hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バクテリオファージを用いた畜産環境中バンコマイシン耐性腸球菌の殺滅

バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)は、ヒトに敗血症などを引き起こす薬剤耐性菌として、世界的に注目される。VREが出現した原因として、畜産環境における抗生物質の多用が指摘されており、畜産環境からの検出報告も実際にある。本研究では、バクテリオファージを用いて、畜産環境中のVREを防除することを目的として、本年度はバクテリオファージの単離と溶菌能力の評価を行った。まず、臨床由来株Enterococcus faeciumを東北大学大学院医学研究科より入手した。各耐性遺伝子特異的プライマー(vanA, vanB, vanC)を用いてコロニーPCRを行った結果、同株がvanA保有型のバンコマイシン耐性腸球菌であることを確認した。東北大学大学院農学研究科附属フィールド教育研究センター内から環境試料として、牛ふん101試料、牛ふん堆積場の液汁2試料、堆積コンポスト1試料、側溝の水1試料、ラグーン水1試料を採取し、これをバクテリオファージ分離源としてプラークアッセイを行い、同分離株を溶菌できるバクテリオファージの単離を探索した。これにより、プラーク形状が異なる2種類のバクテリオファージ(A、B株)を単離した。透過電子顕微鏡による観察により、A、B株の形状は類似しており、頭部は多面体様の構造を持ち、その直径は150nm前後、尾部の長さは50nm前後であった。尾部繊維は両者とも認められなかった。600nmの波長の吸光度測定により、A、B株のVRE株の増殖阻害を評価した結果、両株とも10^5個の添加で、VREの増殖は抑えられた。さらに、10^8個のファージを添加することにより、10^310^4 cells/ml程度のVREを3時間以内にほぼ溶菌した。したがって、本研究で単離したVRE溶菌性バクテリオファージがVRE殺滅に有効であることが示された。
保健師の健康危機管理能力向上のためのＩＣＴ活用教材と教育プログラムの開発・評価

【研究背景および研究目的】虐待対策、災害対策など不安定な社会情勢とともに健康危機管理が保健師に益々期待されているが、保健師学生は、実習で実践場面に遭遇することは極めて難しく、演習などで具体的な実践能力の習得につなげることが教育的課題である。また、新人保健師にとっても、健康危機管理に関する実践活動経験がほぼ皆無と想定される。そこで、(1)現場で求められる健康危機管理能力向上を目指したICT活用教材と教育・研修プログラムを開発する、(2)保健師学生及び新人保健師や健康危機管理初任者を対象に教育・研修プログラムを実施し、健康危機管理のイメージ化及び実践能力の習得度に関する評価を行う、ことを本研究目的とする。特に今年度は、その研究プロセスのうち、実践の専門家エキスパートの意見の合意をもって、健康危機管理に関する実践能力を精選することを目的とした。なお、この調査の結果を基に、保健師学生および新人保健師を対象にしたICT活用教材を視聴する前後の主たる評価指標とする。【今年度の研究成果】「健康危機管理に関する平時の行動レベルの能力」に関する文献検討を研究メンバーとともに十数回行った、主に、類似した実践能力項目の洗い出し、項目の表現や用語の整合性についての検討を重ねた。その後、エキスパート9名による1回のノミナルテクニック調査および2回のデルファイ調査を行った。その結果、「新人保健師(市町村所属)・2年目終了時に到達が求められるレベルとしての健康危機管理に関する平時の行動レベルの能力」について、17項目に集約され、各項目に対する同意率は66.7%100%となった。同意率の低かった項目および「新人保健師(市町村所属)・2年目終了時」に到達が求められるレベルとしては達成が難しいとエキスパートからの意見があった項目については、研究メンバーと検討し、数項目において能力表現の修正を行った。今年度の計画通り、調査を実施でき、健康危機管理能力の選定ができた。また、次年度に向けての防災に関するICT動画制作に関する概要の検討を行うことができた。次年度2019年度は「防災に関する健康危機管理能力」に関する動画制作を予定している。2018年度に行った「健康危機管理能力」の選定を基に、これらの能力を意識化できるような場面設定を計画している。また、最終年度の2020年度に向けて、2017年度に制作した「母子健康手帳交付時場面の動画」と併せて、新人保健師および保健師学生を対象とした調査を行うための対象施設への依頼も必要であると考えている。「地域健康危機管理ガイドライン(平成13年3月)」で示されていることからも、健康危機管理に対応する保健師の社会的要請およびその重要性は窺い知れる。それ以降の大規模な健康危機の発生(東日本大震災、鳥インフルエンザなど)、あるいは終焉が想起できない健康危機管理(新聞ニュースで報道が途切れない虐待など)によって、更に保健師への期待度は高まっているといえる。しかしながら、健康危機管理に関する実践能力について明確化されているとは言い切れない。そこでまず、健康危機管理に関する実践能力について文献検討を行なった。医学中央雑誌をデータベースとし、「健康危機管理」および「能力」で検索した結果、26件の文献が抽出された。これらの文献に加えて、「地域健康危機管理ガイドライン」で示されている内容を国の指針として重要であると捉えて、参照した。保健師経験を有する研究者3名で、7回にわたるディスカッションを通して、検討を行った。なお、平時の取り組みの重要性に焦点を当てたICT活用教材の制作の視聴前後の評価指標として用いることを想定しているため、文献検討時にも平時の取り組みに必要とされる実践能力であることを選択要件とした。検討の結果、25項目がピックアップされた。行為レベルで評価できるように、また新人期の中でも2年目終了時での到達が望ましいレベルを想定し、文言の表現に修正を加えた。今後は、これら25項目をベースとし、エキスパートによるノミナルグループテクニックを用いて、健康危機管理能力の精選を行う予定である。そして、その結果を用いて、ICT活用教材の視聴前後の自己評価を調査する計画をしている。文献検討に十分に時間をかけ、検討することができたが、当初の計画とは異なり、ICT教材製作後の評価指標を検討することが必要になったため。

その結果、「新人保健師(市町村所属)・2年目終了時に到達が求められるレベルとしての健康危機管理に関する平時の行動レベルの能力」について、17項目に集約され、各項目に対する同意率は66.7%100%となった。同意率の低かった項目および「新人保健師(市町村所属)・2年目終了時」に到達が求められるレベルとしては達成が難しいとエキスパートからの意見があった項目については、研究メンバーと検討し、数項目において能力表現の修正を行った。今年度の計画通り、調査を実施でき、健康危機管理能力の選定ができた。また、次年度に向けての防災に関するICT動画制作に関する概要の検討を行うことができた。計画当初には、健康危機管理に関する活動領域(子ども虐待、防災対策、感染症対策)ごとに、各年に制作を行なう予定であった。しかしながら、評価指標を明確化する必要が生じたこと、ICT制作業者の選定および確定後の打合せ・調整などに想定以上の時間を要すること、という理由から、子ども虐待と防災対策に絞ることに変更する計画である。子ども虐待に関しては、保健師と保護者との最も早い段階の出会いの場面である母子健康手帳の交付場面に着目することにした。保護者の発言や表現などに敏感に気づくことができるか、また、非常に短時間の場面で相手の本音・真意を引き出すための対応や言葉がけは何か、などを考えてもらえるようなICT活用教材を検討したい。防災対策に関しては、望ましい選択肢を回答するごとに、より詳細あるいはより多くの防災に必要な情報や人材ネットワークにたどり着けるようなシュミレーションを検討したい。これらのICT活用教材の制作後、看護系大学および都道府県、市町村の保健師を対象に、協力を依頼し、教材視聴を行ってもらい、その評価を行う計画である。次年度2019年度は「防災に関する健康危機管理能力」に関する動画制作を予定している。2018年度に行った「健康危機管理能力」の選定を基に、これらの能力を意識化できるような場面設定を計画している。また、最終年度の2020年度に向けて、2017年度に制作した「母子健康手帳交付時場面の動画」と併せて、新人保健師および保健師学生を対象とした調査を行うための対象施設への依頼も必要であると考えている。
シトクロムの一酸化窒素高捕捉機能を用いた二酸化窒素汚染好植物の創成

(1)藻類および細菌類のシトクロム遺伝子のラン藻・植物への導入と発現の検討(分担-奥):(i)植物のモデル実験として、宿主-ベクター系が確立されており、培養時間が短いラン藻(Synechocystis6803)に紅藻(Porphyrayezoensis)のシトクロムc_6遺伝子を導入・発現の検討を行った。しかし、シトクロムc_6はタンパク質部分とヘム部分の二成分から構成されているため、その発現は難しく、ラン藻において発現した組換えタンパク質はヘムが結合せず、一酸化窒素捕捉機能を有していないタンパク質であった。今後、タンパク質にヘムを結合させる酵素遺伝子の導入などを行い、種々検討する予定である。(ii)植物は、導入系が最も確立されているタバコを対象とする予定であったが、(i)をさらに検討する必要があったため、植物での発現を検討することが出来なかった。(2)トランスジェニック植物の二酸化窒素汚染好性および高タンパク質含有の検討と評価(分担-奥、西尾):トランスジェニック植物をNO_2ガス雰囲気下におき、野生型とのNO_2汚染好性およびタンパク質含有量を評価する予定であったが、(1)での検討がさらに必要あった為、本課題を検討することが出来なかった。尚、紅藻(Porphyra yezoensis)シトクロムc_6の優れた一酸化窒素捕捉機能を明らかにするために、このタンパク質の立体構造解析を行ったところ、1.57Åという高い解像度で解析することに成功した^<1)>。この構造は「IGDV」のProtein Data Bankcodeで登録され、紅藻由来のタンパク質としては初めての解析例である。この結果より、紅藻(Porphyra yezoensis)シトクロムc_6の高い酸化還元電位は、ヘム周辺に存在する水分子によるものであり、一酸化窒素捕捉に関与する部位は、生体内における電子供与体との相互作用部位である酸性パッチのGlu68であることを立体構造から推定した。今後、部位特異的変異作製法を用い、さらに検討を行う予定である。1.紅藻、緑藻および光合成細菌中の一酸化窒素高補足機能シトクロムの検索、一次構造の決定および高次構造の推定(1)紅藻、ノリ(Porphrya yezoensis):シトクロム(Cyt)f__-を硫安分画法、DEAE-celluloseイオン交換カラムクロマトグラフィー(2段階)およびDEAE-SepharoseF.F.イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、純度(A553/272nm)1.0以上のものを得た。還元型にしたCytf__-は553nm(α帯)、522(β)、416(γ)、322(δ)を示した。アミノ酸分析の結果から85残基であり、脱ヘム核後にプロテイン・シークエンサーにより全配列を決定した結果と一致していた。N末端からの1418番目にはCys-X-Y-Cys-His配列が存在し、典型的なCタイプであることが判った。分子量は9,077Da、等電点は4.27であった。Chou-Fasman法で二次構造を予測したところ、4ヶ所のα-ヘリックス、2ヶ所のβ-シートがみられ、21と54番にターンに関与するGlyが認められた。一酸化窒素捕捉部位と推定される第6配位子のMet-58は疎水性配列部位に存在することが予測された(Kate-Doolittle scale)。(2)緑藻、クロレラ(Chlorella vulgaris):Cyt c_6の精製を検討し、高収率の方法を確立した。そのアミノ酸配列や物理化学的特性は現在検討中である。(3)光合成細菌:培養法とCytの精製法を現在検討中である。2.シトクロム類を用いた亜硝酸還元反応の確立と解明(1)ノリから精製したCyt f__-を用いて、亜硝酸還元反応は、pHは48.5の範囲で酸性側ほど速く、温度は2040°Cの範囲では高温ほど高速であった。反応経路は亜硝酸→一酸化窒素→アンモニアであった。(2)Cytf__-と一酸化窒素の結合は、吸収スペクトルの結果からヘム核の鉄とMet-58であることが判明した。以上のように、初年度の目的はほぼ達成されつつある。1藻類および大腸菌の一酸化窒素高捕捉能シトクロム遺伝子のクローニングとその発現(分担奥) :(1)紅藻(スサビノリ)からmRNAを抽出し、シトクロムc_6の一次構造を基にプライマーを作製し、5'-RACE、3'-RACEにより目的遺伝子を増幅後、サブクローニングを行い、全塩基配列483bpを決定した。シトクロムc_6は葉緑体ゲノムDNAにコードされ、トランジットペプチド25残基、成熟タンパク質85残基から構成されていた。得られたシトクロムc_6のcDNAを大腸菌発現ペクターに挿入し、大腸菌DH5αに形質転換を行い、大腸菌での発現系の確立に成功した。酵母宿主系での発現は、現在検討中である。また、繁殖力の旺盛な緑藻の一酸化窒素捕捉分子を探索する目的で、シトクロムcを単離・精製し、その構造と性質も検討した。(2)細菌類については、高熱性菌Bacillus stearothermophilusや光合成細菌Rhodopseudomonas rutilaのDNAを抽出し、現在PCRによるクローニングを試みている。

2発現シトクロムの一酸化窒素捕捉能の検討(分担西尾) :上記1-(1)で発現したシトクロムc_6を精製し、一次配列分析、物理化学的測定(分子量、等電点)および分光学的測定(紫外・可視吸収スペクトル、CD、ラマンスペクトル)を行った結果、一次、二次構造や配位子の状態はスサビノリ由来シトクロムc_6と一致し、大腸菌内で正確にフォールディングしていることが確認された。また、発現シトクロムは一酸化窒素捕捉能を有していた。これらの結果は、該当年度の目的をほぼ達成している。尚、本研究は真核生物のシトクロムc_6を大腸菌で発現させた最初の成功例である。(1)藻類および細菌類のシトクロム遺伝子のラン藻・植物への導入と発現の検討(分担-奥):(i)植物のモデル実験として、宿主-ベクター系が確立されており、培養時間が短いラン藻(Synechocystis6803)に紅藻(Porphyrayezoensis)のシトクロムc_6遺伝子を導入・発現の検討を行った。しかし、シトクロムc_6はタンパク質部分とヘム部分の二成分から構成されているため、その発現は難しく、ラン藻において発現した組換えタンパク質はヘムが結合せず、一酸化窒素捕捉機能を有していないタンパク質であった。今後、タンパク質にヘムを結合させる酵素遺伝子の導入などを行い、種々検討する予定である。(ii)植物は、導入系が最も確立されているタバコを対象とする予定であったが、(i)をさらに検討する必要があったため、植物での発現を検討することが出来なかった。(2)トランスジェニック植物の二酸化窒素汚染好性および高タンパク質含有の検討と評価(分担-奥、西尾):トランスジェニック植物をNO_2ガス雰囲気下におき、野生型とのNO_2汚染好性およびタンパク質含有量を評価する予定であったが、(1)での検討がさらに必要あった為、本課題を検討することが出来なかった。尚、紅藻(Porphyra yezoensis)シトクロムc_6の優れた一酸化窒素捕捉機能を明らかにするために、このタンパク質の立体構造解析を行ったところ、1.57Åという高い解像度で解析することに成功した^<1)>。この構造は「IGDV」のProtein Data Bankcodeで登録され、紅藻由来のタンパク質としては初めての解析例である。この結果より、紅藻(Porphyra yezoensis)シトクロムc_6の高い酸化還元電位は、ヘム周辺に存在する水分子によるものであり、一酸化窒素捕捉に関与する部位は、生体内における電子供与体との相互作用部位である酸性パッチのGlu68であることを立体構造から推定した。今後、部位特異的変異作製法を用い、さらに検討を行う予定である。
歯のう蝕治療での細菌学的アプローチと再生治療

1.う蝕象牙質中の細菌の有無を培養法とPCR法により比較した.培養法ではう蝕検知液の染色程度が薄くなると細菌の存在が認められなかったが、PCR法では1部細菌の存在が示された。2.嫌気性菌はバイオフィルムの状態で生存することで酸素に対する耐性を高めていることが示唆された。3.ヒト生活歯における初期歯髄炎を歯髄組織学的に検討したところ、単純性炎症と血管の拡張が認められ,窩底には細菌の存在が示された。4.歯髄保存療法(IPC法)を適応した症例に対し、臨床経過に伴った細菌学的検索を行った。う蝕検知液濃染部と象牙質脱灰層を全て除去した場合は、全ての症例で良好な結果が得られた。5.試作クロルヘキシジン含有グラスアイオノマーセメントは、う蝕原性細菌の発育を効果的に阻害することがわかった。濃度1%のクロルヘキシジン二酢酸が、セメントの物性と歯質接着性を適切に保ちつつ、有効な殺菌効果を示す至適材料であることがわかった。6.機能性シランを用いて表面改質を行った審美性修復材料表面に対する口腔内細菌の初期付着性についてin vitroでの検討を行った.審美性修復材料の表面改質にアルコキシシランKBM-7803を用いると、in vitroにおける細菌の初期付着が有為に減少する可能が示唆された。7.セルフエッチングレジン接着システムの象牙質に対する接着強さは、健全>う蝕影響象牙質>感染象牙質の順に高かった。また、脱灰部分が混在した象牙質被着面と、全てが脱灰している被着面では、接着強さが近似していた。8.唾液検査キットのう蝕原性細菌検出能力を、ヒトにおいて比較検討した結果、特異抗体を使用した製品と従来の培養法を使用したもので、同等の検出能力が示された。中沖(北海道大学)は,抜去歯を用いてAMFによる象牙質の耐酸層の観察を試みたが,困難であった.耐酸層の広範囲での観察はレーザー顕微鏡を用いれば可能と思われたので,実施予定である.竹中(新潟大学)は,感染象牙質を各種材料で修復し,細菌数の変化をその生死を含めて検討している.今里(大阪大学)は,グラスアイオノマーセメントにバイグアナイド系抗菌剤(クロルヘキシジン)を配合し,抗菌性グラスアイオノマーを試作した.試作セメントの溶出,抗菌性,物性,硬化時間の特性を評価し,クロルヘキシジンの適正濃度を決定するところまで結果が得られ,現在論文を作成中である.Dental MaterialsかOperative Dentistryに年内投稿予定である.高務(岡山大学)は,作製した試料で接着試験・界面の観察および細菌の侵入程度を観察している.現在,シールドレストレーションの可能性を検討するのが目的で,う蝕象牙質(検知液に濃染する部分)を対象としたシールドレストレーションを行っている.レジンをう蝕に接着させた界面をSEMで観察すると著しく劣化した形態を呈していた.このことからmicro-tensileで引張り試験を行っても接着強さの評価は不可能と思われたため,この試験は行っていない.健全部をある程度残した状態で引張り試験を行えば,接着強さが評価できる可能性がある.池永(大阪歯科大学)は,深在性う蝕罹患歯に暫間修復を行ったときの細菌叢変化を検討するための予備実験を行っている.桃井(鶴見大学)は,慢性う蝕象牙質内の一定体積中のう蝕細菌数を測定したいと思っている.

典型的な慢性根面う蝕の着色部には10^2オーダーの細菌しか存在しないことが予備実験で確認できている.これらの段階としては,臨床的に鑑別診断した根面う蝕にどの程度の細菌叢が存在するか測定する予定である.また,根面着色面にコンポジットレジンを充填し,その接着界面をTEMにて観察した実験では,細菌が明瞭に観察出来なかったため,試片作製法を再検討することとした.野田守:被験者の唾液中の蛋白量を測定し、蛋白量は1.92±0.58mg/mLであり従来の報告とほぼ同程度との結果を得た。中沖靖子:ヒト抜去歯にAQ Bond plusとメタフィルC(いずれもサンメディカル)を充填し、原子間力顕微鏡で充填物辺縁に明確な脱灰領域を観察した。中川寛一:臨床検体のう蝕菌群と、感染歯質中の細菌叢の同定を試み、象牙細管内および歯髄側の象牙質面から種々の形態を有する細菌を検出した。竹中彰治:ヒト健全小臼歯根面にフッ化物徐放性コンポジットレジンを充填し、人工脱灰後、修復物辺縁部を走査型レーザー顕微鏡で測定した。この結果、フッ化物徐放性コンポジットレジンは、修復物辺縁歯質の耐酸性向上に有効であることがwかった。大森かをる・桃井保子:市販の唾液検査キッドDentocult SM, Dentocult LB (Orion), CRT bacteria (Vivadent), CARIO CHECK (Sunstar)およびSaliva Check (GC)の感度と操作性を比較し、各製品間の判定結果には差を認めるが、う蝕リスクのスクリーニングレベルでの正確さには製品間で大きな差は認められなかった.今里聡:1% chlorhexidine diacetate配合グラスアイオノマーセメントの歯質接着性は抗菌剤非配合のコントロールと有意差がないことが明らかとなった。健全象牙質,う蝕影響象牙質ならびにう蝕象牙質に対する微小引張り接着強さもコントロールと有意差はなかった。市販化を考えるとき、本濃度が最も有望であることがわかった。高務朋将:セルフエッチングシステムの引っ張り接着強さは、健全象牙質で43.71±11.70MPa、う蝕影響象牙質で30.6±9.77MPaあった。一方、う蝕感染象牙質では接着強さが弱く(10MPa以下)測定不可能であった。野田:齲蝕検知液による染色の程度と齲蝕象牙質中の細菌の有無につき、培養法,PCR法により比較した.培養では、染色が薄くなると細菌の存在は認められなかったが,PCR法では1部細菌の存在が示される場合もあった.中沖:修復物辺縁部におけるう蝕の進行状況を明らかにするため,原子間力顕微鏡により辺縁部脱灰の進行程度の精査を試みた.重谷:嫌気性菌が、好気的な環境である口腔で生存できるのは、バイオフィルム形成により酸素毒性を免れているからであるとの仮定を検証した。その結果、嫌気性菌はバイオフィルムの状態で生存することで酸素に対する耐性を高めていることが示唆された.池永:昨年度より継続している方法を用い,歯髄保存療法(IPC法)を適応した症例に関して細菌学的考察を行った。症例を選択し、治療のステップスごとに細菌の採取・分離・同定を試み、最終的に4症例における結果が得られた.今里:試作抗菌性グラスアイオノマーの、今後の臨床的評価試験に向け,ヒト抜去う蝕歯を用い,窩底部残存細菌に対する殺菌効果判定の手法を確立した。その果,う蝕除去完了時の窩洞深さを正確に記録し,手用切削器具で最深部の充填物を除去し、窩底部を切削することで残存細菌の回収が可能になることが分かった.
先端シミュレーションで低分子結合が制御するGPCR活性化のメカニズムを探る

リガンドの結合によるGタンパク質共役受容体(GPCR)の活性化からGPCRとの結合により活性化されるGタンパク質が解離するに至るまでのメカニズムを、PaCS-MD/MSMなどの最先端のシミュレーション法で明らかにする。まずリガンドがGPCRへ結合・解離する過程をシミュレーションで可視化・定量化し、次にリガンド結合が誘起するGPCRの構造変化とそのメカニズムを解析し、更にGタンパク質のGPCRへの結合と解離・活性化・GPCRからの解離の過程をシミュレーションで再現する。すべての結果を統合して、活性化のメカニズムを分子レベルで明らかにし、GPCRに共通するシグナル伝達原理の解明を目指す。
感染により誘発されるリンパ節高内皮細静脈の機能変換とその獲得免疫成立における意義

【目的】高内皮細静脈(high endothelial venule:HEV)はリンパ球ホーミングを制御する特殊な小静脈で、獲得免疫の成立に必須の役割をになう。本研究では、感染に対する獲得免疫成立過程におけるHEVを介するリンパ球ホーミングの分子機構を明らかにすることを目的として、HEVに発現するケモカインとケモカイン結合分子について以下の解析を行った。【方法と結果】1:HEVに発現するケモカインCXCL13/BLCによるB細胞ホーミングの制御:リンパ節およびパイエル板HEVは、B細胞に作用するCXCL13を特異的に発現することを見いだした。遺伝子欠損マウスを用いた解析から、CXCL13欠損パイエル板では、B細胞のHEVへの接着が特異的に障害されており、これはCXCL13蛋白質の再構成により回復すること、およびCXCL13欠損リンパ節へのB細胞ホーミングが有意に障害されていることが示された。これらの結果から、CXCL13がB細胞のHEVへの接着制御を通じてB細胞のホーミングに重要な役割を担うことが示された。2:HEVに発現するケモカイン結合分子によるケモカインの活性と空間配置の制御:HEVに発現するケモカイン結合分子のうち、DARC(Duffy antigen receptors for chemokines)は主としてHEV管腔面に分布し、CXCL1,CXCL5,およびCCL2などの炎症性ケモカインを結合してその活性を負に制御するscavenger受容体として機能することが示唆された。一方、mac25/angiomodulin(AGM)はHEVの基底膜に濃縮して存在し、CCL21およびCXCL10の活性を保持した状態で捕捉し、ケモカイン提示分子として機能することが示された。さらに、HEVの近傍に分布する細胞外基質成分がケモカイン結合活性を有することを新たに見いだした。【考察】リンパ球ホーミングを司るHEVは、ケモカインのみならず多彩なケモカイン結合分子を発現してケモカインの活性と空間配置を積極的に制御し、効率的なリンパ球ホーミングを可能にする微小環境を構築していると考えられた。
内在性遺伝子発現制御に関わるRNAi関連分子の機能解析

申請者は、精神遅滞を最も高頻度に伴う遺伝性ヒト疾患である脆弱X症候群原因遺伝子FMR1の機能解析を続けてきた。その過程において、FMR1遺伝子が翻訳調節に関与するRNA結合蛋白質をコードすること、さらには、ショウジョウバエFMR1相同蛋白質がRNAi活性中心であるRISC複合体の構成因子Argonauteと結合する事を明らかにした。FMR1遺伝子の機能を探索する上で、RNAi経路に関する新知見を得ることは必須であると考え、RNAi機構分子メカニズムの解析を進めた。基盤(A)によってサポートされた3年間における成果は以下の通りである。ショウジョウバエで恒常的に発現するArgonaute蛋白質(AGO1とAGO2)がそれぞれsiRNA、miRNAと結合する事によって遺伝子発現抑制機構において標的RNA切断nuclease(Slicer)として働くことを分子レベルで明らかにした。ショウジョウバエ抽出液を用いて行うRNAiにはATPは不必要である事を明らかにした。AGO2がsiRNA duplexのunwinding因子であることを明らかにした(以上、Miyoshi et al. Genes & Dev 2005)。生殖細胞特異的に発現するArgonauteの機能に関して研究をすすめ、Piwi、Aub、AGO3がrasiRNAと結合する事によってレトロトランスポゾンの遺伝子発現を抑えること、つまり「ゲノムの品質管理機構」に機能的に寄与することを明らかにした。これらArgonauteの機能が生殖細胞の維持・形成に必須であることが示唆された(Saito et al.Genes & Dev 2006;Gunawardane et al. Science 2007)。ショウジョウバエrasiRNA生合成経路に関するモデルを提唱した(Gunawardane et al. Science 2007)。(成果抜粋)申請者は、精神遅滞を最も高頻度に伴う遺伝性ヒト疾患である脆弱X症候群原因遺伝子FMR1の機能解析を続けてきた。(成果抜粋)2本鎖RNAによる配列特異的遺伝子発現抑制であるRNA interference(RNAi)は、簡便で強力な遺伝子発現阻害法として遺伝子機能の研究に急速に浸透してきた。最近、RNAi関連分子装置が、特異的なmRNAの分解や翻訳抑制、さらにはクロマチン修飾を通して内在の特定遺伝子発現を制御する事によって、個体の発生や分化に関わる事が判ってきた。本研究代表者は、以前、精神遅滞を最も高頻度に伴う遺伝性ヒト疾患である脆弱X症候群原因遺伝子FMR1の機能解析を遂行する研究過程において、FMR1タンパク質が、RNAi活性中心であるRISC複合体のコア構成因子と特異的に結合する事を見出した(GD 16:2497-,2002)。FMR1の機能を正しく理解する上において、新規なRNAi関連分子を探索すること、それら因子の詳細な機能を知ること、そしてRNAiの機構自体を解明する事が必須であると考えている。本研究では、1.RNAi関連分子による遺伝子発現調節機構の解明、2.RNAi関連タンパク質因子が受ける修飾とRNAi反応との相関関係、3.RISC複合体因子の発現が欠損することに起因する特定遺伝子発現動体変化の解析、及び4.RNAi関連分子の遺伝学的相互作用の解析、をサブテーマとして挙げている。本年度の研究実績として、本研究代表者は、ショウジョウバエにおけるAGO1タンパク質はmiRNA機構に必須であり、その一方、AGO1と高い相同性を示すAGO2タンパク質はsiRNA機能(つまりRNAi)において必須であるという様にお互い機能的に分担していることを明らかにした。また、miRNA前駆体から成熟型miRNAを切り出す酵素Dicer1のパートナーとしてLoquaciousというタンパク質が存在すること、また、このタンパク質がDicer1の機能の調節因子である事を明らかにした。脆弱X症候群は最も頻度の高い遺伝性精神遅滞症でありFMR1遺伝子内CGGリピート伸長によるFMR1遺伝子の転写阻害を起因とする。

FMR1はRNA結合蛋白質であり、特定のmRNAを細胞質loci(Stress Granule様)に集積することによってその翻訳抑制を促していると考えられている。翻訳抑制の標的mRNAや分子メカニズムは未だ解明されていない。我々はこれまでに、ショウジョウバエFMR1相同遺伝子(dFMR1)が性行動調節遺伝子lingererと相互作用することを明らかにした。最近、dFMR1及び1ingerer変異体を用いた解析から、dFMR1とlingererの発現の高低によってNMJの形態やbouton数に異常がきたされる事を見出した。現在、その因果関係を分子レベルで解析することを試みている。dFMR1はRNAi因子AGO2とも相互作用する。ヒト細胞において、RNAiやmicroRNAによる遺伝子発現抑制はP-bodyと呼ばれる細胞質lociで起こることが示された。ショウジョウバエ細胞においてもAGO2やlingerer、dFMR1が細胞質中の特定の同一lociに局在する事を明らかにした。これがショウジョウバエStress Granule様lociあるいはP-bodyに相当するか、AGO2やlingerer、dFMR1のlociへの局在がどのような分子メカニズムで起こるか、に関して現在解析を進めている。microRNA経路における必須因子AGO1は、AGO2と共にArgonauteファミリーに属する。AGO1はCG31992タンパク質と相互作用する事を見出した。これら二つのタンパク質は、ショウジョウバエにおけるP-bodyに局在するが、そのメカニズムはAGO2のlociへの局在機構とは異なるという見解を得た。現在、メカニズムの解析を行っている。申請者は、精神遅滞を最も高頻度に伴う遺伝性ヒト疾患である脆弱X症候群原因遺伝子FMR1の機能解析を続けてきた。その過程において、FMR1遺伝子が翻訳調節に関与するRNA結合蛋白質をコードすること、さらには、ショウジョウバエFMR1相同蛋白質がRNAi活性中心であるRIsc複合体の構成因子Argonauteと結合する事を明らかにした。FMR1遺伝子の機能を探索する上で、RNAi経路に関する新知見を得ることは必須であると考え、RNAi機構分子メカニズムの解析を進めた。
解除と危険負担の関係についての基礎理論研究─牽連性に着目した日仏の比較法分析─

わが国民法学の双務契約の牽連性に着目し、フランスの学説・判例を分析して、解除と危険負担が共に牽連性で根拠づけられることを研究した。そして、研究成果を論文として公表した。本稿では、フランスの契約解除規定改正草案を分析して、次の結論を得た。すなわち、従来フランスの解除の基礎理論が担ってきた要件を導き出す機能が逆転し、今後は逆に要件が画定され、そこから基礎理論が考察されるようになるということである。鍵は、「重大な不履行」概念である。わが国の民法(債権法)改正検討委員会が示した解除と危険負担の関係についての方向性(危険負担制度廃止は依然否定されてはいない。)や、フランス民法典債務法改正草案の動向(草案規定趣旨説明では、危険負担理論の解除への組込みが提示された。)に留意して研究を進めたので、進捗状況に遅れを生じ、論説公表には至らなかった。しかし、わが国民法学における解除と危険負担の関係についての研究の到達点の再確認・批判的検討から、以下の知見を得ることはできた。すなわち、わが国民法学が近時に至るまで「牽連性」概念自体に本格的検討を必ずしも加えてこなかったこと、そして、こうした状況の下で解除と危険負担の関係が論じられてきた傾向が見られるとである.その点で、フランス法を比較法の対象とした解除法制・危険負担に関する諸論考には、牽連性の本質に着目して両制度の関係を分析したものが多い(特に、小野秀誠教授の諸論考は牽連性の本質を詳細に検討しており、本報告書作成者は、これらの論考の検討を最優先に行った。)。次に、19世紀末のフランスの学説・判例が、危険負担理論の視角からも民法1184条(法定解除の通則的規定)の位置づけ・要件につき、種々の見解(論理構成)を示していたことを知見として得た.たとえば、1891年4日14日破毀院民事部判決の判旨のなかに、フランスの判例の危険負担理論についての考え方の一端が示されているといった点である。しかし、当該年度はフランス法の分析自体が不充分だったので、その論証が完全だとは言い切れない。この点、分析を急ぎたい、なお、本研究の最終目的は、わが国の法定解除(民法543条の履行不能による解除)と危険負担(債務者主義が採用される危険負担[民法536条1項])、この両制度の一元化が実現する場合、その新たな制度の要件をも見据えた、解釈論レヴェルの議論にも耐え得る基礎理論を構築することにある。民法(債権法)改正検討委員会が2009年10月に危険負担制度廃止を提案したことで、本報告書作成者の研究課題をめぐる問題は、解除一元化へと大きな展開を見せた。また、フランス司法省も2008年7月に契約法改正草案を発表したので(解除に関しては内容的にカタラ草案と大差はない。危険負担についてはなお考究を要する。)、両国の改正動向に留意して研究を進めた結果、進捗状況に遅れを生じた。しかし、新たな知見も得た。まず、危険負担制度廃止論(上掲委員会提案)が解除を牽連性ではなく、重大な不履行という基準で規律し、解除制度の基礎から牽連性を外そうとする点である。また、フランス法では、1934年のボンヌカーズの註釈書で危険負担理論の法的根拠論が展開され、同理論に軸足を置いた解除と危険負担の関係が示されていたという重要な知見を得た。さらに、危険負担問題を解除で処理したとされる1891年4月14日破毀院民事部判決を再検討した結果、リーディング・ケースとしての位置づけに疑問を生じ、現在のフランスの学説が同判決をどのように受止めているか再度分析すべきとの知見を得た。当該年度は、旧民法やボワソナードの学説における解除と危険負担の関係の検討が不充分だったので、その分析を急ぎたい。また、フランス法における不履行、不能、帰責事由概念の考究も不充分と痛感した。これらの分析も拡充して進捗状況の向上を図る。最後に、当該年度研究成果から、両制度一元化には克服すべき課題が多いことを知見として得た。危険負担の債権者主義のみを廃止し、上掲委員会の示す「重大な不履行」概念に惑わされず、危険負担を残す方向で分析を進めるべきである。なお、本研究の最終目的は、日・仏両国での牽連性による解除と危険負担の根拠づけにどのような差異があるかを明らかにし、両制度のあるべき関係を基礎理論レヴェルで提示することにある。法制審議会が公表した議事録を分析した結果、解除と危険負担の関係をめぐる議論は、危険負担存置の方向を強く残すものとの知見を得た。本報告書作成者の研究目的は、わが国における解除と危険負担のあるべき関係を基礎理論レヴェルで解明することである。

だが、フランスでも、債務法・契約法改正草案等が公表され、両制度の関係をめぐる議論は混沌としている。今年度は、債権法改正に留意し、まず、フランスにおける契約解除規定改正草案・試案(いわゆるテレ草案)を分析し、その成果を本報告書裏面記載の立命館法学誌掲載論文として公表した。本稿では、上記分析かち、従来フランス法における解除の法的基礎が担ってきた解除の要件を導き出す機能が逆転し、今後は逆に、解除の要件枠組みが画定され、そこから解除の基礎理論が考察されるようになると結論づけた。今後の鍵は、「重大な不履行」や「送達」といった解除の諸要件といえよう。研究実施計画では、わが国旧民法やボアソナードの学説および19世紀フランスの学説・裁判例の検討を急務としたが、今年度は、両国とも民法改正の議論が加速したので、そのフォローに重点を移した。また、判例評釈も執筆した。本報告書裏面記載の法律時報誌掲載決定判例研究である。本稿では、契約の解除が契約交渉決裂原因となりうることを確認し、この点、危険負担が廃止される場合、興味深い議論の素材を提供するとの知見を得た。また、半田吉信「危険負担制度廃止論批判」千葉大学法学論集25巻2号1頁(2010)に接し、「むしろ危険負担制度を解除権に包摂させると幾多の解釈論上困難な問題が派生し、法適用上の不都合を惹起すると考えられる。」(同55頁)との見解が示され、本研究の目指す、わが国における解除・危険負担両制度のあるべき関係を基礎理論レヴェルで提示することに関して、双務契約の本質論も含めた再検討が必須との知見も得た。
非拘束インタラクションを実現する風力を用いた空中遭遇型力触覚提示に関する研究

平成30年度は、UAV搭載カメラを用いてLSD-SLAMやその他センサ信号を複合的に用いて自己位置推定を行うシステムを構築した。これは、UAVやユーザの位置計測を行うにあたって、外部カメラを用いた場合、作業空間に制限が生じる状況を解決するものであり、これによって、本研究課題が提案する、外部計測装置に寄らない本来の非拘束の空中力触覚提示を初めて実現した。また、力覚と同様に重要な触覚提示を非拘束で実現することを目的とした実験を行った。具体的には、ドローンに硬度の異なる複数のテクスチャ(硬度0、7、15)を取り付け、固定されたプローブの先端に対して、一定の速度でドローンを飛行させ、接触時のテクスチャの変形量をRGB-Dセンサによって計測した。実験の結果、変形量が硬度によって異なることを確認した。一方、ドローンに装着せず、空間に固定したテクスチャを手によって押した場合、最も柔らかい硬度0はドローンに装着した場合と同程度の変形量が観測されたが、硬度7および15においてはドローンに装着した場合に比べて顕著に変形量が増加した。これは、ドローンに装着した場合、力を加えられたときにドローンが十分に力を支えきれずに移動し、変形量が減少したことによると考えられる。結果として、ドローンを用いて硬いテクスチャを提示するためにはより出力の大きなドローンが必要であり、一般的に使用される数百グラム程度の重さのドローンを用いて硬さの違いを提示するためには別の特別な工夫が必要になることが示唆された。力覚提示について、外部計測装置に寄らない非拘束の空中力触覚提示を世界で初めて実現した。加えて、力覚と同様に重要な触覚提示について硬軟感の提示を目的として、異なる硬度の感覚提示を試み、一般的なドローンを用いた場合での提示性能を確かめることができた。これらの成果をそれぞれ国際会議や国内会議で報告した。UAVを用いた粗さ提示および摩擦提示を行う。これにより非拘束での風力を用いた多様な触覚提示を実現することができ、それまでに開発した非拘束での風力を用いた力覚提示と合わせることで、非拘束インタラクションを実現する風力を用いた空中遭遇型力触覚提示の基盤を確立する。物体の硬さや形状などを提示するためには、ユーザに外力を提示する必要がある。外力を提示するためには、その反作用力を環境に逃がす必要があり、一般的にデバイスを床や机に固定することが多い。本研究課題はUAV(Unmanned aerial vehicle、通称ドローン)を用いることで、デバイスを床や机に固定せずに、つまり空間的制約を受けずにユーザに力を提示する方法論である風力を用いた非拘束インタラクションの確立を目的としている。初年度はまずUAVを用いた力覚提示の基礎を確立するために、上下方向ならびに水平方向の1自由度の力覚提示の方法論を開発し、その評価を行った。具体的には、上下方向の1自由度の力提示の可能性を明らかにするため、提示力の範囲や正確性を調査した。AR Drone2(Parrot社)と呼ばれる商用UAVを用いた場合には上下方向には0.4Nから1.4Nの提示可能であり、その正確さは絶対値で平均2.72%程度、相対値では最も大きい場合で13.04%であった。また、水平方向の力提示について、柔軟シートを押し込んだ場合に浮遊用気流を用いた場合は0.12N、浮遊用気流を用いない場合は0.036N程度であることが分かった。UAVは水平方向に動力を有しないことから、力提示が困難とされる。本課題では浮遊用の気流を利用することで提示力の増加を図った。さらに、構築した1自由度力提示システムのアプリケーションとして、バーチャルの重さ提示や跳ねるボールのシミュレーション、バーチャルキャラクターとのインタラクションなどを映像と同期して提示することを可能とした。当初の予定どおり、UAVを用いた非拘束の力覚提示について、1自由度の場合について提示力の範囲や正確性について明らかにし、また柔軟シートを用いて浮遊気流の有無による提示力を明らかにした。研究成果は、当該分野において権威のある国際会議IEEE Haptic Syposium2018、その他関連学会で成果を報告し、おおむね順調に課題が進捗しているといえる。

結果として、ドローンを用いて硬いテクスチャを提示するためにはより出力の大きなドローンが必要であり、一般的に使用される数百グラム程度の重さのドローンを用いて硬さの違いを提示するためには別の特別な工夫が必要になることが示唆された。力覚提示について、外部計測装置に寄らない非拘束の空中力触覚提示を世界で初めて実現した。加えて、力覚と同様に重要な触覚提示について硬軟感の提示を目的として、異なる硬度の感覚提示を試み、一般的なドローンを用いた場合での提示性能を確かめることができた。これらの成果をそれぞれ国際会議や国内会議で報告した。提案したUAVを用いた1自由度の力覚提示システムおよび浮遊用気流・非剛体シートを用いた力覚提示を確立する。また、UAV搭載カメラを用いてLSD-SLAMやその他センサ信号を複合的に用いて自己位置推定を行うシステムを構築することで、非拘束のインタフェースを確立する。UAVを用いた粗さ提示および摩擦提示を行う。これにより非拘束での風力を用いた多様な触覚提示を実現することができ、それまでに開発した非拘束での風力を用いた力覚提示と合わせることで、非拘束インタラクションを実現する風力を用いた空中遭遇型力触覚提示の基盤を確立する。
創傷治癒および腫瘍免疫における、リンパ流の関与

リンパ流に障害のあるマウスでは野生型と比べて創傷治癒が遅延しており、肥満細胞の増加、組織球の減少、IL-10の発現の増加、basic FGFの発現の減少を認めた。正常マウスの尾に人工的に作成したリンパ浮腫でも、同様の所見を認めた。また腫瘍免疫に関しては、リンパ流に障害があるマウスではリンパ節への腫瘍の転移を認めず、リンパ節でのTNF-αやIFN-γの産生が低下していた。一方、皮膚局所での腫瘍形成は促進しており、リンパ節での抗腫瘍免疫が成立しないためと考えた。末梢組織からリンパ節へのリンパ管を介した物質の流れは、炎症性疾患やリンパ浮腫の病態に深く関わっており、また担癌状態における腫瘍抗原の提示や転移の経路の一つとして極めて重要である。これまでリンパ流の障害が炎症性疾患や創傷治癒、腫瘍免疫などにどのような影響を与えるのか、マウスを用いた研究はほとんどなされていなかった。カポジ肉腫ウイルス遺伝子をリンパ管内皮細胞特異的に発現したマウス(カポジ肉腫ウイルスサイクリン遺伝子導入マウス)はリンパ管が存在するもののリンパ流が障害されており、リンパ浮腫や胸水の貯留を来す。このマウスを用いて.創傷治癒、腫瘍免疫におけるリンパ流の役割について解析した。平成22年度において、まずマウス背部に作成した創傷治癒に対する肉眼的評価を行い、リンパ流に障害があるマウスのほうが創傷治癒が遅れることを見出した。これは臨床における経験に合致する所見である。また創部におけるサイトカインの発現を解析したところ、リンパ流に障害があるマウスにおいてIL-10の発現が亢進していることを見出した。IL-10ノックアウトマウスでは創傷治癒が促進することが報告されており、リンパ流の障害に伴って亢進したIL-10が創傷治癒の遅れに関与している可能性が示された。今後はリンパ流に障害があるマウスにおいて、IL-10の発現を抑制することによって創傷治癒が促進するか検討する予定である。これはリンパ浮腫に伴う下腿潰瘍の新たな治療法に結び付くと考えられる。また、マウス腹部に作成した腫瘍の大きさについて肉眼的評価を行い、リンパ流に障害があるマウスのほうが腫瘍形成が促進することを見出した。今後は組織学的評価や浸潤細胞の解析を行い、またリンパ節における抗腫瘍免疫の成立を検討する予定である。リンパ流の障害が創傷治癒や腫瘍免疫にどのような影響を与えるのか、これまでマウスを用いた研究はほとんどなされていない。カポジ肉腫ウイルス遺伝子をリンパ管内皮細施に館覗したマウスはリンパ管が存在するもののリンパ障が陣害されており、リンパ浮腫や胸水の貯留を来す。このマウスを用いて、創傷治癒、腫瘍免疫におけるリンパ流の役割について解析した。前年度までに、リンパ流に障害のあるマウスでは創傷治癒が遅延しており、肥満細胞の増加、組織球の減少、IL-10の免親の増加していることを確認していた。平成23年度において、IL-10ノックアウトマウスとリンパ流に障害のあるマウスを交配し、背部に作成した創傷の治癒を検討したところ、IL-10ノックアウトの背景では、リンパ流の障害の有無で創傷治癒に差がなかった。また、正常マウスの尾に人工的にリンパ浮腫を作成し、そこに創傷を作成したところ、リンパ流に障害のあるマウスと同様の所見を認めた。さらに、創部において肥満細胸がIL-10を発現することを免疫染色で示した。以上より、リンパ流に障害があると肥満細胞が増加し.肥満細胸が産生するIL-10によって組織球の遊走が阻害され、創傷治慮が遅延するという流れが判明した。腫瘍免疫に関しては、リンパ流に障害があるマウスのほうが腫瘍形成が促進することを確認していた。平成24年度において、腫瘍負荷したマウスのリンパ節を確認したところ、リンパ流に障害があるマウスではリンパ節への腫瘍の転移を認めず、リンパ節でのTNF-αやIFN-γの産生も、野生型マウスと比べて著しく低下していた。従って、リンパ流の障害によって腫瘍細胞がリンパ節へ流入しないことにより、リンパ節での抗腫瘍免疫が成立せず.皮膚での腫瘍形成が促進すると思われた。これは腫瘍免疲におけるリンパ流の役割を示唆する重要な知見と考えた。
抗癌免疫応答を惹起するアジュバントによる免疫抑制性ミエロイド細胞の機能転換

多くの癌では免疫機能に変調がみられ、抗癌免疫が機能不全に陥ることにより、癌の進展が促進される。中でも腫瘍内に多数浸潤するM2形質をもったマクロファージは、癌細胞の増殖を多面的に補助し、悪性形質の獲得に寄与している。本研究では、2本鎖RNAアジュバントが腫瘍内マクロファージのTLR3-TICAM-1経路を活性化することにより、癌の増殖抑制をもたらすことを明らかにした。微生物由来アジュバントの投与による自然免疫系の活性化は癌の増殖を抑制するが、その作用機構には不明な点が多い。本研究では、癌によって誘導され、腫瘍内に集積する免疫抑制性能をもったmyeloid-derived suppressor cells(MDSCs)および腫瘍随伴マクロファージ(tumor-associated macrophages, TAMs)のアジュバントに対する応答を解析した。3LL肺癌細胞株を移植したマウスに、アジュバントの一つで二本鎖RNAの合成アナログであるpoly I:Cを投与し、腫瘍からMDSCsおよびTAMsを単離して遺伝子発現やサイトカイン産生を調べた。その結果、いずれの細胞でもIFN-β等の抗癌免疫応答に関連する遺伝子の発現がみられ、poly I:Cの投与によって腫瘍内でこれらの細胞が抗癌活性を獲得していることが示唆された。さらに、活性化したTAMsは癌細胞に対して傷害活性を有していたことから、poly I:Cの作用によってTAMsが新たに抗癌エフェクター細胞としての機能を獲得し、癌の増殖に抑制的に働くと考えられた。Poly I:Cは、細胞内に取り込まれた後、Toll-like receptor 3(TLR3)およびMDA5によって認識され、それぞれアダプター分子であるTICAM-1(TRIF)およびIPS-1(MAVS)を介して標的細胞を活性化する。各アダプター分子のノックアウトマウスを用いてpoly I:Cの治療効果を検討したところ、wild-typeマウスでみられた治療効果はIPS-1-/-マウスでは消失しなかったが、TICAM-1-/-マウスで消失した。さらに、poly I:C投与後のTICAM-1-/-マウスからTAMsを単離し、癌細胞に対する傷害活性を調べたところ、活性が低下していたことから、TICAM-1経路はpoly I:CによるTAMsの抗癌エフェクター細胞としての機能獲得に必須であると考えられた。今後は、TLR3-TICAM1経路の活性化によるTAMsの機能変化を詳細に調べるとともに癌細胞の傷害を担うエフェクター分子を同定し、アジュバント投与によるTAMsの機能転換メカニズムの詳細と抗癌免疫応答の作用機構を明らかにしていく予定である。本年度は、polyI:Cの投与によって活性化された腫瘍随伴マクロファージ(tumor-associated macIophages,TAM)の癌細胞傷害活性に関わるエフェクター分子の同定と機能変化の解析を行った。3LL癌細胞株の移植マウスにpolyI:Cを腹腔内投与したのち腫瘍を観察すると、早期に出血性壊死を起こしていた。PolyI:C投与による壊死や腫瘍増殖の抑制は、TNF-αのノックアウトマウスでは全く観察されなかった。腫瘍内のTNF-αを調べると、polyI:C投与後すぐに発現がみられ、その主な産生細胞はTAMであった。PolyI:Cは、TLR3-TICAM-1経路とMDA5-IPS-1経路を活性化する。TICAM-1ノックアウトマウスでは、腫瘍内でのTNF-α産生はほぼ完全にキャンセルされ、IPS-1ノックアウトマウスではキャンセルされなかった。PolyI:Cで活性化したTAMによる細胞傷害活性は、TNF-αの産生量に相関し、その中和抗体で阻害された。マクロファージの形質は、遺伝子の発現パターンからM1およびM2に分類される。M1形質は抗腫瘍活性と関連する一方、M2形質は腫瘍増殖の促進と関連する。多くの場合、TAMはM2形質を示し、腫瘍の成長を補助している。PolyI:Cの刺激により、TAMではTNF-αを含むM1関連遺伝子群の発現が誘導され、M2関連遺伝子群の発現はほとんど変化しなかった。さらに、M1関連遺伝子群の発現は、TICAM-1のノックアウトマウス由来のTAMでほぼキャンセルされ、IPS-1ノックアウトマウス由来のTAMではほとんど変化しなかった。よって、polyI:CはTAMのTLR3-TICAM-1経路を選択的に活性化し、M1形質を付与すること、それにより発現誘導されたTNF-αによって3LL腫瘍の増殖抑制が起こることが明らかになった。