hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地方自治体における公共政策と情報関係分析－広報・広聴の情報評価を中心に

さらに、簡易的なシステムではあるが、自治体サイトのデータの種類を、拡張子から分類する、その特徴を把握する作業に挑んだ。進捗状況にあたっては、予定通りの部分とそうでない部分があるため、上記の評価とする。昨年度に行ったアンケート調査の分析の結果、ほとんどの自治体において選挙管理委員会の専従職員はゼロで総務課等の職員が兼務しており、そのため、選挙の執行・管理に手一杯で選挙啓発や広聴になかなか手が回らないこと、自治体によって選挙公報の配布方法や取り組んでいる選挙啓発事業の数や種類はかなり異なること、などの実態を明らかにすることが出来た。広報部門へのアンケートに関しても、今後の精緻な分析を待たねばならないが、当初設定した仮説を概ね支持するような結果が得られるような状況になっている。しかしながら、コンテンツから注目した時、その業務内容と地域の社会情報の整合性や合理性が取れているかは不明な点が多く残されている。また、シミュレーションとして実施すべき課題も残されている。情報の送り手に注目した研究として、以下のことが指摘できる。まず、北陸3県におけるネット上における広報紙のテキスト分析から、現状では「お知らせ」、「イベント」などの情報提供やその参加促進を重視する見出しが多いこと、専門性の高い資格や職業をあらわす「○○士」との相談機会、行政・議会・選挙など県政、医療、広義の福祉政策や年金・税制に関する情報が掲載されやすいことが理解できた。一部にパブリックコメントの募集も確認されたが、それが継続的かつ波及的な動向と判断できないという一つの知見であり、同時に、これは広報・広聴に関する課題ともいえる。次に、広報誌の特定の号に取り上げるトピックが市町村内の特定の地域に偏る可能性を、GISを用いて可視化した。その結果、広報担当者がその偏りをなくすよう配慮するかどうかは、(地域間の断絶を生じさせるかもしれない)「平成の大合併」前の自治体数よりは、県ごとの違いがあることなどが容易に理解できた。また、議会調査では、石川県と金沢市の選挙管理委員会、議会事務局、へのインタビュー調査について、その記録を整理するとともに関連資料を収集した。前年度に実施した北陸3県の選挙管理委員会を対象とするアンケート調査のデータについてクロス集計表分析や自由記述回答の分析を重ねた。そこから、広報・広聴についての取り組みの実態、企画・実施のプロセス、成果や課題についての担当者の認識などについての分析を深めた。さらに、少子高齢化や自治体財政政策の意識への自治体広報の刺激をオンライン・アンケートで検討した。その結果、政策の重要度の認識の以外に、被験者が刺激によって積極的に回答する態度の転化、自助ー公助の認識変化が政策領域ごとに現れた。政府に対する信頼は、身近な職員で比較的高いという結果を得られた。行政広報の担当者に関する意識調査、広報誌分析、刺激実験の結果から、以下が指摘できる。議会や選挙の広報部門は区分、ルール、慣習に従い、課題も抱えながら積極的に対応している。
高速エンドミル加工におけるMQLの効果とその解析的評価

本年度はMQLを適用した小径ボールエンドミルによる鋼(S45C)の高速切削実験,および高速切削時の工具温度に着目した有限要素解析を行った.1.S45Cをボールエンドミルで切削し,切削力,仕上面の機械的特性(あらさ,硬度,残留応力),仕上げ面性状の観察,工具摩耗の推移を測定した.その結果,残留応力が圧縮で硬度が高い加工面とするには,オイルミストを供給し工具傾斜角度を小さくする条件で加工するのが良いことが明らかになった.逆に工具傾斜角度を大きく設定する加工は加工変質層を小さくしたい加工に向く.高速加工においても完全ドライあるいは切削油剤の使用をできるだけ抑えた加工の普及が望まれるが,要求される加工面の機械的特性の応じてMQLや加工条件をうまく選定することが必要である.2.高速かつ断続切削におけるエンドミル内の温度を解析する手法を開発した.2枚刃エンドミルを忠実にモデル化し切れ刃部に断続的に熱流量を与えることにより断続切削を模擬した.その結果,断続切削の工具刃先近傍では、急激な温度上昇と下降を繰り返していること,1刃当たりの送り量と半径方向切り込み量は、工具温度に大きく影響しており、切削能率を同一とした場合には、半径方向切り込み量が小さくすれば工具温度が低く抑えられること,切削能率を同一とした場合には、低切削速度よりも高切削速度の方が工具温度が低くなることなどが,解析的に明かとになった.本年度はMQLを適用した小径ボールエンドミルによる鋼(S45C)の高速切削実験,および高速切削時の工具温度に着目した有限要素解析を行った.1.S45Cをボールエンドミルで切削し,切削力,仕上面の機械的特性(あらさ,硬度,残留応力),仕上げ面性状の観察,工具摩耗の推移を測定した.その結果,残留応力が圧縮で硬度が高い加工面とするには,オイルミストを供給し工具傾斜角度を小さくする条件で加工するのが良いことが明らかになった.逆に工具傾斜角度を大きく設定する加工は加工変質層を小さくしたい加工に向く.高速加工においても完全ドライあるいは切削油剤の使用をできるだけ抑えた加工の普及が望まれるが,要求される加工面の機械的特性の応じてMQLや加工条件をうまく選定することが必要である.2.高速かつ断続切削におけるエンドミル内の温度を解析する手法を開発した.2枚刃エンドミルを忠実にモデル化し切れ刃部に断続的に熱流量を与えることにより断続切削を模擬した.その結果,断続切削の工具刃先近傍では、急激な温度上昇と下降を繰り返していること,1刃当たりの送り量と半径方向切り込み量は、工具温度に大きく影響しており、切削能率を同一とした場合には、半径方向切り込み量が小さくすれば工具温度が低く抑えられること,切削能率を同一とした場合には、低切削速度よりも高切削速度の方が工具温度が低くなることなどが,解析的に明かとになった.
コイ補体のB因子およびC2のcDNAクローニング

哺乳類の補体系のC2とB因子は、それぞれ古典経路と第二経路を介して補体系の中心成分であるC3を活性化する重要な役割を担っている。本研究は、硬骨魚類のレベルで補体の古典経路と第二経路の分化を遺伝子レベルで検証することを目的として、コイのC2およびB因子のcDNA断片をRT-PCR法によって単離し、その配列を解析した。PCRプライマーには、両成分のセリンプロテアーゼドメイン内で保存されている2ケ所のアミノ酸配列をもとに合成した20merのオリゴヌクレオチドを用い、コイ肝膵臓から分離したmRNAを鋳型としてRT-PCRを行ったところ、250bpのDNA断片が特異的に増幅された。これをアガロースゲル電気泳動によって精製後、pGEM-Tベクターにサブクローニングして得られた15クローンの塩基配列をABI373Aシーケンサーで決定したところ、すべて同一の配列であった。また、この塩基配列から推定したアミノ酸配列は、マウスのC2およびB因子のアミノ酸配列とそれぞれ44%、42%と同程度の相同性を示した。マウスの肝臓mRNAからは、今回と同様の方法でC2とB因子をコードする2種類のcDNA配列が得られるのに対し、コイからは1種類の配列しか増幅されてこなかったこと、およびその配列が哺乳類のC2およびB因子に対して同程度の相同性を示したことは、硬骨魚類の補体系では、哺乳類とは異なり、C2とB因子の分岐は起こっておらず、両成分の機能を合わせ持つ1種類の成分しか存在しないことを示唆している。現在、本研究で得られたcDNA断片をプローブとして、cDNAの全長クローンの単離を進めているが、今後、この成分が実際にC2とB因子の機能を兼ね備えているかどうかをタンパク質レベルでも検証する必要があると考えられる。
ソフトウェアのオーバーホールアプローチと開発者支援に関する研究

多くのソフトウェア開発プロジェクトでは,ソフトウェアを理解しやすくすることを重視し,ソースコード中の実行可能行だけでなく,仕様書の図や説明,ソースコード中のコメントなど多様な形態でソフトウェアを記述する.すなわち,ソフトウェア開発者はソフトウェアの理解性を高めることにより,他の開発者がソフトウェアを誤解して誤った変更を行う可能性を減らそうとしている.ただし,その効果,すなわち,ソフトウェアがどの程度理解しやすくなったかを評価することは非常に難しい.これは,開発者間の知識の違い,理解する側の理解力の影響,理解プロセスが観測不可能であることなどに起因している.そこで,本研究では,理解の過程を外在化するアプローチとして,ソフトウェアのオーバーホールを提案している.このアプローチは,ハードウェアのオーバーホールと同じく,分解と再構成のプロセスからなる.ただし,分解プロセスはツールが自動的に行い,作業者は再構成プロセスを行う.平成15年度は,再構成プロセスのデータに基づいて理解性を評価するモデルを構築した.また,European Space Agency(ESA)のアンテナ制御用ソフトウェアに対して提案アプローチの適用実験を行った.提案モデルの特性および適用実験についてまとめ,国際会議(ISESE2002,SCI2003)にて発表した.多くのソフトウェア開発プロジェクトでは,ソフトウェアを理解しやすくすることを重視し,ソースコード中の実行可能行だけでなく,仕様書の図や説明,ソースコード中のコメントなど多様な形態でソフトウェアを記述する.すなわち,ソフトウェア開発者はソフトウェアの理解性を高めることにより,他の開発者がソフトウェアを誤解して誤った変更を行う可能性を減らそうとしている.ただし,その効果,すなわち,ソフトウェアがどの程度理解しやすくなったかを評価することは非常に難しい.これは,開発者間の知識の違い,理解する側の理解力の影響,理解プロセスが観測不可能であることなどに起因している.そこで,本研究では,理解の過程を外在化するアプローチとして,ソフトウェアのオーバーホールを提案している.このアプローチは,ハードウェアのオーバーホールと同じく,分解と再構成のプロセスからなる.ただし,分解プロセスはツールが自動的に行い,作業者は再構成プロセスを行う.平成15年度は,再構成プロセスのデータに基づいて理解性を評価するモデルを構築した.また,European Space Agency (ESA)のアンテナ制御用ソフトウェアに対して提案アプローチの適用実験を行った.提案モデルの特性および適用実験についてまとめ,下記の国際会議にて発表した.多くのソフトウェア開発プロジェクトでは,ソフトウェアを理解しやすくすることを重視し,ソースコード中の実行可能行だけでなく,仕様書の図や説明,ソースコード中のコメントなど多様な形態でソフトウェアを記述する.すなわち,ソフトウェア開発者はソフトウェアの理解性を高めることにより,他の開発者がソフトウェアを誤解して誤った変更を行う可能性を減らそうとしている.ただし,その効果,すなわち,ソフトウェアがどの程度理解しやすくなったかを評価することは非常に難しい.これは,開発者間の知識の違い,理解する側の理解力の影響,理解プロセスが観測不可能であることなどに起因している.そこで,本研究では,理解の過程を外在化するアプローチとして,ソフトウェアのオーバーホールを提案している.このアプローチは,ハードウェアのオーバーホールと同じく,分解と再構成のプロセスからなる.ただし,分解プロセスはツールが自動的に行い,作業者は再構成プロセスを行う.平成15年度は,再構成プロセスのデータに基づいて理解性を評価するモデルを構築した.また,European Space Agency(ESA)のアンテナ制御用ソフトウェアに対して提案アプローチの適用実験を行った.提案モデルの特性および適用実験についてまとめ,国際会議(ISESE2002,SCI2003)にて発表した.
バクテリアソーティングを用いた母乳中IgAの新生児腸内細菌叢への関与機構の解明

健常ヒト成人ボランティア6名の便サンプルを用いてIgA-SEQを行なった。結果、ヒト成人では、IgA結合細菌が多い群、IgA結合細菌が少ない群、さらに中間群の3群に分類する事ができた。また、IgA結合細菌とIgA非結合細菌の種(species)レベルでの解析では、6名の個体間では一様ではなかったが、IgA結合細菌には門(phylum)レベルではFirmicutesが圧倒的に多い事が判明した。以上から、消化管の分泌型IgAは、ある種の腸内細菌に特異的に結合していることが確認できた。次に、消化管の宿主免疫に重要と考えられている分泌型IgAに対する生理学的現象をELISAにて評価したところ、ある種の宿主由来プロテアーゼが糞便中のIgA量を低下させる可能性が示唆された。また、in vitroにおいても、ある種のプロテアーゼがIgAを分解しうる事をWestern blottingにて確認できた。以上から、ある種の宿主由来プロテアーゼの制御が、宿主の消化管免疫に重要な役割を担うIgAの保持に重要であると考えられた。今後の研究では、母乳中に含まれる分泌型IgAが果たす役割を検討するため、大腸炎モデルマウスとして知られているIL10遺伝子欠損無菌マウスに壊死性腸炎(NEC)に罹患した未熟児の便を投与し、大腸炎が惹起されるかを検討し、母乳投与による炎症の緩和と母乳中IgAが結合する腸内細菌の同定を試みる。加えて、母乳投与と宿主由来プロテアーゼの関連にも着目し研究を進めて行く。バクテリアソーティング(IgA-SEQ)の実験系の確立が本研究の遂行には必須であったが、以下の理由により難渋した。1糞便から純度の高いバクテリア液を抽出することが非常に難しかった。糞便にはバクテリアと同程度の大きさの糞便夾雑物が無数に含まれていて、これを完全に除去することが困難であった。IgA-SEQは、フローサイトメトリー解析前にバクテリアの純度を上げるの事が重要であるが、本年度に行なった実験結果から、ある程度の夾雑物のコンタミネーションは致し方ないことが理解できた。2フローサイトメトリー解析時のバクテリアfraction設定に難渋した。本年度に行なった実験結果から、バクテリアは、その形状、大きさ(長さや幅)が多種多様であるため、フローサイトメトリー上の初期設定(FSC(バクテリアの長さ)・SSC(バクテリアの太さ)ゲート)上で、広範囲に分布することがわかった。そこで、FSC・SSCゲートを平均的なバクテリアの大きさにあわせるようにminimumに設定し、広い範囲を選択することで、バクテリアを可能な限り認識できるよう設定した。3バクテリア・ソーティング時にフローサイトメトリー回路内にバクテリアが接着し、その影響でコンタミネーションを起こす。この問題に対処すべく、各サンプルのソーティング間の洗浄時間をできるだけ長く行なうこととした。以上の実験結果をふまえ、東京大学学内でのヒト由来試料取り扱いに関する倫理審査の進行状況が遅延していることから、始めに健常ヒト成人ボランティア6名の便サンプルを用いてIgA-SEQを行なった。結果、ヒト成人では、IgA結合細菌が多い群、IgA結合細菌が少ない群、さらに中間群の3群に分類できた。また、IgA結合細菌とIgA非結合細菌は個体間で一様ではなかったが、IgA結合細菌はFirmicutes(門)が圧倒的に多い結果となった。1糞便サンプルからの純度の高いバクテリア液の抽出2フローサイトメトリー解析時のバクテリアfractionの細かい設定3バクテリア・ソーティング時のコンタミネーション等の問題から、IgA-SEQ実験系の立ち上げに難渋している。さらに、4東京大学学内でのヒト由来試料取り扱いに関する倫理審査の進行状況が遅延しているため、新生児糞便や母乳サンプルの確保が得られておらず、研究試料を用いた解析にいたっていない。前年度は受理に至らなかった東京大学学内でのヒト由来試料取り扱いに関する倫理審査が受理された。本研究の遂行には、バクテリアソーティング(IgA-SEQ)の実験系確立が必須であるが、1糞便から純度の高いバクテリア液を抽出することが非常に難しいこと、2フローサイトメトリー解析時のバクテリアfraction設定が難しこと、3バクテリア・ソーティング時にフローサイトメトリー回路内にバクテリアが接着し、その影響でコンタミネーションを起こすこと等の理由から難渋している。他方で、これまでバクテリア由来のプロテアーゼが免疫グロブリンを分解することは知られているが、宿主由来のプロテアーゼがin vivoで免疫グロブリンを分解することはあまり知られていない。そのような状況の中、本研究の主となる分泌型IgAの研究の遂行によって、ある種の宿主由来プロテアーゼが糞便中IgA量をin vivoで低下させる可能性があることが示唆されている。本研究を主に担当している大学院生の研究課題変更により、バクテリアソーティングの実験を一時的に中断している。一方で、本研究を主に担当している大学院生は、現在行っている基礎医学研究を通じて、分泌型IgAや腸内細菌に止まらず、糞便中のタンパクに関する知識と基礎医学実験技術が格段に向上している。

また、IgA結合細菌とIgA非結合細菌の種(species)レベルでの解析では、6名の個体間では一様ではなかったが、IgA結合細菌には門(phylum)レベルではFirmicutesが圧倒的に多い事が判明した。以上から、消化管の分泌型IgAは、ある種の腸内細菌に特異的に結合していることが確認できた。次に、消化管の宿主免疫に重要と考えられている分泌型IgAに対する生理学的現象をELISAにて評価したところ、ある種の宿主由来プロテアーゼが糞便中のIgA量を低下させる可能性が示唆された。また、in vitroにおいても、ある種のプロテアーゼがIgAを分解しうる事をWestern blottingにて確認できた。以上から、ある種の宿主由来プロテアーゼの制御が、宿主の消化管免疫に重要な役割を担うIgAの保持に重要であると考えられた。今後の研究では、母乳中に含まれる分泌型IgAが果たす役割を検討するため、大腸炎モデルマウスとして知られているIL10遺伝子欠損無菌マウスに壊死性腸炎(NEC)に罹患した未熟児の便を投与し、大腸炎が惹起されるかを検討し、母乳投与による炎症の緩和と母乳中IgAが結合する腸内細菌の同定を試みる。加えて、母乳投与と宿主由来プロテアーゼの関連にも着目し研究を進めて行く。IgA-SEQの制度をさらに高めるため、糞便サンプルからの純度の高いバクテリア液の抽出を目的に、バクテリアに結合したIgAを標的としたMACSビーズの使用(MACS purification)を行なう。また、フローサイトメトリー解析時にDAPIなどのバクテリア核染色を追加し、Bacteria fractionの純度向上に努める。加えて、ヒト由来試料研究利用に関する東京大学学内での倫理審査が最終段階に入っている。本倫理審査が受理され次第、新生児の糞便を回収し、ヒト試料を用いたIgA-SEQを行って、母乳中分泌型IgAの新生児正常腸内細菌叢形成におけるIgAの役割を検証する。また、母乳が得られ次第、母乳中分泌型IgAによる腸内細菌叢形成と腸管免疫系確立への関与の検討をマウスモデルを使って検証する。また、ヒト新生児便を回収し、ヒト試料を用いたIgA-SEQを行って、母乳中分泌型IgAの新生児正常腸内細菌叢形成におけるIgAの役割を検証する。さらに、母乳が得られ次第、母乳中分泌型IgAによる腸内細菌叢形成と腸管免疫系確立への関与の検討をマウスモデルを使って検証する。少額の残金が発生し、次年度使用額が生じている(理由)少額の残金が発生し、次年度使用額が生じている(使用計画)研究経費に使用予定研究経費に使用予定
パリに於ける自治体独自の保全的刷新型都市計画に関する研究-POSとZACを中心に

2004年度は、まずこれまで2年分の成果を「オーダー・メイドの街づくり-パリの保全的刷新型『界隈プラン』として出版した。これは、当初の研究計画に記した通り、1990年代にパリで進められた、土地占用プラン(POS)と協議整備区域(ZAC)の詳細化の問題の分析である。とりわけ、前者は小職がパリ市役所研究員時代に整理した諸計画が、時間を経て効果(或いは問題)を明らかにしつつあり、単なる計画論ではない論考仕上げることができたと考えている。また、ZACに関しては、拙著中で扱うには扱かったものの、さらに深い考察のため2004年度を通じても資料の読み込みを実施した。さらに、かねてより土地占用プランの枠組みの中で実施されてきた眺望景観規制を我国の状況に敷衍し、建築学会での口頭発表や読売新聞の記事へのコメント発表を行っている。一方、本年度最も時間を割いたのが、2000年の都市連帯・再生法で制定が決まった、土地占用プランにかわる地域都市計画プラン(PLU)の調査である。これには、(1)都市連帯・再生法と地域都市計画プランの仕組みの分析と、(2)地域都市計画プランの策定動向調査を基本とした。前者に関しては、自治体国際化協会のレポートとして発表することができ、我国の地方行政の現場へささやかな貢献ができた。また、後者に関しては、日経系の地域情報誌に2回に渡り、パリの地域都市計画プラン策定のためのアンケートの速報を出すことができた。本研究は、本年度が助成の最終年だが、当初予定していた土地占用プランと協議整備区域の研究に関しては、満足ゆく結果を出し得たと自負している。しかし、2000年の法改正以降のフランスの都市計画の状況は流動的で、今後さらなる分析を進める方針である。02年度は主に、(1)特別土地占有プラン(POS)の詳細化のパリ市役所研修レポートの邦訳とその欠落の補填、さらに(2)協議整備区域(ZAC)のインフィル型都市計画化の基礎的調査をすることを交付申請書に記述したが、00年から施行された「都市連帯・再生法(Loi SRU : Loi relative a la Solidarite et au Renouvellement Urbains)により、市民参加の重視等、都市計画の策定の枠組みが大きく変わったため、(2)の調査は次年度に回し、(1)の土地占有プランの詳細化と都市連帯・再生法の調査に重点を置いた。具体的には、(1)に関しては、99年のパリ都市計画アトリエに於ける研修時のレポートの邦訳と補完調査を行った。新たに得た情報としては、99年時点で8例あった特別土地占有プランの数自体に変化はないが、新たに2プランが議会の承認を受け発効し、また住民団体の訴訟によって一審敗訴していた1プランが、二審(フランスでは行政裁判は二審制なので最終審)に逆転勝訴した点を把握することができた。都市連帯・再生法に関しては、文献調査が主となった。本法は00年12月13日に制定なため、ようやく適用が開始され、それに伴う雑誌論文が数多く発表され、また単行本の解説書も多く見られるようになり、本年は渡仏調査時にそれらのコピーや購入に追われた。とはいえ、そのうち02年3月の私費渡仏時と、同年6月の科研費による渡仏時の掌握文献に関しては殆ど全て読破し、寺西俊一一橋大学教授の主催する環境再生研究会で「フランスの2000年都市連帯・再生法と1990年代のパリ市の先駆性」という演題で口頭発表した。(1)は99年と00年のパリ市外局パリ都市計画アトリエ(APUR)での研修レポートを基にしているが、本科研費を得たことで本年度も現地調査を実施でき新たな知見を加味して書き下ろしたもので、300ページ程の刊行物である。また、本刊行物の執筆に先立ち、次ページの実績調書に記した2点の雑誌及び単行本に、一部をまとめつつそれぞれフォブール・サン・タントワンヌとシャン・ゼリゼの特別土地占用プランについての小論文をまとめた。ただ、「オーダー・メイドの街づくり」では、単なる事例紹介に留まらないよう、日本の都市計画に示唆的な課題に関しても分析を試みた。これは、結果的にだが現在国会で審議中の仮称景観法にも示唆が少なくないはずである。(2)は本研究の発展課題として取り組んでいるものだが、ともかく大量の既往研究が発現しており、03年12月の現地調査の大半はその収集に追われた。しかし、これにも一定の目途を付けなくてはいかないと考えていたところへ、原田純孝東大教授から社会科学研究所リサーチ・ペーパーへの寄稿の話を頂き、90年代のパリ市の特別土地占用プランの都市連帯・再生法に対する先駆性を大まかに明らかにした。これは近日刊の予定である。

さらに、かねてより土地占用プランの枠組みの中で実施されてきた眺望景観規制を我国の状況に敷衍し、建築学会での口頭発表や読売新聞の記事へのコメント発表を行っている。一方、本年度最も時間を割いたのが、2000年の都市連帯・再生法で制定が決まった、土地占用プランにかわる地域都市計画プラン(PLU)の調査である。これには、(1)都市連帯・再生法と地域都市計画プランの仕組みの分析と、(2)地域都市計画プランの策定動向調査を基本とした。前者に関しては、自治体国際化協会のレポートとして発表することができ、我国の地方行政の現場へささやかな貢献ができた。また、後者に関しては、日経系の地域情報誌に2回に渡り、パリの地域都市計画プラン策定のためのアンケートの速報を出すことができた。本研究は、本年度が助成の最終年だが、当初予定していた土地占用プランと協議整備区域の研究に関しては、満足ゆく結果を出し得たと自負している。しかし、2000年の法改正以降のフランスの都市計画の状況は流動的で、今後さらなる分析を進める方針である。
ラットOlg遺伝子を利用した、より幼若なグリア前駆細胞の探索

この研究は、成ラット脊髄に存在する様々な前駆細胞を可視化し、その能力を見極め、脊髄損傷再生への道を検討することを目的とする。2002年度では以下のことについて扱った。1.olg遺伝子:これまでにin situハイブリダイゼーションによりそのシグナルがオリゴデンドロサイトに陽性であることを確認している。MAGやMBPとの二重染色により比較的成熟した細胞もolig遺伝子を発現していることが明らかとなった。A2B5やNG2といった比較的幼弱な細胞群のマーカーとの二重染色に困難な面があり、現在その解決を図るべく研究を続けている。2.ミエリン関連糖蛋白質(MAG)分子:MAGとS-100蛋白質は、それぞれオリゴデンドロサイト、アストロサイトのマーカーとして用いられてきたが、両方を有する細胞の存在をこれまでに明らかにした。二重免疫電顕法により、両細胞の中間的性格を示す形態の細胞が観察された。現在脊髄内の局在について更なる検討を加えつつ、論文を作成中である。3.中心管周囲上衣細胞:脊髄の上衣細胞が分裂能を有することをこれまでに観察していたが、今回増殖上衣細胞をBrdUで標識しその動態を追跡したところ、多くの細胞が上衣細胞層の外側に移動していることが明らかとなった。更にこの細胞を色素またはアデノウィルスを用いて標識しその後の動態を追跡したところ、2週間でアストロサイトへと分化することをつきとめた。これらについて、現在論文として取りまとめ中である。この研究は、成ラット脊髄に存在する様々な前駆細胞を可視化することを目的としており、2001年度では以下のことについて扱った。1.olg遺伝子:現在oligと改名されolig-1,2,3の3分子がクローニングされている。今回はolig-1遺伝子に関しcRNAプローブを作成し、in situハイブリダイゼーションを行った。シグナルはオリゴデンドロサイトと考えられる細胞に陽性であった。現在in situハイブリダイゼーション法と免疫組織化学法を組み合わせ、既存の分子マーカーとの関連性を検討中である。2.ミェリン関連糖蛋白質(MAG)分子:MAGはオリゴデンドロサイト系細胞のみに陽性である分子で、現在までにL, S, fetal typeの3種が知られている。今回L, Sの共通領域を抗原として作成した抗MAG抗体を用い、成ラット脊髄での免疫組織化学染色を行ったところ、多くの細胞が抗S-100抗体との二重染色を受けた。脊髄白質ではS-100を持つ細胞はアストロサイトあるいはその前駆細胞のみに陽性となると考えられており、MAGとの二重染色を受ける細胞がどの様な細胞であるかについて更に詳細な検討を行うため、現在二重免疫電顕法を用いて観察を行っている。3.中心管周囲上衣細胞:脊髄にも上衣細胞は存在するが、分化能という意味でのその機能はあまり知られていない。BrdUを用いた分裂能の検討により、上衣細胞は脊髄の他の白質・灰白質領域と比べ、かなりの分裂能を有している事を確認している。こうした分裂能を持つ上衣細胞が脊髄において実際にグリア細胞を産生しているかどうかを検討するため、上衣細胞の標識法と標識上衣細胞の動態について研究をすすめている。
糖尿病性腎症の発症・進展におよぼすアディポネクチンおよびその受容体の役割

「研究の目的」糖尿病性腎症におけるアディポネクチンの役割について検討した。「研究の方法」ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルを用い、基礎検討をした。体重、尿量、空腹時血糖、ヘモグロビンAlc、尿蛋白量、血清クレアチニン、血清脂質プロフィール、クレアチニンクリアランス、さらには血漿アディポネクチン濃度を調べた。腎組織所見としては通常のPAS染色にくわえ、ポドサイト関連蛋白であるネフリン、α3インテグリン、αジストログリカン、ポドプラニン、ポドカリキシンさらにアディポネクチンの染色強度を調べた。NIH imageを用いて定量した。一部の実験では局在を明らかにするために二重染色を行った。「研究成果」尿蛋白は8週までは対照ラットと変わらず、12週で有意に増加し、検討した24週まで持続した。ポドサイト関連蛋白の発現変化では、尿蛋白が出現する前の8週時ですでにネフリンの発現が低下しており、24週ではネフリンの発現は復するものの、α3インテグリン、αジストログリカンの発現低下が認められた。血漿アディポネクチンレベルは8週でも糖尿病モデルでは低下傾向を認め、24週では対照群の約20%に低下した。腎糸球体でのアディポネクチン染色強度は、糖尿病群で増強し、24週でさらに顕著であった。このことからアディポネクチンは腎糸球体においてなんらかの保護的役割を担っている可能性が考えられた。糖尿病性腎症のモデルとしては、8週齢の雄性Wistarラットにストレプトゾトシン45mg/kg体重を1回静注することにより糖尿病を惹起した(STZ群)。クエン酸バッファーのみ注射したラットを対照群とした。STZ群では注射1週以内に血糖上昇がみられ、以後インスリンを用いずともケトーシスを起こさずに、24週まで観察できた。尿蛋白は注射後8週過ぎから増加したが、血清クレアチニンは24週まで低下したままであった。また腎組織にて糸球体硬化病変は生じていなかった。したがってSTZ群は糖尿病性腎症でも、初期の糸球体過剰濾過の時期に一致するモデルと考えられた。まずアディポネクチンの血中濃度は、STZ群で8週でも24週でも低値であった。アディポネクチンに対する抗体(昭和大学薬学部中野博士から供与)を用いた免疫組織学的検討では、8週の対照ラットにおいても糸球体が染色されたが、24週での染色性と有意差はなかった(NIH Imageにて定量)。STZ群では24週で約2倍に増加した。いずれの群も染色局在は内皮細胞とメサンギウム細胞であり、内皮細胞とメサンギウム細胞の特異的マーカーであるPCAMあるいはThy-1に対する抗体との二重染色(Bio-Rad)で確認された。一方、マウスアディポネクチン受容体に対する抗体でも同様の染色性と発現変化が見られた。Autocrine的な意味付けがある可能性がある。さらにRT-PCRでも調べたが、明らかな変化は認めなかったことから、遺伝子レベルの変化は大きくないかもしれない。ただ今後Northernブロットでも検討する必要がある。血清アディポネクチンは内蔵肥満患者では低下し、耐糖能低下を招く要因の一つと考えられており、メタボリックシンドロームの基本病態の一つである。メタボリックシンドロームはやがて血管病を引き起こし、心臓、脳および腎臓などの標的器官の臓器不全を招いて死に至らしめる。アディポネクチンの腎における役割についてはほとんど不明であり、メタボリックシンドロームにおける腎臓病の発症と進展を防止するためには、早急な役割解明が必要である。そこで、アディポネクチンと腎の関係を明らかにする目的で、まずアディポネクチン受容体の腎内における存在様式について研究を進めた。さらに、糖尿病性腎症における受容体発現の変化、さらには外因性のアディポネクチンが腎の機能と形態に及ぼす影響について分子生物学的に検討した。1)免疫組織

化学アディポネクチンに対する特異的抗体を用いて染色したところ、腎の糸球体とくに内皮細胞に明らかな染色が認められ、受容体の存在の可能性が示唆された。血管内細胞の特異的抗体(PECAM-1)との二重染色でも内皮細胞に局在することが確認された。ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットを用いた経時的変化では、8週より24週で蛍光強度が増加していたが組織染色は糖尿病の進行とともに上昇し、メサンジウム細胞特異抗体(Thy-1)との二重染色において、メサンジウム細胞の染色も確認した。血清アディポネクチンレベルは24週で糖尿病群で低値であった。2)アディポネクチン受容体のreal time RT-PCRアディポネクチン受容体にはadipoR1とadipoR2が同定されている。それらの発現量の変化をreal time RT-PCRで定量した。内部コントロールとしてGAPDHを用いて検討したところ、受容体の発現量自体には大きな変化は認められなかった。以上の結果から、血清のアディポネクチンレベルは糖尿病状態で低下する一方で、腎糸球体での結合は亢進した。これが受容体を介した特異的結合であるかは不明である。今後in situ hybridizationなどでさらに検討する必要がある。
ペプチド間相互作用に基づくナノ粒子の表面設計法の確立とその表面特性の解析

低副作用で転移がんにも有効ながん治療法として、患者自身の免疫を活性化し、がん細胞を攻撃させるペプチドワクチン療法が注目されている。ワクチンは、体内の樹状細胞に取り込まれることで免疫を誘導する。しかし、ペプチドワクチンを注射などにより投与するだけでは、樹状細胞以外の細胞にも取り込まれてしまう。その結果、免疫は誘導されず、免疫寛容などの副作用を引き起こすことが問題となっている。この問題の解決のため、ペプチドを樹状細胞選択的に送達する手法の確立が求められている。現在、生分解性高分子から成る微粒子状キャリアにペプチドを内包することで、樹状細胞選択性を向上させる手法が主流である。しかし、本手法においても、ペプチドの粒子からの漏出は避けられず、副作用の危険性は排除できない。申請者はこれまで、アミノ酸N-カルボキシ無水物(NCA)重合法により、親水性のポリエチレングリコール(PEG)をコロナ、疎水性のポリフェニルアラニン(PPhe)をコアとするコアーコロナ型の生分解性ナノ粒子が得られることを報告してきた。さらに、PEGとPPheの間にジスルフィド結合を導入することで、還元反応によるPEG鎖の解離と酸化反応による結合により、ナノ粒子の表面構造を自在に制御可能であった。本年度は、得られたナノ粒子の表面構造が樹状細胞に与える影響について明らかにすることを目的とし実験を行った。その結果、特に、解離可能なPEG鎖を有するナノ粒子が、細胞内環境に応答してPEG鎖が解離し、疎水性表面が露出することで樹状細胞を活性化することを見出した。さらにこの知見から、本ナノ粒子をペプチドワクチンキャリアとして展開した。本ナノ粒子を用いることで、ナノ粒子を取り込んだ樹状細胞のみを選択的に活性化し、ペプチドを送達することができることが示唆された。本設計は、安全で効果の高いペプチドワクチンシステムの確立に寄与すると期待される。(抄録なし)医療分野への応用を目指した高分子ナノ粒子の開発では、粒子表面とタンパク質との相互作用の制御が重要である。タンパク質の材料表面への非特異的な吸着は、機能的に設計された表面の構造を損なわせ、機能・性能の低下の原因となる。そのため、高いタンパク質吸着抑制能を有する生分解性ナノ粒子の開発が求められている。高密度ポリエチレングリコール(PEG)ブラシ層の構築は、タンパク質の非特異的な吸着を抑制するための最も効果的な手法の一つである。最近、高分子量と低分子量の二種類のPEG鎖から構成されるヘテロPEGブラシ構造が、高いタンパク質吸着抑制能を発現することから注目されている。しかしこの手法は、金基板とチオール基の相互作用を利用しており、生分解性基板、特にドラッグキャリアへの応用を目指した生分解性粒子表面への適用は困難であった。申請者はこれまで、チオール-ジスルフィドの酸化還元反応に基づき、脱離-再結合が可能な高密度PEGブラシを有する生分解性ナノ粒子に関する研究を展開させてきた。今年度は、高いタンパク質吸着抑制能を有する生分解性ナノ粒子の開発を目的とし、ペプチドナノスフェア表面のPEGブラシ構造の設計によりその達成を試みた。PEGブラシ構造の制御は、元のPEGブラシ(分子量2000)を部分的に脱離させ、次に、より高分子量のPEG(分子量5000-20000)を結合させることで達成した。還元反応および、酸化反応の条件を制御することにより、残存PEGの密度を0%から60%まで、結合するPEGの密度は10%から50%まで制御可能であった。得られた種々のブラシ構造を有するナノ粒子において、タンパク質の非特異的吸着を検討したところ、PEG2k60%/PEG5k40%というヘテロブラシ構造において最も高い吸着抑制能が得られた。さらに本ヘテロブラシナノ粒子は、血清中で3週間以上安定に分散した。ヘテロPEGブラシ層の構築は生分解性ナノ粒子に高いタンパク質吸着抑制能と分散安定性を付与する有用な手法であると期待される。

さらにこの知見から、本ナノ粒子をペプチドワクチンキャリアとして展開した。本ナノ粒子を用いることで、ナノ粒子を取り込んだ樹状細胞のみを選択的に活性化し、ペプチドを送達することができることが示唆された。本設計は、安全で効果の高いペプチドワクチンシステムの確立に寄与すると期待される。従来の生分解性ナノ粒子では、粒子の表面機能を損なわせるタンパク質の非特異的吸着が問題であった。そこで私は、粒子表面へのタンパク質の非特異的吸着を抑制するために、表面PEGブラシ構造の制御に着目した。その結果、極めて高い吸着抑制能を有する生分解性ナノ粒子を得ることができ、生体内を模倣した条件で長期間、その表面機能を保持することを示した。本結果はすでに投稿中である。得られたナノ粒子の表面構造が、細胞とナノ粒子間の相互作用に対して与える影響を明らかにするために、細胞毒性や取込挙動、細胞の産出するサイトカイン等について評価を行う。表面構造と細胞応答の相関が得られることで、生分解性ナノ粒子をドラッグキャリアとして、或いは免疫賦活能を有するナノ粒子アジュバントとして用いる際の最適な表面設計に関する知見が得られるものと期待される。(抄録なし)
市民参加に関する意識構造の細分化分析手法の開発

社会基盤整備において市民参加を進めるに当たっては,意識調査をそのツールとして用いることを前提にして,その結果を分析する手法の開発が必要であるといえる.特に,意識と行動の関係や,サイレント・マジョリティーの存在,多様化する価値観などを考慮した,市民の意識を細分化して捉える方法を研究する必要がある.そこで本研究では,(1)既存の意識調査から得られた回答値間の関係を調べ,(2)意識構造の細分化手法を開発し,(3)実際に意識構造を調査しその実効性を検討することを目的とした.本年度は当初の研究計画のうち,(2)および(3)について実施する予定であったが,「(2)意識構造の細分化手法を開発する.」においては,x2値のロバスト推定の議論をセグメンテーションに応用できないという問題が残っており,この部分について検討したものの最終的には完成させることはできなかった.「(3)実際に意識構造を調査しその実効性を検討する.」においては,実際の社会基盤整備プロジェクトを対象に意識調査を設計し実施することができた.調査内容は,当該プロジェクトに対する意識の他,情報を得たメディアなどである.ここで得られたデータに対しては基礎的な分析を進め,調査手法の有効性やその内容について検討することができた.さらに,市民・計画主体間の情報交換ツールとしての利用可能性,サイレント・マジョリティーの意見の把握可能性等について検討することが可能となった.本年度は,意識調査の分析に良く用いられる構造方程式モデルから得られる意識構造を基準に,何らかの意味で同質な人ごとにセグメンテーションをする方法について検討することを目的とした.その際には,セグメンテーションの指標として,影響関数から得られる値を用いることを試みた.影響関数は,主に回帰分析などのロバスト推定のために導入されたもので,各観測値がモデルの推定結果にどのような影響を与えているかを数値化して,その結果から外れ値を探すために用いられる.構造方程式モデルではその適合度関数を用いて定義されるが,あるサンプルを推定母集団から外すときにパラメータがどう変動するか,あるいは対象に別のサンプルを新たに加える際のパラメータの変動も同様に定義できると考えた.ここで,分析者が着目した部分的な構造(ある一つのパスや,複数のパス,変数間の相関など)の影響係数をもとにセグメンテーションをすることになるが,本研究ではモデル全体への適合度に着目してセグメンテーションを行うため,χ2(カイ二乗)値とGFI(適合度指標)を取り上げた.ケーススタディのモデルについて,セグメンテーションを行った結果,χ2値による方法では,所属セグメント数が多いほど計画への参加傾向が高くなる傾向にあり,これもセグメンテーション方法として利用できる可能性があることが分かった.GFIによる方法では,各サンプルのΔGFIの値が非常に小さかったために,サンプル間の違いがはっきりせず,結局望ましい結果を得ることはできなかった.また,χ2値のロバスト推定の議論をセグメンテーションに応用できないという議論が残り,来年度も引き続き検討していく.社会基盤整備において市民参加を進めるに当たっては,意識調査をそのツールとして用いることを前提にして,その結果を分析する手法の開発が必要であるといえる.特に,意識と行動の関係や,サイレント・マジョリティーの存在,多様化する価値観などを考慮した,市民の意識を細分化して捉える方法を研究する必要がある.そこで本研究では,(1)既存の意識調査から得られた回答値間の関係を調べ,(2)意識構造の細分化手法を開発し,(3)実際に意識構造を調査しその実効性を検討することを目的とした.本年度は当初の研究計画のうち,(2)および(3)について実施する予定であったが,「(2)意識構造の細分化手法を開発する.」においては,x2値のロバスト推定の議論をセグメンテーションに応用できないという問題が残っており,この部分について検討したものの最終的には完成させることはできなかった.「(3)実際に意識構造を調査しその実効性を検討する.」においては,実際の社会基盤整備プロジェクトを対象に意識調査を設計し実施することができた.調査内容は,当該プロジェクトに対する意識の他,情報を得たメディアなどである.ここで得られたデータに対しては基礎的な分析を進め,調査手法の有効性やその内容について検討することができた.さらに,市民・計画主体間の情報交換ツールとしての利用可能性,サイレント・マジョリティーの意見の把握可能性等について検討することが可能となった.
微分幾何学における変分問題

具体的には,以下の通りである.コンパクト4次元多様体上のprincipalbundle上の滑らかな接続は,その位相不変量から決まる,エネルギーの下限を持つ.Yang-Mills heat flowの初期値として与える滑らかな接続の初期値が,エネルギーの下限に十分近い時を考え,その場合には,その初期値に対するYang-Mills heat flowの時間大域的な古典解が存在することを証明した.多様体に曲率の条件を与えない時には,その解は,時刻無限大において爆発する可能性を否定できないが,曲率から決まるある条件の元では,時刻無限大において,(anti-)selfdual connectionに滑らかに収束することも証明した.また,3次元ユークリッド空間上のYang-Mills-Higgs heat flowの大域的な幾何学的解の存在を証明した.これは,3次元ユークリッド空間の無限遠点集合上に特異点が現れる可能性を排除した解のクラスを考え,そのクラスの中で,時間大域的な解の存在を証明したものである.具体的には,以下の通りである.コンパクト4次元多様体上のprincipalbundle上の滑らかな接続は,その位相不変量から決まる,エネルギーの下限を持つ.Yang-Mills heat flowの初期値として与える滑らかな接続の初期値が,エネルギーの下限に十分近い時を考え,その場合には,その初期値に対するYang-Mills heat flowの時間大域的な古典解が存在することを証明した.多様体に曲率の条件を与えない時には,その解は,時刻無限大において爆発する可能性を否定できないが,曲率から決まるある条件の元では,時刻無限大において,(anti-)selfdual connectionに滑らかに収束することも証明した.また,3次元ユークリッド空間上のYang-Mills-Higgs heat flowの大域的な幾何学的解の存在を証明した.これは,3次元ユークリッド空間の無限遠点集合上に特異点が現れる可能性を排除した解のクラスを考え,そのクラスの中で,時間大域的な解の存在を証明したものである.具体的には,以下の通りである.コンパクト4次元多様体上のprincipalbundle上の滑らかな接続は、その位相不変量から決まる,エネルギーの下限を持つ.Yang-Mills heat flowの初期値として与える滑らかな接続の初期値が,エネルギーの下限に十分近い時を考え,その場合には,その初期値に対するYang-Mills heat flowの時間大域的な古典解が存在することを証明した。多様体に曲率の条件を与えない時には,その解は,時刻無限大において爆発する可能性を否定できないが,曲率から決まるある条件の元では,時刻無限大において,(anti-)selfdual connectionに滑らかに収束することも証明した.また,3次元ユークリッド空間上のYang-Mills-Higgs heat flowの大域的な幾何学的解の存在を証明した.これは,3次元ユークリッド空間の無限遠点集合上に特異点が現れる可能性を排除した解のクラスを考え,そのクラスの中で,時間大域的な解の存在を証明したものである.具体的には,以下の通りである.コンパクト4次元多様体上のprincipalbundle上の滑らかな接続は,その位相不変量から決まる,エネルギーの下限を持つ.Yang-Mills heat flowの初期値として与える滑らかな接続の初期値が,エネルギーの下限に十分近い時を考え,その場合には,その初期値に対するYang-Mills heat flowの時間大域的な古典解が存在することを証明した.多様体に曲率の条件を与えない時には,その解は,時刻無限大において爆発する可能性を否定できないが,曲率から決まるある条件の元では,時刻無限大において,(anti-)selfdual connectionに滑らかに収束することも証明した.また,3次元ユークリッド空間上のYang-Mills-Higgs heat flowの大域的な幾何学的解の存在を証明した.これは,3次元ユークリッド空間の無限遠点集合上に特異点が現れる可能性を排除した解のクラスを考え,そのクラスの中で,時間大域的な解の存在を証明したものである.
ヒドロゲナーゼ成熟化における金属クラスター組み込みの分子機構

Hypタンパク質群(HypA, B, C, D, E, F)は,水素代謝を行う[NiFe]ヒドロゲナーゼにニッケル・鉄クラスターを組み込むことで,ヒドロゲナーゼを活性化させる成熟化因子である.これまでの一連のHypタンパク質およびその複合体の構造解析の成果を発展させて,成熟化過程で過渡的に形成される各種複合体(HypAB複合体,ヒドロゲナーゼ・大サブユニットHyhLとHypAおよびHypCとの複合体)やプロテアーゼHybDの構造・機能解析を行い,さらにはニッケル供給タンパク質の探索にも取り組んで,[NiFe]ヒドロゲナーゼ成熟化の分子機構についてのさまざまな知見を得た.本研究は,[NiFe]ヒドロゲナーゼの成熟化過程で過渡的に形成されるHypタンパク質複合体などを中心に構造解析を行い,成熟化過程の分子機構を明らかにすることを目的としている.HypAB複合体のSECカラムを用いた結合実験によって,ATPγS存在下で両者が複合体を形成することが分かった.この結果を基に複合体サンプルを調製し,1.7 A分解能での結晶構造を決定することができた.HypAB複合体は,HypA二分子HypB二分子のヘテロ四量体を形成していた.HypBと複合体を形成することで,HypAは大きく構造変化しており,HypAのHis98がN末端に接近していた.その結果,単独のHypAには存在しなかったNi結合部位がN末端に形成されており,その部位にNiが結合していることも確認できた.等温滴定型熱量測定により,HypAは複合体を形成することで,Niに対する親和性が約600倍上昇することが分かった.HyhL-HypA複合体については,結晶化条件やクライオ条件の最適化を行い,3.7 A分解能の回折強度データを収集することができた.さらに分解能の向上を目指している.Thermococcus kodakarensisの菌体抽出液から,Ni供給タンパク質としての候補タンパク質を探索した.Strepタグ付きHypBを作成し,菌体抽出液とHypBおよびHypAB複合体との反応サンプルをタグ精製することによって,HypB(HypAB複合体)と結合するタンパク質を検索した.HybD(申請書のHycIより名称変更)の大腸菌を用いた大量発現系を構築し,精製方法を確立した.HybD単独の結晶構造を1.8 A分解能で決定することに成功し,決定された構造から金属結合部位を予想した.並行して,HyhL-HybD複合体の結晶化も行った.本研究は,[NiFe]ヒドロゲナーゼの成熟化ではたらくHypタンパク質群を対象に,その作用過程で過渡的に形成される複合体状態を中心に構造解析を行い,金属クラスター組み込みなどの成熟化過程の分子機構を明らかにすることを目的としている.HypAB複合体については,これまでに用いた阻害剤ATPγSの他に,分解されないAMPPCPを用いて複合体を調製し,またNiの存在下,非存在下など複数の状態での構造解析を行うことで,より詳細なNi組み込みの機構を明らかにした.HyhL-HypA複合体については,結晶化条件や凍結条件の最適化を行うことで,3.3Å分解能の完全な回折データを収集することができた.HyhL-HypC複合体についても,安定した複合体形成の条件検討を行い,得られた複合体試料について結晶化を行った.Ni供給タンパクについては,引き続き候補タンパク質の探索を行った.これまでに行ってきたThermococcus kodakarensisの菌体抽出液を用いた結合実験に加えて,新たにNi結合モチーフに基づくアミノ酸配列からの検索も行い,その結果見つかった候補タンパク質に対しては構造解析も行った.プロテアーゼHybD(申請書のHycIより名称変更)については,明らかにした構造から得られた情報に基づいて,計算的手法によって金属結合部位の予想を行った.並行して,HyhL-HybD複合体を調製してその結晶化にも取り組んだ.その際,安定した複合体を調製するために,HybD単独の構造から予想した活性残基を置換した変異体も作成した.HypAB複合体については,構造解析と生化学的解析から,HypAB複合体がNiを捉えるメカニズムを解明した.これらの成果をまとめて論文を出版した.HyhL-HypA複合体については,3.3Å分解能の完全な回折データを収集した.Ni供給タンパクについては,様々な方向から候補タンパク質の検索を行っている.HybDについても,構造解析の結果から金属結合部位の予想を行った.その成果をまとめて現在論文投稿中である.本研究は,[NiFe]ヒドロゲナーゼの成熟化をつかさどるHypタンパク質群を対象に,その作用過程で過渡的に形成される複合体状態を中心に構造解析を行い,金属クラスター組み込みなどの成熟化過程の分子機構を明らかにすることを目的としている.HyhL-HypA複合体については,他種由来ヒドロゲナーゼやHypA単体をモデル分子とした分子置換法により初期位相を決定した.現在,構造の精密化を進めている.HyhL-HypC複合体については,安定した複合体の収量を増やすために,新たな発現条件の検討やタグを用いた精製方法の改善を行った.また,得られたサンプルについて結晶化スクリーニングを行った.Ni供給タンパク質については,SlyDが持つNi結合配列(HGHXH)をT. kodakarensis由来タンパク質全体からBLAST検索したところ,唯一TK2203だけがこの配列を持つことが分かった.このタンパク質について構造解析を行ったところ,1.4A分解能で構造を決定することができた.

しかしながら,得られた構造からTK2203はNi供給タンパク質ではなくジオキシゲナーゼであることが分かり,Niの供給はNi結合配列をもたない他のタンパク質が担っているか,あるいは,別のNi供給機構が存在することが示唆された.プロテアーゼHybD(申請書のHycIより名称変更)については,得られた構造に基づいて金属結合部位の議論を行った.また,HyhL-HybD複合体を作成するために,前年度に作成したHybD変異体を用いた複合体調製を行い,結晶化を行った.さらに,金属クラスターを含んだHyhLをT. kodakarensis菌体から直接精製することも検討した.Hypタンパク質群(HypA, B, C, D, E, F)は,水素代謝を行う[NiFe]ヒドロゲナーゼにニッケル・鉄クラスターを組み込むことで,ヒドロゲナーゼを活性化させる成熟化因子である.これまでの一連のHypタンパク質およびその複合体の構造解析の成果を発展させて,成熟化過程で過渡的に形成される各種複合体(HypAB複合体,ヒドロゲナーゼ・大サブユニットHyhLとHypAおよびHypCとの複合体)やプロテアーゼHybDの構造・機能解析を行い,さらにはニッケル供給タンパク質の探索にも取り組んで,[NiFe]ヒドロゲナーゼ成熟化の分子機構についてのさまざまな知見を得た.HypAB複合体の構造を1.7A分解能で決定することができ,Ni結合部位を特定することができた.また,明らかにした構造を基に生化学的解析にも取り組み,HypAB複合体がNiを捉えるメカニズムを解明した.HyhL-HypA複合体については,3.7 A分解能のフルデータを収集することができた.HybDについても,1.8 A分解能で構造を決定することができた.HyhL-HypA複合体やHyhL-HypC複合体については,引き続き安定な複合体の調製ならびに結晶化条件や測定条件の検索を行い,より高分解能での回折データ収集を目指す.Ni供給タンパク質については,引き続き候補タンパク質の検索を行う.候補タンパク質の遺伝子を破壊したT. kodakaraensis株も作製し,実際にこのタンパク質がヒドロゲナーゼ成熟化機構に与える影響をin vivoで解析する.HyhL-HybD複合体については,HyhLのC末端ペプチドやHybD変異体を用いることも含めて,引き続き複合体の調製や結晶化条件の検索を行う.28年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質結晶学・構造生物学HyhL-HypA複合体については,引き続き結晶化条件や測定条件の検討を行い,より高分解能なデータ収集を目指す.他のHypタンパク質複合体についても,その調製・結晶化ならびに構造解析に取り組む.引き続きNi供給タンパク質の候補タンパク質を検索する.HypAを用いた結合実験や,ゲノム情報を用いたNi結合モチーフの検索にも取り組む.HybD-HyhL複合体については,HyhLのC末端ペプチドを用いることも含めて,引き続き結晶化条件を検索する.本研究で対象としている金属クラスター久組み込みに関与する過渡的な複合体のうち,複合体調製が難しいものについては,共発現などの方法を再検討することとしたため,本年度はそれを重点的に行い,複合体調製,結晶化,構造解析の一部は次年度に行うこととした.28年度が最終年度であるため、記入しない。