hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハニカムコアで仕切られた鉛直多孔質層内のふく射・対流伝熱

六角形ハニカムサンドイッチ構造の断熱壁が鉛直に置かれた場合における多孔質材による伝熱抑止の効果について、実験および数値解析を行ない検討した。本研究では、鉛直多孔質層を仕切るハニカムコアが多数連なっている場合を考え、それらのうちのひとつのハニカムコアの空間内でのふく射および対流熱伝達を対象とした。すなわち、六角形ハニカムコアの内部が多孔質で充たされている場合の数値解析を行なうと同時に、六角形断面を持つ箱の中に球状粒子を充填してその伝熱量を測定する実験を行ない、数値解析との比較検討を試みた。実験は、ハニカムコアの形状比は固定し、充填粒子の径を変えて、平板直接法(JIS A1413)に基づいて伝熱量測定を測定した。。〈数値解析〉ふく射伝熱を考慮した場合については、ふく射の伝播をRosselandの近似で扱って解析を行なった。更に壁面近傍での多孔質の不均一の効果を考慮した解析を行なったが、計算に時間がかかるうえパラメータが多く、年度内に結果をまとめることが出来なかった。現在、計算を続行中である。〈伝熱実験〉実験の安全性とコストの面からハニカムコアの大きさを、平径80mmの正六角形×対向壁の距離80mmとし、対向壁間の温度差の最大を80°Cとして実験装置を設計、製作した。ハニカムコアの内部に平均直径6mmの発泡スチロールの球を充填して、温度差を変えて伝熱量を測定した。ただしこの場合のDarcy-Ralyleigh数はおよそ10にしかならず、ほとんど対流が生じない。そこで、充填する多孔質を浸透性の大きい材料に変えて実験を行なったが、自然対流の伝熱実験は非常に時間がかかるため、年度内に結果をまとめることが出来なかった。現在、実験を続行中である。。
ウィーダ再評価：センセーション・ノヴェルにおける先進的フェミニストの形成をたどる

本研究の目的は、平成2628年までの3年間計画において、ヴィクトリア時代のイギリスにおいて絶大な人気を博しながら長らく等閑視されてきた小説家ウィーダ(Ouida, Marie Louise de la Ramee)について、ヴィクトリア時代のセンセーション・ノヴェルあるいはフィクション(sensation novel or sensation fiction)の系譜からその代表作品を読み解き、時代を先取りした先進的フェミニストとして、ウィーダの再評価をはかることである。以下は、初年度である平成26年度の研究実績の概要である。1)1906年のエリザベス・リーによる信頼できる伝記Ouida: AMemoirと、これを補完する1950年のアイリーン・ビッグランドによる著作Ouida: The Passionate Victorianを基盤として、自らを「文化的アウトサイダー」と見なすウィーダの自己形成を解明した。2)ヴィクトリア時代の文学関連書籍の通読を通して、子どもは「無垢な存在」として表象され、その死がイギリス文学のありふれたテーマであった時代から、子どものイメージは変遷を遂げ、19世紀終わり頃には、大人さながら「自立した個」として認められるようになった時代背景を検証した。3)「敗者の物語」として海外で受容される『フランダースの犬』を明治期に日本に紹介したキリスト教徒の影響を検証しつつ、特に児童文学において、動物を通して子どもの情操を涵養する傾向と、日本における「忠犬」の系譜と忠君愛国のナショナリズムとの関係性にも目配せしつつ、日本における『フランダースの犬』の特異な受容の形態を分析した。当初の研究計画に基づき、初年度研究成果として、論考「日本における「フランダースの犬」の受容と、ネロの救済の物語」を完成し発表する予定であった。日本における忠犬の系譜に関する文献調査に時間がかかり、論考の発表を初年度内に行えなかったものの、科学研究費による研究の成果を未発表に終えることなく、今後も、日本における『フランダースの犬』の受容から、海外におけるウィーダ再評価に貢献していきたいと考えている。
腰部脊柱管狭窄症における脊柱管内炎症ネットワークの解明

腰椎椎間板ヘルニア患者より採取した椎間板ヘルニア成分を免疫組織学的に検討したところ,炎症性蛋白であるJAK-STAT系の発現を認めた研究を参考に,腰椎疾患である腰部脊柱管狭窄症における炎症性蛋白の関わりを調べる目的で本研究を開始した.腰部脊柱管狭窄症患者の手術症例より肥厚した黄色靭帯を採取し,免疫組織学的検討を行った.Western blottingでは,JAK,STAT3,p-STAT蛋白の発現を認めた.免疫染色で組織内のIL-6,p-STAT3の発現を検討した.IL-6は抗体の問題もあり染色される細胞はfibroblastの一部であったが,p-STAT3は肥厚した組織の血管内皮細胞,fibroblastに発現していた.p-STAT3はマクロファージには発現していなかった.また実際の黄色靭帯の肥厚の程度とp-STAT3の発現の程度は相関していた.実際の組織中でJAK-STAT系の活性化は確認できたが,その上流にあたると考えられるIL-6との関係については実際の組織では確認が困難であった.そのため実際の手術症例から採取した靭帯組織から,Fibroblastの培養を行いin vitroでの実験系を計画した.培養細胞に対してIL-6による刺激を行い,培養細胞内でのJAK-STAT系蛋白の発現,細胞増殖の程度,阻害因子を加えることでの反応,を通して,IL-6-JAK-STAT系の一連の流れを検討する予定であった.しかしながら,培養細胞の確保,継代の問題が解決できず,in vitroの実験系の確立に至らず,in vitroの結果を出すことが困難であった.腰部脊柱管狭窄症患者の手術症例より肥厚した黄色靭帯を採取し,免疫組織学的検討を行った.Western blotting法にてJAK,STAT3,p-STAT3の存在を調べ,それぞれの蛋白が発現していることを明らかにした.コントロールとしてactinも調べ,調べた検体でhほぼ同様にJAK,STAT3,p-STAT3蛋白の発現を認めた.肥厚した黄色靱帯組織内で,STAT3がリン酸化STAT3に活性化されていることがわかった.続いて,免疫染色で組織内のJAK/STAT系の発現について検討した.免疫染色では,JAK/STAT系の下流にあるp-STAT3の発現を検討した. p-STAT3は主に肥厚した組織の血管内皮細胞,fibroblastに発現していた.黄色靱帯は主に硬膜側と背側の2層の構造をしているが,p-STAT3は硬膜側よりも背側により多く発現していた.これは過去の文献でも肥厚に関わる蛋白は背側での発現が多いことと同じような傾向であると考えられた.対象として,腰椎椎間板ヘルニアでの摘出された黄色靱帯の組織染色も行った.MRIでは黄色靱帯の厚さは腰部脊柱管狭窄症症例と比べ明らかに薄い靱帯であった.それらのヘルニア群でのp-STAT3の発現率と,腰部脊柱管狭窄症群での発現率を比較すると,明らかに腰部脊柱管狭窄症群で高い発現率を認めた.症例のMRI画像で黄色靱帯の厚みを計測し,p-STAT3の発現率との比較を行うと,厚みと発現率の間には中等度の相関があった.以上から,腰部脊柱管狭窄症における黄色靱帯でのp-STAT3の発現は,その肥厚に関係しているのではないかと考えられた.今回が初年度である.黄色靭帯肥厚による腰部脊柱管狭窄症の検体を免疫組織学的に検討を行い,肥厚症例でJAK-STAT系のタンパクであるリン酸化STAT3の発現が増えていることが確認された.腰部脊柱管狭窄症患者の手術症例より肥厚した黄色靭帯を採取し,免疫組織学的検討を行った.Western blotting法にてJAK,STAT3,p-STAT3の存在を調べ,免疫染色で組織内のp-STAT3の発現を検討した.実際の検体において,JAK-STAT系の下流にあるp-STAT3は肥厚した組織の血管内皮細胞,fibroblastに発現しており,肥厚に相関していた.黄色靱帯組織から靱帯のfibroblastの培養を試みているが,実験系の確立のために培養が成功する症例が少ない.また手術症例が減っていることも検体の確保に影響している.腰椎椎間板ヘルニア患者より採取した椎間板ヘルニア成分を免疫組織学的に検討したところ,炎症性蛋白であるJAK-STAT系の発現を認めた研究を参考に,腰椎疾患である腰部脊柱管狭窄症における炎症性蛋白の関わりを調べる目的で本研究を開始した.腰部脊柱管狭窄症患者の手術症例より肥厚した黄色靭帯を採取し,免疫組織学的検討を行った.Western blottingでは,JAK,STAT3,p-STAT蛋白の発現を認めた.免疫染色で組織内のIL-6,p-STAT3の発現を検討した.IL-6は抗体の問題もあり染色される細胞はfibroblastの一部であったが,p-STAT3は肥厚した組織の血管内皮細胞,fibroblastに発現していた.p-STAT3はマクロファージには発現していなかった.また実際の黄色靭帯の肥厚の程度とp-STAT3の発現の程度は相関していた.実際の組織中でJAK-STAT系の活性化は確認できたが,その上流にあたると考えられるIL-6との関係については実際の組織では確認が困難であった.

そのため実際の手術症例から採取した靭帯組織から,Fibroblastの培養を行いin vitroでの実験系を計画した.培養細胞に対してIL-6による刺激を行い,培養細胞内でのJAK-STAT系蛋白の発現,細胞増殖の程度,阻害因子を加えることでの反応,を通して,IL-6-JAK-STAT系の一連の流れを検討する予定であった.しかしながら,培養細胞の確保,継代の問題が解決できず,in vitroの実験系の確立に至らず,in vitroの結果を出すことが困難であった.靭帯組織から靭帯のfibroblastの培養を行い,培養細胞を用いてSTATの発現や,負荷を与えた場合のJak-STAT系の変化について検討したい.少ない症例であるが,培養に成功した例があるので,組織系での仮説を培養細胞から結果が得られるよう検討する.現在までの進捗状況がやや遅れており、次年度も引き続き培養細胞での検討を行うため次年度使用額が生じた。
金沢市中心市街地における居住に関する研究-高齢者・子ども・女性の視点による-

金沢市では、中心市街地の人口の空洞化が大きな問題となっており、中心市街地を定住の場として魅力ある環境にすることは重要である。そこで本研究では、特に居住環境のあり方が生活の質に大きく関わるであろう、高齢者・子ども・女性にとっての中心市街地居住の問題点やあり方について検討している。元気な高齢者の外出頻度は高く、買い物、余暇活動目的の外出でバスは日常的に利用されている。コミュニティバスであるふらっとバスの認知度や評価は高い。車体などのハード面はもとより、低料金や運転手の人柄や対応の良さに大きな満足が得られている。評価が高く外出の利便性が高まることから、運行ルートの拡充を望んでいる。最も不満が表れたのはバス待ち環境であった。子どもが日常的に自動車交通やおとなによる危険にさらされている現状が明らかになった。自転車や歩行空間、公園内のみならず公園周辺においても、歩道の整備や自動車の規制などにより守られることが必要である。公園の死角となる場所はホームレスなどの居場所や高校生などのたまり場となりがちで、子どもにとっては不安な場所となり、外遊びを阻害している。このような不安感のない公園は特に小さい子どもたちには人気があり、今後の公園・遊び場づくりに活かせるだろう。今後中心市街地では、ファーストフード店、コンビニ、ファッションや雑貨の店舗など、子どもが望む商店の増加は叶えられるだろう。しかし一方で自然や動物と触れ合えるような遊び場も望んでいる者も多い。さまざまな場面で個人化がすすむ中、夫婦の就寝形態には夫婦寝室におさまらない現状があることがわかった。妻はかなりの割合で個室要求を潜在的に持っている。また、就寝環境の個人化志向から、夫婦別就寝希望も見られる。定住できる質を備えた住宅の計画には、夫婦寝室にそれぞれの個室を持つパターンなど、多様な選択肢をつくることも考えられるだろう。現在、全国の都市で中心市街地の空洞化が大きな問題となっている。金沢市も中心市街地の人口の減少、高齢化の進行、空き地や空き家の増加、小売商店数や従業員数の減少など例外ではなく、中心市街地活性化法を受け活性化事業に取り組んでいるが、その中で特に重要だと思われるのは住環境づくりである。中心市市街地の空洞化は、居住の場として成り立たなくなったことが始まりである。従って、定住の場として魅力ある中心市街地の住環境をつくっていくことが必要であると思われる。そこで本研究では、より詳細に問題点を把握し、中心市街地が定住できる住環境となるための示唆を得るために、高齢者、子ども、女性にとっての中心市街地居住の問題点やあり方について検討する。本年度は中学生までの子どもを視点にした調査研究を行っている。平成12年7月8月に中心市街地における子どもの外遊びの実態観察調査及び面接調査を実施した。平成13年2月3月にも同様の調査を現在実施中である。第2回調査は実施中であるため調査結果が未だ出ていないが、第1回調査では以下のような結果が見出せた。子どもには暑さを避けてエアコンの効いた図書館や児童館に人気がある。これらの施設では子ども向きの講座やクラブが開催されていることもその一因である。屋外では人気のない公園が多い一方で子どもの集まる公園も存在した。その要因は自宅の近さや規模によるのではなく、民家に囲まれていて人目に守られていることや、公園まわりの自動車通行の頻度などに影響されているのではないかと推測される。今後さらに詳細にその要因を探り、子どもの求める市街地の姿を検討する予定である。

金沢市も例外ではなく、中心市街地活性化事業に取り組んでいるが、その中で特に重要だと思われるのは住環境づくりであり、定住の場として魅力ある中心市街地の住環境をつくっていくことが必要であると思われる。そこで本研究では、中心市街地が定住できる住環境となるための示唆を得るために、高齢者、子ども、女性にとっての中心市街地居住の問題点やあり方について検討する。本年度は平成12年3月に実施した子どもの外遊びの実態および環境に対する不安感、要求について観察調査及び面接調査の集計を行った。その結果、子どもは、多くが車の危険や不審者などに対する不安感を持っていることが明らかになった。特に金沢の細く入り組んだ生活道路内の車の走行には、日常的に危険を感じている。自宅や学校近くの遊び場として、自然を求める一方、むしろゲームセンター、おもちゃ屋、大型スーパーなどの商業施設を望む声が強い。高齢化する中心市街地において、高齢者が安全で快適により支障なく外出するための有力な手段となりうるコミュニティバス(金沢ふらっとバス)が金沢市内に2ルートある。その利用実態、評価、要求などについて、高齢者を対象に平成13年1112月に質問紙調査を実施し集計を行った。その結果、以下のことが明らかになった。「ふらっとバス」の認知度は90%以上と高い。70歳以上の高年齢層や身体機能の低下した者の利用率が高く、「ふらっとバス」への依存度が高い。「ふらっとバス」によって、中心市街地への外出の増加がみられる。また、現状での評価は高いものの、運行ルート、運行時刻、バス待ち環境などについては、いくつかの要求がみられた。金沢市では、中心市街地の人口の空洞化が大きな問題となっており、中心市街地を定住の場として魅力ある住環境にすることが重要だと思われる。しかし実際は、まちなかの魅力の向上(例えば伝統的町並み保存、緑化推進、文化施設の整備、商業環境の向上、観光イベントの開催など)や渋滞緩和などが中心で、居住関係としては助成金交付による定住促進が主な施策であり、日常生活の居住環境の問題には細かく対処していない(平成1014年度金沢市実施事業より)。そこで本研究では、特に居住環境のあり方が生活の質に大きく関わるであろう、高齢者・子ども・女性にとっての中心市街地居住の問題点やあり方について検討している。高齢化する中心市街地において、要介護高齢者が住み続けられる居住環境を模索するため、本年度は特に高齢者施設の先進事例などの観察調査を実施した。この結果をふまえて11月に金沢市内の特別養護老人ホーム9箇所の観察調査、および4箇所の入居高齢者への面接調査を実施したところ、施設職員と入居高齢者との意識のずれがみられ、職員は高齢者の代弁者ではないことなど根本的な問題が明らかになり、中心市街地居住に関わる調査の対象者や方法を再考しなければならないことがわかった(次年度へ繰り越し)。本年度は平行して、郊外住宅地居住者が高齢化した時、交通の利便性が高く、生活・文化・商業関連施設の充実した中心市街地に転居することが想定される。この可能性を探るため調査を実施した。
3次元空間での追跡眼球運動の発現における小脳背側虫部の役割

両眼視機能を持つ霊長類が、3次元空間をゆっくり動く視覚対象からの情報を適切に取り込むためには前額面の追跡眼球運動である滑動性眼球運動と、奥行き方向の輻輳開散運動信号の協調が必須である。3次元性追跡眼球運動信号は前頭眼野に再現されている。小脳背側虫部が滑動性眼球運動と半規管性前庭眼反射の制御に関わる。この領域が3次元性追跡眼球運動信号の処理と耳石器性前庭眼反射の制御にどのように関わるかを調べ、前頭眼野応答と比較した。第1の実験として、視標追跡眼球運動に応答した100個の背側虫部プルキンエ細胞の60%は、奥行き方向のみ、あるいは前額面のみに応答し、残りの40%が前額面と奥行き方向の両追跡眼球運動に応答した。さらに輻輳に応答したプルキンエ細胞の方が、開散に応答したプルキンエ細胞よりも有意に多かった。奥行き方向に応答したプルキンエ細胞の73%は眼球運動の開始に先行して応答した。記録領域の化学的不活性化により輻輳眼球運動が障害された。第2の実験として、左右方向の直線加速度刺激を正弦波状に与え、視標の眼前距離を65-25cmに変えて視標追跡に関わるプルキンエ細胞応答を調べた。プルキンエ細胞の直線加速度刺激に対する応答は、視標追跡応答の最適方向と良く対応した。前額面に最適方向をもつプルキンエ細胞のほぼ60%は、前庭眼反射抑制課題に応答した。さらに前庭固視課題では結果としての眼球速度に対応した。輻輳開散運動にのみ最適方向をもつプルキンエ細胞は、左右方向の直線加速度刺激には応答しなかった。これらプルキンエ細胞応答は前頭眼野応答とは、異なった。第1の実験結果は、3次元性信号の個々の成分への分解が小脳背側虫部で始まっていること、第2の実験結果は、耳石器入力下で前頭眼野に再現される視標追跡のための視線運動信号は、主に小脳背側虫部に送られ、そこで視標追跡プルキンエ細胞の応答の最適方向に対応した処理がなされることを示唆する。両眼視機能を持つ霊長類が、3次元空間をゆっくり動く対象物からの視覚情報を適切に取り込むためには、前額面の視標追跡運動である滑動性眼球運動と、奥行き方向の視標追跡運動である輻輳開散運動信号の協調が必須であるが、これらは異なる脳内経路を経由する異なる眼球運動システムとして説明されてきた。本研究代表者はこの定説に反し、前頭眼野が前額面と奥行き方向の視標跡眼球運動信号を線形加算した3次元性の追跡眼球運動信号を再現することを始めて明らかにした(Fukushimaら2002)。3次元性の追跡信号が下降経路のどこで、どのようにして前額面と奥行き方向の視標追跡信号に変換されるかを理解するため本研究は、小脳背側虫部追跡眼球運動関連プルキンエ細胞の応答特性を、訓練したニホンサルを用いて調べた。

視標追跡眼球運動に応答した100個のプルキンエ細胞のうち、17%は前額面のみ、43%は奥行き方向のみ、残りの40%は前額面と奥行き方向の両視標追跡眼球運動に応答した。奥行き方向に応答したプルキンエ細胞の大多数(80%)は、輻輳開散眼球運動の速度成分と位置成分(輻輳角)の両方に応答した。これらのなかで、輻輳眼球運動に応答したプルキンエ細胞の方が、開散眼球運動に応答したプルキンエ細胞よりも有意に多かった。また、静止視標の固視中に別のスポットを奥行き方向に動かすと、それに対する視覚応答が、34%のプルキンエ細胞に認められ、その最適応答方向は、輻輳開散運動の最適方向とほぼ一致した。奥行き方向にステップ上に視標を動かして輻輳開散運動により追跡させたときのプルキンエ細胞応答と眼球運動を比較してそれらの応答潜時を調べると、73%のプルキンエ細胞は、眼球運動の開始に先行して応答した。以上の結果は、小脳背側虫部が前頭眼野同様に、3次元性の視標追跡眼球運動信号を再現し、輻輳開散運動の開始に関わることを示唆する。両眼視機能を持つ霊長類が、3次元空間をゆっくり動く対象物からの視覚情報を適切に取り込むためには、前額面の視標追跡眼球運動である滑動性眼球運動と、奥行き方向の輻輳開散運動信号の協調が必須である。また、視標追跡眼球運動は、通常、頭部運動を伴って行われるので、前庭眼反射の制御が必要になる。3次元性追跡眼球運動信号は前頭眼野後部領域に再現され、この領域の追跡眼球運動ニューロンは、半規管性前庭眼反射の制御にも関わることが明らかになった。その下降経路に位置する小脳背側虫部には、滑動性眼球運動と半規管性前庭眼反射の制御に関わる視標追跡プルキンエ細胞が報告されている。今年度は、この領域が耳石器性前庭眼反射の制御にどのように関わるかを調べ、前頭眼野後部領域の応答と比較した。訓練したニホンザルを対象として、頭部を固定して左右方向の直線加速度刺激を正弦波状(0.3Hz,10cm/s)に与え、視標追跡に関わる背側虫部プルキンエ細胞を記録した。視標の眼前距離を65,45,25cmの3点に変えて、視標と頭部を同時に動かす前庭眼反射抑制課題と、頭部運動中、視標を3次元空間で固定する前庭固視課題を用いて応答を調べた。背側虫部視標追跡プルキンエ細胞の直線加速度刺激に対する応答は、視標のみを用いた追跡応答の最適方向と良く対応した。前額面に最適方向をもつ背側虫部のプルキンエ細胞のほぼ60%は、耳石器性前庭眼反射抑制課題に応答した。さらに耳石器性前庭固視課題では、結果としての眼球速度に対応した。輻輳開散運動にのみ最適方向をもつ背側虫部プルキンエ細胞は、左右方向の直線加速度刺激には、殆ど応答しなかった。これらの応答は、前頭眼野の視標追跡ニューロン応答と異なった。以上の結果は、耳石器入力下で前頭眼野に再現される視標追跡のための視線運動信号は、主に小脳背側虫部に送られ、そこで視標追跡プルキンエ細胞の応答の最適方向に対応した信号処理がなされることを示唆する。
マウス新生仔におけるDNAメチル化からみた成人病胎児期発症説の解明

近年,子宮内での発生や分化,成長の過程での遺伝子の発現には多彩な分子が関わり,誤ったエピジェネティックな情報はさまざまな疾病をもたらすことが明らかになりつつある.すなわち子宮内での劣悪な環境によってエピジェネティックな修飾が起こり,それが成長後の成人病罹患のリスクを高めることが「胎児プログラミング」の本態と推測される.そこで本研究は,子宮内環境による胎児組織のDNAメチル化とそれによって生じる遺伝子発現の変化が将来の疾病罹患のリスクに関係するという仮説を検証するために,妊娠中の低栄養ストレスによるマウス新生仔組織のゲノムDNAメチル化の変化を検討した.マウスを全妊娠期間中,9%caseinのタンパク質制限による飼育群(R群)とコントロール群(C群)に分けて飼育した.出生直後の新生仔より肝組織を摘出し,組織をアガロースビーズ内に封入した後に,bisulfite法によりゲノムDNAのシトシンのメチル化の有無を調べた。標的遺伝子としてOct-4およびsphingosine kinase-1a(SPHK1)を選び,そのプロモーター領域をPCRで増幅しシークエンスした.R群(n=14)とC群(n=20)を解析の対象とした.結果としてシトシンのメチル化比率関しては,Oet-4およびSphk-1において有意差を認めなかった.メチル化部位に着目すると,Oct-4では両者に差が認られなかったが, Sphk-1ではメチル化部位が異なるパターンを認めた.CpAやCpTなどのnon-CpGのシトシンにメチル化が付加されており,それがパターンの違いの原因の可能性がある.DOHaD理論の病態と結びつけるために,DNA microarrayにて遺伝子発現の変化を網羅的に調べ,ターゲットとなる遺伝子をさらに絞り込む作業を現在行っているところである.近年,子宮内での発生や分化,成長の過程での遺伝子の発現には多彩な分子が関わり,誤ったエピジェネティックな情報はさまざまな疾病をもたらすことが明らかになりつつある.すなわち子宮内での劣悪な環境によってエピジェネティックな修飾が起こり,それが成長後の成人病罹患のリスクを高めることが「胎児プログラミング」の本態と推測される.そこで本研究は,子宮内環境による胎児組織のDNAメチル化とそれによって生じる遺伝子発現の変化が将来の疾病罹患のリスクに関係するという仮説を検証するために,妊娠中の低栄養ストレスによるマウス新生仔組織のゲノムDNAメチル化の変化を検討した.マウスを全妊娠期間中,9%caseinのタンパク質制限による飼育群(R群)とコントロール群(C群)に分けて飼育した.出生直後の新生仔より肝組織を摘出し,組織をアガロースビーズ内に封入した後に,bisulfite法によりゲノムDNAのシトシンのメチル化の有無を調べた。標的遺伝子としてOct-4およびsphingosine kinase-1a(SPHK1)を選び,そのプロモーター領域をPCRで増幅しシークエンスした.R群(n=14)とC群(n=20)を解析の対象とした.結果としてシトシンのメチル化比率関しては,Oet-4およびSphk-1において有意差を認めなかった.メチル化部位に着目すると,Oct-4では両者に差が認られなかったが, Sphk-1ではメチル化部位が異なるパターンを認めた.CpAやCpTなどのnon-CpGのシトシンにメチル化が付加されており,それがパターンの違いの原因の可能性がある.DOHaD理論の病態と結びつけるために,DNA microarrayにて遺伝子発現の変化を網羅的に調べ,ターゲットとなる遺伝子をさらに絞り込む作業を現在行っているところである.妊娠中に低栄養の母体から出生した児は,成人後に生活習慣病発症のリスクが高いことが知られている.子宮内環境における胎児組織のDNAメチル化とそれによって生じる遺伝子発現の変化が将来の疾病罹患に関係するのではないかと考え,本研究は妊娠中の低栄養ストレスによるマウス新生仔組織のゲノムDNAメチル化の変化を検討した.マウスを全妊娠期間中,9% casein dietでタンパク質を制限した群(R)と18% casein dietでの飼育群(C)に分け,出産後にそれぞれの新生仔から肝臓を摘出した.肝細胞をアガロースビーズ内に封入した後,bisulfite法によりゲノムDNAのメチル化シトシンをチミンに変換した.OCT4およびsphingosine kinase-1a (SPHK)を標的遺伝子としてPCRで増幅し,この配列をR/C群間で比較検討した.増幅された遺伝子のシトシンにおけるメチル化比率は,OCT4では88.61±3.13%(R群)対88.79±1.72%(C群),SPHKでは94.21±3.01%(R群)対93.59±2.66%(C群)となりいずれも有意差を認めなかった.塩基配列中のシトシンを抜き出してみると,ただし非メチル化はある決まった位置のシトシンにしか生じておらず,OCT4ではほとんど差がないのに対しSPHKでは非メチル化部位に異なる傾向が認められた.発生初期を司るOCT4に対し,出生後も発現が続いているSPHKの非メチル化部位に認められる変化は,子宮内環境による児の成長後の罹患リスクにとの関係が示唆される.またタンパク質制限によりのnon-CpGのシトシンにメチル基が付加されているところがあり興味深い.近年,子宮内での発生や分化,成長の過程での遺伝子の発現には多彩な分子が関わり,誤ったエピジェネティックな情報はさまざまな疾病をもたらすことが明らかになりつつある.すなわち子宮内での劣悪な環境によってエピジェネティックな修飾が起こり,それが成長後の成人病罹患のリスクを高めることが「胎児プログラミング」の本態と推測される.

そこで本研究は,子宮内環境による胎児組織のDNAメチル化とそれによって生じる遺伝子発現の変化が将来の疾病罹患のリスクに関係するという仮説を検証するために,妊娠中の低栄養ストレスによるマウス新生仔組織のゲノムDNAメチル化の変化を検討した.マウスを全妊娠期間中,9%caseinのタンパク質制限による飼育群(R群)とコントロール群(C群)に分けて飼育した.出生直後の新生仔より肝組織を摘出し,組織をアガロースビーズ内に封入した後に,bisulfite法によりゲノムDNAのシトシンのメチル化の有無を調べた.標的遺伝子としてOct-4およびsphingosine kinase-la(SPHK1)を選び,そのプロモーター領域をPCRで増幅しシークエンスした.R群(n=14)とC群(n=20)を解析の対象とした.結果としてシトシンのメチル化比率に関しては,Oct-4およびSphk-1において有意差を認めなかった.メチル化部位に着目すると,Oct-4では両者に差が認められなかったが,Sphk-1ではメチル化部位が異なるパターンを認めた.CpAやCpTなどのnon-CpGのシトシンにメチル化が付加されており,それがパターンの違いの原因の可能性がある.DOHaD理論の病態と結びつけるために,DNA microarrayにて遺伝子発現の変化を網羅的に調べ,ターゲットとなる遺伝子をさらに絞り込む作業を現在行っているところである.
光学活性なα, α-2置換シクロヘキサノン誘導体の合成とCDスペクトル

初年度は2-メチルシクロヘキサノンおよび2-エチルシクロヘキサノンに(S)-(-)-フェニルエチルアミンを作用させ得られたイミンとアクリル酸メチルとの反応を検討した.次年度は2-アリルシクロヘキサノン,2-イソプロピルシクロヘキサノン,2-メチル-4-t-ブチルシクロヘキサノン,2-エチル-4-t-ブチルシクロヘキサノンを用いた.また2,3-ジメチルシクロヘキサノンの場合について同様の反応を検討した.絶対配置については一部のものについて外部補助基を導入してX線解析により決定した.3置換体の相対配置の決定には600MHzNMRを用いた.従って立体配座も決定した.生成したケトエステル体すべてについてCDスペクトルを測定した.2位の絶対配置はいずれも(S)と決定した.これより絶対配置が判明するとともに立体配座も明らかとなった.2-メチルシクロヘキサノンと2-エチルシクロヘキサノンの違いは6員環の立体配座の差であることが結論づけられた.それぞれの最安定配座をCONFLEXを用い,MM2の計算を行ったが,実際の存在比との関連は今後の課題である.2,3-ジメチルシクロヘキサノンの場合は3位のメチル基の立体配置によって外部補助基とのマッチング,ミスマッチングが存在し,ジメチル基がcisの化合物の合成に大変利用価値が高いことが判明した.この不斉Michael型反応は一般性が高くまたeeも高いのが特徴であり,多置換体に応用した例を詳細に検討したのはこれが初めてである.初年度は2-メチルシクロヘキサノンおよび2-エチルシクロヘキサノンに(S)-(-)-フェニルエチルアミンを作用させ得られたイミンとアクリル酸メチルとの反応を検討した.次年度は2-アリルシクロヘキサノン,2-イソプロピルシクロヘキサノン,2-メチル-4-t-ブチルシクロヘキサノン,2-エチル-4-t-ブチルシクロヘキサノンを用いた.また2,3-ジメチルシクロヘキサノンの場合について同様の反応を検討した.絶対配置については一部のものについて外部補助基を導入してX線解析により決定した.3置換体の相対配置の決定には600MHzNMRを用いた.従って立体配座も決定した.生成したケトエステル体すべてについてCDスペクトルを測定した.2位の絶対配置はいずれも(S)と決定した.これより絶対配置が判明するとともに立体配座も明らかとなった.2-メチルシクロヘキサノンと2-エチルシクロヘキサノンの違いは6員環の立体配座の差であることが結論づけられた.それぞれの最安定配座をCONFLEXを用い,MM2の計算を行ったが,実際の存在比との関連は今後の課題である.2,3-ジメチルシクロヘキサノンの場合は3位のメチル基の立体配置によって外部補助基とのマッチング,ミスマッチングが存在し,ジメチル基がcisの化合物の合成に大変利用価値が高いことが判明した.この不斉Michael型反応は一般性が高くまたeeも高いのが特徴であり,多置換体に応用した例を詳細に検討したのはこれが初めてである.2-メチルシクロヘキサノンの(S)-(-)-フェニルエチルアミンとのイミンを合成し,アクリル酸メチルと無溶媒で反応させると1,4付加物が生成した.これを加水分解して得たケトエステルのeeは96%であった.そこで絶対配置を調べるために,エステル部分を還元しアルコールとしたものについて(lS)-(-)-カンファニッククロリドを用いて誘導体とし,X線結晶解析を行うことにより絶対配置を決定した.CDスペクトルは(+)のCotton効果を示し,通常の立体配座から想像されるものとは異なっていた.次に側鎖の長さの異なるものを種々合成しCDスペクトルを測定した.また側鎖部分にエステを持たないものも合成し,これらすべての誘導体においてCDスペクトルが(-)のCotton効果を示すことが明らかになった.そこで,2-エチルシクロヘキサノンについて同様に反応した.得られたケトエステルは97%eeであり,CDスペクトルは(-)のCotton効果を示した.このものについてもX線結晶解析を行い絶対配置を決定した.また4-t-ブチル-2-メチルシクロヘキサノンと4-t-ブチル-2-エチルシクロヘキサノンについても同様に行い,立体配座がCDの符号と密接な関係にあることを証明した.その他に,アリル基,プロピル基,イソプロピル基,オクチル基を有するものについても同様に反応しケトエステルについてCDスペクトルを測定した.その結果,2-メチル体はすべて(+)の,またその他の化合物は(-)のCotton効果を示した.これらはシクロヘキサノン部分の立体配座によると思われるが,詳細は力場計算を用いる解析により来年度の計画で行う予定である.このようにカルボニル基のα-位に2つ置換基を有するシクロヘキサノン誘導体においてCDスペクトルを詳しく調べたのは今回が初めてである.今年度は2-アリルシクロヘキサノン,2-イソプロピルシクロヘキサノン,2-メチル-4-t-プチルシク口ヘキサノン,2-エチル-4-t-ブチルシクロヘキサノンに対して(S)-(-)-フェニルエチルアミンを作用させ得られたイミンをアクリル酸メチルと反応させた.加水分解の後,カラムクロマトによって精製し,3置換体については2種のケトエステルを得た.これらはt-ブチル基とメチル基あるいはエチル基がcisおよびtransとなった異性体であり,相対配置は600MHz NMRにより行った.CDスペクトルから2位の絶対配置はいずれも(S)と決定した.4-t-ブチル基によって立体配座が固定されていると考えられるため,CDスペクトルは予想される符号を示した.

これにより2-メチルシクロヘキサノン誘導体のCDスペクトルはその立体配座に起因するものと結論づけられた.次に2,3-ジメチルシクロヘキサノンの場合について同様の反応を行った.ラセミ体では収率が極めて悪く(26%),次に(3R)-2,3-ジメチルシクロヘキサノンを用いると収率は59%と向上し,ee,deともに99.5%以上となった.しかし,(3R)-2,3-ジメチルシクロヘキサノンに対して(R)-(+)-フェニルエチルアミンを用いるとミスマッチングにより反応はほとんど進行しなかった.これは新しい発見であり合成反応に利用可能であると考えられる.以上,2,3-2置換の場合と,2,4-2置換の場合についての選択性は全く異なっていた.CONFLEXを用い,MM2の計算を行いそれぞれの最安定配座を計算したが,スペクトルとの相関は今後の課題である.
生理食塩水に代わる胸腔・腹腔洗浄液の開発と基礎的研究

本研究は術中の腹腔洗浄について実験的検討を行い、腹腔洗浄後の組成を検討した。生理食塩水による腹腔洗浄を再検討し、腹腔洗浄時の生体の恒常性を維持し外科的侵襲を軽減することに意義がある。実験モデルはCAPDに準じた方法にてラットの腹腔内に腹腔洗浄液を投与し、体重、尿量、血中ヘモグロビン濃度、血中および腹水中の浸透圧、電解質濃度の経時的変化を測定している。最終的に投与された洗浄液の浸透圧、電解質濃度は血清のそれに近い値をとることが明らかにされた。また腹腔内細胞の曝露実験による洗浄の影響を見ると(ウサギ壁側腹膜中皮細胞のviability、ヒト末梢血単核球の貧食能・活性酸素産生能、サイトカイン産生能で評価)、洗浄液は中性に近い値において細胞機能が最も維持されることが明らかにされた。EL-Reflac 1号^Rをベースに、pHを中性に近く整え、浸透圧を調節し細胞外液と等張で電解質組成の近い洗浄液を作製した。腹腔洗浄を行うと生理食塩水では腹腔洗浄液に対して有意に洗浄液の体内へ移動が多く、尿量が増加した。また腹水中の浸透圧、電解質濃度変動にも有意差があった。腹腔内細胞への洗浄の影響を見ると、PEG4000の静脈投与による色素透過性試験で、色素の漏出が増加しており、生理食塩水による腹膜損傷が示唆された。新しい洗浄液を用いて腹腔洗浄することにより、術中の循環動態は安定し、安全に周術期を管理することができ、また腹膜や臓器の損傷が少なく、癒着の予防につながることが期待できる。生理的食塩水は、創や腹腔、胸腔の術中の洗浄液として一般に用いられているが、生理的食塩水は、組織への侵襲は無視できない。そこで、これにかわる新しい、生体にやさしい創・腹腔洗浄液の開発をめざして研究をすすめた。まず、生体にやさしい液の性状を基礎的にラットをもちいて検討したところ、ウサギの腹膜中皮細胞の実験から、PHが中性であること、等浸透圧であること、塘を含む細胞外液組成であることが最低条件であった。このようは条件をみたす洗浄液を試作し、生理的食塩水と比較検討した。その結果、腹腔からの水分の吸収は、洗浄液で著明に少なく、電解質(特にCa)の変化がすくなかった。また、PEG4000を用いた色素漏出試験では、生理的食塩水では、漏出が見られ、腹膜上皮細胞の損傷が示唆され、洗浄液では、有意に漏出が少なかった。また、洗浄後の腹水中のサイトカイン(IL-6)の産生をみると有意に試作した洗浄液の方が産生が少なく、また、血液やLPSを腹腔内に投与したマウスの実験でも同様な結果がえられ、洗浄液は、腹膜への侵襲が少ないと考えられた。以上から、生理的食塩水は、最適の腹腔洗浄液ではなく、生体のもっと適した洗浄液の開発が必要で、生体反応の軽減と安全な手術と周術期経過につながると考えられる。本研究は腹腔洗浄について実験的検討を行い、CAPDに準じた方法にてラットの腹腔内に腹腔洗浄液を投与し検討した。ウサギ壁側腹膜中皮細胞のviability,ヒト末梢血単核球の貪食能・活性酸素産生能、サイトカイン産生能で評価から、洗浄液は中性に近い値において細胞機能がもっとも維持されるNa:140mMK:4mMC1:103mMMg:0.5mMCa:1mMLactate:44mMGlucose:5g/L、PH:7.4浸透圧:305mOsm/kgの洗浄液を作成した。

腹腔洗浄を行うと生理食塩水では腹腔洗浄液に対して有意に洗浄液の体内へ移動が多く、尿量が増加し、腹水中の浸透圧、電解質濃度変動にも有意差があった。これに対し洗浄液ではこれらの変化が軽微であり、PEG4000の静脈投与による色素透過性試験で腹腔壁細胞への影響を見ると生食では色素の漏出が増加しており、生理食塩水による腹膜損傷が示唆され、試作した洗浄液は損傷が少ないと考えられた。また、炎症性サイトカイン(IL-6)産生は有意に洗浄液のほうが少なかったが、出血モデルや腹膜炎モデルでは有意ではなかった。は今回考案した腹腔洗浄液は、腹膜・臓器損傷が少ないことにより、術後癒着の予防の効果も期待できると思われる。
電子顕微鏡内マイクロプロセス・マイクロファブリケーションシステム構築と実験

工学,医学,生物等各分野からの微細加工への要望に伴い,SEM内において10^<-8>10^<-4>mの物体を対象に観察と作業を一元的に行なうことができる微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムの研究・開発を行なった.これは,技能未熟者にとっても操作性が高く,作業目的によって容易にカスタマイズでき,軟らかさの異なる生物から硬い無機物までを熟練を要せず扱えるという特性を備えている.平成1014年度に得られた成果を以下にまとめる.1.作業の要望を精査し,顕微鏡下における微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムのコンセプトと構成を明らかにした上で,(1)マンマシンインターフェース部,(2)制御処理部,(3)動作機構部から成るシステムを開発した.2.顕微鏡下における対象物の三次元情報を視覚および力覚から得,それを適宜処理し作業者に返すことで微細作業を容易にする機能として,(1)ビジュアルフィードバックシステムと(2)フォースフイードバツクシステムを組込みんだ.評価実験によりその有効性を確認した.3.ビジュアルフィードバックシステムの機能を自動微細作業システムに発展させた.評価実験により自動微細作業が問題なく効率よく行なえることを実証した.4.力覚情報から対象物の"かたさ""やわらかさ""親和性"を判断するにあたってのそれぞれによる信号の違いを明らかにした.実微細作業実験から,実験工具先端形状および工具への振動付加の有無が加工形態に及ぼす影響を明らかにした.5.応用として,未経験者でも容易に,肉体的・精神的疲労を伴わず,除核や注入などの細胞操作を行なえる自動マイクロ・マニピュレーションシステムのコンセプトと内容を明らかにした.6.研究成果の部を諸学会誌,国際会議,口頭発表論文として公表し,最後に研究成果報告書としてまとめた.工学,医学,生物等各分野からの微細加工への要望に伴い,SEM内において10^<-8>10^<-4>mの物体を対象に観察と作業を一元的に行なうことができる微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムの研究・開発を行なった.これは,技能未熟者にとっても操作性が高く,作業目的によって容易にカスタマイズでき,軟らかさの異なる生物から硬い無機物までを熟練を要せず扱えるという特性を備えている.平成1014年度に得られた成果を以下にまとめる.1.作業の要望を精査し,顕微鏡下における微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムのコンセプトと構成を明らかにした上で,(1)マンマシンインターフェース部,(2)制御処理部,(3)動作機構部から成るシステムを開発した.2.顕微鏡下における対象物の三次元情報を視覚および力覚から得,それを適宜処理し作業者に返すことで微細作業を容易にする機能として,(1)ビジュアルフィードバックシステムと(2)フォースフイードバツクシステムを組込みんだ.評価実験によりその有効性を確認した.3.ビジュアルフィードバックシステムの機能を自動微細作業システムに発展させた.評価実験により自動微細作業が問題なく効率よく行なえることを実証した.4.力覚情報から対象物の"かたさ""やわらかさ""親和性"を判断するにあたってのそれぞれによる信号の違いを明らかにした.実微細作業実験から,実験工具先端形状および工具への振動付加の有無が加工形態に及ぼす影響を明らかにした.5.応用として,未経験者でも容易に,肉体的・精神的疲労を伴わず,除核や注入などの細胞操作を行なえる自動マイクロ・マニピュレーションシステムのコンセプトと内容を明らかにした.6.研究成果の部を諸学会誌,国際会議,口頭発表論文として公表し,最後に研究成果報告書としてまとめた.マイクロマシニング、マイクロマニファクチャリング、マイクロファブリケーションを連携し、一台のマシンに融合することにより、加工、組立、評価点検を一貫融合するシステムを開発する。同時に、五感覚外の無感覚世界とマクロな五感覚世界の実像を結合する、マクロ世界とマイクロ世界との間のインターフェイス開発を行う。平成10年度は〔I〕マニピュレータの構成決定と設計・製作〔II〕マン-マシンインターフェース・ビジョンシステムおよびその制御システムの開発を行った。以下、グループ毎に研究成果を記述する。Aグループ:電子顕微鏡内で部品の移動と位置決めに用いるテーブル、およびその駆動用回路を設計・試作し、ユニット化した。部品加工およびその他の作業用の3軸方向に移動可能な2台のマニピュレータ、およびその駆動用回路を設計・試作し、ユニット化した。同時に、上記2つの駆動用ソフトウェア開発を行った。なお、微動部分の駆動用アクチュエータには、圧電素子を用いた。Bグループ:作業者による加工および作業用マニピュレータの操作に使用するジョイスティックシステム用ソフトウェアの開発(ライブラリ化)を行った。Cグループ:画像検出方法、画像データからの加工部品形状データの処理方法を決定し、画像処理部の構成要素を具体化し、そのシステム化および設計を行った。さらに、加工デバイス(マニピュレータの先端部分)として、調査を通じ要求される各動作を明らかにし、デバイスの設計および試作を行った。加えて、高真空かつ微小スケールでの作業において問題となる、摩擦・摩耗現象について原子オーダでシミュレーション解析を行い、その成果を国際会議ASIATRIB'98(北京、清華大学)にて発表した。本研究では、マイクロマシニング、マイクロマニファクチャリング、マイクロファブリケーションを連携し、一台のマシンに融合することにより、加工、組立、評価点検を一貫融合するシステムを開発する。平成11年度は〔I〕マニピュレータの総合評価

〔II〕電子顕微鏡内での実装及び評価システムの構築を行った。以下、グルーブ毎に研究成果を記述する。Aグループ:操作テーブルの駆動用ソフトウェアおよび双腕型マニピュレータ駆動用ソフトウェアの開発を行った。Bグループ:H10年に引き続き、ジョイスティック用ソフトウェアの開発を行い、Aグループ開発のジョイスティックと駆動系とのシステム融合を図った。Cグループ:画像処理部のソフトウェアライブラリ化、およびカメラ部(CCD)のズームコントロール、X-Y-Z-θテーブルの設計試作、平行バネ方式による3軸力覚センサの設計・試作を行った。ここで、いずれのソフトウェアもWindows上で表示・操作可能なC(C++)言語によるものである。これらを組み込んだ後、大気中でマニピュレータ動作確認を行った。さらに、テーブルおよびマニピュレータを電子顕微鏡内に実装し、真空環境下における双方の動作確認をした。本研究は,SEM内において10-810-4mの物体を対象に観察と作業を一元的に行うことができる微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムを開発している.これは,小型で市販のSEMチャンバーに内蔵できること,技能未熟者にとっても操作性が高いこと,作業目的によって容易にカスタマイズできること,軟らかい生物(含有機物)から硬い無機物までを熟練を要せず扱えることを目指している.特に対象物の大きさやSEM倍率などの作業環境の変化等を意識せずに,直感で作業が行える要素技術の開発を主目的としている.平成12年度には,SEM内で観察・作業するためにマイクロファブリケーションデバイスを完成した.そのデバイスの機能,能力を検証のために実験を行い,次のような結果を得た.1)SEM内蔵可能な双腕型動作機構部,制御部,マン・マシンインターフェースからなるマイクロ・マニピュレーションシステムを開発した.2)ツール先端の作用力を検知し,インターフェースにフィードバックすることにより,微小物をその場観察しながら,固定,切断,把持,移動という一連の作業を通常の作業と同じ様に容易に行うことができた.3)開発したシステムは,高い操作性を有すると同時に,有機物から無機物まで,生体から金属まで扱える柔軟性を持ち,広範囲への応用が期待できる.4)不定形試料に対するマニュアル操作に加え,開発した画像処理によるパターン認識アルゴリズムを使って定型の加工を正確かつ自動的に行うことができた.以上の業績を新聞報道にも取り上げられ,論文3編,特許3件にまとめた.それをシーズに,科学技術庁科学技術事業団の助成を得て,現在は商品化を取り込んでいるところである.本研究は、SEM内において10^<-8>10^<-4>mの物体を対象に観察と作業を一元的に行うことができる微細作業用マイクロ・マニピュレーションシステムの開発を行なっている。
組織特異的な細胞壁構築過程を統御する分子システムの解明

植物体を構成する数十種類の細胞型(組織の種類)は、それぞれに固有の細胞壁構造を持ち、その動態を通して固有の形態を構築・維持し、それが細胞固有の機能発現の基盤を成している。この事実は、細胞壁構築過程が細胞型分化に係わる制御過程と密接に連動していることを意味している。しかし、細胞型固有の細胞壁構築・再編に関わる分子過程は、未だその概要さえ掴めていない。本基盤研究(B)では、シロイヌナズナの細胞壁構築に関連する30遺伝子ファミリー765遺伝子を視野にいれ、(a)独自に設計・製作した70-mer DNAマイクロアレーおよび定量RT-PCRによる網羅的な発現解析、(b)細胞壁サブプロテオームによるタンパク質分泌過程の解析、および(c)細胞壁関連遺伝子ファミリーのT-DNA挿入変異体による包括的表現型解析を組み合わせ、特定の細胞型(組組)形成において特に必須の役割を担う細胞壁遺伝子セットを探索すると共に、特定した遺伝子の発現制御機構およびタンパク質機能の解析を進めてきた。その結果、根で特異的な発現様式を示し、進化的にも近縁であるAtXTH17,AtXTH18,AtXTH19,AtXTH20の4つの遺伝子内に根での発現特性に関わるシス流域を同定し、その機能を実証することができた。また、AtXTH12およびAtXTH18が根の伸長に必須の役割を担うこと、AtXTH27が葉の管状要素の伸長に必須であること、などを実証することができた。更に、胚軸の伸長過程で役割を担う細胞壁遺伝子群、花茎の屈曲過程で機能する遺伝子群、花茎の支持組織の細胞壁構築に特異的に関与する遺伝子群なども特定できた。以上の成果により、私たちが提唱している「細胞壁型特異的遺伝子セット説」は、遺伝子発現のレベルでは、ほぼ実証されたと考えられる。また、細胞壁型特異性の形成過程において、XTH遺伝子ファミリーが際だって重要な役割を担うことが今回の研究により明らかとなった。物体を構成する数十種類の細胞型は、それぞれに固有の細胞壁構造を持ち、その動態を通して固有の形態と機能を発揮している。しかし、細胞型に固有の細胞壁構築の仕組みは、未だ概要さえ掴めていない。本研究では、シロイヌナズナの細胞壁構築に関連する約1000種の遺伝子の発現特性とシス機能を包括的に比較することにより、細胞型固有の細胞壁の動態に協調的に関与する遺伝子群(遺伝子セット)を解明すると共に、それらを統括する転写制御システムの解剖を目指して研究を進め以下の成果を得た。シロイヌナズナの特定組織で特異的に発現する細胞壁関連遺伝子群セットを特定するために、a)花茎の伸長時、b)花茎伸長停止時、c)葉の展開過程、d)根の伸長域、e)GA、IAA、fusicoccin等のホルモンによる胚軸伸長誘導過程、でそれぞれ特異的に発現が変動する遺伝子群を解析した。その結果、細胞壁構築関連遺伝子群の各ファミリーのメンバーはそれぞれ、独自の過程に関与し、明確な役割分担を示すことが明らかとなった。シロイヌナズナの培養細胞系を用い、細胞壁中に分泌されるタンパク質を二次元電気泳動法と質量分析法により、約200の細胞壁タンパク質を同定し、プロトプラストからの細胞壁再生およびジベレリンによる細胞伸長過程において発現の高まる遺伝子を特定した。

シロイヌナズナの細胞壁XTHファミリーに属する33の遺伝子についてT-DNAタグラインを用いて欠損変異体を解析し、a)根で高い発現を示すAtXTH12を欠損した変異体では根の伸長不全、葉の展開不全、爽の形成不全などの顕著な形態異常を示した。b)地上部の各器官で発現するAtXTH27欠損変異体では葉の形態異常が見られ、葉肉組織内に斑点状の細胞の壊死が高頻度で観察された。これらの結果は、XTHの各メンバーがそれぞれの発現組織において独自の機能を担うことを示している。植物体を構成する数十種類の細胞型(組織の種類)は、それぞれに固有の細胞壁構造を持ち、その動態を通して固有の形態と機能を発揮している。この事実は、細胞壁構築過程が、細胞型分化の基盤に係わる重要な過程の一つであることを意味している。しかし、細胞型に固有の細胞壁構築の仕組みは、未だ概要さえ掴めていない。本研究では、シロイヌナズナの細胞壁構築に関連する約1000種の遺伝子の発現特性とシス機能を包括的に比較することにより、細胞型固有の細胞壁の動態に協調的に関与する遺伝子群(遺伝子セット)を解明すると共に、それらを統括する転写制御システムの解剖を目指した研究を進め、細胞壁の動態制御という視点から、細胞分化の基本概念である細胞型のアイデンティティー決定機構解明の糸口の解明を目指した。その結果、以下の成果を得た。根で特異的な発現様式を示し、進化的にも近縁であるAtXTH17,AtXTH18,AtXTH19,AtXTH20の4つの遺伝子のプロモーター領域内に良く保存されている塩基配列が根特異的発現を促すシス活性を持つことをプロモーター解析により見いだした。これら4遺伝子は、根の中での発現組織やシグナル応答性において、それぞれ異なる発現特性を示し、異なる役割を分担していることが示唆された。AtXTH27が葉の維管束、特に前形成層細胞に特徴的な発現パターンを示すことを見いだした。この遺伝子の欠損した変異体(xth27-1,xth27-2)では、ロゼット葉の維管束の形成不全および機能不全をおこし、葉の間抹消維管束周辺の葉肉組織の壊死および三次維管束の節部機能不全を伴った。上記の成果に加え、細胞型特異的な遺伝子発現を示す細胞壁構築関連遺伝子を多数同定した。