hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトの尿に内在する新たな循環器・腎臓疾患のバイオマーカーの開発

ヒトの尿より新たなアンジオテンシン関連ペプチドを単離し、構造解析を行った。その結果、このペプチドはこれまでに報告のない新しい分子型である事が分かった。そこで、このペプチドに対する抗血清をウサギで作製し、測定系を確立した。ヒトの尿500検体の新規ペプチドの測定を行ったところ糸球体濾過率が減少すると尿中の新規ペプチドの排泄量が有意に増加する事が明らかとなった。また蛋白尿を伴う糖尿病患者ではこの新規ペプチドが有意に増加していた。つまり糖尿病性腎症のバイオマーカーになりうる可能性が示唆された。さらに抗血清を用いて免疫染色を行ったところ腎臓・心臓を含めた多くの組織中に新規ペプチドが存在している事が明らかとなった。レニン・アンジオテンシン系(RA系)は、循環器・腎臓疾患の発症や進展において重要な役割を果たしており、RA系の評価(生化学検査)は、これらの疾患の治療・診断に欠かせないものとなっている。最近、研究代表者の予備的検討により、尿中に循環器・腎臓疾患のバイオマーカーとなりうるRA系関連ペプチドの存在が確認された。そこで本研究は(1)尿中に存在するRA系関連ペプチドの精製・構造解析;(2)発見したペプチドの簡便な測定系の確立;(3)各疾患患者で新規ペプチドの特徴付け;(4)動物実験にて新規ペプチドの病態生理学的役割の解明;(5)関連疾患での臨床応用を目指すことを目的として行った。目的(1)に関してヒトの尿中に存在する新規RA系関連ペプチドをゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、自作のアフィニティカラム、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製を行った。精製したペプチドは、質量分析装置を用いて一部の構造を決定し、本ペプチドが何らかの修飾を受けていることが判明した。現在、様々な酵素で部分的消化を行い、修飾部位の構造解析を行っている。目的(2)(3)に関しては、様々な腎疾患患者の尿と血液を採取し、本ペプチド濃度を予備的に測定して臨床パラメータと比較した。本ペプチドは尿蛋白や尿素窒素、血清クレアチニン、総コレステロールなどと相関が見られ、腎疾患・循環器疾患のバイオマーカーおよびメタボリックシンドロームの判定に有用である可能柱が示唆された。しかしながら、測定系は、解析できた一部の構造より確立したものであり、特異性が低いため、改良していく予定である。目的(4)に関しては、高血圧自然発症ラットに降圧剤を投与し、関連ペプチドと考えられるproang-12濃度が組織中で低下していたことから、組織RA系が独立して存在し、ヒト新規ペプチドが臓器障害と関連がある可能性が示唆された。レニン・アンジオテンシン系(RA系)は、循環器・腎臓疾患の発症や進展において重要な役割を果たしている。そのためRA系阻害薬やRA系の評価は、現在の循環器・腎臓疾患の治療・診断に欠かせないものとなっている。そこで本研究は、1、尿中に存在する未知RA系関連ペプチドの精製・構造解析;2、発見したペプチドの簡便な測定系の確立;3、各疾患患者で新規ペプチドの特徴付け;4、動物実験にて新規ペプチドの病態生理学的役割の解明;5、以上4点の研究を行い、関連疾患での臨床応用を目指すことを目的として行った。ヒトのRA系新規ペプチドに関しては複数のRA系関連ペプチドを認識可能なラジオイムノアッセイを確立し、胎盤・尿より単離・精製した。精製したペプチドは、単純なペプチド構造ではなく、なんらかの修飾があると考えられた。そこで様々な酵素を用いて精製したペプチドを断片化し、質量分析装置を用いて構造を決定した。また測定用に循環器・腎臓疾患患者の尿と血液を400検体程集める事が出来たため、今後、特異的な測定系を作製して新規ペプチドの病態生理学的意義について明らかにしていく予定である。また低塩刺激やRAS阻害剤をラットに投与した検討によって、レニンに依存する血中RA系とプロアンジオテンシン-12を介する組織中のレニン非依存性のアンジオテンシン産生経路が相互に独立して存在する可能性が示唆された。これらの成果については、13.研究発表以外に下記の研究会で発表させていただいた。(1)「ラット血中・組織中のアンジオテンシンII産生におけるプロアンジオテンシン-12の役割」(2)「循環器・腎臓疾患の新しいバイオマーカーの開発を目指して」第2回ペプチド・ホルモン若手研究会IN広島(2012年3月)レニン・アンジオテンシン系(RA系)は、循環器・腎臓疾患の発症や進展において重要な役割を果たしている。

そこで本研究は、1、尿中に存在する未知RA系関連ペプチドの精製・構造解析;2、発見したペプチドの簡便な測定系の確立;3、各疾患患者で新規ペプチドの特徴付け;4、動物実験にて新規ペプチドの病態生理学的役割の解明;5、以上4点の研究を行い、関連疾患での臨床応用を目指すことを目的として行った。ヒトのRA系新規ペプチドに関しては複数のRA系関連ペプチドを認識可能なラジオイムノアッセイを確立し、尿より単離・精製し、質量分析装置、プロテインシーケンサーを使って構造を解析する事ができた。発見した新規ペプチドに特異的な抗血清をウサギで作製し、ラジオイムノアッセイとサンドィッチELISAを作製した。しかし、この測定系は感度が低いため現在、サンプルの前処理や検出方法について改良中である。新規ペプチドをラジオイムノアッセイでヒトのスポット尿500検体を予備的に測定したところ糸球体濾過率(eGFR)が減少するにつれ尿中の新規ペプチドの排泄量が増加する事が明らかとなった。つまり腎障害に深く関わりがある可能性が示唆された。また糖尿病患者さんで蛋白尿を伴う場合、この新規ペプチドの尿中排泄量が有意に増加していた。以上より糖尿病性腎症のバイオマーカーになりうる可能性が高い事が示唆された。また抗血清を用いてヒトの組織における新規ペプチドの局在を免疫染色にて確認したところ、心臓や腎臓、消化管など全身に広く分布している事が明らかとなった。今後、心臓疾患との関連性についても明らかにしていく予定である。この新規ペプチドは産業財産権として宮崎大学より出願を行った。研究の中で最も困難を極めると思われた新規RA系ペプチドの構造を決定する事ができた。現在、特異的なアッセイ系を確立するためにウサギを用いて抗血清を作製中である。また循環器・腎臓疾患患者の尿・血液検体を集めており、測定系を確立できればすぐに測定できるように準備ができている。以上より、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、ウサギを使ってRA系新規ペプチドの抗血清を作製中である。この抗血清を使い免疫染色や特異的な測定系の開発を行う。これらの抗血清や測定系を用いることで、RA系新規ペプチドの体内分布、病態生理学的意義の解明(どのような疾患で濃度が上昇するか)を行う。また新規ペプチドの性質(酵素特異性)などについて研究していく予定である。さらにバイオマーカーとしての臨床応用を目指すためには、簡便で特異的なアッセイ系が必要となってくるため、その測定系の改良とサンプルの採取法を検討していく。
脂肪萎縮性糖尿病原因遺伝子POLD1の機能解析

脂肪萎縮性糖尿病は脂肪萎縮によりレプチンが欠乏し、インスリン抵抗性により発症する。既知の原因遺伝子としてAGPAT、BSCL2、CAV1、POLD1等が知られている。今回、我々は本研究を通じて、網羅的遺伝子解析により、脂肪萎縮性糖尿病症例に対し、PIK3R1遺伝子に未報告の挿入変異(新生突然変異)を見いだした。また、本症例の末梢血を用いて、インスリンシグナル異常を同定できた。末梢血を用いての検討が可能なことを示したことで、本疾患を簡便かつ迅速に診断できる可能性があり、意義深いものと考える。脂肪萎縮症は、脂肪組織が全身性あるいは部分性に減少・消失する疾患の総称であり、原因は遺伝子異常による先天性のもの、自己免疫の関与する後天性のものなどがある。脂肪萎縮症ではいずれの原因によっても、高度のインスリン抵抗性を伴う糖尿病(脂肪萎縮性糖尿病と呼ばれる)や、高中性脂肪血症を主体とした脂質異常症、脂肪肝などを合併する予後不良の疾患である。また、疫学的には数百万人に一人の発症頻度の稀少疾患と考えられている。脂肪萎縮症の病態には、脂肪細胞由来のホルモンであるレプチンが欠乏していることが関与するとされており、2013年にはレプチン補充療法が本疾患に対する治療法として認可され、臨床的に糖尿病や脂質異常症の改善に効果を挙げている。遺伝性の全身性脂肪萎縮症の原因遺伝子としては、これまでにAGPAT2、BSCL2、CAV1、PTRF等が知られているが、近年、下顎低形成、難聴、早老症様症状を伴う遺伝性の全身性脂肪萎縮症(Mandibular hypoplasia, deafness, progeroid features and lipodystrophy; MDPL)の原因遺伝子として、POLD1が同定された。自施設内で診療中のMDPL疑い患者につき、文書で同意を得たのちにPOLD1の遺伝子解析を施行したが遺伝子変異は同定されなかった。そこで、次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子解析を施行した。脂肪細胞の培養技術の確立が当初より遅延しているため。また、先天性脂肪萎縮症の頻度は数百万人に1人とされ、複数の原因遺伝子が報告されている。近年ではこれまでに知られていたAGPAT、BSCL2、CAV1、POLD1の他にもいくつかの原因遺伝子が知られるようになってきている。今回、我々は本研究を通じて、網羅的遺伝子解析により、脂肪萎縮性糖尿病に先天性難聴を合併した症例に対し、PIK3R1遺伝子に未報告のフレームシフトを伴う33塩基の挿入変異(新生突然変異)を見いだした。PIK3R1遺伝子は低身長、関節過伸展または鼠径ヘルニア、眼球陥没、Rieger奇形、および歯牙萌出遅延を5主徴とするSHORT症候群の原因遺伝子として知られるが、本症例では眼球陥没以外の主徴がなかったことから診断に難渋した。PIK3R1遺伝子は脂肪萎縮性糖尿病の原因遺伝子としては広く知られてはおらず、原因不明の脂肪萎縮性糖尿病の原因の一つとしてPIK3R1遺伝子によるSHORT症候群は鑑別すべき疾患であることが判明した。また、本研究では、SHORT症候群症例のリンパ球を用いてのインスリンシグナル異常を同定できた。リンパ球を用いることで診断可能なことを示したことで、SHORT症候群が簡便かつ迅速に診断可能となる可能性が示唆されたことは意義深いものと考える。今後は、より多数の症例を集積し、解析することで、SHORT症候群の迅速診断法の確立を目指していきたいと考えている。脂肪細胞の培養技術の確立を急ぎ、POLD1ノックダウンの系を構築する。その上で、当初の研究計画に基づき、POLD1遺伝子の機能解析を行っていく。小児内分泌・代謝当初より研究計画が遅れており、培養細胞や培地の購入が当初の予定より少なかったため。次年度は今年度遅延している研究をすすめるべく、助成金を使用する予定としている。
液中レーザープラズマの生成メカニズムの解明とその場元素分析への応用

水中レーザー誘起ブレークダウン分光法によるその場元素分析法の確立に向けて、以下の成果を得た。1.ロングパルス(パルス幅約100 ns)を照射することによって、水中でも発光線が明瞭になるメカニズムの解明を行うために、パルス間隔が約80 nsと短いダブルパルス照射でロングパルスを模擬し、発光の挙動とレーザーのプロファイルを比較した。照射したレーザーのパルス波形が分離していると、第2パルス照射前に一度プラズマの発光が減衰し、変形したスペクトルが得られた。一方、連続的な場合、プラズマの発光は減衰せず、明瞭な発光線が得られた。これらの結果から、パルス前半で生成されたプラズマを継続的に励起することが、明瞭な発光線を得るために重要であるとわかった。2.生成初期の気泡とプラズマの関係を調べるために、レーザー照射中に気泡とプラズマを同時に観測し、スペクトル形状への影響について検討した。パルス幅が100 nsの場合、20 nsと比較して、照射中に気泡が大きくなり、その後もレーザーが照射されていた。パルス幅が長いほど先鋭な発光線が得られるのは、十分大きな気泡中でレーザー後半部が照射されることで、プラズマ加熱時の周囲の水による冷却が抑制され、液中でも密度の低いプラズマが生成できるからであると考えた。3.気泡中の物質の挙動を解明するために、レーザー誘起プラズマを背景光として気泡内部に入射し、透過スペクトルを測定した。Al原子の吸収線は、スーパーコンティニウム光(SC光)と比べてほぼ毎回安定して観測することができた。これは、背景光であるプラズマの発光が、SC光よりも平滑な連続スペクトルを示したためである。スペクトルを解析することで、プラズマ消光後の気泡内に存在する基底状態原子の密度の絶対値を求めることに成功した。原子密度の時間変化は、気泡内の温度変化によるクラスター化の進行により説明することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。(1)発光スペクトル測定時のプラズマの状態を調べるために、スペクトルと同時にプラズマや気泡の画像を時間分解で観察した。このとき、プラズマと気泡の境界との距離は時間とともに大きくなり、スペクトル形状は明瞭となった。最適なプラズマを得るためには、気泡がプラズマに対して十分に大きく、プラズマが膨張しやすい環境が必要であると考えられる。(2)生成初期の気泡とプラズマの関係を調べるために、同一パルスレーザー照射中に気泡とプラズマ発光領域を観測できる装置を自作し、気泡画像と発光画像を測定した。このとき、プラズマ周縁部と気泡界面の凹凸が一致することが明らかとなった。また、発光線が得られない短いパルス幅(20ns)のレーザーを照射すると、照射中の気泡サイズは100nsの場合と比較して十分に小さいことがわかった。初期の気泡サイズは、プラズマの成長挙動に影響を与えると考えられる。(3)プラズマの状態が安定しない原因を解明するために、レーザーをCu板に対して斜め方向から照射し、パルス幅によってプラズマ発光領域がどう変化するかを調べた。パルス幅が長いと、ターゲット表面に対して垂直な方向ではなく、レーザー照射方向に発光領域の中心が存在した。これは、パルス前半で生成したプラズマにパルス後半のエネルギーが与えられているためと考えられる。安定なプラズマを得るためには、パルス幅を厳密に制御する必要がある。(4)気泡中の物質の挙動を解明するために、スーパーコンティニウム光を背景光として気泡内部に入射し、透過スペクトルを測定した。NaCl水溶液中のAl板にレーザーを照射し、測定を行ったところ、AlとNaの吸収線を得ることに成功した。気泡中の物質の透過スペクトルを観測した例はこれまでなく、新たな知見が得られる可能性がある。

スペクトルを解析することで、プラズマ消光後の気泡内に存在する基底状態原子の密度の絶対値を求めることに成功した。原子密度の時間変化は、気泡内の温度変化によるクラスター化の進行により説明することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。水中レーザー誘起ブレークダウン分光法によるその場元素分析法の定量分析の精度や検出感度の向上を目指し、水中でのレーザープラズマの生成メカニズムを解明することが本研究の目的である。これに対して今年度、プラズマに対する気泡の大きさや生成初期の気泡サイズのパルス幅による違いがプラズマに大きな影響を与えることを見出した。数十nsのパルス幅の違いによってプラズマの成長挙動が大きく異なることを示したことは、定量分析の精度向上に向けて重要な成果であるといえる。さらに早い時間帯となるレーザー照射直後の気泡の観察を行えるようなセットアップを作製し、パルス照射中の気泡の成長過程とプラズマの成長挙動との関係を明らかにすることを目指す。また、透過スペクトルの時間分解測定を行い、気泡中の物質の挙動を調べる予定である。
膠原病の発症を抑制する共通HLAアレル「DRB1*13:02」の作用機序の解明

これまでに申請者らは、ヒト白血球抗原(HLA)のアレルHLA-DRB1*13:02が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、抗好中球細胞質抗体関連血管炎の発症に共通して抑制的に関連することを、日本人集団での関連解析で明らかにしてきた。さらに、DRB1*13:02は自己免疫性肝炎の発症にも抑制的に関連し、成人発症スティル病の発症にも抑制的に関連する傾向があった。これらの疾患で、DRB1*13:02は疾患感受性アレルに対して優性に働いていた。そこで本研究では、膠原病類縁疾患である混合性結合組織病およびリウマチ性多発筋痛症でもDRB1*13:02が抑制的に関連するかどうかを検証する。これまでに本課題は17施設の倫理委員会によって承認されているが、検体の収集はやや遅れている。上記の結果も踏まえて、全身性エリテマトーデスモデルマウスMRL/Mp.FaslprでDRB1*13:02トランスジェニックマウスを作成して、HLA-DR13分子が膠原病の発症を抑制することを証明する。全身性エリテマトーデスの病態形成に重要な役割を果たしている細胞群・分子・遺伝子等の側面から膠原病の発症抑制の機序に迫る。Tgマウスの作成を3度行った。242匹のマウスが得られたが、そのうち遺伝子導入の確認できた個体が11匹であった。生き残ったマウスが9匹であったが、蛋白を発現しているマウスは0匹であった。MRL系統でTgマウスを作成するのは困難であることが知られており、得られるマウスの数が少ないことや、蛋白発現に問題を起こしやすい系統である可能性もなるため、C57BL/6系統でTgマウスの再作成を行うことを計画している。検体の収集はやや遅れている。Tgマウスの作成を3度行ったにもかかわらず、蛋白を発現しているマウスは0匹であり、Tgマウスの作成も遅れている。これまでの筋炎の解析により、DRB1*13:02は筋炎の発症には抑制的に関連しているとは言えなかった。今後は混合性結合組織病およびリウマチ性多発筋痛症の症例の検体をさらに収集し、収集したゲノムDNA検体のHLAのタイピングを行い、関連解析を行う予定である。また、C57BL/6系統でTgマウスの再作成を行う予定である。
１型糖尿病の脂質とタンパク質にも対応する新規追加インスリン投与法の開発

本研究の目的は、『1型糖尿病患者における、カーボカウントに加えて脂質・タンパク質摂取にも対応できる新規追加インスリン投与法の開発』である。研究方法として、マイクロミニブタによる1型糖尿病モデル動物をもちいた研究と、実際の1型糖尿病患者による臨床研究の同時進行で実施している。I,マイクロミニブタを用いた、1型糖尿病モデル動物の作成:メスの1歳マイクロミニブタに全身麻酔下でCVルートの確保、ストレプトゾトシンの投与、フリースタイルリブレの皮下留置した。持続的な血糖モリタリングが可能になり、糖尿病状態を確認しながら、適時採血も可能な状態にとなった1型糖尿病のモデル動物の作成に成功した。II.1型糖尿病患者による臨床研究:インスリンポンプを使用し、カーボカウントが確実に出来ている患者を用いて検証した。1)インスリンポンプの基礎インスリン量とインスリン/カーボ比の設定が問題無いことを確認した。2)オリーブオイル、キャノーラ油、バターなど油脂だけをキャベツやしそなど糖質やタンパク質を含まない食材とともに経口摂取してもらった。その結果、血糖上昇効果を認めなかった。3)脂質をほとんど含まずタンパク質を多く含む食材として鶏ササミ、フグ、キハダ鮪、イカ、ちりめんじゃこをそれぞれ経口摂取してもらった。その結果、鶏ササミ、フグ、キハダ鮪では、血糖上昇を認め、同じタンパク質量を含有するイカ、ちりめんじゃこでは血糖上昇を認めないことが判明した。このことから脂質のみでは食後血糖を上昇させることが無く、タンパク質のみで食後血糖を上昇させること、タンパク質の影響は食材の種類で異なる可能性が示唆された。I.マイクロミニブタを用いた、1型糖尿病モデルの作成:1型糖尿病のモデルの作成には成功した。持続的に血糖値をモリタリングすること、経時的な採血が可能な状況にすることが出来た。しかし、ストレプトゾトシンの副反応と思われる、多臓器不全を起こし、長期生存を維持することには失敗した。また現在、マイクロミニブタの購入が、豚コレラの全国での感染拡大で停止しているため新規の購入が滞ているため。マイクロミニブタの研究は一旦中断している。II.1型糖尿病患者による臨床研究様々な食材の影響を検証するための患者数がまだ不足しており、得られたデータを確証するためには試験患者数の増加が必要である。I.マイクロミニブタを用いた、1型糖尿病モデルの作成全国での豚コレラの感染が沈静化すれば、マイクロミニブタの研究が再開できる。また長期生存を可能とするためには、ストレプトゾトシンが膵β細胞を障害し、多臓器に与える障害程度を最小限にする至適投与量を検討する必要がある。豚コレラの感染が沈静化により、マイクロミニブタの搬入が可能になれば続けて、1型部糖尿病モデル動物作成して、様々な食材による食後血糖の影響と至適インスリン量の血糖を行う予定である。II.1型糖尿病患者による臨床研究当科外来中の1型糖尿病患者は多数(450名)おられるので、本研究に参加できる1型糖尿病患者を募集し、得られたデータを確証するためには試験患者数をさらに増加する。また被験者に負担が少なく、安全な食事負荷の方法や内容を検討することも必要であると考えている。また現在、新たに2種類の持続的な血糖モリタリングシステムが臨床的に導入できる予定であり、様々な食材による食後血糖の変動については患者への負担が少なくデータ収集が出来るようになると考えられる。

II.1型糖尿病患者による臨床研究様々な食材の影響を検証するための患者数がまだ不足しており、得られたデータを確証するためには試験患者数の増加が必要である。I.マイクロミニブタを用いた、1型糖尿病モデルの作成全国での豚コレラの感染が沈静化すれば、マイクロミニブタの研究が再開できる。また長期生存を可能とするためには、ストレプトゾトシンが膵β細胞を障害し、多臓器に与える障害程度を最小限にする至適投与量を検討する必要がある。豚コレラの感染が沈静化により、マイクロミニブタの搬入が可能になれば続けて、1型部糖尿病モデル動物作成して、様々な食材による食後血糖の影響と至適インスリン量の血糖を行う予定である。II.1型糖尿病患者による臨床研究当科外来中の1型糖尿病患者は多数(450名)おられるので、本研究に参加できる1型糖尿病患者を募集し、得られたデータを確証するためには試験患者数をさらに増加する。また被験者に負担が少なく、安全な食事負荷の方法や内容を検討することも必要であると考えている。また現在、新たに2種類の持続的な血糖モリタリングシステムが臨床的に導入できる予定であり、様々な食材による食後血糖の変動については患者への負担が少なくデータ収集が出来るようになると考えられる。全国的な豚コレラ流行のため、マイクロミニブタの実験が中断しているため。
符号理論への応用を意識した代数曲線論

研究代表者が中心となってまとめた研究成果に限って,それらの概要を述べる.さらに,研究期間の終盤にHermitian曲線上の2点を台に持つ因子から得られる符号全体の最小距離についての記述方法を見出すことができ,現在研究が進行中である.これについての結果の公表までには今しばらく時間がかかる見込みである.4.2002年1月28日-31日の日程で山口大学において「代数曲線論国際会議(Curve 02)」を開催し,報告集を作成した.これは当成果報告集の付録Bとして添付されている.研究代表者が中心となってまとめた研究成果に限って,それらの概要を述べる.さらに,研究期間の終盤にHermitian曲線上の2点を台に持つ因子から得られる符号全体の最小距離についての記述方法を見出すことができ,現在研究が進行中である.これについての結果の公表までには今しばらく時間がかかる見込みである.4.2002年1月28日-31日の日程で山口大学において「代数曲線論国際会議(Curve 02)」を開催し,報告集を作成した.これは当成果報告集の付録Bとして添付されている.代数曲線上の2点を台に持つ因子から得られる符号について,1点符号の場合のGarcia-Kim-Laxの定理に相当する事柄をWeierstrass pairの理論の枠組みで定式化し,それをHermitian曲線の場合に適用することによって,1点符号よりもパラメータの意味で良いものが構成できる事をHomma-Kim (J. Pure Appl. Algebra,2001)で示した.さらに,Weierstrass pairの理論を深化させるため,Weierstrass pointの理論に範をとりながら研究をすすめ,問題の曲線から射影直線への被覆の完全不分岐となる2点についてのgap集合を記述する良い手段を見出した.なお,2002年1月28日-31日の日程で山口大学において代数曲線論国際会議を開催し,符号理論と関連した代数曲線論の第一人者として,Arnaldo GARCIA (IMPA教授,ブラジル),特殊線形系の専門家であるSeon Ja KIM (Chungwoon大学助教授,韓国),また幾何学的視点からSijong KWAK (KAIST助教授,韓国)を招聘し本研究課題のそれぞれのトピックに関し議論した.その成果は来年度の研究過程において現れるであろう.有限体上定義された代数曲線上の2点を台に持つ因子から得られる符号について,1点符号の場合のGarcia-Kim-Laxの定理に相当する事柄をWeierstrass pairの理論の枠組みで定式化し,それをHermitian曲線の場合に適用することによって,1点符号よりもパラメータの意味で良いものが構成できる事をHomma-Kim(J. Pure Appl. Algebra,2001)で示したが,Hermitian曲線の場合に,2点を台に持つ因子から得られる符号全てについて,それらのパラメータを決定しようという研究に踏み出し,かなり状況が把握されつつある:もう少し詳しく述べれば,P, Qを問題のWeierstrass点,因子mP+nQに対応する符号をC(m,n)と表すとき,(1)パラメータ決定の意味では,C(m,n)が自明でないような全ての(m,n)について考える必要はなく,0【less than or equal】n【less than or equal】qの範囲で記述すれば十分であること;(2)上記の範囲の各nについて,dimC(m,n)>dimC(m-1,n)となるmは完全に記述できたこと(これは,dimC(m,n)が記述できたことを意味する);(3)n=0および,n=qの場合には最小距離も完全に記述できたこと;(4)任意のnについても,mが比較的小さな値の場合とmが比較的大きな値の場合には最小距離が完全に記述できたことなどである.また,2002年1月28日-31日の日程で山口大学において代数曲線論国際会議を開催したが,その報告集を今年度に纏めた.
開殻一重項金属-金属結合系の三次非線形光学物性に関する理論的研究

本研究では,大きな三次非線形光学物性を持つ物質の設計指針を構築することを目指し,開殻一重項性を有する一次元多核遷移金属-金属結合系の第二超分極率(γ)を系の開殻性の観点から検討している.昨年度は,遷移金属-金属結合系の開殻性とγの基本的な性質を明らかにするために種々の二核遷移金属系を調査し,その結果,系のγに対してdσ電子が主な寄与をしていること,また,その寄与の大きさはdσ軌道の開殻性が中程度の場合に最大化されることを明らかにし,軌道対称性と非線形光学物性との相関を解明した.また,d原子軌道の広がりと非線形光学物性との相関を見出し,それに基づき大きな三次非線形光学物性を実現するための分子設計指針を提案した.今年度は更に大きな非線形光学物性の発現を目指して,二核を超える一次元多核遷移金属-金属結合系を検討した.このような系ではUCCSD(T)法のような高精度計算が適用できないため,まず始めにUCCSD(T)法の結果を再現可能な低コスト計算法を探索し,その結果,range separating parameterが0.8のLC-UBLYP法が種々の遷移金属二核系においてUCCSD(T)法によるYを再現することを見出した.そこで,この計算手法を用いてCrのジカチオンから構成される一重項の一次元金属鎖[Cr(II)_<2n>(n=1-4)]を取り扱い,系の開殻一重項性とγを検討したところ,鎖長の増加に対してγは著しく増大することが判明し,開殻一重項性を持つ一次元多核遷移金属鎖が非線形光学物質として有望であることが示唆された.また,このモデル系では二核系の場合と同様にdσ電子が系の三次非線形光学物性に大きく寄与する特異な系であることも明らかとなった.さらに,開殻一重項一次元金属鎖に結合交替を導入したところ,γが大きく増減することがわかり,結合交替による三次非線形光学物性の制御可能性も示唆された.前年度,および本年度の結果から,開殻一重項性を有する一次元多核遷移金属-金属結合系における三次非線形光学物性制御のための分子設計指針として,遷移金属の周期,族,電荷,また,金属鎖の鎖長と結合交替が提案された.本研究では、大きな三次非線形光学物性を持つ物質の設計指針を構築することを目指して、開殻一重項性の金属-金属結合系の第二超分極率(γ)をジラジカル性の観点から検討している。本年度は、金属-金属結合を持つCr(II)二核系において、ジラジカル性を持つdσ、dπ、dδ軌道がγにどのよに影響を与えるかを調査した。その結果、dσ軌道がγに対して主な寄与をし、一方で、dπ、dδ軌道の寄与は極めて小さいことが明らかとなった。また、これらの軌道のγへの寄与は軌道のジラジカル性が中程度の時に大きくなることも明らかとなった。続いて、他の遷移金属種の二核系においても検討を行ったところ、Cr(II)二核系と同様の結果が得られた。また、金属の正電荷が小さい系や、周期表における族番号が小さい系ほど、dσ軌道のジラジカル性が中程度の時に大きなγを示すことも明らかとなった。これは、大きな核間距離でdσ軌道のジラジカル性が中程度となったためであると考えられる。さらに、金属種の周期もγと関係しており、第一遷移金属の系よりも第二、第三遷移金属の系の方が大きなγを示すことが判明した。この傾向も核間距離とdσ軌道のジラジカル性によって説明される。しかし、第二、第三遷移金属の系ではかなり大きな核間距離でないとdσ軌道のジラジカル性は中間とはならず、これらの系で大きなγを目指すことは非現実的である。本研究の成果はICCMSE2010、Pacifichem2010、分子科学討論会で発表した。来年度は四核系、六核系、八核系を検討することでγのサイズ依存性と結合交替の効果を解明し、それをもとに金属種、核間距離、電荷など具体的な分子設計指針を提案する予定である。本研究では,大きな三次非線形光学物性を持つ物質の設計指針を構築することを目指し,開殻一重項性を有する一次元多核遷移金属-金属結合系の第二超分極率(γ)を系の開殻性の観点から検討している.昨年度は,遷移金属-金属結合系の開殻性とγの基本的な性質を明らかにするために種々の二核遷移金属系を調査し,その結果,系のγに対してdσ電子が主な寄与をしていること,また,その寄与の大きさはdσ軌道の開殻性が中程度の場合に最大化されることを明らかにし,軌道対称性と非線形光学物性との相関を解明した.また,d原子軌道の広がりと非線形光学物性との相関を見出し,それに基づき大きな三次非線形光学物性を実現するための分子設計指針を提案した.今年度は更に大きな非線形光学物性の発現を目指して,二核を超える一次元多核遷移金属-金属結合系を検討した.

このような系ではUCCSD(T)法のような高精度計算が適用できないため,まず始めにUCCSD(T)法の結果を再現可能な低コスト計算法を探索し,その結果,range separating parameterが0.8のLC-UBLYP法が種々の遷移金属二核系においてUCCSD(T)法によるYを再現することを見出した.そこで,この計算手法を用いてCrのジカチオンから構成される一重項の一次元金属鎖[Cr(II)_<2n>(n=1-4)]を取り扱い,系の開殻一重項性とγを検討したところ,鎖長の増加に対してγは著しく増大することが判明し,開殻一重項性を持つ一次元多核遷移金属鎖が非線形光学物質として有望であることが示唆された.また,このモデル系では二核系の場合と同様にdσ電子が系の三次非線形光学物性に大きく寄与する特異な系であることも明らかとなった.さらに,開殻一重項一次元金属鎖に結合交替を導入したところ,γが大きく増減することがわかり,結合交替による三次非線形光学物性の制御可能性も示唆された.前年度,および本年度の結果から,開殻一重項性を有する一次元多核遷移金属-金属結合系における三次非線形光学物性制御のための分子設計指針として,遷移金属の周期,族,電荷,また,金属鎖の鎖長と結合交替が提案された.
乳突蜂巣発育抑制、硬化の予防に関する細胞生物学的、画像的研究

ヒト乳突蜂巣正常発育におけるアポトーシスの関与の有無の検討するため、当施設において行った耳科手術において、中耳炎既往がない症例26例から中耳炎手術時に乳突蜂巣骨組織を採取し、凍結切片を作成してアポトーシス細胞を観察するためにTUNEL染色による組織細胞化学的検討を行った。26例中14例にTUNEL陽性細胞が認められた。さらに5歳以下の症例ではTUNEL陽性細胞が84.6%に認められ、5歳以上の症例より有意にTUNEL陽性細胞の出現率が高かった。また小児の中耳炎例ではTUNEL陽性細胞はみとめられなかった。乳突蜂巣の発育は3-4歳までの幼少児期が最も旺盛で、5-6歳で緩やかになり、10歳前後でほぼ成人のサイズにまで発育する。幼少児期の中耳炎罹患により乳突蜂巣発育は抑制されることが知られているが、それにより中耳の換気・調圧が障害され、より中耳炎に罹患しやすく治癒しがたい状態となるため、中耳炎による乳突蜂巣発育抑制の機序解明は重要である。今回の結果から、乳突蜂巣発育期ではアポトーシス細胞が見られ、年長者や中耳炎症例などの乳突蜂巣の発育が顕著でない例ではアポトーシス細胞が見られなかったことから、乳突蜂巣正常発育にアポトーシスが関与している可能性があるという重要な所見が示された。このアポトーシス細胞は破骨細胞である可能性があるが、骨芽細胞の可能性も否定できず、今後まずこれを同定し、ついでそこに働くサイトカイン等を究明することにより、中耳炎による乳突蜂巣の発育抑制の機序、さらにその予防法が解明される可能性がある。中耳炎例、正常例の乳突蜂巣組織の術中採取術中に乳突部の皮質を露出し、通常の乳突削開術あるいは乳突洞開放術を行う際に削開する骨組織を細径のドリルで一塊として蜂巣、乳突洞まで連続して採取した。正常蜂巣症例が24症例(1歳8ヶ月から73歳3ヶ月まで)、中耳炎症例が36症例(6歳11ヶ月から78歳7ヶ月まで)採取できた。正常乳突蜂巣発育機序の検討今回の研究の目的は中耳炎例で発症する乳突蜂巣抑制に関わる種々のサイトカインの作用機序の解明および治療法の開発であるが、それに先駆け正常蜂巣の発育機序について組織細胞化学的検討を行った。1)各々の組織でHE染色を行い観察した。蜂巣は乳突洞から皮質骨に向かって枝状に成長しており、間質を伴う粘膜上皮と乱れの無い骨構造で構成されていた。年齢が小さいほど、骨構造に接する粘膜上皮下組織が厚く、間質細胞が多いという結果が得られた。2)年齢ごとに分け、アポトーシス陽性細胞発現部位と骨芽細胞、破骨細胞の分布について検討した。方法としてはアポトーシスに関してはTUNEL染色法、骨芽細胞及び破骨細胞の分布に関しては免疫組織化学法を用いた。各々の組織で凍結切片とパラフィン切片の両者を作成し実験に用いた。その結果、乳突洞に面した蜂巣粘膜上皮細胞にアポトーシス陽性細胞が多く認められ、アポトーシス陽性細胞の近くに破骨細胞が集積しているのが認められた。またアポトーシス陽性細胞数及び破骨細胞数は年齢が低いほど多い結果となった。ヒト乳突蜂巣正常発育におけるアポトーシスの関与の有無の検討するため、当施設において行った耳科手術において、中耳炎既往がない症例26例から中耳炎手術時に乳突蜂巣骨組織を採取し、凍結切片を作成してアポトーシス細胞を観察するためにTUNEL色による組織細胞化学的検討を行った。

26例中14例にTUNEL陽性細胞が認められた。さらに5歳以下の症例ではTUNEL陽性細胞が84.6%に認められ、5歳以上の症例より有意にTUNEL陽性細胞の出現率が高かった。また小児の中耳炎例ではTUNEL陽性細胞はみとめられなかった。乳突蜂巣の発育は3-4歳までの幼少児期が最も旺盛で、5-6歳で緩やかになり、10歳前後でほぼ成人のサイズにまで発育する。幼少児期の中耳炎罹患により乳突蜂巣発育は抑制されることが知られているが、それにより中耳の換気・調圧が障害され、より中耳炎に罹患しやすく治癒しがたい状態となるため、中耳炎による乳突蜂巣発育抑制の機序解明は重要である。今回の結果から、乳突蜂巣発育期ではアポトーシス細胞が見られ、年長者や中耳炎症例などの乳突蜂巣の発育が顕著でない例ではアポトーシス細胞が見られなかったことから、乳突蜂巣正常発育にアポトーシスが関与している可能性があるという重要な所見が示された。このアポトーシス細胞は破骨細胞である可能性があるが、骨芽細胞の可能性も否定できず、今後まずこれを同定し、ついでそこに働くサイトカイン等を究明することにより、中耳炎による乳突蜂巣の発育抑制の機序、さらにその予防法が解明される可能性がある。
盲学校の生徒がプログラムできる音声電圧・電流計の開発

盲学校の理科の授業で使いやすい、音声での読み上げ機能を持った電圧・電流計を、岡崎盲学校の前田先生との共同で開発した。AD変換機能を持つワンチップマイコンを核とした試作機2種類の開発は平成15年度までに完了した。平成16年度は、これらの電圧・電流計をなるべく多くの盲学校で使ってもらいながら改善点を探るために、サイエンス・パートナーシップ・プログラムとして、愛知教育大学と愛知県教育委員会の連携で「盲学校で使用する理科教材の開発」というタイトルの教員研修を行った。東海地方を中心に7校で9名の盲学校の理科の先生の参加を得た。研修当日には活発な意見交換があり数多くの改善点を指摘された。参加者には試作機のモニタをお願いした。現在、指摘を受けた改善点を実現すべく作業を行っている。また研修当日に強い要望のあったメーリングリストを開設し継続して情報交換などを行うための枠組みを整えつつある。この研修のまとめはPDFファイル化してあり希望者には配布可能。これらの電圧・電流計の詳細は次のホームページで公開しており、授業などで使ってみたいという方には可能な限り貸出しなどでの対応を行っている。I.作製した電圧・電流計の概要(1)パソコン接続型トライステート社製PICネットワークインターフェイスカードPICNICver.2を使い、これに接続できる、電圧計モジュールと、抵抗を使って電流を電圧に変換する電流計モジュール(共にレンジ切り替え機能付)を作製した。1台のPICNICにはそれぞれ2台までの電圧計と電流計を接続できる。音声での読み上げ機能はパソコン上のプログラムで実現した。0から9までの数字と「.」「ボルト」「アンペア」の音声をwaveファイルとして予め保存しておき、PICNICから読み取った数値に応じて、これらを順次再生する手法をとった。例えば10.5Vは「イチ」「ゼロ」「テン」「ゴ」「ボルト」と読み上げる。(2)自立型先述のPICNICに搭載されているのと同じワンチップマイコンPIC16F877で音声録音再生ICを制御するボードを作製した。録音再生ICに予め録音しておいた音声を再生する事で、パソコン無しでの音声読み上げ機能を実現している。これに上述の「パソコン接続型」と同じ電圧計モジュールと電流計モジュールを接続して使用する。II.盲学校での試用既に作製した電圧・電流計を岡崎盲学校に持ち込んでおり、3学期に実際の授業で試用してもらっている。この中で改良すべき点が今後数多く出てくると考えられる。また、名古屋近郊を手始めに、他の盲学校でも試用してもらうべく準備を進めている。更に、開発したソフトウェアやハードウェアを公開して、盲学校の先生や生徒が目的に応じて機能の追加や変更を自由に行えるようにしていきたいと考えており、このためWebページの準備を行っている。機能の追加としては、一定時間毎に電圧・電流を記録する機能の追加や、サーミスタを使って測定した温度の読み上げ機能の追加などが考えられる。
光重合レジンの重合収縮に及ぼす光強度の影響

重合収縮力測定装置を作製し、光重合コンポジットレジンの重合収縮力を経時的に測定して、重合収縮力に及ぼす光強度の影響を調べた。直径4mm、深さ2mmあるいは3mmの塩化ビニル製模擬窩洞を形成し、窩洞底部にひずみゲージ式変換器の検出部がくるように設定した。窩洞壁には光重合ボンディング剤を、窩洞底部の検出部には金属-レジン接着剤を塗布し、市販の光重合コンポジットレジンを充填して、異なる強度の光を照射し、光照射開始から照射終了後数分間まで経時的に収縮力を測定した。光強度は光量計を用いてエネルギー量で測定し、窩洞表面に照射口を接したときに得られる光強度を基準として、照射距離を変化させて光強度を減じた。基準の光強度の光を重合収縮力がほぼ一定になるまで照射すると、深さ2mmの窩洞では、重合収縮力は照射開始と同時に発現し始め、照射開始から30秒までは急激に増加したが、その後は緩やかに増加し、2分後、重合収縮力がほぼ一定になった。光照射をやめると応力緩和により収縮力はすぐに減少し始め、時間とともに小さくなった。重合収縮力が一定になる前に光照射をやめても、収縮力は減少し始め増加することはなかった。弱い光強度の光を照射してもこの傾向は変わらなかった。また、一定になった重合収縮力の大きさは照射した光の強度にかかわらず同程度であった。深さ3mmの窩洞では、照射時間が長くなるにしたがい収縮力は増大したが、基準の光を5分間以上照射しても重合収縮力が一定にならなず、架橋し続けていることが示唆された。総照射エネルギー量(光強度と照射時間の積)を一定にして光照射した際に生じた最大重合収縮力を比較すると、強い強度の光を短い時間照射した方が最大収縮力は小さかった。この結果から強い強度の光を照射することによって、レジンのフローが起きる前に架橋構造を形成させると重合収縮力が軽減することが示唆された。今年度の科学研究費補助金で購入した小型ひずみゲージ式変換器および動ひずみ測定器を用いて重合収縮測定装置を作製した。この小型ひずみゲージ式変換器の検出部が直径4mmと小さいので、窩壁の一部とすることができ、この研究では窩洞底部とした。塩化ビニル板に形成した直径4mmの窩洞にこの変換器の検出部が窩洞底部になるように設計した。その変換器と窩洞を固定して、変換器に動ひずみ測定器を接続し、窩洞底部にかかる重合収縮力を記録する。この装置は窩洞表面から光照射することができ、光照射方向が臨床における使用条件と同じとした。また、光照射開始と同時に生じる重合収縮応力を速い応答速度で経時的に記録することができる.窩洞として歯を使用することも可能で、歯の方がより臨床的ではあるが、重合収縮力は窩洞壁となる歯質とレジンとの接着性に影響され、この接着性には歯の個体差がみられる。そこで、この研究の目的が光重合レジンの重合収縮力に及ぼす光強度の影響を評価することであるので、この接着性の違いによる影響をなくすよう、窩洞の材質として黒色の塩化ビニルを選択した。また、窩洞の深さは任意に変えることができるが、今回1,2,3,4および5mmとした。新年度には、市販の光重合コンポジェトレジン(clearfil APX,クラレ)に総照射量が一定で光強度の異なる光を光照射器(New light VL-II,GC)を用いて照射し、これにともなって生じる重合収縮力を今年度作製した装置で経時的に記録して重合収縮力に及ぼす光強度の影響を調べる.重合収縮力測定装置を作製し、光重合コンポジットレジンの重合収縮力を経時的に測定して、重合収縮力に及ぼす光強度の影響を調べた。
シナプス形成・維持・再生におけるガングリオシドの役割

Wistarラット18日胚から調整した培養大脳皮質に、培養2日目よりendoglycocerami dase II(EGCase)を5mU/200μm(25mu/ml)の量で添加した。酵素添加した4例中1例はそのまま培養7日目まで酵素を入れ続け、もう3例は培養3日目に全培養液を交換し酵素を除いた。さらに、培養3日目に酵素を除いたものの内、1例はそのまま何も加えず7日目まで培養、残り2例には3日目よりガングリオシドGQ1b(一つは0.2μg/ml、もう一つは3.2μg/ml)を添加した。これらの条件下で7日目まで培養した後、furaー2を用いた細胞内[Ca^<2+>]多点同時測定システムを使い、自発的に出現する細胞内Ca^<2+>変動のパタ-ンを解析した。培養7日目における細胞内Ca^<2+>変動のパタ-ンを解析し、その振動数を求めたところ、無添加コントロ-ルに比べ培養2日目から7日目まで酵素を添加し続けたものは、著しく振動数が低下した(コントロ-ル8.6×10^<-2>Hzに対して1.2×10^<-2>Hz)。また、酵素を2日目から3日目まで添加したものも振動数の低下が見られた(5.5×10^<-2>Hz)が、酵素を入れ続けたものに比べてその減少の幅は小さかった。さらに、この1日の酵素処理後、培養3日目よりGQ1bを添加してみたが、酵素処理のみのものよりも振動数はより低下し、GQlbの濃度が高い方がいっそう振動数の減少が顕著であった。
三次元メゾ空間組織制御に立脚した革新的光機能分子システムの構築

本研究では、従来の孤立分散系や単なる非晶性薄膜では実現できなかった発光機能を開拓し、有機発光材料の新パラダイムの創出を目指している。特に、メゾ階層領域における分子集積・配向構造を能動的に設計・制御するアプローチにより、濃度消光フリー熱活性化遅延蛍光材料、分子内エキシプレックス発光材料などの創出と実デバイスとしての機能検証を進めている。今年度は、励起三重項状態から一重項状態への効率的逆項間交差が可能で、かつ高い発光量子収率を示すドナー・アクセプター型熱活性化遅延蛍光分子の系統的探索を実施した。熱活性化遅延蛍光における濃度消光は励起三重項を介したDexter機構に基づくエネルギー移動が支配的であり、分子間電子交換を防ぐようにメゾ構造を構築することで濃度消光フリーな熱活性化遅延蛍光材料・デバイスが実現可能であることを明らかにした。得られた新知見を発展させ、幾つかの分子系においてメカニズムの一般性・普遍性の検証を行った。分子構造と光物理特性の関係を系統的に調査することで、分散系・凝集系によらず多様な集合形態においても励起エネルギーをロス無く発光に利用可能な発光分子システムを構築することができた。これらの発光分子システムは、単に高効率な有機発光ダイオードの発光材料としてだけでなく、三重項励起エネルギーをロス無く一重項へと変換できる優れた三重項増感機能を有しており、この点に関してさらなる機能化の検討を進めている。熱活性化遅延蛍光における濃度消光機構を解明し、濃度消光フリーな熱活性化遅延蛍光材料・デバイスを実証できている。さらに、メカニズムの一般性・普遍性の検証を行うことができており、計画通りの順調な進捗状況である。今年度は計画通りの順調な進捗状況であり、今後も研究計画に従って研究を推進する。
遺伝子の発現制御のシスートランス共進化から探る脆弱な精巣の理由

種間雑種をつくるとメスよりもオスの不妊がずっと頻繁に現れます.つまり精子形成は進化的に脆弱といえます.精巣の遺伝子発現を調べてみると発現遺伝子,系統特異的に高発現,低発現の遺伝子がクラスター化する傾向があり,揺らぎを受け易いことが分かりました.一方で,これまで考えられていたよりもずっと速い速度で遺伝子発現を制御する因子が協調しながら進化していることも明らかにしました.こうした精巣の細胞内環境の特徴が脆弱な精子形成の大きな理由と考えられます.本研究は精巣特異的に発現する遺伝子の速い進化、脆弱な精巣形成の原因解明を目指している。この目的のため、細胞内環境とともに“共進化"する遺伝子の同定とその特徴抽出を行う。ショウジョウバエ近縁種(D. mauritiana、D. simulans、D. sechellia)間の正逆イントログレッション系統を作出、ヘテロ接合にある2種のアレルの相対発現量比を2種の遺伝的背景で測定した。結果として、アレルの相対発現量が遺伝的背景によって有意に異なることを見出した。この知見はこれまで考えられているよりもずっと速い速度で遺伝子発現を制御するトランス因子と発現遺伝子本体が協調しながら進化(共進化)していることを示している。上記の結果は成虫組織全体から抽出したRNAを用いて得たものである。本年度は精巣の組織特異性を明らかにするため直接、精巣から抽出したRNAを用いて同様の解析を行なった。これまでの成虫組織全体の発現解析において、アレルの相対発現量比が遺伝的背景依存性を示した遺伝子の多くは精巣で高発現することが知られている。にも関わらず、精巣組織からのRNAでは遺伝的背景依存性は認められなかった。主な要因としてサンプル間、個体間のRNA量のばらつきが大きいことが考えられた。実際、精巣は発現する遺伝子の種数も多いことに加え、遺伝的変異量も大きいと考えられている。イントログレッション系統を用いた解析とともに、多量の遺伝的変異と環境・確率要因によって生ずる高い変動性(ノイズ)を精巣組織の特性を表すものとして今後は重点的に解析すべきである。本研究は精巣特異的に発現する遺伝子の速い進化、進化的に脆弱な精巣形成の原因解明を目指している。この目的のため、細胞内環境とともに“共進化"する遺伝子の同定とその特徴抽出を行った。この結果を受け、最終年度はキイロショウジョウバエ精巣の遺伝子発現の遺伝的変異と環境・確率要因によって生ずる変動性(ノイズ)を、トランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析を通じてゲノム規模で解読し、以下の知見を得た。1)X染色体には高転写の遺伝子は少ない。しかし翻訳される遺伝子には染色体間のばらつきは認められない。2)転写レベルの変異量はX染色体の遺伝子で常染色体のものより小さい。3)転写量の多い遺伝子、翻訳される遺伝子ともにクラスターで存在する傾向がある。4)系統特異的に高転写、低転写の遺伝子もクラスター化する傾向がある。5)mRNAは検出できないタンパク質が存在する。以上の結果は精巣の遺伝子発現は厳格に制御されたものでなく、揺らぎを受け易いことを示唆する。種間雑種をつくるとメスよりもオスの不妊がずっと頻繁に現れます.つまり精子形成は進化的に脆弱といえます.精巣の遺伝子発現を調べてみると発現遺伝子,系統特異的に高発現,低発現の遺伝子がクラスター化する傾向があり,揺らぎを受け易いことが分かりました.一方で,これまで考えられていたよりもずっと速い速度で遺伝子発現を制御する因子が協調しながら進化していることも明らかにしました.こうした精巣の細胞内環境の特徴が脆弱な精子形成の大きな理由と考えられます.精巣特異的に発現する遺伝子の速い進化,脆弱な精巣形成の原因解明のため,細胞内環境とともに"共進化"する遺伝子の同定とその特徴抽出を本研究は目指している.この目的のため,本年度はショウジョウバエ近縁種(D. mauritiana, D. simulans, D. sechellia)間の正逆イントログレッション系統を作出,ヘテロ接合にある2種のアレルの相対発現量比を2種の遺伝的背景で測定した.イントログレッション系統はトランスジーンによる半優性の可視マーカーを指標として,F1雑種を2種の親種それぞれに15世代,戻し交雑をすることで作出した.精巣や神経組織で高発現する遺伝子,殊にこれまでの研究結果から種間雑種で発現異常が観察された7つの遺伝子を選定,パイロシークエンスによって発現解析を行った.その結果,解析した7つの遺伝子のうち3つの遺伝子でアレルの相対発現量が遺伝的背景によって有意に異なることを見出した.この知見はこれまで考えられているよりもずっと速い速度で遺伝子発現を制御するトランス因子と遺伝子本体が協調しながら進化(共進化)していることを示している.この成果は米国科学アカデミー紀要Proceedings of the National Academy of Sciences USAに発表した.並行して,新たな解析材料の準備もすすめた.

それぞれ1組の正逆イントログレッション系統では解析できる遺伝子が限られる.解析遺伝子を増やすため,D. simulans,D. mauritiana間の新たな領域(2領域)のイントログレッション系統を作出した.本研究は遺伝子発現を制御する細胞内環境、すなわちトランス因子とともに共進化する精巣遺伝子の同定を目指している。実際、組織全体を使った発現解析からシスートランス因子間の分子共進化がこれまで考えられていたよりもずっと速く進んでいることを明らかにできたことは大きな発見であった。一方で精巣組織から抽出したRNAではこれまでの実験結果を裏付けできていない。ひとつの理由は組織の不安定さ、変動幅が大きいことに起因していると推量する。実際、個別の遺伝子解析から精巣組織のもつ高変異量、高変動性をみることができる。本研究代表者は平成24年2月に国立遺伝学研究所から京都工芸繊維大学へ所属機関を異動した。異動に伴い研究活動に多少の空白期間が生ずることになった。新たな研究環境で再スタートを切ることになり、使用できる設備等に変化が生じた。時として前職場へ赴き実験を行なうことにもなった。一方で、質量分析装置(LC/MS)が使用できることになり、新たな研究の方向性を見いだすことができた。約30万年という比較的新しく分岐した種間でも遺伝子発現を制御する細胞内環境と遺伝子本体の分子共進化がしばしば観察されるという知見は分子共進化が脆弱な精巣形成の原因と十分なりえることを示している.この意味で研究は順調に進んでいるといえる.一方,分子共進化の蓄積(進化)の検証実験についてはさらなる検討が必要となった.より分岐の古いD. melanogasterとD. simulans (両種は約300万年前に分岐)間のイントログレッション系統については,D. simulans遺伝子のD. melanogasterの遺伝的背景への導入系統の入手,導入遺伝子の塩基配列決定による確認作業は計画通りに進んだが,比較のための異なる遺伝的背景にある系統の作出は,交配自体ができなかったために進展できていない.方策を検討する必要がある.また,本研究代表者は平成24年2月に国立遺伝学研究所から京都工芸繊維大学へ所属機関を異動した.但し,平成24年4月までは研究員として国立遺伝学研究所の身分を残し,平成23年度の予算執行は国立遺伝学研究所で行った.異動に伴い研究活動に多少の空白期間が生ずることになった.分子共進化を示す多くの遺伝子が高発現する精巣のみから抽出したRNAを用いて、共進化の証拠が得られていない主因は発現のノイズが大きいためではないかと推量している。実際、精巣は発現する遺伝子も多く、一般に変異量が大きいと理解されている。しかし、遺伝子発現量の変異の大規模な定量解析は報告されていない。そこで、昨年末から遺伝子発現の定量解析から発現ノイズを調査することを開始した。遺伝子発現に関して遺伝的変異量が大きい遺伝子あるいは環境や確率要因による変動の大きい遺伝子をノイズ遺伝子とよび、ゲノム規模で同定する。このノイズ遺伝子から遺伝子発現を制御する細胞環境の変動要因の特定を目指す。