hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトコンピューティングと誘電泳動現象を利用した血中微量循環腫瘍細胞の早期同定

1.血液中の希少な癌細胞を検出するCTCチップ装置について基礎的性能の検討を行った.捕捉抗体として抗EpCAM抗体や抗Podoplanin抗体をCTCチップに結合させ,健常人に癌細胞株を添加した「CTCモデル」を流して血液中の腫瘍細胞捕捉及び捕捉した細胞の検出に関する検討を行い,捕捉抗体濃度などの至適条件を得た.2.得られたCTCについて遺伝子学的解析のための基礎検討を行った.肺癌細胞株及び肺癌組織検体からDNAを抽出し,次世代シークエンサーにて癌特異的遺伝子変異を調べた.3.高導電率溶液中の循環腫瘍細胞の単離と,誘電泳動特性の測定が可能なピラー電極アレイデバイスを試作し,そのデバイスの有用性を基礎実験により評価した.4.循環腫瘍細胞もしくは血液細胞の1個のインピーダンスを広帯域に測定できるマイクロストリップ上平行電極型のリング共振器を設計・試作し,マイクロ粒子の有無によりデバイスの共振周波数が変化することを確認できた.また,負性抵抗素子を上記デバイスに付加することにより,高感度化(共振特性の高Q値化)を実現した.5.誘電泳動下で回転している細胞が形状変化をすると,その回転速度が影響を受ける.誘電泳動下で回転する肺癌細胞の形状分類を行い,その分類結果と回転速度との関係を評価した.形状分類に当たっては,細胞の大きさのみならず,細胞表面の凹凸や円形度も考慮するために,自己組織化マップを拡張した方法を用いた.その結果,細胞の大きさおよび表面の滑らかさが回転速度と密接に関係することが示された.6.クリークギャップ電極によって1個の細胞に生じる誘電泳動力の測定結果と,誘電泳動溶液内で自由落下する時のターミナル速度から求めたその細胞1個の比重から,自己組織化ファジィシステムを用いて,その細胞が白血病細胞,循環腫瘍細胞,正常白血球のいずれに属するかを同定出来た.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1. Universal CTC-chipを用いて,抗原抗体反応を利用した血液中の循環腫瘍細胞の分離・捕捉実験を行い,上皮マーカーEpCAMの発現が低い血液中の中皮腫細胞でも抗ポドプラニン抗体NZ-1を用いることで高感度に捕捉することが出来た.2.循環腫瘍細胞の単離および誘電特性の測定が可能なデバイスを設計・試作し,そのデバイスの有効性を評価するために,ヒト肺がん由来細胞株(PC-9)を用いた基礎実験を行った.細胞懸濁液をデバイスに滴下すると,マイクロウェル内に細胞が単離され,エレクトロローテーションによる誘電特性の測定が可能となることが確認できた.3.循環腫瘍細胞もしくは血液細胞の1個のインピーダンスを広帯域で測定するためにマイクロストリップ上平行電極を設計し,その数値解析を行った.また,平行電極に並列にインダクタンスを配置し,その共振周波数により循環腫瘍細胞を高感度に検出できるデバイスを設計し,電磁界解析による検討を行った.4.交流電源への接続作業の手間の低減化や,複数検体の同時処理を想定し,ワイヤレス給電可能なデバイスを設計・試作した.試作したデバイスは,高効率での給電が可能であり,その特性は電磁界解析結果とほぼ一致した.5.エレクトロローテーションによる細胞の誘電特性測定の自動化を目指し,動画像処理による細胞回転角速度の推定を行い,実測値と比較して良好な結果を得た.また,動画像処理の際に細胞の輪郭抽出を行い,細胞回転角速度に対する細胞形状の依存性について検討した.本研究課題の要素技術の開発に目処が立ち,現在はその高感度化および患者の検体を用いる際に生じる問題の対処法について検討を行っているため.1.血液および高導電率溶液中の循環腫瘍細胞の単離および誘電特性測定が可能なピラー電極アレイデバイスを設計・試作し,チタン酸バリウム粒子を用いてデバイスの有用性を評価した.2.循環腫瘍細胞もしくは血液細胞の1個のインピーダンスを広帯域に測定可能なマイクロストリップ上平行電極を設計・試作した.また,循環腫瘍細胞の検出を目的としたリング共振器型電極・直列スタブ結合電極を設計し,電磁界解析による評価・検討を行い,その有用性を明らかにした.3.現在使用中の誘電泳動用溶液(8.75%ショ糖液にPBSを1%の割合で添加した溶液)は,長時間の実験において細胞破壊や細胞死を起こしやすいという問題点がある.そこで癌細胞にダメージを与えにくい誘電泳動用溶液の検討を行った.調整した種々の溶液それぞれに白血病細胞株HL60を浮遊させ,冷蔵保存し,1週間毎日,生死細胞数を計測した.その結果,マンニトール1gを添加し,pH6.45,浸透圧約300mOsm/Kgに調整した溶液が最も適していることがわかった.4. “universal CTC-chip"に各種抗体を結合させ,血液中から特定の表面抗原を持つ細胞を分離し,さらにその性質を調べるためCTC-chip上で細胞染色を行った.上皮性の癌細胞と血球(主に白血球)はサイトケラチンとCD45により判別された.

5.誘電泳動下で回転する細胞に関し,同種の細胞でも回転速度が異なることを確認し,その要因が細胞形状であると仮定した.細胞形状を種々の方法で数値化し,形状と回転速度の関係性を考察した.形状の数値化に際し,細胞の輪郭線を点の集合とみなすことで多様体と捉えることが可能であり,これにより回転や位置ずれに不変な形状表現が可能である.結果として,細胞の短軸の長さが回転速度との相関が高いことが分かり,誘電泳動デバイスの改良方針を決定し,その試作を行った.循環腫瘍細胞(CTC)に関する新しい分離デバイスの動作原理の創出およびその試作,循環腫瘍細胞の物理化学的性質の把握,臨床現場からの目的達成に向けた実験仕様の確立,循環腫瘍細胞に関して得られた物理化学的実験データをもとに,ICT技術,なかんずくソフトコンピューティング技術を利用したデータマイニングなど,本研究課題の最終目的に到達するために,それぞれの分野での成果が着実に得られている.1.血液中の希少な癌細胞を検出するCTCチップ装置について基礎的性能の検討を行った.捕捉抗体として抗EpCAM抗体や抗Podoplanin抗体をCTCチップに結合させ,健常人に癌細胞株を添加した「CTCモデル」を流して血液中の腫瘍細胞捕捉及び捕捉した細胞の検出に関する検討を行い,捕捉抗体濃度などの至適条件を得た.2.得られたCTCについて遺伝子学的解析のための基礎検討を行った.肺癌細胞株及び肺癌組織検体からDNAを抽出し,次世代シークエンサーにて癌特異的遺伝子変異を調べた.3.高導電率溶液中の循環腫瘍細胞の単離と,誘電泳動特性の測定が可能なピラー電極アレイデバイスを試作し,そのデバイスの有用性を基礎実験により評価した.4.循環腫瘍細胞もしくは血液細胞の1個のインピーダンスを広帯域に測定できるマイクロストリップ上平行電極型のリング共振器を設計・試作し,マイクロ粒子の有無によりデバイスの共振周波数が変化することを確認できた.また,負性抵抗素子を上記デバイスに付加することにより,高感度化(共振特性の高Q値化)を実現した.5.誘電泳動下で回転している細胞が形状変化をすると,その回転速度が影響を受ける.誘電泳動下で回転する肺癌細胞の形状分類を行い,その分類結果と回転速度との関係を評価した.形状分類に当たっては,細胞の大きさのみならず,細胞表面の凹凸や円形度も考慮するために,自己組織化マップを拡張した方法を用いた.その結果,細胞の大きさおよび表面の滑らかさが回転速度と密接に関係することが示された.6.クリークギャップ電極によって1個の細胞に生じる誘電泳動力の測定結果と,誘電泳動溶液内で自由落下する時のターミナル速度から求めたその細胞1個の比重から,自己組織化ファジィシステムを用いて,その細胞が白血病細胞,循環腫瘍細胞,正常白血球のいずれに属するかを同定出来た.平成29年度は,当初の計画通り研究を遂行するとともに,平成28年度の開発した要素技術およびデバイスを改良し,さらなる高感度化・高速化を図る.また,患者の検体を対象とした際に生じる問題点,例えばコロニー化した循環腫瘍細胞を検出するためのフィルターの導入等についても検討を行い,臨床への移行を推し進める.本研究課題の最終目的は,「正常な血球細胞と癌細胞の分離,癌細胞の誘電パラメータ(細胞の構造と材質で決まる)および比重の測定を可能とする誘電泳動デバイスを開発する.さらに,測定した上記パラメータおよび既知の癌細胞名から細胞診断の“ファジィ知識を獲得"する機能と,誘電泳動から得られた検体の誘電パラメータ,比重,周囲温度をもとに癌名称を“ファジィ推論"する機能とを有する自己組織化ファジィシステム(SOF)を構築し,CellSearchを凌ぐ診断精度の装置を開発する.」としている.平成30年度は最終年度であるので,上記目的を達成するために,それぞれの専門分野間で連携を図りながら,
「制度」と表現の自由・学問の自由との関係についての理論的再検討

本研究は,アメリカ憲法学における「制度理論」の研究を行うことを通じて,図書館や大学などの「制度」と表現の自由論・学問の自由論についての理論的な再検討を加えることを目的としている。本年度は,まず,公立図書館と公営放送に関する研究を行った。公立図書館については,昨年度の研究をさらに発展させる形で,公立図書館とパブリック・フォーラム論との関係についての考察を行った。具体的には,公立図書館をパブリック・フォーラムと捉えることの理論的意義を,本研究の問題意識から考察した。この研究の成果の一部は,「憲法と公立図書館との関係についての予備的考察(2)」として公表した。公営放送に関する研究としては,公営放送局が提供する公職選挙立候補者による討論番組がパブリック・フォーラムに当たるか否かについてのアメリカの判例(Arkansas Educational Television Commission v. Forbes, 523 U.S. 666 (1998))に関する研究を行った。具体的には,この事件に関するアミカス・ブリーフなどを分析しながら,パブリック・フォーラム論の限界という観点から考察を行った。この研究の成果の一部は,「パブリック・フォーラム論の限界?(仮)」として,公表される予定である。以上の2つの研究は,いずれも,制度理論の観点から,パブリック・フォーラム論の限界を明らかにしようとするものである。本研究は,アメリカ憲法学における「制度理論」の研究を行うことを通じて,図書館や大学などの「制度」と表現の自由論・学問の自由論との関係についての理論的な再検討を加えることを目的としている。研究代表者は,本研究の準備作業として,すでに大学に関する研究に着手していた。そこで,本年度は,まず,これまで研究代表者が行っていた大学に関する研究を継続して行った。具体的には,大学に関するアメリカの判例研究を行いながら,制度理論についての理論的検討を行った。また,制度理論の日本における受容の可能性を探ることを目的として,いわゆる制度的保障の研究や,日本における大学の自治・学問の自由に関する研究を行った。本年度は,さらに,文化施設に関する研究も行った。具体的には,公立博物館の入館拒否と情報摂取行為との関係が問題となった最近の下級審の裁判例(和歌山地判2016年3月25日判例集未登載)についての検討を行った。研究代表者は,これまで公立美術館や公立図書館・国会図書館についての研究を行ってきていた。従来は,もっぱら表現の自由との関係に着目していたが,今回は,知る権利との関係にも留意しながら従来の研究を捉えなおし,そしてその成果を踏まえつつ,2016年の和歌山地裁判決についての理論的な検討を行った。このような検討を行ったことにより,日本国憲法の下で,「制度」と表現の自由論との関係を考えていくための有益な視座を獲得することができた。本年度は研究初年度にあたることから,当初は,アメリカの制度理論の研究を中心に行うつもりでいた。しかしながら,研究を進めていく過程で,次年度以降に行う予定だった研究の一部を前倒しで行うことが必要になったため,本年度行う予定だったものの一部を次年度以降に繰り越すこととなった。しかしながら,これはあくまでも研究の進め方の変更にすぎず,研究全体としてはおおむね順調に進展している。本年度は,公立図書館に関する研究を行った。公立図書館とパブリック・フォーラム論との関係についての考察は,「制度理論」の意義を考える上で重要な意味を持っている。そこで,本年度は,この問題についてのアメリカにおける判例・裁判例の研究を行い,公立図書館をパブリック・フォーラムと捉えることの意義および限界について検討した。次に,以上の検討を踏まえつつ,船橋市西図書館事件最高裁判決(最一小判2005年7月14日民集59巻6号1569頁)についての研究を行った。同判決は,「公立図書館は,住民に対して思想,意見その他の種々の情報を含む図書館資料を提供してその教養を高めること等を目的とする公的な場ということができる」と述べ,さらに,「公立図書館が......住民に図書館資料を提供するための公的な場であるということは,そこで閲覧に供された図書の著作者にとって,その思想,意見等を公衆に伝達する公的な場でもあるということができる」とも述べていたが,そこでいう「公的な場」と「パブリック・フォーラム」との関係についての考察を行うことは,本研究を進めていく上で重要であると考えたからである。以上の研究の成果の一部を,「憲法と公立図書館との関係についての予備的考察(1)」として公表した。公立図書館とパブリック・フォーラム論との関係についての研究は,本研究を進めていく上でも重要な意味を持っている。この研究は比較的順調に進展したといえるが,次年度に少し積み残すこととなった。

公営放送に関する研究としては,公営放送局が提供する公職選挙立候補者による討論番組がパブリック・フォーラムに当たるか否かについてのアメリカの判例(Arkansas Educational Television Commission v. Forbes, 523 U.S. 666 (1998))に関する研究を行った。具体的には,この事件に関するアミカス・ブリーフなどを分析しながら,パブリック・フォーラム論の限界という観点から考察を行った。この研究の成果の一部は,「パブリック・フォーラム論の限界?(仮)」として,公表される予定である。以上の2つの研究は,いずれも,制度理論の観点から,パブリック・フォーラム論の限界を明らかにしようとするものである。当初の計画を変更したが,本研究を遂行していく上で有益な視座を獲得することができたので,現在の研究計画で研究を進めていく予定である。次年度は,公立図書館についての研究を継続する一方,本研究の総括も行う。当初は,パソコンを購入し,さらに,渡米して資料収集を行うことを予定していたが,研究計画を一部変更した結果,初年度は文献の収集を中心に行うことにし,次年度にパソコンを購入することにした。また,研究計画の一部変更の結果,一部の研究の遅れが生じたことにより,本年度渡米しても,国外出張費に見合う成果を得られないと判断した。当初は,アメリカ合衆国の議会図書館へ資料収集に行くことを予定していた。しかしながら,研究の進捗状況を踏まえると,次年度に行く方がより高い成果を得られると考えられたので,そのための旅費を次年度に繰り越すことにした。データの整理などを行うため,次年度にパソコンを購入し,また,次年度は渡米して資料収集を行う予定である。
多軸性自転車クランクの製作とトレーニング効果の検証

トレーニング機器として,自転車エルゴメータが広く利用されている.しかし,自転車を除く日常生活やスポーツ競技において,力を伝達する足部が完全な円運動を描くことはない.本研究では,クランクとペダルの間に自由回転分節を接続し(多軸性クランク),どのような運動が発生するか検証した.映像および筋電図解析の結果,80mmの自由回転分節を接続することで,歩行や走行に近い運動が観察された.さらに,自由回転分節を2つ接続した場合(クランクから順に160-80-60mm),10分程度のトレーニングで自由度が高く安定した走行様式のペダリングが可能となった.トレーニング機器として,自転車エルゴメータが広く利用されている.しかし,自転車を除く日常生活やスポーツ競技において,力を伝達する足部が完全な円運動を描くことはない.本研究では,クランクとペダルの間に自由回転分節を接続し(多軸性クランク),どのような運動が発生するか検証した.映像および筋電図解析の結果,80mmの自由回転分節を接続することで,歩行や走行に近い運動が観察された.さらに,自由回転分節を2つ接続した場合(クランクから順に160-80-60mm),10分程度のトレーニングで自由度が高く安定した走行様式のペダリングが可能となった.自転車クランクに軸を増やす(多軸性クランク)ことで,歩行や走行のトレーニングやリハビリテーションが可能と仮定し,本来ペダルが接続される部分に,「自由回転分節」を試作し接続した.自転車クランク160mmに対し,自由回転分節は80mmであった.自由回転分節の多端にペダルを取り付けた.軸の数は(1)クランク軸,(2)クランク-自由回転分節軸,(3)ペダル軸の3つとなった.次に,試作品について自転車エルゴメータでの実際の運動と,トレッドミルでの歩行・走行を行わせ,運動パターンの映像解析および筋電図分析を行った.被検者は,女子大学トライアスリート1名とし,大転子・膝関節・足関節・足尖部にマーカーを貼付し,側方ビデオ映像の2次元実長換算処理により各部位の移動軌跡と,下肢の主要な筋の筋電図を比較した.なお,エルゴメータの負荷は2kp,クランク回転速度は60rpmと120rpmとした.また,歩行は4km/h・20steps/min,走行は8km/h・180steps/minであった.結果は,多軸性クランクとすることで,歩行や走行のような三角形に近い楕円軌道が観察され,筋電図も特にペダル引き上げ時が歩行・走行に近似した波形となった.ただし,自由回転分節が1本であったため,引き上げから踏み込みに至る部分で,「カラ打ち」などのギクシャクした動きとなった.下肢障害者のリハビリテーションを視野に入れれば,この点の改良が今後の課題である.自転車クランクに軸を増やす(多軸性クランク)ことで,歩行や走行のトレーニングやリハビリテーションが可能と仮定し,本来ペダルが接続される部分に,「自由回転分節」を装着した.平成22年度の実験における軸の数は(1)クランク軸,(2)クランク-自由回転分節軸,(3)ペダル軸の3つであった.多軸性クランクを装着した自転車エルゴメータでの運動と,トレッドミルでの歩行・走行を比較した結果,多軸性クランクによって歩行や走行のような三角形に近い楕円軌道が観察された.ただし,自由回転分節が1本であったため,引き上げから踏み込みに至る部分で,「カラ打ち」などのギクシャクした動きとなった.平成23年度にはこの点を改良するため「自由回転分節」をさらに増やし,軸の数は(1)クランク軸,(2)クランク-自由回転分節軸,(3)自由回転分節-自由回転分節軸,(4)ペダル軸の4つとした.自由回転分節を120mm,80mm,40mmの3種類作成し,160mmのクランクとの最適な組み合わせを検討した.ヒトの下肢長比(大腿,下腿,足部)を考慮した160-120-80mmや160-120-40mmの組み合わせでは,40mmの分節のみが空回りする現象が起き,全く運動課題を遂行できなかった.これには、ペダルを装着する末端の自由回転分節が最も短かったことが起因していると考えている。また、クランクと自由回転分節との総長が長くなりすぎ、ペダルと地面が激しくぶつかるような動きも発生した。この点の改良が課題である。自転車クランクに軸を増やす(多軸性クランク)ことで,歩行や走行のトレーニングやリハビリテーションが可能と仮定し,本来ペダルが接続される部分に,「自由回転分節」を装着した.最初の実験における軸の数は1クランク軸,2クランクー自由回転分節軸,3ペダル軸の3つであった.

多軸性クランクを装着した自転車エルゴメータでの運動と,トレッドミルでの歩行・走行を比較した結果,多軸性クランクによって歩行や走行のような三角形に近い楕円軌道が観察された.ただし,自由回転分節が1本であったため,引き上げから踏み込みに至る部分で,「カラ打ち」などのギクシャクした動きとなった.次にこの点を改良するため「自由回転分節」をさらに増やし,軸の数は1クランク軸,2クランクー自由回転分節軸,3自由回転分節ー自由回転分節軸,4ペダル軸の4つとした.自由回転分節を120mm,80mm,40mmの3種類作成し,ヒトの下肢長比(大腿,下腿,足部)を考慮した160-120-80mmや160-120-40mmの組み合わせで試みたが,末端分節のみが空回りする現象が起き,全く運動課題を遂行できなかった.これは、ペダルを装着する末端の自由回転分節が最も短かったため,負荷のかかるクランク軸の回転よりも末端がカラ回りすることが原因と考えられた.最後の実験では,クランク長および自由回転分節において,ヒトの下肢長比にこだわらずに最適な組み合わせ(例えば160-40-120mm)を探った.結果として下肢三関節は自由度の高い回転運動を遂行することができた.しかし,歩行や走行に近い安定した反復運動にはならず,力点である母指球部の軌跡は極めて歪かつ再現性の低いものとなった.ヒトの下肢関節は,例えば膝関節は伸展0度(数学的180度)でロックされるなど,関節可動域に制限がある.この問題解決には,各分節間に可動域制限を設けることが類推される.自転車のクランク軸を増やす(自由回転分節を装着する)ことによって歩行・走行運動に近づけることは、概ね予想どおりであった。しかし、後方から前方へのスウィング前半の動きに改善の余地があり、より良いクランク長および自由回転分節との組み合わせを模索中である。したがって、トレーニング効果の検証には至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。クランク長および自由回転分節との組み合わせにおいて、ヒトの下肢長比にこだわらずに最適な組み合わせ(例えば160-40-120mm)を探るとともに,より歩行・走行に近づけるアタッチメントの開発を試み,トレーニング効果の検証までを実施する.なお、トレーニング効果については、長期的なトレーニングによる筋力等の変化よりも、新たな運動器具の使用による動きの発生を検証する方向で検討中である。
天然物超分子ネオカルヂノスタチン・クロモフォアの生合成に関する基礎研究

NCS生産菌をNCSが十分生産する条件と生産しない条件で培養し、これらの菌体内のNCS-chrの前駆体と考えられている脂肪酸をGC-MSで検索した。NCS生産状態では通常の微生物では例外的なiso-C_<16 : 1>(Δ^9)が1020%含まれたいた。また、非生産菌体内ではこの脂肪酸含量は少なく、n-C_<18 : 2>が大部分を占めていた。また、F-41株菌体内の脂肪酸画分にはこれらの脂肪酸の他にNCS-chr構成成分である2-Hydroxy-7-methoxy-5-methyl-1-naphtalenecaboxylic acid(NA)が見いだされたが、この化合物は菌体総脂質を加水分解して得られるもので遊離のものは見いだされなかった。このNAが菌体内に含まれるNCS-chr由来である可能性が考えられるが、NCS非生産のF-41株菌体内からもNAが検出されること、また、NCS-chrを同じ条件で加水分解しても、NAが得られることなどから、NAがNCR-chr以外の成分とエステル結合している可能性が示唆され、NA部分が生合成されていてもNCS-chrまで、すなわち、生物活性発現のcyclic dienediyne部分までは生合成されていないと考えられた。また、NVS-chrのナフタレンカルボン酸誘導体はNCS非生産状態でも菌体内に多量に含まれることにより、5員環と9員環の結合した部分(NCS-chr)の活性中心にiso-C_<16 ; 1>(Δ^9)が取り込まれる可能性が示唆された。このナフタレンカルボン酸誘導体はフリーの状態では検出されず、加水分解することにより初めて得られる。以上、現在これらの不飽和脂肪酸にナフタレンカルボン酸が結合し、その後アミノ糖が結合、さらに不飽和脂肪酸が閉環し、エチレンカーボネート、エポキシド部分が合成されてNCS-chrの生合成が完成するものと考えている。Bligh-Dyer法に従い、NCS生産菌の凍結乾燥菌体から抽出した総脂質画分をNCS-chrの部分構造であるナフタレンカルボン酸(2-hydroxy-7-methoxy-5-methyl-1-naphthalenecarboxylic acid)の紫外線吸収(340nm)でモニターしながらナフタレンカルボン酸に結合した成分を単離精製した。これらは不飽和脂肪酸に結合しているナフタレンカルボン酸であることが予想されている。また、他にもNCS-chrのプリカーサーと思われる化合物が得られている。これらの構造を決定中である。これらが明らかになればNCS-chrの生合成経路をある程度推定できるものと考えられる。(2)NCS-chr誘導体の生産条件の検討ならびにNCS-chr生合成阻害剤のスクリーニングNCS生産菌を種々の培養条件(温度、培地)で培養し、NCS蛋白(apo-NCS)に結合せずフリーの状態で生産される抗菌活性を有するNCS-chrの類似物質が部分精製された。この化合物はUV、NMR、IR等から、やはり脂質の誘導体と思われる。現在、培養条件が必ずしも良いとはいえないのでさらに検討する。また、クロラムフェニコール、ピューロマイシンはNCS-chrの生合成を阻害することがすでに判明している。今後、NCS-chrの生産を阻害する物質のスクリーニングの実施も検討したい。さらに、これらの菌体はNCS-chrの中間体を蓄積する可能性が大であるのでこれらの菌体成分の精製および構造解析を行い、生合成過程解明の一助としたい。

NCS生産菌の凍結乾燥菌体から抽出した総脂質画分をNCS-chrの部分構造であるナフタレンカルボン酸の紫外部吸収(340nm)でモニターしながらナフタレンカルボン酸に結合した成分を単離精製している。また、他にもNCS-chrのプリカーサーと思われる化合物が得られている。現在、構造に関しては検討中。(2) NCS-chr誘導体の生産条件の検討ならびにNCS-chr生合阻害剤のスクリーニングNCS生産菌をNCSが十分生産する条件と生産しない条件で培養し、これらの菌体内のNCS-chrの前駆体と考えられている脂肪酸をGC-MSで検索した。NCS生産状態では通常の微生物では例外的なiso-C_<16:1>(Δ^9)が1020%含まれていた。また、非生産菌体内ではこの脂肪酸含量は少なく、n-C_<18:2>が大部分を占めていた。さらに、、NCS-chrの生合成は脂肪酸の生合成阻害物質セルレニンにより阻害された。また、NCS-chrのナフタレンカルボン酸誘導体はNCS非生産状態でも菌体内に多量に含まれることにより、5員環と9員環の結合した部分(NCS-chrの活性中心)にiso-C_<16:1>(Δ^9)が取り込まれる可能性が示唆された。このナフタレンカルボン酸誘導体はフリーの状態では検出されず、加水分解することにより初めて得られる。以上のことより、現在これら不飽和脂肪酸にナフタレンカルボン酸が結合し、その後にアミノ糖が結合、さらに不飽和脂肪酸が閉環し、エチレンカーボネート、エポキシ部分が合成されてNCS-Chrの生合成が完成するものと考えている。NCS生産菌体には、通常の微生物には例外的に脂肪酸であるiso-C_<16:1>(Δ^9)が1020%含まれていた。しかし、NCS非生産のF-41株菌体からは見いだされなかった。また、F-41株菌体内の脂肪酸画分にはこれらの脂肪酸の他にNCS-chr構成成分である2-Hydroxy-7-methoxy-5-methyl-1-naphthalenecarboxylic acid(NA)が見いだされたが、この化合物は菌体総脂質を加水分解して得られるもので遊離のものは見いだされなかった。このNAが菌体内に含まれるNCS-chr由来である可能性が考えられるが、NCS非生産のF-41株菌体内からもNAが検出されること、また、NCS-chrを同じ条件で加水分解しても、NAが得られることなどから、NAがNCS-chr以外の成分とエステル結合している可能性が示唆され、NA部分が生合成されていてもNCS-chrまで生合成されていないと考えられた。なお、現在NAが結合した文献未知の化合物は得ていない。(2)Neocarzinostatin(NCS)生産菌の菌体成分のトリテルペノイドおよびよりホパノイドの単離精製および構造解析F-41株菌体中の不けん化物よりトリテルペノイド5成分が認められ、そのうち4成分について単離精製した結果squalene,dihydrosqualene,tetrahydrosqualene,diploptene(22-hopene)であった。また、bactriohopane 22-R-bacteriohopane-32-olが検出され,22-R-bacteriohopane-32,33,34,35-tetrolの存在が示唆された。
マイクロRNA徐放を用いた細胞フェノタイプ制御による新規心不全治療の開発

COS-7細胞に対するゼラチン水和ゲルとmiR-29bの組成条件の検討を行った。COS-7細胞へは高効率でmiR-29bの完全相補遺伝子をもつプラスミドを導入でき、マイクロRNAの徐放担体への導入における条件を導き出すことができた。乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)を用いたmiR-126のマウス下肢虚血モデルへの導入効率を検討した。PLGA封入miR-126投与群で血流改善を認め、遺伝子レベル・タンパク発現レベルでも、miR-126によるシグナル活性を示した。PLGAを用いたmiRNAの局所投与による標的細胞への十分な移行性が示され、心臓組織へのマイクロRNA徐放における基礎的知見を得た。研究の目的:miRNA局所徐放による心筋細胞フェノタイプ制御及びそれによる心筋リモデリングの抑制効果、機序の解析研究内容: miRNAを導入する際に用いるゼラチン水和ゲルの最適な組成条件の検討を行った。miRNAは心筋線維化及び心筋リモデリングの抑制の働きを持つmiRNA-29b(miR-29b)を使用し、miR-29bの完全相補遺伝子を組み込ませたdual luciferaseをもつプラスミドを用いた。しかし、ヒト心筋線維芽細胞にこのプラスミド及びmiR-29bを直接導入したところ導入効率が低く、ゼラチン水和ゲルの条件検討にヒト心筋線維芽細胞を用いることは難しいと考えられた。そこで、遺伝子導入に適したCOS-7細胞をゼラチン水和ゲル組成条件の検討に使用することとし、その後ヒト心筋線維芽細胞での検討を行う方針とした。COS-7細胞へは高効率でこのプラスミドを導入できた。次に、miR-29bの長期作用の検討をするために、プラスミドのluciferaseが長期発現する細胞株(安定発現細胞株)を作製中である。意義・重要性:本邦で主要死因のひとつである末期重症心不全は、心筋肥大・線維化など細胞フェノタイプによる心筋リモデリングが引き金となる。心筋リモデリングにはマイクロRNA(miRNA)が関与しているため、miRNAの発現調節により心筋リモデリングの抑制に繋がると考えた。しかし、miRNAの局所発現は難しく他臓器での有害作用が危惧される。そこで、ゼラチン水和ゲルを局所徐放化システムとして用いることで、心臓局所に効率よく長期間miRNAを発現させうることが可能性となる。心臓局所にmiRNAを局所徐放投与することで、細胞フェノタイプの制御・心筋リモデリング抑制が可能であれば、その機序の解明を進めることで末期重症心不全に対する新たな治療法の手掛かりとなり、移植待機患者数の減少が期待できる。(研究の目的)マイクロRNA(miRNA)局所徐放による心筋細胞フェノタイプ制御及びそれによる心筋リモデリングの抑制効果、及び機序の解析(研究内容)すでに安定したmiRNAの導入に成功している乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)を用いたmiR-126の投与による、マウス下肢での血管新生効果を検討した。マウス下肢虚血モデルとして、大腿動脈を結紮・切除により作製し、モデル作製直後にcontrol RNA投与群とmiR-126投与群に分けて、その投与効果を比較した。評価項目は、レーザードップラー血流計による下肢の血流評価、採取標本の免疫組織学的評価、qRT-PCRによる遺伝子レベルの評価およびウエスタンブロッティングによるタンパク発現レベルの評価を行った。結果は、miR-126投与群で血流改善を認め、組織学的にも血管新生および動脈形成の有意な増加が得られた。また、遺伝子レベルおよびタンパク発現レベルも、miR-126の血管新生経路を示すことが出来た。以上より、PLGAを用いたmiRNAの局所投与によるその標的細胞への十分な移行性が示された。心筋への応用につき、今後引き続き別予算にて進めていく。心臓血管外科学徐放担体としてのゼラチン水和ゲル組成の条件検討に時間を要している。当初、ヒト心筋線維芽細胞で条件検討を行ったが、ヒト心筋線維芽細胞自体へのプラスミド導入効率が低く、条件検討は困難であった。現在はCOS-7細胞で条件検討を行う方針とし、プラスミドを導入し、ルシフェラーゼ安定発現細胞株を作成している。miR-29bをヒト心筋線維芽細胞へ導入する際の最適なゼラチン水和ゲル組成を可及的速やかに決定する。その結果を用いて、miR-29bを心筋線維芽細胞に導入した際に変化する心筋リモデリングに関わる遺伝子(CollagenyやFibrillinの遺伝子等)の発現抑制効果を評価する。続いて、ゼラチン水和ゲルを用いたラット心筋梗塞モデルへのmiR-29b投与実験を可及的速やかに進めていく。
高分子半導体不均一光触媒界面における光誘起多電子還元反応

1.ポリパラフェニレン(PPP)界面に生成するカルバニオン中間体の反応性可視光駆動光触媒としてPPPを用い、ベンゾフェノンのα位炭素にCO_2の挿入反応を詳細に検討した。このCO_2固定系では、ベンゾフェノンの連続的2電子還元によって生成したカルバニオン中間体にCO_2が挿入していることを強く示唆する生成物として、1,1-ジフェニル-1,2-プロパンジオールが確認された。この化合物は電子供与体であるトリエチルアミンの酸化生成物であるアセトアルデヒドとカルバニオン中間体のカップリングから生成する。2.多電子還元の活性種としてのバイポーラロンの検出ナトリウム金属還元によるPPP骨格中におけるバイポーラロン生成をEPRにより確認した。上記反応の触媒活性種はPPP骨格中に光化学的に生成するバイポーラロンであり、この化学種がベンゾフェノンからカルバニオンへの多電子還元を可能にしていることが示唆された。3.オリゴピリジンによるPPy可視光駆動光触媒機構の検討可視光駆動光還元触媒能を発現するポリピリジン-2,5-ジイルの機構解明を目的とし、ピリジンの3および4量体を合成し、その光化学的挙動を詳細に検討した。その結果、オリゴポリジンは対応するオリゴフェニレンに比較して高い水還元水素発生活性を発現し、これは3重項励起状態からの高効率なアニオンラジカル生成が原因であることがわかった。また、アニオンラジカルからのプロトン付加体生成が確認され、PPy光触媒作用におけるヒドリド中間体の還元活性種としての働きが示唆された。
省力化と高耐震性を目指した鋼・コンクリート合成骨組の開発

薄肉鋼管で横補強した鋼・コンクリート合成柱材は優れた耐震性能を示すことを明らかとしているが,本研究では,同断面のスタブラカムの圧縮実験および弾塑性解析を行い,薄肉鋼管および内蔵鉄骨によって拘束されたコンクリートの構成則について明らかとした.さらに本合成柱と鉄骨梁で構成された混合骨組の載荷実験を行い,本骨組は柱が高軸力を受ける場合でも優れた耐震性能を発揮することを明らかとした.特に,柱崩壊先行型の試験体でも大変形域まで耐力が低下することなく安定した挙動を示すことから,本柱材を使用することで建築構造物の柱崩壊先行型の骨組の設計法の可能性を示した.薄肉鋼管で横補強した鋼・コンクリート合成柱材は優れた耐震性能を示すことを明らかとしているが,本研究では,同断面のスタブラカムの圧縮実験および弾塑性解析を行い,薄肉鋼管および内蔵鉄骨によって拘束されたコンクリートの構成則について明らかとした.さらに本合成柱と鉄骨梁で構成された混合骨組の載荷実験を行い,本骨組は柱が高軸力を受ける場合でも優れた耐震性能を発揮することを明らかとした.特に,柱崩壊先行型の試験体でも大変形域まで耐力が低下することなく安定した挙動を示すことから,本柱材を使用することで建築構造物の柱崩壊先行型の骨組の設計法の可能性を示した.平成19年度は,薄肉鋼管で横補強した鋼コンクリート合成柱材を対象として,内蔵鉄骨および横補強鋼管によるコンクリートの拘束効果を明らかにするためにスタブカラム試験体を製作し,中心圧縮実験を行った,さらに,本柱材と組合せる梁としてH形鋼のフランジ間にコンクリートを打設した鋼コンクリート合成梁を考えているが,鋼とコンクリートの滑りをなくす機構を考案するために,鉄骨のウエブに孔をあけるだけの穴あきジベルを考え,その効果を調べるためにスタブカラム試験体および梁試験体を製作しそれぞれ,押し抜き実験およびせん断曲げ実験を行った.柱材の中心圧縮実験では,幅厚比が100を越える薄肉鋼管で横補強しても,コンクリートの拘束効果は大きく期待できること,さらに,著者らが考えていたモデルで拘束されたコンクリートの応カ-歪関係を精度良く追跡できることを明らかとした.SC部材の押し抜き試験では,穴あきジベルの効果を明らかにするとともに,孔個数を増やすことによる付着強度の増大が見込まれることを明らかとした.ジベルの強度算定法については来年度の研究課題である,梁材の曲げ実験では,このジベルの効果を明らかにするために,滑り抵抗要素なしとスタッド付き梁の実験を行ったがこれらに大きな違いは見られなかった.来年度の課題として,せん断スパン比の違い,繰り返し載荷の影響を考慮して,さらに,合成梁材の性能を調べていく.平成19年度はさらに,合成柱と鉄骨梁で構成された骨組の弾塑性挙動を調べるために,十字形骨組の試験体を5体製作した.本試験体は平成20年度に載荷実験を行い,その性状を明らかにしていく.平成20年度は,薄肉鋼管で横補強した鋼コンクリート合成柱材と鉄骨梁で構成された骨組の弾塑性挙動を調べるために,十字形骨組の載荷実験を行った。試験体は,柱断面が200mm角で高さ1.5m高さとし,梁スパンは3mで,梁断面は骨組の崩壊型に応じて寸法を変化させている。載荷条件としては,柱脚を固定とし,梁の両端をローラー支持し,柱頭部に繰り返し水平力を載荷する実験とした。主な実験変数は,骨組の崩壊型であり,柱曲げ崩壊先行型,梁曲げ崩壊先行型,仕ロパネルせん断崩壊型とした。また,柱崩壊先行型骨組では柱軸力比が骨組の弾塑性挙動に及ぼす影響を調べるために,柱断面の圧縮耐力に対する作用軸力の比nを0.3と0.6とした2体の試験体とした。なお,梁崩壊先行,仕口崩壊先行骨組では軸力比を0.3としている。載荷実験の結果,以下のことが明らかとなった。1)梁崩壊先行骨組は柱には損傷が生じず梁が塑性化し,最終的に梁端部のフランジおよびウエブが局部座屈を起こすことで骨組が最大耐力に達し,優れた耐震性能を示した。2)柱崩壊先行骨組は,2体とも,柱頭・柱脚部に損傷が集中したが,大変形に至るまで耐力が低下すること無く,優れた耐震性能を発揮できることを明らかとした。特に,軸力比0.6の高軸力下に於いても部材角7%まで軸力を保持できており,このSC柱は優れた耐震性能を保持していることが示された。これらの結果より,柱に損傷を生じさせないために,建築構造骨組の設計で,柱の曲げ耐力を梁の曲げ耐力の1.5倍以上確保されるように設計されているが,このような高軸力化でも優れた耐震性能を保持できるSC柱であれば,この強度比を小さくすることも可能で,柱の断面寸法を小さくすることも可能であると考えられる。さらに,変動軸力が大きいピロティー柱にこの部材を使用する効果が大きいと考えられる。
直下形地震に遭遇した場合の走行列車の安全性に関する研究

阪神大震災で脱線又は重大な損傷を被った車両が在線した箇所は気象庁が発表した震度階級7の被災地域とほぼ一致することがわかった.被災箇所の割合を高架,地上及び地下で区分したところ,地下在線中の車両の被災割合が最も少なく,高架橋在線中の車両の被災割合は圧倒的に高くほとんど全ての車両が何らかの被害を被っていた.よって,地下に在線する車両の耐震性は他の線区のものに比べ高いといえる.脱線の状況を調査した結果,激しい地震動により軌道が全く損傷していないのに飛び上がり脱線した車両があり,走行又は停止中の車両の心皿がが激しい上下動により脱出して心皿の脱出防止用コックが破断した事例も複数確認された.このような信じがたい激しい揺れに遭遇した列車は,どのような手段を講じても脱線を防止出来ない.幸いなことに,このような深刻な事態が発生した場合でも列車が崩壊した橋梁や高架橋に高速で突っ込む可能性は高くはないと判断できる事実を見いだした。土木構造物が重大な損壊を被るような激しい地震動に遭遇した場合,列車は全軸脱線し,非常ブレーキで減速するよりはるかに高い減速度で急停車しているからである.他方,構造物の崩壊や陸橋の落橋は列車が停止した時点以降に発生したと指定される事例がほとんどだったからである。従って,一部で提案されている脱線防止用レールを積極的に架橋橋上の軌道に敷設して震災時の脱線を防止しようとの考え方は必ずしも最善の策とは言えない。走行列車が激震に遭遇した場合に考えられる最も大きな人的被害の一つは,地下鉄内で高速走行する列車が揺れによりトンネル側壁に設置されたトラフや信号機に激突して側窓や側扉が大破するケースである.かような事態を回避するために地下鉄内の工作物はなるべく電車側窓に対応する高さを避けて設置することが望ましい.阪神大震災で脱線又は重大な損傷を被った車両が在線した箇所は気象庁が発表した震度階級7の被災地域とほぼ一致することがわかった.被災箇所の割合を高架,地上及び地下で区分したところ,地下在線中の車両の被災割合が最も少なく,高架橋在線中の車両の被災割合は圧倒的に高くほとんど全ての車両が何らかの被害を被っていた.よって,地下に在線する車両の耐震性は他の線区のものに比べ高いといえる.脱線の状況を調査した結果,激しい地震動により軌道が全く損傷していないのに飛び上がり脱線した車両があり,走行又は停止中の車両の心皿がが激しい上下動により脱出して心皿の脱出防止用コックが破断した事例も複数確認された.このような信じがたい激しい揺れに遭遇した列車は,どのような手段を講じても脱線を防止出来ない.幸いなことに,このような深刻な事態が発生した場合でも列車が崩壊した橋梁や高架橋に高速で突っ込む可能性は高くはないと判断できる事実を見いだした。走行列車が激震に遭遇した場合に考えられる最も大きな人的被害の一つは,地下鉄内で高速走行する列車が揺れによりトンネル側壁に設置されたトラフや信号機に激突して側窓や側扉が大破するケースである.かような事態を回避するために地下鉄内の工作物はなるべく電車側窓に対応する高さを避けて設置することが望ましい.
グラフ描画の理論とアルゴリズムに関する研究

平面グラフの外面も含めて全ての面を矩形(長方形)で描画することを矩形描画という.Thomassenは平面グラフの矩形描画が存在するための必要十分条件を与えているが,それは点に接続している辺の最大本数,即ち最大次数Δが3以下の平面グラフに限定されていた.本研究では,矩形描画を一般化して,内面は全て矩形であるが,外面は矩形であるとは限らず,L字形やT字形のような軸平行多角形であればよい"内部矩形描画"という新しい描画形式を提案した.更に,Δ≦3とは限らない,一般の場合に内部矩形描画が存在するための必要十分条件を与えた.この結果はVLSIレイアウトへの実用的応用があるばかりでなく,30年来の未解決問題を解決したことになる.また内部矩形描画を効率よく求めるアルゴリズムも開発した.矩形描画と箱直交描画を一般化した箱矩形描画という新しい描画形式を提案し,箱矩形描画が存在するための必要十分条件を与えるとともに,効率のよいアルゴリズムを開発した.その計算時間はグラフの点数に比例する程度であるので,最適であり,これ以上改善の余地はない.従来のVLSIレイアウト設計では矩形描画を用いていたため,隣接させたくないモジュールまでもが隣接してしまうレイアウトが求まることがあった.本研究の箱矩形描画を用いたVLSIレイアウトではそのようなことが起きない.他の描画形式である,直線描画,凸描画,矩形勢力描画等に関しても,できるだけ小さく描画する効率のよいアルゴリズムを設計した.特に4連結平面グラフは一般の平面グラフより1/4の面積で描画できるという画期的な結果を与えた.平面グラフの外面も含めて全ての面を矩形(長方形)で描画することを矩形描画という.Thomassenは平面グラフの矩形描画が存在するための必要十分条件を与えているが,それは点に接続している辺の最大本数,即ち最大次数Δが3以下の平面グラフに限定されていた.本研究では,矩形描画を一般化して,内面は全て矩形であるが,外面は矩形であるとは限らず,L字形やT字形のような軸平行多角形であればよい"内部矩形描画"という新しい描画形式を提案した.更に,Δ≦3とは限らない,一般の場合に内部矩形描画が存在するための必要十分条件を与えた.この結果はVLSIレイアウトへの実用的応用があるばかりでなく,30年来の未解決問題を解決したことになる.また内部矩形描画を効率よく求めるアルゴリズムも開発した.矩形描画と箱直交描画を一般化した箱矩形描画という新しい描画形式を提案し,箱矩形描画が存在するための必要十分条件を与えるとともに,効率のよいアルゴリズムを開発した.その計算時間はグラフの点数に比例する程度であるので,最適であり,これ以上改善の余地はない.従来のVLSIレイアウト設計では矩形描画を用いていたため,隣接させたくないモジュールまでもが隣接してしまうレイアウトが求まることがあった.本研究の箱矩形描画を用いたVLSIレイアウトではそのようなことが起きない.他の描画形式である,直線描画,凸描画,矩形勢力描画等に関しても,できるだけ小さく描画する効率のよいアルゴリズムを設計した.特に4連結平面グラフは一般の平面グラフより1/4の面積で描画できるという画期的な結果を与えた.平面グラフの外面も含めて全ての面を矩形(長方形)で描画することを矩形描画という.Thomassenは平面グラフの矩形描画が存在するための必要十分条件を与えているが,それは点に接続している辺の最大本数,即ち最大次数Δが3以下の平面グラフに限定されていた.本研究では,矩形描画を一般化して,内面は全て矩形であるが,外面は矩形であるとは限らず,L字形やT字形のような軸平行長方形であればよい"内部矩形描画"という新しい描画形式を提案した.更に,Δ≦3とは限らない,一般の場合に内部矩形描画が存在するための必要十分条件を与えた.この結果はVLSIレイアウトへの実用的応用があるばかりでなく,30年来の未解決問題を解決したことになる.また内部矩形描画を効率よく求めるアルゴリズムも開発した。矩形描画と箱直交描画を一般化した箱矩形描画という新しい描画形式を提案し,箱矩形描画が存在するための必要十分条件を与えるとともに,効率のよいアルゴリズムを開発した.その計算時間はグラフの点数に比例する程度であるので,最適であり,これ以上改善の余地はない.従来のVLSIレイアウト設計では矩形描画を用いていたため,隣接させたくないモジュールまでもが隣接してしまうレイアウトが求まることがあった.本研究の箱矩形描画を用いたVLSIレイアウトではそのようなことが起きない.他の描画形式である,直線描画,凸描画,矩形勢力描画等に関しても,できるだけ小さく描画する効率のよいアルゴリズムを設計した.特に4連結平面グラフは一般の平面グラフより1/4の面積で描画できるという画期的な結果を与えた.平面グラフの外面も含めて全ての面を矩形(長方形)で描画することを矩形描画という.Thomassenは平面グラフの矩形描画が存在するための必要十分条件を与えているが,それは点に接続している辺の最大本数,即ち最大次数Δが3以下の平面グラフに限定されていた.本研究では,矩形描画を一般化して,内面は全て矩形であるが,外面は矩形であるとは限らず,L字形やT字形のような軸平行長方形であればよい"内部矩形描画"という新しい描画形式を提案した.更に,Δ≦3とは限らない,一般の場合に内部矩形描画が存在するための必要十分条件を与えた.

この結果はVLSIレイアウトへの実用的応用があるばかりでなく,30年来の未解決問題を解決したことになる.また内部矩形描画を効率よく求めるアルゴリズムも開発した.矩形描画と箱直交描画を一般化した箱矩形描画という新しい描画形式を提案し,箱矩形描画が存在するための必要十分条件を与えるとともに,効率のよいアルゴリズムを開発した.その計算時間はグラフの点数に比例する程度であるので,最適であり,これ以上改善の余地はない.従来のVLSIレイアウト設計では矩形描画を用いていたため,隣接させたくないモジュールまでもが隣接してしまうレイアウトが求まることがあった.本研究の箱矩形描画を用いたVLSIレイアウトではそのようなことが起きない.他の描画形式である,直線描画,凸描画,矩形勢力描画等に関しても,できるだけ小さく描画する効率のよいアルゴリズムを設計した.特に4連結平面グラフは一般の平面グラフより1/4の面積で描画できるという画期的な結果を与えた.
微小管構造のC型肝炎ウイルス増殖における役割とその抗HCV薬ターゲットの可能性

我々は、これまでに、抗真菌剤GriseofulvinがC型肝炎ウイルス(HCV)増殖抑制効果を有することを見出した。そこで、その研究成果を新規抗HCV剤開発に繋げるため、本研究では、Griseofulvinの抗HCV剤のための構造最適化およびHCV増殖抑制機序の解明の検討を行った。その結果、抑制効果の高い2種のGriseofulvin誘導体を見出すことが出来た。しかし、HCV増殖抑制の機序解明には至らなかった。本研究は、我々が見出した抗真菌剤Griseofulivinや抗癌剤Paclitaxelの抗HCV抑制効果の作用機序を解明し、更に、それを基に治療薬開発に繋げることを目的とする。具体的には、これら化合物が細胞内の微小管の構造を変化させることにより、HCVウイルス複製・増殖の低下が起こるという作業仮説を立て、ケミカルバイオロジー的なアプローチでその機序を解明する。本年度は、まず、微小管の構成タンパクであるα-tubulinおよびβ-tubulinとHCVのウイルスタンパクの相互作用をするかについて、免疫沈降法により確認を行った。その結果、α-tubulinおよびβ-tubulinタンパクとHCV NS3及びNS5Bが相互作用している可能性があることが示唆された。更に、この相互作用を定量的に測定出来る系として、Bl-molecular fluorescent complementation法を用いた測定法を構築中である。今後は、これらの系を用いて、抗真菌剤Griseofulivinや抗癌剤Paclitaxelの抗HCV効果と微小管の構造との相互関係について検討を行う予定である。また、我々は、Griseofulivinの様々な誘導体を入手していることから、これら誘導体について、HCVレプリゴン細胞を用いて、抗HCV抑制効果を調べた。現在、15種類ほどの誘導体についてその抗HCV抑制効果を調べた結果、4種の誘導体Griseofulivinより強い抗HCV効果が見られた。また、ほとんど抑制効果が見られない誘導体も1種見出した。今後、更に、他の誘導体の抑制効果も調べた上で、化合物と抗HCV抑制効果の構造活性相関の調べ、化合物側からもその抑制効果の機序を解明する。申請者は、これまでに、抗真菌剤Griseofulvin及び抗癌剤Taxol/Paclitaxelが、C型肝炎ウイルス(HCV)増殖抑制効果を有することを見出した。これら薬剤に共通する抗HCV効果の作用機序は、細胞内に存在する微小管の構造変化であると推定した。そこで、本研究は、GriseofulvinやTaxol/Paclitaxelをバイオプローブとして用い、細胞内の微小管の構造がHCVのウイルス増殖にどのような役割を果たすかを、ケミカルバイオロジー的なアプローチで検索を行った。まず、化学合成が行いやすいGriseofulvinをリード化合物とし、25種類の誘導体を作製、それぞれの抗HCV活性についてHCVレプリコン細胞を用いてスクリーニングを行った。このような方法から行った理由は、様々なGriseofulvinの誘導体を作製し、それら化合物の中で抗ウイルス活性の違いが生じれば、異なった活性を持つ化合物をツールとして用い、抗HCV効果の作用機序を解明することが出来るからである。25種類の誘導体の抗HCV活性についてスクリーニングを行った結果、共通母核を有し、一部の官能基の違いで、その活性が大きく異なる3種の誘導体を見出した。具体的には、Griseofulvinに結合させたベンゼン環の側鎖の一部の官能基の位置を変えるだけで、HCVのウイルス増殖を50%抑制する濃度が、約40倍近くの差を生じた。更に、それら化合物のうち抑制効果のもっとも高い化合物は、その50%抑制濃度は数μMオーダーであり、その抗HCV活性は、Griseofulvinより数倍高いものであった。以上のように、これまでの研究から、細胞内の微小管の構造とHCVのウイルス増殖について関連性を解明するためのツールとなる新規化合物を見出した。研究代表者は、抗真菌剤GriseofulvinがC型肝炎ウイルス(HCV)増殖抑制効果を有するという研究成果を基に、過去2年の研究期間において、様々なGriseofulvin誘導体を作製し、その抗HCV活性について検討を行ってきた。その結果、共通母核を有し、一部の官能基の違いから、抗HCV活性が大きく異なる数種のGriseofulvinの誘導体を見出した。そこで、本年度は、抑制活性が強いGriseofulvin誘導体と抑制活性のほとんどないGriseofulvin誘導体のアフィニティービーズを作製し、これら2つビーズを使って抗HCV活性に関与するGriseofulvinの標的タンパクを同定するための実験を計画、遂行した。まず、その基礎実験として、Griseofulvin誘導体をタンパク精製アフィニティービーズに結合させるために、最適なリンカーの検索を行った。具体的には、幾つか異なったリンカーを結合させたGriseofulvinを作製し、それら化合物の抗HCV活性について、HCVサブゲノムレプリコン細胞を用いて評価した。

抑制活性に影響しないものがアフィニティービーズ精製に最適なリンカーとなるが、これまで合成したリンカーを有するGriseofulvinのいずれもが、リンカーを付けることにより、抗HCV活性がGriseofulvinに比べ著しく低下した。従って、これまでのところ、抗HCV活性を保持しつつ、アフィニティービーズに結合させる最適なリンカーを見出すことが出来ていない。そのため、現在、リンカーの種類、挿入部位について引き続き検討を行っている。GriseofulvinやTaxol/Paclitaxelを用いて解析を行う予定であったが、Griseofulvinの誘導体の一部の結果が興味深いものであった。そのため、更に、様々な誘導体を作製し、解析を行うという研究方針に変更し、様々な誘導体の合成にやや時間がかかったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。1)得られた誘導体を使って、細胞内の微小管の構造とHCVのウイルス増殖の関連性について調べる。2)得られた誘導体を結合させた磁気ビーズを作製し、このビーズを使って、結合するタンパクを同定し、活性の高い誘導体に結合するタンパクを精製・同定する。