hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子どもの疲労の神経基盤解明による治療法の開発－慢性疲労とＰＣ・携帯電話依存の関連

慢性疲労症候群患児と携帯電話・インターネット依存症患児を対象とし、意欲・報酬系の神経基盤の違いを明らかにし、自律神経機能計測により労作後の疲労度を定量評価することで、薬物療法の適正化および自律神経機能調節による疲労の軽減・予防法の開発を目的とした。CCFS患児における低報酬知覚時の線条体の活性低下と、報酬課題遂行による自律神経調節機能の低下を明らかにした。CCFS患児のドーパミン神経系と自律神経調節機能をターゲットとする治療法の検討およびその効果の客観的な評価に資する神経生理学的手法を構築することができた。小児型慢性疲労症候群(Childhood Chronic Fatigue Syndrome: CCFS)と携帯電話・インターネット依存症という同じ「疲労」を主訴とする子どもにおいて、両疾患における報酬の知覚に伴う脳賦活度および賦活パターンの相違を機能的磁気共鳴画像法(functional MRI: fMRI)を用いて検証し、さらに、疲労の客観的評価法として有用な脈波を用いた自律神経機能評価をしたうえで、これらの知見に基づく治療法の開発を目的とした。今年度までに、1015歳の健常児および小児慢性疲労症候群患児29名(健常児13名男子/女子=4/9、小児型慢性疲労症候群罹患児16名男子/女子=7/9)を対象に、報酬の知覚に伴う賦活度を計測するためのfMRI実験を行った。報酬課題として、金銭的報酬課題を用いた。また、fMRI実験前後の安静閉眼時の脈波測定から加速度脈波a-a間隔の周波数解析を行い、小児慢性疲労症候群患児は健常児に比べ交感神経活動および副交感神経活動いずれも著しく低下していることがわかった。課題前後では、Visual Analogue Scale等で主観的な疲労感や自律神経活動の指標となる唾液アミラーゼの測定も行った。今後fMRI実験を積み重ね、脳神経活動と自律神経活動の関連性を検討し、意欲・報酬系機能に基づく治療法の検討を行う基盤が構築できた。今後は、fMRIの結果と他の評価系の関連性なども確認しながら必要に応じて追加実験を行う。本研究では、小児型慢性疲労症候群(CCFS)と携帯電話・インターネット依存症という同じ「疲労」を主訴とする子どもにおいて、CCFSでは報酬系に関わる脳領域の賦活低下、携帯電話・インターネット依存症では過剰賦活といった相反する神経基盤が関与するのではないかという仮説を立て、両疾患における報酬の知覚に伴う脳賦活度および賦活パターンの相違を、機能的磁気共鳴画像法(functional MRI: fMRI)を用いて検証することを目的とする。小児期や思春期は一生のうちでも最も成長発達が期待される時期であり、人格形成や脳の発達などにおいて重要な時期でもある。そのため、疲労の持続により学校生活や日常生活が破綻されることは小児の発達に非常に大きな打撃を与える。これらの報酬系の神経基盤仮説を客観的に評価し検証することができれば、治療法が確立していない「子どもの疲労」においても神経基盤に基づく治療法の選択が可能となる。CCFS患者、携帯電話・インターネット依存症患者および健常者を対象とし、報酬系の神経基盤解明のため、金銭報酬の知覚に伴う賦活度・賦活パターンをfMRIにより計測・解析する。fMRI試験(報酬課題)前、試験直後、試験数時間後において、主観的疲労度は質問票により評価し、客観的疲労度は脈波計測から加速度脈波に変換し得られる交感神経と副交感神経成分比を用いた自律神経機能により評価し、労作後の易疲労性と疲労回復力を検証する。また、疲労・学習意欲・携帯電話・インターネット依存等の各種質問票により算出されたスコア、知能・認知機能、fMRIおよび加速度脈波パラメータ間の相関解析を実施する。さらに、得られた研究成果を活用し、報酬系の神経基盤に基づく薬物治療や自律神経機能調節に資する高照度光療法、サウナ療法等の治療を取り入れた治療法の検討を行い研究課題の達成を目指す。小児型慢性疲労症候群と携帯電話・インターネット依存症という同じ「疲労」を主訴とする子どもにおいて、両疾患における報酬の知覚に伴う脳賦活度および賦活パターンの相違を機能的磁気共鳴画像法(functional MRI: fMRI)を用いて検証し、さらに、疲労の客観的評価法として有用な脈波を用いた自律神経機能評価をしたうえで、これらの知見に基づく治療法の開発を目的とした。1015歳の健常児および小児慢性疲労症候群患児を対象に、報酬の知覚に伴う賦活度を計測するためのfMRI実験を行った。報酬課題として、高額報酬セッションと低額報酬セッションを設定した金銭的報酬課題を用いた。また、fMRI実験前後の安静閉眼時の脈波測定から加速度脈波a-a間隔の周波数解析を行い、自律神経機能を評価した。低額報酬セッションにて、小児慢性疲労症候群患児は健常児に比べ報酬の知覚に伴う線条体の活性度が低下していることを明らかにした。インターネット依存症患児も同様の傾向を示した。

また、加速度脈波の周波数解析から得られたトータルパワー値は小児慢性疲労症候群患児で低下していることがわかった。よって、意欲・報酬系機能に関連する脳神経活動と自律神経機能変調を同定し、ドーパミンをターゲットとする治療法の検討およびその効果の客観的な評価に資する神経生理学的手法を構築することができた。小児神経科学今年度は、1015歳の健常児および小児慢性疲労症候群患児29名を対象に、報酬の知覚に伴う賦活度を計測するためのfMRI実験を行った。報酬課題として、金銭的報酬課題を用いた。また、fMRI実験前後の安静閉眼時の脈波測定から加速度脈波a-a間隔の周波数解析を行い、小児慢性疲労症候群患児は健常児に比べ交感神経活動および副交感神経活動いずれも著しく低下していることがわかった。CCFS患者と携帯電話・インターネット依存患者および健常者の報酬系の神経基盤・自律神経機能解析のため、fMRI用報酬課題(金銭報酬課題)を用いたfMRI実験、脈波計測を行った。本年度は、13-15歳(中学生)のCCFS患者7名、インターネット依存患者1名、健常児5名を対象にfMRI実験前に閉眼安静時の脈波計測、VASによる疲労感測定後、報酬課題を用いたfMRI実験を約40分程度実施し、VASと脈波をfMRI実験直後(易疲労性を評価)測定計測した。fMRI実験を積み重ね、脳神経活動と自律神経活動の関連性を検討し、今後、意欲・報酬系機能に基づく治療法の検討を行う。本研究により、CCFSの意欲・報酬系の神経基盤や、自律神経機能の異常反応による疲労の遷延化等について新たな知見が得られれば、医療関係者に新たな治療・介入方法を提案できるだけでなく、講演活動やパンフレット作成などを通して、行政や教育関係者、保護者など子どもを取り巻くすべての国民に対し、疲労のメカニズムや対処法を発信する事が可能となる。研究成果発信は、個人が特定されない形で倫理面に充分な注意を払い行う。さらに、本申請研究による科学的根拠のある成果を、早まって一般化されることのないよう充分な注意を払う。これらのことを前提とし、本申請研究成果を国際的比較可能な形で国際誌および国際(国内)学会で発表し、有識者による専門的な評価を受ける。そのうえで、社会・国民に対して講演などを通じた成果報告活動につなげる。今年度に引き続き同様の質問票、自律神経機能およびfMRI実験を行い、健常者、CCFS患者、携帯電話・インターネット依存症患者およびADHD患者(先行研究データを用いる)における報酬系の神経基盤および自律神経機能を主軸とした相関解析や多変量解析等を用いて各々の臨床像の類似性、相違性を解明する予定である。可能であれば報酬系の神経基盤と自律神経機能を主軸としたCCFS患者と携帯電話・インターネット依存症患者の臨床像を明確化するバイオマーカー検査およびパラメーターを同定し、治療薬物(ドーパミン作動薬や遮断薬)の選択、自律神経機能調節機能が見込まれる高照度光療法とサウナ療法を候補とする治療効果を検証する。さらに、一連の成果から、疲労予防のための適切な成育環境について考察する。実験は概ね予定通り進行しているが、被験者が予定より若干名少なく、未使用額が生じた。
準結晶構造の離散スペクトル幾何に関する研究

研究実施計画に従って,下記の研究成果を得ました.1.射影法の定義自体に関して,通常用いる2つの構成法が本質的に同じであることを示し,成果を論文として発表しました.2.タイリングを無限グラフとみなしたときにその上の離散スペクトル幾何を考えることができます.射影法により得られた準周期タイリングに対して,まずはいくつかの具体例におけるラプラシアンに付随した量を重み付き有限オートマトンを用いて求めることを計画していました.しかしながら,研究当初の予想に反して,重み付き有限オートマトンを用いるだけでは不充分であることが分かりました.有限オートマトンに分岐被覆という生成原理を繰り返すことで,準結晶構造が再構成できることは証明されました.この生成原理は1次元のときには記号力学系,エルゴード理論におけるinterval exchangeという概念と密接に関係しています.成果を論文としてまとめ発表予定しています.3.ルート束を用いた射影法がFoldingという操作に対応していることを示しました.成果を論文として発表しました.4.因子写像を調べることにより,準周期性は双対な構成により得られたタイリング力学系がエルゴード的であることと特徴づけられるといった結果を得て,成果を論文として発表しました.さらに,タイリング力学系の上のflowの軌道閉包による分割が局所同型類による分割と一致すること,射影法によって得られる準周期タイリングの同型類の個数が非可算であること,準周期タイリングの同型類の決定という結果を得ています.この結果の一部は既に口頭発表により公表し,成果は論文としてまとめ発表予定しています.研究計画に従って,下記の研究成果を得た.1.準結晶構造の数学的モデルである準周期的タイリングを構成する方法に射影法がある.射影法により得られたタイリングの全体(タイリング空間)は力学系となる。root latticesから射影法により得られるタイリング空間の周期とその最大数を特徴付けた.integral latticesの場合にも同様の結果の成立を示している.成果は論文にまとめ,Hiroshima Math.J.に掲載された.3.n次元実射影空間のimmersionにassociateした法ベクトル束の自乗が(安定)拡張可能であるための次元の条件ならびにその複素化が拡張可能であるための次元の条件を調べた.成果は論文にまとめ,Hiroshima Math.J.に掲載予定である.4.その他の準結晶構造の離散スペクトル幾何に関する中間的な成果は以下の口頭発表:・射影法により得られるタイリング,2001年6月,京都大学数理解析研究所短期共同研究「準周期タイリングとその周辺」,・無限グラフとしての準周期的タイリングについて,2001年10月,広島大学トポロジーセミナー,において発表した.研究実施計画に従って,下記の研究成果を得ました.1.射影法の定義自体に関して,通常用いる2つの構成法が本質的に同じであることを示し,成果を論文として発表しました.2.タイリングを無限グラフとみなしたときにその上の離散スペクトル幾何を考えることができます.射影法により得られた準周期タイリングに対して,まずはいくつかの具体例におけるラプラシアンに付随した量を重み付き有限オートマトンを用いて求めることを計画していました.しかしながら,研究当初の予想に反して,重み付き有限オートマトンを用いるだけでは不充分であることが分かりました.有限オートマトンに分岐被覆という生成原理を繰り返すことで,準結晶構造が再構成できることは証明されました.この生成原理は1次元のときには記号力学系,エルゴード理論におけるinterval exchangeという概念と密接に関係しています.成果を論文としてまとめ発表予定しています.3.ルート束を用いた射影法がFoldingという操作に対応していることを示しました.成果を論文として発表しました.4.因子写像を調べることにより,準周期性は双対な構成により得られたタイリング力学系がエルゴード的であることと特徴づけられるといった結果を得て,成果を論文として発表しました.さらに,タイリング力学系の上のflowの軌道閉包による分割が局所同型類による分割と一致すること,射影法によって得られる準周期タイリングの同型類の個数が非可算であること,準周期タイリングの同型類の決定という結果を得ています.この結果の一部は既に口頭発表により公表し,成果は論文としてまとめ発表予定しています.
廃棄物燃料に内在する細菌叢及びその機能別遺伝子とくん焼・有炎燃焼・爆発の因果関係

廃棄物固形燃料(RDF)火災・爆発の一要因とされる微生物による水素産生について,三重県で製造した5種類のRDFからメタゲノム解析による同定を行った。3日培養後に水素産生菌の割合が210倍に増加し,桑名RDFがBacillus属、他の4生産地がClostridium属に占有される。同条件でサイズの異なる3種類の容器による結果では,サイズの増加に対して最高温度が上昇すること,外挿法により推定した結果,10kgのRDF貯蔵庫で75°C,100kgで95°Cに達することが判明した。水素産生に関係する遺伝子としてヒドロゲナーゼ遺伝子を特定し,水素発生量と遺伝子発現量の関係を調べる手法を開発した。本研究は,廃棄物固形燃料の貯蔵・保管時に起こるくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子を,燃料に内在する細菌叢の分布および機能別遺伝子と関連づけ,従来の熱的特性に生物学的特性を加味した廃棄物燃料あるいはバイオマスの貯蔵・保管時における危険性評価および燃料化・貯留・搬送設備の火災安全対策に関する科学的データの提供と提言を目的としている.本年度は,産地別に収集された廃棄物固形燃料の水素産生量に与える環境条件(温度,水分,pH)およびスケール(RDF量,容器容量)の影響を明らかにした.(1) RDFは製造地によってpHが違い,pHが強アルカリ性に保たれていても水分と温度によっては菌が活動する.酸素の減少pHの低下が類似することからは好気性菌の活動が行われている.本研究の実験条件でRDFが培養される場合,酸素濃度の減少付近では好気性菌の活動がピークとなる.(2)本実験において,含水率約27wt%のRDFの最高温度は100gの場合38.1°C,750gの場合51.6°C,1,500gの場合57.5°Cを記録した.しかし,その後温度は上昇せずに停滞または低下する推移を示した.これらの温度上昇はRDF内部の微生物活動によるものであり,好気性菌の呼吸による生成熱だと考えられる.好気性菌による発酵熱の温度は約80°Cに達する報告もあり,高温によってRDF内部で化学反応が起こり蓄熱による温度上昇を続け,自己発火する可能性も十分に考えられる.本研究は,廃棄物固形燃料の貯蔵・保管時に起こるくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子を,燃料に内在する細菌叢の分布および機能別遺伝子と関連づけ,従来の熱的特性に生物学的特性を加味した廃棄物燃料あるいはバイオマスの貯蔵・保管時における危険性評価および燃料化・貯留・搬送設備の火災安全対策に関する科学的データの提供と提言を目的としている.現在,三重県で製造されている廃棄物固形燃料について5箇所の産地別にサンプルを収集した.メタゲノム解析により産地別の微生物種類について水素産生菌と非水素産生菌を同定した結果,水素産生菌の割合は,未培養の場合では,桑名33.9%,香肌11.4%,海山13.7%,浜島1.8%,さくら28.8%であった.また,3日嫌気培養した場合では桑名61.2%,香肌98.1%,海山65.4%,浜島20.0%,さくら61.9%であった.バイアル瓶を使った培養実験で,環境条件を変化させた場合の水素発生量等の変化を調べた.桑名とさくらの培養時間毎の水素,酸素,pHおよびその際の廃棄物固形燃料に生息する好気性菌と嫌気性菌の生菌数を測定した. pHと酸素の減少の傾向は良く一致していること,水素産生に要する時間にはpHが大きな影響を与えること,好気性菌は急激な酸素減少近くで菌数のピークを迎えること,嫌気性菌は水素濃度の急激な増加の際菌数のピークとなることがわかった.同培養条件でサイズの異なる3種類の容器に廃棄物固形燃料を入れて実験を行いスケール効果を調べた.培養開始5080時間で最高温度に到達する.廃棄物固形燃料100gで38.1°C,750gで51.6°C,1500gで57.7°Cと容器サイズが大きいほど最高到達温度が増加することが分かった.また.容器内最高到達温度は,外挿法により推定した場合,10kgで75°C,100kgで95°Cに達することが分かった.廃棄物固形燃料(RDF)火災・爆発の一要因とされる微生物による水素産生について,三重県で製造した5種類のRDFからメタゲノム解析による同定を行った。

本研究は,廃棄物固形燃料の貯蔵・保管時に起こるくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子を,燃料に内在する細菌叢の分布および機能別遺伝子と関連づけ,従来の熱的特性に生物学的特性を加味した廃棄物燃料あるいはバイオマスの貯蔵・保管時における危険性評価および燃料化・貯留・搬送設備の火災安全対策に関する科学的データの提供と提言を目的としている.本年度は,メタゲノム解析により産地別に収集された廃棄物固形燃料に内在する細菌叢の分布と水素産生に関与する遺伝子を明らかにした. 5種類のRDFに存在する微生物をメタゲノム解析により推定した。509個の微生物を水素産生菌と非水素産生菌に分けた結果,水素産生菌の割合は,未培養では桑名34%,香肌11,海山14,浜島2,さくら29である.3日嫌気培養では桑名61,香肌98,海山65,浜島20,さくら62である.水素産生菌189個を分類した結果,未培養では,桑名はClostridium属40% ,Bacillus属50%,Janthinobacterium属10%で,香肌50,38,12,海山29,71,0,浜島100,0,0,さくら46,27,27である.3日嫌気培養では,桑名3,97,0で,香肌,海山,浜島,さくら100,0,0である.平成24年度以降の研究計画・方法では,(1)バイアル瓶培養実験として,産地別固形燃料のくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子(温度上昇率,最高到達温度,水素発生量)を調べる.環境条件(酸素濃度,温度,水分,pH)を変化させた場合の細菌叢分布,機能別遺伝子分布の変化を調べる.(2)スケールモデル実験環境条件および熱的条件が制御可能なスケールモデルの製作,産地別固形燃料の貯蔵実験を行い,くん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子および細菌叢分布,機能別遺伝子分布の変化を調べる.(3)因果関係と熱着火理論の検討,貯蔵・保管安全対策くん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子および細菌叢分布,機能別遺伝子分布の因果関係の明確にする.Frank-Kamenetskii熱着火理論に生物学的特性を加味した修正式を提案する..基礎実験データに基づいた廃棄物固形燃料あるいはバイオマスの貯蔵・保管安全対策を提案する.現在,(1)が終了し,(2)の実験を進行中であり,おおむね順調に進展していると考えている.しかし,機能別遺伝子が十分に特定されておらず今後の課題として残っている.「研究の目的」の達成度について期間内に明らかにする点が3点ある.初年度は(1)が修了した.(1)メタゲノム解析により産地別に収集された廃棄物固形燃料に内在する細菌叢の分布と機能別遺伝子(エネルギー生産・変換,水素産生,耐熱性等)を明らかにする.(2)産地別の廃棄物固形燃料のくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子(温度上昇率,最高到達温度,水素発生量)と細菌叢の分布と機能別遺伝子の関連性を明らかにする.(3)環境条件(酸素濃度,温度,水分,pH)の変化による,くん焼・有炎燃焼・爆発の要因と細菌叢の分布と機能別遺伝子の関連性の変化を明らかにする.平成24年度以降の研究計画・方法にある(2)スケールモデル実験環境条件および熱的条件が制御可能なスケールモデルの製作,産地別固形燃料の貯蔵実験を行い,くん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子および細菌叢分布,機能別遺伝子分布の変化を調べる.(3)因果関係と熱着火理論の検討,貯蔵・保管安全対策くん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子および細菌叢分布,機能別遺伝子分布の因果関係の明確にする.「研究の目的」の達成度について期間内に明らかにする点が3点ある.本年度は(2)を実施する.(2)産地別の廃棄物固形燃料のくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子(温度上昇率,最高到達温度,水素発生量)と細菌叢の分布と機能別遺伝子の関連性を明らかにする.具合的には、下記のバイアル瓶培養実験を行う。(1)産地別固形燃料のくん焼・有炎燃焼・爆発の関連因子(温度上昇率,最高到達温度,水素発生量)を調べる.(2)環境条件(酸素濃度,温度,水分,pH)を変化させた場合の細菌叢分布,機能別遺伝子分布の変化を調べる.平成24年度以降の研究計画・方法にある(2)スケールモデル実験装置製作および特にデータの長時間計測に伴う安全管理を含めた計測システムの購入,整備をする予定である.
生活環境下におけるレジオネラの遺伝的群集構造解析と感染リスク低減のための基盤研究

本研究は、レジオネラ属菌の遺伝的群集構造を解析することで、ヒト生活環境中でニッチを獲得する機構を明らかにし、レジオネラの生存戦略の解明を目指す。これまでの研究から、L. pneumophilaにおいて、遺伝子型別解析(SBT, MLVA)から、冷却塔水由来には特徴的な三つのclonal complex(CCs; CC1, CC2, CC3)が定着していること、温泉環境においては多様な遺伝子型が存在し、L. pneumophila以外の特徴的な菌種が定着していることを明らかにした。本年度は、冷却塔由来の三つのCCを構成する代表株について、STの異なる株を追加し、昨年度までに得られたゲノムデータと合わせて計25株の詳細なコアゲノム解析を実施した。その結果、ゲノム系統でも大きく三つにクラスターが分かれ、STのグループを反映した。CC1とCC3にはそれぞれ2つずつサブクラスターが形成されており、サブクラスター内は極めて近縁であったが、サブクラスター間では同一CC(ST)内でもコアSNP数が数百を超えており多様性が見られた。近縁であった株同士は分離年・施設に関わらず近縁であった為、特定の遺伝系統が広く伝播している可能性が示唆された。CC2は他の二つのCCとは大きく離れており、L.pneumophila subsp. fraseriのゲノムと同一クラスターに存在することが明らかとなった。また、同一施設においては、経年的に分離された株が別のサブクラスターまたは別のCCに分類されることが見出されており、冷却塔においては、特定の限られた遺伝系統のL.pneumophilaが共存している可能性が示唆された。本年度は、網羅的に遺伝子型別および種同定を行い、環境中のレジオネラ属菌の分布状況、遺伝学的特徴、病原性遺伝子の保有状況を調べた。その結果、冷却塔水由来のL. pneumophila 161株は30種類の遺伝子型(ST;Sequence type)に分類され、特徴的な三つのclonal complexが定着していること、L. erythra , L. anisa, L. rubrilucens, L. quinlvanii等の多様なレジオネラ属菌の共存が明らかとなった。また、温泉環境のL. pneumophila 235株においては、62種類の新規STを含めて、101種類のSTに分類された。さらに、L. pneumophilaと共にニッチを獲得している菌種として、L. londiniensisとL. israelensisが高頻度に検出された。L. israelensisの増殖能はL. pneumophilaとL. londiniensisと比較して遅いことが明らかとなった。病原性に関しては、遺伝子の水平伝達に寄与すると考えられている病原性遺伝子lvh遺伝子や宿主への侵入・増殖に関与するrtx遺伝子の保有株の存在を見出しており、レジオネラ属菌が生態系の中でのニッチを獲得し、病原性を高める方向に進化できうることを示唆した。当初の予定通り、レジオネラ属菌の生態実態把握のため、遺伝子型別解析・種同定・病原性・生息環境について網羅的な解析を行い、次年度への研究計画に向けた基礎データを得ることができた。これまでの研究から、L. pneumophilaにおいて、遺伝子型別解析(SBT, MLVA)から、冷却塔水由来には特徴的な三つのclonal complex(CC)が定着していること、温泉環境における多様な遺伝子型が存在していることを明らかにした。本年度は、分離年・分離場所の異なる冷却塔由来の三つのCCを構成する代表株17株の全ゲノムデータを取得し、詳細なコアゲノム解析を実施した。その結果、系統解析から3系統のクラスターが確認され、クラスター内はクローナルな集団であることが示唆された。さらに、環境由来別にレジオネラ属菌の宿主となる自由活性アメーバの生態について調べたところ、冷却塔水ではハルトマンネラ属が多く分離され、温泉水では、ステナアメーバ、アカントアメーバ、ファリンゴモナス属、ハルトマンネラ属等多様なアメーバが検出された。また、温泉環境に特徴的な菌種であるL. londiniensisとL. israelensisのアカントアメーバ内での増殖能を調べたところ、L. pneumophilaと比較して非常に遅いことが明らかとなった。冷却塔由来株のゲノム構造解析から、分離年や分離場所が異なる場合でも、3系統のクラスターに分類され、クラスター内はクローナルな集団であることを明らかにした。環境由来別でのレジオネラ属菌の宿主となるアメーバの生態を明らかにし、レジオネラ属菌とアメーバとの親和性についても検討することができた。

これまでの研究から、L. pneumophilaにおいて、遺伝子型別解析(SBT, MLVA)から、冷却塔水由来には特徴的な三つのclonal complex(CCs; CC1, CC2, CC3)が定着していること、温泉環境においては多様な遺伝子型が存在し、L. pneumophila以外の特徴的な菌種が定着していることを明らかにした。本年度は、冷却塔由来の三つのCCを構成する代表株について、STの異なる株を追加し、昨年度までに得られたゲノムデータと合わせて計25株の詳細なコアゲノム解析を実施した。その結果、ゲノム系統でも大きく三つにクラスターが分かれ、STのグループを反映した。CC1とCC3にはそれぞれ2つずつサブクラスターが形成されており、サブクラスター内は極めて近縁であったが、サブクラスター間では同一CC(ST)内でもコアSNP数が数百を超えており多様性が見られた。近縁であった株同士は分離年・施設に関わらず近縁であった為、特定の遺伝系統が広く伝播している可能性が示唆された。CC2は他の二つのCCとは大きく離れており、L.pneumophila subsp. fraseriのゲノムと同一クラスターに存在することが明らかとなった。また、同一施設においては、経年的に分離された株が別のサブクラスターまたは別のCCに分類されることが見出されており、冷却塔においては、特定の限られた遺伝系統のL.pneumophilaが共存している可能性が示唆された。網羅的基礎データを基に、時間軸、環境要因、病原性遺伝子の保有、共存関係等の状況からゲノム解析する菌株を複数株(30株50株)選定する。それらの菌株のゲノム配列をMiseqにより取得し、ゲノムの構造変化によるヒト生活環境での定着性の関与について明らかにする。また、自由活性アメーバとの感染実験を行い、環境由来別でのL. pneumophilaと他のレジオネラ属菌との関連性について検討する。網羅的基礎データを基に、時間軸、環境要因、病原性遺伝子の保有、共存関係等の状況からゲノム解析する菌株を増やし、詳細な系統解析および保有する病原性遺伝子解析、ゲノム再編成パターンについて検討し、レジオネラ属菌の病原性獲得への経時的進化機序について明らかする。設備備品費として、遺伝子解析の系統樹作成のために、系統解析用ソフトの購入を予定していたが、現在保有するソフトで対応した。また、購入予定であったゲノム解析用のPCに関しては、所属での手続き上の調整のため次年度に繰り越した。予定ゲノム解析対象株を増やし、次世代シーケンサー解析を含めた核酸配列解析用試薬として使用し、引き続き適切に予算を執行していく予定である。所属での手続きを踏み、ゲノム解析用のPCを購入予定である。また、予定ゲノム解析対象株を増やし、次世代シーケンサー解析を含めた核酸配列解析用試薬として使用する。
単電子/正孔トンネルデバイス回路の単一分子内集積化のための分子開発

本プロジェクトでは、単電荷(電子/正孔)トンネル素子の単一分子内集積化のための逐次合成手法を開発した。単電荷トンネル素子は、4種の基本部品(クーロン島、トンネル接合、静電接合、ワイヤー)から構成される。そこで、これら根幹部品の候補となる、様々な分子ブロック群を設計・合成した。これら分子部品群から、単電荷トランジスタ、ターンスタイル、ポンプ構造を有する単一巨大モデル分子を構築できることを実証した。[1]格子状大形分子の精密構築プロセスの開拓:単電子/ホールトンネル素子を格子状の単分子骨格内に集積化するための構造ブロックとして、イミダゾール系とピロール系のT字型三端子パーツの合成を進展させた。特に、「応用範囲の広い単分子内トンネル接合、静電接合の作り分け」を目指し、ジアリールーピペラジン系を主鎖や側鎖に導入した三端子パーツ群を開発した。これらの分子ブロックでは、パイ軌道間の距離や二面体角、また共役鎖内の電荷分布等のチューニングにより「接合部近傍における主鎖-側鎖間の電子的相互作用の精密制御」が可能となる。なお、主鎖と側鎖が導電/絶縁接合された三端子パーツについては既に各種、合成済みであり、本計画における必須パーツ群は一通り揃ったことになる。[2]分子内トンネル接合系の設計仕様の決定:既に開発済みのアンカー・絶縁被覆付きオリゴチオフェン鎖の単分子伝導度の温度変化の計測結果から、鎖長6-7nm領域でトンネル伝導からポーラロン伝導(ホッピング伝導)へと変化することを確認した(阪大・多田G)。以上から、チオフェン系パイ共役鎖中の電荷担体のフリーサイズを6-7nmと想定でき、この値の整数倍(n)の鎖長をもった分子セグメントを用いれば、その設定数(n)の荷電担体を安定に保持できるクーロン島を構築可能と期待できる。[3]格子状大形分子の基板上への精密実装技術の探索:各種SPM法による「基板上に設置した大型分子の実空間観測と物性計測」は、本研究における基幹技術である。そのため、パルスジェット法による大型分子の基板上への配置技術のルーチン化を進めてきたが、置換基によっては単純なパルスジェット法では良質なサンプルを作成することが困難であることが判明した。そこで、より一般性のある分子配置手法として、エレクトロスプレーイオン化法の適用を進めている(横市大・横山G)。[1]格子状大形分子の精密構築プロセスの開拓:開発済みの「T字型三端子分子パーツ群」の各末端部に、「導電/トンネル/静電/絶縁接合ユニットを含む二端子分子パーツ群」を位置選択的に逐次接合するためのプロセスを確立した。それらを用いて、三端子系の「単電荷トランジスタ、ターンスタイル」、さらに四端子系の「単電荷ポンプ」の要素構造を単一分子骨格内に集積化した大型分子(主鎖長10nm)の合成に成功した。[2]分子内トンネル接合系の設計仕様の決定:分子鎖長を広範囲に変化させた一連のオリゴチオフェン系の単一分子伝導度の計測から、その伝導機構の解析を系統的に進めた。昨年度は、長鎖系の単一分子伝導がホッピング機構によるものであることを明らかにした。今年度は、短中鎖系(5nm以下)において観測される「トンネル伝導領域の温度依存性」について検討を行った。スケーリング理論による解析の結果、この温度依存性が電子-フォノン結合を考慮することにより説明可能なことが分かった。以上で、本研究の基盤となるチオフェン系分子鎖の伝導特性を、短鎖系から長鎖系にわたって明らかにできた。これを土台として、チオフェン系主鎖に、様々な機能部位を導入した効果を、詳細に検討することが可能となった。(阪大・夛田・山田Gとの共同研究)[3]格子状大形分子の基板上への精密実装技術の探索:大型分子の実装技術の開発のためには、各種SPM法による「基板上に配置した大型単一分子の高分解能観測技術」の確立が前提となる。そのため、パルスジェット法による計測用サンプルの作成法を長らく検討してきたが、その条件最適化は困難なままであった。しかし今回、エレクトロスプレー法を適用したところ、チオフェン288量体(120nm級)といった特大サイズの分子についてまで、容易に良質な計測用サンプルを調製でき、その高分解能STM像を得ることが可能となった。(横浜市大・横山Gとの共同研究)[1]昨年度までに開発済みの「三/四端子型単電荷トンネルデバイスの基本骨格合成法」の応用展開として、多端子型デバイス同士を逐次接合し「単一分子内集積化回路」を構築するための方法論について探索した。低/中サイズのモデル分子群について検討した結果、デバイス本体の構築には高活性の臭素/ヨウ素系のカップリングサイトを、デバイス同士の接合には低活性の塩素/窒素系のカップリングサイトを組合わせて利用する「反応階層化法」が、デバイス構築から集積化までの一連のシステム化に有効であることが分かった。

[2]トンネル接合と静電接合とを作り分けるための指針を実験的に確立するため、「ポテンシャル障壁の形状を精密かつ広範囲に変化させることが可能」であり、かつ「多端子型デバイス分子骨格内に容易に導入が可能」である分子ブロック群(アルカン/シラン/アミノ/アリール環ユニットの混合系)を開発した。[3] 170 nm長までの分子鎖群の「基板上での配座構造」について、エレクトロスプレー法で作成した試料を用いた高分解能STM観測から検討した。本研究の鎖状分子ユニットは、溶液中のスペクトルデータ等からは「分子鎖の剛直性や共平面性は、小」と判定され、直鎖構造ではなく、絡み合った鎖構造をもつものと予想されていた。しかし、平坦基板上では、側鎖部の吸着により主鎖の共平面配座が安定化され、60nm長くらいまでは鎖状に伸展した分子鎖も観測されることが分かった。この結果は、分子-基板間相互作用を活用すれば、柔軟巨大分子の基板上での「その場-形状制御」が可能な事を示すものである。これをうけて、剛直系に比べ溶解性に優れた柔軟巨大分子系を活用したウェットプロセスによる分子配置法の開拓を進めている。本研究の合成標的である「非周期的・定序配列性の大型パイ共役分子」の逐次精密合成は、現在でも非現実的とするのが一般的である。その主因は単離精製の困難さである(特に、大型の非対称性合成中間体の精製は至難である)。しかし、当研究室で開発した基本構築ブロックである「被覆型オリゴチオフェン:nT-Si-Dod」は、一般常識を遙かに上回る「可精製性」を、二/三/四端子型巨大分子の逐次合成プロセスにおいて発揮してくれた。よってあとは、体力と時間の問題で、最終目標である単一分子内集積回路までアクセスできるものと想定している。24年度が最終年度であるため、記入しない。新規巨大分子の開発に傾倒しすぎて、計測系研究グループへの試料分子の供給が、少々おろそかになったことは反省点であり、これを改善する。従来、単一分子計測の研究対象は、おおむね1nm長程度の低分子系で、かつ入手容易なモノに限定されていた。結果、近年初めて出現した「構造や分子量にバラツキの無い機能集積化巨大パイ共役分子」に対応した実験技術は未だ十分には確立されていない(実際、大型分子試料を持て余してしまう計測系研究者は多い)。このままでは、大型分子の精密合成法を確立しても、波及効果は限定的であろう。これを打開するため、「単一分子計測練習用の大型分子試料セット」を、見返りなしで、気合いの入った研究室に広く供与していこうと計画している。「大型分子慣れ」をした若手研究者を新規育成するためである。
低温増殖性を獲得した酵母の応用に向けた基盤構築およびその分子メカニズムの解明

酵母は真菌類に属する単細胞生物であり、真核生物の優れたモデル生物である。一方で、アルコール発酵を行う微生物でもあり、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは酒造やパンの製造に用いられている。例えば、清酒醸造における酵母の発酵は、糖化と発酵のバランスを保ち、酒質を維持するために17、18°C以下の低温下で行われる。よって、清酒醸造において低温での増殖力・発酵力の高い酵母の取得は、製造期間の短縮や品質の向上などの応用につながる。我々は、分裂酵母のDNA複製関連因子MCM-BP(分裂酵母Mcb1)を出芽酵母で発現させ、出芽酵母の細胞増殖制御に与える影響を検証することでその機能解析を行ってきた。その過程において、mcb1遺伝子を導入した出芽酵母株が低温で高い増殖能を示すことを見いだした。しかし、今回の解析から、分裂酵母mcb1遺伝子の導入は出芽酵母の低温増殖能の獲得の原因ではないことが明らかとなった。これまでの知見から、低温では生体膜の流動性が低下するため、輸送体タンパク質の大きな構造変化を必要とするトリプトファンの細胞内への取り込みは低温で抑制されることが知られている。そこで今回、取得した低温増殖性株とトリプトファン輸送能の関係を明らかにするために、出芽酵母のトリプトファン輸送体をコードするTAT2遺伝子に注目して解析を行った。その結果、取得した低温増殖性株においてTAT2遺伝子の27番目のアミノ酸がグルタミン酸からフェニルアラニンに(E27F)変異していることを見出だした。そこで、tat2-E27F遺伝子を有するプラスミドでトリプトファン要求性の野生株を形質転換すると、低温において顕著な生育の向上が確認できた。以上の結果より、低温増殖性獲得の原因は、トリプトファン輸送タンパク質Tat2のE27F変異であるという結論に至った。MCM-BPはDNA複製の際にDNAヘリカーゼとして働くMCM複合体に結合し、複製開始前複合体形成のためのMCM制御因子として重要な役割を担っている。MCM-BPはヒトの細胞ではhMCM-BPが同定されており、分裂酵母におけるオルソログとしてMcb1が知られている。また、MCM-BPは多くの真核生物で保存されているが、線虫や出芽酵母では保存されていない。我々の先行研究において、MCM-BPの機能を解析するために、ガラクトース存在下でmcb1遺伝子を発現するGAL-mcb1出芽酵母株を作製した際、偶然にも低温で生育が可能な株を取得した。このことからmcb1遺伝子の導入が低温増殖能の獲得に関わる可能性が考えられたため、新しくGAL- mcb1株を作り直した。すると、新たに作製した株は低温で生えることができなかった。以上の結果から、低温増殖能の獲得の原因はmcb1遺伝子を導入した際に全く異なる遺伝子上に偶然生じた変異である可能性が考えられた。上記の状況は当初予期したこととは異なることであった。そこで、低温増殖能の獲得の原因となる変異の特定と、変異が持つ性質について解明することに目的を設定し直した。その後の解析により、低温増殖能の獲得の原因となる変異を特定することに成功したので、結果的に本研究計画は大きく進展したと言える。同定したTAT2遺伝子における変異が低温での発酵能力の向上に寄与するかを検証するため、15°Cと30°Cで発酵試験を行い、CO2発生量とCO2発生速度を計測する。また、現在Tat2-E27F変異の近くにある変異で、協会7号等に導入されているTat2-G24E変異が低温増殖能の向上に寄与する可能性についても同時に検証する。・tat2-E27F変異が低温でのTat2輸送体の能力向上にもたらす影響Tat2タンパク質のE27F変異がどのようにTat2輸送体の能力を向上させ、低温増殖性の獲得に寄与しているのか明らかにする。先行研究の知見から、Tat2タンパク質の分解制御に与える影響を中心に解析を進める。

そこで、tat2-E27F遺伝子を有するプラスミドでトリプトファン要求性の野生株を形質転換すると、低温において顕著な生育の向上が確認できた。以上の結果より、低温増殖性獲得の原因は、トリプトファン輸送タンパク質Tat2のE27F変異であるという結論に至った。MCM-BPはDNA複製の際にDNAヘリカーゼとして働くMCM複合体に結合し、複製開始前複合体形成のためのMCM制御因子として重要な役割を担っている。MCM-BPはヒトの細胞ではhMCM-BPが同定されており、分裂酵母におけるオルソログとしてMcb1が知られている。また、MCM-BPは多くの真核生物で保存されているが、線虫や出芽酵母では保存されていない。我々の先行研究において、MCM-BPの機能を解析するために、ガラクトース存在下でmcb1遺伝子を発現するGAL-mcb1出芽酵母株を作製した際、偶然にも低温で生育が可能な株を取得した。このことからmcb1遺伝子の導入が低温増殖能の獲得に関わる可能性が考えられたため、新しくGAL- mcb1株を作り直した。すると、新たに作製した株は低温で生えることができなかった。以上の結果から、低温増殖能の獲得の原因はmcb1遺伝子を導入した際に全く異なる遺伝子上に偶然生じた変異である可能性が考えられた。上記の状況は当初予期したこととは異なることであった。そこで、低温増殖能の獲得の原因となる変異の特定と、変異が持つ性質について解明することに目的を設定し直した。その後の解析により、低温増殖能の獲得の原因となる変異を特定することに成功したので、結果的に本研究計画は大きく進展したと言える。同定したTAT2遺伝子における変異が低温での発酵能力の向上に寄与するかを検証するため、15°Cと30°Cで発酵試験を行い、CO2発生量とCO2発生速度を計測する。また、現在Tat2-E27F変異の近くにある変異で、協会7号等に導入されているTat2-G24E変異が低温増殖能の向上に寄与する可能性についても同時に検証する。・tat2-E27F変異が低温でのTat2輸送体の能力向上にもたらす影響Tat2タンパク質のE27F変異がどのようにTat2輸送体の能力を向上させ、低温増殖性の獲得に寄与しているのか明らかにする。先行研究の知見から、Tat2タンパク質の分解制御に与える影響を中心に解析を進める。当初の研究計画とは異なる進展が見られたため、使用額の変更が生じた。それを踏まえて、次年度の使用計画を再構築した。
分化抑制因子Id2によるB細胞活性化・最終分化抑制機構の解析

1 Id2欠損マウスはT cell independent antigenに対する反応性が亢進している。この性質は、脾臓B細胞を用いた、LPS刺激によるin vitro plasma cell分化誘導系においても確認された。また、野生型B細胞にId2を過剰発現させることによって形質細胞分化は抑制されることも明らかになった。これらのことから、活性化B細胞内におけるId2タンパクの発現量が、形質細胞分化制御に重要である可能性が示唆された。さらに、in vitroでのPlasma cell分化誘導系におけるId2タンパク量の系時的変化の解析から、Id2タンパク量は分化に伴って減少することが明らかになった。これらのことから活性化B細胞内でのId2量がPlasma cell分化を抑制するのに重要であることが確認された。工d2が転写制御因子であることから、形質細胞分化に必須である転写因子の転写が亢進した結果、形質細胞分化が亢進している可能性が想定された。しかし、実際は、形質細胞分化に必須である転写因子Blimp1, Xbp1, IRF4等の発現量の増加は認められなかった。これらのことから、Id2欠損B細胞に認められる形質細胞への分化亢進は、今までに形質細胞分化に重要であることの知られている、転写因子の量を制御することによってもたらされたものでは無いことが明らかになった。2.今回我々は、Germinal Center B細胞得意的マーカーとなり得るGL7抗体が、シアル化された多糖類であるα2,6-linked N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)を認識することを見いだした。さらにgerminal center B細胞におけるGL7エピトープ発現の増強は、Neu5AcからNeu5Gcへの変換酵素であるCMP-Neu5Ac hydroxylase(Cmah)の転写抑制によることも見いだした。これにより、CD22リガンドとして知られるNeu5Gcの減少がgerminal center内で起こっていることが明らかになった。さらに、in vivoでのNeu5Gcの機能的意義を解析する目的にてCmah欠損マウスを作成した。その結果、T cell independent antigenに対するB細胞の反応性が、亢進していることが明らかになった。また、germinal center B細胞では生理的なCmah欠失状況であること等を合わせて考えると、Neu5Gcは、生体内でB細胞活性化の負の制御因子として機能している可能性が示唆された。目的:申請者はこれまで、分化抑制因子の一つであるId2の遺伝子欠損マウスの病態解析を行ってきた。その結果このマウスがTh2優位な環境をつくりだしていることを見い出し、この原因の一つは、CD8+樹状細胞の欠陥であることを示した(Sugai et al.,J Allergy Clin Immunol,)。一方、高IgE血症の主たる原因がB細胞におけるIgE特異的クラススイッチの亢進によるものであること(Sugai, et al.,Nature Immunol.)、さらには、Id2の遺伝子欠損B細胞に認められる、AID遺伝子発現亢進、また、クラススイッチ制御分子機構の一端を明らかにした(Gonda, et al.,J.Exp.Med, Sugai, et al.,Science)。本研究はId2欠損B細胞のさらなる解析から、Id2が成熟B細胞の活性化とその後の最終分化の負の制御因子であるということを見出したことを基礎として、この表現系の病因を分子レベルで明らかにし、分化抑制因子Id2が生体で担う機能を解明することを目的とする。これらの情報から、個体レベルでの免疫応答制御コントロールへの足がかりが得られるものと考えられる。結果:Id2欠損B細胞はT cell independent antigenに対する反応性が亢進している。この性質は、LPS刺激脾臓B細胞を用いた、in vitro plasma cell分化誘導系においても確認された。また、野生型B細胞にId2を過剰発現することにより形質細胞分化は抑制された。さらに、in vitro Plasma cell分化誘導系において、分化に伴いId2量の減少することが明らかになった。しかし、Id2の量と既知のplasma cell分化に重要である転写因子(Blimp1,Xbp1,IRF4等)の発現量、転写活性の変化との間に明らかな相関は認められなかった。考察:Plasma cell分化制御機構に重要な因子は、ノックアウトマウスの解析から明らかになりつつある。Blimp1,Xbp1,IRF4等がPlasma cell分化誘導に必須である。Id2はこれらの転写因子群の発現を制御することや、機能を制御することによるのではなく、おそらく別の経路を介してPlasma cell分化を抑制している可能性が示唆された。これらのことから活性化

B細胞内でのId2量がPlasma cell分化を抑制するのに重要であることが確認された。工d2が転写制御因子であることから、形質細胞分化に必須である転写因子の転写が亢進した結果、形質細胞分化が亢進している可能性が想定された。しかし、実際は、形質細胞分化に必須である転写因子Blimp1, Xbp1, IRF4等の発現量の増加は認められなかった。これらのことから、Id2欠損B細胞に認められる形質細胞への分化亢進は、今までに形質細胞分化に重要であることの知られている、転写因子の量を制御することによってもたらされたものでは無いことが明らかになった。2.今回我々は、Germinal Center B細胞得意的マーカーとなり得るGL7抗体が、シアル化された多糖類であるα2,6-linked N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)を認識することを見いだした。さらにgerminal center B細胞におけるGL7エピトープ発現の増強は、Neu5AcからNeu5Gcへの変換酵素であるCMP-Neu5Ac hydroxylase(Cmah)の転写抑制によることも見いだした。これにより、CD22リガンドとして知られるNeu5Gcの減少がgerminal center内で起こっていることが明らかになった。さらに、in vivoでのNeu5Gcの機能的意義を解析する目的にてCmah欠損マウスを作成した。その結果、T cell independent antigenに対するB細胞の反応性が、亢進していることが明らかになった。また、germinal center B細胞では生理的なCmah欠失状況であること等を合わせて考えると、Neu5Gcは、生体内でB細胞活性化の負の制御因子として機能している可能性が示唆された。
線虫トロポミオシン, パラミオシン, ミオシンの遺伝子構造

線虫のcDNAファージライブラリーを選択することにより,いくつかのcDNAクローンを得て, pUCプラスミドに再クローン化した後塩基配列決定を行った.プローブには,線虫遺伝子DNAの発現プラスミドライブラリーを抗線虫トロポミオシン抗血清で選択して得られた陽性株からのプラスミドで,トロポミオシンの190から225番目のアミノ酸をコードしているDNA断片を用いた.塩基配列決定及びアミノ酸への翻訳には新しく購入した自動塩基配列入力装置及び塩基配列解析ソフトを利用した.これまでに,既知トロポミオシンと比較して5-241番目のアミノ酸配列に相当する部分を決定した.うさぎ骨格筋α型や,ショウジョウバエ筋肉型トロポミオシンと比較して50%以上の相同性を示した.本来の目的である,線虫トロポミオシンがどの型のトロポミオシンに相当するかは,特異性を決めているC末端部分を決定しなければわからない.現在, cDNA及び遺伝子DNAライブラリーを選択して候補株を選び解析中である.塩基配列決定に用いたDNA断片を発現ベクターに組込み,大腸菌内で生産された融合蛋白質の免疫化学的解析から,これらの融合蛋白質を用いて,アクチン,トロポニン等の蛋白質との相互作用を調べたり,遺伝子DNAを含むラムダファージと線虫遺伝子コスミドライブラリーの結果を計算機で処理することにより,トロポミオシン遺伝子の染色体上での位置を決める研究への手がかりがえられた.線虫のcDNAファージライブラリーを選択することにより,いくつかのcDNAクローンを得て, pUCプラスミドに再クローン化した後塩基配列決定を行った.プローブには,線虫遺伝子DNAの発現プラスミドライブラリーを抗線虫トロポミオシン抗血清で選択して得られた陽性株からのプラスミドで,トロポミオシンの190から225番目のアミノ酸をコードしているDNA断片を用いた.塩基配列決定及びアミノ酸への翻訳には新しく購入した自動塩基配列入力装置及び塩基配列解析ソフトを利用した.これまでに,既知トロポミオシンと比較して5-241番目のアミノ酸配列に相当する部分を決定した.うさぎ骨格筋α型や,ショウジョウバエ筋肉型トロポミオシンと比較して50%以上の相同性を示した.本来の目的である,線虫トロポミオシンがどの型のトロポミオシンに相当するかは,特異性を決めているC末端部分を決定しなければわからない.現在, cDNA及び遺伝子DNAライブラリーを選択して候補株を選び解析中である.塩基配列決定に用いたDNA断片を発現ベクターに組込み,大腸菌内で生産された融合蛋白質の免疫化学的解析から,これらの融合蛋白質を用いて,アクチン,トロポニン等の蛋白質との相互作用を調べたり,遺伝子DNAを含むラムダファージと線虫遺伝子コスミドライブラリーの結果を計算機で処理することにより,トロポミオシン遺伝子の染色体上での位置を決める研究への手がかりがえられた.
口腔癌に対する生体防御機構の解析

研究経過1)リンパ球サブセットの解析:口腔扁平上皮癌症例において各種モノクローナル抗体(CD3, CD4, CD8, TNFαβ, CD20, NKH1などに対する)を用いて、サブセットを同定する。2)リンパ球機能の解析:各種刺激での増殖活性ならびに癌細胞に対する細胞障害活性を検討する。4)T細胞のレパトアの解析:腫瘍部浸潤T細胞のレセプターを解析し、口腔癌に特異的に反応しているV領域ファミリーを同定する。5)癌細胞DNA量の測定:凍結癌組織を用い、フローサイトメトリーで細胞当りのDNA量を測定し、口腔癌DNA aneuploidyの発現率やPloidyパターンを同定する。6)生検組織のパラフィン切片において、組織型、組織学的悪性度を判定する。7)生検組織で細胞外基質の状態とMMP-1, -2, -3, -9, TIMP-1, -2の関連性を免疫組織染色を行って検討する。研究結果1)リンパ球サブセットの解析:腫瘍部浸潤リンパ球CD2+, CD3+, CD4+,T細胞レセプターαβ、であったが、活性化されたT細胞は少数であった。2)リンパ球機能の解析:自己やalloの癌細胞に対する著明な細胞障害活性は認められなかった。3)細胞接着分子の検索:細胞外基質の出現状態とVLA1^-6の関連性ならびに転移とVLA2, 3, 6出現との関連性が示唆された。VCAM-1, ICAM-1, ELAM-1, HCAMについては、転移との明瞭な関連性は認められなかった。4)T細胞レパトア-の解析:末梢血と対比してVβ5.2, Vβ6が優位に出現していた。5)癌細胞DNA量の測定:口腔癌の転移傾向と腫瘍細胞のDNA aneuploidyの発現率やPloidyパターンの間に関連性が示唆された。6)組織学的悪性度の検討:腫瘍の転移と組織学的悪性度との間に相関性が認められた。研究経過1)リンパ球サブセットの解析:口腔扁平上皮癌症例において各種モノクローナル抗体(CD3、CD4、CD8、TCR_<alphabeta>、CD20、NKH1などに対する)を用い、サブセットを同定した。さらに二重染色により、これらリンパ球のうち活性化されているものを同定した。2)リンパ球機能の解析:上記症例でのリンパ球について各種刺激での増殖活性ならびに癌細胞に対する細胞障害活性を検討した。4)T細胞のレパトアの解析:腫瘍部浸潤T細胞のレセプターを解析し、口腔癌に特異的に反応しているV領域ファミリーを同定した。研究結果1)リンパ球サブセットの解析:腫瘍部浸潤リンパ球はCD2^+、CD3^+、CD4^+、TCR^+_<alphabeta>、であったが、活性化されたT細胞は少量であった。2)リンパ球機能の解析:現在検討中であるが、著名な細胞障害性は認めえなかった。3)細胞接着分子の検索:細胞外基質の出現状態とVLA-16の関連性、また転移とVLA-16の関連性が示唆された。VCAM-1、ICAM-1、ELAM-1、HCAMについては現在検討中であるが、現段階では転移との明確な関連性は認めていない。