hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中枢神経系機能性疾患における三者間シナプス伝達機能障害仮説の構築

生後01日のラット皮質からアストロサイトを分離・精製培養(2週間)し、純度95%以上の培養アストロサイトを精製した。精製された培養アストロサイトを人工脳脊髄液に移し、人工脳脊髄液内に遊離された伝達物質を、超高速液体クロマトグラフ(蛍光検出器あるいは質量分析装置)を用いて定量した。遊離された化学物質の多くは、電位依存性ナトリウムチャネル非感受性であった。特に、トリプトファン誘導体として、セロトニンとは異なる代謝経路で合成されるキヌレニンとその代謝産物である、キヌレン酸、キノリン酸、シンナバリン酸、キサンツレン酸は、グルタミン酸受容体感受性物質であり、多様な化学伝達特性を有することを明らかにした。また、炎症性サイトカインは、キヌレニン代謝系に対し特異的な作用を有し、てんかん病態に対し選択的影響を与え、この影響は抗てんかん薬の臨床スペクトラムと一致する作用を有していた。前頭葉は認知機能を司る重要な皮質領域であるが、皮質内制御機構と皮質外制御機構ではその作用標的が異なる可能性を取得した。脳微小透析装置を用いた実験では、アストロサイトのアミノ酸トランスポーターがグルタミン酸受容体伝達機能の興奮性と抑制性の補正機能を有している可能性を示した。また、皮質外伝達経路の中で視床皮質路が最も優位な情報伝達回路の一つであり、向精神薬がこの神経回路のグルタミン酸伝達を制御していることを明らかにし、その作用標的をも同定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、一部の物質は、SNAREタンパク質感受性であった。ナトリウムチャネル非感受性+ SNAREタンパク質感受性の物質の中で、アストロサイトのアコニターゼ阻害薬であるフルオロクエン酸によって遊離が減少した物質としては、1)ヌクレオチド誘導体:ATP・ADP・AMP・アデノシン、2)トリプトファン誘導体:キヌレン酸・キサンツレン酸・シンナバリン酸、3)アミノ酸:L-グルタミン酸・D-セリン以上、9種の化学伝達物質が、グリア伝達物質として確定された。サイトカインの上記グリア伝達物質遊離に対する効果を検討したが、グリア伝達物質遊離が増加しており、少なくともAMPA型グルタミン酸受容体が関与する可能性が指摘可能であった。また、このサイトカインによるグリア伝達物質遊離増加は、急性投与と慢性投与で特徴が異なることから、多様なサイトカインの作用機序を示唆する物であった。抗精神病薬、抗てんかん薬のグリア伝達に対する効果を検討し、サイトカインとの相互作用も検証を開始している。グリア伝達物質の探索と、グリア細胞の開口分泌機構解析は当初の計画以上に進展している。抗精神病薬・抗うつ薬・抗てんかん薬・認知症治療薬のグリア伝達物質遊離に対する効果の検討にも着手し、既にスクリーニングは終了していることから、各種薬剤のグリア伝達物質遊離に対する効果の詳細な検討は達成可能である。ナトリウムチャネル非感受性+ SNAREタンパク質感受性の物質の中で、アストロサイトのアコニターゼ阻害薬であるフルオロクエン酸によって遊離が減少した物質としては、1)ヌクレオチド誘導体:ATP・ADP・AMP・アデノシン2)トリプトファン誘導体:キヌレン酸・キサンツレン酸・シンナバリン酸3)アミノ酸:L-グルタミン酸・D-セリン以上、9種の化学伝達物質が、グリア伝達物質として確定された。抗精神病薬・抗うつ薬・抗てんかん薬・認知症治療薬のグリア伝達に対する効果を検討したが、病態と病態生理で予想外の結果が得られ、この想定外の結果が、単なる結果か此れまでの知見を修正する必要性を示唆する結果か、詳細な検証の必要性に迫られている。しかし、抗精神病薬・抗うつ薬・抗てんかん薬・認知症治療薬のグリア伝達物質遊離に対する効果の検討が当初の予想とは異なる結果が明らかとなり、スクリーニンのが完了に時間を要している。各種薬剤のグリア伝達物質遊離に対する効果の詳細は検討は可能である。

精製された培養アストロサイトを人工脳脊髄液に移し、人工脳脊髄液内に遊離された伝達物質を、超高速液体クロマトグラフ(蛍光検出器あるいは質量分析装置)を用いて定量した。遊離された化学物質の多くは、電位依存性ナトリウムチャネル非感受性であった。しかし、一部の物質は、SNAREタンパク質感受性であった。ナトリウムチャネル非感受性+ SNAREタンパク質感受性の物質の中で、アストロサイトのアコニターゼ阻害薬であるフルオロクエン酸によって遊離が減少した物質としては、1)ヌクレオチド誘導体:ATP・ADP・AMP・アデノシン2)トリプトファン誘導体:キヌレン酸・キサンツレン酸・シンナバリン酸3)アミノ酸:L-グルタミン酸・D-セリン以上、9種の化学伝達物質が、グリア伝達物質として確定された。サイトカインの上記グリア伝達物質遊離に対する効果を検討したが、グリア伝達物質遊離が増加しており、少なくともAMPA型グルタミン酸受容体が関与する可能性が指摘可能であった。また、このサイトカインによるグリア伝達物質遊離増加は、急性投与と慢性投与で特徴が異なることから、多様なサイトカインの作用機序を示唆する物であった。抗精神病薬・抗うつ薬・抗てんかん薬・認知症治療薬のグリア伝達に対する効果を検討した。病態と病態生理で予想外の結果が一部で得られた。しかし、この過程を解析した結果、この想定外の結は、直接的ではなく複数の分子の相互作用によって誘導された情報伝達機構の機能変化をとらえたものであった。神経とグリアでは、この分子間相互作用がことなく機序で構成されていることが明らかになりつつある。グリア伝達物質の探索と、グリア細胞の開口分泌機構解析は当初の計画通りに進展している。しかし、抗精神病薬・抗うつ薬・抗てんかん薬・認知症治療薬のグリア伝達物質遊離に対する効果の検討が当初の予想とは異なる結果が明らかとなり、この機構解析に多くの実験を要する結果となり、当初の予定と比べ、進展が遅れている。完了には更に時間を要している。各種薬剤のグリア伝達物質遊離に対する効果の詳細は検討を進めることで対応する予定である。生後01日のラット皮質からアストロサイトを分離・精製培養(2週間)し、純度95%以上の培養アストロサイトを精製した。特に、トリプトファン誘導体として、セロトニンとは異なる代謝経路で合成されるキヌレニンとその代謝産物である、キヌレン酸、キノリン酸、シンナバリン酸、キサンツレン酸は、グルタミン酸受容体感受性物質であり、多様な化学伝達特性を有することを明らかにした。また、炎症性サイトカインは、キヌレニン代謝系に対し特異的な作用を有し、てんかん病態に対し選択的影響を与え、この影響は抗てんかん薬の臨床スペクトラムと一致する作用を有していた。前頭葉は認知機能を司る重要な皮質領域であるが、皮質内制御機構と皮質外制御機構ではその作用標的が異なる可能性を取得した。
新規レーザー微細加工技術を利用した液晶ディスプレイ用の機能性拡散シートの開発

申請者が開発したレーザー微細穴あけ加工技術を応用して、これまでとは異なった新規手法で、かつ簡便に、指向性を有する拡散光を作り出すことのできる機能性拡散シートの開発を行った。具体的には、パルス幅がナノ秒の紫外線レーザーを使用し、ポリエチレンテレフタレート(PET)やポリフェニレンサルファイド(PPS)などの透明樹脂シートに貫通穴を所定の密度で形成する技術の開発を行った。本技術の実用化を前提に、100mm×100mm程度の面積に直径20μm程度のストレート孔を開口率50%であけることを目標として研究を進めてきた。そのために、Optowave社製の紫外レーザーであるAwave-355をX-Y平面内でビームを走査することが可能なワイ・イー・データ社製ガルバノメータースキャナMiramotion、ならびにシグマ光機社製のストローク300mmのマグネスケール内臓自動ステージと組み合わせて加工光学系を構築した。これによりオンザフライによる広範囲な加工が可能となった。今年度使用した集光光学系は、拡大率2倍のビームエキスパンダと焦点距離56mmのfθレンズである。レーザーの照射条件は、波長355nm、パルス周波数2kHz、パルスエネルギー100μJである。被加工材は厚さ25μmのPPSシートであり、355nm紫外レーザー光を1発(シングルショット)のみ照射して貫通孔を形成させた。孔と孔の間隔は使用する光学系の制約から20μmとした。この場合、直径6.3μmの貫通孔が形成され、出射面側での開口率は8.9%であった。この条件で縦13.0mm、横10.8mmの1ブロックを描画し、これを繰り返すことによって名刺サイズ(65mm×52mm)のサンプル加工を行った。今年度はタクトタイム(加工時間)の短縮化を目標の一つとして研究を進めてきたので、シングルショットでの加工としたが、さらなる高開口率を得るためには、当研究室が開発した裏当て材を利用したマルチショット加工を利用すればよい。ただし、これはタクトタイムの長時間化に繋がるので、開口率とショット数との間でバランスを取る必要がある。大面積を短時間で加工するために、レーザー光1ショットで貫通穴を形成するシングルショット加工での穴あけを実施した。使用した試料は厚さ25μmのポリフェニレンサルファイド(PPS)樹脂である。実験に使用したレーザーは、アドバンストオプトウェーブ社製の半導体励起固体YAGレーザー、Awave-355である。基本波長は1,064 nmであるが、非線形光学結晶により355 nmの紫外線に変換して試料に照射した。パルス幅は10 nsである。集光レンズには焦点距離56.0 mmのテレセントリックタイプのfθレンズを使用し、貫通穴の穴間隔は光学系の制約から20μmとした。パルス周波数13kHzまでは穴と穴とが重なることもなく綺麗に貫通穴が形成された。しかしパルス周波数が4kHzを超えると穴と穴とが重なり始め光を通すには不適当な品質となった。加工プログラムではパルス周波数に対応させてビーム走査速度を変化させており、どの周波数においても穴間隔は20μmの等ピッチとなっているはずであるが、入熱の影響のためか4kHz以上では乱れが発生した。パルス周波数2kHzで縦52 mm×横62 mmの大きさの拡散板を作製した。出射面側で直径7.1μmの貫通穴が形成されており、出射面側開口率は11.3%となった。透過照明により、各穴は確実に貫通しており、光が通り抜け可能なことを確認した。現状の最大の課題は、加工時間の短縮化を図ることである。ある一定の開口率のもとにおいて、穴径が微細化するほど穴ピッチを詰めなければならず、そのために加工すべき穴数が膨大なものとなる。この課題に対してはピコ秒レーザーが最適であると考えられる。ピコ秒レーザーはパルス繰り返し数が高く、パルス幅がナノ秒レーザーに比べて1000分の1以下と短いのでアブレーション効果が高く、より少ないショット数での貫通穴の形成が期待できる。従来とは異なった新規手法で、かつ簡便に、樹脂シートにストレート穴を所定の密度で形成し、指向性を有する拡散光を作り出すことのできる機能性拡散シートの開発を行った。樹脂シートには、厚さ25μmのPPS(ポリフェニレンサルファイド)シートを採用した。PPSシートは、耐熱性、高温特性に優れ、かつ高い機械的強度を持つ樹脂シートである。短パルス紫外レーザー装置として、米国Advanced Optwave Corp.社製のナノ秒レーザー、Awave355-500mW-6kを導入し、PPSシートに微細穴あけを実施した。一般的にレーザーによって開けられる貫通穴は、入射面側から出射面側に向かってすぼまっていくテーパー状となる。そしてこのテーパー穴では、高開口率を得ることはできない。高開口率のシートを得るためには、ストレートに近い貫通穴とする必要があるが、この課題に対して、当研究室で開発した裏当て加工を適用した。

裏当て加工とは、被加工材の裏面(レーザーが試料を突き抜ける面)に被加工材とは異なる材料を置き、レーザー加工を行う手法である。これにより、被加工材を突き抜けたレーザー光は裏当て材と反応し、ラジカルを含むプラズマが局部的に発生し、出射面側穴径の拡大が図られる。焦点距離108.3mmの集光レンズを使用し、グリセリンを裏当て材として、PPSシートに紫外レーザー光を照射した結果、入射面側直径で14.8μm、出射面側直径で14.1μmの貫通穴を形成できた。この場合、穴ピッチが20μmであったので、出射面側開口率として44.7%の値となる。ガルバノメータースキャナとX-Y軸自動ステージとを組み合わせて加工光学系を構築したことによる広範囲の加工が実現可能となったこと、シングルショットで被加工材の貫通加工ができこと、合わせて直径10μm以下の孔径があいたことは、おおいなる研究の進展である。しかしながらシングルショットの加工では、目標とする開口率を得ることができないこともわかり、マルチショットへの移行が必要であるとの認識を得た。科学研究費補助金が2回に分けて入金されたこと、合わせて短パルス紫外レーザー装置の納入に時間がかかったことなどにより、研究は当初遅れ気味であった。しかしながらこれまで積んできた経験によるスムーズな実験計画と、代替機によるデータ採取を行うことにより、最終的にはほぼ計画通りの研究を進めることができた。年度当初の10mm×10mm程度の小面積に直径5020μmのストレート穴を開口率50%であけることという目標に対して、直径14μmの貫通穴を開口率44.7%であけることに成功している。高開口率を得るためにマルチショット加工で研究を進める。ただし、マルチショット加工はタクトタイムの長時間化に繋がるので、開口率とショット数との間でバランスを取りながら、研究を進める必要がある。昨年度導入した短パルス紫外レーザー装置をガルバノメータースキャナと組み合わせて加工光学系を構築する。ガルバノメータースキャナは、ミラーを高速、高精度に駆動させ、光を走査、位置決めするという装置であり、加工領域の大面積化を可能とする。そして、本技術の実用化を前提に、100mm×100mm程度の面積に直径5020μmのストレート孔を開口率50%であけることを目標とする。またレーザー加工後の試料観察に使用しているデジタルマイクロスコープが故障したので、その修理費に充てる。ガルバノメータースキャナで描画できる加工領域は50mm×50mm程度であるので、大面積(たとえば100mm×100mmの領域)を加工するためには、試料を設置するステージも可動式とする必要がある。そこで次年度では、X-Y軸自動ステージを導入し、ガルバノメータースキャナと組み合わせて大面積の加工を可能とする。
細胞の増殖と分化におけるMARE依存的転写制御の役割

本研究では、MARE依存的た転写制御の多様性とダイナミックな変動のメカニズムを明らかにすることを通して、細胞のがん化とその進展におけるNrf2-小Mafの貢献を明らかにすることを目的とする。本研究において、幅広い悪性腫瘍で増殖促進因子として働くことが報告されているosteopontinが、ヒト肺癌細胞株においてNrf2の直接の標的遺伝子であることを確認した。これはNrf2か癌細胞の増殖を促進している機序の一端を説明している可能性が高い。(1)巨核球をモデル系とした細胞増殖から細胞死へのスイッチング機構の解析マウス巨核球の初代培養を用いた実験系において、細胞の増殖と核内分裂により巨核球数の増加と大型化がおこる分化前期にはNrf2が機能して細胞の生存を有利にしており、血小板形成のために細胞死の一形態である胞体突起形成を起こす分化後期にはNrf2に代わりp45が機能するとことを示した。Nrf2欠損マウスでは、初代培養で得られる巨核球数が減少し、恒常的なNrf2の活性化がおこっているKeap1欠損マウスでは、幼若な巨核球が増加する。一方、p45欠損マウスの場合は、巨核球数が減少すると同時に、その終末分化も障害されている。p45 : Keap12重欠損マウスでは、p45が欠損した状態で、Nrf2が恒常的に活性化している。このマウスの初代培養では、得られる巨核球数の減少は回復し、ほぼ正常の数の巨核球が得られた。しかし、巨核球の終末分化は、障害されたままであった。このことから、巨核球の分化初期では、Nrf2とp45が協調的に作用してその増殖を促進するが、分化後期では、Nrf2が代償できないp45固有の機能が必須になると考えられる。(2)細胞増殖と分化における酸化ストレスとMARE依存的転写制御の役割の検討p45欠損マウスの巨核球では、抗酸化蛋白質の発現上昇に加えて、細胞内の活性酸素種の蓄積が減少している。p45が巨核球分化後期にNrf2を競合的に抑制し、活性酸素種を蓄積することを、p45 : Nrf22重欠損マウスの巨核球の解析から明らかにした。また、NACが巨核球分化を抑制することを見いだした。これらより、p45が巨核球分化後期にNrf2を競合的に抑制し、活性酸素種を蓄積することが、巨核球分化を推進するものと考えられた。
外傷、手術後の関節拘縮発症機序の分子生物学的解明と治療法の開発

【目的】関節拘縮は関節外傷や手術後に頻発し、治療に難渋する合併症であるがその発生機序は不明で、治療法も確立していない。本研究の目的は関節線維化の機序を明らかとし、治療法の確立に役立てることである。【方法】前十字靭帯損傷後5日から10カ月経過した26膝より靭帯再建時に膝蓋下脂肪体滑膜を採取し、線維化に関係するサイトカイン(PDGF-Β,TGF-β)の発現と局在を検討した。次に時下膝蓋により前十字靭帯を再建したPT群12例、半腱様筋、薄筋腱を使用しtST群14例より再建時に膝蓋下脂肪体滑膜を採取し、HE染色、Sirius red染色による線維化の程度と推移を検討し、臨床成績との関係も検討した。【結果】組織学的検討から前十字靭帯損傷後の膝関節滑膜は経時的に線維化することが明らかとなった。検索した全期間に於いてPDGF-ΒとTGF-βは線維化が進行していると考えられる部位の線維芽細胞に認められ、線維化の進行との関連が示唆された。前十字靭帯再建術の前後の滑膜の組織学的検討では、術後広範に線維化が進行し、Sirius red染色では線維化した部位に一致して多量のcollagenが沈着していることが明らかとなった。再建術で採取時に膝蓋下脂肪体滑膜を損傷する可能性のあるPT群ではその可能性のないST群と比較して線維化の進行を認めた。運動時の疼痛を訴える例に於いては有位に線維化が進行し、しゃがみ込み動作に支障を感じている例では線維化が進行している傾向が認められた。【考察】以上の結果より滑膜の線維化にはこれまで研究され明らかにされてきた肝硬変や肺線維症などの線維化の機序と共通のメカニズムが働いていることが示唆された。また線維化の際産生されるPDGF-ΒとTGF-βなどサイトカインを制御することにより線維化の進行を抑制し、関節拘縮を予防することができるものと推察した。関節拘縮は全ての関節疾患に合併しうるかつ普遍的最も重篤な関節疾患である。この拘縮のメカニズムを解明するために、今年度は様々な関節疾患の患者から生検材料を採取した。比較検討のためには多くの生検材料を一定の部位から採取することが望ましいと考えられるので、生検材料は関節鏡検査を施行することの多い膝関節より採取することとし、また、膝関節のなかでも関節拘縮に深く関わると考えられている膝蓋下脂肪体部の滑膜を採取した。採取した生検材料は全て液体窒素を用いOCTコンパウンド中に包理し冷結保存した。この中から今年度は比較的均一な症例群と考えられる前十字靱帯再建術前、術後の生検材料について検索を行った。まず膝蓋下脂肪体の線維化の程度を定量化し、術前、術後での線維化の変化を明らかとした。また線維化の程度と臨床成績との関連についても検討を行なった。対象として自家膝蓋腱により前十字靱帯を再建したBTB群12例、半腱様筋腱、薄筋腱を使用したST群14例について、HE染色、Sirius Red染色を施行した。Sirius Red染色を施行したものについてはさらに色素を溶出し、その溶出液の吸光度から各切片中のコラーゲン量を求めた。

またコンピューター画像解析から各切片の面積を求め、単位組織中のコラーゲン量を算出し臨床成績との関連を検討した。膝蓋下脂肪体組織中のコラーゲン量は術前15.2±7.0、ST群29.2±8.2、BTB群29.5±18.4μg/mm3であり、前十字靱帯再建術に伴い有意に線維化が進行していた(p<0.01)。臨床成績との関連では、術後運動時の疼痛を訴える症例では有意に線維化が進行しており(p<0.05)、関節組織の線維化と疼痛との関連が示唆された。今後、採取した検体および動物モデルにより、拘縮のメカニズムについて検討を加える予定である。【目的】関節拘縮は関節外傷や手術後に頻発し、治療に難渋する合併症であるがその発生機序は不明で、治療法も確立していない。本研究の目的は関節線維化の機序を明らかとし、治療法の確立に役立てることである。【方法】前十字靱帯損傷後5日から10カ月経過した26膝より靱帯再建時に膝蓋下脂肪体滑膜を採取し、線維化に関係するサイトカン(PDGF-B、TGF-β)の発見と局在を検討した。次に自家膝蓋腱により前十字靱帯を再建したPT群12例、半腱様筋、薄筋腱を使用したST群14例より再建時に膝蓋下脂肪体滑膜を採取し、HE染色、Sirius red染色による線維化の程度と推移を検討し、臨床成績との関係も検討した。【結果】組織学的検討から前十字靱帯損傷後の膝関節滑節膜は経時的に線維化することが明らとなった。検索した全期間に於いてPDGF-BとTGF-βが発現し、TGF-βは線維化が進行していると考えられる部位の線維芽細胞に認められ、線維化の進行との関連が示唆された。前十字靱帯再建術の前後の滑膜の組織学的検討では、術後広範に線維かが進行し、Sirius red染色では線維化した部位に一致して多量のcollagenが沈着していることが明らかになった。再建術で採取時に膝蓋下脂肪体滑膜を損傷する可能性のあるPT群ではその可能性のないST群と比較して線維化の進行を認めた。運動時の疼痛を訴える例に於いては有位に線維化が進行し、しゃがみ込み動作に支障を感じている例では線維化が進行している傾向が認められた。【考察】以上の結果より滑膜の線維化にはこれまで研究されてきた肝硬変や肺線維症などの線維化の機序と共通のメカニズムが働いていることが示唆された。また線維化の際産生されるPDGF-BとTGF-βなどのサイトカンを制御することにより線維化の進行を抑制し、関節拘縮を予防することができるものと推察した。
海洋鉛直微細構造と植物プランクトン挙動との相関を用いた内湾環境の診断評価

平成17年9月15日に沖縄県八重山諸島石垣島沖合において収集した、流速が50cm/sを超える強い沿岸流の影響下で、漂流ブイに沿って30分ごとに3時間、水深100m以浅で繰り返し収集した海洋鉛直微細構造データの解析を行った。鉛直微細構造から求められたエネルギー逸散率の時系列と水温鉛直分布の変化、ならびに八重山諸島の風向風速の対応関係から、風による混合を受けて日混合層が厚みを増し、かつ日射による加熱をうけて日混合層の水温が上昇するという現象が得られた。また、得られたエネルギー逸散率の値は瀬戸内海でこれまで収集した値よりも1桁以上小さかった。これらの結果は、強い沿岸流の表層でも主たる日混合層の拡大は風によることを示しており、貴重な研究成果であると考えられたので、水工学論文集で発表した。今後は、表層混合層に与えられた熱エネルギー、風による混合エネルギー、強い表層流の鉛直シアが与える乱れエネルギーの大きさを比較し、より定量的な考察を進める予定である。なお、平成18年7月4日と5日に、平成17年度観測時よりも陸岸の影響をより受けにくい沖合の観測点などで日混合層中の海洋鉛直微細構造データを繰り返し取得し、成層強度と風向きが異なる新しいデータセットを得たので、前年度データと共に解析を進めている.広島湾、三重県英虞湾、沖縄県石垣島で収集した水平流速の鉛直シア、水温、塩分およびクロロフィル蛍光強度のデータを解析し、瀬戸内海や内湾から外洋的な八重山諸島沖までの幅広い環境下における鉛直混合強度などの微細構造に関して現在解析を進めているところである。1.計測方法の完成大深度を有する海域の表層混合だけをとらえるために,自由浮上型鉛直微細構造測定装置による観測方法を考案した.通常,本装置は水深100m以浅の海底に着底させ自動切り離し装置で錘を切り離して自由浮上を開始させるが,ここでは錘切り離し装置と測器回収用のケブラーワイヤーとの接続を工夫し,海底に着底しなくても中層の水深100m程度から自由浮上を開始できるようにした.この方法で取得したデータを解析したところ風による表層鉛直混合の様子がよく捉えられており,本方法の安定性と有用性が確認できた.2.鉛直微細構造と植物プランクトン鉛直分布との相関性自由落下型鉛直微細構造測定装置を用いて,広島湾の固定観測点で2005年7月27日から28日に20時間連続測定を実施し,水平流速の鉛直シア,水温,塩分,クロロフィル蛍光強度ならびに濁度の微細構造を取得した.また,上層と中層で採水して植物プランクトンの種類と細胞数およびクロロフィルαの分析を行った.このほか,複数の藻類に対するクロロフィルαが一度に観測できる蛍光強度計を併用して,植物プランクトン鉛直分布のデータを取得した.現在,これらのデータをとりまとめて微細構造と植物プランクトン鉛直分布の相関について解析中である.また,三重県英虞湾で取得した鉛直混合強度のデータを整理した.その結果,鉛直方向の鉛直渦動拡散係数Kzの平均値は10^<-5>m^2s^<-1>から10^<-2>m^2s^<-1>であり,湾口部で高く,湾奥部で小さかった.また,湾口部と湾奥部のエネルギー逸散率を比較したところ,やや湾口部が高い程度であった.しかし,成層強度を示すバイサラ周波数の二乗N^2は,Kzが最大だった湾口部よりも湾奥部で強いという結果が得られた.したがって,観測期間中の英虞湾湾奥部の強い成層が,湾奥部でKzが小さかった原因と考えられた.平成17年9月15日に沖縄県八重山諸島石垣島沖合において収集した、流速が50cm/sを超える強い沿岸流の影響下で、漂流ブイに沿って30分ごとに3時間、水深100m以浅で繰り返し収集した海洋鉛直微細構造データの解析を行った。
DNA単鎖切断の細胞応答

我々は、以前に、紫外線損傷の殆どを認識してその直ぐ5'側に3'-OHとなるニックを入れる全く新しい酵素を、アカパンカビ、分裂酵母、枯草菌などから発見し、その酵素をUV Damage Endonuclease(UVDE)と名付けた。この酵素は、ヌクレオチド除去修復でも塩基除去修復でもない第3番目の除去修復を行い、Alternative Excision Repairと呼ばれている。この研究では、まずUVDEの機能解析を行い、この酵素が、種々の紫外線損傷のみならず、活性酸素により生じる塩基の無いサイトも認識してその直ぐ3'側に3'-OHを作るAPエンドヌクレアーゼでもある事を発見した。この遺伝子をヒト細胞に導入して発現させると、ヌクレオチド除去修復の欠損の色素性乾皮症の細胞をほぼ正常細胞なみに紫外線抵抗性にすることから、ヒト細胞でも、UVDEによって導入された3'OHから効果的な単鎖切断の修復が働くことを示している。このヒト細胞は、これまでに生化学的手段や試験管の中で解析されてきた単鎖切断に対するヒト細胞の修復を含めた応答反応を解析するのに最適である。この細胞実験系を用い、さらに、ヒト細胞の核の一部にのみ単鎖切断を導入する方法を導入し、生きたヒト細胞が単鎖切断にどのように反応するかを可視化することに成功した。その結果、単鎖切断の箇所に、PARPが活性化され、それによりXRCC1が来て始まる修復のプロセスと、それとは独立したPCNA依存の径路が同時に働くことが分かった。これらの成果は、通常のゲノム不安定性がどのようにして防がれているかを初めて示したものと評価される。単鎖DNA切断により修復が始まる酵素として我々はUVE(UV Damage Endonuclease)の機能解析とヒト細胞へ導入してその働きによる細胞応答を調べてきた。いずれの研究に於いても、大変重要な発見をした。まず、UVDEは紫外線により生じる6-4光産物を最も効率よく修復するがシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)とDewar型損傷も切り、さらに驚いたことには活性酸素で生じるAPサイトやブレオマイシンなどで生じる単鎖切断の3'側の修復も行うことが分かり、生物で見つかった第3番目のAPエンドヌクレアーゼであることが明らかになった。この蛋白は生物にとって最大の脅威である致死的なDNA損傷を生み出す紫外線と活性酸素による損傷を、単独で修復する唯一の蛋白であることが分かった。この遺伝子を紫外線損傷のヌクレオチド除去修復の出来ないヒトのXPA細胞に導入すると細胞は、ほぼ野生型の紫外線抵抗性となる。すなわち、単鎖切断の経路による紫外線損傷修復がヒト細胞でちゃんと働くということを示した。現在この修復経路がどのようなものかを、分子レベルで解析している。この研究は最も多いDNA損傷であるがその修復経路の全く分かっていない単鎖切断がヒト細胞で如何に修復され、どういう影響を細胞にもたらされるかを明らかにするいい材料である。この遺伝子はこれまでに真核細胞から二種、バクテリアから二種見つかっていて、それらのあいだで保存されている塩基及び酸性アミノ酸の置換を行い、活性に重要なアミノ酸残基を同定した。これにより多様な機能を持ったこの酵素の作用機構が解明される方向に進んだ。DNA単鎖切断は、DNAに生じる損傷の内最も頻度の高いものの一つで、複製を経て二本鎖切断をもたらすことが知られている重要な損傷である。しかし、DNAに単鎖切断のみを起す方法はなく、どのように修復されるのかについては良く知られていない。我々は、紫外線で生じる二つの主な損傷であるピリミジン二量体と6-4光産物のいずれをも認識してそのすぐ5'側に3'-OHを残す様にニックを入れる酵素とその遺伝子を真核微生物で見つけUVDEと名付けた。今年度は、(1)この蛋白が、紫外線のみならず、活性酸素で生じる塩基を失った部位(APサイト)をも切る活性を持つAPエンドヌクレアーゼであることを見つけた。

UVDEは生命にとって最も危険なDNA損傷をもたらす紫外線と活性酸素の両方が生み出すメジャーな損傷を全て修復することの出来る修復酵素であることが明かとなった。(2)この酵素を持つ分裂酵母の種々のDNA修復欠損及びUVDE欠損細胞を遺伝的に解析して、UVDEが始める除去修復がどの生物も持っているヌクレオチド除去修復と役割を分担して、分裂酵母の大変高い紫外線抵抗性を生み出している事を明らかにした。すなわち、UVDEは素早くゲノム全体の修復を行い、とりわけ、細胞が増殖している時は、この修復の効果が大きい。ヌクレオチド除去修復のする、転写鎖に生じた損傷を修復する転写依存修復をUVDEは出来ない。(3)この遺伝子をヒト細胞でヌクレオチド除去修復の欠損細胞に導入したら、果たしてその細胞は野生株と同じ程度の紫外線抵抗性を示し、この修復がヒトでも機能することを証明した。ゲノム不安定や細胞死のそもそもの原因と考えられている塩基損傷や単鎖切断の修復ネットワークとその欠損による影響を解析する為に、紫外線損傷の5'側にニックを入れるUVDEをヒトXPA細胞で発現させ、紫外線照射によるニックがPARP及びXRCC1依存的に修復されることを示した。紫外線照射により直ちに(30秒後)にはPARPの活性化がおき、3-アミドベンザマイド(3-AB)を処理すると細胞は紫外線感受性となった。XRCC1欠損CHO細胞にUVDEを導入すると、紫外線に高感受性となり、その感受性は3-ABの添加により殆ど昂進しなかった。このことは、PARPの機能がXRCC1の機能に含まれることを示唆している。ニックに伴い発現する遺伝子をDNAチップを用いて解析し、単鎖切断の細胞レスポンスを調べつつある。最も致死的な塩基損傷と考えられているチミングリコールを取り除くグリコシラーゼであるマウスNTH1のノックアウト個体を作成した。マウスは外見上異常がなく、mNth1遺伝子の欠損は他の修復系でバックアップされている可能性がある。現在、その細胞、個体への影響を解析中である。このマウスとOgg1やXpa及びCsb遺伝子などのの欠損マウスとのクロスを行いそれらのダブルノックアウトマウスを作成中である。これらのマウスの解析により、活性酸素によるピリミジン塩基の損傷の影響を個体レベルで観察できる実験系が確立される。
Ｇｒａｐｈｉｃａｌ　Ｕｓｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅの操作改善の手法構築および評価

本課題の目的は,コンピュータ操作における作業効率を改善するためのシステムを開発し,またその評価指標となる操作性能モデルを構築することであった.当該年度は特に,基礎であるモデル構築については学会発表,応用であるシステム開発についてはプログラム実装に取り組むのを主な研究実施計画にしていた.まず「ステアリングの法則」と呼ばれる操作モデルの改善を試みた.これは細長い経路からはみ出さないようにストロークを描く操作(たとえば,ペンタブレット上において絵の細かい部分を塗りつぶす作業など)の効率を評価するための指標である.本課題では,経路が徐々に狭くなったり,あるいは経路に繋ぎ目があったりしても,操作性能をより正確に求められるようなモデル修正を行った.これによってモデルの一般性が増し,従来は妥当な評価が不可能だった作業の効率も求められるようになった.この研究成果は国際的に認められており,当該分野のトップ国際会議であるACM CHIでフルペーパーを発表した.また,作業効率を改善するためのシステム開発にも取り組んでおり,自由曲線を描いて複数のオブジェクトを囲む操作(ラッソと呼ばれる)の作業時間を短縮するためのシステムを開発している.このシステムは,ユーザが描きたいと考えているであろう部分の曲線を予測することで,ユーザの作業を割愛できるアルゴリズムを搭載している.このシステムについては現在,国際会議に向けて論文を執筆中である.以上のように,研究実施計画に照らして,基礎研究については世界トップレベルの重要な会議での発表に至っており,また応用研究についてもプログラム開発を終えており,理想的な実績をあげられたと考えている.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。当該度目における当初の目標は,コンピュータにおけるグラフィカルユーザインタフェースを快適に操作するためのシステム構築と,ユーザ実験による操作性の評価であった.この目標に対して,本特別研究員の具体的な取り組みは以下の2点であった.(1)既存のインタフェースにおける操作性を評価するための基礎的な実験:広く使われているインタフェースに不便な箇所はあるか,またユーザは普段どのようにコンピュータを操作しているのかを明らかにする.(2)操作を改善するためのプログラム実装と,どの程度改善できたかをユーザ実験で検証:前項(1)の調査結果を基に,コンピュータを快適に操作できるようになる支援システムを実装する.また,実装したシステムによってどの程度操作が改善できたかを少人数・短時間の実験で検証する.これらの取り組みのうち,(1)の基礎調査に関する研究成果は,査読付き学術論文誌が2件,研究分野におけるトップ国際会議(採択率23%)での口頭発表が1件採択されている.また(2)の操作改善に関する研究成果は,査読付き学術論文誌に1件採録されている.やや基礎調査に関する成果が多く,発展的なシステム構築は多くないのが現状である.しかしながら,これは多くの支援システムを実装するよりも,基礎的な調査実験の重要性を研究遂行中に見出したためである.特に,ペンコンピューティングの操作効率を評価するモデルである「ステアリングの法則」の改善版を提案した研究論文は国際的に高い評価を得ており,初年度において基礎研究に重きを置いたことで重要な知見が得られたため,ポジティブな方向修正であったと考えている.本特別研究員の研究目標は,コンピュータにおけるグラフィカルユーザインタフェースを快適に操作するためのシステム構築と,ユーザ実験による操作性の評価であった.具体的な取り組みとして,(1)既存のインタフェースにおける操作性を評価するための基礎的な実験(2)操作を改善するためのプログラム実装と,どの程度改善できたかをユーザ実験で検証の2点を挙げている.これらのうち,(1)に関する査読付き学術論文誌が2件,研究分野におけるトップの国際会議での口頭発表が1件採択,また(2)に関する査読付き学術論文誌が1件採録されている.基礎調査に関する研究成果に若干偏っているが,これは当初の計画(便利なシステムを多く実装する)よりも,むしろ基礎的な調査実験を重視して研究を進めるべきだと判断したためである.平成26年度に立案した研究計画からは若干の方向修正があるものの,その修正をするに見合うだけの業績は上げている.これは当初の計画に含まれていなかった「期待以上の進展」と評価できる.一方で,操作効率を向上させるシステムのプログラム開発は当所の計画から若干遅れているため,全体として「おおむね順調に進展している」と評価できる.本課題の目的は,コンピュータ操作における作業効率を改善するためのシステムを開発し,またその評価指標となる操作性能モデルを構築することであった.当該年度は特に,基礎であるモデル構築については学会発表,応用であるシステム開発についてはプログラム実装に取り組むのを主な研究実施計画にしていた.まず「ステアリングの法則」と呼ばれる操作モデルの改善を試みた.これは細長い経路からはみ出さないようにストロークを描く操作(たとえば,ペンタブレット上において絵の細かい部分を塗りつぶす作業など)の効率を評価するための指標である.本課題では,経路が徐々に狭くなったり,あるいは経路に繋ぎ目があったりしても,操作性能をより正確に求められるようなモデル修正を行った.これによってモデルの一般性が増し,従来は妥当な評価が不可能だった作業の効率も求められるようになった.この研究成果は国際的に認められており,当該分野のトップ国際会議であるACM CHIでフルペーパーを発表した.また,作業効率を改善するためのシステム開発にも取り組んでおり,自由曲線を描いて複数のオブジェクトを囲む操作(ラッソと呼ばれる)の作業時間を短縮するためのシステムを開発している.

このシステムは,ユーザが描きたいと考えているであろう部分の曲線を予測することで,ユーザの作業を割愛できるアルゴリズムを搭載している.このシステムについては現在,国際会議に向けて論文を執筆中である.以上のように,研究実施計画に照らして,基礎研究については世界トップレベルの重要な会議での発表に至っており,また応用研究についてもプログラム開発を終えており,理想的な実績をあげられたと考えている.基礎研究は当所の計画以上の進展があり,継続的に取り組むことで順調に遂行できると考えている.一方で,発展的な研究(操作効率向上のためのシステム開発)の進捗が少々遅れているため,次年度はそちらにも重点を置きつつ,他の研究者たちとの共同研究も視野に入れて取り組み,研究の遂行ペースを上げていきたい.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
強相関f電子系ペルチェ素子の低次元アモルファス化による熱伝導率低減

本研究では、単相の高純度・高密度のYbAl_3焼結体を作製し、その熱電特性を明らかにするとともに、YbサイトをTm、Luで置換した際の熱電特性に及ぼす影響を調べた。また、B、In、Cu、Agを添加し、Alサイトに置換可能な元素を探索するとともに、その際の熱電特性に及ぼす影響を調べた。高周波溶解によって作製した目的組成のインゴットを粉砕後、2472h、高純度Ar中または真空中で熱処理を行い、さらに未反応で残留しているAlを溶解除去するために1M NaOH水溶液で洗浄した。得られた粉末を、Ar雰囲気中、31.2MPa、1123Kでホットプレスすることにより焼結体を作製した。相の同定および格子定数の測定にはXRDを用いた。起電力と温度差の関係からゼーベック係数(α)、直流四端子法により電気抵抗率(ρ)、レーザーフラッシュ法により熱伝導率(κ)を測定した。本研究で作製した高純度・高密度のYbAl_3のρは、固相反応法およびアーク溶解法で作製された試料の文献値とほぼ一致したが、αの絶対値(|α|)は、Fig.1に示したように、文献値とは異なり、温度の低下とともに増加し、108Kで116μVK^<-1>であった。出力因子(α^2ρ^<-1>)は温度の低下とともに増加し、118Kで797×10^<-4>Wm^<-1>K^<-2>に達した。この値は本化合物における従来の報告値の3.5倍であり、実用化されているBi_2Te_3の17倍であった。YbAl_3のκについては本研究でその温度依存性を初めて明らかにした。ρ、α、κの値から求めたZTは温度の低下とともに増加し、307Kで0.29であった。YbサイトにTm、Luを置換したYb_<1-x>Tm_xAl_3、Yb_<1-x>Lu_xAl_3(x=0.1、0.3)のρ、|α|は、YbAl_3単相の値と比べて小さく、置換量の増加とともに減少した。これは、Yb^<3+>の4f^<13>準位による伝導電子の散乱が置換により減少したためであると考えられる。Alサイトが置換したYbAl_<2.95>M_<0.05>(M:B、In、Cu、Ag)の合成を試みたが、B、Cu、Agの置換は確認されなかった。Inを添加した場合にはAlサイトへの置換が示唆された。YbAl_<2.95>In_<0.05>のρはYbAl_3単相の値とほぼ一致したが、|α|はYbAl_3の値より小さかった。Alサイトが置換したYbAl_<2.95>M_<0.05

>(M:B、In、Cu、Ag)の合成を試みたが、B、Cu、Agの置換は確認されなかった。Inを添加した場合にはAlサイトへの置換が示唆された。YbAl_<2.95>In_<0.05>のρはYbAl_3単相の値とほぼ一致したが、|α|はYbAl_3の値より小さかった。塊状Ybおよび板状Alを原料とし、YbとAlの比が1:2.Oから1:2.4の間で混合した。混合試料をアルゴン中で980°C、3時間溶融を行った。溶融試料を凝固させた後、850°C、12時間、真空中で熱処理を行い、Yb-Al化合物バルク体を作製した。Yb : Alの出発組成が1:2.OではYbAl_2が、Yb : Alの出発組成が1:2.4ではAlが第二相として混在した。Yb:Alの出発組成が1:2.2では、YbAl_3単相が得られた。単相YbAl_3バルクをYb : Alの比を1:2.2として混合、溶融することにより作製し、得られたYbAl_3バルク体を粉砕後、スパークプラズマ焼結により直径5cm、厚さ2mmのディスク状に成型し、スパッタリング用ターゲットとした。キャリアーガスにはAr(99.9999%up)ガスを導入し、スパッタリング圧力はO.5Pa、投入電力は50100W、基板温度は室温とし、基板には石英基板およびアルミナ基板を用いた。得られたYb-Al膜の構造を、XRD測定により評価した。2θが20゚および30゚付近を中心とするなだらかな2つのピークを持つ、非晶質構造に特有なハロー図形が得られた。また、SEMにより、得られたYb-Al膜は平坦で緻密であった。レーザーピット法によりYb-A1膜の熱伝導度を測定したところ、6.76W/K^2mであった。この値は、バルクの値の約1/3で、アモルファス化することにより、Yb-Al膜の熱伝導度を下げることが出来た。得られたYb-Al膜の組成をEPMAで測定した所、Yb : Alはほぼ1:3となっており、ターゲットとの組成ずれはほとんど見られなかった。Yb-Al膜の比抵抗は4.5×10^<-4>Ω・cmと文献値に近い値であったが、ゼーベック係数は-3.4μV/Kと文献値よりかなり小さかった。本研究では、YbAl_3バルク体について組成ずれによる熱電特性の影響を調べ、RFマグネトロンスパッタにより熱電特性の高いYb-Al系金属間化合物薄膜の作製を試みた。溶解法によるYbAl_3単相の作製では、溶解および熱処理によりYbAl_3単相試料の作製に成功した。さらに、YbとAlの比を変化させて、化学量論組成からのずれが、熱電特性に与える影響について検討した。Yb過剰試料ではYbAl_2相が生成し、Al過剰試料ではAl相が生成したが、YbAl_3の格子定数は文献値とほぼ一致し、YbAl_3は化学量論的な組成を有している。YbAl_2混相試料では、YbAl_3単相と比較してゼーベック係数は若干小さくなり、Al混相試料では、ゼーベック係数は著しく低下した。溶解法によって作製したYbAl_3単相試料をターゲットとして、スパッタ法による薄膜試料を作製した。膜組成はYb : Al=1:2.82で、均一な平滑膜が得られた。膜は非晶質であり、熱電性能は低かったが、非晶質膜をAr中、923Kで熱処理することによって、結晶質のYbAl_3膜が得られた。YbAl_3結晶膜のゼーベック係数は、室温で-33μV/Kであった。温度の低下ともに絶対値は増加し、YbAl_3バルク体と同様の傾向を示した。出力因子は9.6×10^<-6>W/m/K^2であった。以上の結果から、本研究ではYbAl_3単相をターゲットとしてRFマグネトロンスパッタにより薄膜作製を行いAr雰囲気で熱処理を行うことにより、YbAl_3結晶薄膜を作製することに初めて成功した。
G1期抑制因子による感覚細胞の長期生存維持メカニズム解析

G1期の抑制は神経細胞の分化過程における細胞増殖と分化の制御を行ない、様々な疾患の発症にも関わっていると考えられている。本研究ではG1期の制御にかかわるショウジョウバエebiの機構を解明することにより、G1期抑制の役割を明確にすることを目的としている。本年度の成果としてはEbiによるポリコーム群の制御メカニズム解析からEbiによるポリコーム群の機能調節メカニズムの一部が明らかになった。Ebiと細胞内で複合体を形成する因子を生化学的に検索した結果、シャペロン分子であるHsc70との複合体形成が確認された。Hsc70はポリコーム群の構成分子の一つであることから、EbiはHsc70の機能調節を介してポリコーム群の標的遺伝子へのリクルートメントに働いていることを突き止めた(津田、投稿準備中)。さらに、Ebiがどのように感覚細胞の生存維持に働いているのかを詳細に解析した結果、Ebiはアポトーシスの実行因子であるCaspaseの阻害因子(IAP)の機能を抑制するPro-apoptotic遺伝子群の発現を直接抑制することにより細胞死を調節していることが解ってきた(PLoS ONE,in press)。Ebiの発現はフィードバック制御によりポリコーム群の調節を受ける事から、感覚細胞の生存維持にストレス応答とエピジェネティック制御間の恒常性の維持が関わっていることを予想している(津田、投稿準備中)。超高齢化社会に移行しつつある我が国において加齢性難聴を始めとした老人性難聴の患者は急激に増加している。本研究により明らかになってきた発症メカニズムに基づいて予防・治療薬が開発されることを期待している。当初予定していたEbiとポリコーム群との関係に関する研究は、順調に進んだと思われるが、他に計画したEbiによるエネルギー代謝の研究はあまり進展できなかった。Ebiによる感覚細胞の生存維持メカニズムが詳しく解って来たことから、その解析に時間がかかったことが主な理由として考えられる。本研究により転写コリプレッサー複合体とエピジェネティックな制御機構との関係が解ってきたので、今後はこれらの機能間における調節がどのようなメカニズムで制御されているのかを明らかにしていきたい。その一つとして、Ebi変異におけるエネルギー代謝変化の要因が転写コリプレッサー複合体とエピジェネティックな制御機構が関わっていることを予想している。今後は、これらの機構を詳しく調べる事により恒常性維持におけるエピジェネティックな遺伝子発現制御の役割を明らかにしたい。細胞周期のG1期制御に関わる因子は進行性の難聴原因因子としても同定されていることから、G1期制御と感覚細胞の生存維持との関係が示唆されている。本研究ではG1期制御に関わることが予想ざれているショウジョウバエebiによる感覚細胞の生存維持メカニズムの解明を目指して研究を行っている。これまでの研究でebiの機能が光受容細胞の長期生存維持に働いそいることを明らかにしている。平成22年度の成果(1)これまでの研究からEbiはAP-1と複合体を形成して転写コリプレッサー複合体として機能していることが示唆されていた。本年度の解析ではEbi/AP-1の標的遺伝子で細胞の生存維持に働く因子としてアポトーシス関連遺伝子であるhidを見いだした。詳しい解析から、Ebi/AP-1はhidのプロモーター領域に存在するAP-1結合サイトを介してhidの発現を抑制していることを見いだした。Ebiの機能欠損では、加齢にともなってhidの発現が上昇してくることから、Ebi/AP-1はhidの発現を抑制することにより感覚細胞の生存維持を制御していることが予想される。(2)加齢とebiの機能との関係を解析して、加齢にともなったEbi/AP-1リプレッサーの活性が減少していることを突き止めた。Ebiのプロモーター領域を詳しく調べることによりebiの発現抑制にポリコーム群(PcG)が働いていることを見いだした。今後、ebiとPcGとの関係をさらに追求していきたい。

当初予定していたEbiとポリコーム群との関係に関する研究は、順調に進んだと思われるが、他に計画したEbiによるエネルギー代謝の研究はあまり進展できなかった。Ebiによる感覚細胞の生存維持メカニズムが詳しく解って来たことから、その解析に時間がかかったことが主な理由として考えられる。本研究により転写コリプレッサー複合体とエピジェネティックな制御機構との関係が解ってきたので、今後はこれらの機能間における調節がどのようなメカニズムで制御されているのかを明らかにしていきたい。その一つとして、Ebi変異におけるエネルギー代謝変化の要因が転写コリプレッサー複合体とエピジェネティックな制御機構が関わっていることを予想している。今後は、これらの機構を詳しく調べる事により恒常性維持におけるエピジェネティックな遺伝子発現制御の役割を明らかにしたい。
フランスガモ膵臓の成長ホルモンの発現作用機序と遺伝子の塩基配列の決定

1.塩基配列の決定成長ホルモン(GH)・プロラクチンファミリー(PRL)のGH,PRL,胎盤性ラクトゲン(PL)そして、ソマトラクチン(SL)の9種類のプライマー(アヒル(du)GH,トリ(a)GH,ニワトリ(c)GHl,cGH2,cGH3,cPR、ウシPL,サケ(s)SLl,sSL2)を設計した。mRNAは1-2週齢のフランスカモの膵臓と下垂体から抽出して、GH様cDNAの増幅を逆転一発RT-PCR法で行った。その結果、膵臓mRNAからのGHcDNAの増幅はできなかった。しかし、下垂体mRNAからはduGH,aGH,cGHのプライマーでGHcDNAの増幅が成功した。フランスカモのGHの塩基配列はアヒルとは3個所異っており、アミノ酸配列も1個所異なっていた。2.成長ホルモン様物質の免疫組織化学法による同定フランスカモ膵臓のA細胞に局在する成長ホルモン様物質(GHL)をGH・PRLファミリーに属する抗GH、抗PRL、抗PL、抗SLの抗体を用いて免疫組織化学的に調べた。その結果、フランスカモの膵臓のA細胞はこれらの4種類の抗体にいずれも陽性だった。また、GH抗体では抗ヒトGHによく反応したが、抗ニワトリでは弱く、抗ラット、抗ウシ、抗マグロ、抗ヒツジ、抗ブタのGH抗体には反応しなかった。以上の結果よりフランスカモの膵臓のA細胞に局在するGH様物質は、GH-PRLファミリーの共通のアミノ酸配列をもつと考えられる。それゆえ、GH-PRLの祖先型のプライマーの設計やGH・PRLファミリーの共通のプライマーなどの設計が必要と考えられる。フランスカモ膵臓内の成長ホルモン様物質の濃度と成長ホルモン分泌細胞の微細構造について調べた。また、成長ホルモン分泌細胞の動態を調べるために、成長ホルモン放出因子(GRF)と甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)を若齢のフランスカモに投与し、免疫組織化学的に調べた。フランスカモの膵臓内の成長ホルモン様物質は分子量、約22,000と約45,000と推定される。また、フランスカモ膵臓内の酸抽出中の成長ホルモン様物質濃度測定法の結果では抗ウシ成長ホルモンにはほとんど反応はなかったが、抗ラット成長ホルモンに強く反応し、高値を示した。各膵葉の比較では脾葉と第3葉で高値を示した。成長のホルモン様分泌細胞はグルカゴン(A)細胞と一致することが光学顕微鏡の段階でほぼ確かめられた。また、電子顕微鏡学的に免疫二重染色法を用いた結果でも成長ホルモン様物質はA細胞の分泌顆粒に局在していた。そして、抗グルカゴンの陽性の分泌顆粒のほとんどに抗成長ホルモンの陽性の反応が観察された。しかし、一部に抗グルカゴンにのみに陽性の顆粒と抗成長ホルモンにのみに陽性の顆粒が観察された。2週齢のフランスカモにGRFおよびTRHを静注し、15分後に膵臓を摘出し、免疫組織学的、電子顕微鏡学的に調べた。光学顕微鏡学的にはGRFおよびTRHの投与によって、抗ヒト成長ホルモンの免疫組織反応は明らかに減少した。また、電子顕微鏡による観察でも、GRFおよびTRHの投与によってA細胞の分泌顆粒の急激な減少が観察された。1.塩基配列の決定プライマーはアヒルの成長ホルモン(GH)に特異的な塩基配列とニワトリとアヒルの共通の塩基配列をもとに2種類設計した。mRNAは2週齢のフランスカモの膵臓、下垂体、肝臓、筋よりBcaBest法と逆転一発法により抽出し、cDNAの増幅はRT-PCR法で行った。その結果、膵臓、肝臓、筋のmRNAからはGHcDNAの増幅はできなかった。しかし、下垂体から抽出したmRNAではGHcDNAの増幅が成功した。そして、フランスカモの下垂体のGHの塩基配列はアヒルとは2個所異っており、アミノ酸配列も2個所異なっていることがわかった。2.成長ホルモン様物質の免疫組織化学法による同定フランスカモ膵臓のA細胞に局在する成長ホルモン様物質(GHL)を成長ホルモン・プロラクチンファミリーに属する成長ホルモン、プロラクチン、ソマトラクチン、胎盤性ラクトゲンの抗体を用いて免疫組織化学的に調べた。そして、いずれの抗体も免疫組織化学的反応に差は見られなかった。以上の結果よりフランスカモの膵臓のA細胞に局在するGHLは、成長ホルモン・プロラクチンファミリーの祖先型のアミノ酸配列と塩基配列をもつ物質か、いまだ発見されていない4足型ソマトラクチン様の物質と考えられる。それゆえ、来年度は祖先型GHならびにソマトラクチンのプライマーの設計を行い、フランスカモ膵臓のGHLのmRNAの抽出と塩基配列の決定を行う予定である。同時に、フランスカモの膵臓よりGHL物質の抽出を行い、抗体を作成する。

しかし、下垂体mRNAからはduGH,aGH,cGHのプライマーでGHcDNAの増幅が成功した。フランスカモのGHの塩基配列はアヒルとは3個所異っており、アミノ酸配列も1個所異なっていた。2.成長ホルモン様物質の免疫組織化学法による同定フランスカモ膵臓のA細胞に局在する成長ホルモン様物質(GHL)をGH・PRLファミリーに属する抗GH、抗PRL、抗PL、抗SLの抗体を用いて免疫組織化学的に調べた。その結果、フランスカモの膵臓のA細胞はこれらの4種類の抗体にいずれも陽性だった。また、GH抗体では抗ヒトGHによく反応したが、抗ニワトリでは弱く、抗ラット、抗ウシ、抗マグロ、抗ヒツジ、抗ブタのGH抗体には反応しなかった。以上の結果よりフランスカモの膵臓のA細胞に局在するGH様物質は、GH-PRLファミリーの共通のアミノ酸配列をもつと考えられる。それゆえ、GH-PRLの祖先型のプライマーの設計やGH・PRLファミリーの共通のプライマーなどの設計が必要と考えられる。