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中近世地中海史の発展的研究: グローバルな時代環境での広域的交流と全体構造

1.研究会の開催2回研究会を開催した。1回目は2018年9月16日(日)に、学習院大学北2号館2階史学科閲覧室にて行われた。齊藤寛海氏の報告「紹介(原本)Youval Rotman, Les esclaves et l'esclavage:De la M&eacute;diterran&eacute;e antique &agrave; la M&eacute;diterra&eacute;e m&eacute;dievale, VIe-XIe si&egrave;cles, Paris (Les Belles Lettres) 2004, 403 pp.」のほか、参加者による文献紹介・回覧、近況報告、抜き刷り配布、また今後の研究計画についての話し合い、さらには年度末に刊行する予定の報告書の進展状況についての報告がなされた。2回目は2019年3月17日(日)に、同じく学習院大学北2号館2階史学科閲覧室にて行われた。齊藤寛海氏の報告:「1415世紀フィレンツェの東方女奴隷」、澤井一彰氏の報告「イスタンブル調査の予備報告:「イスタンブルの「イスラーム化」と「教会」のモスクへの転用ーモスク転用の時期の分析を中心にー」のほか、参加者による文献紹介・回覧、近況報告、抜き刷り配布、また今後の研究計画についての話し合い、科研成果報告書に関する反響や内容についての議論がなされた。2.成果報告書の刊行この科学研究費の成果報告書として、『中近世地中海史の発展的研究グローバルな時代環境での広域的交流と全体構造』を刊行した。科研メンバー11人全員が原稿を寄稿した、159頁にわたる著作であり、中近世地中海史に関する様々な貴重な情報が含まれている。1000部印刷し、様々な研究者に送付し、数々の学術的に好意的な感想が寄せられている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の計画は、ほぼ予定通り進んだ。1.国内研究会の開催については、予定通り、年間2回開催された。1回目は2014年9月28日(日)の10:0018::00に学習院大学北2号館2階史学科閲覧室にて行われた。科研メンバーによる科研の今後についての会議後、科研以外の聴講者も含めた参加者による文献紹介・回覧、近況報告、抜き刷り配布など情報交換の時間を設け、その後、2本の研究報告と質疑応答を行った。報告者と内容は、飯田巳貴「近世のヴェネツィア共和国とオスマン帝国間の絹織物交易」、高田良太「エリック・ダーステラ著『改宗した女性たち--近世地中海におけるジェンダー・アイデンティティー・境界』」である。終了後、18時から懇親会を行った。2回目は2015年3月29日(日)の10:0019:00に学習院大学北2号館10階中会議室にて行われた。前回同様、科研メンバーによる科研の今後に関する会議、参加者による情報交換、2本の報告と質疑応答(報告者とその内容は黒田祐我「中世イベリア半島における改宗動向ー「境域」を渡り歩く改宗者たちー」、)西村道也「ビザンツ貨幣史と中世ヨーロッパ貨幣史研究」)、19:00から懇親会を行った。2.海外調査については、本科研の旅費を用いる形で2件行った。(1件目)出張者:高田良太/期間:平成27年3月16日より24日/出張先:ヴェネツィア(イタリア)/内容:ヴェネツィア国立文書館での文書調査。(2件目)出張者:佐藤健太郎/期間:平成27年3月8日-3月16日/主張先:チュニス、スース、カイラワーン、マフディーヤ、テストゥール(チュニジア)/内容:チュニスに移住したモリスコに関する史跡調査。3.本科研3年目のイスタンブルでのシンポジウム・共同調査での事前準備としては、研究協力者の澤井一彰が、上記企画の打ち合わせをトルコで行なった。・国内研究会の開催年2回の国内研究会を開催した。1回目は、2015年9月27日(日)に学習院大学北2号館2階史学科閲覧室にて行った。当日の時程は以下のとおりである。10:00:科研メンバーによる科研の今後についての話し合い;13:00:参加者による文献紹介・回覧、近況報告、抜き刷り配布など;14:00:高田良太の報告「コンスタンティノープルのヴェネツィア人-13世紀以降の居留地-」;16:30:亀長洋子の報告「近世ジェノヴァ人史に関する断章ー国家体制と海洋政策を中心にー」19:00:懇親会であった。2回目は、2016年3月7日(月)に学習院大学北2号館2階史学科閲覧室にて行った。当日の時程は10:00:科研メンバーによる科研の今後についての話し合い;13:00:参加者による文献紹介・回覧、近況報告、抜き刷り配布など;14:00:亀長洋子の報告「コンスタンティノープル陥落直後における居留民の行動と心性ー中世ジェノヴァ人公証人登記簿の分析からの試論ー」;16:30:飯田巳貴の報告「近世北イタリアの絹撚糸製造業とレヴァント生糸輸出入業」19:00:懇親会であった。・海外調査研究分担者の西村道也を派遣した。

期間、滞在先、調査内容は以下のとおりである。3月16日日本発、3月22日現地発(3月23日日本着)。訪問地はイギリス(宿はすべてロンドン)で、主な訪問先は、大英博物館(ロンドン)、アシュモレアン博物館(オックスフォード)、フィッツウィリアム博物館(ケンブリッジ)である。調査目的は、ビザンツ古銭と古銭学文献の調査であり、三館で古代末期から中世の地中海世界の古銭を写真におさめたり関連資料を購入するなどの作業を行った。細部の分析はこれからであるが、調査の過程で、また各館の中世地中海の古銭の展示の差などから多くの知見を得たとのことである。平成27年度開始時の計画である年2回の国内研究会開催は予定の時期に予定の人数で行われた。国内研究会の内容としても、本研究課題では中近世地中海史に関する個人研究の成果発表に加え、共通テーマであり平成28年度にイスタンブルで行われる国際ワークショップ(シンポジウムという名称とワークショップという名称のどちらがふさわしいかについては検討中)を念頭においての報告を当初より計画しており、その両方の報告がなされた。それらについては、個人研究の成果発表としては、亀長洋子の9月の報告と、飯田巳貴の3月の報告が該当し、また、高田良太の9月の報告や亀長洋子の3月の報告は、コンスタンティノープルを中心テーマに据えた内容であり、この国際ワークショップの事前準備報告となった。通常のメール会議に加え、研究会開催時にも、このワークショップの詳細とイスタンブルやその周辺での海外史資料調査についての話し合いが予定通り行われた。日程と会場、本研究のテーマにふさわしい調査先の史跡の検討、現地の文書館の状況、国際ワークショップにおけるトルコ側のパネリストの研究に関する情報とそれに対するこちら側の対応などについて綿密な話し合いがなされた。トルコ側のパネリストについては、イスタンブル大学助教のオズギュル・オラル氏と日本側のコーディネーターで研究分担者の澤井一彰が綿密に連絡をとりあい予定の詳細が決定しつつある。また、本年度の海外調査予定であった西村道也も、ほぼ予定通りの海外調査を実施した。西村道也の調査はビザンツ古銭学に関するものであり、その内容はコンスタンティノープルの中世史に大きくかかわるものであり、その成果はイスタンブルでのワークショップでの報告に反映される予定である。以上のように、個人研究も成果をあげ、また平成28年度の国際ワークショップに連なる研究上・運営上の準備も着々と進展しているといえる。・海外共同調査・8月26日から29日まで、イスタンブル大学との国際ワークショップ、トルコ内での共同史資料調査を予定し準備も順調だったが、7月15日に発生したトルコでのクーデター未遂事件により同大学もトルコ内も混乱と危険を極め、外務省による渡航自粛勧告もあり、やむなくトルコ内での開催をを中止した。航空券も購入済であるゆえトルコ内を避け、本科研の研究過程で重要性が指摘されていたイスタンブル文化圏に属するマケドニアと北ギリシアの共同調査を、コーディネーターを務める澤井と高田の指導下で実行した。調査実施内容は以下の通り。・8月18日ー20日:マケドニア(澤井、西村がスコピエ、オフリド、ビトラ訪問。旧市街とモスクを調査)・8月20日ー21日:高田によるテサロニキとヴェリア予備調査・8月22日ー25日:北ギリシア(澤井、高田、西村がセレス、ドラマ、カヴァラ、クサンシ、コモティニ、アレクサンドルポリ、ディディモティホ訪問。モスク、民族学博物館、歴史博物館、城塞等を調査)・8月26日:ヴェリア(澤井、高田、西村、亀長がモスク、シナゴーグ、博物館等訪問)
有棘細胞癌におけるTWISTの役割について

金沢大学皮膚科で外科的治療を行った有棘細胞がんの組織を用い、TWIST、Snail、E-cadherin、Human papilloma virus (HPV)の免疫染色を施行し、浸潤がん、表皮内がん、転移リンパ節について検討した。浸潤がんでは、TWIST、Snailで細胞膜および細胞質での発現がみられた。E-cadherinは、細胞膜に染色され、浸潤している腫瘍細胞も染色されたが、同一切片内でも染色程度にばらつきがあった。HPVの発現はみとめなかった。HPVの染色については、従来ウイルス感染と発がんとの関連が示唆されているボーエン病(表皮内がん)から浸潤した有棘細胞がん(ボーエン癌)についても検討したが、染色されなかった。表皮内癌では、TWIST、Snail、E-cadherinともに細胞膜と細胞質において発現がみられ、HPVの発現はみられなかった。表皮内癌のE-cadherinの発現は全例でみとめたが、正常表皮にもE-cadherinは細胞膜に均一に染色された。転移リンパ節でも同様に検討したが、TWISTとSnailが細胞膜および細胞質で発現が亢進していた。E-cadherinの発現もみとめたが、浸潤がんの症例と同様に染色性にばらつきがあった。HPVの発現はなかった。蛋白レベルの発現の検討をまとめると、有棘細胞がんにおいてTWISTとSnailの発現は亢進している。E-cadherinは浸潤がんで一部発現の減弱がみられた。これは転移リンパ節においても同様の傾向だった。蛋白レベルではHPVと有棘細胞がんとの間に関連性はなかった。今後、TWISTとSnailおよびHPVについてはPCRを用いてRNAレベルの発現を検討する。E-cadherinについては一部染色性の減弱した症例での臨床経過を追跡し、転移および予後との関連がないか検討する。金沢大学皮膚科で外科的治療を行った有棘細胞がんの組織を用い、TWISTの免疫染色を行った。浸潤がんの検討では、TWISTの発現の亢進が確認された。一方で、同時に免疫染色を行った、Snailについても発現の亢進がみられた。また、E-cadherinについては、多くの症例で発現が確認できたが、その程度にばらつきがみられた。Humanpapilloma virusについては、免疫染色では発現はみとめなかった。従来からHumanpapilloma virusとの関連が示唆されている有棘細胞がんの類似疾患であるBowen病から生じた有棘細胞がんについても同様に検討したが、免疫染色ではHuman papilloma virusの発現は認めなかった。次に表皮内癌についても同様の検討を行ってみた。TWIST, Snial, E-cadherinともに発現がみられ、Human papilloma virusについては発現がみられなかった。表皮内癌のE-cadherinは全例で全体が均一に染色されていた。転移リンパ節についても同様に検討してみたが、TWISTとSnailの発現の亢進、E-cadherinの発現はみとめた。Humanpapilloma virusの発現はみられなかった。これらを踏まえると、蛋白レベルの発現は、E-cadherinとSnailについては発現の亢進が予測される。ただし、その染色パターンや染色程度に差があり、全体が染色されるものと、部分的に染色されるものがある。全く染色されない症例はなかったため、TWISTとSnail、E-cadherinついては染色パターン別に検討が必要と考える。Humanpapilloma virusについては蛋白レベルでは確認が出来ていない。平成23年度は病棟医長として臨床診療との並行で研究を行っており、そちらの業務に時間が多く割かれてしまった。ただし、症例のリストアップや検体の確保は順調に進んでいるため、今後遅れているRNAに関する解析を進めていきたい。蛋白レベルでの発現については、一通り確認が終了しているため、TWISTを中心にメチル化の有無やmRNAの発現をPCRを用いて確認する予定である。免疫染色の結果は、染色パターンに着目して再評価を行う。これらのデータが出た時点で、臨床経過と照らし合わせて進行度との関連性を検討する。平成23年度と同様に免疫染色の検討を継続し、TWISTのメチル化の有無についてMethylation-specific PCRを用いて検討する。また、TWISTのmRNA発現をquantitative RT-PCRで検討する。それらの抗体やPCR用の試薬関連に研究費を使用予定である。次年度に13万円程度研究費が残ったのは、予定していた実験が遅れたために試薬の購入が遅れた分である。次年度にはPCR用の実験に用いる予定である。
眼内虚血時における病的血管新生を防ぎつつ、生理的血管新生を誘導する方法を検討する

糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症(Retinal Vein Occlusion、以下RVO)といった疾患において眼球組織が虚血に陥ると、網膜新生血管や隅角新生血管といった病的血管新生が起こってくる。虚血組織に対して生理的新生血管が起これば問題なく治癒するはずが、どうして病的血管新生が生じて、やがては視力の低下につながるのかは永年の謎である。申請者は、マウス実験的RVOモデルを作成し、それにおける側副血行形成過程をOCTアンギオグラフィーで観察しながら、生理的血管新生を助長して虚血の改善が起こる条件を探り出し新たな治療アプローチを開発することを目標とする。
核に転移した葉緑体リボソームタンパク質遺伝子の構造と発現

本研究では,葉緑体の機能を改変し育種的に利用するための,基礎的な知見を得るために,イネを材料として実験をおこなった.まず,イネのcDNAライブラリーを作成し葉緑体リボソームタンパク質遺伝子rpl19,rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl15,rpl21,rpl24,rpl28,rpsl,rps9,rps17のcDNAクローンを単離し,塩基配列を決定しその構造を調べた.これらのcDNAをプローブとしてRFLPマッピングをおこない,rpl9,rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24,rpl21,rps9について染色体上の座位を決定した.その結果,これらの遺伝子が,イネの核ゲノム上でクラスターを構成することなく,散在していることが明らかとなった.rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24について,イネの発芽初期における発現を,ノーザンハイブリダイゼーションを用いて解析した.その結果葉においては,発芽初期(吸水後4日目)は,mRNA量の蓄積が認められず,その後給水後10日目まで転写産物量が増加した.葉緑体ゲノムにコードされたリボソームタンパク質遺伝子についても,同様の発現パターンが認められた.根においては,これらの遺伝子はほとんど発現していないことがわかった.さらに,rpl13およびrpl24についてはゲノミッククローンを単離し,転写開始点を決定した.その結果,これらの遺伝子は複数の箇所から転写が始まっていることがわかった.さらに,これら複数の転写開始点は,器官特異的に使い分けられている可能性が示された.本研究では,葉緑体の機能を改変し育種的に利用するための,基礎的な知見を得るために,イネを材料として実験をおこなった.まず,イネのcDNAライブラリーを作成し葉緑体リボソームタンパク質遺伝子rpl19,rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl15,rpl21,rpl24,rpl28,rpsl,rps9,rps17のcDNAクローンを単離し,塩基配列を決定しその構造を調べた.これらのcDNAをプローブとしてRFLPマッピングをおこない,rpl9,rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24,rpl21,rps9について染色体上の座位を決定した.その結果,これらの遺伝子が,イネの核ゲノム上でクラスターを構成することなく,散在していることが明らかとなった.rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24について,イネの発芽初期における発現を,ノーザンハイブリダイゼーションを用いて解析した.その結果葉においては,発芽初期(吸水後4日目)は,mRNA量の蓄積が認められず,その後給水後10日目まで転写産物量が増加した.葉緑体ゲノムにコードされたリボソームタンパク質遺伝子についても,同様の発現パターンが認められた.根においては,これらの遺伝子はほとんど発現していないことがわかった.さらに,rpl13およびrpl24についてはゲノミッククローンを単離し,転写開始点を決定した.その結果,これらの遺伝子は複数の箇所から転写が始まっていることがわかった.さらに,これら複数の転写開始点は,器官特異的に使い分けられている可能性が示された.イネゲノミックライブラリーを作製し、rpl13,rpl24のcDNAをプローブとしてゲノミッククローンのスクリーニングをおこなった。単離された複数のファージクローンからDNAを精製し、制限酵素地図を作製したところ、rpl13,rpl24それぞれについてすべてのクローンで同様の制限酵素地図が得られた。このことから、イネrpl13,rpk24が核ゲノム上において単一コピーで存在することが示唆された。続いてこのゲノミッククローンの塩基配列を決定した。rpl24はその遺伝子の内部に1109塩基、75塩基、113塩基の3つのイントロンが存在していた。植物の核遺伝子のイントロンには、5′と3′のsplice junctionや3′splice junctionの1840の塩基上流に見られるbrunch pointに保存された配列が存在する。rpl24の3つのイントロンもそのような核遺伝子のイントロンの特徴を示していた。また、rpl13も3つのイントロンを含み、splice junction,blanching pointは葉緑体ゲノムではなく核遺伝子の特徴を保持していた。これは、これらの遺伝子が葉緑体ゲノムから核ゲノムへと移行した後に、イントロンが獲得されたことを示唆している。上流の転写調節領域についての解析を行った。rpl24のcDNAの5′末端より356塩基上流と468塩基上流に、ホウレンソウrps1,rpl21の組織特異的な発現の調節に関わるnegative elementとして同定されたS1F結合部位の配列に類似した配列が見いだされた。またcDNAの5′末端の上流6571塩基にシロイヌナズナの4種の葉緑体リボソームタンパク質遺伝子の上流3772塩基に保持された7塩基の配列と完全に一致した。これらの配列が核コードの葉緑体リボソームタンパク質遺伝子の協調的な発現に関与している可能性がある。

1.遺伝子のマッピングこれらのcDNAをプローブとしてRFLPマッピングをおこなったところ,rpl9,rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24,rpl21,rps9のプローブを用いた場合にイネ品種“日本晴"と“Kathalas"の間で多型が認められ,染色体上の位置が決定された.その結果,これらの遺伝子が,イネの核ゲノム上でクラスターを構成することなく,散在していることが明らかとなった.また,これらのcDNAを用いてオオムギ染色体上での位置を現在決定中である.2.発現解析rpl12-1,rpl12-2,rpl13,rpl24について,イネの発芽初期における発現を,ノーザンハイブリダイゼーションを用いて解析した.その結果,葉においては,発芽初期(吸水後4日目)までは,mRNA量の蓄積が認められず,吸水後10日目まで増加した.葉緑体ゲノムにコードされたリボソームタンパク質遺伝子についても,同様の発現パターンが認められた.根においては,これらの遺伝子はほとんど発現していないことがわかった.rpl13およびrpl24についてはゲノミッククローンを単離し,転写開始点を決定した.その結果,これらの遺伝子は複雑の箇所から転写が始まっていることがわかった.さらに,これら複数の転写開始点は,器官特異的に使い分けられている可能性が示された.
エストロゲン受容体遺伝子多型が更年期症状の強さに及ぼす影響

前年度の研究において、エストロゲン受容体β遺伝子のCAリピート多型と更年期障害の症状との間に関連性があることを明らかにした。そこで、本年度はCAリピート多型と薬剤使用動向及び薬物効果との相関を検討した。処方薬剤とCAリピート多型との相関については、千葉県立東金病院で更年期障害の薬物療法が行われた患者63名に対して3ヶ月以上処方された薬剤195件を対象として解析を行った。その結果、漢方製剤単独療法と他の薬剤との併用療法の割合は、SS genotypeが2.14、SL genotypeが1.43、LL genotypeが0.86とSS genotypeはLL genotypeの2.5倍も併用している者が多かった。また、更年期障害治療の3大漢方処方である加味逍遥散、桂枝茯苓丸および当帰芍薬散を合わせた処方率はSS genotypeの者が72.7%、SL genotypeでは47.1%、LL genotypeでは38.5%とSS genotypeがLL genotypeに比べ処方率が有意に高いという結果が得られた。さらに、桂枝茯苓丸の処方率はSSの者は31.8%であるのに対し、他のgenotypeの者は10.0%とSS genotypeが有意に高かった。この結果、CAリピート多型と更年期障害治療の3大漢方処方との間には何らかの相関があり、SS genotypeの者は、これらの漢方製剤、特にhot flashの症状が強い場合には治療薬の1つとして桂枝茯苓丸を選択することに意義があると示唆された。この結果は、Jpn.J.Pharm.Health.Care Sci.に投稿し掲載された。本研究により、更年期障害における薬物療法のエビデンスを遺伝子多型解析という新たな観点から確立することができた。実施に先立ち、東金病院と千葉大学大学院薬学研究院それぞれの倫理審査委員会の承認のもと、千葉県立東金病院を受診した女性患者を対象に検討した。エストロゲン欠乏で生じ、エストロゲンの補充で著明に改善する更年期障害の主要な自覚症状の一つである「のぼせ・ほてり」をはじめとする血管運動神経症状の強さ及び頻度がエストロゲン受容体(ER)の遺伝子多型と関係するかを解析し、ホルモン補充療法(HRT)の根拠ある治療に貢献することを目的に、ホルモン補充療法のテーラーメイド医療の確立を目指して、ホットフラッシュの強さ(頻度)とER遺伝子多型との相関について解析した。具体的には、のぼせ・ほてり・発汗の強さと頻度、不眠、いらいら、うつ症状の有無などで群別し、当該患者のDNA解析を行う。前記ERβのジヌクレオチドリピート並びにER遺伝子の変異部位を決定し、遺伝子多型と臨床パラメーターの相関性を解析した。抽出されたDNAを用い、キャピラリーシークエンシング法及びWAVE法によりリピート回数を決定し、これらの遺伝子解析結果と臨床パラメーターの相関を解析した。ERβのCAリピート多型解析の結果、SLジェノタイプの患者は更年期障害の血管運動神経症状のリスクおよび精神神経症状のリスクが有意に低く、ホルモン補充療法の必要性も有意に低かった。このことから、CAリピート多型と更年期障害の発症リスクとの示唆され、本研究の作業仮説の正しさが明らかになった。この結果は、国際誌Gender Medicineに投稿し掲載が受理された。次年度は、遺伝子多型と薬剤使用動向と薬物効果との相関を検討し、医薬品適正使用におけるエビデンスの蓄積を図る予定である。
アセチル化修飾によるmTORシグナルを介した神経老化制御の解明

カロリー制限や抗酸化作用が老化と密接な関係にあることからインスリンシグナル系の制御に着目し、その中心となるAkt/PKA(Aキナーゼ)の新規の活性制御機構について研究を行った。通常細胞内シグナル系はリン酸化修飾によってタンパク質の活性が制御されているが、本研究ではこれまでにない全く新規な制御因子として脱アセチル化酵素であるHDAC6とN-アセチル化酵素のサブユニットであるMdm20がmTORの活性を介してAktの活性を制御することを突き止めた。今回の成果は長らく不明であった細胞質におけるアセチル化修飾の働きを明らかにすると共に、アンチエイジング(抗老化作用)への寄与が期待できるものでもある。mTORはエネルギー代謝をはじめとし細胞内のホメオスタシス制御を担うことから老化制御因子として注目されている。mTORはRaptorを介したmTORC1とRictorを介したmTORC2の2種類の分子複合体を形成するが、各々異なる基質をリン酸化することからその活性制御機構も異なることが報告されている。本研究ではアセチル化修飾関連分子であるHDAC6(脱アセチル化酵素)及びMdm20(N-アセチル転移酵素Bの補助サブユニット)による2種類のmTORシグナル制御機構について明らかにすることを目的とし、本年度はその標的分子の絞り込み及び活性制御機構について解析を行った。一方、Mdm20に関してはMdm20をノックダウンした細胞でmTORC2の共因子であるRictorの発現が低下することを明らかにしていたが、その発現制御がどの段階で行われているのかについて検証を行った。タンパク質分解を阻害する薬剤(MG132やNH4Cl)で処理してもRictorの発現量の回復が認められなかったこと、定量PCRによるmRNAの発現量についてはMdm20ノックダウン細胞でも十分確認できたことから、Mdm20によるRictorの発現制御は転写から翻訳開始、伸張、終始の段階にあることまで突き止めた。本年度はこれまでのMdm20の研究成果をまとめ、Mdm20がmTORC2の活性をその共因子であるRictorの発現量を調節することで制御することを学術雑誌PLoSOneに投稿し、下記のように受理され掲載された。本研究結果はこれまで情報がほとんどなかったmTORC2の活性制御機構を明らかにしたものであり、今後はこの発見をもとにさらに詳細にその分子メカニズムについて調べていく予定である。一方で、HDAC6の研究についてはmTORC1及びmTORC2に対する親和性については明らかにしたが、実際の標的分子の同定及びその修飾部位の同定まで進めることができなかったので、引き続きこの課題については次年度も検討していく予定である。本年度はMdm20の研究成果をまとめて、学術論文に掲載されるまで進めることができたがHDAC6の研究については予定通り進めることができなかった。その大きな理由として、年度途中での所属先の異動に伴い、研究の一時中断、解析のために必要な質量分析器の利用が困難になったことがあげられる。これらの問題は次年度の研究の進捗に影響する可能性が高いいが、問題解決に向けて鋭意努力をする。本研究では細胞質におけるアセチル化修飾関連酵素によるmTORシグナルの統括的な制御を担っていることを明らかにする目的で研究を行ってきた。昨年度までにいまだ明らかにされていない生体内におけるmTORC2の活性をN-アセチル化酵素の補助サブユニットであるMdm20がmTORC2の構成タンパク質の一つであるRictorの発現を制御することでmTORC2の活性を制御することを報告した。本年度はさらに詳細な分子機構について調べるためにmRNAの転写レベルやタンパク質合成や伸長反応など、発現制御に関わるいくつかのステップを様々な予備実験や検討実験を主体に進めてきたが、現在のところ新しい知見は得られていないが、引き続き今後も検討する予定。一方で、細胞質の脱アセチル化酵素であるHDAC6もmTORC2と相互作用することも見出しており、本年度はHDAC6はmTORC1とも相互作用し、mTORを中心とした複合体形成にアセチル化修飾が関与し、さらにmTOR活性を制御することを明らかにした。しかし、その詳細な分子機構については現在も引き続き検討中であり、論文報告までには至らなかった。引き続きアセチル化修飾を受ける標的分子及び標的アミノ酸を同定し、アミノ酸置換変異体や特異抗体などを作成し、分子機構について明らかにしていく予定。さらにmTORシグナルの統括的制御機構におけるHDAC6とMdm20との関係性についても検討していく予定。本年度は新しい分子機構の解明に取り組むことが多く、予備実験や検討実験を様々な条件下で試すことが多かったこと、また新しい手法の導入及び確立などに時間を割かれたことなどが原因として挙げられる。神経細胞は老化に伴い体内の様々なホメオスタシスのバランスが崩れ、エネルギー代謝の低下に加え酸化ストレスを含む様々なストレスにより変性・脱落が起こりやすくなる。本研究はインスリンシグナル系の中心的な役割を担うAkt/PKAの活性制御をリン酸化修飾ではなくアセチル化修飾により制御されていることに着目してきた。ホメオスタシス制御にはタンパク質の品質管理も重要な制御機構の一つに挙げられ、脱アセチル化酵素であるHDAC6はタンパク質の品質管理にも重要な制御因子でもある。今回はHDAC6が分子シャペロンであるHSP70と相互作用をすることを新規に見出したので、その制御機構について調べた。HSP70は変性タンパク質の修復を行う際に、様々なシャペロン分子と相互に作用する。その一つにHSP105があり、HSP105は5HSP70と結合しHSP70のシャペロン活性を抑制するとが報告されている。

本研究によりHDAC6はHSP70とHSP105の親和性を低下させることを明らかにした。さらにHSP105との親和性が低下することによりHSP70は基質である変性タンパク質との親和性が増加することを確認し、HDAC6がタンパク質の品質管理において正の制御因子であることを明らかにした。さらにHDAC6の標的分子はHSP70ではなくHSP105であり、現在その標的アミノ酸の同定に取り組んでいる。カロリー制限や抗酸化作用が老化と密接な関係にあることからインスリンシグナル系の制御に着目し、その中心となるAkt/PKA(Aキナーゼ)の新規の活性制御機構について研究を行った。通常細胞内シグナル系はリン酸化修飾によってタンパク質の活性が制御されているが、本研究ではこれまでにない全く新規な制御因子として脱アセチル化酵素であるHDAC6とN-アセチル化酵素のサブユニットであるMdm20がmTORの活性を介してAktの活性を制御することを突き止めた。今回の成果は長らく不明であった細胞質におけるアセチル化修飾の働きを明らかにすると共に、アンチエイジング(抗老化作用)への寄与が期待できるものでもある。当初の目的として、平成26年度はHDAC6のmTORC1及びmTORC2に対して、どのように作用しているのか、またその標的分子は何かについて絞り込むことであり、その結果としてHDAC6の脱アセチル化活性がmTORを中心とした複合体形成の親和性を制御することを明らかにしたことから少なくともmTORC1及びmTORC2の複合体を形成する分子のいずれかが直接の標的分子である可能性が高くなった。Mdm20の方はmTORC2の構成分子であるRictorの発現を下げる原因を追求することを目的としており、翻訳段階にあることを突きとめられた。所属先が変わったことにより、研究状況や研究環境も変わった為、若干の方向修正が必要となった。当初の研究計画では神経老化に特化して研究を進める予定であったが、現施設状況では老齢のマウスを飼育するのが困難な為in vivoでの研究を進めるよりは培養細胞を用いて分子メカニズムに焦点を切り替えて進める必要がある。そこでMdm20のRictor発現制御機構の分子メカニズムやHDAC6のmTORC1及びmTORC2への活性制御機構の分子メカニズムを明らかにすることを主たる目的とし、次年度は研究を進めていく予定。本年度実施した予備実験や検討実験の結果より、アセチル化修飾酵素がmTORを中心とした2種類のリン酸化複合体、mTORC1及びmTORC2の活性を複合体構成分子の親和性を介して制御することが明らかとなってきた。今後はアセチル化修飾を受ける分子及びアミノ酸部位を同定し、アセチル化修飾によるリン酸化活性の制御機構の分子機構を解明することで細胞質におけるアセチル化修飾の生物学的意義の提唱を目指す。
核内受容体がDNA-PKと協調し転写抑制をもたらす普遍的な分子機構の解明

代表的な腫瘍随伴症候群である高カルシウム血症の原因の多くを占めるPTHrP遺伝子の転写制御において、核内受容体(NR)ファミリーによる本遺伝子の転写抑制が、多くの種類の核内ホルモンの存在下において普遍的にかつ一部共通した機構によって認められる現象の分子基盤を乳癌細胞、グリオーマ細胞、皮膚ケラチノサイトの株化培養細胞を用いてリアルタイムRT-PCR、ChIp、IP-ウェスタン法を駆使して詳細に検討した。興味あることにこの転写抑制は古典的なステロイドホルモンであるエストロゲン、アンドロゲン、グルココルチコイド、プロゲステロンでは共通に認められるが、転写抑制の見られるビタミンDを除いて、RXRとヘテロダイマーを作るNRと結合するホルモン(甲状腺ホルモン、各種のレチノイン酸誘導体、トログリタゾン)では認められなかった。各ホルモンアンタゴニストでこの抑制がおおむね解除され、NRの存在がほとんど認められない細胞ではそのNRに対応するステロイドホルモンの転写抑制効果が見られないことから、これらの転写調節には各NRの存在が必須であることが判明した。また、時間経過、容量曲線、さらにこのうちの2種のステロイドホルモンの混合実験などから、この転写抑制には共通して、PTHrP遺伝子上に存在する反応性DNA配列とそれに結合する一定の転写共役因子群の機能が必要であることが示唆された。そして、この転写抑制機構においてホルモン依存的な、DNA-PKと各核内受容体の結合が普遍的に見られることを実証し、その生理的な意義について各種の考察を加えている。1)ヒトPTHrP遺伝子の転写を、ビタミンD、E2、DHT、デキサメサゾン、T3、プロゲステロンがいずれも10nMの用量で、ホルモン投与後6-8時間をピークとする時間経過で約1/2程度抑制することを、ヒト乳癌MCF7細胞株を用いた半定量的real-time PCR法で確認した。AtRA、9-cisRA、troglitazone投与では同様の条件下で、同遺伝子転写は2倍以上に促進された。2)各ホルモン(E2、DHT、デキサメサゾン,プロゲステロン)のアンタゴニスト、選択的DNA-PK拮抗薬NU7026、そしてTSAはいずれも上記のPTHrP遺伝子転写抑制をほぼ完全に解除した。3)DNA-PKおよびHDAC2のSiRNAを導入した場合、さらにDNA-PKの調節ユニットであるKu80のアンチセンスDNAを導入した場合にもまたこの転写抑制が解除された。4)RAR、RXR、PPAR_γ以外の各種核内受容体蛋白(VDR、ER_α、AR、GR、TRβ1、PR-B)は、それぞれのホルモン依存的にDNA-PK蛋白およびHDAC2と結合することをIPウェスタン法で確認した。5)ChIPアッセイでPTHrP遺伝子上流のnVDRE領域に、上記の核内受容体、DNA-PK、HDAC2がいずれもホルモン依存的に動員されることを確認したが、その時間経過はこれらの転写(共役)因子ごとに独自のパターンを示した。以上のことから、核内受容体を介したホルモン存在下での遺伝子転写抑制には共通のクロマチンレベルでの分子機構が機能していることが解明されつつある。
基板界面による強誘電性液晶の層構造及び物性制御と新界面評価システムの試作

今年度は反強誘電相を示す液晶の物性研究と新しい表面評価装置である全反射強制レ-リ-散乱装置の試作をおもに行った。反強誘電相1988年に我々が発見した3安定状態間スイッチングが電場誘起反強誘電ー強誘電相転移によるものであることを1989年に明かにした。このことに関し、基礎、応用の両面から研究を継続した。主な成果は(1)自己修複性。電場誘起相転移に基づく分子配向のスイッチングに伴う層のスイッチングは機械的ショックなどによって乱れた配向変化を自発的に修複する効果を持つ。この現象は電場を大きくし、層のスイッチングさえ起こさせれば反強誘電性液晶ばかりでなく、強誘電性液晶に関しても有効である。(2)誘電測定による反強誘電性液晶相を含む相転移の基礎的研究。1次、弱い一次、2次転移を示す物質のキュリ-定数などを決定した。(3)1次相転移を示す物質の光学異性体の混合物に関するX線回折による研究。光学異性体の混合により強誘電相が現れるが、現れる強誘電相の温度範囲に応じて常誘電相の層間隔が変化することが分かった。これは同じ異性体分子の2量体比という反強誘電性の起源を示唆する結果である。(4)フェリ誘電相の分子配列モデルに関する考察。(5)悪魔の階段。スメクチックA相の低温側にしばしば現れるスメクチックCa*相は悪魔の階段と呼ばれる特殊な相であることを明らかにした。(6)反強誘電性液晶相の出現に関する考察。(7)トンネル顕微鏡による強誘電性液晶、反強誘電性液晶の界面構造の観察。(8)るい位と呼ばれる欠陥構造の出現。全反射強制レ-リ-散乱全反射強制レ-リ-散乱装置を設計し、光学系を完成させた。ネマティック液晶を用い、全反射条件で回折信号が観察できることを確認した。信号の解析を進める一方、温度変化測定に対応できるよう準備を進めている。(5)悪魔の階段。
一次相転移点近傍における2相共存状態の安定性と相境界の構造

実験の面では、3相共存状態における分域の挙動の精密測定、及び混合溶媒中でのゲル内部に形成されるセルパターンの測定を、また理論的研究の面では、転移に伴う水の状態の変化と収縮相の安定化条件を解析した。(1)実験的研究:3相共存状態の実験と分域の温度挙動試料の大きさを従来の実験の場合に比べて約1/10の100mμとすることにより、体積緩和時間は約1/100に短縮され、分域壁の温度挙動の実験が短時間必要性から、温度制御は従来よりも難しくなった。試料ホルダーの構造、温度制御機器の精密化によってこの問題に対処し、一応初期の目標を達し得た。NIPAゲルの体積相転移機構の理解には、従来の現象論よりも更に進んだ理論を必要とすることが確認できた。(2)相分離におけるセルパターンの観測エタノールと水との混合溶媒中の相分離において、きわめて特徴的なセルパターンが初めて観測された。この事は、NIPA鎖がかなり剛直である事の証拠であると解釈された。(3)理論的研究:転移におけるゲル水の振舞いと収縮相の安定性今年度の研究から得られた最大の収穫は、現実に起こるゲルの体積相転移が、従来Floryの現象論が予言する相転移とはかなり異なると言う点が明らかになったことである。すなわち、種々の実験事実を総合的に判断すると、収縮相は自由水を含まず、網目と束縛水とが結晶的な構造を形成していると考えられる。この事は、一種類のモノマーから出来た合成高分子でも、溶媒を組み込んだ高次構造を取り得ることを示すものであり、タンパク質のような生体高分子の構造形成のモデル系としても、ゲルが有効であることを示す。本年度は特に、中性poly-N-isopropylacrylamide(NIPA)ゲルの2相共存領域における、相境界移動のカイネチックス、相分離過程での不均一構造の凍結、及び新たに見い出された異常な相分離パターンについての研究を行った。1.相境界移動のカイネチックス:この点に関して特筆すべきは、実験技術の改善である。すなわち、従来の相境界移動の測定は、極めて長時間(数日数週間の程度)を要する事が難点であったが、我々は本研究において直径100μm以下の極めて細いゲルファイバーを作製する事に成功し、それを試料とする事により、測定時間を大幅に(2桁程度)短縮できた。この改善により、相境界の運動に関して多くの詳細なデータを得る事が可能となった。現在、この方法に基づく測定が進行中である。2.不均一構造の凍結:ゲルの相分離の中間過程で、不均一構造が凍結する現象は、試料の巨視的サイズに依存する事が、初めて確認された。この事実は、ゲルの表面構造がバルクとは異なることを示唆するものであり、来年度の研究課題である。3.相分離におけるセルパターンの観測:エタノールと水との混合溶媒中の相分離において、きわめて特徴的なセルパターンが初めて観測された。当初の計画に従って、実験の面では、3相共存状態における分域の挙動の精密測定を、また理論的研究の面では、転移に伴う水の状態の変化と収縮相の安定化条件を解析した。(1)実験的研究:3相共存状態の実現と分域の温度挙動試料の大きさを従来の実験の場合に比べて約1/10の100mμとすることにより、体積緩和時間は約1/100に短縮され、分域壁の温度挙動の実験が短時間で実行できるようになった。ただし、試料の微小化に伴う顕微鏡倍率増大の必要性から、温度制御は従来よりも難しくなった。

NIPAゲルの体積相転移機構の理解には、従来の現象論よりも更に進んだ理論を必要することが確認できた。(2)理論的研究:転移におけるゲル水の振舞いと収縮相の安定性今年度の研究から得られた最大の収穫は、現実に起こるゲルの体積相転移が、従来Floryの現象論が予言する相転移とはかなり異なると言う点が明らかになったことである。すなわち、種々の実験事実を総合的に判断すると、収縮相は自由水を含まず、網目と束縛水とが結晶的な構造を形成していると考えられる。この事は、一種類のモノマーから出来た合成高分子でも、溶媒を組み込んだ高次構造を取り得る事を示すものであり、タンパク質のような生体高分子の構造形成のモデル系として、今後の研究対象になり得ると考えられる。
占領期GHQ／SCAPの看護改革と布教活動の関連性に迫る歴史的研究

占領期日本において、GHQ/SCAP(連合国軍最高司令官総司令部)は看護改革を実施したことは周知の事実である。しかし、筆者らは看護改革の目的を新たな視点での考察を試みた。占領目的の一つは日本の戦前の看護をアメリカ看護へと刷新することであり、もう一つはキリスト教(プロテスタント派)への布教であると考えた。しかし,布教活動が来日の使命であった事実は、これまでの研究であまり注目されてこなかった。そのため、本研究では,看護改革を推進した人物の背景,つまり信仰と活動内容に着目して、アメリカの看護者による看護改革実施の“別の様相"を明らかにすることにした。研究期間を通して、本目的を実証するのは困難であった。その理由は、布教活動を実証する公的な史料の存在が確認できなかったことと、布教活動は個々人の裁量で行われていたと思う事実を得たからである。筆者らの調査結果を、アメリカで開催された看護歴史学会などで発表し意見交換を行ってきた。アメリカの看護歴史研究者は、戦後日本の看護改革の目的には布教活動は掲げてはいなかったと示唆した。GHQ/SCAPが実施した改革の中で布教を色濃くした政策もあったが、医学・看護の分野においては他の改革とは違う様相であったと考えている。また、GHQ/SCAP看護課のスタッフが行っていたと思われる布教活動はすべて業務外の時間であった。つまり、政策実施の一環ではなかったと思われた。さらに、蒐集した資料から考察すると強制的な様子は伺えず、むしろ日本人が積極的に彼女らの開催する英語クラスやバイブルクラスに参加していた事実があった。今後は、一次史料を探究を継続することと、アメリカ人が持つ宗教観を理解したうえで、さらに本研究課題に取り組んでいく。第二次世界大戦後,ダグラス・マッカーサー元帥(Gen. Douglas MacArthur)率いる連合国軍最高司令官総司令部(GHQ/SCAP)は対日占領改革において,日本に精神革命を起こすために宗教と教育を利用した.マッカーサー元帥にとって民主主義とキリスト教への改宗は一心同体であったと言われるように,日本にキリスト教を布教することは占領改革のもう一つの目的であった.筆者らはこれまでGHQ/SCAP・公衆衛生福祉局(PHW)の看護政策の実施過程を論証してきたが,布教活動が来日の使命であったという視点からPHWの活動を解明してはいない.さらに,PHWの初代課長オルト(Grace Elizabeth Al)や二代目課長オルソン(Virginia M Ohlson),看護スタッフのマチソン(Enid Mathison)らは,所属教団は違ったが熱心なキリスト教信者であったことも周知である.そこで,研究課題は占領期における日本での布教活動もGHQ/SCAPの医療・看護改革の一部であったこと,その上で,GHQ/SCAPスタッフらがわが国の看護専門職化にどのような影響を与えたのかを考察することにある.平成28年度は,計画に沿って,既に収集した一次史料の再分析を行うとともに,それらを実証するためにGHQ/SCAPの宗教改革に関する書籍を活用した.また,新たな一次史料及び二次資料の収集を継続して行っている.平成29年度は,新たにアメリカ在住の研究者に筆者らの研究協力(専門的知識の提供,アメリカ国内の資料収集,翻訳など)を依頼する予定である.平成29年度は,研究目的に沿った史料の探究と蒐集および翻訳作業を行った.また,研究代表者と分担者が所属する日本看護歴史学会第31回学術集会とアメリカ看護歴史学会(America Association for the Nursing History)35th Annual Nursing & Health Care History Conferenceにて,研究成果を発表し意見交換を行った.学術集会終了後も引き続き,これら学会メンバーと共同し研究を進めている.本研究の課題は,占領期日本における布教活動の事実を,PHWの看護政策実施過程との関連性から探究することにある.今年度の研究成果の一部は次のようである.1945年11月,GHQ/CIE組織に宗教課が設置され,対日占領改革の方針に則って宗教課は政教分離の原則を守るためマッカーサーが強烈に進めようとした日本のキリスト教化に強く抵抗したことを史料から確認した.また,キリスト教宣教師たちの生活はGHQの活動とはほとんど無関係であったことも伺えた.しかしながら,PHW看護課のみならずGHQスタッフの多数が宗派は違うがキリスト教信者である.GHQは,一方ではキリスト教化を勧め,他方では信教の自由を謳い,政教分離の確立を目指していた.CIE宗教課はこの矛盾に気づきながら宗教政策を展開していた.PHW看護課も公式に看護政策と布教活動を関連させて行うことは控えていたと考えられる.筆者らはマッカーサー元帥の指示のもと,PHW看護課の活動の一端にキリスト教団での講演やキリスト教と看護思想を関連させた話題提供があったと仮説立てていたが,その様相を分析史料からは実証できなかった.つまり,看護政策と宗教政策を関連付ける公式な文書は表面的には存在せず,容易に史料を見出だすことは困難であると推察された.平成29年度に予定していた国内外学術集会での発表と史料探究など,概ね計画どおりである.論文作成に向けて,さらにインタビューなどを計画していく.占領期日本において、GHQ/SCAP(連合国軍最高司令官総司令部)は看護改革を実施したことは周知の事実である。

しかし,布教活動が来日の使命であった事実は、これまでの研究であまり注目されてこなかった。そのため、本研究では,看護改革を推進した人物の背景,つまり信仰と活動内容に着目して、アメリカの看護者による看護改革実施の“別の様相"を明らかにすることにした。研究期間を通して、本目的を実証するのは困難であった。その理由は、布教活動を実証する公的な史料の存在が確認できなかったことと、布教活動は個々人の裁量で行われていたと思う事実を得たからである。筆者らの調査結果を、アメリカで開催された看護歴史学会などで発表し意見交換を行ってきた。アメリカの看護歴史研究者は、戦後日本の看護改革の目的には布教活動は掲げてはいなかったと示唆した。GHQ/SCAPが実施した改革の中で布教を色濃くした政策もあったが、医学・看護の分野においては他の改革とは違う様相であったと考えている。また、GHQ/SCAP看護課のスタッフが行っていたと思われる布教活動はすべて業務外の時間であった。つまり、政策実施の一環ではなかったと思われた。さらに、蒐集した資料から考察すると強制的な様子は伺えず、むしろ日本人が積極的に彼女らの開催する英語クラスやバイブルクラスに参加していた事実があった。今後は、一次史料を探究を継続することと、アメリカ人が持つ宗教観を理解したうえで、さらに本研究課題に取り組んでいく。毎年の研究成果を国内(日本看護歴史学会,日本看護科学学会など)や国外(American Association for the History of Nursing)で報告し,さらに研究の示唆を得る予定である.引き続き,一次史料及び書籍などの二次資料の収集,分析を進めていく.また,学会発表を経て論文作成に取り掛かる.また,占領期の宗教改革に関する研究者とのディスカッションを検討している.平成30年度はさらに研究を蓄積し,国内外で成果報告を行っていく.また,史料の探求に関しては,GHQ,特にPHW看護課やCIE宗教課のスタッフやその家族が日本の宗教的,教育的,医療・社会福祉的な施設に対して与えた貢献について,史料の方向を変えて探究していく予定である.さらに,キリスト教団体や看護職者へのインタビューも予定していく.また,20世紀メディア情報データベースを活用し,地域ごとや民間の新聞,雑誌,書籍などからも資料を探究していく.平成28年度,国際学会発表のために計上した旅費等を私費で支出したため,次年度への使用額が生じた.また,一次史料の所蔵を確認するのに時間を要し,旅費,その他(複写費,投稿料など)を使用しなかったため.今年度は,研究調査のための旅費や史料蒐集に関連する費用(複写費など)が予定より少なく実施できたため,次年度使用額が生じた.次年度は,国際学会への参加費と旅費,および国内外調査のための旅費,複写費などや,国内学会への参加・発表も予定しており,それらに使用する.また,成果報告書作成のための電子機器の購入も検討している.平成29年度は,平成28年度の成果発表を国内及び国外にて行う予定であり,旅費を使用させて頂く予定である.
分布関数を用いた細胞核内の微環境の解析と新しい細胞像の構築

蛍光相関分光法はこれまで細胞内の微環境を解析できる手法として用いられるようになってきた。これまで多くの研究ではFCSの測定で得られる分子の動きの成分は最大3つであると仮定してきた。ところで細胞の中でのタンパク質や分子の動きを示すのに、平均値などの一つの代表値だけで十分なのであろうか?細胞の中は様々な構造体を有し、その分布も様々であろう。また、同じ場所でも時間によっても変化していることが予想される。これまでの3成分解析を一挙に多成分に拡張するには、これまでの方程式の成分を単純に増やすのではなく、新たなアルゴリズムを導入することが必要とされる。そこで我々は散乱測定に既に用いられ数々の成果を上げているCONTINを利用した。初年度は解析法の開発を行い,2年度はモデル系で得られた測定データの解析を行い,モデルと結果の間の関係を明らかにしつつ,さらなる解析法の確立を行った。測定した系は、蛋白の凝集体をモデルとして、アミロイドベータ蛋白質の一部を利用して凝集過程を解析した。時間とともに凝集する過程を分布関数として解析し、表現することができた。蛍光標識オリゴDNAを細胞内に導入してオリゴDNAの動きを拡散時間の分布で解析したこれまでのような2種類の拡散定数(または拡散時間)とその割合という単純な表現ではなく、二つのピークを中心に様々な動きを持った分布をしていることを示している。溶液の中の拡散運動とは異なり、細胞の中ではひとつの分子種でもその動きには幅があることが予想され、分布関数として表現するのが妥当だろうことが示された。今後は,さらに,この手法を空間相関へと展開し,新たな細胞像を構築したいと考えている。これまでFCSの測定で得られる分子の動きの成分は最大3つであると仮定してきた。これを一挙に多成分に拡張するには、これまでの方程式の成分を単純に増やすのではなく、新たなアルゴリズムを導入することが必要とされる。その一つは散乱測定に既に用いられ数々の成果を上げているCONTINを利用した。まずCONTINを蛍光相関分光の測定に利用できる形式、利用可能なインターフェイスを作成した。尚、CONTINはドイツの研究者が開発したアルゴリズムで、利用に当たっては無料であるが、承諾を得た。インターフェースは特によく使われているソフトを利用するために、エクセルによる解析結果の表示を行うようにした。本年度はモデル系で得られた測定データの解析を行い,モデルと結果の間の関係を明らかにしつつ,解析法の確立を行った。また、膜タンパク質の凝集過程も解析を行い、シャペロンの有無により、膜タンパク質が凝集から解離、またはその逆過程を行うこと検出することができた。以上のように、本年度CONTINを用いた分布解析の方法の確立が行えた。また、明らかになった問題点として、分布解析を行ううえで、一成分もしくは2成分を固定して解析する必要があることが判明した。これらは本法が細胞内微環境や生体分子間相互作用を解析するためには重要なため来年度も引き続き構築することを目指す。
Th1病克服を目指したp38MAPK経路活性制御機構の解明と分子標的療法の開発

p38MAPK経路は、サイトカインや抗原刺激によって活性化され、IFNY産生及びTh1免疫に必須のシグナル伝達経路である。申請者はp38経路の主要なMAPKKKであるMTK1を単離し、さらにMTK1の活性化因子としてGADD45関連遺伝子を同定してきた。またTh1細胞において、GADD45分子がサイトカインや抗原刺激によって発現誘導され、MTK1-p38経路の活性化を介してTh1免疫応答の制御に極めて重要な役割を果たすことを示してきた。本研究では、自己免疫疾患の病態解明および新規治療法の開発を目指して、Th1免疫応答の鍵分子であるMTK1活性調節機構の解明を行った。MTK1の活性化機構として、GADD45分子がMTK1のN末端に位置する約100アミノ酸旨の領域に結合すると、まずMTK1制御ドメインと酵素ドメイン間の抑制的相互作用が解除されることを見出した。さらに、coiled-coilドメインを介してMTK1分子同士の多量体化が誘導され、隣接した分子が相互にリン酸化し合い、強い活性化が起こることを明らかにした。またMTKIは活性化されると、MAPKK分子と結合出来るようになり、シグナルが正しく下流へと伝搬されて行くことを見出した。さらに、MAPKK分子内で、MTK1との選択的結合に必要な領域を探索した結果、MAPKKのC末端約20アミノ酸の領域が、ドッキング・サイトであることを見出した。このドッキング・サイトと相同なアミノ酸配列を持つ合成ペプチドを細胞に導入したところ、MTK1-MAPKKの結合が競合阻害され、サイトカインによるp38の活性化が強く抑制されることを見出した。従ってMTK1やドッキング・サイトをターゲットとした分子標的薬剤を開発することで、Th1免疫応答を人工的に制御する新たな治療法を開発し得る可能性が示唆された。また、新規MTK1結合分子の同定に成功した。p38MAPK経路は、サイトカインや抗原刺激によって活性化され、IFN-γ産生及びTh1免疫に必須のシグナル伝達経路である。またTh1細胞において、これらGADD45分子がサイトカインや抗原刺激によって発現誘導され、MTK1-p38経路の活性化を介してIFN-γ産生とTh1免疫応答の制御に極めて重要な役割を果たすことを示してきた。まずMTK1の活性化に必要な自己リン酸化サイトを同定した。さらに同部位に対するリン酸化特異抗体を作成し、この抗体を用いてin vivoでMTK1の活性化を容易に検出する実験系を確立した。また、MTK1の活性化機構として、GADD45分子の結合に伴い制御ドメインと酵素ドメインの抑制的相互作用が解除されること、またその結果、MTK1分子同士の多量体化が誘導され活性化に至ることを見出した。またMTK1の基質特異性決定機構を解明するため、MKK6分子内で、MTK1との選択的結合に必要な領域の同定を試みた。その結果、MKK6のC末端約20アミノ酸の領域が、MTK1とのドッキング・サイトであることを見出した。同様のドッキング・サイトはMTK1の基質である他のMAPKK分子(MKK3/4)にも保存されていた。