hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
琉球語与那国島方言の記述文法書の作成

統語記述はこれまでほとんど手つかずの分野であったが,特にこの言語の統語記述において最も難解なトピックである格組織(主語と目的語の格標示)に関して、フィールドワークと自然談話の両方のデータにもとづき、一定の結論を示した。すなわち、この言語では、日本語やよく知られている琉球諸語のシステムと異なり、他動詞主語や自動詞主語といった統語的な役割よりも意味的な特徴(動作主性が高いかどうか)が重要である。この結論は、先行研究とは大きく異なり、また先行研究で問題とされていた現象をうまく説明できるだけでなく、ほかの琉球諸語の格組織に関する研究にも応用可能な分析である。これについては論文としてまとめ,論集の一章として入稿済である(『琉球諸語と古代日本語』2014年中にくろしお出版から出版予定)。また,より一般的な統語記述(上記を含め,さらに句構造,述語構造,ボイス,複文)は,すでに記述は終えており,その成果は2015年度中に東京外国語大学記述言語学研究室の紀要において出版予定である。一方で、与那国語の数少ない辞書のひとつである『与那国語辞典』(池間苗著)の録音テープを編者から借り、電子化するという作業もこの科研で行った。エクセルなどに見出しを打ち込み、音声にリンクさせて検索可能な形にすることを目指していたが、今年度は実現できなかった。しかし、録音テープを見出し語ごとに切り分ける作業は完了し、今後の研究に役立つ重要な成果を残せたと考える。本年度は、前年度までに収集したデータを書き起こし、分析し、実際に執筆しはじめる時期と位置付けていた。そのうえで、本年度の計画を、1データの書き起こし(既に収集した談話の録音データの書き起こしと、文字化されている談話資料のグロスづけを行う)、2分析(上記1で作成した談話書き起こしデータ(すなわちテキストデータ)と、活用リストや文献資料における音韻・形態論の分析データをもとに、形態論と統語論の基本的な記述を開始する)、および3確認調査(上記1および2の補足調査を今年度後半に行う)として掲げていた。1に関して、目標の半分程度の掻き起しを行うにとどまる結果となったが、これは当初よりも談話の利用を制限する方向で研究計画を転換したからである。結果的に、elicitationデータをより積極的に採取することにつながり、本年度での調査でそれを行った。そのelicitationの方法論に関して多数の先行研究を吟味し、結果として論文の体裁にまとめることができた。この論文は、琉球諸語全体の記述研究にも応用可能なelicitationの方法論をまとめたものであり、本研究における調査で使用しただけでなく、別の科研(狩俣繁久氏が代表を務める基盤A科研)においても採用が決定しているなど、多くの方面に役立つと予想される。2に関して、代名詞体系の分析、動詞活用の分析、基礎的な構文の分析が進み、それは研究成果となって公開ないし出版準備中となっている。3に関して、電話による確認調査にとどまったが、1におけるelicitation調査を補完するものとして有効に作用した。全体的に、本年度はelicitationの方法論を定め、名詞形態論の概要、動詞形態論の概要、そして構文論のうちごく基礎的な部分の記述を行うことができたといえる。構文論に関するより詳細かつ広範な記述は来年度の課題としたい。本年度の目的はテキストの収集と書き起こしであったが、収集については満足のいく結果が得られたものの、テキストの書き起こしが遅れていることから、(3)という自己評価を下した。
新規血管新生抑制因子バソヒビンによる血管内皮の老化と細胞死の抑制

血管新生抑制因子vasohibin-1は血管内皮細胞に細胞死を起こすのではなく、逆に抗細胞死・抗老化作用など内皮細胞の生存や恒常性維持に重要な役割を演じていること、その抗細胞死・抗老化作用は長寿遺伝子SIRT1を介していることを明らかにした。この研究をさらに進めることによって内皮細胞の老化によって生じる動脈硬化(心疾患や脳血管疾患の原因)を抑制できることが期待される。vasohibin-1はVEGFなどの血管新生因子に反応して血管内皮細胞が産生・分泌し、自らに作用して血管新生を抑制するユニークな分子である。申請者はこれまでにvasohibin-1の遺伝子を安定導入したマウス内皮細胞では、H_2O_2などの種々の細胞ストレスに対して細胞死を抑制すること、逆にヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)においてvasohibin-1の発現をノックダウンすると細胞老化に陥った後、細胞死がひきおこされることを確認してきた。平成19年度における研究の進展として、(1)vasohibin-1を過剰発現したマウス内皮細胞では抗細胞死作用を有するGalectin-3の発現が増加しており、Galectin-3を過剰発現したマウス内皮細胞では細胞死が抑制され、逆にGalectin-3をノックダウンしたマウス内皮細胞では細胞死が増加した。このことからvasohibin-1は抗細胞死作用の一部をGalectin-3を介して発揮していることが示唆された。(2)細胞老化に重要な分子であり抗老化作用を持つSIRT1の発現がHUVECにおいてvasohibin-1の発現増加に伴い増加し、逆にvasohibin-1の発現減少に伴い減少することを見出した。このことからvasohibin-1は一部、SIRTIの発現を調節することにより内皮細胞の老化に関与していることが示唆された。以上の結果から血管新生抑制因子として単離・同定されたvasohibin-1は、血管内皮の老化や細胞死をGalectin-3やSIRT1を介して抑制するなど血管内皮の恒常性維持にも重要な役割を演じている事が示唆され、さらなる究明は高齢化社会に伴い増加している老化関連疾患(脳血管障害、虚血性心疾患、動脈硬化、変性神経疾患など)の臨床応用に貢献できると考えられる。平成20年度における研究の進展として、(1)抗老化作用をもつSIRT1の発現がHUVECにおいてvasohibin-1の発現増加に伴い増加し、逆にvasollibin-1の発現減少に伴い減少すること、さらにSIRT1の強力な活性物質であるレスベラトロールがvasohibin-1の発現をノックダウンにより老化した内皮細胞をレスキューすることを示した。このことからvasohibin-1は一部、SIRTIの発現を調節することにより内皮細胞の老化に関与していることを明らかにした。SIRTIはp53, FOXOsなどを脱アセチル化することによって細胞の生存および老化などを調節することから、現在、vasohibin-Iとそれらの分子との関連も解析中である。(2)HUVECにおいてsuperoxide dismutase-2の発現がvasohibin-1の発現の増加に伴い増加し、逆にvasohibin-1の発現を低下させると減少し、活性酸素(ROS)が増加することを見出した。このことからvasohibin-1が活性酸素の産生抑制または除去促進にも関与していると考え解析中である。in vivoにおいてはvasohibin-1ノックアウトマウスの寿命や加齢による変化、特に動脈硬化の進行について解析中である。
カンナビノイドによる脊髄鎮痛の機序解明

大麻の活性成分であるカンナビノイドの脊髄投与による鎮痛効果を検証した。ACEAの脊髄投与により熱刺激に対する逃避行動を抑制が得られた。抗癌剤による末梢神経障害モデルに対してin vivoパッチクランプ法により脊髄神経活動を検討したところ、自発性EPSCおよび寒冷刺激によって誘発されたEPSCは対照群と比較し振幅・頻度が増強していたが、ACEAの脊髄潅流によって抑制された。カンナビノイドの脊髄投与によって鎮痛効果が得られることが行動学的・電気生理学的に示された。古くからマリファナには痛みを和らげる効果があり,不安の軽減や気分の高揚,嘔吐の抑制と食欲増進といった作用があることが知られていた,1960年代には活性成分であるTHC(Δ-9テトラヒドロカンナビノール)が同定され1990年代に入ると内在性カンナビノイド受容体CB1が単離された。現存は不安,食欲,吐気を調節する部位に作用する薬剤の開発が進行しているが,疼痛に関わるメカニズムにおいては,疼痛中枢のいくつかでカンナビノイドが明らかにされているのみで未だ解明されていない。一方,抹消からの侵害情報は脊髄後角、特に膠様質(Substantia gelatinosa:SG)ニューロンに入力し,様々な修飾な受けた後,最終的に一次体性感覚野に投射する。そのため脊髄後角をターゲットとした鎮痛,-脊髄鎮痛-は効果的な鎮痛法であり,CB1受容体は脊髄に多く存在するためCB1受容体を介した脊髄鎮痛が得られる可能性がある。そこで,痛み刺激が脊髄でのシナプス応答に応える影響をin vivoパッチクランプ法で調査した。ウレタンの腹腔内投与による全身麻酔下に6週ラットを椎弓切除し,脊髄を露出しパッチクランプを行い,興奮性シナプス後電流,(EPSC)を記録した。CB1作動薬の投与によりEPSCの頻度・振幅は増加するもの,減少するものと様々であった。ラットの足底にカラゲチンを投与し炎症を作成したラットにおいては、自発EPSCが増加しておりCB1作動薬の投与によってEPSCの抑制が見られた。以上より正常ラットにおいてカンナビノイド投与による反応は一様ではないが炎症モデルラットにおいてはカンナビノイドが侵害刺激の伝達を抑制した。今後,モデルの種類を増やし,様々な状態におけるカンナビノイドの作用を検討していく予定である。古くからマリファナには痛みを和らげる効果があり、不安の軽減や気分の高揚、嘔吐の抑制と食欲増進といった作用があることが知られていた。不安、食欲、吐き気の調節にはCB1受容体が関与していると考えられているが、疼痛に関わるメカニズムについては未だ解明されていない。CB1受容体は侵害情報が入力される脊髄後角に多く存在するためCB1受容体を介した脊髄鎮痛が得られる可能性がある。現在、諸外国においてはがん患者の嘔吐抑制・食欲増進目的にマリファナが使用されつつある。一方、癌に用いられるさまざまな抗癌剤はしばしば末梢神経障害を用いることが知られている。CB1作動薬により末梢神経障害による痛みの緩和が得られれば癌治療においてCB1作動薬の有用性が証明される。そこで抗癌剤(paclitaxel)による神経障害モデルラットを作成し、in vivoパッチクランプによるEPSCの記録を試みた。生後6週のラットにPaclitaxel 2mg/kgを隔日に4回投与したところ、投与終了後1週間後・3週間後にvehicle群と比較しmechanical allodynia, cold allodyniaが認められ抗癌剤による末梢神経障害モデルラットが得られた。次にウレタン腹腔内投与による全身麻酔下に生後6週となる末梢神経障害モデルラットおよびvehicle群のラットを椎弓切除し、脊髄を露出、パッチクランプを行いEPSCを記録した。末梢神経障害モデルラットではvehicle群と比較し自発EPSCの増加が認められた。今後脊髄灌流液にCB1作動薬を投与することによりEPSCの変化を計測していく古くからマリファナには痛みを和らげる効果が知られていた。1960年代に活性成分であるΔ-9-テトラヒドロカンナビノールが同定され1990年代に入ると内在性カンナビノイド受容体CB1受容体が単離された。しかし、疼痛に関わるメカニズムは疼痛中枢のいくつかでカンナビノイドが明らかにされているのみで未だ解明されていない。末梢からの侵害情報は脊髄後角、特に膠様質(substantia gelatinosa : SG)ニューロンに入力し、様々な修飾を受けた後、最終的に一次体性感覚野に投射する.そのため脊髄後角をターゲットとした鎮痛-脊髄鎮痛-は効果的な鎮痛法であり、CB1受容体は脊髄に多く存在するためCB1受容体を介した脊髄鎮痛が得られる可能性がある。そこで、実際の痛み刺激が脊髄でのシナプス応答に与える影響をパッチクランプ法で調査した。In vivoパッチクランプを行ったところ、CB1作動薬の投与によりEPSCの頻度、振幅ともに増加するもの、減少するものと様々であった。

パクリタキセル投与によって生じた末梢神経障害ラットにおいては自発および寒冷刺激に誘発されるEPSCが増加していた。ACEAの灌流により自発、誘発EPSCはともに抑制された。これらの結果からカンナビノイドによる鎮痛効果の発現機序はカンナビノイドにより脊髄SGニューロンのEPSCが抑制されることで生じていると考えられた。カンナビノイドによるEPSC抑制が疼痛緩和の機序の一つとして存在していることが推測された。
動体追跡システムの高度化と強度変調/スキャニング照射への応用

腫瘍追跡システムの高度化をめざしてハードウェアとソフトウェアの改善を行なった。さらに腫瘍領域画像を利用した追跡精度事前評価関数を構築した。大幅な追跡精度向上には至らなかったが、多数の追跡アルゴリズムの試験結果と追跡精度事前評価関数から追跡精度向上のために必要な条件を明確にした。基本的な条件下での呼吸同期の周期性と追跡精度と考慮したスキャニング照射の線量分布を推定した。本年度は、我々が開発している患者体内に標的金属マーカーを留置しない非侵襲的な動体追跡システムについて、より高精度で高信頼の追跡を可能にするためのハードウェアとソフトウェアの整備と強化を進めることが研究目的であり、ほぼ実施計画通りの成果が得られた。具体的には、ハードウェア面では、従来よりもX線動画像を高解像度で取り込むことを可能とし体内の情報量が増加した。同様に、体表情報も従来のレーザー距離計による一点測定だけではなくTOF式赤外線距離カメラと光学カメラにより多点測定を可能とし情報量が増加した。これら体内外の複合的な情報を並列計算により処理するシステムの基本構成を構築した。ソフトウェア面では、追跡精度を呼吸位相毎にパターンマッチングの相互相関係数を基にするコスト関数で評価した。結果として、通常は高い追跡精度が得られるが、低コントラスト画像追跡時にテンプレート画像取得時付近の呼吸位相でも的外れ検出が僅かに発生することが判明した。的外れ検出位置は、ガウス分布型測定誤差を大きく外れるためカルマンフィルター等の線形フィティングでは除去困難であることも明らかどなった。この問題への対応として、線形フィルタで多く採用されている最小2乗法ではなく、的外れデータに比較的強い最小絶対残差によるフィルタを試みたところ、的外れデータが連続しない場合には効果があることが明らかになった。今後、追跡精度の向上と信頼性確保のためには、リアルタイムで体内外情報を有効に利用しながら、パターンマッチングの精度そのものを向上させ、非線形フィルタの適応等による誤検出除去をする必要があるという課題も明らかになった。本年度は、我々が開発している患者体内に標的金属マーカーを留置しない非侵襲的な動体追跡システムについて、より高精度で高信頼の追跡を可能にするためのハードウェアとソフトウェアの整備と強化を、前年度同様に進めることが研究目的であり、ほぼ実施計画通りの成果が得られた。具体的には、次に示す3つの内容で進展が得られた。1)多領域追跡を可能にした。これにより、標的のみならず治療ビームの体内の通過点上の構造物の追跡が技術的に可能となり、不明瞭標的の追跡時に他点からの情報により高精度な追跡を実現できる可能性が開かれた。2)事前に腫瘍追跡精度を予測するシステムの開発を行った。これは、追跡腫瘍を含む画像から、腫瘍の画像特徴量と周辺の画像類似性を数値化し腫瘍の追跡可能性と追跡精度を予測するものであり、現時点では不完全であるが、将来的にはマーカーレス追跡の臨床適応を判断するための指標となる重要な機能である。3)XYZ昭移動ステージによる腫瘍移動の再現システムの開発をおこなった。H23年度は、我々が開発している患者体内に標的金属マーカーを留置しない非侵襲的な動体追跡システムについて、より高精度で高信頼の追跡を可能にするハードウェアとソフトウェアの整備と強化を、前年度同様に進めることが研究目的であり、ほぼ実施計画通りの成果が得られた。1)多領域追跡の精度評価と高度化:昨年度作成した、治療ビームの体内の通過点上の比較的高密度である骨構造の追跡機能の精度評価を実施した。横隔膜がテンプレート画像に含まれる場合に横隔膜の運動方向の影響を若干受けることが判明した。その他の場合は高精度の追跡結果が得られることが判明した。2)不明瞭標的の追跡精度の評価:標的の透視像が不明瞭である場合に、テンプレート画像の特徴量が乏しく追跡精度が低下することが判っている。数名の患者の不明瞭標的の追跡精度評価をおこなった。3)多領域追跡による不明瞭標的の追跡精度向上の試み:上記1)2)を組み合わせ不明瞭標的の追跡精度向上の試みを開始した。本研究は患者体内に標的となる金属マーカーを留置しない非侵襲的な動体追跡システムの開発である。開発中のシステムは透視画像に対してリアルタイムにパターンマッチング演算を実行することが可能であり、既に基本機能を完成させた。本年度はこれまでの研究成果を基に、1)動体追跡システムのさらなる高精度化・高機能化・高信頼度化とその精度検証を行い、また現状の追跡精度環境下における2)強度変調/スキャニング照射を想定した線量分布の精度評価、を研究することが目的であった。追跡精度の向上については、これまでの精度を劇的に上回るアルゴリズムを開発するには至っていない。しかしながら、本研究を通して追跡精度を悪化させる要因が、透視画像上の呼吸に伴う腫瘍の変形や腫瘍周辺の組織等の映り込みによるものであるとことが明らかになっている。

対応策として従来のテンプレートマッチングではなく、オプティカルフローやパーティクルフィルターなどの追跡対象物の変形に強い追跡アルゴリズムを試したが、これらの単一ピクセルの統計的追跡は精度向上に資さないことが判明した。この結果は周辺組織を除外した弱識別器を組み合わせた追跡アルゴリズムの有効性を示唆するものである。変調/スキャニング照射を組み合わせた場合の精度評価については、基礎的な研究に留まっている。動体ファントムに2次元的線量分布測定系を装着した検証系を作成したが、実照射での確認をするまでには至っていない。しかし、数値シミュレーションによってスキャニング方向と呼吸移動方向が線量分布に対する関係を明らかにした。マーカーレスの腫瘍追跡について、多領域追跡により単領域追跡時よりも精度が向上することが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、これまでの成果を論文として発表するとともに、動きのある模擬腫瘍に対して本研究で示された追跡精度に基づき照射をおこなった場合の線量分布評価を進める予定である。
ウニ小割球由来培養細胞の虚足成長誘起機構の研究

ウニ胚から16細胞期に小割球を単離し、馬血清又はウニ胞胚腔内液存在下で20°Cで培養すると、約15時間目に虚足が生じ、その後約5時間目に骨片形成がはじまる。1)ウニ胚細胞はプロテインチロシンキナーゼをはじめ各種のプロテインキナーゼ,Gタンパク質('93,DGD)を含み、インシュリンは虚足成長をひきおこす('94a,DGD)ことを見出した。2)小割球由来培養細胞は、インシュリン受容体をもち('94b,DGD)、インシュリン受容体は培養細胞6時間目のあいだにミクロソームから細胞膜への移動によって増加する('94b,DGD)。3)インシュリン受容体とインシュリンの結合を競合的に阻害する物質が馬血清及び胞胚腔液に存在する('94a,DGD)。4)インシュリン又は馬血清、胚胞腔液で細胞を処理するとタンパク質リン酸化が促進され、つゞいてRNA合成が活性化される。タンパク質リン酸化を阻害するとRNA合成活性化が阻止され、アクチノマイシンDはタンパク質リン酸化を阻止せず、RNA合成を阻害し、インシュリンなどによるタンパク質リン酸化、RNA合成の活性化のおこる時期に限って、虚足成長を阻止する(DGD投稿)。馬血清、胞胚腔内液は、虚足成長後もタンパク質リン酸化、RNA合成率を高くたもち、この時期では、アクチノマイシンDは虚足成長後の骨片形成に限って阻害する(DGD投稿)。馬血清、胞胚腔内液は、インシュリン様物質以外の細胞間情報物質をもち、その物質が骨片形成をひきおこしていると考えられる。今後の研究課題は、虚足成長に関する細胞外情報物質を明らかにし、虚足成長及び骨片形成をそれぞれ支えるRNAを見出すことである。更に、細胞外信号によってリン酸化されるタンパク質及びそれに関するプロテインキナーゼ種を同定する必要があろう。ウニ胚16細胞期から単離した小割球は、馬血清又は胞胚腔内物質の存在下で培養すると、胚に存在する細胞と同じく虚足成長が起り、細胞内の骨格胞内に炭酸カルシウムを含む骨片が形成される。虚足成長はインシュリン投与でおこり、タンパク質のチロシン残基のリン酸化が促進されるが、骨片形成は馬血清又は胞胚腔内物質の存在がなければおこらない。虚足成長開始直前に、インシュリンは馬血清に含まれる物質と競合的に小割球由来細胞と結合するようになる。この時期にインシュリンと結合し得る受容体が細胞膜に発現し、その結合によって細胞内への信号が起生して、虚足成長を引き起すと考えられる。インシュリンによる虚足成長は骨片形成を伴なわない。培養小割球由来細胞の虚足成長と骨片形成は、アクチノマイシンDによるRNA合成で阻害されるが、虚足成長開始直後にRNA合成を阻害すると、虚足成長は続き、骨片形成は起らない。虚足成長と骨片形成は異なったトランスクリプションによるものであり、前者はインシュリンと結合し得る受容体による細胞信号によって開始するものと考えられる。後者を開始する細胞間情報として、インシュリン抗体で処理した馬血清を用い、インシュリン処理細胞に投与すると骨片形成が開始するが、処理されていない細胞では虚足成長、骨片形成は起らない。インシュリン処理で虚足成長がはじまると、新しい骨片形成開始と関連する受容体が生ずる可能性がある。インシュリン受容体は、本研究で得られた知見によれば、チロシンキナ-ゼをもつものと考えられる。もう一方の受容体の特性を知る第一歩として胚細胞のGプロテインを測定した。全胚と同じく、Gs,Gi又はGo,低分子Gプロテインを見出した。

このうち、Gi又はGoの活性に影響する百日咳毒素は骨片形成に影響を与えた。16細胞期のウニ胚から単離した小割球は馬血清存在下で培養すると虚足を生じ、その虚足内に骨(片炭酸カルシウム単結晶)を形成する。虚足成長は、小割球を20°Cで培養すると約10時間目にはじまり、培養開始後約15時間目に骨片形成がはじまる。虚足形成開始5時間前までに培養細胞にアクチノマイシンDを投与すると虚足成長、骨片形成が阻害される。そして、骨片形成開始5時間前にアクチノマイシンDを投与すると虚足成長は阻害されないが、骨片形成は阻害される。虚足成長と骨片形成にはそれぞれ異なった時期での異なった遺伝子発現が必要である。虚足成長は、馬血清のかわりにインシュリンを投与することでおこる。インシュリン受容体は、培養5時間目には見出され、その量は増加し、培養10時間目に最高になる。培養細胞の受容体は、哺乳動物のそれより分子量が小さく、チロシンキナーゼドメインをもつか否か不明である。培養5時間目からRNA合成阻害剤を投与すると、受容体発現速度は遅くなり、インシュリンによる虚足成長はほとんどおこらない。インシュリン受容体遺伝子発現がこの時期におこると考えられる。このことは、虚足成長を支えることを見出しているC-キナーゼ遺伝子発現と共に虚足成長開始の重要な機構であり、これらcDNAを得るべく準備中である。一方、骨片形成開始については、胞胚内液又は馬血清をインシュリン抗体で処理し、インシュリン存在下で15時間飼育した細胞に投与すると骨片形成がおこる。従って、この受容体発現について検当中である。骨片形成に必須であることを明らかにしたH^+、K^+ATPアーゼのcDNA作成と共に、この受容体のcDNAを得るべく準備中である。これら受容体を通じての細胞信号のトランスミッターであるG-プロテイン群の同定、及びその発生過程での量的変化についても明らかにした。ウニ胚から16細胞期に小割球を単離し、馬血清又はウニ胞胚腔内液存在下、20°Cで培養すると、約15時間間目に虚足が生じ、その後約5時間目に骨片形成がはじまる。1)ウニ胚細胞はプロティンチロシンキナーゼをはじめ各種のプロティンキナーゼ、Gタンパク質(′93,DGD)を含み、インシュリンは虚足成長をひきおこす(′94a,DGD)ことを見出した。2)小割球由来培養細胞は、インシュリン受容体をもち(′94b,DGD)、インシュリン受容体は、培養細胞6時間目のあいだに、ミクロソームから細胞膜への移動によって、増加する(′94b,DGD)。3)インシュリン受容体とインシュリンの結合を競合的に阻害する物質が馬血清及び胞胚腔液に存在する(′94a,DGD)。4)インシュリン又は馬血清、胞胚腔液で細胞を処理するとタンパク質リン酸化が促進され、つヾいてRNA合成が活性化される。タンパク質リン酸化阻害RNA合成活性化を阻止し,アクチノマイシンDは、タンパクリン酸化を阻止せず、RNA合成を阻害し、インシュリンなどによるタンパク質リン酸化、RNA合成の活性化のおこる時期に限って、虚足成長を阻止する(DGD、投稿)。馬血清、胞胚腔内液は、虚足成長後もタンパクリン酸化、RNA合成率を高くたもち、この時期では、アクチノマイシンDは、虚足成長後の骨片形成に限って阻害する(DGD.投稿)。馬血清、胞胚腔内液は、インシュリン様物質以外の細胞間情報物質をもち、その物質が骨片形成を引きおこしていると考えられる。
タスク別書き言葉コーパスを利用したメール文のweb自動採点システムの開発

本研究は、「メール文のweb自動採点システム」を開発することを目指した。そのために、本研究は、日本語母語話者30名、および日本語学習者90名(韓中独)によるタスク別(依頼、勧誘、断り、お礼、相談、等)のメール文のデータ1200件を収集し、書き言葉コーパスとした。また、収集したメール文を分析し、文法、語彙、文体、読み手配慮の表現などを明らかにした上で、そのデータをリスト化したものをもとに、メール文のweb自動採点システム『花便り』を開発した。本システムでは、web上でタスクを選び、それにしたがいメール文を入力すると、メール文の判定を行い、読み手に配慮した表現が使えるようにアドバイスを行う。本研究の目的は、日本語母語話者、および日本語学習者によるタスク別(依頼、勧誘、断り、お礼、相談、等)の作文(メール文)のデータを蓄積し、書き言葉コーパスとすること、ならびに、そのコーパスの作文を分析し、構成、内容、文法、表現、語彙、文体などを明らかにした上で、そのデータをリスト化しコンピュータに学習させ、「メール文のweb自動採点システム」を開発することを目的としている。平成27年度は、タスク別に複数の課題を作成し、日本語母語話者、国内外の日本語学習者の一部を対象にデータを収集し、そのデータの分析を行った。また、既存の依頼文のメールの分析結果をもとにしたweb自動採点システムβ版の開発を行った。具体的な内容は次の通りである。1.日本語母語話者のデータ収集:日本人大学生30名を対象に10のメール文タスク(勧誘、断り、お礼、相談、等)を課し、平成28年3月までデータの収集を行った。2.日本語学習者のデータ収集:海外は学習者数が多くデータの利用価値のある中国(上海外国語大学)や韓国(ハンバット大学)の学習者計60名を対象に12のタスクを課し、データを収集した。また、独国(ミュンヘン大学)の協力を得て、データの収集を開始している。3.メール文のweb自動採点システムβ版の開発:データ収集に先行してweb自動採点システムを開発するため、既存の依頼のメール文のタスクのデータを分析し、分析結果からメール文の評価項目を決定し、リストを作成した。そのリストをコンピュータに学習させ、自動採点システムβ版を開発し、http://hanadayori.farm.overworks.jp/において運用実験を開始した。メール文のデータ収集は9月に開始したが、韓国は平成27年12月に終え、中国も3月には十分なデータを得ることができた。欧州圏のデータ収集は中国韓国より遅くスタートしたため、平成28年度中の収集を予定しており、現在進行中である。現在収集したデータをもとに分析を行っており、評価項目を選定し、順次リスト化している。一方、メール文のweb自動採点システムβ版は平成27年7月にはほぼ大枠が決定し、サイトを開設することができた。今後、複数のタスクの示し方、各タスクの評価結果の示し方等、webデザインの検討を進める。メール文の12のタスクのデータを分析した結果、想定以上の内容が盛り込まれ自動評価が難しいタスクが4つあることが判明した。本研究は、タスク別のメール文を蓄積することが目的の一つであり、そのデータ自体、日本語教育の教材開発や習得研究等のために利用価値が高い。これらのデータは日本語教育における研究のため蓄積することにする。1年目の平成27年度は、日本語母語話者、学習者(韓国語、中国語、ドイツ語母語話者)、各グループ30名ずつ、計120名、1012タスク、計1320データを収集した。ドイツ語母語話者のデータ収集は目標人数に達するまで平成28年度も引き続き行った。一方、「メール文のweb自動採点システム」の開発を行った。2年目である平成28年度は収集したデータの分析を行い、8つのタスクに対し、特に、文法、表現についての分析を行った。その中で、各言語母語話者に対する読み手配慮のための表現のリストを作成した。またその結果にもとづき、韓国語母語話者にとって留意しなければならない表現について学会等で発表を行った。また、web自動採点システムβ版の開発を進めており、搭載するリストのアップロード、ダウンロードが可能になった。さらに各タスクが自由に選択できるようにwebデザインを調整中である。またこのシステムの成果の一部として、ウェブ上で使用可能な「文体チェッカー」を作成した。このシステムは、各タスクに共通の文体を確認するためのものであるが、レポートの文体チェックなどにも使用可能なものである。それについても学会等で発表を行った。現在収集した各母語話者のデータをもとに分析を行っており、評価項目を選定し、順次リスト化している。特に、表現の分析を行い、「読み手配慮のための表現」のリストを作成し、韓国語母語話者がメール文を作成する際の留意点を明らかにすることができた。また、他の言語母語話者のデータに対し、引き続き同様の分析を行っている。メール文のweb自動採点システムβ版は、現在http://hanatayori.farm.overworks.jp/において運用実験を開始しており、現在学習のために効果的なwebデザイン(レイアウト)の検討を進めている。

しかしながら、システムに搭載するデータリストがまだ整っていないため、1つのタスクしか運用実験ができなかった。今後も収集したデータの分析を進め、各タスクのリストの8月までの搭載を目指す。本研究は、日本語母語話者、及び日本語学習者によるタスク別(依頼、勧誘、断り、お礼、相談、等)の作文(メール文)のデータを蓄積し、書き言葉コーパスとすること、ならびに収集したメール文を分析し、構成、内容、文法、表現、語彙、文体などを明らかにした上で、そのデータをリスト化しコンピュータに学習させ、「メール文のweb自動採点システム」を開発することを目的とした。平成27年度は、日本語母語話者ならびに国内外で日本語を学習している非母語話者、120名を対象に10タスクのメール文のデータを収集し分析を行った。また、自動採点システムの基本設計を行い、システム開発をすすめた。平成28年度は、収集したタスク別のデータを分析し、その結果の一部を自動採点システムに組み込み、運用実験を行った。このシステムは、学習者がタスクをもとに作成したメール文を自動で評価し、問題点の指摘を行う。本研究では収集した基礎データをもとに、各メールタスクにおいて特に読み手配慮の点から収集した適切な語彙や表現のリストと不適切な語彙や表現のリストを作成し、両リストから指摘を行うことにした。またシステムでは、搭載するリストのアップロード、ダウンロードを可能にした。平成29年度は引き続き収集したデータの分析を進め、作成されたリストと学習者のメール文の照合を行い、メールタスクの達成に必要でかつ適切な表現の有無と、不適切な表現の有無により評価が行えるようにした。完成したシステムを用いて、6つのメールタスクに対し評価実験を行った。それに基づきプログラムやリストの修正を行い、公開可能とした。本研究で収集したデータは従来にないデータであり、学術的に有用なデータである。またこの研究成果はメール作成タスクを用いた作文支援システム『花便り』として無償公開しており、日本語学習者にとって有益な学習支援ツールの一つとなると思われる。本研究は、「メール文のweb自動採点システム」を開発することを目指した。そのために、本研究は、日本語母語話者30名、および日本語学習者90名(韓中独)によるタスク別(依頼、勧誘、断り、お礼、相談、等)のメール文のデータ1200件を収集し、書き言葉コーパスとした。また、収集したメール文を分析し、文法、語彙、文体、読み手配慮の表現などを明らかにした上で、そのデータをリスト化したものをもとに、メール文のweb自動採点システム『花便り』を開発した。本システムでは、web上でタスクを選び、それにしたがいメール文を入力すると、メール文の判定を行い、読み手に配慮した表現が使えるようにアドバイスを行う。平成28年度は、収集したタスク別データを詳細に分析し、評価項目を決定し、web自動採点システムに組み込む必要なリストをタスク毎に作成する。リストを組み込んだweb自動採点システムの運用実験を行い、平成29年3月の完成を目指す。システムの公開はタスク毎に行い、徐々に増やしていく予定である。
到達目標を明確にした教育課程基準のモデル開発に関する研究

日本の教育課程の基準はこれまで各学校で指導すべき内容を中心に示してきた。この研究は、教育課程の基準に関して、内容中心のカリキュラムから、目標に重点を置いたカリキュラムに改善するための方向性を探ることをねらいにした。そのための基礎資料として、諸外国の学校カリキュラムや日本の学校カリキュラムの開発事例の分析を行った。研究の結果、カリキュラムの改善の例として、四つのパターンを示した。本研究では、求められる資質や能力の育成を重視した学校カリキュラムの在り方を展望する目的から、到達目標を明確にした教育課程基準の構成や示し方について検討を進めてきた。その結果、次の結論を得た。1.教育課程基準における到達目標の示し方については、例えば、近年のフランスのように「共通知識技能」を定めて、教育課程基準の内容を示す例、「十大基本能力」を策定し、教育課程を各領域として構成する中華民国の例がある。また各学習領域に諸能力を横断的に位置づけるオーストラリアの教育課程基準の例、複数学年のステージごとに目標を示すイギリスの例がある。これらのタイプを目標と内容の関係の観点から比較すると、基準として目標は示すが、内容は具体的に示さず各学校に委ねるタイプと、内容は教科ではなく緩やかな領域として示すタイプなどに整理できる。2.これらの整理を手掛かりに、教育課程基準の示し方について次のように類型化した。ア学習指導要領の総則において、教科等の学習で共通に習得させる資質や能力を明示し、この共通目標と各教科等における目標との関連を明確にして示す方法。イアに加え、各教科等の内容を示す場合、個々の内容の扱いにおいて習得させる資質や能力をより明確に示す方法。ウ現行の学習指導要領の内容の示し方は、文章で示しているが、これを目標としての資質・能力と扱う内容の例を区別して示す方法。この場合、資質・能力と内容の示し方については、複数学年に渡って示すことが考えられる。エ現行の学習指導要領の構成に加え、教科等横断的な資質や能力を育成する教科等や学年をより具体的に示す方法。これは全体計画の基礎的な枠組みを教育課程の基準として示す方法である。現行の学習指導要領を漸次改善していく際には、これらの中でアとイの方法が現実的であると考えられる。平成23年度においては、次の3点について研究を進めた。(1)外国における教育課程基準に関わる資料の分析整理研究の対象とした国等は、到達目標を重視した教育課程基準を設定している、イギリス、オーストラリア、フランス、中華民国とした。これらの国の教育課程基準の構成について、国立教育政策研究所のこれまでの調査研究の成果や関連学会の成果物、インターネットによって得た資料を参考に整理を行った。分析整理の着眼点は、(1)到達目標設定の根拠や設定手続き、設定方法、(2)到達目標と教育課程を構成する内容との関連、(3)到達目標及び教育課程基準を評価する仕組みと方法、などである。(2)国内における先行開発事例の調査我が国において、目標とする資質や能力の習得を目指した教育課程の開発を進めている、教育課程特例校及び文部科学省研究開発学校における教育課程の開発事例の調査を行った。構造改革特区の指定を受けて行われた東京都品川区の「市民科」や世田谷区の「日本語」等についてカリキュラム関係の資料を収集し、指導目標、内容、指導方法の関係について整理を行った。(3)現行の教育課程基準における目標、内容等の相互関係の整理現行の教育課程基準である学校教育法等の法令及び学習指導要領を、目標、内容等の相互関係の視点から整理・分析を行った。学校教育法に規定されている教育目標と学習指導要領との関係、学習指導要領における総則の目標と各教科等の目標と内容、方法との関連の整理を行った。学習指導要領の総則の意義について、教育課程と各教科等との関連の視点から考察を進めている。「研究実績の概要」欄に記した三つの研究について、それぞれほぼ順調に資料の収集と整理、考察を行ってきたが、それぞれの相互関係を踏まえた体系的な調査にまでは至らなかったのが現状である。また、教育課程特例校及び文部科学省研究開発学校の開発事例に関する資料調査については、報告書等を通して詳細で具体的な内容が把握できない事例も見られ、資料に限界があることが分かった。平成24年度においては、次の二つの点から研究を進める。(1)到達目標を明確にした教育課程基準の示し方の類型化到達目標を明確にした教育課程基準については、例えば、総括目標、領域目標を用意し、それらを元に教育課程の区分を構成する方法、学年段階をステージ等に区分し、ステージごとの目標を示す方法、教育課程のシークェンスとスコープの交差ごとに諸能力を配置編成する方法等が考えられる。一方、国の基準と地方基準、各学校の相互関係についても、視野に入れた類型を考える。これらの視点及び平成23年度の研究から得られた知見を生かしながら、教育課程基準の示し方のタイプ化を図る。(2)到達目標を明確にした教育課程基準の試案の作成到達目標を明確にした教育課程基準について、現行の学習指導要領の範囲を前提に、その組み替え案を作成する。

その際、教育課程を構成する教育目標と教育内容、学年やステージの組み合わせ方法について、教科のように"境界維持"の強い類型と、領域や分野のように弱い類型とに区別して試案を作成する。平成24年度に使用することとなる研究費(19,943円)が生じた理由については、旅費や物品費の額が予定よりも押さえられたからである。平成24年度においては、前年度からの繰り越し分も含めて、物品費約15万円、旅費約25万円、その他約12万円の使用を予定している。物品費は図書や消耗品、旅費は資料収集並びに調査旅費、その他は印刷費等を予定している。
癌特異的プロモーターを導入した組換え単純ヘルペスによる転移性肝癌治療の研究

1組み換えHSV-1の作成survivin promoter下のみで増殖するsurvivin specific HSV-1を作成し、survivin高発現株であるHT-29に感染させsingle step growth assayにより細胞の増殖活性を測定した。この際survivin発現のない繊維芽細胞を用いて同様に実験を行い増殖活性がないことを確認した。この結果survivin発現及び未発現の細胞間での増殖活性の選択性は認められたものHT29における増殖活性が予測していたより弱かった。以上の結果はCEA specific HSV-1についても同様であった。(1)皮下腫瘍モデルを用いた腫瘍縮小効果の検討。ヌードマウスの皮下腫瘍に対する治療効果を検討したところsurvivin高発現株あるhepG3、Panc1での腫瘍縮小効果は認められ、またsurvivin低発現株であるLovoでは腫瘍縮小効果は認められなかった.一方、HSV-survの対照として用いた組み換え型単純ヘルペスウイルスhrR3はHSV-survに比べ腫瘍縮小効果は著明であったがHSV-survに見られたような腫瘍選択性は認められなかった。(2)転移性肝癌モデルを用いたウイルス効果の検討肝動脈内に留置じたカテーテルからのウイルス投与を計画したが手技的に困難であり且つウイルス投与が不確実になるためウイルスを脾臓に投与し経門脈的にウイルスを脾臓に投与し経門脈的にウイルスを肝臓内へ投与した。この結果対照のhrR3は著明な腫瘍縮小効果をみとめたもののHSV-survでは腫瘍効果を認めなかった。本研究の課題としてはウイルス増殖を充分に促す強力なプロモーターを選択且つ改良することにありこの問題が克服されれば癌治療に有効な研究成果が期待出来るものと考える。平成13年度は腫瘍特異性を有する組み換え型単純ヘルペスの作成を以下の通り行った。(1)転移性肝癌に特異的活性を有するプロモーターの作成転移性肝癌に発現の強いCEAのpromoter及びapoptosis inhibitorの一種で癌特異性が極めて高いsurvivinのpromoterの2種類のc-DNAを作成しルシフェラーゼアッセイを行ないプロモーター活性を確認した。(2)組み換え用プラスミドの作成HSV-Iのimmediate early geneであるICP4を上記で作成したプラスミドのプロモーターの下流に組み込みプロモーター/ICP4のfragmentをHSV-IのTKcodingregionにlac Z及びSV40 polyadenylation siteを挿入したpTKΔLの下流に組込みpTKΔL-CEA及びpTKΔL-survivinを作成した。(3)組み換えHSV-1の作成作成したウイルスをsurvivin高発現株である大腸癌細胞株HT-29に感染させ細胞の増殖活性を測定した。この際suvivin発現のない繊維芽細胞を用いて同様に実験を行った。この結果、増殖活性の選択性は認められたもののsurvivin高発現株での増殖活性が予測していたより弱かったため現在、組み換えプラスミドを改良中である平成14年度は昨年度に作成した腫瘍特異性を有する組み換え型単純ヘルペスの改良並びに動物実験を以下の通り行った。(1)ヘルペスウイルスの改良昨年度に樹立した組み換え型単純ヘルペス(以下HSV-surv)は増殖活性の選択性は認められたもののsurvivin高発現株での増殖活性が予測していたより弱かったため、survivin promoterの上流に4F2蛋白のenhancerを組み込んだ。この結果ウイルスの増殖活性が増大した。HSV-CEAは増殖活性が上がらず以下の動物実験には使用しなかった。(a)皮下腫瘍モデルを用いた腫瘍縮小効果の検討。ヌードマウスの皮下腫瘍に対する治療効果を検討したところsurvivin高発現

株あるhepG3、Panc1での腫瘍縮小効果は認められ、またsurvivin低発現株であるLovoでは腫瘍縮小効果は認められなかった。一方、HSV-survの対照として用いた組み換え型単純ヘルペスウイルスhrR3はHSV-survに比べ腫瘍縮小効果は著明であったがHSV-survに見られたような腫瘍選択性は認められなかった。(b)転移性肝癌モデルを用いたウイルス効果の検討上記の腫瘍細胞を脾注し転移性肝癌モデルを作成した。当初、肝動脈内に留置したカテーテルからのウイルス投与を計画したが手技的に困難であり且つウイルス投与が不確実になるためウイルスを脾臓に投与し経門脈的にウイルスを肝臓内へ投与した。この結果対照のhrR3は著明な腫瘍縮小効果をみとめたもののHSV-survでは腫瘍効果を認めなかった。これはHSV-survの増殖活性がまだ不十分であることに起因すると考えられ、今後はさらなるウイルスの改良やウイルスプロモーターの活性を上げる腫瘍細胞内の環境の検討等が望まれる。
ｉＰＳ細胞、及び疾患特異的ｉＰＳ細胞からの骨格筋細胞分化誘導に関する基盤研究開発

ヒトES細胞Kh-ES1およびヒトiPS細胞253G4を用いてin vitroで骨格筋細胞を分化誘導することに成功した。更に、分化誘導した骨格筋細胞は移植実験のもと、生体内での生着することを確認した。今後はこれらの成果を発展させ、移植可能な前駆細胞の抽出を目標とする。また既に確立している筋ジストロフィー患者由来iPS細胞を用い、in vitroでの比較実験等を行う予定である。我々はこれまでにES細胞から骨格筋への分化誘導培養の基盤研究をすすめており、マウスES細胞及びiPS細胞から、実験的に質のよい骨格筋線維を産生し、マウス骨格筋に有効に生着する前駆細胞を抽出する系を確立してきた(Mizuno Y et al. FASEB J 2010)。この方法を応用させ、ヒトES細胞、iPS細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する基盤技術の開発に取り組んできた。未分化ヒトES細胞およびiPS細胞を胚様体と呼ばれる細胞塊として浮遊培養した後、特定条件下で付着培養すると、7週から16週程度で成熟骨格筋マーカーであるミオシン重鎖II型を発現し、間葉系細胞が選択的に誘導可能であった。本研究で誘導された細胞集団は、間葉系幹細胞マーカーであるCD73、CD105、CD166、およびCD29を一様に発現していることに加え、骨格筋前駆細胞マーカーのひとつであるCD56を強発現しており、最終的にin vitroで骨格筋ミオシンとジストロフィンを発現する多核成熟筋管へと分化した。ES細胞およびiPS細胞由来の骨格筋幹/前駆細胞の生体内での骨格筋再生能はいままで十分に検証されて来なかったが、本研究において誘導された筋原性間葉系細胞は、筋衛星細胞分画への生着能と、長期にわたる骨格筋再生能を有しておりより有用であると考えられた。この内容は、PLOS ONE 2012に論文発表している。当研究室において、これまでにES細胞から骨格筋への分化誘導培養の基盤研究をすすめており、マウスES細胞及びiPS細胞から、実験的に質のよい骨格筋線維を産生し、マウス骨格筋に有効に生着する前駆細胞を抽出する系を確立してきた(Mizuno Y et al. FASEB J 2010)。今回、この方法を応用させ、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する基盤技術の開発に取り組み、簡便な分化誘導系を用い、骨格筋選択的な分化誘導を行うことに成功し、論文発表を行った(Awaya T et al. PLOS ONE 2012)。本実験系では成熟骨格筋マーカーであるミオシン重鎖陽性細胞への分化誘導に成功し、また、骨格筋細胞への分化効率としてヒトES細胞、ヒトiPS細胞はともにほぼ同等な効率が得られ、また成熟骨格筋である多核筋繊維の形成も確認している。この実験系を用いて作成したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来の骨格筋細胞を免疫抑制マウス(NOGマウス)の筋障害モデルに移植することにより、マウス筋組織内に生着したこと確認した。また、移植したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来の骨格筋細胞は骨格筋の幹細胞と考えられている筋衛星細胞(PAX7陽性細胞)に組織内にて分化し、かつ、長期生着(少なくとも6ヶ月)を確認した。以上より、現時点で我々はヒトES細胞、ヒトiPS細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する基盤技術を確立させ、この実験系によって分化誘導された骨格筋細胞は再生医療の手段、並びに筋疾患の病態解析のin vitroにおける実験的検証を行うことが可能であると考えている。未分化ヒトES細胞およびiPS細胞を胚様体と呼ばれる細胞塊として富裕培養した後に、特定の条件下で培養すると7週から16週程度で成熟骨格筋マーカーであるミオシン重鎖II型を発現し、間葉系細胞の選択的分化誘導が可能となった。本研究で分化誘導された細胞集団は間葉系幹細胞マーカーを発現し、かつ骨格筋前駆細胞マーカーであるCD56も強発現している。従って、in vitroで骨格筋ミオシンとジストロフィンを発現する多核成熟筋管へと分化していることが判明した。

本研究で分化誘導された筋原性間葉系細胞は生体内においても長期生着、ならびに骨格筋最性能を有しており、有用な骨格筋への分化誘導実験系の確立に成功した。これらの内容についてPLOS ONEに論文報告をした。小児神経近年、iPS細胞へのMyoD導入による骨格筋分化誘導の系が他施設で確立し、これまで当方で行っている分化誘導系より簡便であり、かつ、培養日数(分化誘導日数)の短縮が可能となった。この分化誘導系に変更を検討しており、その基礎検討の実験などにより、当初の目的である疾患iPS細胞の骨格筋分化誘導の実験が当初より遅れているという状況に至っている。我々はDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)疾患特異的iPS細胞(DMD-iPS細胞)を8株所有している。iPS細胞の未分化能、多分化能のクオリティーを確認している。細胞株ごとにより細胞のクオリティーは多様性を示すことから、それぞれの細胞株のクオリティーの安定維持に時間を要している。iPS細胞のMyoD導入による骨格筋分化誘導の実験系の安定化を早急に目指し、その上で、検討すべき筋ジストロフィー疾患特異的iPS細胞の骨格筋分化誘導の実験を進めていく。現在、iPS細胞のMyoD導入による疾患特異的iPS細胞の骨格筋分化誘導を代謝疾患系の疾患特異的iPS細胞で行っている。正常iPS細胞から分化誘導した骨格筋細胞、骨格筋前駆細胞をコントロールとして、DMD-iPS細胞から分化誘導した骨格筋細胞、骨格筋前駆細胞における疾患特異的に発現しているタンパク質、RNA遺伝子を検出することによって、DMDの病態に関与する因子と、その作用機序について検討していくことを予定している。また、近年、DMDの治療として期待されている治療法の1つにエキソンスキッピング療法が注目されており、DMDモデル動物に対する治療効果について報告も多くされるようになっている。本システムがDMDの病態をin vitroで再現することが可能であることが確認されれば、本システムを用いて、DMDモデル動物において効果が示された治療のヒトにおける効果評価を安全に解析してきことも予定している。本年度の旅費を使用しておらず、その分を物品に回したが、金額的に未使用額余った。研究成果の報告として学会などで発表するべく、旅費を使用する。また、疾患特異的iPSの骨格筋分化誘導培養実験系の確立のために、物品などの購入を行う。疾患特異的iPS細胞の骨格筋分化培養の実験系を確立させるため、培養用メディウム250,000円、及び培養用プラスチック製品250,000円を次年度の研究費として計上した。また、骨格筋細胞の分化誘導の効率化の向上を計る目的にて各種サイトカインが必要となり、平成25年度は培養システム確立のため300,000円必要となる。免疫細胞組織染色を行なう上で、各種抗体の購入費用(平成25年度は200,000円)が必要とされ、RT-PCR解析を行なうために、RNA抽出キット、cDNA合成試薬、PCRプライマー等の費用(平成25年度は400,000円)が必要とされる。
肝臓からのコレステロール排泄機構の解明

肝臓は体内のコレステロールを排泄する唯一の臓器である。今回の研究から、(1)ヒトには肝臓特異的なステロリンが存在しており、そのコレステロール排泄力は小腸のそれとは異なること、(2)胆汁中に排泄されたコレステロールはNPC1L1で再度肝臓に取り込まれ、アポEに富んだリポ蛋白の産生に関与していること、(3)肝細胞のコレステロールがどこから由来するかにより、その生理的役割が異なる可能性があること、が示唆された。肝臓からのコレステロール排泄機構の全貌は未だ明らかにはなっていない。我々は、肝臓では小腸と異なるABCG5遺伝子(ステロリン1)が存在することを見出し(未発表データ)、この遺伝子の役割および細胞内動態を追求するとともに、既報のステロール排泄に関与する分子の細胞内動態の研究、および可能ならば新たなトランスポーターの発見を本研究にて目指す。平成20年度は、肝臓特異的ABCG5遺伝子およびNPC1L1遺伝子のクローニングとこれら遺伝子を含有するアデノウイルスの作成、ABCG8遺伝子含有アデノウイルスの作成、およびin vitroで用いる細胞系spheroid HepG2細胞(以下、sHep細胞)の確立とその検証を行った。昨年度提出した報告書に記載したとおり、平成20年度末までにsHep細胞の確立と、通常培養HepG2細胞と比較してのsHep細胞の脂質代謝を検討する上での有用性を確認し、ABCG5遺伝子およびNPC1L1遺伝子のクローニングは終了していたが、各遺伝子発現ウイルス、およびこれら対象遺伝子とGFPなどとの融合蛋白を発現を可能とするウイルス作成するも十分に目的蛋白発現を確認できなかったため、平成20年度研究費の繰越を行い以下の研究を行った。まず、ABCG5およびABCG8遺伝子の上流部に新たにコザック配列を挿入することにより、目的とするステロリン蛋白の発現をWestern blotで十分に確認できるように改良に成功した。また、レポーター蛋白とステロリン蛋白との融合蛋白遺伝子改変においても、目的遺伝子とレポーター遺伝子との接合配列を改変することにより、細胞内でレポーター蛋白の発現を蛍光顕微鏡で確認できるように改良できた。これにより、平成21年度の研究隊行につながった。本年度は昨年度確立したウイルスベクターを用いての検討を行った。ヒト小腸型ABCG5 (iABCG5)とヒト肝臓型ABCG5(hABCG5)をそれぞれ単独でHepG2細胞に発現させると、いずれも理論上想定される分子量に相当する蛋白の発現が確認されたが、それぞれをABCG8と共発現させた場合、iABCG5においてのみ単独発現の場合に比べ新規により大きい分子量の蛋白の発現が確認された。この大きい分子量の蛋白質はPNGase処理にて消失することから、iABCG5が糖化を受けた蛋白質であることが判明した。ABCG8もhABCG5と共発現させた場合には大きい分子量の蛋白を認めなかったが、iABCG5と共発現させるとより大きい分子量の蛋白が出現し、これもPNGaseで消失した。今回の実験の結果から、iABCG5とABCG8は共発現させるとお互いの蛋白の糖化を進行させるが、hABCG5にはそのような作用は認めないことが判明した。なお、肝臓特異的ABCG5 (hABCG5)の確認は欧米人のcDNAライブラリーを用いての検討であったため、日本人でもhABCG5が肝臓におけるABCG5であることを、2名の日本人の肝組織から精製したcDNAを用いて確認した。hABCG5-GFP,iABCG5-YFP,ABCG8-RFPの融合蛋白アデノウイルスを用い、細胞内蛋白局在を単層培養HepG2細胞(mHep)で行ったところ、単独発現でどの蛋白も小胞体に存在するパターンを認めた。iABCG5-YFPあるいはhABCG5-GFPとABCG8-RFPの共発現系にての検討でも、その局在に大きな変化は認めなかった。この現象はmHepの極性非形成によると考え、極性を有するsHepでの検証を試みたが、ウイルスがスフェロイドの表面に存在する細胞にのみにしか感染しなかったため、その局在を検討することができなかった。HepG2細胞にNPC1L1を発現させると、胆汁酸とコレステロールのミセルを培養液中に入れることにより細胞内コレステロール濃度が上昇することを確認し、また細胞の小胞体ストレスがNPC1L1発現により亢進することを発見した。本年度は、昨年度in vitroでの発現検討を行ったABCG5,ABCG8,NPC1L1について、in vivoで肝臓に発現させることにより、その発現蛋白の特徴および生理的役割について検討した。まず、ヒト小腸型ABCG5(iG5),ヒト肝臓型ABCG5(hG5)をコードするアデノウイルスをABCG5/8ダブルノックアウトマウスに感染させたところ、HepG2細胞でみられた蛋白(iG5約70kDa,hG5約55kDa)の他に、hG5,iG5ともにほぼ同じ分子量のより小さい(約50kDa)蛋白を認めた。また、iG5,hG5をそれぞれABCG8(G8)と共発現させると、ともに成熟化(糖化)されていた。