hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ロタウイルス胃腸炎の予防法に関するウイルス学的ならびに免疫学的研究

1987年度から1989年度までの3冬季間にわたり、札幌市におけるヒトロタウイルス各血清型の推移を検討すると、1987年度は1型が主体で4型と2型が続き、1988年度は従来少ないとされてきた2型が7割を占め1989年度には再び1型が大部分を占めるなど、年度により主要流行株の血清型に変動が認められた。各検体についてSDS-PAGF法による検討を行うと、各年度毎に多数の核酸パタ-ンがみられるが年度を越えて同一RNAパタ-ンを示す株は存在せず、ロタウイルスの変異が頻繁に起こっていることが示された。サルロタウイルス由来のワクチンMMUー18006株(血清型3、以下RRV)を接種した後に、血清型1のロタウイルス野性株による胃腸炎の流行に遭遇し、その予防効果について検討した。ワクチン歴から対象乳児をブ-スタ-接種群、1回接種群と非接種群に分けて検討したところ、ほぼ全員が感染を受けたが発症率はそれぞれ20.0%、56.3%、80.6%とワクチン接種歴により発症防御効果に差がみられた。また、対象乳児を発症群と非発症群に分けて流行前血清中和抗体価を検討すると、非発症群では血清型1に対して有意に高い抗体価を有したが血清型3に対しては差がなく、発症防御は血清型特異的であることが再確認された。血清型1と3のロタウイルスに対する血清中和抗体価を経時的に検討した結果、ブ-スタ-群の血清型1に対する流行前平均血清中和抗体価は他の2群より有意に高く、ワクチン接種による1型株に対する随伴免疫応答の効果が考えられた。しかし、個人ごとの推移では随伴上昇率は40%であり、腸清中和抗体価だけでは説明できなかった。今後、血管免疫や1型ロタウイルスの中和エピト-プに対する特異的抗体反応等の検討が必要と思われる。中央乳児院においてRRVワクチンとポリオウイルス(PV)ワクチンの同時接種を行った。接種対象者はPVワクチンの初回ならびに2回目の接種対象者で、ワクチン投与前と投与後1カ月に血清を採取した。今回の研究以前にRRVもしくはPVワクチンを投与されたものを各ワクチンの単独投与群とした。両ウイルスに対する抗体獲得率からみると両ワクチンとも互いに干渉しないことが示されたが、ロタウイルスにつしてはこれまでの結果と比較して1型に対する随伴上昇が殆ど見られなかった。各血清型間の交差免疫に関しては不明な点も多いが、将来有効なロタウイルスワクチンが開発された場合、PVワクチンとの同時投与の可能性が示唆された。
急性脳症の早期診断と治療に向けた血液・髄液microRNA解析

本研究はけいれん重積型急性脳症(AESD)や予後不良のサイトカインストーム型急性脳症(急性壊死性脳症:ANE)を含む急性脳症と、比較的予後良好のけいれん性疾患(熱性けいれん(重積):FS(p-FS))を区別する発症早期バイオマーカーの探索を目的とし、各群において血液/髄液miRNAの発現やそれに制御されるサイトカイン発現を比較検討する。研究代表者が所属する東大発達医科学は従来から東京大学医学部倫理委員会における承認を得て全国の共同研究施設より急性脳症患者の全血検体(末梢血由来DNA)を病歴用紙と共に集積する体制があり、本研究ではその体制を生かし進めていく方策を立てた。平成30年度開始直後より本研究に応用できるよう従来の病歴用紙を一部改定し、7月に本学倫理委員会に髄液・血清検体の集積を可能にするため変更審査依頼を提出、9月に承認通知を得た。その後、東大病院小児科を含め数カ所の医療機関の臨床医と集積体制について相互に意見交換する機会を持ち急性期試料の集積体制を整備した。11月より急性脳症群の血清・髄液、熱性けいれん群の血清・髄液が患者病歴と共に当教室に集積されているが、本年度3月の時点で目標サンプル数には満たないため次年度も集積を継続する。また今年度、血清miRNAの発現解析のパイロット試験を開始した。連携研究者・研究施設(東京都医学総合研究所脳発達・神経再生研究分野こどもの脳プロジェクト)と共同研究体制を構築し、広く急性脳症の亜群である難治頻回部分発作重積型急性脳炎(AERRPS)および対照群(けいれん性疾患)の血清を用いてmiRNA Isolation KitでRNAを抽出後、逆転写反応させcDNA化し、ミクログリア関連の中枢性炎症に関連する、または脳梗塞の早期バイオマーカーとして報告されている複数の候補miRNAについてPCR定量解析および両群で発現比較を進めた。次年度以降でAESD含めた急性脳症群や対照群の血清・髄液のサンプル数およびサンプル量の確保ができた段階で、血清試料については速やかにRNA・cDNA抽出およびPCR定量解析を進める体制は整っている。次年度も継続して急性脳症群や対照群の急性期試料(血清・髄液)を集積し、目標のサンプル数およびサンプル量を確保する予定である。併せて、以下の実験を行うことを計画する。2、3についてはAERRPS群と対照群の試料を用いた予備試験より実施する方策である。3Bio-Plexシステムを用いた血清・髄液サイトカイン解析の実験条件の調整。今年度は検体集積と血清miRNA解析のパイロット実験を進めた。今年度、急性脳症群、対照群のサンプル数・量が解析目標サンプル数に満たなかったため、Bio-Plexシステムを用いた血清・髄液サイトカイン発現解析の試行は次年度以降に実施するように計画を変更した。そのため次年度使用額が生じた。次年度に引き継いだ差引額は、次年度以降に集積が進んだ段階で同解析に使用予定である。
イオン液体による層状遷移金属化合物への高密度キャリア注入-新奇二次元電子系の創製

イオン液体の電気二重層を利用した新しい電界効果トランジスタを作製した。電気二重層の作り出す強電界を利用することで、様々な材料に高密度キャリア注入を行う事に成功した。有機半導体では、低電圧駆動が可能で高速応答を実現する有機電界効果トランジスタの作製に成功した。また遷移金属酸化物薄膜では、高密度キャリア注入を行う事で、金属-絶縁体転移の観測に成功した。イオン液体による遷移金属化合物への高密度キャリア注入の前段階として、イオン液体を、有機トランジスタへ適用する可能性を検討した。イオン液体をゲート絶縁体として用いた有機単結晶電界効果トランジスタを作製し、その基本性能を評価したところ。1)低電圧駆動イオン液体を用いた有機FET(有機単結晶にrubrene)を作製したところ、非常に弱い電圧(約0.2V)でトランジスタとして動作することが分かった。従来の有渡FETに比べて100500分の1程度の電圧で動作する。2)高い電荷移動度電荷移動度を求めると、電気二重層を用いた有機FETの中で最大値(9.6cm^2/Vs)を示すことが分かった。この値は、今まで報告されている有機トランジスタの電荷移動度の最大値の半分程度の値であり、実用化に十分耐えうる値であることが分かった。3)高速スイッチングイオン液体の電解容量の周波数依存性を測定したとこと、0.1Hzから1MHzまで幅広い周波数について、高い電解容量(キャパシタンス)を持つことが明らかになった。このことは、イオン液体は高周波においても電気二重層を形成し、有機半導体に多くのキャリア注入(高容量化)が可能になることを示唆する。イオン液体を用いた有機FETは高速なスイッチング性能をも兼ね備えていることを明らかにした。イオン液体による遷移金属化合物への高密度キャリア注入の前段階として、イオン液体を用いた高密度キャリア注入技術を更に向上させるため、イオン液体をゲート絶縁体として用いた有機単結晶電界効果トランジスタを作製し、その基本性能を評価した。1) n型有機材料昨年度までは、ホールが移動する有機材料(p型)に関してイオン液体を用いることで高密度キャリア注入が可能であることが明らかになった。本年度は、電子が移動する有機材料(n型)に関しても、有機FETを作製したところ、p型と同様にn型に関しても高密度キャリア注入ができることを明らかにした。またn型の場合は、特にイオン液体中の水分に気をつけなくては行け無い事を明らかにした。またn型の材料に関しては、最適なイオン液体の材料を選ぶ事で、従来よりも2桁高い電子移動度を実現できることを明らかにした。2)イオン液体の性能向上イオン液体を用いて、効率よく高密度キャリア注入を行うためには、イオン液体の解離度の向上が不可欠であることが明らかになった。そこでリチウムやカリウムなど電子陰性度の高いイオンを添加することで、イオン液体の解離度を向上させ、実際に注入できるキャリア量が向上することが明らかになった。また添加したイオンによって、電子移動度の劣化などは抑えられる事が明らかになった。イオン液体電界質の電気二重層を利用して、様々な半導体材料に高密度キャリア注入を行った。特に層状遷移金属酸化物に関して、高密度キャリア注入を行うことで絶縁体状態から金属状態まで転移を行うことに成功し、本研究の主目標の達成を行う事ができた。1,p型有機半導体昨年度までに構築してきた知見を活かし、高い電荷移動度をもつ高品質ルブレン単結晶に関して、イオン液体により高密度キャリア注入を行ったところ、伝導度は36uSまで到達することが明らかにした。この値は、2次元の量子抵抗値に限りなく近く、半導体であった有機材料を金属状態近傍まで持って来る事に成功した。2,n型有機材料電子が移動する有機材料(n型)に関しても、有機FETを作製したところ、p型と同様にn型に関しても高密度キャリア注入ができることを明らかにした。n型の材料に関しては、最適なイオン液体の材料を選ぶ事で、従来よりも2桁高い電子移動度を実現できることを明らかにし、イオン液体を利用した、低電圧駆動が可能な有機論理回路の作製に成功した。3,遷移金属酸化物遷移金属酸化物であるニッケル系の酸化物に関して、電気二重層を利用して高密度キャリア注入を行ったところ、絶縁体であったニッケル系の材料が、金属へ転移することが明らかになった。また絶縁体状態から、金属状態へ変化した際の伝導度の変化は60000%と非常に大きく、On-Off比の高いデバイスを作る事に成功した。
LncRNA解析による癌幹細胞の治療開発

癌幹細胞は、自己複製能・造腫瘍能・多分化能を有し、抗癌剤や放射線治療に抵抗性を示し再発・転移を繰り返す原因となる。癌幹細胞は癌細胞集団の中で極めて少数であるためその細胞特性や治療効果の評価が困難である。私たちはODC (Ornithine decarboxylase) -degron遺伝子導入によって癌幹細胞を可視化、濃縮する手法を確立した。ODC-degronを大腸癌細胞株であるHCT116に遺伝子導入することによって癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団を分離した。初年度はRNA-sequencing法によるHCT116の癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団で発現しているLncRNA (Long non-coding RNA)の網羅的な解析、The Cancer Genome Atlas (TCGA)データセットを用いた予後解析の結果、大腸癌の予後不良因子として2種類のLncRNA候補をピックアップした。平成30年度は、大阪大学消化器外科の100例以上の大腸癌組織から抽出したRNAサンプルを用いてqRT-PCRにより二つの候補LncRNAの発現を定量した結果、ひとつのLNC01534で、その高発現が有意に予後不良と関連することが分かった。LNC01534に対するsiRNAは、大腸癌細胞株HCT116の増殖を抑制し、細胞周期解析ではG2/M期での細胞周期停止を誘導した。一方、Annexin Vアッセイによる検討では有意なアポトーシス誘導はみられなかった。LNC01534-siRNAによってG2-M移行に働くCdc2, Cyclin B1, CDC25B, CDC25Cなどの蛋白発現が低下した。LNC01534-siRNAによるこれらの細胞効果はODC-degronを導入したHCT116癌幹細胞で顕著であった。本研究では3年間の研究期間内に、癌幹細胞の特性を賦与するゲノム、エピゲノム変化を見出し、自己複製と細胞分化のチェックポイント機構の仕組みを解明する。特にまだ不明な点が多いlncRNAの癌幹細胞における役割について重点的に検討し、癌幹細胞を死滅させる治療的核酸製剤の創出を行うという目標設定をしていた。これまでに癌幹細胞モデル細胞から、大腸癌患者の予後不良に関わり、癌幹細胞の増殖と細胞周期のG2-M移行に働く新規LNC01534を同定できた。最終年度でこのLncRNAに特異的な分子制御と細胞内局在を組織切片上で明らかとすることを残すのみであることから、研究の進捗としては概ね順調である。最終年度では、このLncRNAの局在をIn situ hybridizationで明らかとすることと、LNC01534の機能面で特異な役割を解明する。そのために平成30年度のうちにmRNAの保存に優れるマイクロウエーブ固定を施した大腸癌組織サンプルのパラフィンブロックを準備した。また、大腸癌細胞にsiRNA処理をした後にRNAseqを実施してOntology解析やIPAによる分析を通じて、小胞体ストレス分子群を介したG2-M制御のシナリオが描けている。最終年度では、これらのパートを完成させ論文投稿を目指す。私たちは癌幹細胞が低プロテアソーム活性を示すという性質を利用し、ODC (Ornithine decarboxylase) -degron遺伝子導入によって癌幹細胞を可視化、濃縮できる独自の手法を確立した。ODC-degronを大腸癌細胞株であるHCT116に遺伝子導入することによって癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団を分離できることが確認できたため、平成29年度はRNA-sequencing法によってHCT116の癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団で発現しているLncRNA (Long non-coding RNA)の網羅的な解析を行い、比較検討することで癌幹細胞と強い関連を示すLncRNAの同定を試みた。その結果、34種類のLncRNAの発現が癌幹細胞集団で有意に2倍以上上昇していることがわかった。次に同定したLncRNAの臨床的意義を明らかにするため、LncRNAを含む様々な遺伝子発現量とそれに対応した予後情報などの臨床病理学的データが登録されているThe Cancer Genome Atlas (TCGA)データセットを用いて解析を行った。その結果、RNA-sequencing法により同定した34種類のLncRNAのうち18種類のLncRNAでTCGAデータセットを用いた大腸癌症例における予後解析を行うことが出来た。予後解析の結果、大腸癌の予後不良因子として2種類のLncRNAを同定した。平成29年度は計画していた(1)癌幹細胞濃縮法による癌幹細胞の分離とLncRNAの網羅的遺伝子発現解析と、(2)当該lncRNAの細胞学的機能解析(癌幹細胞性の証明)のうち、(1)を計画通りに行うことが出来た。(2)に関してはこれから解析を進めていくが、平成30年度以降に計画していたTCGAデータセットを用いた予後解析を行うことが出来たため、計画はおおむね順調に進んでいる。

ODC-degronを大腸癌細胞株であるHCT116に遺伝子導入することによって癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団を分離した。初年度はRNA-sequencing法によるHCT116の癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団で発現しているLncRNA (Long non-coding RNA)の網羅的な解析、The Cancer Genome Atlas (TCGA)データセットを用いた予後解析の結果、大腸癌の予後不良因子として2種類のLncRNA候補をピックアップした。平成30年度は、大阪大学消化器外科の100例以上の大腸癌組織から抽出したRNAサンプルを用いてqRT-PCRにより二つの候補LncRNAの発現を定量した結果、ひとつのLNC01534で、その高発現が有意に予後不良と関連することが分かった。LNC01534に対するsiRNAは、大腸癌細胞株HCT116の増殖を抑制し、細胞周期解析ではG2/M期での細胞周期停止を誘導した。一方、Annexin Vアッセイによる検討では有意なアポトーシス誘導はみられなかった。LNC01534-siRNAによってG2-M移行に働くCdc2, Cyclin B1, CDC25B, CDC25Cなどの蛋白発現が低下した。LNC01534-siRNAによるこれらの細胞効果はODC-degronを導入したHCT116癌幹細胞で顕著であった。本研究では3年間の研究期間内に、癌幹細胞の特性を賦与するゲノム、エピゲノム変化を見出し、自己複製と細胞分化のチェックポイント機構の仕組みを解明する。特にまだ不明な点が多いlncRNAの癌幹細胞における役割について重点的に検討し、癌幹細胞を死滅させる治療的核酸製剤の創出を行うという目標設定をしていた。これまでに癌幹細胞モデル細胞から、大腸癌患者の予後不良に関わり、癌幹細胞の増殖と細胞周期のG2-M移行に働く新規LNC01534を同定できた。最終年度でこのLncRNAに特異的な分子制御と細胞内局在を組織切片上で明らかとすることを残すのみであることから、研究の進捗としては概ね順調である。平成29年度の研究により、大腸癌の予後に関連し、癌幹細胞で発現量の高いLncRNAを2種類同定することが出来た。今後はこれらのLncRNAをsiRNA, shRNAやCRISPR技術を用いてノックアウトまたはノックダウンし、種々の細胞学的機能解析を行う。特に癌幹細胞性の特徴である非対称性分裂(蛍光染色)、抗癌剤耐性(5-FU、L-OHPなどを用いたMTT assay)、sphere形成能、各種癌幹細胞マーカー発現の解析といったin vitroの解析を行う。in vivoではマウス皮下移植での腫瘍形成能、尾静脈投与での肺転移能の解析を行い、さらにxenograftモデルでの抗癌剤投与による抗癌剤耐性も評価する。以上に加え、細胞内における局在解析や結合タンパク質の同定を行うことで、当該LncRNAそのものの機能についても明らかにしていく。さらに、阪大消化器外科の持つ臨床サンプルを用いた臨床病理学的因子および予後との関連についても検討を進めていく予定である。
高齢期に対応した多世代共生型集住（コレクティブハウス）の有用性に関する研究

本研究は、継続的な人間関係と居住環境の中で、日常的な安心が担保され、住棟内に居住者間の交流と生活の一部を協働するシステムをもつ共生型集住(コレクティブハウス)を対象として、高齢期まで住み続けることができる自立期に有用な住運営システムの在り方について検討することを目的としている。居住後25年が経過した先進事例、スウェーデンにある熟年コレクティブハウス「フェルドクネッペン(以下FK)」を対象とした、居住者へのアンケート、訪問ヒアリング調査を実施し、生活・住運営実態から、高齢期まで自立して住み続けられる条件を分析した。その結果、良好で安定した共生環境の継続には、1長期的な課題を整理し、性別や年齢構成、運営上の役割の観点からの慎重な入居者選定2住運営の組織化および運営方法のマニュアル化3運営の中心となる次代の人材育成4入居希望者を含む外部サポーターによるコレクティブ活動の支援5居住者相互の共助意識、が必要であるとの知見を得た。上記の結果を、住総研「研究論文集」にて論文発表、日本建築学会学術講演梗概集に論文を投稿済みで、今年9月に口頭発表する予定である。また、日本の自立期の高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の生活・運営実態の把握のために、「COCO湘南台」「COCOたかくら」の運営者にヒアリング調査を行った。その結果、1調査を実施した2つの事例は居住者の年齢や身体状況に差があること2現在は居住者による主体的な生活運営はほとんどみられない。3生活や精神面を支え、物理的な介護のサポートなどを行うライフサポートアドバイザーの存在が大きいこと、がわかった。コレクティブハウスにおいても、ライフサポートアドバイザーの役割を担うしくみ(居住者の中から選出など)の導入も考えられる。この調査結果についても、上記の住総研「研究論文集」にてまとめて発表した。予定通りに、先進事例であるスウェーデンのコレクティブハウス「フェルドクネッペン」へのアンケート調査およびヒアリング調査を終え、調査結果を整理し、論文にまとめて発表した。また、近年建設された熟年型コレクティブハウスの事例「ドンデルバッケン」についても、アンケート、ヒアリング調査を実施した。さらに、日本の高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の事例も調査実施済みである。最終年度は、調査した内容のさらなる分析を行い、論文として発表する予定である。さらに、調査から得られた高齢期まで住み続けられるコレクティブハウスのシステムについて、日本のコレクティブハウスでの実現性を検討する。具体的には、コレクティブハウスでの暮らしを実践している居住者と、意見交換しながら、検討を進める予定である。北欧の熟年コレクティブハウスにおける高齢期に対応する住運営システムの実態把握のために、コレクティブハウス「フェルドクネッペン」の入居者を対象とした生活実態・住運営に関するアンケート調査を実施した。その結果、入居23年が経過したFKの住運営と生活実態について、以下の点が明らかになった。1居住者と非居住者の会員(サポーターなど)で構成される居住者組合が、住運営(コモンミール、共用空間の掃除、入居者選定など)を行う運営方法や体制には大きな変更はみられなかった。2居住者組合による入居者選定効果から、居住者数や年齢構成の変化が小さく(平均年齢は2007年69.22歳、2016年69.82歳)、多世代居住を継続していた。その一方、現在でも活動の中心となっている創立メンバーの高齢化や人数の減少(全体の35.7%)がみられ、今後の運営体制の維持が課題である。32016年調査では、創立メンバーや居住歴の長い高齢の居住者の回答で中心であった。回答者は退職に伴って住運営への参加がより活発化していた。4体が動かなくなってもFKでの継続居住を8割の人が希望していた。5居住者と入居を希望するサポートメンバーによる役割分担のサポートにより、高齢期の住み続けを可能としていた。6新たに入居した若い年代層との生活スタイルやコレクティブ活動への参加度の違いが課題である。上記の結果について、日本建築学会大会にて口頭にて発表、日本家政学会大会にてポスターにて発表を行った。現在までに下記の2つの項目について研究を進めている。北欧の熟年コレクティブハウスにおける高齢期に対応する住運営システムの把握、高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の住運営方法の実態把握である。北欧の熟年コレクティブハウスにおける高齢期に対応する住運営システムの把握については、研究業績に記した、コレクティブハウス「フェルドクネッペン」を対象とした生活実態・住運営に関するアンケート調査結果のデータ整理・分析し、日本建築学会、日本家政学会にて発表した。現在は、今年8月にスウェーデンへの訪問調査に向けて準備を行っている。具体的には以下の調査を計画している。1「フェルドクネッペン」前回のアンケート調査で回答を得ることができなかった年齢層が若い4060歳代へのアンケートヒアリング調査の実施、2「フェルドクネッペン」以外の高齢者が住み続けているコレクティブハウス事例への訪問ヒアリング調査、3最新のコレクティブハウス事例の居住者への住運営、生活実態調査の実施を計画している。4さらにそれらの位置づけを明確にするべく、文献調査によるスウェーデンの住宅政策の把握、訪問ヒアリング調査による行政による住宅供給会社、民間の住宅開発会社の実施を検討している。高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の住運営方法の実態把握については、グループリビングCOCO湘南台、COCOたかくらの生活・運営実態に関する訪問ヒアリング調査を行った。

本研究は、継続的な人間関係と居住環境の中で、日常的な安心が担保され、住棟内に居住者間の交流と生活の一部を協働するシステムをもつ共生型集住(コレクティブハウス)を対象として、高齢期まで住み続けることができる自立期に有用な住運営システムの在り方について検討することを目的としている。居住後25年が経過した先進事例、スウェーデンにある熟年コレクティブハウス「フェルドクネッペン(以下FK)」を対象とした、居住者へのアンケート、訪問ヒアリング調査を実施し、生活・住運営実態から、高齢期まで自立して住み続けられる条件を分析した。その結果、良好で安定した共生環境の継続には、1長期的な課題を整理し、性別や年齢構成、運営上の役割の観点からの慎重な入居者選定2住運営の組織化および運営方法のマニュアル化3運営の中心となる次代の人材育成4入居希望者を含む外部サポーターによるコレクティブ活動の支援5居住者相互の共助意識、が必要であるとの知見を得た。上記の結果を、住総研「研究論文集」にて論文発表、日本建築学会学術講演梗概集に論文を投稿済みで、今年9月に口頭発表する予定である。また、日本の自立期の高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の生活・運営実態の把握のために、「COCO湘南台」「COCOたかくら」の運営者にヒアリング調査を行った。その結果、1調査を実施した2つの事例は居住者の年齢や身体状況に差があること2現在は居住者による主体的な生活運営はほとんどみられない。3生活や精神面を支え、物理的な介護のサポートなどを行うライフサポートアドバイザーの存在が大きいこと、がわかった。コレクティブハウスにおいても、ライフサポートアドバイザーの役割を担うしくみ(居住者の中から選出など)の導入も考えられる。この調査結果についても、上記の住総研「研究論文集」にてまとめて発表した。予定通りに、先進事例であるスウェーデンのコレクティブハウス「フェルドクネッペン」へのアンケート調査およびヒアリング調査を終え、調査結果を整理し、論文にまとめて発表した。また、近年建設された熟年型コレクティブハウスの事例「ドンデルバッケン」についても、アンケート、ヒアリング調査を実施した。さらに、日本の高齢期に対応した共生型集住(グループリビング)の事例も調査実施済みである。次年度8月にスウェーデンに訪問ヒアリング調査を実施する予定である。現在、各事例や住宅供給会社、民間住宅開発会社へ調査依頼、日程調整を行っている。また、調査手法などについても調査先と相談しながら、最も成果が得られる方法について検討している。調査終了後、調査結果のデータ整理や分析を行い、高齢期まで住み続けられる住運営の仕組みを明らかにする予定である。さらに、スウェーデンでの住宅政策におけるコレクティブハウスや各事例の位置づけを考察していく予定である。来年度は、今年度の調査結果を踏まえて、日本のコレクティブハウスかんかん森の住運営への反映を検討し、日本での高齢期まで住み続けられるコレクティブハウスのあり方を提案する予定である。
将来の計算機構としての可逆コンピューティングとその体系化

物理的可逆性を反映した計算パラダイムである可逆コンピューティングは,微視的レベルでの物理的性質を直接的に利用した将来の計算機構を開発する際の鍵となる.本研究では,可逆論理素子,可逆論理回路,可逆チューリング機械,可逆セルオートマトンなどの可逆計算機構を理論的に探究してそれらの性質や計算能力を解明し,理論を体系化した.そして,この領域には従来にはない斬新な計算モデルや論理素子,計算機構成の方法があり得ることを示した.物理的可逆性を反映した計算パラダイムである可逆コンピューティングは,微視的レベルでの物理的性質を直接的に利用した将来の計算機構を開発する際の鍵となる.本研究では,可逆論理素子,可逆論理回路,可逆チューリング機械,可逆セルオートマトンなどの可逆計算機構を理論的に探究してそれらの性質や計算能力を解明し,理論を体系化した.そして,この領域には従来にはない斬新な計算モデルや論理素子,計算機構成の方法があり得ることを示した.可逆コンピューティングは物理的可逆性を反映した計算の枠組みであり、将来、原子・分子レベルの物理現象を直接的に用いて高集積度のコンピュータを作ろうとしたときに重要になる。本年度は、可逆コンピュータがどれほど単純な可逆的素過程から構成できるのかという問題を、特に可逆論理素子と可逆セルオートマトンを対象として研究した。またこれらをもとに理論の体系化を試みた。1. 2状態可逆論理素子の万能性記憶を持つ可逆論理素子のうちで3入出力2状態可逆論理素子について研究した。この種の素子で縮退していない14種類が全て非同期モードおよび同期モードで計算万能性を有することを証明した。これをもとに、2状態で3以上の記号をもつ「あらゆる」非縮退可逆論理素子の万能性を導くことができる。2.可逆チューリング機械をシミュレートできる可逆セルオートマトンの単純化m状態n記号の可逆チューリング機械を直接的にシミュレートする(m+n+1)(m+2n+1)状態の2近傍可逆セルオートマトンが構成できることを証明し、近傍数、状態数ともに過去の結果を改善した。3.可逆コンピューティングの理論の体系化物理的可逆性は、原子や分子レベルの物理現象を直接利用して高集積度の計算機デバイスを作ろうとしたときに鍵となる物理法則で、これを反映した計算パラダイムが可逆コンピューティングである。本年度は、昨年度に続き記憶つき可逆論理素子の万能性を明らかにすると共に、可逆的な物理モデルによる実現可能性を研究した。また、新しい決算モデルとして可逆マルチヘッドオートマトンを提案・研究した。1.2状態可逆論理素子の万能性非縮退の2状態k記号可逆論理素子は、k>2の場合、どれも例外なく計算万能性を有することを証明した。2.記憶つき可逆論理素子の可逆的な物理モデルによる実現記号数が4以下の記憶つき可逆論理素子は、状態数がいくつであっても、可逆的な物理モデルの中で簡潔かつ体系的に構成できることを示した。3.可逆マルチヘッドオートマトンの計算能力当該の計算モデルを新しく提案・研究し、単純であるにも関わらず高い計算能力を持つことを示した。4.可逆コンピューティングの理論の体系化可逆コンピューティングの代表的モデルである可逆チューリング機械、可逆セルオートマトンを中心とするこれまでの成果を体系化してとりまとめ、雑誌論文、図書、国際会議で発表した。可逆コンピューティングは物理的可逆性を反映した計算パラダイムであり、原子や分子レベルの物理現象を直接利用して高集積度の計算機デバイスを作ろうとしたときに鍵となる。本年度は、可逆コンピューティングの理論の体系化を昨年度に続いて行うとともに、記憶つき可逆論理素子間の能力の階層の解明、および可逆マルチヘッドオートマトンの計算能力の特徴づけについて研究し、以下の成果を得た。1.可逆コンピューティングの理論の体系化物理的な可逆モデル、可逆論理素子、可逆論理回路、各種可逆計算機モデルなどについて、それらの性質や計算能力の関係を明らかにし、理論の体系化を進めた。これらの成果は雑誌の解説論文や国際会議講演として発表するとともに、和文単行本「可逆計算」(2012年)にまとめ、出版した。2.2状態可逆論理素子の能力の階層性非縮退の2状態k記号可逆論理素子は、k>2の場合あらゆる素子が計算万能になるという結果が前年度に得られているが、本年度は3種類の2状態3記号可逆論理素子の非万能性を示し、2状態素子の能力の階層性を導いた。3.可逆マルチヘッドオートマトンの計算能力の解明前年度に提案した可逆マルチヘッドオートマトンが通常の決定性のものと等能力になること、つまり可逆性制約を課しても能力が下がらないことを証明した。この証明手法の応用として、記憶量S(n)の決定性チューリング機械を、同じ記憶量S(n)の可逆チューリング機械でシミュレートする簡潔な手法を与えた。
変異オルニチントランスカルバミラーゼのミトコンドリア局在化の分子機構

1.変異OTCのミトコンドリア間質側への転送の研究プレシークエンスを含む野生型およびR40H変異OTC cDNAをtransfectionし、得られたRNAからmRNAを回収し、OTC mRNAを調製した。それをtemplateとしてin vitro translationによってS35-メチオニン標識OTC調製を行い、分離ラット肝ミトコンドリア分画に添加、転送を行わせたところ、溶出容量および放射活性分画の溶出容量および同分画放射能の取り込み量のいずれについても再現性に乏しく、標識タンパクの生成、転送後のOTCタンパクの分離のいづれにも原因があるものと考えられる。これらの点につき今後も引き続き検討の必要がある。2.古典型OTC欠損症症例の出生前遺伝子診断古典型OTC欠損症の男児例でI261T変異が認められた。次子の出生前診断を行ったところ胎児は野生型のホモ接合と診断した。このような変異は酵素欠損の機構が遅発型の遺伝子変異とは異なることが予想され、細胞内動態の解析が待たれる。3.遅発型男子OTC欠損症の生命予後因子の検討本研究の期間中に過去の症例を含め、10例の遅発型男子OTC欠損症及びその関連症例を経験した。これらの例は、おおくは初発時に死亡することが多く、生命予後が不良であるため、その予後を決める因子の解析を企画した。その結果、発症時年齢、血漿アンモニア値、血液pH、8種類の血漿アミノ酸値などが有意の因子と判明した。本年度は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症男児例で、新生児に発症するような古典的経過を呈する症例での変異OTCタンパクがin vivoでどのような挙動を示すかを検討する基礎的情報を得るために、昨年経験した新生児期発症男児例につき解析をした。剖検肝からRTPCRでcDNAを調製し、ほぼ全長をシークエンスしたところ、782番目のTのCへの置換が同定された。この結果、261番目コドンのイソロイシンのスレオニンへの置換を生じる(I261T変異)事が推定された。この塩基置換がTsp 509I siteを新たに生じる事に基づき、ゲノムDNAについて、このsiteの検索を行ったところ同siteが検出され、cDNAで検出された変異がゲノムDNAでも確認された。また免疫ブロッティングではCRMは検出感度以下であった。また、第5エクソンから下流で247コドンまでの変異はほとんど新生児発症であるのに対し、264コドン以降は遅発型であるが、今回の結果から、変異部位が261コドンと264コドンの間を境に、いずれ側にあるかが臨床症状を規定する一因となる事が推測された。また、患児の母親が再度妊娠、出生前診断の希望があったため、絨毛と羊水細胞を材料として、SRYによる性別診断とTsp509I siteをマーカーとした遺伝子診断を行ったところ、野性型ホモのパターンを呈し、正常女児と判定され、出生後も正常に生育している。来年度以降は、以前同定したR40H変異タンパクと今回同定したような新生児発症の変異タンパクとの発現、ミトコンドリアへのの転送などをin vitroで検索して行く予定である。1. OTCcDNAのin vitroでの転写・翻訳の条件の検討既報に従い調製したプレシークエンスを含む野生型OTCcDNAをT7ポリメラーゼプロモーターを持つベクターに組込んだものを大腸菌JM83にtransfectionして培養後、常法にしたがってプラスミドを分離した。なお、以下の実験には、得られたプラスミドDNAを70%エタノール沈殿処理を1回行ったものを使用した。このプラスミドの種々の量を、5X転写用バッファー、rNTPs.RNAポリメラーゼ、20X翻訳バッファー、ウサギ網状赤血球溶血液、^<35>S-メチオニンからなる反応系内で転写、翻訳を行わせた。翻訳産物を8%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、1-3時間exposeした。

この結果、転写・翻訳産物の収量は実験ごとにかなりのばらつきが認められ、転送実験に利用できるに至らなかった。2.今後の課題1)転写・翻訳産物の収量のばらつきの原因がプラスミドの精製度の違いによるのか、転写系への添加量の問題か、あるいはそれ以外の要因が関係しているかの検討を行う予定である。2)上記の問題が解決したら、ついでミトコンドリアへの放射活性の取り込みの総量を指標として転送の至適条件を決め、ついで各分子量別の分画への取り込みの検討に移りたい。3)野生型OTCcDNAで以上の条件を検討したのち、R40HcDNAなどの変異OTCcDNAにつき同様の系で検討を行う。1.変異OTCのミトコンドリア間質側への転送の研究プレシークエンスを含む野生型およびR40H変異OTCcDNAをtransfectionし、得られたRNAからmRNAを回収し、OTCmRNAを調製した。それをtemplateとしてin vitro translationによってS35-メチオニン標識OTC調製を行い、分離ラット肝ミトコンドリア分画に添加、転送を行わせたところ、溶出容量および放射活性分画の溶出容量および同分画放射能の取り込み量のいずれについても再現性に乏しく、標識タンパクの生成、転送後のOTCタンパクの分離のいづれにも原因があるものと考えられる。これらの点につき今後も引き続き検討の必要あがる。2.古典型OTC欠損症症例の出生前遺伝子診断古典型OTC欠損症の男児例でI261T変異が認められた。次子の出生前診断を行ったところ胎児は野生型のホモ接合と診断した。このような変異は酵素欠損の機構が遅発型の遺伝子変異とは異なることが予測され、細胞内動態の解析が待たれる。3.遅発型男子OTC欠損症の生命予後因子の検討本研究の期間中に過去の症例を含め、10例の遅発型男子OTC欠損症及びその関連症例を経験した。これらの例は、おおくは初発時に死亡することが多く、生命予後が不良であるため、その予後を決める因子の解析を企画した。その結果、発症時年齢、血漿アンモニア値、血液pH、8種類の血漿アミノ酸値などが有意の因子と判明した。
東亜同文書院生の記録からみた20世紀前半期の満州における農業開発に関する研究

本研究は、20世紀前半期のうち満州国成立以前の1920年代までの満州における農業、農地開発を東亜道文書院生による「大旅行」記録のうち、満州の調査旅行記録を抽出し、それをベースにしつつ、明らかにしようとした。その成果は以下のとおりである。1.東亜同文書院生の記録は、清朝末期から民国前半期にあたるこの時期の中国の混乱期において、各班がそれぞれのテーマをもちつつも満州各地を活写した貴重な資料であり、この時期の農業や農地開発に関しても多くの情報を有していることを確認できた。2.それらの記録によれば、すでにロシア南下に対抗した清朝による漢民族の満州への農地誘致が20世紀に入ると、おもに山東省農民の季節出稼形態の中に農民としての定着化がみられるようになり、先行した地主の農業労働力として雇用され、あるいは小作農民として、地主層との階層性を生みつつ展開した。そして農民の増加により、都市部へ商人も流入するようになり、農民、農村相手の商品流通もみられるようになった。3.しかし、寒冷な気候下で、栽培期間は短く、それに対応すべく馬耕による耕作が工夫された。農地開発は南満鉄道沿いの南満州が中心で帯状にハルピン近くまでみられたが、北満、東満、西満は圧倒的未墾地であり、そこが1930年代以降、日本人の入植地域となったことからすれば、この1920年代までは満州のその後の農地開発の棲み分けのベースをつくったといえる。1901年.上海に開学した東亜同文書院(のちに東亜同文書院大学となる)は、1907年から1942年の間に書院生による中国および東南アジアの踏査旅行が行なわれ、多くの調査日誌と調査報告が記録された。その記録内容は風聞を一切排除し、実地踏査で確認した事象のみに限定されており、各地の実態を把握する上で貴重な資料である。本研究ではその記録のうち満州地区における農地開発とそれにともなう農地利用および農業にかかわる記録を抽出し、それらは手書きで読みにくいため、精書をすることによってデータベースを作成しつつ、テーマへのアプローチを図った。第1年目の状況は次の通りである。1当初の記録は、日本農業の満州での定着はその気候条件によりかなり困難であり、失敗例が多かったこと、そのような中で大倉組のように企業組織による農業だけが存続しえたとし、日本の伝統的農法の満州での展開は困難だとしている。2それが満鉄付属地内に日本人が入りこむようになり、満州での体験が生かされると、満人農業のシステムも参考にしつつ、日本人による農業が再挑戦されるようになった。3その上に、その後満蒙開拓団が満州の中・北部に入り込むようになったが、いずれも組織をベースとした農業であり、しかもかなり地域差もみられるようになった。1.東亜同文書院の「大旅行」調査は1907年から最終学年(3年生)によって行なわれ、1943年までつづいた。参加学生は約4500人.総コース数は約700で、中国本土を中心に東南アジア、満州、一部ロシアまで広がった。満州は1910年から「大旅行」コースがみられ、中国本土に比べれば、そのコース数は少いが、ほぼ毎年12コースが設定された。とりわけ、満州事変発生年とその翌年は、中国本土へのビザが発行されず、満州に集中した。2.満洲での調査対象は多様であるが、農業調査や農業への報記録はその中でも目立ち、農産物三品や生産条件、生産概要、輸送状況、農家状況などに関心をもち、調査を行ったり、日本人や漢人、さらには朝鮮人の入植問題などへの考察もみられる。3.それらをふまえ、農地開発をみると、(1)清朝成立後、満州族以外の農業開発は基本的に認められず、それが緩められたのは1870年代であり、20世紀に入り、山東、直隷、山西各省からの移民が増加した。(2)当初は南満州への入植が中心であり、それが長春、さらにはハルピンへと飛び地的に拡大した。

(3)そのさい、東蒙古よりは吉林の東南部での朝鮮人による水田開発がすすんだが、清朝の宮や漢族による妨害もみられた。(4)大正期には日本人の移民がみられるようになった。しかし、当初南満へ入植したのに失敗が多かった。満州の風土への無知、移民目的が日本での人口問題で農業目的が明確でなかった、などを明らかにしている。
子宮内胎児外科治療のための細径多自由度屈曲マニピュレータの研究開発

本研究では,特に子宮内での胎児外科手術を低侵襲に行うための細径多自由度屈曲マニピュレータの実現のため,ワイヤ駆動でもリンク駆動でもない,微細な歯車要素を用いた回転・屈曲機構の開発を進めた.今年度は屈曲機構の動作検証用として,外径5 mmのプロトタイプを設計し製作した.不用意に緩んだり分解されないよう,ねじ止めなどは極力用いず,各フレームを内部パーツと外部パーツに分離して構成し,工具を使わずに,容易に構成部品を組立てられるようにした.また,2自由度の屈曲機構は,全く同じ1自由度の屈曲機構をつなぎ合わせることができるよう設計した.歯車駆動のメインパーツとなる,屈曲フレームと同軸状に配置し回転させるフェースギヤは,モジュール0.2という微細形状であり,一体型のパーツとして製作することは非常に困難であった.そこで薄板のラック歯車としてワイヤカットしたパーツを,円柱状のパーツに巻きつけ固定するという手法を採用し,外径3.2 mm,内腿2.0 mmの剛性の高い小型フェースギヤを製作した.エンドエフェクタを搭載する部分は,様々な機能を容易に交換可能とするため中空とし,先端側からモジュール式に固定できる構造とした.マニピュレータの内部チャネル径は最大2 mmであり,高い拡張性を備えることができた.また,術者から見て最も根本側のフレームには,硬性のパイプや軟性のチューブなどを選択的に取り付けられる構造とした.今後はプロトタイプの性能評価と,動力伝達部材の軟性化,細径化,様々なエンドエフェクタの開発を進める.得られた知見については学会や論文にて発表を行なっていく.本研究では,特に子宮内での胎児外科手術を低侵襲に行うための細径多自由度屈曲マニピュレータの実現のため,ワイヤ駆動でもリンク駆動でもない,微細な歯車要素を用いた回転・屈曲機構の開発を進めた.今年度は屈曲機構の動作検証用として,外径5 mmのプロトタイプを設計し製作した.不用意に緩んだり分解されないよう,ねじ止めなどは極力用いず,各フレームを内部パーツと外部パーツに分離して構成し,工具を使わずに,容易に構成部品を組立てられるようにした.また,2自由度の屈曲機構は,全く同じ1自由度の屈曲機構をつなぎ合わせることができるよう設計した.歯車駆動のメインパーツとなる,屈曲フレームと同軸状に配置し回転させるフェースギヤは,モジュール0.2という微細形状であり,一体型のパーツとして製作することは非常に困難であった.そこで薄板のラック歯車としてワイヤカットしたパーツを,円柱状のパーツに巻きつけ固定するという手法を採用し,外径3.2 mm,内腿2.0 mmの剛性の高い小型フェースギヤを製作した.エンドエフェクタを搭載する部分は,様々な機能を容易に交換可能とするため中空とし,先端側からモジュール式に固定できる構造とした.マニピュレータの内部チャネル径は最大2 mmであり,高い拡張性を備えることができた.また,術者から見て最も根本側のフレームには,硬性のパイプや軟性のチューブなどを選択的に取り付けられる構造とした.今後はプロトタイプの性能評価と,動力伝達部材の軟性化,細径化,様々なエンドエフェクタの開発を進める.得られた知見については学会や論文にて発表を行なっていく.
スピン及び軌道による量子伝導の制御理論

電子は内部自由度として、スピン・電荷・軌道を持つ。そして、物質の性質はこれらの内部自由度により決まる。スピンの秩序は磁気秩序であり、電荷の秩序は金属・絶縁体転移に導く。また、多くの遷移金属酸化物ではその磁気的・電気的性質が軌道の秩序に依存している。電流は電子の電荷の流れである。そして、エレクトロニクスの基本は電流の制御である。スピンの流れであるスピン流を用いたエレクトロニクスはスピン・エレクトロニクスである。同様に多くの遷移金属酸化物では、軌道のダイナミックスが期待される。本研究では、これらの電子の内部自由度のダイナミックスによるさまざまな量子伝導の理論を構築した。1.ナノ構造磁性体におけるスピン流と電流の変換が非局所スピンホールデバイスで可能であることを明らかにし、実験グループと共同でその検証を行った。この変換はOnsager相反定理の一種と考えられ、電子の内部自由度に関する基本的な問題を含んでいる。2.強磁性金属を超伝導体ではさんだ接合素子では、超伝導体間を流れるジョセフソン電流において位相が反転する現象が見られる。これをπ接合と呼ぶ。我々はπ接合を含む超伝導リングでは磁界を印加しなくても量子ビットが可能であることを導いた。3.Na_xCoO_2等の遷移金属酸化物では、軌道縮退のために電子の持つ格子と結晶格子が違う場合があることを明らかにした。そのため、様々な新奇な物性が期待される。この理論を用いてNa_xCoO_2で見られる異常なホール効果や巨大熱電効果を定式化した。以上のように、様々な物質の伝導現象を電子の内部自由度から定式化することに成功した。これをπ接合と呼ぶ。本研究における量子伝導とは、電子のスピンや軌道の示す量子効果により制御された輸送現象一般を示している。当基盤研究の目的は「スピン及び軌道による量子伝導の制御理論」を構築し、電子の内部自由度から出発した新しい物質科学の創成と21世紀のエレクトロニクスの新しい指導原理を引き出すことである。当基盤研究の初年度では、強磁性体(FM)と超伝導体(SC)の接合における量子伝導について集中的な研究を行いこの接合を用いた量子ビットの提案を行った。超伝導リングにおいて超伝導体/絶縁体/超伝導体接合は、通常のジョセフソン接合(ゼロ接合)であり、ジョセフソン結合エネルギーの位相差依存性は余弦波で表される。一方、超伝導体/強磁性体/超伝導体接合は、位相差がパイの場合に系が安定となるパイ接合である。金属接触的なパイ接合の場合、ジョセフソン結合エネルギーの位相差依存性は、単純な余弦波からずれた関数形で表される。その結果、ゼロ接合と金属接触的なパイ接合との競合によって、自由エネルギーが位相差に対して2つの縮退した最小値をもつことが分かった。また、この2つの状態においては、互いに反対回りの循環電流が超伝導リング中を流れていることが示された。2つの縮退した状態間のトンネル効果により、結合・反結合状態が形成されるが、本量子ビットではこの2状態をビットとして利用する。この量子ビットは、定常的な外部磁場を必要とする従来のジョセフソン磁束量子ビットに比べ、磁場を印加せずにコヒーレントな2状態が形成されるという利点を持つ。当基盤研究の初年度では、強磁性体(FM)と超伝導体(SC)の接合を用いた量子ビットの提案を行った。本年度はこの量子ビットの安定性について詳しく調べた。超伝導リングにおいて超伝導体/絶縁体/超伝導体

接合は、通常のジョセフソン接合(ゼロ接合)であり、ジョセフソン結合エネルギーの位相差依存性は余弦波で表される。一方、超伝導体/強磁性体/超伝導体接合は、位相差がパイの場合に系が安定となるパイ接合である。金属接触的なパイ接合の場合、ジョセフソン結合エネルギーの位相差依存性は、単純な余弦波からずれた関数形で表される。その結果、ゼロ接合と金属接触的なパイ接合との競合によって、自由エネルギーが位相差に対して2つの縮退した最小値を持つ。また、この2つの状態においては、互いに反対回りの循環電流が超伝導リング中を流れる。2つの縮退した状態間のトンネル効果により、結合・反結合状態が形成されるが、本量子ビットではこの2状態をビットとして利用する。この量子ビットは、定常的な外部磁場を必要とする従来のジョセフソン磁束量子ビットに比べ、磁場を印加せずにコヒーレントな2状態が形成されるという利点を持つ。本年度の研究で明らかになったことは、温度によりパイ接合がゼロ接合に変わり得ることである。この研究により本量子ビットの設計指針が示された。量子伝導とは、電子のスピンや軌道の示す量子効果により制御された輸送現象一般を示している。多くの遷移金属酸化物は電子のクーロン相互作用が強い、いわゆる強相関電子系である。電子は個々のイオンに滞在する時間が長く、そのため電子の内部自由度であるスピンと電荷の振舞いに軌道状態の個性が顕著に反映され、各自由度の秩序状態がお互いに競合する。そしてその結果、様々な量子現象が現れる。同様のことは分子性の有機化合物でも言える。有機化合物では特に構成分子およびそれが作る結晶構造が実に多様であることから、秩序状態の競合については特に研究が進展している。遷移金属酸化物や有機化合物では電子の自由度が秩序状態を持つだけでなく、それぞれ特徴的なダイナミックスを持つ。またそれぞれのダイナミックスが絡み合うことにより、個々の自由度だけでは得られない性質が現れる。本研究では、電子の持つ内部自由度に基づく次の現象を理論的に明らかにした:(1)1次元モット絶縁体の示すスピン電荷分離を光電子分光実験グループと共同で明確なかたちで示した。また、スピン電荷分離が巨大非線形光学応答に重要な働きをすることを明らかにした。(2)遷移金属酸化物における巨大熱電効果に対し、3d電子の軌道とスピンの自由度がその担い手であることを明らかにし、その一般式を導いた。(3)ナノ構造強磁性体でのスピン流と電流(電荷流)の変換についての理論を構築し、スピンホール効果を実験グループと共同で開発した。以上の成果は、今後の強相関エレクトロニクス及びスピンエレクトロニクスの基礎となるものである。
人工球状タンパク質超分子を用いたナノスケール相分離の実現とその応用

本研究の目的は、これまでに設計と構築に成功してきた、中空人工タンパク質ナノ粒子TIP60を用いて、そのナノ粒子カプセルの内外で相分離を実現することにある。相分離の実現のため、親水性の高いタンパク質表面を疎水化する必要があった。しかし、直接的かつ部位特異的に化学修飾を行うのに適したシステイン残基がTIP60には一つも含まれていないことから、まず、そのシステイン導入変異体を設計する必要があった。対象とするのは、セリン残基である。TIP60の内外には多数のセリン残基が存在することから、構造的差異の小さいシステインを導入しても構造が壊れるといった可能性は低いことが予想された。そこで、これまでに精製に成功していた6つの変異体に1つのシステイン変異体を加えて、計7個の変異体の精製を行った。変異体については、非変性の電気泳動や動的光散乱を用いて、その構造が適切に保たれていることを確認した。一方、一部の変異体では、TIP60間でジスルフィド結合が生じていることをすでに明らかにしていたものの、TIP60の分子内部でジスルフィドが生じている可能性については未検討であった。特に化学修飾の際にはジスルフィド結合が形成されていると、修飾効率が低下しうることから、これを確認する必要があった。想定した立体構造からは分子内ジスルフィド結合はないと考えていたが予想に反して、全ての変異体で、部分的に分子内部で形成されたジスルフィド結合の存在が電気泳動による分析で確認された。その後の実験で、これらのジスルフィド結合は実験操作で生じたアーチファクトであることを解明できた。そこで、全ての変異体について、化学修飾ができるか否かを検討した。その結果、カプセルの内外で、わずかに修飾速度が異なるものの、基本的には内外ともに化学修飾ができることを明らかにした。また、本件については、論文で発表した。本来、変異体について、TIP60の内側と外側に分けて、システインを複数導入した多重変異体の設計と構築を検討していた。しかし、実験の操作によって生じたアーチファクトであったものの、TIP60分子内でジスルフィド結合を形成していることが示唆される結果が得られたことで、その解明に想定以上の時間を要した。そのため、多重変異体の創製はやや遅れた。しかし、変異体をコードする遺伝子の獲得はできており、また、それ以降の課題としていた化学修飾の手法を確立できたことで、計画通りにTIP60の内外の修飾実験に着手できると考えている。多重変異体の精製系の確立に着手することや、その化学修飾実験を遂行する。特に、これまでは、蛍光色素など比較的水溶性が高いものでテストしてきたが、今後は、実際の総分離実現に向けた疎水性化合物を用いたシステイン残基の修飾を検討する。また、内側、あるいは外側一方だけを極端に疎水化することで、TIP60が破壊されるような現象が生じるか否かを確認する。まず、修飾速度も早く、精製系も確立された外側のシステインを対象として疎水化を行い、不溶化するか否かを検討する。仮に不溶化が進行すれば、これを有機溶媒へ抽出する系の確立を行う。

しかし、実験の操作によって生じたアーチファクトであったものの、TIP60分子内でジスルフィド結合を形成していることが示唆される結果が得られたことで、その解明に想定以上の時間を要した。そのため、多重変異体の創製はやや遅れた。しかし、変異体をコードする遺伝子の獲得はできており、また、それ以降の課題としていた化学修飾の手法を確立できたことで、計画通りにTIP60の内外の修飾実験に着手できると考えている。多重変異体の精製系の確立に着手することや、その化学修飾実験を遂行する。特に、これまでは、蛍光色素など比較的水溶性が高いものでテストしてきたが、今後は、実際の総分離実現に向けた疎水性化合物を用いたシステイン残基の修飾を検討する。また、内側、あるいは外側一方だけを極端に疎水化することで、TIP60が破壊されるような現象が生じるか否かを確認する。まず、修飾速度も早く、精製系も確立された外側のシステインを対象として疎水化を行い、不溶化するか否かを検討する。仮に不溶化が進行すれば、これを有機溶媒へ抽出する系の確立を行う。本来、すべての変異体構築とその精製系を構築し、大量精製の目処が立つところまでを当該年度の計画としていたが、想定外の分子内ジスルフィド結合形成が生じたことで、その解明のために大量精製系までの確立が困難となった。そこで、大量精製系を翌年度以降の課題とし、当該年度は本研究の障害になりうる分子内ジスルフィド結合形成の機構解明に時間を当てた。こちらは、少量のスケールで実験実施が可能であったことで、次年度使用額が生じる理由となった。