hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管壁肥厚度とアポE遺伝子及びアンジオテンシン変換酵素遺伝子多型性の関連性

インスリン非依存型糖尿病(NIDDM)患者での血管障害の指標として、頚動脈及び大腿動脈での動脈硬化度を超音波Bモード法にて内膜中膜複合体の肥厚度として測定し,アンジオテンシン変換酵素(ACE)遺伝子およびアポE遺伝子との多型性との関連性について検討した.NIDDM患者356名及び高血圧や高脂血症を伴わない健常者235名を対象とし、ACE阻害剤を服用しているものは除いた.動脈硬化の評価は,超音波Bモード法にて行い、頚動脈及び大腿動脈の内膜中膜複合体の肥厚度(intimamedia thickness, IMT)を計測し左右の最大肥厚度の平均値を求めこれをIMTとした。対象者の全血よりプロテナーゼKを使ってDNAを抽出する.ACE遺伝子多型性の検討はRigatらの方法、アポE遺伝子の多型性の検討はHixson & Vernierの方法に従って解析した.すなわち対象者の全血より抽出したDNAより2種のプライマーを用いてPCRにてアポE遺伝子を増幅し、その後Hha Iにて制限酵素処理を行いポリアクリルアミドゲル電気詠動にて分離後得られるフラグメントサイズより遺伝子型を判定した。NIDDM患者ではIMT値は健常者よりどの年齢層においても高値を示した。アポEのE4,ACEのD遺伝子の有無は各々対象者の年齢、空腹時血糖、コレステロール値、血圧において、影響は認められなかったが、頚動脈のIMT値はACE遺伝子のDD型ではII型より、有意に高値を示した(1.2000±0.586mm vs. 0.990±0.364mm)。ところが、アポEのE4遺伝子は頚動脈のIMT値とは関連が認められなかった。一方、大腿動脈のIMT値とはACEアポE遺伝子ともに関連性は認められなかった。以上よりACEのD遺伝子はNIDDM患者の頚動脈壁肥厚の遺伝的危険因子であることが判明した。
黒曜石資源の獲得と消費からみた先史時代九州の社会変化に関する基礎的研究

本研究は、黒曜石資源の獲得と消費の様相から、先史時代九州の社会変化を探ろうとするものである。研究1年目の本年度は、佐賀県腰岳黒曜石原産地とその周辺遺跡の縄文時代初頭の様相を整理した。前者では、腰岳黒曜石原産地の踏査をおこない複数の先史時代遺跡を発見した。腰岳において、発掘調査が実施されている標高200mまでに約100か所の遺跡を発見しており、標高が下がるにしたがって、遺跡分布が西方から北方山麓に偏ることが明らかとなっている。また今年度は、一連の踏査によって得られた石器や原石などの資料群の分析をおこなった。後者では、縄文時代早期遺跡をターゲットとし、腰岳黒曜石原産地近傍の樽浦遺跡と、30km圏内の佐世保市岩下洞穴、松浦市平野遺跡の資料を用いて、黒曜石の搬入形態を検討し、原石形状や石器技術の分析作業を実施した。その結果、この時期の遺跡には径5cm大の亜角礫円礫の両原石を搬入し、矩形剥片の単設打面剥離、求心剥離、両極剥離によって、石器生産がおこなわれていることがあきらかとなった。また、生産される石器には、局部磨製石鏃のほか、掻器や抉入石器など豊富なスクレイパーの占める割合が多いことも明らかとなった。消費地の原石形状から、縄文時代早期には腰岳低標高部から山麓付近の小型原石を主に利用していること、このほか後期旧石器時代に主に利用される河川を下った段丘礫層の原石も利用が計測していることも確認した。今年度計画の当初の予定として、縄文時代早期の複数遺跡の石器群を対象として、黒曜石の搬入形態や搬入原石の形状、石器技術の分析をおこない、研究の見通しを得ることを目標としていた。今年度の調査によって、腰岳黒曜石原産地周辺の3遺跡の石器群の詳細な分析をおこなうことができ、搬入形態の詳細や原石形状の様相、石器技術が把握できたことは、おおむね当初の目標を達したと考える。今年度、腰岳黒曜石原産地周辺地域の縄文時代早期3遺跡について分析を進め、黒曜石原石の獲得から消費にいたる過程を明らかにした。原産地周辺では石器群が豊富にみられるという分析にかかる利点があるものの、石器技術のバリエーションが多岐にわたり、当該期人類が主要としていた石器技術の把握がやや難しい。そこで、佐賀平野部や福岡平野部など、原産地から50km圏内の遺跡を対象とした分析をすすめ、原産地周辺で認められた様相の相対化をおこないたい。その調査をもとに、縄文時代初頭の黒曜石資源獲得と消費にかんする成果を公表したい。並行して実施している、腰岳黒曜石原産地の調査についても採集石器等の分析、公表をおこない、消費地遺跡の石器群との関係について検討をおこなうこととしたい。並行して実施している、腰岳黒曜石原

産地の調査についても採集石器等の分析、公表をおこない、消費地遺跡の石器群との関係について検討をおこなうこととしたい。本研究では、旅費が研究内訳の多くを利用している。次年度にも複数回の九州地域への調査、また黒曜石原産地調査等で講師派遣を計画していることから、次年度の交付決定額が今年度よりも少ないことを念頭に置くと、次年度調査費用として利用することがより適切と判断したためである。使用計画としては、年度当初に予定している黒曜石原産地調査にかかる講師派遣の旅費に充てることを考えている。
ショウジョウバエ細胞における新規ペプチド鎖解離因子の探索

真核細胞は遺伝情報の維持・発現の過程で生じる異常mRNAを認識・分解する仕組み「mRNA品質管理機構」を備えている。本研究では、高等真核細胞における翻訳終結コドンを欠失したノンストップmRNAの分解機構解明を目的とした。その結果、ノンストップmRNA分解経路がショウジョウバエ細胞にも保存されていること、また、ABCE1(リボソーム解離因子)が関与していることを明らかにした。真核細胞は遺伝情報の維持・遺伝子発現の過程において生じた異常なmRNAを認識し分解する仕組み"mRNA品質管理機構"および、遺伝子発現調節および外来生物感染からの防御機構としてRNAiによる遺伝子発現抑制機構を備えている。"mRNA品質管理機構"はリボソームによる翻訳伸長・終結過程での異常を感知することで、遺伝子変異やmRNA成熟異常に起因して産生される異常mRNAを検出・分解することがわかりつつある。また、さまざまな理由で生じる内在性および外来性の二重鎖RNAがsiRNAの供給源となり、RNAi機構によって標的のmRNAが切断・分解されることが明らかとなっている。これら一見異なる"mRNA品質管理機構"とRNAiによる発現制御機構は、mRNAの分子内切断により標的mRNAの分解を引き起こし、終始コドンを欠失したmRNA(ノンストップmRNA)を産生しうる共通点を有する。本研究では、高等真核細胞におけるmRNA品質管理・発現調節機構によって引き起こされるmRNA内部切断、その結果産生されるノンストップmRNAの分解機構解明および、ノンストップmRNAの3'末端に達したリボソームの翻訳終結コドンに依存しない解離反応の分子機構解明を目的として解析を行った。その結果、酵母研究で既に明らかにされていたノンストップmRNA分解経路がショウジョウバエ細胞にも保存されていること、ならびにこれまで報告がなかったABCE1(リボソーム解離因子)がノンストップmRNA分解に関与することを明らかにした。申請者は、翻訳コドンを欠失したmRNA(ノンストップmRNA)および、ノンストップmRNAから産生されるポリペプチドの蓄積量や安定性の解析に、酵母の先行研究により詳細に解析がなされているGFPノンストップmRNA発現レポーターシステム(GFP-Rz)をショウジョウバエ細胞用へ改変して利用してきた。その中で、本研究課題を進める上での重要な下記の二つ疑問が生じた。1ショウジョウバエ細胞におけるGFP-Rz mRNAおよびポリペプチドの蓄積量や安定性から得られた結果は、内在遺伝子由来のmRNAが細胞質中で内部切断されることにより生じるノンストップmRNAにも共通して観察される現象であるか?それともGFP-Rz固有の現象であるか?2Rz(リボザイム)によるmRNAの内部切断効率が非常によいことから、GFP-Rz由来のノンストップmRNAは核内において生じている可能性が高い。核内でポリA鎖を欠失したmRNAは、核内の3'-5'エクソヌクレアーゼによって分解される。また、核内においてポリA鎖は、mRNAを細胞質へ輸送する非常に重要なIDの一つとして知られる。現段階では、ショウジョウバエ細胞において、ノンストップmRNAの核内での安定性および、細胞質への輸送機構の詳細は明らかとなっていない。ノンストップmRNAの翻訳に依存した細胞質中での安定性、および、そのノンストップmRNA由来のポリペプチド鎖の安定性に焦点を当てた解析を進めるために、ショウジョウバエ細胞におけるノンストップmRNAレポーターシステムの構築の必要性が生じた。そこで、過去の文献の中から、細胞内在遺伝子由来のmRNAで、かつ、細胞質中で内部切断されることが明らかとなっている遺伝子の検索を行った。この文献調査から、ショウジョウバエ細胞においてノンストップmRNA分解機構で分解されている可能性のある遺伝子をみつけた。当初計画していた、ショウジョウバエ細胞におけるノンストップmRNA分解を解析するためのシステムの構築に加え、リボソーム解離因子ABCE1の関与の検討を行い、それらの内容を論文にまとめて発表することができた。ショウジョウバエ細胞におけるノンストップmRNA分解機構の分子メカニズムを明らかにするために、先行している酵母細胞ノンストップmRNA分解の分子機構の解析を参考にして、今回新たに明らかにしたリボソーム解離因子ABCE1とPelota/HBS1に関して解析を進める。また、ショウジョウバエ細胞におけるノンストップmRNA分解経路の生理的意義の一つとして、RNAi機構により産生されるノンストップmRNAの分解経路の検討を行う。
ベンザインの位置制御法を基盤とする多置換芳香族化合物合成法の開発

当該研究者は、ベンザインに対する一級アミンの求核付加反応において、シリル基を配向基とすることで、位置選択的にアミン類を導入することに成功した。また、ホウ素置換ベンザインを温和な条件で発生させることに成功し、新しいホウ素置換芳香族化合物合成のためのビルディングブロックとして有用であることを示した。ケイ素及びホウ素官能基は反応後に多様な官能基変換が可能であるため、本法は多置換芳香族化合物の新規合成法として極めて有用である。ベンザインは高い反応性を示す中間体であり、これを利用した多彩な反応が知られている。しかし、非対称なベンザインの反応位置制御は一般に困難であり、反応後は分離困難な位置異性体混合物となる場合が多い。そこで申請者はベンザインの3位に電気的に陽性な原子(ケイ素やホウ素)を配置することで、この問題点を解決しようと考えた。1)シリルベンザインへのアミンの位置選択的求核付加反応申請者は、シリル置換ベンザインの位置選択的Diels-Alder反応を以前に報告している(Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,7673)。そこで今回、シリル置換ベンザインへのアミンの求核付加反応を検討した。その結果、フッ素アニオン存在下ベンザインを発生させると嵩高いオルト位へ選択的に求核付加反応が進行し、フッ素アニオンが存在しない条件でベンザインを発生させるとメタ位選択的に反応することが明らかとなった。2)温和な条件での3位ホウ素置換ベンザインの調製法の開発と位置選択的環化付加反応申請者は既に、ホウ素置換ベンザインを発生させることに成功していたが(平成19、20年度科研費)、過酷な反応条件が必要であったため適用可能な基質が限定されていた。そこで、温和な条件下で発生可能な前駆体を種々検討した結果、iPrMgCl-LiClを用いる温和な反応条件下、ホウ素置換ベンザイン発生させることに成功した。次に、発生させたホウ素置換ベンザインと種々の4π電子系化合物を反応させ、高位置選択的に環化付加体を得た(Angew.Chem.Int.Ed.accepted)。3)ホウ素置換ベンザインへのアミンの位置選択的求核付加反応アミン存在下、HMPA/THFを溶媒としてホウ素置換ベンザインを発生させると、ホウ素の近傍(オルト位)へ選択的にアミンの求核付加反応が進行した。一方、ピリジン中では完全に位置選択性が逆転し、ホウ素から離れたメタ位にアミンが選択的に求核付加することが分かった。本法では、溶媒の選択のみで位置選択性の制御が可能である。ベンザインは極めて高い反応性を示す中間体であり、これを利用した多彩な反応が知られている。申請者は昨年度までに、ケイ素およびホウ素官能基をベンザインの配向基として用い、アミン類の求核付加反応及びDiels-Alder反応を位置選択的に進行させることに成功している。本年度は、本法をヘテロ環や天然物合成に応用する研究、並びに新しいベンザイン発生法の開発研究を行った。a)ベンザインを用いたヘテロ環化合物の選択的合成ヘテロ芳香環は医薬品の生物活性発現に極めて重要であり、その合成法の開発は重要な研究課題である。我々は、シリルおよびホウ素置換ベンザインと官能基を有する1,3-双極分子との[3+2]環化付加反応を行い、位置選択的にヘテロ環化合物を合成するとこに成功した。このとき、ケイ素置換ベンザインとホウ素置換ベンザインでは全く逆の選択性を与えるため、本法を用いれば両位置異性体を作り分けることも可能である。b)シリルベンザインの位置選択的Diels-Alder反応を利用したaloinの骨格合成Aloinは、様々な疾病の治療に効果がある天然由来物質として知られており、aloinとその誘導体の生物活性に注目が集まっている。我々は、シリルベンザインとフラン類とのDiels-Alder反応を2回繰り返し用いることで、aloinに代表されるグリコシル基を有するアンスロン骨格を短工程かつ柔軟に合成可能な方法を開発することができた。ベンザイン発生法の開発研究は古くから活発に行われているが、その反応条件や前駆体合成法、経済性及び安定性に問題があった。我々は、安価かつ安定なノナフルオロブタンスルホニルフルオリド(NfF)を用いた新規ベンザイン発生法を開発し、従来法と比較して、安価かつ効率的にベンザインを発生させることに成功した。
筋の粘弾性特性を模擬した低体力者のための筋力トレーニング装置

筋は単に力を発生するのみならず,柔軟な動きをする弾性的な機能と適度なダンピングをする粘性的な機能を併せもっている。さらに,筋肉の粘弾性機能が優れている点は,その強さつまり粘弾性係数が機械のように一定でなく,脳からの命令によって自由に変化することである。本研究では,筋の可変粘弾性特性を運動生理学の手法を用いて分析すると共に一つの制御システムとして記述し,これを手がかりに筋の粘弾性機構を模擬したアクチュエータを開発する。さらに,この機構を高齢者・障害者など低体力者の安全な筋力リハビリテーション装置として利用することを目指した。研究はまずヒトの筋粘弾性特性を運動生理学的,運動力学的観点から調査し,これをもとに粘弾性トルクを発生するアクチュエータを開発した。次いで,この装置を用いて弾性負荷に対する追跡動作実験を行い,ウエーブレット変換を用いて追跡誤差の時間-周波数解析を行った。そして,この解析結果と筋の力学モデルを手懸かりとすれば,筋の弾性定数が推定できることを明らかにした。また,運動経験と筋弾性特性との関連を分析し,本装置と数理解析法によって運動経験の差異や特徴がとらえられるかどうか検討した。その結果,手関節を巧緻的,積極的に使う卓球やバドミントンの経験者と比較的粗大な運動である重量挙げや陸上競技の経験者の間に筋弾性特性に違いが認められた。このことは本方法が高齢者・障害者など低体力者のリハビリテーション効果を評価しうることを期待させるところであった。さらに,これまでの研究成果を応用し,低体力者の安全な筋力トレーニング装置を検討した。そこでは急激な力変化が起きにくい粘性抵抗を利用した運動様式に着目し,等粘性筋力トレーニング装置なるものを考案した。その結果,この運動負荷は等張性や等速性収縮でみられる運動前後あるいは運動中の急激な力変化がなく,滑らかな運動を可能とした。また,いずれの負荷強度においても広い範囲の運動が可能であり,かつ,この全域で規定した運動を遂行できた。これらの優れた特徴は高齢者・障害者など低体力者のトレーニングやリハビリテーションにおける安全な運動負荷装置の実用化に寄与できる。さらに,この機構を高齢者・障害者など低体力者の安全な筋力リハビリテーション装置として実用化することを目的とした。特に本年度は研究の初年度であり,まず,人の粘弾性特性を運動生理学,運動力学的手法によって解析し,本アクチュエータの設計に必要な要件を追究した。具体的には,予備的に試作した粘弾性抵抗を発生するユニットを用いて追跡動作実験を行った。追跡動作では,様々な強度の筋収縮を行わせながら目標値に対する位置制御を試行させ,その際の筋力,関節角度,関節角速度,筋電図を測定した。また,筋の微細構造を考慮した筋力学モデル「連成振動モデル」を新たに考案し,筋粘弾特性を推定するための理論的準備を行った。

そして,実験記録からウエーブレット変換を用いて追跡動作誤差の時間-周波数解析を行い,その結果と連成振動モデルを手がかりに,筋の弾性特性を推定した。その結果は従来の生理学的知見ともよい一致を示した。筋の粘性特性については今回試作したアクチュエータでは十分な特性が得られず,次年度の課題とした。筋は単に力を発生するのみならず,柔軟な動きをする弾性的な機能と適度なダンピングをする粘性的な機能を併せもっている。さらに,筋肉の粘弾性機能が優れている点は,その強さつまり粘弾性係数が機械のように一定でなく,脳からの命令によって自由に変化することである。本研究では,筋の可変粘弾性特性を運動生理学の手法を用いて分析すると共に一つの制御システムとして記述し,これを手がかりに筋の粘弾性機構を模擬したアクチュエータを開発する。さらに,この機構を高齢者・障害者など低体力者の安全な筋力リハビリテーション装置として実用化することを目的とした。本年度は,昨年度開発したアクチュエータユニットを用いて,様々な運動経験をもつ被験者を対象に,弾性負荷に対する手関節屈伸による追跡動作実験を行い,ウエーブレット変換を用いて追跡動作誤差の時間-周波数解析を行い,さらに,昨年度考案した連成振動モデルを手がかりに筋の弾性特性を推定した。そして,運動経験と筋弾性特性との関連を分析し,本装置と数理解析法によって運動経験の差異や特徴がとらえられるかどうか検討した。その結果,手関節を巧緻的,積極的に使う卓球やバドミントンの経験者と比較的粗大な運動である重量挙げや陸上競技の経験者の間に筋弾性特性に違いが認められた。このことは本方法が高齢者・障害者など低体力者のリハビリテーション効果を評価しうることを期待させるところであった。また,臨床現場への応用を目的としたアクチュエータユニットの開発にも着手し,次年度は高齢者・障害者を対象とした実証実験に入る予定である。さらに,この機構を高齢者・障害者など低体力者の安全な筋力リハビリテーション装置として利用することを目指した。本年度は,これまで研究開発してきた筋の粘弾性特性を模擬したアクチュエータを応用し,高齢者や障害者など低体力者の安全な筋力トレーニング装置を検討することにした。そこでは急激な力変化が起きにくい粘性抵抗を利用した運動様式に着目し,粘性負荷型筋力トレーニング装置なるものを考案した。つまり,粘性抵抗は油や水など自然界に広く存在し,水泳や漕艇はこれを利用したスポーツといえる。しかし,粘性抵抗に対する運動に関して,等張性や等速性収縮のように系統的な研究は行われていない。本研究ではこの運動様式を等張性収縮と等速性収縮の中間型と位置づけ,等粘性収縮と名付け,その力学的特性を比較分析した。
ヒト遺伝子ノックアウト白血病細胞株の作製とアポトーシスの分子機序の解析

グルココルチコイド(GC)によって誘導される白血病細胞のアポトーシスの分子機序を解明する目的で、GC感受性ヒト白血病細胞株Nalm6においてGCの標的遺伝子をターゲッティングベクターを用いてノックアウトした。標的遺伝子の1つであるRCAN1をノックアウトしたRCAN1-/-細胞は野性株に比べて著明にGCによるアポトーシスが抑制された。逆にRCAN1を強制発現した細胞株ではアポトーシス誘導の増強が認められた。以上の結果よりRCAN1遺伝子はGCによるアポトーシスを媒介する標的遺伝子の1つであると考えられた。小児白血病は小児の悪性腫瘍の中で最も頻度の高いものである。白血病の治療として用いられる化学療法剤は全て白血病細胞にアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘導することでその効果が発揮される。従って白血病細胞を用いた薬剤誘導性アポトーシスの研究からは、より効果的な化学療法剤の開発や薬剤耐性の克服に貢献する成果が期待される。本研究の目的はヒト白血病細胞株を用いてカスパーゼ遺伝子群、グルココルチコイド標的遺伝子をひとつずつ、更にできれば複数個ノックアウトした細胞株を作成し、グルココルチコイドを始めとする様々な刺激によって誘導されるアポトーシスがいかに変化するかを解析することである。本年度は以下に記す段階まで研究が進行した。1.ターゲッティングベクターの作成:ヒト白血病細胞株Nalm-6から抽出したゲノムDNAをもとにPCRを行い、Invitrogen社のMultiSite Gateway Systemを用いてターゲッティングベクターを作製した。以下に列挙した遺伝子に関してターゲッティングベクターが作製された。2.ターゲッティングベクターによる第一アレルのノックアウト:1.で作成したターゲッティングベクターをNalm-6細胞に導入した。翌日からハイグロマイシンを含む培地に替え、3-4週間で薬剤耐性クローンを得た。各耐性クローンの中からベクターが相同組換えを経て正しくゲノムに組み込まれているものをスクリーニングした。その結果以下の遺伝子に関して第一アレルのノックアウトまで進行した。CASP8, CASP10, DSCR1ターゲッティングベクターによる第二アレルのノックアウト:以下の遺伝子に関しては第二アレルのノックアウトまで進行した。CASP8, FKBP5グルココルチコイド(GC)は生体内で合成されるステロイドホルモンであるが、一方で白血病細胞にアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘導することから、化学療法剤の一つとして必須のものである。しかしながら細胞死誘導の分子機序は不明な点が多い。GCは転写因子であるGC受容体(GR)を介して主な生理機能を発揮する。我々はマイクロアレイ法を用いて複数のGRの標的遺伝子を同定している。GCによってアポトーシスがおきるヒト白血病細胞株Nalm6は、ターゲッティングベクターを用いて比較的容易に遺伝子のノックアウトが可能であることが知られている。本研究では、Nalm6細胞株を用いてGCの標的遺伝子のうちFKBP5とRCAN1を相同組換えによりノックアウトした。一方FKBP5とRCAN1の発現ベクターを遺伝子導入し、それぞれの遺伝子の高発現株も作製した。これらの細胞株を用いて、GCによるアポトーシスへ与える影響について解析した。FKBP5の高発現とノックアウトによるアポトーシスへの著明な影響はみられなかった。一方RCAN1のノックアウトにより、GCによるアポトーシスは有意に抑制され、高発現によりアポトーシスは有意に促進された。RCAN1のアポトーシスに与える影響はGCによって誘導されるものに特異的であった。以上の結果より、少なくともRCAN1はGCによる白血病細胞のアポトーシスを媒介する分子であることが示された。現在RCAN1のノックアウトはヘテロの状態であるので、今後残る対立遺伝子もノックアウトされた細胞株を作製し、解析を続ける予定である。グルココルチコイド(GC)は生体内で合成されるステロイドホルモンであるが、一方で白血病細胞にアポトーシスと呼ばれる細胞死を誘導することから、化学療法剤の一つとして必須のものである。本年度も引き続きNalm6細胞株を用いてGCの標的遺伝子のうちRCANIを相同組換えによりノックアウトすることを試みた。その結果昨年度作製済みのヘテロのノックアウト細胞に加えてホモのノックアウト細胞(-/-細胞)の作製に成功した。GCによるアポトーシスはRCAN1遺伝子のアレル数に依存しており、-/-細胞ではアポトーシスが著しく阻害された。一方でRCAN1を強制発現した細胞ではアポトーシスの増強が認められた。RCAN1遺伝子によるアポトーシス制御作用はGCによるものに特異的であり、TRAILにより誘導されるアポトーシスには影響を与えなかった。

更にNalm6同様GCによりアポトーシスが誘導される697細胞を用いてsiRNAでRCAN1遺伝子の発現を抑制したところ、やはりGCによるアポトーシスは抑制された。以上のことより少なくともRCAN1はGCによる白血病細胞のアポトーシスを媒介する重要な分子であることが示された。
B.スメタナの音楽と思想-「チェコ国民楽派」の視座から-

本研究は、19世紀チェコの作曲家B・スメタナの音楽と思想について、それを「国民楽派」の視座から再考したものである。ここではとくに、19世紀、西洋音楽の発展における「民族主義」の実現として、スメタナの「交響詩」の美的諸相に焦点をおいて洞察し、さらに「受容」の観点からも彼の理念を追求していった。標題音楽のカテゴリーに属する交響詩は、音楽外的理念に基礎をなすものとして、F・リストによって開拓されたジャンルであり、それはまた、音楽における「ナショナリズム(民族主義)」の現象とほぼ同時代に生起した方向として理解される。そして、「チェコ国民楽派」の創始者と称されるスメタナは、(従来の)フォークロリズムの音楽に基づく保守的な民族主義に対し、寧ろプラハの美学思想の影響のもとに、より具象的な標題音楽を掲げて西欧の「新ロマン主義」をめざしたのであった。同研究は、そうしたスメタナの「交響詩」の中から最も著名な《我が祖国》(1874-79)に注目し、その美的諸相(美質)について深く洞察したものといえる。本研究で得た新たな知見は以下の通りである。1.スメタナは(同作品の中で)、何よりも「民族復興」の理念に基づいて、チェコ古代の神話・伝説・中世フスの宗教改革といったチェコ民族の栄光の歴史を「象徴的に音楽化」することにより、また国民的生活や自然を描写することによって、いわゆる詩的で理想的な音楽を追求していったと見ることができる。2.即ち、ボヘミア地方の伝統的音楽を、スメタナは「詩と音楽の統合」という、当時ヨーロッパの進歩的な思想の中へと象徴的に融和することによって19世紀のチェコにより相応しい「近代的な国民音楽」を創作しようとしたのである。そして、3.このジャンルにおけるスメタナの貢献を考えるなら、それは、音楽を通して「民族主義」と「モダニズム(近代主義)」の理念の融合をいかに成し遂げたのかを明らかにした点にあったと考えられる。本研究の成果は、「スメタナ『交響詩』の美学:19世紀における『民族主義』の実現」と題して美学会誌『美学』に投稿中である。本年度は研究初年ということで、その基礎的な洞察として歴史的・文化史的な側面に注目し、「民族主義の音楽」の意味や「チェコ国民音楽」の概念の問題を、19世紀プラハの美学思想に言及しつつ検討を行なった。具体的な研究の視点と本年度に得た新たな知見は以下の通りである。(1)19世紀以降「チェコ国民音楽」の概念は、まずヘルダーの思想に基づくフォークロリズムの音楽の方向と、当時ヨーロッパの進歩的プログラムに沿った「標題音楽」の方向の中で論議された。即ち、民謡の模倣に依拠する方向を否定したスメタナは、プラハの美学者O.ホスチンスキーが提唱する「詩と音楽の融合による国民芸術の創造」という思想を受け継ぎ、またリストらによる新ロマン主義音楽全盛の影響を受けて「具体的な形式による創作」を標榜し、近代芸術としての「国民音楽」の理念を確立しようとした。スメタナの思想は、国民様式の決定における美的価値基準をめぐる「受容」の問題として、つまり批評家ネイェドリーのスメタナ擁護論を通してより明確化されたといえる。それらの知見は「20世紀前半の『国民楽派』受容」として日本音楽学会誌に投稿し採択された。

(2)とりわけ民族主義の局面としてスメタナの音楽の内容性に認められる「英雄なるもの」と「素朴なるものの」の存在という相補的側面について、いわゆるロマン主義とリアリズムの両面からスメタナの精神世界をより深層的に考察するに至った。そのようなスメタナのリアリズム思想がいかに20世紀チェコ・オペラにも踏襲されているのかを、民族藝術学会誌にも一部発表した。本年度は、主にスメタナの思想面に注目し研究を行なった。さらに次年度は、これらの知見を作品分析と有効に関係づけらがら、詩と音楽の統合としての「交響詩」を中心に分析的研究に取り組み、スメタナが「民族主義」と「モダニズム」の融合をいかに実現していったのかを探る。本年度は一昨年の研究成果を基盤とした上で、スメタナの音楽思想の実現として、具体的に交響詩《我が祖国》(1874-79)を取り上げ、詩と音楽とがいかに融合されているのかを論点として、詳細な楽曲分析を行ない、19世紀のチェコにおける民族主義美学の実現の諸相について洞察した。本年度に得た知見は以下の通りである。(1)標題音楽のカテゴリーに属する交響詩は音楽外的理念に基礎をなすものとして、F.リストによって開拓されたジャンルであり、それはまた音楽における「ナショナリズム(民族主義)」の現象とほぼ同時代に生起したものであった。今日「チェコ国民楽派」の創始者と称されるスメタナは、従来のフォークロリズムの音楽に基づく保守的な民族主義に対し、プラハの美学思想の影響のもとにより具象的な標題音楽を掲げ、西欧の「新ロマン主義」をめざしたのである。本研究では、スメタナが特に「民族復興narodniobrozeni」の理念を基軸としながら、チェコ古代の神話・伝説・中世フスの宗教改革といったチェコ民族の栄光の歴史を「象徴的」に音楽化することにより、また国民的生活や自然を描写することによって、詩的で理想的な音楽を追求していった点を明らかにした。またスメタナの作品中に引用されている<チェコ・カンツィオナール>に関する考察についても、「音文化にみる伝統の諸相」として紀要にまとめ、発表した。(2)スメタナはこうして、ボヘミアの伝統的音楽を詩と音楽の統合という当時ヨーロッパの進歩的な思想の中に「象徴的」に融和することによって、19世紀のチェコにより相応しい「近代的」な国民音楽を創作しようとしたといえる。同ジャンルにおけるスメタナの貢献に注視するなら、それは、いかにして「民族主義」と「モダニズム(近代主義)」の理念の融合を成し遂げたのかを、標題音楽を通して具体的に示した点にあったと考えることができる。
地震動の方向性も考慮した橋梁システムの耐震・制震設計法に関する研究

本研究は,都市域に存在する高架橋システムの耐震設計法について,これまで,難解のため設計法まで確立できていなかった実地震動により近い水平2方向あるいは,鉛直動も含めた地震動が入力されたときの挙動を考慮した耐震設計法を確立することが主目的である.橋梁は複数の橋脚からなる線的に連なった構造物で,建築構造物とは地震時挙動に特徴的な違いが存在する.本研究ではこの点に着目し,制震部材の導入を含めた解析的な検討を行っている.本研究は,都市域に存在する高架橋システムの耐震設計法について,これまで,難解のため設計法まで確立できていなかった実地震動により近い水平2方向あるいは,鉛直動も含めた地震動が入力されたときの挙動を考慮した耐震設計法を確立することが主目的である.橋梁は複数の橋脚からなる線的に連なった構造物で,建築構造物とは地震時挙動に特徴的な違いが存在する.本研究ではこの点に着目し,制震部材の導入を含めた解析的な検討を行っている.本年度は,橋梁システムとして,鋼製橋脚を有する連続橋を対象として,水平2方向地震動が入力されたときの挙動について解析的に検討した.得られた結論として以下のものがあげられる.1)箱形断面を有する鋼製橋脚は,2方向地震動を受ける際に,断面隅角部にひずみが集中する傾向がある.2)円形断面の有する鋼製橋脚は,2方向地震動を受ける際に,基部に箱形断面の際に見られるほど,ひずむは集中しないが,1方向地震動入力時に比べて,平均的に大きなひずみが発生する.3)円形断面を有する鋼製橋脚は,比較的薄肉な場合,1方向入力時と2方向入力時とでは,面外変形の集中部分に大きな差はないが,比較的厚肉な場合,変外変形の大きな部分が2方向入力時には,基部付近ではなく,それよりも上部に発生することが分かった.4)結果として,これまでの1方向地震動における耐震設計法のうち,限界値としての基準は,比較的,薄肉な場合においては,2方向地震動入力時においても利用が可能であるが,比較的厚肉な場合には,2方向地震動時には基部よりやや上部が早期に耐力を減少させる変形を生じるため,必ずしも1方向地震動に対する限界値は適用することはできないことが判明した.4)これらの成果は定性的に解明したにすぎず,次年度にてパラメトリックスタディを実施することで,さらに定量的判断が下せるよう研究を進める必要がある.本年度は,橋梁システムとして,鋼製橋脚を有する連続橋を対象として,水平2方向あるいは,鉛直動も含めた地震動が入力されたときの挙動について解析的に検討した.得られた結論として以下のものがあげられる.1)2方向地震動をうける橋梁システムの挙動は複雑であるが,線的な構造システムであるため,その挙動に一定の傾向をつかむことができた.2)ただし,特定の地震動に対する検討のみであるので,これらの成果から抽出できる定性的な評価が望まれる.3)本年度は鉛直動の影響についても検討した.その結果,宮城県にて観測された地震動のように鉛直動の非常に大きい地震動の場合,鉛直動の影響によって,橋脚の耐震性能が変化することが分かった,4)鉛直動については,影響の程度は確認したものの,その影響を考慮した設計法を確立するまでにいたっておらず,さらなる検討を必要とすることをまとめた.5)例えば,鉛直動の影響により,鋼製パイプ断面橋脚基部の座屈変形は,大きく異なることを解析的に明らかにした.これらは,橋脚の保有性能を評価する上で,重要な現象であり,今後,この影響を考慮した保有性能評価が望まれる.6)橋梁システムとして,制震部材の導入を試みた数値解析を実施したところ,一定の効果は見られるものの,定量的な判断に乏しい結果となった.今後,さらに検討を続け,特に,固有周期に着目した検討を実施すべきであることを確認した.
膀胱知覚および組織障害に対する一酸化窒素の役割

一酸化窒素は血管内皮から産生される気体の神経伝達物質として同定された。一酸化窒素は生体内の様々な機能の調節に重要であることが明らかにされてきている。膀胱や尿道などの下部尿路の機能の調節においても、一酸化窒素は重要な役割を演じることが明らかにされつつある。一酸化窒素は3種類の合成酵素である神経型(nNOS),上皮型(eNOS),誘導型(iNOS)の合成酵素により産生される。一酸化窒素そのものとしては、下部尿路機能調節に重要とおもわれるが、3種類のNOSそれぞれが下部尿路機能に対してどのような役割をおこなうのかについては未だに明らかにされていない。そこで今回我々は、一酸化窒素の合成酵素のノックアウトマウスを用いて、3種類のNOSの膀胱知覚および組織障害に対する役割を調べた。また今後、3種類のNOSの内2種類をノックアウトしたマウスを用いて、NOSの下部尿路機能に対する役割を詳細に調べる。3種類の一酸化窒素合成酵素のノックアウトマウスを用いて、膀胱内生理食塩水持続注入による膀胱内圧測定を行う。まず、麻酔下に膀胱瘻を作成し、麻酔から回復するまで待つ。その後に無麻酔下に膀胱内に生理食塩水を持続的に注入し、膀胱内圧測定を行う。またサイクロフォスファミド膀胱炎モデルを作成して、組織障害に対するそれぞれのNOSの役割について調べる。同様の実験をダブルノックアウトマウスを用いて行う。これまでの知見としてiNOS由来のNOが膀胱知覚に対して促進的に作用することが明らかになった。そのほかのNOSの役割について調査中である。
パリ亡命ロシア文壇の言説空間に関する研究：「亡命文学」概念の生成現場として

2018年9月に1週間にわたる資料収集出張(イェール大学付属バイネキ稀覯書手稿図書館、米国ニューヘイブン市)を行い、ニーナ・ベルベロワ旧蔵のホダセヴィチ手稿群を中心に、亡命ロシア文学関連の一次史料を閲覧・撮影した。この出張により、本研究計画で予定していた資料収集出張は国内・国外とも、すべて予定どおり完了することができた。収集した資料多数は鋭意分析中であるが、得られた知見の一部を生かし、論文「詩人の誕生:若きホダセヴィチと初期詩篇」を当該年度中に執筆・発表することができた。これは、亡命期を含むホダセヴィチの全創作を視野に、彼の若年期の人生経験が創作に及ぼした影響を考察した論文である。発表雑誌は査読誌ではないが、オープンアクセスにより広く閲覧や批判が可能となっている。研究計画の最終年度であるため、総括として「科研費ワークショップ:革命前後のロシア文学」と題する研究集会を自ら組織・開催した(2019年2月16日、於駒澤大学駒沢キャンパス)。研究集会の冒頭では、研究代表者(三好)が1時間余りの講演「ホダセヴィチの国外アーカイブ」を行い、本研究計画での資料収集結果の概要を報告したほか、今回特に招へいした専門分野の近い研究者2名に関連講演を行っていただいた。さらに各講演の内容に基づき、来聴者もまじえ全員でディスカッションを行った。本研究の意義、あるいは究明すべき今後の課題について多くの知見を得ることができ、研究期間の締めくくりにふさわしい充実した研究集会であったと考えている。本課題の研究期間はとりあえず終了するが、予想を超える大量の一次史料を収集することができたため、さらなる研究の展開をめざし分析を続けてゆきたい。研究計画の初年度は資料収集と分析に重点を置き、研究対象の中心である詩人ホダセヴィチのパリ亡命下における文筆活動や、彼とナボコフの協働、周辺の文壇事情等に関する各種資料を収集するとともに分析を進め、次年度以降の研究に向けて基盤を整備した。また、成果発表については当初、2年目以降を予定していたが、本年度に研究成果の一部を発表する機会を得て、亡命初期のホダセヴィチの文筆活動に関する論考を共著書の形で発表した。それぞれ、具体的には下記の通りである。次年度以降に集中的に行う予定の、日本国外における資料収集に向け、必要な準備が整ったと考える。1.資料収集:パリ亡命ロシア文壇(ホダセヴィチ、ポプラフスキー、ゲオルギー・イワーノフなど)、および隣接領域(プラハにおける亡命ロシア文壇)に関わる各種の博士論文(欧米大学のもの)を購入した。また、北海道大学に出張し(平成28年3月14日17日)、附属図書館の所蔵する関連資料(北海道大学スラブ研究センター旧蔵本)を閲覧・複写した。2.成果発表:共著書『18世紀ロシア文学の諸相』(金沢美知子編、水声社、平成28年3月刊行)において「ヴラジスラフ・ホダセヴィチと18世紀ロシアー評伝『デルジャーヴィン』をめぐって」の項を担当した。この文章は、研究代表者自身が『日本18世紀ロシア研究会年報』第9号(平成25年刊行)に発表した単著論文「ヴラジスラフ・ホダセヴィチと18世紀ロシアー評伝『デルジャーヴィン』の理解に向けて」を原型としつつも、本年度の科学研究費による研究で得られた知見に沿って加筆・改稿を施したものであり、パリ亡命時代初期のホダセヴィチの文筆活動を扱っている。当該年度は日本国内における資料収集(図書購入と北海道大学図書館への出張)について、概ね計画通りの進捗を達成することができた。2年目以降に順次行う予定であった成果発表については、本年度に一部を前倒しで行うこともできた。他方、国外における資料収集出張については、研究代表者の所属機関・学会の公務や研究上の都合、および欧米・ロシアにおける治安情勢を考慮して、実施を約半年延期することとした。すなわち、平成27年度に実施予定であった初回の国外出張(ロシア)は、平成28年夏に行うことにしている。前年度に引き続いて資料収集と分析に重点を置き、研究対象の中心である詩人ホダセヴィチのパリ亡命下における文筆活動や、彼とナボコフの協働、当時の文壇事情等に関する各種資料を収集した。国外における集中的な資料収集に着手したのが、今年度の特徴である。また、今年度以降は成果発表にも軸足を移してゆく計画であったが、概ね当初の予定どおり、単著論文1本を発表し、口頭発表1回を行うことができた(各々テーマは異なっており、口頭発表については翌年度以降に論文化する予定)。具体的には下記のとおりである。1.資料収集:パリ亡命ロシア文壇、および隣接領域に関わる各種の博士論文(欧米大学のもの)を日本国内で購入した。また、ロシア連邦サンクトペテルブルク市に資料収集出張し(平成28年9月2日12日)、国立図書館、新刊書店、古書店において多数の資料を収集した。2.成果発表:論文「大戦と革命の試練の下で: V・F・ホダセヴィチ盛期モスクワ詩篇をめぐって」(『駒澤大学外国語論集』第21号、221ー248頁。平成28年9月刊行)を発表した。この論文は、亡命期ホダセヴィチ詩の基盤である、盛期ホダセヴィチ詩学の確立過程について新たな知見を提示するものである。また、「戦間期ヨーロッパのロシア世界(ルースキイ・ミール)」研究会(平成29年2月16日、於駒澤大学会館246)において、口頭発表

「亡命期ホダセヴィチ詩篇を読む:『ソレントの写真』」を行った。内容は、亡命ホダセヴィチ詩篇の代表作の一つについて詳細な注釈を加えるものである。研究代表者の公務や現地治安情勢などのため前年度に実施を見合わせていたロシアでの資料収集出張を、半年遅れたものの計画通りの内容で実施することができた。また、成果発表についても、概ね計画どおりのペースで行うことができた。他方、当該年度末に予定していたアメリカでの資料収集出張は、諸般の事情から実施を約半年延期し、平成29年夏に行うことにしている。前年度に引き続いて資料収集と分析に重点を置き、研究対象の中心である詩人ホダセヴィチの亡命下における文筆活動や、当時の文壇事情に関する多数の資料を収集した。ロシアと米国において集中的に収集活動を行い、ロシアにおいてはアクセスの難しい学位論文、米国においてはホダセヴィチ自筆のものを含む一次史料を入手したのが、本年度の収穫である。本年度は資料収集が予定を大きく上回る進展をみた一方、成果発表は行っていない。現在、収集資料を鋭意分析中であり、次年度にその成果をまとめて発表する予定である。本年度の活動の詳細は下記のとおりである。1.「ロシア国立図書館」に資料収集出張(モスクワ市、平成29年8月15日23日):亡命ロシア文壇の構造や人間関係を扱うロシアの最新の学位論文を多数入手し、ソ連崩壊ののち進展の著しいロシア本国における亡命ロシア文学研究の状況を把握するとともに、亡命ロシア文壇に関する様々な知識を得ることができた。2.コロンビア大学付属「稀覯書手稿図書館」に資料収集出張(ニューヨーク市、平成29年9月2日11日):亡命ロシア文学に関する世界有数のアーカイヴである同図書館蔵「バフメーチェフ・アーカイヴ」を利用し、その一部をなす「カルポヴィチ文書」(ニーナ・ベルベロワ旧蔵のホダセヴィチの遺稿や遺品多数を含む)を中心に集中的な調査を行い、必要な資料を筆者あるいは写真撮影した。なお、当該年度にはこのほか、フランス国立図書館(パリ市)における資料収集(平成30年3月22日31日)も行っているが、年度末のため形式上は次年度予算からの支弁扱いとなるため、上記には含めていない。前年度まではやや遅れていた資料収集出張について、ほぼ計画通りのスケジュールに戻すことができ、収集できた資料も質・量ともに予定を上回る。一方、成果発表は予定よりやや遅れ、次年度に多くを持ち越すこととなった。総合的には、概ね順調な進展と考えられる。2018年9月に1週間にわたる資料収集出張(イェール大学付属バイネキ稀覯書手稿図書館、米国ニューヘイブン市)を行い、ニーナ・ベルベロワ旧蔵のホダセヴィチ手稿群を中心に、亡命ロシア文学関連の一次史料を閲覧・撮影した。この出張により、本研究計画で予定していた資料収集出張は国内・国外とも、すべて予定どおり完了することができた。収集した資料多数は鋭意分析中であるが、得られた知見の一部を生かし、論文「詩人の誕生:若きホダセヴィチと初期詩篇」を当該年度中に執筆・発表することができた。これは、亡命期を含むホダセヴィチの全創作を視野に、彼の若年期の人生経験が創作に及ぼした影響を考察した論文である。発表雑誌は査読誌ではないが、オープンアクセスにより広く閲覧や批判が可能となっている。
無細胞系ギガスクリーニング法の開発と応用

蛋白質・核酸などの機能分子創製技術は、生命科学・工学、あるいは医療等の産業において、最重要な研究課題のひとつであるものの、これらは精密な分子設計が不可能であるため、膨大なライブラリーを構築し、機能によるスクリーニングする系の開発が欠かせない。本研究では、容積1pL程度の微小液滴中で様々な生化学・分子生物学的反応が可能な系を構築し、酸化還元酵素や、トランスグルタミナーゼ、RNAポリメラーゼなどの酵素を対象として、ギガ(10の9乗)スケールの分子スクリーニングが可能なシステムを構築した。さらに本システムの効率向上を目的として、均一にかつ高速に水/油エマルジョンを作製できる装置も合わせて開発した。本研究は申請者らが独自に開発した、エマルジョンPCRと無細胞蛋白質合成系を組み合わせたDNA-蛋白質のビーズディスプレイ技術を用い、非常に大規模なライブラリー(10の9乗)を構築し、セルソーターによりスクリーニングする、ギガスクリーニングシステム(GSS)を確立する。本手法を用いて、新規な酵素や蛋白質をメタゲノムライブラリーから「探索し」、進化分子工学に応用して新機能タンパク質を「創り出す」ことで、バイオテクノロジーのイノベーションに寄与することを目的としている。酵素アッセイシステムへの応用については、Phanerochaete chrysosporium由来セルラーゼとマンガンペルオキシダーゼのアッセイ系の構築を目指して検討を行った。まずエンドグルカナーゼについては、種々の反応条件等の検討を行い、カルボキシメチルセルロースを基質とし、ベータグルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼと共役させた酵素アッセイシステムの最適化を行った。またマンガンペルオキシダーゼ系については、まず大腸菌由来無細胞タンパク質合成系により、活性体として合成され、ビーズ上に提示させた状態で、ペルオキシダーゼ活性を有していることを確認した。さらに本酵素に対応した蛍光によるアッセイ法を確立した。一方本システムを転写因子の結合DNA配列のエンジニアリングへの展開を目指し、DNAのビーズディスプレイにより、転写因子の結合DNA配列決定に用いた。またエマルジョンの安定化について検討を行い、安定な界面活性剤の配合を見出した。申請者らが独自に開発した、エマルジョンPCRと無細胞蛋白質合成系を組み合わせたDNA-蛋白質のビーズディスプレイ技術を用い、非常に大規模なライブラリー(10の9乗)を構築し、セルソーターによりスクリーニングする、ギガスクリーニングシステム(GSS)を確立することを目的として研究を行なっている。今年度は以下の様な成果が得られた。1)昨年度に開発したDNA結合タンパク質を利用したビーズへの提示法を、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼに適用したところ、両方のタンパク質共にビーズ上に提示され、チラミドを用いたアッセイ系により、ビーズ上で活性を確認することができた。さらにセルソーターを用いて、ハイスループットにスクリーニング可能であることを示した。2)マイクロフォーカシング法によるW/Oエマルジョン作製装置を改良し、より均一なエマルジョンを作製することに成功した。3)T7RNApolymerase活性のスクリーニング系を、より高活性なRNAリガーゼ活性を有するリボザイムを用いて行い、ランダムライブラリーのスクリーニングに適用した。1)ハイスループットスクリーニングにおいてその定量性は、重要なポイントである。まずビーズ1個あたりに固定化されるDNA量や蛋白質量は、できるだけ均一な方が望ましい。そこでマイクロフォーカシング法によるエマルジョン作製法を適用し、均一なエマルジョンを高速に作製することに成功した。2)対象酵素として西洋わさびペルオキシダーゼを取り上げ、その無細胞タンパク質合成系による発現に成功し、ビーズ上に活性体として提示することができた。さらにFACSスクリーニングに対応したアッセイ系を構築し、モデルライブラリーを用いたスクリーニングに成功した。またPhanerochaete chrysosporium由来マンガンペルオキシダーゼの無細胞蛋白質合成系による発現条件を検討し、各種シャペロンの効果を明らかにした。さらにビーズ上での活性発現、およびエマルジョン中での酵素活性を確認した。4) DNA結合タンパク質を用いた新規なビーズーDNA-タンパク質複合体構築をこころみたところ、抗体を介した従来法より約10倍近くビーズ上へのタンパク質の提示量を増大させることに成功した。5)DNAライブラリーをディスプレイさせ、転写因子に結合する配列を取得した。

申請者らが独自に開発した、エマルジョンPCRと無細胞蛋白質合成系を組み合わせたDNA-蛋白質のビーズディスプレイ技術を用い、非常に大規模なライブラリー(10の9乗)を構築し、セルソーターによりスクリーニングする、ギガスクリーニングシステム(GSS)を確立することを目的として研究を行なっている。今年度は以下の様な成果が得られた。1)一作年度に開発したDNA結合タンパク質を利用したビーズへの提示法を、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼに適用したところ、両方のタンパク質共にビーズ上に提示され、チラミドを用いたアッセイ系により、ビーズ上で活性を確認することができた。さらにセルソーターを用いて、ハイスループットにスクリーニング可能であることを示した。2)マイクロフォーカシング法によるW/Oエマルジョン作製装置をさらに改良し、均一性の高いなエマルジョンを短時間に作製することに成功した。さらに本装置を用いて、T7RNApolymeraseの活性スクリーニングシステムおよび蛋白質提示システムにおいてより定量的なアッセイが可能であることを示した。3)本ビーズディスプレイをDNA-転写因子の結合解析に用い、ゲノムSELEXによる結合配列濃縮の濃縮度評価を行った。最終的に次世代シーケンスにより解析したところ、非常に効率よく結合DNA配列を検出することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物工学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初、糖鎖結合配列スクリーンングシステムへの応用を目指していたが、タンパク質のフォールディングの問題で、結合活性が安定せず、断念した。現在までのところ、当初予定していたセルラーゼのアッセイシステムの構築には失敗したものの、新たにアミノ酸オキシダーゼのビーズ上でのアッセイ測定法を構築しつつあり、西洋わさびペルオキシダーゼ、カビ由来マンガンペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびアミノ酸のオキシダーゼの合計4種類の酵素のビーズ上でのアッセイシステムを確立、および確立ししつつある。これまで既に西洋わさびペルオキシダーゼのビーズディスプレイと活性スクリーニングシステムの構築に成功している。また他の3種類の酵素についても無細胞系での活性発現と、ビーズ上への提示に成功している。またエマルジョンの均一化については当初予定したマイクロチャネルによるエマルジョン作製方法が、デッドボリュームが大きく、また装置の安定運転に困難が伴うなどの問題に直面した。そこでマイクロフォーカシング法に変更したところ、十分実用に耐えうる簡便さで非常に均一なエマルジョンを作製することができており、今後スクリーニングの精度を飛躍的にあげられると期待している。基本的には当初の方針通りに、ビーズ上にタンパク質分子を提示し、酵素活性ベースのスクリーニングシステムを開発する。また加水分解酵素、酸化還元酵素に続き、合成酵素、結合タンパク質についても検討を行う。
有用な生物活性を有するC型レクチンドメイン含有蛋白質コード遺伝子の網羅的解析

ヘビ毒に含まれる様々な生物活性を有する種々のC型レクチン様ドメイン含有蛋白質のゲノム構造を解析する試みの第一歩として、まずハブ・ゲノムライブラリーを作製し、このライブラリーより血液凝固IX因子/X因子結合蛋白質(IX/X-bp)(A・B2つのC型レクチン様ドメインが一つのS-S結合で繋がったヘテロダイマー)のA鎖遺伝子を単離し、塩基配列を解析した。その結果、このC型レクチン様ドメイン一個からなる蛋白質コード遺伝子には、他のC型レクチン(様)ドメイン遺伝子には無い特徴的なイントロンの存在が明らかになった。すなわち、ハブ血液から細胞分画により白血球を分離し、定法に従ってゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAを制限酵素Sau 3A1で部分切断し、アガロース電気泳動により断片の大きさを確認後、制限酵素Bam H1で切断したベクターLambdaEMBL3にライゲーションした。これをパッケージングして、1.6x10^5個の独立したクローンを含むハブ・ゲノムライブラリーを作製した。ハブ毒腺cDNAライブラリーより単離したIX/X-bp A鎖cDNAを含む大腸菌クローンを培養し、プラスミドを調製した。これから、インサートDNAを制限酵素Sal I及びNot Iによる消化により切り出してA鎖全長cDNAとし、これをDIGラベルすることにより、A鎖全長プローブを作製した。また、A鎖全長cDNAを制限酵素Bss HIIにより切断し、IX/X-bp A鎖のN末端側約1/3を含むA-5'cDNAと、IX/X-bp A鎖のC末端側約2/3を含むA-3'cDNAを調製し、これらもDIGラベルした。上記ハブ・ゲノムライブラリーについて、DIGラベルしたA鎖全長プローブ等を用いてスクリーニングし、IX/X-bp A鎖遺伝子を含むクローンを単離し、その塩基配列を解析した。その結果、IX/X-bp A鎖遺伝子はこれまでに知られている動物レクチン遺伝子のうち、第VIIグループのC型レクチンに似たエキソン・イントロン構造を有していることが判った。遺伝子中心付近に挿入されたイントロンは、アシアロ糖蛋白質受容体など他のC型レクチン遺伝子にはみられないもので、IX/X-bpに特徴的なドメイン・スワッピングとの関連が示唆された。ヘビ毒に含まれる様々な生物活性を有する種々のC型レクチン様ドメイン含有蛋白質のゲノム構造を解析する試みの第一歩として、まずハブ・ゲノム中に存在する抗凝固蛋白質である血液凝固IX因子/X因子結合蛋白質(IX/X-bp)遺伝子の単離を試みた。ハブ血液から細胞分画により白血球を分離し、定法に従ってゲノムDNAを抽出した得られたゲノムDNAを制限酵素Sau 3A1で部分切断し、アガロース電気泳動により断片の大きさを確認後、制限酵素Bam H1で切断したベクターLambdaEMBL3にライゲーションした。これをパッケージングして、1.6x 10^5個の独立したクローンを含むハブ・ゲノムライブラリーを作製した。ハブ毒腺cDNAライブラリーより単離したIX/X-bp A鎖cDNAを含むクローンを培養し、プラスミドを調製した。これから、インサートDNAを制限酵素Sal I及びNot Iによる消化により切り出しA鎖全長cDNAとし、これをDIGラベルすることにより、A鎖全長プローブを作製した。