hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
製品再生ライフサイクル志向の循環型生産・物流システムのモデル化と評価

本研究は、リユース・リサイクルによる製品の資源循環におけるモノの流れに着目し、組立・分解作業に伴う製品/素材の価値・利益の創出とともに、物流のエネルギー消費で排出してしまう配送・回収のCO2排出量の削減を同時に目指して、資源循環による生産・物流の経済性と環境負荷についての見える化と評価を行った。具体的には、循環型と低炭素型のサプライチェーン設計課題の整理、環境に調和しかつ、経済的な生産・物流システム構成のモデル化および評価と、リサイクル率、CO2排出量および経済性の分解システム設計を行った。本研究では、リユース・リサイクルによる製品の資源循環すなわちモノの流れに着目し、組立・分解による製品/素材の価値・利益の創出と、物流のエネルギー消費で排出してしまう配送・回収のCO2量の削減を同時に目指して、生産・物流の経済性および環境負荷の見える化と評価を行う。本年度の主な研究成果は以下である。1.回収される使用済み製品について、リサイクル率を維持しながら利益を最大化するように、部品ごとに分解あるいは廃棄を決める最適な部品選択法を提案した。さらに、選択される部品の分解作業が分解ラインの作業編成に影響することに着目し、その部品選択のもとで最適な作業編成を行う分解システム設計法を手順化した。この成果の一部は、国際会議APIEMS2012における研究協力者の発表論文で、Best Student Paper Awardを受賞した。2.使用済み製品のリサイクルを行う素材仕分け分解システムについて、素材の流れを待ち行列のシミュレーションや数値解析によってモデル化した。また、具体的な製品CADモデルの例を適用したシミュレーション実験を行って、製品の部品・素材構成がシステムの直行率や素材回収率に与える影響を分析した。3.これまでに整理してきた環境に調和しかつ経済的なサプライチェーン設計の課題解決へ向けて、製品の環境負荷測定法、生産・物流システムの経済性評価・最適設計を組み合わせて体系化する設計アプローチを提案した。また、循環型と低炭素型の統合的なサプライチェーン設計の必要性と課題について議論した。研究成果の一部は、国際会議・国内学会での研究発表のほか、国際セミナーや企業向け研究会での招待講演・論文や、洋書と和書の執筆を行って普及に努めた。また、新興国や先進国の研究拠点を訪問し、講演や研究者らと意見交換を行い、サプライチェーンや環境対応の現地最新事情を調査した。1.使用済み製品のリサイクル分解システムのために、分解部品の選択によるリサイクル率および利益の両立と、そのもとで分解ライン・ステーション数の最小化を行う2段階設計を提案した。さらに、本設計法を携帯電話、パソコンと掃除機の3次元CADモデルに適用し、製品タイプごとの特性を定量的に示した。2.素材仕分け分解システムについて、溢れのある待ち行列としてのモデル構築や、製品構成や作業先行関係を考慮したシミュレーション分析により、システムの性能評価を行った。その結果、各ステーションに適切なバッファ配分を行うことで、スループットや素材回収率を向上させるケースのあることを示した。3.2国間のグローバル・サプライチェーンについて待ち行列としてモデル化し、リードタイムやその時間のバラつきを考慮したシミュレーション分析を行った。研究成果の一部は、国際会議・米国国内会議での研究発表のほか、査読付きジャーナルに論文が3件掲載された。また、会議参加に合わせて、新興国や先進国を訪問して研究者らと意見交換を行い、現地の最新事情の情報収集を行った。本研究では、リユース・リサイクルによる製品の資源循環におけるモノの流れに着目し、組立・分解作業に伴う製品/素材の価値・利益の創出とともに、物流のエネルギー消費で排出してしまう配送・回収のCO2排出量の削減を同時に目指して、資源循環による生産・物流の経済性と環境負荷についての見える化と評価を行う。1.再生される素材価値を考慮したリサイクル生産システムについてモデル化を行い、シミュレーション実験を行って再生素材価値の変化がもたらす経済的な影響を検討した。2.使用済み製品を再生する分解生産のシステム構成について、製品仕分け型と素材仕分け型に分類して整理した。また、素材仕分け型の分解システムをモデル化してシミュレーション実験を行い、製品の部品構成や各ステーションで分解される仕分け素材数がシステムの生産性や経済性に与える影響を分析した。3.循環型と低炭素型のサプライチェーンに関して、環境に調和しかつ経済的な設計のための課題を整理した。また、地球環境問題における資源循環とCO2量削減は相互に関係しており、統合的に議論される可能性について言及した。研究成果の一部は、国際セミナーやシンポジウムでの招待講演や、国際会議・国内学会で研究発表を行った。また、国際会議に合わせて渡航した環境先進国ドイツにおいては、生産・物流システムの研究・実践拠点を複数訪問した。先端研究の実験室や工場の見学を行うとともに、研究者や実務家らと最新の研究や欧州事情について意見交換を行った。

経営情報、サプライチェーン、経営工学本年度までの主な成果によって、循環型サプライチェーンで使用済み製品を再生する分解生産システムの設計に関し、分解部品選択、分解作業編成と仕分けシステムの3段階を対象にし、環境に調和しかつ経済的な設計法をそれぞれで確立したと考えられるためである。また、サプライチェーンと環境対応のグローバルな実地調査によって、先進国(ドイツ、イギリス、米国)のみならず、新興国(インドネシア、ベトナム、タイ)でも講演や工場見学、研究者・企業家との意見交換を行って、海外研究拠点とのネットワーキングを形成できたためである。こうして得られる、あるいは今後も引き続き得られる現地事情は、すでにグローバル化しているサプライチェーンをモデルに反映させるためには不可欠であり、現地事情の入手見通しが立ったと考えられる。以上より、当初の計画以上に進展していると考えられる。本年度の主な成果として、循環型生産・物流システムにおける分解システムを対象に、リサイクル分解システムや素材仕分け型分解システムのモデル化ならびにシミュレーション実験を行ったことが挙げられる。この結果、再生されたリサイクル素材価格の変化や、分解・仕分けのシステム構成の違いがもたらす生産性ならびに経済性の影響について、基礎的な知見を得ることができたと考える。さらに、環境に調和しかつ経済的な循環型と低炭素型のサプライチェーンに関する設計課題の整理や、環境先進国ドイツにおける生産・物流システムの研究・実践拠点の見学とそこでの意見交換の実施が挙げられる。こうした整理や調査で得られた情報は、今後開発する生産・物流システムのモデルに反映することができるため、より実用的な設計基準づくりに貢献したと考える。以上より、本研究の現在までの達成度は、おおむね順調に推移していると考える。今後の推進方策として、物流システム(配送・回収)のモデル化、循環型のリサイクル率と低炭素型のCO2排出量の同時評価と、これまで開発してきた分解システム設計法間の統合が挙げられる。物流システムのモデル化については、新興国では陸上輸送におけるリードタイムの不確実性、先進国では災害やテロなど有事の際のリスク考慮なども考えられる。循環型のリサイクル率と低炭素型のCO2排出量の同時評価では、使用済み製品の分解部品選択において、環境負荷をリサイクル率のみならずCO2排出量でも評価し、利益向上と両立する点がないか検討する。分解システム設計法間の統合では、分解部品選択、分解作業編成と仕分けシステムの3段階について、1つの設計手順として統合する方法について検討する。
魚類の浸透圧調節を担う塩類細胞のライフサイクル

環境水の浸透圧変化に伴う塩類細胞の入替りについて明らかにするため、本研究ではティラピアを淡水から70%海水へ直接移行し、サンプリングを行った。まず環境水の浸透圧変化による鰓での細胞死を検証するため、TUNEL法を用いてアポトーシスを検出した。その結果、移行1日後にアポトーシスを起こす細胞が有意に増加した。更に、移行1日後の鰓上皮細胞を透過型電子顕微鏡で観察したところ、アポトーシスが塩類細胞で起きていることが確認された。以上から、淡水型塩類細胞がアポトーシスを起こすことで鰓でのイオン吸収が抑えられ、70%海水移行に伴い高くなった体液浸透圧の正常化に寄与していると考えられた。次に、BrdU法を用いて塩類細胞の加入を検討するため、淡水馴致ティラピアをBrdUで処理した後、淡水または70%海水へ移行し1,3,7日後に鰓をサンプリングした。この鰓をBrdUとNa+/K+-ATPaseに対する抗体を用いて二重免疫染色を行い、新しく分化した塩類細胞を検出した。その結果、BrdU陽性の核を有する塩類細胞は「単体の塩類細胞」と「塩類細胞の複合体」の2種類に分類できた。BrdUで標識された単体の塩類細胞は、70%海水移行群でも淡水群と同様に出現するのに対し、塩類細胞の複合体の分化は移行群で有意に増加した。ここから70%海水移行群では、単体の塩類細胞に加え塩類細胞複合体を新たに分化させることで海水適応能を高めていると考えられた。成熟した塩類細胞のイオン輸送機能については今まで多くの知見が得られてきた。しかし、塩類細胞が幹細胞や未熟細胞からどのように分化し機能を得るか、また機能を喪失した塩類細胞はどのように死を迎えるかについては研究がほとんど進んでいないのが現状である。そこで本研究では、鰓において塩類細胞の加入、細胞死が起きていることを示すと共に、そのメカニズムを明らかにすることを目的とした。実験魚には多様な浸透圧環境に対して高い適応能力を持ち、イオン調節に関する基礎的な知見が豊富なティラピアOreochromis mossambicusを用いる。淡水中で飼育していたティラピアを塩類細胞のターンオーバーが起きやすいと考えられる海水へ移行し、移行後の鰓を淡水群と比較することで、塩類細胞の加入と細胞死を検証した。塩類細胞での細胞死を検証するため、アポトーシスのマーカーとして知られているTUNEL法を用いて鰓を染色した。その結果、海水移行24時間後にアポトーシスを起こしている細胞が最も増加することが分かった。次に、塩類細胞の加入を検証するため、細胞増殖のマーカーであるPCNA抗体、BrdU抗体を用いて鰓を免疫染色した。その結果、海水移行群と淡水群で塩類細胞の増殖率に大きな変化は見られなかったが、淡水と海水では異なる経路を経て、塩類細胞が分化することが示唆された。以上、本年度の研究では、環境水変化に伴った塩類細胞の加入、細胞死の様子を明らかにすることができた。
光渦を利用した極限精度の波面センシングに関する研究

本研究の目的は、光渦(らせん状の等位相面をもつ光)を利用することにより、これまでにない高い精度の光波面揺らぎセンサーを実現することである。この目的のため、最先端の天文観測技術である光渦コロナグラフ(太陽系外惑星を観測するため、すぐそばの明るい恒星光を除去する技術)を応用した新たな計測原理を提案し、室内実証試験および計算機シミュレーションなどを通じた研究開発を推進する。提案する技術は、光学計測や天文学、医学、生物学など幅広い分野にわたる応用が期待される。
かに星雲の新しい描像の確立

かに星雲はその中心に強磁場・高速自転の中性子星(パルサー)を持っている。パルサーは回転のエネルギーを磁化した相対論的なプラズマとして放出し(これをパルサー風と呼ぶ)、そのエネルギーによりかに星雲は輝いている。従来のかに星雲の描像ではパルサー風のエネルギーは殆どプラズマの運動エネルギーとして放出されていると見ていた(ローレンツ因子が百万以上のプラズマの流れ)。本研究は、この描像が誤りである可能性があることを提案し、それを検証しようとする。本研究で以下の結果を得た。(1)X線観測とモデルの比較から星雲磁場が乱流になっていることを示した、(2)この結果を偏光から確立した、(3)かに星雲の詳細な観測からトーラス磁場が劇的に変動することや低エネルギー粒子が同時に加速されていることを示した、(4)磁気中性面と衝撃波の相互作用を初めて数値計算により解いた。以上から、従来のかに星雲の描像を塗り替えて、磁気散逸を含む星雲の姿がかなり有望なモデルとして浮上したといえる。しかし、今後、さらに精密な観測と理論の比較が必要である。本研究のサイド効果として電子陽電子対生成とパルサー風の形成過程の研究が多いに進歩したことを付け加えたい。かに星雲は1054年に起こった超新星爆発の残骸であり、現在も秒速2000kmの速さで膨張を続けている。爆発の際、中心部に1兆ガウスにも強く磁化した中性子星が形成され、その中性子星は回転のエネルギーを磁化したプラズマとして放出し、そのエネルギーによりかに星雲は輝いている。従来のかに星雲の描像では中心の中性子星(パルサー)からトロイダルな磁場を伴った超相対論的なプラズマ(ローレンツ因子は百万以上)が吹き出ていて、その終端衝撃波で加熱しシンクロトロン放射によって星雲が輝くと考えている。熱化はパルサー風の運動エネルギーによるものであると考えられてきた。しかし、本研究では始めてこの描像に疑いがあることを提示した。これまでに、最近得られたX線望遠鏡チャンドラのイメージと我々のモデル計算を比較し、乱れた磁場の存在を指摘した(研究発表リストShibata et al.2003参照)。これはシンクロトロン放射するプラズマのエネルギー源がパルサー風によって運ばれてきた磁場である可能性を示唆するものである。今年度後半にはこれを更に進め、柴田を中心に、かに星雲の偏光観測から乱流磁場の存在を検討し、やはり、偏光観測も乱流磁場を指示することを示した。また、星野を中心に、パルサー内の逆転する磁場を伴った衝撃波の構造の研究を開始した。逆転磁場のある衝撃波の構造についてはこれまでに研究が無く、今後の発展が期待される。従来のかに星雲の描像ではパルサー風のエネルギーは殆どプラズマの運動エネルギーとして放出されていると見ていた(ローレンツ因子は百万以上のプラズマの流れ)。2003年にはパルサー風の直後のプラズマは乱流的になることを観測的に指摘した。2004年(本年)は、パルサー風の作る衝撃波の下流が乱流的になることを、星雲の偏光を理論的に計算し観測と比較することで確実にした。従来の運動エネルギーが卓越したパルサー風はなく、磁気エネルギーが衝撃波とその下流でプラズマ加速と加熱を起こしている可能性が高まった。乱流磁場の原因としては、パルサー風にたくさんふくまれる磁気中性面の崩壊(磁気リコネクションを含む)がもっとも可能性が高い。この点に注目し多数の磁気中性面が衝撃波にとびこんでくるときの衝撃波の研究を推進した。これは、まだ未開拓の分野であり、従来、衝撃波粒子加速と磁気リコネクションによる粒子加速は独立に研究されて来たが、あたらしく、複合した現象を扱っていることに本研究のオリジナルの成果がある。

今後、X線によるかに星雲の連続観測、磁気中性面を含む衝撃波に於ける粒子加速、乱流加速をふくむかに星雲の流れの研究を推進し、新しい描像を明確にしてゆく。かに星雲はその中心に強磁場・高速自転の中性子星(パルサー)を持っている。パルサーは回転のエネルギーを磁化した相対論的なプラズマとして放出し(これをパルサー風と呼ぶ)、そのエネルギーによりかに星雲は輝いている。従来のかに星雲の描像ではパルサー風のエネルギーは殆どプラズマの運動エネルギーとして放出されていると見ていた(ローレンツ因子は百万以上のプラズマの流れ)。本研究は、この描像が誤りである可能性があることを提案し、それを検証しようとする。2003年にはパルサー風の直後のプラズマは乱流的になることを観側的に指摘した。2004年は、パルサー風の作る衝撃波の下流が乱流的になることを、星雲の偏光を理論的に計算し観測と比較することで確実にした。2005年(本年)は、(1)新しい描像の核心部分である衝撃波およびその下流での磁気エネルギーの散逸課程の研究、および、(2)その過程の直接検証を目指した観測を実施した。(1)については、パルサー風中の磁気中性面が衝撃波において散逸する場合の一般化したジャンプコンディションを定式化し、衝撃波後方の流れを導いた。また、粒子シミュレーションによって磁気中性面を起源に磁気音波が作られ、粒子加速の効率が増加することを示した。(2)については、X線と可視光、赤外線での同時観測を実施し、X線を放射する粒子と赤外線を放射する粒子が同時に加速される様子やそれが波として伝わる現象を見つけた。これらのことから本研究で目指した、磁気散逸効果がキーであることがより明確になった。しかし、新しい描像の完全な姿を導くには至らなかった。
抗糖尿病活性およびDNA修復増強活性を併せもつ機能性食品の開発

PI3-K阻害剤であるWortmanninを用いて3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取り込み測定を行った。その結果Wortmannin処理によりケフランケフィアの効果は完全には抑制されなかったことから、ケフランケフィア水溶性画分の作用点は、PI3-K感受性及び非感受性作用部に複数存在する可能性が示唆された。PI3-K感受性作用部位に関してはインスリン受容体の活性化が確認された。MAPキナーゼ阻害剤を用いた検討により、p38MAPキナーゼが3T3-L1脂肪細胞においてケフランケフィア水溶性画分のグルコース取り込み増強効果に関与することが確認され、Western blottingによって、ケフランケフィア水溶性画分処理によりp38MAPキナーゼのリン酸化の促進が確認された。ケフランケフィア中の抗酸化活性を有する成分を分子量1,000以下に見出し単離・精製を行い、この抗酸化物質が実際に培養動物細胞内で抗酸化活性を示すことを確認した。また培養動物細胞のDNA修復関連遺伝子発現に及ぼす効果をRT-PCRにより検討したところ、p53、PCNA、MLH1、PMS1、PMS2のmRNA発現上昇が確認された。先天的にレプチン受容体欠損により肥満を通して2型糖尿病を発症するC57BL/KsJ-db/dbマウスを用いて抗糖尿病機能性食品の予防・治療効果に関して評価を行った結果、ケフランケフィアを自由摂取させたマウスでは血中インスリン量に関して差は見られなかったが、空腹時血糖値の低下と耐糖能の改善が観察された。糖尿病において、高血糖状態を生じる原因の一つとしてインスリン標的臓器におけるグルコース取り込み能の低下が考えられることから、脂肪細胞へのグルコース取り込みに及ぼす発酵乳ケフランケフィアの効果に関して検討を行った。その結果、ケフランケフィア水溶性画分は、インスリン刺激存在/非存在下において脂肪細胞へのグルコース取り込みを未処理の場合と比較し2倍以上に増強した。またこの効果はインスリン抵抗性状態の脂肪細胞においても確認された。ケフランケフィア水溶性画分を分子量分画したサンプルを用いてグルコース取り込み検定を行った結果、ケフランケフィア中のグルコース取り込み増強活性成分は分子量30,000以上の画分に含まれることが確認された。本活性成分はpH4.010.0の範囲において安定な糖含有物質であることが確認された。細胞がDNA修復を行う際に観察される不定期DNA合成(UDS)活性を指標として、培養動物細胞への紫外線照射により生じるDNA障害修復能を測定する実験系を確立した。紫外線照射後の培養動物細胞のUDS活性を検討した結果、ケフランケフィアのUDS活性増強効果を示唆する結果が得られた。また、ケフランケフィアのDNA修復関連遺伝子発現に及ぼす効果をRT-PCRにより検討したところ、紫外線照射により生ずるDNA障害の修復酵素遺伝子の発現増強が確認された。また、in vitroにおける直接的な抗酸化活性測定に基づくオンラインHPLC-DPPH法を用い、ケフランケフィア中の抗酸化活性を有する成分を分子量1,000以下に見出し単離・精製を行った。この抗酸化物質が実際に培養動物細胞内で抗酸化活性を示すことが確認された。
過冷却凝固における潜在核の緩和過程

ビールやコーラなどから生成される二酸化炭素の泡はどのようにして生成されるのであろうか。本研究では,缶から吹いた噴出量を測定することにより均質核がどれほど生成しているのか,または振動直後からどれほど緩和しているのかを調査した。まず初めに,気泡を発生させるために手による振動を与えることによって核成長を促し噴出させた。手による振動では噴出量が小さく,明らかに小さな振動エネルギーしか与えることができないことが分かった。そのために,より大きな振動エネルギーを与えることができる超音波洗浄機を用いて実験を行った。ここで,一度振動を与えたものの缶内部の状態変化を調べるために,振動を与えなかったものと比較したところ,振動後約1時間放置のものが振動を与えなかったものと比べて著しく噴出量が少なくなった。そこで,液体中からの気泡生成について述べられたPshenichnikov等の説を導入し臨界核よりも小さな核である潜在核というべきものの挙動を考えることによってその理由を解明した。1今年度における研究目的相変態時の核生成に関しては、未だに不明な点が多い。今年度においては、潜在核の存在とその緩和過程について気液系について実験を行なった。潜在核については、缶ビ-ルを振った後、吹くという日常に見られる現象からその存在が示唆された。そこで実験試料には缶ビ-ルを用いた。2研究方法超音波振動機を用いて缶ビ-ルに振動エネルギ-を加えて振動時間と振動終了時から開缶間での時間の二つのパラメ-タについて実験を行なった。3結果以下のことが判明した。但し、ここでいう緩和は元の状態(すなわち開缶時に吹かない)に戻ることを意味している。1.振動時間が長いほど緩和が速い。2.温度が低いほど緩和が速い。以上の結果より潜在核が存在することが確認された。また、その大きさや分布は振動エネルギ-を加えることにより変化し、定常的には得られないこと、温度異存生は小さいことが判明した。これらの結果は、1985年Yu.G.Chirkovらの提唱している亜臨界核の存在と関係しているように思われる。しかし、彼らの緩和過程と我々の実測した緩和過程では速度が大きく違い今後さらなる検討が必要である。ビールやコーラなどから生成される二酸化炭素の泡について、缶から吹き出る噴出量を測定することにより潜在核の発生量を推測した。振動は超音波法浄器を用いて実験を行なった。その結果、つぎの事柄があきらかになった。1.一度振動を与えたものは不均質核生成が減少するため、長時間放置しておいても元の状態には戻らない。2.振動後約1時間放置したものは著しく噴出量が減ることが分った。以上の結果は、Pshenichikovらが報告している臨界核の径より小さい径を有する潜在核が非常に安定であり、時間を経るにしたがい、このサイズの核に一度遷移した後、核が消減すると考えるとうまく説明されることがわかった。
視覚系の細胞分化と形態形成の再生系における解析

プラナリアの眼は視細胞と色素細胞の2種類の細胞で構成され、視細胞は光を受容する感桿と脳への突起(視神経)を備えている。プラナリアの眼を摘出すると、2日目には、眼の再生が観察される。視細胞の分化はVC-1抗原の発現によって、色素細胞の分化はその色素によって特徴づけられる。再生過程における2種類の細胞の分化過程、眼の再生の場の性質、視神経と脳の親和性について調べた。視細胞分化が色素細胞に依存して分化する可能性を調べるために、視細胞の除去、視細胞と色素細胞の間での感桿の切断、視神経の切断の3種類の手術を行った。前2種の手術によって、視細胞は退化するが、色素細胞は残存する。しかし、残存した色素細胞によって視細胞の再生が促進されることはない、つまり、眼全体を除去した場合の再生と変わるところはなかった。視細胞と色素細胞が共通の幹細胞から分化する仮説が有力であると考えられる。また、視神経の切断によっては、視細胞は退化することはなかった。プラナリアの眼の周辺には眼を再生する場が想定される。再生過程の誤りで生じた過剰眼の周辺に再生の場が存在するか否かを調べた。三眼プラナリアを多数集め、正常眼および過剰眼を考えられる7通りのパターンで摘出し、再生の様式を調べた。結果は正常眼の位置では再生が起こるが、過剰眼の位置では再生が起こらなかった。過剰眼は再生過程で生じたhomeoticな異常であり、再生終了後の過剰眼の周辺には、眼を再生する場はないと考えられる。眼の形成はPax6遺伝子に依存して、決定されることがショウジョウバエで示されている。プラナリアのPax6遺伝子をクローニングし、プラナリアにparticle gunで導入し、異所的に眼を形成させることを計画している。プラナリアの正常眼と過剰眼からは2本の視神経束が独立に向かって走行する。プラナリアにおいては、視神経の経路に特別な標識はなく、脳からのchemotactic substanceに反応していると考えられる。
EMCウイルス感染症に関する基礎的研究

脳心筋炎(EMC)ウイルスは豚の急性致死性心筋炎の病因で、そのキャリアとして小型げっし類が疑われている。また、本ウイルスは特定の系統のマウスに糖尿病を起こすことが知られている。本年度は4種類の小型げっし類を用いて脳心筋炎ウイルス感染症に関する基礎的検討を行ない、以下の成績を得た。(1)EMCウイルスに体する感受性:4種類の小型げっし類のEMCウイルスに対する感受性を比較したところ、スナネズミが最も感受性が高く、ラットは全く感受性を示さなかった。また、マウス、ハムスター、スナネズミでは、ウイルスの増殖部位や病変形成部位に差が見られた。(2)EMCウイルス感染スナネズミの急性期病態:(1)でEMCウイルスに最も感受性の高かったスナネズミを用いて、感染初期の膵臓における本ウイルスの増殖様式と病変形成の関係を明かにした。(3)EMCウイルスは感染BALB/cマウスの全身性病態:BALB/cマウスは元来EMCウイルス性糖尿病に抵抗性であるとされているが、若齢動物(4週齢)に10^5PFU/headのEMCウイルスD株(EMC-D)を接種することによって持続性の糖尿病を惹起しえた。また、この系で、EMCウイルスによる脳病変の分布様式(海馬に主坐)と病理組織学的性状(神経細胞の壊死・脱落)が初めて明らかにされ、同時に亜急性期における膵島病変と心筋病変の特徴が示された。(4)EMC-BによるEMC-D誘発心筋炎の防御効果:マウス膵島非障害性のB株をマウス膵島障害のD株と同時投与もしくは前投与することによって、D株誘発心筋炎の発現頻度を低下させ、かつ病変の強変を減弱させることができた。現在、その機序について検討中である。
IgG4関連硬化性胆管炎の網羅的組織プロテオーム・リン酸化修飾解析

IgG4関連硬化性胆管炎の組織からタンパクを抽出し,網羅的なプロテオーム解析ならびにリン酸化修飾解析を行った.対照として用いた原発性硬化性胆管炎と比較すると,IgG4関連硬化性胆管炎は特徴的なリン酸化修飾パターンを示した.パスウェイ解析では,B細胞や免疫グロブリンに関連したシグナルが有意に活性化していた.個別のタンパクでは,FYN-binding proteinやallograft inflammatory factor-1が有意に発現亢進し,主としてM2型マクロファージに発現していた.これらの分子の発現は他臓器のIgG4関連疾患でも見られ,臓器を問わずIgG4関連疾患に特徴的と考えられた.初年度は、IgG4関連硬化性胆管炎(IgG4-SC)と原発性硬化性胆管炎(PSC)の凍結組織から採取したタンパクを用いて、網羅的なプロテオーム解析ならびにリン酸化修飾解析を行った。まず、phosphopeptide enrichment methodを併用したプロテオーム解析で、タンパクのリン酸化修飾が十分検討できることを確認したのち、実際の症例の検討を開始した。最終的に、胆管組織からペプチド23,357個とリン酸化ペプチド4,794個を同定しえた。発現ペプチドに基づいてクラスター解析を行うと、総ペプチドや非リン酸化ペプチドの発現プロファイルはIgG4-SCとPSCで明確な違いはなかったが、リン酸化ペプチド発現プロファイルは両疾患を明確に区別することができ、リン酸化ペプチドが病態の違いをより反映していると考えられた。各疾患で高発現しているタンパクや優位にリン酸化しているタンパクに着目して発現亢進タンパクのネットワーク解析をすると、3つの免疫関連シグナル伝達がPSCに比してIgG4-SCで有意に亢進しており、興味深いことにすべてB細胞や免疫グロブリン関連であった。一方、PSCでは細胞外マトリックスのリモデリングに関連した2つのシグナル伝達が有意に活性化していた。各疾患で過剰発現しているタンパクも同定され、来年度からは個別のタンパクに対して、validation studyを行う予定である。研究計画に記載した予定どおりに、研究が進んでいる。本年度は、プロテオーム解析で得られた昨年度のデータから、IgG4関連硬化性胆管炎や原発性硬化性胆管炎で発現が亢進しているタンパクに対して、局所での発現をより詳細に検討した。予備実験として発現量に有意な差があったタンパクに対して免疫染色を行うことで、各疾患で強発現し、免疫や細胞外マトリックスのリモデリングに関与していると推定される分子を選択した。具体的には、IgG4関連硬化性胆管炎で発現が亢進しているタンパク群から、FYN-binding proteinとallograft inflammatory factor-1が選択された。これらの分子は病変局所で多数の細胞に発現していることが明らかとなり、2重染色ではこれらの分子は主としてマクロファージに発現しており、特にM2型マクロファージが活性化していると考えられた。原発性硬化性胆管炎ではFYN-binding proteinやallograft inflammatory factor-1の発現は部分的であり、プロテオーム解析の結果に合致していた。一方、原発性硬化性胆管炎に対しては、filamin-Aとfilamin-Cに着目して解析したところ、これらの分子はマクロファージと線維芽細胞に過剰発現した。一方、IgG4関連硬化性胆管炎を含めた他の胆道疾患での発現はほとんどなく、原発性硬化性胆管炎の細胞外マトリックスの変化に重要な分子であると考えられた。興味深いことに、filamin-Aは原発性硬化性胆管炎に合併した胆管癌でも発現が亢進しており、発癌プロセスにも関連している可能性がある。さらに、これらの分子は肝生検でもその過剰発現が確認でき、硬化性胆管炎の臨床的な鑑別にも有用である可能性が示唆された。研究計画に記載したとおりに進んでいる。本年度は本研究の最終年度にあたる.昨年度までにIgG4関連硬化性胆管炎の組織片をプロテオーム解析し,原発性硬化性胆管炎に比して優位に発現が亢進,もしくは低下しているタンパクを同定した.本年度は胆管炎で得られた知見を他臓器に応用し,他臓器のIgG4関連疾患でも同様の変化が生じているのか,また同定したタンパクの発現が診断マーカーとなるのかを検証した.解析した臓器は,唾液腺,肺,後腹膜である.唾液腺ではIgG4関連唾液唾液腺炎とシェーグレン症候群を,肺ではIgG4関連肺病変と特発性間質性肺炎を,後腹膜ではIgG4関連後腹膜線維症とIgG4非関連の特発性後腹膜線維症を対象とした.IgG4関連硬化性胆管炎で過剰発現していることが明らかとなったFYN-binding proteinとallograft inflammatory factor-1の発現をこれらの臓器病変で解析したところ,予想していたとおり,これらの分子は他臓器のIgG4関連疾患でも強発現していた.2重免疫染色を行うと,硬化性胆管炎と同様にM2型マクロファージが主な発現細胞であることが明らかとなった.また,対照として用いた他疾患ではIgG4関連疾患に比してこれらのタンパクの発現は弱く,FYN-binding proteinやallograft inflammatory factor-1の過剰発現はIgG4関連疾患に特徴的であることが明らかとなった.さらに,これらのタンパクを発現する細胞は病変内にびまん性に認められ,生検検体でも陽性細胞は容易に検出でき,診断マーカーとして臨床的にも使用できる可能性が示唆された.IgG4関連硬化性胆管炎の組織からタンパクを抽出し,網羅的なプロテオーム解析ならびにリン酸化修飾解析を行った.

対照として用いた原発性硬化性胆管炎と比較すると,IgG4関連硬化性胆管炎は特徴的なリン酸化修飾パターンを示した.パスウェイ解析では,B細胞や免疫グロブリンに関連したシグナルが有意に活性化していた.個別のタンパクでは,FYN-binding proteinやallograft inflammatory factor-1が有意に発現亢進し,主としてM2型マクロファージに発現していた.これらの分子の発現は他臓器のIgG4関連疾患でも見られ,臓器を問わずIgG4関連疾患に特徴的と考えられた.当初の研究計画に沿って研究を進める。具体的には本年度同定した各疾患で過剰発現しているタンパクに対して、免疫染色などの別の方法を用いたvalidation studyを行う。また、胆道系だけでなく、他臓器のIgG4関連疾患にも応用できるかも含めて検討する。次年度は本研究の最終年度に相当する。IgG4関連硬化性胆管炎で発現が亢進していた分子に関して、他臓器のIgG4関連疾患でも同様に発現が亢進しているか検討する。硬化性胆管炎で得られた知見が、全身疾患であるIgG4関連疾患の他臓器病変にも応用できるか明らかにする。人体病理学冷却遠心機を購入予定であったが、消耗品の費用が多くかかった関係で、遠心機を購入しなかったことが差額が生じた主な原因である。初年度に消耗品費がかかった関係で、購入予定だった遠心機を購入しなかった。その残額を昨年度から持ち越し、ほぼ同額が本年度も持ち越しとなった。本年度自体の支出額は、予定支出額とほぼ同額である。来年度は、免疫染色を含めた解析で消耗品費がかかると予想され、そちらに使用する。
児童生徒の攻撃行動の変容を目指したストレスマネジメント実施に関する研究

本研究においては,関東甲信越地区の公立小中学校および公立私立高等学校を対象として,心理的ストレス,学校不適応,および攻撃行動に関する実態調査を実施した.この調査結果と,平成13年度までに行った攻撃行動の変容を目指したストレスマネジメントプログラムの持続性効果の検討結果を踏まえて,ストレスマネジメントプログラムの修正を行った.その後,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,セルフ・エフィカシーの向上(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,および,ソーシャルサポートの充実(児童生徒を取り巻く環境の調整)を中心とした介入を実施する小中学校をそれぞれ選定し,児童生徒の攻撃行動の変容に及ぼすストレスマネジメント実施の効果を検討した.なお,効果測定においては,攻撃性尺度やストレス反応尺度を中心とする質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,友人による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.その結果,ソーシャルサポートの充実による介入は小学生を除き,ほとんど効果がないことが示された.一方,社会的スキル訓練,およびセルフ・エフィカシーの向上による介入は,全般的に児童生徒の攻撃行動を変容する可能性があることが明らかにされた.さらに,児童生徒個人を対象とした介入(ケース研究)においては,小中学生ともに社会的スキル訓練の顕著な介入効果が得られた.しかしながら,セルフ・エフィカシーの向上やソーシャルサポートの充実には介入効果はほとんど得られなかった.以上のことから,児童生徒の攻撃行動の変容には社会的スキルの獲得が大きな効果があること,集団介入と個別介入では,介入を行う要因によってプログラムの効果が異なる可能性があることが示唆された.本研究においては,公立小中学生を対象として,攻撃行動,心理的ストレス,および学校不適応に関する実態調査を実施した.そして,調査の結果を踏まえ,攻撃性の変容を目指したストレスマネジメントを実施した.その際,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,敵意性の変容(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,および,ソーシャルサポートの充実(児童生徒を取り巻く環境の調整)を中心とした介入を実施する小中学校をそれぞれ選定し,ストレスマネジメント実施の効果を比較した.効果測定においては,攻撃性尺度やストレス反応尺度を中心とする質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.攻撃性の変容を目指したストレスマネジメントをクラス集団に実施した結果,小学生を対象とした場合,社会的スキル訓練の攻撃行動低減効果,ストレス反応軽減効果が示された.一方,中学生を対象とした場合には,社会的スキル訓練,敵意性の変容,ソーシャルサポートの充実のいずれにおいても攻撃行動低減効果,ストレス反応軽減効果が示された.特に認知的変容は,学年が上がるにつれてその介入効果が大きくなることが明らかにされた.さらに,児童生徒個人を対象とした介入(ケース研究)においては,小学生においては社会的スキル訓練,中学生においては敵意性の変容を中心として,ストレスマネジメントの介入効果が得られた.今後は,小中学生におけるストレスマネジメント技法の円滑な実施を考える上での問題点,および,本研究において効果が得られなかった技法に関する問題点などを具体的に解決しながら,ストレスマネジメントプログラムの修正を考えていく必要がある.本研究においては,関東甲信越地区の公立小中学校および公立私立高等学校を対象として,心理的ストレス,学校不適応,および攻撃行動に関する実態調査を実施した.この調査結果と,平成13年度までに行った攻撃行動の変容を目指したストレスマネジメントプログラムの持続性効果の検討結果を踏まえて,ストレスマネジメントプログラムの修正を行った.その後,社会的スキル訓練(児童生徒個人の行動的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,セルフ・エフィカシーの向上(児童生徒個人の認知的変容)を中心とした介入を実施する小中学校,および,ソーシャルサポートの充実(児童生徒を取り巻く環境の調整)を中心とした介入を実施する小中学校をそれぞれ選定し,児童生徒の攻撃行動の変容に及ぼすストレスマネジメント実施の効果を検討した.なお,効果測定においては,攻撃性尺度やストレス反応尺度を中心とする質問紙調査(自己評定),教師による他者評定,友人による他者評定,第3者による行動評定などを多角的に用いた.その結果,ソーシャルサポートの充実による介入は小学生を除き,ほとんど効果がないことが示された.一方,社会的スキル訓練,およびセルフ・エフィカシーの向上による介入は,全般的に児童生徒の攻撃行動を変容する可能性があることが明らかにされた.さらに,児童生徒個人を対象とした介入(ケース研究)においては,小中学生ともに社会的スキル訓練の顕著な介入効果が得られた.しかしながら,セルフ・エフィカシーの向上やソーシャルサポートの充実には介入効果はほとんど得られなかった.以上のことから,児童生徒の攻撃行動の変容には社会的スキルの獲得が大きな効果があること,集団介入と個別介入では,介入を行う要因によってプログラムの効果が異なる可能性があることが示唆された.
パルスYAGレーザーを用いたアルミニウムの表面パターニング

本研究は、アルミニウム基板上におけるパターニング技術の新しい方法の開発と確立と目的としており、平成8年度平成10年度にわたって行われたものである。すなわち、アノード酸化皮膜化成試料を金属イオンを含む溶液中に浸漬し、これにパルスYAGレーザーを照射することにより、皮膜を局部的に破壊・除去する。その後、電気メッキあるいは無電解めっきにより、皮膜除去部のみに金属を析出させ、アルミニウム上にパターンを描くとともに、有機絶縁板の接着、素地金属の溶解除去により模擬プリント配線基板を作製しようとするものである。得られた結果の主なものは次の通りである。1)レーザー照射のさい、皮膜は素地金属のレーザーアプレーションにより生じる高圧力により破壊・除去される。そのため、レーザー照射部の周囲の皮膜にはクラックが発生するが、レーザー照射前に皮膜を赤く着色しておくことにより、クラックの発生は防止できる。最大100μmの厚さの皮膜を15500μmの幅で連続的に皮膜を除去できる。2)レーザー照射のさい、皮膜除去部の表面に金属微粒子が析出し、これらが、次の電気メッキおよび無電解めっきのさい、核として作用し、とくに無電解めっきの初期の析出速度に大きな影響をおよぼす。析出Pd金属粒子がもっともその効力が大きい。電気メッキによりNlおよびCuの、無電解めっきによりNI-Pの緻密電析層を得ることができた。3) 15μmのNl電析線で描いたアルミニウム試料板に有機絶縁板を接着し、素地金属を溶解除去により生成した模擬プリント配線基板を形成し、電気伝導性を調べた結果、きわめてよい電気電導性を示した。アルミニウム基板上における新しいパタ-ニング技術の開発・発展を目指し、本年度は、レーザー照射条件(パワー、ビーム系、焦点はずし距離、照射環境)を種々変化し、レーザー照射による皮膜破壊挙動をSEMにより追跡するとともに、金属の電析に及ぼす影響について調べた。パワーの影響:あるしきい値を越えたパワーのレーザーを試料に照射することにより、レーザーアブレ-ジョンによりアノード酸化皮膜を皮膜/素地界面からほぼ完全に除去することができた。除去部はほぼ円形でありその面積はパワーの増大とともに大きくなる。焦点はずし距離とビーム径の影響:照射条件によらず、除去面積は、焦点の位置に試料をおいて照射すると最少になり、焦点はずし距離が長くなると大きくなる。集光前にレーザー光を絞りビーム径を小さくして照射することにより、焦点はずし距離による剥離面積の変化を小さくできる。また,絞ることにより,より小さな面積を剥離可能であった。照射環境の影響:各パワー、位置において水溶液中より空気中で照射すると剥離面積は小さくなった。しかし、空気中で照射したさい、大気酸化皮膜の影響により、めっき層の形成速度が一定になるまでの時間が長くなる。初期から速い速度で皮膜を形成するにはめっき溶液中で照射する必要がある。金属の電析に及ぼす影響:銅およびニッケルめっき溶液中で照射することで、高い電流効率で緻密なめっき相を形成することができた。本研究は、アルミニウム基板上におけるパタ-ニング技術の新しい方法の開発と確立を目的としており、本年度は、厚いメッキ層を局部的に形成する方法について検討した。また、有機絶縁板との接合および素地金属の溶解除去にり、模擬プリント配線基板の作製を試みた。1.レーザー照射によるアノード酸化皮膜の除去機構の解明1)皮膜が薄い(<15μm)場合には、レーザー照射により皮膜は完全に除去できる。2)皮膜が厚い(>20μm)場合には、レーザー照射により皮膜に多数のクラックが発生し、局部的な皮膜の除去は、困難である。

3)アノード酸化ののち、アリザリンレッド溶液中に浸漬して皮膜を染色すると、レーザー照射により、クラックの発生が見られず、皮膜の局部的除去が極めて容易となる。2.局部ニッケルめっきと模擬プリント配線基板の作製1)レーザービームを走査させて500μm幅のパターンを形成後、連続的なニッケルめっきパターンを得ることができる。2)電気絶縁樹脂との接合の後、50.1M-NaOH溶液中に浸漬すると、素樹脂および接着面を損なうことなく素地金属の溶解除去をうまくできる。本研究は、アルミニウム基板上におけるパターニング技術の新しい方法の開発と確立を目的としており、本年度は、1)レーザー照射・無電解めっきによるパターニングの開発および2)光学系の工夫による極微細パターニングの形成について研究を行った。1)レーザー照射・無電解めっきによるパターニングの開発:レーザー照射をPd^<2+>,Ni^<2+>,Cu^<2+>イオンを含む溶液中で行うと、いずれの場合にも、試料のレーザー照射部に金属微粒子が析出することをXPSおよび浸漬電位の測定により明らかにした。また、レーザー照射のさい析出したPd金属は、その後のNi-P無電解めっきの初期過程においてその析出速度を促進するが、Cu粒子は促進効果を有しないことがわかった。2)極微細パターニングの形成:レーザー照射を、レーザーパワー、絞り径および凸レンズ焦点距離の関数としてレーザー照射を行い、皮膜の破壊に伴う皮膜除去部のスポットサイズ(D)および走査線幅(W)を測定したところ、DおよびWの値を」15500μmまで調節することができることがわかった。また、有機絶縁基板との接着および素地金属の溶解除去などにより、微細回路をもつ模擬プリント配線基板を形成できた。
中枢神経悪性リンパ腫の予後規定マーカーの解明

中枢神経悪性リンパ腫(PCNSL)は難治性の脳腫瘍である。PCNSLに対する標準治療は大量Methotrexate(MTX)を中心とする化学療法とそれに引き続き行なう全脳照射であるが、30%の症例は治療抵抗性であり、60%が再発する。再発や治療抵抗性のPCNSLに対してテモゾロミド(TMZ)が有効な症例が存在する。本研究ではPCNSL治療に重要な役割を占める化学療法剤であるTMZ及びMTXの薬剤感受性に関わるマーカー候補であるMGMT遺伝子プロモーターのメチル化、reduced folate carrier (RFC)遺伝子の発現について検討し、化学療法剤の効果、治療成績との関係について検討した。中枢神経悪性リンパ腫(PCNSL)治療に重要な役割を占める化学療法剤である、テモゾロミド(TMZ)及びMetotrexate (MTX)の薬剤感受性に関わるマーカー候補であるMGMT遺伝子プロモーターのメチル化、mRNA発現、蛋白発現、reduced folatecarrier (RFC)遺伝子のプロモーターのメチル化、mRNA発現について検計し、さらにPCNSLを遺伝子学的サブタイピングした上で、化学療法剤の効果、治療成績、予後との関係について検討し、新たな治療法の開発に向けての基盤的研究を行うことを本研究の目的としている。本年度は、PCNSL症例34例の腫瘍組織よりDNAを抽出し、MGMT遺伝子に対するメチル化感受性高解像能融解曲線分析法にて、MGMT遺伝子のプロモーターのメチル化の有無を解析した。Bisulfite処理した各DNAサンプル0.2μgを最終容量20μlに溶解した。メチル化スタンダードは、100%メチル化コントロールDNAを100%非メチル化コントロールで希釈して100%から0%まで10%毎に段階希釈したサンプルを準備した。PCR primerはWojdaczらの論文に従ってデザインした。DNAインターカレート色素を含むLightCvcler480 High Resolution Meltingマスターミックスを使用し、PCRの条件はSYBR GreehI検出フォーマットにて、95°C10分X1サイクル、95°C10秒-60°C20秒-72°C20秒X45サイクル、高解像能融解曲線分析法のステップとして、95°C1分、50°C1分、72°C5秒反応させた後、95°Cへ向かって1°Cにつき30回連続して蛍光を取得した。34例中MGMTのメチル化が確認できたのは17例であった。メチル化の程度は5%から100%まで存在した。再発時にTMZを導入した5例中4例はMGMTのメチル化がみられ、これらの症例では治療に奏功した。一方MGMTのメチル化がみられない1例ではTMZの効果を認めなかった。MGMTのメチル化はTMZの効果を予測する因子となりうる可能性が示唆された。RFC遣伝子に対するメチル化感受性高解像能融解曲線分析法を前述同様に確立した。現在RFC遺伝子のプロモーターのメチル化の有無を解析中である。中枢神経悪性リンパ腫(PCNSL)治療に重要な役割を占める化学療法剤である、テモゾロミド(TMA)及びMetotrexate(MTX)の薬剤感受性に関わるマーカー候補であるMGMr遺伝子プロモーターのメチル化、mRNA発現、蛋白発現、reduced folatecarrier(RFC)遺伝子のプロモーターのメチル化、mRNA発現について検討し、さらにPCNSLを遺伝子学的サブタイピングした上で、化学療法剤の効果、治療成績、予後との関係について検討し、新たな治療法の開発に向けての基盤的研究を行うことを本研究の目的としている。本年度も昨年度に引き続き、PCNSL症例3の腫瘍組織よりDNAを抽出し、MGMr遺伝子に対するメチル化感受性高解像能融解曲線分析法にて、MG辨遺伝子のプロモーターのメチル化の有無を解析した。DNAインターカレート色素を含むLightCycler480High Resolution Meltingマスターミックスを使用し、PCRの条件はSYBRGreenI検出フォーマットにて、95°C10分X1サイクル、95°C10秒-60°C20秒-72°C20秒X45サイクル、高解像能融解曲線分析法のステップとして、95°C1分、50°C1分、72°C5秒反応させた後、95°Cへ向かって1°Cにつき30回連続して蛍光を取得した。昨年より症例が増え、45例中MGMrのメチル化が確認できたのは23例であった。

再発時にTMZを導入した5例中4例はMGMrのメチル化がみられ、これらの症例では治療に奏功した。一方MGMTのメチル化がみられない1例ではTMZの効果を認めなかった。MGMTのメチル化はTMZの効果を予測する因子となりうる可能性が示唆された。MTX療法の感受性に関与する可能性があるRFC遺伝子のタンパク発現を免疫組織化学染色にて検討した。発現を検討できた26例中、RFCの発現を認めたのは9例で、このうち初期MTX療法に効果を示した(CR,CRu)のは7例(78%)であり、RFCの発現を認めない17例中、初期MTX療法中治療抵抗性を示したもの(SD,PD)は12例(71%)であった。以上よりRFCのタンパク発現は初期MTX療法の感受性に関係する可能性が示唆された。現在、Fas,Bc12の発現を免疫組織染色を行っており、今後、治療効果や予後との関わりを検討する予定である。中枢神経悪性リンパ腫(PCNSL)治療に重要な役割を占める化学療法剤である、テモゾロミド(TMZ)及びMetotrexate(MTX)の薬剤感受性に関わるマーカー候補であるMGMT遺伝子プロモーターのメチル化、reduced folatecarrier(RFC)遺伝子のプロモーターのメチル化、遺伝子発現を調べ、これらの化学療法剤の効果との関係を検討する。さらにPCNSLを遺伝子学的サブタイピングした上で、治療成績との関係について検討し、新たな治療法の開発に向けての基盤的研究を行うことを本研究の目的としている。昨年度に引き続き、PCNSL症例の腫瘍組織よりDNAを抽出し、MGMT遺伝子に対するメチル化感受性高解像能融解曲線分析法にて、MGMT遺伝子のプロモーターのメチル化の有無を解析した。Bisulfite処理した各DNAサンプル0.2μgを最終容量20μlに溶解した。メチル化スタンダードは、100%メチル化コントロールDNAを100%非メチル化コントロールで希釈して100%から0%まで10%毎に段階希釈したサンプルを準備した。PCR prierはWojdaczらの論文に従ってデザインした。DNAインターカレート色素を含むLight Cycler480 High Resolution Meltingマスターミックスを使用し、PCRの条件はSYBR GreenI検出フォーマットにて、95°C10分X 1サイクル、95°C10秒-60°C20秒-72°C20秒X45サイクル、高解像能融解曲線分析法のステップとして、95°C1分、50°C1分、72°C5秒反応させた後、95°Cへ向かって1°Cにつき30回連続して蛍光を取得した。PCNSL45例中MGMTのメチル化が確認できたのは23例であった。メチル化の程度は5%から100%まで存在した。再発時にTMZを導入した5例中4例はMGMTのメチル化がみられ、これらの症例では治療に奏効した。一方MGMTのメチル化がみられない1例ではTMZ抵抗性であった。
ABC 輸送体活性・発現制御機構の解明と創薬基盤の構築

P-糖タンパク質(P-gp)はABC輸送体に属する抗がん剤排出ポンプである。がん細胞におけるP-gpの発現増加は抗がん剤耐性の一因とされる。本研究では、P-gpの活性や発現の制御方法を調べ、P-gp阻害薬の開発基盤を構築することを目的として遂行した。本研究では、(1) P-gpはSCFFBX15で認識され、Ube2r1/Cdc34/Ubc3によるユビキチン化を受けてプロテアソームで分解されること、(2)タンパク質脱リン酸化酵素複合体PP5/PPP2R3CはP-gp発現を低下させることを見出した。FBXO15はユビキチンE3リガーゼ複合体(SCF[Fbx15])の構成因子であることから、FBXO15を介したP-gpの分解について検討した。FBXO15はP-gpと結合すること、FBXO15をノックダウンするとP-gpのユビキチン化が抑制され、発現が増大すること、さらにビンクリスチンに対する感受性が低下することを平成23年度に報告した。平成24年度はSCF[Fbx15]が介在するP-gpのユビキチン化タンパク質を探索し、Ube2r1を同定した。Ube2r1のノックダウンはP-gpのユビキチン化を抑制し、P-gpの発現を増大させた。以上よりP-gpのユビキチン化の構図を完成し、論文報告するに至った。PPP2R3Cはprotein phosphatase (PP) 2AやPP5の活性制御サブユニットである。平成23年度までにPPP2R3CとPP5はP-gpのC-末端と共沈すること、それらのノックダウンによりP-gp発現が増加することを報告した。PP2AはP-gpと共沈しなかった。平成24年度はPP5/PPP2R3CをノックダウンするとP-gpの基質であるrhodamine 123の排出が亢進すること、ビンクリスチンやドキソルビシンに対する感受性が低下することを突き止めた。よって、PP5/PPP2R3C複合体はP-gpの負の制御因子であることを明らかした。以上のように、当該研究ではP-gpの分解機構と発現制御機構の解明において成果を挙げることができた。【(1)PP5、PP2AによるP-糖タンパク質/BCRPの発現・機能制御】PP5、PP2A、およびその制御サブユニットPPP2R3CによるP-糖タンパク質の発現制御について検討した。内因性P-糖タンパク質を発現するHCT-15、SW620-14、OVCAR-8、HEK293のいずれの細胞株でも、PP5およびPPP2R3CをsiRNAでノックダウンすると細胞膜上のP-糖タンパク質の発現が増加した。PP2Aのノックダウンは、P-糖タンパク質の発現に影響を与えなかった。これらの結果から、PP5はP-糖タンパク質の安定性を低下させるものと考えられる。抗がん剤耐性の一つとしてP-糖タンパク質の発現が鍵になっているので、PP5がP-糖タンパク質の発現を低下させることは、抗がん剤耐性の克服に向けて重要な証拠になる。【(2)新規P-糖タンパク質C末端領域結合タンパク質の機能解析】F-boxタンパク質として機能分類されているFBXO15に注目して研究を遂行し、以下の結果を得た。(1)FBXO15はP-糖タンパク質と結合した、(2)FBXO15はP-糖タンパク質と共局在した、(3)FBXO15はP-糖タンパク質をユビキチン化した、(4)FBXO15のノックダウンにより細胞膜上のP-糖タンパク質の発現が増加した、(5)FBXO15のノックダウンによりビンクリスチンに対する耐性が増大した。FBXO15はSCF複合体において基質認識を担っており、P-糖タンパク質のユビキチン化、プロテアソームによる分解を制御することが明らかになった。P-糖タンパク質の発現制御に関する報告は乏しく、分解機構については全く明らかになっていないことから、本研究は細胞生物学の面で非常に価値がある。また、FBXO15はドメイン解析からF-boxタンパク質に分類されていたが、その基質は見つかっておらず、P-糖タンパク質はFBXO15の最初の基質である。PP5、PPP2R3CによるP-糖タンパク質の制御では、P-糖タンパク質の脱リン酸化検討の系を現在構築中である。平成23年度中にこの脱リン酸化検討の系を構築することを目指していたが、今のところ完成していない。しかし、他のデータが得られていることから、総合的には比較的順調に進捗しているものと考えられる。FBXO15によるP-糖タンパク質の分解制御は、当初の予定を上回る進捗状況である。論文作成に必要なデータはほぼ揃っている状況である。