hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深層学習を用いた非侵襲細胞分化判別

深層学習を用いて、培養細胞の分化や細胞種を蛍光分子等使わず非侵襲に判断することの出来る技術の構築を行った。C2C12細胞(マウス筋芽細胞)の分化誘導を開始した日をDay0とし、CNN (Convolutional Neural Network)にDay0、Day3、Day6の位相差画像データを分類させたところ91.8%の正答率を達成した。また、DNN (Deep Neural Network)により3種類の生体組織由来のラマンスペクトルデータを86.2%の精度で分類することに成功した。さらに、アンチストークスラマン散乱(CARS)を用いることでデータ取得速度を大幅に向上させた。培養細胞の分化や、分化後の細胞の成熟度を蛍光分子等使わず非侵襲に判断することの出来る技術の構築を目指し、細胞の位相差画像と深層学習を用いて非侵襲細胞分化判定システムを構築した。細胞試料としてC2C12細胞(マウス筋芽細胞)を用いた。C2C12細胞の分化誘導を開始した日をDay0とし、Day0から3日目、6日目をそれぞれDay3、Day6とした。C2C12細胞はDay0では丸みを帯びた形状をしているが、分化が進むにつれて繊維状の長く伸びた形状になる。CNNにDay0、Day3、Day6の画像(各5700枚)を学習させ、Day0、Day3、Day6までのテストデータ(各300枚)を識別させたところ平均83.8%の正答率であった。Day0の識別率は非常に高く、98.4%であった。Day 0, Day 3, Day 6の比較的大きい細胞画像(4080x3072pixel)を用いて、画像内の各領域(200x200 pixel)の細胞をCNN(Concolutional Neural Network)により識別し、Day 0と認識すれば青色、Dya 3あるいはDay 6と認識すればそれぞれ緑色、赤色というように色分けした。分化度の違いを色で視覚的に表現できたと言える。さらに、生体組織由来のラマンスペクトルデータ解析をDNN(Deep Neural Network)により行い分類を行ったところ、それぞれの組織に由来するラマンスペクトルデータをおよそ90%程度の精度で分類することに成功した。一方で、上記と同様のCNNを病理画像解析へ応用したところ、がん細胞と正常組織だけでなく、がん細胞の周辺組織までも分類することに成功した。当初の計画通り、深層学習を用いることで、細胞の分化を位相差画像だけから判別することが可能となった。また、培養開始0日目、3日目、6日目のC2C12細胞を画像から分類できたため、分化の度合いを判別することができたと言える。また、生体組織のラマンスペクトルデータから、組織の種類を判別可能であることを確認した。病理画像中のがん細胞の判別をしたところ、ほぼ100%の精度で判別可能であった。このとき、正常細胞とがん細胞だけでなく、がん細胞周辺の細胞も分類することに成功したため、予想を上回る結果が得られたといえる。C2C12細胞の分化誘導を開始した日をDay0とし、Day0から3日目、6日目をそれぞれDay3、Day6とし、CNNにDay0、Day3、Day6の画像(各5700枚)を学習させ、Day0、Day3、Day6までのテストデータ(各300枚)を分類させたところ平均91.3%の正答率であった。Day 0, Day 3, Day 6の比較的大きい細胞画像(4080x3072pixel)を用いて、画像内の各領域(200x200 pixel)の細胞をCNN(Concolutional Neura l Network)により識別し、Day 0と認識すれば青色、Dya 3あるいはDay 6と認識すればそれぞれ緑色、赤色というように色分けした。iPS細胞を用い、分化前後の細胞を識別したところ、90%以上の正答率で分類することに成功した。また、生体組織由来のラマンスペクトルデータ解析をDNN(Deep Neural Network)により行い分類を行ったところ、それぞれの組織に由来するラマンスペクトルデータをおよそ90%程度の精度で分類することに成功した。ラマン散乱の信号は微弱であり、データ取得に時間がかかる欠点があるため、非線形ラマン散乱(SRS)を用いることでデータ取得のスピードを大幅に向上させた。また、上記と同様のCNNを病理画像解析へ応用したところ、がん細胞と正常組織だけでなく、がん細胞の周辺組織までも分類することに成功した。

これまでは、実験のしやすさからC2C12細胞(マウス筋芽細胞)を用いて分化の判別を行っていたが、今後はiPS細胞を用いる予定であり、すでに実験を始めている。ラマン顕微鏡を用いた測定では、ラマン散乱光が微弱であるために計測時間が長いという問題があるが、今後、非線形ラマン散乱光計測を導入する。非線形ラマン散乱光は通常のラマン散乱よりも強く、計測時間の短縮が見込まれ、短時間で多くの画像が取得できるようになる。人工知能は、画像など学習用のデータが多い方が正答率が上昇するため、画像取得効率の上昇により判別の精度を上昇させる。また、細胞の動画解析を行うためにタイムラプス顕微鏡による位相差観察及び蛍光観察を行い、動画データを収集する。これにより、細胞の動きの情報も利用した細胞種及び状態の判別を行う。深層学習
呼吸様式が認知機能に与える影響について：NIRSによる検討

矯正歯科臨床において、口呼吸により上顎前突や開咬等の不正咬合が生じるほか顎顔面骨格の成長にも悪影響を及ほすことか指摘されている。人間の生理的呼吸様式は本来鼻呼吸であるが、何らかの原因により鼻閉が生じると正常な鼻呼吸が障害され口呼吸を行う。口呼吸時の問題点として、頭痛、疲労感、睡眠障害、注意力の低下によりQOL(生活の質)が低下するという報告も散見される。矯正治療を希望する不正咬合患者の中には、鼻閉などにより鼻呼吸が障害され口呼吸を行う患者も多数見受けられる。口呼吸がもたらす障害として顎顔面の成長発育異常・不正咬合・口腔乾燥・歯周疾患など口腔内に限局するものや、仕事や学習における持久力や活動力の低下など認知機能に及ぶものまで様々な事象が指摘されている。本研究は呼吸様式が認知機能にどのような影響を与えるのかを非侵襲的脳機能計測技術(近赤外分光計測(NIRS)を用いて神経科学的に客観的に解明することを目的とした。通常の鼻呼吸を行う健常者に対して実験的に鼻閉状態をおこし人為的な口呼吸状態を再現した。認知機能を客観的に判断する材料として、作業記憶試験などにも用いられる"Nバック課題"を行った。口呼吸状態時と通常の鼻呼吸時における課題遂行時の認知機能をNIRSを用いて前頭前野活動を計測することにより認知機能を客観的に判断することにより、生理的な呼吸様式を獲得することの必要性・重要性を広く社会にアピールすることをゴールとする。当該年度の研究成果としては、健常ボランティアにおける実験的鼻閉塞時の脳活動を定量的に観測し、ある程度の被験者数のデータを取得することができ、解析を行うことができた。ようやく研究方法が確立し、健常ボランティアにてデータ採取を行い目標としていた被験者数までは到達することができた。データ解析を行い結果をまとめ、学会発表等を積極的に行い成果を論文として公表していく予定である。矯正歯科臨床において、口呼吸により上顎前突や開咬等の不正咬合か生じるほか、顎顔面骨格の成長にも悪影響を及ぼすことが指摘されている。予備実験を重ね実験方法(効率的なデータ取得方法や、課題時間などについて)の確立にようやく目処がたち始めたため、研究計画調書に記載した当初の予定よりも若干研究の進行が遅れていることと考えられる。

予備実験日より実験方法の手段が確立してきたため、今後は健常ボランティアによる実験をスピードアップして行う予定である。データ解析を行い結果をまとめ、学会発表等を積極的に行い成果を論文として公表していく予定である。(理由)本年度使用する予定であった消耗品(NIRS関連部品等)の購入量が当初の予定より減少したため。(使用計画)次年度は更に実験を充実させ、本年度購入予定であったNIRS関連消耗品のぶんも購入予定である。引き続き実験を行っていきデータをまとめていく予定である。学会発表や、論文として公表していくため論文の英語校正費用や掲載費に使用していく計画である。
海洋酸性化に伴う微生物起源温室効果気体の生成過程の量的および質的変化の解明

本研究は、微生物起源微量気体である一酸化二窒素(N2O)の放出量やその生成・消滅過程が海洋酸性化にどのように応答するかについて、実験室で行う微生物純粋培養実験および船上で行う現場海水を用いた培養実験で濃度と安定同位体比を分析することによって明らかにすることを目的としている。2018年度は以下のように研究を進めた。前年度に整備した、ジャーファーメンターと赤外分光式多成分ガス分析計からなる純粋培養システムを用いて、海洋性硝化細菌(Nitrosococcus Oceani NS58株)の純粋培養実験を行った。初期アンモニア濃度38 mmol/L、25°C、酸素飽和条件下でpH=8.3, 8.0, 7.7の3条件で培養して、連続的に観測したN2O濃度からN2O生成速度を求め、随時採取した大気試料を分析してN2O同位体比を求めた。pHの減少に伴って細胞当たりのN2O生成速度が増加することが明らかになった。一方N2O同位体比は、酸素同位体比ではpHによる相違は認められなかったが、窒素同位体比および分子内席選択(SP値)は低pHでそれぞれ減少、増加を示した。またSP値は、酸化的環境での主要なN2O生成過程であるヒドロキシルアミン(NH2OH)経由の過程で予想される値よりも常に低い値を示した。3種の同位体比の結果を総合した解析から、他の生成過程の寄与率増加よりも、NH2OH過程の同位体効果がpHによって変化する可能性が高いと推定した。東京大学大気海洋研究所の白鳳丸航海(KH-18-6)に参加して、ベンガル湾および東部熱帯インド洋において硝化菌の活性が最も高いと予想される水深で採水を行い、船上で15N標識した試薬を加えて酸性化を模擬した培養実験を行った。東部インド洋におけるN2Oの濃度および同位体比分布についても併せて調べるため、複数の測点、水深における海水試料採取も行った。実験室での純粋培養実験は、培養条件の最適化に当初予想よりも時間を要したためにやや遅れが生じたが、硝化菌が最も増殖しやすいと考えられる基質、溶存酸素濃度におけるN2O生成速度および安定同位体比のpH依存性を明らかにすることができた。船上で行う培養実験については、計画通りに試料採取と実験を行うことができた。航海スケジュールの都合上、試料が研究室に届くのが年度末になったので、次年度に分析および解析を進める。以上のようにほぼ計画通りに実験室および船上での実験を進めることができたので、おおむね順調に進捗しているといえる。実験室での純粋培養実験については、溶存無機炭素濃度、溶存酸素濃度、基質(アンモニア)濃度などのpH以外の条件が硝化菌によるN2Oの生成にどのような影響を与えるのかについても検討しつつ、種々の条件を設定して海洋酸性化を模擬した実験を行い、N2O生成速度と生成過程についての解析を進める。船上で行った培養実験試料の分析と解析を行うことにより、硝化速度およびN2O生成速度とそのpH依存性を調べる。複数の測点で行った実験の比較や、N2O濃度および同位体比の水平・鉛直分布との関係についての考察も行う。二つの手法で得られた結果をもとに、硝化細菌の海洋酸性化に対する応答について総合的な考察を行い、将来予測を試みる。本研究は、海洋酸性化によって一酸化二窒素(N2O)などの微生物起源微量気体の放出量やその生成・消滅過程がどのように変化するのかについて、実験室で行う微生物純粋培養実験および船上で行う現場海水を用いた培養実験でN2Oの濃度と安定同位体比を分析することによって明らかにすることを目的としている。H29年度は以下のように研究を進めた。海洋性硝化細菌(Nitrosococcus Oceani NS58株)を研究協力者から譲り受け、継代培養(実験で用いる菌株を維持するための培養)を開始した。ジャーファーメンター(温度、溶存酸素濃度およびpHを制御可能な連続培養装置)の整備を行うとともに、赤外分光式多成分ガス分析計を導入し、硝化菌を培養しながら、発生するN2Oの濃度モニタリングと同位体比測定用試料の採取を可能とする実験系を構築した。継代培養と同じ条件(アンモニア初期濃度38mM、pH7.8、25°C、溶存酸素濃度は大気飽和)で予察的な実験を行い、数日間にわたってN2Oの生成とその濃度変化が追跡できることを確認した。同位体比の測定も数点行ったところ、SP値(N2O分子内の15N分布を表す指標)から、N2Oが主にヒドロキシルアミン(NH2OH)経由で生成していること、培養期間中で若干亜硝酸(NO2-)経由の生成も起き、その寄与率が変動することがわかった。今後、pH以外の条件がN2Oの生成にどのような影響を与えるのかについても検討しつつ、海洋酸性化を模擬した実験を行ってN2O生成速度と生成過程についての解析を進める予定である。当初、糸状菌等による汚染などの問題が発生したものの、実験材料である硝化菌の純粋培養を東工大で継続的に行えるようになった。赤外分光式多成分ガス分析計を導入したことにより、N2Oだけでなく、CO2、CH4、H2Oの濃度もリアルタイムで計測でき、室内大気の混入の有無を確認しながら連続培養できるようになっている。

ジャーファーメンターを2セット用意し、濃度測定を一定時間毎に切り替えながら行えるように配管を工夫し、同一条件での繰り返し実験を同時に行ったり、異なる条件の実験を並列で行ったりできるようにした。以上のようにほぼ計画通りに純粋培養実験系が構築できたので、おおむね順調に進捗しているといえる。本研究は、微生物起源微量気体である一酸化二窒素(N2O)の放出量やその生成・消滅過程が海洋酸性化にどのように応答するかについて、実験室で行う微生物純粋培養実験および船上で行う現場海水を用いた培養実験で濃度と安定同位体比を分析することによって明らかにすることを目的としている。2018年度は以下のように研究を進めた。前年度に整備した、ジャーファーメンターと赤外分光式多成分ガス分析計からなる純粋培養システムを用いて、海洋性硝化細菌(Nitrosococcus Oceani NS58株)の純粋培養実験を行った。初期アンモニア濃度38 mmol/L、25°C、酸素飽和条件下でpH=8.3, 8.0, 7.7の3条件で培養して、連続的に観測したN2O濃度からN2O生成速度を求め、随時採取した大気試料を分析してN2O同位体比を求めた。pHの減少に伴って細胞当たりのN2O生成速度が増加することが明らかになった。一方N2O同位体比は、酸素同位体比ではpHによる相違は認められなかったが、窒素同位体比および分子内席選択(SP値)は低pHでそれぞれ減少、増加を示した。またSP値は、酸化的環境での主要なN2O生成過程であるヒドロキシルアミン(NH2OH)経由の過程で予想される値よりも常に低い値を示した。3種の同位体比の結果を総合した解析から、他の生成過程の寄与率増加よりも、NH2OH過程の同位体効果がpHによって変化する可能性が高いと推定した。東京大学大気海洋研究所の白鳳丸航海(KH-18-6)に参加して、ベンガル湾および東部熱帯インド洋において硝化菌の活性が最も高いと予想される水深で採水を行い、船上で15N標識した試薬を加えて酸性化を模擬した培養実験を行った。東部インド洋におけるN2Oの濃度および同位体比分布についても併せて調べるため、複数の測点、水深における海水試料採取も行った。実験室での純粋培養実験は、培養条件の最適化に当初予想よりも時間を要したためにやや遅れが生じたが、硝化菌が最も増殖しやすいと考えられる基質、溶存酸素濃度におけるN2O生成速度および安定同位体比のpH依存性を明らかにすることができた。船上で行う培養実験については、計画通りに試料採取と実験を行うことができた。航海スケジュールの都合上、試料が研究室に届くのが年度末になったので、次年度に分析および解析を進める。以上のようにほぼ計画通りに実験室および船上での実験を進めることができたので、おおむね順調に進捗しているといえる。純粋培養実験については、初年度に構築した実験系を用いてpHを低下させた場合のN2O生成速度と安定同位体比を調べて酸性化影響を調べる。溶存酸素濃度と温度によってpH依存性が変化するかどうかについても調べる。船上で行う培養実験については、本年11-12月に東インド洋にて予定されているJAMSTEC白鳳丸航海に向けて実験手法を検討、予備実験等を行って準備する。航海に乗船参加し、現場海水を用いた培養実験のほか、複数の測点における海水試料採取も行い、東インド洋におけるN2Oの濃度および同位体比分布についても併せて調べる。
アドレノメデュリンの臨床診断と治療への応用

"アドレノメデュリン(AM)"は1993年にヒト褐色細胞腫より発見された強力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AMは副腎髄質以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が明らかになってきた。本研究では新規循環調節ペプチドであるAM臨床応用のための研究を行っている。ヒト血中を循環しているAM免疫活性は成熟型AM(mAM)が合成される前の中間体のAM-Gly(iAM)であることを証明した。この事実に基づいてAMの測定キットはmAMおよびmAMとiAMを合わせたtotalAMの測定キットとして塩野義製薬と協同で開発した。降圧活性を有するmAMは主に下肢の血管床や心臓で産生、分泌され、肺循環でクリアランスされていることが明らかとなった。mAMが特に静脈系で高濃度に循環していることは、mAMの主な作用が体液量、肺血管抵抗の調節に関与していると推察された。また、心不全、腎不全等の各種疾患におけるmAMとtotalAMの血中濃度が明らかにできた。また、さらに、最近ELISAを用いた、10amol/mlまで測定可能な超高感度の測定系の確立し、血中AMの測定が、動脈硬化の新しい生化学的マーカーになる可能性が明らかにできた。一方AMの治療薬としての応用をするため、レコンビナントAM(rec-AM)の合成を行い、rec-AMが化学合成したAMと同等の血管拡張作用や降圧作用、in vitroでのcAMP増加作用を有することを明らかにした。さらに、心筋梗塞後の心不全モデルラットにおいて、recAMの持続投与が循環動態を改善し、心筋リモデリングの抑制に有効であることが判明した。AMの血管拡張作用や利尿作用および心拍出量増加作用等を考えると心不全の治療薬として期待できる。今回、心不全モデル動物にAMを持続投与し、病態を改善することが明らかになったことで、ヒト心不全治療に対してあらたな治療手段となることが期待されている。AMは副腎髄質以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が示唆されている。この事実に基づいてAMの測定キットはmAMおよびmAMとiAMを合わせたtotalAMの測定キットを塩野義製薬と協同で開発した。今後各種疾患におけるmAMとtotalAMの血中濃度が明らかにされてくると思われる。一方化学合成されたAMに関しては、血管拡張作用や利尿作用および心拍出量増加作用等を考えると心不全の治療薬として期待できる。心不全モデル動物にAMを投与し、病態を改善することが明らかになり、ヒト心不全治療に対してあらたな治療手段となることがおおいに期待されている(現在AMによる急性心不全の実験的治療に関して倫理委員会に申請中である)。

"アドレノメデュリン(AM)"は1993年にヒト褐色細胞腫より発見された強力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AMは副腎髄質以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が示唆されている。本研究では新規循環調節ペプチドであるAM臨床応用のための研究を行っている。ヒト血中を循環しているAM免疫活性は成熟型AM(mAM)が合成される前の中間体のAM-Gly(iAM)であることを証明した。この事実に基づいてAMの測定キットはmAMおよびmAMとiAMを合わせたtotalAMの測定キットとして塩野義製薬と協同で開発した。降圧活性を有するmAMは主に下肢の血管床や心臓で産生、分泌され、肺循環でクリアランスされていることが明らかとなった。mAMが特に静脈系で高濃度に循環していることは、mAMの主な作用が体液量、肺血管抵抗の調節に関与していると推察された。今後各種疾患におけるmAMとtotalAMの血中濃度が明らかにされてくると思われる。また、ごく最近、ELISAを用いた、10amol/mlまで測定可能な超高感度の測定系の確立にも成功し、今後はAMが減少している病態等も明らかにされてくることが期待できる。一方AMの治療薬としての応用をするため、レコンビナントAM(rec-AM)の合成を行い、rec-AMが化学合成したAMと同等の血管拡張作用や降圧作用、in vitroでのcAMP増加作用を有することを明らかにした。今後、recAMを用いた慢性の効果も明らかにされると期待されている。一方化学合成されたAMに関しては、血管拡張作用や利尿作用および心拍出量増加作用等を考えると心不全の治療薬として期待できる。心不全モデル動物にAMを投与し、病態を改善することが明らかになり、ヒト心不全治療に対してあらたな治療手段となることが期待されている。"アドレノメデュリン(AM)"は1993年にヒト褐色細胞腫より発見された強力な血管拡張性の降圧ペプチドでである。AMは副腎髄質以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が明らかになってきた。本研究では新規循環調節ぺプチドであるAM臨床応用のための研究を行っている。mAMが特に静脈系で高濃度に循環していることは、mAMの主な作用が体液量、肺血管抵抗の調節に関与していると推察された.また、心不全、腎不全等の各種疾患におけるmAMとtotalAMの血中濃度が明らかにできた。また、さらに、最近ELISAを用いた、10amol/mlまで測定可能な超高感度の測定系の確立し、血中AMの測定が、動脈硬化の新しい生化学的マーカーになる可能性が明らかにできた。
PETとMRによる老年期痴呆の解明とその制御

本研究では、ポジトロン断層装置(PET)を用いて脳の機能と相関する脳代謝を中心にX線コンピュ-タ断層装置(XーCT)、磁気断層装置(MRI)での形態変化を加えた総合的な脳の画像診断を展開し、正常加齢から老年期痴呆にいたる特徴の抽出を試みた。(1)MRIによる脳の加齢変化と脳代謝加齢にともないMRIで認められる脳室周囲高信号域(PVH)の出現と脳代謝の関係をPETにより脳血流量の変化を中心に検討し、高度なPVHを有する症例では全脳レベルの血流低下が認められた。(2)XーCTによる多発梗塞性痴呆の形態的変化の特徴加齢により脳の萎縮は進行するが多発梗塞性痴呆では正常加齢とは異なり、側脳室下角の拡大が特徴的であることが明かとなった。(3)PETによるアルツハイマ-型痴呆と多発梗塞性痴呆における脳局所糖代謝の特徴多発梗塞性痴呆とアルツハイマ-型痴呆は原因が異なると言われているものの、痴呆という共通の臨床症状を呈することを考慮すると、共通の脳の機能異常と考えられる。これらの共通の脳の機能異常をPETにより脳の糖代謝という観点から研究し、痴呆脳では大脳皮質連合野の対称的な糖代謝低下が認められることが明かとなった。(4)PETによる側脳室下角拡大と脳局所糖代謝の相関側脳室下角の拡大と脳局所糖代謝の関係について検討を加え、側脳室下角の拡大がアルツハイマ-型痴呆、多発梗塞性痴呆にかかわらず大脳皮質糖代謝と強い相関があることが明かとなった。以上により側脳室下角内側壁を構成する海馬、扁桃核が痴呆という症状と密接に関連していることが示唆され、痴呆研究の焦点の一つとして大脳辺縁系に着目しなければならないという重大な結論を得た。1.痴呆発症の責任病巣を明かにすることが出来た(1)痴呆発症の責任病巣を大脳新皮質(neocortex)に求めるすべての研究は徒労に終わった。脳梗塞により大脳半球すべてが機能不全に陥っても痴呆とはならないことが明かとなった。(2)痴呆発症の責任病巣は古い哺乳動物の脳と呼ばれる大脳辺縁系の扁桃核と海馬を主とする神経核である。これらの神経核の萎縮と破壊が進み機能不全に陥ると側頭、頭頂、後頭の各連合野が稼動を停止し、ブドウ糖摂取率の低下や脳血流量の低下を生じ、痴呆が発症する。アルツハイマ-病(AD)とか多発性梗塞性痴呆(MID)など原疾患が異なっても痴呆発症の病態像は同一と考えられた。多くの痴呆の患者(約4/5)では上記の病態に加えて病変が基底核に及び前頭前野の機能不全によるブドウ糖消費量と血流量の低下が見られた。2.神経伝達物質の生合成の障害と脳萎縮は側頭、頭頂、後頭及び前頭連合野などの脳の広範な連合野のブドウ糖摂取率の低下によるアデノシン三燐酸の生合成の障害に伴う二次的現象である。3.予防・治療の可能性AD、MIDなど痴呆発症の直接の原因は扁桃核、海馬などの神経核を構成する神経細胞の酸素欠乏による細胞死によるもので、主因は虚血であると考えられるが、その予防は可能と考えられる。又、海馬は神経伝達物質の受容体の集団であるが、これらのうちの重要な神経伝達物質を加えることにより、痴呆の治療の可能性が大きくなった。

1.PETによるアルツハイマ-型痴呆と多発梗塞性痴呆における脳局所糖代謝の特徴老年期の痴呆は種々の原因により発症するが、頻度の高いものとしてアルツハイマ-型痴呆と多発梗塞性痴呆がある。これらの痴呆は原因が異なると言われているものの、痴呆という共通の臨床症状を呈することを考慮すると共通の脳の機能異常と考えられる。これらの共通の脳の機能異常をPETにより脳の糖代謝という観点から研究すると、痴呆脳では連合野の対称的な糖代謝低下が認められることが明かとなった。2.PETによる側脳室下角拡大と脳局所糖代謝の相関正常の加齢でも脳室周囲高信号域(PVH)が増加し、PVHの高度な場合は、全脳レベルでの血流低下を認める。また、多発梗塞性痴呆の側脳室下角拡大はその内側壁を構成する海馬、扁桃核の萎縮を間接的に反映するものであり、同部が虚血に弱いことを考慮すると海馬、扁桃核が痴呆という症状と密接に関連があることが示唆される。そこで側脳室下角の拡大と脳局所糖代謝の関係に焦点を絞って研究を進め、側脳室下角の拡大がアルツハイマ-型痴呆、多発梗塞性痴呆にかかわらず、脳局所糖代謝と強い相関が認められ痴呆研究の焦点の一つとして大脳辺縁系に着目しなければならないという重大な結論を得るにいたった。
表面新物質相としての反応性表面

「表面新物質相としての反応性表面」を研究課題とする本計画研究班は当初の研究計画の主要設備としての「新物質相創製装置」及び「表面機能化装置」を最終年度である平成元年度までに完成した。「新物質相創製装置」は東北大学電気通信研究所(潮田資勝教授)において主として初年度及び2年度にわたって設計製作し完成した。また、「表面機能化装置」は東京大学物性研究所(田中虔一)において、2年度と最終年度にわたって設計製作し完成した。「新物質相創製装置」(東北大通信研)は超高真空下で単結晶試料を劈開、加熱、烝着等の処理を行えかつ長距離移動用サンプル・トランスファーロッド備えた設計で、試料上への金属の烝着量を単原子層以下にコントロールできるよう設計されている。この装置を使いGaーAs(110)面にCsを烝着しそこへO_2を吸着させることにより生成するショトキーバリアーの高さをラマン散乱の強度からCs量の関数として求めた。「表面機能化装置」(東大物性研)は独自の方式を開発し、気圧から超高真空までの広い範囲でWell Defined Surface上の吸着から反応まで自由に行えるようにした。さらに一気圧Ar雰囲気下でWell Defined Surfaceを使った電気化学反応を行える独自の方式とした。この装置の完成でWell Defined Surfaceを使って気相から液相までの実験が可能となった。この装置の気相反応セルを使ってこれまで見つかっていないRh(100),Pt-Rh(100)表面に準安定状態の表面化合物として窒素原子の配位した表面の合成とその反応性を調べることに成功した。さらに、反応進行中の表面をHREELS,LEED及びAESで調べる事によって、表面における触媒反応の中間体の検出に成功した。
環境放射線測定とチーム医療の推進における診療放射線技師の業務のあり方に関する研究

環境放射線については群馬県内外の環境放射線を3年間継続して測定した。群馬県では10地点をサンプリングした。福島原発事故前後では約3.2倍(1998年と比較)の空間線量率を示したが、本調査により約50%以下に低下しているのが確認できた。また、半減期の長いCs-137については2.3±0.07Bq/kgで、これはCs-134の挙動と類似していた。診療放射線技師の業務のあり方の1つとして、核医学検査における被ばく対策について調剤作業の現状を全国調査した。診療放射線技師における診療の補助の検査関連行為について、医師の考え方を調査した。調査内容は、医師からみた診療放射線技師(または診療放射線技師に係る胃がん検診専門技師、X線CT専門技師、核医学専門技師、血管撮影・インターベンション専門診療放射線技師、磁気共鳴専門技術者、超音波検査士、放射線治療専門技師、マンモグラフィ検診撮影認定者等)による留置針からの造影剤投与、留置針の抜針・止血、CT検査の造影剤自動注入器からの造影剤投与、核医学検査における放射性同位元素の標識、カテーテル挿入部の触診、造影カテーテル挿入、造影剤をカテーテルから投与、下部消化管検査に必要なネラトンチューブ挿入、チューブよりバリウム・空気・ガストログラフィンの注入についてである。結果、高度な技術が備わる診療放射線技師には期待が大きいが、創傷行為は認めない意見が多数であった。なお、調査に協力いただけた医師は20名である。厚生労働省より平成20年6月18日付けで「安心と希望の医療確保ビジョン」がとりまとめられ、国民が安全で質の高い医療サービスを受けられるように医療制度の改善を行うことが示された。診療放射線技師に関しては、平成22年4月30日付け、医政発0430第1号「医療スタッフの協働・連携によるチーム医療の推進について」により、その一翼を担う活動範囲が明記されたが、具体的内容は含まれていない。その一方で、医療方策検討ワーキンググループの方針は、診療放射線技師法の範疇から外れると考えられる検査関連行為の「診療の補助」を行わなければならない実状を鑑み法令整備を急務とし、同時にその適切な遂行のため教育研修を受ける方向性が示された。調査では、技術の到達目標や確認指標、定期的更新制度が実践されている専門・認定技師制度のチーム医療の推進におけるあり方を模索する。次に、放射性医薬品の過剰投与による無用な被曝を未然に防止するため、調査名「核医学検査における放射性医薬品取り扱いに関する実態調査」とし、全国の核医学診療施設1275機関の全数調査を行った。調査内容は、A.施設の概要、B.放射性医薬品の品質管理と安全管理、C.放射性医薬品の検査項目別投与量とした。具体的内容は、放射性医薬品を既調製注射液と凍結乾燥製剤に区分し、1使用放射性医薬品形式、2院内調製の場合は実投与量、3標識済製剤の場合は検定量、4撮像方法、5標準投与量(成人)、6放射性医薬品使用記録簿記載量、7診療報酬請求量とした。さらに、福島第一原子力発電所に関する環境放射線の測定は、事故後2年経過したが放射線の話題は尽きず、汚染地域では未だ不安を抱えている人や風評被害に悩まされている人が多い。環境放射線については事故後一ヶ月以内から定期的に群馬県内においてモニタリングを継続中である。なお、データの詳細については投稿中である。診療放射線技師の業務のあり方の1つとして最終年度は低被ばく線量を考慮し核医学検査における投与量の上限値(平均値の75%)を模索した。詳細は日本診療放射線技師会誌3月号に掲載されたが、核医学検査の骨シンチグラフィではTc-99mMDPが544MBq、脳血流シンチグラフィがI-123 IMPで173MBq、心筋血流シンチグラフィがTl-201で79.5MBqとなった。他のモダリティについては投稿中である。核医学概要に示した調査を行い、学会等で公表できた。また、2年間継続して、群馬県とその周辺の環境放射線測定を実施しデータを県民等に公開した。1チーム医療における専門・認定技師(胃がん検診専門技師、X線CT専門技師、核医学専門技師、救急撮影認定技師、血管撮影・インターベンション専門診療放射線技師、磁気共鳴専門技術者、超音波検査士、放射線治療専門技師、マンモグラフィ検診

撮影認定者等)のあり方に関する調査については、収集したデータ分につき第28回診療放射線技師総合学術大会にて発表した。引き続き論文化を目指す。2チーム医療の推進における診療放射線技師の検査関連行為については、検査関連行為として、留置針からの造影剤投与、留置針の抜針・止血、CT検査の造影剤自動注入器からの造影剤投与、核医学検査における放射性同位元素の標識、カテーテル挿入部の触診、造影カテーテル挿入、造影剤をカテーテルから投与、下部消化管検査に必要なネラトンチューブ挿入、チューブよりバリウム・空気・ガストログラフィンの注入があげられるが、それぞれの行為について医師の考え方を調査する。3核医学検査における放射性医薬品取り扱いに関する実態調査については、論文化を行った。4福島第一原子力発電所に関する環境放射線の測定は、2年分の測定値について公表予定である。放射性医薬品の安全管理及び過剰投与事故防止等マニュアルの作成にとりかかる。1チーム医療における専門・認定技師のあり方に関する調査については、論文投稿を行う。2チーム医療の推進における診療放射線技師の検査関連行為については、データをとりまとめ第29回診療放射線技師総合学術大会にて発表する。3福島第一原子力発電所に関する環境放射線の測定は、半減期の長い核種を中心に継続調査を行う。前年度の繰り越しを未調査分に使用した。遅れていた調査に取り組み適正に使用した。1チーム医療の推進における診療放射線技師の検査関連行為についての実地調査費用。2福島第一原子力発電所に関する環境放射線の測定の調査費用。3診療用放射性同位元素の適切な使用量および安全管理方法の調査費用。
神経細胞における新たな小胞体ストレス応答機構の解明

これまでに転写因子NF-Yをマウス脳の異なる神経細胞種でノックダウンし、その影響を観察してきた。その結果、大脳の錐体細胞、線条体の有棘神経細胞等では、小胞体での異常タンパク質蓄積病態を引き起こすものの、運動ニューロンでは同病態は観察されなかった。詳細な解析により、小胞体シャペロンの選択的発現制御がここに関わっていることを見出してきた(YamanakaT etal. Nat Commun 2014, Sci Rep 2016)。また、その病態機構について、マウス脳よりNF-Yノックダウン細胞をセルソーターにて回収し、RNA-seqによる網羅的トランスクリプトーム解析を行い、遺伝子分類解析により、小胞体に局在する遺伝子群が濃縮していることを見出しており、国際・国内学会で発表した。今年度は、小胞体病態を示す細胞モデルを作製し、病態に伴いどのような分子変化が引き起こされるかについて検討した。まず、小胞体を生化学的に単離する手法を確立し、これを質量分析で解析する網羅的プロテオミクスを行った。その結果、小胞体自体の構成成分は変化していないが、小胞体と他オルガネラとの相互作用が影響されていることが示唆され、小胞体の異常がどのようにして細胞機能障害を引き起こすか、その一メカニズムを見出しつつある。これについてまとめ、国際学会(Cold Spring Harbor Laboratory Conference)、及び国内学会(第70回日本細胞生物学会大会)にて発表した。これまでにノックアウトマウスを用いた解析から、転写因子NF-Yが大脳の錐体神経細胞では、小胞体の恒常性維持を介してその生存に必須であることを明らかとしてきた。今年度は、NF-Yが中枢神経系の各種細胞で広範にその維持に必須であるかを部位特異的ノックダウン・ノックアウトの系を用いて検討した。その結果、線条体や小脳の神経細胞では大脳錐体細胞と同様の病態が得られたのに対し、運動ニューロンでは全く異なる病態を示すことを明らかとした。詳細な解析から、これは細胞特異的な遺伝子発現変化によるものと示唆された。本研究成果は名古屋でのBrain Protein Aging and Dementia Control 1st International Symposium、及び神戸での第38回日本神経科学大会で口頭発表した。一方、別の転写因子USFについて、クロマチン免疫沈降や遺伝子発現アレイにより神経系での下流遺伝子の網羅的検索を行った。その結果、USFがリソソーム関連遺伝子の発現を制御することを始めて明らかとし、2015年3月にFEBS Journalに誌上発表した。中枢神経系でのNF-Y欠損による神経変性病態と遺伝子発現異常を調べることにより、小胞体病態に関わる分子機構の一端が明らかとなってきた。これまでに転写因子NF-Yについて、これをマウス大脳の錐体神経細胞でノックアウトしたところ、小胞体に異常タンパク質が蓄積し神経細胞の脱落・変性を引き起こすことを見出してきた(Yamanaka T etal. Nat Commun 2014)。さらに、中枢神経系での別の神経細胞でのNF-Yノックダウン・ノックアウトの影響を調べたところ、線条体有棘神経細胞や小脳プルキンエ細胞ではタンパク質蓄積病態を引き起こすものの、運動ニューロンでは観察されないことを見出していた。今年度は、運動ニューロンでは主要な小胞体シャペロンであるGrp78/Bipの発現が消失していることを見出し、これが運動ニューロン特異的な病態に関わっていることが示唆された。実際、線条体有棘神経細胞でGrp78/Bipの発現を減少させると、NF-Yノックダウンによるタンパク質蓄積病態が抑制されたことから、この可能性が支持された。よって、タンパク質蓄積病態の進行には小胞体シャペロンGrp78/Bipが関わっていることが初めて明らかとなった。これらをまとめ、論文発表するとともに(Yamanaka T etal.SciRep2016)、プレスリリースを行った(同志社大学)。また、分子生物学会のシンポジウムにて報告した。また慶応大学との共同研究により、運動ニューロンでのノックアウトに使用したVAChT-creトランスジェニックマウスについて、運動ニューロンの中でもslow motor neuronに選択的にcreが発現していることを明らかとし、論文発表した(Misawa H et al. Genesis. 2016)。中枢神経系でのNF-Y欠損による神経変性病態と遺伝子発現異常の特異性を調べることにより、少なくとも小胞体シャペロンの発現制御が小胞体病態の進行に必須であることが示された。その結果、大脳の錐体細胞、線条体の有棘神経細胞等では、小胞体での異常タンパク質蓄積を引き起こすものの、運動ニューロンでは同病態は観察されなかった。今年度は、これらについてまとめた総説論文(査読付き)を発表するとともに、その病態機構について、トランスクリプトームを用いた解析を行った。まず、NF-Yノックダウンによる影響を選択的に解析するため、NF-Yノックダウンした神経細胞をセルソーターにて回収した。RNAを精製し次世代シーケンサーにより、発現変動する遺伝子群を網羅的に同定した(RNA-seq)。遺伝子分類解析により、小胞体に局在する遺伝子群が濃縮していることが見出され、NF-Yがin vivoにおいても小胞体関連遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。

同様に、神経系培養細胞においても、NF-Yノックダウンを行い、DNAマイクロアレイにて発現変動遺伝子を検索したところ、やはり、小胞体に局在する遺伝子群が濃縮していることが見出された。よって、NF-Yは神経系細胞では、小胞体関連遺伝子の発現を調節するキーファクターであり、この異常が神経変性に関わることが示唆された。これらをについてまとめ、2つの国際学会(The 8th International Symposium on Autophagy、World Congress of Neurology 2017)及び第五回NGS研究会にて発表した。中枢神経系でのNF-Yノックダウン細胞を用いたトランスクリプトーム解析は終わっており、多数の小胞体関連遺伝子の発現変化が同定されつつある。ただ、個々の遺伝子についての解析はまだ進行中であり、その分子機構は未だ不明な点が多い。これまでに転写因子NF-Yをマウス脳の異なる神経細胞種でノックダウンし、その影響を観察してきた。その結果、大脳の錐体細胞、線条体の有棘神経細胞等では、小胞体での異常タンパク質蓄積病態を引き起こすものの、運動ニューロンでは同病態は観察されなかった。詳細な解析により、小胞体シャペロンの選択的発現制御がここに関わっていることを見出してきた(YamanakaT etal. Nat Commun 2014, Sci Rep 2016)。また、その病態機構について、マウス脳よりNF-Yノックダウン細胞をセルソーターにて回収し、RNA-seqによる網羅的トランスクリプトーム解析を行い、遺伝子分類解析により、小胞体に局在する遺伝子群が濃縮していることを見出しており、国際・国内学会で発表した。今年度は、小胞体病態を示す細胞モデルを作製し、病態に伴いどのような分子変化が引き起こされるかについて検討した。まず、小胞体を生化学的に単離する手法を確立し、これを質量分析で解析する網羅的プロテオミクスを行った。その結果、小胞体自体の構成成分は変化していないが、小胞体と他オルガネラとの相互作用が影響されていることが示唆され、小胞体の異常がどのようにして細胞機能障害を引き起こすか、その一メカニズムを見出しつつある。これについてまとめ、国際学会(Cold Spring Harbor Laboratory Conference)、及び国内学会(第70回日本細胞生物学会大会)にて発表した。NF-Y下流遺伝子の発現異常が実際小胞体病態に関連するか、そのin vivo神経細胞での発現制御を行い病態への影響を観察することで検討する。また、培養細胞系にて、小胞体膜タンパク質の変異・蓄積と小胞体凝集との関連を調べると共に、ここを制御する化合物・遺伝子の網羅的検索を行う。セルソーターにより神経細胞のみを分離・回収し、変性神経細胞での遺伝子発現異常を明らかとする。
脳時計ニューロンにおける光シグナリングと概日リズム制御の分子解析

本研究では、1)松果体と網膜の光受容ニューロンの特異性を規定する遺伝子ネットワーク、2)概日時計の位相制御機構、3)網膜光受容細胞の光応答特性、という3課題を設定し、動物光受容システムの統合的理解を目指した。その結果、1)松果体特異的な遺伝子発現を司る転写因子等を発見、2)概日時計の位相制御に関わる複数因子を同定して位相決定機構を解明、3)桿体と錐体の光応答特性の違いを生み出す分子機構を明らかにした。光受容系の発達した多くの生物は約一日周期で振動する概日時計を持ち、リズムの位相が光の制御を受けるという共通の特性を示す。これは、地球上の周期的な光サイクルの中で、光受容と概日リズムという機能が相関的に生物に獲得されたことを如実に物語っている。したがって、時計機能と光受容能の分子的な仕組みを比較解析することは、両者がどのように相互作用しながら動物に定着して進化したか、その根底の分子シナリオを理解することにつながる。本研究では、非常に短い時間スケールで空間情報を処理する「視覚」と、長い時間スケールで時刻情報を処理する「概日時計システム」を対照的な情報変換系と捉え、その光シグナリングを支える分子ダイナミズムと個体レベルでの作動原理の理解を目指す。また、光以外の因子による、いわゆる「非光」位相制御との比較解析を通して、概日時計の位相制御機構をより深く理解することを目指す。具体的には、one hybridスクリーニングおよび松果体と網膜の遺伝子発現プロファイリングにより、松果体光受容ニューロンの特異性を解明するとともに、グルコースなどの非光シグナルに応答する遺伝子の機能解析を通じて概日時計の位相同調メカニズムに迫る。交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、以下の成果を得た。1)2種類の光受容ニューロン(松果体細胞と網膜視細胞)の特異性を規定する遺伝子ネットワークを明らかにするため、これらの細胞を選択的にGFPでラベルした遺伝子組換ゼブラフィッシュを用い、松果体細胞に特異的な発現遺伝子のプロファイリングを行った。その結果、転写因子をコードする2種類の新規遺伝子を同定し、その一つが松果体を含む脳領域に限局して発現することを見出した。2)本研究分野における未解決の重要課題である「時計の位相制御メカニズム」に迫るため、光以外の刺激(非光刺激)による位相シフトを解析した。個体レベルでの解析に向け、マウスの行動をリアルタイムで測定し記録する行動記録システムを設計・構築した。一方、この非光位相シフトの分子メカニズムを哺乳類培養細胞を用いて解析する過程で、時計細胞の培地のpHがリズムの周期と減衰に大きな影響を与えることを見出し、さらに培地のpH変化が細胞時計の位相をリセットすることを見出した。3)視細胞の光環境への順応機構を解明するためにG蛋白質に焦点を絞って解析を進めた。従来の私共の研究から、G蛋白質トランスデューシン(Gt)γサブユニットのファルネシル化は視細胞の順応に寄与することが示唆されている。そこでファルネシル基の分子間相互作用に注目し、ファルネシルの光親和性アナログPOGを用いた光親和標識実験を行った。その結果、GtαとGtβに加え、光シグナリングの状態に正確に対応して光受容体と膜脂質(PEとPS)がファルネシルと相互作用することを見出した。一方、視細胞の順応には光受容体キナーゼGRKが関与する。GRK遺伝子の組換え動物を用いた機能解析を次年度以降に行うための準備として、ゼブラフィッシュの視覚行動を定量的に測定するシステムを設計・構築した。1)2種類の光受容体ニューロンの特異性を規定する遺伝子ネットワーク:松果体細胞の特異性を規定する遺伝子ネットワークを明らかにするため、前年度に単離した松果体特異的な転写因子の性状解析を行った。その結果、この因子の特異的な結合DNA配列を同定し、この結合により松果体特異的な遺伝子発現が活性化されることを見出した。一方、松果体にGFPを異所発現する組換えゼブラフィッシュを用いて変異体スクリーニングを行い、松果体の発現誘導に異常を示す変異体を複数系統得ることに成功した。2)時計の位相制御メカニズム:時計の位相制御メカニズムの包括的理解に向け、末梢時計の非光位相シフトの制御機構を解析した。末梢時計モデルとして培養細胞を用いた解析において、培地のpH変化により時計の位相が大きくシフトすることを前年に見出したが、本年度、培地の微弱なアルカリ化によって細胞増殖因子TGFβが活性化されることを見出した。活性化されたTGFβはALK5-SMAD3/4経路を介して時計遺伝子Dec1の転写を一過的に活性化し、培養細胞時計の位相を強烈にリセットすることを明らかにした。さらにDec1欠損マウスの末梢組織の遺伝子発現解析から、この新規の位相制御シグナリングが生体で機能していることを明らかにした。

3)桿体と錐体の応答特性を規定する因子:網膜の2種類の視細胞(桿体と錐体)の応答特性の違いを規定する因子の有力候補として、両者に発現する受容体キナーゼの活性の顕著な違いに着目して研究を進めている。この仮説を検証するため本年度は、桿体特異的プロモータに錐体キナーゼ遺伝子を結合したDNAコンストラクトを作製し、ゼブラフィッシュに導入した。その結果、錐体キナーゼを桿体に異所発現する組換え系統を複数樹立することに成功した。交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、以下の成果を得た。1)2種類の光受容ニューロンの特異性を規定する遺伝子ネットワーク:松果体細胞の特異性を規定する遺伝子ネットワークを明らかにするため、これまでに単離した松果体特異的な転写因子の機能阻害実験を個体レベルで行った。その結果、エクソロドプシン遺伝子プロモータによる松果体特異的なGFP発現が、この機能阻害により抑制された。このことから、この転写因子が松果体特異的な発現調節に必須であることが明らかになった。2)時計の位相制御メカニズム:時計の位相制御メカニズムの包括的理解に向け、末梢時計において「非光」位相制御を担う転写因子の候補であるTIEG1の分子解析を行った。まずTIEG1の発現プロファイルを解析したところ、TIEG1タンパク質は末梢組織において日内変動を示すとともに、培養細胞ではグルコース刺激によって発現量の急激な上昇が観察された。また、TIEG1が時計遺伝子Bmal1のプロモータに結合して、転写を抑制する能力をもつことがわかった。そこでTIEG1の機能阻害実験を行ったところ、培養細胞におけるBmal1の転写リズムの周期に影響をおよぼすことがわかった。以上より、TIEG1は末梢時計の制御に重要な役割をもつことが示唆された。本年度は、錐体キナーゼを桿体に異所発現する組換えゼブラフィッシュ系統(昨年度に樹立)の生理機能解析を行った。この変異個体の網膜試料における光依存的キナーゼ活性を調べたところ、野生型よりも活性が亢進していることを確認した。そこで、変異個体の桿体における光応答特性を単一細胞レベルで測定したところ、野生型の桿体に比べて感度が低下していることがわかった。1)2種類の光受容ニューロンの特異性を規定する遺伝子ネットワーク:これまでに単離した転写因子は、松果体特異的な遺伝子発現に必須であることがわかっている。個体レベルでの機能阻害実験により、この転写因子は、松果体の発生に関与する転写因子群と相互作用して、松果体ニューロンの分化にも重要な役割を果たすことが明らかになった。2)時計の位相制御メカニズム:光感受性の時計細胞であるニワトリ松果体細胞の光シグナリング経路にはGq型Gタンパク質が関与する。in vitro再構成系の実験を行ったところ、これまでニワトリ松果体において同定した光受容分子Opn4がGqを活性化することが明らかになった。一方、ニワトリ松果体のマイクロアレイ解析で同定した遺伝子群の解析から、光による概日時計の時刻合わせにSREBPという転写因子が関与することを解明した。
前立腺癌に対するユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法の開発

細胞内に生じた異常蛋白はプロテアソームによって分解される。私は、vorinostatやritonavirが細胞内に異常蛋白を増加させ、そこにプロテアソーム阻害薬bortezomibを併用することで、それらの分解を妨げ、前立腺癌細胞を死滅できると仮定した。予測通り、これらの併用療法は、ユビキチン化蛋白と呼ばれる異常蛋白を細胞内に蓄積し、前立腺癌細胞を死滅させた。本研究は、前立腺癌に対してユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法を開発することを目的としている。昨年度はSAHAとbortezomibの併用療法について検討を行い、併用療法がユビキチン化蛋白を蓄積し、in vitro、in vivoにおいて前立腺癌に有効であることを示した。今年度は、更なるメカニズム解明のため、小胞体ストレスの誘導についてより詳しくERp44, Ero1Lなどの発現の変化の検討を行い、またcolony formation assayを行ってコロニー形成阻害能についても検討を加えた。更に細胞周期に関連してp21の発現増加に加え、cyclin D1, cyclin-dependent kinase 4の発現減少も示した。また、新たに、より効率的なユビキチン化蛋白蓄積を目指して、HIV protease inhibitorであるritonavirによる小胞体ストレス誘導下におけるbortezomibの併用効果について検討を行った。両者の併用はPC-3, DU145, LNCaPにおいて、細胞増殖を効果的に抑制し、その効果は相乗的であることがisobologram解析で明らかとなった。またannexin-V assay,アポトーシス関連蛋白の検討から、併用療法はアポトーシスを誘導することが示された。更に、細胞周期解析では、併用療法により劇的なsub-G1 fractionの増加が確認された。Western blot法による検討では、併用療法は相乗的に小胞体ストレスを誘導し、ユビキチン化蛋白を蓄積することが示された。Ritonavirとbortezomibの併用効果につき、さらに詳細なメカニズムの解明を行った。両者の併用は、ユビキチン化蛋白を蓄積するのみならず、ヒストンをアセチル化することが確認された。Creb2の発現も同時に増加しており、ヒストンアセチル化の重要なメカニズムの一つと考えられた。他に、panobinostatとbortezomib、ritonavirとpanobinostatの併用についても検討を行ったが、細胞増殖抑制についての相乗性は確認できず、HDAC阻害の選択性が重要と考えられた。また、各種薬剤の組み合わせにおいて、SUMO化に関する検討も行ったが、確認されなかった。本研究では、前立腺癌に対してユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法を開発することを目的としてきた。SAHAとbortezomibおよびritonavirとbortezomibの併用が、最も効率的にERストレスを誘導し、ユビキチン化蛋白を蓄積した。特にSAHAとbortezomibの併用では、in vivoにおける効果も確認されたのみならず、cyclin D1/CDK4 complexの発現と機能の抑制、またアンドロゲンレセプターの発現がbortezomibの効果を抑制するなどの、多くの新しい知見が得られた。SAHAとbortezomibの併用は、すでに多発性骨髄腫患者で臨床応用され、薬物動態パラメーターに関するデータや副作用についても明らかにされており、本併用療法の難治性前立腺癌患者に対する臨床応用が期待される。本研究では、前立腺癌に対してユビキチン化蛋白蓄積を介した新規治療法を開発することを目的とし、本年度は主として、SAHAとbortezomibの併用が前立腺癌においてユビキチン化蛋白を蓄積し、細胞増殖を抑制するか、について検討を行った。前立腺癌培養株LNCaP, PC-3, DU145にSAHA及びbortezomibの併用療法を行ったところ、細胞増殖は効果的に抑制され、その効果は相乗的であることがChou-Talalay methodによるisobologram解析で明らかとなった。ヌードマウスを用いたPC-3皮下腫瘍モデルでの検討では、併用療法は有意に腫瘍の増大を抑制した。大変興味深いことには、併用療法はヒストンのアセチル化も相乗的に促進し、これに伴いp21の発現が増加した。SAHAはヒストンをアセチル化するもののユビキチン化蛋白を蓄積せず、一方でbortezomibはユビキチン化蛋白を蓄積しヒストンをアセチル化したことから、ヒストンアセチル化はユビキチン化蛋白蓄積の2次的な現象と考えられた。更にアンドロゲンレセプターの発現がボルテゾミブの作用を減弱すること、SAHAがアンドロゲンレセプターの発現を抑制することも見出された。SAHAとbortezomibの併用療法につき併用効果、そのメカニズムにつき更に詳しく解明することが出来た。また、ritonavirとbortezomibの併用についてもユビキチン化蛋白を蓄積することが示された。これらは、ほぼ当初の計画通り進行した結果と言える。