hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Biサーファクタントを用いたⅣ族ナノドットの低温形成並びに素子応用の研究

また、400°Cまでの低温アニールによるGeの結晶ナノドットの形成も試みた。この結果、Biを媒介してナノドットが形成され、同アニールによってBiの排出と同時に結晶化が生じていることが明らかになってきた。TEM観察とAES評価の結果からは形成されたGe結晶ナノドットにはBiはほとんど残存しないという状況も確認されている。さらに真空中で300°Cまでの加熱中に観察が可能なAFM装置を用いてその場観察を行った結果、アニールの効果は300°C程度から発現していることもわかった。今後、本研究で得られた知見を生かし、半金属や金属を媒介したIV族半導体ナノ構造の形成と次世代デバイス要素技術への応用に関する研究を展開していく予定である。IV族ナノドットはSiフォトニクス用の受発光素子、新構造メモリ素子、高効率太陽電池等への応用が期待されている。本研究では申請者がビスマスサーファクタントを用いたIn(Ga)As量子ドット成長技術の研究を通じて得た知見をIV族材料に応用し、低温形成並びに形状制御技術を開発することを目的とした。新たに開発した手法は低温(室温130°C程度)下におけるBi、Geの連続蒸着とそれに続く比較的低温(300°C400°C)のアニールであり、結晶Geナノドットの形成に成功した。また、この手法によるドット形成のメカニズムは当初の予想(サーファクタント効果)とは異なる新たなものであることを検証した。前述の通り、H26年度は2元材料同時蒸着のための装置改造を行ったが、最近の景気回復により装置業者が多忙となり、仕様策定や改造作業が遅れ、改造工事の実施が年度末になってしまった。この改造にはナノドット作成の再現性向上のための機能アップも含まれており、結果として混晶ドットのみならずGeナノドットの形成条件の検討にも影響を及ぼした。今後、改造後の立ち上げ作業を急ぐ必要がある。基本的には当初の計画に沿って研究を行うが、具体的な進め方について一部変更を加える。前述の通り、ナノドット形成においてBiを副材料に用いることによる効果を明らかにするための検討を強化する必要が出てきた。そこで当初の計画のうち、太陽電池用多層ドット形成技術の検討とドットinナノワイヤ構造形成技術の検討については優先度を下げ、上記Biの効果に関する検討とGeSnナノドット形成技術の検討、量子ドットフローティングゲートメモリ用基本構造作製の検討に注力することとする。まず、量子ドットフローティングゲートメモリ用ナノドットへの検討を兼ねてトンネル酸化膜を形成したSi基板上へのナノドット形成条件の検討を行う。この構造は透過電子顕微鏡(TEM)やX線光電子分光(XPS)評価を行う際にも有効である。またこの際、ナノドットの材料としてSiを用いる検討を新たに加え、Geドットとの比較検討により上記Biの効果についてより多面的な検討を行う。GeSnナノドット形成については混晶作成条件の検討を進め、次に前記のナノドット形成条件の検討結果と組み合わせてナノドット形成を試みる。
脂質膜の静的及び動的構造の理論的研究

平成10年度から、平成13年度の4年間わたって科学研究費補助金(基盤研究C2)を授与されて「脂質膜の静的及び動的構造の理論的研究」のテーマで理論的研究を遂行してきた。生体膜モデル系としての脂質2分子膜の理論的研究は、伝統的な物理学会の中では必ずしも主流的な分野とは言えなくて研究者人工も少ないが、生物物理の中では生体膜の基本的性質は重要なテーマであり、補助金を授与することでその研究の重要性を認めて戴いたことを先ず感謝したい。当初の研究目標は(1)レーザ照射による膜構造の形態変化(2)単分子膜系の対流発生であった。第一のテーマについてはこの報告書に述べるように、レーザの局所的な加熱効果による理論を提示して一応の完結を見た。その後このテーマの実験的発展は世界的に停滞していて、理論のみが先走りすることは意義が薄れてきたと判断して、継続的に研究している状況である。第二のテーマについては現実的に観測されている事実の詳細な理論的検討の結果、当初予想していた対流の痕跡ではなく荷電した膜の電気的斥力エネルギー効果により、ナノレベルの規則構造が生じるという結論を得て論文として報告した。この当初の研究課題自体より掘り下げる内容が多くあるが、これは将来の問題として残した。この膜系の話題と問題点は多岐で複雑であり、さらに研究の展開と広がりを求めることも重要である。そこで以前から名古屋大学理学部の宝谷研究室で観測されていた、球状脂質2分子膜の蛋白質分子(タリン)の添加によるカップ状ベシクルへの形状相転移の解明に取り組んだ。カップ状ベシクルを割球として近似して、蛋白質のカップの縁への吸着平衡と力学的釣り合いを分かりやすく解析して報告した。この問題は割球近似が局所的な力学的釣り合いを満たしていないので、今後の研究課題として継続研究していることを報告する。例えば、モンテカルロ法による数値計算によって現実に観測されている形を再現する解析を実行中であり、その一部は国際会議(ロンドン、2001)で報告した。麻酔現象は麻酔分子の膜への吸着を通じてその効果を支配しているという仮説に基づいて、ブルガリア科学アカデミーのPetrov教授と共に考えて共同研究を進めた。その結果、神経膜の外側の単分子膜に麻酔分子が吸着することにより、神経膜のイオンチャンネル開閉の確率を有為に変化させうることを計算した。要点は麻酔効果が非特異的な物理化学現象であるという観測事実と、筆者等の膜内部の応力分布に対する推察によって結果を導いたが、直接観測できない膜の内部応力分布の変化が重要である例を示した。本科学研究費補助金を授与されたので、初年度の平成10年には理論計算用のパソコンを購入し、早速、宇都宮大学(加藤貞二教授也)の実験グループのラングミューア単分子膜上における、ナノスケールの規則的クラスター構造の原子間力顕微鏡によって観測結果の解析に着手した。

末崎は観測結果を検討した結果、この現象が当初予測したナノスケールの対流発生(ベナードセル)の可能性に疑問を持ち、竹生、一ノ瀬とも討論し、宇都宮グループとも討論、検討の結果、静電気相互作用によるクラスター形成の理論の可能性を考えた。早速、数値計算を実行して、その結果は論文として投稿中であり、平成10年11月の行われた国際会議“Slow Dynamics in Complex Systems"Abstract book p25,(Tohwa University)において口頭発表した。さらに次のプロジェクトとして、名古屋大学の実験グループ(宝谷教授他)の球状ベシクルが蛋白質分子の吸着により、カップ状に変形する実験の解析を開始した。力学的形状変化と分子的吸着挙動を、統一的に解析する数値計算を竹生、一ノ瀬と共に実行中である。宝谷教授とも研究討論して、この理論的予測モデルが実験事実の本質を再現することを確認しあった。そして、半定量的に実験事実をよく再現する理論解析の予備的結果を得て、この結果は平成11年2月に行われた国際集会Associating Polymer and Surfactant Systems-Microstructure and Macroscopic Properties-に口頭発表した。さらに理論と計算を精密にして学術雑誌への投稿を準備中である。(1)脂質膜の静的物牲に関する研究の一環として、宇都宮大学の加藤らによって観測された部分的にフッ素化されたカルボン酸の作る、2次元のラングミューア単分子膜でのナノクラスター形成要因について前年から研究していた。一様な分布によるカルボン酸の2次元膜上での静電気的反発エネルギーの損失と、クラスター形成によるラインテンションエネルギーの損失との拮抗で、一様なクラスター形成のサイズがきまるというモデルによる計算を遂行した。デバイ-ヒュッケル近似による静電気的反発エネルギーの数値計算の見積もりの結果は、観測されたナノクラスターのサイズをよく説明するものであった。この結果は論文1に発表した。(2)脂質2分子膜の作る水中の球状ベシクルに蛋白質分子タリンを加えると、コーヒーカップ状のベシクルに形態変化を起こすという、名古屋大学の宝谷らの観測結果を理論的に解析した。タリンは濃度依存的にカップの縁に吸着し、縁形成エネルギー(ラインテンション)と膜の曲げ弾性エネルギーの拮抗で、カップの縁の直径が変化するというモデルで観測事実を説明した。ラインテンションは吸着平衡によってきまることを統計力学的に示し、観測結果を説明することができた。この結果は論文2に発表した。(3)科学技術振興財団の佐野らによって観測された、アゾベンゼンカルボン酸のつくる2次元のラングミューア単分子膜でのテープ状会合体の、添加塩による凝集現象の理論的解析を現在進めている。(4)さらに膜融合の理論モデルとして、円筒状ベシクルから分裂して2つの球状ベシクルヘ形態変化を起こす系をモンテカルロ法によって解析するプロジェクトを進めている。(1)〈昨年度までに〉脂質2分子膜の作る水中の球状ベシクルに蛋白質分子タリンを加えると、コーヒーカップ状のベシクルに形態変化を起こすという、名古屋大学の宝谷らの観測結果を理論的に解析した。
齧歯類の網膜におけるメラトニン合成の制御機構

哺乳類では、光の受容は網膜、概日時計の場は視交叉上核が、松果体は内分泌器官としてメラトニンの合成分泌をするといった機能分化が行われていると考えられてきた。近年、齧歯類の網膜にも概日時計の存在が明らかにされたことから、齧歯類の網膜におけるメラトニン合成機構の解明を目的として、メラトニン合成能のないC57BLマウスとメラトニン合成能をもつC3Hマウスを用いて以下の研究を行った。網膜、松果体におけるメラトニン含量、メラトニン合成の律速酵素であるSNAT活性、HIOMT活性の変動を調べるための細胞破壊に際して12年度に設備備品として購入した超音波ホモジナイザーが必需であった。マウスは12L:12D光条件下で飼育し、24時間間隔で眼球と松果体のサンプリングをおこなった。各系統の松果体における結果は既に報告されているものと同様であった。網膜中のメラトニンに関しては測定値が検出限界付近と低く、通常の方法は適さず抽出方法などを工夫したが、さらなる検討が必要である。SNAT、HIOMT活性に関しては、C57BLが日周性を示さなかったのに対してC3H(+/+)では明期に低く、暗期の間ずっと高い値を示し松果体とは異なった変動のパターンであった。また、網膜異常系統であるC3H(rd/rd)の網膜では、両酵素ともに活性は検出限界近くで、視細胞層でメラトニン合成が行われていることが示唆された。以上の結果から、網膜におけるメラトニン合成の制御機構は松果体と異なっており魚類で近年報告されたように遺伝子のレベルで相違がある可能性も考えられた。本研究計画立案後にマウスのSNATをコードする遺伝子nat-2のクローニングが報告されたために当初の計画にあった同様の実験は行わなかったが、per,bmalなどの時計遺伝子も含めてmRNAの動態の比較など遺伝子レベルでの解析が重要である。哺乳類では、光の受容は網膜、概日時計の場は視交叉上核が、松果体は内分泌器官としてメラトニンの合成分泌をするといった機能分化が行われていると考えられてきたが、近年になって齧歯類の網膜にも概日時計の存在が明らかにされた。本研究では齧歯類の網膜におけるメラトニン合成機構の解明を目的として、メラトニン合成能のないC57BLマウスとメラトニン合成能をもつC3Hマウスを用いた遺伝学的および生理学的研究を行っている。in vivoの網膜におけるメラトニン含量、SNAT活性、HIOMT活性の変動を調べるために網膜組織の細胞を破壊するのに今回設備備品として購入した超音波ホモジナイザーが必需であった。各系統の松果体におけるメラトニン、SNAT活性の変動は既に報告されているものと同様であった。網膜中のメラトニンに関しては測定値が検出限界付近と低く、通常の方法は適さないことから現在、抽出方法などを検討中である。SNAT、HIOMT活性に関しては、C57BLが日周性を示さなかったのに対してC3Hでは明期に低く、暗期の間ずっと高い値を示し松果体とは異なった変動のパターンであった。さらに光の照射によるメラトニン合成の抑制が網膜ではほとんど認められなかった。以上のことから網膜におけるメラトニン合成の制御機構は松果体と異なっており遺伝子のレベルで相違がある可能性が考えられることからメラトニン合成の律速酵素であるSNATをコードする遺伝子nat-2とper,bmalなどの時計遺伝子のmRNAの動態の比較など遺伝子レベルでの今後の解析が重要である。

本研究計画立案後にマウスのSNATをコードする遺伝子nat-2のクローニングが報告されたために当初の計画にあった同様の実験は行わなかったが、per,bmalなどの時計遺伝子も含めてmRNAの動態の比較など遺伝子レベルでの解析が重要である。
日本古典籍分類概念表の確立と古典籍総合目録データベースにおける分類化促進

研究期間を通じて、「日本古典籍分類概念表」の一応の完成と、その冊子体による成果の公表に力を注いだ。また、その古典籍分類によるデータベース「日本古典籍総合目録」への適用実験を試みた。1.「日本古典籍分類概念表」の試案としての完成分類の諸部門について、専門研究者による研究発表を通じて検討を加えた。それらの成果を踏まえ、「日本古典籍分類概念表」を完成させ、冊子体「日本古典籍分類表〈試案〉」として公表した。2.「日本古典籍総合目録」への分類適用化の準備データベース「日本古典籍総合目録」で、「俳諧」に分類される約17,700点について、「日本古典籍分類概念表」に基づき、分類語の適用実験を行い、その結果を、冊子体「日本古典籍分類表〈試案〉」に「「日本古典籍総合目録」分類〔俳諧〕の検討-改正試案-」(研究支援者・金田房子)として収めた。3.国内外の古典籍所蔵機関の調査、研究国内の所蔵機関の日本古典籍の調査を実施した。また、海外の米国ハーバード大学燕京大学図書館の日本古典籍の調査を行った。本研究と併行して進めてきた日米共同研究の成果である「ハーバード燕京図書館の日本古典籍」には、未整理分の補遺目録の作成に当たり、「日本古典籍分類概念表」の適用が試みられるなど、本研究の成果が一部、反映されている。平成16年度は本研究の初年度として、「日本古典籍分類概念表」の確立に向けての検討作業を中心に、以下のように研究を進めた。1.「日本古典籍分類概念表」素案の確立日本古典籍の分類について、当時の書籍の実態に即した、『内閣文庫国書分類目録』等の独自分類を基に、多少の訂正を加えて「改正素案」を作成した。また、今年度は対象を文学領域に絞り、近世散文(仮名草子、咄本、実録、読本、草双紙、その他)について、研究会を通じ、具体的な作品を挙げながら、今日の研究状況を踏まえつつ、さらに踏み込んだ検討を加えた。2.「和古書目録」の分類化国文学研究資料館寄託の田安徳川家本約1千点について、その目録化事業に合わせ、分類作業に着手した。とくに、歴史、有職故実、文学、音楽、兵法、書道などの学芸書を核とする本蔵書の構成について、一部を売り払う以前の旧目録資料との照合を通じ、蔵書の全体像を想定しながら、分析、分類作業を進めた。3.「古典籍総合目録データベース」の分類適用化の準備国文学研究資料館で公開中の「古典籍総合目録データベース」の分類語付け替えに向けて、現在の分類語検索によって、不適当な分類語を析出し、適当な分類語への改正を試みた。4.国内外の古典籍所蔵機関の調査、会議国内の天理大学附属図書館、西尾市岩瀬文庫、八戸市立図書館等へ古典籍の出張調査を行い、海外のドイツ・ケルンのプルヴェラー家、米国フリーア美術館、英国リーズ大学等へ日本絵本類の出張調査を行った。平成17年度は、本研究の2年目として、「日本古典籍分類概念表」の整備と、「古典籍総合目録データベース」への分類語付与へ向けての検討を中心に進めた。この「日本古典籍分類概念表」の分類概念表は、ジャンル・様式に基づく件名(例、和歌・勅撰和歌集、近世小説・仮名草子)を基礎とする体系で、それを「古典籍総合目録データベース」に付与することによって、データベースの研究的質を高め、検索利用の多角化を図ることを目的とする。1.「日本古典籍分類概念表」素案の整備「日本古典籍分類概念表」の整備のため、既作成の「改正素案」を基に、文学の散文を中心とした、昨年度の検討に続き、今年度は文学の和歌、連歌・俳諧、及びそれ以外の準漢籍、医書等の領域について検討を加えた。検討に当たっては、専門家の意見を参考にしながら、研究者利用と一般利用の両方を念頭において作業を進めた。2.国文学研究資料館寄託資料の分類化1で検討中の「日本古典籍分類概念表」の適用実験として、国文学研究資料館寄託の田安徳川家約1千点について、その冊子体目録化事業に合わせ、緩やかに適用を試みた。

3.「古典籍総合目録データベース」の分類適用化の準備1の検討と併行して、国文学研究資料館で公開している「古典籍総合目録データベース」の分類(件名)語の付与に向けて、現行の分類語を析出し、「日本古典籍分類概念表」による改正を検討した。4.国内外の古典籍所蔵機関の調査、会議国内の洛東遺宝館(京都)、内藤記念くすり博物館(岐阜県各務原市)、MOA美術館等へ古典籍の現地調査を行い、海外の米国フリーア美術館、UCLA東アジア図書館、ハーバード大学燕京図書館などへ古典籍の現地調査を行った。平成18年度は、本研究の3年目として、「日本古典籍分類概念表」の検討と、「日本古典籍総合目録(旧古典籍総合目録データベース)」への分類語付与へ向けての検討を中心に進めた。この「日本古典籍分類概念表」は、内容とジャンル・様式を基準とする件名(例、和歌・勅撰和歌集、近世小説・仮名草子)による体系で、それを「古典籍総合目録データベース」に付与することによって、データベースの研究的質を高め、検索利用の多角化を図ることを目的とする。1,「日本古典籍分類概念表」素案の検討「日本古典籍分類概念表」の整備のため、既作成の「改正素案」を基に、昨年度までの検討に続き、今年度は総記、神道、仏教、言語、音楽・演劇、歴史、地理、政治・法政、経済、教育、準漢籍などの領域について検討を加えた。検討に当たっては、計10回の研究会を開き、外部を含む専門家を招いて、その意見を参考にしながら進めた。2,「日本古典籍総合目録」の分類適用化の準備1の検討と併行して、国文学研究資料館で公開している「日本古典籍総合目録」の分類(件名)語の付与に向け、俳書について、現行の分類語を析出し、「日本古典籍分類概念表」による改正を検討した。3,国内外の古典籍所蔵機関の調査、研究国内の富加町郷土資料館(岐阜県)、柿衛文庫(伊丹市)、天理大学天理図書館(奈良県)などへ古典籍の出張調査を行った。また、海外の米国フリーア美術館、ハーバード大学燕京図書館、ボストン美術館などへ古典籍の出張調査を行った。特に、燕京図書館では、未整理分の日本古典籍について調査研究を実施し、「日本古典籍分類概念表」を緩やかに適用したリストの作成を進めた。そのアウトプットとして、当研究を包含する形で、19年度に単行書を刊行する予定である。平成19年度は、本研究の最終年度として、「日本古典籍分類概念表」の一応の完成と、その冊子体による成果の公表に力を注いだ。また、その古典籍分類によるデータベース「日本古典籍総合目録」への適用実験を試みた。1.「日本古典籍分類概念表」の試案としての完成前年度までの経過に基づき、本年度も産業・芸術、諸芸、武学・武術部門の検討のほか、とくに医学の本草書、ならびに理学の暦書について、専門研究者による研究発表を通じて検討を加えた。それらの成果を踏まえ、「日本古典籍分類概念表」を完成させ、冊子体「日本古典籍分類表<試案>」として公表した。2.「日本古典籍総合目録」への分類適用化の準備データベース「日本古典籍総合目録」で、「俳譜」に分類される約17,700点について、「日本古典籍分類概念表」に基づき、分類語の適用実験を行い、その結果を、冊子体「日本古典籍分類表<試案>」に「「日本古典籍総合目録」分類〔俳譜〕の検討-改正試案-」(研究支援員・金田房子)として収めた。3.国内外の古典籍所蔵機関の調査、研究国内の香川大学附属図書館、長崎県立図書館などの日本古典籍の調査を実施した。また、海外の米国ハーバード大学燕京大学図書館の日本古典籍の調査を行った。
母乳中ケモカインCCL25が有する新生児期の骨形成促進効果のメカニズム

申請者らのグループは、胸腺および小腸における免疫に関与するケモカインCCL25が乳汁に含まれることを明らかにし、人工哺育実験系によりCCL25が乳幼児期における免疫器官の発達と骨成長を促進する効果をもつことを示した。CCL25が骨組織に与える影響をさらに知るため、CCL25遺伝子欠損マウスを用いて研究を進めた結果、10日齢マウスでは骨格異常等は認められず、大腿骨および脛骨の長さにも大きな差は認められなかった。さらに組織学的な検討を行ったが、野生型と比較して明確な差異は認められなかった。一方で、10週齢マウスにおいては骨格異常および長管骨の長さには大きな差は認められなかったものの、野生型と比較してカテプシンK陽性の破骨細胞数が増加していた。最終年度ではCCL25遺伝子欠損マウスの骨組織での表現型をさらに深く解析した。マイクロCTを用いた骨形態計測を行った結果、10週齢の遺伝子欠損マウスでは骨密度、骨梁数、骨梁幅の有意な増加と骨梁間隙の有意な減少が観察された。すなわち、CCL25遺伝子は成獣期においては骨量を抑制的に調節することが示唆された。骨形成への影響を知るため、Osterix陽性の骨芽細胞数を計測した結果、野生型と大きな差はなかった一方で、アルカリホスファターゼ陽性領域は大きく拡大し、また、血中のGla型オステオカルシン濃度も増加していたことから、骨芽細胞数は増加していないものの、骨形成能が更新している可能性が示唆された。骨吸収に対する影響を知るため、TRAP染色による骨吸収領域を比較した結果、野生型と明確な差は見られなかったことから、破骨細胞マーカーであるカテプシンK陽性細胞は増加する一方で、骨吸収領域は大きく拡大していないと考えられた。以上の結果より、成獣期マウスにおけるCCL25は骨形成を抑制することにより骨量を低下させる働きがあることが示唆された。当初の予定通り、人工的に調整したミルクを用いて生後2日マウスを8日間哺育することによりCCL25投与群と非投与群のマウスから大腿骨および脛骨を採取することに成功した。採取した脛骨および大腿骨の重量および長さを計測した結果、CCL25投与群で有意に重量および長さが増加していた。このことから、乳汁中のCCL25が乳幼児期マウスの長軸方向への骨成長を促進する可能性が示唆された。さらに、脛骨について形態計測を行った結果、CCL25投与群は骨量、骨密度、骨梁数が減少し、骨梁間隔が増加する傾向が認められた。さらに、遺伝子発現を検討した結果、CCL25投与により骨芽細胞マーカーおよび破骨細胞マーカーの発現がともに上昇していた。また、組織学的に単位面積当たりの骨芽細胞数および破骨細胞数を計測した結果、骨芽細胞、破骨細胞ともに細胞数の増加が認められた。以上のことから、CCL25の投与は骨形成および骨吸収の両方を活性化し、長軸方向への成長を促進することが予想される。さらに、野生型マウスの骨組織におけるCCL25およびその受容体CCR9の遺伝子発現を検討した結果、生後0日から10日にかけて両遺伝子の発現を検出した。このことから、骨組織形成において、これらのタンパク質が何らかの役割を担っていることが考えらえる。さらに、CCR9のタンパク局在を免疫組織学的手法により検索した結果、生後0日、5日、10日マウスともに、CCR9は骨組織中の広範囲にわたって局在を示すシグナルが観察されるが、特に、破骨細胞にその局在が比較的強く認められた。このことから、CCL25のシグナルを破骨細胞が受け取ることが、骨組織形成に何らかの影響を及ぼすことが予想された。当初の予定通り、生後2日から8日間、CCL25の有無のみ異なる人工ミルクを投与して乳幼児期マウスを哺育することに成功した。さらに、これらのマウスの骨組織の重量・長さ、骨芽細胞および破骨細胞の細胞数、遺伝子発現、骨密度、骨梁数などのパラメータを比較することができ、母乳中に含まれるCCL25は骨成長を促進する可能性を示すデータを得ることができた。したがって、当初の予定通りの成果が得られていると判断している。さらに、頭蓋骨から骨芽細胞を採取することにも成功しており、今後はCCL25の投与や分泌量の変化を検討することにより、CCL25が骨芽細胞の機能に与える影響についてさらに検討を加える予定である。ケモカインCCL25は胸腺および小腸において免疫に影響を与えることが示されてきた。申請者らのグループはCCL25が乳汁に含まれることを明らかにし、さらに、CCL25を含有した人工乳による人工哺育実験系を確立し、母乳中CCL25が免疫器官の形成を促進することを示唆してきた。しかし、乳幼児の骨形成に与える影響についてはこれまで明らかになっておらず、母乳中ケモカインが骨形成に重要な因子か検討することとした。これまでに、CCL25を含有した人工乳を用いた人工哺育の結果から、対照群と比較して大腿骨の骨長、破骨細胞および骨芽細胞の細胞数、遺伝子マーカーの発現量が増大することを明らかにしてきた。一方で、マイクロCTによる骨形態計測には明確な変化は認められなかった。そこで、今年度は人工哺育期間の延長を試みたが大変困難であり、10日間以上の哺育期間の延長はできなかった。そこで、人工哺育と並行してCCL25遺伝子欠損マウスを用いて解析を行った。

その結果、10日齢マウスでは骨格異常等は認められず、大腿骨および脛骨の長さにも大きな差は認められなかった。さらに組織学的な検討を行ったが、野生型と比較して明確な差異は認められなかった。一方で、10週齢マウスにおいては骨格異常および長管骨の長さには大きな差は認められなかったものの、野生型と比較して破骨細胞数の増加および成長板軟骨の縮小が認められた。この結果は、CCL25遺伝子は成獣マウスの骨形成において、破骨細胞分化の抑制および成長板の形成促進または肥厚化に関わることを示唆している。本年度は、母乳中CCL25の骨成長に対する効果を明らかにするため、人工哺育期間を延長して離乳まで飼育することを試みた。しかし、死ぬマウスが続出したため、10日間以上の人工哺育は大変困難であった。そこで、人工哺育の条件検討と並行してCCL25遺伝子欠損マウスを用いて解析を行った。CRISPR/Cas9により全身性にCCL25遺伝子を欠損したマウスは形態形成に大きな異常はなく、繁殖可能であった。10日齢および10週齢マウスの脛骨および大腿骨を採取してその長さを計測した結果、明確な差は認められなかった。さらに、脛骨の薄切切片を作成してカテプシンKのタンパク局在を指標に破骨細胞数を計測した。その結果、10日齢では明確な差は認められなかったものの、10週齢では単位当たりの破骨細胞数が有意に増加していた。さらに、アルシアンブルー染色により軟骨組織を染色して成長板軟骨領域を野生型マウスと比較した結果、野生型マウスと比較して有意に減少していた。以上の結果から、CCL25遺伝子は成獣マウスにおいて破骨細胞の分化抑制と成長板形成または肥厚化の促進により骨成長を促進している可能性が考えられた。申請者らのグループは、胸腺および小腸における免疫に関与するケモカインCCL25が乳汁に含まれることを明らかにし、人工哺育実験系によりCCL25が乳幼児期における免疫器官の発達と骨成長を促進する効果をもつことを示した。CCL25が骨組織に与える影響をさらに知るため、CCL25遺伝子欠損マウスを用いて研究を進めた結果、10日齢マウスでは骨格異常等は認められず、大腿骨および脛骨の長さにも大きな差は認められなかった。一方で、10週齢マウスにおいては骨格異常および長管骨の長さには大きな差は認められなかったものの、野生型と比較してカテプシンK陽性の破骨細胞数が増加していた。最終年度ではCCL25遺伝子欠損マウスの骨組織での表現型をさらに深く解析した。マイクロCTを用いた骨形態計測を行った結果、10週齢の遺伝子欠損マウスでは骨密度、骨梁数、骨梁幅の有意な増加と骨梁間隙の有意な減少が観察された。すなわち、CCL25遺伝子は成獣期においては骨量を抑制的に調節することが示唆された。骨形成への影響を知るため、Osterix陽性の骨芽細胞数を計測した結果、野生型と大きな差はなかった一方で、アルカリホスファターゼ陽性領域は大きく拡大し、また、血中のGla型オステオカルシン濃度も増加していたことから、骨芽細胞数は増加していないものの、骨形成能が更新している可能性が示唆された。骨吸収に対する影響を知るため、TRAP染色による骨吸収領域を比較した結果、野生型と明確な差は見られなかったことから、破骨細胞マーカーであるカテプシンK陽性細胞は増加する一方で、骨吸収領域は大きく拡大していないと考えられた。
気分・情動に対する成体脳神経細胞新生の役割の解析

脳室下層や海馬における神経幹/前駆細胞から産生される細胞と気分・情動との連関の有無を検討するとともに、細胞新生を調節することによって気分や情動を制御することが可能かどうかを検証することを目的として本研究を行った。その結果、(1)慢性ストレス下の成体マウスの脳では神経幹細胞数が減少し、抗うつ薬の投与によって回復すること、(2)気分安定薬が神経幹細胞においてを活性化し、自己複製能を高めることを明らかにし、(3)テトラサイクリン誘導システムを用いて神経幹細胞の数を制御できるシステムを開発した。これらの成果は、精神神経疾患の病態解明や治療法開発に寄与できると考えられる。哺乳類の成体脳における神経幹細胞およびそれから産生される新生神経細胞は、ある種の記憶や(齧歯類では)嗅覚機能との関係が示唆されている。また、ストレス下や逆に変化に富む環境で神経幹細胞の数が変動することから、気分・情動に深く関与していると考えられている。本研究は、脳室下層や海馬における神経幹/前駆細胞から産生される細胞と気分・情動との連関の有無を検討するとともに、細胞新生を調節することによって気分や情動を制御することが可能かどうかを検証することを目的とする。平成19年度は、Olig2-CreER,GFAP-CreER,Nestin-CreERなどの遺伝子改変マウスを用い、細胞培養とBrdUによる分裂細胞標識とを組み合わせることにより、神経幹/前駆細胞の分布・運命決定のタイミングなどを詳細に解析した。その結果、Nestin陽性(成体脳ではGFAP陽性)の神経幹細胞から分化するOlig2陽性細胞が多能性を維持しつつも、終生にわたって維持されるという幹細胞特有の性質を喪失していることや、成体脳でのオリゴデンドロサイトの発生時期や領域特異性についての知見が得られた。これらの成果は、脳辺縁系の細胞構成および機能についての理解を深め、発達期の細胞分化の異常と脳機能障害、特に精神疾患との関連を考える基礎データとなると考えられる。一方、テトラサイクリン存在下でNotchシグナルの活性を制御できるトランスジェニックマウスシステムの作製を行った。具体的には、神経前駆細胞特異的にテトラサイクリン依存性転写活性化因子を発現するマウスラィンと、テトラサイクリン存在下で転写が活性化するプロモーターの下流に活性型Notchをつないだマウスラインとを作製した。平成20年度以降にこれらのラインを交配し、神経幹細胞数の増減と動物の行動、特に情動に根ざした行動との関連を解明する予定である。昨年度までに、Olig2-CreER,GFAP-CreER,Nestin-CreERなどの遺伝子改変マウスを用い、細胞培養とBrdUによる分裂細胞標識とを組み合わせることにより、神経幹/前駆細胞の分布・運命決定のタイミングなどを詳細に解析した。本年度は、テトラサイクリン存在下でNotchシグナルの活性を制御できるトランスジェニックマウスシステムの作製を行った。具体的には、神経前駆細胞特異的にテトラサイクリン依存性転写活性化因子を発現するマウスラインと、テトラサイクリン存在下で転写が活性化するプロモーターの下流に活性型Notchをつないだマウスラインとを作製し、これらのラインを交配して神経幹細胞数の増減を解析した。その結果、神経幹細胞の数がNotchシグナルの強度と密接に関係していることが確認された。今後は、これらのマウスを用いて、Notchシグナル活性の変化に対応する動物の行動、特に情動に根ざした行動の変化を解明する予定である。哺乳類の成体脳における神経幹細胞およびそれから産生される新生神経細胞は、ある種の記憶や嗅覚機能との関係が示唆されている。

本研究は、脳室下層や海馬における神経幹/前駆細胞から産生される細胞と気分・情動との連関の有無を検討するとともに、細胞新生を調節することによって気分や情動を制御することが可能かどうかを検証することを目的とする。昨年度までに、Olig2-CreER,GFAP-CreER,Nestin-CreERなどの遺伝子改変マウスを用い、細胞培養とBrdUによる分裂細胞標識とを組み合わせることにより、神経幹/前駆細胞の分布・運命決定のタイミングなどを詳細に解析した。また、テトラサイクリン存在下でNotchシグナルの活性を制御できるトランスジェニックマウスシステムの作製を行った。本年度は、Olig2-CreERおよびNestin-CreERマウスの解析から、Nestin陽性(成体脳ではGFAP陽性)の神経幹細胞から分化するOlig2陽性細胞が多能性を維持しつつも、終生にわたって維持されるという幹細胞特有の性質を喪失していることを明らかにし、この性質を活用して成体大脳皮質のオリゴデンドロサイトの発生時期や領域特異性を特定した。さらに、神経前駆細胞特異的にテトラサイクリン依存性転写活性化因子を発現するマウスラインと、テトラサイクリン存在下で転写が活性化するプロモーターの下流に活性型Notchをつないだマウスラインとを交配し、テトラサイクリンの有無による神経幹細胞数の増減を解析した。その結果、神経幹細胞の数がNotchシグナルの強度と密接に関係していることが確認された。
薬物治療におけるCYP2C19遺伝子多型の臨床的有用性の検討

CYP2C19には遺伝子多型が認められており、poor metabolizer(PM)が日本人では約15-20%と、欧米の2-4%に比較し、10倍程度その頻度は大である。このため、CYP2C19遺伝子多型情報の臨床的有用性について検討するのが本研究の目的である。プロトンボンプ阻害薬のomeprazole(OPZ)はCYP2C19の基質であり、H.pyloriは除菌治療の中心薬剤である。本研究は、全て浜松医科大学倫理委員会の承認のもと、文書同意を得て実施した。研究1:PCR-法によりCYP2C19genotypingを行った16名の健常志願者を対象とした。OPZ20mgを早朝空腹時に1回経口投与し、24時間胃内pHモニタリングにより胃酸分泌抑制作用を検討した。また、血中OPZ及びその代謝物濃度、血清gastrin値についても経時的に測定した。胃内pHはOPZ投与後PM群で、著しい上昇が認められ、hetEM群、homEM群の順に胃酸分泌抑制作用を認めた。血清gastrin値も同様にPM群で有意の上昇を認めた。血中opz濃度はPM群、hetEM群、homEM群の順に高値を示し、血中OPZ濃度一時間曲線下面積(AUC)とOPZ投与後の平均胃内pH直とは有意の相関を示した。本研究よりOPZの薬物動態及び薬力学は遺伝子多型に依存することが認められた。研究2:H.pylori除菌に対するCYP2C19遺伝子多型の有用性について検討した。対象はH.pylori陽性でH.pylori除菌が治療上有効であると考えられた上部消化管潰瘍患者62名(PM群=9名、hetEM群=25名、homEM群=28名)である。0PZ20mgを胃潰瘍では8週間にわたり、十二指腸潰瘍では6週間にわたり投与し、同時にamoxicillin2000mg/日を2週間にわたり投与した。治療終了後に尿素呼気試験等によりH.pyloriの除菌判定を行った。結果はPM群では100%の除菌率に達したが、hetEM群では60.0%、homEM群では28.6%とOPZとamoxicillinの除菌結果は明らかにCYP2C19遺伝子多型に依存していた。この機序は遺伝子多型に従ってOPZの血中濃度の上昇が起こり、著明な胃酸分泌抑制作用によると考えられた。これらよりCYP2C19遺伝子多型情報をもとに安全性、経済性に優れたH.pylori除菌効果の高いPPIの投与計画を決定することが可能である。

本研究はCYP2C19の遺伝子多型情報がプロトンポンプ阻害薬(PPI)omeprazole(OPZ)の治療効果を予測し、個別的な投与計画を確立することが可能か検討する目的で行った。研究1:PCR-法によりCYP2C19のgenotypingを行った16名の健常志願者を対象とした。OPZ 20mgあるいはplaceboを早朝空腹時に投与し、24時間胃内pHモニタリングにより胃酸分泌抑制作用を検討した。また、血中OPZ及びその代謝物濃度、血清gastrin値についそ経時的に測定した。胃内PHはOPZ投与後PM群で、著しい上昇が認められ、hetEM群、homEM群の順に胃酸分泌抑制作用を認めた。血清gastrin値も同様にPM詳で有意に上昇した。OPZの血中濃度はPM群、hetEM群、homEM群の順に高値を示し、血中OPZ濃度一時間曲線下面積(AUC)とOPZ投与後の平均胃内pH値とは有意の相関を示した。OPZの薬物動態及び薬力学は遺伝子多型に依存することが認められた。研究2:H.pylori除菌に対するCYP2C19遺伝子多型の有用性について検討した。対象はH.pylori陽性でH.pylori除菌が治療上有効であると考えられた上部消化管潰瘍患者62名(PM群=9名、hetEM群=25名、homEM群=28名)である。OPZ 20mgを胃潰瘍では8週間にわたり、十二指腸潰瘍では6週間にわたり投与し、同時にamoxicillin 2000mg/日を2週間にわたり投与した。治療終了後に尿素呼気試験等によりH.pyloriの除菌判定を行った。結果はPM群では100%の除菌率に達したが、hetEM群では60.0%、homEM群では28.6%とこれら3群間に有意の差をみとめた。この結果はPM群ではOPZの血中濃度の上昇に件い、著明な胃酸分泌抑制作用によると考えられた。以上より、CYP2CI9遺伝子多型の情報は個別的なH.pyloriの除菌療法の投与計画に有用であると考えられる。CYP2C19には遺伝子多型が認められており、poor metabolizer(PM)が日本人では約15-20%であり、欧米の2-4%に比較し、10倍程度存在する。CYP2C19の基質であるプロトンポンプ阻害薬のomepraqzole(OPZ)を本研究の対照薬として用い、浜松医科大学倫理委員会の承認のもと、被験者の文書同意を得てCYP2C19には遺伝子多型の臨床的有用性を実施した。OPZ20mgを早朝空腹時に1回経口投与し、24時間胃内pHモニタリングにより胃酸分泌抑制作用を検討した。また、血中OPZ及びその代謝物濃度、血清gastrin値についても経時的に測定した。胃内pHはOPZ投与後PM群、hetEM群、homEM群の順に胃酸分泌抑制作用を認めた。血清gastrin値も同様の傾向であった。血中OPZ濃度はPM群、hetEM群、homEM群の順に高値を示し、血中OPZ濃度-時間曲線下面積(AUC)とOPZ投与後の平均胃内pH値とは有意の相関を示した。本研究よりOPZの薬物動態及び薬力学は遺伝子多型に依存することが認められた。対象はH.pylori陽性でH.pylori除菌が治療上有効であると考えられた上部消化管潰瘍患者62名(PM群=9名、hetEM群=25名、homEM郡=28名)である。OPZ20mgおよびamoxicillin 2000mg/日を2週間にわたり投与した。
軽い右巻きニュートリノの宇宙物理と実験検証

素粒子標準模型の抱えるニュートリノ質量、宇宙暗黒物質、および宇宙バリオン数の問題を同時に解決する可能性として、新しい素粒子、「電弱スケールよりも軽い右巻きニュートリノ」に着目した。特に、この粒子の実験による検証可能性について検討を行った。今年度は科研費のサポートを受け研究が進展し、合計6編の論文を発表した。内訳は、査読付き論文に発表済みが3編、論文に投稿中が2編、会議紀要が1編が1編である。また研究成果は、国内外の研究会で多数発表してきた。特に、国際会議2回を含む計4回、招待講演を行った。注目すべき研究成果としては、J-Parc加速器にて計画されているCOMET実験において軽い右巻きニュートリノを探索する手法を提案した。COMET実験は、大強度ミューオンを用いてレプトンフレーバーを変えるミューオン電子転換過程を探索する実験である。本研究では、この実験装置をそのまま用い、質量が1MeVから100MeVの右巻きニュートリノを探索する方法を提示した。この領域であるとCOMET実験において大量に生成するミュー粒子の崩壊から右巻きニュートリノが生成可能である。さらに、1MeVよりも重いと右巻きニュートリノはニュートリノと電子対へ崩壊する。この電子対の発生をシグナルとした。我々の解析から、COMET実験での右巻きニュートリノの感度は、CERNでのPS191実験が制限した領域と同程度であり、これまで未探索の領域まで達することが判明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題が目指す「軽い右巻きニュートリノ」の実験・観測による探索について研究を行った。第一の成果として、「軽い右巻きニュートリノ」が引き起こすK中間子崩壊におけるレプトンユニバーサリティの破れの大きさを評価し、今後の実験探索精度との比較を行った。その結果、J-PARCなどで行われる実験により理論の予言する破れを見出す可能性があることを示した。本結果については、査読付論文、および国際会議の招待講演では発表した。第二の成果として、CERNのSPS加速器を用いたSHiP実験計画での「軽い右巻きニュートリノ」探索についても検討した。SHiP実験では、D中間子から生成される「軽い右巻きニュートリノ」の崩壊を探索する。我々は、SHiP実験で探れる物理をまとめた論文作成に携わった。特に、「軽い右巻きニュートリノ」の物理についての章を担当した。完成した論文は、eprint-arxivへ投稿した。また、現在着手中の研究として以下の2つがある。(1)地球大気で生成された「軽い右巻きニュートリノ」の探索方法の確立。(2)SuperKEKB実験などの高エネルギー加速器実験での「軽い右巻きニュートリノ」探索方法の確立。これらのテーマについては、研究協力者の渡邊篤史氏、および新潟大学の大学院生と共同研究を実施している。今年度「軽い右巻きニュートリノ」が引き起こすK中間子崩壊におけるレプトンユニバーサリティの破れ、およびCERNにおけるSHiP実験計画での「軽い右巻きニュートリノ」探索についての成果を論文として発表できた点は、当初研究計画と比較すると順調に研究が進展している点として評価できる。また、国内外の数多くの会議において招待講演などを行い、本研究成果を発表できた点は、本研究課題のもつ重要性を積極的に発信できた点として評価できる。ただし、現在着手中の2つのプロジェクト(1)地球大気で生成された「軽い右巻きニュートリノ」の探索方法の確立。については、研究に若干の遅れが生じ、年度内に論文として発表できなかったため、改善点としてあげられる。今後の研究の推進方策としては、まず第一に、以下に示す現在着手中のプロジェクト2つを早急に完成し、論文として発表する。

本課題については、先行研究で見落とされていた大気中でのK中間子崩壊からの「軽い右巻きニュートリノ」の生成の効果を取り入れ、さらにハイパー神岡実験やIceCUBE実験での探索について検討する。(2)SuperKEKB実験などの高エネルギー加速器実験での「軽い右巻きニュートリノ」探索方法の確立。本課題については、B,D中間子やタウレプトンなどの崩壊から生成される「軽い右巻きニュートリノ」の検出方法を総括的に調査する。以上の結果をまとめることにより、「軽い右巻きニュートリノ」探索の最適方法を見出すことに挑戦する。次なるステップとして、レプトンセクターにおけるCP対称性の破れと「軽い右巻きニュートリノ」の物理について研究を行う。特に、「軽い右巻きニュートリノ」のCP対称性の破れが宇宙バリオン数とどのような相関関係にあるのかを見出す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
移植腎グラフトにおける抗体抵抗性生存シグナル誘導による慢性拒絶反応の予防

DSAの種類によって予後経過が異なることから、免疫順応という概念が生まれた。申請者らは少量のHLA抗体接着であればHO-1やFerritinといった細胞保護遺伝子が誘導されること、さらに内皮細胞の活性化に関与するERK分子の不活性化と補体制御因子の誘導がAB抗体接着で引き起こされることを明らかにしてきた。また、ABO不適合移植患者では適合患者と比べHLA class II DRに対するde novo DSAの出現頻度が少ないこと、in vitroではanti-A/B抗体接着は、内皮細胞においてHLA class DRの発現を低下させることを最近明らかにし報告した。DSA産生は慢性型拒絶反応の原因である。一方、我々の施設ではリツキサンや血漿交換を行わなかったABO不適合移植23例中において1例(4.3%)、処置を行ったABO不適合移植68例中4例(5.9%)、ABO適合移植266例中28例(10.5%)でDSAが産生されていた。つまり、移植前の抗体除去とDSA産生に強い相関関係が無かった。DSA産生は内皮細胞上のHLA抗原の発現と、それを標的とした免疫応答が一因であるため、本研究では内皮細胞におけるAB・HLA抗体接着によるHLA抗原の発現について検討した。IFNg刺激により、HLA-cぁssI/IIの発現は上昇した。HLA class I抗体接着では低濃度では細胞保護シグナルが上昇することを見出していたが、HLA class I抗原の発現が高値の場合いかなる濃度でもそれを確認することはできなかった。一方A/B抗体接着時にはIFNg刺激によるHLA抗原の発現が減少しており、抗体関連型の補体障害が上昇した。現在このメカニズムに関して詳細に検討している。当初の予定通り、anti-A抗体接着による炎症状態化での影響を見ることができた。禁忌と言われた血液型・HLA不適合移植が良質な免疫抑制剤を背景に行われ、腎移植後の短期生着率は95%を超える。現在は濾胞性T細胞(Follicular Helper T-cell; Tfh)とB細胞の関与するde novo DSA (Donor Specific Antibody)による抗体関連型拒絶反応(AMR; Antibody Mediated rejection)の克服と、免疫抑制剤の長期服用による副作用軽減が課題となっている。AMRを回避するために申請者は免疫順応(移植臓器に対する抗体が存在するにもかかわらず、移植臓器が傷害をうけない状態)における内皮細胞応答の重要性について研究してきた。異種移植、ABO血液型不適合移植で免疫順応が臨床の現場から報告されているが、現段階ではその本質はつかめていない。腎移植においてHLA不適合腎臓移植ではDSA産生と拒絶反応は相関があるが、ABO不適合移植では必ずしも連動しない。申請者らは少量のHLA抗体接着であればHO-1やFerritinといった細胞保護遺伝子が誘導されること、さらに内皮細胞の活性化に関与するERK分子の不活性化と補体制御因子の誘導がAB抗体接着で引き起こされることを明らかにした。mTOR阻害剤によりHLA DRの発現制御が可能になったことから、移植領域で使用される様々な薬剤について今後は検討する。さらに2016年度はanti-A抗体接着下での遺伝子発現について、マイクロアレイ解析とプロテオミクスを施工する予定である。移植免疫今後は、このHLA発現抑制の詳細なメカニズムの解明を目指すとともに、Acommodationを引き起こす可能性のある薬剤の探索を試みる。2015年度において、新しい大学で研究室を立ち上げた。そのため、マイクロアレイやプロテオミクスなど当初予定していた実験予定をいくつか中止し、2016年度に持ち越す必要が出てきた。一方で、in vitro実験においては当初の予定よりその進行は進んでいる。移植1年後のプロトコールbiopsyサンプルを用いたアレイ解析に際し、詳細な症例検討を行ったところ、一つのグループで検体数を確保できないことが分かった。現在はすべてのグループで検体がそろいつつあり、これらを用いたmRNA/miRNAのアレイ解析をH27年に行うため、未使用額が生じた。2016年度は、マイクロアレイ・プロテオミクス解析を行う。特にプロテオミクス解析は新しい大学での準備を行うため、2016年度に余裕をもって実験ができるようにしている。in vitro内皮細胞にて免疫順応遺伝子・miRNAの発現メカニズムを解明する。我々が樹立したA/B糖鎖発現内皮細胞EA.hy926を用いる。miRNAの移入・阻害が免疫順応にどのような影響を与えるかについても検討するため、トランスフェクションの試薬等、消耗品に使用する。
マイクロチップ電気泳動によるタンパク質およびペプチドの高感度・高選択性分析法の開発

本年度11月末から研究を始めたばかりであるが、二つの実験を並行して進めている。マイクロチップ電気泳動を行うための準備段階としてキャピラリー電気泳動(CE)を用いて研究を進めている。一つはCEを利用した溶液中での結合定数の測定法に関する研究である。結合定数、とくにタンパク質と薬物との結合定数の測定法は種々報告され、また広く利用されている。CEによる結合定数決定法としては主にアフィニティー電気泳動が利用されている。この方法は、試料消費量が少ない、純粋な試料が必要ではない、短時間で測定可能等の利点がある。一方、結合平衡が迅速に成り立つ必要がある。それに比べて、先端分析CEでは平衡状態にある溶液を電気的に連続的にキャピラリー内に導入して行う方法で、目的試料の結合体と非結合体の濃度を正確に測定できるのが特徴である。マイクロチップ電気泳動では分離時間が短く、使用する溶液量も少ないので先端分析法が適していると考えられる。そのために、CEによる予備実験を行った。UV吸収のない化合物の結合定数は普通のCE装置では検出ができないので間接的測定法を開発した。シクロデキストリン(CD)との結合定数測定をモデルにして実験を行った。CDとナフタリンスルホン酸(NSA)との混合物を用いて先端分析CEにより結合定数を測定した。次に、CDとNSAの混合物にさらに結合定数を測定しようとする化合物(たとえばフェノール)を添加して、CDに対してNSAとフェノールとを競争的に結合させ、NSAの結合定数を測定すると、計算からフェノールの結合定数も算出可能であることを実証した。もう一つの実験はタンパク質のCE-MS分析に関する研究で、ペプチドの電気泳動移動度はその等電点(pI)により大きく変化する特性を利用して、試料溶液のpHを最適化するとスルホン化ペプチドのみを他のペプチドから選択的にキャピラリーに電気的に濃縮導入することができることをCE-MSにより実証中である。
階層的集合振動体としての生物時計機構のモデル化

脳の視交叉上核(SCN)のニューロンにおいて一群の遺伝子(時計遺伝子)が約24時間周期で発現の増減を繰り返していることが明らかになってきた。一方で、時計遺伝子は脳内の他の組織や体内の多くの組織にも発現している。SCNに存在するニューロン群は日周振動子の生理学的実体と考えられる。SCNの腹外側と背内側では、含有されるペプタイド、光感受性、入出力関係などが異なっていることから、少なくとも二つの異なる振動体が存在していると考えられる。SCN外や末梢に存在する振動機構はSCNとは独立した振動子を構成するものと考えられる。今年度は(1)時計遺伝子を含む振動機構をモデル化する基礎として、代表的なモデル化の枠組み、非線形転写制御フィードバックモデル(以下、Goodwin型モデルと呼ぶ)と振動子フィードバック型モデル、についてその外部入力に対する分岐特性を調べた。これより、Goodwin型モデルは1:1の引き込み領域が狭く、外力の強度が増した場合には他の周期比の引き込みに移行するか、引き込まれなくなった。振動子フィードバックモデルは広い1:1の引き込み領域を持ち、振動子自身の固有周期と外力の周波数がかけ離れていても外力が強ければ1:1で引き込んだ。このようなモデルの力学的な構造に依存した本質的な分岐構造の違いは、前提されることが多いが依然として仮説でしかない非線形転写フィードバックが日周リズムを作り出しているとする考えの妥当性を実験的に検証する手がかりを与えている。(2)SCNの大規模シミュレーションに向けて16ノードからなるクラスター計算機を構成した。現在数百程度のHodgkin-Huxley方程式を基幹としたネットワークをシミュレーションした結果、大規模シミュレーションに堪え得るものであることが示された。(3)行動レベルから振動子への適応的なフィードバックを有する位相振動子モデルを構成し、その妥当性をシミュレーションによって示した。フィードバックの必然性が示されたことで、生体リズムでは行動パターンが階層を越えて時計遺伝子を含む分子レベルの時計機構やその集合体における協同性に影響を与えていることが示唆された。これは階層的集合振動体として生体リズム機構を考えていく上での指針を与える。
肝臓の発生および肝幹細胞の分化・増殖における肝癌由来増殖因子HDGFの約割

1.肝細胞のprogenitor細胞の分化・増殖におけるHDGFの役割Oval細胞は肝細胞と胆管細胞に分化しうるbipotentailなprogenitor細胞の一つである。ラットのAAF/PHのOval細胞発現モデルを用いて、Western blotおよびNorthern blot解析にてHDGFの発現はOval細胞の出現と一致していた。抗HDGF抗体による免疫染色法(IHC)およびIn situ hybridization(ISH)法にてHDGFはOval細胞に発現していることを確認した。Western blotにてHDGF蛋白はラットOval細胞の培養株Oc15-5において多量に発現し、抗HDGF抗体によるIHCではOc15-5の核に強く染色され、細胞質にも染色が認められた。Oc15-5に対するrecombinant HDGF添加による細胞増殖促進効果は、Oc15-5の高増殖能およびHDGFの高発現により軽度であった。一方、内因性HDGFの発現抑制によりOc15-5の細胞増殖が抑制された。以上より、HDGFはOval細胞の自立増殖に深く関与していることが示唆された。また、PPARγ受容体のリガンドである15d-Prostaglandin(PG)J2およびciglitazone投与によりOval細胞の増殖が抑制されることを明らかにした。15dPGJ2によるOval細胞の増殖抑制には、HDGF発現の抑制が認められることより、HGDFの発現抑制も関与していた。アルブミンプロモーターを用いたHDGF transgenic(Tg)マウスを作製した。生後12週目の成体マウス肝では通常TOが発現誘導され、G6Paseの発現低下が認められるが、HDGF-Tgマウス肝ではTOは発現誘導されず、G6Paseは高発現を維持していることを明らかにした。HDGF過剰発現により成熟な肝細胞への分化が抑制される可能性が示唆されることを学会報告した。一方、NIH3T3細胞でのHDGF過剰発現によりヌードマウスにおいて腫瘍が形成されること、HDGFの発現がヒト肝癌の再発、生命予後に有意に関連していることを明らかにした。一部のHDGF-Tgマウスにおいて、18ヶ月の肝臓に腫瘍の発生が確認された。HDGFの持続的な高発現は肝腫瘍発生に深く関与していることが示唆された。3.マウス肝発生におけるHDGFの役割肝発生早期でのHDGFの発現をIHC及びISH法にて解析しているが、肝臓において高発現しているが、他の臓器との関連性については現時点では明確な結論を出し得ない状況であり、切片のきり方を工夫して再検討している。HDGFゲノムDNAの解析を行い、HDGFのプロモーター領域の解析を行っている。現在、HDGFノックアウトマウスを作製中である。1.肝細胞のprogenitor細胞における肝癌由来増殖因子HDGFの解析Oval細胞は肝細胞と胆管細胞に分化しうるbipotentialなprogenitor細胞の一つである。