hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラボオートメーションを活用した大腸菌人工進化実験による適応進化ダイナミクスの解析

興味深いことに、同じストレスに耐性となった株には共通の遺伝子に変異が同定されているケースが多く、それらの変異が耐性能の獲得に寄与することが示唆された。また、それらの株についてはマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、耐性能の獲得と遺伝子発現量変化の相関を解析した。結果として、同じストレスに耐性となった株は類似生の高い発現プロファイルの変化を示しており、耐性獲得に寄与すると予想される発現量変化の同定に成功した。これらの表現型と遺伝子型の網羅的情報を統合することにより、様々な環境に対する適応進化がどのようなメカニズムを基盤としているか、新たな理解が可能となると期待できる。ラボオートメーションによる自動培養システムの構築については、機器トラブルも生じたが、現在ではそれらの問題は解決し、データを取得できる状態までのセットアップが完了している。また、エタノール耐性大腸菌株の解析については、高精度の大自由度データの取得に成功しており、今後の解析によって適応進化ダイナミクスの新たな理解が進むと期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の中心的テーマである、ラボオートメーションによる自動進化実験システムに関しては、その構築と安定的な運用に成功しており、様々な研究に対する応用が可能となっている。また、その応用例である複数のストレス環境を用いた大腸菌の進化実験についても、およそ1000時間の培養によって耐性能を持つ大腸菌の獲得に成功し、その解析を進めることが出来ており、高い達成度を持つ研究課題であると言える。24年度は、自動培養システムによって取得した複数のストレス耐性大腸菌株について、次世代シーケンサによるゲノム変異解析とマイクロアレイによる発現解析を行い、その適応進化ダイナミクスについての詳細なデータを取得する。また、今年度に示唆されたゲノム変異に依らない適応進化ダイナミクスについては、ゲノムメチル化などのエピジェネティクスの機構による表現型変化の可能性を実験的に解析することにより、その理解を試みる。今後は、ラボオートメーションによる自動進化実験システムを様々な研究に対して応用していくことを目指す。例えば、医学・薬学の分野では抗生物質の効かない多剤耐性菌の出現が問題となっているが、この進化実験システムによって、どのような表現型・遺伝子型の変化によって抗生物質耐性が獲得・維持されるかについて、詳細な解析が可能となる。また、微生物にとどまらず、ガン細胞などの培養細胞についても進化実験を行うことが可能であり、例えば抗ガン剤に対する耐性獲得メカニズムの理解など、さまざまな細胞腫に対する応用が期待できる。
材料構成則と部材変形解析に基づく建築骨組の損傷制御型構造・耐火調和設計法の開発

建築物が火災時に崩壊・倒壊しないように設計するため,さらには,火災による部材の損傷状態を予測するため,鋼材とコンクリートという構造材料について,高温下での力学性状を調査した。特に,これらの材料間の付着ーすべり関係をモデル化した。さらには,梁と柱部材とそれらの接合部からなる簡単な骨組の耐火実験を行い,部材間の相互作用,接合部の性状を把握し,材料の挙動モデルに基づく数値解析を行い,耐火性能を評価した。また,小さな炉において柱梁骨組を効率的に試験する方法も開発した。最後に,地震や経年劣化によってひび割れた鉄筋コンクリート部材の耐火性を,耐火実験と数値解析により調査した。平成23年度には以下の研究を実施した。1.コンクリートと鉄筋の高温時付着試験および付着-すべり関係のモデル化直径150mm,高さ300mmのコンクリートシリンダー中に打設した鉄筋(φ19mm SD345)の引き抜き試験を実施した。実験パラメータは,温度(室温,100°C,200°C,300°C,400°C,500°Cおよび600°C)である。試験時コンクリート圧縮強度は,23.9MPaであった。試験体を所定の温度までマントルヒータを使用して加熱した後,そのまま温度を維持し,鉄筋を引き抜いた。引き抜き力と抜け出し量の関係から,付着-すべり関係を得,これをfib Codeを参考にして,モデル化した。このような高温下における付着-すべり関係のデータはほとんどなく,鉄筋コンクリート部材および構造の耐火設計を構築する上で,特に変形評価において重要となる。2.ひび割れ幅と部材内部温度分布に注目した鉄筋コンクリート造柱梁骨組の耐火試験鉄筋コンクリート造ト字形柱梁接合部骨組に対して,常時荷重を載荷した状態で,耐火試験を実施した。本実験では,特に,ひび割れ幅と部材内部温度分布について検討した。ト字形試験体を向かい合わせた状態でH形鋼により緊結し,下側柱,梁および柱梁接合部を加熱した。梁端には,ひとつの試験体では下方向に,もうひとつの試験体では上方向に荷重を加えた。上方向に載荷した試験体では,梁断面下側にひび割れが発生し,このひび割れを通して,鉄筋が直接火炎に曝されることになる。一方,下方向に載荷した試験体では,火炎に曝される側でコンクリートが圧縮されており,耐火被覆の役割を果たす。ふたつの試験体の変形挙動と部材内温度分布の違いから,ひび割れ幅とその分布が耐火性能に与える影響についてのデータが得られた。このようなデータは世界的に見ても例がなく,鉄筋コンクリート造構造物の耐火性を考える上で貴重なデータとなる。1.付着構成則のモデル化:コンクリートからの鉄筋引き抜き試験と有限要素解析に基づき,fib Model Codeに記載の常温時付着応力ーすべり関係を高温時まで適用可能なように拡張した。また,コンクリートと鉄筋の高温時におけるヤング係数と強度低下が付着応力ーすべり関係劣化のメカニズム解明につながる基礎資料を得た。2.ひび割れがモルタル内温度分布に与える影響:鉄筋コンクリート部材のひび割れ幅と部材内温度分布との関係を調べるために,50×45×150mmのモルタル直方体中央部に05mm幅のひび割れを,テフロンシートを挟み込むことにより生じさせた。要素内部温度を測定した結果,ひび割れ幅位置での内部温度上昇が確認された。3.ひび割れが鉄筋コンクリート梁の耐火性に与える影響:断面300×400mmで,支点間距離2,700mmの鉄筋コンクリート梁に対して,鉛直荷重を加えることにより150mm間隔でひび割れを生じさせ,そのまま加熱し,梁内の温度分布を調べた。試験体は,無載荷の梁,長期荷重,短期荷重をそれぞれ加えた梁,および,梁変形角1/50まで変形させた後,長期荷重まで除荷した梁である。梁断面隅角部鉄筋位置では,ひび割れがある断面での温度が,ひび割れのない断面での温度を最大で90°C上回った。一方,梁断面中央上下鉄筋位置では,ひび割れのない断面の方が最大で118°C高い温度となった。4.鋼構造不静定骨組の火災時挙動:鋼構造骨組に生じる変位とひずみ,加熱部材の熱膨張を非加熱部材が拘束することによる影響に関するデータを得ることなどを目的として,鋼構造不静定骨組に対して載荷加熱実験を行った。その結果,中段梁の材軸方向の温度分布は,中央部に比べ,高力ボルト継手部では8割程度の温度となり,端部では最高温度で200°C程度低い温度となった。高温下でコンクリートシリンダーからの鉄筋の引き抜き試験を実施し,付着応力ーすべり関係を得た。実験変数は温度であり,常温と,100°C600°Cまで100°C刻みで設定した。常温でのコンクリート圧縮強度試験値は,23.9N/mm2,鉄筋降伏強度試験値は,383N/mm2である。

実験から次のような結果が得られた。最大付着応力は,常温から一旦100°Cで低下するが,200°Cで回復し,以降600°Cまで低下し続けた。これは,コンクリートの熱間圧縮強度の挙動と酷似しており,コンクリートの圧縮強度低下が最大付着応力の低下に大きく影響しているものと考えられる。得られた付着応力ーすべり関係は,fib Model Code 2010の常温時の付着応力ーすべり関係モデルに基づきモデル化された。鋼骨組の載荷加熱実験を実施した。試験体は,高力ボルト梁継手と溶接接合部を有する鋼構造日の字型ラーメンであり,終局耐力については鋼梁を主たる検討対象としている。本耐火実験の目的は,1)鋼骨組における鋼材温度の分布,加熱部材の熱容量および非加熱部材への熱伝導の影響,2)鋼構造骨組に生じる変位とひずみ,加熱部材の熱膨張を非加熱部材が拘束することによる影響,3)骨組内にある鋼梁の限界温度と崩壊モード,単純支持梁との違い,4)高力ボルト摩擦接合継手および溶接接合部の損傷,5)加熱冷却後における骨組の残留応力と変形などである。中段梁の材軸方向の温度分布を見ると、中央部に比べ、高力ボルト継手部は8割程度の温度であったなどの知見が得られた。鋼繊維補強コンクリートを用いたプレテンション梁の載荷実験を行った。これは耐火性が未解明の鋼繊維補強コンクリートとプレテンション梁について,地震により損傷を受けた後の耐火性を調査するため,まず,常温での載荷実験を行い,損傷程度を把握した。平成23年度の計画は,コンクリートと鋼材に対する熱間および冷却後載荷試験を行い,応力-ひずみ関係を得,これをモデル化すること,および,鉄筋とコンクリートとの付着試験とその結果に基づくモデル化,さらには,部材の高温時変形解析法の開発であった。これに対して,炉購入が遅れたため,コンクリートと鋼材に対する試験と応力-ひずみ関係のモデル化を平成24年度に実施することとし,付着試験と付着-すべり関係のモデル化と,平成24年度以降に実施予定であった鉄筋コンクリート造骨組試験体に対する耐火試験を平成23年度に行った。先に骨組に対する耐火試験を行うことにより,ひび割れ幅と部材内部温度分布の関係に関して,平成24年度に実施予定の実験と解析法開発に役立つ資料が得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた研究項目は次の5項目であった:1.ひび割れ幅と部材内部温度上昇の関係を実験的に得ることと,ひび割れ幅の影響を考慮した熱伝導解析法の開発,2.高温下における付着試験を引き続き実施,3.鉄骨梁と鉄筋コンクリート梁部材の耐火試験,4.鉄筋コンクリート柱部材の耐火試験,5.鉄筋コンクリート造および鉄骨造不静定骨組の耐火試験。このうち実施できたのは,高温下における付着試験と鉄骨造不静定骨組の耐火試験であった。付着試験から得られたデータに基づき,高温下での付着応力ーすべり関係をモデル化した。また,当初の計画にはなかったが,鋼繊維補強コンクリートとプレテンション部材が地震により損傷を受けた後の耐火性を調査するため,まず常温での載荷実験を実施した。
入浴前バイタルサインを用いた高齢者の入浴可否判断システムの開発

地域在住健常男性高齢者20名を対象に、安全とされる入浴条件(40°Cの湯に5分間の浸漬)で、入浴による生理作用への影響を明らかにした。すでに獲得していた地域在住健常女性高齢者11名のデータを加え、入浴前のバイタルサインを用いて入浴中の循環変動を予測する重回帰式を高い説明率で得ることができた。各重回帰式を用いて入浴中の変動値を予測し、入浴可否を判断することが可能となった。また、地域在住健常高齢者約200名を対象とした入浴の現状調査から入浴事故との関連を明らかにした。1.在宅健常高齢者の入浴の安全行動モデル作成のために、前年度から実施している調査の対象者数を増やし、220名のデータをもとに入浴事故に関連する要因を検討した。入浴事故の体験者は少なかったが、入浴前の脱衣室の室温調整をすることが入浴事故の循環器症状予防の寄与要因であり、浴室や浴槽などの環境を調整することは、入浴時転倒事故予防の寄与要因であることを明らかにした。2.日常生活における入浴として、ある一定の動作を取り入れた入浴による生理作用への影響を明らかにするために、男性高齢者20名を対象として入浴実験を実施し、測定したデータを分析した。入浴前のSBP,DBPを日本高血圧学会の高血圧ガイドラインに従って高血圧群と正常群の2群に分け、それぞれの影響の違いを分析した結果、DBPのみ高血圧群と正常群で入浴による影響の違いを認めた。高血圧群では正常群に比べて入浴中のDBPの減少が有意に大きいことが判明した。本研究は、高齢者の入浴事故を防ぐために、入浴前に測定するバイタルサインやその他測定可能な指標をを用いて入浴可否判断システムを開発することである。地域在住の健常男性高齢者20名を対象とした入浴実験により、入浴による生理作用への影響を明らかにした。先の実験的研究により得た地域在住健常女性高齢者の入浴による生理作用への影響データと合わせて、入浴中の循環変動を予測するために、入浴による収縮期血圧(Systolic Blood Pressure: SBP)の最高値および最低値、心拍数(Heart rate: HR)最高値、心筋酸素施消費量(SBP*HR:Pressure Rate Product: PRP)最高値を基準値とし、入浴前の指標である安静時SBP,HR,PRPおよび年齢、BMIと活動量である10m歩行に要する時間を説明変数として重回帰分析(強制投入法)を行った。その結果、すべての基準変数において6170%の説明率で重回帰式を得ることができた。環境の整った条件で安全と言われる入浴法(40°Cの湯に5分間胸下浴)においては、男女高齢者の入浴前の10m歩行時間(秒)、BMI、年齢、および循環測定値を用いて入浴可否を判断することが可能となった。今年度の活動は、実験で得られたデータとすでに得ていた女性高齢者のデータを整理、分析して入浴可否判断システムを開発した。研究成果を広く社会に広報するために学会発表や論文投稿をおこなった。1.在宅で生活する高齢者の入浴の現状を明らかにし、高齢者自らが安全な入浴行動を行えるような「在宅高齢者の入浴のための安全行動モデル」を作成することを目的に調査を実施した。研究者らが作成した調査表は、被験者背景に加え、(1)個体要因として身体的要因と心理的要因を、(2)入浴行動、(3)環境要因で構成した。調査対象者の活動性や入浴事故体験に偏りがあり、分析方法を変更して検討した結果、入浴事故体験の項目別にその頻度と入浴行動(危険行動得点)や入浴に対する思い(楽しむ得点と不安得点)に相関を認めた。入浴事故体験の頻度が多いほど入浴に対する不安得点が高く、入浴事故頻度が低いほど入浴の危険行動得点が高いことが明らかとなった。また、危険行動得点と入浴を楽しむ得点にも相関があり、危険行動得点の高い人ほど入浴を楽しむ得点が高い結果が明らかとなった。これらの結果から、活動的な高齢者は入浴事故体験が少なく、入浴の快適性を求めて、高温で長時間の入浴を好む傾向にあり、健康な高齢者にこそ、入浴事故に遭遇する前に安全で正しい入浴方法を知らせる必要があることが示唆された。今回の調査結果からは、被験者の活動性や事故体験に偏りがあり、当初予定していた分析ができなかったため、「在宅高齢者の入浴のための安全行動モデル」の開発には至らなかった。今後さらに被験者を拡大して調査を継続し、モデルの開発をする予定である。このモデルを開発することで、高齢者自らが安全な入浴行動を行い、入浴による事故を未然に防ぐことが可能となる。2.男性高齢者の入浴による生理作用への影響を明らかにするために入浴実験を計画していたが、実験環境や被験者の選定に時間を要し、今年度は実験の実施までには至らなかった。

次年度は実験を行い、入浴前バイタルサインを用いた入浴可否判断システムを作成することで高齢者自らが安全な入浴行動の判断が可能となる。在宅健常高齢者の入浴の現状を調査により明らかにすることができた。また、男性高齢者の入浴による生理作用への影響を実験的研究により明らかにすることができた。今後は、これらのデータをもとに統計的に分析を行い、1高齢者自らが行える入浴の安全行動モデルを開発する。2すでに研究者らが実験により得ている女性高齢者の入浴による生理作用への影響と、今回の実験で得た男性高齢者の入浴による生理作用への影響のデータを用いて高齢者の入浴前バイタルサインを用いた入浴可否判断システムを開発する。研究者が新たに所属した研究機関には、在宅高齢者を対象に入浴実験を行う環境が整っていなかった。入浴実験では被験者のプライバシーの確保や安全性が重要課題である。それらを踏まえ、安全な入浴実験環境を整えることに時間を費やした。また、被験者の選定にも時間要した。プライバシーにかかわる入浴実験への協力は、被験者との間に人間関係の構築がなくては成り立たない。研究者らが地域活動に参加しながら実験対象に該当される方々と関係性を構築していった。こうしてようやく実験への協力を依頼し、内諾を得ることができた。次年度は、内諾を得た高齢者に正式に協力依頼をする予定である。高齢者の入浴の現状調査では、研究者と調査対象者の日程調整が困難であったこと、および被験者に偏りがあり、十分なデータを得ることができなかった。被験者を拡大して調査を継続する予定である。1.高齢者自らが行える入浴の安全行動モデルを作成し、研究者らの関係する学会で成果を発表し助言を得る。そのうえで、広く高齢者にも広報する。2.入浴前バイタルサインを用いた高齢者の入浴可否判断システムを開発し、上記同様、研究者らの関連学会で発表し助言を得るとともに、臨床でシステムの利用可能性を検証する。1.「在宅高齢者の入浴のための安全行動モデル」を作成するために、在宅高齢者を対象とした調査を目標数まで継続する。さらに、現在までの調査対象者は活動性が高く、入浴事故体験の少ない高齢者であり、「在宅高齢者の入浴のための安全行動モデル」を作成するためには被験者を拡大してデータを収集する必要がある。調査対象者を活動量の違いのある対象者に拡大して調査を追加する予定である。それにより、「在宅高齢者の入浴のための安全行動モデル」を開発する。2.男性高齢者の入浴による生理作用への影響については、実験環境もほぼ整い、不足する測定機器や消耗品の購入、被験者への研究依頼、共同研究者及び実験協力者との日程調整を行い、入浴実験を実施する。得られたデータをもとに、生理作用への影響を分析することはもとより、すでに研究者が得ている女性高齢者の入浴による生理作用への影響のデータを合わせて、入浴中の循環変動を予測する。その結果を用いて、「入浴前バイタルサインを用いた入浴可否判断システム」を開発する。開発したシステムを臨床で活用することで、システムの利用可能性を検証する。以上の結果をパンフレットにして、地域在住の高齢者や高齢者の看護・介護に携わる職員に普及するために配布する予定である。、1.高齢者の入浴安全行動モデルを開発したあと、高齢者への広報としてパンフレット作成費用が発生する。2.入浴前バイタルサインを用いた高齢者の入浴可否判断システムを開発後、臨床で試用してその利用可能性を検証したい。
モノクローナル抗体を反応場として用いた天然抗がん剤の新規合成法の開発

1.モノクローナル抗体を反応場とする抗腫瘍剤vinblastine(VLB)の立体並びに位置選択的合成抗VLBモノクローナル抗体IgG1(Mab-10-A9)をBalb/cヌードマウス腹腔内で培養して、大量のMAb-10-A9を得た。一方、GIT+10%FBS+1%P.S.培地を用いて、細胞培養器にて目的の抗体を大量に生産することにも成功した。前年度に、二量体性アルカロイドanhydroVLBを出発物質として、前記抗体の存在下、酸素及びNaBH_3CNと反応させ、最高82.2%の変換率で立体選択的並びに位置選択的にVLBを合成することに成功した。しかし、この条件は、反応の再現性、スケールアップ、に問題があった。そこで、不安定な反応中間体dihydropyridinium中間体を、vindolineとcatharanthineから、既報の光反応によって合成し、これを出発化合物として、抗体反応を行った。その結果、還元剤として、NADH、Na_2S_2O_4を用いることによって高収率でVLBを得ることができた。この結果の一部は、特許に実施例追加として記載した。2.抗taxolモノクローナル抗体を反応場とする抗腫瘍剤taxolの合成2-succinyltaxol-TGを抗原としてDDYマウスに免疫させ、抗体価の高い抗taxolモノクローナル抗体産生細胞株MAT-01-G12を1種類得た。しかし、残念ながら、液体窒素による凍結保存、培養、継代の操作中に抗体価が著しく低下してしまった。その原因を目下調査中であるが、ハイブリドーマのクローニングが未完了であったか、凍結保存、継代中に細胞が変異した可能性などが考えられる。今後、2-succinyltaxol-TGの他、新規構造の抗原を合成し、新たに抗taxolモノクローナル抗体を作製する予定である。1.モノクローナル抗体を反応場とする抗腫瘍剤vinblastine(VLB)の立体並びに位置選択的合成deacetylvinblastine(deacetylVLB)-thyroglobulin(TG)複合体を抗原としてBalb/cマウスに免疫させ、脾臓細胞とミエローマ細胞SP2/0-Ag14とを融合させた。次いで、クローニングすることにより、抗vinblastineモノクローナル抗体産生細胞株を3種得ることに成功した。そのうち、抗体価の最も高かったモノクローナル抗体IgG1(MAb-10-A9)を用いてVLB合成を実施することにした。即ち、MAb-10-A9産生細胞株をBalb/cヌードマウス腹腔内で培養して、大量のMAb-10-A9を得た。ついで、単量体性アルカロイドvindolineとcatharanthineとから容易に誘導される二量体性アルカロイドanhydrovinblastine(anhydroVLB)を出発物質として、前記抗体の存在下、酸素及びNaBH_3CNと反応させたところ、82.2%の変換率で立体選択的並びに位置選択的にVLBが得られた。VLBのC-4'水酸基立体異性体であるleurosidineは全く生成しなかった。この度の結果は、VLBのような複雑な構造をもつ化合物をモノクローナル抗体を用いて合成に成功した初めての例であり、平成16年2月に特許出願した。目下、学術雑誌に投稿準備中である。2.モノクローナル抗体を反応場とする抗腫瘍剤taxolの合成2'-succinyltaxol-TGを抗原としてDDYマウスに免疫させ、血清に抗体価の上昇を認めた。そこで、脾臓細胞とミエローマ細胞SP2/0-Ag14とを融合させた。目下のところ、比較的抗体価の高い抗taxolモノクローナル抗体産生細胞株を1種類得ている。本細胞株をBalb/cヌードマウス腹腔内で培養して、大量のMAT-01-G12を得た。本抗体を用いて、アルコールユニット(BaccatinIII)とエステルユニット(13位側鎖)とを、エステル交換反応によりtaxolへ誘導することを企図している。そのための各ユニットの合成は既に終了し、合成の準備は整った。2.抗taxolモノクローナル抗体を反応場とする抗腫瘍剤taxolの合成2-succinyltaxol-TGを抗原としてDDYマウスに免疫させ、抗体価の高い抗taxolモノクローナル抗体

産生細胞株MAT-01-G12を1種類得た。しかし、残念ながら、液体窒素による凍結保存、培養、継代の操作中に抗体価が著しく低下してしまった。その原因を目下調査中であるが、ハイブリドーマのクローニングが未完了であったか、凍結保存、継代中に細胞が変異した可能性などが考えられる。今後、2-succinyltaxol-TGの他、新規構造の抗原を合成し、新たに抗taxolモノクローナル抗体を作製する予定である。
開胸術後に肺傷害をもたらす胸腔内炎症の発生機序の解析と制御に関する研究

本研究は、開胸術後の肺傷害発生機序における局所炎症の意義の解明と制御を目的としたものである。肺癌や気胸などの呼吸器疾患にて開胸術を受けた症例を対象とし、開胸術後の局所炎症の解析と定量化を試みた。開胸肺切除術後に留置された胸腔ドレーンから経時的に胸水を採取し、その量と白血球、好中球数を測定した。また経時的に末梢血液を採取し、白血球、好中球数を測定した。さらに、肺全摘術、肺葉切除術、肺部分切除術の3群に分け、術式間の差について検討した。開胸術後の胸水の量、好中球数とも手術24時間後をピークに増大し、その後漸減した。好中球分画は、成熟細胞が90%以上あり、その量は同時期の末梢血液に比し高値であった。また両者とも、肺部分切除術で最も高値を示し、次いで、肺葉切除術、肺全摘術の順であった。以上から、開胸術後の胸腔内では、何らかの好中球遊走化因子が発生し、末梢血液から好中球が動員、胸腔内へ遊走されるものと推定された。その量が残存臓側胸膜の多寡に依存していたことから、好中球遊走化因子の発生母体としては、開胸術時の胸腔内操作により炎症が惹起される臓側胸膜が考えられた。好中球遊走化因子のひとつであるG-CSFは、胸水中の好中球数と密接に関連して推移し、また、臓側胸膜、壁側胸膜から産生され得ることが確認された。好中球は種々のElastaseやフリーラジカルを発生し、組織傷害をもたらすことから、開胸術後の肺傷害発生機序において、胸腔内操作による臓側胸膜の局所炎症と、産生されるG-CSFが重要な意義を有していると考えられた。本年度は、主としてヒトを対象とし、開胸術後の局所炎症の解析と定量化を試みた。以上から、開胸術後の胸腔内では、何らかの好中球遊走化因子が産生され、末梢血液から好中球が動員、胸腔内へ遊走されるものと推定された。その量が残存臓側胸膜の多寡に依存していたことから、好中球遊走化因子の産生母体としては、開胸術後の胸腔内操作により炎症が惹起される臓側胸膜が考えられた。好中球は種々のElastaseやフリーラジカルを発生し、組織傷害をもたらすことから、開胸術後の肺傷害発生機序において、胸腔内操作による臓側胸膜の局所炎症が重要な意義を有していると考えられた。今後、産生される好中球遊走化因子の同定、肺傷害発生への経過、機序について解明する予定である。好中球は種々のElastaseやフリーラジカルを発生し、組織傷害をもたらすことから、開胸術後の肺傷害発生機序において、胸腔内操作による臓側胸膜の局所炎症と、産生されるG-
水素誘起接合法によるパワー半導体モジュール部材間の接合

金属の水素チャージ(吸蔵)とディスチャージ(放出)による表面活性化を利用して、パワーエレクトロニクス関連部材間を高真空雰囲気を用いずに拡散接合し、接合界面に耐熱性をもたせることを目的に検討を進めた。その結果、金属部材への水素チャージにより、該部材間が夫々に密着した接合界面を形成し、高強度かつ柔軟性に優れる力学的特性を示すことを見出した。金属の熱分析等の結果から、水素チャージに伴う酸化被膜の除去と格子歪導入に基づく元素拡散促進、ディスチャージによる還元雰囲気の導入と塑性変形性の付与が本質的効果であり、セラミックスー金属間接合の課題である残留応力緩和機構として有望であろうと議論した。パワー半導体構造に基き、サブミクロンスケール以下の傾斜接合層の実現を想定してSiCウェハーAl金属ーAlNセラミックス間の接合実験を行って接合性を評価するとともに、該接合体の耐熱性をその場で評価する為に、使用熱環境下における電気インピーダンスによる接合体評価の準備を進めた。並行して、パワー半導体モジュールの耐熱性確保の基本となる金属ーAlNセラミックス間の接合試験を行い、接合機構に関する知見を得ることを目的とした物性評価も進めたところ、以下に示す成果を得た。結果の一部は学会報告した。接合性と接続性においてAl金属の水素チャージの有効性を確認した。具体的には、接合材としたAl金属の水素チャージにより、サブミクロンスケールでジグザグに組付く形の接合界面微構造を得た。当初想定した傾斜接合層とは異なるが、該微構造に隙間やクラック等はなく、熱伝導に好適と思われる。並行して調査したAl金属の熱特性は、前年度水素吸蔵性に優れるTiについて行った特性評価から想起した「水素チャージの有無による接合性の違いは、水素チャージ(吸蔵)と接合条件下でのディスチャージ(放出)に伴うものと思われる、接合材表面の分子吸着性と極表面(ナノスケール)の塑性変形性の違いに起因する元素相互拡散状況変化に依る」という考えを裏付けた。具体的には、吸着水分子による金属表面酸化層の形成を抑制するとともに、再結晶に伴う塑性変形性に影響を与えるものと考察した。SiCーAl金属ーAlNセラミックス接合体を作製し、大気中、300°Cまでの熱環境下で電気インピーダンスを測定する準備を整えた。予備的に行った結果から、水素チャージしたAl金属を用いて作製した接合体の同特性が、水素チャージしていない金属部材を用いて作製したそれと比較して、同熱環境下において極めて安定であることを見出している。パワー半導体モジュールの基本となる1SiCウェハー金属電極間と2金属電極ーAlNセラミックス間の接合基礎実験を行うとともに、水素吸蔵性に優れるTiを接合材として採用し、接合機構に関する知見を得ることを目的として実験を進め、以下に示す成果を得た。(1)接合性と接続性において水素チャージの有効性を確認した。すなわち、接合材の水素チャージ条件と接合条件(温度、圧力)を変化して接合体を作製し、接続性や接合性について評価したところ、接合材の水素チャージにより、より低温での異種部材間の接合が可能となり、適当なチャージ条件で水素予添加した金属部材を用いて作製した接合体が、水素チャージ無しの場合と比較して接続性に優れることを見出した。(2)主には接合材としてTiを用いた実験により、異種部材間接合における水素効果に関する知見を得た。具体的には、金属・合金間の接合界面の微構造の比較と非接触評価及びせん断強度試験、更には破面の表面状態評価と主にはTi部材の昇温ガス脱離(TDS)分析の比較から、水素チャージの有無による接合性の違いは、水素チャージ(吸蔵)と接合条件下でのディスチャージ(放出)に伴うものと思われる、接合材表面の分子吸着性と極表面(ナノスケール)の塑性変形性の違いに起因する元素相互拡散状況変化に依るものと考察した。また、陰極電解の為の適当な通電量の選択が、線膨張係数の異なる両部材間に必然的に発生する熱応力を緩和する接合層形成の為の表面処理として有望であろうことを示唆した。実験的検討を中心に進めた結果を以下にまとめる。1.前年度までに選定した接合材金属と水素チャージ条件を用いて、パワー半導体モジュール構造の基本となる接合体を各接合条件下で複数個作成し、大気中、300°Cで耐熱試験を行った。電気インピーダンス法によるその場測定を行ったところ、同条件下で接合材の水素チャージの有無による明確な差異は認められなかった。並行して行ったAl金属ーAlNセラミックス接合体の作製条件の内、元素拡散性に大きく影響を与える接合時間を変化したところ、サブミクロンスケールでジグザグに組み付く形の接合界面微構造の形成程度との連関を見出した。2.接合時間を変化して作製したAl金属ーAlNセラミックス接合体の微構造観察と水素チャージした金属の熱分析の見直し等により、昇温時の還元雰囲気の導入が金属部材表面の吸着水の低減によるものであり、一定水準で表面研磨したセラミックス部材に対しては、設定した金属部材の再結晶点を上回る接合温度において、水素チャージ無の場合でも接合性に影響を与えるであろうことを確認した。すなわち、水素チャージの効果は比較的低温において発現されるであろうと考察した。接合時間が長じれば、接合界面に残留した金属酸化物と拡散に伴う金属間化合物の形成により、硬くて脆い接合層を形成するものと議論した。また、生産性の観点から通電過熱を試みたが、通電の為の治具設定だけでなく、その条件選定に再検討の必要があると考えている。

3.耐熱性を担保するパワー半導体モジュール基本構造の非真空雰囲気環境における作製方法・条件と、その根拠の提示を目標として研究を取りまとめる予定であったが、特に、SiCー金属ーAlNセラミックス接合体の接合界面微構造観察の為の試料研磨条件の策定に苦慮したことから、研究期間の延長を申請し、許可を得た。パワー半導体モジュール基本構造の非真空雰囲気環境における作製方法とその根拠の提示を目標とし、強度特性に課題をもつ良熱伝導性セラミックスー金属間の接合に集中して進めた結果を以下にまとめる。1.焼結プロセスと表面仕上げ程度の異なるAlNセラミックスを用いて接合試験を行ったところ、Al金属の水素チャージとそのディスチャージにより、金属表面の酸化被膜成長と残留応力によるものと思われる接合界面のクラックや隙間を回避できること、強度特性に優れるセラミックス部材を用いた場合には、セラミックスの粒界破壊を生じることなく接合可能であり、柔軟かつ強度に優れる傾向にあることを確認した。これらから、パワー半導体放熱基板ー金属電極間の非真空雰囲気における接合において、金属の水素チャージが有効な表面処理方法であることを示せたものと考える。今後、水素チャージ条件を最適化する方向で実験的検討を進めていく予定である。2.水素チャージ処理の有無に伴う異種部材間の接合界面微構造と電気インピーダンスを比較したところ、両者に対応する明確な差異を見出した。すなわちサブミクロンレベルの隙間や亀裂が接合体の電気的特性として検出でき、熱環境下でその場測定しうることを確認した。また、SiCーAl金属電極ーAlNセラミックス放熱基板間の接合体の界面微構造を比較したところ、金属の水素チャージの有無に寄らず隙間等なく密着して接合するが、水素チャージ処理はより傾斜的な接合界面を形成することを見出した。3.金属の水素チャージ条件とした通電電流密度の増加に合わせて金属表面からの水素放出温度が低温化し、その量も増加の傾向にあることを検出した。このことは、前年度、接合に対する水素効果のモデルとして議論した接合環境における還元雰囲気の現出だけでなく、水素導入に伴う金属表面の塑性変形性の付与の双方を妥当な要因として裏付けるものである。金属の水素チャージ(吸蔵)とディスチャージ(放出)による表面活性化を利用して、パワーエレクトロニクス関連部材間を高真空雰囲気を用いずに拡散接合し、接合界面に耐熱性をもたせることを目的に検討を進めた。その結果、金属部材への水素チャージにより、該部材間が夫々に密着した接合界面を形成し、高強度かつ柔軟性に優れる力学的特性を示すことを見出した。金属の熱分析等の結果から、水素チャージに伴う酸化被膜の除去と格子歪導入に基づく元素拡散促進、ディスチャージによる還元雰囲気の導入と塑性変形性の付与が本質的効果であり、セラミックスー金属間接合の課題である残留応力緩和機構として有望であろうと議論した。電極として軟金属Alを選定し、パワー半導体モジュール構成の基本となるSiCウェハー金属電極ーAlNセラミックス接合体を各条件において複数個作製した。接合界面の微構造観察の準備を進めるとともに、電気インピーダンス法による接合界面のその場測定を行った。
子宮体癌・卵巣癌においてアポトーシスを誘導する新規分子標的治療法の探索

我々は子宮体癌と卵巣癌(特に明細胞腺癌)において、分子生物学的なサブグループおよび治療標的候補分子を同定し、新規分子標的治療薬の有効性について新たな知見を得た。1.子宮体癌、PI3K経路を阻害する薬剤の抗腫瘍効果を増強する治療法を探索し、MAPK経路阻害剤もしくは放射線照射との併用で、相乗的な効果が得られることを示した。PI3K/mTOR経路において、HIF-1α/VEGFの活性化が腫瘍増殖に重要であることを見出した。2.卵巣明細胞癌において、ゲノム解析により予後不良なサブグループを明らかとした。MDM2高発現が予後不要因子であり、MDM2を阻害する治療薬が抗腫瘍効果を示すことを報告した。【目的】近年、細胞内のタンパク質を分解するための機序の一つであるオートファジー(自食作用)と癌の関係性が注目されているが、子宮体癌において、オートファジーの役割については、十分な知見が得られていない。そこで、オートファジー阻害剤の子宮体癌における抗腫瘍効果、アポトーシス誘導作用を解明することを研究の目的とした。【方法】子宮体部細胞株6種類を用いて、オートファジー阻害剤(抗マラリア薬として実地臨床使用歴あり)クロロキンを添加し、MTTアッセイ法、Flow cytometry法にて細胞増殖抑制能を評価した。また、Annexin V法にてアポトーシス誘導能を検討した。さらに、Ishikawa株を用いてシスプラチン耐性株(CP-r)を樹立し、クロロキンの効果を親株と比較した。【成績】子宮体癌細胞株6種類にクロロキンを添加した。クロロキン添加により、LC3蛋白の蓄積やオートファゴソームの形成が認められており、オートファジーが実際に阻害されていること確認した。MTTアッセイを施行したところ、全6株において、クロロキンは濃度依存性に子宮体癌細胞の増殖抑制効果を示した。Flow cytometryによる細胞周期の解析では、いずれの細胞株でもSub-G1の比率が濃度依存性に上昇しており、Annexin V法にて、アポトーシスを誘導することが示された。さらに、MTTアッセイにてシスプラチン耐性株CP-rでは、クロロキンの感受性が高まり、シスプラチンとクロロキンの併用により、シスプラチンの感受性が高まることが示された。【結論】クロロキンはオートファジー阻害剤として、子宮体癌の増殖抑制、アポトーシス誘導作用を有しており、有望な新規分子標的治療法として期待される。さらに、オートファジーはシスプラチン耐性とも関連しており、シスプラチン耐性を示す子宮体癌細胞において、薬剤耐性を克服する手段としても有効である可能性がある。【目的】子宮体癌の局所的な治療において放射線照射が広く行われているが、放射線のみでは感受性が低いことが課題となっている。そこで子宮体癌細胞において、放射線照射によって活性化されるシグナル伝達経路を検討し、放射線感受性を増強する新規治療法を見出すことを研究目的とした。【方法】子宮体部細胞株8種類を用いて、放射線照射(2Gy10Gy )を行い、MAPK経路、PI3K/mTOR経路の活性をImmunoblotting法にて解析した。Clonogenic assayを用い、TP53変異と放射線感受性の相関を調べるとともに、照射後に活性化される経路の阻害が放射線感受性を増強するかを検討した。また、siRNAを用いて標的分子のノックダウンにより感受性増強に関わる因子を調べた。【成績】子宮体癌細胞株8種類に放射線照射を行ったところ、TP53変異陽性5株では、変異陰性3株に比べ、感受性が有意に低かった(p<0.05)。また、TP53変異によらず、MAPK経路(ERKのリン酸化)、PI3K/mTOR経路(AKTのリン酸化)が活性化されていた。併用実験では、MAPK経路阻害剤は有意な放射線増強作用を示さなかったが、PI3K/mTOR同時阻害剤BEZ235添加時には放射線感受性が増強し、細胞死が有意に多く誘導された。さらに、mTORの下流分子であるHIF-1αが放射線照射後に発現上昇し、siRNAにてノックダウンした場合にも、放射線照射による細胞死の割合が有意に上昇した。【結論】TP53変異は子宮体癌細胞における放射線抵抗性を促す因子であることが示された。放射線照射により活性化される経路の一つであるPI3K/mTOR経路の阻害、さらにはその下流のHIF-1αの阻害が放射線感受性を高める可能性があり、今後の臨床への応用が期待される。【目的】卵巣明細胞癌では化学療法低感受性で予後不良であり、新たな治療薬の開発が喫緊の課題である。卵巣明細胞癌はTP53変異率が低いことより、TP53を分解するユビキチンリガーゼであるMDM2に着目し、MDM2阻害剤の抗腫瘍効果を明らかにすることを研究目的とした。【方法】75例の卵巣明細胞癌(臨床検体)について、発現アレイにより、MDM2の発現レベルと予後との相関を検討した。卵巣明細胞癌細胞株7種類を用いて、MDM2阻害剤を添加し、細胞周期、細胞死誘導の有無を含めた抗腫瘍効果について、in vitroおよびin vivoで解析した。【成績】卵巣明細胞癌において、MDM2発現は正常組織や卵巣漿液性癌に比べて、有意に高く、さらにMDM"高発現例は卵巣明細胞癌において予後不良因子であることが示された。多変量解析の結果、MDM2高発現は年齢や臨床進行期とは独立した予後不良因子であった。

卵巣明細胞癌細胞株7種類にMDM2阻害剤RG-7112を添加したところ、TP53変異陽性3株は抵抗性であったが、変異陰性4株ではすべて高感受性を示した(p<0.001)。TP53変異陰性株ではMDM2阻害剤によりTP53経路が活性化し、アポトーシスや細胞周期に関わる標的遺伝子の発現が誘導された。MDM2阻害剤は、細胞周期Sub-G1期の誘導、アポトーシス誘導効果を示した。siRNAでMDM2をノックダウンした際にも、抗腫瘍効果が確認された。ヌードマウスを用いたin vivo実験により、MDM2阻害剤は細胞死誘導に加えて、血管新生も抑制し、コントロール群よりも有意に腫瘍増殖を抑制することが示された。【結論】卵巣明細胞癌ではMDM2発現上昇がTP53機能抑制に寄与している可能性が示された。MDM2阻害剤はTP53機能の活性化を通して抗腫瘍効果を発揮することより、卵巣明細胞癌での新規治療法として期待される。我々は子宮体癌と卵巣癌(特に明細胞腺癌)において、分子生物学的なサブグループおよび治療標的候補分子を同定し、新規分子標的治療薬の有効性について新たな知見を得た。1.子宮体癌、PI3K経路を阻害する薬剤の抗腫瘍効果を増強する治療法を探索し、MAPK経路阻害剤もしくは放射線照射との併用で、相乗的な効果が得られることを示した。PI3K/mTOR経路において、HIF-1α/VEGFの活性化が腫瘍増殖に重要であることを見出した。2.卵巣明細胞癌において、ゲノム解析により予後不良なサブグループを明らかとした。MDM2高発現が予後不要因子であり、MDM2を阻害する治療薬が抗腫瘍効果を示すことを報告した。順調に研究を遂行できており、研究の成果を英語論文としてすでに投稿を行った。査読において改訂を求められたが、追加実験を行ったうえで再投稿まですでに済ませており、初年度としては、当初の計画以上に研究成果が得られているといえる。また、子宮体癌における放射線照射の感受性規定因子に関する研究でも成果が得られ、すでに論文投稿を行った。卵巣がんを用いた他のプロジェクトも現在進行中である。H26年度のAmerican Association for Cancer Research (AACR)AnnualMeetingをはじめ、国内外の学会発表の場でも研究成果を報告している。以上の通り、本研究プロジェクトは非常に順調であり、当初の計画以上の進展があったといえる。平成27年度は、子宮体癌において放射線感受性を増強するための標的分子として、PI3K/mTOR/HIF-1α経路を同定した。H28年度以降においても、これまでの成果をもとに子宮体癌・卵巣癌におけるアポトーシスを誘導する新規分子標的治療法の探索研究を遂行していく予定である。今後については、以下の2つのプロジェクトを中心に研究をさらに推進していく予定である。一つは、子宮体癌において細胞生存(抗アポトーシス)に関わる分子を明らかとし、既存薬を活用することで、アポトーシス誘導効果を示す新規治療法を見出していくことである。
植物免疫におけるRNAサイレンシング機構のプライミング

ウイルス抵抗性に重要な役割を持つことが報告されているRNAサイレンシング関連因子AGO2の遺伝子発現はBTH処理によってプライミングされ、刺激に対して通常の状態よりも強く早く応答する。この遺伝子発現の制御にはヒストン修飾などのエピジェネティックな制御が関与していると考えられ、実際に転写開始点近傍のヒストンH3タンパク質の第4リジンのトリメチル化(H3K4me3)のレベルがBTH処理によって増加することが明らかになっている。本年度、さらに上流域のプロモーターのH3K4me3レベルの変化をChIP解析によって調べたところ、転写開始点から2kb上流にH3K4me3レベルが大きく上昇する領域が存在することが明らかになった。この領域にはWRKY転写因子が結合する保存配列であるW-boxが複数存在していたことから、この領域がAGO2の発現制御に重要な役割を持つと考え、この領域に結合する転写因子を酵母One-hybrid(Y1H)スクリーニングによって探索した。その結果、DNA結合モチーフをもつ候補因子としてWRKY25(部分配列)、AtHMGB9、AtPDCD5(部分配列)などが得られた。Beit配列への結合特異性をY1Hによって確認したところWRKY25とAtHMGB9が特異的結合であることが示唆された。しかしながら、WRKY25については全長配列を発現させた酵母は得られず、酵母の生育に悪影響を及ぼしている可能性が推測されたため、他の方法による確認が必要である。さらに、wrky25変異体ではAGO2のプライミングが増強されていたことから、WRKY25はAGO2のプライミングを負に制御している可能性が考えられた。我々はこれまでに、RNAサイレンシング関連因子であるAGO2及びAGO3の遺伝子発現がプライミング誘導剤BTH処理によってプライミングされること、すなわち通常の状態に比べ、刺激に対して強く早く発現誘導される状態になっていることを明らかにした。一方で、AGO2およびAGO3はAGO1を介してmiRNAによる発現制御を受けること知られているため、AGO2及びAGO3のプライミングに対するmiRNAの関与を検討した。まず、AGO2およびAGO3をターゲットとするmiRNAであるmiR403とAGO1をターゲットとするmiR168の蓄積量をノーザンブロット法によって解析した結果、BTH処理によるプライミング誘導時に両miRNAの蓄積量が増加すること、さらにmiR168についてはプライミング誘導後のストレス処理によって、さらに増加することが明らかになった。このことから、プライミング状態の形成にmiRNAが関与する可能性が考えられた。一方で、miRNA生合成が異常なhyl1-2変異体では、ウイルス抵抗性が亢進し、さらにAGO2およびAGO3の発現が恒常的にプライミング状態になることが明らかになった。このことからhyl1-2おけるmiRNAの産生異常がAGO2などのプライミングを促進し、その結果ウイルス抵抗性が亢進される可能性が考えられた。また、プライミング誘導時のAGO2プロモーターの構造変化がプライミングに影響する可能性については、ヒストンH3タンパク質の第4リジンのトリメチル化(H3K4me3;遺伝子活性化の指標)が増加することが明らかになっていたが、さらに詳細に解析するため、FAIRE法によるクロマチン密度の解析を行ったところ、AGO2の転写開始点付近は常時クロマチン密度が低く、転写可能な状態と判断された。現在、このようなクロマチン構造が転写因子等のアクセッシビリティーにどのように影響するか検証している。プライミング誘導時にmiRNAの変動が認められたこと、およびhyl1-2変異体におけるプライミング異常とウイルス抵抗性の変化が確認されたことから、RNAサイレンシング機構のプライミングにはなんらかの形でmiRNAによる遺伝子発現制御機構が関連していることが把握できた。さらに、AGO2プロモーターのクロマチン構造の解析についてもFAIRE法やChIP法による解析が進行中であり、おおむね順調に進んでいると判断している。今後解析に用いる、ヒストン修飾関連の変異体やmiRNA制御系の変異体についてもそれぞれ多重変異体を作出するため交配を行い、ある程度準備が完了している。昨年度までに、BTH処理によるプライミング誘導時にmiRNA(miR403およびmiR168)が蓄積することや、miRNA産生変異体であるhyl1-2においてAGO2が恒常的なプライミングすることやCMV抵抗性が亢進することを示し、miRNAがAGO2のプライミングに関与していることを示唆した。本年度はさらに、miRNA産生変異体hst15とmiRNAを取り込みRNAの分解に関わるAGO1の変異体ago1-45をもちいて解析を行った。その結果、hyl1-2と類似の結果が得られたことから、miRNAのプライミングへの関与がさらに強く支持された。そこで、miR403のターゲット配列を欠失したAGO2ゲノム配列を(プロモーター約2kbとターミネーター約500bpを含む)をago2-1変異体に形質転換し、AGO2のプライミングについて解析を行った。その結果、AGO2のBasalな発現が野生型や、コントロールとして野生型のAGO2ゲノム配列を形質転換した系統と比較して上昇するが、BTH処理によるプライミングを示す発現パターンは維持された。従って、miR403はAGO2のBasal levelの制御に機能していることが示唆された。

一方、AGO2プロモーターへのRNAポリメラーゼのaccessibilityの解析ではプロモーター領域のRNAPII(CTD-Ser5P)量がBTH処理によって減少することが示唆され、プロモーター領域のクロマチン密度やヒストン修飾の変化がRNAPIIの結合に影響している可能性が考えられた。ヒストン修飾関連の変異体についてもヒストン脱メチル化酵素(LDL1, LDL2, LDL3)の変異体を入手し、CMV抵抗性の解析を行ったが野生株と変化が認められなかったため、交配により、多重変異体の作成を行った。現在までにmiRNAがAGO2のプライミングやCMV抵抗性に関与することが示唆された。また、AGO2のmiRNAターゲットサイトを欠失させた遺伝子導入形質転換体を作出したことで、miRNAのAGO2発現制御について直接的に解析ができるようになった。一方、プロモーター領域のクロマチン構造の解析では、具体的に転写機構がプライミング時にどのように制御されているのかを示唆する結果が得られてきている。ヒストン修飾関連の変異体についてもメチル化酵素ATX遺伝子5個の多重変異体を作成中で、現在までに4重変異体を得ている。脱メチル化変異体はldl1, ldl2, ldl3の3重変異体を作成済みであり、解析を始めているところである。プライミング時のmiRNAの動態を把握するため、miRNA-seqを計画していたが、現在までに行えていない点で遅れが生じている。しかしながら、研究室にMiSeqが導入されたことで、行う環境が整い、次年度には行う予定である。これまでに、miRNAがAGO2のBasalな発現制御を介してプライミング制御に係わる可能性を示した。このことからプライミング誘導時のmiRNAの変動をmiRNA-seqによって明らかにすることを試みた。シロイヌナズナにBTHをスプレー処理し、3日後にストレス処理としてロゼット葉の細胞間隙に水を浸透させ、3時間後にサンプリングした。コントロールとしてはBTH非処理区と水ストレス非処理区を設けた。それぞれの処理区のサンプルからRNAを抽出しsmall RNA画分を濃縮後cDNA合成し、MiSeqを用いたmiRNA-Seqを行った。その結果、miR398b, miR447a, miR3932b, miR1888bなどがBTH処理及び水ストレスを与えた区で多く蓄積する傾向があった。また、BTH処理によってmiR841aやmiR172bが蓄積する傾向なども見られた。しかしながら、全体的にリード数が少なかったことから、再度確認する必要があると考えられる。また、ヒストン修飾によるAGO2プライミング制御およびウイルス抵抗性への影響の解析においては、ヒストン脱メチル化酵素(LDL1, LDL2, LDL3)の三重変異体に加え、ヒストンメチル化酵素(ATX1, ATX2, ATX4, ATX5)の四重変異体を作成し、キュウリモザイクウイルス抵抗性の変化を解析した。atx四重変異体は矮化や葉が変形するなどの奇形が認められたが、ウイルス増殖量は野生型に比べて抑えられており、ウイルス抵抗性が亢進していると考えられた。今後は変異体におけるAGO2のプライミングやプロモーター領域のヒストン修飾の状況を解析する必要がある。
エネルギー概念の系統的な理解を促す中学校理科カリキュラムの開発

中学校学習指導要領では,理科の学習内容を「エネルギー」,「粒子」,「生命」,「地球」といった概念で再構成することが示されている。これらのうち「エネルギー」については,抽象性が高く理解に困難が生じることが予想される。そこで国内の教科書での「エネルギー」の使用状況を調査し,考察したところ、「エネルギーを取り出す」,「エネルギーをもっている」といった表現を理解させるための学習プランが第1学年から必要であることが示唆された。小・中・高の学習指導要領で示された方向性をより具体的にしていくためには、より多くの学習プランの開発と実践、およびその効果の検証が望まれるが、その理論的な背景として、教科書で用いられている「エネルギー」の語句についての調査および研究が必要であると考えた。この点が、本研究に取り組む申請者の問題意識である。本研究では、1年目に、日本国内で使用されているすべての教科書を対象に、「エネルギー」の語句を含んだ文章が、どのような単元で、どのくらい使用されているかを調査する計画であった。これについては、計画通り実施することができた。その経過を日本教科教育学会で発表し、概念の扱い方とデータの分析方法について有益な示唆を得ることができた。特に、データの分析方法に関しては、テキストマイニングの手法を用いてはいたものの、申請者の主観に基づく分析になる可能性が高いとの指摘を受けた。そのため、恣意的な分類にならないよう、テキストマイニングソフトをより効果的に活用していくことを2年目は意識したい。この研究の途中経過については、申請者の所属する北海道教育大学の紀要に投稿している。2年目は、前年度の学会発表で得られた示唆をもとに、データ分析をより客観的なものにし、その結果をもとに「エネルギー」の概念で再構成すべき単元を考察することとしたい。そして、再構成すべきと判断された単元について学習プランを作成し、研究協力者(中学校教員)に実践してもらい、その効果を検証したい。これは、申請時と同様の流れとなっている。中学校学習指導要領では,理科の学習内容を「エネルギー」,「粒子」,「生命」,「地球」といった概念で再構成することが教科の目標の一つとして示されている。これらの概念のうち、特に「エネルギー」については,その抽象性が高く理解に困難が生じやすいことがかねてから指摘されてきた。また、科学用語としての「エネルギー」と、日常語としての「エネルギー」があることが認識されているものの、その使い分けについては、教科書の記述の中では明確に指摘されていないという状況である。そこで国内の中学校で使用されている中学校理科教科書における「エネルギー」の使用状況を調査し,分類などの作業を経た上で考察をおこなった。その結果,次の3点が明らかとなった。1)「エネルギー」は,主に第1分野(物理・化学分野)で扱うことになっているが,第2分野(生物・地学分野)においても頻繁に用いられている。特に使用数が多かったのは「動物の生活と生物の変遷」単元である。2)「エネルギー」の定義を学習するのは第3学年であるが,第1学年の教科書にも「エネルギー」が、例えば「植物の生活と種類」単元で用いられている。3)「エネルギー」は「取り出す」,「もっている」といった表現と共に用いられているが、文脈によってその意味が異なることを指導者側は意識する必要がある。これらを検討した結果,「エネルギーを取り出す」,「エネルギーをもっている」といった表現を理解させるための学習プランが第1学年から必要であることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。理科教育学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度の計画については、国内の中学校で使用されている全ての教科書を購入し、「エネルギー」という語句がどの単元でどのように使用されているかを調査し、中学校理科の単元カリキュラム開発および指導計画立案のための第一次資料とする計画であった。そのために中学校・小学校の教科書を中心に調査をおこない、学会発表を経て学内の紀要論文としてまとめた。現時点で投稿を終えていることから「おおむね順調に進展している」と判断した。平成26年度の計画については、「エネルギー」の語句が頻繁に用いられている単元が授業実践の対象となりうる。申請者はこれまでにそのような単元を選定し、中学校理科の単元で実践研究をおこなってきた。これらの実践研究の過程で、「エネルギーをもっている」、「エネルギーを出す」という表現が、いくつかの単元において横断的に使用されていることを見いだすことができた。2年目の計画では、「エネルギーをもっている」、「エネルギーを出す」ということの意味を捉えるための教材を開発、実践し、その結果を検証したい。そして、それらの実践を系統的にまとめる予定である。