hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA複製における岡崎フラグメントの非対称的分布は細胞分化と関連しているか

本研究では、シロイヌナズナの葉の発生過程で裏側化している細胞から表側細胞が分化する際の非対称分裂におけるETT遺伝子の非対称な発現抑制と親細胞のDNA複製における非対称性(リーディング鎖とラギング鎖複製という非対称性)との間に相関があるかどうかを調べた。そのために、わずかに表側化が阻害されているas2変異体に、両鎖それぞれの複製反応に関連している種々の遺伝子の変異を導入し、二重変異体を作成し、表側化の阻害の程度を調べた。その結果、ラギング鎖複製に関わる遺伝子変異の場合には、僅かに表側化が阻害され、複製の開始に関わる遺伝子変異などの場合には表側化とETT発現抑制が顕著に阻害されることがわかった。本研究では、シロイヌナズナの胚や葉形成の鍵となっている遺伝子の転写制御が、不連続的DNA複製という複製の非対称性(リーディング鎖として複製されるのか岡崎フラグメント(OF)として不連続的に複製されるのか)と関連しているかどうかを調べる。具体的にはまず、そのような鍵遺伝子に注目して遺伝学的にその可能性を検討する。さらに鍵となる遺伝子領域のOFをDNA鎖ごとにマップして転写方向との関連性を調べる。本年度は、OFの形成に関わる遺伝子の変異により鍵遺伝子であるWUS(幹細胞形成)、ETT/ARF3(葉原基形成)の転写レベルが影響を受けるかどうかを検討することにした。これらの遺伝子レベルの上昇や発現領域が変化すると、特徴的な葉の形態異常が観察され、表現型解析で転写レベルを推定できるからである。また、すでに我々の解析により、WUSはBOB1やFAS1遺伝子の変異により、ETT/ARF3はAS2遺伝子の変異により、転写レベルが若干上昇することがわかっている。WUSでは38キロ塩基、ETT/ARF3では3キロ塩基上流に複製起点がある。そこで、OFが蓄積されると期待される種々の遺伝子の変異を、bob1変異体とas2変異体に導入した。OFが蓄積されると期待される遺伝子変異体として、TEB (polymerase Iのホモログ)変異体、ICU2 (polymerase αのホモログ)変異体、AtLIG1A/B (ligaseホモログ)変異体を選び、bob1, fas1, as2変異体と交配した。現在までに二重変異体を含むと期待されるF2世代の種子を得た。今後、F2植物で、形態異常が亢進されるかどうかと転写レベルの変化を解析する予定である。OF形成に関わる遺伝子変異により異常が亢進されれば、OFが由来するDNA鎖とこれらの遺伝子転写の方向との間に相関がある可能性がある。初期葉原基では、まず葉の裏側化遺伝子が全体的に発現する。その後予定表側領域で表側遺伝子が発現し、表側部分が形成される。我々は、葉の表側分化にとって、裏側化遺伝子であるETT/ARF3が抑制される必要性を見いだした。この時に裏側因子が発現する細胞が非対称分裂により生まれ、一方の娘細胞でETTが抑制され、同時に表側遺伝子が発現するというモデルを立てた。本研究では、この非対称分裂におけるETT遺伝子の非対称な転写抑制と親細胞のDNA複製における非対称性(リーディング鎖とラギング鎖複製という非対称性)との間に相関があるかどうかを調べた。ETT遺伝子の3キロ上流に複製起点が存在するので、ETTはラギング鎖として複製されるDNA鎖を鋳型にして転写されることになる。まず(1)ラギング鎖合成に関わっている遺伝子の変異が、葉の表側分化を阻害するのか、またETTの発現抑制に影響するのかを調べた。(2)ETTの発現レベルと岡崎フラグメントの蓄積レベルとの相関を研究する計画であった。実験では、表現型が見やすいas2変異体に複製関連変異を導入し、二重変異体の表現型を観察した。8種類の複製関連遺伝子、ラギング鎖合成に関わるICU2 (ポリメラーゼα)、POLD (ポリメラーゼδ)、PCNA、RNASEH2A;FEN1(RNaseH),LIG1A/B(DNAリガーゼ)及びリーディング鎖合成に関わるPOLE(E1,E2:ポリメラーゼε)、両鎖の染色体複製に関わるFAS2遺伝子のT-DNA挿入変異体を解析した。その結果、fas2変異体では95%で表側化が阻害され、ICU2, POLD3, RNASEH2変異体においては1-10%の個体で抑制されることがわかった。この結果から、染色体複製は表側分化にとって極めて重要であり、またラギング鎖合成が適切に進行することも表側分化に関係していると考えられる。植物分子発生学少なくとも表現型の解析までは進む予定であったが、二重変異体の作成に予想以上に時間がかかり、十分に進んでいない。

大きな理由としては、アメリカ合衆国とイギリスからのT-DNA挿入変異体の入手に半年近くかかったことがあげられる。今後の研究の重要な材料であるF2種子がそろったので、表現型の解析により、細胞分化と不連続複製との関連性が予測できる実験を遂行できると期待している。表現型を観察すると同時に鍵遺伝子の転写レベルの解析も行う。さらに、計画に従い、岡崎フラグメント(OF)の蓄積量が上昇しているかどうか検討する。蓄積している多重変異体が得られれば、OFを抽出して次世代シーケンサーにより塩基配列を決定し、鍵遺伝子DNAのどちらのDNA鎖からOFが由来しているかを調べる。研究の出発材料であるシロイヌナズナの変異体をアメリカ合衆国とイギリスに発注していたが、到着が半年近く遅れたため、研究を進めることが困難であった。また、大学内の建物新築にともない実験温室の移転を余儀なくされたことも、研究の遅延の原因となった。表現型解析と鍵遺伝子の転写レベルの実験のための費用を次年度に繰り越した。研究の進展は半年遅れたが、多重変異体の作成は順調に進んできた。実験温室も矮小であるが借用できることになり、表現型解析と遺伝子発現解析をする準備ができた。今年度は、繰越した経費でこれらの実験を行い、これと平行して早急に分子遺伝学的実験により岡崎フラグメントが蓄積されている多重変異体を同定する実験をスタートさせて、遅れを取り戻したい。
色白遺伝子(MC1RとP遺伝子)の多型と皮膚癌発症との関連

日本では高齢化社会の到来とともに皮膚癌発症が増加しています。皮膚癌発症の最も大きな環境因子は紫外線暴露です。色素異常に関する遺伝子が明らかになるにつれ、健常人の皮膚の色調を規定する遺伝子が明らかとなってきました。代表的なMC1R遺伝子やP遺伝子の遺伝子多型と皮膚癌発症との相関を検討しています。最終的な解析結果により、紫外線暴露を避けるべきサブグループを特に明らかにできる可能性が出ました。日本では、高齢化社会の到来とともに皮膚癌発症が増加傾向である。紫外線暴露が皮膚癌発症の最も大きな環境因子である。色素異常に関連する遺伝子が明らかになるにつれ、「色白遺伝子」の存在が解明されてきた。われわれは特にMC1R遺伝子とP遺伝子に着目している。近畿大学遺伝子倫理委員会の指針にしたがって患者ならびに健常コントロールの皆様に、研究に関して説明し、同意が得て、同意書にザインを頂いてから、採血を実施した。血液内の白血球より、ゲノム遺伝子を抽出した。サンプルは近畿大学遺伝子倫理委員会指針に従って、匿名化して保存した。紫外線発癌の対象疾患は、日光角化症並びに日光角化症由来有棘細胞癌・露光部基底細胞癌・露光部悪性黒子および悪性黒子由来悪性黒色腫とした。対象患者は日本人とした。日光角化症と皮膚癌患者、コントロールのサンプル採取を実施した。患者由来およびコントロール由来のゲノムDNAを集積した。今後、症例を蓄積して、さらにゲノムDNAを蓄積していく。一部のサンプルについては遺伝子多型解析を実施した。MC1R遺伝子多型とP遺伝子多型において、PCRを実施した。P遺伝子については、コドン481の遺伝子多型をターゲットとしていることから、SSCP法で解析した。その一部はPCR産物を用いて、ダイレクトシークエンスを実施した。具体的には、PCR産物をサイズマーカーとともにアガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、陽性バンドを切り出した。Gel-purification Kitを用いて精製し、シークエンス反応のテンプレートに使用した。シークエンス反応させたサンプルをシークエンサーで解析した。MC1R遺伝子については、複数の候補遺伝子多型が存在することから、ダイレクトシークエンス法で多型解析を実施した。日本では、高齢化とともに皮膚癌発症が増加傾向である。紫外線暴露が皮膚癌発症に関与している。眼皮膚白皮症や雀卵斑などの色素異常症に関与する遺伝子が解明され、「色白遺伝子」群の存在が明らかとなった。われわれはMC1R遺伝子とP遺伝子に着目している。近畿大学遺伝子倫理委員会の指針にしたがって患者ならびに健常コントロールの皆様に、研究に関して説明し、同意が得て、同意書にサインを頂いてから、採血を実施した。白血球より、ゲノム遺伝子を抽出した。患者由来ゲノムDNAは80例以上集積できた。コントロール由来ゲノムDNAは100例以上集積できた。一部のサンプルについては遺伝子多型解析を実施している。MC1R遺伝子多型とP遺伝子多型において、PCRを実施している。P遺伝子については、コドン481の遺伝子多型をターゲットとしていることから、SSCP法を実施している。その一部はPCR産物を用いて、ダイレクトシークエンスを実施している。MC1R遺伝子については、複数の候補遺伝子多型が存在することから、ダイレクトシークエンス法で多型解析を実施している。日本人において色白に関連する遺伝子群の多型と皮膚癌発症が相関するかどうかを検討しています。近畿大学遺伝子倫理委員会の指針に従って患者ならびに健常コントロールの皆様に、研究に関して説明し、同意が得られた場合に、同意書にサインを頂いた後に採血しました。血液内の白血球より、ゲノム遺伝子を抽出しました。サンプルは近畿大学遺伝子倫理委員会指針に従って、匿名化して保存しました。紫外線発癌の対象疾患は、日光角化症並びに日光角化症由来有棘細胞癌・露光部基底細胞癌・悪性黒子由来悪性黒腫としました。日光角化症と皮膚癌患者・健常コントロールからのサンプル採取は予定人数に達しました。色白遺伝子であるMC1R遺伝子とP遺伝子の多型解析はPCR産物をSSCPとDirectSequencingにより順次実施しています。MC1R遺伝子は数多くの遺伝子多型が存在するため、ダイレクトシークエンスを行って、塩基配列を解析しています。P遺伝子Ala481Thr多型のhomozygousvariants, compound heterozygous variantの3種類のコントロールと異なるバンドパターンを示したものはすべてダイレクトシークエンスで遺伝子配列を確認しています。最終的に統計学的優位差があるかどうか、検討予定です。白人でのMCIR遺伝子多型と皮膚癌発症と関連するとする報告はありますが、日本人での解析結果報告はこれまでありません。

P遺伝子Ala481Thr多型と皮膚癌発症との関連はこれまで検討されていません。本研究の最終結果は日本人も白人と同様に光発癌を生じやすいサブグループが存在するかどうかを解明できます。皮膚癌発症予防を特に奨励すべきサブクループへのアプローチが重要であるかどうかを明らかにできます。
脳内転写制御因子のシグナル応答性に関する研究

コア塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いたゲルシフト法の結果から、activator protein-1(AP1)などのロイシンジッパー型だけでなく、ヘリックス・ターン・ヘリックス型や亜鉛フィンガー型など、異なる蛋白質構造を有する転写制御因子群が、マウス全脳細胞核抽出液中に存在することが明かとなった。イオノトロピック型グルタメイト(Glu)レセプターアゴニストの一つであるN-methyl-D-aspartic acid(NMDA)をマウス腹腔内に投与すると、投与後2時間の時点で海馬のAP1プローブ結合能が6倍以上に上昇したが、他の脳内部位のAP1結合能やあるいは他の転写制御因子DNA結合能には著変は見られなかった。他のGluレセプターアゴニストであるkainicacid(KA)も同様に選択的な海馬AP1結合能上昇を誘発したが、NMDAの場合には海馬AP1結合能上昇が一過性であるのに対して、KAの場合は少なくとも投与24時間後でも著明なAP1結合能上昇が観察された。イムノブロッティング法を利用してAP1構成蛋白質について同様の解析を行ったところ、NMDA投与およびKA投与はいずれも海馬にc-Jun蛋白質を強く発現させることが明かとなった。さらに、両アゴニストともに海馬にc-Fos蛋白質を強く発現させたが、KA投与の場合はAP1結合能上昇とc-Fos蛋白質発現とは高い相関性を示したのに対して、NMDA投与の場合は投与2時間後ではAP1結合能上昇が見られるにもかかわらず、c-Fos蛋白質の発現は極めて小量しか認められなかった。また、KA投与の場合にはc-Fos蛋白質の分子量以外の位置に抗体陽性蛋白質の強い発現が観察された。以上の結果より、海馬のAP1はGluシグナルに対して強い応答性を示すが、そのシグナリングメカニズムはレセプターサブタイプにより異なるものと推察される。Gluシグナリングは、レセプターサブタイプの種類に対応した特定の転写制御因子の誘導メカニズムを通じて、中枢神経系構築細胞に長期的な機能変動を招来する可能性が示唆される。
脳腫瘍における成長ホルモンおよびIGF1レセプターmRNAの発現と腫瘍増殖

方法:・アイソジェン(Takara)にてmRNAを抽出し、reverse transcriptase(RAV-2,Takara)を用いてcDNAを作製したのち、Taq polymerase(Takara)にてPCRを行った。結果:・神経膠腫の悪性度とGH-R、IGH-1-RmRNAの発現には、有意差は見られなかった。・今後の課題として、悪性度との相関の判定には、競合的PCRなどによる定量化が必要と考えられた。結果:既存のホルマリン同定、ハラフィン包理の標本では、染色は不可能であった。OCT compound包理後に-80°C保存したsampleを4%PFAにて固定、薄切したものは染色良好で髄膜腫では胞体に明らかな陽性像を得た。神経膠腫も胞体に陽性像を認めている。現在、良好なsampleを集積中である。1.研究目的ヒトの各種脳腫瘍におけるGH-R,IGF-1-RのmRNAの発現の有無を、RT-PCR法において検索し、さらに非放射線ジゴキシゲニン標識GH-R,IGF-1-RのcRNAプローブを用いて、腫瘍細胞レベルでの発現について調べる。2.平成8年度の研究計画・方法(2)ISH法:両receptorのcRNAprobeを作成する。3.平成8年度に行った研究によって得られた新知見(1)RT-PCR法:既知の論文のGH-R,IGF-1-RのcDNAからRT-PCRのプライマーとして最適な部位を検索し、20bpのsense,anti-sense primerを作成した、各脳腫瘍の凍結組織からtotalRNAを抽出し、逆転写酵素を作用させ各種脳腫瘍のcDNAライブラリーを作成後、前に作成した両プライマーを使用しPCRで増幅後、電気泳動法にて発現を検討した結果、現時点ではgliomaの中でanaplastic astrocytomaにIGF-1-Rの発現を認めたがlow gradeではその発現率は低く、悪性化との関与が示唆されている。現在良性腫瘍を検討中である。(2)ISH法:現在ISH法に用いるプローブとして最適な塩基配列を検討中である。・cycleの条件結果・神経膠腫の悪性度とGH-R、IGF-1-R mRNAの発現には、有意差は見られなかった。2.IGF-1-Rに対する抗体(CALBIOCHEM社)を入手できたので、ABC法による免疫染色で同タンパクの発現を検索した。結果:ホルマリン固定、パラフィン包埋の標本では、染色は不可能であった。OCTcompound包埋後に-80°C保存したsampleを4%PFAにて固定、薄切したものは染色良好で髄膜腫では胞体に明らかな陽性像を得た。神経膠腫も陽性像を認めている。
炎症修復機序における細胞表在性・内在性マトリックス高分子成分の代謝解析

マトリックス合成、分解系への病態情報伝達を多種のムコ多糖の代謝異常から把握した。ヘパラン硫酸(HS)異性体の定量法を改良すると共に、コンドロイチン硫酸(CS)とデルマタン硫酸(DS)異性体の代謝変動と対比して検討した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用い、ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸由来の高分子多糖を特異酵素(heparitinases)及びchondroitinasesで分解し、得られた均一性を持つ不飽和構成二糖(ΔDi-ΔS)を微量分析した。ヘパラン硫酸由来のΔDi-SのHPLC系を改良すると共に、コンドロイチン硫酸のΔDi-ΔSレベルと対比した。母体サンプルより得られたΔDi-ΔSから、病態、代謝の異常を検討した。1)ヒト尿中ムコ多糖の構成成分析解について:生体代謝産物、尿中ムコ多糖に於て、Hurler症候群ではDS,HSの増加を認め、DS異性体,ΔDi-diS_2系の代謝異常を認め,HS異性体ではΔDi-0S,ΔDi-6S,ΔDi-NS,ΔDi-diS_2,ΔDi-diS_1,ΔDi-triSを認め、特に硫酸化活性機構の高い結果を得た。2)十二指腸壁高分子ムコ多糖について:二次元電気泳動により高分子ムコ多糖を同定し、HPLCによるΔDi-ΔS分析を行い,マトリックス中、蛋白・炭水化物分解酵素の多い十二指腸壁にはDS,HSの含量が多く,全ムコ多糖の1/3以上を占め、DS異性体がΔDi-Sa,ΔDi-HS_Hであることを証明した。この成績より十二指腸では、食道、胃壁とは異なるマトリックス構成成分であることが判明した。3)間接軟骨ムコ多糖:骨粗そう症,変形性関節症の関節軟骨では、CS主体の正常ムコ多糖成分と対比し、B型DS異性体及びHAが(5-10%)存在することを見出した。このDS,HAが病的軟骨組織に増加し,軟骨線維性荷重部に増加することを証明した。ムコ多糖合成系への情報伝達、修復機序を多種のムコ多糖、とくにコンドロイチン硫酸(CS)とデルマタン硫酸(CS)異性体A,B,C,D,E,G,H,Kタイプ,ヘパラン硫酸(HS)異性体の分別定量から検討した。ムコ多糖を酵素(chondroitinase-ABC,-AC,heparitinase-I.-II)分別法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて対比し、以下の成績を得た。これより、本法はムコ多糖研究の骨子となり、炎症修復・治癒過程、細胞増殖など細胞間マトリックスの分子種変動を解析するのに有効であることを示した。1)ヒト尿中ムコ多糖の構成成分解析:尿中ムコ多糖は、マトリックス成分の産生物質として、生体代謝機構の解明に重要である。そこで酵素分解後、不飽和構成二糖(ΔDi-S)に分解し、これをHPLCにより分析した。その結果ヒト尿には主CSムコ多糖としてΔDi-4S,ΔDi-6S,ΔDi-0Sを認め、その他ΔDi-diS_G,ΔDi-diS_B,ΔDi-diS_H,ΔDi-diS_Eの存在を確認した。またΔDi-triS,及びΔDi-diS_Bの新しいΔDi-diSが検出出来た。

特にハーラー症候群では高濃度のDSが含まれ、その他のΔDi-diS_B、ΔDi-diS_H,ΔDi-0Sの増加の他、ΔDi-diS_G,ΔDi-S_2の異常構造を認め、ハーラー症候群がDS異性体、ΔDi-diS_2系の代謝異常によることを証明した。HS異性体はΔDi-0S,ΔDi-6S,ΔDi-NS,ΔDi-dis_2,ΔDi-diS_1,ΔDi-triSを認めた。全身性硬化症患者の尿中ムコ多糖ではほぼ同様なパターンで,ΔDi-Sが検出された他、ΔDi-diS_B,ΔDi-diS_Hが相対的に多く検出された。2)十二指腸壁高分子ムコ多糖:二次元電気泳動により未消化高分子ムコ多糖を同定した。またHPLCによるムコ多糖の同定を行い,蛋白・炭水化物分解酵素の多い十二指腸壁にはDS,HSが多く全ムコ多糖の1/3以上を占め、CSは少なかった。分子特異性体の同定をHPLCで行ったおこなった結果CS系ではΔDi-4S,ΔDi-6S,ΔDi-0S,ΔDi-4S(DSタイプ)が認められ、食道、胃壁とは異なる構成成分であることが判明した。3)関節滑膜組織をリウマチ、変形性など、対象正常関節より採取した結果、始めてヒト関節軟骨にDS異性体が(5-10%)存在することを見出、正常ムコ多糖主成分であるCSに加え、DSが病的組織滑膜・軟骨組織の線維性変化に平衡して増加することを証明した。マトリックス合成、分解系への病態情報伝達を多種のムコ多糖の代謝異常から把握した。ヘパラン硫酸(HS)異性体の定量法を改良すると共に、コンドロイチン硫酸(CS)とデルマタン硫酸(DS)異性体の代謝変動と対比して検討した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用い、ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸由来の高分子多糖を特異酵素(heparitinases)及びchondroitinasesで分解し、得られた均一性を持つ不飽和構成二糖(ΔDi-ΔS)を微量分析した。ヘパラン硫酸由来のΔDi-SのHPLC系を改良すると共に、コンドロイチン硫酸のΔDi-ΔSレベルと対比した。母体サンプルより得られたΔDi-ΔSから、病態、代謝の異常を検討した。1)ヒト尿中ムコ多糖の構成成分解析について:生体代謝産物、尿中ムコ多糖に於て、Hurler症候群ではDS,HSの増加を認め、DS異性体,ΔDi-diS_2系の代謝異常を認め,HS異性体ではΔDi-OS,ΔDi-6S,ΔDi-NS,ΔDi-diS_2,ΔDi-diS_1,ΔDi-triSを認め、特に硫酸化活性機構の高い結果を得た。2)十二指腸壁高分子ムコ多糖について:二次元電気泳動により高分子ムコ多糖を同定し、HPLCによるΔDi-ΔS分析を行い,マトリックス中、蛋白・炭水化物分解酵素の多い十二指腸壁にはDS,HSの含量が多く,全ムコ多糖の1/3以上を占め、DS異性体がΔDi-S_B,ΔDi-HS_Hであることを証明した。この成績より十二指腸では、食道、胃壁とは異なるマトリックス構成成分であることが判明した。3)関節軟骨ムコ多糖:骨粗そう症、変形性関節症の関節軟骨では、CS主体の正常ムコ多糖成分と対比し、B型DS異性体及びHAが(5-10%)存在することを見出した。このDS,HAが病的軟骨組織に増加し,軟骨線維性荷重部に増加することを証明した。
トカラ海峡における黒潮の流路変動と流速断面分布との関係

本研究は,トカラ海峡での黒潮流路の変動と流速断面分布との関係,流速断面分布の変動特性,流路変動と流速断面分布の変動の関係を観測資料から明らかにすることを目的として行われた。平成17年度の研究実績の概要は以下の通りである。トカラ海峡を横断する(株)マルエーフェリーの「フェリーなみのうえ」に搭載した超音波流向流速分布計(ADCP)により,2005年は150回の断面観測を行った。この観測は2003年から継続しており,3年間で計475回の観測資料を得た。11月には,鹿児島大学水産学部の練習船「かごしま丸」の実習航海に便乗し,トカラ海峡のフェリー航路上で12測点でCTD・LADCP観測を行った。観測資料の解析により,トカラ海峡の流速断面分布は大きく5つのパターンに分類できることを示した。また,トカラ海峡から北太平洋に流出する流速が50cm/s以上の流れ(黒潮)の流量には約10日周期の黒潮前線波動に伴う変動と,1ヶ月から2ヶ月周期の東シナ海における黒潮流路の蛇行にともなう変動があることを確認した。黒潮前線波動に伴う変動では黒潮の強流コアはトカラ海峡の北部と南部で維持されたが(いわゆるdouble core),黒潮流路蛇行に伴う変動では大陸棚縁辺以南で強流コアが発達すると,北側のコアは消滅することが明らかになった。本年度の実施計画には無いが予定外の成果を得たので報告する。本研究の解析期間中に,都井岬沖で発達した小蛇行の下流への伝播が2回起こり,1回は黒潮流路の大蛇行に移行した。この2回の小蛇行の下流伝播が起きている期間中に(停滞期は除く),トカラ海峡の黒潮流量は10Sv減少することを見出した。なお,流速断面分布の時空間変動解析は計算過程に不備があったため結果を得られなかったが,これ以外の成果については論文誌への投稿準備を行っている。本研究は、トカラ海峡での黒潮流路の変動と流速断面分布との関係、流速断面分布の変動特性、流路変動と流速断面分布の変動の関係を観測資料から明らかにすることを目的として行われている。平成16年度の研究実績の概要は以下の通りである。トカラ海峡を横断する大島運輸の「フェリーなみのうえ」に搭載した超音波流速分布計(ADCP)により、2004年は160個の流速断面資料を得た。また、鹿児島大学水産学部の練習船「かごしま丸」の実習航海に便乗し、トカラ海峡のフェリー航路上で5月15日-16日にCTD・LADCP観測、11月28日にXCTD観測を行った。11月は荒天のため予定していたCTD・LADCP観測は行わなかった。前述の流速断面資料は2003年にも165個が得られているので、2004年分と合わせて325断面について解析を行った。トカラ海峡から北太平洋に流出する流速が50cm/s以上の流れ(黒潮)の流量には10日周期および年周期の変動があった。10日周期の変動は黒潮流軸位置指標(KPI)にもみられた。黒潮流路は2004年7月頃から大蛇行期に入ったといわれている。先にあげた流量は2004年の5月を境に前半年の平均値が27Svであったのに対し後半年の平均値は17Svであり、黒潮流路が大蛇行期に入った後は流量が少ない状態を保っていた。また、流速断面分布では大蛇行期に入ってからは流速が50cm/s以上の強流コアが最大でも深度400mまでしか発達せず、最大流速も表層に出現することが多かった。黒潮流路の変動と流速断面分布との関係を調べるため、流速断面分布パターンの分類を行ったが、黒潮流路が大蛇行期に入るという想定外の事が起きたため、これを考慮して再検討することにした。

本年度の実施計画には無いが予定外の成果を得たので報告する。本研究の解析期間中に,都井岬沖で発達した小蛇行の下流への伝播が2回起こり,1回は黒潮流路の大蛇行に移行した。この2回の小蛇行の下流伝播が起きている期間中に(停滞期は除く),トカラ海峡の黒潮流量は10Sv減少することを見出した。なお,流速断面分布の時空間変動解析は計算過程に不備があったため結果を得られなかったが,これ以外の成果については論文誌への投稿準備を行っている。
転移性骨腫瘍に対する内固定の腫瘍抑制効果の検討

癌の骨転移に対する治療は担癌患者の増加する高齢社会にとって極めて重要な問題である。われわれは、兎悪性腫瘍株(VX2)Carcinomaを人工的に家兎脛骨に埋植し、人工的に転移性骨腫瘍モデルを作成することに成功した。さらに、転移のある脛骨に予防的に内固定術を施行することで骨破壊の進展を予防し、さらには生命予後が延長する可能性を明らかにした。今後はそれらのメカニズムについてさらに探求していく必要がある。(1)腫瘍細胞の継代と播種方法の確立:日本白色家兎の大腿筋内でVX2 carcinomaを2-3週おきに継代し、腫瘍組織0.5 gを刻み、腫瘍組織をcollagenaseとDNaseを添加した培地上で18時間培養し、腫瘍細胞を回収・凍結保存することに成功した。腫瘍接種直前に解凍して、細胞カウントを行い20 millioncell/mlに濃度調整を行い家兎骨内で再び腫瘍が増生することを確認できた。(2)内固定と腫瘍接種:顎骨骨折用locking plate(Striker社)の7穴プレートを用いて腫瘍の接種を行う方法を確立した。具体的には径2mmのhigh-speed-drillでcortexを開窓した後5mmの深さまで21G針を外套として挿入し、Hamilton syringeを用いて腫瘍細胞を3×105 cell( 15μl)を注入した。腫瘍細胞が漏れないよう骨ろうで開窓部をsealingを行った。いずれの家兎内でも100%腫瘍が局所で定着すること、遠隔転移を起こすことが確認できた。(3)生存期間と骨破壊の定量的評価:家兎脛骨内に腫瘍を接種し、内固定を行った群、行わなかった群(Control)でその後の生存期間に違いが出ることが判明した。内固定群では腫瘍の増大が早く、骨破壊が対照群と比較して急速に進展することが証明された。上記(1)(3)が平成25年度の研究計画であったが、現在までにおおむね遂行でき方法論として確立しえた。HE染色は行ったが、TRAP染色、破骨細胞などの動態などは観察できておらず次年度以降の課題である。(1)腫瘍細胞の継代と播種方法の確立:日本白色家兎の大腿筋内でVX2 carcinomaを2-3週おきに継代し、腫瘍組織0.5gを刻み、腫瘍組織をcollagenaseとDNaseを添加した培地上で18時間培養し、腫瘍細胞を回収し凍結保存することに成功した。腫瘍接種直前に解凍して細胞カウントを行い200万cell/mlに濃度調整を行い、家兎骨内で再び腫瘍が増生することを確認した。(2)内固定と腫瘍接種:顎骨骨折用locking plate(Striker社)の7穴プレートを用いてて腫瘍の接種と脛骨の固定を洞叔父に行う方法を確立した。具体的には径2mmのhigh-speed-drillでcortexを開窓した後5mmの深さまで21G針を外套として挿入し、Hamilton syringeを用いて腫瘍細胞を30万cell(15μl)を注入する。腫瘍細胞が漏れないよう骨ろうで開窓部のsealing行う。この方法では100%腫瘍が定着し確実に遠隔転移を引き起こすことが証明された。(3)生存期間と骨破壊の定量的評価:家兎脛骨内に腫瘍を接種し、術直後と術後毎週に単純X-PとCTで骨欠損部の大きさを評価した。内固定を行った群と行わなかった群で比較した結果、内固定群では腫瘍の増大が小さく、骨破壊が抑制されていた。また生存期間の延長が認められた。上記の実験結果から、転移のある骨を内固定することによって骨内の腫瘍進展と遠隔転移が抑制することが示唆された。整形外科学おおむね計画した研究を実行し、手術手技が確立できたと考えるが、組織学的評価には至っていない。今後はHE染色のみならず、TRAP染色など破骨細胞の動態について調査をすすめていきたいと考えている。動的ストレス制御が骨破壊過程へ及ぼす影響を免疫組織学的、分子生物学的に検証する。両群において骨破壊が進んでいる部分と、骨破壊が起こっていない部分(前肢)から骨組織を採取し、固定群と非固定群での違いを骨形成/骨破壊に関わる転写因子を中心として免疫組織学的、分子生物学的に検証する。具体的には、腫瘍接種後3週時点で腫瘍接種部と明らかな転移が起こっていない前肢から骨組織を採取し、破骨細胞の活性化に関わる転写因子(RANK/RANKLなど)を中心に調べる。今年度の実験計画として(1)腫瘍細胞の継代(2)動物実験モデルの確立(3)組織学的検討をかかげ、そのうち(1)(2)は実施できたが(3)の部分が途上である。(3)の実験系では生存期間の解析とは別系統の経時的な組織学的解析が必要となるため、それにかかる実験動物、染色関連の費用が未使用となっている。

経時的な動物実験モデルの作成に必要な家兎の購入と染色関連、破骨細胞動態研究(HE染色、TRAP染色、骨形態計測)に使用する予定である。(平成26年度の計画として計上されていないため)
高齢者特有の身体能力に応じたトレーニング法の開発

従来型の有酸素運動や筋力トレーニングが健康増進のため推奨されてきたが、高齢者にとっては様々な事情により敬遠されがちなケースが多々みうけられる。今回は高齢者を対象として、新しく開発された認知動作型トレーニングの効果をみることを目的とした。本研究では歩行能力等の日常生活動作能力が著しく向上した。本トレーニングマシンは運動と脳との関係性に基づいたコンセプトにより開発されており、包括的運動神経回路の改善を重視している。今回の研究により、高齢者のQOL(Quality of Life)の向上に寄与しうる効果的なトレーニング方法であることが示された。高齢者特有の身体能力に応じたトレーニング法の開発研究として、当年度はこれまでの研究データ等を整理した形での論文発表や学会発表等を行いながら、研究の進展を図った。日本体育学会大会では介護福祉・健康づくり専門領域において「半身不随者を対象とした認知動作型トレーニングマシンの効果運動生理指標の観点から」を発表し、認知動作型トレーニングの効果について、生理学的観点から評価・検討を行った。さらに、日本スポーツ栄養研究会大会においては、「クレアチン摂取がやり投げ選手のパフォーマンスに及ぼす影響について」を発表し、スポーツ栄養の観点からの考察も今後活用していくことの可能性についても検討された。当年度はこれまでの研究データ等を整理した形での学会発表等を行いながら、研究の進展を図った。日本体育学会大会では介護福祉・健康づくり専門領域において、生活習慣が骨密度に及ぼす影響について研究発表を行った。日本スポーツ栄養学会大会では陸上長距離選手における鉄・葉酸摂取と貧血指標との関連性について研究発表を行った。日中国際共同研究において健康領域に関する測定・調査を中国青海省、上海体育大学等と連携しながら実施した。超高齢社会では高齢者の年齢に伴う低体力化によって、自立した身体動作が困難になることへの問題が深刻化しており、高齢者の身体的自立をできるだけ長期にわたって維持できる健康寿命の延伸が望まれている。今回は、筋力トレーニングや有酸素トレーニングの要素を含みながら、動作の質(QOM:Quality of Motion)の改善や向上を主目的として開発された「認知動作型トレーニングマシン」(開発者:小林寛道東京大学名誉教授)が低体力高齢者に対する運動手段として用いられた。本研究では認知動作型トレーニングマシンを用いたトレーニングを行い、従来のトレーニング方法では困難と考えられた運動動作の質の改善や、脳と運動神経系の活性化による知的・精神的状態の改善を図ることであった。これまでにスポーツ選手等の動作フォームの改善によるパフォーマンスの向上が確認されてきたが、中高齢者にも安全性・効果が示されるのではないかと考えた。今回は個人差の大きい高齢者の身体能力レベルに応じて、どのような効果の違いが出るのかを分析し、高齢者に適した運動形態とは何かを検討することを目的とした。トレーニング効果の指標として、身体運動能力・生活状況の変化、知的・精神的側面の変化を追った。これまでの結果から日常生活動作をはじめとする身体能力の向上が確認され、それにともない精神的・社会的側面においても効果が認められた。さらに高齢者から敬遠されがちな従来的な運動トレーニングの場合には継続困難者が多い傾向にあったことに比べ、本トレーニングマシンを用いたトレーニングの継続希望者は多いこともみられた。認知動作型トレーニングは、運動と脳との関係性に基づいたコンセプトにより開発されており、包括的運動神経回路の改善というとらえ方で研究が進められてきている。研究において主に活用する認知動作型トレーニングマシン(スプリントトレーニングマシン)の搬入が遅れてしまったことと、実験開始前の機器のメンテナンスや動作確認に時間を要したため、研究が遅れてしまっている状況である。またパイロットスタディとして協力頂いた被験者による実験とその評価にも時間を費やす必要が生じたため、本実験の実施が遅れてしまったことなどが挙げられる。スポーツ健康科学実験を集中的に遂行できる時期を再検討している。研究目的の達成度を上げるための十分な時間の確保の目処をつける。被験者への適正な対応ができるよう協力機関である自治体等との連携を密にしていく。大学内における実験・研究室の環境を整え、安全かつ快適に被験者の対応をしながら、着実に実験データを確保していく。研究時間の確保のため、大学授業等の時間について適宜調整に努め、研究時間の十分な確保と研究内容の質の向上を図っていく。実験補助者への事前レクチャーも充実させ、万全の研究体制で取り組んでいく。当初の研究遂行が遅れてしまったことと関連して、当年度の予算執行に至らなかった費目が出たため次年度使用額が生じることとなった。

現在、実験の遂行を集中的に実施する時期を再検討している。「研究の目的」の達成度を上げるための十分な時間の確保の目処は立っている。被験者への適正な対応ができるよう協力機関である自治体等との連携を密にしていく。大学内における実験・研究室の環境を整え、安全かつ快適に被験者の対応をしながら、着実に実験データを確保していく。研究時間の確保のため、大学授業等の時間を良好に調整できる見通しになったため、研究時間の十分な確保と研究内容の質の向上を図っていく。実験補助者への事前レクチャーも充実させ、万全の研究体制で取り組んでいく。研究の達成度を上げるためにも、前年度執行すべき費目であった実験協力謝金や消耗品等にあてることが必要な見通しである。当初の研究遂行が遅れてしまったことと関連して、当年度の予算執行に至らなかった消耗品が出たため次年度使用額が生じることとなった。研究の目的の達成度を上げるため、円滑な実験遂行に関わる消耗品等にあてることが必要な見通しである。
地域特性を考慮した地域計画のためのデータベース作成に関する基礎的研究

本年度に研究を行った結果,次のようなことが知見として得られた.まず,村落空間の構造を民俗学における把握の1基本型である「ムラ・ノラ・ハラ」モデルと,文化人類学において指摘された「中心・周縁」モデルとの関係を考察し,さらに伝説に対する構造分析の結果を考慮することで,村落における心理的な空間把握モデルを仮定することができた.次に,研究対象地域を滋賀県北西部(湖北地方)および兵庫県西南部(播磨地方)として事例研究を行った.この時,伝説に語られる場所やものの村落内での分布状況に着目した.結果として,村落の構造上,等質な空間と考えられてきたムラ・ノラ・ハラの中にも,不連続で異質な部分が等質な空間を寸断する形として内包されていることがわかった.さらにそれらが境界性を有しているものであることがわかった.以上のことから村落のコスモロジーを実在空間と心理的空間の2様の関係から把握することができた.また,異質なものとして認知された地物が村落の中で特定の境界を示すランドマークであり,村落の住民と境界を示すランドマークとの心理的な関わり方を定性的に把握することができた.さらに伝説が集中的に語られる場所は,村落の歴史上極めて重要な境界を示すものであることがわかった.特に,隣接する村落ないしは(藩制村でいう)郷との関係の深さ,敷延すれば地域内の村落間,字間の心理的な連携の深さを示す可能性があると推察された.一方,伝説に語られる地物は地形的な変化の端緒に位置する場合が相当数あることがわかった.このことから,村落の住民から見た景観の重要性を知るための情報源としても伝説などの民俗情報を位置づけることの有意性を示した.最後に,データベース化を図るに当たり,伝説に語られる(イメージの集中する)要素を地形別・形態別に整理することを検討した.本年度に研究を行った結果,次のようなことが知見として得られた.まず,村落空間の構造を民俗学における把握の1基本型である「ムラ・ノラ・ハラ」モデルと,文化人類学において指摘された「中心・周縁」モデルとの関係を考察し,さらに伝説に対する構造分析の結果を考慮することで,村落における心理的な空間把握モデルを仮定することができた.次に,研究対象地域を滋賀県北西部(湖北地方)および兵庫県西南部(播磨地方)として事例研究を行った.この時,伝説に語られる場所やものの村落内での分布状況に着目した.結果として,村落の構造上,等質な空間と考えられてきたムラ・ノラ・ハラの中にも,不連続で異質な部分が等質な空間を寸断する形として内包されていることがわかった.さらにそれらが境界性を有しているものであることがわかった.以上のことから村落のコスモロジーを実在空間と心理的空間の2様の関係から把握することができた.また,異質なものとして認知された地物が村落の中で特定の境界を示すランドマークであり,村落の住民と境界を示すランドマークとの心理的な関わり方を定性的に把握することができた.さらに伝説が集中的に語られる場所は,村落の歴史上極めて重要な境界を示すものであることがわかった.特に,隣接する村落ないしは(藩制村でいう)郷との関係の深さ,敷延すれば地域内の村落間,字間の心理的な連携の深さを示す可能性があると推察された.一方,伝説に語られる地物は地形的な変化の端緒に位置する場合が相当数あることがわかった.このことから,村落の住民から見た景観の重要性を知るための情報源としても伝説などの民俗情報を位置づけることの有意性を示した.最後に,データベース化を図るに当たり,伝説に語られる(イメージの集中する)要素を地形別・形態別に整理することを検討した.
脳における交差性投射形成の分子機構

脳における神経回路形成の分子機構を明らかにするために、ネトリンを用いて交差性、非交差性投射ニューロンの成長円錐のガイド機構の解明を進展させた。また、chemotropic因子の受容体の同定をはじめとする受容機構の解析、高次脳におけるこれらの分子の発現パターンの解析をおこない、交差性投射形成の分子機構の解明に大きく迫った。Mark Tessier-Lavigneをリーダーとする米国のグループは主にネトリンを安定に発現するcell lineの開発、またネトリンレセプターの強制発現実験を行うことにより、後脳、中脳、前脳における交差性、非交差性ニューロンの投射様式の解明に迫った。村上富士夫をリーダーとする日本のグループは、脊髄と脳における軸索誘導のメカニズムの分子レベルでの共通性の存在を、ネトリンを導入した培養細胞、抗ネトリン抗体の作製、コラーゲンゲル共培養により検討をおこなった。また、宋文烹、山本亘彦が北米神経科学会においてこれまでに得られた知見をもとに研究成果の発表を行った。また、非交差性投射の形成過程を解析することにより交差性投射の形成機構を明らかにするため、Eric Frank博士の協力を得て非交差性投射ニューロンの成長円錐のガイド機構の検討をおこなった。さらに、濱、Ellisman,Martone博士らの協力のもとに、生理学研究所及び大阪大学の超高圧電顕を用いてトモグラフィー用写真撮影およびコンピューター画像解析法によって、交差が起こる際の成長円錐が腹側正中部で示す形態変化の解析をおこなった。脳における交差性、非交差性投射の形成の分子機構を明らかにするために、脊髄の交差性ニューロンに対してchemoattractiveな、また滑車神経に対してはchemorepulsiveな活性を示すネトリンの役割を中心に、脳における他の交差性非交差性投射ニューロンの成長円錐のガイド機構の検討をおこなった。Mark Tessier-Lavigneをリーダーとする米国のグループは主にネトリンを安定に発現するcell lineの開発、ネトリンレセプターの強制発現実験を行い、後脳、中脳、前脳における交差性、非交差性ニューロンの投射様式の解析をおこなった。村上富士夫をリーダーとする日本のグループはこれまでに得られた後脳や中脳の交差性投射ニューロンに関する知見をもとに、脊髄と脳における軸索誘導のメカニズムの分子レベルでの共通性の存在をネトリンを導入した培養細胞、抗ネトリン抗体の作製、コラーゲンゲル共培養により検討をおこなった。また、宋文杰が北米神経科学会においてこれまでに得られた知見をもとに研究成果の発表を行った。また、セマフォリンの神経軸索のガイドへの関与を明らかにするため、Luo,Kobayashi,Yuzaki博士らの協力を得て、この問題へのアプローチをおこなった。さらに、濱、Ellisman博士らの協力のもとに、生理学研究所の超高圧電顕を用いてトモグラフィー用写真撮影およびコンピューター画像解析法によって伸展中の成長の形態学的解析をおこなった。また、chcmotropic因子の受容体の同定をはじめとする受容機構の解析、高次脳におけるこれらの分子の発現パターンの解析をおこない、交差性投射形成の分子機構の解明に大きく迫った。Mark Tessier-Lavigneをリーダーとする米国のグループは主にネトリンを安定に発現するce11 1ineの開発、またネトリンレセプターの強制発現実験を行うことにより、後脳、中脳、前脳における交差性、非交差性ニューロンの投射様式の解明に迫った。また、宋文杰、山本亘彦が北米神経科学会においてこれまでに得られた知見をもとに研究成果の発表を行った。

さらに、濱、Ellisman,Martone博士らの協力のもとに、生理学研究所及び大阪大学の超高圧電顕を用いてトモグラフイー用写真撮影およびコンピューター画像解析法によって、交差が起こる際の成長円錐が腹側正中部で示す形態変化の解析をおこなった。
生体内動態の時空間制御による機能的核酸デリバリーシステムの創製

表面に温度応答性高分子ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)共重合体を修飾したカチオン性リポソームを作製した。リポソーム表面の固定水層厚(FALT)を測定し,細胞取り込み効率について評価した結果,PNIPAAmが親水性となる転移温度LCST以下ではPEG修飾リポソームと同様に表面に水和層が形成され,血清タンパクとの相互作用を回避でき,血中安定性が高くなる。一方,LCST以上ではPNIPAAmが脱水和して疎水性となるためFALTが小さくなり,細胞親和性が高くなり細胞取り込み効率が向上した。毒性も少なく遺伝子導入への応用も可能であった。本研究では生体内の特定部位で細胞を分化誘導させるため標的部位にRNAを的確に送達するデリバリーシステムを構築し,生体内及び細胞内動態を時空間的に制御する機能的核酸デリバリーシステムの創製を目指す。DDSキャリアとして用いられるリポソームは生体安全性などの利点が多いが,血中安定性が低いという問題があり,ポリエチレングリコール(PEG)などの親水性高分子を修飾し表面を水和する方法が広く用いられている。これによりリポソームはRESなどの免疫系を回避できるが,この方法は薬物の病態細胞内導入効率が低くなるという問題がある。本研究では,血中で高い安定性および細胞内へ高い導入効率を実現できるキャリアを見出すことを目的として,表面にポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)及びその共重合体を修飾した機能性リポソームを作製した。PNIPAAmは転移温度(LCST)を境に親媒性が著しく変化する。リポソーム表面をPNIPAAmで修飾すると、PNIPAAmが親水性となるLCST以下ではPEGで修飾した場合と同様にリポソーム表面が水和して固定水層が形成され、血中安定性が高くなると考えられる。一方、LCST以上ではPNIPAAmが脱水和して疎水性となるため細胞取り込み効率が高くなると考えられる。本研究では、リポソームの固定水層厚(FALT)を測定し、温度とFALT変化の関係及び細胞取り込み効率について評価した。LCST以下ではPEG修飾リポソームと同様に表面に水和層が形成され、血清タンパクとの相互作用を回避できることが分かった。また、温度上昇に伴いFALTが小さくなり、高い細胞取り込み効率を示した。以上のことから、PNIPAAm修飾リポソーム表面のFALTを温度により変化させることで、細胞取り込み制御が可能となることが示唆された。本研究では,血中で高い安定性および細胞内へ高い導入効率を実現できるキャリアを見出すことを目的として,表面にポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)及びその共重合体を修飾したカチオン性リポソームを作製した。一方、LCST以上ではPNIPAAmが脱水和してリポソーム表面が疎水性となるため細胞親和性が高くなると考えられる。リポソーム表面の固定水層厚(FALT)を測定し、温度とFALT変化の関係及び細胞取り込み効率について評価した結果、LCST以下ではPEG修飾リポソームと同様に表面に水和層が形成され、血清タンパクとの相互作用を回避できることが分かった。物理薬剤学、ドラッグデリバリーシステム研究実施計画に基づきPNIPAAm等の温度応答性高分子とN,N-dimethyl amino- propylacrylamide( DMAPAAm )等のカチオン性モノマーを共重合した環境応答性高分子の側鎖に,相転移温度が異なる温度応答性高分子をグラフトしたナノリポソームを作成した。(1)カチオン性,(2)細胞内への取り込み,

(3)核に到達しやすい特徴を有する,環境応答性高分子を用いた核酸デリバリーにより,温度刺激によってDNAを放出し,核内での遺伝子発現効率の上昇を図ることが可能である。ナノキャリア表面の高分子による固定水和層FALTコントロールによる安定化と放出制御については、本研究で開発した温度応答性リポソームは,体内動態・安定性に大きく関連しているキャリア表面の固定水和層(FALT)の制御が可能である。実際高分子を修飾することにより安定なナノキャリアを作成した。本研究では,高分子を分子設計し,FALTの最適化を行う。さらにLCSTに応じた温度応答性の薬物放出制御も可能であった。これは,透過型電子顕微鏡(TEM)による観察結果から,導入した高分子のLCST付近での性質・構造変化により脂質膜が不安定化しラメラ相からヘキサゴナル相への相転移によることが示唆された。siRNAを標的部位へ効率的に送達する機能性キャリアの開発作成した機能性高分子修飾リポソームを用いて、乳がんMCF-7細胞と子宮頸がんHela細胞にsiRNAを導入し、48時間後に細胞を溶解させ、ルシフェリンを添加して化学発光量をルミノメーターで測定する。その後、サンプル間の値を補正するために、タンパク定量を行う。多くの細胞外マトリックス(ECM)タンパク質において共通するアミノ酸配列(Arg-Gly-Asp;RGD)が発見され,それらが細胞接着に密接に関わっていることが知られている。本研究ではRGD配列やラミニンに存在するアミノ酸配列(YIGSR)など,細胞表面タンパクや抗体との結合機能を有する複数のアミノ酸配列変異体を合成し,これらを導入することにより選択性を高めた機能性高分子を開発する。さらに選択性を確認するために,高分子を導入したナノキャリアにGAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)のsiRNAを内封し,HepG2細胞(ヒト肝癌細胞株)等の培養細胞に導入し,導入後のGAPDH発現量をreal-time PCR法で検討する。標的細胞への集積性向上と抗原認識による放出制御, pH応答型ポリマーによるライソソーム等の細胞内pH変化を利用した刺激応答性の薬物放出制御について検討する。
特定妊婦をシームレスに支援するための “関連部署・多職種連携システム”の構築

本研究は児童虐待予防に向けたモデル事業として、総合周産期母子医療センターにおける妊娠期、分娩期、育児期を通して、シームレスに特定妊婦を支援するための“関連部署・多職種連携システム"を構築し、そのシステムを評価することを目的としている。初年度の平成29年度は、「システム構築のための事前準備」として、以下に示す研究活動内容を計画し実施した。1聖マリア病院総合周産期母子医療センターにおける過去5年間の特定妊婦に関する実態調査:関連部署の管理者に依頼し調査協力者を選出した。調査項目について、先行研究から抽出し調査用紙の作成に着手した。また、関連研究として平成29年12月に第68回聖マリア医学会において、「特定妊婦への支援(第1報)-事例の振り返りからみえてきた支援のあり方-」「心理・社会的ハイリスク妊婦への援助(第2報)-妊娠期からの切れ目のない支援を目指して多職種連携のツール作り-」「特定妊婦への支援(第3報)-アセスメントシート・毎日カンファレンス導入後の看護スタッフの意識・行動の変化-」の3題を発表した。2実態調査の結果を聖マリア病院内の関連部署、多職種に報告し、システムの構築や特定妊婦支援委員会の発足メンバーの選定:1の実態調査が実行できておらずできなかった。3特定妊婦支援を先駆的に行っている施設見学や専門看護師などとの情報交換:平成29年6月第4回CNS学会に参加し情報収集、8月に母性看護CNSからスーパーバイズを受け、情報交換を行った。また、9月には聖路加国際大学の片岡弥恵子教授によるドメスティック・バイオレンスに関する研修会を開催した。
高分解能時間分解X線吸収微細構造法の開発と金属担持酸化物触媒の電子移動機構の解明

時間分解XAFS法は特に金属担持酸化物触媒などの不均一反応系についての動的構造変化や電子状態変化の知見を得る上で最も優れた手法であり、分散型X線光学系を備えるDXAFS法では必要なX線エネルギー領域のデータを一度に得ることが可能であるために、繰り返し測定の必要がなく、不可逆な反応過程のメカニズム解析に威力を発揮する。本研究では、これまでにPF及びPF-ARで開発したDXAFS装置の分光結晶(ポリクロメーター)を二結晶化することによってエネルギー分解能と測定精度を飛躍的に向上させ、金属を担持した酸化物触媒の電子移動反応機構を解明することを目的とした。平成18年度は、平成17年度に開発した高分解能時間分解DXAFS装置並びに反応を迅速に開始するための反応セルを用いて、銅を担持したゼオライト触媒における銅の酸化還元反応機構の解明を行った。窒素酸化物の還元除去能力を有するゼオライトに担持した銅触媒では、その触媒反応過程で生じるCu(I)種が重要な鍵化学種であると考えられていた。そこで、まずは定量的にCu(II)状態で存在する触媒試料をイオン交換法によって調製し、それを反応セル中で真空環境下に置いた後、COガスを迅速導入することによって開始される銅の還元反応過程を時間分解DXAFS装置を用いて追跡した。その結果、Cu(II)→Cu(I)→Cu(0)のように銅の還元反応が進行することを直接観測した。更に、得られた結果を反応速度論を用いて解析することによって、少なくとも2種類のCu(I)状態が存在することを明らかにした。また、構成化学種の構造解析から、最初の還元過程でフラグメント化されたCu(I)種が生成した後、それらの自己会合によってCu_2O類似状態になり、引き続く2段階目の還元過程でCu(0)状態へ至ることが明らかになった。その結果を基に、Cu(II)の触媒試料へCOとNOの混合ガスを迅速に導入する反応を種々の条件下で観測し、反応過程でCu(I)状態が生成するものの、その後にCu(II)状態が再生する触媒反応過程を直接観測することに成功した。その反応速度のCOまたはNOガス圧に対する変化から、COによって生じるフラグメント化されたCu(I)化学種がNOを還元する活性化学種であることを証明することに成功した。本研究では、これまでにPF及びPF-ARで開発したDXAFS装置の分光結晶(ポリクロメーター)を二結晶化することにより、エネルギー分解能と測定精度を飛躍的に向上することを目的としている。平成17年度は、現状のDXAFS装置でのポリクロメーターの分光状況を定量的に評価し、間接冷却を施した固定湾曲率のブラッグ型結晶ホルダーで得られるX線が、水平面内の位置とX線エネルギーの間に高い直線性を持って分散していることを明らかにした。また、同じく間接冷却で固定湾曲率のラウエ型結晶ホルダーを開発し、その分光X線も同様に第二ポリクロメーターで二度目の分光を行うのに十分な直線性が得られることを確認した。これらの知見を基にして、二結晶DXAFS装置の設計・開発を行った。一方で、空間分解能が十分に高い一次元検出器を用いて、粉体試料や金属箔試料、溶液試料などの透過X線の分散状況を調べ、特に粉体試料においては試料上での散乱X線が水平面内に広がることを明らかにした。これは、透過法で測定するDXAFS法において検出データのエネルギー分解能の劣化に直結するものであり、二結晶DXAFS装置の第一集光点に試料を配置し、その透過X線を第二ポリクロメーターで分光することによって初めて、目的とするエネルギー分解能が達成されることを明らかにした。さらに、金属担持酸化物触媒とCOやNOなどの有害ガスを反応させるための試料セル部および反応開始機構を開発し、有害ガスの迅速導入によるバッチ法での反応追跡と不活性ガス又は前処理ガスから反応ガスへの迅速切替によるフロー法での反応追跡を可能にした。これらの試料セルは本特定領域研究における共同研究に適用し、銅担持ゼオライト触媒の不均化反応機構やニッケル担持シリカ触媒の還元反応機構の研究を展開した。