hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中高年期における職業からの引退過程と家庭、健康のダイナミクスに関する研究

本研究の研究課題は、(1)定年退職というイベントが、中高年者に対して肯定的な効果をもたらすのか、それとも否定的な効果をもたらすのか、心理的・社会的な適応指標を用いて検討すること、(2)生産的な活動(「有償労働(就労)」「家族や親族に対する無償労働(家事や介護関連活動)」「他人への支援提供(友人や近隣に対する私的な支援提供とボランティア活動)」)への関与が生活習慣病の発症に及ぼす影響とそのメカニズムを検討すること、(3)中高年齢者が近い将来必要になると思われる老後に関する知識の度合いをもつことが、生活満足度の維持や向上に貢献するか否かを検証すること、(4)調査データの質を検証するため、パネルからの脱落に関連する要因を明らかにすること、であった。分析の結果、(1)定年退職は、生活満足度に対しては否定的な効果をもつものの、友人との接触については肯定的な効果をもち、肯定的な効果、否定的な効果のいずれの可能性もあること、しかし、これらの効果は定年退職後再就職した人では消失してしまうこと、(2)男性では、奉仕活動やボランティア活動のような家庭外の無償労働は、生活習慣病のリスクを抑える効果があること、女性では有償労働が生活習慣病のリスクを下げる効果があること、そしてこれらの効果はいずれも、ライフスタイルや心理的なWell-beingを媒介として起こっているわけではないこと、(3)中高年齢者の老後に関する知識量が生活満足度の維持や向上に貢献する可能性があること、(4)男女ともに都市度の高い地域に居住している者の方が、パネルから脱落する確率が高いことを示していたこと、さらに男性では年齢が低い者、女性では日常生活動作に障害がある者、友人接触頻度が低い者が脱落する傾向が高いこと、など明らかとなった。1.既存のデータベースの解析1999年に全国5564歳の男女を対象に実施した調査(初回調査)のデータを解析した。1)就労希望に関連する要因を分析した結果、男性では収入が低いこと、仕事満足度が高いこと、女性では仕事満足度が高いことが66歳以後まで就労し続けたいことと関連していた。2)主観的に良好な転職ができたか否かに関連する要因を分析した結果、仕事以外の知人の紹介や家族・親族からの紹介で転職した人が良好な転職の割合が高かった。求人広告や公共職業安定所のルートを通しての転職ではこのような効果はなかった。3)転職の困難に関連する要因を分析した結果、45歳以降に離職経験がある人の中で現職がある人(転職成功層)と就労意思があるにもかかわらず現職のない人(転職困難層)でその特性の違いが見られ、転職困難層では前職の企業規模が小さく、前職の業種が製造業、建設業、運輸通信業である人の割合が高かった。4)失業や企業の雇用調整の中高年の精神健康に与える影響を分析した結果、失業者や雇用調整が進む企業に勤めている人ではうつ症状が有意に高かった。5)就労からの引退後において社会貢献活動(家庭向け、友人・知人向け、地域や社会向け)が精神的な健康に与える効果を分析した結果、地域や社会に対する貢献活動(ボランティアなど)は精神的な健康の向上に関連していたが、家庭向け(家事など)や友人や知人向け(家事手伝いなど)の貢献活動は精神の健康の向上と関連がみられなかった。2.2001年の追跡調査に向けての準備初回調査の対象者に対する追跡調査の準備を行った1)調査協力者向けのパンフレットの作成と送付追跡調査の回収率を高めるため、初回調査の回答者向けのパンフレットの作成と送付を行った。2)対象者の所在確認追跡調査を効率的に行うため、対象者の所在確認(転居、死亡など)を住民基本台帳に基づき行った。1.追跡調査の実施本研究では、中高年期における引退過程と健康、家族との関係を縦断的な調査に基づいて解明することを目的としている。

初回調査は、平成11年10月に全国5564歳の男性6,000人、女性2,000人に対して訪問面接法によって実施し、男性では2,533(回収率63.3%)、女性では1,440(回収率72.0%)から回答をえた。今年度は縦断調査のデータベースを作成するため、初回調査の完了者に対して訪問面接法によって追跡調査を実施した。実施時期は平成13年10月であった。さらに回収率を高めるために、「不在」「多忙」「病気」などの理由で調査不能であった人に対して、あらためて平成13年12月に追跡調査を実施した。最終的な回収数は、男性2,073(回収率81.8%)、女性1,213(回収率84.2%)であった。2.データの質のチェック追跡調査によって、初回調査だけでは確認できない基本属性を含めたデータのミスチェックが可能となる。初回調査のデータと追跡調査のデータとをマージし、データの質の確認を行った。3.解析結果1)仕事の特質(「仕事の要求量」「自由裁量」「技術や能力の活用」)のうち、中高年就労者の心身の健康維持に重要であるのは[技術や能力の活用」であることが明らかとなった。2)就労を中止する予測要因としては、健康状態が悪い、非自営業という従来から指摘されてきた要因以外に、仕事上の特性として「自分の技術や能力を生かせていない」ことが重要であることが明らかとなった。3)定年による職業からの引退は、精神的な健康や自尊感情に対してマイナスの影響はなく、ストレスフルライフイベントとして位置づけられるようなイベントではない可能性が示唆された。1.調査結果紹介のためのパンフレットの作成と調査協力者への送付パネルの対象者に対しては、今後も継続して追跡調査を実施する予定でいる。パネルからの脱落者をできるだけ少なくするために、調査結果を紹介したパンフレットを作成し、対象者に送付した。2.解析結果1)パネルからの脱落者の特性:パネルの代表性を検討するため、追跡調査における脱落者の特性を解明した。分析の結果、男女ともに都市度の高い地域に居住している者の方が、パネルから脱落する確率が高いこと、また男性では年齢が低い者、女性では日常生活動作に障害がある者、友人接触頻度が低い者が脱落する傾向が高いことが分かった。2)仕事の特質と心身の健康:「仕事の要求量」「自由裁量」「技術や能力の活用」のうち、中高年就労者の心身の健康維持に重要であったのは「仕事の要求量」であった。3)定年の心身の健康に与える効果:定年による職業からの引退は、精神的な健康や自尊感情、愁訴に対してマイナスの影響はなく、ストレスフルライフイベントとして位置づけられるようなイベントではない可能性が示唆された。4)転職に関する満足度の差異を予測する要因:転職の満足度は前職の職種によって違いがみられ、その満足度は「専門職」では相対的に高く、「ブルーカー職」では相対的に低いことがわかった。5)就労以外の社会貢献活動と生活習慣病の発症:社会貢献活動に従事することは生活習慣病の発症を有意に低下させることが明らかになった。6)家族内のイベントと心身の健康:男性にとっては、追跡期間中に家族が重大な病気やケガを経験した場合、女性では介護者になることによって、心身の健康が有意に低くなることがわかった。
小児専門領域外の医療環境で子どもの権利を保護するための支援方略の開発

医療現場において保障されるべき子どもの権利への理解が深まる一方、小児医療の不採算や小児科医師の減少、超少子化などの社会背景から小児科病棟の閉鎖や縮小は相次ぎ、混合病棟や成人病棟への子供の入院を余儀なくされている現状がある。よって子どもの権利の保護は小児科を受診する子どもに限定されている可能性が高い。超少子化にある我が国において将来的に子ども病院などの新規開設は容易ではないことを考えると、現状の成人病等に入院した場合でも子どもの権利を行使できる環境を整える必要がある。本研究では小児を専門としない医療現場で子どもの権利を保護する環境を整備することを目的とした。まず初めに、研究基盤確立として、子どもの権利に関する先行研究について国内外を含め文献レビューを行う予定とした。次に、我が国の小児医療現場の現状を明らかにするために、各診療科における子どもの権利に関する取り組みの現状と阻害する因子を、自己記入式質問紙を用いて各施設へ調査を行う予定とした。そして最終的には子どもの権利を保護するための医療現場アセスメントツールを開発する予定としていた。しかし、研究基盤を確立しようと文献調査を行い、各施設に研修や資料の採集を行っている最中に、研究代表者が急病となり、所属大学の一時的な休職もせざる得ない状況になったため、本研究の継続も困難と考え中止の申請を行った。医療現場において保障されるべき子どもの権利への理解が深まる一方で、小児医療の不採算、小児科医師の減少、超少子化社会などの社会背景から小児科病棟の閉鎖や縮小は相次ぎ、成人との混合病棟へ子どもが入院を余儀なくされている現状がある。よって、子どもの権利の保護は、小児科を受診する子どもに限定されている可能性が高いこと、超少子化にある我が国において、将来的に子どもの病院などの新規開設は容易ではないと考えられ、本研究の目的は、成人との混合病棟に入院した場合でも、子どもが権利を行使できる環境を整えることを目的としている。本年度の取り組みは、研究基盤確立期として、文献レビューの実施と分析モデルの作成、及びそのモデルに基づいた調査に取り組むことであった。1.先行研究による国内外の動向の調査:国内外の医療における子どもの権利に対する支援の取り組みについて体系的に文献レビューを行った。2014年11月までの約20年間分の小児看護及び、医療全体において蓄積されてきた子どもの権利に関する研究の動向を文献検討により体系的に明らかにし、今後取り組むべき課題を検討した。結果、日本においては、45条ある子どもの権利条約のうち、17条のみに限局した研究が報告されていたことが明らかとなり、その結果を平成27年度学会発表を行う。2.分析モデルの作成:子どもの権利条約は世界の子どもを対象としているため、文化の違い、宗教的な背景の違いなどの影響を考慮する必要があるため、本研究の求める国内における子どもの権利を、研究者および関係者間での日本国内に限定した現状把握を行い、時間をかけて分析モデルの基盤を作成検討している。分析モデルを作成するにあたり、子どもに関わる様々な医療従事者からの情報が不可欠であるため、今年度は医師、看護師、保育士、理学療法士などの多職種で構成された研究会を開催することとした。昨年度の調査結果より、医療における子どもの権利の保護は、45条ある子どもの権利条約うち17条のみに限局した視点で展開されていることが明らかとなった。また、国内外ともに子ども病棟および混合病棟のどちらの医療環境においても、保障されるべき子どもの権利は十分に守られているとは言えないことが明らかになった。これにより、分析モデルを作成するにあたり、子どもの権利を守るための関わりは子ども病棟に限られているのではないかという本研究の仮説だけではなく、子ども病棟において子どもの権利を保護するための問題を明らかにするための調査がさらに必要となった。研究代表者の急病と長期療養により、予定した研究会の開催と調査が実施できなかったため。本年度は、分析モデルに基づいた調査表の作成までを目標としていたが、「子どもの権利条約」の「権利」について、子どもから大人までが持つ人間の基本的な「権利」と、医療における子どもの権利と成人との違いを再確認する作業に時間を要した。

看護文献の中にも「権利」という言葉は散見するが、正しく定義されている先行研究が少ないことから、分析モデルを作成する前に、定義づけを入念に行ったたため、分析モデルの作成に若干の遅れが生じた。昨年度到達に至らなかった研究会の開催と調査を共同研究者と連携を図りながら進めていく。1.分析モデルを作成し、プレテストを実施し、その後対象施設へ質問紙調査を行う【平成27年度】2.上記の結果から実態を明らかにし、子どもの権利アセスメントツールの作成を行う【平成28年度】研究代表者の急病及び長期療養により、予定した研究会の開催と調査が実施できなかったため。昨年度実施に至らなかった研究会の開催と調査に使用する。
近現代イギリスにおける身体観・疾病観・死生観

本研究は、19世紀後半から20世紀前半のイギリスにおける身体観・疾病観・死生観の変化を分析することを目的とし、具体的には現地調査を通じて体温計の利用法という事例を検討した。その結果、体温計の利用は、技術的発展、マーケティング技法の発展、1918-19年インフルエンザという新規感染症への恐怖、家庭看護を女性のジェンダーとする文化を要因とすることを確認した。この知見は、医療の社会史学会大会(於ケント大学;平成28年7月8日)にて口頭報告し、平成29年度には国際学会誌East Asian Journal of Science and Technologyに論文として投稿し、現在審査が進められている。本研究の目的は、19世紀後半から20世紀前半のイギリスにおける身体観・疾病観・死生観の変化を分析することである。この時期のイギリスでは、コレラや結核といった感染症の死亡率が低下し、社会の広い層で相対的な健康が実感されつつあった。その結果、人々は、(1)以前は気にしなかった微細な身体の失調を問題視するようになった。また、(2)感染症ではなく、生活習慣病や慢性疾患へと関心を寄せていった。他方で、(3)死は非日常的なイベントとなり、死との直面はより深刻に受け止められていった。本研究では、このような身体・疾病・死と生にかかわる認識の変化を、「ポスト感染症時代」を迎えた西洋世界を規定するものと捉え、闘病記、病院史料、友愛組合史料などから実証的な検討を試みる。平成26年度においては、関連文献資料の収集と読解、現地での史料調査を中心に研究活動を行った。特に、平成27年2月22日から同年3月2日かけて、イギリス・ロンドンで実施された現地調査においては、ウェルカム医学史図書館にて文献・史料収集を実施した。上記図書館においては、臨床体温計と体温記録の文化に関する文献・雑誌記事(医学雑誌ランセット(Lancet))の収集を行った。その過程においては、臨床体温計製造業者Tagliabue and CasellaとJamese Joseph Hicks、臨床体温計の利用を重視した内科医William RobertsとClifford Allbuttが重要な役割を果たしていることが確認された。今後は、体温計測という具体的な問題を通じて、以前は気にしなかった微細な身体の失調の問題化、生活習慣病や慢性疾患への関心増大がいかにして近代イギリスで進んだかを検討する予定である。その結果、人々は、以前は気にしなかった微細な身体の失調を問題視するようになった。また、感染症ではなく、生活習慣病や慢性疾患へと関心を寄せていった。その具体的な事例として、本研究では、体温計の利用法について検討を進めてきた。体温計は1870年代に携帯できる小型商品が実用化され、一般家庭にも広がりを見せた。これによって、人々は日々の体調の変化を自ら観察できるようになったのである。この点に関する、2015年度の主たる研究成果は、2015年8-9月と2016年2-3月に現地調査を行い、その調査結果をもって、2016年医療の社会史学会(Society for Social History of Medicine)大会の口頭発表に応募し、採択となったことである。現地調査においては、ウェルカム医学史図書館、大英図書館、ハックニー史料館、北ヨーク史料館、ブーツ史料部門などで各種一次史料を収集した。特に重要な一次史料としては、ハックニー史料館所蔵の医学機器製造会社キャセラの発注台帳を入手した点である。そこで得られた体温計購入者のデータを基に、北ヨーク史料館では利用者の実態分析に踏み込むことができた。また、イギリス最大の医薬品小売店であるブーツの史料部門では、小売店の体温計販売戦略を検討した。以上によって、製造業者、小売店、利用者が織りなす、健康維持の力学が徐々に明らかとなってきた。以上で述べたような、近代ヨーロッパの健康意識にかかわる歴史学的研究は乏しく、その意義を強調することができるだろう。本研究の目的は、19世紀後半から20世紀前半のイギリスにおける身体観・疾病観・死生観の変化を分析することであるが、2015年度においては、現地調査や文献調査を通じて、体温計の利用法という具体的な検討事例を得ることができた。体温計の利用は、人間身体の異常を日常的に個人が感知するための重要な手段であり、近代的な身体観と疾病観の根幹に位置するものである。この検討事例を得て、本研究は次のステップへと進むことが可能となった。また、2015年8-9月と2016年2-3月に実施された現地調査では、特にハックニー史料館、北ヨーク史料館、ブーツ史料部門での一次史料が行われ、実証的な議論を行うための基盤が確立された。ハックニー史料館では、医学機器製造会社キャセラによる体温計製造の実態について検討し、体温計購入者のデータから利用者像の描出にいたった。また、体温計購入者の意図や利用実践についてはさらなる調査を進め、ヨークシャーに所在した私立学校グレート・アイトン校の校長ハーバート・デニスが大量購入者であったことから、この学校とデニスに関する一次史料を北ヨーク史料館で確認した。そこからは、第一次世界大戦時のスペイン風邪(インフルエンザ)が背景となっていたことを確認することができた。

また、イギリス最大の医薬品小売店であるブーツの史料部門も訪問し、体温計販売戦略について小売店の時点で検討した。ここでは、スペイン風邪への罹患を気にする消費者に対する小売店のマーケティングが明らかとなった。以上によって、製造業者、小売店、利用者が織りなす、健康維持の力学が明らかとなった。今後は、この研究成果を国際学会にて発表し、さらに国際学会の雑誌への投稿をめざしてゆきたい。平成28年度においては、研究成果の公表を主たる目的として、以下2点の研究活動を行った。(1)国際学会での発表:(2)現地史料調査平成28年7月57、同月9日、イギリス・ロンドンのウェルカム医学史図書館(Wellcome Library for understanding medicine)において現地史料調査を実施した。主として、臨床体温計測法の歴史について、特に利用者の日記や手記の収集を行った。本研究は、19世紀後半から20世紀前半のイギリスにおける身体観・疾病観・死生観の変化を分析することを目的とし、具体的には現地調査を通じて体温計の利用法という事例を検討した。その結果、体温計の利用は、技術的発展、マーケティング技法の発展、1918-19年インフルエンザという新規感染症への恐怖、家庭看護を女性のジェンダーとする文化を要因とすることを確認した。この知見は、医療の社会史学会大会(於ケント大学;平成28年7月8日)にて口頭報告し、平成29年度には国際学会誌East Asian Journal of Science and Technologyに論文として投稿し、現在審査が進められている。当初計画していた、イングランド北部の都市サンダーランドに存在した病院施設にかかわる一次史料の現地調査については、予備的調査段階において、その有効性に疑念がもたれたため、計画を一部変更し、体温計測の問題に絞って検討を進めることとした。そのため、ロンドンを中心とした現地調査を主として行った。2015年度において、本研究では、文献調査と現地での一次史料調査に注力し、その結果、十分な一次史料を確保することができた。そのため、2016年度以降は、当初の研究計画に沿って、研究成果の取りまとめと発表へと移行してゆきたい。まず、既に予定されている点から触れると、2016年医療の社会史学会(Society for Social History of Medicine)大会の口頭発表に応募し、採択となった(発表予定日は2016年7月8日。ケント大学にて開催)。発表タイトルは「The “Quantified Self" in History: ClinicalThermometryin England between Late Nineteenth and Early Twentieth Century」である。該当の学会は、医療の歴史に関する世界最大規模の会合であり、そこで得られたフィードバックをもとに論文の投稿に備えたい。そして、2016年度後半においては、論文の執筆へと移り、年度内の投稿を目指す。具体的には、上記学会の会誌である『医療の社会史』(Social History of Medicine)への投稿を検討している。
光増感剤修飾分子を用いたPCI の分子科学

細胞内で機能する医薬は、自発的に細胞内に侵入するものでない限り、キャリアによって細胞内まで届ける必要がある。キャリアによって細胞内に医薬や生理活性物質を細胞内に導入する際にしばしば問題となるのが、導入した物質のエンドソーム内トラップである。この問題の解決策の1つにPhotochemical internalization (PCI)法がある。これは、光照射によりエンドソームに溜まってしまった物質をエンドソーム外(細胞質内)に放出させる方法である。この方法で利用される物質として、光増感剤を付加した細胞内侵入性分子(光応答コンジュゲート)が挙げられる。しかしながら、現在、PCIの成否に関わる光増感剤の性質はまだ明らかではなく、光応答コンジュゲートの設計指針も確立していない。そこで本研究では、まず、PCI法における光照射によるエンドソーム破壊機構の解明に取り組んだ。光増感剤からの一重項酸素生成、熱生成、蛍光放射に加え、スーパーオキシドの生成等についても調べ、それぞれの光応答反応がどのくらいの割合でエンドソーム破壊に寄与しているかを調べた。結果として、最も関係するのは一重項酸素の生成であることが分かり、そのことは一重項酸素クエンチャーを用いた研究においても確認された。また、一重項酸素の短寿命の割には長い時間をかけてエンドソーム膜破壊が起こること、エンドソーム破壊までの間にpH上昇がみられること、などを明らかにした(Ohtsuki et al, Scientific Reports, 2015)。また、効率よくPCIを起こす光応答コンジュゲートの設計指針についても検討した。光増感剤を付加するペプチド上の位置はCPPと逆側(C末)の方がよかった。光増感剤の近傍配列として好ましい配列も分かってきた。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞に投与した際エンドソームに集積する生体分子について、光と光増感剤を用いてエンドソームから脱出させる方法(photochemical internalization; PCI)が知られている。本研究は、PCI法における光照射後のエンドソーム脱出のメカニズムを探ることを目的とする。これまでに光増感剤の性質として光照射時の一重項酸素(1O2)の生成が重要であることが分かってきた。本年度は、このように1O2の寄与が大きいことを更に裏付ける結果を得た。また、光照射後の細胞観察により、エンドソームの膜にプロトンが通り抜けるような小さな隙間が生じた後に膜の破裂が起こるような現象を確認した。エンドソーム膜破壊へのコレステロールの関与が示唆された。十数マイクロ秒の1O2の寿命と比べると、かなり長い時間(数秒から百数十秒)かけてエンドソーム破壊が起こることから、1O2が最初に起こす反応は膜破壊を即座に起こしうるものではないと推察される。1O2と最初に反応した何らかの物質はじわじわ時間をかけて膜を不安定化させるか、または別の物質との反応を経由して膜不安定化に関わるのだと考えられる。当初の計画では光増感剤修飾分子のエンドソーム脱出効率に関係の深い(光増感剤部分の)光応答パラメータを探ることを本年度の目標としていた。その光応答パラメータに関しては、1O2生成量子収率の関係が深いことが明らかになってきた。そのうえで、1O2生成以降のエンドソーム破壊メカニズムの解明に着手しはじめ、コレステロールの関与の可能性などが分かってきた。このことから、当初の計画以上に進展していると判断した。1O2生成以降のエンドソーム破壊メカニズムの解明をさらに続ける。

すなわち、エンドソーム破壊時にエンドソーム膜のどの分子が関与しているのかを阻害剤を用いた実験等により調べ、エンドソーム破壊時に膜で起きる現象をその動画から詳細解明する。また、ペプチドや蛋白質の末端に光増感剤を付加する際の設計指針の確立に取り組む。また、少し視点を変えてエンドソーム以外に局在する光応答分子を作製してそれにより光照射後細胞内で何が起こるかも調べる。27年度が最終年度であるため、記入しない。
水素脆化破面直下の局所かつ原子レベルでの結晶学的・格子欠陥解析と新試験法への展開

本年度は、焼戻しマルテンサイト鋼において、水素起因で破壊した各種破壊形態(粒界、擬粒界、擬へき開割れ)破面直下の局所領域を抽出し、EBSDを用いて破面の結晶学的解析、破面直下のひずみ分布を解析した。その結果、粒界破壊においては、特定の結晶面での破壊は認められず、マルテンサイトブルックおよびラスに対応した複数の結晶面が認められた。一方、擬へき破壊においては、約半数の解析箇所で(011)面が認められた。特に、ブロックあるいはラスの成長方向に垂直に破壊する領域は、ブロックやラスを引き裂くようにして、MVC破壊のように大きな塑性変形を伴った延性的な破壊となる。一方、すべりおよびブロック・ラス界面の割れに対応した領域は、ブロックまたはラス境界破壊である。また、破面直下のひずみ分布を明らかにするため、KAM値による比較を行った結果、粒界、擬粒界、擬へき開割れの順でKAM値が徐々に大きくなった。さらに低温TDSを用いて、各種破面近傍のひずみ誘起格子欠陥形の水素による助長について検討した結果、粒界破壊近傍では空孔型欠陥の助長が認めれなかったが、擬へき開破壊近傍では空孔型欠陥の助長が認めれた。以上、破面直下のEBSDによる結晶学的解析、ひずみ分布、さらには低温TDSによる解析から、粒界破壊はすべり面分離ではなく、破面形成時にはほとんど塑性変形を伴わなわず、主に水素自体の関与が示された。一方、擬へき開破壊においては、一部、塑性関与を含んだ破壊であることが示された。本研究の第1の目的は、水素起因で破壊した高強度鋼の「破面および破面直下のより局所領域」を抽出し、破壊の結晶学的および格子欠陥形成の観点から、「よりミクロな原子スケール(原子空孔・転位・結晶粒界スケール)」で水素起因破壊の本質を探究することである。第2の目的は、水素を含んだ材料に応力が負荷され破壊した場合の「マクロな力学特性変化(水素脆化特性)」を「局所領域で発現した原子スケールでの変化」まで破壊の本質掘り下げて探求し、両者の関係を明らかにした上で一致を目指すことである。第3の目的は、上記の第2の目的で明らかになった関係を基に、「各種水素脆化試験方法」、および「各種材料」において得られた局所情報を比較し、「各試験方法で起こる本質的な違い」、「各材料で起こる本質的な違い」を抽出することである。既に第1の目的がほぼ達成され、第2の目的について試験を着手しており、当初3年間の計画より前倒しで進展している。本年度の研究実施計画として、以下の2点を中心に取り組む。(1)「破面直下の局所領域の情報」と「離れた箇所の平均情報」の違いを明らかにする:各種金属材料(bcc:焼戻しマルテンサイト鋼、冷間伸線パーライト鋼、fcc:残留γを含む鋼など)において、水素起因で破壊した各種破壊形態(粒界、擬粒界、擬へき開割れ)破面直下の局所領域を抽出し、EBSDを用いて破面の結晶学的解析、破面直下のひずみ分布を解析する。また、低温TDSを用いて、水素による格子欠陥形成助長の有無を明らかにし、さらには水素助長欠陥の種類(原子空孔or空孔クラスターor転位)を同定する。(2)「局所領域かつ原子スケール解析の情報」と「水素脆化特性」の対応を明らかにする:従来、「試験片全体から得られた平均情報(破面観察、平均水素量、水素ひずみ助長格子欠陥量)」と「マクロな力学特性(水素脆化特性)」は必ずしも一致しなかった。しかし、本研究では実際に破壊した破面の直接情報(EBSDによる破面の方位マップ、二面トレース解析)、破面直下の情報(破面からの距離:100,500,1000μmにおけるKAMマップ、および低温TDSによる局所水素量、局所水素助長格子欠陥量)など、従来に比べ格段に精緻な実験を積み重ねることで、水素脆化特性との対応を目指す。

以上、破面直下のEBSDによる結晶学的解析、ひずみ分布、さらには低温TDSによる解析から、粒界破壊はすべり面分離ではなく、破面形成時にはほとんど塑性変形を伴わなわず、主に水素自体の関与が示された。一方、擬へき開破壊においては、一部、塑性関与を含んだ破壊であることが示された。本研究の第1の目的は、水素起因で破壊した高強度鋼の「破面および破面直下のより局所領域」を抽出し、破壊の結晶学的および格子欠陥形成の観点から、「よりミクロな原子スケール(原子空孔・転位・結晶粒界スケール)」で水素起因破壊の本質を探究することである。第2の目的は、水素を含んだ材料に応力が負荷され破壊した場合の「マクロな力学特性変化(水素脆化特性)」を「局所領域で発現した原子スケールでの変化」まで破壊の本質掘り下げて探求し、両者の関係を明らかにした上で一致を目指すことである。第3の目的は、上記の第2の目的で明らかになった関係を基に、「各種水素脆化試験方法」、および「各種材料」において得られた局所情報を比較し、「各試験方法で起こる本質的な違い」、「各材料で起こる本質的な違い」を抽出することである。既に第1の目的がほぼ達成され、第2の目的について試験を着手しており、当初3年間の計画より前倒しで進展している。本年度の研究実施計画として、以下の2点を中心に取り組む。(1)「破面直下の局所領域の情報」と「離れた箇所の平均情報」の違いを明らかにする:各種金属材料(bcc:焼戻しマルテンサイト鋼、冷間伸線パーライト鋼、fcc:残留γを含む鋼など)において、水素起因で破壊した各種破壊形態(粒界、擬粒界、擬へき開割れ)破面直下の局所領域を抽出し、EBSDを用いて破面の結晶学的解析、破面直下のひずみ分布を解析する。また、低温TDSを用いて、水素による格子欠陥形成助長の有無を明らかにし、さらには水素助長欠陥の種類(原子空孔or空孔クラスターor転位)を同定する。(2)「局所領域かつ原子スケール解析の情報」と「水素脆化特性」の対応を明らかにする:従来、「試験片全体から得られた平均情報(破面観察、平均水素量、水素ひずみ助長格子欠陥量)」と「マクロな力学特性(水素脆化特性)」は必ずしも一致しなかった。しかし、本研究では実際に破壊した破面の直接情報(EBSDによる破面の方位マップ、二面トレース解析)、破面直下の情報(破面からの距離:100,500,1000μmにおけるKAMマップ、および低温TDSによる局所水素量、局所水素助長格子欠陥量)など、従来に比べ格段に精緻な実験を積み重ねることで、水素脆化特性との対応を目指す。
活性化T細胞上の膜型TNF-αの機能解析と自己免疫疾患の病態解明への応用

TNF-αは慢性関節リウマチ(RA)をはじめとした自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たしていることが知られており、従来可溶性TNF-αがその働きの中心を担っていると考えられてきた。可溶性TNF-αは、その前駆体として細胞膜表面にとどまった形の膜型TNF-αとして表出したのち、メタロプロテイナーゼで切断をうけて可溶型として放出される。膜型TNF-αの生理学的機能はほとんど不明であったが、近年その受容体がtype2TNF受容体であることが明らかにされ(Cell 1995)、膜型TNF-αの機能が注目されている。われわれは活性化T細胞上に発現している膜型TNF-αが、細胞と細胞の接着を介して標的細胞に作用することにより、可溶性TNF-αと全く異なる様々な免疫応答を惹起することを見いだした。すなわち、T細胞上の膜型TNF-αはautoのB細胞にはたらいて抗体産生を惹起し、また一方では抗TNF-αによりT細胞自身が活性化され、種々のサイトカインや接着分子の発現が誘導される。今回いただいた助成金を用いて我々はT細胞の表面上に存在する膜型TNF-αの機能発現に必須の細胞内シグナル伝達経路ならびにシグナル伝達に関与する分子の同定を行った。その結果細胞内シグナル伝達経路としてチロシンリン酸化が重要であること、膜型TNF-αに会合する分子としてB cell-associated protein(BAP37)を見いだした。さらにRA滑膜細胞での膜型TNF-αの発現、in vitroでの抗TNF-α抗体投与による滑膜増殖への効果についても検討した。我々の研究は従来のサイトカインの生理作用が可溶型のみを介するという概念とは全く異なり、細胞膜にとどまった形(膜型)のサイトカインの新しい機能に着目したものであり独創的である。膜型TNF-αは細胞表面機能分子として特に炎症局所での免疫応答をつかさどると考えられ、われわれの研究は新しい視点からのRAの病態解明と治療戦略の構築を可能にすると考える。TNF-αは慢性関節リウマチ(RA)をはじめとした自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たしていることが知られており、従来可溶型TNF-αがその働きの中心を担っていると考えられてきた。可溶型TNF-αは、その前駆体として細胞膜表面にとどまった形の膜型TNF-αとして表出したのち、メタロプロテイナーゼで切断をうけて可溶型として放出される。われわれは活性化T細胞上に発現している膜型TNF-αが、細胞と細胞の接着を介して標的細胞に作用することにより、可溶型TNF-αと全く異なる様々な免疫応答を惹起することを見いだした。すなわち、T細胞上の膜型TNF7-αはautoのB細胞にはたらいて抗体産生を惹起し、また一方では抗TNF-αによりT細胞自身が活性化され、種々のサイトカインや接着分子の発現が誘導される。またその際、細胞内カルシウムの上昇や、複数のタンパクのチロシンリン酸化の修飾を伴う。

本年度の成果は、膜型TNF-αの刺激により接着分子であるE-セレクチンの発現がT細胞上に誘導されたことであり、膜型TNF-αは局所において炎症を正の方向に制御する新しい分子であることがさらに明らかになった。我々の研究は従来のサイトカインの生理作用が可溶型のみを介するという概念とは全く異なり、細胞膜にとどまった形(膜型)のサイトカインの新しい機能に着目したものであり独創的である。膜型TNF-αは細胞表面機能分子として特に炎症局所での免疫応答をつかさどると考えられ、われわれの研究は新しい視点からの自己免疫疾患の病態解明と治療戦略の構築を可能にすると考える。TNF-αは慢性関節リウマチ(RA)をはじめとした自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たしていることが知られており、従来可溶型TNF-αがその働きの中心を担っていると考えられてきた。可溶型TNF-αは、その前駆体として細胞膜表面にとどまった形の膜型TNF-αとして表出したのち、メタロプロテイナーゼで切断をうけて可溶型として放出される。膜型TNF-αの生理学的機能はほとんど不明であったが、近年その受容体がtype2 TNF受容体であることが明らかにされ(Cell 1995)、膜型TNF-αの機能が注目されている。われわれは活性化T細胞上に発現している膜型TNF-αが、細胞と細胞の接着を介して標的細胞に作用することにより、可溶型TNF-αと全く異なる様々な免疫応答を惹起することを見いだした。すなわち、T細胞上の膜型TNF-αはautoのB細胞にはたらいて抗体産生を惹起し、また一方では抗TNF-αによりT細胞自身が活性化され、種々のサイトカインや接着分子の発現が誘導される。今回いただいた助成金を用いて我々はT細胞の表面上に存在する膜型TNF-αの機能発現に必須の細胞内シグナル伝達経路ならびにシグナル伝達に関与する分子の同定を行った。その結果細胞内シグナル伝達経路としてチロシンリン酸化が重要であること、膜型TNF-αに会合する分子としてB cell-associated protein(BAP37)を見いだした。さらにRA滑膜細胞での膜型TNF-αの発現、in vitroでの抗TNF-α抗体投与による滑膜増殖への効果についても検討した。膜型TNF-αは細胞表面機能分子として特に炎症局所での免疫応答をつかさどると考えられ、われわれの研究は新しい視点からのRAの病態解明と治療戦略の構築を可能にすると考える。
遺伝子改変ブタを用いたヒト造血幹細胞評価システムの構築

我々の研究室では既に経子宮的にブタ胎児腹腔内に臍帯血由来のヒト造血幹細胞を移植し、出生後ヒト血球細胞をもった血液キメラブタの作製に成功していた。しかしこれらのブタ血液中にしめるヒト細胞の頻度は非常に低いため、ブタ体内におけるヒト血球細胞のgrowth advantageを得るため、遺伝子破壊によって高度の貧血をきたすようなレシピエントブタを作製することにした。標的とする遺伝子としては、c-kit遺伝子とPU.1遺伝子を試みた。農業科学技術研究所より梅山ブタ、ランドレースブタ由来の細胞を採取してもらい各ブタ数個体由来のゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーをスクリーニングし、PU.1、c-kit各遺伝子座の1520Kbのゲノム断片を得た。ブタなどの家畜動物は個体間での遺伝的多系が存在し、そのため相同組み換えに用いる細胞と同じ個体(isogenic)由来のコンストラクトを用いる必要がある。そめため、それぞれの遺伝子に対し、数個体由来のコンストラクトを構築した。構築したベクターをそれぞれのブタ由来の初代培養繊維芽細胞に導入し、薬剤選択を行った後、PCRによって標的遺伝子座の相同組み換えの有無をスクリーニングした。しかし、ブタ繊維芽細胞はこれらのlocusにおいて非常に相同組み替え効率が低く、合計約2000クローンのスクリーニングのうち組換えの検出は9クローンのみしか得られなかった。また、クローニングした組換え細胞は、核移植によってブタ個体を作製するにあたって、非常に増殖状態が悪く、今のところ利用しうる株は得られていない。相同組み換えの効率を上げるため、ベクター側において、polyA less, promotor lessなどのテクニックを導入しているところである。
脳血管疾患患者のライフの再構成の過程とそれに影響する要因に関する縦断的研究

脳血管疾患患者は、発病から1年間に、「生命の維持」「日常生活動作の訓練」「退院後の生活の再建」「人生の再構成」という過程を経て、ライフを再構成していることが明らかとなった。この過程の進行には、病状の回復や周囲の人々からの支えが大きく影響していた。一方で、医学的には一定の身体機能に達しているとされる維持期にも、症状に悩んでいたり、人生の再構成に向けて苦闘していたりするなど、支援が必要な課題が示された。本研究は、脳血管疾患患者が様々な苦痛や困難に対処し、ライフ(生存・生活・人生)の再構成を図っていく過程、ならびに、その過程に影響をもたらす対処戦略、支援環境について、特に変化の大きい発病後1年後までの経過を追い、実証的に把握することを目的とした。本年度は、調査票策定のため文献レビュー、パイロット調査と、調査対象者のリクルートを行った。まずは、発病後1年以内の脳血管疾患患者にかかわる理学療法士等の専門職者に半構造化面接を行い、治療やリハビリテーションの現状と課題、患者のたどる主な経過を確認した。次に、脳血管疾患患者の患者会の会員20名に自由記述を中心にした質問紙調査を実施し、心身機能の経過、困難だったこと、役立つ支援などについて発病後1年以内の経験を振り返ってもらった。文献については、脳血管疾患患者の発症後の心身機能の変化や生活、人生の経過を実証的にとらえた学術論文のほかに、出版されている患者の手記や患者会の会報などをレビューした。医学的にいう急性期、回復期、維持期の時期によって、患者の治療や生活場所が影響されるため、患者の経験を理解するうえでもこの時期別に分析していくことが必要である。時期や症状によってさまざまな苦痛・困難が経験されていること、家族や専門職者による支援が重要であること、患者の要望などについて、現在解析中である。次年度は、この結果を踏まえて、調査票を確定し、調査の実施を行う予定である。本研究は、脳血管疾患患者が様々な苦痛や困難に対処し、ライフ(生存・生活・人生)の再構成を図っていく過程と、その過程に影響をもたらす対処戦略、支援環境について、特に変化の大きい発病後1年後までの経過を追い、実証的に把握することを目的とした。それらを明らかにすることにより、脳血管疾患患者に関する施策や実践ならびに脳血管疾患患者や家族のライフの再構成に役立てられる提言を行うことを目指している。本年度は、昨年度から本年度にかけて行った脳血管疾患の患者会の会員20名への調査結果を分析した。この調査は、自由記述を中心にした質問紙調査であり、心身機能の経過、困難だったこと、支えになったことなどについて発病後1年以内の経験を振り返ってもらったものである。調査対象者の「苦痛・困難」や「支えとなったこと」は、急性期、回復期、維持期という医学的な区分の影響を受けており、その時期ごとに特徴がみられた。おおまかにみると、急性期は(1)「生命の維持」、回復期は(2)「日常生活動作の訓練」、維持期は(3)「退院後の日常生活の再建」と(4)「人生の再構成」ということが中心的な課題となっていた。また、いずれの時期も、リハビリテーションの専門職や家族などの周囲の人々の支えが大きいといえる。発病後1年後までのライフの再構成の過程は、欧米の研究結果と同様に4区分できる可能性があるが、入院期間の違いから各区分の時期が異なっていることも考えられる。現在、調査対象先と交渉中であり、次年度はこの結果を踏まえて、患者の追跡の調査を行う予定である。本研究は、脳血管疾患患者が様々な苦痛や困難に対処し、ライフ(生存・生活・人生)の再構成を図っていく過程と、その過程に影響をもたらす対処戦略や支援環境について、特に変化の大きい発病から1年後までの経過を追い、実証的に把握することを目的とした。これにより、脳血管疾患患者に関する施策や実践ならびに脳血管疾患患者や家族のライフの再構成に役立てられる提言を行うことを目指している。本年度は、脳血管疾患患者の患者会に参加し、その様子を参加観察するとともに、患者の追跡のインタビューを行った。また、関連する先行研究をレビューし、結果を比較検討した。調査対象者の抱える苦痛・困難は、医学的な3区分である急性期、回復期、維持期の影響を受けており、急性期は「生命の維持」、回復期は「日常生活動作の訓練」、維持期は「病院からの退院後の生活の再建」とその後に続く「人生の再構成」にかかわる内容が主にあげられた。ライフの再構成に役立つものとして、「心身機能の回復」があげられ、これは維持期に入っても、微細な回復であっても、非常に重要なものであった。また、「周囲の人々の支え」はライフの再構成のために不可欠であった。

上記の結果は、欧米の先行研究の結果と似ていたが、本調査の対象者は心身機能が比較的高い在宅の患者であるにもかかわらず、「人生の再構成」には至っていない者も多く、実際のライフの再構成にはより時間がかかる可能性が示唆された。また、ライフの再構成が進んでも、症状に悩んだり再発への不安を抱いたりすることは続いており、患者の医療的ケアにおける課題も抽出された。これらの結果は論文にまとめており、投稿準備中である。
円環状対物瞳と動的ホローコーン照明を用いた無収差線形結像位相差顕微鏡法

本研究の目的は、過去の科研費の交付を受けた「能動型画像処理方式による結像光学系収差除去・補正、合成結像法」に関連する研究の延長として、収差補正処理と試料複素透過率定量評価双方に対して妨げとなる非線形結像成分の完全除去を目指すものである。これに導入される新概念は、以前の焦点移動画像平均法に代る円環状対物レンズ瞳による焦点深度拡大処理の導入であり、これに基づく新しい能動型無収差線形結像位相差顕微鏡法を開発する予定である。本研究での無収差線形結像位相顕微鏡法は結像光学系の焦点深度拡大と透過波・回折波の波数ベクトル制限から発想された。平成15年度(第1年度)においては、まず既存の結像光学系3次元結像理論に円環状対物瞳の効果を組み入れ、結像光学系(光学・電子顕微鏡等を含む)固有の状況を考慮した結像理論体系をまとめた。円環状対物レンズ瞳と8の字領域抽出フィルターの併用によって以前には除去しきれなかった非線形成分が大幅に除去され、再生像は線形結像成分のみで形成されるものと期待される。さらに本理論に基づき動的ホローコーン照明下での無収差線形結像位相顕微鏡3次元結像のシミュレーションを実施した。平成16年度(第2年度)にはこれらの結像シミュレーションの結果を基に、既設透過型光学顕微鏡鏡体の照明系に動的ホローコーン照明装置を取り付けるとともに、円環状瞳付き対物レンズを装着して、「能動型無収差線形結像位相顕微鏡」のテストベンチを完成した。本装置により得られた観察像に上記処理を適用することで、非線形結像成分の除去と位相物体の無収差観察が同時に実現されることが確認できた。本手法は光学顕微鏡におけるまったく新しい結像方式であるとともに、位相板の実現が困難である透過型電子顕微鏡への応用が大いに期待できるものである。本研究の第1の目的は、過去の科研費の交付を受けた「能動型画像処理方式による結像光学系収差除去・補正、合成結像法」に関連する研究の延長として、収差補正処理と試料複素透過率定量評価双方に対して妨げとなる非線形結像成分の完全除去を目指すものである。平成15年度(第1年度)においては、まず既存の結像光学系3次元結像理論に円環状対物瞳の効果を組み入れ、結像光学系(光学・電子顕微鏡等を含む)固有の状況を考慮した理論体系をまとめた。さらに本理論に基づき動的ホローコーン照明下での無収差線形結像位相顕微鏡3次元結像のシミュレーションを継続中である。以上のシミュレーションの結果を基に、平成16年度(第2年度)に試作予定の「無収差線形結像位相顕微鏡」の設計を開始し始めた。既設の透過型光学顕微鏡鏡体の照明系に取り付けられる動的ホローコーン照明装置と、焦点位置制御機構と円環状瞳を有する新対物レンズの設計が課題である。一方、顕微鏡に対する能動制御と画像データー収集処理サブシステムについては、過去の研究で開発したPCシステムが小改造で利用できる見通しである。

本研究の目的は、過去の科研費の交付を受けた「能動型画像処理方式による結像光学系収差除去・補正、合成結像法」に関連する研究の延長として、収差補正処理と試料複素透過率定量評価双方に対して妨げとなる非線形結像成分の完全除去を目指すものである。これに導入される新概念は、以前の焦点移動画像平均法に代る円環状対物レンズ瞳による焦点深度拡大処理の導入であり、これに基づく新しい能動型無収差線形結像位相差顕微鏡法を開発する予定である。本研究での無収差線形結像位相顕微鏡法は結像光学系の焦点深度拡大と透過波・回折波の波数ベクトル制限から発想された。前年度に実施した既存の結像光学系3次元結像理論に円環状対物瞳の効果を組み入れ、結像光学系(光学・電子顕微鏡等を含む)固有の状況を考慮した理論体系を基に、平成16年度(第2年度)には、既設透過型光学顕微鏡鏡体の照明系に動的ホローコーン照明装置を取り付けるとともに、円環状瞳付き対物レンズを装着して「能動型無収差線形結像位相顕微鏡」のテストベンチを完成した。制御、画像データー収集システムによりLANを介して収集された画像データーは処理用PCに転送される。これらの画像データーに対して上記の処理を適用することで、非線形結像成分の除去と位相物体の無収差観察が同時に実現されることが確認できた。さらに電子顕微鏡への適用を考慮して、動的ホローコーン照明時の磁束漏洩による像移動効果の影響に関する解析を行うとともに、像移動の評価と補正手段を提案した。以上のように本手法は光学顕微鏡におけるまったく新しい結像方式であるとともに、位相板の実現が困難である透過型電子顕微鏡についても、この手法の応用が大いに期待できるものである。
配偶子および胚性幹細胞をベクタ-とする遺伝子導入動物作出に関する基礎研究

1.配偶子による遺伝子導入のための基礎的検討.精子を経由する遺伝子導入動物作出の可能性についてマウスを用いて検討した。すなわち,DNAとしてSV40プロモ-タ-に大腸菌βガラクトシダ-ゼ遺伝子を連結したものを用い,体外受精の条件下で受精卵への導入を検査した。その結果,卵割期胚の組織化学的検査によっても,また移植後の胎子におけるDNAの分析においても,外来性DNAが導入された形跡は全く認められなかった。従って,少くとも通常の体外受精の条件下では精子を経由する遺伝子の導入はきわめて困難であると結論された。しかし本研究を通して外来性DNAの発現を初期胚で検出する系が確立され,また卵丘細胞層除去および透明帯除去卵子の体外受精の条件が改善された。2.胚性幹細胞を経由する遺伝子導入動物作出のための基礎的検討.まず,胚性幹細胞を初期胚から分離し,細胞株として樹立するための条件について検討し,129/SuJ系マウスの胚盤胞をマウス胎子由来の線維芽細胞上で培養することにより2株の樹立に成功した。そのうち,一方の細胞株(A3ー1)については,宿主胚盤胞へ注入してキメラ胚を作製し,その胚を偽妊娠雌マウスの子宮へ移植することによってキメラ雄マウスを得ることができた。このキメラ雄マウスは正常な雌との交配によって胚性幹細胞由来の産子を出産させ得ることが確認され,本研究で樹立された細胞株が機能的な生殖細胞へも分化し,遺伝子導入動物作出のための細胞として有用であると考えられた。遺伝子導入の条件については,ネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだベクタ-の導入を試み,エレトクロポレ-ションによってG418耐性の細胞株の樹立に成功した。この細胞は受容胚へ注入するとキメラ胚を形成し,偽妊娠雌マウスへの移植後キメラ個体へ発生し得ることが確認された。今後,相同組換えによる遺伝子導入の基礎が確立されたと考えられる。1.配偶子による遺伝子導入の検討.C57EL/G×DBA/2F1マウスを用いて体外受精の条件下で遺伝子導入の可能性を検討した。DNAとしてpCH110プラスミドを用い,精子前培養あるいは受精用培地へ添加して受精卵への導入を調べた。その結果,Xーgal(5ーbromoー4ーchlsroー3ーindolylーβーDーgalactoーpyranoside)を基質とする染色においても,また,移植後の胎児におけるDNAのサザン法による分析においても,外来性DNAが導入された形跡は全く認められなかった。この結果から,少くとも通常の体外受精の条件下では,受精卵への外来性DNAの導入はきわめて困難であると考えられた。2、胚性幹細胞の樹立に関する検討.胚性幹細胞を経由する遺伝子導入の条件を検討するために,初期胚からの胚性幹細胞の分離を試みた結果,C57BL/6L胚では成功しなかったが,129/SvJマウスの胚盤胞をマウス胎児由来の支持細胞上で培養することにより,2株の樹立に成功した。そのうち,一方の胚性幹細胞(A3ー1株)については,宿主胚盤胞へ注入してキメラ胚を作製し,その胚を偽妊娠雌マウスの子宮へ移植することによって一匹のキメラ雄マウスを得ることができた。

このキメラ雄は正常アルビノ雌との交配によって,宿主胚の特徴を示す野生色の産子とともに,胚性幹細胞の特徴であるアルビノの産子を出産させることに成功した。この結果は,本研究で得られた胚性幹細胞が,広範囲な組織に分化し得るのみならず,機能的な生殖細胞へも分化し,胚性幹細胞由来の産子の作出の可能性を実証するものであり,遺伝子導入動物作出のための細胞として今後の研究に役立つことを期待させるものである。なお,今回分離された胚性幹細胞は,浮遊培養することにより胚様体を形成し胚体外胚葉,心筋様細胞を含む様々な細胞へ分化すること,および染色体分析の結果,高率に正二倍体の核型を保持していることも確認した。1.配偶子による遺伝子導入のための基礎的検討.前年度の結果から通常の体外受精の条件下では精子を経由する外来性DNAの導入はきわめて困難と考えられたので,本年度は卵子への精子侵入における最大の障壁となっている透明帯を除去した条件下で体外受精を試み,得られた受精卵を個別に培養して胚盤胞まで発生させ,さらに偽妊娠雌マウスの子宮へ移植して胎子へ発生し得るか否かを検討した。その結果、79%の卵が正常に受精し,移植胚の21%に相当する37匹の正常な新生子が得られた。この発生率は対照区である無処理卵の値よりも低い値であったが,透明帯を全く欠く条件下でも,卵子は正常に受精し,発生する能力を有することを示した点で,遺伝子導入動物作出のための新しい可能性を示唆するものと考えられる。なお,卵丘細胞層のみを除去し透明帯で包まれた状態の卵子は受精しにくいこのが知られているが,この場合には受精用培地のカルシウム濃度を1.71mMから3.42mMに増加させることが受精率の向上に効果的であることも明らかにした。2.胚性幹細胞を経由する遺伝子導入のための基礎的検討.前年度の研究成果により生殖細胞への分化能力を有する胚性幹細胞を新たに分離することに成功したので,その細胞株を用いて遺伝子導入のための基礎的条件の検討を行った。まず,レポ-タ-遺伝子としてSV40またはメタロチオネイン遺伝子のプロモ-タ-領域の下流に大腸菌のβーガラクトシダ-ゼ遺伝子と連結したDNAを用いてエレクトロフュ-ジョンによるDNA導入の条件を検討した後に,ネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだベクタ-の導入を試み,G418耐性の細胞株の樹立に成功した。この細胞は受容胚に注入するとキメラ胚を構成し,偽妊娠雌マウスへの移植後キメラ個体へと発生した。しかし,現在までは,そのキメラ個体から耐性細胞株由来の子孫は得られていない。