hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファジィコーチ・プレイヤーシステムによる音声指示ロボット鉗子システムの開発

ファジィコーチ・プレイヤーシステムの枠組みで,人によるロボットへの知識の付与とそのロボットの行動獲得を目指して,人とロボットの知的協調制御の仕方について論じる基礎的研究を行った.具体的タスク環境としては,ロボットマニピュレータによるロボット鉗子の音声指示による位置・姿勢制御を想定し,その有用性を実験を通して検証した.さらに,マニピュレータそのものの音声制御に関して,幾つかの知的な音声教示法,音声言語理解法についても付加的研究を行った.ファジィコーチ・プレイヤーシステムの枠組みで,人によるロボットへの知識の付与とそのロボットの行動獲得を目指して,人とロボットの知的協調制御の仕方について論じる基礎的研究を行った.具体的タスク環境としては,ロボットマニピュレータによるロボット鉗子の音声指示による位置・姿勢制御を想定し,その有用性を実験を通して検証した.さらに,マニピュレータそのものの音声制御に関して,幾つかの知的な音声教示法,音声言語理解法についても付加的研究を行った.本年度の前半では、ユーザとロボットが同時環境下にいる「音声・直接観測方式によるファジィコーチ・プレイヤーシステム」での鉗子運動制御、特に、従来の2指ハンド機構を介した回転プーリーによる鉗子の開閉機構の試作ならびに位置・姿勢制御システムを開発した。後半では、同時環境下あるいは遠隔環境下でのモニター画像を利用する「音声・間接観測方式によるファジィコーチ・プレイヤーシステム」での問題を扱った。ロボットに音声で「右に動け」などの直接的な動作の教示を行うだけでは、ロボットは「赤い物体の目的地へ移動する」などの具体的なタスクを効率よく、あるいは一気に実行できない。そこで研究では、タスクを表す大域的教示と直接的な動作を表す局所的教示の2つに音声教示を分けたファジィコーチ・プレイヤーシステムについて検討した。このようなシステムをロボット鉗子システムに適用し、その有効性を実験を通して検証した。ただし、局所的教示の自然言語に含まれる「ちょっと」などのあいまいな表現は、状況や主観的尺度に依存するものであり、一般的な解釈は困難である。そこで、ここでは程度を表す副詞をファジィ推論によって定量化しマニピュレータ動作に反映させる方法を採用した。2008年度は,前半では,二次元画像では奥行きが判断しにくいので三次元位置姿勢の動作のための教示について検討し,特に,照明により鉗子の影を発生させる方法を検討し,実験による有効性を示した.後半は,鉗子先端位置の直接の画像情報の他に,補助情報を付加し鉗子先端の位置をユーザに知らせることにより3次元方向の鉗子の操作がやりやすくなった.ただし,ユーザに提示する補助情報としては,鉗子先端の3次元位置情報と音声指示による移動量を画面に表示させた.また,鉗子先端位置と音声指示情報,あるいは前回の移動量と音声指示情報を用いたファジィルール後件部の更新法を提案し,より各ユーザとの親和性を向上させることができた.平成21年度はこれまでのまとめとして,マニピュレータそのものの音声制御に関して,あいまいな音声言語を理解するための「内部リハーサル法」と「音声キューによるロボット知覚の適応化」について,付加的研究を行った.「少し」のようなあいまい言語の用語に関する定量的評価は,周辺環境の空間配置に依存する.過去の運動に関するロボットの経験は,ある状況依存な手法でそのような情報を解釈するのに非常に有用である.したがって,内部リハーサル法の研究では,過去の運動に関するロボットの経験を獲得するために「内部リハーサルシステム」を導入した.あるロボットマニピュレータのエンドエフェクター動作や単一関節運動を原始運動として考えるとき,提案システムをその原始運動に関係するあいまい音声指令値を評価するために使った.ただし,原始運動は内部リハーサルシステムのガイドを用いて「行動評価ネットワーク」により実現した.提案法の概念は,ユーザの作業空間内でPA-10ロボットマニピュレータをナビゲートさせることで説明し,対応環境のロボット経験を獲得することで,あいまい言語情報をよりよく評価できることを実証した.一方,音声キューによるロボット知覚の適応化では,音声キューを評価することであいまい言語情報についてのロボット知覚を適応化する一手法を提案した.前の研究と同じように「ほんの少し」のようなあいまい言語情報についてのロボット知覚は,環境配置やユーザの期待値に依存する.したがって,対応する環境についてロボット知覚は,音声キューを通してのユーザの知覚を獲得することで修正できる.また,原始運動に関係するあいまい言語情報は,行動評価ネットワークで評価した.さらに,音声キュー評価システムは,行動評価ネットワークを修正するための音声キューを評価するのに利用した.
小児てんかんにおける脳波基礎波活動および事象関連電位(P300)の発達特徴

てんかん児約150例において、脳波基礎波活動の定量的評価および聴覚事象関連電位(P300)を経時的に測定し、てんかんにおける発達障害の特徴を検討し以下の結果を得た。1.脳波基礎波活動:1)除波化はてんかん児全般で認められ、その程度および年齢発達は各てんかん症候群によって特徴的であった(部分>全般,症候性>特発性)。2)除波化の原因:てんかん症候群(てんかん原性)が最も重要であるが、年齢因子(低年齢で除波化は顕著)および発作予後も関係していた。一方、抗痙攣剤投与の影響は比較的小さく、さらに薬剤種類は投与時期によって若干影響が異なることが示唆された。3)基礎波活動の経過中の発達は予後と密接に関係しており、治療中止後の再発予測の良い指標になることが推測された。2.P300潜時:1)潜時の延長はてんかん児で広く認められ、その程度および年齢発達はてんかん症候群で明らかに違った(症候性部分>特発性全般>特発性部分≧正常)。2)延長の原因:てんかん症候群,年齢因子が主であり、抗痙攣剤の影響は小さかった。また、延長は高年齢児または経過が長くなるに従って顕著となり、障害が累積する可能性が推測された。3.基礎波活動とP300潜時:1)正常児では両所見は良好な相関を示した。2)てんかん児ではこの相関が弱く、基礎波に比べP300潜時の発達が不良である傾向を認めた。しかし、特発性部分てんかんだけは正常児類似の相関を示した。小児てんかんにおいては何らかの発達障害,認知機能障害が広範囲に合併していることが示唆された。小児てんかんの診療においては、発作抑性のみに終始することなくこの発達障害に対する療育・教育も平行してゆくことが重要であり、包括的医療に繁がるものと思われる。てんかん児約150例において、中枢神経系の発達の指標として脳波基礎波活動を定量的(パワースペクトル分析)に評価し、認知機能の客観的な指標として聴覚事象関連電位P300を経時的に測定し、以下の結果を得た。A.てんかん児の基礎波活動:1)正常児に比較して有意に徐波(δ,θpower)の混入が多い、2)徐波化の程度はてんかん症候群間で明らかに異なる、3)年齢に伴う変化もてんかん症候群間で異なる、4)年齢発達はてんかん発作の予後と密接に関連する、5)抗痙攣剤はある程度影響するが、その影響は抗痙攣剤の種類・投与時期によって異なる。B.てんかん児のP300潜時:1)正常児に比較して延長する、2)延長程度はてんかん症候群で明らかに異なる、3)年齢発達は各てんかん症候群で特徴的であり、また、高年齢児ほど延長が目立つ、4)抗痙攣剤は影響するがその程度は軽い。C.基礎波活動とP300潜時の比較:1)てんかん児では両検査結果の相関が比較的弱く、基礎波活動の変化に比べてP300潜時の変化が小さい、2)てんかん症候群によって両者の相関関係は異なり、特発性部分てんかんのみが正常児類似の相関を認める。てんかん児においては中枢神経系の発達障害、何らかの認知機能障害が広範囲に存在しており、その障害の程度はてんかん症候群、発作予後、年齢経過、抗痙攣剤療法など多くの因子に影響されていることが示唆された。また、両機能の発達は若干異なっていることが推察された。今後、影響因子をさらに明確にし発達障害の予防法、てんかんの包括的治療の開発に役立てる予定である。

小児てんかん約150例において、脳波基礎波活動の定量的分析(パワースペクトラム解析)および聴覚事象関連電位(P300)を経時的に測定し、小児てんかんにおける中枢神経系および認知機能の年齢発達を定量的に評価した。本年度は特に抗痙攣剤のこれらの発達に与える影響について検討した。1.脳波基礎波活動、1)治療開始前後での変化:Carbamazepine(CBZ)を投与した部分てんかん例では投与3-6カ月後に基礎波活動の有意な徐波化を認めた。これに対して、Valproicacid(VPA)を投与した全般てんかん例では変化は認めなかった。2)投与中の変化:CBZおよびVPA投与群とも、発作抑制が良好な例では基礎波活動の年齢発達は認められた。しかし、変化率は正常小児に比べて若干小さかった。3)治療中止前後での変化:全体的に中止後に明らかな基礎波活動のcatchup(θの減少,α-2の増加)を示す傾向を認めた。2.P300潜時(特発性部分てんかんにおける検討)、1)治療前後での変化:抗痙攣剤投与にも拘わらず潜時の短縮を示す傾向を認めた。2)投与中の変化:正常児に比べて軽度の延長を示すが年齢経過による潜時の短縮は認められた。3)治療中止前後での変化:多くの例では中止直前までにほぼ正常な潜時に改善していたが、一部の例では中止後に明らかな短縮を示した。抗痙攣剤療法は中枢神経系の発達(基礎波活動の年齢変化)に対して、主たる原因ではないもののある程度影響しており、且つ薬剤の種類によって若干その程度が異なることが示唆された。一方、認知機能の発達(P300潜時)に対しては、影響は極めて少ないことが推察された。以上より、小児てんかんに存在する両機能の発達障害は、主にてんかん原性そのもの,発作予後などに起因していることが推察された。
MDPレセプターと細胞内シグナル伝達機構

従来細菌細胞壁ペプチドグリカン(MDPを含む)およびリポポリサッカライド(LPS)等々の細菌細胞壁成分によるマクロファージ活性化に関する研究は,形態学的変化,代謝変化,モノカイン産生能の増加等を観察する「現象論的」解析が主流であり,活性化物質とそのレセプターとの反応,さらにはその後に起こる細胞内シグナル伝達というような「機序論的」解析は進んでいない。それゆえ,MDPを含む細菌細胞壁成分によるマクロファージ活性化のメカニズムをレセプターおよびそれが介在した膜情報伝達機構の解析に焦点を絞って研究を行う事を試みた。細菌細胞壁成分によって活性化されたマクロファージは,形態変化およびモノカイン産生増強等々の代謝変化を生じると同時に,DNA合成が抑制され,細胞周期がGI期で停止することを見い出した。この現象はマクロファージが細菌細胞壁成分で活性化され,より強力な生体防御活性を持つ細胞へと分化する初期変化を観察していると考えられるので,本反応をマクロファージ活性化の指標とした。レセプターの解析は充分進めることはできなかったが,レセプター以後の膜情報伝達においてマクロファージのDNA合成抑制にはサイクリックAMP依存性リン酸化酵素(A kinase)が関与している結果が得られた。細菌細胞壁成分で活性化されたマクロファージのDNA合成抑制は,Thymidine kinase活性が特異的に低下すること,さらにThymidine kinase活性の低下は本酵素のmRNAの発現低下によった。現在,どのような機序でThymidine kinaseのmRNAの発現が低下するのかを解析するため,RBタンパク,E2Fあるいはサイクリン/サイクリン依存性リン酸化酵素の動態等々を調べている。さらに,A kinaseの活性化とThymidine kinaseのmRNA発現低下がどのように関連しているのかを,今後検討していかなければならないと考えている。
タンパク質性アミロイド線維凝集過程における生物学的毒性評価とその抑制

神経変性病を引き起こすタンパク質(αシヌクレイン,SOD1,Aβペプチド)のアミロイド線維形成メカニズムや特徴をアミノ酸レベルで明らかにするとともに,その過程で生じる凝集分子種の細胞毒性について評価した。また,アミロイド線維凝集形成を抑制するアントシアニンの作用機作や特徴について分子論的に明らかにした。アントシアニンは細胞毒性を有しない非アミロイド性の凝集体に導く働きをしていることが分かった。多くのタンパク質は構造変化によってアミロイド線維というβ構造に富んだ凝集体を形成することが分かっている。特に神経変性病に関わるタンパク質をターゲットにしてそのアミロイド線維形成メカニズムの分子論的詳細と形成される過程で生じる分子種の細胞毒性,さらにこれらの構造を形成する生理学的意義について研究を行っている。本年度は以下について明らかにした。パーキンソン病発症原因であるαシヌクレインタンパク質を用いたアミロイド線維形成機構について,蛋白質工学的手法を駆使して研究を行い,その核部位周辺の負電荷と正電荷のバランスの重要性を明らかにした。また,筋側索硬化症発症原因タンパク質であるSOD1のin vitroでのアミロイド線維形成とその制御メカニズムに関しても分子内部のジスルフィド結合が重要であることを明らかにした。さらに,病気とは関連性のないものの,変性条件下では典型的なアミロイド線維を形成することを独自に見出しているコシャペロニンGroESを用いて,その凝集過程やアミロイド線維自体の細胞毒性を調べた。その結果,アミロイド線維形成途中の中間体分子種に高い細胞毒性があることを初めて発見した。また,ポリフェノールの一種であるアントシアニンによって,このアミロイド線維形成がほぼ完全に抑制されるとともに,すでに形成されたアミロイド線維も可溶化されることが明らかになった。また,途中に生じた細胞毒性を示す分子種の形成もアントシアニンによって抑制され,その結果,無毒化されることが判明した。現在そのメカニズムについて詳細を検討している。多くのタンパク質は様々な条件下でコンフォメーションが変化することでβ構造に富むアミロイド線維という凝集体を形成することが知られている。中でも脳神経変性病に関連するタンパク質がどのようにコンフォメーション変化をして,アミロイド線維形成をするかという分子論的メカニズムと凝集過程で生じる細胞毒性やそれらの制御方法について研究を行った。本年度は特にパーキンソン病発症に関わっているαシヌクレインタンパク質のアミロイド線維凝集形成機構とその制御について研究を行い,以下について明らかにした。αシヌクレインタンパク質は本来立体構造を有しておらず,溶液中では非常に柔軟性に富む,いわゆる天然変性タンパク質である。このタンパク質を試験管内で長時間インキュベーションするとアミロイド線維凝集を形成するが,このときアミロイド核を形成する疎水性に富むアミノ酸残基領域とその前後周辺に存在している正電荷と負電荷アミノ酸残基は,アミロイド線維凝集形成に重要な因子となり得ることを蛋白質工学的変異導入法によって明らかにした。また,アミロイド線維の安定性にもこの電荷が効いていることが明らかになった。さらに,アミロイド線維の形成と溶解に超音波照射が効果的であることも分かった。αシヌクレインのアミロイド線維は超音波照射によって分解されるが,返って細胞毒性が高くなることが明らかになった。これらの結果は,αシヌクレインのアミロイド線維凝集と細胞毒性の制御は複雑であることを示している。一方,アルツハイマー病の原因ペプチドAβ1-42の凝集抑制にポリフェノールが有効であることも明らかにし,その細胞毒性も調べた。モデルマウスの実験結果も現在得られつつある。神経変性病の発症原因の一つに蛋白質の凝集が関与している。β構造に富んだアミロイド線維形成中に細胞毒性を示す分子種が生じることが問題であり,その分子種の形成メカニズムの解明と蛋白質アミロイド線維形成を抑制することが重要である。今年度は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因蛋白質であるスーパーオキシドディスムターゼ(SOD1)とアルツハイマー病の原因ペプチドであるAβのアミロイド線維形成メカニズムを調べるとともに,ポリフェノールの一種であるアントシアニンを用いたアミロイド形成抑制について詳細に調べ,以下の点を明らかにした。(1) SOD1のアミロイド線維形成メカニズムについて蛋白質の構造安定性と関連させて詳細に調べた結果,銅と亜鉛が脱離したアポ体のSOD1の分子内部に位置するSS結合がさらに還元されるとアミロイド線維がすみやかに形成されることが明らかになった。家族性変異体であるSOD1の場合では,アポ体SOD1蛋白質自体がかなり不安定化されており,生体内の還元環境下でその変異体SOD1のSS結合が還元されやすいのでアミロイド線維形成が早く起こることが明らかになった。この結果は家族性ALSの早期発症原因が蛋白質科学的に説明できることを示している。(2) Aβ42が形成するアミロイド線維反応中に生じるオリゴマー分子種がマウス神経細胞であるNeuro2Aに対して毒性を示すことが分かった。しかし,アントシアニンを共存させると不定形の凝集体は生じるものの,アミロイド線維は形成されず,細胞毒性も見られなかった。また,アルツハイマー病モデルマウスにアントシアニンを豊富に含むビルベリーエキスを食餌に混ぜて摂取させると,摂取していないマウスに比べて短期記憶力の低下が抑制されることが明らかになった。このことはアルツハイマー病の発症予防にアントシアニンが有効であることを示している。

また,アミロイド線維凝集形成を抑制するアントシアニンの作用機作や特徴について分子論的に明らかにした。アントシアニンは細胞毒性を有しない非アミロイド性の凝集体に導く働きをしていることが分かった。アミロイド線維凝集を形成するパーキンソン病発症原因タンパク質のαシヌクレインの反応機構をアミノ酸レベルで明らかにできたこと,そして中間体分子種の細胞毒性評価ができたことなど,研究は順調に進んでいる。生物学脳神経変性病の主要なものであるアルツハイマー病の原因ペプチドAβ1-42の凝集と細胞毒性の関係についてマウスを利用した研究成果をしっかりと出して行く予定である。また,ポリフェノールの有効性についてもin vivoでの結果をはっきりとさせる。さらに,ALSに関係するSOD1や白内障に関わるクリスタリン蛋白質の凝集抑制についても発展的に調べることにしている。アミロイド線維凝集を形成するパーキンソン病発症原因タンパク質のαシヌクレインやアミロイド線維形成モデルタンパク質であるGroESを用いて,アミロイド線維形成の特徴をクローズアップするとともに,中間体である分子種に細胞毒性があることを突き止め,さらにその制御と毒性の中和できるポリフェノール,アントシアニンの効果を実験的に明らかにできた点で,研究は順調に進んでいる。脳神経変性病に直接関わるタンパク質や白内障に関わるクリスタリンについても同様な方法を調べていく予定である。すなわち,パーキンソン病原因タンパク質のαシヌクレインのアミロイド線維形成中に生じる細胞毒性について,蛋白質科学的にさらに明らかにするとともに,細胞毒性を調べる。また,アルツハイマー病原因ペプチドAβについても同様に細胞毒性を調べ,ポリフェノールのアントシアニンが有効かどうかをさらに追求していく予定である。さらにクリスタリンの凝集にも効果があるかどうかを調べる。
病理形態学へのフラクタル幾何学の応用

本研究は生体における形の変化を客観的および定量的に評価する方法を検討し、病理学へ応用することを目的としている。フラクタル幾何学を生体の構造に応用するためのコンピュ-タ-画像解析法の確立、および生体のいろいろな構造のフラクタル次元の測定を行った。その結果は次のようにまとめられる。(1)科学研究費によって購入したマルチ計測ユニット、モニタ-テレビ、顕微鏡照明装置など用いて、顕微鏡の画像を直接コンピュ-タ-で画像処理できるシステムを開発した。(2)パタ-ンの自己相似性(フラクタル性)を確かめるための画像処理プログラムを作成した。Boxーcounting法(正方形のます目により画像の分布の特徴を調べる方法)およびMassーRadius法(同心円の中の画像の分布を基にして調べる方法)の両者についてプログラムを作成した。(3)実験動物(ネコ20匹、ウサギ2羽、ラット15匹)の脳血管内に鋳型用樹脂を注入し、その後サリチル酸メチルまたはグリセリンにより組織を透明化して血管の標本を作成した。さらに上記の画像解析により血管分布のフラクタル性を調べた。ネコの脳表の動脈では10ー120ミクロンの観測ケ-ル範囲でフラクタル次元が1.30±0.03であり、140ミクロン以上のスケ-ルでは1.79±0.02であった。ラットではそれぞれ1.18±0.03および1.74±0.02であり、小さいスケ-ル範囲での次元に有意に差が現れた。(4)ヒト蛍光眼底血管像(13例)について同様にしてフラクタル性を調べた。この血管の分布も測定のスケ-ルによって、2つのフラクタル次元で特徴づけられることが分かった。ヒト網膜の血管は、高血圧や糖尿病性網膜症などによって拡張や蛇行を示すが、これらの変化は小さい方のフラクタル次元に主として反映され、大きい方の次元には余り反映されないことが明らかになった。血管の場合にスケ-ルによって2つの次元が出てくることは、血管の分布が「一様でないフラクタル」になっているためと考えられる。(5)消化管粘膜の光反射像や神経細胞の樹状突起もまた1桁程度のスケ-ルでフラクタル性を示す。以上のように、生体のいろいろな形の複雑さがフラクタル次元で表されること、眼底の血管像の変化が次元の値で定量化し得ることが明らかになった。しかし次元を測る方法によってその値に若干の違いが出ること、形の変化がどの様に次元の値に反映するのかなどの基礎的問題が今後の課題として残されている。本年度は、フラクタル幾何学を生体の構造に応用するためのコンピュ-タ-画像解析法の確立、および血管分布のフラクタル性の測定を行った。

(1)現有のパ-ソナルコンピュ-タ-と顕微鏡を、科学研究費によって購入したマルチ計測ユニット(JEー12C)およびモニタ-(PMー953T)を通して結合し、顕微鏡の画像を直接コンピュ-タ-で処理できるようにした。また顕微鏡撮影の精度を上げるために、対物レンズ(DFPLAN 2X)および照明装置を購入した。(2)パタ-ンの自己相似性(フラクタル性)を確かめるための画像処理プログラムを作成した。Boxーcounting法(正方形のます目により画像の分布の特徴を調べる方法)およびMassーRadius法(同心円の中の画像の分布を基にして調べる方法)の両者についてプログラムを作成し、それぞれの結果を比較した。(3)実験動物(ネコ15例、ラット8例)の脳血管内に鋳型用樹脂を注入し、その後サリチル酸メチルまたはグリセリンにより組織を透明化して血管の標本を作成した。さらに上記の画像解析により血管分布のフラクタル性を調べた。またヒト蛍光眼底血管像(13例)について同様にしてフラクタル性を調べた。その結果、血管の分布は測定する尺度によって、2つのフラクタル次元で特徴づけられることが分かった。例えば、脳表の動脈では10ー120ミクロンの観測スケ-ル範囲でフラクタル次元が1.30となり、140ミクロン以上のスケ-ルでは1.79となることなどが分かった。(4)ヒト網膜の血管は、高血圧や糖尿病などによって拡張や蛇行を示すが、この様な変化は小さい方のフラクタル次元に主として反映され、大きい方の次元には余り反映されないことが明らかになった。以上のように生体でのフラクタル次元を求める方法が確立した。今後計測例を増やしていくと共に、2つの次元の出てくる原因を調べていく必要がある。本研究は生体における形の変化を客観的および定量的に評価する方法を検討し、病理学へ応用することを目的としている。フラクタル幾何学を生体の構造に応用するためのコンピュ-タ-画像解析法の確立、および生体のいろいろな構造のフラクタル次元の測定を行った。その結果は次のようにまとめられる。(1)科学研究費によって購入したマルチ計測ユニット、モニタ-テレビ、顕微鏡照明装置など用いて、顕微鏡の画像を直接コンピュ-タ-で画像処理できるシステムを開発した。Boxーcounting法(正方形のます目により画像の分布の特徴を調べる方法)およびMassーRadius法(同心円の中の画像の分布を基にして調べる方法)の両者についてプログラムを作成した。(3)実験動物(ネコ20匹、ウサギ2羽、ラット15匹)の脳血管内に鋳型用樹脂を注入し、その後サリチル酸メチルまたはグリセリンにより組織を透明化して血管の標本を作成した。ネコの脳表の動脈では10ー120ミクロンの観測ケ-ル範囲でフラクタル次元が1.30±0.03であり、140ミクロン以上のスケ-ルでは1.79±0.02であった。ラットではそれぞれ1.18±0.03および1.74±0.02であり、小さいスケ-ル範囲での次元に有意に差が現れた。(4)ヒト蛍光眼底血管像(13例)について同様にしてフラクタル性を調べた。この血管の分布も測定のスケ-ルによって、2つのフラクタル次元で特徴づけられることが分かった。
森林の空間構造が植物-植食者-寄生蜂群集の動態に及ぼす影響の機械的解明

本研究は、樹木の分布様式に基づく寄生蜂-植食者-植物の三栄養段階が構成する空間構造が、野外の寄生蜂-植食者群集動態に及ぼす影響を「機械論的」に解明することを目的とした。昨年度までに得られたデータを用いて、いくつかの研究論文を発表した。これらは、森林生態系における、植食者-寄生蜂群集構造に森林の空間構造が与える影響(Hirao and Murakami 2007, Murakami et al. in press)、森林に対する大規模攪乱が昆虫群集に与える影響(Hirao at al. 2007)、植食性昆虫の群集形成過程に、餌となる植物の種類、樹木の空間分布、大スケールでの森林構造(攪乱)、さらに、生物間の相互作用(捕食者の影響)が確認された。これらの成果は、これまで、個別に扱われてきた、群集の形成機構に関わる要因を大規模に、統一的に把握している点で重要である。しかし、現状ではこれらの要因んお効果を個別に検討するに留まっており、今後も、これらの要因相互の関係、またその相対的な重要性を解明するために、解析をすすめていく。17年度、本経費により標題の研究課題について以下の調査を行った。1. LMと寄生蜂の分布様式に関する野外調査研究林内の調査プロットにおいて、LM個体数を全樹木個体でカウントし、一部を採集して飼育した。羽化したLMか寄生蜂を回収し同定を行った。その結果をもとに、量的食物網を構築し、その特徴を評価した(投稿中)、2. LM種間の間接相互作用の解析各樹木ごとの寄生率と、各樹木でのLM個体数および森林の構造に関するデータを元に、周辺の樹木個体からの効果を考慮した、LM種間の間接相互作用についてのモデルを構築した。これらの要因を、一般化線形混合モデルに取り込み解析した。その際、周辺個体の影響を対象樹種からの距離関数で重み付けし、その程度により複数のモデルを用意し、モデル選択により最適モデルを選択することにより、空間構造=寄生蜂の探索範囲を具体化する。ここで得られた寄生蜂分布の集中度を用いて、数理モデルを再構築し、シミュレーションを行い、樹木個体間のLM相互作用を定式化する。樹木の空間分布様式、あるいは寄生蜂の種により共生-中立-競争の関係が変化し、その森林内での分布が解明した(投稿準備中)。本研究の成果として、原著論文および総説を発表したほか、国際学会、国際シンポジウム、国内の学会において研究成果を口頭発表した。さらに、複数の原著論文を投稿中および投稿準備中である。18年度は本経費により、標題の研究課題について以下の調査を行った。1.広葉樹、樹木上に成立する鱗翅目幼虫群集の群集構造決定機構の解明研究林内の林冠クレーンを用い、広葉樹10種類に成立する鱗翅目群集を記載し、その構造の決定機構を解析した。(研究業績1,3)2.LMと寄生蜂の分布様式に関する野外調査研究林内の調査プロットにおいて、LM個体数を全樹木個体でカウントし、一部を採集して飼育した。その結果をもとに、量的食物網を構築し、その特徴を評価した。(研究業績2)3.LM種間の間接相互作用の解析各樹木ごとの寄生率と、各樹木でのLM個体数および森林の構造に関するデータを元に、周辺の樹木個体からの効果を考慮した、LM種間の間接相互作用についてのモデルを構築した。その際、周辺個体の影響を対象樹種からの距離関数で重みつけし、その程度により複数のモデルを用意しモデル選択により最適モデルを選択することにより、空間構造=寄生蜂の探索範囲を具体化する。ここで得られた寄生蜂分布の集中度を用いて数理モデルを再構築し、シミュレーションを行い、樹木個体間のLM相互作用を定式化する。樹木の空間分布様式、あるいは寄生蜂の種により共生-中立-競争の関係が変化し、その森林内での分布が解明した。(投稿準備中)本研究の成果として、原著論文を発表したほか、国内の学会において研究成果をポスター発表した。
各種固形癌におけるアミノペプチダーゼNの発現機序の解明及びその阻害剤の臨床応用

現在までに我々は、APNが癌細胞運動および血管新生の過程で、癌の転移形成、進展に関わっていることを明らかにした。そこで臨床応用を目標に、キリン麦酒(株)が確立したKMマウスを使用し、これを免疫して数種のヒト型モノクローナル抗APN抗体を作製した。その中でもヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19-12抗体は強いAPN活性抑制効果を示した。その効果はマウスMH7-5抗体やマウスMH8-11抗体よりも強い抑制効果を示した。同一のAPNを認識するヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19-12抗体を比べると、ヒト型MT95-4抗体のAPN活性抑制効果はかなり高い。この相違の原因として、異なる糖鎖構造を認識していることが考えられるので、APNの修飾糖鎖構造を明らかにしてその生理機能を明らかにすることを検討中である。これまでに、実際の肺癌・膵癌・大腸癌患者の切除標本を用いてAPN発現とその予後との関係をretrospective studyを行い検討し、APN発現と共に予後が悪化し、APN発現は予後不良因子となることを明らかにした。膵癌・肺癌では、APNの発現と血管新生が相関することも明らかにした。また我々は、抗APN抗体の機能を動物実験で検討し、抗APN抗体で肺転移を著明に抑制できることを明らかにした。我々が作製したヒト型抗APN抗体は転移を抑制する機能を持つ世界では類を見ないユニークな抗体であり、ヒト化抗体やキメラ抗体に比べ、副作用は更に少ないと考えられ、直ちに臨床応用可能であると考える。我々は今まで血管新生を抑制するモノクローナル抗体MH8-11を作製し、抗体クローニングから、これがAminopeptidase N(APN)/CD13を認識していることを明らかにしてきた。マウス黒色腫の低肺転移株B16-F1にAPNを強発現させる高肺転移株に変化し、APNが転移能に関与していることを明らかにした。肺癌、大腸癌、膵癌の手術標本を用いて、APNと血管新生の関係を検討したところ、APNの発現は血管新生と関与しかつ予後不良因子になることが判明した。また、我々が作製したMH7-5抗体もAPNを認識していたが、MH7-5抗体では160kDaと120kDaのバンドが存在するのに対し、MH8-11抗体は150kDaのみであった。これは糖鎖の修飾によることが判明したので、糖鎖の変化により転移能が変化するか現在検討している。次に、F1高肺転移株を用いたマウス実験で、抗APN抗体で肺転移を抑制可能かどうか検討した。MH8-11抗体投与群では肺への転移数は41.4±24.4であったのに対して対象群では98.3±41.8と、MH8-11抗体を投与すると肺転移を効果的に抑制することができた(p=0.0043)。このように、APN自体が転移、血管新生促進遺伝子としての性格を有しており、その制御は転移の抑制に非常に役に立つと考えられた。そこで、我々は初めMH8-11を用いてヒト化キメラ抗体を作成しようとしたが、失敗に終わった。次に、キリン麦酒(株)との共同研究によりその人型抗体遺伝子を持ったKMマウスを用いて、人のAPNを認識していると思われるヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマM2-E95,M2-F19,M2-F80を作成することに成功した。これらはいずれも、IgG抗体であり、強いADCC効果を要しており、APN陽性癌患者に対して強力な抗体作用の成果を期待できると思われる。

そこで臨床応用を目標に、キリン麦酒(株)が確立したKMマウスを使用し、これを免疫して数種のヒト型モノクローナル抗APN抗体を作製した。その中でもヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19-12抗体は強いAPN活性抑制効果を示した。その効果はマウスMH7-5抗体やマウスMH8-11抗体よりも強い抑制効果を示した。同一のAPNを認識するヒト型MT95-4抗体とヒト型MT19-12抗体を比べると、ヒト型MT95-4抗体のAPN活性抑制効果はかなり高い。この相違の原因として、異なる糖鎖構造を認識していることが考えられるので、APNの修飾糖鎖構造を明らかにしてその生理機能を明らかにすることを検討中である。これまでに、実際の肺癌・膵癌・大腸癌患者の切除標本を用いてAPN発現とその予後との関係をretrospective studyを行い検討し、APN発現と共に予後が悪化し、APN発現は予後不良因子となることを明らかにした。膵癌・肺癌では、APNの発現と血管新生が相関することも明らかにした。また我々は、抗APN抗体の機能を動物実験で検討し、抗APN抗体で肺転移を著明に抑制できることを明らかにした。我々が作製した、ヒト型抗APN抗体は転移を抑制する機能を持つ世界では類を見ないユニークな抗体であり、ヒト化抗体やキメラ抗体に比べ副作用は更に少ないと考えられ、直ちに臨床応用可能であると考える。
大脳基底核の発達形成におけるNetrinの機能的役割

線条体の軸索投射神経細胞はGABA作動性であり、コンパートメント構造の構成要素である早生まれのpatch細胞と遅生まれのmatrix細胞に大別される。これまでの研究で、matrix細胞が産生され、外向きに遊走する時期に一致して、ventricular zoneでnetrin-1が発現・分泌され濃度勾配を形成していることを見出した。また、netrin-1の受容体と考えられているDCCの発現様式はnetrin-1のそれと相補的であった。Matrix cellsのprecurserである線条体のsubventricular zone (SVZ) cellsとnetrin-1分泌型HEK293-EBNAcellsをcollagen gel存在下で共培養した結果、netrin-1はSVZ cellsに対して反発因子として作用しており、このnetrin-1のrepulsive actionは抗DCC抗体の添加によって完全に阻害された。さらに、切片培養で、Matrix細胞が産生される時期にSVZ cellsをBrdUで標識すると、標識された細胞は線条体軸索投射細胞に分化しそのマーカーであるGAD, calcineurin, STEPを発現していることを証明した。以上のことから、netrinはMatrix細胞の前駆SVZ cellsの外向き遊走に関与し線条体形成において重要な役割を演じていることが判明した。そして、線条体形成には、大脳皮質からのpreplate neuronsのinward migration, medial ganglionic eminenceからの介在神経細胞のtangential migration、およびSVZからの軸索投射細胞のoutward migrationが必要であることを提唱した。これらの所見を踏まえ、現在は、黒質神経細胞の遊走に対するnetrin-1の関与について、knock-out mouseを用いた解析を行っている。線条体の軸索投射神経細胞はGABA作動性であり、コンパートメント構造の構成要索である早生まれのpatch細胞と遅生まれのmatrix細胞に大別される。これまでの研究で、matrix細胞が産生され外向きに遊走する時期に一致して、ventricular zoneでnetrin-1が発現・分泌され濃度勾配を形成していることを見出した。Matrix cellsのprecursorである線条体のsubventricular zone(SVZ)cellsとnetrin-1分泌型HEK293-EBNAcellsをcollagen gel存在下で共培養した結果、netrin-1はSVZ cellsに対して反発因子として作用しており、このnetrin-1のrepulsive actionは抗DCC抗体の添加によって完全に阻害された。さらに、切片培養実験で、Matrix細胞が産生される時期にSVZ cellsをBrdUで標識すると、標識された細胞は線条体軸索投射細胞に分化しそのマーカーであるGAD,calcineurin,STEPを発現していることを証明した。そして、線条体形成には、大脳皮質からのpreplate neuronsのinward migration, medial ganglionic eminenceからの介在神経細胞のtangential migration,およびSVZからの軸索投射細胞のoutward migrationが必要であることを提唱した。現在、線条体神経細胞の軸索形成・伸展に対するnetrin-1の作用についてさらに解析を進めている。

Matrix cellsのprecurserである線条体のsubventricular zone (SVZ) cellsとnetrin-1分泌型HEK293-EBNAcellsをcollagen gel存在下で共培養した結果、netrin-1はSVZ cellsに対して反発因子として作用しており、このnetrin-1のrepulsive actionは抗DCC抗体の添加によって完全に阻害された。さらに、切片培養で、Matrix細胞が産生される時期にSVZ cellsをBrdUで標識すると、標識された細胞は線条体軸索投射細胞に分化しそのマーカーであるGAD, calcineurin, STEPを発現していることを証明した。以上のことから、netrinはMatrix細胞の前駆SVZ cellsの外向き遊走に関与し線条体形成において重要な役割を演じていることが判明した。そして、線条体形成には、大脳皮質からのpreplate neuronsのinward migration, medial ganglionic eminenceからの介在神経細胞のtangential migration、およびSVZからの軸索投射細胞のoutward migrationが必要であることを提唱した。これらの所見を踏まえ、現在は、黒質神経細胞の遊走に対するnetrin-1の関与について、knock-out mouseを用いた解析を行っている。
乳癌におけるマイクロRNAの解析と新規バイオマーカー、分子標的治療薬の開発

エストロゲンレセプター(ER)陽性乳癌において乳癌組織のER、Ki67の発現量は内分泌療法や化学療法の奏効性および予後に関与する。我々は、ER高発現Ki67低発現(内分泌高感受性)乳癌と、ER低発現Ki67高発現(内分泌低感受性)乳癌の乳癌組織を用いてマイクロRNAとmRNAのマイクロアレイ解析を行い、ER高発現Ki67低発現乳癌で有意に発現の低いマイクロRNA,miR-1290を同定した。エストロゲンレセプター(ER)陽性乳癌において乳癌組織のERの発現量は内分泌療法や化学療法の奏効性および予後に関与する。また、ER陽性乳癌には内分泌高感受性でKi67低発現であるluminal Aと内分泌低感受性でKi67高発現であるluminal Bサブタイプが存在することが明らかとなっている。我々は、遺伝子発現制御機構の一つとして最近注目されているマイクロRNA(microRNA)について、ER遺伝子の発現調節やER陽性乳癌の生物学的特性への関与に関する研究を行ってきた(Cancer Res 2008, Breast Cancer Res Treat 2011)。今回我々は、ERの発現が高くKi67の発現が低い内分泌高感受性乳癌と、ERの発現が低くKi67の発現が高い内分泌低感受性乳癌の乳癌組織を用いてmicroRNAとmRNAのマイクロアレイ解析を行い、これら2群間でmicroRNAとmRNAの発現パターンが異なることを見出した。さらに、ERの発現が高くKi67の発現が低い乳癌で有意に発現の低いmicroRNA, miR-1290を同定し、miR-1290の発現は、このmicroRNAの標的遺伝子候補である4つの蛋白(BCL2, FOXA1, MAPT, NAT1)の発現と逆相関することを見出した。ER陽性乳癌細胞を用いた検討でも、miR-1290はFOXA1とNAT1発現を抑制した。ER陽性乳癌の生物学的特性に関与するmicroRNAと標的遺伝子が治療標的あるいは薬物療法の感受性のバイオマーカーとして有用であると推測している。幾つかのmicroRNAがER陽性乳癌の発生・進展に関与していると推測され、そのメカニズムの解明が新たな治療法の確立に繋がると考えている。本研究では、特にエストロゲンレセプター(ER)陽性乳癌について、その発生・進展に関与するマイクロRNAについて解析し、臨床的意義および新規治療薬の開発について検討することを目的としている。これまで、ER陽性乳癌の生物学的特性に関与するマイクロRNAを同定し、その臨床的意義についての検討をほぼ終了した。今年度実施計画に沿って解析を行い、ER陽性乳癌の生物学的特性に関与するマイクロRNAを同定した。さらに次年度実施計画として予定していた臨床的意義についての検討までほぼ終了したため。同定したマイクロRNAの機能解析を行う。乳癌培養細胞を用いて同定したマイクロRNAの機能解析を行う。
高エネルギーイオン飛跡を微小電極に利用した金属ナノドットアレイの創製

ダイヤモンドライクカーボンなど電気絶縁性の炭素材料に高エネルギー重イオンビームを照射し、飛跡に沿って形成される電気伝導性の円柱状領域を微小電極として利用することで、金属ナノドットアレイを電解析出させた。6 MeV C60や1.2 GeV 197Auイオンによる飛跡は、直径数十nm程度の円柱形状で、電極として十分な電気伝導性と電気化学安定性を示した。電解析出したPtナノドットアレイは電極触媒活性を有し、ドット間の物質輸送が制御された固体高分子形燃料電池向けのモデル触媒など、新たな応用性を探索することができた。本研究では、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)などの電気絶縁性炭素材料において、イオン飛跡に沿って形成される電気伝導性の円柱状領域をごく微小な電極として利用し、電解析出法により金属ナノドットアレイを創製する。このうち今年度は、電気伝導性の基板に堆積したDLC薄膜に核種、エネルギーを変化させMeV-GeV重イオンを照射することによって、ナノドットアレイの形成条件を検討した。具体的には、以下のとおりである。まず、炭素材料として、高い電気絶縁性、成膜の容易さなどの特徴を有するDLCに着目し、そのイオン飛跡における構造変化が水素の含有量に影響されることから、プラズマCVD法を利用してできる限り含有水素の少ない薄膜試料を得た。ここで、電気化学プロセスを利用するため、高ドープSi基板、金属Ni基板、グラッシーカーボン基板によってDLC薄膜と電気的導通をとった。堆積厚さは、予めTRIMコードによる理論計算に基づき、100150 nmの範囲とした。次に、作製したDLC薄膜に対して、MeV-GeV重イオンを核種、エネルギーやフルエンスを変化させて照射した。百MeV級の重イオンとクラスターイオンは日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所の保有するイオン照射施設TIARA、GeV級はドイツ重イオン研究所(GSI)の線形加速器UNILACにて照射を行った。特に、クラスターイオンの照射では、DLC薄膜の膜厚に対して飛程が十分に長い6 MeV C60+ビーム(100 keV 12C+で350 nmと計算)を選択し、照射フルエンスを5×E9から2×E10 ions/cm2の範囲で変化させた。保有している顕微ラマン分光装置を用いて、以上のDLC薄膜とその飛跡内における微細構造を解析している。金属等からなる電気伝導性の基板に堆積したDLC薄膜に核種、エネルギーを変化させMeV-GeV重イオンを照射することによって、ナノドットアレイ形成条件の検討に着手することができた。本研究の特色でもあるクラスターイオンの照射についても、イオン照射施設TIARAにて6 MeV C60+ビームをフルエンス5×E9から2×E10 ions/cm2の範囲で照射、その後の構造解析までおおむね順調に進展している。また、現有装置の仕様、及びその適合性を考慮した結果、照射中の試料を500°Cまでの範囲で加熱できる見通しを得た。このうち当該年度は、本研究費による部品購入で準備した小型照射セルを利用して、電気伝導性の基板に堆積したDLC薄膜に重イオン照射を行い、ナノドットアレイの作製条件の検討を進めた。まず、プラズマCVD法によって含有水素の少ないDLC薄膜(100150 nm厚)を堆積し、それに6 MeV C60+ビーム(フルエンス:5.0×E92.0×E10 ions/cm2)、あるいは1.2 GeV 197Auビーム(同:3.0×E9 ions/cm2)を照射した。DLC薄膜の基板としてグラッシーカーボン(GC)を用い、電気的導通を十分に取ったため、イオン照射DLC薄膜を作用電極としてサイクリックボルタモグラム(CV曲線)を測定できた。したがって、電位窓とバックグランド電流から金属の電解析出に必要な微小電極としての特性を見出すに至った。次に、6 MeV C60+ビームを照射したDLC薄膜上に、金属ナノドットアレイを電解析出する条件を検討した。実験では、析出金属であるPtの模擬としてCuに着目し、その塩である硫酸銅(CuSO4)を含む水溶液を用いた。電気伝導性炭素、すなわちグラファイトの基板における析出条件(既報)をもとに、組成を0.05 M CuSO4 + 0.1 M H2SO4に制御した水溶液中でCV曲線を測定し、その結果から電解析出の電位をー0.3 V (対Ag/AgCl)、時間を10秒と決定した。走査型電子顕微鏡による表面観察では、フルエンスとほぼ同じ面密度で析出する微粒子が確認され、金属ナノドットアレイの作製条件を確立できた。前年度までの順調な研究進展、すなわちGC基板へのDLC薄膜の堆積と種々の条件下における重イオン照射が可能になったおかげで、ナノドットアレイ作製条件の検討を効率的に進めることができた。研究代表者の所属機関における6 MeV C60+ビームの利用により、電解析出に必要な微小電極を形成でき、電極上への金属ナノドットアレイの作製条件を確立することにも成功した。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。

本研究の目的は、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)などの電気絶縁性炭素材料において、イオン飛跡に沿って形成される電気伝導性の円柱状領域をごく微小な電極として利用し、電解析出法により金属ナノドットアレイを創製することである。このうち最終年度は、グラッシーカーボン(GC)基板上のDLC薄膜に重イオン照射を行うことでPtナノドットアレイを作製し、その触媒性能を示唆する電気化学特性と微視的形態を明らかにした。これにより、固体高分子形燃料電池(PEFC)のモデル電極触媒としての利用など、この新規作製法の応用性も探索できた。具体的には以下のとおりである。厚さ100150 nmのDLC薄膜に6 MeV C60+ビーム(フルエンス:5.0×E92.0×E10 ions/cm2)を照射した。Ptの電解析出については、昨年度に行ったCu析出と同様に、サイクリックボルタモグラム(CV曲線)をもとに条件検討を進めた。その結果、電解析出の水溶液組成1 mM H2PtCl6 + 0.1 M HCl、電位ー0.145 V (対Ag/AgCl)、温度25°C、時間10秒が最適であることを見出した。電界放出型走査電子顕微鏡による表面観察では、フルエンスとほぼ同じ面密度で析出するPtナノドットが確認された。このPtナノドットを微小電極とした過塩素酸水溶液(pH = 1.0)のCV曲線を測定し、水素原子の吸脱着反応に起因する信号を観測できたことから、電気化学的活性表面の形成が示唆された。フルエンス5.0×E9 ions/cm2の場合、整列したナノドット間の平均距離である約70 nmの間隔で物質輸送が制御されるため、反応機構が単純化できPEFCモデル触媒としての利用が可能と考えられる。ダイヤモンドライクカーボンなど電気絶縁性の炭素材料に高エネルギー重イオンビームを照射し、飛跡に沿って形成される電気伝導性の円柱状領域を微小電極として利用することで、金属ナノドットアレイを電解析出させた。6 MeV C60や1.2 GeV 197Auイオンによる飛跡は、直径数十nm程度の円柱形状で、電極として十分な電気伝導性と電気化学安定性を示した。電解析出したPtナノドットアレイは電極触媒活性を有し、ドット間の物質輸送が制御された固体高分子形燃料電池向けのモデル触媒など、新たな応用性を探索することができた。イオン飛跡が有する微小電極としての特性を評価した後、イオン照射DLC薄膜による電解析出の条件と得られた金属微粒子の形態、結晶性との関連性を調べることでナノドットアレイの形成条件を確立する。また、試料の触媒性能を示唆する電気化学特性(特に酸化還元の開始電位、反応過電圧や有効活性面積、電荷移動速度)を評価し、上で調べた特性との関係を明らかにする。実験条件との関連性において着目すべき電気化学特性は、サイクリックボルタモグラムにおける反応の開始電位と電流、過電圧、さらには水素の吸脱着による電気量から計算できる有効活性面積である。また、回転電極法で得られる電荷移動速度も、電極表面の拡散層の影響を排除した真の反応活性を表すので重要である。その後、作製条件へのフィードバックをかけることで、イオン飛跡の構造変化による制御可能性を検討する。金属ナノドットアレイの触媒性能を示唆する電気化学特性(特に酸化還元の開始電位、反応過電圧や有効活性面積、電荷移動速度)を評価し、形態と結晶性との関係を明らかにする。その後、作製条件へのフィードバックをかけることで、イオン飛跡の構造変化による制御や高配向・単結晶化の可能性を検討する。
In vitro免疫法とパッチクランブ法を用いた歯髄細胞の生体警告系の解析

1.象牙芽細胞標識モノクローナル抗体象牙芽細胞をラベルするモノクローナル抗体の産生に成功した(IgG3種とIgM1種)。これらモノクローナル抗体のラベリングの局在を透過型電子顕微鏡レベルで解明しようと試み、3種で成功した。IgG抗体(1)は象牙芽細胞の細胞質全域を;IgG抗体(2)は表面マーカーで、細胞膜のみをラベルした。IgG抗体(4)は象牙芽細胞細胞質、dendritic cell細胞質、血管内皮細胞細胞質を染めることを明らかにした。これらの抗体を用いて単離歯髄細胞中で象牙芽細胞を科学的に同定することができるようになった。2.象牙芽細胞膜の電気生理学的特性最適細胞外液をはじめ新鮮単離象牙芽細胞を長く生かす方法を検討した。その結果、電極内をHEPE溶液に電極外をりん酸緩衝液(オスモラリティー325)が最適であった。この後、ギガΩレベルのシールを獲得し、シングルチャンネル記録を行った。陰圧あるいは電気ショックを用いても、タフな象牙芽細胞の細胞膜に穿孔することはできなかった。そこで、ナイスタチンを用いて化学的に象牙芽細胞に穿孔し、細胞全体からの記録を可能にした。I-V関係はほぼ直線で、電位依存性のチャンネルは検出できなかった。3.象牙芽細胞膜と他の細胞とのcoupling歯髄細胞を単離すると希に象牙芽細胞と別の細胞がくっついて分離されることがある。一方(象牙芽細胞)にガラス微小電極を介して、低分子の色素を注入すると他の細胞(樹状の細胞)に色素が広がることがわかった。象牙芽細胞は別の細胞と機能的に結合している可能性が示された。免疫組織学的研究1.モノクローナル抗体の産生In vitro免疫法を用いることにより、既成抗体やin situ免疫法で得た抗体では標識することができなかった、象牙芽細胞をラベルするモノクローナル抗体の産生に成功した。内訳はIgG3種とIgM1種であった。2.モノクローナル抗体のラベリングの詳細な局在を透過型電子顕微鏡で解明上記のモノクローナル抗体の標識部位を詳細に明らかにする目的で、免疫電顕法を用いた。すなわち、IgG抗体(1)は象牙芽細胞の細胞質全域を;IgG抗体(2)は表面マーカーで、細胞膜のみをラベルした。IgM抗体(4)は象牙芽細胞細胞質、dendritic cell細胞質、血管内皮細胞細胞質を染めることを明らかにした。電気生理学的研究1.シングルチャンネルの獲得オスモラリティーの調整をはじめとした最適細胞外液を検討し、いかなる環境が新鮮象牙芽細胞を長く生きたままで保存できるかを検討した。この後、ギガシールの獲得に成功し、シングルチャンネル記録を行った陰圧あるいは電気ショックといった、通常の細胞でwhole-cell状態にできる刺激を用いても、タフな象牙芽細胞の細胞膜に穿孔することはできなかった。そこで、ナイスタチンを用いて科学的に象牙芽細胞に穿孔し、細胞全体からの記録を可能にした。