hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテオミクス基盤技術としてのリガンド-情報分子コンジュゲート創製

蛋白質やペプチドなどの生体分子を固体表面に保持するための手法を開発することを本申請課題の目標とした.そのための第一段階として,ペプチドをプローブとして保持したチップ上において,ペプチド-蛋白質相互作用を行うための分析手法を開発した.ここではペプチドをオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートとして調製することによって,疎水性ペプチドであっても水溶液中において取り扱い可能となることを期待するとともに,先行するDNAチップ技術を取り込むことを目論んだ.また,オリゴヌクレオチドコンジュゲートの二重鎖置換能を利用することによって,新しい概念の生体分子間相互作用検出法を実現することも目標とした.リガンドをオリゴヌクレオチドと共有結合することによって,分子間相互作用の特異性が損なわれる恐れがある.そこでオリゴヌクレオチドと共有結合したリガンド分子と,水溶液中のリガンド分子とによる競争標的蛋白質結合実験を行い,生体分子間相互作用能を維持した状態でのリガンド固定法を実現するための基礎的知見を得た.続いて,オリゴヌクレオチド分子が可逆的に二重鎖を形成および解離する性質を利用して,リガンド分子を固体表面上において可逆的に着脱する分子操作法確立を試みた.分子鎖置換における熱力学的最適条件の検討を含め,基礎なデータを収集し,オリゴヌクレオチド分子がコードする情報を用いて生体分子間相互作用の有無を検出する,新しい概念の分析手法を実現した.さらに,リガンド-情報分子コンジュゲートをマイクロリアクター内に導入し,微小空間内における分子鎖置換反応を達成するための予備的検討にとりくんだ.約1cm四方のDNAチップ上にマイクロ流路を組み合わせたマイクロ流体デバイスを作製し,これを用いた生体分子ハンドリングに関する基礎的知見を得た.ペプチドをプローブとして用いて特定の蛋白質を検出する手法の開発に取り組んだ.まず,ペプチドを固体表面に保持する手法を開発した.ペプチドの配向を制御しつつ試料の非特異的吸着を防ぐため,ペプチドと固体表面とを化学合成DNAでつなぎとめることとした.そのために短鎖一本鎖DNAの5'-末端にペプチドを共有結合した化合物Peptide-Oligonucleotide Conjugate (POC)を合成した.同時に,このDNA部分と相補的配列のDNAを固体表面に固定しておき,両者を二重鎖形成させることにより,ペプチドを間接的に固体表面につなぎとめることを試みた.続いて,金表面への非特異的吸着を防ぐ目的で,新しいブロッキング剤APEGを開発した.APEGはポリエチレングリコール分子の両末端にアクリジンを共有結合させた化合物であり,アクリジン環がDNA塩基対間に並行挿入する性質を利用して,POCを足場にポリエチレングリコール層が形成されるものと考えた.POCとAPEGを組み合わせたペプチド保持法の有効性を検証するため,水晶発振子(QCM)を用いて分子構造体形成を追跡した.一本鎖DNAが保持された金チップ上においてPOCが二重鎖形成されるに伴って振動数変化が観測された.さらに,この振動数変化が飽和した段階からAPEGを加えて行ったところ,再び振動数低下が観測された.十分に振動数が低下した段階で目的蛋白質を与えると,再び振動数低下が観測された.この振動数低下は,ペプチドと相互作用しないことがわかっている別の蛋白質を加えた際には観測されなかった.以上から,金チップ上においてPOCとAPEGを組み合わせた構造体を用いることによって,ペプチド-蛋白質相互作用を特異的に観測可能であることが示された.蛋白質やペプチドなどの生体分子を固体表面に保持するための手法を開発することを本申請課題の目標とした.そのための第一段階として,ペプチドをプローブとして保持したチップ上において,ペプチド-蛋白質相互作用を行うための分析手法を開発した.ここではペプチドをオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートとして調製することによって,疎水性ペプチドであっても水溶液中において取り扱い可能となることを期待するとともに,先行するDNAチップ技術を取り込むことを目論んだ.また,オリゴヌクレオチドコンジュゲートの二重鎖置換能を利用することによって,新しい概念の生体分子間相互作用検出法を実現することも目標とした.リガンドをオリゴヌクレオチドと共有結合することによって,分子間相互作用の特異性が損なわれる恐れがある.そこでオリゴヌクレオチドと共有結合したリガンド分子と,水溶液中のリガンド分子とによる競争標的蛋白質結合実験を行い,生体分子間相互作用能を維持した状態でのリガンド固定法を実現するための基礎的知見を得た.続いて,オリゴヌクレオチド分子が可逆的に二重鎖を形成および解離する性質を利用して,リガンド分子を固体表面上において可逆的に着脱する分子操作法確立を試みた.分子鎖置換における熱力学的最適条件の検討を含め,基礎なデータを収集し,オリゴヌクレオチド分子がコードする情報を用いて生体分子間相互作用の有無を検出する,新しい概念の分析手法を実現した.さらに,リガンド-情報分子コンジュゲートをマイクロリアクター内に導入し,微小空間内における分子鎖置換反応を達成するための予備的検討にとりくんだ.約1cm四方のDNAチップ上にマイクロ流路を組み合わせたマイクロ流体デバイスを作製し,これを用いた生体分子ハンドリングに関する基礎的知見を得た.
オセアニア地域住民の成人病ハイリスクに関する遺伝生態学調査研究

アジアから先史時代に移住・拡散したオセアニア島嶼集団は、アジア人の遺伝形質を保持しながらも、遠洋航海を伴う移住過程とその後の新環境への適応過程で頻発したと考えられる飢餓などにより淘汰がかかり、潜在的に肥満・糖尿病などの成人病(生活習慣病)のリスクが高い遺伝形質をもつ。現実に多くの集団で肥満および成人病が大きな健康問題になっている。オセアニア島嶼集団は遺伝的に大きく2つのグループに分けられ、多くの疫学研究は、その1つの集団(AN集団)に肥満・成人病の頻度がとくに高いことを明らかにしてきた。本研究課題は、遺伝形質と生態学的特性を密接に関連づけ、肥満・糖尿病をはじめとする成人病リスクが高いものの集団間差が大きいAN集団から6集団を選定し、成人病発症にかかわる遺伝形質と生態学的特性の関連性の解明を目的とした。トンガ集団のBMIは「肥満」のカテゴリーに入り、またウエスト囲/ヒップ囲は加齢とともに増加する傾向がみられた。糖尿病および糖耐能異常の有無と肥満の指標(BMI、ウエスト囲など)には有意な関連がみられ、とくに腹部の脂肪が糖耐能異常のリスクとなっていることが示唆された。インドネシアの2集団のBMI平均値はトンガ集団にくらべて著しく低く、「肥満」は1名(0.2%)のみであった。空腹時血糖値と肥満の指標には有意な相関はみられなかったものの、収縮期・拡張期血圧との間に関連がみられ、成人病のリスクが連関性が示唆された。ソロモン諸島の3集団は近代化の程度が異なる2集団(メラネシアン)と遺伝的に異なる1集団(ミクロネシアン)から構成されている。BMI平均値はインドネシアより高く、トンガ集団よりは低く、男性は「標準」の上限、女性は「過体重」に分類された。尿試験紙結果は、近代化の程度が低い集団は伝統的な食生活を維持していること、また遺伝的背景と食生活の近代化の相乗作用の反映が示唆された。本年度は、計画どおりトンガ王国において集中調査を行うとともに、インドネシアにおいて予備調査を行った。トンガ王国の首都近郊に位置するコロバイ地域において、住民の居住歴を含む基本情報の把握とともに、集中的な健康調査を実施した(代表者、5名の分担者、及び2名の協力者)。健康調査は、18歳以上の住民228名(平均年齢45.1歳)に対し、生体計測、血圧測定、エネルギー代謝、経口糖負荷試験、採血、採尿、食習慣調査などを行った。血液試料などは現在も分析中であるが、現時点で明らかになっている主要な成果は以下のとおりである。Body Mass Index (BMI:体重(kg)/身長(m)^2)の平均値は男性で30.4、女性で33.6であり、女性で有意に高かった。男性の平均値も、WHOによる「肥満」(obesity)のカテゴリーにはいっていた。胴囲/腰囲の平均値は男性で0.94、女性で0.90であり、年齢とともに増加する傾向がみられた。2型糖尿病の割合は対象者の5.7%であり、空腹時血糖試験および75g糖負荷後2時間値から糖尿病と判断されたのは6.1%、それ以外で糖耐能異常を示したのは10.5%であった。糖尿病および糖耐能異常の有無とBMI、胴囲、胴囲/腰囲等の肥満の指標には有意な関連がみられ、特に腹部の脂肪が糖耐能異常のリスクとなっていることが示唆された。

当初(計画調書作成段階)は、平成15年度にインドネシアのアンボン地域とジャヤプラ地域での調査を予定していたが、同国の政情不安と平成15年度に総選挙が行われるため、同国における調査を平成14年度にスンバ地域で行うことが適切と判断し、インドネシアでの調査経験が豊富な分担者の石田が予備調査を行い、平成14年度にスンバの2地域で調査を実施する準備を整えた。本年度は、インドネシアのスンバ島において、昨年度に行った準備に基づき、集中調査を実施した(代表者、5名の分担者、及び4名の協力者)。具体的な対象集団は、スンバ島の州都ワインガプ周辺のワトハダンとクタ集団である。この2集団は、ともにオーストロネシアンに属し、本プロジェクト全体における位置づけは、相対的に近代化の影響が小さいことである。なお、ワインガプ所在の保健局および地域の保健所の全面的な協力の下、これらの機関に保管されていた住民の基本情報の提供を得ることができた。集中調査では、生体計測、血圧測定、エネルギー代謝、経口糖負荷試験、採血、採尿、食習慣調査を含む健康調査を行った。対象者は18歳以上の住民とし、ワトハダンは241名(平均年齢36.2歳)、クタは210名(平均年齢38.1歳)が参加した。血液試料などは現在も分析中であるが、現時点であきらかになっている主要な成果は以下のとおりである。Body Mass Index (BMI:体重(kg)/身長(m)^2)の平均値は男性で19.4、女性で19.2であり、昨年度の対象であるトンガ集団の平均値の30.4(男性)、33.6(女性)に比べて著しく低く、トンガでみられた男女差も顕著ではなかった。WHOによる「肥満」のカテゴリーにあたるBMI≧30は1名のみであった。血圧の平均値は収縮期血圧が111mmHg、拡張期血圧が68mmHgであり、年齢との関係をみると、男性の収縮期血圧と拡張期血圧、および女性の収縮期血圧とに正の相関関係がみられた。境界域高血圧以上を示したのは19名であった。空腹時血糖値とBMI、胴囲、胴囲/腰囲等の肥満の指標には有意な相関はみられなかったが、空腹時血糖値が高いものほど収縮期・拡張期血圧が高い傾向がみられ、成人(生活習慣)病のリスクが互いに関連していることが示唆された。この点については、血液生化学分析の結果などとあわせて分析する予定である。本年度はソロモン諸島国において集中調査を行った(代表者、6名の分担者、及び3名の協力者)。同国ウエスタン州のムンダ、パラダイス、ラワキの3村落において、住民の基本情報の把握とともに、生体計測、血圧測定、エネルギー代謝、経口糖負荷試験、採血、採尿、食習慣調査を行った。対象者は18歳以上の住民とし、ムンダは187名(平均年齢45.3歳)、パラダイスは212名(37.2歳)、ラワキは154名(33.3歳)が参加した。BMI平均値は男性で24.7、女性で26.8であり。インドネシア調査の19.4(男性)、19.2(女性)より高かったが、トンガ調査の平均値の30.4(男性)、33.6(女性)に比べると低い結果であった。ソロモン諸島の3地域の尿試験紙結果を比べると、パラダイスの尿pH値は遺伝的背景が等しいムンダにくらべて高く、この村の住民が近代化の影響をあまり受けず、伝統的な食生活を維持していることが示唆された。また全般的に潜血陽性が多かったものの亜硝酸塩や白血球陽性の者は少なく、尿路感染症は低レベルに留まっていると考えられた。ラワキでウロビリノーゲンに性差がみられ女性で高値を示した。この結果は遺伝的背景と食生活の近代化の相乗作用を反映しているものと考えられる。
バイオリアクター技術と生体吸収性ポリマー、自己細胞による心臓人工弁の作成

生分解性ポリマーを応用した組織工学による弁膜組織研究は,新岡らがポリマーと血管細胞の共培養複合体から,羊で肺動脈-弁を再生に成功しているが,当施設で行った「自己骨髄細胞と吸収性ポリマーを用いた再生医工学による肺動脈弁の開発と臨床応用」では、約6ヶ月の生存実験の結果,同手技では肺動脈組織の再生は困難で,移植弁膜組織は肥厚、硬化及び退縮していた.以上より生体内のみでの自己骨髄細胞,ポリマーからなる弁組織の再生は困難であり、バイオリアクターを用いた再生弁の生体内での作成を試みるのが当研究の目的である。すなわち、細胞播種した生分解性組織をバイオリアクターで生体内移植前に数週間in Vitroで培養することによって、培養細胞がポリマーの間隙を細胞と細胞外間質で満たし周囲で立体構築するとこから、物理的強度とポリマーへの細胞の固着が増強される。これにより、生分解性ポリマーが生体内吸収される時の強度低下による弁機能不全の防止と、弁機能を維持しながら弁構造構築の進行を同時にする事が可能であると考えられる。培養過程では、生体内と同環境でかつ弁組織に力学的負荷がかからない培養環境とする目的で拍動性バイオリアクターを用いるが、数週間ごとの培養組織の培養状況、強度、さらに生体移植後の弁組織を経時的に機能的、組織学的検査により評価を行い、自己組織からなる移植生体弁の生体の循環動態内での生理的変化、反応、また将来的な臨床応用の可能性を検討したい。現在の進行状況は実験動物としてビーグル犬の骨髄液を5-10ml採取し,フィコー留法にて単核球成分のみ採取して培養を行いstroma cellを誘導。生分解性ポリマー(一弁つきの肺動脈弁(10X 20mm)に細胞播種後、バイオリアクター内で約4週間、37°Cの培養液による拍動流(圧、流量調整により)により培養を行っている。バイオリアクター内での培養で自己細胞による弁組織形成において形成不全が培養経過中に発生する頻度が多く、十分な強度をもった弁組織形成過程およびポリマー成分の検討を行っています。鋳型となる吸収性ポリマーの種類により、加水分解による吸収速度の調整をしている。ポリマーの種類PGA,PLLAの配合比率を調整し、自己細胞増殖速度に即して消失するポリマーの改善を行っている。清潔操作を徹底し、contaminationによるdrop out数の減少に努力しています。生分解性ポリマーを応用した組織工学による弁膜組織研究は,新岡らがポリマーと血管細胞の共培養複合体から,羊で肺動脈一弁を再生に成功しているが,当施設で行った「自己骨髄細胞と吸収性ポリマーを用いた再生医工学による肺動脈弁の開発と臨床応用」では、約6ヶ月の生存実験の結果,同手技では肺動脈組織の再生は困難で,移植弁膜組織は肥厚、硬化及び退縮していた.以上より生体内のみでの自己骨髄細胞,ポリマーからなる弁組織の再生は困難であり、バイオリアクターを用いた再生弁の生体内での作成を試みるのが当研究の目的である。生分解性ポリマー(一弁つきの肺動脈弁(10×20mm)に細胞播種後、バイオリアクター内で約4週間、37°Cの培養液による拍動流(圧、流量調整により)により培養を行っている。

培養過程では、生体内と同環境でかつ弁組織に力学的負荷がかからない培養環境とする目的で拍動性バイオリアクターを用いるが、数週間ごとの培養組織の培養状況、強度、さらに生体移植後の弁組織を経時的に機能的、組織学的検査により評価を行い、自己組織からなる移植生体弁の生体の循環動態内での生理的変化、反応、また将来的な臨床応用の可能性を検討したい。現在の進行状況は実験動物としてビーグル犬の骨髄液を5-10ml採取し,フィコー留法にて単核球成分のみ採取して培養を行いstroma cellを誘導。生分解性ポリマー(一弁つきの肺動脈弁(10X 20mm)に細胞播種後、バイオリアクター内で約4週間、37°Cの培養液による拍動流(圧、流量調整により)により培養を行っている。バイオリアクター内での培養で自己細胞による弁組織形成において形成不全が培養経過中に発生する頻度が多く、十分な強度をもった弁組織形成過程およびポリマー成分の検討を行っています。鋳型となる吸収性ポリマーの種類により、加水分解による吸収速度の調整をしている。ポリマーの種類PGA,PLLAの配合比率を調整し、自己細胞増殖速度に即して消失するポリマーの改善を行っている。清潔操作を徹底し、contaminationによるdrop out数の減少に努力しています。
新人看護師の臨床実践能力獲得をめざした学習支援システム構築に関する基礎的研究

臨床現場の看護職との協働により、現任教育で有用性の高いeラーニング教材の開発を行い学習成果を明らかにした。プロジェクトメンバーで「手洗い」「点滴作成」の教材作成をした。メンバーの体験としては≪現場の看護を振り返りながら活用可能な教材を考える≫≪自身が新人時代の困った経験を振り返る≫≪日頃の看護実践を振り返り、確実な方法との照らし合わせを行う≫≪教える側の意識や行動を見直す必要性に気づく≫等だった。教材は高評価だったが、eラーニングだけで行う限界も明らかになり、ブレンディッドラーニングを基盤にした教育提供や新人看護師の学習スタイルを活かした学習支援システムの構築が重要であることが示唆された。平成25年度は、「現任教育で有用な教材とITを具体化する」「eラーニング教材を1例作成する」ことを課題とした。臨床現場の看護職と協同するという特徴をいかすために、1医療施設の協力を得て、本研究に関するプロジェクトチームを作成した。実地で指導する先輩自身の実践知や指導上の工夫等を共有して、教材に活かすこともねらい、チームは看護師経験36年目の看護師5名と管理者3名、研究者1名の構成として1回/月研究会を開催した。チームで既存のeラーニング教材を視聴し、現場で有用な教材に関して検討した結果、“視聴時間"“いつ、何を目的に視聴するか"が現場での活用においては重要な要素であることが明らかになった。つまり、丁寧に説明してある長時間の教材は、時間をかけて学ぶにはよいが、現場ではケアの直前等に新人に確認をしてもらうために活用したい、というニーズがありそれに適した教材であることも重要である。作成した教材は、基礎教育では十分な学習経験がないが、就職後は当然にように実施が求められることが多い技術が有用であるということも明らかになった。したがって、検討した複数項目から、本年度は「点滴の作成ー準備編」に決定した。本項目は基礎教育では経験数が少ないものの、現場では早期に求められるが、手順を先輩看護師から十分に教わる機会もないため、見よう見まねでできるようになってきた、というメンバーの新人時代の経験も反映して決定した。その後、メンバー間でストーリー作成、学習項目と視聴覚教材に適した要素を導き、それらに沿って映像化し洗練させた。その他、日本の看護教育においてeラーニングを用いた取り組みは増加傾向にあるが、継続教育において新人看護師を対象とした研究的な展開は数少ない現状が文献検討より明らかになった。また米国の医療施設の視察から、現場における新人看護師支援の現状を把握し、我が国の課題を検討した。平成26年度は、前年度に作成した1つの教材について幅広い看護スタッフからの評価を得て完成させることが目標であった。この目標を達成するために、研究協力施設とのプロジェクトチームの活動を5回実施した。活動では、撮影した映像教材の確認と修正、運用に向けて、教材の評価についての話し合いを重ねた。その結果、施設の実態にあわせた教材(点滴作成、手洗い)が完成した。完成を目指した活動として、1部署で指導するスタッフの視聴、2新人研修での仮運用を行った。その結果、部署のスタッフからは「自分達の実践の振り返りになる」「個人情報の観点から、被写体の氏名等は見えないほうがよい」「10分程度という時間はちょうどよい」等の意見が聞かれ、新人看護師からは「実際に部署で使われている物品、手順、環境で映像が進行していくため、イメージがしやすかった」という意見が多くあり、好評価だった。いくつかの改善点をもとに、映像を完成させた。今回の研究の1つの特徴は、現場で管理者ではないが指導的立場に立つ経験年数の比較的浅い看護師とともにプロジェクトチームをつくり、教材作成を行うことがあげられる。したがって、現場で活用可能な教材が完成するまでのプロセスをプロジェクトチームに参加した看護師の体験を分析し、第34回日本看護科学学会学術集会(名古屋)の示説で発表した。開発プロセスと看護師の体験としては、≪現場の状況を振り返りながら活用可能な教材を考える≫≪メンバー自身が新人時代の経験の困った経験を振り返る≫≪自身の日頃の看護実践を振り返り、確実な方法との照らし合わせを行う≫≪教える側の意識や行動を見直す必要性に気づく≫等があった。このような教材作成を行った結果、施設にあわせた教材作成ができるメリットもある一方で、技術的、時間的な側面から課題もあることが見えてきた。また平成27年度の教材評価(質問紙)に向けた準備を行った。本研究課題の目的は、臨床現場の看護職との協同により、現任教育での有用性が高いeラーニング教材の開発を行い、その学習効果を明らかにすることである。最終年度は、主に作成した教材を実際に運用し、学習効果を測定した。平成2526年度に36年目の役職のない看護師6名、役職のある看護師3名、研究者が加わり10名でプロジェクトメンバーを立ちあげ、9回のプロジェクトにより「手洗い」と「点滴作成」に関する教材を作成した。実際には、この2つの教材を統合し、1つの教材とした。作成した教材を研究者と共にeラーニング教材を作成した1医療施設の点滴作成に関する研修で使用し、学習効果を測定した。研究対象者は、研修に参加した新人看護師31名、無記名自記式質問紙調査への回答を求めた。質問紙の構成は、全16項目であり、個人背景と学習経験(2項目)、演習に対する認識(1項目)、演習内容の到達度と実行可能性(2項目)、教材評価(4項目)、学習スタイル(7項目)および自由記載とし、質問紙は研究者らで作成した。

流れとしては、研修の説明→研究の説明ー研究者(5分程度)→アンケート(1枚目)への記入→研修の実施ーうち約10分の視聴覚教材を使用→アンケート(2枚目)への記入であった。結果:回収数(30:回収率96.7%)、有効回答率(28:有効回答率93.3%)であり、作成した教材は受講者が理解できた割合が高く視聴時間(プロジェクトメンバーの議論により10分以内として作成した)も適切であるという評価であった(いずれも8割以上)。実際に点滴作成をする前に視聴したいという割合も高かったが、研修で印象に残っていることは実技が最も高かった。eラーニングだけではなく実技との併用をしたブレンディドラーニングを基盤にした教育機会の提供や新人看護師の学習スタイルを活かした学習支援システムを検討することが重要であることが示唆された。臨床現場の看護職との協働により、現任教育で有用性の高いeラーニング教材の開発を行い学習成果を明らかにした。プロジェクトメンバーで「手洗い」「点滴作成」の教材作成をした。メンバーの体験としては≪現場の看護を振り返りながら活用可能な教材を考える≫≪自身が新人時代の困った経験を振り返る≫≪日頃の看護実践を振り返り、確実な方法との照らし合わせを行う≫≪教える側の意識や行動を見直す必要性に気づく≫等だった。教材は高評価だったが、eラーニングだけで行う限界も明らかになり、ブレンディッドラーニングを基盤にした教育提供や新人看護師の学習スタイルを活かした学習支援システムの構築が重要であることが示唆された。研究実績の概要でも示したように、平成26年度は1つの教材について洗練させて完成させることであったため、その目的は十分達成されている。さらに、eラーニングを現場で導入するうえでの課題や教材作成についての課題も同時に明らかになり、予定通りに進んでいる。看護教育学当初の予定通り、平成27年度は作成した教材を実際に運用して、学習効果を測定する。一方で、eラーニングという学習支援だけでは新人看護師の臨床実践能力の獲得には限界もあることが明らかになってきているため、その限界を明確にしていくことが1つの課題である。それを踏まえて、eラーニングのメリットをいかした現任教育において新人看護師の臨床実践能力を向上させるための方略と、他の支援方法・内容のあり方について、多岐にわたる視点から検討していくことを課題とする。研究実績の概要に示したように、平成25年度の目的はほぼ達成できている。これには、医療施設との研究会も定期的に実施し活発な討議がされていることも大きな要因である。映像化に関しては、チームメンバーは被写体になることはあるが、撮影や編集等を専門業者に委託することにより予定通りに進捗できているものと思われる。海外の文献検討については、収集は完了し、引き続き分析をしているところである。また、米国視察は当初明確には予定していなかったが、新人看護師の臨床実践能力獲得を促進するための方略を幅広く検討するためには重要な側面であるとの考えにいたり、遂行した。このことにより、より明確に本研究で取り組むべき課題が明らかになった。以上の理由から、おおむね順調に進呈していると評価する。
細胞内主要ＡＴＰ分解酵素ＶＣＰの機能とその調節機構の解析

本研究では、VCPと呼ばれる細胞の主要なATPaseが果たす細胞・生体での生理的な役割と病態での役割との解析を行い、VCPによるATPの消費を抑制することはATPの重要な節約手段になること、飢餓状態で、VCPはファイバー様の構造物となり、自身のATPase活性を抑制すること,新規に開発したVCPのATPase阻害剤KUSは、VCPの細胞機能を阻害せずにVCPによるATPの消費(浪費)を抑制する働きがあり、ストレス下でのATPの消費を抑制することで細胞を保護する作用があること、KUSの投与によって網膜色素変性症および緑内障のモデルマウスの発症及び病態の進行を顕著に抑制できることを明らかにした。ヒトは一日あたり体重に相当する重さのATPの合成と分解を行っており、ATPとATPaseは、生物(細胞)の活動になくてはならないものである。ATPaseの中で最も豊富に存在するのが、VCPと呼ばれるATPaseであるがその機能はよく解っていない。本研究では、VCPが果たす細胞・生体での生理機能及び神経変性を初めてとする病態での役割とその調節機構を解明することを目的とし、以下の諸点を明らかにした。1)飢餓時でのVCPファイバー形成の役割・意義の解析:本研究では、培養細胞を飢餓時にするとVCPが細胞内で特殊な線維状の構造をとることを見いだした。このVCPファイバーの形成にはビメンチンとチュブリンが必要であり、VCPファイバーを形成した細胞では、ATPの消費が抑制されていることが観察され、このVCPファイバーの形成はVCPのATPase活性を素早くシャットダウンする飢餓に対する反応であることが示唆された。さらに、血清中の脂質成分の欠乏がVCPファイバーを誘導していることを明らかにした。2)ATP産生におけるVCPの役割の解析:VCPをノックダウンした細胞では、細胞外のグルコースを有効に利用できないことを見いだした。少なくともグルコース細胞内への取り込みにVCPが必須であることを明らかにした。3)ショウジョウバエのsiRNA発現ラインのスクリーニングを行い、ポリグルタミンの蓄積時でVCPの下流でリン脂質の低下に関与する候補遺伝子を数個同定した。4)VCP阻害剤の疾患モデルでの効果の解析:我々の開発したVCP阻害剤には、網膜の神経節細胞をNMDAによる興奮毒性から保護する作用を有することを見いだした。網膜の神経節細胞は、緑内障で特異的に傷害を受ける細胞であり、これらの薬剤が緑内障の予防薬のシーズとなる可能性が示唆された。本研究では、ATPaseの中で最も豊富に存在するVCPが果たす細胞・生体での生理機能及び神経変性など病態での役割とその調節機構を解明することを目的とし、以下の諸点を明らかにした。1)我々が開発したVCPのATPase阻害剤(KUSs:Kyoto University Substances)は、100300nMのIC50でVCPのATPase活性を阻害するが、VCPのノックダウンによって認められる細胞周期の停止、ERADの阻害、細胞死等は全く観察されない。よって、KUSによるVCPのATPase活性の抑制は、VCPの細胞での機能阻害を誘導しないことが明らかになった。2)培養細胞で、VCPは脂肪が欠乏するとファイバー状の構造物を形成し、その時、ATPの消費速度が、20%近く減少する。従って、細胞質でのVCPは、総ATPの消費の20%程度を担っていることが示唆された。3)グルコース除去やツニカマイシン処理時にも、細胞内のATP量の減少が引きこるがその減少をKUSが抑制することを明らかにした。さらに、KUSはグルコース除去やツニカマイシン処理で誘導される細胞死を抑制することを見いだした。4)グルコース除去やツニカマイシン処理で誘導されるERストレスが、KUSのみならずATPや膜透過性のピルビン酸によって抑制される事を見いだした。この結果は、ER内のATPの低下がERストレスを誘導している可能性を強く示唆している。5)ショウジョウバエのsiRNA発現ラインのスクリーニングで、ポリグルタミンの蓄積による神経変性を抑制する2系統のsiRNA発現ラインを得た。この時、VCPの核移行が抑制され、さらにヒストンのアセチル化の低下が抑制されており、これら2つの遺伝子産物がポリグルタミン蓄積時でのVCPの核移行に関与していることが示唆された。

1)飢餓時でのVCPファイバー形成の役割・意義の解析:本研究では、培養細胞を飢餓時にすると形成されるVCPファイバーは細胞内のATPの消費を抑制することに加え、近接する細胞とネットワークを形成し、ATPのやりとりを行っていることを見いだした。即ち、ATPの減少した細胞に回りの細胞がVCPファイバーを有する構造物を介してATPを供給し、その細胞を救っていることが見いだされた。2)ATP産生におけるVCPの役割の解析:VCPをノックダウンした細胞では、細胞外のグルコースを有効に利用できない。この時、グルコースの細胞内への取り込みの抑制が起こると同時に、解糖系からβ酸化へのスイッチが生じていることが示唆された。3)ショウジョウバエのsiRNA発現ラインのスクリーニングで得られたラインの解析を行い、ポリグルタミンの蓄積時で見いだされるリン脂質の低下はVCPの核移行とは独立した事象であることを見いだした。4)VCP阻害剤の疾患モデルでの効果の解析:我々の開発したVCP阻害剤の投与によって、緑内障および網膜色素変性症のモデルマウスの症状の進行が劇的に遅延することが判明した。したがって、VCP阻害剤は緑内障及び網膜色素変性症の治療薬のシーズとなることが示唆された。医歯薬学予定した実験をほぼ順調に遂行し、実験結果が得られている。25年度が最終年度であるため、記入しない。予定した実験をほぼ順調に遂行し、実験結果が得られている。次年度(H24)も予定した実験を順次遂行する予定であり、特に問題となる点は見いだされていない。次年度(H25)も予定した実験を順次遂行する予定であり、特に問題となる点は見いだされていない。
卵白の熱凝固で構築されるゲル様食品の微細構造やレオロジー特性に及ぼす卵黄の影響

卵は,卵黄が有する乳化性と卵白及び卵黄たんぱく質が有する熱凝固性から,多くの食品のレオロジー特性を決定している。30年度は,牛乳配合温度が異なるプディングを試料として,卵白たんぱく質の構造構築への卵黄の影響について,冷却遠心分離による脂質分画とTG量,PL-Pi量の定量,β-MeあるいはUrea処理したSDS-PAGEから検討した。なお,29年度までにより,牛乳配合温度が高いプデイングほど硬く,崩れにくく,きめ細かいことを確認している。プディング液の脂質分画の結果,TGは牛乳配合温度に関わらず上層に多く分画された一方,PL-Piは牛乳配合温度が高いほど上層に多く分画された。このTGとPL-Piが異なる画分への分画と,PL-Piの上層への分画は,卵黄LDLの表面たんぱく質の変性によるLDLの構造変化の結果と考えられた。プディングの脂質分画では,TGは上層に分画されにくくなったが,牛乳配合温度が高くなるほど上層に多く分画された。また,PL-Piは8000rpmでは上層に,16000rpmでは下層に多く分画され,また,牛乳配合温度が高くなるほど,上層に多く分画された。PL-Piはリン脂質の構成成分であり,たんぱく質とも脂質とも親和性を有することから,焼成によって,卵白たんぱく質との結合が優位になるものの,牛乳配合温度が高い場合はその結合が緩やかになることが示された。プディングのSDS-PAGEでは,オボアルブミンのバンドがβ-Me処理で濃く観察され,Urea処理ではほぼ認められず,また,β-Me処理で認められたオボアルブミンのバンドの濃度は牛乳配合温度が高いほど低くなった。以上より,牛乳配合温度が高い場合は,卵黄LDLの表面たんぱく質の熱変性により,卵白たんぱく質との相互作用が抑制され,結果,卵白たんぱく質同間の構造構築が十分となり,テクスチャーに影響することが示された。しかし,卵の物理的・化学的複雑さから,レオロジー特性がどのような機構により決定されているのかは不明である。28年度は,その構造構築が卵白たんぱく質の熱凝固によってなされるカスタードプディングを試料とし,牛乳温度のプディング液や焼成後のプディングのレオロジー特性等への影響を検討した。プディング液の動的粘弾性測定の結果,温度依存性測定では,牛乳温度が高いほど4050°C付近のG"の上昇温度が高くなり,粘性要素の高い温度領域が狭かった。応力依存測定では,線形領域は20°Cでは牛乳温度が高いほど広く,85°Cでは牛乳温度が高いほど狭かった。また,牛乳温度が高いほどG',G"の値は大きく,応力の増加による低下も大きかった。周波数依存測定は,20°Cでは牛乳温度が低いほどtanδが弓なりの挙動となったが,85°Cでは牛乳温度による著しい差は認められなかった。粒度分布測定の結果では,牛乳温度が低いと超音波処理時間による粒度分布が一致しなかったが,高いと一致した。焼成後のプディングのテクスチャー測定では,牛乳温度が高いほど破断強度は高くなったが破断歪は一定であり,官能評価では,牛乳温度が高いほうが硬く,崩れにくく,きめこまかいと評価された。走査電子顕微鏡観察では,牛乳温度が高いとなめらかで均一な構造であるとされた。以上より,牛乳温度の高いプディング液は,安定性が高く,加熱過程でG"の占める割合が小さいまま焼成され,G',G"ともに高いプディングとなること,結果として硬く崩れにくいテクスチャーとなることが示され,この要因として,牛乳温度が低い場合は卵黄LDLが卵白たんぱく質の構造構築を妨げるのに対し,牛乳温度が高い場合はLDL表面のたんぱく質が変性,凝集等を生じさせることが推察された。本研究は、「卵白タンパク質の熱凝固による構造構築」「卵黄の構造構築への影響」「構築された構造のテクスチャーへの寄与」を明らかとすることを目的としている。28年度は、カスタードプディングを試料として、加熱によるゲル形成機構における卵黄の熱凝固の影響を検討し、「研究実績の概要」に記述したように多くの結果を得ており、おおおむね順調に進展していると判断できる。卵は,卵黄LDLが有する乳化特性と卵白たんぱく質が有する熱凝固特性から,その配合は多くの食品の調理加工過程での構造構築に影響する。29年度は,28年度に引き続きカスタードプディングの構造構築への影響を検討するとともに,加熱時に内部からの圧力で膨化し多孔質構造となるパンおよび揚げ物の衣の構造構築へ卵黄の影響を検討した。すなわち,動的粘弾性測定,走査電子顕微鏡観察,体積測定,テクスチャー測定,官能評価等を行った。以下,パンでの結果を報告する。パン生地の動的粘弾性測定の結果,全卵または卵黄を含む生地のG'および|η*|は50°C付近から低下,70°C付近から急激な上昇を示し,また,全卵を含む生地の40°C,60°Cでの線形領域が狭かった。この加熱過程におけるレオロジー挙動から,卵黄の存在が卵白たんぱく質の熱凝固を抑制,でんぷんの糊化開始温度を上昇,糊化時間を短縮させていることが示唆された。

また,卵白を配合したパンと比較して,全卵,卵黄,レシチンを配合したパンの体積,比容積は大きく,SEM観察から,卵白を配合したパンでは,グルテンがでんぷん粒の周囲を密に取り囲み,CO2によって形成された空隙が小さく厚みのある膜で形成されている一方,卵黄やレシチンを配合したパンではでんぷん粒の周囲に空隙を有し,CO2によって形成された空隙は大きく薄い膜で形成されていることが確認された。官能評価においても,卵白を配合したパンは硬く,ふわふわ感に欠けると評価された。以上の結果から,卵白たんぱく質の熱凝固性が加熱時のCO2による体積増加を小さくするものの,卵黄成分(レシチン等)がグルテンやでんぷん粒子表面に存在することで,生地中の水分移行を変化させ,卵白たんぱく質の熱凝固を抑制するとともに,小麦でんぷんの糊化を遅延させ,ドウの進展性とCO2の移動性を確保し,加熱後のパンの性状に影響していることが示された。本研究は、「卵白タンパク質の熱凝固による構造構築」「卵黄の構造構築への影響」「構築された構造のテクスチャー」を明らかとすることを目的としている。29年度は、カスタードプデイング、フライ、パンを試料として、加熱によるゲル形成機構における卵黄の熱凝固の影響を検討し、「研究実績の概要」に記述したように、多くの結果を得ており、おおむねに進展していると判断する。卵は,卵黄が有する乳化性と卵白及び卵黄たんぱく質が有する熱凝固性から,多くの食品のレオロジー特性を決定している。30年度は,牛乳配合温度が異なるプディングを試料として,卵白たんぱく質の構造構築への卵黄の影響について,冷却遠心分離による脂質分画とTG量,PL-Pi量の定量,β-MeあるいはUrea処理したSDS-PAGEから検討した。なお,29年度までにより,牛乳配合温度が高いプデイングほど硬く,崩れにくく,きめ細かいことを確認している。プディング液の脂質分画の結果,TGは牛乳配合温度に関わらず上層に多く分画された一方,PL-Piは牛乳配合温度が高いほど上層に多く分画された。このTGとPL-Piが異なる画分への分画と,PL-Piの上層への分画は,卵黄LDLの表面たんぱく質の変性によるLDLの構造変化の結果と考えられた。プディングの脂質分画では,TGは上層に分画されにくくなったが,牛乳配合温度が高くなるほど上層に多く分画された。また,PL-Piは8000rpmでは上層に,16000rpmでは下層に多く分画され,また,牛乳配合温度が高くなるほど,上層に多く分画された。PL-Piはリン脂質の構成成分であり,たんぱく質とも脂質とも親和性を有することから,焼成によって,卵白たんぱく質との結合が優位になるものの,牛乳配合温度が高い場合はその結合が緩やかになることが示された。プディングのSDS-PAGEでは,オボアルブミンのバンドがβ-Me処理で濃く観察され,Urea処理ではほぼ認められず,また,β-Me処理で認められたオボアルブミンのバンドの濃度は牛乳配合温度が高いほど低くなった。以上より,牛乳配合温度が高い場合は,卵黄LDLの表面たんぱく質の熱変性により,卵白たんぱく質との相互作用が抑制され,結果,卵白たんぱく質同間の構造構築が十分となり,テクスチャーに影響することが示された。29年度は、当初の予定どおり、パンや揚げ物を試料とした実験を行うとともに、28年度に得られたカスタードプディングの結果を補足し、論文発表の準備をすすめる。30年度は、当初の予定通り、カスタードプディング等を試料とした実験を行うとともに、28,29年度に得られた結果を補足し、論文発表の準備をすすめる。
ケロイド発生に関与するＩＬ－６プロモーター領域一塩基多型の同定とその機能解析

ケロイド発生は人種による頻度差が知られており、遺伝要素の関与が推測されている。これまでの研究結果より、ケロイド発生とIL-6遺伝子との関連性が明らかになったことから、臨床的に明らかなケロイドを持つ患者群とケロイドを持たないコントロール群のDNAを用いてIL-6プロモーター領域のSNP(一塩基多型)解析を行った。その結果、IL-6SNP(rs1800796)が、有意に関わっていた(P≦0.05)。特に、ケロイド発生部位が3部位以上の群では、オッズ比5.333、フィッシャーの正解確率法による検定P値は5.349x10ー5で有意な関連性が示唆され、ケロイド体質早期診断や新治療への応用等が期待される。平成24年度に引き続き、1)ケロイド100例と正常例(ケロイドを認めない人)100例の末梢血を収集し末梢血よりゲノムDNAを抽出。2)IL-6プロモーター領域における4つの一塩基多型(SNPs)についてケロイド症例と正常例を対象とした関連解析によりケロイド発生に関わるSNPを同定。3)SNPの結果と臨床データの比較。4)末梢血から得られた血清中IL-6濃度を測定しSNPの遺伝子型ごとに解析した。われわれは、ケロイド発生にIL-6シグナルが関与していることを明らかにしてきた。これまでの研究成果により、Il-6がケロイド感受性遺伝子のひとつになっている可能性が高く、今回は、IL-6プロモーター領域の一塩基多型(SNP)解析を行い、ケロイド発生に関与するSNPを同定し、その機能を明らかにすることを本研究の目的とした。ケロイド100例と正常例(ケロイドになっていない例)54例の末梢血からゲノムDNAを抽出し、IL-6プロモーター領域における4つのSNPsについて、ケロイド症例と正常例を対象とした関連解析によりケロイド発生に関わるSNPを検討した。さらに、SNPの結果と臨床データの比較や、血清中IL-6濃度測定を行い、SNPの遺伝子型ごとの解析を行った。ケロイド症例においてIL-6-572のオッズ比が正常例と比較して高く、さらに、その傾向は重症例において強かった。末梢血中のIL-6濃度に関しては、ケロイド症例と正常例で有意差は認められなかった。IL-6Rにおける一塩基多型についても解析を行ったが、ケロイド症例に特徴的なSNPは認められなかった。本年度は、ケロイドになっていない正常例のサンプル収集に時間がかかり、目標の半分が集まった状況である。時間を要している理由は、正常例は、ケロイド以外の皮膚手術を受けた患者のうち、手術瘢痕の異常を認めない症例を抽出しているためである。引き続き、サンプル収集を行い、上記同様の検討を行っていく。ケロイドは原因不明で動物モデルも確立していない。放置すれば増大して痛みや痒みを伴い患者の苦痛は少なくないため、早期診断・治療が重要である。ケロイド発生頻度は、人種による差があることが報告されており、遺伝子的要素が関与している可能性が高い。われわれは、ケロイド発生とILー6遺伝子の関連性について報告してきた。ILー6遺伝子の一塩基多型とがケロイド発生に関与している可能性が高い。本研究では、ケロイド患者のILー6プロモーター領域の遺伝子解析を行い、平成26年度もサンプル数を増やし、最終的には、日本人におけるコントロール群239例、ケロイド群376例の解析を行った。その結果、IL-6-572C>Gとケロイド発生との間に統計学的有意差を認めた。ケロイドケロイドおよび正常サンプルの収集は、当初の予定数はクリアできたが、統計学的に充分ではないため、追加で、再度サンプル収集を行い解析した。計画通り進んでいるが、正常サンプル収集のみが遅れた。現時点で正常サンプルは100例に達しているので、二回目の解析を急ぐ。解析し比較検討する。(C)トランスフェクト後の正常真皮由来線維芽細胞に、ヒト抗IL-6R抗体やSTI571などの小分子ペプチドを作用させLuciferase活性を測定する。今回注目したIL-6プロモーター領域にあるケロイド発生に関与するSNPをコントロールする新治療薬を検討する。ケロイド症例に有意なSNPが認められたことから、今後サンプル数をさらに増やして確認していく。また、IL-6-572のC→G変化によるケロイド発生への機能的影響について検討していく。さらに、ケロイド体質の早期診断キットやケロイド新治療薬への応用へと発展させていく。サンプル数を予定より増やしたため、収集に時間がかかり、予定していた機能解析に遅れが出たため、その分の研究費が持ち越しとなった。
嗅覚2次ニューロンの多様性に基づいた軸索伸長制御機構

嗅球に伝達された臭い情報は、嗅球に存在する嗅覚2次ニューロンによって中継されて終脳の中枢へと伝達されるが、その神経回路の形成を制御するメカニズムについては、依然として未知の部分が多い。今回、これら嗅覚2次ニューロンの回路形成を制御する分子機構について解析を行った。マウスの嗅球には主嗅球(MOB)、前側副嗅球(aAOB)、後側副嗅球(pAOB)と呼ばれるサブ領域が存在し、それぞれ異なるタイプの臭い情報の入力を受ける。これまでにMOBとAOBの嗅覚2次ニューロンは、まず終脳表層の同じ経路に軸索を伸長して嗅索(LOT)と呼ばれる軸索の束を形成し、その後LOTを経由して、それぞれ異なる終脳領域に投射することが明らかになっていた。まず、これらの嗅球のサブ領域を特異的に蛍光色素ラベルすることで、各サブ領域ごとの軸索の投射経路を可視化した。その結果、それぞれの嗅球サブ領域の軸索は、確かに一つのLOTを形成するが、LOTの内部において走行経路が異なることが明らかとなった。このLOT内部での軸索走行パターンの中には、すでに報告されている幾つかの軸索ガイド分子の発現パターンと良く似ているものがある。そこで次に、これらのガイド分子のノックアウトマウス胚を用いて、嗅球のサブ領域ごとの軸索投射について解析を行った。その結果、Nrp2遺伝子ノックアウトマウス胚では、aAOBとpAOBの軸索投射は大きく乱れるが、MOBの軸索投射はほぼ正常であることが明らかとなった。一方、Slit1,Slit2の遺伝子ノックアウトマウス胚では、MOBの軸索投射は大きく乱れるが、aAOBとpAOBの軸索の走行パターンはほぼ正常であることもわかった。これらの結果は、MOBとAOBの軸索は同じLOTを形成するが、その投射は異なる分子機構によって制御されていることを示唆している。嗅上皮や鋤鼻器といった感覚器で認識された臭い情報は、それらの感覚器を構成する嗅覚1次ニューロンによって、終脳先端にある嗅球へと集められ、嗅球内の嗅覚2次ニューロンに引き継がれる。その後、嗅覚2次ニューロンは終脳表層に軸索を伸長してLateral Olfactory tract (LOT)と呼ばれる軸索の束を形成し、嗅皮質などのさらに高次の神経組織へ臭い情報を伝える。本研究では、マウス胚のLOTを構成する神経軸索を発現分子の異なるサブタイプに分類するとともに、それらの嗅覚2次ニューロンの多様性に注目して、それぞれの神経軸索がLOT内での走行をどのように制御されているのかを明らかにすることを目標とした。まず、LOTを構成する神経軸索を免疫染色法よって複数のサブタイプに分類することに成功した。次に、嗅球の様々な場所を蛍光色素でラベルすることにより、各サブタイプの嗅覚2次ニューロンの細胞体が嗅球のどこに分布しているのかを詳細に解析した。最後に、神経軸索伸長をガイドすることで知られるNetrin-1やDCC、Neuropilinなどの遺伝子を欠失したマウス胚を用いて、それぞれのサブタイプごとに嗅覚2次ニューロンの神経回路形成過程を解析し、サブタイプごとに異なる表現型が生じることを明らかとした。これらの結果は、臭い情報を中継する嗅覚2次ニューロンには多様性が存在すること、その発生運命と神経回路形成機構はある程度まで遺伝学的に決定されていることを示している。本研究により、多くの点で未知のままである、嗅覚2次ニューロンの軸索ガイダンス機構の一端を明らかにすることができたと言える。
頭蓋内胚細胞腫瘍発生機序に関する分子遺伝学的研究

1頭蓋内胚細胞腫瘍発生におけるgenetic backgroundの関与に関する知見を得るために,Y染色体に注目して,そのハプロタイプの詳細な解析を行った.2男性頭蓋内胚細胞腫瘍35症例から血液を採取しgenomic DNAを抽出した.(1)Y染色体上の多型マーカー,YAP,SRY465,47Zについて,PCR-basedにWAVEを用いて解析し,Y染色体ハプロタイプをD(type 2),02b*(type 3),02b1(type 4),および残りのtype 1(Cおよび0のうち02b*と02b1以外のハプロタイプ)に分類した.(2)男性頭蓋内胚細胞腫瘍患者35例のY染色体ハプロタイプは,type 1=12例(34%),type 2=13例(37%),type 3=2例(6%),type 4=8例(23%)であった.これは健常日本人におけるハプロタイプ分布と同様であった.結論.Y染色体ハプロタイプによって頭蓋内胚細胞腫瘍発生頻度に差がみられるのではないかという仮説は否定的であったが,type 1/2のハプロタイプに予後不良群の頻度が高い傾向が示唆された.1頭蓋内胚細胞腫瘍発生におけるgenetic backgroundの関与に関する知見を得るために,Y染色体に注目して,そのハプロタイプの詳細な解析を行った.2男性頭蓋内胚細胞腫瘍35症例から血液を採取しgenomic DNAを抽出した.(1)Y染色体上の多型マーカー,YAP,SRY465,47Zについて,PCR-basedにWAVEを用いて解析し,Y染色体ハプロタイプをD(type 2),02b*(type 3),02b1(type 4),および残りのtype 1(Cおよび0のうち02b*と02b1以外のハプロタイプ)に分類した.(2)男性頭蓋内胚細胞腫瘍患者35例のY染色体ハプロタイプは,type 1=12例(34%),type 2=13例(37%),type 3=2例(6%),type 4=8例(23%)であった.これは健常日本人におけるハプロタイプ分布と同様であった.結論.Y染色体ハプロタイプによって頭蓋内胚細胞腫瘍発生頻度に差がみられるのではないかという仮説は否定的であったが,type 1/2のハプロタイプに予後不良群の頻度が高い傾向が示唆された.1.頭蓋内胚細胞腫瘍症例の手術サンプルおよび家族からのgenomic DNAの収集を行った.2.本課題の研究の手始めにまず,Y染色体に注目して,そのハプロタイプの解析を行った.3.男性頭蓋内胚細胞腫瘍35症例から血液を採取しgenomic DNAを抽出した.(1)YAP, SPY465,47Zを用いてY染色体のハプロタイプをD(type 2),02b*(type 3),02b1(type 4),および残りのtype 1(Cおよび0のうち02b*と02b1以外のハプロタイプ)に分類した.PCRの手法での多型解析およびWAVEの手法を用いた.健常日本人のY染色体ハプロタイプの比率はtype 1=40%,type 2=30%,type 3=10%,type 4=20%と報告されている.(2)男性頭蓋内胚細胞腫瘍患者のY染色体ハプロタイプはtype 1=12例(34%),type 2=13例(37%),type 3=2例(6%),type 4=8例(23%)であった.(4)Type 1/2のハプロタイプに予後不良群の頻度が高い傾向が示唆された.1頭蓋内胚細胞腫瘍発生におけるgenetic backgroundの関与に関する知見を得るために,Y染色体に注目して,そのハプロタイプの詳細な解析を行った.2男性頭蓋内胚細胞腫瘍35症例から血液を採取しgenomic DNAを抽出した.(1)Y染色体上の多型マーカー,YAP, SRY465,47Zについて,PCR-basedにWAVEを用いて解析し,Y染色体ハプロタイプをD(type 2),02b*(type 3),02b1(type 4),および残りのtype 1(Cおよび0のうち02b*と02b1以外のハプロタイプ)に分類した.(2)男性頭蓋内胚細胞腫瘍患者35例のY染色体ハプロタイプは,type 1=12例(34%),type 2=13例(37%),type 3=2例(6%),type 4=8例(23%)であった.これは健常日本人におけるハプロタイプ分布と同様であった.3 Y染色体ハプロタイプによって頭蓋内胚細胞腫瘍発生頻度に差がみられるのではないかという仮説は否定的であったが,type 1/2のハプロタイプに予後不良群の頻度が高い傾向が示唆された.
腸管上皮幹細胞初代培養を用いた炎症性腸疾患における幹細胞病態解明と新規治療薬開発

代表的な消化管疾患である大腸癌や炎症性腸疾患は上皮細胞の異常により生じることが主要な病態として考えられており、Wntシグナル亢進、Notchシグナル亢進など、上皮細胞の分化制御機構の破綻が様々な腸疾患の病態と関連することを当教室では明らかとしてきた。しかしながら、幹細胞自体の制御機構破綻については未だ明らかではなく、特に炎症性腸疾患による幹細胞形質への影響については全く解析されていない。そこで本研究では、ヒト腸管上皮細胞オルガノイドを用いて幹細胞可視化を試み、幹細胞機能を動揺させる化合物を同定し、炎症性腸疾患の新規治療薬を開発することを目的とする。当研究室では初代培養系を用いて体外炎症性疾患疑似モデルの確立に独自に成功している。この疑似モデルを用いてIBD新規治療候補薬の効果を評価し、その作用機序の詳細を明らかにした(JG 2019)。また、初代培養系への遺伝子導入法を独自に開発し、レンチウイルスを用いて初代培養細胞に遺伝子導入する技術を確立している(BBRC 2014)。まずヒトLgr5プロモーターを抽出し、GFP遺伝子と結合させる。さらにLgr5p-GFP遺伝子もしくはCMVプロモーターを用いたCMVp-GFPを組み込んだレンチウイルスを構築する。マトリゲル内にヒト小腸・大腸オルガノイドとウイルスを同時に混入し培養ディッシュ上で固形化させる。さらに培地を添加して培養を行い、1週間後に蛍光の発光を共焦点蛍光顕微鏡にて確認する。可視化した幹細胞の機能評価法を開発することにより、IBD患者の幹細胞病態を明らかとすると共に、幹細胞機能を動揺させる化合物を同定し、上皮幹細胞を標的としたIBD新規治療薬開発の基盤を構築する。当研究室では初代培養系への遺伝子導入法を独自に開発し、レンチウイルスを用いて初代培養細胞に遺伝子導入する技術を確立している(BBRC 2014)。本学倫理審査委員会承認のもと、クローン病非病変部の大腸より内視鏡生検検体からヒト大腸オルガノイドを樹立した。ヒト大腸オルガノイドの炎症性サイトカイン、Toll like receptor(TLR)の発現をRT-PCRにて同定した。発現を認めたレセプターのリガンドにて刺激を行うとIL-8の発現上昇を認めた。さらに、1週間の刺激にて酸化ストレス関連遺伝子であるDuoxa2の発現上昇を認めた。応答を認めたリガンドを混合して刺激を行った所、各単剤での刺激と比較して最も大きい炎症応答を認めた。そこでリガンド混合刺激を6週間行い、炎症応答をマイクロアレイにて解析したところ、炎症関連遺伝子の上昇及び粘液形質の減少を認めた。酸化ストレス可視化及び定量化により炎症刺激による酸化ストレス上昇を認めた。さらに新規治療候補薬の添加により、炎症環境においても炎症関連遺伝子の低下、粘液形質の上昇を認め、酸化ストレスの改善を認めたことから、抗炎症作用、粘膜再生作用の効果を確認し得た。ヒトの細胞における体外炎症性腸疾患(IBD)擬似モデルを確立させるとともに、上皮細胞機能評価システムを構築できた。また、IBD病変由来オルガノイドを樹立した。非炎症環境下で2か月以上継代培養することでVivoでの炎症の影響を除去した。潰瘍性大腸炎患者の病変部由来オルガノイドは同一患者の非病変部由来オルガノイドよりも細胞増殖能が低下していること、酸化ストレスが亢進していることを認めた。マイクロアレイにて遺伝子発現の差異を網羅的に解析したところ、病変部で特異的に発現が増加している遺伝子と減少している遺伝子を見つけた。これらの遺伝子の発現パターンが潰瘍性大腸炎患者において保存されているかを確認するために同一患者における遺伝子発現を10症例において調べた。その結果病変部特異的な遺伝子をいくつか見つけ出した。