hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高減衰能Cu基制振合金の特性制御とマイクロ防振部品への適用

騒音や振動は、特に人口の密集する都市部における環境問題として大きく取り上げられている。これら騒音公害を解決する手段として、音や振動を吸収する制振材料や制振システムの開発がある。形状記憶合金は双晶型の制振合金としても知られており、制振材料の中でも高い減衰能と高い強度を有している。しかし、実用形状記憶合金であるTiNi合金は冷間加工性に乏しく、高コストのため制振材料として利用されることはほとんど無かった。そこで本研究では、低廉で優れた特性を有するCu-Mn-Al系高性能制振材料の開発を行い、マイクロ防振部品への適用を検討した。1.種々の結晶粒径を有する試料について粘弾性試験機を用いて周波数(周波数範囲:0.520Hz)および歪振幅(歪振幅範囲:1.3×10-41×10-3)の範囲における減衰能を-100°Cから100°Cの温度範囲について系統的に評価した結果、平均結晶粒径を大きくすると極めて良好な制振特性が得られることを明確にした。2.2%のNiを添加し加工熱処理を行った集合組織材の制振特性を評価した。その結果、極めて良好な結果が得られた。これらの集合組織材の結晶粒径を調査して、室温において最も良好な制振特性を得るための合金設計を行い、マイクロ部品の試作用として相応しい合金を作製した。3.マイクロ部品の製造性を評価するために(1)で作製した合金の冷間加工性や、伸び、強度などの機械的性質を調査した。その結果、本合金系は、精密部品を製造するために必要となる加工性や製造性に問題が無い事が判明した。4.マイクロ制振部品として音響機器用のアイソレータを試作し、簡単な音響テストを実施した。その結果、低周波数領域において特に優れた制振特性が確認された。5.既存材として最も性能の高いMnCuFeNi合金(M2052)を比較材として粘弾性試験および音響テストを行い、本合金系の特徴を明確にした。しかし、実用形状記憶合金であるTiNi合金は冷間加工性に乏しく、高コストのため制振材料として利用されることがほとんどなかった。最近、本研究グループは、高い延性と形状回復率を兼ね備えたCu-Mn-Al基形状記憶合金を開発したが、その基本特性を調査している中で、本合金が制振鋼鈑に匹敵する優れた制振特性を有することを見出した。そこで、本研究では、Cu-Mn-Al系高性能制振材料の開発を行い、小径ねじやバネ等のマイクロ防振部品への適用を検討する。本年度は、以下のような結果が得られた。1.室温近傍のマルテンサイト変態温度を有する合金を高周波溶解炉により溶解し、容体化温度や容体化時間を変えることにより種々の結晶粒径を有する合金を作製した。また、冷間圧延によりそれぞれの冷間加工性を評価した。その結果、合金の冷間加工性は粗大結晶粒でもさほど低下しないことが判明した。2.Niをはじめとした種々の添加元素を加え、主に冷間圧延による加工熱処理を用いて集合組織を出現させることができた。その後、電子線背面反射回析装置(EBSD)により集合組織の度合いを評価した。

その結果、特に約2%以上のNiを添加することにより強い集合組織が得られることを見出した。3.1.で得られた資料を所定のサイズに加工した後、これらの試料について粘弾性試験機を用いて周波数(周波数範囲:0.520Hz)および歪振幅(歪振幅範囲:1.3×10-41×10-3)の範囲における減衰能を-100°Cから100°Cの温度範囲について系統的に評価した。以上の結果から、平均結晶粒径を大きくすると極めて良好な制振特性が得られることを明確にした。騒音や振動は、特に人口の密集する都市部における環境問題として大きく取り上げられている。これら騒音公害を解決する手段として、音や振動を吸収する制振材料や制振システムの開発がある。形状記憶合金は双晶型の制振合金としても知られており、制振材料の中でも高い減衰能と高い強度を有している。しかし、実用形状記憶合金であるTiNi合金は冷間加工性に乏しく、高コストのため制振材料として利用されることはほとんど無かった。最近、本研究グループは、高い延性と形状回復率を兼ね備えたCu-Mn-Al基形状記憶合金を開発したが、その基本特性を調査している中で、本合金が制振鋼板に匹敵する優れた制振特性を有する事を見出した。そこで本研究では、Cu-Mn-Al系高性能制振材料の開発を行い、マイクロ防振部品への適用を検討する。本年度は、以下の様な結果が得られた。1.15年度の結果に基づいて、2%のNiを添加し加工熱処理を行った集合組織材の制振特性を評価したところ、極めて良好な結果が得られた。これらの集合組織材の結晶粒径を調査して、室温において最も良好な制振特性を得るための合金設計を行い、マイクロ部品の試作用として相応しい合金を作製した。2.マイクロ部品の製造性を評価するために(1)で作製した合金の冷間加工性や、伸び、強度などの機械的性質を調査した。その結果、本合金系は、精密部品を製造するために必要となる加工性や製造性に問題が無い事が判明した。3.マイクロ制振部品として音響機器用のアイソレータを試作し、簡単な音響テストを実施した。その結果、低周波数領域において特に優れた制振特性が確認された。4.既存材として最も性能の高いMnCuFeNi合金(M2052)を比較材として粘弾性試験および音響テストを行い、本合金系の特徴を明確にした。
インド・西部太平洋におけるタイ科ヘダイ属魚類の分類学的研究，系統と歴史的分散課程

本研究の対象種であるタイ科ヘダイ属魚類(全5有効種)は,インド西部太平洋に分布しそのほとんどの種が大型になる水産重要種である.しかし,本属魚類は各海域において同胞種を含む可能性が示唆されており、また遺伝学的・形態学的にも研究が不十分であり,多くの分類学的問題を抱えているグループである.そこで本研究では,本属魚類が分布するほぼすべての海域から,標本とDNAサンプルを採集し,形態学的・遺伝学的双方の観点から分類学的再検討,および系統関係と歴史的分散過程の解明を行った.まず,ヘダイ属魚類のR. haffaraについて,本種は,体高が低く,吻部が丸みを帯びることなどの特徴で同属他種から識別され,これまで紅海およびペルシャ湾に分布することが知られていた.しかし,本研究により両海域産の形態比較および遺伝解析を行った結果,本種は両海域において形態的にも遺伝的にも別種レベルで異なることが明らかとなった.また,ヘダイ属のヘダイは,これまで本属魚類の中で唯一インド・西部太平洋に広く分布するとされてきたが,本研究により各海域(1南アフリカ・紅海,2アラビア海,3インド周辺,4オーストラリア,および5東アジア)で形態的に異なるとこが明らかとなった.またミトコンドリアCyt-b全領域(1141bp)を用いて系統解析を行った結果,ヘダイはそれぞれの海域(1-5)で分化し,形態による分類とよく一致した.また,ヘダイ属魚類の分散過程について検討した結果,当初の研究仮説である,古テーチス海が閉じた後,南アフリカを分散の起源とし,インド洋から東アジアへと分散・分化するという仮説を支持する結果となった.以上の研究成果により,分類学的問題を多く抱えていた水産重要種の本属魚類において,系統を反映した正しい分類体系を提唱することができ,魚類学と水産学の基礎的知見に貢献できた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。沿岸性魚類の代表的分類群であるタイ科ヘダイ属魚類は,そのほとんどが大型になる水産重要種であり,これまで以下の5種が有効種とされてきた: R, sarba(ヘダイ), R. globiceps, R. holubi, R. thorpei,及びR. haffara.ヘダイ以外の4種は,それぞれ局所的に分布しており(R. globiceps, R. holubi, R. thorpeiの3種は南アフリカ, R. haffaraは紅海),これまでヘダイのみインド・西部太平洋に広く分布するとされてきた.しかし,これまでの研究からヘダイは各海域で形態やDNAが微妙に異なるなど数種の同胞種を含む可能性が示唆された.従って,ヘダイも同属の他の4種と同様に局所的な分布をとる可能性が高い.このように,ヘダイは分類がかなり混乱しており,分類学的再検討が急務である.そこで本研究では,まずこれまでの調査で採集したヘダイ属魚類(Rhabdosargus globiceps, R. haffara, R. holubi, R. sarba,及びR. thorpei)の標本の整理と体各部の測定を行なった,測定項目は棘数,鱗の枚数や体長など全48箇所を用いた.特に,インド・西部太平洋に広く分布するヘダイ(R. sarba)は,各海域ごと(南アフリカ,アラビア海,オーストラリア,東アジア)に分けて比較検討を行なった.その結果,アラビア海産(パキスタン)のヘダイは他の個体と比べ尾鰭後縁の黒色域が広いことが分かった.今後,ヘダイのタイプ産地である紅海産のヘダイの標本を採集し,それとこれまでに採集した各海域産のヘダイの標本と詳細に比較検討を行い,ヘダイの分類学的再検討を行う.また,遺伝学的研究では,紅海湾奥部のイスラエル産とアラビア海産のR. haffaraはミトコンドリアDNAのCyt-b領域において遺伝的に異なることが明らかとなった.従来R. haffaraは,紅海からアラビア海に分布することが知られているが,前記の結果から両産地の個体は別種である可能性が高い.しかし,今回の調査で用いた紅海産の個体が少ないため,今後は紅海産の標本を増やし,分類学的・遺伝学的研究を進めていく.本研究の対象種であるタイ科ヘダイ属魚類(全5有効種)は,インド西部太平洋に分布しそのほとんどの種が大型になる水産重要種である.しかし,本属魚類は各海域において同胞種を含む可能性が示唆されており、また遺伝学的・形態学的にも研究が不十分であり,多くの分類学的問題を抱えているグループである.そこで本研究では,本属魚類が分布するほぼすべての海域から,標本とDNAサンプルを採集し,形態学的・遺伝学的双方の観点から分類学的再検討,および系統関係と歴史的分散過程の解明を行った.まず,ヘダイ属魚類のR. haffaraについて,本種は,体高が低く,吻部が丸みを帯びることなどの特徴で同属他種から識別され,これまで紅海およびペルシャ湾に分布することが知られていた.しかし,本研究により両海域産の形態比較および遺伝解析を行った結果,本種は両海域において形態的にも遺伝的にも別種レベルで異なることが明らかとなった.また,ヘダイ属のヘダイは,これまで本属魚類の中で唯一インド・西部太平洋に広く分布するとされてきたが,本研究により各海域(1南アフリカ・紅海,2アラビア海,3インド周辺,4オーストラリア,および5東アジア)で形態的に異なるとこが明らかとなった.

またミトコンドリアCyt-b全領域(1141bp)を用いて系統解析を行った結果,ヘダイはそれぞれの海域(1-5)で分化し,形態による分類とよく一致した.また,ヘダイ属魚類の分散過程について検討した結果,当初の研究仮説である,古テーチス海が閉じた後,南アフリカを分散の起源とし,インド洋から東アジアへと分散・分化するという仮説を支持する結果となった.以上の研究成果により,分類学的問題を多く抱えていた水産重要種の本属魚類において,系統を反映した正しい分類体系を提唱することができ,魚類学と水産学の基礎的知見に貢献できた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画通り,サウジアラビア(紅海)へ行き,ヘダイ属魚類の標本とDNAサンプルを採集する事ができなかったが,これまでの調査で採集した標本やDNAサンプルをもとに形態学的・遺伝学的研究を行い, R. haffaraは紅海とアラビア海で別種の可能性がある事を明らかとした。今年度の研究計画は,まず紅海に面するエリトリアに在住する日本人や現地の水産研究者とアポイントメントを取ることができたため今年度の6-7月にエリトリアへ訪問し紅海産のヘダイ属魚類のサンプリングに行く予定である.その後,前記産地のヘダイ属魚類の標本とこれまでに採集した本属の標本と詳細な比較検討を行い,分類学的再検討を行う.また,紅海産のヘダイのDNAサンプルを解析し,ヘダイ属の系統と歴史的分散過程について検討し,科学論文としてまとめる。
スフィンゴ脂質シグナリング酵素の構造・機能生物学とその応用

(1)エンドグリコセラミダーゼの構造に関する研究本酵素の構造をセルラーゼを鋳型にしたホモロジーモデリングによって調べた。その結果、本酵素はセルラーゼ(β-1,4-glucanase)と同じくα-ヘリックスとβ-シートを交互に7回繰り返すTIM-バレル構造を有している保持型の酵素であることが明らかになった。しかし、セルラーゼとは基質が結合する溝の構造が異なり、糖脂質に特異的に作用することが示された。また、点変異を用いた実験により、セルラーゼの触媒部位で保存されている7つのアミノ酸残基が全て保存され、本酵素の触媒部位を形成していることが分かった。(2)中性セラミダーゼの構造に関する研究ラット中性セラミダーゼのN-末に存在するセリン、スレオニン、プロリンに富んだドメインが高度にO-グリコシル化を受けること、このドメインが本酵素を形質膜II型蛋白質として発現させる必要十分条件であることを様々な変異体酵素を作製して明らかにした。また、C-末にはバクテリアからヒトに至るまで保存されている3つのアミノ酸残基が存在し、本酵素のホールディング、細胞内移行に重要な役割を果たしていることを見いだした。(3)中性セラミダーゼの機能に関する研究中性セラミダーゼが細胞表層のセラミド代謝に関与していることを明らかにした。また、細胞表面で産生されたスフィンゴシンの一部は細胞表面でスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)に変換され、S1Pの受容体であるEdgのリガンドとなることを見いだした。ゼブラフイッシュ初期発生系において中性セラミダーゼ遺伝子をノックダウンすると血管新生が著しく遅滞することを見いだした。興味深いことに、この血管新生不全は、受精卵に中性セラミダーゼmRNA、スフィンゴシンS1Pをマイクロインジェクションすることによりほぼ完全に回復した。一方、Edgをノックダウンすることによっても中性セラミダーゼノックダウン胚と同様に血管新生の不全が惹起されたが、S1Pのマイクロインジェクションでは回復しなかった。以上のように、ゼブラフイッシュの初期発生において、中性セラミダーゼはS1Pシグナリングを介して、血管新生に深く関わっていることを強く示唆する結果を得た。セラミドを分子内に持つスフィンゴ脂質は,脊椎動物では主として形質膜マイクロドメイン(ラフト)に存在し,細胞の接着やシグナル伝達の制御に関わっている。本研究では,私たちが世界に先駆けて見いだし,クローニングしたスフィンゴ脂質代謝酵素(エンドグリコセラミダーゼ,スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ,セラミダーゼ,微生物由来のエキソ型ガングリオシド分解酵素)の立体構造およびそれらの触媒機構をX-線構造解析と点変異導入法を含む分子生物学的な手法で明らかにすることを第一の目的とする。また,これら代謝酵素の阻害剤の開発も視野に入れる。ほ乳動物セラミダーゼの機能を研究する過程でムチンボックス(セリン,スレオニン,プロリンに富む約30アミノ酸からなるドメイン)がセラミダーゼを形質膜貫通II型蛋白質へリクルートするために必須であること,オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質(GFP)にラットのシグナル配列とムチンボックスを融合させるとGFPは形質膜貫通II型蛋白質となることを見いだした。

本研究の第二の目的は,その分子機構を明らかにすると共に様々な可溶性蛋白質を形質膜貫通II型蛋白質に変換する技術の最適化を計ることである。本年度は,以下の研究を実施した。(1)中性セラミダーゼの大量精製法を完成し,X-線結晶構造解析に着手した。現在,3Å分解能程度の回折が得られている。次年度は,解像度を上げ,中性セラミダーゼの完全構造解析を成し遂げたい。(2)エンドグリコセラミダーゼがセルラーゼ(エンドβ1,4グルカナーゼ)と相同性が高いことを見いだし,ホモロジーモデリングで構造を決定した。(3)分子生物学的なアプローチから中性セラミダーゼのC-末端部位に存在するPhe756とIle758が本酵素の活性,細胞内局在ホールディングに極めて重要であることを見いだした。この2つのアミノ酸に変異を入れるとプロテアソームで迅速に分解されてしまうことを示した(平成15年度日本生化学会で報告)。(4)Paenibacillus sp.から発現クローニング法により新奇ガングリオシド分解酔素遺伝子を単離した(平成15年度日本生化学会で報告)。今後,大量精製系を確立し,X-線結晶構造解析を試みる。(5)レクチン,スフィンゴ脂質代謝酵素等にムチンボックスを付与することで各々のタンパク質を形質膜にリクルートさせ,そこで機能的に働くことを示した(平成15年度日本農芸化学会で報告)。(6)海藻の抽出液中にセラミダーゼの阻害活性を見いだし,現在この低分子化合物を精製中である。(1)中性セラミダーゼの構造に関する研究ラット中性セラミダーゼのN-末に存在するセリン、スレオニン、プロリンに富んだドメインが高度にO-グリコシル化を受けること、このドメインが本酵素を形質膜II型蛋白質として発現させる必要十分条件であることを様々な変異体酵素を作製して明らかにした。また、C-末にはバクテリアからヒトに至るまで保存されている3つのアミノ酸残基が存在し、本酵素のホールディング、細胞内移行に重要な役割を果たしていることを見いだした。(2)中性セラミダーゼの機能に関する研究中性セラミダーゼが細胞表層のセラミド代謝に関与していることを明らかにした。また、細胞表面で産生されたスフィンゴシンの一部は細胞表面でスフィンゴシン-1-リン酸(SIP)に変換され、SIPの受容体であるEdgのリガンドとなることを見いだした。ゼブラフイッシュ初期発生系において中性セラミダーゼ遺伝子をノックダウンすると血管新生が著しく遅滞することを見いだした。興味深いことに、この血管新生不全は、受精卵に中性セラミダーゼmRNA、スフィンゴシンS1Pをマイクロインジェクションすることによりほぼ完全に回復した。一方、Edgをノックダウンすることによっても中性セラミダーゼノックダウン胚と同様に血管新生の不全が惹起されたが、S1Pのマイクロインジェクションでは回復しなかった。以上のように、ゼブラフイッシュの初期発生において、中性セラミダーゼはS1Pシグナリングを介して、血管新生に深く関わっていることを強く示唆する結果を得た。(3)エンドグリコセラミダーゼの構造に関する研究本酵素の構造をセルラーゼを鋳型にしたホモロジーモデリングによって調べた。
閉塞性睡眠時無呼吸症候群に伴う脳微細構造変化と眠気・認知機能障害の検討

重度の閉塞性睡眠時無呼吸症候群の症例を対象に意欲・高次認知機能を評価し、睡眠呼吸指数との関連を検討した。また、認知機能に影響を与えている睡眠呼吸指数の影響を受ける脳領域をFA/ADC画像、灰白質画像・白質画像にて検討した。その結果、自覚的な眠気と意欲に関連があり、睡眠呼吸指数のうち最低SpO2のみが高次脳機能に影響を与えていた。神経軸索の微細な変化を反映するADC・FA画像では高次脳機能を司るとされる内側前頭野・下前頭葉および覚醒に関わる神経核群が存在する脳幹・中脳橋部のADC・FA値が低酸素侵襲の指標である最低SpO2と正の相関を認め、同領域の白質密度も同様に正の相関を認めた。また、海馬傍回灰白質密度も最低SpO2と正の相関を認めた。以上のことから、重度閉塞性睡眠時無呼吸症候群では、低酸素侵襲がわずかながらに認知機能低下をもたらし、これは、脳の軸索レベルでの低酸素侵襲による微小な障害を伴っていることが示された。方法:当院通院中の、精神疾患の既往および向精神薬服用歴のない、PSG検査にてAHI>40/h以上の重度OSASと診断された35歳以上の男性12例(平均年齢48.1±8.5歳)を対象として、日本高次脳機能障害学会が作成した標準意欲評価(CAS)、および標準注意検査(CAT)のうち、選択的注意能力を評価する視覚性抹消課題、注意分配能力を評価する数字符号照合検査(SDMT)、記憶更新検査、および葛藤条件の監視機能を評価する位置ストループ課題を行った。それぞれの課題の得点はそれぞれの課題の健常者における年齢毎の平均値をもとにz値に変換した。また、3.0TのMRIスキャナにより撮像したMR-DTIを元に作成したFA画像およびADC画像、SPM8-segmentationによりT1画像から作成した灰白質画像・白質画像において相関のある脳領域をSPM8を用いて解析した。結果:対象の重度OSAS患者のAHIは63.9±15.4/h、中途覚醒指数は54.0±17.1/h、うち呼吸関連覚醒指数は49.0±19.2/h、最低SpO2は70.5±7.2%、総睡眠時間におけるSpO2<90%の占める時間は18.8±13.4%であった。臨床指標と認知課題において、ESS(エプワース眠気尺度)スコアが標準意欲評価のスコアおよび視覚性抹消課題の所要時間と正の相関を認め、最低SpO2のみが視覚性抹消課題と位置ストループ課題の遂行時間と負の相関、数字符号照合検査(SDMT)の成績と正の相関を認めた。脳画像解析の結果、認知機能への影響を示した最低SpO2は、右下側頭領域、両側中前頭領域のFA値と負の相関、両側海馬傍回の灰白質密度と負の相関を認めた。考察:重症OSASにおける低酸素状態が脳に微細な構造変化をもらたし、その結果、わずかながらにも認知機能に影響を与えていることが示された。重症の閉塞性睡眠時無呼吸症候群患者において、日中の眠気だけでなく、高脂血症・糖尿病といった生活習慣病や脳梗塞をはじめとする虚血性疾患のリスクの上昇、注意・集中力低下といった認知機能への影響が指摘されている。そこで、当院を初診受診した、未治療の重度閉塞性睡眠時無呼吸症候群(無呼吸低呼吸指数≧40/時間)を対象に、治療導入前に、血液生化学検査(肝機能、脂質代謝、耐糖能)、脳MRI画像検査、および、認知機能として、選択的注意能力を評価する視覚性抹消課題、注意分配能力を評価する数字符号照合検査(SDMT)、記憶更新検査、および葛藤条件の監視機能を評価する位置ストループ課題を行った。なお、それぞれの課題の得点はそれぞれの課題の健常者における年齢毎の平均値をもとにz値に変換した。対象は、35歳以上の男性12例(平均年齢48.1±8.5歳)であり、平均AHIは62.5±15.3/h、中途覚醒指数は54.5±16.3/h、うち呼吸関連覚醒指数は47.6±18.8/h、最低SpO2は70.0±10.1%、総睡眠時間におけるSpO2<90%の占める時間は17.8±14.4%であった。自覚的な眠気の尺度であるESS(エプワース眠気尺度)

スコアは標準意欲評価のスコアおよび視覚性抹消課題の所要時間と正の相関を認め、中途覚醒指数は視覚性抹消課題の正答率と負の相関を認めた。最低SpO2が位置ストループ課題遂行時間と負の相関を認めた。この結果、自覚的な眠気の強さと意欲・注意力持続、および、中途覚醒の頻度と注意力低下に関連があることが示唆された。また、睡眠時の呼吸関連指数に関しては、最低SpO2のみが高次脳機能に影響を与えていた。なお、虚血性脳病変の確認のために、脳MRI画像検査を施行した結果、視認できる虚血性病変は全例、確認されなかった。エントリーした被験者の臨床データは予定通り収集できているが、条件を満たす対象群が予定より少ない状況にある。当院を初診受診した、未治療の重度閉塞性睡眠時無呼吸症候群(無呼吸低呼吸指数≧40/時間)をリクルートしつつ、既にエントリーしている被験者群に対して、安定して6か月以上の経鼻的持続陽圧呼吸法(nasal Continuous Positive Airway Pressure:nCPAP)による治療が継続された被験者に対して、血液生化学検査(肝機能、脂質代謝、耐糖能)、脳MRI画像検査、および、認知機能として、選択的注意能力を評価する視覚性抹消課題、注意分配能力を評価する数字符号照合検査(SDMT)、記憶更新検査、および葛藤条件の監視機能を評価する位置ストループ課題を行う。治療前後において、これらの臨床症状・臨床データの可逆的変化および非可逆的変化について、以下を検討する。(1) CPAP治療によるFA・ADC画像の変化の検討:認知機能・EDS(日中の眠気)改善群において、これらの改善がCPAPによる間歇的低酸素状態の改善による脳の可逆的改善と関連を示すかを検討する。(2)認知機能・EDS非改善群におけるCPAP治療前脳画像の比較検討:認知機能・EDS非改善群におけるCPAP治療前から認められるFA・ADC画像上の微細な脳虚血性変化の特徴、および、FA・ADC画像所見と従来のMRI画像によるFazekas分類の関連を検討する。(3)認知機能・EDS非改善群の予測因子の検討:喫煙・飲酒、年齢、性別に加え、治療前後の血液生化学検査、睡眠時の動脈血酸素飽和度(最低値および平均値)やAHIなどの終夜PSG検査指標、従来のMRI画像によるFazekas分類から、認知機能・EDS非改善群の危険因子を推定する。6カ月以上のCPAP治療継続群全例に対する脳MRI画像の再検査に対して、撮像費が1名につきおよそ10,000円、時間を要する認知機能検査に対する謝金として1名につき5,000円の謝金を要する。画像データは1症例につき治療前後の2画像で約2ギガバイトの容量があるため、個別保存用のDVD-R、および、高容量のデータバックアップシステム(HD-QSS4.0T)を購入する。また、認知機能検査の評価紙20部を4セット購入する。多大なデータの解析を行うため、検査および解析補助員の協力を必要とするため、これらにたいする謝金も要する。研究結果を、国内の学会にて2件、海外での国際学会にて2件発表する。また、英語専門誌に研究結果を投稿する。
乳酸代謝能改善をねらいとした高強度間欠的低酸素トレーニングの効果

本研究では、低酸素環境下で高強度間欠的トレーニングの効果を検討するこを目的とした。その結果、球技選手を対象にした低酸素トレーニングは、間欠的なペダリングテストにおける最大パワーおよび平均パワーの増加に有効であること、陸上競技短距離選手を対象にした低酸素トレーニングは、短距離走における加速局面前半の疾走速度の改善に特に有効であることなどが示された。これらの結果は、これまで持久性種目の競技者において取り入れられてきた低酸素環境下でのトレーニングが、無酸素性エネルギーの発揮能力が重要とされる競技種目での体力強化にも活用できることを示唆するものと考えられる。研究1では、低酸素環境下でのペダリング運動時の代謝および運動パフォーマンスを検討した。若年男性8名を対象に、通常酸素環境下または低酸素環境(酸素濃度14.5%)下で行う一過性のペダリング運動時における代謝応答および運動パフォーマンスを比較した。その結果、60秒以内で運動が完結するような間欠的な全力ペダリング運動時における発揮パワーの推移に、両条件間で有意差は認められなかった。研究2では、陸上競技短距離種目選手に対する短期間の低酸素トレーニングの効果を検討した。陸上競技短距離種目を専門とする男性競技者18名を、通常酸素環境下でトレーニングを行う「通常酸素群」と低酸素環境下(酸素濃度14.5%)でトレーニングを行う「低酸素群」に分類した。トレーニングには自転車エルゴメーターによる間欠的な全力ペダリングを用いて、両群ともに6日間連続で実施した。その結果、両群ともに30秒間全力ペダリングテストにおける発揮パワーや最大酸素摂取量には、トレーニング期間前後で有意な変化はみられなかった。一方、低酸素群では、60m走の加速局面前半部分におけるタイムの有意な向上が認められたが、通常酸素環境群において同様の変化はみられなかった。研究3では、陸上競技女性マラソン選手に対する長期間の低酸素トレーニングの効果を事例的に検討した。フルマラソン2時間45分前後の記録を有する女性マラソン選手1名に対して、トレッドミルを用いた週2回・8週間にわたる低酸素トレーニング(3分間のランニング×1020セット、セット間1分休息)を取り入れた。トレーニング期間前後において、時速15kmにおけるランニングエコノミー(酸素摂取量)を評価したところ、トレーニング期間後に約3%の記録改善(酸素摂取量の低下)が認められた。今年度は球技選手を対象に、低酸素環境で行う高強度・間欠的トレーニングの効果を検討した。大学球技選手32名を、通常酸素環境(酸素濃度20.9%)でトレーニングを行う「通常酸素群」と、常圧・低酸素環境(酸素濃度14.5%)でトレーニングを行う「低酸素群」に分類した。両群ともに、週2回・4週間にわたりハイパワー式自転車エルゴメーターを用いた高強度・間欠的ペダリングトレーニング(10セット)を実施した。その結果、4週間のトレーニングに伴い、両群ともに間欠的ペダリングテスト(10セット)における平均パワーの向上が認められた。一方、トレーニング期間前後での改善率に着目すると、最高パワー、平均パワーのいずれに関しても低酸素群が通常酸素群に比較して有意に高値を示した。最大酸素摂取量の増加率には、群間で有意な差は認められなかった。上述の結果から、低酸素環境下で行う高強度・間欠的トレーニングは通常酸素環境で行う同様のトレーニングに比較して、最大無酸素パワーおよび無酸素性持久力の改善に有効であることが明らかになった。今年度は大規模なトレーニング介入実験を2つ実施し、いずれも新規性の高い研究結果が得られた。この研究結果は今年度の国際学会で発表した上で、論文投稿する予定である。また、当初今年度に予定していた研究の一部を前倒しで実施することができた。以上の諸点から、研究の進捗は概ね順調であると評価できる。これまでおもに、長期間のトレーニングに伴う運動パフォーマンスの変化に着目した研究を行ってきた。そこで今後は、低酸素環境で行う一過性の運動に対する代謝・内分泌応答を詳細に検討する予定である。この研究を行うことにより、低酸素環境での高強度トレーニングの有益な効果を機序を明確にすることができると考えられる。平成24年度に予定していた研究の進行の一部に変更が生じ、次年度に実施することになった。そのため、消耗品購入に関わる使用額が当初の予定を下回った。次年度に研究を継続する際に、平成24年度の未使用額を消耗品購入費として使用したい。
金属-硫黄部位を有する酵素活性中心のモデル化研究

ヒドロゲナーゼ活性部位を模倣するカルボニル鉄-ニッケル二核錯体の合成に成功した。チオラートNaS^tBuの溶液に対して低温でFeBr_2(CO)_4,NiBr_2(EtOH)_4を順次加える反応系から、自己集合的にFe-Ni-Ni-Fe四核錯体[(CO)_3Fe(μ-S^tBu)_3NiBr]_2(1)が得られることを見いだした。錯体1は[NiFe]の二核単位が置換活性なBrで架橋された二量体とみなすことができ、チオラート架橋[NiFe]二核錯体の有用な前駆体になると期待される。しかし、錯体1に対し2当量のNaSPhを低温で反応させたところ、Brとベンゼンチオラートの置換反応が進行し、Ni-Fe間を架橋するチオラートの1つが鉄上の末端配位子となることで、四核錯体[(CO)_3Fe(S^tBu)(μ-S^tBu)_2Ni(SPh)]_2(2)が生成した。過剰のNaSPh存在下でも錯体2の四核骨格は安定であり、Fe-Ni-Ni-Feの四核からNiFe二核単位への開裂は起こらない。そこで、チオラートによるNi-Ni間の架橋を防ぐ目的で、嵩高い置換基を持つNa(SDmp)(SDmp=2,6-dimesitylphenylthiolate)を1に反応させた結果、二核錯体(CO)_3Fe(μ-S^tBu)_3Ni(SDmp)(3)が得られた。錯体3はニッケル-鉄間の三つのチオラート架橋を保持したまま末端に嵩高いDmpチオラート配位子を持ち、結果としてニッケル周りは特異なtrigonal pyramidal構造を強制されている。そこで、この歪みがかかったニッケル部位を利用したドナー分子との反応を検討した。[NiFe]ヒドロゲナーゼの反応はCOによって阻害されるが、その際COはニッケルに配位すると報告されている。錯体3は1気圧のCOと速やかに反応し、平面四配位Niを形成するとともに1つの架橋チオラートが鉄末端に移動した二核錯体(CO)_3Fe(S^tBu)(μ-S^tBu)_2Ni(SDmp)(CO)(4)を与えた。この反応は可逆であり、減圧下で錯体3を再生する。錯体4はCO阻害型[NiFe]ヒドロゲナーゼの初の構造モデルであると同時に、立体的制約により歪んだニッケル上において配位構造を変えながらドナー分子を脱着させる点で興味深い。
小胞体膜蛋白質膜透過チャネルを構成する蛋白質の解析

小胞体における蛋白質の透過チャネルを構成すると考えられる小胞体膜蛋白質の候補として、架橋反応によって、低分子量膜蛋白質(Cp9)を同定していた。以下のごとく、Cp9の候補として、イヌ膵臓粗面小胞体から9kDaの膜蛋白質を単離精製した。即ち、イヌ膵臓から生化学解析に耐えうる充分量の粗面小胞体膜をショ糖密度勾配遠心法によって精製しin vitroにおける蛋白質透過活性の高いことを確認した。この粗面小胞体膜をジギトニン処理によって穏やかな条件で可溶化した後、リボソーム・蛋白質膜透過装置複合体を超遠心分画法により濃縮した。その後、ジギトニン存在化の高濃度の塩処理によって同複合体膜蛋白質を解離させ、リボソームから解離可溶化し、リボソームを超遠心によって除いた。この複合体には、9kDa蛋白質が主要成分として含まれていたのでこれをCp9の候補と考え、調製用SDS-電気泳動法を用いて単離した。精製された蛋白質を、アスパラギニルエンドペプチダーゼ、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼで消化後、ペプチド断片をC18逆相カラムを用いたHPLCによって単離し、それぞれの部分アミノ酸配列を決定した。この配列を元にして、15アミノ酸からなる合成ペプチドを作成し、ウシ血清アルブミンに化学架橋反応によって結合させ、ウサギに免役し抗血清を得た。抗血清から合成ペプチドを結合した樹脂を用いて、特異抗体を精製し、免疫沈降法によってCp9との反応性を調べたが沈降しなかった。しかし、蛋白質膜透過チャネルの成分の一つが単離及び構造決定できたと考え、現在機能解析を進めている。
降雨に起因したアオコ発生トリガーの普遍性調査

申請者ら世界的にも問題となっているダム湖でのアオコを対象とした研究を実施してきている。20172018年には,従来手法と比較して詳細なデータが得られる観測手法を用いた調査を尾原ダムにおいて実施し,降雨に起因するアオコ発生メカニズムを明らかにした(増木ら,2018,土木学会水工学論文集)。本研究では,申請者が明らかにしたアオコ発生メカニズムの普遍性(一般性)について明らかにするものである。本研究の実施により当該分野における重要な知見が得られるのみならず,世界的に大きな問題となっているアオコの対策技術への波及効果も強く期待できるものである。
皮膚悪性腫瘍に対する抗癌剤感受性試験

進行期皮膚悪性腫瘍に対する抗癌剤感受性試験を、histoculture drug response assay(HDRA)法を用いて15例に対して行った。15例中14例で結果が判明し、内訳は感受性群10例、低感受性群4例であった。未だ観察期間が充分とは言えないが、感受性を示す抗癌剤投与により複数の有効例を経験し、完全寛解例も経験した。進行期皮膚悪性腫瘍に対する抗癌剤感受性試験は保険診療・先進医療として承認されておらず、当科では2009年度5例(メラノーマ3例、有棘細胞癌2例)、2010年度6例(メラノーマ2例、有棘細胞癌2例、乳房外パジェット病1例、原発不明癌1例)に施行した。2011年より研究期間となり、2011年度4例(メラノーマ3例、原発不明癌1例)、2012年度11例(メラノーマ5例、有棘細胞癌3例、乳房外パジェット病2例、皮膚付属器癌1例)をHDRA法が商業化されているエスアールエル社に検体を提出し癌剤感受性試験を受けた。2011年度以降の15例中14例で結果が判明し、内訳は感受性群10例、低感受性群4例となった。2011年以降では有棘細胞癌StageIVの1例は感受性を示した抗癌剤による術前抗癌剤投与により、PRを示し、その後根治術可能となり、現在もCRを継続している。2011年以前の有棘細胞癌StageIVの1例でも同様の治療経過で現在もCRを継続している症例がある。メラノーマStageIIICの3例中2例で根治術後に感受性を示した抗癌剤投与により、現在もCRを継続している。未だ観察期間が充分とは言えないが、感受性群ではCR、PR症例を複数症例経験した。CR症例については、2011年6月3日・4日開催の第27回日本皮膚悪性腫瘍学会学術大会で報告した(抗癌剤感受性試験に基づいた化学療法を行った乳房外Paget病の1例)。さらに観察期間を延長し、抗癌剤感受性試験の有用性を示すことができればと考えている。抗癌剤の感受性は同一の臓器由来で同一の組織型を有する癌においても一定しない。これまで、皮膚悪性腫瘍に対しては病名によって盲目的に抗癌剤が投与されてきた現実がある。個々の症例に対して、有効な抗癌剤を予測・選択して投与し、有効性が期待できない抗癌剤の投与を最小限にとどめることを目的とする。この有効な抗癌剤を予測・選択する手法が抗癌剤感受性試験と考える。具体的には、皮膚悪性腫瘍StageIII/IV症例、当科で扱う原発不明癌を対象とし、手術あるいは生検によって得られた原発巣もしくは転移リンパ節などの腫瘍組織を抗癌剤感受性試験へ提出した。抗癌剤感受性試験はHistoculture Drug Response Assay(HDRA法)を選択し、商業化されているエスアールエル社に検体を提出した。Inhibition Index(%)50%以上を示す抗癌剤が存在する症例は感受性群として、その抗癌剤を含むregimenで化学療法を行うこととした。平成23年度はメラノーマ6症例、原発不明癌1症例の計7症例に対して抗癌剤感受性試験を行い、感受性群5例、低感受性群2例であった。感受性群4例に対しては、感受性を示した抗癌剤を含むregimenで化学療法を行った。当科では平成21年度5症例、平成22年度6症例に対して、抗癌剤感受性試験を行っており、これらの結果も含めて、抗癌剤感受性試験の臨床的有用性を現在検証している。進行期皮膚悪性腫瘍に対し抗癌剤感受性試験を行い、有効と判定された薬剤による抗癌剤治療を行い、良好な結果を示すことができれば、従来の経験的判断に基づいた抗癌剤治療から、個々の患者に対して最も有効で適切な抗癌剤を選択して治療することができると考える。症例数が当初の目標より伸びていない現状がある。進行期皮膚悪性腫瘍の頻度の問題も関係あると考える。また、高齢の症例においては、抗癌剤感受性試験で高い感受性を示しても、全身状態、合併症から抗癌剤投与が難しい症例や、副作用から抗癌剤を継続できない症例もみられた。症例によっては、未だ短い観察期間ながら現在までのところ、良好な経過をたどる例もみられている。今後の症例の集積、慎重な観察が必要と考える。症例の集積が最も重要と考える。十分な観察期間が得られる訳ではないが、感受性群と低感受性群の2群で疾患別、病期別に生存予後を検討する。抗癌剤感受性試験の臨床効果予測率の判定方法は、測定可能病変を有する場合と有しない場合で異なる。測定可能病変を有する場合の効果判定は、Revised Evaluation Criteria in Solid Tumor(RECIST)判定により行う。完全奏効(complete response; CR)+部分奏効(partial response; PR)を奏効症例とし、奏効率を測定する。可能病変を有しない場合は、生存期間により判定する。症例集積に努める。
マラリア感染によるCD4陽性T細胞機能抑制の分子機序の解明

マウスマラリアPlasmodium berghei ANKAの実験モデルを用い、感染に伴う免疫抑制機序の解析を行った。感染マウスのCD4^+ T細胞は、他のCD4^+ T細胞のIL-2産生を抑制する能力があり、それは液性因子によることを明らかにした。抑制性細胞はfoxp3-のマラリア特異的活性化CD4^+ T細胞であった。抑制因子はIL-10やTGF-βではなく、T細胞の産生する新たな抑制性サイトカインXであると考えられた。マラリア感染マウスのCD4^+T細胞は、T細胞受容体(TCR)刺激に対してIFN-γ産生亢進、IL-2産生低下を示す。本研究では、このサイトカイン産生の調節機構、特にIL-2産生抑制機構の分子基盤の解明を目指している。研究の一年目に当たり、IL-2産生抑制因子の同定についてはアレイ解析や蛋白精製を試みているが未だに到達できていない。しかしながら、IFN-γ産生亢進とIL-2との関連について新たな知見を得ることが出来た。卵白アルブミン(OVA)特異的TCRトランスジェニックマウスOT-IIのCD4^T細胞を受け身移入したマウスにマラリア原虫Plasmodium berghei ANKA株を感染させ、精製したCD4^+T細胞をOVAで刺激したところ、高いレベルのIFN-γ産生が得られた。しかしながら産生細胞OT-IIではなく、宿主のCD4^+T細胞であった。この実験を契機に、OVAにより活性化されたOT-II細胞がIL-2を産生し、それが活性化宿主CD4^+T細胞のIL-2受容体に結合してIFN-γ産生を促進することが明らかになった。即ち、感染マウスCD4^+T細胞はIL-2受容体を発現しており、自身のTCR刺激がなくても他の細胞が産生するIL-2により傍観者的にIFN-γを産生することができる。さらに、マラリア抗原に対するT細胞反応の際に抗IL-2受容体抗体を添加しておくとIFN-γ産生が抑制されることから、マラリア抗原に対するCD4^+T細胞のIFN-γ産生はIL-2に依存的であることが明らかになった。このことは、マラリア感染においてIL-2発現レベルが他のサイトカイン産生にも調節的に機能していることを示している。従ってIL-2産生調節機序の解明は極めて重要である。マラリアは世界的に極めて重要な感染症であるが、その病態や宿主の免疫応答機序については十分に解明されていない。ワクチン開発のためにはこれら基礎的な理解が不可欠である。我々は、マラリア感染マウス実験モデルにおいてCD4^+T細胞の抗原刺激に対する応答は通常のT細胞とは異なり、IL-2産生は低下し、IFN-γ、IL-4やIL-10産生は亢進していることを明らかにした。さらにこの機序を解明する目的で、モデル抗原OVAを発現するマラリア原虫Plasmodium berghei ANKA (PbA-OVA)を作製し、OVA特異的T細胞の応答を解析した。その結果、意外なことにPbA-OVA感染マウスでOVA刺激に対し高いIFN-γ産生を示すのはOVA特異的T細胞ではなく、むしろ他のCD4^+T細胞であることが明らかになった。さらに詳細な解析から、マラリア感染マウスでは、感染により活性化されIL-2受容体を発現するCD4^+T細胞は、抗原非存在下IL-2刺激だけでもIFN-γ産生を誘導されることが明らかになった。一般にCD4^+T細胞は抗原刺激を受けてIFN-γ産生を行うと考えられており、IL-2のみでIFN-γ産生を行うことは新規の重要な知見である。さらに、抗原刺激に対するIFN-γ産生についても、抗IL-2受容体抗体で完全に抑制されることから、IL-2依存的であることが明らかになった。どのような場合にIL-2依存性のIFN-γ産生を行うのか、どのような場合に非依存的な産生を行うのか、現在メカニズムの解明へと進んでいる。またCD4^+T細胞のIL-2産生抑制は、以上にように主要な抗炎症生サイトカインIFN-γ産生とも密接に関連しており、本研究の目的であるIL-2産生抑制機構の解明と共に、宿主サイトカインネットワークの制御機構がマラリア感染に伴いどのような修飾を受けるのか、全体像の解明に向けて今後とも研究を推進する。本研究は、マラリア感染に伴う免疫抑制・修飾機構の解明を目的として、マウスマラリア原虫Plasmodium bergheiの実験モデルを用いた基礎的研究である。マラリア原虫に感染したマウスCD4^+T細胞を抗原刺激すると、IL-2産生が著しく低下している。

この低下は、CD4^+T細胞自身が産生する抑制性因子によるものであることをつきとめたので、平成23年度はこの抑制因子の本体の解明と抑制因子産生細胞の解析を目的として研究を推進した。当初は、計画に従って抑制因子を含むT細胞の培養上清から生化学的手法により抑制因子を精製することを試みたが、技術的な様々な問題に直面して精製は困難を極めた。一方、発現遺伝子のアレイ解析も試みたが、それらしい遺伝子の同定には至らなかった。一方、既知の抑制性サイトカインとしてIL-10、TGF-β・IL-4・IFN-γなど候補になったが、抗体による中和実験では抑制性因子を含む培養上清の抑制活性を十分に中和することができず、これらの既知のサイトカインではないと考えられた。一方、その他のサイトカインでもIL-2産生を抑制する可能性のある分子について広く調べた結果、上記抑制因子の有力な候補となるサイトカインが明らかになった。このサイトカインX(名称は、今回非公表)の遺伝子ノックアウトマウスにP.bergheiを感染させて抑制因子産生を調べた所、培養上清中に抑制活性がみられず、このサイトカインXが抑制因子である可能性が極めて高くなった。現在最終的につめている段階である。抑制因子産生細胞については、CD4^+T細胞の様々な活性化マーカーで染色、ソーティングにより調べた結果から、CD45RB^+CD44^+のマラリア抗原特異的T細胞が産生することが示唆された。
乳児重症ミオクロニーてんかんにて検出される変異型イオンチャネル遺伝子の機能解析

乳児重症ミオクロニーてんかん(severe myoclonic epilepsy in infancy ; SMEI)は生後4-6ヶ月から熱性けいれんや種々のてんかん発作が出現する難治てんかん症候群のひとつである。我々はこの疾患の原因遺伝子の検索を目的とした遺伝子解析を行った結果、ナトリウムイオンチャネル遺伝子SCN1Aのアミノ酸変異を伴う遺伝子変異を検出した。このSCN1A遺伝子変異はSMEI患者において非常に高い相関が見られることより、これらのSCN1A遺伝子変異がSMEIの発症に重要な役割を担っていると考えられた。そこで、変異型イオンチャネル蛋白の解析を行うことによりこれらの遺伝子変異がイオンチャネルの機能にどのような影響をもたらしているのかを明らかにする目的の為に、変異型および正常型遺伝子のSCN1A cDNAをクローニングし発現ベクターの構築を計画した。容易に蛋白局在が検出でき、蛋白機能に影響を与えず、かつ、膜への移行をさまたげないようなTagとしてLumio Tagを選び、その融合蛋白発現系を作成することにした。これは6アミノ酸からなり、特殊な蛍光物質と結合し強い蛍光を発するようになる領域である。まずこれらを正常型、変異型のC末に取り付けた発現ベクターを作成し、SCN1A遺伝子を発現していないヒト細胞株HEK293に導入した。生きたままの細胞に蛍光試薬を添加し蛍光顕微鏡で観察したところ、バックグラウンドの蛍光が非常に強く、局在を同定するのは困難であった。そこで、細胞固定後、界面活性剤処理を施した後に蛍光試薬を添加したところ、バックグラウンドの改善がみられ、ある種の変異型蛋白は細胞膜に局在することが判明した。この結果は抗SCN1A抗体を用いた免疫染色によっても確認された。このことは、正常蛋白と変異型が共発現している状態でも、変異型がDominant Negative効果により、細胞膜上で正常型の機能を阻害している可能性を示唆している。また、cDNAを回収する過程で、ヒトの脳組織ではSCN1A遺伝子のIsoformが複数存在することを発見した。そこで、そのIsoformの解析を行ったところ、これらはエキソン11に、11アミノ酸および28アミノ酸の欠失を持つタイプであることを明らかにした。この領域はゲートを構成するドメインIとIIの間にある細胞内ループ領域であり、そこは高頻度で変異が見つかっている領域であることより、これらのIsoformもイオンチャネルの機能に影響を及ぼすのではないかと考えられた。このSCN1A遺伝子変異はSME1患者において非常に高い相関が見られることより、これらのSCN1A遺伝子変異がSMEIの発症に重要な役割を担っていると考えられた。

そこで、今年度は変異型イオンチャネル蛋白の解析を行うことによりこれらの遺伝子変異がイオンチャネルの機能にどのような活性変化をもたらしているのかを明らかにする目的の為に、変異型および正常型遺伝子のSCN1A cDNAをクローニングし発現ベクターの構築を行った。遺伝子サイズが大きいので複数の領域に分断・作成し組み立てているが、遺伝子配列の特徴の為に分子内再編成、欠失を生じてしまう傾向にあり変異型の作成が遅れている。チャネル複合体形成に必要なサブユニット遺伝子SCN1B cDNAの発現ベクターは、細胞に確実に発現プラスミドが導入されたことを確認できるように、蛍光蛋白マーカーを持つプラスミドにクローニングを行った。また、cDNAを回収する過程で、ヒトの脳組織ではSCN1A遺伝子のIsoformが複数存在することを発見した。そこで、そのIsoformの解析を行ったところ、これらはエキソン11に、11アミノ酸および28アミノ酸の欠失を持つタイプであることを明らかにした。この領域はゲートを構成するドメインIとIIの間にある細胞内ループ領域であり、そこは高頻度で変異が見つかっている領域であることより、これらのIsoformもイオンチャネルの機能に影響を及ぼすのではないかと考えられる。乳児重症ミオクロニーてんかん(severe myoclonic epilepsy in infancy ; SMEI)は生後4-6ヶ月から熱性けいれんや種々のてんかん発作が出現する難治てんかん症候群のひとつである。我々はこの疾患の原因遺伝子の検索を目的とした遺伝子解析を行った結果、ナトリウムイオンチャネル遺伝子SCN1Aのアミノ酸変異を伴う遺伝子変異を検出した。このSCN1A遺伝子変異はSMEI患者において非常に高い相関が見られることより、これらのSCN1A遺伝子変異がSMEIの発症に重要な役割を担っていると考えられた。そこで、変異型イオンチャネル蛋白の解析を行うことによりこれらの遺伝子変異がイオンチャネルの機能にどのような影響をもたらしているのかを明らかにする目的の為に、変異型および正常型遺伝子のSCN1A cDNAをクローニングし発現ベクターの構築を計画した。容易に蛋白局在が検出でき、蛋白機能に影響を与えず、かつ、膜への移行をさまたげないようなTagとしてLumio Tagを選び、その融合蛋白発現系を作成することにした。これは6アミノ酸からなり、特殊な蛍光物質と結合し強い蛍光を発するようになる領域である。まずこれらを正常型、変異型のC末に取り付けた発現ベクターを作成し、SCN1A遺伝子を発現していないヒト細胞株HEK293に導入した。生きたままの細胞に蛍光試薬を添加し蛍光顕微鏡で観察したところ、バックグラウンドの蛍光が非常に強く、局在を同定するのは困難であった。そこで、細胞固定後、界面活性剤処理を施した後に蛍光試薬を添加したところ、バックグラウンドの改善がみられ、ある種の変異型蛋白は細胞膜に局在することが判明した。この結果は抗SCN1A抗体を用いた免疫染色によっても確認された。