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実用的なポリ塩化ビフェニルを分解する芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの創製

ポリ塩化ビフェニル類(PCBs)は、世界的にも認識されている環境汚染物質である。難分解性のPCBsに対して高分解性を示す芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体酵素を得るために、Commamonas属由来の芳香環水酸化酵素を改変した。結果、基質特異性を改変した変異体酵素を数種類取得することに成功した。さらに、基質特異性が異なる2種類の芳香環水酸化酵素の発現系を構築した。本研究では高塩素化ポリ塩化ビフェニル類(PCB)に対して高分解性を示す芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ(BDO)の変異体酵素の創製を目指すことを目的とする。本年度はComamonas属由来のBDOを対象に下記2点の実験を実施した。(1)基質特異性に関与するアミノ酸残基の同定本酵素のPCB複合体の推定構造を基に、基質結合部位ならびにその周辺部位を候補として37種類の1重変異体酵素を作製し、これらの特性を解析した。その結果、元の酵素では分解できない、もしくは分解効率が低い4または5塩素化PCB異性体の一部を分解できる変異体酵素を数種類取得することに成功した。しかし、どの変異体酵素も、5塩素以上の高塩素化されたPCB異性体を多種類含むPCB標品であるカネクロールKC-500に対しては高い分解効率を示さなかった。(2)BDOの末端ジオキシゲナーゼを構成する小サブユニット(BphA2)の基質特異性への効果の検討本酵素ならびに本酵素と基質特異性が異なるBDOを構成する大小サブユニット(BphA1/BphA2)を相互に交換した2種類のハイブリット酵素を作製し、その特性を解析した。その結果、両酵素とも元の酵素のBphA1と同じ基質特異性を有しており、BphA2の基質特異性への効果は観察されなかった。本年度はComamonas属由来のBDOの変異体解析を予定通り終了し、基質特異性が拡大した変異体を取得することに成功した。BDOの変異導入が基質特異性の拡大に有効であることを示したことから、研究進展状況は順調であると言える。よって、今後は、より高塩素化されたPCB異性体に作用し、カネクロールKC-500に対して高い分解効率を有するBDOを取得することが課題である。本研究では高塩素化ポリ塩化ビフェニル類(PCB)に対して高分解性を示す芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体酵素の創製を目指すことを目的とする。昨年度のComamonas属由来の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体解析の結果から、6塩素以上の高塩素化PCBに作用する酵素の創製は当初予想していたよりも困難であると考えた。そこで、本年度は当初の計画を変更し、下記2点の実験を実施した。(1)3種類の候補遺伝子の大腸菌発現系の構築高塩素化PCBを分解する酵素を得るためには、Comamonas属由来の多重変異体酵素よりも他の酵素を試すことが有効であると考えた。本年度はComamonas属由来の酵素以外の可能性について検討することにした。そこで、Comamonas属由来の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとは構造が異なるために基質特異性が異なると推定される酵素を3種類選択し、候補酵素とした。それらのうち、1種類の酵素については単離し、その発現条件を検討した。その結果、発現ならびに活性が検出されたが、今後はよりよい発現条件が必要だと考える。また、残り2種類の酵素については人工的に合成した遺伝子を発現ベクターに組み込み、その発現条件を検討しているところである。(2)PCB分解活性の評価系の改良これまでは、PCBの分解活性は、親化合物である残存PCB量を検出することにより行っていた。この場合、分解活性が弱いと、親化合物の減少はわずかであるために検出できない可能性が考えられる。そこで、活性が弱くても検出できるように、代謝産物を検出する系を検討しているところである。本年度は、候補の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ遺伝子をコードする発現ベクターを3種類準備し、現在、発現条件を検討しているところまで進んだ。よって、違った種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを準備できたためより改変できる可能性を広げたと言える。さらに、別の検出系を検討したことは、活性が弱くても検出できる可能性を高めたと言える。この2点のことから、研究進展状況は順調であるといえる。よって、今後は、より高塩素化されたPCB異性体に作用し、カネクロールKC-500に対して高い分解効率を有する芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを取得することが課題である。平成27年度に行ったComamonas属由来の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体解析の結果からComamonas属由来の多重変異体酵素よりも他の酵素を試すことが有効であると考え、昨年度に引き続き、本年度も当初の計画を変更してComamonas属由来の酵素以外の可能性について検討した。昨年度に候補として選定した3種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ遺伝子の大腸菌での発現条件を検討した。これら3種類の酵素をコードした発現ベクター(昨年度作成済)を大腸菌(BL21(DE3)株、BL21(DE3)株pLysS、Rosetta2(DE3)株)に形質転換し、宿主を決定した。

その結果、これら酵素のうち、2種類の酵素はBL21(DE3)株を宿主としてビフェニル代謝活性を検出することができたが、残り1種類はどの宿主においてもほとんど活性が検出できず、発現も確認できなかった。そこで、活性が検出された2種類の酵素のうちビフェニル代謝活性が高かった酵素に対して、PCB複合体の推定構造を基に基質結合部位ならびにその周辺部位を候補として変異体酵素を作成し、ビフェニル代謝活性を指標にスクリーニングを行った。それらのうち、数種類の変異体で活性が保持されていたので引き続きPCB分解活性を検討する必要がある。ポリ塩化ビフェニル類(PCBs)は、世界的にも認識されている環境汚染物質である。難分解性のPCBsに対して高分解性を示す芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体酵素を得るために、Commamonas属由来の芳香環水酸化酵素を改変した。結果、基質特異性を改変した変異体酵素を数種類取得することに成功した。さらに、基質特異性が異なる2種類の芳香環水酸化酵素の発現系を構築した。Comamonas属由来のBDOの改変により基質特異性の拡大に成功したものの、6塩素以上の高塩素化PCBに作用する変異体酵素は得られなかったことから、当初計画していた本酵素の多重変異体酵素の解析を行うより他のBDOの変異体解析を試すことが有効であると考え、下記の実験を行う予定である。(1)他のBDOのPCBに対する分解特性の解析他の有望なBDO遺伝子を人工的に合成し、本遺伝子の大腸菌での発現条件を検討する。発現を確認したBDOのPCB分解特性を解析する。(2)BDOの変異体解析PCB分解特性がユニークなBDOに対して、本酵素と同様に、PCB複合体の推定構造を基に基質結合部位ならびにその周辺部位を候補として変異体解析を行う。本年度準備した3種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼについて、下記の実験を行う予定である。(1)PCBに対する分解特性の解析本年度に引き続き、大腸菌での発現条件を検討する。発現を確認した酵素に関してPCB分解特性を解析する。(2)変異体解析(1)で有望であると分かった酵素に対して、PCB複合体の推定構造を基に基質結合部位ならびにその周辺部位を候補として変異体解析を行う。環境学試薬などの消耗品費が当初の予定よりも少額で済んだことによる。試薬などの消耗品費が当初の予定よりも少額で済んだことによる。本年度とは異なる芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの変異体解析を行うことを計画しており、本酵素の発現用ベクターを作製するために消耗品が必要で、そちらに使用する予定である。本年度は、構築した3種類の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼについて変異体解析を行うことを計画しており、そちらに使用する予定である。
伝統工芸と先端技術による複製古典籍を活用した書誌学研究と書物文化の世界への発信

研究代表者(小林一彦、以下「代表者」)と研究分担者(彬子女王殿下、以下「分担者」)2名で研究を進めている。今年度の研究実績としては、まず分担者による単著『日本美のこころ最後の職人ものがたり』(小学館)があげられる。高度な印刷複製「コロタイプ」技術が紹介されており、伝統的な職人の手わざが、美術・文学などの作品を精巧に複製する上で、いかに裨益してきたかが説かれている。代表者は、分担執筆「後桜町天皇御製「御法楽五十首和歌」(住吉大社蔵)をめぐって」を『歌神と古今伝受』(鶴崎裕雄・小髙道子編、和泉書院)に掲載し、原本の書誌学的な調査から導かれ得た新見を提示した。また、冷泉家時雨亭文庫の精巧な影印による複製をもとに、古典籍の紹介を兼ねた女流歌人の小論を4回、時雨亭文庫の機関誌「しくれてい」に連載した。さらに、国文学研究資料館の研究会における講演発表を修正加筆して、研究報告『初中等学校における古典教育』に「デジタル世代に和本のアナログ文化を伝える」と題し、次世代の子どもたちに伝統工芸による職人の手わざを利用した、モノ(精巧な複製物)による古典教育の必要性と可能性を提言した。調査実績としては、富士ゼロックス京都の文化推進室の協力を得て、京都の老舗料亭にて、複製中の極彩色の古文書原本を閲覧した。斎宮歴史博物館所蔵の資経本「斎宮女御集」(鎌倉時代書写)の原本調査を行った。その際、あわせて精巧な複製品も、展示室にて実見した。このほか、地元工業高校と連携し、最新技術である3Dプリンターを用いた文化財の複製で知られる和歌山県立博物館にも調査に赴いた。2次元の複製にとどまらず、仏像や能面などの3次元立体造形物の複製にも、最新技術が寄与しており、世界への日本文化の発信に最先端の工業技術がもつ可能性を探るよい機会となった。複製品とその元になる(あるいは元となった)原本の比較調査は、順調に進んでおり、書誌学的な知見やデータも集積されつつある。また、伝統工芸に携わる職人・技術者への取材、聞き取りも進んでいる。このほか、複製物の展示および発信においても、文書館・歴史館・博物館などの調査見学を通じて、複製品の利用・発信方法を模索している。専門研究者からの意見聞き取りや、一般市民の複製物への反応などの意見収集なども計画され、ほぼ実行に移されている。ジャポニズム研究の世界的権威、ロンドン芸術大学名誉教授の渡辺俊夫氏が来日され、宿泊先の京都のホテルにて、代表者と分担者は面談の機会を得た。富士ゼロックス京都CSRグループ文化推進室の協力を得て、同室製作の複製古文書・古典籍の優品(南方熊楠の大英博物館ノートなど)を持参し、複製古典籍の活用と世界発信への知見をいただく機会を得た。周到に準備を重ねながら当日の不測の事態により、直前で実現できなかった計画もある。和食文化学会が設立され、和食文化を世界に向けて発信するため、2019年2月に第1回の大会が、京都歴彩館にて開催された。その折に、研究代表者の企画・発案で、室町時代から続く京都の老舗料亭所蔵の、貴重な料理関係の極彩色絵巻の複製を展示することが決定し、料亭には富士ゼロックス文化推進室の室長と原本照合のため調査見学にも赴いた。学会事務局と展示品も選定し、会場へ複製品を搬入した当日の朝に、老舗料亭からサプライズのご好意で原本が持ち込まれ、急遽、複製品を原本にさし替えて展示が行われた。もとより原本に優るものはないが、複製古文書・古典籍の利用と発信をテーマに、会場の反応や複製品に対するアンケートなども可能であっただけに、我々の準備は水泡に帰した点が、幾重にも惜しまれる。以上、残念な事例もあったが、研究計画は、ほぼ順調に推移していると認められる状況にある。古典籍の形状や用字書記法の研究を進めるために、古典籍の原本調査については引き続き各地に出向き、さらなる書誌学上の情報を収集するために詳しい調査を行う。国文学研究資料館・東大史料編纂所などにも頻繁に足を運び、高精細度のデジタル資料なども閲覧調査の対象として有効に活用したい。複製古典籍の製作を自社の最先端技術をベースに伝統工芸の力を借りながら手がけている富士ゼロックス京都の文化推進室とは、引き続き連携を強化していく。製作現場に立ち会い、京都の伝統工芸の活用や、製品としての特徴、また複製古典籍への応用などを確認、情報を共有し、古典籍研究への新知見を得ることを考えている。成果の発信については、大規模な市民向け京都学講座「京の伝統と先端ーみやこが育んだ“モノ"と“技"ー」シリーズ(全10回)にコロタイプ複製と複製古文書・古典籍の2つの企画を提案、講座の担当が決定している。7月20日には、研究分担者(彬子女王殿下)が著書でも紹介した便利堂のコロタイプ研究所の山本所長が「コロタイプって何ー京都に残る世界最古の写真印刷技術ー」を、9月15日には、研究代表者(小林)が富士ゼロックス京都文化推進室の吉田長と2人で「手に取って触れる古文書への挑戦ー京の匠の技と最先端技術との融合ー」を、それぞれ一般市民向けに発信する。

後者の機会においては、500名の申込者(3月確定)にアンケート協力をお願いし、複製古文書・古典籍の活用と発信について一般市民の意見を集積し、分析することで今後の活動に活かす方針である。研究計画の段階ではホームページの開設を企図していたが、原本・原点の高精細度のデジタルカラーでの写真公開が急速に進みつつあり、研究が本格的にスタートしてから、複製品をどう発信していくかは再考を迫られているといえ、より適切な活用法を模索し提言することも研究計画に組み入れたい。研究代表者(小林一彦、以下「代表者」)と研究分担者(彬子女王殿下、以下「分担者」)2名で研究を進めている。今年度の研究実績としては、まず分担者による単著『日本美のこころ最後の職人ものがたり』(小学館)があげられる。高度な印刷複製「コロタイプ」技術が紹介されており、伝統的な職人の手わざが、美術・文学などの作品を精巧に複製する上で、いかに裨益してきたかが説かれている。代表者は、分担執筆「後桜町天皇御製「御法楽五十首和歌」(住吉大社蔵)をめぐって」を『歌神と古今伝受』(鶴崎裕雄・小髙道子編、和泉書院)に掲載し、原本の書誌学的な調査から導かれ得た新見を提示した。また、冷泉家時雨亭文庫の精巧な影印による複製をもとに、古典籍の紹介を兼ねた女流歌人の小論を4回、時雨亭文庫の機関誌「しくれてい」に連載した。さらに、国文学研究資料館の研究会における講演発表を修正加筆して、研究報告『初中等学校における古典教育』に「デジタル世代に和本のアナログ文化を伝える」と題し、次世代の子どもたちに伝統工芸による職人の手わざを利用した、モノ(精巧な複製物)による古典教育の必要性と可能性を提言した。調査実績としては、富士ゼロックス京都の文化推進室の協力を得て、京都の老舗料亭にて、複製中の極彩色の古文書原本を閲覧した。斎宮歴史博物館所蔵の資経本「斎宮女御集」(鎌倉時代書写)の原本調査を行った。その際、あわせて精巧な複製品も、展示室にて実見した。このほか、地元工業高校と連携し、最新技術である3Dプリンターを用いた文化財の複製で知られる和歌山県立博物館にも調査に赴いた。2次元の複製にとどまらず、仏像や能面などの3次元立体造形物の複製にも、最新技術が寄与しており、世界への日本文化の発信に最先端の工業技術がもつ可能性を探るよい機会となった。複製品とその元になる(あるいは元となった)原本の比較調査は、順調に進んでおり、書誌学的な知見やデータも集積されつつある。また、伝統工芸に携わる職人・技術者への取材、聞き取りも進んでいる。このほか、複製物の展示および発信においても、文書館・歴史館・博物館などの調査見学を通じて、複製品の利用・発信方法を模索している。専門研究者からの意見聞き取りや、一般市民の複製物への反応などの意見収集なども計画され、ほぼ実行に移されている。ジャポニズム研究の世界的権威、ロンドン芸術大学名誉教授の渡辺俊夫氏が来日され、宿泊先の京都のホテルにて、代表者と分担者は面談の機会を得た。富士ゼロックス京都CSRグループ文化推進室の協力を得て、同室製作の複製古文書・古典籍の優品(南方熊楠の大英博物館ノートなど)を持参し、複製古典籍の活用と世界発信への知見をいただく機会を得た。周到に準備を重ねながら当日の不測の事態により、直前で実現できなかった計画もある。和食文化学会が設立され、和食文化を世界に向けて発信するため、2019年2月に第1回の大会が、京都歴彩館にて開催された。その折に、研究代表者の企画・発案で、室町時代から続く京都の老舗料亭所蔵の、貴重な料理関係の極彩色絵巻の複製を展示することが決定し、料亭には富士ゼロックス文化推進室の室長と原本照合のため調査見学にも赴いた。
汎用生薬の抗酸化作用画分および同作用成分の予防医学への応用に関する基礎研究

1.前年度においてロシア甘草の塩化メチレン抽出物(PT ext.)から得たフェノール性成分のうち、PL-A、RL-B、RL-C、RL-D、RL-E、RL-G、RL-Hの7種について、耐性菌(MRSA)を含むグラム陽性細菌、酵母、かび、う蝕菌、乳酸菌に対する抗菌活性試験を行った。酵母に対しては明確な活性を示すものはなかったが、かびに対してはRL-Aなど一部の成分に活性が確かめられたほか、乳酸菌には試験サンプルのほどんどに弱いながら活性が認められた。MRSAを含むグラム陽性細菌やう蝕菌に対しては、RL-A、RL-D、RL-Gなどはかなり強い活性を示した。2.ロシア甘草の主要成分についてリノール酸の酸化抑制作用について検討した。その他、前年度で検討したラット肝ミトコンドリアを用いた抗脂質過酸化作用については呼吸鎖の電子伝達系の遮断下と非遮断下の両方について、NADPHまたはDHF誘導の脂質過酸化抑制作用について詳細に検討した。これらの系でもラット肝ミクロソームを用いた抗脂質過酸化作用において強い活性を示したRL-Mに極めて強い活性が認められた。RL-Mは大半の天然起源抗酸化作用物質に共通してみられるカテコール残基を持たない点で注目に値する。更に、フリーラジカルの誘導による赤血球の溶血の阻害試験も行った。残念ながら精製サンプルを用いた試験は赤血球に対する直接作用のため検討できなかったが、ロシア甘草の脂溶性画分(PT ext.)について検討した結果、明確な赤血球膜保護活性が認められた。1、G.glabraを基原とするカンゾウ(甘草)の微量成分の単離と構造決定旧ソ連産カンゾウ(甘草)はG.glabraを基原とし、歴史的には主に欧州で繁用されてきた生薬であるが、この塩化メチレン抽出エキスについて順相及び逆相シリカゲル、セファデックスLH-20を用いた各種クロマトグラフィを行うことで得られた各画分について更に詳細な化学的精査を加えた結果、新たにRL-Q.RL-R、RL-U、RL-Vの4種の微量成分を得た。これらはいずれも新規物質であり、構造はNMR等の分光学的検討によりそれぞれ2',4'--dihydroxy-[6",6"-dimethylpyrano(2゙,3":7,8)]-isoflavanone、2'-hydroxy-4'-methoxy-[6",6"-dimethylpyrano(2",3":7,8)]-isoflavanone、4',7-dihydroxy-[6",6"-dimethylpyrano(2",3":3',4')]-3-arylcoumarin、3-hydroxy-[6",6"-dimethylpyrano(2",3":7,8)]-benzopyranと決定した。G.glabraを基原としたカンゾウからはこれまでに得られているものも含めて20種以上の成分が単離されたことになり、きわめて多様な化学成分の存在が明らかとなった。2、カンゾウ成分の抗酸化活性とミトコンドリア機能保護作用の検討ラット肝臓のミトコンドリア及びミクロソームにおける,ADP-Fe存在下NADH-rotenone依存性又はNADPH-P450reductase依存性過酸化脂質の生成をTBA法で測定することで、各カンゾウ成分の脂質過酸化に対する抑制作用を検討した。その結果、各フェノール性成分に顕著な活性が認めら、RL-EとRL-Mと仮称する成分には強い作用が認められ、ADP-Fe存在下NADH依存性及びdihydrofumarateるによる呼吸鎖酵素系の活性低下を著しく抑制することが明らかとなった。。キサンチン-キサンチンオキシダーゼ系やミクロソームにおけるスーパーオキサイドアニオンの生成に対する阻害作用も検討したが、これはRL-Mだけに認められた。

2.前述の成分研究で得られたロシア甘草の主要フェノール性成分について、耐性菌(MRSA)を含むグラム陽性細菌、酵母、かび、う蝕菌、乳酸菌に対する抗菌試験を行い、そのいくつかに強い抗菌活性が認められた。3.同上の成分についてリノール酸の酸化抑制作用、xanthinc oxidascにより生成されたスーパーオキサイドアニオン(SO_2)の捕捉作用、ラット肝ミトコンドリアを用いた抗脂質過酸化作用、ラット肝ミクロソームを用いた抗脂質過酸化作用及びラット肝ミクロソームを用いた抗スーパーオキサイドアニオン(SO_2)作用に対して試験を行い、各成分において特色ある活性が見られた。とりわけ、RL-Mは多くの天然抗酸化作用物質に共通して見られるカテコール基を分子内にもたないにもかかわらず極めて強力な抗酸化作用を示した。赤血球膜の保護作用については、精製サンプルを用いた試験は赤血球に対する直接作用のためできなかったが、ロシア甘草の脂溶性画分(PT-ext.)について検討した結果顕著な活性が見られた。
個別栄養指導を効果的に行うための双方向型集団栄養教育法の確立と評価に関する研究

我が国では平成9年より新しい地域保健法を施行し、市町村に管理栄養士が配置され住民の栄養指導業務を行うことになった。しかし、地域における生活習慣病の罹患率は年々増加していることからも、正しい食生活を実践するための栄養教育・栄養指導法の確立が望まれている。しかしながら、地域における保健活動に対する改善効果を求めた評価、報告は乏しく、どのようにその業務に取り組んでいくのか、その方法論は十分に確立されていない。そこで、異なる地栄養教育法の違いによる教育効果について検討した。我々は生活習慣病ハイリスク(肥満、高血圧、高脂血症、糖尿病)者に対する6ヶ月間の行動療法を用いた栄養教育により、生化学的データと食習慣(栄養素と食品摂取量)がどのように変化するか、それらの変化は指導方法により異なるのかについて試験した。生化学的データと食習慣は介入前後で地域の保健システムを利用し、食事調査はFFQを使用して解析した。介入方法は介入前の調査に基づいて計画し、行動変容に影響を与えると報告されている自己監視や自己効力感のトレーニングを含む双方向型栄養教育と通常の一方向型栄養教育(コントロール)を2ヶ月ごとに6ヶ月間行った。我々は、双方向型栄養教育にセルフチェック用紙を利用した。これは、対象者と話し合い(双方向)、対象者が自分で実施可能と判断できる目標をいくつか話し合いながら作り、用紙上に毎日の実行できたか、できなかたかを、○、×、△などで日記風に記入して、日々の実行度を本人が容易に理解できるようにしたものである。双方向型介入前後での体重、BMI、収縮期・拡張期血圧、HDLコレステロールはコントロール群に比較して有意(P<0.05)に改善していた。一方で食事については2群で有意(P<0.05)な変化が見られたが、食品群別摂取量の変化はコントロール群でのみ有意(P<0.05)な変化が見られ、介入方法の違いによる差は見られなかった。双方向型介入群ではコントロール群に比較して、介入後で肥満、高血圧の対象者数が減少した。介入後で食事・運動についての行動変容を達成している対象者数は通常介入群と比較して双方向型介入群で有意(P<0.01)に多かった。これらの結果、通常介入群では介入前後で改善が見られたのは食習慣のみであったが、双方向型介入群では、血液性状、食習慣、行動変容全てにおいて改善が見られており、行動療法を用いた栄養指導が通常の栄養指導に比べて効果が高いと考えられた。市町村で行われている栄養改善事業では様々な保健サービスが住民に提供されており、何らかのリスクを持った対象者に対する個別栄養指導もその一つである。しかしながら、適切に計画され、実施、報告されている介入は少ない。また、栄養指導自体の効果についても有効性やその方法の確立はなされておらず、より効果の高い栄養指導方法についてはその開発の必要性は高い。

本研究では、市町村で行われている栄養改善事業を利用し、BMI25以上の対象者(25名)を適切にスクリーニングしたうえで通常介入群と特別介入群に無作為割り付けし、栄養情報の提供方法の違いによって指導効果(体重、BMI、血液性状、食習慣、QOL)に影響が出るかどうかを検討した。食事調査には妥当性が確認されたFFQ、QOLの調査にはSF-36を使用した。介入のプログラムは3ヶ月間であり、BMIを3kg低下させることを目的とし、1月毎に3回の個別栄養指導を行った。また、減量に役立つ情報を載せたニュースレターを1月に2回郵送した。栄養指導では対象者の主体性を重視した指導を行ったが、特別介入群ではさらに対象者の状況にあわせた情報提供と、対象者自身が指導者側に要望を伝えられる仕組みを作った(双方向型栄養指導)。介入により2群で体重の減少が見られたが、特別介入群では平均約2kgの減量に成功した(p<0.01)。また、血液性状でも特別介入群で有意(p<0.05)な改善が見られた。しかしながら、食習慣の調査では介入前後、2群で有意な変化は見られなかった。QOLの調査では特別介入群において、全体的健康観、心の健康が有意(p<0.05)に改善した。以上のことより、対象者への働きかけの違いが指導効果に影響を与えることが明らかになり、情報の提供方法を個人に対応した形に工夫することは指導効果を高めるうえで有効であると考えられた。本研究の目的は異なる地域においても同等の効果が得られる栄養指導法の確立とその有効性の評価である。我々はこれまでに.対象者からの情報を適切にフィードバックし、指導内容に反映させる双方向型栄養教育において、これまでの方法に比較して有効であることを確認した。平成16年度の目的は昨年度に得られた知見を基に栄養教育法をさらに発展させて実施・評価することであった。私たちは双方向型栄養教育において、対象者の準備性に応じて目標設定をすることが、生活習慣の変容に有効であると考えた。対象者は日本のある地域の住民であり、年度毎の健康診断で生活習慣病のリスクが高いと判定された者であった。介入を行った対象者は自身の意志によりbehavioral intervention(BI)群(n=27)とknowledge-based ordinary intervention(OI)群(n=27)に分けられた。BI群は今回の仮説を明らかにするために設定された。Control(C)群(n=28)は介入を行った群と同じようにリスクが高いと判定されたが、介入に参加しなかった対象者であった。介入期間は6ヶ月間であった。対象者は2ヶ月毎に計3回の個別栄養指導を受けた。栄養素摂取量は食物摂取頻度調査法により調査した。BI群では地域の栄養士によるサポートのもと、対象者自身が実行可能な行動目標を設定した。また、行動目標の達成状況を毎日記録するためにセルフチェック表を使用した。BI群では体重、BMI、血圧、HDLコレステロールがC群と比較して有意に改善した(P<0.05)。栄養素摂取量の変化は2つの介入を行った群で類似しており、C群に比較して有意に改善した(p<0.05)。BI群ではOI群に比較して介入後行動改善が定着した者が有意に多かった(p<0.01)。以上のことから、双方向型栄養教育において対象者の準備性を把握し、行動目標を設定する事は生活習慣の改善に効果的であり、重要であると考えられた。
遷移金属錯体上でのフッ素脱離の遷移状態制御と触媒反応への応用

昨年度、NHC配位子を有するボリル銅錯体、シリル銅錯体に対して四フッ化エチレン(TFE)を室温で作用させたところ、前者の錯体ではCu-B結合に対してTFEが挿入した後にフルオロボランの脱離を伴うβフッ素脱離が速やかに進行し、トリフルオロビニル銅錯体を定量的に与えた(J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 12855)。一方、後者の錯体ではCu-Si結合へのTFEの挿入が起こるのみであり、対応するフルオロアルキル銅錯体からのβフッ素脱離が進行するためには昇温が必要であった(Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 328)。これら2種類のフルオロアルキル銅錯体からのβフッ素脱離における反応性の相違についてさらに深く検証したところ、1,10-phenanthroline (phen)配位子を有する銅フルオリド錯体がTFEに付加して生じるペンタフルオロエチル銅錯体が60度以上においても安定に存在することを明らかにするとともに、この錯体を鍵活性種とするヨードアレーン類の触媒的ペンタフルオロエチル化反応の創出を達成し、専門誌にその成果を発表した(Chem. Eur. J. 2018, 24, 9794)。一方、これら2種類のフルオロアルキル銅錯体からのβフッ素脱離における反応性の相違について、理論化学的手法に基づいた機構解析を進めている。一方、理論化学計算に立脚したαフッ素、および、βフッ素脱離の遷移状態と機構解析を進めたところ、後者の系において複数の反応機構の存在が示唆されたため、更なる理論化学的な検証が必要となっている。フルオロアルキルニッケル錯体のαフッ素脱離(ACIE 2017, 56, 2435)や、フルオロアルキル銅錯体のβフッ素脱離(JACS 2017, 139, 12855; ACIE 2018, 57, 328; CEJ 2018, 24, 9794.)など、実験化学アプローチについては当初計画を大幅に超える進捗が見られ、特に、フルオロアルキル銅錯体を鍵中間体とする新たな触媒反応の創出を達成した。一方、理論計算については、特にβフッ素脱離を伴う反応系の計算において、複数の反応機構の可能性を示唆する結果が得られたため、一連の計算結果を精査するために本年度の理論化学計算に基づく成果発表を延期せざるを得ず、同時に、研究計画の1年間延長を余儀なくされている。先述の通り、実験化学を基盤とするアプローチは当初の計画以上で進展しているが、理論化学計算に基づいた遷移状態、および、機構解析において、特にβフッ素脱離を経る反応系において複数の反応機構の存在が示唆されている。そのため、当初計画を1年間延長し、その期間は本年度を理論計算結果を詳細に検証する期間とし、ここで得られた成果を学会にて発表する。また、来年度より、所属機関を異動することになったので、未使用額は主に、新たな所属機関での計算(研究)環境の整備費用と学会への出張費用に充てる予定である。シクロヘキシルホスフィン配位子存在下、0価ニッケル上での四フッ化エチレンとスチレンとの酸化的環化によって生じるニッケラシクロペンタン錯体に対し、ジベンジルアミンを加えると、ニッケル上でのαーフッ素脱離が進行し、シクロブチル基を有するニッケル(II)錯体二量体を与えることを見出し、その分子構造を単結晶X線構造解析により明らかにした。一方、アミンとしてトリエチルアミンを用いた場合には、同様のαーフッ素脱離は一切進行しないことを明らかにした。さらに、二座配位子の1つである2,2'-ビピリジンを配位子とした場合にも、αーフッ素脱離の進行は確認されなかった。これらの結果から、アミンの窒素原子上のプロトンが存在していること、および、反応過程において配位不飽和座を生じさせることが有利となる単座配位子がニッケルの支持配位子であることが、αーフッ素脱離を進行させる鍵であることが明らかとなった。現在、αーフッ素脱離の素反応過程における遷移状態を明らかにすべく、理論化学計算に基づくアプローチを進めており、アミン窒素がニッケルに配位すると同時に、窒素原子上のプロトンがαーフッ素脱離によって引き抜かれるフッ素と相互作用を有していることが示唆されている。また、得られた二量体錯体を溶液中、室温下にて静置すると、さらなるβーフッ素脱離の進行を経てジフルオロシクロブテンへと変換されることを確認した。これらの実験化学的手法によって得られた一連の成果を専門誌(Angew. Chem. Int. Ed)に投稿し、掲載が決定された。さらに、ニッケル触媒を用いたアルケンの分子内ヒドロアシル化反応について、理論化学的手法に基づいた機構解析を進め、本反応がニッケル上での酸化的環化を経由して進行していることを明らかにし、専門誌に投稿した。平成28年度の計画においては、αーフッ素脱離について実験化学・理論化学という両者のアプローチから検証を進める予定であったが、実験化学アプローチについては、当初計画を越える進捗が見られ、その内容を論文として発表する段に至った。理論化学のアプローチについても、概ね順調に進捗しており、アミン窒素のニッケルへの配位とともに、窒素原子上のプロトンとαーフッ素との相互作用がαーフッ素脱離促進の鍵であることを突き止めた。現在、論文としての成果発表にこぎつけるため、理論化学計算をさらに進めている。NHC配位子を有するボリル

銅錯体に四フッ化エチレンを室温で作用させたところ、Cu-B結合に対して四フッ化エチレンが挿入した後にフルオロボランの脱離を伴うβフッ素脱離が速やかに起こり、トリフルオロビニル銅錯体を定量的に与えることを見出した。得られた錯体の単結晶X線構造解析を行い、確かにトリフルオロビニル基が銅に結合した構造であることを確認した。この銅錯体をビスピナコラートジボロンで処理したところ、ボリル銅が再生するとともにトリフルオロビニルホウ素化合物が得られた。これらの知見をもとに、銅(I)触媒とビスピナコラートジボロンを用いたフルオロアルケン類の脱フッ素ホウ素化反応を開発した(J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 12855)。本反応は、四フッ化エチレンのみならず、トリフルオロスチレン誘導体やgem-ジフルオロアルケン誘導体にも適用可能である。一方、ジボロンの代わりにシリルボランを本触媒系に用いたところ、Cu(I)前駆体として銅フルオリド(NHC)CuFを用いた際に対応する脱フッ素シリル化が進行することを見出した(Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 328)。本触媒反応の鍵過程を量論反応から明らかにすべく、NHC配位子を有するシリル銅錯体に四フッ化エチレンを室温で作用させたところ、Cu-Si結合に対して四フッ化エチレンが挿入したフルオロアルキル錯体が定量的に得られたが、この錯体からβフッ素脱離が進行するためには昇温が必要であった。現在、これら2種類のフルオロアルキル銅錯体からのβフッ素脱離における反応性の相違について、理論化学的手法に基づいた機構解析を進めている。平成29年度の計画において、フルオロアルキル銅錯体のβーフッ素脱離について実験化学・理論化学双方から体系的な検討を実施し、遷移金属活性種を用いた炭素ーフッ素結合切断の素反応の1つとして重要なβーフッ素脱離の遷移状態を支配する電子的・立体的因子を解明する計画であったが、実験化学アプローチについては、当初計画を超える進捗が見られ、ボリル銅、および、シリル銅から得られるフルオロアルキル銅錯体を鍵中間体とする新たな触媒反応の開発を達成し、これらの内容を論文として発表する段に至った。理論化学のアプローチについても、概ね順調に進捗しており、現在、論文としての成果発表にこぎつけるため、理論化学計算をさらに進めている。昨年度、NHC配位子を有するボリル銅錯体、シリル銅錯体に対して四フッ化エチレン(TFE)を室温で作用させたところ、前者の錯体ではCu-B結合に対してTFEが挿入した後にフルオロボランの脱離を伴うβフッ素脱離が速やかに進行し、トリフルオロビニル銅錯体を定量的に与えた(J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 12855)。一方、後者の錯体ではCu-Si結合へのTFEの挿入が起こるのみであり、対応するフルオロアルキル銅錯体からのβフッ素脱離が進行するためには昇温が必要であった(Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 328)。
戦間期香港、台湾の阿片政策と国際関係

平成19年度上半期には、昨年度までに収集した史料の読解を進める一方、日本国内の各史料館を訪問し、史料の収集に努めた。東洋文庫では、モリソン文庫に収録されている阿片関係文書、および昨年度までに閲覧することのできなかった文献等を調査・収集した。他方、19世紀から20世紀への転換期における香港の阿片関係の資料が、台湾総督府関係の史料にも収録されていることを知り、後藤新平文書から必要な史料の収集に努める一方、台湾総督府文書の閲覧のために、国内において目録の確認等、必要な下調べを行った。さらに、台湾への阿片供給に関連して、イギリスの日本関係外交文書を、東京大学総合図書館、および横浜開港資料館で閲覧・収集した。このような国内における調査を経て、8月から9月にかけてほぼ1ケ月間、台湾、香港、そして澳門へと渡航し、各地にて資料の収集を行った。台湾では、台北にて台湾大学をはじめ、複数の図書館を利用、さらに南投市では国史館台湾文献館を訪問し、台湾総督府関係文書の調査・収集をおこなった。さらに香港では香港大学図書館と香港歴史档案館を訪問、澳門では澳門歴史档案館にて、資料を収集した。下半期には、これらの史料の読解を進める傍ら、イギリズにおける再調査の準備を進め、2008年1月から3月にかけて調査を実施した。まずロンドンでは、国立公文書館をはじめ、アジア・アフリカ研究院の文書館を訪問し、中国関係の外交文書、およびChina Association関係文書等を閲覧・収集した。さらにオックスフォードでは、ローズハウス図書館において、香港総督経験者、および香港勤務経験のある植民地官僚の個人文書を、閲覧・収集した。これらの成果を公表するため、香港・澳門関係資料に関する紹介を執筆したほか、滋賀大学経済学部ワークショップにて、香港における20世紀初頭の阿片商社に関する研究を発表、貴重なコメントを得た。本年度は、主として先行研究の読み込みを行い、加えて研究員採用以前に収集した史料を通じて関心を持った、阿片商社の活動を調査するため、日本内外の史料館を調査した。まず、研究員採用以前に収集した史料を改めて読み返した結果、東アジアへの阿片輸入を担ったネマジ商会(H.M.H.Nemazee and Co.)の活動に関心を持った。同商会は戦間期に大量の東アジア向け阿片を取り扱っており、戦間期における阿片の国際的な需給を考察する上で、同商会の活動は重要な論点を提出するものと考えた。以上の問題関心を持ち、8月には香港にて10日間の調査を行い、主に香港大学図書館にて現地における史料を調査、収集した。このほか、10月3日から6日まで京都大学東南アジア研究所にて、海峡植民地関係史料を収集した。また、翌平成18年1月から2月にかけて、イギリスのThe National Archivesへと赴き、主に外務省、および植民地省関係の史料を調査・収集した。他方、阿片問題を考察する上での華僑の重要性を認識し、9月に京都大学の東南アジア研究所で開催された、第29回東南アジアセミナー、および10月に京都の人文科学研究所で開催された、国際ワークショップへと参加し、東南アジアにおける華僑の生活などを学んだ。また、阿片の生産地であるインドの財政政策における阿片の重要性を認識し、10月に龍谷大学にて開催された日本南アジア学会第18回全国大会に参加、インド植民地経済に関する知見を得た。このほか、6月4日に天理大学で開催された日本台湾学会第七回学術大会に参加し、日本国内に所蔵されている台湾関係資料の現況を学んだ。また、香港、及びイギリスで収集した史料を読み込んだ結果、ネマジ商会が日本の三井物産と阿片の取引を行なっていたことを知り、財団法人三井文庫、および外務省外交史料館において史料を閲覧し、これらを収集した。平成18年度においては、前年度の調査において着目した香港における阿片商社に加え、香港における阿片販売請負人の活動に焦点を当て、香港に長期滞在して研究を進めた。香港においては、香港大学亜洲研究中心のVisiting Scholarとして滞在し、主に香港大学、および香港公共梢案館1に所蔵されている史料を閲覧した。長期にわたる滞在を経て、香港の研究には欠かすことのできないイギリス植民地1省の公文書をはじめ、現地の文書館にのみ所蔵されている各種契約書や、香港において出版された各種新聞、香港商工会議所関係文書、および裁判関係史料などを幅広く閲覧することができた。この結果、昨年着目したネマジ商会(H.IM.H.Nemazee and Co.)の活動についてもより幅広い知見を得ることができた上、香港で阿片の販売に従事していた各商社の、中束から極東に至る広汎な活動の一端にも触れることができた。他方、これらの文書の読解を通じて、香港において阿片の小売を受け持つていた阿片販売請負人は香港在住の華僑のみならず、マカオやシンガポール出身の華僑によっても担われていたことを理解した。これらのイギリス本国出身者ではないものの、イギリス帝国内において広汎な商業活動を展開した商社・商人の活動を追うことは、従来とは異なる立場から極東におけるイギリスの利権・商権を捉えなおす視座を与えるものであろう。また香港滞在中は、香港と隣接するマカオをはじめ、シンガポール、上海へ調査に赴き、各地の文書館に所蔵されている一次史料の閲覧、および収集に努めた。まずマカオにおいては、澳門歴史梢案館、民政總署大樓圖書館などを利用し、同地に所蔵されている政庁関係文書、新聞などを通じて、マカオの阿片問題に関する知見を深めた。

マカオは経済的に香港と密接な関係を有するが、香港に着目した従来の歴史研究では、マカオを十分に考察に含める傾向が少なかった。しかしながら、両地が地理的に近い関係にあり、双方とも中国本土とは統治体制の異なる植民地である上、相互に異なる宗主国を持っていたという事実は、これらの両地を往来して活動を行っていた商社・商人にとって重要な意味をもっていた筈である。この点を追求し、マカオと香港における阿片政策の接点と相違を明確にするため、香港から帰国後の平成19年1月末から2月上旬にかけてリスボンの外交史料館、国立文書館などで調査を行い、史料を収集した。シンガポールでは、シンガポール国立文書館、シンガポール国立大学図書館を利用し、ネマジ商会の活動、および同地出身の香港における阿片販売請負人に関する資料を捜索した。また上海では上海市梢案館にてネマジ商会の上海支店に関する資料を閲覧した。両地における史料収集は、香港で活動していたにも関わらず、香港に所蔵されている史料からは窺うことの出来ない商社・商人の姿を映し出すものであり、研究に資することであった。平成19年度上半期には、昨年度までに収集した史料の読解を進める一方、日本国内の各史料館を訪問し、史料の収集に努めた。東洋文庫では、モリソン文庫に収録されている阿片関係文書、および昨年度までに閲覧することのできなかった文献等を調査・収集した。他方、19世紀から20世紀への転換期における香港の阿片関係の資料が、台湾総督府関係の史料にも収録されていることを知り、後藤新平文書から必要な史料の収集に努める一方、台湾総督府文書の閲覧のために、国内において目録の確認等、必要な下調べを行った。さらに、台湾への阿片供給に関連して、イギリスの日本関係外交文書を、東京大学総合図書館、および横浜開港資料館で閲覧・収集した。このような国内における調査を経て、8月から9月にかけてほぼ1ケ月間、台湾、香港、そして澳門へと渡航し、各地にて資料の収集を行った。台湾では、台北にて台湾大学をはじめ、複数の図書館を利用、さらに南投市では国史館台湾文献館を訪問し、台湾総督府関係文書の調査・収集をおこなった。さらに香港では香港大学図書館と香港歴史档案館を訪問、澳門では澳門歴史档案館にて、資料を収集した。下半期には、これらの史料の読解を進める傍ら、イギリズにおける再調査の準備を進め、2008年1月から3月にかけて調査を実施した。まずロンドンでは、国立公文書館をはじめ、アジア・アフリカ研究院の文書館を訪問し、中国関係の外交文書、およびChina Association関係文書等を閲覧・収集した。さらにオックスフォードでは、ローズハウス図書館において、香港総督経験者、および香港勤務経験のある植民地官僚の個人文書を、閲覧・収集した。これらの成果を公表するため、香港・澳門関係資料に関する紹介を執筆したほか、滋賀大学経済学部ワークショップにて、香港における20世紀初頭の阿片商社に関する研究を発表、貴重なコメントを得た。
客の意思決定と混雑現象の相互依存性に関する待ち行列解析

本課題では,到着客に対して受付期間がある離散時間型の単一窓口待ち行列モデルにおいて,各客が自身の待ち時間の最小化を目的として行動した場合について,均衡を実現する到着時点分布の数値計算アルゴリズムを導いた.数値実験から,サービス時間分布のばらつきが,受付期間の特に初期における到着確率の増加を招くことを示した.さらに,各客が経験に基づき到着時点分布を逐次修正するシミュレーションモデルを提案し,理論解との数値比較も行った.シミュレーションの到着時点分布は厳密には理論解と一致しないが,初期時刻の到着確率の高さ,サービス時間のばらつきが待ち時間に及ぼす影響,などは理論解と同じ傾向を示すことが観察された.到着客に対して受付期間がある単一窓口待ち行列モデルにおいて,各客が自身の待ち時間を最小化とした場合,均衡した期待待ち時間を実現する到着時点分布を求めた.ここでは,離散時間の待ち行列モデルを考え,そのシステム内仕事量に着目することにより,先行研究では扱うことのできなかったサービス時間を一般化したモデルの解析を可能にした.さらに本研究では,均衡を実現する解(到着時点分布)を求めるための数値計算アルゴリズムを導出し,先行研究では明らかにされていなかった解の存在性を理論的に示すことにも成功した.このようにモデルの一般化だけでなく解の存在性を示したことは,本研究は当該分野における理論面での発展に寄与できたといえる.さらに本研究では,サービス時間分布の形状が均衡における到着時点分布および期待待ち時間に与える影響について数値実験を実施した.ここでは,サービス時間が定数,幾何分布もしくは二値分布に従う3つの場合について,同一の期待値をもつとした場合の比較実験を行った.実験結果から,サービス時間分布の分散が増加するとともに,受付期間の特に初期における到着確率が増加するだけでなく,期待待ち時間も場合によっては数十%程度増加することが分かった.この結果は,現実の受付期間があるサービスシステムにおいて,サービス時間のばらつき(分散)が大きいほど,利用者の不利益が増加しうることを示唆している.ゆえに本モデル解析により,現実の受付期間があるサービスシステムにおいて,その設計および運用のための知見を得られることが分かった.最も基本的なモデルについて,理論解析および数値解析の両面の目途が立った.受付期間のある待ち行列モデルについて,各客が目的(ここでは自身の期待待ち時間の最小化)をもち,いつ到着すべきかの意思決定を行った結果,どのような到着時点分布が発現するのかについて,待ち行列理論にゲーム理論の考えを融合した待ち行列ゲームの理論解析を行い明らかにした.得られた均衡における到着時点分布の形状は,実生活でも度々観測される形状であり,待ち行列ゲーム解析の現実問題への応用可能性を十分に示唆する結果であることが分かった.数値実験から,サービス時間分布のばらつきが大きいほど,初期時刻へ客が殺到しうることも示された.最終年度の研究成果は以下の通りである.(1)待ち行列ゲームのプレーヤー数が不確実なゲームとしてのモデルの精緻化:ここで対象とする待ち行列ゲームのように,客の母集団が不確実である待ち行列ゲームについて,先行研究ではモデルの記述方法に曖昧さを含んだまま議論が進められてきた.これは,モデルの解釈だけでなくその解析結果を読み違いかねない.そこで,対象とする待ち行列ゲームについて,ゲーム理論の枠組みに従い,プレーヤー数が不確実なゲームとしてモデルの精緻化を行い,議論の展開を明確にした.(2)シミュレーションモデルの構築および理論解との数値比較:待ち行列ゲームにおける解析結果の現実問題への応用のためには,シミュレーション実験による数値比較が重要である.ここでは,各客が自身の経験に基づいて待ち時間を最小化するように到着時点分布を逐次修正するシミュレーションモデルを提案し,理論解との数値比較を行った.シミュレーションから得られる到着時点分布は厳密には理論解と一致しないが,初期時刻における到着の確率が高いこと,さらに,サービス時間のばらつきが待ち時間に及ぼす影響,などは理論解と傾向が一致することが示された.これは本研究で得られた結果の現実問題への適用可能性を示唆している.本課題では,到着客に対して受付期間がある離散時間型の単一窓口待ち行列モデルにおいて,各客が自身の待ち時間の最小化を目的として行動した場合について,均衡を実現する到着時点分布の数値計算アルゴリズムを導いた.数値実験から,サービス時間分布のばらつきが,受付期間の特に初期における到着確率の増加を招くことを示した.さらに,各客が経験に基づき到着時点分布を逐次修正するシミュレーションモデルを提案し,理論解との数値比較も行った.シミュレーションの到着時点分布は厳密には理論解と一致しないが,初期時刻の到着確率の高さ,サービス時間のばらつきが待ち時間に及ぼす影響,などは理論解と同じ傾向を示すことが観察された.最も基本的なモデルの解析について目途が立ったため,モデルにおけるサービス時間分布以外の一般化を目指し,それらが均衡における到着時点分布および期待待ち時間に与える影響について解析を進める.さらに一般化されたモデルの解析が理論及び数値的に困難である場合には,対応する近似モデルについて解析を試みる.待ち行列理論参加を予定していた国際会議について,学内スケジュールとの折り合いが付かなかったことを理由として,参加できなかったため.共同研究者と数値実験について打ち合わせを行うために,旅費および持ち運びが可能である高性能なノートPCを購入のために使用予定である.
腸管寄生性原虫赤痢アメーバの貪食に関与するイノシトールリン脂質シグナルの解明

我々は以前腸管寄生性原虫赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)の貪食と貪食胞の成熟にフォスファチジルイノシトール3-リン酸を介したシグナルが重要であることを示した。本研究ではリン脂質シグナルを介した貪食胞成熟の分子機構を明らかにすることを目的に研究を展開したが、その過程でリソソーム酵素を小胞体からリソソームあるいは貪食胞へ輸送するレセプター分子を見出し、その機能解析を行った。CPBF1 : cysteine protease binding proteinfamily 1と名付けた分子はシステインプロテアーゼ(CP)との結合分子として見出され、E. histolyticaゲノムに11のファミリー分子として存在していた。少なくとも4つのCPBFはリソソーム酵素をリガンドとすることが明らかになっており、ファミリー分子間でリガンドを分担し、輸送を行う分子群と考えられた。ここではCPBF8について機能解析を行った。CPBFは酵母やヒトでMPR, Vps10p/Sortilinとして知られる分子の機能ホモログと考えられるが、ファミリー分子がこの役を担うのは初めての発見であった。腸管寄生性原虫赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)における貪食過程に関与するイノシトールリン脂質シグナルについて解析を行った。赤痢アメーバの貪食は栄養源の取得以外に寄生環境でホスト細胞・組織の貪食を行うことで組織障害や免疫細胞へのダメージを引き起こし、病態形成に重要な働きをすると考えられている。よって貪食の分子機構の解明は赤痢アメーバの病原機構の理解に重要である。以前論文発表したFYVEドメインとRhoGEFドメインを持つEhFP4分子の解析(Nakada-Tsukui et. al., Cell. Microbiol., 2009)から、貪食過程にPI4Pが関与することが考えられた。そこでPI4Pに結合することが知られるFAPP1とOSBPのPHドメインにGFPを融合し、赤痢アメーバでの局在を検討した。しかし定常的発現が難しく、解析可能なGFP融合タンパク質を発現する細胞の割合は約1%以下であった。発現細胞数が低い中でも発現細胞における局在の検討を試みたが、細胞膜への局在がみられず、細胞全体にGFPのシグナルが観察された。赤痢アメーバにおいて脂質結合ドメインの立体構造が上手く保てなかったのか、赤痢アメーバのPI4P量が少なく、特異的局在を検出するに至らなかったのか、PI4Pに対する抗体を用いて検討中である。また、PI3Pに結合する分子の同定を試みた。PI3PまたはPIを固層化したビーズを用いて共沈するタンパク質を検索したが、結合するたんぱく質が検出されなかった。そこでPI3Pを含むリポソームを用いた実験系を試みた。しかしバックグラウンドが高くなり、やはり特異的結合タンパク質を同定するに至らなかった。PI3P結合タンパク質は少なくとも貪食胞上に集積することから、ビーズやリポソームと反応させる材料を貪食胞膜上から精製するなど、より感度のよい検索方法を確立する必要がある。腸管寄生性原虫赤痢アメーバの貪食胞成熟化の分子機構について解析を行った。これまでの研究から貪食胞でイノシトールリン脂質、特にイノシトール3-リン酸の生成が起こることが明らかとなっており、貪食胞の成熟化に関与するシグナル伝達を行っていると考えられた。貪食胞の成熟は加水分解酵素の貪食胞への輸送と酸性化により進む。このため加水分解酵素の輸送機構の解明が重要と考えられた。そこで代表的な加水分解酵素の一つであるシステインプロテアーゼ5(CP5)に結合する分子の探索を行い、904アミノ酸からなるタンパク質を同定した。この分子は赤痢アメーバゲノムに11の相同性の高い分子が存在していたことからファミリーであると考えられ、cysteine protease binding proteinfamily:CPBFとした。CPBF1,6,8は以前行われた貪食胞のプロテオーム解析から貪食胞に存在することが示されていた。各CPBFとの共沈実験から、CPBF6はlysozyme1,2,beta-hexoaminidaseと、CPBF8はalpha-amylase,gamma-amylaseと結合することが示され、貪食胞への各分子の輸送を行っていることが明らかになった(Furukawa et a.,PLoSPthog.,2012)。

今後これらレセプターによる輸送に脂質シグナルがどのように関与するのか、その分子機構を解明し、脂質シグナルの実態を明らかにしたい。