hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブドウ雌ずい中の花粉管誘導組織(TT)細胞間隙マトリックスの生化学的特性

まず、開花期に2倍体3品種(Muscat of Alexandria, Cabernet Sauvignon, GA処理及び無処理のDelaware)と4倍体2品種(4n-Muscat, Kyoho)の雌ずいから、上記の方法で隔壁組織を取り出し、NaClとMgCl_2でアポプラスト抽出した。このTT-ECMを透析チューブで脱塩後、花粉管生長アッセイをした結果、今年も4倍体品種で花粉管生長促進活性が認められた。その活性物質の単離・同定のために、現在QIカラム、ゲルろ過カラムで分画中である。一方、雌ずい内での花粉管先端の形態を詳細に観察した結果、膨張、破裂、コイル化、方向異常などが認められ、その構成比率は品種によって異なった。特に、GA処理したデラウエアでは伸長停止した花粉管先端はほとんどすべてコイル状を呈した。TT-ECM抽出物をin vitroで発芽した花粉管に与え、その後の花粉管先端の形態変化を調査したところ、いずれの品種でもMgCl_2抽出物に雌ずい内と同様な異常を引き起こす傾向が認められた。したがって、MgCl_2抽出物に雌ずい内での花粉管生長を支配している物質が含まれている可能性が高い。ただし、デラウエアではTT-ECMの抑制活性が強く、雌ずい内部と同様のコイル化を引き起こす画分を見出すことができなかった。2倍体および4倍体のブドウ数品種について、雌ずい中のTT-ECMを抽出、花粉管生長に対する活性を調査した結果、4倍体品種の巨峰、4倍体マスカット、ピオーネのいずれでも花粉管の生長を促進する成分(PGP)が存在することが確認された。これらの4倍体品種の雌ずい内では、通常、2倍体品種に比べて花粉管生長が不良であり、その中でPGPが検出されたことは、非常に興味深いことである。ブドウ属植物では世界で初めて発見されたこのPGPの化学的特性を明らかにするために、物質の精製と単離、および2,3の解析を行った。その結果、ピオーネのNaCLによるアポプラスト抽出物に含まれるPGPが、主としてD-glucoseから構成される多糖であることを見出した。この研究の過程で、花粉管生長に対する活性のアッセイとして、花粉を予備培養して花粉管が一定の長さまで生長してから被検液(抽出されたTT-ECM)を培地に添加し、その後に伸長した花粉管長を比較する方法を開発した。また、デラウエアの無核果生産のために実施されているGA処理によって、受粉後の花粉管生長は著しい影響を受け、受粉後824時間に花粉管の先端は方向性を失ってコイル化をすると言う、極めて特異な現象が発見された。それを引き起こしているTT-ECM成分の特定は、本研究では完了できなかったが、今後の研究の進展によってそれが明らかになる可能性は高い。それによって、他のブドウ品種に対する無核化技術の開発に大きな貢献を与える可能性がある。
高次元幾何学的変分問題の研究

本研究の目的は、位相的に非自明な関数空間上定義された高次元幾何学的変分問題に対して、その関数解析学的な基礎を与える事であった。これに対して得られた成果は1)ソボレフクラスの写像に対して、その特異点の分類を行った。特に大域的特異点の一般論を完成した。2)ソボレフバンドルの位相的性質と解析的性質の相関関係を調べ、高次元のゲージ理論に応用した。3)3次元多様体上のシグマ模型の一般化である、Faddeev-Skyrme模型に対して、Hopfソリトン解の強安定性を証明した。4)臨界次元における、退化型Yang-Mills方程式の弱解の正則性を証明した。5)境界付き4次元多様体上のYang-Mills-Dirichlet問題に対するモース理論を部分的に構築した。6)4次元多様体上のYang-Mills-Dirac方程式の弱解の正則性と、エネルギー量子化を証明した。位相的に非自明な関数空間上定義された、高次元の幾何学的変分問題の解析的な基礎付けを与える。特に関数空間の完備化とその位相的意味を解明する。写像空間上の変分問題に関連して、ソボレフクラスの写像の特異点の分類を行った。高次元においては、今まで大きく分けて2種類の特異点の存在が知られていた。1つは局所的特異点と呼ばれ、現在までの研究でその性質に関してはかなりよく理解されているものである。一方、それとは異なる種類の特異点として、大域的特異点と呼ばれるものがあるが、その存在は知られていたものの、その性質等に関しては体系的な研究は成されていなかった。本年度の研究において、大域的特異点の一般的な性質の解明を行った。特異点を滑らかな写像による近似の障害として捉え直すことで局所的特異点、大域的特異点を別の角度から眺めることが出来ることが分り、その結果、局所特異点は近似の第1障害、大域的特異点は2次以降の障害で、それはソボレフ位相に関する位相不変量であることを示した。また後者はコホモロジーの言葉で記述できることを示した。特に、はじめて大域特異点が出現する場合である単連結4次元多様体上定義された写像の場合を詳しく調べ、この場合に大域的特異点を完全に分類した。またソボレフバンドルのトポロジーとその解析的性質の研究に着手した。はじめに臨界次元におけるソボレフバンドルは滑らかなバンドルのなすカテゴリーと同値であることを示した。この証明はソボレフバンドルの滑らかなバンドルによるある種の近似定理に基づいて証明されるが、その近似定理の応用として、ウーレンベックの弱位相による滑らかなバンドルの空間の閉包の特徴付け、共形変換で不変なバンドル上の変分問題の解の存在およびある種の最小化列の位相的コンパクト性の証明を行った、これらは臨界次元を超えた高次元のソボレフバンドルの研究、および高次元の変分間題を考える上で基礎となるものである。これらの結果は学術雑誌および京大数理解析研究所講究録に発表した。ソボレフクラスの主バンドルの解析的性質と位相的性質の相関関係およびそれらの主バンドル上の変分問題、特にYang-Milks方程式への応用を研究した。ソボレフの埋め込みの臨界次元に対応する場合には、そのクラスのソボレフバンドルは滑らかなバンドルでソボレフの位相で近似できることを示し、ソボレフバンドルのなすカテゴリーは普通の滑らかなクラスのバンドルのなすカテゴリーと同値であることを示した。またこれら臨界次元の場合に、対応する共形変換で不変なYang-Mill汎関数の変分的性質を調べ、臨界点の存在定理を証明した。ソボレフの埋め込み定理を超えた、より高次元の場合には、ソボレフラクスのバンドルのなすカテゴリーは滑らかなクラスのなすカテゴリーとは本質的に異なる。しかしこの場合にも、ソボレフ位相に適合したある種の位相的不変量が定義可能であることを示し、その位相不変量を用いて高次元の場合にYang-Mills汎関数の変分的性質をいくつか証明した。特にエネルギーの下限が0になるための条件が、ここで導入した位相不変量で的確に記述できることを示した。また古典的なChern-Weil理論をソボレフクラスのバンドルにまで拡張し、ソボレフの指数からきまるある次元以下では、不変多項式から決まる曲率の多項式は位相不変量を決めることを示した。

またバンドルがある次元の特異点を持つようなソボレフバンドルに対しても、これらの結果は部分的に拡張可能であることを示し、応用として高次元の場合のある種のYang-Mills接続の弱極限の位相的性質を調べた。これらの結果は2つの論文にまとめあげ、現在投稿中であるFaddeev-Skyrmeモデルは、3次元の場の理論において、中間子等の素粒子とその相互作用を記述するモデルである。これは、シグマモデルとは異なり、組紐状の弦粒子を記述する可能性のあるモデルとして、注目されている。しかしこのモデルにおいては、非常に強い非線形性から、その定常安定解の構造等はよくわかっていない。本研究では、3次元球面上のモデルに対して、最小エネルギー解の構造を決定した。Wardは1999年に、半径が2の平方根より大きい球面上では、このモデルの代表的な解、Hopfソリトンは不安定解であることを示し、この逆も成り立つだろうと予想した(Ward予想)。本研究では、これを数学的に厳密に証明し、更にHopfソリトン解の近傍の最小エネルギー解の構造を完全に決定した。(2)臨界次元における、退化ヤンーミルズ接続の正則性の研究:幾何学的変分問題に由来する多くの偏微分方程式には、臨界次元という、固有の次元が存在する。それは偏微分方程式が、ある種の郡変換で不変になる唯一の次元であり、このことから、この次元における偏微分方程式は、他の次元では見られない、多くの構造をもつ。一般に、臨界次元における偏微分方程式のエネルギー有限な弱解は実は滑らかな古典解になることが、期待されているようである。このことは、山辺の問題に関連して現れるスカラーの非線形偏微分方程式では正しいことが、1960年代には知られていた。一方、調和写像の場合は、2次元以外は、この問題は一般的な形では未解決である。本研究では、代表的な幾何学的偏微分方程式の一つである、ヤンーミルズ方程式に対して、臨界次元におけるエネルギー有限の(5次元以上では退化型の)ヤンーミルズ方程式の弱解は実は滑らかな古典解となることを証明した。本年度は、境界付き4次元多様体上のヤンーミルズ方程式のディリクレ問題に対するモース理論の研究と、4次元スピン多様体上のヤンーミルズーディラック方程式の弱解の正則性、および、この方程式の解の列の、共形変換で不変なエネルギーに関する、エネルギー量子化の問題に取り組んだ。ヤンーミルズ方程式のディリクレ問題のモース理論に関しては、各連結成分における最小エネルギー解の存在-非存在については、1997年にほぼ完全な形で解決していたが、今回の研究では、非最小エネルギー解の存在、および、ある連結成分における多重解の存在を証明した。特に、解が同一連結成分で2つ(あるいは3つ)以上存在するための条件を、境界値に依存してきまるある行列の特異値とその行列式の符号に関する明確な条件として与えることができたことが、大きな成果である。ヤンーミルズーディラック方程式に関しては、エネルギー有限な弱解の正則性を証明した。これは、既に知られている、孤立特異点の除去可能性定理を含むより一般的な結果である。つぎに、ヤンーミルズーディラック方程式の解空間のコンパクト性に関して、共形変換で不変なエネルギーに関して、エネルギーの量子化現象が起こる事を示した。これは今後、この方程式を関数解析的な変分法で取り扱う場合の基礎を成すものと考える。
低分子プローブを用いたストリゴラクトン受容と代謝機構の解明

ストリゴラクトン(SL)は、植物の根圏に分泌される化合物で、アーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐や根寄生雑草種子の発芽刺激活性を有する。また近年、リンや窒素が不足した栽培条件下で生合成され、植物の枝分かれ抑制や根の発達など植物ホルモンとしての作用も見出された。SLの基本骨格は三環ラクトンとエノールエーテルで結合したメチルフラノン環からなるが、2つのラクトン以外の部分は植物によって様々な修飾を受けている。それらの修飾は植物の種とは関係なく、また活性にも大きな影響がない。そこで今年度は、今後SLの生合成酵素や修飾酵素のスクリーニングができるようにSL生合成が活性化される要因について精査し、また様々な植物のSL様化合物を探索した。材料は5-デオキシストリゴール(5-DS)の9位水酸化体・ソルゴモールを主要SLとして生合成しているソルガムを使用した。水耕ソルガムを栄養培地で育て、水道水に替えることで増加するソルゴモールの量について経時的にモニターした。すると水道水に替えてから3日後にソルゴモール量は急激に増加し、4日後からは24時間あたりの生合成量に変化がなかった。またソルガムの場合は、リン欠乏とともに窒素欠乏がSLの生合成活性化に重要であった。一方でトウモロコシ、ヒマワリなどのSLについて再分析を行った。先行研究で、トウモロコシは5-DSとソルゴモール、ヒマワリは5-DSとアレクトロールを生合成していると報告されていた。しかし実際には両植物とも既知のSLは生合成しておらず、新規のSL様化合物を分泌していることが判明した。そこでヒマワリの新規SLを単離し、構造を決定した。(抄録なし)ストリゴラクトン(SL)は、根寄生雑草種子の発芽誘導や宿主植物の枝分かれ抑制活性など様々な作用を有する植物由来の化合物群である。SLの基本骨格はエノールエーテルで結合した三環性ラクトンとメチルフラノンから成るが、三環性ラクトン部分は様々な酸化修飾を受けており、それと生合成する植物種との関連性は今のところ見出されていない。そこで本研究では宿主植物におけるSLの生理活性と酸化体の意義を明らかにするため、SL受容体のアンタゴニストや酸化酵素阻害剤を開発し、植物に対する影響を解析することを目的としている。本年度は受容体阻害剤のスクリーニングおよび研究に用いる植物体の選抜を行った。宿主植物(イネ)や根寄生雑草(Striga hermonthica,Orobanche minor)に対して、高いアゴニスト活性を示さなかった化合物のアンタゴニスト(阻害)活性を調べたが、そのような活性を示す化合物は得られなかった。しかしSLの構造を厳密に認識するStriga gesnerioidesに対して、宿主であるササゲが生合成しているSLと同じ立体を有した化合物はアゴニストとして作用する一方、他の立体異性体はアンタゴニストとして作用することが明らかになった。これに生物種が限定されているものの、SL受容メカニズムにおいてアンタゴニスト活性が確認された初めての報告である。一方、SLの酸化修飾の意義を確認するためには、SL酸化物を高生産している植物体を選抜する必要がある。そこで様々な植物体を用い簡便にSLを得るための水耕栽培方法及び抽出方法、分析方法を確立した。結果、水耕液回収から分析まで12日で行えるようになり、また各SLを主に生合成している植物体を選抜することができた。更に従来の分析方法を改良することで、既知のSLだけでなく未知のSLを生合成する植物を見つけることができるようになった。ストリゴラクトン(SL)と総称される一連の化合物は、根圏に放出される生物間のシグナル物質として、根寄生雑草種子の発芽やアーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐を誘導する。またSLを生合成する植物に対しては、枝分かれの抑制物質として作用する。SLの基本骨格は三環性ラクトンとメチルフラノンから成り、2つのラクトンとそれらを繋いでいるエノールエーテル結合は活性に必要な部位であるが、それ以外の二環部分は活性に大きな影響を与えない。そのためか様々な植物において二環部分が色々な酸化修飾を受けたSLが単離されている。これらの酸化修飾の意義、即ち酸素官能基導入は活性体合成の一部なのか、もしくは不活性化のための代謝反応なのかを明確にするため、本年度は多種多様なSLを生合成する植物体を体系化し、酸化反応メカニズムの解明のため、植物によるSLの酸化的代謝物の解析を行った。SLには、全く酸化修飾されていない5-デオキシストリゴール(5-DS)、水酸基が1つ導入されたオロバンコール、ストリゴール、ソルゴモールが含まれている。これらの酸化SLが5-DSを基質として生合成されるのか確認するため、安定同位体で標識した5-DSを様々な植物に投与し変換をLC-MS分析で確認した。するとソルゴモールとストリゴールは5-DSから変換された。これらへの代謝はウニコナゾールで阻害されたことから、チトクロムP450が水酸化反応に関与していると思われる。それに対し、オロバンコールは5-DSの酸化によっては生合成されない場合もあることが明らかになった。5-DSをオロバンコールへ変換できない植物は、外生5-DSをソルゴモールの異性体へと変換した。この異性体は未だ天然からは同定されていない。以上の結果を踏まえると、一連の酸化型SLの生合成には、5-DSを経由する経路と経由しない経路が存在していることが示唆された。

ストリゴラクトン(SL)は、植物の根圏に分泌される化合物で、アーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐や根寄生雑草種子の発芽刺激活性を有する。また近年、リンや窒素が不足した栽培条件下で生合成され、植物の枝分かれ抑制や根の発達など植物ホルモンとしての作用も見出された。SLの基本骨格は三環ラクトンとエノールエーテルで結合したメチルフラノン環からなるが、2つのラクトン以外の部分は植物によって様々な修飾を受けている。それらの修飾は植物の種とは関係なく、また活性にも大きな影響がない。そこで今年度は、今後SLの生合成酵素や修飾酵素のスクリーニングができるようにSL生合成が活性化される要因について精査し、また様々な植物のSL様化合物を探索した。材料は5-デオキシストリゴール(5-DS)の9位水酸化体・ソルゴモールを主要SLとして生合成しているソルガムを使用した。水耕ソルガムを栄養培地で育て、水道水に替えることで増加するソルゴモールの量について経時的にモニターした。すると水道水に替えてから3日後にソルゴモール量は急激に増加し、4日後からは24時間あたりの生合成量に変化がなかった。またソルガムの場合は、リン欠乏とともに窒素欠乏がSLの生合成活性化に重要であった。一方でトウモロコシ、ヒマワリなどのSLについて再分析を行った。先行研究で、トウモロコシは5-DSとソルゴモール、ヒマワリは5-DSとアレクトロールを生合成していると報告されていた。しかし実際には両植物とも既知のSLは生合成しておらず、新規のSL様化合物を分泌していることが判明した。そこでヒマワリの新規SLを単離し、構造を決定した。根寄生雑草種子に対する受容体阻害剤を開発し、宿主植物が生合成するSLの分析系は確立されたが、宿主植物へ投与する化合物の選抜には至っていないため。研究対象を代謝酵素に集中させることで、複数の植物におけるSLの酸化反応メカニズムを解析することができた。また代謝酵素阻害剤の種類も決定することができたため。SL受容体が未だ不明であるため、ドッキングシミュレーションによる受容体阻害剤候補化合物のスクリーニングを行わない。また所有している化合物からも受容体阻害剤を選抜することができなかったため、一旦化合物のスクリーニングは中止する。その代わり、現時点で最も研究が進行しているSL酸化体の生合成・代謝に重点を置くことにし、今年度確立した分析系を用い、in vivoでのSLの代謝を確認する。また同様の試験系を用い、酸化酵素阻害剤のスクリーニングを行う。引き続き、SLの代謝酵素に注目して研究を進めていく。5-DSからストリゴールもしくはソルゴモールへの変換を触媒する酵素はP450であることが判明したので、いくつかのウニコナゾール類縁体を購入し、これらの反応を特異的に阻害する阻害剤のスクリーニングを行う。また今年度の研究を通して、SLの代謝経路だけでなく生合成に関わるいくつかの結果が得られた。今年度SL生合成の一部が明らかになったので(Alder, et al. 2012, Science)、それを踏まえてSLの生合成経路の解明にも着手していく。具体的には、5-DSを経由しないでオロバンコールを生合成する植物に対して市販の酸化酵素阻害剤を処理し、内生オロバンコールの減少や増加する物質の探索をLC-MSを用いて行う。
蛋白質のハイブリッド化による成長因子受容体を標的とする細胞増殖阻害分子の構築

標的細胞の選択的増殖阻害分子の構築を目的としてヒト塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)といくつかの消化酵素(ヒト膵臓RNase1,ウシRNaseA,ブタペプシノーゲン)を遺伝子上で融合,あるいは化学的に架橋したハイブリッド蛋白質を調製した。調製したRNase1-bFGF融合蛋白質及びRNaseA-bFGF架橋蛋白質は,約3μM及び約0.4μMの濃度でFGF受容体高発現マウス黒色腫B16/BL6細胞株の増殖を50%阻害(GI_<50>)したが,ペプシノーゲン-bFGF架橋蛋白質は顕著な増殖阻害効果を示さなかった。また,RNase1-bFGFはいくつかのヒト由来の培養ガン細胞に対してもμMのオーダーで増殖を阻害し,そのうち3種類の細胞ではFGF受容体の発現が報告されていた。FGF受容体を発現しない細胞に対しては増殖阻害効果は認められないことから,RNase1-bFGFあるいはRNaseA-bFGFの細胞成長阻害活性はFGF受容体を過剰発現する細胞に対して特異的であると結論した。RNaseA-bFGFとRNase1-bFGFを比較し,RNase1-FGFの機能を蛋白質工学的に強化するための方策を検討した。その結果,毒素ドメインであるRNase1を,プロテアーゼによって消化されにくくすること,細胞内のRNaseインヒビターによって阻害されにくくするこ,さらには粗面小胞体に効率的に集積するためのシグナル配列を導入し,蛋白合成の現場で効率的に働かせることが重要であることがわかった。
緑膿菌Twitching Motilityの遺伝子機能阻害-RNAiによる治療

緑膿菌Twitching motility(以下TM)をtargetにしたsiRNAの治療応用について検討した。当教室で保有するTM欠損株と同じ遺伝子pilH,pilI,pilJ,pilKおよび線毛構成蛋白pilA遺伝子をtargetにしてsiRNAの設計を計画した。各緑膿菌遺伝子のシークエンスはhttp://www.pseudomonas.comより調べ、Web上の設計ソフト(http://design.rnai.jp)をもとにsiRNAをデザインした。各々のsiRNAをSIGMA Genosys siRNAServiceに発注して合成した。TM抑制効果の実験:(1)液体培地にsiRNAを加えて緑膿菌PAO-1株に受動的に作用させた(37°C、4時間静置培養)実験ではpilK抑制siRNAのみ79±9%(対Control比)の抑制効果を得たのみでpilH,I,Jでは十分な効果を得られなかった。(2)pilK抑制siRNAを用い、能動的に菌体への取り込みを促すために、大腸菌電気穿孔法を応用した。緑膿菌濃縮液(10%グリセロール加、2×10^<10>細胞数/ml)液を作成して、ジーンパルサー(Bio-Rad社)にて同液40μlにsiRNA10μlをくわえ、2.5kVにて通電した後、SOC培地にて1時間振盪培養を行った。Controlに比してsiRNA添加群ではtwitching抑制効果を得られていたが、抑制効果の発現率は60%前後ですべての菌体にsiRNAが取り込まれなかった。また電気穿孔法をin vivoで再現することは困難であり、緑膿菌は大腸菌より細胞壁が厚く、また細胞壁内蛋白が多く、複雑な菌体内環境の維持効果があると考えられていることからsiRNAを菌体内へ導入することは本期間内では難しく、今後他の方法を含めて再検討が必要である。緑膿菌標準株PAO-1を一晩LB寒天培地で培養し、滅菌PBSで洗浄後に濁度で菌数を1×10^8にそろえた。RNAase freeのPBSでさらに100倍希釈した菌液を分注して室温に整地した。各試験管に2μM相当の各siRNAを0、1、2、3時間のタイミングで添加して、菌体にsiRNAを作用させた。4時間後に菌を滅菌toothpickで採取してLB寒天培地(2% agar)の中央に底まで突き刺すように接種して37°C下48時間培養した。培地の底と寒天の間に接種点より同心円に広がるTwitching zoneの最長半径(mm)をもってTwitching motilityの評価とした。各siRNAの効用の比較はコントロールとして非作用PAO-1株のTwitching motilityを100%として相対評価とした。3)結果初回実験ではpi1K, pi1Aに対するsiRNA作用群が各々コントロールに比して、79±9%、81±9%と有意にTwitching motilityが低下していた(n=5)。しかし、欠損株であるΔpi1HIJK株に比べてその低下は少なく、再現性に問題があるため、siRNAが十分に作用しているのかあるいは菌体内に取り込まれていないのかの判定が困難であった。4)今後の展望菌体内へのsiRNA取り込みの方法としてElectroporationが用いられないか、検討中である。またsiRNAが効用しているか評価のためにtarget遺伝子の遺伝子発現あるいは蛋白発現の評価方法を検討中である。2)Twitching motility抑制効果の実験:液体培地にsiRNAを加えて緑膿菌PAO-1株に受動的に作用させた(37°C、4時間静置培養)

実験ではpilK抑制siRNAのみ79±9%(対Control比)の抑制効果を得たのみでpilH, I, Jでは十分な効果を得られなかった。次にpilK抑制siRNAを用い、能動的に菌体への取り込みを促すために、大腸菌電気穿孔法を応用した。緑膿菌濃縮液(10%グリセロール加、2×10^<10>細胞数/ml)液を作成して、ジーンパルサー(Bio-Rad社)にて同液40μ1にsiRNA10μ1をくわえ、2.5kVにて通電した後、SOC培地にて1時間振盪培養を行った。siRNAを加えず通電した菌をcontrolとして2mm厚の2%寒天含Luria-Betani培地の中央底に近を接種して、37°C,48時聞培養して形成されるtwitching zoneの最長半径を比較した。3)結果:Controlに比してsiRNA添加群ではtwitching抑制効果を得られていたが、抑制効果の発現率は60%前後ですべての菌体にsiRNAが取り込まれなかった。また電気穿孔法をin vivoで再現することは困難であり、緑膿菌は大腸菌より細胞壁が厚く、また細胞壁内蛋白が多く、複雑な菌体内環境の維持効果があると考えられていることからsiRNAを菌体内へ導入することは本期間内では難しく、今後他の方法を含めて再検討が必要である。
bHLH蛋白質(E2A)によるB細胞クラススイッチ制御機構の解析

1.分化抑制因子Idは、種々の細胞分化過程で重要な役割を果たすbasic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子の機能阻害因子であり、細胞分化を抑制して未分化状態を維持する活性を持つ。この機能抑制因子のひとつ、Id2の欠損マウスの血中IgEが著明に上昇しており、CD4T細胞の分化が、Th2に傾いていることを見出した。これは、1.生体内でのヘルパーT細胞分化がTh2にシフトしていること2.B細胞のIgEクラススイッチが亢進していることに起因することを明らかにした。Th2型サイトカインの産生はCD8+樹状細胞の欠陥がひとつの原因である可能性が示唆された。また、IgEのクラススイツチにはE2Aという転写因子が重要であり、E2Aの負の制御因子であるId2が実際にIgEのクラススイッチを負に制御していることが明らかになった。さらに,TGF-β1がId2を誘導する活性を持ち、過剰なIgE産生の負の制御因子として働いていることも明らかにした。2.Idの過剰発現によりクラススイッチが抑制されることから、IdはAID発現の負の制御因子として働いているのではないかという作業仮説を検証した。Id2過剰発現B細胞ではAID発現が1/5に減少していた。さらに、Id2欠損マウスのB細胞では通常の五倍の発現していることを見い出した。さらなる解析の結果、AID転写はPax5とIdのバランスで制御されていることが明らかになった。3.クラススイッチ組み換えは領域特異的(S領域)DNA組み換えであり、この結果、抗体遺伝子に様々な異なる生物学的機能が付与される。スイッチするべきクラスの決定は、S領域への組み換え酵素のaccessibility制御によることが想定されているが、その分子的実体は明らかではない。Accessibilityはヒストンアセチル化、もしくは転写(Germline転写)によって制御されていることが想定されているが、クラススイッチにはGermline転写が必須であることが明らかになった。分化抑制因子Idは、種々の細胞分化過程で重要な役割を果たすbasic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子の機能阻害因子の一つであり、細胞分化を抑制して未分化状態を維持する活性を持つ。bHLH型転写因子(E2A等)の機能抑制因子のひとつ、Id2の欠損マウス(パイエル板・末梢リンパ節欠損、CD8T細胞数低下、NK細胞数低下などの特徴を持つ)の血中IgEが著明に上昇しており、CD4T細胞の分化が、Th2環境に傾いたマウスであることを見出した。このことから、Id蛋白を介するbHLH転写因子の制御の乱れがIgE産生、Th2への分化亢進の要因の一つである可能性が示唆された。また、CD8T細胞の欠陥が非常に重要であることを明らかにした。この欠陥はIL-12,IFN-γ以外のCD8T細胞のもつ機能であり、その実体は現在解析中であるB細胞のIgEクラススイッチ亢進は、Id2の欠失によるE2A活性の亢進により、IgEへのスイッチが直接的に増強されていることが明らかになった。

さらに実際生体内では、Id2がTGF-β1により誘導され、TGF-β1によるIgEクラススイッチ抑制のエフェクター分子として働いていることも明らかにした。1.アレルギーの原因となるIgE抗体は、他の抗体の1/1000以下という低い血中濃度で維持されていることは広く知られていたが、その分子機構は全く不明であった。Id2欠損マウスの血中IgEレベルが亢進していることをみいだしたため、Id2がIgEクラススイッチの負の制御因子として機能しているのではないかとの作業仮説として実験を行った。その結果、IgEのクラススイッチにはE2Aという転写因子が重要であり、E2Aの負の制御因子であるId2が実際にIgEのクラススイッチを負に制御していることが明らかになった。さらに,免疫系のホメオスタシス維持に重要であるTGF-β1がId2を誘導する活性を持ち、過剰なIgE産生の負の制御因子として働いていることも明らかにした。2.Id2(ベーシックヘリックスループヘリックス型転写因子であるE2Aの抑制因子)の過剰発現によりクラススイッチが抑制されること(Murreら)から、我々の研究室ではIdはAID発現の負の制御因子として働いているのではないかという作業仮説をもとに、さらには実際にAIDの発現を正に制御している因子を検索する目的にて実験を行った。まず我々は、Id2過剰発現B細胞でのAID発現が1/5に減少していることをみつけた。さらに、Id2欠損マウスのB細胞は正常個体の五倍のAIDを発現していることを見い出した。さらにAID発現には、Pax5が正の制御因子として働いていることを示した。3.クラススイッチ組み換えは領域特異的(S領域)なDNA組み換えであり、この結果、抗体遺伝子に様々な異なる生物学的機能が付与される。スイッチするべきクラスの決定は、エンハンサー、プロモーターによるS領域への組み換え因子のaccessibility制御によることが想定されているが、その分子的実体は明らかではない。そこでまずはじめに、ヒストンアセチル化、germline transcript、クラススイッチ組み換えが常に正の相関をしめすことを見い出した。次に、IL-4はIgEへのスイッチを亢進因子、TGF-β1は、IgE特異的なスイッチ抑制因子であることを利用し、さらにTSAを加えることにより、IgEローカスにてgermline transcriptが発現せずに、ヒストンのアセチル化された状態を作り出すことに成功した。この時、IgEへのスイッチは抑制されたままだったことから、クラススイッチのaccessibility制御はヒストンアセチル化ではなく、転写自体がより重要な役割を果たしていることが示唆された。
曲面の特徴線抽出による形状の類似識別

前年度の研究成果として、平滑化の適応に関して入力形状に平滑化を行うのではなく、公正された中立面に対して平滑化を行った方が良いことがわかった。中立面の縁は尾根谷線に一致し、尾根谷線の抽出に際しては中立面の縁線を検出する必要がある。本研究で用いた中立面は二面で構成される特殊な構造を持つ為、面の折り返し線が中立面における縁、すなわち入力形状の尾根谷線となる。以前は、面の折り返しを判定する際に、単純な内積判定を用いていたが、上記平滑化を行うことで縁に該当する部分が丸くなり、内積判定だけでは十分な制度を得られず、尾根谷線の抽出精度は逆に悪くなる結果が得られた。中立面の特徴として入力形状の少量のノイズに対し過敏に反応する点があり、平滑化はノイズ処理のため不可欠である。しかしながら、平滑化を行った後で中立面の形状を調べたところ、縁付近における曲率は高い値を保持しており、平均曲率を用いた手法により中立面の縁抽出が安定して行えることを確認した。上記手法により抽出された尾根谷線を元に、それぞれの線上における曲率の分布を調べ、階層化することにより、大まかな形状の類似性は判定可能となったが、現存する類似識別手法と比べると本手法の制度は劣る。原因としては、形状全体の曲率分布を考慮していない点が挙げられる。本手法では、特徴線のみを比較している為、極端に異なる形状であったも、2つの形状が同じような特徴線分布を持っている場合、類似度が高いという結果に至ってしまう。特徴線における曲率分布の比較だけではなく、それぞれの特徴線の座標値等も考慮して比較判定を行うことで、本手法の精度を向上させることができると思われる。本年度における初段階の研究として、3Dスキャナによって取得された形状データに対する平滑化に関して調査を行った。Laplacian等の一般的な平滑化手法を適用した場合、入力データにおけるノイズの量によっては、大部分の特徴情報も平滑化されてしまい、本研究の目的である特徴線による類似識別には不向きであると予想された。平滑化を行うことでどの程度特徴が保持されるかを検討したが、やはり入力データに対して平滑化を行うことは本研究の主題には不向きであるという結論に至った。本研究では特徴情報取得のため、入力された形状データから中立面を構成する。中立面の構成にはボロノイ図を使用するが、ボロノイ図の構成は入力データのノイズに左右される為、入力データのノイズが著しい場合には少量の平滑化が必要となる。ただし基本的には入力データに対しては平滑化を行わず、入力データから構成された中立面に対して平滑化を行うことにした。本研究における最終目的として、"2つの形状が与えられそれらがどの程度類似しているかを数値的に表現し判定を行えること"があげられる。形状の類似度を判定する際に、処理の効率化のため数段階の特徴レベルを設定した。本研究においては、入力された形状における曲率からこれら特徴のレベル設定を行った。入力された形状と構成された中立面は1対1の対応関係を持つ。中立面のある箇所と入力された形状における対応箇所の距離は中立面の定義から、対応箇所における曲率半径に相当する為、これら距離の計算により曲率を近似することができる。今回の実験では入力された形状の最大主曲率と最小主曲率を5段階から10段階程度に分け、それぞれのレベルにおける分布を調査することで類似度の判定が可能かどうか検討した。類似度の判定方式に関して現在も研究を続けており現段階として結論を出すに至っていない。
特異空間の変分法

松井の一つの研究はリーマン多様体に埋め込まれたグラフの変分についてである。これは以前から研究していたがその間違いなども訂正した。グラフの辺は張力に関してばねの性質を持つとする。ユークリッド空間の中の延びた状態のグラフが張力の影響で動くと張力ベクトルの大きさの総和は減少するので、リーマン多様体のなかでグラフが張力ヤコビ場に沿って動くと張力ベクトルの大きさの総和は減少すると考えた。負曲率多様体それが成り立つことが証明できたが、一般には成り立たないような例が構成できた。次にハミルトングラフの一般化を試みた。グラフの各頂点に零以上の整数もしくはmod nの整数を定めるそれを分配と呼ぶことにする。グラフの歩道に対して分配が定義される。二部グラフでないときは歩道から作られるmod n分配が与えられた任意のmodn分配に等しくなるような歩道が存在することを証明した。二部グラフの場合はそうなる必要十分条件をもとめた。石井は二つのパラメータをもつ二階連立線形微分方程式の固有値問題を研究した。大矯はWalsh関数列に限定した時、どんな部分列から作られたサンプル過程がウィナー過程へ収束するかという問題を研究した。グラフをバネをつないで出来たもの考える。グラフが多様体の中で辺が伸びが状態ではめ込まれたとする。辺が測地線で各頂点での張力和(張力ベクトルと呼ぶことにする)が0のとき測地的と呼ぶことにする。各頂点を固定し、辺が測地線であるとする.このときいくつかの頂点をはなすと張力ベクトル方向に移動するであろう。当初張力ベクトルの大きさは移動の瞬間小さくなる、即ち、張ベクトルの大きさの総和を張力ベクトル方向に微分すると負になると考えた。負曲率多様体のなかでグラフの各辺が伸びているときは負になる.正曲率多様体のときはそれが正になる例が構成出来た。グラフのはめ込みに対し張力ベクトルのエネルギーの概念を導入すると張力ベクトルにより作られるヤコビ場方向の第一変分がほぼ張力ベクトルの大きさの総和に等しい.また第二変分が張力ベクトルの大きさの総和の微分に等しいことがわかった。大橋はWalsh系の部分系から作られた部分和を考えた。区間[0,1]上に適当な順番のついた点で、この部分を値としてとり、その他は線分で結ぶときに出来る関数をX(n)とする。この関数X(n)は区間[0,1]上の確率過程である。こと確率過程がどのような条件のときWiener過程へ収束するか調べた。石井は2変数のパラメータをもつ固有値問題を考えその2変数の間の解析的性質を調べている。松井は一つはリーマン多様体に埋め込まれたグラフの変分について研究した。これは以前から研究していたが間違い等も訂正した。リーマン多様体に埋め込まれたグラフの各頂点に対して張力ベクトルを定義し、グラフの張力ヤコビ場の概念を導入する。負曲率多様体それが成り立つことが証明できた。また一般には成り立たないような例が構成できた。石井は二つのパラメータを持つ2階連立線形微分方程式系に対して、「一般化された固有値問題」を検討し、固有値の分布状況と、その時のパラメータ同士の関数関係、それに対する固有関数の存在を示した。
眺望景観の保護に関する計画論的研究

イギリス・フランス・ドイツ・オーストリア・イタリア・アメリカ・カナダの欧米7カ国の景観に関する計画諸制度をわが国で初めて綿密に比較検討した。さらに主要都市として、ロンドン・パリ・ウィーン・シュツットガルト・ローマ・ボストン・サンフランシスコ・バンクーバー・モントリオールという主要9都市の都市計画施策とその運用実態を明らかにした。調査の中で明らかになった点として、景観問題が特別な立法による規制以前に、都市計画システムの中で考慮される仕組みが形成されていること、歴史的環境の保全問題が主要な課題として取り組まれていること、詳細な地区データが蓄積されており、これをもとにきめの細かいデザインコントロールが実現していること、モニュメントや周辺の山並みなどに対する眺望が主要な規制対象として挙げられて来つつあること、総じて都市の周辺部や農地を含んだ風景計画が計画対象としてここ10年の間に確立しつつあるということなどが具体的な制度とともに明らかにされた。さらに市民参加の手続きの具体的な方法や、行政の裁量の具体的なあり方をヒアリングによって明らかにした。裁量のもとには詳細な規制があること、眺望保存の試みは各国とも実験段階であることなどが明らかになった。欧米諸国の眺望景観規制(たとえばイギリス・ロンドンのセント-ポールズ・ハイツ、ヴィジュアル・コリド-、フランス・パリのフゾ-規制、イタリア・ガラッソ法(1985年)による農村景観規制、アメリカ各都市の眺望規制の内容を比較整理した。とりわけ特に以下の規制手法について重点的に情報を収集した。イギリスでは、ロンドンの新しいユニタリー・ディベロップメント・プランにおける眺望規制の扱いを明らかにした。フランスでは、パリの土地占有計画(POS)といわゆるZPPAUP(都市・農村・景観風景規制地区)の実態を調査した。イタリアでは、農村風景の保存に関するガラッソ法の詳細とその運用について明らかにした。アメリカでは、ボストンの眺望景観保護のための条例の整理とその運用状況を明らかにした。カナダでは、ヴァンクーバーならびにモントリオールにおける眺望景観規制手法の対比を行った。これらの成果は隔月刊『造景』各号に連載しているところである。
ベトナム紅河デルタ農村の地下水ヒ素汚染に対する大量化学肥料投与の影響評価

ベトナム・ハノイ市南部農村では、地下水のヒ素濃度(μg/L)最高150、平均40と高い値であった。地下水中のヒ素は、堆積物に含まれるヒ素が地下水の還元環境下で溶出することにより発生していた。窒素肥料は、地下水のアンモニウム態窒素の発生源となっており、地下水ヒ素濃度の高い所では、この窒素の濃度が高くかつ酸化還元電位は低く、窒素肥料の地下水ヒ素汚染への関与が認められた。リン肥料の地下水ヒ素汚染への関与の度合は小さかった。ベトナム紅河デルタの農村で発生している地下水ヒ素汚染について、農業で大量に使用される化学肥料がこの汚染にどの程度影響しているかを、現地での水質モニタリングと関連土地環境の調査等によって、評価する。2006年10-11月にベトナムを訪問し,ハノイ農業大学の共同研究者とともに,ハノイ近郊農村の地下水のヒ素汚染に関する情報を収集し,同地域で5つの農村を調査対象地に選定した.これら各農村で,クロッピングパターン・化学肥料の施肥状況を調査し,地表水と地下水(各5-6箇所)の水質測定を行った.調査の結果,各農村のクロッピングパターンは,稲作,稲作+野菜作,野菜作のいずれかで,これらクロッピングパターンの年間の窒素施肥量は220-2,600kg/haの範囲であった.地下水のヒ素濃度は,いずれの農村でもWHO飲用水水質基準(10ppb)を超える所があり,100ppb以上の箇所も3農村で見出された(最大値145ppb).地表水のヒ素濃度は,地下水よりも低かった(最大値80ppb).地下水のヒ素濃度が高い農村では酸化還元電位が低く(130mV未満),地下水中のヒ素は,還元的な状態で地中から溶出した可能性が高い.地下水のアンモニウム態窒素(NH_4-N)濃度(各農村の平均値2-21ppm)は,地下水ヒ素濃度の高い農村で高い傾向があり,地下水のアンモニウム態窒素の富化とヒ素汚染との間に因果関係があると判断された.硝酸態窒素(NO_3-N)濃度は,地表水・地下水ともに低かった(ほぼ2ppm未満).各農村の代表的地下水サンプルについて窒素同位体比分析を行った結果,地下水の無機態窒素(NH_4-NとNO_3-Nを合わせたもの)の起源は,全農村のうち3農村が化学肥料,他の2農村は畜産廃液と判断された.このことより,まだ定性的な推論ではあるけれども,地下水へのヒ素溶出には,化学肥料はもちろん,畜産廃液も影響している可能性のあることが明らかになった.ベトナム紅河デルタ農村で行った地下水ヒ素汚染に関する調査結果を、2007年9月にハノイで行われたセミナーで発表した。即ち、調査した複数の農村のうち、ハノイ市南部の農村では、井戸水のヒ素濃度がWHO水質基準(10 ppb以下)を超え、各農村の平均値は6080ppの範囲であった。地下水の酸化還元電位とヒ素濃度の関係から、地下水の還元的状態が強まるにつれ、井戸周辺の地層から地下水中により多くのヒ素が溶出していることが示された。また、地下水を還元的にする要因として、農地への窒素化学肥料の投入と畜産廃液の浸透が考えられた。2007年6月には、ベトナム南部ドンナイ省の農村で、井戸水のヒ素濃度を調査した。ここでも、ハノイ付近の農村と同様、農地に大量の化学肥料が投入されていた。しかし、井戸水のヒ素濃度は、調査した15地点で0.10.5ppb、と低かった。地下水のヒ素汚染は見られず、その背景として地層がヒ素を含まないことが考えられた。2008年3月には、ベトナム南部メコン川沿いにあるドンタップ省の農村で、地下水ヒ素濃度を調査した。調査した7箇所の井戸水のヒ素濃度は2502,500ppbの範囲で、極めて高かった。この高いヒ素濃度が発生する背景として、地層がヒ素を大量に含むことが考えられた。この農村でも農地への化学肥料投入量は多かったが、畜産農家の井戸水でもヒ素濃度は高く、地下水ヒ素汚染の背景には、化学肥料投入と畜産の影響の両面が考えられた。地下水の酸化還元電位は60100mVと低く、地下水は還元的状態であった。以上の結果より、地下水のヒ素汚染は、高濃度のヒ素を含む地層と接している地下水が何かの要因で還元的になり、ヒ素が地下水へ溶出することによると考えられた。投与された化学肥料は、地下水の還元化を進める要因として作用し、地下水のヒ素汚染をもたらす可能性が示唆された。ベトナム・メコンデルタの農村で2008年に行った地下水ヒ素汚染調査の結果を、2009年にバングラデシュで開かれた「地下水ヒ素汚染から人的健康被害に関するセミナー」で発表した。

調査した農村では、地下水のヒ素濃度は平均1,050ppbで、これはWHO水質基準を大幅に超えていた。地下水ヒ素濃度と酸化還元電位およびペーハー値には負および正の各相関関係があり、地層から地下水へのヒ素溶出機構として、還元溶出と、配位子交換の2つが考えられた。地下水ヒ素濃度の高いところでは、アンモニウム態窒素濃度も高く、アンモニウム態窒素が間接的にヒ素の還元溶出に係わっていると考えられた。また、2008年にベトナム・紅河デルタで地下水ヒ素汚染の調査を行った。このうち前回地下水ヒ素濃度の高かったハノイ南部の農村では、地下水の水質を再測定した。また海岸近くの地区を調査対象に加え、ここでも他と同様の調査を行った。ハノイ南部の農村では今回も地下水のアンモニウム態窒素濃度が高かった(平均15mg/L)。海岸近くの地区では、地下水にヒ素は殆ど検出されなかった。地下水のアンモニウム態窒素濃度は平均で4mg/Lで、比較的大きかった。ここでは、地下水にヒ素が溶出しやすい環境にあるが、地層中にヒ素が含まれないと考えられた。水の流れのシミュレーションには、地形、土壌、水理条件および気象要素、特に日射量が必要である。ここでは、気温・日照時間から日射量を予測するモデルについて、諸モデル間の予測精度の比較を行った。日照時間・気温・日射量を紅河デルタ農村で実測し、その値を各モデルにあてはめて検討した。その結果、Angstromのモデルの精度が良く、気温のデータし得られない所では、Hargreavesのモデルの精度が良いことがわかった。紅河デルタに位置するハノイ市南部の農村を対象にして、地下水ヒ素濃度の時空間的変動について`検討し、またその濃度と地下水の酸化還元電位、アンモニウム態窒素濃度との関連を解析した。さらに、地下水ヒ素濃度と地下水の深さとの関係についても検討した。対象とした農村は、都市近郊農村で、農地では、年に複数回稲作または野菜作が行われ、筆者らの現地調査によれば、農地への窒素化学肥料施肥量は年間に140-1600kg/haで、ばらつきはあったが全般に大きな施肥量であった。地下水の調査はこれまでに2回、2年の間隔を置いていずれも乾季に行った。地下水ヒ素濃度は、対象地全体の最大値がおよそ150μg/Lで、これはWHO水質基準の約15倍の値であった。農村別に見ると、対象とした4農村のうち3農村で、ヒ素濃度の最大値は100μg/L以上で、これら農村全体としてはヒ素濃度が高いと認められた。しかし、各農村及び各調査時期の違いによる地下水ヒ素濃度の違いは認められなかった。地下水の酸化還元電位が低い箇所で、また、そのアンモニウム態窒素濃度が高い箇所で、それぞれ地下水ヒ素濃度が高い傾向が認められた。前者より、地下水の還元的環境下で堆積物に含まれるヒ素が地下水に溶出していること、後者より、堆積物からのヒ素溶出に農業における窒素化学肥料施肥が加担しているとそれぞれ推察された。さらに、地下水ヒ素濃度は、地下水の深さが40-65mの箇所で最も高いとう結果が得られた。これについては、対象地域の40-65mの深さの堆積物がヒ素を多く含み、このヒ素が地下水に溶出しているためと考えられた。
新規脳キナーゼLMTK1の生理機能と神経病理に関する先駆的な研究

Lemur kinase 1 (LMTK1)は哺乳動物脳で高発現する新規キナーゼである。やはり脳で機能するキナーゼCdk5に結合するタンパク質として単離された。長らく機能不明であったが、最近、LMTK1活性の低下(ノックアウト、ノックダウン、不活性型の発現など)が軸索や樹状突起の過形成を引き起こすことから、軸索や樹状突起の伸長をネガティブに制御していること、および、その仕組みとしてRab11を介したエンドソーム輸送を介してであることを明らかにした。昨年度では、LMTK1ノックアウトマウスのオープンフィールドテストから多動であることを見つけた。今年度では、メチルフェニデートを用いて、多動が抑えられることから、LMTK1ノックアウトマウスと注意欠陥多動性障害との関係が示唆された。LMTK1ノックアウトマウスを用いてさらなる行動解析を行った。その結果、記憶形成などには異常は見られなかったが、高架十字テストでは不安様行動が低下していることがわかり、自閉症の表現型の一部を再現することが示された。また、昨年度にはLMTK1ノックアウトマウスの脳でシナプスが増加していることを見つけたが、今年度はさらに詳しい解析を進めた。培養神経細胞でLMTK1をノックダウンすると、樹状突起におけるスパインの密度が増加することが示された。これにはRab11を介したエンドソーム輸送が関与していた。LMTK1はRab11の不活性化を介して、スパイン形成をネガティブに制御していること、それにはRab11の不活性化因子であるRab11-GAPのTBC1D9Bが関わることを見つけた。LMTK1が神経軸索、樹状突起、スパインを制御する分子カスケード、LMTK1-TBC19B-Rab11-recycling endosomeが初めて明らかとなった。LMTK1のスパイン形成における役割については現在論文投稿中である。長らく機能不明であったが、最近、LMTK1活性の低下(ノックアウト、ノックダウン、不活性型の発現など)が軸索や樹状突起の過形成を引き起こすことから、軸索や樹状突起の伸長をネガティブに制御していることを明らかにした。本研究では、LMTK1の新規機能として、スパイン形成における役割を検討した。スパインの形成や形態に対する影響は培養神経細胞と胎児脳を用いて調べた。培養神経細胞でスパイン形成を観察するには軸索や樹状突起形成よりもより長い培養日数を要する。培養14日目以降でLMTK1をノックダウンしたり、不活性型LMTK1を発現させ、その影響を調べた。その結果、LMTK1活性を抑えるとスパインの大きさ、密度が増加することを見つけた。子宮内穿孔法を用いて、マウス胎児脳におけるLMTK1をノックダウンし、分化後の神経細胞を観察したところ、形成されたスパインが減少していた。以上のことからLMTK1はスパイン形成にもネガティブに働くことが明らかとなった。LMTK1はRab11活性を制御している。Rab11活性に関与する因子としてGrabを見つけた。Grabは小胞輸送を制御するRab11のエフェクターであり、Rab8の活性化因子である。Grabの軸索伸長に対する影響を調べたところ、Grabも軸索伸長調節の一つであり、その活性はCdk5によるリン酸化で制御されていることを見つけた。Cdk5はLMTK1とGrabのリン酸化を介して、Rab11の上流と下流の両方で軸索伸長を制御することが判明した。LMTK1は新規の脳キナーゼであり、その機能ばかりでなく、基礎的な情報も不足している。LMTK1のマウス脳における発現をRT-PCR法、ウェスタンブロット法とin situ hybridization法により検討し、ほどんどの神経細胞と一部のグリア細胞に発現していること、発現は加齢に伴い上昇することなどを明らかにした。また、LMTK1にはAとBの二つのアイソフォームがあるが、それらを別々に検出できるプライマーを作成して定量的PCRを行なったところ、マウス脳内ではLMTK1AとLMTK1Bがほぼ同じ割合で発現していることが判った。また、LMTK1ノックアウトマウスを用いて、脳の形態に対する影響を調べた。光学顕微鏡レベルでは大きな異常は観察されなかった。電子顕微鏡で小脳プルキンエ細胞のシナプス部位を観察したところ、プレスナプス領域が増大している傾向が見られた。LMTK1及び関連因子の細胞内小胞輸送における役割についても検討した。特にLMTK1の新規機能として、樹状突起のスパイン形成に注目して実験を行なった。その結果、LMTK1はRab11活性を阻害的に制御することにより、スパインの密度と大きさを適切に保つように働いていることが判明した。更に、関連因子であるGrabの解析も行い、Grabは軸索伸長を制御していること、及び、その活性はCdk5によるリン酸化で調節されていることも明らかとした。

本研究では、LMTK1の二つのアイソフォーム、LMTK1AとLMTK1Bの発現パターンの解析やノックアウトマウスを用いて行動解析を行った。LMTK1には膜貫通領域の有無によって、LMTK1A(膜貫通配列なし)とLMTK1B(膜貫通配列あり)が存在する。しかし、これまでの研究のほとんどはLMTK1Aで行われてきた。そこで、LMTK1Bがどの程度発現しているかをまずは調べた。それぞれを特異的に認識する抗体は存在しないため、mRNAレベルでの検討を行った。LMTK1A、LMTK1Bともに発生直後の脳で検出されたが、発達に伴い量は増加していた。成体に到るまで、ほぼ同じ程度で発現していた。脳内のほとんどの神経細胞で発現が見られ、一部のグリア細胞でも発現しているようであった。ノックアウト(KO)マウスの脳の組織を観察したが大きな異常は見られなかった。ただし、シナプスタンパク質に対する抗体で脳を染色した時、シナプスの数が増加していることが判明した。電子顕微鏡観察を行うとシナプス前週末の肥大が観察された。シナプスの増加は発達障害でも報告されている。LMTK1 KOマウスの行動解析を行ったところ、不安様行動が減少して、行動が過剰になっていた。現在論文を執筆中である。これらは自閉症の特徴とも一致しており、LMTK1 KOマウスは自閉症モデルマウスとして利用できる可能性が示された。LMTK1は新規の脳キナーゼであり、その機能ばかりでなく、基礎的な情報も不足していた。LMTK1のマウス脳における発現をRT-PCR法、ウェスタンブロット法とin situ hybridization法により検討し、ほどんどの神経細胞と一部のグリア細胞に発現していること、発現は加齢に伴い上昇することなどを明らかにした。LMTK1には非膜貫通型のAと膜貫通型のBの二つのアイソフォームがあるが、それらを初めて別々に検出し、マウス脳内ではLMTK1AとLMTK1Bがほぼ同じ割合で発現していることが判った。この様にLMTK1についての基礎的な知見を本年度の研究で得ることができた。LMTK1 KOマウスの表現形はLMTK1の生体内での機能についての情報を得ることができる。KOマウスを用いて、脳の形態や行動に対する影響を調べた。脳の構造については、小脳を中心にして調べた。蛍光抗体法によりシナプスの数が増加していることが判明した。電子顕微鏡で小脳プルキンエ細胞のシナプス部位(平行繊維領域)を観察したところ、プレスナプス領域が増大していた。また、昨年度から今年度にかけてLMTK1のシナプス形成に対する影響も検討を続けていた。その点における大きな進捗はLMTK1がRab11を制御する仕組みを見つけたことである。LMTK1はRab11のGAP(不活性化因子)であるTBC1D9Bを活性化し、Rab11活性を抑制していることが判明した。これによりCdk5から、LMTK1/TBC19B/Rab11/recycling endosomeというシグナル伝達のカスケードが確立された。
出生三世代コホートによる常位胎盤早期剥離の遺伝・環境要因の究明

常位胎盤早期剥離(PA: Placental Abruption)は、全妊娠の0.4-1.0%に発症する多因子疾患であるが、いまだ明確な原因は不明である。これまで多くのリスク因子が報告されているが、民族差も大きいことが知られている。本研究は、出生三世代コホートの検体・情報を用い、夫婦児トリオの複雑な遺伝効果を考慮に入れたゲノムワイド関連解析を行う。具体的には、これまで報告された疾患感受性遺伝子変異の妥当性検証を行い、さらに新規ゲノム変異の探索を行う。加えて、これらのゲノム変異情報に、疾患に有意に関連する疫学的要因を加えることで、発症予測式構築を目指す。