hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ構造チタニアの生体活性とバイオ医用応用

(1)ミクロ条溝形成チタニア表面への細胞接着表面に幅12及40ミクロンの溝を形成したチタニア(TiO2)と平滑面試料をゾルーゲル法とリソグラフィー法を組合せて作製し、骨芽細胞(MC3T3-E1)を培養し光学顕微鏡とSEMで細胞接着挙動を調べた。細胞は溝の方向に沿って配列し、溝幅が狭いほどその傾向は強くなった。Alamar blue assay解析からミクロ溝は細胞の成長を規定し、ALP活性解析から増殖速度を規定すること、溝幅が狭いほどその傾向が強くなることが示された。表面エネルギーは12<40<平滑面の順であり、骨芽細胞の増殖と分化は表面エネルギーとよく関連している。(2)チタニアへの蛋白質吸着特性のシミュレーション計算評価分子軌道(MD)法を用いてRGDペプチドとチタニアの界面での相互作用をRGDの初期構造、チタニアの結晶構造、表面欠陥、水性環境の4つの因子を考慮しシミュレーション計算した。RGD初期構造よりもチタニア結晶構造のほうが、ルチル(110)面よりもアナターゼ(101)面のほうが、及び原子面のステップ構造がRGDの吸着に大きな影響を及ぼすことが示された。インプラントの歯科・整形外科応用へのチタンの表面修飾に理論的な指針を与えるものである。(3)チタニアナノチューブ表面への細胞接着チタン表面に形成したチタニアナノチューブ上に、熱水条件下で断面六角形のプリズム型ハイドロキシアパタイト(HA)結晶を合成した。HAの成長を制御し形態に影響を与える沈殿エージェントとして尿素を添加し、尿素の分解を導く熱水温度を選択した。密度関数理論(DFT)計算から、尿素の結合工ネルギーは(001)より(100)表面のほうが高く、HA結晶の形態に影響し、核生成・成長段階でHA結晶の成長を制御できることが示された。インプラントに用いられるチタン(Ti)の生体親和性の基本となる耐食性酸化被膜を構成するチタニア(TiO2)は材質的にもともと生体親和性に富むことから、そのナノチューブはすぐれたバイオ特性を発揮すると期待される。本研究では、チタニア(TiO_2)の幅12μmと40μmの溝を形成した試料と平滑面試料をゾルーゲル法とリソグラフィー法を組合せて作製し、骨芽細胞(MC3T3-E1)を培養し光学顕微鏡とSEMで細胞形態を観察し接着挙動を調べた。各試料の表面エネルギーはγ12μm<γ40μm<γflat surfacesの順であり、骨芽細胞の増殖と分化は表面エネルギーとよく関連している。次にミクロ/ナノチタニアの蛋白質吸着特性を評価するために、モリキュラーダイナミックス(MD)法を用いてRGDペプチドとチタニアの界面での相互作用を計算した。RGDの吸着性に及ぼす影響としてRGDの初期構造、チタニアの結晶構造、表面欠陥、水性環境の4つの因子を考慮しシミュレーション計算した結果、RGD初期構造よりもチタニア結晶構造のほうが結合エネルギーに及ぼす影響はより重要であり、ルチル(110)面よりもアナターゼ(101)面のほうがRGDとの結合エネルギーが強く、原子面のステップ構造がRGDの吸着に大きな影響を及ぼすことが示された。これらは整形外科へのチタンの表面修飾に理論的な指針を与えるものである。インプラントに用いられるチタン(Ti)の生体親和性の発現には、表面へのチタニア(TiO2)の耐食性酸化被膜の形成が基本となる。チタニアは条件により様々な形態を示すが、本研究ではナノチューブを形成する条件を求め、そのバイオ特性と応用開発を目的とした。尿素を添加した熱水条件下でTiO2ナノチューブ上に六角柱のプリズム状形態のハイドロキシアパタイト(HA)結晶が形成される条件を求めた[後出文献1,2]。TiO2ナノチューブは、熱水条件下でHA結晶の核生成を誘導するテンプレートとして作用する。チタニアとして金属チタン基盤の上に垂直に成長林立したチタニアナノチューブ表面と通常の平坦な表面におけるHAの形成を比較することにより、ナノチューブ表面はプリズム状六角柱HA結晶の形成を導くことが示された。尿素は溶解イオンの析出・沈殿促進剤としてHAの核生成・成長を制御し、その形態に影響を及ぼす。熱水温度としてはHAの形成を確実にするために尿素の分解が起きる温度が必要である。密度関数理論(DFT)を用いて結合エネルギーを計算すると、尿素はHAの(001)表面よりも(100)表面とより高い結合エネルギーを有することが示され、HA結晶の(100)表面の成長を抑制し結晶成長時の形態に影響すると考えられる[3]。このことは核生成と成長の段階でHA結晶の成長をコントロールできることを示している。またコンピュータ・シミュレーションが、目的とする形態の結晶を得るために適切な析出促進剤を選択する上で有用であることが示された。

細胞は溝の方向に沿って配列し、溝幅が狭いほどその傾向は強くなった。Alamar blue assay解析からミクロ溝は細胞の成長を規定し、ALP活性解析から増殖速度を規定すること、溝幅が狭いほどその傾向が強くなることが示された。表面エネルギーは12<40<平滑面の順であり、骨芽細胞の増殖と分化は表面エネルギーとよく関連している。(2)チタニアへの蛋白質吸着特性のシミュレーション計算評価分子軌道(MD)法を用いてRGDペプチドとチタニアの界面での相互作用をRGDの初期構造、チタニアの結晶構造、表面欠陥、水性環境の4つの因子を考慮しシミュレーション計算した。RGD初期構造よりもチタニア結晶構造のほうが、ルチル(110)面よりもアナターゼ(101)面のほうが、及び原子面のステップ構造がRGDの吸着に大きな影響を及ぼすことが示された。インプラントの歯科・整形外科応用へのチタンの表面修飾に理論的な指針を与えるものである。(3)チタニアナノチューブ表面への細胞接着チタン表面に形成したチタニアナノチューブ上に、熱水条件下で断面六角形のプリズム型ハイドロキシアパタイト(HA)結晶を合成した。HAの成長を制御し形態に影響を与える沈殿エージェントとして尿素を添加し、尿素の分解を導く熱水温度を選択した。密度関数理論(DFT)計算から、尿素の結合工ネルギーは(001)より(100)表面のほうが高く、HA結晶の形態に影響し、核生成・成長段階でHA結晶の成長を制御できることが示された。
骨格筋分化における遺伝子発現秩序形成の解明

本研究では、骨格筋分化時の“個"の遺伝子の発現を繋ぐ“群"の遺伝子発現制御を明らかにし、分化における遺伝子発現の秩序形成の解明を目指した。ゲノムマーキングによるヒストンバリアントの取り込みから高次クロマチン構造解析、そして転写活性化に至る過程を解析し、ランダムから秩序だった発現に切り替わるポイントの同定を試みた。結果、骨格筋分化時にクロマチンを構成するヒストン遺伝子を網羅的に同定し組織特異的なクロマチン構造の捕捉を目指した。結果、14種の未知ヒストン遺伝子を同定し、骨格筋幹細胞の時点で、骨格筋分化を制御するクロマチン構造の存在を明らかにした。昨年度までの解析により、骨格筋分化遺伝子は核内で未分化段階では骨格筋遺伝子座が近接しており、この近接が未分化段階での遺伝子活性化抑制に寄与していることが示唆された。この未分化段階での近接に関わる分子候補としてBrg1を同定した。Brg1はクロマチンリモデリング因子としてATP依存的に構造の弛緩に関わるとされてきたが、高次クロマチン構造を形成する上でも重要な役割を担っていることが明らかとなった。更にこの近接現象を、Brg1の活性抑制や、転写因子Myg/Mef2Dによるバイパスさせた骨格筋分化誘導の解析により阻害すると、通常の分化より加速された分化現象が確認される一方で、成熟度が不十分となることが明らかとなった。以上の結果により、未分化段階で骨格筋遺伝子座が近接している領域へのヒストンバリアントの集積が、単に遺伝子発現のON/OFFではなくゲノムワイドな同調的制御、そして、秩序だった骨格筋分化遺伝子発現制御にかかわっていることが考えられる。本研究成果についてHarada et al Nuclei. Acids, Res 2015の二報に発表を行った。本年度は昨年度までの解析で明らかにした高次クロマチン構造制御を行うクロマチンリモデリング酵素Brg1の活性制御機構を明らかにした。本研究はマサチューセッツ大学医学部Imbalzano博士との共同研究で発表を行った(Nasipik et al, Nat Commun. 2015)。Brg1は活性を正に制御するCalcineurinによる脱リン酸化制御と、負に制御するPKAの経路が互いに拮抗的に働きクロマチン構造活性を制御していることを明らかにした。現在、特異的なリン酸化部位に対する抗体作成を進めておりエピゲノム解析の準備を行っている。また、本研究を進めるうえでエピゲノム解析の技術開発も並行して行った(Maehara et al, Bioinformatics. 2015)。agplusと名付けたツールを開発し、転写因子結合位置、あるいは、転写開始点等の任意のアノテーション情報に基づき、数万のエピゲノムデータを高速で俯瞰的なデータとして可視化を可能にした。現在公開データベース上で普及を図っている。また、本研究の推進は極めて顕著であり、新たに別角度の検討として、高次クロマチン構造に必要となるクロマチン構成要素の探索を追加して行った。その一つとしてChd5クロマチンリモデリング因子がゲノム上のレトロトランスポゾンの抑制に機能していることを明らかにした。(Hayashi et al, J cell Biochem. 2016)当初の研究計画を先行して達成しつつあり新たな解析についても2報、関連技術解析についての2報論文発表を行った。また共同研究を含めて22報の国際査読誌への論文発表を行った。極めて順調に推移している。細胞分化では、一群の分化関連遺伝子が選択されて、適切なタイミングで同調した遺伝子発現が誘導される。これら一群の遺伝子の発現誘導は、ゲノム上でヌクレオソーム配置からクロマチン構造変換といった局所的なクロマチン構造制御から更に遺伝子座の近接、空間配置に至ると高次制御が関わり、極めて秩序だって行われている。幹細胞における分化能としてプログラムされた分化後の遺伝子発現が、いかにして秩序だった遺伝子発現制御を受けるのか未だ明らかになっていない。そこで本研究では、全ゲノムレベルでの時間的、空間的クロマチン構造解析により、骨格筋分化をモデルとして分化時の遺伝子の発現制御機構の解明を進めた。まず、2015年にマウスゲノムに存在する未知のヒストンH3様のバリアント遺伝子を14種同定した.この発見を元に精巣に発現するヒストンH3tの機能解析を行い報告した。さらにヒストンH3mm7, H3mm13が骨格筋特異的な発現パターンを示すことを明らかにした。これらは空間的に離れた複数の遺伝子を制御する新たな機構として現在投稿準備中である。さらに、細胞分裂時のクロマチン構造の伝達機構について解析を進めマスター転写因子MyoDのRNA安定化機構を明らかにした。骨格筋幹細胞においてN6-methyladenosine(m6A)がMyoDのmRNAレベルを安定的に維持することが骨格筋分化能維持に必須であることを見出している(論文投稿中).m6Aは,哺乳類のmRNAに最も広く認められる修飾で,近年mRNAのスプライシングや翻訳,安定性に関与する等多様な役割が明らかになりつつある.今後,m6Aの機能と骨格筋分化における遺伝子発現秩序形成について明らかになることが期待される。

結果、14種の未知ヒストン遺伝子を同定し、骨格筋幹細胞の時点で、骨格筋分化を制御するクロマチン構造の存在を明らかにした。研究計画通り、進展し主要な成果は2誌にそれぞれ論文発表を行った。3C-seqデータについては現在別途論文投稿準備中であり、おおむね良好な進捗であると判断している。本研究計画はおおむね達成しつつあり、残り期間ではChd2を高次クロマチン構造制御について解析を進める。研究計画に大きな変更はない。28年度が最終年度であるため、記入しない。クロマチン制御研究計画に基づき、以下のように計画通り進展を期す。すでにゲノムマーキングに関わるChd2/H3.3複合体が、遺伝子発現秩序形成の最初期イベントであるジーンクラスタリング形成誘導に関わっていることを見出している。そこで、現在明らかとなった骨格筋分化段階での遺伝子集積の情報のうち、最終骨格筋分化マーカー遺伝子座が含まれるカテゴリーがマーキングされる時期と、クラスタリングが形成される時期のサンプルを限定し、それぞれH3.3あるいはChd2抗体アフィニティカラムを用いてジーンクラスタリング関連因子の探索と同定を試みる。すでに樹立済みのH3.3あるいはChd2に対するモノクローナル抗体を用いてアフィニティカラムを作製し精製を行った後、網羅的な質量分析により結合タンパク質の同定を試みる。抗体アフィニティカラムを用いた複合体同定法は、申請者グループではルーチンに行っている。Chd2・H3.3いずれも特異的なDNA結合モチーフを持っておらず、何らかキャリアー(転写因子等)を必要とすることから、各カテゴリー特異的なキャリアーが同定できる可能性がある。結合因子が同定され次第、ChIP-Q-PCRや免疫共染色、そして免疫共沈降でH3.3との共局在性を評価する。最終的にはChIPseqを行い分化の時間変化に応じたゲノム上での分布を解析し、遺伝子発現秩序への相関性を評価する。抗体が存在しない場合は適時エピトープタグ付きのタンパク質をC2C12細胞に強制発現させ、同様に共局在性を評価する。一方で、前年度までに行った3C-seqの解析を報告するため、追加解析として3Cによる検証等を加えて行う。
石炭・メタノ-ルスラリ-製造プロセスの開発による石炭ガス化プロセスの高効率化

石炭ガス化プロセスの高効率化には多くの要因が考えられているが、ガス化プロセスへの原料供給系の簡素化、いわゆるcoalーchainとして海外山元からガス化炉サイトまで一貫したスラリ-輸送技術を確立することによるハンドリングコストの低減を目的として、また石炭ガス化プロセスのより一層の高効率化を図るため、本研究では石炭とメタノ-ルを混合した石炭・メタノ-ルスラリ-(CMM)の高濃度化、安定化を検討しCMMの石炭ガス化プロセス用原料としての有用性を検討することを研究目的とする。本年度は研究の基礎となる下記の2項目の検討を行った。(1)高濃度CMMの調整方法の最適化:報告者が先に提案した石炭・水スラリ-を2段粉砕で調整する場合の最適粒度分布の決定方法をCMMに対しても適用し、微粉と粗粉両試料を混合した場合の固体充填体積分率を種々の混合割合について算出した。次に最大充填体積分率を示す混合割合を決定し、この混合割合を最適値とした。この最適粒度分布を持った石炭試料をメタノ-ルと混合してCMMを調整した。界面活性剤を用いない場合は石炭固体分率が62wt%の流動性の良いCMMが得られ、アニオン系添加剤を分散剤として用いた場合には66wt%のCMMが調整され、高濃度CMMの調整と言う初期の目標は達成された。(2)動的安定性を有するCMMの調整方法の検討:安定なCMMを調整する為の添加剤に関する情報は現在まで公表されていない。そこで本研究では従来石炭・水スラリ-の調整に用いられており、安定性の発現に効果があるとされている安定化剤,アタパルシャイト(膨潤性粘土),ザンサンガム(天然多糖類)およびCMC(カルボキシメチルセルロ-ス)を分散用添加剤と併用することを検討した。また分散効果と安定化効果の両方を備えているノニオン系添加剤,Koalー501の使用も試みた。これらの添加剤の安定化効果は十分でなく、今後安定化剤の探索を更に続ける必要がある。
チリ北部アタカマ砂漠における中性炭素原子サブミリ波輝線の銀河面広域観測

本研究の目的は、小型超伝導受信機を搭載した可搬型18cmサブミリ波望遠鏡を南米チリのアタカマ砂漠の高地(標高4800m)で運用して中性炭素原子スペクトル線(周波数492GHz)の広域観測を行うことにある。この目的を達成するために、まず小型超伝導受信機の整備を行った。小型のGA42段型冷凍機を用いることによってコンパクトな受信機システムを構成し、492GHzにおいて受信機雑音温度で約200Kを達成した。この受信機を可搬型18cmサブミリ波望遠鏡に搭載し、アタカマ砂漠での観測実験を行った。実験は平成13年3月、平成13年9月、平成14年9月の3回行なった。第1回目の実験では輸送中に望遠鏡のアジマス駆動軸が破損するなどのトラブルが発生し、また、天候も著しく悪かったので、機器の動作確認を行うに止まった。第2回目の実験では望遠鏡としての立ち上げを行うことができ、光学カメラを用いた指向精度の較正、太陽・月のサブミリ波連続波を用いた望遠鏡の能率測定などを行った。これらの経験を踏まえ、第3回目の実験において、へびつかい座分子雲で中性炭素原子スペクトル線(492GHz)の初受信に成功した。その後、わずか1週間程度の限られた期間ではあったが、NGC6334,M17などのいくつかの天体で観測を行うことができた。特に、M17において速度幅は40km s^<-1>に達するウイング成分を検出した。この成分は空間的にも広がっていることから、原始星からの双極分子流では説明が難しい。従って、星間雲の新しい形態の可能性を秘めた重要な結果と言える。このように、本研究では、可搬型18cmサブミリ波望遠鏡の本格運用への橋頭堡を確立するとともに、重要な科学的成果を挙げることができた。本研究では.可搬型18cmサブミリ波望遠鏡システムを南米チリのアタカマ砂漠(標高4800m)に持ち込み.中性炭素原子のサブミリ波輝線(^3P_1-^3P_0;492GHz,^3P_2-^3P_1;809GHz)で銀河面広域観測を斤なうことを目的としている。実験実施にあたり、18cmサブミリ波望遠鏡システムの組み上げ試験を行なった。492GHzにおける受信機雑音温度は200K(DSB)であり.広域サーベイに十分な感度をもっていることが確認できた。また、電波分光計の整備もすすめ,帯域700MHz以上が確保されていることを確めた。さらに.計算機制御系についても信頼性の向上を図った。これらのシステムを平成13年1月に現地に輪送した。通関の後,2月中にチリのアタカマ砂漠での実験を開始する。このサイトでの恵まれた観測条件を活かして.特に銀河中心方向における中性炭素原子の広域分布をはじめて明らかにする予定である。これによって、銀河系における分子雲形成のダイナミックスについて観測的にメスが入れらるれようにはると期待される。本研究では、可搬型サブミリ波望遠鏡システムを南米チリのアタカマ砂漠(標高4800m)に持ち込み、中性炭素原子のサブミリ波スペクトル輝線(492GHz, 809GHz)で銀河系主要部の広域観測を行なうことを目的としている。これによって、銀河系スケールでの原子ガス相から分子ガス相への「相変化」を捉え、銀河系のダイナミクスとの関連を調べる。昨年度に引き続いて、平成13年9月から10月の間に、アタカマ砂漠における観測実験を行なった。前回の実験の経験を生かして、運搬時における望遠鏡システムの防振保護に配慮した結果、現地において望遠鏡は概ね動作することが確認された。

まず、星を用いた光学ポインティングによる望遠鏡指向の校正を行なった。その上で、492GHz帯受信機を用いて太陽の観測を行い、電波軸と光学軸のずれを求める方法を確立した。太陽のリムの観測結果から、望遠鏡のビームサイズは15.3分角と求められた。この値は設計値13.2分角よりもやや大きいが、許容範囲と思われる。また、大気放射の天頂角依存性を測定して、大気透過度を見積もった。その結果、492GHzにおける大気透過度は0.5-0.9であり、非常にすぐれたサブミリ波観測環境にあることが確かめられた。システム雑音温度は650-1000Kである。次に、電波分光計までをつないでスペクトルの測定を行なった。周波数スイッチモードで動作させることにより、地球大気に含まれるオゾンの回転スペクトル輝線を感度良く検出できた。さらに、天体を追尾して中性炭素原子のスペクトルの検出を試みたが、時間が十分にとれなかったために、確固とした検出には至らなかった。2回目の運用は、1回目の運用に比べて格段に進展したが、観測ソフトの整備や電波分光計の安定性、さらには現地での風除けの必要性など、新たな課題が浮き彫りになった。これらの問題点を克服し、次回の運用では中性炭素原子のスペクトル線の広域観測を実現する計画である。本研究では、可搬型サブミリ波望遠鏡システムを南米チリのアタカマ砂漠(標高4800m)に持ち込み、中性炭素原子のサブミリ波スペクトル線(492GHz,809GHz)で銀河面主要部の広域観測を行うことを目的としている。これによって銀河系スケールでの原子ガス相から分子ガス相への「相変化」を捉え、銀河系のダイナミックスとの関連を調べる。一昨年度、昨年度に引き続き、平成14年9月から10月の間に、アタカマ砂漠における観測実験を行った。前回までの実験の経験を生かし、望遠鏡設置のためのコンクリート基礎を作るとともに、望遠鏡の風除け小屋を設置した。また、国立天文台のご厚意で、ASTE望遠鏡施設から100V電源を供給していただいた。その結果、望遠鏡を安全かつ効率よく運用することができるようになった。そして、9月28日にへびつかい座分子雲において中性炭素原子の492GHz輝線の受信に成功した。このことにより、本望遠鏡システムは、18cmと非常に小さい口径ながら十分な観測感度を持ち、銀河面のような広がった天体の観測に非常に有効であることを実証した。また、大質量星形成領域M17において、中性炭素原子輝線で明瞭なウイング成分を検出した。このウイング成分は原始星から放出されるアウトフローと考えるにはあまりにも広範囲に広がっている。このような広い速度幅をもつ拡がった成分は、この領域でかつて認識されておらず、新しい星間現象を示唆する可能性がある。この結果は、可搬型18cmサブミリ波望遠鏡による観測の新しい意味を示すものとして重要と考えられ、今後、一層展開を図りたい。このほかにも巨大分子雲NGC6333などで分子雲スケールでのマッピング観測を行った。このように、本研究では可搬型18cmサブミリ波望遠鏡の運用を確立し、中性炭素原子スペクトル線による銀河面の広域サーベイへの橋頭塗を確立した。
多種化学物質の周産期曝露における母子間移行動態モデル式の構築

メチル水銀、ポリ塩素化ビフェニルなどの残留性有機汚染物質(POPs)は、魚介類からのばく露が多く、魚食習慣のある人は少しずつ蓄積することになる。POPsは、その脂溶性・難分解性という性状から排泄されにくく、経胎盤的あるいは母乳に移行し、感受性の高い胎児や乳幼児への影響が懸念されている。そこで本課題では、メチル水銀とPOPsといった混合ばく露が母子移行に与える影響について動物(当該年度)とヒトデータ(昨年度報告)から検討し、リスク評価に有用なモデルを構築することを目的としている。当該年度はばく露油選定の後、マウスを使用した動物実験を行った。マウスの繁殖実験では、POPsばく露の高低、メチル水銀ばく露の有無、クジラ油か否かの関係から6群設定した。6群のうち、POPs高汚染油(WPO)およびPOPs高汚染油+メチル水銀群(WMP)のPOPs分析を実施した。ばく露方法は精製飼料のAIN93G(妊娠・泌乳用)に含有される大豆油を抜いた粉末に、それぞれ該当する油を混ぜばく露飼料とした。POPs高汚染油に含有されるp,p'-DDEの10%に相当する量のp,p'-DDE-d8体を添加した飼料を作製した。出産日、離乳時に解剖を行い、脳、肝臓、血液および胃内ミルクのPCBおよびDDEの分析を行った。メチル水銀のばく露があったWMPでは、離乳時の母で血液中PCB濃度がWPOと比較し低下していた。逆に、仔の血液中PCB濃度はWMPで高くなっていた。DDEも同様の傾向を示したものの、出産時解剖したものについてはメチル水銀の有無による濃度の大きな違いはみられなかった。p,p'-DDEとp,p'-DDEのd8体は、餌中に添加したときとほぼ同じ割合で各組織に分布し、分布率の算出に良い指標となると考えられた。環境汚染物質ばく露は、食品由来の多種類かつ低濃度の混合ばく露である。メチル水銀、ポリ塩素化ビフェニル、農薬などの残留性有機汚染物質(POPs)は魚介類からのばく露が多く、それらを食することで人体に蓄積される。POPsは、経胎盤あるいは母乳から感受性の高い胎児や乳幼児に移行し、発達への影響が懸念されている。そこで本研究では、POPsの母子の移行動態を動物とヒトの両側面からアプローチし、リスク評価に有用なモデルを提案することを目的としている。当該年度は、動物にばく露に使用可能な魚油等の材料を収集した。さらに当教室で進めている出生コホート調査のばく露データについて、POPs濃度と水銀濃度の関係について解析することを目的とした。その結果、初産妊婦の母体血水銀濃度を四分位にわけ、臍帯血総PCB濃度との関係を比較すると、母体血水銀が高くなると臍帯血総PCB濃度が有意に高くなった。これは出産時年齢、BMI、魚摂取量で補正しても有意な関連がみられた。さらに異性体ごとに見ていくと、母体血水銀濃度が高くなるにつれ、10種の同族体のうち臍帯血中の5、6、7塩素体が有意に高くなった。この現象は、母親のメチル水銀曝露が高くなると臍帯血PCB濃度が高くなる可能性を示唆した。この研究成果の普及のため、国内学会(フォーラム2009:衛生薬学・環境トキシコロジー)にて発表を行った。
イタリアにおける非定型BSEの現地調査

イタリア・トリノ市の家畜衛生研究所のカラメリ部長、インスブリア大(バレセ市)のトニオロ教授、ベロナ大学医学部のザヌソ教授のグループとともに、イタリアのヤコブ病、BSE材料を用いて、日本のモノクローナル抗体との反応性を見た。日本のモノクローナル抗体は日本生物化学研究所の上田所長の研究グループにより開発されたものを用いた。モノクローナル抗体の反応性は、免疫組織化学及びウエスタン・プロッティングにより検討した。モノクローナル抗体の内、立体エピトープに反応するものが、マウス、羊、牛、サル、ヒトのプリオン病に対し、反応する事が明らかにされた。その中でクローン6C4抗体は、2型クロイツフェルトヤコブ病、クールー斑の周辺部のみと反応する事が明らかにされた。それに対し、クローンT2抗体は、クールー斑全体と反応するのが見られた。したがって、クールー斑の成熟には、様々な段階の存在することが明らかにされた。線上(liner)エピトープに対する抗体は、細胞質内のプリオン蛋白を染色した。それに対し、立体エピトープに対する1D12抗体は、核内に存在する正常プリオン蛋白を染色した。今まで核内における正常プリオン蛋白染色の結果は、他に報告されていない。したがって、1D12抗体はプリオン遺伝子の核内発現産物を研究する上で有用と考えられる。この内容は、Journal of Nero Virologyと、Journal of Microbiology and Immunologyに投稿され、現在審査中である。モノクローナル抗体の反応性は、免疫組織化学及びウエスタン・ブロッティングにより検討した。この内容は、Journal of General Virologyに投稿され、現在審査中である。

今まで核内における正常プリオン蛋白染色の結果は、他に報告されていない。したがって、1D12抗体はプリオン遺伝子の核内発現産物を研究する上で有用と考えられる。この内容は、Journal of General Virologyに投稿され、現在審査中である。
次世代診断試薬創出プラットフォームの確立を目指す変異抗体選択法の抜本的改革

疾患バイオマーカーを検出する抗体は診断試薬として必須である。現在は主にハイブリドーマ法で調製されているが、その抗原結合能には遺伝子レパートリーに起因する制約があるため、試験管内分子進化法による抗体の改変に期待が寄せられている。天然型抗体の可変部に多様な変異を導入し、生じる分子集団から改良分子種を「パンニング」により選択・単離する。その効率を高めるために抗体をファージ粒子の表面に発現させるファージ提示法が活用される。しかし、現状では多大の労力を要するうえ必ずしも好結果が得られない。本研究では、新規な選択法としてコロニーアレイプロファイリング法を開発して希少な改良型抗体を網羅的に単離する道を開く。
ブタ体細胞核移植効率改善に向けたドナー細胞側のゲノム修飾効果の検討

体細胞核移植(SCNT)に用いるブタドナー細胞に遺伝子工学的な手を加え、「ヒストンの脱メチル化誘導」(エピゲノム修飾)を一過的に誘導し、細胞が卵子と似たような分子環境(幼弱化)にすることにより、SCNT後、得られた胚(クローン胚)が通常の胚と似た発生様式を示すかを検討する。具体的には、ゲノム編集用試薬を投じ、内在性のLDLR遺伝子を破壊し、tetracycline系ベクターを用いたRNAi(DNMT1を標的)、KDM4Dの一過的な誘導的発現を行うことで、ドナー核のエピゲノム修飾を達成させる。最終的に、このドナー細胞を用いたSCNTを通じ、LDLR遺伝子破壊クローンブタを効率的に作成する。
グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリーの同定と機能解析

1.成人ヒト骨格筋におけるダリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の発現を詳細に検討した。GDNFに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色で、GDNF様免疫反応性が、すべての筋線維の細胞膜直下、細胞膜、内鞘および筋内有髄神経軸索にみられた。特に神経筋接合部に著明な集積がみられた。RT-PCR解析を行ったところ、骨格筋からGDNF分子が増幅されたが、運動ニューロンを含む脊髄前角細胞からは増幅されなかった。神経筋接合部において、GDNF受容体分子の一つであるGFRα-1様免疫反応性が集積していることがわかった。以上の結果から、筋由来のGDNFが神経筋接合部にある運動ニューロン終末から受容体分子を介して取り込まれ、軸索内を逆行性に輸送されることが示唆された。2.ヒト神経筋疾患におけるGDNFの発現変化を検討した。その結果、多発性筋炎、Duchenne型筋ジストロフィー症などの疾患筋において、再生線維に免疫反応性の亢進が見られた。RT-PCR解析を行ったところ、これらの筋では正常筋で発現していた短い型のGDNF mRNAに加え、完全長型のGDNF mRNAが発現していることがわかった。以上の結果から、GDNFが筋再生あるいは筋再生に伴う神経筋接合部の再構築に関与している可能性が示唆された。3.ニワトリ胚肢芽cDNAからGDNFファミリーのクローニングを試みた。得られた分子はヒトあるいはげっ歯類GDNFと約90%の相同性を持ち、ニワトリのGDNFであると考えられた。RT-PCR解析によって、GDNFは4日目胚で発現し、6日目で発現が減少することがわかった。スクリーニングで得られたGDNF cDNAは成熟型ペプチド翻訳部分の上流を一部欠損する短い型であった。Northem blot解析で、げっ歯類と異なり、ヒト成人骨格筋および心筋においては多量のGDNFmRNAが発現していた。免疫組織化学では、正常骨格筋において、全てのファイバータイプの筋細胞にGDNF免疫反応性がみられた。免疫反応性は細胞膜直下、細胞膜および内鞘に集積して観察された。一部の筋細胞においてGDNFの著明な集積がみられ、α-bungarotoxinとの二重染色によって、この部位が神経筋接合部であることが確認された。また筋内有髄神経軸索および筋紡錘においてもGDNF免疫反応性が見られた。RT-PCR解析では、正常骨格筋では短いGDNFが増幅されたが、脊髄前角細胞では増幅されなかった。以上より、筋由来のGDNFが運動ニューロン終末から取り込まれ、軸索内を輸送されることが示唆された。このことからGDNFが運動ニューロンに対して標的依存性の生存活性を示す分子として作用しているのではないかと考えられた。2.ニワトリ胚肢芽よりGDNFをクローニングした。成熟型ペプチド翻訳部分のアミノ酸配列は、ヒトあるいはげっ歯類と約90%の相同性を持っていた。RT-PCR解析によって、4日目胚肢芽に発現し、6日目で発現が減少した。現在この遺伝子を組み込んだベクターを細胞株に導入し発現させ、遺伝子産物が実際に培養上清中に分泌されるか、運動ニューロンに対して生理活性を持つかを検討中である。1.昨年に引き続き、成人ヒト骨格筋におけるグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の発現を詳細に検討した。GDNFに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色で、GDNF様免疫反応性が、すべての筋線維の細胞膜直下、細胞膜および内鞘にみられた。一部の筋細胞に著明な集積がみられ、α-bungarotoxinとの二重染色によって、この部位が神経筋接合部であることがわかった。

さらに、筋内有髄神経軸索および筋紡錘でもGDNF免疫反応性がみられた。RT-PCR解析を行ったところ、骨格筋からGDNF分子が増幅されたが、運動ニューロンを含む脊髄前角細胞からは増幅されなかった。神経筋接合部において、GDNF受容体分子の一つであるGFRα-1様免疫反応性が集積していることがわかった。以上の結果から、筋由来のGDNFが神経筋接合部にある運動ニューロン終末から受容体分子を介して取り込まれ、軸索内を逆行性に輸送されることが示唆された。2.GDNFは標的依存性栄養因子として、重要な役割を担っている可能性が考えられたので、ヒト神経筋疾患における発現変化を検討した。抗GDNFポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色で、さまざまな筋標本をスクリーニングした。その結果、多発性筋炎、Duchenne型筋ジストロフィー症などの疾患筋において、一部の筋線維に免疫反応性の亢進が見られた。これらの筋線維は抗胎児型ミオシン重鎮抗体との二重染色によって、再生線維であることがわかった。RT-PCR解析を行ったところ、これらの筋では正常筋で発現していた短い型のGDNF mRNAに加え、完全長型のGDNF mRNAが発現していることがわかった。以上の結果から、GDNFが筋再生あるいは筋再生に伴う神経筋接合部の再構築に関与している可能性が示唆された。
平安貴族における遅刻と時間厳守の研究

平安貴族の遅刻の実例を集め、遅刻が多発する原因について、特に摂関期に関して、その原因を明らかにできた。また報時装置である漏刻と日本の時刻制度について、その起源を推測し、古代・中世日本において信じられていた宇宙構造論に関して、多くのことを明らかにした。平安貴族の時間観念、特に時聞遵守に関わる観念を解明することを目的とする。そのため古代の法制文書・儀式書における時間規定、実際の儀式・行事における貴族官人の時間遵守および遅刻に関する様態を調査する。本年度はまず研究環境の整備を行い、次いで予定通り法制関係史料の調査を行った。環境整備としては、主に調査用ノートパソコン並びに周辺機器を購入し、また木簡・時間関係を中心とする研究図書を購入し、古代を中心とする時間意識または関連の研究論文・史料を入手した。また法制関係史料と六国史を対象に諸行事、諸儀式における時間規定および時間関係記事を調査し、データ集積を行った。この過程で特に六国史における時間関係記事が事実の記録としてどの程度忠実か、またどのような時間計測法を反映するのかが問題となる箇所も発見された。また『朝野群載』は現行の活字本(新訂増補国史大系)に大きな問題がある事が予想されたため、写本調査を行った。まず神宮文庫にて活字本の底本、校訂使用本を漏刻・時刻関係の史料の多い巻一、八、十五を中心に検討したところ、予想以上に活字本には指示のない意改が多く見られ、また時刻の数字や行幸時の漏刻に同行する守辰丁の数などに関して、校訂注のない写本間の違いが見られること等が判明した。このため宮内庁書陵部・国立公文書館(内閣文庫)にて同写本の追加調査を行った。この結果、概ねこうした数字の精度を確認する事ができた。また派生して字句の最終確定の前提となる同書写本系統を将来的に解明する手がかりが得られた。次に陰陽師若杉家に伝来の若杉家文書に反閉関係史料・日時勘文が多い事が判明したので、京都府立総合資料館で史料調査を行った。目録を使って抜き取り調査した結果、古代・中世初期の日時勘文および儀式記録を確認することができた。以上、本年度の研究により法制史料に見える時間規定そのものは明確だが、それを厳密に実行させる計時環境の解明が重要課題である事、史料校訂の必要性がより明らかになった。2007年度は古記録を中心に時間遵守観念(あるいは時間を厳守しないことを許容する観念)の検出を行い、その観念を形成した歴史的要因の解明を目的とする作業を開始した。ただし作業を途中まで進めた段階で、時間遵守観念(または逆の観念)の存在を示す史料は少なからず検出できるものの、その背景を端的に示すものが必ずしも多くないことに気づいた。そのため、一時軌道修正を行うこととした。具体的には時間遵守の前提となる計時装置(特に漏刻)、報時制度に関する資料蒐集を行い、特に7世紀の漏刻導入より平安時代末期までの日本における計時装置の展開を確認した。さらに時間測定の基準となる天体観測と、天体の運行の仕組みである宇宙構造についての観念を、大化前代から平安時代に亘って諸史料において検討した。宇宙構造論を検討対象に含めたのは,前述の一般的理由と併せて、漏刻の中には宇宙構造モデルを象った仕様のものが存在するからである。この結果、次のことが判明した。まず日本の時刻制度と宇宙構造論は、中国南朝の仏教文化の一環として倭国段階に伝来し、これが律令国家期の時刻制度(および貴族官人等に対する時刻単位での仕事の強制システム)へと発展した。しかしこれらは本来は中国南朝のものであるため、日本の天象とは必ずしも合致しない。このことが結果的に貴族官人に、時刻単位での職務遂行を遵守させえない前提条件となったとの見通しをえた。また古代の日本では科学的思考が発達しなかったというのが、従来の通説であった。しかし8世紀の日本律令国家内では、中国の正統的な宇宙構造論である渾天説とならんで、すでに中国では勢力を失っていた蓋天説が支持されていたことを検出した。これは日本科学史において、重要な発見である。以上の成果は、中国におけるワークショップで口頭報告をした。またその内容は補訂の上、2008年度中に論文として発表する予定である。本研究は平安貴族における時間意識の解明を目的とする。そこでその前提として不可欠な計時装置(漏刻=水時計)および時刻制度に関して先行研究および関連史料を検討したところ、次の結果となった。まず「日本古代の宇宙構造論と初期陰陽寮技術の起源」においては、いくつかの通説を覆す発見をした。従来の日本科学史の研究においては、大航海時代にヨーロッパ自然学・技術が伝来する以前の日本に関して、科学的な興味が弱く、宇宙構造についても関心が低かったというのが一般的であった。ところが本論文により古代・中世初期の日本では宇宙構造に関する関心が強く、特に中国では早くにその有効性が否定された蓋天説が仏教の須弥山説との類似性のため、渾天説とともに一貫して支持を得ていたことがわかった。また「十二時漏刻銘」で知られる平安時代末期の比叡山にあった漏刻が、実は蓋天説を模った水運蓋天儀であることも指摘した。

この水運蓋天儀は梁武帝が作らせたそれとの関係が想定され、起源が不明であった日本の時刻制度である一日四十八刻制も、梁武帝が一時採用した九十六刻制の変形である可能性も指摘できた。以上から平安貴族の時間意識そのものの起源も、中国南朝並びに仏教を考慮すべきであることが明らかとなった。そして時間の目安となる天体の運行を平安貴族がどのように理解していたのかも判明した。つづいて「中国天文思想導入以前の倭国の天体観に関する覚書」では『入唐求法巡礼行記』の航海記事について古天文学的成果を利用しての検討などを行い、北部九州などの海民による天体観測、また北斗七星による計時の様相を指摘した。本事業研究の計画では平安貴族の時間意識解明の前提は所与のものとしていたが、実際に作業を進める過程で未解明の問題をいくつも発見した。今年度の研究では前年度の作業をもふまえて、そうした問題をひとつならず解明できたものととらえている。摂関期に関して次のことが判明した。(1)高位貴族は政務・儀式への遅刻が常態化しており、それを踏まえて遅刻の作法が存在した。これは時刻に拘束されないことが、その尊貴性と関わっていたからである。(2)一般官人も遅刻が常態化しているが、高位貴族より厳しく対処される傾向がある。(3)遅刻常態化の背景には、一般的には時刻の表示装置が共有されていないこと、呪詛が横行するなかで貴族は自己の物忌を優先したこと、貴族の不摂生な生活態度より来る不健康さ、道路等のインフラの未整備、またそれが貴族社会全体にルーズな政務・儀式運営を許容する雰囲気をもたらしていた点があったこと。以上である。このうち最も重要なのは、時刻の表示装置が共有されなかったことである。天皇は計時装置としての漏刻の所有者でもあり、時間による労働管理を通じて臣下に対して権威をもち、これによって「来るべき時刻に遅刻」したという概念が成立した。ただし、時間が共有されない状況下での時間管理の強化は、遅刻の頻発をもたらしたのである。しかし一方で、陰陽師の日時勘文等によって、儀式の時刻を厳重に管理しようとする建前が、陰陽道成立との関係で9世紀後半から強調されるようになった。また遅刻への厳しい態度は、指導力のある政治家において顕著であり、一方で下級官人など、立場の弱い者に対して向けられやすいことも明らかとなった。この他、中世日本の宇宙構造論として、蓋天説と仏教の須弥山説とが一体となり、古代以上に社会に浸透した様相も明らかにした。また須弥山説支持の僧侶と渾天説支持の暦道の対立の焦点が、月の運動(盈虚と月食)にあり、二種類の宇宙構造論が対立していた結果-ヨーロッパの自然学・技術が伝来する大航海時代以前の日本人は科学的関心が弱く、宇宙構造に興味がなかったとする通説に反して-中世以前の日本でも宇宙構造論に関する関心が高かったことが判明したのである。
なぜマントル流体は二酸化炭素に富むのか？：流体包有物による二酸化炭素の起源の解明

マントル捕獲岩中の流体包有物は産地に依存せず普遍的に非常にCO2に富んでいる.しかし,炭素の起源やCO2が果たす物質循環への役割は未解明であり,地球の長期的進化へのCO2流体の影響は未知数である.本研究ではまず,流体包有物の残留圧力と組成を利用して,流体が鉱物に捕捉された時空間を特定する手法を開発する.その後,流体包有物に含まれる揮発性物質の同位体比の測定を行い,様々なセッティングにおける地球深部炭素の循環様式の時空間分布を明らかにする.マントル捕獲岩中の流体包有物は産地に依存せず普遍的に非常にCO2に富んでいる.しかし,炭素の起源やCO2が果たす物質循環への役割は未解明であり,地球の長期的進化へのCO2流体の影響は未知数である.本研究ではまず,流体包有物の残留圧力と組成を利用して,流体が鉱物に捕捉された時空間を特定する手法を開発する.その後,流体包有物に含まれる揮発性物質の同位体比の測定を行い,様々なセッティングにおける地球深部炭素の循環様式の時空間分布を明らかにする.
日本映像芸術の1960-1970年代：その歴史的全体像について

研究課題の目的は、1960年代から1970年代を中心とする日本の映像芸術を調査したうえで、作品等をデジタルアーカイブ化し、その成果を社会に還元することにある。この目的に沿って、研究代表者は映像作家である相原信洋、松本俊夫、中島崇などの調査と、作品等のデジタル化を行った。特に相原信洋の作品に関してはデジタル復元の作業を行い、残存するほぼ全て作品のデジタル化を達成することができた。それに併行して、研究成果を社会に還元するために、国内外の上映会にデジタルデータの提供を行った。研究実績の概要平成27年度の研究活動においては、日本国内の19601970年代の映像芸術(実験映画・ビデオアートなど)を調査しながら、優先的に作業する作品を検討したうえで、以下のデジタル化作業を実施した。1:松本俊夫のマルチ・プロジェクション作品『スペース・プロジェクション・アコ』(1970)のうち未デジタル化の35mmネガフィルム8本についてニュープリントを作成し、そこからHDテレシネを行った。2:松本俊夫のビデオアート作品のうち未デジタル化の状態にあった『殺人カタログ』(1975)についてHDテレシネを行った。また、それ以降の松本俊夫のビデオアート作品についても『Trauma』(1989)、『Old/New=気配』(1990)、『Dissimulation=偽装』(1992)といった未デジタル化の作品が存在したため、その重要性を鑑みてHDテレシネを行った。3:中島崇のフィルム作品『セスナ』(1974)についてデュープネガとニュープリントを作成し、そこからHDテレシネを行った。また、作家に対する聞き取り調査も合わせて実施した。平成27年度の研究活動においては、まず文献・文書資料類の調査と、東京国立近代美術館フィルムセンター・川崎市市民ミュージアム等の学芸員より収集状況のヒアリングを行った。そのうえで平成27年度の研究活動のなかでデジタル化作業に着手すべき作品として、松本俊夫と中島崇の作品を選定した。以下、個別に説明する。松本俊夫については。日本万国博覧会「せんい館」にて発表されたマルチ・プロジェクション作品『スペース・プロジェクション・アコ』(1970)のうち未デジタル化の35mmネガフィルム8本と、ビデオアート作品『殺人カタログ』(1975)のデジタル化作業を実施した。また、1970年代以降の松本俊夫のビデオアート作品についても、『Trauma』(1989)、『Old/New=気配』(1990)、『Dissimulation=偽装』(1992)といった作品のデジタル化が行われていなかったことから、その重要性を鑑みてデジタル化作業を行った。中島崇については、フィルム作品『セスナ』(1974)のデジタル化作業を実施した。この作業はネガフィルムの存在しない8mmフィルム作品のアーカイブ化をどのように進めるべきかというテストを兼ねており、作業の過程で、今後の作業に関わる有益な知見を得ることができた。なお、『セスナ』のデジタル化作業の中間生成物である35mmデュープネガについては、フィルム専用の温度湿度管理ができる環境にて保管されるべきという作者の意向を尊重し、東京国立近代美術館フィルムセンターに寄贈した。また、松本俊夫と中島崇それぞれに対する聞き取り調査も、合わせて実施した。平成28年度の研究活動においては、日本国内の19601970年代の映像芸術(実験映画・ビデオアートなど)を調査しながら、優先的に作業する作品を検討したうえで、日本を代表する個人アニメーション作家である相原信洋氏の、現存するフィルムのうち、以下の29作品のデジタル化作業を完了させた。うち15作品(*を付記)はニュープリントを作成して、試写による品質チェックを行ったうえで、デジタル化作業を行なった。19601970年代の作品を基本としながら、その後の作家活動も含め包括的に明らかにすることができたと考える。また、平成27年度の研究成果を含む博士論文「前衛記録映画論の戦後的意味ー1970年までの松本俊夫の諸活動をもとに」を執筆し、京都精華大学大学院芸術研究科に提出した。平成28年度の研究活動においては、まず京都造形芸術大学の大西宏志教授などと協力しながら、相原信洋氏の残存するフィルム(ネガフィルムおよび上映用プリント)の調査と整理を進めた。そのうえで、平成28年度の研究活動のなかで作業すべき作品を選定し、デジタル化作業を実施した。また、1970年代以降の作品についても、その重要性を鑑みて、デジタル化作業の対象に含めた。これらの作品のうち、特に上映用プリントについては、ネガフィルムが残存しない作品が多数存在しており、詳細な事前調査が必要であった。そこで、東京都国立近代美術館フィルムセンターに協力を求め、技術面でのご助力を得た。それにより、極めて詳細な上映用プリントの調査を行うことができた。また、平成27年度の研究成果を含む博士論文「前衛記録映画論の戦後的意味ー1970年までの松本俊夫の諸活動をもとに」を執筆し、戦後の映像芸術の発展に大きな影響を与えた映画監督・映像作家である松本俊夫氏の1970年までの活動を明らかにした。この論文は京都精華大学大学院芸術研究科に提出された。平成29年度の研究活動においては、日本国内の1960年代から1970年代にかけての映像芸術(実験映画・ビデオアートなど)を調査しながら、個人アニメーション作家である相原信洋氏の現存するフィルムのうち、以下の19作品などのデジタル化作業を完了させた。

この作業は平成28年度に引き続いて行われたものであり、1960年代から1970年代にかけての作品を基本としながら、その後の作家活動も含め包括的に明らかにすることができたと考える。『Stop』(1969)、『サクラ』(1970)、『おしろい羽根』(1972)、『みつばちの季節は去って』(1973)、『赤いギヤマン』(1973)、『うるし』(1973)、『短距離ランナー』(1973)、『水輪カルマ2』(1980)、『風触』(1980)、『SHELTER』(1981)、『逢魔が時』(1985)、『しゃぼん玉』(1985)、『PRIVATE』(1986)、『とんぼ』(1988)、『雲の水』(1990)、『LINE』(1990)、『鴉』(1992)、『気動カラーバージョン』(1994)、『Memory of Red』(2004)また、平成27年度より継続していた、映画監督・映像作家である松本俊夫氏の映像素材などのデジタル化作業を完了させた。研究課題の目的は、1960年代から1970年代を中心とする日本の映像芸術を調査したうえで、作品等をデジタルアーカイブ化し、その成果を社会に還元することにある。この目的に沿って、研究代表者は映像作家である相原信洋、松本俊夫、中島崇などの調査と、作品等のデジタル化を行った。特に相原信洋の作品に関してはデジタル復元の作業を行い、残存するほぼ全て作品のデジタル化を達成することができた。それに併行して、研究成果を社会に還元するために、国内外の上映会にデジタルデータの提供を行った。平成28年度の研究においては、引き続き文献・文書資料類の調査と、映像作品のデジタル化作業を進めてゆく予定である。本報告書作成時点では、1960年代末から活動を開始した、日本を代表する実験アニメーション作家である相原信洋の映像作品が候補に挙がっている。これらの作業に併行して、文書・文献資料のスキャンによるデジタルデータ化と、研究成果を美術研究者・映画研究者や美術館学芸員に向けて公開するための準備作業を進めてゆく予定である。また、平成29年度の映像作品のデジタル化作業の候補についても、平成28年度中より調査を開始する予定である。平成29年度の研究においては、引き続き文献・文書資料の調査と映像作品のデジタル化を進めてゆく予定である。本報告書作成時点では、相原氏の作品のデジタル化作業の継続と、平成27年度より取り組んでいる松本氏の作品のデジタル化作業の継続が候補に挙がっている。これらの作業に併行して、文献・文書資料のスキャンによるデジタルデータ化と、研究成果を美術研究者・映画研究者に向けて公開するための準備作業を進めてゆく予定である。芸術
初期発生過程におけるウシ形質転換胚の選別

ウシ形質転換胚を受卵雌に移植する前に選別するため、ルシフェラーゼ遺伝子をウシ胚に注入し初期発生過程での胚の発光検出の有効性を検討している。すでに、遺伝子注入胚における発現は授精後60時間以降開始することを報告している。しかしながら、120時間以降その発現率が低下することから、初期の発現はほとんどが一過性と思われた。安定的な発現を検出するため、今回、まず、遺伝子注入胚の胚盤胞期での発現検出を試みた。二ワトリβアクチン/ホタルルシフェラーゼ(β-act/lUc)融合遺伝子を、体外成熟・受精で作製したウシ胚前核に注入した。これらのの胚を7日間培養して胚盤胞期まで発生させ、イメ一ジングフォトンカウンターを用いて胚の発光を観察した。1,402個の胚にβ-act/lUc遺伝子を注入したところ、63個(4.5%)が胚盤胞に発生したが、発育胚において発光は観察されなかった。今回遺伝子発現が全く検出されなかったことは、用いたβ-act/lUc遺伝子のウシ胚内でめ発現効率が低いことも考えられた。そこで、SV40由来プロモータ/エンハンサーを有する改良型ルシフェラーゼ(SV/luc+)遺伝子およびニワトリβアクチンプロモータを有する改良型ルシフェラーゼ(β-act/lUc+)遺伝子をウシ胚に注入し、その発現効率を検討し、効率よく発現するレポータ遺伝子を検索した。遺伝子は、プラスミドを用いた。SV/luc+およびβ-act/lUc+注入胚は、授精後60時間以降で発光が検出され、発光した胚の割合は、それぞれ、28.5および20.0%といずれも高率だった。また、発光強度は、以前用いたβ-act/lUcより強かった。以上より、より効率に生物発光を検出するには、改良型ルシフェラーゼ遺伝子が適していると思われた。ウシにおいて、外来遺伝子の初期胚前核への顕微注入法により形質転換動物の生産が報告されている。しかし、その効率はマウスに比べてきわめて低く、0.1%程度である。遺伝子注入胚を受卵雌に移植する前に形質転換胚をあらかじめ選別できれば、生産効率は飛躍的に向上するものと思われる。本研究では、ルシフェラーゼ遺伝子をマーカー遺伝子としてウシ前核に注入し、その生物発光により選別が可能かどうか検討している。ニワトリβアクチン/ホタルルシフェラーゼ(β-act/luc)融合遺伝子を、40μg/mlの濃度で、体外成熟・受精で作製したウシ胚前核に注入した。これらの胚を培養して発生させた。授精後の時間から6時間間隔で72時間まで、イメージングフォトンカウンターを用いて胚の発光を観察した。、胚は、授精後60時間以降で発光を開始し、その割合は、5.414.4%だった。しかしながら、発光は、胚全体ではなく、一部の割球の発光によるモザイク発現であった。このことから、次に、注入した遺伝子の胚内での分布と発現の関係を調べた。あらかじめ核酸標識試薬(LabelIT)でローダミン標識したβ-act/luc遺伝子をウシ胚前核に注入した。遺伝子の胚内での分布を調べるため、遺伝子注入後、経時的に共焦点レーザースキャン顕微鏡(LSM)で観察した。胚内の遺伝子の量を蛍光強度で調べたところ、経時的に減少していくことが観察された。遺伝子注入直後は、注入した前核に多くの遺伝子が観察でき、細胞質内にも拡散した遺伝子が確認できた。卵割した胚では、一部の割球の核に蛍光が観察され、モザイク状に遺伝子が分布していることが推測できた。また、発光胚の割球を単離してLSMで標識遺伝子の検出を試みたが、蛍光検出はできなかった。以上のことから、外来遺伝子を注入したウシ胚はモザイク発現が多いこと、注入遺伝子はモザイク状に胚割球に分布し、核内に局在していることが確認できた。今後、発現胚が遺伝子導入されているかどうかを検討するため、発現胚のウシへの移植による形質転換動物の作製や導入遺伝子の染色体上への取り込みをFISH法により検討する予定である。

そこで、SV40由来プロモータ/エンハンサーを有する改良型ルシフェラーゼ(SV/luc+)遺伝子およびニワトリβアクチンプロモータを有する改良型ルシフェラーゼ(β-act/lUc+)遺伝子をウシ胚に注入し、その発現効率を検討し、効率よく発現するレポータ遺伝子を検索した。遺伝子は、プラスミドを用いた。SV/luc+およびβ-act/lUc+注入胚は、授精後60時間以降で発光が検出され、発光した胚の割合は、それぞれ、28.5および20.0%といずれも高率だった。また、発光強度は、以前用いたβ-act/lUcより強かった。以上より、より効率に生物発光を検出するには、改良型ルシフェラーゼ遺伝子が適していると思われた。