hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超分子による分子シンクロナイゼーションとその生体刺激伝達

ダンシル修飾β-シクロデキストリン(CD)の熱ショック蛋白質(HSP)70および90をゲストとした時の蛍光強度変化より蛋白質の包接形成が判明した。CD存在下,非存在下でのトリプシン消化酵素の蛋白分解反応を検討した。HSP70はCD共存下でより分解されやすく,トリプシンも同時にCDに取り込まれたことが示唆される。ATP共在下では分解されにくい。これはATPによるHSP70の二次構造の変化が報告されているがATP存在によりHSP70の高次構造がα-ヘリックスの減少とβ-シート構造の増大へと変化したためと考えられる。HSP90ではATP非共存,CD共存でより分解が促進された。ATP共存下ではCD存在で抑制が認められた。HSP90のシャペロン活性はcirtrate synthase(C.S.)の熱変形により生ずる凝集を吸光度より検討した。C.S.: HSP90=1:2で凝集は完全に抑えられシャペロン活性が認められた。CDのみでは50%の活性が発現された。CDおよびHSP90共存下でさらに25%の増加が認められ、CD介在によるコア形成が考えられ、このことはCDによる生体高分子との分子シンクロナイゼーションであると考えられた。ダンシル修飾β-CDダイマーおよびトリマーのステロイド類をゲストとした時の蛍光強度変化によりその包接挙動が判明した。蛍光性β-CDダイマーおよびトリマーはゲスト添加に伴いその蛍光強度は減少し、そのセンシング能は蛍光性β-CDモノマーと比較すると胆汁酸に対して優れた選択性を示した。また、linerDNAに対してもその添加に伴う蛍光強度変化を示すことから、これらの生体関連物質を分子認識することが示唆され、蛍光性β-CDダイマーおよびトリマーによる生体関連物質との分子シンクロナイゼーションの可能性を見い出した。ヘテロ2置換修飾シクロデキストリン(CD)の合成と分子認識能について検討した。シアノベンゼン-ピン修飾CDはCD空孔内での自己包接により,エキサイプレックス蛍光を示した。ゲスト添加によりエキサイプレックス蛍光強度の減少と通常蛍光の強度の増加が観察された。AC体及びAE体の蛍光及び円二色性スペクトルでは、AE体はそのエキサイプレックス蛍光は観察されずモノマー蛍光強度も弱い。円二色性では250nm付近の負のコットン効果強度が強くシアノベンゼン残基が空孔内にありピレン残基は空孔外にあると推定されAC体と異なる挙動を示した。ダンシル修飾β-CDのHSP70あるいは熱ショック蛋白質(HSP)90をゲストとした時の蛍光強度変化よりタンパク質の包接形成が判明した。HSP90のシャペロン活性はcitratesynthase(C.S.)の熱変形により生ずる凝集を吸光度より検討した。C.S.:HSP90=1:2で凝集は完全に抑えられシャペロン活性が認められた。

また、linerDNAに対してもその添加に伴う蛍光強度変化を示すことから、これらの生体関連物質を分子認識することが示唆され、蛍光性β-CDダイマーおよびトリマーによる生体関連物質との分子シンクロナイゼーションの可能性を見い出した。
寝たきり老人に対する補綴処置の簡略化と装着義歯の即日改修による咀嚼能力の変化

在宅歯科診療の対象となる患者の全身状態や口腔内の状態は健常者と比較して不良となることが過去の研究結果より確認されている(文部省科学研究費補助金課題番号05671644)。そのため、通常の診療回数を減らすという歯科治療の簡略化が必要となってくる。そこで今回我々は、鋳造操作など、診療回数の増加する方法を極力避けて行う診療方法を試みた。少数歯残存の部分床義歯については、装着後のメインテナンスを考えて根面アタッチメントを用いる方法にし、残根上義歯を装着している患者に対しては、残根歯を積極的に維持歯として用いることとした。結果の概要:維持歯の破折やカリエス等により維持不良となり、義歯の機能が損なわれた症例を選択し、我々の開発した鋳造を必要としない維持棒付きの根面板(磁性合金)を使用し、義歯の即日改修を行った。術式としては、歯牙を歯肉縁にて切断し、合釘を形成し適当な長さに切断した維持棒付きの根面板をビスタイトセメントにて合着する。義歯側には磁性アタッチメントマグフィットEXを旧義歯内面に設置し咬合面部を形成しオーバーデンチャータイプとした。これにより、義歯の維持力は格段に向上し、摂取可能な食品数の増加が、当講座にて考案し、使用している簡易咀嚼能力検査表の評価でも確認できた。次にこの方法を、残根上義歯を装着していた、いわゆる寝たきり高齢者に適用した。残根歯のうち維持歯として利用できるものはかなり限られてくるが根面アタッチメントを適用した症例では維持力の増加が明らかに確認でき、咀嚼能力も向上した。
小腸液灌流法を用いた食物繊維のヒト消化吸収機能に及ぼす影響の検討

食物繊維が人の消化吸収機能に及ぼす影響を以下のように検討した。(1)まず、小腸液灌流法を用いて回腸末端部の小腸液の食物繊維(難消化性澱扮とペクチン)含有量を測定し経口摂取したそれと比較した。(2)大腸内の発酵によるカロリー摂取状況を評価するために食物繊維(難消化性澱粉、ペクチン、セルロース、ラクツロース)摂取後の呼気ガス(水素とメタン)を測定した。(3)^<13>Cにより標識された中性脂肪をペクチンとともに摂取させ、呼気中の^<13>CO_2と^<12>CO_2を測定してペクチンの中性脂肪吸収に及ぼす影響を評価した。本研究で得られた主要な結果を列挙すると以下のようになる.1.内視鏡的逆行性腸管挿管法を用いた小腸液灌流法による食物繊維の回収実験で,食物繊維の一種である難消化性澱粉の回収率は平均値±標準偏差値で345±9.7%であった。これは難消化性澱粉の食物繊維としての価値が平均でわずか34.5%しかないことを示唆した。また個体差が非常に大きく約20%の幅がみられた。2.同様方法で同じく食物繊維の一種であるペクチンの回収実験を行ったところ,平均値±標準偏差値は88.4±10.5%であった。以上よりペクチンは難消化性澱粉に比較し,食物繊維としての価値はほぼ90%と高かった。しかし,難消化性澱粉と同様に20%以上の個体差がみられた.以上より食物繊維はその種類によって真の食物繊維としての価値は大きく異なり,また個人差が大きいことが明らかになった。このことは食物繊維の真の値がin vivo系で明らかにされるべきであることを示唆し,また個人によって異なる消化吸収システムが食物繊維の真の値に大きく影響するものと考えられた.3.食物繊維の大腸内における発酵パターンにはいくつか存在することが明らかになった。この相違は腸内細菌叢の種類と量、食物繊維の小腸通過時間・通過率及び食物繊維の種類に依存していると考えられた。4.短時間における食物繊維の脂肪の消化吸収に及ぼす影響は,想定されているほど大きくないことが明らかになった。食物繊維は1971年のバーキットの繊維仮説の提唱以来注目を浴びてきた。しかし,それは根拠のない健康ブームに乗っかった側面もあった。近年,食物繊維の種類分け,測定法が厳密化し,食物織維と健康に関する研究そのものも,より厳密化してきた。したがって,食物繊維の厳密な評価による,さらなる説得力のある研究が始まりつつある.本研究は食物繊維の評価を科学的に厳密に追及したものであり,今後のより成熟した食物繊維の研究に資するところ大であると信じる。したがって,食物繊維の厳密な評価による,さらなる説得力のある研究が始まりつつある.

本研究は食物繊維の評価を科学的に厳密に追及したものであり,今後のより成熟した食物繊維の研究に資するところ大であると信じる。本年はendoscopic retrograde bowel insertion method (ERBI)による回腸末端流量の測定技術を習熟することを目的として,比較的測定法が簡便な難消化性澱粉を対象として実験を行った。難消化性澱粉は小腸で消化吸収されずに大腸に進み,大腸癌に対し抑制的にはたらく短鎖脂肪産生の基質となる。大腸内視鏡を回腸まで挿入し,ガイドワイヤーを使用してダブルルーメンのチューブを回腸に挿入,バルーンを膨らませて固定した。これまでに7名の健常対照者により実験を行ってきたが,当初はチューブの挿入に苦慮し,また測定途中でチューブが抜けるなど結果が得られなかったが,ようやく2名について測定を行うことができた。チューブ挿入後,難消化性澱粉50gとPEGを含む試験食を負荷し,回腸末端にPSP溶液を一定量持続的に注入,チューブから得られた回腸末端潅流液より回腸末端の難消化性澱粉量を経時的に測定した。難消化性澱粉量は加水分解した後,HPAE-PAD法によりglucoseとして測定した。2名から得られた結果では,負荷直後は回腸末端潅流液中のglucoseは測定限界以下であったが,試験食負荷後26時間の間では平均156.1mg/mlであった。これから換算すると回腸末端の難消化性澱粉濃度は62.3mg/minであった。難消化性澱粉は広義の食物繊維に含まれ,小腸で消化吸収されずに大腸に進み大腸癌に対し抑制的にはたらく短鎖脂肪酸産生の基質となる他,最近ではその存在が肥満に対して抑制効果をもつとの報告がある。本年は昨年度に確立したendoscopic retrograde bowel insertion method(ERBI)による回腸末端における回腸液の採取を行い,回腸液中の難消化性澱粉の測定を行った。大腸内視鏡を回腸まで挿入し,ガイドワイヤーを使用してダブルルーメンチューブを回腸に挿入,バルーンを膨らませて固定した。当初は難消化性澱粉とPEGを含む試験食を負荷していたが,PEGの吸収動態が難消化性澱粉と一致しないことが多いことが分かり,マーカーとして改にたPSPを使用することとした。回腸末端にPSP溶液を一定量持続的に注入,チューブから回収された回腸末端潅流液より回腸末端の難消化性澱粉量を経時的に測定した。これまでの検討では経口摂取されたRSの回腸末端における回収率は36.247.5%であった。全例で潅流開始後に回腸液中にRSが出現し始め、潅流終了時には回腸液中からRSは検出されなくなっており、経口摂取したRSはすべて回腸末端部に到達したものと考えている。回腸灌流法により高難消化性澱粉含有食品添加物に含まれるヒト消化管で消化吸収されない難消化性澱粉の割合を測定することが可能であり,回腸末端部に到達するRS量には個体による大きな相違は認めなかった。次年度では,これまでの技術を活かして食物繊維を経口摂取させ,回腸末端液中での食物繊維量の測定を行う予定である。本年はendoscopic retrograde bowel insertion method(ERBI)による回腸末端における回腸液の採取を行い,非消化の澱粉の割合を高めたcornstarch(HMT-HAS)のうち実際に回腸末端に達する難消化性澱粉の割合を算出し,in vitroで算出される割合と比較検討した。
実代数曲線の位相的性質と、対合をもつ格子の不変量との間に対応について

研究計画に書いたように、まず、V.V.Nikulin:Involutions of integral quadratic formsandtheir applications to real algebraic geometry,Math.USSR Izv,22(1984)を読解して我々の場合の分類結果を書き下す作業に取り組んだ。この論文は、記号定義の部分が長く煩雑で、所々、あまり一般に知られていない概念の知識も仮定しており、大変苦労したが、我々の場合である、条件がS=(20^^<02>)、θ=-1の場合に限定して書き下せば、現れてくる不変量は案外単純で理解しやすいものであることが判明してきた。しかし結局、最終部分で理解しにくい不変量が現れ、そこで行き詰まってしまった。(論文のp.115以降の部分)この部分までの中間経過について、3月7日、京都大学数理解析研究所短期共同研究「実特異点の幾何学的様相」で報告した。一方、RP^1×RP^1上のbidegree(4,4)の実代数曲線の“camp lex orientation"に関して、4^^→なる型の場合に、2種類のcomplex orientationの存在が予想されるような、4^^→現象が観察された。この予想を証明すること、そして、その2種類のcomplex orientationはV.V.Nikulinの論文の中で定義されている、どの不変量によって識別できるものなのか、それを知るためにも、上に述べた分類結果の書き下し作業を完結すべきである。また、8月29日から9月1日、大沼で行われた「特異点論研究集会」では、名古屋工業大学の福井敏純氏が実トーリック曲線上の実代数曲線に関する研究発表を行っていたが、この研究にも、Nikulin理論を適用することができるだろう。また、鹿児島大学理学部の大本亨氏からは、complex orientationの研究方法についての助言を受けた。
X線レーザーとナノ構造形成技術を駆使した高速電子密度マッピング

パルス状コヒーレントX線溶液散乱(Pulsed Coherent X-ray Solution Scattering, PCXSS)法と名付けられた新しいX線イメージング法は、短波長性・超短パルス性・高い空間コヒーレンスという特長をもつX線自由電子レーザー(X-ray Free-Electron Laser, XFEL)と、独自開発の溶液試料環境セル(Micro-Liquid Enclosure Array, MLEA)によって、溶液試料のナノ空間分解能観察を可能にする。本研究課題では、単一試料にX線が照射される確率(試料ヒット率)をフォトリソグラフィに代表される微細加工技術によって向上させることで、高い測定スループットの実現を目指している。平成30年度は、1枚のMLEAに集積されたマイクロ溶液槽どうしを隔てている仕切りの高さと試料ヒット率の関係に着目した。変えることが難しい試料の大きさや溶液中粒子密度にあわせて、仕切り高さを制御し、溶液槽の体積を変化させることで、試料ヒット率の向上が期待できる。リソグラフィ条件を変えながら仕切りの試作を行い、電子顕微鏡や非接触三次元表面形状測定装置で構造を評価した結果、エポキシ樹脂ベースのフォトレジストであるSU-8の粘度や、それを基板にスピンコートする際の回転数を最適化することで、500 nmから2 umまで仕切り高さを制御できることが分かった。また、平成29年度に研究を進めた、ナノ構造体が表面に形成されたMLEAに関する成果を、査読付きの国際学術誌に投稿した。リソグラフィ条件を最適化することによって、MLEAの仕切り高さをサブマイクロメートルスケールで制御することに成功したため。加えて、その仕切り高さを制御したMLEAを用いたPCXSS測定により、生細胞や機能性ナノ粒子からのコヒーレントX線回折パターンを取得できたため。さらには、ナノ構造体が表面に形成されたMLEAに関する成果を査読付きの国際学術誌に投稿できたため。制御可能となった溶液槽の体積と試料ヒット率の関係を、試料に生細胞を用いて、実際のPCXSS測定により評価する。もう一つは、すでに取得済みの生体・材料試料からのコヒーレントX線回折パターンのデータ解析を進める。XFELで取得できるテラバイトスケールの回折パターンデータを効率的に解析するため、XFEL施設SACLAに整備されているハイパフォーマンスコンピュータを利用するとともに、プログラムの改良も進める。平成29年度は、パルス状コヒーレントX線溶液散乱法のための、ナノ構造体付き環境セルを作製することを目指した。独自開発の溶液試料を保持できる環境セル(Micro Liquid Enclosure Array, MLEA)は、エポキシ樹脂による隔壁で500 nmから2 um程度のギャップを持たせながら、厚さ200 nmの窒化ケイ素薄膜を貼り合わせた構造になっている。そのうちの1枚の窒化ケイ素薄膜上に、北海道大学電子科学研究所が共同管理するオープンファシリティ装置を利用した電子線リソグラフィによってナノ構造体を作製した。ナノ構造体の材質はアルミニウム、大きさは直径200400 nmの円柱で、その厚さは50 nmとした。ナノ構造体の間隔は5 umで作製範囲はMLEAの1つの照射窓よりも十分に大きい100 um×100 umとした。リフトオフのプロセスの際に薬液を70°C程度に熱すること、また洗浄時にアセトン、メタノール、純水をかけ流すことで、薄膜を破壊してしまう超音波洗浄装置を利用することなく、薄膜上にナノ構造体を作製することに成功した。作製したナノ構造体は走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)によって確認した。さらに、アルミニウム表面にビオチン末端ホスホン酸自己組織化単分子膜(Self-Assembled Monolayer)の形成することを試みた。ナノ構造体に対して、ピオチンホスホン酸SAM形成処理を施した後、蛍光標識ストレプトアビジンを結合させ、蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ナノ構造体の間隔と一致する規則的な蛍光が観測された。つまり、ナノ構造体上でのみ、ビオチン末端ホスホン酸SAMが形成され、さらに、そのビオチンと蛍光標識ストレプトアビジンが問題なく結合しているということが分かった。当初の計画にあるナノ構造体付きMLEAの作製に成功したため。加えて、SAM技術を利用して、バクテリアをナノ構造体上にのみ選択的に結合させる手法の開発も進んでいるため。

リソグラフィ条件を変えながら仕切りの試作を行い、電子顕微鏡や非接触三次元表面形状測定装置で構造を評価した結果、エポキシ樹脂ベースのフォトレジストであるSU-8の粘度や、それを基板にスピンコートする際の回転数を最適化することで、500 nmから2 umまで仕切り高さを制御できることが分かった。また、平成29年度に研究を進めた、ナノ構造体が表面に形成されたMLEAに関する成果を、査読付きの国際学術誌に投稿した。リソグラフィ条件を最適化することによって、MLEAの仕切り高さをサブマイクロメートルスケールで制御することに成功したため。加えて、その仕切り高さを制御したMLEAを用いたPCXSS測定により、生細胞や機能性ナノ粒子からのコヒーレントX線回折パターンを取得できたため。さらには、ナノ構造体が表面に形成されたMLEAに関する成果を査読付きの国際学術誌に投稿できたため。ナノ構造体の表面形状や厚さにばらつきがないか、SEMや高速原子間力顕微鏡による観察を進める。また、X線自由電子レーザー施設SACLAにおいて、ナノ構造体付きMLEAに封入したバクテリアの計測を行う。さらに、同様のリソグラフィ技術を駆使して、より小さなタンパク質粒子を自然な状態で保持できるMLEA開発の可能性を探る。制御可能となった溶液槽の体積と試料ヒット率の関係を、試料に生細胞を用いて、実際のPCXSS測定により評価する。もう一つは、すでに取得済みの生体・材料試料からのコヒーレントX線回折パターンのデータ解析を進める。XFELで取得できるテラバイトスケールの回折パターンデータを効率的に解析するため、XFEL施設SACLAに整備されているハイパフォーマンスコンピュータを利用するとともに、プログラムの改良も進める。
脊椎動物網膜の外網状層内シナプス結合の生理学的解析

脊椎動物網膜外網状層は視細胞、双極細胞と水平細胞によって構成されている。外網状層内でのシナプス結合及びその機構を解明するには、その構成要素の性質を理解する必要がある。今回、水平細胞に存在するリガンドレセプターとイオンチャネルの性質を調べた。実験は、アメリカナマズから単離・培養した水平細胞に、ガラス管微小電極性とパッチクランプ法を適用して行った。1.水平細胞に発生するL-グルタミン酸(Glu)応答は、Gluアナログである2-amino-4-phosphonobutyric acid(APB)投与によって制御された。双極細胞に対してはアゴニストとして働くことが知られている。APBが、水平細胞に対してはアンタゴニストとして作用することが明らかになった。また、この抑制作用は、細胞内の酸性化で増大し、アルカリ化で減少した。2.水平細胞に存在する高閾値型カルシウムチャネル電流は、Gluによって抑制された。この抑制は、Gluによる細胞内の酸性化が原因となっていた。細胞内酸性化による抑制のEC_<50>はpH7.1であり、ヒル係数は約2であった。Gluには、視細胞の伝達物質として光情報を水平細胞に伝達する役割以外に、水平細胞の細胞内プロトン濃度を増加させ、カルシウムチャネルを抑制する神経修飾物質としての作用もあることが明らかになった。プロトンは現在まで殆ど注目されていない物質であるが、細胞内セカンドメッセンジャーとしてリガンドレセプターやイオンチャネルの制御に関与していることが示唆された。脊椎動物網膜外網状層内のシナプス機構の解明には、その構成要素である視細胞、双極細胞及び水平細胞の生理学的・生物物理学的性質を完全に理解する必要がある。今年度は、魚類網膜水平細胞に存在するL-グルタミン酸(Glu)受容体及び電位依在性カルシウムチャネルの性質をガラス管微小電極法を用いて調べ、以下の結果を得た。1.アメリカナマズ網膜から単離した水平細胞は、Glu投与に対し脱分極応答を発生する。この応答は、Gluアナログである2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)投与によって抑制された。この抑制効果は、25mM-酢酸ナトリウムの潅流投与により細胞内を酸性化させると増大し、20mM-塩化アンモニウムにより細胞内をアルカリ化させると減少した。APBを単独で投与しても、水平細胞の膜電位に有意な変化は観察されなかった。以上から、APBは水平細胞のGlu受容体でアンタゴニストとして作用すること、またその作用は細胞内の水素イオンによって調節されていることが示唆された。2.単離水平細胞は、脱分極刺激に応じて時間経過の長いカルシウム活動電位を発生する。細胞内酸性化により活動電位の特続時間は著しく短縮し、振幅は減少した。一方、アルカリ化で逆の現象がみられた。活動電位の細胞内pH依存性は、カリウム及びナトリウムチャネル阻害剤並びに細胞内環状ヌクレオチド濃度の上昇を誘発するIBMXの存在下でも観察された。また細胞内カルシウム濃度をBAPTAを用いて低下させた場合でも、活動電位の振幅及び特続時間は細胞内pHの影響を受けた。以上から、カルシウムチャネルの活動は細胞内の水素イオンによって直接調節されていることが示唆された。本年度は、魚類網膜水平細胞に存在するカルシウムチャネルの性質をパッチクランプ法を用いて調べた。その結果、1.アメリカナマズ網膜から単離・培養した水平細胞には、高閾値型カルシウムチャネルが存在している。このチャネル電流は、細胞内の酸性化で抑制され、アルカリ化で増強された。カルシウム電流の細胞内酸性化による抑制のEC_<50>はpH7.1であり、ヒル係数は約2であった。2.グルタミン酸は、水平細胞内を用量依存的に酸性化した。

100muMのグルタミン酸は細胞内pHを約0.3酸性化した。この酸性化は可逆的であった。3.グルタミン酸は細胞内を酸性化することによって、高閾値型カルシウムチャネルを抑制した。110muMのグルタミン酸は、細胞内pHを約0.1酸性化し、その結果としてカルシウムチャネル電流のピーク値が約20%抑制された。等が明らかとなった。以上から、グルタミン酸には、光情報を視細胞から二次ニューロンに伝達する神経伝達物質としての役割以外に、細胞内のプロトン濃度(酸性化)を上昇させ、カルシウムチャネルを抑制する神経修飾物質としての作用もあることが明らかとなった。プロトンは現在まで殆ど注目されていない物質であるが、細胞内セカンドメッセンジャーとしてリガンドレセプターやイオンチャネルの制御に関与していることを強く示唆している。
刺激競合に関する比較心理学的研究:同一の刺激により生じる連合学習の総量は一定か?

連合学習場面において、複数の手がかり刺激が、ある結果事象と対提示されると、各手がかり刺激に対して生じる連合学習は減少する。本研究の目的は、この刺激競合現象のメカニズムに関する実験的検証をラット、ヒト、さらにはより低次な動物など複数の被験体種を対象として行うことである。具体的には、これまで広く受け入れられてきた限定資源仮説から導かれる、競合する個々の手がかり刺激に対する連合学習は変動するが、全手がかり刺激に対する連合学習の総量(総和)は一定となる、という予測を、ラットやより低次な動物を対象とした条件づけ場面、ヒトを対象とした因果推論場面などさまざまな場面において、実験的に検証する。本年度は、最初二ヶ月の間、昨年度から引き続き行ったアカハライモリを被験体に用いた研究を行ったのに加え、6月より渡米し、米国ニューヨーク州立大学ビンガムトン校のMiller教授との共同研究として、ラットやヒトを対象とした実験を精力的に行った。イモリを被験体に用いた条件づけ事態においては、明確な成果をあげるには至らなかったが、ラットを被験体に用いた実験事態において、本研究計画の焦点である、刺激競合場面において同一の結果事象が用いられているにもかかわらず生じる条件づけ量が変動するという現象を発見した。これらの成果はすでに論文として投稿し、審査結果を受けて現在修正中である。また、逆行ブロッキングなど、他の刺激競合現象に関する実験的研究でも成果を上げ、現在投稿準備中である。また、並行し、ヒトを対象とした随伴性判断事態における実験研究を行った。この結果、実験場面がある程度確立されたため、今後の研究の進展が期待される。さらに、石田雅人教授と、他複数の研究者との共同で、教育関係者のストレス解消法に関する書物を翻訳し、出版した。さらに、石田雅人教授と他研究者との共同で、イルカ介在活動に関する文献調査を行った。連合学習場面において、複数の手がかり刺激(例えば古典的条件づけにおける条件刺激)が、ある結果事象(例えば古典的条件づけにおける無条件刺激等、生活体にとって重要な刺激)と対提示されると、各手がかり刺激に対して生じる連合学習は減少する。この刺激競合現象に関してこれまで広く受け入れられてきたのは、刺激競合現象を、結果事象の持つ資源が複数の手がかり刺激間で分割された結果であるとする説明(限定資源仮説)である。本研究の目的は、刺激競合現象のメカニズムに関する実験的検証を、限定資源仮説に注目し、ラット、ヒト、さらにはより低次な動物など複数の被験体種を対象として行うことである。具体的には、限定資源仮説から導かれる、競合する個々の手がかり刺激に対する連合学習は変動するが、全手がかり刺激に対する連合学習の総量(総和)は一定となる、という予測を、ラットやより低次な動物を対象とした条件づけ場面、ヒトを対象とした因果推論場面などのさまざまな連合学習場面において、実験的に検証する。本年度は、アカハライモリを被験体に用いた条件づけ事態において、基本的な刺激競合現象を確認することを目的とし、一連の実験を行った。しかしながら、イモリにおける刺激競合現象を検証するのに適切と思われる実験パラダイムの確立には至らなかった。使用する刺激、行動指標などのさらなる検討が必要と思われる。また、並行し、ヒトを対象とした随伴性判断事態における実験の準備を行った。来年度以降に実験を行う予定である。さらに、前年度までに得られたデータを雑誌論文あるいは学会発表等の形で公表した。
バイオマーカーと形態診断モダリティーによる肺高血圧症の診断と治療効果判定法の確立

肺高血圧症に対する種々の治療が進歩し、かつては有効な治療法がなく病態の改善も見込めなかった患者についても、早期に発見し、適切な治療を行うことによってその予後を大幅に改善することが可能となってきた。しかし、その早期の診断方法や治療効果を経時的に判定する方法は、患者数の多い左心系の疾患に比べるとまだまだ遅れている。肺高血圧症とそれに伴う右心不全の診断および治療効果の判定に有用な方法を血中のバイオマーカーを中心に心エコーなどの画像診断と組み合わせて検討する計画である。対象は肺高血圧症を疑って当学附属病院で検査を受けた患者で、日本循環器学会の「肺高血圧症診療ガイドライン2017年改訂版」に従って臨床的に診断・分類する。そのうち第1群の肺動脈性肺高血圧症(PAH)と第4群である慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)を主たる対象とする。第2群の左心系疾患に伴うものと第3群の呼吸器疾患に伴うもの、および第5群に分類される肺高血圧症は、肺動脈以外の要因が大きく、治療もそれぞれ原疾患に対するものが主となるため、治療経過を追跡する対象とはしないが、診断時の血中バイオマーカーの測定と心エコーによる右心負荷の評価は実施する。また、対照は当学附属病院循環器内科で治療を受けた肺高血圧症以外の患者とする。対象患者からはインフォームドコンセントのもとに血液サンプルの提供を受け、肺高血圧診断に役立つと考えられるバイオマーカー(後述)の測定を行い、BNP値など既存のマーカーと比較検討する。また、それらとは別に、糖尿病患者における肺高血圧症合併リスクについても検討を行った。肺高血圧症の診断と治療効果判定に使用可能な血中バイオマーカーとして、肝硬変のマーカーとして知られる「7S domain of collagen type IV」が有用であるという仮説のもとに検証を進める。また、IV群である慢性肺血栓塞栓性肺高血圧症患者への治療として、近年盛んに行われているバルーン肺動脈形成術においては、周術期の肺出血合併症が問題となっているが、画像診断としてのCTあるいはMRIにより、その合併症リスクが層別化ができないかどうかを検討する予定である。肺高血圧症は希少疾患(福島県内の指定難病の認定者数は、I群肺高血圧症が58人、IV群肺高血圧症が54人と少ない)であるため、引き続き関連病院とも連携して、対象患者のリクルートに努力する。ただし、肺高血圧症自体が希少疾患であるため、症例数の確保に苦労しているが、他施設からの紹介増加を促している。差額は8767円であり、区切りよく0円にならなかった。次年度の使用で調整予定。
多糸染色体の人工的作製のための基礎的研究

ショウジョウバエの唾腺染色体に代表される多糸染色体は、遺伝子のマッピングや転写節機構の研究などの分子遺伝学的研究に広く利用されているにもかかわらず、その形成機構の解明をめざす研究は少ない。また大きな利点にもかかわらず、多糸染色体を利用できる生物種は少ないので、人工的に任意の生物種の染色体を用いて多糸染色体が作製できれば、遺伝子座の精密な決定など、応用範囲が飛躍的に広がることが期待される。本研究は多糸染色体の人工的作製に必要な基礎的知見を得ることを目的として行った。前年度の研究結果によりカフェインのDNA再複製促進作用が認められたので、MCM蛋白質の局在に対するカフェインの効果について検討した。アフリカツメガエル未受精卵をカルシウムイオノフォアで処理することにより得られる賦活卵をEGTAを含む緩衝液中で破砕し、低速遠心を行い、上清をS期卵抽出液とした。ツメガエル精子核を、ロ-ダミンで標識したdUTPとともにS期卵抽出液に加えてインキュベートした。経時的に核を含む卵抽出液の少量を取り出し、抗MCM2抗体およびFITC標識二次元抗体を用いた蛍光抗体法によりMCM2の局在を調べた。インキュベート開始から15分以内にDNA複製が開始したが、このときMCM2は核に局在が認められた。その後、核局在を示す蛍光の強さは次第に減弱し30分後には認められなくなった。10mMカフェイン存在下で同様の実験を行ったが、核に局在するMCM2の減少の時間経過は非存在下の場合と同様であった。これらの結果から、カフェインのDNA再複製促進作用は核に局在するMCM蛋白質の減少の抑制によるものではないことが示唆された。アフリカツメガエル未受精卵をカルシウムイオノフォアで処理することにより得られる賦活卵を、EGTAを含む緩衝液中で破砕し、低速遠心を行い、上清をS期卵抽出液とした。ツメガエル精子核を、α-[^<32>P]-CTPとともにS期卵抽出液に加えてインキュベートした。経時的に核を含む卵抽出液の少量を取り出し、トリクロル酢酸により生成する沈澱中の放射活性を測定し、DNA複製の示標とした。インキュベート開始から15分以内にDNA複製が開始し、α-[^<32>P]-CTPのDNAへの取り込みは時間とともに増加し45分以後はほぼ一定の値となった。培養細胞にゲノムの倍数化を誘導する作用をもつプロテインキナーゼ阻害薬K-252aの存在下でもα-[^<32>P]-CTPのDNAへの取り込みの増加は認められなかった。これに対して10mMカフェイン存在下では、20-80%の取り込みの増加が認められた。カフェインのDNA再複製促進作用について更に検討する必要がある。
マイクロバイオーム解析に基づく高齢者肺炎の病態解明と革新的予防法への展開

高齢者肺炎の病態を解明する目的で、上気道マイクロバイオームの探索を実施した。肺炎発症には、原因菌の上気道への定着が重要であると考えられている。特に高齢者での上気道への定着はしばしば観察され、上気道と下気道には密接な関係性がある。肺炎のように下気道感染症を発症時に上気道マイクロバイオームが影響を受けるのかは知られていない。そこで、マウスを用いて下気道感染症発症中の上気道マイクロバイオームの特徴を解析した。C57Bl/6Jマウスへ、Klebsiellapneumoniae KEN-11株経気管的に接種することで、肺炎モデルを作成した。感染24時間後の口腔ぬぐい液、鼻腔洗浄液、気管支肺胞洗浄液を採取した。それぞれの細菌叢プロファイルを見るために、各サンプルからの抽出核酸に対して、メタシークエンスを行った。細菌叢解析は多様性の変化をShannon index(α多様性)を用いて評価し、非感染マウスと感染マウスの間の細菌叢(β多様性)を比較した。下気道では、多様性に明らか有意差は認めなかったものの、感染マウスでは細菌叢の変容が起きていた。口腔内細菌叢では、Weighted UniFracに差はないものの、感染マウスで有意な多様性の低下が観察された。感染群では占拠率が科レベルで増加している細菌が感染群で多く、特に、感染群でCarnobacteriaceae科グループ細菌の上昇が観察された。本研究では、下気道感染症発症中に鼻腔よりもむしろ口腔内の細菌叢の特徴に変化が観察されることが明らかとなった。口腔内環境は誤嚥性肺炎の原因としての認識が強いが、下気道感染症の存在自体で口腔内細菌叢が変容することが示され、下気道から上気道への何らかのフィードバック機能があるものと推測された。1.長崎市内の老健施設において、臨床研究を進めるべく、患者の概要などを調査した。概ね、対象施設を決定することができた2.次世代シークエンサーを別予算で購入し、そのセットアップを行った。3.マイクロバイオーム解析に関する基礎研究を進めている。採取された検体(舌背ぬぐい液および糞便)から、DNAを抽出し、16S遺伝子の可変領域を共通PCRプライマーで一括増幅する方法を確立した。現時点で、問題はなく、順調に進んでいる。本研究にもっとも重要な次世代シークエンサーを予定通り、導入できた。高齢者肺炎には様々な原因菌が関与すること、誤嚥する症例が多く、口腔内環境が重要である、全身の免疫低下状態も大きな要因となる。ことから、より包括的で新しいアプローチが必要である。高齢患者は多くの基礎疾患を有し、内服薬も多岐にわたるため、データ解析等が複雑になることが予想される。そのため、高齢者肺炎の本研究に進む前に基礎疾患を有さない群を対象にした予備検討を行うことにした。抗菌薬投与は腸内細菌叢に強い影響を与えることが予想されるため、その解析も実施した。この検討では、長崎大学病院整形外科に入院し、手術療法を受ける患者20名を対象にした。文書により同意を取得した。(長崎大学倫理委員会承認済み)この結果から、界、門、綱、目、科、属、種とレベルにより、類似している点と異なる点があることが明らかになった。これは腸内細菌叢解析を進めるうえで情報であり、高齢者肺炎研究の基礎データとなるものである。これらのデータを平成29年度に実施する臨床検体(舌ぬぐい液、糞便)の解析に活用する。次世代シークエンサーのセットアップやデータ解析手法の確立が完了した。また、腸内細菌叢に関するknow-howが十分蓄積されてきている。高齢者肺炎の発症には宿主免疫との関連が重要である。臨床研究を円滑に進めるためには、マイクロバイオームを基礎研究で明らかにすることが必要と判断した。細菌叢と宿主防御との関連について、実験動物を用いて多面的に解析を進めた。マウスに抗菌薬を内服させたのち、盲腸内容物の細菌叢のメタゲノム解析を行ったところ、抗菌薬非投与群と比較して、有意な細菌叢構成の変化(dysbiosis)が観察された。また、腸管に発現するReg3タンパクなどの抗菌ペプチド発現量も抗菌薬投与群で変化が見られた。一方、遠隔臓器である肺の抗菌ペプチド発現量にも変化が見られ、肺局所の細菌叢にもdysbiosisが観察された。抗菌ペプチドの発現ならびにdysbiosisの誘導は、外界からの侵入微生物に対する抵抗性に影響する可能性があり、呼吸器感染症の発症の関連が示唆された。これらのデータは、高齢者肺炎患者の臨床検体を用いたマイクロバイオーム解析に重要な示唆を与えるものである。平成30年度に実施する臨床研究のプロトコール確立に役立てたい。本研究を遂行するために必要な技術の習得や基礎データの蓄積は、予定通り進んでいる。臨床研究を着手するためには、どのような患者情報を取得するかが重要であり、プロトコールの確定に時間を要した。

そこで、マウスを用いて下気道感染症発症中の上気道マイクロバイオームの特徴を解析した。C57Bl/6Jマウスへ、Klebsiellapneumoniae KEN-11株経気管的に接種することで、肺炎モデルを作成した。感染24時間後の口腔ぬぐい液、鼻腔洗浄液、気管支肺胞洗浄液を採取した。それぞれの細菌叢プロファイルを見るために、各サンプルからの抽出核酸に対して、メタシークエンスを行った。細菌叢解析は多様性の変化をShannon index(α多様性)を用いて評価し、非感染マウスと感染マウスの間の細菌叢(β多様性)を比較した。下気道では、多様性に明らか有意差は認めなかったものの、感染マウスでは細菌叢の変容が起きていた。口腔内細菌叢では、Weighted UniFracに差はないものの、感染マウスで有意な多様性の低下が観察された。感染群では占拠率が科レベルで増加している細菌が感染群で多く、特に、感染群でCarnobacteriaceae科グループ細菌の上昇が観察された。本研究では、下気道感染症発症中に鼻腔よりもむしろ口腔内の細菌叢の特徴に変化が観察されることが明らかとなった。口腔内環境は誤嚥性肺炎の原因としての認識が強いが、下気道感染症の存在自体で口腔内細菌叢が変容することが示され、下気道から上気道への何らかのフィードバック機能があるものと推測された。予定通り、推進する。長崎市内の老健施設(道ノ尾病院、新里病院、昭和会病院など)において、文書同意を取得後70歳以上の入所者400名からの舌背ぬぐい液および糞便を採取する。尚、担癌患者、自己免疫疾患患者、ステロイドあるいは免疫抑制剤治療中の患者はマイクロバイオームに影響を与える可能性があるため、除外する。研究計画は下記のように進める。1.高齢者施設入所者400名からの舌背ぬぐい液および糞便の採取、2.検体からのDNA抽出およびメタ16S遺伝子解析による菌種・菌種組成解析、3.2年間の観察を行い、肺炎発症群では検体の採取と臨床評価を実施する。4.肺炎発症群におけるマイクロバイオームの特徴を明らかにする。肺炎発症群においては、以下の臨床データをカルテベースで登録し、詳細な解析を実施する。同意取得日、性別、体重、生年月日(年齢)、入院・外来区分、基礎疾患・合併症(有無、疾患名・症状名、感染症との関係)、アレルギー歴、既往歴、血管内治療の有無、誤嚥の有無、使用抗菌薬(薬剤名、投与期間、)、肺炎の重症度(A-DROP、PORTスコア)、細菌性肺炎と非定型肺炎の鑑別、PS、経管栄養の有無など長崎市内の老健施設において、文書同意を取得後、70歳以上の入所者200名からの舌背ぬぐい液および糞便を採取する。1.高齢者施設入所者200名からの舌背ぬぐい液および糞便の採取、2.検体からのDNA抽出および16S遺伝子解析による菌種・菌種組成解析、3.肺炎発症群におけるマイクロバイオームの特徴やdysbiosisに関して明らかにする。
突然死における血小板の関与に関する研究

1.ヒト心筋アクトミオシンの各種病態における変化中年対象者の心筋アクトミオシンを調べ,虚血性心疾患対象者のミオシン・トロポニンに蛋白分解を高頻度に認め,ATPase活性も変化していたが,心肥大による変化は認めなかった.単冠動脈症の一例の虚血部及び非虚血部のアクトミオシンに蛋白分解や顕著なATPase活性の変化を認めなかった.2.心筋カルモジュリンの組織化学的研究冠動脈結紮犬心筋や突然死症例の心筋におけるカルモジュリン局在を酵素抗体法により調べた.収縮帯,水腫様変性あるいは明白な病変を欠く部分のカルモジュリンの染色性が亢進していた.これは細胞内カルシウム濃度の上昇に対応していると思われ,早期心筋虚血の診断法としても従来よりの方法に優ると思われる.3.各種外因死における心筋病変若年者外因死症例の心筋を調べ,突然死症例の外因・内因の関与について検討した.墜転落症例,開胸蘇生例,脳死遷延例等の心筋に,内因性病変と鑑別不能な組織学的変化及び通常の組織学的検査法で検出不可能なカルモジュリンの変化を見い出した.4.急性アルコ-ル摂取の血小板凝集に対する影響飲酒中の急性心臓死をよく経験するので,健常者に飲酒させ,経時的に採血し血小板を分離して,その凝集能を調べた.個体により,あるいは凝集惹起物質により,凝集亢進や阻害がみられ,一定しなかった.尚症例を増やし,条件を調べて検討したい.1.ヒト心筋アクトミオシンの各種病態における変化中年対象者の心筋アクトミオシンを調べ,虚血性心疾患対象者のミオシン・トロポニンに蛋白分解を高頻度に認め,ATPase活性も変化していたが,心肥大による変化は認めなかった.単冠動脈症の一例の虚血部及び非虚血部のアクトミオシンに蛋白分解や顕著なATPase活性の変化を認めなかった.2.心筋カルモジュリンの組織化学的研究冠動脈結紮犬心筋や突然死症例の心筋におけるカルモジュリン局在を酵素抗体法により調べた.収縮帯,水腫様変性あるいは明白な病変を欠く部分のカルモジュリンの染色性が亢進していた.これは細胞内カルシウム濃度の上昇に対応していると思われ,早期心筋虚血の診断法としても従来よりの方法に優ると思われる.3.各種外因死における心筋病変若年者外因死症例の心筋を調べ,突然死症例の外因・内因の関与について検討した.墜転落症例,開胸蘇生例,脳死遷延例等の心筋に,内因性病変と鑑別不能な組織学的変化及び通常の組織学的検査法で検出不可能なカルモジュリンの変化を見い出した.4.急性アルコ-ル摂取の血小板凝集に対する影響飲酒中の急性心臓死をよく経験するので,健常者に飲酒させ,経時的に採血し血小板を分離して,その凝集能を調べた.個体により,あるいは凝集惹起物質により,凝集亢進や阻害がみられ,一定しなかった.尚症例を増やし,条件を調べて検討したい.1.ヒト心筋アクトミオシンの各種病態における変化に関する研究以前からの研究で心筋アクトミオシンが加齢に伴い変化する事がわかったので、対象を30ー40歳台にしぼり、各種病態における心筋アクトミオシンの変化を調べた。虚血性心疾患を死因とする対象者の心筋のミオシンやトロポニンにタンパク分解を高頻度に認め、ATPase活性も変化していることを見い出した。心肥大は心筋アクトミオシンの性質に特別変化をもたらしていなかった。2.血小板活性化におけるカルパインの役割に関する研究種々のアゴニストによる刺激により、血小板の可溶性分画のカルシウム依存性プロテア-ゼ、カルパインが小胞体に転移して、そのCa^<2+>ーATPase活性を一過性に上昇させ、活性化に伴って上昇した細胞質Ca^<2+>濃度を減少させ、活性化の諸反応を終息させることを見い出した。カルパインは虚血等による心筋障害にも関与していると考えられるので、抗カルパイン抗体を作成して酵素抗体法により、冠動脈結紮イヌ心筋や突然死症例の心筋におけるカルパインの局在の変化等を検索しつつある。3.心筋カルモジュリンの組織化学的研究冠動脈結紮イヌ心筋や突然死症例の心筋におけるカルモジュリンの局在の変化を調べ、収縮帯や水腫様変性などの病変(Ca^<2+>濃度が上昇していると考えられている)に一致して、カルモジュリンの染色性が亢進していた。これはCa^<2+>濃度の上昇に対応して、カルモジュリンが膜分画に転移している事を反映しているものと考えられる。従来より早期心筋虚血の診断法として頻用されている、ミオグロビン染色が壊死を必要条件とするのに比べて、カルモジュリン染色は壊死の前段階の細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を検出しているものと考えられ、心筋障害におけるCa^<2+>やカルモジュリンの関与を調べる方法としても有用であると思われる。1.心筋カルモジュリンの組織化学的研究冠動脈結紮犬心筋や突然死症例の心筋におけるカルモジュリン局在を酵素抗体法により調べた.収縮帯,水腫様変性あるいは明白な病変を欠く部分のカルモジュリンの染色性が亢進していた.

これは細胞内カルシウム濃度の上昇に対応していると思われ,早期心筋虚血の診断法としても従来よりの方法に優ると思われる.2.各種外因死における心筋病変若年者外因死症例の心筋を調べ,突然死症例の外因・内因の関与について検討した.堕転落症例,開胸蘇生例,脳死遷延例等の心筋に,内因性病変と鑑別不能な組織学的変化及び通常の組織学的検査法で検出不可能なカルモジュリンの変化を見い出した.3.急性アルコ-ル摂取の血小板凝集に対する影響飲酒中の急性心臓死をよく経験するので,健常者に飲酒させ,経時的に採血し血小板を分離して,その凝集能を調べた.個体により,あるいは凝集惹起物質により,凝集亢進や阻害がみられ,一定しなかった.尚症例を増やし,条件を調べて検討したい.
糖鎖受容体のturn-on型蛍光プローブの開発手法の確立

本研究では、細胞の糖鎖受容体のイメージングや阻害剤探索の基盤技術となる、turn-on型蛍光プローブの開発手法の確立を目指している。in silicoと実際の化合物ライブラリーの合成を連動させた探索法による、種々の糖鎖受容体や他の受容体タンパク質にも適用可能な蛍光プローブ開発を進めている。申請者はこれまでに、標的レクチンに結合して蛍光応答を示す蛍光プローブ開発に成功している。一方で、これまでの標的レクチン存在下での蛍光応答比は6倍程度にとどまっている。そこで蛍光応答比の向上を目指し、種々のGFP色素誘導体の合成を行って蛍光特性を調べた。また、複数の標的受容体を同時に標的にできるよう、複数色の蛍光波長を有する誘導体の開発を目指したGFP色素誘導体の合成を行った。これらの結果、GFP色素に導入するアミノ基として、これまでのジメチルアミンをアゼチジンやピロリジンに置換すると、グリセロール中での蛍光強度が上昇することを見出した。また、ベンジリデン部位のベンゼン環をジュロリジンに置換し、アミノ基とベンゼン環の間のN-C結合の回転を完全に固定した場合も蛍光強度が上昇することが分かった。また、これらを蛍光プローブに導入すると、レクチン添加時の蛍光応答比が向上することが分かった。また、標的受容体に結合して蛍光応答を示すプローブを探索する方法として、これまでプローブを固相合成法によって合成した後、固相担体から切り出し溶液中で蛍光強度を測定していたが、ビーズ上にプローブを残したまま蛍光顕微鏡を用いて評価する方法を検討する。そこで、ビーズ上の蛍光プローブを選別する際の最適測定条件を調べるため、蛍光プローブの濃度を種々変えたビーズを合成し、標的レクチンとの蛍光応答を評価する検討を行っている。初年度では、ビーズを用いた蛍光プローブの新規探索法に関する検討を開始したほか、蛍光プローブの蛍光応答比の向上並びに複数色化を目指して蛍光色素の合成と蛍光特性評価を行った。蛍光色素の合成に関しては、新たに13種類の誘導体の合成に成功している。これらの中でこれまで用いたGFP色素誘導体と比較して、4化合物についてはこれまでよりも優れた蛍光応答を示した。つづいて得られた蛍光色素をプローブに導入して標的レクチン存在下での蛍光応答比を調べたところ、蛍光応答比はこれまでと比較して最大で約2倍向上した。これらの検討から、蛍光応答比を向上させる置換基の種類について指針を得ることができた。また、芳香族アミンを導入した誘導体において、蛍光極大波長が長波長化した複数の誘導体の開発に成功した。これらを踏まえ、次年度ではビーズを用いたプローブ探索法の開発を進め、蛍光応答比の優れたプローブ探索を順調に進められると考えられる。初年度で検討を進めているプローブ探索法を確立して、プローブライブラリーを合成し、実際の標的受容体に対するプローブ探索するとともに、得られたプローブの構造を元にin silicoによる構造探索を合わせて進める。一方、初年度で得られた蛍光色素の構造ー蛍光特性相関研究から、ベンジリデンイミダゾリン骨格のベンゼン環部位に導入するアミノ基によって粘度環境に対する蛍光応答比が変化すること、さらにイミダゾリン環に置換基を導入することで励起状態におけるねじれが抑制され蛍光応答が向上していることを示唆する知見を得ている。次年度では、必要に応じてこれらの知見に基づきさらなる蛍光応答比の優れた蛍光色素の開発を行う。さらに、プローブ探索により得られたプローブを用いて、蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行うなど、実践的な応用研究を進める予定である。

これらの中でこれまで用いたGFP色素誘導体と比較して、4化合物についてはこれまでよりも優れた蛍光応答を示した。つづいて得られた蛍光色素をプローブに導入して標的レクチン存在下での蛍光応答比を調べたところ、蛍光応答比はこれまでと比較して最大で約2倍向上した。これらの検討から、蛍光応答比を向上させる置換基の種類について指針を得ることができた。また、芳香族アミンを導入した誘導体において、蛍光極大波長が長波長化した複数の誘導体の開発に成功した。これらを踏まえ、次年度ではビーズを用いたプローブ探索法の開発を進め、蛍光応答比の優れたプローブ探索を順調に進められると考えられる。初年度で検討を進めているプローブ探索法を確立して、プローブライブラリーを合成し、実際の標的受容体に対するプローブ探索するとともに、得られたプローブの構造を元にin silicoによる構造探索を合わせて進める。一方、初年度で得られた蛍光色素の構造ー蛍光特性相関研究から、ベンジリデンイミダゾリン骨格のベンゼン環部位に導入するアミノ基によって粘度環境に対する蛍光応答比が変化すること、さらにイミダゾリン環に置換基を導入することで励起状態におけるねじれが抑制され蛍光応答が向上していることを示唆する知見を得ている。次年度では、必要に応じてこれらの知見に基づきさらなる蛍光応答比の優れた蛍光色素の開発を行う。さらに、プローブ探索により得られたプローブを用いて、蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行うなど、実践的な応用研究を進める予定である。初年度では、蛍光プローブのコアとなる色素の合成を中心に取り組んだが、想定よりも効率よく複数の化合物(約13化合物)の合成に成功したため、次年度使用額が生じた。次年度では、標的受容体や細胞に対して適用可能なビース上でのプローブ合成を行うために必要な固相合成にかかる経費として使用する。さらに、プローブ探索の結果、さらなる色素合成が生じた際に必要な合成のための経費として使用する予定である。
細胞内ステロール代謝平衡とHDL新生の分子機構

1)ABCAI蛋白は、HDL新生反応に伴う細胞スフィンゴミエリンの搬出の補充により生ずるジアシルグリセロールによって活性化されたPKCαによって燐酸化を受け、これがカルパインによる分解を阻害し安定化される。この反応はHDLを新生するヘリックス型アポリポ蛋白質について普遍的に見られ、その界面活性を模したモデルペプチドによっても再現された。2)ABCAIと相同性の高いヒトABCA7の機能を検討した。HEK293細胞に導入され発現したABCA7はABCAIと同様apoA-Iによるコレステロール含有HDLの新生反応を媒介し、この反応による安定化も証明された。3)HDLによる細胞コレステロールの搬出反応は非特異的なコレステロールの流出と、apoA-IなどによるABCAIを介したHDL新生反応に分解される。後者の反応がどのように起こるのかを、脂質より乖離したapoA-Iに特異的に反応するモノクローン抗体を用いて検討した。その結果、ABCAIに依存する部分はこの抗体により効率よく阻害され、またABCAIによる細胞への結合は脂質では起こらず、HDLの蛋白質成分のみに起こる。これらの結果より、apoA-IはHDLより一旦乖離してABCAIを持つ細胞の表面と反応することが分かった。1)ABCA1蛋白レベルはapoA-I、apoA-IIまたはチオールプロテアーゼ分解阻害剤の存在下でmRNAの変化なしに著明に上昇するが、プロテオソーム阻害剤やHDLでは認められなかったこれらの効果はABCA1分解抑制によるものであることが分り、ABCA1はチオールプロテアーゼによる分解で発現レベルの調節が行われ、ヘリックス型アポリポタンパク質によって阻害されることが分かった。この酵素はcalpainと考えられ、その阻害剤はHDL新生を増加させることが示されて、薬剤開発の新しい可能性を開いた。2)ABCA1とアポリポタンパク質により産生するHDLの組成を六種類の繊維芽細胞で検討して、HDL粒子新生とそれへのコレステロール組み込みの相対的に独立した制御を明らかにした。細胞燐脂質とHDL粒子の新生はABCA1の発現に直接依存し、これがABCA1の基本的役割であることが示された。新生したHDLのコレステロール含有量はABCA1の発現、細胞コレステロールレベル、caveolin-1発現などのいずれにも依存せず、独立した制御を受けていることが分かった。物理化学的拡散による細胞コレステロールの流出は細胞コレステロールレベルに直接依存することから、HDLへのコレステロール積み込みが先に生じたHDLへ2次的に拡散によって起こる機序について否定的結果が得られた。3)アストログリアにいて、アポA-I刺激により、生合成されるコレステロールと燐脂質及びcaveolinが細胞質へ移転することが分かった。また、アポリポタンパク質ABCA1によるHDL新生反応は細胞膜からスフィンゴミエリンをも搬出し、これが、レシチンからフォスフォリパーゼCにより生成した燐酸コリンがセラミドに転移されて補充される。その結果、DGが産生し、これがアポリポタンパク質によるABCA1を介した細胞内情報伝達系の起動の機序である可能性が示唆された。1)ABCA1蛋白は、HDL新生反応に伴う細胞スフィンゴミエリンの搬出の補充により生ずるジアシルグリセロールによって活性化されたPKCαによって燐酸化を受け、これがカルパインによる分解を阻害し安定化される。2)ABCA1と相同性の高いヒトABCA7の機能を検討した。HEK293細胞に導入され発現したABCA7はABCA1と同様apoA-lによるコレステロール含有HDLの新生反応を媒介し、この反応による安定化も証明された。3)HDLによる細胞コレステロールの搬出反応は非特異的なコレステロールの流出と、apoA-IなどによるABCA1を介したHDL新生反応に分解される。その結果、ABCA1に依存する部分はこの抗体により効率よく阻害され、またABCA1による細胞への結合は脂質では起こらず、HDLの蛋白質成分のみに起こる。