hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報伝達による細菌の薬剤耐性因子発現制御機構の解明

ゲノム情報を用いることで、新薬開発の段階で将来の耐性菌を予想することが可能であることを証明した。これからは、未来に出現するであろうと推定される耐性菌に対してもあらかじめ手を打たねばならないし、それが可能な段階に入った。また、これら薬剤排出蛋白質ほとんどが通常培養条件においては発現していないことが分かってきた。もし、何らかの要因で排出蛋白質発現が誘導されると、細菌は強力な薬剤耐性菌になる可能性がある。よって、薬剤排出蛋白質が誘導される要因を探ることが重要であると考え、解析を行った。その結果、細菌の環境感知応答システムである二成分情報伝達系が複数の薬剤排出遺伝子を発現誘導し、多剤耐性化を引き起こすことを発見した。また、抑制性因子として、ヒストン様タンパクであるH-NSを同定した。さらに、DNAマクロアレイを使用し、二成分制御系のゲノムワイドでの発現調節ネットワーク解析を行った。その結果、潜在的耐性遺伝子が、pH、浸透圧、温度、そして細胞間情報伝達シグナルといった因子によりコントロールされていることを明らかにした。このような耐性調節機構は、これまで誰も注目してこなかったことであり、私の発見以後、この観点に立った研究が行われるようになってきている。これら一連の成果に対し、Science誌よりYoung Scientist Awardが表彰された。
生きた細胞内でのオートファジー発光定量法の開発

細胞中のオートファジーを,生きた細胞で検出するための発光検出系を開発した.発光タンパク質ルシフェラーゼを2断片に分割し,ルシフェラーゼ再構成を利用して,オートファジーの際に形成される小胞「オートファゴソーム」の構成成分にルシフェラーゼ断片を融合させる形でプローブを作製した.プローブをヒト培養細胞に導入したのち,血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えてオートファジーを誘導した.結果,種々のプローブペアは発光を生じた.さらには異なるルシフェラーゼペアを導入する事で,より発光強度の強いオートファジー検出プローブの作製に成功した.本申請研究では,細胞の維持機構の一端である「オートファジー」現象を対象とし,生きた細胞内にて発光検出する方法を開発する.発光検出する原理として,発光タンパク質ルシフェラーゼを用いたタンパク質再構成法を導入する.タンパク質再構成法は, 2断片に分割したルシフェラーゼが接近する際に,再び発光活性が回復する原理であり,ルシフェラーゼ2断片をそれぞれ各種オートファジーに関するタンパク質へ連結させることで,オートファジー下におけるタンパク質間相互作用の検出を可能とする.最終年度では,これまで開発を行ってきたルシフェラーゼプローブの改良を行った.前年度までのプローブの発光強度は最低限の感度を満たしているものの,細胞イメージングなどの用途にはその発光強度は不十分であった.そこで,発光強度が強く且つ安定しているNanoLucルシフェラーゼを導入した.まず, NanoLucの再構成法上での最適な切断位置を決定した.切断位置の予測に関しては,先行論文を参照し,アミノ酸配列の特徴,極性から候補位置を選出して随時確認した.最終的に決定した切断位置でNanoLucを分断し,オートファジー関連遺伝子と融合させて細胞用発現ベクターを作製した.精製した発現ベクターをヒト培養細胞に導入したのち,その発光値を確認した.オートファジーは培地の栄養条件が劣悪になった場合誘導されることから,血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えて培養を行った.その結果,前年度のプローブと比較して, 100倍以上の発光値が観測された.さらに,オートファジー関連タンパク質に結合するドメインを利用する事で,内在のタンパク質量を反映した発光検出法の可能性も見出した.細胞中のオートファジーを,生きた細胞で検出するための発光検出系を開発した.発光タンパク質ルシフェラーゼを2断片に分割し,ルシフェラーゼ再構成を利用して,オートファジーの際に形成される小胞「オートファゴソーム」の構成成分にルシフェラーゼ断片を融合させる形でプローブを作製した.プローブをヒト培養細胞に導入したのち,血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えてオートファジーを誘導した.結果,種々のプローブペアは発光を生じた.さらには異なるルシフェラーゼペアを導入する事で,より発光強度の強いオートファジー検出プローブの作製に成功した.本申請研究では,細胞の分解機構の一端である「オートファジー」に対して,生きた細胞内にて検出する方法を開発する.検出する手法としては,発光タンパク質ルシフェラーゼを用いたタンパク質再構成法によって行う.タンパク質再構成法は, 2断片に分割したルシフェラーゼが接近すると,再び発光活性が回復する原理であり,ルシフェラーゼ2断片にそれぞれ各種オートファジーに関するタンパク質を連結させることで,オートファジー下でのタンパク質間相互作用を検出する事が可能となる.本年度は,ルシフェラーゼの断片化および各種オートファジー関連因子との融合化を実現する,ほ乳類細胞発現ベクターを作製した.既に最適な切断位置が明らかとなっているヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼのそれぞれの断片遺伝子を, PCRおよびライゲーション法を用いてベクター上でオートファジー関連遺伝子と連結した.オートファジー関連遺伝子としては, LC3, DFCP-1, ATG14等を用いた.作製した発現ベクターは配列の確認を行ったのち,大腸菌を用いて大量に精製した.精製した発現ベクターをヒト培養細胞に導入したのち,その発光値を確認した.オートファジーは培地の栄養条件が劣悪になった場合に誘導されることから,血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えて培養を行った.その結果,大きく発光値が上昇した.ただし,貧栄養下では細胞自体の活性も低下しているため,内在コントロールとして,ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの全長を同時に導入することにした.ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発光値でプローブの発光値を補正した結果,やはり貧栄養下でプローブの発光値が上昇していることが確認された.本年度は当初の目的であった,タンパク質再構成法を用いたオートファジーに対するルシフェラーゼ発光プローブの作製に着手した.ルシフェラーゼの種類および分割位置を検討した結果,長波長且つ高い発光強度をもつヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼを選択した.このルシフェラーゼ遺伝子の断片とオートファジー関連遺伝子を融合させた発現ベクターコンストラクトの完成に至った.当初は,オートファジーの主要な膜成分であるオートファゴソームの形成に対して,膜成分である「LC3」および,オートファゴソームがリソソームと融合するタイミングを捉えるためリソソーム膜上の「LAMP-1」をターゲットと定めプローブの作製を行った.しかしながら,オートファジーでの後期ステップの検出だけでは,オートファジーの全容を捉えるには不十分であるとの理由から,オートファジー初期における膜タンパク質DFCP-1や,シグナルタンパク質ATG14などもターゲットとして導入する事とした.

また,タンパク質の過剰蓄積に依る影響は本来の細胞のバランスを損なう恐れがあることから,内在のタンパク質へ結合するペプチド配列を選抜して,影響の少ないプローブの作製も同時に進めている.実際に作製した発光プローブは, LC3とLAMP-1のペアも,その他の各種組み合わせも,細胞に導入した結果発光を生じた.さらにはオートファジーを誘導する各種刺激に対しても明確に反応を示した.従い当初の予定通り,プロトタイプとなる発光プローブの開発を実現した.マウス等個体への導入に関しては,プローブのキャラクタライゼーションが完全に出来ていないことと,改良の余地がみられることから,次年度以降に行う.平成25年度は,まずプローブの改良を行う.現時点でのプローブの発光強度は最低限の感度を満たしているが,細胞イメージングなどの用途には向いていない.また,細胞内環境の変化に発光反応が影響を受け易い.そこで,発光強度が強く且つ安定しているNanoLucルシフェラーゼを導入する.ただしNanoLucは再構成法上での最適な切断位置が決定されていないため,切断位置の決定から行う.位置の予測に関しては,先行論文を参照し,アミノ酸配列の特徴から候補を選出して随時確認する.決定した切断位置でNanoLucを分断し,オートファジー関連遺伝子と融合させて再度発光プローブを作製する.プローブが完成次第,実際に発光値を計測するとともに細胞観察を行い,オートファジーの進行とともにプローブの凝集等,一般的なオートファジーの特徴を呈するかどうか確認を行う.NanoLucをベースとしたプローブが完成した場合,長時間モニタリングを行い,各種細胞活動におけるオートファジー活性の変遷を追う.具体的には当初の予定通り,細胞周期および概日リズムに着目する.それぞれを蛍光タンパク質もしくは異なる波長のルシフェラーゼでモニターすることで,オートファジーと同時に計測する.続いて,細胞死アポトーシスとの関連性を調査する.胚発生や細胞老化におけるアポトーシス過程において,オートファジーとの関係性をそれぞれの現象を同時に計測する事で解析する.最終的にはマウスへの導入を行う.ウイルス等の作製によってマウスへの導入系を確立する.マウスの肝臓や皮下組織へ発光プローブを導入し,飢餓状態や炎症反応においてオートファジーの活性を個体イメージングする.平成25年度は,まずプローブの改良を行う.新規にNanoLucを導入したプローブを作製するため, PCRに用いる酵素等の試薬代,プライマーの外注代を予定している.さらにベクターへの導入およびベクターの大量精製においては各種キットを購入して行う.細胞実験では,細胞継代用の培地,血清,各種試薬,ディッシュ等の予算を計上する.細胞への遺伝子導入として遺伝子導入試薬を購入する.細胞の発光観察及び,各細胞活動の観察は顕微鏡を使用して行うため,顕微鏡関連機器,消耗品の購入を予定する.マウスを用いた個体イメージングでは,ウイルス作製用のキットおよび培地代,さらには実験用マウスの購入費を計上する.
プログラミング教育支援システムのためのプログラム理解機能の汎用化の研究

高度情報社会においてプログラミング教育の重要性とそのニーズは高く,知的プログラミング教育環境は益々重要となってきた.これを知的CAIの概念に基づく知的プログラミング環境として実現するには,生徒のプログラム中の論理エラーを適切に指摘し,それに基づいて訂正の助言を行い正しい知識を提示する機能が必須である.我々は既に10数年前よりこれを目的としてプログラム理解の研究に取り組み,独自にPASCALを対象とするプログラム理解システムALPUSの開発に成功した.本研究では,ALPUSを基盤として言語独立で汎用なプログラム理解システムの研究開発を行うことであり,特にCおよびPASCAL両言語を対象として実験システムを開発し,実際のデータによって評価を行うところまでを行った.更に、このシステムをINTERNETを通して広くサービスするシステムの開発に着手した.汎用化の方法は,言語独立な抽象言語ALを設計し,CあるいはPASCAL言語で書かれた学生のバグを含むソースプログラムを,先ずALの記述に変換し,次にこの記述を標準的なプログラミング表現に'正規化'し,最後に,同じくAL形式で記述されたプログラミング知識との照合を行うことによって,学生の不完全なプログラムを意味的に理解し,バグとその原因を推論するというものである.本研究によって,プログラム理解システムALPUSの基本部分をほぼ完成させることができた.また,実際のデータを用いて評価実験を行い,ほぼ予期した能力を持つことを確かめられた.ただし,対象プログラムがクイックソ-ト法を中心とした2,3のアルゴリズムに限定されていることや,スタンドアローン型システムでは実用化が困難なため,INTERNET化に着手し,その基本設計を行った.今後は,この成果を基盤として,WWWによるバーチャルプログラミング教育環境へと展開する予定である.高度情報社会においてプログラミング教育の重要性とそのニーズは高く,知的プログラミング教育環境は益々重要となってきた.これを知的CAIの概念に基づく知的プログラミング環境として実現するには,生徒のプログラム中の論理エラーを適切に指摘し,それに基づいて訂正の助言を行い正しい知識を提示する機能が必須である.我々は既に10数年前よりこれを目的としてプログラム理解の研究に取り組み,独自にPASCALを対象とするプログラム理解システムALPUSの開発に成功した.本研究では,ALPUSを基盤として言語独立で汎用なプログラム理解システムの研究開発を行うことであり,特にCおよびPASCAL両言語を対象として実験システムを開発し,実際のデータによって評価を行うところまでを行った.更に、このシステムをINTERNETを通して広くサービスするシステムの開発に着手した.汎用化の方法は,言語独立な抽象言語ALを設計し,CあるいはPASCAL言語で書かれた学生のバグを含むソースプログラムを,先ずALの記述に変換し,次にこの記述を標準的なプログラミング表現に'正規化'し,最後に,同じくAL形式で記述されたプログラミング知識との照合を行うことによって,学生の不完全なプログラムを意味的に理解し,バグとその原因を推論するというものである.本研究によって,プログラム理解システムALPUSの基本部分をほぼ完成させることができた.また,実際のデータを用いて評価実験を行い,ほぼ予期した能力を持つことを確かめられた.ただし,対象プログラムがクイックソ-ト法を中心とした2,3のアルゴリズムに限定されていることや,スタンドアローン型システムでは実用化が困難なため,INTERNET化に着手し,その基本設計を行った.今後は,この成果を基盤として,WWWによるバーチャルプログラミング教育環境へと展開する予定である.本研究では、これまでに研究開発を進めてきた教育向き知的プログラミング環境INTELLITUTORのサブシステムであるプログラム理解システムALPUSの、汎用化の研究を行っている。ここでいう汎用化は、複数のプログラミング言語、すなわちPASCALとC、に対応できるプログラム理解システムの実現、および色々なプログラミングスタイルに対応できる理解法の実現を意味する。汎用化の方法としては、1)プログラム文の抽象表現化、2)プログラム文の正規化、3)プログラミング知識の抽象表現化、4)抽象表現に対応した汎用な推論法の研究、などである。これによって、学習者のプログラムは一度この抽象表現に書き換えられ正規化されるので、元のプログラミング言語や書き方の依存性がかなり解消される。本研究では、基本的なアルゴリズム教育に必要な部分に限定して、そのためにPASCALと等価なC言語のサブセットを設定した。なお、汎用化によってコンピュータ処理の負担が増大するので、理解のための推論手法の改良や、そのために必要な学生のプログラミング過程の分析も行っている。平成7年度は、中間的な研究報告として、学会の研究会やワークショップ等で発表し、今後の研究の為の方向づけ等を行った。また、プログラム理解技術の重要な応用分野であるリバースエンジニアリングに関しても、関連研究として考察し、報告した。高度情報社会においてプログラミング教育の重要性とそのニーズは高く,知的プログラミング教育環境は益々重要となってきた.これを知的CAIの概念に基づく知的プログラミング環境として実現するには,生徒のプログラム中の論理エラーを適切に指摘し,それに基づいて訂正の助言を行い正しい知識を提示する機能が必須である.我々は既に10数年前よりこれを目的としてプログラム理解の研究に取り組み,独自にPASCALを対象とするプログラム理解システムALPUSの開発に成功した.本研究では,ALPUSを基盤として言語独立で汎用なプログラム理解システムの研究開発を行うことであり,特にCおよびPASCAL両言語を対象として実験システムを開発し,実際のデータによって評価を行うところまでを行った.

更に,このシステムをINTERNETを通して広くサービスするシステムの開発に着手した.汎用化の方法は,言語独立な抽象言語ALを設計し,CあるいはPASCAL言語で書かれた学生のバグを含むソースプログラムを,先ずALの記述に変換し,次にこの記述を標準的なプログラミング表現に'正規化'し,最後に,同じくAL形式で記述されたプログラミング知識との照合を行うことによって,学生の不完全なプログラムを意味的に理解し,バグとその原因を推論するというものである.本研究によって,プログラム理解システムALPUSの基本部分をほぼ完成させることができた.また,実際のデータを用いて評価実験を行い,ほぼ予期した能力を持つことを確かめられた.ただし,対象プログラムがクイックソ-ト法を中心とした2,3のアルゴリズムに限定されていることや,スタンドアローン型システムでは実用化が困難なため,INTERNET化に着手し,その基本設計を行った.今後は,この成果を基盤として,WWWによるバーチャルプログラミング教育環境へと展開する予定である.
葉緑体蛋白質輸送における膜透過中間体の解析

核内ゲノムにコードされた葉緑体蛋白質の前駆体は、二重の包膜に存在する独自の蛋白質輸送装置(トランスロコン)を利用して、サイトゾルより輸送される。多くの知見は、包膜透過に必要なエネルギーを制限することで形成される、前駆体輸送がトランスロコン中で停止した初期膜透過中間体の解析により得られてきた。しかし、初期段階における各因子のかかわりや、初期段階以降の前駆体蛋白質、トランスロコン因子の分子機構については未解明である。本研究では、蛋白質輸送における前駆体蛋白質とトランスロコン因子間、またはトランスロコン因子同士間の分子間相互作用を解析するための基盤を整備した。本研究は、独自の蛋白質輸送システムを有する葉緑体の蛋白質輸送時における同定済蛋白質輸送装置構成因子の連携および未同定蛋白質輸送装置構成因子の同定を目的としている。この目的の達成のためには、輸送基質である前駆体蛋白質に、蛋白質輸送チャンネルをふさぐのに十分な大きさの立体障害を導入することで、前駆体蛋白質の輸送が停止した膜透過中間体の獲得が有効であると考ている。平成25年度においては、立体障害を導入するために、葉緑体蛋白質輸送研究で広く用いられているRubisco小サブユニット前駆体蛋白質をベースにして、タグやポリペプチドの導入による改変を行った。改変の結果、以下の前駆体蛋白質を新たに作製した:1将来的に前駆体蛋白質を特異的に検出したり、前駆体蛋白質自身、あるいは、前駆体蛋白質と相互作用する因子を精製をしたりするためのタグを挿入したもの、2前項の前駆体蛋白質に、さらにメトキサートの存在下で3次構造を形成するジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)を複数個挿入したもの、3ストレプトアビジンを結合させるために、大腸菌でin vivoでビオチン化するビオチンアクセプターペプチド(BAP)タグを連結したもの。いずれの前駆体蛋白質も大腸菌で過剰発現し、得られたリコンビナント前駆体蛋白質をin vitro葉緑体蛋白質輸送実験に供したところ、葉緑体内部への輸送が観察された。特に3のBAPタグを有する前駆体蛋白質は過剰発現の際、in vivoビオチン化があわせて観察され、ストレプトアビジンアガロースを用いた精製に有用であった。本研究は、独自の蛋白質輸送システムを有する葉緑体の蛋白質輸送時における同定済蛋白質輸送装置構成因子の連携と未同定蛋白質輸送装置構成因子の同定を目的としている。この目的の達成には、輸送基質である前駆体蛋白質に、蛋白質輸送チャンネルを塞ぐのに十分な大きさの立体障害を導入することで、前駆体蛋白質が輸送装置内で滞留した膜透過中間体の獲得が有効であると考えている。立体障害をフォールドした蛋白質を連結することで形成させるためには、従来のように大腸菌で封入体として獲得した前駆体蛋白質を尿素で可溶化した後、蛋白質輸送実験に用いることに疑念を抱いた。そこで平成26年度は、前駆体蛋白質に異種蛋白質を連結し、大腸菌で発現した際に、その異種蛋白質がフォールディングした状態、すなわち可溶性の状態で獲得することを試みた。可溶性促進タグとTEVプロテアーゼ認識配列を前駆体蛋白質の葉緑体移行シグナルであるトランジット配列のアミノ末端に、可溶性蛋白質をカルボキシ末端部に連結した。トランジット配列カルボキシ末端と可溶性蛋白質との間は、ランダムコイル構造をとる、4個のグリシン残基と1個のセリン残基からなる繰り返し配列で連結した。蛍光蛋白質を可溶性蛋白質として用いることで、蛍光蛋白質が大腸菌内で発する蛍光を指標に、組換え蛋白質が可溶性状態で回収できることを確認した。さらに、大腸菌の抽出液をTEVプロテアーゼ処理することで、可溶性前駆体蛋白質を獲得することができた。また、平成25年度に作製した大腸菌でin vivoでビオチン化するビオチンアクセプターペプチド(BAP)タグを連結した前駆体蛋白質に一価性ストレプトアビジン4量体を結合する条件検討した。その結果、ストレプトアビジンを前駆体蛋白質のカルボキシ末端部に付加することに成功した。今後はこれらの前駆体蛋白質の葉緑体への輸送がブロックされるかどうかを確認する。本研究の目的は、独自の蛋白質輸送システムを有する葉緑体の蛋白質輸送時における同定済蛋白質輸送装置構成因子の連携、ならびに未同定蛋白質輸送装置構成因子の同定である。目的達成には、前駆体蛋白質の輸送が途中で停止した膜透過中間体の解析が不可欠であり、立体障害を導入することで蛋白質輸送チャンネルをふさぐことのできる前駆体蛋白質の開発を行ってきた。平成27年度は、以下の二つの実験を行った。I.昨年度作製した、大腸菌での過剰発現の際、in vivoでビオチン化するビオチンアクセプターペプチド(BAP)タグを連結したRubisco小サブユニット前駆体蛋白質(prSS)に、ストレプトアビジンを結合させ、in vitro葉緑体蛋白質輸送実験を行った。II.prSSの葉緑体移行シグナルに各種タグや、相互に分子間イソペプチド結合を自発的に形成する蛋白質ドメインを導入した、人工前駆体蛋白質を新たに作製した。得た結果を次に示す。I.ビオチンとストレプトアビジンは強固に結合するにもかかわらず、ストレプトアビジンを結合した前駆体蛋白質は、蛋白質輸送の際、葉緑体表層でストレプトアビジンが解離し、葉緑体内へ輸送された。

ストレプトアビジンの解離は、葉緑体表層での非常に強力なアンフォールディング活性、あるいは、前駆体蛋白質の葉緑体内への非常に強力な引き込みに起因する可能性が考えられる。II.1人工前駆体蛋白質を大腸菌で過剰発現した際、同一分子内でイソペプチド結合が形成した。したがって、ストレプトアビジンのように別分子の介在なく前駆体蛋白質に立体障害を導入することが可能となった。2このイソペプチド結合を形成した前駆体蛋白質をin vitro葉緑体蛋白質輸送実験に供したところ、蛋白質輸送が途中で停止した前駆体蛋白質が観察された。今後は、この前駆体蛋白質を含む複合体を精製することで、中間体構成因子を同定する。核内ゲノムにコードされた葉緑体蛋白質の前駆体は、二重の包膜に存在する独自の蛋白質輸送装置(トランスロコン)を利用して、サイトゾルより輸送される。多くの知見は、包膜透過に必要なエネルギーを制限することで形成される、前駆体輸送がトランスロコン中で停止した初期膜透過中間体の解析により得られてきた。しかし、初期段階における各因子のかかわりや、初期段階以降の前駆体蛋白質、トランスロコン因子の分子機構については未解明である。本研究では、蛋白質輸送における前駆体蛋白質とトランスロコン因子間、またはトランスロコン因子同士間の分子間相互作用を解析するための基盤を整備した。研究実績の概要でも記したが、本研究は、蛋白質輸送チャンネルをふさぐ前駆体蛋白質の作製の成否が目的達成の大きなカギとなる。研究計画で提案した一部の課題については、すでに、確立している実験系であり、また、予備的な実験を実施済みであったりするために、平成26年度も前年度と同様に、前駆体蛋白質の改変を優先的に進めた。その過程で、分子量が大きくなるにもかかわらずゲル電気泳動での移動度が大きなどの予測しない実験結果が得られたりして、そのような問題を一つ一つ解決するために多くの時間を費やすこととなったため、進行がやや遅れているといえる。農学平成26年度の研究実績により、膜透過中間体の形成に必要な材料が整いつつあるので、当初の研究計画に記した課題に取り組む。それらを具体的に記述する。1.ストレプトアビジン付加前駆体蛋白質や可溶性前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験:一価性ストレプトアビジンをビオチン化したBAPタグをカルボキシ末端に連結した前駆体蛋白質を獲得することが可能になったので、ストレプトアビジン付加前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験を行う。また、異種蛋白質を連結した人工前駆体蛋白質を可溶性状態で獲得することができたので、精製した上で、人工前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験を行う。蛋白質輸送条件下で輸送阻害が観察された場合、以下の2.に取り組む。;2.膜透過中間体を形成させた葉緑体からの中間体の可溶化と精製:回収した膜透過中間体を形成させた葉緑体懸濁液に界面活性剤を添加することで、包膜蛋白質を可溶化する。前駆体蛋白質には、Hisタグやビオチン化タグを挿入しているので、これらのタグを利用することで膜透過中間体を精製する。エネルギー制限条件下で形成される初期膜透過中間体に対しても同様の操作を行う。;3.膜透過中間体の解析:精製した膜透過中間体の構成因子をSDS-PAGEで分離し、解析する。推定分子量から未知因子の存在が推測される場合には、未知因子の同定するための作業に取りかかる。
膵組織保存と酵素分離過程への酸素化システム導入による分離膵島の質の向上

膵島移植において安定して質の高い膵島を得る方法を確立することは移植成績の向上に直結する重要な課題のひとつである。そこで、本研究では保存過程の虚血状態や、膵島分離工程での溶存酸素濃度の低下による膵島損傷を解決するために、膵臓摘出直後から膵島分離終了までの間の酸素供給システムを確立することを目的とした。膵組織の保存の酸素化についてはは人工ヘモグロビンを膵管から導入したが、分離膵島の収量や質の向上は確認出来なかった。いっぽう、膵島分離工程における中空糸加圧モジュールを用いて閉鎖分離回路内を酸素化することで、膵島の収量、energy statusが向上し、アポトーシスを回避出来ることが明らかになった。重症糖尿病患者に対する膵島移植医療において、質の高い膵島を安定して得る方法の確立は移植成績の向上に直結する重要な課題のひとつである。本研究では、保存過程の虚血状態や、37°Cの閉鎖回路内で行われる膵島分離工程での溶存酸素濃度の低下による膵島損傷を解決するために、膵臓摘出直後から膵島分離終了までの間継続して酸素供給を供給するシステムを確立し、質の高い膵島を安定して回収することを目的とする。本年度は、保存段階における膵組織の酸素化を効率よく行うために酸素化人工ヘモグロビンが有効であるかどうかを検討した。実験モデルは人工ヘモグロビンを保存前に膵管内に注入し、膵管保護および内部からの組織酸素化を意図したPre-ductal injection実験、および保存液として使用し外部からの浸透での組織全体の酸素化を期待した保存実験の2つの系とし、生理食塩水をコントロールとした。4°Cで10時間保存した後の膵臓からコラゲナーゼを用いて膵島を分離し、収量、形態、機能(ADP/ATP、ATP/DNA、呼吸S.I.)を評価した。その結果、現在膵組織保存で広く使われているPerfluorochemica(PFC)ように分離膵島にまで影響が残らず、実験中の酵素による消化の過程での明らかな消化阻害は見られなかった。しかしPre-ductal injection実験では、形態に差はなかったが、他のすべての項目で生理食塩水群を下回り、保存実験では、形態を含めすべての項目で生食群が上回っていた。次年度においては、保存膵組織の酸素化においては膵管からの酸素を飽和させた保存溶液の持続注入の効果を検討し、さらに分離工程においては、中空糸モジュールを使って分離回路内を効率的に酸素化することで、分離膵島の質が向上するかどうかを、大動物モデル(ブタ)を用いて検討する予定である。重症糖尿病患者に対する膵島移植医療において、安定して質の高い膵島を得る方法を確立することは移植成績の向上に直結する重要な課題のひとつである。そこで本研究では、保存過程の虚血状態や、37°Cの閉鎖回路内で行われる膵島分離工程での溶存酸素濃度の低下による膵島損傷を解決するために、膵臓摘出直後から膵島分離終了までの間継続して酸素供給を供給するシステムを確立し、質の高い膵島を安定して回収することを目的とした。昨年度のラット膵臓を用いた実験において、人工ヘモグロビンの導入によりで保存膵組織の酸素化を試みたが、分離膵島の収量や質の向上は見られなかった。そこで、平成22年度は、心停止ドナーを使用せざるを得ない我が国の膵島移植の現状を鑑み、温阻血を約40分被った臨床疑似モデルであるブタ膵臓を用いて、分離過程における酸素化に特化して通常回路と加圧式中空糸モジュール導入回路により膵島分離を施行した。分離回収したブタ膵島の品質について、膵島収量、培養中残存率、エネルギー保持率、viabilityなどを評価したところ、現行の通常膵島分離回路に比べ、加圧式中空糸モジュールを導入した膵島分離回路を使用することで分離膵島のenergy statusが向上し、それに伴いアポトーシスに陥る膵島の割合が有意に減少する事が判明した。また、膵島の収量や機能も温阻血障害を伴う膵島分離においては顕著に改善する事が判明した。回路の煩雑さや容存酸素濃度の継続的モニタリング手法などに課題を残すものの、本研究のストラテジーは心停止ドナーの使用を余儀なくされている我が国の膵島移植にとって有用である事が本研究により明らかとなった。
マウスES細胞から肝細胞およびインスリン産生膵β細胞への新規分化誘導法の確立

(1)マウスES細胞に対する転写因子発現制御系の確立マウスES細胞より胚葉体を形成させ、中内胚葉系転写因子であるMixおよびHexのOpen Reading Frameをcloningし、Tet-ON systemを用いた発現制御プラスミドを構築した。IRESを用いて目的遺伝子発現細胞はGFP陽性細胞として認識可能とし、これを遺伝子導入することにより遺伝子改変マウスES細胞を作成した。(2)成熟肝細胞および膵β細胞への分化誘導へのin vitro分化誘導上記マウスES細胞からMix発現細胞を蛍光励起セルソーターにより分離回収し、種々の培養条件下における経時的RT-PCRにより中胚葉系細胞マーカーおよび内胚葉細胞マーカー発現を検証した。GFP陽性細胞においてGscなど他の中胚葉系細胞マーカーの発現を認め、かつGATA4、FoxA2などの内胚葉系転写因子発現を認めたものの、肝細胞マーカーの発現は認めなかった。insulin遺伝子の発現は認めたものの、GLUT2やPdx-1などの発現は認めず、十分な膵β細胞分化誘導所見は得られなかった。一方、胎仔肝由来Thy1陽性間葉系細胞と共培養したマウスES細胞由来内胚葉細胞に肝細胞マーカーの遺伝子発現を確認すると共に、位相差顕微鏡や電子顕微鏡にて肝細胞としての形態変化を認めた。(3)マウスES細胞由来肝細胞移植AFPプロモーター制御下にGFPを発現するように構築した遺伝子改変マウスES細胞に対し、LacZ遺伝子を導入し生体内において移植細胞をX-gal染色陽性細胞として識別可能にした。これを致死的肝障害モデルマウスの脾臓内にマウスES細胞由来肝細胞を細胞移植し、移植細胞生着を確認できただけでなく致死率の改善を確認できた。(1)マウスES細胞に対する転写因子発現制御系の確立胚様体内部には非特異的初期分化誘導が惹起されることから、マウスES細胞から胚様体を作製した上で、胚様体構成細胞からmRNAを回収しcDNAを作製した。作製したcDNAよりPCR法を用いて中内胚葉系転写因子であるMixおよびHexのOpen ReadingFrameをクローニングし、これをTet-ON systemを利用して発現制御するプラスミドを構築した。本プラスミドにおいては、転写因子配列の下流にIRES(internal ribosomal entry site)をはさんでGFP(green fluorescent protein)配列を組み込むことで、目的転写因子発現細胞をGFP発現細胞として認識できるように設計した。これをマウスES細胞に遺伝子導入した後、獲得したトランスジェニックES細胞株に対し、Doxycycline(Dox)添加によるEGFP発現細胞の出現を蛍光顕微鏡により確認した。GFP発現細胞を蛍光励起セルソーターにより分離回収し、GFP発現細胞群および非発現細胞群における転写因子発現をRT-PCRや免疫染色法にて確認した。(2)マウスES細胞から肝細胞への分化誘導上記の転写因子発現制御系を用いて、マウスES細胞から誘導されるEGFP陽性細胞を蛍光励起セルソーターにより分離回収した。現在、分離した細胞に対し、これまで内胚葉細胞の発生分化に関わることが報告されているFGF、EGF、HGFなどの増殖因子の添加や細胞外マトリックスの組み合わせによる培養を行っている。現在、分化誘導中に経時的にRT-PCRを行い、中胚葉系細胞マーカー(Lim1、Gsc、T、Cerberus、Nodal、Shh、CD34、Flk1など)および内胚葉細胞マーカー(AFP、Albumin、GATA4、HNF3β、Sox17など)発現を検証中である。(1)成熟肝細胞および膵β細胞への分化誘導へのin vitro分化誘導マウスES細胞に対しTet-On systemを利用して中内胚葉細胞特異的転写因子であるMixを発現させた細胞を蛍光励起セルソーターにより分離回収し、種々の培養条件(増殖因子、細胞外マトリックス)による培養を行った。

培養中に経時的RT-PCRを行い、中胚葉系細胞マーカーおよび内胚葉細胞マーカー発現を検証した結果、GFP陽性細胞においてGscなど他の中胚葉系細胞マーカーの発現を認めたが、その後の分化誘導の結果、GATA4、FoxA2などの内胚葉系転写因子発現を認めたものの、肝細胞マーカーの発現は認めなかった。膵β細胞マーカーとしてはinsulin遺伝子の発現は認めたものの、GLUT2やPdx-1などの発現は認めず、十分な分化誘導所見は得られなかった。一方、分化誘導したマウスES細胞由来内胚葉細胞を胎仔肝由来Thy1陽性間葉系細胞と共培養することにより、in vitroにおいて分化誘導したところ肝細胞マーカーの遺伝子発現やタンパク発現を確認すると共に、細胞の形態学的変化を位相差顕微鏡や電子顕微鏡にて検証し、肝細胞への分化誘導所見を得た。(2)マウスES細胞由来肝細胞移植AFPプロモーター制御下にGFPを発現するように構築した遺伝子改変マウスES細胞に対し、マーカー遺伝子としてLacZ遺伝子を導入した。これにより生体内において移植細胞をX-gal染色陽性細胞として識別可能にした上で、致死的肝障害モデルマウスの脾臓内にマウスES細胞由来肝細胞を細胞移植したところ、移植細胞生着を確認できただけでなく致死率の改善を確認できた。
スピードスケートにおける専門的体力トレーニングに関するバイオメカニクス的研究

本研究では,スピードスケート競技の陸上トレーニングにおける動作と氷上での滑走パフォーマンスを分析し,これまでに究明されている滑走動作の力学的メカニズムや優れた選手に内在する技術的要因とを総合的に関連づけて検討した.その結果,スピードスケートの陸上トレーニング手段の運動負荷は,氷上滑走時のそれに比して低い可能性があることや,氷上パフォーマンスの高い選手は,陸上トレーニングにおける運動負荷よりも氷上滑走動作における負荷が大きい傾向にあることがわかった.本研究では,スピードスケート競技の陸上トレーニングにおける動作と氷上での滑走パフォーマンスを分析し,これまでに究明されている滑走動作の力学的メカニズムや優れた選手に内在する技術的要因とを総合的に関連づけて検討した.その結果,スピードスケートの陸上トレーニング手段の運動負荷は,氷上滑走時のそれに比して低い可能性があることや,氷上パフォーマンスの高い選手は,陸上トレーニングにおける運動負荷よりも氷上滑走動作における負荷が大きい傾向にあることがわかった.本研究の目的は,スピードスケートの陸上トレーニングにおいて用いられている主なトレーニング手段でのパフォーマンスをバイオメカニクス的に解析し,それらとこれまでに究明されてきた氷上滑走動作の力学的メカニズムや優れた選手に内在する技術的要因などとを総合的に関連づけて検討することにより,トレーニング手段の有効性を明らかにし,スピードスケートにおける専門的体力トレーニングを体系化するための基礎的資料を得ることである.本計画では,目的を達成するために4つの研究課題を設定した.研究期間の3ヵ年度のうち平成21年度(初年度)は,研究課題1として陸上トレーニング手段における力学的特徴をバイオメカニクス的に測定するための牽引力測定装置を開発した.従来,スポーツの現場でトレーニング中のさまざまな張力などの力学量を測定するためには,センサー部,アンプ,AD変換装置,PC取り込み部と大掛かりな装置が必要であった.今回開発した牽引力測定装置は,重量500g程度の装置の中にこれらのすべての機能が装備され,小型メモリー媒体を通じてPCにテータを転送して解析できるものである.また,設計が順調に進んだために予定を下回る低コストで作成できたため,ソフトウエアの開発にも資金を捻出することができた.特筆すべき成果は,本研究の成果の積み上げとして,2010年バンクーバー冬季オリンピックで銀メダルを獲得した選手のトレーニング中のスピードスケート模倣動作中に発揮された牽引力を計測し,さっそく実践に役立てたことが挙げられる.本研究の目的は,スピードスケートの陸上トレーニングにおいて用いられている主なトレーニング手段でのパフォーマンスをバイオメカニクス的に解析し,それらとこれまでに究明されてきた氷上滑走動作の力学的メカニズムや優れた選手に内在する技術的要因などとを総合的に関連づけて検討することにより,トレーニング手段の有効性を明らかにし,スピードスケートにおける専門的体力トレーニングを体系化するための基礎的資料を得ることである.本計画では,目的を達成するために4つの研究課題を設定した.研究期間の3ヵ年度のうち初年度(平成21年度)は研究課題1として陸上トレーニング手段における力学的特徴をバイオメカニクス的に測定するための牽引力測定装置を開発した.2年目の昨年度(平成22年度)は,研究課題2として,開発した牽引力測定装置を用いて,10名程度の被験者に3種類の陸上トレーニング手段を行わせてその技術的および力学的特徴をバイオメカニクス的に測定するとともに,氷上滑走における技術的および力学的特徴をバイオメカニクス的に測定した.測定精度に問題があることが判明したが,これまでに我々が明らかにしている世界一流スピードスケート選手の技術的要因と解析されたキネマティクスを比較し,各選手の滑走技術について特徴を評価した.本研究の目的は,スピードスケートの陸上トレーニングにおいて用いられている主なトレーニング手段でのパフォーマンスをバイオメカニクス的に解析し,それらとこれまでに究明されてきた氷上滑走動作の力学的メカニズムや優れた選手に内在する技術的要因などとを総合的に関連づけて検討することにより,トレーニング手段の有効性を明らかにし,スピードスケートにおける専門的体力トレーニングを体系化するための基礎的資料を得ることである.本計画では,目的を達成するために4つの研究課題を設定した.研究期間の3ヵ年度のうち初年度(平成21年度)は研究課題1として陸上トレーニング手段における力学的特徴をバイオメカニクス的に測定するための牽引力測定装置を開発した.2年目(平成22年度)は,研究課題2として,開発した牽引力測定装置を用いて,10名程度の被験者に3種類の陸上トレーニング手段を行わせてその技術的および力学的特徴をバイオメカニクス的に測定するとともに,氷上滑走における技術的および力学的特徴をバイオメカニクス的に測定した.最終年度である平成23年度は,牽引力測定装置の測定精度に関する問題点を改善し,追加実験を行い,これまでに我々が明らかにしている世界一流スピードスケート選手の技術的要因と解析されたキネマティクスを比較し,各選手の滑走技術について特徴を評価した.その結果,大学段階におけるスピードスケートにおける専門的体力トレーニングを体系化するための基礎的資料を得ることができた.
「地域の学校経営コンサルテーション」に関する萌芽的調査研究

本研究は、「地域の学校経営コンサルテーション」構想の可能性を考察・検討するために、基礎的データを得るものである。コンサルテーションにおいて、退職校長が助言者である場合の役割は、(1)日常的な相談役、(2)管理職の育成役、(3)学校と関係機関をつなぐパイプ役、(4)学校と学校をつなぐ橋渡し役であり、研究者が助言者の場合は、(1)教育的支援者、(2)相談相手・心の支え、(3)実践を意義付け・理論化する役割であったことが明らかとなった。また、助言者はいないが地域との連携という点で先進的な事例からは(1)学校運営協議会がコンサルテーションの場として機能していること、(2)退職校長や研究者の助言により一層の学校改善が図られる可能性があること、(3)アドバイザー制度を取り入れている学校や地域は、地域の課題により一層積極的に応える必要があることが示唆され、地域の学校経営コンサルテーション構想の潜在的なニーズと求められる課題が明らかとなった。本研究は、市町村教育委員会を単位とする地域の中に、現職および退職の校長・教員を助言者とする学校経営コンサルテーションの組織をつくり、地域内の学校に対し経営コンサルテーションを行う「地域の学校経営コンサルテーション」の構想を実現する手法開発と理論構築を行うための基礎データを得ることを目的として、現在行われている教育委員会による学校経営支援の実態を把握し、実践的課題を明らかにした。具体的には、(1)学校経営に関する支援の取り組みについて、県・市町村教育委員会のWEBページや資料、電話による問い合わせなどの調査を行い、県・市町村教育委員会の学校経営支援の状況を把握た。その調査結果から調査対象として広島県内の市教育委員会を選定し、(2)学校経営支援の体制や方法、課題などについて聴き取り調査を行い、分析することによって、コンサルテーションによる学校経営支援の詳細な実態を把握した。また、(3)研究者による学校経営コンサルテーションによって学校組織改善に至った事例を分析し、そのプロセスと役割について明らかにした。(2)と(3)から、異なる助言者によるコンサルテーションの具体的な経営支援の実態を把握分析することで実践的課題が明確になり、学校にとって身近な存在の助言者として退職の校長が担い手となる「地域の学校経営コンサルテーション」構想の可能性が示唆された。これらの知見は、専門家以外による学校経営コンサルテーションの手法開発と理論構築および質的向上に貢献しうる。
ラヴェンナ総督設置後のビザンツ帝国のイタリア支配と新興有力層の形成

6世紀中頃のラヴェンナ総督府の設置は、ビザンツ帝国の軍事制度のイタリアへの導入を単に意味するのではなく、兵農一致体制へと向かうビザンツ軍制の方針により、イタリア社会に著しい変化をもたらしたと評価されてきた。具体的には、東ゴ-ト王国において維持されてきた古代ローマ以来の元老院文官層が、屯田兵用の軍事保有地として広大な所有地を没収されたために没落し、彼らに代わって東方から派遣されてきた駐屯軍が軍事貴族化して新たな支配層を形成したと主張されてきた。しかし、近年の研究により、この旧来の主張に批判がくわえられるようになってきている。本研究は、この新しい学説に着目し、その論拠についての検証をおこなった。まず、東方派遣軍の規模については、従来は現地に残っている要塞の数と収容能力から膨大な兵力の存在が想定されていたが、考古学的発掘の成果により、従来ビザンツ軍が築いたとみなされてきた要塞の多くがローマ時代の遺物であったことが判明し、ビザンツ軍が築いたものは比較的小さい要塞がほとんどであるという事から、派遣軍の規模は従来の説よりかなり少数であったと推定される。それにより、軍事保有地用の土地の規模も再検討されねばならないし、また強制没収という見方にも検討の余地が生じてきた。この問題のために、ラヴェンナ周辺の土地証書を利用して、土地の寄進・売買にかかわった人々の身分等の検討をおこなった。その結果確かに、兵士の割合は多かったものの非軍事職にある者や被征服民であるゴ-ト人が関与している例も以外に多く、国家による土地の没収及び兵士への再分配という旧来の図式は、極端すぎる事が明白になった。また、軍人は東方出身者よりも、むしろ現地出身者が多く、旧元老院層・ゴ-ト人など出自も様々であった。故に、東方軍事貴族により支配ではなく、軍隊を基盤としての支配層の再構成と評価する方が適切であるとの感触を得た。
年金税制の日欧比較研究

平成13年度においては、主として日本とEUにおける年金、税制、そして年金税制の制度について調査、研究した。このため年金や年金税制に関する基本文献を読解した。平成14年度においては、制度研究を踏まえて、インタビューによる実態調査、ヒアリングによる調査に注力した。具体的には、年金税制の利害関係者に面会をお願いし、年金税制に関する実態、要望、展望等を聞き取り調査してきた。平成15年度においては、研究成果をまとめるため、研究会での報告を行い、成果集約のため論文執筆に取り組んだ。研究会報告は、(財)日本証券経済研究所ヨーロッパ資本市場研究会、中央大学経済研究所財政金融部会などで行った。研究成果としては、第一に、2002年4月に出版された、拙著『日本の株式市場と外国人投資家』(東洋経済新報社)の第7章「株式相互持合いの解消と日本版401(k)の解消」である。このなかで、年金税制に関する日欧比較を踏まえて、日本の年金税制の問題点を指摘した。科研費成果の旨、はしがきに記した。第二に、『証券経済研究』(財)日本証券経済研究所、2004年6月号に「日本の年金税制と確定拠出年金イギリスとの比較」を発表予定した。科研費成果の旨、末尾に記した。今年度は3年間における初年度であったために、研究の準備期間として位置づけられる。まず日本とEU諸国における年金制度、税制、そして年金税制の歴史をふまえる必要があった。このために、年金、年金税制に関する基本文献を読解してきた。また従来の研究業績のサーベイのために、学術雑誌掲載の研究論文も読んできた。ついで基礎データの収集、データの分析が必要であった。基礎データとしては、EU加盟国と日本についての人口構成、高齢化に関する人口の年齢構成、公的年金の財政収支、私的年金の財政収支、税収構成、年金課税による税収等が重要になる。データ収集にあたっては、本学や関西圏の図書館では不十分であり、東京出張を実施してきた。年金は税制上の優遇措置を受けていることが多い。イギリスの私的年金は拠出局面のみならず、運用局面でも、ほとんど非課税となっている。こうして年金に資金が流入し、資金運用を活発におこなうことで、年金基金は証券市場において巨大な機関投資家となっている。イキリスの場合、株式保有において、実に30%程度が私的年金によって保有されている。また同時に活発に海外証券投資も行っており、日本の株式にも投資している。こうした側面を中心に今年度は研究ノート「欧州系機関投資家の日本株投資」をまとめた。今年度(14年度)においては、制度研究をふまえて、インタビューによる実態調査、ヒアリングによる調査に注力した。とりわけ、年金基金が証券市場において、有力な機関投資家として影響力を強めていることに注目し、証券市場の活性化を展望し、年金税制はいかにあるべきか、という問題意識で調査、研究を進めてきた。結果として、年金拠出金課税の整理統合、年金運用への課税問題、年金給付金課税のあり方等が課題として浮かび上がった。日本においても確定拠出型年金が開始され、従来の確定給付型年金との税制面の検討が必要になっている。研究成果の一部は、2002年4月に出版された、拙著『日本の株式市場と外国人投資家』(東洋経済新報社)の第七章「株式相互持合いの解消と日本版401(K)の始動」である。また2002年8月16日付読売新聞の拙稿「個人マネーを株式市場に」、2003年3月19日付読売新聞の拙稿「不況対策としての投資教育」も成果の一部である。

とりわけ、年金基金が証券市場において、有力な機関投資家として影響力を強めていることに注目した。平成15年度においては、引き続き日本や、EUの年金税制に関する資料収集をしつつ、研究成果をまとめるため、研究会での報告を行い、成果集約のため論文執筆に取り組んだ。研究会報告は、(財)日本証券経済研究所ヨーロッパ資本市場研究会、中央大学経済研究所財政金融部会などで行った。研究成果としては、第一に、2002年4月に出版された、拙著『日本の株式市場と外国人投資家』(東洋経済新報社)の第7章「株式相互持合いの解消と日本版401(k)の解消」である。このなかで、年金税制に関する日欧比較を踏まえて、日本の年金税制の問題点を指摘した。科研費成果の旨、はしがきに記した。第二に、すでに掲載が確定しているが、『証券経済研究』(財)日本証券経済研究所、2004年6月号に「日本の年金税制と確定拠出年金イギリスとの比較」を発表予定である。科研費成果の旨、末尾に記した。
多糖分子構造膜のナノアーキテクトニクス

セルロース系多糖分子の還元末端特異的なアンカー分子の導入とAu(111)基板や金ナノ粒子表面での自己組織化による分子鎖ベクトル制御技術、および新規開発の非水系酵素触媒反応技術を組み合わせて、ユニークなナノ構造と界面・生体機能を持つ種々の多糖分子ナノアーキテクチャーを設計した。1.平行鎖セロオリゴ糖ナノ構造体セロヘキサオースのS誘導体をQCM分析に供したところ、金チップ表面に0.79chains/nm^2の濃厚密度で薄膜が形成された。また、本来酸化的なNMMO系セルロース溶剤を用いて、金イオンから粒径20nmの金ナノ粒子の合成に成功した。これらにより、金ナノ粒子表面にセロオリゴ糖が平行鎖で集密化したナノ粒子を新規に調製し、XRD解析によりセルロースI型結晶の存在が確認された。2.熱応答性メチルセルロース薄膜メチルセルロースのチオセミカルバジド誘導体を金基板上に造膜して、その界面のぬれ性を検討したところ、もとのLCSTに近い70°C付近で急激に撥水性が増大する現象を見出した。この外部温度依存的で可逆的なぬれ性変化は、溶液の塩濃度が高くなるにつれて転移温度が低下した。さらに、この多糖系薄膜をラット肝細胞の培養基材として用いたところ、非常に良好な細胞増殖性と接着性を示した。3.ガラクトース修飾バイオインターフェース非水系酵素触媒反応を利用して、セルロース表面に生体機能糖のガラクトース(Gal)残基を含むラクトースの導入を試みた。ろ紙(セルロースI型)と再生セルロースフィルム(II型)の双方に結晶構造を維持したままでGal修飾を施し、Gal認識部位を持つラット肝細胞の良好な細胞増殖性を確認した。以上より、多糖分子のナノ構造制御による新規ナノ・バイオ機能材料の創出に成功した。また、多糖一分子観察など派生研究とあわせて、多糖分子構造膜のナノアーキテクトニクスの研究基盤を築いた。セルロースに代表される構造性多糖分子は、単純な一次構造でありながら高度な階層的集合化機能を有する。また、生命情報分子として働く機能糖鎖についても、高次集合体の形成がユニークな生理機能の発現に深く関与している。本研究では、ナノテクノロジーの要素技術である自己組織化による多糖分子ベクトルの配向制御により、構造と機能が一体化したナノアーキテクチャーの創出に挑戦する。本年度は、セルロース分子構造薄膜の調製とキャラクタリゼーションを行い、以下の成果を得た。1.膜設計セルロース溶剤のN-メチルモルフォリン-N-オキシド(NMMO)を反応媒体とし、セルロース分子の還元末端特異的にチオセミカルバジドを導入した。Au(111)基板上でS-Au結合を介して化学吸着させ、NMMO分子を取り除きながらセルロース分子鎖間に働く規則的かつ固有の相互作用を誘発し、分子鎖ベクトルが揃った超薄膜(30nm)を構造設計した。2構造解析X線光電子分光分析により、薄膜がセルロースのみからなることを確認した。また、原子間力顕微鏡観察により、薄膜表面が分子レベルで平滑(RMS<1nm)であることが示された。さらに、金基板ごと剥離して透過型電子顕微鏡観察に供したところ、薄片周囲に同一配向で集積した物質が確認され、電子線回折測定により、セルロースI型の結晶構造体であることが判明した(格子間隔:0.63nm(1-10),0.56nm(110),0.43nm(200),0.26nm(004))。すなわち、分子分散状態から熱力学的制約を超えて天然セルロースの結晶構造を再構築することに成功した。3.界面機能セルロースI型の結晶構造薄膜を、SPRおよびQCMの検出器に適用した。酵素反応や染料分子の吸着現象等のモニタリングが可能で、セルロース/水界面における諸現象解明に有用であった。ろ紙(セルロースI型)と再生

セルロースフィルム(II型)の双方に結晶構造を維持したままでGal修飾を施し、Gal認識部位を持つラット肝細胞の良好な細胞増殖性を確認した。以上より、多糖分子のナノ構造制御による新規ナノ・バイオ機能材料の創出に成功した。また、多糖一分子観察など派生研究とあわせて、多糖分子構造膜のナノアーキテクトニクスの研究基盤を築いた。