hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RBファミリータンパク質のリン酸化と分解を介した細胞周期制御機構

[目的]細胞周期のG1期において、RBタンパク質はE2Fをはじめ、多くの転写因子や分化調節因子と結合し、それらの標的遺伝子の発現を制御していると考えられている。これまでの研究からサイクリンCDKによるRBタンパク質のリン酸化がRBタンパク質の転写因子との結合活性消失(変化)を引き起こし、それがRB活性の主な制御機構であると考えられてきた。本研究ではRBタンパク質およびRBファミリータンパク質(p107やp130)の分解機構とその調節機構を明らかにする。[研究成果]我々はプロテアソーム阻害剤により蓄積することからRBタンパク質がユビキチンプロテアソーム系により分解されること。Mdm2がRBタンパク質のユビキチン化と分解を促進することを昨年までの研究で見いだしている。加えて、Flat formationアッセイによりMdm2によりRBタンパク質の機能が抑制されること。ヒトの肺癌検体でMdm2の発現とRBタンパク質の量が逆相関することも見いだした。本年度は、Mdm2のsiRNAによるノックダウンによりRBタンパク質が蓄積し、細胞周期のG1/S進行が抑制されることを見いだした。また、Mdm2ノックアウトMEFでもRBタンパク質は蓄積している一方、Mdm2阻害活性を持つARFノックアウトMEFではRBタンパク質は減少していた。以上よりRBタンパク質はMdm2をユビキチンリガーゼとしたユビキチン-プロテアソーム系を介した分解による量的制御も受けていることが強く示唆された。本研究では、RB癌抑制経路の癌抑制遺伝子産物の分解亢進による細胞悪性化機構の解明を目指す。特に癌抑制遺伝子産物RBタンパク質のユビキチンリガーゼの同定、細胞内での分解機構の詳細を明らかにする。さらに、RBタンパク質のユビキチンリガーゼの発現亢進に伴うRBタンパク質の分解亢進による細胞癌化について培養細胞および臨床癌での解析を行うことを目的とする。p53のユビキチンリガーゼであるMdm2がRBタンパク質に結合し、ユビキチン化することを見出した。Mdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化しp107やp130はユビキチン化しなかった。また、癌抑制遺伝子産物ARFはRBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進し、プロテアソーム阻害剤処理で抑制された。またドミナントネガティブMdm2やMdm2のsiRNAでRBタンパク質の分解が阻害されることがわかった。さらにヒトのMdm2が高発現している癌検体において、RBの発現量が低く、Mdm2によりRBの分解亢進が細胞癌化に寄与していることが判明した(Uchida et al. EMBO J 2005)。また一方で、我々はCDK阻害タンパク質p27をユビキチン化し分解に導く新たなユビキチンリガーゼを同定した。
アコヤガイ幼生の貝殻形成関連遺伝子の探索

アコヤガイ幼生の貝殻形成の仕組みを解明するために、貝殻形成に関わるタンパク質および遺伝子を同定した。タンパク質の分析や遺伝子発現の情報から、アコヤガイの幼生と成体の貝殻は、全く異なる仕組みで形成されていることが明らかになった。アコヤガイゲノム情報、次世代シーケンサーを用いた遺伝子発現解析、アコヤガイ全遺伝子を対象としたマイクロアレイ解析、貝殻プロテオーム解析を行うことで、網羅的にタンパク質及び遺伝子の探索に成功した。成体と幼生でタンパク質の組成や遺伝子発現パターンを比較したところ、アコヤガイの幼生と成体の貝殻は、全く異なる仕組みで形成されていることが明らかになった。研究対象生物であるアコヤガイの全ゲノム解読を行った。具体的には、次世代シーケンサーを用いたゲノム配列のシーケンシング、アセンブル、遺伝子モデルの作成等に携わった。これによりアコヤガイのゲノムワイドな遺伝子情報を得る事ができたので、本研究課題の最終目的である新規貝殻形成遺伝子の探索にも大いに役立てる事ができた。ゲノム解読の成果は、論文として報告を行った(Takeuchi et al. 2012, DNA Research 19, 117-130)。また、平成22年度内に得ていたトランスクリプトームデータに加え、平成23年度もアコヤガイ幼生及び成体複数組織のトランスクリプトームシーケンスを行った。最初の計画では貝殻形成期前および形成中の幼生の遺伝子発現データのみを比較する予定であったが、より多くの発生段階・組織の発現情報を得る事ができたので、貝殻形成期に特異的に発現する遺伝子の絞り込みを高精度で行えるようになった。ゲノムデータ及びトランスクリプトームデータを解析した結果、D型幼生期に特異的に発現する遺伝子の候補配列を79個得た。これらの配列について、機能ドメインの探索、シグナルペプチドの有無、繰り返し配列の有無等の各種解析を行った。このように、平成23年度はゲノム解読やトランスクリプトームデータの追加など、網羅的遺伝子探索の基盤となる実験・解析を主に行った。結果として、当初計画していた少数の候補遺伝子についてのクローニングや発現解析を行うまでにはいたらなかった一方、ゲノム情報・トランスクリプトーム情報を充実させる事により、新規貝殻形成関連遺伝子をゲノムワイドに網羅的探索・解析する事が可能になった。アコヤガイゲノム解読やトランスクリプトームデータの追加により、当初の計画を遥かに上回る塩基配列データを得る事ができた。特にゲノム解読の成果は、本研究にとどまらず、今後アコヤガイ研究においてきわめて重要なデータベースとなることは疑いの余地がない。本研究においては、より網羅的かつ高精度な情報に基づいて新規貝殻形成関連遺伝子の探索を行う事ができた。実際に、トランスクリプトームによる発現パターン解析や演繹アミノ酸配列の機能ドメイン探索の結果、新規貝殻形成関連遺伝子の有力候補を多数得る事ができた。当初は貝殻形成に関わる新規遺伝子を発見し、その機能を実験により詳細に解析する計画であり、研究対象は多くとも数個の遺伝子を想定していた。一方、アコヤガイのゲノム解読に成功し、トランスクリプトームも含めて膨大な遺伝子情報が得られたことにより、貝殻形成における遺伝子発現のゲノムワイドな全体像をとらえる事が可能になりつつある。そこで今後の研究方針としては、ごく少数の遺伝子の解析にとどまらず、貝殻形成に関わる遺伝子群の包括的な発現動態を明らかにすることを目的とし、マイクロアレイを用いた発現解析を行いたい。すでに様々な発生段階の幼生のマイクロアレイ実験用サンプルを得ている。マイクロアレイを用いて連続的な発現変動を解析し、貝殻形成期の遺伝子発現の特徴を明らかにしたいと考えている。マイクロアレイ実験に必要な試薬類、プローブの設計と作成にかかる費用として使用する。なお、本実験は当初の計画の予算範囲内で遂行可能である。
ダイヤモンドアンビルセルを用いた、高圧下での鉱物の偏光顕微赤外吸収スペクトル測定

フーリエ交換型顕微赤外分光法を用いた鉱物中の`水'の分析は、一気圧下の測定に限られ、高圧下での赤外吸収スペクトル測定は、なされてこなかった。マントル構成鉱物の変形に対する`水'の影響が色々と議論されているが、高圧下での鉱物の赤外吸収スペクトルは測定されていない。ダイアモンドアンビルを赤外顕微鏡に装着できるよう改良し、高圧下での鉱物中の`水'の赤外吸収スペクトルを測定し、高圧下での鉱物中の化学形態の推定をするシステムを確立した。ダイヤモンドアンビルを赤外分光法に適用する際に問題となる以下の点を特に考慮した。第一に圧媒体の選定である。圧媒体には赤外域で透明なKBr粉末、フッソ系有機溶液のフロリナ-ト、アルゴンの3種類を選定した。特にアルゴンの封入のためにアルゴンの液化装置を設計した。発生圧力の検出には、石英の赤外吸収ピークとルビーのR線の発光ピークのシフトにより求めた。層状珪酸塩と含水鉱物の原型であるブルーサイトを加圧し、常圧での吸収スペクトルとの比較から、加圧によりOHダイポールの振動エネルギーが数種類のエネルギーに分裂することがわかった。また4GPaをこえる圧力範囲から別の波数位置に吸収ピークが現われる。この吸収ピーク波、第一励起状態から第二励起状態への遷移に対応するとされてきたが、本研究によれば新たなOH結合を示すと考えられる。それは基底状態から第一励起状態への遷移を起こす赤外光をカットして測定しても、新たなピークは依然存在するからである。これは、中性子回折、ラマン散乱分光分析で確認されているブルーサイトの不連続な状態変化に対応するものと考えられる。
日本語音声教育の基本語彙データベース作成と音声教育シラバスについての研究

『日本語教育のための基本語彙調査』(国立国語研究所)所収「基本6000語」をパソコンPC9801を用い、パソコンソフト『桐VER.3』(管理工学研究所)上でデータベース化した。元の情報に加え各語のモ-ラ数、特殊拍の配置、アクセント、無声化の位置の4つの情報をコード化して入力を完了し、諸音声的条件での語彙検索を可能とした。この結果得られたデータベースから外国語としての日本語の音声教育にとって必要な語彙が容易に得られるようになった。さらにこのデータベースを利用して、ケニヤ人日本語学習者の韻律習得の調査を実施した。この調査ではまず『日本語教育のための基本語彙調査』で重要度の高いとされる語彙から2モ-ラ、3モ-ラの語をアクセント型別に選び出した調査票を作成し、被験者のアクセント習得を調査した。さらに複合語のアクセント規則の習得度を見るための調査票、文構造によるアクセント抑制の規則の習得、強調や疑問表現のピッチ変化におけるアクセントの保持を見るための調査票を同様に作成し録音資料を得て試行的な分析を行った。現段階では時間の制約などからアクセントの情報が研究代表者1名(東京出身)の直感のみに頼って入力されているため、今後アクセント辞典など何らかの情報源を典拠として再度チェックを行ったうえで本データベースを公開したいと計画している。
抗出血因子の構造と作用機構に関する遺伝子工学的研究

本研究では典型的な蛇毒出血毒であるハブ毒に対して抗毒作用を示すマングース血清中に存在する抗出血因子の構造と作用機構を遺伝子工学的手法を用いて明らかにすると共に、その大量発現の条件を確立し、ハブ咬症に対する新規治療薬として抗出血因子を活用することを目的とした。その結果以下の研究結果を得た。1.マングースの血清から3種の抗出血因子、AHFI、AHF2、AHF3を精製し、それらのタンパク質化学的性質、糖含量、一次構造等を調べた。2.これらの抗出血因子とハブ毒の出血因子との相互作用を調べ、その作用機構が、一般に知られているプロテアーゼ阻害剤とは異なり、抗原抗体反応と類似していることを明らかにした。すなわち、抗出血因子と出血因子は弱く結合した複合体を形成するが、その前後においてそれぞれの構造、作用機能に変化はないことを示した。3.抗出血因子の一次構造を他のタンパク質の構造と比較することにより、同因子が分子進化上免疫グロブリンンのスーパージーンファミリーに属すること、また、爬虫類と哺乳類では抗出血因子の起源が異なることを明らかにした。4.マングースの肝臓から抗出血因子の遺伝子を含むcDNAライブラリーを作成することができた。以上のように当初の研究目的を達成するには至らなかったが、マングース抗出血因子を用いた新規抗ハブ毒剤の開発の基盤を作ることができた。本研究は典型的な出血性蛇毒であるハブ毒に対し抗毒素作用を示すマングース血清中に存在する抗出血因子の構造と機能を遺伝子工学的手法を用いて明らかにするとともに、その大量発現の条件を確立し、ハブ咬症に対する新規治療薬として抗出血因子を活用することを目的としており、本年度の研究において以下の成果が得られた。1.マングース血清から精製した3種の抗出血因子、AHF1,AHF2およびAFH3の構造をタンパク質化学的に調べた結果、AHF1とAHF2は糖含量において異なっていたが、同一の一次構造を示した。しかし、AHF3は他の二者とは異なっていることがわかった。この結果、マングース血清中には少なくとも二種類の抗出血因子が存在していることが明らかになった。2.比較的精製の容易なAHF1の全一次構造をタンパク質化学的に検討した。すなわち、AHF1をカルボキシメチル化した後、ブロモシアン、V8プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼを用いて断片化し、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。さらにそれらの配列を他のタンパク質の配列と比較した結果、フクロネズミの抗出血因子およびヒトalpha1B-グリコプロテインの構造との間に高い相同性が認められた。しかし、ハブの抗出血因子の構造との間には相同性はなかった。この結果から爬虫類と哺乳類の抗出血因子の起源がことなることが示唆された。3.本年度の研究で得られた成果に基づいて次年度遂行予定のクローニング実験のためのプローブを合成することができた。なお、本年度の研究成果は、国際毒素学会の学会誌、Toxiconに投稿中である。本研究は典型的な出血性蛇毒であるハブ毒に対して抗毒作用を示すマングース血清中に存在する抗出血因子の構造と機能を遺伝子工学的手法を用いて明らかにすると共に、その大量発現の条件を確立し、ハブ咬症に対する新規治療薬として抗出血因子を活用することを目的としており、昨年度までに(1)マングース血清から精製した3種の抗出血因子、AHF1,AHF2およびAHF3の構造を比較し、糖含量、一次構造における相違を明らかにした、(2)AHF1の構造とフクロネズミの抗出血因子およびヒトα1B-グリコプロテインの間に高い相同性をみいだした、などの成果を挙げている。本年度ではAHF1の遺伝子をクローニングする目的で以下の研究を行った。1.マングースの肝臓からグアニジノチオシアン酸法により全RNAを抽出、精製し、さらにオリゴdTセルロースカラムを用いて総RNAを調製した。この操作を数回繰り返すことにより約10gの肝臓から約20mgのmRNAを得る事ができた。

2.調製したmRNAをドットブロッチングし、さらに、昨年度の研究で得られた一次構造の情報に基づいて作製した2種類のプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、調製したmRNA標品にAHF1のmRNAが存在することを明らかにした。3.mRNAと逆転酵素を反応させ、cDNAの合成条件を詳細に検討し、供試mRNAの約30%からcDNAを合成することができた。以上のように本年度はAHF1の遺伝子のクローニングには至らなかったが、今後の研究の基盤を作ることができた。
カンキツ類における花成の分子制御機構の解明

カンキツにおける幼樹開花特性の分子制御機構を解明するために、マーシュシードレスグレープフルーツを含むカンキツ4品種の種子を5月に播種し、各300以上の実生苗を露地で育成した。12月中旬に加温ガラス室に移したところ、1月下旬からマーシュシードレスグレープフルーツのみ着花を観察した。個体の樹高、葉数、着花時期を調査し、茎および葉から抽出したRNAを用いて主要な花成関連遺伝子の発現量を解析した。その結果、秋冬季の低温に遭遇する前の樹高および葉数に依存して着花率が異なること、茎組織で低温遭遇によりCiFT遺伝子の発現量が増大することが明らかになった。一方、9月から25°Cの人工気象室で育成し低温遭遇させない個体では、着花が抑制され、CiFT遺伝子の発現量が低いことを明らかにし、マーシュシードレスグレープフルーツの実生で観察される幼樹開花特性に低温とCiFT遺伝子が関連していることを示唆した。カンキツ(Citrus)やカラタチ(Poncirus)の近縁属でありながら、これらと異なる開花特性を示すキンカン(Fortunella)の花成特性を明らかにすることを目的に、キンカン腋芽の形態的な変化を顕微鏡下で観察するとともに、主要な花成関連遺伝子の発現を解析した。その結果、キンカンではカラタチとほぼ同じ時期に形態的な花芽分化が起こり、その時期に、葉でCiFT遺伝子の発現が増大することを明らかにした。また、開花直前の時期には別の花成関連遺伝子の発現量が茎で増大することを明らかにした。これらの研究成果を園芸学会平成20年度春季大会で発表した。
蛋白の2次元電気永動法に基づく肺癌蛋白の解析と外科切除後科学療法適応への応用

1.原発性肺癌各組織型に特徴的な16種類の組織分化関連蛋白を2次元電気泳動像上で同定した。2.組織分化関連蛋白および細胞増殖関連蛋白の発現に基づき原発性肺腺癌の典型的泳動像を示す症例(定型例)と示さない症例(非定型例)に分類した。定型例では非定型例に比べ高分化型・リンパ節転移陰性例が多かった(定型例の65.4%、非定型例の20.5%が高分化型、定型例の65.4%、非定型例の34.9%がリンパ節転移陰性)。また定型例で再発までの期間も有意に長かった(3年間無再発率で定型例62.9%、非定型例で27.1%、p=0.0011)。3.肺腺癌関連蛋白TA02分子のN末端側を認識するモノクローナル抗体を作製した。ヒト正常組織での免疫組織化学的解析で組織学的分布を明らかにした。5.以上より2次元電気泳動法による肺癌蛋白の解析は腫瘍の生物学的悪性を評価する上で有用と考える。原発性肺癌の2次元電気泳動法による解析を継続的に行い、特に低分子領域に認められていた各組織型特異的なパターンを確立した。このうちTA02polypeptide(原発性肺腺癌に特異的発現が確認されたペプチド)およびTS02polypeptide(小細胞癌・カルチノイド腫瘍に発現頻度が高いペプチド)と命名した2つのペプチドを2次元電気泳動法により分離後Western Blot法にてmenbramleに転写、menbrameを切り出すことで収集し、N-末端よりのアミノ酸配列の解析を行った。決定したアミノ酸配列からTA02 polypeptideはある種のaspartic proteinaseとhomologyが高いことが分かり、決定された配列をもとに合成ペプチドを作成、免疫源としモノクローナル抗体を作成した。この抗体は免疫組織染色・WesternBlot法に応用可能であることが確認された。原発性肺癌各組織型での免疫組織化学染色の結果は以下のとおりである。TS02 polpeptideは脳組織から既に分離・同定されているneuronspecificprotein PGP9.5と100%homologousな分子であった。同ペプチドは非小細胞肺癌でも12.5%に発現し、非発現症例に比較し高頻度に2年以内再発を認めている(再発率:TS02発現非小細胞肺癌症例:64.3%,TS02非発現症例:40.3%)。高分化症例の検討で原発性肺癌各組織型に特徴的な2次元電気泳動パターンを決定した。これに基づき原発性肺腺癌の典型的泳動像を示す症例(定型例)と示さない症例(非定型例)で病理学的諸因子・予後(再発までの期間)を比較検討した。定型例では非定型例に比べ高分化型・リンパ節転移陰性例が多く(定型例の65.4%、非定型例の20.5%が高分化型、定型例の65.4%、非定型例の34.9%がリンパ節転移陰性)、また定型例で再発までの期間も長かった(3年間無再発率で定型例62.9%、非定型例で27.1%、p=0.0011)。肺腺癌関連蛋白TA02分子のN末端側を認識するモノクローナル抗体を作製した。ヒト正常組織での免疫組織化学解析でTA02はII型肺胞上皮の細胞質に高発現し、尿細管、膵外分泌腺上皮の一部で発現していた。原発性肺癌組織では腺癌の81%が陽性、その他の組織型では大細胞癌の一部で弱陽性、その他の組織型では陰性だった。膵癌・乳癌・甲状腺癌・大腸癌・卵巣癌のごく一部で弱陽性を示した。98年に新しいasparticprotenaseとしてNapsinAの遺伝子配列が公表されたがTA02のN末端と相同性が高った。RNAレベルでのTA02発現肺腺癌症例のnapsinA発現と、napsinn A-GSTfusion proteinの抗TA02抗体との反応性を示すことでnapsinAとTA02との同一性を示した。
在ウクライナ史料を導入した初期ソ連農民史の再構築

これまで申請者は専ら在ロシアの諸史料を用いて初期ソ連農民史の研究を進めて来たが、本研究では、史料上の新機軸として在ウクライナのアーカイヴ史料の本格的導入を試みる。その効果としては、(1)ウクライナ独自の史料による特殊ウクライナ的諸事象の解明、およびそれによるソ連レヴェルでの特殊ロシア的諸事象の相対化と補正、(2)主要な連邦構成共和国としてのウクライナの首都キエフに残っている、モスクワでは散逸ないし利用制限のため閲読できない文書の発掘と活用がまず挙げられるが、さらに、(3)モスクワにも存在するものの、諸々の閲読上の不便が存在する諸文書の効率的利用という研究遂行上重要な利点も見込まれる。
ガラス転移の統一概念

(1)研究代表者・分担者による打ち合わせとミニシンポジウム(2006年8月5日):2006年度に計画されていた第4回「ガラス物性の統一概念」国際会議が2008年に延期されたことを受けて、研究代表者と分担者の会合を行い、第5回会議を日本で開催することを確認した。(2)第4回非平衡現象に関する国際ワークショップにおける情報収集(2006年9月1722日):1名を派遣し、研究発表を行うとともに情報収集を行った。(3)東京大学物性研究所短期研究会「ガラス転移の統一概念」の開催(2006年11月2022日):全国から様々な分野の研究者が延べ158名参加し、口頭発表32件、ポスター発表11件の講演が行われた。理論的枠組みの構築、実験手法の改善、実験対象の拡大などガラス転移の本質的な理解に向けて、我が国における研究が着実に発展していることが示された。また、国際会議の開催に向けた今後の取り組みが報告された。(5)組織委員会立ち上げ(2007年9月24日):9月初旬に2008年に計画されていた「ガラス物性の統一概念第4回会議」が中止となり、関係者より急遽日本での開催が要請された。国内関係者の会合を持ち、平成20年11月に日本で開催するための組織委員会を設立した。(6)国際ワークショップの開催(2007年11月22-24日):インドのDas教授、ベトナムのHoang教授を招いて、ワークショップ「Unifying Concepts of Glass Transition」を開催した。およそ50名の参加があり、国内の研究の動向を調査した。(7)ファーストサーキュラーの発送(2007年12月12日):「ガラス物性の統一概念第4回会議」を2008年11月25-28日に京都大学芝蘭会館稲盛ホールで開催することとし、ファーストサーキュラーを発送した。
低分子量G蛋白質の活性調節におけるイソプレニル化酵素の役割

我々はこれまでに蛍光標識したGGTaseおよびFTaseの基質ペプチドを用いて細胞のFPPやGGPPがHMG-CoA還元酵素阻害薬処理後ダイナミックに変化することを示した。また、この方法を応用して内因性のGGTaseおよびFTaseの活性を測定し、Gタンパク質共役型受容体刺激がGGTaseやFTase(の活性化を増大させることを見出した。今回はその作用機構について検討した。血管内皮細胞において、リゾホスファチジン酸(LPA)やトロンビン、スフィンゴシン1リン酸(S1P)は、内因性のFTase活性を増大させた。この反応は細胞を百日咳毒素で処理すると抑制されることから、Giを介した反応であると考えられた。このFTaseの活性化はPI3キナーゼ阻害薬や、ERK阻害薬、p38MAPキナーゼ阻害薬では影響されなかったが、チロシンキナーゼ阻害薬のPP2により抑制された。また、βγサブユニットの機能を阻害するβARKのc末端をアデノウイルスにより発現させると抑制された。FTaseは、FTaseαとFTaseβのヘテロダイマーで機能的な酵素を構成する。HEK293細胞にFTaseαとFTaseβのcDNAを発現させると、FTase活性の増大が認められた。このリコンビナント酵素の活性調節も、内皮細胞で認められた制御機構と同様の性質を示した。このことから、イソプレニル転移酵素のうち少なくともFTaseの活性はG蛋白質のβγサブユニットの下流でチロシンリン酸化を介して制御されることが示唆された。
大きな双極子モーメントを有する棒状高分子における新規強誘電ネマチック液晶

本研究では、頭尾の識別された全芳香族ポリエステルをヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシナフトエ酸をベースに種々合成し、そのサーモトロピック液晶特性及び液晶構造を調べ、以下の点を明らかにした。(1)SHG活性であるか否かを検討し、極性構造の有無について確認した結果、重合度が3040以上のポリエステルのネマチック液晶が、極性構造を有することが明らかにされた。(2)SHG強度の偏光子角依存性を調べた結果、Csの対称性を有する極性ネマチック相であることが判明した。これは、分子軸方位のみならず、それに垂直な方位にもダイレクターが存在し、また同時に極性も存在する特異な構造であることを示す。(3)メタ・ヒドロキシ安息香酸の導入(5%程度)で、Csの対称性からCrovの対称性に変換することがわかった。これはメタ体によるキンク構造をネマチック液晶場に収容するには、分子軸に垂直方位の極性をキャンセルせざるを得ないという解析結果と一致するものである。本研究では、ヒドロキシ安息香酸とヒドロキシナフトエ酸、またヒドロキシビフェニルカルボン酸とヒドロキシナフトエ酸から合成される二つの系での共重合体(それぞれC-1系とC-2系とする)を合成し、その二次の非線形光学効果(SHG)を調べることで、極性ネマチック相の確認を行ない、以下の諸点を明らかにした。1.これらC-1とC-2共重合体系は、いずれも頭尾の識別される全芳香族高分子であるとともに、共重合成分のランダムシークエンスのため、高温(280°C以上)においてネマチック液晶を形成する。2.ネマチック相においてSHGを調べた結果、10pm/V程度の比較的大きな二次の非線形光学効果を示すことがわかり、極性構造を有するものであることがわかった。3.この極性ネマチック相の発現は、分子量に依存するものであり、分子量がある程度大きくない(7inh>1.0dL/g)と出現しない。4.繊維試料のSHGを、入射光、反射光の偏光面と繊維軸とのさまざまの角度関係で観測した結果、C-1系はCsの対称性、C-2系は、C_∞Vの対称性を有する極性ネマチック相であることを確認した。これは、C-1系では分子軸に平行方位のみならず垂直な方位にも、極性が存在することを示すものである。本研究では、頭尾の識別された全芳香酸ポリエステルをヒドロキシ安息香酸、ヒドリキシナフトエ酸をベースに種々合成し、以下の点を明らかにした。(1)SHG活性であるかどうかを調べることで、極性ネマチックの確認を行った結果、重合度が3040の領域で、ネマチック相の構造が本見的に変化することがわかった。この限界重合度以下では通常のネマチック相であるのに対して、これ以上では、極性ネマチック相となる。(2)種々のポーラライザー、アナライザーの角度変化に対するSHG強度依存性を調べた結果、C_Sの対称性を持つ極性ネマチック相であることが判明した。(3)メタ・ヒドロキシ安息香酸の導入(5%程度)で、C_Sの対称性からC_<OOV>の対称性に転換できることがわかった。これはメタ体によるキンク構造をネマチック液晶場に効果的に収容するには、分子軸方位の極性をキャンセルせざるを得ないという解析結果と一致することを明らかにした。
いもち病菌の病原性レース変異機構に関する研究〜非病原性遺伝子と遺伝的組換え〜

1.非病原性遺伝子の解析K59に対する病原性変異株が取得できなかったため,既存の愛知旭に対する病原性変異株Ina168m95-1を用い,親株Ina168r95-1とのゲノムDNA多型を検索した.その結果変異株Ina168m95-1に特異的に欠失したDNA断片PM01を得た.PM01と非病原性遺伝子Avr-piaは強く連鎖していることが示された.PM01の周辺領域を含む,3つのコスミドクローンを用いて変異株を形質転換したところ1つのクローンでその変異が相補され,Avr-piaが含まれていることが示唆された.一方,交配可能な2つのイネ菌株を用い交配後代菌の病原性の分離を調べた.その結果,イネ品種「石狩白毛」に対して非病原性を示す菌株と病原性を示す菌株の比は1:1に適合し,「石狩白毛」に対する非病原性は1個の遺伝子により支配されていることが明らかとなった。同様にして,イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子も同定した.RFLP解析、RAPD分析をすることにより、イネ品種分子マーカーを選抜し,染色体地図上にマッピングした.イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子Avr-Hattan3近傍の物理地図を作製するため,Avr-Hattan3と密接に連鎖するマーカーを用いて,いもち病菌のBACライブラリーを選抜し,約600kbにわたるBACコンティグを作成した.2.組換えに関する遺伝子の解析Degenerate PCR法を用いて,いもち病菌のRad50,Rad52,Rad54,mre11のいもち病菌ホモログのクローニングを行い,さらに上記のゲノムライブラリーより,全長のRad52,Rad54,Mre11遺伝子を含むクローンを得た.これらの塩基配列を解析したところ,アカパンカビの相同遺伝子と高い相同性を示した.これらの遺伝子をそれぞれRhm52,Rhm54,Mhm11と命名した.これらのクローンを用いてアカパンカビの相同遺伝子の変異株を形質転換したところ,Rhm52,Rhm54遺伝子はその変異を相補し,ホモログであることが確認された.このうちRhm54遺伝子については,MMS処理によりその転写が誘導されることが確認された.1.非病原性遺伝子の解析K59に対する病原性変異株が取得できなかったため,既存の愛知旭に対する病原性変異株Ina168m95-1を用い,親株Ina168r95-1とのゲノムDNA多型を検索した.その結果変異株Ina168m95-1に特異的に欠失したDNA断片PM01を得た.PM01と非病原性遺伝子Avr-piaは強く連鎖していることが示された.PM01の周辺領域を含む,3つのコスミドクローンを用いて変異株を形質転換したところ1つのクローンでその変異が相補され,Avr-piaが含まれていることが示唆された.一方,交配可能な2つのイネ菌株を用い交配後代菌の病原性の分離を調べた.その結果,イネ品種「石狩白毛」に対して非病原性を示す菌株と病原性を示す菌株の比は1:1に適合し,「石狩白毛」に対する非病原性は1個の遺伝子により支配されていることが明らかとなった。同様にして,イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子も同定した.RFLP解析、RAPD分析をすることにより、イネ品種分子マーカーを選抜し,染色体地図上にマッピングした.イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子Avr-Hattan3近傍の物理地図を作製するため,Avr-Hattan3と密接に連鎖するマーカーを用いて,いもち病菌のBACライブラリーを選抜し,約600kbにわたるBACコンティグを作成した.2.組換えに関する遺伝子の解析Degenerate PCR法を用いて,いもち病菌のRad50,Rad52,Rad54,mre11のいもち病菌ホモログのクローニングを行い,さらに上記のゲノムライブラリーより,全長のRad52,Rad54,Mre11遺伝子を含むクローンを得た.これらの塩基配列を解析したところ,アカパンカビの相同遺伝子と高い相同性を示した.これらの遺伝子をそれぞれRhm52,Rhm54,Mhm11と命名した.これらのクローンを用いてアカパンカビの相同遺伝子の変異株を形質転換したところ,Rhm52,Rhm54遺伝子はその変異を相補し,ホモログであることが確認された.このうちRhm54遺伝子については,MMS処理によりその転写が誘導されることが確認された.1.非病原性遺伝子の解析K59に対する病原性変異株が取得できなかったため,既存の愛知旭に対する病原性変異株Ina168m95-1を用い,親株Ina168r95-1とのゲノムDNA多型を,AFLP法で検索した.その結果,350bpの変異株のみに存在する多型断片を得た.一方,交配可能な2つのイネ菌株を用い交配後代菌の病原性の分離を調べた.その結果,イネ品種「石狩白毛」に対して非病原性を示す菌株と病原性を示す菌株の比は1:1に適合し,「石狩白毛」に対する非病原性は1個の遺伝子により支配されていることが明らかとなった.同様にして,イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子も同定した.

2.組換えに関する遺伝子の解析DegeneratePCR法を用いて,いもち病菌のRAD50,RAD52,RAD54ホモログのクローニングを試みた.既知のホモログのアミノ酸配列より,プライマーを設計し,これを用いてPCR反応を行ったところ,それぞれ450bp,300bp,400bpのDNA断片が検出された.このうち,RAD50,RAD52についてはプラスミドベクターpBluescriptにクローニングし,その塩基配列を決定した.既知のホモログとの相同性は,RAD50ホモログはヒトと41%,出芽酵母と46%,アカパンカビとは45%の相同性があり,RAD52ホモログはひとと56%,出芽酵母と55%,分裂酵母と72%の相同性があり,とくに分裂酵母と高い相同性が見られた.1.非病原性遺伝子の解析いもち病菌株Y90-71と3514R-2の交配後代146菌株について、RFLP解析、RAPD分析をすることにより、イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子の近傍に位置する、分子マーカーを選抜した。同様にして、イネ品種「愛知旭」および「石狩白毛」に対する非病原性遺伝子についても、近傍の分子マーカーの探索を行った。一方,昨年度報告した病原性変異株Ina168m95-1に特異的なAFLP断片E+AA/M+T350の塩基配列はDNA型トランスポゾンMGR586とレトロトランスポゾンMaggyに類似の配列からなっていた.一方、愛知旭への病原性を獲得した変異株Ina168m95-1に特異的に欠失したDNA断片PM01を用いてRFLP解析を行った.クロス5307交配後代におけるPM01のRFLPの分離と愛知旭への病原性の分離を比較したところ完全に一致し,PM01と非病原性遺伝子Avr-piaは強く連鎖していることが示された.PM01を含む領域の欠失が非病原性遺伝子の変異の原因であることが強く示唆された.2.組換えに関する遺伝子の解析Degenerate PCR法を用いて,本年はrad54とmre11のいもち病菌ホモログのクローニングを試みた.その結果,それぞれ443bp,376bpの増幅断片をクローニングした.増幅断片の塩基配列を決定した.Neurospora crassaのホモログとのアミノ酸配列及びDNA塩基配列の相同性は,rad54についてはそれぞれ93.5%,75.7%,mre11についてはそれぞれ83.1%,73.3%,と高い相同性を示した.これらの遺伝子及び昨年度クローニングしたrad50,rad52ホモログがシングルコピー遺伝子であることがサザン法により確認された.1.非病原性遺伝子の解析非病原性遺伝子Avr-pia,Avr-Hattan3,Avr-piiに関して,昨年度探索したRFLPマーカーを用いて染色体地図上にマッピングした.また,イネ品種「八反3号」に対する非病原性遺伝子Avr-Hattan3近傍の物理地図を作製するため,Avr-Hattan3と密接に連鎖するマーカーを用いて,いもち病菌のBACライブラリーを選抜し,約600kbにわたるBACコンティグを作成した.一方,コスミドベクターpMOcosXを用い,平均40kbのインサートを持つ,4800クローンからなる菌株ina168のゲノムDNAライブラリーを作成した.このライブラリーより,菌株2107-33より発見された,Avr-piaに密接に連鎖したDNA断片PM01の周辺領域を含む,3つのクローンを得た.このクローンを用いて変異株を形質転換したところ1つのクローンでその変異が相補され,Avr-piaが含まれていることが示唆された.
トルコ・イスラム時代中央アジア文化の総合的研究

平成6年度は史料・文献の収集に重点をおき、公刊史料はもちろん、未公刊史料のマイクロフィルムや、世界各国で出版されている写本カタログなども積極的に収集した。同時に各研究班(トルコ語文献研究班・ペルシア語文献研究班・ス-フィズム研究班・口承文学研究班)の単位で、パーソナル・コンピュータを活用し、文献から得られた情報のデータベース化を進行させた。その過程で、バ-ブル著「バ-ブル・ナ-マ」(トルコ語文献研究班)やヤズディー著「ザファル・ナ-マ」(ペルシア語文献研究班)などティム-ル朝期の史料に関して大きな成果が上がった。特に「バ-ブル・ナ-マ」の研究では、世界初の校訂テキストを発表することができた。平成7年度は、史料・文献の収集を継続する一方、各研究班で、重要な史料のテキスト・語彙の研究、および日本語訳を行った。コンピュータによるデータベース化は、史料・文献に関する情報だけでなく、テキスト・語彙および日本語訳についても進行させた。その結果として「バ-ブル・ナ-マ」(トルコ語文献研究班)の全単語索引が完成し、また、ヤズディー著「ザファル・ナ-マ」(ペルシア語文献研究班)に関する成果も公表することができた。最終年度の平成8年度は、全研究班合同で、これまでに得られた情報の整理、および史料のテキスト・語彙や日本語訳の再検討を行った。また、必要に応じて、コンピュータによるデータベース化の作業を継続した。その決果、主に史料のテキスト・語彙に関して多くの成果が上がった。これらの成果は、全て、トルコ・イスラム時代中央アジアの文化を多角的に捉える上で極めて重要なものである。しかし、研究成果報告書において全てを公表することは不可能であったため、ミールザ-・ハイダル著「タ-リ-ヒ・ラシーディー」とビナ-イ-著「シャイバーニ-・ナ-マ」に関する成果だけを掲載するにとどめた。1.トルコ語文献研究所では、文献調査の一環として、昨年アメリカで出版された、W.M.サクストンによる『バ-ブル・ナ-マ』ローマ字転写テクストとペルシア語訳本校訂テクストの内容を綿密に検討した。その結果、この刊本には欠落部や不備な点が多く、最も重要なハイデラーバード写本と唯一の校訂本(N.イルミンスキー編)の比較検討も十分ではないことが判明した。また、同じく『バ-ブル・ナ-マ』に関して、よく知られているペルシア語訳写本(在インド)は、本文より挿絵の細密画を優先しており、テクストとしては価値が低いこと、エルフィンストン写本(在イギリス)は、旧来の説とは異なり、ハイデラーバード写本を補う意味で独自の価値を持つこと、が明らかになった。これら一連の作業では、設備備品として購入したコンピュータを活用し、テクストのデータベース化を行った。2.ペルシア語文献研究所では、ティム-ル朝関係文献のうち、ヤズディー著『ザファル・ナ-マ』のマシュハド写本が独自の価値を持つことが明らかになり、この歴史書の成り立ちを再検討する必要性が確認された。また、最も有名なティム-ル朝史家ハーフィズィ・アブルーによる『歴史集成』の、高い価値を持つ、トプカプ・サライ所蔵写本の内容が、製本時に不手際により非常に混乱しており、原形の復元作業が急務であることが確認された。3.ス-フィズム研究班では、ナクシュバンディー教団に属した著名シャイフの伝記を調査し、これまで我が国ではほとんど知られていなかった史料(アブドゥル・ワ-スィ著『マカ-マ-ティ・ジャーミ-』など)の内容と性格を明らかにした。

4.口承文学研究班では、最近旧ソ連中央アジア諸共和国で活発に出版されている民族文学諸作品を調査し、『チンギズ・ナ-マ』など極めて重要な資料を多数発見した。1.平成6年度に続いて、原典史料の収集・購入は活発に推進した。近年イランで校訂・出版されたティム-ル朝およびサファヴィー朝関係史料を多数入手し、公刊されていない写本史料についても、研究代表者・研究分担者が個人的に入手したマイクロ・フィルムをもとに、利用し易い形に整理した。その過程で、ナヴァーイ-著『マフブ-ブ・アルクルーブ』など、史料的価値が正当に理解されていなかったものを、数多く発見した。また、海外の図書館に所蔵されている写本コレクションの目録類の購入では、ポーランドほか、意外な国のコレクションの内容が明らかになった。2.パーソナル・コンピュータを利用した作業では、間野英二作成の校訂本をもとに『バ-ブル・ナ-マ』に見られる語彙の分析を進め、予定通り、地名・人名・部族名などの固有名詞のみならず、複合動詞や一般名詞も含めた索引が完成した。その結果、中央アジア文化に対する理解を深める上で、極めて重要な述語の抽出に成功した。また、ヤズディー著『ザファル・ナ-マ』マシュハド写本に関して昨年度得られた新知見を、安藤志朗が独文で発表し、世界的に高い評価を受けた。来年度久保一之により公刊される予定のビナ-イ-著『シャイバーニ-・ナ-マ』からも、16世紀初頭のウズベク諸族に関する貴重な情報が多く得られた。3.各研究班では、平成6年度に収集・整理しておいた、チャガタイ・トルコ語文献、ティム-ル朝関係ペルシア語文献、ナクシュバンディー教団関係文献、口承文学資料について、重要記事の抽出ならびに翻訳の作業をほぼ予定通りに完了した。これらの翻訳自体は公表可能な分量を大きく上回ってはいるが、作業中に得られた新知見は、来年度公刊する報告書において発表される予定である。今年度が本研究のプロジェクトの最終年度にあたるため、全ての研究班(トルコ語文献研究班・ペルシア語文献研究班・ス-フィズム研究班・口承文学研究班)合同で、次のように作業・考察を重ね、研究成果をまとめた。1.各研究班でこれまでに収集した未公刊史料や書籍を再検討し、特に最新の学術情報について、パーソナル・コンピュータによるデータベース化を行った。2.各研究班で進めてきた史料の日本語訳については、主要な記述のコンピュータ入力を完了した。特にトルコ語文献研究班では、一貫して研究対象としていたバ-ブル著「バ-ブル・ナ-マ」の日本語全訳とそのコンピュータ入力を終え、公刊の準備すら整った。他の史料については、残念ながら部分的な翻訳にとどまり、さらに検討すべき箇所を残している。3.未公刊史料の中で、特に重要なものについては校訂作業を進め、適宜コンピュータ入力を行った。その結果、ペルシア語文献に関して大きな二つの成果が得られた。第一は、部分的なものではあるが、ミールザ-・ハイダル著「タ-リ-ヒ・ラシーディー」に見られる極めて重要な記事の、世界最良の校訂テキストが完成したことである。第二は、これまで部分的なロシア語訳注しか公刊されていなかったビナ-イ-著「シャイバーニ-・ナ-マ」の、校訂テキストが完成した。
局所トンネル電子励起による自己組織化分子発光測定

研究は以下の3つのサブテーマに分けて行った.(1)表面上での単一分子計測および分子自己組織化制御,(2)導電性透明薄膜(ITO)でコーティングしたSTM探針を用いたSTM発光測定の高精度化,(3)単一分子レベルのSTM発光を得るための基板作成.(1)については,様々な分子の基板上での吸着状態や自己組織化状態を明らかにし,蒸着条件などを変化させることで制御を試みた.(2)については,発光検出の高効率化を実現し,分光も検出できるようになった.さらに, (3)の分子発光測定に適した絶縁薄膜基板を実現することで,微弱ながら単分子からの発光検出に成功した.研究は以下の3つのサブテーマに分けて行った.(1)表面上での単一分子計測および分子自己組織化制御,(2)導電性透明薄膜(ITO)でコーティングしたSTM探針を用いたSTM発光測定の高精度化,(3)単一分子レベルのSTM発光を得るための基板作成.(1)については,様々な分子の基板上での吸着状態や自己組織化状態を明らかにし,蒸着条件などを変化させることで制御を試みた.(2)については,発光検出の高効率化を実現し,分光も検出できるようになった.さらに, (3)の分子発光測定に適した絶縁薄膜基板を実現することで,微弱ながら単分子からの発光検出に成功した.走査型トンネル顕微鏡(STM)の探針から注入したトンネル電子を励起源とした発光を調べるために,まず直接遷移半導体であるp-GaAs(110)表面を試料として計測の最適化を行った.探針は先鋭化した光ファイバーにITOをコーティングしたものを用い,探針直下の発光を効率良く検出する.p-GaAs(110)表面を試料として用いた場合,フォトンカウンティング領域ではあるが,数pAの微弱トンネル電流でも発光を検出することが出来た。また,この光ファイバー探針を用いても原子分解能のSTM観察が可能なことを確認した.さらに,この微弱光を分光することもでき,そのピーク波長は838nmとGaAsのバンドギャップと一致しており,バルクからの発光を計測していることが分かった。以上のように,STMの原子分解能観察と,STMのトンネル電子を励起源とした発光を検出および分光を同時に行えることを確認した.また,分子組織化については,マクロ計測が可能な低速電子線回折装置に試料冷却機構を設置し,周期構造の高分解能計測が行えるようにした.基板上での分子自己組織化の研究として,有機EL素子の発光分子として有名なAlq3分子について,Cu(111)を基板として用いて,低温・走査型トンネル顕微鏡(STM)で調べた.室温基板上に蒸着した時,Alq3分子は自己組織化することなく単分子が分散していたのに対し,基板温度が260K以下では一次元鎖を形成することが明らかになった.詳しい解析により,室温基板に吸着した分子が安定な吸着構造をとるのに対し,低温基板では準安定な吸着構造をとり,その準安定構造の時のみ一次元鎖を形成することが明らかになった.このAlq3分子のSTMトンネル電子励起による発光を調べたが,検出感度以下であった,これは,金属基板へのエネルギー失活が原因と考えられる。そこで,基板をNiAl(110)に変え,酸化によってアルミナ絶縁薄膜を形成させ,エネルギー失活を抑える試みを行ったところ,微弱ではあるが単一分子からの発光を検出することに成功した.発光は,正負両バイアス電圧で検出することができた.今後は,この発光の詳細を測定して行く予定である.
水素吸蔵合金における特異な水素誘起せん断型変態の材料科学とその工学的応用

RENi_5,RE_2Ni_4ユニット(RE:希土類元素)の積層構造からなるLa_2Ni_7の水素吸蔵過程で生じるRE_2Ni_4ユニット層の周期的なせん断変形を伴う変態の素過程について,室温での圧力-水素(PCT)線図の解析ならびに,X線回折,透過電子顕微鏡,走査透過電子顕微鏡観察に基づいた詳細な水素化物の結晶構造解析により解明を試みた.RENi_5,RE_2Ni_4ユニット(RE:希土類元素)の積層構造からなるLa_2Ni_7の水素吸蔵過程で生じるRE_2Ni_4ユニット層の周期的なせん断変形を伴う変態の素過程について,室温での圧力-水素(PCT)線図の解析ならびに,X線回折,透過電子顕微鏡,走査透過電子顕微鏡観察に基づいた詳細な水素化物の結晶構造解析により解明を試みた.RENi5,RE2Ni4ユニット(RE:希土類元素)の積層構造からなるLa2Ni7の水素吸蔵過程で生じるRE2Ni4ユニット層の周期的なせん断変形を伴う変態の素過程を室温での圧力ー水素(PCT)線図およびX線回折,透過電子顕微鏡,走査透過電子顕微鏡(STEM:scanning transmission electronmicroscopy)観察から解明を試みた.このせん断型相変態は,30%もの大きな格子膨張を伴ってはじめにRE2Ni4ユニットが水素化し,引き続いて起こるRENi5ユニットの水素化過程でRE2Ni4ユニット層内で生じる周期的なせん断変形であり,水素化の第1サイクルでRE2Ni4ユニット層で生じ,その後の高H/M比を伴う一連の水素化物の形成,分解過程でも安定で,その構造は崩れることはない.また,水素圧力を可能な限り下げても逆変態は起こらない.この周期的なせん断変形の結果,結晶格子は六方晶(空間群P63/mmc)から斜方晶(空間群Cmcm)へと相変態する.X線回折でもこの2つの空間群の区別は可能であり,これまでの他者の研究でこれが明らかにされなかった理由は不明である.このせん断変形は,六方晶格子では底面(積層面)に平行で,(0001)1/6<1100>と表される.このため3つの等価な方向があり,せん断ベクトルの方向により3つのバリアント(斜方晶)が形成される.このせん断ではRE原子面だけでなく,Ni原子面にもせん断変位が生じるが,引き続いて起こる高H/M比を伴う一連の水素化物の形成ではせん断変位が生じたNi原子面のNi原子のうち半数に逆方向のせん断が生じ、この半数のNi原子の正逆方向のせん断が出し入れ可能な可逆的水素の挿入・脱離と密接に関連していることが明らかになった.
ポリシアル酸とＦＧＦ２による神経機能の新しい制御メカニズムの証明

ポリシアル酸(polySia)はシアル酸が8-400残基縮重合した構造体の総称で、胎児脳の神経細胞接着分子(NCAM)を修飾している。成体脳ではpolySia構造はほとんど消失するが、海馬や嗅球などの神経新生が盛んな領域ではその発現が維持されている。NCAM上のpolySia構造はその巨大な排除体積によって、細胞接着を負に制御することが知られていたが、本研究によりpolySiaはFGF2などの神経における生理活性物質を自身に保持する分子保持機能を持つこと、またその受容体への提示を制御することで神経機能を制御しうることが示された。この機能はpolySiaの構造によって調節されることも示唆された。ポリシアル酸は脳に局在するユニークな生理活性糖鎖であり、これまでその巨大な排除体積による反接着作用のみが考えられてきた。我々は近年ポリシアル酸が、脳に存在する種々の神経作用因子、脳由来神経栄養因子(BDNF)や神経伝達物質(ドーパミン)と特異的に結合し複合体を形成すること、それらの細胞外濃度を制御することにより細胞内へのシグナル伝達を変化させることを明らかにしてきた。本研究では、特に神経作用因子の中でも増殖因子FGF2に焦点をあて、そのポリシアル酸との複合体の性質を詳細に検証すること、FGF受容体(FGFR)との三者会合体の可能性をさぐること、細胞増殖やそのシグナル伝達に及ぼす影響を明らかにすることが目的である。本年度は昨年度に確立した方法を用いて、ポリシアル酸とFGF2の結合性を、脳に共局在するヘパラン硫酸とFGF2の結合性と比較することにより、より詳細に解析した。その結果、ポリシアル酸とFGF2の結合性は、ヘパラン硫酸とFGF2との結合性と全く異なり、複合体がより大きいこと、受容体と三者会合体を作らないこと、ポリシアル酸ーFGF2複合体からFGFは移動できるが、HSーFGF2複合体からFGF2は移動できないこと、FGF2の各酸性多糖に対する結合サイトが異なることなどが新たに明らかになった。また、細胞におけるFGF2の効果について、NIH-3T3細胞を用いた結果から、ポリシアル酸は生存よりもむしろ増殖に関与することが明らかになった。本研究では、我々が初めて明らかにしたポリシアル酸の分子保持機能のうち、特にFGF2分子に着目し、その構造的基盤および制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度はポリシアル酸の担体タンパク質としてpolySia-NCAMを安定発現する細胞株を樹立し、polySia-NCAMの精製法を確立した。精製したpolySia-NCAMとFGF2との相互作用を分子間力測定装置を用いて解析したところ、polySia-NCAMのpolySia鎖のFGF2に対する親和力は10-9(M)であること、polySia鎖単独で計測した値よりも10倍程度強いことがわかった。このことは、polySia-NCAMのpolySia鎖が結合しているN型糖鎖もFGF2との結合に重要であることを意味している。加えて、FGF2のpolySia鎖への結合は、時間依存的に減少することが明らかになり、FGF2の時間依存的におこる微妙な構造変化をpolySia鎖は感知すること、すなわちFGF2の寿命を制御しうる機構の存在が示唆された。一方、ヘパラン硫酸(HS)が発現しており、polySia鎖を発現していないNIH-3T3細胞を用いて、polySia転移酵素発現プラスミドおよびHS合成酵素siRNAを用いて、polySIa+/HS+, polySia+/HS-, polySia-/HS+, polySia-/HS-の4種類の細胞を作製し、FGF2依存的な増殖を解析した。その結果、FGF2依存的な増殖はHS依存的であるが、この増殖はpolySia鎖の存在で、消失することが明らかになった。このことはFGF2依存的な増殖がHSだけでなくpolySia鎖を介しても行われることを示唆している。またpolySia存在下での増殖に関しては、FGFRを介するErkのシグナル変動から、その制御機構としてローパスフィルターモデルが提唱された。

本研究では、特に神経作用因子の中でも増殖因子FGF2に焦点をあて、そのポリシアル酸との複合体の性状を詳細に検証すること、FGF受容体(FGFR)との三者会合体の可能性をさぐること、細胞増殖やそのシグナル伝達に及ぼす影響を明らかにすることが目的である。本年度は特にポリシアル酸とFGF2の相互作用解析の方法を確立することを目的とした。ゲル濾過クロマトグラフィーとゲルシフトアッセイによりポリシアル酸とFGF2との直接的な結合の証明を様々なポリシアル酸構造(結合位、重合度、シアル酸組成)とFGF2を用いて行った。またポリシアル酸とFGF2との解離常数の解析には表面プラズモン共鳴法を用いた。特に特異的な結合に対する解離常数を正確に求めるために、カルボキシメチルデキストランコートされている通常のChipではなく、金表面に自己組織膜を形成させ、その表面上に多糖を固相化するという工夫を行った。加えて非特異的な吸着に関しては(GlcNAc)3のセンサーグラムをバックグラウンドとして用いることで、より正確な解離定数を求めることに成功した。ポリシアル酸のFGF2保持機能をHSのFGF2保持機能と比較検討を行い、その違いを発見できた。また、統合失調症由来の酵素を用いたポリシアル酸鎖の解析も終了したため。ポリシアル酸とFGF2の相互作用を直接的に解析する方法を確立し、ポリシアル酸とFGF2の相互作用が定量的に解析できるようになったため。今後、計画にあった統合失調症患者由来のポリシアル酸転移酵素由来のポリシアル酸をもつNCAMを用いた機能解析や、抗体を用いたポリシアル酸鎖の検出法の解析を進める。今後、ポリシアル酸のFGF2保持機能をHSとFGF2との関係性と比較する予定であり、計画通りに推進する。次年度も計画に従って遂行する予定である。次年度も計画に従って使用する予定である。