、まだ終えておらず継続中である。一方、平成31年度に予定していたMyD88の阻害剤の効果について、オルガノイド培養を用いた予備実験を前倒しで開始している。TMTプロテオーム解析の結果得られた候補因子についての検討を鋭意進める。検討した候補因子の中から、MyD88の欠損による合成致死誘導に関与する因子を同定し、同定された因子がどのようなメカニズムで作用するのか、オルガノイドやヒト大腸がん細胞株を用いて検討する。また、平成32年度に予定している、マウスへの阻害剤等の投与による同定因子や経路の治療標的としての評価のため、培養細胞やオルガノイド培養を用いて候補となる阻害剤等の投薬試薬の検討やしぼりこみを行う。研究計画の一部がやや遅れており、その研究計画の遂行に計上してした研究費用が未使用のため、次年度使用額が生じた。やや遅れている一部の研究計画については、次年度早々に遂行する予定であり、次年度使用額はその費用として使用する計画である。
プラーク細菌叢の網羅的解析結果を基盤にした成人齲蝕病因論の新たな進展

う蝕未経験群のプラーク中のGemella属の分布割合はう蝕経験多発群に比べて高い傾向が認められた。また、Gemella属の菌種の分布割合はう蝕未経験群のプラークでは形成課程を通じてG. haemolysansが高い割合を占めたのに対し、う蝕多発群では形成初期はう蝕未経験群と同様にほとんどG. haemolysansであったが、後期ののプラークではG. haemolysansのみではなく、G. morbillorumとG. sanguinisが高い比率で検出された。以上の結果から、プラーク中のGemella属の分布割合ならびに菌種が両群で異なっていることが明らかとなり、Gemella属の菌種がう蝕抑制的な影響を及ぼしている可能性が示唆された。先の萌芽研究により、鯖蝕経験のない群と齲蝕経験の多い群とでそれぞれのプラークの細菌叢に有意な違いがあることが明らかとなり、さらに、齲蝕経験のない群のプラーク細菌叢では齲蝕経験の多い群に比べて、X属の細菌の占める割合が大きいことがわかった。本研究では、まず、X属の細菌に着目し、両者のプラークにおけるX属の細菌種の分布を調べた。X属には数種類の菌種が知られている。X属に特異的な16S rRNA部位の配列をプライマーとして設計し、先の萌芽研究の各被験者のDNAをテンプレートとして16S rRNA遺伝子断片を増幅し、クローンライブラリーを作製した。齲蝕経験のない9名と齲蝕経験の多い10名に対して各々10クローンずつ抽出し、塩基配列を決定してその細菌種を特定したところ、齲蝕経験のない群については9名中8名から1菌種のみが検出され、残りの1名からは2菌種が検出された。さらに興味深いことに、8名から検出された菌種はすべて同一のものであった。一方、齲蝕経験の多い群では、10名中7名から複数の菌種が検出され、そのうち2菌種が検出されたのが5名、3菌種が検出されたのが2名であった。齲蝕経験のない群と齲蝕経験の多い群のプラーク細菌叢では、X属の細菌の構成割合が異なるのみならず、細菌種の分布にも違いがあることが明らかとなった。次に、被験者からのX属細菌種の分離同定を試みた。縁上プラークを採取し、コロンビアCNAヒツジ血液寒天培地に塗沫し、コロニー形態を参考にして釣菌し、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。分離同定を試みた14名の被験者のうち、9名からX属の細菌を分離することに成功した。昨年度の研究に引き続き、今年度はまず初めに、被験者からのX属細菌種の分離同定を試みた。その結果、齲蝕経験のない群の被験者9名中7名よりX属12種、および齲蝕多発群の被験者8名中4名よりX属6種を分離した。分離したX属の菌種を明らかにするために、約1300bpの16S ribosomal RNA遺伝子断片の塩基配列を決定し、解析した。その結果、齲蝕経験のない群から分離したX属12種の内訳は、A菌種2個、B菌種10個、C菌種0個であった。一方、齲蝕多発群から分離したX属6種はすべてB菌種であった。昨年行った研究(ハイドロキシアパタイト上に形成されたプラークを培養を介さずにクローンライブラリー法を用いてX属の菌種を明らかにした)結果では、齲蝕経験のない群に存在するX属は9人の被験者のうち8人がA菌種のみであり、齲蝕多発群においては、10人中2人がA菌種のみであったが、他の8人は2菌種以上存在した。培養法による結果とクローンライブラリー法による結果には大きな相違が認められた。次に、X属3菌種の標準株について、アピストレップ20同定キットを用いて生化学的性状を調べた。AとC菌種にはアセトイン産生能およびアルカリホスファターゼ活性が認められ、B菌種には両者とも認められなかった。また、A菌種のみピロリドニルアリルアミダーゼ活性が認められた。糖発酵試験では、C菌種のみがマンニトールおよびソルビトール発酵能を示した。同様の方法で被験者からの分離株の生化学的性状ならびに糖発酵能を調べた結果、若干の違いはあるもののすべての分離株が塩基配列解析から推定された菌種の特徴を示した。

今年度はまず、齲蝕未経験群および齲蝕経験多発群から分離されるGemella属(前回まで特許申請の関係上、X属と記載していた)について、プラーク形成初期(1日目あるいは2日目)、中期(4日目)、後期(7日目)のプラークにおける両群の菌種の違いを詳細に調べた。プラーク中のGemella属の分布割合はすでに報告したとおり、5日まで齲蝕未経験群で高い傾向が見られ、2日目と4日目に有意差が認められた。7日目になると両者の間にGemella属の分布割合の違いはなかった。菌種については、齲蝕未経験群では、プラーク形成過程を通して、G. haemolysansがGemella属全体の90%以上を占める者が9名中8名存在した。齲蝕経験多発群では初期のプラークについては10名すべてからG. haemolysansが90%以上検出されたが、4日目に5名、7日目には4名に減り、G. morbillorumとG. sanguinisが比較的多量に認められようになった。以上の結果より、Gemella属に関しては分布割合のみでなく、菌種構成も両群で著しく異なることが明らかになった。次に、う蝕細菌であるStreptococcus mutansの生育に対するGemella属の影響を調べた。Gemella属の標準株3菌種はどれもS. mutans UA159株に対して生育阻害を示さなかった。一方、S. mutansはG. morbillorum ATCC27824に対して生育阻害を示したが、G. haemolysans ATCC 10379およびG. sanguinis ATCC 700632の生育には影響しなかった。また、Gemella属3菌種間に阻害効果は認められなかった。さらに、被験者より分離したGemella属菌種とS. mutansについて生育阻害効果を調べたところ、標準株と同様の結果であった。2年間で齲蝕多発群と齲蝕経験のない群におけるX属の菌種の構成の違いを明らかにし、その生化学的性状を調べた。さらに、被験者からのX属細菌種の分離同定にも成功している。よって、当研究はおおむね順調に進展していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。まず、X属細菌種について、更なる生化学的性状の解明および齲蝕原性細菌との競合性や相互作用の検証を行い、齲蝕抑制への関与について明らかにする。さらに、T-RFLPパターンを詳細に解析し、X属細菌種以外で成人齲蝕の促進ならびに抑制に関与している細菌種を同定し、X属細菌種の場合と同様に生化学的性状、齲蝕原性ならびに齲蝕細菌との相互作用を調べる。今年度の研究で、X属細菌種の菌種構成について、培養法による結果とクローンライブラリー法による結果に大きな相違が認められた。しかしながら、これは方法が異なるだけでなく、サンプルについてもハイドロキシアパタイト上に形成されたプラーク(4日目)と歯面上に形成されたプラーク(形成日数は不定)という違いが存在する。今後は上記の結果の食い違いが何によるものか検証する必要があると思われる。
ミトコンドリア膜タンパク質のトポロジー形成原理の解明

真核細胞内では、小胞体由来のオルガネラ膜に存在する膜タンパク質は、タンパク質合成に共役して小胞体膜に組み込まれ膜内トポロジーを形成する。一方ミトコンドリア等の膜系には、小胞体系とは本質的に異なった経路で標的化・組み込みが行われる。本研究ではN-末端がオルガネラ内腔側・C-末端側が細胞質側という、いわゆる『SA-I』トポロジーを形成している膜タンパク質のミトコンドリア標的化やSA-I膜トポロジーを規定する配列情報の解明に向けた実験系設定に焦点をあてた。N-末端に膜アンカー配列を有しSA-Iトポロジーを示すTom20は、ミトコンドリア外膜に存在する。このSA-I膜タンパク質のミトコンドリアへの特異的標的化には、(1)やや低い(小胞体指向性配列ほどは高くはない)疎水性度の膜結合配列と、(2)その直後5残基以内の総電荷が正、という特性が必要十分であることを明らかにした。さらに、(3)膜結合領域の『高い疎水性』は小胞体へ向けた『優性のシグナル』となることを示した。また、小胞体のSA-I膜タンパク質(synaptotagmin II、Syt-II)について、ミトコンドリア膜系と比較対照するために詳細な検討を行ない、Syt-II分子の小胞体への標的化やN-末端ドメインの膜透過は合成の極めて初期に、『完全にCo-translationalに』進行すること、(2)N-末端ドメインの膜透過には疎水性セグメントの直前の『ターン形成傾向』の高いアミノ酸残基及び疎水性セグメント直後の正荷電アミノ酸残基が必須であることを明らかにした。ミトコンドリア膜タンパク質のトポロジー形成を小胞体系と比較しながら解明することに成功しつつある。本研究はミトコンドリア膜タンパク質の配列自体に、内膜・外膜への仕分けや、それぞれの膜上でのトポロジー形成に関する情報がいかに書き込まれているかを網羅的に解明しようとするものである。この目的に向けて本年度は、(1)カルボキシル末端にミトコンドリア指向性配列を有するTom5タンパク質の外膜認識シグナル配列の確定、および、(2)この外膜指向性シグナル配列認識細胞質因子の評価系の確立を目指した。(1)シグナルについては、Tom5を蛍光タンパク質であるGFPのカルボキシル末端に融合し、培養細胞において改変タンパク質の局在を迅速かつ簡便に評価することが可能となった。このTom5-GFPの"網羅的な改変体"を作成し、各変異の細胞内局在に対する影響を詳細に検討している。これまでのところ、カルボキシル末端側の"膜結合セグメント"のさらに末端側にある、数残基の正電荷がミトコンドリア外膜認識に必須であることなどが明らかになりつつある。(2)の局在シグナル認識因子については、Tom5-GFP融合タンパク質と細胞質を除いた培養細胞(すなわち"セミインタクト細胞"系)を用いた局在評価系の検討を行った。先ず、大腸菌において"GFP-Tom5"融合タンパク質を大量発現するためのコンストラクトを作成し、大量発現に成功した。現在、組み換えタンパク質の精製条件の検討を行っている。またストレプトリシンを用いたセミインタクト化実験系を導入し、GFP-Tom5融合タンパク質の部分精製漂品を用いて、評価系の至適化を行ったところ、低分子物質や細胞質タンパク質に依存したミトコンドリアへの局在化が見られることが判明した。この評価系を用いて、局在化に必要な細胞質因子の分離・同定に向けて鋭意進行中である。
特定の細胞集団のみを選択的に包括することを可能とする革新的細胞包括法の創出

本研究では、さまざまな細胞を含む細胞集団から特定の集団に属する細胞のみを選択的に、細胞よりわずかに大きなハイドロゲル粒子に1個ずつ別々に包括する方法の創出に挑戦した。新たに開発した方法は、細胞方面の抗原に対する抗体に西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)を標識したものを用い、抗原抗体反応を経て特定の細胞表面にのみHRPを固定化し、そのHRPの酵素反応を利用して細胞表面にヒドロゲルを形成させるものである。この方法では、約1マイクロメートルのヒドロゲルが細胞表面に形成した。また、それによる細胞への顕著な毒性は確認されなかった。さらに、形成した皮膜の存在を利用した細胞分離も可能であった。本研究では、さまざまな細胞を含む細胞集団から特定の集団に属する細胞のみを選択的に、細胞よりわずかに大きなハイドロゲル粒子に1個ずつ別々に包括する方法の創出に取り組んでいる。平成26年度には、まず、ヒト肝臓ガン由来HepG2細胞表面のCD326をターゲットにして蛍光標識された抗CD326抗体に市販のキットを用いて西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)を修飾した後、それを溶解させた溶液にHepG2細胞とCD326を発現していないマウス繊維芽細胞を分散させた。その後、アルギン酸ナトリウム誘導体水溶液に細胞を分散したところ、HepG2細胞表面のみにゲルが形成し、選択的な細胞包括に成功した。また、HepG2細胞と抗CD326抗体の組み合わせ以外に、ヒト血管内皮細胞と抗CD31抗体の組み合わせに関して検討を実施し、同様に選択的な包括が可能であることを確認した。また、共焦点顕微鏡を用いた観察により、細胞表面に形成したヒドロゲル皮膜の厚みが約1マイクロメートル程度であることを明らかにした。さらに、皮膜を形成させた後の細胞の生存率を計測および、アルギン酸リアーゼにより皮膜を除去した後の細胞の増殖を評価した結果、この包括法は細胞に対して穏和な条件が存在することを明らかにした。さらに、細胞特異的にゲル粒子に包括することで細胞周囲の環境を制御し、機能発現や幹細胞の場合には分化を制御することができることを示すためには、アルギン酸誘導体以外のゼラチン誘導体およびヒアルロン酸誘導体にも適用可能であることを実証することができた。本研究では、さまざまな細胞を含む細胞集団から特定の集団に属する細胞のみを選択的に、細胞よりわずかに大きなハイドロゲル粒子に1個ずつ別々に包括する方法の創出に取り組んだ。平成27年度は、前年度の検討に引き続いて、前年度に確認した天然高分子であるアルギン酸、ゼラチンおよびヒアルロン酸の誘導体以外の材料として、合成高分子であるポリビニルアルコールにフェノール性水酸基を導入した材料に関して、同様に皮膜形成が可能であることを実証した。また、これまで皮膜の厚みの測定に蛍光顕微鏡を使用していたが、観察される蛍光の散乱などにより正確に膜厚を測定できているかどうか不明であったことから、新たに原子間力顕微鏡を用いて厚みの計測を試みた。具体的には、原子間力顕微鏡のプローブをヒドロゲル皮膜に突き刺し、ゲルと細胞膜との力学的特性の違いを利用して、ゲル皮膜の厚みを測定することを試み、この方法が有効であることを実証することができた。この計測により測定された皮膜の厚みは、蛍光顕微鏡による観察によって推測された値とほぼ同じであった。これらの検討に加えて、本研究で開発した細胞包括ゲル粒子作製法が広く使用するようになるために不可欠である、ヒドロゲル皮膜が形成した細胞とそうでない細胞を容易に選別するための方法について検討を行った。具体的には、壁付着性細胞に対して、その性質を利用して選別することを試みた。その結果、皮膜が形成した細胞とそうでない細胞が混在した状態で、数時間細胞培養皿上に培養液に分散した状態で静置するという簡単な操作により、ヒドロゲル皮膜が形成していない細胞だけを培養皿に接着させることで、95%以上の純度で皮膜の形成していない細胞を分離することに成功した。平成26年度に検討し実証する予定としていた項目は全て達成することができたため。生物化学工学当初の予定どおり、平成27年度は本研究が成功することによって作製が可能となる細胞包括ゲル粒子の応用を考えた「ハイドロゲル層の透過特性・強度の制御に関する設計指針を明らかにするための検討」および「細胞包括ゲル粒子を包括されなかった細胞を含む集団から選別することに関する検討」を実施し有望な結果を得ることを目指す。現段階では研究を遂行する上での解決すべき課題は特にない。当初の予定以上に順調に研究が進んだため、消耗品の消費が抑制できたため。より研究の進度を速めると共に、より本研究の有用性を実証するための、より挑戦的な実験を実施するための消耗品の購入に使用する。
球陽外巻『遺老説伝』の総合的研究

本研究は、18世紀前半に成立した琉球史書『球陽』の外巻とされる説話集『遺老説伝』について、現存する諸本の料紙に対する物質的調査を行いつつ、本文の校訂や内容の研究を並行して進めることにより、その史料としての特徴を多面的に明らかにするものである。そのために、伊波普猷文庫No14と宮良殿内文庫No26を修復した際に得られた試料(紙片)や資料(袋綴じ本文の内部に綴じられていた新聞紙、裏表紙の芯に使われていた反古紙)を分析し、料紙や装幀について所見を得た。さらに、尚家文書No1251を底本として全文の校訂を行い、史話史伝という観点から宮古島の旧記との比較検討を行うなどテクストの変容面についても明らかにした。当該資料の『遺老説伝』四冊本について専門家に委託し修復を完了した。分解に立ち会うことで想定通りサンプルとして紙片を得ることができ、高知県立紙産業技術技術センターにてC染色法などによる繊維分析を行い、料紙が竹紙であることを示すエビデンスを得た。表紙や遊び紙などの素材も判明し、装丁の変化について考究することができた。当初は近代の写本と見ていたが、成立年代はより遡ると考えられる。各葉に綴じられていた新聞紙については、裁断されているものが多いが、デジタル撮影した画像を国会図書館にて照合することで、238枚全ての紙名と日付等(大正13年1月3月)を確定した。これにより、伊波普猷の沖縄図書館長最後の年(1924年)に沖縄で最終的な装丁が行われた蓋然性の高さを指摘できる。新聞紙に関する成果は『琉球大学教育学部紀要』85集(2014年6月)、装丁と料紙については平成26年度末の論集に掲載される予定である。テクストについては、修復作業の間に尚家文書本『遺老説伝』の複製を入手し、校訂と読解を進めている。これにより、琉球的な中世と近世の差異、中国と日本の文化的影響と変容に関する認識に基づき、歴史学のテーマに即した論考を投稿予定である。これまでの成果の意義の一つとして、地元紙が重視されてきた沖縄にあって、全国紙の早版とりわけ九州版の附録の実物という、首都圏で公蔵が確認できない全国的にも希少な新聞紙資料が確認されたことは、資料に対する視座を広げると考えられる。つまり、酸性の新聞紙が綴じられている和本や冊子の存在に注目し、資料を摘出し調査することで、本資料の保存と研究だけでなく、新聞紙を通した近代史の研究や教育に寄与することも可能となる。そのような拡張性のある文献研究のスキームを実践したと考える。18世紀前半の琉球においては、『中山世譜』『球陽』『琉球国由来記』『琉球国旧記』など近世を代表する重要な典籍が成立した。その中でも、史書『球陽』の外巻と位置づけられた『遺老説伝』については、その内容が説話的であり、国文学の観点から論じられることが多く、歴史学ではあまり扱われてこなかった。また、写本の来歴についても、実物に即した研究はなされてこなかった。そこで、本研究においては、新聞紙を綴じ込んでおり、修復の緊急性の高い、伊波普猷文庫『遺老説伝』四冊本の修復を実施し、分解された状態を調査することで、料紙や装幀など物質的側面から考究することができた。さらに、沖縄県内にある諸本や他の典籍・文書についても、専門家の助力を得て可能な限り調査を行い、近世琉球の典籍における中国産の竹紙の使用頻度や沖縄で漉かれたとみられる楮紙やアオガンピ紙の特徴などを把握することができた。その間、校訂テキストを作成しながら、テキストの内容についても主題研究を推進している。この方面ではテーマを設定して他の史料を参照することにより、文学研究に見られるような観念的な理解に対し、具体的な近世琉球の社会や思想を読み解いている。本研究においては、料紙に対する法量の測定と繊維の顕微鏡写真の分析により、体系的かつ実証的な調査手法を適用してきた。これが有効であることを確認したことから、冒頭に挙げた近世琉球の典籍や文書類を視野に入れた、悉皆的なデータ取得を目的とする料紙研究の重要性を展望するものとなっている。『遺老説伝』とは、近世琉球において通史として編纂された『球陽』の外巻である。その基本的性格は説話集であるが、地域の固有性や編纂者の論理などが読み解かれるべきである。さらに、その貴重な料紙を検討することにより、日本史における史料論の側面から研究を推進することができる。本研究においては、以下の3点により、総合的に推進してきた。1.各種テクストの調査にもとづく校訂本の作成、現代語訳への取り組みなど、新たな底本・定本確立のための基礎的研究を行った。2.本文内容について、その主題や編纂意図を他の文献と比較しながら検討してきた。そこから、近世琉球の王府の統治意識などを読み取ることができる。3.書物の実物に着目し、その装幀や料紙など、物質面に関する調査・分析を行った。計画とは別の本についても、サンプルを得て顕微鏡観察などを行い、書写された地域に即した紙の原料(青雁皮)が配合されていることを明らかにした。

平成27年度にて研究終了としていたが、事情により、延長していただいた。年度末に、専門家を研究協力者として、計画対象外としていた典籍の修復・調査・分析を行うことになり、また、『遺老説伝』に関連記事の多い宮古島への実地調査が可能となった。こうした追加調査を行ったことにより、校訂テクストの訳注を主体とする研究成果報告書の刊行を先送りせざるを得なくなった。研究成果報告書として、『球陽外巻「遺老説伝」の総合的研究本文篇』を印刷した。これにより、尚家文書No1251『球陽遺老説伝』(尚家本)を底本とする校訂について、本文全文の校訂テキストと書き下し文を提示することができた。今後、校訂テクストにより、用語用字の検討や現代語訳など、さらなる研究の推進が可能となった。料紙研究の領域においては、基本的な手法の習得により、近世琉球の文書・典籍を対象とする史料論の体系化に関わる研究を推進していく方途を見い出すことができた。今年度は、宮良殿内本『遺老説伝』の調査により、裏表紙から文書を摘出し、料紙の分析を行うことにより、新たな知見を得た。内容面では、宮古島に関する内容が多いことに注目する先行研究に対し、元テクストの『旧記』や大正期の郷土史家の認識などと対比することにより、首里王府直轄以前の宮古島をめぐる史話史伝について新たな位置づけを行った。本研究は、18世紀前半に成立した琉球史書『球陽』の外巻とされる説話集『遺老説伝』について、現存する諸本の料紙に対する物質的調査を行いつつ、本文の校訂や内容の研究を並行して進めることにより、その史料としての特徴を多面的に明らかにするものである。そのために、伊波普猷文庫No14と宮良殿内文庫No26を修復した際に得られた試料(紙片)や資料(袋綴じ本文の内部に綴じられていた新聞紙、裏表紙の芯に使われていた反古紙)を分析し、料紙や装幀について所見を得た。さらに、尚家文書No1251を底本として全文の校訂を行い、史話史伝という観点から宮古島の旧記との比較検討を行うなどテクストの変容面についても明らかにした。初年度の修復によってはじめて得ることのできた情報を他の資料調査の所見と関連させながら、2篇の論文により体系的にまとめることができた。資料の装幀と料紙について、写本成立の時期と最期の装幀に関する物質的認識を深めることができた。摘出した新聞紙については、戦前の新聞の複製DVDを製作している出版社より問い合わせがあった。和本の合紙として使用された戦前の新聞紙に対する資料的価値を喚起することができたと考えている。テキストの内容についても、読解を進め、歴史学のテーマに即した論文原稿2篇を完成させており、最終年度中に公開することが可能となっている。校訂テキストは報告書への掲載を目標に作業を進めている。本文テクストの校訂・訓読と一部の現代語訳(試訳)を推進し、研究成果報告書を刊行する。その間、本文内容と料紙、二つの領域における研究成果を論文としてまとめる。歴史学本文内容に即した論考を公表する。1篇は、家譜などと照合しながら近世琉球の特色(婚姻・継承・生計)について考察する。もう1篇は、地域(久高島・久米島・南部・宮古島)に着目して、収録される説話の意義を旧記と呼ばれる原資料と照合しながら検討する。所蔵先との調整ができた場合、追加の修復・調査を行い、その所見をまとめる。報告書においては、校訂したテクスト、さらに仮訳として書き下しと現代語訳(一部)を掲載する。また、研究全体の成果と課題について示す。東京都内における近世琉球の典籍・文書に対する料紙調査の見通しについて把握する。修復や繊維分析など専門外の作業は完了した。サンプルは保管しており追試も可能である。新聞紙資料は整理・調査が済み論文が印刷中である。
地球化学図による地圏環境ダイナミクスの研究

本研究では川床堆積物(stream sediments)を試料とした。これは小さな沢ごとにその出口で川砂を集め、それがその集水域の地表の化学組成を表すと考えるわけである。現場で180μm(80メッシュ)の篩を通し、細かい粒子だけを集める。川床堆積物の代表性は、チタンなど重鉱物の存在度に依存する元素のばらつきがもっとも大きく50%程にもなるが、地域による変化よりはるかに小さい。分析は、大学共同利用研究で日本原子力研究所JRR4気送管を使った中性子放射化分析により、As, Se, Br, Sb, Sc, Co, La, Ce, Sm, Eu, Tb, Yb, Lu, Re, Os, Ir, Au, Th, Uを、蛍光X線分析により、Si, Ti, Al, Fe, Mg, Ca, Mn, Na, K, Pを定量した。中性子放射化分析は100mgの試料をポリエチレン封入/気送管5分照射の条件下で中4日の冷却後、名古屋大学RIセンターへの郵送した。測定は、サンプルチェンジャーを装着したγ線計測解析システムを用いた。測定は順調で、3月4日までに実試料106カプセルの照謝/浸淀を終えた。蛍光X線分析は約950試料の測定を終えた。共同研究者によって開発された図化/解析プログラムを用いた解析をすすめた。1、自然界のバックグラウンドとしての地質との関連:花崗岩の露出する地域にAl, Ca, Na, Srが多く、堆積岩(第三紀)の分布する地域にFe, Co, Cr, Ni, Vが多いこと、TiとCeの存在度力高い相関を示すが、Spheneの存在によると思われる。2、鉱物と元素存在度の関係:基盤岩および河川堆積物中の主要構成鉱物中の微量元素を比較した。その結果、黒雲母は相対的にMg, Fe, Mn, Ti, Co, VおよびZnに富み、基盤地質による河川堆積物中の元素組成の違いは黒雲母/長石比の寄与が大きいことがわかった。3、金の鉱化作用に関係した元素:金の鉱化作用に関係した元素の挙動を調べるため、津具鉱山周辺地域を検討した結果、金、ヒ素、アンチモン、亜鉛、セシウムが金の異常値を囲むようにハローを形成していることがわかった。金の産出は報告されていないが、とくに大峠に異常が際立っている。大気や水質の環境は外的要因(たとえば人為的な作用)に反応し易く、短時間の内にその影響は汚染といった形で表面化する。しかし、外的要因が取り除かれれば、自然環境がもとに復するのにそう時間はかからない。しかし、地圏環境の変化は、一旦汚染を被れば、水俣の例が示すように、その回復には地質学的な時間を要する。さらに、地圏環境では人為的な付加が予想される元素は、すべて自然環境にバックグラウンドとして含まれている。本研究はこれらの起源を地球化学サイクルの観点から区別・評価するところに目的をおく。試料採集は愛知県東部および岐阜県南部を中心にして、代表者/研究協力者が試料採集補助約20名ををともなってすすめている。

現場で80メッシュの篩を通した試料は、揮発性元素の散逸がないように室温で風乾した。試料の均質性を高めるため、ボールミルで約20分程粉砕/撹拌を行った。分析は、日本原子力研究所JRR4を使った中性子放射化分析により、As,Se,Br,Sb,Sc,Co,La,Ce,Sm,Eu,Tb,Yb,Lu,Re,Os,Ir,Au,Th,Uを、蛍光X線分析により、Si,Ti,Al,Fe,Mg,Ca,Mn,Na,KPを定量している。中性子放射化分析においてはこれまでの研究で、100mgの試料をポリエチレン封入/気送管5分照射の条件下で中4日の冷却後、名古屋大学RIセンターへの郵送が可能であるかとがわかった。測定は、サンプルチェンジャーを装着したγ線計測解析システムを用いている。3月6日までに実試料21カプセルの照射/測定を終えた。蛍光X線分析は約400試料の測定を終えた。図化/解析作業は平成13年度に行う。大気や水質の環境は外的作用に反応し易く、短時間の内にその影響は汚染といった形で表面化する。しかし、外的要因が取り除かれれば、自然環境がもとに復するのにさほどの時間はかからない。しかし、地圏環境の変化は、一旦汚染を被れば、その回復には地質学的な時間を要する。さらに、地圏環境では人為的な付加が予想される元素は、すべて自然環境にバックグラウンドとして含まれている。本研究はこれらの起源を多数の元素挙動を基礎にした地球化学的元素循環の観点から区別・評価するところに目的をおく。試料採集は愛知県東部および岐阜県南部を中心にして、代表者/研究協力者が試料採集補助約20名をともなってすすめている。今年度は愛知県串原村、旭町、岐阜県土岐市周辺を重点的に調査した。分析は、大学共同利用研究で日本原子力研究所JRR4気送管を使った中性子放射化分析により、As,Se,Br,Sb,Sc,Co,La,Ce,Sm,Eu,Tb,Yb,Lu,Re,Os,Ir,Au,Th,Uを、蛍光X線分析により、Si,Ti,Al,Fe,Mg,Ca,Mn,Na,K,Pを定量している。中性子放射化分析においてはこれまでの研究で、100mgの試料をポリエチレン封入/気送管5分照射の条件下で中4日の冷却後、名古屋大学RIセンターへの郵送が可能であることがわかった。測定は順調にすすみ、3月4日までに実試料106カプセルの照射/測定を終えた。蛍光X線分析は約950試料の測定を終えた。共同研究者によって開発された図化/解析プログラムを用いて、作業をすすめている。2002年内に印刷公表を予定。
扁形動物無腸類の系統的特異性に関する分子的および細胞学的解析

1.扁形動物渦虫綱の7目(無腸目、カテヌラ目、多食目、棒腸目、全腔目、三岐腸目、多岐腸目)について、ミトコンドリアDNA遺伝子(CO1およびチトクロームb)において遺伝子暗号を推定した。その結果は、無腸目を除く6目においては、コドンAAA, ATAは各々アスパラギン酸、イソロイシンを、無腸目では各々リジン、メチオニンを指定していることを強く示唆していた。2.18SリボソームDNA(18S rDNA)の塩基配列に基づく扁形動物渦虫綱各目の系統解析を従来より精密に行った。禍虫綱の9目(上記+卵黄皮目、順列目)より、17種を選び、18S rDNAのほぼ全長にあたる約2000塩基対に、データバンクから取得した菌類、原生、海綿、刺胞、有櫛動物、条虫類、吸虫類の配列を加え,近隣結合法、最節約法、最尤法により系統樹を作成した。その結果、無腸目は、渦虫類のなかで最も早期に分岐したグループであるという従来の推定を再確認することが出来た。3.無腸目Convoluta naikaiensisの発生を卵割期を中心にさらに詳細に調べ、初期細胞系譜を確定した。卵割様式は変形ラセン卵割で、割球が、動物極、植物極の2極から胚内部へ進入するという、渦虫綱の他目には見られないユニークなものであった。4.渦虫綱上記9目の間で表皮構造とその発生過程を透過型電子顕微鏡観察により比較した。無腸目では他の8目と異なり、表皮と筋肉が複合構造を形成しており、上皮細胞と筋肉組織の間に基底膜構造が全く存在しなかった。また、発生期間中に筋表皮複合構造に基底膜構造が出現する時期は全くなかったので、この筋肉表皮複合構造は退化の結果生じたものではないと思われる。5.以上の結果は、無腸目は他の渦虫綱各目とは基本的に異なるユニークな動物であることを示唆している。無腸類に対して、扁形動物門とは別な動物門を設定すべきであろう。1.本年度は主として形態的手法で無腸目の特異性を検討した。前に走査型電子顕微鏡を用いて記載した無腸目Convoluta naikaiensisの初期発生過程をさらに詳しく調べ、産卵から孵化(約90時間後)までを卵割期、陥入期、球形期、扁平期にわけた。卵割様式は2つの大割球を基礎とする変形縲旋卵害であり、変形ラセン卵割で、割球の胚内部への侵入は動物極、植物極の2極で進行した。このように発生様式において無腸目は渦虫綱の他の目には見られないユニークなものであることが確認できた。2.扁形動物渦虫綱より無腸目、カテヌラ目、多食目、卵黄皮目、順列目、棒腸目、全腔目、三岐腸目、多岐腸目の9目を選び、表皮の構造を透過型電子顕微鏡で比較した。無腸目以外の8目では表皮は細胞間基質がつくる基底膜構造で裏打ちされていたが、無腸目では体表上皮細胞とその下の筋肉組織を隔てる基底膜構造が全く存在せず、表皮と筋肉が複合構造を形成していた。筋表皮複合構造の形成過程を透過型電子顕微鏡で追跡したところ、発生過程においても基底膜構造が出現する時期は全くないという結論を得た。

この事実は、無腸目の筋肉表皮複合構造が退化の結果生じたものではないということを示唆している。3.以上の形態的結果は、無腸目が他の渦虫綱各目とはかけ離れた特異的グループであることを示唆している。今後は分子的解析によりこのことを確かめてゆく予定である。1.扁形動物渦虫類の各目の系統的関係を18SリボソームDNA(18SrDNA)の塩基配列に基づく解析により推定した。渦虫綱より無腸目、カテヌラ目、多食目、卵黄皮目、順列目、棒腸目、全腔目、三岐腸目、多岐腸目の9目より17種を選び、18SrDNAのほぼ全長にあたる約2000塩基対のDNA断片の塩基配列を決定した。そのデータにDNAデータバンクから引用した菌類、原生生物、二胚葉性動物(海綿、刺胞、有櫛動物)、条虫類、一吸虫類の配列を合わせて,近隣結合法、最節約法、最尤法により系統樹を作成した。結果は、渦虫類のなかで最も早期に分岐したグループは無腸目であるということが判明した。渦虫類の塩基配列を多くの多細胞生物の18SrDNA塩基配列と併せて系統樹を作成した場合も、無腸目は必ず三胚葉性動物の中で最も早く分岐しており、無腸目が三胚葉性動物の起源近くに位置する動物である可能性が強く示唆する結果が得られた。2.扁形動物渦虫綱の無腸目、カテヌラ目、多食目、棒腸目、全腔目、三岐腸目、多岐腸目の7目のミトコンドリアのC01,およびチトクロームb遺伝子を用いて、そこで用いられている遺伝子暗号を比較した。その結果、無腸目を除く6目においては、AAA, ATAは各々アスパラギン酸、イソロイシンを指定してたが、無腸目ミトコンドリアではリジン、メチオニンを指定していることが判明した。この事実は、無腸目は他の扁形動物渦虫綱とは系統が特異的に異なる動物で、渦虫綱には含めるべきではないことを示唆している。
ロケットターボポンプのロータダイナミクスの半解析的流体振動連成解析技術の開発

ロケットエンジンには過酷な供給性能要求が課せられる.それに付随してそのターボポンプには様々な流体力が作用して軸振動が発生し問題となる.現在開発中の新型基幹ロケットH3のメインエンジン設計でも,流体力と振動の連成問題に起因して多数の困難な課題が挙がっている.この課題に対し,本研究では「流体力の作用を考慮したロケット用ターボポンプの実稼働時の流体振動連成振動を評価し得る解析技術の開発」を目的とする.ロケットエンジンには過酷な供給性能要求が課せられる.それに付随してそのターボポンプには様々な流体力が作用して軸振動が発生し問題となる.現在開発中の新型基幹ロケットH3のメインエンジン設計でも,流体力と振動の連成問題に起因して多数の困難な課題が挙がっている.この課題に対し,本研究では「流体力の作用を考慮したロケット用ターボポンプの実稼働時の流体振動連成振動を評価し得る解析技術の開発」を目的とする.