hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
陸域水圏環境変化のプロキシ:オオクチバスと鱗の中の炭素・窒素安定同位体比

狭い範囲に標高差3000mもの多様な環境がある日本中部の富山県において,10カ所の調査地点(水圏環境:ダム湖8カ所,溜池2カ所)から各水圏のTop Predatorであるオオクチバス(910個体)を採集し,脱脂筋肉のδ15Nとδ13Cを分析・比較した。δ15Nとδ13Cは各調査地点内においては大きな変異を示さない一方で,それぞれの調査地点では異なる値を示した。ダム湖は集水域の標高と湖水の回転率により二つのグループに分けられ,食物連鎖の栄養源が異なることも示唆された。オオクチバスのδ13C・δ15Nは,生息する水圏環境を反映でき,淡水域の環境評価や食物連鎖のプロキスとして有効であり,同一種を用いた世界規模での水圏環境の比較やモニタリングが可能である。さらに,オオクチバスの脱脂筋肉と鱗のδ13C・δ15Nには高い相関があることから,保存や処理の簡便な鱗が活用できる。本研究では,世界各地に移植されている外来生物オオクチバスを対象に,δ13C・δ15Nを用い,世界規模でのダム湖や池沼の現状と環境変化を把握するための水圏環境指標としての有効性を検証した。対象地域は狭い範囲に標高差が3000mもあり,人為的影響がほとんどない山岳地帯を集水域に持つ河川が多い富山県とし,全域からオオクチバスが定着しているダム湖8カ所とため池2カ所を選び,オオクチバスやその餌となる魚類,湖底表層堆積物などのδ13C・δ15Nを測定した。オオクチバスでは,筋肉と鱗を測定した。これらの同位体比分析結果と,ダム湖の諸元や集水域のデータとの関連について解析した。その結果,1オオクチバス(水域ごとに910個体)筋肉のδ13C・δ15Nは,各水域でまとまった値を示す一方で,水域間では異なる値を示した。各水域におけるオオクチバスのδ15Nは9‰を境として,9‰以上では丘陵域ダムや溜池であり,9‰以下では渓流域ダムであった。さらにδ13Cは,渓流域ダムの中でも湖水の年間回転率が10回/年以下では丘陵域ダムと同様にδ13Cが-23‰以下であったが,年間回転率が10回/年以上ではδ13Cが-23‰以上であり付着藻類を栄養源とする食物網と推定された。28カ所のダム湖において,集水域の平均標高とオオクチバスの食物連鎖長との相関を求めたところ,相関係数r=-0.87と高い負の相関を示した。次に,人為的な影響が強い大谷ダム以外の7カ所のダム湖では,食物連鎖長と集水域平均標高はr=-0.87と高い負の相関を示し,さらに集水域平均標高とオオクチバスのδ15Nでは,r=-0.97と極めて高い負の相関となった。3オオクチバスの鱗と筋肉のδ13C・δ15Nは高い相関(R2=0.98)を持つことが確認でき,サンプル処理の容易なオオクチバスの鱗を用いても,水圏環境の指標になることが分かった。地球温暖化影響は降雨(雪)量の変化などを生じ,気象異常として世界各地で顕著になってきている。さらに,生物多様性の減少や人為的開発などによる環境の変化により,地球上の物質循環に重要な役割を果たす陸域水圏(河川,ダム湖,池沼など)の環境も変化していると推測される。本研究では,世界各地に移植されている外来生物オオクチバス,特にその鱗の炭素・窒素安定同位体比により,陸域水圏の環境モニターとして,世界規模でのダム湖や池沼の現状と環境変化を把握するための簡易的な方法の提案を目的としている。本年度は,主にフィールド調査と実験室での試料分析に力を注いだ。対象地域は狭い範囲に標高差3000mもあり,人為的影響がほとんどない山岳地帯を集水域に持つ河川が多くある富山県とした。オオクチバスが定着しているダム湖8カ所とため池2カ所を選び,オオクチバスやその餌となる魚類などを採集し炭素・窒素安定同位体比を測定した。測定は筋肉と非致死的かつ簡易的試料として鱗を測定し,さらに,基礎生産の代表的指標として沿岸堆積物の同位体比も分析した。

その結果,(1)オオクチバス(地点ごとに910個体)から得た脱脂筋肉のδ13Cとδ15Nを比較したところ,それぞれの調査地点においてまとまった値を示す一方で,各調査地点間では異なる値を示し,それぞれの調査水圏や食物網の特徴を表していると考えられた。また,(2)水圏の基礎生産のプロキシとして沿岸域の湖底表層堆積物の同位体比も加えて検討したところ,ダム湖は集水域の標高とダム湖の回転率により区別される二つのグループに分けられ,オオクチバスが水圏環境モニターとしての可能性が示唆された。更に,(3)オオクチバスの鱗と筋肉の炭素・窒素同位体比は高い相関(R2=0.98)を持つことが確認でき,鱗の炭素・窒素安定同位体比がインテグレートされた水圏環境の指標になりうることが分かった。本研究は,世界各地に移植されている外来生物オオクチバスが陸域水圏の環境モニターとして,世界規模でのダム湖や池沼の現状と環境変化を把握するための簡易的な指標としての可能性を模索することを目的としている。今年度は,狭い範囲に標高差3000mもあり,人為的影響がほとんどない山岳地帯を集水域に持つ河川が多くある富山県をモデル域として,オオクチバスが定着している10地点より試料を採集し炭素・窒素安定同位体比を測定した。また,オオクチバスのδ13Cとδ15Nは調査地点間で異なり,各々の水圏や食物網の特徴を表し,水圏環境モニターとしての可能性が示唆された。更に,オオクチバスの鱗と筋肉の炭素・窒素同位体比は高い相関を持ち,鱗がインテグレートされた水圏環境の指標になりうることが分かった。平成24年度は,オオクチバス以外に一部のダム湖においては,堆積物の炭素・窒素同位体比を分析し,オオクチバスとの関連性を明らかにし,異なる水圏環境における食物網の栄養源情報を把握する。また,水質データや水文学データを併せて,水質の季節的な変化も精査し,オオクチバスの淡水域における環境評価指標としての有効性を考察する。さらに,オオクチバスを陸域水圏環境汚染指標としての有効性を評定するため,筋肉中の重金属含有量の分析・評価も試みる。物品費(観測・分析用消耗品類;試薬類):250,000円旅費(調査・資料収集・研究打合せ・学会参加旅費):300,000円人件費・謝金(実験補助;資料提供・閲覧):250,000円その他(機材・試料等運送費用;印刷費;英文校閲費):200,000円計:1,000,000円
炎症をターゲットとした糖尿病性腎症に対する新規治療法の開発

我々は過去の一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因に炎症(microinflammation)が関与していることを明らかにした。本研究の目的は、糖尿病性腎症の成因に関与する炎症関連分子を探索するとともに、microinflammationをターゲットとした腎症の新しい治療薬を開発することである。Oeteopontinノックアウトマウスに糖尿病を惹起して、腎障害の進展を野生型マウスと比較解析することにより、osteopontinが腎症の進展に深く関与しており、腎症の治療標的となる可能性が示された。また、GLP-1受容体が糸球体内皮細胞や単球/マクロファージに発現しており、糖尿病ラットにGLP-1受容体作動薬を投与することによって抗炎症作用を介して腎障害が抑制されたことから、GLP-1受容体作動薬が腎症の治療薬として有望であることが確認された。糖尿病性腎症は、わが国における透析療法導入の最大の原因心であり、腎症の成因を明してしい治手段を開発ることが危急の課題である。我々はこれまでの一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因には、軽微な慢性炎症(microinflamation)が関与しており、これは動脈硬化の成因と共通したメカニズムであることを明らかにした。さらに、我々の最近の研究の結果、osteoponnn、RANTESやIP-10などのケモカイン・サイトカインやcholecystokinin(CCK)などの炎症関連分子が、腎症の病因に関連している可能性があることが明らかになった。本研究では、糖尿病性腎症の進展におけるCCKとosteopontinの役割を詳細に解析するために、これまでに引き続いて、CCK type A receptorとtypeBreceptorの単独ノックアウトマウスと両者のダブルノックアウトマウス(CCK-ABKOマウス)およびwild typeマウスに糖尿病を発症させ、腎障害の進展を比較したところ、CCK-AB KOマウスでは、他の系統のマウスに比較して、糖尿病発症後の腎障害の進展が著明に加速していることが明らかとなった。DNAマイクロアレイでは、CCK-AB KOマウスではwild typeマウスに比較して、腎臓における炎症性遺伝子群の発現が亢進していることが明らかとなった。さらにCCK peptideを用いて、in vitroとin vivoにおけるCCKの作用を検討した、その結果、CCKが内皮細胞とマクロファージに対して、抗炎症作用を示すことと、糖尿病ラットの腎臓における炎症を抑制することが明らかとなった。一方、osteopontin KOマウスに糖尿病を発症させると、腎障害が軽減する結果が得られたため、詳細な解析を進めている。糖尿病性腎症は、わが国における透析療法導入の最大の原因疾患であり、腎症の成因を解明して新しい治療手段を開発することが喫緊の課題である。我々はこれまでの一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因には、軽微な慢性炎症microinflammation)が関与しており、これは動脈硬化の成因と共通したメカニズムであることを明らかにした。さらに、我々の最近の研究の結果、osteopontin、RANTESやIP-10などのケモカイン・サイトカインやcholecystokinin(CCK)などの炎症関連分が、腎症の病因に関連している可能性があることが明らかになった。本研究では、糖尿病性腎症の進展におけるCCKとosteopontinの役割を詳細に解析するために、昨年度に引き続いて、CCK type A receptorとtype B receptorの単独ノックアウトマウスと両者のダブルノックアウトマウス(CCK-AB KOマウス)およびwild typeマウスに糖尿病を発症させ、腎障害の進展を比較したところ、CCK-AB KOマウスでは、他の系統のマウスに比較して、糖尿病発症後の腎障害の進展が著明に加速していることが明らかとなった。さらに、CCK peptideを用いて、in vitroとin vivoにおけるCCKの作用を検討した、その結果、CCKが培養糸球体内皮細胞とマクロファージに対して、抗酸化作用、抗炎症作用および遊走抑制作用を示すことが明らかとなった。一方、osteopontin KOマウスに糖尿病を発症させると、腎組織障害、腎組織へのマクロファージの浸潤とサイトカイン産生が抑制されることが明らかとなった。糖尿病性腎症は、わが国における慢性血液透析導入の最大の原因疾患であり、腎症の成因を解明して新しい治療手段を開発することが重要な課題となっている。我々は過去の一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因に炎症が関与していることを明らかにしてきた。我々はさらに、炎症が動脈硬化と腎症の共通の進展

メカニズムの一つであることを明らかにした。糖尿病性腎症で見られる「炎症」は、関節リウマチなどの炎症性疾患に見られる炎症と比較すると臨床的にも組織学的にも軽微なものであり、動脈硬化の成因に関与するmicroinflammation(微小炎症)と共通した特徴を持つと考えられる。本研究の目的は、糖尿病性腎症の成因に関与する炎症関連分子を探索するとともに、microinflammationをターゲットとした腎症の新しい治療法を開発することである。ICAM-1ノックアウトマウスと野生型マウスに糖尿病を惹起して、腎組織における遺伝子発現プロファイルをDNAマイクロアレイを用いて比較し、糖尿病性腎症の発症に関わる炎症関連遺伝子をスクリーニングした結果、osteopontinやcholecystokinin(CCK)が候補分子として抽出された。本研究では、oeteopontinとCCK受容体のノックアウトマウスに糖尿病を惹起して、腎障害の進展を野生型マウスと比較解析することにより、これらの分子が糖尿病性腎症の新規治療ターゲットとなる可能性を検証した。その結果、Osteopontinノックアウトマウスでは、腎障害の進展が抑制され、CCK受容体ノックアウトマウスでは腎障害がさらに進展した。さらにCCK peptideの投与によって腎障害が抑制されたことから、CCK peptideが糖尿病性腎症の新たな治療薬として有望であることが確認された。
単電子制御による量子標準・極限計測技術の開発

本年度は、各担当チームにて量子計測三角形の実現に必要な要素技術の開発を進め、以下の進捗があった。NTTにおいては、新規の単電子転送素子の作製をほぼ完了し、テスト測定の準備を進めた。既存素子を用いた測定では、高周波動作(サブ10GHz)や動作温度上昇(数10K)に伴う単電子転送精度の劣化機構を調べ、高周波動作下では理論で予測される温度依存性が抑制されるとともに、電子の非断熱励起が生じていることを見出した。単電子の高速ダイナミクスを理解する上で重要な知見である。また、欧州量子電流標準プロジェクトとの連携では、NTT素子を含む各国標準機関で作製された単電子転送素子がいずれも1ppmレベルでユニバーサルに動作することを確認した。産総研においては、NTTで作製されたシリコン単電子転送素子の動作について、産総研システムでの検証と並列動作実験のための低温駆動実験系の構築を行った。また、産総研で作製した高抵抗量子ホールアレーのより詳細な検証実験に成功し、同素子を用いた量子電流電圧変換実験に成功した。量子計測三角形の測定系構築に向けて、ジョセフソン量子電圧計の素子の専用冷凍機を用いた精密評価を終了させ、「産総研トライアングルシステム」への実装を行なっている。電通大においては、単電子転送素子の転送エラーの高速検出を目指して試作する単一磁束量子回路(SFQ)を用いた回路方式を実現するために、次の3項目に取り組んだ。(1)希釈冷凍温度で動作するプレーナ型のSFQ用接合を作製するために、簡便に利用できるCr/Au薄膜シャント抵抗を見出した。(2)希釈冷凍温度から室温へのSFQパルスの読み出しのための低温高周波回路の構築と、読み取り可能性の検証を行った。(3) SFQ回路に組み込む電荷(電圧)敏感な素子としての超伝導単電子トランジスタ(SSET)の超伝導スイッチとしての機能を検証した。本年度は、計画通り、各担当チームにて研究の推進と要素技術の開発を進めた。NTTにおいては、計画通り、新しい設計に基づく素子作製を進め、ほぼ完了にこぎつけた。また、スクリーニングテスト用に導入した低温プローバ装置の立ち上げを完了した。高速単電子ダイナミクスの制御についても、既存素子を用いた測定で温度依存性の特異な抑制効果を見出すなど進展があった。欧州の量子電流標準プロジェクトに協力し、単電子転送素子のユニバーサル動作の実証に貢献した。産総研においても、計画通り、高抵抗量子ホールアレーの作製と詳細な検証実験を行うとともに、同素子を用いた量子電流電圧変換実験に成功した。また、「産総研トライアングルシステム」の構築についても、NTTのシリコン単電子転送素子の低温駆動実験系の構築、ジョセフソン量子電圧素子の精密評価を完了するなど着実な進展があった。電通大においても、計画通り、単一磁束量子回路の開発を進め、薄膜シャント抵抗作製条件の最適化、希釈冷凍機内での読み出し用の低温高周波回路の構築とその動作性能の検証、電荷計となる超伝導単電子素子の動作確認に成功した、また、量子電流ミラーの作製技術の改善に向けて自動化改造を完了した。以上ように、計画に基づいて研究は概ね順調に進展している。今後は各担当チームにて量子計測三角形の実現に必要な要素技術の開発を進めるとともに、共同実験の準備として産総研におけるNTTの単電子転送素子のテスト測定を開始する。NTTにおいては、昨年度から進めている新規デバイス作製を完了し、作製した単電子転送素子、アレイ型転送素子の基本動作確認の測定を行うとともに、前年度に導入した低振動プローバ等を用いてスクリーニングテストを行う。また、既存の単電子素子を用いて、産総研や海外の標準研究所におけるテスト測定を順次進める。単電子転送の精度を支配する単電子ダイナミクスの物理の研究も引き続き推進する。特に、サブ10 GHz動作下の電子非断熱励起や電子格子相互作用との競合について理解を深めるともに、最適な制御方法や素子構造についての知見を蓄積していく。産総研においては、NTTで作製されたシリコン単電子転送素子の動作について、産総研システムでの検証と並列動作実験を実施する。また、産総研で作製した高抵抗量子ホールアレーを用いた電流電圧変換の実験より詳細に実施する。また、量子計測三角形の測定系構築に向けて、ジョセフソン量子電圧計の「産総研トライアングルシステム」への実装を行い、テスト測定を実行する。電通大においては、昨年度に作製条件を最適化したCr/Au薄膜シャント抵抗を用いて、過減衰特性をもつAl/AlOx/Al接合系の作製および単一磁束量子回路(SFQ)の試作を進める。また、前年度作製したSFQパルス読み出し回路や単電子検出用の超伝導単電子トランジスタについてさらなる改良を加える。電流ミラー用の高誘電体絶縁膜形成については、原子層堆積装置の原料ライン増設などを進める。

産総研においては、NTTで作製されたシリコン単電子転送素子の動作について、産総研システムでの検証と並列動作実験のための低温駆動実験系の構築を行った。また、産総研で作製した高抵抗量子ホールアレーのより詳細な検証実験に成功し、同素子を用いた量子電流電圧変換実験に成功した。量子計測三角形の測定系構築に向けて、ジョセフソン量子電圧計の素子の専用冷凍機を用いた精密評価を終了させ、「産総研トライアングルシステム」への実装を行なっている。電通大においては、単電子転送素子の転送エラーの高速検出を目指して試作する単一磁束量子回路(SFQ)を用いた回路方式を実現するために、次の3項目に取り組んだ。(1)希釈冷凍温度で動作するプレーナ型のSFQ用接合を作製するために、簡便に利用できるCr/Au薄膜シャント抵抗を見出した。(2)希釈冷凍温度から室温へのSFQパルスの読み出しのための低温高周波回路の構築と、読み取り可能性の検証を行った。(3) SFQ回路に組み込む電荷(電圧)敏感な素子としての超伝導単電子トランジスタ(SSET)の超伝導スイッチとしての機能を検証した。本年度は、計画通り、各担当チームにて研究の推進と要素技術の開発を進めた。NTTにおいては、計画通り、新しい設計に基づく素子作製を進め、ほぼ完了にこぎつけた。また、スクリーニングテスト用に導入した低温プローバ装置の立ち上げを完了した。高速単電子ダイナミクスの制御についても、既存素子を用いた測定で温度依存性の特異な抑制効果を見出すなど進展があった。欧州の量子電流標準プロジェクトに協力し、単電子転送素子のユニバーサル動作の実証に貢献した。産総研においても、計画通り、高抵抗量子ホールアレーの作製と詳細な検証実験を行うとともに、同素子を用いた量子電流電圧変換実験に成功した。また、「産総研トライアングルシステム」の構築についても、NTTのシリコン単電子転送素子の低温駆動実験系の構築、ジョセフソン量子電圧素子の精密評価を完了するなど着実な進展があった。電通大においても、計画通り、単一磁束量子回路の開発を進め、薄膜シャント抵抗作製条件の最適化、希釈冷凍機内での読み出し用の低温高周波回路の構築とその動作性能の検証、電荷計となる超伝導単電子素子の動作確認に成功した、また、量子電流ミラーの作製技術の改善に向けて自動化改造を完了した。以上ように、計画に基づいて研究は概ね順調に進展している。今後は各担当チームにて量子計測三角形の実現に必要な要素技術の開発を進めるとともに、共同実験の準備として産総研におけるNTTの単電子転送素子のテスト測定を開始する。NTTにおいては、昨年度から進めている新規デバイス作製を完了し、作製した単電子転送素子、アレイ型転送素子の基本動作確認の測定を行うとともに、前年度に導入した低振動プローバ等を用いてスクリーニングテストを行う。また、既存の単電子素子を用いて、産総研や海外の標準研究所におけるテスト測定を順次進める。単電子転送の精度を支配する単電子ダイナミクスの物理の研究も引き続き推進する。
TGFβシグナル系に着目した大動脈疾患修飾因子の検討

大動脈疾患のうち、若年の大動脈瘤・解離を生ずるマルファン症候群(MFS)、ロイス・ディーツ症候群(LDS)など遺伝性疾患は個々の病状は多様であり、大動脈病変の個人差が大きく、病態の共通機序としてTGF-βシグナルの機能異常があり、これを標的とする薬物療法の有効性が期待されているが、その効果も一様ではない。本研究は、大動脈疾患の進展発症病因の遺伝子変異、病態修飾遺伝子変異、さらに病態修飾因子について検討を行った。これまでに解析した1500例以上の若年性大動脈疾患に新規協力患者を加えて、従来法ならびに次世代シーケンサーによる解析手法を導入して、TGF-βシグナルに関連する遺伝子を中心に病因の遺伝子変異、病態修飾遺伝子変異、さらに病態修飾因子の検討を行い、病因ならびに病型、病態に関係する遺伝子バリアントの効率的な検討方法を確立した。さらに、国外研究者との連携により特異な所見を伴う病型分類につながる遺伝情報を明らかにし、また、日本人患者の特徴についても検討することができた。なお、患者iPS細胞の樹立と血管細胞への分化検討についての検討については、所属施設の異動により研究基盤構築にとどまった。本研究では、遺伝子バリアントの解析により、若年性大動脈疾患の遺伝学的検討手法の有効性の確立と有用性が確認され、診療につながる情報が集積され、診療に役立つ知見が得られたので、的確な診断と早期治療に資することが期待される。大動脈疾患のうち、若年の大動脈瘤・解離を生ずるマルファン症候群(MFS)、ロイス・ディーツ症候群(LDS)など遺伝性疾患はその病状は同一でなく、大動脈病変の個人差は少なくない。病態の共通機序としてTGF-βシグナルの機能異常があり、これを標的とする薬物療法の有効性が期待されているが、その効果も一様でないことも報告されている。以上より、大動脈疾患の進展発症には原因として知られる遺伝子変異に加えて、他の遺伝要因や環境要因を含むエピジェネティック因子の関与が少なくないと考えられる。しかしながら、病因遺伝子変異以外の病態修飾因子についての知見はまだ不十分である。そこで、本研究では、大動脈疾患の病態修飾因子について、病状の異なる同一家系内あるいは家系の異なる患者につき、TGF-βシグナルに関連する遺伝子多型の検討と環境要因や治療服薬薬剤を比較検討して病態修飾因子を探索し、大動脈疾患の治療管理に役立つ知見を得る。本研究の開始と研究代表者、研究分担者の異動が同時期になったことから、平成28年度は、これまでに得られた遺伝子バリアント情報と環境要因、治療薬のデータベースの構築と、研究協力者とともに新規遺伝子解析システムの確立、また、研究協力者とともに患者iPS細胞の樹立と血管細胞への分化の検討、について検討を進め、新規遺伝子解析システムの確立やiPS細胞の血管内皮細胞への分化系の確立など、次年度以降につながる研究基盤の構築が達成された。本研究の開始と研究代表者、研究分担者の異動が同時期になるといったことから、一部の検討内容について、当初の見込みより実施の遅れのある事項があるものの、解析手法の検討確立、iPS細胞の分化系の確立など、当初見込み以上の研究進捗があり、全体としては、おおむね順調に研究進捗が見られたと判断している。具体的には次の通りである1)情報データベースの構築:平成28年度は、これまでの検討で変異が同定され、大動脈原因遺伝子変異を有する症例について、研究分担者とともに遺伝子バリアント情報、環境要因、治療薬についてのデータベース作成を開始した。2)遺伝子バリアント同定に関する効率的解析手法の検討:TGFβシグナル伝達系の変化をもたらす遺伝子バリアントの効率的な同定手法の確立を目指して、研究分担者と研究協力者とともに次世代シーケンサーによる解析手法と従来法(サンガー法)との比較検討を進め、低コストで解析できるシステムが確立でき、精度の検証を含め、方法の代替にむけた検討を進めることができた。3)マルファン症候群(MFS)・ロイスディーツ症候群(LDS)患者由来iPS細胞の樹立と分化誘導の検討:TGF-βシグナル伝達系の変化を生じる遺伝子変異を有するマルファン症候群・ロイスディーツ症候群患者症例より疾患iPS細胞を樹立し、研究協力者とともに内皮細胞、平滑筋細胞への分化系の検討を行い、内皮細胞への分化系を確立した。大動脈疾患のうち、若年の大動脈瘤・解離を生ずるマルファン症候群(MFS)、ロイス・ディーツ症候群(LDS)など遺伝性疾患は個々の病状は多様であり、大動脈病変の個人差が大きい。病態の共通機序としてTGF-βシグナルの機能異常があり、これを標的とする薬物療法の有効性が期待されるが、その効果にも個人差のあることも報告されている。以上より、これら大動脈疾患の進展発症機構には、遺伝子変異に加えて、他の遺伝要因や環境要因を含むエピジェネティック因子の関与が少なくないと考えられる。本研究では、大動脈疾患の病態修飾因子について、病状の異なる同一家系内あるいは家系の異なる患者につき、TGF-βシグナルに関連する遺伝子多型の検討と環境要因や治療服薬薬剤を比較検討して病態修飾因子を探索し、大動脈疾患の治療管理に役立つ知見を得る。平成29年度は、前年度に引き続いて遺伝子バリアント情報と環境要因、治療薬についてのデータベースの拡充を行い、研究分担者ならびに研究協力者とともに次世代シーケンサーを用いた新規遺伝子解析システムの確立を行うことができた。今後、この新規遺伝子解析システムの改良と検証を行いつつ、遺伝子バリアント情報と環境要因・治療薬についてのデータベースの拡充を進めるとともに、患者細胞を用いた機能解析などを行う予定である。

本年度は、全体として、おおむね順調に研究進捗が見られたと判断している。具体的には次の通りである1)情報データベースの構築:平成29年度は、前年度に引き続き、これまでの検討で変異が同定され、大動脈原因遺伝子変異を有する症例について、研究分担者とともに遺伝子バリアント情報、環境要因、治療薬についてのデータベースの拡充を行った。2)遺伝子バリアント同定に関する効率的解析手法の検討:TGFβシグナル伝達系の変化をもたらす遺伝子バリアントの効率的な同定手法の確立を目指して、研究分担者と研究協力者(かずさDNA研究所小原收・藤木亮次)とともに次世代シーケンサーによる解析手法を確立し、従来法(サンガー法)と比較し、低コストで効率良いシステムを確立することができた。3)既に樹立したマルファン症候群(MFS)・ロイスディーツ症候群(LDS)患者由来iPS細胞の分化誘導の検討を行った。大動脈疾患のうち、若年の大動脈瘤・解離を生ずるマルファン症候群(MFS)、ロイス・ディーツ症候群(LDS)など遺伝性疾患は個々の病状は多様であり、大動脈病変の個人差が大きく、病態の共通機序としてTGF-βシグナルの機能異常があり、これを標的とする薬物療法の有効性が期待されているが、その効果も一様ではない。本研究は、大動脈疾患の進展発症病因の遺伝子変異、病態修飾遺伝子変異、さらに病態修飾因子について検討を行った。これまでに解析した1500例以上の若年性大動脈疾患に新規協力患者を加えて、従来法ならびに次世代シーケンサーによる解析手法を導入して、TGF-βシグナルに関連する遺伝子を中心に病因の遺伝子変異、病態修飾遺伝子変異、さらに病態修飾因子の検討を行い、病因ならびに病型、病態に関係する遺伝子バリアントの効率的な検討方法を確立した。さらに、国外研究者との連携により特異な所見を伴う病型分類につながる遺伝情報を明らかにし、また、日本人患者の特徴についても検討することができた。なお、患者iPS細胞の樹立と血管細胞への分化検討についての検討については、所属施設の異動により研究基盤構築にとどまった。本研究では、遺伝子バリアントの解析により、若年性大動脈疾患の遺伝学的検討手法の有効性の確立と有用性が確認され、診療につながる情報が集積され、診療に役立つ知見が得られたので、的確な診断と早期治療に資することが期待される。平成29年度以降は、初年度での開始が遅れていた、遺伝子発現・タンパク質発現の解析も実施するとともに、効率的な解析手法により同定をすすめている遺伝子バリアントを用いた疾患病像に関する関連解析を進める。これにより、病態修飾因子の絞り込みをめざす。さらに、候補として浮かび上がった因子について、患者由来細胞(患者iPS細胞由来血管細胞を含む)を用いて、因子の機能修飾も行って、治療法につながる新知見の獲得をめざす。具体的には以下の事項の検討を進める1)原因遺伝子変異と疾患病像の違いの検討:平成29年度以降は、確立した効率的遺伝子解析手法により、病因遺伝子変異ならびに遺伝子バリアントの同定を進め、遺伝子変異と疾患病像の違い、患者間での疾患病像の違いについてパネル化を進める
光照射と生体反応に関する研究-とくに低出力エネルギ-光照射による疼痛・創傷・治癒促進現象の解明

創傷モデルに対するレ-ザ光照射は効果的に創傷治癒を促進する事実を各種の方法論によりアプロ-チをしてきたが、本年度は、「生物フォトン」情報と呼ばれる光情報が、どのように関与しているかを目的として、創傷面からの情報観察を中心に検討した。その結果、創傷面から極微弱発光が認められ、それを二次元情報として捉え、映像化することに成功するとともに、発光量の経時的変化としても捉えることができた。また、その極期における創傷面での反応細胞は主としてマクロファ-ジであることも病理組織学的に確かめることができたが、その性状であるとか、発光種であるとかの詳しい点に関しては未だ判っていない。レ-ザ-光照射の生体内ラマン散乱に関して、創傷モデルで分光特性を中心に検討したが、はっきりしたデ-タは得られていない。臨床的な事項として、半導体レ-ザ装置を用いて、二重盲検試験により、疼痛に対する評価を行い、レ-ザ照射は疼痛寛解に有効な手段であることを証明するとともに、サ-モグラフィ-の変化として局所情報を整理した結果、レ-ザ照射は、血管運動神経になんらかの影響を及ぼしていると推察される多くの所見を得た。この結果をふまえ、疼痛と神経系へのレ-ザ照射による電気生理学的研究の必要性を再認識し、その実験を開始した。極微弱発光現象は、創傷や皮膚疾患あるいは局所の血流等で検討をしているが、複雑な生体系を統一して、思考すべき結論には至っていないが、多くの未知の情報が集積されており、新しい分野での展開が考えられている。創傷モデルならびに難治性潰瘍に対するレーザー光照射は効果的に創傷治癒を促進することは確実な事実となった。レーザー光のもつ光特性の中で、波長にはあまり依存していないようである。コヒーレントの光はレーザを特徴ずける大きな要因で、インコヒーレント光を使い、偏光特性の検討をした結果、上記モデル及び臨床経験から、無偏光では効果がなく、直線偏光にすると効果があることが判明した。さらに、左右の円偏光の差の検討を行ったとこ、右円偏光で効果があり、左円偏光では無偏光と同様の結果を得た。これらの検討は、主として、創傷モデルで治癒日数の差としてのみならず、抗張力測定、肉芽中のハイドロオキシプロリンの定量がなされ、同様の結果を得た。光照射が何故、創傷治癒促進に効果的かを検討中であるが、現象面からは、サーモグラム、色素希釈曲線等で、末梢循環の改善が認められている。病理組織学的には、光照射例で新生血管の増生、消褪が、非照射例より早期に認められている。但し、このことは定性的で未だ定量的な研究はなされていない。また、肉芽のプロトンNMRから、肉芽増生時の細胞内自由水と結合水との比が光照射、非照射で異ることから、光照射に伴う細胞の動態の違いを検討する必要がある。線維芽細胞、リンパ球、癌細胞等の単独細胞に光照射を行い、フローサイトメトリーによるDNA合成を検討したが、今のところ何ともいえない。また、細胞電気泳動をしたところ、G_0G_1、S、G_2Mの細胞周期に分けたとき、光はG_0G_1で刺激的にG_2Mで抑制的に働いているようで、このことをさらに理解するため、レーザ励起蛍光顕微鏡のシステムに細胞形状の分析、運動能の測定を可能とさせた。また、この顕微鏡のCaイオンの動態、ミトコンドリアの染色を可能とさせ、鋭意努力中である。
GnRHサージジェネレーター機能におけるCa^<2+>チャネルの役割

1.視索前野電気刺激誘発LH分泌に対する、視索前野へのNa^+チャネル阻害剤投与の効果4日性周期を回帰する雌性ラットの発情前期の日の13:45時に定型的にネンプタール麻酔(35mg/Kg)を行った。その後視索前野内にTTXもしくは生理的食塩水を0.5μl投与し、その直後から30分間にわたる視索前野の電気刺激を行った。その結果、2μMのテトロドトキシン(TTX)投与によって、その電気刺激のLH分泌刺激効果が完全に阻止された。2.白発性サージ状LH分泌に対する、視索前野へのNa^+チャネル阻害剤投与の効果4日性周期を回帰する雌性ラットの発情前期の日の14:30時に、両側の視索前野内に5μMのTTXもしくは生理的食塩水を15μ1づつ投与した。その結果、TTX投与によりサージ状LH分泌が阻止された。3.自発性サージ状LH分泌に対する、視索前野へのCa^<2+>チャネル阻害剤投与の効果4日性周期を回帰する雌性ラットの発情前期の日の14:30時に、両側の視索前野内に5μMのL型Ca^<2+>チャネル阻害剤もしくは生理的食塩水を15μlづつ投与した。その結果、完全にサージ状LH分泌が阻止された。4.前額断切片を用いたGnRHサージジェネレーター活動と視索前野領域のCa^<2+>変動およびGnRH分泌の解析4日性周期を回帰する雌性ラットの発情前期の日の10:0011:00時に、ラットを断頭して脳を摘出し200μmの前額断切片を作成した。Calclum Green 1を取り込ませ、マクロCa^<2+>イメージングを行った。自発的なCa^<2+>変動は認められなかったが、100μMのGABA_A受容体アンタゴニスト、ピククリンにより視索前野領域でのCa^<2+>上昇が認められた。同時に測定した環流液中のGnRH濃度は、ビククリン投与により著明に上昇した。ナロキソン投与では、このようなGnRH分泌の変化は惹起されなかった。以上の結果から、GnRHサージジェネレーターの活動には、TTX感受性電位依存性Na^+チャネルとL型Ca^<2+>チャネルが必須の役割を演じていること、また我々の仮説通り、GABAニューロンの脱抑制によりGnRH分泌が惹起され、オピオイドニューロンはサージ状GnRH分泌には関与しないこと、が明らかとなった。

1.発情前期の日に、定型的にネンブタールによりLHサージ状分泌阻止を行い、あらかじめ植え込んだ刺激電極を用いて片側の内側視索前野に定型的に30分間の電気刺激を与え、刺激電極とともに植え込んだパイプを介して、刺激部位にNaチャネル阻害剤であるTTXを1,2,5μM投与した。2あるいは5μMが電気刺激によるLH分泌を完全に阻止した。続いて,発情前期の日午後に,あらかじめ植え込んだパイプを介して、TTX2μMを両側の内側視索前野に投与した。その結果、TTXは、自発性のLHサージ状分泌には全く影響をおよぼさないことが明らかとなった。2.GnRHサージジェネレーターの活動を,マクロ・カルシウムイメージングの手法を用いて検討した。発情前期のラットから,視索前野-視交叉上核を含む矢状断の急性切片を作製し,95%CO2/5%Oで飽和したリンゲル液にCalcium Green 1を添加し60分間インキュベートした。さらに60分間Calcium Green1無しでインキュベートし,カルシウムイメージングを開始した。基礎実験として,まず,カルシウム指示薬の蛍光強度の減衰を測定した。連続して2時間490nmの1波長励起を行った結果,得られた蛍光強度は約20%減少した。従って,目的とする時間(11-18時)の経時的なカルシウム変動を測定するための1分ごとのカルシウムイメージングは十分に可能であることが明らかとなった。ただし,計測していない時は,励起を中断する必要があることがわかった。次に、発情前期のラットから視索前野一視交叉上核の矢状断切片および視索前野の冠状断切片を用いて,さまざまな領域のカルシウム変動を13時から19時まで1分間隔で連続して測定したが,著明なカルシウムの変動は認められなかった。引き続いて,視索前野の冠状断切片を用いて,10μMのNMDAもしくはGABA-A受容体の阻害剤のビククリンを投与した。NMDAの場合は,10分間の投与後半より、ゆるやかなカルシウム上昇を認めた。一方、ビククリン投与の場合、投与開始後より直ちにカルシウム上昇を認めた。1.昨年度、TTXを視索前野内に投与してもサージ状LH分泌は抑制されないことを示唆する結果を得たが、投与薬物の作用した部位が限局されすぎている可能性があったため、今年度は、先ずTTXの投与量を昨年度の0.5μlから1.5μlに増量し、同様の実験を行った。その結果、サージ状LH分泌が抑制されることが明らかとなった。従って、サージ状LH分泌には、少なくともTTX感受性電位依存性Na+チャネルの活動が必須の役割を演じている事が示唆された。また、サージジェネレーターの活動を抑制するためには、ある程度広い領域のニューロンの活動を抑制する必要のあることが明らかとなった。2.現在、各種Ca2+チャネル阻害剤を用いて、どのCa2+チャネルがサージジェネレーターの活動に必要なのか検討している。3.サージジェネレーターの活動をカルシウムの変動として捉えるために、発情前期および非発情期のラットからサージジェネレーターの存在する視索前野領域の冠状断切片を作製し、Calcium Green 1を用いて、マクロカルシウムイメージングを行った。その結果、分界条床核において、100μMビククリンもしくは80mMの高カリウム投与により、急激なカルシウム上昇を認めた。この上昇反応は、視索前野領域より2倍程度強いものであった。50μMおよび100μMのバソプレッシン投与は、何ら変化を惹起しなかった。また、5μMのNPY、100μMのアセチルコリン、50μMのナロキソン、100μMのGABAの投与は、いずれの領域でもなんら変化を惹起しなかった。現在、引き続いて、サージジェネレーターの活動に特異的なカルシウム変動を探索している。
発現遺伝子マッピングによるシイタケ高密度連鎖地図の構築

我が国の特用林産物の基幹作物であるシイタケLentinula edodesについて作製したAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)マーカーによる連鎖地図に発現遺伝子をマッピングし、連鎖地図のマーカー密度、並びに、マーカー間の連鎖関係の精度を高めることを目的とする。初年度は、cDNAクローン及びEST情報よって得られる遺伝子マーカーをそれぞれ、RFLP-サザン法とPCR-電気泳動法によってマッピングするための検討を行った。約100株の交配家系の分離世代について、サザン解析によるcDNAクローンのマッピングに必要となるゲノムDNAを調製するとともに、交配親株の成熟子実体のヒダ部位より、常法に基づいてcDNAラィブラリーを作製した。また、担子菌類及び菌類を材料としたEST情報をデータベースより収集した。EST情報に基づいてそれらとホモロジーのあるシイタケのゲノム領域の増幅を試みたが、シイタケで報告されている遺伝子の塩基配列情報を利用する場合(本課題とは別に行った予備的検討)とは異なり、異種生物の配列情報に基づいてシイタケの配列の増幅と多型を検出することは容易ではなかった。このため、次年度では、cDNAクローンの部分配列を決定し、その配列より遺伝子領域を増幅するためのPCRプライマーを設計して、多型マーカーを分離する手法を取り入れる計画である。申請者らは我が国特用林産物の基幹作物であるシイタケLentinula edodesのAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)マーカーによる連鎖地図を作製している。本課題ではその連鎖地図に発現遺伝子をマッピングし、連鎖地図のマーカー密度、並びにマーカー間の連鎖関係の精度を高めることを目的とする。初年度はマッピングに必要となる交配家系の分離世代約100株のゲノムDNAを調製するとともに、担子菌類及び菌類のEST情報を利用してシイタケのゲノム領域の増幅を試みた。しかしながら、異種生物の配列情報に基づいたシイタケ遺伝子の増幅と多型検出は容易ではなかった。このため、シイタケ自身の遺伝子配列に基づいた検討を行うために、交配親株成熟子実体より、常法に基づいてcDNAライブラリーを作製した。本年度は継続して、栄養菌糸体および幼子実体それぞれよりcDNAライブラリーを作製し、前年度分と合せて合計約5.12X10^3個のcDNAプラスミドクローンを分離した。このうちの一部についてプラスミドDNAを分離し、cDNA領域の塩基配列を決定した。得られた配列に対してプライマーを設計し、交配親株間でPCR解析を行い、多型マーカーを探索した。その結果、24個の多型マーカーを作出できた。さらに、相同性検索によりこれらマーカーのほとんどについて遺伝子機能を推定することができ、遺伝マーカー化することができた。今後、多型マーカーの探索を継続するとともに、得られたマーカーの既製連鎖地図における座上連鎖群および連鎖群上の位置を特定する計画である。申請者らは我が国特用林産物の基幹作物であるシイタケLentinula edodesについて、203個のAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)マーカーからなる遺伝連鎖地図を作製している。最終年度は(1)前年度より継続してcDNAライブラリークローンの塩基配列を決定し、その配列情報に基づいて多型マーカーのスクリーニングを行った。その結果、既得(前年度)24マーカーに加え、新たに61個(合計85個)の機能遺伝子に基づく多型マーカーを選抜、作成することができた。(2)このうち、32個のcDNA由来の遺伝子マーカーについて、連鎖解析用交配家系の分離世代約120株における分離を調査し、同じ分離世代を用いてマッピングされている203個のAFLPマーカーに加えて連鎖解析を行った。その結果、29個の遺伝子マーカーを11連鎖群からなるAFLP連鎖地図の7連鎖群に組み入れることができた。(3)現在までに(1)の項目で277個のcDNAクローン(平均塩基数、約1.2kb)の塩基配列を決定した。得られた配列についてデータベースによる相同性検索を行った結果、約50%の配列が期待値E-value 1x10^<-10>以下の確率で既知配列と相同性を示した。以上の結果より、配列情報のあるcDNA由来の遺伝子マーカーは連鎖地図統合のアンカーマーカーとして利用可能であることから、本課題で作製した地図は今後のゲノム情報を利用した育種研究等への活用が期待される。
専門学校が養成する「能力」に関する検討―教員への量的・質的調査を中心に

専門学校教員への調査を通じて明らかになったのは以下の点である。第一に、専門学校教員が有する「能力」観によって専門学校教育が強く規定されていることである。第二に、そうした「能力」観の学科・学校ごとの多様性である。専門学校教育の多様性は、こうした教員の「能力」観の多様性に規定されていることが推測される。この点も研究の成果の一つである。平成25年度は本研究の中心をなす、「専門学校教員への質的調査」の予備的検討ならびに、その過程の中でなされた成果の学会報告を行った。およそ月に1度のペースで1日をかけての研究会を福岡大学で実施し、専門学校教育ならびに専門学校教員の研究状況とその課題を丹念に整理した。また、10月には高等教育研究の専門的知見を有する児島功和氏を招き、児島氏から本研究に対する多くのアドバイスをいただき、そのアドバイスをもとに、本研究の課題を整理した。その過程において、専門学校教育研究の枠組みがいまだに構築されていないこと、その枠組み構築を「職業的社会化」・「青年期職業教育」という観点から実施していく必要性を見出した。10月27日に名古屋大学において開催された日本産業教育学会第54回研究大会において、その成果を、瀧本知加(東海大学)が「専門学校教育研究の枠組み構築にむけて(1)-制度論的観点の批判的検討-」として、植上一希(福岡大学)が「専門学校教育研究の枠組み構築にむけて(2)ー職業的社会化の観点から-」として、学会発表として報告した。11月以降は、学会での議論をもとに、専門学校教育研究の枠組み構築の理論的検討を重ねるとともに、植上・瀧本がそれぞれ専門学校への調査研究を実施した。とくに、瀧本はドイツ・ハイデンハイムデュアル専門大学への調査なども海外調査も実施した。その実施調査は予備的調査として、今後の本格的な質的調査の知見としている。平成26年度は、主に以下の3つの柱に沿って研究を実施した。1専門学校の教育組織に関する検討:専門学校の教育組織の構成原理やそれとの教育との関係性に関する検討は、まったくなされていない。本研究が主たるテーマとする専門学校教員の能力観を見る土台として、そもそも専門学校教員がいかなる組織のもとにおかれているのかの検討が不可欠と考えその点についての検討を実施した。具体的には、専門学校への量的調査および質的調査をもとに、専門学校の種類によって、その教育組織が大きく異なること、そして、その組織原理により、求められる教員像や教員としての資質能力が異なることが明らかとなった。その点について、平成27年度において学会報告をする予定である。また、美容師養成の専門学校研究を行っている竹井沙織氏を招いて、竹井氏の調査先の美容専門学校の教育組織の構成原理と教育との関係性についても理解を深めることができた。2専門学校の教職員の実態に関する調査:並行して、専門学校の教職員の実態に関する調査も行った。とくに、日本工学院専門学校に関しては、実地調査ならびに聞き取り調査を複数回行い、各学科の教職員の資質や置かれた状況について、教職員の意識を把握することができた。こうした調査から得られた点をまとめて、平成27年度において学会報告等を行う予定である。3専門学校をめぐる制度政策状況に関する検討:専門学校をめぐる政策動向は変化が著しい。とくに、「職業実践的な教育に特化した枠組み」を巡る議論は、専門学校教育に大きな影響を及ぼす。政策動向や、それに対する専門学校の以降について、政策研究および専門学校関係者への聞き取り調査等を実施した。研究最終年度においては、専門学校教員が専門学校において養成する「能力」をいかにとらえているのかについて、質的調査を中心に実態を調査した。前年度までの調査ならびに、理論的検討もふまえて主に明らかになったのは、以下の2点である。第一が、専門学校教員が有する「能力」観に専門学校教育が強く規定されていることである。教育内容編成の自由度が他教育機関に比して高い専門学校において、また、卒業後のキャリア形成を強く意識する専門学校においては、教員が意識する「能力」観が専門学校教育に強く影響を与えている。そのことが教員調査ならびに、各学校の教育内容の照らし合わせにより明らかになった。第二に、「能力」観の学校・学科ごとの違いである。専門学校の多様性に対応して、専門学校教員が抱く「能力」観も学校・学科によって非常に多様であった。この点が確認できたことも研究の成果の一つである。こうした成果とともに、研究課題もまた浮かび上がってきた。とくに、専門学校教員について検討すべき要素が多数存在すること、そのなかでもとくに専門学校教員としての職業的アイデンティティがその教育実践等を強く規定することが明らかになってきた。一般の学校教員とは異なり、専門学校教員の制度的規定は緩やかであり、教員の養成制度も確立していない。そのため、専門学校教員の職業的アイデンティティは非常に多様であり、それぞれ多種多様な役割認識、専門性認識のもとで専門学校教育は編成・実施されている。今後、専門学校教育研究を進めるにあたっては、この専門学校教員の職業的アイデンティティについて明らかにする必要がある。研究計画はおおむね順調に進展している。

研究過程の中で、基礎的な点の確認が必要となったため、本年度はその点に力をかけたが本研究を遂行する上で不可欠な作業だったと考えている。共同研究者の瀧本氏の出産があったため、学会報告や調査を見送ったものもあるが、それらは平成27年度に行いたい。教育学平成27年度は平成26年度に実施した調査、検討の成果を学会で報告し、さらには論文化することを第一の作業課題とする。また、必要な調査を随時実行し、それらをもとに報告書を作成することを第二の作業課題とする。研究計画は、おおむね予定通り実施している。研究過程のなかで、枠組み構築に向けてのさらなる理論検討が必要になったため、本年度はその点にも力をかけたが、本研究を遂行する上での必要な作業だったと考える。学会報告も2本実施したし、質的調査の予備調査も実施している。瀧本氏の出産などがあり、予定していた学会報告ならびに調査等を平成26年度は実施しなかったため繰越金が発生した。平成26年度は、平成25年度に作り上げた研究枠組みのもとで、さらには予備的調査をもとに、本格的に質的調査を実施していく。上記の理由で、平成26年度に実施予定だった学会報告ならびに調査等を平成27年度実施する。25年度実施計画の量的調査を平成26年度に実施することにしたため、その分の費用が予定よりかからなくなったため。25年度に実施する予定だった量的調査を実施し、その予算とする。
ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞による心筋再生治療における細胞の至適生着条件の検討

iPS細胞を用いた心臓細胞治療は、重症心不全に対する新たな治療法として期待されている。しかし、その他の幹細胞移植治療と同様、投与細胞の生着率の低さが問題となっている。そこで、iPS細胞由来分化細胞の移植後心臓生着における至適化を目的として、ルシフェラーゼを恒常的に発現するiPS細胞株を用いて、未分化iPS細胞、分化4日目中胚葉細胞、分化8、20、30日目分化心筋を免疫不全マウスの心臓に直接注入し、生着率をin vivo bioluminescence imagingにて定量化し、比較した。結果、分化20日目心筋がその他の分化細胞に比べ有意に高い生着率を認め、分化20日目心筋が生着における至適細胞だと考えられた。そこで、分化20日目心筋を心筋梗塞モデルマウスに直接注入し、治療効果を確かめたところ、良好な生着と、有意な心機能改善を認めた。さらに、生着後の経時変化を観察したところ、imagingシグナルの経時的増加を認め、組織所見上もKi67陽性生着心筋がin vitroに比べ有意に増加していた。この結果は、移植後生着心筋がマウス心臓内で増殖していることを示している。このimagingシグナルの増加は移植後3ヶ月にてプラトーに達したが、組織所見上は移植後3ヶ月から6ヶ月にかけての心筋成熟が認められた。以上のことから、iPS細胞由来分化20日目心筋は高い生着率、増殖能をもち、障害心筋に対する高い治療効果を有することが示唆され、今後の心臓細胞治療への応用が期待される。今後は、今回のマウス実験での結果を踏まえて、至適分化心筋細胞を用いた大動物への移植実験を行い、マウスでの詳細な評価が困難である治療効果、不整脈原性を中心に臨床応用への可能性を追求していく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。iPS細胞からの心筋分化を効率化することにより、どのような細胞株でも60-70%が心筋特異的トロポニンT陽性心筋細胞に分化させることができる。この心筋分化系を用いてiPS細胞由来心筋細胞の移植治療における生着効率を測定した。初めに、細胞移植生着効率を経時的に定量化するために、発光物質(ルシフェラーゼ)を恒常的に発現するiPS細胞株を作成した。細胞数とin vivoイメージングシグナルが相関し、生着細胞数を定量的に測定できることが分かった。この細胞株を用いて心筋分化における各段階の細胞(未分化iPS細胞、中胚葉分化細胞(分化4日目)、初期心筋細胞(分化8日目)、成熟心筋細胞(分化20日目)をNOGマウスの非虚血心に直接注入したところ、未分化iPS細胞、中胚葉細胞では生着が認められなかったが、心筋分化細胞においては細胞生着が認められた。組織所見でも移植心筋細胞が心筋細胞として生着している様子が観察された。しかし、この実験で移植した細胞は純化された心筋細胞ではないため、分化心筋細胞自体の正確な生着能を評価することが困難であった。そこで、心筋特異的αMHCにGFPを組み込んだ細胞株を作成し、心筋純化を試みた。心筋特異的αMHC-GFP発現細胞株を作成し、その細胞株を用いることにより、心筋分化各段階において、フローサイトメトリーを用いて純化心筋を得ることができた。そして、上に記載した発光物質を用いたin vivoイメージングシステムをこれらの細胞株にも導入することにより、純化心筋細胞の正確な生着能を評価できる実験系の確立に成功した。この実験系を用いることにより、分化心筋の移植後生着率を分化段階によって定量的に比較することができ、至適細胞を明らかにすることが期待できる。また、生着率の違いを検討することにより、生着における重要因子の抽出も検討することができる。前年度に確立したルシフェラーゼ発現iPS細胞を用いたin vivoイメージングを使用し、心筋分化における各段階の心筋細胞を実際に健常NOGマウス心臓に移植し、至適細胞の検討を行った。1まず、未分化ips細胞移植を行ったところ、シグナルは数日で消失した。また、分化4日目の中胚葉前駆細胞を移植したところ、同様に数日でシグナルは消失した。それに対し、分化8,20,30日目純化心筋を移植すると、数日でシグナルが一旦減少するも、その後増加に転じ、21-3か月後にもシグナルを確認することができた。さらに詳細に検討したところ、分化8日目心筋は移植後数日でシグナルが20%程度にまで低下するのに対し、分化20,30日目心筋は40-50%程度の低下に留まった。分化&20,30日心筋すべてにおいて移植後1週間後あたりからシグナルが増加したが、この現象は分化20日目心筋で最も著明であり、2か月まで観察したところ、分化18,30日目心筋に比べ、分化20日目心筋で有意にシグナル増加、すなわち生着率が高値であった。このことより、生着心筋細胞が増殖していることが示唆された。もちろん、2か月の段階での組織染色では、十分なサルコメア構造を持つ生着心筋が観察でき、移植細胞が心筋としてマウス心臓に生着していることを確認できた。また、生着心筋と周囲のマウス心筋の間にはコネキシン43の発現も見られ、移植心筋とマウス心筋の電気的交流が存在することが示唆された。