hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線エリプソメーターの開発とその応用研究

エリプソメトリー(偏光解析法)は、偏光状態のわかった完全偏光の光を試料へ入射し、反射の際の偏光状態の変化を測定して試料の光学定数を求める測定法である。この測定法は、可視光領域では金属や半導体の表面の複素屈折率の測定、基板上の薄膜の厚さや屈折率の測定、単分子層以下のガスの吸着量の測定など、広い分野で用いられている。しかし、X線領域の光に対するエリプソメトリーは、偏光光学素子がなかったため、これまで実現されていない。ところが、近年、X線に対する偏光光学素子(偏光子、検光子、移相子)が我々のグループを含め世界の数グループにより開発され、これらを偏光度の高いシンクロトロン放射X線源と組み合わせてX線エリプソメーター(X線偏光解析装置)を開発すれば、X線領域の光に対するエリプソメトリーが可能である。本研究では、先ず、我々がこれまでに開発したX線ポラリメーター(X線偏光計:X線偏光子とX線検光子から成る)に新しく考案したダイヤモンド結晶を用いた回転型四象限X線移相子を組み合わせて、偏光度の高い水平偏光、垂直偏光、円偏光のみならず、任意の角度に傾斜した直線偏光や任意の長軸傾きと楕円率を有する楕円偏光を含む任意の偏光状態の生成、および、偏光状態の高精度な解析を行うことのできるX線エリプソメーターを開発した。また、二次元スキャン(偏光子の回転・検光子の回転)をX線エリプソメーターに導入する事により、結晶の対称性に関わらず、円複屈折と円二色性の精密測定を行うことができた。さらに、回転型四象限X線移相子を用いて高精度な偏光スイッチングを行い、一軸性結晶であるCo(en)_3Br・H_2O単結晶の非光学軸の四つの光学パラメーター(直線複屈折・直線二色性・円複屈折・円二色性)を得ることに成功した。本研究では、回転型四象限X線移相子と二次元スキャンの導入によりX線エリスソメトリーの基礎を確立することができた。今後は、測定精度の高い技術を活かし、物質構造や電子状態の構造異方性と磁性の研究に関する応用研究をさらに発展させて行きたい。本研究の目的は、これまでに開発したX線ポラリメーターに新しく考案したダイヤモンド結晶を用いた収差補償型X線移相子を組み合わせて、偏光度の高い任意の偏光状態の生成、および、偏光状態の高精度な解析を行うことのできるX線エリプソメーターを開発することである。本年度は、2枚、もしくは4枚のダイヤモンド結晶からなる収差補償型X線移相子の製作を行った。光軸収差を補償するために2枚のダイヤモンド結晶を使用し、さらに色収差も補償するためにはさらに2枚の移相子を加えて、合計4枚のダイヤモンド結晶を連続して配置した。個々のダイヤモンド結晶は、結晶性の高い特注品を購入し、α度、(α+90)度、(α+180)、(α+270)度、傾いた配置になるように並べ、また、回折条件を満たす角度の近傍で精密(0.1秒の精度)にブラッグ角の調節を行った。

この配置によって放射光の横偏光を縦偏光に変換して、理論通り光軸収差、色収差の両方が補償されていることを、縦直線偏光度を測定することによって評価した。本年度は、まず2枚移相子の性能に重点を置いてその性能評価を行った。水平偏光から垂直偏光に変換したときの垂直偏光度は、1枚移相子では87%であったものが、2枚移相子では99%に向上することが実験的に示された。これはX線ビーム広がりによる収差が補正されたことを示している。このときの透過率はニッケルK吸収端(8.3KeV)で47%であった。4枚移相子についても性能評価を行った。X線のエネルギー幅が広いときにエネルギー収差が補正されることが期待されるが、その結果は現在解析中である。本研究の目的は、これまで開発したX線ポラリメーターに新しく考案したダイヤモンド結晶を用いた収差補償型X線移相子を組み合わせて、偏光度の高い任意のX線偏光状態を生成し、かつ、試料から散乱されたX線の偏光状態の高精度な解析を行うことのできるX線エリプソメーターを開発することである。昨年度製作した4枚のダイヤモンド結晶からなる収差補償型X線移相子を一つのカイ軸ゴニオメータの内側に取り付け、装置全体がX線ビームの周りに任意の角度で回転できる回転型四象限移相子を完成させた。4枚のダイヤモンド移相子は、X線ビームの周りにお互いに90°づつ角度をなしていて、光軸収差と色収差が同時に補償できる配置に保たれている。シンクロトロン放射の水平偏光を高い偏光度の垂直偏光と円偏光に効率よく変換できることは昨年度に示したが、回転型四象限移相子の作成により、任意の方位角を有する直線偏光を生成するが可能になった。入射する水平偏光を一度円偏光に変換した後で任意の方位角の直線偏光に変換する方法(パス1)と4枚の移相子を1枚の移相子としての機能を持たせて1回の変換で任意偏光を生成する方法(パス2)を比較して、得られる直線偏光度の比較を行った。その結果、パス2の方が、直線偏光度および方位角の精度の両面で優れていることが分かり、収差補償型X線移相子である四象限移相子が任意の方位角でも理論通り動作することを実験的に確認することができた。任意の楕円偏光度の生成も可能であるが、その評価実験は現在進行中である。任意の方位角の直線偏光を生成できることが可能になったことの意義は大きい。すなわち、試料によるX線の散乱面を常に一定(たとえば鉛直面)にして実験を行いながら、すべての散乱テンソルを測定することが可能であり、そのためには通常のθ-2θ二軸ゴニオメーターがあれば十分である。これまでスカラー量として扱われてきた原子散乱因子をテンソル量として測定できる計測システムが現実的なものになったといえる。
熱酸化法によるチタン上への遷移金属-チタン複合酸化物皮膜の形成と物性評価

1.遷移金属のチタンへのコーティング:チタン板上に真空蒸着により遷移金属(ニッケル、クロム、鉄、モリブデン、タンタル、タングステン、亜鉛)を蒸着した。走査型電子顕微鏡による形態の観察その際、ピンホールがなく、均一な析出状態の膜を得るための最低膜厚は1ナノメートルで良いことが解った。逆に、200ナノメートル以上蒸着すると、蒸着時に膜中に発生する応力により、亀裂が発生することが明らかとなった。2.熱酸化実験と表面のキャラクタリゼーション:それぞれの遷移金属を20ナノメートル真空蒸着したチタン板を急速酸化実験用電気炉を用いて1気圧の酸化雰囲気中で熱酸化し、それを光電子分光分析、X線回折によって分析した。タンタル、モリブデン、タングステンなどの高融点遷移金属を蒸着した試料を熱酸化によって酸化物に転換させるためには加熱温度を800°C以上、昇温速度を毎秒10°C以上にする必要がある。一方亜鉛のような低融点遷移金属の場合、毎秒1°C以下で昇温し、金属の融点より50°C以上低い温度に保持して母相のチタンへの金属の拡散を促進した後、600°C以下で酸化すべきであることが解った。生成相は亜鉛を蒸着・熱酸化した場合にはチタンとの複合酸化物であり、それ以外の場合には遷移金属が置換固溶した酸化チタンが生成した。3.光電気化学特性の評価:キセノンランプ照射下でのアノード分極実験から、酸化チタンよりも大きな光電流が得られたのは、ニッケル、タンタル、タングステン、および亜鉛を蒸着・熱酸化して得られた酸化物であった。混合酸化物が生成する場合には光電流の立ち上がり波長は酸化チタンと等しく光量子収率は30%以下であったが、複合酸化物が生成する場合には(亜鉛)立ち上がり波長は長波長側にシフトし、収率は90%以上となった。以上の結果から、亜鉛を蒸着、熱酸化して得た酸化物は、光アノード電極として適当である事が明らかとなった。
von Gierke病患者の遺伝子解析

96年度の研究により、von Gierke病患者のglucose-6-phosphatase遺伝子に点変異(G727T)を同定し、これが日本人に多い変異であることを明らかにした。また、制限酵素多型を利用したG727T変異の簡便な検出法を開発し、von Gierke病のDNA診断と患者家系での無症候性キャリアーの判定を可能にした。von Gierke病2家系3例の患者を対象とした。S家系の患者1,3は兄弟例で、両親はいとこであった。患者2のM家系にも同様の血族結婚があった。患者1のG6Pase遺伝子の5つのエクソンとエクソン-イントロン接合部の全塩基配列を解析し、727番目の塩基がGからTへと点変異(G727T)していることを同定した。また、患者2の塩基配列の結果も同一の点変異であった。ミスマッチを導入したプライマーを用いたPCR産物の制限酵素多型を利用して患者を分析すると、3例すべてがG727T変異のホモ接合体であった。2家系の患者以外の家族は無症候であったが、両親はいずれもT727T変異のヘテロ接合体であり、S家系の兄はヘテロ接合体であった。また、216人の健常人をスクリーニングしたところ、ヘテロ接合体が一例見つかった。von Gierke病患者3例が同じ点変異のホモ接合体であり、また健常人にもキャリアーを認めたことからG727T変異は日本人に多い変異でああると考えられた。以上の成果は、現在英文誌に印刷中である。
活性酸素シグナルー毒性物質から脳内生理活性物質へのパラダイムシフトー

スポーツや日常の活動に伴い発生する活性酸素種は、生体分子の酸化修飾を介してガン化、細胞死、老化を招く「悪玉」であるとされている。一方で、生体は活性酸素種を積極的に産生する酵素を有しており、活性酸素種が何らかの生理的な役割を担うことが考えられる。そこで本研究では、活性酸素種の「善玉」としての役割に着目し、特に小脳を介した運動記憶および神経可塑性への活性酸素種の関与を解明する。
新規エネルギー代謝制御系・APJ受容体シグナルの生理機能解析

APJ欠損マウスでは体温の上昇が観察され、高脂肪食負荷による脂肪組織重量の増加やインスリン感受性の低下、また耐糖能異常が、野生型マウスと比較して軽減することが判明し、APJ欠損マウスではエネルギー消費が亢進していることが示唆された。また、脂肪細胞特異的APJ受容体過剰発現マウスにおいては、野生型マウスと比較して脂肪組織量の減少や、アディポサイトカインであるLeptinの血中濃度の低下、また耐糖能の亢進などが観察され、脂肪組織のAPJシグナルが全身の代謝機能に大きく寄与することが明らかとなった。近年、代謝性疾患において三量体G蛋白質と共役している7回膜貫通型受容体からのジグナルが、その病態の進行や抑制に重要であることが判明しつつある。申請者は最近、7回膜貫通型である新規受容体APJをクローニングした。APJ受容体は心血管系にて発現し生体内において血圧降下作用を有する新しい血圧制御系であることをこれまでに明らかとしたが、糖代謝・脂質代謝に重要な組織においても強発現しており、当研究室にて開発したAPJ受容体欠損マウスにおいては抗肥満作用が確認されるなど、APJ受容体が実際にエネルギー代謝制御に関わっていることが判明した。そこで、新規エネルギー代謝制御系としてのAPJ受容体シグナルの生理機能解明のため、以下の2つに焦点を絞り研究を行うこととする。(1)APJ受容体シグナルの標的因子の同定も含め、APJ受容体欠損マウスで認められた抗肥満作用やエネルギー代謝亢進作用の分子メカニズムの解明(2)脂肪組織特異的APJ受容体過剰発現マウスを新たに開発することによる脂肪組織からのAPJ受容体を介する全身性の代謝ネットワーク制御機構の解明これまでの解析から、APJ欠損マウスにおいて体温の上昇が観察され、高脂肪食負荷時において野生型マウスでは脂肪組織の重量増加やインスリン感受性の低下、また耐糖能異常が認められたものの、APJ欠損マウスにおいてはこれら所見が軽減されていることが判明した。最近、脂肪組織は様々な生理活性物質を全身に供給する活発な内分泌器官と捉えられつつある。そこで、各マウスの白色脂肪細胞からのRNAを用いてマイクロアレイ解析を行っている。また、脂肪細胞特異的APJ受容体過剰発現(aP2-APJ)マウスの開発に成功し、表現型の解析とともに、APJ欠損マウスと交配し、脂肪組織でのみAPJ受容体を有するマウスを作製し、APJ欠損マウスで認められた所見と脂肪組織のAPJ受容体機能との関連を検証している。近年、代謝性疾患において三量体G蛋白質と共役している7回膜貫通型受容体からのシグナルが、その病態の進行や抑制に重要であることが判明しつつある。APJ受容体は心血管系加え、糖代謝・脂質代謝に重要な組織においても強発現しており、当研究室にて開発したAPJ受容体欠損マウスにおいては抗肥満作用が確認されるなど、APJ受容体が実際にエネルギー代謝制御に関わっていることが判明した。そこで、新規エネルギー代謝制御系としてのAPJ受容体シグナルの生理機能解明のため、以下の2つに焦点を絞り研究を行った。(1) APJ受容体シグナルの標的因子の同定も含め、APJ受容体欠損マウスで認められた抗肥満作用やエネルギー代謝亢進作用の分子メカニズムの解明(2)脂肪組織特異的APJ受容体過剰発現マウスを新たに開発することによる脂肪組織からのAPJ受容体を介する全身性の代謝ネットワーク制御機構の解明ARJ欠損マウスにおいて体温上昇が観察され、高脂肪食負荷時において野生型マウスで認められる脂肪組織の重量増加やインスリン感受性の低下、また耐糖能異常が、APJ欠損マウスにおいて軽減されていることが判明し、APJ欠損マウスではエネルギー消費が亢進していることが示唆された。このAPI欠損による代謝亢進の作用点として、尿中カテコラミンレベルの上昇を同定した.また、脂肪細胞特異的ARI受容体過剰発現(aP2-APJ)マウスの開発に成功し、aP2-ARIマウスでは、野生型マウスと比較して脂肪組織量や脂肪細胞のサイズの減少が観察された。さらに、aP2-ARIマウスでは、アディポサイトカインであるLeptinの血中濃度の低下が観察され、APJシグナルが脂肪組織の代謝機能に大きく寄与することが明らかとなった。
HTLVー1感染Tリンパ球の機能異常,特にリンパ球ホ-ミング異常の分子機構の解明

本年度、我々はHTLVー1感染によって発症する第三の疾患としてHTLVー1ぶどう膜炎(uveitis)の存在を明らかにして報告した。この疾患は、血管炎と硝子体への細胞浸潤を中心とする病態を示し、臨床的にも他のぶどう膜炎とは異なる病像が明らかにされつつある。この疾患においては浸出細胞の中にHTLVー1感染細胞が常に検出され、炎症局所への感染細胞の浸潤が特徴的な病態として認められる。これは、本研究課題における仮説の妥当性を支持するものと考えられる(Mchizuki M et al,Jpn J Cancer Res,inpress,Mochizuki M,et al,Am J Ophthalmol,submitted,Mochizuki M etal,J Infect Dis,submitted,Watanabe T etal,manuscriptinpreparation)。また、我々はATL腫瘍細胞におけるLECAMー1の構成的過剰発現と、Tリンパ球活性化刺激に対する発現調節異常を見いだした(Watanabe T et al,manuscript in preparation)。実験動物モデルとしてラットを利用するために、これまで同定されていなかったラットのLECAMー1のcDNAクロ-ニングを行い、その構造および発現の解析を行った。その結果、lectin binding domain,EGFーlike domain,CR repeatと言うドメイン構造がよく保存されており、全体としてアミノ酸レベルでマウスと90%、ヒトと84.4%の相同性を示した。mRNAの発現は、リンパ系の組織に認められること、活性化刺激により発現がdownーregulateされることなど、これまでヒトおよびマウスのLECAMー1について報告されているのと同様の発現様式が確認された(Watanabe T et al,BBA submitted)。更にこのcDNAを用いて可溶性のリコンビナント蛋白を作製し、これを抗原として各種の単クロ-ン抗体を作製し解析を進めている(Tamatani T etal,manuscript in preparation)。動物実験系に関しては、FITCで標識した細胞をラットに投与して免疫組織学的に組織分布を解析する系を確立した。これを用いて各種のHTLVー1感染ラットT細胞株の組織分布の解析と、LECAMー1を発現していないこれらの培養細胞に発現ベクタ-を用いてLECAMー1を発現させ組織分布に与える影響を解析中である。
「ヒトの免疫学」からアプローチする抗膀胱癌免疫療法ナノメディシンの開発

BCG生菌の抗膀胱がん作用を模倣したナノ粒子の構築に関する研究を行った。基盤技術として、膀胱内での凝集を抑制するナノ粒子設計理論、世界トップクラスのsiRNA導入技術を開発するとともに、BCG成分の膀胱がん細胞への内在化が抗腫瘍活性に及ぼす影響を明らかにした。また、BCG生菌とBCG成分搭載ナノ粒子のがん免疫応答の比較を行い、有効成分の抽出とNano-BCGの設計・構築を進めている。平成26年度では、BCG-CWS搭載ナノ粒子を用いたBCG菌による抗膀胱がん免疫誘導の分子メカニズムの解明を目的として実験を行った。マウスを用いた実験より、BCG-CWS搭載ナノ粒子による抗膀胱がん作用の開始には、樹状細胞などの免疫担当細胞ではなくBCG-CWS搭載ナノ粒子が膀胱がん細胞に内在化することが必要であることを明らかにした。この結果はBCG生菌の免疫活性化中心であるBCG-CWSの膀胱がん細胞への内在化が抗膀胱がん免疫応答を開始させることを示しており、BCG生菌においても膀胱がん細胞へのBCG生菌の感染に起因するBCG-CWSの内在化が重要であることが予想された。そこで、まずマウス膀胱がん細胞を用いた分子メカニズムの解析を行うこととした。マウス膀胱がん細胞(MBT-2)にBCG-CWS搭載ナノ粒子を取り込ませることでBCG-CWSをMBT-2細胞に内在化させる。その後、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、BCG-CWS搭載ナノ粒子を処理した群では、コントロール群と比較して有意に発現変動が起こっている遺伝子群を見出すことに成功した。さらに、それらの遺伝子群はmRNAレベルだけではなく、タンパク質レベルでも変動していることが明らかになった。この結果はBCG-CWS搭載ナノ粒子を用いることで初めて明らかになったものであり、BCG生菌による抗膀胱がん免疫誘導のメカニズム解明に大きく貢献する知見である。平成27年度では、BCG-CWS搭載ナノ粒子とBCG生菌が誘導する免疫反応を比較することで、抗膀胱がん免疫誘導の分子メカニズムの解明を行うとともにBCG-CWS搭載ナノ粒子の機能を向上させるための因子の探索を行った。BCG-CWS搭載ナノ粒子もしくはBCG生菌をマウス膀胱がん細胞(MBT-2、MB49)に取り込ませた後の培養上清中のサイトカイン、その培養上清とマウス脾臓細胞を混合培養した際に産生されるサイトカイン、BCG-CWS搭載ナノ粒子もしくはBCG生菌を直接脾臓細胞に作用させた際に産生されるサイトカインをELISA法により評価した。その結果、BCG生菌による膀胱がんに対するメカニズムの一旦を明らかにするとともに、本申請研究の目的であるNano-BCGを構築するための情報を得ることに成功した。また、Nano-BCGの機能を評価するための系として、マウス膀胱がん同所移植モデルの構築と免疫細胞の標的遺伝子をノックダウンするためのsiRNA搭載ナノ粒子の構築を行った。マウス膀胱がん同所移植モデルの構築では、マウス膀胱がんMB49を膀胱内に移植する際の前処理、細胞数などの実験条件の確定とポジティブコントロールであるBCG生菌の抗腫瘍活性を評価することでマウスモデルを構築した。siRNA搭載ナノ粒子の構築に関しては、免疫細胞の一種である樹状細胞における標的遺伝子を世界トップレベルの効率でノックダウン可能なsiRNA搭載ナノ粒子の開発に成功し、国際誌に発表した。BCG-CWS搭載ナノ粒子とBCG生菌のサイトカインプロファイルを細胞レベルで比較することで、BCG生菌による抗膀胱がん免疫応答の分子メカニズムが明らかになりつつある。さらには最終目的であるNano-BCGの構築に必要な情報を得ることに成功した。これらの成果は予定通りの進捗である。加えて、Nano-BCGの機能評価をするための評価系としてマウス膀胱がん同所移植モデルの構築に着手し、ほぼ構築することができた。またsiRNA搭載ナノ粒子に関する成果を論文にまとめることができた。平成28年度も、引き続きBCG-CWS搭載ナノ粒子とBCG生菌が誘導する免疫反応を比較することで、抗膀胱がん免疫誘導の分子メカニズムの解明を行うとともにBCG-CWS搭載ナノ粒子の機能を向上させるための因子の探索を行った。BCG-CWS搭載ナノ粒子もしくはBCG生菌をマウス膀胱がん細胞およびマウス脾臓細胞に作用させ、各時間におけるサイトカインのmRNAレベルを評価した結果、BCG生菌に特有なサイトカインプロファイルを見出すことに成功した。また、Nano-BCGの構築のための技術開発として、ナノ粒子の尿中での安定性向上を試みた。モデルとしてカチオン性リポソームを用いて、PEG化脂質を導入することによるヒト尿中でのリポソームの安定性を評価した。PEG化脂質を導入することでカチオン性リポソームのヒト尿中での安定性は大きく向上し、その効果はPEG化脂質の脂質構造や修飾密度によって変化することを明らかとし、国際誌に発表した。この成果をもとに、BCG-CWS搭載ナノ粒子へとPEG化脂質を導入し、ヒト尿中での安定性が大きく向上した。さらに興味深いことに、PEG化脂質の導入は膀胱がん細胞への取込み効率と均一性を改善した。一方で、昨年度の開発したsiRNA搭載ナノ粒子技術をヒト免疫細胞株へと応用し、標的遺伝子のノックダウン効果を評価した。実験に使用したJurkat、THP-1、KG-1、NK92細胞は、市販試薬では十分な遺伝子ノックダウンが得られなかったが、我々のsiRNA搭載ナノ粒子は70-90%という高い効率で標的遺伝子をノックダウンすることに成功した。

本成果は国際誌に発表済である。現在は、サイトカインプロファイルの解析結果に基づき、BCG生菌のがん免疫誘導に関する成分を同定し、Nano-BCGの設計・構築を行っている。BCG生菌の抗膀胱がん作用を模倣したナノ粒子の構築に関する研究を行った。基盤技術として、膀胱内での凝集を抑制するナノ粒子設計理論、世界トップクラスのsiRNA導入技術を開発するとともに、BCG成分の膀胱がん細胞への内在化が抗腫瘍活性に及ぼす影響を明らかにした。また、BCG生菌とBCG成分搭載ナノ粒子のがん免疫応答の比較を行い、有効成分の抽出とNano-BCGの設計・構築を進めている。マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析により、BCG-CWS搭載ナノ粒子が誘導する膀胱がんに対する抗腫瘍免疫に関連する遺伝子を見出すことに成功した。これは当初予定した通りの成果であり、次年度の解析の基盤となるものである。Nano-BCGの構築に必要な免疫活性化ユニットを決定し、Nano-BCGを構築する。そして、マウス膀胱がん同所移植モデルを用いた機能評価を行い、Nano-BCGを最適化する。28年度が最終年度であるため、記入しない。薬物送達学腫瘍免疫学マイクロアレイ解析により見出した遺伝子発現変動と抗腫瘍活性との関連性をin vivoで調べるとともにヒト細胞を用いた分子レベルのメカニズム解析へと展開する。平成27年度中に全額使用済であるが、年度末に購入した物品費の支払いが本報告書の作成時点で反映されていないため。平成26年度中に全額使用済みであるが、年度末に購入した物品費の支払いが本報告書の作成時点で反映されていないため。上記の通り、平成27年度中に全て使用済である。上記のとおり、平成26年度中に全て使用済みである。
全身性エリテマトーデスにおける自己抗体による直接的血液脳関門破壊機序の解明

全身性エリテマトーデスの中枢神経病変とりわけ精神症状発症の原因として、疾患の特徴である自己抗体のニューロンへの直接的結合とそれに伴うニューロンの障害が想定されている。しかしながらニューロンへの自己抗体の直接的アクセスには血液脳関門の透過性亢進に伴う全身循環から中枢神経への自己抗体の流入が必要である。本研究では自己抗体が脳血管内皮へ直接的に作用し、MMMP-2産生誘導とタイトジャンクション分解亢進が血液脳関門の障害を引く起こすかについて検討する。またMMP-2活性抑制作用のあるアンギオテンシン変換酵素阻害剤が自己抗体による血液脳関門の破綻を抑制するかについて検討し新たな治療介入の可能性を探る。
多環芳香族炭化水素類が環境・生体で新たに獲得する毒性に関する戦略研究

水試料中のPAH,NPAH類を対象にHPLC/蛍光検出法,HPLC/化学発光検出法を用いた超高感度分析法を開発し,前者を用いて日本海及び周辺海域のPAH汚染の現状を明らかにした。また,PAH水酸化体とPAHキノン体の酵母two-hybrid法を用いた内分泌かく乱作用とキンギョ鱗培養システムに及ぼす影響に関連があり,作用を示す化合物との間に構造活性相関があることを明らかにした。目的:原油タンカーやパイプラインの事故、あるいは化石燃料の燃焼等に伴って大量放出された多環芳香族炭化水素(PAH)類が、水・大気・土壌中で反応し、また動物体内で代謝されて新たな毒性を獲得する機序とそのリスクを明らかにするために、本年度は以下の3項目において実験を行った。研究成果今回試験した20種のPAHQのうち、3種(1,2-CQ,BaP-3,6-Q,BaP-7,8-Q)がエストロゲン活性を示し、最も活性の強かったbenzo[a]pyrene-[3,6]-quinoneではE_2 100nMの47%のβ-galactosidase産生を誘導した。抗エストロゲン活性を測定したところ、11種のPAHQで活性が見られ、活性の強かった1,2-chrysenequinone, benzo[a]pyrene-[7,8]-quinoneではそれぞれE_2 1nM存在下で59%、56%のβ-galactosidase産生を抑制した。2)構造パラメータ計算酵母two-hybridアッセイ法によりエストロゲン様/抗エストロゲン活性が見られたPAHQの構造的及び物理化学的パラメーターとの関係について考察した。エストロゲン様活性を示す3種のPAHQは、O-H distance、第1イオン化エネルギー、双極子モーメント、log Pのパラメーターがそれぞれ10.290から11.519Å,8.526から9.029eV、4.909から5.556debye、3.462から3.782の狭い範囲に存在した。抗エストロゲン活性を示す11種のPAHQでは、第1イオン化エネルギー、log Pがそれぞれ8.526から9.201eV、2.459から3.782の比較的狭い範囲に存在し、これらのパラメーターの範囲が活性を示すための指標となる可能性が示唆された。3) PAHQの魚鱗に対する影響評価1)の酵母two-hybrid法を用いて解析した結果、最も強いエストロゲン様活性を示したPAHQ(BaP-7,8-Q)を魚鱗のin vitroの評価システムを用いて、骨芽細胞と破骨細胞に対する影響を評価した。その結果、魚鱗では骨芽細胞と破骨細胞の両方の細胞活性を抑制することが判明した。エストロゲンは骨芽細胞と破骨細胞の両方の活性を上昇させるが、PAHQは抗エストロゲン活性を示した。今後、PAHOの毒性機構を詳細に調べていく予定である。目的:化石燃料の燃焼、あるいは原油タンカーやパイプラインの事故等に伴って大量放出された多環芳香族炭化水素(PAH)類が、大気・水・土壌中で反応し、また動物体内で代謝されて新たな毒性を獲得する機序とそのリスクを明らかにするために、本年度は以下の3項目において実験を行った。研究成果PAH酸化体類としてPAHケトン体(8種類)及びジハイドロキシPAH(4種類)を酵母two-hybrid法を用いてエストロゲン様及び抗エストロゲン様作用を調べた。その結果、ジハイドロキシPAHの4, 4-biphenol(4, 4-BP)においてのみ、エストロゲン活性が認められた。さらに受容体結合試験法の測定結果より、4, 4-BPはヒトのエストロゲン受容体に対して強い結合親和性を示すこともわかり、PAH酸化体類においても内分泌攪乱作用があることが判明した。2)大気中におけるPAH、ニトロPAH(NPAH)の二次反応と毒性発現大気浮遊粉塵に結合している1-Nitropyreneが紫外線により数種の水酸化体(Hydroxynitropyrene)となることを明らかにした。また、大気中に数種のPAHキノンが存在することを証明した。更に、大気のAhR活性化作用が金沢と中国・北京で大きく異なることが分かった。3)海洋のPAHレベル測定日本海域の表層水を4L採水して、0.5μmガラス繊維ろ紙を用いて濾過して、ろ液(溶存相)とSS : Suspended matter(粒子相)に分けた。その後、ろ液に内部標準物質を加え、前処理済みのC18カートリッジに濃縮捕集した。次に、溶媒抽出を行いHPLC/FLを用いてPAH類を測定した。その結果、海水を濃縮することにより、様々な種類のPAHの測定が可能になった。今後、中国、韓国を含む様々な海域でサンプリングしていく予定である。

目的:原油タンカーやパイプラインの事故,あるいは化石燃料の燃焼等に伴って大量放出された多環芳香族炭化水素(PAH)類が,水・大気・土壌中で反応し,また動物体内で代謝されて新たな毒性を獲得する機序とそのリスクを明らかにするために,本年度は以下の3項目において実験を行った。エストロゲン受容体競合試験,並びに酵母two-hybbid法で特に作用が強かったPAH酸化体(OHPAH,PAHQ)について,構璋と結合作用の強さとの関係を,コンピュータソフトを用いて詳細に解析した。その結果、PAHQはエストロゲン活性がないが、4,5環のPAHQにはOHPAHと同様に強い抗エストロゲン活性を示すものがあった。比較的強い抗エストロゲン活性を示すPAHQのL/B比(長軸と短軸の長さ比)は,OHPAHと殆ど同じ範囲であることがわかった。(2)PAH類の魚鱗に対する影響評価昨年度までの実験で強い活性が認められたOHPAHとPAHQを対象に,完成した再生鱗を用いるシステムを用いて,骨芽細胞と破骨細胞に対する作用を解析した。その結果、多くのOHPAHが,ウロコの骨芽細胞及び破骨細胞の活性を変化させ,エストロゲン様/抗エストロゲン様活性が確認された。なお,酵母two-hybrid法の結果と必ずしも一致しなかったので,魚鱗試験法にはERに依存しない作用発現経路もある可能性が高い。(3)海洋のバックグラウンドPAH,NPAHレベル測定海洋の極低濃度NPAHが定量出来るHPLC分析法の開発を行い。既に開発したPAH分析法を用いて,日本海域のPAH分布を明らかにした結果,・NPAH分析法が完成次第,日本海域のNPAH分布の測定を開始する。発癌性や変異原性を初めとして種々の毒性を有する多環芳香族炭化水素(PAH)類の海洋汚染実態を明らかにするとともに,その誘導体の新規活性の評価を行った。まず,水中のPAHをオンカラム濃縮して分離後に蛍光測定するHPLC分析システムを開発した。これにより,わずか100 mLの試料量で16EPAPAHのうち蛍光を有する15種が0.071.7 ng/Lまで定量可能になった。本法を用いて,日本海及び周辺海域,河川水を分析した結果,日本海の海水中のPyrene Banz[a]anthracene,Chrysene,Benzo[b]fluoranthene,Benzo[k]fluoranthene,Benzo[a]pyreneの合計濃度は7.67 ng/L(ロシア沿岸)9.63ng/L(日本沿岸)で,太平洋より濃度が高く,PAH収支計算を行った結果,PAHの主要移入ルートは大気と対馬海流であることが明らかになった。また,PAHより濃度が遥かに低いニトロ多環芳香族炭化水素については,逆相ディスクを用いた濾過でより大量の水試料をろ過することにより,定量分析が可能なことが分かった。一方,酵母two-hybrid法でエストロゲン様若しくは抗エストロゲン作用があった水酸化PAH(PAHOH)について,キンギョ鱗培養システム(in vitro)に及ぼす作用を評価したところ,前者でエストロゲン作用が最も強かった4-Hydroxybenz[a]anthraceneの作用が極めて強く,両評価系が相関しており,しかも構造活性相関が認められた。また,その作用が現れる濃度は,重油や原油の流出事故海域の魚が体内で代謝生成する濃度域にあることがわかった。PARの水酸化体及びキノン体の内分泌かく乱作用の構造活性相関を明らかにし、これらの魚類に及ぼす影響についても結果を得る事が出来、交付申請書通りに研究が進行した。24年度が最終年度であるため、記入しない。
現職院生と学卒院生のシナジー効果を通して授業力を高める教職大学院カリキュラム開発

本研究の目的は、教職大学院において追究される「学部段階での資質能力を修得した者の中から、さらにより実践的な指導力・展開力を備え、新しい学校づくりの有力な一員となり得る新人教員の養成」と「現職教員を対象に、地域や学校における指導的役割を果たし得る教員等として不可欠な確かな指導理論と優れた実践力・応用力を備えたスクールリーダー(中核的中堅教員)の養成」について、それぞれの特殊性を活かすシナジー効果を発揮させることによってより高い授業力育成の可能となるような専門領域のカリキュラムとその運用法の実践的開発であった。その際、当初の予定通り、まったく新しいカリキュラムの創設ではなく、現在のカリキュラムをベースにエビデンスに基づくカリキュラム改善を進めた。具体的には、PDCAサイクルを3重に回していくことによって、短期的(授業レベル)、中期的(単科目のカリキュラムレベル)、長期的な改善活動(科目間連携:専門科目のカリキュラムレベル)を積み重ねていく中で、仮説設定ー検証ー再仮説設定を多重に行った。これらボトムアップ型FD活動の結果、最終年度には、以下の3つの成果が明らかになった。1特に意図的に現職院生と学卒院生を協働的な関係(学び合い)に置く場面を組織するために連携を組んだ授業においてはシナジー効果が創発された。しかも、2必ずしも意図的に現職院生と学卒院生を協働的な関係におく場面を組織したわけではない現職院生と学卒院生共修の科目への波及効果が見られた。さらに3協働的な関係の中で行われた指導やアドバイスについて現職院生・学卒院生ともに高い有用感が認知されており、総じてこの2年間のシナジー効果の活性化を意図したカリキュラム改善は、現職・学卒院生ともにその力量形成の一端に資することができたことが見取られた。本研究の目的は、教職大学院において追究される「学部段階での資質能力を修得した者の中から、さらにより実践的な指導力・展開力を備え、新しい学校づくりの有力な一員となり得る新人教員の養成」と「現職教員を対象に、地域や学校における指導的役割を果たし得る教員等として不可欠な確かな指導理論と優れた実践力・応用力を備えたスクールリーダー(中核的中堅教員)の養成」について、それぞれの特殊性を活かすシナジー効果を発揮させることによってより高い授業力育成の可能となるような専門領域のカリキュラムとその運用法の実践的開発である。その目的を達成するため、初年度(2016年度)は、月1回程度、専門科目を中心とした教職大学院の担当授業について、2015年度に引き続き科研関係者で集まって授業検討会を行い、当該授業の到達点と課題を確認すると同時に、専門科目カリキュラム改善のための方策を検討した。(ボトムアップ型FDの実践)それと平行して、昨年度までのボトムアップ型FDの実践についてその到達点と課題について、論文を共同執筆し、本学紀要に投稿し、掲載された。また、シナジー効果をより発揮するための授業改善やカリキュラム改善を行うための基礎データとして、2016年度2年生に対する意識調査を行い、その分析と合わせて論文を共同執筆し、本学紀要に投稿した(掲載予定)。また、当初の予定通り、当該テーマについて先進的な実践を行っている福井大学教職大学院への訪問調査を行った。初年度に計画していた、「専門科目を構成する10の科目中、院生の実践研究をゼミ形式でサポートする「教育実践開発研究」を除く9科目について、1科目の到達目標の構成、2目標実現の程度を測定するための評価方法(例えば適切なパフォーマンス課題の設定)、3その評価のためのルーブリックの作成、4評価された結果の適切なフィードバック方法の開発および5それを助けるツールである振り返り票の開発を行い、授業にて実際に使用した上で、その適否や必要な改善点を確認する」ことを行った。これらは、2017年度のシラバスに反映されている。また、上述の通り、「シナジー効果を発揮させることによってより高い授業力育成の可能となるような専門領域のカリキュラムとその運用法の実践的開発」の基礎作業としての授業研究や意識調査を行い、その結果等を論文にまとめ、投稿(掲載)した。加えて、上述の通り現職院生と学卒院生との協働的活動に工夫を加えている、福井大学教職大学院での実践やその理論的背景を調査した上で、実際に大学を訪れてその担当教員との意見交流などを行った。初年度(2016年度)は、月1回程度、専門科目を中心とした教職大学院の担当授業について、2015年度に引き続き科研関係者で集まって授業検討会を行い、当該授業の到達点と課題を確認すると同時に、専門科目カリキュラム改善のための方策を検討した。また、シナジー効果をより発揮するための授業改善やカリキュラム改善を行うための基礎データとして、2016年度2年生に対する意識調査を行い、その分析と合わせて論文を共同執筆し、本学紀要に投稿し、掲載された。2年目(2017年度)も前年度と同様、月1回程度、専門科目を中心とした教職大学院の担当授業について、2016年度に引き続き科研関係者で集まって授業検討会を行い、当該授業の到達点と課題を確認すると同時に、専門科目カリキュラム改善のための方策を検討した。(ボトムアップ型FDの実践)

それと平行して、2016年度および2017年度のボトムアップ型FDの実践(とりわけ、現職院生と学卒院生とのシナジー効果をあげるための取り組み)の到達点と課題について、各々論文を共同執筆し、本学紀要に投稿し、掲載された。また、当初の予定通り、当該テーマについて積極的な取り組みを行っている東京学芸大学教職大学院や通常規模での実践を行っている静岡大学教職大学院への訪問調査を行った。初年度に確立した体制の下、ボトムアップ型FDを地道に遂行することで、2016年度および2017年度について(とりわけ現職院生と学卒院生とのシナジー効果の面で)授業やカリキュラム改善を進めることができ、その成果を2本の共同執筆の論文にまとめて本学研究紀要に投稿し、掲載された。また、当初の予定通り、当該テーマについて積極的な取り組みを行っている東京学芸大学教職大学院や通常規模での実践を行っている静岡大学教職大学院への訪問調査を行うことができた。本研究の目的は、教職大学院において追究される「学部段階での資質能力を修得した者の中から、さらにより実践的な指導力・展開力を備え、新しい学校づくりの有力な一員となり得る新人教員の養成」と「現職教員を対象に、地域や学校における指導的役割を果たし得る教員等として不可欠な確かな指導理論と優れた実践力・応用力を備えたスクールリーダー(中核的中堅教員)の養成」について、それぞれの特殊性を活かすシナジー効果を発揮させることによってより高い授業力育成の可能となるような専門領域のカリキュラムとその運用法の実践的開発であった。その際、当初の予定通り、まったく新しいカリキュラムの創設ではなく、現在のカリキュラムをベースにエビデンスに基づくカリキュラム改善を進めた。具体的には、PDCAサイクルを3重に回していくことによって、短期的(授業レベル)、中期的(単科目のカリキュラムレベル)、長期的な改善活動(科目間連携:専門科目のカリキュラムレベル)を積み重ねていく中で、仮説設定ー検証ー再仮説設定を多重に行った。これらボトムアップ型FD活動の結果、最終年度には、以下の3つの成果が明らかになった。1特に意図的に現職院生と学卒院生を協働的な関係(学び合い)に置く場面を組織するために連携を組んだ授業においてはシナジー効果が創発された。しかも、2必ずしも意図的に現職院生と学卒院生を協働的な関係におく場面を組織したわけではない現職院生と学卒院生共修の科目への波及効果が見られた。さらに3協働的な関係の中で行われた指導やアドバイスについて現職院生・学卒院生ともに高い有用感が認知されており、総じてこの2年間のシナジー効果の活性化を意図したカリキュラム改善は、現職・学卒院生ともにその力量形成の一端に資することができたことが見取られた。ほぼ計画通りに進んでいるため、今後も交付申請書に記載した「研究実施計画」に沿って研究を進めていく。具体的には2017年度は、《現職院生と学卒院生の共修科目》である、【前期科目】「学習環境とICT活用」(研究分担者の永田、森山と研究代表者の伊藤が担当)と「授業研究の理論と実践」(研究分担者の松本、吉水、森山、永田が担当)、【後期科目】「学習指導と授業デザイン」(研究分担者の吉水、松本、中村、宮田が担当)「授業実践研究のためのデータ分析」(研究分担者の森山、黒岩、宮田が担当)、「教師の専門的思考と知識基盤」(研究分担者の黒岩、長澤が担当)について、現職院生と学卒院生各々の経験や能力の差を活かしてシナジー
光誘起トンネル電流による真実接触面の評価-二相分離系合金の表面偏析に伴う摩擦現象の解析-

本研究は、レーザー光を半導体に照射する際に生じる光誘起電流(PIC)を用い、金属-半導体界面に生じる真実接触面の分布および、摩擦の原理的な研究を電子論の観点から行うものである。本研究は以下の4点からなる。それらは、(1)PICによる固体間界面の電流透過率の評価を行い、摩擦係数、その他の物理量との関係について考察を行うこと、(2)様々な金属についての、半導体界面に生じる真実接触面の分布を測定すること、(3)光学解析(分光偏光解析装置)により、2相分離系合金の表面偏析について解析を行うこと、(4)摩擦や摩耗について、接触界面での電子やモル流束の観点から基礎理論を導出すること、である。以下に、それぞれの研究の概要をまとめる。「PICによる固体間界面の電流透過率の評価」では、荷重の増加に対して比例するPICの積分値およびレーザーの強度による半導体界面の励起電子数の見積もりの比(平均界面電流透過率:γ)から、固体間界面の電流透過率の評価を行った。種々の材料について単位圧力当たりのγの増加率(平均界面電流透過係数:β)を測定したところ、βは弾性定数の逆数(1/C_<11>)に、近いオーダーの値を示すことが分かった。現在のところ、弾性定数と摩擦係数(μ)の関係からこの理由を考察しているが、良い結果は得られていない。「真実接触面の分布を測定」については、Cu,Ni,Inについて、真実接触面の分布を測定した。真実接触面積は、塑性流動圧力(pm)に反比例し、分布も、Inについては、中央部に真実接触分布が見られたのに対し、Cu,Niでは、試料周辺部に分布が存在した。「分光偏光解析装置による2相分離系合金の表面偏析の解析」では、分光偏光解析装置を作製し、Al-Pb系多層膜の表面偏析による光学定数の変化について解析を行った。蒸着により作成した多層膜よりも単層膜の方が、より偏析の効果が大きいことが分かった。これは、Pb粒子の微細化により、拡散圧が減少したためと考えられた。「流速方程式による摩擦・摩耗の基礎理論」については、非平衡熱力学によるモル流速から導いた核生成理論を応用し、固体間の接触界面における最低摩耗粉の臨界半径について、理論を構築し、材料による摩耗の違いを熱力学的に理解する手法を与えた。一般的な単体金属を始め、二相分離系合金に広く見られる表面偏析についても、PIC及び光学解析により、表面状態の変化について議論を行う予定である。本年は、以下の3点について研究をおこなった。それらは、(1)PICによる固体間界面の電流透過率の評価を行い、摩擦係数、その他の物理量との関係について考察を行うこと、(2)様々な金属についての、半導体界面に生じる真実接触面の分布を測定すること、(3)光学解析(分光偏光解析装置)により、2相分離系合金の表面偏析について解析を行うこと、である。以下に、それぞれの研究実績の概要をまとめる。「PICによる固体間界面の電流透過率の評価」荷重の増加に対して比例するPICの積分値およびレーザーの強度による半導体界面の励起電子数の見積もりの比(平均界面電流透過率:γ)から、固体間界面の電流透過率の評価を行った。単位圧力当たりのγの増加率(平均界面電流透過係数:β)は、弾性定数の逆数(1/C_<11>)に、ほぼ等しいことが分かった。そこで、弾性定数と摩擦係数(μ)の関係を調べたところ、μとC_<12>/C_<11>は、比較的良い一致を示した。「真実接触面の分布を測定」Cu,Ni,Inについて、真実接触面の分布を測定した。真実接触面積は、塑性流動圧力(P_m)に反比例し、分布も、Inについては、中央部に真実接触分布が見られたのに対し、Cu,Niでは、試料周辺部に分布が存在した。「分光偏光解析装置による2相分離系合金の表面偏析の解析」分光偏光解析装置を作製し、Al.Pb系多層膜の表面偏析による光学定数の変化について解析を行った。多層膜よりも単層膜の方が、より偏析の効果が大きいことが分かった。今後は、2相分離系合金の表面偏析による固体間界面の電流透過率および真実接触面の分布の変化について、研究を進める予定である。

「PICによる固体間界面の電流透過率の評価」では、荷重の増加に対して比例するPICの積分値およびレーザーの強度による半導体界面の励起電子数の見積もりの比(平均界面電流透過率:γ)から、固体間界面の電流透過率の評価を行った。種々の材料について単位圧力当たりのγの増加率(平均界面電流透過係数:β)を測定したところ、βは弾性定数の逆数(1/C_<11>)に、近いオーダーの値を示すことが分かった。現在のところ、弾性定数と摩擦係数(μ)の関係からこの理由を考察しているが、良い結果は得られていない。「真実接触面の分布を測定」については、Cu,Ni,Inについて、真実接触面の分布を測定した。真実接触面積は、塑性流動圧力(pm)に反比例し、分布も、Inについては、中央部に真実接触分布が見られたのに対し、Cu,Niでは、試料周辺部に分布が存在した。「分光偏光解析装置による2相分離系合金の表面偏析の解析」では、分光偏光解析装置を作製し、Al-Pb系多層膜の表面偏析による光学定数の変化について解析を行った。蒸着により作成した多層膜よりも単層膜の方が、より偏析の効果が大きいことが分かった。これは、Pb粒子の微細化により、拡散圧が減少したためと考えられた。「流速方程式による摩擦・摩耗の基礎理論」については、非平衡熱力学によるモル流速から導いた核生成理論を応用し、固体間の接触界面における最低摩耗粉の臨界半径について、理論を構築し、材料による摩耗の違いを熱力学的に理解する手法を与えた。
心臓異常電気活動のサブセルラーメカニズムとその制御に関する研究

本領域研究は、突然死の主因をなす重篤な不整脈を予知し、それを未然に防止するための最有効手段を見出だすためには、先ず心臓の異常電気活動の基礎的研究が必要であるとの考えのもとに計画組織された。そのため、研究の重点は心臓異常電気活動のサブセルラーメカニズムの解明に置かれた。しかしながら、不整脈が重篤な疾患たり得る所以は心臓が全体として統合された機能を失うためであるので、研究は心筋イオンチャンネル、イオン交換機構等のレベルから心臓全体としての異常電気活動のレベルにまで及んだ。また研究手段的に見ても、電気生理学的手法、生化学的手法、薬理学的手法、コンピューターシミュレーション等多岐に亘った。そして、見るべき研究成果を挙げることができたことは、平成5年1月発刊の本領域の研究業績集の示す通りである。ところで、本年度は、本領域研究のまとめの年に当たるわけであるが、このように多岐に亘った研究をまとめて成書とすることは至難の術である上に、本領域研究が日進月歩であることを合わせ考えると、せっかく作った成書も時を待つことなく過去のものとなることを危惧した。そこでまとめの意味で本領域研究の和文総説集の刊行を行った。本領域研究者や研究協力者がそれぞれの専門分野において、レビューした和文総説は、本人の最新の研究成果を踏まえたものであり、その分野の最新の情報を擁しているという点で、他の分野の研究者や本領域から派生し発展する種々の分野をこれから志す若い研究者にとって益するところ大と考えられる。本領域研究のもう1つの成果は研究開始当時には如何ともし得なかった心筋イオンチャンネルの分子生物学的研究に着手することができたことである。これらの実績を踏まえ、次の重点領域研究として「心筋イオンチャンネルの分子機能、調節と病態に関する研究」を準備し、平成7年度発足を目指して申請した。本領域研究の研究者は専門分野的には多岐に亘りながらも、心臓異常電気活動を解明し、それを制御する最有効の手段を見出そうという共通の目的をもっているので、本年度も計画班会議を公募研究者をも含め、班員が一堂に会する形で、平成4年9月18日、19日の両日東北大学艮陵会館で行った。各主要研究項目において従来の方法を駆使し、数々の新知見が得られたが、注目すべきことは、本会議において、心筋のShaker型カリウムチャンネルについて分子生物学的方法による研究成果が2名の班員から、本領域研究発足以来初めて発表されたことである。また、本年度も平成4年10月8日、東京女子医科大学弥生記念講堂において、総括班主催の公開シンポジウム「不整脈研究の最前線」を開催した。シンポジウムのテーマとして、イオンチャンネル修飾の新しい局面、イオンチャンネルの分子生物学、細胞機能修飾の新しい局面の3本の柱を立てた。さらに、小澤高将総括班員が「不整脈研究における分子生物学的寄与の展望」という題で、特別講演を行い、今回も300名を越す参加者を得る事ができた。そして、本年度も本領域研究果成の社会への還元の実を挙げるために、公開シンポジウムの各演者に講演内容をミニレビューにまとめて貰い、雑誌「心臓」の1993年第25巻第2号に掲載した。本年度はニュースレターを2号発行したが、第1号には「イオンチャンネルに関するゴードンカンファランス」と「心筋調節機能に関するゴードンカンファランス」の印象記を、第2号には「第65回アメリカ心臓病学会(AHA)」の印象記を出席した班員に寄稿して貰い、本領域研究者の国外の研究への注目を喚起することを図った。本総括班は平成5年9月19日開催の会議で決定した通り、3年度に亘る研究成果のまとめを予定通り、年度内に出版した。本総括班として所有していた消耗品費は本年度も心筋のイオンチャンネルの分子生物学的研究を進めている班員に重点配分した。

本領域研究のもう1つの成果は研究開始当時には如何ともし得なかった心筋イオンチャンネルの分子生物学的研究に着手することができたことである。これらの実績を踏まえ、次の重点領域研究として「心筋イオンチャンネルの分子機能、調節と病態に関する研究」を準備し、平成7年度発足を目指して申請した。
生物窒素固定の細胞工学的研究

微生物的窒素固定は、生物生産の基盤を支える基本的問題としてその重要性が注目されている。ラン藻は主要な窒素固定微生物であり、その分布は広いが、窒素固定能をもつものはラン藻の一部にすぎず、窒素固定能力にも差異が大きい。しかし、ラン藻と水生シダとの共生体Azollaのように旺盛な窒素固定を行うものもある。本研究は、窒素固定能力の増強・拡大を図る細胞工学的研究に必要な基礎資料を得る目的で行われた。まず、西日本に分布する3種のAzolla共生体について、その生育と窒素固定活性に及ぼす無機養分の濃度、窒素化合物の形態と濃度、および温度の影響を明らかにした。また、共生体からalgal packetおよびその中の共生ラン藻Anabaema azollaeを分離するとともに、Azollaおよびalgal packetの糖・アミノ酸組成を調べ、これらが共生ラン藻の窒素固定に及ぼす影響を検討した。ついで、水田および畑土壌からラン藻Dermocarpa,Amabaena等の細胞壁を溶解する微生物の検索を寒天重層法で行い、数種のラン藻細胞壁溶解能の高い菌を分離した。その中で溶解活性の特に強い3種の分離菌についてその細菌学的性状を調べ、形態学的・生理学的特徴に基づいてこれらの菌をそれぞれFlexithrix sp.(CL-101),Arthrobacter sp.(CL-105)およびBacillus sp.(CL-106)と同定した。これらの菌が産生するラン藻細胞壁溶解酵素を用いてラン藻細胞のプロトプラスト形成を行うため、まず、溶解酵素産生のよい培養条件・培地を検討し、1%ペプトンおよび0.2%K_2HPO_4を含むpH7.5のMDM培地が最適であることを明らかにした。つぎに、この培養濾液、あるいはそれより調製した粗酵素を用い、0.03MのTris-HCL緩衝液(pH7.5)に0.5Mのシュクロースで浸透圧調節をしたラン藻細胞懸濁液と混合して作用させ、ラン藻細胞のプロトプラストを得た。得られたプロトプラストの細胞融合については、プロトプラスト形成率と生存率の向上が必要と思われた。微生物的窒素固定は,生物生産の基盤を支える基本的問題としてその重要性が指摘されている.ラン藻は主要な窒素固定微生物であり,その分布は広いが,窒素固定能をもつものはラン藻類の一部にすぎず,窒素固定能力にも差異が大きい.本研究は,細胞工学的手法によってラン藻における窒素固定能の拡大と増強を図り,食糧・資源問題の解決に寄与する目的で行われた.まず,酵素リゾチームを用い, Anabaena, Gloeothece,およびDermocarpa等の種々のラン藻細胞のプロトプラスト化を試みたが,細胞壁溶解が不十分であるばかりでなく,処理による影響が大きく,ラン藻細胞原形質の破壊が進み,期待する結果がえられなかった.それで,土壌からラン藻細胞壁溶解菌を分離し,その産生する溶解酵素を用いてラン藻細胞のプロトプラスト形成を試みた.種々の水田および畑土壌から上記のラン藻細胞壁を溶解する菌の検索を寒天重層法により行い,数種のラン藻細胞壁溶解活性の強い菌を分離した.その中で溶解活性の最も強い分離菌についてその細菌学的性状を調べ,形態学的・生理学的特徴に基づいてこの菌をFlexithrix SP.と同定した.