hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HGF/SF刺激によるヒト口腔癌細胞の浸潤能促進におけるRhoタンパク質の関与

ヒト口腔扁平上皮癌細胞株SAS細胞のHGF/SFによる浸潤能の促進は細胞運動能の亢進と関連性が高いと考えている。これまでに、HGF/SF刺激の細胞内シグナルは、SAS細胞のHGF受容体(c-Met)を介し、FAKを活性化し伝達されること、SAS細胞のHGF/SFによる運動能の亢進にRhoが関与し、HGF/SF刺激の細胞内シグナル伝達において、FAKの上流にRhoが存在し制御している可能性を報告した。そこで、SAS細胞の運動能が促進する際のRhoの関与について以下の検討を行った。HGF/SF刺激によるSAS細胞のRho変化を検討した結果、Rhoが不活性型から活性型に変換する際に抑制的に作用するGDP解離抑制蛋白質(RhoGDI)に変化は認められなかったが、RhoサブファミリーであるRhoAは、HGF/SF刺激後30分をピークとして経時的に増加した。HGF/SF刺激がSAS細胞のRhoのmRNA及ぼす影響を検討した結果、SAS細胞のRhoのmRNAの発現は、観察した24時間では変化が認められなかった。また、SAS細胞のRhoのmRNAの発現は、HGF/SF非刺激の状態においても発現されており、常時Rhoが産生されている可能性が示唆された。また現在、HGF/SF刺激によるSAS細胞のRhoの細胞内局在変化を検討するため、抗RhoA抗体を用いた免疫蛍光染色による共焦点レーザー顕微鏡の観察を行っている。ヒト口腔扁平上皮癌細胞株SAS細胞のHGF/SFによる浸潤能の促進は細胞運動能の亢進と関連性が高いと考え以下の検討を行った。l)HGF/SF刺激によるSAS細胞のHGF受容体(c-Met)およびFAK^<p125>のチロシンリン酸化の変化を検討した結果、HGF/SF刺激後5分よりc-Metのチロシンリン酸化の亢進が認められ、FAK^<p125>のチロシンリン酸化はHGF/SF刺激後30分をピークとする経時的な亢進が認められた。この結果からHGF/SF刺激の細胞内シグナルは、SAS細胞のc-Metを介し、FAK^<p125>を活性化し伝達される可能性が示唆された。2)Rhoの特異的阻害剤であるC3酵素処理したSAS細胞のHGF/SF刺激による浸潤能および運動能の変化をi検討した結果、HGF/SF刺激により亢進したSAS細胞の浸潤能は、C3酵素処理により有意に抑制された。また、HGF/SF非刺激のSAS細胞をC3酵素処理したところ、この運動能も有意に抑制された。この結果からSAS細胞のHGF/SFによる運動能の亢進に、Rhoが関与していることが示唆された。また、SAS細胞はHGF/SF非刺激においてもRhoが関与し、その運動能が亢進されている可能性が示唆された。3)HGF/SF刺激によるc-Metのチロシンリン酸化後のシグナルがFAK^<p125>に伝達される過程で、Rhoが関与するかを明らかにするためにC3酵素処理によるHGF/SF刺激後のFAK^<p125>チロシンリン酸化の変化を検討した結果、HGF/SF刺激により亢進したSAS細胞のFAK^<p125>チロシンリン酸化は、C3酵素処理により減弱された。この結果からHGF/SF刺激の細胞内シグナル伝達においてFAK^<p125>の上流にRhoが存在し制御している可能性が示唆された。
認知症早期発見を可能とするMRI撮像法と機器保守管理システムの開発

健忘症軽度認知症障害からアルツハイマー型認知症への進行を早期に予測できる組織コントラストを強調できるMRIの撮像条件と経時的に評価できるMRI性能評価システムの開発である.MR現象を数理的に解析できるBloch方程式を数値シミュレーションし組織コントラストが強調できるMRIパルスシーケンスのRF角度のα度ーβ度を算出した.RF角度を90度ー180度からα度ーβ度に変更すると白質と灰白質のCNRを26%改善し,SARも33.6%低減した.併せてDiffusion画像からエッジレスポンス,SNR評価法を確立しことでたMRIの機種依存性を受けないベンチマーク評価が可能になった.H27年度では白質ー灰白質を高コントラストで撮像できるMRIの撮像法の開発を行い、脳の特徴的な経時的変化を時系列データ解析としてアルツハイマー型認知症への進行診断を支援するシステム開発の構築を行った.システム開発の構築は,アルツハイマー型認知症で早期に特異的に側頭葉内部内側で萎縮を計測する白質ー灰白質が高コントラストで描出できる90度-180度RFパルスシーケンス以外の角度を使用したα度-β度RFパルスシーケンスの最適化に関しての構築を行った.しかし,MRIのパルスシーケンス開発ではMRI実機搭載するまでに試験的に数値シミュレーションでパルスシーケンス改良の効果を確認する必要がある.この数値シミュレーションにはBlchが提案したBloch方程式を4次Runge-Kutta法で数値シミュレーションすることでMRI実機撮像時と同じ信号強度を示す白質-灰白質の信号強度を算出してα度-β度RFパルスシーケンスの最適化の検討を行った.最適化では基準角度である90度-180度RFパルスシーケンスでの白質ー灰白質の信号強度とスピンの位相角を基準としてα度-β度RFパルスシーケンスの信号強度及び位相角分散の値が最小になる角度を算出した.しかし,この数値シミュレーションは演算時間がかかるので複数台のパーソナルコンピュータを使用して分散型数値シミュレーションシステムの開発しを行うのと併せて、時系列的解析を可能にするには頭部MRI画像の画質を一定に保つ必要があるので撮像条件の保守管理とMRI装置のハードウエア系の保守管理が同時にできる機器保守管理システムの開発の構築を行った.このシステム開発を構築することで認知症の時系列解析がMRIの経時的変化を考慮することなく、高精度で解析が可能になるので認知症の早期発見の精度が飛躍的に向上する。白質ー灰白質を高コントラストで撮像できるMRIの撮像法の開発を行い、脳の特徴的な経時的変化を描出できるMRIのパルスシーケンス開発を行った.MRI現象を理論的に検証できるBloch方程式を数値シミュレーションして白質ー灰白質の信号強度をした.しかし,数値シミュレーションでの変数組み合わせが非常に多く演算時間がかかるので複数台のパーソナルコンピュータを使用して分散型数値シミュレーションシステムの開発に時間がかかっている.この為,分散型数値シミュレーションシステム開発と平行して単独型数値シミュレーションシステムでも数値解析を行っている.また,Bloch方程式の数値シミュレーションでは白質・灰白質の縦緩和時間(T1値)及び横緩和時間(T2値)が必要なるがこの値はMRIの磁場強度により異なるのでアルツハイマー型認知症早期発見に関与する確率が高い病院が多く保有している静磁場強度は1.5テスラのT1値・T2値を数値シミュレーションで行った.また,併せてMRI時系列的解析を可能にする保守管理とMRI装置のハードウエア系の保守管理が同時にできる機器保守管理システムの開発の構築を行い画質評価を行っている.平成28年度ではH27年度に引継ぎ白質-灰白質を高コントラストで撮像できるMRI撮像法の開発を行い,脳の特徴的な経時変化を時系列変化データとして解析しアルツハイマー型認知症への進行診断を支援するシステム開発の構築を行った.システム開発の構築は,アルツハイマー型認知症で早期に特異的に側頭葉内部内側で萎縮計測をする白質-灰白質を高コントラストで抽出できる90度-180度RFパルスシーケンス以外の角度を使用したα度-β度RFパルスシーケンスの最適化に関する構築を行った.MRIのパルスシーケンス開発では,MR現象を理論的に解析できるBloch方程式を4次Runge-Kutta法で数値シミュレーションすることでMRI実機撮像と同じ信号強度を示す白質-灰白質の信号強度を算出してα度-β度RFパルスシーケンスの最適化の検討を行った.最適化では基準角度である90度-180度RFパルスシーケンスでの白質-灰白質の信号強度とスピンの位相角を基準としてα度-β度RFパルスシーケンスの信号強度が同等かつ位相角分散値が最少になる角度の算出が完了した.この角度は90度-180度-echoのスピンエコー型と90度-180度-echo-180度-echo型の高速スピンエコー法でα度-β度RFパルスシーケンスが異なることが証明できた.また,時系列的解析を可能にする頭部MRI画像の画質を一定に保つ必要があるで撮像条件の保守管理とMRI装置のハードウエア系の保守管理が同時にできる機器保守管理システムの開発の構築を行った.このシステム開発を構築することで認知症の時系列解析がMRIの時系列変化を考慮することなく,高精度で解析が可能になるので認知症の早期発見の精度が飛躍的に向上する.白質-灰白質を高コントラストで撮像できるMRIの撮像法の開発を行い,脳の特徴的な経時的変化を描出できるMRIのパルスシーケンス開発を行った.MR現象を理論的に検証できるBloch方程式を数値シミュレーションして白質-灰白質の信号強度を算出した.

Bloch方程式の数値シミュレーションでは白質-灰白質の縦緩和時間(T1値)及び横緩和時間(T2値)が必要になるがこの値はMRIの磁場強度により異なるのでアルツハイマー型認知症早期発見に関与確率が高い病院が多く保有している静磁場強度は1.5テスラのT1値・T2値を使用し数値シミュレーションで行った.しかし,数値シミュレーションでの組合せが非常に多く演算時間がかかるので複数台のパーソナルコンピュータを使用して分散型数値シミュレーションシステムの開発に時間がかかっている.しかし,分散型数値シミュレーションシステム開発と平行して単独型数値シミュレーションシステムでの数値解析を行った結果,90度-180度-echoのスピンエコー型と90度-180度-echo-180度-echo型の高速スピンエコー法でα度-β度RFパルスシーケンスが異なることが証明できた.また,併せてMRI時系列的解析を可能にする保守管理とMRI装置のハードウエア系の保守管理が同時にできる機器保守管理システムの開発の構築を行い画質評価を行っている.臨床機実装での側頭葉内部内側の組織コントラスト問題点に対してのRapid Imaging with Refocused Echoes(RARE)型のRFパルスシーケンスの角度をα度-β度でコード化を行い,臨床機評価での撮像条件の問題点と改良を目的とした再数値シミュレーションおよび解析システムの改良を行い精度の向上の検討を行ったが再数値シミュレーション工程数が非常に多くなり再数値シミュレーション時間が大幅に延長したので再数値シミュレーションを行うPC台数を増やし再数値シミュレーション時間の短縮を検討した.また,軽度認知症からアルツハイマー型認知症への進行を時系列的に評価できるようにMRI画質も時系列的に変化しないようなMRIの機器保守管理が必要となるので、精度が良くMRI保有病院の全てが保持できるような安価で新規格のMRIファントムを含めた機器保守管理システムの開発を検討した.機器保守管理システムで使用するMRI用ファントム形状は球状で検討し磁場不均一性の影響を受けないような大きさとして作成した.併せて撮像条件およびデータ解析システムの臨床機への実装を行い撮像条件を臨床実機に搭載し認知症の早期発見ができるように検討した.健忘型軽度認知症障害に対して適切な診断を促すシステムの開発およびアルツハイマー型認知症への進行予測および予後予測のシステム開発に関しては、医学的な観点からシステムの評価を行い、不備の点の改良を行いだけでなく医師および医療従事者が使いやすいシステムになるよう人間工学的な観点での検討を行う予定であったが再数値シミュレーション時間が延長した為にアルツハイマー型認知症への進行予測および予後予測システム構築が大幅に遅れる結果となった.健忘症軽度認知症障害からアルツハイマー型認知症への進行を早期に予測できる組織コントラストを強調できるMRIの撮像条件と経時的に評価できるMRI性能評価システムの開発である.MR現象を数理的に解析できるBloch方程式を数値シミュレーションし組織コントラストが強調できるMRIパルスシーケンスのRF角度のα度ーβ度を算出した.RF角度を90度ー180度からα度ーβ度に変更すると白質と灰白質のCNRを26%改善し,SARも33.6%低減した.
キューバにおける政治指導者たちの思想的基盤と政治行動に関する研究

キューバ共産党機関紙『グランマ』における主な政治指導者の発言及びそれに関連する政治行動を調査・分析し、中央及び地方、大衆組織等のリーダー達の政治行動原理を、特に思想的基礎を明らかにすることで解明しようとした。研究成果の一部として、試論ではあるが平成10年6月開催の日本ラテンアメリカ学会(於、神戸大学)にて「キューバナショナリズムの変容」と題して研究報告した。この中で、特に強調したのは、近年におけるキューバ政治指導者たちのホセ・マルティ思想の新しい解釈、チェ・ゲバラ的な理想主義への回帰、キリスト教、特にカトリック教会との和解等に関する言及が増えていること、その背景に、現在推し進めている政治、経済、外交面での政策的再編の正当化や、地方組織、地方指導者への一定の権限委譲や大衆組織の活性化といった目的がある点を指摘したいということである。こうした流れは、中長期的にみればキューバ民主化を一段と促進する方向に働くことは疑いなく、その点を含め、平成11年度中に研究の全体的とりまとめを行う。ポスト冷戦時代に入って、キューバにおいて進行している経済改革、共産党や国会(人民権力議会)の機構改革、その他の制度的改革や人事面での刷新といった動きは、最高指導者たるフィデル・カストロ国家評議会議長の主導のもとにすすめられてきた。しかしながら、この間にキューバにおいては社会的流動化が進行し、共産党の指導力は大きく低下している。こうした状況下で、党の中枢部では、世代交代と地方組織の強化、職場や教会といったインフォーマルな共同体との関係強化等にとりくみはじめており、新しい時代におけるキューバ社会主義のあり方を模索している。その際、カストロらは米国的な民主主義の価値観や市場メカニズム万能主義を厳しく批判しつつも、政府と市場の調整機能を果たしうるような共同体重視の姿勢を見せている。本研究(平成910年度実施)では、キューバの政治指導者たち(カストロを除く)の政治行動原理に大きく影響を与えている思想として、キューバ独立の父といわれるホセ・マルティがあること、ただし、それをどのように解釈するかにあたってはカストロの言動に制約されていることを実証的に研究する。尚、カストロが青少年期にどのような思想的形式を行ってきたかについては『クロニック20世紀人物史』(講談社、1998年刊行予定)に、概要として投稿した。
制御性樹状細胞を用いた炎症性腸疾患発症進展因子の探索と治療への応用

[目的]申請者は、炎症性腸疾患への関与が想定されている盲腸細菌抗原(Cecal bacterial antigen:CBA)をパルスした制御性樹状細胞が炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を抑制できるか検討を行った。[材料と方法]CBAはBALB/cマウスより採取した回盲部を破砕し上清を回収後、滅菌処理を行って作製した。制御性樹状細胞は,BALB/cマウスの骨髄細胞をIL-10、TGF-β1、GM-CSFで8日間培養後、LPSで24時間培養して作成した。CBAまたはKLHをパルスした制御性樹状細胞をCBAパルス制御性樹状細胞(Reg-DC_<CA1>)、KLHパルス制御性樹状細胞(Reg-DC_<KLH>)とした。炎症性腸疾患モデルはSCIDマウスにBALB/cマウスの脾細胞から採取したCD4^+CD25^-T細胞を腹腔内投与して作成した。制御性樹状細胞はCD4^+CD25^-T細胞投与と同時に腹腔内投与した。対照群にはPBSを投与した。制御性樹状細胞群とPBS群における体重変化、大腸の長さ、腸炎の組織所見を比較した。[結果]Reg-DC_<CBA>群はPBS群と比較して、体重減少、大腸の短縮が抑制され、組織学的にも腸炎の程度は軽度であった(いずれもp<0.05)。Reg-DC_<KLH>群ではReg-DC_<CBA>群程の腸炎改善効果はみられなかった。CBAを2次元電気泳動法、TOF-MASS分析を行ったところ、主要物質は炭酸脱水素酵素I(CA1)であった。CA1パルス制御性樹状細胞には、Reg-DC_<CBA>と同様の腸炎の抑制効果がみられた。[考察]Reg-DC_<CBA>はCD4^+CD25^-細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎の進展を抑制した。また、CA1をパルスした制御性樹状細胞が腸炎の進展を抑制したことから、CA1が炎症性腸疾患における標的抗原である可能性が示唆された。[結論]CBAパルス制御性樹状細胞が炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を抑制できることを明らかにした。CA1は炎症性腸疾患における標的抗原である可能性がある。【背景および目的】炎症性腸疾患は、腸内細菌を含む腸内蛋白抗原に対する過剰な免疫応答が主な原因と考えられている。本年度は、腸内蛋白抗原特異的制御性樹状細胞を作成しマウス腸炎モデルを治療できるか否かを明らかにすること、また、制御性樹状細胞が制御する腸内蛋白抗原のうちどの蛋白抗原が重要かを明らかにすることを目的とした。【方法】腸炎モデルは、CD4+CD25-T細胞移入モデルを使用した。腸内蛋白抗原の抽出は、盲腸から行った。BALB/cマウスの盲腸を摘出し腸内溶物をPBSに懸濁した。腸内細菌を含む全細胞を破砕し蛋白(腸内細菌抗原cecalbacterialantigen : CBA)を抽出した。制御性樹状細胞の作成は、BALB/cマウス骨髄細胞を、GM-CSF、IL-10、トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)とともに8日間培養して作製した。最後の24時間はLPSとCBAとともに培養してCBA特異的制御性樹状細胞を作成した。作成した制御性樹状細胞を、腸炎モデルに腹腔内投与した。【結果】制御性樹状細胞は、未熟樹状細胞に近い表面マーカーを示した。制御性樹状細胞は、Toll様受容体の刺激によってIL-10を産生した。制御性樹状細胞は、制御性T細胞を誘導した。制御性樹状細胞を投与したマウスでは、腸炎の発症が抑制された。特にCBAをパルスした制御性樹状細胞では腸炎の抑制が強かった。CBAを、さらに2次元電気泳動によるウエスタンブロット法で蛋白を分離し解析している。【考察】腸内細菌抗原特異的制御性樹状細胞が、腸炎の発症を抑制した。制御性樹状細胞によって腸内細菌抗原に対する免疫寛容が誘導され腸炎が抑制された可能性がある。現在、腸内細菌抗原のさらに標的蛋白を絞り込む作業を行っている。これが明らかとなれば炎症性腸疾患に対する新しい細胞療法が開発できる可能性がある。

対照群にはPBSを投与した。制御性樹状細胞群とPBS群における体重変化、大腸の長さ、腸炎の組織所見を比較した。[結果]Reg-DC_<CBA>群はPBS群と比較して、体重減少、大腸の短縮が抑制され、組織学的にも腸炎の程度は軽度であった(いずれもp<0.05)。Reg-DC_<KLH>群ではReg-DC_<CBA>群程の腸炎改善効果はみられなかった。CBAを2次元電気泳動法、TOF-MASS分析を行ったところ、主要物質は炭酸脱水素酵素I(CA1)であった。CA1パルス制御性樹状細胞には、Reg-DC_<CBA>と同様の腸炎の抑制効果がみられた。[考察]Reg-DC_<CBA>はCD4^+CD25^-細胞移入炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎の進展を抑制した。また、CA1をパルスした制御性樹状細胞が腸炎の進展を抑制したことから、CA1が炎症性腸疾患における標的抗原である可能性が示唆された。[結論]CBAパルス制御性樹状細胞が炎症性腸疾患モデルマウスの腸炎を抑制できることを明らかにした。CA1は炎症性腸疾患における標的抗原である可能性がある。
自己免疫性膵炎の発症と線維化に関する免疫学的研究

自己免疫性膵炎の発症や病態における制御性T細胞(Treg)やIgG4の意義については不明である。本研究は、自験臨床例と膵炎動物モデルを用いて、末梢血TregやIgG4の解析を行うことにより、自己免疫性膵炎の病因や病態におけるIgG4やの関与を明らかにすることを目的として遂行された。AIP患者では末梢血中ナイーブ制御性T細胞(FoxP3^+CD4^+RA^+CD25^<high>)の有意な低下を認めることが自己免疫異常の発症に関係する一方で、メモリー制御性T細胞(FoxP3^+CD4^+RA^+CD25^<high>)は有意に増加するとともに、血中IgG4値と正の相関のあることを明らかにした(Pancreas.2008;36:133-40.他)。線維化に関わるTGF-βは血中レベルでは、自己免疫性膵炎と他の原因の慢性膵炎患者間で差異は認められなかった。また、膵炎自然発症モデルであるWB/Kobラットを解析すると、膵炎だけでなく、胆管炎、唾液腺炎、涙腺炎、腎炎など、ヒト自己免疫性膵炎と類似の膵外病変を認め、自己免疫性膵炎の動物モデルとして有用であることを示した。さらに、WB/KobラットではTregが減少しており、野生型正常ラットより分離したTregを骨髄内骨髄移植法により移入することにより、膵炎だけでなく膵外病変の発症を抑制でき、Tregの減少が発症に関わる可能性を示唆した。以上より、胸腺由来のナイーブ制御性T細胞の減少が発症に関与するとともに、末梢でのメモリー制御性T細胞は反応性に増加し、IL-10産生の亢進を介して、IgG4へのクラススイッチを誘導し、IgG4陽性形質細胞の浸潤や血中のIgG4上昇に関与することが考えられた。自己免疫性膵炎はTリンパ球やIgG4陽性形質細胞の膵管周囲への著しい浸潤と特異な線維化が病理組織学的特徴であり、時に硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、後腹膜線維症などを合併することがある。世界的に報告例が急増しており、わが国より発信された新しい疾患概念として、国際的にもほぼ認められつつある。高IgG/IgG4血症や自己抗体を認め、ステロイド治療が奏功するため、発症機序には自己免疫の関与が推定されているが、その詳細は不明である。一方、近年、多くの自己免疫疾患において制御性T細胞(Treg)の破綻や強力な抗原呈示細胞である樹状細胞(DC)の異常が関与することが明らかにされつつあるが、自己免疫性膵炎におけるTregの関与については不明である。我々は発症機序に関しで、まず膵cDNAを組み込んだ蛋白発現ベクターと患者血清を用いで膵管上皮に分布するcarbonic anhydrase(CA)-IIおよび膵腺細胞に分布するlactoferrinを同定し、これら蛋白に対する自己抗体が臨床例の90%において検出されることを明らかにしてきたが、新たに、CA-II,lactoferrinと同様に広く外分泌腺に分布するPSTIに対する自己抗体の存在を同定した。また、自験臨床例54例と申請者らの開発したマウスモデルやWBN/Kob ratを含む膵炎動物モデルを用いて、末梢血の末梢血制御性T細胞の解析を行った。その結果、ナイーブ制御性T細胞(CD4^+CD25^+CD45RA)の低下とメモリー制御性T細胞(CD4^+CD25^+CD45RA^-)は増加していることを見出した。

減少したナイーブ制御性T細胞が自己免疫性膵炎の発症に関与するとともに、IL-10、TGF-bの産生を促すメモリー制御性T細胞を介してIgG4産生や線維化を来たし、病態生理に関与する可能性がはじめて示唆された。自己免疫性膵炎の発症や病態における制御性T細胞(Treg)やIgG4の意義については不明である。本研究は、自験臨床例と膵炎動物モデルを用いて、末梢血TregやIgG4の解析を行うことにより、自己免疫性膵炎の病因や病態におけるIgG4やの関与を明らかにすることを目的として遂行された。AIP患者では末梢血中ナイーブ制御性T細胞(FoxP3^+CD4^+RA^+CD25^<high>)の有意な低下を認めることが自己免疫異常の発症に関係する一方で、メモリー制御性T細胞(FoxP3^+CD4^+RACD25^<high>)は有意に増加するとともに、血中IgG4値と正の相関のあることを明らかにした(Pancreas.2008;36:133-40.他)。線維化に関わるTGF-βは血中レベルでは、自己免疫性膵炎と他の原因の慢性膵炎患者間で差異は認められなかった。また、膵炎自然発症モデルであるWB/Kobラットを解析すると、膵炎だけでなく、胆管炎、唾液腺炎、涙腺炎、腎炎など、ヒト自己免疫性膵炎と類似の膵外病変を認め、自己免疫性膵炎の動物モデルとして有用であることを示した。さらに、WB/KobラットではTregが減少しており、野生型正常ラットより分離したTregを骨髄内骨髄移植法により移入することにより、膵炎だけでなく膵外病変の発症を抑制でき、Tregの減少が発症に関わる可能性を示唆した。以上より、胸腺由来のナイーブ制御性T細胞の減少が発症に関与するとともに、末梢でのメモリー制御性T細胞は反応性に増加し、IL-10産生の亢進を介して、IgG4へのクラススイッチを誘導し、IgG4陽性形質細胞の浸潤や血中のIgG4上昇に関与することが考えられた。
調節性B細胞機能解明による肝移植後個別化免疫抑制療法の開発

前年度に続き、肝移植後の調節性B細胞の機能を解明することにより、臓器移植後の個別化免疫抑制療法開発(免疫抑制剤の減量あるいは離脱)の基盤となる研究を行うことを目的とし、当科で生体肝移植術を施行したレシピエントの内、3年以上経過し外来通院中の患者18名からサンプリングを行った(免疫抑制剤を減量できている患者群:tolerant patients(TOL)4名、減量できていない患者群:stable patients(STA)14名)。また対照となるhealthy volunteer(HV)として当科の医局員のうち持病のない者5名からサンプリングを行った。サンプリングした全血からリンパ球を抽出し、MACS、FACSを用いてB細胞分画の測定を行った。調節性B細胞(CD20+CD24hiCD38hi)はHV(n=5)で3.90±1.05%、TOL(n=4)で0.87±0.44%、STA(n=14)で0.30±0.12%の発現であった。ナイーブB細胞(CD20+CD24loCD38lo)はHVで55.4±0.97%、TOLで30.2±13.0%、STAで19.2±5.4%であった。形質細胞(CD20-CD38+CD138+)はHVで1.57±0.40%、TOLで2.07±1.52%、STAで3.67±0.92%であった。これは2014年にAmerican Journal of transplantationに報告された腎移植後患者での検討とHVにおいてほぼ同等の値であった。当科で免疫抑制剤を使用している患者ではTOL、STAともに既報と比べて調節性B細胞、ナイーブB細胞は少なく、形質細胞は多かった。既報と免疫抑制剤の量と種類が異なることが関係していると思われた。これまで得られた知見をまとめ、学会、論文発表していく予定である。申請者らは1996年10月から2015年9月までに597例の生体肝移植および18例の脳死肝移植の後、さらに現在2017年4月現在663例の生体肝移植を臨床的に施行してきている。また脳死肝移植は32例にまで増加し、研究を十分に推進していける体制にあります。研究業績にあるように多くの臨床研究報告を継続しておこなっており、当科における肝移植後時期別死因としては1年未満の死因としては様々な感染症とC型肝炎再発などの肝不全が主であるが、1年以降では肝細胞癌の再発やde novo悪性腫瘍による腫瘍関連死が約半数を占めている。以上の結果から、臓器移植後の長期予後を高めるためには可能な限りの免疫抑制剤の減量または離脱が必要と考えられる。しかしながら免疫抑制剤減量あるいは離脱を可能とする指標は現状ではなく、拒絶反応の惹起を恐れるためほとんどの臓器移植患者が過剰免疫抑制状態にあると考えられる。これまでの移植免疫学はT細胞の解析が主であり、B細胞はT細胞の指令の下に、移植片に対する抗体産生を行う補助的役割として位置づけされてきた。しかしながら近年、自己免疫、移植免疫の分野で調節性B細胞の役割が注目されており、この細胞が自己免疫疾患の緩和、移植片に対する拒絶反応に対して中心的防御的役割を担っていると考えています。現在健常者及び患者血液をリンパ球分離液で処理し、リンパ球を採取し、このリンパ球をB cell isolation kitTMを用いて調節性B細胞のみをフローサイトメトリーを用いて分離する手技の確立に努めています。CD24、CD27、CD19、CD38、CD25、CD71の抗体を用いてCD20+CD24hiCD38hi細胞を調節性B細胞として、まずは肝移植後3ヶ月を経過して安定した肝移植を受けた患者(レシピエント)を中心に鋭意、採血によってリンパ球の分離に努めている段階である。当初計画していた調節性B細胞の同定はフローサイトメトリーで行うこととしていたが、この調節性B細胞を抗体にて同定し、分離することには、非常に熟練した実験手技が必要であることが研究の非常に大きな妨げとなっており、さらには、分離する細胞のリンパ球の割合が非常に少量であることがわかった。そのため患者血液をリンパ球分離液で処理し、リンパ球を採取し、このリンパ球をB cell isolation kitTMを用いて調節性B細胞のみを正確に、また研究として使用するリンパ球を分離するのにもうしばらくの時間が必要と考えられます。研究の基礎環境が整い、今後は実臨床での応用へと進む予定である。

調節性B細胞(CD20+CD24hiCD38hi)はHV(n=5)で3.90±1.05%、TOL(n=4)で0.87±0.44%、STA(n=14)で0.30±0.12%の発現であった。ナイーブB細胞(CD20+CD24loCD38lo)はHVで55.4±0.97%、TOLで30.2±13.0%、STAで19.2±5.4%であった。形質細胞(CD20-CD38+CD138+)はHVで1.57±0.40%、TOLで2.07±1.52%、STAで3.67±0.92%であった。これは2014年にAmerican Journal of transplantationに報告された腎移植後患者での検討とHVにおいてほぼ同等の値であった。当科で免疫抑制剤を使用している患者ではTOL、STAともに既報と比べて調節性B細胞、ナイーブB細胞は少なく、形質細胞は多かった。既報と免疫抑制剤の量と種類が異なることが関係していると思われた。これまで得られた知見をまとめ、学会、論文発表していく予定である。上記の遅延がありますが、現在鋭意実験手技の確立に努めており、この確立を待って、以下の項目を進める予定です。肝移植後長期免疫抑制状態にある患者の調節性B細胞の同定および発現率を確認し、これらの調節性B細胞の発現が維持している免疫抑制剤の種類によって異なるかどうかを調べる予定です。次にこれらの調節性B細胞を分離しin vitroでの免疫調節機能(混合リンパ球培養反応抑制効果、サイトカイン発現量)を明らかにします。また、この免疫調節機能がドナー特異的であるかどうか(ドナーリンパ球に対する反応とhealthy volunteerリンパ球に対する反応に差があるかどうか)を確認し、肝移植後段階的に免疫抑制剤を減量している患者において、継時的に調節性B細胞の発現率の変化を調べます。研究に配分するエフォートを30%から40%ほどに上昇させることによって、研究を推進する方針です。H30年度の方針として、1調節性B細胞はIL-10の産生を特徴とするため検出した調節性B細胞のうちIL-10産生の割合の調査を行う。調節性B細胞の分離を安定して行えるようになってから、2当科で生体肝移植後3年経過しているドナー、レシピエント、healthy volunteerにおいて調節性B細胞の割合に差を認めるか否かを検討する予定である。当初、臨床検体を用いた研究・実験を行う予定だったが、来年度行うこととなったため。
糖尿病における酸化的遺伝子損傷の特異的診断法の開発と病態の解明

我々は活性酸素によるDNA損傷産物と慢性合併症の関連性を明らかにしてきた.活性酸素によるDNA損傷産物は多種同定されている.しかし,測定法の煩雑さから糖尿病で詳細に測定した報告はなく,糖尿病における活性酸素によるDNA損傷の特徴はわかっていない.本研究では,酸化障害DNA塩基測定法を開発し,糖尿病における酸化的DNA損傷の特徴を明らかにし,かつ酸化的DNA損傷マーカーと糖尿病性慢性合併症の関連を明らかにすることを目的に実施された.2.糖尿病合併症と酸化的DNA損傷との関連性糖尿病合併症の発症・進展と酸化的DNA損傷蓄積との関連性をprospectiveに検討し,酸化的DNA損傷と糖尿病性腎症の進展との関連を明らかにした(Diabetologia, in press).また糖尿病性網膜症の進展との関連性を明らかにした.本研究により,新しい酸化障害DNA塩基測定法が開発され,糖尿病における酸化的DNA損傷の特質が明らかになった.糖尿病性合併症の成因における酸化的DNA損傷の役割が解明されることが期待される.我々は活性酸素によるDNA損傷産物と慢性合併症の関連性を明らかにしてきた.活性酸素によるDNA損傷産物は多種同定されている.しかし,測定法の煩雑さから糖尿病で詳細に測定した報告はなく,糖尿病における活性酸素によるDNA損傷の特徴はわかっていない.本研究では,酸化障害DNA塩基測定法を開発し,糖尿病における酸化的DNA損傷の特徴を明らかにし,かつ酸化的DNA損傷マーカーと糖尿病性慢性合併症の関連を明らかにすることを目的に実施された.2.糖尿病合併症と酸化的DNA損傷との関連性糖尿病合併症の発症・進展と酸化的DNA損傷蓄積との関連性をprospectiveに検討し,酸化的DNA損傷と糖尿病性腎症の進展との関連を明らかにした(Diabetologia, in press).また糖尿病性網膜症の進展との関連性を明らかにした.本研究により,新しい酸化障害DNA塩基測定法が開発され,糖尿病における酸化的DNA損傷の特質が明らかになった.糖尿病性合併症の成因における酸化的DNA損傷の役割が解明されることが期待される.我々は活性酸素によるDNA損傷産物と慢性合併症の関連性を明らかにしてきた.活性酸素によるDNA損傷産物は多種同定されている.しかし,測定法の煩雑さから糖尿病で詳細に測定した報告はなく,糖尿病における活性酸素によるDNA損傷の特徴はわかっていない.本研究では,酸化障害DNA塩基測定法を開発し,糖尿病における酸化的DNA損傷の特徴を明らかにする.2.糖尿病合併症と酸化的DNA損傷との関連性糖尿病患者を対象にしたcloss-sectional研究から,合併症と酸化的DNA損傷との関連性が明らかになった.また,糖尿病合併症の発症・進展と酸化的DNA損傷蓄積との関連性をprospectiveに検討し,酸化的DNA損傷と糖尿病性腎症の進展性の関連が明らかになった.我々は活性酸素によるDNA損傷産物と慢性合併症の関連性を明らかにしてきた.活性酸素によるDNA損傷産物は多種同定されている.しかし,測定法の煩雑さから糖尿病で詳細に測定した報告はなく、糖尿病における活性酸素によるDNA損傷の特徴はわかっていない.本研究では,酸化障害DNA塩基測定法を開発し,糖尿病における酸化的DNA損傷の特徴を明らかにし,かつ酸化的DNA損傷マーカーと糖尿病性慢性合併症の関連を明らかにすることを目的に実施された.2.糖尿病合併症と酸化的DNA損傷との関連性糖尿病合併症の発症・進展と酸化的DNA損傷蓄積との関連性をprospectiveに検討し,酸化的DNA損傷と糖尿病性腎症の進展との関連を明らかにした(Diabetologia, in press).また糖尿病性網膜症の進展との関連性を明らかにした.本研究により,新しい酸化障害DNA塩基測定法が開発され,糖尿病における酸化的DNA損傷の特質が明らかになった.糖尿病性合併症の成因における酸化的DNA損傷の役割が解明されることが期待される.
比喩における創造的解釈の創発に関わる神経ネットワーク・認知メカニズムの解明

「AはBだ」という形式比喩は、ある概念(被喩辞(A))を全く異なる概念(喩辞(B))を用いて表現する修辞的表現である。この比喩表現の解釈における最も創造的な現象として,喩えられる語・喩える語のどちらにも由来しない創造的解釈の創発が挙げられる.本研究では、眼球運動測定を用いた心理実験・fMRI実験の実施を通じ、創造的解釈生成に関わる認知メカニズム・神経ネットワークを明らかにした。その結果、創造的解釈生成メカニズムが意味探索と評価からなることを示唆した。本研究では、「AはBだ」という形式で表現される名詞が名詞を喩える比喩文の解釈生成において、文章に含まれる単語(「A:喩えられる語」、「B:喩える語」)に由来しない特徴が文章の解釈として創発する現象(特徴創発)の神経ネットワーク・認知メカニズムを明らかにすることを目的としている。既に、比喩理解過程における意味的な相互作用に基づく意味の探索を行う過程が必要であることが示されている(Terai&Goldstone 2011,2012).そこで、「AはBだ」という形式の文章を実験参加者に提示し、自由に解釈を生成させる課題(解釈生成課題)を用い、創造的解釈生成プロセスを検討した.実験では、「AはBだ」という形式で表現される文章(字義通り文、慣習的比喩文、新奇比喩文)を提示し、実験参加者に自由に口頭で文章の解釈を回答させる課題(解釈生成課題)と回答された解釈が創造的か否かを評定する評定課題を用いた。まず、解釈生成課題遂行中の視線計測を行う実験を実施した。その結果、新奇比喩文において、非創造的解釈と比較し、創造的解釈生成過程では、「A:喩えられる語」、「B:喩える語」に対する注視時間が長く、特に解釈を発話する118秒前において「A:喩えられる語」に対する注視が増加していることが明らかとなった。次に、特徴創発の神経ネットワークの解明を目的として、解釈生成課題遂行中の脳活動をfMRIを用いて測定する実験を実施した。その結果、非創造的解釈と比較し、創造的解釈生成過程では、腹側内側前頭前皮質を含む右半球の広範な領域において、8秒前発話オンセットにかけて急激に賦活が強くなることが明らかとなった。本研究では、「AはBだ」という形式で表現される名詞が名詞を喩える比喩文の解釈生成過程において、喩えられる語(A)、喩える語(B)のどちらにも由来しない新たな解釈(創造的解釈)が創発する現象の神経ネットワーク・認知メカニズムの解明を目的としている。今年度は、MRIを用いた脳活動の測定を伴う心理実験で得られたデータの解析を中心に実施した。実験では、「AはBだ」という形式で表現される文章を実験参加者に提示し、自由に口頭で文章の解釈を回答してもらい、その後、参加者自身に自らが回答した解釈が創造的か否かの評定を行ってもらった。解釈発話86秒前、64秒前、42秒前、2秒前発話オンセットの4種類のタイムウィンドウを設定し、各タイムウィンドウにおける脳活動データを分析するとともに、計画的比較を行ったところ8秒前から発話オンセットにかけて腹側内側前頭前皮質と左側後頭側頭回において、非創造的解釈と比較し創造的解釈生成過程において有意に賦活が強くなることが明らかとなった。また、脳領域間の関連を明らかにすべく、賦活の増加が見られる8領域に関して心理生理交互作用(PPI)解析を実施した。その結果、非創造的解釈生成過程では8領域間のネットワークにあまり変化が見られないのに対し、創造的解釈生成過程では、腹側内側前頭前皮質を中心としたネットワークが徐々に見られなくなることが明らかとなった。平成27年度に計画していたfMRI実験を終了させ、実験から得られたデータの解析をほぼ終了させることができた。また、予定していた国際学会、国内学会での発表を実施した。「AはBだ」形式の比喩理解と、2つの単語「A」「B」の組み合わせ(概念融合)による、創造的な意味(解釈/特徴)の創発に関わる神経ネットワークを明らかにし、比較することで、2つの異なる概念の融合によるひらめき・創造に対する「比喩」という文脈の影響を明らかにすることを目的とした実験を実施した。実験では、2つの単語「A」「B」を同時に参加者に提示し、単語の組み合わせが表す特徴を自由に口頭で回答させ、その際の視線情報を計測した。その後、参加者自身に自らが回答した特徴が提示された単語に由来しない創造的な特徴か否かを評定してもらった。刺激は比喩理解に関する先行研究(Terai et al. 2015)で用いられた「AはBだ」における単語対(A,B)を用いた.これらの単語対は,新奇単語対(例:知識ー廊下),慣習的比喩文「AはBだ」における喩えられる語(A)・喩える語(B)からなる比喩的単語対(例:知識ー食物),字義通り文「AはBだ」における単語A・Bからなる字義通り単語対の各15対からなっており、3種類の単語対で共通の単語Aを共通単語,3種類の単語対において異なる単語Bを固有単語とした.その結果、比喩理解での創造的特徴生成過程においては有意に喩えられる語方向を注視しているのに対し、概念融合では固有単語(≒喩える語)を注視している傾向が示された。

すなわち,喩える語,喩えられる語といった役割のない概念融合においては,単語対の条件(新奇単語対・比喩的単語対・字義通り単語対)間で異なる固有単語をより注視しており、比喩理解での喩えられる語への注視は「喩えられる語に適応可能な特徴か否かの評価」という評価メカニズムの存在を示唆している。実験参加者募集が難航し、十分な数の参加者を集めることができなかった。そのため、平成29年度も引き続き実験を実施し、十分な数のデータを収集する予定である。「AはBだ」という形式で表現される比喩の解釈として、文章に含まれる単語に由来しない創造的な解釈が創発する認知メカニズムの解明を目的とした心理実験を実施した。先行研究の知見から、比喩における創造的解釈生成は(1)広範な意味探索(2)喩えられる語に適応可能な特徴か否かの評価,の2つのメカニズムからなるとの仮説が提案できる.そこで,「AはBだ」形式の比喩理解(比喩理解)と、2つの単語「A」「B」の組み合わせ(概念融合)の比較を通じ、「比喩」という文脈の影響を明らかにした。本年度は2つの概念「A」「B」の組み合わせが表す特徴を口頭で自由に回答してもらう特徴生成課題を用い、特徴生成過程における視線の動きを測定した。刺激は比喩理解に関わる先行研究(Terai et al. 2015)で用いられた「AはBだ」における単語対(A,B:新奇単語対・比喩的単語対・字義通り単語対)を用いた3種類の単語対に共通の単語Aを共通単語,3種類の単語対において異なる単語Bを固有単語とする。その結果,新奇比喩文では創造的解釈生成過程において解釈発話数秒前に有意に喩えられる語を注視しているのに対し,新奇単語対では発話数秒前に有意に固有単語(≒喩える語)を注視していることが示された.喩える語,喩えられる語といった役割のない概念融合においては,単語対の条件(新奇単語対・比喩的単語対・字義通り単語対)間で異なる固有単語をより注視しているが,比喩条件では条件間で異なる喩える語ではなく喩えられる語をより注視していることが示された。すなわち、比喩という文脈により喩えられる語への視覚的注意が促進されることから、評価メカニズムの存在を示唆した。「AはBだ」という形式比喩は、ある概念(被喩辞(A))を全く異なる概念(喩辞(B))を用いて表現する修辞的表現である。この比喩表現の解釈における最も創造的な現象として,喩えられる語・喩える語のどちらにも由来しない創造的解釈の創発が挙げられる.本研究では、眼球運動測定を用いた心理実験・fMRI実験の実施を通じ、創造的解釈生成に関わる認知メカニズム・神経ネットワークを明らかにした。その結果、創造的解釈生成メカニズムが意味探索と評価からなることを示唆した。平成26年度に計画していた実験である、比喩文における創造的解釈の生成過程におけるアテンションの変遷に関する解明を、解釈生成過程の視線計測を行う実験を実施することで明らかにした。さらに、解釈生成過程の神経ネットワークの解明を目的としたfMRI実験の一部を実施できた。すでに終了した分析結果を論文としてまとめ、国際ジャーナルに投稿する予定である。また、平成26、27年度に得られた成果に基づき実験計画を修正し、比喩という文脈における2つの概念の融合による創造的思考に関する時間動態を明らかにしたいと考えている。引き続き視線計測を伴う実験を実施する予定である。さらに本実験課題と同様の課題を用いたfMRI実験を実施し、概念融合での創造的特徴生成過程における神経ネットワークを明らかにするとともに、平成27年度に明らかにした比喩理解での創造的特徴生成過程における神経ネットワークとの比較を行う予定である。
細胞内分解システムの活性化によるレビー小体病の治療戦略

レビー小体病(パーキンソン病、レビー小体型認知症)では、異常αシヌクレイン(a-syn)の蓄積が神経細胞の機能不全を引き起こすことから病因の一つと考えられている。本研究では異常a-synの蓄積を防止、または軽減することでレビー小体病の症状を改善する方法を模索した。特に脳内の代謝を活性化する細胞内分解システム(オートファジー)に着目し、以下の知見を得た。パーキンソン病モデルマウスにおいて、トレハロース短期投与が脳内オートファジーを効率的に活性化し、不溶性a-synが減少した。これは、孤発性シヌクレイノパチーの病態解明にむすびつくと同時に、治療への標的につながる可能性がある。本研究では『脳内オートファジーの活性化が異常αシヌクレインの蓄積を防止し、レビー小体病の症状を改善する』可能性を検証することを目的とした。正常マウスにトレハロースを給水投与したところ、1週間の給水投与で脳内オートファジーの活性化が認められた。しかし、3週間及び24週間の長期投与では、この効果は認められなかった。そこで、トレハロースの短期給水投与(3日間)によるレビー小体病モデルマウスへの効果について検討した。トレハロース投与群では、マルトースおよびショ糖投与群と比較して、脳内オートファジーの活性化が認められたが、ヒトαシヌクレインの発現量および発現部位に差は認められなかった。マウスの実験結果から、PDにおいて、オートファジーが活性化されていても、オートファジーが十分に機能できない病態があるのではないかという仮説に至った。まず、PDモデル培養細胞を用い、オートファジー上流分子(ULK1、ULK2、VPS34、Beclin1、AMBRA1)のウエスタンブロット解析を行った。レビー小体様封入体の形成に伴い、AMBRA1を除くオートファジー関連分子の発現量は経時的に増加していた。次に、PDおよびDLB患者の剖検脳を用い、免疫組織化学染色及び2重蛍光染色を行った。ULK1、ULK2、VPS34、AMBRA1は、成熟したレビー小体に陽性であった。さらに、DLB患者と正常対照群のbrain lysateを用い、ウェスタンブロット解析を行った。ULK1ならびにULK2は、DLB脳の可溶性分画において発現が確認された。VPS34、Beclin1は、不溶化分画において異常αシヌクレインの発現部位に一致してスメア化していた。以上より、オートファジーの上流分子はレビー小体の形成にかかわっていることが示された。しかし、本研究の結果はレビー小体が既に成熟した段階でオートファジーが活性化されている可能性があることを示すものであり、PDではオートファジーが十分に機能できない病態が示唆された。レビー小体病(パーキンソン病、レビー小体型認知症)では、α-シヌクレイン(a-syn)の異常蓄積が神経細胞の胞体および神経突起に認められ、さらにタンパク質分解酵素に耐性を示す異常a-synが軸索末端に多量に蓄積している。これらの知見から異常a-synの蓄積が神経細胞の機能不全を引き起こし、レビー小体病の病因の一つであると考えられている。1)オートファジーを調節する分子の一つBeclin1の15番目セリン残基をリン酸化することで、オートファジーの活性化がはじまること、2)トレハロース短期投与(1週間の給水投与)が脳内オートファジーを効率的に活性化すること、3)複数のシャペロン分子(HSP90、SIGMAR1)が発現亢進したこと、4)脳全体のa-syn量には変化がなかったが、Triton X-100に不溶性のa-synが減少したこと、5)ヒト培養細胞および患者検体を用いて、細胞内の小胞体関連分解を活性化すると細胞内凝集物の形成が有意に抑制されたこと、6)ヒトレビー小体病の患者脳内ではオートファゴソーム形成を調節する分子群の異常があること、である。トレハロースは培養細胞およびマウス脳内において効率的にオートファジーを誘導したが、異常凝集に対する効果は限定的であった。これは、細胞内分解機構を活性化すべき時期は、異常a-synが線維凝集する前の段階(オリゴマー)であることを示唆する。本研究の結果は、孤発性シヌクレイノパチーの病態解明にむすびつくと同時に、治療標的ならびに治療介入時期を示唆するものである。マウスの実験結果から、オートファジーが活性化されていたが、異常αシヌクレインの蓄積を防止するには至っていないことが分かった。

その後の追加実験から、オートファジーが適切な時期に十分に活性化されていない可能性が示唆された。当初の目的である、1レビー小体病モデルマウスの症状改善にトレハロースは有効か?、2投与後の組織変化(封入体形成および前シナプスに及ぼす影響)は?、3投与後の異常αシヌクレインへの影響は?、4ヒト脳の各種病態(神経変性、虚血、炎症、腫瘍)におけるトレハロース誘導遺伝子群の病理学的および生化学的変化、5マウス初代培養神経細胞における、遺伝子群導入によるオートファジー活性化の有無、の5つの目的のうち1-3については、達成できた。しかし、PDにおけるオートファジーの機能異常が示唆されたため、4および5については未評価である。神経内科これまでの研究結果を論文化し、報告する。さらに、レビー小体形成のどの時期にオートファジーが活性化され始めるか生化学的に評価する予定である。抗体などの物品を安価に購入できたため、次年度使用額が生じた。物品購入に次年度使用額をあてる予定である。
視覚サイクルにおけるレチナールの再異性化の分子メカニズム

視覚サイクルにおける、レチナールの再異性化の分子メカニズムを明らかにする目的でヒトのモデル動物としてその最も原始型である脊索動物ホヤを用いた。無脊椎動物ではレチナールの光異性化酵素レチノクロームが機能しており、脊椎動物では暗異性化酵素RPE65が視覚サイクルを担っている。ホヤにはレチノクロームのホモログであるCi-opsin3とRPE65のホモログCi-RPE65があるが、Ci-opsin3が光異性化することを確認できたが、Ci-RPE65は暗中で11-シス型レチナールに異性化する活性は見出すことはできなかった。この結果はホヤではCi-RPE65は存在するが、暗異性化の機能は出来ていないと考えられ、進化的に興味ある結果が得られた。視物質ロドプシンの発色団11-シス型レチナールであるが光受容により全トランス型に異性化後、オプシンタンパク質とレチナールに分解する。従って、視覚を維持するためには全トランス型レチナールを11-シス型レチナールに再異性化してロドプシンを再生する仕組みが存在しこれを視覚サイクルという。本研究で視覚サイクルにおける、チナールの再異性化の分子メカニズムを明らかにする目的でヒトのモデル動物としてその最も原始型である脊索動物ホヤを用いる。我々は既にヒトの視覚サイクルの機能分子のホヤ・ホモログである光異性化酵素Ci-opsin3、暗異性化酵素RPE65、BCOのホモログCi-RPE65、Ci-BCO遺伝子をクローニングし培養細胞に遺伝発現をしてそのタンパク質をもちおいで抗体の作成を進めてきた。本年度はCi-opsin3、Ci-RPE65、Ci-BCOのタンパク質の局在を明らかにするため、抗体を作りそれらのタンパク質の幼生における局在を明らかにした。視細胞の局在はアレスチン抗体により染色し、Ci-opsin3、Ci-RPE65、Ci-BCOとの2重染色を行った。その結果、いずれの視覚サイクルタンパク質は視細胞だけでなぐ脳胞全体を染色した。共焦点顕微鏡による光学切片で観察すると、視細胞との共発現がみられた。この結果から視覚サイクルタンパク質は視細胞に局在しているが、さらに脳胞全体に発現していていることが明らかとなった。無脊椎動物頭足類ではレチノクロームが全トランスレチナールを光により11シス型に異性化することにより視覚サイクルが成り立っている。脊椎動物にもそのホモロである光異性化酵素RGRが存在するが、視覚サイクルには暗異性化酵素RPE65が視覚サイクルを担っていることが明らかとなった。ホヤにはレチノクローム、RGRのホモログである光異性化酵素Ci-opsin3が存在する。さらに、暗異性化酵素RPE65のホモログCi-RPE65もあり、ホヤの視覚サイクルはどちらが機能しているかは脊椎動物の視覚サイクルを明らかにする上で重要である。脊椎動物の視覚サイクルには暗異性化酵素RPE65が重要であることを明らかにした研究協力者であるSing博士にCi-RPE65の遺伝子を送り、培養細胞でタンパク質を発現して頂いた。私な昨年度までに作成したCi-opsin3の抗体により、このタンパク質が交差反応を知ることを明らかにした。今後はこのタンパク質が暗異性化酵素であるかどうかを明らかにする。本研究で視覚サイクルにおける、レチナールの再異性化の分子メカニズムを明らかにする目的でヒトのモデル動物としてその最も原始型である脊索動物ホヤを用いる。レチナールの再異性化酵素としてレチノクロームが無脊椎動物で明らかになっている。脊椎動物にもそのホモロである光異性化酵素RGRが全トランスレチナールを光により11シス型に異性化することがあきらかになっているが、より視覚サイクルが成り立っている。

脊椎動物にもそのホモロである光異性化酵素RGRが存在するが、RGRをノックダウンしたマウスでも視覚サイクルが機能している。研究協力者であるSing博士らは暗異性化酵素RPE65が視覚サイクルを担っていることを明らかとなった。ホヤにはレチノクローム、RGRのホモログである光異性化酵素Ci-opsin3とRPE65のホモログCi-RPE65もあり、ホヤの視覚サイクルはどちらが機能しているかは脊椎動物の視覚サイクルを明らかにする上で重要である。Sing博士にCi-RPE65の遺伝子を送り、培養細胞でタンパク質を発現して頂いた。本年は発現したCi-opsin3とCi-RPE65をCi-opsin3、Ci-RPE65の抗体により、このタンパク質が交差反応をすることを確認できた。Ci-opsin3が光異性化することを確認できたが、Ci-RPE65が全トランス型レチナールを暗中で11-シス型レチナールに異性化する活性は見出すことはできなかった。この結果はホヤではCi-RPE65は存在するが、暗異性化の機能は出来ていないと考えられ、進化的に興味ある結果が得られた。