hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍血管内皮分泌タンパクを用いた腎がんの転移予測

血管内皮マーカーであるLOXとbiglycanの転移における機能の解明は計画通り概ね順調に進んでいる.がん治療において新規分子標的薬の開発が盛んであるが、臨床の現場ではこれらの中から患者個別に効果のある薬剤を事前に推測することはできず、治療効果と予後の予測ができるマーカーは現時点で存在しない。平成28年度はがん患者血清を用いたbiglycanなどの腫瘍血管内皮マーカーの診断ツールとしての可能性について検討した.転移性腎がん患者血清中の症例数が解析に十分ではなかったため,多臓器がんの血清(肺がん患者)の血清37例をもちいて,腫瘍血管内皮細胞からの分泌タンパクであるbiglycan, PTX3, SBSNの血清中の濃度をELISAにより解析した.Biglycan ,SBSNについてはそれらの血中濃度とT因子,血管浸潤との間に有意な相関が見られたが,転移とは有意差はみられなかった.今後症例を増やして検討予定である.また,腎癌患者の血清についても現在北大病院バイオバンクと連携し検体採取バンキングを開始しており,これらの検体数が十分なものになった後に解析予定としている.さらに,血管新生阻害剤である分子標的薬治療により腫瘍血管内皮マーカーの発現がどのように変化するのかについても解析をおこなった.マウス腎癌移植モデルにおいてSunitinibにより血管新生阻害療法を行い抗腫瘍効果と転移巣,さらに血中のBiglycan , PTX3, SBSNなどの分泌タンパクのレベルの推移をELISAにより解析した.また,免疫染色により,腫瘍血管内皮マーカーの発現の推移とともに,血管の数ならびに成熟度(周皮細胞の被覆や管腔の大きさ)などについても組織学的に解析を行った.分子標的薬による治療により,これら腫瘍血管内皮マーカーの血中のレベルが下がり腫瘍血管内皮由来因子が血管新生阻害療法中のバイオマーカーになり得る可能性が示唆された.本研究では,申請者らが報告した腫瘍血管内皮マーカーのうちbiglycanなどの分泌タンパクががんの転移メカニズムにどのように関わっているのかを、細胞実験、動物実験にて解析した.腫瘍血管内皮細胞からの分泌タンパクであるbiglycanに関してはがん細胞のNF-kB,ERKを活性化し浸潤能を亢進させ,さらに血管内皮の方へがん細胞をひきよせる働きがあることがわかった.その結果血管内浸潤を誘導し肺転移を促進することが見出された.またがん患者の血清におけるBiglycanのレベルとがんの血管内浸潤の有無にも相関が見られた.これら腫瘍血管内皮由来因子ががん転移のバイオマーカーになり得る可能性が示唆された.当初の計画通り,がん患者の血清を用いてbiglycanの検出を試みているが,腫瘍組織の凍結切片が用意可能な症例を用いて,血清中のbiglycanが確かに腫瘍血管由来であることを同時に検証しながら解析をすすめている.血液と凍結標本の両方をそろえられる症例を選びながら検討をおこなっているため,症例数を確保することに時間がかかっている.
沿岸漁業における投棄魚の混獲過程に関する研究

平成8年度に行われた研究はおもに、(1)3つのフィールド調査・実験、(2)水槽での行動学的実験、(3)漁獲・選択過程のシミュレーションによる研究に分かれる。(1-1)深海かけ回し式底曳き網の網本体部・魚捕部の網目を開閉二つの状態として、操業実験で選択性を比較した。網目を閉じると、(a)エビ類の網本体部・魚捕部からの排除が減少し、(b)網全体の選択性は鈍くなった。これらより「網目-選択体長管理図」を作成し漁業管理への実用化を図った。(1-2)継続してきたかけ回し式沿岸小型底曳き網混獲投棄魚調査から、温帯・熱帯海域における多魚種漁業での混獲投棄の特徴を考究し、適切な投棄量推定法を提案した。この結果は1996年9月FAO混獲投棄量推定専門家会議で発表し、FAO漁業技術報告書として印刷中である。(2)クルマエビを用いて、目合いと縮結の異なる網地に衝突した時の通過・残留率を求める実験を行い、幾何学的に求めた率と比較した。開状態の網目とエビの体最大断面の差が小さいときには、網目通過は幾何学的に体最大断面で支配されるが、エビが小さい時にはより通過しやすくなる機構を確認した。(3-1)赤外線ビデオ装置を用いて撮影した網地への衝突・通過行動から、エビの網地への繰り返し衝突による網目通過・残留確率のモデルを作成し、深海かけ回し式底曳き網の選択性発現機構の単純化モデルを作成した。この結果は、1996年7月第2回世界水産会議で発表した。(3-2)(2)で求めたエビの「1回衝突あたり網目通過率モデル」と、(3-1)の「繰り返し衝突モデル」を統合し、供試網の選択性をシミュレーションによって求めたところ、実験で得た選択性ときわめてよく一致した。現在、任意の網地構成・網目形状における選択性シミュレーションモデルを開発中である。平成6年度に行われた研究は、主に(1)フィールドでの漁獲実験、(2)実験水槽での行動学的実験、(3)室内での生理学的実験に分かれる。(1)ヒゲナガエビかけ回し式底曵き網漁業で、ポケット網とカバー網を装着した試験網による操業実験を繰り返し行った。ポケット網によるサンプルから、エビと魚類では、排除される網部位が異なっていることが分かった。カバー網の資料からは、サイズ選択性と種選択性を統一的に取り扱うモデルを開発中である。上と同時に、小型かけ回し式底曵き網漁船による混獲魚投棄の実態調査を継続するとともに、生残率調査の予備実験を行った。前者からの資料と水揚げ量の統計から、判別関数分析・重回帰分析により、調査海域における投棄種・全投棄量の推定を進めている。後者では、有用種に関しては投棄後概ね数時間の内にほぼ全個体が死亡するという結果を得た。(2)150トン海水タンクで、表層用ビデオ撮影装置を用い、水中を曳航されたロープ・網地・オドシに対する、マダイ・マアジの行動を分析した。両種ともロープ・オドシの前方を同航する行動を見せた。この行動は空間的に「逃避」が可能な場合にも一般的に見られたため、後方を同航する場合も含めて視覚運動反応による占位行動と考えた。(3)実験室でコイの側線による水擾乱の受容感度を電気生理学的に調べた。側線はこれまで、運動中の漁具に対する魚の認知機関として働くと考えられてきたが、遠隔感覚としては機能しないことが明らかになった。本年度に予定していた海上実験による魚群行動観察は、研究費補助金の追加交付以降に深海用水中ビデオ撮影装置を試作したため、平成7年度に行う。

この結果は、1996年7月第2回世界水産会議で発表した。(3-2)(2)で求めたエビの「1回衝突あたり網目通過率モデル」と、(3-1)の「繰り返し衝突モデル」を統合し、供試網の選択性をシミュレーションによって求めたところ、実験で得た選択性ときわめてよく一致した。現在、任意の網地構成・網目形状における選択性シミュレーションモデルを開発中である。平成7年度に行われた研究はおもに、(1)3つのフィールド調査・実験、(2)水槽での行動学的実験に分かれる。(1-1)平成6年度に開始した、深海かけ回し式底曳き網にポケット網とカバー網を装着した試験網を用いた操業実験を継続した。その結果、(a)エビと混獲魚類では網全体での排除部位が大きく異なる。(b)シミュレーションにより、サイズ選択性の改善で種選択性も向上すると予測できる。この結果は平成7年度日本水産学会秋季大会で口頭発表された。(1-2)赤外線ビデオ撮影装置を試作し、深海かけ回し式底曳き網内におけるエビ・混獲魚類の行動の撮影に着手した。その結果、エビ類が見せた脱網行動のパターンはただ一つであった。この結果は1996年7月に行われる第2回世界水産会議での発表が採択されている。(1-3)継続していた小型かけ回し式底曳き網漁船による混獲魚投棄の実態調査と、判別関数分析・重回帰分析による調査海域における投棄種・全投棄量の推定を完了した。この結果、マダイ・ヒラメの幼魚の投棄が著しく、同海域を漁場としている漁業協同組合による種苗放流尾数の17.8倍、3.4倍にのぼることが分かった。(2)クルマエビとモエビの視運動反応を調べる水槽実験を行った結果、クルマエビの遊泳継続時間は視覚刺激の種類によって変化することが確認され、ごく微弱な視運動反応を行うと推定した。これは、ヒゲナガエビが底曳き網内でごくわずかに漁具と同航するという観察と似た結果であった。平成8年度に行われた研究はおもに、(1)3つのフィールド調査・実験、(2)水槽での行動学的実験、(3)漁獲・選択過程のシミュレーションによる研究に分かれる。(1-1)深海かけ回し式底曳き網の網本体部・魚捕部の網目を開閉二つの状態として、操業実験で選択性を比較した。網目を閉じると、(a)エビ類の網本体部・魚捕部からの排除が減少し、(b)網全体の選択性は鈍くなった。これらにより「網目-選択体長管理図」を作成し漁業管理への実用化を図った。(1-2)継続してきたかけ回し式沿岸小型底曳き網混獲投棄魚調査から、温帯・熱帯海域における多魚種漁業での混獲投棄の特徴を考究し、適切な投棄量推定法を提案した。この結果は1996年9月FAO混獲投棄量推定専門家会議で発表し、FAO漁業技術報告書として印刷中である。(2)クルマエビを用いて、目合いと縮結の異なる網地に衝突した時の通過・残留率を求める実験を行い、幾何学的に求めた率と比較した。開状態の網目とエビの体最大断面の差が小さいときには、網目通過は幾何学的に体最大断面で支配されるが、エビが小さい時にはより通過しやすくなる機構を確認した。(3-1)赤外線ビデオ装置を用いて撮影した網地への衝突・通過行動から、エビの網地への折り返し衝突による網目通過・残留確立のモデルを作成し、深海かけ回し式底曳き網の選択性発現機構の単純化モデルを作成した。この結果、1996年7月第2回世界水産会議で発表した。
法人資本主義における会社自立化の検討-市場原理と共同体原理の相克

本研究計画は,「法人資本主義」として特徴づけられている,大企業における会社の自立化を市場原理と共同体原理の相互浸透として把握することを意図して,次の3つの目標を立てた。(1)法人資本主義論の内在的批判,(2)「企業の経済学」にみられる,企業内関係,企業間関係の新古典派的解釈の検討,(3)会社の自立化を市場原理と共同体原理の相互浸食としての位置づけ。そのうち,当該年度内に実行できたのは,主に(1),(2)であった。(1)に関してはここ2,3年の筆者の研究をまとめる意図で「法人資本主義における形態と実体」を発表した(94年6月)。そこでは,従来の法人資本主義論は,会社間の株式持合という事実から,あるいは資本物化から直裁に会社ないし経営者が資本家になったと説くのみで,会社自立化の必然性を商品経済ないし資本の論理に即して明らかにしていないこと,資本家人格が商品経済による物化作用である以上,会社自立化ないし経営者支配という事態は商品経済形態による社会的生産の実体の媒介が十全に機能しなくなったということ,いわば「形態と実体のズレ」の現れであり,市場原理と共同体原理の相克としてという視角からはじめて解明できるということを明らかにした。上記論文を投稿したのは前年度末になるが,この論文をもとに馬渡尚憲東北大学教授が主催される研究合宿(94年8月22,23日)にて報告させていただき,種々の貴重な助言を受けた。また,(2)に関しては,「企業の経済学」関連の図書を購入し,そのテキスト・クリティークを続けてきた。この側面に関しては,上述の合宿で関心と大まかな見通し(組織における市場原理の貫徹と限界)を明らかにしたのみで,計画年度内にはその成果を発表できなかったが,来年度中にはまとめて早急に発表する予定である。また,その研究は次年度開講される本学での講義「経済と法」(テーマは会社主義)に早速取り入れるなど,教育活動にも反映されることになる。
事業継続計画(BCP)策定マネジメントの提案-日本企業のBCP実証研究を通じて-

本研究は、日本企業の事業継続計画(以下、BCP)を実証的に分析調査することにより、効果的なBCPのあるべき姿とBCP策定を推進するマネジメントを提案することを目的とした。サステナビリティ報告書におけるBCPに関する情報開示、阪神淡路大震災及び東日本大震災の被災企業への聞き取り調査、BCP策定マネジメントに関する質問票調査、さらにBCPとCSR及びリスクマネジメントの関係の理論的考察を行った。そして、大震災後においても国の目標を満足できていないBCP策定率の向上の一助として、企業がBCPを策定しない原因の究明と、BCP策定を推進するマネジメントの明確化を行った。将来発生が予想される巨大災害に備えた国の事業継続マネジメントシステム(BCMS)導入目標が達成されていない現状を鑑みて、日本企業が取り組むべき効果的なBCMSの導入マネジメントを明らかにする研究を進めている。平成26年度の研究活動実績は次のとおりである。1東日本大震災の被災地である岩手県沿岸部の被災および復旧調査、2リスクマネジメント及び事業継続計画に関する文献調査、3日本企業のサステナビリティ報告書におけるBCP開示状況調査、4過去に行った企業への聞き取り調査結果の分析、などであるが、これらを通じてBCMSの本質と導入促進要因を明らかにすることを試みた。BCMSを普及させるためには,その本質を理解したうえで,導入にあたっての阻害要因を究明し,その改善に取り組む必要がある。そこで、BCMSのマネジメント技術としての本質を、リスクマネジメントとCSRの観点から理論的に考察し,BCMSの導入企業に対して聞き取り調査を行い,BCMSを導入する場合の鍵となる促進要因を究明した。その結果、BCMSの本質は、リスクマネジメントやCSRの両方の側面にわたる複合的なマネジメント実践であり、BCMSの導入には経営者が重要な役割を担うことを明らかにした。すなわち、経営者が、BCMSの本質を理解し、企業が担っている社会的な役割や責任、すなわちCSRの理解を深めることである。一方、BCMSの普及には社会が果たす役割も重要である。BCMSの普及が社会の喫緊の課題であること、CSRの一環としてBCMSの普及を社会全体が要望していることを、社会が強く発信することも欠かすことができない。平成26年度は、これらに加え、5統計分析ソフトSPSSの前倒し購入と試用を行った。将来発生が予想される巨大災害に備えた国の事業継続計画(BCP)導入目標が達成されていない現状を鑑みて、日本企業が取り組むべき効果的なBCPの策定マネジメントを明らかにする研究を進めている。平成27年度は、平成26年度に実施した研究を発展させて、1東日本大震災の被災地である宮城県沿岸部の被災および復旧調査、2BCPを策定していない企業への聞き取り調査、3日本企業のサステナビリティ報告書におけるにおけるBCP開示状況調査、などを実施した。2の聞き取り調査の結果、BCPの策定には経営者の役割がきわめて重要であることが確認できた。この結果は、平成28年度に実施する効果的なBCP策定マネジメントを明らかにするための大規模質問票調査に反映させる。また、3のBCP開示状況調査の結果、まず、BCPを経営課題として位置づけている企業は、BCPが社内で定着するようになったことで、経営トップはBCPに関する言及の必要性を認めなくなったことを明らかにした。次に、BCPを経営課題として位置づけている企業は、全体としては未だ少ないことを指摘し、経営者にはBCPを単にインシデントに対して素早く復旧するマネジメントシステムとしてだけではなく、製品供給や社会インフラ維持という社会課題を、自社の社会的な責任、すなわちCSRとして認識して最優先事項として取り上げることの重要性を示すとともに、そのためにも多くの企業がBCPを経営課題として取組むことが強く望まれることを主張した。本研究では2つの目標を掲げているが、平成26年度及び27年度の研究で「目標<1>BCPのあるべき姿の模索」は、ほぼ達成できたと考えている。「<目標2>BCP策定マネジメントの提案」に対し、当初計画では、平成27年度に質問票調査を行う予定であったが、平成27年度に行った聞き取り調査やサステナビリティ報告書の分析結果を、質問票により強く反映させるため、質問項目の再設計を行った。そして、神戸大学社会環境会計研究会で質問票の精緻化を行った。質問票の設計が平成27年度末にずれ込んだことにより平成27年度中の質問票の発送ができなかった。現在、質問表はほぼ完成し、質問票の発送が株主総会終了後(7月)、分析・評価が9ー12月の予定である。質問票の発送が遅れるが、当初の研究計画の遂行は問題ないと考えている。本研究は,日本企業のBCPを実証的に分析調査することにより、1効果的なBCP手法の開発と2BCP策定を推進するマネジメントを提案することを目的とする。この目的を達成するために、東北地区,阪神地区の企業事例の現状と変化を分析して,現実適応力の高い研究成果の公表を目指している。平成28年度は、1企業が発行するサステナビリティ報告書および有価証券報告書情報の情報分析、2東証1部及び2部上場企業(2,574社)に対しBCP策定マネジメントに関する質問票調査の設計と実施・回収、集計結果報告書の作成を行った。平成28年度に行った質問票調査結果、東証1部及び2部上場企業の95%がすでにBCPを策定済であった。また、外部要因の策定理由は、「災害・事故・テロなどの危険性の増大」と「東日本大震災の状況を見て」が多く、内部要因には「製品の安定供給」「CSRの観点」「過去の災害、事故の経験等からの必要性」「事業リスクの低減」「従業員の安全を守るため」が指摘された。

さらに、1効果的なBCP手法の開発と2BCP策定を推進するマネジメントについては、「経営トップの指示、強い意志」は重要で、「事業リスクとしての強い懸念」を共有し、BCP策定を経営課題として位置づけることが重要であることが明らかになった。BCPを策定しない理由は、「コストがかかる」「策定する人材が確保できない」が指摘された。今後はBCPの策定が遅れていると指摘されえている中堅企業を対象とした質問票調査を実施し、中堅企業がBCPを策定しない、あるいは策定できない理由を明確化し、BCP策定を推進させるマネジメントを明確化することが課題として重要であることが明らかになった。なお、研究成果のまとめ、論文化については最終年度に間に合わず、平成29年度に実施する。本研究は、日本企業の事業継続計画(以下、BCP)を実証的に分析調査することにより、効果的なBCPのあるべき姿とBCP策定を推進するマネジメントを提案することを目的とした。サステナビリティ報告書におけるBCPに関する情報開示、阪神淡路大震災及び東日本大震災の被災企業への聞き取り調査、BCP策定マネジメントに関する質問票調査、さらにBCPとCSR及びリスクマネジメントの関係の理論的考察を行った。そして、大震災後においても国の目標を満足できていないBCP策定率の向上の一助として、企業がBCPを策定しない原因の究明と、BCP策定を推進するマネジメントの明確化を行った。本研究では、2つの研究目標を掲げているが、平成26年度に実施した研究、すなわち過去に行った企業への聞き取り調査結果の分析及びリスクマネジメントおよびBCPMの理論研究により、BCMSの本質と導入促進要因を明らかにできたため、第1の研究目標である「<目標1>東日本大震災(以下、大震災)の発生後におけるBCPの見直し内容の調査に基づくBCPのあるべき姿の模索」は、ほぼ達成できたと考えている。平成28年度は、「<目標2>BCP策定マネジメントの提案」の目標を達成するために、質問票調査を実施する。質問票はほぼ完成し7月に発送、9月から分析を実施する。そして、BCPを策定していない企業の中で、聞き取り調査可能な企業を訪問し、質問票調査結果を補強する。これらの研究成果は、学術雑誌に論文として報告する。経営学平成27年度は、「<目標2>大震災後においても国の目標を満足できていないBCP策定率の向上を目的とした、企業がBCPを策定しない原因の究明と、BCP策定を推進するマネジメントの明確化。」の目標を達成するために、質問票調査の設計と質問票の作成・発送を行うことを目標にする。具体的には、内閣府が継続して実施しているBCP実態調査の質問票を参考にして、BCPに取り組まない理由を明らかにするための質問票を設計する。この内容については、神戸大学社会環境会計研究会での議論を通じて質問票を精緻化させ、さらに集計結果の統計分析手法の検討を行う。803,408円の次年度使用額が生じた理由は、平成27年度実施計画であった質問票調査が、質問項目の追加、平成27年度の研究成果を反映する必要が生じたこと等により、平成28年度に遅延したことによる。
炎症性腸疾患における消化管ホルモンを介した免疫応答機構の総合理解

本研究では、炎症性腸疾患の腸管粘膜固有層免疫細胞、主に肥満細胞において消化管ホルモンであるコルチスタチンとその受容体であるMrgX2を介した免疫応答・炎症・線維化の機序を明らかとすることを目的とする。またクローン病において有効であるとされる成分栄養剤のメカニズムを解明するために、成分栄養療法における肥満細胞や消化管ホルモンを介した炎症免疫応答への効果を明らかにし、炎症性腸疾患、特にクローン病の発症や線維化狭窄に関するメカニズムの解明と新規治療ターゲットの可能性の探求を目的とする。
立体映像コンテンツによるユーザ体験の解明と効能を増進するための表現技術の開発

立体(3D)映像によるユーザ体験に寄与する心理的コンポーネントとして情緒表現に着目し、コンテンツの特徴量との対応付けを行った。ケーススタディとして著名な3D映画を対象として、情緒表現シーンの視差分析を行った。分析の結果から、特定の感情表現を増進するための視差操作を定量化し、その有効性を検証した。本研究課題の目的は、立体視(3D)コンテンツの表現技術と、3Dによるユーザエクスペリエンス(User Experience:UX)の認知・情緒的な側面を統合し、クオリティ・オブ・ライフ(Quality Of Life:QOL)創出への活用というイノベーションを実現することが目的である。そのマイルストーンとして、(1)3DコンテンツのUXを解明し、その付加価値を理解すること、(2)3Dの付加価値として、QOLの創出効果を計測・検証すること、(3)3Dの効能を、再現性をもって実装可能な制作技術を構築することを設定し、研究課題を推進した。具体的に、本研究課題の推進方法として、UXやQOLに寄与する心理的コンポーネントとして情緒表現に着目し、コンテンツの特徴量との対応付けと制作技術への反映に取り組んだ。初年度の実績として、基礎的な映像刺激に加え、ハリウッドの著名な3Dコンテンツを取り上げ、両眼視差量の分布を中心とした特徴量の分析を行った。分析に際しては、コンテンツ全体を対象としたマクロ分析と、特定個所を抽出したシーン分析の2種類のアプローチを行い、ストーリーテリングとの時系列的な相互作用も考慮して進めた。さらに、コンテンツ内での感情表現を意図したと考えられる(エモーショナル)シーンを対象とした、特徴量の分析も行った。最終年度の実績として、上記のエモーショナルシーンを感情円環モデルと照合し、幸福・驚き・悲しみ・恐怖を表現するための特徴量の操作として、3Dコンテンツで再生される空間の範囲と中心位置の変化の度合いと方向を定量化した。その結果を、2D映像に対して人工的に両眼視差を付加する2D/3D変換技術を用い、評価用の3D映像刺激を作成した。評価実験の結果から、エモーショナルシーンの分析結果に基づいた特徴量の操作を加えることで、覚醒度を強調する効果が得られる可能性があることが分かった。本研究課題では、立体映像(3D)コンテンツの表現技術と、3Dによるユーザエクスペリエンス(User Experience:UX)の認知・情緒的な側面を統合し、クオリティ・オブ・ライフ(Quality Of Life:QOL)創出への活用というイノベーションを実現するために、以下の三つのマイルストーンに挑戦することを目的とする。・3DコンテンツのUXを解明し、その付加価値を理解すること。・3Dの付加価値として、QOLの創出効果を計測・検証すること。・3Dの効能を、再現性をもって実装可能な制作技術を構築すること。本研究課題の実施方法として、UXやQOLを構成する生理・心理的コンポーネントと、コンテンツの特徴量との対応付けを行っていく。初年度の実績としては、基礎的な映像刺激に加え、ハリウッドの著名な3Dコンテンツを取り上げ、両眼視差量の分布を中心とした特徴量の分析を行った。具体的に、作品内のエモーショナルシーンを抽出・分類し、奥行き感の操作・制御と照合することで、特定の感情表現に対する演出傾向について、基礎的な知見を得ることができた。本研究課題の今後の推進にあたり、大きく以下の3点を方策として予定している。・分析対象とするコンテンツの増加と、得られた知見の活用方法の検討・特徴的なシーンの詳細な分析と、新たな表現手法の構築・特定の感情表現を意図した奥行き感の操作の考案と、有効性の検証さらに、観察者の学習や理解という、認知的な側面も考慮した表現技術の開発と応用にも、併せて取り組んでいきたい。次年度の研究費の使途としては、大きく以下の4点を予定している。・実験的研究の環境整備にかかる物品費・本研究課題の成果発表にかかる出張旅費・研究推進に必要となる海外研究者の招聘旅費・その他、消耗品費
磁気体積力による常磁性および反磁性液滴のレビテーション

本研究では常磁性および反磁性液滴の非接触保持および位置制御技術の確立の基礎的な知見を得ることを目的とし,磁性流体を用いたモデル実験とVOF法による数値シミュレーションを行い,次の結論を得た.常磁性液滴のレビテーション: 1)常磁性液滴は磁場強度の強い方向に作用する磁気力を受けるが,磁場強度の最大値は磁場を発生するコイルあるいは永久磁石上にあり,自由空間内での浮揚は基本的に不安定である.そのため,安定浮揚には浮揚対象物の位置を検出してフィードバック制御を行う必要がある.2)軸対称系では,軸と直交する平面内で軸上の磁場強度が極小値をもつ領域と極大値をもつ領域が存在する.前者は一般的に励磁コイルや永久磁石などの磁界源の近傍にあり,最低でも平面内の二次元の位置制御が必要になり,実現は極めて困難である.後者は一般的に磁界源からやや離れた領域に存在し,軸上の一次元の位置制御で安定浮揚が可能である.3)軸対称のモデル系で励磁電流を変化させPID制御により常磁性液滴を安定浮揚できることが数値シミュレーションと磁性流体を用いた実験により確認された.4)制御変数の増加によって安定浮揚状態に至るまでの時間は減少するが,過度に大きくすると液滴に形状振動が現れ,分裂によって浮揚が困難になる.安定浮揚の条件は液滴の物性値,制御変数の値,液滴体積だけでなく初速初期の位置なども依存する.5)安定浮揚した液滴は磁場方向に伸張する.浮揚体積の増大あるいは表面張力の現象によってこの傾向は顕著になる.反磁性液滴のレビテーション: 1)磁界源の適当な配置により自由空間内に磁場強度の極小点をつくることができるため,制御系を用ず反磁性液滴を特定点に安定浮揚させることが可能である.2)数値シミュレーションと周囲の媒質として磁性流体,浮揚対象として非磁性液体を用いたモデル実験により反磁性液滴の安定浮揚の可能であることが示された.3)界面は磁力線を貫かないように磁力線に沿った形状になる傾向があるが,表面張力の増大あるいは液滴体積の減少によってこの傾向は薄らぎ球形に近づく.本研究では常磁性および反磁性液滴の非接触保持および位置制御技術の確立の基礎的な知見を得ることを目的とし,磁性流体を用いたモデル実験とVOF法による数値シミュレーションを行い,次の結論を得た.常磁性液滴のレビテーション: 1)常磁性液滴は磁場強度の強い方向に作用する磁気力を受けるが,磁場強度の最大値は磁場を発生するコイルあるいは永久磁石上にあり,自由空間内での浮揚は基本的に不安定である.そのため,安定浮揚には浮揚対象物の位置を検出してフィードバック制御を行う必要がある.2)軸対称系では,軸と直交する平面内で軸上の磁場強度が極小値をもつ領域と極大値をもつ領域が存在する.前者は一般的に励磁コイルや永久磁石などの磁界源の近傍にあり,最低でも平面内の二次元の位置制御が必要になり,実現は極めて困難である.後者は一般的に磁界源からやや離れた領域に存在し,軸上の一次元の位置制御で安定浮揚が可能である.3)軸対称のモデル系で励磁電流を変化させPID制御により常磁性液滴を安定浮揚できることが数値シミュレーションと磁性流体を用いた実験により確認された.4)制御変数の増加によって安定浮揚状態に至るまでの時間は減少するが,過度に大きくすると液滴に形状振動が現れ,分裂によって浮揚が困難になる.安定浮揚の条件は液滴の物性値,制御変数の値,液滴体積だけでなく初速初期の位置なども依存する.5)安定浮揚した液滴は磁場方向に伸張する.浮揚体積の増大あるいは表面張力の現象によってこの傾向は顕著になる.反磁性液滴のレビテーション: 1)磁界源の適当な配置により自由空間内に磁場強度の極小点をつくることができるため,制御系を用ず反磁性液滴を特定点に安定浮揚させることが可能である.2)数値シミュレーションと周囲の媒質として磁性流体,浮揚対象として非磁性液体を用いたモデル実験により反磁性液滴の安定浮揚の可能であることが示された.3)界面は磁力線を貫かないように磁力線に沿った形状になる傾向があるが,表面張力の増大あるいは液滴体積の減少によってこの傾向は薄らぎ球形に近づく.
日中の覚醒レベルを維持するための休息・睡眠法の開発に関する研究

現代人の3人に1人は睡眠問題を抱えており、その結果、日中に耐え難い眠気や居眠りが発生している。眠気や居眠りによる産業事故や作業能率の低下は、甚大な被害を与えているが、この予防システムの開発は遅れている。そこで、本研究では、日中の覚醒レベルを維持するための方略の一つとして短時間仮眠法を開発した。平成11年度は、1日間の短期的効果を検討し、仮眠時間を1020分の短時間に抑えると、1)その後の夜間睡眠に影響することなく、2)眠気や疲労を抑え、3)作業成績を改善することができることを明らかにした。平成12年度は、長期的効果を検討した。被験者は規則正しい生活習慣を持つ大学生10名で、実験前に小型活動計を2週間連続装着した。仮眠をとる仮眠条件と仮眠をとらない休憩条件に、1週間づつ参加し、月曜から金曜日までの連続5日間、各条件を1日1回づつ行った。12:00に昼食をとったのち、12:40から15分間の仮眠または休憩をとり、その後、認知課題を行った。その結果、仮眠直後には睡眠慣性が発生し、眠気が強く現れたが、日数の経過とともに仮眠直後の眠気は減少した。このことは、仮眠習慣の形成が仮眠直後の睡眠慣性を除去するのに効果的であることを示している。一方、日中の眠気が最も高い14:40、16:30においては、短時間仮眠をとると、眠気、疲労とも低下した。このことは、短時間仮眠による眠気や疲労低減効果が、3時間以上持続しでいたことを示している。また、仮眠条件では日数の経過とともに眠気がさらに減少したことから、仮眠習慣を形成することによってさらなる眠気軽減効果が得られることがわかった。以上の結果から、短時間仮眠法を生活習慣の中に組み入れることは、仮眠直後に発生する睡眠慣性の除去や、午後の眠気の低減に効果的であり、日中の覚醒レベルを維持するための効果的な方法であることがわかった。眠気や居眠りによる産業事故や作業能率の低下は、甚大に被害を与えているにもかかわらず、この予防対策に有効なシステムの開発は遅れている。そこで、本研究では、覚醒レベルを維持するための方略の一つとして短時間仮眠法の有効性を検討した。実験前2週間連続して活動量を計測した結果、睡眠習慣に乱れがなく、仮眠の習慣をもっていない者10名(2022歳)を被験者として選択した。通常の夜間睡眠後、10:00から18:00まで20分毎に、1)安静時脳波、2)眠気・疲労、3)コンピュータ課題による作業成績を測定し、12:20から20分の仮眠をとる条件と、仮眠をとらない条件における成績を比較検討した。その結果、1)仮眠をとらないで単調作業を続けると、覚醒度が低下するとともに午後に強い眠気が発生する。2)短時間の仮眠をとると覚醒度が上昇し、眠気が改善されるのみならず、作業に対する自信をもたらす。以上の点から、午後の眠気を改善し、日中の覚醒レベルを維持するための方略として20分間の短時間仮眠が有効であることがわかった。従来、日中に仮眠をとると、1)かえって眠気や疲労が増大し、作業成績が低下すること、2)その後の夜間睡眠に悪影響を及ぼし、不眠が発生することが指摘されてきた。しかし、これらの結果は、仮眠時間が1時間以上と長いためにマイナス効果が現れたと考えることができる。本研究では、仮眠時間を1020分の短時間に抑えることによって、1)その後の夜間睡眠に影響することなく、2)眠気や疲労を抑え、作業成績を改善することができることを明らかにした。

また、仮眠条件では日数の経過とともに眠気がさらに減少したことから、仮眠習慣を形成することによってさらなる眠気軽減効果が得られることがわかった。以上の結果から、短時間仮眠法を生活習慣の中に組み入れることは、仮眠直後に発生する睡眠慣性の除去や、午後の眠気の低減に効果的であり、日中の覚醒レベルを維持するための効果的な方法であることがわかった。
歯胚の組織分化における肝細胞増殖因子の役割の解析

肝細胞増殖因子(HGF)とその受容体c-Metの遺伝子の発現パターンをラット下顎臼歯の歯胚にRT-PCR法を応用して検索した。in situハイブリダイゼーションでは、HGF遺伝子は歯乳頭の間葉細胞だけで発現していることが明らかになった。HGFとc-Metは、歯の発生において時期および空間特異的な分布を示すことが免疫組織化学的検索で明らかになった。HGFの歯の発生における役割を検索するため、培養歯胚にアンチセンスオリゴDNAを用いてHGF遺伝子の発現阻害を行った。無添加対照群は、胎齢14日の蕾状期マウス臼歯歯胚を、無血清のTrowell培養系で14日間培養した。他のの歯胚は、HGFのmRNAに対する15塩基のアンチセンスまたはセンスオリゴDNAを添加して培養した。無添加またはセンスオリゴDNA添加対照群では、in viroと変わらない正常な組織形態の歯胚が形成された。しかし、アンチセンスオリゴDNA添加群では、エナメル器が薄い象牙質の層と歯乳頭で囲まれた、正常の歯胚とは組織形態が逆転した異常な形態の歯胚が形成された。しかし、エナメル芽細胞と象牙芽細胞の分化は阻害されなかった。アンチセンスオリゴDNAと同時にリコンビナトヒトHGFを添加したレスキュー実験では、対照群と同様の正常な組織形態の歯胚が形成された。この異常形態は、HGFの発現阻害によって生じた内エナメル上皮細胞と歯乳頭細胞の増殖活性のアンバランスが原因となってもたらされたものであることが、BrdUを用いた検索によって示唆された。これらの結果は、HGFが齧歯類の臼歯の形態形成に関与していることを示す。肝細胞増殖因子(HGF/SF)は、最初ラットの初代培養肝細胞の増殖促進物質として発見され、分子クローニングがされたが、種々の細胞の増殖促進のみならず細胞運動の促進や、分化誘導または形態形成誘導因子として、種々の器官の分化と形成に中心的な役割を担うサイトカインであると考えられるようになった。われわれは、上皮と間葉の相互作用によって形態形成がおこる歯の発生においてもHGFが関与しているのではないかと考え、歯胚におけるHGFの分布とその遺伝子発現を、さらにHGFの受容体であるc-metの遺伝子発現を検索した。材料は、胎生15日生後2日のSD系ラットの下顎を用いた。免疫組織化学的検索は、PLP固定した凍結切片を用いて、1次抗体にはウサギ抗ラットHGF抗体を用い、間接螢光抗体法によって行った。また、一部の試料は、ABC法による増感を行った。HGFおよびc-metの遺伝子発現の検索は、摘出した歯胚よりチオシアン酸グアニジン法によって抽出したmRNAを用いて、RT-PCR法によって行った。HGFの免疫組織化学的検索では、陽性反応は歯乳頭に限局し、歯胚周囲の下顎組織には認められなかった。第1臼歯の歯乳頭での陽性反応は、帽状期の胎生16日から見られるようになり、鐘状期の初期から中期にかけての胎生18日に最も強くなり、以後咬頭部より消退し始め、20日から生後1日にかけて消失した。歯胚のHGF遺伝子の発現の消長は、免疫組織化学的検索結果とほぼ一致して、胎生18日でピークを示した。また、HGFの受容体c-metの歯胚での遺伝子発現も、HGFの発現時期に一致して認められた。HGFは主として間葉細胞で合成・分泌され、上皮細胞に作用して形態形成を誘導すると考えられているが、上記の結果は、歯胚においてもHGFが形態形成に関与していることを強く示唆するものである。

in situハイブリダイゼーションでは、HGF遺伝子は歯乳頭の間歯細胞だけで発現していることが明らかになった。HGFの歯の発生における役割を検索するため、培養歯胚にアンチセンスオリゴDNAを用いてHGF遺伝子の発現阻害を行った。無添加対照群は、胎齢14日の蕾状期マウス臼歯歯胚を、無血清のTrowell培養系で14日間培養した。他の歯胚は、HGFのmRNAに対する15塩基のアンチセンスまたはセンスオリゴDNAを添加して培養した。無添加またはセンスオリゴDNA添加対照群では、in viroと変わらない正常な組織形態の歯胚が形成された。しかし、アンチセンスオリゴDNA添加群では、エナメル器が薄い象牙質の層と歯乳頭で囲まれた、正常の歯胚とは組織形態が逆転した異常な形態の歯胚が形成された。しかし、エナメル芽細胞と象牙芽細胞の分化は阻害されなかった。アンチセンスオリゴDNAと同時にリコンビナトヒトHGFを添加したレスキュー実験では、対照群と同様の正常な組織形態の歯胚が形成された。この異常形態は、HGFの発現阻害によって生じた内エナメル上皮細胞と歯乳頭細胞の増殖活性のアンバランスが原因となってもたらさされたものであることが、BrdUを用いた検索によって示唆された。これらの結果は、HGFが齧歯類の臼歯の形態形成に関与していることを示す。
生体分子モーターダイニンのモーター領域に関する研究

細胞骨格を利用した生体分子モーターとしてミオシン、ダイニン、キネシンがあげられる。このうちダイニンとキネシンは微小管に沿って積み荷をそれぞれ細胞核の方向、細胞周辺へと運ぶ。これらのモーターはいずれもATPの化学エネルギーを機械エネルギーに換えている点で共通性がある。これらのモータータンパク質はアミノ酸配列においては共通性がないにもかかわらずX線解析によってミオシンとキネシンのモーター領域で極めてにかよった立体構造をとっていることが判明している。ダイニンはその構造の大きさ故他の分子モーターとモーター領域の立体構造も異なると推測されるがその点を明らかにするのが本研究の目的である。そのためにダイニンのモーター領域を大量に発現する系をバキュロウイルスを使って確立することを目指した。軸糸の外腕ダイニン重鎮をベクターにつなげ発現させたところ、タンパク質は不溶性となってしまいその後の処理ができなかった。そこで重鎮は生体内では中間鎖1と強く結合していることがわかっていたので、両者を同時発現させてみた。その結果重鎮は中間鎖1と複合体をつくり可溶性となった。まず第一段階として可溶性の問題をクリアーした。今後の課題として中間鎖1はチオレドキシン様配列とNDPキナーゼ様配列があることより、中間鎖1のどの領域と重鎮のモーター領域が結合しているのかをより詳細に明らかにしていきたい。またモーター領域をさらに削っていき、中間鎖1との細小結合領域を明らかにしていきたい。次にインビトロ運動活性とATPase活性を保持したモーター領域の大量発現を目指したい。
歯を用いた環境放射能汚染評価

本研究では福島第一原発事故後の汚染環境において、アカネズミを採取し、採取地点における土壌中のSr-90、Cs-134およびCs-137の測定を実施した。アカネズミの歯については上下の切歯における放射能強度を示すイメージングプレートにおけるQL値を画像解析による求めた。その結果、個体のQL値は空間放射線量率、土壌中Sr-90, Cs-134およびCs-137濃度と明らかな関連を認めなかった。したがって個体被ばく量を知るうえで、歯は非常に有用な器官である。福島第一原発事故後の環境における汚染を評価するために測定環境に棲息する標準生物であるアカネズミの採取と捕獲場所における土壌採取を行った。環境における汚染評価は土地の状態によって近接している地点においても非常にばらつきがあり、画一的な汚染評価を行うことが困難である。そのため本研究では地域に生息する動物の汚染評価を行うことでその棲息地域の汚染評価をできるのではと考え実施した。世界的な標準生物であるアカネズミを対象として採取し、併せて捕獲場所の土壌並びに環境空間線量率の計測を行った。採取にあたっては福島県の帰宅困難区域と、コントロールとして弘前市郊外の地点を設定した。採取に先立ち、研究協力者である弘前大学保健学科の三浦冨智准教授の支援を受け、当該自治体の区域内への立ち入り許可を得た。福島県の採取地域における空間放射線量率は20.4μSv/h, 19.8μSv/h, 7.8μSv/h, 0.27μSv/hであった。捕獲地点において土壌を採取し、その中に含まれる放射性セシウム137、放射性セシウム134をゲルマニウム半導体検出器により測定した。それぞれの採取地点の土壌への放射性セシウム137、放射性セシウム134の沈着量は空間線量率と相関があった。βカウンター移設による影響で純ベーター線核種である放射性ストロンチウム測定が遅延しているが、次年度に速やかに実施する予定である。アカネズミについてはイメージングプレートによる含有放射性物質スクリーニングのために上下切歯を抜去が終了した。今後は切歯のQL値と土壌含有放射性セシウム137、放射性ストロンチウム90濃度との相関を検討し、アカネズミの歯におけるQL値が環境汚染程度とどのような相関があるのかを検討し、アカネズミの歯を用いた環境評価が妥当であるのか否かの総合的な判断を行う。放射性ストロンチウム測定のためのβカウンターの移設が必要になり、そのために数か月βカウンターの使用ができない状況であった。そのため今年度はサンプル採取と空間線量率およびγ線計測の測定にとどまってしまったが、βカウンターの移設が完了し校正も実施したことから次年度以降速やかに測定を開始できる。本年度はアカネズミ採取地点における土壌中のSr-90およびCs-137の測定を実施した。Sr-90については、採取した土壌は1週間風乾、灰化しSrキャリアーと60 %硝酸によりSr-90を抽出した。その後、Sr resinによる化学分離を行いβ線の測定を行った。Cs-137とCs-134は、高純度Ge半導体検出器によるガンマ線スペクトロメトリーにより定量した。Cs-137は662 keVの、Cs-134は605 keVの光電ピークから放射能を定量した。Cs-134は605 keVと796 keVの光子によるサムピークの補正を行った。測定した核種は採取日に遡上して壊変補正した。アカネズミの歯については上下の切歯を抜去し、乾燥したのちイメージングプレートに4週間露光し、画像解析によるQL値として求めた。本研究では異なる3地点におけるすでに測定してある空間線量率とCs-137、Cs-134、Sr-90、QL値との関連を検討した。CS-137とCs-134の東日本大震災発災時点での放射能比はほぼ1で、測定された放射性セシウムは全て福島第一原発事故由来と考えられた。それぞれの地域でのSr-90/Cs-137は、ほぼ10-4のオーダーであった。この核種比は、文科省の土壌測定データとほぼ同様であった。核種比と放射性Csの結果から、ネズミ採取地域で検出されたSr-90は、福島原発事故によるものが支配的であると考えられた。しかしながら土壌サンプルの放射能濃度は採取地ごとの変動が大きく、地点ごとの代表値を合理的に求めることは困難と考えられた。さらにアカネズミの歯におけるQL値も同じ生息域においてさえも、個体間の変動が大きく、個体ごとで取り込み放射能に大きな違いがあることが示され、QL値の平均値では、必ずしも空間線量率との関連を認めなかった。

今年度実施する予定であったβカウンターによる放射性ストロンチウム等のβ線放出核種の測定を実施し、併せて高感度ゲルマニウム検出器による放射性セシウムの定量を土壌サンプルについて行う。併せて切歯におけるイメージングプレートの検討でのQL値を測定し、土壌サンプルや空間線量率との相関を検討する。硬組織薬理学放射性同位体濃度を定量する際にβ線核種の測定にβカウンターを使用しているが、本年度はこのβカウンターを移設する必要が生じた。移設とキャリブレーションのために数か月のロスタイムが生じ、そのため進捗に遅れが出たが移設が終了したので速やかに測定できる状態にある。以上の経緯からβ線測定にかかる費用を次年度に計上した。β線測定時にサンプル調整が不可欠であるが、本検討では放射性ストロンチウム測定が必要になる。そのために化学分離を経てストロンチウムを抽出するが、その際の核種試薬、測定にかかるガス、外注費として執行する予定である。
拡張型および肥大型心筋症の原因となる転写制御因子の同定と発症メカニズムの解析

膜型増殖因子であるHeparin-binding EGF-like growthfactor(HB-EGF)はメタロプロテアーゼによって細胞膜直上にて切断され遊離型となり、自らもしくは周囲細胞のEGF受容体を活性化させる。切断不全変異体を導入したマウスでは胎児期に心臓の拡張を生じ、生後まもなく死亡することが報告されている。しかしながら、成体での影響については不明であった。この度我々は、ラット心筋細胞H9c2株に切断不全HB-EGF変異前駆体(uc proHB-EGF)を組み込んだアデノウイルスベクターを導入し、心筋細胞における影響について調べた。野生型proHB-EGF導入細胞に比してuc proHB-EGF導入細胞群では有意に細胞死の誘導がみられ、かつTUNEL陽性細胞の数が上昇していた。さらに低酸素条件にて同様の検討を行うと、uc proHB-EGF細胞での細胞死誘導が増強された。我々はHB-EGFのC末端ペプチド(CTF)は切断後に細胞核膜へと移動し、Znフィンガー型転写抑制因子PLZFやBcl6と結合することによって転写抑制を解除することを報告している。このことから細胞死誘導にもHB-EGF CTFが産生されないために、ある遺伝子の転写抑制が解除できない結果抗細胞死因子の発現が認められずに細胞死へと進むのではないかと考えた。現在DNAマイクロアレイにて変化する遺伝子を数種同定した。一方、発達する心筋細胞に関与するZnフィンガー型転写抑制因子を探索するため、その前駆細胞である中胚葉系前駆細胞をマウスES細胞より作出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果いくつかの転写抑制因子を同定し、遺伝子の抽出および精製を行った。これらの結果から低酸素ストレスにはHB-EGF前駆体の切断が重要な働きをしていることが明らかとなり、心筋症の発症メカニズムの解明の一端をつかんだと思われる。切断されないHB-EGF変異体はマウスにおいて拡張型心筋症に類似した心臓形態を示すことがすでに報告されている。この変異体による細胞機能への影響を調べるために、まず胎児線維芽細胞を採集してアデノウイルスにて遺伝子導入を行った。その結果変異体導入細胞では細胞増殖の低下が認められ、その原因がc-myc遺伝子の発現抑制に起因していることが明らかとなった(投稿中)。よって心筋細胞においても同様の結果が得られるかどうかを検討するために、現在心筋細胞株や新生児マウス心筋細胞を用いた実験計画の準備を進めている状態である。またマウス胚性幹細胞(ES細胞)を用いた培養系において中胚葉系前駆細胞への分化を60%以上に誘導する条件を確立し、分化した細胞およびマウス心筋細胞株からtotal RNAを抽出した。これらをサンプルとして我々の研究室で作成したZnフィンガー型転写抑制遺伝子DNAマイクロアレイチップを用いた遺伝子発現パターンについて解析を行った。その結果特異的に変化する7遺伝子の抽出に成功し、RT-PCRにてその発現の変化が一致することも確認できた。現在はさらにES細胞から心筋細胞への分化誘導を行いさらに特異的発現遺伝子解析の範囲を広げている。また同時に抽出した遺伝子のクローニングおよびsiRNAを用いたノックダウンによる分化誘導の影響を検討中である。膜型増殖因子であるHeparin-binding EGF-like growthfactor (HB-EGF)はメタロプロテアーゼによって細胞膜直上にて切断され遊離型となり、自らもしくは周囲細胞のEGF受容体を活性化させる。

この度我々は、ラット心筋細胞H9c2株に切断不全HB-EGF変異前駆体(uc proHB-EGF)を組み込んだアデノウイルスベクターを導入し、心筋細胞における影響について調べた。野生型proHB-EGF導入細胞に比してuc proHB-EGF導入細胞群では有意に細胞死の誘導がみられ、かつTUNEL陽性細胞の数が上昇していた。さらに低酸素条件にて同様の検討を行うと、uc proHB-EGF細胞での細胞死誘導が増強された。我々はHB-EGFのC末端ペプチド(CTF)は切断後に細胞核膜へと移動し、Znフィンガー型転写抑制因子PLZFやBc 16と結合することによって転写抑制を解除することを報告している。このことから細胞死誘導にもHB-EGF CTFが産生されないために、ある遺伝子の転写抑制が解除できない結果抗細胞死因子の発現が認められずに細胞死へと進むのではないかと考えた。現在DNAマイクロアレイにて変化する遺伝子を数種同定した。一方、発達する心筋細胞に関与するZnフィンガー型転写抑制因子を探索するため、その前駆細胞である中胚葉系前駆細胞をマウスES細胞より作出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。その結果いくつかの転写抑制因子を同定し、遺伝子の抽出および精製を行った。これらの結果から低酸素ストレスにはHB-EGF前駆体の切断が重要な働きをしていることが明らかとなり、心筋症の発症メカニズムの解明の一端をつかんだと思われる。
絶滅した動物細胞復活のための新技術開発

本研究は絶滅動物の凍結死体細胞からクローンをよみがえらせる手法を開発することが目標である。そこで核移植技術を中心に、絶滅動物を復活させるために解決しなければならない問題を想定しマウスを用いて実験を行った。本研究費助成期間内に新たな染色体移植の方法、死滅した動物からの細胞の採取法、ならびに半永久的にクローン動物を継続維持できることなどを証明した。本研究では、最終的には絶滅動物の凍結死体細胞からクローンをよみがえらせる手法を開発することを目標としている。従来、異種間核移植は近縁種の卵子へドナー核を注入する方法が用いられてきたが、近縁種の卵子が入手困難な場合や、異種間核移植そのものが難しい場合が多く困難であった。そこで今回我々はドナーの染色体を一本だけマイクロマニュピレータでつまみとり、受精卵に挿入する方法を開発した(投稿準備中)。まず挿入したい染色体をもつ体細胞を除核卵に核移植する。体細胞核が膨大化するタイミング(3時間)を見計らい、細胞骨格をばらばらにする薬剤(ノコタゾール、デメコルチンなど)で培養し、一つ一つの染色体を抜き出せる状態にする。次に同時進行で用意した別のマウス受精卵、または未受精卵に抜き出したドナー染色体を一本だけ注入する。染色体移植した卵子は胚盤胞まで培養し、ES細胞化する。すでにラット染色体1本を持つマウスES細胞の樹立に成功しており、現在ラット染色体の番号の特定とキメラマウス作製後のラット染色体由来遺伝子発現について解析中である。しかし、成功率が非常に低いことから、染色体を取り出す際の細胞骨格を壊すための薬剤の検討、及び染色体移植された卵子がその染色体を取り込むための最適な受精卵細胞周期の条件などを検討している。また毛皮やはく製からのクローン動物作成を目指す研究の一環として凍結乾燥させた体細胞(リンパ球を使用)からの核移植実験も行っている。この実験では胚盤胞期までの発生を観察することができた(未発表)。絶滅動物の体は永久凍土、剥製、毛皮、ホルマリン保存した標本など過酷な悪条件下で見つかることが多い。永久凍土などで発見される試料は凍結だけでなく乾燥しダメージも大きい。しかし現時点ではどの体細胞がもっとも耐性があるのか、核移植へのDNA損傷の影響は全くわかっていない。そこで本年我々は、ホルマリン標本した体組織から核を採取し、クローン個体の作製を試みた。しかし、体細胞自体を一つ一つばらばらにするところまではできたのだが、体細胞自体がホルマリン変性を起こし、核移植用の核を採取するのが困難なため実験は失敗に終わった。次に、絶滅危惧種は直接個体を捕獲することは難しく、糞などからその生存などがあきらかにされることが多いことから、GFPマウスの糞から採取した腸内壁細胞を使用し、核移植を試みた。糞を採取し分離したところ、体細胞数は少ないもののGFPを発する細胞を採取することに成功した。さらにその細胞を用い核移植を試みた。核移植胚は前核を構成し、2細胞まで分裂するものがあったがそれ以上発生することはなかった。以上の2つの試みは失敗に終わったが、その他劣悪条件下で保存されている体細胞をさらに検討してみる必要があるであろう。また、我々は今回新たに凍結死体の体細胞から染色体を取り出し、マウス卵子へ移植するという新技術を開発することで、最終的にマウスES細胞内で絶滅動物の染色体復活を目指す実験を試みた。まだ実験途中段階であるがマイクロマニピュレーターで単一染色体だけを取り出し卵子へ移植する。具体的には、染色体を認識する抗体を細胞に注入し、細胞骨格を薬剤で壊し紡錘体をバラバラにしたあと、マイクロマニピュレーターで単一染色体だけを取り出すのである。ハロゲンランプで蛍光ラベルした染色体を識別する新技術を用い、この実験は可能になった。しかし、非常に成功が低確率であることから、今後より安定した再現性を見出したい。平成25年度では本年度の研究計画の(1)“核移植後の初期化促進の検討"は行わなかったが、(2)“凍結乾燥させた組織からのクローンの試み"を行った。現在までにOnoら(J Reprod Dev. 2008)により、凍結乾燥した体細胞の核移植を試み、核移植ES細胞を樹立し、それを核移植し、クローン個体を得た報告がある。この場合、凍結乾燥する試料は培養細胞の状態であるため、乾燥する前に事前に細胞培養の準備を行わなければならない。今回研究代表者は直接体組織を採取し培養することなくそのまま乾燥する方法を行った。使用したサンプルはBDF1マウスの筋肉、肝臓、卵子(卵丘組織付きMII)を用いた。乾燥方法は凍結乾燥機による方法と、スライドにグラスに組織片を貼り付けデシケータ内で乾燥させる方法を用いた。いずれも乾燥後水和を行い、細胞を単離したのち核移植に用いた。