hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳のクリアランス促進による恒常性維持機構の解明

脳卒中や外傷性脳損傷などの脳血管障害では、多くの場合、障害発生部位のみならず健康な部位にまで損傷が拡大してしまう二次的損傷が起こる。損傷拡大には、脳血管障害の超急性期に繰り返し生じる拡延性脱分極が関与している。拡延性脱分極の発生には、主に脳内のカリウムイオン(K+)濃度の急上昇が引き金となる。脳血管障害の一種である虚血性脳卒中では、梗塞によって生じる虚血が組織の壊死を引き起こす。現在利用されている脳梗塞の治療法は、血栓溶解剤や脳保護薬などの対処療法であり、細胞外K+濃度の正常化を標的とした具体的な治療法の開発が喫緊の課題となっていた。脳は、頭蓋骨の中で脳脊髄液に浸っている。脳脊髄液は、ナトリウムイオン(Na+)やK+をはじめとするさまざまなイオンが含まれており、健常状態にある脳では各イオン濃度は一定に保たれている。脳脊髄液は頭蓋内を循環し、その動態が脳機能の恒常性に重要な役割を果たしていると考えられるが、その詳細は完全には解明されていない。我々は、これまで脳脊髄液の動態に、水分子の動態が関与することに着目して研究を進めてきた。今年度は、脳脊髄液を脳組織内へ浸潤させる機序に、水分子の透過を担う「アクアポリン4」が関与する検証実験を行った。また脳脊髄液の動態に、神経伝達物質のノルアドレナリンが関与している可能性がある。これまで、アドレナリン受容体を阻害することによって、脳脊髄液の浸潤が促進されることが報告されている。さらに脳梗塞の直後、脳のノルアドレナリン濃度が急激に増加することが知られている。これまで、脳梗塞の超急性期においてアドレナリン受容体に着目した研究結果は断片的に報告されていたが、統一的な見解は得られていなかった。これまでに我々は、アドレナリン受容体を阻害することで、脳脊髄液の浸潤を促進し、脳梗塞後の細胞外K+濃度の正常化を図れると予想している。今年度は、以下の論文を出版した。ロチェスター大学メディカルセンター(アメリカ合衆国)を中心とした6カ国(アメリカ合衆国、デンマーク、スウェーデン、ノルウェー、中国、日本)14機関が連携、参画した共著論文。脳脊髄液の動態に、水分子の動態が関与することに着目して研究。脳脊髄液を脳組織内へ浸潤させる機序に、水分子の透過を担う「アクアポリン4」という膜タンパク質(チャネル分子)が関与する検証実験を担った。レーザーを用いた光血栓法によって、大脳皮質に局所的に脳梗塞を生じる脳梗塞モデルマウスを作製し、アドレナリン受容体の阻害薬の効果を調べた。24時間後に脳の損傷を評価するTTC染色を行った結果、アドレナリン受容体の阻害薬を投与しないマウスでは、レーザーを照射した面積よりも損傷部位が広がっていた。一方、マウスにアドレナリン受容体の阻害薬をあらかじめ投与した場合は、損傷を最小限に食い止められることを見いだした。また、右側大脳皮質に梗塞をおこしたマウスを透明な円柱の中で自由に行動させ、つかまり立ちをする際に使用する前肢の使用パターンを観察した(シリンダー試験)。その結果、マウスは脳梗塞後2日間にわたって、左側皮質が支配する右前肢を使用する頻度が上昇した。一方、アドレナリン受容体の阻害薬を事前に投与したマウスでは、左右の前肢の使用頻度に差は見られなかった。これにより、アドレナリン受容体の阻害薬の事前投与は、行動試験による運動機能の回復にも有効であることが分かった。次に、脳梗塞に伴う脳内の水の動きの変化を詳しく調べるために、主にアストロサイトに発現するアクアポリン4の免疫組織化学染色により、脳内のアクアポリン4の分布を可視化した。その結果、脳梗塞3時間後では、損傷部位でアクアポリン4の標識が約6割減少していた。一方、アストロサイトにだけ発現している別のタンパク質(GLAST)の発現には変化が見られなかった。このことは、アクアポリン4の減少が細胞死によるものではないことを示唆している。一方、アドレナリン受容体の阻害薬を事前に投与すると、アクアポリン4の標識が維持されることを見いだした。しかしながら、アドレナリン受容体がアクアポリン4の標識を維持する詳細な分子メカニズムは未解明である。今後、生化学的手法や蛍光イメージング法等を用いて解明する脳卒中や外傷性脳損傷などの脳血管障害では、多くの場合、障害発生部位のみならず健康な部位にまで損傷が拡大してしまう二次的損傷が起こる。

我々は、これまで脳脊髄液の動態に、水分子の動態が関与することに着目して研究を進めてきた。今年度は、脳脊髄液を脳組織内へ浸潤させる機序に、水分子の透過を担う「アクアポリン4」が関与する検証実験を行った。また脳脊髄液の動態に、神経伝達物質のノルアドレナリンが関与している可能性がある。これまで、アドレナリン受容体を阻害することによって、脳脊髄液の浸潤が促進されることが報告されている。さらに脳梗塞の直後、脳のノルアドレナリン濃度が急激に増加することが知られている。これまで、脳梗塞の超急性期においてアドレナリン受容体に着目した研究結果は断片的に報告されていたが、統一的な見解は得られていなかった。これまでに我々は、アドレナリン受容体を阻害することで、脳脊髄液の浸潤を促進し、脳梗塞後の細胞外K+濃度の正常化を図れると予想している。今年度は、以下の論文を出版した。ロチェスター大学メディカルセンター(アメリカ合衆国)を中心とした6カ国(アメリカ合衆国、デンマーク、スウェーデン、ノルウェー、中国、日本)14機関が連携、参画した共著論文。脳脊髄液の動態に、水分子の動態が関与することに着目して研究。脳脊髄液を脳組織内へ浸潤させる機序に、水分子の透過を担う「アクアポリン4」という膜タンパク質(チャネル分子)が関与する検証実験を担った。レーザーを用いた光血栓法によって、大脳皮質に局所的に脳梗塞を生じる脳梗塞モデルマウスを作製し、アドレナリン受容体の阻害薬の効果を調べた。24時間後に脳の損傷を評価するTTC染色を行った結果、アドレナリン受容体の阻害薬を投与しないマウスでは、レーザーを照射した面積よりも損傷部位が広がっていた。一方、マウスにアドレナリン受容体の阻害薬をあらかじめ投与した場合は、損傷を最小限に食い止められることを見いだした。また、右側大脳皮質に梗塞をおこしたマウスを透明な円柱の中で自由に行動させ、つかまり立ちをする際に使用する前肢の使用パターンを観察した(シリンダー試験)。その結果、マウスは脳梗塞後2日間にわたって、左側皮質が支配する右前肢を使用する頻度が上昇した。一方、アドレナリン受容体の阻害薬を事前に投与したマウスでは、左右の前肢の使用頻度に差は見られなかった。これにより、アドレナリン受容体の阻害薬の事前投与は、行動試験による運動機能の回復にも有効であることが分かった。次に、脳梗塞に伴う脳内の水の動きの変化を詳しく調べるために、主にアストロサイトに発現するアクアポリン4の免疫組織化学染色により、脳内のアクアポリン4の分布を可視化した。その結果、脳梗塞3時間後では、損傷部位でアクアポリン4の標識が約6割減少していた。一方、アストロサイトにだけ発現している別のタンパク質(GLAST)の発現には変化が見られなかった。このことは、アクアポリン4の減少が細胞死によるものではないことを示唆している。一方、アドレナリン受容体の阻害薬を事前に投与すると、アクアポリン4の標識が維持されることを見いだした。しかしながら、アドレナリン受容体がアクアポリン4の標識を維持する詳細な分子メカニズムは未解明である。今後、生化学的手法や蛍光イメージング法等を用いて解明する研究設備費として、蛍光実態顕微鏡、電算機器を申請する予定である。また、すでに3件の海外出張が決まっており、当該研究に関連する国際共同研究を行う予定である。その他に、国際会議に出席し、情報収集を行う。
染色体転座によって形成されるキメラ蛋白の細胞死抑制と薬剤抵抗性への関与

染色体バンド11q23に切断点をもつ染色体転座は造血器腫瘍の各種の白血病に観察されることから血液細胞の分化・増殖に関与する遺伝子が局在していると考えられている。llq23はとりわけ1歳以下の乳児白血病における染色体転座の主な切断点の一つである。llq23転座を持つ白血病は一般的に予後が悪いとされており、その病態の究明が急務である。我々は、1992年、これら11q23転座の責任遺伝子としてMLL遺伝子を単離した(Cancer Res 1992)。分子生物学的解析からMLL遺伝子は転座によって一定の領域で切断され、転座のパートナー遺伝子と融合しキメラ蛋白を作ることによりMLL蛋白の本来の機能がdominant negativeに不活化され、癌化に関わっていることを証明した(Oncogene 1994)。さらにt(11;19)のキメラ遺伝子の切断点領域に対するアンチセンスを作成し、t(11;19)転座を有する細胞株に導入した結果、アポトーシスが誘導された(Cancer Res 1998)。このような事実からキメラ蛋白が発癌に直接関与していることが示唆された。この研究では、キメラ蛋白の細胞死伝達経路との関係、さらに予後または薬剤耐性との関連を追求した。生後10か月の乳児白血病細胞(急性単球性白血病)にみられたt(6:ll)(q27;q23)転座の解析では、第6番側にAF6を同定し、正当なキメラMLL遺伝子であるMLL exon 6/AF6(染色体6q27)以外にMLL遺伝子のexon 6がスプライスアウトされたvariant MLL exon 5/AF6遺伝子が存在することが明らかになった。このバリアントMLLexon5/AF6は臨床経過から薬剤耐性と関連し、キメラMLL遺伝子バリアントの発現量と薬剤耐性又は予後との間に関連が示された(Genes Chromo & Cancer 2000)。しかし、このバリアントMLL exon 5/AF6遺伝子の産物を検出できなかった。近年、亜ヒ酸がレチノイン酸抵抗性の急性前骨髄球性白血病に著効することが報告されていることから、11q23転座を有するB細胞白血病細胞3株に低濃度の亜ヒ酸を暴露した結果、すべての細胞株で細胞増殖抑制が観察され、アポトーシスが誘導された。アポトーシス誘導はMLLキメラ蛋白の減少と相関しており、MLLキメラ蛋白とアポトーシスとの関連が示唆された(Leukemia and Lymphoma,2000)。このようにMLLキメラ蛋白の多様性が細胞増殖のみならず、細胞死、薬剤耐性にも関与していることが明らかになった。

染色体バンド11q23転座は造血器腫瘍の各種の白血病に観察され、とりわけ1歳以下の乳児白血病における染色体転座の主な切断点の一つである。11q23転座を持つ白血病は一般的に予後が悪いとされており、その病態の究明が急務である。これら11q23転座の責任遺伝子としてMLL遺伝子が単離された。我々は分子生物学的解析からMLL遺伝子が転座によって一定の領域で切断され、転座のパートナー遺伝子と融合しキメラ蛋白を作ることによりMLL蛋白の本来の機能がdominant negativeに不活化され、癌化に関わっていることを証明した(Oncogene 1994,Cancer Res.1998)。今回、生後10ヶ月の乳児の白血病細胞にみられたt(6:11)(q27;q23)を解析し、第6番側にAF6を同定し、本来のキメラMLL遺伝子であるMLL exon 6/AF6(染色体6q27)以外にMLL遺伝子のexon 5がスプライスアウトされたvariant MLL exon 5/AF6が存在することを認めた。このバリアントMLL exon 5/AF6は臨床経過から薬剤耐性と関連している可能性が示され、キメラMLL遺伝子のバリアントと薬剤耐性又は予後との間に関連のあることが示唆された(Genes Chromo & Cancer 2000)。近年、亜ヒ酸がレチノイン酸抵抗性の急性前骨髄球性白血病に著効を示すことが報告されているので、11q23転座を有するB細胞白血病細胞3株を低濃度の亜ヒ酸に暴露した。その結果、すべての細胞株で細胞で増殖抑制が観察され、アポトーシスが誘導された。アポトーシス誘導はMLLキメラ蛋白の減少と相関しており、MLLキメラ蛋白とアポトーシスとの関連が示唆された(Leukemia and Lymphoma 2000)。以上の結果からMLLキメラ蛋白が細胞増殖のみならず、細胞死、薬剤耐性にも関与していると考えられた。染色体バンド11q23に切断点をもつ染色体転座は造血器腫瘍の各種の白血病に観察されることから血液細胞の分化・増殖に関与する遺伝子が局在していると考えられている。11q23はとりわけ1歳以下の乳児白血病における染色体転座の主な切断点の一つである。我々は、1992年、これら11q23転座の責任遺伝子としてMLL遺伝子を単離した(Cancer Res 1992)。分子生物学的解析からMLL遺伝子は転座によって一定の領域で切断され、転座のパートナー遺伝子と融合しキメラ蛋白を作ることによりMLL蛋白の本来の機能がdominant negativeに不活化され、癌化に関わっていることを証明した(Oncogene 1994)。さらにt(11;19)のキメラ遺伝子の切断点領域に対するアンチセンスを作成し、t(11;19)転座を有する細胞株に導入した結果、アポトーシスが誘導された(Cancer Res 1998)。このような事実からキメラ蛋白が発癌に直接関与していることが示唆された。この研究では、キメラ蛋白の細胞死伝達経路との関係、さらに予後または薬剤耐性との関連を追求した。生後10か月の乳児白血病細胞(急性単球性白血病)にみられたt(6:11)(q27;q23)転座の解析では、第6番側にAF6を同定し、正当なキメラMLL遺伝子であるMLL exon 6/AF6(染色体6q27)以外にMLL遺伝子のexon 6がスプライスアウトされたvariant MLL exon 5/AF6
強非線形振動系に対する平均法の高性能化に関する研究

強非線形振動系の高精度近似解を求めるために,平均法の母解にヤコビの楕円関数を利用した楕円平均法の開発を行い,以下のような成果を得た.1.Duffing系を基盤とする系に対する単項型楕円平均法の開発:不減衰Duffing方程式に強制力項,減衰項,変位の3次項以外の非線形項より構成される摂動項が付与された系を解析対象とする楕円平均法を開発した.漸硬型,漸軟型及び飛移り型Duffing系を基盤とする系に対して,単一項のヤコビの楕円関数を母解とする単項型楕円平均法(cn型,sn型,dn型平均法)を開発した.この単項型楕円平均法の知用により,Duffing系を基盤とする系の定常振動近似解を簡便かつ高精度に計算することが可能となった.2.2次ばね系を基盤とする系に対する楕円型平均法の開発:2次ばね系を基盤する系に,摂動項が付与された系を解析対象とする楕円平均法を開発した.この方法は,母解としてsn関数の自乗関数を利用し,非対称性の非線形系の高精度近似解を計算することができる.3.結合型楕円平均法の開発:楕円平均法のさらなる高性能化を目的として,結合型楕円平均法を開発した.この手法は2つの異種楕円関数を結合した関数を母解とするものであり,本研究ではcn関数とsn関数を結合した関数を母解とするsn+cn型平均法を開発した.結合型楕円平均法は,単純な単項型平均法よりも,より高精度な近似解を計算することが可能であり,さらに高調波振動や分数調波振動の近似解をも簡便かつ高精度に求めることができる.4.安定判別法の確立:楕円平均法に対する最適な安定判別法を確立した.5.楕円平均法の有効性の検証:種々の振動系に対する詳細な数値計算を実施して,シューティング法による数値解との比較をとおして,本研究で開発したすべての楕円型平均法の有効性を確認した.強非線形振動系の高精度近似解を求めるために,平均法の母解にヤコビの楕円関数を利用した楕円平均法の開発を行い,以下のような成果を得た.1.Duffing系を基盤とする系に対する単項型楕円平均法の開発:不減衰Duffing方程式に強制力項,減衰項,変位の3次項以外の非線形項より構成される摂動項が付与された系を解析対象とする楕円平均法を開発した.漸硬型,漸軟型及び飛移り型Duffing系を基盤とする系に対して,単一項のヤコビの楕円関数を母解とする単項型楕円平均法(cn型,sn型,dn型平均法)を開発した.この単項型楕円平均法の知用により,Duffing系を基盤とする系の定常振動近似解を簡便かつ高精度に計算することが可能となった.2.2次ばね系を基盤とする系に対する楕円型平均法の開発:2次ばね系を基盤する系に,摂動項が付与された系を解析対象とする楕円平均法を開発した.この方法は,母解としてsn関数の自乗関数を利用し,非対称性の非線形系の高精度近似解を計算することができる.3.結合型楕円平均法の開発:楕円平均法のさらなる高性能化を目的として,結合型楕円平均法を開発した.この手法は2つの異種楕円関数を結合した関数を母解とするものであり,本研究ではcn関数とsn関数を結合した関数を母解とするsn+cn型平均法を開発した.結合型楕円平均法は,単純な単項型平均法よりも,より高精度な近似解を計算することが可能であり,さらに高調波振動や分数調波振動の近似解をも簡便かつ高精度に求めることができる.4.安定判別法の確立:楕円平均法に対する最適な安定判別法を確立した.5.楕円平均法の有効性の検証:種々の振動系に対する詳細な数値計算を実施して,シューティング法による数値解との比較をとおして,本研究で開発したすべての楕円型平均法の有効性を確認した.非線形振動系に対する代表的近似解法である平均法は、基本的に弱非線形系を対象とした解法であり、系の非線形性の増大とともにその精度は悪化することは周知である。本研究では、この平均法の高性能化を目的として、平均法の母解にヤコビの楕円関数を利用した高性能平均法(楕円平均法)の開発を行う。本年度の研究においては、以下のような知見を得た。1.単項型楕円平均法の開発:非線形振動系の代表的モデルであるDuffing系および2次ばね系に、強制力項、非線形減衰項、非線形復元力項から構成される任意の摂動項が付与された強非線形振動系を解析対象として、その定常解を単一項のヤコビの楕円関数(sn関数、cn関数、dn関数)を母解として利用する単項型楕円平均法を開発した。2.結合型楕円平均法への発展:単項型楕円平均法をさらに発展させ、より高性能な振動解析手法の開発を行うため、異なったヤコビの楕円関数の結合関数を母解とする結合型楕円平均法の計算理論を構築し、定式化までを完成させた。3.安定判別法の検討:本手法で得られた近似解に最適な安定判別法の検討を行った。平均化方程式を利用した安定判別法、フローケの定理を用いた無限小安定判別法の2種類の方法の適用を試みた。本手法の安定判別法としては、フローケの定理を用いた無限小安定判別法が有効であるとの結論を得た。

4.本手法の適用範囲の確認と有効性の検証:開発した単項型楕円平均法を種々の強非線形振動に適用し、実際の数値計算をとおして、本手法の適用範囲と信頼性を確認した。高精度数値解法であるシューティング法による数値解との比較を行った結果、本手法による近似解は、従来の平均法による近似解に比較して定性的かつ定量的に極めて良好な結果が得られ、高精度な近似解を求め得ることが明らかとなった。非線形振動系の代表的近似解法である平均法の高性能化を目的として、平均法の母解にヤコビの楕円関数を母解として利用する楕円型平均法を開発した。平成15年度は単一項の楕円関数を母解として用いる単項型楕円平均法(cn型平均法、sn型平均法、dn型平均法)を開発した。平成16年度の研究では、以下のような成果を得た。1。2次ばね系を基盤とする系に対する楕円型平均法の開発:非線形ばね項が変位の2次項で構成される2次ばね系を基盤する系に、減衰項、強制力項、2次以外の非線形ばね項などにより構成される摂動項が付与された系を解析対象とする楕円平均法を開発した。この方法では、母解としてsn関数の自乗関数を利用する。開発した楕円型平均法によれば、非対称性の非線形振動系に対して高精度な近似解を簡便に求めることが可能となる。2。結合型楕円平均法の開発:楕円型平均法のさらなる高性能化を目的として、前年度に開発した単項型楕円平均法を改良した結合型楕円平均法を開発した。この手法は2種の楕円関数を結合した関数を母解とするものであり、本研究では、cn関数とsn関数を結合した関数を母解とするsn+cn型平均法及びdn関数とzeta関数を結合した関数を母解とするdn+zeta型平均法を開発した。これらの結合型楕円平均法は、単純な単項型平均法と比較して、極めて広範な非線形振動系の近似解を高精度に求めることが可能である。さらに、結合型楕円平均法は、主共振域を含む基本調波振動解以外にも、高調波振動や分数調波振動の近似解をも簡便かつ高精度に求めることができる。3。結合型楕円平均法に対する最適な安定判別法を確立した。4。多くの非線形振動系に対する詳細な数値計算を実施し、シューティング法による高精度数値解との比較を行い、本研究で開発したすべての楕円型平均法の有効性を確認した。
海洋産生理活性大環状アルカロイドの効率的合成戦略の開発

新規な多元素環状化合物として複雑でユニークな大環状構造をした海洋産抗腫瘍性アルカロイドを取り上げ、それらの仮想生合成経路において提唱されている、様々なアルキル鎖で架橋された大環状ビスジヒドロピリジン中間体の分子内Diels-Alder反応を基本戦略とした生合成類似経路による効率的骨格構築法の開発を目指している。実際のターゲットとしてケラマフィジンBの合成を計画しているが、既にBaldwinらにより大環状ビスジヒドロピリジン誘導体の分子内Diels-Alder反応が試みられている。しかしながら、収率がわすか0.20.3%と極めて低い結果に終わっている。この反応の主生成物は、分子内不均化反応によって生じる化合物であると報告されている。我々は、この望ましくないヒドリド還元が起こらない基質としてピリドン誘導体を設計し、その合成ルートを検討した。マクロサイクル形成に必要な5-アルキル-2-メトキシピリジン誘導体は、アリルアルコールの9-BBNでのヒドロボレーション、得られたアルキルボランと5-プロモ-2-メトキシピリジンの鈴木-宮浦カップリング、アルコールのアルデヒドへの酸化、(Z)-選択的なWittig反応、TBDMS保護基の除去、水酸基のメシル化により調製した。そして、既に合成法を確立している3-アルキルピリジン誘導体とのステップワイズな分子間及び分子内ピリジンN-アルキル化反応により大環状ピリジニウム塩を形成し、これをNaBH_4によって還元することによりピリドン環を組み込んだ生合成中間体類似物の合成ルートを確立した。今後、この大環状ピリドン誘導体を用いてDiels-Alder反応の反応条件を検討する予定である。
低造腫瘍性を示すアフリカツメガエルのゲノム情報による原因遺伝子同定とヒトへの応用

X.laevisの低造腫瘍性の原因を探るため、本年度は、以下の項目1および2に取り組んだ。1X.laevisのゲノムの解析からCdk7とCyclin H (Cdk7+CyclinH = CAK複合体)の両遺伝子数の割合が、X.laevisでは他の動物種の半分になっていることを見出している。CAK複合体は、他の細胞周期制御因子の上流因子として細胞周期制御に対し化学量論的に働くため、遺伝子数が少ないことは細胞増殖の低下につながり得ることから、Cdk7、Cyclin H、およびCAK複合体がX.laevisの低造腫瘍性の原因の最有力候補と考えた。そこで、低造腫瘍性にCdk7、Cyclin H、およびCAK複合体の遺伝子割合が少ないことが関与する可能性を検討した。2低い造腫瘍性の原因となり得る遺伝子候補を広げるため、X.laevis遺伝子発現量のin silico比較解析を行った。<結果> 1X.laevis受精卵に対してCdk7 and/or Cyclin HのmRNAをマイクロインジェクションすることで存在量を増やした際に、X.laevisの細胞周期の回転速度が癌細胞のように早くなり得るかどうかどうかを調べ、Cdk7およびCyclin H遺伝子数が半減していることの機能的意義の検討を行った。Mock, Cdk7単独、Cyclin H単独、Cdk7+Cyclin Hコンビネーションの各々のmRNAを調製して受精卵にマイクロインジェクションし、各導入胚の経時的な割球の大きさから分裂速度・タイミングを検討したところ、どのmRNA導入杯についても割球の大きさに有為な差は認められなかった。このことから、Cdk7とCyclin Hの両遺伝子量の半減はX.laevisで特異的に低いものの、Xenopusの低造腫瘍性に直接関与しているとは考えにくいと結論した。2X.laevis遺伝子発現量のin silico比較解析を行った結果、X.laevisで特異的な動きを示すCyclin E1を見出した。研究実施計画においてCDK阻害因子以外の低造腫瘍性原因の最有力候補として考えていたCdk7とCyclin H (Cdk7+CyclinH = CAK複合体)についての解析を完了した。また、時間と労力を要する発現遺伝子のin silico比較解析を進め、新たな候補としてCyclin E1を見出したことから、研究計画は大凡順調に進展しているといえる。一方、研究実施計画においてはX.laevisのp21CIP1変異体およびp27XIC1のcDNAクローニングと解析を含めていたが、時間的な都合から今年度は実施を延期した。これは、in silico解析により新たにCyclin E1を見出したことから、その解析を優先したためである。Cyclin Eは体細胞周期のG1期に発現してS期に減少し、CDKの活性制御を通してG1/S期の制御を担っていることが広く知られている、一方、Cyclin E1はX.laevisの母性因子として受精卵に多量に保持されており胞胚中期から急激に減少するが、その機能は不明のままである。本年度実施したin silico遺伝子発現解析により、胞胚中期から急激に減少して低いレベルにあるCyclin E1が、尾芽胚頃となるst35以後から再度発現量が急激に上がっていることも見出した。このことから母性因子と考えられているCyclin E1が、Xenopusでは体細胞においても機能を有する可能性が考えられた。X.laevisのCyclinE1についての知見は1995年に報告されて以来、20年以上も未解明のままとなっており、本研究による再発見が機能解明につながることも期待できる。本年度の研究結果をうけ、今後の研究においては、まずCyclin E1についての解析を継続する。具体的には、1Cyclin E1変異体作成による機能解析、2Cyclin E1結合因子の探索、を引き続き行う。また、3in silico比較解析などを継続し、さらに他の細胞周期制御因子の関与の可能性も探る。本年度に延期した当初計画4p21CIP1変異体およびp27XIC1のcDNAクローニングについても順次進めており、クローニングに成功次第、機能解析を実施する。これらの研究実施について研究補助員を雇用することで速やかに計画を遂行する。これらの結果、X.laevisの低造腫瘍性に係わり得ると可能性が考えられた因子について、ヒト癌細胞の増殖への影響を調べていく。

<結果> 1X.laevis受精卵に対してCdk7 and/or Cyclin HのmRNAをマイクロインジェクションすることで存在量を増やした際に、X.laevisの細胞周期の回転速度が癌細胞のように早くなり得るかどうかどうかを調べ、Cdk7およびCyclin H遺伝子数が半減していることの機能的意義の検討を行った。Mock, Cdk7単独、Cyclin H単独、Cdk7+Cyclin Hコンビネーションの各々のmRNAを調製して受精卵にマイクロインジェクションし、各導入胚の経時的な割球の大きさから分裂速度・タイミングを検討したところ、どのmRNA導入杯についても割球の大きさに有為な差は認められなかった。このことから、Cdk7とCyclin Hの両遺伝子量の半減はX.laevisで特異的に低いものの、Xenopusの低造腫瘍性に直接関与しているとは考えにくいと結論した。2X.laevis遺伝子発現量のin silico比較解析を行った結果、X.laevisで特異的な動きを示すCyclin E1を見出した。研究実施計画においてCDK阻害因子以外の低造腫瘍性原因の最有力候補として考えていたCdk7とCyclin H (Cdk7+CyclinH = CAK複合体)についての解析を完了した。また、時間と労力を要する発現遺伝子のin silico比較解析を進め、新たな候補としてCyclin E1を見出したことから、研究計画は大凡順調に進展しているといえる。一方、研究実施計画においてはX.laevisのp21CIP1変異体およびp27XIC1のcDNAクローニングと解析を含めていたが、時間的な都合から今年度は実施を延期した。これは、in silico解析により新たにCyclin E1を見出したことから、その解析を優先したためである。Cyclin Eは体細胞周期のG1期に発現してS期に減少し、CDKの活性制御を通してG1/S期の制御を担っていることが広く知られている、一方、Cyclin E1はX.laevisの母性因子として受精卵に多量に保持されており胞胚中期から急激に減少するが、その機能は不明のままである。本年度実施したin silico遺伝子発現解析により、胞胚中期から急激に減少して低いレベルにあるCyclin E1が、尾芽胚頃となるst35以後から再度発現量が急激に上がっていることも見出した。このことから母性因子と考えられているCyclin E1が、Xenopusでは体細胞においても機能を有する可能性が考えられた。X.laevisのCyclinE1についての知見は1995年に報告されて以来、20年以上も未解明のままとなっており、本研究による再発見が機能解明につながることも期待できる。本年度の研究結果をうけ、今後の研究においては、まずCyclin E1についての解析を継続する。具体的には、1Cyclin E1変異体作成による機能解析、2Cyclin E1結合因子の探索、を引き続き行う。また、3in silico比較解析などを継続し、さらに他の細胞周期制御因子の関与の可能性も探る。本年度に延期した当初計画4p21CIP1変異体およびp27XIC1のcDNAクローニングについても順次進めており、クローニングに成功次第、機能解析を実施する。これらの研究実施について研究補助員を雇用することで速やかに計画を遂行する。
腸管と多様な生体異物の相互作用及びその認識機構の解析

二週間培養し充分に分化させたCaco-2細胞、およびLS180細胞に様々な小胞体ストレス誘導剤tunicamycin(TM)、A23187、thapsigargin(Tg)、A23187)と同時にquercetinを処理したところ、誘導剤の濃度依存的・曝露時間依存的に発現が亢進する小胞体ストレスマーカー(GRP78とCHOP mRNA)がケルセチン濃度依存的に減少されることを見出した。また、quercetinが小胞体ストレスセンサータンパク質であるIRE1とPERKの活性に与える影響を調べた。LS180細胞にA23187あるいはthapsigarginとquercetinを同時添加し、RT-PCRによりIRE1活性の指標であるXBP-1 mRNAのスプライシングを検討した結果、スプライシングはquercetin濃度依存的に抑制された一方、quercetin単独処理により逆に亢進した。PERK活性の指標として、ウェスタンブロット解析によりeIF2・のリン酸化を、metabolic labelingにより新規タンパク質合成のシャットダウンを調べた結果でも、XBP-1 mRNAのスプライシングと同じ傾向が認められた。続いて、quercetinはPI3K(Phosphatidilinositol-3 kinase)の阻害剤であることが知られているため、LS180細胞に代表的なPI3K阻害剤(LY294002及びwortmannin)とthapsigarginを同時添加してGRP78 mRNA量の変化を調べた。その結果、PI3K阻害剤濃度依存的にGRP78 mRNAの発現亢進が抑制された。更に、quercetinとLY294002による相加的な抑制は認められなかった。[目的]主に野菜などに含まれるフラボノイドの一種であるQuercetinおよび様々なQuercetin配糖体がマウス腸管上皮の遺伝子発現に与える影響をマイクロアレイにより網羅的に検討し、その遺伝子発現プロファイルを比較することにより、Quercetin類が腸管上皮に与える影響および結合している糖の有無・部位・種類の違いによる影響について明らかにする。[結果]MAS5.0とdChipの結果より、「フラボノイド低濃度投与群」と「コントロールおよびフラボノイド高濃度投与群」で有意に発現プロファイルが異なることが見出された。更に、糖の種類が遺伝子発現に影響することが示唆された。帰無仮説(Ho:二群間に差がない)のもとで、204個の有意な発現変動遺伝子(False Discovery Rate=10%;dChipデータ)を見出した。これらをさらに遺伝子別にクラスタリングしたところ、糖結合部位による違いにはほとんど影響がみられなかった。[目的]平成17年度の研究結果より、ケルセチン類が小胞体の機能に影響を与えることが示唆された。特に、小胞体ストレスマーカーとして知られるGRP78 mRNA量を低下させる現象が見られたため、in vitroの実験系で更に詳細に解析を進めることとした。[方法]二週間培養して充分に分化させたヒト結腸癌由来Caco-2細胞、及び同じくヒト結腸癌由来LSI80細胞に様々な小胞体ストレス誘導剤(tunicamycin、A23187、thapsigargin、brefeldinA)を添加し、GRP78およびCHOPのmRNA発現量の変動を確認した。さらに、(1)小胞体ストレス誘導剤とケルセチンを同時に、(2)ケルセチン処理後、小胞体ストレス誘導剤とケルセチンを同時に、(3)ケルセチン処理後、小胞体ストレス誘導剤のみ、添加して一定時間後にリアルタイムRT-PCRによりGRP78とCHOPのmRNA量を測定した。[結果]Caco-2細胞に小胞体ストレス誘導剤(tunicamycin:3μg/ml、A23187:3μM、thapsigargin:0.5μM、brefeldinA:0.3ng/ml)とケルセチンアグリコン(25150μM)を同時に添加したところ((1)の条件)、A23187刺激の場合においてのみケルセチンの抑制効果が認められた。傾向は(2)の条件でも同様(brefeldinAを除く)であったが、(3)の条件において抑制効果が消失した。LS180細胞に小胞体ストレス誘導剤(tunicamycin:0.75μg/ml、A23187:0.5μM、thapsigargin:0.3μM、brefeldinA:0.4ng/ml)とケルセチンアグリコン(25150μM)を同時に添加したところ((1)の条件)、brefeldinAを除く3種の誘導剤においてケルセチンの抑制効果が認められた。

PERK活性の指標として、ウェスタンブロット解析によりeIF2・のリン酸化を、metabolic labelingにより新規タンパク質合成のシャットダウンを調べた結果でも、XBP-1 mRNAのスプライシングと同じ傾向が認められた。続いて、quercetinはPI3K(Phosphatidilinositol-3 kinase)の阻害剤であることが知られているため、LS180細胞に代表的なPI3K阻害剤(LY294002及びwortmannin)とthapsigarginを同時添加してGRP78 mRNA量の変化を調べた。その結果、PI3K阻害剤濃度依存的にGRP78 mRNAの発現亢進が抑制された。更に、quercetinとLY294002による相加的な抑制は認められなかった。
金融法の域外執行における国際法上の根拠について

本研究は、金融犯罪を規律する手続法を域外的に執行する際の国際法上の根拠を、実証的に分析することを目的とする。金融法領域においては対象となる企業や私人が域外に所在していても、当該企業らに国内手続法の遵守を強制し、違反した場合に公的制裁を科す国家実行が見られる。本研究は金融犯罪の特殊性を踏まえながら、そのような実行の妥当性を国際法学の観点から検証する。2年目の平成25年度は、本研究では経済犯罪一般とは区別される金融犯罪の特殊性に着目して、先行研究を分析していく作業を丹念に行った。とりわけ、申請者は本研究の主題と国際行政法学が密接な関連性を有することに着目し、国際行政法の業績を集め、その整理を試みた。金融法は行政法的側面と刑事法的側面を併せ持っているが、国際法体系において行政法と刑事法のいずれも属地主義に基づいた運用がなされてきた。そこで金融犯罪の国際的規制がいかなる固有の法構造を有するかという点に着目して、各国行政法学と刑事法学からの検討を行う。これらの作業を踏まえた上で、金融法、行政法、国内刑法における研究の蓄積と国際法学におけるそれを比較対照し、前者の成果をいかに国際刑事法学に応用することができるかについて検討した。また今年度は、平成24年度の研究成果を踏まえて、日本における金融法のあり方について、国際法学の観点から分析することに力点を置いた。方法としては、まず日本の金融商品取引法、外国公務員贈賄罪を定める不正競争防止法、資金洗浄罪を定める組織犯罪防止法、租税関連法、及び、そのガイドライン、事例、判例、関連省庁の報告書を手掛かりにして、欧米と比較した際の固有性を明らかにすることを試みた。加えて、日本は米国、カナダ、EU等と金融規制に関して一定の司法共助を行う旨の国際協力協定を締結している。そこでその運用のあり方についても併せて調査した。これらを踏まえて、日本の金融法の特殊性がどのように理解されるべきであるか内在的に分析した。本研究は、金融法の域外適用の根拠を国際法学の観点から分析・検証し、国際的な金融法上の規制のあり方について理論的基盤を提供することを目的とするものである。本研究は欧州が実施主義を積極的に導入し始めた1990年代以降の国家実行を中心として、米国、欧州、日本における国家実行を実証的に分析し、その射程を明らかにすることを狙いとしていた。そのため、本研究は(1)米国、欧州、金融法規制を行っている主要なEU加盟国(英、仏、独、西)、中国、日本における金融法違反行為の国際的規制の実行を丹念に追うことによって、その域外適用がどのような根拠に基づいてなされているのか、どのような機能を果たしているのかを明らかにすることを試みた。申請研究期間の1年目は、各国の金融法の実証研究を行った。そのために各国法令の制定過程、その趣旨目的、制定を主導した国内の政治動態や社会的背景、制定後の運用過程、実施のメカニズム等を、一次資料と有益な二次資料を中心にして調査した。米国に関しては、金融法の基礎が構築された1930年代から遡って、主要な実行を追った。特に、米国で確立された金融法の適用の制約基準は、その後欧州や日本に継承されていることから、理論的な分析も含めて、包括的な検討を行った。欧州に関しては、主として欧州連合(EU)における実行が重要である。とりわけ、2008年のリーマンショック以降は域内の規制を強化する方向で立法が進められている。この場合はEU法上の別途の考慮が必要となる。現時点では、その制定経緯や各国の社会状況は当然のことながらそれぞれ異なるものの、金融法の域外適用の基準は国ごとに大きく異なるわけではないという暫定的な結論が得られた。国際法上、他国領域内における法執行は、当該領域国の同意がない限り違法である。しかし金融法領域においては対象となる企業や私人が域外に所在していても、当該企業らに国内手続法の遵守を強制し、違反した場合に公的制裁を科す国家実行が見られる。なお、本研究において、金融犯罪とは、金融活動を規制する法(証券法、租税法、外国公務員贈賄禁止法、資金洗浄罪規制法等)の違反であって刑事上の制裁が科されるものを指す。本研究は、国際法学を主軸としながらも、関連する国内実定法学(各国における証券法、租税法、外国公務員贈賄禁止法、資金洗浄罪規制法、刑法)、比較法学の幅広い知見を動員した総体的アプローチを取る点に特色がある。研究期間を通じて、金融犯罪の国際的規制に関して国際学会での報告を2回行った他、ハーバード法科大学院での在外研究を含めて、十分に研究を深めることができ、成果を上げることができた。

国際公法本研究は、金融犯罪を規律する手続法を域外的に執行する際の国際法上の根拠を、実証的に分析することを目的とするものであった。国際法上、他国領域内における法執行は、当該領域国の同意がない限り違法である。本研究は金融犯罪の特殊性を踏まえながら、そのような実行の妥当性を国際法学の観点から検証することを予定していた。上記のように、研究期間中に行うことを計画していた主要な資料収集は十分に出来たと考えているし、それに基づいた理論的な分析も、ある程度行うことができた。もっとも、平成25年度の最後の3ヶ月は、論文の公刊を計画の中に入れていた。具体的には、これまでの研究成果を総括し、公刊するための論文執筆に当て、また、各種の研究会やワークショップ、学会などにおいて、本研究の成果を公表していくことを予定していた。しかし、作業量が多いこともあり、公刊のプロセスはやや遅れている。この点は、平成26年度中に克服することを目標としている。当初の研究の目的は、金融犯罪を規律する手続法を域外的に執行する際の国際法上の根拠を、実証的に分析することであった。しかし金融法領域においては対象となる企業や私人が域外に所在していても、当該企業らに国内手続法の遵守を強制し、違反した場合に公的制裁を科す国家実行が見られる。本研究は金融犯罪の特殊性を踏まえながら、そのような実行の妥当性を国際法学の観点から検証する。なお、本研究において、金融犯罪とは、金融活動を規制する法(証券法、租税法、外国公務員贈賄禁止法、資金洗浄罪規制法等)の違反であって刑事上の制裁が科されるものを指す。今年度は、上記の研究実績の欄で詳述したように、証券法、租税法についての各国国内法の調査を行うことができた。研究計画はおおむね順調に進展していると評価できる。ただし、目標としていた金融法の基礎理論の検証は、まだ完全には終わっていない。申請者は既に、経済犯罪規制の国際法学上の位置づけについては、丹念な考察を展開した。その一部は公刊しているし、その総括は博士論文として完成させることができた。本研究ではその成果を発展させる形で、経済犯罪一般とは区別される金融犯罪の特殊性に着目して、先行研究を分析していくことを狙いとしていた。金融法は行政法的側面と刑事法的側面を併せ持っているが、国際法体系において行政法と刑事法のいずれも属地主義に基づいた運用がなされてきた。そこで金融犯罪の国際的規制がいかなる固有の法構造を有するかという点に着目して、各国行政法学と刑事法学からの検討を行うことが当初の計画であった。現時点では必要な文献は入手し、その精読も開始しているものの、それを纏める作業は完結していない。今後の作業の中で進めていく予定である。本研究は平成24ー25年度の2年間のプロジェクトであったが、概ね順調に進めることが出来たため、公刊のプロセスが終わった後には、次のような関連領域に関心を払って研究を推進していくことを計画している。まず、本研究では、金融犯罪を規律する法の域外適用を主題としたが、私法あるいは行政法としての金融法の執行についても更に検討する余地が大きく残されている。実行においては刑事罰を伴わずに法執行が行われることが多く、それらにおいて国際公法がどのように関わっているのかを評価する作業は意義のある営みといえる。
抗がん剤担持型熱分解性ハイドロゲルの開発による光駆動型化学療法の確立

本年度は、ゲルに対する高分子量物質の挙動の検討、プローブから発生する熱量の計測、および熱分解性のポリマーの合成を行った。ゲルに対する高分子物質(酵素)の浸透・拡散挙動の検討:高分子物質を用いた場合に、どのような反応挙動を示すのかを調べるために、酵素にβGal (Mw=113 kDa)、基質にTG-βGalを用いた検討を行った。具体的には、3種類の条件で実験を行い、いずれの条件においても、各部位で時間経過に伴う蛍光強度の増大が観察されたプローブから発生する熱量の計測:本テーマでは、プローブから発生する熱量をトリガーとするため、実際にどのくらいの熱量が発生しうるのか、という点について知ることは、ポリマー設計の点からも極めて重要である。そこで、実際にプローブから発生する熱量を見積もるために、工学系研究科の北森研究室の熱レンズ顕微鏡を用いて検討を行った。励起光およびプローブ光のみでは、シグナルは観測されず、両者がチャネルに照射されている場合にのみシグナルが観測された。この結果から、各プローブおよびPBSにおいて、光吸収および熱発生(photothermal effect)があることが確認された。熱分解性のポリマーの合成:熱分解部位として、無水カルボン酸部位を有するポリマーの合成を行った。先行文献より、エステル結合に隣接する部位の構造を変えることによって、分解温度を変化させることが可能であることがわかっている。想定している温度は、人の体温よりも高く、組織損傷を起こさない範囲で考えており、今回はもっとも体温に近い37°C付近で分解すると予想されるポリマーを合成した。今後、実際にゲルを作成し、どのくらいの温度・時間で分解するかについて調べたいと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ゲルに対する色素・プローブの挙動および、細胞および組織への効果等の基礎的な検討(拡散・浸透挙動の調査、細胞実験、組織実験)を行った。ゲルに対する低分子化合物(色素・プローブ)の浸透・拡散挙動の検討では、作製したゲルを3種類の色素・プローブ溶液に浸すことで浸透挙動を、また、内包したゲルの外液をPBSに変えることでゲルからの拡散挙動を調べた。その結果、色素・プローブの種類・濃度によらず速度定数は一定であり、また浸透・拡散速度は濃度を調整することで変更可能であることが明らかとなった。細胞実験(ゲルから細胞へのプローブの取込み挙動)では、GGT (がん細胞で多く見られる酵素)発現細胞に、gGlu-HMRG (GGTと特異的な反応する基質)を内包したゲルを乗せ、蛍光イメージング観察を行った。イメージング画像から、ゲルが置いてある箇所の蛍光強度のみが著しく増大し、拡散による溶液中のプローブ濃度よりも直に細胞と接する箇所のプローブ濃度が高く、細胞表面の活性を認識しやすい環境にあるとことが示唆された。組織実験(ゲルから細胞への色素・プローブの取込み挙動)では、ゲルに内包した色素・プローブと組織上の酵素との反応についての検討を行った。実験手法としては、組織(ささみ)に色素もしくはプローブを内包したゲルをのせ、蛍光イメージング観察を行った。本報告では、HMRGの結果のみについて言及するが、時間経過とともに蛍光強度はexponentialで増大し、Fitting結果より算出された速度定数はin vitroでの拡散速度定数と一致した。最終的には、組織内に取り込まれるはずだが、表面に付着しても蛍光は観測されるため、拡散速度定数に従って蛍光が増大したと推測される。今年度の研究を通して、特異的環境下で機能するハイドロゲルを作製するための基礎固めが十分達成できたものと考えている本年度は、ゲルに対する高分子量物質の挙動の検討、プローブから発生する熱量の計測、および熱分解性のポリマーの合成を行った。今年度は、主にハイドロゲルに対するプローブの振る舞い、ゲル内に内包したプローブが機能するかを中心とした検討を行ってきた。

得られた結果から、今回検討したプローブ群はハイドロゲル内に内包することができ、プローブ濃度を調整することで、浸透・拡散挙動をコントロール可能であることが示唆された。また、本研究テーマを遂行するにあたり、『接触により、ゲル内外の物質輸送が可能かどうか』という点について大きな懸念があった。一般的に、ゲルを用いた拡散実験では周囲に大量の溶媒がある条件で行われるため、接触(わずかな溶媒)のみでの物質輸送が行われるかについてはわからなかった。しかしながら、本実験を通して、細胞および組織にゲルを接触させることにより、ゲル内のプローブと組織・細胞上の物質との反応が可能であることが明らかとなった。これは、この研究テーマを遂行する上で重要な結果であると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。ここまでは、プローブをより効率的に機能する足場材料としてゲルを用いた実験を行ってきた。この結果は、今後の研究の基礎となるが、今後は以下のようなゲルへの機能性付与に重き研究を進めて行く予定である。熱分解性ポリマーの開発:生体適合性高分子として認可され幅広く医療材料として用いられているポリエチレングリコール(PEG)とポリアスパラギン酸(PAsp)との共重合体を用いる。抗がん剤を担持した熱分解性ハイドロゲルを構成する高分子の場合は、PEGとPAsp及びPAsp側鎖と抗がん剤間に熱によって壊裂するペルオキシド構造を組み込んだ高分子を合成する。またペルオキシド構造近傍の構造と分解温度との相関が既に明らかになっている為に、合成するプローブに対して最適な温度で分解が起こるような官能基を導入した高分子を合成する。新規プローブの合成: GGTと反応する蛍光プローブの構造を基盤として、一部をアシンメトリーな構造にすることで目的の化合物を合成する。合成物はGGT溶液と混合し光を照射し、発生する熱をカロリーメーターで測定する。合成が達成した時点でゲルを作製および評価を行う予定である。
熱帯性タマネギ(シャロット)およびその近縁種の種内分化に関する研究

アジア各地から収集したシャロットもしくはワケギ228系統を供試し,葉,球根や花の形態と開花特性に基づいてグループ化を試み,ほとんどの系統がシャロット群かワケギ群かに分類されることを示した.アイソザイム分析で,シャロットとワケギを容易に区別できること,日本,韓国,台湾の系統はすべてワケギで,タイ,マレーシア,バングラデシュの系統はすべてシャロットであるが,インドネシアにはシャロットとワケギが混在していることが明らかとなり,なかでも西ジャワおよび南スマトラでもっとも多くの特異的な変異が存在することから,この地域がワケギの起源地である可能性が示唆された.さらに,RAPD分析で遺伝的変異の多様性を,葉緑体DNAのPCR-RFLP分析で,ほとんどのワケギの系統は既知のようにネギを母親とした雑種であるが,一部の系統はシャロットを母親としたワケギであることをはじめて明らかにした.生理学的にはまず,耐病性との関連が示唆されている球根の保護葉の色素と色素発現を調べ、主要アントシアニン色素(An)はシャロット、ワケギのいずれでもシアニジンであり、フラボノール(F1)としてはケルセチンのみが検出され,F1/Anはシャロットとワケギでは明らかに異なること、いずれの種にも紫外線除去下での色素発現が安定な系統と不安定な系統があることを示した.また,球根形成に及ぼす日長および温度の影響,球根の休眠の程度について調査し,日長不感応型系統や低温感応型系統が存在し,休眠の深さにも大きな変異があることを明らかにした.さらに,アイソザイム,DNAおよび形態に基づく分類のそれぞれの関連性についても検討し,ともに高い割合で関連していることを示唆した.アジア各地から収集したシャロットもしくはワケギ228系統を供試し,葉,球根や花の形態と開花特性に基づいてグループ化を試み,ほとんどの系統がシャロット群かワケギ群かに分類されることを示した.アイソザイム分析で,シャロットとワケギを容易に区別できること,日本,韓国,台湾の系統はすべてワケギで,タイ,マレーシア,バングラデシュの系統はすべてシャロットであるが,インドネシアにはシャロットとワケギが混在していることが明らかとなり,なかでも西ジャワおよび南スマトラでもっとも多くの特異的な変異が存在することから,この地域がワケギの起源地である可能性が示唆された.さらに,RAPD分析で遺伝的変異の多様性を,葉緑体DNAのPCR-RFLP分析で,ほとんどのワケギの系統は既知のようにネギを母親とした雑種であるが,一部の系統はシャロットを母親としたワケギであることをはじめて明らかにした.生理学的にはまず,耐病性との関連が示唆されている球根の保護葉の色素と色素発現を調べ、主要アントシアニン色素(An)はシャロット、ワケギのいずれでもシアニジンであり、フラボノール(F1)としてはケルセチンのみが検出され,F1/Anはシャロットとワケギでは明らかに異なること、いずれの種にも紫外線除去下での色素発現が安定な系統と不安定な系統があることを示した.また,球根形成に及ぼす日長および温度の影響,球根の休眠の程度について調査し,日長不感応型系統や低温感応型系統が存在し,休眠の深さにも大きな変異があることを明らかにした.さらに,アイソザイム,DNAおよび形態に基づく分類のそれぞれの関連性についても検討し,ともに高い割合で関連していることを示唆した.(1)これまでの収集系統に加えて、本年度、台湾、中国、インドネシア、フィリピンおよび韓国より計27系統をあらたに導入した。(2)本年度は、DNA分析に必要な抽出法について検討し、CTAB法の変法で最も良い結果が得られることがわかったので、現在この方法で全収集系統のDNA抽出を行っているところである。この中で、一部RAPD分析を行い、多型を示すプライマーを調査中である。さらに、類縁関係を探るうえで非常に重要となる細胞質のDNA多型を探るために、葉緑体に存在するrbcL遺伝子のPCR-RFLP法について検討しており、イネ・トマト・ジャガイモなどで保存されている配列部分をプライマーにして、シャロットとワケギにおいてもrbcL遺伝子が増幅されることを確認した。(3)鱗茎の色に着目し、フラボノイド色素の変異を調査した。鱗茎の色は、食味や耐病性とも関連しているといわれている重要な形質でもある。シャロット、ワケギともに主要アントシアニンはシアニジンであったが、インドネシアから収集したシャロット2品種、ワケギ1品種のみに611%のペオニジンが含まれていた。検出されたフラボノールはすべてケルセチンのみであった。アントシアニン量に対するフラボノール量はワケギがシャロットよりも有意に高いことがわかった。(4)25°Cおよび20°C、短日条件(12時間日長)下におけるワケギおよびシャロットの球根形成を調査した。球根形成はシャロットがワケギよりも早く、シャロットの短日性が示唆された。しかし、同じインドネシアのシャロットでも、系統によって球根形成に明らかな早晩が見られ、生態的種内分化がおこっていることも示唆された。本年度はDNA分析を主体に研究を進めた.50種類のランダムプライマーを用いたPCRによるDNA分析を試みた.そのうち,7種類のプライマーにおいて種間ならびに種内変異を識別できるDNA断片が確認できた.プライマーCMN-A45を用いた分析では,すべてのシャロットはタマネギは同じbandを有し,また,すべてのワケギのうち3系統をのぞいてはネギと同じbandをもっていた.ワケギの3系統はシャロットとネギの両方のbandを有していた.