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「生命に対する権利」を巡る「市民的価値」と「軍事的価値」との鬩ぎ合い

2003年イギリス軍はイラクを攻撃しそれに続き占領をおこなったが、その間多くの兵士が死傷し、またそれを上回るイラク市民が死傷した。死傷したイギリス兵の遺族は国防省に対し、また死傷したイラク市民の遺族はイギリス政府に対し訴訟をおこした。それらの訴えの法的根拠は、ヨーロッパ人権条約の生命に対する権利および1998年人権法であった。前者の判決が、Smith事件の最高裁判決であり、後者のそれがAl-Skeini事件のヨーロッパ人権裁判所判決であった。後者では遺族が勝訴した。前者では原告が生命に対する権利の侵害を、国防省が戦闘行動免責を主張し、最高裁は事実審査のため高等法院に差戻した。イラク戦争・占領に参加し、現地で死亡あるいは負傷したイギリス兵士の遺族あるいは本人たちが、イギリス国防省を相手におこした損害賠償を求める訴訟の最高裁判決が、2013年6月19日に下された(Smith & Others vs The Ministry of Defence [2013]UKSC 41)。その多数意見の判断は、本案は詳細な事実関係にもとづいて判断される必要があり、高等法院へ差し戻すというものであった。高等法院での審理は現在も継続中である。この間、この最高裁判決をめぐる様々な議論が展開されている。第1は、ヨーロッパ人権条約およびその中の大半の人権保障条項を国内法化した1998年人権法の、特にその「生命に対する権利」の「戦場」での適用の可否に関するもの、第2は、コモンロー上の過失責任およびそれに関連する戦闘行動免責に関するものである。2015年に発表され、注目された論文の1つが、Clearing the Fog of law, by Richard Ekins, Jonathan Morgan, Tom Tugendhat(Policy Exchange)である。この中では、ヨーロッパ人権条約からの免脱および戦闘行動免責の行使が提案されている。そこには、イギリス軍の戦闘行動能力が訴訟を恐れる上官達によって低下してしまうことへの危機感がある。つまり、軍事的価値を市民的価値よりも重視する姿勢である。では、死亡・負傷した兵士立ちはどうなるのか?この著者たちは、潤沢な補償金等での対応を主張する。こうした法的・制度的対応をめぐる主張を収集・整理してきたのが、今年度の研究実績である。イラク戦争・占領に参加し、現地で死亡あるいは負傷したイギリス兵士の遺族あるいは本人たちが、イギリス国防省に損害賠償を求めた訴訟の最高裁判決が、2013年6月19日に下された。(Smith & Others vs The Ministry of Defenece [2013]UKSC 41)その多数意見は、本案は詳細な事実関係にもとづいて判断される必要があり、高等法院に差し戻すというものであった。それから約3年、高等法院の判断はまだ示されていない。その遅れの要因として、イラク戦争・占領全般を調査したthe UK's Iraq Inquiry(Chilcot Inquiry)の調査報告書の公表が遅れていることが関係している可能性もあるが、この報告書は今年の7月に公表されるとされており、高等法院の判決が待たれている。この間、議会・庶民院の国防委員会は、2016年4月に報告書“Beyond endurance?Military exercises and the duty of care "を発刊した。これは、イラク戦争・占領での国防省の兵士に対する安全配慮義務違反が上記の訴訟で問われていることに加え、訓練中の兵士の死亡事故等を問題とし、平時における安全配慮義務を厳しく問うものとなっている。このように、イギリス国防省は、戦時・占領下での安全配慮義務のみならず、平時おけるそれに関しても、従来の法的枠組の検討を求められている。こうした争点をめぐる議論を分析・整理していく中で、「軍事的価値(公共性)」と「市民的価値(公共性)」との鬩ぎ合いの一側面を検討中である。高等法院判決が、予想を超えて遅れている。そこで、議会・庶民院の国防委員会の報告書“Beyond endurance? Military exercises and the duty of care "をめぐる議論を整理していく中で、平時における兵士の「生命に対する権利」、軍隊の兵士に対する「安全配慮義務」を分析している。2016年9月、Warwick大学において、McEldowney教授(憲法学)とイギリス軍兵士に「生命に対する権利」の適用を認めたSmith事件最高裁判決を巡る評価について、意見交換をおこなった。教授とは従来から情報交換をおこなっており、前回の意見交換では、教授は国外のイギリス兵士に1998年人権法の適用を認めることに反対の意見であり、軍事法に服しているイギリス兵には1998年人権法の適用を認めるべきであると考えていた申請者と鋭く対立するという関係にあったが、今回も、この問題に関しては議論は平行のままであった。が、それに加えて、Chilcot Inquiry Reportに関する教授の意見を聞くことができた。帰国後も、この問題に関する情報提供を得ている。2017年3月、再びWarwick大学を訪問し、Andrew Williams教授(人権法)とイギリス軍と人権問題に関する意見交換をおこなった。特に、2016年9月の控訴院判決(Al-Saadoon v. Secretary of State for Defence)に関する情報は、この10年間ほどイギリス国防省・政府が敗訴を強いられてきた状況に変化が生じていることを示すものであり、ほぼ同時期から始まったイギリス議会における、海外で戦闘活動に従事するイギリス軍につきヨーロッパ人権条約から免脱させようとする議論とともに、大いに注目すべき展開であり、こうした情報を早めに入手できたことは研究の方向性を明確にする上で、非常に有益であった。

残念ながら、こうした動向を踏まえた研究の成果を2016年度内にまとめることはできなかったが、2017年度にはまとめて公表する作業・準備を進めている。イギリス軍兵士に「生命に対する権利」の適用を認めたSmith事件最高裁判決の後、それが差し戻された高等法院判決がまだ下されないことから、司法の最終判断が示されていない状況が続いている。「生命に対する権利」、戦闘行動免責および安全配慮義務などの1998年人権法、ヨーロッパ人権条約およびコモンロー上の争点が、詳細な事実認定をもとに判断されると期待されているが、もうしばらく待たなければならない。29年度は、今回の2つの研究課題のうち、ヨーロッパ人権条約2条「生命に対する権利」を当該国家の領域外にも適用していくという法解釈がイギリス司法においてどのような展開していくのかを探ることに重点を置くものとなった。この法解釈に関する2013年の最高裁判決(Catherine Smith事件)の差戻審である高等法院での審理に注目していたが、最終的には原告(死亡したイギリス兵士の遺族)に対し国防省が謝罪するという形で決着がついた。また、イギリス軍により虐待されたというイラク人からの訴えを審理した2016年9月の控訴院判決(Al-Saadoon v. Secretary of State for Defence)は原告敗訴となり、その主任弁護士の弁護士資格剥奪の影響もあり、上告されないままとなった。イギリス軍がその戦場・占領地から撤退してから約10年、イラク戦争・アフガン戦争を巡るイギリス国内裁判所での事件は、ほぼなくなった。他方で、この問題は、将来の海外でのイギリス軍の軍事行動に関しヨーロッパ人権条約から免脱(derogation)させようとする政府案を巡り、議会で議論されている。免脱に関しては、拙稿「軍隊の海外での作戦行動に関しヨーロッパ人権条約からの免脱を巡るイギリスにおける議論の検討」(津山工業高等専門学校紀要59号、2017年)においてその賛否の意見を紹介しているが、「生命に対する権利」を当該国家の領域外にも適用していくという法解釈が軍事行動を過度に制約するのではという危険性を認める意見が多い一方で、それを回避するために免脱という手段は必ずしも有効ではない、あるいは免脱そのものができないとする意見が出され、まだ方向性が見えてこない状況である。2003年イギリス軍はイラクを攻撃しそれに続き占領をおこなったが、その間多くの兵士が死傷し、またそれを上回るイラク市民が死傷した。死傷したイギリス兵の遺族は国防省に対し、また死傷したイラク市民の遺族はイギリス政府に対し訴訟をおこした。それらの訴えの法的根拠は、ヨーロッパ人権条約の生命に対する権利および1998年人権法であった。前者の判決が、Smith事件の最高裁判決であり、後者のそれがAl-Skeini事件のヨーロッパ人権裁判所判決であった。後者では遺族が勝訴した。
腹側内側手綱核の衝動性制御における役割の解明

自閉症スペクトラム症候群と関連があるとされる遺伝子cAMP-GEFII(CG2)の内側手綱核特異的ノックアウトマウスを作成し、その変異マウスの行動実験を行うことによりCG2の衝動性の制御における役割を明らかにする。また行動学的に自閉症スペクトラム症候群との関連の有無を明らかにする。その結果、このノックアウトマウスにおいて新奇環境における行動量の亢進、不安用行動の減少が観察された。しかしながら遅延時間に対する報酬価値の割引に関してはコントロール群と差異は観察されなかった。一方で社会行動では新奇マウスに対する探索行動の減少という自閉症様の表現型が観察された。衝動性制御の異常は多くの精神疾患で共通してみられる中間表現型であり、暴力や問題行動の一因になっている。さらに精神疾患の主な死因は自殺であり、これも衝動性制御の異常がが原因であると考えられる。これらを解決するために衝動性の制御の神経生物学的機構の理解は非常に重要であると考える。申請者らの研究により内側手綱核を遺伝学的に欠失させたマウスは様々な認知機能の異常を示すとも著しい衝動性の制御の異常が観察された。これらのことより申請者らは腹側内側手綱核に着目し、その衝動性制御における役割を解明しようと研究を行っている。腹側内側手綱核にウィルスを注入して化学的遺伝学手法(DREADD)あるいは光遺伝学手法を用いて急性に腹側内側手綱核の神経活動を抑制し、衝動性制御をはじめとする様々な行動にどのような変化があるのかを観察した。今後は内側手綱核にウィルスを注入し、内側手綱核の投射先である、脚間核及び縫線核の神経終末を抑制したとき認知機能あるいは衝動性の制御にどのような影響があるのかを検証する予定である。急性スライスにおけるパッチクランプ法による腹側内側手綱核の電気生理学的解析の確立。これらにより衝動性の高い動物で内側手綱核の電気生理学的特性がどのように変化しているのか調べることができるようになった。慢性的なストレス負荷動物モデルはうつ病様の行動を示すことが知られている。このストレス負荷動物の外側手綱核の神経活動が亢進していることが報告されている。しかしながらストレス負荷動物における内側手綱核の電気生理学的特性の変化などは知られていない。今後は母子分離ストレス負荷マウスにおいての衝動性制御の異常を行動学的に解析を行い、それらのマウスにおいてどのような電気生理学的特性の変化があるのかを検証していく。内側手綱核を急性に操作するためにAAVウィルスを注入する。その注入の条件検討に時間を要したが、最終的に最適な実験条件を得ることができた。現在は化学的遺伝学的手法による内側手綱核の神経活動の抑制したマウスで様々なの行動実験を行っている。今後は光遺伝学的手法を用いて経路選択的な神経回路の抑制を行い、その効果を衝動性制御をはじめとする認知機能に関して行動学的解析を行う。一方で、化学的遺伝学や光遺伝学の効果を検証するために急性スライスによるパッチクランプ法による電気生理学的測定を試みたところ、測定手法を確立することができた。このことにより化学的遺伝学や光遺伝学の効果を検証する。さらにまた遺伝学的(遺伝子ノックアウトマウスなど)、ストレス負荷モデル、薬剤投与モデルによって衝動性制御の異常を示す動物で内側手綱核の電気生理学的特性がどのよう変化するのか検証を行えるようになった。ストレス負荷モデル動物として衝動性制御の異常や情動行動の異常が報告されている母子分離ストレス負荷マウスを作製し、情動行動や活動量にコントロール群との間に有意な差が観察され、ひとつのストレス負荷マウスの作製を確立することができた。衝動性の制御に関する行動解析終了後に急性スライスによる電気生理学的解析の実施を予定している。この実験により内側手綱核の神経活動と衝動性制御の関係が明らかになると考える。衝動性制御の以上は統合失調症、大うつ病、注意欠陥多動性障害、摂食障害などをはじめとする精神疾患で共通してみられる中間表現型であり、暴力や問題行動の一因になっている。さらに精神疾患患者の主な死因は自殺であり、これも衝動性制御の異常が原因の一つであると考えられる。これら問題を解決するために衝動性制御の神経生物学的基盤の理解は非常に重要であると考える。申請者らの研究により内側手綱核を欠失させたマウスは様々な認知機能の異常を示すとともに著しい衝動性制御の異常が観察された。これらのことにより申請者らは腹側内側手綱核及びその主な投射先である脚間核に着目し、その衝動性制御における役割を解明しようと研究を行った。内側手綱核に強く発現しているcAMP-GEFII(CG2)という遺伝子に着目した。cAMP-GEFII(CG2)はPKAとは違ったcAMPの下流標的分子であり、内側手綱核に特に強く発現している。またこの遺伝子のアミノ酸置換を伴う変異が自閉症スペクトラムの患者から発見されたことにより、この遺伝子の機能異常と精神疾患との関連が示唆された。これらの知見をもとにCG2の内側手綱核特異的ノックアウトマウス(Hb-cKO)を作成し、内側手綱核のCG2が衝動性制御に関してどのような役割を果たしているか明らかにするために衝動性を測る行動実験を実施した。このHb-cKOマウスはOpen Fieldで活動量がコントロールに比べ亢進していた。また5選択反応時間試験におけるお手付き反応や遅延時間に対する報酬価値の減少関してはコントロールとの間に有意な差は見いだせなかった。

これらの実験結果より、内側手綱核のCG2は運動衝動性の制御に役割を果たしていることが示唆された。自閉症スペクトラム症候群と関連があるとされる遺伝子cAMP-GEFII(CG2)の内側手綱核特異的ノックアウトマウスを作成し、その変異マウスの行動実験を行うことによりCG2の衝動性の制御における役割を明らかにする。また行動学的に自閉症スペクトラム症候群との関連の有無を明らかにする。その結果、このノックアウトマウスにおいて新奇環境における行動量の亢進、不安用行動の減少が観察された。しかしながら遅延時間に対する報酬価値の割引に関してはコントロール群と差異は観察されなかった。一方で社会行動では新奇マウスに対する探索行動の減少という自閉症様の表現型が観察された。内側手綱核にウィルスを注入し、投射先である脚間核あるいは縫線核の神経終末の活動を光遺伝学的抑制した場合、行動あるいは衝動性制御にどのような影響があるのか、高架式十字迷路、行動量測定、5選択反応時間試験、T字迷路を用いた意思決定課題などを行う。衝動性制御の異常や不安行動の異常が報告されている母子分離ストレスを与えたマウスを作製し、衝動性を測定するために行動量測定、5選択反応時間試験、T字迷路を用いた意思決定課題を行いストレス負荷群にどのような衝動性制御の異常が観察されるかを確認する。さらにこれらのそれぞれのマウスに関して腹側内側手綱核の急性スライスにおける電気生理学的実験を行い、どのような電気生理学特性の差異がコントロール群とストレス負荷群の間にあるか検証を行う。その電気生理学特性と各種の行動の相関も検証する。また内側手綱核は不安などの情動行動の制御も行っていると考えられている。情動行動に関しても内側手綱核の神経活動との相関があるのかを検証を行いたいと考えている。さらに母子分離ストレスには性差があると報告されている。このストレス負荷群において電気生理学特性についても性差があるか検証を行う。ストレス負荷群において例えば神経活動の亢進または減弱が見られて場合、内側手綱核を光遺伝学的手法により神経活動を調整しコントロールレベルに戻してあげることによって衝動性制御の異常が回復するかを回復実験を行う。さらに分子生物学的機構の知見を得るため腹側手綱核特異的にCreの組換えがあるChat-CreマウスとCre依存的にYFPをマウスを掛け合わせ、その仔に母子分離ストレスを与え、そのごフローサイトメトリーで内側手綱核を回収し、ストレス負荷群とコントロール群で網羅的遺伝子発現解析行うことも可能である。神経科学
肝細胞機能、肝線維化および肝壊死炎症に対する新たな定量的MRI診断法の開発

本年度は、T1ρ計算画像とT2計算画像を用いて、非侵襲的な肝細胞機能、肝線維化、肝炎症壊死の評価に関する有用性を検討した。方法は、肝腫瘍術前にMRIにてT1ρとT2マップを撮影し、術後に組織学的結果が得られた76名(男/女=49/27、平均年齢=74才)を対象とした。T1ρ計算画像はスピンロック時間(0,20,40,60ms)、T2計算画像はエコー時間(0,20,40,60ms)を用いて撮影。肝実質のT1ρ値とT2値は脈管や病変を除いた関心領域を3箇所設定し算出。肝障害度はMRI撮影日近傍の採血結果より評価したChild-Pugh分類(CP)を、壊死炎症(A)と線維化(F)は組織学的結果を使用。T1ρ値やT2値と、CP、AやFの関係をスペアマン順位相関係数にて評価。また、CP(CPACPC)、A(A0A2)、F(F0F4)の各グループ間において平均値をTukey-Kramer HSD testにて対比した。結論として、T1ρ値とT2値を用いて肝障害度、壊死炎症、線維化を評価できる可能性がある。その診断能はT1ρ値がT2値を上回ることが示唆されると考えた。仮説に合う結果が得られている実感はあるが、対象症例を更に増やした上で検討を行いたいとも考えている。しかし、その対象症例を増やすにも時間がかかっている。時間的な限界と対象を増やした上で検討し、得られる結果が変化するのかどうかも今後考慮しながら、計画を進めていく。対象症例を更に増やした上で検討を行いたいのだが、その対象症例を増やすにも時間がかかる。また、研究計画にて設定した期間内に成果を示すことも必要である。対象症例を今後も増やしつつ、結果に大きな変化がないと判断できた時点で、設定した目標を多く達成できるように計画を進める。MRIは、臓器の形態の評価、腫瘍や炎症などの病変検出、細胞レベルの変化など評価に応用可能である。肝臓においては、肝細胞特異性造影剤を用いると、動脈血流量や肝機能の評価も可能である。複数のMRI撮像法を用いることで、形態や構造変化、肝機能を多面的かつ総合的に評価して診断し、正診度の向上や異なる評価者間において再現性の高い診断法が可能となりえる。我々の目的は、肝機能や肝線維化、肝壊死炎症に関して、信頼性の高い診断法を確立することである。仮説に合う結果が得られている実感はあるが、対象症例が少ないために、臨床において利用可能な評価法とは言えない。また、T1ρ強調画像も十分な画質の改善が得られていない。撮像方法に問題があるのか、評価方法に問題があるのかなど、検討する予定である。T1ρ値計算画像を用いた肝機能の検証は今後も継続する。T1ρ値計算画像のアーチファクト軽減、評価方法の確立を行っていきたい。また。Gd-EOB-DTPAを用いた、肝機能や肝線維化、肝壊死炎症に関して、信頼性の高い診断法を模索して行く。経費の節約に努めたため当初の執行予定額より支出額が削減したことや、物品の購入が遅れた為に次年度使用額が生じました。研究の進捗に合わせて、次年度で今年度分も執行致します。今年度は国際学会にて学会発表を行うことが不可能であった。

その為、次年度に再度国際学会へ抄録を投稿しており、学会発表を行う予定である。その為、学会発表の為の英語校正、論文作成、及び旅費が必要となる。
シリコン・イオン注入した酸化膜を持つMOS構造による可視発光素子の研究

大規模集積回路(VLSI)の基本材料であるシリコン系材料で発光素子が可能になればVLSIと共存可能な表示素子や光デバイスへの幅広い応用が期待できる。本研究では、シリコン・イオン注入したゲート酸化膜を持つMOS構造による可視発光素子(以下、シリコン・イオン注入型MOS発光素子)に関するものである。イオン注入条件が電気的およびエレクトロルミネッセンス(EL)特性に与える影響を調べた。シリコン・イオン注入によって発光強度は50-70倍となり、C-V特性のヒステリシスも大きくなり、シリコン・イオン注入によってトラップ準位が生成されることが推定できる。ポリシリコンをゲート電極とした発光素子について、交流駆動によるEL発光特性を測定した。駆動周波数が大きく(100kHz)なると、発光強度は大きくなり、長波長成分が増加した。短波長領域解析のための透明電極の形成短波長領域でのEL測定のため、Au薄膜透明電極を形成した。イオン・ビーム方式のスパッタリングにより、膜厚が薄くても低抵抗で高透過率の薄膜の形成が可能となり、厚さ15nm Au薄膜において、抵抗率が約3μΩcmで、波長300nm以上の透過率が約40%の電極が得られた。上記の電極を用いて、短波長領域解析のためのシリコン・イオン注入型MOS発光素子をp型シリコン基板を用いて作製した。直流電圧を印加し、EL発光を確認した。Au透明電極を用いたことにより、従来のポリシリコン電極では困難であった、短波長領域の発光特性の観測が可能となり、青色の発光を確認した。いずれの条件でも、発光スペクトルは、ガウス分布を仮定してhν=1.2,1.6,1.9,2.4,2.8eVの5種類の中心波長に分離することができ、酸化膜中の発光中心と相関があると考えられ、発光機構モデルの提案を行った。シリコン・イオン注入したゲート酸化膜を持つMOS構造による可視発光素子(以下、シリコン・イオン注入型MOS発光素子)に関する以下の研究を行った。1.シリコン・イオン注入型MOS発光素子の電気的特性、EL特性の解析可視光領域エレクトロルミネッセンス(EL)を観測し、イオン注入条件が電気的およびEL特性に与える影響を調べた。イオン注入エネルギー25keV、ドーズ量3x10^<16>cm^<-2>)において、最も大きな発光強度が得られた。ゲート電流はドーズ量とともに増加し、C-V特性のヒステリシスも大きくなり、シリコン・イオン注入によってトラップ準位が生成されることが推定できる。ポリシリコンをゲート電極とした発光素子でについて、交流駆動によるEL発光特性を測定した。駆動周波数が大きく(100kHz)なると、長波長成分が増加し発光色は赤味を帯びた。2.短波長領域解析のための透明電極の形成短波長領域でのEL測定のため、Au薄膜透明電極を形成した。デュアル・イオン・ビーム方式のスパッタリングにより、膜厚が薄くても低抵抗で高透過率の薄膜の形成が可能となり、厚さ15mn Au薄膜において、抵抗率が約3μΩcmで、波長300nm以上の透過率が約40%の電極が得られた。3.上記2.の電極を用いて、短波長領域解析のためのシリコン・イオン注入型MOS発光素子をp型シリコン基板を用いて作製した。EL発光には、hν=1.25,1.6,1.9,2.4,2.8eVの波長成分が含まれる。

大規模集積回路(VLSI)の基本材料であるシリコンは、間接遷移形半導体でバンドギャップも小さく発光素子には適さないとされてきた。しかし、シリコン系材料で発光素子が可能になればVLSIと共存可能な表示素子や光デバイスへの幅広い応用が期待できる。本研究では、シリコン・イオン注入したゲート酸化膜を持つMOS構造による可視発光素子(以下、シリコン・イオン注入型MOS発光素子)に関するものである。シリコンウエハ上に厚さ50nmの酸化膜を作製し、シリコン・イオン注入によって過剰なシリコンを酸化膜中に導入する。従来の研究成果を基に、3、5、10-10^<16>cm^<-2>とドーズ量を変化させた試料とシリコン・イオン注入していない試料とを作製した。さらに上部電極を形成しMOS構造とする。上部電極には、短波長領域(波長300500nm)解析のためにAu透明電極をイオン・ビーム・スパッタリングによって作製した。シリコン基板の導電形をn形およびp形に変化させた結果、いずれも、しきい値電圧のヒステリシス現象を示す電流-電圧特性となり、透明電極側から電子を注入する方向の電圧印加が発光現象に効果的であることを明らかにした。発光特性解析システムを構築し、EL分光特性を測定した結果、シリコン・イオンのドーズ量が、3×10^<16>cm^<-2>の試料で450nmの波長成分が最も大きくなることが分かった。いずれの条件でも、発光スペクトルは、ガウス分布を仮定して5種類の中心波長に分離することができ、酸化膜中の発光中心と相関があると考えられる。Au以外の透明電極材料に関しては、短波長領域の透過率と導電率を両立させるため、ITOを中心に検討した。
原田病の分子免疫学的検索

原田病患者前房水あるいは脳脊髄液から樹立したT cell clone (TCC)の解析を行った。これまでに10名の原田病患者から採取した前房水あるいは脳脊髄液をHSVc488でtransformし、合計12名からTCCを得ることができた。前房水からは5名、697クローン、脳脊髄液からは12名、1452クローンが樹立された。これらのクローンの内、1名の前房水から樹立した、21クローン、脳脊髄液から樹立した9クローンをランダムに選び出し、解析した。その結果前房水ではT cell clone (TCC)全体で10/21,CD4陽性T細胞に限れば9/16もの多数のクローンがtyrrosinase (TYR)あるいはtyrosinase related protein 1 (TRP1)に反応性を示した。脳脊髄液ではT cell clone全体で2/9,CD4陽性T細胞に限れば2/6がTYRあるいはTRP1に反応性を示した。TCCの細胞表面抗原の解析では全てのクローンがCD3陽性でT細胞であることが確認され、CD4/CD8は16/5であった。これらのTCCのサイトカイン産生能の解析ではTYRあるいはTRP1に反応性を持っているクローンはIL-2とINF-γの産生がみられ、Th1系の細胞が多数を占めると考えられた。このことから原田病の病態形成にはtyrosinase family proteinに反応性を持っているTh1系細胞が深く関与していることが示された。原田病患者前房水・脳脊髄液からT cell cloneを樹立し、解析することを目的とした。私達はこの1年間で3名の原田病患者から採取した前房水あるいは脳脊髄液をHSVc488でtransformし、合計7名からTCCを得ることができた。しかし目標の10例以上、それぞれ50クローン以上のTCCの樹立にまでは至っていない。現在も原田病新鮮例からの樹立を継続しているが、T cellを採取できる患者さんの数は限られており、今後1年以上は必要と思われる。これまでに樹立したTCCについては特異性等をtyrosinase family proteinを抗原としたlymphocyte proliferation assay等にて検討した。Tyrosinasefamily proteinに特異的なクローンについてはその表面マーカーを同定するとともにサイトカインの産生能についても測定した。上記のtyrosinase family proteinに特異的なクローンの反応する部分を更に詳細に決定するために、現在TCCを増殖させている途中である。方法は上記クローンについてtyrosinaseではTYR1からTYR25までの25の、TRP1ではTRP1-1からTRP1-22までの22のpeptideに対するlymphocyte proliferation assayを行う。陽性反応のみられたpeptideについては11残基のpeptideを合成し、同様に陽性反応のみられるpeptideを同定し、それぞれのTCCに特異的なサイトを決定する。原田病患者前房水あるいは脳脊髄液から樹立したT cell clone(TCC)の解析を行った。その結果前房水ではT cell clone(TCC)全体で10/21,CD4陽性T細胞に限れば9/16もの多数のクローンがtyrrosinase(TYR)あるいはtyrosinase related protein 1(TRP1)に反応性を示した。

これらのTCCのサイトカイン産生能の解析ではTYRあるいはTRP1に反応性を持っているクローンはIL-2とINF-γの産生がみられ、Th1系の細胞が多数をを占めると考えられた。このことから原田病の病態形成にはtyrosinase family proteinに反応性を持っているTh1系細胞が深く関与していることが示された。
微分方程式の幾何学的研究

本年度特に国成果を挙げた研究は「多面体の組み合せ論,有限鏡映群の不変式論と偏微分方程式系」に関するものである。これに関しては、先ず1962年に応用数学者FriedmanとLittmanによって提出された、「多面体に関して平均値の性質を満たす関数(多面体調和関数)全体は有限次元線型空間をなすか?」という未解決問題を解決した。これは従来のFourier解析的手法と全く異なった,多面体の幾何と組み合せ論にホロノミックな偏微分方程式系の理論を組み合せる新しい手法に基づく。この結果は雑誌Geometryに掲載が決まっている。さらに高い対称性を持つ多面体に関する多面体調和関数全体を決定するために,有限鏡映群の不変式と不変偏微分方程式系について考察を進めた。そして一連の新しい不変式環の基底を発見した。この結果を用いて,一般次元での凸正多面体の大部分に対して,対応する多面体調和関数の空間を具体的に決定することができた。他の研究主題に関しては,差分方程式の漸近解析とコホモロジー論,分岐理論の逆問題,多変数超幾何関数に付随する捩れコホモロジー論について研究を行い,成果を論文にまとめた。差分方程式の研究については,Gevreyコホモロジー群という新しい概念を導入し、研究が端緒についたばかりである。合流型超幾何関数への応用を含め,これからの大いなる発展を期していかねばならない。
網羅的遺伝子発現解析を用いたバクテリアの増殖再開メカニズムの解明

バクテリアが増殖停止から増殖再開に至るメカニズムを解明することを目的として、様々な生育状態にある細胞を使ったmicroarray解析を進めた。研究には大腸菌をモデル生物として使用した。本研究の結果、増殖再開の初期に多くの遺伝子が発現していること、栄養環境の違いによって増殖停止期の適応状態が異なり、増殖再開期の遺伝子発現プロファイルも互いに違っていること、などが明らかとなった。本研究は、大腸菌をバクテリアのモデル生物として用い、増殖再開時期の様々な細胞内機能構造の変化を遺伝子発現の観点から追うことで、増殖再開に関わる生命システムの構築原理と動作機構を解明することを主たる目的としている。この達成に向けて、平成20年度前半は、研究実施計画に従い定常期、増殖再開初期、増殖中期、それぞれの細胞からRNAを抽出してmicroarray解析を行い、増殖再開初期に特異的に発現する遺伝子群のスクリーニングをおこなった。その結果、複数の遺伝子が候補として挙げられるデータを得た。しかしこれらの遺伝子が別の時期、すなわち増殖期から定常期までのどこかで発現していた可能性が残された。そこで、平成20年度後半からは研究内容を発展させ、大腸菌の生活環全体を対象としてmicroarray解析を進めた。年度末までに、増殖期、定常期初・中・後期、増殖再開初期、といった生活環の全課程の大腸菌をサンプルとしてRNAを抽出し、microarray解析の結果を得ることに成功している。しかし、対象とする細胞状態が多様になったため、クラスタ解析に適した品質のデータが得られていない。今後はこの問題を解決してクラスタ解析を進めることで、時期特異的に発現する遺伝子群を把握することが課題である。それぞれの機能に関しては、増殖再開初期特異的遺伝子群を抽出した後、各遺伝子破壊株の表現型観察やプロテオーム解析によって解明していく予定である。本研究はバクテリアが増殖停止から増殖再開に至るメカニズムを解明することを目的とし、大腸菌をモデル生物として、主に遺伝子発現の観点から、様々な生育状態にある細胞を使ったmicroarray解析を進めている。平成21年度前半までは、当初の計画通り増殖停止期と増殖再開期時期に注目しつつ、対象とする生育時期を広げ、生活環全体を通して網羅的遺伝子発現解析を進めた。その結果、増殖再開の初期に発現する遺伝子群の存在が明らかとなった。しかし、バクテリアの増殖に必要な栄養素は一つではなく、それぞれによって増殖の停止と再開のメカニズムは異なっていることが予想された。そこで平成21年度後半からは、含まれる栄養素をコントロールできる最少培地を用い、窒素(N)、リン酸(P)、グルコース(C)を欠乏させた場合の増殖停止期と、再供給したときの増殖再開期の細胞について、遺伝子発現のプロファイルを調べ、各栄養素ごとに比較する研究を進めている。これまでに、栄養素の違いによって増殖停止期の細胞の寿命や生理的状態は違っており、飢餓環境への適応がそれぞれ異なっていることが明らかとなった。また栄養供給後の遺伝子発現プロファイルも互いに違っており、増殖再開メカニズムも異なっていることが示唆されている。今後は特徴的な発現パターンを示す遺伝子を探索し、遺伝子破壊株の表現型観察やプロテオーム解析、蛍光融合タンパク質による細胞内局在の観察などから、その機能解析を進めていく予定である。バクテリアの生育は、栄養環境の悪化に伴って、対数増殖期から定常期へと移行する。この間、細胞は生理的、構造的に様々な変化を経て栄養枯渇環境に適応する。一方、定常期のバクテリアは生育環境が改善すると増殖を再開するが、実際の増殖開始までには、lag phaseと呼ばれる増殖準備期を必要とする。我々のこれまでの研究から、ゲノムDNAの複製に必要と考えられる時間を大きく超えて、長時間のlag phaseを要する場合があることが解ってきた。これは増殖停止に至る過程で、増殖に関わる機能構造の一部が失われ、増殖再開の過程でこれらが再構築を必要としていることを示している。では、定常期では何が失われ、lag phaseでは何がどのような順序で発現すると、増殖能が再度獲得されるのだろうか。この解明を目的として、本年度は、多様な栄養条件下における大腸菌の生育とマイクロアレイを用いた網羅的転写産物解析を行った。その結果、枯渇する栄養源が異なると定常期の生存率やlag Phaseの長さに大きな違いが見られること、lag Phaseが長くなる条件ではリボソームの分解が進み、寿命が短くなることを確認した。このことにより、栄養環境の悪化による増殖停止の状態には、リボソームを温存して長寿命化する適応と、リボソームを積極的に分解して短寿命化しながらも生命維持に努める適応があり、増殖再開のメカニズムも多様であることが明らかとなった。このようなリボソームの分解に至るシグナルや、それ以外の細胞内機能構造の変化は、未だ不明である。今後バクテリアの環境応答の解析をさらに進めることで、増殖再開のメカニズムを解明していきたい。
病態時のリンパ管・リンパ組織の可塑性を制御する生理活性脂質の解析と治療への応用

慢性増殖性炎症時の肉芽生成に伴って認められるリンパ管新生は、cyclooxygenase (COX)-2由来のprostaglandin (PG)で増強することが判明した。多くの腫瘍で転移前段階(premetastatic phase)において何らかの分子機構により、特定の器官により転移しやすい傾向があることが知られている。肺がんリンパ節転移モデルにおいて、がんのリンパ節転移に先立ってCOX-2由来のPGがリンパ組織の可塑性を制御し、niche形成に役割を持っていることが判明した。2次性リンパ浮腫をミミックするモデルにおいて、COX-2由来のPGがリンパ管新生を増強していることが判明した。増殖性の炎症をミミックするマトリゲル皮下接種モデルを作成し、増殖性炎症時のリンパ管新生を検討した。マトリゲルをマウスの皮下に接種すると、ゲル周囲では肉芽組織形成が認められ、マトリゲル周囲に集積した細胞は、COX-2やその下流でPGE2を合成する最終段階を担う酵素であるmPGES-1を発現していた。リンパ管内皮マーカーであるVEGFR-3遺伝子発現量をゲルで調べると、FGF-2刺激で発現量が増大し、COX-2阻害薬であるcelecoxibの連日投与により、VEGFR-3発現量は用量依存的に抑制された。免疫染色像でも、celecoxibの効果は確認出来た。このモデルのリンパ管新生はCOX-2、mPGES-1由来のPGE2が重要であることが推定された。4種のEPノックアウトマウスを用い検討し、EP3、EP4がリンパ管新生が増強に重要であることが確認できた。また、LPSを間欠的に腹腔内に投与して腹膜炎を惹起する別のモデルでは、COX-2依存的に横隔膜腹腔側にリンパ管が新生することが明らかに出来た。野生型マウスにおけるLPS誘発腹膜炎に伴うリンパ管新生は、選択的COX-2阻害薬のセレコキシブ連日投与で抑制され、さらにCOX-2の下流でPGE2産生に関与する誘導型PGE合成酵素のmPGES-1ノックアウトマウスでも、リンパ管新生は野生型に比べ有意に抑制された。リンパ管新生部位を詳細に見ると、COX-2及びCD11b陽性細胞、VEGF-C/Dの遺伝子発現の増加も認めた。LPS誘発の腹膜炎時の腹腔からのリンパ流(腹水流出)を腹腔内にFITC-dextran、indian inkを投与して評価すると、COX-2阻害薬投与時には腹腔から排泄される腹水の速度は有意に抑制された。以上より、腹腔からの腹水の排泄に、リンパ管新生が関与し、アラキドン酸代謝物により、制御されていることが明らかになった。がんのリンパ節転移は重要な予後決定因子であり、リンパ管はがんの進展に関わる重要なルートの一つである。リンパ節転移に関してはその分子メカニズムの解明や治療標的の特定が遅れている。多くの腫瘍細胞が転移前段階(premetastatic phase)において何らかの分子機構により、特定の器官により転移しやすい傾向があることが広く知られており、この転移を助長する状況(premetastatic niche)を形成することで転移を促進することが血行性転移の過程で報告されている。しかし、リンパ行性転移でのリンパ節におけるpremetastatic nicheの形成の有無、さらに転移メカニズムについてはまだ明らかにされていない。肺がんの所属リンパ節転移モデルを作成し、肺がんリンパ節転移におけるpremetastatic nicheの形成の有無を検討し、niche形成におけるCOXおよびPGの役割を解明した。原発巣の増殖に伴い、所属リンパ節でごく早期からCOX-2が誘導され、COX-2依存性に産生されたPGE2がEP3刺激することによりケモカインであるstromal cell derived factor (SDF)-1の発現増大がsubcapsular regionで生じSDF-1受容体を高発現する肺がん細胞をトラップすることでpremetastatic nicheを形成すること、さらに、COX-2陽性のSDF-1産生細胞は樹状細胞であり、EP3依存性にTGF-βを産生することでregulatory Tcell (Tregs)を動員することによって腫瘍免疫を抑制して、腫瘍転移を増強させる可能性を示すことが出来た。内因性のPGがpremetastatic niche形成の増強を介して、がんのセンチネルリンパ節転移を増強していることが明らかに出来た。COX-2阻害やEP3シグナルを遮断することが、がんのリンパ節転移を抑制する標的になることが示唆された。所属リンパ節における転移niche形成のデーターが得られ、新規リンパ行性転移を制御する治療標的として極めて興味深い成果と考えられる。マウス横隔膜での炎症誘発性リンパ管新生における生理活性脂質の役割を解析した。マウス腹腔内に大腸菌由来のLPSを間歇的に投与すると、横隔膜ホールマウント標本において、投与後2週間でLyve-1陽性のハシゴ状の新生リンパ管が認められた。COX-2阻害薬のセレコキシブを連日投与(100mg/kg/day)すると、同リンパ管新生が強く抑制された。誘導型PGE合成酵素であるmPGES-1のノックアウトマウスでも有意な横隔膜上のリンパ管新生の抑制が認められ、PGEの関与が明らかにできた。意外なことに, PGE以外にも、thromboxaneの関与が判明した。すなわち、thromboxaneの受容体であるTPをsystemicに消失しているTP受容体ノックアウトマウスでは、野生型に比べ、有意な横隔膜上のLPS誘導リンパ管新生の抑制が認められた。

TPの発現を調べると、LPS投与後1日目頃から横隔膜上で有意な増加が認められ、それはthromboxane合成酵素のTXSの誘導増大を伴っていた。横隔膜上でリンパ管新生誘導因子のVEGFアイソフォームVEGF-CがLPS投与に伴って発現が増加した。その発現は、TP受容体ノックアウトマウスでは、野生型に比べ、有意な抑制が認められた。横隔膜組織でのVEGF-C陽性細胞はCD4陽性のTリンパ球とCD11b陽性のマクロファージであった。野生型のLPS投与マウスの腹腔から採取したTリンパ球とマクロファージをin vitroで安定化thromboxaneアナログで刺激すると、両細胞でVEGF-Cの発現量の増大が認められた。細胞特異的なTP受容体のノックアウトを行うために、TP floxマウスの作成を始め、ほぼ完成に近い状況である。今後、Creマウスとの交配、phenotype解析のために、一部経費を平成29年度まで使うことにした。意外な生理活性脂質の関与を証明でき、同受容体Floxマウスの作成がほぼ完成しており、今後、細胞特異的なノックアウトの作成、phenotype解析を行う予定である。極めてインパクトのある報告になると思われる。腫瘍増殖に伴って形成されるストローマ組織において、PGが形成増強作用を発揮していることを報告している。多くのケモカイン系とその受容体の評価を行ったところ、中でもSDF-1がストローマの主要構成骨髄細胞の動員に役割を持つことが判明した。subcapsular領域におけるケモカイン系の発現を調べると、確かにSDF-1の発現が腫瘍接種に伴って、ごく早期から高まってきていた。COX-2および内因性PGの関与について検討すると、PG receptor内でEP3が最も高発現を呈し、マウスにcelecoxib投与した群においてvehicle群と比較し、リンパ節内subcapsular sinusにおける前転移状態(pre-metastatic phase)でのSDF-1発現の低下が確認できた。vehicle群において、リンパ節転移成立後のリンパ節のsubcapsular sinusにおけるSDF-1陽性部分は腫瘍細胞と一致しており、この部位が転移の温床となることが確認され、celecoxib群では有意に抑制されていることがわかった。DCsマーカーであるCD11c・IDOとCOX-2・SDF-1を用いて免疫染色を用いて解析すると、DCsはCOX-2およびSDF-1陽性であり、vehicle群に比べるとcelecoxib、SDF-1 antagonist(AMD3100)、CXCR4中和抗体処置群のリンパ節内subcapsular sinusでの発現量が有意に低下していた。以上から、腫瘍接種という刺激を受け、premetastatic siteに遊走したDCsがSDF-1を産生し、premetastatic nicheを形成することが示唆された。
細胞、組織、そして個体におけるプロトン・サーキットの研究

哺乳動物は、多種の高度に分化した細胞により構築されている。これらの細胞は形態・機能がそれぞれ特殊に分化し、その細胞に託された機能を協調して遂行することによって、高等生物が示す高次の個体機能を実現している。エンドソーム・リソソーム系のオルガネラは、これらの分化形質の発現に直接的に関与する。ゴルジ装置,エンドソーム,リソソームあるいは液胞などのエンドソーム・リソソーム系オルガネラは、段階的により低い内腔のpHを形成・維持する。しかしながら、この『酸性オルガネラのpH感知・制御メカニズム』に関しては、未だ不明である。研究代表者がハーバード大学医学部との共同研究で、V-ATPaseのサブユニットが低分子GTPase Arf6のグアニンヌクレオチド交換因子(ARNO)とpH依存的に結合を示すことを見いだした。今年度は、色素細胞や内分泌系組織におけるV-ATPaseの局在と機能を解析し、V-ATPaseが貯留小胞やエンドソームなどを含むオルガネラの内部の酸性pH-senserとして機能することを強く示唆する結果を得た。さらに、V-ATPaseサブユニット・イソフォームa3とpH感受性型緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパクのノックイン・マウスを用い、オルガネラ膜輸送および酸性pHをGFPのみならず、個体レベルで酸性コンパートメントを可視化し、プロトンの動態を追跡する系を構築した哺乳動物は、多種の高度に分化した細胞により構築されている。V-ATPaseがタンパク質分解経路に制御的な役割を持つことを明らかにした。さらに、V-ATPase酵素自身が貯留小胞やエンドソームなどを含むオルガネラの内部の酸性pH-senserとして機能することを強く示唆する結果を得た。これは、酸性pHと膜輸送との関連を解明する上できわめて重要な研究結果といえる。さらに、V-ATPaseサブユニット・イソフォームa3とpH感受性型緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパクのノックイン・マウスの作出に成功した。オルガネラ膜輸送および酸性pHをGFPのみならず、個体レベルで酸性コンパートメントを可視化し、プロトンの動態を追跡する系を構築した。ゴルジ装置,エンドソーム,リソソームあるいは液胞などのエンドソトム・リソソーム系オルガネラは、段階的により低い内腔のpHを形成・維持する。しかしながら、こゐ『酸性オルガネラのpH感知・制御メカニズム』に関しては、未だ不明である。研究代表者がハーバード大学医学部との共同研究で、V-ATPaseのサブユニットが低分子GTPaseAr6のグアニンヌクレオチド交換因子(ARNO)とpH依存的に結合を示すことを見いだした。さらに、V-ATPaseサブユニット・イソフォームa3とpH

感受性型緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパクのノックイン・マウスを用い、オルガネラ膜輸送および酸性pHをGFPのみならず、個体レベルで酸性コンパートメントを可視化し、プロトンの動態を追跡する系を構築した。
ヒト遺伝子病(ウィルソン病)の多様性モデルの作製と解析

LEC ratはウイルシン病の動物モデルとして知られており、ヒトのATP7B遺伝子に相同なラットAtp7b遺伝子の変異により、銅輸送P-type ATPaseが欠損している。この結果、ヒトウイルソン病の肝型と類似の臨床症状である劇症肝炎、胆管線維症および肝癌を発症する。今回我々は、ヒトのATP7B遺伝子の生体内での機能を確かめ、この遺伝子をLECラットに導入することにより肝臓疾患が救助することができるか否かを調べることを目的とした。導入遺伝子はヒトATP7BcDNAにCXNプロモータを結合させ、LECラット受精卵の前核に注入した。作製されたトランスジェニックラットの導入遺伝子のPR-PCR解析により肝臓及び他の臓器における発現が示された。また、タンパクの発現はノーザンプロット解析により同様に肝臓及び他の臓器に見られた。トランスジェニックラットの血液中にホロセルロプラスミン合成が回復し、胆汁中に分泌される銅含量が増加することにより、肝臓と腎臓の銅含量が減少した。そしてトランスジェニックラットは血液中のGOTおよびGPT活性が大幅に減少し、劇症肝炎および胆管線維症の発現が抑制された。生存率もLECラットの26.3%から97%へと飛躍的に高まった。さらに、興味深いことは肝臓には鉄の蓄積が激減していることである。これらの知見はヒトATP7B遺伝子の産生物がラットの生体内でも銅がセルロナラスミンに結合して細胞間銅輸送を行うことができること、さらに胆汁による銅の排泄経路が機能することを示した。そして、ヒトATP7B遺伝子がLECラットにおいても機能し、ウィルソン病からの回復を示した。加えて、鉄は銅との共同作用でウィルソン病の肝臓疾患に必須の役割を果たしている事が示唆された。この研究におけるラット生体内でのヒトATP7B遺伝子の発現と機能の発現は、ウィルソン病の遺伝子治療の可能性に重要な証拠を与えている。ウイルソン病の遺伝子は酵素蛋白P type-ATPaseをコードしている。この疾患には大きく分けて肝硬変や肝炎を発症する肝型と精神障害を引き起こす神経型および両型のハイブリッド型が知られている。それぞれの病型の相違は、遺伝子欠損部位やその欠損様式による酵素蛋白質の機能の障害の程度に依存している可能性が示唆された。しかし、この仮説が正しいか否かは証明されていない。一方、ウイルソン病モデルであるLECラットの遺伝子異常は、P type-ATPase遺伝子の3'側の数百塩基にわたる大きな欠失であり、その遺伝子は全く発現していない。そしてその病型は、劇症肝炎を起こす肝型である。つまり、ヒトウイルソン病の肝型の患者の性質と一致している。この研究はヒト由来P type-ATPase cDNA遺伝子のLECラット受精卵への導入により、このラットの劇症肝炎の発症が治るか、また、こ遺伝子に各種の変異を挿入し、この遺伝子をLECラット受精卵へ導入することにより、このラットの病型を変えることが出来るかを目的とした。そして今年度はヒト由来の正常P type-ATPase cDNA遺伝子のLECラット受精卵への導入により、このラットの劇症肝炎の発症が治るか否かを目的に、研究を行った。まず、ヒト由来P type-ATPase cDNA遺伝子のコンストラクトを作製し、つぎにLECラットに過剰排卵を誘起し、交配後、受精卵を採取した。遺伝子をマイクロインジェクション法にて受精卵に注入し、偽妊娠ラットに移植しトランスジェニックラットを作製した。現在注入遺伝子が染色体に導入されているか否かを検討中である。

ウイルソン病の遺伝子は酵素蛋白P type-ATPaseをコードしている。この疾患には大きく分けて肝硬変や肝炎を発症する肝型と精神障害を引き起こす神経型および両型のハイブリッド型が知られている。それぞれの病型の相違は、遺伝子欠損部位やその欠損様式による酵素蛋白質の機能の障害の程度に依存している可能性が示唆された。しかし、この仮説が正しいか否かは証明されていない。一方、ウイルソン病モデルであるLECラットの遺伝子異常は、P type-ATPase遺伝子の3'側の数百塩基にわたる大きな欠失であり、その遺伝子は全く発現していない。そしてその病型は、劇症肝炎を起こす肝型である。つまり、ヒトウイルソン病の肝型の患者の性質と一致している。この研究はヒト由来P type-ATPase cDNA遺伝子のLECラット受精卵への導入により、このラットの劇症肝炎の発症を押さえられるか、また、こ遺伝子に各種の変異を挿入し、この遺伝子をLECラット受精卵へ導入することにより、このラットの病型を変えることが出来るかを目的とした。今年度も昨年度に引き続きヒト由来の正常P type-ATPase cDNA遺伝子のLECラット受精卵への導入により、このラットの劇症肝炎の発症を押さえられるか否かを目的に、研究を行った。まず、ヒト由来P type-ATPase cDNA遺伝子のコンストラクトを作製し、つぎにLECラットに過剰排卵を誘起し、交配後、受精卵を採取した。遺伝子をマイクロインジェクション法にて受精卵に注入し、偽妊娠ラットに移植しトランスジェニックラットを作製した。十数匹のファウンダー動物が誕生し、F1の繁殖を行っているが、産子の死亡率が高く、成功していない。引き続きファウンダーの作製とF1の作製を行い、肝炎の発症の有無を観察するつもりである。ウイルソン病は、肝臓や腎臓、脳に銅が蓄積することによる肝疾患と進行性神経疾患を主徴とする遺伝性疾患である。原因遺伝子はATP7B遺伝子であることが明らかにされたが、これは細胞膜に存在する銅輸送性P-type ATPaseをコードしており、この蛋白は6個の銅結合部位を持つ。LECラットはウイルソン病のモデル動物であり、Atp7b遺伝子に大きな欠失変異を起こしている。この結果、銅のセルロプラスミンヘの結合や胆汁への排泄能を欠損しており、肝疾患を引き起こす。この研究では正常のヒトATP7BcDNAをLECラットヘ導入し、肝疾患への効果を調べた。7014bpのヒトATP7BcDNAをトリβ-actinプロモータにつなげ、LECラットおよびSDラット受精卵に注入した。3系統のトランスジェニック(TG)ラットを確立し、RT-PCRによりほとんど全ての臓器に導入遺伝子mRNAが発現していることが確認された。さらにWestern Blottingにより肝臓にヒト型のATP7B蛋白が検出された。このラットは10週齢で、セルロプラスミン活性のわずかな上昇が見られたが、血清銅のレベルの変化は見られなかった。
高立体規則性ポリスチレン結晶中の積層欠陥の構造解析

新しい立体特異性重合法により合成されたシンジオタクチック・ポリスチレンS-PSは、高立体規則度・超高重合性が得られるだけでなく、高融点(275°C)かつ結晶化速度も大きく、エンジニアリングプラスチックスとしての期待が大きい。分子量(Mw)7万あるいは16万のS-PSを、n-テトラデカンとデカリンの体積比2:1の混合溶媒に溶かし、0.01%程度の稀薄溶液とした。温度範囲160-200°Cでの等温結晶化によって薄板状の単結晶が得られた。溶液中に岩塩を入れ、その(001)面に生長させた単結晶は平面性が良く、かつ単層であった。しかし現在まだ、エピタクシ-生長の特徴は確認できていない。この板状単結晶は、先端の切れたひし形を呈した。S-PSには種々の結晶多形があるが、本研究で得られた単結晶は分子鎖が平面ジグザグ構造をとる斜方晶(P2,2,2:a=2.87nm,b=0.8nm,c=0.51nm)であり、分子鎖軸(C軸)は単結晶板面に垂直である。この単結晶のhko電子回折には次の三つの特徴がある。(1)hOOとOKOは偶数次しか現われずスポット状である。(2)hKOはh+Kの偶数の場合はスポット状、h+Kが奇数の場合はa^*軸方向にストリ-ク状である。(3)散漫散乱は認められない。以上のことを考慮に入れ、若干の試行錯誤の後、次のようなモデルに到達した。規則的結晶のbc面に平行な分子層を2分子層毎に区切ると、2種類のモチ-フの交互的な積層が出来上がる。規則的結晶の構造も充分には解析されていなかったので、エネルギ-計算を行ない、構造を決定した。モチ-フの交互性がくずれた積層欠陥部分についても計算を行ない、2分子層がC軸に平行な2回らせん軸をもつ組合せ(モチ-フ)ならば積層欠陥が生じてもエネルギ-がそれほど大きくならず規則構造に次いで安定であることがわかった。高分解能電子顕微鏡観察によって、提案した規則構造が妥当であることが確認されたが、積層欠陥についてはまだ充分な分解能を有する像は得られていない。