hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組換え頻度の高いジーンターゲッティング法の開発

1.ジーンターゲッティングとは、細胞の相同的組換え能により、染色体上の特定遺伝子を標的として、外から導入した遺伝子断片と組換え、計画的に染色体遺伝子構造を改変する手法である。本研究の目的はジーンターゲッティングの効率を飛躍的に高める事である。方法は標的遺伝子の近傍を積極的に切断するような化学修飾オリゴヌクレオチドを合成し、それをターゲッティングベクターとともに標的細胞に導入することにより、遺伝子の相同組換え頻度を増幅することである。2.まず標的遺伝子として選んだマウスのHPRT遺伝子のエキソン8にneo遺伝子を挿入することによりターゲッティングベクターを調製した。次にエキソン8上流部と3重鎖DNA構造を形成するような部位をえらび、その領域をふくむオリゴヌクレオチドを合成した。さらにその5'末端に2価の鉄イオンが結合できるように化学修飾を行なうことにより化学修飾オリゴヌクレオチドを合成した。3.つぎに実際にそのオリゴヌクレオチドがHPRT遺伝子を特異的に結合し切断する活性をもつかどうか試験管内で調べた。3重鎖構造を形成する活性を調べる方法としてDNaseIフットプリンティング法を用いた。切断活性については、放射能で標識したHPRT-DNAを基質としてオリゴヌクレオチドと反応させ、その後ゲル電気泳動により解析している。in vivoへの適用が今後の課題である。通常の3重鎖DNA構造は生理的なpHでは解離してしまうと考えられているため、それを防ぐような化学修飾オリゴヌクレオチドの開発及びスクリーニングを現在おこなっている。
計画集合住宅地におけるこどものあそび空間の評価と空間構成計画に関する研究

本研究は、今後の住宅地再整備計画に求められるあそび場の機能・規模・配置に関する新しい計画条件を得ることを目的とするものである。本年度は計画集合住宅地における住棟廻りのあそび場の物的特性と利用実態より機能・規模・配置に関わる基礎的計画条件を明らかにするため、また総合評価指標化を行うその第一段階としての分析からあそび場の類型化を行った。すなわち、アンケート・ヒアリングと観察調査を元にした利用に影響する要因分析の結果や整備特性を踏まえ、単にあそび場自体だけではなく、それを取り巻く周辺の状況も含めて考えられた21の計画指標と環境指標を用いて主成分分析を行っている。その結果、「街区総合接近性」、「50m圏の機能性」、「樹木による環境性」、「配置接近性」、「密度性」の5つの主成分を抽出し、さらにクラスター分析を行い住棟廻りのあそび場を5つに類型した。加えて年間最多出現人数(5月)をもとに5類型を考察した。これによれば、昨年度でも着目したあそばれないあそび場の比率は、類型I;40.7%・類型II;48%、類型III;50%、類型IV;42.9%、類型V;60%であり、いずれも約半数を占める。その中でも利用のあるあそび場の比率が多い類型I、類型IVはその配置条件に特徴があるものであった。これらを詳細に観察すると、一時的に利用がない場合でも、集中している片方のあそび場を補完する役割をもつようである。これは機能が異なる場合によくみられる。もう一つは類型IVのように殆ど同じ機能を持った34個のあそび場が約100m間隔で歩行者専用路で結びついて連携しているとき、例えば4個連結の場合は、1つおきにあそび場が利用され、別の日には別の2箇所のあそび場が利用されるといった特色がみられた。また、規模条件については遊具の種類やその中での構成も重要となる。機能条件に関しては、利用者(こども・親)の意識するものとそれ以外の意識されない潜在的ものが存在している。従って、遊具種類、あそび場の構成、地表面仕上げ、日当り・日影の状態、などの質的な指標の導入も含めての考察が総合指標化の際に重要となることを示唆した。
半導体ディスク装置の高信頼化および長寿命化の研究

本研究ではフラッシュメモリを用いたディスク装置の高信頼化と長寿命化手法を提案した.高信頼化手法として隣接誤り訂正符号を提案し,長寿命化手法としてガーベージコレクションを用いたデータ移動法を提案した.隣接誤り訂正手法では多レベルメモリセルに記憶された値が隣接値に誤る確率が高いこと考慮して,訂正する誤りを隣接値に限定することにより効率の良い符号を提案している.ガーベージコレクションでは書き換え頻度の高いデータと頻度の低いデータを分別し,頻度の高いデータを定期的に移動することにより書き換えが特定のセルに集中することを防止して寿命を延長している.今年度は,データを頻繁に更新されるデータ(ホットデータ)とほとんど更新されないデータ(コールドデータ)に分けてそれぞれを別ブロックに格納することにより,更新されるブロックをホットデータのブロックのみに限定する,長寿命化手法について検討した.このデータをボットデータとコールドデータに分類してデータの格納ブロックを移動する作業をガーベージコレクションと呼ぶ.本手法では以前開発したウェアレベリング(消去回数が多いセルにには消去および書き込みを行わず,読み込み時には検査情報を用いてデータを復元する手法)を組み合わせている.得られた成果を国際会議PRDC2012(IEEE Racific Rim international Conference on Dependable Computing 2012)で発表した.今後は学術論文にまとめて学会誌に投稿する予定である.また,フラッシュメモリの高信頼化のための誤り訂正符号を開発した.本符号は高集積フラッシュメモリである多レベルセル(1セルで複数ビットを記憶できる)における誤りの大半が±1の隣接レベルにであることに注目して符号化効率を向上させた手法である.得られた成果は上述の国際会議PRDC2012で発表した.さらに,学術論文にまとめて電子情報通信学会英文論文誌に投稿した.第1回目の審査結果は「条件付き採録」であり,現在採録条件を満たすよう修正中である.近年のフラッシュメモリを用いた大容量記憶装置では集積度の高いマルチレベルセルのフラッシュメモリが用いられている.マルチレベルセルではフローティングゲートに蓄積される電荷量でトランジスタの閾値電圧が変化することを利用して1個のトランジスタで多値の情報を記憶している.この場合,トランジスタが故障するとフローティングゲートに蓄えられた電荷が変化し,閾値電圧が変化する.このようなマルチレベルセルに故障が生じたときには閾値電圧は近隣の値に誤る確率が高くなる.すなわち,多値の非対称誤りになる.本年度はこのような隣接値にのみ誤る傾向のあるフラッシュメモリに適した符号を構成した.すなわち,多値情報における隣接値への誤りを訂正する符号を構成した.通常のシンボル誤り訂正符号ではすべての誤りに対して訂正機能を持っているのに対し,本提案の符号では誤りに制限が加えられているので効率の良い符号,すなわち同じ情報長に対してより少ない検査数で符号を構成できる.今年度は実際に符号の構成法を考案し,性能評価を行った.成果を国内の研究会や国際会議で発表した.さらに,学術論文にまとめ電子情報通信学会英文論文誌に投稿し,掲載された.また,フラッシュメモリのメモリセルには書き換え回数に制限があり,限度を超える回数の書き換えを行うとセルの誤り率が高くなり使用できなくなる.そこで,今年度はガーベージコレクションを用いた長寿命化法を提案した.本手法ではデータを頻繁に更新されるデータと更新頻度の低いデータに分別し,前者のデータは書き込み位置を頻繁に変更することにより特定のセルに書き換えが集中しないように工夫した.この成果は国内の研究会において発表した.今後は国際会議での発表や論文誌への投稿を予定している.本研究ではフラッシュメモリを用いたディスク装置の高信頼化と長寿命化手法を提案した.高信頼化手法として隣接誤り訂正符号を提案し,長寿命化手法としてガーベージコレクションを用いたデータ移動法を提案した.隣接誤り訂正手法では多レベルメモリセルに記憶された値が隣接値に誤る確率が高いこと考慮して,訂正する誤りを隣接値に限定することにより効率の良い符号を提案している.ガーベージコレクションでは書き換え頻度の高いデータと頻度の低いデータを分別し,頻度の高いデータを定期的に移動することにより書き換えが特定のセルに集中することを防止して寿命を延長している.フラッシュメモリは電源を切っても記憶内容が消失しないという性質(不揮発性)を持った半導体記憶素子である.フラッシュメモリの高集積化・低価格化に伴い,これをディスク装置に用いたフラッシュSSDが実用化されている.フラッシュSSDは磁気ディスクに比べて低消費電力であり,耐衝撃性に優れることから,モバイル機器への導入が進んでおり,データセンターへの導入も検討されている.しかし,フラッシュメモリとしてよく利用されるNAND型のメモリセルではメモリセルへの書き換え回数に制限があり,一般的に10万回(高密度記録に用いられいるマルチレベルセルの場合はさらに少なく1万回)書き込みを行うとメモリセルが故障して使用できなくなると言われている.そのため,長寿命化の手法が検討されている.今年度はフラッシュメモリの長寿命化のためのウェアレべリング(書き換え頻度の高いデータを過去の書き換え回数の少ないメモリセルに割り付けることによって各セルの書き換え回数を平準化する手法)とガーベージコレクション(書き換え頻度の高いデータを特定のブロックに集めることにより書き換えブロック数を削減する手法)を組み合わせた手法を開発した.これにより,これらの手法を個別に適用していた従来手法に比べて約4割寿命を改善できた.この成果は国内の研究会で発表した.さらに,本手法を応用した並列分散処理システムを開発するための検討を進め,CPUネットワーク内の耐故障通信方式や,信頼度を考慮したグリッドシステムの構築方法についても研究した.

この成果は国内の研究会,国際会議,論文誌に発表した.期待した通りの成果が出ており,研究発表もおこなっているため.開発すべき手法について基本的アイデアが得られ,基礎的な評価が得られたため.さらに手法を改良して,国際会議で発表する.得られた成果を学術論文にまとめて投稿する.さらに検討を進め,より詳細な評価を得る.成果を国際会議で発表し,世界的に著名な研究者達との議論を通して今後の研究の指針を得る.国際会議PRDC2013において成果発表を行うので,旅費を使用する.また,学術論文を投稿するので掲載料(別刷り代)を使用する.成果発表のために国内・外国旅費を使用する.実験データを整理して可視化するためにパーソナルコンピュータとソフトウェアを購入する.
心臓徐脈を支える分子機構に基づく不整脈発生機構の数理解析

迷走神経刺激依存性の心臓徐脈に機能するG蛋白質制御内向き整流性カリウム(KG)チャネルは、G蛋白質共役型受容体-G蛋白質-効果器(R-G-E)シグナルの典型的な効果器として研究されている。これまで我々は、R-G-Eシグナルの数理モデルを構築し、心臓徐脈分子機構を解析してきた。しかし、近年上室性不整脈時の異常KGチャネル活性や細胞質因子による受容体リガンド応答の調節等、既存の概念では合理的に説明できない知見が報告された。これらの示唆する未知の生理調節機構の解明を計り、数理モデルの精密化を目指すことが研究目的である。我々は以前acridine骨格を有する化合物がKGチャネルの属するKirチャネルを阻害することを報告した。一方で、類似化合物である消毒薬acrinolが特徴的な薬物作用機序を示すことも判ってきた。即ち、proflavine等のacridine誘導体は細胞質側からアクセスし、中心洞に結合するのに対し、acrinolはチャネルの細胞外領域に結合して、阻害活性を示す。洞結節細胞には、KGチャネルだけでなく、多くの類似Kirチャネルが存在する。Acrinol型の阻害作用はKirチャネルサブタイプに選択的であるため、モデルの精密化に欠かせないイオン電流の構成成分の定量化を可能とすることが期待された。チャネルの細胞外領域に結合し、チャネルを活性化する薬物も見出されている。そのため、これらの知見は、チャネルの開閉は膜貫通領域、細胞質領域に限局された領域での分子運動ではなく、分子全体の構造変化を伴うこと、その構造に親和性を示す化合物はチャネル活性を調節できることを示唆した。さらに、細胞外から直接チャネルに結合する薬物には特異性が期待できる。そのため、Kirチャネルを標的とする新たな作用基盤を持った創薬の可能性が考えられた。RGS蛋白質による部分アゴニストの作用発現を解析するため、R-G-E連関に機能的に共役するRGS蛋白質の動的な挙動と分子連関の解明を目指し、全反射顕微鏡を用いた一分子の挙動の直接測定を目指している。そのために必要なコンストラクトの作成を行った。R-G-Eシグナル修飾因子のチャネル活性に対する作用を解析するため、様々なシグナル阻害薬を用いた電気生理学的解析を行った。また、KGチャネルの短期脱感作を支える分子機構を解析するため、cell-attachedモード観察される単一チャネル活性の脱感作現象の再現性を確認した。研究中に、Kirチャネルを選択的に抑制する新規阻害作用を有した薬物を見出した。本薬物はサブタイプに選択性を示すため、数理モデルの精密化に欠かせないイオン電流の構成成分の定量化を可能とすることが期待された。チャネルの機能状態と上室性不整脈との連関を数理解析するためには、現有する心臓徐脈分子機構の数理モデルに拡張性を持たせる必要がある。そこで、本研究では、1) RGS蛋白質による部分アゴニストの作用発現、2) R-G-Eシグナル修飾因子のチャネル活性に対する作用、3) KGチャネルの短期脱感作の分子機構を、モデル細胞、単離心房筋細胞を用いて計測する計画である。その中で、来年度は、短期脱感作現象に焦点を当てる。我々は心房筋細胞で生理的に測定される短期脱感作機構を組込んだR-G-Eシグナルの数理モデルの構築に成功している。この機構は高次組織モデルである洞結節活動電位発生モデルで、強い迷走神経刺激で生じる一過性の心停止を再現するための必須要因であった。しかし、我々は、単一チャネル活性もまた、同様の時間スケールで、脱感作反応を示すことを観察している。この現象は急性単離細胞のみならず、異所性チャネル発現細胞でも観察されるため、普遍的な内因性のチャネル調節機構であることが推定された。この現象を全細胞電流測定法で解析する。細胞内に対応するガラス電極液中のR-G-E連関を修飾する液性因子、リン酸化酵素やPIP2代謝酵素の阻害剤を添加することにより、短期脱感作の分子機構を特定することを中心に同機構の特定を目指す。さらに、R-G-E連関に機能的に共役するRGS蛋白質の動的な挙動と分子連関の解明を目指し、全反射顕微鏡を用いて、一分子の挙動で直接測定する。GPCRのリガンド刺激に対する動的な振る舞いを検討することで、R-G-Eシグナル伝達分子の生物物理的な連関をパラメーター化する。これらの解析から得られた結果を数式化し、ロバストなR-G-Eシグナルシュミレーションモデルの構築を行う。

即ち、proflavine等のacridine誘導体は細胞質側からアクセスし、中心洞に結合するのに対し、acrinolはチャネルの細胞外領域に結合して、阻害活性を示す。洞結節細胞には、KGチャネルだけでなく、多くの類似Kirチャネルが存在する。Acrinol型の阻害作用はKirチャネルサブタイプに選択的であるため、モデルの精密化に欠かせないイオン電流の構成成分の定量化を可能とすることが期待された。チャネルの細胞外領域に結合し、チャネルを活性化する薬物も見出されている。そのため、これらの知見は、チャネルの開閉は膜貫通領域、細胞質領域に限局された領域での分子運動ではなく、分子全体の構造変化を伴うこと、その構造に親和性を示す化合物はチャネル活性を調節できることを示唆した。さらに、細胞外から直接チャネルに結合する薬物には特異性が期待できる。そのため、Kirチャネルを標的とする新たな作用基盤を持った創薬の可能性が考えられた。RGS蛋白質による部分アゴニストの作用発現を解析するため、R-G-E連関に機能的に共役するRGS蛋白質の動的な挙動と分子連関の解明を目指し、全反射顕微鏡を用いた一分子の挙動の直接測定を目指している。そのために必要なコンストラクトの作成を行った。R-G-Eシグナル修飾因子のチャネル活性に対する作用を解析するため、様々なシグナル阻害薬を用いた電気生理学的解析を行った。また、KGチャネルの短期脱感作を支える分子機構を解析するため、cell-attachedモード観察される単一チャネル活性の脱感作現象の再現性を確認した。研究中に、Kirチャネルを選択的に抑制する新規阻害作用を有した薬物を見出した。本薬物はサブタイプに選択性を示すため、数理モデルの精密化に欠かせないイオン電流の構成成分の定量化を可能とすることが期待された。チャネルの機能状態と上室性不整脈との連関を数理解析するためには、現有する心臓徐脈分子機構の数理モデルに拡張性を持たせる必要がある。そこで、本研究では、1) RGS蛋白質による部分アゴニストの作用発現、2) R-G-Eシグナル修飾因子のチャネル活性に対する作用、3) KGチャネルの短期脱感作の分子機構を、モデル細胞、単離心房筋細胞を用いて計測する計画である。その中で、来年度は、短期脱感作現象に焦点を当てる。我々は心房筋細胞で生理的に測定される短期脱感作機構を組込んだR-G-Eシグナルの数理モデルの構築に成功している。この機構は高次組織モデルである洞結節活動電位発生モデルで、強い迷走神経刺激で生じる一過性の心停止を再現するための必須要因であった。しかし、我々は、単一チャネル活性もまた、同様の時間スケールで、脱感作反応を示すことを観察している。この現象は急性単離細胞のみならず、異所性チャネル発現細胞でも観察されるため、普遍的な内因性のチャネル調節機構であることが推定された。この現象を全細胞電流測定法で解析する。細胞内に対応するガラス電極液中のR-G-E連関を修飾する液性因子、リン酸化酵素やPIP2代謝酵素の阻害剤を添加することにより、短期脱感作の分子機構を特定することを中心に同機構の特定を目指す。さらに、R-G-E連関に機能的に共役するRGS蛋白質の動的な挙動と分子連関の解明を目指し、全反射顕微鏡を用いて、一分子の挙動で直接測定する。
メイラード反応による蛋白質の老化変性における架橋構造の質量分析法による解明

メイラード反応の中間代謝産物の3-デオキシグルコソン(3-DG)のタンパク質の架橋重合作用をin vitroで検討した。3DG(100mM)とタンパク質(リゾチーム)を37°Cで4週間インキュベートし、架橋、重合変性の状態を電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析した。リゾチーム単独ではモノマーが検出されたが、3DGとインキュベートしたものではモノマー、ダイマー、トリマーと重合体がみられた。架橋重合部に特徴的な蛍光を検出したクロマトグラムではリゾチーム単独では殆ど蛍光ピークが検出されず、3DGとインキュベートしたものでは非常に強い蛍光ピークが検出された。以上、3DGはタンパク質の架橋重合体形成作用が強いこと、さらに蛍光を有する架橋重合構造の生成作用が強いことが明らかになった。そこで3-DGが糖尿病患者の血清中に存在するか、また存在すればその濃度が糖尿病患者において正常者より増加しているか、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS)により検討した。GC/MSの電子イオン化選択イオン検出(EI-SIM)および化学イオン化選択イオン検出(CI-SIM)により糖尿病患者および正常者の血清中に3-DGを検出した。そこで濃度を測定したところ、正常者18例では314±27(SE)ng/mlであるのに比較して、糖尿病患者30例では778±148(SE)ng/mlと有意に(p<0.05)増加していた。特に尿中アルブミン20mg/日以上の蛋白尿を呈する糖尿病性腎症の患者11例では1235±345(SE)ng/mlと糖尿病性腎症を呈さない19例の513±68(SE)ng/mlに比較して有意に(p<0.01)増加していた。これらの結果は、メイラード反応が生体内で実際に起きていること、および糖尿病患者、特に糖尿病性腎症の患者ではメイラード反応が進行していることを意味している。グルコース、3-デオキシグルコソン(3DG)のタンパク質架橋重合作用について検討するために、グルコース(100mM、1M)、3DG(100mM)とタンパク質(リゾチーム、ヒト血清アルブミン、各々100mg/ml)37°Cで4週間インキュベートし、蛋白質のグリケーションを行った。架橋、重合変性の状態を電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などにより分析した。電気泳動の結果、リゾチーム単独に比較して、グルコースとインキュベートしたサンプルではモノマーの他にダイマーのバンドが強く検出され、トリマーと思われるバンドも検出された。3DGとインキュベートしたリゾチームではモノマーの他にダイマーのバンドが強く検出され、トリマーから高分子に至る連続したバンドも検出された。ダイマーのバンドも3DGとインキュベートしたものの方がグルコースとインキュベートしたものに比較して、より高分子側に泳動されていた。ヒト血清アルブミンとグルコースまたは3DGを同様にインキュベートしたものの電気泳動パターンは明確なダイマーのバンドは検出されず、特に3-デオキシグルコソンとインキュベートしたものではモノマーから高分子まで連続したバンドが検出された。HPLCの結果、UVによるクロマトグラムではリゾチーム単独では単一ピークが検出されたが、グルコースとインキュベートしたものではダイマー、トリマーに相当すると考えられるピークが検出された。3DGとインキュベートしたものではモノマー、ダイマー、トリマーのピークまで連続したリゾチームの重合体の溶出がみられた。

架橋重合部に特徴的な蛍光を検出したクロマトグラムではリゾチーム単独では殆ど蛍光ピークが検出されず、グルコースでは蛍光ピークが検出され、3DGとインキュベートしたものではグルコースに比較して非常に強い蛍光ピークが検出された。以上、3DGはグルコースに比較してタンパク質の架橋重合体形成作用が強いこと、さらに蛍光を有する架橋重合構造の生成作用が強いことが明らかになった。架橋重合構造のESI-MSによる解析を現在行っているところである。メイラード反応の中間代謝産物で架橋作用が強い3-デオキシグルコソン(3-DG)が糖尿病患者の血清中に存在するか、また存在すればその濃度が糖尿病患者において正常者より増加しているか、ガスクロマトグラフィー/質量分析法(GC/MS)により検討した。内部標準物質として、有機合成した^<13>C_6-3-DGを用いた。血清1mlに200ngの内部標準物質を添加し、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼと混合し、37°Cで1時間インキュベートした。エタノールで除蛋白した後、陽イオン交換カートリッジ、陰イオンカートリッジに添加し、溶出液を凍結乾燥し、メトキシム-トリメチルシリル化した。GC/MSの電子イオン化選択イオン検出(EI-SIM)および化学イオン化選択イオン検出(CI-SIM)により糖尿病患者および正常者の血清中に3-DGを検出した。そこで濃度を測定したところ、正常者18例では314±27(SE)ng/mlであるのに比較して、糖尿病患者30例では778±148(SE)ng/mlと有意に(p<0.05)増加していた。特に尿中アルブミン20mg/日以上の蛋白尿を呈する糖尿病性腎症の患者11例では1235±345(SE)ng/mlと糖尿病性腎症を呈さない19例の513±68(SE)ng/mlに比較して有意に(P<0.01)増加していた。これらの結果は、メイラード反応が生体内で実際に起きていること、および糖尿病患者、特に糖尿病性腎症の患者ではメイラード反応が進行していることを意味している。
難治性角膜ヘルペス原因ウイルスの解明(DNAポリメラーゼ遺伝子変異迅速検出法の開発)

角膜ヘルペスは単純ヘルペスウイルス(HSV)の感染による角膜疾患である。難治性角膜ヘルペスは,HSVのチミジンキナーゼ(TK)もしくはDNAポリメラーゼの遺伝子変異に起因することが多い。そこでこれら遺伝子変異の迅速検出法の開発を試みた。1)プライマーの設計:TK遺伝子は1131塩基対からなる。この領域を含む7組のプライマーを作成し,遺伝子変異検出に利用し有効であった。一方DNAポリメラーゼ遺伝子は3708塩基対からなる。この内薬剤耐性化に強く関与するcodon437-963をカバーする7組のプライマーを作成し,遺伝子変異検出に利用し有用であった。角膜ヘルペスは単純ヘルペスウイルスの感染による角膜疾患である。チミジンキナーゼもしくはDNAポリメラーゼの遺伝子変異に起因する薬剤耐性難治例が問題になっており,今回はDNAポリメラーゼ遺伝子変異の検出法確立を目指し,以下のような研究実績を得ていると共に今後の展望を述べる。1)プライマーの設計単純ヘルペスウイルス1型のDNAポリメラーゼ遺伝子は3708塩基対からなる。この内薬剤耐性化に関与する可能性が非常に高いアミノ酸配列保存領域8つ(codon 437-963)をカバーする,7組のプライマーセットを設定した。これらプライマーを用いて,耐性ウイルスのDNAポリメラーゼ遺伝子変異を検出する。2)実験的薬剤耐性ウイルスの作成単純ヘルペスウイルス1型PH株とVERO細胞を用いて,adenine arabinoside(ara-A)およびfoscarnetに対する耐性株の作成を試みた。Ara-Aに対するPH株のED_<50>を測定した所,4.4x10^<-5>Mであった。そこで10^<-4>Mおよび10^<-5>Mのara-Aを含む培養液中でPH株を5回継代培養し耐性株の有無を調べたが,まだ耐性株は出現していなかった。Ara-A耐性株確保のため,現在引き続き継代培養を続けている。Foscarnetに関しては,スウェーデンからやっと原末を手に入れ,同様の実験を始めだした所である。
サービスラーニングを通じた学習者の「学び」の変容に関する対話的評価の試み

本研究の課題は、「サービスラーニングを通じた学習者の『学び』の変容に関する対話的評価の試み」である。2009年度から「体験」と「振り返り」を組み込んだサービスラーニング的な体験的学習を実施し、当初1年生であった学生を対象に、2年間かけてそこでの「学び」を継続的に観察した。そこで浮かび上がった成果は次のようなものであった。(1)講義の知識と体験から得た知識との関連性の発見、(2)他者の存在への気づき(3)地域住民との関係性の深化(4)地域への貢献意識の向上、である。本研究のテーマは、「サービスラーニングを通じた学習者の『学び』の変容に関する対話的評価の試み」である。とりわけ平成21年度の新入学生(北九州市立大学地域創生学群)を対象に「ポートフォリオ」の手法を活用して、学習者自身の自己認知とそれについての自己評価を主眼においた学習効果の評価実践を4年間にわたって実施することが目的である。初年度は、学生と教員との間で、新たな環境に馴染みながら、同学群で学んでいく上で必要な、基礎的な知識の積み上げと関係づくりなどの準備期間として設定した。具体的な実施事項としては、同学群で開講される基盤教養科目や専門基幹科目、専門科目などの各講義、そして演習科目での学習を通じて、学生とのコミュニケーションの場をもった。こうした場面を活用しながら、「対話的評価」を行う上での関係づくりを行うことができたことは、今後の研究にとってたいへん意義のあることだと考えている。また、サービスラーニングの学習効果についての基礎研究も行ってきた。具体的な実施事項としては、前任大学(立命館大学)で実施してきた体験型学習のプログラムを素材として、学生がサービスラーニングのプログラムを通じて、そこから何を学んでいるのかについてレポートをまとめた。「地域的な連帯」「専門知識の模索」「企画の発想力」「ボランティア活動の問い直し」といった気づきや試行錯誤の見られることが明らかとなった。いずれも、欧米の先行研究で明らかにされているような教育的意義の抽出にまでは至らなかったが、十分に能動的な学びが形成されていることを発見できたことを重視したい。また、サービスラーニングの学びの成果に関する評価方法を構築するための基礎的な検討作業となったことも本研究にとっては重要であると位置づけている。平成21年度の新入学生(北九州市立大学地域創生学群)を対象に、学習者自身の自己理解とそれについての自己評価を主眼においた学習効果の評価を4年間をつうじて実施することが目的である。22年度は前年で共有した基礎的な知識を踏まえ、講義科目と連動させながら「現場実習」に向かう年として設定した。サービスラーニング的な教育手法の実践として位置づけられる。プロセスとしての学生の「学び」についてデータを積み重ねる最初の時期となった。具体的には、地域での毎週の実習活動と毎月1回実施する活動の振り返りを積み重ねた。実習活動の主な内容は、北九州地域の老舗商店街の一画を活用した学生商店の運営である。活動の振り返りでは、商店の運営に関する課題(接客の仕方、イベントの実施、広報の仕方など)について省察と各月の目標設定を行った。本研究の課題である「対話的評価」については、主に後者の振り返りの時間でのレポート提出とそれを踏まえた指導教員との「対話」を通じて実施した。本年度の成果としては、上記の実習活動と振り返りを踏まえ、商店街店主や商店街周辺の観光客に対して学生と共同でアンケート調査を行い、その結果にもとづき学生商店の運営目標を商店街に対して提案できたことである(これは学生と商店街との「対話」手段として活用されたため未発表にとどまる)。当初予定していた北米の大学での教育手法に関するヒアリングはできなかったが、報告者の所属する大学と地域の連携を通じたサービスラーニングの枠組みづくりに関しては一歩前進することができた。平成21年度の新入学生(北九州市立大学地域創生学群)を対象に、学習者自身の自己理解とそれについての自己評価に主眼をおいた学習効果の評価を4年間をつうじて実施することが目的である。23年度は前年度に引き続き講義科目と連動させながら「現場実習」に向かう年として設定した。プロセスとしての学生の「学び」についてデータを積み重ねる2年目の時期となった。

本研究の課題である「対話的評価」については、主に後者の振り返りの時間でのレポート提出とそれを踏まえた指導教員との「対話」を通じて実施した。本年度の成果としては、現場実習2年目の経験を生かしながら、多様なイベントを実施できたことである。とくに観光客を商店街の中へと誘致するためのイベントを企画・実施できたことは参加学生の運営能力の向上につながったものと思われる。一方、こうした能力を「学び」の成果としてアウトプットするには至っていない。本研究のテーマは、「サービスラーニングを通じた学習者の『学び』の変容に関する対話的評価の試み」である。平成21年度の新入学生(北九州市立大学地域創生学群)を対象に、学習者自身の自己理解とそれについての自己評価に主眼をおいた学習効果の評価を4年間をつうじて実施することが目的である。24年度は前年度に引き続き講義科目と連動させながら「現場実習」に向かう年として設定した。サービスラーニング的な教育手法の実践として位置づけられる。プロセスとしての学生の「学び」についてデータを積み重ねる3年目の時期となった。具体的には、地域での毎週の実習活動と毎月1回実施する活動の振り返りを積み重ねた。実習活動の主な内容は、北九州地域の老舗商店街の一画を活用した学生商店の運営である。活動の振り返りでは、商店の運営に関する課題(接客の仕方、イベントの実施、広報の仕方など)についての振り返りと各月の目標設定を行った。本年度の成果としては、現場実習3年目の経験を生かしながら、前年に引き続きさらに多様なイベントを企画・実施できたことである。一方、こうした能力を「学び」の成果としてアウトプットすることは充分には至っていない点で課題が残る。サービスラーニングを用いた学習方法に求められる大学と地域との連携づくりそのものに時間と労力を要しており、学生の「学び」をプロセスとして把握するための作業に充分に着手できていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。学生の「学び」の変容を捉えるための枠組みづくりに力を入れる。本研究課題に照らしたとき、本来は地域貢献型の「学び」の評価軸を作成することが主要な目的となる。だが、その点を変更して、ひとまず学生の最終レポート(卒業実践報告)の作成指導にあたることで、そこでの成果物から各学生の「学び」の変容についてのプロセスを整理し、それをもって今後の現場実習指導に活かしていくことを検討したい。
皮質基底核変性症・進行性核上性麻痺の動的神経病理学的研究

本研究は、タウPETの解析において、鑑別の難しい皮質基底核変性症(CBD)と進行性核上性麻痺(PSP)で、タウ蓄積量の違う部位を後方視的な病理学的解析から抽出し、両者の鑑別に役立つ関心領域を見出すこと、そして、それをタウPET(THK5351)撮像の解析に応用すること、そして、実際にタウPETを撮像した例の画像・病理連関を見て、それらの確からしさお検証することのふたつの柱からなる。後方視的な検討では、PSP, CBDともに基底核のタウの蓄積量が多いことが明らかであり、関心領域としては適当と考えられた。研究期間中、タウPET撮像例のうち2例で病理解剖の承諾が得られ、検討を行うことが出来た。一例目は死亡時76歳男性で、前頭葉症状を含む精神症状、認知症、パーキンソニズムで始まった例で、前頭側頭型認知症と診断されていたが、病理診断がCBDであった例である。タウPETの集積は右に強い前頭葉、基底核、脳幹に見られた。二例目は死亡時77歳男性で、左に強い小脳症状で始まったPSPで、病理診断もPSPであった。タウPETの集積は基底核、脳幹のほか、左歯状核に強く認められた。集積が強く認められていた部位は、タウの沈着も強いが、変性も強い部位であった。本研究と並行して、本タウPETはMAO-Bにも集積してしまうことが明らかとなってきた。病理学的にタウ沈着があって、タウPETの集積があった部位はアストログリアの増生も強く、それを裏付ける結果となった。変性疾患によってはアストログリアの増生が目立つ特異的な部位が存在する(例としては嗜銀顆粒性認知症)疾患もあり、異なった観点からのTHK5351の活路もあると考えられた。本研究の目的は、臨床診断が困難であるタウオパチーの代表である進行性核上性麻痺(PSP)のブレインバンク登録例の病理学的な解析を行うことと、近年撮像が開始されたタウPETの解析を行うこと、そして両者の対応を行い、実証研究に結びつけることである。通常の神経病理の検索方法とは異なり、病理解析をマクロ的に行うことで、タウPETの解析に最も適した部位を決定する。そして研究の後半には、タウPETが撮像された例の剖検確定診断を行うこと、それらの症例のタウ沈着の分布を検索することで、タウPETの実証検証を行い、日常の臨床に生かすことが最終的な目標となる。ブレインバンク登録例、つまり、通常の病理解剖の同意に加え、研究同意を得られたPSPあるいはPSP疑い症例の剖検例の病理解析をこれまでの蓄積例で行うと共に、今年度は新規3例について行った。一例は例はPSP-Parkinsonismであり、タウの沈着が少なかった。少ないながら分布を調べると基底核が最もタウの蓄積が強いこと、ウエスタンブロットの結果はPSPパターンであることを確認出来た。もう一例は臨床診断がPSPであり、通常変性が見られる領域に萎縮は確認出来たが、循環障害の影響が大きく、タウの沈着は少ない。3例目は100寿者である。病理形態やウエスタンブロットでGGTに近い、特殊なタウオパチーであり、この病理解析は進行中である。タウPETは画像部門で、臨床診断PSP疑い例も含めたタウオパチー全般の症例についての撮像を行っている。あくまで臨床診断であり、症例差が大きく、非特異集積が疑われる部位もあり、他のモダリティーとの総合的な判断を行っているが、今後病理との対応が必要と考えられる。今年度は、双方の研究を合わせた形の倫理委員会申請を行ったが差し戻しとなってしまった。現在は申請書を改訂中である。従って両者の関連の解析については次年度以降となる。倫理委員会への申請が差し戻しとなり、さらに改訂倫理指針対応のため、改訂版の提出が遅れているため。今年度は変性疾患の剖検例、ひいてはブレインバンク登録例が、新規で18例と飛躍的に伸びた。その中で、病理学的に皮質基底核変性症が2例、進行性核上性麻痺が2例と本研究対象となる疾患が多く含まれていた。すべての例に研究および教育目的での利用の同意が得られている。従来の症例に加え、これらの症例について、関心領域とすべき部位、すなわちリン酸化タウの沈着が普遍的に目立つ部位につき引き続き病理学的解析を行った。方法はこれまでと統一し、ブレインバンクプロトコールに従って、同様部位を全例同じ抗体、鍍銀染色を用いて評価した。対象について、今年度からは、皮質基底核変性症の1例、および進行性核上性麻痺の1例(計2例)において、生前に形態画像に加え、FDG,アミロイドおよびタウPETが施行されている例の剖検が得られた。後者においては髄液バイオマーカーも採取されている。大脳皮質および基底核への集積の状態がPET所見と合致していた。今年度は2例であったが基底核での評価が妥当であることが証明された。特にCBSと臨床的に診断されている例のタウPET施行例が蓄積されており、病理解剖は今後も増える可能性が高い。次年度に向けた後方視的検討および、タウPET施行例についての病理と画像の対比のデータ解析の準備が整った。臨床病理カンファランスを開催し、若手および在宅医師やパラメディカルへの教育を行った。学会報告、雑誌での投稿準備を行い、成果を発信すべくすすめている。病理解剖例の中にタウPET施行例が含まれるようになってきた。

今後も蓄積が見込まれる。本研究は、タウPETの解析において、鑑別の難しい皮質基底核変性症(CBD)と進行性核上性麻痺(PSP)で、タウ蓄積量の違う部位を後方視的な病理学的解析から抽出し、両者の鑑別に役立つ関心領域を見出すこと、そして、それをタウPET(THK5351)撮像の解析に応用すること、そして、実際にタウPETを撮像した例の画像・病理連関を見て、それらの確からしさお検証することのふたつの柱からなる。後方視的な検討では、PSP, CBDともに基底核のタウの蓄積量が多いことが明らかであり、関心領域としては適当と考えられた。研究期間中、タウPET撮像例のうち2例で病理解剖の承諾が得られ、検討を行うことが出来た。一例目は死亡時76歳男性で、前頭葉症状を含む精神症状、認知症、パーキンソニズムで始まった例で、前頭側頭型認知症と診断されていたが、病理診断がCBDであった例である。タウPETの集積は右に強い前頭葉、基底核、脳幹に見られた。二例目は死亡時77歳男性で、左に強い小脳症状で始まったPSPで、病理診断もPSPであった。タウPETの集積は基底核、脳幹のほか、左歯状核に強く認められた。集積が強く認められていた部位は、タウの沈着も強いが、変性も強い部位であった。本研究と並行して、本タウPETはMAO-Bにも集積してしまうことが明らかとなってきた。病理学的にタウ沈着があって、タウPETの集積があった部位はアストログリアの増生も強く、それを裏付ける結果となった。変性疾患によってはアストログリアの増生が目立つ特異的な部位が存在する(例としては嗜銀顆粒性認知症)疾患もあり、異なった観点からのTHK5351の活路もあると考えられた。各々は、個々の倫理委員会承認のもと研究推進を行っているので、双方の関連についての申請が承認されたら、対応をすみやかに行う予定である。そして、それらの結果を臨床にフィードバックする次の段階についても施行する。アルツハイマー病と比べ、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺はタウPETが有用であると思われた。他のモダリティーの結果とも合わせてさらに、それらの詳細な解析を行う。一方、現行のタウPETの問題点は指摘されており、病理解析を行うことで、その具体的な点を明らかにし、今後に繋げたい。ブレインバンクでの病理解析とPETの撮像結果の対応についての倫理委員会承認が済んでいないため、個々の倫理委員会承認のもとに部分的に研究を行っているため。今後も想定を超えて、PET施行例の病理の解析の可能性が充分に出てきたため。双方を組み合わせて解析を行うことで、結果の公表等に使用刷る予定である。
文化財保存修復技術と倫理の教育　アプローチ確立への研究

文化財の保存修復は理論と技術、どちらも理解した上での総合的な判断が要求される。しかし、日本の文化財保存修復教育では修復技術者に至る明確なプログラムは確立されていない。本研究では日本における修復技術と修復理論に焦点を当て、日本の技術に呼応した理論を構築し、文化財保存修復教育のアプローチの確立を目的とする。2019年度は1文化財修復技術と理論間・教育への国内・海外の比較と問題提示、2日本の修復技術を継承しつつ、倫理や科学的方法論を合わせた現代的理論の構築を行う予定である。2020年度には3保存修復技術教育と倫理教育の構造枠組みを検討する。4実践的な教育の中でプログラムの実施と評価を行う。
高分子鎖の形体とダイナミックス:高分子凝集系の構造と物性の相関に関する分子論的研究

研究は4つのグル-プに分かれて実施されたが、まとめの討論は合同で行い、意見の交換と総合、および、境界領域への展開を目指した。第1グル-プ「孤立鎖と溶液中の分子間相互作用」の研究では、Helical wormlike鎖モデル理論の展開(山川)と実験への適用性の検討(則末・寺本、早川)が行われ、また、第3ビリヤル係数の精密測定により、2定数理論の枠組みでは理解できない新しいθ形体の描像(則末・寺本)が示された。また、カルモデュリン(和泉)、卵白アルブミン(福田)等生体高分子の溶液中での形態に関する知見が得られた。第2のグル-プ「均一系」のダイナミックス・形態に関する研究では、レプテ-ションの位相幾何学理論(岩田)、ギャ-モデル理論(足立)、DNAのパルスゲル電気泳動理論、棒状高分子溶液の流動場中での安定性(土井)、ネマチック効果(渡辺)の理論等が展開され、実験的研究では、棒状分子(寺本)、ブレンド(尾崎,橋本)、電解質溶液(野田)、3成分高分子系(牛木)、拡散(橋本、網嶋)などの成果が報告された。ゲストの各氏から、高分子の局所運動について中性子散乱(梶:京大化研)と蛍光偏光解消法(山本:京大工)が解説されたほか、微分粘弾性(五十野:長岡技科大)、流動場における相分離理論(小貫:京大基研、太田:お茶の水大)、ブロック共重合体の密度汎函数理論(川崎:九大理)などが紹介された。第3の「臨界現象、相転移と界面現象」のグル-プは、コイルーグロビュ-ル転移(窪田)、様々な系の相転移(小高、橋本)、平板間の鎖の形態(塩川)、界面における高分子膜(川口、高橋)等に関する研究成果が報告された。第4の「理論的解析とシミュレ-ション」のグル-プは、UCST挙動、熱可逆性ゲルの相形成、ゾルーゲル転移(和泉、田中)などについての理論のほか、高分子理論の発展として、生物進化のパ-コレ-ション理論(石鍋)が展開された。研究は4つのグループに分かれて進められた。第1グループでは「孤立鎖の溶液中における相互作用」の研究が行われた。山川は高分子鎖に対してhelical wormlike鎖のモデルを適用し、形態およびダイナミックスに関する一般理論を発展させた。早川等は棒状高分子のダイナミックスを電気複屈折法で研究した。また寺本、則末等は多糖高分子について形態および粘度を調べ山川理論の妥当性を調べた。福田は高分子・高分子・溶媒三成分系の熱力学的研究を行った。第2グループは「均一系:準濃厚系と凝縮系をテーマとして研究を進めた。土井はDNAの異常な電気泳動挙動を管模型に基づいて理論的に研究した。またコロイド分散系の凝集構造とレオロジーの関係についても計算機シミュレーションにより研究した。牛木は高分子鎖ダイナミックスの解析システムを開発した。岩田は高分子鎖の相互作用について位相幾何学に基づいた理論を発展させ、環状高分子の溶液物性や架橋網目の力学的性質の理論的解釈を行った。尾崎等はポリスチレン/ポリビニルエーテル系のレオロジー測定を行い、異種高分子混合系のからみ合い効果を研究した。また野田等は応力下におけるブロック共重合体の広がりを中性子小角散乱法により研究した。

第3グループは「臨界現象、相転移と界面現象」をテーマとする。桑原等は界面活性剤の臨界現象を、また和泉は高分子溶液の臨界現象を調べた。高橋等は界面における高分子の脱着について精密な実験を行った。橋本はブロック共重合体や高分子ブレンド系における秩序-無秩序転移をX線小角散乱や光散乱法で研究した。第4グループは「理論的解析とシミュレーション」をテーマとして研究を進めた。三宅、石鍋は分岐高分子の広がりについて理論を発展させシミュレーションを行った。田中は熱可逆ゲルの理論を展開した。研究は昨年度に引き続き4つのグル-プに分かれて進められた。第1のグル-プでは寺本・則末はポリスチレン溶液について光散乱のデ-タから第3ビリヤル係数を決定し理論と比較した。福田は卵白アルブミンの光散乱および固有粘度の測定を行い、加熱によりひも状の会合体が生成することを見い出した。また寺本らは剛直な棒状高分子の粘度を測定し、土井、早川等による棒状分子のからみ合いの理論と比較した。第2のグル-プでは土井は流動場中における棒状高分子溶液の安定性を理論的に研究し、伸張流動状態におけるオ-ダ-パラメ-タのひずみ速度依存性を計算した。牛木は昨年に引き続いて高分子鎖ダイナミックスの階層構造の解析システムを開発した。尾崎らは流動複屈折法により相容性高分子混合系のレオロジ-と配向緩和を研究した。野田は電解質高分子の準希薄溶液の粘弾性を研究し定常コンプライアンスおよび粘度に対する静電的相互作用の影響を調べた。小高、足立は誘電的手法により、ポリイソプレン鎖の形態とダイナミックスを研究した。また塩川は平板にはさまれた高分子鎖の拡がりを理論的に研究した。第3のグル-プでは桑原等は高分子鎖のコイル-グロビュ-ル転移について研究した。和泉はポリスチレン溶液のゾル-ゲル転移について調べ、溶媒和が重要な役割を持つことを示した。橋本は高分子ブレンドにおけるパタ-ン形成について光散乱および中性子散乱測定により詳細な研究を行った。また橋本等はブロック共重合体とホモポリマ-接合面におけるドメインの拡散についても調べた。第4のグル-プでは田中は溶媒和によるゾル-ゲル転移を理論的に解析した。また三宅は分岐高分子のダイナミックスの理論的研究を行った。石鍋はパ-コレ-ション理論により生物進化のシミュレ-ションを行った。
雌性生殖機能を維持する分子機構の解明と試験管内再構成

本研究では、近年開発された体外培養による卵子誘導系を用いて、マウスにおいて原始卵胞を樹立・維持するメカニズムの解析、そして原始卵胞の試験管内誘導を目的としている。今年度はこれまでに得られていた、生体内及び体外培養系の卵母細胞の遺伝子発現データを詳細に解析した。すると生体内の卵母細胞に比べ、体外培養系の卵母細胞ではFoxo3遺伝子の発現が低いことが明らかとなった。そこで、活性化型のFoxo3であるFoxo3dNESを体外培養系の卵母細胞で過剰発現させたところ、原始卵胞様のサイズの小さな卵胞が多数観察された。Foxo3dNESを過剰発現させた卵母細胞では低酸素関連遺伝子の発現が上昇していることがRNA-seqにより明らかとなった。また生体内原始卵胞の形成過程において、卵母細胞では酸化ストレス応答に関連する遺伝子、抗酸化遺伝子の発現が上昇しており、原始卵胞が酸化ストレスを受けていることが示された。これらの実験結果から、「低酸素条件が原始卵胞形成に寄与する」という仮説を立て、低酸素下での卵母細胞誘導を行ったところ、Foxo3が核内に局在し、形態的にも生体内に近い原始卵胞が形成された。さらにFoxo3 KOやHIF抑制剤の実験から、酸素環境の下流でFoxo3遺伝子及びHIF遺伝子がエフェクターとして働き、体外培養系にて原始卵胞を形成していることが示された。本研究によって、体外培養系において原始卵胞を再構築することが可能となり、原始卵胞における遺伝子の機能解析を容易に行うことが出来るようになった。このことは、当該分野において機能解析の手法を拡げる、大変意義深い成果であると考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。原始卵胞は生体内における最も幼若な卵胞であり、排卵サイクルの起点となること、形成された後に増殖しないことからも雌性生殖機能の中枢であると考えられる。本研究では、近年開発された体外培養による卵子誘導系を用いて、原始卵胞維持機構に寄与する新規遺伝子の同定及び機能解析、そして原始卵胞の試験管内誘導を目的としている。これまでの研究により、卵子誘導系では原始卵胞の指標となる核内FOXO3が維持されていないことが免疫染色法により明らかとなった。さらに、生体内及び体外培養系にて誘導した卵母細胞を用い、発生段階に従って網羅的な遺伝子発現解析を行った。これにより出生直後に原始卵胞の静止状態に入る生体内の卵母細胞とは異なり、体外培養系の卵母細胞は原始卵胞のような静止状態に入らず、すぐに活性化しているような遺伝子発現様式を示すことが明らかになった。これらのことから、体外培養系では原始卵胞が形成されていないことが示唆された。また卵母細胞の遺伝子発現解析により、生体内原始卵胞の形成過程において卵母細胞で特異的に発現が上昇し、体外培養系の卵母細胞では発現の低い遺伝子群を選出した。この遺伝子群には原始卵胞の維持に寄与する遺伝子が含まれると考えられる。また、体外培養系において安定的に発現が得られるプロモーターを同定し、それを用いた発現ベクターを構築した。さらに候補遺伝子のmRNA由来cDNAクローニングも行った。今後は体外培養系の卵母細胞にて、選出した候補遺伝子を強制発現させることで原始卵胞が誘導されるかを評価していく。現在までの研究は概ね順調に進んでいる。本年度の目標であった卵母細胞の網羅的な遺伝子発現解析を終え、候補遺伝子の選出まで完了している。強制発現系の構築も行い、来年度に予定している候補遺伝子の機能解析につなげることができた。これまでの研究により、卵子誘導系において卵母細胞は原始卵胞のような静止状態に入らず、すぐに活性化しているような遺伝子発現様式を示すことが明らかになった。また生体内及び卵子誘導系にて得られた卵母細胞を用いてRNAseq法により遺伝子発現を解析し、サンプル間の遺伝子発現様式を比較した。原始卵胞形成過程において発現が上昇し、体外培養系の卵母細胞では発現の低い、原始卵胞の維持に寄与しうる候補遺伝子群を同定した。さらに、候補遺伝子のCDSを生殖細胞で発現するプロモーター下流にクローニングし、PIggy BacシステムでES細胞のゲノムDNAに挿入した。このTgES細胞を用いて卵母細胞を誘導し、候補遺伝子を過剰発現させることで機能解析を行った。すると、候補遺伝子群の一部の遺伝子の過剰発現によって卵母細胞が優位に小さくなり、原始卵胞様の小さい卵胞が再構成卵巣において誘導された。これにより、候補遺伝子の原始卵胞の維持への寄与が示唆された。今後はこれら候補遺伝子の過剰発現により卵母細胞においてどの様な遺伝子発現変動が起きているかをRNAseq法によって解析する。本年度の目標であった候補遺伝子の機能解析を行い、機能的な遺伝子の絞り込みを完了することができた。来年度にはこれらの遺伝子のより詳細な機能解析を行う予定である。

本研究では、近年開発された体外培養による卵子誘導系を用いて、マウスにおいて原始卵胞を樹立・維持するメカニズムの解析、そして原始卵胞の試験管内誘導を目的としている。今年度はこれまでに得られていた、生体内及び体外培養系の卵母細胞の遺伝子発現データを詳細に解析した。すると生体内の卵母細胞に比べ、体外培養系の卵母細胞ではFoxo3遺伝子の発現が低いことが明らかとなった。そこで、活性化型のFoxo3であるFoxo3dNESを体外培養系の卵母細胞で過剰発現させたところ、原始卵胞様のサイズの小さな卵胞が多数観察された。Foxo3dNESを過剰発現させた卵母細胞では低酸素関連遺伝子の発現が上昇していることがRNA-seqにより明らかとなった。また生体内原始卵胞の形成過程において、卵母細胞では酸化ストレス応答に関連する遺伝子、抗酸化遺伝子の発現が上昇しており、原始卵胞が酸化ストレスを受けていることが示された。これらの実験結果から、「低酸素条件が原始卵胞形成に寄与する」という仮説を立て、低酸素下での卵母細胞誘導を行ったところ、Foxo3が核内に局在し、形態的にも生体内に近い原始卵胞が形成された。さらにFoxo3 KOやHIF抑制剤の実験から、酸素環境の下流でFoxo3遺伝子及びHIF遺伝子がエフェクターとして働き、体外培養系にて原始卵胞を形成していることが示された。本研究によって、体外培養系において原始卵胞を再構築することが可能となり、原始卵胞における遺伝子の機能解析を容易に行うことが出来るようになった。このことは、当該分野において機能解析の手法を拡げる、大変意義深い成果であると考えている。今後は、原始卵胞の維持に寄与していると考えられる候補遺伝子群の機能解析を行う予定である。具体的には、ES細胞に候補遺伝子のcDNAをクローニングした発現ベクターをPiggyBacシステムにより導入し、ゲノムへの挿入が確認されたES細胞を用いて卵子誘導を行う。候補遺伝子を卵子形成過程において強制発現することで、原始卵胞が形成されるか否かを評価する。強制発現により原始卵胞が形成された遺伝子に関しては、得られた卵母細胞の遺伝子発現解析や遺伝子欠損による生体内での機能解析を試みる。今後は、体外培養系の卵母細胞における過剰発現により機能が示された一部の候補遺伝子に関して、より詳細な機能解析を行う。具体的には、機能的な幾つかの候補遺伝子を同時に卵母細胞に強制発現させることで、どの様な表現型が観察されるかを解析する。さらに、候補遺伝子を過剰発現させた卵母細胞を用いてRNAseqを行い、遺伝子発現への影響を解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。