hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
集積型金属錯体の化学的機能

○伊藤は,「Ru三核クラスターユニット間の混合原子価状態」における分子内電子移動速度を赤外吸収線形から決定する手法を''非対称なポテンシャル面をもつ系"へ展開し,三つのクラスター骨格間での分子内電子移動速度定数の決定に成功した.また,平面型白金錯体そのものを配位子とする手法を発展させ、Rh複核クラスターに配位させたユニークな一次元および分子性錯体の合成に成功した.○佐々木は,配位子の酸化還元に基づく"混合原子価状態"の安定性を評価し,金属中心,配位子双方で混合原子価状態となる"Double-mixed-valence状態"の存在を見いだした.さらに,新たな集積体ユニットとしてレニウム6核錯体を取り上げ,巨大配位子6個を有するRe六核錯体の構造解析に成功した.○西原は,光応答性アゾ共役遷移金属錯体の研究において単一紫外光のみでのtrans-cis双方向の異性化を酸化状態スイッチングと組み合わせることで実現させた.またフェロセンとキノンをπ共役系で連結したプロトン共役分子内電子移動系において,プロトン付加体が構造,物性において異常に揺らいだ錯体であることを見いだした.○芳賀は、表面錯体集積体の構築を目指し,基板上で電位傾斜を持たせた多積層体の合成に成功した.また,配位高分子の気水界面における二次元構造制御に関する研究を行い,気水界面上で配位高分子の二次元結晶と見なせる錯体集合体の生成を明らかにした.○藤田は,三座配位子2,4,6-トリス(4-ピリジル)トリアジンと種々の金属イオンからなる2次元あるいは3次元ネットワークの構築に関する研究を推し進め,ゲスト包接と連動した可逆的結晶構造変化を示す3次元ネットワーク構造体の構築に成功した.○伊藤は,「Ru三核クラスターユニット間の混合原子価状態」における分子内電子移動速度を赤外吸収線形から決定する手法を''非対称なポテンシャル面をもつ系"へ展開し,三つのクラスター骨格間での分子内電子移動速度定数の決定に成功した.また,平面型白金錯体そのものを配位子とする手法を発展させ、Rh複核クラスターに配位させたユニークな一次元および分子性錯体の合成に成功した.○佐々木は,配位子の酸化還元に基づく"混合原子価状態"の安定性を評価し,金属中心,配位子双方で混合原子価状態となる"Double-mixed-valence状態"の存在を見いだした.さらに,新たな集積体ユニットとしてレニウム6核錯体を取り上げ,巨大配位子6個を有するRe六核錯体の構造解析に成功した.○西原は,光応答性アゾ共役遷移金属錯体の研究において単一紫外光のみでのtrans-cis双方向の異性化を酸化状態スイッチングと組み合わせることで実現させた.またフェロセンとキノンをπ共役系で連結したプロトン共役分子内電子移動系において,プロトン付加体が構造,物性において異常に揺らいだ錯体であることを見いだした.○芳賀は、表面錯体集積体の構築を目指し,基板上で電位傾斜を持たせた多積層体の合成に成功した.また,配位高分子の気水界面における二次元構造制御に関する研究を行い,気水界面上で配位高分子の二次元結晶と見なせる錯体集合体の生成を明らかにした.○藤田は,三座配位子2,4,6-トリス(4-ピリジル)トリアジンと種々の金属イオンからなる2次元あるいは3次元ネットワークの構築に関する研究を推し進め,ゲスト包接と連動した可逆的結晶構造変化を示す3次元ネットワーク構造体の構築に成功した.○伊藤らは,「クラスターユニット間の混合原子価状態」における分子内電子移動速度を赤外吸収線形から決定する研究手法を,4,4'-ビピリジン架橋三核ルテニウムクラスター二量体に適応した.混合原子価中心間の距離が11Å程度に長くなっても,電子移動速度が速い系では,赤外吸収線形にその影響が現れ速度定数の桁を評価することが可能であることを明らかにした.○佐々木は,μ-オキソ型のルテニウム複核錯体について,ルテニウムの酸化状態が(II,II)から(III,IV)までの各酸化状態におけるμ-ヒドロキソ/μ-オキソのプロトン脱着平衡定数(pK_a),および,μ-ヒドロキソならびにμ-オキソ錯体それぞれの各状態間の酸化還元電位を全て決定した.このような一連のデータは報告例がないものであり,酸化状態がpK_a値に及ぼす影響や,「プロトン共役電子移動」が発現する条件などがこれにより明らかにされた.○「多サイト反応場の構築とその利用」に向け,鈴木は,かさ高い三脚型四座配位子を含むビス(μ-ヒドロキソ)二核ニッケル錯体と過酸化水素との反応を調べた.低温で生成するビス(μ-オキソ)二核ニッケル(III)錯体,および,ビス(μ-スーパーオキソ)二核ニッケル(II)錯体の構造を決定し,これらが,-40°C以上で配位子に導入したメチル基のC-H結合を活性化して水酸化出来ることを明らかにした.○芳賀は,長鎖アルキル基を有するルテニウム錯体を用いて,気水界面へ錯体を集積させた「表面錯体」の形成とその機能開発をめざして研究を行った.界面における錯体集合体の構造は,架橋配位子やアンカー配位子の性質に大きく依存することを明らかにした.○伊藤は,「Ru三核クラスターユニット間の混合原子価状態」における分子内電子移動速度を赤外吸収線形から決定する手法の開発研究を継続して行った.

従来に比べ最も大きなpKa値をもつキヌクリジンを含むピラジン架橋三核ルテニウムクラスター二量体にこの手法を適用した結果,最も大きな速度定数1x10^<12>s^<-1>(-18°C)が得られた.○佐々木は,プロトン共役電子移動反応を示すオキソ架橋ルテニウムおよび鉄錯体を金電極上に自己集積化することに成功し,水溶液との界面でプロトン共役電子移動反応を実現した.また,八面体型レニウム六核錯体にピリジン型配位子を数および幾何構造を制御して導入し、それらの酸化還元挙動を系統的に調べた他,レニウム六核錯体が発光性であることを初めて見い出し,一連の錯体の光物性を明らかにした.○「多サイト反応場の構築とその利用」に向け,鈴木は,三脚型四座配位子(Me3-tpa=tris(6-methyl-2-pyridyl-methyl)amine)を含む高原子価ニ核ニッケル(III)オキソ錯体([Ni_2(μ-O_2)_2(Me_3-tpa)_2]^<2+>)の構造と酸素活性化機構を詳細に見当した.その結果,bis(μ-oxo)dinickel(III)錯体のオキソ基は配位子に組み込んだメチル基の水素原子を引き抜き,水酸化あるいはカルボン酸イオンにまで酸化することを見だした.さらにこの水素原子の引き抜きには,オキソ基と水素原子の間の近接効果が重要であることを明らかにした.○芳賀は,2,6-ビス(オクタデシルベンズイミダゾリル)ビリジン(L18)を有し,かつ配位能をもつ一連のルテニウム錯体[Ru(L18)(L)]^<n+>(L=4,4'-ビピリジンあるいはシアノ基)を新規に合成し,下層液中の金属イオンとの界面での錯形成が起こることを明らかにした.また,ジスルフィド基あるいはホスホン酸基をもつビス(2-ベンズイミダゾリル)ピリジン基を有するルテニウム錯体を合成し,金あるいは酸化物表面への自己集積化を行った.表面でのプロトン共役電子移動が起こることならびに接触角の変化を観測した.○伊藤は,「Ru三核クラスターユニット間の混合原子価状態」における分子内電子移動速度を赤外吸収線形から決定する手法の開発研究を継続して行った.本年度は"非対称なポテンシャル面をもつ系"にこの手法を適用した.^<13>COや^<13>C^<18>Oを含む試料を用いることにより,平衡状態で存在する二つの混合原子価化学種それぞれにおける分子内電子移動速度定数の決定に成功した.また,供与型Pt-Ag結合生成を利用し,...Pt-Ag-Pt-Ag...型の一次元らせん構造の構築に成功した.○佐々木は,次の系の酸化還元特性を研究した:一連のオキソ架橋クラスター系のクラスターユニットを介した配位子間相互作用,Ru三核錯体を金電極上へ3段階まで段階的に集積化した系,ジフォスフィンやポルフィリン配位子を含むレニウム6核錯体.更に,ルテニウムポルフィリンニ量体の混合原子価状態が特異な振電作用に基づく赤外スペクトルを与えることを初めて見い出した.○西原は,光応答性アゾ共役遷移金属錯体の研究において,光定常状態におけるtrans体:cis体比がCo(II)とCo(III)で異なることを利用し酸化状態スイッチングと組み合わせて単一紫外光のみでのtrans-cis双方向の異性化を実現させた.またアゾフェロセン系において,MLCTバンドの可視光励起による,また,レドックスのみによるtrans-cis異性化の発現を見いだした.
c-AblファミリーのクロマチンにおけるRad51の機能制御の意義

DNA二重鎖切断等のDNA損傷応答に中心的な役割を果たしているATMの下流で,c-AblチロシンキナーゼがATM依存性に,DNA相同組み換えタンパク質RAD51をリン酸化するが,相同組み換え修復経路におけるRAD51の多岐にわたる機能のうちのどの部分に関わるかは明らかではない.我々は,c-Ablのクロマチン結合はGlivecで阻害され,Kinase-dead変異体では起こらないことを明らかにした.また最近新たに同定したRAD51-R167G変異体(R167G)は,単独発現ではクロマチンに集積しないが,c-Ablとの共発現により,RAD51野生型と同様に,クロマチン分画に集積し,抗Y-54pあるいはY-315p特異抗体を用いた解析により,c-AblによるRad51の54番,315番のチロシンのリン酸化がクロマチン分画でのみ起こることを認めた.R167Gは,RAD51がフィラメントを形成した時に,隣接するRAD51分子との境界領域に存在すると考えられている.やはり,この領域に存在すると予想されるRAD51-F86E変異体(ケンブリッジ大,Venkitaraman博士から供与された.)についても,c-Ablとの共発現でクロマチン集積が回復し,54番,315番のチロシンリン酸化を確認した.さらにR167Gの54番と315番のどちらのチロシンがリン酸化によるクロマチン集積に必要かを調べるために,二重の変異体(RAD51Y54F/R167GとRAD51R167G/Y315F)を作製して,蛍光抗体法でc-Abl共発現の場合のRAD51の局在を検討した.その結果,R167Gのc-Abl共発現によるクロマチン集積には,RAD51の315番のチロシンのリン酸化が重要であることが判明した.以上の結果から,c-Ablが自身のキナーゼ活性依存性にDNA損傷部位に移行し,BRCA2依存性にDNA損傷部位に移行したRad51のチロシン隣酸化を行い,おそらくはRad51の自己集合あるいはDNA結合を制御することにより,最終的にRad51のDNA損傷部位でのフィラメント形成を促進すると考えられる.今後,DNA損傷によるc-Ablファミリーの活性化と,チロシンキナーゼ活性依存性に起こるDNA損傷部位への集積の機序について,BRCA1とTopBP1の役割に重点をおいて検討すると共に,Rad51の相同組み換えDNA修復能への,分子標的薬剤Glivecの影響について検討する.DNA二重鎖切断等のDNA損傷応答に中心的な役割を果たしているATMの下流で,c-AblチロシンキナーゼがATM依存性に,DNA相同組み換えタンパク質RAD51をリン酸化するが,相同組み換え修復経路におけるRAD51の多岐にわたる機能のうちのどの部分に関わるかは明らかではない.我々は,c-Ablのクロマチン結合はGlivecで阻害され,Kinase-dead変異体では起こらないことを明らかにした.また最近新たに同定したRAD51-R167G変異体(R167G)は,単独発現ではクロマチンに集積しないが,c-Ablとの共発現により,RAD51野生型と同様に,クロマチン分画に集積し,抗Y-54pあるいはY-315p特異抗体を用いた解析により,c-AblによるRad51の54番,315番のチロシンのリン酸化がクロマチン分画でのみ起こることを認めた.R167Gは,RAD51がフィラメントを形成した時に,隣接するRAD51分子との境界領域に存在すると考えられている.やはり,この領域に存在すると予想されるRAD51-F86E変異体(ケンブリッジ大,Venkitaraman博士から供与された.)についても,c-Ablとの共発現でクロマチン集積が回復し,54番,315番のチロシンリン酸化を確認した.さらにR167Gの54番と315番のどちらのチロシンがリン酸化によるクロマチン集積に必要かを調べるために,二重の変異体(RAD51Y54F/R167GとRAD51R167G/Y315F)を作製して,蛍光抗体法でc-Abl共発現の場合のRAD51の局在を検討した.その結果,R167Gのc-Abl共発現によるクロマチン集積には,RAD51の315番のチロシンのリン酸化が重要であることが判明した.以上の結果から,c-Ablが自身のキナーゼ活性依存性にDNA損傷部位に移行し,BRCA2依存性にDNA損傷部位に移行したRad51のチロシン隣酸化を行い,おそらくはRad51の自己集合あるいはDNA結合を制御することにより,最終的にRad51のDNA損傷部位でのフィラメント形成を促進すると考えられる.今後,DNA損傷によるc-Ablファミリーの活性化と,チロシンキナーゼ活性依存性に起こるDNA損傷部位への集積の機序について,BRCA1とTopBP1の役割に重点をおいて検討すると共に,Rad51の相同組み換えDNA修復能への,分子標的薬剤Glivecの影響について検討する.ATMの相同組み替えDNA修復機能に,c-AblファミリーによるRad51のチロシン燐酸化が関与しているが,その機序は明らかではない.我々は,Rad51-Y315F変異体は,BRCA2との結合やクロマチン結合に異常は認められないが,刺激と関係なくself-

associationが充進しており,放射線照射後のRad51focus形成のパターンが野生型とは異なる等,c-AbによるRad51のY-315のチロシン隣酸化が,その機能制御に係わることを示唆する結果を得た.さらに,抗Y-54pあるいはY-315p特異抗体を用いた解析により,c-AbIによるRad51チロシン隣酸化はクロマチン分画でのみ認められることや,c-Ablのクロマチン結合はGlivecで阻害され,Kinase-dead変異体では起こらないことを明らかにした.従って,c-AbIが自身のキナーゼ活性依存性にクロマチン結合(移行あるいは停留)し,それとidependentにクロマチン移行した(おそらくBRCA2依存性に)Rad51のチロシン隣酸化を行い,おそらくはRad51のself-associationあるいはDNA結合を制御することにより,Rad51のchromatin assemblyを促進し,最終的にRad51のfocus/filament形成を促進すると考えられる.今後,DNA損傷によるc-Ablファミリーの活性化と,チロシンキナーゼ活性依存性に起こるDNA損傷部位への集積の機序について,BRCA1とTopBPIの役割に重点をおいて検討すると共に,RadSIの相同組み換えDNA修復能への,分子標的薬剤Glivecの影響について検討する.DNA二重鎖切断等のDNA損傷応答に中心的な役割を果たしているATMの下流で,c-AblチロシンキナーゼがATM依存性に,DNA相同組み換えタンパク質RAD51をリン酸化するが,相同組み換え修復経路におけるRAD51の多岐にわたる機能のうちのどの部分に関わるかは明らかではない。我々は,c-Ablのクロマチン結合はGlivecで阻害され,Kinase-dead変異体では起こらないことを明らかにした。また最近新たに同定したRAD51-R167G変異体(R167G)は,単独発現ではクロマチンに集積しないが,c-Ablとの共発現により,RAD51野生型と同様に,クロマチン分画に集積し,抗Y-54pあるいはY-315p特異抗体を用いた解析により,c-AblによるRad51の54番,315番のチロシンのリン酸化がクロマチン分画でのみ起こることを認めた。R167Gは,RAD51がフィラメントを形成した時に,隣接するRAD51分子との境界領域に存在すると考えられている。やはり,この領域に存在すると予想されるRAD51-F86E変異体(ケンブリッジ大,Venkitaraman博士から供与された。)についても,c-Ablとの共発現でクロマチン集積が回復し,54番,315番のチロシンリン酸化を確認した。さらにR167Gの54番と315番のどちらのチロシンがリン酸化によるクロマチン集積に必要かを調べるために,二重の変異体(RAD51Y54F/R167GとRAD51R167G/Y315F)を作製して,蛍光抗体法でc-Abl共発現の場合のRAD51の局在を検討した。その結果,R167Gのc-Abl共発現によるクロマチン集積には,RAD51の315番のチロシンのリン酸化が重要であることが判明した。以上の結果から,c-Ablが自身のキナーゼ活性依存性にDNA損傷部位に移行し,BRCA2依存性にDNA損傷部位に移行したRad51のチロシン隣酸化を行い,おそらくはRad51の自己集合あるいはDNA結合を制御することにより,最終的にRad51のDNA損傷部位でのフィラメント形成を促進すると考えられる。
針葉樹人工林の帯状・群状択伐方式における伐区の時空間配置の最適化

多様な森づくりが世界的に指向されている一方で、大面積を一度に伐採・更新する「皆伐方式」が一般的である。本研究では、小面積の伐採面を分散させる「帯状・群状択伐方式」に着目し、次の結果を得た。1)植栽木の良好な成長を維持するために最低限必要な群状伐区のサイズは、スギで2500m2、ヒノキで900m2であり、スギの帯状択伐の場合は保残木の樹高程度の帯幅が最低必要である。2)スギ林の場合、高頻度(回帰年10年)で0.2haの伐区面積で群状択伐を実施することで、木材生産機能が維持された択伐林業が可能である。本研究では、小面積の伐採面を分散させる「帯状・群状択伐方式」に着目し、どのような大きさ・形状の伐採面をいつ・どこに・どのように配置すればよいか?という問い答えることを目的とする。本年度は、宮崎県椎葉村に設定している群状択伐試験地を対象に調査解析を進めた。調査対象地はスギとヒノキが植栽されており、それぞれ面積は0.1haである。各伐区全木に対し2014年6月に樹高、根元直径、胸高直径を計測した。2014年時で下木13年生、上木61年生である。樹高・直径・成長量の説明変数として垂直的競争指数VCIを用いて保算木の影響をモデル化した。その際、保残木の方位を考慮しVCIを各方位に分けて算出した。モデルの結果を用いて伐区長10m70mや伐区の形状を変化させて、シミュレーションを行った。シミュレーションの結果、伐区サイズにおいてスギで2500m2以上、ヒノキでは900m2以上で樹高・直径・成長量が一定となることが分かった。形状は、両伐区ともに正方形において最も成長が良い結果となった。この結果より、群状択伐における伐区サイズについては樹種特性を考慮する必要があり、耐陰性の低いスギの方がヒノキよりも大きな伐区を設定する必要があることが分かった。また、過密な針葉樹人工林の場合,林分密度とは無関係に単位面積あたり樹幹表面積合計が一定かつ上限となることを発見し,「樹幹表面積の保存則」と名付けた。この樹幹表面積合計は,単位土地面積に生存しうる生活細胞の量に比例することが予想される。今後,この上限値と帯状・群状複層林における樹幹表面積合計とを比較することにより,帯状・群状複層林において,より大きい樹幹表面積合計を保持できるのかという仮説を検証する予定である。本研究では、小面積の伐採面を分散させる「帯状・群状択伐方式」に着目し、どのような大きさ・形状の伐採面をいつ・どこに・どのように配置すればよいか?という問いに答えることを目的としている。本年度は、まず、大分県に設置している帯状択伐林のヒノキ植栽木試験地と無植栽試験地の再測を行った。ヒノキ植栽木試験地では、皆伐区植栽木の成長と比較した結果、前回計測時の3年生時とは異なり、69年生時では、帯状択伐区での植栽木は皆伐区より樹高・直径ともに下回り、当地で設定した15m幅の伐採は植栽木の成長の観点からは狭いと判断された。無植栽区の天然更新状況については、更新本数を従属変数に、帯幅、伐採後の経過年数、帯の方位、近接広葉樹までの距離、保残木樹種(スギもしくはヒノキ)を独立変数にGLM分析を行ったところ、帯幅、伐採後の経過年数、保残木樹種が変数として選択されたが、概ね、大分県の天然更新完了基準を満たしていた。さらに、カナダや東南アジアにおいて、非皆伐施業の現状と課題を整理するとともに、択伐における保残木の損傷推定モデルを構築した。本年度は計画どおり、大分県に設定している試験地の再測を行い、帯状択伐の設定方法(帯幅および方位)がヒノキ植栽木の成長に与える影響についての結果を得ることができた。加えて、帯状択伐後に無植栽で放置した場合の結果も得ることができ、この点は計画以上に進展しているが、全体としてはおおむね順調であるといえる。本研究では、小面積の伐採面を分散させる「帯状・群状択伐方式」に着目し、そのような大きさ・形状の伐採面をどのように配置すればよいか、という問いに答えることを目的としている。本年度は、まず、大分県に設置している帯状択伐試験地のスギ・ヒノキ保残区、帯状伐採ーヒノキ植栽区、帯状伐採ー無植栽区の調査、再測を行った。ヒノキ植栽木の成長については、皆伐区の植栽木と帯状伐採区の植栽木が統一的に推定できる成長モデルを構築することができ、伐採強度に対して柔軟な成長予測が可能となった。

無植栽区の植生動態モデルについては、昨年までのデータからさらに伐採後の経過年数が増したデータを追加することができ、より長期の植生成長(本数と平均樹高および上層木樹高)の推定が可能となった。スギ・ヒノキ保残区については、林縁に近いほど樹高、胸高直径が小さくなり、曲がりになる確率が高いことが分かったが、一斉林と比較すると、曲がりや枯死率には有意な差がなく、林木の形質は両者で同等あるといえた。さらに、スギ群状択伐林の長期的な成長予測が可能な成長モデルを構築し、森林レベルの面積を対象にモデルシミュレーションによって、回帰年(10,20、25年)と伐区面積(0.05,0.1, 0.2, 0.5ha)の検討を行った。その結果、高頻度(回帰年10年)で0.2haの伐区面積で群状択伐を実施することで、木材生産機能が維持された択伐林業が可能でであることが示唆された。多様な森づくりが世界的に指向されている一方で、大面積を一度に伐採・更新する「皆伐方式」が一般的である。本研究では、小面積の伐採面を分散させる「帯状・群状択伐方式」に着目し、次の結果を得た。1)植栽木の良好な成長を維持するために最低限必要な群状伐区のサイズは、スギで2500m2、ヒノキで900m2であり、スギの帯状択伐の場合は保残木の樹高程度の帯幅が最低必要である。2)スギ林の場合、高頻度(回帰年10年)で0.2haの伐区面積で群状択伐を実施することで、木材生産機能が維持された択伐林業が可能である。本年度は研究計画に従い、2007年に設定した群状択伐林の再測を着実に実施することができ、データ解析も順調に進んで、スギ、ヒノキに関する伐区サイズと伐区形状について有効な知見をえることができた。当初の研究計画に従い、大分県や宮崎県に設定している試験地の再測を行い長期的な傾向を明らかにする。加えて、帯状・群状伐区の空間配置の最適化を考案する。森林計画学当初の研究計画に従い、宮崎県や大分県に設定している試験地の再測を行い長期的な傾向を明らかにする。また、帯状群状択伐施業が進んているカナダをはじめとする諸外国の同行について精査を進める。今年度はカナダでの事例調査・資料収集により多く時間を割いたため、当初予定していた日本での現地調査が予定よりも少なくなったため。当初は複数の調査地での調査を予定でしていたが、着実な結果とその後の展開を図るため、一つの調査地での調査・解析に絞り込んだ。当初から予定していた大分県、宮崎県の試験地の調査を着実に進めるため、それらの調査旅費に使用する。また、成果の論文化・投稿を精力的に進め、英文校閲費や投稿料として使用する。初年度の調査結果を踏まえ、今年度は複数の調査地での調査を実行する。また、カナダ等の非皆伐施業の先進国での事例収集を実行する。
線条体パッチ・マトリックスと入出力の解析

A.線条体パッチ・マトリックスへの入力1.黒質線条体投射様式(シングルニューロントレース)従来の報告とは異なり、黒質緻密部の一つのドーパミンニューロンでさえ、パッチ・マトリックスを含む広い範囲に投射する。Matsuda et al.,J Neurosci.,20092.視床線条体投射様式(シングルニューロントレース)視床線条体投射のうち、髄板内核群、特に束傍核からのものはマトリックス領域を好んで投射する。また、正中線核群からのものはパッチ領域を好んで投射するものが多く、大脳皮質のみならず視床からの投射もパッチ・マトリックス固有の経路が存在することが考えられる(Unzai et al.学会報告)。3.パッチ・マトリックスの生後発達。Nakamura et al.,Neuro Report, 2009B.線条体パッチ・マトリックスからの出力(シングルニューロントレース)2.パッチの間接路ニューロンはマトリックスのそれと比べてエンケファリン発現量が少ない。Koshimizu et al.,Eur J Neurosci.,2008(エンケファリンBACトランスジェニックマウス)3.パッチの直接路ニューロンは全て、ドーパミンニューロンが存在する黒質緻密部に投射するが、マトリックスのニューロンが同部位に投射することはない。Fujiyama et al.,submitted線条体にはパッチ・マトリックスという解剖学的なコンパートメントがあり、近年、強化学習や報酬系における機能的な役割分担の面でも注目されている。しかしながら、大脳基底核の中でこのパッチ・マトリックスを巡るネットワークはどのように違うのか、ということに関しては解明されていない点が多い。まず入力の点から考えると、線条体は大脳皮質と視床から興奮性のグルタミン酸入力を受けているが、皮質線条体入力に比べると、視床線条体入力とパッチ・マトリックス領域との関係はほとんど論じられてきていない。一方、出力に関しては、直接路・間接路という概念とパッチ・マトリックスという解剖学的な構造が同じ線条体内でどのように共存しているのかは未だコンセンサスがない状態である。例えば、パッチのニューロンは本当に黒質緻密部に投射されるのだろうか、パッチにも直接路・間接路ニューロンとにしているのだろうか。また、直接路・間接路の投射形式にはどの程度バリエーションがあるのだろうか。大脳基底核ネットワークをパッチ・マトリックスという視点で再構成するために、シナプス小胞性グルタミン酸トランスポーター(Fujiyama, et al.,2004.2006,Nakamura, et al.,2009)、遺伝子組み換えウイルストレーサー、エンケファリントランスジェニックマウス(Koshimizu, et al.,2008,Matsuda, et al.,2009)等を用いて解析し、大脳基底核ネットワークを検証し、再構築しているところである。Fujiyama et al.,submitted
経静脈的肝内門脈静脈短絡術による門脈圧亢進症に関する基礎的・臨床的研究

頚静脈的肝内門脈静脈短絡術は食道静脈瘤による吐血、下血や難治性腹水を引き起こす門脈圧亢進症に対する新しい治療法であるが、その適応と選択についての詳細な研究はほとんど見られないのが現状である。本法施行に当たり最も重要なことは短絡路と門脈圧減圧効果との関係を知ることであるが、これについての基礎的研究はほとんど見られない。本研究の目的は短絡路の直径と門脈圧減圧との関係を実験的に検討すること、および臨床的には手技の容易化と術後の変化やその管理について検討し、さらに肝癌合併例に対する適応などについて検討した。実験的研究では実験動物を用いてRoschらの方法に準じて肝内に直径が6mm,8mmおよび10mmの自作の金属ステントを挿入し門脈-肝静脈短絡路を作成した。その結果、短絡路直径と門脈圧減圧との間に相関関係のあることが明らかとなり、門脈像との比較により適切なステント直径は8mmであるとの結論を得たが、従来まったく報告がなく、新知見と考えられる。臨床研究は現在55症例が集積されたが、消化管出血例では%、難治性腹水例では%で本治療が奏功した。金属ステントは直径8mmおよび10mmの2種を用いたが、10mm径の使用例は門脈圧減圧が大で、治療効果も高く臨床例においてはより適切と考えられた。一方、肝癌合併例は15例あったが、本治療の適応は1.穿刺経路に腫瘍のないこと、2.腫瘍が他治療によりコントロールされていること、3.予後規定因子が門脈圧亢進症であることの3点が満たされた場合のみあると考えられた。本研究の第一段階である本年度においては実験動物を用いて肝静脈-門脈間の短絡路径と門脈圧減圧効果との関係についての基礎的検討を主として行った。実験動物はブタを用い、頸静脈から穿刺針を肝静脈内に挿入し、臨床と同様の手技にて肝臓内に肝静脈一門脈間に短絡路を作成した。合計10匹に行ったが、全例で短絡路形成に成功し、手技上の問題点は特になく行える手技であると考えられた。実験動物のうち6匹には短絡路形成術前に経皮経肝的手技で血管カテーテルを門脈内に挿入し、門脈枝を塞栓して門脈圧亢進症をあらかじめ作成した。これについても全例に成功したが、これら処置を加えた実験動物に対して上記手技で肝臓内の短絡路内に6mm,8mm,10mm直径の金属ステントを挿入し、門脈圧下降程度の観察および門脈造影像の変化についての検討を行った。門脈圧の低下は挿入された金属ステント直径とほぼ比例関係にあることが確認され、また肝内門脈枝の造影程度は短絡路直径と反比例の傾向にあることがわかった。以上の結果から本法は手技上の問題点は特になく、臨床応用が可能であるとの結論が得られた。適切な短絡路直径ついては次年度の検討を待って報告したい。1.実験的検討前年度の研究によりステント直径と門脈圧低下度と密接な関係のあることが明らかとなったが、今年度の研究により経頸静脈的肝内門脈静脈短絡術のシャント径は肝内の門脈血流の検討から8mmが適切であるとの結果が得られた。2.臨床的研究実験的検討を踏まえて臨床例においても適切なシャント径について検討した。シャント径は8mm10mmの2種類を用いたが、その結果肝性脳症の発生頻度、肝機能に及ぼす影響、肝内の門脈血流量などの観点から8mm径が適切との結果を得た。

しかし、シャントの開存性の観点からはシャント径の大きい10mmの方が長期開存が得られる傾向にあり、さらに検討の必要があると考えられた。一方、経頸静脈的肝内門脈静脈短絡術の適応については従来、欧米では内視鏡的硬化療法で止血困難な静脈瘤及び難治性腹水とされている現在本院では50症例に対して経頸静脈的肝内門脈静脈短絡術をおこなったが、適応については特に胃静脈瘤に対する有効性が示唆されており、また難治性腹水にも良い適応のあることが確認された。頸静脈的肝内門脈静脈短絡術は食道静脈瘤による吐血、下血や難治性腹水を引き起こす門脈圧亢進症に対する新しい治療法であるが、その適応と選択についての詳細な研究はほとんど見られないのが現状である。本法施行に当たり最も重要なことは短絡路と門脈圧減圧効果との関係を知ることであるが、これについての基礎的研究はほとんど見られない。本研究の目的は短絡路の直径と門脈圧減圧との関係を実験的に検討すること、および臨床的には手技の容易化と術後の変化やその管理について検討し、さらに肝癌合併例に対する適応などについて検討した。実験的研究では実験動物を用いてRoschらの方法に準じて肝内に直径が6mm, 8mmおよび10mmの自作の金属ステントを挿入し門脈-肝静脈短絡路を作成した。その結果、短絡路直径と門脈圧減圧との間に相関関係のあることが明らかとなり、門脈像との比較により適切なステント直径は8mmであるとの結論を得たが、従来まったく報告がなく、新知見と考えられる。臨床研究は現在55症例が集積されたが、消化管出血例では%、難治性腹水例では%で本治療が奏功した。金属ステントは直径8mmおよび10mmの2種を用いたが、10mm径の使用例は門脈圧減圧が大で、治療効果も高く臨床例においてはより適切と考えられた。一方、肝癌合併例は15例あったが、本治療の適応は1.穿刺経路に腫瘍のないこと、2.腫瘍が他治療によりコントロールされていること、3.予後規定因子が門脈圧亢進症であることの3点が満たされた場合のみあると考えられた。
C型肝炎ウイルスNS3蛋白質と宿主病態制御分子の相互作用に関する研究

C型肝炎ウイルス(HCV)1b型のNS3蛋白質N末端120残基の二次構造に基づきHCV NS3グループ分類(A,B,Cの3型)を行い、ペグインターフェロン・リバビリン(PegIFN・RBV)併用療法の治療効果および肝がんの発生リスクとの関連性を、前向きコホートにて検討した。その結果、このHCV多型分類が、C型慢性肝炎におけるPegIFN・RBV併用療法の治療効果の予測に有効であり、また、C型慢性肝炎患者の発がん予測に有用な指標となり得る可能性が示唆された。C型慢性肝炎の標準治療は、ペグインターフェロン・リバビリン(PegIFN・RBV)による抗HCV療法であるが、様々な治療効果や副反応から、治療前に治療効果を予測することは患者個人に適した治療を行う上で重要である。本研究の目的は、HCV NS3蛋白質二次構造多型性とC型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン(PegIFN・RBV)併用療法の治療効果についての関連性を検討し、抗HCV療法における新たなウイルス学的治療効果予測マーカーを見いだすことである。HCV-1b型感染で高ウイルス量(100KIU/ml以上)のC型慢性肝炎139例を対象とした。このうち、PegIFN・RBV両薬剤ともに、投与予定量の80%以上の投薬がなされ、かつ治療を完遂した75症例について検討した。HCV NS3蛋白質二次構造は、患者血清より得られたHCV NS3領域の推定アミノ酸配列に基づき、N末端側アミノ酸120残基の蛋白質二次構造をグループAとグループBに分類した。このHCV NS3蛋白質二次構造多型性と、PegIFN・RBV併用療法の治療効果の関連性について検討を行った。HCV NS3蛋白質の二次構造分類は、グループAが28例(37%)、グループBが40例(53%)、いずれにも属さない型が7例(10%)、であった。グループAおよびグループBの両群の患者間に、年齢、性、HCV RNA(アンプリコア法)、ALT、肝線維化ステージ、に有意差は見られなかった。このグループ分類とPegIFN・RBV併用療法の治療成績の検討では、ウイルスを排除できたsustained virological resonse(SVR)は、グループAでは18例(64%)に対し、グループBでは15例(38%)であり、グループAに多かった(P<0.05)。本研究により、HCV NS3領域アミノ末端120残基の蛋白質二次構造の多型性が、C型慢性肝炎におけるPegIFN・RBV併用療法の治療効果を予測する上で、有用なウイルス因子の一つとなりうることが示唆された。HCV NS3蛋白N末端120残基の二次構造多型性に基づいたHCV NS3グループ分類は、後ろ向き患者コホート研究にて、肝細胞がん(HCC)の発がんリスクとの関連性を有している。このNS3グループ分類とC型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン(PegIFN・RBV)併用療法の治療効果との関連性を、前向き患者コホート研究にて検討した。対象は、HCV-1b型感染で高ウイルス量(100KIU/ml以上)のC型慢性肝炎132例。NS3グループ分類は、Robson法によりグループA,B,Cに分類した。これら3グループに分類可能であった129例を解析対象とした。NS3グループ分類とPegIFN・RBV併用療法の治療効果の関連性について検討した。平均観察期間は5.9±1.2年。HCV NS3蛋白質の二次構造分類は、グループAが43例(31%)、グループBが71例(51%)、グループCが15例(10%)、混合型が3例(7%)、であった。グループA,B,Cの3群間に、性、年齢、ALT、HCV RNA(アンプリコア法)、線維化ステージ、に有意差は見られなかった。NS3グループ分類とPegIFN・RBV併用療法の治療成績の検討では、sustained virological response(SVR)となった症例は、グループA/Cに多く(52%)、グループBに少なかった(32%)(P<0.05)。

また、本コホートのおけるHCC発がんは、グループAで1例(2.3%)、グループBで5例(7.4%)、グループCで3例(20.0%)であった(P=0.075)。発がん症例9例のうち、8例はPegIFN・R8V療法のウイルス学的無効症例であった。本研究により、HCV NS3領域アミノ末端120残基の蛋白質二次構造の多型性が、C型慢性肝炎におけるPegIFN・RBV併用療法の治療効果の予測に有効であり、また、C型慢性肝炎患者の発がんにも関連している可能性が示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)1b型のNS3領域蛋白質N末端120残基の二次構造に基づきHCV NS3グループ分類を行い、このNS3グループ分類とC型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン(PegIFN・RBV)併用療法の治療効果および肝がん(HCC)の発生リスクとの関連性を、前向き患者コホート研究にて検討した。対象は、HCV-1b型感染で高ウイルス量(100 KIU/ml以上)のC型慢性肝炎132例。NS3グループ分類は、Robson法によりグループA,B,Cに分類した。これら3グループに分類可能であった129例を解析対象とした。(1)NS3グループ分類とPegIFN・RBV併用療法の治療効果の関連性、(2)HCV NS3グループ分類と肝発がんの関連性、について検討した。発がん検討症例の観察期間は、PegIFN・RBV開始から肝がん発生時(発がん症例)/最終受診日(非発がん症例)とした。平均観察期間は5.9±1.2年。HCV NS3蛋白質の二次構造分類は、グループAが43例(31%)、グループBが71例(51%)、グループCが15例(10%)、混合型が3例(7%)、であった。グループA,B,Cの3群間に、性、年齢、ALT、HCV RNA(アンプリコア法)、線維化ステージ、に有意差は見られなかった。NS3グループ分類とPegIFN・RBV併用療法の治療成績の検討では、sustained virological response(SVR)となった症例は、グループA/Cに多く(52%)、グループBに少なかった(32%)(P<0.05)。本コホートのおけるHCC発がんは、グループAで1例(2,3%)、グループBで5例(7.4%)、グループCで3例(20.0%)であった(P=0.075)。NS3グループ別HCC累積発生率の検討では、グループC>B>Aで累積発生率が異なる傾向であった(p=0.06, Log rank test)。発がん症例9例のうち、8例はPegIFN・RBV療法のウイルス学的無効症例であった。本研究により、HCV NS3領域アミノ末端120残基の蛋白質二次構造の多型性が、C型慢性肝炎におけるPegIFN・RBV併用療法の治療効果の予測に有効であり、また、C型慢性肝炎患者の発がん予測に有用な指標となり得る可能性が示唆された。
ヴァチカン,システィナ礼拝堂天井・壁画調査

(1)現在修復が進行中の「アダムとエヴァの楽園追放」「エヴァの誕生」と,これまですでに修復を完了した各場面を足場の上に登ぼり,近接した場所から各部分を比較検討し,ミケランジェロの制作過程の推移について考察.(2)すでに修復した「ノアの泥酔」ならびにその四隅のイニューディ等に修復の結果,弟子の手になる部分があることが判明,プットーを含めて各場面,各形態を直接調査し,ミケランジェロと弟子の問題にも検討を加える.(3)フレスコ画におけるカルトーンの使用,インチジオーネ,スポルヴェロなどどのように使い分けられたのか検討する.(4)システィナ礼拝堂の建築について,その様式や思想を天井壁画との関連から調査する.(5)ミケランジェロと同1987年(昭和62年)において,「エヴァの創造」およびその下の預言者,巫女像そしてリュネット部分を観察,調査を行なったが「研究成果の概要」にも述べたように技術的な問題と図像的な問題でそれぞれ研究調査を行なった.「アダムの創造」はまだ修復にかかっておらず,三場面「アダムの創造」「エヴァの創造」「楽園追放」まとめて考察するわけにはいかないが,研究実積としては預言語,巫女像についての観察,調査がある.これは今回調査の「巫女エトルリア」が頂度同じシスティナ礼拝堂の壁画のシニョレルリの「モーセの遺言と死」の中の裸体の青年と形態的によく類似しており,さらにジニョレルリのオルヴィエートのサン・ブリツィオ礼拝堂天井画の「教会博士たち」,「族長たち」「聖処女たち」の中の多くの座像との関連が見出せることが新しくわかった.ミケランジェロの師として,シニョレルリの反サヴォナローラの「反キリスト」図を含む「最後の審判」の礼拝堂壁画との思想的関連が検討されねばならない.「預言者ザカリア」が「聖ヒエロニムス」,「預言者ヨエル」や「預言者イザヤ」などが「族長たち」の人物達,又,「巫女デルフィカ」が「最後の審判」の天使に類似するものがあり,他の預言者・巫女たちも,かなりシニョレルリ図との関連が見出される.又,その中に描かれたプットーたちも,「コンコルダンス(和)とカリアテュードのプットーたちが「ディスコルダンス(不和)であることが判明した.これまで預言者,巫女が切り離されて論じられてきたが,交互に一人ずつ配置され(祭壇上,入口上を除く),やはり四気質,四世代,四つの時,四大元素などの単位でそれぞれ四人ずつの単位で描かれていることがほぼ判明した.このことは研究代表者の第三回の調査報告に記されている.(1)現在修復が進行中の「アダムとエヴァの楽園追放」「エヴァの誕生」と,これまですでに修復を完了した各場面を足場の上に登ぼり,近接した場所から各部分を比較検討し,ミケランジェロの制作過程の推移について考察.(2)すでに修復した「ノアの泥酔」ならびにその四隅のイニューディ等に修復の結果,弟子の手になる部分があることが判明,プットーを含めて各場面,各形態を直接調査し,ミケランジェロと弟子の問題にも検討を加える.(3)フレスコ画におけるカルトーンの使用,インチジオーネ,スポルヴェロなどどのように使い分けられたのか検討する.(4)システィナ礼拝堂の建築について,その様式や思想を天井壁画との関連から調査する.(5)ミケランジェロと同1987年(昭和62年)において,「エヴァの創造」およびその下の預言者,巫女像そしてリュネット部分を観察,調査を行なったが「研究成果の概要」にも述べたように技術的な問題と図像的な問題でそれぞれ研究調査を行なった.「アダムの創造」はまだ修復にかかっておらず,三場面「アダムの創造」「エヴァの創造」「楽園追放」まとめて考察するわけにはいかないが,研究実積としては預言語,巫女像についての観察,調査がある.これは今回調査の「巫女エトルリア」が頂度同じシスティナ礼拝堂の壁画のシニョレルリの「モーセの遺言と死」の中の裸体の青年と形態的によく類似しており,さらにジニョレルリのオルヴィエートのサン・ブリツィオ礼拝堂天井画の「教会博士たち」,「族長たち」「聖処女たち」の中の多くの座像との関連が見出せることが新しくわかった.ミケランジェロの師として,シニョレルリの反サヴォナローラの「反キリスト」図を含む「最後の審判」の礼拝堂壁画との思想的関連が検討されねばならない.「預言者ザカリア」が「聖ヒエロニムス」,「預言者ヨエル」や「預言者イザヤ」などが「族長たち」の人物達,又,「巫女デルフィカ」が「最後の審判」の天使に類似するものがあり,他の預言者・巫女たちも,かなりシニョレルリ図との関連が見出される.又,その中に描かれたプットーたちも,「コンコルダンス(和)とカリアテュードのプットーたちが「ディスコルダンス(不和)であることが判明した.これまで預言者,巫女が切り離されて論じられてきたが,交互に一人ずつ配置され(祭壇上,入口上を除く),やはり四気質,四世代,四つの時,四大元素などの単位でそれぞれ四人ずつの単位で描かれていることがほぼ判明した.このことは研究代表者の第三回の調査報告に記されている.
Rhoファミリーシグナル伝達系分子を対象とした疾患関連遺伝子の探索

Rhoファミリーシグナル伝達系分子は主に細胞骨格の調節を介して様々な生理機能や疾患の発症に重要な役割を果たしている。本研究ではヒト疾患(循環器系疾患や精神疾患等)の発症に関わるRhoファミリーシグナル伝達系分子の同定とその分子基盤を明らかにすることを目的としている。内皮型NOS(eNOS)は循環器疾患と深い関わりがあることが知られている。eNOSは複数のキナーゼによりリン酸化を受け、1177番目のセリンのリン酸化はeNOSの活性について促進的に、495番目のトレオニンのリン酸化は抑制的に働く。しかしながら、抑制的リン酸化を担うキナーゼについては不明の部分も多い。申請者らは、Rho-kinaseがin vitroおよび、内皮細胞において495番目のトレオニンをリン酸化することを見出した。このことは、Rho-kinaseが血管攣縮や高血圧を引き起こす機序の一端を示唆するものである。細胞極性の形成にRhoファミリー間のクロストークが重要であると考えられているが、その機序についてはほとんど明らかにされていない。申請者らはCdc42からRacへのシグナルメディエータであり細胞の極性化を担うPAR複合体の構成因子であるPAR-3をRho-kinaseがリン酸化し、その結果PAR複合体の機能を抑制することを見出した。また、Rho-kinaseがRac活性化因子であるSTEFをリン酸化すること、リン酸化を受けたSTEFはin vitroで結合蛋白質との相互作用が低下することを示し、リン酸化によりSTEFの機能が抑制されることを示唆する結果を得た。このようなRho/Rac/Cdc42の間の機能調節により、細胞の極性が正しく形成されることを示した。さらに、Rhoファミリー分子とその活性制御因子の38遺伝子(特にアミノ酸置換を伴う57SNPs)について解析を行い、薬物誘発性冠攣縮と関連が認められる候補遺伝子(ARHGAP9A370S)を見出した(投稿準備中)。Rhoファミリーシグナル伝達系分子は様々な生理機能や疾患の発症に重要な役割を果たすと考えられている。これまでに遺伝性精神遅滞の原因遺伝子として複数のRhoファミリーシグナル伝達系分子が報告されている。また血管の異常収縮や動脈硬化の改善にRhoのエフェクター分子であるRho-kinaseの阻害剤が有効であることから循環器系疾患においてもRhoファミリーシグナル伝達系分子が疾患の原因遺伝子や感受性遺伝子となっている可能性は極めて高いと考えられる。このような観点から、本研究ではヒト疾患(循環器系疾患や精神疾患等)の発症に関わるRhoファミリーシグナル伝達系分子の同定とその分子基盤を明らかにすることを目的としている。Rhoファミリーシグナル伝達系においてはRacとRhoのシグナル経路が互いに桔抗することが細胞の運動や形態形成に重要な役割を果たしていると考えられているが、その機構については不明の部分も多かった。申請者は本研究においてRhoのエフェクター分子であるRho-kinaseがRac活性化因子であるSTEFをリン酸化すること、リン酸化を受けたSTEFはin vitroで結合蛋白質との相互作用が低下することを示し、リン酸化によりSTEFの機能が抑制されることを示唆する結果を得た。このことはRacとRhoシグナルが桔抗することを部分的に脱明するものであると考えている。また現在、Rhoファミリーの活性制御因子のSNPと疾患の関連解析を進めると共に、生化学的、および細胞生物学的解析を進めている。

Rhoファミリーシグナル伝達系分子が循環器疾患や精神疾患の原因遺伝子や感受性遺伝子となっている可能性は極めて高いと考えられる。このような観点から、本研究ではヒト疾患(循環器系疾患や精神疾患等)の発症に関わるRhoファミリーシグナル伝達系分子の同定とその分子基盤を明らかにすることを目的としている。内皮型NOS (eNOS)は循環器疾患と深い関わりがあることが知られている。eNOSは複数のキナーゼによりリン酸化を受け、1177番目のセリンのリン酸化はeNOSの活性について促進的に、495番目のトレオニンのリン酸化は抑制的に働く。しかしながら、抑制的リン酸化を担うキナーゼについては不明の部分も多い。申請者らは、Rho-kinaseがin vitroおよび、内皮細胞において495番目のトレオニンをリン酸化することを見出した。このことは、Rho-kinaseが血管攣縮や高血圧を引き起こす機序の一端を示唆するものである。また、細胞の遊走においてRhoファミリー間のクロストークが重要であると考えられているが、その機序についてはほとんど明らかにされていない。申請者らはCdc42からRacへのシグナルメディエータであり細胞の極性化を担うPAR複合体の構成因子であるPAR-3をRho-kinaseがリン酸化し、その結果PAR複合体の機能を抑制することを見出した。このようなRho/Rac/Cdc42の間の機能調節により、細胞の前後方向の極性が正しく形成されることを示した。さらに、Rhoファミリー分子およびRhoファミリーの活性制御因子の38遺伝子(特にアミノ酸置換を伴う57SNPs)について解析を行い、薬物誘発性冠攣縮と関連が認められる候補遺伝子(ARHGAP9A370S)を見出した(投稿準備中)。
血液脳関門モデルを用いたウエストナイルウイルス神経侵襲メカニズムの解明

2.pCMVベクターにWNV NY99 6LP株およびEg101株の構造遺伝子(C、PrM、E)を組み込んだ発現プラスミドを作製した。これとWNVレプリコン(WNV非構造蛋白遺伝子全長と緑色蛍光蛋白EGFP発現カセットを有する)をBHK細胞に共導入し、ウイルス様粒子(Virus-like particles; VLPs)を作製した。3.WNV強毒株である6LP株のVLPs(6LP-VLPs)および弱毒株であるg101株のVLPs(Eg-VLPs)をin vitroBBBモデルに感染させ、BBBを透過したVLPsの量を24時間後に測定した。Transwell内に接種した6LP-VLPsの約1/10量が下方のチャンバーから検出されたが、同様に接種したEg-VLPsは下方のチャンバーからほとんど検出されなかった。このように両者のin vitroBBB透過性には有意な差が認められ、ウイルスの毒力とBBB透過性との関連性が示唆された。次にHUVECに6LP-VLPsを感染させ、タイトジャンクション(TJ)のマーカーであるZO-1の免疫染色を行った。その結果、非感染細胞と感染細胞のZO-1の局在には差がなく、WNV感染によりTJの構造は変化しないことが示唆された。一方、クラスリンエンドサイトーシスの阻害剤であるChlorpromazineでHUVECを処理することにより、WNV 6LP株の感染が有意に減少した。以上の結果から、WNVはクラスリン介在性経路を利用したトランスサイトーシスによってBBBを通過する可能性が示唆された。血液脳関門(BBB)のin vitroモデルを構築するにあたり、ヒト初代培養脳微小血管内皮細胞(BMECs)とヒト初代培養星状膠細胞の共培養をまず行った。Transwell filterの上面に2×10^5個のBMECsを、下面裏側に9×10^4個の星状膠細胞を接着させ培養を行い、膜間電気抵抗値(TEER値)の計測によってintegrityを評価したが、BMECsと星状膠細胞の増殖が非常に遅いため、安定した結果を得ることが困難であった。次に、Transwellの上面に2×10^5個のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を接着させ、単層培養を行ってintegrityを評価したところ、上述の共培養に比較して安定なTEER値が得られ、FITC標識デキストラン(MW70,000)の透過性も非常に低い値を示した。以上より、ウイルスの血管内皮細胞通過性を評価する系として、HUVEC単培養を使用したin vitroモデルは信頼性が高く、より適切であると考えられた。pCMVベクター(Invitrogen)にWNV NY99 6LP株およびEg101株の構造遺伝子(C、PrM、E)のcDNAを組み込んだ発現プラスミドを作製した。WNV非構造蛋白遺伝子全長とその下流に緑色蛍光蛋白EGFP発現カセットを有するWNVレプリコン(テキサス大学医学部Peter Mason博士より分与)をBHK細胞に電気穿孔法によって導入し、24時間培養後に発現プラスミドのトランスフェクションを行い、さらに48時間培養後、上清中にVLPsの産生が確認された。VLPs感染細胞は緑色蛍光により容易に同定され、かつ子孫ウイルスの産生は認められない。このVLPsと上述のin vitroモデルを併用することにより、WNVの血管内皮通過様式を詳細に検索することが可能となった。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をトランスウエルに培養することにより作製した血液脳関門(BBB)のin vitroモデルと、ウエストナイルウイルス(WNV)ウイルス様粒子(VLPs)を利用して、以下の実験を行った。WNV強毒株である6LP株のVLPs(6LP-VLPs)および弱毒株であるEg101株のVLPs(Eg-VLPs)をin vitro

BBBモデルに感染させ、BBBを透過したVLPsの量を24時間後に測定した。トランスウエル内に接種した6LP-VLPsの約1/10量が下方のチャンバーから検出されたが、同様に接種したEg-VLPsは下方のチャンバーからほとんど検出されなかった。このように両者のin vitroBBB透過性には有意な差が認められ、ウイルスの毒力とBBB透過性との関連性が示唆された。次に6LP-VLPsのBBB透過機序の解明を試みた。タイトジャンクション(TJ)の構造変化による透過性亢進の可能性を検討するために、HUVECに6LP-VLPsを感染させ、0、8、24時間後にTJのマーカーであるZO-1の免疫染色を行った。非感染細胞と感染細胞のZO-1の局在には差がなく、WNV感染によりTJの構造は変化しないことが示唆された。また、トランスサイトーシスによってウイルスが血管内皮細胞を通過する可能性を検討するため、カベオラエンドサイトーシスの阻害剤であるFilipin、クラスリンエンドサイトーシスの阻害剤であるChlorpromazineがWNV6LP株の細胞への侵入に及ぼす影響を検討した。その結果、Chlorpromazine処理によりWNV感染が有意に減少し、WNVの血管内皮細胞への侵入にはクラスリンエンドサイトーシスが関与することが示唆された。以上より、WNVはクラスリン介在性経路を利用したトランスサイトーシスによってBBBを通過する可能性が示唆された。