hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組合せ理論とその周辺分野(代数群りー群りー環代数幾何学解析学等)の研究

組合せ理論の周辺分野との関連について研究者達の密接な関係が生じ、種々の興味ある結果が生じた。長野正は(竹内勝氏らと共同に)ケーラー多様体(四毛数上の)のコホモロジー、コンパクト対稱空間の包合変換、リーマン幾何学的不変量とそのボレル-セールの問題への応用について興味ある結果を与えた。岩堀長慶は無限個のパラメーターをもつ二項係数の一般化の行列を導入し、その応用を与えた。筱田健一は有限代数群の表現論と、古典的な整数論的算式との間の不思議な共通部分を見出し、表現論の世界の言葉で興味ある意味づけを与えた。大内忠は複素領域における線型微分方程式の解の特異点の近傍での擧動について重要な結果を与えた。森本光生は解析汎関数の球面調和関数展開について、また円分数の素因数分解(及びこれとコンピュータ・プログラムの製作との関係)について興味ある結果に達している。野海正俊は(名大の友人らと共に)量子群(という名のalgebra)の表現と直交多項式のq-analogueとの関係について有意義な結果をC.R.に発表した。金行壯二はJordan-Trcple,graded Lie algebra,Jordan環に関するSylvesterの惰性律などについて面白い結果を得ている。加藤昌英は、コンパクト複素多様体の連結和、またその上の特性形式について重要な結果を得ている。和田秀男は斉藤美千代と共著で実二次体のイデアル類群(【○!h】(√<m>、m<100000)を、狭義と広義の場合に分けて、計算機を用いて計算した。沢田秀樹はChevalley群の既約モヂュラー表現とある共変関手との関係について興味ある結果を得ている。内山康一は双典型方程式の初期値問題のL^2-評価、およびEcalle-Vor^<os>-Phamのresurgent関数の理論について組合せ論との関係を得た。横山和夫はDS-diagramの変形について結果を得た。西沢清子は或る種の無限型のベキと力学系のbifurcationとの関係を与えた。
スリランカにおける非定型的リーシュマニア症に関する研究

スリランカはこれまでリーシュマニア症の浸淫地とは考えられていなかったが、本研究により内臓型リーシュマニア症の病原種とされているLeishmania donovani s.l.による皮膚型リーシュマニア症がスリランカにおいて浸淫していることが明らかとなった。1.NNN培養法あるいは皮膚生検材料の塗抹標本により原虫を検出することにより確定診断を行った。病変は顔、手、足の皮膚露出部に多く、直径520mm程度の水泡状あるいは結節状の丘疹が多く、丘疹中央部に潰瘍を認める場合もあった。内臓型リーシュマニア症の診断に有用なrK39抗原を用いたディップスティック法では全ての患者が陰性を示した。2.分離された原虫のミニエクソン遺伝子、アクチン遺伝子について一部塩基配列を決定し既知のL.donovani, L.major等8種のリファレンス株と比較解析を行った。その結果ミニエクソン遺伝子の解析では、L.donovaniとPCR産物の泳動パターンが一致した。アクチン遺伝子の解析では946塩基中、スリランカ株はL.majorとは34塩基異なるのに対し、内臓型リーシュマニア症の病原種とされるL.donovani, L.infantum, L.chagasiとは04塩基のみ異なった。以上の結果よりスリランカにおける皮膚型リーシュマニア症の病原種はL.donovani s.l.であることが示唆された。3.媒介昆虫の探索のためサシチョウバエの分布調査を行った結果Phlebotomus argentipes及びP.stantoniの存在が明らかとなった。インドにおいてP.argentipesがL.donovani s.l.によるカラアザールの媒介昆虫として知られているため、P.argentipesが媒介昆虫候補種の一つであることが示唆された。本研究で得られた「L.donovani s.l.による皮膚型リーシュマニア症の浸淫」はスリランカだけで見られる特異な新規感染症であり、「L.donovani s.l.は内臓型リーシュマニア症の病原種である」とする従来の学説に修正を求めるものである。スリランカはこれまでリーシュマニア症の浸淫地とは考えられていなかった。ところが数年前より皮膚型リーシュマニア症患者の急増が注目されはじめたが、当初輸入例と考えられていた。本年度は、スリランカ国内のAnuradhapura県、Kurunegala県、Matale県において現地調査を行い、渡航暦がなく臨床症状よりリーシュマニア症が強く疑える患者を対象にinformed consentを得た上で聞き取り調査および検体採取を行った。病変は顔、手、足の皮膚露出部に多く、直径520mm程度の水泡状あるいは結節状の丘疹が多く、また丘疹中央部に潰瘍を認める場合もあった。皮膚型リーシュマニア症を疑える35名に対し患部のニードルバイオプシーを行い、得られた生検材料の一部を血液寒天培地にて培養した結果、11名の生検材料よりリーシュマニア原虫を検出した。これら11名の患者が始めて丘疹を自覚してから410ヶ月経過していた。これら11名中3名に所属リンパ節腫大を認め、1名には軽度の脾腫が認められた。さらにスリランカにおける病原原虫種を同定するために、患者から分離されたリーシュマニア原虫のミニエクソン遺伝子等の一部塩基配列を決定した。

その結果、内蔵型リーシュマニア症の病原種であるとされているLeishmania donovaniと最も相同性が高いことを示し、スリランカにおいてL.donovaniを病原体とする皮膚型リーシュマニア症が浸淫していることを示唆した。平成16年から我々が行った調査により、内臓型リーシュマニア症の病原種であるとされているL.donovani complexによる皮膚型リーシュマニア症が、スリランカにおいて浸淫していることを示唆した。本年度は、引き続きスリランカ国内のAnuradhapura県、Kurunegala県、Matale県においてヒト皮膚型リーシュマニア症の調査を行い、さらにスリランカにおいて媒介昆虫は未だ不明であることから、上記県の他、Hambantota県、Galle県においてサシチョウバエの生息調査を行った。ヒトにおいては渡航暦がなく臨床症状よりリーシュマニア症が強く疑える患者を対象にinformed consentを得た上で聞き取り調査および検体採取を行った。病変は顔、手、足の皮膚露出部に多く、直径520mm程度の水泡状あるいは結節状の丘疹が多く、また丘疹中央部に潰瘍を認める場合もあった。皮膚型リーシュマニア症を疑える11名に対し患部のニードルバイオプシーを行い、得られた生検材料の一部を血液寒天培地にて培養した結果、7名の生検材料よりリーシュマニア原虫を検出した。これら11名中うち1名は治療後に再発した症例であった。サシチョウバエは主にライトトラップを用い採取し、male genitalia、spermathecae、pharynxをkeyに形態学的に同定した結果、フレボトムス属ではPhlebotomus argentipesが216匹、P.stantoniが6匹同定され、スリランカ国内において、媒介昆虫となりうるフレボトムス属の存在を確認した。平成16年から我々が行った調査により、皮膚型リーシュマニア症がスリランカにおいて浸淫していることを明らかにした。本年度は度航歴がなく、臨床症状より皮膚型リーシュマニア症が強く疑われた患者からinformed consentを得たうえで患者皮膚部のニードルバイオプシーを行い、NNN培地を用いた培養により検出されたプロマスティゴートのミニエクソン遺伝子、アクチン遺伝子について一部塩基配列を決定し、既知のL. donovani、L. major等8種のリファレンス株と比較解析を行った。その結果ミニエクソン遺伝子の解析では、内臓型リーシュマニア症の病原種であるL. donovaniとPCR産物の泳動パターンが一致した。アクチン遺伝子の解析では946塩基中、スリランカ分離株はL. majorとは34塩基異なるのに対し、内臓型リーシュマニア症の病原種とされるL. donovani, L. infantum, L. chagasiとは04塩基のみ異なり、予想されるアミノ酸配列においては100%一致した。したがってスリランカにおける皮膚型リーシュマニア症の病原原虫はL. donovani s.l.であることが示唆された。しかしながら内臓型リーシュマニア症の診断に有用なrK39抗原を用いたKalazar detect dipstick testではすべての患者が陰性を示した。これらのことは、スリランカにおける皮膚型リーシュマニア症の病原原虫種がL. donovani s
送粉者シフトを介する生態的種分化はどのような環境で進行するか？

ママコナ属では極端に長い花筒を持つ集団と、それとは逆に短花筒を持つ集団が知られているが、これらの集団がどのような環境の下で進化してきたのか明らかにすることが本研究の目的である。この目的の達成のために1)長花筒の集団と短花筒の集団で訪れる昆虫類にどのような違いがあるか、2)生育地周辺の訪花昆虫相に違いはあるか、3)長花筒集団と短花筒集団はどのようなママコナから派生してきたのか、4)花筒の変化に加えて、変化している形質はあるか、の4点について調査を行う。平成30年度は高知県の長花筒集団及びその近隣のシコクの自生地における訪花昆虫調査を実施予定であった。また、長野県の短花筒集団については、30年度前半に長野県のママコナ属標本を閲覧し、現地予備調査を実施する予定であった。高知県のママコナ属調査に関しては、台風等の悪天候により実施することができなかったが、本年度に実施を予定している。また、長野県の短花筒集団については、予定通りに進行し、標本調査、現地予備調査ともに完了し、国立公園特別保護地区での採取申請等の許可手続きを実施中である。標本調査に関しては、30年度で予定したもののすべてが完了した。DNA解析については、日本産ママコナ属に関して葉緑体DNAの配列を用いて系統解析を行い、種間の系統関係の概要を明らかにできた。コアレセント解析による各集団の分岐年代の推定については、次世代シーケンサーを用いて行い、専門機関に委託する予定であったが、30年度は予備実験のみの実施となった。ママコナ属の生育地周辺での訪花昆虫相の把握(訪花昆虫環境調査)および、蜜量等調査は、予定していた調査時期に悪天候が重なり、ほとんど実施できなかった。平成31年度にはこの二つの調査を中心に実施予定である。なお、平成30年度までの成果については、第66回日本生態学会で公表した。標本調査によるママコナ属の分布状況把握については、平成30年度でほぼ完了した。平成29年度に未実施だった長野県2施設で標本閲覧を行い、長野県植物誌でミヤマママコナの高山型(f. alpina)(短花筒集団)と記載のあった標本・採集地について確認ができた。また、周辺地域のミヤマママコナの分布状況・生育地についても情報を得ることができた。ミヤマママコナ高山型については、令和元年以降の訪花昆虫調査実施のために現地踏査を実施するとともに、採取等の許可手続きを行った。ママコナ属のサンプリング及び訪花昆虫調査については、長花筒集団であるイセママコナの探索は平成30年度も実施したが確認できなかった。今後は、平成29年に高知県で確認されたイセママコナの記載に該当する特異な集団について調査を進める予定である。この高知で確認された集団については、平成30年度に訪花昆虫調査を実施予定であったが、調査期と悪天候が重なり実施できなかった。葉緑体DNA解析については、平成30年度も概ね予定通りに進行した。令和元年度には、九州南部のサンプルを追加し、あと数領域で解析を実施予定である。蜜量等の調査については、平成30年度にも実施する予定であったが、調査期と悪天候が重なり、実施することができなかった。調査集団として、新たにミヤマママコナの高山型として記載のあった集団を追加でき、生育地も特定できたことは成果だったが、今年度予定していた訪花昆虫調査、蜜量調査等は悪天候のためほとんど実施できなかった。このことから、平成30年度に実施予定であった計画に対して、現状はやや遅れている状況であると判断した。悪天候が重なったため訪花昆虫等の調査は遅れているものの、当初調査予定であった集団については、いずれもその生育地を特定でき、生育状況も確認できた。また、調査許可関係の手続きに関しても現在順調に進行している。今年度は、長花筒集団及び短花筒集団の訪花昆虫調査を中心に実施していく予定である。今年度はこれまで実施できていなかった高知県の長花筒集団及びその近隣のシコクママコナの自生地における訪花昆虫調査を実施予定である。また、長野県の短花筒集団についても、同様に調査を実施予定である。並行して、紀伊半島南部のオオママコナ及びシコクママコナ集団、高知県の長花筒集団及びその近隣のシコクママコナ、長野県の短花筒集団で蜜量計測を行う。DNA解析については、引き続き、日本産ママコナ属に関して葉緑体DNAの配列を用いて系統解析を行い、種間の系統関係を明らかにする。平成30年度に実施したものに、九州南部などそれ以降に追加したサンプルを加えて実施する。また、複数の核遺伝子領域のDNA配列を用い、コアレセント解析による各集団の分岐年代の推定を行う。この解析は次世代シーケンサーを用いて行い、専門機関に委託する予定である。今年度の成果については、平成31年3月に実施される日本生態学会において成果の公表を行う予定である。平成29年度には標本によるママコナ属の分布調査、タカネママコナ、ミヤマママコナ、イセママコナ、シコクママコナ(以後、ママコナを省略)のサンプリング及び訪花昆虫調査、葉緑体DNAを用いた系統解析、予備調査結果の公表の4点について調査・研究を進める予定であった。

標本によるママコナ属の分布調査については、大阪市立自然史博物館の標本をはじめ、京都大学、三重県立博物館、鹿児島大学博物館、鹿児島県立博物館、宮崎県立総合博物館、高知県立牧野植物園の標本を閲覧することができ、これまで未調査だった九州南部、四国南部の主にシコクママコナの分布状況を把握することができた。その過程で高知県においてシコクママコナの特異な集団を確認することができたことは大きな成果であった。この集団は、花形態がイセに類似しており、29年度に実施した予備的調査ではシコクの主なポリネーターであるトラマルハナバチではなく、異なるハナバチ類の訪花が観察された。イセはまだ再発見されていないが、この集団のように、トラマルハナバチとは異なるハナバチに適応した集団である可能性が考えられる。タカネ、ミヤマ、イセ、シコクのサンプリングについては未実施の場所も多いが、高知県のシコクで実施した。未実施のタカネ、ミヤマについては平成30年度に実施予定である。葉緑体DNA解析については概ね予定通りに進行し、長花筒花のオオママコナと紀伊半島のシコクママコナが非常に近縁であることが明らかになった。成果は2018年3月に実施された日本植物分類学会大会において公表した。標本調査によるママコナ属の分布状況把握については、四国、九州南部の集団をある程度把握でき、平成30年度サンプリングへの足掛かりを作れた。ただし、長野県の標本閲覧が未実施であり、タカネ、ミヤマの分布状況把握がまだできていない。これについては平成30年度の早いうちに標本閲覧を実施予定である。「タカネ、ミヤマ、イセ、シコクのサンプリング及び訪花昆虫調査」については、イセは詳細な探索にも関わらず確認できていない。しかし、高知県において、イセの記載に該当する特異な集団を確認することができ、その周囲のシコクの分布状況も把握することができた。全く新たな生育地における調査のため、訪花昆虫調査は遅れているが、今後土地所有者の了解を得て、平成30年度から訪花昆虫調査を実施予定である。葉緑体DNA解析については概ね予定通りに進行し、長花筒花のオオママコナとシコクママコナが非常に近縁であることが明らかになった。平成30年度にはあと数領域解析を実施予定である。平成29年度の調査結果については3月に行われた日本植物分類学会で公表した。調査集団として、新たに特異的な集団を確認できたことは大きいが、今年度予定していた短花筒集団の分布及び、調査実施集団の特定ができておらず、平成29年度に実施予定であった計画に対して、現状はやや遅れている状況であると判断した。ママコナ属では極端に長い花筒を持つ集団と、それとは逆に短花筒を持つ集団が知られているが、これらの集団がどのような環境の下で進化してきたのか明らかにすることが本研究の目的である。この目的の達成のために1)長花筒の集団と短花筒の集団で訪れる昆虫類にどのような違いがあるか、2)生育地周辺の訪花昆虫相に違いはあるか、3)長花筒集団と短花筒集団はどのようなママコナから派生してきたのか、4)花筒の変化に加えて、変化している形質はあるか、の4点について調査を行う。平成30年度は高知県の長花筒集団及びその近隣のシコクの自生地における訪花昆虫調査を実施予定であった。また、長野県の短花筒集団については、30年度前半に長野県のママコナ属標本を閲覧し、現地予備調査を実施する予定であった。高知県のママコナ属調査に関しては、台風等の悪天候により実施することができなかったが、本年度に実施を予定している。
ゲノム配列の種間・種内比較に基づく進化過程の推定

理化学研究所が中心となって日独中韓台の9センターで編成したコンソーシアムにおいて、霊長類の染色体としては世界で初めてのチンパンジー22番染色体(PTR22)の完成配列を決定し、Nature誌のArticleとして発表した。この論文において本研究代表者は比較解析全般を担当し、ヒト相同染色体であるヒト21番染色体(HSA21)および他の類人猿との間で種間比較解析を行った。本研究の目的は、500-700万年前にヒトとチンパンジーが分岐した後に、それぞれの系統において生じてきたゲノムの構造変化の詳細を明らかにすることである。同コンソーシアムによる先行研究(Fujiyama et al.,2002)において両ゲノムは塩基配列レベルで平均1.23%の塩基置換が起きていることをあきらかにしていたが、PTR22-HSA21間では若干高い1.44%の平均塩基置換率になっていた。これは主としてテロメア側半分ではGC含量が高くCpGのメチル化脱アミノ化による塩基置換(C:G→T:A)が高頻度で起こっていることによることがわかった。他に、PTR22はHSA21よりも約1%小さいこと、多くの挿入・欠失が存在し短いものほど頻度が高いこと、300bp以上の長さの挿入は大部分が散在性反復配列の挿入によるものであること、挿入はHSA21で高頻度で起こっている一方、欠失は両染色体で完全に同じ傾向をしめしていること、たんぱく質をコードしている遺伝子の83%でアミノ酸置換が起きておりそのうちの23%は単純なアミノ酸置換ではない大規模な変化によるものであること、免疫系遺伝子において転写レベルでの発現にHSA21とPTR22の間で有意に異なっていること等が明らかになった。また、ヒトゲノムプロジェクトを締めくくるヒトゲノム真正クロマチン部分の完成配列の決定完了をコンソーシアムとしてNature誌で報告した。
乳タンパク質ラクトフェリンの抗ウイルス・抗菌作用の構造基盤解明と活性増強

・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製HCV外被タンパク質E2について、大腸菌および原虫を宿主とする発現系を構築し、大腸菌を宿主として発現させたE2を精製した。一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、大腸菌を宿主とする発現系を構築し、精製系を確立した。・LFとウイルス外殻/受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析大腸菌で発現し精製したHCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出しようと試みたが、検出できていない。E2コンストラクトと結合条件の検討を進めている。一方、大腸菌で発現し精製したNV外被タンパク質Pdomainについては、ヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出した。さらに等温滴定熱測定(ITC)による定量的相互作用解析においても相互作用を検出できたため、Pdomainの機能を保持した状態で発現・精製に成功したことが示された。現在、解離定数と化学量論(結合する分子数の比)の解析を進めており、その後、PdomainとLFの相互作用解析を行う。・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析唾液凝集素タンパク質のSRCRドメインおよび虫歯菌表層タンパク質のAVPドメインの発現系を構築し、大腸菌で発現、精製した。プルダウンアッセイにより、LFとSRCRドメインとAVPドメインの、どのペア間にも相互作用解析が検出された。・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製HCV外被タンパク質E2について、精製はできたが、期待されたLFとの相互作用が検出されておらず、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため。発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。[(3)やや遅れている。]一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、発現・精製系を確立し、機能を有することも確認できたため。[(2)おおむね順調に進展している。]・LFとウイルス外殻/受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析HCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出できていないため。E2コンストラクトと結合条件の検討を進める。]一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、ヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用を検出でき、機能を持った状態で発現できたことが確認できたため。解離定数と化学量論(結合する分子数の比)を解析し、続いて、LFとの相互作用解析も行う。]・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析平成31年度に予定していた実験を前倒しして、進めた。唾液凝集素タンパク質も虫歯菌表層タンパク質も、発現・精製に成功し、期待した通りの相互作用が検出されたため。]・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため、発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。・LFとウイルス外殻/受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたら、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析唾液凝集素タンパク質SRCRドメイン、虫歯菌表層タンパク質PAc、LFはいずれも相互作用することが示されたので、三種類の二者複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。また、定量的相互作用解析により、各相互作用の強弱の関係を明らかにすることにより、LFが虫歯菌の歯面付着予防に有効であるか否か、分子レベルで検討する。

プルダウンアッセイにより、LFとSRCRドメインとAVPドメインの、どのペア間にも相互作用解析が検出された。・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製HCV外被タンパク質E2について、精製はできたが、期待されたLFとの相互作用が検出されておらず、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため。発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。[(3)やや遅れている。]一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、発現・精製系を確立し、機能を有することも確認できたため。[(2)おおむね順調に進展している。]・LFとウイルス外殻/受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析HCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイによって検出できていないため。E2コンストラクトと結合条件の検討を進める。]一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、ヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用を検出でき、機能を持った状態で発現できたことが確認できたため。解離定数と化学量論(結合する分子数の比)を解析し、続いて、LFとの相互作用解析も行う。]・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析平成31年度に予定していた実験を前倒しして、進めた。唾液凝集素タンパク質も虫歯菌表層タンパク質も、発現・精製に成功し、期待した通りの相互作用が検出されたため。]・ウイルス外膜タンパク質の発現、精製HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたかはまだ不明であるため、発現系の改善を進め、機能を有する状態での発現を確定した後に、精製系を確立する。・LFとウイルス外殻/受容体タンパク質の相互作用解析、複合体構造解析HCV外被タンパク質E2について、機能を有する状態で発現できたら、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。一方、NV外被タンパク質Pdomainについては、LFとの相互作用解析、複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析唾液凝集素タンパク質SRCRドメイン、虫歯菌表層タンパク質PAc、LFはいずれも相互作用することが示されたので、三種類の二者複合体の精製、共結晶化、複合体の立体構造解析を進める。また、定量的相互作用解析により、各相互作用の強弱の関係を明らかにすることにより、LFが虫歯菌の歯面付着予防に有効であるか否か、分子レベルで検討する。
血液血管界面の物質移動に及ぼす血流の影響

1.動脈瘤の拍動流パターンと壁内応力分布:流れの可視化法を用いて動脈瘤内の拍動流パターンを調べた。加速の初期に、流れは動脈流内の中枢側から剥離を起こした。流れの剥離域と渦は急速に成長・肥大し、瘤内全体に広がった。この間に渦の中心は動脈瘤内の中枢側から末梢側に移動した。加速期に終りに、一時的な逆流が動脈瘤の壁と渦との間に生じた。流量や拍動の周波数を高くすると、動脈瘤の末梢側で乱れた。動脈瘤の長さを増加させるとおなじ様な効果があらわれた。拍動の振幅を小さくすると、定常流に似たパターンになった。有限要素法を用いて軸対称の動脈瘤を通過する速度場と圧力場を求めた。計算した結果は、可視化実験の結果とよく一致した。末梢側での渦の生成と消滅により、複雑な圧力場と壁ずり応力場になった。流量のピークで、壁ずり応力の最小値と最大値は瘤の出口端のすぐ上流と下流に発生した。壁ずり応力と圧力が動脈瘤の血管壁に負荷したときの、血管壁内の応力分布を求めた。壁内の応力分布には壁ずり応力よりも圧力による影響が大きかった。せん断応力の大きい領域が瘤の中心と出口端に発生していた。2.頸動脈分岐部での流れのパターン:透明化処理したヒトの総頸動脈の拍動流パターンを流れの可視化法用いて調べた。非対称の狭窄管内の流れに観察された馬蹄形渦に似た螺旋状の渦運動のパターンが、この研究で使われた全てのヒトの総頸動脈に観察された。レイノルズ数が100以上の定常流で観察された馬蹄形渦は、拍動流の減速相でも観察された。この旋回運動により、分岐の頂点の上流側の壁に淀み点が生じた。この位置は、枝管への流量比に依存して変化した。また流れの剥離域が枝管の内側と外側に観察された。3.分岐管の管軸に垂直な断面の管壁内の応力解析をした。長軸上の断面では、内側に引っ張り応力、外側に圧縮応力が生じた。壁内の力学的性質と血管病変との関連に注目する必要がある。1.透明血管標本の流れの可視化による流れのパターンの観察,透明化処理した血管分岐部の可視化実験より,分岐部手前に馬蹄形渦が発生していること,そして,分岐起始部の外側壁では流れの剥離が起こり得ることなどが明らかになった.分岐部の1つの枝管に注目すれば,そこの流れのパターンは3つに分けられた. 1つは分岐の外側壁に沿う流れは順方向に下流に向かった.一方他の2つのタイプは逆流が起こった.逆流の1つのタイプは,逆流した流体が壁に沿って主管を横断し,他方の枝管に流れた.他方は逆流した流体が分岐起始部で剥離を起こした後,この枝管に連なっている馬蹄形渦に巻き込まれて下流に流れた.このような流れのどのタイプに流れになるかは,分岐の形状と枝管への流量配分によることが分かった.2.有限要素法を用いた数値計算. (1)流れの数値研鑽:非定常3次元の流れに対する有限要素法プログラムは現在開発中である.そこで2次元非定常流れに対するプログラム(開発済み)で,軸対象動脈瘤モデルに対して有限要素法による数値解を求めた.拍動流の可視化実験の流量波形をフーリエ展開し,入口端の境界条件とした.加速相の後期から剥離渦が形成され,減速相にかけて成長し,肥大化して下流に押し流された.瘤の後縁近傍に壁ずり応力が大きくなり,また瘤の下流に最大の壁ずり応力が発生した. :(2)血管壁応力場の数値計算血管分岐部の血管形状は円形から楕円形を経て亜鈴形に変化している.いくつかの超音波断層写真から血管形状を数量化し,有限要素法を用いて応力解析をした.楕円形の断面では,長軸の壁厚が短軸よりも厚くなっており,主応力が零になる部分が存在し,基本的には周方向に正の主応力が作用した.亜鈴形では短軸近傍に負の主応力が作用した. 3.以上の知見に基づき,3次元モデルを作成し,可視化実験及び数値計算を継続中である.1.動脈瘤の拍動流パターンと壁内応力分布:流れの可視化法を用いて動脈瘤内の拍動流パターンを調べた。壁ずり

応力と圧力が動脈瘤の血管壁に負荷したときの、血管壁内の応力分布を求めた。壁内の応力分布には壁ずり応力よりも圧力による影響が大きかった。せん断応力の大きい領域が瘤の中心と出口端に発生していた。2.頸動脈分岐部での流れのパターン:透明化処理したヒトの総頸動脈の拍動流パターンを流れの可視化法用いて調べた。非対称の狭窄管内の流れに観察された馬蹄形渦に似た螺旋状の渦運動のパターンが、この研究で使われた全てのヒトの総頸動脈に観察された。レイノルズ数が100以上の定常流で観察された馬蹄形渦は、拍動流の減速相でも観察された。この旋回運動により、分岐の頂点の上流側の壁に淀み点が生じた。この位置は、枝管への流量比に依存して変化した。また流れの剥離域が枝管の内側と外側に観察された。3.分岐管の管軸に垂直な断面の管壁内の応力解析をした。長軸上の断面では、内側に引っ張り応力、外側に圧縮応力が生じた。壁内の力学的性質と血管病変との関連に注目する必要がある。1.透明血管標本の流れの可視化による流れのパターンの観察:透明化処理したヒトの頚動脈分岐部の可視化実験をした。定常流ては分岐部手前に馬蹄形渦が発生していること、そして、分岐起始部の外側壁では流れの剥離が起こり得ることなどが明らかになった。拍動流については、加速期では分岐上流は壁に沿う流れになっているが、分岐頂点にさしかかると、2つの枝管に流れ込む。最大流量ては、分岐の頂点を回り込むU字型の流れになり、枝管の壁にそった逆流が発生し、馬蹄形渦を生成する。この馬蹄形渦は減速相でもでも認められた。このパターンは定常流に似たパターンになった。しかし、外頚動脈の外側壁での流れの剥離は認められなかった。むしろ外頚動脈の形状に起因した剥離が内側の壁に見られた。2.有限要素法を用いた数値計算:(1)流れの数値計算:軸対称動脈瘤モデルを通過する拍動流について有限要素法を用いて数値解を求めた。流れのパターンは可視化実験とよく一致した。最大流量のとき、瘤出口端の上流に負の最大壁ずり応力、下流に正の最大壁ずり応力が発生した。:(2)血管壁応力場の数値計算:血管分岐ぶ管軸に垂直な断面の管壁内の応力解析をした。血管形状を円形から楕円形を経て亜鈴型に変化させると、楕円形あるいは亜鈴形ともに長い軸上では内側が正の主応力、外側が負の主応力になった。しかし短軸上では楕円形では内側が正の主応力になっているのに対し、亜鈴型では負の主応力になった。また、動脈瘤について有限要素法で得られた速度場と圧力場を使って、管壁内の応力分布を求めると、瘤の入口端、出口端、中心部に応力集中がみられた。また、瘤の中心部と出口端の中間の壁内では、大きなずり応力が発生していた。3.血管を通過する流れによる壁内の応力分布が、血液血管壁の物質移動に影響を与え、血管病変の発生と進展させうることが示唆された。
新疆の形成とウイグル民族問題に関する調査研究

本研究は中国がいうところの「新疆」の形成をめぐる歴史的言説を再検証し、そのうえで、新疆ウイグル自治区で勃発しているウイグル民族問題の歴史的由来と性質、現状について民族学的考察を加える。再検証と実態考察にあたっては、1884年の清朝による新疆省設置から1949年までを「新疆省期」、1949年から1976年までを「民族自治区期」、1976年から現在までを「民族問題勃発期」と可視化する。民族問題というローカルな地域紛争の歴史的変遷と現状について調査する際にはまた国際関係との関連性にも配慮する。歴史と国際関係との連動に着手することで、新たな知見を構築し、グローバル・ヒストリー研究の進展に貢献する。
二種類の感動によって生じる脳活動の解明

本年度は、fMRI(functional magnetic resonance imaging,機能的磁気共鳴映像装置)による実験を行った。前年度に構築した、実験参加者を選出するためのweb調査システムを使用して、100名程度の大学生に音楽によって感動しやすい程度を問う質問紙への回答を依頼した。質問紙の得点に基づいて参加者を選出してから、fMRIでの実験参加を依頼した。fMRI内で個々人の好きな音楽および実験者が選出した音楽を聴取させる実験を大学生40名程度について行った。fMRI実験において、心拍数などの自律神経活動についても計測を行った。現在、これらのデータの分析を進めており、自律神経活動の変化を伴って報告される鳥肌感と涙感について、どのような脳活動が生じるか検討する予定である。併せて計測を行った中性と快の感情状態とどのような脳活動パターンの違いが認められるかについても検討予定である。また、本年度は、実験において鳥肌感や涙感を喚起させた楽曲の音楽情報処理による解析を行った。鳥肌感ラベル、涙感ラベル、ランダムサンプリングによって抽出した中性ラベルについて、それらの時点における前後10秒程度の音楽特徴量を用いて機械学習による分類・予測を試みた結果、チャンスレベルを超える精度でどの反応が生じていたか予測することができた。さらに、本年度は、web調査による鳥肌感や涙感を喚起させる楽曲の大規模調査も行ったため、これらの曲についても機械学習による分析を進めることで、次年度に鳥肌感や涙感を喚起させやすい楽曲の選出プロトコルを作成することを計画している。データはパスワードのあるパソコンに保存し、研究代表者以外が見ることができないようにして個人情報を保護する。研究内容を発表する際には、個人が特定できないよう匿名化したデータを使用することで参加者のプライバシーを保護する。本年度実施を予定していた研究「鳥肌感,涙感,基本感情がもたらす脳活動パターンの分類」について、計画を変えて実施することができた。脳活動を比較するためのfMRI実験については、十分な人数で検討を行うことができたものの、解析を終えることができなかった。しかし、来年度に予定していた音楽情報処理の解析を一部検討することができたという点から、概ね順調に進んでいると判断した。本年度に実施した実験のデータ解析を進める。本年度に行った音楽情報処理による機械学習解析を発展させて、鳥肌感や涙感を喚起させやすい楽曲を選出する。この手法を用いて、実験参加者にとって親和度が低く、楽曲に対する記憶の影響を排除できる未知の楽曲を選出してfMRI実験に用いる。実験で得られる脳活動を検討することで、個々人のバイアスをできる限り除外した、音楽による感動の脳活動を検討する。本年度は実験参加者選出のためのweb調査およびfMRI(functional magnetic resonance imaging,機能的磁気共鳴映像装置)による実験を行った。最初に当該研究テーマに関連する先行研究を調べるとともに、実験参加者を選出するためのweb調査システムを構築した。Web調査システム上で100名程度の大学生に、音楽によって感動しやすい程度を問う質問紙への回答を依頼した。fMRI内で好きな音楽を聴取させる実験を大学生10名について行った結果、感動したときに生じる鳥肌感と涙感で異なる脳領域に活動が生じる傾向が認められた。鳥肌感が生じたときの脳活動と涙感が生じたときの脳活動について、機械学習による分類・予測を試みた結果、チャンスレベルを超える精度でどちらの反応が生じていたかを脳活動から予測することができた。このことは、鳥肌感と涙感が異なる脳活動パターンを持つことを示唆する。先行研究では、感動の鳥肌感に関する脳活動のみが計測の対象とされており、涙感のもたらす脳活動については未知であった。本研究の結果から、鳥肌感と涙感が異なる神経基盤を持つことが示唆され、感動に関する脳活動の知見が広まったと言える。加えて、fMRI実験では心拍数などの自律神経活動についても計測を行っており、これらのデータの分析準備を進めた。fMRIデータについてRepresentational Similarity Analysisや深層学習といったより複雑な分析を行うための解析プログラムを準備した。本年度実施を予定していた研究「鳥肌感もしくは涙感を喚起しやすい参加者の選出」および「好きな音楽による鳥肌感と涙感の脳活動の比較」について、実施することができた。脳活動を比較するためのfMRI実験については、予定人数に達することができなかった。しかし、来年度にスムーズに実験の続きを実施することができるとともに、来年度に実施予定であった脳活動パターンの分類解析を一部検討することができたという点から、概ね順調に進んでいると判断した。

現在、これらのデータの分析を進めており、自律神経活動の変化を伴って報告される鳥肌感と涙感について、どのような脳活動が生じるか検討する予定である。併せて計測を行った中性と快の感情状態とどのような脳活動パターンの違いが認められるかについても検討予定である。また、本年度は、実験において鳥肌感や涙感を喚起させた楽曲の音楽情報処理による解析を行った。鳥肌感ラベル、涙感ラベル、ランダムサンプリングによって抽出した中性ラベルについて、それらの時点における前後10秒程度の音楽特徴量を用いて機械学習による分類・予測を試みた結果、チャンスレベルを超える精度でどの反応が生じていたか予測することができた。さらに、本年度は、web調査による鳥肌感や涙感を喚起させる楽曲の大規模調査も行ったため、これらの曲についても機械学習による分析を進めることで、次年度に鳥肌感や涙感を喚起させやすい楽曲の選出プロトコルを作成することを計画している。データはパスワードのあるパソコンに保存し、研究代表者以外が見ることができないようにして個人情報を保護する。研究内容を発表する際には、個人が特定できないよう匿名化したデータを使用することで参加者のプライバシーを保護する。本年度実施を予定していた研究「鳥肌感,涙感,基本感情がもたらす脳活動パターンの分類」について、計画を変えて実施することができた。脳活動を比較するためのfMRI実験については、十分な人数で検討を行うことができたものの、解析を終えることができなかった。しかし、来年度に予定していた音楽情報処理の解析を一部検討することができたという点から、概ね順調に進んでいると判断した。本年度に実施した実験の人数を追加するとともに、準備を進めていたデータ解析を実践する。今後は鳥肌感と涙感という二種類の感動が喜びや悲しみなどの基本感情と異なる脳内表象を持つかについての検討を行う。本年度は実験参加者の好きな音楽を用いて検討を行ったため、実験刺激が個々人でバラバラであったが、実験の統制を高めるためすべての参加者に実験者が選んだ同一の音楽を聞かせて鳥肌感や涙感を喚起させる実験についても実施する。参加者が選んだ音楽による感動の脳活動と、実験者が選んだ音楽による感動の脳活動についての比較検討を行う。本年度に実施した実験のデータ解析を進める。本年度に行った音楽情報処理による機械学習解析を発展させて、鳥肌感や涙感を喚起させやすい楽曲を選出する。この手法を用いて、実験参加者にとって親和度が低く、楽曲に対する記憶の影響を排除できる未知の楽曲を選出してfMRI実験に用いる。実験で得られる脳活動を検討することで、個々人のバイアスをできる限り除外した、音楽による感動の脳活動を検討する。物品費として使用を考えていたもののうち、実験用の高性能デスクトップPCは研究所内のPCでも補えたため必要がなくなった。実験人数が少なかったため、謝金については当初の予定よりも支出額が少なかった。
フォソスタチンを用いた腎臓再生医学の確立

ラット腎虚血再潅流モデルを作成し、アクチビン・フォリスタチン系の関与を検討した。虚血再潅流後、尿細管におけるアクチビンAの発現が一過性に増加したが受容体の発現は変化しなかった。またアクチビン・アンタゴニストであるフォリスタチンの発現は一過性に減少した。この結果は虚血再潅流後にアクチビン作用が増強していることを示唆している。そこでアクチビン作用をフォリスタチン投与により抑制したところ、虚血再潅流後の細胞浸潤、アポトーシスなどの組織学的異常所見が著明に改善するとともに、上皮細胞におけるDNA合成が増加した。フォリスタチンが尿細管障害を減少させるとともに尿細管上皮の再生を促進することが明らかになった。また虚血再潅流後にみられるBUN、クレアチニンの増加は有意に改善した。これらの結果は、アクチビンが虚血再潅流後の尿細管障害を増悪していること、この作用をフォリスタチンで抑制すると腎障害が改善することを示している。次にこの腎障害モデルにおいて、アクチビンの作用点を明らかにするため検討を行った。虚血再潅流後に発現が変化する転写因子を検討したところPax-2の発現が増加することが明らかになった。Pax-2陽性細胞は上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンと間葉系細胞のマーカーであるビメンチンの両者を発現しており、尿細管上皮の前駆細胞であると推定された。腎虚血再潅流後にアクチビンを投与するとPax-2陽性細胞は著減し、また逆にフォリスタチンを投与するとPax-2陽性細胞は著増した。また培養尿細管細胞を用いた検討によりアクチビンがPax-2のmRNA発現を増加させた。以上の結果から、アクチビンは尿細管前駆細胞においてPax-2発現を抑制的に調節するとともにPax-2陽性細胞の分化をも抑制的に制御していることが推定された。まず一過性腎虚血・再灌流後の腎尿細管壊死の病態におけるアクチビンとそのアンタゴニストであるフォリスタチンの発現を検討した。虚血・再灌流後にアクチビンの発現は24時間後をピークとする増加を示した。アクチビン受容体の発現には変化を認めなかった。これに対してアクチビンのアンタゴニストであるフォリスタチンは鏡像的な変化、すなわち減少を示した。すなわち虚血・再灌流後にアクチビン作用が増強していることが推定された。そこで、このアクチビンの作用をうち消すべく、フォリスタチンの静脈内投与を行い、虚血・再灌流後の腎組織の変化を検討した。その結果、再灌流時にフォリスタチンを静注すると尿細管の組織障害が軽減し、尿細管細胞のアポトーシスが減少した。さらに尿細管細胞のDNA合成が増加した。虚血・再灌流後に認められるBUNやクレアチニンの増加も有意に減少し、腎障害が軽減されることが確認された。逆に再灌流時にアクチビンを投与すると尿細管の組織学的所見は悪化し、腎障害は増悪した。これらの結果から、虚血・再灌流後に尿細管で発現するアクチビンは腎障害を悪化させる要因の一つになっており、その作用を中和すべくフォリスタチンを投与すると、腎障害が軽減され尿細管の再生が促進されることが明らかになった。

ラット腎虚血再潅流モデルにおいて、アクチビンの作用点を明らかにするため検討を行った。とくに尿細管再生時に発現することが知られている転写因子の関与について検討した。虚血再潅流後に発現が変化する転写因子を検討したところPax-2の発現が増加することが明らかになった。Pax-2陽性細胞は上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンと間葉系細胞のマーカーであるビメンチンの両者を発現しており、尿細管上皮の前駆細胞であると推定された。腎虚血再潅流後にアクチビンを投与するとPax-2陽性細胞は著減し、また逆にフォリスタチンを投与するとPax-2陽性細胞は著増した。また培養尿細管細胞を用いた検討によりアクチビンがPax-2のmRNA発現を増加させた。以上の結果から、アクチビンは尿細管前駆細胞においてPax-2発現を抑制的に調節するとともにPax-2陽性細胞の分化をも抑制的に制御していることが推定された。腎尿細管細胞におけるアクチビン作用の意義を明らかにするため、尿細管由来の細胞株LLC-PK1細胞を用いて検討を行った。LLC-PK1細胞はアクチビンAとその受容体を発現しており、アクチビンがこの細胞のオートクリン因子であることが明らかになった。外因性にアクチビンAを投与するとLLC-PK1細胞の増殖は抑制された。一方、変異アクチビン受容体遺伝子を導入してアクチビン作用をブロックするとLLC-PK1細胞の増殖スピードは速まった。またアクチビン作用をブロックした細胞ではカドヘリンの発現など上皮細胞としての分化マーカーの発現が低下した。これらの結果から、尿細管細胞においてオートクリン因子アクチビンAは増殖を抑制するとともに分化機能を誘導するように作用していると考えられた。
中和抗体を用いた接着関連因子periostin阻害による乳癌への抗腫瘍効果の検討

初年度に作成したperiostin特異的プライマーを用いて、乳癌組織臨床サンプルにおけるperiostinのバリアント解析を行った。はじめに、乳癌組織よりmRNAを抽出し、RT-PCRにて大まかなバリアントの発現解析を行った。そうしたところ、多くのサンプルで複数のバリアントの発現を認め、一部には、あるバリアントのみが強く発現していることが認められた。そこで、これらをrealtimePCRにて詳しく定量解析を行うこととした。各プライマーを用いたrealtimePCR(SYBR)の至適条件を細かに検討し、解析条件を決定した。この予備実験を基に、臨床サンプル中のperisostinバリアントの定量解析を行った。この結果を、患者データや腫瘍ステージ、グレード、組織分類などの臨床背景と照らし合わせ、相関がないかを統計処理を行った。すると、periostinバリアントの一部がグレードの高い腫瘍において、より発現していることを見出した。また、T分類の高い乳癌組織において、同じperiostinバリアントの発現が高い傾向があった。これらより、periostinのバリアントの発現が腫瘍の悪性度と関係する可能性が示唆され、periostinのバイオマーカーとしての可能性が示唆された。昨年度の推進方策にそり、臨床サンプルにおけるバリアント発現解析を順調に進め、統計解析を行うことができたため、概ね順調に進展したと考えられる。本年度までの研究課題とする。はじめに、ヒト腫瘍組織におけるperiostinの発現解析を行った。様々な癌種においてperiostinの発現が確認された。既知のスプライシングバリアント以外の存在が示唆された為、PCR cloning法を用いて探索したところ、新規バリアントを同定した。各々に対する特異的なプライマーを設計・合成し、ヒト乳癌細胞株におけるスプライシングバリアントの発現解析を行ったところ、悪性度の高い一部の細胞株にのみバリアントの存在が確認された。これらより、バリアントの出現及び悪性度には何らかの相関があるのではないかと考えられ、臨床サンプル等における発現解析を進めることで、悪性度の指標としての有用性を検討することが可能になる。また、periostinの特定exon領域に対する中和抗体がマウス乳癌に対して、抗腫瘍効果を示すことがわかっているが、この抗体を確立する為、モノクローナル抗体を作製することとした。抗原に対する反応性、数種の細胞株に対する細胞増殖抑制作用・細胞毒性作用といった培養系の実験により、十数個の候補にまで絞り、動物実験において更なる絞り込みを行った。これに先立ち、いくつかの細胞株と免疫抑制マウスにより、マウスにおけるヒト乳癌モデルを作製した。一部の細胞株にのみマウスでの生着が確認され、この系を用いて、動物実験におけるスクリーニングを行った。原発巣及び転移巣における増殖抑制効果を比較し、数個の候補にまで絞ることができた。これらを通じて、より効果の高い抗体を得ることが期待できる。初年度のスクリーニングにより絞られた候補抗体を用いて、抗体のヒト乳癌細胞に及ぼす影響について検討を行った。はじめに、periostinがヒト乳癌細胞の接着能に対して及ぼす影響について検討した。候補抗体の抗原を有する全長型periostinが、細胞接着低下作用を及ぼすことを確認した。これは、マウス乳癌細胞を用いた先行研究で得られた結果と同様であった。続いて、この系に候補抗体を添加したところ、細胞接着低下作用が減弱した。これより、候補抗体はperiostinに対する中和抗体として機能していると考えられた。続いて、ヒト乳癌担癌マウスモデルを作製して、候補抗体の抗腫瘍効果について検討を行った。これに先立ち、担癌マウスへの接種細胞数について、検討した。免疫抑制マウスへのヒト癌細胞の生着は、各細胞株の性質に依存するため、モデルの再検討を行った。投与実験に用いる数種の細胞株について、適当な細胞数を決定した。この後、先に行ったスクリーニングにおける動物実験でのデータを参考に、投与プロトコールの立案を行い、本実験に用いた。数種のヒト乳癌細胞株の担癌マウスに対して、中和作用を有する候補抗体は原発巣の増殖抑制作用を示した。これは先行研究と比較すると、著しい抑制効果ではなかったが、条件検討の余地は十分にある。評価にふさわしいプロトコールの検討を行い、この候補抗体の抗腫瘍効果を確認できれば、さらに転移巣などへの効果を検討することが可能となる。

初年度にスクリーニングを行った候補抗体を用いて、マウス担癌モデルにおける抗体の抗腫瘍効果を評価しており、計画に沿って概ね順調に進展していると考えられる。昨年度の推進方策にそり、臨床サンプルにおけるバリアント発現解析を順調に進め、統計解析を行うことができたため、概ね順調に進展したと考えられる。臨床サンプルにおけるバリアント発現解析を積極的に進め、悪性度など何らかの指標との相関を見い出す。本年度までの研究課題とする。
ssPalmが拓くマルチ創剤基盤：生体内包括イムノエンジニアリングと次世代癌治療

癌ワクチンの機能には、細胞傷害性T細胞の活性化を介して標的細胞を抗原特異的に攻撃する『細胞性免疫』の誘導が必須である。これを人工的に誘導する技術として、DNAワクチンは非常に有用な技術である。一方、腫瘍内は免疫が負に制御された環境であり、効果的な癌ワクチンを開発するためには、腫瘍内環境を矯正する技術が必要である。我々はこれまで、細胞内環境に応答して生体膜を突破し、自己崩壊する脂質様材料(ssPalm)と、本材料から形成されるナノ粒子製剤技術を開発している。本研究では、ssPalmを基盤とした遺伝子および低分子のデリバリー技術を開発し、生体内の抗腫瘍免疫を人工的に制御するため技術へと応用した。効果的な癌ワクチンを開発するためには、『細胞性免疫』を誘導し、『抑制的な腫瘍内免疫環境』を矯正する技術が必要である。本研究では、細胞内微小環境(低pH及び還元環境)に応答して帯電・崩壊する、脂質様材料(SS-cleavable pH-activated lipid-like material: ssPalm)を共通のプラットフォームとし、癌免役療法の実現を目指した2種の製剤を開発する。(細胞性免疫を活性化するDNAワクチン技術)細胞内環境応答性と高い生体適合性を有する新規脂質様材料を導入し、さらに表面修飾素子(KALA)に改良を加えながら、汎用性の高いin vivo直接投与型DNAナノワクチン製剤を開発する。(腫瘍免疫環境を矯正する難水溶性薬物搭載微粒子)従来のリポソームよりも小さな(<50 nm)血中滞留性超微粒子製剤を新規脂質様材料との『共集合』原理に基づき開発する。最終的にはこれらの技術を組み合わせ、生体内・腫瘍内の免疫を包括的に操作する『イムノエンジニアリング』を確立し、癌を『治療』するための新しい医療技術を提唱することを目的とする。初年度はssPalmや表面修飾素子(KALA)の分子チューニングにより材料自身を改良すると共に、自己組織化制御の観点から、遺伝子の内封技術や難水溶性薬物の超微粒子化技術を確立した。KALAに関しては、オリジナルのKALA配列から系統的に配列を改変し、樹状細胞に対する遺伝子導入ならびに免役活性化能を促進するための最小単位を同定した。また、ssPalmと組み合わせるヘルパー脂質や、調整法の改変により、同一組成からなる様々な粒子系の粒子を調製できることを見出した。さらに、ナノ粒子の表面および内部構造に関して、各種の蛍光技術を用いて解明した。DNAワクチン用ナノ粒子の開発の観点からは、免疫担当細胞の活性化効果が報告されているビタミンEを脂溶性足場としたssPalmを開発した。エンドソーム内の微弱なpH変化を敏感に感知して正に帯電し、エンドソーム膜を破壊できるようにssPalmの第三級アミン構造をチューニングした。一方、ssPalmに対して、様々な種類のKALAペプチド誘導体を修飾した結果、オリジナルのKALA配列と同等の活性を有する、短い配列(最小単位)を同定することに成功した。また、CDスペクトルの解析により、遺伝子導入や免役活性化機構が消失したペプチドに関しては、αヘリクス構造が消失することが明らかとなった。また、物理学的な観点から、ssPalm粒子の表面が中性環境下でゲル相に近い構造をとっていること、pHが低い環境下において水分子の侵入しやすい性質となること、さらには、その内部構造はpHによらず常に流動的であることを見出した。本粒子表面に水溶性ポリマーを修飾することにより、血中滞留性や癌への蓄積が上昇することも見出した。さらに、難水溶性薬物の搭載については、難水溶性薬物として、4-メチルウンベリフェロンを選択し、ssPalm粒子への搭載をこころみた。本薬物自身の封入率は低いものであったが、疎水性基を導入し、より親油性を高めることにより、その封入率は劇的に改善した。また、細胞内環境を模倣した還元状態において、本薬物が極めて効率的に放出できることが明らかとなった。本特徴は、従来の脂質を用いた製剤では見られない特徴である。表面修飾素子やナノ粒子形成材料(ssPalm)の機能的な最適化や、ssPalm粒子へ薬物を搭載するための基本的な条件を設定することができた点で、当初の目的を達成することができたと言えよう。我々はこれまで、細胞内環境に応答して正に帯電し、自己崩壊する遺伝子・核酸送達システムとして、環境応答性脂質様材料(SS-cleavable pH-activated lipid-like material: ssPalm)を基盤としたナノ粒子を開発してきた。一方、これまでの研究において、ssPalmは核酸等のない条件では小さな脂質滴を形成することを見いだしている。本研究では、ssPalmを基盤とし、『細胞性免疫』を活性化するためのDNAワクチンと、『抑制的な腫瘍内免疫環境』を矯正するための抗炎症薬送達技術を開発する。これらの相乗的な機能を介した抗腫瘍効果を検証することを最終目的とする。具体的には、下記の検討を進める。1細胞性免疫を活性化するDNAワクチン技術:細胞内環境応答性と高い生体適合性を有する新規脂質様材料を導入し、さらに表面修飾素子としての長鎖ペプチド(KALA)の機能を維持する上で必要な最小単位を同定しながら、汎用性の高いin vivo直接投与型DNAナノワクチン製剤を開発する。2腫瘍免疫環境を矯正する難水溶性薬物搭載微粒子: ssPalmからなる粒子に血中滞留性や組織標的化能を付与する為に必要となるサイズ制御法や、表面に修飾するポリマーの条件を見いだす。さらに、脂溶性薬物を粒子に『共集合』原理に基づき搭載する方法論を確立する。