hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肉腫診断のためのcDNAアレイ開発とその臨床応用に関する研究

肉腫は,その発生母地である間葉系細胞の多彩さを反映し,非常に多くの種類がある.その中には悪性度の高いものも多く含まれているが,個々の肉腫の頻度は低いため,病理診断が極めて難しい.一方,適切な治療や予後の推定のためには正確な病理診断が不可欠である.近年,多くの肉腫に腫瘍特異的な染色体相互転座とそれに由来するキメラ遺伝子の存在が明らかとなったので,これを指標としてDNAアレイ技術に基づいた分子病理学的診断法の構築を試みた.滑膜肉腫,明細胞肉腫,ユーイング肉腫の腫瘍RNAよりcDNAを作成後,これらを含む数種類の肉腫特異的なキメラ遺伝子群のmultiplexPCRを施行,この際反応産物に組み込んだSP6プロモーターにより逆転写しビオチン標識キメラ遺伝子cRNAを作成した.シグナルの検出には,各パートチー遺伝子のエクソン内の配列をプローブとしてメンブレン上に配置しプレパラートに貼り付けたマクロアレイスライドを用いた.cRNAとスライドのハイブリダイゼーション後アルカリフォスファターゼ発色し,シグナルを可視化した.その結果,殆どの検体で当該のキメラ遺伝子の検出ができ,ダイレクトシーケンス法の結果と一致した.また,キメラ遺伝子融合部位のエクソンの同定も可能であった.本法は遺伝子増幅装置があれば病理検査室で充分実施可能な簡便な方法で,また3日程度で実施可能なため通常の組織標本作成と並行して行うことができる.結果は組織標本と共に保存が可能である.診断面の利点として,多くのキメラ遺伝子を一度に検索できるので,病理組織学的診断に左右されない分子病理学的診断を行える.したがって本法は肉腫の病理診断の精度向上が期待できる,新しい実践的なキメラ遺伝子検出法として意義深いと考える.肉腫は,その発生母地である間葉系細胞の多彩さを反映し,非常に多くの種類がある.その中には悪性度の高いものも多く含まれているが,個々の肉腫の頻度は低いため,病理診断が極めて難しい.一方,適切な治療や予後の推定のためには正確な病理診断が不可欠である.近年,多くの肉腫に腫瘍特異的な染色体相互転座とそれに由来するキメラ遺伝子の存在が明らかとなったので,これを指標としてDNAアレイ技術に基づいた分子病理学的診断法の構築を試みた.滑膜肉腫,明細胞肉腫,ユーイング肉腫の腫瘍RNAよりcDNAを作成後,これらを含む数種類の肉腫特異的なキメラ遺伝子群のmultiplexPCRを施行,この際反応産物に組み込んだSP6プロモーターにより逆転写しビオチン標識キメラ遺伝子cRNAを作成した.シグナルの検出には,各パートチー遺伝子のエクソン内の配列をプローブとしてメンブレン上に配置しプレパラートに貼り付けたマクロアレイスライドを用いた.cRNAとスライドのハイブリダイゼーション後アルカリフォスファターゼ発色し,シグナルを可視化した.その結果,殆どの検体で当該のキメラ遺伝子の検出ができ,ダイレクトシーケンス法の結果と一致した.また,キメラ遺伝子融合部位のエクソンの同定も可能であった.本法は遺伝子増幅装置があれば病理検査室で充分実施可能な簡便な方法で,また3日程度で実施可能なため通常の組織標本作成と並行して行うことができる.結果は組織標本と共に保存が可能である.診断面の利点として,多くのキメラ遺伝子を一度に検索できるので,病理組織学的診断に左右されない分子病理学的診断を行える.したがって本法は肉腫の病理診断の精度向上が期待できる,新しい実践的なキメラ遺伝子検出法として意義深いと考える.【はじめに】軟部腫瘍はその種類の多さ,希少性,組織像の多彩さから病理組織学的診断に難渋することが多い.近年,多くの肉腫に特異的キメラ遺伝子が同定され,その検出が有力な病理補助診断になりつつあり.一方,cDNAアレイは同時に多数の遺伝子の発現解析が可能な技術であるが,中でもcDNAマクロアレイ法は,限定的な数の遺伝子の詳細な解析に適している.【目的】肉腫特異的なキメラ遺伝子のcDNAマクロアレイ法による検出法を確立し,新たな肉腫診断法として位置付ける.【方法】特異的キメラ遺伝子を有する肉腫(EWS-Fli13例,EWS-ATF14例,EWS-WT12例,EWS-CHN2例,TAF2N-CHN1例)に関して,病理組織標本(ホルマリン固定パラフィン包埋材料)より抽出したRNAよりcDNAを作成後,キメラ遺伝子の様々なエクソン特異的プライマーによるビオチン付加PCR法を施行し,各キメラ遺伝子のプローブを搭載したメンブレンとハイブリダイゼーションを行い,化学発光法により検出した.【結果】個々の肉腫に特異的なプライマーのみの検出系ではEWS-CHN, TAF2N-CHNを除き,シグナルの検出が良好であり,キメラ遺伝子の融合エクソンの同定が可能であった.一方,すべてのプライマーを混合した場合には非特異的シグナルの増強が認められ,本来のシグナルの同定が困難になる傾向があった.【結論】cDNAマクロアレイ法によるキメラ遺伝子同定法は構築可能であるが,特異性に関して改善を要すると考えられた.特に,1)PCR反応時の非特異的増幅,2)PCR法によるラベリング,3)ハイブリダイゼーションの効率に関してさらなる検討が必要である.EWS-CHN, TAF2N-CHNでは検出感度に問題があると考えられた.【はじめに】軟部肉腫には腫瘍特異的なキメラ遺伝子を有するものが多く知られている.特異的キメラ遺伝子の検出は,病理学的診断が困難な肉腫症例の補助診断

法として極めて有効である.これらの肉腫特異的キメラ遺伝子の検出にmultiplexPCR-cDNAマクロアレイ法が適用できれば,一度に多くのキメラ遺伝子の検出が短時間に可能となり,病理診断上有用である.昨年度(平成16年度)は本法が原理的にキメラ遺伝子検出に応用可能であることを示したが,同時にいくつかの問題点も明らかとなった.中でも特異性の向上が当面の課題と考えられた.【目的】非特異的なシグナルの増強の原因として,1)PCR反応時の非特異的増幅,2)PCR法によるラベリング,3)ハイブリダイゼーションの効率,の影響が考えられるので,これらを改善を目的とする.【方法】1)に関して,キメラ遺伝子特異的プライマーにアンカープライマー配列を付加し,従来のPCRの後にアンカープライマー配列を用いた第2回目のPCRを施行した.2),3)に関してはPCR施行時にSP6プロモーターを産物に組み込み,これを用いてin vitro transcriptionを施行しcRNAを作成した.この際,ビオチン標識UTPを取り込ませて標識し,これを従来の膜上で化学発光により検出する方法とした.本法を特異的キメラ遺伝子を有する肉腫(EWS-Fli1 2例,EWS-ATF1 2例,EWS-CHN2例,SYT-SSX7例)に適用した.【結果】上記の方法により,全例で非特異的なシグナルをほぼ消失させることができ,膜状での陽性シグナルが容易に判定可能となった.ただし,SYT-SSX1とSYT-SSX2のように産物のホモロジーが高い場合には両方のシグナルが検出されてしまうことがあり,プローブの配列の検討が必要と考えられた.【結論】検出特異性を向上する新たな方法が確立され,multiplexPCR-cDNAマクロアレイ法は実際のキメラ遺伝子診断に応用可能であると考えられる.【はじめに】軟部腫瘍のキメラ遺伝子の検出にcDNAアレイ技術が適用できれば,一度に複数のキメラ遺伝子について検索が可能となり,病理診断上極めて有用である.我々は,平成17年度までにmultiplexPCR-cDNAアレイ法に.よるキメラ遺伝子の検出法の確立し,さらに特異性の問題点を改善するためにin vitro transcription法を組み合わせた新たな検出法を構築した.【目的】本法を通常の病理診断に応用するためには,キメラ遺伝子検出過程(プローブアレイ作成過程を除く)が,病院内の病理検査室レベルで実施できる必要がある.その方法について,詳細な検討を行った,【方法】東京大学附属病院病理部において,本法を施行した.キメラ遺伝子を有する軟部腫瘍の凍結検体を用いて,(1)tota1RNAの抽出、(2)1^<st> strandcDNA synthesis,(3)Nested PCR,(4)ln vitro transcription法によるbiotin付加RNの作成,(5)プローブ(アレイスライド上)へのhybridization,(5)シグナルの検出,のすべての過程を施行した.アレイスライドは通常の病理検査に用いられるプレパラートに検出用メンブレンを貼り付けたものを予め作成した.【結果】
浸潤性膵癌形成後の維持・進行におけるクロマチン制御因子の機能とその分子機構の解明

膵癌は最難治性癌であり、新規治療法の開発は急務の課題である。申請者らは、SWI/SNFクロマチンリモデリング複合体の必須因子BRG1に以前より着眼し、膵癌形成におけるBRG1の役割を世界に先駆けて明らかにしてきた。本研究では、一連の研究成果を踏まえ、独自の遺伝子改変膵癌モデルマウスを用いて、BRG1を標的とした新規膵癌治療法の開発に向けて、浸潤性膵癌の維持・進行におけるBRG1の機能的役割とその分子機構を解明する。
移動境界問題の界面を追跡するための数値解法の開発とその解析

これまでの研究において移動境界問題の中で代表的な、氷の融解・凝固の過程を記述する古典的ステファン問題の近似解法について研究した。特に、線形問題の繰り返しによる近似と反応拡散系による近似である。線形熱方程式を繰り返し解くことによる古典的ステファン問題の近似解法を2つ提出し、その収束性について論じた。一つ目(スキーム1)は、ステファン問題を近似する反応拡散系(RD1)の特異極限を表現するために導出されたものである。このスキーム1の収束性について空間一次元の場合に証明した。スキーム1を性質の良いものへ修正した二つ目の近似解法(スキーム2)を提案し、その空間多次元での収束性を示した。スキーム1により得られる近似解は一般に不連続であるのに対し、スキーム2により得られる近似解は滑らかである。この意味でスキーム2はスキーム1を滑らかにしたものと考えることができる。古典的ステファン問題の弱解は一般に不連続であるがこれを滑らかなもので近似するということは、解析のしやすさや数値解法の有用性の面において重要であるといえよう。そこで、この考えをスキーム1導出に用いた反応拡散系RD1に適用することにより、新たに古典的ステファン問題を近似する反応拡散系(RD2)を提出した。RD1、RD2のそれぞれの収束性を研究することにより、反応拡散系の場合にも滑らかなもので近似することの有用性が分かった。さらに、この研究の過程において、古典的ステファン問題だけではなく、多くの小さな孔が空いている媒体中の流体の流れを表すPorous medium方程式や生物の競合の問題である交差拡散系など、退化放物型の方程式系に対する統一的な反応拡散系近似を導出することができた。
放電法及び質量選別多光子イオン化法による不安定分子種の生成及び電子構造の研究

本研究ではまず、主チャンバーで放電法により生成されたイオンを別室に分子線として導入するため作動排気型の真空チャンバーを製作した。別室には四重極質量分析計を取り付けイオン種を観測した。さらに放電条件を変え、イオン種の生成パターンの変化を調べ、目的のイオンを得るための最適条件を調べた。実験の結果、キャリアーガスの種類によってイオンの開裂パターンに違いが生じた。例えば芳香族分子において、Heをキャリアーガスとして使った場合、親イオンのピークは弱く、かなりイオンの開裂が起こるのに対し、Arをキャリアーガスに使った場合、ほとんど親分子のみが出現した。さらにいずれの場合もキャリアーガスのピークは目的の親分子に比べて非常に小さい。また放電電圧が高いほどイオンが小さく断片化することが分かった。上記の実験事実と、我々が以前に報告した放電法によって、超音速自由噴流中に非常に効率よく有機分子の3重項状態が生成される事から、今回の実験において、イオンの生成過程は主に3重項状態にあるキャリアーガスの準安定種と分子の衝突によるPenningイオン化であると結論される。この時、HeとArの最低励起状態である3重項状態のエネルギーはそれぞれ19.82eV及び11.6eVであり、このエネルギーと分子のイオン化ポテンシャルの差が親イオンに与えられる。そのため分子がイオン化された場合、Heの方がArの場合より大きな過剰エネルギーを持つために開列が起こると結論される。以上の結果、目的とする親イオンを研究対象とする場合、Ar分子をキャリアーガスとして用い放電電圧を低くし、娘イオンを研究対象とする場合は、Heをキャリアーガスとして用い放電電圧を高くすればよいと結論される。現在質量分析計のイオン源が分子線を乱してしまうため、改良を行い、レーザー光解離の実験により、イオン及びそのクラスターの極低温気体の電子スペクトルの研究に着手したい。
事例ベース意思決定の拡張による消費者モデリングとその応用

本研究は、過去に経験した事例をもとに判断を行う、事例ベース意思決定理論(CBDT)を拡張し理論研究や実証を行い、マーケティングに応用することを目的としたものである。理論では、CBDTの際の対象の属性の数や選択肢数により問題が発生することを明らかにした。実証では主観的評価を組み込んだCBDTや過去の他者の行動(外部性)を組み込んだ状態依存モデルを構築し、それが既存のモデルよりも説明力が高いことを調査データを用いて示した。また消費者間の類似性が意志決定や幸福度と関連することも明らかにした。応用では、消費者の類似度関数を自動で導くシステムの構築を行った。成果は学会報告や論文、書籍を通して発表した。本研究は,事例ベースの意志決定をもとにした消費者モデリングを通じて新たな消費者行動のモデル開発を行い,マーケティングなどへの知見をもたらすことを目的としている.計画は大きく分けて理論研究(研究実施計画書における(1)),実証と応用(計画書における(2)(4)),システムの作成(計画書における(5))で構成されている.本年度の成果は,理論研究においては下記の1(および2),実証においては2,3,システムの開発では4の合計4点でとなっている.1.事例ベース意志決定など距離を用いる方法の理論研究を行った.結果として距離に基づくとき意志決定では属性が多数ある場合,混乱が生じる可能性があることが明らかとなった.2.理論・実証研究において仮説を豊富化させるための意志決定の研究を行った.事例ベース意志決定モデルが想定しているのは過去の行為や過去に購入した製品属性などの影響(状態依存)である.これに加え過去における他者の行動の影響(外部性)に関する研究を行い事例ベース意志決定との違いを考察にした.さらに意志決定の方法はそのひとの知識や状況に応じて変化する.その例としてモバイルに関する行動の分析を行った.3.実証を行うための調査を実施し,記述統計レベルの分析を行った.事例ベース意志決定の事例として時系列的であり,また不確実性が伴うような事例としてテレビ番組の選択に関する調査を行った.4.事例ベースの意志決定を仮定した消費者やマーケティングの意志決定支援システムの開発を行った.まず,事例ベース意志決定と同様に類似性を用いる推論形式を調べた.次に事例ベース意志決定を発想推論という枠組みでとらえ,そのシステムを考案し,シミュレーションデータでの検証を行い成功した.1,2,4,に関しては対外的な発表をし,また査読付きの論文誌もしくは査読つきの国際会議に投稿している.本研究は,意思決定理論における新たなパラダイムである事例ベース意思決定理論の拡張を行い,特にマーケティングで応用することを目的としていた.計画の区分は,(1)手法の理論的妥当性の検証, (2)/(3)調査データ,購買データに基づいた応用可能性の検証,(4)/(5)マーケティングにおける活用方法の検討,自動推薦システムの構築,であり,大きくわけると,1.理論的側面の検証,2.調査・購買データによる実証,3.マーケティングへの応用やシステム構築の3つである.研究業績は,下記の発表および論文投稿である.理論面では,一つ目に,事例ベース意志決定理論などの距離にもとづいた意志決定理論がもつ問題点を指摘した.距離にもとづいた意志決定の場合,製品属性が増加につれて消費者は混乱し,購入確率が等しくなるということを数理的に示した.二つ目に,上記に関連し,商品数の増加からくる混乱とその場合における企業の戦略策定の方法も明らかにした.続いて,実証について述べる.一つは,意志決定に関するウェブ調査を行い,過去の主観的評価を用いた事例ベース意志決定の実証モデルを構築し,それが既存の事例ベース意志決定モデルよりも説明力が高いことを示した.二つ目に,コンジョイント分析による調査をし,事例ベース意志決定を単純化した,過去の同じ商品の購入経験から影響を受けるモデルについて実証している.この影響に加え他者の影響(外部性)をいれた場合,後者の影響が高くなることを示した.三つ目に,事例だけでなく消費者間の類似性が効用や幸福度に関連することを明らかにするため調査と分析を行い実証した.最後に,応用やシステム構築では,消費者が事例ベース意志決定を行うと仮定し,仮に新たな商品を購入した際に,どのような類似性を元に意志決定しているかを自動的に導き出し,推薦に利用できるルールを導くシステムを構築を行い検証した.researchmapのブログを利用している.マーケティング本研究では,初年度は主に理論と実証のための準備を行う計画であった.具体的にはモデル構築・シミュレーションによる提案手法の理論的妥当性の検証(計画書における(1)),調査データに基づいたモデルの妥当性の検証(計画書における(2))の前半部分である調査設計を行う計画であった.これに対して,本年度は,まず理論的な研究に関して進展があった(計画書の(1)).

具体的には距離を用いた意志決定における問題点として属性が過剰に増えたときは識別が困難になることが明らかになった.さらに,状態依存との関連を明らかにしている.これらの成果については査読付きの論文誌に登録しているほか,国際会議での発表も行う.また,特に状態依存に関する研究の成果については現在論文誌に投稿中である.以上のように理論的な考察については大きな進展があった.次に,調査計画のみならず調査を実施したことがあげられる(計画書の(2)(4)).調査の設計や試作が予想以上に早かったため予算の前倒しを行ってデータの分析を行った.ただし,調査したデータを分析するという点については来年度実施予定である.このように現在分析途中ではあるが,当初の予定を1年前倒しし,調査を行うことができた.さらに,最終年度で開発を行う予定であった事例ベース意志決定を用いたマーケティングに関連するシステムの開発(計画書の(5))について前倒しで行った.具体的にはアブダクションという推論の枠組みとの関連が明らかになったことで,意志決定を用いたシステムの開発を行い,簡単な実験をするところまで行った.このように最終年度で取り組む予定であった一部をすでに行っており完成に向けて大きな前進があった.以上の3点を鑑み,おおむね順調に進展していると考えられる.最終年度は実証研究の続きおよび,応用の検討,さらにシステム化に向けた検討を行う.その上でその成果の取りまとめや公表を行う.研究については,まず,第一に得られたデータをもとに分析をすすめることを考えている.特に事例ベース意志決定モデルを用いた統計モデルに対して分析を行う(計画書の(2)(3)).さらに決定モデルを用いたマーケティングへの応用についても検証する(計画書の(4)).具体的には,広告や価格戦略などを行った場合など様々な状況下におけるシミュレーションを実施してその結果を考察する予定である.次に,システムの検証についても実データを用いて検証することを想定している(計画書の(5)).具体的には調査で得られたデータに対して分析をすすめることを考えている.それぞれ学会発表を行い,さらに論文として査読付きの学会に投稿する予定である.また,Webなどを通じて研究成果の発表おこなう.最終的には,これらの成果を取りまとめた報告書を作成する予定となっている.当初,次年度に行う予定であった調査を前倒しし,当該年度に行うことになった.その調査費用が予定よりも安くで済んだほか,旅費を抑えたために差額が生じている.この費用は査読に出している論文が返ってきた場合の修正後の英文校正の費用が生じるリスクに対応したものとなっている.今後は,昨年から投稿している論文の査読などにあてる.また,次年度においては実データの購入や調査を追加的に行う際に利用する.さらに特に成果の発表のために国内外の出張を予定しておりそのために旅費を多くとっているため,これにあてる予定である.
戦略的車線変更意思決定メカニズムを考慮した交通流解析

本研究では,車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係について把握することを目的としている.2018年度はその分析の内,主に車線変更時のドライバーの意図の多角的な視点での把握に関しての運転実験を行った.具体的には,ドライビングシミュレータで運転する場合に自然な車線変更を被験者に行わせる手法の検討・計画と,実際の運転実験での観測を30名の被験者に対して行った.その結果,走行車線から追越車線への車線変更を数百回観測することができた.このとき観測した項目は,走行軌跡,車間距離等のドライビングシミュレータから得られるデータ,心拍,呼吸数,筋電,発汗,体温に関しての時々刻々のデータ,意図が変化した時点を被験者に直接入力してもらったデータである.これらのデータを収集した後,時系列に従ってデータの統合を行い,車線変更のパターン別に意図が観測されているか否かを確認した.これらのデータを用いて今後,車線変更時のドライバーの意図を把握する上でより高度な統計的分析を行うことが可能であると考えられる.一方,ドライバーの意図の違いが交通流に与える影響の把握を分析するに関しても,交通ミクロシミュレーションモデルを用いてモデルの精度検証を兼ねた実践的な解析を行い,より高度なモデリング方法について検討を進めた.交通ミクロシミュレーションモデルに組み込まれている加減速のモデルのパラメータ等の交通流への感度について解析を行った.また,交通ミクロシミュレーションモデルに組み込まれている車線変更モデルの精度確認に用いることが可能な実際の車線変更数のデータの分析・整理を平行して行った.これらの精度検証を通してより現実的な車線変更の交通流への影響を分析できると考えている.2018年度はドライビングシミュレータ上において,自然な車線変更のデータを取得する方法の検討とその計画を主体に研究を進めており,計画段階で予定していたデータの高度な解析が課題として残された.取得したデータのエラーやデータの複雑さなどに基づく補間・整形作業が発生した点が予定通りに進まなかった一因である.今後は,ドライビングシミュレータ実験を通して取得したデータの高度な解析を行い,その結果を交通ミクロシミュレーションモデルへ反映した上で,車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係についての解析を交通ミクロシミュレーションモデルを用いて進めてゆき,研究全体の統括を行ってゆく.本研究では,車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係について把握することを目的としている.この分析手法として,1.車線変更時のドライバーの意図の多角的な視点での把握,2.ドライバーの意図の違いが交通流に与える影響の把握という2段階の解析を計画している.29年度は,1段階目に対応する部分に関しては,ドライバーの意図を生理学的視点からとらえるためのデータ収集を行い,その解析および関連文献の整理を行った.収集したデータは,実道上走行時の走行軌跡,車間距離,心拍,呼吸数,筋電等に関しての時々刻々のデータ,ドライビングシミュレータ上において車線変更を自由に行った場合のデータである.これらは今後,線変更時のドライバーの意図を把握する上でより有用なデータ項目を確認するために用いる.得られたデータに関しては,生体データと走行データの関連性などに関して既存の文献を参考にしつつ確認を行った.また,2段階目に対応する部分に関しては,ドライバーの車線変更挙動の違いが交通流に与える影響のシミュレーション解析について,交通ミクロシミュレーションモデルの構築・実装とそのモデルを用いた解析を行い,より高度なモデリング方法について検討を進めた.交通ミクロシミュレーションモデルには,車線変更のモデルと加減速のモデルが組み込まれており,双方の開発とモデルパラメータ等の交通流への感度について解析を行った.特に,車線変更時には車線変更車線変更車両の後方,すなわち車線変更を受け入れる車両の加減速が渋滞等の要因であると考え,その加減速のモデルを重要視した開発と解析を行った.交通ミクロシミュレーションモデルを用いたドライバーの意図の違いが交通流に与える影響の解析は十分に進んでいると考えられる.車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係については,実走行の生体データと走行データが取れており,その解析を行っているが,その中の車線変更に関しては有用なデータが少ない.また,ドライビングシミュレータ上において,うまく車線変更のデータを取得する方法を模索中であるため,今後のデータ収集をうまく進める必要がある.本研究では,車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係について把握することを目的としている.2018年度はその分析の内,主に車線変更時のドライバーの意図の多角的な視点での把握に関しての運転実験を行った.具体的には,ドライビングシミュレータで運転する場合に自然な車線変更を被験者に行わせる手法の検討・計画と,実際の運転実験での観測を30名の被験者に対して行った.その結果,走行車線から追越車線への車線変更を数百回観測することができた.このとき観測した項目は,走行軌跡,車間距離等のドライビングシミュレータから得られるデータ,心拍,呼吸数,筋電,発汗,体温に関しての時々刻々のデータ,意図が変化した時点を被験者に直接入力してもらったデータである.これらのデータを収集した後,時系列に従ってデータの統合を行い,車線変更のパターン別に意図が観測されているか否かを確認した.これらのデータを用いて今後,車線変更時のドライバーの意図を把握する上でより高度な統計的分析を行うことが可能であると考えられる.一方,ドライバーの意図の違いが交通流に与える影響の把握を分析するに関しても,交通ミクロシミュレーションモデルを用いてモデルの精度検証を兼ねた実践的な解析を行い,より高度なモデリング方法について検討を進めた.交通ミクロシミュレーションモデルに組み込まれている加減速のモデルのパラメータ等の交通流への感度について解析を行った.また,交通ミクロシミュレーションモデルに組み込まれている車線変更モデルの精度確認に用いることが可能な実際の車線変更数のデータの分析・整理を平行して行った.

これらの精度検証を通してより現実的な車線変更の交通流への影響を分析できると考えている.2018年度はドライビングシミュレータ上において,自然な車線変更のデータを取得する方法の検討とその計画を主体に研究を進めており,計画段階で予定していたデータの高度な解析が課題として残された.取得したデータのエラーやデータの複雑さなどに基づく補間・整形作業が発生した点が予定通りに進まなかった一因である.今後は,交通ミクロシミュレーションモデルの改善とその解析を進めるとともに,車線変更時の走行軌跡,車間距離,心拍,呼吸数,筋電等のデータを,ドライビングシミュレータ実験などを通して適切に収集し,それらのデータの解析と,研究全体の統括を行ってゆく.今後は,ドライビングシミュレータ実験を通して取得したデータの高度な解析を行い,その結果を交通ミクロシミュレーションモデルへ反映した上で,車線変更時のドライバーの意図と交通流の関係についての解析を交通ミクロシミュレーションモデルを用いて進めてゆき,研究全体の統括を行ってゆく.実験に用いるドライビングシミュレータソフトの更新費用が想定よりも安価に収まり,また,実験時の人件費に関して外部の予算で賄うことができたため,当該助成金が生じた.次年度には実験時の人件費を増やし,実験のサンプル数を増やす計画である.出張旅費が別の予算から出せることになり,また,運転実験に必要な被験者を募集を効率よく行ったため,人件費も少なく抑えられたため次年度使用額が生じた.次年度の補完的な運転実験や研究成果の発表のための費用として使用する予定である.
疾患抵抗性を示す在来種家畜におけるサイトカインストーム回避機序の解明

アフリカ大陸、アジア諸国、南米などに古来より生息する在来種家畜や野生動物は、種々の疾病に対して抵抗性を示す。本研究により、外来種家畜が致死的であるスーラ病の起因原虫Trypanosomaevansiや東海岸熱の起因原虫Theileriaparvaに感染しても制御性樹状細胞などの作用により炎症が緩和される結果、サイトカインストームを起こさず疾病に対して抵抗性を示すことが明らかとなった。アフリカ大陸、アジア、南米などに生息する在来種家畜や野生動物は、種々の疾病に対して抵抗性を示す。本研究により、外来種家畜が致死的であるダニ媒介性原虫やウイルスに感染しても在来種家畜や野生動物はサイトカインストームを起こさず無症状であることが明らかとなった。しかし、このような疾患感受性の違いを示す詳細な機構は未だ解明されていない。今年度は、サハラ砂漠以南に広く分布し、各種感染症に対して非常に強い抵抗性を示すアフリカスイギュウ(Syncerus caffer)の免疫学的調査を開始した。アフリカスイギュウの免疫学的解析は行われていないことから、まずサイトカイン遺伝子などの塩基配列を同定し、他種哺乳類のものとの系統学的比較解析を行った。ケニア共和国ナイロビ国立公園内にてアフリカスイギュウより血液を採取した。白血球分画を調製後、RNAを抽出しcDNAを合成した。既知ウシサイトカイン遺伝子より各種プライマーを設計し、調製したcDNAを鋳型としてPCRを行った。各PCR産物を精製後、各サイトカイン遺伝子のORF全長をクローニングし塩基配列を決定し、他のウシ科動物を中心に系統学的比較解析を行った。今回得られたアフリカスイギュウのIL-1α,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IFN-γおよびTNF-α遺伝子の予想アミノ酸配列のウシ(Bos taurus)との相同性はそれぞれ、99.4%,99.1%,99.4%,98.5%,99.5%,98.5%,98.1%,100%であった。今後、得られた配列を基にサイトカイン定量法の開発、組換え体や抗体の作製を行い、疾患感受性の解析や各種病原体への免疫応答などについて感受性動物との比較免疫学的解析を行う予定である。アフリカ、アジアおよび南米などに生息する在来種家畜や野生動物は、種々の疾病に対して抵抗性を示す。Theileria parva (T.parva)原虫によるウシの東海岸熱の致死率は70100%にも至る。我々は、外来種ウシ(Bos taurus)が、T.parvaに感染すると炎症性サイトカインストームが引きここされ数日で死に至ること、アフリカ在来種(Bos indicus)は、T.parvaに感染しても無症状であることを報告した。これらの在来種が分布するアフリカサハラ砂漠以南ではアフリカスイギュウ(Syncerus caffer)が、T.parva感染に対しさらに強い抵抗性を示すことが知られているが不明な点が多い。そこでケニア共和国ナイロビ国立公園内にてアフリカスイギュウより採材を行い、比較免疫学的解析を行った。各サイトカインの遺伝子塩基配列を決定しReal-time PCR法による定量解析法を構築後、発現解析(IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-12p40,IFN-γ,TGF-β1,TGF-β2およびTNF-α)を行った。血液塗抹中の原虫の有無ならびにReal-time PCR法を用いたp104遺伝子の定量的検出により、7頭中3頭においてT.parvaの感染が確認された。しかし、ウシでの感染致死量以上の原虫数が認められたが、臨床症状は全く呈しておらず、感染および非感染両群間におけるサイトカインの発現にも顕著な差は認められなかった。今回の結果より、アフリカスイギュウはT.parvaに感染後、原虫血症を呈するにもかかわらず、感染ウシで認められた炎症性サイトカインストームを起こさないことが明らかとなった。今後、このような疾患感受性の違いを示す詳細な機構について解明したい。本研究により、外来種家畜が致死的である原虫やウイルスに感染しても在来種家畜や野生動物はサイトカインストームを起こさず無症状であることが明らかとなった。今年度は、スーラ病の起因原虫であるTrypanosoma evans野外分離株を用いてサイトカインストームによる病態発生機序の解析を行った。フィリピンで分離したT. evansi樹立クローンをマウス(BALB/c)に接種し比較病原性解析を行なった結果、強毒株接種マウスでは、接種後8日目に著しい脾臓の腫大や白血球数の増加が認められた。存期間が短かった原虫クローンの接種動物においては著しい脾臓の腫大、白血球数の増加などサイトカイン・ケモカインストームを伴う激しい炎症反応が認められた。

ウシにおいてもマウスと同様、原虫の増殖に有意な差が認められ、マウスで強い病原性を示した原虫クローン接種ウシでは原虫出現期間が他の原虫クローン株に比べて短く、白血球数の急激な減少や貧血も観察され、腫瘍壊死因子(Tumor necrosis factor-α)の発現増加が確認された。原虫クローンを接種したマウス脾細胞の炎症性遺伝子発現量をPCRアレイ法にて網羅的に解析し結果、脾臓におけるCcl8およびIl10の著しい発現上昇が確認され、病態発生には制御性DCsが関与することが示唆された。そこで、感染マウスへの制御性DCs移入試験を行ったところ、移入群において細胞数依存的な生存期間の延長および炎症性サイトカインの発現低下が観察された。また、T. evansi感染ウシの末梢血中においてもCCL8およびIL10の発現増加が認められたことから、ウシのスーラ病の病態発生機序には制御性DCsが関与することが明らかとなった。T.parva原虫感染症をモデルに比較疾病感受性解析を行なった結果、疾患感受性が異なる動物間の感受性の差は感染に対する抵抗性の差ではなく、病原体に対する免疫応答の差であることが明らかとなった。今後、このような疾患感受性の違いを示す詳細な機構について解明したい。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、T.parva原虫感染症モデルに加えトリパノソーマ原虫感染モデルにおいても比較解析を行なっている。トリパノソーマ原虫はマウスへの感染性があることから、異なる疾患感受性の機序について詳細な解析が可能である。今後、タンパクレベルでの比較免疫学的解析を行ない機序について明らかにしていきたい。また、トリパノソーマ病の自然宿主であるウシを用いた感染実験には、農林水産省からの学術研究機関指定が必要なことから、申請し承認を得た。今後はウシを用いた病態解析も行なう予定である。
RGS8による受容体選択的Gq系制御の分子機構

RGS8は、Gαとの反応部位であるRGSドメインと短いN端配列のみから成る比較的低分子のRGSタンパクである。このRGS8は、活性化されたGαiファミリーに直接結合しGAPとして作用して、Gi系制御を行う。一方、Gq系については、生化学的解析で、かなりGαqへの親和性が低いことが明らかになった。しかし、種々のGq共役受容体と共発現させ解析すると、RGS8は特定のGq受容体の応答を強く抑制することが判明した。更に、最近見つかった分子種のRGS8Sは、N端部9残基のみの違いにも関わらず、いずれのGq共役受容体に対してもその抑制効果は弱かった。そこで、本研究は、どのような機構によって、RGS8が、受容体選択的にGq系を阻害するのかを明らかにしようというものである。15年度は、RGS8のGAP活性がその受容体選択的なGq系制御に必要かどうか検討を行った。即ち、RGS8のGq受容体制御の機構を明らかにしていくには、その制御にRGS8の特異的なN端部とさらにそのRGSドメインの機能の両方が寄与しているのかが、まず重要な問題である。Gq系の制御ができるRGS8とその能力の弱いRGS8Sの違いは、N端9残基の配列だけである。そのため、一つの可能性としては、Gq系の制御には、RGS8のN端9残基のみが必要で、これが直接受容体に作用して阻害作用を示すことも考えられる。この場合、RGS8のGα結合能・GAP活性は、必要ないことになる。そこで、この可能性を検討するため、RGS8のRGSドメイン内に点変異を導入し、Gαに結合できなくした変異体RGS8(L153F)を用いて、そのGq系制御能を検討した。ツメガエル卵母細胞に、このRGS8(L153F)を発現させ、Gq応答を解析した。結果、RGS8は、RGSドメインが機能しなくなると、Gq受容体の制御能が激減してしまうことが明らかになった。このように、RGS8のGq制御には、そのN端9残基とRGSドメインのGAP活性の両方が必要であることが判明した。16年度は、Gタンパク質以外のGqシグナリングに関わる既知の情報伝達因子で、直接RGS8あるいはRGS8Sと相互作用するものはないか検討を行った。結果、まずRGS8がCa^<2+>依存的にカルモジュリンに結合することが明らかになり、しかもN端9残基のみが異なるRGS8Sは反応性が弱いことが判明した。このことは、RGS8の特異的N端部に直接Ca^<2+>/カルモジュリンが結合することを示唆している。また、M1、M2、M3ムスカリン受容体の第三細胞内ループの組み換え蛋白質を用いて、GqあるいはGi系のGPCRとの直接の反応性を解析した。すると、RGS8がGq系のM1及びM3受容体とは結合するが、Gi系のM2受容体とは結合しないことが判明した。特に、M1への結合性が強いものであった。さらに、N端が異なるRGS8Sは、受容体結合能が低く、その上RGS8はN端がないと受容体結合能が著しく減少することが確認された。このようにRGS8が、その特異的N端を中心に相互作用して、細胞膜上でCa^<2+>/カルモジュリンさらに直接Gq受容体を巻き込んだ複合体を形成して、反応特異性を調節している機構が明らかになってきた。

結果、RGS8は、RGSドメインが機能しなくなると、Gq受容体の制御能が激減してしまうことが明らかになった。このように、RGS8のGq制御には、そのN端9残基とRGSドメインのGAP活性の両方が必要であることが判明した。16年度は、Gタンパク質以外のGqシグナリングに関わる既知の情報伝達因子で、直接RGS8あるいはRGS8Sと相互作用するものはないか検討を行った。結果、まずRGS8がCa^<2+>依存的にカルモジュリンに結合することが明らかになり、しかもN端9残基のみが異なるRGS8Sは反応性が弱いことが判明した。このことは、RGS8の特異的N端部に直接Ca^<2+>/カルモジュリンが結合することを示唆している。また、M1、M2、M3ムスカリン受容体の第三細胞内ループの組み換え蛋白質を用いて、GqあるいはGi系のGPCRとの直接の反応性を解析した。すると、RGS8がGq系のM1及びM3受容体とは結合するが、Gi系のM2受容体とは結合しないことが判明した。特に、M1への結合性が強いものであった。さらに、N端が異なるRGS8Sは、受容体結合能が低く、その上RGS8はN端がないと受容体結合能が著しく減少することが確認された。このようにRGS8が、その特異的N端を中心に相互作用して、細胞膜上でCa^<2+>/カルモジュリンさらに直接Gq受容体を巻き込んだ複合体を形成して、反応特異性を調節している機構が明らかになってきた。RGS8は、Gαとの反応部位であるRGSドメインと短いN端配列のみから成る比較的低分子のRGSタンパクである。このRGS8は、活性化されたGαiファミリーに直接結合しGAPとして作用して、Gi系制御を行う。一方、Gq系については、生化学的解析で、かなりGαqへの親和性が低いことが明らかになった。しかし、種々のGq共役受容体と共発現させ解析すると、RGS8はムスカリニックm1受容体とサブスタンスP受容体の応答を強く抑制することが判明した。しかし、同じGq受容体でも、ムスカリニックm3受容体の応答は、RGS8は抑制することができなかった。更に、最近見つかった分子種のRG38Sは、N端部9残基のみの違いにも関わらず、いずれのGq共役受容体に対してもその抑制効果は弱かった。このように、「RGS8は、特定のタイプのGq受容体系を選択して、その応答を抑制する。しかし、N端9残基が異なるRGS8Sは、この能力を欠いている。」ことが明らかなった。本研究は、どのような機構によって、RGS8が、受容体選択的にGq系を阻害するのかを明らかにしようというものである。おそらく、RGS8は、本来親和性が低いためGqタンパクにはなかなか近づけないが、RGS8がN端を介して特定の受容体と直接相互作用すると、RGS8は細胞膜上のGqタンパクの近傍にリクルートされ、そしてGq制御因子として機能することができるようになるのではないだろうか。15年度は、RGS8のGAP活性がそのGq系制御能に必要かどうか検討を行った。即ち,RGS8の、Gq制御の機構を明らかにしていくには、Gq制御にRGS8のN端部とそのRGSドメインの機能のどちらか一方が、あるいは両方が寄与しているのかが、まず重要な問題である。Gq系の制御ができるRGS8とその能力のないRGS8Sの違いは、N端9残基の配列だけである。そのため、一つの可能性としては、Gq系の制御には、RGS8のN端9残基のみが必要で、これが直接受容体に作用して阻害作用を示すことが考えられる。この場合、RGS8のGα結合能・GAP活性は、そのCq系の阻害作用に必要ないことになる。
ゼブラフィッシュ網膜における錐体を規則的格子パターンに配置する分子基盤

ゼブラフィッシュの規則的錐体モザイクでは、青錐体、赤錐体、緑錐体が網膜の円周方向に緑、赤、青、赤、緑の順に直線状に並んだ錐体の5量体と、UV錐体が繰り返し現れる。この規則的モザイクパターンの形成過程を解析するため、トランスジェニックラインTg(crx:nlsEOS)を用いてCMZにおける錐体の配置パターンを解析した。その結果、まず一組の赤錐体と緑錐体が接着して双錐体を形成し、次に双錐体を形成する赤錐体と青錐体が接着した3量体を形成し、最後にもう一つの双錐体がやはり赤錐体が青錐体と結合することにより、規則的な錐体モザイクパターンを構成する錐体5量体が段階的に形成されることを示唆する結果が得られた。上記の結果と、昨年度までに得られた結果を総合すると、緑錐体が赤錐体に接着することが引き金となり、赤錐体が極性化して緑錐体との接着面とは反対側に青錐体と細胞接着を形成することが可能になるのではないかと考えられた。この仮説を検証するために、以下の実験を試みた。1、赤錐体と緑錐体間の細胞接着阻害錐体5量体を形成する錐体の内節部に細胞接着因子Crb2aは一様に見られる。それに対し細胞接着因子Crb2bは緑錐体と赤錐体の内節部接着面と赤錐体と青錐体の内節部接着面にのみ局在が見られる。このことからCrb2bが錐体5量体の段階的形成に何らかの役割を果たしている可能性が考えられた。そこで、CRISPR/cas9法を用いてcrb2bを赤錐体でのみノックアウトさせるためのDNAコンストラクトの作製を行った。Crb2bの局在を乱した場合の規則的錐体モザイクパターンへの影響を検討するため、Crb2aの細胞外領域とCrb2bの細胞内領域からなるキメラ分子を赤錐体に発現させるためのコンストラクトの作製を行った。変態後のゼブラフィッシュにおいて産生された錐体視細胞が形成する規則的格子パターンの形成機構の解明について、昨年度は以下に示す成果を得ることができた。(1)甲状腺ホルモン受容体β2(thrb)遺伝子の欠損変異体をCRISPR/cas9法により作製し解析を行った。この変異体の変態後の網膜では赤錐体が特異的に欠損していたが、青・UV錐体列と緑錐体の列が交互に現れる比較的規則な配置パターンを示した。しかし、局所的に観察すると、野生型では一つの青錐体の両側に赤錐体が一つづつ結合した鏡像対称の細胞間接着様式を示すが、thrb変異体では鏡像対称な細胞間接着様式を持つ青錐体は稀で、一つの緑錐体とのみ接着するものや、3つもしくは4つの緑錐体と接着するものといったばらつきが見られた。このことは緑錐体と青錐体間には強固な細胞間接着を形成することができないことを示唆するものと考えられる。(2)緑錐体を欠くsix7遺伝子の変異体を入手し解析を行った。変態後のsix7変異体の網膜では錐体の配置パターンは大きく乱れており、一つのUV錐体を取り囲むように赤錐体と青錐体が配置していた。特に赤錐体間の細胞間接着が増えていることから、規則的モザイクパターンの形成には、緑錐体が赤錐体に結合することにより、赤錐体の接着性が適切に制御されることが必須である可能性が示唆された。(3)錐体モザイク形成に関わる遺伝子をスクリーニングするため、赤、青、UV錐体視細胞が特異的に蛍光タンパクの発現により標識された3種類のトランスジェニック系統から、標識された錐体細胞をセルソーターにより分取し、RNAを採取する条件を決定した。27年度秋に追加採用されたため、当初の計画に比べ進捗が遅れている。そこで、CRISPR/cas9法を用いてcrb

2bを赤錐体でのみノックアウトさせるためのDNAコンストラクトの作製を行った。Crb2bの局在を乱した場合の規則的錐体モザイクパターンへの影響を検討するため、Crb2aの細胞外領域とCrb2bの細胞内領域からなるキメラ分子を赤錐体に発現させるためのコンストラクトの作製を行った。追加採択であったため、研究計画に比べ進捗が遅れているが、thrb変異体とsix7変異体の解析により、規則的な格子状の配列構造を形成するための細胞接着の働きを明らかにすることができた。今後は、これらの錐体間を実際に接着している細胞接着因子やそれらを制御するシグナル因子を明らかにするための遺伝子スクリーニングを行う。追加採用のため研究開始時期が遅れた。その結果、当初予定していた次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析に必要とされる予算の執行が次年度にずれてしまった。次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を取り急ぎ行う。
青年男女が父親役割を学ぶ教育プログラムの開発-生涯発達の視点からの親性の育成-

1)高校生・大学生の父親役割認識および影響を与える社会的・心理的要因、家族との関係などに関して、平成19年度に質問紙調査を実施した結果、父親の多面的な役割を認識していること、この認識には、発達の知識や関係スキル、親子関係、男女平等観などが影響していることが示されている。平成20年度は、アメリカで開催された国際学会で発表し、意見交換をしたが、今年度は、アジアで開催された国際学会で発表し、日本の父親をめぐる課題をより明確化した。2)アメリカのミネソタ州で開発され、実績のある「Dad make a difference」(父親教育プログラム)の理論と実践の調査・分析を基に、I発達の知識IIケアのスキルIII日本の親子関係の特徴(法律を含む)という枠組みを平成20年度に設定し、今年度は、父親役割を学ぶプログラムの詳細を作成した。3)2)で開発したプログラムを実施するための研修プログラムを考案し、高校の家庭科の教師3名と大学の教員2名を対象に、実施した。事前事後の質問紙調査から、親になるための教育の重要性に関する認識が高まること、保育教育に関しての捉え直しがはかられたことが明らかになった。3)3)の研修を修了した高校の家庭科教師3名が東京都・千葉県の公立高校において、また、大学の教員2名が、千葉県・北海道の国立大学教育学部において、開発した父親プログラムを実施した。生徒たちに対しての事前事後の質問紙調査の結果、父親役割に対して、特に子どものケアに関わる役割を重要視するようになったこと、子育てにおける男女の協力の重要性への認識が高まったこと、幼児との関係性スキルへの有能感を高めたことが示された。以上の成果から、本研究の意義が明確になった。1)高校、大学生の父親役割に関する意識調査心理、教育学領域における先行研究をもとに,高校生、大学生を対象(各10名)にして,父親役割と母親役割に対する認識の違い,父親役割に関する社会的要因・心理的要因,家族観との関連性などに関しての予備調査(面直調査)を実施した。この予備調査の分析とこれまでの先行調査で使われてきた項目を基にして,質問紙調査の枠組みを決定した上で,項目を設定し,質問紙調査用紙を作成した。質問紙調査の項目は、(1)父親役割に対する認識(2)母親役割に対する認識(3)親との関係(4)親になることに対する意識(5)ジェンダー意識(6)対子ども自己効力感(7)これまでの子どもとのふれ合い体験や保育学習の履修の有無(8)属性:年齢,性別,家族構成,生育歴などで構成した。この質問紙調査用紙を用いて,2008年1月2月にかけて,公立高校3校・大学(教育学部)3校を対象にして,調査を実施した。結果は統計的手法で処理し(SPSS),分析・考察を進めた。2)欧米の父親教育プログラムについての情報収集欧米における父親教育プログラムについての情報収集をおこなった。アメリカのミネソタ州で開発され,実績のある「Dadsmakeadifference」という教育プログラムの教材(テキスト,ビデオ)を入手し,テキストの翻訳など,教材の内容の分析をおこなった。また,ミネソタ州のペアレンティング教育について,長い歴史を有しているプログラム「MELD」に関する情報収集もおこなった。1)高校・大学生の父親役割に関する意識調査結果の分析と成果の発表,高校生・大学生の父親役割認識および影響を与える社会的・心理的要因、家族観との関連性などに関しての質問紙調査((1)父親役割に対する認識(2)母親役割に対する認識(3)親との関係(4)親になることに対する意識(5)ジェンダー意識(6)対子ども自己効力感(7)これまでの子どもとのふれ合い体験や保育学習の履修の有無(8)属性:年齢、性別、家族構成、生育歴)を実施し、統計解析による分析をおこない、日本の若者の父親役割認識に影響を与える要因を明らかにした。この成果は、National council on Family Relations 70th Annual Conferenceにおいてポスター発表を行い、各国の関連領域の研究者と意見交換をおこない、高い評価を得た。2)高校・大学生の父親役割を学ぶプログラムの開発,アメリカのミネソタ州で開発され、実績のある「Dad make a difference」(父親教育プログラム)の理論と実践に調査・分析を基に、日本における父親役割を学ぶプログラム(内容:(1)父親のイメージ分析(2)子育てスキルの獲得(3)法律から捉えた父親の責任(4)父親のなるために必要な資質の考察)の枠組みを作成し、千葉県立高校の家庭科の授業において実施し、効果測定をおこなった。

3)2)で開発したプログラムを実施するための研修プログラムを考案し、高校の家庭科の教師3名と大学の教員2名を対象に、実施した。事前事後の質問紙調査から、親になるための教育の重要性に関する認識が高まること、保育教育に関しての捉え直しがはかられたことが明らかになった。3)3)の研修を修了した高校の家庭科教師3名が東京都・千葉県の公立高校において、また、大学の教員2名が、千葉県・北海道の国立大学教育学部において、開発した父親プログラムを実施した。生徒たちに対しての事前事後の質問紙調査の結果、父親役割に対して、特に子どものケアに関わる役割を重要視するようになったこと、子育てにおける男女の協力の重要性への認識が高まったこと、幼児との関係性スキルへの有能感を高めたことが示された。以上の成果から、本研究の意義が明確になった。