hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高校家庭科において男女が共に学ぶための教育内容と指導方法の開発

これらの領域について,指導の必要性が大きいと教員が考えている教育内容をみると,「家族と家庭生活」の領域では「高齢者の心身の特徴と家庭生活」,「社会福祉とボランティア」,「家族の役割と人間関係」,「家族の機能」であり,「家庭経済と消費」の領域では「クレジットカード」,「地球にやさしい生活」,「消費者の権利と責任」,また「住生活の設計と住居の管理」の領域では「高齢者に配慮した住宅計画」,「老人のための地域環境と地域施設」である。3領域に共通して重要視されているのは高齢者問題,消費者問題,資源環境問題など現代的な課題である。第2に指導方法については2つの試みを行なった。ひとつは,指導の必要性が大きいにもかかわらず生徒の興味関心が低いため,指導が困難と思われる「家族と家庭生活」領域における「家族の機能」について,生徒が自分の家庭生活を客観的に捉えて自らの意識変容をねらう授業を考察し、授業実践を通してその効果について検討を行なった。いまひとつは、授業時間数が少なく,また内容の精選が遅れているために指導が困難だと考えられている住居領域において,「高齢者の住生活」に関するビデオ教材を制作し,授業実践を通してその効果を調査した。その結果,それまで高齢者に縁がなく無関心に生活してきた生徒に対して,とくに,短時間で効果的なインパクトを与えることができるということが明らかになった。
多元環の近似に関する問題

C^nのコンパクト部分集合KからC^nへの写像f=(f_1,・・・,f_m)によるグラフG={(z,f(z)):z∈K}の多項式凸性については、n=m=1のときの結果が多く見られるので、これらの拡張として、主にn=m>1のときにKを超球や多重円板の場合に取り、研究計画に従い、いくつかの例を構成することができた。これらを総合し、本質的な部分が解明されつつあるので、定理の形としまとめられるよう、現在鋭意検討中である。また、m=1,n>1,Ref,1mfが多重調和の時は、グラフGが多項式凸集合であるとのAlexanderの結果の関数環的な別証明を得たので、さらにこの拡張も考慮中である。超球Bで正則、Bで連続な関数族A(B)の2つの関数f,gによる零集合がBの境界に含まれるならば、A(B)の峯集合であるとの、Stoutの予想は、fに少し条件を付ければ、正しいことを示せた。以上の経過については、関数環研究集会で話した。得られた結果は次のとおりである。作用素環分野では、単純C^*-環の最小指数の乗法性の簡易な証明を与えた。これは、フォンノイマン因子環の最小指数の乗法性の証明としても有効である。後者の乗法性は、煩雑な手続きのもとで、その成立は確認されていたが、C^*-環の指数理論を適用することで、それが初等的に証明できることを示した。K-理論分野では、フレイムド多様体としての射影シムプレクティック群のコボルディズム類の非自明性を調べるため、そのフレイミングを考察する観点からその位相的実K群の環構造を決定した。
公的病院の業績評価に関する理論的・実証的研究

平成30年度の研究内容は,以下の2つである。(1)入院基本管理料算定病院別の財務指標の検討と考察。(2)政策医療を担う公的病院の業績評価に関する財務指標の整理と検討。医療機関,とりわけ公的病院の評価指標の検討に向けて,理論的な検討を実施し,業績評価の実証分析に向けた準備を行った結果,病院機能,規模別に財務構造を把握するためのデータベースを完成させた。具体的に述べると,22年度から28年度の国立病院機構の財務諸表をマトリックスとして入力し,年度,病院機能,病床規模別に検討することが可能となった。そのため(1)の研究内容である,一般基本管理料算定病院ごとに,財務指標を比較検討し考察を行った(投稿論文)。また,(2)の政策医療(重症心身障害病床,精神疾患病床)を主とする病院機能ごとの抽出を行い,財務構造の特徴を抽出するための比較検討を進めている。具体的には,売上高経常利益率の代理指標でもある経常収支比率を目標成果指標として,その改善に因果関係を有すると思われるKPI指標を取り上げ,それらの関係を実証的に解明する.重要業績評価指標の選択にあたっては,BSCの4つの視点,「財務的視点」「顧客の視点」「内部ビジネスプロセスの視点」「学習と成長の視点」に着目し,9つのKPIを選択し,従属変数を経常収支比率,説明変数を先のKPIとして重回帰分析を行う方法をとる。この方法により,公的病院の特徴を概観する。また,黒字・赤字別,病院機能,規模別に分析を進める。最終年度は現実妥当性を有する理論構築が必要とされるため,公表データが揃っている国立病院機構グループに対象を絞り検証を試みる。平成30年度の研究内容は,以下の点に集約される。医療機関の業績評価に関する財務指標の整理と検討であり,医療機関,とりわけ国立病院の評価指標の検討に向けて,理論的な検討を積み重ねながら,業績評価の実証分析に向けたデータの整備を行った。国立病院機構の公表データをデータベース化できたことにより,病院機能別,病院規模別に調査研究を進めている。得られた結果に対して,理論的な検討に際しては,医療分野の実務家,医療マネジメント研究者,さらには経営・会計分野の研究者の知見も得ながら,医療機関の評価をどのような視点からとらえることが適当であるかという点について,理論的な検討を行うとともに,具体の財務指標の内容について論点整理を行った。その検討時間に最も時間を費やしたのが,分析手法の検討である。従来の統計的分析を行うだけでは,財務構造の特性を導く公的病院の機能を説明するための仮説検証が不足することが予測されたため,KPIとBSCによる関連を用いることによって業績評価を可視化する結論にたどり着くまでに時間を要した。このBSCに対応するデータを算出するためには公表されている財務諸表データだけでは算定できないため,141病院のBSCに対応する職員配置人数,入退院数,紹介数などの機能データを調べ入力する時間を要する。そのため,若干遅れ気味ではあるが,所期の目的を達成する上で不可欠な作業であり,特段の支障にはならないと考えている。(1)今後は,上記データを用いて,重要な評価指標として取り上げられている分析指標に着目しながら,「国立病院機構」に焦点を絞り,財務データの視点から,規模,機能別に,単変量に基づく黒字・赤字病院間の評価判別指標を明らかにしていきたいと考えている。(2)分類別の単変量から,さらには多変量分析,KPI指標との関係から黒字・赤字病院の財務構造について検討し,黒字・赤字病院間にどのような財務的特性が認められるかを明らかにしていきたいと考えている。平成29年度の研究内容は、以下の3つである。(1)過去における病院の業績評価に係る文献の渉猟とその考察。(2)医療機関の業績評価に関する財務指標の整理と検討。医療機関、とりわけ公的病院の評価指標の検討に向けて、理論的な検討を実施し、業績評価の実証分析に向けた準備を行った。具体的に述べると、理論的な検討に際しては、医療分野の実務家、医療マネジメント研究者さらには経営・会計分野の研究者の知見も得ながら、医療機関の評価をどのようにとらえることが妥当であるかに関して概念的な検討を行うとともに、具体の財務指標の検討に向けた論点整理を実施した。また国立病院機構の公表データはpdfファイルで提供されており、これらの数値データを電子データに落としこむ作業を行った。これには膨大な手間がかかり、141病院の280程度に及ぶ会計データ等の7年分(平成22年度平成28年度)を手作業で入力した。(3)医療機関の業績内容を把握するために、評価のための統計的手法の検討が必要である。企業の業績評価手法については、多くの研究実績が積み重ねられていることから、研究代表者を中心に、医療機関にも同様な評価手法が適用できるか、その理論モデルの検討を、過去の研究文献や企業の評価モデル等についても検討し、サーベイ調査を行った。他方で、理論的な評価モデルの開発・検討には、実際のデータを用いた試行錯誤を要することから、パイロット的に国立病院機構グループに対して検討を重ねながら、現実妥当性を有する理論モデルの検討が必要とされる。そのため、若干遅れ気味ではあるものの、所期の目的を達成する上では特段の支障にはなっていないと考える。この点は次年度の平成30年度においても継続して検討したいと考えているテーマである。平成29年度の研究内容は、以下の2点に集約される。

(1)医療機関の業績評価に関する財務指標の整理と検討であり、医療機関、とりわけ公的病院の評価指標の検討に向けて、理論的な検討を積み重ねながら、業績評価の実証分析に向けた準備を行った。具体には、理論的な検討に際しては、医療分野の実務家、医療マネジメント研究者さらには経営・会計分野の研究者の知見も得ながら、医療機関の評価をどのような視点からとらえることが適当であるかという点について、理論的な検討を行うとともに、具体の財務指標の内容について論点整理を行っているところである。また国立病院機構の公表データはpdfファイルで提供されており、これら数値を電子データに落としこむ作業を行っているが、これには膨大な手間がかかり、141病院の280個に及ぶ財務データの7年分を手作業で入力するのに多くの時間を要した。(2)医療機関の業績把握と評価のための統計的手法の検討が必要であり、従来から企業の業績評価手法については、多くの研究実績が積み重ねられていることから、それらの手法が医療機関にも同様に適用できるか、その理論モデルの検討を、実際の企業の評価モデルや過去の研究文献のサーベイも行いながら進めている。他方、この理論モデルの検討には、データを用いた試行錯誤を要するために、パイロット的に特定の病院集団に対して当てはめてみて、その試行錯誤をくり返しながら、現実妥当性を有する理論モデルを構築する必要がある。そのため、若干遅れ気味ではあるが、所期の目的を達成する上で不可欠な作業であり、特段の支障にはならないと考えている。平成30年度の研究内容は,以下の2つである。(1)入院基本管理料算定病院別の財務指標の検討と考察。(2)政策医療を担う公的病院の業績評価に関する財務指標の整理と検討。医療機関,とりわけ公的病院の評価指標の検討に向けて,理論的な検討を実施し,業績評価の実証分析に向けた準備を行った結果,病院機能,規模別に財務構造を把握するためのデータベースを完成させた。具体的に述べると,22年度から28年度の国立病院機構の財務諸表をマトリックスとして入力し,年度,病院機能,病床規模別に検討することが可能となった。そのため(1)の研究内容である,一般基本管理料算定病院ごとに,財務指標を比較検討し考察を行った(投稿論文)。また,(2)の政策医療(重症心身障害病床,精神疾患病床)を主とする病院機能ごとの抽出を行い,財務構造の特徴を抽出するための比較検討を進めている。具体的には,売上高経常利益率の代理指標でもある経常収支比率を目標成果指標として,その改善に因果関係を有すると思われるKPI指標を取り上げ,それらの関係を実証的に解明する.重要業績評価指標の選択にあたっては,BSCの4つの視点,「財務的視点」「顧客の視点」「内部ビジネスプロセスの視点」「学習と成長の視点」に着目し,9つのKPIを選択し,従属変数を経常収支比率,説明変数を先のKPIとして重回帰分析を行う方法をとる。この方法により,公的病院の特徴を概観する。また,黒字・赤字別,病院機能,規模別に分析を進める。最終年度は現実妥当性を有する理論構築が必要とされるため,公表データが揃っている国立病院機構グループに対象を絞り検証を試みる。平成30年度の研究内容は,以下の点に集約される。
出芽酵母をモデル系とした抗癌剤ストレスのプロテオーム解析

昨年度に引き続き、独自に作製した酵母ゲノムライブラリーを用いて5-FU耐性株の取得を進めた。耐性株の取得後、ゲノムライブラリー由来のプラスミドを回収し、耐性に関与している遺伝子の同定を行った。また、得られた耐性株について、細胞内で特異的に発現しているタンパク質についてHPLCによる解析を進めた。1 5-FU耐性株の取得昨年度の終わり頃に開始した5-耐性株の取得を継続して行った。ゲノムライブラリーを酢酸リチウム法でW303-1A株に導入し、レプリカにより5-FU濃度の異なる培地に形質転換体を移しとるという手法は昨年度と同様であるが、形質転換効率を高めるための条件検討も行った。2 5-FU耐性に関与する遺伝子の解析得られた5-FU耐性株からプラスミドを回収し、耐性に関わっていると考えられる遺伝子の同定を進めた結果、現在までに報告されている遺伝子も含まれていたが、これらとは異なる遺伝子も耐性に関わっている可能性が示唆された。3 HPLCによる発現タンパク質の解析上記で得られた5-FU耐性関連遺伝子を過剰発現している細胞内で、遺伝子産物以外に特異的に発現しているタンパク質を解析した。細胞質画分タンパク質についてSDS-PAGEを行い、このデータをもとに分子量ごとに細胞質画分をさらに分画した。これらの試料を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、コントロール細胞のものと比較することで特異的に発現しているタンパク質を分離、精製した。単離されたタンパク質を質量分析につなげるためのシステムの検討も行ない、詳細な分画操作等の前処理が不必要なタンパク質同定システムを構築した。今後、耐性関連遺伝子と、本システムにより同定された特異的発現遺伝子産物の関連性について詳細に明らかにしていく。抗癌薬5-FUストレス応答の細胞内メカニズムを、出芽酵母モデル系を用いたプロテオーム解析により解明するにあたり、宿主細胞の5-FU閾値の調査、ゲノム遺伝子ライブラリーの作成、5-FU耐性株の取得を進行中である。1 5-FUの閾値について出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのYPD培地における5-FU阻害効果として、400μg/mlの濃度で生育が完全に阻害されるとの報告を参考に、本研究では宿主として用いるW303-1A株の閾値について調査した。本株は400μg/mlの5-FU濃度においては微少ではあるが生育が確認され、既に報告されている文献とは若干異なる結果が得られた。耐性株のスクリーニングにおいては、ここで得られた閾値を基準にした。2ゲノムライブラリーの作製S.cerevisiae W303-1A株のゲノム遺伝子を抽出、精製し、6-10kbpのDNA断片が得られるようにSau3 AIで消化した。このDNA断片をpRS406mプラスミドベクターのBamHIサイトに導入し、ライブラリーの作製を試みたが、挿入断片の長さに偏りがみられた。そこで、YEp13プラスミドベクターを用いるとともに、形質転換、ライゲーション等の実験条件について再検討を加えた。YEp13の場合でライブラリーとして利用できる遺伝子集団が得られたため、これを用いて5-FU耐性株の取得を進めることにした。3 5-FU耐性株の取得上記で作製したゲノムライブラリーを酢酸リチウム法を用いてW303-1A株に導入した。選択培地(SD-Leu培地)上で形質転換体を得、レプリカにより複数の異なる5-FU濃度を含むYPD培地に移し採り、5-FU耐性株の取得を行っている。
高等植物光屈性の分子機構

本研究は高等植物の光屈性に関与する光シグナル伝達系を分子遺伝学的手法によって明らかにすることを目的とした。光屈性についての多くの生理学的知見がトウモロコシなどイネ科植物の幼葉鞘を用いて得られてきたことを考慮して、全ゲノム配列の解読が進められ、分子遺伝学的研究のモデル植物として確立されつつあるイネを主要な材料とした。まず、光屈性が異常な突然変異体の選抜法を確立し、この方法を用いて、Y線で突然変異を誘発したイネ(ニホンマサリ)から2つの異なった遺伝子座の突然変異体を分離した。その内の一つ(cpt1)は幼葉鞘がまったく光屈性を示さないものであった。この突然変異体の原因遺伝子(CPT1)をマップベースクローニングと遺伝子組み換えによる相補性検定によって明らかにした。CPT1遺伝子はシロイヌナズナのNPH3とオルソログな関係にあるタンパク質をコードしていることが判明し、この結果から、NPH3/CPT1は高等植物を通して光屈性に必須なものであることが浮き彫りになった。さらに、^3Hで標識したオーキシン(IAA)を用いて、光屈性刺激を施した野生型品種の幼葉鞘では照射側と影側でオーキシンが不均等に分配されるが、cpt1突然変異体では不均等に分配されないことを明らかにした。これによって、オーキシンの不均等分配は光屈性に関与することがほぼ確実になった。さらに、分離したもう一つの突然変異体(cpt2)は幼葉鞘先端における光受容機能が特異的に欠損した変異体であることを突き止め、原因遺伝子のマップベースクローニングを進めた(現在進行中)。また、本研究の開始時点に、光屈性の網羅的な総説の執筆依頼があり、長年の光屈性研究の成果をまとめるとともに、多くの問題点を論説した総説を発表した。資料収集など大掛かりな準備を要し、本研究補助金の援助なしには成しえなかったので、本研究費の補助によるものとした。本研究は、高等植物の光屈性に特異的な初期反応系ー青色光受容からオーキシン横輸送までに働く一連の分子系ーを、その遺伝子から解明することを目的としている。本年度は、次の2つの研究を進めた。(1)イネ光屈性欠損突然変異体を用いた研究。私たちは既に、幼葉鞘の光屈性が欠損したイネ突然変異体を分離している。本年度は、この突然変異変異体の性質を更に詳細に調べて、幼葉鞘における正の光屈性はどの光強度においても起こらないこと、根における負の光屈性も異常であること(ただし、正常種の1/4の反応は起こること)、幼葉鞘と根における伸長成長と重力屈性、根で観測される回旋運動は全く正常であることを明らかにした。更に、青色光受容体として同定されている2種のアラビドプシス遺伝子(CRY1、NPH1)と相同な遺伝子の発現について調べたところ、それらのmRNAは正常に発現していることが判明した。変異を受けている遺伝子はこれら以外のものであると考えられる。現在、その遺伝子を同定するための研究を進めている。(2)光受容機能再生系を用いた研究。トウモロコシ幼葉鞘の光屈性において、光受容はその先端5mmの部分で行われている。私たちは、その先端部を切除すると、残された幼葉鞘の先端部に光受容機能が再生することを既に見出している。本年度は、先端切除後に特異的に発現するmRNAをサブトラクション法(Clontech,PCR-Select Subtraction method)によって解析した。

まず、この方法によって、3つの新規なcDNA断片を得ることができた。次に、ノーザンブロット法により、いずれの断片も先端切除によって特異的に発現することを確認し、更に、幼葉鞘先端には発現していることを明らかにした。従って、分離したcDNAの遺伝子は、先端切除で発現が誘導されるだけではなく、先端特異的に発現しているものであることが分った。現在、分離したcDNAをプローブとして、全長cDNAを単離し、その塩基配列を解明する研究を進めている。本研究は、高等植物の光屈性の初期反応系に働くタンパク質成分を分子遺伝学的手法によって遺伝子から解明することを目的としている。本年度は次の成果を得ることができた。(1)イネ光屈性欠損突然変異体を用いた研究。幼葉鞘と根の光屈性が欠損したイネ突然変異体(cpt1)の原因遺伝子を解析している。この突然変異体はγ線で突然変異を誘発したイネM2種子から私たちによって分離され、既に十分な戻し交配がなされている。原因遺伝子はシロイヌナズナからクローニングされた2種の遺伝子(CRY1、NPH1)とは異なることを前年度の研究で明らかにした。今年度は更にNPH3遺伝子とも異なることを確認し、新規の光屈性関連遺伝子であると想定されたので、AFLP法を用いた遺伝子の単離とクローニングに向けた研究を開始した。現在までのところ、野生種とは確実に異なる遺伝子断片を幾つか見い出し、その解析を進めている。また、本年度は光屈性の突然変異体を新たに1系統分離することができた。この突然変異体は幼葉鞘の光屈性が損傷を受けているが、根の光屈性は正常なので、上記cpt1とは異なる遺伝子の突然変異体であると考えられる。(2)光受容機能再生系を用いた研究。トウモロコシ幼葉鞘の光屈性において光受容は先端部5mm以内で起こるが、先端を切除すると残された幼葉鞘の先端部に光受容機能が再生する。前年度、先端切除したトウモロコシ幼葉鞘に特異的に発現するmRNAのcDNA断片をsuppression subtractive hybridization法によって解析し、3つの新規なcDNA断片を得ることができた。本年度はそのうちの一つの全長cDNAをクローニングすることができた。配列の相同性検索から、まだ機能が明らかにされていない遺伝子であることが判明した。本研究は、高等植物の光屈性の初期反応系に働くタンパク質を分子遺伝学的手法によって遺伝子から解明することを目的としている。本年度は特に次の成果を得ることができた。(1)イネ光屈性突然変異体を用いた研究。幼葉鞘と根の光屈性が欠損したcpt1突然変異体の原因遺伝子を解明するための研究を進展させた。まず、十分に戻し交配を行った突然変異体を用いてAFLP解析を行い、野生種と異なる遺伝子断片をいくつか分離した。次に、インデカと掛け合わせたF2集団を用い、農水省イネゲノムプロジェクトで得られた遺伝地図とDNAマーカーによって突然変異領域の解析を行った。原因遺伝子は第2染色体のRFLPマーカーS1716とR447の間(S1716から0.8cMの距離)に存在することが分かった。現在、さらに詳細なDNAマーカーを用い、またAFLP法で分離した遺伝子断片もマーカーとして利用しながら、原因遺伝子の絞込みを行っている。
共用ベクターを用いた難培養性口腔嫌気性菌への遺伝子導入・発現系の開発

難培養性口腔嫌気性細菌のタンネレラ・フォーサイシアは最も重要な歯周病原因菌の一つであるが、その遺伝子操作に必要な基本技術の殆どが未確立のままだった。本研究過程において、血液平板上でバイオフィルム状に増殖させた本菌には菌体外DNAを自発的に取り込み形質転換を容易に起こす性質があることを発見した。これを応用し、狙った遺伝子のみが破壊された変異株を簡単にかつ高効率で作製する方法を確立した。また、本菌のみならず他の重要な歯周病原細菌でも自律的に機能する薬剤耐性遺伝子カセットを新規に開発し、その応用として、複数菌種に跨がった遺伝子導入と発現が可能となる共用発現ベクターを設計した。共用プラスミドの改変とそれらの効率的な導入方法の探索を進める過程で、タンネレラ・フォーサイシア(以下Tf菌)が、自ら菌体外のDNAを取り込みゲノム改変を起こす能力、いわゆるナチュラルコンピテンスの高い細菌であることを初めて発見した。更にこの能力を応用して、任意の遺伝子破壊株を簡単に作製する方法を確立した。従来この菌種に形質転換を起こすためには、数日間の液体培養後グリセロール水に再懸濁した菌細胞に対し、電気的穿孔法にてDNA構築体を強制的に送り込む方式(エレクトロポレーション)が専らとられていた。しかし現実にはこの方法による成功率は低く、仮に成功しても一度に得られる変異株の数は非常に少ないので、効率と再現性の両面で課題が残されていた。しかし今回、血液寒天培地上でバイオフィルム状態を保ったまま任意のDNA構築体と混ぜ、ある一定時間嫌気培養条件下で放置すると、それ以上何ら人為的な操作を加えなくとも、本菌が自然にDNA構築体を細胞内に取り込み、目的の遺伝子座に高効率に相同組換えを起こす現象を初めて確認した。実験を反復し、この現象に再現性が有ることを確認すると共に、複数の遺伝子破壊株作製へと応用を試み、いずれも短期間で目的とする変異株を多数得ることに成功した。今回開発した方法は特別な装置を必要とせず、プロトコル自体非常に単純であるが、形質転換効率は極めて高い。従来のエレクトロポレーション法に取って代わり得る、本菌では初の再現性の高い形質転換(遺伝子破壊)プロトコルが確立できたと考えている。この成果は第35回日本分子生物学会で発表し、更に論文に纏め専門分野の英文雑誌に投稿中である。主要な歯周病原細菌タンネレラ・フォーサイシア(Tf菌)とポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)両菌種において機能する共用ベクターの構築を進め、そのプロトタイプとなるpEPT1exを作製した。このベクターはPg菌では良好に機能し、病原因子の発現調節に関わるセンサー遺伝子fimSの変異株ライブラリー作製に応用できた。一方Tf菌では薬剤耐性遺伝子tetQが機能せず、ベクター導入株の共通選択マーカーとしてテトラサイクリンが使えないことが判明した。そこで別の薬剤耐性マーカーとしてクロラムフェニコール(CP)に着目し、その耐性遺伝子CATと発現制御配列を連結した新規薬剤耐性カセットpermF-CATを開発した。permF-CAT単体でのTf菌における機能性を検証するため、前年度までに確立した自然形質転換法による遺伝子破壊株作製への応用を試み、成功した。この実験で、Tf菌バイオフィルムの持つDNA取り込み能力がcomF遺伝子に依存していることが明らかになった。次にpEPT1exベクターのtetQ部分をpermF-CATに置換したpEPT1exCATを構築した。Tf菌への導入を試みたところ、自然形質転換法ではCP耐性株が得られず、電気穿孔法でようやく導入自体には成功したかに見えた。しかし本ベクターはTf菌内に入ると意図しない大幅な構造変化を来し、得られた耐性株から導入したはずのプラスミドが回収できなかった。つまりTf菌でプラスミドを保持させることは困難であることが示唆された。以上の知見を総合し、両菌種で共通遺伝子の導入・発現に便利な「共用ベクター」として機能させるには、Pg菌では従来通りプラスミドとして保持される一方、Tf菌では必要部分のみがゲノムの特定領域に組込まれるように設計変更する必要があるとの結論に至った。その設計は既に終了しており、当初目的は達成できる見込みである。ポルフィロモナス・ジンジバリス(Pg菌)で有用性が認められたpTCB系プラスミドを、タンネレラ・フォーサイシア(Tf菌)でも応用可能な共用ベクターの原型候補として選択した。pTCBは鎖長が9kbを超える大型のプラスミドで、Pg菌への導入は専ら大腸菌を介した接合法で行われてきた。しかし煩雑な接合法に依らずともエレクトロポレーション法(EP法)でpTCBを直接Pg菌に導入できることを新たに見出した。

そこで詳細が不明だったpTCB全長の塩基配列を決定し、接合に関わる遺伝子領域などを同定し削除することによって、コンパクトなpEPTシリーズへと再構築した。これらは実際にPg菌に導入でき機能する。サイズ縮小によってEP法専用ベクターとなったが、遺伝子操作性と安定性は格段に向上し、形質転換効率の向上も期待できる。Tf菌標準株のゲノムデータベースを検索し、外来DNA取り込み能力(コンピテンス)の障壁となり得る制限修飾系オペロンの存在を確認した。一方、Pg菌のコンピテンスに重要とされるcomF遺伝子クラスターがTf菌にも存在することを発見した。Pg菌では液体培養よりも固形培地上で培養した時の方がcomFの発現量は増加し、逆に制限修飾系の発現量は減少するとの報告がある。そこでTf菌の形質転換にバイオフィルム状態の菌を用いる方法を検討した。血液平板上で培養したTf菌の菌塊をグリセロール水に懸濁し、薬剤マーカーを含むPCR産物をEP法で強制導入し、直後の回復培養も血液平板上で行った結果、従来法よりも形質転換効率が向上することが判った。更に、EP法に依らずとも、DNA断片をTf菌バイオフィルムと混ぜるだけで自然にDNAの取り込みが起きる現象(ナチュラルコンピテンス)が初めて観察され、Tf菌への遺伝子導入方法を検討する上で重要な新知見が得られた。これまで共用ベクター候補のプラスミドの改変作業を精力的に行い、ポルフィロモナス・ジンジバリス(以下Pg菌)において機能することが確認できた構築体はいくつか得られたものの、それらのうち、Tf菌体内への導入と保持に成功したものは、現時点ではまだ無い。少なくともPg菌で機能するプラスミドベクターがそのままTf菌でも機能するという訳にはいかないことは明白である。単にベクターのサイズだけの問題ではなく、プラスミド複製に関わる制御配列や、薬剤耐性マーカー遺伝子産物のTf菌における機能性などの更なる検討が今後必要と思われる。Tf菌におけるナチュラルコンピテンスの発見とそれを応用した高効率かつ簡便な新しい形質転換プロトコルの確立によって、予定していた2種類のハイブリド型2成分制御系遺伝子の破壊株作製は容易にかつ再現性良く成功したが、それらに特徴的な表現型を明らかにするところまでは解析が進んでいない。年度途中で当初予定していたプロテオミクス関連機器の使用ができなくなったことが大きい。親株と比較した際の自己凝集能や増殖度など、見掛け上変異株に特徴的と思しき現象はいくつか認められるものの、それらを裏付ける遺伝子レベル、若しくはタンパク質レベルでの網羅的な解析がまだ途上であるため、本質的な所までは明らかになっていないのが現状である。共用ベクター候補として選んだプラスミドの全塩基配列を決定し、その改良型の構築は計画以上に順調に進んでいる。更に2成分制御系遺伝子のクローニングとベクターへの組込みも、計画よりも速いペースで進んでいる。ゲノムデータベースの検索結果から、Tf菌では制限修飾系の働きがPg菌よりも強い可能性が考えられた。潜在的な制限酵素活性による分解を防ぐため、プラスミドベクターを予め人工的なメチル基修飾法(PAM法)で保護したうえでTf菌に導入する試みは現在も継続中である。当初は大腸菌接合法による導入も検討したが、Pg菌の場合とは異なり、大腸菌共存下でのTf菌の分離培養は想像以上に困難で現実的な方法ではないとの結論に達した。
気液２相型アルゴン光検出器による暗黒物質の直接探索

本研究の目的は小型で高感度な2相型検出器を設計・製作し未だ検証されていないアルゴンによる低質量領域の探索を行う事である。本年度前半は、主に2相型プロトタイプ検出器を用いた性能評価及び、本検出器設計に向けたシュミレーション構築を行った。前年度の2相型運用試験では窒素不純物の影響による光量減少が見られていたため、窒素フィルターを用いた改善を行った。結果として不純物の低減(ppb)を達成し、検出光量は前回の1.5倍の7.9pes/keVee(ゼロ電場)を得た。また低エネルギー事象を捉えるため、PMTAmpを導入し高純度アルゴン環境下でも高いPMTGainを確保した。これにより低エネルギー事象の所得・解析が可能となり、アルゴン2相型の特徴を用いた背景事象分離手法により30keVnr領域・信号取得効率50%で10^3以上のガンマ線除去能力が得られた。さらなる分離能力の向上のための信号詳細理解、本検出器設計のためにGeant4による検出器シミュレーションの構築を進めた。光検出器の応答波形やGain、ノイズなどをデータや個別の測定から実装し現実的な検出器応答を構成、検証が行える環境を整えた。これらを用いた検出器内光学過程の検証、アルゴンでの理解が十分でない励起・電子生成過程のデータとの比較検証を進めている。また本実験用のテストスタンド構築も既に行っており、シミュレーションによる検出器設計と併せて本実験への指針を作った。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年の暗黒物質直接探索では、特に低質量領域で相互矛盾する実験結果が共存し、混沌とした現状となっている。このような状況下では、異なる媒質・手法・背景事象環境下での多角的な検証が重要となる。本研究では、小型で高感度な2相型検出器を製作し未だ検証されていないアルゴンによる低質量領域の探索を行う。この領域に感度を持つためには、十分な光検出効率と閾値付近での背景事象分離能力が必要となる。これまで液体1相の小型検出器にて高い検出効率(7.3pes/keVee)を達成していたが、大型・2相型化により光量が減る事を見据え、小型検出器にて検出光量の向上を行った。液体アルゴン用の新しい高QE PMTを個別の低温基礎特性試験を踏まえた上で検出器に導入し、結果としてアルゴンでの世界最高レベルの検出効率(10pes/keVee)を達成した。さらに、これを踏まえて高い検出効率を維持する2相型プロトタイプ検出器の設計製作に着手した。これまでの2相型の結果から、検出器の内蔵物の遮光により検出光量が大きく減少する事が判明したため、10nmの透明電極膜Indium Tin Oxide(ITO)を石英ライトガイドに成膜したものを電場形成に用いた。これにより、これまで遮蔽体となっていたステンレスGridを減らせ、結果として検出光量が大幅に向上し、またGrid間の不感領域も抑えられた事により背景事象分離能力を高めることに成功した。窒素不純物除去による光量のさらなる増加も見込まれており、これを達成するための窒素除去フィルター導入も完了している。これらの検出効率向上により、明確な背景事象分離能力の向上が確認されており、定量評価に向け追加のデータ取得を行う予定である。また分離能力向上のために利用する予定の新型VUV MPPCの開発結果として、低温環境下での液体アルゴン蛍光直接検出の検証が行え、実用の目処が立ってきている現状である。当初の大きな課題であった光検出効率は潜在的に世界最高レベルを達成し、懸念していた2相型プロトタイプ検出器においてもそれを維持する。また窒素不純物除去による光量のさらなる向上が見込まれ、検出効率に一定の目処がたっている。背景事象分離能力に関しても、検出光率の向上・検出器構造の見直しにより明確に向上が見られ、分離能力の定量評価とそれに悪影響を及ぼす問題の洗い出しを行う準備が整った。

またこれら課題を切り分け、理解・改善を行うためのシミュレーション構築も進んでいる現状である。27年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度構築した大光量2相型検出器のデータにより背景事象分離能力の定量化と課題の洗い出しを行う。この結果をシミュレーションにフィードバックし、問題の理解と改善を測る。このシミュレーションを用いて低質量領域に感度を持つ本実験用検出器の設計・製作を行う。その後、この検出器を用いた地上本実験にて検出器性能評価を行う。その結果を基に地下施設への移行・運用に目処をつけていく。
硝酸還元酵素の翻訳後制御に関わる14-3-3タンパク質の細胞生物学的研究

植物を明所から暗所に移したときに起こるNRの急激な失活は、NRタンパク質のリン酸化と、それに続く14-3-3タンパク質の作用による。本研究では、14-3-3タンパク質の機能発現を細胞生物学的に解析した。1.免疫組織化学的解析のための特異抗体の精製タンパク質の免疫組織化学的解析には、高純度の特異抗体が必須となる。まず,大腸菌で発現させた組み換えオオムギ由来の14-3-3タンパク質を抗原としてウサギに免疫し抗血清を得た。次に,抗血清を14-3-3タンパク質を固定化したカラムに供試することによって,抗体を精製した。この抗体は非特異的に他のタンパク質を認識することの無いことが確認できた。2.発芽中の種子から胚乳と胚を分けて採取した。幼植物の地上部からは、展開中および未抽出の葉身、根からは皮層と中心柱を採取した。各部位の試料について、14-3-3タンパク質に対するウェスタンブロット分析を行ったところ、14-3-3タンパク質は全ての組織に同程度の含量で存在することが分かった。3.14-3-3タンパク質の免疫組織化学的解析葉および根における14-3-3タンパク質の組織内局在性の解析を試みた。葉組織切片は,固定包埋後,抗14-3-3タンパク質を一次抗体,FITCラベルの2次抗体として蛍光染色した。その結果,14-3-3タンパク質の存在を示唆する強いシグナルが維管束組織に観察された。根組織切片は,固定包埋後,抗14-3-3タンパク質抗体を反応させABC法で染色した。その結果,14-3-3タンパク質の存在を示唆する強いシグナルが,皮層細胞の最も外側と中心柱の内鞘細胞に認められた。「目的」植物を明所から暗所に移したときに起こるNRの急激な失活は、NRタンパク質のリン酸化と、それに続く14-3-3タンパク質の作用によることがin vitroで明らかにされている。しかし、14-3-3タンパク質がin vivoでリン酸化NRに作用しているという確たる証拠はまだ得られていない。本研究では、14-3-3タンパク質の機能発現を細胞生物学的に解析することにより、このタンパク質のNRに対するin vivoでの生理機能を明らかにすることを目的とする。本年度は、NRと14-3-3タンパク質の細胞生物学的解析に必要な特異抗体の調製と14-3-3タンパク質の免疫組織化学的観察を行った。「結果と考察」1)免疫組織化学的解析のための特異抗体の精製タンパク質の免疫組織化学的解析には、高純度の特異抗体が必須となる。NRに対する抗体については、免疫源である合成ペプチドを固定化したカラムに抗血清を供する事で精製した。14-3-3タンパク質に対する抗体については、大腸菌で発現させた組み換え14-3-3タンパク質(オオムギ)を固定化したカラムに抗血清を供試することによって、抗体を精製した。両抗体ともに、非特異的に他のタンパク質を認識することの無いことが確認できた。2)14-3-3タンパク質の免疫組織化学的解析葉における14-3-3タンパク質の組織内局在性の解析を試みた。FITCラベルの2次抗体を用いて14-3-3の存在部位を蛍光染色すると、維管束組織に強いシグナルが観察された。植物を明所から暗所に移したときに起こるNRの急激な失活は、NRタンパク質のリン酸化と、それに続く14-3-3タンパク質の作用による.本研究では、14-3-3タンパク質の機能発現を細胞生物学的に解析した.1.免疫組織化学的解析のための特異抗体の精製タンパク質の免疫組織化学的

解析には、高純度の特異抗体が必須となる。まず,大腸菌で発現させた組み換えオオムギ由来の14-3-3タンパク質を抗原としてウサギに免疫し抗血清を得た.次に,抗血清を14-3-3タンパク質を固定化したカラムに供試することによって,抗体を精製した。この抗体は非特異的に他のタンパク質を認識することの無いことが確認できた。2.14-3-3タンパク質の免疫組織化学的解析葉および根における14-3-3タンパク質の組織内局在性の解析を試みた。葉組織切片は,固定包埋後,抗14-3-3タンパク質を一次抗体,FITCラベルの2次抗体として蛍光染色した.その結果,14-3-3タンパク質の存在を示唆する強いシグナルが維管束組織に観察された.根組織切片は,固定包埋後,抗14-3-3タンパク質抗体を反応させABC法で染色した.その結果,14-3-3タンパク質の存在を示唆する強いシグナルが,皮層細胞の最も外側と中心柱の内鞘細胞に認められた.
長崎県地方における黄砂現象と大気光学に関する環境動態解析

本研究課題に関連する2年間にわたる主な研究実績は次のようにまとめることができる。(1)長崎地方の黄砂現象の出現頻度を再点検するために、長崎海洋気象台の観測記録を用いて、黄砂現象の経年変化を調査した。その結果を従来から蓄積されていたデータと結合し、19142001年に及ぶ88年間の出現頻度分布を明らかにした。その結果、近年においては増加傾向にあることが明らかになった。(2)光散乱式粒子測定器(Optical Particle Counter ; OPC)を用いて、2年間にわたって春季の大気中のエアロゾル濃度をほぼ連続的に測定し、黄砂現象出現前-黄砂現象中-現象後に至る大気中の粒度分布の変動を詳細に解析した。黄砂時の顕著な大粒子の急増ばかりでなく、小粒径の濃度にもかなり複雑な変化があることが明らかになり、大陸からの大気汚染物質の流入の可能性が示唆された。(3)今回の研究経費で新規に導入したスカイラジオメーター(Sky Radiometer)によって、波長別直達日射量、波長別天空散乱光の散乱角度分布を連続的に測定し、黄砂現象時の光学的特性を明らかにした。また、この基礎的データは研究分担者(森山)の主たる研究課題である衛星リモートセンシングの解析にも活用された。(4)国立環境研究所との共同研究計画に基づいて、同研究所のレーザーレーダー装置(lidar)が長崎大学構内に設置され、2001年春季には、北京・長崎・つくばの3地点ネットワーク観測が実現した。この観測によって、長崎上空の大気エアロゾルの3次元的構造について従来は思いも寄らなかった貴重な知見が得られ、今後の総合的な解析に有用な黄砂現象に関する大気光学的データデットが蓄積できた。本研究の本年度(初年度)における主な研究活動は以下の通りである。(1)アジア大陸方面から流入する黄砂粒子および大気汚染起源の微粒子の大気光学的動態を解析するために,2000年当初から天候を観察しながら,本研究室の光散乱式粒子測定器(OPC)を用いて,大気中のエアロゾルの濃度をモニターし,顕著な黄砂現象のデータが6例得られたので,気象衛星ひまわり画像,長崎海洋気象台の地上気象観測記録などを併用して解析を行った。それらの解析結果を論文として報告するために,図表類や原稿を作成中である。(2)2000年8月に待望の最新鋭型のスカイラジオメーターが入荷したので,本学部屋上に設置し直ちに観測を開始した。黄砂の季節は終了していたか,連続的な観測によって長崎地方の夏秋冬の良質のバックグランドデータが得られた。それらのデータは,研究分担者の森山雅樹助教授と分担して解析を行っている。筆者はおもにOPCとの関連性から,森山は衛星情報との関連性に焦点を当てて解析中である。(3)2000年9月に国立環境研究所高層大気研究室から,大気エアロゾルの鉛直分布に関するレーザーレーダー観測の共同研究計画の提案があり,本研究課題にも有益であると判断し,国立環境研究所のレーザーレーダー装置を長崎大学に設置することなった。設置までには若干の事務上の協議や交渉を必要としたが,2001年2月に長崎大学構内への設置が実現したので,大気エアロゾルの鉛直構造に関する連続観測も可能となった。このような状況を有効に活用して,来年度(2年目)の研究を強力に推進したいと考えている。本研究課題に関する最終年度(2年目)における主な研究活動は以下の通りである。(1)長崎地方の黄砂現象の出現頻度を再点検し、黄砂現象の経年変化を調査した。

(2)光散乱式粒子測定器(Optical Particle Counter ; OPC)を用いて、春季の大気中のエアロゾル濃度をほぼ連続的に測定し、黄砂現象出現前-黄砂現象中-現象後に至る大気中のダストの変動を詳細に解析し、黄砂時の大粒子急増傾向とともに、小粒子の濃度にも複雑な変化があることを見出した。(3)今回の研究経費で新規に導入したスカイラジオメーター(Sky Radiometer)によって、波長別直達日射量、波長別天空散乱光の散乱角度分布を連続的に測定し、黄砂現象時の光学的特性を明らかにした。また、この基礎的データは研究分担者(森山)の主たる研究課題である衛星リモートセンシングの解析にも活用された。(4)国立環境研究所との共同研究計画に基づいて、同研究所のレーザーレーダー装置(lidar)が長崎大学構内に設置され、2001年春季には、北京・長崎・つくばの3地点ネットワーク観測が実現し、長崎上空の大気エアロゾルの3次元的構造が明らかなり、それらのデータを組み込んで黄砂現象に関する総合的な解析を行った。
新規肝切除後肝再生促進・癒着防止療法の開発：大型動物モデルを用いて

原発性及び転移性肝がんに対する治療において、『繰り返し肝切除』は生存期間の延長や根治を期待しうる方法である。しかし『繰り返し肝切除』の問題点として、前回手術後の癒着と残存肝の再生能低下という2つの問題点が挙げられる。我々はマウス肝切除後癒着モデルにおいて、中皮前駆細胞を移植することで肝切除後の癒着を防止しうること、加えて肝切除後の肝再生を促進しうることをすでに明らかにしている。本研究では、大型動物モデルにおいても中皮細胞移植により良好な癒着防止効果を得ることが出来た。またマウスのアロ移植においても同種同系移植と同様の効果が得られた。原発性肝がん・転移性肝がんに対する治療法として「繰り返し肝切除」が生存期間の延長や根治を期待しうる方法としてその有効性が広く認められている。しかしながら「繰り返し肝切除」をおこなう際の問題点として、前回手術後の癒着と残存肝の再生能の低下という2つの問題点が挙げられる。術後癒着は一般的には腸閉塞や慢性骨盤痛、腹痛、不妊などの原因となるほか、再肝切除時には癒着剥離操作が加わることで手術操作が煩雑となり、手術時間の延長や出血量の増大、合併症の増加といったリスクをもたらす。術後癒着を防止するために様々な高分子吸収性癒着防止材が使用されているが、肝切除後の癒着防止効果についての齧歯類を用いた検討では、その効果は不十分であり、新たな癒着防止策を開発する必要がある。また残存肝の再生能低下は術後肝不全のリスクを高めるため、現実問題として「繰り返し肝切除」を行える回数は有限回であり、切除可能な肝臓の容積も制限されていく。これらの要因を解決することで実際の切除率が上がり、更なる患者予後の改善につながることが期待される。本研究ではミニブタ肝切除後癒着モデルを確立し、新たな肝切除後肝再生促進・癒着防止療法を開発する。これまでミニブタから様々な部位の細胞を採取して培養をおこなった。さらに温度応答性培養皿上で培養をおこない、細胞シートを作成するとともに、肝再生促進効果・癒着防止効果についてin vitroの系での検討をおこなっている。原発性肝がん・転移性肝がんに対する治療法として「繰り返し肝切除」が生存期間の延長や根治を期待しうる治療法としてその有効性が広く認められている。これらの要因を解決することで実際の切除率を上げ、更なる患者予後の改善につながることが期待される。成体ミニブタから大網と肝臓を採取して、腹膜中皮細胞と肝中皮細胞をそれぞれ回収した。培養条件を検討した結果、腹膜中皮細胞は細胞シートとして移植可能な程度にまでExpandすることが出来た。肝中皮細胞に関しては十分にExpandせず培養条件の更なる改良が必要と思われた。細胞シート化した腹膜中皮細胞を、同一個体に再肝切除を施してその肝切離面に移植したところ、十分な癒着防止効果を得ることが出来た.またマウスやラットとは異なり、ミニブタは近交退化の傾向が強いため、99.99%以上遺伝子が同一である真の意味での近交系が実際には確立していない。そのため、ミニブタ間の移植の場合同系統でもアロ移植となってしまう。そこで自家移植だけでなくアロ移植でも同等の効果がみられるかを小動物間の移植で検討した。C57BL/6Jマウス由来の肝中皮細胞シートをBALB/cマウス・FVB/NJclマウス・C3H/HeJJclマウスの3系統のマウス肝切除後癒着モデルに移植して、癒着防止効果や肝再生促進効果を検討したところ同種同系移植とほぼ同等の効果が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。肝胆膵外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。ミニブタ肝切除モデルを用いての肝再生促進効果や癒着防止効果についてin vivoでの検討はまだおこなっていないが、一方で培養法の確立や細胞シートの作成、in vitroにおける肝再生促進効果の検討などは進んでおり、おおむね順調に研究が進展しているといえる。今年度は引き続き、培養法のさらなる改良をおこなって様々な細胞シートを作成し、In vitroの系でその肝再生促進効果・癒着防止効果効果を評価する。最終的に優れた効果を持つと思われる細胞シートをミニブタ肝切除モデルに対して移植して、肝再生促進効果や癒着防止効果についてin vivoでの検討をおこなう。
血漿中アミノ酸プロファイルに着目したアルツハイマー病の血液マーカー探索

アルツハイマー病に対する侵襲性が低い診断マーカーの必要性が増している。血液中の微量成分を測定する血液バイオマーカーの開発が進歩している。本研究では,生体内の代謝経路の中心的な存在であるアミノ酸に着目し,アミノ酸を網羅的にプロファイルする技術をアルツハイマー病の血液バイオマーカーに応用する取り組みを行った。アルツハイマー病患者(n=36)と年齢をマッチさせた対照者(n=34)の血漿中アミノ酸プロファイルを測定した。アルツハイマー病患者で有意に変動するアミノ酸を5種類同定した。これらの結果から,血漿中アミノ酸はアルツハイマー病の診断に有用な血液マーカーとなる可能性が示された。アルツハイマー病患者数の増加に伴い簡便かつ非侵襲的な診断マーカーの必要性が増している。この観点から血液を用いた診断マーカーは汎用性を有し,血液マーカーに対する期待は大きい。しかしながら,現在までにアルツハイマー病の血液マーカーの候補として報告されたものはあるが,再現性が担保され実用化にまで至ったものは未だ存在しない。研究代表者は,生体内の代謝経路の中心的な役割を果たすアミノ酸に着目し,多種類のアミノ酸の組み合わせを統計学的手法で解析することによりアルツハイマー病の診断に応用出来る可能性を本研究において探求した。NINCDS/ADRDA(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)診断基準に適合するアルツハイマー病患者36人および年齢をマッチさせた認知機能正常高齢者34人からインフォームドコンセントを所得し,早朝空腹時に血液を採取した。遠心器にて血漿を分離し,液体クロマトグラフィー・質量分析機を用いアミノ酸を含む代謝産物を測定した。5種類の代謝産物がアルツハイマー病群と対照群で有意な差を示した。その内の1種類の代謝産物は,ミニメンタルステイト検査(MMSE)得点と有意な相関を示した。研究計画にそって疾患群と対照群の血漿中のアミノ酸分析が進行しており,幾つかの有意な変動を検出している。成果に基づいた学会発表を積極的に進めている。研究を進める上で,大きな支障はない。認知症の診断は問診,身体的診察,認知機能検査,神経学的診察を基盤に,補助診断として画像検査(形態・機能)や脳脊髄液バイオマーカーの測定が活用されている。認知機能障害や神経所見は脳病変の局在に有用な情報を与えてくれるが,認知症の原因となる分子病理については十分な情報を得ることができない。分子病理を的確に把握することは,疾患修飾治療などの分子標的治療を行う際には重要なポイントとなる。本研究はバイオマーカーの中でも血液マーカーに焦点を当てた探索研究である。血液マーカーは,腰椎穿刺を要する脳脊髄液マーカーと比較して,低侵襲であり汎用性がある点で優れている。アミノ酸は生体内の代謝経路に中心的な役割を果たしており,多種類のアミノ酸を測定することにより疾患の診断に有用であることが示されている。本研究は血漿中アミノ酸プロファイルに着目してアルツハイマー型認知症の血液マーカーを探索する課題である。平成27年度は臨床的にアルツハイマー型認知症と診断した患者36人と年齢をマッチさせた対照群34人のアミノ酸解析を行い,アルツハイマー型認知症群で有意に変動する5種類のアミノ酸代謝産物を同定した。平成28年度は軽度認知障害と診断された方の中で経過観察中にアルツハイマー型認知症にコンバートした群(n=17)と非コンバート群(n=10)でアミノ酸解析を行い,軽度認知障害からアルツハイマー型認知症にコンバート予測に有用なマーカーの探索を行った。両群で有意な差が認められたマーカーについてはROC(受信者動作特性)解析を行い感度,特異度,AUC (area under curve)の算出を行った。研究計画に沿って疾患群と対照群のアミノ酸分析を終えた。平成28年度には軽度認知障害由来のサンプルのアミノ酸分析を終えた。アルツハイマー病等の認知症の患者数の増加に伴い侵襲性が低い簡便な診断マーカーの必要性が増加している。血液中の微量成分を測定するblood-based biomarker (BBB)は期待されている低侵襲性診断マーカーでありその開発が先端計測技術の進展とともに進んでいる。本研究では,生体内の代謝経路の中心的存在であるアミノ酸に着目し,アミノ酸を網羅的にプロファイルする技術をアルツハイマー病のBBB開発に応用する取り組みを行った。血漿試料をカラムで全処理後,high performance liquid chromatography/electrospray mass spectrometry (HPLS/ESI-MS)を用いアミノ酸及びアミノ酸代謝産物を網羅的に測定した。アルツハイマー病患者(n=36)と年齢をマッチさせた対照群(n=34)の血漿中アミノ酸プロファイルを質量分析により測定した。血漿サンプルの採取は空腹時午前中の採血とし,採血後直ちに冷却し,4時間以内に血漿遠心分離を行うプロトコルに準じた。アルツハイマー病患者で有意に変動する5種類のアミノ酸代謝産物を同定した。その中の一つのアミノ酸代謝産物は,認知機能スケールMini-Mental State Examination (MMSE)スコアと有意な相関を示した。また,軽度認知障害(mild cognitive impairment)と診断した方の中で,経過観察中に認知症にコンバートした群と非コンバート群において血漿中のアミノ酸分析を行い,コンバート予測に有用なアミノ酸代謝産物を3種類同定した。

これらの結果から,血漿中アミノ酸プロファイルはアルツハイマー病の診断及びMCIから認知症へのコンバート予測に有用なBBBとなる可能性が示唆された。アルツハイマー病に対する侵襲性が低い診断マーカーの必要性が増している。血液中の微量成分を測定する血液バイオマーカーの開発が進歩している。本研究では,生体内の代謝経路の中心的な存在であるアミノ酸に着目し,アミノ酸を網羅的にプロファイルする技術をアルツハイマー病の血液バイオマーカーに応用する取り組みを行った。アルツハイマー病患者(n=36)と年齢をマッチさせた対照者(n=34)の血漿中アミノ酸プロファイルを測定した。アルツハイマー病患者で有意に変動するアミノ酸を5種類同定した。これらの結果から,血漿中アミノ酸はアルツハイマー病の診断に有用な血液マーカーとなる可能性が示された。患者と対照群の血液を用いた横断的な解析により差がみられた代謝産物に関して,再現性を得るとともに,縦断的な解析を行う必要がある。アミノ酸代謝物の測定感度の向上させ,より微量な代謝産物の測定を実施していく。認知症学神経内科学バイオマーカー年度当初の予定より少ない臨床検体サンプルの解析を実施したため,本年度の支出が予定よりも少なくなった。次年度に臨床検体サンプルの解析を追加して実施する。