hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
比較ゲノム解析のための情報変換モデルの構築と計算手法の開発

複数種のゲノム配列から保存領域を高速に検出するシステムMurasakiを開発した.次にMurasakiを並列化するために,クラスターマシンと呼ばれる数十から数百,数千のCPUを並列に同時に動かすことのできる計算機を用いて,ヒトゲノム比較などの非常に大きな仕事を多数のCPUに分散して手分けして処理する仕組みを開発した.その結果,ヒト,チンパンジー,アカゲザル,マウス,ラット,ドッグなどを含む哺乳類8種のゲノムを丸ごと比較解析することが達成された.複数種のゲノム配列から保存領域を高速に検出するシステムMurasakiを開発した.次にMurasakiを並列化するために,クラスターマシンと呼ばれる数十から数百,数千のCPUを並列に同時に動かすことのできる計算機を用いて,ヒトゲノム比較などの非常に大きな仕事を多数のCPUに分散して手分けして処理する仕組みを開発した.その結果,ヒト,チンパンジー,アカゲザル,マウス,ラット,ドッグなどを含む哺乳類8種のゲノムを丸ごと比較解析することが達成された.複数種のゲノム配列から正確にシンテニーブロックを同定する2つの新しい方法を開発した.新しい手法により信頼性の高いシンテニー領域を同定することが可能であるか検証するために,この手法をバクテリアゲノムに適用して考察を行った.1つの方法は,ゲノム距離(再編成に基づく距離)と分子進化距離の無矛盾性から妥当なパラメータ値を求める方法である.もう一つの方法は,機能アノテーション情報を用いてパラメータ値を決定する方法である.それぞれの手法に対して,酵母,マイコバクテリアにおける複数種のゲノムを用いて計算機解析実験を行った.この研究結果は,バイオインフォマティクスの国際会議(BIOINFO2005)において発表を行う.一方,比較ゲノムの手法を用いて非コードRNA領域を探索・発見するアルゴリズムの開発も行った.一般に,配列比較を行うためのアライメントの精度を向上させるためには,精度の高いアライメントアルゴリズムの設計と信頼度の高いスコア行列の計算が必要とされる.とくに,RNA配列の2次構造を考慮した構造的アライメントにおいては,塩基間のスコアだけでなく,塩基の相補的ペア間のスコアを必要とするという従来のアライメントにはない特徴がある.今までは,非常にアドホックなスコア行列を用いていたが,この問題を解決するために,条件付き確率場を用いて信頼度の非常に高いスコア行列を計算する方法を開発した.そして,すでに構造的アライメントが行われているRNA配列のデータベースから訓練データを取得して,本手法を適用することにより既存の提案されているどのスコア行列よりも信頼度の高いスコア行列を計算することに成功した.これらの研究成果は,Bioinformaticsの国際学術誌に発表した.複数種のゲノム配列から保存領域を高速に検出するシステムMurasakiの最新バージョンの性能評価を行った結果,マイコバクテリア5種のゲノム比較において,複数種のゲノム比較が可能な唯一の既存システムであるMauveと同精度のアンカーを検出することができた.さらに,酵母と糸状菌のゲノム比較,ヒト,マウス,ラットの3種のすべての染色体のゲノム比較を行ない,有意な結果を得ることができた.各計算時間は,マイコバクテリアの比較において2種で22秒,3種で42秒,5種で3時間,酵母と糸状菌で90秒,ヒト,マウス,ラットの染色体の比較で12分,という結果が得られた.ヒトなどの高等生物の複数種のゲノム比較を計算できる既存のシステムは存在しないため(Mauveは微生物ゲノムの大きさまでが適用の限界である.また,Pattern HunterやBLASTZなどは2種間のゲノム比較のみ適用可能である.),Murasakiの性能評価結果は非常によいものと言える.さらに,アンカーの出現頻度を用いた統計的解析の実験をヒトとマウス,酵母と糸状菌に対して試みたところ,いずれの解析においても,配列パターンの出現頻度はスケールフリーとなることが分かり,このスケールフリー性はランダム配列には現れないことから,そこに言語的構造が存在することが判明した.また,出現頻度に基づく単語の重み付けという統計言語的解析手法を適用して,アンカーの重要度を計算したところ,ノイズの効率的な除去が可能となり,さらに逆位などのゲノム再編成構造が明確に検出されるようになった.また,Murasakiによって計算したアンカーを可視化するためのインタラクティブなツールIGMVの開発も行った.GMVは,配列およびアンカーの情報に加えて,GenBankやGFF(Gene Feature Format)といったファイルからのアノテーション情報や発現プロファイルを重ねて表示することができる.比較ゲノムシステムMurasakiの並列化とそれによってヒトを含む霊長類ゲノムの3種比較を全染色体丸ごと比較することが可能になった.比較ゲノムシステムMurasakiは従来のシステムに比べて優れた性能を発揮したが,1 CPUを使った計算では残念ながらヒトの一本の染色体の大きさまでが比較の限界であった.そこで,24本の染色体全部を丸ごと比較することができるようにするために,クラスターマシンと呼ばれる数十から数百,数千のCPUを並列に同時に動かすことのできる計算機を用いて,ヒトゲノム比較などの非常に大きな仕事を多数のCPUに分散して手分けして処理する仕組みを開発した.多数のCPUを用いることにより高速化されると同時に,使用できるメモリの容量が増えることにより高スケール化できたことが最大のポイントである.

次に, Murasakiにより検出されたアンカーからシンテニー領域を計算するアルゴリズムを開発して,それに基づいて哺乳類ゲノムのゲノム再編成解析を行った.ヒト,チンパンジー,アカゲザル,イヌ,マウス,ラット,オポッサムの7種に対して再編成に基づく系統樹を計算した.再編成に基づく進化系統樹は,霊長目と食肉目のクレイドに対して,げっ歯目は遠縁であることを示した.一方,機能性RNAの解析のための新たなアルゴリズムやシステムの開発も積極的に行った.サポートベクターマシンを用いて機能性RNA配列の識別と探索を行うために,新しくカーネル関数を設計して,RNAファミリーの識別に関する計算機実験を行い,さらにこの手法を適用して線虫ゲノム上のsnoRNAを網羅的に予測した.比較ゲノムシステムMurasakiの並列化によってヒトを含む哺乳類ゲノム5種比較を全染色体丸ごと比較することが可能になった.さらに, Murasakiの最後の課題であったマルチプルアライメントを計算するアルゴリズムは,ギャップ無し局所的マルチプルアライメントを計算するところまでシステムに組み込むことができた.アライメントを計算するアルゴリズムの概要は以下の通りである:(1)従来のMurasakiの機能により多種間に保存されたアンカーを検出する,(2)BLASTスコア関数を用いてアンカー領域を拡張する,(3)オーバーラップする領域を結合する,(4)(2)と(3)をスコアが閾値より低くならない限り繰り返す, (5)最終的に計算された最長領域をギャップ無し局所的マルチプルアライメントとする,一方,機能性RNAの解析のための新しいアルゴリズムの開発では, RNA2次構造の与えられたエネルギーモデルと,予測に適した評価尺度に対して,理論的に予測精度が最大となる予測手法を開発した.構造既知のRNAによる計算機実験では, 1本のRNA配列からの2次構造予測, RNA配列群からの2次構造予測のどちらにおいても,既存のどの手法よりも精度が高いことが実証された,さらに,次世代シークエンサーを用いたショートリードからの微生物ゲノムの比較ゲノムアセンブリにMurasakiを適用する実験を行った.対象としたのは,ゲノムが未解読である納豆菌ゲノムの配列決定で,枯草菌ゲノム配列をテンプレートとした.解析の手順は, Solexaを用いた納豆菌ゲノムのショートリードから,既存のアセンブリプログラムVelvetによりコンティグを生成して, Murasakiによりコンティグを枯草菌ゲノムに整列させた.複数種のゲノム配列から保存領域を高速に検出するシステムMurasakiを並列化するために,クラスターマシンと呼ばれる数十から数百,数千のCPUを並列に同時に動かすことのできる計算機を用いて,ヒトゲノム比較などの非常に大きな仕事を多数のCPUに分散して手分けして処理する仕組みを開発した.その結果,ヒト,チンパンジー,アカゲザル,マウス,ラット,ドッグなどを含む哺乳類9種のゲノムを丸ごと比較解析することが達成された.次に,Murasakiにより検出されたアンカーからシンテニー領域を計算するアルゴリズムを開発して,それに基づいて哺乳類ゲノムのゲノム再編成解析を行った.
^<99m>Tc-MIBIによる抗癌剤感受性の評価の研究

化学療法に対する多剤耐性の機序は複雑で様々なメカニズムが考えられ、その一つに腫瘍細胞の細胞膜に存在するmulti-drug resistance(MDR)の関与が示唆されている。^<99m>Tc-MIBIはMDRで排泄される薬剤の一つとされ、^<99m>Tc-MIBIを用いたシンチグラムで集積の低いものはMDRの機能が亢進していると考えられ、ある種の抗癌剤に耐性を示すものと推察される。その一方で,verapamilなどのカルシウム拮抗薬に多剤耐性克服薬剤としての作用が報告されている。多剤耐性腫瘍に耐性克服薬剤を用いて、^<99m>Tc-MIBIの腫瘍細胞への取り込みの変化を観察し、耐性克服薬剤の影響をin vitroで検討を行った。方法はヒト由来の癌細胞であるSNB19を用い抗癌剤であるvincristineの存在下で培養を行い、耐性株を樹立した。Reverse transcriptase polymerase chain reaction法を用いて、MDRの発現の有無を調べたところ、耐性細胞はMDRが発現し、親株であるSNB19細胞はMDRの発現は確認されなかった。次に上記細胞内への^<99m>Tc-MIBIの取り込みをautowell scintillation counterで調べた。SNB19感受性細胞への^<99m>Tc-MIBIの取り込みは10分の反応で7%で、60分で12%とほぼプラトーに達した。これに対し耐性細胞では、^<99m>Tc-MIBIの細胞への取り込みは5%で感受性細胞に比べ低値を示した。verapamilを加えた検討では、SNB19感受性細胞では^<99m>Tc-MIBIの細胞への取り込みはverapamil添加前後で変化はなかったが、耐性細胞では30分頃より^<99m>Tc-MIBIの細胞への取り込みが亢進し90分では感受性細胞とほぼ同様の取り込みを示した。以上の結果より、^<99m>Tc-MIBIの細胞内への取り込みはMDR発現の有無を反映し、更に多剤耐性克服薬剤を用いることで耐性克服薬剤の影響を同時に調べる事が可能と推察された。化学療法に対する多剤耐性の機序は複雑で様々なメカニズムが考えられ,その一つに腫瘍細胞の細胞膜に存在するmulti-drug resistance(MDR)やMRP(MDR-related protein)の関与が示唆されている。^<99m>Tc-MIBIもMDRやMRPで排泄される薬剤の一つとされ,^<99m>Tc-MIBIを用いたシンチグラムで集積程度の低いものはMDRやMRPの機能が亢進していると考えられ,ある種の抗癌剤に耐性を示すものと推察される。その一方で,ベラパミールなどのカルシウム拮抗薬やシクロスポリンなどの免疫抑制剤に多剤耐性克服薬剤としての作用があることが報告されている。つまり,多剤耐性克服薬剤はMDRやMRPに直接作用し,耐性細胞において亢進した抗癌剤の細胞内からの排出を阻害するものである。そこで多剤耐性腫瘍細胞において多剤耐性克服薬剤を用いて,^<99m>Tc-MIBIの腫瘍への取り込みの変化を観察し,耐性克服薬剤の影響をin vitroで検討を行う事を目的とした。今後はこの耐性株群と親株群に^<99m>Tc-MIBIを添加し、インキュベートの後well counterでそれぞれの群のカウント数を調べ、更にベラパミールやシクロスポリンなどの多剤耐性克服薬剤を添加し、再度^<99m>Tc-MIBIを加えそれぞれの群のカウント数を調べ、前述の結果と比較検討する。

verapamilを加えた検討では、SNB19感受性細胞では^<99m>Tc-MIBIの細胞への取り込みはverapamil添加前後で変化はなかったが、耐性細胞では30分頃より^<99m>Tc-MIBIの細胞への取り込みが亢進し90分では感受性細胞とほぼ同様の取り込みを示した。以上の結果より、^<99m>Tc-MIBIの細胞内への取り込みはMDR発現の有無を反映し、更に多剤耐性克服薬剤を用いることで耐性克服薬剤の影響を同時に調べる事が可能と推察された。
ハイスループット化疾患iPS病態解析による睡眠時ブラキシズムの発症メカニズム解明

申請者らはこれまで睡眠時ブラキシズム(SB)とセロトニン2A(5-HT2A)受容体遺伝子の一塩基多型(SNP)との関連を報告し,細胞レベルでのSB発症メカニズム解明を目標として,患者およびコントロール各3名より樹立したiPS細胞より5-HT2A受容体遺伝子を発現する神経細胞の誘導法を確立した.本研究ではSNPによる機能的差異の解明を目的に,iPS細胞樹立と神経分化誘導,表現型解析を96-wellのプレート上で高効率に可能とするハイスループットなシステムを用い,患者・コントロール各100検体を対象に表現型の異常を解析・データベース化し,臨床データを参照して分類し,さらにそのデータベースを用いてSB表現型の回復を指標とした化合物スクリーニングを行なって新規薬剤の臨床応用を目指すものである.平成30年度は,睡眠ポリグラフ(PSG)検査による確定診断とSNPの遺伝子型解析により決定された睡眠時ブラキシズム患者およびコントロールのiPS細胞から神経細胞に誘導を行なった.Shhにて背腹軸, CHIR99021にて前後軸を調整し,三叉神経関連領域である後脳腹側領域へと誘導領域を調整した.分化過程における遺伝子発現をqRT-PCRにて確認し,誘導された神経細胞に対し,抗5-HT2A受容体抗体を用いた免疫染色による確認を行った.ホールセルパッチクランプ法を用いて,これらの神経細胞の電気刺激への応答(電位記録モード),TCB-2(5-HT2A受容体選択的アゴニスト)投与時の応答(電流記録モード)を観察した.目的とする神経細胞(培養38日目)の測定を行なった結果,脱分極性パルスに対する連続発火が認められ,また,TCB-2(80μM)を投与したところ,内向き電流の発生が認められた.さらに,ハイスループットな解析に向けて,被験者の募集を開始できるよう,環境を整備した.活動電位の発生を確認できており,現在,検体数を増やして解析を試みており,その結果により生理学的パラメータを決定するところまで進んでいる.また,ハイスループットなシステムを用いた解析に向けて,被験者の募集を開始している.被験者を募集し,睡眠時ブラキシズムの確定診断を行なっていく予定である.また,神経細胞の応答の解析を継続して行い,その電気生理学的パラメーターの検出を試み,ハイスループットな解析に着手する予定である.申請者らはこれまで睡眠時ブラキシズム(SB)とセロトニン2A(5-HT2A)受容体遺伝子の一塩基多型(SNP)との関連を報告し,細胞レベルでのSB発症メカニズム解明を目標として,患者およびコントロール各3名より樹立したiPS細胞より5-HT2A受容体遺伝子を発現する神経細胞の誘導法を確立し,特定の歯科疾患に関連するiPS細胞樹立に世界で初めて成功している.本研究ではSNPによる機能的差異の解明を目的に,iPS細胞樹立と神経分化誘導,表現型解析を96-wellのプレート上で高効率に可能とするハイスループットなシステムを用い,患者・コントロール各100検体を対象に表現型の異常を解析・データベース化し,臨床データを参照して分類し,さらにそのデータベースを用いてSB表現型の回復を指標とした化合物スクリーニングを行なって新規薬剤の臨床応用を目指すものである.平成29年度は,睡眠ポリグラフ(PSG)検査による確定診断とSNPの遺伝子型解析により決定された睡眠時ブラキシズム患者およびコントロール各3名のiPS細胞から神経細胞に誘導を行なった.さらに,Venusを挿入したレポーターレンチウイルスを導入して,5-HT2Aポジティブな神経細胞を可視化させた.神経細胞に対してはパッチクランプ解析を行なった.目的とする5-HT2A受容体発現神経細胞の細胞膜にパッチ電極をマイクロマニピュレータを用いて接触させ,繰り返し活動電位を誘発して膜電位の測定を行なった結果,単一刺激で誘発される膜電位と繰り返し刺激に対する膜電位の変化を測定し,生体の神経細胞と同様の反応性が認められた.さらに,ハイスループットな解析に向けて,被験者の募集を開始できるよう,環境を整えた.パッチクランプ法を行なって,生体と同様の活動電位の発生を確認できている.また,ハイスループットなシステムを用いた解析に向けて,被験者の募集を開始できるように,申請者の所属機関における倫理審査委員会での申請を行っており,あとは承認を待つのみである.申請者らはこれまで睡眠時ブラキシズム(SB)とセロトニン2A(5-HT2A)受容体遺伝子の一塩基多型(SNP)との関連を報告し,細胞レベルでのSB発症メカニズム解明を目標として,患者およびコントロール各3名より樹立したiPS細胞より5-HT2A受容体遺伝子を発現する神経細胞の誘導法を確立した.本研究ではSNPによる機能的差異の解明を目的に,iPS細胞樹立と神経分化誘導,表現型解析を96-wellのプレート上で高効率に可能とするハイスループットなシステムを用い,患者・コントロール各100検体を対象に表現型の異常を解析・データベース化し,臨床データを参照して分類し,さらにそのデータベースを用いてSB表現型の回復を指標とした化合物スクリーニングを行なって新規薬剤の臨床応用を目指すものである.

平成30年度は,睡眠ポリグラフ(PSG)検査による確定診断とSNPの遺伝子型解析により決定された睡眠時ブラキシズム患者およびコントロールのiPS細胞から神経細胞に誘導を行なった.Shhにて背腹軸, CHIR99021にて前後軸を調整し,三叉神経関連領域である後脳腹側領域へと誘導領域を調整した.分化過程における遺伝子発現をqRT-PCRにて確認し,誘導された神経細胞に対し,抗5-HT2A受容体抗体を用いた免疫染色による確認を行った.ホールセルパッチクランプ法を用いて,これらの神経細胞の電気刺激への応答(電位記録モード),TCB-2(5-HT2A受容体選択的アゴニスト)投与時の応答(電流記録モード)を観察した.目的とする神経細胞(培養38日目)の測定を行なった結果,脱分極性パルスに対する連続発火が認められ,また,TCB-2(80μM)を投与したところ,内向き電流の発生が認められた.さらに,ハイスループットな解析に向けて,被験者の募集を開始できるよう,環境を整備した.活動電位の発生を確認できており,現在,検体数を増やして解析を試みており,その結果により生理学的パラメータを決定するところまで進んでいる.また,ハイスループットなシステムを用いた解析に向けて,被験者の募集を開始している.パッチクランプ法を継続して行い,ハイスループットな解析に向けて,その電気生理学的パラメーターの検出を試みていく.さらに,被験者を募集し,睡眠時ブラキシズムの確定診断を行なっていく予定である.被験者を募集し,睡眠時ブラキシズムの確定診断を行なっていく予定である.また,神経細胞の応答の解析を継続して行い,その電気生理学的パラメーターの検出を試み,ハイスループットな解析に着手する予定である.
Wntシグナル活性を指標としたプロテオゲノミクス探索解析による骨形成促進薬の開発

本研究では、ゲノム編集酵素による遺伝子発現活性化(Crispr-A)ライブラリーにより発現した遺伝子機能を、Wntシグナル活性依存性の薬剤感受性レポーターシステムで評価することで、骨形成制御因子を同定する。また、Wntシグナルによるタンパク質リン酸化、活性化の量的変化を、リン酸化タンパク質量分析法とマルチインヒビター固相化ビーズを用いた活性化タンパク質捕獲質量分析法により調べ、骨形成制御因子を探索する。本研究では、未知のリン酸化部位、タンパク修飾、相互作用を明らかにする。従って本研究は、我々のWntシグナル伝達への理解が大きく変わる可能性のある重要かつ挑戦的な研究であると考える。
消化器外科領域における自己生体素材を用いた再生医療の開発

成体由来の幹細胞のうち脂肪由来幹細胞(Adipose Derived Stem Cells;ADSC)は比較的採取が容易で魅力的である。近年では多分化能、血管新生効果などが報告され、すでに肝・腎などの再生、心筋梗塞の治療、形成外科領域などで応用されているが、消化器外科手術領域ではまだ報告がない。消化器外科手術領域における感染性合併症には、死腔が原因と考えられるものは少なからず存在し、死腔が原因であるがゆえに治療に難渋する症例も多い、今回、腹腔内の死腔をマウスモデルで作成し、脂肪による充填を行い、組織構築における脂肪由来幹細胞の効果を検討した。C57BL/6Jマウスのソケイ部の反下脂肪を摘出しコラゲナーゼによる処理にてADSCを採取し、10日間培養した。フローサイトメトリーにて血管固有のマーカーであるCD31の発現を確認した。10週齢のオスのC57BL/6Jマウスに対し、精巣周囲の脂肪組織を摘出し、死腔モデルとした。摘出した脂肪片を死腔に充填し、PBSに浮遊させた1×10^6個のADSCを腹腔内投与する群(ADSC群)と、PBSのみ腹腔内投与する群(PBS群)を比較検討した。移植後3,7,14,21日目にマウスを犠死させ,下記の検討を行った。(1)移植片生着重量,(2)H&E染色による充填組織像,(3)CD31による免疫染色による血管密度評価,(4)摘出組織より抽出したtotal RNAの定量PCRによる血管新生因子VEGF。フローサイトメトリーにおいて、脂肪由来幹細胞にCD31陽性細胞が約7%に存在した。充填物重量は3、7日目では両群間に有意差を認めなかったか、14,21日目ではADSC群において有意に死填物重量が大きかった。またH&E染色においてPBS群は出血梗塞単を多数認めた。CD31抗体を用いた免疫組織染色において、400倍視野におけるCD31陽性細胞数を計測すると、3,7,14日目においてADSC群か有意に多かった。移植片より抽出したtotal RNAを用いたPCRでは血管新生因子であるVEGFは3、7日目において、ADSC群において有意に多かった。以上より腹腔囚における遊離脂肪片生着に対してADSCの共移植は有効な手段であると考えられた。『消化器外科領域における自己生体素材を用いた再生医療の開発』を行うに当たり、細胞材料とその足場の開発が必要と考えている。本年をこの2つの因子のうちの細胞材料の検討期間と位置づけ、その採取法の確立と安定化を目的に研究を行った。計画書において、生体材料の候補として脂肪由来幹細胞(ADSC)、皮膚幹細胞、頬粘膜細胞、大腸上皮細胞を列挙した。このうち細胞数の確保が見込め、生体にとって比較的低侵襲に採取可能と考えられる皮下組織からのADSC採取を第一候補と考えた。実際確立した手技は以下のとおりである。採取の対象としてBL6マウス(C57BL/6J,10週齢,オス)を選択した。皮膚切開を加え、皮下脂肪を採取する。採取された皮下脂肪をコラゲナーゼや物理的な消化を加えたのち、70μmセルストレイナーを通してselectionを行う。こうすることで1匹あたり、5x10^6個の細胞成分が得られ、その生存率は85%であった。これを胞培養用のdishに播種し、翌日にはその12%の細胞がADSC様の細胞として観察された。採取した細胞は初代培養から7日おきの継代を行い、最大14代まで継代を確認した。われわれが得た細胞が他の報告と遜色がないことを確認するために、1代目、4代目、8代目にてフローサイトメトリーにて表面抗原の解析を行った。結果Sca1陽性,CD44陽性,CD45陰性,CD31陰性であり、既存の報告と同様であった。

フローサイトメトリーにおいて、脂肪由来幹細胞にCD31陽性細胞が約7%に存在した。充填物重量は3、7日目では両群間に有意差を認めなかったか、14,21日目ではADSC群において有意に死填物重量が大きかった。またH&E染色においてPBS群は出血梗塞単を多数認めた。CD31抗体を用いた免疫組織染色において、400倍視野におけるCD31陽性細胞数を計測すると、3,7,14日目においてADSC群か有意に多かった。移植片より抽出したtotal RNAを用いたPCRでは血管新生因子であるVEGFは3、7日目において、ADSC群において有意に多かった。以上より腹腔囚における遊離脂肪片生着に対してADSCの共移植は有効な手段であると考えられた。
ヒト臼歯歯冠内の詳細構造のサイズと非計測学的歯冠形質による集団間比較

南太平洋フィジー共和国・ビティレブ島・首都スバの住民(男性53名,女性52名,1119歳)と日本人(男性54名,女性50名,1824歳)の上顎歯列石膏模型の上顎右側第一小臼歯をデジタルノギスで計測した。計測項目は頬側咬頭および舌側咬頭の近遠心・頬舌径,咬頭頂間距離,歯冠頬舌径で,計測値から各咬頭の面積を算出した。その結果,日本人はフィジー住民に比べて以下の特徴が認められた。1歯冠全体の大きさの縮小,2舌側咬頭の大きさの縮小(頬側咬頭は両集団で大きな違いは認められなかった),3頬舌径に対する相対的な咬頭頂間距離は両集団でほぼ同じ。集団間の違いが頬側咬頭より舌側咬頭で顕著であったことから日本人とフィジー住民は小臼歯の機能に違いがある可能性が示唆された。台湾先住民ヤミ族(男性88個体,女性74個体)の石膏模型上で上・下顎第一大臼歯の計測を行い,すでに報告した日本人および台湾在住の中国人のデータと比較した。計測項目は上顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径および4つの咬頭の咬頭径,下顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径,トリゴニッドとタロニッドの各近遠心径である。これらの計測値から歯冠指数および歯冠面積を算出し,さらに,上顎大臼歯では各咬頭の相対的なサイズ,下顎大臼歯ではトリゴニッドとタロニッドの比率を算出した。その結果,3集団は全体的に大きな違いはなかったが,歯全体の大きさは日本人>中国人>ヤミ族の順であった。集団間の違いは上顎では頬舌径,下顎では近遠心径に顕著であった。上顎ではパラコーン径に集団間の違いがみられなかった。下顎ではヤミ族のタロニッド,中国人のトリゴニッドが他の2集団より小さい傾向があった。以上より,集団間の違いは発生の早い近心の構造より発生の遅い遠心の構造に認められる傾向があったことが示された。小臼歯に関しては,南太平洋フィジー人および日本人の第一小臼歯のデジタルノギスでの計測が終ったが,第二小臼歯の計測は完了していない。遅れている原因は教育等の日常業務に追われて計測の時間が確保できず,データがなかなか増やせなかったからである。効率良く計測を行えば遅れは取り戻せると考える。大臼歯に関しては,台湾先住民ヤミ族の計測が一通り終了したが,計測の信頼度を算出するための計測が十分なサンプル数に達しなかった。代表的な資料の写真撮影を優先したために計測時間が確保できなかったからである。写真記録がしっかりできて,計測値の評価に自信が持てるようになったことは今回の調査の大きな成果である。したがって,研究全体の遅れとは言えないかもしれない。小臼歯に関しては非計測学的形質の観察は可能であれば同時に行うが,第二小臼歯の計測を優先事項として計測データの充実に努める予定である。大臼歯に関してはおおむね予定通りの進捗であるが,計測の信頼度の検証が出来ていない。そこで,最初に計測の信頼度を検証するための計測を再度行う予定である。次に台湾先住民のアミ族,ブヌン族の計測を行う予定である。台湾先住民の模型を保有する長崎大学に出張できる時期は学生教育がない夏期休暇に限られるが,次年度は春の連休の補填のために夏期休暇が短くなる。このため,出張期間を短縮せざるを得ず,効率良く計測する必要があると思われる。計画をチェックして全体の進捗に影響の出ないように万全を期すつもりである。また,長崎大学の共同研究者(真鍋・小山田)との意見交換も十分に行う予定である。南太平洋フィジー共和国・ビティレブ島・首都スバの中高生(1119歳:男性53名)の上顎歯列石膏模型の上顎右側第一・第二小臼歯をデジタルノギスで計測した。さらに退化指数により第一・第二小臼歯間の比較を行った。その結果,第二小臼歯では以下の退化傾向が認められた。1歯冠全体の大きさの縮小,2頬側咬頭の大きさの縮小(舌側咬頭の大きさは第一小臼歯と第二小臼歯で変わらなかった),3咬頭頂間距離の接近。これらの退化傾向は従来の観察を主体とする研究でも指摘されてきたことではあるが,数値として結果を提示できたことは意義深いと考える。また,第一小臼歯は前歯と臼歯の間に位置する歯であることから第一・第二小臼歯間の違いは前歯と臼歯の調整機能に関係していると考えられる。台湾先住民ヤミ族(男性88個体,女性74個体)の石膏模型上で上・下顎第一大臼歯の計測を行い,すでに報告した日本人データと比較した。計測項目は上顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径および4つの咬頭の咬頭径,下顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径,トリゴニッドとタロニッドの各近遠心・頬舌径である。

これらの計測値から歯冠指数および歯冠面積を算出し,さらに,上顎大臼歯では各咬頭の相対的なサイズ,下顎大臼歯ではトリゴニッドとタロニッドそれぞれの面積,タロニッドの全面積に占める割合を算出した。その結果,ヤミ族の歯は日本人と大きな違いはないが,上顎ではメタコーンが,下顎ではタロニッドが絶対的にも相対的にも日本人より小さいことが分かった。以上の結果より,ヤミ族の歯は日本人とほぼ同じ大きさではあるが,遠心部の退化傾向が強いことが明らかとなった。小臼歯に関しては,南太平洋フィジー人(男性)におけるデジタルノギスでの計測が終ったが,女性の計測は完了していない。今後は写真上での計測に切り替える予定であるが,そのためには計測の信頼度を見極める必要がある。そこで,次年度は日本人の上顎第一小臼歯および第二小臼歯の写真上での計測およびデジタルノギスによる計測を行って,両者の計測誤差を算出する。写真上での計測方法が確立できれば,時間的に制約を受ける長崎大学での計測もスムーズに進むものと思われる。遅れている原因は計測に時間がかかり,データがなかなか増やせないからである。計測方法を確立することで遅れは取り戻せると考える。大臼歯に関しては,台湾先住民ヤミ族の計測が一通り終了したが,計測の信頼度の算出がまだ出来ていない。これは十分な時間的な間隔を空けて計測を2回行うことが出来なかったからである。南太平洋フィジー共和国・ビティレブ島・首都スバの住民(男性53名,女性52名,1119歳)と日本人(男性54名,女性50名,1824歳)の上顎歯列石膏模型の上顎右側第一小臼歯をデジタルノギスで計測した。計測項目は頬側咬頭および舌側咬頭の近遠心・頬舌径,咬頭頂間距離,歯冠頬舌径で,計測値から各咬頭の面積を算出した。その結果,日本人はフィジー住民に比べて以下の特徴が認められた。1歯冠全体の大きさの縮小,2舌側咬頭の大きさの縮小(頬側咬頭は両集団で大きな違いは認められなかった),3頬舌径に対する相対的な咬頭頂間距離は両集団でほぼ同じ。集団間の違いが頬側咬頭より舌側咬頭で顕著であったことから日本人とフィジー住民は小臼歯の機能に違いがある可能性が示唆された。台湾先住民ヤミ族(男性88個体,女性74個体)の石膏模型上で上・下顎第一大臼歯の計測を行い,すでに報告した日本人および台湾在住の中国人のデータと比較した。計測項目は上顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径および4つの咬頭の咬頭径,下顎大臼歯では歯冠近遠心・頬舌径,トリゴニッドとタロニッドの各近遠心径である。これらの計測値から歯冠指数および歯冠面積を算出し,さらに,上顎大臼歯では各咬頭の相対的なサイズ,下顎大臼歯ではトリゴニッドとタロニッドの比率を算出した。その結果,3集団は全体的に大きな違いはなかったが,歯全体の大きさは日本人>中国人>ヤミ族の順であった。集団間の違いは上顎では頬舌径,下顎では近遠心径に顕著であった。上顎ではパラコーン径に集団間の違いがみられなかった。下顎ではヤミ族のタロニッド,中国人のトリゴニッドが他の2集団より小さい傾向があった。以上より,集団間の違いは発生の早い近心の構造より発生の遅い遠心の構造に認められる傾向があったことが示された。小臼歯に関しては,南太平洋フィジー人および日本人の第一小臼歯のデジタルノギスでの計測が終ったが,第二小臼歯の計測は完了していない。遅れている原因は教育等の日常業務に追われて計測の時間が確保できず,データがなかなか増やせなかったからである。効率良く計測を行えば遅れは取り戻せると考える。大臼歯に関しては,台湾先住民ヤミ族の計測が一通り終了したが,計測の信頼度を算出するための計測が十分なサンプル数に達しなかった。代表的な資料の写真撮影を優先したために計測時間が確保できなかったからである。写真記録がしっかりできて,計測値の評価に自信が持てるようになったことは今回の調査の大きな成果である。したがって,研究全体の遅れとは言えないかもしれない。
強磁性金属と有機分子を用いた複合デバイスにおける電気磁気効果の研究

本研究は金属界面を有機分子により修飾することにより大きな電気磁気効果の実証を目指すものである。金属界面を有機分子で修飾することにより金属の表面電子状態をさせ、大きな電気磁気効果の発現を目指す。金属/分子接合を持つデバイスの作製及び特性の評価と、理論計算による結果を組み合わせ、大きな電気磁気効果の実現が期待できる金属と分子の組み合わせを提案する。そして提案した構造のデバイスを実際に作製し大きな電気磁気効果の実現を目指す。
大腸癌血管新生阻害薬の効果予測を可能にするバイオマーカーの網羅的探索

進行大腸癌に対して抗VEGF抗体薬bevacizumab(Bmab)を投与する際の、治療効果予測バイオマーカー(BM)を探索した。まず、Bmab投与前後のVEGF血中濃度を測定したところ、治療後のBmab非結合VEGFは治療抵抗群で有意に高かった。一方、治療前のサイトカイン・ケモカイン全48項目を網羅的に解析したところ、IL-10, VEGFの血中濃度は治療抵抗群で有意に高く、これらサイトカインが高い症例は生命予後も不良であった。また、ヒト血管内皮細胞培養系でVEGF刺激によって発現が亢進・抑制するmiRNAを研究期間内に選別したので、今後これらが治療効果予測BMとして有用か否か検討する。本研究は、bebacizumab(以下Bmabと略)療法を受ける再発・難治大腸癌患者を対象とし、以下の4アスペクトから構成されている。1)Vebacizumab(以下Bmabと略)投与患者における血中Bmab-unconjugated freeVEGFの測定、2)VEGFシグナルによって発現が亢進する血管内皮細胞特異的microRNA(以下miRNAと略)の解析、3)治療開始前の血中サイトカイン、血管新生因子の網羅的解析、4)VEGF以外の血管新生因子の同定。これらの各アスペクトを遂行するために、研究初年度であるH27年度においては、1再発・難治大腸癌患者のBmab治療前後の血液検体、臨床データの収集、2VEGF等のサイトカイン、血管新生因子のアッセイ法の確立、3VEFG刺激によって発現量が変動するmiRNAの同定、を行った。以下、それぞれについて概略を述べる。1再発・難治大腸癌患者のBmab治療前後の血液検体、臨床データの収集再発・難治大腸癌患者でBmab投与を受ける症例を中心に、臨床データと治療前後(Bmab投与6Mまで)の血清サンプルを収集した。今日まで、約25例の症例の集積が終了した。これらのサンプルは上記のアスペクト1)3)4)において使用予定である。2VEGF測定のためのELISAおよびサイトカイン、血管新生因子網羅的解析のためのBioPlexによるアッセイ系の確立が終了した。3血管内皮細胞(HUVEC)をVEGF欠乏下でO/N培養した後にVEGFを加え、VEGFを添加する前後のHUVECを回収し、miRNAを精製した。これらmiRNAを網羅的に解析し、VEGF添加の前後で5倍以上の発現上昇または低下を来した12のmiRNAを見出した。研究遂行上の障害はなく、予定どおりに研究は進んでいる。本研究はbevacizumab(Bmab)投与を受けた再発・進行大腸がんを対象として、Bmabの有効性を治療開始前または開始後早期に予測することが可能なbiomarkerの発見、実臨床に応用可能な検査法の確立を目的として企画された。平成27ー28年度においては、1Bmab血中濃度およびBmab-unconjugated VEGF血中濃度、2治療開始前のサイトカイン血中濃度が、治療効果予測のbiomarkerになり得るかという観点から、大腸がん患者約30例の検証実験を行ったが、これらの中にbiomarker候補として有力なものを見出すことは出来なかった。平成28年度半ばからは、3血中microRNAをtargetとした検討を開始している。具体的には、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)培養系にVEGFを添加したときに著しく増加または減少したmicroRNAを候補とし、これらのmicroRNAが実際に大腸癌患者において健常人と比較して血中濃度が上昇もしくは低下していないか、これらのmicroRNAがBmab治療に際しての治療効果予測のbiomarkerになり得るかという点の検討に着手している。現在までに、HUVEC培養実験の結果をもとに候補となる10のmicroRNAの選定が終了している。これらが、実際の患者でBmab治療効果推定のためのbiomarkerになり得るかを平成29年度の主たる研究課題としている。研究遂行上の問題はなく、概ね順調に進んでいる。再発・難治大腸癌に対して血管新生阻害薬である抗VEGF抗体薬bevacizumab (Bmab)を投与する際の、治療効果予測バイオマーカー(BM)開発を目指して以下の仮説に基づいて研究を遂行した。仮説1)Bmab投与後において、Bmab非結合のfreeVEGFの血中濃度が高いとBmabの臨床的効果は認められない。2)Bmab投与前の患者血中サイトカイン、血管新生因子を網羅的に解析することによって、Bmabの効果予測BMを見いだすことができる。3)VEGFによる血管新生が癌の発育に関与している症例では、VEGFが血管内皮細胞に作用し細胞内情報伝達系が作動するので、血管内皮細胞活性化に関連する一連のmicroRNA(miRNA)が放出される。各仮説に関する検討結果を以下に記載する。1)Bmab投与後1M、2MのfreeVEGF血中濃度はnon-responderではresponderに比較して有意に高い。一方、Bmab投与前のVEGF血中濃度と治療効果には関連性はなかった。2)化学療法導入前の血中サイトカイン、血管新生因子、全34項目をBio-Plexを用いて網羅的に解析したところ、IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, VEGFが抽出された。これらのうち、IL-10, VEGF血中濃度の高い症例ではBmabを含む一次治療の継続期間が短い傾向にあり、また全生存期間も短かった。

3)血管内皮細胞を培養し、VEGF刺激によって培養上清に放出されるmiRNAを回収し、VEGF添加前後の発現量が10倍以上上昇または低下するmiRNA(各8つおよび4つのmiRNA)を抽出した。これらのmiRNAがBmabの効果予測BMになるか否かを、患者検体を用いて現在検討中である。進行大腸癌に対して抗VEGF抗体薬bevacizumab(Bmab)を投与する際の、治療効果予測バイオマーカー(BM)を探索した。まず、Bmab投与前後のVEGF血中濃度を測定したところ、治療後のBmab非結合VEGFは治療抵抗群で有意に高かった。一方、治療前のサイトカイン・ケモカイン全48項目を網羅的に解析したところ、IL-10, VEGFの血中濃度は治療抵抗群で有意に高く、これらサイトカインが高い症例は生命予後も不良であった。また、ヒト血管内皮細胞培養系でVEGF刺激によって発現が亢進・抑制するmiRNAを研究期間内に選別したので、今後これらが治療効果予測BMとして有用か否か検討する。引き続きbebacizumab(以下Bmabと略)療法を受ける再発・難治大腸癌患者の血液サンプル、臨床データを集積する。これらのサンプルを材料として、以下の測定に着手する。1.治療前後のサイトカイン、血管新生因子の網羅的測定2.治療前後のVEGFおよびBmab-freeVEGF血中濃度の測定3.治療前後の候補miRNAの変動の測定平成29年度が本研究プロジェクトの最終年度にあたるので、「研究実績の概要」に記載した10のmicroRNAが、Bmabの治療効果予測のbiomarkerとなり得るか否かを明らかにし、publicationを目指す。腫瘍内科学
ラット心移植におけるアロ抗原継続投与法および有茎大網被覆による免疫寛容の試み

1)あらかじめF344ラットからリンパ球分離液及び冷却遠心機にて分離したドナーリンパ球を用い、A.コントロール群(移植のみ)、B.移植前7日目1回のみ注入群、C.移植前1週間継続注入群、D.移植前後1週間継続注入群の4群にWKAラットを分類し(B群はドナーリンパ球1×10^8個、C,D群は共に毎日それぞれ1×10^8個注入)それぞれに対してF344ラットをドナーWKAラットをレシピエントとする腹腔内異所性心移植を施行した。正着日数はA:9.6日±2.7 B:16.7日±3.2C:12.8日±2.6D:10.4日±2.3とB群で最も延長したが、他のC群、D群ではむしろ正着期間は減少傾向にあった。2)異所性心移植において有茎大網被覆の効果をみるため移植心の周囲を有茎大網で被覆した群を作成し、移植後毎日移植心の拍動を触診し生着日数を調べたが、無処置群9.6日±2.7に比べ、有茎大網被覆では10.1日±2.5と生存期間に有意差を認めなかった。3)上記1、2について各群で移植後10日目に犠死せしめ無菌下に脾臓からリンパ球を分離し、^3H-チミジンを用いたリンパ球混合試験や、^<51>Crを用いた細胞障害性Tリンパ球試験を施行したが、各群間に統計学的有意差は認めなかった。
歯の萌出不全マウスを用いた異所性骨形成促進機構の解析

破骨細胞の分化障害が認められるop/opマウスにおいては,BMP誘導性の異所性骨形成の著明な亢進を示している。また,これらの異所性骨には形態学的異常が観察されたことより,骨形成の際に出現する破骨細胞が正常な骨の形態形成に重要な役割を果たしていることが示され、破骨細胞の存在の重要性がさらに深まった。局所性の骨吸収亢進が認められる歯周疾患や口蓋裂等における骨欠損症例に対して、骨誘導因子(BMP)を移植することにより骨組織の補填を行う試みも進行している。そこで、破骨細胞の骨形成における役割を明らかにすることを目的に,歯の萌出不全を呈する大理石骨病マウスであるM-CSF遺伝子欠損マウス(op/op)を用いて、破骨細胞が存在しない条件におけるBMP誘導性の骨形成についての検討を行った。4週齢雄のop/opマウスと正常マウス(C57BL/6J)の背筋筋膜下にrhBMP-2含有コラーゲンペレットを埋入し、異所性骨形成を誘導した。その結果、BMP誘導性の異所性骨形成(骨密度)はop/opマウスにおいて正常マウスと比較して,約3倍の促進が認められた。また、op/opマウスにおける異所性骨の外面は大変粗雑な形態を呈していた。以上の結果は破骨細胞が存在しないop/opマウスにおいては,BMP誘導性の異所性骨形成の著明な亢進を示している。骨吸収を司る破骨細胞の分化と機能は、骨芽細胞により厳格に調節されていることが破骨細胞分化因子(RANKL)の発見により明らかとなった。骨組織は、破壊と吸収が繰り返されている動的組織であり、このリモデリングを通して骨組織は一生涯絶えず作り替えられている。本研究においては、破骨細胞分化障害または破骨細胞による骨吸収機能障害により歯の萌出が認められない大理石骨病マウスに対する異所性骨形成を促す為に、骨誘導因子(BMP)を移植することにより、骨形成における破骨細胞の役割解明を目指すものである。平成19年度は、破骨細胞分化の部位を決定する因子を同定することを目標として次の実験結果を得た。大理石骨病を呈するRANKL欠損マウスおよびc-Fos欠損マウス(破骨細胞分化に必要な転写因子c-fos遺伝子が欠損したマウス)は、TRAP陽性の破骨細胞が全く存在しない。そこで、これらのマウスの脛骨におけるQOPの局在を、免疫組織染色にて調べた。(1)RANKL欠損マウスにおいて、骨組織に沿った場所にのみRANKとc-Fmsダブル陽性細胞(QOP)が認められた。このことにより、QOPへの分化と骨組織への局在には、RANKLは必要ないことが示唆された。(2)c-Fos欠損マウスにはRANKとc-Fmsダブル陽性細胞(QOP)は認められなかった。このことにより、c-fos遺伝子は、破骨細胞前駆細胞からQOPへの分化、もしくはQOPの骨組織の定着に必要である可能性が示唆された。【目的】局所性の骨吸収の亢進が認められる歯周疾患や口蓋裂等における骨欠損症例に対して、骨誘導因子(BMP)を移植することにより骨組織の補填を行う試みも進行している。そこで、破骨細胞の骨形成における役割を明らかにすることを目的に,大理石骨病マウスであるM-CSF遺伝子欠損マウス(op/op)を用いて、破骨細胞がほとんど存在しない条件におけるBMP誘導性の骨形成についての検討を行った。【結果】4週齢雄のop/opマウスと正常マウス(C57BL/6J)の背筋筋膜下にrhBMP-2含有コラーゲンペレットを埋入し、異所性骨形成を誘導した。【結論】以上の結果は破骨細胞の分化障害が認められるop/opマウスにおいては,BMP誘導性の異所性骨形成の著明な亢進を示している。
再生可能エネルギー技術移転による日越韓台持続可能社会実現ロードマップ策定国際研究

本研究は、日本政府が進めていたベトナムへの原発輸出に関する基礎情報を収集し、福島原発事故の課題をベトナムに伝え、国際協力のもと両国のエネルギー政策の在り方を提示するものである。本研究遂行上、台湾台南市に建設計画が進んでいた、再生可能エネルギー「グリーンエネパーク」の現状を視察し、台湾における再生可能エネルギー促進政策を、ベトナムに紹介・導入することを目的の一つとした。2018年5月21日から24日にかけて科研費研究メンバーは、現地視察を実施し、最新の研究動向を得た。また、台南嘉義市が再生可能エネルギーを市長を先頭に推進している動向も把握し、科研費研究課題の最新動向を得ることができた。当初計画では、日本政府が計画していたベトナム・ニントゥアン地区への原発輸出計画に対して、2011年の福島原発事故による被害の現状、原発事故の原因、健康被害、技術者養成、避難計画の点などを考慮し、いかにその教訓を生かすことができるかを日越両政府に提示することを目指した。その結果、ベトナム国会議員、政府指導者、ベトナムホアセン大学、ホーチミン自然科学大学、ホーチミン市地理学研究所、ホーチミン市文化大学、オープンユニバーシティなどの研究機関と十二分な研究交流を実施することができた。今後は、再生可能エネルギー導入促進での国際協力を進めることが求められている。ベトナムは2016年に新たな電力供給計画「PDP7A」を発表した。この計画では、2030年をめどに原子力発電比率を10パーセントほどに高める計画であったが、2016年のベトナム国会の原発導入計画白紙撤回決議によって、再度の更新が求められている。そもそも2030年をめどとした、PDP7Aでは、石炭火力発電を2015年比約3.5倍まで比重を高める計画であり、さらにベトナムが歴史的に依存してきた水力発電比率を半分以下とするものである。COP23で示された、ベトナムのCO2削減目標達成にも重大な影響をおよぼしかねない。ベトナムで今求められることは、2000kmにもおよぶ海岸線、ラオス・カンボジア国境の山間地など地形を生かした、太陽光発電、風力発電、小水力、バイオマス発電の本格的充実整備である。同時に再生可能エネルギー導入は、地域住民が主体となり再生可能エネルギー施設を計画、建設、維持補修をすることで地域に雇用を生み出し、貧困解消の手段となるものである。その際、福島県、日本が進める再生可能エネルギー技術の移転は重要な国際貢献となる。今後の研究の推進策はこれらの再生可能エネルギー技術国際移転をどのように進めるかを課題としたい。
X連鎖重症複合免疫不全症に対するキメラ二重鎖切断酵素を利用した遺伝子治療法の開発

X-SCIDは先天的にT細胞、NK細胞が欠損し、B細胞は抗体を産生できないため、重症な感染症を発症し、乳児期に死亡する致死的疾患である。一般的な治療法は骨髄移植であるが、HLA一致同胞ドナーが存在しない場合の予後は不良である。このためフランスで遺伝子治療が開始された。その結果、遺伝子治療の有効性が示された一方で、レトロウイルスベクターの挿入変異による白血病が報告された。このため、安全性を高めた遺伝子治療の開発が急務となった。そこで我々は生体内に元来備わっている遺伝子相同組み換えによる遺伝子治療法の開発を計画した。一般的に相同組換え効率はきわめて低いが、DNA二重鎖切断部位で組換え効率が上がることが示された。目的とする遺伝子をZnフィンガーで認識させ、そのZnフィンガーと結合させた非特異的二重鎖切断酵素で切断し、組み換えを促進する方法を考えた。コンピュータ解析でγc鎖エクソン5に見出したZnフィンガー結合可能領域をターゲットとしたZnフィンガー開発を試みたが、うまくいかなかった。そこで、昨年度、同様の実験手法で成果をあげたと報告のあった、米国加州Sangamo社のMichael Holmes博士と連絡を取ったが、特許の関係もあり、共同実験は実現しなかった。このため、安全性を高めた遺伝子治療法開発の実験手法を変更し、我々がこれまで研究を進めてきた発がんした場合でもがん細胞を特異的に排除できる自殺遺伝子HSVtkを用いた治療法を応用することとした。具体的にはγc鎖とHSVtkの融合蛋白を発現するベクターを開発した。このベクターの特徴は二つの遺伝子が常に同時に発現でき、これまでのように一方の遺伝子発現のみが不活化される危険性を排除したものであり、理想的な治療法となることが期待できる。X連鎖重症複合免疫不全症は先天的にT細胞及びNK細胞が欠損し、B細胞も抗体産生できず、重篤な感染症のために乳児期に死亡する致死的疾患である。このため骨髄移植を施行されるが、HLA一致同胞が存在しない場合の予後は不良で、これらの患者を対象に遺伝子治療が開始された。しかし、フランスで遺伝子治療を受けた10例のうち3例でレトロウイルスベクターの挿入変異による白血病が発症した。この副作用を克服する方法の一つとして生体内に備わった遺伝子相同組み換えを利用する方法があげられる。しかし、組み換え効率は極めて低く約100万個の細胞に1個の割合である。一方で、二重鎖DNAが切断された部位で組み換え効率が上がることがわかった。それらの応用として、目的とする遺伝子をZnフィンガーで認識させ、非特異的二重鎖切断酵素で切断し、組み換えを促進する方法が考えられる。コンピューター解析でγc鎖遺伝子にはエクソン5にZnフィンガー結合可能領域TCC___TGC___CTC___ACAGGAG___CTG___TTG___TGが存在することを見いだした。この配列はエクソン5にあることから、遺伝子組み換え効率を確認するにはまず、エクソン5に変異を持つ患者さんの細胞を用いて実験することが望ましい。このため我々がこれまでに解析した41家系のXSCID患者のうちエクソン5に変異を持つ患者の末梢血単核球細胞からEBウイルスでB細胞株を樹立した。目的の遺伝子を認識させる方法として特定の遺伝子領域に結合するZnフィンガーを発現するプラスミド作成を試みたが、うまくいかないため、今年度途中に同様の実験で成果を上げたと報告のあった米国加州SangamoのMichael Holmes博士と連絡をとり現在研究を進めている。今後このエクソン5に結合するZnフィンガーキメラ二重鎖切断酵素でどの範囲まで遺伝子修復が可能であるか患者細胞を用い実証する予定である。

このベクターの特徴は二つの遺伝子が常に同時に発現でき、これまでのように一方の遺伝子発現のみが不活化される危険性を排除したものであり、理想的な治療法となることが期待できる。