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心と行為の哲学的分析による倫理的諸概念の解明-モラル・サイコロジーからの接近-

問題群(1)と(2)に関しては、Michael Slote(マイアミ大学)による連続セミナーを開催し、信念や推論にも感情が内在しているからこそ実践的推論が成立するという彼独自の理論を検討した。さらに、(1)に関しては、ヴォルフガング・エアトル(慶應義塾大学)がG.E.ムアの善概念をアリストテレスの形而上学からの影響という観点から読み直し、ムアの実在論の新解釈を提供した。また、(2)に関しては、奥田太郎(南山大学)から、ヒュームのコンヴェンションの成立過程における感情のやりとりの役割に関する知識提供をうけた。(3)に関しては、塩野直之(東邦大学)から、行為のコントロールにおける価値評価の役割に関する研究成果の提供がなされた。(4)に関しては、吉沢文武(千葉大学)と柏端達也(慶應義塾大学)が、死が与える不幸という観点から検討を加えた。さらに、(5)に関しては、林誓雄(立命館大学)によって、Michael Sloteが展開している感情主義的徳倫理学に関する知識提供が行われた。以上のような研究報告や知識提供とそれに伴う意見交換をへて、とくに感情が実践的推論において果たし得る役割について解明が進むと同時に、価値判断が自律において果たす役割について検討を加えた。また、徳と感情との関係に関する理解も深まった。
肺炎球菌の宿主間の伝播におけるボトルネック効果の解明

平成29年度に肺炎球菌の宿主間伝播におけるボトルネック効果を調節する宿主側の因子として、病原微生物の構成因子を認識するToll様受容体(TLR)の刺激についてそれぞれのアゴニストを使用し調査した。日齢4に肺炎球菌臨床分離株(血清型6A)を経鼻接種し、保菌モデルを作成した。次に日齢8から日齢11まで、それぞれのTLRアゴニストを連日経鼻投与した。日齢12における鼻咽腔保菌量に有意な差を認めなかった一方で、TLR3、TLR7/8およびTLR9のアゴニスト刺激が宿主鼻咽腔から肺炎球菌の排菌を促進することが判明した。平成30年度はTLR3ノックアウトマウス、TLR7ノックアウトマウス、TLR9ノックアウトマウスを導入し、肺炎球菌の鼻咽腔保菌及び宿主外への排菌量について野生型マウスとの比較検討を行った。日齢4に肺炎球菌臨床分離株(血清型6A)を経鼻接種し、日齢12における鼻咽腔保菌量を検討したところ、野生型マウスと比較して有意な変化を認めなかった。一方、TLR3およびTLR9ノックアウトマウスでは日齢8から日齢12における排菌量の有意な低下を認めた。以上の研究結果より、TLR3、TLR7、TLR9による刺激は宿主鼻咽腔の保菌量に影響を及ぼさないが、宿主体外への排菌量を増加させることが証明された。これらのTLRsは微生物の核酸を認識する自然免疫であり、微生物の宿主間伝播と密接な関係があることが示唆される。これまでの肺炎球菌の病態解明は鼻咽腔における保菌の成立から感染症発症の過程に重点が置かれてきた。我々は肺炎球菌の保菌が成立するためは保菌者から新たな宿主へ伝播することが必要であることに着目し、仔マウスを用いた兄弟間における宿主間伝播モデルを確立した。これまでの研究においてインフルエンザウィルスの重感染により肺炎球菌の兄弟間伝播が著明に促進されるとともに、伝播の過程において肺炎球菌は強いボトルネック効果を受けることを見出した。本研究において、肺炎球菌の宿主間伝播におけるボトルネック効果を調節する重要な因子であると考えられている鼻腔から体外への排菌量と宿主自然免疫との関連をToll-like receptor(TLR)を中心に検討した。まず肺炎球菌の鼻咽腔保菌が成立した仔マウスに各種TLRアゴニスト(TLR2:Pam3CSK、TLR3:poly(I:C)、TLR4:LPS、TLR7/8:R848、TLR9:CpG ODN)を連日経鼻接種して、排菌量の経時的な変化を検討した。肺炎球菌の菌体成分を主に認識すると考えられているTLR2およびTLR4による刺激では、鼻咽腔の保菌量や排菌量は変化しないか有意な減少傾向を認めた。一方で、病原微生物の核酸成分を認識するTLR3、TLR7/8およびTLR9の刺激では鼻咽腔の保菌量に有意な変化はなく、排菌量の増加を認めた。とりわけpoly(I:C)による刺激では鼻咽腔に好中球の遊走を主体とした炎症反応が惹起された。現在これらの自然免疫応答が肺炎球菌の宿主間伝播に及ぼす影響を検討するために、各種TLRノックアウトマウスを導入し、兄弟間における伝播率の変化を観察している。各種TLRノックアウトマウスの導入における手続きと、凍結胚よりマウスを実験可能な状態にセットアップするための時間が予定以上にかかってしまったため、平成30年度に完了予定であったノックアウトマウスを用いた伝播実験の実施において遅れが生じている。平成30年度に予定しているTLRノックアウトマウスを用いた宿主間伝播の実験を予定通り遂行する。実験で使用する予定のTLR3、TLR7、TLR9ノックアウトマウス、およびエンドソームに存在するTLRのシグナリングに必須の蛋白であるUnc93b1のノックアウトマウスは全て当教室に導入済みである。
分子操作による超構造の設計.評価

最終年度でのこの1年間、計画研究班の一つ(A02班)として機能発現の最小単位の「素構造」を有する有機分子を、分子間相互作用を利用して自然界に存在しない分子系集合系(超構造)を構築するという本重点領域研究の目的を達成するため、これまでの成果を土台に走査型トンネル顕微鏡(STM)や原子間力顕微鏡(AFM)などの各種走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた分子操作の試み、および新たな有機超薄幕の構造・機能評価技術の確立に関する研究を行ない、下記のような成果を得た。代表者の松重は、「SPMによる有機強誘電性薄膜のnmスケールの分子記憶」に取り組み、有機超薄膜における電気的双極子配向の誘起およびその検出をナノ領域で実現した。次に、「エネルギー分散型X線反射率測定装置の開発と有機超薄膜構造評価への応用」に取り組み、薄膜の膜厚、密度、界面状態を評価するための"エネルギー分散型X線反射率測定装置を開発し、真空蒸着超薄膜の膜構造評価に応用し、実用化への見通しを得た。班員の金藤は、導電性高分子、オリゴマーおよびモノマーの固液界面での自己組織化配向膜の作成に取り組み、硫黄が金の表面に強く吸収する性質を用いて、チオフェン誘導体に応用し単分子配向膜の作成に成功したまた、更に、導電性高分子薄幕の電解伸縮挙動の評価に関して、自己ドープされたポリアニリン薄膜を電気化学的に酸化・還元することによって、イオンの出入りと電子状態の変化が分子の形態に及ぼす効果を調べた。同じく班員の鷲津は、多価イオン存在下でも壁面へのDNAの吸着が生じないようなDNAの両端固定を実現するための微細電極構造を考察し、それを製作するためのプロセスを開発した。更に、この電極を持ちいて、制限酵素を用いたDNAのモレキュラーサージェリーを実証した。松重らは、本年度有機分子超構造の構造制御および評価法の開拓に努め、X線全反射現象を利用した多機能全反射X線回析計を製作すると共に、有機分子のエピタクシャル成長観察に成功した。SPM(捜査型プローブ顕微鏡)を用いた分子操作の可能性を示すものとして、AFM探針による分子結晶の整形を実現した。一方、金藤らはSTM探針を用いて電極基板上にポリアニリン、ポリピロールなどの導電性高分子のスポット電解重合を試みるとともに、重合される形状を計算によりシミュレーションした。その結果、探針と基板との距離が近いほど高分子のスポット径は小さく、距離が10μmの場合、スポット径は約30μmで計算値ともほぼ一致すること、また探針を重合中に走引することにより線引できることを見出した。橋本らは高い磁気転移温度を持ち、かつその磁気的特性を外部からの摂動で制御可能な磁性材料の構築を目指し、プルシャンブルー類似物質のCN架橋クロム錯体に着目した。その結果、物質を薄膜状態で電極上に降出させ、270Kの磁気転移温度という、安定な分子磁性体としてはこれまで知られているものの中で最も高い転移温度を持つ物質を得ることに成功した。さらに電気化学的にイオンをド-ピング、脱ド-ピングさせ薄膜中の金属の電荷状態をコントロールすることにより物質の磁性をフェリ磁性と常磁性の間で可逆的に変化させることに成功した。更に鷲津らは、微細加工技術により製作された電極中に作られる高周波高電界を用いてDNAを直線状に伸長し,かつ分子の両端のみで基板上に固定する手法を開発した。直径3マイクロメートル程度の微粒子表面にDNA切断酵素を固定し,これをレーザーマニピュレーションにより上記の固定化DNAに押し当てDNAの切断を観察した。このような手法は,生化学に空間分解能を導入するための有力な手段となることが期待される。本年度は、計画研究班の一つ(A02班)として、機能発現の最小単位の「素構造」を有する有機分子を、分子間相互作用を利用して自然界に存在しない分子系集合系(超構造)を構築するという本重点領域研究の目的を達成するため、近年進歩の目覚ましい走査型トンネル顕微鏡(STM)や原子間力顕微鏡(AFM)などの各種走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた分子操作の試み、および新たな有機超薄膜の構造・機能評価技術の確立に関する研究を行った。まず、「SPMによる有機強誘電性薄膜のnmスケールの分子記憶」に取り組んだ。有機超薄膜における電気的双極子配向の誘起およびその検出をナノ領域で実現するために、新たに導電性探針を用いたSPM装置を構築した。Pt基板上にスピンコート法により作製したP(VDF/TrFE)(73/27)超薄膜(数十nm厚)試料を対象に、導電性(Auコート)探針を試料表面に接触させ、パルス状電圧を印可することにより、薄膜中の双極子配向を誘発し、局所的に分極領域を形成する事に成功し、有機強誘電性薄膜におけるnmスケールの分子加工・記憶が可能であることを初めて実証した。次に、「エネルギー分散型X線反射率測定装置の開発と有機超薄膜構造評価への応用」に取り組んだ。実際的には、薄膜の膜厚、密度、界面状態を評価するための"エネルギー分散型X線反射率測定装置を開発し、銅フタロシアニン真空蒸着超薄膜の膜構造評価に応用した。その結果、CuPc蒸着膜が2層構造であることが判明し、薄膜成長過程に2段階の素過程が存在することが明らかとなった。これらの結果、分子と基板との相互作用の変化が明らかに示された。

今後、高品質の機能性有機超薄膜を開発する上で、こうした精密な膜構造の解析が必要不可欠であり、さらに構造と物性の相互関係を深く研究し、理解することが重要な課題となるとの結論を得た。最終年度でのこの1年間、計画研究班の一つ(A02班)として機能発現の最小単位の「素構造」を有する有機分子を、分子間相互作用を利用して自然界に存在しない分子系集合系(超構造)を構築するという本重点領域研究の目的を達成するため、これまでの成果を土台に走査型トンネル顕微鏡(STM)や原子間力顕微鏡(AFM)などの各種走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた分子操作の試み、および新たな有機超薄幕の構造・機能評価技術の確立に関する研究を行ない、下記のような成果を得た。代表者の松重は、「SPMによる有機強誘電性薄膜のnmスケールの分子記憶」に取り組み、有機超薄膜における電気的双極子配向の誘起およびその検出をナノ領域で実現した。次に、「エネルギー分散型X線反射率測定装置の開発と有機超薄膜構造評価への応用」に取り組み、薄膜の膜厚、密度、界面状態を評価するための"エネルギー分散型X線反射率測定装置を開発し、真空蒸着超薄膜の膜構造評価に応用し、実用化への見通しを得た。班員の金藤は、導電性高分子、オリゴマーおよびモノマーの固液界面での自己組織化配向膜の作成に取り組み、硫黄が金の表面に強く吸収する性質を用いて、チオフェン誘導体に応用し単分子配向膜の作成に成功したまた、更に、導電性高分子薄幕の電解伸縮挙動の評価に関して、自己ドープされたポリアニリン薄膜を電気化学的に酸化・還元することによって、イオンの出入りと電子状態の変化が分子の形態に及ぼす効果を調べた。同じく班員の鷲津は、多価イオン存在下でも壁面へのDNAの吸着が生じないようなDNAの両端固定を実現するための微細電極構造を考察し、それを製作するためのプロセスを開発した。更に、この電極を持ちいて、制限酵素を用いたDNAのモレキュラーサージェリーを実証した。
ジャークセンサによる極低速回転軸受の新しい多事象損傷診断システムの開発

独自に開発したジャークセンサと独自に考案した軸受診断のための信号演算処理方法によって,転がり軸受のための新しい診断法の有効性を示した。内輪,外輪,転動体に傷がある場合のすべてに対して有効であることを示した。実用化を念頭に置いて,実時間処理システムを構築し,システムとしての課題を明確化した。また低コスト化のためのワンチップマイコンによる具体的課題も明らかにし,低速回転から高速回転まで対応可能な,本研究の提案する転がり軸受診断システムの有効性とその実現手法を実証した。本研究は数rpm程度で極低速に回転する転がり軸受の損傷の有無を判定するための新しい損傷診断システムを開発することを目的としている。具体的にはリアルタイム計測システムの試作と損傷部位の多様性への対応の有効性を検証し,実用化の目処を立てる。そして明らかにしようとしているのは,(1)信号処理のリアルタイム化と,(2)実証範囲の拡大である。平成26年度は,前者(1)について,DSPによる実システムを構築し,処理法の簡略化を検討した。DSPボードによる処理回路と機構の試作と改造を進めた。提案方法のリアルタイム信号処理回路を設計し,システムを試作した。数rpm数千rpmの回転に対する検討を可能にさせるよう,モータの交換を実施した。また予圧の状況が信号の大きさに影響することから,予圧に対する信号の検出具合を詳細に調整した。試作回路の調整のための予備実験を最終回路を製作する前に実施した。予備実験はこれまでにオフライン処理していた実験と同条件で検証実験した。同条件とは,回転数が10,20,40,200rpmで,かつ模擬損傷が外輪に一箇所の場合の条件である。その後,提案診断法の適用条件事例の増加と診断システムとしての確実化を検討する。回転数が数rpmでの検証実験を進めた。処理回路メモリ限度での最低回転速度での診断を実施した。損傷部位が複数箇所の場合への適用と問題点を洗い出し,それに対する対処法を検討した。損傷部位が複数箇所の場合への適用と問題点を洗い出した。平成27年度は内輪損傷に対する提案法の有効性を検討した。平成26年度までの装置では円錐ころ軸受を使用した。円錐ころ軸受の場合は内輪に転動体がリテーナとともに組み込まれて一体となっているため,模擬損傷を内輪の軌道面上に人為的に設けることが出来ない。そのため円筒ころ軸受に対象軸受を変更し,それに対応するため,実験装置を再設計し製作した。円筒ころ軸受には軸受隙間があり,異常信号の特殊性があることを新たに明らかにした。さらに本研究で提案する損傷診断法が転動体が損傷を通過する周期を基準として処理する方法であったが,軸受隙間のある場合は,その処理基準の周期を軸の回転周期に変更し,信号処理回路の時定数を調整することによって,そのまま同手法の概念を適用できることを明らかにした。計画通りに予備実験を重ね, DSPによる実システムを構築し,処理法の簡略化を検討し,DSPによりリアルタイム信号処理回路を設計し,システムを試作した。低速から高速回転に対応できるようモータの交換と機械構造を含めた回転実験装置を改造製作した。外輪損傷に対して低速回転での実証実験を実施し,5rpmまではシステムの検証できた。さらに同じ装置では内輪に傷がある場合の検討が物理的にできないため,実験装置全体を再設計し,内輪損傷に対する検討が可能な装置を新たに製作した。内輪に人為的に損傷を付けるためには,内輪が外せるタイプの軸受を使用する必要がある。そのため軸受隙間がある円筒ころ軸受を使用した。この場合は軸受隙間が存在するが,これにより内輪損傷の場合は軸受隙間の存在による信号の特殊性があることを明らかになった。その上で,提案する診断法を改良することによって内外輪両方の損傷を検出し診断できることを明らかにした。以上のように実施計画に沿った内容を検討でき良好な結果を得られた。実験計画の後半に検討予定の転動体に損傷がある場合についても現在進行中である。以上により概ね順調に進展していると判断した。本研究は数rpm程度の非常に低速で回転する転がり軸受の損傷の有無を判定するための新しい損傷診断システムを開発することを目的としている。本研究助成期間

全体を通じた具体的実施内容と得られた成果は,独自に開発してきた高周波数領域で高感度という特徴を有するジャークセンサを軸受近傍に設置し,軸受の発生する振動を測定し,さらに独自で考案した信号処理方法でその振動信号を処理するリアルタイム計測システムを試作し,損傷部位の多様性への対応の有効性を検証し,実用化に対する課題を明らかにした。平成28年度は,本信号処理システムが対象とする損傷部位の多様性への対応として,転がり軸受の転動体上に発生した損傷について検討した。さらに信号処理の実時間化に対するより簡易化した実用性をめざし,PICマイコンによる処理システムの構築に挑戦し,ワンチップ化の技術課題も明らかにした。転がり軸受の転動体上に発生した損傷に対しては,軸受隙間がある場合と無い場合とでは,損傷による信号発生周期が異なり,違った特徴を有することが明らかとなり,それに対する本信号処理法における対策方法を明確化した。具体的には軸受隙間が無い場合は一般に定式化されている損傷信号の発生周期で信号が検出されるが,軸受隙間がある場合は回転周期に依存した間隔で損傷信号が発生するが,その発生間隔は必ずしも回転周期ではなく,その2倍の周期で発生することを明らかにした。さらに本信号処理においては,区分重畳乗算処理の区分時間を,軸受隙間の有無の情報すなわち軸受の仕様から予め設計値としてわかっている情報を基にして変更することで診断が可能であることを実験で検証した。また処理システムのPIC化については,低速回転軸受の場合はPICのメモリ容量に情報処理の可否が影響し,高速回転の場合は演算速度とサンプリング速度によって高速上限が決まることを明らかにすることができた。独自に開発したジャークセンサと独自に考案した軸受診断のための信号演算処理方法によって,転がり軸受のための新しい診断法の有効性を示した。内輪,外輪,転動体に傷がある場合のすべてに対して有効であることを示した。実用化を念頭に置いて,実時間処理システムを構築し,システムとしての課題を明確化した。また低コスト化のためのワンチップマイコンによる具体的課題も明らかにし,低速回転から高速回転まで対応可能な,本研究の提案する転がり軸受診断システムの有効性とその実現手法を実証した。計画通りに予備実験を重ね, DSPによる実システムを構築し,処理法の簡略化を検討していること,リアルタイム信号処理回路を設計し,システムを試作したこと,低速から高速回転に対応できるようモータの交換と機械構造を含めた回転実験装置を改造製作したこと,低速回転での実証実験を実施し,5rpmまではシステムの検証できたことなど,実施計画に沿った内容を検討でき良好な結果を得ている。さらに損傷が傷通過周期内で2か所に信号が発生しうるような位相に2つの損傷を設けた場合について検討し,2か所に損傷がある場合は,2つ目の傷の信号が出難いことを明らかにした。それに対する対策については継続検討中である。以上により概ね順調に進展していると判断した。円筒ころ軸受により,外輪と内輪の損傷に対する本研究の提案法の調整法と有効性を明らかにしたが,引き続き転動体に損傷がある場合についても診断法の有効性を検討する。内輪に損傷がある場合に,損傷による異常振動の特殊性と同様に,転動体に損傷がある場合も類似の特殊性があることが推察される。そのためまずは内輪と同様の検討と対応が可能かどうかを検証する。
ベイズ流アプローチによる探索的がん臨床試験デザインの開発

新規治療法開発を効率的に推進することを目的として、第I相試験および第II相試験の新規統計的デザインの開発を行った。治療法の安全性を評価する第I相試験においては過去に行われた試験のデータを新規に行う試験に適切に取り込む工夫を行い、治療法の有効性を評価する第II相試験では層別化(サブグループ化)医療を目指してバイオマーカーを考慮した試験デザイン開発を行った。今後、実施する実際の臨床試験デザインに積極的に活用したい。研究代表者を中心に研究分担者および海外研究協力者による研究打ち合わせを実施した。2回の会合を実施し、研究実施の方向性およびスケジュールを議論した。海外研究協力者とメール会議を行うことで、方向性についてアドバイスを受けた。そのもとで、第I相試験においては個人的要因を考慮した試験デザイン、第II相試験ではバイオマーカーを考慮した試験デザインについて研究作業を進めた。研究代表者を中心に研究分担者および海外研究協力者による研究体制立上げを完了した。年間2回の会議を実施し、研究実施の方向性およびスケジュールを議論した。適宜、海外研究協力者とメール会議や電話会議を行い、方向性についてアドバイスを受けた。第I相試験においては個人的要因を考慮した試験デザイン、第II相試験ではバイオマーカーを考慮した試験デザインについて研究作業を進めた。研究代表者を中心に研究分担者および海外研究協力者による研究打ち合わせを繰り返し実施した。研究分担者とは会合を持つことで議論を重ね、海外研究協力者からはメールおよびWeb会議を通じて研究推進の方向性についてアドバイスを受けた。また、臨床家である研究分担者から臨床試験における臨床的ニーズについてアドバイスを受けた。第I相試験については、海外先行の試験データをヒストリカルデータとして本邦で行う試験に取り込むことで効率的な試験デザイン開発を行った。ヒストリカルデータの取り込みはベイズ流事前分布の形式で行い、その事前分布の情報量を適切に調整するためprior effective samplesize(情報量を仮想患者人数に変換した定量値)を用いた。第II相試験については、コントロール群に対する細胞ターゲットの新規治療の効果を評価するための肝細胞がんにおける臨床試験を題材した新規試験デザイン開発を行った。バイオマーカー(0; 1+; 2+; 3+の4カテゴリー)サブグループを考慮し、新規治療効果を最大化できるサブグループ探索を行えるデザイン開発を行った。最終年度には、上記バイオマーカーを考慮したランダム化第2相試験のデザインのためのシミュレーションを実行するためのプログラム開発を、ユーザーへの浸透性を考慮し、R統計パッケージを用いて完成させた。最終的なプログラム開発は外部専門業者に業務委託し、独立に作成したプログラムを作成して開発プログラムの検証作業を行った。生物統計当初の計画に従って会合を行い、研究内容の検討を行うことが出来たため。当初に計画した通り、会議を実施して決定した計画に従い、研究活動を実施することが出来たため。生物統計的検討を引き続き行い、今後は臨床家との打ち合わせを行うことで臨床的ニーズの試験デザインへの反映を検討する。適宜研究打ち合わせを行い、海外共同研究者からのアドバイスも引き続き受ける。研究成果を国内外の学会で発表し、英文論文にまとめて国際ジャーナルに投稿する。新規手法を実行するためのコンピュータプログラム開発を行う。ユーザーインターフェースの作成を考慮し、外部専門業者に業務委託して公開用プログラム開発を検討する。生物統計的検討については2425年度に行い、今後は臨床家との打ち合わせを行うことで臨床的ニーズの試験デザインへの反映を検討する。また、新規手法を実行するためのコンピュータプログラム開発のため、シミュレーションプログラムを作成し事前検討を行う。最終的には使用者に使いやすいユーザーインターフェースの作成を考慮し、外部専門業者に業務委託して公開用プログラムを開発する。プログラム開発のための使用設定の詳細を継続検討しているため諸々の予算執行を計画通りに行い、最も大きな割合を占めるプログラム開発により予定した予算使用を達成する予定である。諸々の予算執行を計画通りに行い、最も大きな割合を占めるプログラム開発により予定した予算使用を達成する予定である。
自己組織化と強制情報の結合による外挿的動画像生成

本研究は、「自己組織化+外部からの強制情報」という結合系により、知的情報処理を可能にすることを目的としている。対象としてはディジタル画像を選んでいる。このとき、自己組織化による画像処理は、サブシンボリックな処理であり、強制情報の注入はシンボリックな操作に関連するとみなすことができる。従って、本研究の意図は、シンボルとサブシンボルの結合処理を目指したものである。具体的には、一枚の静止画像を強制情報により変形した別画像を生成し(知的外挿)、さらにはモ-フィングを行って動画像を生成することを行う。また、より一般的な「自己組織化+教師あり学習」のアルゴリズムの開発も目的としている。上のような目的に従って得られた成果は次の通りである。1.多重降下競合学習により最適化特徴マップおよび色彩標本を得た。この色彩標本は、特定の画像に依存するものではなく、広いクラスの画像に対して汎用の能力を有するものとなっている。これは、情報圧縮を行ったことにもなっている。2.最適化特徴マップの頂点を外部知性が与える指定に基づいて移動し、そこに色彩標本を埋め込んで別の静止画像を得ることができた。3.情報圧縮済みの二つの静止画像を用いて時間的に線形補間を行い、中間のフレームを得て動画像を生成した。これは、ニューロコンピューティングが、仮想現実およびマルチメディアに手法を提供した初めての例となっている。4.2次元の静止画像にz軸を与えて、3次元の動画像を生成するアルゴリズムを得た。これは、当初は計画していなかった成果である。
融合遺伝子を標的とした横紋筋肉腫胞巣型に対する分子標的治療の開発

当初、難治性小児悪性固形腫瘍である横紋筋肉腫の中でも極めて予後不良である胞巣型横紋筋肉腫に対し、特徴的な融合遺伝子に着目して、これを分子標的として抗腫瘍効果を得ることを計画した。しかし研究途上において、他施設より融合遺伝子に対するRNA干渉を行うと細胞増殖抑制が得られるとされる論文が発表された。そこで、新たな横紋筋肉腫の分子標的として、最近成人の悪性腫瘍で注目されているHedgehog signaling pathwayに着目し、その構成転写因子であるGli1の発現を検討したところ、横紋筋肉腫細胞株において発現亢進が認められた。そこでまた、Gli1に対する阻害剤であるFSKを投与したところ、濃度依存性に細胞増殖を抑制することができた。この点に着目し、ヌードマウスに移植した横紋筋肉腫に対し、FSKを投与したところ、腫瘍増殖抑制効果を得ることができた。したがって横紋筋肉腫に対する分子標的としてHedgehog signaling pathwayが有力であることが明かとなった。先に報告されたPAX3-FKHR融合遺伝子に対するRNA干渉を行うと細胞増殖抑制が得られるとされる論文「Kikuchi K,etal:Effects of PAX3-FKHRon malignant phenotypes in alveolar rhabdomyosarcoma.Biochem Biophys Res Commun 365:568-574,2008」に示されたsiRNAを用い、生体内での導入に適しており、将来の臨床応用に有用であると思われるHVJ-envelope法にて細胞内に導入を試みた。しかしながら融合遺伝子の発現抑制を達成するために必要な導入効率は得られなかった。発表されたsiRNA以外のsiRNAも数種類作成したが、これも有意な発現抑制をもたらすことはできなかった。また、もう一つのPAX7-FKHR融合遺伝子に対するRNA干渉も計画したが、PAX7-FKHR融合遺伝子を発現している胞巣型細胞株が得られず断念した。新たな横紋筋肉腫の分子標的として、Hedgehog signaling pathwayに着目し、その構成転写因子であるGli1の発現を検討したところ、横紋筋肉腫細胞株において発現亢進が認められた。そこで、Gli1に対する阻害剤であるFSKを投与したところ、濃度依存性に細胞増殖を抑制することができた。
成人の口腔内におけるピロリ菌の定着部位の探索および胃感染との関連の検討

2016年1月から2017年2月までに京都府立医科大学附属病院歯科外来を受診した成人のうち、歯髄処置または抜歯処置をした205名を対象とし、処置歯髄・唾液・歯垢を採取し、それらのサンプル内のHelicobacter pyloriの有無をPCR法を用いて検証した。また、尿抗体検査で全身のピロリ菌感染の有無を確認し、口腔内の種々のサンプル内のH. pyloriの有無と全身感染の関連を検討した。他の採取資料・試料は、自記式質問票による生活習慣・口腔衛生習慣、既往歴、H.pylori除菌歴等であった。解析対象となった192人中25人(13.0%)が尿中抗体検査にてH. pylori感染陽性であった。また、192人中23人(12.0%)の歯髄よりH. pyloriが検出された。21人はH. pylori感染及び歯髄からの検出の両方がみられた。歯垢からH. pyloriは2人検出されたが、唾液からH. pyloriは検出されなかった。また、歯髄H. pylori陽性者の内、重度う蝕・重度歯周病混合が66%(15/23)、重度う蝕が30%(7/23)と診断され歯科処置を行っており、合わせて96%(22/23)がう蝕を有していた。また、重度歯周病と診断された者は4%(1/23)であった。以上よりH. pylori全身感染しているものは、口腔内では歯髄にH. pyloriが定着しやすいこと、唾液や歯垢など流動性の高いところは、定着しにくいことがわかった。う蝕の早期発見・早期治療はピロリ菌の定着防止につながる可能性がある。Helicobacter pylori(以下H. pylori)菌は、胃疾患の原因となり、感染経路の1つに口腔感染が想定されているが、調査方法に信頼性が乏しく、未だ口腔内の定着部位は明確でない。そこで、同一被験者で口腔内の複数の検体によるH. pylori遺伝子を検証、口腔内感染巣を検討することとした。2016年19月に本学附属病院歯科外来にて、歯髄処置及び抜歯処置施行患者102名に対して、研究参加への同意後に歯髄、歯垢(前及び臼歯部)、唾液を採取した。そして、被験者毎に4検体採取、PCR法によるH. pylori遺伝子の有無について同定した。なお、H. pylori菌感染の有無は、尿中抗H. pylori抗体検査を用いた。102名中11名の歯髄よりH. pylori遺伝子が検出された(検出率:11%)。そのうち、1名の歯垢(臼歯部)よりH. pylori遺伝子が検出、10名より尿中抗H. pylori抗体が認められた(検出率:10%)。しかし、唾液からH. pylori遺伝子は検出されなかった。尿中抗H. pylori抗体陽性者と歯垢中H. pylori遺伝子陽性者は、全て歯髄内H. pylori遺伝子陽性者であることから、歯髄組織はH. pylori菌の感染巣となりうる可能性が示唆された。また、歯髄内H. pylori遺伝子陽性者は、重度歯周病であるが歯垢中H. pylori遺伝子検出率は低く、関連は不明である。今後、検体数を増やして検討を加えたい。目標の症例数にはまだ及ばないものの、約1/2を収集している。検体の収集とともに、PCRでのピロリ菌の解析も並行して行っているが、目標症例数の1/3以上は既に終わっている。残りの症例数の確保と解析を進めていきたい。また、尿抗体検査で全身のピロリ菌感染の有無を確認し、口腔内の種々のサンプル内のH. pyloriの有無と全身感染の関連を検討している。他の採取資料・試料は、自記式質問票による生活習慣・口腔衛生習慣、既往歴、H. pylori除菌歴等である。解析対象となった192人中25人(13.0%)がH. pylori感染陽性であった。

以上よりH. pylori全身感染しているものは、口腔内では歯髄にH. pyloriが定着しやすいこと、唾液や歯垢など流動性の高いところは、定着しにくいことがわかってきた。実験における対象者の資料・試料採取は予定通り終了したが、PCR法によるピロリ菌の同定やデータ解析、論文作製に時間を要している。2016年1月から2017年2月までに京都府立医科大学附属病院歯科外来を受診した成人のうち、歯髄処置または抜歯処置をした205名を対象とし、処置歯髄・唾液・歯垢を採取し、それらのサンプル内のHelicobacter pyloriの有無をPCR法を用いて検証した。また、尿抗体検査で全身のピロリ菌感染の有無を確認し、口腔内の種々のサンプル内のH. pyloriの有無と全身感染の関連を検討した。他の採取資料・試料は、自記式質問票による生活習慣・口腔衛生習慣、既往歴、H.pylori除菌歴等であった。解析対象となった192人中25人(13.0%)が尿中抗体検査にてH. pylori感染陽性であった。また、192人中23人(12.0%)の歯髄よりH. pyloriが検出された。21人はH. pylori感染及び歯髄からの検出の両方がみられた。歯垢からH. pyloriは2人検出されたが、唾液からH. pyloriは検出されなかった。また、歯髄H. pylori陽性者の内、重度う蝕・重度歯周病混合が66%(15/23)、重度う蝕が30%(7/23)と診断され歯科処置を行っており、合わせて96%(22/23)がう蝕を有していた。また、重度歯周病と診断された者は4%(1/23)であった。以上よりH. pylori全身感染しているものは、口腔内では歯髄にH. pyloriが定着しやすいこと、唾液や歯垢など流動性の高いところは、定着しにくいことがわかった。う蝕の早期発見・早期治療はピロリ菌の定着防止につながる可能性がある。症例は共同研究期間からの協力もあり、順調に増加しており、目標まで見込まれている。症例の確保と並行して、PCR解析やデータ入力・解析を進めていく。PCR実験などの基礎実験を早期に終わらせて、データ解析、論文作製を進めていきたい。2018年中には、医学雑誌に投稿予定である。当該年度に集めた症例数は概ね収集できたが、得られた試料のPCR解析及びデータ解析はまだ2/3となっており、残りの解析を次年度に繰り越したため。実験の計画からの遅れとそれによるデータ解析・論文作製が遅れている。すでに基礎実験はおおむね終了したため、今年度はデータ解析・論文投稿を行っていく。前年度に未解析に終わった試料のPCR解析・データ解析に加えて、当初より予定していた症例数を目標として、症例数の確保とそれに伴うPCR解析やデータ解析を進めていきたい。
二本鎖RNAを用いたアジュバント併用経鼻不活化インフルエンザワクチンの開発

【目的】高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)のヒトでの感染がアジアを中心に増加し高い致死率を示しており、それらに対応できる交叉防御能のあるワクチンの開発が急務である。我々は2005/2006シーズンのインフルエンザ三価HAワクチンの経鼻接種によるH5N1ウイルスに対する交叉防御を調べる事を目的とした。【材料と方法】本邦で認可されている三価インフルエンザHAワクチンをBALB/cマウスに経鼻接種及び皮下接種した。アジュバントとして合成二本鎖RNAであるpoly(I):poly(C_<12>U)(Ampligen[○!R])を用いた。ワクチン1μgをアジュバントと共にマウスへ3週間隔で3度経鼻又は皮下接種した。接種2週間後の血清中、鼻腔洗浄液中のウイルス特異的な抗体価をELISAで測定した。さらにワクチン接種2週間後に強毒H5N1株を1,000PFU経鼻感染させ(2μl/片鼻)、感染3日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価をプラークアッセイ法にて測定し、マウスの生存率を14日間観察した。【結果と考察】皮下接種群ではワクチン特異的な血液中のIgG抗体応答が、経鼻ワクチン接種群ではワクチン特異的な血清中のIgG、鼻腔洗浄液中のIgA抗体応答が誘導された。高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)による攻撃感染に対し、皮下接種群では防御効果が認められなかったが、経鼻接種群においてウイルス価の減少と生存率の上昇が認められた。アジュバント併用経鼻ワクチン群では、ワクチン株とは異なるH5N1ウイルス感染に対しても感染防御効果が見られた。このことからシーズナルインフルエンザワクチンの経鼻接種によりワクチン株と抗原性が異なる株が流行を起こしても、ある程度の感染防御効果が期待できることが示された。1.目的高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)ワクチンは、ヒトへの皮下接種において免疫応答が低いことが知られている。またワクチン株と流行株が一致しないとワクチンの効果が期待できないが、流行前にどの株がパンデミックを起こすのか予測することは難しく流行前にパンデミックワクチンを準備しておくことは困難である。より効果的なワクチン方法の開発を目的とし、マウスをもちいてアジュバント併用経鼻ワクチンのH5N1亜型内での交叉防御効果の検討を行った。2.材料と方法ワクチンにはホルマリン不活化全粒子ワクチンNIBRG14(H5N1)を用いた。粘膜アジュバントには合成二重鎖RNAでありヒトへの投与実績のあるPolyI : PolyC_<12>U (Ampligen(【○!R】))を用いた。ワクチンを1μg単独もしくはアジュバントと共にマウスへ4週間隔で2度経鼻又は皮下接種した。さらにワクチン接種2週間後に強毒株A/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/HK/483/97(H5N1)、A/Indonesia/6/2005(H5N1)を1,000PFU経鼻感染させ(2μl/片鼻)、感染3日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価をプラークアッセイ法にて測定し、マウスの生存率を14日間観察した。3.結果と考察皮下接種群ではワクチン特異的な血液中のIgG抗体応答が、経鼻ワクチン接種群ではワクチン特異的な血清中のIgG、鼻腔洗浄液中のIgA抗体応答が誘導された。両群はワクチン株と感染ウイルス株が一致した場合、致死的なウイルス感染に対して防御が可能であったが、感染ウイルス株が異なる場合、経鼻ワクチン群で交叉防御効果が高かった。このことからワクチン株と抗原性が異なる株が流行を起こしても、経鼻接種により交叉感染防御できることが期待された。

アジュバント併用経鼻ワクチン群では、ワクチン株とは異なるH5N1ウイルス感染に対しても感染防御効果が見られた。このことからシーズナルインフルエンザワクチンの経鼻接種によりワクチン株と抗原性が異なる株が流行を起こしても、ある程度の感染防御効果が期待できることが示された。
ヘパラン硫酸・ヘパリンの6-硫酸化パターンによる生物学的・生理的機能の解析

ヘパラン硫酸(HS)は様々な発生、生理的、病理的な過程に重要な役割を持つ。これらの機能は細胞増殖因子を含め多種類のタンパクとHSの構造に依存した相互作用による。私たちはマウス、ショウジョウバエ、ニワトリ胚、変異細胞を用いてHSの2-硫酸、6-硫酸の機能を解析した。1ヘパラン硫酸によるヘパリン結合性増殖因子(HB-GF)シグナリングの制御(1)強力な血管形成因子であるVEGF165の管控形成能、シグナル活性にヘパラン硫酸の6-硫酸残基が必要であることを明らかにした(2005,J.Biol.Chem.)。(2)ヘパラン硫酸6-硫酸転移酵素(HS6STs)の3つのアイソフォームのうちHS6ST1遺伝子を破壊したマウスの胎盤迷路層では血管形成異常が観察され、VEGFの発現が減少することによることを示唆した(2007,J.Biol.Chem In press)。(3)ショウジョウバエにおいてHS6ST遺伝子を破壊すると、39%に気管形成の異常が現れ、FGF/FGFRのシグナルの阻害によることを明らかにした(2006, J.Cell Biol.)。(4)ニワトリ胚肢芽形成におけるFGF-8,-10のシグナルをHS2STが制御していることを明らかにした(2007,J.Biol.Chem. In press)。(5)FGFファミリーのシグナリングにおける6-硫酸化の要求性を調べるため、HS6ST1とHS6ST2のダブルノックアウトマウスから線維芽細胞を単離した。変異細胞ではHSヘパラン硫酸の6-硫酸残基をほとんど合成できず、FGF-4の活性が最も強く阻害された。2ヘパリンの6_硫酸化機構マスト細胞の顆粒内にあるタンパク質のいくつかはヘパリンと結合して保存され、IgEの刺激によって脱顆粒を引き起こし、アレルギーを引き起こす。タンパクとの結合にはヘパリン中の硫酸残基が重要であることが示されているが6-硫酸化の関与についてはわかっていない。先ず、ヘパリンの6_硫酸化合成機構を明らかにするため、マスト細胞が多く存在する耳のヘパリン構造を解析した。その結果、HS6ST-1ノックアウトマウス(KO)のヘパリン構造は野生型マウスと同じであった。一方、HS6ST-2KOでは典型的なヘパリン構造はほとんど合成されず、6_硫酸化構造が半減することを明らかにした。1ヘパラン硫酸によるヘパリン結合性増殖因子(HB-GF)シグナリングの制御VEGFは重要な血管新生因子であり、ヘパリン結合型のアイソフォームが存在する。私たちはこれまでにこの結合にはヘパラン硫酸の6-硫酸も2-硫酸残基も必要であることを報告した(2004,J.Biol.Chem.)。さらにVEGF165による管控形成、シグナル伝達活性をヘパラン硫酸が促進すること、その活性に6-硫酸残基が必要であることを明らかにした(2005,J.Biol.Chem.)。

実際に、HS6ST1ノックアウトマウスの胎盤迷路層では血管形成異常が観察されるので、このようなシグナリング制御がin vivoで作用する器官があることを強く示唆した。HS6ST1とHS6ST2のダブルノックアウトマウスから得られる線維芽細胞はHSヘパラン硫酸の6-硫酸残基をほとんど(野生型の5%以下)合成できなかった。これらの細胞を用いてHB-GFのシグナリングにおける6-硫酸化の影響を調べ、次年度に報告したい。2ヘパリンの6-硫酸化機構マスト細胞の顆粒内にあるタンパクはヘパリンと結合して保存され、IgEの刺激によって脱顆粒を引き起こし、細胞外に分泌される。従って、ヘパリンの生合成経路を解析するのは重要である。ヘパラン硫酸の6硫酸化酵素(HS6ST)は3つのアイソフォームが存在するが、ヘパリンの6-硫酸化がどのアイソフォームによって合成されるかはわかっていなかった。我々は結合識型マスト細胞が多く存在する耳を材料にヘパラン硫酸、ヘパリンの構造を解析した。その結果、HS6ST1ノックアウトマウスのヘパリン構造、含量は野生型マウスと同じであった。HS6ST2ノックアウトマウスでは典型的なヘパリン構造はほとんど合成されず、6-硫酸化構造が半減していた。これらからHS6ST2は少なくともヘパリンの6-硫酸化活性を持つことが明らかになった。しかし、HS6ST2ノックアウトマウスではまだ50%近くのヘパリン6-硫酸残基があるので、これが3つ目のアイソフォームHS6ST3によるのか、あるいは他のアイソフォームの代償によるかどうか今後明らかにすべき課題である。1ヘパラン硫酸によるヘパリン結合性増殖因子(HB-GF)シグナリングの制御強力な血管形成因子であるVEGF165の管控形成能、シグナル活性にヘパラン硫酸の6-硫酸残基が必要であることを明らかにした(2005,J.Biol.Chem.)。ヘパラン硫酸6-硫酸転移酵素(HS6STs)の3つのアイソフォームのうちHS6ST1遺伝子を破壊したマウスの胎盤迷路層では血管形成異常が観察され、VEGFの発現がmRNA、タンパクともに減少した。6-硫酸化がin vivoにおいても上記のような機能をもつことを示した(2007,J.Biol.Chem.In press)。またショウジョウバエにおいてHS6ST遺伝子を破壊すると、39%に気管形成の異常が現れ、これはFGF/FGFRのシグナルの阻害によることを明らかにした(2006,J.Cell Biol.).さらにFGFファミリーのシグナリングにおける6-硫酸化の要求性を調べるため、HS6ST1とHS6ST2のダブルノックアウトマウスから線維芽細胞を単離した。変異細胞ではHSヘパラン硫酸の6-硫酸残基をほとんど合成できず、FGF-1、-2、-4のうちFGF-4の活性が最も強く阻害された。これらの成果について論文を作成中である。2ヘパリンの6-硫酸化機構マスト細胞の顆粒内にあるいくつかのタンパク質はヘパリンと結合して保存され、IgEの刺激によって脱顆粒を引き起こし、アレルギーを引き起こす。これらの結合にはヘパリン中の硫酸残基が関わっていることが示唆されているが6-硫酸化の関与についてはわかっていない。従って、ヘパリンの6-硫酸化生合成経路を明らかにするのは重要である。我々はマスト細胞が多く存在する耳のヘパリン構造を解析した。
激運動がマウス海馬神経細胞に及ぼす影響とその機序

研究実績の概要本研究の目的は、昨年同様に激運動をマウスに行わせ、脳神経細胞に及ぼす活性酸素の影響を確認し、その機序を探った。今年度は、海馬神経細胞において抗酸化防御酵素のチオレドキシン(Trx)、細胞質やミトコンドリアの抗酸化酵素のチオレドキシン依存性ペルオキシダーゼ(SP-22)及び酸化修飾タンパク質の4-HNEに着眼し免疫組織化学法を用いて、さらに、DNAの酸化ストレスのマーカーである8-OHdGを用いて評価した。そして昨年同様に、8方向迷路による記憶行動学習能力も評価した。トレッドミルにて2つの運動群(HardTraining群:HT・MildTraining群:MT群)に走運動を行わせ、灌流固定を行い凍結切片を作成した。HE (Hematoxylin-Eosin)染色でHT群における海馬錐体細胞の障害を確認した。そして、Trx抗体やSP-22抗体、4-HNE抗体による免疫染色を行い、酸化ストレスの神経細胞への障害を調べ、さらに8-OHdGを用いてDNAの酸化ストレス障害を分析した。また、8方向放射状迷路を用いて、記憶行動学習能力も分析した。本研究の結果として、昨年度同様にHT群にのみ海馬錐体細胞の障害が確認され、その障害部位で4-HNE抗体による強い反応を示したが、Trx抗体やSP-22抗体では、変化が見られず、8-OHdGも同様に変化が見られなかった。さらに8方向放射状迷路では、両群においてわずかな変化しか確認されなかった。以上の結果から、激しい持久運動による海馬錐体細胞障害への要因として、酸化ストレスが関与していると考えられる。しかし、記憶行動学習能力では変化が確認さ、機能的には正常であり、神経細胞は障害を受けるが、修復もしくは保護される可能性が示唆された。研究実績の概要本研究の目的は、従来通り激運動をマウスに行わせ、脳神経細胞に及ぼす活性酸素の影響を確認し、その機序を探ると共に自由運動も行わせ、ストレスホルモンの関与を探る。平成17年度は、マウスを用いたモデル動物を作成し、海馬神経細胞において抗酸化防御酵素のチオレドキシン(thioredoxin : Trx)、細胞質やミトコンドリアの抗酸化酵素のチオレドキシン依存性ペルオキシダーゼ(mitochondrial protein SP-22)及び酸化修飾タンパク質の4-HNE(4-hydroxynonenal)に着眼し免疫組織化学法を用いて評価した。トレッドミルにて2つの運動群(HardTraining群:HT群・MildTraining群:MT群)に走運動を行わせ、灌流固定を行い凍結切片及びパラフィン切片を作成した。HE(Hematoxylin-Eosin)染色でHT群における海馬錐体細胞の障害を確認、抗酸化酵素のTrx抗体による免疫染色を行い、さらに細胞質やミトコンドリアの新規の抗酸化酵素のSP-22抗体でも同様に行い、酸化ストレスの神経細胞への障害を調べた。また、酸化ストレスの障害を検出する指標として、酸化修飾タンパク質の一つである4-HNE(4-hydroxynonenal)抗体による免疫染色を行った。また、自発運動も行わせ、ストレスホルモンの脳への影響をHE染色で調べた。本研究の結果として、HT群にのみ海馬錐体細胞の障害が確認され、その障害部位おいて4-HNE抗体による強い反応を示した。しかしながら、抗酸化防御酵素のTrx抗体やSP-22抗体では、変化が見られなかった。さらに、自発運動群では、海馬錐体細胞において変化が確認されなかった。しかし、自発運動群では変化が確認されなかったことから、他の要因として強制的に運動を強いられることによるストレス(ストレスホルモン)も否定できない。来年度以降にその関与を詳細に検討し、その機序の解明を目指す指針となりうるものである。研究実績の概要本研究の目的は、昨年同様に激運動をマウスに行わせ、脳神経細胞に及ぼす活性酵素の影響を確認し、その機序を探った。今年度は、海馬神経細胞において抗酸化防御酵素のチオレドキシン、細胞質やミトコンドリアの抗酸化酵素のチオレドキシン依存性ペルオキシダーゼ及び酸化修飾タンパク質の4-HNE(4-hydroxynonenal)に着眼し免疫組織化学法を用いて評価し、さらに、記憶行動学習能力も評価した。トレッドミルにて2つの運動群(HardTraining群:HT群・MildTraining群:MT群)に走運動を行わせ、灌流固定を行い凍結切片及びパラフィン切片を作製した。HE(Hematoxylin-Eosin)染色でHT群における海馬錐体細胞の障害を確認し、抗酸化酵素のTrx抗体や新規の抗酸化酵素のSP-22抗体による免疫染色を行い、酸化ストレスの神経細胞への障害を調べた。そして、酸化ストレスの障害を検出する指標として、酸化修飾タンパク質の一つである4-HNE抗体による免疫染色を行った。また、8方向放射状迷路を用いて、記憶行動学習能力を分析した。本研究の結果として、昨年度同様にHT群にのみ海馬錐体細胞の障害が確認され、その障害部位おいて4-HNE抗体による強い反応を示した。しかしながら、抗酸化防御酵素のTrx抗体やSP-22抗体では、変化が見られず、さらに8方向放射状迷路では、両群において変化が確認されなかった。以上の結果から、激しい持久運動による海馬錐体細胞障害への要因として、酸化ストレスが関与していると考えれる。

しかし、記憶行動学習能力では変化が確認されなかったことから、機能的には正常であり、神経細胞は障害を受けるが、修復される可能性があることが示唆された。来年度以降にその関与を詳細に検討し、その機序の解明を目指す指針となりうるものである。研究実績の概要本研究の目的は、昨年同様に激運動をマウスに行わせ、脳神経細胞に及ぼす活性酸素の影響を確認し、その機序を探った。今年度は、海馬神経細胞において抗酸化防御酵素のチオレドキシン(Trx)、細胞質やミトコンドリアの抗酸化酵素のチオレドキシン依存性ペルオキシダーゼ(SP-22)及び酸化修飾タンパク質の4-HNEに着眼し免疫組織化学法を用いて、さらに、DNAの酸化ストレスのマーカーである8-OHdGを用いて評価した。そして昨年同様に、8方向迷路による記憶行動学習能力も評価した。トレッドミルにて2つの運動群(HardTraining群:HT・MildTraining群:MT群)に走運動を行わせ、灌流固定を行い凍結切片を作成した。HE (Hematoxylin-Eosin)染色でHT群における海馬錐体細胞の障害を確認した。そして、Trx抗体やSP-22抗体、4-HNE抗体による免疫染色を行い、酸化ストレスの神経細胞への障害を調べ、さらに8-OHdGを用いてDNAの酸化ストレス障害を分析した。また、8方向放射状迷路を用いて、記憶行動学習能力も分析した。本研究の結果として、昨年度同様にHT群にのみ海馬錐体細胞の障害が確認され、その障害部位で4-HNE抗体による強い反応を示したが、Trx抗体やSP-22抗体では、変化が見られず、8-OHdGも同様に変化が見られなかった。さらに8方向放射状迷路では、両群においてわずかな変化しか確認されなかった。以上の結果から、激しい持久運動による海馬錐体細胞障害への要因として、酸化ストレスが関与していると考えられる。しかし、記憶行動学習能力では変化が確認さ、機能的には正常であり、神経細胞は障害を受けるが、修復もしくは保護される可能性が示唆された。
血中プロスタサイクリン産生刺激因子及び安定化因子の精製とその生理的意義の解明

血清又は血漿中には血管壁のプロスタサイクリン産生を刺激する物質と血中に放出されたプロスタサイクリンを安定化する物質が含まれている事が最近明らかになってきている。本研究ではこの2つの物質の構造を決定しその生理的役割を明らかにする事を目的とした。(1)PG【I_2】産生刺激因子:本物質は血漿又は血清中に存在して血管壁のPG【I_2】産生を促進する未知の物質である。限外濾過法,高速GPCから分子量分画が千以下の物質である。心筋梗塞急性期に活性が著明に低下し冠動脈内血栓の発生と密接な関連を示唆する。高速液体クロマトグラフィを使ったイオン交換クロマト、逆相クロマトにより分離しGC-MS,NMRにより構造を決める。(2)PG【I_2】安定化因子:本物質は血漿又は血清中に存在する未知の生理活性物質でありPG【I_2】と結合して安定なPG【I_2】結合物を形成する。本物質は蛋白質であり、血清から高速イオン交換クロマト、高速ゲル濾過法により精製された。現在モノクローナル抗体、cDNAを作成してその生理的意義を検討中である。