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ガス浸炭・ラジカル窒化処理歯車の負荷性能および歯面損傷発生メカニズムの解明

ガス浸炭・ラジカル窒化処理をクロムモリブデン鋼(SCM415H)歯車に適用するための基礎的研究として,まず,ラジカル窒化処理を施した高炭素クロム軸受鋼(SUJ2)について,曽田式四球試験機による焼付き試験を行った.次に,ガス浸炭後,ラジカル窒化処理を施したSCM415H円筒について,二円筒試験機による焼付き試験を行った.さらに,ガス浸炭,プラズマ浸炭およびラジカル窒化処理を施したSCM415H歯車について,動力循環式歯車試験機によるスコーリング試験を行った.これらの実験結果より,以下のことが明らかになった.(1)四球試験では,ラジカル窒化処理球同士の焼付き荷重は,未処理球同士の約2.6倍となり,ラジカル窒化処理は焼付き強さの向上に効果的である.また,回転球側のみラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,固定球側のみラジカル窒化処理を施した場合の約3.3倍となり,試験球の組合せは極めて重要である.(2)二円筒試験では,高速側および低速側円筒にガス浸炭・ラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,ガス浸炭処理のみ施した円筒同士の約1/2に低下し,ラジカル窒化処理による効果は認められなかった.しかしながら,ガス浸炭・ラジカル窒化処理を施した円筒とガス浸炭処理のみ施した円筒を組合せた場合の焼付き荷重は,ガス浸炭処理のみ施した円筒同士の約2.4倍に向上することが明らかになった.(3)スコーリング試験では,SCM415H歯車のスコーリング強さに及ぼすプラズマ表面改質の効果は顕著に認められ,プラズマ浸炭処理を施した場合のスコーリング限界荷重は,ガス浸炭処理を施した場合の約1.5倍となった.また,ラジカル窒化処理を施した場合のスコーリング限界荷重は,ガス浸炭処理を施した場合の約1.9倍に向上することが明らかとなった.本年度では,ガス浸炭・ラジカル窒化処理をクロムモリブデン鋼(SCM415H)歯車に適用するための基礎的研究として,ラジカル窒化法により表面改質を施した高炭素クロム軸受鋼球(SUJ2)について,曽田式四球試験機を使用し,油浴潤滑条件下で焼付き試験を行った.特に,焼付き強さに及ぼすラジカル窒化処理の影響,回転球および固定球のいずれか一方を窒化処理球とした試験球の組合せ対する焼付き強さの相違などについて検討した結果,以下のことが明らかになった.(1)ラジカル窒化処理を施した試験球の表面粗さは約0.2μmR_yであり,未処理球の場合(約0.1μmR_y)と比較して僅かに増加する.(2)ラジカル窒化処理を施した試験球の表面上のマイクロビッカース硬さは約1050HVであり,未処理球の場合(約900HV)と比較して上昇する.しかしながら,表面より20μm以上の内部におけるラジカル窒化処理を施した試験球のマイクロビッカース硬さは,窒化処理温度(480°C)による焼戻しの影響により,未処理球の場合と比較して約300HV低い.(3)回転球および固定球にラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,未処理球向士の場合の約2.6倍となり,ラジカル窒化処理はクロムの含有量の少ないSUJ2鋼の場合においても焼付き強さの向上に効果的である.(4)回転球側のみラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,固定球側のみラジカル窒化処理を施した場合の約3.3倍となり,試験球の組み合わせは極めて重要である.(5)焼付きを生じる直前における摩擦係数は,回転球側のみラジカル窒化処理を施した場合が最も小さく,約0.07となる.ガス浸炭・ラジカル窒化処理をクロムモリブデン鋼(SCM415H)歯車に適用するための基礎的研究として,まず,ラジカル窒化処理を施した高炭素クロム軸受鋼(SUJ2)について,曽田式四球試験機による焼付き試験を行った.次に,ガス浸炭後,ラジカル窒化処理を施したSCM415H円筒について,二円筒試験機による焼付き試験を行った.さらに,ガス浸炭,プラズマ浸炭およびラジカル窒化処理を施したSCM415H歯車について,動力循環式歯車試験機によるスコーリング試験を行った.これらの実験結果より,以下のことが明らかになった.(1)四球試験では,ラジカル窒化処理球同士の焼付き荷重は,未処理球同士の約2.6倍となり,ラジカル窒化処理は焼付き強さの向上に効果的である.また,回転球側のみラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,固定球側のみラジカル窒化処理を施した場合の約3.3倍となり,試験球の組合せは極めて重要である.(2)二円筒試験では,高速側および低速側円筒にガス浸炭・ラジカル窒化処理を施した場合の焼付き荷重は,ガス浸炭処理のみ施した円筒同士の約1/2に低下し,ラジカル窒化処理による効果は認められなかった.しかしながら,ガス浸炭・ラジカル窒化処理を施した円筒とガス浸炭処理のみ施した円筒を組合せた場合の焼付き荷重は,ガス浸炭処理のみ施した円筒同士の約2.4倍に向上することが明らかになった.(3)スコーリング

試験では,SCM415H歯車のスコーリング強さに及ぼすプラズマ表面改質の効果は顕著に認められ,プラズマ浸炭処理を施した場合のスコーリング限界荷重は,ガス浸炭処理を施した場合の約1.5倍となった.また,ラジカル窒化処理を施した場合のスコーリング限界荷重は,ガス浸炭処理を施した場合の約1.9倍に向上することが明らかとなった.
大気圧プラズマポストプロセスによるフラクタル状薄膜構造形成とその機能性探索

大気圧マイクロプラズマにより、高活性(還元性)の分子であるヒドラジンを生成し、水溶液中の金属イオンの還元作用による自己組織化プロセスによりフラクタル状構造の生成を確認した。ヒドラジンの密度導出を行い生成条件の最適化を行った後、硝酸銀水溶液の還元処理に適用したところ、基板上にフラクタル状形状の銀ナノ粒子ネットワークが形成した。このフラクタル状構造はフラクタル次元で1.6-1.9となり、その電気特性は、導電性と絶縁性が閾値を持って変化するパーコレーション現象を示し、また、中赤外光域での光学特性は、化学組成から予測されるもの以外にも吸収特性を示し、光メタマテリアルとしての動作の可能性を示した。今年度は、ヒドラジン生成のためのプラズマ部の最適化を行い、合わせて生成された自己組織化銀粒子パターンの評価に着手した。ヒドラジン生成のための材料ガスとしては、アルゴンをキャリアガスとしたアンモニア混合気体を供給した。これを誘電体バリア放電により生成された大気圧プラズマ部に供給し、大気圧プラズマ内を通過する間にアンモニアの解離と反応を通してヒドラジンを合成した。我々は、プラズマ部として、ガス配管とほぼ同じ外径のガラス管内に、そのガラスを誘電体バリアとする形態でプラズマを生成した。長さ25 mmのプラズマ部の数を直列に14個と変化させ、また誘電体バリア放電を生成する電源周波数を1030 kHz変化させて、ヒドラジンの生成量を紫外吸収分光法により測定した。すると、プラズマ部の数は4個までにおいては数を増やすほど増加した。また、プラズマの生成個数を4個としたときの電源周波数による依存性は緩慢で、20 kHz付近に最適値があると推定された。すなわち、アンモニアの解離を促進するためには解離を主導するプラズマ中の電子の生成が欠かせないが、一方で生成されたヒドラジンまで分解してしまうことが考えられる。すなわち、以上の設定条件の範囲内で、取り出しうるヒドラジン量の最適条件が含まれていると考えられる。そして、生成したヒドラジンによる還元反応により得られる銀のパターンについての機能性評価を行った。具体的には、今年度は導電率測定を行い、導電性薄膜と見なしたときに、市販の透明導電膜と同オーダーの導電率は確保できたが、透過率が50%程度に留まり、今後その改善を目指す。さらに、ボックスカウンティング法によるフラクタル次元を評価し、1.61.9という値を得た。今年度は、大気圧プラズマにより生成されたヒドラジンによる自己組織化銀粒子パターンの生成と評価、およびその他機能性薄膜処理を行った。ヒドラジン生成のための材料ガスとしてアルゴンをキャリアガスとしたアンモニア混合気体を供給し、誘電体バリア放電により生成された大気圧プラズマ部を通過させた後、ヒドラジンを合成した。そして、硝酸銀水溶液表面へのヒドラジン等の粒子輸送制御を行うことで、各種の銀パターン作製に成功した。まず、粒子輸送制御を行わない条件において、種々のフラクタル状のパターン形成に成功した。プラズマ部の制御によりヒドラジンの生成量を密度を1立方cm当たり14乗15乗で調整したところ、導電性と絶縁性がパーコレーション機構の転移点を伴って実現された。このようなフラクタル形状のパターン構造については、粒子分散・凝集理論に基づく数値計算で良く説明できた。また、絶縁性パターンについて光応答特性を評価したところ、赤外光(波長8ー12ミクロン)の領域で構造起因の吸収スペクトルが現れた。これは、磁気共鳴効果を示す異常透磁率メタマテリアルの特性と推定された。そして、粒子輸送を制御するため、硝酸銀水溶液に50ー200ミクロンの粒子を多数導入し、それによる基板上の銀パターン制御を目指した。まず、粒子間部分にはヒドラジンが入り込み、同様のフラクタル状パターンが形成された。一方で粒子設置部においては、導入粒子の外縁部に添う形でスプリットリング状の銀パターンが現れた。光学応答特性においては赤外光領域での応答性は失われておらず、また100ミクロンオーダーのスプリットリング状パターンはテラヘルツ波帯での応答性を期待でき、マルチ周波数帯メタマテリアルの一括作製プロセスを実現した。また、機能性薄膜処理については、ヒドラジンによる表面酸化膜層の制御により、抵抗変化薄膜のスイッチング電圧制御に成功した。プラズマ理工学平成25年度の研究実施計画に掲げていた、ヒドラジン生成のための大気圧プラズマのパラメータ最適化について、気相診断法を駆使して成功した。また、同じく平成25年度の研究実施計画に掲げていた、生成したヒドラジンによる銀パターンについて、透明導電膜のパラメータに迫りうる面内導電率を確認し、また構造解析においてフラクタル次元の導出にも成功した。研究計画の変更は無く、交付申請書に記載の通り遂行する。
自己反映アーキテクチャによる動的適応とその移動計算機環境への適用

動的適応のための基本的な自己反映計算機構,およびそれに基く言語LEADの設計とその処理系の実装を行った.LEADの基本的な適応機構はオブジェクト指向計算モデルにおける総称関数の機構を拡張したものである.これは計算対象となるオブジェクトだけでなく,実行環境の状態がメソッド選択に関与する.そしてアプリケーションの特性に合わせた適応を可能にするために,この適応機構自身もLEADの自己反映機構によって拡張することが可能になっている.基本的なアイディアは,・適応の粒度を手続きとする.・実行環境の状態に応じて呼ばれる手続きの実体を動的に切替える.・実行環境の状態に適した手続きの実体を容易かつ安全に修正・追加できる.・動的適応可能性のための記述(適応の記述)を問題領域の記述(問題の記述)から分離・独立させる.である.つまり1つの手続きは実行環境の状態に応じた複数の実体を持ち,手続き呼び出し時に,その実行環境の状態に適した実体が選択され実行される.このように手続きの振舞いを実行時に変えることで動的適応可能性を実現する.現在のLEAD処理系は,Pentiumプロセッサを搭載するワークステーションおよび可搬型パーソナルコンンピュータからなる分散・移動計算機環境上に実装されている.この上でアプリケーションを記述して計算機実験を行った結果,実行環境の動的変化が著しい場合におけるLEADの適応機構の有効性を示すことができた.動的適応のための基本的な自己反映計算機構,およびそれに基く言語LEADの設計とその処理系の実装を行った.LEADの基本的な適応機構はオブジェクト指向計算モデルにおける総称関数の機構を拡張したものである.これは計算対象となるオブジェクトだけでなく,実行環境の状態がメソッド選択に関与する.そしてアプリケーションの特性に合わせた適応を可能にするために,この適応機構自身もLEADの自己反映機構によって拡張することが可能になっている.基本的なアイディアは,・適応の粒度を手続きとする.・実行環境の状態に応じて呼ばれる手続きの実体を動的に切替える.・実行環境の状態に適した手続きの実体を容易かつ安全に修正・追加できる.・動的適応可能性のための記述(適応の記述)を問題領域の記述(問題の記述)から分離・独立させる.である.つまり1つの手続きは実行環境の状態に応じた複数の実体を持ち,手続き呼び出し時に,その実行環境の状態に適した実体が選択され実行される.このように手続きの振舞いを実行時に変えることで動的適応可能性を実現する.現在のLEAD処理系は,Pentiumプロセッサを搭載するワークステーションおよび可搬型パーソナルコンンピュータからなる分散・移動計算機環境上に実装されている.この上でアプリケーションを記述して計算機実験を行った結果,実行環境の動的変化が著しい場合におけるLEADの適応機構の有効性を示すことができた.
時刻情報伝達物質であるメラトニンによる象牙質の組織構造と象牙芽細胞の制御機構

メラトニン投与群では象牙芽細胞内のメラトニン受容体MT1の発現がより強かった。メラトニン投与群では象牙芽細胞の背が高く、象牙芽細胞数が増加していた。象牙前質中の石灰化球の数が増加し、大きさも増大していた。象牙質のアパタイト結晶が均一な大きさで規則的に配列し、結晶性がやや向上した。またコラーゲン線維が増加した。メラトニン投与により血清中のCaやP濃度の挙動に変化をもたらし、メラトニン代謝産物の量が増加した。メラトニンが体内の血中組成に変化をもたらし、象牙質や象牙芽細胞に影響を与え、基質のコラーゲン線維の分泌、石灰化機構、アパタイト結晶の結晶性を変化させる可能性が示唆された。本年度は成長線の形成や象牙質形成におけるメラトニンの役割を調べることを目的として、実施した。本研究は出生後5日、6日、7日令のSDラットを対照群(0.5%アルコール含有飲料水)、低濃度群(0.5%アルコール+20&micro;g/mlメラトニン含有飲料水)、高濃度群1(0.5%アルコール+100&micro;g/mlメラトニン含有飲料水)、高濃度群2(0.5%アルコール+1000&micro;g/mlメラトニン含有飲料水)の4群に分けて行った。脱灰試料はHE染色、鍍銀染色、免疫染色(メラトニン受容体抗体染色:MT2,MTR)を施した。試料は組織学的に観察した。研磨試料を用いてTOF-MS分析、レーザーラマン分光分析、偏光顕微鏡、X線回析法にて組成分析を行った。夜間標本のメラトニン投与群では鍍銀染色においてコルクの線維がより明瞭にかつ多く分布していた。象牙芽細胞はメラトニンを投与すると活性化されて数を増やし、コルフ線維の形成が促進して象牙質の石灰化も亢進されると推察した。メラトニン受容体抗体染色では象牙芽細胞でMT2の発現が認められ、メラトニンの量に応じて受容体はより発現し、メラトニンの濃度依存性が認められた。偏光顕微鏡の観察では投与群では成長線ごとに干渉色の違いが見られた。メラトニン投与により成長線形成が速くなり、層構造の差が生じたと考えられる。夜間において顕微ラマン分光法ではメラトニン投与群で結晶性が高く、また配向性はよくなった。X線回析では夜間のメラトニン投与群において、C軸の長さが変化している可能性が見いだされた。TOF-MS分析では849m/zのピークが認められ、メラトニン投与群では高濃度に分布していた。849 m/zのピークはI型コラーゲンの分解されたペプチドと推定された。メラトニンが成長線形成機序以外に象牙質の組織や石灰化にも影響していると考察した。メラトニン投与実験を本年度に実施した。偏光顕微鏡法により、成長線に挟まれた層の干渉色が変化し、基質線維や結晶の走行が変化している可能性を見出した。対照群とメラトニン投与群で周期性の変動やコラーゲン線維の構造変化が見いだされる可能性が示唆された。メラトニンレセプターMT2の発現は確認でき、投与群ではより発現が強かった。顕微ラマン法によりメラトニン投与群で結晶性が高く、また配向性はよくなるとの結果が出た。質量分析法のMELDITOF-MS分析結果から、849m/zのピークが認められた。象牙質を構成するI型コラーゲンで主として構成されているため、849 m/zはα1鎖とα2鎖からなるI型コラーゲン成分の分解されたペプチドを検出したと推察される。今後より詳細に成分分析を行う計画である。イメージング画像では、低濃度群は対照群と比較して先端に向かうほど849m/zが高濃度(赤色)に分布していた。切歯の先端にある象牙質はメラトニンを投与することにより象牙芽細胞のコラーゲンの分泌が高くなったと考察される。本年度は、メラトニン投与による象牙質や象牙芽細胞への影響を組織学的または分析学的に調べることを目的として、実施した。本研究は前年度と同様に出生5日、6日、7日令のSDラットを対照群、低濃度群(20μg/mL)、高濃度群の3群に分けて行った。PAM染色、TIブルー染色などを施し、低真空SEMや光学顕微鏡などで組織学的に検索した。さらにメラトニン受容体の局在を免疫組織学的に検索した。また偏光顕微鏡、MELDITOF-MS法、顕微ラマン分析やX線回折にて解析した。低真空SEMや光学顕微鏡の観察では、対照群と比較し、メラトニン投与群では象牙芽細胞の背が高く、より象牙芽細胞数が増加していた。また象牙芽細胞層に毛細血管が多く分布していた。さらに偏光顕微鏡では成長線間の層毎に干渉色の違いが見られた。免疫染色では象牙芽細胞でMT1とMT2の発現が確認され、MT2に比べMT1の発現が強かった。SEMの反射電子像でも、石灰化球の大きさが増大していた。X線回折において、対照群と比較し、高濃度メラトニン投与群ではアパタイト結晶のピークが明瞭に検出された。

メラトニン投与により象牙質のアパタイト結晶の結晶性及び配向性が良くなったと考察された。メラトニンが成長線形成機序に以外に、象牙質や象牙芽細胞の組織に影響を与え、基質のコラーゲン線維の構造や石灰化機構、さらにアパタイト結晶の結晶性を変化させる可能性が示唆された。低真空SEM及び高真空SEMでPAM染色やTIブルー染色を施した脱灰試料で稲賀らが開発した手法(稲賀ら,2014)で観察した。投与群では象牙芽細胞の背が高く、より密集しており、毛細血管の分布量が多くなっていた。免疫染色では象牙芽細胞でMT1とMT2両方の発現が確認され、MT2に比べMT1の発現が強かった。MT1の発現濃度の比較より、メラトニンの量に応じてメラトニン受容体はより発現した。偏光顕微鏡での観察では、前年度認められた高濃度群の成長線が層毎にみられる干渉色の違いが確認された。X線回析では対照群と比較し高濃度群ではアパタイト結晶の2つのピークが検出された。メラトニン投与によりアパタイト結晶の結晶性が良くなったと考察された。前年度に行った質量分析法MELDITOF-MS分析をより詳細に検索した。質量分析法ではI型コラーゲンのα1鎖とα2鎖のピークは849-960 m/zに検出され、789 m/zと805 m/zのピークはI型コラーゲンα2鎖の成分である(Shweitzerら, 2009)。今回、MELDI TOF-MS分析で検出した795m/zと818m/zのピークは、I型コラーゲンのα2鎖が分解されたペプチドが検出されたと推定される。ペプチドの検出強度はメラトニンの投与量に比例して高い値となったため、メラトニンの投与により象牙質のコラーゲン分泌が促進されていると考察した。ただ、電子線後方散乱解析法EBSD分析の結果では金属や天然鉱物で見られるキクチパターンは確認できなかった。象牙質のアパタイト結晶が非常に小さいことや、コラーゲンのような有機物が結晶周囲に存在することが原因と考えられる。本研究は出生5日、6日、7日令のSDラットを対照群、低濃度群、高濃度群の3群に分けて行った。低真空SEMや光学顕微鏡、AFMなどで組織学的に検索した。メラトニン受容体(MT1とMT2)の局在も検索した。また偏光顕微鏡、CMR分析、MALDI TOF-MS法、顕微ラマン分析やX線回折にて解析した。免疫染色では象牙芽細胞でMT1とMT2の発現が確認され、MT2に比べMT1の発現が強かった。対照群と比較して、メラトニン投与群では象牙芽細胞の背が高く、象牙芽細胞数が増加していた。また象牙芽細胞層に毛細血管が多く分布していた。象牙前質中の石灰化球の数が増加し、大きさも増大していた。MT1の発現がより強かった。偏光顕微鏡では成長線間の層毎に干渉色の違いが見られた。SEMの反射電子像でも、石灰化球の大きさが増大していた。X線回折において、高濃度メラトニン投与群ではアパタイト結晶のピークが明瞭に検出された。AFMでは、夜間のメラトニン高濃度投与群では結晶が均一な大きさで規則的に配列していた。CMR分析では、メラトニンの量に応じて石灰化度がわずかに上昇していた。MALDI TOF-MS分析では2つのピーク(795m/zと818m/z)が増加した。MELDITOF-MS分析で検出した795m/zと818m/zのピークがI型コラーゲンのα2鎖が分解されたペプチドと考察され、メラトニンによりコラーゲン線維が増加したと考えられる。夜間においてメラトニン投与により血清中のCaやP濃度の挙動に変化をもたらし、メラトニン代謝産物の量が増加した。
自然免疫反応からみた１型自己免疫性膵炎の病態解明

自己免疫性膵炎は、本邦より発信された新しい疾患概念であり、現在日本でよく見られるIgG4の関与する1型と日本では少ない好中球病変が主体の2型に分類されている。近年自然免疫反応が様々な疾患に関与しているが、1型AIPにおいては我々は膵組織にTLR7陽性M2 Mφが多数浸潤しており、線維化、Th2反応に関与している可能性について報告した。更にこのM2Mφは、通常組織には存在しない好塩基球が炎症局所においてIL-4、IL-13を産生することで炎症性単球からM2 Mφへ分化されることが知られていることから、好塩基球が浸潤しているかを調べたところ13例中10例で浸潤が認められることを見出した。この好塩基球はTLR2もしくはTLR4が陽性であり、膵切除を受けた患者末梢血中の好塩基球も膵組織と同じTLR刺激で活性化されることがわかった。そこで本研究では、1型自己免疫性膵炎における自然免疫反応の関与(特に近年喘息、アトピー性皮膚炎で注目されているM2マクロファージ(Mφ)-好塩基球-Group2自然リンパ球(ILC)による慢性アレルギー炎症)を解析することを目的とした。本年度は、臨床的研究では、文書にて同意の得られた1型自己免疫性膵炎患者(20例)と健常者20例、アルコール性膵炎患者20例を対象として、患者末梢血を採取し、白血球数、白血球分画、血清IgG4を含むIgGサブクラス、IgE、IgA、IgM、CH50、C3、C4について測定した。またフローサイトメトリーを用いて、CD45+Lin-CD127+自然リンパ球とそのサブセットGroup1 (CRTH2-/CD117-)、Group2 (CRTH2+)、Group3 (CRTH2-/CD117+)について解析した。基礎的研究では、モデル動物を作成し膵炎、唾液腺炎、胆管炎を惹起することを試みた。末梢血中の自然リンパ球の解析は終了し、動物モデルの作成にも取り掛かっており、概ね順調に進展しているものと考えられるため。現在、臨床的研究である末梢血中の自然リンパ球の解析については、データを整理して論文化している。翌年度以降は、引き続き末梢血中の他の自然免疫細胞についても解析する予定である。基礎的研究については、モデル動物の確立を目指しその解析に取り掛かる予定である。自己免疫性膵炎は、本邦より発信された新しい疾患概念であるが、未だその病態は十分には解明されていない。また自然免疫反応は様々な疾患でその重要性が言われているが、1型自己免疫性膵炎での役割についての解明はその途についたばかりである。引き続き臨床、基礎の両面から、1型自己免疫性膵炎における自然免疫反応の関与(特に近年喘息、アトピー性皮膚炎で注目されているM2マクロファージ(Mφ)-好塩基球-Group2自然リンパ球(ILC)による慢性アレルギー炎症)を解析していきたいと考えている。

また自然免疫反応は様々な疾患でその重要性が言われているが、1型自己免疫性膵炎での役割についての解明はその途についたばかりである。引き続き臨床、基礎の両面から、1型自己免疫性膵炎における自然免疫反応の関与(特に近年喘息、アトピー性皮膚炎で注目されているM2マクロファージ(Mφ)-好塩基球-Group2自然リンパ球(ILC)による慢性アレルギー炎症)を解析していきたいと考えている。購入を予定した研究試薬が年度内に納品されないことが判明したため次年度購入としたことによる。
脳動脈瘤破裂機構解明へ向けた分子生物学的・血行力学的統合解析と新規薬剤治療の開拓

ヒトの脳動脈瘤において、瘤壁には非常に菲薄化して脆弱な部分もあれば、動脈硬化に類似した変化で厚くなっている部分も混在している。また、最も破裂につながりやすいと考えられている突出部も、壁が厚く硬化したものもあれば薄いものも存在する。これらの中で、どの部位がどのような経緯で破裂するのかは、いまだ不明なままである。そこで本研究では、易破裂性の大型脳動脈瘤動物モデルを用いた病理組織解析と臨床ヒト動脈瘤の血流解析を組み合わせて、動脈瘤内皮の機能・形態の異常と動脈瘤壁の特異的組織変化が壁組織崩壊すなわち動脈瘤破裂とどう関係しているかを解明し、その破裂機転を回避する薬剤治療を開拓することを目的とする。
サッカー戦術の合理性とその意味に関する研究―ゲーム分析指標の組み合わせを用いて―

これまで本研究グループでは、DLT法による三次元解析を利用し、サッカー競技の選手のポジショニングとチームの戦術について客観化を行なってきた。そして、本年度はサッカー競技(日本代表vs. UAE、サンフレッチェ広島vs.横浜マリノス、韓国Kリーグの公式戦)を研究対象とし、「モダンサッカーにおける攻守の切り替えとコンパクトの関係」について考察した。この研究については、The Vth World Congress on Science and Footballにて発表予定である。モダンサッカーでは、一試合<90分>を通じてチームの状態がコンパクトに保たれ、その結果、攻守の切り替えの数は約400回にも及んでいる。つまり、技術や体力の向上が繰り返されてきたにもかかわらず、攻撃のチームがボールを短い時間内で失っている。この現象は、モダンサッカーのキーワードとも言えるコンパクトが戦術的にどのように関係しているか、客観的なデータを元に考察を加えた。以上の結果は以下のように示された。1.分析対象とした試合について、チームの縦幅と横幅を測定した結果、攻撃のほうが守備よりも広く、守備のほうが攻撃よりも狭い傾向が認められ、現代サッカーにおける「コンパクト」は、守備における合理性を意味し、攻撃時の合理性ではない。2.コンパクトなもとでの戦いの意味は、「攻撃側が狭い形、守備側が広い形」での両チームにとって不完全な状態での戦いを意味していることが示唆された。このことより現代サッカーでは、攻守の切り替え時から、ほぼ同時に守備から攻撃に移行し、また対戦相手は攻撃から守備に移行するので前で述べた不完全な形での戦いであり、結果として短い時間内でボールを失ってしまう傾向が生じると結論付けた。この分析方法をサッカー競技のピッチで測定ポイントを制限し、選手の位置をピッチの1ポイントとして三次元座標データが得られるかを検討した。そして、本年度はサッカー競技の105m×68mのピッチ(日本代表vs. UAEとサンフレッチェ広島vs.横浜マリノス)を撮影し、このゲームの選手の動きを分析した(サッカー医・科学研究にて報告)。上で述べた分析内容は、1.日本代表が用いているモダン戦術の一つであるフラットスリーをベースとするゾーンディフェンスについて、選手の動きの性質を客観的に表す指標(移動距離、スピードの頻度、ピッチ上のエリア等)を用いて、実際のゲーム場面で起こった結果と比較することで、このモダン戦術の合理性について説明した。2.サンフレッチェ広島vs.横浜マリノスの試合で得られた選手とボールの位置データより、試合中における全選手の移動距離とスピード、試合中におけるボールの移動距離とスピードの変化について算出した。また、それらの移動距離とスピードの変化を各ポジション別に比較した結果、従来の報告(大橋ら)より移動距離においては23km程度多く移動していたが、これについては測定方法の違いや測定対象となった試合が行われた年代(以前のサッカーゲームより現代のサッカーゲームは格段に進歩し、スピードアップしていることなど)等の違いによるものであると推測された。

以上の結果は以下のように示された。1.分析対象とした試合について、チームの縦幅と横幅を測定した結果、攻撃のほうが守備よりも広く、守備のほうが攻撃よりも狭い傾向が認められ、現代サッカーにおける「コンパクト」は、守備における合理性を意味し、攻撃時の合理性ではない。2.コンパクトなもとでの戦いの意味は、「攻撃側が狭い形、守備側が広い形」での両チームにとって不完全な状態での戦いを意味していることが示唆された。このことより現代サッカーでは、攻守の切り替え時から、ほぼ同時に守備から攻撃に移行し、また対戦相手は攻撃から守備に移行するので前で述べた不完全な形での戦いであり、結果として短い時間内でボールを失ってしまう傾向が生じると結論付けた。
インスリン遺伝子転写活性化因子A-1の多型性-インスリン遺伝子発現に及ぼす影響並びに糖尿病発症との関連-

膵β細胞におけるインスリン遺伝子発現制御に関与する2つの転写因子IEF1およびIPF1は、それらの異常が糖尿病患者の多くに認められるインスリン生合成、分泌の不足に直接関与する可能性があり、臨床的に極めて興味深い。我々は、最近、転写因子IEF1の構成蛋白であるA1/kA1を単離、解析し、これらの蛋白の中で生理的に特に重要とされるleucinezipper領域に1アミノ酸(glutamine)の欠失を認めた。当該年度は、このA1の多型性と、もうひとつの転写因子IPF1の生理的・病態生理学的意義に関して以下のような知見を得た。1)A1多型性:libraryscreeningによるcloningに成功したfull-length A1 cDNAはglutamine挿入型であったので、さらにこのcDNAと我々がPCRで部分cDNAを単離していたglutamine欠失型cDNAとのキメラを作成し、glutamine挿入型および欠失型の両方のfull length cDNAを得た。この各々をSV40のpromoterを有する高度発現ベクターに組み込み、さらにCHO細胞にtransientに遺伝子導入して細胞内で各タイプのA1を過剰発現させた。この細胞より核抽出物を得てIEF1の結合領域であるヒト・インスリン遺伝子のhInsE1領域をプローブとしたgel-shift解析を行ったところ、glutamine挿入型・欠失型とも同程度の量のDNA-蛋白複合体を認めた。また、インスリン遺伝子promoter活性に対する影響でも両者に差を認めなかった。2)IPF1 : HIT細胞を用いた実験系により、IPE1はグルコキナーゼ遺伝子プロモーターの膵β細胞特異性獲得にprimaryな役割を果たすことが示された。また、IPF1は単独ではグルコース応答性のIns遺伝子転写活性化を媒介し得ないことも併せて明らかとなった。一方、グルカゴン産生細胞でIEF1の存在が確認されているαTC1細胞にIPF1をstableに発現させたところ、IAPP遺伝子の発現だけが誘導されたが、インスリンおよびグルコキナーゼ遺伝子は誘導されず、両遺伝子の発現には何らかの(IEF1およびIPF1以外の)別の因子が必要であることが明らかとなった。我々は、最近、preadipocyteの細胞株Ob1771細胞よりinsulin遺伝子のNir box等に結合する転写因子E47(ヒト)のmouse homologueであるA1 cDNAを独自に単離し、既報のA1に比し、同蛋白のdimer形成に重要であるleucinezipper motif部位に1アミノ酸(グルタミン)の欠失を認め報告していた。平成5年度には、さらに、Ob1771細胞が由来するC57BL/6 ob/obマウス、加えて、C57BL/6、C57BL/Ks、DBA/2、C3H、Swiss(ICR)、BALB/cの各マウスstrainにおいて、肝より回収したtotal RNAを用いたRT-PCR法を行い、A1 cDNAをcloningし解析した。その結果、C3HマウスのA1のみが既報のA1に一致し、その他の5つのstrainでは全てOb1771細胞タイプのA1が同定された(Gene(1994),in press)。C3Hは従来よりインスリン分泌の少ないことが知られており、A1に認められた多型性との関連が注目される。E47が由来するE2A遺伝子からは、alternative splicingにより、互いにbHLH領域のみを異にするE12が産生される。

bHLH領域はdimer形成とDNAへの特異的結合に重要な配列であり、両者がいかに役割を分担するかが注目されていた。我々は、やはり平成5年度に、ヒトE12のmouse homologueのdoningに初めて成功しkA1と名付けた(投稿中)。E47/E12の構造比較では、A1とkA1の間の相同性は約70%に留まったのに対し、E47とA1或はE12とkA1の間ではともに97%以上の高い相同性を認めた。このような進化上のb-HLH構造の保存はE47(A1)、E12(KA1)の各々が、共有されない何等かの固有の機能を有していることを強く示唆している。そこで我々はA1,kA1の個別の転写因子としての生理的意義を明らかにする一歩として両者の発現比率をmRNAレベルで検討した。その結果、筋芽細胞C2C12では分化に伴ってAl/kA1とdimerを形成するmyogeninは増加を示したのに対し、A1/kA1は逆に減少し、且つ、A1とkA1との発現比率に変化を認めなかった。膵β細胞に由来するMIN6細胞においてはglucose濃度の変化に反応してA1/kA1の発現量が変化したが、同じく発現比率に変化を認めなかった。一方で、mouseの各臓器において、A1/kA1比は、骨格筋0.34、脾臓0.36、脳0.55、肺0.39、心筋0.42、肝臓0.85、膵臓0.80、精巣1.09と臓器により大きく異なるという興味深い知見を得た。現在、このA1/kA1の発現の組織特異的発現比率の違いの生理的意義についてはさらに検討中である。膵β細胞におけるインスリン遺伝子発現に関与するtrans-acting因子は、その異常が糖尿病患者の多くに認められるインスリン生成、分泌の不足に直接関与する可能性があり、臨床的にも極めて興味深い。当該年度においては、我々が転写因子E47/E12(A1/kA1)に見いだしたアミノ酸レベルでの多型性の病理的意義を検討し糖尿病の発症成因としての転写因子の病理的関与を明らかとするため、以下のような検討を行った。従来より報告されているタイプA1と、Ob1771細胞で我々が認めたタイプの(グルタミンを欠く)A1のそれぞれが、各マウスのstrainに如何に分布しているかを検討する為に、各マウスstrainの肝よりtotal RNAを回収し、RT-PCRを行った後に、plasmid Bluescriptにcloningし、DNA sequencingを行いA1cDNAの構造を決定した。その結果、我々がこれまでに検討した、C57BL/6 ob/ob、C57BL/6、C57BL/Ks、DBA/2、SwissICR、C3H、BALB/cByのうちC3Hのみが従来タイプであり、その他が全てObタイプであることが明らかとなった(Kajimoto Y etal.Gene 139:247,1994)。
慢性痛の発症とその維持に関わる因子を探る

免疫炎症刺激と侵害刺激によって作製する筋侵害性モデル動物では、炎症を強く起こさせた群や神経系が未発達な幼若群で慢性痛の発症が阻害され、その発症には傷の大きさではなく、免疫炎症性背景と侵害性神経入力の二つの要因が関係し合っていることが明らかになった。ギプス固定モデル動物では、痛みの拡がりにあわせた脊髄グリア活性の可能性があった。自律神経機能の記録解析では固定期に交感神経活動が亢進し、慢性痛を呈するギプス除去後には低下を維持することが明らかになった。明らかな神経損傷のない慢性痛患者の発症起因に着眼して開発した2種類の運動器障害性の慢性痛モデル動物を用い、長期間にわたる痛みの評価を基盤に下の成果を得た。1)筋侵害性モデル(一側の腓腹筋にLPSおよび高張食塩水(HS)を注入したモデル)3週齢ラットへの処置は、9週齢処置とは違い、慢性痛を発症しないことが明らかになり、処置段階で未発達なものが慢性痛発症に関与していることが示唆された(Pain Resに発表)。HSの投与前のLPS投与において、LPSの増量が慢性痛発症を阻害することが明らかとなり、慢性痛患者において発症起因となる侵害刺激を受けたときの生体環境が発症に関与することが示唆された(論文執筆中)。また、発症群と発症阻害群の行動学的データの比較から、薬物投与から発症に至るまでの期間が限定され、分子生物学的および免疫組織学的検索を進めていく日標が定められた。2)ギプス固定モデル(一側下肢のギプス固定によるモデル)覚醒下の血圧心拍記録から、固定期および慢性痛期の安静時および寒冷曝露刺激に対する自律神経機能の変調が明らかとなり、自律神経遮断薬を用いた実験から、慢性痛期には交感神経活動の低下が示唆されつつある。長期間の記録のため、age-matched control群を作成し、同様の実験を行なった。また、モデル動物の日内変動の変調にも焦点をあて、明期暗期の血圧心拍変動と痛みおよび行動量の詳細な解析を進めている。本モデルの痛みの時間的空間的拡がりにあわせて、腰髄仙髄の脊髄(ニューロン、ミクログリア、アストロサイト)の免疫組織学的解析をも進め、グリア活性が空間的に拡がっていることを確認した。慢性痛の発症起因に着眼して我々が開発した2種類の運動器障害性慢性痛モデル動物を用いた。これらモデルの特徴は、処置部位から離れた部位に10週以上の両側性で二相性のhypersensitivityを示す。筋侵害性モデル(LPSおよび高張食塩水を一側の腓腹筋に注入したモデル)免疫炎症系の背景を作り上げた後、侵害的な刺激を受けさせるモデルであり、これまでに、幼若ラットへの処置およびLPS増量処置が慢性期のhypersensitivityを完全に阻害し、免疫系と神経系の絶妙な関わり合いが慢性痛発症に重要であることが示された。神経ブロックの実験から、急性期と慢性期のhypersensitivityは発信源が異なる(急性期は中枢の一過性感作、慢性期は可塑的変化)可能性が示された。慢性痛発症群と発症阻害群において、脊髄における物質変化を追い、発症にかかわる物質や発症後慢性痛維持にかかわる物質を検索している。ギプス固定モデル(一側下肢のギプス固定によるモデル)血圧プローベを埋め込んだラットを用い、ギプス固定期、痛み行動急性期および慢性期における覚醒状態の自律神経機能を測定し、これまでに安静時および寒冷曝露刺激に対する自律神経機能の変調を捉えている。自律神経遮断薬を用いた予備実験の結果から、ギプス固定期では交感神経機能亢進、慢性期ではその低下が明確になりつつある。長期に渡る実験のため、加齢による自律系変化を考慮したage-matched control群における予備実験では、加齢の影響は否定された。明期暗期における血圧心拍記録および行動量の日内変動の変調も捉えている。データ整理および解析に時間を要する実験系であるため、人的動員が必要であった。病態各時期の腰髄から仙髄までの脊髄免疫組織学実験では、ミクログリア活性後にアストロサイト活性が起こることが観察され、痛みの拡がりにあわせた活性も観察されている。トレッドミル運動負荷実験では、運動効果として痛み行動の減弱が示唆されたが、部位による解離も認められており、今後の検討を必要とした。最終年度であることから、開発した2種の運動器障害性慢性痛モデルラットにおけるこれまでの研究成果の取りまとめを主に行なった。(年度中に熊澤孝朗客員教授急逝のため、代表者を交代)1)筋侵害性モデル(LPSと高張食塩水を一側腓腹筋に注入):免疫・炎症刺激(LPS)により末梢組織のバックグラウンドを作った上で侵害刺激(高張食塩水)を与えるモデルであり、低濃度LPS前投与群では両側足底で10週以上のhypersensitivityが起こる。

その亢進は二相性を示し、神経ブロック実験から急性期では一時的な脊髄感作、慢性期では中枢における何らかの可塑的変化が起こっていることが推察された。高濃度LPS前投与群では急性期には強い亢進をみせたが、慢性期の亢進は完全に阻害された。このことから、本モデルにおける慢性痛の発症は、単に末梢組織の傷の大きさではなく、免疫・炎症系と侵害刺激の微妙な関わり合いによることが明らかになった(European Journal of Painに発表、Faculty of 1000に選定)。慢性痛発症群と阻害群で、脊髄IL6, TNF-α, TLR4等のPCR定量を行なったが、現段階では明確な違いを検出できていない。採取時期・部位の検討が必要とされた。2)ギプス固定モデル(一側下肢ギプス固定による):本モデルも足底の10週以上のhypersensitivityを呈する(投稿中)。尾など離れた部位にも痛み行動亢進が観察され、脊髄ミクログリアとアストロサイトの活性も腰髄から仙髄へと移行することが観察された。自律系変化として、ギプス固定期では交感神経機能亢進、慢性期ではその低下が示唆された(投稿準備中)。この血圧プローベを埋め込んだ実験では、寒冷曝露実験に加えて、自律神経遮断薬を用いた実験を行ない、我々の周波数解析法では、血圧MFが血管運動性、HFが心臓性の交感神経活動を表わしていることを認めた(投稿中)。
中国産ショウジョバエの系統分類学・進化遺伝学的研究

1983年以来継続している我々の日中共同研究は,広大な中国本土のショウジョウバエ相の全てを明らかにすることを目的としている。平成2年度までに,ショウジョウバエの豊富な多くの地域で採集を行ってきたが,平成3及び4年度には,従来ほとんど調査が行われていなかった東北地区と華中域を中心として採集を行うと共に,中国本土と密接な関係を持つ台湾で近縁種を採集し,日本産も含め比較検討することを目的しとた。(1)中国産ショウジョウバエの系統分類学的研究北川・戸田・渡部・汪は,従来の調査では空白となっていた東北地区と華中域を中心に採集を行った。四川省峨眉山で中国科学院動物研究所の成都支所の応援を受け,山頂近くから麓まで十分な時間をかけて採集を行った。戸田・渡辺・汪は,湖北省の自然保護林である神農架地区で採集を行い,多くの成果を得た。それらの採集標本は,北京の中国科学院動物研究所に持ち帰り,種の分類・同定を行った。一部分類困難な標本については汪が日本に持参し,十分な文献を参考に共同で種を同定した。平成3年度には,新種48,中国新記録種30,中国内分布新記録80を確認した。また,平成4年度には,新種137,中国新記録種81,中国内分布新記録種166を確認した。1983年以来本研究によって,中国に産するショウジョウバエの総数は,新種163を含め既知種が378,末同定種を含む合計は697種に達している。ちなみに,日本産は270種である。平成5年度に華東域で採集した標本は陳が,華南域で採集した標本は張が,分類困難な標本をそれぞれ日本に持参し,戸田・渡部等と共同で種の分類・同定を行った。戸田は広州を訪問し,採集してあった標本の分類・同定を行った。(2)台湾産ショウジョウバエの系統分類学及び進化遺伝学的研究渡部は台湾の採集によって,これはobscura群に属する新種を発見したが,obscura群の本来の分布からみれば生物地理学的に画期的な発見である。集団遺伝学的な解析によって,従来のどの種とも強い生殖的隔離のあることから,新種であることは確実である。木村は,台湾産を含めDrosophila takahasii亜群に属するD.pros+ipennis,D.takahashii,D.triluteaの3種を用いて温帯と亜熱帯に生息する同種の気候に対する適応の違いを調査した。温帯産の種は,光周期性生殖休眠が低い温度の方にシフトしていることが明かとなった。(3)台湾産ショウジョウバエの分子遺伝学的研究北川・青塚は,台湾の林・張と共同して,日本産と台湾産のオオショウジョウバエ合計117系統について,ミトコンドリアDNAの12種の6塩基認識制限酵素による切断部位を解析し,地域集団間の分子レベルでの比較を行った。その結果,合計18種類のミトコンドリアハプロタイプが発見され,高度に多型であることがわかった。ハプロタイプ間の塩基置換率を推定した後,UPGMA法によりハプロタイプ間と地域集団間の類縁関係を示す系統樹を作成した。それによれば,台湾産と日本産のオオショウジョウバエの間には,両者を区別できる遺伝的分化は存在しないことが明かとなった。現在,日本産と台湾産のオオショウジョウバエ亜群に属する他の種も含め,分子進化遺伝学的解析を行っている。

(2)台湾産ショウジョウバエの系統分類学及び進化遺伝学的研究渡部は台湾の採集によって,これはobscura群に属する新種を発見したが,obscura群の本来の分布からみれば生物地理学的に画期的な発見である。集団遺伝学的な解析によって,従来のどの種とも強い生殖的隔離のあることから,新種であることは確実である。木村は,台湾産を含めDrosophila takahasii亜群に属するD.pros+ipennis,D.takahashii,D.triluteaの3種を用いて温帯と亜熱帯に生息する同種の気候に対する適応の違いを調査した。温帯産の種は,光周期性生殖休眠が低い温度の方にシフトしていることが明かとなった。(3)台湾産ショウジョウバエの分子遺伝学的研究北川・青塚は,台湾の林・張と共同して,日本産と台湾産のオオショウジョウバエ合計117系統について,ミトコンドリアDNAの12種の6塩基認識制限酵素による切断部位を解析し,地域集団間の分子レベルでの比較を行った。その結果,合計18種類のミトコンドリアハプロタイプが発見され,高度に多型であることがわかった。ハプロタイプ間の塩基置換率を推定した後,UPGMA法によりハプロタイプ間と地域集団間の類縁関係を示す系統樹を作成した。それによれば,台湾産と日本産のオオショウジョウバエの間には,両者を区別できる遺伝的分化は存在しないことが明かとなった。現在,日本産と台湾産のオオショウジョウバエ亜群に属する他の種も含め,分子進化遺伝学的解析を行っている。1)系統分類学的研究:本年度行われた遼寧省、山東省、安徽省、浙江省、福建省での現地調査と、東北師範大学生物系、中国科学院動物研究所(北京)、広東省昆虫研究所、及び中国科学院昆明動物研究所での標本の調査によって、新たに新種48、中国新記録30種、中国国内の分布新記録80種を確認した。以下に各省毎の上記3新知見の種数を示す。黒竜江省(0、0、1)、吉林省(7、10、0)、遼寧省(0、0、4)、内蒙古自治区(0、0、1)、北京(0、0、1)、河北省(0、1、3)、新〓ウイグル自治区(2、8、0)、山東省(0、0、8)、青海省(0、0、1)、安徽省(0、0、1)、四川省(8、4、12)、浙江省(2、0、11)、福建省(1、0、11)、広東省(10、4、2)、海南省(1、0、0)、雲南省(6、4、5)、チベット自治区(2、0、1)。以上の調査結果を加え、中国大陸産ショウジョウバエの総種数は575種に達した。そのうち既知種335、投稿中新種17、投稿準備中新種20である。本年度は台湾における予備的な野外調査と、台湾中央研究院動物研究所に保存されている台湾産ショウジョウバエの標本の調査を行った。その結果、新種8種、台湾新記録9種を得た。台湾からはこれまでに200種近いショウジョウバエが報告されているが、中国大陸産との近縁種が多く、今後の比較研究が強く望まれる。2)進化遺伝学的研究:今年度、山東省と浙江省でアカショウジョウバエが初めて採集され、生きた標本を日本に持ち帰ったので、日本産との分子レベルでの比較研究を行う。
近代日本における社中を通じた邦楽の趣味縁形成過程の解明―箏・長唄を中心に―

1年目に当たる本年度は、当該研究を進める前提となる、近現代のアマチュア芸術文化活動の教習をめぐる概念整理を中心に行った。具体的には、日本における「趣味」「たしなみ」「稽古(事)」「習い事(物)」等の変遷について整理を行った。この作業を踏まえて、近代日本における女子の箏、長唄、ピアノのたしなみを題材に「趣味」の受容を整理し、年度末に単著化した。合わせて、欧米の余暇社会学で用いられている「シリアスレジャー」概念と上記の概念の関連について考察し、関係する研究者との情報交換を行った。資料収集については、東京都内の旧制高等女学校に所蔵されている校友会雑誌・同窓会雑誌を収集し、女性の趣味縁形成にまつわる基礎データの構築に努めた。また、特に長唄については能や茶道等と合わせて、紳士のたしなみの対象でもあったため、能や茶道に関する資料や先行研究も収集し、データ化に努めた。単著として研究成果を公表でき、また基礎データ構築も順調に進んだため。1年目に収集した基礎データの分析にとりかかるとともに、旧制高等女学校の校友会雑誌・同窓会雑誌の資料収集を継続する。2年目には社中の資料も、関連団体にご協力いただける範囲で収集していきたいと考えている。物品費として使用予定。
乳腺で産生される生理活性モノアミンの働きに関する研究

ヒスタミン合成酵素(HDC)を欠損するマウスに認められた著しい成長遅延が、母個体の泌乳不全が原因である事を明らかにした。この泌乳不全は、組織および行動観察結果から乳脂肪滴の分泌が正常に行なわれず細胞内に止まっていることに起因するものと考えられた。その原因として脳下垂体由来のオキシトシンの不足が疑われたが、HDC-KOマウスにおいて搾乳刺激後の血中オキシトシン濃度には野生型個体との差が認められなかったことから、乳腺組織のオキシトシン感受悔が低下していることが示唆された。一方、このHDC-KOマウスに認められた表現型は泌乳期のヒスタミン投与によっては補償されないこと、また野生型にヒスタミン受容体阻害剤を投与しても同様の表現型を得られなかったことがわかった。したがって、HDC欠損マウスの泌乳異常は、ヒスタミンの発生影響によるもの、HDCのヒスタミン合成以外の機能によるもの、ヒスタミンの細胞内機能によるもの、のいずれかが関与していることが示唆された。また、ドーパミン水酸化酵素(DBH)およびその類似遺伝子moxd1産物(Mox)について、CHO細胞を用いた誘導発現系を作製し、同タンパクの精製法も確立した。Moxの過剰発現により、DBH発現では見られない細胞の接着性の低下が観察された。さらに、Moxに強いDBH活性は認められなかった。したがって、MoxはDBHとは異なる機能を有する事が示唆された。以上の事から、乳腺局所で発現する酵素によって産生されるモノアミンは、細胞内外で固有の働きを有し、泌乳を制御していることが示唆された。<セロトニンの乳腺局所の生理作用>βカゼイン遺伝子プロモーターおよびGAS配列を3つ繰返したSTAT5応答プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組込んだレポーターベクターを作成し、JAK/STAT5リン酸化タンパク系を介したプロラクチン応答を解析するためのレポーターアッセイ系を確立した。これを用いて、いくつかの乳腺由来細胞株で、プロラクチンによるJAK/STATを介した遺伝子転写活性化経路に対するセロトニン作用を調べたところ、セロトニンの影響は認められないか、転写活性を高めるという実験結果を得た。これは、セロトニンが乳汁タンパク合成を抑制するという従来の知見からの予想とは異なる。セロトニンは遺伝子の転写ではなくmRNAの安定性などを介して、乳汁合成を負に制御している可能性が示唆された。また、コロニー形成率へのセロトニンの影響を調べたが、概ね変化はみられなかったが、いくつかの細胞でセロトニンが細胞増殖を正に制御している傾向が認められた。<MOXの生化学的性質>マウスMOX遺伝子を発現するS2細胞を作製し、生化学的機能解析のための精製を試みたが、収量が著しく少なく、解析には至っていない。機能解析に用いる抗体の作成を行い、MOXを精製せずに機能を推定する系を確立する必要がある。<乳汁含有成分の胎児への影響>乳汁成分の胎児への影響を調べる一環として、母体由来エストロゲンの胎児生殖系発達への影響を調べ、過剰エストロゲンによる生殖輸管の発達異常はKGF/FGFR2IIIb情報伝達系を介して生じることが明らかとなった。1.ドーパミン水酸化酵素類似遺伝子moxd1産物(Mox)について、マウス乳腺の各発達段階における発現を調べたところ、Moxは腺房上皮で恒常的に発現しているらしいことがわかった。2.HC11細胞においてRNAiによるMoxの発現を抑制したが、顕著な表現型の変化は認められていない。一方、Moxを薬剤誘導的に発現するCHO細胞系を作製したところ、過度のMox発現は細胞死を招くらしい事がわかった。3.セロトニンは乳腺細胞内で小胞に局在している事がわかった。一部の乳腺細胞株では、セロトニン合成阻害剤が細胞機能に重大な影響を及ぼすこと、また、この機能が既知のセロトニン受容体の阻害剤では再現できないことから、これらの細胞では、既知の受容体に依らないセロトニンの「細胞内機能」が存在することが示唆された。しかし、それがセロトニン化によるものかどうかはまだわからない。4.ヒスタミン合成酵素(HDC)が乳腺でも発現していることが確認された。その量は比較的少なく、乳腺局所でのヒスタミンの泌乳修飾作用は限定的なものであると思われる。一方で、HDC欠損雌マウスには著しい泌乳障害が認められ、これには中枢ヒスタミンの欠乏が関与している可能性が示唆された。5.乳汁含有成分のひとつであるエストロゲンの、仔の成長に対する影響を調べた。その結果、過剰量のエストロゲン投与が膣の正常な発生を妨げ、TFF1をはじめとする遺伝子発現を著しく変化させることがわかった。

一方、このHDC-KOマウスに認められた表現型は泌乳期のヒスタミン投与によっては補償されないこと、また野生型にヒスタミン受容体阻害剤を投与しても同様の表現型を得られなかったことがわかった。したがって、HDC欠損マウスの泌乳異常は、ヒスタミンの発生影響によるもの、HDCのヒスタミン合成以外の機能によるもの、ヒスタミンの細胞内機能によるもの、のいずれかが関与していることが示唆された。また、ドーパミン水酸化酵素(DBH)およびその類似遺伝子moxd1産物(Mox)について、CHO細胞を用いた誘導発現系を作製し、同タンパクの精製法も確立した。Moxの過剰発現により、DBH発現では見られない細胞の接着性の低下が観察された。さらに、Moxに強いDBH活性は認められなかった。したがって、MoxはDBHとは異なる機能を有する事が示唆された。以上の事から、乳腺局所で発現する酵素によって産生されるモノアミンは、細胞内外で固有の働きを有し、泌乳を制御していることが示唆された。