hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シナプス形成・制御分子の解析

神経軸索の伸長とシナプス形成は神経回路網形成の最も重要な過程であり、我々はこの発生過程の現象とシナプスの可塑的変化の間に共通のメカニズムがあるものと考えている。本研究では、シナプス形成過程の解析からこの仮説と支持する結果を得、シナプス可塑性を制御する分子の存在を明らかにした。我々の開発した培養系においては、胚令等価日数1317の間にシナプス形成が完了し、シナプス入力・頻度が上昇する。この過程の制御機構を解明するため、異胚令培養系を用い、このシナプス形成のシンプス後細胞依存性を解析した。その結果、シナプス形成には後細胞の何らかの成熟が必要であることが明らかになった。さらに個々のシナプス電流の波形を詳細に検討した結果、この培養系で観察されるシナプスはA/K型グルタミン酸受容体とNMDA型グルタミン酸受容体の両者を含むデュアルコンポーネントシナプスであることが分かった。さらに微小シナプス後電流の波形解析から、個々のシナプス部位に両受容体を含むことも明らかになった。この両受容体の発生過程での挙動を解析すると、興味深いことに、A/K型グルタミン酸受容体が組み込まれる前の胚令等価日数11においてもNMDA型グルタミン酸受容体がシナプス部位に組み込まれ適当な入力があれば機能しうることを発見した。昨年報告した新しい神経突起伸長活性を有する蛋白質は培養系に添加して神経細胞に作用するため、細胞の外側から作用する因子である。しかし、この遺伝子の全長をクローニングしてもシグナル配列は認められなかった。そこで我々はCOS細胞の形質転換を行いこの遺伝子を導入した。1日培養後の培養液を解析すると、この遺伝子産物が培養液中に放出されており、この因子が細胞外で作用できることを抗体を用いて確認した。
旧ユ-ゴスラヴィア紛争と国際社会介入の問題点

旧ユ-ゴスラヴィア紛争は社会主義体制の崩壊から内戦の惹起というユ-ゴスラヴィアの内在的要因と、それへの国際社会の関与による紛争の国際化という双方から捉えられなければならない。本研究はこのうち後者の外在的要因について、国際社会(主として欧米諸国、EU、国連)のボスニア独立承認、調停努力ト分割案の提示、平和保護軍の派遣、国際刑事法廷の設置、和平会議における当事者間の交渉の斡旋、そして95年11月のオハイオ州デイトンでの和平合意に至る過程で、紛争の展開、拡大、終息に果たした国際社会の役割を検証しようとしたものである。当初、欧米諸国はユ-ゴスラヴィアの解体の解釈として、民族自決権を盾に分離独立を指向するクロアチア、スロヴェニア、ボスニアを民主主義的勢力とし、それに反対しユ-ゴスラヴィアの一体性を主張するセルビアを権威主義的体制と規定した。これ以後92年5月のセルビアを含む新ユ-ゴスラヴィア制裁決議、セルビア人による民族浄化の実行、セルビア人戦争犯罪人の摘発といったセルビア敵視政策によって紛争の解決を図った。しかし、紛争は膠着し、提示される分割案がセルビア人勢力受け入れられず、解決のめどが立たなくなると欧米社会は、紛争当事者すべてが民族浄化、戦争犯罪に関わっているとし、セルビア敵視を放棄した。冷戦後の西側欧米諸国の管理能力、国連の信頼性の確保が優先されるなかで、欧米諸国は敵視し、犯罪者とみなしたセルビアに交渉のテーブルに着くように呼びかけ、さらには和平の鍵を握るのはセルビアであるとまで認識を変化させたのである。結局、デイトン合意ではボスニアの一体性と二つの政治的実体の併存、49:51という分割案に落ち着いたが、ボスニア問題の解決には程遠い、大国の面子をかけたボスニア紛争の処理でしかなかったのではないだろうか。
小脳顆粒細胞における低カリウムで誘導されるアポトーシスの細胞内分子機構

私は、昨年度までに小脳顆粒細を用いて、低カリウムで誘導されるアポトーシスにおいてp38 MAPKがc-Junの活性化およびアポトーシス誘導に深く関与していることを報告した(J. Biol. Chem.2001,276,5129-5133)。今年度は新たに以下のことを明らかにした。ASK1はストレス応答に重要なJNKやp38 MAPKを活性化させることがよく知られているキナーゼである。そこで私は、培養小脳顆粒細胞においてASK1がp38 MAPKの活性化に関与しているかを検討した。その結果、LK培地置換後3時間において、ASK1が活性化されることを見出した。優性抑制変異型ASK1(ASK-KM)を発現させると、p38 MAPKおよびc-Junのリン酸化が抑制され、細胞死が抑制されることを見出した。また、恒常的活性化型ASK1を発現させると、p38 MAPKおよびc-Junのリン酸化の増強が観察された(J. Biochemistry, in press)。(2)PI3-KによるASK1経路の活性化抑制生存維持に関わっていることが知られているPI3-KとASK1-p38 MAPK-c-Jun経路の関係について、PI3-Kの阻害剤であるLY294002を用いて解析を行った。その結果、LY294002を投与することにより、ASK1の活性および、p38 MAPKとc-Junのリン酸化が顕著に亢進することがわかった。この結果は、PI3-KがASK1-p38 MAPK-c-Jun経路を負に制御していることを示している。また、BDNFとIGF-1はPI3-K経路の活性化を介し、ASK1にはじまるp38 MAPK-c-Jun経路を抑制することにより生存維持効果を発揮していることも見出した(論文投稿中)。
ゲノム規模データによる節足動物の系統進化の解明

節足動物の進化と多様化のメカニズムを探る上で、系統関係はもっと重要な情報である。本研究の目的は、節足動物門の4亜門(鋏角亜門、多足亜門、甲殻亜門と六脚亜門)の代表的な種からゲノム規模の核タンパク遺伝子の配列を決定し、データベースに公開されている配列データも加え、数百のオーソログ遺伝子のアミノ酸配列を用いて系統解析を行い、節足動物全体を網羅した高次分類群(綱と主要な目)間の系統関係を明らかにすることである。そのうえ、分岐年代を推定し、系統関係の結果と合わせて節足動物の系統進化と陸上進出のプロセスを考察する。初年度では、多足亜門のサンプルを中心にトランスクリプトーム配列の決定と系統解析を行った。その結果、多足亜門の4綱の関係については、コムカデ綱とエダヒゲムシ綱、ヤスデ綱とムカデ綱がそれぞれ姉妹群であることが示唆された。多足亜門の目レベルの系統関係については、概ね形態に基づく分類学的知見と一致した。次年度では、主として鋏角亜門と甲殻亜門の試料からトランスクリプトーム配列の決定を行った。鋏角亜門では、ウミグモ綱とカブトガニ綱から1種ずつ、甲殻亜門では、鰓脚綱から3種、顎脚綱から3種、軟甲綱から4種、計12種のトランスクリプトーム配列を決定した。それぞれの試料から約1500-3600万リードの配列データが得られ、コンティグ数は種によって異なるが、およそ9万-40万得られた。昨年度では、主としてこれまでに得られたトランスクリプトーム配列データを用いて系統解析を行った。節足動物門の4亜門の系統関係については、鋏角亜門と多足亜門の系統的位置は系統解析法やデータセットによって異なる結果が得られている。今後、系統解析により適切な遺伝子とサンプルの選択を行い、節足動物4亜門を網羅した系統関係を明らかにする。これまでの解析により、多足亜門、鋏角亜門と甲殻亜門については必要なトランスクリプトーム配列データを得ることができた。六脚亜門については、代表的な種のトランスクリプトーム配列データをデータベースから入手した。外群の配列データも加えて系統解析するためのデータセットを複数構築した。それらのデータセットを用いた系統解析から、多足亜門の綱レベルと目レベルの系統関係が明らかになった。しかし一方、節足動物門の4亜門の系統関係については、鋏角亜門と多足亜門の系統的位置はデータセットによって異なる結果も得られているため、データセットを構築するにあたって、系統解析により適切な遺伝子とサンプルの選択が必要であると考えている。平成30年度後半では、体調が崩れたために解析の進行に若干遅れが生じた。今後、より適切な遺伝子とサンプルの選択を行い、節足動物門の系統関係を解明し、その進化を考察したい。これまでの研究遂行により、節足動物門の高次分類群間の系統解析に必要な種のトランスクリプトーム配列データはほぼ揃った。これらのデータを用いた多足亜門の系統解析の結果から、信頼性の高い系統樹の構築が可能であることが示唆された。今後は、外群の配列データも加え、これらの配列データをさらに精査し、系統解析により適切な配列データを取り出し、系統解析を行う。解析過程の状況に応じて、他の研究機関または民間のデータ解析の専門機関に相談や一部解析の依頼をすることも考えている。最終的に節足動物門4亜門を網羅した高次分類群間の系統関係を明らかにする予定である。そのうえ、得られた系統関係に基づき、節足動物の形態や機能の進化を考察する。本研究の目的は、節足動物門の4亜門(鋏角亜門、多足亜門、甲殻亜門と六脚亜門)の必要なサンプルからゲノム規模の核タンパク遺伝子の配列を決定し、データベースに公開している配列データも加え、数百のオーソログ遺伝子のアミノ酸配列を用いて系統解析を行い、節足動物全体を網羅した高次分類群(綱と主要な目)間の系統関係を明らかにすることである。そのうえ、分岐年代を推定し、系統関係の結果と合わせて節足動物の系統進化と複数回にわたる陸上進出のプロセスを考察する。昨年度までは、多足亜門のサンプルを中心にトランスクリプトーム配列の決定と系統解析を行った。データベースに公開された配列データも加えて多足亜門の大部分の目を含めた系統解析を行うことができた。その結果、およそ800の遺伝子座(約19万のアミノ酸座位)を含めたアライメントデータセットを構築することができた。この配列データセットを用いて、最尤法による系統解析を行ったところ、多足亜門の4綱の関係については、コムカデ綱とエダヒゲムシ綱、ヤスデ綱とムカデ綱がそれぞれ姉妹群であることが明らかになった。一方、節足動物門においては、鋏角亜門と甲殻亜門の配列データが不足しているため、4亜門の関係はまだはっきりしない。今後この2亜門のデータを増やして節足動物全体を網羅した系統関係を明らかにする。これまでの解析によって、節足動物門の4亜門のうち、多足亜門について必要な配列データがほぼすべて得られた。他の3亜門の一部のサンプルと外群の配列データも加えて系統解析を行った。その結果、予定していた遺伝子数とアミノ酸座数のアライメントデータセットを構築することができた。

そのデータセットを用いた系統解析から、信頼性の高い系統樹を得ることができ、多足亜門の綱レベルと目レベルの系統関係が明らかになった。目レベルの系統関係についてはこれまでの形態に基づく分類学的知見とほぼ一致したが、綱レベルの系統関係については、これまでの形態や分子データから提唱されたものと異なり、興味深い結果となった。今後、この新しい系統関係に基づき、多足類動物の形態や機能の進化を考察したい。節足動物の進化と多様化のメカニズムを探る上で、系統関係はもっと重要な情報である。本研究の目的は、節足動物門の4亜門(鋏角亜門、多足亜門、甲殻亜門と六脚亜門)の代表的な種からゲノム規模の核タンパク遺伝子の配列を決定し、データベースに公開されている配列データも加え、数百のオーソログ遺伝子のアミノ酸配列を用いて系統解析を行い、節足動物全体を網羅した高次分類群(綱と主要な目)間の系統関係を明らかにすることである。そのうえ、分岐年代を推定し、系統関係の結果と合わせて節足動物の系統進化と陸上進出のプロセスを考察する。初年度(平成28年度)では、多足亜門のサンプルを中心にトランスクリプトーム配列の決定と系統解析を行った。データベースに公開された配列データも加えて多足亜門の大部分の目を含めた系統解析を行うことができた。その結果、多足亜門の4綱の関係については、コムカデ綱とエダヒゲムシ綱、ヤスデ綱とムカデ綱がそれぞれ姉妹群であることが示唆された。多足亜門の目レベルの系統関係については、概ね形態に基づく分類学的知見と一致した。次年度(平成29年度)では、主として鋏角亜門と甲殻亜門の試料からトランスクリプトーム配列の決定を行った。鋏角亜門では、ウミグモ綱とカブトガニ綱から1種ずつ、甲殻亜門では、鰓脚綱の無甲目、背甲目、双殻目から1種ずつ、顎脚綱のカラヌス目、キクロプス目、無柄目から1種ずつ、軟甲綱の根鰓亜目(十脚目)、エビ亜目(十脚目)、コノハエビ目、シャコ目から1種ずつ、計12種のトランスクリプトーム配列を決定した。それぞれの試料から約1500-3600万リードの配列データが得られ、コンティグ数は種によって異なるが、およそ9-40万得られた。今後、系統解析を中心としたデータ解析を行い、節足動物全体を網羅した系統関係を明らかにする予定である。初年度の解析によって、節足動物門の4亜門のうち、多足亜門について必要な配列データがすべて得られた。他の3亜門の一部のサンプルと外群の配列データも加えて系統解析を行った。その結果、予定していた遺伝子数とアミノ酸座数のアライメントデータセットを構築することができた。次年度では、鋏角亜門と甲殻亜門から代表的な種(計12種)のサンプルが入手でき、それらのトランスクリプトーム配列データを得ることができた。六脚亜門については、代表的な種のトランスクリプトーム配列データはほとんど公開されているデータベースから入手することができたため、節足動物門の4亜門の配列データはほぼ揃った。今後、外群の配列データを加えて、節足動物門の系統解析を行い、その進化を考察したい。
接触過敏におけるASK1の機能解析

接触過敏は遅延型過敏反応であり、感作相におけるハプテンのへ反応と惹起相において反復される反応により引き起こされる。私たちはASK1が接触過敏反応を促進し、惹起相でのASK1の抑制が接触過敏反応を低下させることを示した。接触過敏反応で重要な役割をもつサイトカインであるIL-17の産生が、ASK1活性化阻害により感作されたリンパ球細胞において強く抑制されることを明らかにした。これらの結果から、ASK1は接触過敏反応における惹起相により関係し、IL-17の産生に寄与することや、ASK1がアレルギー性接触皮膚炎や他のIL-17関連炎症性疾患の治療ターゲットとなりうる可能性が示唆された。皮膚の炎症は外的・内的要因により、自然免疫や獲得免疫機構を介した免疫応答により引き起こされる。しかしながら、外的刺激に対するストレス感受機構と炎症性皮膚疾患との関連性は十分には解明されていない。そこで我々は、ストレス応答分子ASK1に着目し、ASK1欠損マウスやchemical genetic approachを用いたノックインマウス(ASK1ASKAマウス)、時期特異的なASK1発現マウスなどを用いて接触過敏におけるASK1の機能解析を行い、これらの実験系に新規ASK1活性阻害剤を投与して接触皮膚炎の治療薬の開発を目指すことを研究目的とした。H25年度の研究として以下を計画していた。CHSマウスモデルにおけるASK1の機能解析のため、ASK1欠損マウスを用いた。またノックインマウスであるASK1ASKAマウスの作製およびASK1欠損マウスを用いた実験は、東京大学大学院薬学系研究科細胞情報学教室の一條秀憲教授の協力を得て行った。ASK1欠損マウスの繁殖・維持に関しては問題なく行えた。また東京大学大学院薬学系研究科細胞情報学教室の一條秀憲教授の協力を得て、ASK1ASKAマウスの作製およびASK1欠損マウスを用いた実験を遂行した。炎症を惹起させた耳の組織から凍結標本を作製した。耳組織中の炎症性サイトカインや皮膚組織のウェスタンブロット法によるタンパク検出の差異について検討したが、検出感度や結果のばらつきなどにより、一定したデータが得られなかった。そこで本実験で重要な役割を担うリンパ球系の実験を進めたところ、DNFB感作4日後のDNFB特異的リンパ球の養子免疫実験において、リンパ球におけるASK1の存在または活性化が炎症反応の惹起に関わることが示唆された。しかしながら、外的刺激に対するストレス感受機構と炎症性皮膚疾患との関連性は十分に解明されていない。H25年度の研究に引き続き、東京大学大学院薬学系研究科細胞情報学教室の一條秀憲教授の協力を得て研究を遂行した。H26年度はASK1ASKAマウスを用いて、ASK1の特異的活性阻害剤を用いた実験により、in vitro, in vivoにおいて、惹起相におけるASK1の活性化が接触皮膚炎を引き起こすことが明らかとなった。惹起相でのリンパ球細胞、特にCD4+Tリンパ球おけるASK1の活性化がIL-17の産生に寄与し、炎症反応を引き起こすことを明らかにした。また野生型マウスにおいて、惹起相にASK1活性化阻害薬を投与したところ、接触皮膚炎の発症を軽減することが明らかとなった。以上のことより、ASK1は接触皮膚炎マウスモデルにおいて、リンパ球におけるIL-17産生に寄与し、特に惹起相での活性化が接触皮膚炎の発症に寄与することを明らかにした(論文投稿)。皮膚科当初予定していた耳の組織学的検討および炎症性サイトカイン等の検出を目的とした実験では安定した結果が得られなかった。しかし、CHSの重要な病態のメカニズムを担うリンパ球系でのASK1が炎症反応の惹起に何らかの形で関係することが示唆された。このことから、H25年度で作製したASK1ASKAマウスなどを用いて、さらにASK1のCHSにおける機能解析および治療ターゲットとしての解析を目的として、当初の予定通りにH26年度の研究内容を遂行する予定である。当初の予定通り、、CHSの時期特異的なASK1の機能解析を行う。CHSの感作期におけるリンパ球の分化・機能、サイトカイン産生能、時期特異的なASK1の機能解析についてはASK1ASKA

マウスを用いた検討、野生型マウスに対してASK1活性阻害剤を用いることでASK1の治療応用効果を検討する。当初行う予定であった実験であった組織免疫学的検討などを行わず、物品費など予定額に達しなかったため。H26年度に予定していた実験を前倒しで遂行しているが、その他に新たに関連する実験を加えて使用する予定である。
アポリポタンパク質によるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤解明と創薬展開

本研究課題では、血中や脳内でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEについて、(1)HDL非結合-結合型構造間の動的平衡コンフォメーションに関する蛍光分光学的解析、(2)ABCA1トランスポータータンパク質との相互作用を介したHDL形成反応の物理化学的基盤解明と新たなHDL検出法の開発、(3)遺伝的変異アポリポタンパク質の高次構造異常が引き起こす機能欠損・疾患発症の物理化学的メカニズム解明などを行うことで、アポリポタンパク質によるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤解明を進めた。本研究課題では、血中や中枢神経系(脳内)でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEについて、1.HDL非結合-結合型構造間の動的平衡コンフォメーションに関する物理化学的解析、2.ABCトランスポータータンパク質との相互作用を介したHDL形成過程に関する物理化学的・細胞生物学的解析、3.遺伝子変異や多型によるタンパク質高次構造変化とコレステロール代謝調節機能異常・欠損との構造作用相関解析、などの横断的・統合的解析を行うことで、アポリポタンパク質によるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤を解明するとともに、コレステロール代謝制御システムの破綻によって引き起こされる脂質異常症やアミロイドーシス、神経変性疾患などに対する新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。平成25年度は、アポA-Iによる血漿HDL産生・代謝制御機構の解明を目的として、アポA-I-ABCA1相互作用によるHDL形成過程の1分子リアルタイム観測法開発に向けた部位特異的システイン残基導入・環境感受性蛍光プローブ標識化アポA-I分子を設計し、細胞からのHDL形成過程がアポA-I分子の蛍光特性変化から簡便に検出できることを確認した。また、アミロイドーシス変異によるアポA-Iアミロイド線維形成のメカニズム解明を目的として、組織沈着領域であるN末フラグメントのアミロイド線維形成性や線維形態の評価などを行った。さらに、アポEによる脳内HDL代謝制御機構の解明を目的として、アポA-Iの場合と同様な部位特異的システイン残基導入・環境感受性蛍光プローブ標識法の適用によるアポEアイソフォームの分子間会合体とHDL結合構造間での動的平衡コンフォメーション解析を行った。この際、分子間会合性の影響も考慮する目的で、単量体化C末領域変異を導入したアポEアイソフォームの設計・作製も同時に進めた。本研究課題では、血中や中枢神経系(脳内)でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEによるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤を解明するとともに、HDL代謝制御システムの破綻によって引き起こされる疾患の新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。平成26年度は、アポA-Iによる血漿HDL産生・代謝制御機構に関し、前年度に開発した環境感受性蛍光プローブ標識アポA-I分子を用いて、アポA-Iの抗動脈硬化活性の指標となるHDLからの解離特性(HDL非結合アポA-Iとの交換反応)についての詳細な速度論的・熱力学的解析を行った。その結果、低HDL血症変異アポA-Iでは、この反応遷移エネルギーが高いためにHDL間交換反応が抑制されていることが明らかとなった。さらに、HDLの形成・成熟過程でのアポA-I分子のコンフォメーション変化を認識・識別する抗アポA-I抗体の設計・開発に着手し、いくつかのHDL認識抗体候補を得た。また、脳内でのHDL形成を担うアポEアイソフォーム間での水溶液構造や動的HDL結合構造の差異を検出することを目的として、ドメイン特異的トリプトファン変異体の設計・作製やヘリックス領域特異的環境感受性蛍光プローブ標識により、アポEアイソフォームの自己会合や脂質膜結合に伴うN末及びC末ドメインの構造変化をそれぞれ独立して評価する手法を確立した。その結果、アポEアイソフォームの脂質膜への結合にはC末領域を介した会合体から単量体への解離過程が律速であること、また、アポE3とE4アイソフォーム間で自己会合性が異なることよって脂質膜へのC末領域の結合速度が異なることを見出し、アイソフォームによる病態発症機序にアミノ酸置換のあるN末領域ではなくC末領域が深く関与する可能性を示唆した。平成27年度は、HDLの形成・成熟過程でのアポA-I分子のコンフォメーション変化を認識・識別する抗アポA-I抗体の開発を目指し、アポA-I分子内のN末側44-65残基、84-126残基並びに中央部122-143残基領域をエピトープとする抗アポA-I抗体を作成した。これらのうち、N末側44-65残基をエピトープとする#20-7抗体が、アポA-IのHDL結合構造によって結合性が大きく変化することを見出し、アポA-Iのコンフォメーション変化を認識している可能性が示唆された。HDLのコレステロール除去作用には、結合しているアポA-I分子のコンフォメーションが密接に関連していると考えられており、アポA-Iコンフォメーション認識抗体の開発はよりコレステロール除去活性を反映した新たなHDL測定法につながる可能性がある。

一方、ヒト変異アポA-Iによるアミロイドーシス発症の物理化学的機序解明においては、アポA-Iの組織沈着領域であるN末1-83残基フラグメントのアミロイド線維化が、脂質膜環境におけるヘリックス構造形成によって阻害されること、水溶液中での線維化を促進する変異であるG26Rはヘリックス構造の不安定化を通じて脂質膜環境での線維化も促進すること、を新たに見出した(JBC 290, 20947-20959, 2015)。さらに、ポリフェノールの一種であるEGCGがアポA-Iのアミロイド線維形成を強く阻害すること(Amyloid 23, 17-25, 2016)や、細胞表面ヘパラン硫酸の多硫酸化ドメインがアポA-Iアミロイド線維の細胞毒性発現に関与していること(JBC 290, 24210-24221, 2015)、なども明らかにした。平成27年度は、主にアポA-Iタンパク質の環境による高次構造変化、すなわち、HDL結合に伴うαヘリックス構造転移やアミロイド線維形成によるβ構造転移に焦点を当て、その物理化学的メカニズム解明や構造転移検出法について検討した。HDLのコレステロール除去作用には、結合しているアポA-I分子の高次構造(コンフォメーション)が密接に関連していると考えられており、この点で、新たに作成したアポA-Iコンフォメーション認識抗体は、よりコレステロール除去活性の高いHDLすなわち“善玉HDL"の測定法開発につながる可能性を秘めている。また、アポA-Iコンフォメーション認識抗体は、アミロイドーシス変異アポA-Iの構造転移を伴うアミロイド線維形成を高感度で検出できる可能性もあり、疾患誘発性異常アポA-Iの高感度検出・診断法への応用展開が期待される。一方申請者は、アポA-Iフラグメントによるβ構造転移・アミロイド線維形成が脂質膜環境におけるαヘリックス構造形成によって著しく阻害されることを見出し、リポタンパク質粒子や細胞膜脂質などとの結合状態では線維化が起こりにくいこと、アミロイドーシス変異であるG26Rはヘリックス構造形成性を低下させることで脂質膜環境においても線維化を促進すること、などを明らかにした。すなわち、G26R変異はアポA-Iの水溶液中でのアミロイド線維形成を促進するだけでなく、細胞脂質膜上でのアミロイド線維形成においても重要な役割を果たしている可能性が示された。これらの知見は、アポA-IやアポCなどのアミロイド線維形成性の高いアポリポタンパク質が、遺伝的変異によって生理的環境でアミロイド線維形成を起こすメカニズムの解明に重要な示唆を与える。以上のように、当初の研究計画に対しておおむね順調に進展している。本研究課題では、血中や中枢神経系(脳内)でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEによるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤を解明するとともに、HDL代謝制御システムの破綻によって引き起こされる脂質異常症やアミロイドーシスなどの疾患の新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指した。最終年度である平成28年度は、アポリポタンパク質によるHDL産生やアミロイド線維形成における生理的因子として、細胞表面糖鎖による制御機構の解明を進めた。申請者は既に、細胞表面ヘパラン硫酸の多硫酸化ドメインがアポA-Iアミロイド線維の細胞毒性発現に関与していることを明らかにしているが(JBC 290, 24210, 2015)、実際、硫酸化糖鎖であるヘパリンが、ヒトアミロイドーシス変異の一つであるアポA-I 1-83/W50Rフラグメントのアミロイド線維伸長を著しく促進することを見出した。
免疫染色を用いたシグナル伝達分子の発現パターンによる腫瘍のプロファイリング

悪性腫瘍に対するテーラーメード治療を行うためには、個々の症例に対して個別に生物学的悪性度を評価する個別化診断を行う必要がある。本研究は、その基盤となるデータを作製するために、選定した腫瘍において免疫染色によりシグナル伝達分子の発現パターンをプロファイルするパイロット研究である。胃癌における結果では、新規分子標的薬の治療対象となる分子の発現などが見つかり、この方法の有用性が示された。【免疫染色によるプロファイリング】1.対象組織の選定:大腸癌及び胃癌組織を浸潤部間質量(med, int, sci)により10例ずつ選定した。腫瘍の間質量に比例して悪性度(脈管侵襲、Stage)が高くなることが判明。2.対象分子の選定と分類、免疫染色の条件検討:検討予定だった細胞増殖群(リン酸化を検出)、アポトーシス群(発現量、リン酸化の検出)、細胞周期群(発現量、リン酸化)、受容体群(発現量、リン酸化)、その他(転写制御、細胞接着、シグナル伝達分子など)の抗体のうち、約20種類の抗体の条件検討を終了。当初、使用予定だったpERK, pP38の抗体は染色ムラが強く、使用に適さないことが判明したため、現在他の会社の抗体を選定中。また、新たに、腫瘍血管の性状を判定するための抗体群(alpha-SMA,Desmin, PDGFR-beta, CD31, VEGFR)も追加検討を行っている。【低分子量G蛋白の活性化状態の病理組織標本での可視化】形質転換細胞を用いた検討: RasV12及びRacV12(ともに恒常的活性化型変異体)、あるいはRasN17及びRacN17(ともに恒常的非活性化型変異体)を強制発現させた293T細胞を、スライドガラス上に付着。風乾あるいはホルマリン固定後に染色を行った。pH6.0クエン酸バッファーにて賦活処理後、融合蛋白1ug/mlを4°C、1時間反応させ、抗GSTmAb(x200希釈)を用いて染色を行った。結果、GTP-Racが細胞質内及び細胞膜近傍に検出可能であることが判明した。しかさらなるBack groundの調整が必要である。病理組織への応用:パラフィン包埋セルブロックでの検討でもRacの検出が可能であった。【免疫染色によるプロファイリング】1.対象組織の選定:胃癌20例を選定し、脈管侵襲の程度、発症年齢にて分類し下記の染色を施行。また悪性リンパ腫(T細胞、B細胞、それぞれ20例ずつ)についても、シグナル分子の検討を行った。3.結果:【胃癌】正常部に比して腫瘍部で明らかな発現上昇を認めたのが、DOCK180、COX-2、PDGFR-beta、CD44、MMP7であった。また、c-Kit,EGFRについては、明らかな発現を認める症例が20-30%認められた。脈管侵襲や間質量と相関のある分子群は同定出来なかった。40歳以下の若年発症例では、40歳以上の症例に比して有意にbeta-Cateninの核染色性が認められた。【悪性リンパ腫】検討を行った全ての症例においてDOCK2の発現が認められた。4.考察、意義、重要性:胃癌において、EGFRやc-kitの発現している症例については、分子標的治療が有効である可能性があり、治療法の選択枝を増やすことが期待できる。また、予後不良な若年例でb-cateninが陽性となることから、Wnt-pathwayの関与や示唆され、新たな治療戦略の策定が期待できる。
認知的尺度に基づく動画の検索および発信の支援に関する研究

認知的尺度に基づく動画検索に関する研究では、動画に投稿された時刻同期コメントを利用し、視聴者が「かわいい」や「高音綺麗」などと言っている動画を探すことを実現した。研究成果をICDMW 2016で発表し、Webサービス「Songriumコメント分析」(http://comment.songrium.jp/)として公開した。N次創作活動のモデル化に関する研究では、派生コンテンツの制作を引き起こした要因を推定するためのモデルを提案した。研究成果をCIKM 2016で発表し、Webサービス「Songrium派生要因分析」(http://factor.songrium.jp)を公開した。本年度は、視聴者の反応をクエリとして使用することで、ユーザが自分好みの動画のランキングを生成できるシステムSmartVideoRankingを提案した。たとえばユーザが「初音ミク」というクエリを入力すると、SmartVideoRankingは「ベースかっこいい」や「鳥肌がすごい」といった視聴者の反応をキーワードとしてユーザに推薦する。ユーザが「鳥肌がすごい」というキーワードを選択すると、SmartVideoRankingは「初音ミク」に関する動画の中で「鳥肌がすごい」という反応が多い動画ほど上位に表示されるランキングを生成してユーザに提示する。本研究では、クエリに対して有用な視聴者の反応を抽出するために,視聴者が動画に投稿した時刻同期コメントを利用した。提案手法では,コメントに関する特徴を用いた機械学習により、クエリに対するコメントの有用度を推定する。50個のクエリを用いた評価実験の結果、提案手法によって推定された有用度と評価者によって判定された有用度の相関は平均で0.7547を達成した。また、クエリに関する動画を再生数の多い順に表示する従来のランキングと、ユーザが選択したコメントに基づいて生成されるランキングを比較したところ、上位30件の重複の平均は2.923件であり、コメントを検索に用いることで従来のランキング方法では発見が困難な動画を閲覧可能なランキングを生成できることを示した。最後に、SmartVideoRankingのプロトタイプを実装し、コメントに基づく動画のランキングシステムを実現した。平成27年度は、(1)認知的尺度の自動抽出、(2)認知的尺度に基づく動画のランキング、(3)検索支援のためのWebサービスの開発、に取り組むことを掲げ、いずれも予定通りに達成された。(1)認知的尺度の自動抽出については、コメントごとに14カテゴリから成る特徴量を求め、機械学習によって各コメントの認知的尺度としての有用性を測ることで自動抽出を実現した。また、1万件のコメントに対する有用度を人手でラベル付けすることで、推定された有用度の精度を定量的に評価し、十分に高い精度で推定できていることを示した。(2)認知的尺度に基づく動画のランキングについては、対象コメントおよびその類似コメントの各動画への投稿数を求めることで、対象コメントとの関連が強い順に動画をランキングすることを実現した。(3)検索支援のためのWebサービスの開発については、認知的尺度に基づく動画検索システムのプロトタイプSmartVideoRankingを作成し、翌年度のWebサービスの公開につながる成果をあげることができた。また、当初は平成28年度に取り組む予定であった、検索クエリにとって重要な認知的尺度の推薦にも、当初の予定を前倒しして取り組んだ。認知的尺度の自動抽出において、検索クエリとの関連度も特徴量として考慮することで、クエリに応じた動的な認知的尺度をユーザに推薦することを可能とした。以上の理由により、現在までの進捗状況は当初の計画以上に進展していると言える。本年度は大きく分けて二つの研究に取り組んだ。一つ目は認知的尺度に基づく動画検索である。動画に投稿された時刻同期コメントを利用することで、みんなが「かわいい」や「高音綺麗」、「イントロ超かっこいい」などと言っている動画を探すことを実現した。昨年度は簡単なプロトタイプの作成にとどまっていたが、本年度は、誰もが利用できるように、その機能をWebサービス「Songriumコメント分析」(http://comment.songrium.jp/)として公開した。本サービスでは、検索に使用するコメントの推薦、直接コメントを入力することによる動画検索、動画の見どころの可視化などを実現した。また、本研究の成果を国際会議IEEE ICDMW 2016で発表した。二つ目はN次創作活動のモデル化である。オリジナルコンテンツから次々と新しい派生コンテンツが制作されるN次創作活動において、派生コンテンツの制作を引き起こした要因を推定するためのモデルを提案した。提案モデルでは、クリエータが派生コンテンツを制作する際に次の3つの要因が影響すると考えた:(1)オリジナルコンテンツの魅力、(2)オリジナルコンテンツの人気、(3)派生コンテンツの人気。各要因の影響力を確率的に推定することで、各クリエータが各要因を重視する度合いの可視化や、オリジナルコンテンツを起点とする派生樹形図の作成を実現した。そして、推定結果をWebブラウザ上で閲覧できるWebサービス「Songrium派生要因分析」(http://factor.songrium.jp/)を公開した。さらに研究成果を国際会議ACM CIKM 2016で発表した。

研究成果をCIKM 2016で発表し、Webサービス「Songrium派生要因分析」(http://factor.songrium.jp)を公開した。平成27年度に作成した認知的尺度に基づく動画検索システムのプロトタイプSmartVideoRankingを元にしたWebサービスを、誰もが無償で利用できるかたちで公開する。公開後は、サービス利用者のプライバシーに配慮しつつ、サービス上での利用者の操作ログを収集する。ログを用いて、認知的尺度に基づく動画検索という新しい体験を提供したときに、ユーザの動画検索および閲覧行為にどのような影響を与えるかを分析する。また、これまでは事前に用意した1万件のコメントに対するラベルだけを正解データとしていたが、サービス上でユーザが好んで選択するコメントの情報を収集することで、実際のユーザのニーズにより即した正解データを日々更新しながら収集し、学習に反映させる。発信支援に関しては、発信直後でユーザの反応が少ない動画であっても各認知的尺度で検索された際に適切な順位にランキングされるよう、各尺度について、コメントの内容と動画の特徴量の関係の強さを明らかにする。また、コメント量や内容に応じて、動画の特徴量とコメントのどちらをどの程度重視するかを動的に変更することで認知的尺度の推定精度を高める方法についても検討を行う。動画の持つ個性の明確化を目的とした、制作者に対するキーワードやサムネイルの推薦については、ユーザの検索行動の分析などから、認知的尺度ごとに、ユーザが動画に到達しやすいパターン(タグでの検索が多い、など)を明らかにする。これにより、動画への到達可能性が最も高くなる情報推薦の手法について検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。情報検索・知識抽出28年度が最終年度であるため、記入しない。
九州における先白亜紀火成活動の実態解明

東アジアでは,白亜紀の火成活動と同様にジュラ紀以前の活動が活発であった.ここ数年九州においても先白亜紀の火成活動の存在が知られるようになってきたが,これまでその実態は不明であった.本研究では,九州における先白亜紀の火成活動に焦点をあて,その位置付けを明らかにしてきた.そして,これらに白亜紀の活動を含め,九州における中生代の火成活動の時空変化とその起源を考察した.その結果,今年度の研究成果は以下に集約される.1.211Ma示す肥後変成帯の宮の原トーナル岩は,年代値および岩石学的な類似性から飛騨帯の三畳紀花崗岩類に対比されることが明らかとなり,アジア大陸東縁の沈み込みに伴う火成活動として位置付けることができる.2.九州の白亜紀花崗岩類は,122Ma頃中部九州で始まり115Ma頃終わる.一方,北部九州では11590Maにかけて活動した.つまり,火成活動場は年代とともに北上した.10070Maになるとさらに北上し,火成活動場は朝鮮半島南部に達した.このような火成活動場の移動は海嶺の接近に伴う沈み込みシステムの変化に対応している可能性がある.3.白亜紀花崗岩類のSr同位体比初生値は限られた範囲の組成を示し,朝鮮半島南部の花岡岩類の値も類似する.このことから,朝鮮半島南部も含めた九州の白亜紀花崗岩類は,同位体的に比較的均質な起源物質からもたらされたことを示唆する.4.九州における中生代花崗岩類は岩石学的特徴が類似しており,主・微量元素組成や同位体比組成からこれらのマグマは苦鉄質な下部地殻の部分溶融によって生じたと考えられる.東アジアでは,白亜紀の火成活動と同様にジュラ紀以前の活動も活発であった.最近,中部九州の肥後変成帯地域および朝地変成帯地域において,先白亜紀に活動した花崗岩体の分布が明らかにされてきた.これらジュラ紀以前の火成活動も含め,九州における中生代の火成活動と東アジア大陸縁辺部のそれとの対比を検討した.その結果,今年度の研究成果は以下の4点に集約される.1. 211Ma示す肥後変成帯の宮の原トーナル岩は,年代値および岩石学的な類似性から飛騨帯の三畳紀花崗岩類に対比されることが明らかになった.2.朝地変成帯地域の山中花崗閃緑岩(164 Ma)および国東半島に分布するのトーナル岩(142 Ma)は,舞鶴帯および朝鮮半島のジュラ紀花崗岩類に対比される可能性がある.3.白亜紀火成岩類は西南日本内帯に広く分布している.九州の白亜紀火成活動は,中国地方に分布する領家帯および山陽帯の花崗岩類よりむしろ朝鮮半島南部の花崗岩類に対比されることを明らかにした.東アジアでは,白亜紀の火成活動と同様にジュラ紀以前の活動が活発であった.ここ数年九州においても先白亜紀の火成活動の存在が知られるようになってきたが,これまでその実態は不明であった.本研究では,九州における先白亜紀の火成活動に焦点をあて,その位置付けを明らかにしてきた.そして,これらに白亜紀の活動を含め,九州における中生代の火成活動の時空変化とその起源を考察した.その結果,今年度の研究成果は以下に集約される.1.211Ma示す肥後変成帯の宮の原トーナル岩は,年代値および岩石学的な類似性から飛騨帯の三畳紀花崗岩類に対比されることが明らかとなり,アジア大陸東縁の沈み込みに伴う火成活動として位置付けることができる.2.九州の白亜紀花崗岩類は,122Ma頃中部九州で始まり115Ma頃終わる.一方,北部九州では11590Maにかけて活動した.つまり,火成活動場は年代とともに北上した.10070Maになるとさらに北上し,火成活動場は朝鮮半島南部に達した.このような火成活動場の移動は海嶺の接近に伴う沈み込みシステムの変化に対応している可能性がある.3.白亜紀花崗岩類のSr同位体比初生値は限られた範囲の組成を示し,朝鮮半島南部の花岡岩類の値も類似する.このことから,朝鮮半島南部も含めた九州の白亜紀花崗岩類は,同位体的に比較的均質な起源物質からもたらされたことを示唆する.4.九州における中生代花崗岩類は岩石学的特徴が類似しており,主・微量元素組成や同位体比組成からこれらのマグマは苦鉄質な下部地殻の部分溶融によって生じたと考えられる.
流域でのフミン鉄の挙動に着目した河口・沿岸域生態系保全のための流域管理手法の開発

毒素生産シアノバクテリアであるL.majusculaは,自らスーパーオキシドを生成し,熱力学的に安定な第二鉄(Fe(III))をより溶解度の高い第一鉄(Fe(II))に還元することで鉄を摂取すると考えられている。しかし,この鉄摂取戦略を議論する上で必要不可欠である,沿岸域で優位なフミン鉄や水酸化鉄とのスーパーオキシドの反応性は未だ把握されていない。平成18年度では,スーパーオキシドを介したL.majusculaによる鉄摂取経路解明を行った。まず,キサンチンの酸化によりスーパーオキシドを生成し,還元反応により生じたFe(II)をフェロジンによりトラップすることで,鉄を摂取する過程を室内実験で再現した。生物利用可能なFe(II)の生成実験から,スーパーオキシドによるフミン鉄の生物利用性はその起源により異なるが,酸性官能基を多く含むフミン物質に結合した鉄ほど生物利用性(還元速度)が低いことが明らかとなった。また,Fe(II)生成に関わる各種反応速度を測定した結果,フミン鉄の中でも特に強く結合している錯体は,錯体が還元された後解離し,摂取される経路が優位であった。以上の結果は,フミン物質の起源,すなわち土地利用や植生等の流域環境の違いが,沿岸域での鉄の生物利用性に大きな影響を与えることを示す。また,実験的に算出されたFe(II)生成に関わる各種反応速度を用いて,L.majusclaの鉄摂取に関する新たな反応スキーム(鉄摂取モデル)が構築された。以上の研究から,スーパーオキシドを用いた藻類の鉄摂取過程に関する新たな知見が得られ,鉄摂取モデルの構築に成功している。前年度までに構築されている,沿岸域でのフミン鉄の錯平衡及び凝集モデルや,潮流拡散モデルを融合させることで,鉄の供給形態から生物摂取までの一連の過程を総合的に捉えた上で,鉄の生物利用性を評価することが可能となった。平成17年度では,現地調査及び室内実験モデルを通して,沿岸域におけるフミン鉄の錯平衡挙動及び鉄の生物利用性を評価した。松島湾における年間調査では,沿岸域における溶存有機物質の性質(フミン物質含有量,分子量,安定同位体比)と溶存鉄の季節及び空間的分布変化が観測された。塩濃度増加に伴い,鉄はフミン物質から解離して,水酸化鉄を形成するため,河川から沿岸域にかけて鉄濃度は急激に減少することが示された。しかしながら,沿岸域ではフミン物質が外洋より高濃度で存在するため,溶存鉄(フミン鉄)濃度(0.11.0μM)が外洋(数nM)よりも高いことが分かった。沿岸域におけるフミン鉄の錯平衡は,デバイ-ヒュッケル理論に基づき電気化学的視点から構築された。理論式は,フミン物質官能基種の量,分子量,溶液のイオン強度,pH等の物理化学的なパラメータを考慮することができる。一般に,デバイ-ヒュッケル理論は高塩濃度域に適用できないが,このモデル式では,Davies近似を導入することで,イオン強度と自由エネルギーの関係について補正を行い,高塩濃度においても適用可能にした。構築されたモデルは,フルボ酸及びフミン酸と鉄の錯平衡実験結果と非常によく適合した。スーパーオキシドにより第二鉄を還元し藍藻類独自のタンパク質により鉄を摂取する過程を,キサンチン,キサンチン酸化酵素及びフェロジンを用いることで再現した。この研究では,鉄の形態として水酸化鉄及び起源を異にする様々なフミン鉄を用いた。スーパーオキシドによるフミン鉄の還元速度(すなわち生物利用性)は,その起源及び性質(酸性官能含有量)により異なることが分かった。また,これまで水酸化鉄は植物プランクトンに使用されにくい形態とされてきたが,形成時間(酸化程度)が比較的短い場合においては,水酸化鉄はフミン鉄と同程度の還元速度を示すことが明らかとなった。

前年度までに構築されている,沿岸域でのフミン鉄の錯平衡及び凝集モデルや,潮流拡散モデルを融合させることで,鉄の供給形態から生物摂取までの一連の過程を総合的に捉えた上で,鉄の生物利用性を評価することが可能となった。
齧歯類におけるハンタウイルス持続感染成立機構(感染免疫担当細胞の機能)の解析

ハンタウイルスは持続感染齧歯類が感染源となる人獣共通感染症でヒトに腎症候性出血熱やハンタウイルス肺症候群という重篤な疾病を引き起こす。齧歯類は血中に高い中和抗体を保有しつつ不顕性にウイルスを排泄し続けるというきわめて特徴的な持続感染を成立させている。本研究では齧歯類におけるウイルス特異的CTL抑制を中心とする免疫抑制を介したハンタウイルス持続感染成立機構の詳細を明らかにすることを目的とする。ハンタウイルスは持続感染げっ歯類が感染源となる人獣共通感染症でヒトに腎症候性出血熱やハンタウイルス肺症候群という重篤な疾病を引き起こす。本研究では齧歯類におけるハンタウイルス持続感染成立機構を明らかにすることを目的とする。本年度はまず持続感染マウスでの免疫担当細胞の感染を検討した。その結果、新生仔期に感染させ二週後のマウスの脾細胞中から局在的に付着系の免疫担当細胞に感染が確認された。この二週を境界にマウスの細胞性免疫は抑制され、持続感染期にはいり、その後ゆっくりと脾細胞中の抗原は排除に向かいウイルスの潜伏は肺に集中する。次にハンタウイルス感染抗原提示細胞の持続感染成立への関与を明らかにするために、細胞移入によって持続感染を誘導することを試みた。はじめに移入源として新生仔期に感染させ2週後のマウス脾細胞を用いた。感染二週後マウスの脾細胞をスキッドマウスに移入しその後の経過を観察したところ、スキッドマウスに持続感染を誘導することに成功した。次に細胞性免疫測定用の抗原提示細胞として用いている持続感染P388D1細胞を移入したところ、本来のガン細胞としての毒性のため使用できなかった。次に、マウスの尿・鼻腔粘膜洗浄液を用いて細胞への感染増強効果を検討したが効果は認められず、in vitroでのプライマリー細胞への感染増強による持続感染抗原提示細胞の調整は困難であると考えられた。持続感染誘導メカニズムを明らかにするために、誘導に成功した感染二週齢マウスの脾細胞中の感染細胞種の特定を行った。その結果CD11c陽性細胞で有意に感染が起こっていることが確認された。そこでこの感染マウス由来由来CD11c陽性細胞と、非感染マウス由来相当細胞の遺伝子発現パターンをマイクロアレイで比較し、現在解析中である。本年度はマウスでの免疫担当細胞中に高い感染効率を持つ細胞群がCD11c陽性細胞であることから、この感染マウス由来由来CD11c陽性細胞と、非感染マウス由来相当細胞の遺伝子発現パターンをマイクロアレイで比較し解析した。その結果IRF7の関与する情報伝達系に異常がある可能性が示された。また、ハンタウイルスの外被糖蛋白由来の合成ペプチドを調整しCTLエピトープをH-2Dマウスについて決定した。その結果既報のNP上のエピトープよりも主要なエピトープを決定すした。最終的に持続感染成立とCTLエピトープの抑制を3つのエピトープについて解析することが可能となった。これらの新規エピトープは一過性感染では誘導されるものの持続感染マウスにおいては抑制状態にあることが明らかとなった。ひとつは既報のNPエピトープと同様にMHC tetramerで検出される細胞を欠いており、クローンの消失が起こっている可能性が示された。一方、主要エピトープにおいてはMHC tetramerで検出されるCD8+T細胞はあるものの、このペプチドで刺激した場合のIFN-gammaの産生が見られず、何らかの機能不全に陥っている可能性が示された。さらに、持続感染マウスのT細胞においては抑制系のコレセプターであるPD1が高率に発現していることが明らかとなった。以上の結果からハンタウイルス感染抗原提示細胞からの何らかの不正な働きかけによって、PD1システムによる免疫抑制がCTLに起こり、結果として持続感染が成立している可能性が示された。ハンタウイルスは持続感染げっ歯類が感染源となる人獣共通感染症でヒトに腎症候性出血熱やハンタウイルス肺症候群という重篤な疾病を引き起こす.齧歯類は血中に高い中和抗体を保有しつつ不顕性にウイルスを排泄し続けるというきわめて特徴丙な持続感染を成立させている。

本研究では齧歯類におけるハンタウイルス持続感染成立機構を明らかにすることを目的とする、昨年度までの結果で、持続感染マウスのT細胞においては抑制系のコレセプターであるPD1が高率に薬現していることが明らかとなり、ハンタウイルス感染抗原提示細胞からの何らかの不正な働きかけによって、PD1システムによる免疫抑制がCTLに起こり、結果として持続感染が成立している可能性が示された。今年度は野生ラットでの本抑制システムの実証を目指して、ラットでの感染実験を進めた。成熟ラットにハンタウイルスを実験感染し、一過性感染を誘導した。このラットからIgM検出系・リアルタイムPCRによるウイルスゲノム定量系を構築した。この二つはIgG抗体と並んで持続感染の指標となると考えられる。これらのラットを用いてこれまでに合成したソウルウィルス合成ペプチドを用いてCTLエピトープの検索を進めている。さらにベトナムサイゴン湾近郊で発見した持続感染ラットコロニー由来ウイルスの配列に準じたリアルタイムPCRによるゲノム検出システムを開発した。現在これらの解析系を用いて自然感染ラットにおける免疫の状態を解析中である。これまでの結果では自然感染ラットは高いIgG抗体を持ちながらウイルスゲノムも同時に保有し、さらにIgMも検出される。この状態はこれまでの実験マウスを用いた持続感染モデルで得られた結果と一致することから、おそらく昨年度までに解析を進めた実験感染モデルは野外の状況を反映した解析系で有ると考えられた。今後CTLの抑制と抑制系分子の発現についても解析を進あることで、持続感染成立のメカニズムを実験感染および野外例の解析の両面から明らかにすることができると考えられる
安全な光による生体透視と機能イメージングを実現するシステムの創成

本研究は、マクロな生体内部の構造情報および機能情報を、光により3次元的に透視イメージングすることをめざし、安全で臨床応用に実用可能なシステムを開発しようとするものである。本年度は主として、初年度の基礎的検討で定められた3次元光透視原理の具体化をめざして研究を行った。具体的成果は次のとおりである。1.以下のシミュレーションを繰り返し行い、システムパラメータの最適化を図った。1)輸送方程式の拡散近似解またはモンテカルロ法を用いた、拡散性散乱媒質における光伝搬のシミュレーション。2)光計測における誤差が吸光度推定の逆問題解に及ぼす影響のシミュレーション。3) 3次元透視像再構成アルゴリズムのシミュレーション。2.シミュレーションにより得られた最適化パラメータの実験的検証を行った。実用条件に合致しない場合は、1項に戻り再度シミュレーションを行った。3.決定したシステムパラメータを実装するハードウェアおよびソフトウェアを設計した。設計にあたっては、ロボットアームのようなインテリジェント機構の利用を前提にした。またソフトウェアでは、深層学習など最新技術の援用を図った。4.設計したシステムを、次の各段階を経てプロトタイプシステムに作り上げる工程を開始した。1)設計に基づき、ハードウェア各部を製作するとともにソフトウェア各部を実装する。2)ハードウェア各部、ソフトウェア各部をシステム化し、バラックシステムを作り上げる。3)バラックシステムの動作試験を通して、システム化に起因する問題点を抽出し、その解決を図る。4)バラックシステムを計測アプリケータ部と制御・表示用コンソール部の2筐体に統合する。5.これらの成果を国際会議や国内学会で発表するとともに、学術誌に投稿し採択された。発表の内1件は、表彰を受けた。また、2019年10月開催の国際会議での基調講演が決定した。生体の光透視では、生体組織における強い光散乱により、体内深部構造の吸光像は顕著にぼけたものとなる。この問題をどう解決するかが、本研究の成否を分ける鍵となる。我々はこれまで、体内点光源が体表面に形成する光強度の空間分布を点拡がり関数(PSF)として理論的に導出した。当初の計画では、このPSFを用いた画像演算により散乱効果の抑制を図ってきた。これに対し本基盤研究において、深層学習(deep learning)により散乱効果を抑制する手法の可能性が見出され、その有効性が実証された。これにより、ソフトウェアの性能が大きく向上するだけではなく、本研究開発が加速すると期待される。当初の研究計画に加え、深層学習による散乱効果抑制手法の有効利用により、さらに高性能なシステムの開発を追求する。具体的には、散乱を抑制した透視等の原理を3次元透視法に発展させ、理論解析や光伝搬シミュレーションを通して最適化したプロトタイプシステムを開発するところまでを、本研究の目標とする。初年度の研究は、3次元光透視原理の確立をめざして行われた。1.透過型光透視による3次元光透視の実現:申請者らが開発した散乱抑制原理および点拡がり関数(PSF)による散乱効果抑制原理を集約し、高分解能な透視法に発展させた。また、多方向からこのような高分解能透視像を撮影し、3次元透視像に再構成する方法を開発した。2.反射型透視による3次元光透視の実現:後方散乱光の時間分解計測または空間分解計測により深さ方向吸光度分布を推定する方法を考案し、反射型光透視を実現した。透過型では拡散透過光が得られる厚みの生体にしか適用できないが、反射型では厚くとも適用可能である。ただし得られる3次元透視像は、中央部が不可視の一定深さまでのものとなる。3.光CT法による3次元光透視の実現:申請者らが考案したCT像再構成法により断層像が得られる。得られた断層面をその法線方向に順次シフトして3次元光透視を実現する方法を開発した。4.シミュレーション:生体組織をモデル化し、上記開発手法の有効性をコンピュータシミュレーションにより検証した。5.研究成果の報告:これらの成果を国内学会や国際シンポジウムで発表しそれらのいくつかは表彰された。また2018年7月の国際会議において基調講演として発表することが決定した。我々はこれまで、体内点光源が体表面に形成する光強度の空間分布を点拡がり関数(PSF)として、理論的に導出したPSFを用いた画像演算により散乱効果の抑制を図ってきた。今年度の研究を通し、深層学習(deep learning)により散乱効果を抑制する手法の可能性を見出した。これが有効になれば、ソフトウェアの性能が向上するだけではなく、全システムの開発が加速されると期待される。