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株主代表訴訟における手続法上の証拠収集と実体法秩序

本研究課題は、会社法制に留まるものではなく、民事手続法の基本に関わり、より根本的な検討が必要である。すなわち、証拠収集に関する基本的な発想が、英米法と日本法では異なっている。証拠は全て訴訟当事者が共有することを基本とする英米法の発想のもとで、当事者主義・弁論主義を基礎とするわが国において、米国法に由来する代表訴訟の証拠収集の在り方を同じ土俵で検討することは妥当ではないと考えられる。この点を確認した上で、代表訴訟における原告株主の証拠収集のあるべき姿が模索されるべきである。本研究課題の研究を遂行するための基礎的な情報収集を行った。南山大学の家田崇教授にも同行していただき、初期の計画通り、シンガポールに出向き、シンガポール国立大学の研究者と議論をするとともに、資料の提供を受けた。今後も、適宜、資料や知見の提供を受けることを了解いたただいた。本研究課題の研究を遂行するために、基礎的な情報収集、分析などを継続した。これまでの検討の結果については、Sean McGinty名古屋大学大学院法学研究科特任講師(当時)とともに、国際的なワークショップにおいて(ソウル大学、ブツェリウスロースクール、名古屋大学に所属する研究者を中心とするもの)、「Derivative Action and Measures to Collect Evidences in the Civil Procedure」と題する報告を共同で行った。Sean McGinty特任講師は、カナダの法学部を卒業し法曹資格を有しており、ワークショップの報告においても、日本とカナダとの比較法的検討を行った。参加者から貴重な意見などをいただいた。上記ワークショップでも議論がなされたように、裁判における証拠についての各国の考え方の違いを意識する必要があることを確認した。すなわち、英米法の諸国では、裁判手続において、当事者は自分に有利か否かを問わずに、証拠を法廷に提出し合って、弁論に臨み、裁判所が判断を示すという発想で証拠が扱われている。他方で、日本では、当事者は自分に有利な証拠は自分で収拾して裁判所に提出することが基本的な発想とされており、相手方から自分に不利な証拠の収集するためには、民事訴訟法、会社法などで法定された申立権や請求権を活用することが予定されている。このような発想の違いを前提としつつ、主たる比較法の対象国を変更することも含めて、比較法的考察を進める必要があることが理解された。上記のワークショップで頂戴した意見等は有益であり、それは研究が相当に進捗したが故にであるとは考えている。もっとも、研究成果の公表については、本務校の校務に追われたため、十分にまとまった時間を取ることができずに、僅かに留まった。本研究課題の研究を遂行するための情報収集や分析を継続した。前年度の国際的なワークショップ(ソウル大学、ブツェリウスロースクール、名古屋大学に所属する研究者を中心とするもの)での報告に対して受けた意見等を踏まえて、さらに検討を進めた。前回の実施報告において「今後の研究の推進方策」として述べたように、期せずして、研究課題が次回の会社法改正のテーマの1つとして検討されることになった。商事法務研究会で開催されている会社法研究会で議論が進められ、研究代表者も委員に参加した。その成果は、平成29年3月2日付けの「会社法研究会報告書」に取りまとめられた。この際の議論を踏まえて公表した論文が、後掲の論文である。制度の基礎にある思想を意識することが肝要であることを主張した。また、本年度は、代表訴訟制度を含む共同研究の実績のあるDan Puchuniakシンガポール国立大学准教授をシンガポールに訪問するなどして、情報収集、議論等を行った。前年度は、やや遅れ気味であったが、会社法研究会を通して各界の意見に直接的に触れることができ、また、Dan Puchuniak准教授との討議でも成果を得た。初年度から、本研究課題の研究を遂行するための情報収集を継続的に行った。期せずして、補助事業期間の最中に、本研究課題が次回の会社法改正のテーマの一つとしても検討されるようになった。商事法務研究会の会社法研究会で取り上げられたものであるが、研究代表者も委員として参加して、議論の成果は、平成29年3月2日付の「会社法研究会報告書」に取りまとめられた。この際の議論を踏まえて、論文を公表した。このような議論の動向を踏まえて、シンガポールに出向き、かねてからの共同研究者であるDan Puchuniakシンガポール国立大学准教授などと、議論をするとともに、今後の研究の方向性についても検討した。これらの一連の研究の結果、本研究課題は、会社法制に留まるものではなく、民事手続法の基本に関わり、より根本的な検討が必要であると考えるに至った。

この点を確認した上で、代表訴訟における原告株主の証拠収集のあるべき姿が模索されるべきである。シンガポールでの調査の成果は期待通りであったものの、本務校の管理職の職務に追われため、提供された資料や知見の分析が適時に追いつかなかった。若干の遅れを取り戻しつつ、当初の計画に沿って、研究を進める予定である。なお、期せずして、研究課題が次回の会社法改正のテーマの1つとして検討されている。現在は商事法務研究会で開催されている会社法研究会で議論が進められているところ、研究代表者も委員であるため、その場においても、他の委員等から知見を得るとともに、研究成果を発信していく予定である。この改正の議論の行方によっては、当初の計画を柔軟に変更していくことが、研究課題の目的を達する上で重要になる可能性があると考えている。社会科学若干の遅れを取り戻しつつ、当初の計画の通りに、研究を進める予定である。カナダでの調査に代えて、ソウルでの国際ワークショップに参加したため、海外旅費が少額に抑えられたなどのためである。カナダでの調査に代えて、シンガポールでの調査を実施したため、海外旅費が少額に抑えられたとなどのためである。提供された資料などの分析や、それに基づいて研究を展開するために、さらに資料を収集したり、検討会を開催したり、大学院生の協力を得る予定であったが、そこまで至らなかった。カナダが最適であるかは、国際ワークショップでの議論を踏まえると見直しの余地があるが、異なる法域の研究者と討議する機会を設ける。カナダが最適であるかは見直しの余地があるが、異なる法域の研究者と討議する機会を引き続き設ける。上記の理由で述べた点を追完する計画である。
海外での教育実習による幅広い視野を持つ教員の養成

教員を志す学生たちが、他国の学生たちと協力して授業を創り上げることによって、幅広い視野を持つ教員を育成することを目指した。国の違う学生たちであっても、一緒に授業を創るパートナーとなり得ることが示された。しかし、学生たちは(1)国と文化を一体化し、社会の中の多様性に向きにくい、(2)徳育的な目標を設定しがち、という傾向があった。この学生たちが、どのような教員になっていくかが、今後の課題である。また、授業を受けた子どもたちへの議論と評価ができていない。本研究は,海外での「教育実習」を通して、幅広い視野をもつ教員を育成することを目的とする。具体的には,海外国際交流協定締結校との間で,本学学生が海外における小学校等で実際に観察・参加・実習を行い,その効果を明らかにする。さらに海外国際交流協定締結校の学生が,本学附属学校園等で同様の教育実習を行う。その相互の効果も明らかにする。(1)海外での「教育実習」の試行2007年度から2010年度にかけて、海外国際交流協定締結校の学生が相互に「教育実習」を行う。(2)上記学生のコミュニケーションにはeラーニングシステム等を活用する。(3)これら効果について調査を行って評価を明らかにする。1晋州教育大学校→愛知教育大学4月研究代表者らは,eラーニングシステムや学内での掲示等を用いて,本研究に参加を希望する学生、大学院生を公募した。研究協力者は,本学で教育実習を行う学生を晋州教育大学校で公募し,12名を選抜した。研究分担者らは,5月に行う受入れの評価方法について検討を行い,定めた。本学ならびに晋州教育大学校で選抜された学生は,研究代表者や分担者,協力者の指導の下,本学で行う教育実習について,指導案の作成等の準備を行った。5月研究協力者が晋州教育大学校の学生を引率して,本学を訪問した。本学の学生、大学院生が翻訳などのサポートを行った。晋州教育大学校の学生は,知立市の小学校で「教育実習」を行った。研究分担者は,事前ならびに事後調査などを行い,これを評価した。2愛知教育大学→晋州教育大学校6月8月本学で選抜された学生13名は,研究代表者や分担者,協力者の指導の下,eラーニングシステム等を用いて,晋州教育大学校で行う教育実習について,指導案の作成等の準備を行った。9月研究代表者ならびに分担者は,本学の学生13名を引率して,海外国際協力締結校を訪問した。本学の選抜された学生、大学院生は2日間,晋州教育大学校より依頼を受けた初等学校で「教育実習」を行った。3検討10月12月研究代表者ならびに分担者,協力者は,本研究の検討を行った。13月研究代表者ならびに分担者は,本研究について関係機関への説明を行った。また,成果をまとめ,本学教育実践総合センター紀要に発表した。1晋州教育大学校→愛知教育大学4月研究協力者は,学生を晋州教育大学校で公募し,12名を選抜した。本学ならびに晋州教育大学校で選抜された学生は,研究代表者や分担者,協力者の指導の下,指導案の作成等の準備を行った。本学の学生・大学院生が翻訳などのサポートを行った。2愛知教育大学→晋州教育大学校6月8月本学で選抜された学生13名は,研究代表者や分担者,協力者の指導の下,準備を行った。9月研究代表者ならびに分担者と学生・大学院生は,韓国の初等学校で「教育実習」を行った。また,研究分担者らは,2008年9月に「韓日国語教育・国際学術シンポジウム-韓国と日本が出会う・言語の交感と国語教育-」に発表ならびに参加した。3検討と発表10月12月研究代表者ならびに分担者,協力者は,晋州教育大學校大學論文集に発表した。13月研究代表者ならびに分担者は,本研究について検討をまとめ,本学教育実践総合センター紀要に発表した。1晋州教育大学校→愛知教育大学4月研究代表者らは,eラーニングシステムや学内での掲示等を用いて,本研究に参加を希望する学生・大学院生を公募した。

5月研究協力者が晋州教育大学校の学生を引率して,本学を訪問した。本学の学生・大学院生が翻訳などのサポートを行った。晋州教育大学校学生の学生は,知立市の小学校で「教育実習」を行った。2愛知教育大学→晋州教育大学校6月8月本学で選抜された学生12名は,研究代表者や分担者,協力者の指導の下,eラーニングシステム等を用いて,晋州教育大学校で行う教育実習について,指導案の作成等の準備を行った。9月研究代表者ならびに分担者は,本学の学生12名を引率して,海外国際協力締結校を訪問した。本学の選抜された学生・大学院生は2日間,晋州教育大学校より依頼を受けた初等学校で「教育実習」を行った。研究分担者は,事前ならびに事後調査などを行い,これを評価した。3検討10月12月研究代表者ならびに分担者,協力者は,本研究の検討を行った。13月研究代表者ならびに分担者は,本研究について関係機関への説明を行った。また,成果をまとめ,本学教育実践総合センター紀要に発表した。1晋州教育大学校→愛知教育大学4月研究代表者らは,本研究に参加を希望する学生・大学院生を公募した。研究協力者は,本学で教育実習を行う学生を晋州教育大学校で公募し,12名を選抜した。晋州教育大学校の学生は,知立市の小学校で「教育実習」を行った。2愛知教育大学→晋州教育大学校9月研究代表者ならびに分担者は,本学の学生12名を引率して,海外国際協力締結校を訪問した。晋州教育大学校より依頼を受けた初等学校で「教育実習」を行った。3検討・まとめ10月12月研究代表者ならびに分担者,協力者は,本研究の検討を行った。また,研究分担者である真島聖子を編集責任者として「グローバル時代に育む関係性」を愛知教育大学出版会より出版した。本書は,本研究の総括と評価・まとめを意図しており,研究代表者・研究分担者の他,晋州教育大学校での研究協力者,本研究に実際に参加した本学ならびに晋州教育大学校の学生,卒業生,その他本学の国際交流の関係者等によって執筆された。同書で真島は,内容面で3つの課題,制度面でも3つの課題を挙げている。また江島は,検討として,パートナーとしての充実を挙げるが,継続的な評価の必要性を課題に挙げた。詳細は同書をご覧いただければ幸いである。
訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ー

平成26年度より平成29年度までの四年間、科学研究費補助金基盤研究(C)課題番号26370539「訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ー」(代表者・松本光隆)の課題の元に、次の研究に従事してきた。1、身延山久遠寺蔵本朝文粋、金沢文庫本群書治要、高山寺聖教、石山寺聖教の訓読文作成。2、身延山久遠寺蔵本朝文粋、金沢文庫本群書治要、高山寺蔵聖教の訓読語用語集の作成。3、漢文訓読語コーパス作成への問題点の整理平成26年度の科学研究費補助金、基盤研究(C)による研究の実績は、以下の通りである。(1)大学院生および研究生(李玉テイ;曹亜瓊;王暄;王徳俊;戴玉潔;陳翰柯;陳博林)を雇用し、各自にノートパソコンを購入譲与(李玉テイ;曹亜瓊;王暄;王徳俊;戴玉潔;陳翰柯;陳博林;孫瑾;薛東東)した上で、そのノートパソコンを使用し、金沢文庫本群書治要を分担して入力を行った。入力資料の様態は、文脈つき(原則一文)の訓点語彙(片仮名の用例)の検索用見出し語を付したコーパスを目指して用語集を作成した。実績の公開の場として、上記大学院生と研究生の協力によって、『広島大学日本語史研究論集』(創刊号、平成27年3月31日)の作成にあたった。(2)上記の(1)作業の公表のために、金沢文庫本群書治要の作業は継続中であるが、平成26年度分の中間報告として、『広島大学日本語史研究論集』(創刊号、平成27年3月31日)を刊行して、その中に、「金澤文庫本群書治要訓点用語集稿(一)」「身延山久遠寺藏本朝文粹訓点データ集稿(一)」を発表した。なお、『広島大学日本語史研究論集』誌は、電子ジャーナルとして、広島大学図書館の学術情報リポジトリに挙げたものであるが、訓点語彙のコーパスの利用の便を考慮して、ロックの掛かっていないPDFファイルとして、公に供したもので、ネット上からの検索は勿論、雑誌ファイルをダウンロードして切断、結合などの加工を前提に、より自由度の高い科研実績の公開後の各研究者における頻度の高い利用を念頭においての刊行形態を採った。平成二十七年度の研究実績は、以下のとおりです。(1)在学中の大学院生を任用して、金沢文庫本群書治要の訓読文入力を行い訓読文の作成と訓点の加点の存する内、音節に不確定要素の含まれるヲコト点の情報を排除して、仮名点の語について抽出して、訓読文の次に、検索用の見出し語情報を立てたデータ集の作成を進行した。それに基づいた、漢文訓読語コーパスに至る前段階の方法を模索した。訓点資料のコーパス作成を目指しているが、漢文訓読語の意味論に資するためのコーパス作成には、漢文訓読語資料(訓点資料)の全文の総ルビに訓読文が必要となる。訓点資料の総ルビの訓読文作成は、これまでにも試みられて来ているところではあるが、研究目的の主たる方向性は、訓点加点字と無点字との訓読語内部における質的差を求めるためのものであった。読み添え語に対する配慮は十分とは言えず、全文の語形を決定するためには、繰り返しての総ルビの訓読文作成で、スパイラルに深化させて行く必要がある。そのための無訓字の訓の決定、訓み添え語の選択等の確実な情報を集積するために、付仮名字、仮名訓み添え語の集積を目的とした資料データ集を作成したもので、上記の目的のためには、まさに、入り口に立った状況である。比較的仮名加点の密度の高い資料を選択して作業の進行中である。今ひとつは、鎌倉時代漢籍資料は、規範性の高かった資料であると判断されるところで、その規範性に拠るための分析も今後の課題である事が判明した。(2)本研究の実績は、平成二十八年三月末日発行の『広島大学日本語史研究論集第二号』に掲載した。当初の計画通り、資料データ集の作成と、各年度の論考の発表は、『広島大学日本語史研究論集』第二号の発刊によって概ね順調に推移していると判断している。訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ーの研究課題のもとに、平成28年度には、金沢文庫本群書治要の文脈付きの仮名加点例用例集の作成を、前年度に続いて行った。今年度は、金沢文庫本群書治要の、特に、史部が中心となったが、訓点資料のコーパス作成上に持つ問題点を浮き彫りにする状況に直面した。すなわち、金沢文庫本群書治要の史部は、経部などに比べても、格段に仮名点の加点密度が低くく、例えば、この金沢文庫本群書治要の史部を基に、訓読語コーパスの作成を想定した場合、推読箇所が極めて多いコーパスとなる。つまり、訓読語コーパスとしては、誠に頼りないものとなることが判明したが、漢籍訓点資料の全体を覆って、訓読語コーパスを作成しようとする場合、史部の資料性を措いてコーパスを作成しても欠落のあるものにしかならないと判断された。

経部の場合、仮名点加点の密度は高いが、やはり、無点の漢字があるので、経部訓読語コーパスを作成する場合も、本訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ーにおいては、文脈付きの用例集を、仮名加点のあるところを漏らさず作成して、その確例の集積の上にコーパス用の総ルビの訓読文を作成して、それを基として経部訓読語コーパスを作成せざるを得ないと言う段階的手続きを経る方向で研究を進めてきたが、金沢文庫本群書治要の史部の場合には、もっと基礎的な段階からの、訓読語採取から始めてみなければならないことが判明した。よって、従来の方向の修正を図って、原漢文をその語序のまま引用して文脈上での意義解析ができることに配慮した仮名加点語用例集の作成を目指すこととして、平成28年度には、その作業の殆ど完成させた。研究実績の概要にも記した如く、金沢文庫本群書治要の経部では、漢字訓読の確例となる仮名加点が、比較的に密で、文脈付きでの用例の採取を、金沢文庫本群書治要以外にも、数種作成して累積すれば、それを基として、蓋然性の高い総ルビの訓読文が作成できて、その訓読文を基に訓読語コーパスが作成できるものとの当初の推定に力を得たが、史部の資料の場合は、仮名加点密度の低い資料も多くて、数量的に多くの資料を選択して作業範囲を大幅に拡張する必要があると判断されるに至った。平成29年度科学研究費補助金による研究は、「訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ー」の研究課題の下に、漢文訓読語・訓点資料のコーパス作成のための基礎資料の整備とその基礎資料整備に関する論考をものす活動を行った。本年度は、平成29年4月よりの六ヶ月間、研究代表者である松本光隆が、広島大学よりの行政処分・懲戒休職6月に服したため、平成29年度分の科学研究費の直接経費700,000円の使用についての制限を受けた。科学研究費の使用による研究は、平成29年10月1日から許されることとなった。遺憾ながら研究の活動を、平成29年10月1日からとせざるを得なかったが、研究協力者の助力を得て、平成30年3月には、著書二冊、論文二篇の成果を公表することができた。科学研究費補助金による最終年度の研究では、訓点語彙コーパスが一朝一夕には作成できないことが明確になり、今後の研究展開に委ねなければならないことが明らかとなった。訓点語彙コーパス作成の困難は、訓読文本文を用意して、その本文に対してコンピュータによる自動化された形態素解析を行い、タグとして必要な語の情報を埋め込もうとする場合、現行の一般的な訓点資料の訓読文を元にすると、形態素解析のための辞書が膨大なものになり、プログラムも非常に複雑なものになることが明らかになった。即ち、訓点資料中に現れる総ての語についての語彙コーパス作成のための本文の必要条件は、なるべく単純な書式の、しかも、総ルビの訓読文を用意する必要があって、この本文となる訓読文の作成のための方法論を着手最初の段階から見出すのが必須であると判明した。ただし、本研究を通じて明らかにした所では、訓点資料の総ての語を対象にせず、タグの埋め込みを手作業でやれば、全語ではないが仮名加点の要語のコーパスは、公表にしてきた資料によって可能であることが明確となった。平成26年度より平成29年度までの四年間、科学研究費補助金基盤研究(C)課題番号26370539「訓点語彙の意味論的研究ー文脈付き訓点語彙コーパスの作成ー」(代表者・松本光隆)の課題の元に、次の研究に従事してきた。1、身延山久遠寺蔵本朝文粋、金沢文庫本群書治要、高山寺聖教、石山寺聖教の訓読文作成。2、身延山久遠寺蔵本朝文粋、金沢文庫本群書治要、高山寺蔵聖教の訓読語用語集の作成。3、漢文訓読語コーパス作成への問題点の整理漢文訓読語史研究のための語彙論意味論研究の基礎資料となる漢文訓読語の語彙についての、用例付きデータ集は、当初計画したところを、大学院生・研究生の雇用、研究助力によって、その一部を広島大学図書館学術情報リポジトリに電子雑誌として「広島大学日本語史研究論集」創刊号を刊行し、ネット上からデータ集が検索、ダウンロード出来る状況として実現し、概ね順調に計画通り進展している。
ドラッグリポジショニングによる骨折・骨欠損新規治療法の開発

前期まで材料に担持させてきた薬剤は不溶性のため、薬液の調製に溶媒としてDMFが必要であった。一方当該薬剤には水溶性製剤が存在するため、その骨形成促進効果をin vitroやin vivoで検討した。その結果、水溶性製剤もマウス骨髄由来間葉系細胞からの骨芽細胞分化を有意に促進することが分かった。さらに骨分化誘導開始時には、短時間の薬剤刺激の方が分化促進効果に優れていることも明らかとなった。またin vivoでの骨形成促進効果を評価するため、マウス頭蓋骨欠損モデルに同種骨髄由来培養骨芽細胞様細胞と水溶性製剤と担体を移植する実験を行った。すると薬剤添加群においてのみ、頭蓋骨欠損部の修復を確認することができた。以上の結果を踏まえ、今期は当初から使用してきた不溶性の原末に代わり、この水溶性製剤を担持させた人工骨を使用して埋植実験を行った。3種類のランソプラゾール水溶液(2 mM, 200 &micro;M, 20 &micro;M)に含浸させたβ-TCP製の連通孔多孔体をウサギ脛骨近位に作製した矩形の皮質骨欠損に埋植し、4週後に検体を回収して組織学的、X線学的に材料内の骨新生や材料周囲の異物反応を定量評価した。その結果、対象群と比較して、2 mMと200 &micro;Mの材料内に有意な骨新生の増加が確認され、20 &micro;Mでも増加している傾向を認めた。不溶性の原末で認めた材料周囲を取り囲む肉芽組織の形成はなく、細胞・組織毒性は確認されなかった。今期は材料の形状変更を行ったため、前期まで認めていた材料と母床との間隙はなく一律にpress-fitされており、材料の髄腔内への落ち込みもなかった。不溶性原末を使っていた前期までは、高濃度では細胞・組織毒性が顕在化し、低濃度では一貫した有効性が示されていなかったため、やや遅れている進捗状況であった。今期は水溶性製剤に変更したことで、ランソプラゾール自体が有する骨形成促進効果を確認することができたため、順調に経過していると判断した。ただ単純に水溶液に含浸して担持させた場合、材料からの薬剤溶出は指数関数的に生じるため、母床に内在する骨芽細胞系譜細胞への有効な薬剤暴露はせいぜい12日間と考えられる。そのため来期からは徐放期間を延長させた材料を使用した埋植実験を行うことにしている。また骨再生医療のマーケットはより短期間での骨新生を望んでいるため、薬剤のポテンシャルを探る意味でもより短期間の埋植期間で評価することも検討している。来期からも中型動物への埋植実験を継続し、水溶性ランソプラゾール含有人工骨のin vivoでの有効性を確認していく。まず有効性を示し、毒性を発揮しない上限の薬剤担持濃度を確認するため、材料を含浸する水溶液の濃度を上げて実験を行う。並行して薬剤の担持方法に修飾を加え、3日以上薬剤が徐放されるような材料を準備し、同じく埋植実験を行う。最後に実験期間を23週に短縮した実験を行い、製品化に向けて臨床的に価値を持つ有効性を見出す予定である。ランソプラゾール含有人工骨の非臨床POC(Proof Of Concept)を取得するため、ウサギを用いた動物実験を行った。共同研究を行っている骨補填材料製造メーカーからβ-TCP素材の移植用サンプル(上底3 mm×下底5 mm×高さ5 mm×奥行き7 mmの台形柱)の提供を受け、実験を行った。サンプルに薬剤を吸着させるために用意したランソプラゾール溶液の濃度は0 (control), 10, 25, 40 mMである。この溶液に人工骨を含浸させて薬剤を吸着し、薬剤のburst releaseを防止するためさらに洗浄工程を加えた。各群のNは3とした。日本白色ウサギの両側後肢の脛骨近位に矩形状の皮質骨部分欠損をサージエアトームで作製し、各サンプルを可及的にpress-fitして埋植した。埋植から4週、8週の時点でサンプルを含む脛骨を回収しレントゲン検査、μ-CT検査、非脱灰骨標本(ビラヌエバゴールドナー染色)による人工骨内の骨新生および走査型電子顕微鏡による材料の生体吸収の各割合を評価した。レントゲン検査とμ-CT検査では、先行研究で認めた材料周囲の透亮像(=炎症性肉芽組織)や明らかな材料の吸収遅延は確認されなかった。材料全体をROI(Region Of Interest)とした組織学的評価を行うと、ランソプラゾール担持群では骨新生は抑制される傾向を示したが、皮質骨部分(材料全体から髄腔内に埋植されている部分を除いた部分)をROIとした評価では、移植後8週で薬剤群(10, 25 mM)においてより多くの新生骨を材料内に認めた。しかし移植後4週ではむしろ材料内の骨新生は抑制傾向を示した。材料内の骨新生と材料の生体吸収の割合は同期しており、薬剤担持によって材料自体の生体吸収性は損なわれなかった。本研究に先立って行われた同様の埋植実験では、人工骨を含浸するランソプラゾール溶液の濃度は250mMと400mMであり、今回と比べて高濃度であった。そのため局所に徐放される薬剤濃度は著しく高濃度になったと考えられる。その結果細胞毒性が発揮され、サンプル周囲に線維性肉芽組織が形成される副反応が出現した。

本来当該人工材料は連通気孔を豊富に有し、周囲から骨芽細胞や未分化幹細胞、成長因子の侵入を許す構造体であるが、副反応によって被包化されたため、こうした現象が阻害され、材料内外の骨新生促進効果を示すことができなかったと考えられる。本研究ではISOに準拠した細胞毒性試験の結果を踏まえた上で薬剤溶液濃度を下げ、先述の細胞毒性の出現を回避することができた。しかし有効性についてはN数が少ないこともあり統計学的に有意な結果は得られていない。サンプルによっては人工骨内の新生骨量は薬剤担持群で多くなったが、個体差が大きく明らかな有効性を示すことができていない。1.これまでに2回、ウサギ皮質骨欠損モデルへの薬剤含有人工骨の埋植実験を行った。1回目は細胞毒性が出現し、有効性を示すことができなかった。薬剤の担持量を大幅に少なくして行った2回目は、毒性は消失したものの明確な有効性を示すことができなかった。3回目の実験を行う前に今年度はまず移植環境を模したシミュレーションを実験室内で行い、薬液濃度と徐放濃度との相関関係を調べた。その結果、徐放濃度は薬液濃度に比例して上昇し、70100 mMからの徐放濃度は40 mMからの徐放濃度よりも、150 mMからの徐放濃度は70 mMからの徐放濃度よりもそれぞれ有意に高いことが分かった。以上の結果を踏まえ3回目は、当初70と150 mMの薬液に浸漬させた人工骨サンプルの埋植実験を行う予定となった。2.これまで人工骨に担持させてきた薬剤は不溶性の原末のため、薬液の調製には溶媒としてDMFを使用してきた。一方で当該薬剤には水溶性製剤も存在するため、本研究とは別に、その骨形成促進能をin vitroやin vivoにて検討した。その結果、水溶性製剤もマウス骨髄由来間葉系細胞からの骨芽細胞分化を有意に促進することが分かった。さらに骨分化誘導開始時には、短時間の刺激の方が分化促進効果に優れていることも明らかとなった。またin vivoでの骨形成促進効果を検討するため、マウス頭蓋骨欠損モデルに同種骨髄由来培養骨芽細胞様細胞と水溶性ランソプラゾールとアテロコラーゲン担体を同時に移植する実験を行った。すると薬剤添加群においてのみ、頭蓋骨欠損部の骨新生を確認することができた。以上の結果を踏まえ、当初予定していた原末の使用を中止し、3回目では水溶性製剤を使用することに決め、実際、年度末に動物への埋植実験を実施した。来年度は早々に移植骨サンプルを回収し、効果判定を行う予定にしている。1.これまで行った2回の動物実験では、1回目は細胞毒性が出現、2回目は効果にばらつきが生じてしまい、明確な有効性を示すことができなかった。そのため、今年度は至適濃度の決定に時間を費やしてしまい、3回目の動物実験が遅れることとなった。これまで行った2回の動物実験において、有意差のある有効性を見出せなかった理由として、これまで使用してきた薬剤の原末が不溶性のため、基材からの薬剤徐放量がそもそも不十分であった、あるいは基材の吸収に依存した徐放となり局所の薬剤濃度が有効濃度に達していなかった、あるいは細胞毒性をもたらすような高濃度となっていた、または徐放期間が遷延して骨芽細胞分化を抑制する方向に作用した可能性が考えられた。2.電動ドリルを使い、人の手で作成する骨欠損は、どうしても大きさや形状にばらつきが生じてしまう。そのため個体によっては材料の埋植がルースとなり、材料が経過中に髄腔内に落ち込んでしまうケースが散見された。この点も特に2回目でばらつきが生じ、明確な有効性を示すことができなかった理由として考えられた。
イオン液体の凝集構造と集団的ダイナミクス

イオン液体中で構成カチオンおよびアニオンが集団化した"イオン集団"に焦点をあて、そのイオン集団の構造-ダイナミクス相関を明らかにすることを目的とした。X線・中性子による散乱実験を中心に、イオン液体のアルキル鎖長依存性について検討を行った。本研究では、イオン液体(IL)中で構成カチオンおよびアニオンが集団化した"ILイオン集団"に焦点をあて、そのイオン集団の構造-ダイナミクス相関を明らかにすることを目的とした。X線・中性子による散乱実験を基軸として、イオン液体のアルキル鎖長依存性(ナノ不均一構造形成の効果)の観点から研究を進めた。1-alkyl-3-methylimidazolium bis(trinuoromethanesulfonyl)amide,[CnmIm][TFSA]を対象として(アルキル鎖長数,n=2-12)、非弾性X線散乱(IXS)により比較的早い集団運動を(ピコ秒)、中性子スピンエコー(NSE)実験により遅い集団運動(ナノ・サブマイクロ秒)を評価した。また、中性子散乱実験では重水素化サンプルが必要となるため、重水素化[CnmIm][TFSA]合成のための合成システムを研究室内に構築した。IXS実験では、n=2-6で明瞭なIXSスペクトルが観測され、解析で得られる動的構造因子や中間散乱関数のアルキル鎖長依存性を評価した。重水素化[C12mIm][TFSA]に対してNSE実験を行い、得られた中間散乱関数の解析を行ったところ、ナノ不均一構造に由来する小角散乱(プレピーク)が現れるQ領域においてnsオーダーの緩和が現れることが明らかになった。現在、MDシミュレーションを用いて中間散乱関数を理論的に見積もり、実測値との比較・検討および集団運動の成分帰属を行っている。
レトロウイルス発現系を用いた「インスリン依存性糖輸送活性化」調節因子の同定

当初の研究計画は、(1)インスリン依存性GLUT4 translocation-incompetentな細胞に細胞外myc epitopeを付したGLUT4を発現させ、(2)この細胞にGLUT4 translocation-competentな3T3-L1脂肪細胞より調整したcDNA libraryをレトロウィルス発現系により感染させ、(3)単クローン化した細胞株をflow cytometryに供し、細胞外myc epitopeの蛍光標識を指標としてスクリーニングを行う。(4)細胞外標識の増加(すなわちGLUT4の細胞膜面への移動)の確認されたクローンを単離後、(5)同クローンより調整したゲノムDNAをtemplateに、ベクター特異的塩基配列をprimerとしてPCRを行い、(6)更に単離遺伝子を導入した細胞を用いた分子細胞生物学的解析により分子機能の確認を行い、integrateされたGLUT4 translocation惹起分子を同定する、というものである。この内既に(1)(4)が終了し、複数の陽性クローンの単離に成功した。今後は(5)・(6)の計画に基づき、単離クローンを使用してintegrateされた遺伝子の同定及びその遺伝子の機能、特にインスリン感受性糖輸送活性化への関与を順次検討する予定である。また当該研究期間中に、今回使用したflow cyometryを使用した方法のscreening効率及び精度を向上する目的で、異なるアプローチ、すなわち当初の研究計画でも用いた細胞表面蛍光標識を蛍光マイクロプレートリーダーで測定し、多数cloneの同時処理を可能とする検討を試みた。現段階で当初のscreening目的に耐える条件の設定に成功しており、今後この方法を併用して、更に多数cloneの一層効率的なscreeningを継続する予定である。研究計画の概略は、(1)インスリン依存性GLUT4 translocation-incompetentな細胞に細胞外myc epitopeを付したGLUT4を発現させ、(2)この細胞にGLUT4 translocation-competentな3T3-L1脂肪細胞より調整したcDNA libraryをレトロウィルス発現系により感染させ、(3)単クローン化した細胞株をflow cytometryに供し、細胞外myc epitopeの蛍光標識を指標としてスクリーニングを行う。(4)細胞外標識の増加(すなわちGLUT4の細胞膜面への移動)の確認されたクローンを同定後、(5)調整したゲノムDNAをtemplateに、ベクター特異的塩基配列をprimerとしてPCRを行い、(6)cDNA libraryの感染によりintegrateされたcDNAをGLUT4 translocation惹起因子として同定する、というものである。この内既に(1)(4)の段階が終了し、既に複数の陽性クローンが単離された。今後は(5)・(6)の計画に基づき、単離クローンを使用してintegrateされた遺伝子の同定を進めると同時に、さらに対象クローン数を増加させて(3)・(4)によるスクリーニングを継続する予定である。また、(5)・(6)により同定された遺伝子の機能、特にインスリン感受性糖輸送活性化への関与を検討する上で、先ず単離遺伝子を発現させた細胞を用いたassayを行う予定であるが、現時点で既に当該遺伝子が導入された単clone細胞株は樹立されている。これらを脂肪分化誘導後、インスリン依存性糖輸送活性化・GLUT4 translocationに関する各種細胞生物学的評価を行う。当初の研究計画は、(1)インスリン依存性GLUT4 translocation-incompetentな細胞に細胞外mycepitopeを付したGLUT4を発現させ、(2)この細胞にGLUT4 translocation-competentな3T3-L1脂肪細胞より調整したcDNA libraryをレトロウィルス発現系により感染させ、(3)単クローン化した細胞株をflow cytometryに供し、細胞外myc epitopeの蛍光標識を指標としてスクリーニングを行う。(4)細胞外標識の増加(すなわちGLUT4の細胞膜面への移動)の確認されたクローンを単離後、

(5)同クローンより調整したゲノムDNAをtemplateに、ベクター特異的塩基配列をprimerとしてPCRを行い、(6)更に単離遺伝子を導入した細胞を用いた分子細胞生物学的解析により分子機能の確認を行い、integrateされたGLUT4 translocation惹起分子を同定する、というものである。この内既に(1)(4)が終了し、複数の陽性クローンの単離に成功した。今後は(5)・(6)の計画に基づき、単離クローンを使用してintegrateされた遺伝子の同定及びその遺伝子の機能、特にインスリン感受性糖輸送活性化への関与を順次検討する予定である。また当該研究期間中に、今回使用したflow cyometryを使用した方法のscreening効率及び精度を向上する目的で、異なるアプローチ、すなわち当初の研究計画でも用いた細胞表面蛍光標識を蛍光マイクロプレートリーダーで測定し、多数cloneの同時処理を可能とする検討を試みた。現段階で当初のscreening目的に耐える条件の設定に成功しており、今後この方法を併用して、更に多数doneの一層効率的なscreeningを継続する予定である。
題材論的方法と絵画療法における教育的作用の連関を求めて

題材論的方法の社会的意義を新たに問うために、隣接領域である絵画療法的行為との関係に着目しその共通性と相違性をあらわにして、両者の関連構造を究明しようとした。美術制作は元来、浄化や癒しの作用の側面を内在させており、この点で絵画療法と共通している。相違性を明らかにするべく研究方法として選んだのは、絵画療法としてこれまで成果をあげてきた課題を、改めて題材論的方法の題材として選び健常者である学生に実践したことである。次いで、同一製作者の場合における絵画療法的スケッチと、本絵作品の関係を考察したことである。第一段階で行われた療法的スケッチによって、制作者にとっての不満感や不足感、ストレスの意味と根拠が一層顕在化された。しかし、自己世界の意味づけとしての物語は、没時間的で図式性の強い療法的スケッチによるのでは不十分で、質的に意味を担わなかった。表現の形態は美術的な操作がなされず、不完全なのである。小論では、療法的スケッチのそうした特徴を「言語的要説明性」と「造形的不完全性」という用語で言い表して概念化した。第二段階としての美術活動では、マイナス価値的感情も美的なもの(日常的利害や必要を超えた感性的快)の働きによって、作品に日常性や自己を超越するより大きな自己が現れ、それと普段の自己が二重写しになり、真実なるものとして作者によって感受され、自己刷新が行われたのである。それは美術的特質が教育的作用を発揮した事態である。絵画療法は浄化や癒しを専らとするが、題材論的方法はそれらも表現の前提として人格的な表現を行うのである。これが絵画療法と大きく異なる点で、題材論的方法に発展的な形で認められる、社会的な意義といえよう。ここに両者における教育的作用の連関が認められる。題材論的方法と絵画療法的行為との関係に着目し、その共通性と相違性をあらわにして、両者の関連構造を究明したい。そうした視点から、「癒し」や浄化的な側面が、より濃厚に内在されているような題材をいくつか考案した。熟慮の末、絵画療法の課題としてこれまで安定した効果が指摘されてきた、「雨の中の私」「集団と私」、さらには今回新たに「イレギュラーの物語」を題材に設定し、平成14年度、健常者としての宮城教育大学学生、広島市立大学学生、宮城県認定講習参加者としての教員を対象として実践した。そのことによって、「絵画療法」と「題材論的方法」の美術的特質及び教育的作用の関係が、構造的に解明されることを目論んだ。いわば描画の社会的な役割における内容上の差を、制作体験的にそれぞれ明確にしようとしたのである。その際、時間経過的には第一に絵画療法的制作を8分間内に、第二に題材論的方法に基づく制作を3時間内に行わせ、とりわけ絵画療法時のスケッチに現れると予定された心理的な葛藤や鬱積した感情が、その後における美術的活動に対してどのように作用したのか。いわば制作過程でこうした感情が基礎となるものの、時間的経過とともに質的にどのように変換され、あるいは充実することで美術的活動がいかに達成されるのかを究明した。画面に現れた主題形成や、その表現性に触発されて生じる美的内容が、制作者に見つめられることで生(価値を求める営みとしての生きること)の意味が感受されたと見られよう。美術的特質は作品にリアリティ感として現れることになるが、それに広く内在する教育的作用が大いに発揮されたのである。これが、浄化や癒しを専らとする絵画療法と大きく異なる点で、題材論的方法に認められる社会的な意義といえよう。
空間構造を持つ低次元量子磁性体の理論的研究

1.S=1カゴメ格子反強磁性ハイゼンベルグ系において、格子変形と異方性による量子相転移を調べ、変形のない等方的な系の基底状態が代表者の提唱したHSS状態と考えられることを示した。2.S=1の1サイト異方性のある1次元XXZモデルの基底状態の定量的に正確な相図を得た。この相図は定性的に新奇な点はないが、今後のこの分野の研究においての標準として有用な結果となる。3.2種のジグザグボンド交替鎖の混合鎖と強い反強磁性ボンドを強磁性ボンドでランダムに置換したジグザグボンド交替鎖の飽和磁化の半分(m=1/2)でのプラトーの振る舞いを密度行列繰り込み群(DMRG)を用いて調べた。4.反強磁性交替ボンド鎖と一様鎖の混合系の磁化過程についてDMRGを用いて調べ、網代らの実験で得られた磁化過程が理解できることを示した。5.フィボナッチ反強磁性XXZモデルについて、2種類の交換相互作用の違いが大きいときに、実空間繰り込み群を用いて再考し、基底状態の相図を明らかにし新しいユニバーサリティの存在を示した。6.ボンド演算子平均場近似法を1次元ジグザグボンド交替鎖のm=1/2プラトー状態に適用し、利根川らによる相図を再現した。さらに、鎖間相互作用の効果も調べた。7.3倍周期S=1/2ジグザグハイゼンベルグモデルのm=1/3プラトーの内、古典的プラトー状態と量子的プラトー状態が異なる相でありZ_2対称性の破れた中間相が存在することを示した。また、量子的プラトー状態が厳密に基底状態となる4体相互作用を持つモデルを構成した。8.一イオン異方性Dが空間的に変化するS>1反強磁性ハイゼンベルグ鎖の基底状態を数値対角化により考察し、空間変化のパターンに応じて種々の反強磁性相やフェリ磁性相が現れることを示した。これはハルデン状態に存在する隠れた反強磁性秩序の1つの成分が、異方性の空間変化によって顕在化することを意味している。9.磁場中の擬一次元量子磁性体において、ランダムネスはスピンを生き返らせて磁場に垂直な方向の磁気秩序を引き起こす一方、ランダムネス誘起プラトーを引き起こしこの秩序を壊す。この二つの競合の結果、この系は磁場の増大と共に多重リエントラント転移を起こすことを示した。・ランダム1次元磁性体戸塚は1次元量子スピン系において、並進対称性の破れを伴う非自明な磁化プラトーはランダムネスに対し不安定であることを示した。この現象について数値的に検証するため、強磁性・反強磁性交替ボンドハイゼンベルグモデルで、強磁性ボンドを強さの異なる反強磁性ボンドでランダムに置き換えたモデルにフラストレーションを入れて調べた。

その結果、ランダムネスによって誘起されるプラトーがある一方で、ランダムでない系で存在した非自明なプラトーは単に消滅するだけでなく、2つのプラトーに分裂し、その位置を連続的に変えることが分かった。これらの振る舞いはクラスター描像によってよく理解できる。さらに、ボンド交替のあるジグザグ鎖や、出口らによって実験がなされた桁にランダムネスのある梯子系など様々なランダム量子スピン系についてプラトーの消長の様子を明らかにした。また、網代らによって実験的に研究されている反強磁性交替ボンド鎖と一様鎖の混合系の磁化過程について調べ、交替ボンドクラスター同士の空間相関の有無によって、基底状態の性質が量子グリフィス相からランダムシングレット相に変化すること、またこの違いが低エネルギー磁化過程に反映することを明らかにした。・カゴメ格子反強磁性体カゴメ格子上のスピン1の反強磁性ハイゼンベルグ系の基底状態において、格子変形と異方性によって引き起こされる相転移を厳密数値対角化法によって調べた。その結果、変形のない等方的な系の基底状態が代表者の提唱したHexagonal Singlet Solid描像によって記述されると考えると相図全般の様相を理解できることを示した。また、現在埼玉大学において物質合成が進んでいるスピン1のカゴメ格子反強磁性体と比較するため、高温展開と数値対角化によって帯磁率や比熱の温度依存性を調べた。・S=1の1サイト異方性のある1次元XXZモデルの基底状態相図このモデルはハルデンギャップ問題の研究の初期から調べられていながら、定量的に信頼できる相図は得られていなかった。そこで、近年進歩したレベルスペクトロスコピーや有限サイズスケーリングなどの方法を用いて数値対角化の計算結果を詳細に解析し、正確な相図を得た。この相図は定性的に新奇な点はないが、今後のこの分野の研究においての標準として有用な結果となると思われる。・フラストレートしたランダム1次元磁性体の磁化プラトー戸塚は1次元量子スピン系の並進対称性の破れを伴う磁化プラトーはランダムネスに対し不安定であることを示した。この現象を数値的に検証するため、交替ボンドS=1/2反強磁性ジグザグハイゼンベルグ鎖の飽和磁化の半分(m=1/2)でのプラトーに対するランダムネスの効果を密度行列繰り込み群(DMRG)を用いて次の二通りの場合に調べた。1.2種のジグザグボンド交替鎖の混合鎖一様な場合にプラトーを示す2つのジグザグボンド交替鎖を混合すると、プラトーが消滅することを示した。一方、飽和磁化近傍にランダムネスに誘起される局在状態のため、小さなプラトーが現れることが分かった。2.強い反強磁性ボンドを強磁性ボンドでランダムに置換したジグザグボンド交替鎖ランダムネスによって誘起されるプラトーがある一方で、一様な系の非自明なプラトーは2つに分裂し、その位置を連続的に変えることが分かった。・網代らが測定した反強磁性交替ボンド鎖と一様鎖の混合系の磁化過程についてDMRGを用いて調べ、交替ボンドクラスターの空間相関の有無によって、基底状態が量子グリフィス相からランダムシングレット相に変化し、磁化過程も変化することを示した。また、上記の実験結果が交替ボンドクラスター同士の相関がないとして理解できることを示した。・磁化プラトー状態へのボンド演算子平均場近似法の応用ボンド演算子平均場近似法を1次元ジグザグボンド交替鎖のm=1/2プラトー状態に適用し、利根川らによる相図を再現した。さらに、鎖間相互作用がプラトーを抑制することも示した。この結果は数値対角化の結果とも整合している。・1次元準周期反強磁性XXZモデルの実空間繰り込み群による研究
新規エクアトリアル位占拠型配位子を用いたシリカートの合成と有機合成反応への応用

まず昨年度の検討によって合成したAr_3CSiCl_3,1(Ar=2-MeO-5-t-Bu-C_6H_3)の官能基変換を検討した。1に対してAgBF_4を反応させたところ、1の塩素原子がフッ素原子に置き換わったAr_3CSiF_3,2の合成に成功した。この反応機構は次のように考えられる。すなわち、銀により塩化物イオンが引き抜かれ生成したシリセニウムカチオンが、テトラフルオロボラートからフッ化物イオンを引き抜き、Ar_3CSiFCl_2を与え、この反応を繰り返すことで2が得られたものと考えられる。2のX線結晶構造解析を行ったところ、三つのメトキシ基が中心ケイ素原子に対してフッ素原子のちょうど反対側に位置し、メトキシ基の酸素原子の孤立電子対がSi-Fの反結合性軌道と相互作用しており、ケイ素原子周りは7配位構造をとっていることがわかった。またメトキシ基の酸素原子とケイ素原子間の原子間距離は1に比べて若干短くなっており、ケイ素原子と酸素原子との間に吸引的な相互作用があることが示唆された。続いて1のメトキシ基の脱メチル化を検討した。脱メチル化試剤としてはTMSI, BBr_3を検討した。TMSIとの反応においては生成物の同定には至らなかったが、1に対してBBr_3を作用させた後、エタノールで処理をしたところ、3段階の脱メチル化が進行した後、三つのケイ素-酸素結合が生成した結果、三環性のシラン3に対して、エタノールが1分子配位したと思われる化合物4を得た。4の水処理を行ったところ、配位エタノール分子が水分子へと置き換わった5が得られた。化合物4および5の構造の詳細について現在検討中である。以上のように、本計画は計画通り遂行できた。これまでの検討から2,2',2"の位置に3つのメトキシ基を有するトリアリールメタン(Ar_3CH)から容易に調製が可能であることが明らかとなっているAr_3CLiに対し、SiCl_4のようなケイ素試剤を反応させることにより、中心炭素上にケイ素原子の導入を検討した。種々条件を検討した結果、ベンゼン溶液中でAr_3CLiを発生させた後、テトラヒドロフランに溶媒交換し、添加剤としてHMPAを加えた後にSiCl_4と反応させることにより、12%という低収率ながら、中心炭素状にケイ素原子を導入したトリアリールメチルトリクロロシラン(Ar_3CSiCl_3,1)の合成に成功した。1の単結晶を作成し、X線結晶構造解析を行った結果、3つのメトキシ基が中心ケイ素原子に対して塩素原子のちょうど反対側に位置し、メトキシ基の酸素原子の孤立電子対がSi-Clの反結合性軌道と相互作用していることがわかった。また1の^<29>Si NMRを測定したところ、0.30ppmにシグナルを観測した。この値はメトキシ基の配位の影響がないPh_3CSiCl_3の3.4ppmに比べ、わずかに高磁場シフトしており、溶液中においても弱いながらO...Siの相互作用が存在することが示唆された。続いて、分子内配位の効果の反応性に対する影響を検討するため、各種求核試剤との反応を行った。加メタノール分解、n-BuLiとの反応、およびLiAlH_4との反応を行ったが、いずれの場合もまったく反応は進行せず、1が求核試剤に対して極めて高い安定性を有していることがわかった。これは、X線結晶構造解析の結果から示唆されたとおり、メトキシ基の酸素原子の孤立電子対が、σ^*_<Si-Cl>軌道に相互作用するとともに、求核試剤のケイ素原子への背面攻撃をメトキシ基が立体的に抑制した結果と考えられる。
ダイニン２運動活性からのＩＦＴ機構解明

当初の研究課題名の方針からは若干の変更があったものの、前年度に引き続き、繊毛虫テトラヒメナでの組換え体ダイニンの発現を行い、その分子構築について調べた。外腕ダイニン複合体の軽鎖LC1にHis-tagを導入し、Ni-NTAナノ金粒子標識をして電子顕微鏡観察することで、軽鎖LC1の局在がダイニンのストーク先端であることが分かった。この結果をさらに単粒子解析・生化学的実験を用いて追及した。テトラヒメナのダイニン頭部断片の電顕像を用いて単粒子解析した結果、ダイニンストーク先端の微小管結合領域(MTBD)付近にLC1であると考えられれる構造体が付随していることが分かった。また、大腸菌で発現したストーク領域の断片とLC1を用いてプルダウンアッセイを行い、生化学的にも両者の結合を示した。キメラストークコンストラクトを用いて結合領域のマッピングを行うことで、MTBD領域のみでLC1結合に十分であることが明らかとなった。さらに、微小管共沈実験によって、LC1が結合することでダイニンストークの微小管への結合能が下がることを明らかとした。先行研究で軽鎖LC1はダイニンのAAA+リングに結合しており、AAA+リングを軸糸ダブレット微小管A小管にアンカーさせる役割を担っていると考えられていたが、本研究結果から、LC1が外腕ダイニンの軸糸ダブレット微小管B小管へのアフィニティーを調節することでその活性を制御しているという新たなモデルを構築するに至った。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度は、ダイニン2のin vitroでの運動活性を詳細に調べるためダイニン2の大量発現の方法を模索した。ダイニン2重鎖全長のN末に精製用のSBP-tag,解析用のSNAP-tagをつけたコンストラクト(SBP-SNAP-DHC2-full)を遺伝子導入したHEK293細胞から組換え体ダイニン2複合体を精製した場合、その収量は極めて低かった。そこで、ダイニン2重鎖のうちのモータードメインのみのコンストラクト(SBP-SNAP-DHC2-364kDa)及びN末にGST-tagを付加して人工的に二量体化したコンストラクト(SBP-SNAP-GST-DHC2-364kDa)の構築し、HEK293細胞に導入して精製を行ったところ、ダイニン2重鎖全長よりも収量が改善された。SBP-SNAP-GST-DHC2.364kDaのSNAP-tagを蛍光色素で標識して全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)で観察を行ったが、これまでのところ一分子で連続的な運動をする様子は確認されていない。生体内でダイニン2が機能する際には尾部に制御タンパク質が結合することが必要である可能性がある。さらにダイニン2の収量を上げるため、根本的な発現系の見直しも行い、体表に多数の繊毛をもつ繊毛虫テトラヒメナ(Tetrahymena)を用いることとした。テトラヒメナは、ダイニン2研究のモデル生物としても用いられているため、ダイニン2の発現系として理想的であると考えたためである。当該年度に、GFP-tagをつけた組換え体タンパク質がテトラヒメナの繊毛内に輸送されることも確認した。前年度に繊毛虫テトラヒメナで組換え体ダイニン2の発現を行うように方針転換を行ったが、それに伴い、当初は想定しなかった障害が複数発生した。特に大きな問題だったのはテトラヒメナの大核内の組換え体遺伝子の割合を上げる必要があったことと、組換え体テトラヒメナ繊毛内でダイニン重鎖が分解を受けやすかったことの二点であった。そこで当該年度は、これらの課題に対し、条件検討や手法の改善を行った。まず、ツールとして、テトラヒメナ用にコドンを改変した蛍光観察・精製・構造解析用の多機能タグ(GFPのループ内にHisタグを挿入したhGFPタグ及びGFPのループ内にHisタグ・SBPタグを挿入したhsGFP・タグ)を構築した。これらのhGFPタグ・hsGFPタグを相同組換えでテトラヒメナ大核内に導入するための薬剤耐性遺伝子カセットも構築した。所属研究室で、テトラヒメナ大核内の組換え体遺伝子の割合を上げる工程(フェノティピックアソートメント)の系を確立するために、軸糸ダイニン重鎖にhGFPタグを付加して検討を行った。その結果、薬剤濃度を段階的に上げていくことで大核内の45コピーの遺伝子を全て組換え体遺伝子に置き換えることができた。また、組換え体テトラヒメナ内でダイニン重鎖の分解が激しかったため、培養温度・精製条件を検討したところ、導入したHisタグ・SBPタグで組換え体軸糸ダイニンが精製できた。これらの結果、組換え体テトラヒメナを株として樹立し、安定して維持することが可能となっただけでなく、テトラヒメナから再現良く組換え体ダイニンを精製できるようになった。テトラヒメナがダイニン重鎖の発現系として使用可能であることを示したものである。所属研究室において、テトラヒメナを用いた組換え体ダイニン精製の系が確立されたので、次年度は細胞質ダイニン2についても精製・運動活性測定を行う予定である。