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埼玉県における自由民権運動の実証的研究-演説会の広がりを中心に-

本研究の目的は、現在の埼玉県域(以下本県)を中心とした地域で展開した自由民権運動、とりわけその初期における民権結社の結成と演説会の広がりの過程を、他地域との比較の視点を加えて実証的に明らかにすることである。この目的の背景には、従来本県を対象とした研究においては、秩父事件に関心が集中し、名望家の運動に関する研究が進んでいなかったこと、他地域との関係が十分明らかにされていないことといった状況がある。そこで本研究では、本県については埼玉県立文書館などで、他地域については、国会開設運動で本県同様に県会議員が活躍した岡山県、埼玉県に地理的に近い神奈川県、千葉県、群馬県、栃木県など関東諸県の図書館やアーカイブズで調査を実施し、民権結社や演説会に関する行政文書・古文書、あわせて各地域の自治体史における自由民権運動関係の記述を収集した。これらの分析を通し、本県の自由民権運動の地域的展開を確認し、他地域との比較の視点から本県における最初期の民権結社及び演説会の萌芽と展開を検討した。その結果、本県最初の演説会について、従来いわれているように1875(明治8)年に慶應義塾の弁士が行ったのではなく、翌年に県内名望家が行ったものである可能性が見出された。そのうえでなお、本県の演説会の開催は他地域に比し早かった。その背景には名望家による運動の高揚があったと同時に慶應義塾に学んだ本県出身者の影響があった。1877年以降開催された慶應義塾関係者を招いた本県での演説会は本県地域史にとっての意味と同時に、慶應義塾による演説会の外部への展開であった点で、日本近代の演説に関する歴史過程においても意味をもつものだった。本研究を通して本県の自由民権運動草創期の過程の一端が精緻化された。この研究で得られた成果は、市民向け講演などで活用したほか、今後さらに研究を進め、学術誌などで積極的に発表していく。
知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発

本研究の目的は、平成21年3月告示の高等学校学習指導要領「外国語」の方針に則り、普通科高校における英語授業の改革の具体的モデルを示すことである。多くの普通科高校で行われている訳読と文法説明一辺倒の授業を克服して、本来のコミュニケーション能力を育て、なおかつ進路選択のニーズにも対応でき、しかも英語という教科の特徴を生かして生徒の知性を高められる授業のモデルの開発である。改革モデルは教材・授業運営法・言語活動の3領域にまたがって開発し、実際に高校の授業において学習効果を確認した上で、その成果を出版物や研究発表会を通して広く全国に還元した。1.高校での授業実践を通じた改革的授業プログラムの検証を進めた。前年度に作成した授業方法の理論的解説に基づいて、O. HenryのThe Gift of MagiとSteve JobsのStanford Univ. Commencement Addressを題材とする具体的な授業プログラムをそれぞれ4本と9本作成し、メンバーの相互批評および試行的実践を通じて、授業プラン集(『知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発:授業プラン集・改訂版』平成24年度科学研究費事業学術研究助成金(課題番号23531265)研究成果報告書』、2012年12月)を作成した。2.改革的授業法の教師用指導書作成に向けた、実態把握の一環として、大学入試問題の詳細な内容分析を行った。3. 1.と2.の途中経過および成果について、2012年8月5日の全国英語教育学会第38回大会(愛知学院大学)において2件の共同発表を行った他、2012年5月13日に「大学入試問題追跡調査の方向性と課題」および「大学入試英語問題と対策指導の現状について」というテーマのシンポジウムを開催した(名城大学名駅サテライト)。また、12月9日には「これからの高校英語授業のあり方」と題するシンポジウムを開催した(名城大学名駅サテライト)。1.高校・大学での授業実践を通じた改革的授業プログラムの検証を進めた。前年度に作成した授業プラン集(『知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発:授業プラン集・改訂版』、2012年12月)に基づく実践を収集・分析し、2013年8月11日の全国英語教育学会第39回北海道研究大会(北星学園大学)にて共同発表を行った。2. 1.の内容・成果に基づく高校用の英語テキスト『Trinity English Series』をメンバーとの協議の上で編集し、浜島書店の協力を得てBook 1を1000部を刊行、メンバー及び希望者に必要数(教員・生徒人数分)を配布した。Book 2とBook 3についてもプロジェクトのWeb上において公開した。交付申請書の研究実施計画における「高校生・一般を対象にした教材集・英語読本」に該当する。3.高校教員を主たる対象として、1.、2.および3年間の成果と課題について、2014年3月9日に「知的なコミュニケーション力を育てる高校英語教育シンポジウム・完結編」と題するシンポジウムを開催した(名城大学名駅サテライト)。4.本研究課題の次の段階として、『Trinity English Series』を用いた実践事例の収集・分析、および交付申請書の研究実施計画における「高校教師向けの指導書」に該当する報告の準備に着手した。1)普通科高校における英語授業の改革の具体的モデルを示すことを目的として、それを可能にする新タイプの教材集の編集に着手した。まず、各メンバーが推選する豊かな内容の伝記・記録・スピーチ・手紙・論説・物語・映画・詩などを収集し、蓄積した教材候補を内容・対象レベル・テキスト構成・ジャンルの観点から分類・精選した。その内18本の教材を授業案の形に具体化し、相互批評を通じて最終的に16本の教材・授業案を集めた冊子(『平成23年度科研費助成事業「知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発」(課題番号23531265)研究成果中間報告書』、2012年3月)を作成した。2)多くの普通科高校で行われている文法訳読式の授業とドリル的補習授業の授業を克服して、本来のコミュニケーション能力を育て、なおかつ進路選択のニーズにも対応でき、しかも英語という教科の特徴を生かして生徒の知性を高められるような授業の要件について検討を重ねた。そのような授業は、(1)繰り返し味わうに足る教材を用いて、(2)教材について生徒の考えを問い、(3)生徒が疑問・意見・対案等を出し合い、(4)教材を生徒の調べ学習でintegrateし、(5)授業の目標を明確にする頂上タスクを設け、(6)意味ある課題を通して重要文法概念をspiral的に学ぶ活動を取り入れることが必要であるとの仮説のもと、2012年3月4日にシンポジウム「Intelligenceを高める英語教育を求めて」(キャンパスプラザ京都)を開催した。

改革的授業の担い手となる「英語教師の成長」という観点で柳瀬陽介准教授(広島大学)に講演を依頼し、1)で作成した教材案に基づく試行的実践について報告しながら、改革的授業のモデルを提示・意見交換を行った。研究実施計画において掲げた2つの研究について、「研究B(高校での授業実践を通じた改革的授業プログラムの検証)」は、各メンバーによって着実に進められており、その成果の一部は『知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発:授業プラン集・改訂版』平成24年度科学研究費事業学術研究助成金(課題番号23531265)研究成果報告書』として結実している。「研究C(改革的授業法の教師用指導書、および高校生・一般向けの英語読本の作成)」についても、大学入試の内容分析に基づく提言や、シンポジウムの開催、Webページを通じたディスカッションによって作業が進められている。以上に照らして、「おおむね順調に進展している」と言ってよいものと考える。研究実施計画において掲げた2つの研究について、「研究A.改革的授業を可能にする新タイプの教材集の編集」は『平成23年度科研費助成事業「知的・創造的英語コミュニケーション能力を伸ばす進学高校英語授業改革モデルの開発」(課題番号23531265)研究成果中間報告書』として結実し、標記の目標を達成したと言ってよい。「研究B.高校での授業実践を通じた改革的授業プログラムの検証」については、十分な検証は次年度以降の課題となったものの、いくつかの教材・授業案について試行的実践が行われており、シンポジウムの開催やWebページを通じて議論の経過および成果は広く全国に還元されている。「実際に高校の授業において学習効果を確認した上で、その成果を出版物や研究発表会を通して広く全国に還元する計画である」という研究目的に照らして、「おおむね順調に進展している」と言ってよいものと考える。研究C(改革的授業法の教師用指導書、および高校生・一般向けの英語読本の作成)をメンバー全員で進める。追加・修正を加えた研究Aの教材集と前年度に研究Cで作成した草稿をベースとし、実践結果の分析に基づいて授業プログラムに必要な改善を行い、高校教師および一般向けの指導書兼教材モデルとして完成させ、印刷・製本の上、発表する。さらに、研究ACを通じて得られた知見・データを取りまとめ、学会・研究会を通じて全体的な成果の発表を行う。研究B(高校での授業実践を通じた改革的授業プログラムの検証)を進める。前年度に作成した授業方法の理論的解説に基づいて、具体的な授業プログラムを作成する。作成は、これまでに高校教師として様々な学校環境で質の高い授業を実践してきた研究協力者が、研究代表者・分担者と協力して行う。高校教員メンバーはこれを用いて各自の勤務校で授業実践を行い、メンバー全員で得られたデータを量的・質的に分析する。授業実践とその分析は、進捗に応じて平成25年度前期に継続して実施する。研究C(改革的授業法の教師用指導書、および高校生・一般向けの英語読本の作成)に着手する。前年度に作成した授業方法の理論的解説と、研究Aで編集した教材集とを関連づけ、教師用指導書の草稿を作成する。
血漿交換で難治性EBV関連リンパ腫が治る？

これまでの研究でEBウィルス関連リンパ腫における腫瘍ニッチの形成に腫瘍が分泌する、細胞外小胞の一種、エクソソームが重要な機能を持つことを示してきた。そこでEBV関連リンパ腫において、腫瘍由来エクソソームを除去することが有効な治療法になり得るか検討した。エクソソームの希釈効果をパラビオーシスを用いて検討した。EBV感染リンパ腫NOGマウスと無処理NOGマウスの皮膚を吻合し二匹のマウスの間で体液交換を行った。その結果予想外にも、担癌マウスと担癌マウスのペア、正常マウスと正常マウスのペアに比して、担癌マウスと正常マウスのペアが吻合後早期に死亡する現象を認めた。この現象の機序を今後検討していく予定だ。EBV関連リンパ腫は高齢者に多い難治性悪性造血疾患である。診断が困難で、激しい炎症を伴う場合が多く、診断が確定した時には、全身状態の悪化のため、抗がん剤を用いた化学療法が困難な症例が多い。このような症例に化学療法に代わる、非侵襲的な治療はないだろうか?我々はこれまでの研究により、血液中に含まれるエクソソームが腫瘍形成において重要な機能を持つことを明らかにし、血漿交換がEBV関連リンパ腫に対して有効な治療となる手がかりを得た。そこで、その仮説を検証するために、ヒト化マウスモデルにおける体外循環を用いた血漿交換法を構築し、EBVリンパ増殖疾患モデルにおける血漿交換の有効性を検討することを本研究の目的とした。まず、上記の仮説を比較的簡便なシステムで検証するために、マウス間における体液交換を試みた。担癌マウスと正常マウスにおいて、体液交換がおこると、担癌マウスの血漿が2倍に希釈される。担癌マウスの生存が延長されると、血漿交換の有効性が示される。そこで、上記2種類のマウスの皮膚を吻合した。このシステムにおいては、通常2週間後に血球成分を含む完全な体液交換が起こる。結果は予想外にも、早期に、正常マウスが死亡するというものであった。この現象がいかなる機序によってもたらされるのか、について、今後明らかにしていきたい。予想外の結果を得たため、計画の大幅な変更を余儀なくされた。しかしながら、非常に興味深い結果であるため、最終的に得られる科学的な価値は高いと考えている。これまでの研究でEBウィルス関連リンパ腫における腫瘍ニッチの形成に腫瘍由来エクソソームが重要な機能を持つことを示してきた。エクソソームは細胞外小胞であり、液性因子の一つである。欧米においては、HIV感染症において、患者血液中に含まれるHIV感染細胞由来エクソソームをエクソソーム吸着膜と体外循環を用いて、除去する試みが治験レベルで行われ、安全性は確認された。そこで、現在有効な治療法がみとめられないEBV関連リンパ腫において、腫瘍由来エクソソームを除去することが有効な治療法になり得るのか否かを検討するために研究を行った。EBウィルスは霊長類の一部にしか感染しないため、EBウィルスの感染するB細胞をヒト化するために、NOGマウスを造血ヒト化を行う必要がある。マウスでは体外循環が確立されていないため、まず、エクソソームの希釈効果をパラビオーシスを用いて検討した。EBV感染リンパ腫NOGマウスと何も処理を行っていないNOGマウスをパラビオーシスを用いて皮膚を吻合し二匹のマウスの間で体液交換を行った。これにより、担癌マウス由来エクソソームは2倍に希釈される。その結果、予想に反して、担癌マウスと担癌マウスのペア、正常マウスと正常マウスのペアに比して、担癌マウスと正常マウスのペアが吻合後1週間という早期に死亡する現象を認めた。この現象の機序を今後検討していく予定である。免疫不全マウスにおける体外循環の構築は技術的に非常に困難である。それに取り組むにあたり、体液希釈が担癌マウスの生存延長をもたらすとの結果を得ることが必須であったが、予想外の結果を受け、今後は、正常マウスが担癌マウスから体液により死亡する機序を明らかにしていく。血液腫瘍内科学最初に行った研究結果が、予想外の結果であり、当初予定していた研究計画を大幅に変更する必要性が生じ、当初購入を予定していた試薬などを購入する必要がなくなった。次年度においては、新たな研究計画に沿って、網羅的な遺伝子解析、タンパク解析を行い、研究費を適切に使用する計画である。
連立線形行列不等式の非共通解による多目的最適制御系設計

LMI(=Linear Matrix Inequality,線形行列不等式)に基づく多目的制御系設計では、各設計仕様毎に定まるLMIを連立させて設計が行われる。各仕様は凸であるが、連立させると凸でなくなる。従来、この非凸問題を凸化するため、問題がLMI共通解で解かれ、設計結果が保守的になっている。例えば、ロバスト安定性が過度に保証されて、過渡応答などの性能が犠牲になったりしている。本研究の目的は、問題の凸性を崩さずに、LMI非共通解を用いて多目的制御系設計を行う新たな枠組みを構築し、これにより、LMIに基づく多目的制御系設計における、従来の保守性を低減することである。H_2仕様を含む多目的制御系設計問題には、大きく分けて二種類の問題が存在する。1.同時成立問題(LQG制御器が偶然他の仕様も満足する。)2.制約付きH_2コスト最小化問題(他の仕様を満たしながら、H_2コストを最小化する。LQG制御器は、もはや他の仕様を満足しない。)平成11年度は、H_2/H_∞制御、領域極配置、強正実H_2制御器の設計問題について、状態フィードバック、出力フィードバックの両面から研究を行い、以下の結果を得た。1.同時成立問題では、制御器の構造が定まる。この制御機構造に基づいて、以下の結果を得た。(a)LMI解と制御器の双方を、共通の、より基本的なパラメータによってパラメトライズした。(b)LMI解のうち、どの部分を拘束し、どの部分を拘束しなくてよいかを明確にした。(c)非拘束部分の自由度を生かしながら二種類の設計法-二段階設計法、多段階設計法-を提案した。2.制約付きH_2コスト最小化問題では、もはや制御器の構造は固定されない。このとき、以下の結果を得た。(a)平方完成によりBMI項をLMI化する方法の提案。(c)準負定二次項の逐次LMI化と反復計算を用いた、LMI非共通解による多目的制御系設計法。二慣性系やEuler-Bernouli梁の数値例でH_2コストに関する保守性を実際に大きく改善することができた。近年,混合H_2/H_∞問題に代表される多目的最適制御系設計が注目されている.当初解析的に解くのが難しかったこの問題も,最近,LMI(=Linear Matrix lnequality,線形行列不等式)に基づく制御系設計の出現によって容易に解けるようになった.この問題の解は,各設計仕様毎に定まるLMIを連立させることによって求められるが,問題の凸性を崩さずに各仕様を満たすコントローラを共通のものとして定めるために,これまでのところ,LMI共通解すなわち共通のLyapunov関数でしか問題が解けていない.このため設計結果が保守的になっている.本研究の目的は,LMIに基づく多目的制御系設計において,各仕様を満たすコントローラが共通に定まることを保証しながら,問題の凸性を崩さずにLMI非共通解すなわち異なるLyapunov関数で問題を解くことである.平成10年度は,状態フィードバック混合H_2/H_∞コントローラと出力フィードバック強正実H_2コントローラについて,この問題を検討した.その結果,以下の結果を得た.1. LMI解とコントローラの双方を,共通の,より基本的なパラメータによってパラメトライズできた.2.各仕様を満たすコントローラが共通に定まるために,LMI解のうち,どの部分を拘束し,どの部分を拘束しなくてもよいかを明確にした.3.非拘束部分の自由度を生かしながら主に二種類の設計法を提案した.(a)二段階設計法従来通りX=P^<-1>>0をLMI変数として選ぶ.まずLMI共通解で連立LMIを解く(第一段階).得られた解のうち,LMI解とコントローラの一部を固定すれば,残りのパラメータに関して連立LMIが非共通解で解ける.この自由度を生かして再度連立LMIを非共通解で解く(第二段階).(b)反復計算法従来とは異なりP=X^<-1>>0をLMI変数として選ぶ.その結果,二段階設計法で十分に生かせなかった非拘束部分の自由度がより多く生かせるようになる.代償としてLMI化にSchurの相補定理が使えなくなる.そこで,反復計算によりコントローラの導出を行う.このアルゴリズムの収束性もまた理論的に保証できた.混合H_2/H_∞問題の二慣性系への適用例で,実際のH_2コストが,従来よりも(a)10%程度,(b)50%程度改善した.LMI(=Linear Matrix Inequality,線形行列不等式)に基づく多目的制御系設計では、各設計仕様毎に定まるLMIを連立させて設計が行われる。)

2.制約付きH_2コスト最小化問題(他の仕様を満たしながら、H_2コストを最小化する。LQG制御器は、もはや他の仕様を満足しない。)平成11年度は、H_2/H_∞制御、領域極配置、強正実H_2制御器の設計問題について、状態フィードバック、出力フィードバックの両面から研究を行い、以下の結果を得た。1.同時成立問題では、制御器の構造が定まる。この制御機構造に基づいて、以下の結果を得た。(a)LMI解と制御器の双方を、共通の、より基本的なパラメータによってパラメトライズした。(b)LMI解のうち、どの部分を拘束し、どの部分を拘束しなくてよいかを明確にした。(c)非拘束部分の自由度を生かしながら二種類の設計法-二段階設計法、多段階設計法-を提案した。2.制約付きH_2コスト最小化問題では、もはや制御器の構造は固定されない。このとき、以下の結果を得た。(a)平方完成によりBMI項をLMI化する方法の提案。(c)準負定二次項の逐次LMI化と反復計算を用いた、LMI非共通解による多目的制御系設計法。二慣性系やEuler-Bernouli梁の数値例でH_2コストに関する保守性を実際に大きく改善することができた。
難治性消化器癌における転移・再発の分子診断と分子標的治療の開発

肝癌の致死的再発を解析した結果、Aurora kinase Bが予測因子となることを見出し、特異的阻害剤が肝癌治療に有効であることを前臨床試験によって実証した。予後不良な肝癌の肉眼形態である多結節癒合型では、幹細胞マーカーEpCAMの発現が高く、予後規定分子であることを示した。正常肝に比較してメチル化と相関し発現低下が認められ、さらに細胞増殖を負に制御する2種類のmicroRNAを同定した。またこれらmicroRNAの標的分子を明らかにした。非癌部におけるCYP1A2の低発現が癌再発に関わることを示した。GSEA解析によって酸化ストレスと有意な相関を認め、酸化ストレスが肝癌の発生に関与する知見であると考えられた。癌幹細胞ではプロテアゾーム依存性が低いことを応用して、ヒト膵癌細胞から癌幹細胞の特性を示す細胞群を抽出した。本細胞群に対して、選択的に殺細胞効果をもつ薬剤スクリーニングに成功した。オミックス解析による分子診断と分子標的治療の開発という2つの視点から消化器系難治癌の診断・治療ツールの開発を目的とする。具体的方法として臨床検体とヒト癌培養細胞を用いて、DNAミクロアレイ、BACアレイによる遺伝子異常の網羅的解析と臨床・病理情報との統合解析、Pre型miRNAライブラリーの遺伝子導入手法、MeDIP-chip解析、miRNA発現解析による癌抑制miRNAの同定などを行い、目的を達成する。臨床情報が明らかで、病理学的解析の行われている約180症例の外科切除標本の癌組織、非癌部組織を用いてcDNAアレイを行った結果、致死的再発に関わる遺伝子として細胞分裂に必須であり、ゲノム不安定性に関与する分裂キナーゼAurora kinase B(ARKB)を同定した。患者予後及び致死的再発に関する因子を臨床病理学的事項を含めて解析した結果、ARKBがもっとも有意な独立因子であった。本遺伝子の発現と臨床標本の免疫染色の結果は有意な相関を示した。さらにvalidation testにおいても同様に有意な遺伝子であることが検証され、肝細胞癌のもっとも重要な予後因子である門脈浸潤に深く関わることも判明した。さらなる解析の結果、ARKB高発現症例ではゲノム不安定性を有していることがCGHマイクロアレイで確認された。このような機能を有するARKBを高発現することにより癌細胞はaggressivenessを獲得するものと推察された。以上の結果はARKBが分子標的になりうることを示唆するものであり、製薬メーカーとの共同研究によりARKB阻害剤による肝細胞癌治療の前臨床試験を行った。その結果、本阻害剤がヒト肝癌細胞株の増殖をARKBの発現に相関して抑制すること、ARKBの作用であるクロマチンタンパク質ヒストンのリン酸化を阻害すること、細胞核分裂が生じるにもかかわらず細胞質分裂を阻害し、細胞死に至らせることなどが明らかとなった。そしてヌードマウスを用いた肝癌細胞株xenograftモデルにおいて腫瘍増殖を抑制することが示され、新しい分子標的薬としての応用が期待された。以上、本研究において肝細胞癌のaggressivenessに関わる遺伝子が同定された。今後、新たなる分子標的治療へと展開したい。今年度は肝細胞癌を中心に研究を行った。切除後に予後不良となる再発を来した肝細胞癌患者の切除標本について網羅的に遺伝子解析を行った。その結果、細胞分裂に必須であるM期キナーゼのAurora kinase Bの高発現が予後不良な再発様式に最も有意に関与することが明らかとなった。また、Aurora kinase B高発現を示す肝癌ではCGH Arrayによる解析の結果、高度なgenetic instabilityが観察され、癌細胞のaggressivenessの要因と考察された。以上の知見を踏まえてAurora kinase Bを分子標的とする研究を展開し、以下のような結果を得た。Aurora kinase Bの阻害剤による培養ヒト肝がん細胞の増殖抑制効果が明らかに認められ、その効果は培養細胞のAurora kinase B発現程度と相関した。また、免疫不全マウスを用いたヒト肝癌皮下移植モデル、肝臓内移植モデルにおいても腫瘍縮小効果、延命効果を認めた。以上、本研究においてAurora kinase Bが新しい予後予測、再発予測のバイオマーカーになるとともに、有望な分子標的であることを示した。また、肝細胞癌は高率に多中心性発癌を生じ、このことが高い再発率の主因でもある。そこで切除標本の非癌部の網羅的遺伝子解析と再発データを統合的に検討して、再発にかかわる非癌部由来の遺伝子を同定することを試みた。その結果、7遺伝子が選択され、これらの組み合わせによる再発予測が臨床的、病理的予測を凌駕した。

癌部についても同様の手法で検討し、6遺伝子の組み合わせが臨床的、病理的再発予測を上回ったが、上述した非癌部の遺伝子発現パターンが癌部のそれより優れていた。本知見は発癌予知、発癌予防に繋がる可能性を示すものであり、今後、validation testを行う予定である。肝癌、膵癌について研究を行った。I.肝癌(1)3型に分類される肝癌の肉眼形態が予後に深くかかわることから、それらの遺伝子発現プロファイルをDNAマイクロアレイにて解析した。その結果、予後不良な肉眼形態である多結節癒合型ではstem cell markerのひとつでもあるEpCAMの高発現を認め、かつ有意な予後規定分子であることを明らかにした。現在、抗EpCAM抗体による分子標的治療に関する研究を進めている。(2)肝切除後の再発症例の遺伝子発現解析から、非癌部のCYP1A2の低発現が再発にかかわることを明らかにした。CYP1A2は酸化ストレスによって発現が抑制されることが知られていることから、酸化ストレスと発癌の関連性を示唆する知見であるとともに、発癌、多中心性再発の分子マーカーであると考えられた。3)核内輸送分子Importin familyの網羅的発現解析によりImportin α1の肝癌部における発現が進行度、予後と相関し、新たな分子マーカー、分子標的となることが示された。II.癌幹細胞がプロテアゾーム活性の低いことに着目し、ユビキチン非依存性プロテアゾーム活性によって分解されるornithine decarboxylaseのプロテアゾーム認識部位degron配列とZsgreenの融合蛋白を発現するレトロウイルスベクターを構築し、ヒト膵癌細胞に導入し、癌幹細胞の特性を有する細胞群を抽出することに成功した。本細胞群(Zsgreen蛍光+)は蛍光-の細胞に比べ強い抗がん剤耐性を示した。一方、種々の検討の結果、Zsgreen+細胞に選択的に殺細胞効果を示す薬剤を得ることにも成功し、in vivoの実験系で研究を進めているところである。I.肝癌1)3型に分類される肝癌の肉眼形態が予後に深くかかわることから、それらの遺伝子発現プロファイルをDNAマイクロアレイにて解析した。2)単一施設における肝切除標本(trainingセット)の遺伝子発現解析から得られたデータを多施設のvalidationセットを用いて検証した結果、背景肝におけるCYP1A2低発現が再発のハイリスクであることを明らかにした。CYP1A2は酸化ストレスによって発現が抑制されることから、酸化ストレスと発癌の関連性を示唆する知見であるとともに、CYP1A2が発癌、多中心性再発の分子マーカーであると考えられた。
高原子価錯体における各種気体分子の取り込み反応とその活性化反応

1ニトロシル錯体(〔Ruce(NO)(py)4〕【J^(2+)】)から酸素原子を配位する錯体(〔Ruce(o)(py)4【J^+】)が生成する過程を電気化学的手法により検討した。その過程は次の3段階にわけて記述できる:(1)式は既知の酸塩基反応であり、(3)式は単純な一電子反応である。それに対し(2)は検討の結果極めて復雑で酸化時の温度に依存する反応であることがわかった。すなわち室温では【〔Ru^(II)-NO_2〕^+】の電極酸化により直ちに【〔Ru^(II)-NO^+〕^(2+)】と【〔Ru^(III)-OH〕^(2+)】がほゞ等しい割合で生成する。酸化反応に要した電子数は約1.3であった。これに対し-40°CではMeyerの機構(Inarg・Chem,19,1986,'80)に対応し【〔Ru^(III)-NO_2〕^(2+)】が【〔Ru^(III)-ONO〕^(2+)】へ異性化する反応を径由し最終的に【〔Ru^(II)-NO^+〕^(3+)】と【〔Ru^(III)-ONO_2〕^(2+)】を生成する1.5電子反応であった。前者の1.3電子反応は既知の研究にはないもので新らしい別の酸化機構が存在する事を意味する。なおこの様な配位状態にある【NO(^-_2)】の酸化反応の第一段階が金属サイトの電子移動(【Ru^(II)】→【Ru^(III)】)であることを合成化学的手法により明らかにすることが出来た。2上記の酸素錯体(【〔Ruce(o)(py)_4〕^+】)における活性酸素のアルコール中における化学挙動を明らかにした。反応は先づ一電子還元種としてのヒドロキソ錯体(【〔Ru^(III)ce(OH)(py)_4〕^+】)を生成し、次にアルユキソ錯体(【〔Ru^(III)ce(OR)(py)_4〕^+】)が生成する。活性酸素はヒドロキソ錯体にとり込まれているがアルユキソ錯体には保持されていない事が【^(18)O】を用いる実験から明らかになった。3上記の酸素錯体と【SO_2】,NOおよび【NO(^-_2)】との反応は検討中である。4【SO(_3^(2-))】-を取り込んだ錯体(【〔Ru(SO_3H)_2(bp)_2〕】)の結晶構造解析は終了している。
終神経が介在する二酸化炭素からの忌避行動の神経基盤

化学感覚が引き起こす生得的な誘引・忌避行動は、刺激に応じて適切な行動を生み出す感覚神経回路メカニズムを理解する上で強力なモデルである。申請者は、脳全体の神経活動マッピングが可能なゼブラフィッシュ稚魚を用いて、稚魚に行動を誘起する化学物質の探索を行い、頭部への二酸化炭素(CO2 )刺激が強い忌避行動を誘起すること、この忌避行動は終神経が介在することを発見した。そこで本研究課題では、化学感覚系としての終神経の機能解析を通して、感覚入力から行動出力に至るCO2忌避行動の神経回路メカニズムを明らかにすることを目的とする。本研究実績は、2018年1月にCell Reportsに論文を発表した。Terminal nerve GnRH3neurons mediate slow avoidance of carbon dioxide in larval zebrafish.Koide T, Yabuki Y, Yoshihara Y.Cell Reports(2018) 22(5):1115-1123.これまでに、終神経に発現するCO2受容体遺伝子を明らかにするため以下の実験に取り掛かっている。終神経にGFPを発現するトランスジェニックフィッシュ系統のGFP陽性細胞をFACS装置で回収し、RNAシークエンスを行う予定である。現在の終神経にGFPを発現するトランスジェニック系統は、必ずしも特異的に終神経だけに発現しているわけではなく、他の領域にも発現が認められる。そこで、現在、改めて複数系統の終神経にGFPを発現するトランスジェニックフィッシュ系統の作成を行っている。出来次第、神経に特異的なRNAの発現プロファイルをもとにして、遺伝子リストの上位からCO2受容体候補遺伝子のcDNAプローブを作成し、終神経に発現していることを確認し、CO2受容体遺伝子の分子実体を明らかにする。昨年4月、理化学研究所から現勤務先の帝京科学大学に異動し、実験室のセットアップと平行しながら研究をすすめている。そのため現在までの進捗状況は、やや遅れているものの、概ね順調といえる。CO2受容体遺伝子の同定は、本研究の主要な目的であり、その後に機能解析が待っている。特に、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法を用いてCO2受容体欠損変異体の作成、さらには、CO2受容体およびGnRH受容体のゲノム領域にGal4を挿入したトランスジェニックフィッシュを作成し、解析を進めていく予定である。当該助成金が生じたのは、次年度、購入予定の必要試薬類のためである。
マウス初代培養細胞を用いた膵管がんの遺伝的再構成

膵発がんにおいてはKrasの活性化変異が最も初期の変化であり、その後に様々ながん抑制遺伝子の機能的失活が起こる。我々は以前マウスの腸管オルガノイドでApcをノックダウンすることでは直接発がんが誘導可能であることを報告したが、今回同様の手法を膵臓オルガノイドに適用した。具体的にはLSL-KrasG12Dマウス由来の膵臓オルガノイドに対しレンチウイルスでCreを導入して組み換えによりKrasG12Dアレルの発現を誘導し、がん抑制遺伝子に対するshRNAを追加導入することで腺癌類似の組織像を呈する皮下腫瘍をヌードマウスに誘導することに成功した。本モデルは膵癌研究の様々な分野での有用性が期待される。膵がんは難治がんであり、発がん機構の解明および革新的な早期診断・治療法の確立が喫緊の課題である。膵がんで頻度の高い遺伝子異常を膵臓特異的に再現した遺伝子改変マウスが疾患モデルとしてこれまで汎用されてきており、これまでに、膵がんモデルとして膵臓特異的なKras変異マウスが多数作成されている。Kras変異は、単独の場合は先天的に誘導されたものでも腫瘍形成には時間を要すること、しかしp53やp16などの主要ながん抑制遺伝子のノックアウトマウスと交配することで腫瘍化が大幅に促進化されること、などが明らかにされてきた。しかし、これら動物モデルを用いた解析は生理的な環境における発がんを忠実に再現する利点がある一方で、上皮と間質に含まれる複数の細胞腫間の複雑な相互作用を分離して解析することが技術的に困難な点、またマウスの作成に時間と労力を要する点などが問題とされてきた。本研究では、より単純な方法、すなわちマウスの膵管上皮初代培養細胞とレンチウイルスによる遺伝子導入のみにより、短期間で発がん過程が再現可能であることを明らかにした。上皮細胞への体細胞変異をin vitroで模倣した場合でも発がん性に関しては個体レベルでの解析と同様の結果が得られたことから、上皮細胞における遺伝子変異の蓄積が膵臓がんの発がん過程を促進する主要な要素であることが強く示唆されると同時に、細胞レベルの簡便かつ迅速な膵管発がんモデルとして本モデルは有用な実験系になると考えられる。本研究で作成された細胞レベルの膵発がんモデルは、従来技術的に困難とされた早期病変の詳細な解析に道を開くものであり、発がん機構の解明のみならず早期診断マーカーの開発にも資する成果と考えられる。また、任意の遺伝子異常を擁する膵がん細胞株を短期間で作成可能なことから、治療標的の探索や分子標的治療薬候補物質の評価系としての利用にも応用が期待される。これまでに、膵がんモデルとして膵臓特異的なKras変異マウスが多数作成されてきたが、我々は膵癌研究に新たな切り口を提供することを目的に、本研究でオルガノイドによるin vitroの膵発がんモデルの確立を行った。具体的には、マウスの膵管上皮初代培養細胞に対するレンチウイルスによる遺伝子導入のみにより、短期間で膵発がん過程が再現可能であることを示した。本モデルを用いた解析により、(1)膵発がんにはKras活性化は必要だが十分ではないこと、(2)変異型Krasの存在下では高頻度でKras野生型アレルの消失により腫瘍形成が可能になること、(3)Cre-recombinaseによるKras活性化のタイミングとin vivo/in vitroの違いにより、自然発症した膵癌よりも我々のモデルで作成した腫瘍の方が皮下腫瘍としてはアグレッシブであること、などが明らかとなった。特に(2)に関しては、実際のヒト膵癌においても高率に観察される現象でありながら、これまでそれを自然に再現したモデルは皆無であり、本モデルはがん抑制遺伝子としてのKras野生型アレルの発がんにおける意義の解析を可能とする初めてのモデルとなると考えられる。また、(3)からは実際の膵癌の発症には膵臓の微小環境が大きく関与している可能性が強く示唆された。本研究で作成された細胞レベルの膵発がんモデルは早期病変の詳細な解析に道を開くものであり、発がん機構の解明のみならず早期診断マーカーの開発にも資する成果と考えられる。本年度は研究開始後数ヶ月で所属機関が変更になったために若干の研究の中断があったが、幸い移籍先での立ち上げも順調に進んだ。マウス膵臓上皮細胞の3次元初代培養を最小限の因子で安定的に実行可能な実験条件を見出し、LSL-KrasG12

Dマウスを用いた細胞レベルの膵がんモデルを作成し、個体レベルでの膵がんモデルと同様の結果が得られた事から、本研究は順調に進展していると言える。さらに、得られた膵がん細胞株はヌードマウスの皮下への移植を繰り返す過程で悪性化を顕著に示すことから、Krasをドライバーとする膵発がんに関して悪性化も含めて再現されていると考えられる。ただし、3次元培養においてオルガノイドを維持する祭の培養条件や期間によっては、Kras活性化のみでも発がんが見られてしまい追加で導入したshRNAの効果が判然としない場合がある。そのため、多段階発がんの再現や遺伝子間の相互作用の検出に関しては、実験条件の更なる最適化を行なう必要がある。特に、Kras活性化のみで膵がんの初期病変や前がん病変と同等の組織学的変化が誘導されることを期待しているものの、正常に近い組織像かがんに近い組織像の両極端に分かれた結果となることが多いため、今後初期病変を効率よく再現できるかどうかを指標として条件検討をしていく必要がある。分子腫瘍学本モデルの最大の特徴は、遺伝子改変マウスの作成を経ることなく当該遺伝子異常の膵発がんへの寄与度を簡便に検証可能な点である。そこで、膵がんで変異が報告されていながら遺伝子改変マウスが未作成の遺伝子なために発がんへの関与が未検証である遺伝子異常に関して、積極的かつ迅速に、Kras変異と協調的に発がんを誘導するか検証を今後進めて行く。初年度の成果により、膵発がんがin vitroで再現可能であること、組織学的にも繊維化が強い腺がんの組織型を示すことなどは確認済みであり、新規の膵がんモデルを確立したと考えられる。そこで、得られた腫瘍由来のオルガノイドを用いて多段階発がんの各ステップにおけるシグナル経路の活性化がどのように変化していくかなど追跡していくことにより、膵発がんの分子機構を明らかにしていく。また、本モデルのもう一つの特徴である、上皮のみの集団の解析が容易である点を最大限に利用し、個体レベルのモデルではサンプルが採取しにくい初期小病変相当のオルガノイドの解析にも今後力を入れて行く。さらに、遺伝子異常を追加導入しない場合でも、Kras活性化後の時間経過にしたがい自動的に悪性化が進展しているように見える点については、転写制御におけるある種のポジティブフィードバックループが想定される。その詳細な分子機構を明らかにすべく詳細な解析を行なって行く予定である。年度の途中で所属機関を異動し、研究室を新たに立ち上げた。その結果、動物実験が開始できるまでの準備期間について動物の購入を行なわず、相当する費用の減少につながったため3次元培養に用いるマトリゲル1本とR-spondin1本でほぼ使い切ることになり、4月中に消耗品として使いきる予定である。
エクオール産生と乳がんリスクの関連およびエクオール産生能の規定因子に関する研究

エクオール産生能の規定因子を明らかにするため,尿中エクオール排出と食習慣を中心とした生活環境因子との関連性を評価した。対象は乳がんのケース・コントロール研究参加者の内コントロール424名である。生活習慣に関する質問票および食物摂取頻度調査票により回答を得た。午後2時に部分尿を採取し,尿中ダイゼイン,ゲニスタイン,エクオール,クレアチニンを測定した。エクオールの先駆物質であるダイゼインは大豆食品に含まれるが,soy challenge testを行っていない状態では,エクオール産生能を有しても大豆を摂取していない場合,尿中にエクオールが検出できない。そこでsoychallengeを行った状態に相当すると考えられる尿中ダイゼイン量(10nmol/mg CRE以上)の163名に限定した解析も行った。尿中エクオール検場者は20.0%であった。エクオール排出と体格,婚姻状態,閉経の有無,喫煙,飲酒,運動との関連性は認められなかった。食物摂取頻度調査票をもとに推定した各種栄養素,食品群のうち,乳製品摂取のみ全体および限定した対象で尿中エクオールとの有意な関連性が認められた。尿中エクオール排出者は乳製品摂取量が低かった。エクオール産生と腸内細菌に関する研究では便サンプルを用いて,マイクロアレイによる腸内細菌解析を行い,尿中エクオール産生との関連を調べた。腸内細菌解析は16名が終了した。尿中エクオールが検出された者はこのうち11(68.8%)である。96種類の細菌のうち,尿中エクオール排出と有意な関連性を示した菌はBifidobacterium adlescentis,Clostridium cocleatum,Clostridium perfringenS,Ruminococcus hansenii,Bacteroides fraglisでどれもエクオール排出者に多く検出された。エクオール産生と乳がんリスクとの関連性を評価するため、乳がんのケース・コントロール研究参加者(ケース160名、コントロール455名)の尿サンプルを用い、尿中エクオールおよびダイゼイン、ゲニスタイン等のイソフラボン代謝物を測定した。尿採取はケースでは手術後で乳がん治療開始前、コントロールは乳がん検診受診時においての部分尿を用いている。エクオール測定感度は0.04nmol/mlで、エクオールの尿中同定の有無と乳がんリスクとの関連を計算した。尿中にエクオールが同定された女性はそうでない女性に比べ有意に低い乳がんリスク(OR=0.3)が認められたが、ケースは術中の抗生剤使用によりエクオール産生能が低下した可能性も考えられた。そこで現在、改めて手術前に採取された血清を用いてエクオール測定を行っている。あわせて使用抗生剤の種類によるエクオール産生への影響、手術前後のサンプル比較によるエクオール産生の有無についても評価する予定である。エクオール産生と腸内細菌に関する研究の参加者は現在、一般健康人38名である。アンケート調査にて年齢、身長・体重、既往歴、喫煙歴、飲酒歴、薬剤、サプルメントの使用、便通等の情報を得、早朝尿採取を行った。栄養素、食品摂取量推定には食物摂取頻度調査票を用いた。便採取前の3日間は抗生物質、納豆の摂取を避けてもらい、約2グラムの便を採取した。今後、便サンプルを用いて、マイクロアレイによる腸内細菌解析を行い、尿中エクオール産生との関連を調べる。妊娠中の胎児のエストロゲン環境は将来の乳がんリスクに関与するという仮説がある。妊婦を対象とした縦断研究では、まず母親の尿・血液および臍帯血中のエクオールその他のイソフラボン値を測定しエストロゲン値との関連性を評価した。血中および尿中エクオールの有無と臍帯血中E2,E3は関連性が認められなかった。

96種類の細菌のうち,尿中エクオール排出と有意な関連性を示した菌はBifidobacterium adlescentis,Clostridium cocleatum,Clostridium perfringenS,Ruminococcus hansenii,Bacteroides fraglisでどれもエクオール排出者に多く検出された。
表皮角化細胞の細胞周期制御機構の異常とその臨床応用

表皮角化細胞の細胞周期制御機構の異常を探るため、表皮角化細胞由来の皮膚腫瘍である、有棘細胞癌(SCC)、基底細胞癌(BCC)、ボーエン病(BD)、日光角化症(AK)、脂漏性角化症(SK)、エクリン汗孔腫(EP)、ケラトアカントーマ(KA)において、細胞周期関連遺伝子の発現を検討した。細胞周期関連遺伝子として、p14、p16、p21、p27、SIRT1の5つの遺伝子を選択した。前4者の遺伝子産物は、in vitroではストレスにより誘導され、細胞周期を負に制御する。SIRT1は、寿命延長作用の知られている酵母Sir2の哺乳類におけるホモログで、細胞周期に関与する脱アセチル化酵素である。SCC、BCC、BD、AK、SK、正常表皮の各20例、EP4例、KA3例の合計107例の皮膚腫瘍のパラフィン包埋切片を用い、SIRT1蛋白の発現を免疫組織学検索にて検討した。正常表皮や皮膚良性腫瘍と比較して、SCC、BCC、BD、AKの各腫瘍では高頻度にSIRT1を強発現していた。特にBD20例全例でSIRT1を強発現していた。BCCでは、病変の周辺部で強発現している傾向があった。また、SCCとAKでは、SIRT1の強発現の頻度はほぼ同様でありSIRT1の強発現は、皮膚発癌の初期に生じていることが示唆された。SKでは、陽性細胞の数をみれば全例で強発現していたが、その染色の濃度は悪性腫瘍よりも淡く、腫瘍径が大きくなればより淡くなる傾向が認められた。皮膚悪性腫瘍では高頻度にSIRT1が強発現しており、その強発現は皮膚発癌過程に一役を担っており、皮膚癌を治療する上でSIRT1が一つの標的となり得る可能性が示唆された。表皮角化細胞の細胞周期制御機構の異常を探るため、表皮角化細胞由来の皮膚腫瘍である、有棘細胞癌(SCC)、基底細胞癌(BCC)、ボーエン病(BD)、脂漏性角化症(SK)の皮膚腫瘍において、細胞周期関連遺伝子の発現を検討した。SCC、BCC、BD、SK、正常表皮の各6例、計30例よりRNAを抽出し、細胞周期関連遺伝子の発現を半定量的RT-PCR法にて検討した。SCC、BCC、BDにおいて症例間で共通する遺伝子の発現様式を見出すことはできなかったが、SKにおいてはすべて症例でSIRT1が高発現していた。また、SIRT1によって誘導されうるp27も、SIRT1と同様にすべてのSKで高発現していた。次に、SIRT1とp27蛋白の発現を調べるため、SKと正常皮膚各20例において免疫組織学的検索を行った。RT-PCR法の結果と同様、正常表皮と比較してSKではSIRT1とP27陽性細胞が増加していた。また、両方法に共通して表皮肥厚の程度が軽いSKほどSIRT1とp27の発現が強い傾向がみられた。以上より、SK発症の初期過程にSIRT1とp27の高発現し、表皮角化細胞の細胞周期を負に制御している可能性が示唆された。

表皮角化細胞の細胞周期制御機構の異常を探るため、表皮角化細胞由来の皮膚腫瘍である、有棘細胞癌(SCC)、基底細胞癌(BCC)、ボーエン病(BD)、日光角化症(AK)において、細胞周期関連遺伝子SIRT1の発現を免疫組織学検索にて検討した。SIRT1は、寿命延長作用の知られている酵母Sir2の哺乳類におけるホモログで、細胞周期に関与する脱アセチル化酵素である。SCC、BCC、BD、AK、正常表皮の各20例、エクリン汗孔腫4例、ケラトアカントーマ3例の合計87例の皮膚腫瘍のパラフィン包埋切片を用い、SIRT1蛋白の発現を免疫組織学検索にて検討した。正常表皮や皮膚良性腫瘍と比較して、SCC、BCC、BD、AKの各腫瘍では高頻度にSIRT1を強発現していた。特にBD20例全例でSIRT1を強発現していた。BCCでは、病変の周辺部で強発現している傾向があった。また、SCCとAKでは、SIRT1の強発現の頻度はほぼ同様でありSIRT1の強発現は、皮膚発癌の初期に生じていることが示唆された。昨年度の解析において、皮膚良性腫瘍である脂漏性角化症の発症の初期過程でSIRT1が高発現している可能性を示したが、基本的には皮膚悪性腫瘍では高頻度にSIRT1が強発現しており、その強発現は皮膚発癌過程に一役を担っている可能性が考えられた。
なぜカルシウム拮抗薬が脊髄での抗侵害刺激作用を増強するのか?

我々は、以前にopioid、α_2agonist、benzodiazepineが、痛覚伝達を脊髄レベルにおいて直接的抑制作用のあることを明かにしてきた。その抑制作用のion-channelレベルでの作用機序を解明する一助となる事を期待して、これらの薬剤の脊髄レベルでの鎮痛作用にCa^<++>channel blockerやK^+channel blockerがどのように影響を及ぼすか検討してきた。その結果、behavior testにおいてopioidとしてfentanyl、α_2agonistとしてclonidineの脊髄レベルでの鎮痛作用をCa^<++>channel blockerが増強すること示した。我々は昨年度までにクモ膜下に投与されたL-typeのCa channel blockerがopioid,アルファ2agonist,serotoninの抗侵害刺激作用を相乗的に増強することをbehavior testで示してきた.本年度はこれらをさらに進めて,3,来年度はN-typeのCa channel blockerのcholinergic agonistの抗侵害刺激作用に及ぼす影響,さらにクモ膜下K channel blockerがopioid,α2agonistによる脊髄鎮痛にどのように関与するかについて研究する.我々は、昨年度までにbehavior testによってopioid、α_2agonist、serotonin、cholinergic agonistの脊髄レベルでの抗侵害刺激作用にはCa^<++>channel(特にN-type)が関与していることを明かにしてきた。本年度は、さらにK^+channelがこれら薬剤の脊髄レベルでの抗侵害刺激作用にどのように関与するのか調べた。つまり、以上よりopioidやα_2agonist抗侵害刺激作用にはCa^<++>channelのみならず、K^+channelも大きく関与していることが示された。さらに二剤に対するCa^<++>dependent K^+channel blockerの作用の違いが二剤の作用機序の違いを示唆しているものと考えられた。今年度の結果より、最近各方面で注目されつつあるKCO(K^+channel openner)に抗侵害刺激作用を有する可能性が考えられた。来年度はopioid、α_2agonistの脊髄レベルでの抗侵害刺激作用にKCOがどのように関与するかについて研究する。その抑制作用のion-channelレベルでの作用機序を解明する一助となる事を期待して、これらの薬剤の脊髄レベルでの鎮痛作用にCa^<++>channelb1lockerやK^+channel blockerがどのように影響を及ぼすか検討してきた。その結果、behaviortestにおいてopioidとしてfentanyl、α_2agonistとしてclonidineの脊髄レベルでの鎮痛作用をCa^<++>channel blockerが増強すること示した。
四肢パターン形成におけるWntおよびBMPシグナリング

四肢パターン形成におけるWntファミリーなどの機能を理解するために,主にニワトリ肢芽を用いて以下の点を調べた。マウス肢芽ではWnt-3aはAERで発現していないが,変わりにWnt-10aがWnt-5b,Wnt-6,Wnt-11などと共にAERで発現している。一方,ニワトリ肢芽ではWnt-3aがWnt-10a,Wnt-5aと共にAERで発現し,さらにWnt-10aは外胚葉全体でも発現している。レトロウイルスベクターでマウスWnt-10aを肢芽先端部の間充織で発現させると軟骨形成が阻害され、特に先端部の軟骨分化が抑制された。Wnt-10aの過剰発現ではMsx-1,Fgf-10,Lef-1の発現に影響が見られなかったが,軟骨分化マーカーaggrecanの発現は顕著に抑制され,また軟骨化に先立つ間充織細胞の凝集過程で発現するFrzb-1は,初期(48時間後)には抑制されるが、後期(72時間後)では差が見られなくなる。一方,ニワトリWan-3aを肢芽間充織で過剰発現した時にはこれらの効果が全く見られないだけでなく,Lef-1の発現促進も見られなかった。この原因の1つとしてマウスWnt-3aとニワトリWnt-3aの構造上の相違があり,事実,マウスとニワトリ間でシグナルペプチドの配列が大幅に異なっていることが確認された。ツメガエル初期胚での検定で,ニワトリWnt-3aは効率よく細胞外へ分泌されない可能性が示唆された。マウスWnt-3aはニワトリ肢芽の外胚葉で異所的に発現したとき,FGF-8の発現を誘導しAERを誘導する。この活性はWnt-10aでも認められ,Wnt-3aほど強力ではないが肢芽外胚葉で異所的なFGF-8の発現誘導が見られた。しかし,Wnt-3aは細胞質にβ-cateninを集積することができるが,Wnt-10aではβ-cateninの集積は検出されなかった。従って,Wnt-3aとWnt-10aはそれぞれβ-catenin依存性および非依存性のシグナリング経路で作用し,いずれの経路でもAERマーカーのFGF-8を誘導できることが確認された。