hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水溶性多糖からなる水不溶性フィルムの薬物徐放担体および細胞培養基材としての評価

本研究では、研究代表者が最近開発した、水溶性多糖のみを原料としながら水不溶性をもつフィルム材料(多糖複合フィルム)について(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価、(3)新規成膜法の開発、について検討を行った。成果として(1)フィルムは薬物モデルとしての色素やタンパク質を担持・徐放可能である、(2)フィルム上で細胞培養が可能である、(3)加熱延伸法によりフィルムを連続的に作製できる、ことなどを明らかにした。本研究では、研究代表者が最近開発した、水溶性生物由来多糖のみを原料としながら水不溶性をもつフィルム材料(多糖複合フィルム)について、医用材料としての応用を念頭におき(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価、(3)新規成膜法の開発、について検討を行うことを目的としている。本年度は(1)については、種々の条件におけるコンドロイチン硫酸(CS)/キトサン(CHI)複合フィルムの薬物モデル(色素)担持および徐放能を、分光学的手法を中心に用いて評価した。その結果、色素としてメチレンブルー(カチオン性)およびカルボキシフルオロセイン(アニオン性)を用いた実験の結果より、色素がもつ電荷によってフィルムへの効率良い担持のための最適な試料作製条件が異なる事がわかり、また徐放挙動にも差が見られた。さらに溶液の温度、pH、塩強度がフィルムからの色素の徐放性に影響を与えることも明らかになった。(2)については、はじめにCS/CHIフィルムの滅菌方法について検討を行い、紫外線滅菌処理が有効であることを見出した。滅菌したフィルムに対するNIH3T3細胞の接着・増殖性を評価した結果、通常の培養ディッシュと比較しても遜色ない結果を示した。詳細には接着した細胞の形態や増殖過程において通常の培養ディッシュを用いた場合との相違が見られ、今後さらなる解析が必要であることが確認された。(3)については今年度は具体的な検討を行わなかった。本年度は(1)については、種々の条件におけるコンドロイチン硫酸(CS)/キトサン(CHI)複合フィルムの薬物モデル(色素)担持量を定量的に解析した。また高分子としてタンパク質BSAの担持および徐放にも成功した。タンパク質の担持にあたり従来よりも低温でのプレスによってフィルムを作製したが、高温で熱プレスした場合とマイクロスケールの形態評価では同様のフィルムが得られることがわかった。ただし材料特性などについてはさらなる検証が必要と思われる。(2)については、CS/CHIフィルム上でのNIH3T3細胞の増殖性を詳細に評価した結果、細胞増殖が抑制されていることが明らかとなった。その機構については、フィルム表面形態の影響が示唆されたが、今後さらなる検討が必要である。フィルム上の細胞の増殖活性を回復できるかについて検討を行ったところ、培地中に生理活性ペプチドや増殖因子を添加することで、回復の傾向が見られることがわかった。(3)については、備品として購入した加熱延伸機を用いてCS/CHIフィルムの作製について検討した。種々の条件について検討したところ、従来の熱プレス法よりも大面積のフィルムを再現性良く作製することに成功した。延伸ローラー間の距離を制御することによりフィルムの膜厚が制御可能であることも示され、膜厚20μm程度のフィルムになると、高い柔軟性をもつフィルムが得ることが明らかとなった。今後は熱プレス法で作製したフィルムとの材料特性の比較を行う予定である。最終年度の本年度は、それぞれ前年度のまでの実績を基に以下の成果を得た。(1)については、コンドロイチン硫酸(CS)/キトサン(CHI)複合フィルムについて、低分子色素を薬物モデルとした一連の研究を論文にまとめた。またBSAやリゾチームなどのタンパク質の担持および徐放挙動の定量的評価を進めた。タンパク質の徐放は数日以上にもわたり、また放出されたリゾチームがその酵素活性を保持していることも示された。(2)については、CS/CHIフィルム上でのNIH3T3細胞の増殖性が抑制されるという現象に対して、フィルムに接着タンパク質をあらかじめコートすることで増殖性が回復することを見出した。また種々のアニオン性多糖とCHIとの複合フィルムに対するNIH3T3細胞の接着、増殖性を評価し、それらがアニオン性多糖の種類によって影響を受けることを明らかにした。(3)については、加熱延伸機を用いたCS/CHIフィルムの作製についてさらに検討を進め、温度と延伸回数の至適条件を見出した。フィルムの物性評価について、まず従来の熱プレスによって作製したフィルムの特性を論文にまとめた。加熱延伸によって作製したフィルムの評価を行い、熱プレスによるものと比較して延伸方向により大きな引っ張り強度を示し、力学的異方性が見られることを明らかにした。

以上(1)(3)の各項目とも、本研究で得られた成果から新たな研究の展開が見え始めており、研究期間終了後もそれぞれ発展的な課題を設定し、検討を続けていく予定である。本研究では、研究代表者が最近開発した、水溶性多糖のみを原料としながら水不溶性をもつフィルム材料(多糖複合フィルム)について(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価、(3)新規成膜法の開発、について検討を行った。成果として(1)フィルムは薬物モデルとしての色素やタンパク質を担持・徐放可能である、(2)フィルム上で細胞培養が可能である、(3)加熱延伸法によりフィルムを連続的に作製できる、ことなどを明らかにした。(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価、(3)新規成膜法の開発、のいずれにおいても予定した通りの体制を組み一定の成果を得ることができた。その点では順調であったが、成果が出るにつれ新たな検討課題も見つかり、その意味では完全に順調であるとするべきではないと判断している。複合化学、生体関連高分子化学、生体機能材料(1)薬物徐放担体としての評価、(3)新規成膜法の開発、については研究計画としては概ね当初計画通りに進めていけばよいと考えている。(2)細胞培養基材としての評価については、当初計画していた(1)の成果と融合させた、薬物徐放性をもつフィルム上での細胞増殖性についての検討を目指すだけでなく、フィルム上で細胞活性を一時的に休止させ、外的因子によって必要なときに細胞活性を回復させることができるような材料としての方向性についても検討した方が良いと考えられる。(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価については計画通りの体制を組むことができ、実験方法も確立されてきており、成果も着実に積み重なってきている。(3)新規成膜法の開発、は具体的に検討できなかったが、研究全体としてみればおおむね順調に進展しているといえる。外部講師による講演などの謝金、および印刷費や研究成果公開費などその他としての支出が予定通り執行できなかったため。(1)薬物徐放担体としての評価、(2)細胞培養基材としての評価については基本的には当初計画通りに進めていけばよいと考えている。(3)新規成膜法の開発、は来年度は具体的な検討に着手する予定である。試薬等の購入のための物品費(消耗品費)に充て、より多くの実験を行うこととする。また最終年度であるため論文投稿、研究成果の公開を積極的に行う。その他として想定していた支出が少なかったため。実験回数を増やすため試薬等の購入のための物品費(消耗品費)に充てる。
律速段階の解明に基づいたウイルスを凌駕する革新的医薬分子送達システムの創製

本研究は次の4本の柱から成る。1siRNAの送達システム開発における新たな律速段階を定量的・速度論的に解明する。2pDNA送達による遺伝子発現における律速段階(TC/TL)の分子機構を解明し、最高水準のpDNA送達システムを創製する。3がん免疫療法のブラックボックスを開き、個別化医療に対応したがん免疫ナノ治療法を確立する。4疾患細胞のMtへの遺伝子送達法を確立し、Mt遺伝子治療の道を拓く。ナノDDSの律速段階の分子機構を解明し、核酸ナノ医薬・遺伝子治療へ臨床応用可能な送達システムを創出する。ナノDDS技術を駆使することでブラックボックスを解明するとともに、がん免疫療法の進化へ貢献する。また、疾患細胞のミトコンドリア(Mt)への遺伝子送達システムを開発し、Mt遺伝子治療の臨床応用へ展開する。最終的に、大学発の革新的核酸ナノ医薬品の創出に大きく貢献することを目標としている。薬効の機序解明と理解を進める点で、学術的に重要な研究課題である。研究方法等は明確に記述されており、内容も適切であると判断できる。医薬分子送達について、分子の細胞内動態や転写翻訳速度などに着目して律速機構の解明と応用を段階的に進めていく点で、学術的な問いが明確であり、独自性と創造性も十分に認められる。学術的、科学技術的および社会的に波及効果が期待できる。
脳シナプス形成機構解明からの精神疾患関連分子標的探索

グルタミン酸受容体GluRδ2がneurexinの4量体化を促し、小脳皮質のシナプス形成を誘導することを明らかにした。知的障害と自閉症の原因分子であるIL1RAPL1の細胞内領域に結合するMcf2lとその下流のRhoA-ROCKシグナルが大脳皮質神経細胞のスパイン形成誘導に働くことを示した。また、IL-1RAcPもシナプス前部のPTPδと相互作用することにより興奮性シナプス形成を制御していることを見出した。さらに、IL1RAPL1-PTPδ複合体の結晶構造を解析し、PTPδに挿入されたmini-exonペプチドがIL1RAPL1との相互作用に重要であることを明らかにした。小脳シナプス形成を担うGluRδ2-Cbln1-Neurexin複合体がシナプス前部の発達を制御する機構を明らかにするために、シナプス形成誘導後に細胞膜透過性のcross-linkerを用いて単離したNeurexin結合蛋白質の候補分子を質量分析により同定した。スコア値の高い30種類のシナプス前部細胞内蛋白質をcDNAから細胞に発現させ、Neurexinとの結合活性を検定した結果、半数の分子に結合活性を認めた。自閉症と統合失調症の原因分子として知られるNeurexin分子群はPTP分子群とともに大脳シナプス前部における主要なシナプス形成分子であると考えられる。Neurexin分子群の生理機能を明らかにするため、Neurexin 1, Neurexin 2, Neurexin 3の各遺伝子にCre標的配列loxPを挿入したマウスを作成し、これらを順次掛け合わせることによりNeurexin 1, 2, 3 triple foxマウスを得ることに成功した。知的障害と自閉症の原因分子として知られるIL1-receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1)による大脳皮質神経細胞シナプス形成の分子機構を明らかにするために、affinity chromatographyにより単離したIL1RAPL1の細胞内領域に結合する5種類の細胞内分子の機能を調べた。IL1RAPL1によるスパイン形成誘導に必要なTIR domainに結合する分子に焦点を絞り、大脳皮質神経細胞のMcf2lをノックダウンするとIL1RAPL1によるスパイン形成誘導能が障害されることを見いだした。さらに、Mcf2lシグナルの下流のRhoA及びROCKシグナルを阻害するとIL1RAPL1によるスパイン形成誘導が低下することを明らかにした。また、IL1RAPL1からMcf2lを経由するRhoA-ROCKシグナルがAMPA型グルタミン酸受容体のシナプス膜挿入を制御し、興奮性シナプスの安定化に寄与することを明らかにした。GluRδ2によるシナプス形成誘導の機構を明らかにする目的で、GluRδ2/Cbln1/β-Neurexinの三者複合体の量比を解析し、4量体GluRδ2の1分子に6量体Cbln1が2分子、単量体β-Neurexinが4分子の比率で結合していることを見いだした。したがって、GluRδ2がCbln1を介して結合することによりシナプス前部に存在するNeurexinの4量体化を促し、シナプス形成を誘導することを明らかにした。Neurexinの4量体化によりC末端を介する蛋白質相互作用が引き起こされ、シナプス前部の神経伝達物質放出装置active zoneを構成する蛋白質群の組織化が進むことがシナプス形成の引き金になることが推察された。さらに、細胞膜透過性cross-linkerを適用することにより、シナプス形成誘導GluRδ2-β-Neurexin系およびIL1RAPL1- PTPδ系について、シナプス前部あるいはシナプス後部の細胞内分子をcross-linkerで固定、精製し、高速液体クロマトグラフィー/質量分析計で解析した。Neurexin 1, Neurexin2, Neurexin 3の各遺伝子にCre標的配列loxPを挿入したNeurexin 1, 2, 3 triple foxマウスを作成し、小脳顆粒細胞特異的Creマウスと掛け合わせた結果、小脳顆粒細胞が脱落することを見出した。したがって、自閉症と統合失調症の原因分子として知られるNeurexin分子群はシナプス形成を制御するだけでなく、神経細胞の生存・維持あるいは発達に関与することを見出した。知的障害と自閉症の原因分子として知られるIL1-receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1)がシナプス前部の受容体型チロシン脱リン酸化酵素PTPδと相互作用することにより、大脳皮質神経細胞のシナプス形成を制御していることを明らかにし、IL1RAPL1の欠損は神経ネットワーク形成の不全を引き起こすことにより知的障害と自閉症の引き金となっていることを提唱した。

脳に発現するPTPδにはminiexonsにコードされた数アミノ酸の有無によるsplice variantsが存在し、シナプス形成能およびIL1RAPL1との結合に大きく影響した。PTPδとIL1RAPL1の細胞膜外領域をFreestyle 293-F細胞に発現させ、精製した両タンパク質の複合体を結晶化し、立体構造を明らかにした。PTPδのimmunoglobulin-like domain 2 (Ig2)の中央に挿入されたminiexon AペプチドはIL1RAPL1のIg1との結合部位を構成し、PTPδのIg2とIg3の境界に挿入されたminiexon BペプチドはIL1RAPL1のIg1を挟み込むためのspacerとして機能した。したがって、miniexonペプチドはシナプスオーガナイザー特異性決定に重要であることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学26年度が最終年度であるため、記入しない。グルタミン酸受容体GluRδ2がシナプス前部のβ-NeurexinとCbln1を介して結合することにより小脳皮質のシナプス形成を誘導することを解明した成果(Cell, 2010)を発展させ、シナプス形成を制御する三者複合体の量比を解析することによりGluRδ2がNeurexinの4量体化を促し、シナプス形成を誘導することを明らかにした(J. Neurosci., 2012; Front. Neural Circuits, 2012)。また、自閉症と統合失調症の原因分子であるNeurexin分子群の生理機能を明らかにするため、Neurexin 1, 2, 3遺伝子にCre標的配列loxPを挿入したtriple foxマウスを作成した。知的障害と自閉症の原因分子であるIL1RAPL1が大脳皮質神経細胞のシナプス形成を制御していることを明らかにしたこと(J. Neurosci., 2011)を発展させ、純系C57BL/6遺伝子背景の下にIL1RAPL1欠損マウスを作成し、大脳皮質および海馬の錐体神経細胞のスパイン密度が有意に減少していることを見いだすとともに空間参照記憶、空間作業記憶及び恐怖条件付け学習のいずれにおいても障害が認められることを明らかにした。また、IL1RAPL1の細胞内領域のTIR domainに結合するMcf2lとその下流のRhoA-ROCKシグナルがIL1RAPL1によるスパイン形成誘導に重要であること、さらに、IL1RAPL1- Mcf2l-RhoA-ROCKシグナルがAMPA型グルタミン酸受容体のシナプス膜挿入を制御し、興奮性シナプスの安定化に寄与することを明らかにした(PLoS ONE, 2013)。IL-1受容体複合体を構成するIL-1 receptor accessory protein (IL-1RAcP)もシナプス前部のPTPδと相互作用することにより大脳皮質神経細胞の興奮性シナプス形成を制御していることを明らかにした(J. Neurosci., 2012)。
廃用による筋萎縮メカニズムの解明

廃用による筋萎縮メカニズムの解明を行うため、マウス片側下肢強制外固定モデル、座骨神経切断モデル、脊髄損傷(胸髄完全切断)モデルを確立した。いずれのモデルに於いても組織学的検索では細胞核数の変化を伴わない急速な筋萎縮を認めた。これらのモデルに於ける経時的な発現遺伝子解析を行った結果、細胞周期制御因子やクロマチンリモデリングに関わるSWI/SNFファミリーなどに早期からの変化が認められ、筋萎縮は受動的なイベントではなく、転写活性が劇的に変化するactiveな現象であることが示唆された。また、筋の再生時に於いてはクロマチンリモデリング因子Chd2の働きが重要であり、エピジェネティックな制御が必須であることが明らかとなった廃用による筋萎縮メカニズムの解明を行うため、マウス片側下肢強制外固定モデル、座骨神経切断モデル、脊髄損傷(胸髄完全切断)モデルを確立した。また、筋の再生時に於いてはクロマチンリモデリング因子Chd2の働きが重要であり、エピジェネティックな制御が必須であることが明らかとなった筋萎縮モデルとして強制外固定と挫骨神経切断、脊髄切断モデルの3種類を作成し、大腿周径の経時的な測定を行なったが、これらのモデルに於ける筋萎縮のスピードに有意な差は認められなかった。筋萎縮はわずか1日で著明に進んでおり、非常にダイナミックな現象であることが推測された。これらの劇的なイベントを解析するためには、萎縮前後で筋組織に発現している全遺伝子の種類と発現量を網羅的に解析できるハイスループット技術が有効であると考え、次世代シークエンサーSolexaGA IIを用いて、筋萎縮前後でのトランスクリプトーム解析を行なった。その結果、従来筋萎縮のマーカーとなる遺伝子はFbxo32(別名atrogin-1)とTrim63(別名muscle-specific E3 ubiquitinligases MuRF1)が提唱されていたが、筋萎縮誘導後のトランスクリプトーム解析ではFbxo32の発現がRPKM値で萎縮前0.086が萎縮後0.007、Trim63に関しては0.80が0と有意な変動は認められなかった。全体として著明な発現変動が確認され、特に萎縮前にRPKM値で数十数百発現していた遺伝子が、萎縮後に0となっている遺伝子が30個以上確認された。また、逆に、萎縮前に発現がほとんど無かった遺伝子が、萎縮後に劇的に発現上昇したものも40個弱捉えられた。このように、筋萎縮は単なる受動的なイベントではなく、転写活性が劇的に変化する能動的な現象であることが示唆された。せき損センターに損傷急性期より入院加療した患者の、経時的な筋萎縮の計測データを大腿周囲径ならびに下腿周囲径を計測して集積している。これまでに35名の患者について入院時、損傷後72時間、2週間、4週間のデータが蓄積されているが、マウス筋萎縮モデル(脊髄離断モデル)で認められたような急速な筋萎縮(損傷後72時間で31%の筋萎縮)は認められていない。特に完全麻痺患者でも大腿周囲径は数センチメートル程度の減少しか認められなかったため、周囲径の計測よりはエコー下に大腿四頭筋断面積によりデータを集積した方が適切ではないかと考えているが、引き続き損傷後6ヶ月までデータを蓄積する予定である。不全麻痺患者の場合は大腿周囲径、下腿周囲径ともに減少の程度はわずかであり、麻痺の程度や回復に相関することが明らかとなった。一方、基礎研究に於いては連携研究者である岡田、大川らの成果により、クロマチンリモデリング因子Chd2が筋分化のマスター遺伝子であるMyoDと供作用して筋分化に必須であることを解明した。特に、Chd2はヒストンバリアントであるH3.3を予め取り込むことにより、筋分化が開始する以前に分化関連遺伝子群をマーキングしており、このようなエピジェネティックなメカニズムにより筋分化が制御されていることを明らかにした。実際、筋萎縮マウスへの幹細胞移植に於いて、Chd2の機能を阻害した幹細胞移植では細胞は分化も生着も認められないのに対し、Chd2を強制発現させた細胞移植に於いては良好な細胞の生着と分化を認めた。これらの結果は、細胞移植による廃用性筋萎縮の治療や予防に資する成果であると考えている。廃用による筋萎縮メカニズムの解明を行うため、まずマウス筋萎縮モデルとして、片側下肢強制外固定モデル、片側座骨神経切断モデル、胸髄完全切断モデルの3種類を確立した。いずれのモデルに於いても組織切片状では細胞核数の変化を伴わない急速な筋萎縮を認めた。脊髄完全切断モデル作成後、72時間では31%の筋萎縮が確認された。これらのモデルにおいて、経時的な発現遺伝子解析を行った結果、筋萎縮は非常にダイナミックな現象であることが示唆された。特に、骨格筋マーカー群、神経筋接合部遺伝子、萎縮マーカー遺伝子(Fox0、Fbox32、Trim63など)、骨格筋関連転写因子、細胞周期制御因子、クロマチンリモデリングに関わるSWI/SNFファミリーなどは筋萎縮後早期の劇的な変化が認められ、筋萎縮は単なる受動的なイベントではなく、転写活性が劇的に変化するactiveな現象であることが示唆された。

さらに、筋萎縮の一方では同時に再生へ向けたイベントも生じており、特に筋分化に重要な役割をはたすクロマチンリモデリング因子Chd2が筋分化マスター遺伝子であるMyoDと供作用してエピジェネティックなメカニズムで分化に関わっていることが明らかとなった。一方で臨床的研究に於いては、総合せき損センターに損傷急性期より入院加療した患者の、経時的な筋萎縮の計測データを大腿周囲径ならびに下腿周囲径を計測した。その結果、完全麻痺患者と下肢不全麻痺患者間では大腿周囲径、下腿周囲径とも筋萎縮に有意な差を認め、麻痺の程度や回復に筋萎縮イベントは相関することが示唆された。しかし、萎縮が生じるタイミングには個人差が大きく、急速に萎縮の進行を認めた動物実験とは乖離する結果であり、今後の課題であると考えられた。脊髄損傷患者の筋萎縮データが順調に集積されていること、マウス筋萎縮モデルを用いた基礎研究により、筋萎縮モデルの確立ならびに筋分化に関するエピジェネティック因子の同定がなされたこと、などから。筋萎縮データの集積を継続し、場合によってはエコーガイド下に大腿四頭筋断面積のデータを追加する。データが集積された段階で、年齢や麻痺の重症度と筋萎縮の程度や形成速度に関する相関解析を行なう。基礎研究に於いては筋萎縮の際に発現上昇するエピジェネティックなマスター遺伝子の同定を進める。
雄性減数分裂期のＸＹボディ形成におけるＹ染色体の機能解析

本研究はRNAスプライシングを介した減数分裂制御機構の解明に向けて1)減数分裂特異的、XY body特異的スプライシング標的hnRNAの取得を試み、Rbmyに結合するmRNA前駆体であるヘテロ核RNA群を探索した。精原細胞由来細胞株NEC14においてRbmyを用いたRNA-タンパク質免疫共沈降法の詳細な条件検討を行い、Rbmy結合hnRNA群の一部の同定に成功した。2)Rbmyを標的としたshRNA発現ノックダウンマウスの作出を試み、ノックダウン型ベクターを構築し細胞レベルでの条件を検討した。さらに組織特異的なノックダウンを制御するためにpol IIで制御されるベクターの構築を行った。哺乳類の減数分裂時にはXYボディと呼ばれる特化したクロマチン構造体を形成する。また減数分裂において常染色体では減数分裂開始に二重鎖切断の機能をもつSpo11遺伝子が鍵分子として知られている。しかしながらSpo11遺伝子のスプライシング調節機構は未解明である。本研究ではRNAスプライシングを介した減数分裂制御機構の解明に向けて、Rbmy遺伝子を標的とした生殖細胞特異的shRNA発現型ノックダウンマウスの作出と表現型解析および、雄性特異的、生殖細胞特異的スプライシング機構の解析を目的としている。最終年度の成果:1)マウスSpo11遺伝子のスプライシング機構を解析するために、人工遺伝子発現ベクターとしてmini-gene vectorの作成を完了した。このvectorを用いてRbmyの選択的スプライシング効果を検討した結果、Spo11遺伝子のエクソンスキッピングへの関与が示唆された。2)前年度までにpol III誘導型のノックダウンベクターを構築し、さらに組織特異的なノックダウンを制御するためにpol IIで誘導されるRbmyノックダウンベクターの構築を試みた。その結果、マウス生殖細胞株において30%程度のノックダウン効率のベクターを確認した。期間全体の成果:1)Rbmyタンパク質に結合するmRNA前駆体を精製し、一部を同定した。2)Spo11のスプライシング機構についてRbmyの効果が示唆された。3)Rbmyノックダウンマウス作出のためのベクターを一部作成した。今後の展開:Rbmy結合mRNA群の全体像を解明する必要があり、またSpo11遺伝子に関して詳細なスプライシング機構の解析が必要である。さらにRbmyノックダウンマウスの継続的な作出が必須であると考える。本研究はRNAスプライシングを介した減数分裂制御機構の解明に向けて、Rbmyを標的とした生殖細胞特異的shRNA発現ノックダウンマウスの作出と表現型解析および、雄性特異的、生殖細胞特異的スプライシング機構の解析を目的としている。減数分裂特異的、XY body特異的スプライシング標的hnRNAの取得Rbmyに結合するmRNA前駆体であるヘテロ核RNA群を探索するために、精原細胞由来細胞株NEC14においてRbmyを用いたRNA-タンパク質免疫共沈降法の詳細な条件検討を行い、Rbmy結合hnRNA群の一部の同定に成功した。Rbmyを標的としたshRNA発現ノックダウンマウスの作出ノックダウン型ベクターを構築し細胞レベルでの詳細な条件を検討した結果、60%以上の効率で遺伝子ノックダウンを可能とした。さらに組織特異的なノックダウンを制御するためにpol IIで制御されるベクターの構築を継続している。Rbmyに結合するhnRNA群の一部の解明に成功した。さらに全貌の解明にはより多くの精度の高いRNAサンプルが必要であると考えられる。そのためサンプルの精度と量の問題を解決するために継続している。また25年度計画に予定している生化学的アプローチ達成のために形質安定細胞株の取得を試み、候補となるクローン株の増幅を行っている。当初の計画に沿ったpol IIIで制御されるノックダウン型ベクターは、より効率をあげるために継続している。またpol IIで制御されるベクターは現在条件検討中である。以上より当該年度を十分達成した項目とやや遅れている項目に分けられ、全体としてやや遅れていると自己点検した。Rbmyに結合するhnRNA群の探索は有効な条件を確立できたため、このまま継続していく予定である。また多コピー遺伝子である多様性から遺伝子ノックダウンの高効率部位の探索を継続し、より精度をあげていく予定である。さらに25年度計画に沿った生化学的アプローチを達成するために、形質安定細胞株の作成に伴いRbmy結合タンパク質の同定を試みる予定である。1)生化学的アプローチによるXY body特異的Rbmy複合体の探索、2)Spo11結合配列の解析、3)Rbmyを標的としたshRNA発現ノックダウンマウスの作出と表現型解析、に関して、おおむね研究計画に沿った形で遂行していく予定である。
不動産投資にファイナンス理論を適用するための理論構築と実証分析

2008年金融危機で見たように、不動産と金融が融合した近年では、不動産市場を国内外の金融市場と同じ脈絡で統一的に分析・理解することが極めて重要である。しかし、これらを統一的に扱える確固たる学術的な理論体系は存在していない。そこで、本研究は、不動産市場を、国内外の金融市場と関連付け、同じ脈絡で分析・理解するべく、不動産に最新のファイナンス理論を適用するための理論構築と実証分析に取り組んだ。本研究では、不動産を金融資産と同様、最新のファイナンス理論によって統一的に分析すべく、その橋渡しとなる理論構築と実証分析を行うことが目的である。具体的には、2つの研究テーマに取り組むことを目的としている。【研究テーマ1】不動産のリターンを高頻度な時間間隔で生成する理論と統計分析法の確立【研究テーマ2】不動産のリスクとリターン特性の金融資産との比較解明H25(2013)年度は、上記の2つのテーマに沿った研究を行い、国内外の学会発表や学術研究論文として結実することができた。その研究成果は以下の2つの研究項目として要約される。(1)不動産価格の擬似リターンの生成方法、および統計モデルの提案:昨年度に引き続き、実際には一定の時間間隔で観測されない不動産価格およびリターンを擬似的に生成するため、適切な統計モデルに基づいた方法を精緻化した。具体的には、擬似的なリターンを、市場全体の要因、クラス(層区分)ごとの要因、そして個別要因の3つのファクターに適切に分離して生成する方法を確立した。(2)不動産投資を組み入れた最適ポートフォリオ選択とそのリスク・リターン特性の分析:(1)の方法により適切に生成された不動産の擬似リターンに基づき、不動産投資にファイナンス理論を適用する基本的な方法を確立した。その適用例として、わが国における不動産投資のリスク・リターンの特性を、Markowitz流の平均分散モデルの枠組みで、株・債券等の伝統的金融資産やコモディティなどのオルタナティブ投資と比較しつつ明らかにした。【研究テーマ1】不動産のリターンを高頻度な時間間隔で生成する理論と統計分析法の確立【研究テーマ2】不動産のリスクとリターン特性の金融資産との比較解明H24(2012)年度は、上記の2つのテーマに沿った研究を行い、多くの国内外の学会発表や学術研究論文として結実することができた。その研究成果は以下の3つの研究項目として要約される。(1)不動産のリターンに関する理論モデルの構築:研究代表者・連携研究者がすでに構築した完全競争市場における不動産価格評価理論を拡張し、その「リターン」に関する理論モデルを構築した。その上で、不動産研究で代表的なモデルとの対応関係を理論的に導いた。(2)不動産価格の統計モデルの構築:いくつかの技術的な条件の下、不動産の理論価格はこれを構成する属性価格の線形結合として表現される。しかし、実際の市場での価格はこれと乖離していることが考えられる。そこで、(i)実際の市場価格の理論価格からの「歪み」、および(ii)不動産には同じものは1つしかないという「個別性」を考慮し、統計学分野で研究されているBox-Cox付き混合効果モデルとして構築した。(3)不動産のインプライド・リターンの生成方法の考案:(2)の不動産市場価格の統計モデルを、各時点において不動産クラスごとに推定する。これを利用して、各時点において価格が観測された不動産が、もし、その1時点前に取引されたら評価されたであろうインプライド価格(帰属価格)を推定することにより、インプライド・リターンを定義できる。その具体的な生成方法を確立した。本研究では、不動産に最新のファイナンス理論を適用するための理論構築と実証分析をすべく、2つの研究テーマに取り組むことを目的とする。【研究テーマ1】不動産のリターンを高頻度な時間間隔で生成する理論と統計分析法の確立【研究テーマ2】不動産のリスクとリターン特性の金融資産との比較解明この目的を達成すべく、2014(H26)年度は、以下に述べる2つの研究項目に取り組むことにより、不動産のリスクとリターン特性を金融資産との比較しつつ解明する方法を提案し、その有効性を実証した。(1)前年度までに取り組んできた、不動産を一般的な金融資産と同列に扱うことを可能にする理論と統計分析方法について発展研究を行った。具体的には、動的均衡モデルの枠組みを拡張して、個々の不動産物件レベルで、仮想的な価格変化率データ、すなわち「擬似リターン」を生成し、それを用いた「リスク」と「リターン」などの指標を算定した。その上で、不動産の金融投資としての位置付けを考察した。(2)不動産投資における市場リスクを計測する2段階ファクターモデルを提案した。具体的には、第1段階ファクターモデルにより、不動産投資における市場リスクを計測する。続いて行う第2段階ファクターモデルにより、その市場リスクを不動産が保有する属性の線形結合で説明する。

さらに、本モデルをわが国の不動産市場に適用し、不動産投資におけるリスクについて有用な知見を得た。つまり、不動産投資におけるリスクとリターンの基本的な振る舞いを調べた上で、どのような属性を持つ不動産のリスクとリターンが高いのか・低いのかを明らかにした。これより、不動産を金融資産と同様にポートフォリオ戦略に組み入れることが可能となり、不動産投資のリスクとリターン特性を金融資産と比較解明の枠組みや基本的な示唆を与えるものである。ファイナンス理論および金融工学。特に、ポートフォリオ選択、資産価格評価理論、不動産ファイナンス。研究成果は、国内外の学会発表や学術研究論文として結実することができたという点で、おおむね順調に進展していると言える。ただし、今年度予定していた、2つの研究テーマに沿った研究項目の1つであった「不動産と金融資産のリターンの間に存在するリード・ラグ分析」については、継続分析中である。昨年の成果である、不動産価格およびそのリターンの理論モデルの特色は、均衡不動産価格のみならず、均衡金融資産価格と均衡不動産賃料も同時に導出される点にあった。この特色により、定常状態における、不動産取引市場のリターンと金融資産取引市場のリターンとの間に成立する関係式「不動産と金融資産のパリティ」を基礎とした適切な統計モデルを構築した。これを用いて、不動産価格のリターンと、株式等の金融資産のリターンとの間のlead-lag構造を明らかにすべく実証分析を行った。この実証分析については、いまだ公表には至っていない。本研究は、不動産を金融資産と同様、最新のファイナンス理論によって統一的に分析すべく、その橋渡しとなる理論構築と実証分析を行うことが目的とし、2つの研究テーマに沿って、「研究成果」に述べた3つの研究項目に取り組んだ。その際、理論や統計モデルの構築に加えて、その有効性を示すべく実証分析を行ったことにより、多くの国内外での研究発表や学術研究論文として結実することができたと考えている。具体的には、以下の2点が上げられる。(1)不動産の価格形成に関する実証分析:提案した統計モデルに基づき、不動産価格形成における個別性の要因として、立地地域・用途・経年等に着目し、我が国の不動産市場における価格形成を詳細に分析した。(2)不動産のインプライド・リターンに関する実証分析:提案した統計モデルに基づき、不動産のインプライド・リターンを推定することにより、市場全体と不動産クラスごとのリターンに分離・抽出が可能となった。これらは、不動産市場全体および各不動産クラス・層区分という新たなアセットクラスのリターン・インデックスと見なすことができる。つまり、不動産の投資について、金融資産と同様にリスクとリターンの評価を行うことができることを意味する。したがって、本研究成果として、不動産投資に、ファイナンス理論や金融工学を直接的に適用した分析を可能とした点が上げられ、その波及効果が期待される。今後も上述の2つの研究テーマに沿って、以下の研究項目に取り組むこととする。
結晶粒構造に起因する界面強度局所変動の定量評価

半導体デバイスのような微小な積層構造物の機械的信頼性を確保するため、微小な領域での積層界面強度を局所的に直接評価し、その強度を左右する因子の特定を試みた。半導体配線構造でよく用いられるCu/SiN界面構造において単結晶銅試料では均一な界面強度であったが多結晶銅では強度が大きくばらついたことから、銅の複雑に分布する結晶粒構造が局所強度変動の一因であることを見出した。また、強度と密接に関わる銅の塑性変形についても、その場結晶方位観察をおこなうことで、界面剥離時に結晶粒構造に応じた局所的な変形が生じていることを確認した。半導体およびMEMSデバイス開発における極端な小型化・高密度化は、従前の機械的信頼性設計手法では予測不能な破壊事例を生じさせる。このような極微細な構造物の場合、その構造寸法と材料の微視組織の寸法に匹敵するようになっているため、微視組織に対応した局所的な強度変動が構造の破壊に直結する可能性が示唆されている。したがって、既存のマクロな評価に基づく強度情報からは脱却し、局所的な強度情報を扱うことが、微細な構造を有する構造物設計における信頼性向上の鍵となる。本研究では、そのような破壊の起点となる異種材界面の局所強度変動について、支配的な一因子と推察される金属結晶粒構造の変形に関して実測に基づく評価を行い、界面強度分布を規定する諸量の探索を目指して研究を進めている。初年度である平成25年度は、評価用試料としてデバイス配線構造を模擬した積層構造体を作製した。また、材料微視組織だけでなく界面強度の異なる構造体の作製も成膜プロセス条件の制御によって成功した。それと平行して、小型機械試験機を装荷した電子顕微鏡装置を用いて、機械試験時の微小構造体における局所変形場が評価可能な実験系を構築した。単結晶からなる積層構造体からイオンビーム加工により試験用サンプルを切出し、その破壊試験を構築した評価システムで実施することで、剥離試験中での結晶方位分布のその場観察に成功した。変形前後の結晶方位情報から導かれた変形場は、数値シミュレーションの結果と定性的には一致しており、構築した評価システムの有効性を示すものであった。今後は本システムを活用してデータの蓄積および解析を進める。微小デバイスの開発における極端な小型化・高密度化は、従前の機械的信頼性設計手法では予測不能な破壊事例を生じさせる。このような極微細な構造物の場合、その構造寸法が材料微視組織の寸法に匹敵するようになっているため、微視組織に起因する局所的な強度の変動が構造の破壊に直結する可能性が示唆される。本研究では、そのような破壊の起点となる異種材界面の局所強度変動について、支配的な一因子と推察される金属結晶粒構造の局所変形の評価を行い、界面強度分布を規定する諸量の探索を目指して研究を進めた。まず、評価用試料としてデバイス配線構造を模擬した積層構造体を作製した。また、小型機械試験機を装荷した電子顕微鏡装置を用いて、機械試験時の微小構造体における局所変形場が評価可能な実験システムを構築した。作製した積層構造体からイオンビーム加工により試験用サンプルを切出し、その破壊試験を構築した評価システムで行うことで、剥離試験中での結晶方位分布のその場観察に成功した。変形前後の結晶方位情報から導かれた変形場は、数値シミュレーションの結果と定性的に一致しており、構築した評価システムの有効性を示すものであった。単結晶からなる積層構造体の剥離試験において、異なる荷重方向で得られた変形および強度が結晶塑性に起因する塑性変形の難易との相関性を示す結果を得た。一方で、同一方向での評価結果はほぼ一定の強度を示したことから、局所強度変動は微小変形における統計的な揺らぎよりもむしろ、結晶粒構造に応じた塑性変形の異方性による見かけの強度変動であることを明らかにした。材料力学本研究では、局所界面強度の変動について、その支配的な因子と推察される金属結晶粒構造に関して実験に基づく評価を行い、界面強度分布を規定する諸量の探索を目指している。界面結合エネルギーおよび塑性散逸エネルギーとそれらの和とされる界面じん性値をそれぞれ実験的に評価し、結晶粒構造との関係を明らかにするためには、剥離試験時におけるき裂近傍のひずみ場が計測可能な実験スキームの構築が不可欠である。計画初年度である平成25年度には、電子線後方散乱回折(EBSD)像用カメラを含むFIB-SEM複合ビーム装置に対応型ナノインデンタを装荷した評価システムを基幹として、平滑な自由表面を側面に有する剥離試験用の評価試料を作製することで、剥離試験中にき裂近傍のEBSD像を取得しながら剥離試験を行うことを可能とした。

変形前後に得られたEBSD像から算出された変形場は、結晶塑性を考慮した有限要素解析から得られた変形場と定性的に一致しており、構築した評価手法が正しく機能していることが確認できた。評価手法の構築およびデモデータの取得を初年度内に達成できたことから、次年度以降はそれを用いたデータ蓄積および解析に集中することで、当初計画通り、強度と局所構造との相関解明を目指すことが可能であると考える。計画の最終年度にあたる平成26年度には、構築した評価手法を用いて、まず銅単結晶/窒化硅素界面を有する構造での界面結合エネルギーおよび塑性散逸エネルギーとそれらからなる界面じん性値を評価し、構築した手法の再現性および信頼性を検討する。さらに、寸法の異なる試験片を対象とすることで、塑性変形挙動が統計的に揺らぐ挙動を確認し、その分布の定量評価を行う。また、結晶粒界を含む系を対象として、メッキにより成膜された多結晶銅薄膜を基材とした配線構造体における局所界面付着強度の評価を行う。前年度で得られた各銅結晶方位での界面結合エネルギーをリファレンスとし、粒界の存在による界面エネルギーの変動を評価するとともに、塑性変形挙動および塑性散逸エネルギーの変化も検討する。さらに、配線構造の局所強度低下を誘引する諸量の探索を行い、得られた統計的な強度データを元に、同一構造体中での局所強度分布の推定を試みる。いずれも積層構造体はすでに前年度に作製済みであり、本年度はサンプル加工とその評価を実施するのみである。また本年度は、得られた試験/観察結果を解析する計算機設備へ重点的に投資し、解析の高速化を図る。当初計画では、積層構造体の作製プロセスをファウンドリへの外部委託を予定していたが、東北大学ナノテク融合技術支援センターを利用することで省コスト化に成功した。その一方で、イオンビーム加工による試験片作製ノウハウの取得に時間を要したため、実験データ取得が当初計画より遅れ、初年度での計算機導入を見送る形となった。初年度予定していた計算機購入費を、次年度に予定していた同じく計算機購入費用と合算してより高性能の設備を導入し、前年度の解析作業の遅れをキャッチアップする。
地球中心核の形成過程の数値シミュレ-ション

地球集積時に形成されたと考えられる珪酸塩を主とするプロトコアとその上に沈積した金属鉄に富んだ密度の高い層とさらにその上に存在するマグマオ-シャンと言った3層構造の力学的進化を追跡する事が本年の研究課題であった。これを軸対称の自己重力を持つ球の非圧縮粘性流体中におけるレイリ-・テイラ-不安定問題として捉え,これを数値シミュレ-ションで不安定構造がいかにして安定構造に推移していくかを調べた。この結果,まずプロトコア全体が一方向に浮きあがるタイプの運動(1次の運動)が起きた後,密度の高い層の一部がプロトコアの内へ沈み込むような(2次の運動)運動が起こる。全体の変形のタイムスケ-ルはこの2次のタイプの運動によって支配されている。この事はこれまでの線型理論で提晶されていた1次の運動がタイムスケ-ルを決めていると言う考えは単純化しすぎた議論であった事を明らかにしたものである。2次のパ-タ-ベ-ションは変形がすすむにつれて、高次への変形も引き起こし、タイムスケ-ルは徐々に長くなる。コア形成の最終段階では高次の変形(コア表層の不規則,小規模変動)が起こる様になり、プロトコアは金属質コアの表面にパッチ状に残る事になる。このような構造は現在話題になっているコアの凹凸の問題,ホットスポットの起源,始源的組成を持つガスの問題など多くの地球科学的問題と関連があるものと思われる。
ニュートリノレス二重ベータ崩壊感度向上のための精密モニター付きエネルギー較正

キセノン136を用いたニュートリノレス二重ベータ崩壊(0νββ)探索実験「カムランド禅」において、位置モニター付きの精密エネルギー較正を行い、0νββ探索感度の向上を実現した。位置モニターを行うため、有機溶媒中で使用可能なモニターカメラーを選定、開発した。これを用いて精密に線源の位置を確認しながらガンマ線源によるエネルギー較正を行った。光電子増倍感が検出する総光量とエネルギーの関係(比例係数)は、線源の位置によって変わるため、位置モニターをすることにより、エネルギー較正の精度は高まる。この効果により、エネルギースケールの不定性が減少したため、より高感度の二重ベータ崩壊探索が可能となった。精密エネルギー較正のための線源懸架システムの開発を行った.線源懸架システムは,カムランド・太陽ニュートリノ観測のために開発されたシステムを再利用する.ただし,カムランド禅ではキセノン入り液体シンチレータ保持のための「ミニバルーン」(直径3.2 m)が取り付けられたため,エネルギー較正用線源がミニバルーンに接触する危険性が高まった.このため,懸架用に用いていたステンレスワイヤーを,強化繊維「ベクトラン」の紐に変更し,線源,懸架用プーリーをこれに適合させる改造を行った.また,精密位置モニターカメラ用に,光学系の開発を行った.バルーンフィルムからのバックグラウンドによる,液体シンチレータの発光を観測することによって,バルーンの位置をモニターできることがモンテカルロシミュレーションによって確認された.そこで,光電子増倍管を用いて一光子を観測するモニターカメラへと設計変更を行った.これにより,受光面積の大きな反射鏡による光学系が必要になったが,光学設計ソフト「ゼマックス」を用いて開発に成功した.ゼマックスの講習会にも参加し経費が生じたが,カメラ開発費の範囲内に収まった.光検出器としては,16×16チャンネル・マルチアノード光電子増倍管を選択し,これを2モジュール購入した.シグナルのパルス高,その印加電圧依存性,ノイズレートなど基本的な性能をチェックし,現在読み出し回路の設計,製作を行っている.反射鏡とマルチアノード光電子増倍管を支える治具を設計し,モジュールとして完成させるため,光学系アラインメントのノウハウ,調整機構の設計に着手したところである.平成25年度に光学シミュレータ「ゼマックス」を用いて設計した、エネルギー較正モニター用カメラを実際に作製し、基本性能のテストを行った。2枚の凹面鏡を用いた結像系と、マルチアノード光電子増倍からなるカメラで、アクリル板へのアルミ蒸着ミラーなどを用いて、ほぼ設計どおりに作製した。また、発光ダイオードを一定間隔で並べた「ダイオードアレイ」を作製し、その像をモニターカメラで取得した。そのデータから、画像処理を含むオフライン解析を行い、アレイの像を再構成することによってカメラの撮像性能を評価した。その結果、1光子検出に対して10センチメートルの位置分解能が得られることが分かった。1事象辺りの光子数とエネルギー較正時の事象数を考慮すれば、線源位置に関して1センチメートル以下の位置分解能が得られると期待され、エネルギー較正モニター用に十分な性能であることが分かった。いくつかのパラメータに、シミュレーションとの不一致が見られたので、それらはシミュレーションへとフィードバックする貴重なデータとして、今後活用していく。エネルギー較正用線源の懸架、挿入システムは昨年度開発がほぼ終わっているので、微調整とメンテナンスを行い、エネルギー較正に備えた。平成26年度中は、二重ベータ崩壊実験カムランド禅では、シンチレータ純化後の良質なデータを、また反ニュートリノ観測カムランドでは、国内の原子炉が停止中であることから、地球ニュートリノの低バックグラウンドデータを取得していた。このような貴重なデータ収集期間であるため、平成26年度中は、検出器内への機器の挿入テストは行われなかったが、性能評価はすべて終わり、エネルギー較正の準備は整った。ニュートリノレス二重ベータ崩壊探索実験カムランド禅で、位置モニターをともなう、精密エネルギー較正を行った。セシウム137,ゲルマニウム68、コバルト60からなる線源モジュールを、昨年までに準備した懸架システムを用いて、キセノン入り液体シンチレータ保持用ミニバルーン内に沈めて、データを取得した。線源位置は、懸架用ベクトラン(強化繊維紐)の長さ測定に加え、モニターカメラの画像から決定し、位置の不定性に起因するエネルギー誤差を低減させた。現在、このエネルギー較正の結果を含んだ二重ベータ崩壊探索データの解析を進めている。エネルギー精度の向上によって、ニュートリノレス二重ベータ崩壊探索の感度向上が期待されている。エネルギー較正の準備は完了した。平成27年度冬の、二重ベータ崩壊探索実験データ収集終了と同時にエネルギー較正を始めることができる状態となっている。素粒子実験平成27年度冬にデータ収集終了予定であり、その後すぐにエネルギー較正を行う。

その後、キセノン入り液体シンチレータ用「ミニバルーン」の撤去作業を行う予定である。この撤去作業の予定から逆算して、エネルギー較正のために約1週間の期間が与えられるように、通常のデータ収集を終える予定である。精密エネルギー較正に必要な物品購入,基礎的開発がほぼ終了した.グローブボックスなど再利用できるものが確認された一方,ステンレスワイヤーをベクトラン紐に変更したための開発が加わった.全体としては当初予定に近い進捗状況となっている.カメラ作製と性能テストのための装置の一部(光学機器など)が現有設備でまかなえたため、平成26年度の使用額が少なくなった一方、エネルギー較正を行う平成27年度の旅費が、当初の計画より増える可能性が出てきたため、平成26年度研究費の一部を平成27年度に使用することとした。実際にエネルギー較正を行う時期が,カムランド禅実験全体のスケジュールからほぼ決まり,平成27年度後半となる予定である.そこで平成26年度は位置モニターカメラの調整,懸架システムの動作テストなど綿密な準備をすすめ,27年度のエネルギー較正に向けて万全の状態にする.平成27年度は、エネルギー較正を行うため、岐阜県飛騨市の茂住実験室への旅費、およびクリーン作業用の消耗品費として使用する。
免疫抑制剤ラパマイシンの合成生物学に関する研究

本研究では、二次代謝産物の生産者として著名な放線菌由来薬用成分の生合成経路を利用した物質生産系の構築に関する研究に従事する。特に、抗腫瘍、抗免疫化合物として著名なポリケタイド化合物であるrapamycinなどに注目して、その生合成経路の解析と、前駆体供給をゲノム編集や化合物投与によって最適化し、高収量の物質生産系の構築を達成する。転写解析や代謝物解析など各種オーム解析を行い、遺伝子発現に用いるプロモーターや包括転写因子の最適化を行う。また、キャリアープロテインのホロ体化酵素やII型チオエステラーゼなど翻訳後修飾に必要なタンパク質の発現についても同時に取り組み、収量の増加を試みる。同時に、基質のポリケタイド合成酵素(PKS)へのロードに関わる酵素であるRapPの結晶構造解析を行い、その構造情報をもとにエンジニアリングを行い、非天然型のrapamycin生産系の構築を目指す。昨年11月に研究に着手し、発現系の構築を完了した。加えて、類縁二次代謝産物の生合成に関わる酸化酵素のX線結晶構造解析に成功した。昨年度に引き続き、Rapamycin生産菌Streptomyces hygroscopicusのトランスクリプトーム解析、LC-MSメタボローム解析を行う。特にスターター基質となる4,5-dihydroxycyclohex-1-ene carboxylic acid、L-pipecolic acid、malonyl-CoA、methylmalonyl-CoAの前駆体について詳細に解析を行う。CRISPR/Cas9を用いて、代謝経路特異的、また、グローバルな転写因子の破壊または過剰発現を行い、一次代謝経路の最適化を行い、rapamycin生産の増大を試みる。メタボローム解析に関しては、親水性相互作用のカラムクロマトグラフィーを用いて、アミノ酸、糖などを分析する。また、Rapamycin生産PKSの遺伝子発現プロモーターについても検討を行い、PKS発現、rapamycin生産の最適化を行う。