hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南アジアにおける赤痢アメーバ症のゲノム疫学および免疫学的コホート研究

バングラデシュにおいて赤痢アメーバ症のゲノム疫学および免疫学的コホート研究を展開した。研究期間中、生後30ヶ月までの新生児385人より1426検体の下痢便検体が得られた。病原性E. histolyticaに加えて、非病原性E. dispar、病原性が未確定のE. moshkovskiiの検出・同定を試みたところ、4.6%の検体において病原性E. histolyticaが検出され、およそ3%の検体においてはE. moshkovskiiが検出され、同原虫と下痢症との相関関係が認められた。一方、非病原性E. disparは僅か0.4%の検体で検出されるにとどまった。さらに、少なくとも6検体がE. moshkovskii単独感染による下痢と考えられた。以上の研究結果よりE. moshkovskiiが小児下痢症の原因となる病原性アメーバである可能性が示唆された。赤痢アメーバ症は発展途上国における小児下痢症の主要原因であり、世界中の感染者人口およそ5000万人、同症で毎年10万人の命が失われています。我々は赤痢アメーバ症が蔓延している南アジアにおいて、感染の成立から赤痢アメーバ症の発症・重症化までを規定する宿主因子ならびに病原体の病原性因子の同定を目指して国際的な共同研究を開始しました。具体的には、1.ICDDR,B.(国際下痢症研究センタ、ダッカ、バングラデシュ)で研究の詳細を綿密に打ち合わせ、2.ダッカ市のスラム街Mirpurで保健婦の方々も交えて研究計画の詳細に関する確認を行い、3.コホート集団を設定し、ICDDR,B.の倫理委員会での承認を経て、家屋配置も含めた住民台帳の準備、ICDDR,B.による個人情報の管理・保護をスタートさせました。実際の研究に関しては、現在、追跡している既存の400名のコホート集団のSNPs解析を更に推し進めると共に、新生児を漸次コホート研究の対象に追加してきました。新生児乳幼児の感染と免疫応答の動態を疫学的に捕捉するために最終的には500人の新生児群を追加する予定です。現地の医療スタッフがコホート集団の追跡調査を行っており、下痢・発熱・腹痛・赤痢アメーバの感染などのエピソードに関して経時的に観察・治療を続けています。また、新生児からから血清と末梢血単核球を回収・刺激・上清の保存などを行い、母親から移行する赤痢アメーバのレクチン特異的移行抗体の測定や新生児末梢血単核球の赤痢アメーバに対する自然免疫応答の測定などに備えています。赤痢アメーバ症は発展途上国における小児下痢症の主要原因であり、世界中の感染者人口はおよそ5000万人、同症で毎年10万人の命が失われている。効果的な対策には、赤痢アメーバの感染成立のメカニズムならびに同原虫に対する感染防御機構の理解が不可欠である。我々は赤痢アメーバ症が蔓延している南アジアにおいて、国際的な共同研究を展開し、感染の成立から赤痢アメーバ症の発症・重症化までを規定する宿主因子ならびに病原体の病原性因子の同定を目指している。前述の目的を達成するため、バングラデシュ国際下痢症研究センター(ICDDR,B.)のRashidul Haque博士、Mondal Dinesh博士、ヴァージニア大学のWilliam A.Petri Jr.博士と綿密な打ち合わせを重ね、調査地であるバングラデシュはダッカのスラム街ミルプールにおいて、既存の400名のコホート集団に加えて、新たにコホート研究対象となった400人余りの新生児に関して追跡調査を行い、10年前に同地域で行われた研究に比べて赤痢アメーバの罹患率が低下していることを明らかにした。また出生半年後の乳児から末梢血単核球と血清を回収し、末梢血単核球の赤痢アメーバに対する自然免疫応答を測定(上清中の炎症性サイトカインの量をCytokine Bio-Plexで測定)すると共に、赤痢アメーバのレクチン特異的移行抗体の推移を測定した。次年度以降は、これらデータの詳しい解析に着手すると共に、さらなるコホート研究を継続する予定である。我々はPetri教授やHaque博士らと共にバングラデシュのミルプールでCohort研究に携わり、同研究における免疫学的側面を強化すると共に、スラムの現状に対する理解を深めてきた。赤痢アメーバ症の動物モデルを使用した研究より、病原性が未確定の赤痢アメーバEntamoeba moshkovskiiがCBA/Jの腸管に定着し下痢や粘血便などアメーバ赤痢に典型的な消化管症状を引き起こすことが判明したため、今回、E.moshkovskiiのヒトにおける下痢原性を調査した。

まず、同地域において新たに開始された約400人の新生児・乳児を対象としたBirth Cohort研究において、下痢エピソードとE.histolytica,E.moshkovskii,E.disparの関連性を調査した。すると生後30ヶ月までの小児に認められるアメーバ陽性下痢検体において、E.histolytica陽性検体が約38%、E.moshkovskii陽性検体が約59%、非病原性E.dispar陽性検体が5%であった。同地域での健常者におけるアメーバとしては、非病原性E.disparが最も蔓延していろことから、下痢エピソードとE.histolyticaならびにE.moshkoyskiiの強い関連が示唆された。また、E.moshkovskii陽性検体42例において、下痢を引き起こす可能性のある原虫7種、細菌8種、ウイルス6種などと多重感染している検体を除いたところ、少なくとも6検体では、E.moshkovskiiのみが陽性であり、病原性E.histolyticaに加えて、ヒトにおいてもE.moshkoyskiiも病原性を有することが強く示唆された。
農村生活環境整備の経済評価と生活圏重視の農村整備に関する研究

わが国農政に求められているのは、将来にわたって国民生活及び経済に安定的な役割を果たすことはもとより、農村地域における自然的、社会的諸条件等を考慮する中で農業の生産基盤整備やこれと密接に関連を持つ農村生活環境の整備を総合的に実施し併せて都市と農村の交流促進のための条件整備を図りながら活力ある農村地域を発展させることが重要な課題となっている。具体的な農政施策として農村生活環境整備事業の実施では、これまで定住促進、地域活性化、景観形成等の直接的な効果以外に地域にもたらした様々な波及的効果が生み出されていると云われているが、実際にはこれらの効果を適切に測定・評価していないのが現状である。そこで、本研究では、農村生活環境整備事業がもたらす質的・量的な側面を包含する多面的効果をマクロ計量経済モデルによるシミュレーション分析を通じて実際に計測し、政策評価を行った。また、農村地域の計画的な整備の促進、有効な事業の実施手法を検討するために実態調査を行い、今後の農村地域の活性化戦略に向けた総合的、計画的な整備のあり方や地域資源の有効活用による地域づくりを実現するための各種施策を提言した。計量分析並びに実態調査の結果、(1)農村生活の質の向上を意図する当該整備は、農地のスプロール的改廃の抑制を通じて耕地面積、作付面積を増加、農業部門の投資・生産、分配面へプラス効果。(2)非農業部門に対しては、住環境整備による新規住宅需要の創出や建設・不動産等関連産業への誘発、さらに3次産業及び消費需要への効果や経済効率が高い。また、農村生活環境整備に関連した事業として、農村地域での有機性資源の堆肥化・資源化に向けた協働による地域環境創造事業(例えば、生ゴミの堆肥化処理委託事業等)は、社会的便益評価の観点から経済的合理性を十分に有することが確認された。本研究は、農村生活環境整備事業がもたらす質的・量的な側面を包含する多面的効果を可能な限りモデル化し得る有効なシミュレータを構築し、実際にこれらの効果を適切に把握し評価を行い、今後の農村地域の活性化戦略に向けた総合的、計画的な整備のあり方や地域資源の有効活用による地域づくりを実現するための各種施策を提言するものである。初年度である本年度は、農村生活環境整備事業の効果測定の基本的な考え方の検討するとともに、併せて理論モデルの定式化に関して検討を行った。具体的に本年度実施した内容は以下の通りである。1)農村生活環境基盤整備事業の実施による地域及び地域住民に与える影響について、主に北海道の十勝エリア、斜網根釧エリアの農村部、また、札幌圏を中心とした都市部それぞれについてヒアリング調査を実施した。2)ヒアリング調査の結果を踏まえ、生活環境基盤整備事業の効果計測に必要な基礎データの収集と具体的に計量モデルを構築するための公表統計データの抽出・整理を行った。3)本年度は、農村生活基盤事業がもたらす農業生産・農家経済構造、非農業・国民経済全体への相互依存関係について、その波及構造を考慮し得る全体構造を理論モデルにより構築した。4)都市部と農村部との混住社会化の進展を考慮し得る効果フローの作成を行うとともに、データ収集、理論モデルの構築を行った。以上、今年度の中間的な成果を踏まえながら、次年度では、構築した理論モデルに従って、具体的な計量モデルを定式化するとともに、シミュレーションによる効果分析を実施する。併せて、生活の質やアメニティといった質的指標の検討や全体として農村環境を評価する手法の検討を加え、具体的な政策評価と提言を行うものである。

わが国農政に求められているのは、将来にわたって国民生活及び経済に安定的な役割を果たすことはもとより、農村地域における自然的、社会的諸条件等を考慮する中で農業の生産基盤整備やこれと密接に関連を持つ農村生活環境の整備を総合的に実施し併せて都市と農村の交流促進のための条件整備を図りながら活力ある農村地域を発展させることが重要な課題となっている。具体的な農政施策として農村生活環境整備事業の実施では、これまで定住促進、地域活性化、景観形成等の直接的な効果以外に地域にもたらした様々な波及的効果が生み出されていると云われているが、実際にはこれらの効果を適切に測定・評価していないのが現状である。そこで、本研究では、農村生活環境整備事業がもたらす質的・量的な側面を包含する多面的効果をマクロ計量経済モデルによるシミュレーション分析を通じて実際に計測し、政策評価を行った。また、農村地域の計画的な整備の促進、有効な事業の実施手法を検討するために実態調査を行い、今後の農村地域の活性化戦略に向けた総合的、計画的な整備のあり方や地域資源の有効活用による地域づくりを実現するための各種施策を提言した。計量分析並びに実態調査の結果、(1)農村生活の質の向上を意図する当該整備は、農地のスプロール的改廃の抑制を通じて耕地面積、作付面積を増加、農業部門の投資・生産、分配面へプラス効果。(2)非農業部門に対しては、住環境整備による新規住宅需要の創出や建設・不動産等関連産業への誘発、さらに3次産業及び消費需要への効果や経済効率が高い。また、農村生活環境整備に関連した事業として、農村地域での有機性資源の堆肥化・資源化に向けた協働による地域環境創造事業(例えば、生ゴミの堆肥化処理委託事業等)は、社会的便益評価の観点から経済的合理性を十分に有することが確認された。
自己修復機能を有する多孔性ソフトマテリアルの創出

ナノサイズ空間を有する分子である金属錯体多面体(MOP)を用い、自己集合化プロセスを制御することで、多孔性を有するソフトマテリアル(ゲルやコロイド粒子)を合成する研究は、空間機能と材料物性の相関という基礎的研究に加えて、空間材料のプロセッシングといった応用研究への展開にむけて大変重要である。本研究では、これまでの多孔性材料では達成できなかった自己修復能の発現を目指す。課題としては、(1)MOP表面の事後修飾による可逆的結合サイトの導入、(2)超分子重合によるゲル化、(3)自己修復能評価と(2)へのフィードバック、(4)多孔性ゲルの機能評価を行う。
新世代光ネットワーク基盤におけるコンテンツベース交換方式

光回線/光パケット/光バースト交換網などの将来ネットワークに対し、それらをコンテンツ転送という視点から統一的に扱うことが可能な新たな光・電気融合ネットワーク基盤を提案し、拡張設計を行った上で・仕様を作成した。全光の交換処理ではなく、特定の中継ノードで光電変換を伴うトランスルーセント(半透明)な光ネットワークにおいて、転送コンテンツのサイズと各中継ノードにおける波長・メモリなどのネットワーク資源の利用状況に基づき光電変換処理及び蓄積転送処理を行うべき必要最低限の中継点を自律的に決定する制御を確立し、そのシグナリング規律を拡張設計した。シミュレーション評価により性能改善効果を明らかにした。最終目標である新世代光ネットワーク基盤におけるコンテンツベース交換方式の確立に向けて、平成24年度は、前年度の基礎評価の結果、問題となっていた中継トラヒックとアクセス部からの入力トラヒックが混在するため、長距離パスの特性が大きく劣化する問題に対応するため、波長資源の優先利用領域を確保する方式を導入した。次に、前年度では、コンテンツのサイズに応じて、ブロッキング特性や遅延特性に大きな違いがでることから、サイズに応じた異なるシグナリング方式を検討・評価してきたが、根本的な問題として、サイズ境界をどのように決定するかという方針が確定しない。そこで、シグナリング方式を統一化するため、絶対的なサイズによる判定ではなく、基本的に経路上の波長資源とノード内メモリ資源の空き状況に応じて特定サイズのコンテンツの伝送要求をLarge用として扱うか、Small用として扱うかを適応的に判断する方式を提案した。途中で資源が不足した場合などの各ケースに対して網羅的にシグナリング手順を規定した。性能評価のためには大幅なシミュレータ改良を伴うことが自明であったため、平成24年度は入念な仕様の策定と、性能評価が可能なOmnet++を利用した計算機シミュレータの構築に専念した。また、詳細に規定できていなかった、アクセス部における、コンテンツ転送要求が不可能であった場合の再試行の方式や複数の転送要求のスケジューリング機構の方式を検討し、具体的な手順を明確化した。本研究では,様々な種類の大容量通信を伝送・交換することができる将来のネットワークアーキテクチャの確立を目的として,これまで個別に研究開発が進められてきた光回線交換網,光パケット交換網,光バースト交換網などの将来ネットワークに対し,それらをコンテンツ転送という視点から統一的に扱うことが可能な新たな光・電気融合ネットワーク基盤を提案し,継続して詳細設計を行った.全光の交換処理ではなく,特定の中継ノードで光電変換を伴うトランスルーセント(半透明)な光ネットワークにおいて,転送コンテンツのサイズと各中継ノードにおける波長・メモリなどのネットワーク資源の利用状況に基づき,光電変換処理及び蓄積転送処理を行うべき必要最低限の中継点を自律的に決定する制御を確立し,そのシグナリング規律を詳細に設計した.さまざまな条件におけるシグナリングを網羅的に抽出し,適切な手続きを明確化した.また,計算機シミュレーションによる性能評価を通して,各種交換原理を統一化した提案方式により,コネクションの接続成功率が向上することを定量的に明らかにした.転送対象である情報(コンテンツ)を一体として伝送するという斬新な原理を導入し,情報転送の単位をパケット,部分ファイル,完全ファイル,複数ファイル集合など,任意に設定可能とすることにより,従来のTCP/IPネットワークにおける情報の細断に伴う不到達問題や順序逆転問題,部分再送問題などの複雑性を原理的に解消できることを示唆した.送受信ノード間距離が離れた通信に対して,特に接続成功率が低下するという接続品質の不公平性問題に対し,優先利用波長領域を導入し,適応的にその優先領域を変更することにより,長距離大容量伝送の要求に対する接続成功率を向上させ,公平な接続品質を達成した.光回線/光パケット/光バースト交換網などの将来ネットワークに対し、それらをコンテンツ転送という視点から統一的に扱うことが可能な新たな光・電気融合ネットワーク基盤を提案し、拡張設計を行った上で・仕様を作成した。最終目標である新世代光ネットワーク基盤におけるコンテンツベース交換方式の確立に向けて、平成23年度は、基本方式や原理の詳細化を行い、基本特性の基礎評価を行った。具体的な成果は以下のとおりである。まず、詳細なシグナリングプロトコルを設計した。コンテンツ転送に先立ちシグナリングプロトコルによりメモリ確保や波長リンクの予約を行う必要がある。上記の物理資源を確保できない場合にコンテンツ交換ノードでの大容量蓄積部での蓄積を遂行する。いくつかのアプローチでシグナリング手順を検討した結果、メモリ資源の容量や往復の信号伝搬遅延に対し相対的に大きなコンテンツと小さなコンテンツでシグナリング手順を変更すべきであると判断し、適切な基本提案方式を規定することができた。また、ノードの構成法に関して詳細な検討を行い、入出力側のインタフェースカードに対し、交換部を光交換部と電気交換部を並列に配置し、光カットスルーと電気蓄積交換とを資源予約処理の状況に応じて自在に切り替えることが可能なコアの交換ノードアーキテクチャを採用することとした。これにより、全光伝送交換の高速性と電気交換の蓄積能力を適応的に使い分けることが可能となった。次に、計算機上でOmnet++を利用した提案方式のシミュレータを開発した。本シミュレータを用いた基本性能評価を行い、光回線交換とコンテンツベース交換とを転送時間と転送要求の棄却率の面から比較した。

その結果、両方式間で転送時間の大きな差はなく、ホップ数の長い経路の設定要求に対して特に棄却率を大きく改善できることが明らかとなった。様々な種類の大容量通信を伝送・交換することができる将来のネットワークアーキテクチャの確立を目的として、これまで個別に研究開発が進められてきた光回線交換網、光パケット交換網、光バースト交換網などの将来ネットワークに対し、それらをコンテンツ転送という視点から統一的に扱うことが可能な新たな光・電気融合ネットワーク基盤を提案し、拡張設計を行った上で・仕様を作成した。全光の交換処理ではなく、特定の中継ノードで光電変換を伴うトランスルーセント(半透明)な光ネットワークにおいて、転送コンテンツのサイズと各中継ノードにおける波長・メモリなどのネットワーク資源の利用状況に基づき光電変換処理及び蓄積転送処理を行うべき必要最低限の中継点を自律的に決定する制御を確立し、そのシグナリング規律を拡張設計した。様々な条件におけるシグナリングを網羅的に抽出し、適切な手続きを明確化した。また、計算機シミュレーションによる性能評価を通して、各種交換原理を統一した提案方式により、コネクションの成功確率が向上することを定量的に実証した。提案方式の普及問題に着眼し、提案方式を実装した交換機がネットワークコア部に限定的に設置された場合の制御機構を提案・設計し、計算機シミュレーションによりある程度の割合の提案ルータが存在すれば性能向上が見込まれることを実証した。提案方式を経路設定問題について、事前計算型経路候補を全体の負荷バランスを考慮に入れつつ事前に準備する方式をヒューリスティック・メタヒューリスティックの両視点から提案し、その負荷バランス効果を計算機シミュレーションを通して実証した。総合領域-情報学・計算機システム・ネットワーク当初の予定とは異なり、段階を踏んで研究を進めて行くにつれて、新たな課題が浮上したものの、本研究全体における各課題解決の重要度を鑑みて、適切な改良を行うことができている。平成24年度の研究の進捗により、より多様性のある、フレキシブルなネットワーク制御方式が確立できた。本申請課題では、将来の全光ネットワーク基盤と連携可能であるコンテンツ配信指向のフレキシブルなネットワーク基盤のあり方に関して、情報の交換・転送単位を敢えてコンテンツそのものに拡張した「コンテンツベース交換網」という新たなパラダイムを提唱し、技術的課題を抽出するとともに、有効性を定量的に明らかにすることを目的としているが、本目的に対し、新方式を提案し、きわめて詳細に設計を行った。本方式では、経路に沿ったシグナリングを経て適切なコンテンツ交換ノード間で、互いに独立なコンテンツ単位の蓄積・交換・転送を行う。
結合振動子としての生命システムの自律分散的な機能発現と位相ダイナミクス

哺乳動物由来の培養細胞の代謝相関と協調による同調的な細胞機能を実験的に研究した。すなわち、ヒト子宮頸がん細胞であるHeLaに抗腫瘍薬を投与しアポトーシスを誘導すると、ある培養条件下でアポトーシス進行が局所的に同期し、巨視的スケールでチューリング様構造を形成することを見い出した。このようにアポトーシスに関わる細胞内シグナル伝達が細胞を超えて相関をもち、何らかの協調機構の存在が示唆されたため、この新奇なパターン形成現象について詳しく調べた。まず細胞からの代謝シグナルを無侵襲的に検出する目的で、昨年度までに構築した極微弱発光測定装置を改良し、検出感度を高めるとともに細胞培養の維持時間を60時間まで延長し、長時間にわたる代謝変動の測定を可能とした。ここで極微弱発光(UPE)とは、細胞内代謝やシグナル伝達において生じるフリーラジカルを起因とする発光現象である。通常状態にある細胞は活性酸素消去系などの作用によりほとんど発光を示さないが、生体防御機構によりフリーラジカル生成量が過剰となると、細胞構成成分の過酸化とともにUPEが増大する。次に、アポトーシスのうちフリーラジカルが関わるシグナル伝達過程に着目し、UPEを用いてアポトーシス動態を詳しく観察した。実験系には抗がん剤(2-ME)による腫瘍細胞(培養細胞)のアポトーシスを用いた。細胞から発生するUPEを高感度計測した。その結果、2-MEを投与しない培養条件では、HeLa細胞はごくわずかのUPEを示すのみであったのに対し、2-MEを投与すると細胞からの発光レベルが有意に上昇した。発光強度は時間的に一定でなく絶えず揺らいだ。一方、同調培養を行ったサンプルに2-MEを投与すると、ほぼ一定の時期に顕著な発光バーストが見いだされた。この発光バーストのタイミングはアポトーシスに伴う細胞形態の変化に先立つため、発光バーストがアポトーシス最終段階のdeath signalではなく、シグナル伝達の比較的上流側の反応過程に依存することが示唆された。ここで発光バーストは細胞内シグナル伝達の細胞間相関を意味するが、このバーストとともにアポトーシス細胞のクラスター構造が観察された。この細胞間協調がマクロスコピック・スケールでのアポトーシスを亢進するものと考えられる。但しこの協調性を担う細胞間シグナル伝達機構は未解決として残された。多細胞システムの結合性・協調性と機能発現の関係を物理的観点から明らかにし、システムの自律分散機構を細胞間引き込みによる組織的ネットワーク形成として記述する為に、細胞を2次元的に分散培養した系における細胞集団の運動(遊走)、分裂増殖などのダイナミクスの時空間相関を調べた。まず培養細胞の2次元位相差像を長時間にわたって継続的に観察するための実験系を構築した。その上で、多細胞性の動物細胞(HeLa)の2次元界面上での運動と増殖をさまざまな生理条件・細胞密度の下で観察した。この細胞は情報伝達チャネルであるギャップ結合を失っているために細胞間の自律的な増殖調節機構が機能しない。それにも関わらず、細胞運動や分裂サイクル位相は、局所的には同調し、空間的コヒーレンスを示すことが実験的に分かった。またこのコヒーレンスは細胞同士が互いに接触せずある程度離れていても同様に見られる。このことは、細胞間にはギャップ結合を介さない長距離型の相互作用機構が存在することを示唆するが、この生理的背景はこれまで知られていない。そこで次に、細胞間の代謝活性相関を検出する指標を確立するために、細胞呼吸によって産生する活性酸素に着目した。細胞に備わる活性酸素消去機構によって分解されずに残留する余剰活性酸素は細胞膜や細胞内オルガネラを酸化しDNAに損傷を与えるが、このとき開放される電磁エネルギーが可視波長域のフォトン(極微弱生体発光)として放出される。そこでこのフォトンを超高感度光電子増倍管により検出することで、細胞動態をモニタリングすることができるか否かを実験的に検討した。その結果、細胞の代謝活性はフォトン発光量と相関があることが分かった。この検出法を用いて細胞の運動状態による代謝活性を計測したところ、多数の細胞が同調して増殖する場合とランダムに増殖する場合には、発生するフォトン量に有意な差異が見られた。すなわち細胞間の位相分布が、系全体の代謝活性量に反映することが明らかになった。これらの発見は細胞間相互作用とマクロスコピックな多細胞システムの代謝機能との連関を示すものであり、新しいタイプの細胞結合機構が系全体の代謝レベルを制御していると推測される。これについて今後さらに詳しく調べる予定である。多細胞システムにおける代謝制御の細胞間相関の一端を明らかにする目的で、アポトーシスのシグナル伝達過程に関与するフリーラジカルに着目し、極微弱生体発光によるモニタリングを試みた。ヒト子宮頚癌由来の株化細胞であるHeLaを分散培養し、有糸分裂を阻害してアポトーシスを誘導する2-メトキシエストラジオール(2-ME)を加え、細胞集団としてのアポトーシスの経過進行を観察した。その結果、細胞密度が低いときはアポトーシスに細胞間相関は見られず、ある一定の割合で細胞ごとに独立してアポトーシスを起こした。一方で細胞密度がある値を超えて高くなると、以下のような集団的効果が現れた。すなわち、(1)アポトーシス誘導が細胞間で協調的に起こり、(2)集団全体としてのアポトーシス発生率が格段に増大した。またこの際に、(3)一過的で強い発光が、ある決まった時刻(細胞死の46時間前)に観察された。

なお、極微弱発光が観察されるのは細胞周期におけるG2/M期であり、細胞質と染色体の複製が終わって細胞が球状に膨張した状態である。したがって発光に現れる細胞間相関はアポトーシス実行段階における細胞質を介した情報伝達ではなく、それ以前のアポトーシス決定段階における高効率の細胞間シグナル伝達によって成される。このシグナル因子は同定されていないが、非常に高速で隣接する細胞に伝達し機能を発現する因子であると推測される。今回見い出した現象が細胞密度に依存することから、細胞間相互作用に対して臨界的な細胞密度が存在し、これを超えると時間的・空間的な細胞間相関が顕著となって集団的なアポトーシスが起こったものと考えられる。したがってこの現象を支配する相互作用の因子を同定することで、アポトーシスや制癌作用の効率、ならびに制癌剤等の薬効を高めることができると期待される。哺乳動物由来の培養細胞の代謝相関と協調による同調的な細胞機能を実験的に研究した。すなわち、ヒト子宮頸がん細胞であるHeLaに抗腫瘍薬を投与しアポトーシスを誘導すると、ある培養条件下でアポトーシス進行が局所的に同期し、巨視的スケールでチューリング様構造を形成することを見い出した。このようにアポトーシスに関わる細胞内シグナル伝達が細胞を超えて相関をもち、何らかの協調機構の存在が示唆されたため、この新奇なパターン形成現象について詳しく調べた。まず細胞からの代謝シグナルを無侵襲的に検出する目的で、昨年度までに構築した極微弱発光測定装置を改良し、検出感度を高めるとともに細胞培養の維持時間を60時間まで延長し、長時間にわたる代謝変動の測定を可能とした。ここで極微弱発光(UPE)とは、細胞内代謝やシグナル伝達において生じるフリーラジカルを起因とする発光現象である。通常状態にある細胞は活性酸素消去系などの作用によりほとんど発光を示さないが、生体防御機構によりフリーラジカル生成量が過剰となると、細胞構成成分の過酸化とともにUPEが増大する。次に、アポトーシスのうちフリーラジカルが関わるシグナル伝達過程に着目し、UPEを用いてアポトーシス動態を詳しく観察した。実験系には抗がん剤(2-ME)による腫瘍細胞(培養細胞)のアポトーシスを用いた。細胞から発生するUPEを高感度計測した。その結果、2-MEを投与しない培養条件では、HeLa細胞はごくわずかのUPEを示すのみであったのに対し、2-MEを投与すると細胞からの発光レベルが有意に上昇した。発光強度は時間的に一定でなく絶えず揺らいだ。一方、同調培養を行ったサンプルに2-MEを投与すると、ほぼ一定の時期に顕著な発光バーストが見いだされた。この発光バーストのタイミングはアポトーシスに伴う細胞形態の変化に先立つため、発光バーストがアポトーシス最終段階のdeath signalではなく、シグナル伝達の比較的上流側の反応過程に依存することが示唆された。ここで発光バーストは細胞内シグナル伝達の細胞間相関を意味するが、このバーストとともにアポトーシス細胞のクラスター構造が観察された。この細胞間協調がマクロスコピック・スケールでのアポトーシスを亢進するものと考えられる。但しこの協調性を担う細胞間シグナル伝達機構は未解決として残された。
消化管における上皮細胞増殖因子(EGF)前駆体の生理的、病態的意義に関する研究

1.高分子EGFの酵素免疫測定系の調節ヒトEGF前駆体の分子構造中、高分子EGFに相当するアミノ酸配列のうちN末端より858番-873番、952番-969番のペプタイドを合成した。これらを牛血清アルブミンまたはヘモシアニンにカップリングし、えられた4種類の抗原で家兎を免疫し、特異的抗体(γ-グロブリン分画)として858-873抗体(抗体I)、952-969抗体(抗体II)をえた。これら両抗体とすでに所有している抗ヒトEGF抗体をそれぞれ一次抗体、二次抗体とする組み合わせによる各種サンドイッチ型EIA系を調整し、湧永製薬研究所より提供されたヒト高分子EGFをスタンダ-ドとして測定系を検定した。しかし、蛍光強度の最大値は約3倍にとどまり、高分子EGFのEIAの確立には本研究で用いたよりも高分子のペプタイドを合成し検討を進めることの是非を検討中である。2.高分子のEGFの精製健常男性尿からえられた290gの高分子EGF溶出濃縮液(日立化成より提供)を精製し約300ngのヒト高分子EGFをえた。しかし、EIA系の調整には少なくともμg単位の量が必要で、これに要する数千リッタ-の人尿の収集は極めて困難なため高分子EGFの自己精製は不可能と判断した。3.EGFの臓器局在性に関する免疫組織学的検討抗体I、抗体IIを用い、剖検でえられたヒト正常腎臓の血管内膜細胞、尿細管上皮、間質、顎下腺の導管上皮、間質に染色陽性所見がえられ、現在、染色像について高分子EGFであることの同定を検討する一方、他臓器についても染色を進めている。1.高分子EGFの精製高分子EGFの尿よりの精製はゲル濾過等によりおこなったが、尿中の高分子EGF濃度は低く、約300ng(ヒトEGF換算)を精製したにすぎなかった。そのため、EGF前駆体EIA系のスタンダードには湧永製薬株式会社より提供された高分子EGF(5μgヒトEGF換算)を使用している。ヒト尿中の高分子EGFは収量が低く、高分子EGF精製には大量スケールの精製法が必要であると考えられた。2.ペプチド合成によるEGF前駆体抗原の合成Bellらによって決定されたEGF前駆体の分子構造中高分子EGFに相当する部分(N末端より828-1023番目)のアミノ酸配列のうち、858-873(分子量1668)、952-969(分子量2099)の2種類のポリペプチドを合成した。(塩野義製薬に合成を依頼)3.抗EGF前駆体抗体の調製及びEIA系の確立合成したペプチドをbovine serum albumin(BSA)をキャリアとして家兎に免疫したところ、858-873,952-969の両ペプチドに対する抗体が得られた。抗体価測定にはimmunablottingとEGF抗体を用いたヘテロEIA法を用いた。これらの抗体(γ-G1b分画)から、それぞれのペプチドにアームスペーサーをつけセファロースに結合させたアフィニティカラムにより、さらに特異的な抗体を単離した。現在この特異抗体を用いEGF前駆体EIA系を調整している。4.免疫組織化学的検討今後、抗EGF前駆体抗体を用い、手術、剖検で得られるヒト唾液腺、消化管組織、膵、肝、腎などを対象にヒト臓器に於けるEGF前駆体あるいは高分子EGFの局在と産生細胞の同定を行う予定である。1.高分子EGFに対するEIA系の調整昨年度報告したように、高分子EGFのアミノ酸配列から2種類のペプタイドを合成し、それに対する抗体(858ー873抗体:抗体I、952ー969抗体:抗体II)を調整した。

これらにすでに所有している抗ヒトEGF抗体をくわえた3種類の抗体の組み合わせでサンドイッチ型EIAを調整し、湧永製薬から提供されたヒト高分子EGFをスタンダ-ドとして測定系を検定した。しかし、蛍光強度は最大約3倍にとどまり、このため、競合阻害反応による酵素標識免疫吸着法でも測定系を検討したが、所期の感度を得るに至らなかった。以上より、高分子EGFのEIA系の確立にはさらにアフイニテイの高い抗体の調整を現在検討中である。2.高分子EGFの局在に関する免疫組織学的検討抗体I、IIを用いABC法により、まずラットの顎下腺、膵蔵、肝蔵、腎蔵、胃、十二指腸、大腸について染色を試みた。しかし、いずれの臓器とも染色像は得られず、その原因として高分子EGFに対する両抗体のcross-reactivityの欠如もしくは抗体の組織へのlow affinityなどが推測てれた。ABC法の信頼性に関しては、所有している抗ヒトペプシノ-ゲンIおよびII抗体でラット顎下腺とヒト胃について染色を行ない検定した。その結果、ヒト胃の主細胞には明瞭な染色像が得られ、ABC法の手法には問題ないと判断している。つぎに、ヒトに正常腎蔵と顎下腺では、抗体IIによって腎蔵の血管内膜細胞、尿細管上皮および間質、顎下腺では腺管と間質に陽性所見が得られた。現在この染色像が高分子EGFであることの同定を進めている。
子宮内膜症発症・内膜症性嚢胞癌化に関わる腟細菌叢のメタゲノム解析

体内細菌叢が各種疾患と関連することが明らかになり、メタゲノム解析は非常に注目されている。本邦では子宮内膜症の若年化や、子宮内膜症が前駆病変の卵巣明細胞癌の増加が報告されており、そのために若年者の卵巣癌死亡率は欧米よりも高い。子宮内膜症と月経血逆流・腹腔内免疫系と密接な関連及び、性交開始の若年化・Sex Partnerの増加という若年女性の性行動の変化という二つの観点から、申請者は子宮内膜症の若年化と腟細菌叢との関連性を想定した。そこで本研究では、子宮内膜症、明細胞腺癌発症のリスク因子となる細菌群の特定を試みることが目的である。まず初めにヒトの腟内細菌叢と婦人科疾患との関連を検討するために準備段階として日本人と韓国人の腟内細菌叢を解析した。日本人女性計67人の腟内分泌液からDNA抽出し、次世代シークエンサーIonPGMで16S rRNA遺伝子領域をシークエンスして細菌叢データを得た。また、MiSeqによりシークエンスを行った韓国人542人のデータも使用した。これをGenomeSyncを使った独自の高解像度ゲノム解析にかけ、さらにMultiExperiment Viewer(MeV)を用いて細菌種分布のクラスタリング解析を行った。種レベルで細菌叢を比較解析した結果、日本人サンプルでは細菌種分布に基づき少なくとも6、人数が少ないものを合わせると9つのクラスターに分けられた。このうちLactobacillus属が優占するクラスターは人数が最大で、韓国人でも同様であり、Simpsonの多様度指数は他のクラスターよりも低かった。一方、Lactobacillus inersは例外的に多くのクラスターに含まれていた。疾患群ごとのクラスター組成を調べたところ、がんの病態になるとPrevotella biviaが優占するクラスターJ6の割合が増える傾向が見られた。我々はすでに予備実験を行い、日本人と韓国人を対象に腟細菌叢の多様性解析を行い、6つのグループに症例を分類できることを第41回日本分子生物学会2018 (横浜)にて発表を行っている(演題名:次世代シークエンサーを用いたヒト腟内細菌叢の多様性解析)。本研究は、共同研究者の持つ方法にて検査方法は確立していることから、子宮内膜症、明細胞腺癌患者の腟帯下をできるだけ多く採取することを試みる。初年度は、すでに研究計画申請承認前よりも前に行っていたパイロット研究の結果の分析・検討とサンプルの収集を中心に行っていたために経費が予想よりも少なくて済んだ。次年度には採集されたサンプルを用いた分析、論文投稿費用、学会報告を行うことに繰越金を充当する予定である。
FT-ICRによるシリコンクラスターの化学反応と構造制御

1991年に発見されたカーボンナノチューブは炭素原子の6員環と5員環で編まれたネットワーク構造をもち,単層のナノチューブ(SWNT : single-walled carbon nanotube)と,複数のチューブが入れ子状になった多層ナノチューブ(MWNT : multi-walled carbon nanotube)の2種類に分類される.カーボンナノチューブはその幾何学的構造に基づく,様々な物理・化学的性質から新しい材料としての応用が期待されており,ナノテクノロジーの代表的な新素材である.一例を挙げると,電子素子,平面型ディスプレーなどのための電界放出電子源,走査型プローブ顕微鏡の探針,熱伝導素子,高強度材料,導電性複合材料やガス吸蔵材として利用するための応用研究も活発に行われている.一方,SWNTsの大量生成に関してはCVD法やHiPco法による生成に期待が持たれており,本研究室でもアルコールを炭素供給源とした新合成法ACCVD法を確立している.しかしながらその成長過程に関しては不明な点が多く,高品質なSWNTsを生成するためには基礎的な研究が必要である.CVD法では触媒として遷移金属が広く用いられるが,最近では単一種の金属を用いるよりも混合金属を触媒として用いるほうが,より効果的な触媒作用を得ることが分かってきた.そこで本研究ではカーボンナノチューブに対して非常に効率的な鉄・コバルト混合金属の触媒機構を理解するため,混合クラスターの生成機構を主に調べ,アルコールとの反応に関しても調べた.カーボンナノチューブは炭素原子の6員環と5員環で編まれたネットワーク構造をもち,単層のナノチューブ(SWNT : single-walled carbon nanotube)と,複数のチューブが入れ子状になった多層ナノチューブ(MWNT : multi-walled carbon nanotube)の2種類に分類される.カーボンナノチューブはその幾何学的構造に基づく,様々な物理・化学的性質から新しい材料としての応用が期待されており,ナノテクノロジーの代表的な新素材である.一方,SWNTsの大量生成に関してはCVD法やHiPco法による生成に期待が持たれており,本研究室でもアルコールを炭素供給源とした新合成法ACCVD法を確立している.しかしながらその成長過程に関しては不明な点が多く,高品質なSWNTsを生成するためには基礎的な研究が必要である.CVD法では触媒として遷移金属が広く用いられるが,鉄,コバルト,ニッケルなどの遷移金属は他の反応分野でも使われており,クラスターレベルでの研究も多く進められている.しかしながらサイズの大きなクラスターは生成自体が困難であり,世界中で行われている研究の多くが10量体以下の小さなクラスターに関する研究である.そこで本研究では,既存の研究より一回り大きなサイズであり,またACCVD法での実際の触媒サイズを念頭に置いた遷移金属クラスターとエタノールとの素反応について実験をおこない,その反応機構を探った.遷移金属クラスター(Fe, Co, Ni)とエタノールの反応では,反応速度定数が定性的に同じ様相を示し,更に原子番号の順にシフトすることから価電子による影響が考えられる.コバルトクラスターとエタノールの同位体実験に成功し,脱水素反応で脱離する水素原子を特定できた.1991年に発見されたカーボンナノチューブは炭素原子の6員環と5員環で編まれたネットワーク構造をもち,単層のナノチューブ(SWNT : single-walled carbon nanotube)と,複数のチューブが入れ子状になった多層ナノチューブ(MWNT : multi-walled carbon nanotube)の2種類に分類される.カーボンナノチューブはその幾何学的構造に基づく,様々な物理・化学的性質から新しい材料としての応用が期待されており,ナノテクノロジーの代表的な新素材である.一例を挙げると,電子素子,平面型ディスプレーなどのための電界放出電子源,走査型プローブ顕微鏡の探針,熱伝導素子,高強度材料,導電性複合材料やガス吸蔵材として利用するための応用研究も活発に行われている.一方,SWNTsの大量生成に関してはCVD法やHiPco法による生成に期待が持たれており,本研究室でもアルコールを炭素供給源とした新合成法ACCVD法を確立している.しかしながらその成長過程に関しては不明な点が多く,高品質なSWNTsを生成するためには基礎的な研究が必要である.CVD法では触媒として遷移金属が広く用いられるが,最近では単一種の金属を用いるよりも混合金属を触媒として用いるほうが,より効果的な触媒作用を得ることが分かってきた.そこで本研究ではカーボンナノチューブに対して非常に効率的な鉄・コバルト混合金属の触媒機構を理解するため,混合クラスターの生成機構を主に調べ,アルコールとの反応に関しても調べた.
小学校高学年および中学校技術分野における先端技術の教材化と標準モデルの開発・評価

小学校高学年から中学生までを対象として,子どもたちが先端技術を直接体験することができる安価な教材を開発した。具体的には,マイクロコントローラを搭載した自律走行型ロボットの標準仕様ともいうべきものを開発した。基礎的なセンサは標準装備,ロボットの機構部分の製作は自由度が大きく,子どもの発想力を生かせる形のものを検討した。開発した教材については教育現場等で実践を行い,その効果について評価を行った。先端的な科学技術の基礎を子どもたちに教えようとするとき,その技術を取り込んだコンパクトな標準的な教材があれば,指導者の大きな助けとなると期待されることから,本研究では,先端技術を教材化して扱いやすい形で普及することを目的とし,特に,小学校高学年から中学生までを対象として,一貫して先端技術を学べるような,子どもたちが先端技術を直接体験することができる安価な教材の開発・評価・普及を目指している。この研究では,小学校および中学校において,教材として利用可能なロボットの標準仕様ともいうべきものを開発するため,具体的には,マイクロコントローラ搭載で自律走行が可能なビークル型ロボットで,基礎的なセンサは標準装備,ロボットの機構部分の製作は自由度が大きく,子どもの発想力を生かせる形としたい。いずれもプロトタイプを試作した後,研究室レベルで必要数を製作して,子どもたちに教材として授業実践を行い,有効性の評価とそれに基づいた改良を行い広く教材としての普及を考えている。そのため平成19年度は,ロボットのハードウェアの製作を中心に行なった。具体的には,(1)教材として参考になると考えられる市販ロボットの調査,(2)ロボットに盛り込むべき内容についての意見交換及び検討,(3)ロボットの基本設計(子どもたち自身によるフレーム・外形等のデザイン・製作可能性の検討等も含む),(4)ロボットの基本部分の製作,などを中心に検討を行い,継続して研究を行っている。プロトタイプを試作した後,研究室レベルで必要数を製作して,子どもたちに教材として授業実践を行い,有効性の評価とそれに基づいた改良を行い広く教材としての普及を考え,平成20年度は,ロボットのハードウェアの製作と子どもたちにも簡単に扱えるソフトウェアの製作を中心に行なった。具体的には,(1)ロボットに盛り込むべき内容についての意見交換及び検討,(2)ロボットの基本設計(子どもたち自身によるフレーム・外形等のデザイン・製作可能性の検討等も含む),(3)ロボット本体といくつかのセンサユニットの製作,(4)子どもたちにも簡単に扱えるロボット動作用プログラミングソフトウェアの製作などを中心に行い,今後の教育場面での実践に備えて継続して研究を行っている。この研究では,小学校および中学校において,教材として利用可能なロボットの標準仕様ともいうべきものを開発するため,具体的には,マイクロコントローラ搭載で自律走行が可能なビークル型ロボットで,基礎的なセンサは標準装備,ロボットの機構部分の製作は自由度が大きく,子どもの発想力を生かせる形のものを考えている。プロトタイプを試作した後,研究室レベルで必要数を製作して,子どもたちに教材として授業実践を行い,有効性の評価とそれに基づいた改良を行い広く教材としての普及を考え,平成21年度は,最終年度であるため,前年度に製作したロボットのハードウェア,および開発したソフトウェアを用いて,子どもたちに授業実践を行なった。具体的には,(1)教材として製作したロボットおよび開発したソフトウェアについての意見交換・検討,(2)実践案の作成と評価方法の開発,(3)製作したロボットを用いた子どもたちに対する実践と評価,などを中心に行い,20人程度の規模であるがそれなりの評価を得た。また,今後,更に大きな規模での実践に備えて研究を継続している。
都市公園の平面形態における形式分析

初年度は、事例研究の対象を日本国内における戦前の都市公園に限定したうえで、平面形態を(1)形態要素、(2)形態構成、(3)形態構造の3つの段階において分析した。その結果、戦前の小公園の平面構成は、平面形態を構成する軸の数とそれによって分割される図形の輪郭形態によって分類することが可能であること、さらに公園の中に植栽された樹木群と諸施設の配置形態の分析から、空間軸の象徴的表現、空間輪郭の明示、空間の等質化、空間機能の直接的・間接的表示などの形態構成上の特徴が抽出された。また、形態の求心性と拡散性、完結性と部分拡張性、外部閉鎖性と内部拡張性などが、形態構造的な概念として特定できた。第2年度は、初年度において実施した研究の成果から得られた平面形態の分析方法論を用いて、3つの異なる種類の都市公園を対象としたケ-ススタディを実施した。まず、台東区の小公園における平面形態の改変構造では、改修による形態要素と形態構成の変化は著しいが、それらは開園当初の平面形態が有していた構造的特徴に規定されるかたちで生じていることが明らかとなった。つぎに、防災公園の平面形態の特徴としては、空間に求められている機能の特殊性ゆえに、形態要素と形態構成のありかたに重点をおいた整備がなされている。しかし、どの事例においても、形態構成のヒエラルキ-を生成するために形態要素の配置を改変することによって、構造を形成する余地は十分にのこされていることが確認された。さらに、平面形態における「地域性」の演出手法を検討した国内の18の事例では、形態要素、形態構成、形態構造のいずれのレベルにおいても、「地域性」を意図したデザインのありかたを抽出することが可能であった。形態要素には素材と工法が、形態構成には公園の立地特性が、形態構造には公園敷地外部への視覚の延伸が、それぞれ対応しているものと推察された。初年度は、事例研究の対象を日本国内における戦前の都市公園に限定して実施した。具体的には、東京の日比谷公園、震災復興52小公園ならびに大阪、京都、神戸においてこの時期に開園された3つの都市公園である。これらの都市公園の平面形態を(1)形態要素、(2)形態構成、(3)形態構造の3つの段階において分析を行ない、以下の知見を得た。・震災復興小公園の平面構成は、平面形態を構成する軸の数とそれによって分割される図形の輪郭形によって分類することが可能である。その結果、「空間連結型」、「分節シンメトリ-型」、「一体シンメトリ-型」、「空間分節型」、「重複型」の5つのタイプを見いだすことができた。・公園の中に設置された樹木群と諸施設の配置形態の分析から、空間軸の象徴的表現、空間輪郭の明示、空間の等質化、空間機能の直接的・間接的表示、といった形態構成上の特徴が抽出された。・形態構成上の特徴が、一つの公園空間の内部に共存している状態を説明する形態構造的な概念として、形態の求心性と拡散性、完結性と部分拡張性、外部閉鎖性と内部拡張性、という3対の対立項を指摘することができた。・日比谷公園の平面形態は、全体を小公園のコラ-ジュとして理解することが可能であり、各部分の平面形態においては上記のような分析手法が有効であることが確認された。しかし、全体的な平面形態におけてる要素、構成、構造間の関係は、周辺の都市空間の変容と関連づけて分析する必要があることが確認された。

・戦前の大阪、京都において設計された都市公園では、敷地の立地する地域の固有性が強調される傾向が強く、震災復興小公園や日比谷公園のような特徴を明確に指摘することはできなかった。第2年度は、初年度において実施した研究の成果が得られた平面形態の分析方法論を用いて、下記の3つの異なる種類の都市公園を対象としたケ-ススタディを実施した。1.台東区の小公園における平面形態の改変構造:震災復興公園として戦前に設置され、東京都台東区に現存する小公園を対象として、戦後数次にわたって実施された改修において、オリジナルな平面形態が改変される過程をトレ-スした。その結果、改修による形態要素と形態構成の変化は著しいが、それらは開園当初の平面形態が有していた構造的特徴に規定されるかたちで生じていることが明らかとなった。2.防災公園の平面形態の特徴:関東地方の12か所を対象とした分析を実施した。震災時の一時非難場所として整備されてきた防災公園は、空間に求められる機能の特殊性ゆえに、形態要素と形態構成のありかたに重点をおいて整備がなされている。このため、日常の利用を想定した明確な形態構造・空間構造の把握は困難である。しかし、どの事例においても、形態構成のヒエラルキ-を生成するために形態要素の配置を改変することによって、構造を形成する余地は十分にのこされていることが確認された。3.平面形態における「地域性」の演出手法:日本国内の18の事例を対象に、「地域性」のデザイン的演出手法を平面形態から読み取る分析を行った。その結果、形態要素には素材と工法が、形態構成には公園の立地特性が、形態構造には公園敷地外部への視覚の延伸が、それぞれ対応しているものと推察された。
アジサイの花房型を制御する遺伝子の単離

本研究はアジサイの花房型の制御に関与する遺伝子の単離目的としている.本年度は,Subtractive Hybridization法により額咲き型花房で特異的に発現する遺伝子を探索するとともに,花房型制御遺伝子の機能及び発現時期の解明のために,額咲き型と手まり咲き型の栄養生長の比較を行った.Hydrangea macrophylla品種`ブルースカイ'(額咲き型)と, `ブルースカイ'から芽条変異により発生した手まり咲き変異枝の挿し木株(手鞠咲き型)を供試した.挿し木後40日目の発根率に関しては,花房型間で有意な差は認められなかった.鉢上げ後5ヶ月目の葉数についても大きな違いは認められなかった.しかし節間長に関しては,額咲き型が手まり咲き型に比べて有意に大きかった.一方,手まり咲き型は額咲き型に比べて,地際部からの側枝の発生が多い傾向が認められた.昨年度に引き続きSubtractive Hybridizationを行った.昨年度行った方法に関して,サブトラクト後のPCR増幅のためのアダプター配列について改良を行った.またハイブリダイゼーション温度について,マーカーを用いて特異性が最も高い適温を探索した結果,昨年度より5°C高い65°Cに設定した.サブトラク卜処理により得られた処理液をPCRで増幅し増幅産物をクローニングしたところ,1000-1500bpの長さの5個のクローンが単離された.これらの塩基配列を解析したところ,これらのうち4個は機能不明の未知の遺伝子であり,残り1個はcalreticulin遺伝子と相同性が高かった.今後,これらのクローンについてノーザン解析を行っていくとともに,さらにいくつかの発達ステージの花芽を用いてSubtractive Hybridizationを行い,花房型に特異的な遺伝子の探索を行っていく必要がある.本研究はアジサイの花房型の制御に関与する遺伝子の単離を目的としている.本年度は、額咲き型花房で特異的に発現する遺伝子を単離するために、Subtractive Hybridization法を行った.Hydrangea macrophylla品種'ブルースカイ'(額咲き型)と,'ブルースカイ'から芽条変異により発生した手まり咲き変異枝の挿し本株(手鞠咲き型)を供試した.額咲き型の花芽を0.03g、手まり咲き型の花芽を0.3gに調整し、それぞれmRNAを抽出した.磁性ビーズの付いたdTプライマーで逆転写を行い,磁性ビーズ付きのcDNA(アンチセンス鎖)を作成した.額咲き型では、このアンチセンス鎖のcDNAを鋳型として、センス鎖のcDNAを作成した.額咲き型のセンス鎖cDNAと手まり咲型のアンチセンス鎖cDNAをハイブリダイズした.ハイブリダイズにより2本鎖となったcDNAを磁石を用いて除去し、ハイブリダイズされなかった額咲き型のセンス鎖cDNAを回収した.このハイブリダイズ処理を5回行った後、ハイブリダイズされなかった額咲き型cDNAを含む溶液を用いてPCRを行った.PCR産物の電気泳動を行った結果、5002000bpの間に5本のバンドが得られた.今後、これらの増幅産物について塩基配列を決定しノーザン解析を行っていく予定である.また同様の手法で、手まり咲き型{こ特異的に発現する遺伝子についても調査する.アジサイにおけるカルスを経由した植物体再生系の確立を試みた.葉身と胚軸のいずれからもカルスは誘導されたが、葉身由来のカルスからの植物体の再生はほとんどみられなかった.胚軸を外植体として用いた場合、0.5mg・1^<-1>NAA添加培地で誘導したカルスを0.1mg・l^<-1>NAAと1mg・l^<-1>BAを添加した培地で培養すると、33%のカルスで不定芽が形成された.本研究はアジサイの花房型の制御に関与する遺伝子の単離目的としている.本年度は,Subtractive Hybridization法により額咲き型花房で特異的に発現する遺伝子を探索するとともに,花房型制御遺伝子の機能及び発現時期の解明のために,額咲き型と手まり咲き型の栄養生長の比較を行った.Hydrangea macrophylla品種`ブルースカイ'(額咲き型)と, `ブルースカイ'から芽条変異により発生した手まり咲き変異枝の挿し木株(手鞠咲き型)を供試した.挿し木後40日目の発根率に関しては,花房型間で有意な差は認められなかった.鉢上げ後5ヶ月目の葉数についても大きな違いは認められなかった.しかし節間長に関しては,額咲き型が手まり咲き型に比べて有意に大きかった.一方,手まり咲き型は額咲き型に比べて,地際部からの側枝の発生が多い傾向が認められた.昨年度に引き続きSubtractive Hybridizationを行った.昨年度行った方法に関して,サブトラクト後のPCR増幅のためのアダプター配列について改良を行った.またハイブリダイゼーション温度について,マーカーを用いて特異性が最も高い適温を探索した結果,昨年度より5°C高い65°Cに設定した.サブトラク卜処理により得られた処理液をPCRで増幅し増幅産物をクローニングしたところ,1000-1500bpの長さの5個のクローンが単離された.これらの塩基配列を解析したところ,これらのうち4個は機能不明の未知の遺伝子であり,残り1個はcalreticulin遺伝子と相同性が高かった.今後,これらのクローンについてノーザン解析を行っていくとともに,さらにいくつかの発達ステージの花芽を用いてSubtractive Hybridizationを行い,花房型に特異的な遺伝子の探索を行っていく必要がある.