hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経イオンチャネル障害から見たレット症候群の病態解明と治療薬の探索研究

ES細胞からSFEB法の変法を用いて分化誘導したグルタミン酸作動性神経を用いて、qRT-PCRにて各種イオンチャネルおよびその関連因子の遺伝子発現の変化の有無を調べた。いずれの因子においてもその発現変化は認められなかった。前年度までの動物モデルを用いた実験において、肺組織の病理学的検討、生体での誤嚥評価でMeCP2欠損マウスでは右前葉に限局した誤嚥性肺炎を生じることを明らかにしており、今年度は引き続いて、その原因検索を中心に研究を行った。肺胞壁間距離の解析で、MeCP2欠損マウスでは肺胞腔の拡大が見られた。I型/II型肺胞上皮細胞の比率解析を行い、ABCA3陽性のサーファクタントを産生するII型肺胞上皮細胞の減少が見られた。肺組織の肺特異的マーカー遺伝子ならびに、サイトカインや細胞表面抗原などの炎症に関連した遺伝子の発現をRT-PCRで確認し、肺胞サーファクタントの遺伝子発現が低下を確認した。脳幹組織を用いた嚥下関連神経回路の評価でMeCP欠損マウスの脳幹ではグルタミン酸作動性神経マーカー、コリン作動性神経マーカー、ドパミン作動性神経マーカー、サブスタンスPなどのいずれも発現が低下しており、脳幹神経回路の機能不全が示唆された。さらに脳幹免疫染色で、脳幹嚥下中枢を構成する孤束核、最後野、迷走神経背側核にて、サブスタンスPの発現が低下していた。サブスタンスPは嚥下反射、咳嗽反射の形成における主要な神経伝達物質であり、その発現低下から、嚥下中枢の機能不全を引き起こし、誤嚥性肺炎を来たしていると考えられた。RTTモデルマウスにおいては、肺組織の成熟障害のみならず、脳幹における神経伝達物質放出の異常異常が誤嚥性肺炎を惹起している可能性が示唆された。Rett症候群(RTT)は、MeCP2遺伝子変異を主因とする小児の中枢神経障害であり、その発症機構の解明や治療法の確立が切望されている。これまでに申請者らは、MeCP2欠損マウスの不整脈の病態メカニズムを解析する過程において、心臓及び中枢神経系に発現する種々のイオンチャネルの発現異常を見出している。そこで、MeCP2欠損マウス、及びES/iPS細胞をRTT動物、細胞モデルとして、中枢神経系におけるイオンチャルの発現や機能変化が、RTT病態に及ぼす影響を解析し、RTT病態機構の解明、イオンチャネル作用薬の利用による治療法の開発を目的として研究を進めている。計画初年度の今年は、SasaiらのSFEB法(Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates)に若干の改変を加え、RTTモデル(MeCP2欠損)ES細胞から大脳皮質系の神経細胞の分化誘導を行なった。その結果、マウスES細胞のMeCP2の有無にかかわらず、様々な神経分化マーカーを発現する神経細胞の高効率な分化誘導に成功した。また、この分化誘導法でMeCP2欠損、野生型ES細胞をそれぞれ異なる6クローンずつ調整し、誘導開始後、6日目、10日目の細胞凝集塊からRNAを抽出し、定量PCRにて解析した。その結果、イオンチャンネル分子をはじめとする幾つかの遺伝子の発現がMeCP2欠損ES細胞で変化することを見出した。現在、MeCP2欠損、野生型ES細胞を35日間分化誘導した神経細胞の電気生理学的な解析を行ない、発現変化が認められるイオンチャンネル分子のRTT病態における役割を解析している。初年度にして高効率な神経分化誘導に成功し、ターゲットとなるイオンチャネルの同定ができたため。前年度までにMeCP2欠損ES細胞や野生型は高率に神経細胞に分化誘導することが可能で、両者で発現の異なるいくつかの遺伝子を見出している。本年度はさらに詳細な解析を進めるため、長期間分化誘導後の神経細胞の解析を行うとともに、マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子解析を行った。その結果、MeCP2欠損ES細胞において電気生理学的な変化が疑われる結果を得た。マイクロアレイでは病態に関わる可能性のある遺伝子群の発現変化を認めており、病態との関連を検討する。現在、さらなる電気生理学的解析を進めるとともに、樹状突起上のスパイン形成などを免疫染色を用いて定量的に解析する方法を模索している。長期間の培養によりES細胞から比較的成熟した神経細胞が分化誘導されていることを電気生理学的な膜特性解析により確認できたため。今年度はMecp2欠損ES細胞から誘導した神経細胞の解析を継続するとともに、Mecp2欠損モデルマウスの解析を中心に行なった。Mecp2欠損マウスは、生後3-4週目までほぼ正常に成長する一方で、その後、体重増加が遅延し、7-8週頃から死亡する個体が出現し、10-12週目までに全て死亡する。これまでの報告によると、死亡原因は、不整脈や呼吸異常によると考えられてきたが、その詳細は不明であった。モデルマウスを詳細に解析したところ、7-9週の死亡前に、極度に衰弱し、呼吸異常を認めること、病理学的な肺組織の観察で炎症性の傷害が認められることを見出した。また、偏光顕微鏡観察の結果、肺胞腔にforeign bodiesが認められ、炎症の本態が誤嚥性肺炎であることが明らかとなった。誤嚥の発症機序を探索する目的で、橋、延髄の嚥下反射中枢領域の解析を行なった結果、野生型と比較してモデルマウスでは、種々の神経伝達物質およびその関連因子の発現に変化が認められることが明らかとなった。

現在、脳幹領域を中心とした自律神経系の情報伝達にHCNsが関わる可能性を解析することで、in vivo脳組織におけるHCNsなどチャンネル分子の病態における役割を解析している。当初の計画では、本年度はES細胞から分化誘導した神経細胞の電気生理学的な膜特性解析をさらに重ねるとともに、免疫染色による形態学的解析法の確立を目標としていたが、実験の実施ができなかった。ES細胞からSFEB法の変法を用いて分化誘導したグルタミン酸作動性神経を用いて、qRT-PCRにて各種イオンチャネルおよびその関連因子の遺伝子発現の変化の有無を調べた。いずれの因子においてもその発現変化は認められなかった。前年度までの動物モデルを用いた実験において、肺組織の病理学的検討、生体での誤嚥評価でMeCP2欠損マウスでは右前葉に限局した誤嚥性肺炎を生じることを明らかにしており、今年度は引き続いて、その原因検索を中心に研究を行った。肺胞壁間距離の解析で、MeCP2欠損マウスでは肺胞腔の拡大が見られた。I型/II型肺胞上皮細胞の比率解析を行い、ABCA3陽性のサーファクタントを産生するII型肺胞上皮細胞の減少が見られた。肺組織の肺特異的マーカー遺伝子ならびに、サイトカインや細胞表面抗原などの炎症に関連した遺伝子の発現をRT-PCRで確認し、肺胞サーファクタントの遺伝子発現が低下を確認した。脳幹組織を用いた嚥下関連神経回路の評価でMeCP欠損マウスの脳幹ではグルタミン酸作動性神経マーカー、コリン作動性神経マーカー、ドパミン作動性神経マーカー、サブスタンスPなどのいずれも発現が低下しており、脳幹神経回路の機能不全が示唆された。さらに脳幹免疫染色で、脳幹嚥下中枢を構成する孤束核、最後野、迷走神経背側核にて、サブスタンスPの発現が低下していた。サブスタンスPは嚥下反射、咳嗽反射の形成における主要な神経伝達物質であり、その発現低下から、嚥下中枢の機能不全を引き起こし、誤嚥性肺炎を来たしていると考えられた。RTTモデルマウスにおいては、肺組織の成熟障害のみならず、脳幹における神経伝達物質放出の異常異常が誤嚥性肺炎を惹起している可能性が示唆された。ES細胞由来神経細胞から抽出したRNAの神経分化マーカーならびにイオンチャネル関連分子の発現の解析および電気生理学的な膜特性解析は継続して行う。病態への関与が疑われる遺伝子は、プロモーター領域のCpGメチル化状態を解析し、ChIP法を用いたMeCP2によるエピジェネティックな転写調節機構の解析を行う。試料数を増やして電気生理学的解析を重ねることで、精度を高める。免疫染色による形態学的解析法を確立する。ES細胞から分化誘導した神経細胞の電気生理学的な膜特性解析をさらに重ねるとともに、免疫染色によるin vivoにおける形態学的解析法の確立により、HCNs等チャンネル分子の病態における役割を明らかにする。分化誘導した神経細胞の遺伝子発現解析にDNAマイクロアレイなどによる解析を予定していたが、試料の純度が不十分で、精製が必要と判断し、今回は見送ったため、若干の繰り越しが発生した。形態学的な解析に用いるいくつかの抗体購入を予定していたが、定量的な解析方法が完全に確立しておらず、今年度は購入を見送ったものがあるため。形態学的な解析に用いるいくつかの抗体購入を予定していたが、実験の遂行に遅延が生じ、定量的な解析方法が完全に確立しておらず、今年度は購入を見送ったものがあるため。
森林生態系における窒素流出メカニズムの解明と窒素飽和の将来予測

本研究は,森林から流出する硝酸の濃度や季節性を制御する要因を明らかにすることを目的とし,気象条件の異なる日本各地の森林渓流を対象に調査を行った。硝酸濃度の平均値は年降水量や窒素流入量との間に明瞭な関係が認められなかったが,季節性の規定要因として夏季の降雨や冬季の積雪が重要であった。物質循環モデルを用いて窒素流出の規定要因を検討した結果,日本の森林生態系では降雨流出過程の他に,過去100年程度の土地利用履歴も重要であることが分かった。本研究では日本全国の森林を対象とした窒素循環や渓流水中の硝酸態窒素濃度の比較解析を行い,森林生態系から流出する窒素の制御要因を明らかにすることを目的とした。平成22年度は,調査を実施する森林の選定と観測体制の構築を行い,本研究の目的を達成させるための準備を進めることができた。調査対象地は,すでに水文観測や植生調査を行っている北海道,青森,秋田,千葉,滋賀,京都,和歌山,高知,福岡,鹿児島,沖縄の森林サイトで,様々な緯度系列の森林で調査を開始した。水文データや植生データに関して,調査を実施する機関との連携を確認することができた。北海道,千葉,高知,沖縄サイトでは新たに降水の採取を開始した。平成23年度から全森林集水域で月に12度の渓流水・降水の採取を開始し,森林生態系の窒素流入量と流出量を算出するための準備が整った。また,青森,千葉,福岡サイトでは月に1度リターフォールを採取して重量測定と化学分析を行い,経年的な毎木調査データと合わせて森林の物質生産量を算出するための準備が整った。全サイトで窒素循環・窒素流出に関する定量的なデータをそろえることができ,今後分析と解析を進めていく。また,全国の降水・渓流水サンプルを用いて硝酸イオンの窒素・酸素同位体比の測定を進めることで,渓流水中の硝酸態窒素の起源の推定と,その制御要因について明らかになることが期待される。平成23年度は,新たに富山・島根サイトも調査地に加え,北海道・青森・秋田・京都・奈良・島根・高知・沖縄サイトで渓流水・降水の採取を開始し,水質の測定を行った。また,富山・千葉・滋賀・福岡サイトでは,各サイト担当者から水質データや植生データの利用の許可を取得した。一部の渓流水・降水サンプルは,硝酸の窒素・酸素の安定同位体比の測定を行った。富山サイトでは,毎木調査を実施してバイオマスの推定を行い,リタートラップを設置して生産量推定に向けた準備を行った。北海道・青森・島根・福岡サイトではすでに設置しているリタートラップを利用して試料採取を開始した。各地域間で渓流水中の硝酸態窒素濃度や季節性に違いが認められ,窒素循環機構の地域性が存在している可能性が示された。シカによる下層植生の衰退が著しい京都サイトでは,防鹿柵の設置によって下層植生が回復した集水域と,隣接する対照集水域との間で窒素流出や下層植生による窒素保持量を比較した。その結果,下層植生による窒素保持が,集水域からの窒素流出を強く規定することが示され,植生による窒素保持が窒素流出を抑制する重要な要因であることが分かった。富山サイト2地点のうち,1地点で渓流水中の硝酸態窒素濃度が極めて高く,窒素飽和現象が懸念された。近接する富山サイトの別の1地点では硝酸態窒素濃度が低いことから,窒素飽和の原因について植物の生葉やリター,土壌の成分を2地点間で比較解析することで明らかにする予定である。近年,日本で森林からの窒素流出が増加する地域が見られ,窒素飽和が懸念されている。窒素飽和の主要な指標として,渓流水中の硝酸態窒素の濃度レベル,その季節性,窒素保持率(窒素流入量に対する窒素流出量の割合)が挙げられる。しかし,依然として森林渓流の硝酸態窒素の流出要因が明らかにされてない。本研究では,全国29の森林集水域を対象に月14回,降水や渓流水の定期採水を行い,広域比較によって硝酸態窒素の流出の規定要因を明らかにすることを目的とした。渓流水硝酸態窒素濃度の年平均値は,年降水量の多い地域で低い傾向が見られたが,濃度の高い地域には共通した気象条件が見られなかった。また,渓流水の硝酸濃度と窒素安定同位体比との間には相関はなく,酸素同位体比とは弱い正の相関が認められた。このことは,降水由来の硝酸が土壌微生物や植物に利用されず流亡しやすい森林ほど渓流水の硝酸濃度が高いことを示し,生物活動と水文過程の相互作用によって濃度が規定されることを示唆する。日本海側に典型的な冬季積雪型で春先に融雪出水がみられる地域は,渓流水の硝酸態窒素が冬に高く,夏に低い傾向を示したのに対し,太平洋側に典型的な夏雨型地域では,降雨時に濃度が上昇し,年間を通して一定の季節性が見られなかった。窒素収支の観点から窒素飽和の定義に該当しない地域でも,季節性が見られない森林集水域が存在した。

このことから,硝酸態窒素濃度の季節性は積雪量や降雨の季節性で規定され,季節性の有無から窒素飽和の可能性について言及できないものと考えられた。本研究結果をもとに,欧米で開発された物質循環モデル(PnET-CN)のパラメータを調整し,日本のスギ林,ヒノキ林,落葉広葉樹林に適用した。その結果,今後の窒素降下物量に対する窒素流出を精度よく予測するためには,過去100年程度までの土地利用履歴や森林施業履歴が不可欠であることが分かった。当初予定以上の調査地を設定でき,各調査地において渓流水・降水,リターの既存データの確保や,サンプル採取の開始が多くの研究者の協力の下で行われている。24年度が最終年度であるため、記入しない。残りあと1年で,引き続き渓流水・降水の採取・分析,リターの採取・分析を行う。また,渓流水・降水中の硝酸の窒素・酸素同位体の測定も引き続き進めて渓流水中に含まれる硝酸の降雨寄与率を算出する。加えて,土壌の採取・分析を行い,窒素生成・吸着能を評価する。新たにとられたデータに加え,すでに各サイトで取られているデータを整理し,メタ解析を行うことで,日本の森林において窒素循環・窒素流出を規定する要因を明らかにする。
小脳型スパイキングニューラルネットワークによる革新的機械学習機構の構築

動的に変化する対象に対しては,古典制御や従来のニューラルネットワーク,ファジーといった機械学習法は,十分に対応できないことが知られている.それに対して本研究では,小脳型スパイキングニューラルネットワークにより,動的に変化する制御対象にも有効な新たな機械学習機構の構築を目指し研究を実施した.得られた成果として,小脳運動学習機構を構築するための各種ニューロンモデルとニューラルネットワークを構築した.そして,構築したスパイキングニューラルネットワーク上で,学習性能を最大化するカオス共鳴の誘起を実現した.本申請課題の達成に向けて,次の項目1,2について研究を遂行した.1.大規模ニューラルネットワークの構築に向けた計算機環境の整備とベンチマークテストの実施:マルチコアなワークステーションに対して並列計算ライブラリを装備し,最大で数万個の下オリーブ(IO)ニューロンで構成されるニューラルネットワークの発火活動がシミュレートできることを確認した.2.少ない計算量で多様な発火パターンを再現できるLlinas ApproachニューロンモデルとIzhikevichニューロンモデルの特性評価:小脳運動学習機構は小脳皮質と小脳核,IO核から構成されている.この機構を実現するニューラルネットワークを構築するためには,Llinas ApproachニューロンモデルとIzhikevichニューロンモデルのような少ない計算量で多様な発火パターンを再現できるモデルが適している.そこで,本年度はこれらのモデルを用いて,ニューロンレベルでの発火活動やその信号応答性を評価した.具体的には,実際のIO核で存在が示唆されているカオス状態における発火活動の分析,数種類の特性の異なるシナプス結合を持ったニューロンに対する信号応答性の評価を実施した.これにより,これらのモデルのニューロンレベルでの基本特性を捉えることができた.1,2の成果に基づき,次年度は小脳型スパイキングニューラルネットワークの構築を実施する予定である.本年度に予定されていた計画内容であった大規模ニューラルネットワークを動作させる計算機環境が整備され,また本研究で用いるスパイキングニューロンモデルの基本特性が捉えられたことから,現在のところ順調に計画を遂行できている.本研究で構築する小脳運動学習機構は小脳皮質と小脳核,下オリーブ核によって構成される.平成28年度は本申請課題の達成に向けて,小脳運動学習機構を実現するスパイキングニューラルネットワークの構築を以下の1,2の項目に関して実施した.1. Velarde-Llinasスパイキングニューロンモデルを用いて,小脳運動学習機構を実現する下オリーブ核のニューラルネットワークを構築した.運動学習時の誤差情報の入力に対して,カオス共鳴的応答により情報伝播が促進されることを確認した.また,このカオス的なスパイク活動については,実際の下オリーブ核において観測されるスパイク活動と同期特性・基準振動・スパイク頻度といった生理学的な特性に関して一致していることも確認した.2.皮質系のスパイクパターンを生成する状態跳躍を含んだスパイキングニューロンモデルの分岐解析を実施した.状態跳躍の導入により,アトラクター構造に非線形性を有した折畳み構造が追加され,その効果によって,跳躍パラメータの調整により,従来の連続的なスパイキングニューロンモデルでは現れなかった多様な分岐と発火パターンが生成されることを確認した.このように構築したスパイキングニューロンモデルは,小脳運動学習機構を実現するスパイキングニューラルネットワークにおける小脳核や小脳皮質系のニューロンに利用できるものである.1,2の成果に基づき,次年度は小脳型スパイキングニューラルネットワークの学習性能評価を実施する予定である.本年度に予定されていた計画内容であった小脳運動学習機構を実現するニューラルネットワークの構築がほぼ完了したことから,現在のところ順調に計画を遂行できている.平成29年度は,平成28年度に構築した小脳運動学習機構のスパイキングニューラルネットワークの学習性能を評価するために,多関節アームのフィードバック誤差学習を実施する予定であった.しかし,スパイキングニューラルネットワークのカオス性をカオス共鳴に最適な状態に遷移させるためには内部パラメータのみの調整では難しいことが判明した.そのため,非線形写像の構造を外部信号により制御する手法の考案が新たに必要となった.そこで,その手法の構築のために,スパイキングニューラルネットワークよりも比較的単純なcubic離散写像とカオスニューラルネットワークに対して,外部フィードバック信号によってカオス共鳴に最適な状態へとダイナミクスを遷移する手法を考案し,その信号応答性の評価を行った(SICE Annual Conference 2017で成果を発表).また平成28年度に実施した状態跳躍を伴うスパイキングニューラルネットワークのカオスルートとカオス共鳴への関連について,更なる検討を行い,カオスの縁付近でアーノルドの舌の特性により,カオス共鳴の性能が最大化することを確認した(Scientific Reportsに2本の原著論文,システム制御情報学会に1本の原著論文,学会発表2件として成果を発表)

.今後の研究の進展としては,この新たなカオス制御手法に基づき,当初平成29年度に実施予定であった小脳運動学習機構のスパイキングニューラルネットワークの学習性能を評価するために,制御系の性能試験でよく用いられる多関節アーム(M. Katayama et al.,Biological Cybernetics, 1993; I.T. Tokuda it et al., Neural Networks, 2010)に対してフィードバック誤差学習を実施し,実際の小脳のような制御と精巧な運動学習が同時に進行出来る画期的な運動学習機能を実現することが期待される.動的に変化する対象に対しては,古典制御や従来のニューラルネットワーク,ファジーといった機械学習法は,十分に対応できないことが知られている.それに対して本研究では,小脳型スパイキングニューラルネットワークにより,動的に変化する制御対象にも有効な新たな機械学習機構の構築を目指し研究を実施した.得られた成果として,小脳運動学習機構を構築するための各種ニューロンモデルとニューラルネットワークを構築した.そして,構築したスパイキングニューラルネットワーク上で,学習性能を最大化するカオス共鳴の誘起を実現した.本年度に構築した計算機環境とニューロンレベルでの解析を行ったスパイキングニューロンモデルを用いて,小脳型スパイキングニューラルネットワークの実装を行う.本年度に構築した小脳型スパイキングニューラルネットワークを用いて,その学習性能の評価を実施する.計算論的神経科学
小児急性脳症の網羅的メタボローム・マイクロＲＮＡ解析を用いたバイオマーカー探索

29年度が最終年度であるため、記入しない。(1)キヌレニン代謝物の定量測定前年度までの研究でバイオマーカー候補の一つとなったキヌレニンとその下流産物であるキノリン酸の絶対定量系を作成し、インフルエンザ及びHHV-6症例の解析を行った。インフルエンザ感染症例55症例を脳症12例、熱性けいれん18例、非熱性けいれん25例の3群で比較解析した。キヌレニン、キノリン酸とも脳症群は非熱性けいれん群と比べ有意に上昇していた。髄液のキノリン酸定量では脳症13例、熱性けいれん11例の2群で解析を行ったところ有意差はなかったが、脳症でとくに高値の症例がみられた。HHV-6感染症例を脳症17例、熱性けいれん14例、非熱性けいれん7例の3群にわけて解析した。3群間の中央値の比較解析では有意な差なかったが、一部の脳症症例でキヌレニン、キノリン酸が高い値を示した。髄液キノリン酸の解析では5例の脳症症例のうち、高値を示した2例は後遺症を遺しており、予後と相関する可能性が示唆された。BBBキットは脳毛細血管内皮細胞、周皮細胞及び星状神経膠細胞により構成されており、タイトジャンクション機能は経内皮電気抵抗(TEER)と相関する。キットの血管側にキノリン酸、キヌレニンを添加後、TEERを測定した。脳血流関門の透過性を評価するためナトリウムフルオレセインの透過係数を測定し、タイトジャンクションタンパク質の局在を蛍光抗体染色して観察した。結果、キヌレニン投与後TEER変化はなかったが、キノリン酸投与後はTEERの低下をみとめた。透過性試験・タイトジャンクションタンパク質の局在はキヌレニン、キノリン酸ともに変化はみられなかった。しかし、ポジティブコントロールであるリポ多糖投与後も変化なかったためキノリン酸のBBBに与える影響を否定するものではないと考えられた。平成27年度の大きな成果は大きくわけて二つある。ひとつは前年度までのメタボローム解析で、脳症に関与すると思われた物質のうち、キヌレニンとその下流産物であるキノリン酸に着目し、絶対定量系を作成して症例を増やし検討できた。症例をふやして検討することでインフルエンザ感染、あるいはHHV-6感染という同じ背景で脳症、熱性けいれん、けいれんなし(発熱のみ)、という多様な病態ごとにて検討を行えた。結果、インフルエンザでは脳症症例はけいれんなしの群と比べてキヌレニン、キノリン酸が上昇していたがHHV-6では3群に有意差がないものの脳症ではキヌレニン、キノリン酸が高値である症例があることを見出した。インフルエンザ脳症でもHHV-6脳症でもキヌレニン、キノリン酸が関与している可能性があることが分かったため原因ウイルスは違っても共通の宿主反応が起きていることが推定された。このことは小児の急性脳症共通の病態解明の手掛かりとなると考えられた。二つ目はin vitroの脳血流関門モデルを用いてキヌレニン代謝物が中枢神経にもたらす影響を検討できたことである。ラットやサルの初代培養細胞から構成されるキットを用いて、キヌレニンやキノリン酸を投与して、脳血流関門のタイトジャンクション機能の変化を評価した。結果、キヌレニンではなくキノリン酸がタイトジャンクション機能を低下させることが示された。インフルエンザ脳症の結果はMetabolomics誌に投稿し掲載予定である。HHV-6脳症の結果とin vitroの脳血流関門モデルを用いた実験の結果は合わせて投稿準備中である。(1)HHV-6脳症におけるメタボローム解析及びキヌレニン代謝物の脳血流関門に与える影響の評価(2)HHV-6脳症における網羅的マイクロRNA発現解析平成28年度の成果は大きくわけて二つある。ひとつは、HHV-6脳症におけるメタボローム解析の結果、11種類の代謝産物が痙攣重積症例と比較して優位に変化していることがわかった。(脳症で有意に上昇:Kynurenine、Quinolinic acid、3-Amynobutyric acid、Pipecolic acid脳症で有意に低下:Butyric acid、cis-Aconic acid、Aspartic acid、Taurine Tryptophan、Hexanoic acid、Isocitric acid)なかでもインフルエンザ脳症と共通するキヌレニン代謝物の活性化がHHV-6脳症でも示された。これらキヌレニン代謝物と脳症の病態との関連についてサルの脳血管内皮細胞から構成される再構築モデルを用いた実験を行ったところ、Quinolinic acidが脳血流関門に影響を与える可能性が示された。ふたつめに、急性脳症におけるマイクロRNA解析について実験を考案し、着手した。当初は血漿を用いたバイオマーカー探索を考えていたが、炎症が起きている脳実質に近い脳脊髄液を検体とすることにした。HHV-6脳症の中で神経学的後遺症を遺す確率が高い病型であるAcute encephalopathy with biphasic seizures and late reduced diffusion (AESD)症例の脳脊髄液におけるマイクロRNA発現プロファイルを痙攣重積症例を対照として比較解析を行うことにした。現在、脳脊髄液からエクソソームを抽出できることを確認した。さらに、抽出したエクソソームからRNAが抽出できることまで確認している。平成27年度の結果、キヌレニン及びキノリン酸はインフルエンザ脳症やHHV-6脳症の血清検体で高いことが示された。

しかし、インフルエンザ脳症では非けいれん例と差があるものの熱性けいれん症例とは有意差がなく、HHV-6脳症では熱性けいれん症例や非けいれん症例とも中央値の比較解析で有意差がみられなかったので、診断バイオマーカーとしての応用には限界があると考えられた。しかし、インフルエンザ脳症でもHHV-6脳症でもキヌレニン、キノリン酸の高値を示す症例が存在することから、病態への関与が示唆された。特に髄液や血清のキノリン酸が高値の症例は重症例(後遺症を遺した症例)であり重症度と関与する可能性が示唆されたが、今回の検討では重症例が少なかったために統計学的に証明することができなかった。そこで、今後は重症症例を中心に症例を蓄積しさらに定量解析をすすめる予定である。また、近年では脳症の分類として原因病原体ではなく症候別にも分類されるようになった。たとえばAcute encephalopathy with biphasic seizures and late reduced diffusion (AESD)とよばれるタイプの脳症はHHV-6脳症やインフルエンザ脳症でよくみられるサブタイプであるが、生命予後はよいものの、高頻度に神経学的後遺症を遺す。今後は症候性分類でも検討する予定である。また、平成28年度はマイクロRNAアレイを用いてHHV-6脳症症例と非脳症症例の血清中のマイクロRNA定量を行い、発現プロファイルの比較解析を予定している。平成29年度はマイクロRNA発現の比較解析を中心に研究を進める。脳脊髄液のマイクロRNAの解析にあたり、課題となるのは、脳脊髄液から抽出されるRNA量が少ないことである。そこで研究者はエクソソームについて着目した。エクソソームとは細胞から放出される小胞体であり、その中に多くのマイクロRNAを含んでいることが知られている。さらに、脳脊髄液エクソソームのプロファイルは脳組織由来のエクソソームと近似しているという報告があり、脳実質の炎症を反映しうると考えられた。昨年度までの検討で、エクソソームの膜上に発現しているCD9およびエクソソームの膜には発現しないが細胞膜上に発現するCalnexinをイムノブロットで染色したところ、脳症髄液検体から抽出したエクソソームではCD9が発現しており、Calnexinは発現していなかった。以上からエクソソームを抽出できたことが示唆された。そこで、今度は脳症1例及び痙攣重積例1例から採取した脳脊髄液各1mlからエクソソームを分離し、さらにmiRCURY RNA Isolation Kit Cell and Plantを用いてRNA抽出を行った。QubitでRNA濃度を測定したところ、感度未満であったが、Taqman MicroRNA Assaysを用いて内在性コントロールであるmiR-16の発現をリアルタイムPCRで確認したところ発現を認めたことから、RNAが抽出できていることが示唆された。今年度はNEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illuminaを用いてライブラリ調整法を検討し、対象疾患であるHHV-6脳症(AESD)5例およびHHV-
bc1-2とNFκBを分子標的とした泌尿器系癌に対する遺伝子治療の開発

腎細胞癌において癌の進行と比例してNFκBの活性化が認められた。腎細胞癌培養細胞においてNFκBの特異的な抑制因子であるIκBαのcDNA(AxIκBαΔN)を導入することにより増殖が抑制された。これら感受性の細胞株ではカスパーゼ活性の増強とアポトーシスの誘導を認めた。NFκBの恒常的活性化が生じている細胞はTRAILに非感受性であり、TRAILの感受性とAxIκBαΔNの感受性とは逆相関した。膀胱癌細胞株やホルモン非依存性前立腺癌細胞株においてNFκBが活性化されており、新規に開発されたNFκB阻害剤であるDHMEQはNFκB活性を抑制するとともにアポトーシスを誘導した。アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞においてbcl-2が発現しており、antisense bcl-2 oligodeoxynucleotideはアポトーシスを誘導し、さらにはdiethylstilbestrolの殺細胞効果を増強した。CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)は細胞の分化誘導に関する遺伝子およびサイトカインの発現を制御する転写因子群であるが、局所浸潤を認める腎癌では限局性の腎癌に比べて活性が有意に増強しており、C/EBPβの活性化は腎細胞癌の浸潤性増殖と関連し、新たな治療に結びつく可能性が示唆された。腎細胞癌培養細胞においてIL-6がSTAT3のDNA bindingを増加させ、IL-6による腎細胞癌の増殖刺激においてSTAT3が重要な役割を果たしていることが示された。さらにはJakに特異的な阻害剤であるAG490はIL-6により誘導されるSTAT3の活性化を抑制し、アポトーシスを誘導し、STAT3のsignal pathwayを抑制することが腎細胞癌に対する新たな治療戦略となりうることがしめされた。TRAILはTumor necrosis factor(TNF)ファミリーに属するリガンドであり、癌細胞に特異的にアポトーシスを誘導する分子として注目されている。腎細胞癌に対するTRAILの抗腫瘍効果を細胞株を用いて検討した。TRAILの抗腫瘍効果は6種の腎細胞癌株(KU-2,Caki-1,KU19-20,ACHN,769P, A498)を使用して検討した。TRAILは3種の腎細胞癌株(Caki-1,ACHN, A498)でのみアポトーシスを誘導した。非感受性の機序を調べるため、リセプターあるいはリセプターの細胞内ドメインと結合するアダプター蛋白の発現との相関、さらにシグナル伝達の下流に存在するNF-κBの活性化との関連につき検討を加えた。KU-2ではリセプターであるDR4とDR5の発現を認めず、非感受性の原因と考えられた。ところが他の細胞株では感受性との相関は認めなかった。アダプター蛋白であるFADD、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3の発現をRT-PCR法で検討したが、感受性との相関は認めなかった。NF-κBの活性化をゲルシフト法で検討した結果TRAILに非感受性であるKU19-20と769Pで高い活性化を認めた。NF-κBの細胞内抑制因子であるIkBaのcDNAをサブクローニングし、アンチセンスの方向にレトロウイルスに組み込み、これをTRAILに感受性であるCaki-1とACHNに感染させてstableな系を得た。この系ではNF-κBの恒常的活性化が生じており、これらの細胞はTRAILに非感受性となった。以上、TRAILに対する感受性はリセプターの発現が寄与するだけでなくNF-κBが抑制的に作用しているものと考えられる。

腎細胞癌は治療的側面から見て、NF-κBの活性化が低くTRAILに感受性であるものとNF-κBの活性化が高くTRAILに非感受性であるものとに分類できる可能性がある。新規NFκB阻害剤であるDHMEQを用いた前立腺癌に対する新しい治療戦略の可能性さらにはその確立を目指した。まずin vitroにおいて48時間後に、DHMEQがDU145細胞に対して10μg/ml以上の濃度で、PC-3細胞に対しても10μg/ml以上の濃度で、JCA-1細胞に対しては2.5μg/ml以上の濃度で有意な抗腫瘍効果を示した。また、20μg/mlのDHMEQはこれらの細胞に対して時間依存性の抗腫瘍効果を示した。ついでDHMEQのNFκB活性に対する効果をNFκBluciferase reporter geneを用いたluciferase assayにより検討したところ、DHMEQはDU145に対しては10μg/ml以上の濃度で、JCA-1に対しては2.5μg/ml以上の濃度で、PC-3に対しては10μg/ml以上の濃度でいずれもNFκB活性を抑制した。一方、western blottingでDHMEQはIκBαの発現には影響しないことが示された。20μg/mlのDHMEQはこれらの細胞のアポトーシスを誘導したが、apoptosisと関連するBcl-2やBcl-xLなどの蛋白の発現には影響しないことが示された。DHMEQのin vivoでの抗腫瘍効果を検討した。5x10(6)のJCA-1細胞をヌードマウスの背部に移植し、腫瘍が触知できるようになった時点で8mg/kgのDHMEQを連日腹腔内投与したところ、21日目にはコントロールの腫瘍容積は2.07±0.75cm(3)であり、DHMEQ投与群は0.27±0.12cm(3)であり有意な抗腫瘍効果がin vivoにおいても認められた。以上より、ホルモン抵抗性前立腺癌においてはNFκBが活性化されており、新規NFκB阻害剤であるDHMEQはNFκBを抑制しアポトーシスを誘導することにより、ホルモン抵抗性前立腺癌に対する新しい抗癌剤として期待できることが示唆された。
介護保険制度の政策評価-レセプトデータによる介護サービスの効果・効率性の分析-

昨年度は、介護施設の効率性について一年目と同様にドイツとの国際比較など様々な視点から分析を行った。わが国については介護施設の効率性が介護従事者の供給不足によって大きく阻害されていることが考えられる。そこで、介護従事者として外国人労働者を活用することのメリット・デメリットについてEPA(二国間経済連携協定)による介護福祉士候補者の導入について分析を行った。インドネシア、フイリッピン、ベトナムからの受入れ候補者では介護福祉士の国家試験の合格率が大きく異なっている。これらの原因について、介護事業所内での人材育成のための枠組みの整備の程度や介護施設の相違などによる効果などについて実証的な分析を行った。また、要介護者の増加により今後一層の施設利用の必要性が高まることが予想される。介護施設全体についての動向を把握すると伴に、各介護サービスがどのように連携してきているのか、その結果、各施設の効率性がどのように変化していったのか分析することが急務である。そこで、介護施設(特に特別養護老人ホーム)について国際比較をすることなどにより、日本の施設の効率性について分析を行った。また、これまでの研究から介護施設に関する既存のデータベースからだけでは詳細な分析を行うことができないことが確認できたため厳密な統計作業を行うことができるような新たなデータベースを作成することとした。現在、このデータベースは作成中であり、最終年度の研究において利用する予定である。当該年度は、3年計画の2年目であるが研究計画全体としては予定した範囲内で順調に推進している。特にEPA外国人介護従事者に関するデータベースは、ほぼ完成し「EPA介護福祉士にみる外国人労働者の受入れ体制と人材育成」(中村二朗と菅原慎矢の共著)において既に利用されている。上記論文は既に投稿中であるが、データベースをさらに完全なものにすると共に、より詳細な分析を行っている状況である。介護施設の効率性の分析に関しては既にある程度の分析を行っているが、体系的なデータベースが存在していないのが現状である。昨年度は、厚生労働省から提供された『介護サービス施設・事業所調査』や民間(国際航業株式会社)の介護サービス事業所データベースをリンクさせるだけでなく、足りない情報については各介護施設のホームベージを参照することにより、介護施設の動向や効率性について分析可能となるようなデータベースの構築を試みた。現在作業は順調に進んでおり、構築されたデータベースを用いてさらに厳密な分施を行う予定である。それぞれの分析作業において、想定内の進捗状況であり、本年度も当初の予定通りに研究を推進する。今後は、作成された二つのデータベース(EPA介護福祉士候補者受入れデータベースと介護サービス施設に関するデータベース)をより精緻化するとともに、両者をマージすることにより、EPA介護福祉士候補者の人材育成および介護サービス施設の効率性に関する研究について、より精緻化した分析を行う予定である。また、最終年度ということもあり、他に予定された分析についても計画通り推進する。昨年度は、計画の1年目ということもあり、各分析の準備作業を主に行うこととしていた。研究のための作業内容は主に以下の4点である。ドレスデン工科大学のAlexander Karmann教授、同大学大学院生のCornelius Plaul氏との共同研究を行い、ともに公的介護保険制度によって高齢化政策を展開している日本とドイツの比較研究を行った。具体的には、日本の特別養護老人ホームとドイツの老人ホームについて、利用率や利用額に対してどのような要素が影響を与えており、特に二国間でどのような要素が類似・相違しているのかを検証するための作業を行った。介護の予防効果を分析するために、全国版と福岡市の介護保険データを整備した。全国版については、厚生労働省より介護サービス施設・事業所提供と共に提供を受け分析作業が進められるようなデータベースを構築している。福岡市については、担当者から2016年までの介護保険のデータのコピーを入手した。このデータは介護認定審査の詳細なデータも含まれている。データを使用するに当たり、まず学内の倫理審査を申請し、承認を受けた。データを連結するためのIDとして被保険者番号がデータに含まれているため、被保険者番号を乱数に置き換える作業を行った。これらの作業により、個票データを用いた分析が可能となる。EPAによる介護福祉士候補者の人材育成の実態等を分析するために、介護福祉士候補者に関するデータベースの構築を行った。ドレスデン工科大学のAlexander Karmann教授との日独の共同研究による日独比較による分析の結果、ドイツにおいては介護保険以外の要素として生活保護の割合が高く、これが施設・利用者双方のモラルハザードをもたらしているという結論が示唆された。該当結果に関しては、2018年のEuropean Health Economic Association Meeting(オランダ、マーストリヒト)での発表が採択されるという成果を得た。この学会では、菅原とKarmann教授を中心に組織した、日独韓蘭4ケ国の研究者による介護保険に関する企画セッションが採択された。この分析作業については、概ね順調に進んでいる。介護予防等の効果に関する分析については、データベースの整備が一段落し、今後の分析作業を順調に行うための環境を整えた。データの性質上、各大学での倫理委員会等の審査を受ける必要が生じるが、この作業も終了しつつあり、概ね予想通りの進捗状況である。EPAの海保福祉士候補者に関する人材育成の分析についても、データベースの作成がほぼ完成し、今後分析を進める環境が整いつつあり、順調な進捗状況といえる。

そこで、介護従事者として外国人労働者を活用することのメリット・デメリットについてEPA(二国間経済連携協定)による介護福祉士候補者の導入について分析を行った。インドネシア、フイリッピン、ベトナムからの受入れ候補者では介護福祉士の国家試験の合格率が大きく異なっている。これらの原因について、介護事業所内での人材育成のための枠組みの整備の程度や介護施設の相違などによる効果などについて実証的な分析を行った。また、要介護者の増加により今後一層の施設利用の必要性が高まることが予想される。介護施設全体についての動向を把握すると伴に、各介護サービスがどのように連携してきているのか、その結果、各施設の効率性がどのように変化していったのか分析することが急務である。そこで、介護施設(特に特別養護老人ホーム)について国際比較をすることなどにより、日本の施設の効率性について分析を行った。また、これまでの研究から介護施設に関する既存のデータベースからだけでは詳細な分析を行うことができないことが確認できたため厳密な統計作業を行うことができるような新たなデータベースを作成することとした。現在、このデータベースは作成中であり、最終年度の研究において利用する予定である。当該年度は、3年計画の2年目であるが研究計画全体としては予定した範囲内で順調に推進している。特にEPA外国人介護従事者に関するデータベースは、ほぼ完成し「EPA介護福祉士にみる外国人労働者の受入れ体制と人材育成」(中村二朗と菅原慎矢の共著)において既に利用されている。上記論文は既に投稿中であるが、データベースをさらに完全なものにすると共に、より詳細な分析を行っている状況である。介護施設の効率性の分析に関しては既にある程度の分析を行っているが、体系的なデータベースが存在していないのが現状である。昨年度は、厚生労働省から提供された『介護サービス施設・事業所調査』や民間(国際航業株式会社)の介護サービス事業所データベースをリンクさせるだけでなく、足りない情報については各介護施設のホームベージを参照することにより、介護施設の動向や効率性について分析可能となるようなデータベースの構築を試みた。現在作業は順調に進んでおり、構築されたデータベースを用いてさらに厳密な分施を行う予定である。それぞれの分析作業において、想定内の進捗状況であり、今後も当初の予定通りに研究を推進する。また、新たな作業として要介護度についての再定義を試みるとともに、新規に定義された要介護度に基づく多相生命表を2000年から2016年までのデータを用いて作成することを試みる。日独共同研究については該当研究を英語論文として仕上げ、学術雑誌に投稿すべく準備を行っている。今後は、介護サービスの消費者選択モデルの分析を中心に行う予定である。
原子炉圧力容器鋼中の照射誘起ナノ析出物および照射欠陥の形成・発展過程の解明

原子炉圧力容器(RPV)鋼の照射脆化の主因となるCuナノ析出物および照射欠陥(ナノボイド・転位ループなど)に関して、商用稼働中の加圧水型炉である欧州Doel炉のRPV鋼監視試験片を対象として、陽電子消滅法と3次元アトムプローブ(3D-AP)の併用によるナノ組織分析を行った。その結果、Cuナノ析出物の形成過程がCu濃度によって異なることが3D-AP観察から分かった。すなわち、監視試験片のCu濃度が高い(0.30%)場合、わずか3年間の照射期間に相当する低い照射量(0.83×10^<19>n/cm^2)からCuナノ析出物が形成された。一方、中程度(0.15%Cu)の場合、3年間の照射後は未だCuナノ析出物は形成せず、約10年間に相当する照射(3.7×10^<19>n/cm^2)後、Cuナノ析出物が初めて観察された。Cu濃度が低い(0.05%Cu)場合、20年間の照射期間に相当する最も高い照射量(6.4×10^<19>n/cm^2)でもCuナノ析出物はほとんど形成しないことが分かった。また、陽電子消滅測定から、高Cu材では、照射量が増加するとともに空孔型欠陥への陽電子捕獲割合が増加し、高照射量(20年相当)では、空孔クラスターが形成することが分かった。従って、Cuナノ析出物は比較的低い照射量から形成し、次いで空孔型欠陥(照射欠陥)が蓄積することを実験的に直接示した。一方、中Cu材では、低照射量では陽電子は主に空孔型欠陥に捕獲され消滅するが、照射量の増加とともにCuナノ析出物への陽電子捕獲が増加した。低Cu材では、照射量の増加とともにCu原子が関与しない空孔型欠陥への陽電子捕獲が増加した。以上の結果は、これまでほとんど報告例のない実際のRPV鋼中で長期間の照射中に起きるナノ組織の変化(Cuナノ析出物や照射欠陥の形成・発展過程)を明らかにしたものである。本年度は、原子炉圧力容器(RPV)鋼の照射脆化の主因となるCuナノ析出物および照射欠陥(ナノボイド・転位ループなど)に関して、商用稼働中の加圧水型炉である欧州Doel炉のRPV鋼監視試験片を対象として、陽電子消滅法と3次元アトムプローブ(3D-AP)の併用によるナノ組織分析を行った。すなわち、監視試験片のCu濃度が高い(0.30%)場合、わずか3年間の照射期間に相当する低い照射量(0.83×10^<19>n/cm^2)からCuナノ析出物が形成する。

従って、Cuナノ析出物は比較的低い照射量から形成し、次いで空孔型欠陥(照射欠陥)が蓄積することを実験的に直接示した。一方、中Cu材では、低照射量では陽電子は主に空孔型欠陥に捕獲され消滅するが、照射量の増加とともにCuナノ析出物への陽電子捕獲が増加した。低Cu材では、照射量の増加とともにCu原子が関与しない空孔型欠陥への陽電子捕獲が増加した。以上の結果は、これまでほとんど報告例のない実際のRPV鋼中で長期間の照射中に起きるナノ組織の変化(Cuナノ析出物や照射欠陥の形成・発展過程)を明らかにしたものである。
神経芽腫に対するGD2を標的とした新規キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法の開発

神経芽腫の生存率は極めて侵襲の強い集学的治療を行っても40%程度であり、副作用の少ない新規治療法が切望されてきた。米国では、新たながん免疫療法として、再発、難治性のB細胞性悪性腫瘍に発現するCD19分子を標的としたキメラ抗原受容体(CAR)を用いた遺伝子改変T細胞療法(CAR-T療法)の有効性が示されたが、他のがんへの応用が期待されている一方で、その高い製造コストが問題視されている。本研究では、神経芽腫に対するCARを新たに作製し、製造コストの低いpiggyBacトランスポゾン遺伝子導入法を用いた神経芽腫に対するCAR-T細胞療法の基盤構築を目的とする。
善・美・正義の倫理学的解明を目指す後期プラトン哲学の存在論・認識論的探究

本研究は、プラトンの後期著作『パルメニデス』『テアイテトス』『ソフィスト』『政治家』などのテキスト解釈に基づき中期と後期のイデア論の異同を明らかにし、後期プラトンが存在論と認識論のより確かな基盤の上で、初期以来の探究対象であった善・美・正義の理解に向けた新たな道を歩んでいることを示す。その作業を通じて、哲学と倫理学を綜合的に捉えるプラトン哲学の今日的意義を探索する。
江戸時代における漢籍の流転-佐伯文庫を例に-

江戸時代に、佐伯藩第八代藩主毛利高標が城中に創設した文庫にたくわえられた漢籍の一大コレクション、いわゆる佐伯文庫本は、そのほぼ半数が高標の孫の高翰の代に幕府に献上され、江戸城中の紅葉山文庫、ならびに昌平坂学問所・江戸医学館に分蔵された。この献上本は、明治維新以後いくたの変遷をへたが、今も独立法人国立公文書館附設の内閣文庫と宮内庁書陵部に、九割以上が遺されている。ところが、佐伯藩に残された非献上書の行方については、これまでよくわかっていなかった。非献上本は、幕末まで手厚く保存されていたようだが、維新後散逸する。きっかけは、文部省が、各府県から旧藩襲蔵書の目録を提出させ、そこから「聚珍書目一覧表」を作ろうとしたこと、にあった。明治四年のことである。各府県はきそって旧藩の蔵書を集めて目録化し、文部省に提出した。誕生したばかりの後の国会図書館、当時の書籍館は、自らの和漢書不足をこのリストから採選することによって補おうと考え、さっそくそれを実行に移した。この結果、国会図書館には今なお3種の存疑本を含む24種の佐伯文庫本が遺されている。このおり大分県に留め置かれた佐伯文庫本もあったが、洋書5種をのぞき、それらは戦災で焼失した。また、書籍館による採選の後、県下ならびに毛利家に留め置かれた佐伯文庫本の多くは、売却処分に附されたらしい。そして、その多くを購入したのが方功恵であって、方功恵に購入された佐伯文庫本は、再度海を渡り、多くは中国に戻ることになった。現在中国国家図書館・北京大学図書館などに蔵されているものがそれである。今回報告書の第一分冊として作成した「佐伯文庫旧蔵畳現存書目録(漢籍之部)」は、佐伯文庫本の、現所蔵機関をも明らかにしたユニオンカタログであり、第二分冊として作成した「方功恵碧琳瑯館旧蔵書総合目録(第二稿)」は、方功恵旧蔵書のユニオンカタログである。より完備した「佐伯文庫旧蔵及現存書目録(漢籍之部)」を作成すべく、佐伯文庫関係の数種の目録を比較対照し統合整理する作業を進め、これによって作成した仮目録により、内閣文庫の漢籍目録では佐伯文庫本とされていなくとも、書誌学的、論理的にその可能性が存在するものを借覧し、推定の当否を確認した。この結果、30部にものぼる漢籍が、蔵書印により新たに佐伯文庫本と確定した。かくて『改訂内閣文庫漢籍分類目録』に記載される旧蔵者注記も完璧なものではでないことが明らかとなった。のみならず、佐伯文庫の旧蔵書は幕府への献上にあたってすべてに蔵書印が捺されたと考えられてきたのだが、実際はそうではなく、捺印漏れが少なくなく、捺印箇所も巻頭とかぎっていなかったことがわかった。しかも、捺印数はいかに大部なものであっても一箇所に限られていた。したがって、佐伯文庫では一部の書物としてあつかわれていたものが、内閣文庫に入って分割され、二部以上の書物扱いされた場合には、必ず迷子の佐伯文庫本がでることになる。佐伯文庫本には本来蔵書印など捺されておらず、いざ献上となって、捺印作業が倉卒の間におこなわれたに相違ない。

しからば、蔵書印のみに頼った佐伯文庫本の同定作業は検討を要しよう。実際、先の30部以外の70部ほどの漢籍にも、蔵書印によりそれと確定することは難しくとも、佐伯文庫本である可能性が存することがわかった。国会図書館においては、後に上野図書館をへて国会図書館となる新設の東京書籍館における和漢書の不足を補うべく、明治初年に、政府の肝いりで各県を通じて集められた旧藩校所蔵本のリストから、漢籍であって大分県献上分をリストアップし、これと『国立国会図書館漢籍目録』とを比較対照し、同一書の可能性のあるものについては借覧し、佐伯文庫本か否かを調査した。この結果、新たに8部の漢籍について、これまで知られていなかった佐伯文庫本であることが、その蔵書印から判明した。今後の調査事項は、リストアップされたにもかかわらず、国会図書館に所蔵されていることが確認されなかった漢籍の行方であろう。大分県立図書館では新たに1部の佐伯文庫本が存在していることを確認した。なお、この調査の過程で、大分県立図書館所蔵の佐伯文庫本には異なる二つの出自があることが分かった。内閣文庫所蔵漢籍中、筆者の調査により、新たに佐伯文庫本と認定されたものは30部である。うちわけは、紅葉山文庫本8部、昌平坂学問所本19部、江戸・医学館本1部、旧蔵機関不明本2部である。このほか、書誌学的に見て佐伯文庫本の可能性が存するものが50部以上存在するが、いずれも大部の書籍であって、内閣文庫当局の協力がえられず、いまだにその是非が確認できない状態にある。また、調査のなかで、かねて想定していた要因以外にも、内閣文庫の漢籍蔵書目に、佐伯文庫本の一部が著録漏れとなった要因が存在することが判明した。佐伯藩では一部の書籍とされてきたものが、内閣文庫において二つもしくはそれ以上の書籍に分割著録された結果として、出自が不明となったケースがそれである(逆に、出自の異なるものがあわせられ、本来佐伯文庫本でないものが佐伯文庫本とされている例もあった)。これらには、当然ながら「佐伯侯毛利高標字培松蔵書画之印」の印は捺されていないが、種々の状況から、佐伯文庫本にほぼ間違いないとみなせる。こうしたものが(先の50部以外に)現時点でも84部存在している。かくて、あわせて100部以上の書籍が、新たに佐伯文庫本ないしは限りなくそれに近いものとして浮上してきたのである。こうした書籍は、宮内庁書陵部蔵本にも少なくとも2部は存在していることが確認されており、完壁な調査をすれば、さらに増加することがみこまれる。佐伯文庫所蔵の漢籍を明治維新のおりに大量に購入し、中国に還流させた方功恵の蔵書については、作成時期・精粗・著録対象を異にする複数の蔵書目が存在することが判明している。そこで、それらを調査し、すべてを統合した方功恵蔵書目とすべく、平成14年3月と7月の二回、北京図書館北海分館を訪れ調査をした。北京大学所蔵の目録の調査が未済なため完壁なものとはいいがたいが、成果は、四部分類により3000点前後の漢籍を著録する『方功恵碧琳瑯館書目(初稿)』として公開している。いわゆる佐伯文庫本には、幕府に献上されることなく佐伯藩で明治維新をむかえ、その後その多くが散逸した、筆者が非献上本と命名した一群が存在する。今年度は、そうした佐伯文庫の非献上本の検討・考察を中心に研究を実施した。非献上本の一部は、すでに再渡海して中国にもどり、その一部が北京大学図書館・北京図書館をはじめとする北京の複数の大学・図書館・研究所に蔵されており、なかにはアメリカに渡ったものもあることが知られているが,今年度は、それ以外の、おそらくそれ以前に、現国会図書館の前身である東京書籍館に納められた、これも筆者により明治献上本と命名された一群の書物の全貌を明らかにし、その間の経緯、現存状況などを明らかにすることを目指した。