hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アノールトカゲにおける温度適応機構の遺伝的基盤の解明

1活性化温度は分化していないことを示唆している。外温性動物において、環境の温度は生存や繁殖成功を左右する重要な要因である。トカゲ類において、温度環境に適応するには、外気温を感知するための温度感知形質、日光浴や姿勢変化などによって体温を行動的に調節する温度調節形質、そして獲得した体温下での生理的応答を行う温度依存形質の三つが考えられる。本研究では野外において異なる体温を維持するアノールトカゲ三種(Anolis allogus, A. homolechis, A. sagrei)に注目し、これら三形質を包括的に研究することで、温度適応機構の解明を目的とした。本年度では、温度依存形質について前年度までの研究成果をまとめ、国際誌へ論文を投稿することを目的とした。温度感知形質と温度調節形質については前年度まで進めてきた解析を完了させ、論文投稿までを目的とした。アノールトカゲ三種の温度感受能の分化を検証するため、高温刺激に対する忌避行動と、高温感受性TRPであるTRPA1の活性化温度の種間比較を前年度に引き続き行なった。その結果、低温環境に生息する種(A. allogus)において、中温または高温環境に生息する種(A. homolechis, A. sagrei)に対し、比較的低い温度刺激で忌避行動が誘発された。さらに、A. allogusのTRPA1においても他二種に対し低い温度で活性化した。この結果は、高温に対する行動と分子の温度感受性が相関しているだけでなく、選好する温度環境とも相関しており、種間で温度感受性が分化していることを示唆している。温度感受性TRPの近縁種間における機能分化を明らかにし、野外におけるトカゲのニッチ選択との関連を示した今回の結果は世界に先駆けた研究である。前年度までに進めてきた温度依存形質に着目した研究については、Molecular Ecologyに受理された。今年度は、目的としていた追加解析も完了し、前年度までの成果も論文として発表することができ、計画に沿って研究を遂行することができた。本年度は、異なる温度環境に生息するアノールトカゲ三種(Anolis allogus, A. homolechis, A. sagrei)の、温度感受性TRPイオンチャンル受容体タンパク質の機能解析を行なった。これは、当初の計画通りの進捗であり、研究遂行は順調である。さらに、次年度に予定していた、アノールトカゲを用いた行動実験にもすでに着手しており、次年度も予定通りの進捗が期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、現在までに実験、解析が終了している研究結果の論文執筆、投稿を行なう。さらに、次年度の研究計画にある通り、アノールトカゲにおける温度依存的な行動の種間比較を行なう。体温調節に重要な、高温刺激に対する忌避行動や、ある温度環境下での"行動力"を比較する予定である。忌避行動と"行動力"を比較するうえでの予備実験はすでに終了しており、現在までに確立した手法で実験をすすめることができると考えられる。
経済危機下のタイにおける流通構造の再編成

タイでは1997年に発生した通貨危機とその後の不況の深刻化に伴い、個人消費が大きく落ち込んだ。そうしたなか、小売業界では、ヨーロッパ系流通外資がもたらしたディスカウントストアやハイパーマーケットなどの新業態が台頭した。低価格販売を売り物にするこれら新業態は、不況下で消費性向を低下させた消費者の需要を満たすことに成功したのである。対照的に、地場系小売企業は、中小業者だけでなく大手資本も含めて業績を悪化させ、事業の縮小や売却を余儀なくされるところもあった。このように、確かに通貨危機がタイ流通業界に与えた衝撃は絶大であった。しかし、実はこうした構造変化は、危機以前の経済ブーム期に上記新業態の登場によって既に始まっていた。これら新業態は、仕入方式から多店舗化戦略、在庫管理と物流に至るまで従来の小売業とは大きく異なる流通システムを特徴としており、百貨店を中核事業として成長してきた地場系大手資本にとっても、流通外資に対して競争優位を発揮できる事業分野ではなかった。地場系最大手グループの場合も、経営ノウハウを十分には有しない新業態への多角化が、むしろグループ全体の財務構造脆弱化の要因にさえなった。その結果、地場系大手資本は、外資と直接競合しない百貨店事業を中心とするコア・ビジネスに回帰するほかなくなった。現在タイでは、近年の外資規制緩和が流通外資の台頭を促し、地場の小売業を圧迫する事態を招いていると懸念されている。流通業界の一部には、強硬な外資規制を唱える動きもみられる。しかし、現在のタイでは、外資のみをターゲットにした規制政策は現実的ではない。今後、タイの流通業は外資主導で構造変化がいっそう進むと考えられるが、そうしたなかで地場系小売企業が果たす役割がいかなるものかが注目される。1997年の通貨・金融危機(経済危機)以降、タイの流通業界がどのように変化したかについて、業界レベルおよび個別企業・企業グループレベルでの実態調査を行なった。そのうち、後者のレベルについては、タイの3大小売企業グループである「CPグループ」、「CRCグループ」、「ザ・モールグループ」に注目した。調査の結果、次の2点が明らかになった。第1に、1990年代前半の経済ブーム期にタイ系小売企業グループは小売業の多業態化を急速に進めたものの、経済危機発生以後、グループの事業再構築を断行し、各グループはそれぞれ従来からの基幹事業に重点を戻している。なぜなら、各グループは90年代前半の急速な事業拡大のために積極的に外貨借入を行なったが、危機後の通貨価値の下落と消費市場の冷え込みに伴って巨額の為替差損と負債を抱え込むことになり、その返済のために傘下企業の売却と不採算事業の整理とを余儀なくされたからである。第2に、ただし、小売業全体が等しく大幅な売上減少に喘いでいるわけではなく、一部には経済危機の影響をほとんど受けずに好調を維持している企業・業態もある。その代表は、CPグループ傘下の会員制ホールセールクラブ「サイアム・マクロ社」である。同社は、徹底した低コスト・オペレーションによる低価格販売を実現しているが、この経営方針が経済危機下のタイの消費者に支持されていると考えられる。以上2点より、タイの小売業界は、経済ブーム期の「グループ間(多業態化)競争」から、経済危機以降の「業態間競争」へと大きく変化したと考えられる。小売業態のうち、特に、従来の主要近代小売業である百貨店業態と近年台頭しているディスカウント業態とが注目されるが、その詳細な比較検討は平成13年度の研究課題としたい。
フロログルシノール誘導体による光合成機能の化学調節に関する基礎的研究

本研究では、フロログルシノール誘導体の光化学系II(PSII)に対する影響を、ゼニゴケ光独立栄養培養細胞、コムギ葉切片および無傷植物を用いて検討した。なお、フロログルシノール誘導体としては、破砕チラコイド膜を用いたHill反応試験で強力な阻害活性を示した3ーニトロフロログルシンカルボキサミド及びユーカリに含まれる天然の光合成阻害物質であるグランジノールを用いた。光独立栄養培養細胞(ゼニゴケ)による検討では、電子伝達の阻害に伴うクロロフィル蛍光の増大をモニタすることによりPSII阻害活性を定量的に検定する手法を確立した(投稿中)。フロログルシノール誘導体の阻害活性は一時的であり、時間の経過とともに阻害から回復する傾向であった。また、光合成以外の部位を阻害している可能性が示唆されたことから、ミトコンドリアの呼吸系に対する影響を検討した結果、フロログルシノール誘導体はいずれも強力な脱共役活性を有することが明かとなった。コムギ葉切片の光合成電子伝達系に対する影響を気相系酸素電極により検討した結果、フロログルシノール誘導体の阻害活性は微弱であり、恐らく脱共役活性に由来する酸素発生の増大が認められた。コムギ葉切片のクロロフィル蛍光の測定による電子伝達活性のモニタリングについては、今後検討する予定である。無傷植物に対する影響についての検討は不十分であるが、今後、特に水分ストレスとの係わりを含めて電子伝達系の活性に及ぼすフロログルシノール誘導体の影響を解析する予定である。
生体分子モーターを駆動源とするバイオマイクロマシンの創製

体内を自在に移動して治療を行う医療マイクロマシンは、マイクロマシン技術の中で最も切望されている課題の1つである。本研究では、ATPにより駆動する生体分子モーターを融合させたバイオマイクロ・ナノマシンの開発を目指した。このようなバイオマイクロマシンを構築するには、生体適合性の高い材料で構成されたマイクロ可動機構が不可欠である。我々の提案するバイオマイクロマシンは、独自開発の2光子マイクロ光造形法を用いて作製したマイクロ可動機構を基本部品とする。そこで、2光子マイクロ光造形法に使用可能でかつ、生体適合性の高い材料を探索した。その結果、コラーゲンなどの生体高分子と、生体適合性の高いシリコーン樹脂を見いだした。しかしながら、生体高分子は元来生体由来であるので生体適合性は非常に高いが、機械部品として利用するには剛性が不足していた。そこで、本年度は、マイクロマシンの構成材料としてシリコーン樹脂を用いて、独自開発の2光子マイクロ光造形法によって可動部品を作製することを試みた。実験では、シリコーン樹脂に光開始材を混合し、独自の樹脂材料を調合した。この材料を用いて、直径10マイクロメートルのシリコーン樹脂製マイクロローターを高精度に試作することに成功した。また、マイクロローターを光トラッピングによって回転駆動させることにも成功した。光トラッピングの発生力は、数ピコニュートンオーダーであることから、DNAの伸縮運動によっても十分駆動可能であると考える。今後は、DNAと可動部品の接合方法を確立し、DNAをアクチュエータとする新しいバイオマイクロマシンの構築を目指したい。本研究では、ATPにより駆動する生体分子モーターを融合させたバイオマイクロ・ナノマシンの開発をめざす。生体分子モーターの発生トルクは、数ピコニュートン(pN)と極めて微小であるため、本研究では、独自に開発した「3次元マイクロ・ナノ光造形法」によって、液体中で自由に駆動するポリマー製マイクロマシンを作製し、生体分子モーターと融合した新原理バイオマイクロマシンの実現をめざす。以下に、本年度の具体的な成果をまとめる。(1)生体分子モーターの融合に向けた各種マイクロ可動機構の試作2光子マイクロ光造形法によって、マイクロスライダー、マイクロホイール、マイクロアームなど各種マイクロ構造を設計・試作した。(2)マイクロマシンの光駆動実験試作したマイクロマシンが、生体分子モーターの発生トルクと同等のピコニュートンオーダーの力で液中駆動できることを確かめるために、光トラッピング技術を応用してマイクロマシンの遠隔駆動実験を行った。さらに、液体中で駆動するマイクロマシンに働く流体抵抗から駆動トルクを計算し、実験結果と比較することにより、ピコニュートンオーダーの力で駆動可能であることを確認した。(3)生体分子モーター観察システムの試作倒立型顕微鏡システムを基礎として、光トラッピング用レーザー光の導入部および高精細観察システムを組み込んだ実験装置を試作した。今後、本システムを用いて生体分子モーターの駆動観察を行っていく予定である。
新規HDL機能評価指標の実用性の検証と規定因子の同定

近年、コレステロール逆転送系の最初のステップを反映するHDLのコレステロール引き抜き能が、HDL-Cよりも冠動脈疾患のリスク層別化により有用であるという報告が相次いでいる。しかしその評価にはラジオアイソトープや細胞を必要とし、臨床応用が困難である。これらの弱点を克服すべく、1) RIの代替として蛍光色素を用い(非放射性)、2)血清と蛍光標識コレステロールをインキュベートし(無細胞)、3) ApoAI抗体でHDL粒子を捕捉した後の蛍光強度を測定する(HDL特異的)、新たなHDL機能評価系を開発し、得られた指標をコレステロール「取り込み」能と命名した。経皮的冠動脈形成術を施行した計207名の患者を対象に本指標を測定し、冠動脈ステントを留置してから平均42.3か月後に光干渉断層法を用いて冠動脈内を観察したところ、HDLコレステロール取り込み能の低下がステント内の新生動脈硬化病変の形成を予測する危険因子であることを明らかにした。また、本指標は標的病変の再血行再建率と有意な負の相関を認めた。さらにコレステロール取り込み能はステント内に生じた脂質リッチなプラーク病変の大きさならびにマクロファージの集積についても負の相関を示すことを明らかにした。一方、これまで用手法によりコレステロール取り込み能の測定を行っていたが、最近、完全自動化測定システムを構築した。引き続き本指標の臨床応用を目指し、心血管疾患のリスク層別化における有用性について検討する。さらに本指標を規定する因子について包括的な基礎研究・臨床研究・疫学研究を通じて解明する。コレステロール取り込み能の低下が冠動脈ステント留置術後の標的病変に対する再血行再建率の上昇につながることを明らかにしており、コレステロール取り込み能の臨床応用を目指し、心血管疾患のリスク層別化における有用性について検証するという目的に対し一定の成果を上げている。また多検体のコレステロール取り込み能をより短時間かつ、高い堅牢性をもって測定できる完全自動化測定システムが完成し、機能不全HDLが実際に日常臨床に及ぼすインパクトについて検証できる段階に到達している。現在、各種病態や薬物がコレステロール取り込み能に及ぼす影響について検討を開始している。さらにコレステロール取り込み能を規定する因子を同定することを目的とした基礎研究も着実に遂行中である。このように当初の研究目的に対し、順調に進展していると判断した。完全自動化測定システムを用いて、久山町研究において2002年に健診を行った集団の保存血清のコレステロール取り込み能を測定し、1)性別・年齢毎の測定値との分布状況、2)各種脂質プロファイルとの関連、3)糖尿病や肥満、腎臓病など様々な病態との関連、4)食生活や運動、飲酒、喫煙などの生活習慣との関連、5)心血管病や脳卒中、認知症、悪性腫瘍などとの発症との関連について検討する。コレステロール取り込み能を既定するHDL粒子に関する各種パラメーターとして、1)核磁気共鳴法により測定したHDL粒子数・サイズとの関連、2)アポ蛋白構成およびプロテオーム解析による翻訳後修飾との関連、3) HDL中のリン脂質量・脂肪酸組成およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性との関連、4)運動療法や既存の薬物療法による介入が与える影響について検討を行う。各種薬物がコレステロール取り込み能に及ぼす影響について臨床研究を行う。

完全自動化測定システムを用いて、久山町研究において2002年に健診を行った集団の保存血清のコレステロール取り込み能を測定し、1)性別・年齢毎の測定値との分布状況、2)各種脂質プロファイルとの関連、3)糖尿病や肥満、腎臓病など様々な病態との関連、4)食生活や運動、飲酒、喫煙などの生活習慣との関連、5)心血管病や脳卒中、認知症、悪性腫瘍などとの発症との関連について検討する。コレステロール取り込み能を既定するHDL粒子に関する各種パラメーターとして、1)核磁気共鳴法により測定したHDL粒子数・サイズとの関連、2)アポ蛋白構成およびプロテオーム解析による翻訳後修飾との関連、3) HDL中のリン脂質量・脂肪酸組成およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性との関連、4)運動療法や既存の薬物療法による介入が与える影響について検討を行う。各種薬物がコレステロール取り込み能に及ぼす影響について臨床研究を行う。
自伝的記憶の解析による経験価値の測定尺度の開発及び有効性の実証

経験価値とは,製品やサービスの物質的・金銭的価値ではなく,その利用や保有といった経験が有する価値であるとされている。本研究では,ある消費経験が有する経験価値の高さを評価する際の尺度を作成することを目的とする。その際,消費した人がその経験をどのような記憶として思い出すか,という観点からの評価も含めることで,ある経験が記憶として保持されることの価値も含めて測定する尺度の構築を目指すものである。
カルボン酸-アミン塩よりなる二成分液晶を用いた新規反応場の創成

我々はこれまでに、カルボン酸と第一級アミンとの塩において、どちらか一方のユニットにアルキル長鎖を導入することにより、サーモトロピック液晶が形成されることを見いだしてきた。本研究では、この酸-塩基二成分液晶を利用し、液晶中に閉じ込められた物質の化学反応について系統的な研究を行なうことにより'液晶反応場'の潜在能力を明らかにすることを目標とした。研究の初期段階として、カルボン酸ユニットとして光二量化能を有するアントラセンカルボン酸を用い、これと両親媒性アミンとの塩が形成する液晶の中でカルボン酸の光反応を行ない、反応効率・選択性を調べた。昨年度の研究において、代表的天然アルカロイドであるノルエフェドリン類似の骨格を有する両親媒性アミン、ならびにそのジアステレオマーであるシュードノルエフェドリン型の両親媒性アミンの合成法が確立された。そこで、これらの両親媒性アミンが形成する液晶の構造を調べた所、1-アントラセンカルボン酸との塩では矩形柱状液晶、2-アントラセンカルボン酸との塩では層状液晶となることが分かった。得られた酸塩基液晶を用い、アントラセンカルボン酸の光二量化反応を行なった。この反応では生成物として4種類の位置異性体が生成しうるが、興味深いことに、いずれの場合にも2種類の異性体のみ選択的に合成されることが明らかとなった。特に、ノルエフェドリン型の両親媒性アミンと2-アントラセンカルボン酸との塩を用いた場合には、キラルな異性体が主生成物(生成比70%)となり、その光学的組成に最大で86%eeの偏りが生じた。このように、結晶反応場に匹敵する選択性、ならびに結晶反応場では得難い基質一般性が達成され、本液晶反応場の有用性が示された。我々はこれまでに、カルボン酸と第一級アミンとの塩において、どちらか一方のユニットにアルキル長鎖を導入することにより、サーモトロピック液品が形成されることを見いだしてきた。本研究では、この酸-塩基二成分液晶を利用し、液晶中に閉じ込められた物質の化学反応について系統的な研究を行なうことにより`液品反応場'の潜在能力を明らかにすることを目標とした。研究の初期段階として、カルボン酸ユニットとして光二量化能を有するアントラセンカルボン酸を用い、これと両親媒性アミンとの塩が形成する液晶の中でカルボン酸の光反応を行ない、反応の効率および選択性を調べた。始めに、光学的に純粋な両親媒性アミノアルコールの合成法として、(1)目的物またはその前駆体のラセミ体を合成した後にこれを光学分割する手法と(2)天然アミノ酸を出発原料として目的化合物へと誘導する手法とを開発し、それぞれ効率良く日的化合物を得た。続いて、これらの両親媒性アミンとアントラセンカルボン酸類との塩を調製し、液晶相発現の有無を調べた。置換基位置の異なる二種類のカルボン酸(1-アントラセンカルボン酸および2-アントラセンカルボン酸)を川いたところ、光学分割法より合成した両親媒性アミンはいずれのカルボン酸とも液晶を形成出来るのに対し、アミノ酸より誘導した両親媒性アミンは1-アントラセンカルボン酸とのみ液晶を形成することが明らかとなった。特に、光学分割法により合成した両親媒性アミンと2-アントラセンカルボン酸との塩を用いた場合には、生成物の光学的組成に30%eeの偏りが見られることが分かった。
画像確率モデルに基づく非一様焦点ずれ画像のパラメーター推定と復元

今年度は、昨年度のパラメータ推定方法と復元方法に関すろ考察結果、および計算機シミュレーション結果をふまえ、以下のような計算機シミュレーションの継続、および画像入出力システムの構築と方法の検証を行った。●計算機シミュレーションの継続昨年度の計算機シミュレーション結果を踏まえて、さまざまな非一様焦点ずれ画像を作成し、パラメータ推定および復元処理を行った。この計算機シミュレーションによりパラメータ推定時のウィンドウサイズなどの実際に処理をする際に、必要となるパラメータがわかった。●画像入出力システムの構築と方法の検証実際の非一様焦点ずれ画像をビデオカメラで撮影し、計算機に入力するためのシステムを作成した。また、そのシステムを用いて、実際の非一様焦点ずれ画像に対して、処理を行い、本研究の有効性を確認した。また、研究を遂行する上で、復元画像を定量的に評価する方法を見出したので、それについても考察および計算機実験を行った。●復元画像の定量的評価の考察および計算機実験復元画像に観測値差分フィルタを通した出力のスペクトルの歪みを、復元画像の評価に用いることができることを見出したので、計算機実験を行い、その有効性を確認した。以上、復元画像の定量的評価に関する研究成果を日本鑑識科学学会学術集会、情報理論とその応用シンポジウムにて、口頭発表した。また、この課題に関する研究成果をまとめ、電子情報通信学会論文誌に投稿準備中である。今年度は、以下のようなパラメータ推定および復元方法に関する考察と、計算機シミュレーションを行なった。・パラメータ推定の考察これまでに、一様劣化画像のパラメータ推定法として用いてきた周波数領域で尤度関数を評価する方法を発展させて、画像中の各画素を中心とした矩形領域で、局所的な尤度関数を評価し、その積をパラメータ推定の評価関数とする定式化を行なった。その評価関数に対して、最急降下法を適用して、局大値を求めることにより、パラメータ推定を行なう方法を考察した。・復元方法の考察劣化システムが非一様であるために、従来の復元方法は適用できない。そこで、MAP(最大事後確率)復元を基礎とし、計算時間などを考慮して、画像中の各画素を中心とした矩形領域で、ウィナーフィルタのような周波数領域での復元処理を行なう定式化を行なった。・計算機シミュレーション計算機シミュレーションにより、非一様劣化画像を作成し、パラメータ推定と復元処理を行ない、良好な結果が得られることがわかった。ただし、残念ながら、パラメータ推定には、かなりの計算時間が必要であることがわかり、今後、パラメータ推定法の処理時間の短縮について、考察を行なう必要があることがわかった。以上の本年度の理論的な処理方法に関する考察および計算機シミュレーション結果を、情報理論とその応用シンポジウム、電気関係学会関西支部連合大会、日本鑑識科学学会学術集会にて、口頭発表を行なった。
ペプチドリード創薬のための新規アミド結合等価体の創出と応用

創薬標的分子として重要なペプチドをリードとするペプチドリード創薬研究を加速することを目的として、ペプチド結合をクロロアルケン類に置換した生物学的等価体の合成法の開発と構造解析について検討した。その結果、trans-アミド配座を模倣したクロロアルケン型ジペプチドイソスター(以下、CADI)のラージスケール合成法およびジアステレオ選択的アリル位アルキル化反応を利用したXaa-Xaa型CADIの高立体選択的合成法の開発に成功した。これらの成果は、今後のアルケン型ジペプチドイソスターを用いた創薬研究の進展に資するものである。近年ヒトとウィルスの戦いは複雑になり疾病構造が大きく変化しつつある。この変化に対応するために、ペプチド性医薬品の需要が著しく高まっているものの、ペプチドが有する加水分解性や凝集性など問題となり、医薬品への直接展開は困難を極めている。これら問題を解決すべく、本研究では、アルケン型ジペプチドイソスターに軸足をおいた創薬研究を行い、ペプチドリード創薬を強力に推進するペプチドミメティックの創出を目的とする。本年度の研究では、前年度に見出したクロロアルケン型ジペプチドイソスター(以下、CADI)の合成法の高度化に取り組み、以下の成果を得た。昨年度の検討によって、γ位に二つの塩素原子を有する(E)-α,β-不飽和エステルに対し、有機銅試薬を作用させることで、δ位の不斉点に由来する1,4-遠隔不斉誘起によってジアステレオ選択的なアリル位アルキル化反応が進行し、trans-アミド結合を模倣したCADIが得られることを見出した。しかし、X線結晶構造解析の結果から、得られたCADIは非天然アミノ酸に相当する(L,D)型であり、様々な生理活性ペプチドに応用するには、(L,L)型CADIの合成法を開発する必要がある。そこで、高ジアステレオ選択的に進行する本反応の特徴に着目し、幾何異性体である(Z)-α,β-不飽和エステルを新たに合成し、同様に有機銅試薬を作用させたところ、期待した通り(L,L)型CADIが得られることを見出した。さらに、有機亜鉛試薬をアルキル源とすることで、一般的には困難とされるアリル基や嵩高いアリール基の導入も可能となり、目的とする(L,L)型CADI類が高収率および高立体選択的に得られることを見出した。また、本反応で得られるジアステレオ選択性について検討した結果、γ位の二つの塩素原子とδ位の不斉点との立体反発がジアステレオ選択性発現に大きく寄与していることが示唆された。ペプチドは微量で強力な生理活性を有するものが多いことから、古くからペプチド性医薬品の開発研究が行われているが、ペプチドは主鎖骨格を形成するペプチド結合や構成分子であるアミノ酸の側鎖に起因する加水分解性や凝集性などが問題となり、医薬品への直接展開は容易ではない。そこで、本研究ではこれら問題を解決すべくペプチド結合をクロロオレフィンで置換したクロロアルケン型ジペプチドイソスター(以下CADI)の合成および機能評価を行い、いまだ有効なものが見出されていないペプチド結合の基底状態を模倣したペプチドミメティックの創製を目的とする。本年度の研究ではクロロアルケン型ジペプチドイソスターの合成研究に取り組み、以下のような成果を得た。Ellmanらによって報告された光学活性なイミンから誘導したγ位に二つの塩素原子を有するα,β-不飽和カルボニル化合物に対し、アミノ酸の側鎖に相当するアルキル基を有する有機銅試薬を作用させることで、立体特異的なアリル位アルキル化反応が進行し、目的としたtrans-アミド模倣型CADIの合成に成功した。興味深いことに本反応はδ位の不斉点に由来する1,4-遠隔不斉誘起によって反応が進行することがわかった。cis-アミド配座を模倣したE型クロロアルケン骨格の構築法について検討したところ、γ位に二つの塩素原子を有するα,β-不飽和カルボニル化合物に対し、有機銅試薬の調製に用いる銅塩や添加剤によってクロロオレフィンの幾何異性が制御できることを見出した。さらに反応機構について精査したところ、本反応の選択性は基質の電子的および立体的要因によって大きく影響を受けることを明らかにした。trans-アミド模倣型CADIの立体選択的合成法の開発研究では、期待通り立体選択的な合成法の開発に成功した。また、本反応は有機銅試薬による新規な1,4-不斉転写を契機とするジアステレオ選択的アルキル化反応であることから、学術的な意義はきわめて大きい。これらの結果から、当初計画したtrans-アミド模倣型CADIの合成研究において大きく進展した。さらに、当初の計画では二年目に計画していたcis-アミド模倣型CADIの合成研究では、これまでほぼ皆無であった鎖状化合物のE型クロロアルケン骨格の構築に成功した。以上のことから、本研究はおおむね順調に進行している。平成24年度の研究において見出したE型クロロアルケン骨格の構築

法を応用して、本反応をγ位に二つの塩素原子を有するアルケニルアジリジンやアリルジクロジド類に適用することで、cis-アミド配座を模倣した(E)-CADIsの合成法を開発する。また、本反応における(E)-選択性の発現機構を解明し、さらにはα位アルキル基の導入を目指して、求電子剤の添加や銅試薬の活性化など種々の反応条件を精査する。2)環状ペプチドを用いたペプチド主鎖の二面角(φ,ψ)の等価性についての評価ペプチドの立体構造はペプチド結合面同士の二面角(φ,ψ)で決まり、基底状態ミメティックはこの二面角を忠実に再現することが求められる。そこで、CADIを環状ペプチドに導入することで、その模倣能を検討する。具体的には、二面角が高度に制御されたペプチドモチーフである環状ペンタペプチドテンプレート[cyclo(-D-Xaa-Yaa-Arg-Nal-Gly-)]3のD-Xaa-Yaa配列にCADIを導入し、NMRによる構造解析を行う(Fig. 1)。また、アルケン型やフルオロアルケン型ミメティックも合成し、同様に解析することで種々のイソスター導入に伴う構造変化を詳細に検証する。さらに本テンプレートはエイズやがん転移など様々な疾患に関与するCXCR4リガンドに由来することからCXCR4結合活性を評価し、構造と活性の相関の有無を調べる。これら二つの課題を進め順調に進んだ場合には、これまで報告されている種々のイソスターに加え、今回合成したCADIsをコラーゲンの三重らせん構造に応用し、ペプチド結合の立体電子効果が分子構造に与える影響を原子レベルで解析する。これまでとは異なる新しい領域(創薬研究を指向した反応開発)の研究を立ち上げたばかりのため、設備備品として反応の精査および不斉収率の決定に必要な高速液体クロマトグラフ(HPLC)を購入する予定である。また、本年度は継続する反応開発研究に加え、生理活性ペプチドへの応用研究へと展開するために、これまでの消耗品費に加え、保護アミノ酸や樹脂などペプチド合成用の合成試薬を購入する予定である。それ以外は消耗品費を主たる経費とする予定である。さらに、本研究により得られた研究成果の外部への発信のため、国内学会での発表旅費や論文校閲費も併せて計上した。
非対称行列を係数行列とする連立方程式に対する反復解法の研究

非対称行列を係数行列とする連立方程式を解くために、SOR法に順序付け(非対称性が強いほど効果的)と、成分に対応した緩和係数の選び方を考慮した順序付き改良SOR法を提案し、2次元までの誤差解析及び3次元の緩和係数などの結果を得ている。係数行列がn次三重対角行列の場合、緩和係数は反復行列のスペクトル半径を0とするように決められるため、高々n回の反復での収束が保証される。そこで直接法のGaussの消去法のLU分解との対応付けを表した論文"Improved SOR method with orderings anddirect methods"が今年度にJJIAMに掲載された。加えて、2次元の問題に適応した論文も同雑誌に掲載されている。尚、上記論文の例題に誤差を完全に消去する現象が起こり得ることがわかり、現在調べている。
新しく見出されたグリコサミノグリカンの線維芽細胞増殖因子調節活性

これまでグリコサミノグリカンの構造と分布,生理的な役割を解明することを目的として検討を行ってきたが,幸運にも韓国,アメリカ合衆国の著明な研究者との共同研究によって全く新しいグリコサミノグリカンの発見に貢献することができた.さらに,その生物活性の解明においても,構造と機能を結びつけるための方法論の確立に貢献した.さらに新規のグリコサミノグリカンが細胞増殖因子との結合活性を有し,細胞増殖と分化に少なからず影響することを証明し得た.今後この非常に珍しいアフリカマイマイが産生するグリコサミノグリカンの新しい生理活性を明らかにすると共に,新しい医薬品への応用・開発がおおいに期待できる.今回申請者が用いたアフリカマイマイ由来のグリコサミノグリカンは,申請者らが1995年に新しく見出した新規酸性多糖である.Journal of Bilogical Chemistryに発表以来,国内では愛知医科大学木全弘治教授らのグループと共同で,硫酸基転移酵素の基質としての可能性を探索するプロジェクトが進行中であり,また国内の複数の試薬供給会社,製薬会社からパテントに関する問い合わせがあり,現在米国,韓国において申請中である.また,米国ハーバード大学医学部小児科病院Prof.Merton Bernfieldらとの共同研究によって,ヘパラン硫酸と増殖因子との親和性,すなわち活性調節機構の解明を目指して種々検討を行い,新規グリコサミノグリカンはヘパラン硫酸と共通の構造を持つため,あらゆる角度から類似の効果をもつことが明らかになった.一方,大腸菌細胞壁にはグルクロン酸とN-アセチルグルコサミンからなる多糖が存在するが,スエーデンのProf.Ulf Lindahlはこの多糖を化学的に硫酸化し,申請者らと同様の戦略で検討を行っており,情報を交換し合ってその生理的な活性についても検討を進めている.以上のように,細胞増殖因子の活性調節機構を解明するために国の内外を問わず数多くの研究者が努力を重ねており,今回の助成で得られた結果は国の内外で注目を集めている.これまでグリコサミノグリカンの構造と分布,生理的な役割を解明することを目的として検討を行ってきたが,幸運にも韓国,アメリカ合衆国の著明な研究者との共同研究によって全く新しいグリコサミノグリカンの発見に貢献することができた.さらに,その生物活性の解明においても,構造と機能を結びつけるための方法論の確立に貢献した.さらに新規のグリコサミノグリカンが細胞増殖因子との結合活性を有し,細胞増殖と分化に少なからず影響することを証明し得た.今後この非常に珍しいアフリカマイマイが産生するグリコサミノグリカンの新しい生理活性を明らかにすると共に,新しい医薬品への応用・開発がおおいに期待できる.今回申請者が用いたアフリカマイマイ由来のグリコサミノグリカンは,申請者らが1995年に新しく見出した新規酸性多糖である.Journal of Bilogical Chemistryに発表以来,国内では愛知医科大学木全弘治教授らのグループと共同で,硫酸基転移酵素の基質としての可能性を探索するプロジェクトが進行中であり,また国内の複数の試薬供給会社,製薬会社からパテントに関する問い合わせがあり,現在米国,韓国において申請中である.また,米国ハーバード大学医学部小児科病院Prof.Merton Bernfieldらとの共同研究によって,ヘパラン硫酸と増殖因子との親和性,すなわち活性調節機構の解明を目指して種々検討を行い,新規グリコサミノグリカンはヘパラン硫酸と共通の構造を持つため,あらゆる角度から類似の効果をもつことが明らかになった.一方,大腸菌細胞壁にはグルクロン酸とN-アセチルグルコサミンからなる多糖が存在するが,スエーデンのProf.Ulf Lindahlはこの多糖を化学的に硫酸化し,申請者らと同様の戦略で検討を行っており,情報を交換し合ってその生理的な活性についても検討を進めている.以上のように,細胞増殖因子の活性調節機構を解明するために国の内外を問わず数多くの研究者が努力を重ねており,今回の助成で得られた結果は国の内外で注目を集めている.細胞外マトリックス(ECM)や細胞膜に存在するグリコサミノグリカン(GAG)が細胞の増殖因子・成長因子や様々な活性化因子と選択的な親和性を有することが,相次いで明らかとなり,これまで単にECMあるいは細胞膜構成成分としか捉えられていなかったGAGの役割が脚光を浴びるに至っている.申請者らが見出した新しいヘパラン硫酸素グリコサミノグリカンの生理活性の一つとして,塩基性線維芽細胞増殖因子との相互作用を明らかにした.さらにこの新しいGAG鎖が,増殖因子受容体とヘパラン硫酸の相互作用を抑制する効果について,定量的に追求した.また核磁気共鳴スペクトル法による二分子間の相互作用を定量的に解析する手法も確立した.これらの結果を基に,細胞内極微量のGAGの挙動解析を追求している.また,化学的に脱硫酸化,あるいは過硫酸化したグリコサミノグリカンを調製し,抗ウイルス活性,抗血液凝固活性あるいは細胞増殖阻止活性などを調べた結果,非常に強い表記活性を示した.現在,これらの作用メカニズムについても検討を進めている.これまで著者らが進めてきた生体内グリコサミノグリカンに関する研究は,どのような種類のグリコサミノグリカンが,どこに,どれほどの量存在しているかを明らかにすることを第一の目的としてきた.その結果,哺乳動物の各種臓器におけるグリコサミノグリカンの構造と分布(Biochem.J.,322,499-506(1997)に発表)や,新しいグリコサミノグリカンの発見(J.Biol.Chem.,271,11750-11755(1996)に発表)などの成果を挙げた.

この中で,特にヘパラン硫酸に含まれるアミノ基が置換されていないグルコサミンを含む糖鎖配列の発見は(Biochem.J.,322,499-506(1997)に発表)は,白血球膜表面に発現するセレクチンに特異的に結合することが明らかとなり,その構造特異性を証明することができた.また,アフリカマイマイから単離精製されたヘパリン様グリコサミノグリカンは(J.Biol.Chem.,271,11750-11755(1996)),新規のグリコサミノグリカンとして世界中から注目を集め,現在も継続してその生理活性が精力的に検索されている.また,反応条件を詳細に再検討し,NMRスペクトル,及び様々な化学分析により,完全O-硫酸化グリコサミノグリカンの調製に成功し(Carbohydr.Res.,306,35-43(1998)),これらの抗血液凝固活性(Int.J.Biol.Macromol.,26,233-241(1999).),抗ヒアルロニダーゼ活性(Arch.Biochem.Biophys.,370,176-182(1999)),細胞増殖阻害活性(Arch.Biochem.Biophys.,371,228-233(1999))などを示した.一方,NMRスペクトルを用いた糖鎖配列及び立体構造の解析法に関しては,ヘパリン由来アンチトロンビンIII結合領域を含む糖鎖の単離(Proc Natl Acad Sci USA.97(19):10359-10364(2000)),完全O-硫酸化ヒアルロオリゴ糖の調製とその生理活性に関する検討(Glycobiology(2001)を通して確立された.
メカニカルシャペロニン:単一分子レベルでの力学的タンパク質再生実験

本研究は最近の発明である原子間力顕微鏡(AFM,Atomic Force Microscope)を使用して、単一タンパク質分子のN-末端とC-末端をつまんで引き延ばした後、再び両末端間距離を縮めてゆくことによって立体構造を再生して、単一分子レベルの人工シャペロニン機能を実現しようとするものである。立体構造の上下にN-末端とC-末端を持ち、システインを含まないタンパク質として球状構造を持つ酵素である炭酸デヒドラターゼを選んでその両末端にタンパク工学的手法によりシステイン残基を導入し、これを単結晶基板とAFM探針の間にサンドイッチ状に固定した上で、上下に引き延ばす実験を行なったところ,両末端間距離が20nmにまで引き延ばされた時点で立体構造の全体的な破壊が相転移的に進行し、その時点でタンパク質はほぼランダムコイル状に「変性」する。一度伸長したタンパク質の両末端間距離を再び縮めることにより立体構造の再生を促すシャペロニン実験においては,数100ミリ秒の短時間内にアミノ酸残基側鎖間の強い相互作用を示す力学曲線が得られた.この構造がタンパク質立体構造再生反応の初期に対応するものであると考え,基板上の反応時間を10秒程度までのばす実験を行なっている.また,天然型の酵素には結び目構造があることに注目し,延伸の際に結び目ができない変異体を作って力学実験を行ない,天然型と異なる結果を得た.これは結び目がタンパク質の力学的性質に大きな影響を与えていることを示唆している.タンパク質のモデルとしてポリペプチド鎖を使用した力学実験も行ない,新規なデータを得た.本研究は最近の発明である原子間力顕微鏡(AFM,Atomic Force Microscope)を使用して、単一タンパク質分子のN-末端とC-末端をつまんで引き延ばした後、再び両末端間距離を縮めてゆくことによって立体構造を再生して、単一分子レベルの人工シャペロニン機能を実現しようとするものである。一度伸長したタンパク質の両末端間距離を再び縮めることにより立体構造の再生を促すシャペロニン実験においては,数100ミリ秒の短時間内にアミノ酸残基側鎖間の強い相互作用を示す力学曲線が得られた.この構造がタンパク質立体構造再生反応の初期に対応するものであると考え,基板上の反応時間を10秒程度までのばす実験を行なっている.また,天然型の酵素には結び目構造があることに注目し,延伸の際に結び目ができない変異体を作って力学実験を行ない,天然型と異なる結果を得た.これは結び目がタンパク質の力学的性質に大きな影響を与えていることを示唆している.タンパク質のモデルとしてポリペプチド鎖を使用した力学実験も行ない,新規なデータを得た.原子開力顕微鏡のナノ力学測定機能を使用して単一たんぱく質分子の力学的アンフォールディング実験とフォールディング実験を行った.窒化シリコン製の探針をシラン化したのち,同じくシラン化したシリコン基板にジスルフィド結合を介して化学架橋剤で固定したたんぱく質分子に近づける.たんぱく質の基板とは反対側の端が探針上の化学架橋剤と反応するのを待ち,探針-基板間距離を増すことにより,たんぱく質分子はその両端から引き伸ばされてゆく.この様子を印加力と分子の延伸距離の関数としてプロットすると,たんぱく質の今まで知られていなかった力学的性質を知ることができる.その結果によるとカルボニックアンヒドラーゼのようにβ-シート構造をもち,また立体構造に「結び目」がある場合には2nNの力を加えないと分子は破壊されないが,この「結び目」ができない変異体を使用すると,分子は1nN程度の力で破壊される.一度引き伸ばしたたんぱく質を再び縮める実験も可能であるが,カルボニックアンヒドラーゼは立体構造再生に比較的長い時間がかかるたんぱく質であるため,部分的立体構造再生は観測されるが,完全な立体構造再生にはさらに長時間かける必要がある.現在β-シート構造を持つたんぱく質の他にα-へリックス構造を主構造とするたんぱく質についても延伸と収縮実験を行っている.この実験で判明したたんぱく質の延伸力学を利用して,酵素と基質の相互作用,たんぱく質問相互作用,リガンドと受容体の相互作用を精確に測定することができるようになった.本研究は最近の発明である原子間力顕微鏡(AFM,Atomic Force Microscope)を使用して、単一タンパク質分子のN-末端とC-末端をつまんで引き延ばした後、再び両末端間距離を縮めてゆくことによって立体構造を再生して、単一分子レベルの人工シャペロニン機能を実現しようとするものである。一度伸長したタンパク質の両末端間距離を再び縮めることにより立体構造の再生を促すシャペロニン実験においては,数100ミリ秒の短時間内にアミノ酸残基側鎖間の強い相互作用を示す力学曲線が得られた.

この構造がタンパク質立体構造再生反応の初期に対応するものであると考え,基板上の反応時間を10秒程度までのばす実験を行なっている.また,天然型の酵素には結び目構造があることに注目し,延伸の際に結び目ができない変異体を作って力学実験を行ない,天然型と異なる結果を得た.タンパク質のモデルとしてポリペプチド鎖を使用した力学実験も行ない,新規なデータを得た.
細胞間マトリックスの形成と細胞制御

1.各種のプロテオグリカンの生合成においてβ-キシロシドはコア蛋白質(キシロシルプロテイン)のアナログとして強力なグリコサミノグリカン鎖伸長イニシエーターとして作用すること、その効力はアグリコン部分の構造によって大きく変化することを明らかにした。この発見をもとに受精卵中でのニワトリ胚の骨格系の形成発達がβ-キシロシドによって制御できることを示した。2.ラット乳孔の脳から4種のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを単離し、これら成分が辺縁層と中間層に分布することを免疫蛍抗体法で明らかにした。3.フイブロネクチンがヒト胎盤組織で合成、保存されていることを明らかにした。胎盤組織はプロテオグリカンも合成するが、これはフィブロネクチンと相互作用して胎盤における細胞外マトリックスの形成と、細胞活動の制御に関与するものと考えられる。4.ヒト血漿からビトロネクチンを単離した。この分子はそのままの形ではヘパリンと何らの相互作用も行わないほうが8M尿素または4Mグアニジン塩酸処理によってヘパリンと強く結合する性質を現わすようになることを見出した。一方、新鮮血をしらべると変性処理をしなくてもヘパリン結合性をもつビトロネクチン成分が少量見出された。これらの結果はヒト血漿中に存在するビトロネクチン分子は均一でなく何らかの構造不均一性があることを示している。5.ヒト血漿をエラスチン固定カラムに通すと明らかにエラスチンとの結合性のあるタンパク質が存在することが示された。この成分は免疫グロブリンに類似した化学的性質をもつものであった。
肝移植における血行動態と肝摘出保存の研究

1.(1)無肝期血行動態の研究;肝移植における無肝期血行動態を安定化するために犬を用いて実験を行なった。アンスロンを用いたVーVバイパス下無肝期の全身血行動態は、ハイポボレミアに伴うハイポダイナミックな状態と考えられ、肝遊離操作前からの充分な補液(30ml/kg/hr)とドブタミン(10mg/kg/min)等による循環補助が有効と考えられた。(2)部分肝移植法;レシピエントのIVCを温存レドナーの左肝静脈をドレナージベイントした左側70%部分肝移植を行ない長期生存犬を得た。また右側部分肝移植(30%)を行ない門脈圧を観察すると、前値7mmHgから移植後15mmHgまで上昇し肝床の減少による門脈圧の上昇を確認した。そこで移植肝重量比を増して70%とした時、移植後門脈圧は減少し術後歩行するにいたった。現在のところ右側部分肝移植(30%)における生存可能限界は移植肝重量比で70%(体重比で2.0:1)と考えられた。右側及び左側部分肝移植法を組合せて1donor2recipientsを完成させたい。2.肝摘出・保存の研究;ウイスター系雄性ラットを用いて低酸素血症及び肝阻血モデルを作製し、エネルギー代謝の面より検討し、さらに種々の薬剤による保護作用について調査した。(1)低酸素血症時にエネルギー伝達物質の動的平衡はATPからAMP、キサンチン、ハイポキサンチンへと移動していくことが示され、de novo合成系の関与が考えられた。(2)ラットを用いて70%部分肝阻血を行ない、温阻血時のエネルギー代謝および温阻血障害に対する薬剤の効果を検討した。薬剤はトロンボキサンA_2合成酵素阻害剤(CVー4151;武田薬品)、蛋白分解酵素阻害剤(ウリナスタチン)およびインドメサシンを用い、肝組織中エネルギー代謝に対する影響につき検討した。これらの薬剤は肝内ATPおよびエネルギーチャージを改善し、生存率の上昇をみた。1.肝移植における無肝期全身血行動態:雑種成犬を用い無肝期全身血行動態を研究した. VーVバイパスとしてヘパリンコーティングを施したアンスロン68D1【O!R】.ニD1チューブによる非強制灌流法を用いた.〈結果〉本法による全身血行動態はハイポボレミアに伴うハイポダイナミックな状態であることが示された.即ち肝摘除による心機能の低下と,門脈及び下大静脈の遮断による静脈還流の減少そして腸管及び下半手のうっ血によるハイポボレミアが本態であると考えられた.そこで肝摘除前より充分な補液を行い,Dobutamineの如き循環補助剤を用いることが無肝期血行動態を安定化する為に必要であると考えられた.本法の臨床応用は充分可能なことと考えられた.今後Biopump^<【O!R】>を用いた強制灌流群との比較検討を行う予定である.2.臓器保存の研究:ウィスター系雄性ラットを用いて低酸素血症及び肝虚血が肝及び腎組織に及ぼす影響についてエネルギー代謝の面より検討した.〈結果〉(1)低酸素血症時にエネルギー伝達物質の動的平衡はATPからAMP,キサンチン,ハイポキサンチンへと移動してゆくことが示された.

ATPの合成系は,ハイポキサンチンの変動がスクレオチドより遅れることからRー5ーPより合成されるdenovo合成系の関与が考えられた.又,肝におけるATP代謝は腎より大きな変動を示し,肝移植においては一層良好な状態での摘出,保存が必要であると考えられた.(2)部分肝虚血実験を行いATP代謝を測定した.組織エネルギーチャージは組織のエネルギー状態を示す良好な指標とは言えないと考えられた.現在低酸素状態,虚血状態時に保護作用を示す抗凝固剤,抗酸化剤,プロテアーゼ阻害剤等につき検討を加えているところである.1.部分肝移植法;小児肝移植における肝サイズの問題を解消するのみならず、ドナー肝の有効利用のため肝分割使用(1ドナー2レシピエント)を目的とした部分肝移植法を検討した。ベンチサージェリーにてドナー肝を左側の70%と右側の30%に分割し以下の実験を行なった。(1)左側70%部分肝移植法;レシピエントのIVCを温存しドナーの左肝静脈をドレナージベインとした左側70%部分肝移植を行ない長期生存犬を得た。(2)右側30%部分肝移植法;まず肝門部にて門脈左枝をクランプすることにより30%肝状態を作成し門脈圧の変化を観察したところ、前値7mmHgであった門脈圧が11mmHgまで上昇し肝床の減少による門脈圧上昇を確認した。ここで右側部分肝移植(30%)を行ない門脈圧の変化をみるに、移植後には15mmHgと上昇し24時間以内に死亡した。そこで移植肝重量比を増して70%とした時、移植後門脈圧は減少し術後歩行するにいたった。現在のところ右側部分肝移植(30%)における生存可能限界は移植肝重量比で70%(体重比で2.0:1)と考えられた。2.肝摘出・保存の研究;(1)ラットを用いて70%部分肝阻血を行ない、温阻血時のエネルギー代謝および温阻血障害に対する薬剤の効果を検討した。薬剤はトロンボキサンA_2合成酵素阻害剤(CV-4151、武田薬品)、蛋白分解酵素阻害剤(ウリナスタチン;持田製薬)およびインドメサシンを用い、肝組織中エネルギー代謝に対する影響につき検討した。これらの薬剤は肝内ATPおよびエネルギーチャージを改善し、生存率の上昇をみた。温阻血に対するこれら薬剤のメカニズムをさらに検討する予定である。
転写因子CREB情報伝達系による記憶制御機構の解析

昨年度までの解析から、前脳特異的にCREB活性型変異体CREB_<DIEDML>あるいはCREB_<Y134F>を過剰発現するマウスでは、多くのタイプの学習・記憶課題において、海馬のCREB活性と正に相関して、長期記憶ばかりではなく、短期記憶(30分-2時間程度)も向上することが明らかになった。今年度は、これら変異型マウスにおける短期記憶と長期記憶向上のメカニズムを解析した。学習の難易度が高くなると変異型マウスでは、長期記憶形成の向上は観察されるものの、短期記憶の向上は観察されなることが明らかになり、CREBの恒常的活性化により短期・長期記憶の両方の向上が導かれるものの、短期記憶と長期記憶は異なるメカニズムで制御されるものと考えられた。続いて、CREB活性型変異体発現マウスでは、CREB標的遺伝子群の恒常的な高発現が短期記憶向上を導いたものと考察し、CREB標的遺伝子であるBDNFに着目し、海馬BDNFの発現レベルを解析した。その結果、短期記憶向上が顕著なトランスジェニックラインほどBDNF発現レベルが高いことが明らかとなった。そこで、BDNF発現制御を介したCREBによる記憶制御のメカニズムを解析するため、海馬にBDNFあるいはBDNF inhibitor(K252a)を注入して、短期及び長期記憶を解析した。その結果、BDNF投与により野生型及びCREB活性化変異マウスの両者で短期記憶の向上が観察されること、一方、K252a投与により、野生型及び変異型マウスの両者で短期記憶の障害が観察された。従って、CREB活性化によるBDNFの高発現が短期記憶の向上を導いたと判断した。さらに、BDNF投与により、CREB活性化変異マウスにおける長期記憶形成がより向上することも示され、BDNFの発現レベルの上昇とCREB活性化による記憶固定化能力向上の相互効果により、長期記憶形成がさらに強化されるものと考えた。本研究課題では、短期・長期記憶形成、さらに、再固定化及び消去を含めた一連の記憶制御プロセスにおけるCREBによる記憶制御の分子機構の解明を目的として研究を進めた。(1)記憶形成に対するCRE8上流キナーゼCaMKIVの役割の解析記憶形成時に中心的役割を果たすCREB活性化を導くキナーゼの同定は進んでいない。そこで、Ca^<2+>情報伝達経路に存在するCaMKWに着目し、野生型CaMKIV過剰発現マウスを作製、解析した。変異型マウスでは、CaMKIV発現量に相関した学習後のリン酸化型CREB量の上昇、海馬CA1-LTPの増強、記憶固定化能力の向上が観察され、CaMKIVはCREBキナーゼとして記憶固定化を正に制御すると結論した。また、加齢後のCaMKIV発現量の低下と記憶形成能力の減退が相関することも新たに明らかとされた。この結果に一致して、CaMKIV過剰発現マウスでは加齢後の記憶障害が観察されなかった。従って、CaMKIV-CREB情報伝達経路が加齢後の記憶能力減退を防ぐ鍵遺伝子群であることが考えられた。(2)記憶再固定化及び消去に対するCREB情報伝達経路の役割の解析恐怖条件付け文脈学習課題における記憶再固定化と消去のメカニズムを解析した。コンディショナル変異マウスを用いた解析から、CREBによる遺伝子発現が再固定化及び消去に必要であることが明らかとなった。続いて、再固定化が誘導される際には海馬と扁桃体、消去が誘導される際には扁桃体と前前頭皮質において、CREBを介する遺伝子発現が活性化されることが示された。最後に、タンパク質合成阻害剤の脳内局所注入実験を行い、再固定化には海馬と扁桃体、消去には扁桃体と前頭前野における遺伝子発現が必要であることが裏付けられた。以上より、再固定化あるいは消去の誘導を決定するメカニズムにおいて、CREB活性制御が重要なポイントとなることが示唆された。

さらに、BDNF投与により、CREB活性化変異マウスにおける長期記憶形成がより向上することも示され、BDNFの発現レベルの上昇とCREB活性化による記憶固定化能力向上の相互効果により、長期記憶形成がさらに強化されるものと考えた。