hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
化学発癌過程において活性化する遺伝子の探索

我々は、ラットの肝化学発癌過程で特異的に発現される酵素、胎盤型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-P)遺伝子の発現制御機構について研究を進めて来た。本年度は、(1)GST-P遺伝子のクローニング,(2)クローン化した遺伝子を用いた発現制御領域の同程と解析、(3)肝細胞および肝癌細胞中でのGST-P遺伝子クロマチンの構造解析、および(4)ヒト胎盤型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-π)のcDNAクローニンブについて研究を行った。(1)ラット遺伝子ライブラリーを、GST-P,cDNAをプローブとしてスクリーンし、数個のクローンを得た。このうち多くのものはイントロンを持たない偽遺伝子であった。活性型の遺伝子は、7個のエクソンと6個のイントロンより成る全長約2.5Kbの遺伝子であった。(2)クローンした遺伝子の【5! ́】上流のさまざまな部分をCAT遺伝子につなぎ、肝癌細胞に導入して、転写活性におよぼす影響を調べた。その結果、転写開始点の上流約2.5Kbにエンハンサー、0.5Kb上流にサイレンサー様の活性が見い出された。エンハンサー領域の解析の結果、この領域に特異的に結合するトランス作用因子の存在が明らかとなった。又、このエンハンサーはSV40などのプロモーターにつないでも高い転写効率は得られず、GST-Pのプロモーターに特異的に作用する事も示唆された。(3)GST-P遺伝子のメチル化及びDNase高感受性部位を、肝および肝癌細胞で比較した結果、肝癌細胞では肝細胞よりDNaseに対し高い感受性を示し、メチル化の程度も低いことが分った。肝癌細胞では、より活性化されたクロマチン構造をしているものと思われる。(4)ヒトのGST-Pに相当する酵素、GST-πのcDNAをヒト胎盤cDNAライブラリーより得、解析の結果、GST-πはGST-Pと86%の相同性があった。このcDNAをプローブとしてヒト肝癌におけるGST-πの発現を調べたが、正常肝との間に大きな変化は見られなかった。
代謝物マススペクトルからの構造推定

一次代謝に関与する物質の標準GC/MSスペクトルを国内外の5機関から集め、物質ごとにスペクトルを比較したライブラリを構築した。またESIスペクトルはMassBank、PRIMe、KNApSAcK等、代表的なメタボロームデータベースにおける代謝物のIDをInChIコードやCAS番号といったIDから物質毎のスペクトルをとりまとめた。またESIデータについてはクロマトグラムのピーク比較・評価手法を設計し、統合スペクトルデータのwikiサイトを構築した。また二次代謝物に関してはフラボノイドを解析した。これらの成果を、スペクトルを閲覧・解析するための統合メタボロミクスソフトウェアの一部として実現した。メタボロミクス分野で頻繁に計測される、一次代謝に関与する物質の標準GC/MSスペクトルを国内外の5機関から集め、物質ごとにスペクトルを比較したライブラリを構築した。スペクトルが安定すると言われるGC/MSでも計測機器による違いがある。それを明らかにすべく、ノイズに基づくばらつきと機器によるばらつきの違いを推定した。これら比較結果を今後ウェブ上で無償公開する予定である。この情報を用いれば、国内外の研究者が標準物質を購入することなくGC/MS計測をおこなう際の大きな助けになる。また、このデータと、文献からディジタル化したピークーフラグメンテーション間の対応関係を照らし合わせることで各標準物質において特徴的と考えられるピークの同定を行った。実測スペクトルに対するアノテーションを比較して、機関間において同定の程度にばらつきがあることを確認した。とりわけ糖はアノテーションの方針によりばらつきが大きくなる。また一部の機関しか同定していない物質もある。これらと標準スペクトルを詳細に比較検討することで全体的な同定率の向上を促すだけでなく、機関間の連携やデータ共有も促進できる。最後にスペクトルを閲覧するためのソフトウェア開発をおこなった。別研究費で開発するMassBankシステムのフォーマットと世界標準ともいえるNISTデータベースのフォーマットは異なっている。しかし実用上はどちらも重要なため、両者を自由に閲覧・比較できるソフトウェアを開発しており、平成24年度に公開予定である。研究協力関係にある機関(ドイツMPI-MP,スウェーデンUmea Univ)から提供された基礎代謝物のGC-MSスペクトル、およびMassBank上に登録されたGC-MSスペクトル(理研CSRS,大阪大学など)を総当りで比較し、研究機関毎のスペクトル処理方法の違いやバイアスを精査した。また同一代謝物におけるスペクトルどうしを比較し、スペクトルの類似性を判断する基準値の設定を進めた。この情報を元に、昨年度作成した統合スペクトルを評価し、最終的にはGC-MSの理論スペクトル構築を目指している。またこの情報とはイオン化法が異なるESIスペクトルとも比較をおこない、共通するピーク情報の抽出をおこなった。この情報はまだ論文にしていないが、26年度中には国際共著論文として報告する予定である。また、スペクトルからの代謝物同定作業を迅速に進めるためのソフトウェア開発をおこなった。とりわけMultiple reaction monitoring (MRM)法における代謝物同定の指標(昨年度実績を参照)を用いて、脂質の同定作業を効率化する手法をプログラム化している。グリセロリン脂質は多くの場合に標品がなく、精密質量だけからは同定できない。そこでMS/MS情報を考慮した同定ソフトウェアを作成した。極性頭部の違いによる大局的な溶出時間の設定と脂肪酸鎖長による溶出時間の遅れを組み合わせた理論溶出時間をもとに構造を絞りこみ、MS/MS情報から候補を選び出すソフトウェアを無償提供することができた。マススペクトル重ね合わせアルゴリズムに基づいて、GC-MSの半実験ー半理論的スペクトルライブラリ(計測結果に基づくスペクトルを理論的に補正したライブラリ)を構築した。このライブラリと世界標準となっているNISTライブラリを比較し、両者の間に見られる違いを検証している。作成した重ねあわせアルゴリズムが、有効なスペクトル情報を抽出できているか、スペクトルの検索実験を通して検証中である。MassBank、PRIMe、KNApSAcK等、代表的なメタボロームデータベースにおける代謝物のIDをInChIコードやCAS番号といったIDを手がかりに物質毎にスペクトルをとりまとめた。これらのデータを用いて、統合マススペクトルデータのwikiサイトを構築中である。LC-ESI-MSの重ねあわせアルゴリズムに先立ち、クロマトピーク評価手法を設計した。特にMultiple reaction monitoring (MRM)法におけるクロマト情報の統計的評価として溶出時間とピークの高さに加え、ピーク形状およびトランジションにおける高さ比などを考慮した指標を作成し、MRM法において効率よく代謝物を同定できることを示した。申請書には各物質について重ねあわせたスペクトルライブラリを世界標準となっているNISTと比較し、違いを明らかにするとある。単純比較は簡単だが、その比較から有用な結果を導き出すところまで研究は進展しておらず、やや遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。予定ではESI-MSnデータにおける重ね合わせアルゴリズムを開発する予定であったが、実現できなかった。できる限り早くNISTライブラリとの比較をおこない、データを一般公開したい。ESI用の重ね合わせアルゴリズムを開発する。
ミュウタントアレレ特異的プローブによるXb+型慢性肉芽腫症の家系調査

Gp91-phox遺伝子に変異を認めたチトクロームb_<558>陽性の慢性肉芽腫症の遺伝子診断および遺伝子診断に基づく家系調査を行い得た。遺伝子診断は、遺伝子解析の結果判明したx染色体上のgp91-phoxの変異部位を含んだmutant allele specific oligonucleotide probe (ASO)を用いて試みた。変異部位を含む約100base pairの部分をgenomic DNAから増幅し、Northern blotを行い、biotinでラベルしたASOをhibridizeさせた後、化学発光法によりバンドの検出を行なった。その結果、正常遺伝子と異常遺伝子を明確に区別することができた。このprimer setとprobeを用いて患者、患者の妹、母親、母方の姉、母方の祖父、祖母についてのDNA診断を行った。その結果、患者の妹、母親の姉、祖父は正常遺伝子のみを有しており、母親および祖母は、正常と異常の遺伝子を有していることが明らかとなった。異常遺伝子は母方祖母、母親そして患者に受け継がれていることが明らかとなった。この方法は、PCRにてgenomicから当該遺伝子を増幅するので少量のDNAがあれば可能である、従って少なくともこの家系に関しては羊水診断も可能である。
取締役の経営責任に関する研究-とくに企業買収における防衛手段を中心として-

「野村證券事件」・「ハザマ事件」等、企業の不祥事件が多発している状況をふまえ、本研究は取締役の経営責任について考察を加えた。まずは、アメリカ法で確立されている「経営判断の原則(Business Judgment Rule)」に手がかりを求め、次いで「野村證券事件」等を端緒として検討したのち、企業買収(M&A)のうちとくに第三者割当に絞って同原則のわが国への適用可否について考察した。アメリカ法上、経営判断の原則は司法審査排除機能および取締役の責任抑止機能を有するとされるが、Van Gorkom Case以後、取締役の裁量権が縮小される場合を認めることができ、また判例から同原則の適用基準を抽出できた。わが国でも「野村證券事件」をはじめ同原則を適用したかの判決例を散見でき、第三者割当の事例についてはアメリカ法の適用基準に照らして検討を加えた。その結果、以下の結論に達した。取締役の会社への誠実さだけで免責するのは問題であり、経営判断の原則により責任を軽減するには相当の努力と注意力をつくしたことが必要であり、無知・無経験であっても免責されるというのは認められない。結局、アメリカ法と同様な司法審査排除機能をわが国でも認めるというのは難しく、同原則の意義を認めるとしても取締役の責任抑止機能にとどまるものである。すなわち、善管注意義務について裁判所が判断する際に、不注意すなわち過失の認定につき同原則が適用され善管注意義務が斟酌されるということになる。なお、株主代表訴訟の増加が予測されるなか、取締役の損害賠償責任の負担軽減および損害賠償の確実化の観点から、今後は取締役の責任保険制度の研究が重要となるといえる。
エビジェノタイピングによる予防医学/個別化医療の実践に関する研究

本研究では、種々の病態において、ジェネティックな遺伝子多型/変異だけでなくエピジェネティックな変化を、病変部位だけでなく血球細胞からとらえ、その変化の程度と、疾患/病態の客観的な進行度の指標としての検診などの臨床検査データを比較検討することを企画した。本研究では、癌を第一に研究を進めた。Synuclein γ(SNCG)遺伝子は、細胞株での検討から、メチル化によって発現が沈黙し低メチル化によってSNCG遺伝子の発現が生じていた。白血病・消化器癌・脳腫瘍でも約半数で低メチル化とSNCG遺伝子の発現が認められた。健常人の全血から抽出したDNAではメチル化しており、発現は認められなかった。大腸癌および泌尿器系の癌におけるDNAメチル化について検討した。大腸癌はhMLH1,hMSH2のエピミューテーションが見つかっている代表的な癌であり、癌細胞におけるマイクロサテライト不安定性とそれらミスマッチ修復遺伝子のメチル化について検討したが、エピミューテーションは見いだせなかった。泌尿器系の癌について、LDHA, LDHB, CKB, CKM, SNCG, MAD2, NPTX2, SARP2, p16, GSTP1, BNIP3遺伝子プロモーター領域のメチル化、およびmRNA発現量を解析した。SARP2遺伝子の発現は、正常組織で強く腫瘍組織では発現消失する傾向が認められ、14例中12症例でメチル化バンドが認められ、また正常組織にも7例で腫瘍組織よりも少ないながらもメチル化バンドが認められたが、尿中の有形成分、血球細胞におけるDNAメチル化(エピミューテーション)は見いだされなかった。BNIP3遺伝子は、6症例でメチル化が認められ、メチル化している組織ではBNIP3発現が低下している傾向が認められた。ただ、2例については、対照とした正常組織にもメチル化が認められ、また部分的なメチル化が疑われた症例もPCR産物をクローニングして複数クローンの塩基配列を決定した結果、正常組織よりも腫瘍組織でメチル化の程度が強くなっていることが判明した。エピジェノタイプは組織特異的かつ時期特異的に遺伝子発現を制御する。しかしながら、その制御機構は一律ではなく、症例によって異なることが示唆された。腫瘍組織におけるDNAメチル化について、血液悪性腫瘍と固形癌を比較しながら検討した。Synuclein γ(SNCG)遺伝子は、細胞株での検討から、メチル化によって発現が沈黙し、低メチル化によってSNCG遺伝子の発現が生じていた。しかし、メチル化されていても発現している細胞もあった。従って、全血を試料とすれば、低メチル化が異常細胞の存在を示す可能性がある。JAK2遺伝子のF617Vミスセンス変異が、近年ヒト骨髄増殖性疾患において報告されてきたが、メチル化状態の報告はない。そこで、白血病および固形癌の細胞株でJAK2プロモーターのメチル化と遺伝子発現について検討した。その結果、DaudiではJAK2遺伝子プロモーター領域とexon1inton1内CpGアイランドのいずれもメチル化していた。この細胞株では遺伝子発現が低く、プロモーター領域のメチル化が発現抑制に関与していると考えられた。

RUNX1/AML1遺伝子は、造血系細胞の発生・分化に必須の転写因子であり、exon2の上流のプロモーター領域に巨大なCpGアイランドを有している。さらにexon1とexon2に転写開始部位があり、多様なsplicing variantを発現する。RUNX1遺伝子のCpGアイランドのメチル化状態とsplicing variantの発現について調べた。AML 1aはほとんどの細胞株で発現がほとんどなかった。AML 1cは、固形癌細胞株のMKN1、KATO IIIおよびCaki-1で高発現していたが、その他ではほとんどなかった。固形癌細胞株では白血病細胞株と部位によって異なるメチル化パターンを示した。以上の結果をふまえ、末梢血液中におけるDNAメチル化もしくは低メチル化を指標とした検索を進めている。大腸癌および泌尿器系の癌におけるDNAメチル化について、sodium bisulfite処理後のmethylation specific PCRおよびPCR-SSCPによって検討した。また、該当遺伝子のmRNA発現量をRT-PCRを用いて解析した。患者の同意を得て、癌組織だけでなく、血液、尿を試料として集めた。大腸癌はhMLH1,hMSH2のエピミューテーションが見つかっている代表的な癌であり、癌細胞におけるマイクロサテライト不安定性とそれらミスマッチ修復遺伝子のメチル化について検討した。37例の大腸癌を調べた結果、2例のみがメチル化であったため、血球細胞の同じ遺伝子のメチル化を調べたが非メチル化であった。すなわち、エピミューテーションは見いだせなかった。同じ症例でK-rasとBRAFの高頻度に生ずるとされる遺伝子変異を調べたところ、特に関連して意義が高いと考えられた症例はなかった。泌尿器系の癌45例について、LDHA, LDHB, CKB, CKM, SNCG, MAD2,NPTX2,SARP2,p16,GSTP1遺伝子プロモーター領域のメチル化について検討した。合わせて、同じ遺伝子のmRNA発現量を解析した。メチル化していた症例でmRNA発現量が低下し、癌化との関連性が疑われた症例について、その遺伝子のメチル化を尿中の有形成分から抽出したDNAを試料として調べた。また、血球細胞におけるDNAメチル化(エピミューテーション)についても併せて検討した。その結果、まだエピミューテーションは見いだされていない。尿中DNAと血球細胞におけるDNAメチル化についてはまだ十分解析が進んでいないため、これから進めていく予定である。低酸素は種々の腫瘍において細胞のストレスの重要な要素である。低酸素下で発育する腫瘍細胞は化学療法や放射線療法に耐性になりやすく予後不良である。低酸素に陥ると,HIF-1などの遺伝子が誘導され,解糖系,血管新生,細胞生存に関わる遺伝子群の発現が亢進する。アポトーシスを抑える遺伝子発現も亢進することが多くBNIP3もそのような遺伝子の一つである。
メタル触媒を活用する新規多環性ヌクレオシド及びそのオリゴライブラリーの創成

本研究では有機金属触媒を用いて、従来合成できなかった新規多環性ヌクレオシドの合成とそのオリゴライブラリーの創成を目的としている。その修飾したヌクレオシドの抗癌性、抗ウイルス性、抗マラリア性などの生理活性、または機能性も期待される。具体的5-ヨードデオキシチジン(5-I-dC)や5-ヨードデオキシウリジミン(5-I-dU)などを原料として、Sonogashira反応によってこれらのフェニルアセチレン誘導体を効率よく合成できた。得られたヌクレオシドのアセチレン誘導体を一酸化炭素の雰囲気下ロジウムカルボニル触媒によるカルボニル化反応を行った。一酸化炭素の圧、反応溶媒、反応温度などを検討した。反応したものの、選択性が悪い。触媒をルテニウムカルボニルや鉄カルボニルを変えて、また、種々なアミン添加剤を入れて、触媒の活性を調べた。その結果、修飾ヌクレオシドの環化カルボニル化反応は普通のフェニルアセチレン誘導体の環化カルボニル化反応と異なり、ヌクレオシドの水酸基やヌクレオシドの塩基も反応に障害したことが分かった。水酸基の場合には保護基で保護すれば、解決できたが、ヌクレオシド塩基の障害が避けられなかった。目的物が確認されたにもかかわらず単離できなかった。今後、これまでの経験を生かして、修飾ヌクレオシドの種類を変えて、天然のグアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシンの代わりにフェニルアセチレンを五員環糖と直接結合し、天然ヌクレオシド塩基の障害を防ぎ、より選択的、効率的環化カルボニル化生成物が得られると期待している。また、機能性DNAを合成の一環として、遷移金属イオンと修飾ヌクレオシドの反応も検討した。ビピリジンで修飾したウリジンの合成に成功し、さらに合成した修飾DNAを銅イオンと反応させて、銅イオン一つが取り込まれたことを見いだした。この成果を第88日本化学春年会で発表した。本年度主として修飾ヌクレオシドの合成とその環化カルボニル化反応の開発とその最適反応条件の確立を検討した。まず5-ヨードデオキシチジン(5-I-dC)や5-ヨードデオキシウリジミン(5-I-dU)などを原料として、糖の水酸基を保護し、そしてSonogashira反応によってフェニルアセチレン誘導体が効率よく合成し、NMR、ESIMSなど種々なスペクトルから生成物を同定した。続き、得られたフェニルアセチレン誘導体をロジウムカルボニル触媒の存在下、カルボニル化反応を行った。一酸化炭素の圧は70気圧にし、いろいろな温度下で反応を行った。5-ヨードデオキシウリジミン(5-I-dU)はほとんど反応進行しなかった。これはウリジミン4位のカルボニル基(ケトン)がエノールになりにくいことを示唆している。この対策としてアセチレンのフェニル基側に水酸基を導入し、検討する。また、5-ヨードデオキシチジン(5-I-dC)は100度以下では反応しないものの、150度の反応条件では反応進行した。原料はほぼ完全に反応し、目的のものがMSで検出されたが、生成物が多く、単離が困難である.選択性をあげるために、溶媒効果、触媒種類を広い面で検討する必要である。また、置換基の位置も選択性に影響すると考え、フェニルにある置換基の位置や、使うアミンの種類を変更し、良い收率を目指している。また、これらの反応と同時に生成物同定の一つ手段として、DNAの再結晶も検討している。

予備な実験であるが、ミスマチDNAやミスマチDNAと小さい有機分子の共結晶も試みた。現在幾つの結晶ができた。今年度は昨年度の引き続き修飾ヌクレオシドの環化カルボニル化反応の最適反応条件の確立を検討した。用いられる触媒はロジウムカルボニルやルテニウムカルボニルまた鉄のカルボニル化合物である。また、反応系は水、テトラヒドロフランと水の混合溶液、アミンとテトラヒドロフランやアミン系溶媒だどを用いて研究を行った。その結果、修飾ヌクレオシドの環化カルボニル化反応は普通のフェニルアセチレンの環化カルボニル化反応と異なる、ヌクレオシドの水酸基が反応を障害することが明らかにした。また、当初の予想と異なるヌクレオシドの塩基部分も触媒に配位し、触媒の活性が減少する。そのため、反応溶媒をトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルメチルアミンなどを変えて見た。反応が進行したものの、目的化合物が単離できなかった。つまりカルボニル化反応が進行するために、遷移金属触媒が修飾ヌクレオシドのアセチレン部位に配位しないといけないなのに、ヌクネオシドの塩基と配位したことが分かった。今後、これまでの経験を生かして、修飾ヌクネオシドの種類を変えて、天然のグアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシンの代わりにフェニルアセチレンが直接に五員環糖と結合し、天然ヌクレオシド塩基の障害を防ぐ、より選択的、効率的に環化カルボニル化生成物が得られると期待している。また、これらの研究の一環として、遷移金属イオンと修飾ヌクレオシドの反応も検討した。ビピリジンで修飾したウリジンの合成に成功し、さらにDNA合成機で修飾DNAを合成した、合成したDNAに銅イオンを入れて、銅に配位したビピリジンDNAを見いだした。この成果を今度の日本化学春季年会で発表予定である。
独立型社会福祉士におけるビジネスモデルに関する実証的研究

独立型社会福祉士の実践モデルとして、地域課題を事業の機会と捉えビジネスとして継続的に事業を展開するビジネスモデルの存在が明らかとなった。しかし、(1)制度外の相談援助で対価根拠が不明確(2)対価発生方法の未確立(3)世代間における対価認識のズレ(4)事業拡大が制限(5)孤立化などの課題を抱えていた。倫理的実践を担保した実践に向けて(1)事業のハイブリッド化(2)ライフステージに応じたサポートシステム(3)相互批判的ネットワークの整備の検討の必要性が示唆された。平成24年度は、前年度の調査結果からビジネスモデルに分類された独立型社会福祉士15名を対象に、1ビジネスモデルを選択する要因とそのリスクを明らかにする、2非倫理的実践を予防するシステムを備えたビジネスモデルの構築を行う、を目的にインタビュー調査を行った。インタビューは半構造化面接を用い、1独立過程におけるジレンマ経験、2現在の実践内容と課題、3実践する上で意識していること、4今後の展望などを中心に聞き取りを行った。インタビューは、1回1時間半から2時間実施し、2012年3月から2013年3月の期間に実施した。すべてのインタビュー・データはICレコーダーで録音した。録音したデータはすべて逐語録に起こし、それを基に時系列に沿って活動および課題を整理した。また、作業効率を高めるために質的データ分析ソフトMaxqda2010を使用し、分析は1行ずつ読みまとまりごとにコード化を行い、概念の生成および定義づけを行った。そして、分析ワークシートに概念名、定義、コードとデータの一部、解釈を記載し、概念のまとまりをカテゴリーおよびサブカテゴリーとして形成し、概念やカテゴリーの関連性を全体関連図に書きだした。調査の結果、ビジネスモデルを選択する要因として、1収益確保の見通し、2仕事のイメージ、3仲間の獲得、4モデルの発見、がみられた。またビジネスモデルのリスクとして、1営利重視による利用者不在、2リスクマネジメントの未整備、3孤立化、がみられた。以上から、ビジネスモデルにおけるリスクへの対応として、非倫理的実践の予防に向けたシステム構築の必要性が示唆された。非倫理的実践を予防するシステムの構築に向けて、1ライフステージによる事業の住み分けとサポート体制の整備、2事業継続性の担保に向けた事業の多角化とハイブリッド化、が今後の検討課題として抽出された。平成23年度は、独立型社会福祉士の実態を把握から活動課題および倫理的課題の整理を目的にアンケート調査を行った。調査対象は、「独立型社会福祉士養成研修」を修了し日本社会福祉士会会員名簿にて所属先種別コードが独立型社会福祉士に該当する全独立型社会福祉士693名とした。回収された有効回答は、267(38.5%)であった。アンケートの質問項目は、(1)活動開始年および独立理由、(2)事業属性、(3)経済的基盤の確保方法、(5)活動の課題と対応、(6)非倫理的実践と対応、(7)今後のサポートとした。調査方法は、無記名自記式質問調査を用いた。調査の結果、年齢は50歳代、60歳代が多く、一定程度の経験を積んだ状態で独立を選択していることが伺えた。また、取得資格については社会福祉士以外に複数の資格を取得しており多様な資格を背景に事業が行われていた。独立理由は、「自由裁量性を発揮するため」が最も多かった。その中でも、「定年退職後に地域貢献を行うため」も一定数おり、独立理由が多様である状況が伺えた。認識されている課題については、「代わりがいない」ことが認識されており、一人で活動することの多様なリスクを感じていることが伺えた。これらの課題の対応については、主に「ネットワークの構築」や「研修会への参加」が行われていたが、「未対応」も多くみられた。また、倫理的葛藤については、「クライエントの意思確認の難しい場合」や「資産が十分でないクライエントから報酬を要求する場合」に葛藤を感じていた。倫理的葛藤への対応については、「日本および都道府県社会福祉士会の研修会や学習会へ参加している」が最も多く、次いで「社会福祉士会以外が開催する研修などへ参加している」が多かった。その他には、「要求に応じて開示できる記録がある」などがみられた。平成23年度は、独立型社会福祉士のビジネスモデル構築に向けて、アンケート調査から実態把握と課題の整理を行うことを予定していたが、アンケートの依頼に時間を要し実施時期が遅れたがおおむね計画通りに実施することができた。回収率も予定をしていた40%には届かなかったが約38%であったことから予定とするデータを集めることができた。

アンケート調査からは、(1)世代間によって対価に対する認識にズレが見られること、(2)対価を発生させる課題として相談援助の根拠を明確にできていないこと、(3)個人事務所の形態が多い中で業務を引き継げる者がいないこと、(4)資産が十分でないクライエントへの対応が多い中で対価を発生させる方法が見つけられていないこと、(5)多様な課題を認識しているが具体的なサポートシステムが整備されていないこと、といった課題を抽出することができた。これらの課題から、独立型社会福祉士が倫理的実践を担保した実践を展開するためには、(1)職能団体を中心としたスーパービジョン等の評価システムの構築、(2)ソーシャルワーク実践の可視化および言語化、(3)成年後見制度や介護保険制度などを活用した事業における報酬の安定化に向けた制度変革、について今後対応が必要であることが伺えた。これら平成23年度の成果をもとに、平成24年度は訪問調査によるインタビューデータの収集および分析から、これらの課題について具体的な対応を検討するとともに、倫理的実践を担保するビジネスモデルの構築とその環境整備について次年度取り組む予定である。平成24年度には、平成23年度のアンケート調査の中からソーシャルワーク実践と収益確保のバランスに問題意識を持つ独立型社会福祉士でアンケートにおいてインタビュー調査を承諾した独立型社会福祉士約20名を抽出し質的調査を行う。このインタビューからビジネスモデルを選択する要因とそのリスクを明らかにし、非倫理的実践を予防するシステムを備えたビジネスモデルの構築を行う。調査方法は、実践地域を訪問し半構造化面接を用いてインタビューを行う。手続きとして、事前に調査目的およびインタビュー内容を提示するとともに、インタビュー対象者の権利や保護等を伝える。またこれらの内容は、インタビュー開始前に再度確認し、インタビュー参加への同意として署名と日付を記入した承諾書を2部作成し、1部を対象者へもう1部を調査者が保管する。インタビューの内容は、(1)活動理念、(2)実践形態の選択理由、(3)経済的基盤の確保方法、(4)ソーシャルワーク理念と経営のバランス、(5)非倫理的実践の予防、(6)制度外の新たなニーズへの対応、とする。インタビューは1回約3時間とし、インタビューはすべてICレコーダーで録音する。分析方法は、録音したデータをすべて文字に起こし、専門職を対象とした実践への活用が容易であるという利点をもつ修正版グラウンデッド・セオリーアプローチを基に分析を行う。調査の流れは、(1)4月10月:調査の実施、(2)9月10月:データの書き起こし、(3)10月12月:データの分析、(4)1月3月:研究の総括、とする。平成24年度は、主にインタビュー調査を行うための各地域への訪問に要する旅費および研究成果の報告を学会や研究会で行う旅費で使用する。1)旅費:訪問調査に係る旅費として約30万円を使用予定である。訪問地域、訪問時期および調査人数は、青森県(8月・4名)、埼玉県(9月・4名)、東京都(7月・5名)、大阪府(10月・4名)、広島県(11月・3名)の6ヶ所20名へのインタビュー調査を予定している。2)旅費:研究成果の口頭発表および報告に係る会場までの旅費として約30万円を使用予定である。主な学会及び研究会は、(1)第20回日本社会福祉士会全国大会(岡山県)、(2)第9回独立型社会福祉士全国実践研究集会(東京都)、(3)日本社会福祉学会第60回大会秋季大会(兵庫県)、
アメロジェニンの炎症制御機序の解明ーマクロファージM2極性化の観点から

エナメル基質タンパク質(enamel matrix derivative: EMD)は歯周組織再生治療において良好な臨床成績が報告されている。申請者らはこれまで、EMDの主成分であるアメロジェニンが組織治癒を促進するM2マクロファージの分化を誘導することで炎症反応の収束に関与すること、また単球へのアメロジェニン刺激における遺伝子発現変動をマイクロアレイで解析した結果、抗原提示関連遺伝子の発現が減少することを報告した。しかしながら、アメロジェニンの自然免疫制御機構に関しては未だに不明な点が多い。本研究では、歯周組織再生に果たすアメロジェニンの免疫細胞を起点とした炎症制御に着目し、アメロジェニンがマクロファージ本来の重要な機能である抗原提示能へ及ぼす影響及びその作用メカニズムを解明することを目的とした。本年度は、アメロジェニン前処理刺激がMHC IIの細胞表面発現およびmRNA発現を抑制しすることを明らかにした。また、その作用機序の解明として、まずアメロジェニン前処理刺激がIFNγ受容体下流のシグナル伝達経路へ及ぼす影響を、ウエスタンブロッティング法を用いて行った。その結果、アメロジェニン前処理刺激はIFNγ刺激後のJAK/STAT経路におけるJAKおよびSTATのリン酸化活性やIFN制御因子であるIRF-1の活性化に影響を与えなかった。しかしながら、MHCII分子の転写活性化因子であるMHC IIトランス活性化因子(CIITA)のmRNA発現およびタンパク質発現はアメロジェニン前処理刺激によって抑制された。つまり、アメロジェニン前処理刺激がCIITAの発現を制御することで、結果としてMHCIIの細胞表面発現が抑制される可能性が示唆された。当初予定していたアメロジェニンの抗原提示能への影響についての解析が前進したと考え、上記の区分と判断した。以下の研究を推進する予定である。1、MHCII分子の転写活性化因子であるCIITAの発現抑制メカニズムの一つとしてヒストン修飾によるクロマチン構造変換に焦点を当てクロマチン免疫沈降法を行う。2、アメロジェニン刺激によるMHCII発現抑制がT細胞活性へ及ぼす影響を確認する。(理由)計画していた実験が難航し、当初予定していた試薬等の購入を保留しているため。(使用計画)引き続き、実験は継続して行っているため、次年度に必要な試薬等を購入する予定としている。
iPS由来間葉系幹細胞を用いた口唇口蓋裂治療の基礎的研究

iPS細胞からiPSMSLCの樹立は、シャーレのコーティングに利用する細胞外マトリックスを従来のビトロネクチンからマトリゲルに変更することでフィーダーフリー化に成功した。細胞播種密度、培養液組成、細胞外マトリックス等をアレンジすることでiPS細胞からiPSMSLCの作製効率が高くなる。現在、理化学研究所等で提供されるプラスミドベクターを用いて樹立された歯髄や皮膚由来のインテグレーションフリーのiPS細胞株からもiPSMSLCの作製が可能である。iPS細胞の特徴である無限に細胞が増殖する利点を受け継ぎ、安全で全く新しい再生医療用のインテグレーションフリーの幹細胞を用いて骨増生を行う。申請者らはすでに、口腔軟組織由来、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からMSC様細胞(MSLC)を樹立し、さらにMSLCを骨芽細胞様細胞へと分化させることに成功した。本申請では、将来的な唇顎口蓋裂などの骨欠損治療への応用を目指し、MSLC由来の骨芽細胞(MSLCOB)をラット顎裂モデルに移植し、MSLCOBの骨系性能を評価する。また、足場材料としてゼラチンスポンジを使用し、作製したMSLCOBの安全性をゲノム異常と造腫瘍性とを調査することで明らかにし、顎顔面領域再生のための臨床応用の可能性を探索することが目的である。歯肉由来iPS細胞を10% FBSを含むDMEM low glucoseに10 ng/mL bFGFで2週間培養し、継代を行い、ゼラチンコートシャーレに移しHGiPSMSLCの作製を行った。HGiPSMSLCの作製効率をフローサイトメトリー解析によって行った。安全性試験として未分化マーカーLin-28の発現を調べた。HGiPSMSLCをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%FBS、10 ng/mL線維芽細胞増殖因子を含む培地で培養後、DMEMに10%FBSと骨芽細胞分化因子(50 μMアスコルビン酸-2-リン酸、10 mM β-グリセロリン酸、100 nMデキサメタゾン、100 ng/mL BMP-2)を含む培地に交換し、骨芽細胞様細胞への分化誘導を行った。また、ヒトI型コラーゲンα1鎖から、細胞接着性の高いRGD配列を含む部位を4パターンのフラグメントに切り出し、連結させたものをさらに3つ連結した構造で、抗原部位を含まずに高い接着性を維持した多孔質粒子足場材料(Cellnest)が開発された。それらと幹細胞を組合わせてオルガノイドの作製に成功した。iPS細胞からMSLCを樹立し、さらにMSLCを骨芽細胞様細胞へと効率的に分化させることに成功したから。8週齢F344ラット雄に先天性顎裂モデルを作製する。下顎の下縁を覆って皮膚に切開を施す。多孔質複合体にiPSMSLCOBを播種し、下顎の中央の空間に埋入を行う。埋入手術終了後、顎骨部を摘出しマイクロCT、組織学的評価を用いて新生骨組織評価を行う。

それらと幹細胞を組合わせてオルガノイドの作製に成功した。iPS細胞からMSLCを樹立し、さらにMSLCを骨芽細胞様細胞へと効率的に分化させることに成功したから。8週齢F344ラット雄に先天性顎裂モデルを作製する。下顎の下縁を覆って皮膚に切開を施す。多孔質複合体にiPSMSLCOBを播種し、下顎の中央の空間に埋入を行う。埋入手術終了後、顎骨部を摘出しマイクロCT、組織学的評価を用いて新生骨組織評価を行う。
小胞体ストレス応答性膜蛋白質Herpの機能および翻訳調節機構の解析

近年私達は、小胞体ストレスで強く発現誘導される機能未知の小胞体膜蛋白質Herpを発見した。小胞体ストレスとは、小胞体内腔に構造不全蛋白質が過剰に蓄積した状態を指す。本研究では、Herpの機能解明、および小胞体ストレス時の翻訳調節機構の解明をめざした。【Herpの機能解明】小胞体ストレス時に誘導される蛋白質の多くが小胞体内腔の蛋白質に対する分子シャペロンであるのに対し、Herpは、その局在様式から、シャペロンである可能性が低い。しかし、本研究において、Herpはプレセニリンのγセクレターゼ活性を促進することを見出した。プレセニリンの成熟を促進する能力をもつのかもしれない。さらに、Herp遺伝子欠失マウスを作成し、Herpが生存不可欠でないことを明らかにした。【小胞体ストレス応答性蛋白質の探索】小胞体ストレスによって転写レベルで発現誘導される遺伝子は、数多く知られている。しかし、小胞体ストレス時には翻訳反応が全般的に強く抑制されるため、誘導された多くの遺伝子も、蛋白質レベルでは即座に増量しない。一方、転写因子ATF4は翻訳レベルで発現促進される唯一の例外として知られている。本研究では、小胞体ストレス時に翻訳促進される蛋白質の包括的探索を試みた。細胞から抽出したRNAを比重差で分画し、DNAマイクロアレイで解析したところ、ATF4以外にも3種の蛋白質が翻訳促進される可能性が示された。今後、これらを材料にして、翻訳促進機構の解明に結びつけたい。小胞体内腔に構造不全蛋白質が蓄積し、過剰な負荷が課せられた状態を小胞体ストレスと呼ぶ。このとき細胞は、分子シャペロン量を増加させると同時に、蛋白質全般の翻訳量を抑制し、さらなる負荷を防ぐ。私達は、小胞体ストレスで転写誘導される機能未知蛋白質Herpを発見した。蛋白質レベルにおいてもHerpの誘導量は著しく、上述の翻訳抑制と一見矛盾する。現在、ストレス蛋白質の合成がストレス時の翻訳抑制機構から逃れる仕組みは不明である。そこで本研究は、Herpの機能解明および翻訳抑制回避機構の解明を目的としている。本年度は以下の成果を得た。【Herp mRNAに存在するIRESの同定とその役割の評価】小胞体ストレス時にHerpなどのストレス蛋白質が効率良く翻訳されるのは、キャップ構造非依存的翻訳開始反応、すなわちmRNAの5'非翻訳領域に存在するIRESに依存する可能性がある。そこで、Herpの5'非翻訳領域を詳細に調べた結果、強いIRES活性を示す短い塩基配列を同定した。しかし、このIRES依存性翻訳が小胞体ストレス時に特異的に機能する現象は見られなかった。したがって、ストレス時の翻訳抑制回避には未知の機構が潜む可能性が高い。【Herp発現に伴う細胞機能の変化】Herp過剰発現によって、プレセニリンによるアミロイド蛋白質生成が促進されることを見出した。すなわち、Herpが神経細胞死に関わる可能性、あるいは膜蛋白質の成熟を促進する可能性が示された。現在、小胞体における蛋白質の品質管理機構に対するHerpの役割を検討中である。【Herpノックアウトマウスの作成】ターゲティングベクターと相同組み換えしたES細胞の複数クローンを単離した。このうち2種を用いてキメラマウス2系統を作成し、さらにヘテロマウスの作成に成功した。次年度には、以上の成果をさらに発展させ、本研究の目的達成を目指す。
エンドトキシンショックにおける腎障害の発現における一酸化窒素の役割に関する研究

エンドトキシンショック時の腎障害の発生におけるnitric oxide(NO)の役割について検討した。【結果】LPS静注後約1時間後より血圧の低下と心拍数の増加が観察され、約6時間でratは致死状態となった。血圧低下が見られない早期より尿量、尿中電解質(Na,K)排泄量およびクレアチニンクリアランスの低下と尿中nitrite/nitrate排泄量の増加が見られた。この時期、腎皮質血流量は有意に減少し、一方髄質血流量は有意に増加した。これと相関してNO濃度は髄質で有意の増加が観察された。この傾向はLPS静注後約4時間後まで認められた。その後はさらなる血圧の低下とともに腎機能は悪化し、尿中nitrite/nitrate排泄量と腎組織内NO濃度、組織血流量はいずれも減少した。NO合成阻害剤(N^ω-monomethyl L-arginine)および我々が見いだしたNO消去剤(imidazolineoxyl N-oxide;carboxy-PTIO)の投与はいずれも上記のparametersの変化を有意に抑制し、腎機能は温存されratはショック状態より回復した。【結論】以上の結果はエンドトキシンショック時の腎障害の発生初期には腎内、特に髄質でのNO産生増加および腎内組織血流量分布の変化が見られ、これらが腎障害の発生に関与している可能性が示唆された。またNO合成阻害剤やNO消去剤は血圧の低下を抑制しショック状態を改善するばかりではなく、腎機能保護作用も有することが明かとなった。
天然林の樹齢構成とその空間分布の解析

本研究は東京大学北海道演習林の天然林の林分構造とその成長過程を分析したものである。更にこの結果に基づいて同演習林の天然林施業を発展させるために、新しい天然林施業体系を構築することを終局的目的とした。このために同演習林内のトドマツ主体の針広混交林に三ケ所の調査地を設定し毎木調査を行い、樹木位置図を作成した。また直径階別に合計70本の林木を伐倒して樹幹解析を行い、林木の配置と単木ごとの成長との関係について分析した。同時に、本調査では林木の生長解析に本演習林の106ケ所の固定試験地の資料も利用した。一般に天然林では、林木はその初期において上木から被圧の影響を受けながら生長してゆく。ギャップなどの発生により生育環境が課員されると成長増大の時期を迎え、林木は急速に成長を続け上木層に達する。この過程には林木相互の位置関係により多様な変化が認められる。被圧期間が余り長期間続いた林木では生育環境が改善されてもその効果を充分に利用できず上木層に到達できないものある。また、一般に長い被圧に耐えることはできない。しかし成長増大期にはその成長は針葉樹に比較して一般に早い。直径と樹高では成長増大期における成長に微妙な差があり一般的には樹高成長の方がより鋭敏に環境に反応することが分かった。天然林の直径分布は人工林の場合と比較して複雑な形が認められる。林木の成長経過および固定試験地の時系列資料を分析することによって、直径分布の形の形成には直径階ごとの成長速度が大きな影響を与えることがわかった。以上の分析結果と本演習林の森林施業実績記録を利用して、林型ごとの直径遷移確率計算の新方法を考えた。これらの成果に基づき天然林施業いをより集約かつ能率よく実施できる天然林施業のための意志決定支援システムを作成した。1.現地調査東京大学北海道演習林管内の50班a小班にある固定試験地5137の隣接地,および24林班b小班の固定試験地5206において毎木調査を実施し,それぞれ26本, 27本計53本の標本木を伐倒した.また,固定試験地5206では樹木位置図作成のための測定も行った.2.調査の整理と解析樹幹解析資料の年輪測定は現在までにその過半を完了し,樹高,胸高直径,幹材積に関してそれらの成長過程解析している.3.解析の結果樹幹解析の結果明らかになった事実は以下の通りである.(1)ほとんどの林木が幼齢,壮齢時に被圧期を経験している.(2)壮齢時に長い被期を経験した場合,その林木は後に良好な環境条件が与えられたとしても上層木となることはできない.(3)中下層にある林木は,上層にトドマツやエゾマツがある場合つよい被圧をうける.しかし,上層木がナラのような広葉樹の場合には被圧の影響は弱い.4.結論林木はいかにして陽光を受けるのに有利な空間を占めるかで林木相互の間で厳しく競争している.これは天然林,人工林のいずれでも変りない.しかし天然林の場合,現在中層を占めている林木のうち次代に上層を構成するものが何かということが森林施業上重大な問題となる.中層木に比べて上層木の本数が少ないからである.上層があいた場合次にその空間を利用できるものは過去に長い被圧期をもたずかつその空間を利用できる位置を占めている林木に限られる.

こうした競争過程を経て形成される林分構造の特徴はその直径分布に現われている.更新のよい林分で,もし適切な施業をうけていない場合,その直径分布は全体に右下りの曲線を画くが,中径木あたりによどみが生じ曲線が脹らむ.天然林施業とはこうしたよどみをなくすことで,その手段は林木の空間配置を調整することである.この問題が本研究の次年度の課題である.1.東京大学演習林固定試験地5137と5138との中間に位置する場所に第3調査区を設定し、その樹木位置図を作成し、森林調査を行い、樹幹解析木を採取した。2.前年度ならびに本年度調査結果、および107ケ所の固定試験地時系列資料を分布し、林木の配置と成長との関係、林木の直径成長と樹高成長との周囲の環境に対する反応の相違を調べた。3.上記解析の結果に基づき、林分の直径分布を適切に予測できる直径遷移確率の計算方式を決定した。4.天然林の直径分布の多様な形がどのようにして決定されるかについて、林分遷移モデルを作成して検討した。その結果、直径階ごとの成長速度とその分散の相違によりさまざまな分布の形が形成されることを証明した。5.上記成果と東京大学北海道演習林でこれまで行ってきた天然林施業の実践記録を利用して、当演習林における今後の天然林施業方式について検討した。その結果に基づいて天然林施業をより集約に、かつ能率よく実施することを可能にするパーソナルコンピュータを利用した天然林施業のための意志決定支援システムを作成した。
細菌のアルカリ条件下における新規細胞分裂維持機構の解明

我々は、機能未知であったDedDが大腸菌のアルカリ条件下での細胞分裂維持に必須であることを見出した。dedD破壊株のアルカリ条件下での分裂障害はSOS応答や核様体閉鎖に依存せず、また同条件下でFtsNの局在異常が認められた。一方、DedDと複数のdivisome蛋白質との相互作用も示しており、DedDがdivisome構造の安定化を通じてアルカリ条件での細胞分裂維持を担うことが強く示唆された。細菌のアルカリ耐性は、これまで細胞内pHやH+駆動力の維持機構を中心に議論されて来たが、他の観点からのアプローチは少なかった。一方で、我々は独自の検討により、大腸菌のアルカリ耐性にH+輸送とは無関係の蛋白質が複数関与することを見出している。その過程で、これまで機能不明であったDedDが、アルカリ条件下における細胞分裂の維持に必須の機構を担うことを示唆する知見を得た。本年度は、この未知の機構に関する手掛りを得るべく、dedD破壊株の表現型の詳細な解析を行った。dedD破壊株をpH 7.09.0の条件下で振盪培養し、経時的に観察した結果、同株の分裂異常がpH 7.5以上で生じること、かつpH依存的に憎悪することを見出した。加えて、pH 7.58.5における分裂異常は一過性であり、対数増殖期を過ぎると分裂が再開することも明らかとした。なお、pH 9.0では分裂の再開は認められなかった。また、dedD破壊株をDAPI染色後蛍光顕微鏡で観察した結果、分裂異常が生じた細胞においても核様体の分離に異常は認められなかった。以上の知見より、DedDの機能がアルカリの程度および増殖期により異なる可能性、および核様体の分離とは無関係である可能性が示唆された。さらに、上述の表現型はsulAもしくはslmAとdedDの二重破壊株でも観察されたことから、dedD破壊株の細胞分裂異常がSOS応答および核様体閉鎖とは別の機構によることが示唆された。上記と並行して、既知のdivisome関連蛋白質の局在におけるDedDの役割について、mCherry融合蛋白質(FtsZ-mCherryおよびmCherry-FtsN)を作成して検討を開始した。ただし、いずれの融合蛋白質も過剰発現によりdedD破壊株の表現型に影響を及ぼすことが示されたため、現在コンストラクトの再構築を含め、発現条件の検討を続けている。上述のFtsZおよびFtsNとmCherryとの融合蛋白質について発現条件の検討が遅れている一方で、平成28年度に予定していたdedDのdeletion cloneの解析に既に着手しており、全体として進捗状況に遅れは無いと判断している。また、DedDと相互作用するタンパク質の探索をBacterial Two Hybrid法(BACTH法)により行う準備も進めており、divisomeタンパク質の解析が頓挫した場合でも研究の遂行に影響が生じないよう配慮している。また昨年度までに、dedD破壊株の分裂異常がpH依存的に生じること、pH 7.58.5における分裂異常が一過性であること、さらにdedD破壊株の細胞分裂異常がSOS応答および核様体閉鎖とは別の機構によることを示す結果を得ている。今年度は、DedDによる細胞分裂維持の分子機構について手掛りを得るべく、DedD蛋白質がアルカリ条件下において既知のdivisome蛋白質の局在に影響を与えるかについて、昨年度に引き続き検討した。昨年度の課題であったFtsZおよびFtsNとmCherryとの融合タンパク質の発現条件の検討ののち、mCherry融合タンパク質のdedD破壊株における局在をpH 7および9で解析した結果、FtsZの局在にはいずれのpHにおいても影響がみられなかった一方で、FtsNの局在がアルカリ条件下でのみ異常となることを見出した。また、DedDタンパク質の機能に必須の領域を特定する目的で、C-末端の一定領域を欠くGFP融合deletion cloneを複数作成し、dedD破壊株に発現させてアルカリ条件下での表現型解析を行った。その結果、DedDの活性に必要な領域がペリプラズム領域のN末端側半分程度に含まれることを見出した。一方で、部分欠損タンパク質の局在解析を行った結果、いずれについてもseptumへの局在が認められなかったことから、septumへの局在がDedD蛋白質の活性に必須ではないことが示された。今年度の検討で、DedDがアルカリ条件下においてのみFtsNの局在に必須であることを見出し、dedD破壊株に見られた分裂異常がdivisomeの形成異常によるものであることを示すことが出来た。また、同条件でFtsZの局在に影響が見られなかったことから、DedDがassemblyに関与する因子について、FtsZよりも後、かつFtsNより前にdivisomeにassembleされる数種の蛋白質に絞り込むことが出来たため、続く相互作用の解析に予定通り進むことが出来ると考えている。加えて、DedDの構造活性相関についての解析が当初の予定よりも進んでいることからも、研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。

細菌のアルカリ耐性は、これまで細胞内pHやH+駆動力の維持機構を中心に議論されて来たが、他の観点からのアプローチは少なかった。一方で、我々は独自の検討により、大腸菌のアルカリ耐性にH+輸送とは無関係の蛋白質が複数関与することを見出していた。その過程で、機能未知であったdivisome蛋白質の一つであるDedDが、アルカリ条件下における細胞分裂維持に必須であることを示す知見を得ていた。本研究では、この機構におけるDedDの役割の解明を目指した解析を進めており、前年度までに、dedD破壊株の分裂異常がpH依存的に生じ、かつSOS応答および核様体閉鎖とは別の機構によることを明らかとした。また、DedDの部分欠損蛋白質の解析から、C末端のSPORドメインがDedD自身のseptumへの局在に必須であること、一方でこの領域が活性には必須ではないことも示した。加えて、mCherry融合蛋白質の局在解析から、DedDが後期divisome蛋白質であるFtsNのアルカリ条件下での局在に必須である一方で、divisome形成の端緒となるFtsZの局在には関与しないことを明らかとし、DedDがdivisomeの安定化に重要な役割を果たす可能性も見出した。そこで本年度は、DedDが他の必須divisome蛋白質間のアンカーとして機能する可能性について検証した。DedDと主要なdivisome蛋白質(FtsZ、X、Q、L、W、I、およびN)との相互作用についてBACTH法により検討したところ、DedDとFtsQ、FtsLおよびFtsIとの相互作用を強く示唆する結果を得た。以上より、DedDがdivisome形成中期以降に集合する蛋白質間の相互作用の安定化に寄与することが示された。我々は、機能未知であったDedDが大腸菌のアルカリ条件下での細胞分裂維持に必須であることを見出した。dedD破壊株のアルカリ条件下での分裂障害はSOS応答や核様体閉鎖に依存せず、また同条件下でFtsNの局在異常が認められた。一方、DedDと複数のdivisome蛋白質との相互作用も示しており、DedDがdivisome構造の安定化を通じてアルカリ条件での細胞分裂維持を担うことが強く示唆された。上述のFtsZ-mCherryおよびmCherry-FtsNのdedD破壊株における発現条件の検討を継続し、DedDのdivisome形成の関与の有無を明らかとする。またDedDと相互作用する蛋白質について、BACTH法を用いた探索を開始する。また、平成27年度に開始したdedDのdeletion cloneの作成と機能解析を継続し、DedDのアルカリ条件下における機能、分裂面への局在、および他の蛋白質との相互作用に必須のアミノ酸領域の特定を進める。FtsZ以降FtsN以前にdivisomeにassembleされる蛋白質について、dedD破壊株におけるアルカリ条件下での局在解析、並びにbacterial two-hybrid法(BACTH)によるDedDとの相互作用解析を行い、DedDがdivisomeのどの因子の局在に関与するのかについて解明を試みる。また、DedDがdivisome蛋白質以外とも相互作用する可能性を鑑み、BACTH法によるcDNAライブラリーのスクリーニングも試みる。