hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト急性心筋梗塞組織における網羅的マイクロRNA解析

(1)法医解剖例のうち、死後1日以内に冷蔵保存され、1週間以内にサンプリングが行われた組織では、miRNAが安定して検出された。(2)ホルマリン固定組織では、miRNAは長いRNAよりも劣化しにくいものの、固定期間と相関して検出量は減少した。(3)ホルマリン固定期間が2ヶ月以内の組織では、長さの一致したmiRNAを内部標準として用いれば、qPCRによるmiRNAの定量解析は可能であった。(4)次世代シーケンサーで同定された心臓miRNA1,134種のうち、14miRNAが心房で、11miRNAが心室で優位に発現していた。(5)miR-208familyは著明な房室局在を示した。法医解剖で得られた組織検体のmiRNAについて、定量性が担保される保存条件を検討した。心臓左室組織を用い、200nt以下のsmallRNAに注目して分析を行った。抽出RNAのキャピラリー電気泳動では、40nt以下のmiRNAは、40-200ntのsmallRNAよりもスメア化が起こりにくかった。凍結組織中の21-106ntのsmallRNA10種について、リアルタイムPCRを行ったところ、死後1日以内に冷蔵保存された症例では、死後1週間までsmallRNAの有意な減少は認めなかった。しかし、42-106ntのsmallRNAは21-23ntのmiRNAよりも検出量の個体差(SD)が大きく、smallRNA間でも長いRNAの方が環境変化の影響を受けやすいことが示唆された。一方、ホルマリン固定組織を用いたリアルタイムPCRでは、固定期間と極めて高い相関でmiRNAの減少を認めた(R2=0.80-0.98)。しかし21-23ntのmiRNAの減少率は、42-106ntのsmallRNAの減少率のおよそ半分に留まり、長期固定下でも著明な安定性を示した。3年間固定された組織検体においても、miRNAは35サイクル以下の通常増幅範囲内で検出できた。内在性コントロールとなるsmallRNAを含め、各miRNA間での減少率の差を考慮すると、定量解析の対象としてはホルマリン固定3ヶ月以内の標本が望ましいと考えられた。上記保存条件の急性心筋梗塞組織と健常組織を用い、既知のバイオマーカーmiRNAをリアルタイムPCRで定量した。その結果、miR-499aが患者組織で有意に減少することが確認された。よって解剖で得られた死後組織検体や長期ホルマリン固定組織検体でも、miRNA定量解析は可能であると結論づけた。ヒト心臓組織おけるマイクロRNA(miRNA)発現を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に定量解析した。心疾患のない4剖検例で、左心房(LA)と左心室(LV)の凍結組織からsmall RNAを抽出し、IonTorrentPGMsystemでシーケンスしたところ、各ライブラリで平均250万リードを検出し、その90%がヒトゲノム、35%がmiRNAデータベースと一致した。総リード数で各ライブラリを標準化した後、LAとLVで各miRNAの発現を比較した。主成分分析では、LA群とLV群が分離され、心房と心室は異なるmiRNAプロファイリングを有すること示された。同定された1134種のmiRNAのうち、14miRNAが心房で、11miRNAが心室で特異的に発現していた。サンプル数を9名分に増やしてリアルタイムPCRを行ったところ、miR-208aとmiR-204が心房で、miR-208bとmiR-378aが心室で優位に発現していることが確認された。miR-208aはαミオシン重鎖(α-MHC)、miR-208bは(β-MHC)のイントロンにそれぞれ存在する。α-MHCは心房に、β-MHCは心室に多いことが知られており、本研究で示されたmiRNA-208の心臓内局在は、ホストgeneの発現分布と一致する。また、miR-208aの発現変動が上室性不整脈を起こすこと、梗塞心室筋ではmiR-208bの発現量が増加することが知られており、心臓におけるmiR-208の局在は、房室特異的な機能に関与していると考えられる。さらに、心房特異性が確認されたmiR-208aやmiR-204は、慢性心不全時には心室筋で増加することも報告されており、房室間でのmiRNA発現バランスが心不全病態に寄与している可能性が高い。網羅的解析前の条件検討を詳細に行った。実際の長期保存サンプルを分析することで、ヒト組織検体におけるmiRNAの安定性について、新たに実用的な知見を得ることができた。

これまでの核酸研究の主流であったDNAやmRNAは、死後分解やホルマリン固定の影響で断片化してしまい、法医解剖検体での定量分析は困難であった。しかし、今回miRNAが死後、ホルマリン固定下でも長期間安定に存在していることが確認され、解剖実務における有用な標的分子としての可能性が示された。法医学や病理学の教室では、研究に有効活用されないまま長期保管される組織検体も多く、高い安定性を示すmiRNAはそのような埋蔵組織検体に新たな研究利用の道を拓くものでもある。本研究ではmiRNAの定量性が保たれる一定の条件も明らかとなっており、今後の網羅的定量解析の基盤として十分な研究成果を得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。法医学サンプリング:本年度得られた検体保存条件にあった症例を対象とする。各症例の左心房(左心耳)と左心室(自由壁)から、線維化巣や腱索を避けて心筋組織を採取する。組織は凍結およびホルマリン固定にて保存する。症例の分類は、臨床経過、解剖時肉眼所見、染色標本の顕微鏡所見に基づいて行う。クオリティチェック:キャピラリー電気泳動にて、抽出RNAのクオリティチェックおよびsmallRNA濃度測定を行う。スクリーニング:健常例と患者の組織をマイクロアレイで網羅的に解析する。原則として凍結標本での解析を目指すが、症例数が集まらない場合は過去のホルマリン固定組織での解析に挑戦する。バリデーション:マイクロアレイで変動が見られたmiRNAについて、特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRにて発現変動を確認する。パスウェイ解析:有意な発現変動が確認されたmiRNA群について、miTALOSを用い機能解析を行う。web解析ツールであるmiTALOSは、KEGGとNCI PIDの2大データベースを基盤とし、さらにTargetScanS、RNA22、PtcTar、PiTa、TargetSpyという5つの標的解析ツールを複合的に利用することで、極めて精度の高いパスウェイ解析が行える。
重い電子系の高圧・低温におけるフェルミ端電子構造の赤外分光研究

重い電子物質で外部圧力によって誘起される量子臨界点(QCP)近傍の異常物性の起源解明のため、本研究では高圧、低温において重い電子物質の赤外分光を行い、得られた電荷励起スペクトルσ(ω)に基づいて圧力誘起QCP近傍の電子構造を調べことを目的とした。H22年度では、初年度(H21)からの継続実験として、圧力2.4GPa付近でQCPを示すCeRhIn_5、さらに圧力で重い電子系から半導体への変化を見せるCeRu_4Sb_<12>,さらに金属絶縁体(MI)転移を示すPrRu_4P_<12>を研究対象として選んだ。そしてσ(ω)に現れるフェルミ端近傍の電子構造が、f電子の局在・遍歴転移やMI転移などに伴いどのように変化するか詳しく調べた。その結果、CeRu_4Sb_<12>においては高圧での半導体への電子状態変化によりσ(ω)にエネルギーギャップが成長する様子を観測し、H23に論文出版することができた。またPrRu_4P_<12>は14GPaの高圧においてMI転移が抑制されることを見いだし、H23に予備結果を国際会議のProceedingsに発表し、本論文は現在(H24.4)本論文を投稿中である。さらにCeRhIn_5およびCeCoIn_5では、新奇物性の鍵を握るf電子と伝導電子の混成状態を反映する「赤外吸収ピーク」の顕著な成長とシフトを観測できた。このピークはCeRhIn_5においてQCPに対応する2GPa付近から急速な変化を見せるが、常圧で既に超伝導を示す参照物質CeCoIn_5では単調な変化しか見られない。現在さらにデータ解析中である。なおH22年度終了間際の日本物理学会(新潟大)での発表のために確保していた旅費は、この学会が東日本大震災で中止されたためH23年度に繰り越し、H23年9月に富山大学で開催された物理学会での発表に用いた。Ce化合物などの重い電子物質では、一般に外部圧力によってf電子の局在から遍歴状態への移行が誘起される。その際に現れる超伝導、非フェルミ液体的性質などを理解するため、フェルミ端近傍の電子構造をエネルギー分解で調べることが強く望まれる。本研究ではこの問題に対する新たなアプローチとして、高圧かつ低温において重い電子物質の赤外分光を行い、得られた光学伝導度に基づいて圧力下の電子構造を直接観測することを目的とした。測定対象は高圧で超伝導を示す物質CeRhIn_5, SrFe_2As_2、および金属絶縁体(MI)転移が高圧で抑制されるPrRu_4P_<12>を取り上げた。高圧低温での赤外分光実験は大型放射光施設SPring-8の赤外ビームラインで、高輝度な放射光を光源として、またダイヤモンドアンビルセルを高圧発生装置として行った。初年度は主に遠赤外領域の測定を行った結果、各物質で高圧下でのスペクトルの温度変化が常圧でのそれに比べて顕著な変化をすることを見いだした。まずCeRhIn_5であるが、この物質は常圧では反強磁性体であり、伝導電子とf電子の混成は弱いことを反映して、光学伝導度の温度変化は非常に小さい。しかし超伝導が現れる2.5GPaの高圧下ではかなり明快な温度変化を示した。またSrFe_2As_2も常圧で反強磁性体であり、ネール温度以下で光学伝導度に明快な擬ギャップが観測されていた。しかし高圧印加と共にこの擬ギャップが減少していくことがわかった。さらにPrRu_4P_<12>ではMI転移によるスペクトルの温度変化が、10GPaと14GPaの間で急激に変化することを見いだした。これら結果を受け、2年目では中赤外領域の測定を追加して光学伝導度を導出することにより、電子構造に関する議論を行う予定である。

このピークはCeRhIn_5においてQCPに対応する2GPa付近から急速な変化を見せるが、常圧で既に超伝導を示す参照物質CeCoIn_5では単調な変化しか見られない。現在さらにデータ解析中である。なおH22年度終了間際の日本物理学会(新潟大)での発表のために確保していた旅費は、この学会が東日本大震災で中止されたためH23年度に繰り越し、H23年9月に富山大学で開催された物理学会での発表に用いた。
ANCA関連血管炎の病態評価に寄与する臨床検査法開発研究

2018年度の研究成果の概要として、「ANCA関連血管炎・急速進行性糸球体腎炎の寛解導入治療の現状とその有効性と安全性に関する観察研究(Remit-JAV-RPGN)」のANCA関連腎炎患者コホートを対象とし、172名のtotal-VEGF-A及びVEGF-A165b濃度測定を完了した。現時点で以下のような解析結果を得ている。ANCA関連腎炎患者コホート172名を対象としたtotal-VEGF-A及びVEGF-A165b濃度測定を完了し、初年度での研究計画通り遂行した。従って、現時点での達成度はおおむね順調であると考えられる。申請内容に準じた形で遂行していく予定である。具体的には、腎臓機能や尿蛋白など従来の治療効果のパラメーターと血中total VEGF-A及びVEGF-A165bとの関連を検討し、治療効果を予測するバイオマーカーになりうるか検討する。
ランドサット画像を利用したボノボとチンパンジーの生息植生の比較分析

ランドサット画像の分析による植生の分類については、実際の植生調査と併用することによって、チンパンジーやボノボの植生利用にとって重要な一次林、二次林、湿地林などの分類が容易にできることがわかった。また、これらの比較情報にもとづいて、遊動域のうち植生調査でカバーしきれない部分の植生を推定することができ、チンパンジーやボノボのような遊動域の大きな種の生息地利用を考えるのには有効な手段であることが明らかになった。さらに、ネスト・カウントによるチンパンジーやボノボの生息数調査の方法を改良し、従来よりも短期間の調査でチンパンジーの密度や植生利用の季節変化を調べられる方法を開発した。ウガンダ・カリンズ森林やタンザニア・ウガラ丘陵とルクワ地区、コンゴ民主共和国・ワンバ地区とイロンゴ地区でのネスト・カウントによる生息密度調査、植生調査、ランドサット画像の分析による研究の結果としては、チンパンジーは植生のタイプによって生息密度が異なること、季節によって利用場所が変化することが明らかになった。また、チンパンジーやボノボでは複数の植生タイプにまたがる遊動域を持つことによって、高い個体密度を維持できることが示唆された。今後さらに、各調査地から得られた結果を総合的に分析することにより、チンパンジーとボノボの生息地利用を決める共通要因を調べ、生息植生における種内変異、種間変異についての考察を行いたい。また、今回の研究では、実際に現地調査が行われている地域のみを対象としてランドサット画像の分析を行ってきたが、ここで得られた知見を応用することにより、より広い地域のチンパンジーやボノボの生息予測を行うことができるようになった。平成10年度では、ボノボの生息地であるワンバ森林・イロンゴ森林(以上コンゴ民主共和国)と、チンパンジー生息地であるカリンズ森林(ウガンダ)・ルクワ丘陵・ウガラ丘陵(以上タンザニア)についての現地調査のとりまとめを行った。1)森林とイロンゴ森林における植生調査の結果の一部ををとりまとめた。胸高面積にして70%以上がボノボの食用植物であり、きわめて豊かな生息地であることが分かった。このあと、各植生タイプとランドサット画像の照合を行い、各地のボノボ密度推定に役立てる予定である。2)カリンズ森林での植生調査結果をとりまとめ植生図を作成した。ネストセンサスの結果、この地域のチンパンジーの密度は、2.7-4.0頭/km2と極めて高い値を示す。3)ルクワ丘陵とウガラ丘陵における植生調査の結果をとりまとめた。とくにルクワ丘陵地帯の植生は希薄であるばかりでなく、食用植物は、胸高面積で35%を占めるにすぎない。以上のように、平成10年度においては、現地調査のとりまとめについてはほぼ所期の予定を達成したがそのために多くの時間を費やしたため、またランドサット画像の選定に手間取ったため、当初計画にあったワンバ森林とカリンズ森林を実際にランドサソト画像上で同定する作業に入ることはできなかった。しかし、必要と思われるランドサット画像12シーンを取りそろえることができたので、来年度以降には画像上での植生型の同定を進めていきたい。平成11年度では、ボノボの生息地であるワンバおよびイロンゴ森林(コンゴ民主共和国)、チンパンジーの生息地であるカリンズ森林(ウガンダ共和国)、リランシンバ丘陵およびウガラ丘陵地帯(タンザニア共和国)について、植生調査の結果をとりまとめ、いくつかの植生に分類した。植生調査による結果とランドサット画像の分析による結果とを比較した。さらに、各調査地における、チンパンジーのネストカウントによる調査の結果を分析し、それぞれの植生タイプにおける個体群密度を推定した。

ウガンダ・カリンズ森林の結果からは、分類できた4つの植生のうち、Musanga優占二次林や混交一次林に多く生息し、他のタイプの二次林の生息密度は低かったこと、また、タンザニアのウガラ丘陵とルクワ地区からの結果では、ほとんどのチンパンジーのネストは川辺林にのみ発見されることが示され、チンパンジーの生息密度は、同じ場所でも植生のタイプによって変わることが明らかになった。さらに、ネストの分布によって推定された遊動域や直接観察による遊動域を考えると、チンパンジーやボノボでは複数の植生タイプにまたがる遊動域を持つことによって、高い個体密度を維持できることが示唆された。以上の分析を通して、ランドサット画像の利用が、踏査では不可能な広域の植生の分析にきわめて有効であることがわかり、今後のより詳細な分析が期待されている。平成12年度では、これまで3年間にわたる研究のとりまとめをおこなった。まず、ランドサット画像の分析による植生の分類については、チンパンジーやボノボの植生利用にとって重要な一次林、二次林、湿地林などの分類が容易にできることがわかった。また、植生調査と併用することによって、植生調査だけではカバーしきれない広い地域の植生を分類することができ、チンパンジーやボノボのような遊動域の大きな種の生息地利用を考えるのには有効な手段であることが明らかになった。さらに、ネスト・カウントによるチンパンジーやボノボの生息数調査のやり方を改良し、従来のやり方よりも短期間の調査で密度推定ができ、また植生利用の季節変化がわかる調査方法を考案した。ウガンダ・カリンズ森林やタンザニア・ウガラ丘陵とルクワ地区、コンゴ民主共和国・ワンバ地区とイロンゴ地区でのネスト・カウントによる生息密度調査、植生調査、ランドサット画像の分析による研究の結果としては、チンパンジーは植生のタイプによって生息密度が異なること、季節によっても利用場所が変化することが明らかになった。また、チンパンジーやボノボでは複数の植生タイプにまたがる遊動域を持つことによって、高い個体密度を維持できることが示唆された。今後さらにそれぞれの調査地から得られた結果を総合的に分析することにより、チンパンジーとボノボの生息地利用を決めるのに共通してみられる要因を特定し、生息植生における種内変異、種間変異についての考察を行いたい。また、今回の研究では、実際に現地調査が行われている地域のみを対象としてランドサット画像の分析を行ってきたが、ここで得られた知見を応用することにより、より広い地域のチンパンジーやボノボの生息予測を行うことができるようになった。
放射線による脳皮質発達障害の分子機構:神経細胞遊走障害とCR細胞特定遺伝子の関連

医療放射線あるいは環境放射線によるヒト胎内被ばく問題になるのは精神遅滞や脳の発達障害である。その原因のひとつは胎児の脳は放射線に最も感受性が高い器官であり、脳皮質の発生過程の神経細胞死と神経細胞の遊走障害と考えられる。しかし、神経細胞の遊走障害の分子機構、特に神経細胞遊走障害と脳皮質層状構造の形成と神経細胞遊走の役割を果たしているCajal-Retzius細胞の関連についてはまだ解明されてない。本研究はmGluR2遺伝子のプロモーターにGFP発現遺伝子を組み込んでいたトランスジェニックマウスを用いて、放射線による大脳皮質形成障害、神経細胞遊走異常に関して免疫組織化学的な検索を行った。妊娠13日のマウスに1.5GyのX線を照射し、神経細胞の遊走を調べるため、妊娠15日にプロモデオキシウリジン(BrdU)30mg/kgを母体に腹腔内投与した。照射6時間後及び生後2日、8週に胎仔の大脳を採取し、固定後、脳の横断切片を作成した。HE染色あるいは抗BrdU、抗midkineと抗CR50抗体を用いた免疫組織化学染色により脳皮質層状構造、異なるタイプの神経細胞の配列及びBrdU標識神経細胞遊走・分布を観察した。放射線照射した脳では異常な大脳皮質層が形成され、多くの標識細胞は皮質原基の下部に滞留していた。大脳皮質I層にあるCR50陽性Cajal-Retzius細胞は明らかに減少していた。これらのCajal-Retzius細胞は神経細胞遊走の際、scaffoldingの役割を果たすことから、Cajal-Retzius細胞の欠如が神経細胞遊走障害の原因の一つと考えられる。胎児の脳は発生学的な特徴から放射線に最も感受性が高い器官であり、ヒトの被ばく後に問題となるのは精神遅滞をともなう脳皮質発達障害である。その原因のひとつは神経細胞死と神経細胞の遊走障害と考えられる。しかし、神経細胞の遊走障害の分子機構、特に神経細胞遊走障害と脳皮質層状構造の形成と神経細胞遊走の役割を果たしているCajal-Retzius (CR)細胞の特定遺伝子の関連についてはまだ解明されてない。本研究はmGluR2遺伝子のプロモーターにGFP発現遺伝子を組み込んでトランスジェニックマウスを作成し、放射線による大脳皮質形成障害、神経細胞遊走異常に関して免疫組織化学的な検索と、CR細胞の遺伝子変動の網羅的解析を行い、放射線のもたらす神経細胞の遊走障害の分子機構を明らかにする。今年度はマウスにおいてCR細胞に主に発現するmGluR2遺伝子のプロモーターに、GFP/hIL-2R (human interleukin-2 receptor)をマーカーとして結合させ、GFP-Tgマウスを作製しました。PCR及びサザンハイブリダイゼーション法によりGFP/hIL-2Rをゲノムに挿入されるか否か、Tgマウス(ファウンダー、F及びファウンダーの子孫、F1)の検出を行った。妊娠13日及び生後2日に検出されたTgマウスの大脳を採取し、固定後、大脳切片を作製した。CR細胞の特異的なマーカー蛋白質、抗midkineと抗CR-50抗体を用いて免疫組織化学染色実験を進んでいる。環境放射線あるいは医療放射線によるヒト胎内被ばくで問題になるのは精神遅滞や脳の発達障害である。しかし、神経細胞の遊走障害の分子機構、特に神経細胞遊走障害と脳皮質層状構造の形成と神経細胞遊走の役割を果たしているCajal-Retzius(CR)細胞の関連についてはまだ解明されてない。平成18年度はmGluR2遺伝子のプロモーターにGFP発現遺伝子を組み込んでいたトランスジェニックマウスを用いて、放射線による大脳皮質形成障害、神経細胞遊走異常に関して免疫組織化学的な検索を行った。妊娠13日のマウスに1.5GyのX線を照射し、神経細胞の遊走を調べるため妊娠15日にブロモデオキシウリジン(BrdU)30mg/kgを母体に腹腔内投与した。照射6時間後及び生後2日、8週に胎仔の大脳を採取し、固定後、脳の横断切片を作製した。HE染色あるいは抗BrdU、抗midkineと抗CR-50抗体を用いた免疫組織化学染色により脳皮質層状構造、異なるタイプの神経細胞の配列、及びBrdU標識神経細胞遊走・分布を観察した。また大脳皮質I層にあるCR細胞は減少していた。このことから、放射線により誘発された脳の構築発生異常は神経細胞遊走異常によることが明らかになった。この神経細胞遊走異常とCR細胞の関連実験は現在進んでいる。本研究はmGluR

2遺伝子のプロモーターにGFP発現遺伝子を組み込んでいたトランスジェニックマウスを用いて、放射線による大脳皮質形成障害、神経細胞遊走異常に関して免疫組織化学的な検索を行った。妊娠13日のマウスに1.5GyのX線を照射し、神経細胞の遊走を調べるため、妊娠15日にプロモデオキシウリジン(BrdU)30mg/kgを母体に腹腔内投与した。照射6時間後及び生後2日、8週に胎仔の大脳を採取し、固定後、脳の横断切片を作成した。HE染色あるいは抗BrdU、抗midkineと抗CR50抗体を用いた免疫組織化学染色により脳皮質層状構造、異なるタイプの神経細胞の配列及びBrdU標識神経細胞遊走・分布を観察した。放射線照射した脳では異常な大脳皮質層が形成され、多くの標識細胞は皮質原基の下部に滞留していた。大脳皮質I層にあるCR50陽性Cajal-Retzius細胞は明らかに減少していた。これらのCajal-Retzius細胞は神経細胞遊走の際、scaffoldingの役割を果たすことから、Cajal-Retzius細胞の欠如が神経細胞遊走障害の原因の一つと考えられる。
糖鎖脱離の生物学-N型遊離糖鎖の生成、分解機構とその生理機能の解明に向けて

平成20年度は、N型糖鎖の新しい代謝機構を更に詳細に解析する目的で様々な研究を行った。まず、前年度より検討していた哺乳動物における遊離糖鎖の構造のHPLCによる微量簡便検出法を確立し、発表した(Suzuki,et al.,Anal,Biochem.381,224-232)。この方法を用いて様々な細胞の遊離糖鎖を解析し、細胞の種類、または培養条件によって蓄積する糖鎖の構造や量に大きな変化があることが示された(Ishizuka,et al.,Biochem.J.413,227-237)。一方、これまで遊離糖鎖の代謝に関わらないとされていたオートファジーという細胞質やオルガネラの代謝機構が、オートファゴソーム(オートファジーの機構に必須な細胞小器官)形成不全株を用いることで、糖鎖の代謝に関わることを明らかにした。このオートファジーによる糖鎖代謝は構造特異的であり、オートファジーがどのように糖鎖構造特異的に糖鎖を代謝するのか、その分子機構は今後非常に興味深い。また、これまで困難だった小胞体から細胞質へ糖鎖を輸送するトランスポーターの活性測定法を、蛍光ラベルした糖鎖を基質に用いることで初めて確立した。一方出芽酵母における遊離糖鎖の解析をすすめたところ、あきらかに糖タンパク質由来で、ゴルジ体において修飾された糖鎖構造が見出された。このことによって、小胞体関連分解の過程で分解される糖タンパク質のうち、一部はゴルジ体まで運ばれることが明確に示された。また、細胞質における糖鎖生物学の重要性を総説に記した(Funakoshi and Suzuki,Biochim.Biophys.Acta,1790,81-94)。糖タンパク質のアスパラギン(N)型糖鎖の付加は、真核細胞においてはもっとも普遍的な翻訳後修飾機構の一つであり、タンパク質の安定性や可溶性といった物理化学的性質を制御しうる上に、最近ではたんぱく質の生理活性や細胞内局在性も規定しうることが分ってきている。糖鎖の生合成についてはこの20年あまりの間に爆発的な進歩をとげ、そのほとんどの分子機構が解明したといってもいいのに対し、糖鎖がどのように代謝されるかについては哺乳動物においても分子機構が明らかにはなっていない。特に我々が見出した細胞質の脱糖鎖酵素、PNGaseが脱離する細胞質糖鎖の代謝については、どのように代謝されるのか全く不明である。我々はこれまでPNGase、およびPNGaseが糖鎖を脱離した後に働く酵素(ENGase)の遺伝子の同定を行ってきたが、本年度は細胞質遊離代謝に関わる第3の酵素、マンノシダーゼの遺伝子を同定し、それがこれまで小胞体の酵素といわれてきたMan2C1と同一であることを明らかにした(Suzuki, T., et al.(2006)Biochem.J.400,33-41)。また、逆相HPLCを用いて遊離の糖鎖を、特に還元末端の構造のわずかな違いから効率よく分離する系を確立した(T.Suzuki, et al.発表準備中)。また、細胞質に存在し、やはり遊離の糖鎖代謝に関わることが予想される酵素、キトビアーゼのアッセイ系を確立するための基質を作成し(横浜市立大学、梶原康宏助教授との共同研究)、現在条件検討を開始している。糖タンパク質のアスパラギン(N)型糖鎖の生合成についてはこの20年あまりの間に爆発的な進歩をとげ、そのほとんどの分子機構が解明したといってもいいのに対し、糖鎖がどのように代謝されるかについては哺乳動物においても分子機構が明らかにはなっていない。我々はこれまで、PNGase依存的な、高マンノース型遊離N型糖鎖代謝の系に関わる2つのグリコシダーゼ、ENGaseとMan2Clについてその遺伝子を同定してきた。今年度は、これらとは別のタイプの遊離糖鎖である、複合型糖鎖がある種のがん細胞の細胞質に蓄積していることを明らかにした(近畿大学薬学部、掛樋一晃教授との共同研究)。また、この細胞質蓄積のシアリル化複合型糖鎖の代謝において、細胞質シアリダーゼであるNeu2がその代謝に関わりうることを明らかにした(石塚ら、投稿中)。これらの結果は、我々の見出した高マンノース型糖鎖の代謝機構とは別の、複合型遊離糖鎖に対する非リソソーム糖鎖の代謝機構が存在することを意味している。また、ENGaseに関してはKOマウスを作成した。このマウスはホモ変異によって致死ではなかったが、この系を用いて細胞質遊離糖鎖の機構の更なる詳細な解析と生理機能の解析が可能となった。また前年度より開発中であった、遊離糖鎖の還元末端の構造に着目した糖鎖の微量分離解析法を確立し、現在論文を執筆中である(鈴木ら、投稿準備中)。更に現在糖鎖を細胞内に打ち込んで、細胞における影響をタイムラプスで解析する系を確立し、今後遊離糖鎖の新しい代謝機構の発見と解析の系を立ち上げることが出来た。

この方法を用いて様々な細胞の遊離糖鎖を解析し、細胞の種類、または培養条件によって蓄積する糖鎖の構造や量に大きな変化があることが示された(Ishizuka,et al.,Biochem.J.413,227-237)。一方、これまで遊離糖鎖の代謝に関わらないとされていたオートファジーという細胞質やオルガネラの代謝機構が、オートファゴソーム(オートファジーの機構に必須な細胞小器官)形成不全株を用いることで、糖鎖の代謝に関わることを明らかにした。このオートファジーによる糖鎖代謝は構造特異的であり、オートファジーがどのように糖鎖構造特異的に糖鎖を代謝するのか、その分子機構は今後非常に興味深い。また、これまで困難だった小胞体から細胞質へ糖鎖を輸送するトランスポーターの活性測定法を、蛍光ラベルした糖鎖を基質に用いることで初めて確立した。一方出芽酵母における遊離糖鎖の解析をすすめたところ、あきらかに糖タンパク質由来で、ゴルジ体において修飾された糖鎖構造が見出された。このことによって、小胞体関連分解の過程で分解される糖タンパク質のうち、一部はゴルジ体まで運ばれることが明確に示された。また、細胞質における糖鎖生物学の重要性を総説に記した(Funakoshi and Suzuki,Biochim.Biophys.Acta,1790,81-94)。
植物オルガネラ遺伝子発現を統御するPPR蛋白質によるRNA配列認識機構の解明

植物オルガネラにおいて、RNA編集は転写産物中の特定のC塩基をUへと変換する。これまでに同定されたRNA編集の部位特異的因子はすべてpentathco-peptiderepeat(PPR)蛋白質である。特定のPPR蛋白質機能の欠損はしばしば複数のサイトの欠損を生じる。多くの場合、これら編集サイトのシス配列は一次配列の保存性が低い。一つのPPR蛋白質が複数の編集サイトに共有される分子機構はまだよくわかっていない。我々は、互いに部分的に保存、または保存されていない標的配列を認識することが予測されるPPR蛋白質OTP82とCRR22に着目した。大腸菌発現系を用いて組み換えOTP82とCRR22を発現、精製した。組み換えOTP82は標的サイトの-150領域に特異的に結合した。組み換えCRR22はndhB7およびndhD5サイトの-200領域、およびrpoB3サイトの-170領域に特異的に結合した。遺伝学的データとあわせて、我々はOTP82とCRR22が葉緑体における複数の編集サイトの部位特異的因子として働くことを結論した。加えて、配列相同性を示さないシス配列へのCRR22の高親和性結合は、シス配列中におけるある特定のヌクレオチドのみがPPR蛋白質の高親和性結合に十分であることを示唆した。それゆえ、シス配列は一次配列上保存性が低くても一つのPPR蛋白質によって認識されることができると考察した。植物オルガネラゲノムの遺伝子発現、特に転写後過程の大部分はPPR(pentatrico-peptide repeat)蛋白質ファミリーによって制御されている。PPR蛋白質はPPRモチーフと呼ばれる35アミノ酸からなるモチーフを反復して持つ蛋白質で、植物に巨大な遺伝子ファミリーを形成している。PPR蛋白質はオルガネラ転写産物中から標的とするRNA配列を特異的に認識し、標的サイトにプロセシング酵素を呼び込む役割を担っていると考えられている。しかしながら、PPR蛋白質機能の主幹である標的RNA配列を特異的に認識する分子機構についてはいまだ不明な点が多い。本研究では、PPR蛋白質によるRNA配列認識機構を解明するため、配列相同性を示さない複数のRNA配列認識に関わると考えられるPPR蛋白質とその標的RNAとの結合をゲルシフト法により解析した。解析には、複数の葉緑体RNA編集に必要とされるPPR蛋白質OTP82とCRR22を選んだ。解析の結果、1.OTP82は標的とする葉緑体ndhB9およびndhG1サイトを含むその上流15塩基RNA配列(弱い配列相同性を示す)に、ほぼ同じ結合親和性を伴い、かつ特異的に結合すること、2.CRR22は標的とする葉緑体ndhB7、ndhD5、およびrpoB3サイトを含むその上流20塩基RNA配列(配列相同性を全く示さない)に、ほぼ同じ結合親和性を伴い、かつ特異的に結合することが明らかになった。最近の研究から、PPR蛋白質の持つPPRモチーフと標的RNA中の塩基が1:1で相互作用することが提唱されている。CRR22はまったく相同性を示さない複数の配列を認識できることから、PPRモチーフと塩基の相互作用の一部が高親和性なRNA結合を決定していることが示唆された。
有機塩素系農薬を30年間連用した畑土壌からの新規脱塩素遺伝子・酵素群の単離

1.多様なlinB(ハロアルカン脱ハロゲン酵素をコードする遺伝子)の取得κ-HCH区土壌の希釈液を集積培養を経ないで直接γ-HCH無機寒天培地に塗布して培養し、新規なγ-HCH分解菌5株を得た。この5株はいずれもSphingomonas sp.に分類された。既知のγ-HCH分解酵素遺伝子の塩基配列をもとにPCR、クローニング、シーケンスを行ったところ、8塩基の部分で相違が見られる多様なIinBが得られた。また、γ-HCHを添加して培養した堆肥区土壌から抽出した土壌DNAから、可動性遺伝因子IS6100に挟まれた遺伝子を標的としてPCRを行い、増幅産物をクローニング、シーケンスしたところ、塩基配列レベルで多様なlinBが得られた。2.多様なlinA(脱塩化水素酵素をコードする遺伝子)の取得農薬長期連用圃場の各区の土壌から直接DNAを抽出し、linAを標的としてPCRを行ったところ、いずれの区のDNAからも増幅産物が得られた。シーケンスの結果、IinA相同遺伝子であることが分かり、また、既知のlinAと数塩基異なる多様性が見られた。γ-HCH区土壌にγ-HCHを添加して培養した土壌から抽出したDNAからも、既知のIinAとは数塩基配列が異なるIinAが得られた3.多様な石油成分分解系遺伝子の取得堆肥区、TPN・堆肥区、TPN・HCH・堆肥区土壌に石油成分ナフタレン・フルオレン・石油エーテルを添加して培養した。培養後の土壌からDNAを抽出し、ナフタレン分解系酵素遺伝子群を標的としてPCRIを行い、増幅産物をクローニング、シーケンスした。全ての土壌からジオキシゲナーゼ遺伝子のものと思われるクローンが得られた。既知のジオキシゲナーゼ遺伝子とほぼ100%の相同性を示すクローンが得られた一方、相同性が低い多様なクローンが得られ、新規なジオキシゲナーゼが数多く存在することが示された。圃場のγ-HCH連用区土壌にγ-HCHを添加してインキュベートした後に、土壌の希釈液を直接γ-HCH無機寒天培地に塗布して培養した。クリアゾーンを伴って形成したコロニーを純化してγ-HCH分解菌5株を得た(SS04-1,2,3,4,5株)。5株ともSS86株と同等のγ-HCH分解能を有していた。この5株は16S rDNA塩基配列からともSphingomonas sp.に分類され、16S-23SITS領域の塩基配列から、2系統に分けられた。5株のゲノムDNAを鋳型とし、SS86が有するγ-HCH分解酵素遺伝子linA,B,C,D,Eの塩基配列をもとに設計したそれぞれのプライマーを用いてPCRを行ったところ、すべてについて増幅が確認された。PCR増幅産物をクローニングして塩基配列を決定したところ、配列はlinAとlinC,D,EはSS86のものとほぼ相同であったがlinBは8塩基の部分で相違が見られた。linBは基質特異性の広いハロアルカン脱ハロゲン酵素であることが知られている。今回NA塩基配列レベルで多様なlinBを取得することができた。有機塩素系農薬長期連用圃場の過去の研究において、土壌の植物遺体画分は脱塩素遺伝子を保有する微生物が集積している場であることが予想されていた。

そこで本年度は、土壌の植物遺体画分に生息する土壌微生物からγ-BHC分解系遺伝子群を保有する微生物の探索を試みた。また、植物遺体画分から直接抽出したDNAを用いて、PCRベースにより多様なγ-BHC分解系遺伝子群を単離することを試みた。土壌にγ-BHCを添加して培養した後に植物遺体画分を回収し、その希釈液を各種培地に塗布・培養してコロニーを形成させ、コロニーから抽出したDNAを鋳型としてlinAE遺伝子を標的とするPCRを行った。しかしながら、これらの遺伝子を保有するコロニーは見出されなかった。また、回収した植物遺体から直接抽出したDNAを鋳型として同様にlinAE遺伝子を標的とするPCRを行ったところ、増幅産物が得られた場合もあったが偽陽性のバンドであることが多く、lin遺伝子の相同配列は見出されなかった。そこで、土壌全体から抽出した土壌DNAをPCRの鋳型とすることに方針を変更した。農薬長期連用圃場の各区の土壌から直接DNAを抽出し、linAを標的としてPCRを行ったところ、いずれの区のDNAからも増幅産物が得られた。シーケンスの結果、linA相同遺伝子であることが分かり、また、γ-BHC分解菌Sphingobium japonicum SS86のlinAと数塩基異なる多様性が見られた。BHC区土壌にBHCを添加して培養した土壌から抽出したDNAからは、SS86株や昨年度単離したSS04-15株の有するlinAとは数塩基配列が異なるlinAが得られた。以上の結果から、農薬連用圃場の土壌にはこれまでに単離されたBHC分解菌以外にもlinA相同配列を保持する微生物が存在すること、さらにそれらのlinAには多様性があることが示された。1.可動性遺伝因子IS6100に挟まれた遺伝子の取得有機塩素系農薬長期連用圃場のγ-HCH連用区土壌から過去に分離されたγ-HCH分解菌Sphingobiumが保有するγ-HCH分解酵素遺伝子のいくつかは、可動性遺伝因子IS6100によって他の微生物から水平伝達されてきたことが示唆されている。そこで、この試験圃場の土壌から抽出した土壌DNAを鋳型とし、IS6100の配列から設計したプライマーを用いてPCR反応を行い、この可動性遺伝因子に挟まれた遺伝子を取得することを試みた。対照区土壌、堆肥区土壌、HCH区土壌について、γ-HCH添加または無添加条件でインキュベートし、土壌DNAを抽出してPCRを行った。γ-HCHを添加した堆肥区土壌由来の土壌DNAから明確なPCR増幅産物が得られた。これをクローニングしてシーケンスしたところ、γ-HCH分解酵素遺伝子の一つであるlinBがIS6100に挟まれていることが分かり、その配列には多様性が見られた。2.石油成分分解系遺伝子の多様性解析農薬長期連用圃場の堆肥区、TPN・堆肥区、TPN・HCH・堆肥区土壌に石油成分であるナフタレン・フルオレン・石油エーテルを添加してインキュベートした。インキュベート前、後の土壌からDNAを抽出し、ナフタレン分解系酵素遺伝子群を標的として設計したプライマーを用いてPCRを行った。プライマーセットの1つBPDOXにより増幅産物が得られ、これをクローニング、シーケンスした。その結果、全ての土壌からジオキシゲナーゼ遺伝子のものと思われるクローンが得られた。既知のジオキシゲナーゼ遺伝子とほぼ100%の相同性を示すクローンが得られた一方、相同性が低い多様なクローンがインキュベート後の土壌から得られ、新規なジオキシゲナーゼが数多く存在することが示された。
てんかんの根治を目的としたけいれん準備性の定量法開発とその応用

てんかんは脳内にけいれん準備性が形成されて、発作を繰り返し起こすようになる病態である。てんかんを根治するためには、けいれん準備性を客観的に評価し、低減・消去する手法を開発する必要がある。しかしこれまでけいれん準備性の実態が不明で、その評価が困難であることが根治療法の研究開発を妨げてきた。そこで本研究では、まずてんかん動物モデルおよびてんかん患者の神経活動記録からけいれん準備性を説明するパターンを情報学的手法で抽出・同定し、その程度をスコアとして定量化する技術を確立する。次にその定量法と経頭蓋脳深部刺激法等を組み合わせ、けいれん準備性スコアを低減する手法を見いだすことを目的とする。
MEMSとDNA融合プロセスによる光電気複合型ナノポアセンサデバイスの基盤構築

DNAナノ構造に直径30nmの金ナノ粒子を2個結合し、DNAナノ構造を分解することによってシリコン基板上への二量体形成に成功した。基板上にランダム配置した金ナノ粒子二量体によるSERS分子検出を実施した結果、検体分子に由来するSERSシグナルの高感度検出に成功した。金ナノ粒子二量体のナノポア近傍への固定に向け、DNAナノ構造の固定化を実施した結果、56%の高い固定化率を達成した。直径5nmの金ナノ粒子を成長させDNAナノ構造の形状に沿った大粒径金ナノ粒子の二量体を形成した結果、5%以下の収率で所望の二量体が形成されることを確認した。金ナノ粒子二量体を用いたSERSによる光学的DNA塩基識別に関して、8鎖長DNAオリゴマー内に含まれる単一のアデニンからラマンピークを得るとともに、ラマンシフトのばらつきから空間分解能について検証した。電気的DNA検出・識別実現のため、ナノギャップを有する金配線を作製し、DNAオリゴマー分散溶液を滴下した際のトンネル電流時間変化から16鎖長DNAオリゴマーの検出に成功した。高いレーザ光強度で検出確率が向上することを明らかにした。銅媒基板上へCVD成膜させたグラフェンを間接転写法によりた異方性ウェットエッチングした酸化膜付シリコン基板に転写し、スピンコート法により塗布した金ナノ粒子をマーカーとしてフォーカス調整とドーズ量を最適化したHeイオンビームを用い、あらかじめ設定した描画シーケンスにより任意の間隔と孔径を持ったグラフェンナノポアアレイを作製した。作製したナノポア基板の両面に銀/塩化銀電極を挿入したDNA溶液チャンバーを接続して電圧を印加し、パッチクランプアンプによる微小電流測定によりDNAセンシングを行った。迅速な熱交換が可能なマイクロ流路を用い、従来のDNAナノ構造体作製法に比べ最大20倍のアニール時間の短縮と歩留まりの改善を実現した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1)矩形DNAオリガミの表裏に球形金粒子(直径15nm)を固定した後、この高次複合体をシリコン基板上に固定し、UV照射によりDNAナノ構造を除去することにより、シリコン基板上に金ナノ粒子二量体構造を形成でき、基板洗浄後も安定に基板上に保持できることを検証した。(2)シリコン基板上にナノトレンチを用いたセルフアセンブル法により形成した粒子間ギャップ1nm程度の球形金ナノ粒子(直径100nm)二量体構造を形成し,まず,4,4'-ビピリジン分子の極低濃度溶液を用いた短時間ラマン分光計測において,ラマン強度の離散的な分布から1分子検出の可能性を示した。次に,10pMの極低濃度溶液においてアデニン(A),グアニン(G),シトシン(C),チミン(T)の4種類の特徴的なピークが確認され,塩基の検出・同定が可能であることを明らかにした。さらにAGCTAGCTの8塩基オリゴマーを用いた計測では,AおよびGのピークとデオキシリボース,リン酸のピークが確認された。これらの結果から,二量体構造を用いたSERSによるDNA塩基識別の可能性を示した。(3)異方性ウェットエッチングによって形成したシリコン酸化膜の自立薄膜にFIBを用いて100-300nm程度のナノポアを形成し、そのナノポア部へ単分子膜を転写することでグラフェン等の自立膜を形成した。その後、フォーカス距離とドーズ量を最適化したヘリウムイオンビームによってグラフェンにナノポア加工を行い、最小約1.5nmナノポアを実現した。また、電解液中での電圧印可による絶縁破壊において印加電圧と印加時間を最適化することでシリコン酸化膜の自立膜への210nmナノポア形成を実現した。無機材料メンブレン膜へのナノポア形成、金ナノ粒子二量体を用いたSERSによるDNA塩基の検出技術、およびDNAナノ構造を用いた直径15nmの金ナノ粒子二量体作製技術の構築は順調に進んでいる。しかし、金ナノ粒子のサイズをSERSに必要な50nm程度に大きくした場合、DNAナノ構造を用いた二量体形成収率が極めて低いという問題が明らかとなった。犠牲DNAナノ構造を応用して作成した金ナノ粒子二量体のナノギャップでは真空紫外線照射と純水洗浄によってDNAと残留物が完全に分解・除去されていることを確認した。FDTD解析からシャープエッジナノギャップ部を有する金ナノロッド二量体が電場増強に有効であることを明らかにした。セルフアセンブルで連結したDNAナノ構造内部に固定した金ナノ粒子をめっき処理で成長させた後にDNAナノ構造を除去してナノギャップ形成する新規手法を考案し、二種類の犠牲DNAナノ構造の設計を行った。FDTD解析および実験から,金ナノ粒子二量体を用いた表面増強ラマン分光(SERS)におけるレーザ波長の影響および最適な金ナノ粒子径を明らかにした。実験的に直径200 nmの粒子が最も大きなラマン強度を示した。作製した金ナノ粒子二量体構造を用いてSERSによるDNA検出特性評価を行い、溶液中のDNA塩基を1分子感度で検出可能であること、多くの実験においてラマンピーク位置が変化することを明らかにした。電気的DNA検出・識別実現のため、1 nm程度のギャップを有する金ナノ粒子二量体に金配線を接続したナノギャップ電極構造を作製した。電子ビーム描画装置の高精度なアライメント機能と加工条件最適化により、基板上の金ナノ粒子と金ナノ配線を接続した構造を実現した。

ヘリウムイオンビームにおけるフォーカスとドーズ量による加工精度を調査し、DNAの塩基計測に最適な1.5-2nmのグラフェンナノポアを再現性よく形成できることを見出した。CVDグラフェンの間接転写、シリコン結晶方位を利用したマイクロ流体デバイスへのナノポア集積化プロセスの開発を行い、ナノポアを有する隔膜とDNA伸長用ナノピラーアレイ構造の一体化を実現した。グラフェン膜上に形成したナノポアを用いてイオン電流によるDNAセンシングを確認した。無機材料メンブレン膜へのナノポア形成、金ナノ粒子二量体を用いたSERSによるDNA塩基の検出技術、トンネル電流を用いた塩基識別実験技術の構築は順調に進んでいる。DNAナノ構造に直径30nmの金ナノ粒子を2個結合し、DNAナノ構造を分解することによってシリコン基板上への二量体形成に成功した。基板上にランダム配置した金ナノ粒子二量体によるSERS分子検出を実施した結果、検体分子に由来するSERSシグナルの高感度検出に成功した。金ナノ粒子二量体のナノポア近傍への固定に向け、DNAナノ構造の固定化を実施した結果、56%の高い固定化率を達成した。直径5nmの金ナノ粒子を成長させDNAナノ構造の形状に沿った大粒径金ナノ粒子の二量体を形成した結果、5%以下の収率で所望の二量体が形成されることを確認した。金ナノ粒子二量体を用いたSERSによる光学的DNA塩基識別に関して、8鎖長DNAオリゴマー内に含まれる単一のアデニンからラマンピークを得るとともに、ラマンシフトのばらつきから空間分解能について検証した。電気的DNA検出・識別実現のため、ナノギャップを有する金配線を作製し、DNAオリゴマー分散溶液を滴下した際のトンネル電流時間変化から16鎖長DNAオリゴマーの検出に成功した。高いレーザ光強度で検出確率が向上することを明らかにした。銅媒基板上へCVD成膜させたグラフェンを間接転写法によりた異方性ウェットエッチングした酸化膜付シリコン基板に転写し、スピンコート法により塗布した金ナノ粒子をマーカーとしてフォーカス調整とドーズ量を最適化したHeイオンビームを用い、あらかじめ設定した描画シーケンスにより任意の間隔と孔径を持ったグラフェンナノポアアレイを作製した。作製したナノポア基板の両面に銀/塩化銀電極を挿入したDNA溶液チャンバーを接続して電圧を印加し、パッチクランプアンプによる微小電流測定によりDNAセンシングを行った。迅速な熱交換が可能なマイクロ流路を用い、従来のDNAナノ構造体作製法に比べ最大20倍のアニール時間の短縮と歩留まりの改善を実現した。平成29年度は、それぞれの研究者が構築した要素技術をベースに、研究者間の連携をより密にして研究を推進する。前年度明らかとなった課題については、DNAナノ構造を鋳型として金ナノ構造を作製する先行研究結果を参考に実験を進め、金ナノ粒子のサイズと形状を制御してSERSに適した金ナノ粒子二量体を形成する技術構築を進める予定である。現在の課題は、金ナノ粒子のサイズをSERSに適した100nm200nm程度、かつシャープエッジにより形成されるナノギャップを形成する技術確立であり、この課題解決に向けて、DNAナノ構造内部に固定した金ナノ粒子をめっき処理によって成長させた後にDNAナノ構造を除去する新規提案技術の構築に取り組んでいる。
マイクロマシン・シーブ電極を用いた神経朿刺激型人工感覚インターフェイスの研究

本研究の目的は、シーブ(Sieve)電極をラットの感覚神経束に埋め込み、人工感覚における刺激電極インターフェイスとして利用するための技術を確立することにある。研究開始時点ですでに所有していたシーブ電極とそれを改良した電極を鼓索神経と後耳介神経に埋め込み電気刺激を行った。改良電極ついては、計画どおり神経束の固定強度を上げる目的でシープ孔の数を増やし、さらにインピーダンスを下げ同時に金属層がポリイミド基板から剥離しにくい構造にするために電極金属を金からイリジウムに変更したものを製作した。埋め込み前の電極の電気的特性を試験したところ、期待どおりにインピーダンス値を減少させることができた。麻酔下および覚醒下で自由行動するラットの後耳介神経に対してシーブ電極による電気刺激を行い、自由行動下では耳介のエアーパフ刺激時に観察されるものと同様の耳介反射を生じさせることができた。シーブ電極を味覚神経(鼓索神経)に埋め込んだラットについても、電気刺激によって生ずるリッキング反射行動を観察することができた。長期の電極埋め込み実験では、最長7ヶ月までは刺激効果が持続することを確認した。しかしその後は頭部ソケットの脱落や電極ワイヤの切断によって実験の継続を断念した。頭部にソケットを取り付ける従来の方法では半年以上ソケットの脱落や電極の切断等の事故を防ぐことが困難であり、電極性能の長期評価の妨げになっている。この問題を解決するには完全埋め込み型の経皮的記録/刺激インターフェイスを実現させる必要があり、現在そのための研究を進めている。さらに、シーブ電極の最適化とより効果的な電気刺激条件を求めるために、孔の直径、電極リングの金属露出面積、配線間隔等を見直してデザインを一新した数種類の電極の製作を行った。これらの新デザイン電極を用いた実験は現在計画中である。本年度の研究実施計画は、現在所有するシーブ電極と新規開発改良した電極を鼓索神経と後耳介神経に埋め込み埋め込んで電気刺激を行い、刺激電極としての評価を行うことであった。新電極ついては、当初の予定どおり神経束の固定強度を上げる目的でシーブ孔の数を増やし、さらにインピーダンスを下げ同時に金属層がポリイミド基板から剥離しにくい構造にするために電極金属を金からイリジウムに変更したものを試作した。神経線維束への埋め込みにはこの電極のほかに、白金イリジウム線を用いたカフ電極を使用した。現在迄に約10例の埋め込み手術に成功している。埋め込んだ神経は後耳介神経である。埋め込み後、2ヶ月以内に感覚刺激に対して複合活動電位が記録できた数例について、研究計画通りに電極を通じた電気刺激を行った。その結果、耳介感覚毛への触圧刺激や空気の吹き付け刺激で生じる反射的な耳介の攣縮運動同様の運動を電気刺激によって生起させることができた。これによりシーブ電極が人工感覚システムにおける刺激型神経-マシンインターフェイスとして利用可能であることがとりあえず実証された。今後は次年度にかけて長期間の慢性実験を行い、電極性能の試験や、長期埋め込み時に発生する問題点の調査や対策について研究を進める計画である。昨年度に継続し、シーブ(Sieve)電極の人工感覚用インターフェイスとしての評価実験を行った。また、新しいデザインの電極開発も引き続き行った。昨年度はラット後耳介神経感覚枝へのシーブ電極の埋め込みとその電極を介しての神経刺激を行い、浅い麻酔下ではあるが耳介反射を生起させることができた。今年度は完全覚醒下で自由行動するラットに対して同様の神経刺激を行い、より確実に耳介反射を生じさせることができた。

シーブ電極を味覚神経(鼓索神経)に埋め込んだラットについては、麻酔下では反射的行動をうまく引き起こすことが出来ていなかったが、本年度の完全覚醒下における実験では、電気刺激によって生ずる反射的行動を観察することができた。また本年度は長期の電極評価を行ない、最長7ヶ月までは刺激効果が持続することを確認した。しかしその後は頭部ソケットが脱落し、実験の継続を断念した。頭部にソケットを取り付ける方法では半年以上ソケットの脱落や電極の切断等の事故を防ぐことが困難であり、電極の長期評価の妨げになっている。この問題を解決するには完全埋め込み型の経皮的刺激インターフェイスの実現が必要であり、現在そのための研究を進めている。さらに、シーブ電極の最適化とより効果的な電気刺激条件を求めるために、孔の直径、電極リングの金属露出面積、配線間隔等を見直してデザインを一新した数種類の電極の製作を行った。これらの新電極を用いた実験は現在計画中である。