hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モルフォーゲン勾配によるマウス初期胚細胞の動態制御機構

これは、細胞外基質と細胞表面でのヘパラン硫酸の微細構造の違いが、ヘパラン硫酸の機能的な差異を生む一因であることを示唆している。3、我々は、マウス前脳領域においてWntシグナルがエピブラストから神経前駆細胞又は表皮細胞への細胞運命を制御していることを明らかにしている。今年度は、どのような下流標的因子を介して制御しているのか明らかにするため、8日目胚の前脳神経上皮と隣接する表皮外胚葉を用いて、マイクロアレイ解析を行い、表皮外胚葉特異的に発現する標的候補群をプロファイリングした。更に、詳細に発現解析を行うことで、候補遺伝子が、発生過程において表皮外胚葉の系譜で発現していること、Wntシグナル活性の挙動とも良く一致することが分かった。ヘパラン硫酸鎖を介して、FGF等の拡散性シグナル因子の活性がどのように制御されうるのか、マウス初期胚発生過程における細胞動態や分子の発現を詳細に解析することによって、新規な知見(ヘパラン硫酸鎖の脱硫酸化などの微細構造の差異がFGFシグナルの局所的活性と相関する点等)を見いだしており、順調に進展している。Ext2欠損胚では、原条形成は起こるが、中胚葉の移動が正常に進行しないことが分かっている。そこで、中胚葉の移動過程において、拡散性シグナル因子が、ヘパラン硫酸鎖を介してどのように細胞動態を制御しているか明らかにするため、ヘパラン硫酸鎖、拡散性シグナル因子、中胚葉細胞の移動に働く分子などの発現を単一細胞レベルで解析する。
自己免疫疾患治療を目指した新規蛋白性アンタゴニストの創製

本研究は、リウマチや多発性硬化症などの自己免疫疾患の克服を目指し、腫瘍壊死因子(TNF)の2種類の異なるレセプター(TNFR1およびTNFR2)のうち、特に炎症反応の惹起に深く関わるTNFR1に選択的結合能を有した構造変異TNFアンタゴニスト(TNFR1指向性アンタゴニスト)の改良と治療効果の検討を通じて、画期的自己免疫疾患治療薬の開発に有用な知見を集積した。本研究は、リウマチや多発性硬化症などの自己免疫疾患の克服を目指し、腫瘍壊死因子(TNF)の2種類の異なるレセプター(TNFR1およびTNFR2)のうち、特に炎症反応の惹起に深く関わるTNFR1に選択的結合能を有した構造変異TNFアンタゴニスト(TNFR1指向性アンタゴニスト)の改良と治療効果の検討を通じて、画期的自己免疫疾患治療薬の開発に有用な知見を集積するものである。本年度は、我々が独自に創出したリジン欠損TNFR1指向性アンタゴニストであるT2の体内安定性を高める目的で、N末端へのバイオコンジュゲーションを試みるとともに、自己免疫疾患に対する有用性について、慢性関節リウマチのモデルであるコラーゲン関節炎(CIA)モデルを用いて検討を行った。T2に対して、N末端部位特異的PEG化を行ったPEG-T2は、比活性の低下を招くことなく未修飾T2と同等のアンタゴニスト活性を保持し、かつ優れた体内安定性を呈した。続いて、PEG-T2のCIAモデルにおける有効性を検討したところ、PEG-T2投与群では顕著な関節炎抑制効果を発揮し、既存のTNF阻害薬Etanerceptと同程度の関節炎抑制効果を発揮したことから、有効な関節リウマチ治療薬となり得る可能性が示唆された。さらにT2は炎症の悪化に関与するTNFR1の作用を選択に阻害し、ウイルス感染防御に重要と考えられているTNFR2の作用は阻害しないために、既存の抗TNF療法で致命的問題点であった副作用を低減できるものと期待される。今後は、T2のさらなる安全性・有用性を評価すべく、既存のTNF阻害薬では投与禁忌と指定されている多発性硬化症モデルに対しての治療実験を進めるとともに、生体防御機構に及ぼす影響を評価する予定である。本研究は、疾患や治療目的、蛋白質の作用機序に応じて、特定蛋白質や特定レセプターに対する選択的結合能とアンタゴニスト活性を併せ持つ機能性人工蛋白質を薬物として応用し、治療効果の検討を通じて、画期的自己免疫疾患治療薬の開発に資することを目的とするものである。これまでに我々は、リウマチや多発性硬化症といった自己免疫疾患の発症や悪化に関わると考えられている腫瘍壊死因子(TNF)に着目し、その2種類の異なるレセプター(TNFR1およびTNFR2)のうち、特に炎症反応の惹起に深く関わるTNFR1に選択的結合能を有した構造変異TNFアンタゴニスト(RlantTNF)を創製することに成功している。また、近年の動物モデルを用いた検討から、多発性硬化症においてTNFR2が病態の寛解作用に関与することが示唆されており、TNFR2を介した作用を確保したままTNFR1の作用のみを選択的に阻害することが、新たな治療戦略として考えられる。そこで本年度は、RlantTNFの多発性硬化症のマウスモデルに対する治療効果を評価することで、新規自己免疫疾患治療薬としての可能性を検証した。なお実験には、体内安定性を向上させる目的で高分子修飾(PEG化)をしたPEG-RlantTNFを用いた。実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症させたマウスにPEG-RlantTNFを投与したところ、PBS投与群と比較してクリニカルスコアが低くなる傾向が認められた。既存のTNF阻害薬は多発性硬化症患者に禁忌に指定されているが、TNFR1選択性を付与したRlantTNFは、病態を悪化させることなく、症状を緩和させる可能性を示したことから、多発性硬化症患者にも適用可能であり、TNF阻害薬の自己免疫疾患治療薬としての適用範囲拡大に繋がるものと期待される。
サル類を用いた内分泌撹乱化学物質の神経発達影響評価系の確立

本研究では内分泌撹乱化学物質のヒトにおけるリスク評価、特に神経発達影響のリスク評価について有用な情報を提供するためにカニクイザルを用いた神経発達影響評価系の確立を試みた。まず、カニクイザルの神経発達を分子生物学的に評価した結果、生後直後から60日にかけて急激に発達することを明らかにした。また、この時期に甲状腺ホルモンを欠乏させると抑制性神経伝達システムの発達が妨げられることを明らかにした。加えて影響評価に適したカニクイザル胎仔由来神経系細胞の培養法を確立した。3年計画の初年である本年度は次年度以降に続く実験系の確立を最優先課題として研究を行った。1、カニクイザルにおける中枢神経発達カニクイザル脳組織発達の評価を行うため、胎齢50、80、110、140日、生後30日のカニクイザルの脳組織を各23例、組織学的または生化学的検索に適した形で採取した。現在、組織切片を作成し免疫組織学的手法等により神経発達イベントを解析している。2、カニクイザル由来神経幹細胞胎齢80日カニクイザル脳組織より得た細胞を神経幹細胞培養用の特殊な培養液中で培養することにより神経幹細胞から成ると考えられる細胞塊を成長させることに成功した。増殖スピードはげっ歯類のそれよりも著しく遅いが今後、これをさらに増殖させ神経幹細胞であることを分子生物学的に確認するとともに細胞株の安定供給・維持を目指す。3、ラットにおける甲状腺ホルモン欠乏モデル来年度はカニクイザルに抗甲状腺薬を投与することによりカニクイザル甲状腺ホルモン欠乏モデルの作成および解析を目指すが、その準備としてラットにおいてポンプによる持続的皮下投与の際の抗甲状腺薬の濃度等の条件を検討した。これは今後投与期間が長くなるサルで行う際に妊娠期の連続多数回経口投与によるストレス性流産をさけるために必要な検討である。4、水酸化PCBによる甲状腺ホルモン撹乱作用胎生期ラットに水酸化PCBを曝露し、生後直後の脳における遺伝子発現を評価したところ脳部位特異的に甲状腺ホルモン応答性遺伝子の発現変化が確認された。また、本実験結果より水酸化PCBによるグルタミン酸作動性神経伝達の異常が示唆された。ラット胎齢18日海馬または大脳皮質より得た神経細胞に対し甲状腺ホルモンと同時に水酸化PCBを添加し本物質の甲状腺ホルモン撹乱作用の確認を遺伝子発現変化を指標として評価している。3年計画の2年目である本年度は昨年度得られた結果を踏まえて以下のように研究を行った。1、正常カニクイザルの神経発達イベントカニクイザル脳の正常発達を組織学的、生化学的に評価するために胎齢50日、胎齢80日、胎齢110日、胎齢140日、生後30日、生後90日、成熟サルとして3歳の脳組織を各2例サンプルとした。その結果、カニクイザルの脳はマクロ形態(体積、シワ等)はほぼ胎齢140日で完成しているが、神経伝達に重要なタンパク質(シナプス構成タンパク、神経伝達物質受容体、および神経伝達物質合成酵素)は出生後爆発的に発現量を増すことが明らかとなった。また、げっ歯類では大脳神経細胞の発生は比較的早期(出生前)に終了することが知られているが、カニクイザルでは生後も持続的に増殖マーカー陽性細胞が観察できた。2、カニクイザルにおける発達期甲状腺ホルモン欠乏の神経発達イベントへの影響前述の事実を踏まえ、甲状腺機能低下カニクイザルの作成を抗甲状腺剤であるメチマゾールを生後3日目から60日目まで投与した。本実験は現在、新生仔の神経機能等の評価を含め精査中である。3、カニクイザル神経細胞を用いたin viroモデル系の作出前年度作成に成功した神経幹細胞様の細胞塊は非常に増殖能が低く、培養液に加える栄養因子等の改善による増殖能の改善を試みている。また、in viroで増殖能を有するアストロサイトに着目し、大脳皮質、海馬、小脳より大量のアストロサイトを培養することに成功した。現在これらの細胞に化学物質を曝露し、その影響についてげっ歯類との相違を評価している。3年計画の最終年度である本年度は以下のように研究を行った。1.正常カニクイザルの神経発達イベント胎齢80、11O、130日、生後30、60、90日、4歳のカニクイザルの前頭葉皮質、帯状皮質、尾状核、海馬、および小脳の神経発達に重要な一連のタンパク質発現をWesternblotting法により評価した。その結果、神経系細胞の分化は出生前にほぼ終了し、興奮性神経伝達系は胎齢後期から、抑制性神経伝達系は出生後急激に発達することを明らかにした。本成果は霊長類の脳発達の分子生物学的情報として広く神経科学分野にとって重要な情報となる。2.カニクイザルにおける発達期甲状腺ホルモン欠乏の神経発達イベントへの影響生後3日目から生後60日目まで甲状腺ホルモン合成阻害剤であるメチマゾールを投与したカニクイザルの前頭葉皮質、尾状核、扁桃体、海馬、および小脳の発達を評価した。

まず、生後60日においてメチマゾールにより甲状腺の過形成、血漿中甲状腺ホルモンの有意な減少を確認した。ついで項目1と同様に神経発達に重要なタンパク質発現を評価した結果、神経細胞の形態発達に重要な細胞骨格タンパク質であるMAP-2の発現低下、アストロサイトの形態発達に重要なGFAPタンパクの発現上昇傾向が確認された。さらに、抑制性神経伝達物質であるGABAを合成する酵素GAD67およびGABA受容体の部位特異的発現低下が確認された。本成果は世界で初めて霊長類であるカニクイザルにおける化学物質による脳発達の撹乱を分子生物学的に明らかにしたという意味で重要である。
スペイン・バロック演劇の研究

計画段階において本研究は総じて6章からなっていた(「平成8年度以降の研究計画・方法」を参照)が、研究の進展にともない全体の構想そのものに大きな変化はないものの、序と第3章が新たに加わり、またサブタイトルにも若干の修正が施され以下のように7章立てとなった。序、ロペ・デ・ベ-ガ以前の演劇第1章、スペイン・バロック演劇-(1)ルネサンス演劇からバロック演劇へ(2)コメディアの意味(3)ロペ・デ・ベ-ガと「新しい演劇」第2章、劇場と観客-(1)マドリードの常設劇場(2)観客(3)宮廷劇場第3章、演劇論争をめぐって第4章、喜劇(≪マントと剣≫のコメディア)-(1)喜劇の特徴(2)様々なモティーフ第5章、悲劇-(1)夫婦の悲劇と名誉意識(2)農夫と名誉意識第6章、宗教劇-(1)カトリック教徒と異教徒の汗格齟齬(2)聖体神秘劇第7章、バロック演劇にみる人生観しかしながら、まだ7章が未完成なことや、4章・5章にも部分的にデーターが不足していること、全体的に細部の文献を慎重にチェックする必要があること、それにこれから出版社をさがす仕事も残っていることから、完成にはもうしばらく時間をいただきたい。予定としては、万全を期すために平成9年12月末までに完成原稿に限りなく近いものに仕上げ、出版社との交渉をはじめたいと考えている。スペイン・バロック演劇に関する研究において、今年度に行う予定であった第一章から第三章(全六章)までのなかで、特に「演劇賛否両論」を深く掘り下げて研究することができた(『日本演劇学会紀要』にその一部を発表の予定)。収集した資料の分析から、必ずしも神学者・聖職者全員が芝居に対して批判的でないことや、興行主・演劇家・劇評論家のあいだにも賛否両論が飛び交ったことを確認したあと、双方の様々な意見から、当時の大衆演劇が人々の道徳観念に多大な影響を及ぼしていたことを明らかにすることができた。また同時に、一七世紀を通して芝居に対する人々の見方が徐々に変化していく様子も捉えることができた。第一章、第二章はマドリードの劇場、劇場の運営、観客等についての研究であることから、当時の膨大な資料を丹念に調べ上げる必要があり、かなり時間を要する部分である。これまでに概ね骨組みを仕上げたうえで、適材適所に詳細なデーターを挿入することによって劇場の内部構造や観客の特徴を調査してきたが、劇場の運営、すなわち慈善団体と劇場経営および契約の問題、それに役者に関してはまだ完成しておらず、もう少し時間をかけて考察する必要がある。第三章はコメディア(悲劇・喜劇・悲喜劇)および演劇と社会との関係についての分析である。一七世紀中だけでも、宗教劇(聖体神秘劇)を含め、書き上げられた脚本の数が優に一万篇を越えるともいわれており、未だ調査されていない作品も数多くあることから、この章でももう少し資料を整理する必要がある。しかしながら現時点では、すでに『日本演劇学会紀要』(三一号、一九九三年)等の誌上で発表した拙稿にもとづいて、本稿の基礎となる論旨はすでに完成済みである。
マラリアダイナミンを標的としたマラリア特効薬の開発

in vitroアクチン重合を指標にした小分子スクリーニンングにより(N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide)(DBHA)によるダイナミン阻害効果を見いだした。さらに、ラッフル膜形成能、細胞遊走活性に対するDBHAの影響も調べ、解析結果を学術論文にまとめた。熱帯熱マラリア原虫ダイナミンpfDyn1, pfDyn2を昆虫細胞に発現、精製し、マラリアダイナミンがGTPアーゼ活性と脂質膜変形能を持つことを明らかにした。GTPアーゼ活性を指標とした小分子スクリーニンングにより、pfDyn2阻害候補物質を同定した。1.アクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤スクリーニング:ダイナミン阻害剤ダイナソアの構造類似体181種類について、in vitroアクチン重合を指標としてスクリーニングした。リーディング化合物であるダイナソア(既知のダイナミン阻害剤よ)りも、強力なアクチン線維形成阻害作用を持つ分子(N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide)(DBHA)を同定した。DBHAのがん細胞の遊走に対する効果を調べた。DBHAは、ヒト肺ガン細胞株(H1299)における血清刺激依存性ラッフル膜形成を強く阻害(IC50=16.7 μM)するとともに、細胞遊走活性を著明に抑制することを創傷治癒試験により明らかにした。細胞遊走を阻害するDBHAの濃度では、細胞毒性も見られなかった。2.ダイナミンによるアクチン制御機構:ダイナミン/コルタクチンによるアクチン制御機構の一部を解明した。ダイナミン/コルタクチン複合体は、神経細胞成長円錐の糸状仮足に局在しており、ダイナミン阻害剤やコルタクチンの発現抑制によりこれら分子の機能を抑制すると、成長円錐の急激な退縮を引き起こした。分子機構については、ダイナミン/コルタクチン複合体はリング状を呈し、機械的にアクチン線維を束化することにより成長円錐の糸状仮足を安定させることが判明した。これらの結果結果を学術論文にまとめ、米国神経科学会誌に発表した(Yamada et al. J. Neurosci. 2013)。3.マラリアダイナミンの機能解析:マラリア原虫2種類のダイナミンアイソフォーム(pfDyn1, pfDyn2)について、リコンビナントタンパクを昆虫細胞に発現させた。また、pfDyn1, pfDyn2の部位特異的抗体を作成した。新規のダイナミン阻害剤を探索するため、in vitroアクチン重合を指標にした小分子スクリーニングにより、(N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide)(DBHA)によるダイナミン阻害効果を見いだした。さらに培養細胞を用いて仮足形成、遊走に対するDBHAの影響を解析した。その結果、DBHAは仮足先端部へのダイナミンの動員とラッフル膜形成に対し抑制効果を示した。さらに、細胞の遊走、浸潤に対してもDBHAの抑制効果が認められた。小分子探索による新規のダイナミン阻害剤DBHAの同定と、細胞に対するDBHAの影響についての解析結果を学会発表するとともに学術論文にまとめた。次に、Hisタグをつけた熱帯熱マラリア原虫ダイナミンpfDyn1, pfDyn2を昆虫細胞に発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製した。リコンビナントタンパクを用いたin vitro解析により、マラリアダイナミンがGTPアーゼ活性と脂質膜変形能を持つことを明らかにした。また、pfDyn1, pfDyn2をそれぞれ特異的に認識する抗ペプチド抗体を作成し、ウエスタンブロットにより特異性を確認した。さらに、GTPアーゼ活性を指標とした小分子スクリーニンングにより、pfDyn2阻害候補物質を同定した。マラリアダイナミンの機能を明らかにするためにマラリアダイナミンの発現精製系を確立するとともに、マラリアダイナミンの阻害剤探索のためのGTPアーゼ活性測定系の条件検討を行った。また、ほ乳類のアクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤のスクリーニングを行なった。1)マラリアダイナミンの精製:熱帯熱マラリア原虫に発現しているダイナミンホモログであるpfDyn1及びpfDyn2遺伝子を全合成し、pET15bにクローニングした。大腸菌にpfDyn2を発現させ、0.1%NP40存在下に、可溶性画分にpfDyn2を得た。pfDyn2をCoカラムに吸着後、50, 100, 200, 250mMイミダゾールを用いてステップワイズに溶出した。pfDyn2は、200mMイミダゾールで溶出され、CBB染色において、ほぼ単一バンドにまで精製する方法を確立した。2)GTPアーゼ活性の測定:哺乳類のダイナミンGTPase活性は、低イオン強度溶液中での自己重合による活性が上昇することから、低イオン強度条件下で、pfDyn2のGTPase活性を測定する比色定量法を構築した。

哺乳類ダイナミン1をコントロールとしてGTPase活性を比較した結果、イオン強度依存性のダイナミンGTPase活性変化がpfDyn2ではほとんど見られないことが判明した。3)哺乳類のアクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤のスクリーニング:ピレンでラベルした単量体アクチンを脳細胞質に加え、ATP存在下でリン脂質を含んだ人工脂質膜で刺激するとアクチン重合が誘導され、ピレンに由来する蛍光強度を測定することによりアクチン重合を定量的に測定出来る。この測定系を用いて、哺乳類ダイナミン阻害剤のスクリーニングを約150の候補物質について行なった。1.アクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤スクリーニング:ダイナソアよりもアクチン重合、ラッフル膜形成,細胞遊走に対する阻害効果が高く、毒性の少ない化合物にヒットしているので、スクリーニングは順調に達成できている.2.ダイナミンによるアクチン制御機構:ダイナミン/コルタクチン複合体によるアクチン制御機構の解析についても順調に進んでいる。既述の研究成果に引き続いて、ダイナミン、コルタクチンのリン酸化による複合体の機能制御調べた結果、コルタクチンがin vitroでタンパクキナーゼCによりリン酸化され、リン酸化によりアクチン束化能が顕著に減少することを見いだしている。3.マラリアダイナミンの機能解析:pfDyn1, pfDyn2発現ベクターを作成し、昆虫細胞に発現させた。精製については、pfDyn2は精製方法が確立されたが,pfDyn1については現在取り組んでいる。pfDyn1, pfDyn2の部位特異的抗体については、抗原を特異的に認識することをウエスタンブロットにより確認した。マラリアダイナミンpfDyn1およびpfDyn2はともに遺伝子を全合成し、大腸菌で発現させた。さらにpfDyn1についてはCBB染色において、ほぼ単一バンドにまで精製する方法を確立した。抗マラリアダイナミン抗体については、作成のための準備はすでに終了している。従って、マラリアダイナミンの機能解析のための実験ツールの作成は順調に達成されていると評価出来る。哺乳類のアクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤のスクリーニングについても、高いアクチン重合阻害効果を示す候補物質がいくつか得られており、阻害剤探索に関してもほぼ順調に進展している。1.アクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤スクリーニング:これまでのスクリーニング、DBHAに関する解析結果を学術論文にまとめる。2.ダイナミンによるアクチン制御機構:今後、アクチン制御におけるダイナミン・コルタクチン複合体のリン酸化の生理的意義を明らかにする。平行して、ダイナミン/コルタクチン複合体の構造解析を安藤敏夫教授(金沢大学)との共同研究によりすすめる。3.マラリアダイナミンの機能解析:昆虫細胞に発現させたpfDyn1, pfDyn2を精製市,GTPアーゼ活性をHPLCにより解析する。
肝臓におけるω3脂肪酸欠乏の認識機構の解明

ドコサヘキサエン酸(DHA)に代表されるオメガ3(ω3)脂肪酸は生体において重要な働きを持ち、その摂取は心血管系障害のリスク低減や抗炎症作用などの効果を示す事が古くから知られてきたが、生体においてω3脂肪酸の量の認識機構や恒常性維持機構については不明な点を多く残しているため、本研究ではその解明を目的としている。平成30年度は以下の結果を得た。本研究の予備検討において、DHA含有グリセロリン脂質を全身性にほぼ欠いているリゾホスファチジン酸アシル転移酵素3(LPAAT3)欠損マウスの肝臓では、DHA合成に必須の脂肪酸不飽和化酵素群と伸長酵素群が誘導されるという知見を得ている。これらの酵素群のLPAAT3欠損マウスにおける誘導はマウスの週齢に関わらず新生児期から見られること、また脳や白色脂肪組織、褐色脂肪組織においては見られないことが明らかとなった。また、LPAAT3欠損マウスにおいてはDHA含有リン脂質の著しい減少する一方、ω6多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸含有リン脂質量が増加していることを見出した。アラキドン酸含有リン脂質の増加については肝臓以外の組織においても見られたことから、肝臓における脂肪酸不飽和化および伸長酵素群の誘導は、リポタンパク質などを介して全身の脂質組成に影響を与えている可能性が示唆された。また、LPAAT3欠損マウス肝臓におけるトランスクリプトーム解析により、欠損マウスの肝臓においては脂質合成のマスターレギュレーターであるSterol regulatoryelement-binding protein-1 (SREBP1)の標的遺伝子群に増加が見られることが明らかとなった。DHA合成に必須の脂肪酸不飽和化、伸長酵素群もSREBP1の標的遺伝子であるため、DHA欠乏時の肝臓におけるセンサーとしてSREBP1が機能する可能性が示唆された。本研究のこれまでの結果から、DHAの欠乏時に肝臓においてはDHAの産生を高める遺伝子発現の変化が起こっており、それには脂質合成のマスターレギュレーターであるSREBP1が関与する可能性が示唆された。また、この誘導は本研究において解析を行った臓器の中では肝臓に特異的であったことから、肝臓においてはDHAの欠乏を認識し、DHAをはじめとした多価不飽和脂肪酸の産生を高める機構が存在することが明らかとなった。過去の研究により、多価不飽和脂肪酸の欠乏は脂肪肝を誘導することが明らかとなっていることと合わせると、本研究において見られたDHA欠乏時の肝臓における脂肪酸不飽和化酵素群の誘導は肝臓における多価不飽和脂肪酸量の維持機構であり、肝臓における脂質代謝に深く関与することが予想される。また、肝臓はリポタンパク質として全身に脂質を供給する臓器であることから、全身性のDHAを含めた多価不飽和脂肪酸量の維持に中心的な役割を持つ可能性がある。事実、本研究においてLPAAT3欠損マウスの様々な組織におけるリン脂質組成を解析した結果、欠損マウスではDHA含有リン脂質が著しく減少しているのに対し、ω6多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸含有リン脂質の量が増加していた。アラキドン酸含有リン脂質の増加は肝臓以外の脳や脂肪組織においても見られたことも、肝臓が全身における多価不飽和脂肪酸量の恒常性維持機構に寄与する可能性を示唆するものであると考えられた。これまでの解析から、DHA欠乏時には肝臓においてSREBP1の標的遺伝子の誘導を介して全身の多価不飽和脂肪酸量を調節する機構が存在することが示唆された。今後は、DHA欠乏時のSREBP1を介した脂肪酸不飽和化酵素や伸長酵素の誘導がどのような機構で起こるかのより詳細な解析を行う。具体的にはSREBP1タンパク質量の変化に加え、活性化型(核内型)のSREBP1のについても解析を行う。また、SREBP1の標的因子のプロモーター領域におけるメチル化やクロマチンの状態なども合わせて解析を行う。また、申請者は現在、肝臓特異的なLPAAT3欠損マウスを作成中であり、このマウスの解析を行うことによりさらに詳細に肝臓におけるDHA欠乏の認識機構が明らかになるものと考えている。さらに、肝臓由来の多価不飽和脂肪酸が全身に供給される機構を明らかにするために、リン脂質のみでなく、トリグリセリドやコレステロールエステルなどの測定することが必要であると考えられる。また、血清から各種リポタンパク質や遊離脂肪酸など様々な画分を分取し、それぞれに含まれる脂質の解析を行うことにより、肝臓におけるDHA欠乏時の脂質代謝酵素の変化が全身に与える影響についても詳細に解析する予定である。これらの解析結果を合わせることにより、肝臓が全身のDHAや多価不飽和脂肪酸量を調節する機構を明らかにし、またその破綻がどのような疾患と結びつくかについても解析する。これらの酵素群のLPAAT

3欠損マウスにおける誘導はマウスの週齢に関わらず新生児期から見られること、また脳や白色脂肪組織、褐色脂肪組織においては見られないことが明らかとなった。また、LPAAT3欠損マウスにおいてはDHA含有リン脂質の著しい減少する一方、ω6多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸含有リン脂質量が増加していることを見出した。アラキドン酸含有リン脂質の増加については肝臓以外の組織においても見られたことから、肝臓における脂肪酸不飽和化および伸長酵素群の誘導は、リポタンパク質などを介して全身の脂質組成に影響を与えている可能性が示唆された。また、LPAAT3欠損マウス肝臓におけるトランスクリプトーム解析により、欠損マウスの肝臓においては脂質合成のマスターレギュレーターであるSterol regulatoryelement-binding protein-1 (SREBP1)の標的遺伝子群に増加が見られることが明らかとなった。DHA合成に必須の脂肪酸不飽和化、伸長酵素群もSREBP1の標的遺伝子であるため、DHA欠乏時の肝臓におけるセンサーとしてSREBP1が機能する可能性が示唆された。本研究のこれまでの結果から、DHAの欠乏時に肝臓においてはDHAの産生を高める遺伝子発現の変化が起こっており、それには脂質合成のマスターレギュレーターであるSREBP1が関与する可能性が示唆された。また、この誘導は本研究において解析を行った臓器の中では肝臓に特異的であったことから、肝臓においてはDHAの欠乏を認識し、DHAをはじめとした多価不飽和脂肪酸の産生を高める機構が存在することが明らかとなった。過去の研究により、多価不飽和脂肪酸の欠乏は脂肪肝を誘導することが明らかとなっていることと合わせると、本研究において見られたDHA欠乏時の肝臓における脂肪酸不飽和化酵素群の誘導は肝臓における多価不飽和脂肪酸量の維持機構であり、肝臓における脂質代謝に深く関与することが予想される。また、肝臓はリポタンパク質として全身に脂質を供給する臓器であることから、全身性のDHAを含めた多価不飽和脂肪酸量の維持に中心的な役割を持つ可能性がある。事実、本研究においてLPAAT3欠損マウスの様々な組織におけるリン脂質組成を解析した結果、欠損マウスではDHA含有リン脂質が著しく減少しているのに対し、ω6多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸含有リン脂質の量が増加していた。アラキドン酸含有リン脂質の増加は肝臓以外の脳や脂肪組織においても見られたことも、肝臓が全身における多価不飽和脂肪酸量の恒常性維持機構に寄与する可能性を示唆するものであると考えられた。これまでの解析から、DHA欠乏時には肝臓においてSREBP1の標的遺伝子の誘導を介して全身の多価不飽和脂肪酸量を調節する機構が存在することが示唆された。今後は、DHA欠乏時のSREBP1を介した脂肪酸不飽和化酵素や伸長酵素の誘導がどのような機構で起こるかのより詳細な解析を行う。具体的にはSREBP1タンパク質量の変化に加え、活性化型(核内型)のSREBP1のについても解析を行う。また、SREBP1の標的因子のプロモーター領域におけるメチル化やクロマチンの状態なども合わせて解析を行う。
RNAポリメサーゼIIによる転写開始の酵素機構

RNAポリメラーゼII(polII)による転写反応において, RNA5′末端のキャッピングとATP水解の要求性の2点は他のRNAポリメラーゼ種(I, III)と異る大きな特徴であり,いずれも転写開始と密接に関連すると考えられている.本研究では, HeLa細胞より得た無細胞転写系を用いてpolIIによる転写開始反応と上記二つの特徴との関連を解析し,以下の結果を得た.(1)転写開始複合体形成におけるキャッピング酵素系の関与-まず, invitro転写系におけるキャップ形成の特異性を調べるためにpolIIおよびpolIII転写産物の5′末端分析を行った.アデノウィルス後期主要プロモーター(Ad2MLP)および同pIXプロモーター(Ad12pIXP)からの転写産物の5′末端はほとんどがキャップされており,それぞれ, m^7Gpppm^6Am, m^7GpppGmであった.一方, polIIIで転写されるAd12VA1RNA遺伝子からの産物の5′末端はpppG-でありキャップ構造は検出されなかった.すなわち,この系ではinvivoと同様, polII転写産物に対するキャッピングの特異性が保持されていた.次に, Ad2MLPを用いて形成させた転写開始複合体(50S)を精製し,鎖の伸長反応を行わせたところ, RNAにm^7GpppAなるキャップ構造が付加された.この事から,キャップ形成に関与する酵素系のうちキャッピング酵素とmRNA(グアニンーク)メチル基転移酵素が転写開始複合対に特異的に組込まれている事が示唆された.(2)転写開始反応とATP水解-塩濃度の違いにより転写の開始と伸長を分離した2段階反応系を用いて各反応のATP水解要求性を調べた.その結果, Ad2MLP, Ad12pIXPいずれを用いた場合にも開始反応にはATP(2′-dATP, 3′-dATP)の存在が必須でありATPはAMPPNPで置換しえなかった.実際に,これら2種類のプロモーターを用いて50S転写開始複合体形成反応を解析したところ,いずれの場合もその形成にはATPのγ位リン酸の水解が必須である事が明らかとなった.RNAポリメラーゼII(polII)による転写反応において, RNA5′末端のキャッピングとATP水解の要求性の2点は他のRNAポリメラーゼ種(I, III)と異る大きな特徴であり,いずれも転写開始と密接に関連すると考えられている.本研究では, HeLa細胞より得た無細胞転写系を用いてpolIIによる転写開始反応と上記二つの特徴との関連を解析し,以下の結果を得た.(1)転写開始複合体形成におけるキャッピング酵素系の関与-まず, invitro転写系におけるキャップ形成の特異性を調べるためにpolIIおよびpolIII転写産物の5′末端分析を行った.アデノウィルス後期主要プロモーター(Ad2MLP)および同pIXプロモーター(Ad12pIXP)からの転写産物の5′末端はほとんどがキャップされており,それぞれ, m^7Gpppm^6Am, m^7GpppGmであった.一方, polIIIで転写されるAd12VA1RNA遺伝子からの産物の5′末端はpppG-でありキャップ構造は検出されなかった.すなわち,この系ではinvivoと同様, polII転写産物に対するキャッピングの特異性が保持されていた.次に, Ad2MLPを用いて形成させた転写開始複合体(50S)を精製し,鎖の伸長反応を行わせたところ, RNAにm^7GpppAなるキャップ構造が付加された.この事から,キャップ形成に関与する酵素系のうちキャッピング酵素とmRNA(グアニンーク)メチル基転移酵素が転写開始複合対に特異的に組込まれている事が示唆された.(2)転写開始反応とATP水解-塩濃度の違いにより転写の開始と伸長を分離した2段階反応系を用いて各反応のATP水解要求性を調べた.その結果, Ad2MLP, Ad12pIXPいずれを用いた場合にも開始反応にはATP(2′-dATP, 3′-dATP)の存在が必須でありATPはAMPPNPで置換しえなかった.実際に,これら2種類のプロモーターを用いて50S転写開始複合体形成反応を解析したところ,いずれの場合もその形成にはATPのγ位リン酸の水解が必須である事が明らかとなった.
哺乳動物初期胚の発生と分化に関与する細胞接着および細胞間情報伝達機構に関する研究

卵管の影響下でマウス1細胞期胚を体外培養すると、胚は体外培養における発生停止を起こすことなく、正常にその後の発生を維持できる。これらの胚では4細胞期に割球の偏平化と細胞接着面の増大が観察されることが報告されているが(Minami et al., 1992)、本研究において、この4細胞期胚の細胞接着面にカドヘリン分子が局在することが間接蛍光抗体法によって明らかになった。一般に、カドヘリン分子の細胞接着面への局在は8細胞期におけるコンパクション開始に起こるとされているが、体外における卵管組織との共培養系においては局在が早期に起こることが観察された。このカドヘリンの局在にはプロテインキナーゼCが関与すると考えられているが、接着面の増大した4細胞期胚をPKC阻害剤で処理すると細胞接着が減少すること、またPKA阻害剤で処理すると割球の偏平化が阻害されることが明らかになったが、詳細な分子機構については不明である。また、同様の卵管環境下で発生した4細胞期においては、細胞間の情報伝達に関与するGap Junctionがすでに形成されていることも観察された。機能的なGap Junctionの形成はコンパクション時に始まることや、コネキシン43がGap Junctionへと形成される場合にもコネキシン43のリン酸化が関与していることが示唆されており、初期胚発生過程における卵管の影響とタンパク質のリン酸化についてもさらに詳細な検討が必要である。また、細胞分裂に大きく関与するp34^<CDC2>キナーゼの活性についても測定し、卵管の影響が初期胚の細胞周期の機能に与える影響についても検討した。卵管環境下で発生する胚においてはp34^<CDC2>キナーゼ活性は上昇し、正常な発生過程を示すのに対して、発生停止を示す胚ではp34^<cdc2>キナーゼ活生の上昇は認められなかった。発生停止を示す胚においてもDNA合成は完了しているため、発生停止がG2期に起こることが確認されたが、核膜の崩壊や染色体の凝縮は観察されなかった。また、この胚をokadaic acidで処理すると、核膜の崩壊と染色体の凝縮が観察されることから、G2期における発生停止には減数分裂におけるdictyate期での停止と共通のメカニズムが存在している可能性が示唆され、卵管環境が発生停止を解除するなんらかのシグナルを供給していることが明かとなった。これらの胚においては4細胞期における細胞接着面が卵管の影響を受けずに発生した4細胞期胚に比較して非常に大きくなることがすでに示されており(Minami et al.,1992)、本研究において、この4細胞期胚の細胞接着面にカドヘリン分子の存在が認められ、この時期にすでに局在が開始していることが間接螢光抗体法によって明らかになった。また、卵管の影響を受けずに発生した4細胞期胚については、カドヘリン分子の局在は認められず、細胞表面に点在することが観察された。

一般に、カドヘリン分子の細胞接着面への局在は8細胞期におけるコンパクション開始時に起こるとされているが、体外における卵管組織との共培養系においては局在が早期に起こることが観察された。このカドヘリンの局在にはプロテインキナーゼCが関与すると考えられているが、この卵管組織との共培養系においてもなんらかのかたちでプロテインキナーゼCが活性化されたのではないかと考えられるが、卵管の影響とプロテインキナーゼCの活性化についての詳細なメカニズムについては今後の検討課題である。また、同様の卵管の影響下で発生した4細胞期において、細胞間の情報伝達に関与するGap Junctionがすでに形成されていることも観察された。Gap Junctionはコネキシン43タンパク質の6量体からなり、そのタンパク質の合成は4細胞期に開始されるが、機能的なGap Junctionの形成はコンパクション時に始まることが示されている。また、コネキシン43がGap Junctionへと形成される場合にもコネキシン43のリン酸化が関与しているとが示唆されており、初期胚発生過程における卵管の影響とタンパク質のリン酸化についても詳細な検討が必要であると考えられる。発生過程における卵管の効果は、体外における初期胚の発生停止の解除に対しても有効に作用することから、以上のような胚の形態変化にともなう細胞間情報伝達機構の形成と発生に卵管がどのように作用しているかについて今後さらに研究が必要だと考えられる。昨年度の研究において、卵管環境下で体外培養した4細胞期胚の細胞接着面にカドヘリン分子の局在していることが間接蛍光抗体法によって明らかになった。本年度の研究では、このカドヘリンタンパク質の局在と、細胞間の情報伝達に重要な役割を果たすと考えられているGap Junctionの形成について検討した。その結果、卵管環境下の体外培養で発生した4細胞期胚においては、Gap Junctionの形成も認められた。一般に、カドヘリンの局在やGap Junctionの形成は8細胞期のコンパクション時に誘導されることが分かっているが、体外での卵管環境によってこれが早期に誘導されることが明らかとなった。また、体外での卵管環境によって細胞接着が増大した4細胞期胚をプロテインキナーゼC(PKC)阻害剤で処理すると、割球間の接着が阻害されることが観察されたが、割球の偏平化は阻害されなかった。しかしながら、プロテインキナーゼA(PKA)阻害剤でこの胚を処理すると、割球の偏平化も阻害されることが観察され、割球間の接着と割球の偏平化は種類の異なるリン酸化酵素によって調節されていることが示唆された。リン酸化酵素阻害が実際にカドヘリンの局在や、Gap Junctionの形成にどのように作用するかは今後の課題である。また、本年度の研究では、卵管の影響が発生停止を解除し細胞を分裂に導くことから、細胞分裂に大きく関与するp34^<cdc2>キナーゼの活性についても測定し、卵管の影響が初期胚の細胞周期の機能に与える影響についても検討した。その結果、卵管環境下で培養した胚においては、分裂後20時間からp34^<cdc2>キナーゼ活性は上昇し始め、21時間でピークに達して、24時間で完全に低下した。しかしながら、発生停止を示す条件下では、p34^<cdc2>キナーゼ活性の上昇は認められなかった。
歯牙移動の促進のための遺伝子導入法の検討

マウス歯周組織における遺伝子導入法の検討前年度に確立した、歯間にエラスティックを挿入して歯を移動するワルド法の実験系は、短期間に強い矯正力が加わるため、歯周組織に発現する因子を長期的に観察するには不適であった。そこで緩徐で持続的な矯正力が加わる実験系を確立することを目的に、マウスの上顎切歯にニッケルチタンワイヤーを装着し、上顎臼歯を口蓋側に移動した。歯の移動から0、1、3,5、7、14、21及び28日間後に薄切切片を作成し、H-E染色及びTRAP染色を用いて、組織形態学的な解析を行った。またIn situ hybridyzation法を用いて,Collagen Type I, osteopontin及びosteocalsinの発現を経時的に解析した。その結果から2週間以上にわたって緩徐な矯正力が持続的に加わる、新たな実験系の確立に成功した。(国際誌に投稿準備中)現在、前年度に確立したHVJ-liposome法を用いた遺伝子導入の実験系を、この新しい歯の移動の実験系に応用し、in vivoでの遺伝子導入を試みている。CSF-1やCTGFなどの遺伝子を組み込んだplasmid DNAとHVJ-liposomeを混合し.これをマウスの上顎右側第一臼歯口蓋側の歯周組織に直接投与し、同時に実験的歯の移動を行った。歯の移動開始から1,3,5,7,14,28日後にマウスをパラホルムアルデヒドにて灌流固定した。摘出した上顎骨において、導入した遺伝子の発現状況をin situ hybridization法を用いて観察し、遺伝子導入の成果を検討している。また、これらの内容の一部はすでに国際誌に発表した(Journal of Bone and Mineral Metabolis,2005)。マウス歯周組織における遺伝子導入法の検討マウス歯周組織にHVJ-liposome法を用いて遺伝子導入を試み,その導入効果を検討するため,in vitroでの予備実験を行った.マウスから単離した未分化間葉系細胞にHVJ-liposome法を用いてLuciferase遺伝子を組み込んだplasmid DNAを遺伝子導入した.24時間後,ルミノメーターを用いて,ルシフェラーゼアッセイを行い,in vitroにおける遺伝子導入の至適条件を検索した.予備実験としてマウスにおける実験的歯の移動の系を確立した.ワルド法を用いて上顎右側臼歯の移動を行いin situ hybridyzation法を用いてosteopontinの発現を解析し,TRAP染色を用いて破骨細胞の発現様相を経時的に観察した.(国外誌に発表予定)次に,HVJ-liposome法を用いてin vivoでの遺伝子導入を試みた.β-galactosidase遺伝子(LacZ)を組み込んだPlasmid DNAとHVJ-liposomeを混合し.これをシリンジにより上顎右側第一臼歯近心の歯周組織に直接投与した.遺伝子導入1,3,5,7,14,28日後にマウスをパラホルムアルデヒドにて灌流固定し,上顎骨を摘出した.EDTAによる2週間の脱灰の後,クリオスタットにて凍結切片を作成しX-gal染色した.β-galactosidase遺伝子(LacZ)の発現様相を蛍光顕微鏡下で観察し,マウス歯槽骨における遺伝子導入の至適条件を検討した.今後,それらに条件設定を踏まえ,CSF-1,CTGFなどの歯牙移動促進因子を遺伝子導入させ,局所で発現させる予定である。
魚類における外来遺伝子の導入と発現に関する研究

本研究は魚類の染色体の発現シグナルにかかわる遺伝子の構造と機能の解明を行い、さらに、魚類培養細胞あるいは卵へ遺伝子を導入する方法の確立を目的とする。研究実績は以下の通りである。1.魚類(コイ・ハマチ)のαーグロビン遺伝子の5'上流領域に-100領域、CCAATボックス、TATAボックスが存在した。キャップサイトはコイの場合開始コドンATGより上流48番目に、ハマチの場合46番目に認められた。5'フランキング領域および5'非翻訳領域の塩基配列はコイおよびハマチ間においてほとんど差が認められなかった。2.ハマチのαーグロビン遺伝子の5'上流領域とクロラムフェニコ-ル不活化酵素(CAT)産生遺伝子の組換え体は3種類の異なった魚類培養細胞においてCAT産生遺伝子が翻訳され、CATの産生が認められたことより、5'上流領域にプロモ-タ-領域が存在することが確認出来た。3.ウイルス山来SV40の初期遺伝子のプロモ-タ-は魚類培養細胞内で機能することが確認された。そのプロモ-タ-活性は魚類培養細胞とほぼ細胞とほぼ同様であった。4.コイaーグロビン(CαG)遺伝子を1mM還元型グルタチオンで処理した二ジマス受精卵の細胞質にマイクロインジェクション法により導入を行ったところ、約65%が孵化し、ほぼ正常に発生した。5.導入した遺伝子は魚体内において複製していることが確認出来た。その遺伝子導入雄魚より採精し、完熟卵に媒精し、孵化した仔魚よりCαG遺伝子の存在が確認できた。この事実は雄親魚の体内にCαG遺伝子をもつ細胞がモザイク状に分布し、子孫に導入遺伝子が継代することが明らかとなった。本研究は魚類の染色体の発現シグナルにかかわる遺伝子の構造と機能の解明を行う。さらに、魚類の培養細胞あるいは卵への遺伝子導入法の確立を目的とする。平成元年度の研究実績は以下の通りである。1.魚類(コイ・ハマチ)のαーグロビン遺伝子の発現領域はー100領域、CCAATボックス、TATAボックスは5'ーフランキング領域に認められた。キャップサイトはコイの場合開始コドンATGより上流48塩基目に、ハマチの場合46番目に認められた。5'ーフランキング領域および5'ー非翻訳領域の塩基配列はコイとハマチ間においてほとんど差は認められなかった。2.クロラムフェニコ-ル耐性遺伝子(CAT)をコ-ドするpSRrーCAT196およびpSUーCATを魚類培養細胞GF、TUおよびCHHー1にリン酸カルシウム法にて導入を行った。クロラムフェニコ-ル・アセチルトランスフェ-ラ-ゼ(CATase)の産生が認められた。3.魚類のグロビン遺伝子の5'ーフランキング領域および5'ー非翻訳領域とCAT遺伝子とのリコンビナントプラスミドを作製し、魚類培養細胞への導入を試みたところ、CATaseの産生が認められた。4.コイのαーグロビン遺伝子2.2KbのDNA断片を1mM還元型グルタッチオンで付活した受精卵の細胞質にマイクロインジェクションを行った。導入卵の約65%が孵化し、ほぼ正常に発生した。サザン・ブロット・ハイブリダイゼ-ションを行ったところ、導入遺伝子(コイのαーグロビン遺伝子)の複数が確認された。現在、CAT遺伝子を魚類細胞内導入実験においてはプロモ-タ-の違いによるCATaseの発現量の差をニジマス受精卵への遺伝子導入実験においてはコイのαーグロビン遺伝子が発現しているかどうかを確認中である。さらに、魚類培養細胞あるいは卵へ遺伝子を導入する方法の確立を目的とする。

平成2年度の研究実績は以下の通りである。1.ハマチのaーグロビン遺伝子の5'ー上流領域とクロラムフェニコ-ル不活化酵素(CAT)産生遺伝子の組換え体は3種類の異なった魚類培養細胞においてCAT産生遺伝子が翻訳され、CATの産生が認められた。ハマチのaーグロビン遺伝子の5'ー上流領域にプロモ-タ-領域が存在し、遺伝子の転写の調節活性を有することっが示唆された。2.CAT遺伝子は4種類の魚類培養細胞のいずれでも発現し、そのうちGF細胞においてもっとも強く発現した。3.ウイルス由来SV40の初期遺伝子のプロモ-タ-は魚類培養細胞内で機能することが確認された。そのプロモ-タ-活性は4種類の魚類培養細胞とほぼ同様であった。4.既に前年度おいてコイaーグロビン(CaG)遺伝子をニジマス卵に導入し、導入遺伝子が複製していることを明らかにしたが、その遺伝子導入雄魚より採精し、完熟卵に媒精し、仔魚よりCaG遺伝子の存在が確認できた。この事実は雄親魚の体内にCaGをもつ細胞がモザイク状に分布し、子孫に導入遺伝子が継代することが示唆された。
バイオマス由来カルボン酸の選択的水素化触媒の開発

コハク酸(SUC)やアジピン酸(ADI)などのジカルボン酸の水素化反応は,高分子の原料となるジオールが得られるため有用な反応である.SUCの水素化ではラクトンを経由し,ADIの水素化ではヒドロキシカルボン酸を経由して(Scheme 1(B))ジオールが生成される.これまでの研究より,高級脂肪酸の水素化反応用触媒としてin-situ液相還元(1,4-ジオキサンとジカルボン酸の溶液中で還元)Re-Pd/SiO2触媒(Re=14 wt%, Pd=1 wt%, Re/Pd=8; Catalysis Science & Technology, 2 (2012) 2221-2223,ACS Catal., 182 (2016) 193-203)が高選択的・高活性であることを見出した.よって,本研究ではこのRe-Pd/SiO2触媒を基にジカルボン酸の水素化反応においてジオールを高収率で得る触媒開発とその触媒の構造解析を目的とした.結果として,これまで課題だったRe-Pd/SiO2触媒を用いたジカルボン酸の水素化反応について,Re種の還元状態をコントロールすることにより高活性を示すことを見出した.また,ジカルボン酸の水素化反応における反応速度論,主な活性種,触媒構造などを明らかにすることで,Re-Pd/SiO2触媒の反応機構も提案し,現在学術論文を執筆中である.また,国内・国際学会にも積極的に参加し,これらの研究については,申請者が全て実験を行っており,1回の口頭発表(国内1)と1回のポスター発表(国際1)を行っている.また,現在論文を執筆中である.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究にて,バイオマス由来カルボン酸の一種であるステアリン酸の水素化反応においてReOx-Pd/SiO2触媒が特に有効であり,温和な条件下で高活性か高アルコール選択的であることを報告している(Catalysis Science & Technology, 2 (2012) 2221-2223).今回,この触媒の構造解析と反応機構の解明,そして課題である触媒安定性の改善を目的とした.結果として,触媒上のRe種の一部が23 nmの高分散したメタル状態であり,このメタルが活性に寄与していることが示唆された.また,この結果を踏まえて,再利用試験を行った.それまで,空気中処理による触媒の再利用試験を行っており,この方法では活性が最初の半分程度まで減少してしまっていた.この再利用後触媒のXRDを行うと,活性に寄与するReメタル種が大きく減少しており,これが活性低下の原因であると考えられる.そこで,Reメタルが酸化されないように再利用操作を窒素雰囲気下で行った.その結果,活性低下を起こすことなく再利用が可能となった.これらの研究結果について,現在論文を執筆中である.その他にも,バイオマス由来カルボン酸の一種である乳酸の水素化用触媒として有能なRu-MoOx/SiO2やアミノ酸の水素化反応に有効な触媒であるRh-MoOx/SiO2について,反応特性や触媒のキャラクタリゼーションを行った.これらの研究については3報学位論文を発表している.また,国内学会や国際学会に積極的に参加し,口頭発表3回,ポスター発表1回を行っている.コハク酸(SUC)やアジピン酸(ADI)などのジカルボン酸の水素化反応は,高分子の原料となるジオールが得られるため有用な反応である.SUCの水素化ではラクトンを経由し,ADIの水素化ではヒドロキシカルボン酸を経由して(Scheme 1(B))ジオールが生成される.これまでの研究より,高級脂肪酸の水素化反応用触媒としてin-situ液相還元(1,4-ジオキサンとジカルボン酸の溶液中で還元)Re-Pd/SiO2触媒(Re=14 wt%, Pd=1 wt%, Re/Pd=8; Catalysis Science & Technology, 2 (2012) 2221-2223,ACS Catal., 182 (2016) 193-203)が高選択的・高活性であることを見出した.よって,本研究ではこのRe-Pd/SiO2触媒を基にジカルボン酸の水素化反応においてジオールを高収率で得る触媒開発とその触媒の構造解析を目的とした.結果として,これまで課題だったRe-Pd/SiO2触媒を用いたジカルボン酸の水素化反応について,Re種の還元状態をコントロールすることにより高活性を示すことを見出した.また,ジカルボン酸の水素化反応における反応速度論,主な活性種,触媒構造などを明らかにすることで,Re-Pd/SiO2触媒の反応機構も提案し,現在学術論文を執筆中である.また,国内・国際学会にも積極的に参加し,これらの研究については,申請者が全て実験を行っており,1回の口頭発表(国内1)と1回のポスター発表(国際1)を行っている.また,現在論文を執筆中である.これまで課題であった触媒構造の解明や触媒の再利用に成功した.これらの結果を国際学会および国内学会にて発表しており,また学術論文を現在執筆中であるため,研究は順調に進展していると考えます.27年度が最終年度であるため、記入しない。

基質を変え,バイオマス由来カルボン酸の一種であるコハク酸から1,4-ブタンジオールへの水素化反応を高収率で行う触媒を開発する.コハク酸はカルボキシル基を二つ持つジカルボン酸であるため,触媒や反応条件の見直しが必要である.具体的には,添加金属の変更や水素解離能力の高いCo,Niなどの第三金属の添加,担体として活性炭などの高表面積担体を用いた活性点の分散化,触媒還元方法の変更などが考えられる.また,最適化された触媒については種々のキャラクタリゼーションを行い,触媒構造と反応機構を明らかにする.27年度が最終年度であるため、記入しない。