hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
教育場面での規範逸脱行動を拡散する要因の検討および規範について考える授業案の開発

今のところ,小学生,中学生,小学校教員という多様な対象者から順調にデータの収集が行われた。また,質問紙やWEB調査だけでなく,コンピュータ・シミュレーションも実施された。これらの方法で収集されたデータの分析についても大きな問題なく進められている。そして,分析結果も研究計画を大きく見直す必要があるようなものは特に見られていない。これらのことから,今後も当初の計画に沿った形で進めていくことができると考えられる。また,研究成果を学会で発表するための準備も進められている。「規範逸脱行動について考える授業」については,当初の計画よりも早めに一定の成果が得られた。しかし,その一方で「授業を難しいと考えた者については,授業の効果が弱まる」といった問題も見られており,今後,改善策を検討していくことが重要であると思われる。以上のことから,全般的に円滑に研究が進められていると考えられる。したがって,進捗状況については「おおむね順調に進展している」と思われる。現在のところ,研究計画を大幅に変更する必要性を示す研究結果は見られておらず,研究遂行上,大きな支障となる事項も発生していない。このため,基本的には,当初の計画に基づいて研究を推進していくことを考えている。具体的には,昨年度収集した,中学生,小学生および小学校教員を対象とした調査データの分析を進める。また,コンピュータ・シミュレーションで使用しているモデルについても,その妥当性について,質問紙やWEB調査によるデータ等を参照しつつ検討していく。「規範逸脱行動について考える授業」については,効果測定の結果をふまえて,授業内容の説明を平易にしたり,「難しい」と感じたとしても高い効果を示すことが可能な授業となるような方策を考察していく。また,研究の進行に伴って新たに得られた知見を授業に反映させる等して,より充実した内容となるように授業案の改訂を進めていく。なお,昨年度の研究成果については,順次,学会や学術雑誌などで発表していく予定である。また,授業においても紹介するなどして,研究者以外の者も研究成果に触れることが可能なようにしていく。
在宅検診を可能とする視線揺動からの精神状態解析

本研究ではストレスなどの心因的疲労が発生したときに起こりうる生態的な変化を,視線移動,表情,カメラ型心拍変動から抽出する手法を開発した.視線の動きでは,意図的に動作させる操作と脳での判断タスクを組み合わせて,その反応時間を測る方法を開発した.表情の変化に対しては,散漫と集中時における眼と口の開き具合を特徴として捉え,時系列な解析と状態変化を推定する方法を開発した.また,ストレス指標として著名な心拍変動についてはカメラで計測する方法に挑戦した.今回の心因的疲労負荷は一時的な計算課題等による簡易的なものであるが,いずれの方法でも正常状態との差を検出できる可能性を得た.本研究の目的は,ストレスの蓄積具合が顕著に現れる生理的な特徴量の確定である.ここで,本研究成果は日常生活で使用可能であることを前提と考え,非接触・非侵襲を制約条件としている.ストレスは自律神経系の働きに大きく影響を及ぼすため,まずは,特徴量として眼球運動や表情変化そして呼吸間隔などを評価の対象とする.続いて,本研究提案では上記特徴量の検出を顕在化させる手法を確立する.眼球の動きや表情,呼吸などの生理現象は日常行動でも活動を行っているが,特定の動作を誘導した場合,自律神経系の影響が顕著に現れる可能性を持つ.また,僅かな変化でも,時系列で捉えた経時変化は確実な変化を捉える可能性がある.それ故,特徴量抽出と顕在化を組み合わせることで,今まで困難であったストレスの蓄積具合を定量化する仕組みを確立する.本年度は心拍と眼球運動に現れるストレス起因の変化に注力して研究を行った.心拍については非接触測定方法としてカメラ画像から心拍を抽出して心拍変動を捉える手法を検討した.約30秒間の測定映像から心拍を抽出することはできたが,心拍波形の検出能力が悪く,変動を正確に把握することは難しいことが判った.一方,眼球運動に対しては視線検出装置による非接触測定システムを構築し,脳の判断過程を考慮した反応時間差に着目して実験を行った.この結果,模擬的なストレスではあるが,心因的疲労が発生している場合,特定の条件で反応時間に差が生じることを明らかにした.条件としては,意識的な眼球動作(アンチサッカードタスク)とワーキングメモリを利用した判断タスクを組み合わせた場合が最も顕著であった.約10名の被験者でも確実にその変化が捉えられており,ストレス状態を把握する方法としては適していることを明らかにした本研究提案では「心の病」が自律神経のバランスの崩れから発症することに注目し,最も神経系が集中している眼球の運動緩慢検出を特徴としている.また,表情の弛緩や呼吸感覚の変化等も取り入れることにより,ストレスを確実に診断可能と考える.我々は成熟社会が乗り越えるべき先進国病に対して,世界に先駆けて予兆が可能な早期発見手法の開発を行うことを目標としている.平成27年度はストレスが大きく影響を及ぼす自律神経系の働きに着目し,眼球運動や心拍変動などの評価を行った.この結果は昨年の報告通り,自発的な視線移動の判断過程において,ストレス負荷がその判断を鈍らせることを明らかにした.これにより,テレビモニタ等で誘導的な視線移動を発生させたときの反応を測定すれば,ストレス具合を定量化できる可能性を得た.本年度(平成28年度)はストレスが行動や記憶に与える影響について検討を行った.記憶はその持続時間に応じて短期と長期に大別されるが,特に一時的な記憶である短期記憶は海馬を含む脳幹の働きに影響されることが指摘されている.そのため,短期記憶の能力を推し量ることで,間接的ではあるが,ストレス定量化できる可能性がある.一方,ストレス具合が頭部移動の有無にも関連がある可能性をH27年度で確認しているため,視線移動に伴う頭部の移動も正確に捉えることができるシステムを構築した.また,心拍変動に関しては分担者協力のもと,カメラによって非接触で計測できる手段を確立した.H28年度は主にストレスによる海馬の影響を短期記憶力で測る手法に挑戦した.ストレスが蓄積されると脳幹における“知的な"行動の制御が低下することがH27年度の研究でも明らかになっている.よってH28年度は同様に脳幹部分が司る短期記憶に着目している.外部感覚器で捉えられた刺激は直接,大脳で記憶されるわけではなく,一旦,脳幹部分,特に海馬に蓄積される,いわゆる記憶の二重貯蔵モデルが提言されている.そのため,短期記憶力を探ることでストレスとの関連が明らかになる可能性を持つ.ところが,この短期記憶力を定量的に計測する手法が確立されていない.従来から系列位置効果を用いた方法が提案されているが,個人的好みが記憶力に影響を与えやすいこと,対話形式のために1人ではなかなか行えないことが欠点と指摘されてきた.そこで本研究では視線検出装置とランダムな位置に発生する色票表示から,単独で実施可能な視覚的な系列位置検査方法を開発した.表示装置ではカテゴリカルカラーに基づく代表色を用いた色票を,色と出現位置をランダムにしながら表示することができる.被験者は順番で5色分を記憶していくが,そのときの位置と順番は視線検出装置が記録していく.3秒の空白時間の後に1つの色票の色のみを変化させたときの違いを回答してもらうが,その順番と正誤をコンピュータが読み取ることで,順番に関する記憶能力を定量化することができる.現状としては健康な被験者で従来の系列位置効果と同様の検査ができることを確認した.今後はストレス負荷をかけ,その有無で能力が変化するかを確認する.また,H28年度には頭部の動きを監視できるシステムの構築も実施した.

通常,視線移動には頭部の移動も連動して生じるが,ストレス負荷がかかると人間は最小限の動きを優先する傾向が指摘されている.そこで,視線検出時に頭部の移動量も正確に計測できるカメラシステムを構築した.本研究課題はストレスなどの心因的な疲労によって生じる生体変化を捉え,予兆に対して有益な時系列解析手法を確立することである.本年度は提案手法の時系列分析について検討を行った.本年度の題材としては人間の表情変化を取り上げ,カメラで捕らえた被験者の顔映像に対して特徴点分析した結果,目と口の開き具合が人間の心理状態,特に集中と散漫(簡易脳波計で測定したγ波)に関連があることを見出した.続いて,この両者の時系列情報を重回帰分析することで自己回帰移動平均モデルを作成した.更にはこのモデルを自己組織化マップ上に構築することで,被験者の状態が推移していく様子を予測することができ,心因的疲労などで思考が散漫になる状態を可視化することを可能とした.一方,昨年までの研究については本年度予算で論文化や国際会議での成果報告を行った.具体的には1年間に4件の国際会議,及び4件の国内発表を行うことができた.特に,本研究課題の総まとめ的な発表をIEEE(米国電気学会)で発表したことが大きな研究公開への貢献と考える.また,カメラ画像からの心拍変動計測については従来法の欠点である照明環境の変化への対応をヘモグロビン抽出手法によって解決する新たなアイデアが認められ,論文として掲載された.また,視線の反応時間検出については視覚関連で著名なOSA(米国光学会)での国際会議で発表することができ,当研究成果を広く公表することができた.本研究ではストレスなどの心因的疲労が発生したときに起こりうる生態的な変化を,視線移動,表情,カメラ型心拍変動から抽出する手法を開発した.視線の動きでは,意図的に動作させる操作と脳での判断タスクを組み合わせて,その反応時間を測る方法を開発した.表情の変化に対しては,散漫と集中時における眼と口の開き具合を特徴として捉え,時系列な解析と状態変化を推定する方法を開発した.また,ストレス指標として著名な心拍変動についてはカメラで計測する方法に挑戦した.今回の心因的疲労負荷は一時的な計算課題等による簡易的なものであるが,いずれの方法でも正常状態との差を検出できる可能性を得た.今年度は眼球運動に加えて,表情変化によるストレス定量化にも挑戦する.昨年度の結果から眼球運動のみでもストレスの状態を捉えることはできたが,ストレス量を推し量るまでは至っていない.また,条件として設定したタスクは日常生活であまり行われない動作であるため,より自然な測定条件が必要となる.そのため,眼球運動と表情の喧嘩を組み合わせることにより,ストレス量の定量化を日常的な動作の中から探る手法を検討する.本検討は計画通りであり,研究を予定通り進めることができている.いままで,眼球運動に起因する二種類のシステムと頭部の動きに関するシステムを構築したため,H29年度ではこれら異なるシステムの連携により,ストレスの定量化を推進する.課題はストレスの与え方であり,従来はクレペリン検査を行っていた.しかしながら,クリペリンはあくまでも知的能力を測る繰り返し計算課題であり,その疲労度やストレス具合が十分に考察はされていない.
電磁気学教材としての簡易電子顕微鏡製作Ⅱ

本研究では、学生に対して、電子顕微鏡の原理を解説するための簡易電子顕微鏡の製作を行った。市販の実験装置は、使いやすさが向上するとともにブラックボックス化が進んでいる。ブラックボックス化は、研究の迅速化という利点の一方で、装置の仕組みや測定原理を覆い隠してしまうため、教育機関としては望ましくない側面がある。そこで、学生たちの装置に対する理解を深めるために、単純な構造で分解や組み立てが容易に可能な装置を製作することを考えた。本研究は、装置の仕組みや測定原理と物理の基礎科目である電磁気学とのつながりを学生に意識させることを目的として、簡易電子顕微鏡を製作するものである。実際に研究で扱う実験装置の原理を学ぶことで、基礎科目の知識をより確かなものにしていくことが大学の教育としては望ましいと考え、本研究を計画した。本研究は、H28年度科研費奨励研究「電磁気学教材としての簡易電子顕微鏡製作」(奨励研究:課題番号16H00298)の継続研究である。昨年度の研究では、主に電子顕微鏡の電子線照射系及び電子レンズ系を製作し、基礎的な電磁気学の内容(静電磁場中の電荷の運動、アンペールの法則、物質の透磁率、電気回路など)の教材となるように研究を進めた。昨年度の研究に引き続き、本研究では、電子顕微鏡の制御系と検出器系を製作し、実際に走査型の電子顕微鏡として稼動させ、二次電子像を得ることを目指した。走査型の電子顕微鏡で主に必要とされる制御は、偏向コイルに流す電流を制御し、電子線を走査させることである。検出器としては、二次電子検出用のEverhart-Thornley検出器(ET検出器)の製作を製作する。ET検出器の出力信号と電子線の走査信号を同期させることによって、二次電子像を得ることを目指す。
ホルモンによるウナギの精子形成開始の分子機構;生殖細胞の分化マーカーの検索

人工飼育下のニホンウナギの精巣は、脊椎運動で唯一、精子形成をin vitro系で完全に再現することができる。この時、精子形成の開始は、生殖腺刺激ホルモン(GTH)-11-ketotestosterone-アクチビンBという経路で誘起される。今回、この精子形成の開始の分子機構を明らかにするために、精子形成の開始に伴って生殖細胞で発現の変化する遺伝子を検索することを試みた。GTH処理後、0、3日目(精原細胞が増殖し始める)の精巣組織より、poly(A)^+・RNAを調製し、サブトラクション法、RNA differential display法を用いて、発現の促進される遺伝子と抑制される遺伝子を検索した。得られた遺伝子断片をプローブにして、ノーザン解析をした結果、発現の促進されるもの、抑制されるもの、それぞれ、2、3ケの遺伝子断片を得た。この中で、発現の促進されるもの、抑制されるもの、それぞれ、2、3ケの遺伝子断片を得た。この中で、発現の促進されるもの一つ(RD3-3)をプローブとして、ウナギ精巣cDNAライブラリーをスクリーニングし、完全長のORFを含むcDNAクローンを単離した。シークエンスした結果、この遺伝子は、DEAD-box protein familyに属することが、明らかとなった。このクローンは、DEAD-box protein familyの一員であるmvh,RVLG,XVLG1とアミノ酸レベルで、約70%の相同性を示した。ノーザン解析をした結果、精巣、卵巣で発現が認められたが、脳、肝臓、心臓、頭腎などでは、発現が認められなかった。精子形成の開始に伴う、この遺伝子の発現は、精子形成の開始と共に増大し、GTH処理後、9日でピークに達した。また、in situ hybridizationを行った結果、この遺伝子の発現は、生殖細胞に限られること、精原細胞から第一次精母細胞にかけてみられることが明らかとなった。最近、この遺伝子のコードするタンパク質を特異的に認識する抗体が得られるので、現在、タンパクの局在、タンパク量の変化について検討している。
通信ネットワークを使った不登校者のための教材管理提供システムの開発

本研究では,教材管理システムを利用した地域の教育施設・家庭等での在宅教育を可能にする教材管理システムの構成,通信ネットワークを用いた教材提供を可能にした。この研究のため,次のような教育情報システムの在り方を明らかにした。(1)不登校者に適応した教育システムの調査家庭、地域社会、学校内で利用できる不登校者用の教育システムについて検討し試案を構成した。(2)教育システムの構成の検討学校,生涯学習施設,教育センター等でテレビ会議システム等を利用した学習環境を開発した。(3)不登校者用の教材等の整備不登校者に対応した個人学習を可能にする教材の整備を行うために,教育情報管理システムを開発した。(4)教材・学習支援情報のデータベース開発学習目的に応じて教材を取り出すことが可能な教材管理システムを開発した。地域,歴史,産業,文化,自然などの身近な情報が提供できる教材データベースを作成した。(5)通信ネットワークを利用した学習情報管理システムは,一つの体系化された教育情報システムが必要とされる。次のような在宅学習用のデータベースを開発した。(1)基礎基本的な学習事項を管理するデータベース,(2)地域の状況に興味・関心を高めさせる情報,(3)図書館,博物館,歴史資料館,科学館などの施設情報など(6)学習指導方法の開発検討各教材が記録されたCD-ROM等を提供し,学習が可能な教育システムとして開発した。(7)教育システムの構成家庭,学校,地域の教育施設で教材データベースを利用するには,学習ガイド用のシソーラスの開発が必要である。このため,各教材が学習に適応できるシソーラスの構成方法を開発した。平成9年度における本研究は以下のように実施した。不登校者に対する教材、学校支援情報、通信ネットワークを可能にする教材管理提供システムを,岐阜大学カリキュラム開発研究センターに不登校者用の教材資料データベース管理のための情報処理システムを設置し,次のように開発研究を進めた。(1)不登校者に適応した教育システムの調査家庭、地域社会、学校内での不登校者に対する学習支援の可能性を担当教師に調査し、不登校者の学習指導面での実態について分析し,その教育システムの在り方について検討し,そのネットワークの方法について試案を構成した。(2)教育システムの構成の検討(1)の結果をもとに、各場所での教育システムについて分析し、学校,生涯学習施設,教育センター等で学習環境の構成について検討し,そこで,必要な通信システムとして,テレビ会議システム等の利用の試案を作成した。(3)不登校者用の教材等の整備学校教育で教師による指導等と違い、不登校者に対応した個人学習を可能にする教材、学習支援情報の整備を行うために,学習情報の管理システムを構成し,データベース管理を可能にした。そこに記録管理し,学習者によって利用可能にする教材データベースの構成案を作成し,その試行を実施した。(4)教材・学習支援情報のデータベース開発(3)で整理した教材等を管理・流通できる教材管理提供装置を用いて、各不登校者が学習目的に応じて資料を取り出すことが可能な教材管理システムを開発し,不登校者の地域への関心を高めるために地域情報データベースの構成案を作成した。とくに,市町村等での地域素材資料を構成するために,地域の様子,歴史,産業,地域からの情報発信(各学校,市町村施設等)など,不登校者の身近な情報が提供できるような教材開発(データベース)の試案を作成した。教材管理システムを利用した地域の教育施設・家庭等での在宅教育を可能にする教材管理システムの構成,およびその問題点を明らかにし,通信ネットワークを用いて教材提供を可能にした。この教材としては,教材データベースと通信ネットワークの可能なシステムを構成し,不登校者が学習の理解・定着を目的とする資料を地域社会への興味・関心を高められるような資料の提供を可能にした。これらを用いて,次のような事項について,研究試行し,不登校者(適応教室,在宅学習)の学習を支援できる教育情報システムの在り方を明らかにした。

(1)通信ネットワークを利用した学習情報管理システムは,一つの体系化された教育情報システムが必要とされ,特に,そこで管理する情報が最も重要であり,学習者に適応できる多様なデータベースを用意する必要がある。このため,在宅学習に必要な,(1)基礎基本的な学習事項を管理するデータベース,(2)地域の状況に興味・関心を高めさせる情報,(3)図書館,博物館,歴史資料館,科学館などの施設情報などを,県生涯学習センターの協力を得て構成した。また,基礎・基本的な学習では,国語,算数など,他の教科の学習等の基礎となる個人学習資料をデータベース化し,ネットワーク等での利用を可能にした。これらの資料を,地域の教育施設、学校,家庭等で利用可能とした。(2)学習指導方法の開発検討地域の教育施設,学校,家庭での学習方法の試行としては,多様な情報の活用の中から,いかに学習者が教材を選択し,学習が可能か各教材が記録されたCD-ROM等を提供し,試行した。(3)教育システムの構成・構成家庭,学校,地域の教育施設での利用するためには,学習をガイドするようなシソーラスの開発が必要であることが明らかになり,各教材が学習に適応できるシソーラスの構成方法を明らかにした。
造血細胞の増殖における非受容体型チロシンキナーゼ,p72^<syk>を介した情報伝達機構

本研究は,造血系細胞の増殖における非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性化機構とその生理的機能を解明することを目的とし、インスリン受容体が過剰発現したリンパ芽球細胞株IM9cellsにおけるインスリンおよびIGF-1刺激による非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性制御機構について検討した。その結果、p72^<syk>がIM9cellsに存在し,InsulinおよびIGF-1刺激後共に15-30secでチロシン自己リン酸化活性が増加し,2-5min以後徐々に低下することが認められた。その活性化機構として,Insulin receptorとp72^<syk>が直接的あるいは間接的にassociateしているか否かを各種抗体を用いて解析を行った。抗syk抗体での免疫沈降物を抗インスリン抗体および抗リン酸化チロシン抗体でウエスタンブロットした結果、Insulin receptorとp72^<syk>の共沈がわずかに確認された。しかし、抗インスリン抗体での免疫沈降物の抗syk抗体でのウエスタンブロットでは共沈が検出されず、直接的なassociationを裏づける明確なデーターは得られなかった。次にインスリン作用に類似した効果を示し、チロシンホスファターゼ阻害剤および酸化ストレス剤でもあるH_2O_2を用いてIM-9cellsを刺激し、インスリン受容体およびp72^<syk>のチロシンリン酸化を検討した。その結果、インスリン受容体およびp72^<syk>は共に1-3分で顕著なチロシンリン酸化の亢進が認められた。この条件下で、抗インスリン抗体で免疫沈降し抗リン酸化チロシン抗体でウエスタンブロットした結果、95kDaおよび72-74kDaのバンドが刺激依存性にチロシンリン酸化が確認された。更にH_2O_2刺激によるp72^<syk>のチロシンリン酸化に対するAキナーゼ活性化剤dibutyryl cAMPおよびforskolinの制御機構の解析を行った。その結果、dibutyryl cAMPで前処理した場合には、p72^<syk>のチロシンリン酸化および自己リン酸化がdose dependentに抑制されたが、forskolin前処理では、逆にp72^<syk>のチロシンリン酸化を促進させる結果が得られた。現在、それらのp72^<syk>のチロシンリン酸化に対する反応性の違いが何によるかを検討中である。一方、造血系細胞の増殖におけるp72^<syk>の活性制御機構の研究の一環として、骨髄球系細胞におけるIL-3刺激時の非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性化について共同研究で検討した。その結果、IL-3およびG-CSF刺激時にp72^<syk>のチロシンリン酸化が亢進することを抗リン酸化チロシン抗体で確認したと同時に、in vitro kinase assay法により、IL-3およびG-CSF刺激でp72^<syk>の自己リン酸化能の亢進も認めた。更に、免疫沈降法を用いて、p72^<syk>とIL-3受容体βサブユニットが共沈することを確認した。以上の結果から、骨髄球系培養細胞の増殖シグナルにp72^<syk>が関与していることが明らかとなった。

その結果、dibutyryl cAMPで前処理した場合には、p72^<syk>のチロシンリン酸化および自己リン酸化がdose dependentに抑制されたが、forskolin前処理では、逆にp72^<syk>のチロシンリン酸化を促進させる結果が得られた。現在、それらのp72^<syk>のチロシンリン酸化に対する反応性の違いが何によるかを検討中である。一方、造血系細胞の増殖におけるp72^<syk>の活性制御機構の研究の一環として、骨髄球系細胞におけるIL-3刺激時の非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性化について共同研究で検討した。その結果、IL-3およびG-CSF刺激時にp72^<syk>のチロシンリン酸化が亢進することを抗リン酸化チロシン抗体で確認したと同時に、in vitro kinase assay法により、IL-3およびG-CSF刺激でp72^<syk>の自己リン酸化能の亢進も認めた。更に、免疫沈降法を用いて、p72^<syk>とIL-3受容体βサブユニットが共沈することを確認した。以上の結果から、骨髄球系培養細胞の増殖シグナルにp72^<syk>が関与していることが明らかとなった。本研究は,造血系細胞におけるインスリン刺激依存性の非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性化機構とその生理的機能を解明することを目的とし,本年度はB細胞株IM 9 cellsにおけるインスリン刺激による非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>の活性化機構の解析を行っている。その結果,抗syk抗体を用いた解析から,非受容体型チロシンキナーゼp72^<syk>がB細胞株IM 9 cellsに存在し,Immunoprecipitation kinase assay法でInsulin刺後15secでチロシンリン酸化活性の増加が認められ,30secから1minで最大活性を示し,2min以後徐々に低下することが認められた。そのリン酸化活性はInsulinの濃度依存性に活性化し,KOH処理により,その増加したリン酸化活性はチロシン残基によるものであることが確認されている。その活性化機構として,Insulin receptorとp72^<syk>が直接的なあるいは間接的なassociationを介しているか否かが重要な課題となっており,各種抗体を用いて解析を進めている。現在抗syk抗体での免疫沈降物中には95KDaあたりのチロシンリン酸化蛋白質バンドが一応確認されるので,Insulin receptorとp72^<syk>が直接associationしている可能性が考えられ、それを裏づける実験データーを検討中である。また最近,Insulin receptorのNPEYmotifのTyr-950のチロシン残基がadaptor proteinであるSHCおよびInsulin receptor kinaseの基質であるInsulin receptor substrate2(IRS-2)と同じsiteで結合していることが報告されており,現在Insulin receptorを介したp72^<syk>とSHCとの相互作用について解析中である。
網膜色素上皮細胞の遊走能の研究

網膜色素上皮細胞は増殖性硝子体網膜症のもっとも重要な構成細胞であり、その遊走因子の研究は増殖性硝子体網膜症の治療方を開発する上で極めて重要な意味をもつ。網膜色素上皮細胞が白血球と同じような遊走反応をしめすのかどうかを検討したところ、白血球遊走能因子N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanineが培養ニワトリ胚網膜色素上皮細胞を白血球に対すると同じ程度の濃度で化学走性活性をもっていることがわかった。網膜に存在が知られている種々の物質に遊走活性を検討したところ、メラトニンに特異的に化学走性活性があり、その活性はN-formyl methionyl-leucyl-phenylalanineと匹敵していた。白血球の遊走因子であるアラキドン酸代謝物質について検討すると、ロイコトリエンB_4、5-Hydroxyeicosatetraenoic acidに強い化学走性活性があり、プロスタグランジンD_2に化学運動活性が認められた。これらはヒト培養網膜色素上皮細胞にも同じ効果をしめした。増殖生硝子体網膜症例から得た眼内増殖組織構成細胞に対しても遊走活性をがあるかどうかを調べると、網膜前および網膜下増殖組織から培養した細胞に対しても遊走活性をしめした。これらはアラキドン酸代謝産物が実際の増殖生硝子体網膜症においても遊走活性を現していることを示唆する。遊走因子による細胞内酵素系の活性動態を検討する予備実験により、網膜色素上皮細胞の細胞分画法を確立した。アデニルシクラーゼとグアニルシクラーゼ活性はミクロゾームとミトコンドリアの両画分に認められた。眼内増殖組織の構成細胞には網膜色素上皮細胞以外のものがあり、むしろ同定不能細胞が多い。金コロイド法による免疫組織学的細胞固定を試みた。網膜前後増殖組織中の形態的に細胞起源を同定できない細胞のなかにglial fibrillaryacidic蛋白陽性の細胞が多数あり、グリア起源であることが判明した。グリア細胞の遊走能の検討が今後必要である。仔牛血清添加Minimum csscntial mediumを用いてニワトリ7日胚から分離した網膜色素上皮細胞の大量培養に成功し,培養細胞は継代10代目まで生存可能であった.ヒト網膜色素上皮細胞は仔牛血清添加HamF-10培養液で培養に成功した.得られた培養細胞シボイデンチャンバーに注入して位相差顕微鏡下で遊走細胞数を数えた.フォルミル化メチオニルロイシンフェニルアラニンでは100mM以下で,フォルボールミリステートアセテートでは100mM以下でヒトフィブロネクチンでは100μg/ml以下で,血小板由来細胞成長因子では80ng/ml以下で,神経成長因子では1μg/ml以下で,上皮細胞成長因子では1μg/ml以下で,メラトニンでは1mM以下で,経時的に濃度依存性に細胞遊走効果が認められた.タウリン,サイクリックAMP,サイクリックGMP,繊維芽細胞成長因子ではいずれの濃度でも効果がなかった.

チェッカーボード解析を行なうと,フォルボールミリステートアセテートは,化学運動性として,他の有効物質は化学走性として,細胞遊走作用を示した.細胞遊走効果を示した物質が網膜色素上皮細胞内の細胞骨格にどのように作用するのかを検討するため,カバーグラス上に網膜色素上皮細胞を培養して,シート状になるまえの細胞(培養2週目まで)を用意した.細胞内のアクチンはローダミンーファロイジンを用いて染色して蛍光顕微鏡下で観察した.アクチンは,遊走効果を持つ物質すべてにおいて,遊走至適濃度に一致して,経時にアクチン繊維が断裂して作用後4時間たつと細胞が紡錐状を呈して繊維芽細胞様になった.ニワトリ胚培養網膜色素上皮細胞に対するアラキドン酸代謝産物の遊走効果をボイデンチャンバー法で検討した。ロイコトリエン(LT)B_4には非常に強い遊走効果があり、チェッカーボード解析を行うと、その遊走効果は化学走性であった。5-ヒドロキシエイコサテトラエノイン酸(5-HETE)にも同様に化学走性効果があった。プロスタグランジン(PG)D_2にも遊走活動がみられたが高濃度が必要で、その効果は化学運動性であった。PGE_2にも同じ程度の化学運動性がみられた。LTC_4,PGF_<2α>には遊走効果がみられなかった。ヒト培養網膜色素上皮細胞を用いて同じ実験を行うと、LTB_4と5-HETEには化学走性効果がみられ、ニワトリ細胞には無効なLTC_4にも化学走性効果がみられた。PGD_2、PGE_2にはニワトリ細胞とは異なって、非常に化学運動効果が弱く観察されただけであった。増殖性硝子体網膜症例から治療目的で採取された眼内増殖組織を集めて培養し、増殖した細胞について、アラキドン酸代謝産物の遊走効果をボイデンチャンバー法で検討した。網膜前増殖組織からの培養細胞に対してはLTB_4は強い化学走性効果をしめし、5-HETE、LTC_4にも化学走性効果がみられた。PGD_2は化学運動効果をしめしたが、PGE_2はほとんど効果がなかった。網膜下増殖組織からの培養細胞に関しても同様にLTB_4、5-HETE、LTC_4はいずれも化学走性効果をしめし、PGD_2とPGE_2は化学運動効果をしめした。ヒト培養網膜色素上皮細胞、網膜前増殖組織由来培養細胞、網膜下増殖組織由来培養細胞のすべてが、LTB_4と5-HETEに対しては化学走性、PGD_2に対しては化学運動性をしめした。網膜剥離の重篤な併発症の増殖性硝子体網膜症の発生にアラキドン酸代謝産物による網膜色素上皮細胞の遊走が関係するものと考えられる。
芳香族ポリケタイド生合成マシナリー再構築に向けた比較ゲノム機能解析

Streptomyces coelicolorの生産するactinorhodin (ACT)は、ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質(BIQ)に属する芳香族ポリケタイドである。本研究では、既知のBIQ関連生合成遺伝子クラスター3種類に加えて、別種放線菌のゲノムドラフト解析を行い、比較ゲノム解析に供することを中核とする。(1) ACT生合成において6位酸化反応の基質となる中間体6デオキシジヒドロカラファンギン(DDHK)を生産する遺伝子再構成株(CH999/pIJ5659)にactVA-ORF5、gra-21およびmed-7を導入し、得られた形質転換体の代謝産物を分析したところ、actVA-ORF5、gra-21を導入した株は8-hydroxy-DHKを生産するのに対し、med-7導入株はDHK生産を確認した。この結果、ActVA-ORF5とGra-21はDDHKの6位および8位を連続して酸化する二機能性モノオキシゲナーゼであり、Med-7は6位のみを酸化する単機能性であること、さらに、ACT生合成は二量化前に8位水酸化反応が進行することが示された。(2) Streptmyces tanashiensisJCM4086株のゲノムドラフト解析を実施し、総コンティグ数1,912、総コンティグ塩基数9,202,482bpを得た。配列情報はBIQ基本骨格形成に必須のketosynthase(ActI-ORF1)との相同性を基準に解析したところ、6個のコンティグ配列を見出すことに成功した。特に全長22kbを有する#823の中には、別種放線菌が生産するmedermycin(MED)の生合成遺伝子クラスターとほぼ同一配列であった。JCM4086株からMEDを生産する報告はこれまでなくバイオインフォマティクスから潜在的な菌代謝産物の生産性を予測できる有用な知見と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。Streptomyces coelicolorA3(2)の生産するactinorhodin(ACT)は、ベンゾイソクロマンキノン系抗生物質(BIQ)に属する芳香族ポリケタイドである。BIQ系抗生物質の生合成研究には、生合成の反応として有機化学的に興味深い諸反応を含んでいるほか、生産菌中の二次代謝制御全体を考える上でも有用な諸問題を提示している。本研究では、既にBIQ関連生合成遺伝子クラスターとして取得している3種類に加えて、ACT生合成中間体を生産する別種放線菌のゲノムドラフト解析を行い、比較ゲノム解析に供することを中核とする。本年度中の研究成果として以下の通りである。ACT,granaticin,medermycinの各生合成遺伝子クラスターに共通する二成分系FMOは、BIQ基本骨格形成に必須である6位キノン形成に関与している[1]。多環性芳香族化合物を基質とする同様のFMOは他に例がないため、ACT生合成に関与するActVA・ORF5/ActVBの酵素機能について検討したところ、新たにBIQ骨格をエポキシ化する機能を見出した[2]。他のクラスター中のFMOの機能にも興味がもたれるので、比較機能解析を行った。まずactVA-ORF5破壊体に相同遺伝子med-7,gra-21,alnT(BIQ類縁体alnumycin生合成遺伝子)を導入して機能相補性を検討した。この機能相補性は、ACT生産の回復を示唆する青色色素生産で確認できるが、遺伝子導入株はいずれも青色色素は生産しなかった。3遺伝子産物はいずれもActVA-5に対し6366%と比較的高い相同性を示す。モデリング予測した立体構造も全体的な構造は類似したものの、基質ポケットを構成すると思われるアミノ酸残基についてActVA-5のみ構造が違うことが示唆され、相同遺伝子がActVA-5の機能を完全には相補しなかったと考えている。一部の遺伝子導入株では、コントロールにはみられない色素生産性が認められたのでその代謝産物プロフィールを解析中である。一方、放線菌Sttreptomyces tanashiensisを比較ゲノムの対象として選定して、ゲノムドラフト解析を実施し、配列データの取得に成功した。現在、アセンブルデータの解析を進めている。(2) Streptmyces tanashiensisJCM4086株のゲノムドラフト解析を実施し、総コンティグ数1,912、総コンティグ

塩基数9,202,482bpを得た。配列情報はBIQ基本骨格形成に必須のketosynthase(ActI-ORF1)との相同性を基準に解析したところ、6個のコンティグ配列を見出すことに成功した。特に全長22kbを有する#823の中には、別種放線菌が生産するmedermycin(MED)の生合成遺伝子クラスターとほぼ同一配列であった。JCM4086株からMEDを生産する報告はこれまでなくバイオインフォマティクスから潜在的な菌代謝産物の生産性を予測できる有用な知見と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。比較ゲノム機能解析の対象となる放線菌株のドラフトゲノムデータは取得しており、遺伝情報の中から目的遺伝子の探索と同定を進めている。当初計画と比較して遜色ない進行度である。探索した遺伝子の機能解析には、遺伝子相補実験、生化学的実験(酵素機能同定)を予定している。
呼吸器感染症ウイルス活性化酵素TMPRSS2の役割ならびに阻害化合物に関する研究

肺炎や下気道炎を起こすウイルスは多様である。しかしながら、これら呼吸器ウイルスは、ウイルス種としては多様であるものの、それら呼吸器ウイルスの膜融合蛋白が宿主気道上皮のプロテアーゼで活性化するという共通の性質を持つと考えられる。申請者らは「プロテアーゼ依存性トロピズム」理論に立脚した考えのもとに、ウイルス活性化に関する研究を推進してきた。その結果、ノックアウトマウス技術を用いることで、呼吸器上皮細胞に発現しているセリンプロテアーゼTMPRSS2が、インフルエンザウイルスの生体内活性化酵素であることを証明した。本研究では、TMPRSS2の生理機能や細胞内動態の解析、TMPRSS2の阻害化合物の大規模スクリーニングを実施し、TMPRSS2阻害化合物の呼吸器ウイルス感染阻害効果を検証することを目的に実験を行なっている。また、MERSコロナウイルス受容体(CD26)導入遺伝子改変マウスならびにTMPRSS2 KOマウスを用いて、MERSコロナウイルスのin vivo増殖、病原性発現におけるTMPRSS2の役割を解明するとともに、TMPRSS2の阻害化合物による各種呼吸器ウイルスやMERSコロナウイルスの生体内での増殖抑制効果を明らかにすることを目的に実験を行った。本研究開始以前に、MERSコロナウイルス受容体(CD26)導入遺伝子改変マウス(CD26-tgマウス)を作出することによって、すでにMERSコロナウイルスのin vivo(マウス)モデルを確立していたので、本マウスとTMPRSS2 KOマウスを交配されることによって作出されるマウス(CD26-tg/TMPRSS2 KOマウス)を用いて、MERSコロナウイルスのin vivo増殖におけるTMPRSS2の役割を解析した。の結果、TMPRSS2がMERSコロナウイルスの気道での増殖ならびに気道で起こる免疫反応に重要な意義があることが確認された。本研究課題の一つの主要な目的であった、TMPRSS2のMERSコロナウイルス感染症における意義が証明でき、著名な国際誌に発表できた。他の主要目標である、(1)TMPRSS2活性阻害化合物の同定・作出、(2)TMPRSS2 KOマウスのトランスクリプトーム解析、(3)TMPRSS2の細胞内局在、ならびにARIウイルス膜融合タンパクとの会合部位の解析について、解析を進めていく。
衛星軌道を乱す極域熱圏大気密度上昇の解明  - 国際共同観測ロケット

人工衛星は大気の空気抵抗を受けて姿勢や軌道を変化させる.人工衛星に影響を与える熱圏中性大気の密度分布に未知の異常上昇が極域カスプで見つかった.この密度異常の原因を明らかにするためには,この場所でのジュール加熱を見積もる必要がある.それを調べるためには熱圏大気風とその場での電場を同時に計測する必要がある.太陽極端紫外光により短時間でイオン化するバリウムとイオン化しないストロンチウムを観測ロケットから高度100 km付近に放出し,発光するそれらの動きを地上から追跡することにより熱圏大気風とプラズマドリフト速度を同時に計測する.電場はプラズマドリフト速度から見積もることができる.人工衛星は大気の空気抵抗を受けて姿勢や軌道を変化させる.人工衛星に影響を与える熱圏中性大気の密度分布に未知の異常上昇が極域カスプで見つかった.この密度異常の原因を明らかにするためには,この場所でのジュール加熱を見積もる必要がある.それを調べるためには熱圏大気風とその場での電場を同時に計測する必要がある.太陽極端紫外光により短時間でイオン化するバリウムとイオン化しないストロンチウムを観測ロケットから高度100 km付近に放出し,発光するそれらの動きを地上から追跡することにより熱圏大気風とプラズマドリフト速度を同時に計測する.電場はプラズマドリフト速度から見積もることができる.
嫌気性自己固定型反応器の生物膜・グラニュール形成における細胞外ポリマーの役割

嫌気性固着型反応器での生物膜,グラニュール増殖体形成(自己固定化)における細胞外ポリマーの役割を以下の手法で検討した。(1)UASB反応器の長期連続実験によって、反応器の異なる高さから採取したグラニュール生物体をサイズにより分級し、細胞外ポリマー(ECP)成分とメタン生成活性に及ぼす有機物負荷(流入有機物強度)の影響を検討した。この結果、ECPの(タンパク質/炭水化物)比は、0.7から2.1の範囲でベッド上部にいくに従い増加傾向を示し、グラニュール径の増大に伴い減少する傾向を示し、グラニュレーションにはECP中の炭水化物画分がより緊密に関与していることが明らかになった。また、グラニュール汚泥の水素利用メタン生成活性は、グラニュール径が増大するに従い低下し、基質の拡散移動抵抗が存在した。(2)UASB反応器中に装着した付着担体への嫌気性微生物群の付着・生物膜形成過程における形態学的観察、細胞外ポリマーの挙動及び各栄養菌群の付着細菌数の推移を追跡した。その結果、嫌気性微生物の付着・凝集過程は4段階の継起プロセス(Adhesion、Clump形成、Conglomerate形成、およびAggregate形成過程)によって特徴付けられることが判明した。EPC中の炭水化物含量はAdhesionフェイズからClumpフェイズの中期までは増加し、以降のConglomerateフェイズおよびAggregateフェイズでは減少傾向を示したが、一方ECP中のタンパク含量はその反対の傾向を示した。その結果、ECPの(タンパク質/炭水化物)比は0.3から1.8まで増加し、細胞の初期付着には、炭水化物画分がより有効に関与していることが判明した。また、同一環境条件下での生物膜形成とグラニュール形成過程における構成菌フローラの形態学的推移を綿密に観察し、嫌気性微生物の自己固定化機構の普遍的なアナロジーを明らかにした。
Alzheimer病の発症過程におけるアストロサイトのPETイメージング

APP遺伝子knock-inによるアルツハイマー病モデルで当初は実験を行っていたが、期待していた早期からのアミロイドの沈着が得られなかった。そこで、アストロサイト障害モデルによる脳循環代謝計測を行った。ラットのフルオロクエン酸(FC)脳内注入モデルを用いて、O-15ガスによる脳循環代謝測定、ならびにC-14 Acetateオートラジオグラフィー(ARG)を行い、アストロサイトの代謝評価を行った。その結果、FC注入によるアストロサイトの代謝障害時においても局所脳血流量ならびに脳酸素消費量は維持されていることが明らかになった。Alzheimer病の発症過程におけるアストロサイトのPETイメージングとして、C-11 PIBによるアミロイドイメージングとF-18 DPA714(TSPO)による活性化グリア細胞(アストロサイト、ミクログリア)の神経炎症イメージングを行った。対象のAlzheimer病モデルマウスとして、APP-KI(アミロイド前駆体蛋白遺伝子ノックイン)マウスを用い、普通食・高脂肪食負荷群に分けて、PET撮像を行った。高脂肪食負荷群では神経炎症の増悪により、より早期での変化が捉えられることが予測される。また野生型マウスについても、普通食・高脂肪食負荷群に分けて、同様に撮像を行った。PET撮像時は2匹同時撮像により、1日12匹の収集を行い、各群3匹ずつを3ヶ月ごとの定期撮像を行った。現時点ではマウスの月齢が12ヶ月未満と高齢でないことから、アミロイドの沈着と随伴するアストロサイトの変化には乏しいと思われるが、今年度に高齢化する中での過程をイメージングで捉えられるように計画している。また免疫染色切片との比較についても、高齢APPマウスの脳切片を用いて、アミロイド・TSPO・CD11bの3重染色ならびにアミロイド/GFAP観察を行い、アミロイド沈着部周囲にGFAP陽性アストロサイトならびにCD11b陽性ミクログリアの存在を確認している。今後、APP-KIマウスでのPET実験終了後に同様に脳免疫染色による確認を予定している。Alzheimer病モデルマウスについてはAPP(アミロイド前駆体蛋白)遺伝子ノックインマウスを用いて、普通食・高脂肪食負荷群に分けて、順調に定期的なPET撮像を行っている。また免疫染色切片との比較についても、アミロイド_TSPO_CD11b_3重染色観察を行い、アミロイド沈着部周囲にアストロサイトならびにミクログリアの活性化を確認している。【方法】画像評価(11C-Acetate PET・11C-PIB PET・MRI撮像):平成27年度に引き続き、アルツハイマー病モデル(APP-Tgマウス)における同一個体での経時的変化の評価を行った。以下の4群に対して、PIB-PET(アミロイドβの蓄積を評価)、TSPO-PET(グリア細胞の活性化を評価)を3ヶ月おきに同一個体で、繰り返し実施(各群n=3)。【今後の方針】現時点では21ヶ月齢においても明瞭なアミロイド沈着が得られていないため、原因の究明のために今後免疫組織染色による評価を予定している。アミロイドβの染色だけでなく、ミクログリア(CD11b)、アストロサイト(GFAP)の活性化についても評価し、それぞれのTSPO発現についても共染色で評価を行う。アルツハイマー病モデルマウスにおいて、アミロイドβの蓄積が当初の予想よりも遅く、PIB PETでアミロイドの蓄積過程を捉えることができていない。今年度は脳循環代謝におけるアストロサイトの役割について、検討を行った。フルオロクエン酸(FC)はアストロサイトのTCAサイクルのinhibitorであり、脳内に注入することで、アストロサイトの代謝を止めることができる。今回、ラットのFC脳内注入モデルを用いて、O-15ガスによる脳循環代謝測定、ならびにC-14 Acetateオートラジオグラフィー(ARG)を用いて、アストロサイトの代謝評価を行った。その結果、FC注入によっても脳内の脳血流量、脳酸素消費量は維持されることが明らかになった。FC注入側と対側の定量値はそれぞれ、CBF (54.4 ±8.8 and 55.3 ±11.6 ml/100ml/min), CMRO2 (7.0 ±0.9 and 7.1 ±1.2 ml/100ml/min), OEF (72.0 ±8.9 and 70.8 ±8.2 %), and CBV (4.1 ±0.8 and 4.2 ±0.9 ml/100ml)であり、統計学的な有意差を認めなかった。ニューロンがアストロサイトの代謝低下を代償している可能性が示唆された。一方、C-14 Acetate ARGではFC注入部位の集積低下を認めており、アストロサイトの代謝が低下していることが確認された。以上の結果より、アストロサイトの代謝障害時においても局所脳血流量ならびに脳酸素消費量は維持されていることが明らかになった。

今後、これまでのPET実験を継続すると共に、C-11 AcetateあるいはC-11 benzyl acetateを用いて、アストロサイトのTCA回路代謝についての定量的PETイメージング評価を行いたいと考えている。またアミロイドの沈着が十分に確認することができれば、抗アルツハイマー病薬投与前後での変化も併せて評価する計画である。PIB PETが陰性の場合であっても、病理学的には軽度のアミロイドβ蓄積を認めることがあるため、病理学的評価(CD11b, GFAP, TSPO, Aβの染色)によって、アミロイドβの蓄積の有無、活性化ミクログリアやアストロサイトの状況、TSPOの発現を詳しく調べる。PET分子イメージング実験の計画段階での想定と実際の進展状況との相違のため。アルツハイマー病モデルマウスへのアミロイド沈着が検出できず、研究の進捗が遅れているため。引き続き本研究の目標達成のための物品費として使用する。PET撮像実験や免疫組織染色の消耗品、学会発表等の旅費に使用する。
パーソナルコンピュータによる中期インド・アリアン古文献の解析

中期インド・アリアン語の古文献(仏教とジャイナ教等)は現代文明の重要な源流の一つでありながら,殆どの文献は死蔵された状態になっている。この言語の研究を飛躍的に進展させるためには,聖典の計算機解析が有効であると考えられている。我々は前年度までにジャイナ教聖典の解析ツール(韻律解析,単語の正順索引・逆順索引と詩脚の正順索引・逆順索引作成,文法解析)を開発した。本年度は,我々は仏教文献をも解析出来るようにツールを拡張した。これらの研究を,パーリ聖典の計算機解析-成果と問題点-と言う題名で論文にまとめた。ところで,これまで初期仏教文献の重要な原典テキストは,世界での仏教研究の中心的な機関の一つであるパーリ文献協会(PTS)より計画的に発行され、研究者に多大の便宜を供してきた。しかしながら、これらの原典テキストには語彙索引が殆ど付されていないのが現実であり、付されている場合でも不完全で誤りが多く、完全な語彙索引が研究者に切望されている。我々は、主に散文からなる膨大な『律蔵』(Vinaya-pitkaka:全5巻・総ページ数1,588)の索引作成に成功し,PTSより出版した。これらの研究は,中期インド・アリアン語の古文献の研究を進展させるものとして期待されている。
サブポアソン光の発生機構及び高次の揺らぎの研究

半導体発光素子は、注入する電流の揺らぎを小さくすることにより、非古典光(サブポアソン光)を比較的容易に発生することができる。非線形光学効果による非古典光の発生に比べると、実験装置が簡便である、エネルギー効率が良い、デバイスの構造や電子系を変化させることによるシステムの制御性が良い等の利点がある。従来、この発生過程は、確率過程として記述できると思われていたが、注意深い定量的な比較から、実験で測定される雑音の減少量は、単純なポアソン過程による予測値とは定量的に一致しないことがわかった。このような不一致は、素子の平均発光効率が、微分発光効率と異なる場合に見られる。微分効率が、サブポアソン光の発生過程で果たす役割を考慮した理論式を直観的な議論で導き、実験結果と比較した。その結果、新しい理論式と実験結果は良く一致した。このことから、単純なポアソン過程による抽象が不十分であることがわかった。次に、素子のI-V特性と効率の関係を調べた。LEDの発光効率は、注入電流の大きさにより変化する。この現象は、トラップ準位の存在を仮定し、有限の個数のトラップ準位が飽和を起こすことにより、定性的に理解できる。定量的な議論をするために、接合電圧と電流の関係を実測し、トラップ準位が存在するときの順電流を与える理論式にフィッティングした。得られたフィッティングパラメータにより効率を推定し、実測した効率と比較すると、素子によっては良く一致した。また、定電流駆動された半導体発光素子から発生したサブポアソン光の光子数分布関数を初めて測定した。
膜電位変化により調節される膜酵素活性の研究

血管平滑筋の膜電位を過分極させ弛緩を生ずる種々の生体物質と治療薬が関心を呼んでいる。Kチャネルが開くと膜電位が過分極して、電位依存性L型Caチャネルが脱活性化され、細胞内Caイオン濃度(〔Ca^<2+>〕i)が低下し、血管平滑筋が弛緩するというのが一般的な理解であるが、もっと踏み込んだ検討が必要と考えられた。イヌ冠動脈において、Kチャネル開口薬(KCO)や細胞外のKCl濃度を変化させて、膜電位を変化させて、〔Ca^<2+>〕iと収縮の関係を膜電位も測定し検討した。トロンボキサンA_2受容体を刺激して、ホスホリパーゼC活性を高める作用をKCOは抑制し、過分極は、膜酵素活性を抑制する。ホルボールエステルはCa感受性を高めて、きわめて低い〔Ca^<2+>〕iでも強力な収縮を生じるが、レブクロマカリムで過分極させると、ホルポールエステルの収縮を抑制した。この抑制作用はグリベンクラミドや20mM KClの部分脱分極で消失した。逆に90mM KClで脱分極すると、〔Ca^<2+>〕iは変化せずにホルボールエステルの収縮を増強した。90mM KClで脱分極後、5mM KClにして再分極させて弛緩させると、細胞外無Ca液で弛緩させた時とほぼ同じ時間経過で〔Ca^<2+>〕iが減少する。にもかかわらず、前者は後者よりも速く弛緩する。後者の弛緩は〔Ca^<2+>〕iと同じ時間経過で弛緩することからも、再分極あるいは過分極は、冠動脈平滑筋のCa感受性を抑制すると考えられる。我々の提唱している「過分極弛緩速関」という現象が、タンパクリン酸化酵素Cが関与する機構においても、生じていることを示すものである。新しい酵素機能調節が提示できたものと考える。血管平滑筋の膜電位を過分極させて弛緩を生ずる内皮田来過分極因子(EDHF)が探求されている。Kチャンネルが開くと膜電位が過分極して電位依存性L型Caチャンネルが脱活性化され、細胞内Caイオン濃度([Ca^<2+>]_i)が低下し、血管が拡張するというのが一般的な理解であるが、もっと踏み込んだ検討が必要と考えられた。Fura-2を取り込ませたイヌおよびブタ左冠動脈リング標本で、Fura-2の蛍光比を張力とともに測定し、また膜電位やcAMP,cGMP,IP_3と張力の同時測定も行った。比較的特異的なKチャンネル開口薬(KCO)のクロマカリムやその活性左旋体のレブクロマカリムはその過分極作用でアゴニスト(U46619,FT-1)のCa流入と収縮作用を強力に抑制する.このCa流入はもっぱら電位依存性L型Caチャンネルを介するものある。さらに、KCOは外液無Caの状態で、U46619によるIP_3の生成とそれに伴う[Ca^<2+>]_iと収縮を抑制した。KCOはその細胞膜過分極作用により、アゴニスト収縮に関与するホスホリパーゼCの活性化を[Ca^<2+>]_i低下作用とは独立に抑制する。続いて、血管平滑筋の[Ca^<2+>]_i対発生張力の関係を検討すると、KCOの過分極作用や外液のKCl濃度減少の再分極作用は、収縮蛋白Ca感受性を減弱し、それらの膜電位変化対Ca感受性減弱効果関係は同一の曲線となった。