hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
いわゆる系統逸脱白血病の起源機能および病態に関する研究

本研究は多系統の形質を同時に保持するいわゆる系統逸脱白血病出現の機序を、分子生物学的、免疫細胞学的に解明することを目的とし遂行された。これらの白血病の表現型、免疫関連遺伝子型、各細胞増殖分化因子に対する反応性などの性格は多岐にわたり、その程度は様々であったが、以下の2群に大別された。1;多潜能幹細胞由来が強く示唆される白血病で、表現型ー遺伝子型(特に骨髄球系抗原ー再構成免疫関連遺伝子型)不一致を示す例が多い。この白血病には骨髄細胞系増殖因子に反応し、骨髄球系への分化傾向も認められた。ph1やt(4;11)染色体異常の高頻度の存在、臨床経過中での白血病細胞の形質転換、治療抵抗性等多潜能幹細胞由来を示唆する所見が多く、多系統形質の発現、保持は腫瘍化標的細胞の分化能(遺伝子再構成を含む)表現と理解された。2;特定の系統へ分化した細胞が腫瘍化標的細胞とみなされる白血病で、主としてB前駆細胞性白血病のIg及びTcR両遺伝子再構成例に認められ、表現型ー遺伝子型不一致の程度は低い。IgH鎖V、D、J領域遺伝子の対立遺伝子レベルの検討では、両対立遺伝子共にVーDーJ構造を示しており、有効なIg産生へ向けての活発なVーDーJ、VーVーDJ再構成が行われた細胞に由来したと考えられた。TcR遺伝子は、そのような活発なIgH遺伝子再構成の過程で、Ig及びTcR遺伝子再構成に関与するcommon recombinase活性の高まりにより二次的に再構成されたと考えられる。これらの白血病は臨床経過中形質転換する例は稀れで、抗リンパ球系化学療法に反応する例が多い。両群の白血病とも染色体相互転座を示す例が存在したが、その異常が白血病細胞の血球分化形質発現に直接係っていたとの証在は認められなかった。このように本研究により、系統逸脱白血病の形質自体には腫瘍化に伴う若干の増幅はあるものの、その出現には各正常血球分化段階に対応する複数の機序が深く関与していることが明らかとなった。
東アジア地域住民の環境微量元素の暴露・影響調査

東アジア地域における環境蓄積性および生物学的半減期の長い重金属を主とする微量元素の人体暴露・影響の調査・研究を環境中毒学および公衆栄養学的視点で実施した。調査地域は中国山東省の2地域,都市部は省都の済南市を農村部は済南市から40km程離れた章丘県白泉村である。対象は健康な成人女性の各々50名。調査項目は食事調査,一日尿調査および身体と血圧測定,血液臨床検査である。調査器具・器材は全て日本から運搬した。食事調査は陰膳法により対象者の一日の全飲食物を採集した。一日尿は食事調査の当日の全尿を採集した。なお,各家庭別に飲料水および小麦粉,米も採集した。食事検体は山東医科大学栄養学教室のスタッフが食品毎に分別秤量・記録した。食事検体は個人別に全量をミキサ-で混合粉砕後に一部を分取し,一日尿も秤量後に一部を分取し,各々は測定用に凍結保存した。血液・血清生化学的検査は国内の臨床検査機関で実施した。なお,健診データーは検査結果と所見を書き添えて対象者に報告した。栄養摂取量の算出は中国食品成分表を用い,パーソナルコンピューターにより国内で実施した。微量元素の測定成績から,鉛は摂取量と血液濃度が都市部では25.8ug/dayと35.3ug/ml,農村部が45.8ug/dayと50.2ng/mlであり,いずれも農村部が都市部よりも高値で,地域差が明らかになった。毛髪中の鉛濃度も農村部が都市部よりも有意に高い。なお,農村部の鉛の摂取量,血中濃度は日本人に比して明らかに高い。カドミウムの摂取量と血中濃度は,都市部が6.43ug/dayと0.48ng/ml,農村部が5.93ug/dayと0.29ng/mlで,いずれも農村部が都市部よりも低値を示した。カドミウムの摂取量と血中濃度レベルはこれまでの東アジア地域での報告値に比してほぼ同レベルかやや低く,日本人の値に比し明らかに低い。栄養摂取量は,エネルギー,脂質,たんぱく質は所要量に対していずれも充足されている。農村部は植物性食品の依存が大きく,献立内容も都市部よりも単純である。健康状況は,都市部は身長,体重およびBHJ値はいずれも農村部に比し大きく,肥満者の割合も高い。貧血や高脂血者の出現率は都市部と農村部とも10%前後と低く,2地域間に差は認められない。

調査項目は食事調査,一日尿調査および身体と血圧測定,血液臨床検査である。調査器具・器材は全て日本から運搬した。食事調査は陰膳法により対象者の一日の全飲食物を採集した。一日尿は食事調査の当日の全尿を採集した。なお,各家庭別に飲料水および小麦粉,米も採集した。食事検体は山東医科大学栄養学教室のスタッフが食品毎に分別秤量・記録した。食事検体は個人別に全量をミキサ-で混合粉砕後に一部を分取し,一日尿も秤量後に一部を分取し,各々は測定用に凍結保存した。血液・血清生化学的検査は国内の臨床検査機関で実施した。なお,健診データは検査結果と所見を書き添えて対象者に報告した。栄養摂取量の算出は中国食品成分表を用い,パーソナルコンピュタ-により国内で実施した。微量元素の測定成績から,鉛は摂取量と血中濃度が都市部では25.8ug/dayと35.3ng/ml,農村部が45.8ug/dayと50.2ng/mlであり,いずれも農村部が都市部よりも高値で,地域差が明らかになつた。毛髪中の鉛濃度も農村部が都市部よりも有意に高い。なお,農村部の鉛の摂取量,血中濃度は日本人に比して明らかに高い。カドミウムの摂取量と血中濃度は,都市部が6.43ug/dayと0.48ng/ml,農村部が5.93ug/dayと0.29ng/mlで,いずれも農村部が都市部よりも低値を示した。カドミウムの摂取量と血中濃度レベルはこれまでの東アジア地域での報告値に比してほぼ同レベルかやや低く,日本人の値に比し明らかに低い。栄養摂取量は,エネルギー,脂質,たんぱく質は所要量に対していずれも充足されている。農村部は植物性食品の依存が大きく,献立内容も都市部よりも単純である。健康状況は,都市部は身長,体重およびBMI値はいずれも農村部に比し大きく,肥満者の割合も高い。貧血や高脂血者の出現率は都市部と農村部とも10%前後と低く,2地域間に差は認められない。
新規多量体インドールアルカロイドの探索と細胞死誘導機構の解析

キョウチクトウ科Leuconotisgriffithiiを素材として新規医薬リードの探索研究を行った結果、2種の新規骨格アルカロイドを含む4種の新規ビスモノテルペンインドールアルカロイドcompound ADを単離した。得られた新規化合物について各種活性評価を行ったところ、compound A、B、DにA549細胞に対する細胞増殖阻害活性を見出し、その機構はオートファジーによる細胞死であることを見出した。インドネシア産キョウチクトウ科Leuconotisgriffithiiを素材として成分研究を行った結果、4種の新規ビスモノテルペンインドールアルカロイドの分離に成功し、それらの構造を各種二次元NMRおよび化学変換により明らかにした。2種の化合物についてはがん細胞においてオートファジーによる細胞死を示すことを明らかにした。残る2種については今後、活性評価の検討を行う。キョウチクトウ科Leuconotisgriffithiiを素材に4種の新規アルカロイドの分離に成功し、2種の生物活性を評価した。現在さらなる研究素材としてTabernaemontana divaricataの検討を行っており、新たな知見が得られるものと考えられる。28年度は、マレーシア産キョウチクトウ科Leuconotis griffithiiの樹皮の成分検索を行った結果、3種の新規ビスモノテルペンインドールアルカロイドcompound BDを単離し、その構造を各種スペクトルデータにより明らかにした。compound Bはeburnane骨格の16位とaspidosperma骨格の10位が結合し、さらにaspidosperma骨格の1位にホルミル基が結合した新規骨格を有する構造である。compound Cはeburnane骨格の16位とaspidosperma骨格の12位が結合し、さらにeburnane骨格のC環が芳香化した構造である。compound Dはspiroeburnane骨格の16位とaspidosperma骨格の12位が結合した新規骨格を有する構造である。単離したアルカロイドについてA549細胞に対する細胞増殖阻害活性を評価したところ、compound A、B、Dが活性を示し、その機構はオートファジーによる細胞死であることを見出した。compound Aはbisleuconothine AのN-ホルミル体であるが、同等の活性を示したことから2つの化合物の表面上の変化は乏しいことが窺える。compound Cは他に比べて水溶性が高い構造をしており、そのことが活性を減弱していると考察した。また、compound DはBより活性が弱く、spiroebunane骨格の構造が活性値に影響を及ぼすと考えた。Tabernaemontana属植物の成分検索を活発に行い、新規多量体アルカロイドの単離、構造解析を進めていく。既に単離している新規アルカロイドについては詳細な活性評価ならびにメカニズムの解明を行う。天然物化学
宇宙構造の起源・進化の双方向研究

本研究計画は、初期宇宙の進化史を、観測データから出発する還元的手法と基礎物理学理論に基づく原理的な考察による双方向から明らかにすることを目的に、2000年秋に企画立案された。その主たる目的は、ダークマター・ダークエネルギーという宇宙のエネルギー密度の二大構成要素の正体に迫ることとともに、宇宙論的精細観測データが得られた際に、それを初期宇宙の理論に還元する方法を開発することにあった。研究成果として、まずダークマターについては、コールドダークマターの二大候補の一つであるアキシオンがどれだけ生成するか、アキシオンストリングの宇宙論的進化の大規模な数値シミュレーションを行うとともに、その新しい解析法を提唱し、それによって正しい生成量を求めることに初めて成功した。ダークエネルギーの起源としては、宇宙の量子状態に関する考察により、このような微小な量を勝手に導入するにとなく観測値を自然に説明する理論の構築に成功した。一般に縮退した摂動的真空を持つ理論では、真の真空は摂動的真空の重ね合わせで表される。然るにもしわれわれの宇宙が摂動的真空のある状態にあるとすると、これは真の真空よりも極僅かだが大きなエネルギー密度を持つことになる。その値は摂動的真空間を結ぶインスタントンの作用の-1倍をべき指数に持つ指数関数に比例する。したがって作用が十分大きければ観測されている小さな宇宙項の値を説明できるのである。また、宇宙背景輻射の非等方性の角度相関から初期曲率揺らぎのスペクトルを再現する手法を提唱し、WMAPの初年度データに応用したところ、細かな振動構造を持ったスペクトルが再現された。この多くは観測誤差によるものだと思われるが、モンテカルロ計算の結果、一部にはスケール不変スペクトルからの有意なズレがあることを見出し、初期揺らぎが細かな構造を持っていた可能性が高いことを明らかにした。このほか、WMAPの観測データを説明するインフレーションモデルの構築など数々の研究を行った。以上のように大きな研究成果を挙げることができた。現代宇宙論の抱える最も大きな問題は、最近のIa型超新星のナンバーカウント観測によってその存在が示唆されている、真空のエネルギーすなわち正の宇宙項の起源を説明することである。これまで所謂クイントエッセンスのように小さなポテンシァルエネルギーを持ったスカラー場によってこれを説明する試みが闊歩してきたが、本年私は宇宙の量子状態に関する考察により、このような微小な量を勝手に導入することなく観測値を自然に説明する理論の構築に成功した。実際、ゲージ理論の真空構造を利用することにより、現在の観測値を無理なく説明できることを明らかにした。また、宇宙背景輻射の非等方性の角度相関から初期曲率揺らぎのスペクトルを再現する手法を提唱し、いくつかの理想化された場合について、極めて精度良く再現可能であることを示した。このほか、一般化された重力理論においてインフレーション中に生成する密度揺らぎのスペクトルを求める手法を確立し、いくつかの具体例についてこれを実行した。

本年度は、昨年度に開発した、宇宙背景輻射の角度相関関数から初期密度ゆらぎのスペクトルを再構築する方法を改良し、現実的なデータが得られた際に現実的な宇宙パラメタの下で初期ゆらぎを取り出す方法を完成した。また、予想される観測誤差が初期ゆらぎの誤差にどのように伝搬するかを解析した。さらに、宇宙論的パラメタの間違った値で再構築を試みると、病的な振る舞いが出てくることを示し、これによって宇宙論パラメタを制限することが可能であることを示した。2003年2月に発表された、WMAP衛星のデータに基づいて現在これを実行中である。ダークマターの正体としては超対称粒子の他アキシオンが有力であるが、その存在量を正しく求めるため、アキシオンストリング系の新しいシミュレーション方法を開発し、従来より正確な値を得ることに成功した。また、昨年度に提案した小さな宇宙項を説明する理論を発展させ、インフレーションによって必要とされる量子状態が実現することを示した。2003年2月に宇宙背景輻射探査衛星WMAPの初年度データが発表され、それによって宇宙論は誤差の値まで詳細な議論のできる精密科学の時代に入った。このデータの発表を受け、私はまず銀河の化学進化に基づく高赤方偏移での宇宙年齢推定法とWMAPの初年度データを双方考慮すると、I型超新星爆発を起こすふつうの星も従来以上に高赤方偏移で形成が始まったことを明らかにした。また、WMAPの初年度データは揺らぎのスペクトル指数がスケール依存性を持ち、大スケールで1以上、小スケールで1以下に変化している可能性を強く示唆した。従来このような変化を実現するインフレーションモデルは知られていなかったが、超重力理論においてハイブリッドインフレーションとニューインフレーションを結びつけることにより、これを実現することができることを示唆した。さらにより考察を進め、WMAPの初年度データが得たもう一つの新しい結果である、宇宙の早期再イオン化を実現できるような密度揺らぎのスペクトルを小スケールで生成できるように改良を加えた。宇宙背景輻射の非等方性データから初期揺らぎのスペクトルを再構築する方法をわれわれは既に開発していたがこれをWMAPの初年度データに応用したところ、細かな振動構造を持ったスペクトルが再現された。この多くは観測誤差によるものだと思われるが、モンテカルロ計算の結果、一部にはスケール不変スペクトルからの有意なズレがあることを見出し、初期揺らぎが細かな構造を持っていた可能性が高いことを明らかにした。
精神障害者のrecoveryを促進する看護師の態度に関する研究

精神科病院に入院経験のある当事者14名から、看護師の言動によって「夢や希望が持てた」「元気が出た」「積極的になれた」「安心できた」エピソードを聴取し、質的分析によって「前向きな気持ちにさせる看護師の態度」として7カテゴリーを抽出した。また、この質的分析で得た24サブカテゴリーから質問項目を作成し、44施設116名の当事者からの回答をもとに因子分析を行い、【思いやるかかわり】(12項目α=.933)、【気さくな付き合い】(5項目α=.891)、【やりくりの手助け】(3項目α=.764)の3因子で構成された「前向きな気持ちにさせる看護師の態度」モデルを導き出した。3ケ年計画である本研究の最終目的は、精神障害者のrecoveryを促進させる看護師の態度モデルの構築(試案)を行うことにある。平成20年度は、日本におけるこれまでの精神医療福祉における事象について、事例や当事者の手記、文献を検討し、recovery概念の適応及び日本におけるrecovery概念の特徴を明確にすることを目的とした。recoveryに関連するデータの収集・分析を中心とした研究実施計画に基づく具体的内容を以下に記す。1.JocobsonとGreenly (2001)のrecoveryに関する概念モデルを参考にし、我が国における精神障害者のこれまでの状況、特に当事者の内面的状態(希望、癒し、エンパワメント、結びつき等)について、文献、事例、当事者の手記等からデータを収集した。それらにより、日本におけるrecovery概念の適応、日本におけるrecovery概念の特徴等を明らかにした。2.recoveryに関する外面的問題として、人権に関しては、大阪精神医療人権センター、日本精神障害者リハビリテーション学会、全国精神医療労働組合協議会の主催講演会、分科会に参加した。これらを通して、当事者及び専門家らからの情報・専門的知識の提供を得た。3.recovery推進に寄与していると考えられる目標を掲げている作業所等を全国から選出し、北海道、和歌山、大阪等計5ヶ所を訪問・資料収集し、内容や特徴等を明らかにした。また、当事者とのかかわりを継続的に強化し、相談体制の準備を行った。4.研修会への参加、有識者を招聘し開催した研究協力者との研修会等を通じて、研究協力者がデータ収集する際に重要であるインタビューの知識や技術について、また、データの分析方法等における知識や留意について準備を行った。以上の成果は、次年度の研究目的である、当事者へのインタビューの実施により当事者が感じた看護師の認識等を明らかにすることに寄与し、当事者のrecoveryに影響をあたえた項目の抽出と質問調査用紙の作成、そして、海外視察・情報収集を具現化する重要性をもつ。3ケ年計画である本研究の最終目的は、精神障がい者のrecoveryを促進させる看護師の態度モデルの構築(試案)を行うことにある。2年目となる平成21年度は、当事者の入院及び回復過程における体験から、看護師との関係によるrecoveryに影響を及ぼした事象の内容と当事者が感じた看護師の認識等を明らかにし、当事者のrecoveryに影響をあたえた項目を抽出することを目的とした。主な内容は以下のとおりである。1.近畿圏で地域活動支援センター等の事業を利用し、精神科での入院経験をもつ精神障がいのある当事者で、施設長からの紹介の上、同意を得られた女性7名、男性7名の計14名を対象とし、前年度のデーター収集・分析を参考に作成したインタビューガイドによる半構成的面接を行った。面接による当事者の語りを質的記述的に分析した結果、129のコードから、43のサブカテゴリーと13のカテゴリーを抽出した。さらに、13のカテゴリーを、前向きな気持ちにさせる看護師の態度と前向きな気持ちになるのを妨げる態度に分類した。前向きな気持ちにさせる看護師の態度は、当事者の希望を呼び起こす、或いは希望を生む出すことにつながっている一方、前向きな気持ちになるのを妨げる看護師の態度は、当事者が希望を生みだすことにほど遠いものといえた。2.海外におけるrecoveryの促進と阻害に影響する精神保健福祉の情報を得ることを目的に、イタリアのトリエステ等の精神保健福祉施設・病院の視察および看護師との意見交換を行った。当事者のrecoveryを促進させる看護師の態度として重要なことは、垂直的でなく水平的な関係性である一方、入院中心の療養環境では極めて困難を伴うという意見が交わされた。以上の成果により、精神科の臨床における看護師の態度の重要性が明らかとなり、研究の最終目的である看護師の態度モデルの構築への示唆を得た。3ヶ年計画である本研究の最終目的は、精神障がい者のrecoveryを促進する看護師の態度モデルの構築(試案)を行うことにある。

最終年度である平成22年度は、これまでの調査を踏まえ、以下のことを実施した。1.精神障がい者への質問紙調査の実施及び分析全国主要都市の地域活動支援センター等の社会復帰関連施設において無作為に抽出した200施設のうち、調査協力の得られた44施設に225名分の質問紙を送付し、施設長を通じて同意を得た対象者に配布した。質問紙は自記式回答・個別回収とし、調査票への回答及び郵送による回収をもって調査への同意とみなした。回収数は150(回収率66.7%)であり、無効回答を除き131(有効回答率87.3%)を分析対象とした。質問項目は、前年度の調査より抽出した前向きな気持ちにさせる看護師の態度24項目からなり、KMOの標本妥当性の測度は.943、Bartlettの球面性検定では有意差が認められた(x2=1539.743、df=190、p<.001)。因子分析を行い3因子20項目が抽出された。因子の内的整合性の検討では、Cronbachのα係数は.953(20項目)、各因子では.937(13項目).883(5項目).737(2項目)であった。2.精神障がい者のrecoveryを促進する看護師の態度モデルの検討尺度因子として抽出された看護師の態度について、その因子負荷量の多いものをみると、「私が納得できる丁寧な説明をする」「人間として対等であると私が実感できるように対話する」「私の存在価値を認める」「私が親しみを感じられるようざっくばらんに接する」「ユーモアを活用してかかわる」「経済的なことについて助言をする」といった、対象者を慮る対応や親しみが伝わるメッセージ、経済的なことに対してもやりくりの手助けが大事であると示唆された。尺度としての妥当性については課題が残るが、精神障がい者にとって前向きな気持ちにつながる看護援助モデルとして意義のある成果と言える。
科学的法則を発見する機械学習アルゴリズムの研究

本課題では,科学的法則を発見する機械学習アルゴリズムついて研究を行ない,次の成果を得た.機械学習とは人間の持つ学習機能をコンピュータ上で実現することである.実験,観測データからコンピュータに科学的法則を発見させることを事実からの機械発見という.機械発見の本質が論駁推論であり,論駁推論可能な仮説空間は機械発見が可能であることがわかっている.論駁推論アルゴリズムは,特別な帰納推論アルゴリズムであり,次のように動作する.アルゴリズムにデータを与えたとき,データを説明する仮説が仮説空間にあるときには正しい仮説を同定し,そうでないときには,データを説明できる仮説が仮説空間にないことを知らせて停止し,仮説空間全体を棄却する.最近,言語を対象として機械発見の計算論的学習理論が創始され,機械発見の理論的基礎が確立された.本研究では帰納的関数の論駁推論可能性を調べて,機械発見の理論的基礎を与えた.機械発見の現実的理論を展開するため,帰納的関数を計算する具体的なプログラミング系の論駁推論可能性を調べた.ループ関数と単純関数のプログラムを具体的プログラミング系として,このプログラミング系が計算する関数のクラスの論駁推論可能性を調べた.ループ命令の入れ子の深さがnであるループプログラムで計算できる関数全体のクラスをF Loop(n)で表すと,F Loop(0)は論駁推論可能であるが,F Loop(n)(n≧1)は論駁推論不可能であることを証明した.論駁推論不可能な関数のクラスは,論駁推論可能な部分クラスの無限列で近似できれば,実質的に機械発見が可能となる.そこで,単純関数を計算する命令を用いて,F Loop(1)を近似する論駁推論可能な部分クラスから成る無限列を構成した.本課題では,科学的法則を発見する機械学習アルゴリズムついて研究を行ない,次の成果を得た.機械学習とは人間の持つ学習機能をコンピュータ上で実現することである.実験,観測データからコンピュータに科学的法則を発見させることを事実からの機械発見という.機械発見の本質が論駁推論であり,論駁推論可能な仮説空間は機械発見が可能であることがわかっている.論駁推論アルゴリズムは,特別な帰納推論アルゴリズムであり,次のように動作する.アルゴリズムにデータを与えたとき,データを説明する仮説が仮説空間にあるときには正しい仮説を同定し,そうでないときには,データを説明できる仮説が仮説空間にないことを知らせて停止し,仮説空間全体を棄却する.最近,言語を対象として機械発見の計算論的学習理論が創始され,機械発見の理論的基礎が確立された.本研究では帰納的関数の論駁推論可能性を調べて,機械発見の理論的基礎を与えた.機械発見の現実的理論を展開するため,帰納的関数を計算する具体的なプログラミング系の論駁推論可能性を調べた.ループ関数と単純関数のプログラムを具体的プログラミング系として,このプログラミング系が計算する関数のクラスの論駁推論可能性を調べた.ループ命令の入れ子の深さがnであるループプログラムで計算できる関数全体のクラスをF Loop(n)で表すと,F Loop(0)は論駁推論可能であるが,F Loop(n)(n≧1)は論駁推論不可能であることを証明した.論駁推論不可能な関数のクラスは,論駁推論可能な部分クラスの無限列で近似できれば,実質的に機械発見が可能となる.そこで,単純関数を計算する命令を用いて,F Loop(1)を近似する論駁推論可能な部分クラスから成る無限列を構成した.
細胞障害や殺菌と関する食細胞NADPHオキシダ-ゼの精製とその性質

好中球のス-パ-オキサイド生成に関わるNADPHオキシダ-ゼは、FADを含むフラビン蛋白質と食細胞に特異的なチトクロムb_<558>からなると考えられている。我々は、無細胞系を用いて主として細胞質に存在する因子とチトクロムb_<558>について研究を行った。1.好中球細胞質因子の解析:ブタ好中球の細胞質をゲルロ過クロマトグラフィ-(セファデックスGー200)にて分画すると、各画分にはス-パ-オキサイド生成能は認められなかったが、分子量30万と5万の画分を混合することにより再構造された。このことは、細胞質には少なくとも2つ以上の因子が存在することを示唆している。分子量30万画分を、2'、5'ーADPアガロ-カラムで分析すると、GTPに依存する活性と分子量5万画分に依存する活性とに分離することができた。このことは、GTP依存性と非依存性の活性化経路が存在していることを示している。また、2'、3'ージアルデヒドNADPHを用いた実験より、NADPH結合部分は細胞質の分子量30万画分に存在することがわかった。2.チトクロムb_<558>に関する研究:無細胞系を用いて膜画分の構成成分、特にチトクロムb_<558>の役割について検討した。0.75%オクチルグコシドで可容化した膜標品をコムギ胚凝集素カラムクロマトグラフィ-で分析することにより、チトクロムb_<558>はNADPHオキシダ-ゼの構成成分の1つであり、また無細胞系での本酵素の活性化にはリン活性化にはリン脂質との再構成が必要であることがわかった。また、マウスの2.2万サブユニットに対するcDNAをクロ-ニングした。そのシ-マクエンスとはヒトのものと高い(87%)相同性を示した。このcDNAを用いて各組織での発現を調べてみると、驚くべきことに、食細胞だけでなく、腎、脾、小腸にも発現していることが判明した。このことは、チトクロムb_<558>の小サブユニットはス-パ-オキサイド生成とは別の機能を有していることを示唆している。好中球のNADPHオキシダーゼについて以下の新しい知見を得た.1)NADPHオキシダーゼの精製ブタ好中球に油滴を食べさせ食胞を調製し,そこに存在するNADPHオキシダーゼをTween20で可溶化後DEAEーセファロース,フェニールセファロースカラムを用いて精製すると,SDSーPAGEでほぼ単一のバンドを形成するまで純化された.しかし,活性が不安定なため活性の回収が著しく低く,今後精製標品の性質を調べるとともに活性の安定化の条件を検討する必要がある.2)NADPHオキシダーゼのNADPH結合部位の検討すでにブタ好中球の可溶化したNADPH

オキシダーゼのNADPH結合部位については2′,3′ージアルデヒドNADPHを用いてアフィニティラベルし,66K蛋白質に結合することを明らかにしている.本年度はヒト休止時好中球と慢性肉芽腫症の好中球においてNADPHが結合するかどうかを検討した,その結果,休止時および慢性肉芽腫症の好中球ともにNADPHは66K蛋白質に結合することが明らかとなった.またヒト血液細胞では好中球の他単球がNADPH結合能を有するがリンパ球,血小板,赤血球はもたないこともわかった.3)チトクロムb_<558>に対するモノクローン抗体の作製ヒト好中球のチトクロムb_<558>に対するモノクローン抗体(7D5)を作ることに成功した.本抗体は,可溶化したチトクロムb_<558>に特異的に結合し,ヘモグロビンやミエロペルオキシダーゼ,チトクロムp_<450>とは結合しなかった.免疫化学的研究により,本抗体は正常好中球とは結合するがリンパ球や赤血球それに慢性肉芽腫症の好中球とは結合しないことが明らかとなった.さらに患者の母親の好中球には結合するものとしないものがあることがわかった.今後この抗体を用いてチトクロム_<558>とNADPHオキシダーゼ活性との相関についての研究が予定されている.好中球のNADPHオキシダーゼについて以下の知見を得た。1.NADPHオキシダーゼの精製前年度までに、ブタ好中球の食胞に存在するNADPHオキシダーゼを可溶化し、DEAE-セファロースとフェニールセファロースを用いてSDS-PAGEでほぼ単一にまで精製した。その分子量は4.5万であった。今年度は、フェニールセファロースで部分精製した後、SDS-PAGEで4.5万蛋白質を分離し電気的溶出によって精製し、これをウサギに免疫してポリクローン抗体を得た。現在、本抗体のNADPHオキシダーゼ活性に対する作用について検討中である。2.無細胞系を用いたNADPHオキシダーゼ活性化の研究好中球細胞膜画分と細胞質画分にアナキドン酸あるいはSDSを加えるとNADPHオキシダーゼが活性化される。細胞質因子はゲルロ過で分子量30万と5万の少なくとも2つの因子からなることをすでに見出していた。今年度はGTPを添加するとO^-_2生成活性が310倍高くなり、このGTP依存性の活性には細胞質因子の一方(分子量30万)のみでよいこと、またこの分子量30万の因子を2′5′ADPセファロースで解析するとGTP依存性と非依存性の2つの成分に分かれることを見出した。このことは、NADPHオキシダーゼ活性化経路に少なくとも2つあること、およびNADPHオキシダーゼのNADPH結合成分は細胞質にあることを示唆している。これらのことを確認するため、2′3′ージアルデビドNADPHを作製しNADPHオキシダーゼの活性化に対する影響をみてみた。NADPHアナログを細胞質成分の一方と前処理すると、活性酸素生成は時間依存性に抑制され、前処理時にNADPHを添加しておくとこの抑制は防止された。細胞質画分のもう一方と細胞膜画分はアナログの前処理によって影響を受けなかった。これらの結果はNADPH結合成分が細胞質画分に存在することを強く示した。好中球は、食作用時あるいは種々の可溶性刺激物質で刺激された時にス-パ-オキサイドをはじめとする活性酸素を生成する。これは膜に存在するNADPHオキシダ-ゼによるが、本酵素はFADを含むフラビン蛋白質とチトクロムb_<558>からなると考えられている。本研究では活性化されたNADPHオキシダ-ゼの精製を試みているが、昨年度からは無細胞系での活性化系を用いて研究を進めている。
学習と記憶のダイナミックモデルとその実験的検証

理論と実験によって、海馬-皮質系の記憶の書き込みと読み出しの情報表現(コーデング)を明らかにした。具体的には、海馬神経回路において、塚田らは時空間パターンをCA1回路のシナプス荷重空間に一時的に貯えるのに時空間学習則が有効に働いていることを理論と実験によって示した(Tsukada et al.,1996,1998;塚田,2004;Tsukada et al.,2005;Aihara et al. 2005;Tsukada and Pan,2005)。聴覚皮質では、聴覚皮質に感覚情報と海馬情報の間にタイミングに依存したゲーティング(タイミング窓)が存在することを示した`(Yamamoto et al.、1999、Miyazaki et al.,2005)。海馬CA1の活動規模によって聴覚野の応答に対し抑制性と興奮性の修飾が生じることは,海馬から大脳皮質聴覚野へ情報を書き込む際により複雑な能力の高い情報処理が可能であることを意味している。また、音と電気ショックの恐怖条件付け学習前後の聴覚皮質応答の光計測に成功した。条件付けられた周波数ではその応答領域が拡大するのにたいし、条件付けのない他の周波数では応答領域に有限な変化が見られなかった(Miyazaki et al.,2005)。実験結果に基づいてモデルを構築し、次の結果をえた。海馬の文脈情報の導入により引き込み領域が拡大するとともに,書き込み及び読み出し時間が著しく改善され、記憶パターンの正解率も向上した(Tsukada and Pan、2005)。また,引き込み領域の拡大はCS音を聴かせた場合のみ聴覚野の応答面積の有意な増加がみられた実験結果を説明していると考える。本研究は脳の学習・記憶・思考のダイナミックな情報表現に注目し、質的に異なる情報を統合した複合システムがどのような情報表現を創出するかをモデルと実験によって明らかにした。具体的には海馬(短期記憶)と皮質(長期記憶)の複合システムに注目し、記憶の書き込みと読み出しのダイナミックモデルを構築した。モデルは次の4つのアルゴリズムからなる。記憶の書き込みモデルのアルゴリズム1)時空間学習則により時空間の事象の文脈を形成し、海馬ニューラルネットの荷重空間に一時的に記憶する(短期記憶)。2)1)の文脈情報と感覚入力をアドレス情報として連合野に安定なアトラクター構造を作り記憶する(長期記憶)。記憶読み出しモデルのアルゴリズム3)海馬の文脈と感覚入力がアドレス情報となる。4)アドレス情報に基づいて皮質上にダイナミックな細胞集合体を形成することによってアトラクターの引き込み領域を読み出す。このアルゴリズムに基づいてシミュレーションを実施した結果、塚田の提案した時空間学習則が学習の書き込みではヘブおよびヘブの拡張則に比較して文脈の分離機能の向上に極めて有効である。また、学習速度も速く"にせ"記憶の数も減少した。読み出し機能では従来の勾配降下法やランダム検索のメモリ想起方法に比較し、読み出し速度と誤り率で極めて優れていることが明らかとなった。斎藤は実験的立場から視覚的運動の認知と神経系の情報表現の関係をサルのMT、MST野細胞の反応特性から明らかにした。深井は理論モデルの立場からダイナミックな情報表現であるタイミング、振動現象、ダイナミック細胞集合がどのように神経系で使われているかを明らかにした。1,実験的研究海馬における文脈生成の基本メカニズムとして次のことが明確となった。(1)海馬CA1における入力-入力および入力-出力のタイミング依存性LTP/LTDの時間窓の存在を明らかにした。(2)DGの電気刺激によるDG-CA3-CA1の海馬周回回路のダイナミックな情報の流れをオプティカルレコーディング装置で計測するのに成功した。今後DG-CA3-CA1回路での文脈生成メカニズムの解析が可能である。

(3)海馬-聴覚皮質系において海馬の電気刺激と音声刺激のタイミングに依存した抑制効果が聴覚皮質系のII、III層のニューロンに表れV、VI層は逆に増強効果が観測された。層間の情報処理の違いが示唆された。2,モデルの研究(1)生理実験結果に基づいて海馬-皮質系の記憶の書き込みと読み出しのプロトタイプのモデルを構築した。モデルは感覚系、海馬系(短期記憶)、連合野(長期記憶)からなり、感覚系からはローカル情報のキイコードがまた海馬系からはグローバル情報の文脈コードとが連合野上でダイナミックに相互作用する。連合野の入力層は両入力のタイミング検出ニューロンとして働き出力層はその情報をアトラクタとして記憶する再帰ニューラルネットワークの構造を持つ。このローカル・グローバル情報は連合野上の記憶場所を指定するアドレサーとして働き記憶の書き込みと読み出しの効率を飛躍的に高めていることが明らかとなった。(2)事象の起こる順番やそれが持続している時間を記憶することは、行動の時間秩序を生成するために、基本的に要求される脳機能である。ここでは、連想記憶モデルやワーキングメモリーモデルで馴染みの深い相互結合型の神経回路モデルを構築し、興奮性細胞の自律発火の持続時間による時間記憶のモデル化を試みた。このモデルでは、時間認知の心理実験においてよく知られているウェーバー則(スケーリング則)が満たされることが証明できた。学習と記憶、推論と思考および行動決定のそれぞれのダイナミックな情報表現を計算論的手法、神経回路モデル、電気生理学実験、行動実験によって明らかにした。具体的には次の成果を得た。(1)ネズミに古典的条件付けや文脈依存の報酬課題を学習させ、オプチカルレコーデングとマルチユニットレコーデングによって海馬-皮質記憶系のダイナミックな情報表現を明らかにした。(2)モルモットの海馬神経回路網で理論学習仮説(時空間学習則)を裏付ける"入力信号の同期生に依存した長期増強(LTP)"の実験結果を得た。(3)オプチカルレコーデングとマルチユニットレコーデングのデータに独立成分解析を応用して、単一ニューロン活動の特徴を分類した。(4)上記(1)(2)の実験結果に基づいて海馬-皮質記憶系のモデルシミュレーションを実施し、文脈に基づく記憶の書き込み・読み出しの高速化モデルを実現した。(5)サルの視覚連合野において、visual flow(等速並進運動、回転運動、接近/離反、奥行きのある3次元運動)の情報表現の理論仮説を裏付ける研究成果を得た。(6)前頭葉の神経活動に基づいて時間記憶の新規なモデルを提案した。(7)2つの弁別課題を組合せ連続的・予測的に選択を行う課題をサルに学習させ、行動学習をさせることにより、推論機能の基礎となる予測的反応をサルが行っていることを明らかにした。またそのときの前頭前野ニューロンの活動を記録し、前頭前野が行動の実行のための認知情報処理だけでなく、刺激-報酬関係の予測的モニターも行っていることを示した。
イマージョン教育と伝統的な外国語教育に於ける音声の習得と維持

本研究は、早期外国語教育が成人になってからの発音能力にどのような影響を及ぼすかを検証した。日本語イマージョン・プログラムの小学校を卒業した学習者と、高校・大学から伝統的な外国語カリキュラムで日本語を学習した者との日本語の発音能力を比較した。その結果、両グループの発音能力において有意差がなく、イマージョン教育のようなインプット量が多い早期外国語教育が成人になってからの音声習得に十分な利益をもたらさなかったと言える。本研究の目的は、イマージョン教育により幼稚園・小学校低学年から外国語に触れ、その後中学校から普通の伝統的なカリキュラムで外国語教育を行なった場合、年少の頃に習得した音声や音韻体系が大人になっても維持できるかを検証することにある。本年度は、幼稚園から小学校まで米国の日本語イマージョンプログラムに在籍していた大学生(n=10)と高校から従来のカリキュラムで日本語を学習した大学生(n=10)を比較し、音声体系がどのように異なるかを調査した。日本語と英語のVoioe Onset Time (VOT)と日本語の促音・非促音の生成に焦点を当てて、VOTは日英とも語頭の[p, t, k]、促音・非促音は[pp, tt, kk: p, t, k]の持続時間を音響分析した。両グループとも、1)学習開始時期に関わらず、日本語と英語のVOTと日本語の促音・非促音を区別しており、2)両グループのVOTと促音・非促音の持続時間には、有意差が見られなかった(VOT: p=.71、促音・非促音の持続時間p=.13)。年少期の教室ではなく、自然な環境での外国語の音声インプットは、その後長い間その言語に触れなくとも、大人になってから学習を再開した場合、音声習得に良い影響を与える(Knightly, Jun, Oh, and Au,2003)とされているが、幼少期から外国語学習を始めた場合でも、イマージョン教育のような教室での限られたインプットでは、青年期から開始した学習者と子音の音声特徴が同じであることが判明したのは興味深い。この結果は、一般に早期言語教育が音声習得に良い影響を及ぼすという考え方に相反するもので、注目に値する。児童期に、自然な言語環境で外国語に触れた経験は、その後インプットが激減しても、外国語の発音に良い影響を与えるとされている(Knightly et al., 2003)。しかし、教室での早期外国語教育がその後の音声習得にどのような影響を及ぼすかは明らかでない。そこで、幼稚園から小学校5年生まで日本語イマージョンプログラムに在籍していた大学生で英語を母語とする日本語学習者と、伝統的なカリキュラムで同レベルの日本話コースを履修し、児童期に日本語学習経験のない英語を母語とする大学生の促音・非促音の発音を比較した。音響的な分析に加え、今年度は日本語母語話者による促音、非促音の聴取実験により、日本語学習者の促音をどのように同定するかを測定した。児童期に日本語イマージョンプログラムに在籍していた大学生、伝統的なカリキュラムで大学入学後日本語の学習を開始した大学生それぞれ13人、日本語母語話者6人が発話した促音を含む3語、含まない3語を2回ずつ繰り返したものを、日本語母語話者8人が促音か非促音のどちらに聞こえるかを判定した。その結果、イマージョン出身者も大学で初めて日本語を学習し始めた者も非促音が促音に判定される傾向があり、両グループとも有意差がなかった。また、促音ではイマージョン出身者のほうが正確で、日本語母語話者との有意差は見られなかった。すなわち、児童期に日本籍のインプットがあろうとなかろうと、母語にない音声よりも、母語にある非促音のほうが習得が難しいと言える。この結果は、児童期の第二言語のインプットが大人になってからの発音に良い影響を与えるという仮説は、イマージョン教育のような多くのインプットが与えられる教室であっても必ずしも当てはまらないと言える。また、母語と学習言語の音声が近ければ近いほど、その相違に気付きにくいというFlege(1995)のSLMの仮説の一つも支持される。本研究は、幼稚園や小学校で外国語を学習した場合、大人になってからの外国語の音声習得や維持にどのような影響を及ぼすかを、最近の第二言語の音声習得の理論的枠組みで、音響分析と聴取実験により検証した。具体的には、日本語イマージョン・プログラムの小学校を卒業後、日本語インプットが少なくなった場合、その後の日本語の音声能力(閉鎖音の開放から次の母音が始まるまでの時間であるvoice onset time(VOT)と促音)にどのような影響を与えるかに焦点を当てた。1)日本語母語話者、2)英語母語話者、3)

幼稚園または小学校1年生から米国の日本語イマージョン・プログラムに在籍し、中学校と高校では伝統的なカリキュラムで日本語を学習し、データー収集の時点で大学3・4年生の日本語(中級)を履修している英語を母語とする学習者、4)高校または大学から日本語を学習し始めた、同じく3・4年生の日本語を履修している英語を母語とする大学生の計4グループのVOT、促音と非促音の閉鎖持続時間、促音対非促音の長さの比を音響分析した。さらに、学習者が促音と非促音の区別が正確にできているかを判定するために、日本語母語話者による学習者の促音と非促音の聴取評価を行った。幼児期に日本語インプットがなかった大学生グループより、幼稚園・小学校で日本語イマージョン教育を経験した大学生グループのほうが優れていた項目は、母語話者による促音の判定のみであった。その他の項目(VOT、閉鎖持続時間、促音と非促音の閉鎖持続時間の割合、非促音の聴取判定)では、両グループとも統計的な有意差はなかった。すなわち、伝統的な外国語教育に比べて、イマージョン教育のようなインプット量の多い外国語教育でも、音声習得への長期的な効果はあまり期待できないという前年度までの暫定的な研究結果が立証された。
コンポーネント発現系を用いたウイルス構造蛋白質の解析

この研究は、麻疹ウイルスとレトロウイルスの構造蛋白質の機能を調べるために構造蛋白質のコンポーネントを単独で発現する培養細胞を樹立し、その解析を行なったものである。ネオマイシン耐性遺伝子を持つウシパピローマウイルス(BPV)ベクターを用いて麻疹ウイルスの糖蛋白質HとFをコードする遺伝子をヒトT細胞株Jurkatに導入したがFは発現せず、Hも細胞表面にはほとんど発現しなかった。発現ベクターを強力なpCXN2(CMVエンハンサーとトリ・βアクチンプローモーターを発現プロモーターとし、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ)に換え、標的細胞としてVero細胞を用いる事により細胞表面にHを発現しているVero細胞のクローンを得ることができた。麻疹ウイルスの感染価はHを発現したクローンと親株の間に差は無かった。従って、ウイルスレセプターと結合するHを細胞に強制発現させても麻疹ウイルスに対する感受性には変化が生じない事がわかった。pCXN2ベクターでもFは発現しなかった。Hを発現しているVero細胞を用いて解析を継続する予定である。マウス白血病ウイルス(MLV)のGag蛋白質の一部、キャプシド(CA)をSRαプロモーター(SV40由来)によりNIH3T3細胞に発現させ、当初CAが核局在傾向を示すとの結果を得た。その後、より強力な発現を求めてMLV・LTR、pCXN2などを用いたが、高い発現を示す細胞を得るのが困難で、細胞内での局在部位も安定した結果ではなかった。CAをコードする領域に潜在的なスプライスドナー部位があり、その配列がRNAの発現量(安定性)に関与する可能性がある。また、MLVのEnv糖蛋白質の変異体でERからゴルジ装置への移行が悪く、その性質のためにMLVの重感染に対しdominant negative mutantとして働くものを発見した。(1)レトロウイルスGag蛋白質コンポーネントの発現:本来はGag前駆蛋白質からプロセスされてはじめて発現するマウス白血病ウイルス(MLV)のキャプシド蛋白質(p30)を、単独で発現可能な形にPCRで増幅し、SRaベクターに組み込みマウス線維芽細胞に導入した。p30に対する単クローン抗体で蛍光染色すると、単独発現したp30は核局在化傾向を持つ。一方、Gag前駆蛋白質の形で発現させてp30に対する単クローン抗体で調べると、細胞質に局在する。p30のアミノ酸配列を詳細に検討するとC末端にいわゆる核移行シグナル(NLS)と思われる配列がある。Gag前駆蛋白質は、そのN末端をミリスチン酸修飾され細胞膜下に運ばれることが知られているが、p30単独発現系ではこのミリスチン酸修飾部位が無いため、p30内部の核移行シグナルの効果が現れたと考えられる。現在この核移行シグナルを欠損したp30の発現を行なっている。SV40プロモーターを用いた発現系の効率は、本研究の対象であるマウス線維芽細胞では良くない。発現効率をあげる工夫のなかから、MLV・LTRを用いる発現系では効率の良い発現のためにはスプライシング部位が重要であることが分かった。(2)レトロウイルスEnv蛋白質の発現:MLV・LTRをプロモーターとしてプライシング機構の下流にenv遺伝子を挿入した場合のEnv蛋白質の発現効率は良い。一つのシステイン残基に変異のあるEnv蛋白質は細胞内輸送に異常をきたし、粗面小胞体に留まることが分かった。(3)麻疹ウイルス糖蛋白質コンポーネントの発現:ウシ・パピローマウイルスベクターにより麻疹ウイルス血球凝集素の遺伝子をJarkat細胞に発現させたところ、粗面小胞体からゴルジ体への移行が悪く細胞表面での発現が少ない。さらに検討中である。麻疹ウイルスの糖蛋白質であるH蛋白質とF蛋白質をヒト

T細胞株Jurk atに発現させるために、ネオマイシン耐性遺伝子を持つウシパピローマウイルス(BPV)ベクターを用いたところF蛋白質は発現できず、H蛋白質も粗面小胞体(ER)からゴルジ装置への移行が不良で細胞表面にはほとんど発現されなかった。そこで発現ベクターをpCXN2(CMVエンハンサーとトリ・βアクチンプロモーターを発現プロモーターとし、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ)に換え、標的細胞としてVero細胞を用い、細胞をクローニングすることにより発現の高い細胞を探した。その結果、蛍光染色法で細胞表面にH蛋白質を発現しているVero細胞のクローンを得ることができた。H蛋白質の発現が最も高いクローンと親株のVero細胞を用いて麻疹ウイルスの感染価測定を行ったが、両者に差を認めなかった。従って、ウイルスレセプターと結合するH蛋白質を細胞に強制発現させても麻疹ウイルスに対する感受性には変化が生じない事がわかった。pCXN2ベクターによってもF蛋白質は発現させられなかった。マウス白血病ウイルス(MLV)のシャプシド蛋白質(CA)および核移行シグナルと思われる配列を除いたCAをNIH3T3細胞に発現させるためにSRα(プロモーターはSV40由来)、MLV・LTR、pCXN2などを用いたが、細胞内での発現局在部が蛍光染色法で判明するほど強い発現を認めなかった。平成4年度にCAの核局在を認めた細胞を凍結状態から戻し蛍光染色法で調べたが、核に局在傾向を示すものの時によっては細胞質により強く染色されたり、細胞全体が染色されたりして安定な結果を得なかった。この研究施行中にアメリカのグループがCAの核移行シグナルが機能してGag蛋白質Pr65の一部が核に移行することを示したが、我々の結果からは確定的とは云えない。
新しい痛み治療薬の開発に向けた炎症性内臓痛発現メカニズムの解明

慢性炎症性腸疾患モデルマウスにおけるTmem45bの役割を、組織学的解析および行動解析によって明らかにする。本研究では以下の5つの実験を行う計画とする。1逆行性神経トレーサーを用いたTmem45bの発現・分布解析2後根神経節におけるTmem45bの発現解析3Tmem45b遺伝子欠損マウスを用いたTmem45bの機能解析(行動解析)4Tmem45b遺伝子欠損マウスを用いたTmem45bの機能解析(CRDテスト)5炎症性腸疾患モデルにおける脊髄でのc-Fos発現解析慢性炎症性腸疾患モデルマウスにおけるTmem45bの役割を、組織学的解析および行動解析によって明らかにする。1逆行性神経トレーサーを用いたTmem45bの発現・分布解析2後根神経節におけるTmem45bの発現解析3Tmem45b遺伝子欠損マウスを用いたTmem45bの機能解析(行動解析)4Tmem45b遺伝子欠損マウスを用いたTmem45bの機能解析(CRDテスト)5炎症性腸疾患モデルにおける脊髄でのc-Fos発現解析
慢性閉塞性肺疾患における呼気ガス分析を用いた診断システムの探索

スパイロメトリーを中心に行われてきたCOPD診断、重症度評価を呼気ガス検査と組み合わせることにより、スパイロメトリーだけでは検出できないCOPDの病型(亜型)や肺の潜在能を検出し、さらに早期診断に役立てることでCOPDの新たな評価方法を見出したいと考えている。患者の呼気ガスは、採血と異なり、苦痛を与えず複数回の採取が可能な検体である。また、特殊な採取装置や点滴ルート、薬剤などを用いないため事前の入念な準備や人手が不要であり、有用性が見いだせれば臨床で用いられ、診療に直結する情報を提供できる可能性が高いと考えている。
精巣における精子形成、消去の動的バランスを考慮した造精機能の新規計量モデル構築

1.精子染色体断片化の組織化学的観察:TUNEL法による染色体nickの検出を試みた。始めに染色体nickの陰性標品を得るため、精液を99%Percoll撹拌密度勾配法、swim up法により分画し、1.13g/ml以上の密度を有する運動精子を分離した。常法に従いTUNEL法による染色を行い、nickをFITCラベル化し、PIで対比染色を行った。nick陽性精子は緑色、陰性精子は赤色蛍光を発する。従来の報告では、FITC/PI2重フィルターを用いる観察が行われたが、定量的観察には両者の高感度CCDカメラによる個別観察、画像合成が不可欠であることが明らかとなった。精製標品のTUNEL陽性比率は1.0%以下であった。本法により、精子精製によって染色体断片化精子排除の可能性が示され、さらに精子精製条件を検討している。TUNEL法により129精液標本のTUNEL陽性率を観察し、精液所見との相関を検討した。WHO基準で精液所見を分類した結果、normozoospermiaは9.4±6.2%(n=73)であったのに対し、oligo-asthenozoospermiaでは(25.9±16.0%(n=24)と有意に高値であった。2.細胞電気泳動による精子染色体断片化の観察:精子をagaroseに包埋し、界面活性剤、酵素処理後、電気泳動した。定量性の向上を目的として実験条件を検討した結果、既報の泳動条件(40V、5分間)では疑陽性の結果が得られることが明らかとなり、精製標品を用いた対比観察により5V、40分間の泳動条件で定量的結果が得られることが明らかとなった。染色後、サイバーゴールドを用いてDNA染色し、蛍光像を顕微用観察した。精液中の精子は染色体断片化に起因するコメット像を示す精子を認めた。100症例の精液所見との相関を検討した結果、所見の低下に伴いコメット陽性像の増加を認めたが、TUNEL陽性率とは相関せず、ヒト精子DNA損傷の観察には両者の同時測定が重要であることが示唆された。3.血漿、精漿中にはアデニルブリンが存在した。血漿ではATPが約50%を占め、アデノシン、cAMPは検出限界以下であった。一方、精漿ではアデノシンが約57%を占め、ATPは1%以下であり、両者のアデニルブリン構成比は大きく異なっていた。

本法により、精子精製によって染色体断片化精子排除の可能性が示され、さらに精子精製条件を検討している。精製標品をDNAase処理すると全ての精子が緑色蛍光を発することを認め、緑色蛍光が精子染色体nickに由来することを確認した。現在、制限酵素を用いて精子DNAの限定的切断を行い、本法のnick検出感度の定量化を検討している。2.1.で検討したTUNEL法により129精液標本のTUNEL陽性率を観察し、精液所見との相関を検討した。WHO基準で精液所見を分類した結果、normozoospermiaは9.4±6.2%(n=73)であったのに対し、oligo-asthenozoospermiaでは(25.9±16.0%(n=24)と有意に高値であった。3.細胞電気泳動による精子染色体断片化の観察:精子をagaroseに包埋し、界面活性剤、酵素処理後、電気泳動した。染色後、サイバーゴールドを用いてDNA染色し、蛍光像を顕微用観察した。精液中の精子は染色体断片化に起因するコメット像を示す精子を認めたが、1.に示した精製精子標品はコメット像を示す精子比率は1.0%以下であった。現在2.で行った精液所見との相関を検討中である。4.血漿、精漿中にはアデニルプリンが存在した。血漿ではATPが約50%を占め、アデノシン、cAMPは検出限界以下であった。一方、精漿ではアデノシンが約57%を占め、ATPは1%以下であり、両者のアデニルプリン構成比は大きく異なっていた。今後、精漿中のアデノシンの起源を検索していく予定である。1.精子染色体断片化の組織化学的観察:TUNEL法による染色体nickの検出を試みた。始めに染色体nickの陰性標品を得るため、精液を99%Percoll撹拌密度勾配法、swim up法により分画し、1.13g/ml以上の密度を有する運動精子を分離した。常法に従いTUNEL法による染色を行い、nickをFITCラベル化し、PIで対比染色を行った。Nick陽性精子は緑色、陰性精子は赤色蛍光を発する。従来の報告では、FITC/PI2重フィルターを用いる観察が行われたが、定量的観察には両者の高感度CCDカメラによる個別観察、画像合成が不可欠であることが明らかとなった。精製標品のTUNEL陽性比率は1.0%以下であった。TUNEL法により129精液標本のTUNEL陽性率を観察し、精液所見との相関を検討した。2.細胞電気泳動による精子染色体断片化の観察:精子をagaroseに包埋し、界面活性剤、酵素処理後、電気泳動した。定量性の向上を目的として実験条件を検討した結果、既報の泳動条件(40V、5分間)では疑陽性の結果が得られることが明らかとなり、精製標品を用いた対比観察により5V、40分間の泳動条件で定量的結果が得られることが明らかとなった。精液中の精子は染色体断片化に起因するコメット像を示す精子を認めた。