hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規生理活性リゾリン脂質受容体ＧＰＲ５５及びＧＰＲ３５の機能解析

GPR55は、新規カンナビノイド受容体(マリファナ受容体)として報告された受容体で、その内在性リガンドは、リゾホスファチジルイノシトール(LPI)である。今回の研究で確立したLC-MS/MSの測定系を用いて様々な系におけるLPIの産生を調べたところ、マウス脾細胞をマイトジェン刺激した際や血漿を加温した時、アレルギー性炎症において、2-アラキドノイルLPIが選択的に産生されることが分かった。GPR55は免疫系に多く発現していること、種々のLPI分子種のうち、2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことから、2-アラキドノイルLPIは炎症・免疫応答に深く関与している可能性がある。研究代表者は、これまでの研究で、新規カンナビノイド受容体として報告されたGタンパク質共役型のオーファン受容体GPR55の内在性リガンドが、リゾリン脂質の一種であるリゾホスファチジルイノシトール(LPI)であることを明らかにした。LPIに対する受容体の同定は研究代表者の報告が初めてである。マリファナの主要活性成分であるΔ9-テトラヒドロカンナビノール(Δ9-THC)などのカンナビノイドが持つ多彩な作用のうちの幾つかはGPR55を介している可能性が高いが、詳細は不明である。ところで、LPIは代謝回転の早い不安定な化合物である。そのため、刺激に応じて速やかに産生され、代謝されると考えられるが、具体的なことは分かっていない。そこで今回の研究では、LC-MS/MSを用いたLPIの測定系を確立し、種々の系におけるLPIの産生を調べた。本研究で確立した分析条件では、LPIをそれぞれの分子種ごとに分離し、さらに、1-アシル体と2-アシル体を分けて検出できることが分かった。この系を用いてマウス脾細胞をマイトジェン刺激した際のLPI量の変化を調べたところ、主に、グリセロール骨格の2位にアラキドン酸が結合した2-アラキドノイルLPIが産生されることが分かった。このことから、LPIの産生にはホスホリパーゼA1が関与していることが示唆された。GPR55は免疫系に多く発現していること、種々のLPI分子種のうち、2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことから、LPI、特に2-アラキドノイルLPIは炎症・免疫応答に深く関与している可能性がある。今回の研究では、研究代表者が確立したLC-MS/MSを用いたLPIの測定系を用いて、様々な系におけるLPIの産生を調べた。その結果、マウス血中には相当量のLPIが存在することが分かった。最も多量に含まれていたのはアラキドン酸を含むLPIで、次いでステアリン酸を含むLPI、リノール酸を含むLPIであった。更に、血漿を加温することにより、種々のLPI分子種のうち、2-アラキドノイルLPIが選択的に産生されることも見いだした。このことは、LPIの産生にはホスホリパーゼA1が関与していることを示すものである。また、体内では、LPI、特に2-アラキドノイルLPIの産生および分解または取り込みが常に起こっていることも示唆される。GPR55に対しては、2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことから、2-アラキドノイルLPIが選択的に代謝回転していることは大変興味深い。研究代表者が本研究で確立したLC-MS/MSの測定系を用いて様々な系におけるLPIの産生を調べたところ、マウス血中には相当量のLPIが存在し、さらに、血漿を加温することにより2-アラキドノイルLPIが選択的に産生されることを見いだした。このことは、加温血漿におけるLPIの産生にはホスホリパーゼA1が関与していることを示すものである。また、体内でLPI、特に2-アラキドノイルLPIの産生と分解又は取り込みが常に起こっていることも示唆される。GPR55に対しては2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことから、2-アラキドノイルLPIが選択的に代謝回転していることは大変興味深い。

H26年度は育児休業により研究中断していたため、研究は進んでいないが、研究再開後はこの点を明らかにしたい。研究代表者は、これまでの研究で、新規カンナビノイド受容体として報告されたGタンパク質共役型のオーファン受容体GPR55の内在性リガンドが、リゾリン脂質の一種であるリゾホスファチジルイノシトール(LPI)であることを明らかにした。LPIに対する受容体の同定は研究代表者の報告が初めてである。LPIは代謝回転の早い不安定な化合物である。そのため、刺激に応じて速やかに産生され、代謝されると考えられるが、具体的なことは分かっていない。研究代表者が本研究で確立したLC-MS/MSの測定系を用いて様々な系におけるLPIの産生を調べたところ、マウス血中には相当量のLPIが存在し、さらに、血漿を加温することにより2-アラキドノイルLPIが選択的に産生されることを見いだした。このことは、加温血漿におけるLPIの産生にはホスホリパーゼA1が関与していることを示すものである。また、体内でLPI、特に2-アラキドノイルLPIの産生と分解又は取り込みが常に起こっていることも示唆される。一方、アレルギー性炎症においても、2-アラキドノイルLPIが産生されていることが分かった。研究代表者はこれまでに、2-アラキドノイルグリセロール(2-AG、カンナビノイド受容体の内在性リガンド)がアレルギー性炎症に伴って増大することを報告してきた。2-AGはアラキドン酸含有ホスファチジルイノシトールからジアシルグリセロールを経て産生されると考えられてきたが、今回、炎症部位で2-アラキドノイルLPIの増大が観察されたことから、LPI経由の2-AG産生ルートが考えられた。今後は本当にLPIから2-AGが産生されるかどうか、酵素の同定を含め、検討を行う予定である。GPR55は、新規カンナビノイド受容体(マリファナ受容体)として報告された受容体で、その内在性リガンドは、リゾホスファチジルイノシトール(LPI)である。今回の研究で確立したLC-MS/MSの測定系を用いて様々な系におけるLPIの産生を調べたところ、マウス脾細胞をマイトジェン刺激した際や血漿を加温した時、アレルギー性炎症において、2-アラキドノイルLPIが選択的に産生されることが分かった。GPR55は免疫系に多く発現していること、種々のLPI分子種のうち、2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことから、2-アラキドノイルLPIは炎症・免疫応答に深く関与している可能性がある。H26年度は、育児休業により年度を通して研究を中断していたため。脂質生化学研究再開後は、LPIの産生についてさらに詳しく調べ、GPR55とその内在性リガンドであるLPIの生理的意義を調べる。種々の培養細胞や、動物細胞から調整した血小板、リンパ球などをリポポリサッカライドやTNF-α等で刺激したときにLPIが産生されるかどうかをLC-MS/MSを用いて調べる。LPIは、ホスファチジルイノシトール(PI)からホスホリパーゼA1又はA2によって産生されると考えられるが、詳しいことは分かっていない。どのタイプのホスホリパーゼA1又はA2によりLPIが産生されるのかを明らかにしたい。LC-MS/MSを用いたLPIの微量分析の系を確立することができた。得られたマスクロマトグラムのピーク面積をプロットしたところ、30 pmolまで良好な直線性を有する検量線が得られ、検出限界はおよそ30 fmolであった。本研究で確立した分析条件では、LPIをそれぞれの分子種ごと、また、1-アシル体と2-アシル体を分けて検出できることが分かった。
傾斜濃度勾配法による均質組成化合物半導体の育成

傾斜濃度勾配法による化合物半導体結晶の育成について、理論・数値解析を行った。まず、二元系化合物半導体結晶成長モデルを開発し、結晶成長過程(溶液内速度・温度・濃度場、結晶内温度・濃度場、結晶界面形状、結晶界面成長)が数値的に解析できるようになった。上記解析モデルと計算手法を用いて、傾斜濃度勾配法による二元系化合物半導体の結晶成長過程を解析した。結晶成長方法としてBridgman法とzone法を採用した。本研究によって、以下の結果が得られた:(a)微小重力場においても、Bridgman法で結晶成長させた場合には、浮力対流の影響が強く、溶液中に過冷却が誘起され、結晶界面が歪められ、均一組成の結晶育成は非常に困難である。(b)Zone法で結晶を育成した場合には、zone幅を変えることにより溶液内対流が大きく変化する。結晶径によらず、zone幅が20mmを越えると浮力対流の影響が顕著となり、高品質結晶が育成できないが、zone幅が15mmの場合には、対流および過冷却が抑えられ、ほぼ拡散律則で結晶成長する。また、溶液内温度勾配を10K/cmに設定することで、均質組成結晶の育成が可能となる。上記結果を踏まえ、均質組成化合物半導体の育成条件を以下にまとめる:(a)微小重力場でzone法を採用する。(b)Zone内溶液に傾斜濃度勾配を付与する。(c)初期zone幅を15mmにする。(d)ヒーター速さを0.5mm/h程度とする。(e)Zone内溶液中の温度勾配を10K/cmとする。以上の条件により:(a)拡散律則成長;(b)過冷却の低減;(c)均質組成結晶の成長が可能となる。今後は、上記結晶条件により、実際に結晶成長実験をする必要がある。少なくとも結晶径が5mm以下の場合には、地上重力下においても、均質組成結晶を育成できる可能性があるので、地上実験を行う必要がある。本年度は、二元系化合物半導体の結晶成長モデルとそのコンピュータシミュレーション法を開発し、微小重力環境下におけるInAs-GaAs結晶成長解析を行った。傾斜濃度勾配法による結晶成長は微小重力場においてのみ実現されるため、国際宇宙ステーションにおける残留重力、g-jitter等のデータを基に計算を行った。また、地上においてInAs-GaAsの成長実験を行い、組成の均一性について検討した。本年度の研究結果は以下のとおりである;(1)10^<-6>gという微小重力場においても、浮力対流によって濃度場が拡散状態とは大きく異なり、結晶界面形状が歪む。(2)結晶成長方向が重力と反平行となる場合に、均質結晶をもっとも育成しやすい。実際の宇宙ステーションでは、この条件は満足されないため、均質組成結晶育成の新たな手法を開発する必要がある。(3)結晶成長におよぼすg-jitterの影響は無視できる。(4)結晶成長におよぼすSoret効果の影響は無視できる。(5)溶液内に発生する組成的過冷却度は小さい。(6)Bridgman法では均一組成結晶を育成することは困難である。(7)均一組成結晶の育成にはZone法の方が適している。(8)結晶径を小さくすることにより、地上においてもある程度均質な組成を持つ結晶は育成できるが、単結晶化は困難である。

今年度の成果を基に、来年度は、Zone法による均質組成InGaAs結晶成長の実験的・理論的解析を行う。昨年度、Bridgman法による結晶成長を解析した結果、1μgという微小重力下においても二元系化合物半導体の場合には、結晶成長過程が拡散律則とはならず、結晶界面が歪み、均質組成結晶が育成されないことがわかった。そこで、本年度は結晶育成方法として、傾斜濃度勾配法とzone法を組み合わせた方法を採用した。zone法による結晶成長過程のシミュレーション法を開発し、1gと1μg下における結晶成長解析を行った。解析によって、以下の結果を得た:(a)Bridgman法に比べてzone法の場合には、溶液内対流が非常に弱くなる。(b)一般に、1g下では溶液内の結晶界面近傍に強い過冷却領域が発生する。1μg下においても弱い過冷却領域が溶液中央部に発生する。(c)1g下では、結晶径が5mmを越すと対流速度と過冷却度が極端に増し、単結晶育成が困難となる。(d)1μg下では、ゾーン幅20mmおよび結晶径20mmの結晶成長においてもほぼ拡散律則となる。今後は、傾斜濃度勾配法とzone法による結晶成長をさらに詳しく解析し、均一組成単結晶育成のための最適条件を求める。傾斜濃度勾配法による化合物半導体結晶の育成について、理論・数値解析を行った。昨年度の解析より、微小重力場においても、Bridgman法で結晶成長させた場合には、浮力対流の影響が強く、溶液中に過冷却が誘起され、結晶界面が歪められ、均一組成の結晶が育成できないことがわかった。今年度は、上記結果を踏まえ、zone法による結晶成長解析を行った。Zone法で結晶を育成した場合には、zone幅を変えることにより溶液内対流が大きく変化することがわかった。結晶径によらず、zone幅が20mmを越えると浮力対流の影響が顕著となり、高品質結晶が育成できないが、zone幅が15mmの場合には、対流および過冷却が抑えられ、ほぼ拡散律則で結晶成長することがわかった。また、溶液内温度勾配を10K/cmに設定することで、均質組成結晶の育成が可能となることがわかった。つまり、(1)微小重力場でzone法を採用すること;(2)Zone内溶液に傾斜濃度勾配を付与すること;(3)初期zone幅を15mmにすること;(4)ヒーター速さを0.5mm/h程度とすること;(5)Zone内溶液中の温度勾配を10K/cmとすること;により、(1)拡散律則成長;(2)過冷却の低減;(3)均質組成結晶の成長が可能となることがわかった。今後は、上記結晶条件により、実際に結晶成長実験をする必要がある。少なくとも結晶径が5mm以下の場合には、地上重力下においても、均質組成結晶を育成できる可能性があるので、地上実験を行う必要がある。
ユビキチン・プロテアソーム系による酵母細胞機能制御の解析

出芽酵母の26Sプロテアソームの調節因子の構成成分の一つとして昨年までの研究で同定されたRpn9に関して遺伝学ならびに生化学からの研究を進めた。遺伝学的アプローチ:昨年までに、rpn9Δが温度感受性増殖を示すことを利用して多数の復帰突然変異体が分離されていた。今年度はこれらの復帰変異体を分類し、原因遺伝子のクローニングを開始した。一つの優性復帰突然変異はATPase遺伝子RPT3に生じたものであることを明らかにし、突然変異による塩基置換が保存領域SHR内にあることを突き止めた。他の優性変異遺伝子を遺伝的マッピングにより分類した。劣性の復帰変異についても変異遺伝子を染色体上にマッピングすることにより、ポジショナルクローニングを進めている。生化学的アプローチ:ヒト26Sプロテアソームの調節因子の新規構成成分p28の酵母ホモログ(Rpn13)を同定し、それに対する抗体を作製した。これを用いて、Rpn13が酵母のプロテアソームの構成成分であるかどうかを検討したところ、Rpn13は26Sプロテアソーム中には無いが、Rpt1と共沈するので、26Sプロテアソームの成熟段階にトランジエントに存在することが分かった。rpn9Δ株の抽出液をグリセロール濃度勾配遠心で分画した後、各分画を非変成ポリアクリルアミド電気泳動法により再分離すると、野生型と比べて成熟途中のプロテアソームが蓄積していることが分かった。この結果から、Rpn9は26Sプロテアソームの集合に関与することが予想された。
癌胎児性抗原(CEA)をコードする遺伝子のクローニングとその発現の機序について

癌胎児性抗原(CEA)は初めヒト内胚葉由来消化器癌組織に共通に出現する抗原物質として同定されたが、その後消化器以外の癌や非腫瘍性疾患でもCEAの上昇がみられ更にCEA関連抗原が正常組織中にも認められ、CEA遺伝子の発現の多様性が問題となった。我々はCEA蛋白部分に対する多くのモノクローナル抗体を確立した。次にこれらの材料をもとにCEAをコードするCDNA遺伝子のクローニングを行い、クローン化されたCDNAを用いて種々の癌細胞、正常組織でのCEA遺伝子の発現状態を検索することを試みた。CEAを高度に産生しているヒト胃癌細胞株(MKN-45)よりmRNAを抽出し、in vitro translation assayとモノクローナル抗体により活性のあるmRNA分画を得た。このRNAよりcDNAを作製後、末端をEcoRIサイトとしてλg+11のベクターに組み込みcDNAライブラリーを作製した。λg+11発現ベクターによって得られたファージプラークをELISA法にてモノクローナル抗体で検索した。またCEA,NCA-2のアミノ酸配列について、CEAとNCA-2とで明らかにアミノ酸配列の異なる領域と共通の領域について14merの合成オリゴヌクレオチドを合成しプローブとして用いた。現在、CEAをコードしていると思われるいくつかのクローンを得たので解析中である。
高化学選択性発現のための求核的活性法の開拓

今回昨年度より引き続き酸化的なエノラートのクロスカップリング反応の開発とその反応機構解析、それに基づく新たな酸化的クロスカップリング反応の開発を行った。これまでにアズラクトンとアシルイミダゾールをエノラート前駆体として用いる触媒的酸化的クロスカップリング反応の開発に成功している。今回開発した反応の特徴として、通常酸化的なエノラートのクロスカップリング反応では問題となるホモカップリング体を経由することで、過剰量の反応基質を用いること無く高収率で目的物を得ることが可能である。また本反応の詳細な反応機構解析を行った結果、Lewis酸性の高い鉄のカチオン種が生成し、アシルイミダゾールのエノラート化に寄与していることが示唆された。続いて、鉄触媒によるアシルイミダゾールの効率的な活性化が可能であることを活用し、炭化水素とアシルイミダゾールとの酸化的クロスカップリング反応の開発に着手した。これまでにカルボニル化合物と炭化水素との酸化的クロスカップリング反応はいくつか報告例があるものの、いずれもエノール化が容易に進行する1,3-ジカルボニル化合物が用いられており、また高温条件が必要であった。さらに過酷な反応条件のため、炭化水素同士のホモカップリング体の生成も問題となっている。モデル反応としてトルエンをベンジル化試薬として検討を行ったところ、エノラートの酸化的クロスカップリング反応と同様に本反応においても、配位子の添加による顕著な反応加速効果が確認された。本反応では配位子としてホスフィンオキシドが最も効果的で、温和な条件下においても目的のベンジル化体を高収率で得ることが可能であり、トルエン由来のホモカップリング体はほとんど観測されない。反応機構解析の結果、配位子はtert-butoxy radical種の生成を加速させ、トルエンのC-H結合活性化が円滑に進行することが示唆されている。29年度が最終年度であるため、記入しない。触媒的酸化的クロスカップリング反応は、反応基質のハロゲン化等の事前官能基化を必要としない理想的な合成プロセスである。本年度は、これまで触媒的な反応が困難であった酸化的クロスエノラートカップリング反応の開発に着手した。酸化的クロスエノラートカップリングでは、目的のクロスカップリング体に加えて、望みでないホモカップリング体の生成が副生してしまう。そのため一般に、エノラートの事前活性化が必須であり、また化学量論量以上の金属酸化剤が用いられていた。これらの問題点を解決すべく我々は、新たなアプローチとしてホモカップリング体の炭素ー炭素結合活性化によるクロスカップリング体への収束反応に着目した。種々検討を行った結果、アズラクトンを用いることで鉄触媒、配位子存在下、望みのクロスカップリング体を得ることに成功した。またこれまでエノラートの酸化的クロスカップリングでは達成されていない連続四置換炭素の構築にも成功した。さらに本反応では等量の反応基質を用いた場合においても高収率で目的物を得ることに成功している。またエノラート以外にもα位の直接的なアリール化も進行することを見出した。反応機構解析として、アズラクトンのホモカップリング体を反応基質として用いて検討を行った場合において、目的のクロスカップリング体を良好な収率で得られた。本結果は、本反応ではまずホモカップリング体が生成した後に、クロスカップリング体が生成していることを示唆している。また本反応では配位子の効果が顕著であり、鉄触媒と配位子により生成する触媒活性がクロスカップリング体への収束反応に重要であることが示唆された。本年では触媒的な酸化的クロスエノラートカップリング反応を開発することに成功し、予備的な反応機構解析も行った。開発した反応の立体選択的な反応開発を行う。
光プローブによる結晶成長の原子・分子レベルの新しいその場観察法の研究-表面光干渉法-

本研究では、本申請者らが開発した表面光干渉法(Surface Photo-Interference:SPI)と呼ぶ新しい原理に基づいた原子・分子レベルでの成膜モニターについて、下記のように検討を進め、MOVPEなどの非真空系での化合物半導体のヘテロエピ成長でのその場観察手段として有効であることを確認・実証した。まず、GaAs基板上へのZnSe成長とともにCdSeの成長についても、MOVPEとMOMBE成長系でのヘテロエピ成長過程のSPIによる解析をすすめ、実験結果を詳細に比較検討し、両者では成膜素過程に大きな相違があることを明らかにし、今後の伝導性制御への有効な知見を得た。次に、多波長のSPI信号の同時測定のための準備として、プローブ光の波長を変えた場合の理論解析をすすめ、プローブ光のエネルギーが成長中の半導体のエネルギーギャップより大きい場合であってもSPI信号が得られることを確認した。これに基づき、ハロゲンランプを光源として白色光ビームをつくり、これをプローブ光として得られた反射光を、光マルチチャネルアナライザーで多波長のSPI信号を同時に検知する分光SPI信号測定系を構成した。これにより、表面反応に基づくと考えられる分光SPI信号の測定に成功したが、分光SPIではヘテロエピ膜の厚さの変化につれてスペクトル構造が変化することがわかり、現在、詳細な解析を進めている。この分光SPI信号は、SPI信号をより発展させた形で、MOVPE系での有望な成膜モニターと成ると考えられる。本研究で提案している表面光干渉(SPI)法は、半導体薄膜のエピタキシャル成長での原子・分子レベルでの成膜モニターとしての新しいその場観察法である。本年度は、まず、SPI法の原理と特徴について、GaAs基板上のZnSeの成長を例に取り、プローブ光として紫外から近赤外までの光を用い、かつ、入射角度をパラメータとした理論的解析を行った。次にZnSeおよびCdSeのMOMBE成長について実験的検討を行った。これに基づきII-VI族化合物のエピタキシーでの表面反応過程を解析した。主な結論を以下に示す。1.表面光干渉法では、化合物半導体のヘテロエピタキシーにおいて、最表面に交互に出現する構成元素の光学定数の内、主として虚数部の変化により、反射・透過時に大きな位相変化を受け、これがヘテロエピ膜全体での光干渉強度に影響し、これにより、原子・分子レベルでの成膜モニターを可能としている。2.上記理由により、プローブ光としては成長中の薄膜に吸収されない低エネルギーのレーザ等を使うことが好ましい。しかし、紫外光などであっても、II-VI族やIII-V族化合物半導体では光の侵入長がおよそ100nm程度はあるので、量子効果を期待するような超格子構造などの一層の膜厚よりは十分大きいので、表面光干渉(SPI)法はどのようなヘテロエピ成長系にも適用可能である。3.ZnSeとCdSeのMOMBE成長では前者がII族原料供給時に主たる成膜反応がおこるが、後者では逆にVI族原料供給時成膜反応がおこるなど、その成膜素過程が大きく異なっており、不純物添加などではこれを考慮して最適化を図る必要がある。本研究では、本申請者らが開発した表面光干渉法(Surface Photo-lnterference:SPI)と呼ぶ新しい原理に基づいた原子・分子レベルでの成膜モニターについて、下記のように検討を進め、MOVPEなどの非真空系での化合物半導体のヘテロエピ成長でのその場観察手段として有効であることを確認・実証した。

これに基づき、ハロゲンランプを光源として白色光ビームをつくり、これをプローブ光として得られた反射光を、光マルチチャンネルアナライザーで多波長のSPI信号を同時に検知する分光SPI信号測定系を構成した。これにより、表面反応に基づくと考えられる分光SPI信号の測定に成功したが、分光SPIではヘテロエピ膜の厚さの変化につれてスペクトル構造が変化することがわかり、現在、詳細な解析を進めている。この分光SPI信号は、SPI信号をより発展させた形で、MOVPE系での有望な成膜モニターと成ると考えられる。
骨髄増殖性腫瘍における重複遺伝子異常の意義及び急性転化メカニズムの解明

遺伝子改変マウス、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入法、骨髄移植法などの材料・手法を用いて、JAK2変異(JAK2V617F)、TET2欠損、CBFb-MYH11融合遺伝子の遺伝子異常を2重3重で有するマウスモデルを作成した。「JAK2変異+TET2欠損」、「JAK2変異+CBFb-MYH11融合遺伝子」の2重異常モデルでは急性転化は生じなかった。つまり、JAK2変異骨髄増殖性腫瘍の急性転化には2つ以上の付加的異常が必要である。上記遺伝子異常の3重異常モデルを作成し解析に着手した。骨髄増殖性腫瘍の急性転化を検討するにあたり、計画書記載モデル2:「JAK2変異+転写因子異常」による2重変異モデルを作成した。転写因子異常としてRUNX1変異と類似の効果(分化阻害作用)を有するCBFb-MYH11融合遺伝子を用いた。JAK2V617F変異マウスの骨髄細胞(Ly5.2)にレトロウイルスベクターで融合遺伝子を導入後、同細胞を野生型骨髄細胞(Ly5.1)とともに放射線照射マウス(Ly5.1)に移植した(Double群)。コントロールとして、野生型骨髄細胞に空ベクターを導入した群(WT群)または融合遺伝子を導入した群(CBFb-MYH11群)、およびJAK2変異骨髄細胞に空ベクターを導入した群(JAK2V617F群)を作成した。6ヶ月以上の長期観察では、Double群における末梢血血球数、末梢血/骨髄/脾臓の遺伝子導入細胞(GFP陽性細胞)の比率、およびc-kit陽性細胞の比率はコントロール群と差はみられず、「JAK2変異+転写因子異常」では急性転化は生じないことが明らかとなった。次に、計画書記載モデル3:「JAK2変異+エピゲノム異常+転写因子異常」による3重変異モデルの基盤となる、「JAK2変異+エピゲノム異常」による2重変異モデルを作成した。エピゲノム異常としてTET2欠損を用いた。各々の変異マウスの交配により得られた2重変異胎児肝細胞(Ly5.2)を放射線照射マウス(Ly5.1)に移植した(Double群)。コントロールとして、野生型または単独変異の胎児肝細胞を移植した群(WT群、TET2欠損群、JAK2V617F群)を作成した。12ヶ月の長期観察では、Double群においてJAK2V617F群と比較し慢性期病態の増悪がみられたが急性転化はみられず、「JAK2変異+エピゲノム異常」では急性転化は生じないことが明らかとなった。骨髄増殖性腫瘍の急性転化メカニズムを検討するにあたり、計画ではモデル1:「エピゲノム異常+転写因子異常」による2重変異モデル、モデル2:「JAK2変異+転写因子異常」による2重変異モデル、モデル3:「JAK2変異+エピゲノム異常+転写因子異常」による3重変異モデルの、3つの多重変異モデルの解析を予定している。このうち、現在までにモデル2、およびモデル3の基盤となる「JAK2変異+エピゲノム異常」の作成・解析が修了し、各々急性転化が生じないことが明らかとなった。急性転化のメカニズムとして「エピゲノム異常+転写因子異常」の組み合わせが重要である可能性が残されているため、引き続きモデル1およびモデル3の作成を進めている。骨髄増殖性腫瘍は、時に急性白血病へ転化し、その場合の予後は不良である。遺伝子変異の多段階蓄積により急性転化が生じると想定されるが、詳細な分子機構は未解明である。本研究では、慢性期に高頻度にみられるシグナル伝達異常であるJAK2変異(JAK2V617F)、エピゲノム異常であるTET2欠損のマウスモデルに、転写因子RUNX1の機能異常を引き起こすCBFb-MYH11融合遺伝子を導入し、2重3重変異のモデルを作成し、急性転化が生じるかを検討した。2重3重変異モデルの作成に際しては、JAK2変異およびTET2欠損の遺伝子改変マウス同士の交配、骨髄細胞に対するレトロウイルスベクターを用いた融合遺伝子の導入、および骨髄移植などの実験手法を用いた。昨年度までに作成した「JAK2変異+転写因子異常」、および「JAK2変異+エピゲノム異常」による2重変異モデルにおいては、12ヶ月の長期観察で急性転化は認められなかった。本年度は「エピゲノム異常+転写因子異常」による2重変異モデル、および「JAK2変異+エピゲノム異常+転写因子異常」による3重変異モデルを作成し、解析を行った。骨髄細胞に対するレトロウイルスベクターを用いたCBFb-MYH11融合遺伝子の導入は約20%の効率で可能であり、遺伝子導入後の全骨髄細胞をレシピエントマウスに移植し、上記モデルマウスを作成した。作成したモデルマウスにおいて、現在までの約2ヶ月の観察期間内では急性転化は認められなかった。また本研究から派生して、シグナル伝達異常と慢性血小板増多を呈するCALR変異マウス、およびCALR変異とTET2欠損の2重変異マウスを作成し、急性転化の有無について検討を開始した。これらの作成済みのモデルにおいて急性転化が生じるかについては、引き続き観察が必要である。

上記遺伝子異常の3重異常モデルを作成し解析に着手した。モデル1:「エピゲノム異常+転写因子異常」の作成法としては、TET2欠損胎児肝細胞(Ly5.2)にレトロウイルスベクターでCBFb-MYH11融合遺伝子を導入後、放射線照射マウス(Ly5.1)に移植する方法を予定している。モデル3:「JAK2変異+エピゲノム異常+転写因子異常」の作成法としては、JAK2V617F変異マウスとTET2欠損マウスの交配で得られる2重変異胎児肝細胞(Ly5.2)にレトロウイルスベクターでCBFb-MYH11融合遺伝子を導入後、放射線照射マウス(Ly5.1)に移植する方法を予定している。いずれのモデルにおいても、コントロール群として空ベクターを導入した群を作成する。末梢血血球数、変異クローンのキメリズムの推移、血球異形の有無、細胞免疫学的所見、組織学的所見やマウスの生存期間から、急性転化の有無を判断する。白血病細胞の増殖がみられる場合には罹患マウスの骨髄細胞の継代移植を行い、骨髄細胞中に白血病幹細胞が含まれているかどうかを確認する。セルソーターを用いた細胞分取と分画毎の継代移植を行い、白血病幹細胞が骨髄のどの分画に高頻度に含まれているかを明らかにする。白血病幹細胞分画と正常造血幹細胞分画の遺伝子発現パターンをマイクロアレイで比較し、白血病幹細胞分画で異常発現している遺伝子群を同定し発症メカニズムを明らかにする。また異常発現している遺伝子群の中から新たな治療標的分子を探索する。血液内科学
ウイルスを認識し抑制する新規分子群の単離とその機能

C型肝炎ウイルスや新型インフルエンザ等のウイルス感染症は個人の健康や社会全体にとって解決されるべき切実な問題である。上記のウイルスはRNAをゲノムに持つため細胞内では、ウイルスRNAを認識する受容体によって認識されI型インターフェロンを初めとした免疫応答が誘導されウイルスを排除する。しかし、この仕組みの多くは謎であり、この仕組みを解決することが新たな治療薬や治療法開発にとって必須である。本研究では、ウイルス感染時のI型インターフェロン産生に必要な未知の分子の探索を行い、Ripletと名付けた新たな分子と、細胞内のDDX3と呼ばれるヘリケースがウイルスの排除に非常に重要なことを発見した。C型肝炎ウイルスや鳥インフルエンザなど、ウイルスによる感染症問題はその解決が社会的に要請される重要な問題である。これらウイルス感染の抑制にはヒトのI型インターフェロン(IFN)応答が重要である。近年、このIFN応答の分子基盤が明らかになりつつあり、ウイルスによる感染症対策の為の重要な基礎基盤が確立されつつある。しかし、その全貌はまだ明らかになっていない。本研究では、ヒトのIFN応答に関わる分子群の探索を行い、酵母のTwo-hybrid法によるスクリーニングによって、ヒトの肺のcDNAライブラリー中から、新たにRipletと申請者が名付けた分子を単離した。RipletはRNAウイルス感染時にそのRNAを認識する細胞質内受容体のRIG-I分子と結合すること、また、結合することによりRIG-I分子をユビキチン化することで、RIG-I分子を活性化することを明らかにした。Ripletを過剰発現させると、水泡性口内炎ウイルス(VSV)感染時のIFN応答が増強されうこと、またRiplet遺伝子の発現をsiRNAを用いて減少させるとIFN応答が減少したことから、Riplet分子がウイルス感染時にIFN応答においてRIG-Iを活性化させることで、IFN産生のシグナルを増強することを解明した。RIG-IはC型肝炎ウイルスやインフルエンザの認識に関わることから、本研究で明らかにしたRiplet分子が、これらC型肝炎ウイルスやインフルエンザの感染時の工FN応答に関与することが期待され今後の研究が進展することが期待される。また、現在、Ripletノックアウトマウスを作成している。ヒトでは最近になって、Ripletは遺伝病の原因遺伝子として同定され、ヘテロ欠損で発達や学習能力に異常がでることが知られている。現在作成中であるRipletノックアウトマウスも、90%程度の効率のキメラ率を持つマウスは同腹の個体と比較し発達に異常が観られることから、Ripletノックアウトマウスが、ウイルス感染時のIFN応答に加えて、ヒト遺伝病のモデルマウスとなることが期待される。ウイルス感染時にはI型インターフェロン産生が生体防御の最初の過程で働く。これは樹状細胞やマクロファージ等の細胞から主に産生されるが、この時、細胞内センサーのRIG-Iと呼ばれる分子がウイルスのRNAを認識し、I型インターフェロン産生のシグナルを出す。ウイルスはそのため、このRIG-I経路を抑制することで宿主のI型インターフェロン産生を抑制し、宿主の免疫反応を逃れる。RIG-Iに依存した経路に関わる分子には未知の分子があり、またウイルスによるその抑制メカニズムも十分に解明されていない。そこで、本研究では、このRIG-Iに依存した経路に関わる未知の分子の探索を行った。マイクロアレイと分子間相互作用を指標にRIG-Iと結合する分子として新規分子のRiplet分子、また、細胞内RNAヘリケースのDDX3がRIG-Iと結合することを新たに発見した。興味深いことに、RipletはRIG-IのC末端と結合し、ウイルス感染時にRIG-IのC末端をユビキチン化し、その活性化を引き起こすことで、ウイルス感染時のI型インターフェロン産生に関与することが明らかとなった。また、DDX3はRIG-Iとそのアダプター分子のIPS-I分子の両方に結合すること、細胞内でRIG-Iと共局在をすることを明らかとした。さらに、DDX3分子をノックダウンすることRIG-Iに依存したI型インターフェロン産生が減少したことから、RIG-I経路を正に制御する分子であることを発見した。この時の制御にはC末端の20アミノ酸の領域が重要であることが試験管内の解析から明らかとなった。
19世紀ドイツにおける古典生成とゲーテ-規範化のメカニズムと記憶・伝播のメディア

本研究は19世紀におけるドイツ国民文学の生成過程を、ゲーテを古典化していくさまざま現象を取り上げ、それらを分析することによって明らかにした。以下に、本研究において対象とした諸現象のうち重要なものを挙げる-1.ヴィンケルマンにおける古代ギリシャ礼賛と近代批判-ゲーテ=ギリシャ人のディスクルスの源2.古代ギリシャのディオスクロイの近代における具現=ゲーテ・シラーのカップリングの成立(F.シュレーゲル)3.初期ロマン主義的読解術とゲーテの『マイスター』4.ゲーテの作品の「不妊性」-芸術による共生の不可能性(ハイネによるロマン派批判)5.規範化のメカニズム-選別と排除、普遍化と超越化、親密性の構築(「遅れてきた国民」と古典)6.引用される古典的名句-ゲオルク・ビューヒマンの構想7.自動販売機で売られる古典-廉価版となった古典8.「簡要文学史」と古典9.ゲーテの未完のプロジェクト-「民衆読本」の構想10.黙読する女性読者-ドロテーアとベッティーナ11.ゲーテ郵便王国とベッティーナの『往復書簡』12.「暴走するファンタジー」か、あるいは「中世を具現する存在」か?13.記念碑化されるゲーテ以上のようなテーマ群を分析することによって、19世紀におけるドイツ国民文学成立のなかでゲーテの古典化が重要な役割を果たしたことを明らかにし、イキリスとフランスとは異なるドイツ固有の古ギリシャにたいする関わりとゲーテ崇拝の関わりも取り上げた。1.ワイマールのアンナ・アマーリア図書館において、ゲーテ崇拝の系譜に関する以下の調査を遂行した。1)18世紀後半期におけるギリシャ学の興隆の特質と、ギリシャ精神の具現をゲーテに見る同時代の傾向。文献学者ハイネによるヴィンケルマン賞賛の文書、F.シュレーゲルのギリシャ学構想に関する貴重な資料を収集した。2)19世紀後半期におけるゲーテ学の形成に関する資料を収集した。ヘルマン・グリム関連の文書調査の過程で、当時のゲーテ学形成を批判する資料なども発見し、立体的な再構成が可能となった。3)ドイツの高等学校においてゲーテがどのように読まれるべく指導されたのかについて、当時の教員によって書かれた貴重な資料を収集した。4)世紀転換期から特に強まっていく極端なゲーテ崇拝の傾向を代表する資料を収集し、同時にこのような時代思潮にたいする批判的言説についても、当時の雑誌などから抽出した。5)1932年のゲーテ没後150周年記念行事に関する多くの資料を収集した。2.ワイマールのゲーテ・シラー古文書館において、次のテーマに関するゲーテの手稿資料を調査した。1)ゲーテの民衆読本構想に関して調査を進めていく過程で、この構想に関する資料発見が1889年のゲーテ生誕140周年行事と関係している点が明らかとなった。つまり民衆読本構想は、ゲーテをドイツ国民作家として位置づける試みが文化政策として遂行される過程との関係のなかで読まれたのである。2)ゲーテの『プロゼルピーナ』の手稿資料を調査していくなかで、ゲーテの手稿資料のなかにゲーテ自身によらずに、口述や秘書に書かせた資料が多く含まれている点が鮮明になった。ゲーテ工房とも言うべきテキスト生成の創作現場が存在していたことを、これらの資料は語っている。今年度は、昨年3月にWeimarのAnna Amalia-Bibliothekで行った資料調査をもとに、「ギリシャ人と表象されるゲーテ」というテーマをめぐって、多面的な視点から研究を遂行した。その成果は、学習院大学ドイツ文学会『研究叢書』第8号に掲載した論文「ギリシャ人として表象されるゲーテ-シュレーゲルとハイネにおけるゲーテ崇拝のディスクルス」に凝縮されている。以下のような内容構成になっており、これまで考察されてこなかった現象をゲーテ崇拝を軸に分析した-1.胸像となるギリシャ1)理想の身体=古代ギリシャの彫像2)不在の身体の代理機能=記念碑(胸像・メダリエetc.)2.古代ギリシャ風に生きる-フリードリヒ・シュレーゲル3.規範性と歴史性-ゲーテとギリシャ4.ハイネにおけるゲーテ崇拝のディスクルス1)「原-著者」

ゲーテにたいする「嫉妬」-ロマン派的心性の共有2)ゲーテの作品の「不妊性」-芸術による共生の不可能性2004年3月にWeimarのAnna Amalia-Bibliothekにおいて、ニーチェにおけるゲーテ崇拝現象を分析するための徹底した資料調査を遂行し、その成果は2004年度中に発表される。1)平成16年9月2日から4日までアーヘン工科大学文学部で開催されたシンポジウムにおいて、二つの講演"Die Entwicklung des japanischen Schriftsystems"と"Die Rezeptionausserchinesischer Schriftsysteme im Japanischen"を行った。この講演の枠組みのなかで、特に文字の伝承と新しい文字の成立に関連して、本研究の方法論的成果を十分に活用した。また、ゲーテが文字に関して記述している、これまであまり考察されてこなかった領域についても、このシンポジウムのテーマの枠組みのなかで紹介し分析した。3)学燈社刊行『國文學』創刊50周年記念号『森鴎外の問題系』に、論文「森鴎外と演劇」を発表し、日本の演劇の近代化に果たしたゲーテ受容に言及しながら、ドイツにおけるゲーテの規範化の問題にも触れた。ドイツ演劇における形式の形成に関するゲーテの発言は、現代再びアクチュアルな問題になっている点にも言及した。4)さらに、明治大学図書館刊行の機関誌『図書の譜』に、雑誌ユーゲントに関する論文を発表し、同雑誌におけるゲーテ受容の特質について分析した。現在、雑誌ジンプリチスムスにおけるゲーテの表象についても分析を進めている。5)ニーチェにおけるゲーテ受容の変遷について、大学院の授業で集中的に取り上げた。ニーチェにおけるカノンの意味、形式の継承の意味を探る上で、ゲーテが重要な位置にあることが明かとなり、現在その成果の公表を準備中である。
ガット/WTOにおけるダンピング防止税制度の機能

第2次世界大戦直後の起草当時のガット6条のもとでは、ダンピング防止税の二面性に対応し、非関税障壁となりうるダンピング防止税の濫用を抑えることが図られると同時に、「異常かつ一時的な競争」を防止するという一定の機能がダンピング防止税に認められていた。ガットは戦後自由貿易体制を構築するという米国の理想主義的な構想に基づいていたこと、ダンピング防止税制度の理論的根拠として異常競争防止説という当時の自由貿易主義的経済学の学説があったこと、そして、圧倒的な経済力を持つ米国が自国産業の輸出市場を確保するために非関税障壁の削減・撤廃を進めようとしていたこと、この3つの要因が重なり合って、非関税障壁としてのダンピング防止税に限定的な機能が認められたのである。しかし、これら3つの要因については、1960年代末を境に大きな変化が生じた。米国内では保護貿易主義が高揚し、米国ダンピング防止税法上、国際的価格差別でないコスト割れ販売にもダンピング防止税の対象が拡大し、さらに国内産業への損害が程度の低いものであってもダンピング防止税が発動されるようになった。また、それに呼応して学説上も、これらの措置を正当化するような競争条件平準化説と緩衝的制度説が主張された。東京ラウンドとウルグアイラウンドでは、このような米国等によるダンピング防止税の機能拡大が正当かどうか明確な結論が出なかったため、WTOダンピング防止税協定は、緩衝的制度説や競争条件平準化説の主張するダンピング防止税の機能を否定はしていないものの、積極的に是認したともいえない法的構造となっている。なお経済学の学説では、異常競争防止説から競争政策説への理論的変遷があり、ガット6条の成立時よりもさらにダンピング防止税の発動を厳しく制約する方向へ推移したが、現行制度を裏付ける理論的基盤とはなっていない。本研究は、ガット/WTOにおけるダンピング防止税制度の機能を国際経済法学の観点から分析し、あるべき改革の方向を見出すことを目的とする。ダンピング防止税制度をめぐっては、一方で、自由貿易原則に反する非関税障壁だという非難がなされるが、他方で、自由貿易体制にとって必要な制度であるという擁護論も存在する。そこで本研究ではこれら従来の議論を整理した上で、ダンピング防止税制度は、なぜ自由貿易体制において必要なのかを分析することを試みている。本年度においては、まず、各国国内法上のダンピング防止税制度の誕生、国際法規としてのガット6条の成立、東京ラウンド及びウルグアイ・ラウンドにおけるダンピング防止税協定の交渉といった、一連の歴史的過程の中で、ダンピング防止税制度の趣旨・目的・機能がどのように考えられてきたか検討した。具体的には、第1に、第2次世界大戦前から現在までの各国のダンピング防止税制度についての旧法令・判例で、主として米国に関する資料を収集した。第2に、国際連盟、国際連合、ガット/WTO等で行なわれた国際交渉に関する資料も収集した。特にガット/WTOの公文書については、本研究にとって非常に重要な文書を、WTO本部(ジュネーヴ)において入手することができた。以上の資料を分析した結果、起草時におけるガット六条は、ダンピング防止税を基本的には非関税障壁の一つと位置づけていたが、東京ラウンド以降はダンピング防止税の必要性を強調する傾向が強まったことが明らかになった。そのため、ガット六条の正常価額要件と実質的損害要件は厳格なものとして起草されたが、近年ではこれを緩和してダンピング防止税を発動しようとされ、困難な解釈問題が発生することになったことも判った。すなわち、ダンピング防止税制度の趣旨・目的は、そもそもは異常競争防止説という理論的根拠に沿っていたと考えられ、諸要件もそれに合致したものであったが、その後、競争条件平準化説、緩衝的制度説、競争政策説等、諸説が提示され、ウルグアイ・ラウンド協定はこれらの理論的基盤に関する議論がまとまらないまま成立してしまったのである。

なお経済学の学説では、異常競争防止説から競争政策説への理論的変遷があり、ガット6条の成立時よりもさらにダンピング防止税の発動を厳しく制約する方向へ推移したが、現行制度を裏付ける理論的基盤とはなっていない。
モデル膜を使用した溶血性タンパク質の膜チャンネル(超分子)形成機構の研究

標的細胞に膜孔(membrane pore)を形成し細胞障害作用を示すタンパク質が、生物界には広範囲に存在し、孔形成タンパク質と呼称されている。本研究では,我々がヒラタケ(Pleurotus ostreatus)の子実体抽出液中に発見し、精製に成功した二成分溶血素、POHによる膜孔超分子の形成について検討した。POHは、A成分(15kDa)とB成分(59kDa)から成り、各々単独では溶血作用を示さないが、共存すると強力な溶血活性を発現する。A成分はスフィンゴミエリン結合タンパク質であり、単独で赤血球を球状化する。一方,POH-Bについては、その膜結合能は低く,脂質特異性も示さない.A、B成分の作用順序について検討した結果、A西部の赤血球への結合が先行し,その後にB成分が作用して溶血を起こす事実が明らかになった。ヒト赤血球に両成分を作用させると,赤血球内部のカリウムイオンの流出と赤血球の膨潤が溶血に先行するので,POHによるmembrane pore形成が推定された.種々の大きさのポリエチレングリコールによるPOHの溶血阻害効果を測定し、POHの二成分は赤血球膜に直径約4nmの膜孔を形成すると推定した.POHが形成する膜孔の分子的実体を知るために,A成分とB成分の膜結合状態を赤血球、及びスフィンゴミエリンから調製したリポソームを用いて解析した。これらの膜に結合した溶血素を界面活性剤で可溶化したのちにSDS電気泳動、またはゲル濾過法により分離して分析した結果、両成分は高分子複合体(>700kDa)を形成し、このA-B複合体が膜孔超分子を形成する可能性が示された。溶液中では共存していても互いに結合しない2種類のタンパク質が,スフィンゴミエリン膜の表面においては効率的に集合して機能性超分子を形成する点が興味深い.標的細胞に膜孔(membrane pore)を形成し細胞障害作用を示すタンパク質が、生物界には広範囲に存在し、孔形成タンパク質と呼称されている。溶液中では共存していても互いに結合しない2種類のタンパク質が,スフィンゴミエリン膜の表面においては効率的に集合して機能性超分子を形成する点が興味深い.
歯髄炎の病態形成における炎症－抗炎症バランス制御の解析

う蝕が進行すると、歯髄組織にエフェクターT細胞が浸潤し、プロスタグランディン(PG)などの炎症関連因子の産生が顕在化する。本研究では、歯髄炎の病態形成における炎症ー抗炎症バランスの役割について、歯髄細胞を用いて検討した。エフェクターT細胞から産生されるインターロイキン-17は歯髄細胞に対し、サイトカインであるCXCL10やCCL20の産生を誘導することが示された。一方、PGF2αは、活性化歯髄細胞おけるCCL20産生を増強させるがCXCL10産生を抑制させることが示された。本研究では、エフェクター細胞であるTh17細胞の歯髄炎における役割を検討するため、まず代表的な液性因子であるインターロイキン(IL)-17を歯髄細胞に作用させたときの炎症メディエーター発現について検討した。その結果、IL-17濃度依存的にCXCL10やvascular endothelial growth factor (VEGF)の産生が上昇することが示されたが、cyclooxygenase-2 (COX-2)の発現は認められなかった。また、歯髄細胞において恒常的に発現が認められるheat shock protein 27 (Hsp27)については、IL-17の影響はみられなかった。一方、Th1サイトカインのインターフェロン-γは歯髄細胞に対しCXCL10産生を強力に誘導したが、VEGFやCOX-2の発現は誘導されず、Hsp27発現にも影響を及ぼさなかった。これらの結果より、歯髄細胞は自然免疫応答に加え、エフェクターT細胞から産生される液性因子に対する反応性を有することから、歯髄炎の病態形成における役割の一端を担っている可能性が示唆された。また、歯髄の最外側に位置し外来刺激に対する最初の防御線となる象牙芽細胞に着目し、象牙芽細胞様細胞として樹立されたラットKN-3細胞を用いて、自然免疫受容体に対するリガンド刺激を行ったときのサイトカイン産生について検討した。その結果、NOD1リガンド刺激によりKN-3細胞におけるCCL20やMCP-1の発現誘導が認められたが、NOD2, TLR2またはTLR4リガンド刺激に対しては発現誘導は認められなかった。これは、歯髄細胞がこれらの自然免疫受容体に対するリガンド刺激に対し様々なサイトカイン産生を示したのと比較して、KN-3細胞は異なる反応性を示すことが明らかになった。臨床的に不可逆性歯髄炎と診断された炎症歯髄組織を採取し、ホルマリン固定・パラフィン包埋したのち、薄切組織切片を作製した。ヘマトキシリンエオジン染色にて炎症の程度を確認したのち、活性化T細胞に発現するCD45ROやB細胞に発現するCD20に対する免疫染色を行うとともに、Th17マーカーとされるCCR6発現について検討したところ、T細胞の集積が認められる領域にCCR6陽性細胞の発現を確認した。エフェクター細胞としてのTh17細胞から産生される液性因子が歯髄細胞に与える影響について検討するため、まず代表的な液性因子であるインターロイキン(IL)-17に対するレセプター発現をフローサイトメトリーにて解析した。その結果、IL-17レセプターであるIL-17RAおよびIL-17RCが歯髄細胞に発現していることが示された。また、炎症歯髄で産生亢進が認められているプロスタグランディン(PG)F2aに着目し、TLR2シグナルにより活性化された歯髄細胞に対するPGF2aの影響について炎症メディエーター(IL-8, CXCL10, CCL20)産生の観点から検討した。歯髄細胞にPGF2aを単独に作用させたところ、IL-8の産生が僅かながら亢進したが、CXCL10およびCCL20の産生亢進は認められなかった。さらに、TLR2リガンド刺激した歯髄細胞にPGF2aを共刺激させたところ、CCL20産生は相乗的に増強された。一方、CXCL10産生はPGF2a濃度依存的に抑制され、IL-8産生は影響を受けなかった。なお、歯髄細胞におけるPGF2aに対するレセプターであるFP receptor発現については、ウエスタンブロット解析により一定の発現量が維持されていた。これらの結果より、PGF2aは歯髄細胞における炎症メディエーター産生を調節している可能性が示唆された。本研究では、歯髄炎の病態形成における炎症ー抗炎症バランス制御機構を明らかにすることを目的とし、エフェクターT細胞やプロスタグランディンの役割を中心に解析を進めてきた。これまでの研究で、Th17細胞関連ケモカインレセプターであるCCR6を発現した細胞が歯髄炎組織に認められたことから、最終年度はCCR6リガンドであるCCL20に着目し、インターロイキン(IL)-17をヒト歯髄細胞に作用させたときのCCL20発現について検討した。その結果、IL-17濃度依存的にCCL20の産生が上昇することが示された。

さらに、IL-17刺激したヒト歯髄細胞に、炎症性サイトカインであるIL-1を加え共刺激したときのCCL20発現について検討したところ、CCL20産生誘導が相乗的に増強されることが示された。研究期間全体を通して、歯髄細胞はエフェクターT細胞から産生されるインターフェロン(IFN)-γやIL-17に応答し、CXCL10など様々な炎症メディエーター産生を誘導することやIL-1存在下ではその反応性が増強されることが示された。一方、プロスタグランディンF2alpha(PGF2α)は、自然免疫受容体に対するリガンド刺激にて活性化された歯髄細胞に対し、CCL20産生を相乗的に増強させるがCXCL10産生をPGF2α濃度依存的に抑制させることが示された。これらの結果より、細菌由来因子など自然免疫受容体に対するリガンド、エフェクターT細胞から産生されるIFN-γ等のサイトカインおよびIL-1等の炎症性サイトカインは歯髄組織構成細胞である歯髄細胞を活性化するが、PGF2αは一部の炎症メディエーター産生を抑制することから、歯髄炎の病態における調節的役割を果たしていることが示唆された。歯内治療学現在までの研究で、エフェクター細胞であるTh1サイトカインやTh17サイトカインに対し、歯髄細胞がCXCL10等の炎症メディエーターを産生することが示されており、歯髄炎における歯髄細胞の役割についての解析は順調に進行していると考えている。また、炎症ー抗炎症のバランス制御という観点からは、Treg細胞の解析が望まれるが、今までのところ炎症歯髄における発現があまり確認できていない。しかしながら前年度に、活性化された歯髄細胞におけるCXCL10産生を脂質メディエーターであるPGF2alphaが抑制することが明らかとなっており、正負のバランスに関する解析の一部は達成できていると考えている。炎症歯髄組織におけるTh17細胞マーカーの解析に関しては、その発現を確認することができ順調に進行していると考えている。一方で、Treg細胞マーカーについては、使用する抗体の免疫組織化学への相性等の問題から十分な解析結果を得ることができず、予定より少し遅れており、今後も継続して研究を実施していく必要がある。また、培養歯髄細胞に対する炎症関連因子の影響についての検討では、PGF2aが歯髄細胞に対し炎症メディエータ産生の調節性因子として作動しうる可能性が示され、炎症ー抗炎症のバランス制御という観点から本課題の一部を達成できたと考えている。エフェクターT細胞から産生される液性因子に対する歯髄細胞の反応性についての解析を進展させ、自然免疫受容体に対するリガンド刺激との相互作用について検討する。さらに、Treg細胞に関する解析を継続していく。また、象牙芽細胞様細胞におけるサイトカインに対する反応についても検討を加え、総合的に歯髄炎の病態形成の解析を進める。加えて、抗菌物質であるカテキンを作用させたときの歯髄細胞や象牙芽細胞様細胞の反応性を検討する。平成24年度においては実験に供与するための試料数が十分に採取できなかったが、研究を完遂するには今後も引き続き試料収集ならびに免疫組織化学に適した条件設定を検討していく必要がある。なお、十分な試料数が得られない場合を考え、平成24年度に一部行ってきた歯髄細胞を用いたin vitro実験をさらに展開していくことも視野に入れている。