hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミリ波で観る地球 - 高精度水蒸気モニターで切り拓く次世代自然ハザード精密予測

年度当初の研究開発方針を踏まえ、気象研究所、国土地理院、及びNICTリモートセンシング研究室の協力を得て、KUMODeSの小型版である試作2号機「ミニデス」による試験観測を11月5-9日に気象研究所において実施した。天頂方向の湿潤遅延量変動を比較するため、同時にGNSS、Radiometrix社製マイクロ波放射計MP3000、及び地上気象測器の観測を行った。予備的な結果によれば、観測は成功し、取得データについて引き続き解析中である。研究グループ内での議論を重ねつつ、次世代高感度ミリ波放射計の仕様について、要となる受信系の検討を進めた。20-60GHzの全帯域を受信可能な広帯域フィードを設計・製作し、フィードの後段で導波管型偏波分離器(OMT)を用いて水蒸気と液水の吸収帯域を含む20-30GHz帯と酸素の吸収帯である50-60GHz帯の2系統(水平・直交のそれぞれの偏波成分を取り出す)に分離、各々の信号を低雑音増幅器で受ける受信系とする仕様を固めた。まず常温の受信系を製作するが、その性能評価を踏まえて、必要な感度や時間分解能に応じてこの受信系全体を少なくとも77Kまで冷却することを想定した仕様とした。この仕様を踏まえ、研究代表を担うNICT時空標準研究室が、低雑音増幅器や冷凍機等の必要な電子部品の調達を進めている。一方で、次世代超高感度ミリ波放射計の応用や計画年度後半での実証観測を想定し、東北大学では、断層すべりを搬送波位相変化から直接推定する手法によるゆっくりとした地殻変動現象をとらえるための技術開発を開始した。その結果、湿潤遅延量推定値と断層すべりの間に一定の相間があるとの知見を得た。また、国土地理院では、マイクロ波放射計等を用いて得た湿潤遅延量により生じ得るGNSS測位解について、先行研究の文献調査を行うとともに、影響の検証に使用する計算機を調達した。まず、KEKにより開発された「ミニデス」の試験観測を実施し、データについて解析中である。また、今後の実証実験を見据えた測地学的観点からの湿潤遅延によるGNSS測位への影響評価については、主として研究分担者の国土地理院と東北大学によって進められており、査読付き論文成果も得ている。同じく実証実験に向けての気象測器やGNSS解析環境等の整備も順調に進めることが出来た。一方、試作機開発について、核となる広帯域受信系の設計・仕様固めは年度半ば過ぎには完了したが、電子部品の価格高騰や開発期間の制約の影響について慎重な検討が必要となった。そこで、研究グループ内での調整を踏まえて、まずは完動する試作機1台の開発を進め、必要に応じて改良を加えていく開発方針に修正した。広帯域受信系の構成を検討する中で、周波数変換回路の工夫により、DC26GHzの帯域で測定可能なスペクトラムアナライザ1台のみを用意するだけでデータ取得出来る可能性が見えてきた(開発当初は2台、ないしは3台のスペクトラムアナライザが必要と考えていた)。そこで、開発当初は77Kまで冷却した受信系を試作初号機として開発する予定だったが、まずは常温受信系として組み上げ、実際の受信性能試験を急ぐ方針に変更した。年度末までに、受信系試作機を構成する電子部品は概ね納入されており、次年度の当初より本格的な開発に着手できる状況にある。以上、当初の研究計画から多少の修正を要したものの、全体的にはおおむね順調に進展していると言える。計画当初は、後年度実施予定の実証実験で積乱雲周辺や火山噴煙柱内の水蒸気分布2次元構造を得るために、放射計の試作機を2台製作する予定であった。しかしながら、前述の事情により、完動する試作機1台の開発を進め、必要に応じて改良を加える開発方針に修正した。これにより、実証実験の進め方も今後要修正だが、研究期間終了前に更に予算規模の大きな競争的資金の獲得も視野に入れて今後検討を進める。今年度は、常温系の広帯域受信系試作機が夏頃には完成する見込みであり、これを既存のパラボラアンテナに搭載した試験観測を予定している。搭載候補アンテナは、NICT沖縄電磁波技術センターの3.7m口径、あるいは同鹿島宇宙技術センターの34m口径のパラボラアンテナである。沖縄では、アンテナ周辺に発生する積乱雲がターゲットになる。一方、鹿島では、34mアンテナ近傍の鹿島臨海工業地域に複数の大出力の火力発電所が点在しており、これらから排出される水蒸気の検知を目指す。34mアンテナは、水蒸気の吸収帯である22GHzの周波数では約0.03°のビーム幅となり、約3km離れた火力発電所からの排出煙を約1.4mの空間分解能で観測できる。ただし、排出される水蒸気の絶対量は非常に小さいと予想され、この評価観測は周辺の水蒸気量が少ない冬季に行う。NICTリモートセンシング研究室、東北大学、及び国土地理院の各研究分担者については、「従来型マイクロ波放射計及び地上気象測器による性能評価観測の実施(NICTリモセン)。」、「外部情報としての湿潤遅延量を取り込むことで、新たに開発した断層すべり推定手法の安定性が向上するかの検討(東北大)」、及び「GNSS測位解への湿潤遅延量の影響を評価・検証するための数値計算環境整備(国土地理院)」、を各々実施し、後年度の実証実験に向けて準備を進める予定である。

年度当初の研究開発方針を踏まえ、気象研究所、国土地理院、及びNICTリモートセンシング研究室の協力を得て、KUMODeSの小型版である試作2号機「ミニデス」による試験観測を11月5-9日に気象研究所において実施した。天頂方向の湿潤遅延量変動を比較するため、同時にGNSS、Radiometrix社製マイクロ波放射計MP3000、及び地上気象測器の観測を行った。予備的な結果によれば、観測は成功し、取得データについて引き続き解析中である。研究グループ内での議論を重ねつつ、次世代高感度ミリ波放射計の仕様について、要となる受信系の検討を進めた。20-60GHzの全帯域を受信可能な広帯域フィードを設計・製作し、フィードの後段で導波管型偏波分離器(OMT)を用いて水蒸気と液水の吸収帯域を含む20-30GHz帯と酸素の吸収帯である50-60GHz帯の2系統(水平・直交のそれぞれの偏波成分を取り出す)に分離、各々の信号を低雑音増幅器で受ける受信系とする仕様を固めた。まず常温の受信系を製作するが、その性能評価を踏まえて、必要な感度や時間分解能に応じてこの受信系全体を少なくとも77Kまで冷却することを想定した仕様とした。この仕様を踏まえ、研究代表を担うNICT時空標準研究室が、低雑音増幅器や冷凍機等の必要な電子部品の調達を進めている。一方で、次世代超高感度ミリ波放射計の応用や計画年度後半での実証観測を想定し、東北大学では、断層すべりを搬送波位相変化から直接推定する手法によるゆっくりとした地殻変動現象をとらえるための技術開発を開始した。その結果、湿潤遅延量推定値と断層すべりの間に一定の相間があるとの知見を得た。また、国土地理院では、マイクロ波放射計等を用いて得た湿潤遅延量により生じ得るGNSS測位解について、先行研究の文献調査を行うとともに、影響の検証に使用する計算機を調達した。まず、KEKにより開発された「ミニデス」の試験観測を実施し、データについて解析中である。また、今後の実証実験を見据えた測地学的観点からの湿潤遅延によるGNSS測位への影響評価については、主として研究分担者の国土地理院と東北大学によって進められており、査読付き論文成果も得ている。同じく実証実験に向けての気象測器やGNSS解析環境等の整備も順調に進めることが出来た。一方、試作機開発について、核となる広帯域受信系の設計・仕様固めは年度半ば過ぎには完了したが、電子部品の価格高騰や開発期間の制約の影響について慎重な検討が必要となった。そこで、研究グループ内での調整を踏まえて、まずは完動する試作機1台の開発を進め、必要に応じて改良を加えていく開発方針に修正した。広帯域受信系の構成を検討する中で、周波数変換回路の工夫により、DC26GHzの帯域で測定可能なスペクトラムアナライザ1台のみを用意するだけでデータ取得出来る可能性が見えてきた(開発当初は2台、ないしは3台のスペクトラムアナライザが必要と考えていた)。そこで、開発当初は77Kまで冷却した受信系を試作初号機として開発する予定だったが、まずは常温受信系として組み上げ、実際の受信性能試験を急ぐ方針に変更した。年度末までに、受信系試作機を構成する電子部品は概ね納入されており、次年度の当初より本格的な開発に着手できる状況にある。以上、当初の研究計画から多少の修正を要したものの、全体的にはおおむね順調に進展していると言える。計画当初は、後年度実施予定の実証実験で積乱雲周辺や火山噴煙柱内の水蒸気分布2次元構造を得るために、放射計の試作機を2台製作する予定であった。
成長に伴うグレリンの受容体発現及び生理的役割の変化：ニワトリを用いての解析

ニワトリ成長過程で腺胃のグレリン収縮性が孵化後日齢に依存して減弱し、その低下は内在性グレリン増加によるグレリン受容体遺伝子の発現低下が関与することを示した。グレリンの増加はグレリン脂肪酸添加酵素遺伝子の発現にも影響を与えたが、グレリン遺伝子発現には影響しなかった。脳においてもグレリン関連遺伝子は部位と孵化後日齢に依存して変化した。本実験の結果は成長期にグレリン関連遺伝子の発現が内在性グレリンにより制御されることを示した。本研究では成長過程におけるニワトリ消化管のグレリン反応性と受容体発現の変化を明らかにして、このペプチドの生理学的役割が成長過程で変化するか検討した。以下、実績を示す。1日齢による消化管グレリン反応性およびグレリン受容体(GHS-R1a)発現の変化:ニワトリ消化管で腺胃のグレリン反応性が日齢により低下することを示した。一方、そ嚢のグレリン反応性は日齢によっても変化しなかった。グレリン受容体発現は腺胃のみで有意に低下した。即ち、消化管のグレリン受容体発現は部位依存性に日齢により変化することが解った。グレリンfamilyに属するモチリンの腺胃における反応性も低下したが、回腸での反応は変化しなかった。モチリン受容体の発現量は、いずれの消化管部位でも減少する傾向にあったが、減少は腺胃で著明であった。Atropine処置腺胃標本では、日齢によるモチリン反応性の変化は有意ではなくなったので、日齢により主に神経性反応が低下することが示唆された。2日齢による内在性グレリン量の変化:各日齢における腺胃グレリン量、血中グレリン濃度の変化を検討した。いずれも3日齢までは低値であったが5ー10日齢で増加し30日齢でほぼ一定の値になっていた。腺胃ではグレリン受容体の発現量は、グレリン含有量と逆相関を示すことが解った。3中枢神経グレリン受容体発現の変化:中枢神経では、小脳、視床下部、下垂体、中脳でグレリン受容体の高い発現を認めたが、嗅球、松果体、大脳半球では低かった。成長に伴い発現は小脳、中脳で低下したが、他の部位では変化が認められなかった。グレリン、グレリン脂肪酸付加酵素(GOAT)の分子生物学的な解析についても手法を確立し中枢神経での発現変化を明らかにした。4論文作成:魚類の消化管収縮におよぼすグレリンの作用、ニワトリ消化管グレリン、モチリン反応性の成長による変化について論文を作製した。本研究では、孵化後のニワトリで腺胃のグレリン反応性と受容体(GHS-R1a)、グレリンおよびグレリン合成酵素(GOAT)発現を総合的に解析し成長過程におけるグレリン系の変化とそのメカニズムを検討した。末梢組織との比較のため脳においてもグレリン関連遺伝子の発現の変化を観察した。腺胃のGHS-R1a、グレリンおよびGOAT mRNA発現の日齢による変化:ニワトリ腺胃のGHS-R1a発現は孵化後日齢(1ー100日齢)に依存して低下し血漿中グレリン濃度、腺胃グレリン量の増加と負の相関を示した。腺胃グレリンmRNA発現は孵化直後に低下した後、一定となりグレリン濃度との相関は認められなかった。GOAT mRNAは孵化後日齢に依存し低下した。この低下とグレリン濃度の増加には弱い負の相関が認められた。これらのことから、孵化後のグレリン濃度の増加によりGHS-R1aとGOAT mRNAの発現が負のフィードバックを受ける可能性が示唆された。血液中グルコース濃度の変化:孵化後の血中グルコース濃度は200ー300mg/dlとほぼ一定であり、グレリン濃度の変化とは無関係であった。中枢神経におけるグレリン関連遺伝子発現の変化:中枢神経(小脳、視床、視床下部、下垂体、中脳、嗅球、延髄、大脳半球)でグレリンmRNAは部位依存性に発現していたが、日齢では変化しなかった。GHS-R1aも部位依存性に不均一な発現を示し、日齢に依存した低下は小脳のみで観察された。GOAT mRNAは、中枢神経では殆どの部位で孵化後、日齢依存性に増加した。中枢神経と消化管では日齢に依存したグレリン関連遺伝子の発現変化に差が認められた。このことは、グレリンによる生理機能が孵化後、部位依存性に変化する可能性を示唆したニワトリ成長過程で腺胃のグレリン収縮性が孵化後日齢に依存して減弱し、その低下は内在性グレリン増加によるグレリン受容体遺伝子の発現低下が関与することを示した。本研究は、成長過程でのニワトリ消化管グレリン反応性の変化とその特徴を調べ、グレリンの生理学的役割が動物の成長過程でどのように変わっていくのかを明らかにする試みである。今年度の実績を以下に示した。(1)日齢による消化管薬物反応性の変化:そ嚢、腺胃、結腸はグレリンに反応性を示したが、回腸は非感受性であった。そ嚢のグレリン収縮は、孵化後100日まで殆ど変化しなかったが、腺胃でのグレリン収縮は日齢により減少した。

腺胃におけるカルバコール、セロトニン収縮は日齢によっても変化しなかったが、グレリン類似peptideのmotilinによる収縮も日齢により低下した。収縮の低下はアトロピン処置標本では顕著ではなかった。このことから、日齢によりmotilin収縮の神経性要素が低下する可能性が考えられた。一方、回腸のmotilin収縮(筋原性)は日齢によっても変化しなかった。腺胃でグレリンおよびmotilin収縮のみが日齢により変化することが示された。(2)日齢によるグレリン受容体(GHS-R)およびmotilin受容体mRNA発現の変化:腺胃のGHS-R発現は日齢により減少した。一方、そ嚢、回腸、結腸では著明な変化は起きなかった。Motilin受容体発現は、回腸で最も高く、そ嚢、腺胃、結腸での発現はほぼ同程度であった。日齢によりmotilin受容体発現も低下した(腺胃が著明)。消化管以外の組織、特に脳についてはサンプリングを終了した。24年度にGHS-R発現の解析を行う。(3)腺胃および血液のサンプリング:1-100日齢でのグレリン動態を明らかにするため血液、グレリンが合成される腺胃のサンプリングを行った。24年度に血液中のグレリン濃度変化、グレリンmRNA発現の変化、グレリン合成酵素発現の変化を解析する予定である。(4)他の動物種におけるグレリン研究の推進:モルモット、イヌでの成績をまとめて論文に報告した。1成長過程におけるグレリン、グレリン受容体、グレリン脂肪酸付加酵素(GOAT) mRNAの解析を中枢神経と腺胃で行った。中枢神経では成長との関係で相関がある成績が得られている(結果参照)。しかし、グレリンが合成分泌される腺胃におけるmRNAの解析は3回おこなっているが数値にばらつきがあり、一定の方向性が得られていない(蛋白質レベルの解析では良い結果が出ている)。サンプリング方法等を再度検討している。2グレリンの消化管運動におよぼす影響の比較生物学的検討ということでニワトリと同時進行で行っていた魚類(金魚、ニジマス)の消化管収縮に関する仕事について論文作成を行う必要があった(魚類の論文は公表した。ニワトリの成績に関しても2013年度前半に公表される予定)。また研究分担者として参加している課題についても論文作成をした(ムスカリン受容体ノックアウト動物を用いた検討)。(1)グレリン、GHS-Rに加えて、ニワトリ消化管においてmotilin反応性, motilin受容体の発現についても検討したため。Motilinは、グレリンに類似した消化管ホルモンでありニワトリでも反応を誘起する。近年、種々の哺乳動物でグレリンとmotilinの相互作用が証明されており、研究の質をあげるためにもmotilinついてもニワトリで検討する必要があると考えた。(2)イヌおよびモルモットで行っていたグレリン関連の研究に区切りがつき、ちょうど論文をまとめる時期にあったこと。グレリンは種々の動物でその作用が検討されており、比較生物学的見地からも興味深い物質であるので、他の動物での研究も遅滞なくまとめ、論文作成する必要があると考えた。腺胃については、再度サンプリングを行いグレリン受容体、グレリン、グレリン脂肪酸付加酵素(GOAT)mRNA発現について検討する。同時に腺胃や血液中グレリン濃度についてサンプルを集め再測定する。このため研究分担者の海谷にも研究費を分担した。
Affibodyを用いた中枢神経系悪性腫瘍のHER-2受容体発現の画像化

HER-2発現の有無の確認は治療法の選択、予後など臨床上極めて重要であると考えられている。本研究ではAffibodyという抗体の約10分の1程度の分子量でありながら、抗体と同様の機能を果たす小分子に着目し、それを磁性粒子(SPIO)で標識することによりMRIでのHER-2受容体の検出を試みた。実験動物の背部に移植したHER-2陽性腫瘍(SKOV-3)はAffibody-SPIOで標識されることがMRIならびに病理組織検査で確認することができた。本年度はHER-2特異的Affibodyによる培養細胞におけるHER-2のMRIによる画像化を主にin vitroの実験系において検証した。HER-2陽性である卵巣癌細胞株である、SKOV-3細胞をHFR-2特異的biotine化Affibodyに暴露し、その後avidin-biotine反応を用いてavidin化superparamagnetic iron oxide(SPIO)と反応させるとMRIのT2強調画像において著しいlow intensity signalを認めた。これは細胞膜上にHER-2ならびにaffibodyを介してSPIO(超磁性体)が沈着したため、T2緩和時間が著名に短縮したことによると考えられた。この現象はHER-2陰性細胞であるラットC6細部、ならびにavidine化されていないaffibodyで予めSKOV-3を処理し、HER-2をマスクした状態では観察されない現象であった。これらの結果よりこれによりHER-2特異的biotine化Affibodyならびにavidin化superparamagnetic iron oxide(SPIO)によるMRIでの信号強度の変化は細胞でのHER-2露出量依存的であることが示された。AffibodyによりHER-2のMRIによる画像化がin vitroで可能であることが証明された。また、これらの結果は先行しているPETでのAffibodyによる分子イメージングと似通った結果となっており、MRIでの応用も十分に可能であることが示された。本年度では、前年度に引き続き、Affibodyならびにsuperparamagnetic iron oxide(SPIO)を用いたHER-2受容体のin vivo imagingを行った。HER-2陽性である卵巣がんSKOV-3細胞株を用いて、脳内腫瘍モデルを施行した。しかしながら種々の実験条件を試みたものの、nude mouseでのSKOV-3生着が極めて悪く、脳内腫瘍接種部位にわずかに腫瘍細胞が生着するという結果を得た。この状態で、AffibodyならびにSPIOを経静脈的に投与したが、MRIで腫瘍細胞を画像化することはできず、必ずしも本方法の有用性を証明することはできなかった。これは、実際に正着させることができた腫瘍細胞数が少なすぎたことによるものか、それともAffibodyとSPIOを共使用するという、方法論自体の問題なのか、結論をだすことができなった。その一方で、これまで、頭蓋外腫瘍ではHER-2受容体の局在をMRIで画像化できていることから、少なくとも、本研究課題で提案しているAffibodyとSPIOはMRIを用いた分子イメージングにおいて頭蓋外病変で有用である事が示された。本研究課題により、今後MRIを用いた分子イメージングが少なくとも頭蓋外病変では可能であり、当初研究の目的としていた、「病変組織を非侵襲的に分子レベルで画像化する」という日標に一歩近づくものと考える。
次世代高速通信を用いた微動2点観測によるリアルタイム地盤探査システムの開発

本研究では、地表に直線的に微動計を設置するだけで、地盤のS波構造をリアルタイムに推定する簡便な地盤探査システムの開発を目的としている。そのためには、あらかじめ1点での観測から微動の到来方向の頻度分布を把握し、その特性を利用して数台の微動計を直線的に配置し、微動に含まれる表面波の分散性が抽出できるかどうかまず把握する必要がある。そこで、微動3成分1点観測から微動の到来方向を同定する理論を構築し、微動の到来方向の頻度分布を解析するプログラムを開発した。さらに、その頻度特性を利用して配置した直線アレイで観測された微動データから、表面波の分散性を求めるプログラムを開発し、その有効性を確認するため、微動2次元アレイ観測との比較実験を行った。直線アレイにより求められる分散曲線は、微動が一方向から到来する場合は、1次元F-k法から求められる分散曲線が、2次元アレイ観測より求めたものと同等であり、微動が等方的に多方向から到来する場合は、空間自己相関法(SAC)法から求められる分散曲線が、2次元アレイ観測より求めたものと同等である可能性が高いこ七を示した。さらに、リアルタイムで分散曲線と地盤構造を推定するため、GPSにより観測点問の時刻を合わせるとともに、高速無線LANにより観測点間のデータ転送を行なえるシステムを開発した。開発したシステムの有効性を確認するため、有線を用いたアレイ観測との比較実験を行い、開発したシステムにより求められる分散曲線が有線を用いたアレイ観測より求めたものと同等であることを確認した。本研究では、地表に直線的に微動計を設置するだけで、地盤のS波構造をリアルタイムに推定する簡便かつ信頼性のある地盤探査システムの開発を目的としている。そのためには、あらかじめ1点での観測から微動の到来方向を把握し、それと平行に数台の微動計を直線的に配置し、微動に含まれる表面波の分散性が抽出できるかどうかまず把握する必要がある。そこで、微動3成分1点観測から微動の到来方向を同定する理論を構築し、リアルタイムで微動の到来方向を解析するプログラムを開発した。提案理論の妥当性を検討するため、微動2次元アレイ観測との比較実験を行い、微動3成分1点観測からある程度の精度で微動の到来方向が推定できることを確認した。さらに、到来方向と平行に配置した直線アレイで観測された微動データから、アレイに平行して伝播する表面波の分散性をリアルタイムで求めるプログラムを開発した。開発したプログラムの有効性を確認するため、微動2次元アレイ観測との比較実験を行い、直線アレイにより求められる分散曲線が微動2次元アレイ観測より求めたものと同等であることを確認した。直線アレイが道路を跨ぐ場合やその全長が長くなり観測点間を有線でつなぐことが難しい場合にも、リアルタイムで分散曲線と地盤構造を推定するためには、各観測点での時刻を合わせて観測を行い、さらにデータを1点に集める工夫が必要である。そこで、GPSにより観測点間の時刻を合わせるとともに、高速無線LANにより観測点間のデータ転送を行い、分散曲線をリアルタイムで推定するシステムを開発した。
ＴＦＡＭを中心としたヒトミトコンドリアヌクレオイドの構造および機能の解明

ミトコンドリアヌクレオイドの機能調節において、TFAMの重要性を明らかにし、TFAMの翻訳後修飾による調節機構を中心に明らかにした。その過程で、TFAMのアセチル化修飾の機構が、核や細胞質では見られないミトコンドリア特有のものであることを示した。この修飾機構は、TFAMのみに限らず、ミトコンドリア内の多くのタンパク質に一般化することができることが分かった。また、アセチル化のみならず、サクシニル化、マロニル化などの翻訳後修飾も同様の機構で行われていることを示した。これらにより、ミトコンドリアにおける翻訳後修飾による新規の調節機構を明らかにした。TFAMを中心としたミトコンドリアヌクレオイドの解明のために、今年度は具体的にTFAM/mtDNA複合体のX線結晶構造解析とTFAMの修飾機構の解明を行った。TFAM/mtDNA複合体の原子レベルの構造解明に向けて、TFAMのX線結晶構造解析を引き続き行った。前年度作製した、ヒトTFAMの一部領域のみの変異体、酵母のTFAMホモログであるAbf2p、結晶化を促進することが予想される40種類の点変異体、結晶化を促進すると予想されるタンパク質との融合体など、様々な種類のTFAMについて、DNAとの複合体を作製し、よりよい結晶化条件を引き続き探索した。それぞれ改善した面もあるが、まだ構造解析できるレベルの結晶は得られていない。また、TFAMの修飾機構の解明に関しては、アセチル化について、修飾の機構と、修飾後の機能の変化を調べた。まず、TFAMがどのようにアセチル化されるのか、アセチルトランスフェラーゼの存在の有無やアセチル化機構の解明を行った。また、TFAMが細胞内でアセチル化されるのか、またされるならどの部位なのかについて、阻害剤により脱アセチル化酵素の活性を抑制した状態の細胞から、TFAMを免疫沈降で回収して、質量解析装置による解析を行った。また、アセチル化されたTFAMの作製に成功し、それを用いてアセチル化TFAMのDNA結合能を調べた。これにより、TFAMのアセチル化により、DNA結合能が下がることを明らかにした。さらに、DNAからはずれたTFAMがLon proteaseによって、分解されるのかどうかを調べるために、大腸菌によるLon proteaseの発現系の構築を行った。TFAMを中心としたミトコンドリアヌクレオイドの機能の調節機構の解明のために、今年度はTFAMの修飾機構の解明を中心に行った。昨年度からのTFAMのアセチル化機構の解明から、その修飾機構は核や細胞質では見られない独特で興味深いものであった。さらにこれは、TFAMのみならず多くのミトコンドリア内のタンパク質に一般化できる可能性が示唆された。そのために、グルタミン酸脱水素やリンゴ酸脱水素酵素など他の40種類程度の酵素について同様の修飾機構が使われているのかどうかを調べた。またこの修飾機構は、サクシニル化およびマロニル化にも適応されているのではないかと考え、それらについても調べた。抗アセチル化リジン抗体、抗サクシニル化リジン抗体、抗マロニル化リジン抗体を用いたウエスタンブロッティングおよび質量解析法により、これらの修飾を確認した。また、修飾率および修飾部位も求めることができた。また修飾機構の詳細な条件なども確認した。また、Sirt3, Sirt5を用いて、これらの修飾体の脱修飾も確認した。生体内で行われている活性調節がここで確認した修飾および脱修飾と相関がある事も確認した。またヌクレオイドにおけるTFAMの翻訳後修飾による活性調節機構について明らかにした。さらにミトコンドリアで独特な修飾機構がとられている原因について、AcCoA、SucCoA, Malonyl-CoAなどのミトコンドリア内の代謝が関連しているのではないかと考え調べた。TFAMを中心としたミトコンドリアヌクレオイドの解明のために、今年度は具体的にTFAMのX線結晶構造解析とTFAMの分子機構の解明を行った。TFAM/mtDNA複合体の原子レベルの構造解明に向けて、TFAMのX線結晶構造解析のために、様々な種類のTFAMを大腸菌を用いて高純度で作製することができた。ヒトTFAMだけでなく酵母のTFAMホモログや、これらの一部領域のみの変異体や、結晶化を促進することが予想される点変異体や、結晶化を促進することが予想されるタンパク質との融合体などを作製した。これらに対して、より結合力の強いDNAの配列の決定を行い、DNAとの複合体を作製した。これらすべてにおいて、結晶化を行い、いくつかにおいて38オングストローム程度の結晶を得ることができた。様々な種類のサンプルを準備でき結晶を得ることができるようになったことは、結晶化の成功率を大きく上げたことを意味する。TFAMの分子機構の解明では、まず、重要と予想されるアミノ酸を置換した変異体、および結晶化のために作製した変異体のDNA結合能、転写活性能の評価を行った。

これらにより、TFAMのどのアミノ酸がDNA結合および転写活性に重要なのかそうでないのかを明らかにすることができた。また、in vitroでTFAMが酸化修飾されることを示し、またその修飾されるアミノ酸残基の部位およびその修飾の程度まで求めることができた。同時に酸化修飾されたTFAMのDNA結合能を評価した。これにより、酸化修飾によりどのアミノ酸が修飾されどのようにDNA結合能に影響を与えるかを明らかにすることができた。以上より、TFAMの分子機構の一部を明らかにすることができた。ここで得られた情報は、原子レベルでの構造と照らし合わせることでより重要な意味を持つようになる。前年度、研究実施計画書に従って、TFAMを中心としたミトコンドリアヌクレオイドの機能の調節機構の解明を進めていた過程で、ミトコンドリアでの翻訳後修飾機構が、核や細胞質ではみられない独特なものである可能性が示唆された。今年度は、その機構が、アセチル化に限らず、サクシニル化、マロニル化にまで共通である事、また、対象となるタンパク質が、本研究の対象としたTFAMのみに限られたものではなく、より広く他のタンパク質にも共通の機構であることを確認した。これらを確認する上で、修飾タンパク質、その修飾部位およびその修飾率をより正確に求めるために、それぞれ再現性を確認した。また、この修飾機構の詳細を明らかにするために、様々な修飾条件を調べることで、その特異性を示す機構を明らかにした。また、この修飾をはずす脱修飾機構は、既知のSirt3やSirt5を使用していることも再現性を確認した。今後、この機構が生体内でどのように調節されているかを明らかにしていきたいと考えている。生化学分子生物学本年度も、引き続きTFAMを中心としたミトコンドリアヌクレオイドの調節機構の解明を目指して、立体構造と機能の両方の面から総合的に解析を行っている。まず、立体構造からの解明では、原子レベルの構造を明らかにするうえで必要となるTFAM/mtDNA複合体のX線結晶構造解析を行った。前年度までに様々な種類のサンプルを準備することに成功しており、最も困難と予想される結晶化のステップにおいて、多角的に攻めることを可能にしている。本年度はこれらを用いて、良質な結晶を得る条件をしぼりこんでいる。今後、構造解析をできるレベルの結晶を得て、TFAMの原子レベルの構造を解明することができる可能性は高いと予想しており、順調であると考えられる。次に、機能からの解明では、前年度までに、TFAMのDNA結合能に重要なアミノ酸残基、転写活性に重要なアミノ酸残基を明らかにすることができた。また、in vitroでの酸化修飾によるTFAMの分子機構を明らかすることができた。本年度では、アセチル化について、アセチルトランスフェラーゼの有無や、アセチル化によりTFAMがDNAとの結合能を下げるなど、アセチル化による機能調節機構の解明をすすめることができた。またDNA結合能が弱まったTAFMがそのあとどうなるか解析するためのLon proteaseの準備も進めている。
降下火砕堆積物の圧密現象と古記録の信頼性

1783年(天明3年)の浅間火山の降下軽石と1707年(宝永4年)の富士火山の降下スコリアの両試料について,圧密実験を行った.その結果次のようなことが判明した.供試体を乾燥状態で一軸圧縮した時、その減少量は経過時間の対数に従って直線的に増加する。浅間降下軽石堆積物から製作した供試体と富士降下スコリア堆積物から製作した供試体を一軸圧縮した時、変位量-経過時間の片対数グラフ上に描ける近似直線の傾きは、後者の軽石供試体の方が前者のスコリア供試体より3.6倍大きい値をとる。粒径をそろえた場合、最大密度と最小密度の比は供試体の構成粒子に依存せず0.8前後の値をとる。圧縮試験の結果,最小密度(堆積当時)からきわめて短時間内に最大密度近くに達し,その後200から300年経た時点での密度にほぼ等しいのではないかという展望が得られた.富士火山宝永4年降下スコリア堆積物について,既存の資料を検討したが,浅間火山天明3年噴火降下軽石堆積物の層厚変化(荒牧ほか,1998)とはやや異なった経時変化を示すような結果を得た.史料に記載された堆積直後の層厚値は、富士火山宝永4年噴火降下スコリア堆積物で1.69倍、浅間火山天明3年噴火降下軽石堆積物で体積換算の時1.34倍、直接測定の時2.01倍、過大視して書かれているという結果となった。火山噴火により火砕物が降下堆積した後,何らかの作用で厚さが変化することが知られている.このため,古記録に記載された層厚が記録自体の不確かさなのか,あるいは圧密作用など,事後の変化によるものかを判定するための方法を考究した.1783年(天明3年)の浅間火山の噴火では,古文書に記載された降下軽石層の厚さは,現在の実測値に比べて平均して1.7倍大きすぎる.噴火後一定の期間経過した後で再測定した例はきわめて少なく,今回の調査でも未だ新しい資料は発見されていない.一方,軽石質降下物の圧密作用の特性を実験するために圧縮試験機の改良をすすめている.予察的結果では,緩い充填のごく初期に顕著な体積減少が起きるが,その後はあまり圧密されないと言う特性を示す.1707年の冨士火山の降下スコリア堆積物および1929年の北海道駒ヶ岳火山の降下軽石層についても予察的調査を行った.両者とも,最上部によいマーカーとなる層がないため,侵食による層圧現象の可能性を見分けることが困難であることが明らかになった.1783年(天明3年)の浅間火山の降下軽石と1707年(宝永4年)の富士火山の降下スコリアの両試料について,圧密実験を行った.その結果次のようなことが判明した.供試体を乾燥状態で一軸圧縮した時、その減少量は経過時間の対数に従って直線的に増加する。圧縮試験の結果,最小密度(堆積当時)からきわめて短時間内に最大密度近くに達し,その後200から300年経た時点での密度にほぼ等しいのではないかという展望が得られた.

富士火山宝永4年噴火降下スコリア堆積物について,既存の資料を検討したが,浅間火山天明3年噴火降下軽石堆積物の層厚変化(荒牧ほか,1998)とはやや異なった経時変化を示すような結果を得た.史料に記載された堆積直後の層厚値は、富士火山宝永4年噴火降下スコリア堆積物で1.69倍、浅間火山天明3年噴火降下軽石堆積物で体積換算の時1.34倍、直接測定の時2.01倍、過大視して古文書には書かれているという結果となった.北海道駒ヶ岳1929年降下軽石堆積物,桜島火山1914,1770年降下軽石堆積物等についても現地調査を行った.両者とも,データポイントが未だ十分でなく,浅間,富士火山の場合のような実験はまだ完了していない.
研究デザインデータベース構築及び個人情報セキュリティシステムの開発・臨床応用

臨床試験、特に生活習慣病を中心とする循環器領域の試験を実施するためには、がんを対象とする臨床試験とは異なり、数千人から数万人といった多くの患者を対象とした長期間の追跡を行う必要があるだけでなく、がん領域と同様、多大な労力および費用がかかる。また、製薬企業主導の臨床試験では、有意差を認める結果が得られない場合、それ自体有用な情報であるのもかかわらず、公開される機会が乏しい、という現実もある。このため、海外では臨床研究デザインの事前登録が義務付けられる傾向にあり、我が国の研究においても同様にいくつかの臨床研究登録サイトが出現してきた。これらは、登録された各臨床試験がPositiveまたはNegativeな結果にかかわらず、適正に公表するための登録サイトである。そこで今回我々は、本研究においてこれらの経験を活用し、まず、(1)臨床試験研究デザインのデータベース登録サイトを構築し、適正に公表するための基礎情報収集とそのデータベース化可能なシステムを構築した。次に(2)「循環器大規模臨床試験要約集」の中からサンプル試験として約250試験をピックアップしてこれらの掲載サイトを作成し公開した。このシステムには、キーワード検索による簡易なテキストマイニング機能を搭載した。さらにこうした臨床データ登録、臨床研究閲覧におけるセキュリティシステムとして、単なるID・パスワードのみならず、(3)指紋認証技術を活用した登録およびログ管理セキュリティシステムを構築し、データベース管理だけでなく、実際の臨床試験への応用の導入も視野に入れた研究を行った。これらの研究結果は、今後の臨床試験を実施するうえで、セキュリティ面、ユーザー活用面からも必要なツールであると考えられる。臨床試験、特に生活習慣病を中心とする循環器領域の試験を実施するためには、数千人から数万人といった多くの患者を対象とした長期間の追跡を行う必要があり、多大な労力および費用がかかる。にもかかわらず、有意差を認める結果が得られない場合、それ自体有用な情報であるのにもかかわらず、公開される機会が乏しい、という現実もある。本研究で我々は、臨床試験の研究デザインのデータベースを構築し、適正に公表するための登録サイト作成するための基礎情報収集とそのデータベース化、さらに単なるID・パスワードのみならず、様々なセキュリティシステムを構築し、データベース管理だけでなく、実際の臨床試験への応用の導入も視野に入れたシステム構築を目的とした。今年度は、まず循環器領域の代表的な大規模臨床試験約200論文を吟味し、各カテゴリー(重要病名)、試験デザイン、追跡期間、対象症例数、試験結果の要約などをデータベース化し、簡易検索もしくは全文検索システムを用いた全文検索を行うことができるようにした。このことにより、これまでに行われてきた臨床試験を容易に検索し、今後行うべき研究に一定の指針を与えることができるようにした(http://210.154.16.231/pal/pages/main/Top)。また、デザインデータベースに関しては、上記データベースを模範とし、地域、対象疾患病名、人数、試験デザインなどを含めた登録システムの構築を必要十分な項目を入力しやすい形式で行った。研究デザイン登録を事前に行い、これに基づき最終結果報告を行うという国際的な流れは、医学雑誌編集者国際委員会(ICMJE)が提唱し、2005年7月1日以降に開始されてきた。その結果、現在では研究デザインの事前登録が義務付けられており、我が国の臨床研究においても同様に行われてきている。また、臨床試験は、被験者の個人情報が多く集積されており、近年ではゲノム解析を絡めた研究も多く、その個人情報セキュリティ対策は現在も大きな課題である。本研究において、昨年度は循環器領域の代表的な約250論文を、各項目を要約してデータベース化し、検索機能を搭載した。多くの試験が登録され容易に検索しできることで、今後行う試験に対して一定の指針を与えることが可能となった。

また、臨床研究デザインに関しては、上記データベースを模範とした必要十分な項目を入力しやすい形式で整頓した。今年度は、臨床試験を適正に公表するための登録サイトを作成した。ICMJEの登録基準を参考にして、これらで推奨する項目に準拠した登録サイトを2006年10月に公開した(http://healthcare.ebm.ac/ctdp_submission00.htm)。さらに、昨年度に行った大規模臨床研究の250サンプルを登録し、検索可能な機能を搭載、これらを検証した(http://healthcare.ebm.ac/pal/designpaper00.htm)。臨床試験セキュリティシステムへの応用を視野に、指紋認証によるログイン機能の開発も行った。これは単にID, passwordのみでアクセス管理するだけでなく、データ変更などの履歴管理なども管理可能であり、個人情報の改竄や変更記録の管理に活用が可能である。こうしたシステムにより、臨床試験の運営に有用なシステム構築を行った。
自己免疫性疾患を制御する新規サブセットメモリー型T細胞の分化・機能の解明

生体防御反応において、ヘルパーT細胞は様々な免疫反応を制御する細胞としての重要性が知られていたが、最近の知見から生体の中にはこれらのT細胞サブセットを高次で制御するT細胞群の存在が明らかにされている。これらサブセットには、NKT細胞、Natural occurring Treg(nTreg)細胞に加え、我々が新たに同定した「記憶型T細胞」の表現型を持つNatural IL-4産生T細胞、Natural IL-17産生T細胞等がある。同様のNatural IL-17産生T細胞は胸腺にて自己抗原を認識してIL-17を産生するTh17とは異なるサブセットとして分化し,自己免疫炎症を制御する可能性があることから注目を集めていた。本研究は自己免疫性疾患を制御する新規免疫細胞サブセット「メモリー型T細胞」の分化過程の解明、そして機能の解明とリンパ濾胞型T細胞としての可能性を究明が目的であった。Natural IL-4産生記憶型T細胞は、IL-4の産生制御メカニズムの違いから、IL-4を産生する記憶型T細胞はTh2細胞とは異なることを証明した。Th2細胞はI14遺伝子の第2番目のイントロン領域に存在するHS2と呼ばれる転写制御領域によってコントロールされている。ところが、記憶型T細胞がIL-4を産生するためには、I14遺伝子の下流に位置する異なる制御領域、CNS2による制御が必要であった。さらに、記憶型T細胞の多くがリンパ系2次組織であるバイエル板に特に多く分布しており、リンパ濾胞型ヘルパーT細胞(TFH)が持つ表現型であるCXCR5,PD-1,ICOSなどを恒常的に発現しており、遺伝子プロファイリングもTFHと非常に類似していた。また、リンパ組織内における局在をみると胚中心やB細胞濾胞領域に局在することから、記憶型T細胞はTFHとしての特性を持つことが証明された。CNS2をゲノムから欠く欠損マウス由来のT細胞は、B細胞におけるIgG1とIgE抗体産生が傷害されることから、TFHにおいてCNS2によって発現が制御されるIL-4は、抗体産生を制御する重要な働きを持つことが示された。これらサブセットには、NKT細胞、Natural occurring Treg (nTreg)細胞に加え、我々が新たに同定した「記憶型T細胞」の表現型を持つIL-4産生T細胞とIL-17産生T細胞等がある。本研究は、記憶型T細胞の自己免疫性反応における役割を明らかにすることにある。これら抗原による鼻腔暴露は、抗原感作がないマウスにおいても24時間以内に、IL-17依存的に誘導される気道炎症反応を惹起する。この抗原特異的気道炎症反応は、OVA特異的TCRトランスジェニックマウスを、OVAで感作した場合でも観察されることから、我々は抗原特異的に刺激に対してIL-17を産生できるNatural IL-17産生T細胞の関与を検討した。その結果メモリー型を表現型に持つCD4T細胞集団の中に、分化という過程を経ることなくIL-17を産生しうるTh17と非常に良く似たT細胞集団の存在を確認し、このT細胞をNaturalTh17細胞と定義づけた。Natural Th17は通常Th17細胞が分化に必要とするIL-6やIL-23が存在しないI16欠損・p19欠損マウスにおいても存在していた。この細胞は、OVAの鼻腔暴露似ともない、鼻腔へと浸潤し、IL-17を産生することにより、好中球を鼻腔に集積させ、炎症反応を惹起していた。この結果から、生体にはinnateの状態でIL-17を産生するT細胞が存在し、気道における炎症初期反応を制御する役割があることが示された。この研究成果より、自然免疫の過程で炎症性サイトカインであるIL-17を産生することができるT細胞サブセットNatural Th17の存在が明らかにされた。このサブセットは急性の気道炎症を形成する働きを持つことから、獲得免疫が成立する以前にすでに、自己免疫反応を制御できるT細胞が存在することが示唆された。Th2細胞はI14

遺伝子の第2番目のイントロン領域に存在するHS2と呼ばれる転写制御領域によってコントロールされている。ところが、記憶型T細胞がIL-4を産生するためには、I14遺伝子の下流に位置する異なる制御領域、CNS2による制御が必要であった。さらに、記憶型T細胞の多くがリンパ系2次組織であるバイエル板に特に多く分布しており、リンパ濾胞型ヘルパーT細胞(TFH)が持つ表現型であるCXCR5,PD-1,ICOSなどを恒常的に発現しており、遺伝子プロファイリングもTFHと非常に類似していた。また、リンパ組織内における局在をみると胚中心やB細胞濾胞領域に局在することから、記憶型T細胞はTFHとしての特性を持つことが証明された。CNS2をゲノムから欠く欠損マウス由来のT細胞は、B細胞におけるIgG1とIgE抗体産生が傷害されることから、TFHにおいてCNS2によって発現が制御されるIL-4は、抗体産生を制御する重要な働きを持つことが示された。
第一次大戦前のイギリス植民地省による帝国統治政策に関する研究

本研究では、イギリス植民地省による帝国統治の具体的事例として、「研究実施計画」に基づき、世紀転換期の帝国通商同盟問題、とりわけ1897年のカナダによる「対英特恵関税」設定を契機とした植民地省とカナダ自由党政府との対抗を取り上げた。W.ロ-リエのカナダ自由党が、国内での英仏系の対抗を妥協させるため、1897年に二重関税制度の導入を余儀なくされ、それがチェンバレンを筆頭とするイギリス植民地省からの圧力で、本国産品のみを優遇する対英特恵に変容させられた経緯が焦点とされている。研究方法としては、(1)基本文献の調査と収集、(2)マイクロフィルム形態での基礎史料の購入、(3)諸研究組織での研修の三点が柱となった。本年度の研究による新たな知見として、(1)フランス系カナダ人を党首とし、伝統的に本国からの独立と合衆国との貿易拡大を目指してきた自由党政府が、カナダ政治・経済を支配してきた親帝国的なイギリス系カナダ人との妥協のために導入したのが1897年関税であり、それは一般関税よりも12.5%低い互恵関税を新設して二重関税制度を導入し、当面本国に互恵関税を適用することで、合衆国にカナダとの貿易改善交渉を迫ろうとするものであったことを、実証的に明らかにした。(2)これに対し本国植民地省は、カナダの二重関税制度が、本国とベルギ-、ドイツ両国との通商条約に抵触するとの理由から、互恵関税の適用を明確に本国のみに限定するよう迫った。チェンバレンからの圧力と、英加双方での帝国主義的世論とに押され、ロ-リエが98年に二重関税を帝国特恵関税へと修正せねばならなくなった経緯を、主に植民地省文書Colonial Office Papersを利用して論証した。(3)さらに1897年イギリス植民地会議でチェンバレンとロ-リエの間で戦わされた通商同盟論争の分析が重要であるが、これは来年度以降の課題に残されている。
転写制御の異常と細胞の増殖・分化

転写制御の異常は細胞周期制御の破綻を導き、時には、癌化を誘導すると考えられているが、不明な点が多い。本研究では、「転写因子の活性制御機構及び、転写因子の異常によって生じる細胞機能の破綻を分子レベルで解明する」ことを目指す。特にNFκB活性化のがん化における役割、TRAF6によるNFκB活性化シグナル伝達機構及びTRAF6シグナルによる細胞増殖・分化の誘導機構の解明を目的として今年度は以下の結果を得た。1)HTLV-1 Taxタンパク質によるNFκB活性化にK63型ユビキチン付加酵素Ubc13およびTAK1活性化は必要ない。従ってTaxはIL-1やLPS等のシグナルとは異なる機構でIKKを活性化する。また、HTLV-1感染細胞ではTax依存的NFκB活性化とTax非依存的かっ恒常的NFκB活性化の両者が起こっている。2)TRAF6による細胞増殖機構に関与する考えられるDRG1とDRG2を同定した。さらにDRG1とDRG2の発現量をユビキチン化反応の阻害により維持する特異的結合タンパク質DFRP1とDFRP2を同定した。3)TRAF6がTLR3以外のTLRの下流で必須な役割を果たしていることを明らかにした。またTRAF6欠損により胸腺上皮細胞の分化不全が起こりその結果自己抗体が産生されることを示した。即ちTRAF6によるNFκBの活性化が自然免疫と獲得免疫において重要な役割を果たし、がん免疫に必須であることが明らかとなった。1 TRAF6欠損細胞にTRAF6変異体を発現させ、TRAF6の生理的な機能領域を同定した。N端側にあるRING finger及び5つの中の最初のZn fingerはNFκB活性化に必須でなかった。しかし、この領域はMAPK活性化に関与した。またNFκB活性化においてLPSの場合2と3番目のZn fingerを必要としたが、IL-1は4と5番目を必要とした。本結果は、TRAF6がZn結合領域中に複数の機能部位を有し、その部位により複数の下流タンパク質にシグナルを伝達することを示唆する。2本GTP結合タンパク質をCEGA(conserved ERA like GTPase)と命名した。リコンビナントCEGAタンパク質は、GTP及びRNAと結合した。またGTP結合部位への点変異導入により細胞死誘導活性が観察された。即ち、CEGAはシグナル依存性にGDP/GTP交換反応を行い細胞死誘導シグナルを伝達すると考えられる。3 WT1はGATA-1との結合を介して、GATA依存性転写を協調的に促進すると同時に血球分化を制御するFOG-1の転写抑制作用を無効にした。今後はGATA-WT1の融合遺伝子を用いて、細胞増殖と分化への影響および標的遺伝子の検索を行う。4 PEBP2β-SMMHCキメラ蛋白及び正常PEBP2β蛋自の局在を白血病細胞を用いて解析した結果、細胞膜と核の両画分に存在した。キメラ蛋白・PEBP2β蛋白のパートナーであり、DNA結合能のあるAML1蛋白は、核のみに分布した。キメラ蛋白とAML1蛋白の一部が、核マトリックスで共局在することを蛍光抗体法により確認した。従ってキメラ蛋白によるPEBP2依存性転写の脱制御は核内の事象と考えられる。一方細胞膜でキメラ蛋白は、細胞骨格系に関わると考えられる。TRAF6によるシグナル伝達機構及び細胞増殖・分化の誘導機構の解明を目的として以下の結果を得た。2)TRAF6のRing Fingerを介するシグナル依存的なTRAF6自身のユビキチン化によるTAK1の活性化及びIKKの活性化を示した。さらにはTRAF6のRingfingerでなくZinc fingerを介したIKKの活性化を示した。3)GFP変異体融合TRAF6を作製し、TRAF6欠損細胞に発現させることにより、刺激依存的なTRAF6の挙動を可視的に解析する系を確立した。4)TRAF6欠損マウスでは、毛包及び体毛の分化抑制、汗腺の欠損及び皮脂腺の分化抑制が観察された。即ちTRAF6欠損マウスは無汗性外胚葉形成不全症であった。本研究では、「転写因子の活性制御機構及び、転写因子の異常によって生じる細胞機能の破綻を分子レベルで解明する」ことを目的とする。特に我々が同定したシグナル伝達因子TRAF6によって活性化される転写因子NFκBとAP-1の制御機構及びその異常によって誘導される細胞増殖・分化の破綻に焦点を絞る。以下の結果を得た。1)昨年度同定したTRAF6結合分子TIFAは過剰発現系でIRAK-1と結合し、さらにTRAF6とIRAK-1の結合を顕著に促進した。一方、内在性TIFAはTRAF6と恒常的に結合しているのに対してIRAK-1とはIL-1刺激依存的に結合した。即ちTIFAはIL-1シグナルにおけるTRAF6とIRAK-1のリンカータンパク質であることが明らかとなった。2)TRAF6欠損マウスで見られる神経管閉管不全や胸腺の構築異常の原因を解明するためアフリカツメガエルを用いて初期胚発生におけるTRAF6とTIFAの発現を解析した。両遺伝子ともに神経胚初期の段階からmRNAの発現がはじまり、以降の段階で発現量が増加していた。Whole mount in situ hybridizationの結果、TRAF6は尾芽胚において咽頭弓、頭部の周辺部および脊髄で発現していた。

咽頭弓は胸腺原基を形成する部位であるのでTRAF6欠損マウスにおける胸腺の構築異常の原因解明につながると考えられる。3)TRAF6の活性化と分解に関わるユビキチン化にTRAF6がE3ユビキチンリガーゼとして働くことを明らかにした。本研究では、「転写因子の活性制御機構及び、転写因子の異常によって生じる細胞機能の破綻を分子レベルで解明する」ことを目的とする。特に我々が同定したシグナル伝達因子TRAF6によって活性化される転写因子NFκBとAP-1の制御機構及びその異常によって誘導される細胞増殖・分化の破綻に焦点を絞り、以下の結果を得た。1)昨年度同定したTRAF6活性化タンパク質TIFAの関連タンパク質TIFABを同定した。TIFABはTRAF6とは結合せずTIFAと結合し、TIFAによるNFκB活性化を抑制した。TIFABとTIFAの発現が同様の臓器特異性を示すことから両者が同一のシグナルにおいて正と負の制御を担っていると考えられた。2)CD40とRANKは同程度にNFκB, MAPKsを活性化し、その活性化はTRAF6に依存する。しかし、RANKは破骨細胞形成をTRAF6依存的に誘導するがCD40にはその活性は無い。その原因についてCD40/RANKキメラ受容体を用いて解析しRANKがTRAF6依存的にNFAT2を誘導するのに対してCD40では同程度のNFκB, MAPKs活性化が起こる条件でもNFAT2の誘導が起こらないことを示した。3)TRAF6のRINGfingerのアミノ酸置換変異体(T6Rm)をTRAF6欠損細胞に発現させ検討した結果、in vivoにおいてもTRAF6がそのRING fingerを介してE3として機能しシグナルを伝達することが明らかとなった。転写制御の異常は細胞周期制御の破綻を導き、時には、癌化を誘導すると考えられているが、不明な点が多い。本研究では、「転写因子の活性制御機構及び、転写因子の異常によって生じる細胞機能の破綻を分子レベルで解明する」ことを目指す。特にNFκB活性化のがん化における役割、TRAF6によるNFκB活性化シグナル伝達機構及びTRAF6シグナルによる細胞増殖・分化の誘導機構の解明を目的として今年度は以下の結果を得た。1)HTLV-1 Taxタンパク質によるNFκB活性化にK63型ユビキチン付加酵素Ubc13およびTAK1活性化は必要ない。従ってTaxはIL-1やLPS等のシグナルとは異なる機構でIKKを活性化する。また、HTLV-1感染細胞ではTax依存的NFκB活性化とTax非依存的かっ恒常的NFκB活性化の両者が起こっている。2)TRAF6による細胞増殖機構に関与する考えられるDRG1とDRG2を同定した。さらにDRG1とDRG2の発現量をユビキチン化反応の阻害により維持する特異的結合タンパク質DFRP1とDFRP2を同定した。3)TRAF6がTLR3以外のTLRの下流で必須な役割を果たしていることを明らかにした。またTRAF6欠損により胸腺上皮細胞の分化不全が起こりその結果自己抗体が産生されることを示した。