hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「分権的取引モデルによる価格理論の精緻化についての理論研究」

1では、動学的環境下で、何らかの配分問題を解決しようとする計画者が、完全な余剰の搾取を達成可能であるため条件を探索した。研究課題である「分権的取引モデルおける価格理論の精緻化」の文脈で考えると、財の売り手ないし買い手が、独占的な地位を利用して、全ての余剰が獲得可能であるような状況を明らかにした研究であると言える。エージェントが私的情報を持っていた場合でも、各エージェントの私的情報の間に相関がある場合は、私的情報が公的に観測可能であるときと同じ期待収入が達成可能であるというのは古典的な結果であるが、本論文では、動学的な環境においては、より弱い相関関係をもとに、より強い誘因整合性の条件を要求して、余剰の搾取が可能であることを明らかにした。2は、動学的環境下で、エージェントが将来の配分から受け取る効用を、事前の行動によって操作可能であり(例:公共事業を引き受ける前に設備投資を行い、工事を行うコストを減らす)、更にその事前行動が外部性を持つ場合、効率性を達成可能なメカニズムが、外部性がない場合よりも大幅に限定されることを示した。このため、財の売買のような単純な状況も含めたかなり広範な状況下で、効率性と黒字は同時には達成不能となることが明らかとなった。いずれも、動学的環境における、分権的取引を含む広範な状況に応用可能な分析であり、研究課題の解決への貢献が期待できる内容である。本研究課題は、平成26年度で終了となるため、記入しない。
肝細胞癌組織中治療抵抗性細胞集団の同定とその特徴

本研究は肝細胞癌の治療抵抗性細胞集団を同定するため、各種抗酸化ストレス酵素群の主な転写因子であるNrf2 (NF-E2-related factor 2)をターゲットとして肝切除検体を用いた研究を進めた。しかし、癌非癌部境界に存在するNrf2陽性細胞集団に特異的分布を示す分子種は同定されなかった。よって、Nrf2による解析では治療抵抗細胞の同定は困難と考え、抗がん剤の汲入及び排出を司るtransporterの解析を行った。新鮮凍結組織から抽出した蛋白を用いてWestern blot (WB)法にて解析した。Western blot法および免疫染色法により、微細胆管側へ排出するtransporterであるMultidrug resistance protein (MDR) 3の発現が低下している患者群の予後が有意に不良であることが判明した。また、MDR3多寡によって細胞の脂質であるPhosphatidylcholine (PC)の組成が変わることも判明した。治療抵抗性細胞集団の同定という本来の目的は達成できなかったが、予後と関連する蛋白としてMDR3を同定でき、その発現が脂質分布に影響を及ぼすことが判明した。本研究の目的は、肝細胞癌切除検体を用い、抗酸化ストレス酵素群及びその中枢的転写因子Nrf2の発現を基に、治療抵抗性細胞集団を同定、選別し、それらの特徴を調べることで臨床的な治療に応用しようとするものである。現在の成果:肝細胞癌切除検体を約20例ほど収集し、-80度で保存してある。このうち、3例ほどNrf2の免疫染色を施行した。腫瘍細胞の一部にNrf2陽性細胞を認めることが発見された。また、組織質量分析を過去の検体を含めて15例前後解析した。その結果、肝細胞癌組織と周囲非癌部肝組織との間に量の差を認めた脂質が数種類発見された。現在、その脂質の差をもたらす原因酵素の遺伝子発現量の差、培養細胞を用いた原因遺伝子のknock-down、過剰発現による細胞機能変化を解析中である。残念ながら、現時点ではNrf2発現細胞集団に特異的な発現差を認める脂質、蛋白質は同定されていない。よって、その差が得られない場合は、肝細胞癌・非癌部の脂質差をもたらす原因酵素の発現を調節をすることがNrf2の発現などに影響を及ぼすか、を検討し、何らかの形で肝細胞癌におけるNrf2の役割を調べる方向性への転換が必要かもしれない。現在の成果:現在までに、我々は質量顕微鏡の手技を用いることで、肝細胞癌組織と周囲非癌部肝組織との間に量の差を認めた脂質があること、その原因となる脂質代謝酵素LPCAT1が肝細胞癌の増殖や浸潤に関与することを確認した(現在投稿中)。また、現在までに5例の肝細胞癌切除検体を用いたNrf2免疫染色を施行し、腫瘍細胞の一部にNrf2陽性細胞を認めることを確認した。しかし、質量顕微鏡解析上、Nrf2蛋白発現分布の差と正もしくは逆相関するような蛋白、脂質などの物質分布が確認されなかった。よって、Nrf2によって発現調節される物質輸送蛋白の発現に着目する研究に切り替え、約30例の肝細胞癌切除検体を用いて、それら輸送蛋白の発現量や分布をWestern blotting、免疫染色などを用いて解析している。現在までのところ、術前診断EOB-Gd造影MRI(EOB-MRI)においてEOBの肝細胞癌内取り込みのある症例では、ある種の輸送蛋白が高発現していること、切除検体近赤外線観察において術前肝機能評価として投与されたIndocyanine green (ICG)の蓄積が見られること、を発見した。この解析を継続することで、輸送蛋白に特異的に輸送されて肝細胞内に蓄積するような物質を同定すること、個々の症例での輸送蛋白分布を調べることでTailor-made chemtherapyへ臨床応用すること、の可能性がひらけてくる。本研究の目的は、抗酸化ストレス酵素群及びその中枢的転写因子であるNrf2の発現を基に、肝細胞癌組織中の治療抵抗性細胞集団を同定選別し、それらの特徴を調べることで臨床的な治療に応用することであった。

切除検体凍結組織を用いたNfr2免疫染色では非癌部に隣接した癌細胞にNrf2蛋白が強発現したが、質量顕微鏡などの解析ではNrf2発現癌細胞集団に一致するような特異的分布を示す分子種は同定されなかった。ただし、肝細胞癌組織にはある種のPhosphatidylcholine (PC)が多量に蓄積していることが判明した。よって、この新たな発見に基づいた別研究を発展させ、PC蓄積の原因となる酵素Lysophosphatidylcholineacyltransferase 1 (LPCAT1)を同定、LPCAT1強発現が肝細胞癌悪性化につながることを確認して論文投稿した(Morita Y et al. J Hepatol, in press)。Nrf2を主体とした解析では治療抵抗細胞同定は困難と考え、抗癌剤の汲入及び排出を司るtransporterの解析を行った。Western blotおよび免疫組織染色にて、微細胆管側へ薬剤を排出するtransporterのMultidrug resistance protein (MDR) 3低発現群が有意に予後不良であった。現時点では何故MDR3発現の差が肝切除後予後に影響を与えるかは不明である。しかし、質量顕微鏡解析ではMDR3多寡でリン脂質PCの組成に差が観察されている。このことはMDR3が細胞膜リン脂質のFlippaseと働くことが関係していると予想している。当初の予想とは異なっていたが、transporter蛋白の免疫染色によって肝細胞癌切除後の予後予測が可能であることは、臨床上意義が深く、現在論文投稿準備中である。質量顕微鏡解析では非常に有意な結果が得られたものの、当初予想していた、Nrf2発現細胞分布と一致するような蛋白・脂質集団の同定が得られていない。方向性の変換が必要であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。転写因子Nrf2にこだわらず、化学療法抵抗性に関与する蛋白の同定を追求する方針である。また、薬剤の輸送蛋白発現とEOBやICGの分布を比較検討することで、将来のtailor-made chemotherapyへの応用に期待する。
微生物でのビタミン生産のための基礎的研究

微生物によるビタミンの生産についてはビタミンB_2、ビタミンB_<12>あるいはメタノ-ル資化菌によるコエンザイムQなどの生産が実用化されている。一方バイオテクノロジ-の進捗に伴い、従来の醗酵法に加えて酵素法による生涯が検討され始めている。酵素法での生産を成立させるためにはどの中間体を酵素法の基質として用いるか、またその酵素系をどうするかという検討が必要であるが、そのためには目的とするビタミンの生合成経路を確定するとともにその酵素系の検討がなされなければならない。ビタミンB_<12>下方配位子となっているヌクレオチド部分の塩基5,6-ジメチルベンツイミダゾ-ルの起源についてはリボフラビンまたはその前駆物質6,7-ジメチル-8-リビチルルマジンとされているがその生合成経路は確立されていない。この生合成経路をトレ-サ-法で確認することを目的とした。そのため、通性嫌気性菌である酵母を用いて、リボフラビンのビタミンB_<12>生合成に及ぼす影響を検討した。その結果、好気条件下、半嫌気条件下ともビタミンB_<12>生合成はリボフラビンによって影響を受けないことから、5、6-ジメチルベンツイミダゾ-ル部分はリボフラビンの前駆物質6,7-ジメチル-8-リビチルルマジン経由で生合成されることが明かになった。
転写終結因子Rho蛋白の分子解剖

大腸菌転写終結因子rhoは46kDaの単一サブユニットからなる六量体の蛋白質因子である。これまでの研究からrho蛋白質は大きく三つの機能領域に分けることができることが知られている。すなわちN末およそ3分の1を占めるRNA結合領域、F_1-ATPaseとのホモロジーの高い中央領域、および機能が明らかでないC末領域である。我々はrho蛋白質の構造と機能との相関について理解を深めるため、rho蛋白質の各領域にランダムな変異を系統的に導入する試みを進めてきた。これまでに、特にC末領域の変異体について詳細な解析を行ったところ、この領域がATP結合とRNA結合との双方に重要な関与をしていることが明らかになった。また、最近bovine F_1-ATPaseの結晶構造が明らかにされたので、これをモデルとしてC末領域の変異体のうちATP結合能に欠陥のあるものの変異部位をプロットしてみると、それらは、全てATP結合部位の近傍に位置することが明らかとなった。このことはrho蛋白質のATP結合領域がF_1-ATPaseのそれと同様の立体構造をとることを強く示唆する。さらに、rho六量体は従来D_3配置をとると考えられていたが、これは誤りでありF_1-ATPaseと同様にC_6対称をとることが示唆された。この考えは我々が以前得ているクロスリンク実験の結果とも合致する。
高次元数理統計解析と多元素同位体分析で読み解く深海底のレアアース濃集メカニズム

本研究は,有望な新規レアアース資源「超高濃度レアアース泥」の生成機構の解明を目的とする.本研究では,超高濃度レアアース泥が分布する南鳥島周辺の深海堆積物を対象に,(1)独立成分分析とクラスター分析を組み合わせた高次元データ解析を行い,超高濃度レアアース泥を含む全堆積層の化学的特徴を客観的かつ網羅的に分離・抽出する.さらに,(2)上記統計解析を基に,各堆積層の化学的特徴を代表する試料群を選定して多元素同位体分析を行い,各層が記録する具体的な地質現象(海洋循環変動や物質供給源の変遷など)を読み解く.上記(1)及び(2)の結果を統合して,超高濃度レアアース泥を特徴づける物質やプロセスの組合せを解明し,それらを説明可能な海洋学的・堆積学的メカニズムを考察する.2018年度はまず,2017年12月2018年1月に南鳥島周辺で実施されたKM17-14C航海(研究代表者も乗船)で採取された5本の堆積物コアから採取した133試料について全岩化学分析を行った.これと過去の研究で蓄積されたデータを統合し,総計1,646試料×41元素の濃度値から成る大規模・多変量データセットを構築した.このデータセットに独立成分分析及びクラスター分析を適用し,5つの独立な起源成分と10個の地球化学的クラスターを抽出した.このアプローチは,レアアース泥を含めた遠洋性粘土の化学組成データ解析として過去最大規模のものであり,遠洋性粘土に内在する地球化学的バリエーションの網羅的把握という点で新しく重要な意義を持つ.次のステップとして現在は,抽出した10クラスターの中心にあたる試料を各クラスターの代表試料とみなし,その砕屑性成分を分離して,同位体分析作業に着手している.今後,これらの代表試料についてSr, Nd, Pbなどの同位体比を測定し,物質供給源の変遷を考察する予定である.本研究では,申請後に実施されたKM17-14C航海で得られた新規コアも対象に加えた方がより包括的な研究になると判断したため,当該新規コア試料の化学組成データの取得を年度前半に行った上で,統計解析に着手することとした.データ解析は順調に進捗し,当初計画の約1,500試料を上回る1,646試料×41元素の大規模・高次元データセットから,統計学的根拠に基づいて10試料を選定することができた.その後は,当初予定通り,2018年度内に海洋研究開発機構地球内部物質循環研究分野が所有するクリーンルームにおいて同位体分析のための前処理作業に着手し,現在も試料処理を進めているところである.なお,申請時点の当初計画には含まれていなかったが,化学組成データの多変量統計解析に先立ち,オリジナルデータからの考察として,次世代の低環境負荷技術の鍵を握るスカンジウムがレアアース泥に多く含まれることに着目し,その資源ポテンシャルを定量的に議論した論文を2018年9月にOre Geology Reviews誌にて発表した.以上の進捗状況・成果公表状況を踏まえ,本研究は「(1)当初の計画以上に進展している」と評価した.引き続き,試料溶液のカラム分離等の前処理作業を進め,2019年度前半から半ばにかけて,南鳥島周辺堆積物の地球化学的クラスターを代表する10試料のSr-Nd-Pbの多元素同位体比データセットを構築する予定である.このデータに基づき,研究対象海域への供給物質の変化等を読み解く.その結果を踏まえ,前年度の統計解析によって抽出された独立成分や各クラスターの地質学的意味を考察する.そして,プレート運動に伴う堆積場の変化等も念頭に置きつつ,超高濃度レアアース泥の生成に関与した環境因子を明らかにする.本研究は,有望な新規レアアース資源「超高濃度レアアース泥」の生成機構の解明を目的とする.本研究では,超高濃度レアアース泥が分布する南鳥島周辺の深海堆積物を対象に,(1)独立成分分析とクラスター分析を組み合わせた高次元データ解析を行い,超高濃度レアアース泥を含む全堆積層の化学的特徴を客観的かつ網羅的に分離・抽出する.さらに,(2)上記統計解析を基に,各堆積層の化学的特徴を代表する試料群を選定して多元素同位体分析を行い,各層が記録する具体的な地質現象(海洋循環変動や物質供給源の変遷など)を読み解く.上記(1)及び(2)の結果を統合して,超高濃度レアアース泥を特徴づける物質やプロセスの組合せを解明し,それらを説明可能な海洋学的・堆積学的メカニズムを考察する.2018年度はまず,2017年12月2018年1月に南鳥島周辺で実施されたKM17-14C航海(研究代表者も乗船)で採取された5本の堆積物コアから採取した133試料について全岩化学分析を行った.これと過去の研究で蓄積されたデータを統合し,総計1,646試料×41元素の濃度値から成る大規模・多変量データセットを構築した.このデータセットに独立成分分析及びクラスター分析を適用し,5つの独立な起源成分と10個の地球化学的クラスターを抽出した.このアプローチは,レアアース泥を含めた遠洋性粘土の化学組成データ解析として過去最大規模のものであり,遠洋性粘土に内在する地球化学的バリエーションの網羅的把握という点で新しく重要な意義を持つ.次のステップとして現在は,抽出した10クラスターの中心にあたる試料を各クラスターの代表試料とみなし,その砕屑性成分を分離して,同位体分析作業に着手している.

今後,これらの代表試料についてSr, Nd, Pbなどの同位体比を測定し,物質供給源の変遷を考察する予定である.本研究では,申請後に実施されたKM17-14C航海で得られた新規コアも対象に加えた方がより包括的な研究になると判断したため,当該新規コア試料の化学組成データの取得を年度前半に行った上で,統計解析に着手することとした.データ解析は順調に進捗し,当初計画の約1,500試料を上回る1,646試料×41元素の大規模・高次元データセットから,統計学的根拠に基づいて10試料を選定することができた.その後は,当初予定通り,2018年度内に海洋研究開発機構地球内部物質循環研究分野が所有するクリーンルームにおいて同位体分析のための前処理作業に着手し,現在も試料処理を進めているところである.なお,申請時点の当初計画には含まれていなかったが,化学組成データの多変量統計解析に先立ち,オリジナルデータからの考察として,次世代の低環境負荷技術の鍵を握るスカンジウムがレアアース泥に多く含まれることに着目し,その資源ポテンシャルを定量的に議論した論文を2018年9月にOre Geology Reviews誌にて発表した.以上の進捗状況・成果公表状況を踏まえ,本研究は「(1)当初の計画以上に進展している」と評価した.引き続き,試料溶液のカラム分離等の前処理作業を進め,2019年度前半から半ばにかけて,南鳥島周辺堆積物の地球化学的クラスターを代表する10試料のSr-Nd-Pbの多元素同位体比データセットを構築する予定である.このデータに基づき,研究対象海域への供給物質の変化等を読み解く.その結果を踏まえ,前年度の統計解析によって抽出された独立成分や各クラスターの地質学的意味を考察する.そして,プレート運動に伴う堆積場の変化等も念頭に置きつつ,超高濃度レアアース泥の生成に関与した環境因子を明らかにする.本研究では,申請段階では未採取であったKM17-14C航海のコア試料を新たに研究試料として追加した.その全岩化学分析を本年度前半において新規に行ったため,同位体分析の前処理作業への着手が当初予定より後ろ倒しとなった.そのため,当初計画では2018年度内に購入予定であった同位体分析前処理(カラム分離)用のイオン交換樹脂等の購入を2019年度に回すこととした.従って,次年度使用額(B-A)は2019年度の物品費に算入する予定である.
ハロゲン化アルキルピリジニウムの水溶液内ミセル形成とミセルの球・棒転移

塩化、臭化およびヨウ化ドデシルピリジニウム(DPC、DPBおよびDPI)のそれぞれNaCl、NaBrおよびNaI水溶液について表面張力、部分比体積および光散乱を測定して水溶液表面への吸着およびミセル形成を論じた。DPCの水溶液の表面張力は臨界ミセル濃度以上で濃度の増加と共に減少し、ミセルが小さいことを示唆した。分子占有面積はDPC、DPB、DPIに対して64.8、59.3、55.1A^2で、電離度ルよる表面での静電反発を反映しており、特に臨界ミセル濃度は16.6、12.0、5.35mMで大きな対イオン依存性を示した。光散乱は、DPCのNaCl水溶液およびDPBのNaBr水溶液共に、塩濃度の増加と共に増加した後、それぞれ1.0MNaClおよび0.5MNaBrで雄大となつた後、減少する。DPCのミセルは水中から0.05MNaClまでは会合数18.6から43.5まで、それ以上4.0MNaClで71.9まで増加し、それぞれ多北性ミセルと球状ミセルと帰属できる。DPBのミセルは水中から0.3MNaBrまで会合数46.0から70.7まで増加するが、それ以上6、0MNaBrまで大きさが変らない。すなわち球状ミセルと〓家ミセルができると考えられる。DPIのNaI水溶液の光散乱から、そのミセルは水中で会合数が、71.6があるが、0.007MNaIのとき会合数90.7となり、球状ミセルをつくることが分る。さらにNaI濃度を増すときには、臨界ミセル濃度できた球状ミセルはミセル濃度の増加と共に棒状ミセルに会合する。棒状ミセルは0.05MNaIでは会合数1360に達する。球状ミセルの電離度は比較的大きく、棒状ミセルの電離度もヨウ化物にしては大きく、ピリジニウム環の寄与があると考えられる。臭化ドデシルピリジニウムを臭化ドデカンとピリジンとの反応によって合成し,その水溶液およびNaBr水溶液の表面張力,密度および静的光散乱を測定した。NaBr濃度はOから6.00Mまで変化させた。いずれの方法でもミセル形成の徴候を示すことができたが,特に表面張力は異常な現象を示し,その解釈は今後の研究に俟たなければならない。こゝには光散乱測定の結果について述べる。還元散乱強度は界面活性剤濃度が臨界ミセル濃度を越えると,急増し、その程度はNaBr濃度0.51.0MまではNaBr濃度が高いほど大きいが,1.0M以上ではNaBr濃度が高いほど低くなる。臨界ミセル濃度は,CorrinーHarkinsの式に從って,イオン生産との間に直線二重対数関係を示して,NaBr濃度の増加と共に減少する。その傾斜は0.573で,水中の電離度0.580に対応する。Debyeプロットは,NaBr濃度の増加と共に勾配が低くなる直線となり,3.00MNaBrで勾配はOとなり,それ以上では負の勾配をもつが,その程度は小さい。直線の切片の逆数からミセル分子号を求めると,水中では1.5,100で,NaBr濃度の増加と共に少し増加するが,0.30MNaBr以上では23,200と一定である。

すなわち、NaBr濃度が0から0.30Mまでは,会合数が46.0から70.7までの球状ミセルが形成されるが,それ以上のNaBr濃度では,ミセル会合数は70.7のまゝでNaBr濃度によって変らないことになる。このような最大会合数をもつ球状ミセルは稠密で,しかも単量体との解離会合も抑制されているのでないかと想像される。ミセル溶液の第二ビリアル係数は水中で,9.85×10^<-3>,1.00MNaBr中で0.110×10^<-3>,6.00MNaBr中では-0.235×10^<-3>である。塩化ドデシルピリジニウムをAldrich社から買ってアセトンで再結晶し、その水溶液の表面張力を測定した所、臨界ミセル濃度以上で濃度の増加と共に減少した。塩化ドデシルピリジニウムのNaCl水溶液の光散乱を測った所、NaCl濃度を1Mまで増加する間は光散乱は増加するが、それ以上では減少することを見出した。しかし、デバイプロツトは正の勾配をもつ直線であった。そのミセルの会合数は水中で18.6、0.01MNaCl中で25.6で、恐らくミセルは多孔性である。0.05M以上のNaClの存在ではミセル会合数は43.5から71.9までNaCl濃度の増加と共に増加し、ミセルは球状である。ヨウ化ドデシルピリジニウムは、臭化ドデシルピリジニウムを飽和〓NaI水溶液に溶かして氷冷で結晶を出し、これを繰返した後、アセトンで再結晶して得た。その水溶液の表面張力から臨界ミセル濃度は5.35×10^<-3>Mであった。そのNaI水溶液の光散乱はNaI濃度の増加と共に急増し、ミセルの成長を示唆する。デバイプロットは0.01M以下のNaIのとき正の勾配を示し、それ以上では負の初期勾配をもつと共に角度依存性を示す。これらの事実はNaI濃度0.007Mにおいてミセルは球、棒転移を起すことを意味している。ミセル会合数は水中で75.7、闊値で91.7であり、球状ミセルができている。それ以上では棒状ミセルができ、0.05MNaIで会合数1360に達する。棒状ミセルの会合数はデバイプロットの極小から求めたものである。その慣性半径は分子量の0.8乗と共に変り、棒がかなり剛いことを示す。ミセル分子量とイオン強度とは両対数関係が直線となり、球状および棒状ミセルについてはそれからミセルの電離圧および水和についての値を得ることができた。
若年性特発性関節炎における新規バイオマーカーとしてのmiRNAの同定

若年性特発性関節炎(JIA)は小児リウマチ性疾患の中で最も高頻度な疾患であり、難治性の経過をたどる例も稀ではない。本研究ではJIA患者における血液中のmiRNAの発現について検討し、miR-146aやmiR-223の発現が、全身型JIAおよび関節型JIAで有意に発現が亢進していることを見出した。miR-223はJIAの急性期でより発現が亢進しており、治療による疾患活動性の低下に伴い、発現が低下することが確認された。また、一部の血清中のマイクロRNAはJIAの疾患活動性との相関を認めた。以上のことから、血清中のマイクロRNAは、JIAの新規バイオマーカーとして有用である可能性が示唆されたタンパクをコードしていないnon coding RNAの一種であるマイクロRNA (miRNA)は、生体内の様々な遺伝子発現を調節することで、生命体の恒常性維持に密接に関与している。一方で、miRNAによる調節機能の破綻は様々な疾患に帰結し、腫瘍や関節リウマチなどの自己免疫性疾患にもmiRNAが関与していることが明らかになりつつある。miRNAは血清などの体液中でも安定して存在するという特徴があり、様々な疾患において、新規の疾患バイオマーカーとしての有用性が示されている。若年性特発性関節炎(juvenile idiopathic arthritis; JIA)は、小児リウマチ性疾患の中では、最も高頻度な疾患である。サイトカインシグナルを遮断する生物学的製剤の導入により、その予後は改善を認めている。その一方で、難治性の経過をたどる例も稀ではなく、早期診断や、疾患活動性を適切に評価した上での、積極的な治療介入が求められる。JIAに疾患特異的なmiRNAや、疾患活動性を反映するmiRNAの同定により、病態の解明や、診断および治療に有用な新規バイオマーカーとして応用が期待される。本研究では、JIA患者の血清および、血球を用いて、成人のリウマチ性疾患で発現の亢進が報告されているmiRNAを中心にreal-time PCRによる定量を行った。現在までのところ、miR-146aや、miR-223の発現が、全身型JIAで有意発現が亢進していることを見出した。一方で、少関節型JIAは、成人の関節リウマチに類似した疾患と考えられているが、関節リウマチで発現の亢進が報告されているmiR-155は、少関節型JIA患者において発現の亢進は認めなかった。これらのことは、JIAの病態を考える上で興味深い知見であり、今後も検討を進めていく予定である。タンパクをコードしていないnoncoding RNAの一種であるマイクロRNA (miRNA)は、生体内の様々な遺伝子発現を調節することで、生命体の恒常性維持に密接に関与している。一方で、マイクロRNAによる調節機能の破綻は様々な疾患に帰結し、腫瘍や関節リウマチなどの自己免疫性疾患にもマイクロRNAが関与していることが明らかになりつつある。マイクロRNAは血清などの体液中でも安定して存在するという特徴があり、様々な疾患において、新規の疾患バイオマーカーとしての有用性が示されている。生物学的製剤の導入により、その予後は改善を認めているが、難治性の経過をたどる例も稀ではなく、早期診断や、疾患活動性の適切な評価が求められる。JIAに疾患特異的なマイクロRNAや、疾患活動性を反映するマイクロRNAの同定により、病態の解明や、診断および治療に有用な新規バイオマーカーとして応用が期待される。本研究では、JIA患者の血清および、血球検体を用いて、成人のリウマチ性疾患で関連が示唆されているマイクロRNAを中心に、リアルタイムPCR法による定量を行った。現在までのところ、血清中のmiR-146aやmiR-223の発現が、全身型JIAおよび関節型JIAで有意に発現が亢進していることを見出した。さらに、miR-223は、全身型および関節型JIAの急性期でより強く発現が亢進しており、治療による疾患活動性の低下に伴い、発現が低下することが確認された。また、一部の血清中のマイクロRNAは、赤沈やMMP-3等のJIAの疾患活動性を反映している検査項目との相関を認めた。以上のことから、血清中のマイクロRNAは、JIAの新規バイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。昨年度に引き続き、本年度もJIA患者の血清および血球を用いて、マイクロRNAの定量を行った。対象患者数は、全身型JIA 8例、多関節型JIA 16例、少関節型JIA 5例、健常小児5例である。患者および健常対照から採取した血清および血球からマイクロRNAを抽出し、cDNAを合成した。その後に目的とするマイクロRNAおよび、コントロールのためにスパイクしたelegans miR-39の定量を、リアルタイムPCR法により行った。各種マイクロRNAの相対定量は、elegans miR-39のCT値と比較することで行った。昨年度に行ったmiR-146a、miR-223、miR-155に加え、本年度はmiR-132、miR-16の定量も行った。さらには、それぞれのJIA症例の回復期の検体を用いてマイクロRNAを定量し、各マイクロRNAと疾患活動性の関連についても評価を行った。また、本年度は、血清に加えて、末梢血白血球中のマイクロRNAの解析も進めた。

昨年度の検討で、全身型JIAにおいて血清中のmiR-146aやmiR-223が、健常対照に比べて発現が亢進していることを見出したが、それらのマイクロRNAは、治療に伴う疾患活動性の低下とともに、発現量が健常対照と同じレベルまで低下していることを確認した。一方で、成人のリウマチ性疾患との関連が報告されているmiR-16やmiR-132は、全身型JIAおよび関節型JIAにおいて、有意な発現の亢進は確認されなかった。また、白血球中の各種マイクロRNAの発現量についても、各疾患群において、有意な発現量の変化は認めなかった。また、各種マイクロRNAの発現量と、臨床的にJIAの疾患活動性の評価に用いられる各種検査項目との相関を検討した。その結果、血清中miR-223は、赤沈値と有意な相関関係を認め、血清中miR-16は、MMP-3と有意な相関関係を認めた。以上のことから、マイクロRNAは、全身型および関節型JIAの疾患活動性を反映している可能性があり、今後も検討を進めていく予定である。タンパクをコードしていないnoncoding RNAの一種であるマイクロRNA (miRNA)は、生体内の様々な遺伝子発現を調節することで、生命体の恒常性維持に密接に関与している。マイクロRNAは血清などの体液中でも安定して存在するという特徴があり、様々な疾患において、新規の疾患バイオマーカーとしての有用性が示されている。若年性特発性関節炎(juvenile idiopathic arthritis; JIA)は、小児リウマチ性疾患の中では、最も高頻度な疾患である。生物学的製剤の導入により、その予後は改善を認めているが、難治性の経過をたどる例も稀ではなく、早期診断や、疾患活動性の適切な評価が求められる。JIAに疾患特異的なマイクロRNAや、疾患活動性を反映するマイクロRNAの同定により、病態の解明や、診断および治療に有用な新規バイオマーカーとして応用が期待される。本研究では、JIA患者の血清および、血球検体を用いて、成人のリウマチ性疾患で関連が示唆されているマイクロRNAを中心に、リアルタイムPCR法による定量を行い、血清中のmiR-146aやmiR-223の発現が、全身型JIAおよび関節型JIAで有意に発現が亢進していることを見出した。さらに、miR-223は、全身型および関節型JIAの急性期でより強く発現が亢進しており、治療による疾患活動性の低下に伴い、発現が低下することが確認された。また、一部の血清中のマイクロRNAは、赤沈やMMP-3等のJIAの疾患活動性を反映している検査項目との相関を認めた。さらに、miR-164aの発現が亢進している患者は、関節炎のコントロールが困難であり、生物学的製剤による治療を必要とする頻度が高かった。以上のことから、血清中のマイクロRNAは、JIAの新規バイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。若年性特発性関節炎(JIA)は小児リウマチ性疾患の中で最も高頻度な疾患であり、難治性の経過をたどる例も稀ではない。本研究ではJIA患者における血液中のmiRNAの発現について検討し、miR-146aやmiR-223の発現が、全身型JIAおよび関節型JIAで有意に発現が亢進していることを見出した。
花芽形成物質の化学的研究

短日処理葉1200枚分の滲出物より精製した活性画分(200μg)はODS-HPLCで単一ピークを示し、O.01ppmで花芽形成活性を示した。しかしながらこの活性画分には夾雑物がまだ含まれていることが判明し、これをDEAE-sephadexイオン交換カラム、Sephadex G-25 superfineゲル濾過カラムおよびTOYOPEARL HW-40Sゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて精製、0.0002ppmという極めて低い濃度で活性を示す画分10μgを得ることができた。200μgの活性画分に含まれていた夾雑物はHPLC展開溶媒に由来する塩であるとわかったため、精製方法を変更し更に大量のタバコ葉1900枚を用い活性物質の抽出精製を行った結果、最終的に0.0002ppmで花芽数を1.5倍に増加させる活性画分53μgを得た。活性物質は水溶性の塩基性物質であり、透析実験の結果から活性物質の分子量は1000以下であることがわかった。また、タバコ葉からの滲出を行う前に葉柄切断面がカロースの形成により塞がれるのを阻止する目的でEDTA・2Na水溶液による切断面の侵漬処理を行い、得られた滲出物の花芽形成を検討した。TPYOPEARL HW-40Fカラムゲル濾過クロマトグラフィーの画分について花芽形成活性を試験したところEDTA無処理の場合にも出現する低分子の活性画分に加えて新たに高分子の活性画分が見いだされた。この高分子活性画分は、分子量約2万5千で低分子活性物質と同じく水溶性であった。本研究で採用した生物検定法は活性サンプル無投与の対照でもある程度の花芽が発生する系であるため得られた活性物質が花芽形成を促進するのみなのか、花成ホルモン活性と呼ぶべき花芽誘導活性も示すものであるかは、別個に調査すべき問題である。その実験の一つとして、本活性画分を短日性のアオウキクサLemna paucicostataに長日条件下で与えたが、Lemna植物体に花芽を誘導することはできなかった。1.タバコ葉より単離された花芽形成物質の化学的性質の解明単離された0.0002ppmという低濃度で花芽形成活性を示す分子量1000以下の低分子活性物質の化学的性質を解明するためには新たに3000枚のタバコ葉篩管液を採取して精製に努力したが、最終得量は約10μgに過ぎず、精密なスペクトル測定には至っていない。2.タバコ葉滲出物中に含まれる新たな花芽形成物質の精製低分子活性物質を得る際に、タバコ葉葉柄の切断面をあらかじめEDTA水溶液で浸漬処理してから滲出実験を行ったところ新たに高分子量の活性物質の存在が見出された。そこで改めて本高分子活性物質の精製の検討を開始した。TOYOPEARL HW-55Sを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分子量2万数千と推定された。現在、精製を進行中である。

3.花芽形成活性が真の花成誘導活性か、または花芽促進活性かの精査従来活性物質の単離には開花植物体から得た組織を用いる検定系を使っており、活性が誘導的、誘導的のいずれであるかは改めて精査する必要がある。我々はそのための生物検定系として、花成ホルモン存在の状況証拠とされている接木等の実験手法、また、非誘導の植物を材料とした組織培養法等が採用出来ないか検討を行った。その中で、光周期を感受するまでに成長したタバコ植物体から得た花を倍養材料としたin vitro系で、タバコ短日処理葉滲出物を培地へ投与したところ、花芽成形には至らなかったものの長日処理葉滲出物添加やサンプル無添加のコントロールではみられない特徴的な芽の生育が観察された。本in vitro系は当初目的のための生物検定系の候補として有望であり、更なる検討を行っている。0.1ppmで活性を示す活性フラクション200μgをDEAE-sephadexイオン交換カラムおよびSephadex G-25 superfineゲル濾過カラムにて精製し0.0008ppmで活性を示すフラクションを得、更に精製を進め0.0002ppmという極めて低い濃度で活性を示すフラクション10μgが得られたことから、その精製方法に従って更に大量のタバコ葉1900枚を用い活性物質の抽出精製を行った結果、0.0008ppmで花芽形成促進の活性を示すフラクションを合計168μgを得るに至った。このフラクションを更にTOYOPEARL HW-40Sカラムクロマトグラフィーを行って精製した。その際、クロマトグラフィーにかけたサンプルは何等UV吸収を示さなかったため、本クロマトグラフィーでは蒸留水で展開した各分離フラクションの凍結乾燥重量測定を行った。この重量測定の結果より溶出図を作成したところ、活性化区分を一つの山として描くことができた。この活性区分を集めて秤量すると53μgが得られ、0.0002ppmで花芽数を1.5倍に増加させる花芽形成促進活性を示した。本研究で採用した生物検定法は活性サンプル無投与のコントロールでもある程度の花芽が発生する系であり、これにより得られた活性物質が花芽形成を促進するだけのものなのか、花成ホルモン活性と呼ぶべき花芽誘導活性も示すものなのかは、別個に調査すべき問題である。その実験の一つとして、本活性フラクションを短日性のアオウキクサLemna paucicostataに長日条件下で与えたが、Lemna植物体に花芽を誘導することはできなかった。
骨格・筋系の発育スパートが脳血流配分を低減させるのか?

骨格筋系および脳血流配分の発達を検討するため,発育期における女子中高生141名(1218歳)において,心拍出量(CO),心拍数(HR),一回拍出量(SV),左総頸動脈血流(CCABF),左中大脳動脈血流速度(VMCA),平均血圧,握力,頭蓋計測,身長,体重を検討した.そして個々のパラメータが前学年の平均値よりも有意に変化する年を見出した.本研究ではCCABFを脳血流指標として用い,CCABF/CO×100の式により脳血流配分(%)を算出した.その結果,各測定パラメータの変化が著しかった時期は次のような順となった.まず一回拍出量(SV)の増大が中1(12歳)から生じ,高1(15歳)までその増大が続いた.一方,HRは中3(14歳)高1において急激に減少したが,その減少を凌駕するSVの増大のために,HRとSVの積であるCOは中1中3にかけて著しい上昇を示していた.このような心機能の発達の後に脳血流が変化した.VMCAが中2中3に,CCABFが中3高1において急激に増大した.そして高校生以降になり,体重および握力の急激な増大がみられた.握力の顕著な変化は高1高2であった.したがって,心機能,脳血流,筋系といった順序で発育することが示唆された.また脳血流配分の発達は,中1の11%を最高に中3では成人の値である7%(但し左側のみで計算)まで減少し,高校以降はほぼ7%という一定値を示し変化がみられなかった.この11%から7%への配分減少は,CCABFの低下ではなく,COの著しい増大に起因する配分比率の低下であった.これらの結果から,脳血流配分は骨格・筋系の発育スパート(高1高2)が起こる前にその発育を終了させ,そして骨格・筋系のスパート時期が脳血流配分を低減させるようなことはないと結論づけられた.「一部の体組織が急速に成長特化することが,他の組織へどのような波紋をなげかけるのか?」という課題はいまだ明らかではない.本研究では,この課題について次のような仮説を立てた.発育スパート期には骨格や筋組織が一挙にその成長を加速する.組織成長には血流増加が必要であるが,心拍出量には限界があるため,骨格や筋への血流増大を支える血流減少対象として,発育期には脳血流の低減が起こるのではないかと仮定した.この仮説を検証するため,本年度は脳血流指標の妥当性と実用性を検討した.まず(1)近赤外光分析法による酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの変化,(2)超音波画像診断装置を用いた経頭蓋脳内血流として,前大脳動脈,中脳大動脈(MCA),後大脳動脈の血流計測技術について検討をした.また,心拍出量(CO)を同時計測が本研究には必要であり,そのために指動脈圧波形法によるCOの推定値の検討を行った.その結果,次のようなことが明らかとなった.(1)近赤外光分析法による酸素化ヘモグロビン/脱酸素化ヘモグロビンの指標は,頭蓋形状により,また女子ではS/N比が低下しがちであり,頭頂葉,側頭葉では信号が捉えにくかった.また血圧変動による影響を受けやすいことが示された.(2)超音波ドップラー法によるMCA血流については,計測者が熟練すれば,血流速度の計測が可能であり,被験者の拘束度も低く,再現性のある測定値が得られた.しかしMCAの血管径を正確に計測することは難しく,また前大脳動脈と後大脳動脈における血流計測の精度得られ難いことが示された.このことからMCA血流速度計測は仮説の検証に適用可能と考えられた.(3)指動脈血圧計によるCOの推定値は,安静時であれば,超音波法における値に近似することが示され,この手法も本研究に適用可能と考えられた.骨格筋系および脳血流配分の発達を検討するため,発育期における女子中高生141名(1218歳)において,心拍出量(CO),心拍数(HR),一回拍出量(SV),左総頸動脈血流(CCABF),左中大脳動脈血流速度(VMCA),平均血圧,握力,頭蓋計測,身長,体重を検討した.そして個々のパラメータが前学年の平均値よりも有意に変化する年を見出した.本研究ではCCABFを脳血流指標として用い,CCABF/CO×100の式により脳血流配分(%)を算出した.その結果,各測定パラメータの変化が著しかった時期は次のような順となった.まず一回拍出量(SV)の増大が中1(12歳)から生じ,高1(15歳)までその増大が続いた.一方,HRは中3(14歳)高1において急激に減少したが,その減少を凌駕するSVの増大のために,HRとSVの積であるCOは中1中3にかけて著しい上昇を示していた.このような心機能の発達の後に脳血流が変化した.VMCAが中2中3に,CCABFが中3高1において急激に増大した.そして高校生以降になり,体重および握力の急激な増大がみられた.握力の顕著な変化は高1高2であった.

したがって,心機能,脳血流,筋系といった順序で発育することが示唆された.また脳血流配分の発達は,中1の11%を最高に中3では成人の値である7%(但し左側のみで計算)まで減少し,高校以降はほぼ7%という一定値を示し変化がみられなかった.この11%から7%への配分減少は,CCABFの低下ではなく,COの著しい増大に起因する配分比率の低下であった.これらの結果から,脳血流配分は骨格・筋系の発育スパート(高1高2)が起こる前にその発育を終了させ,そして骨格・筋系のスパート時期が脳血流配分を低減させるようなことはないと結論づけられた.
深層学習を用いた生物との双方向コミュニケーションの確立

今年度は,初年度に作成した実験装置を用いて引き続き実験を行った.初年度の相違点は,初年度は白点の制御を行っていたが,よりメダカに対して自然な相互作用ができるように白点を用いるのではなく,メダカに対して提示する視覚刺激を仮想メダカとした.仮想メダカは,メダカの3Dモデルを入手し,その3Dモデルからメダカの運動画像を生成して表示するように改良して実験を行った.実験では,双方向相互作用条件と単方向相互作用条件の比較を行った.双方向相互作用条件では,リアルのメダカの位置を検出して,その位置に応じて仮想メダカの動きを変える(メダカ=>仮想メダカ).仮想メダカの動きが変わればその動きに応じて,メダカは動きを変えると考えられる(仮想メダカ=>メダカ).これによって双方の動きが影響を与えることができる.一方,単方向相互作用条件では,仮想メダカは,リアルのメダカの動きから影響を受けることなく,動きが生成される.仮想メダカからリアルのメダカへの視覚情報の提示のみ行われる(仮想メダカ=>メダカ).この双方向相互作用条件と単方向相互作用条件において,メダカの振る舞いに変化が生じるかどうかを比較した.仮想メダカの動きは本年度においては,ボイドモデルを用いることによって生成した.仮想メダカの位置とリアルのメダカの位置をボイドモデルの個体の位置とし,これらの位置から次の時間での仮想メダカの位置を計算し,それを実現する仮想メダカの運動を提示した.実験の結果,双方向相互作用条件のときにリアルのメダカは仮想メダカに興味を示し,単方向相互作用実験よりも仮想メダカの存在する画面の方に滞在する時間が増加した.双方向相互作用条件の時に,リアルのメダカの特定の行動を誘発することが可能であった.これはコミュニケーションのような相互作用を仮想メダカとリアルのメダカに実現できたといえる.平成30年度の研究計画にもとづき研究を進めた.平成30年度には,初年度において構築した実験装置を用いてターゲット行動の誘発実験と双方向コミュニケーションの検証実験を行う予定であった.ボイドアルゴリズムを用いた方法であるが,ターゲット行動の誘発を行い,双方向コミュニケーションの検証のために,単方向相互作用実験を行っている.概ね計画通りに進行している.最終年度には,本年度も行っていた深層強化学習を用いた方法を中心に行っていく.今後は,申請研究計画の通り,メダカに対してターゲット行動の誘発実験と双方向コミュニケーションの検証を引き続き行っていく予定である.平成30年度には,仮想メダカの運動生成にボイドアルゴリズムを用いていた.これは機械学習を行うことなく実験することが可能であったために採用した.本プロジェクトの目的であるターゲット行動の誘発と双方向コミュニケーションは,ボイドアルゴリズムで仮想メダカを動かしても可能であることが明らかになった.最終年度では,このボイドアルゴリズムを用いた実験を行ってより精緻な結果を得るとともに,深層強化学習を用いた実験を行っていく.深層強化学習の用いた方法は,現在も行っているが,学習が安定しない.この点については,新しい深層強化学習も開発されているため,新しい技術を試すとともに,学習を安定化するための方法の検討開発を行う.また.現在の実験は,仮想メダカ1個体とリアルなメダカ1個体の2者間の相互作用において実験を行っている.メダカは社会的相互作用を見せるという先行研究もあり,多個体の条件での相互作用における振る舞いの違いについても明らかにする.初年度は,申請した研究計画の通り,まず実験装置の作成を行い,先行研究の追試から行った.水槽横にディスプレイを取り付け,白点を表示し,1/f揺らぎを使って白点の動きを制御した.これは,最終目的である双方向コミュニケーションに向けた提示条件を明らかにするための実験である.ここでは,メダカに一方向的に情報提示をすることによってメダカの行動を誘発できることを確認した.ホワイトノイズや定速で動く白点に対するメダカの行動を基準として,1/f揺らぎの白点の運動はメダカを誘引する先行研究と同様の結果がほぼ得られた.問題は実験の条件によっては,メダカが白点に慣れてしまう,ディスプレイの白点を見逃している,と考えられる事象が生じた.これはディスプレイの配置や,実験を開始するための条件を明らかにすることでの克服が可能である結果が得られつつある.また,メダカと深層強化学習を通して相互作用をさせるための,ボイドを用いたシミュレーション実験,複数メダカ個体の群行動実験と深層強化学習の実装も同時に行った.水槽(白色の発砲スチロール)の上部にカメラを固定し,12匹程度のメダカの群の動きを計測した.カメラから得られた映像では背景差分法と各メダカの個体の色からメダカの抽出を行った.その後,各個体がどのように動いたかのトラッキング処理を行うことで,各個体の移動の検出も行った.相互作用を行う前の群行動を明らかにするために,いくつかの指標を用いて群を定量的に評価した.また,深層強化学習で機械側の動作を決定するための入力を明らかにする学習実験を行った.メダカは近接個体の動きに依存して行動を決定していると考えられる結果が得られ,30年度に行っていく深層強化学習時の表示条件に利用していく.平成29年度の研究計画にもとづき研究を進めた.初年度にはメダカを用いた実験装置の構築と先行研究の追試とそれを利用した提示条件の明確化を行う予定であった.提示条件の明確化は引き続き各実験設定において行う予定であるが,概ね予定どおり進行している.

また,次年度に利用する深層強化学習のアルゴリズムの構築も同時に行っている.今年度は,初年度に作成した実験装置を用いて引き続き実験を行った.初年度の相違点は,初年度は白点の制御を行っていたが,よりメダカに対して自然な相互作用ができるように白点を用いるのではなく,メダカに対して提示する視覚刺激を仮想メダカとした.仮想メダカは,メダカの3Dモデルを入手し,その3Dモデルからメダカの運動画像を生成して表示するように改良して実験を行った.実験では,双方向相互作用条件と単方向相互作用条件の比較を行った.双方向相互作用条件では,リアルのメダカの位置を検出して,その位置に応じて仮想メダカの動きを変える(メダカ=>仮想メダカ).仮想メダカの動きが変わればその動きに応じて,メダカは動きを変えると考えられる(仮想メダカ=>メダカ).これによって双方の動きが影響を与えることができる.一方,単方向相互作用条件では,仮想メダカは,リアルのメダカの動きから影響を受けることなく,動きが生成される.仮想メダカからリアルのメダカへの視覚情報の提示のみ行われる(仮想メダカ=>メダカ).この双方向相互作用条件と単方向相互作用条件において,メダカの振る舞いに変化が生じるかどうかを比較した.仮想メダカの動きは本年度においては,ボイドモデルを用いることによって生成した.仮想メダカの位置とリアルのメダカの位置をボイドモデルの個体の位置とし,これらの位置から次の時間での仮想メダカの位置を計算し,それを実現する仮想メダカの運動を提示した.実験の結果,双方向相互作用条件のときにリアルのメダカは仮想メダカに興味を示し,単方向相互作用実験よりも仮想メダカの存在する画面の方に滞在する時間が増加した.双方向相互作用条件の時に,リアルのメダカの特定の行動を誘発することが可能であった.これはコミュニケーションのような相互作用を仮想メダカとリアルのメダカに実現できたといえる.平成30年度の研究計画にもとづき研究を進めた.平成30年度には,初年度において構築した実験装置を用いてターゲット行動の誘発実験と双方向コミュニケーションの検証実験を行う予定であった.ボイドアルゴリズムを用いた方法であるが,ターゲット行動の誘発を行い,双方向コミュニケーションの検証のために,単方向相互作用実験を行っている.概ね計画通りに進行している.最終年度には,本年度も行っていた深層強化学習を用いた方法を中心に行っていく.今後は,申請研究計画の通り,メダカに対してターゲット行動の誘発実験を行っていく予定である.まずは,機械とメダカの間で相互作用が成立している状態を明らかにする.機械とメダカのやりとりの結果,メダカがある特定の行動を誘発しやすくなるなど,機械とメダカのやりとりの結果としてメダカの行動が変化したのであれば,それは機械とメダカの間になんらかのコミュニケーションが成立しているといえる.
生体イメージングにより解析する体軸調律の細胞機能メカニズム

ショウジョウバエ雄性生殖器は発生過程で時計回りに1回転することが知られており、回転が不十分な個体は外生殖器の軸がみだれる。生体イメージングの結果、1回転には外生殖器を取り囲む単層上皮シートが2つに分離して2段階で回転することが必要であることを明らかにした。アポトーシスによって開始される2段階目の回転は、最初の回転を加速していることを見出し、発生の時間軸に沿った左右軸調律のメカニズムの一旦を明らかにした。左右非対称に器官形成を行う外生殖器の回転運動という、器官形成過程で詳細な記載の難しい制御メカニズムにどのようにして迫るのかが重要なポイントであると考えられる。我々はすでに、雄性外生殖器の正常な形成過程を単一細胞の動きのレベルでイメージングすることに成功している。単一細胞レベルのイメージングには核移行シグナルを付与した蛍光タンパク質を用いた。このイメージングから、360度の正常回転の際に外生殖器を取り囲む細胞集団であるA8体節細胞において、発生の決まったタイミングで時計回りに一部の細胞集団が移動を開始し、一定のスピードで回転運動を行ったのちに、ちょうど12時間後に360度の回転を終えて停止することが明らかになった。さらに詳細な解析を行った結果、外生殖器の周りを取り囲む細胞が、集団で同一方向に移動していることで回転を制御している様子が観察された。一方、移動している細胞のさらに周囲を取り囲む細胞層では、細胞の移動は観られず、一部の細胞が死んでいることが明らかとなった。この細胞死を抑制することで回転異常を示すことから、外生殖器の器官形成における細胞移動と細胞死の相関が示唆された。細胞死の回転への寄与を定量化するために、正常な個体と細胞死を抑制した個体で回転のスピードを比較したところ、正常な個体において観られる回転速度の上昇が、細胞死を抑制した個体では観察されず、一定の速度で回転して正常な個体と同じ時間経過で停止してしまった。この結果から、細胞死は発生の一定時間内に外生殖器の形態形成を完了するために重要な役割を持つことが示唆された(投稿中)。左右非対称に器官形成を行う外生殖器の回転運動という、器官形成過程で詳細な記載の難しい制御メカニズムにどのようにして迫るのかが重要なポイントである。イメージング解析の結果、360度の正常回転の際に外生殖器を取り囲む細胞集団であるA8体節細胞において、発生の決まったタイミングで時計回りに一部の細胞集団が移動を開始し、一定のスピードで回転運動を行ったのちに、ちょうど12時間後に360度の回転を終えて停止することが明らかになった。この速度の上昇は、回転する外生殖器のさらに外側を取り囲む細胞集団の動きによって引き起こされることが、個々の細胞の追跡によって明らかとなった。加えてその外側の細胞集団の回転には細胞死が必要であり、細胞死が器官形成の完了と体軸形成に重要な働きを持つことが明らかになった(Kuranaga et al., Development 2011)。一方、アポトーシスを抑制した場合、回転開始と停止は野生型と同様のタイミングでおこるにも関わらず、回転が不十分のまま止まってしまった。そこで、回転速度を定量的に解析すると、正常な回転は4つのステップ、すなわち開始、加速、減速、停止で進行しており、アポトーシスを抑制した場合は加速出来ずに不十分に停止することが明らかになった。さらに詳細な解析を行った結果、外生殖器の周りを取り囲むリング状の細胞集団(A8背板)が、内側と外側の2つに分かれて、回転開始の2時間までは内側のリングだけが回転し、加速のタイミングで外側のリングが回転したことから、加速が外側のリング回転によって引き起こされると予測された。

確かにアポトーシスを抑制した個体では外側のリングが回転出来ず、内側のリングだけが回転していたことから、外生殖器の回転は、A8背板が2つのリングに分かれてそれぞれが180°回転した結果、正常に完了することが明らかになった(Kuranaga et al.,2011)。つまり、A8背板の内側と外側のリングは別々に回転することが示唆された。Noselliらは、ハエ左右軸制御因子であるMyo1Dを内側だけ、あるいは外側だけでノックアウトすることで、2つのリングは互いに違う方向に回転し、結果的に-180°+180°で0°回転となることを報告した。このイメージングは我々のシステムでも再現されており、体軸形成に2つの細胞集団が協調する必要があることを示している。