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アイヒェンドルフの文化史的研究

平成16年度から18年度まで以下の3点の解明を中心に研究を進め、当初通りの成果を収めることができた。1アイヒェンドルフの政治思想の再考2アイヒェンドルフ文学における神話的女性像の意味の解明3アイヒェンドルフ文学の二重世界構造(彼岸と此岸)の分析アイヒェンドルフの政治思想はその「保守性」の故にアイヒェンドルフ文学研究では忌避される傾向が長らく続いてきた。本研究では、アイヒェンドルフの政治思想を、彼が生きた19世紀前半の政治状況に置き直し、それが保守的であることを認めた上で、たとえばA.ミュラーのような他の保守主義者の思想とどう違うのかを明らかにし、彼の政治思想が彼の文学と密接に関係することを解明した。アイヒェンドルフ文学にはとりわけ女性像として神話的形象が現れるが、その意味するところはずいぶんと違う。本研究では、男の願望を具現した、多分にエグゾティックな描かれ方をする「航海」の「女王」像を一方に配置し、他方で水の精に現れる「溶融」への「誘惑」がソクラテス以来の西洋合理主義思考を揺るがす力を持っていることを分析した。最後に、一般にアイヒェンドルフ文学の「象徴性」といわれるものの構造をアイヒェンドルフ文学の表現方法に基づき分析し、「二重世界構造」とでもいうべきものがアイヒェンドルフ文学の表現のあらゆるレベルに現れることを指摘した。当初通り本研究を終えることができた。今後は、この成果を江湖に問う予定である。平歳16年度ではアイヒェンドルフ文学における女性像をドイツロマン派に好まれた鉱山のモチーフに関連させて明らかにした。「鉱山」のモチーフはドイツロマン派の時代に好まれたものである。ゲーテ、ノヴァーリス、ティーク、ホフマン、アイヒェンドルフ等といった作家にこのモチーフの作品を見いだすことができる。今年度はほぼ同時期に成立したホフマンの「ファールン鉱山」(1818)とアイヒェンドルフの『大理石像』(1817)という短編を比較し、同じく鉱山のモチーフを用いた両作品」の異同を明らかにした。ホフマンの作品はロマン派におけるこのモチーフの作品群の典型ともいえるものである。その特徴は、この作品では「鉱山」を舞台に恐怖と戦慄の美を体現する女性像と「純真」で「天使」にも比せられる女性像の二つが現れ、前者の圧倒的な力が描かれる点にある。前者は19世紀末の「宿命の女」像を先取りしている。アイヒェンドルフの作品においても女性像の描き方は基本的にホフマンのそれと同じである。しかしながら、二人の女性像に対する主人公(男)の扱い方において両者は決定的に違っている.ホフマンにあっては主人公の破滅で作品が終わるに対して、アイヒェンドルフは主人公を助けるために物語の構造を破綻させている。このことはしかしながらロマン派の時代に発見されたこの戦慄の美を体現する女性像の魔力を逆に際だたせることとなっている。さらに、本年の研究では、この二つの女性像が、「鉱山」のモチーフのみならず、「水の精」、エグゾティシズムの女性像にも現れていることを指摘し、この両者が一見対立しているように描かれていようとも、実は、ロマン派の、そして男の無意識に現れた「自然」の投影であったことを論証した。平成17年度ではアイヒェンドルフ文学における女性像の分析をさらに深めた。平成16年度に研究したアイヒェンドルフ文学における鉱山のモチーフと女性像については、独文学会誌『ドイツ文学』125号、2005年Neue Beitrage zur Germanistik Bd.4/Heft 3、42-55頁に「鉱山のモチーフと戦慄の美学-アイヒェンドルフの自然表象-」と題して寄稿した。また、アイヒェンドルフ文学における「水の精」のモチーフについては、『ロマン主義研究』(お茶の水書房、2006年度刊行予定)に「ドイツロマン派における神話的形象-アイヒェンドルフ文学における女性像-」と題した論文を寄稿した。

後者の論文においては、ロマン派における水の精のモチーフ、とりわけブレンターノによって文学的に形象化されたローレライ像及びフーケーの「ウンディーネ」と、アイヒェンドルフ文学における水の精のモチーフとの関連を明らかにするとともに、アイヒェンドルフ文学における水の精のモチーフの独自性を明らかにした。アイヒェンドルフが水の精を主題とした詩は幾つかあるが、中でも「誘い」Lockung(『詩人とその仲間たち』1834年第9章初出)においてアイヒェンドルフは「水の精」が象徴するもっとも深い層に達している。「水」は、この詩にあっては西欧を近代に至るまで呪縛してきた、アドルノ・ホルクハイマーが言う意味での「啓蒙」から逃れ、すり抜けながら、「ユートピア」を指し示す指標として現れている。この詩においては、「啓蒙された主体」が溶解し、未だ人間が自然と一体であった太古の時代が「水の精」の「不思議な音」とともに一瞬顔を覗かせていることを指摘した。平成17年度には、さらにアイヒェンドルフの政治思想の再検討に着手した。平成18年度の成果は二点である。第一点は、平成17年度の成果である、アイヒェンドルフ文学における女性像の意味を解明した論文「ドイツロマン派における神話的形象-アイヒェンドルフ文学に現れる女性像」を公刊したことである。(『ドイツ・ロマン派研究』お茶の水書房2007年、1月、305330頁)第二点は、アイヒェンドルフ文学の二重世界構造に関する論文を科研費報告書「アイヒェンドルフの文化史的研究」にまとめたことである。この論文は、一般にアイヒェンドルフ文学の象徴性といわれるものの構造をアイヒェンドルフ文学の表現方法に基づいて探求したものである。それはアイヒェンドルフ文学の二重構造(此岸と彼岸)を彼の第二長編小説『詩人とその仲間たち』(1834年)の登場人物オットーに則し、そこに現れるals ob文、wie文、「夢」に導かれる文の意味、そして「現実」と「もうひとつの世界」が直説法で表現され、ついには両者の区別がつかなくなる現象の意味を明らかにすると同時に、アイヒェンドルフの宗教性と一般に言われるものが限りなく神秘主義に近づき、さらにアイヒェンドルフ文学の「自然」とは、実は、この神秘主義体験の表現ではないかと推測したものである。その上で、この論文は、アイヒェンドルフの「近代」との対峙が、彼自身、自らの拠り所と考えていたキリスト教信仰を越えて西洋知の基盤そのものに対する批判に及んでいるのではないかを示唆した。この論文をもって、本研究課題は終了する。当初予定していた課題は、時間的前後はあったが、すべて終えることができた。平成19年度には出版助成を受け、今までの成果を江湖に問う予定である。
大腸癌におけるラミニンの発現と予後の検討,肝組織でのラミニンの発現と肝細胞癌の鑑別

A.大腸癌におけるラミニンの発現と予後の検討1.はじめに:大腸癌の場合,原発巣で癌腺管周囲に基底膜を形成するものは肝転移に有利だと言う報告がある.大腸癌肝転移とLNの発現の関係を検証した.2.対象と方法:大腸癌手術切除症例197例を対象とし,抗ヒトLN抗体の1次抗体でのABC法で免疫染色した.3.結果:ラミニンの発現が癌腺管の50%以上に見られるものを基底膜形成癌とした.197例中基底膜形成癌は109例55.3%,非基底膜形成癌は88例44.7%であった.組織型別にみると,基底膜形成癌の割合は高分化型腺癌で63.2%,中分化で54.0%,低分化で33.3%で,高分化のものに基底膜形成癌が多い傾向があった.肝転移のあるものは基底膜形成癌は19例61.3%あり,肝移植のないものでは55.7%で有意差はなかった.4.考察:これまでの報告では,大腸癌症例のうち基底膜形成癌は1/31/4で,今回の我々の検討では1/2以上の症例が陽性であったのと大きな差がある.これはLNの染色方法(特に前処置と1次抗体の違い)によるものと考えられる.今後方法も検討し,また肝転移巣では大腸癌に限らず,様々な癌でLNの発現を確認する予定である..肝組織でのラミニンの発現と肝細胞癌の鑑別1.はじめに:肝組織の線維化に伴い,類洞の基底膜様構造が変化し通常毛細管の基底膜構造に近づくことが知られている.我々はLNの発現が肝細胞における悪性化の一つの指標となるか検討した.2.対象と方法:切除肝組織65例および肝針生検100例を対象にした.切除肝組織は,結節を有するものは結節部と周囲組織とで別々に評価し,さらに肝細胞癌では同一症例でも分化度が違えば別のものとして統計処理した.3.結果:切除肝では肝細胞癌中88%でLNの発現が見られた.肝細胞癌以外では硬変肝で再生結節周囲にLNの発現が見られるものの結節内の肝細胞にはLNの発現はない.針生検標本でも良性疾患ではLNは陰性で,肝細胞癌では65.5%でLN陽性であった.4.考察:高分化肝細胞癌と異形成の強い肝組織とで鑑別が問題になることがLNの発現を調べることにより,特に針生検で診断の決め手となるものと考える.A.大腸癌におけるラミニンの発現と予後の検討1.はじめに:大腸癌の場合,原発巣で癌腺管周囲に基底膜を形成するものは肝転移に有利だと言う報告がある.大腸癌肝転移とLNの発現の関係を検証した.2.対象と方法:大腸癌手術切除症例197例を対象とし,抗ヒトLN抗体の1次抗体でのABC法で免疫染色した.3.結果:ラミニンの発現が癌腺管の50%以上に見られるものを基底膜形成癌とした.197例中基底膜形成癌は109例55.3%,非基底膜形成癌は88例44.7%であった.組織型別にみると,基底膜形成癌の割合は高分化型腺癌で63.2%,中分化で54.0%,低分化で33.3%で,高分化のものに基底膜形成癌が多い傾向があった.肝転移のあるものは基底膜形成癌は19例61.3%あり,肝移植のないものでは55.7%で有意差はなかった.4.考察:これまでの報告では,大腸癌症例のうち基底膜形成癌は1/31/4で,今回の我々の検討では1/2以上の症例が陽性であったのと大きな差がある.これはLNの染色方法(特に前処置と1次抗体の違い)によるものと考えられる.今後方法も検討し,また肝転移巣では大腸癌に限らず,様々な癌でLNの発現を確認する予定である..肝組織でのラミニンの発現と肝細胞癌の鑑別1.はじめに:肝組織の線維化に伴い,類洞の基底膜様構造が変化し通常毛細管の基底膜構造に近づくことが知られている.我々はLNの発現が肝細胞における悪性化の一つの指標となるか検討した.2.対象と方法:切除肝組織65例および肝針生検100例を対象にした.切除肝組織は,結節を有するものは結節部と周囲組織とで別々に評価し,さらに肝細胞癌では同一症例でも分化度が違えば別のものとして統計処理した.3.結果:切除肝では肝細胞癌中88%でLNの発現が見られた.肝細胞癌以外では硬変肝で再生結節周囲にLNの発現が見られるものの結節内の肝細胞にはLNの発現はない.針生検標本でも良性疾患ではLNは陰性で,肝細胞癌では65.5%でLN陽性であった.4.考察:高分化肝細胞癌と異形成の強い肝組織とで鑑別が問題になることがLNの発現を調べることにより,特に針生検で診断の決め手となるものと考える.
ヒト免疫不全ウイルス阻害活性と立体化学

HIV(ヒト免疫不全ウイルス)に対する特効薬の開発が待たれているが、突然変異が容易に起こるために困難になっている。最近、HIVの逆転写酵素に対する特異的阻害剤として、非ヌクレオシド系阻害剤が注目されている。その一つとして、ヘテロ芳香族化合物Nevirapineがあり、阻害活性、Nevirapineによる特異的アミノ酸変更などが明らかにされている。このNevirapineおよびその類縁体がHIV逆転写酵素に特異的に結合すると誘起円二色性を生ずる。Nevirapine自身は光学不活性であるが、非平面の立体配座をとり、逆転写酵素に結合したときに一方の絶対立体配座をとり誘起円二色性を生ずるためである。本研究では、酵素と阻害剤との超分子形成における誘起円二色性から、結合中心での構造解明のために次の研究を行った。Nevirapine自身は光学分割できないが、N-methyl体は立体障害のために、キラルHカラムを用いて、低温で光学分割できることを見出した(Chiralpak AS,hexane/isopropanol,-10°C)。エナンチオマーの分割には、溶解度と分離能の細い条件がある。低温で分離した光学異性体の-30°CでのCDスペクトルを測定することができた。2.Nevirapineの酵素結合時の絶対立体化学の理論的決定上記のN-methyl体のCDおよびNevirapineの酵素結合時の誘起CDをもとに、その絶対立体化学を決定した。すなわち、MOPAC計算により、安定配座を計算して、原子座標を求めたのち、ねじれたπ電子系に対するπ電子SCF-CI-DV分子軌道法を用いて、CDを計算した。その結果は、実測の基本的な形を良く再現でき、超分子形成時の立体化学を明らかにすることができた。
低廉な高性能エアカソードを用いた有機物・窒素同時処理モジュールの創製

粉末活性炭を原料として、1硝酸溶液の還流または2窒素源となる尿素とともに不活性ガス雰囲気下での熱処理という異なる2つの方法で窒素ドープし、原料に比べて酸素還元反応活性(ORR活性)の高い試料が得られた。調整試料のORR活性は、前者では硝酸濃度や熱処理時間、後者では加熱温度に依存し、比表面積等の物理性状や炭素骨格へ導入された窒素や酸素の形態との関連についての知見も得られた。適用した窒素ドープ法のそれぞれで最も高いORR活性が得られた試料を触媒に用いて作製したエアカソードを設置した一槽式MFCを対照系(原料の粉末活性炭使用)とともに所定条件下で運転したところ、触媒として使用した試料のORR活性とMFCで得られた出力の大小関係が概ね一致し、2の方法による窒素ドープ活性炭を触媒に用いたMFCの性能が最も高くなった。この窒素ドープ活性炭を触媒に用い、触媒担持量やバインダーとなる固体電解質の添加量等を変化させて作製した触媒層を有するエアカソードを設置したMFCで実験を行い、固体電解質の添加量を従来に比べて大幅に低減可能であることならびに適切な触媒担持量等を明らかにして、エアカソードの触媒層の最適な調整条件に関わる知見を得た。また、ORR触媒に粉末活性炭、電極基材に金属メッシュを用いて作製したエアカソードを設置したMFCを運転し、低廉な金属メッシュの電極基材としての利用可能性が実証されるとともに目開き等の性状がMFCの出力や有機物除去速度等に及ぼす影響を明らかにした。これらの検討から、金属メッシュを電極基材および窒素ドープ活性炭をORR触媒に用い、触媒層のバインダーとなる固体電解質の添加量を極力低減した低廉で高性能なエアカソードを作製する可能性が示された。初年度の取り組みを通じて、1ORR活性の高い窒素ドープ活性炭触媒の作製条件やエアカソードの触媒層における適切な触媒担持量等に関する知見が集積されるとともに、2バインダーとして従来から用いられてきた固体電解質の添加量を大幅に低減する可能性および、3電極基材として金属メッシュの適用可能性が示されたこと等、当初計画で見込んでいた低廉で高活性なエアカソードの作製へ向けた手がかりや足掛かりとなる知見が概ね得られていると判断できるため。一方で、さらなる高性能化や低廉化に寄与する作製条件や方法ならびに影響因子について検討する余地もまだあると思われる。順調に進展していることもあり、当初計画に沿って窒素除去エアカソードやアノード材に関する各検討項目を遂行していく。なお、低廉で高性能なエアカソードの作製については、バインダーの種類や添加量を広範に変化させるとともに触媒層の微視的な構造や物理性状等との関係も交えて性能への影響因子を検討することに加えて、電極基材との相互関係や種類の影響についても継続して調査する。

なお、低廉で高性能なエアカソードの作製については、バインダーの種類や添加量を広範に変化させるとともに触媒層の微視的な構造や物理性状等との関係も交えて性能への影響因子を検討することに加えて、電極基材との相互関係や種類の影響についても継続して調査する。
確率Runge-Kutta法の研究

ノイズ項をもった常微分方程式の数値解法について考察した.このような解法では一般にたくさんの(擬似)乱数を生成し,関数の計算を何回も行う必要がある.本研究では,これらの総数が比較的少なく,高精度の数値解法を導出した.また,数値計算では数値計算誤差が生じるので,その影響を受けにくい数値解法が望まれる.本研究では,そのような解法で,高精度の数値解法も導出した.(1)弱い意味の近似解を与える陰的SRKスキームの導出.(2)ドリフト係数についてのみ陰的あるいは半陰的であるdrift-implicit SRKスキームの導出.(3)数値的安定性に優れた陽的SRKスキームの導出.(4)少ないシミュレーション回数で良い近似を与える効率的なSRKスキームの導出.ノイズ項をもった常微分方程式の数値解法について考察した.このような解法では一般にたくさんの(擬似)乱数を生成し,関数の計算を何回も行う必要がある.本研究では,これらの総数が比較的少なく,高精度の数値解法を導出した.また,数値計算では数値計算誤差が生じるので,その影響を受けにくい数値解法が望まれる.本研究では,そのような解法で,高精度の数値解法も導出した.1.Wiener過程が1次元である確率微分方程式に対してWeakオーダー1あるいは2のRunge-Kutta型陰的数値スキームを導出した。ここで、Weakオーダーは近似解の収束の速さ(オーダーが高いほど速い)を表し、「陰的」は、計算コストはかかるが数値的安定性が優れていることを意味する。本研究の成果をまとめた論文は18年度に投稿済みであったが、19年度に新たな成果を加えることによって、その掲載が決定した。本研究課題では、一般化されたRunge-Kutta法の新しい型とその解析理論を提供し、確率微分方程式に対するRunge-Kuttaスキームを導出する為の基本的枠組みを与える、上で述べた19年度成果は、この枠組みの妥当さを示す上で非常に意義がある。数理解析に対する要求の高まりとともに、確率的な振舞いを考慮に入れた数式モデルは今後様々な分野に広がることが予想される。時刻を固定するとき確率微分方程式の解は確率変数となるので、その近似として分布の近似や任意のモーメントの近似を求めることは極めて実際的である。このような近似を必要とする分野として、ファイナンスが挙げられる。上で述べた数値スキームは、これらの分野に出現する確率微分方程式の漸近的な性質を保持した近似解を与えるという意味で、重要である。2.Wiener過程が多次元である確率微分方程式に対して、非確率項だけが陰的であるDrift-implicit Runge-Kutta法について考察し、Weakオーダーが1のものを導出した。本解法は、Wiener過程が多次元であっても数値的安定性に優れた解法を導き得る証拠を提供し、Weakオーダー2のDrift-implicit Runge-Kutta法を導出する為の手がかりを与える。1.Wiener過程が1次元である確率微分方程式に対する陰的確率Runge-Kutta法を導出した.離散時間の刻み幅hが十分小さいならば,これらの解法による任意のモーメントの近似誤差はhまたはhの二乗に比例する(それぞれ,弱い意味で1次または2次と言う).これらの解法はドリフト係数と拡散係数の両方について陰的であり,平均二乗の意味でA-安定(任意のh>0で絶対安定)を達成している.本研究成果をまとめた論文が20年度に印刷された.2.Wiener過程が多次元である確率微分方程式に対しても同様に両係数について陰的解法を考え得るが,確率Runge-Kutta法の段数を必ずしも小さくできるわけではない.加えて,Wiener過程の次元が高くなるにつれて計算コストが急激に増大する.そこで,ドリフト係数についてのみ陰的な確率Runge-Kutta法を考えた.しかし,弱い意味で2次で,A-安定な解法が得られなかった.3.すべての問題においてA-安定性が必要なわけではない.その一方,常微分方程式に対するChebyshev法は陽的解法でありながら,大きな絶対安定領域を持ち得る.そこで,確率Runge-Kutta法にChebyshev法のアイディアを取り入れ,平均二乗の意味で大きな絶対安定領域を持った陽的解法の導出に取り組んだ.その結果,弱い意味で1次なら,そのような確率Runge-Kutta法が得られる可能性は高いとわかった.2次のものについても考察し,見込みがありそうだとわかった.Stratonovich型の確率常微分方程式(SODE)に対するRunge-Kutta法を作成した.硬い(解きにくい)SODEに対して陽的な解法を用いると,数値的安定性の要求から離散時間の刻み幅を非常に小さくしなければならない.その一方で,丸め誤差の影響を考えるなら,刻み幅を極端に小さくするわけにはいかない.この為,計算コストの高い陰的あるいは半陰的な解法が一般に使用される.しかし,問題によってはこれらの解法では計算コストがかかり過ぎている場合がある.例えば,ある種の確率偏微分方程式を離散化して得られるSODEのように,ドリフト係数の固有値が負の実軸周りに分布する問題に対しては,拡張された安定領域を持つ陽的な解法が効果的である.実際,AbdulleとCirilli(SIAMJ.Sci.Comput.,2008)は,強い意味で1次のChebyshev法(陽的Runge-Kutta法の一種)を提案し,上で述べた問題に対して良い性能を持つことを示した.

本研究では,彼らの考えを拡張して,弱い意味で2次で,以下の特徴を持つ陽的Runge-Kutta法を導出した.1.平均二乗の意味で絶対安定領域が,負の実軸周りに広く,しかも解法の段数を増せば,負の実軸方向に伸びる.2. 1ステップあたりの計算において,必要とされる擬似乱数の数が少なく,拡散係数の評価回数も少なくて済むので,計算コストが非常に低い.これまでの研究成果を原稿にまとめ,また,4段のRunge-Kutta法から104段のRunge-Kutta法まで,解法のパラメータ値を計算し終えた.後は数値実験を行い,結果を原稿に追加すれば良い.よって,まもなく投稿できるであろう.以前,本研究代表者は,Stratonovich型の確率常微分方程式(SODE)に対する確率Runge-Kutta (SRK)族を提案し,それを基にSRKスキームを導出した(Y. Komori, J. Comput. Appl. Math., 2007).これらの結果を利用して研究を進めていたが,計算コストの面で改善すべきところがあり,また,それが可能であるとわかった.それゆえ,この欠点,つまり,計算コストがWiener過程の次元に比例して増大するという欠点を克服したSRK(スキームを導出した.いくつかの既存のSRKスキームと比較する数値実験を行い,本SRKスキームが,計算で用いる擬似乱数の個数においてだけでなく,拡散係数に関する計算回数においても効率的であることを示した.以上の結果をまとめ,J. Comput. Appl. Math.に論文を投稿した.本論文は一度修正を求められた後,現在査読中である上で導出したSRKスキームは4段スキームであった.これと同様に拡散係数に関しては4段であるが,ドリフト係数に関しては一般のs(>=4)段のSRK法を考察し,陽的スキームであるにも関わらず,平均二乗の意味で絶対安定領域が負の実軸周りに広いSRKスキームを導出した.数値実験においてこれらのSRKスキームを1)確率偏微分方程式を空間離散化して得られるSODEや2)硬い(解きにくい)SODEに適用し,その有効性を確認した.以上の結果をまとめ,SIAMの雑誌に論文を投稿した.本論文は現在査読中である
窒息における肺の超微構造的, 免疫組織化学的ならびに生化学的研究

1)昨年度の研究は,主として基礎的なものであり,低酸素ないし無酸素の状態では,肺表面活性物質がtubular myelinの形態で肺胞腔内に出現することが,電子顕微鏡により確認された.2)62年度では,この現象を,炭酸,メタン,フレオンなどのガスにより,低酸素ないし無酸素状態の環境を作り,また一酸化炭素ガスを含む空気をラットに吸入させて,これらのすべての条件で確認した.3)さらに,ヒトの肺表面活性物質に対するマウスのモノクローナル抗体を用いて,特に新生児の肺の検索に応用し,絞殺死体の肺肺内にtubular myelinを確認して,死体の表面に証拠を見いだすのが困難な鼻口の閉塞による窒息に対しても,その可能性を大きいとする判断の根拠を提供し得ることを確認した.4)現在は窒息と判断される人体例に対する,電顕,免疫の両法を用いた,応用を行っている.窒息に陥った動物の肺組織における形態学的検索が端緒である.吸入させる酸素を量的に制限して,含まれる酸素のみ減少した空気,炭酸ガス,メタンガス,一酸化炭素ガスなどが混合したために相対的に酸素が減少した空気などを準備し,これらを吸入したラットの肺について検索した.光学顕微鏡による検索では,いずれの場合でも,肺胞の中に淡い紅色ないし桃色に染まる液体様の物質が認められたが,種々の特殊染色で特徴的な反応を示さなかった.電子顕微鏡によって,この物質が微細な糸屑様の形態を示し,その中に格子状,膜状ないし糸状の構造物が見いだされ,大きさ,分布ならびに位置などに差異はあるが,特に格子状の構造物が動物の新生仔の肺の表面活性物質の形態と全く同様のものであることが確認された.更に,司法解剖で絞頸による窒息と判定された人体例に対しても検索を行なったところ,同様の所見が得られた.動物実験に並び,人体例にも肺の洗浄を行なって,得られた液体の生化学的分析を行ない,病的状態にない肺の洗浄液と比較したところ,蛋白質と脂質がそれぞれ5倍と2から3倍増量していること,脂質については肺表面活性物質の構成成分が確認された.また,肺表面活性物質に含まれるアポ蛋白に対するモノクローナル抗体を作成し,パラフィン切片に対する免疫組織学的検索で,上記増量が光学顕微鏡的に確認された.以上の結果を総合すると,窒息の際に肺表面活性物質が肺胞内に大量に分泌されること,それには酸素の減少がただ一つの要因として上げられることなどが結論付けられると考える.1)昨年度の研究は,主として基礎的なものであり,低酸素ないし無酸素の状態では,肺表面活性物質がtubular myelinの形態で肺胞腔内に出現することが,電子顕微鏡により確認された.2)62年度では,この現象を,炭酸,メタン,フレオンなどのガスにより,低酸素ないし無酸素状態の環境を作り,また一酸化炭素ガスを含む空気をラットに吸入させて,これらのすべての条件で確認した.3)さらに,ヒトの肺表面活性物質に対するマウスのモノクローナル抗体を用いて,特に新生児の肺の検索に応用し,絞殺死体の肺肺内にtubular myelinを確認して,死体の表面に証拠を見いだすのが困難な鼻口の閉塞による窒息に対しても,その可能性を大きいとする判断の根拠を提供し得ることを確認した.4)現在は窒息と判断される人体例に対する,電顕,免疫の両法を用いた,応用を行っている.ラットを4群に分け、対照群,メタンガス及び炭酸ガスならびに一酸化炭素ガスを夫々の濃度で死亡するまで吸入させ、肉眼的、光顕的ならびに電顕的観察を行い、各群の一部の肺洗浄液について、肺表面活性物質の検出を試みた。対照群は、無処理群と酸素を5%と窒素を95%に調整した空気を吸わせた群に分け、同様の検索を行ったが、既報の所見を確認した。一般に肺は萎縮して含気性に乏しい。光顕的に肺胞内に貯留物があり、電顕的には微小な構造物の充満する中に、格子状,渦巻状の構造物が存在している。これらの構造物は、ラットの出産直前の胎仔肺ならびに直後の新生仔の肺に見られる構造物と同様で、肺表面活性物質であるとされている。吸入するガスの種類に特徴的な所見を見いだすことはできない。肺の洗浄液に含まれる燐脂質についての分析は、いずれの群もタンパクおよび脂質が対照群に比較してともに増加している。人体例は、司法解剖の中から適当な例を選んで、上記の検索法と同様の事を行い、絞頸による窒息例では、ラットにおいて見たものと同様の形態学的所見を得たが、例数が少ないので追加収集を行う予定である。
ヒト卵子凍結におけるコヒーシン蛋白関連の加齢性変化と、卵子凍結安全性に関する検討

本年度は45歳以下で同意を得られた子宮体がんIA期症例が少なく、昨年度までの5症例未成熟卵子55個におけるデータ解析を主に施行した。タイムラプスデータを用いて未成熟卵子の成熟過程における第1極体放出タイミングにより、その後の単為発生過程における単為発生由来胚盤胞到達割合を検討した。また第1卵割前の前核持続時間、Reverse cleavage, Direct cleavageの有無が単為発生成績に与える影響を検討している。現時点での結果として体外成熟培養過程における第1極体放出のタイミングが、その後の胚盤胞到達割合に関与することが有意に示されており、タイムラプスにより得られているその他の因子が与える影響については解析を継続している。これらの知見はヒト卵子凍結を施行する際に、GV期、MI期、MII期それぞれのタイミングで凍結-融解処理を行うことが適切であるか、その後の染色体異常発生に関するコヒーシン蛋白染色、次世代シーケンサーを用いた異数性発生有無の検討につながるものである。本年度は体外受精の際に生じる廃棄胚盤胞を用いて次世代シーケンサの運用を行い、栄養外胚葉、胚全体における異数性検出の成績についても検討を行っており、現在データ解析処理中である。体外成熟培養については未成熟卵から成熟卵に至るmaturation rateは50%以上であり、非刺激下摘出卵巣から得た未成熟卵子をマテリアルとしている中で、国内外の報告と同等の成績を得ている。症例数を追加し更に検討を行うため2019年度まで1年間研究期間を延長し解析を行っていく予定である。本研究においてはヒト未成熟卵子のマテリアル確保の一つとして若年子宮体がん患者の協力を必要とする。本研究施設における手術症例数が減少しており、マテリアル確保が課題となっている。一方で本研究において重要な次世代シーケンサを用いた異数性検出に関しては、研究施設内におけるプロトコールが確立されており、データが蓄積されており進捗は順調である。研究成果においては英語論文、国際学会発表、国内発表などを継続しており、今後も継続していく。本研究課題としてはヒト未成熟卵子をマテリアルに、成熟過程、単為発生過程で凍結-融解という介入を行い各群で検討を行うためマテリアル確保が課題である。現状の成績としては成熟率56%、単為発生胚盤胞到達率7.1%であり、10症例以上の症例確保が望ましく、子宮体がん患者における摘出卵巣由来卵子を当院、協力施設から得ることで研究推進を行う。また蛍光免疫染色によるコヒーシン蛋白、Oct4、Cdx2などの検出においては電界撹拌を用いた迅速免疫染色装置を活用していく予定である。2016年度は子宮体癌患者5例より計13個の未成熟卵子を摘出卵巣から回収した。東北大学症例1例は卵胞液を5%CO2, 36度環境下で秋田大学まで輸送を行った。秋田大学4症例は卵胞液回収後速やかに体外成熟培養(IVM)を行った。今回は非刺激下(non FSH/non hCG)摘出卵巣由来の未成熟卵子に対しIVMを行っている。極体放出過程をタイムラプス下に観察し、培養開始から極体放出プロセスの継時的変化を確認した。Maturationrateは46.2%であり、これまでfertility preservation(FP)領域で報告されているmaturation rateに比しても、ほぼ同等の成績であった。今回の患者背景は38-41歳(平均39.2歳であり、回収卵子個数は0-5個(平均2.8個)であった。非刺激下における子宮体癌患者における摘出卵巣由来の未成熟卵子に対するIVM過程を詳細に検討した報告はない。今後のoncofertility分野におけるIVMおよび顕微授精(ICSI)や成熟卵子凍結のタイミングを考慮する上で重要な知見を得ることが可能である。また、研究マテリアルとして得た未成熟から成熟卵子の様々なステージにおいて、コヒーシン蛋白や細胞骨格を含めた構造を分子生物学的に評価することで、卵子凍結の安全性にもつながる基礎的知見を得ることが可能となる。また多施設から研究センター施設へ卵子を輸送することで、研究マテリアルの集約化およびFPにおける配偶子輸送における観点からの知見も得ることにつながると考える。2016年度は5症例から患者平均2.8個の卵子を回収しているが、当研究では卵子回収目的が非臨床使用であるため、non-FSH/non-hCGの非刺激下であることが卵子回収個数が少ない一つの要因である。非刺激下摘出卵巣由来の未成熟卵子に対するmaturation rateは、これまでの当教室のデータからも40-50%であり、commercial baseのIVMキットを用いている成績として大きな問題はないと考える。卵子凍結、卵子解凍プロセスを複数回行い、卵子内部の蛋白などを定量的に評価していくには更なる患者数、検討卵子個数の上乗せが必要である。しかし、対象患者が子宮体癌IA期に限定され、現在の手術術式として腹腔鏡下手術が増加傾向にあり、研究対象から外れる症例がやや増えており、患者数確保がやや遅れている。非刺激下摘出卵巣由来の未成熟卵子に対するIVM成績をmaturation rateの観点から評価することは現在十分な知見を得ている。継時的な評価を行うためのタイムラプス画像を用いた極体放出などのイベントに関する知見も蓄積しており、今後各年齢層、卵子凍結前後の評価など、対象患者を2017年度も継続して加えていくことで更に詳細なデータが得られると考える。本年度は子宮体癌5症例の摘出卵巣より計55個のヒト未成熟卵子を回収して研究に供した。

患者平均年齢は35.8歳であり、体外成熟培養により56.0%が第1極体を放出し、第2減数分裂期(MII期)に至った。当科は2014年より計19症例(患者平均年齢39.0歳)の子宮体癌患者から同様に未成熟卵子を回収しており、これまでの体外成熟培養による成熟率は52.5%であり、本年度の体外成熟培養の成績はほぼ同程度であった。本年度はMII期まで成熟した成熟卵28個に対し単為発生刺激(parthenogenetic activation:PA)を行い、その後の卵割過程をタイムラプスにより詳細に観察し、卵割を認めた卵に対しては栄養外胚葉、内部細胞塊のマーカーであるCdx-2, Oct-4の染色も施行し評価した。またヒト卵子の加齢性変化を検討する上で、ヒト卵子を研究目的に用いることは必須であるが、ヒト卵子を確保する際に大きなハードルがある。我々は2014年より継続して摘出卵巣から卵子を回収する手法を確立し、本年度はタイムラプスによる評価で患者年齢、第一極体放出時間の差異によるPA後の卵割過程および蛍光免疫染色による卵の質評価を行った。これらの知見は貴重なヒト卵子を用いて各年齢層の比較による加齢性変化(卵子老化)を検討する上で重要な知見となる。また、体外成熟培養後の第1極体放出時間の差異によるその後の卵割過程の比較検討は、妊孕性温存の際などにおける卵子凍結のタイミングを測る際にも重要な知見になると考える。これらの知見をもとに卵子凍結の安全性について、蛍光免疫染色などによる卵内部の蛋白発現を加齢性変化の影響を加味して検討を現在行っている。研究方針自体は概ね順調に推移している。摘出卵巣からの卵子回収、体外成熟培養の過程は我々の既報を含めた過去の報告とほぼ同様の成績となっている。これらの体外成熟培養過程もタイムラプスにより評価を行っており、卵子凍結のタイミングを含めた評価を行っている。本年度は体外成熟培養、単為発生プロセスを連続してタイムラプスにより評価し、動的解析および蛍光免疫染色による蛋白発現過程の評価も行いデータの蓄積をしている。単為発生プロセスもカルシウムイオノファおよび6-DMAPによる単為発生刺激を用いて卵割率は39.3%となっており、非刺激下摘出卵巣由来の、未成熟卵子に対する体外成熟培養後の単為発生過程であることを考慮し、既報との比較検討を行っている。しかし、morula以上への到達率は単為発生を試みた成熟卵に対し7.1%と低率であり、卵子の質を評価する上で更に単為発生の効率を向上させるか、症例数を更に積み重ねて評価していく必要がある。年間10症例程度の子宮体癌症例の蓄積を目指しているが、本年度は協力施設における手術症例がなく卵子輸送の機会がなかったため、総症例数が5症例にとどまり55個の卵子回収となった。本年度は45歳以下で同意を得られた子宮体がんIA期症例が少なく、昨年度までの5症例未成熟卵子55個におけるデータ解析を主に施行した。タイムラプスデータを用いて未成熟卵子の成熟過程における第1極体放出タイミングにより、その後の単為発生過程における単為発生由来胚盤胞到達割合を検討した。
一般分枝過程の個体群動態諸問題への応用的研究

分枝過程の生物個体群動態への応用として,以下のような問題について知見を得た.4.Simplebranching processを同時に多数用いて,一生態学的群集の構造と環境のランダム変動および移入率との関係.5.ランダム環境下のNear-critical branching processを応用して,ミトコンドリア・イヴの年代推定への環境変動の影響.これらの結果の一部は著書「確率過程と数理生態学」にも取り入れることができた.以上で得られた知見は数学的にはまだ明らかにされていないことが多いが,コンピュータシミュレーションを活用することで得られたものである.今後,これらの問題をさらに発展的にかつ数学的にも研究を進めることは課題である.これまでの研究から分枝過程は個体群動態など生態学に限らず,DNA分子のPCR増殖法などより広く生命科学の諸問題に応用可能でありかつ有意義であることを認識した.このようなことから金沢で開催した研究集会「確率過程と数理生物学」(広島大学の瀬野裕美氏に企画を依頼)は今後の研究発展のために大変有意義であったと考える.分枝過程の生物個体群動態への応用として,以下のような問題について知見を得た.4.Simplebranching processを同時に多数用いて,一生態学的群集の構造と環境のランダム変動および移入率との関係.5.ランダム環境下のNear-critical branching processを応用して,ミトコンドリア・イヴの年代推定への環境変動の影響.これらの結果の一部は著書「確率過程と数理生態学」にも取り入れることができた.以上で得られた知見は数学的にはまだ明らかにされていないことが多いが,コンピュータシミュレーションを活用することで得られたものである.今後,これらの問題をさらに発展的にかつ数学的にも研究を進めることは課題である.これまでの研究から分枝過程は個体群動態など生態学に限らず,DNA分子のPCR増殖法などより広く生命科学の諸問題に応用可能でありかつ有意義であることを認識した.このようなことから金沢で開催した研究集会「確率過程と数理生物学」(広島大学の瀬野裕美氏に企画を依頼)は今後の研究発展のために大変有意義であったと考える.分枝過程の生物個体群動態への応用として,主として藤曲が以下のような知見を得た。4.Simplebranching processを同時に多数用いて,生態学的群集の構造と環境のランダム変動および移入導との関係。これらの結果の一部は著書「確率過程と数理生態学」にも取り入れることができた。以上で得られた知見は数学的にはまだ明らかにされていないことが多いが,コンピュータシミュレーションを活用することで得られたものである。今後,これらの問題をさらに発展的にかつ数学的にも研究を進めたい。また,確率論の極限定理の観点から,主として高信が次の結果を得た。5.ディリクレの密度定理に関連した中心極限定理スケーリングとそれが収束する場合の極限分布。他方,偏微分方程式の粘性解の観点から,主として後藤が次の問題についての知見を得た。また,非線形偏微分方程式系の数値解析の観点から,主として小俣が次の問題についての知見を得た。分枝過程の生物個体群動態への応用として,以下のような問題について知見を得た.4.Simplebranching processを同時に多数用いて,生態学的群集の構造と環境のランダム変動および移入率との関係.5.ランダム環境下のNear-critical branching processを応用して,ミトコンドリア・イヴの年代推定への環境変動の影響.これらの結果の一部は著書「確率過程と数理生態学」にも取り入れることができた.以上で得られた知見は数学的にはまだ明らかにされていないことが多いが,コンピュータシミュレーションを活用することで得られたものである.今後,これらの問題をさらに発展的にかつ数学的にも研究を進めたい.これまでの研究から分枝過程は個体群動態など生態学に限らず,DNA分子のPCR増殖法などより広く生命科学の諸問題に応用可能でありかつ有意義であることを認識した.このようなことから金沢で開催した研究集会「確率過程と数理生物学」(広島大学の瀬野裕美氏に企画を依頼)は今後の研究発展のために大変有意義であったと考える.
ゼブラフィッシュの挿入変異生成法による脊椎動物遺伝子の機能解析

複雑な生命現象を制御する脊椎動物遺伝子の機能を解明するためには、モデル動物であるゼブラフィッシュを用いて、興味深い表現型を示す変異体を分離し、その表現型を制御する遺伝子群を明らかにし、それらの機能を解析するというフォワード遺伝学的アプローチが非常に重要である。本研究では、変異フィッシュから変異の原因遺伝子を容易にクローニングするための新しい挿入変異生成法の開発と挿入変異生成法により得られたゼブラフィッシュパターン形成異常変異の解析を行った。メダカにおいては、トランスポゾン様配列Tol2が既に同定されていた。本研究では、このTol2因子を用いた新しい外来遺伝子導入法を開発するために、Tol2因子のゼブラフィッシュにおける転移活性を調べ、以下の成果を挙げてきた。(1)Tol2因子が転移の第一段階である切り出し反応を自律的に起こしうる因子であること。(2)Tol2因子がコードする転写物のcDNAをクローニングし、このcDNAが切り出し活性をもつ転移酵素をコードすることを明らかにした。(3)Tol2因子cDNAから作製したRNAとTol2因子DNAをゼブラフィッシュ受精卵に微量注入することにより、Tol2因子がゼブラフィッシュ生殖細胞において転移することを明らかにした。(4)ゼブラフィッシュhagoromo遺伝子はマウス指形成異常原因遺伝子Dactylinのorthologであり、この遺伝子の変異によってゼブラフィッシュではストライプパターン形成に異常が生じることを明らかにした。
夫における認知症介護準備態勢の自己評価式尺度の開発

本研究は60歳以上の男性の夫を対象に、認知症介護の準備態勢について自己評価式の尺度を開発することを目的としている。平成30年度は、尺度開発にあたり訪問看護師・ケアマネジャーからのインタビュー内容と夫介護者からのインタビュー内容の分析、文献研究をもとに尺度項目を抽出した。看護学研究者、臨床心理士等で構成された会議を開き、尺度項目を精選した。尺度項目は、介護知識、認知症の知識、介護方法、夫婦間関係、社会交流の5分野から質問項目を生成した。それぞれの項目が目的にあった内容か、表現の不明瞭や重複・欠損がないかを確認し、内容的妥当性を確保した。男性高齢者5名に意味不明な項目、回答困難な表現、意味内容の重複等を確認し、表面的妥当性を確保した。25項目の「認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」の原案を作成した。質問紙は開発した尺度と個人属性および基準関連妥当性を確認するための外的基準となる尺度を用いて作成した。所属の研究倫理委員会の承認後、質問紙調査を実施した。調査対象は、生きがい大学やA市の60歳以上の男性高齢者とした。回収は407部、有効回答の290部を分析対象とした。記述統計、因子分析等データを分析している段階である。夫介護者のインタビュー内容を分析し、認知症ケア学会、日本家族看護学会で発表した。「認知症の妻を介護する夫の介護課題と克服プロセス」についての投稿論文を執筆中である。25項目の「夫の認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」を原案として、質問紙を作成した。研究倫理委員会承認後、生きがい大学、A市住民を対象に質問紙を配布した。質問紙407部回収後、有効回答の290部を分析対象として、記述統計、因子分析等のデータ分析をしている。分析をすすめ、尺度の信頼・妥当性を検証していく予定である。「夫の認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」の信頼性・妥当性が検証をすすめ、学会発表、学術誌に論文を投稿していく予定である。本研究は、男性高齢者の夫を対象に認知症介護準備態勢の自己評価式尺度を開発することを目的としている。認知症の人の増加により高齢の配偶者間による介護も増え、介護する前の事前準備が必要と考えている。平成28年度は、調査票の構成要素を抽出するために、夫の認知症介護の全貌と課題について明らかにすることにした。夫介護者の支援にあたっているケアマネージャーと訪問看護師11名に「夫が介護するうえでの準備」「夫の認知症介護の問題点と現状」についてインタビューをして、質的帰納的に分析をした。その結果、「夫の抱え込み」「認知症の理解不足」「共通の相手の存在」「認知症と気づかない」「情報不足」「妻の好きなことに対する関心」などがあげられた。さらに夫介護者18名に「認知症介護の経過と実際」についてインタビューして質的帰納的に分析した。その結果、「初期の困惑」「抱え込み」「家事・介護の不慣れ」「精神的ストレス」「認知症の理解不足」などがあげられた。「夫の認知症介護」の概念分析の先行要件としては、「使命感と義務」「高齢男性の障壁」「男性介護の戸惑い」「家事困難」「経済問題」「認知症の理解不足」があげられた。「夫の認知症介護の準備態勢」の構成要素の範囲について関連文献レビューをしているが、時間を要している。今後、ケアマネジャーと夫介護者のインタビューを質的に分析した内容と概念分析の結果、関連文献レビューを合わせ、調査票の構成要素を抽出し質問紙を作成する予定である。認知の妻を介護する夫とケアマネジャーのインタビュー後、質的分析に相当の時間を要した。さらに認知症介護準備態勢の構成要素について、関連文献レビューを含めその調整に時間を要している。本研究は高齢男性の夫を対象に「認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」を開発することを目的としている。介護者になる前の準備として、自己評価をして介護者としての事前準備につなげていきたいと考えている。平成29年度の研究推進計画は、訪問看護師・ケアマネジャーからのインタビュー内容と夫介護者からのインタビュー内容の分析、「夫の認知症介護」の概念分析により得た項目を基に、構成要素を抽出し質問紙を作成し調査を実施する予定であった。1.インタビュー内容と概念分析により「夫の認知症介護の準備態勢」として、「認知症の病気の理解」「家事経験」「介護経験」「経済力」「夫の主観的健康観」「介護する意志」「相談できる人の有無」「妻に対する思い」などの項目が抽出された。介護の動機となる夫婦関係、家族関係、経済性などに関しては、関連文献をレビューして内容を決める必要があったが、関連文献のレビューに時間を要した。「認知症介護の準備態勢」として取り扱う範囲が定まらないため、質問紙の完成まで至らなかった。2.訪問看護師・ケアマネジャーのインタビュー内容を質的に分析して、国際家族看護学会(スペイン)、日本家族看護学会にてポスター発表した。夫のインタビュー内容分析については認知症ケア学会で発表予定である。今後の予定として、質問紙の作成をし倫理委員会に提出する。承認後、老人大学等で男性高齢者を対象に質問紙調査を実施する予定である。平成29年度の推進計画は「夫の認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」の質問紙を作成し調査を実施する予定であった。

具体的には1.訪問看護師・ケアマネジャーからのインタビュー内容抽出、夫介護者からのインタビュー内容抽出と「夫の認知症介護の概念分析」より質問調査内容を選定する。2.インタビュー内容と関連文献より質問紙を作成し調査を実施する。インタビュー内容のデータ分析にて項目の抽出はできたが、「夫の認知症介護準備態勢」で取り扱う範囲が曖昧で質問紙調査の作成・調査まで至らなかった。本研究は60歳以上の男性の夫を対象に、認知症介護の準備態勢について自己評価式の尺度を開発することを目的としている。平成30年度は、尺度開発にあたり訪問看護師・ケアマネジャーからのインタビュー内容と夫介護者からのインタビュー内容の分析、文献研究をもとに尺度項目を抽出した。看護学研究者、臨床心理士等で構成された会議を開き、尺度項目を精選した。尺度項目は、介護知識、認知症の知識、介護方法、夫婦間関係、社会交流の5分野から質問項目を生成した。それぞれの項目が目的にあった内容か、表現の不明瞭や重複・欠損がないかを確認し、内容的妥当性を確保した。男性高齢者5名に意味不明な項目、回答困難な表現、意味内容の重複等を確認し、表面的妥当性を確保した。25項目の「認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」の原案を作成した。質問紙は開発した尺度と個人属性および基準関連妥当性を確認するための外的基準となる尺度を用いて作成した。所属の研究倫理委員会の承認後、質問紙調査を実施した。調査対象は、生きがい大学やA市の60歳以上の男性高齢者とした。回収は407部、有効回答の290部を分析対象とした。記述統計、因子分析等データを分析している段階である。夫介護者のインタビュー内容を分析し、認知症ケア学会、日本家族看護学会で発表した。「認知症の妻を介護する夫の介護課題と克服プロセス」についての投稿論文を執筆中である。25項目の「夫の認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」を原案として、質問紙を作成した。研究倫理委員会承認後、生きがい大学、A市住民を対象に質問紙を配布した。質問紙407部回収後、有効回答の290部を分析対象として、記述統計、因子分析等のデータ分析をしている。分析をすすめ、尺度の信頼・妥当性を検証していく予定である。認知症の介護準備態勢の定義を明確にし、質問紙を作成し倫理委員会に提出する。倫理委員会承認後、シルバー大学等にて調査を実施する予定である。「夫の認知症介護準備態勢」の質問紙を作成し倫理委員会に提出する。承認後、老人大学等で男性高齢者を対象に調査する予定である。「夫の認知症介護準備態勢の自己評価式尺度」の信頼性・妥当性が検証をすすめ、学会発表、学術誌に論文を投稿していく予定である。予定していた学会発表が次年度発表となったため。質問紙調査を実施できなかったため、30年度は質問紙調査にかかる費用と調査データの入力や分析ソフト購入に使用する予定である。データ分析段階であるため、打ち合わせのための会議費、交通費が必要である。データ分析後、学会発表や学術誌投稿を予定している。そのための学会関連経費(英文校閲費、学会参加費、旅費)、投稿論文の英文校閲費が必要である。質問紙調査を実施するにあたって、調査票の印刷、郵送代、データ入力など必要な費用を次年度使用する予定である。
ナノ粒子内を反応の場とする有機反応を利用したナノ空間分解性mRNAベクターの開発

本研究では、ナノ粒子内で特異的に誘起される分解反応を新原理として提唱し、ナノ粒子に対して細胞内環境応答的な崩壊性を付与することで、核酸を細胞内へ送達する技術の開発を進めてきた。搭載する核酸としては、DNAと比較して変異原性などのリスクを持たないmRNAに着目し、世界最高水準の効率と安全性を兼ね備えたmRNAベクターの開発を目指す。基盤技術として独自の環境応答性脂質であるSS-cleavable Proton-Activated Lipid-like Material(ssPalm)を用い、本分子の設計に分解性リンカーを導入することで新規素材の開発を目指した。平成30年度の当初計画へ『ベクター開発』、『遺伝子発現活性、免疫原性評価(細胞)』であった。『ベクター開発』については、粒子内ナノ空間という高度に濃縮的な環境でのみ特異的に切断されるリンカー構造(フェニルエステル)を見出し、新規化合物ssPalmO-Phenyl-P4C2(SS-OP)を開発した。SS-OPは非分解性コントロールに比較し優れたmRNA導入効率を示した。さらに、市販のトランスフェクション試薬や既承認核酸医薬品の主成分と比べ有意に高い導入効率を示した。本素材と化学修飾核酸を組み合わせることで、反復投与可能なベクターを開発した。『免疫原性評価』では、細胞にトランスフェクションを行った際の応答を炎症応答やストレス応答を低分子で阻害することで、各パスウェイの寄与を調べた。その結果、炎症に対する広範な抑制作用を示すデキサメタゾンが外来mRNAの導入効率を改善可能であることを明らかとした。本年で目標としていた『ベクター開発』、『遺伝子発現活性、免疫原性評価(細胞)』は計画通り完了した。本年で開発した素材は、既存のベクターと比較しても優れた機能を有するため、特許出願(国内/PCT)を行った。また、免疫原性の評価では、1型インターフェロンやストレス応答ではなく、炎症性の応答が外来mRNAの発現に影響する可能性を見出し、論文として報告した。以上より、研究は計画通りに進展していることから、(2)おおむね順調に進展していると判断した。本年で開発したSS-OPのIn vivo応用をさらに進める。具体的には、研究計画に従い肝臓における炎症性疾患モデルに対する治療効果を検証する。炎症性疾患モデルとしては、劇症肝炎モデルであるガラクトサミン/LPSモデルおよび、FASに対するアゴニスティック抗体(Jo2)を用い、抗アポトーシスタンパク質(Bcl-2)や抑制性サイトカイン(IL-10など)をmRNAの形で導入する。炎症環境時における遺伝子発現を検証しながら、導入されたタンパク質による肝炎治療効果を検証する。肝臓毒性の指標であるAST/ALTの評価を行う。また、遺伝子発現の結果を鑑みて、mRNAの配列最適化や化学修飾の検討を行う。また、潰瘍性大腸炎モデルに対する遺伝子導入についても検討を進める。
PCR-RFLP法による恙虫病リケッチアのDNA型別と病原性の関連

[材料と方法]BS-C-1細胞で継代培養したR.tsutsugamushiの標準3株(Gilliam、Karp、Kato)および入江、平野株。患者末梢血は19901994年度に宮崎地方で発生した恙虫病患者17例よりヘパリン採血し単核球を分離した。培養株および分離した単核球より常法にてDNAを抽出しnested法にてPCRを行った。産物をHhaIなど10種類の制限酵素で処理し、アガロースゲル電気泳動し、そのパターンによってDNA型別に分類した。[結果]1)RFLP法によるR.tsutsugamushiの型別:標準3株および入江、平野株を増幅し産物をHhaI処理した場合、泳動パターンにより各株の鑑別が可能であった。2)患者末梢血よりのリケッチアDNAの検出とその型別:患者17例中14例で末梢血単核球よりPCR法にてリケッチアDNAが検出可能であった。産物をHhaIで処理したところ10例が入江株、4例が平野株と同一のパターンを示した。14例全例が蛍光抗体法による血清型と一致した。HhaIにて平野株と同じパターンを示した4例中2例はHinfI、AluI処理にて平野株と異なるパターンを示した。この2例よりリケッチアを分離しマウスに対する病原性を検討したところ平野株より弱毒であった。[結論]本法ではPCRにて増幅した産物をHhaI処理することで分離株だけでなく患者末梢血よりリケッチアを分離することなく血清型の鑑別が可能であった。さらにHinfI、AluI処理することで検討した5株以外のDNA型のリケッチアの同定が可能であった。現在さらに検体を増やしてDNA型を検討するとともに、検討した5株と異なるDNA型を示す株の免疫学的性状を検討中である。