hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的糖鎖解析による新規癌マーカーの探索と診断技術の開発

世界初の「疾患糖鎖構造データベースの構築」を目標として、医師を含む臨床チームとの強力な連携により3500件を超える患者検体を用いた大規模網羅的糖鎖解析による新規バイオマーカーの探索を進めた。特に消化器癌と泌尿器癌に焦点を絞りバイオマーカーとして有望な糖鎖構造情報を獲得するため、独創的な「全自動糖鎖解析装置」による大規模糖鎖解析からの疾患糖鎖データベースの構築に挑戦した。具体的には膵臓癌、膵炎、肝細胞癌、肝炎、潰瘍性大腸炎、大腸癌、自己免疫性膵炎等の消化器疾患領域、および腎細胞癌、腎炎、前立腺癌等の泌尿器疾患領域を中心に疾患糖鎖情報を収集して世界初の疾患関連糖鎖データベースの構築が実現した。平成25年度の計画に従い研究を進め、以下の各項目について予定通りあるいはそれ以上の成果を得た。1大規模糖鎖解析拠点の整備北海道大学を糖鎖プロファイルデータ収集のプラットフォームとして整備した。2患者検体の収集と臨床情報の管理各研究分担者の所属する研究機関(弘前大学、岡山大学、北海道大学医学部)は各疾患患者試料(血清を中心とした尿、組織・細胞など)の収集と糖鎖プロファイルデータとの関連付けに必要となる広範な臨床情報の管理を行った。また、各々の疾患領域ごとに200300例程度の患者検体を系統的に採取するために必要な準備・手続き等を完了した。健常者においても血清糖鎖発現プロファイルは性別や年齢、さらに生活習慣などによるある程度の変動(個体差)が観察されることは既に判明しているので、これらの影響をできる限り排除するため、個々の患者の詳細な臨床情報に加えて性別・年齢・既往症や生活習慣に至る基本データの収集を徹底した。3大規模糖鎖解析各分担者により収集された患者検体の糖鎖解析をすみやかに開始した。弘前大学においては、一昨年度導入したSweetBlotによりglycoblottingまでを現地で実施し、質量分析用プレートに点茶腐れた上体で北大拠点へ輸送後測定する、という仕組みを構築した。本年度は以下の研究について大きな進展があった。(1)これまでに、肝細胞癌の悪性度ならびに予後に関与する特異的糖鎖(仮称:G3560、G2890)が存在することを報告してきたが、この悪性度のうち浸潤能と糖鎖がどのような関連性を持つか検討した。その結果、高浸潤能のHLEはu-PAの産生が高く、G2890が高値である一方、低浸潤能のHepG2はu-PAの産生が低く、G2890が低値であった。(2)腎細胞癌の診断と生命予後因子としての臨床的有用性を明らかにした。この成果は平成26年度日本泌尿器科学会賞を受賞した。一方、進行性前立腺癌においても、3本鎖、4本鎖のN-グリカンの発現が去勢抵抗性獲得過程におけるバイオマーカーとして有用であること、さらに、前立腺特異抗原(PSA)のN-グリカンの癌性変異を利用した新規アッセイ法を開発し、従来のPSAによる前立腺癌診断能力を遥かに凌駕することを示した。(3)消化器病領域については、新たにSweetBlotが設置され、実サンプルでの一斉解析を開始した。その結果、肝細胞癌での糖鎖発現パターンを確定し、論文として発表した。また、分子標的薬であるソラフェニブ投与前の血清を、多数例で網羅的に解析し、(m/z3195/1914)が最も予後を反映するマーカーであることを明らかとした。また、高齢化に伴い増加している、非ウイルス性肝細胞癌の原因となる、非アルコール性脂肪性肝炎の糖鎖パターンを明らかとした。膵癌については、膵管内乳頭粘液性腫瘍の発現パターンの解析を行い、悪性化との関連を報告した。1大規模糖鎖解析拠点の整備:北海道大学先端生命科学研究院・医学部、弘前大学医学部、ならびに岡山大学医学部に大規模糖鎖自動解析を可能とした「SweetBlot」が設置された。また研究分担者は患者検体の収集を加速し、糖鎖プロファイルデータの取得を進めた。健常者においても血清糖鎖発現プロファイルは性別や年齢、さらに生活習慣などによりある程度の変動(個体差)が観察されることが既に判明しているため、これらの影響をできる限り排除するために個々の患者の詳細な臨床情報はもとより性別年齢・既往症や生活習慣に至る基本データの収集を徹底した。疾患ごとに収集された患者血清検体は初年度から速やかに各拠点の全自動血清糖鎖解析装置による糖鎖プロファイルの取得と統計解析によるマーカー探索を開始した。2各拠点における糖鎖バイオマーカー探索研究の進捗状況:患者検体の大規模糖鎖解析・質量分析データの自動アノテーション法やPCA(principal component analysis)、BPA(biosynthetic pathway analysis)等の大規模統計解析による健常者の糖鎖プロファイルとの比較に基づいて有意な変動の認められた疾患糖鎖情報の収集を進めた。蓄積された疾患ごとの糖鎖発現プロファイルデータから疾患特異度や進行度、薬剤に対する治療効果、予後などを含めた臨床統計調査を行い、各疾患に特異的で臨床的に有望な糖鎖マーカーを抽出することに成功した。得られた糖鎖マーカー候補の診断指標としての有効性を、各研究分担者が現在現場で使用している体外診断法と比較検討・評価した。本研究課題に直接関係する臨床グライコミクスの研究成果についてはこれまでの3年間(20132015年度)で査読付き学術論文を20篇発表した。本年度計画していた

1患者検体の収集と臨床情報の整理、2各拠点における大規模糖鎖解析の継続、について設定したクライテリアを充分達成できたと判断する。本年度は以下の各項目において大きな進展があった。1血清N結合型糖鎖の網羅的質量解析による各種悪性腫瘍のバイオマーカー探索を新たに、精巣腫瘍、膀胱癌、腎盂・尿管癌を対象に拡大して実施し、各々の癌に特徴的な糖鎖発現における顕著な変化を数種類同定した。また、同様の方法で腎移植後の抗体関連拒絶反応を早期に予測する診断マーカーを開発した。2これまで解析が遅れていた大腸癌の血清糖鎖解析結果を公表するとともに、進行食道癌についても、新たに網羅的血清糖鎖解析に着手した。また、様々な消化器癌で、免疫グロブリン結合糖鎖のアガラクトシル化が普遍的に生じていることを初めて明らかとし報告した。アガラクトシル化のメカニズムとして、癌細胞株の培養液清中に、B細胞のガラクトース転移酵素発現を抑制する因子が存在することを見出しており、現在癌診断への応用を視野に入れ、この因子を同定中である。3全自動血清糖鎖プロファイル解析装置による糖鎖解析により、根治的な肝切除を受けた肝細胞癌患者において、特定の糖鎖が予後・再発予測に関連していることが判明したため、肝癌細胞株において浸潤能の変化と糖鎖構造変異の関係を調べた。HLEは細胞外マトリックスの破壊に関連するurokinase type plasminogenactivator (u-PA)の産生が高く、浸潤能はu-PA産生能に応じて、HLEは高浸潤能を有した。高浸潤能肝癌細胞株HLEにおいてu-PAをノックダウンすると、グライコブロッティング法による糖鎖の網羅的定量解析では13種類の糖鎖発現量が低下していた。血中バイオマーカーは疾患の早期発見や進行度、治療効果等を簡単・迅速に判定する際に極めて重要な分子である。昨年度までに神山(北大医)と能祖(岡山大医)が担当する膵臓癌、膵炎、肝細胞癌、肝炎、潰瘍性大腸炎、大腸癌さらに自己免疫性膵炎等の消化器疾患領域、大山(弘前大医)が担当する腎細胞癌、腎炎、前立腺癌等の泌尿器疾患領域に焦点を絞り、健常者の糖鎖プロファイルとの比較に基づいて有意な変動の認められた疾患糖鎖情報を収集してきた。我々は既に、肝細胞癌・膵臓癌・大腸癌と腎細胞癌や前立腺癌において高感度で疾患・病態特異的なバイオマーカー候補の抽出に成功している。また、3つの研究拠点では信頼性の高い血中糖鎖発現プロファイルデータベースの構築を目指して蓄積された各疾患ごとの糖鎖発現プロファイルデータから、疾患特異度や進行度などを含めた多角的な臨床統計調査を行ってきた。その結果、既に各疾患に特異的で臨床的に有望な糖鎖マーカーが見出されており、その診断性や新たな創薬研究への可能性等の臨床意義の検証を進めて実用化に向けた研究に進展している。本年度については以下の各項目において大きな進展があった。1新たに腎移植後の抗体関連拒絶反応を早期に予測する診断マーカー候補を同定・開発し、論文として公表した。2肝癌細胞株における浸潤能の変化と糖鎖変異の関係をさらに詳細に検討した。すなわち、高浸潤能を有するHLE株と低浸潤能であるHepG2間で糖鎖発現を比較したところ、11種類の糖鎖がHLEにおいて高発現していることが新たに明らかとなった。
極限材料合成装置の開発

爆発衝撃によって材料を一様圧縮させる従来タイプの材料合成装置とは異なり,衝撃波の収束効果によって材料中に極限状態を生成させる装置(極限材料合成装置)の開発を試み次の成果を得た。(1)PETN爆薬(密度:0.5-1.0g/cc)表面を覆うように銅細線(径:100μm-175μm)を平行に多数設置し,これにキャパシターバンク(高電圧低容量)からの衝撃電流(1本当りMax.2kA以上)を流して一斉爆発させることで爆薬を面起爆させることが可能であり,そのための線間隔と薬厚との関係等の諸条件について実験的に把握した。この技術を応用して従来の爆薬レンズに替わる平面爆轟波発生装置を開発し,ダイヤモンド合成に適用できることを確認した。(2)円筒状爆薬殻(外径:100mm,軸長132mm)の外表面周方向に設置した22本の細線を爆発させることで±170ns以内の時間精度を有する収束爆轟波が生成できた。細線条件は爆薬殻内部への爆轟波面の到達をストリーク写真で計測して評価した。次に爆薬殻(PETN,PETN/シリコンゴム)中心部にPMMA(アクリル)を設置し,その中を衝撃波が収束する挙動(シャドウグラフ)を計測した。その結果,衝撃波は中心付近まで真円性を保って収束しており,本装置を用いれば収束中心部に設置する固体または粉体を強力に圧縮して極限状態が生成できることが分かった。(3)収束衝撃波の解析に適するランダムチョイス法(RCM)を初めて固体に適用し,各種材料における衝撃波の収束特性を明らかにした。また爆轟波の解析もできる気体・固体用一次元RCMコードを作成し,これを用いて実験による収束衝撃軌跡が良好にシミュレートできた。また極限状態生成後の試料を破壊させずに回収することは現状の装置では困難であることも明らかとなり今後の課題である。本年度は基礎実験として、既存の衝撃大電流発生装置(キャパシタバンク;40μF,20kV)を用い、多数本の平行線列を一斉起爆させるための銅線(175μmφ)の長さと本数の組合せについて検討した。予備実験として実施した線爆のみでは十分な精度での評価が難しく、平板状の爆薬(PETN、密度:1.0g/cc)を片面から起爆させて発生させた爆轟波が他方の面に到達する斉時性によって評価した。その結果、薬厚Hと線間隔Bの比H/Bを2.0-1.3程度以上にすると10cm長さ16本の平行細線列(間隔5mm)を用いて±200ns程度の時間精度で爆轟波の平面性が得られた。一方、他場所(物質研)での衝撃大電流発生装置(12.5μF、Max.40kV)を用いて同様の実験(但し銅線径:100μmφ、PETN密度:0.6g/cc)を実施した結果、120mm長さ16本の細線列を用い100mmφの面積に±100nsの平面性を達成することができ、従来の爆薬レンズに替わる新しい平面爆轟波発生装置として衝撃材料合成(ダイヤモンド)に適用できた。特に後者の大電流発生装置はさらに大面積の平面爆轟波生成の可能性を有していることから、最終的な目標である一次元円筒状収束波を利用する極限材料合成装置としては大電流発生に高電圧低容量キャパシタ型を用いることとし2×5μF,40kVのキャパシタバンクとサイラトロン(トリガーモジュール付き)を準備した。

以上の実験と平行して固体中収束波の解析に最適と考えられるランダムチョイス法コードを開発した。試解析として円筒状リーマン問題を種々の固体を対象に解析し、円筒状衝撃波が固体中を収束・反射する挙動を把握した。また従来の差分法との比較検討を行い、収束波に対する本解析法の優位性を示した。さらにこのコードは今後爆薬殻の一斉起爆による固体中収束波生成のシミュレーションにも拡張できる可能性があることが分かった。本年度は昨年度の予備試験の結果から多数の細線列の一斉爆発に適すると考えられる高電圧低容量タイプ(Max.40kV,10-12.5muF)のキャパシターバンクを用いて最終的な目標である一次元円筒状収束波を固体中に生成することを試みた。まず長胴の爆薬円筒殻(低密度PETN爆薬、外径:100mm、有効軸長:132mm)に±170ns以内の時間精度を有する収束爆轟波を発生させる細線条件(線径:100mum、本数:22、線間隔:6mm、薬厚:6mm以上)を把握した。この実験では爆発殻内部への爆轟波面の到達時間精度をストリーク写真で計測し、細線条件を評価した。次に爆薬殻(PETNまたはPETN/シリコンゴム)中心部に透明固体であるPMMA(アクリル)を設置し、その中を衝撃波が収束する挙動(シャドウグラフ)をストリーク及びフレミングカメラを用いて計測した。その結果、衝撃波は中心点付近まで真円性を保って収束しており、収束点近傍では加速効果もあることが分かった。この結果、本装置を用いれば収束中心部に設置する固体または粉体を協力に圧縮して極限状態が生成できることが分かった。以上の実験による研究と平行して数値シミュレーション技術の研究も行った。昨年度開発した固体用ランダムチョイス(RCM)コードを拡張して爆轟波の解析もできる気体・固体用一次元RCMコードを作成した。このプログラムを用いて収束波生成実験の数値解析を行った結果、PETN駆動による衝撃波軌跡の計測結果が良好にシミュレートできた。また種々の固体や境界条件に対する収束波生成のシミュレーションを行い、中心部でのエネルギー集中特性や反射後の負圧発生(破壊)についての知見が得られた。この結果、極限状態生成後の固体・粉体を破壊させずに回収することは現状の装置では端難であることが分かった。この衝撃破壊防止構造の開発が今後の課題である。
スターリン期ソヴィエト連邦における物理学の制度史的・思想史的解明

平成19年度においては、研究対象であるソ連時代の科学史関係の資料(1920-30年代の各種公刊書籍、小冊子、文書館料等)を収集するためにロシア連邦・モスクワに赴いた(6月13日-11月25日)。現地ではモスクワ国立人文大学を受け入れ先として滞在しつつ、国立図書館、科学技術図書館、科学アカデミー文書館、ロシア国立社会経済史文書館、ロシア連邦国立文書館等の施設にて資料の探索・入手・読解に従事した。ここで得られた成果は、帰国後にまとめた二つの論文-現在、双方とも学術雑誌への投稿を準備中-に直接生かされている。具体的には、1920-30年代の哲学論争という歴史的事例を通じながら、弁証法的唯物論というソ連公認の哲学体系と物理学の具体的な成果との関係において、どのような軋みがみられたか、(そしてより重要なことに)どれほどの親和性がみられたのか、総合的に検討することができた。また、1930年代のソ連における哲学者あるいは哲学者的な工学者と指導的物理学者との間に行われた具体的な論争の過程を追い、これまで不十分にしか知られていなかった前者の哲学的な主張を明確にすることができた(空間やエネルギーの担い手としての何らかの物質を想定するべきであるとする明確な立場)。このことによって、20世紀半ばにおいて知的世界で国際的にも影響力をもった-ソ連においてはそれと個別学問との調停が死活間題ともなった-マルクス主義において自然哲学がいかなる位置を占めており、具体的な政治的・社会的状況の中で科学者がいかなる対応をとりえたのか、内在的で哲学的内容そのものに踏み込んだ理解が可能になりつつある。この歴史過程はソ連邦という権威主義的国家のもとで進行し、それゆえに政治状況との複雑な関係を伴っていたが、そうした側面にも注意を払いつつ内在的理解をも押し進めることで、科学と哲学の相互関係-20世紀のような専門分化あるいは脱・形而上学化が進行した時代においてぱ等閑視されがちな-を考える際に重要な事例を提供できたと考えられる。また、ソ連史の文脈においても、なぜ物理学者集団と政権が比較的平穏な共生関係を営み続けることができたのか、という問いに対する、重層的で明快な回答が為されつつある。モスクワではロシア随一の科学史研究機関である科学アカデミー自然科学史・技術史研究所において、ウラジミール・ヴィズギン博士ら一流の物理学史家のもと、討論を積み重ね、博士のセミナーにおいて自らの研究成果の一部を発表する機会を得ることができた。これによって、ロシア人歴史家との双方向的な知的交流の端緒につくことができた。彼らとの交流は現在も続いており、今後も続くであろうが、こうした交流の開始もモスクワにおける在外研究の貴重な成果といえるであろう。ソ連邦における科学(とりわけ物理学)と国家制度・イデオロギーとの相関関係を歴史的に検証するため、1930年代におけるいくつかの科学哲学上の論争一指導的物理学者・旧世代の物理学者・共産党員である科学哲学者の三者の問でたたかわされた一を選出し、その政治的文脈のみならず哲学上の内容にも踏み込んで、史料解釈を行った。これまで時系列に沿った綿密な史料検証ができていなかった時期・テーマに対し、歴史的理解を精緻化することができた。すなわち、ソ連の物理学に関して従来は、その制度的・社会的の強さに裏付けられた物理学者集団が、現代物理学の実践的成果等を無理解な哲学者や旧世代の物理学者たちに示したがゆえに「イデオロギーによる害悪」を比較的こうむらなかったという解釈が主流であったが、これが十分な史料読解の裏づけを欠いた説得力の不足したものであることを示した。1930年代の哲学論争はいったん険悪化したあと沈静化するが、これは物理学者の哲学者に対する単純な勝利といったものではなく、物理学者集団内の対立が「イデオロギー的正当性」を求める戦いに転じたという性格を有していたこと、指導的物理学者はかなり後になるまで自らの立場の擁護に成功していなかったこと、哲学者たちの論難はその科学上・哲学上の内容を検討してみた場合まったくの不当な、非科学的なものとは言いがたいこと、指導的物理学者がかなりの譲歩を含む巧妙な政治的振る舞いを取ることでようやく論争が沈静化したこと、等に着目しなければならない。また、付随的な研究成果として、イデオロギー的な「抑圧」といわれがちな思想の方向づけが、きわめて「民主的」な外観によって行われていたことも明らかにできた。

また、1930年代のソ連における哲学者あるいは哲学者的な工学者と指導的物理学者との間に行われた具体的な論争の過程を追い、これまで不十分にしか知られていなかった前者の哲学的な主張を明確にすることができた(空間やエネルギーの担い手としての何らかの物質を想定するべきであるとする明確な立場)。このことによって、20世紀半ばにおいて知的世界で国際的にも影響力をもった-ソ連においてはそれと個別学問との調停が死活間題ともなった-マルクス主義において自然哲学がいかなる位置を占めており、具体的な政治的・社会的状況の中で科学者がいかなる対応をとりえたのか、内在的で哲学的内容そのものに踏み込んだ理解が可能になりつつある。この歴史過程はソ連邦という権威主義的国家のもとで進行し、それゆえに政治状況との複雑な関係を伴っていたが、そうした側面にも注意を払いつつ内在的理解をも押し進めることで、科学と哲学の相互関係-20世紀のような専門分化あるいは脱・形而上学化が進行した時代においてぱ等閑視されがちな-を考える際に重要な事例を提供できたと考えられる。また、ソ連史の文脈においても、なぜ物理学者集団と政権が比較的平穏な共生関係を営み続けることができたのか、という問いに対する、重層的で明快な回答が為されつつある。モスクワではロシア随一の科学史研究機関である科学アカデミー自然科学史・技術史研究所において、ウラジミール・ヴィズギン博士ら一流の物理学史家のもと、討論を積み重ね、博士のセミナーにおいて自らの研究成果の一部を発表する機会を得ることができた。これによって、ロシア人歴史家との双方向的な知的交流の端緒につくことができた。彼らとの交流は現在も続いており、今後も続くであろうが、こうした交流の開始もモスクワにおける在外研究の貴重な成果といえるであろう。
野外体験学習を支援する自律的エージェント機能に関する研究

野外活動支援として本年度も京都市立稲荷小学校5年生を対象に、海の家での活動、動物園での活動、水族館での活動に参加した。これらの活動をとおして携帯情報端末(PDA)を用いた環境学習支援システムの各種機能の完成度を再確認した。また、子供たちが自らコンテンツを作成し、他の児童と共に学習する機会を持った。この学習法は単に与えられたコンテンツだけによって学習するより、興味や意欲を増進させることがわかった。また、子供の見方や考え方が大人のものと異なり、コンテンツ作成における多層的な興味の引き出し方の重要性を再認識した。また、環境学習におけるエージェントによる情報提示方法について検討するため、画像によって構成された環境教育教材の認知過程における学習者の相違について実験をおこなった。その結果、環境教材が意図する題材についての背景知識の無い被験者は、画像情報から環境問題の関連付ける推論において、代表性や利用可能性の高い情報に基づきヒューリスティック的な処理をおこなうことがわかった。ヒューリスティックとしての推論は知識構造や信念体系と合致するため、もっともらしい解にすばやく到達できる利点がある。しかし一方では系統的なバイアスを生む危険性も考えられる。この実験結果から環境教育のためのエージェントは、教材の認知過程を把握することにより学習者の背景知識や認知資源の利用状況を判断し、呈示する適切な関連情報を選択する機能を具備する必要があることがわかった。さらに判断基準に基づき呈示した情報と学習結果をもとに、判断基準を更新する機能の検討も必要と考える。野外活動における提供情報の重要性について検討した。すでに開発運用されているPDAとGPSを用いた野外活動支援システムを用い、EXPO2005の野外体験ゾーンで森林環境学習をおこなった。この実証実験では、特定の場所で特定の情報が提供される。利用者対応としては一般と小学生程度の2種類のコンテンツを用意した。実験後の利用者へのアンケート調査によれば、「もっと詳しいことを知りたい」、「昆虫などについてもっと知りたい」など、利用者のニーズを取り入れたコンテンツ提供を望む意見があった。システムの物理的な完成度だけではなく、学習意欲とその進度に応じた情報提供の仕組み立てが必要であることを再認識した。簡単な対応としては、提供する情報の種類を多く揃え、利用者の興味などに応じて事前に選択する方法も考えられる。一方、エージェント導入の前段階となる、利用者の興味や関心がどこにあるのか探索するための方法について検討した。これはいくつかの画像を含むコンテンツを表示し、利用者にそのコンテンツに対する興味度を3段階で評価し、どのようなカテゴリーに興味があるのか探索するものである。この方法では、初期段階ではランダムにコンテンツを表示し、ある程度興味あるカテゴリーが出てきた段階では関連するコンテンツを表示する手法で、絞込みをおこなっている。小学生を対象とした実験では、ある程度の段階まで興味を絞り込むことが可能であることがわかった。問題点としては、表示するコンテンツの量が不足している点、意図するカテゴリーを明確に認知できるコンテンツが不足していた点である。すでに開発運用されているPDAとGPSを用いた野外活動支援システムを用い、名古屋市立東山動植物園で展示植物等の案内学習支援を、京都市立稲荷小学校では総合的学習における野外活動支援をおこなった。これらの実証実験では、支援システムとしての物理的機能の完成度は確認されたが、学習者の簡単な属性を事前入力し、それに応じた教育コンテンツの提示、学習意欲の喚起、学習進度に応じた情報提供の仕組み立てが、まだ不十分であり、必要とされていることを再認識した。これに対応するため、提供する情報の種類を多く揃え、学習者の属性に応じ、確率的に情報の組み合わせを教材コンテンツとする方法について検討している。一方、エージェント導入にあたり、前年度に引き続き利用者の興味や関心がどこにあるのか探索するための方法について検討した。また、教材コンテンツが意図する学習項目・興味分野・関連コンテンツをデータベース化し、学習者にそれらをどのように関連付けて提示・閲覧するのが効果的なのかについて検討をおこなった。対象とした教材コンテンツは稲荷小学校で過去作成されたものである。小学生を対象とした調査実験では、教材コンテンツを系統的に提示閲覧させることはある程度有用であることが確認できた。しかし、提示閲覧は必ずしも一系統でなく複系統あり、エージェントが教材コンテンツを制御するためには、決定木のようなものも含め、確率遷移的に扱うことも必要であることが判った。

この実験結果から環境教育のためのエージェントは、教材の認知過程を把握することにより学習者の背景知識や認知資源の利用状況を判断し、呈示する適切な関連情報を選択する機能を具備する必要があることがわかった。さらに判断基準に基づき呈示した情報と学習結果をもとに、判断基準を更新する機能の検討も必要と考える。
抗原提示とT細胞認識の分子機構の解明および免疫制御療法の開発をめざした基礎研究

抗原提示細胞とT細胞の相互作用の観点から免疫応答制御の分子機構を解明し、さらに自己免疫疾患病因の解明と治療法の開発へアプローチすることをめざして研究を行い、以下のような成果を得た。1.CLIP/抗原ペプチド置換インバリアント鎖遺伝子を利用したエピトープ提示ライブラリーを用いることにより、T細胞クローンが認識できるエピトープの多様性を解析できるシステムを開発した。これを用い、IDDM患者から樹立したGAD65ペプチドに自己抗原反応性を示すTh細胞クローンについて、認識できるエピトープの共通性(パターン)を明らかにし、さらに、交差反応性を示す微生物抗原を同定した。2.T細胞の抗原認識は厳密に制御されていると考えられていたが、化学構造の酷似した抗原アナログペプチドに対しても、抗原提示細胞上の濃度がある閾値よりも高い場合に、T細胞がこれを認識し増殖応答を示すことを明らかにした。さらにこの場合、抗原の刺激と異なり、T細胞受容体近傍に存在するZAP-70の活性化を伴わない、ユニークなシグナル伝達機構が用いられることを示し、このシグナル伝達機構に関わる分子としてB-Raf、PKCμを同定した。3.マウスES細胞から樹状細胞を分化誘導する方法を用いて、ES細胞の段階で遺伝子改変を行った後に樹状細胞(ES-DC)へ分化させたものを生体内へ移入し、免疫制御を行うモデル実験を行った。その結果、卵白アルブミン(OVA)抗原とケモカイン(SLC)を共発現したES-DCにより、OVA特異的T細胞を活性化し、腫瘍拒絶能を強力に活性化できることが明らかとなった。また、ミエリンオリゴデンドロサイト(MOG)抗原と同時にT細胞に対して抑制効果を発現する分子をES-DCに発現させ、これをマウスに投与することにより、実験自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の発症を抑制できることを見いだした。近年、ヘルパーT(Th)細胞クローンが予想外に多様なペプチドに対して交叉反応を示すことが明らかにされた。また自己免疫疾患の発症機序の1つとして、感染に際して微生物抗原ペプチドにより活性化されたT細胞が自己抗原ペプチドに交叉反応を示し、自己免疫現象が発生するという分子擬態(molecular mimicry)仮説が提唱されている。本研究はヒトTh細胞クローンが交叉反応を示す抗原ペプチドの多様性を網羅的に解析するシステムを構築し、これを自己免疫疾患における分子擬態仮説の検証に応用できるか否かを検討することを目的とする。このためにインバリアント(Ii)鎖のHLA-IIペプチド収容溝に結合するCLIP部分を、多様なペプチドをコードするように改変した変異Ii鎖遺伝子ライブラリーを作製した。これをHLA-DR遺伝子と共にCOS-7細胞に一過性に発現させ、多様なペプチド・HLA-DR複合体を発現する細胞ライブラリーを作り、Th細胞クローンと共培養した際に産生されるIFN-γを指標にして、Th細胞を活性化するペプチド抗原を同定する方法を開発した。I型糖尿病ではGAD65が重要な自己抗原の一つと考えられており、日本人ではHLA-DR53遺伝子が疾患感受性と相関し、感染を契機にして発症する症例があることも知られている。そこで患者から樹立された、HLA-DR53分子により提示されたGAD65ペプチドに自己反応性を示すTh1細胞クローンが認識するペプチドの多様性を上記のシステムを利用して解析した。このようなTCR認識ペプチドに共通した特徴をもつペプチドを微生物蛋白質データベースの中から探索し、Th細胞が交差反応を示す微生物抗原を複数同定した。

本システムは、Th細胞クローンが認識するペプチドとその多様性に関する基礎研究、ならびに臨床免疫学研究の発展に貢献するものと期待される遺伝子改変樹状細胞を用いた抗原特異的免疫制御マウスのES細胞からin vitroにおいて樹状細胞を分化誘導する方法を用いて、ES細胞の段階で遺伝子改変を行った後に樹状細胞(ES-DC)へ分化させたものを生体内へ移入し、免疫制御を行うモデル実験を行った。免疫応答増強法として、卵白アルブミン(OVA)を腫瘍抗原のモデルとし、OVAとケモカイン(Mig,SLC,Lptn)遺伝子を同時に発現するES-DCのマウス腹腔内投与により、OVAを発現させたB16メラノーマ細胞のin vivoにおける拒絶を誘導できるか否かを検討した。その結果、SLCを共発現したES-DCにより、OVA特異的T細胞を活性化し、腫瘍拒絶能を強力に活性化されることが明らかとなった。また、ミエリンオリゴデンドロサイト(MOG)抗原の遺伝子、ならびにT細胞に対して抑制効果を発現するPDL-1あるいはTRAILの遺伝子をES-DCに発現させ、これをマウスの腹腔内に投与した後にMOGを免疫することにより、実験自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の発症を抑制できることを見いだした。過剰発現させたT細胞レセプター(TCR)アンタゴニストを認識して増殖するTh細胞において活性化されるユニークなシグナル伝達系の解析:これまで、T細胞は厳密に抗原を認識し応答すると考えられていたが、TCRアゴニストの1アミノ酸残基を他に置換したTCRアンタゴニストであっても、抗原提示細胞表面に人為的に過剰発現させることにより、野生型アゴニストに特異的なヒトTh細胞クローンに強い増殖応答を誘導できることを見いだした。このT細胞増殖応答は、従来TCRを介した抗原刺激のシグナル伝達に必須であると考えられていた、チロシンリン酸化酵素であるZAP-70の活性化を伴わないユニークなものであった。種々の阻害剤を用いた増殖応答に対する阻害効果を調べた結果、このT細胞増殖応答には新規PKCが関与することが示唆された。実際に過剰発現させたアンタゴニストの刺激で増殖するT細胞において、この新規PKCは活性化されることが明らかとなった。さらに高感度質量分析により、このPKCの分子種は同じファミリーに属する新種であることがわかった。
脇役が語るアミロイドーシスの診断および治療～アミロイド共存蛋白質の世界～

アミロイド線維に共存する蛋白質は、アミロイドーシスの病態に深く関与していることが知られている。本研究では、質量分析装置を用いて、早期の診断マーカーや治療分子となりうる新規アミロイド共存蛋白質を同定することを目的とした。本解析の結果、アミロイド沈着組織のLC-MS/MSを用いた解析で、クラスタリンやビトロネクチンをはじめとするいくつかの候補蛋白質を同定した。家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)患者では、健常者に比べ、有意な血清クラスタリン濃度の増加を認めた。さらに、FAPの心臓において、ビトロネクチンの沈着量とTTRの沈着量に有意な相関を認めた。本研究は、アミロイド線維に共存する蛋白質に着目し、質量分析装置を駆使して、新規アミロイド共存蛋白質を網羅的に同定するとともに、共存蛋白質の機能を解析し、治療分子や早期診断マーカーの開発を行うことを目的とする。前年度に引き続き、症例数を増やし、各種アミロイドーシス患者(AL, AA, SSA, FAP)のアミロイド沈着組織に存在する蛋白質をLC-MS/MSを用いて網羅的に解析した結果、治療分子や早期診断マーカーとなりうる蛋白質が多数同定された。FAPのアミロイド沈着組織の解析では、アミロイド沈着量の多い群に、多量に沈着しているいくつかの蛋白質を同定した。新たに同定された蛋白質のひとつであるビトロネクチン(細胞外分泌蛋白質)において、組織への沈着量は、アミロイドの沈着量と有意な相関を示すことが明らかとなった。また、チオフラビンTを用いたアミロイド形成抑制実験では、アミロイド線維形成を抑制するというデータは出ず、治療標的分子の特定には至らなかった。前年度に引き続き、SSAにおいて、血清クラスタリン濃度を測定した結果、FAPの場合と異なり、健常者に比べて、増加傾向は認められなかったことより、アミロイドのタイプによって蛋白質の挙動が異なる可能性が示された。しかし、本研究を実施していく過程で、副産物として、FAPにおいて、性差や年齢によって組織に沈着するアミロイドの構成成分が変化するという病態を見出し、本研究は、これまでに明らかとなっていないTTRアミロイド形成メカニズムを紐解く一助となった(業績参照)。クラスタリンおよびビトロネクチンの迅速測定法については、現在も検討中である。アミロイドーシスは、現在、日本に約500万人以上の患者がいる巨大な難治性の疾患群である。本疾患は、詳細なアミロイド形成機構が不明であることから、未だに根治的な治療法や早期診断法がない。本研究では、アミロイドーシスの根治治療法と早期診断法の確立を目標とし、アミロイド形成におけるclusterinの役割の解析、ならびに質量分析装置を用いた新規解析法を駆使し、新たなアミロイド線維に共存し線維形成に対して阻止的に働く蛋白質を網羅的に解析し、治療分子や早期診断マーカーの開発を行う。計画初年度である平成24年度は、clusterinの新規早期診断マーカーとしての可能性を探索するために、FAP患者血清のclusterin濃度を測定した。その結果、FAPでは、健常者に比べ、血清clusterin濃度の有意な増加を認め、さらに、重症度ともに、減少する傾向も確認した。また、FAPキャリアでも血清clusterin濃度が上昇している傾向が示された。アミロイド沈着部位に存在する新規アミロイド共存蛋白質を探索するために、代表的な全身性アミロイドーシス(FAP 20例、SSA 5例、ALアミロイドーシス10例、AAアミロイドーシス、5例)の剖検、生検ホルマリン固定組織をLC-MS/ MSを用いて解析した。結果として、上記のclusterin以外にもアミロイド形成への関与が疑われる数種の新規アミロイド共存蛋白質を同定した。その中には、蛋白質の処理に関与するヒートショックプロテイン(HSP)やユビキチン関連蛋白質、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)が含まれていた。これらclusterinやHSP, MMPはFAPの早期診断マーカー、更には治療薬の候補になり得る可能性をもつ。clusterinの新規早期診断マーカーとしての可能性の探索に関して、初年度は、FAPにおいて血清clusterin濃度が健常者群に比べて、優位に増加しており、重症度とともに減少する傾向が確認された。さらに、FAPキャリアにおいても、血清clusterin濃度は、増加傾向を認め、早期診断マーカーとしての可能性を示すことが出来た。また、clusterinのアミロイド線維形成への影響に関して、各種アミロイドーシスのアミロイド沈着部位の解析から、clusterinがFAPだけでなく、ALアミロイドーシス、AAアミロイドーシス、SSA、角膜アミロイドーシスにおいてもアミロイドと共存していることが明らかとなり、各種アミロイド線維の形成への関与が疑われた。

アミロイド沈着部位に存在するアミロイド共存蛋白質の探索に関しては、各種アミロイドーシス患者のホルマリン固定組織を用いたLC-MS/MSによるプロテオーム解析から、アミロイド形成阻止に働く可能性のある各種蛋白質(HSP、ユビキチン関連蛋白質、MMPなど)を同定できた。また、FAPにおいて、アミロイドの沈着量と比例して有意に増加する診断マーカーとして期待できる細胞外分泌蛋白質も同定できた。以上のように、clusterin以外にも治療薬および早期診断マーカーとしての候補蛋白質を同定することができたため順調と考えられる。次年度の研究に向けての準備が整った。次年度は、前年度の計画を継続して行うと同時に、更に研究を発展させ、clusterinおよび新規アミロイド共存蛋白質による治療法および早期診断マーカーの開発に向けて研究する。FAP以外のアミロイドーシスでもclusterinの新規早期診断マーカーとしての可能性を探索するために、AL、AA、SSAの患者の血清clusterin濃度を測定し、健常者と比較する。さらに、血清clsuterin濃度を迅速かつ汎用的に測定できるように、自動分析装置によるclsuterinの測定法を確立する。また、clusterinの治療薬としての可能性を探索するために、in vitroおよびin vivoの実験系でclusterinのアミロイド線維形成に与える影響を評価する。前年度のLC-MS/MSによる組織解析の結果から、明らかとなった蛋白質のうちアミロイド線維形成に対して阻止的に働く可能性のある蛋白質および、早期診断マーカーとなる可能性のある蛋白質にフォーカスを当て更なる検討を実施する。治療薬の候補となる蛋白質に関しては、in vitroでのチオフラビンTなどを用い、アミロイド線維形成に与える影響を評価する。また、早期診断マーカーの候補蛋白質に関しては、アミロイドーシス患者と健常者血清における発現の違いをELISAにて定量的に比較検討する。FAP以外のアミロイドーシスにおいても、血清clusterinの早期診断マーカーとしての有用性を検証するために、ELISA kitを購入する。また、clusterinの自動分析装置による測定法を確立するために、抗clusterin抗体および二次抗体を購入する。また、in vivoにおいて、clusterinのアミロイド線維形成に与える影響を評価するため、実験動物の購入費や飼育費に研究費を用いる。前年度にアミロイド沈着組織からLC-MS/MSにより同定した蛋白質に関して、アミロイド線維形成への影響をin vitroで評価するために、リコンビナント蛋白質を購入する。また、アミロイド沈着に比例して増加していた細胞外分泌蛋白質に関して、新規早期診断マーカーとしての有用性を検証するために、候補蛋白質のELISA kitを購入する。当初の計画どおり、以上に示した研究に次年度の研究費を用いる。
粒子衝突エロ-ジョンにおける臨界衝突速度

金属材料の固体粒子衝突エロ-ジョンは2種類の損傷機構によって進行する。一つの塑性変形の繰り返しによる材料の脱離であり,他の一つは切削である。これらのプロセスは同時に起こるが,全損傷に対するそれらの寄与の割合は衝突角度ばかりでなく,衝突速度にも依存する。衝突速度が低くなるにつれて,固体粒子はターゲット材料表面を滑りにくくなり,切削による損傷は減少する。さらに低いある速度において,粒子は全く滑らなくなり,その場所では切削損傷が無くなり塑性変形損傷のみとなる。この速度を′′臨界衝突速度′′と定義した。本研究では,摩擦係数の測定から,すなわち,滑っている間は動摩擦係数を,滑らずに回転している間は静摩擦係数を示すことを利用して臨界速度を決定する方法を確立した。粒子衝突の瞬間における摩擦係数を測定するために,回転ターゲット装置を開発した。このように測定された臨界衝突速度は材料と粒子の両方の硬さばかりでなく固体粒子の形状と大きさに依存した。さらに,球形固体粒子が衝突するときのターゲット材料表面の挙動の解析より,臨界衝突速度を理論的に導出した。粒子が斜めから衝突する瞬間,表面にはへこみが形成されると同時に,粒子の動く方向に表面接線方向の歪みが生じる。歪み量が弾性限界を越えると,衝突した固体粒子は表面を滑り始め,その表面に切削損傷が引き起こされる。その限界の歪みは粒子速度,回転速度および粒子と表面との接触時間の関数として導出された。衝突挙動を特徴付けるこれらのパラメーターは全てターゲット材料と粒子の機械的性質から得られる摩擦係数,反発係数と粒子に関する他の因子から導出された。その結果,臨界衝突速度の理論値はターゲットと粒子の機械的性質の関数として表された。実験によって決定された臨界速度と理論式によって予測されたそれとの間には良い相関があった。固体粒子が金属表面に衝突して生ずる圧痕では色々な損傷機構(切削,塑性変形,押し込み)によって特徴的表面が生ずる.まず,これら損傷機構の違いによる腐食速度の変化を調べたところ,切削部表面の腐食速度は減少し,塑性変形によって生じる盛り上がり部分の腐食速度は加速されていた.押し込み部分の腐食速度は衝突前と変化がなかった.これらの結果より,腐食速度が金属表面の損傷機構により異なることが確認された.次に,粒子の衝突角度を30°,50°,60°と変化させたときの腐食速度を調べたところ,30°,60°,50°の順に増加した.これは30°においては表面が切削損傷を多く受けているので腐食速度が減少し,50°,60°においては表面に盛り上がり部分が多く存在し腐食速度が増加するためである.しかし衝突速度を下げていくと腐食速度の差は減少し,ある衝突速度以下では粒子衝突角度に関係なく同一の腐食速度となった.この速度を,衝突角度によらず損傷機構が一定になる速度,すなわち臨界衝突速度とした.今年度は,損傷表面の腐食速度を測定することによって臨界衝突速度を実験的に求め,臨界衝突速度に対する粒子径の影響を調べた.衝突粒子の粒径を大きくすると臨界衝突速度の値は減少するが,粒径40μm以上ではほとんど変化がなかった.来年度以降は,エキソ電子測定装置や当研究室で新しく開発した回転試片式摩擦係数測定装置を用いることによって臨界衝突速度を求め,それらを比較する.さらに,任意の粒子と試片の組み合わせについての臨界衝突速度を求める理論式を導出する.昨年度は,損傷機構の腐食速度を測定することにより,臨界衝突速度を実験的に求めた.しかし,この測定方法を用いると,(1)損傷部の作成,腐食速度の測定に対して膨大な時間を要する.(2)鉄鋼材料についてしか腐食速度測定を行うことができない.という短所が明らかになった.

それに基づき,今年度は当研究室で新しく開発した回転試片式摩擦係数測定装置を用いることによって臨界衝突速度を求めることとした.この装置を用いることにより,腐食速度測定に比べ,(1)任意の粒子,試片の組合わせについて測定を行うことができる.(2)比較的短時間で測定を行うことができる.という利点が得られた.この方法で求められた臨界衝突速度は,昨年度求められた値とほぼ一致しており,本装置が正しく臨界衝突速度を測定していることが分かった.求められた臨界衝突速度からは,(1)球形粒子については,臨界衝突速度は粒子半径が大きくなるにつれ増加する.(2)試片硬さと粒子の硬さの比が大きい,すなわち試片が粒子より硬いほど,臨界衝突速度の値は大きくなる.しかし,試片硬さが粒子硬さを越えると,ほとんど臨界衝突速度は変化しない.(3)有角粒子については,臨界衝突速度は粒子径が大きくなるにつれて減少する.ということ,すなわち,臨界衝突速度は粒子径,粒子形状,粒子および試片の硬さなどの機械的性質によって変化するということが分かった.来年度は,任意の粒子と試片の組合わせについての臨界衝突速度を,実験的にではなく,理論的に求める推定式を導出する.金属材料の固体粒子衝突エロ-ジョンは2種類の損傷機構によって進行する。一つは塑性変形の繰り返しによる材料の脱離であり、他の一つは切削である。これらのプロセスは同時に起こるが、全損傷に対するそれらの寄与の割合は衝突角度ばかりでなく、衝突速度にも依存する。衝突速度が低くなるにつれて、固体粒子はターゲット材料表面を滑りにくくなり、切削による損傷は減少する。さらに低いある速度において、粒子は全く滑らなくなり、その場所では切削損傷が無くなり塑性変形損傷のみとなる。この速度を“臨界衝突速度"と定義した。本研究では、摩擦係数の測定から、すなわち、滑っている間は動摩擦係数を、滑らずに回転している間は静摩擦係数を示すことを利用して臨界速度を決定する方法を確立した。粒子衝突の瞬間における摩擦係数を測定するために、回転ターゲット装置を開発した。このように測定された臨界衝突速度は材料と粒子の両方の硬さばかりでなく固体粒子の形状と大きさに依存した。さらに、球形固体粒子が衝突するときのターゲット材料表面の挙動の解析より、臨界衝突速度を理論的に導出した。粒子が斜めから衝突する瞬間、表面にはへこみが形成されると同時に、粒子の動く方向に表面接線方向の歪みが生じる。歪み量が弾性限界を越えると、衝突した固体粒子は表面を滑り始め、その表面に切削損傷が引き起こされる。その限界の歪みは粒子速度、回転速度および粒子と表面との接触時間の関数として導出された。衝突挙動を特徴付けるこれらのパラメーターは全てターゲット材料と粒子の機械的性質から得られる摩擦係数、反発係数と粒子に関する他の因子から導出された。その結果、臨界衝突速度の理論値はターゲットと粒子の機械的性質の関数として表された。実験によって決定された臨界速度と理論式によって予測されたそれとの間には良い相関があった。
全ゲノム情報を活用したOutbreak関連大腸菌の下痢原性の解明

Outbreak関連大腸菌O166:H15についてCaco-2細胞およびT84細胞への付着性試験を実施した。Caco-2細胞については、事例患者由来株4株中3株でびまん性付着が確認されたが、陰性対照株として用いた食品由来株でも同様の付着性が認められた。また、T84細胞では、いずれの事例患者由来株についても付着は認められなかった。2017年に発生したO166:H15食中毒患者由来株を含む事例患者由来株5株について、制限酵素XbaI処理によるパルスフィールドゲル電気泳動を実施したところ、すべての株でパターンが異なり、遺伝的関連性は示されなかった。O166:H15について付着因子以外の病原因子候補を再度検索するため、これまでに得られた全ゲノムデータを用いてDDBJ Fast Annotation and Submission Toolによるアノテーションを実施し、事例患者由来4株と健康保菌者由来2株の共通遺伝子検索をIn Silico Molecular Cloningソフトウェアを用いて実施した。結果として、事例患者由来4株のうち少なくとも3株が保有し、いずれの健康保菌者由来株も保有しない遺伝子は、165遺伝子であった。これら165遺伝子についてNCBIの遺伝子データベースと照合した結果、病原性への関与が推測される線毛や分泌装置に関係する遺伝子が同定された。astA遺伝子のリファレンス配列について相同検索を実施したところ、事例患者由来の4株中3株で95.73%から98.29%の相同性を持つ配列が決定された。平成30年度は事例患者由来株のCaco-2細胞付着性と物質透過性を中心に検討する予定であったが、患者由来株で有意な付着が確認されなかったため経上皮電気抵抗値の測定は実施しなかった。事例患者由来のO166:H15について、大腸菌以外の病原因子を含めて病原遺伝子を再度精査したところ、収束線毛あるいは分泌装置に関連する遺伝子の保有が明らかとなった。現在、これらを評価するためのアッセイ方法の確立を目指している。当初の計画よりも多くの遺伝子が病原因子候補として挙がっているため、特定に時間がかかっている。しかしながら、これらの絞り込みは着実に進んでおり、おおむね順調に進捗していると考えている。最終年度である平成31年度は、主としてO166:H15の侵襲性に着目し研究を進める。コンタクトヘモライシス試験あるいは感染実験を実施し、ゲノム情報から得られた病原因子候補について精査する。また、必要に応じ病原因子欠損株を作出し、その表現型を野生株と比較する。新規の病原遺伝子が決定された場合は検出法を確立し、過去に大阪府で分離されたOutbreak関連大腸菌について、病原遺伝子の保有状況を調べる。また、事例患者由来O166:H15のastAについては、定量PCR法を確立し、その発現量を食品由来株や保菌者由来株と比較する。Outbreak関連大腸菌O166:H15、O128:H12、O146:H28を用いて、乳のみマウス試験による下痢原性の検討を行った。また、O166:H15については、HeLa細胞とHep-2細胞を用いた付着性試験を実施し、さらに、Outbreak患者由来株、散発下痢症患者由来株、健康保菌者由来株の全ゲノム解析を行った。Escherichia coli O166:H15は、4件のOutbreakの患者に由来する4株、散発事例患者由来の2株、健康保菌者由来の2株を供試した。また、E. coli O128:H12とE. coli O146:H28は、各1事例に由来する別患者由来の2株をそれぞれ供試した。乳のみマウス試験では、トリソイ寒天平板に発育した供試株を、1.3×1010から2.8×1010 CFU/mlでPBS(-)に懸濁し、超音波処理後、遠心ろ過処理した上清100μlを乳のみマウスに投与した。また、トリソイブロスによる振とう培養(150rpm、37°C、18時間)上清も試料とした。投与後、4-5時間後に腸管内液体貯留値(FA値)を確認し、非病原株と比較した。結果として、供試したすべてのOutbreak関連大腸菌で有意差は認められなかった。HeLa細胞とHep-2細胞を用いた付着性試験では、供試したE. coli O166:H15株でびまん性の付着が確認された。また、O166:H15の全ゲノム解析では、供試した8株のうち6株がST349で、Outbreak患者由来の4株のうち3株がST349であった。また、すべての株について病原因子を検索したところ、細胞付着性に関与する病原因子およびastAがOutbreak患者由来の3株のみで確認された。平成29年度はOutbreak関連大腸菌の下痢原性を評価するためのアッセイ法の確立を目標として、研究を進めた。乳のみマウス試験によるO166:H15、O128:H12、O146:H28の下痢原性の検討では、様々な手法を検討することで、安定したデータを得るための手技を確立することができた。その結果、供試株では腸管内液体貯留活性が認められなかったため、毒素タンパク等による下痢原性の可能性は低いと判断した。

一方、O166:H15によるHeLa細胞とHep-2細胞を用いた付着性試験では、びまん性の付着が確認され、さらに、全ゲノム解析によりOutbreak患者由来株のみに存在する付着因子の存在が明らかとなった。今後は供試株の付着性を指標として研究を進めていく予定であり、ほぼ予定通りに研究計画は進んでいると判断している。Outbreak関連大腸菌O166:H15についてCaco-2細胞およびT84細胞への付着性試験を実施した。Caco-2細胞については、事例患者由来株4株中3株でびまん性付着が確認されたが、陰性対照株として用いた食品由来株でも同様の付着性が認められた。また、T84細胞では、いずれの事例患者由来株についても付着は認められなかった。2017年に発生したO166:H15食中毒患者由来株を含む事例患者由来株5株について、制限酵素XbaI処理によるパルスフィールドゲル電気泳動を実施したところ、すべての株でパターンが異なり、遺伝的関連性は示されなかった。O166:H15について付着因子以外の病原因子候補を再度検索するため、これまでに得られた全ゲノムデータを用いてDDBJ Fast Annotation and Submission Toolによるアノテーションを実施し、事例患者由来4株と健康保菌者由来2株の共通遺伝子検索をIn Silico Molecular Cloningソフトウェアを用いて実施した。結果として、事例患者由来4株のうち少なくとも3株が保有し、いずれの健康保菌者由来株も保有しない遺伝子は、165遺伝子であった。これら165遺伝子についてNCBIの遺伝子データベースと照合した結果、病原性への関与が推測される線毛や分泌装置に関係する遺伝子が同定された。astA遺伝子のリファレンス配列について相同検索を実施したところ、事例患者由来の4株中3株で95.73%から98.29%の相同性を持つ配列が決定された。平成30年度は事例患者由来株のCaco-2細胞付着性と物質透過性を中心に検討する予定であったが、患者由来株で有意な付着が確認されなかったため経上皮電気抵抗値の測定は実施しなかった。事例患者由来のO166:H15について、大腸菌以外の病原因子を含めて病原遺伝子を再度精査したところ、収束線毛あるいは分泌装置に関連する遺伝子の保有が明らかとなった。現在、これらを評価するためのアッセイ方法の確立を目指している。当初の計画よりも多くの遺伝子が病原因子候補として挙がっているため、特定に時間がかかっている。しかしながら、これらの絞り込みは着実に進んでおり、おおむね順調に進捗していると考えている。平成30年度はO166:H15の細胞付着性に着目し研究を進める。Caco-2細胞を用いて付着性の精査を行い、さらに、経上皮電気抵抗値(TER)の測定による物質透過性変化のモニタリングを実施する。また、必要に応じ病原因子欠損株を作出し、細胞付着性や物質透過性を野生株と比較する。次に、Outbreakの患者に由来するO166:H15のastAについて、その周辺を含めた塩基配列を精査し、食品由来株や保菌者由来株と比較を行う。研究の進捗状況により可能であれば、2017年に新たに発生したO166:H15によるOutbreakの患者由来株およびO128:H12、O146:H28についても全ゲノム解析を実施し、病原因子の検出を行う。