hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラン藻の光・酸素ストレス適応の分子生物学的機構

1.らん藻には、葉緑体と同様に光還元生成物を電子供与体とするペルオキシダ-ゼ反応で過酸化水素を消去できる種とできない種が存在し、これはアスコルビン酸ペルオキシダ-ゼ活性の存否と対応する。しかしこのペルオキシダ-ゼの直接の電子供与体のアスコルビン酸ではないことを見出した。このペルオキシダ-ゼが存在しない種では過酸化水素の消去は、専らカタラ-ゼに依存していた。2.光・酸素ストレス下では、電子伝達系で過剰な還元力が生成し、細胞成分に障害をもたらすが、らん藻の呼吸伝達鎖は、光合成電子伝達鎖と共役しているため、過剰な還元力が生じた際の還元力の消去に機能している可能性がある。こうした光合成と呼吸の相互作用を解析するため、パルス振幅変調蛍光計を用いた分光法による分析手段を開発した。らん藻、Synechococcus PCC7002,Synechocystis PCC6803では、呼吸基質の酸化分解による還元力のプラストキノンプ-ルへの流入が大きく暗所でもプラストキノンが還元状態にあることが幾つかの電子伝達阻害剤存在下での光化学系I反応中心P700の吸光度変化から推定された。またS.6803を用いた実験でNADPHプラストキノン還元酵素をもたない突然変異株では、赤外光照射下のP700の酸化が促進された。またDCMU存在下、飽和白色光パルス照射後のP700^+の再還元速度が赤外光照射後のそれに比較して著しく速いことから、この酵素がらん藻では呼吸ばかりではなく、循環的電子伝達にも機能していることが明らかになった。この呼吸および循環的電子伝達によるプラストキノンの還元活性は、上述のらん藻2種やクラミドモナスでは極めて高いが、高等植物の葉緑体やアナベナでは、低かった。1.らん藻には、葉緑体と同様に光還元生成物を電子供与体とするペルオキシダ-ゼ反応でH_2O_2を消去できる種と、できない種が存在し、これはAscorbate peroxidase(APX)活性の存否と対応する。らん藻のAPXは高等植物の酵素と異なり、その電子供与体はアスコルビン酸(AsA)ではないことを見いだした。1)らん藻粗抽出液のCh1当りのAPX活性はホウレンソウの10%以下であった。さらにAsAがない条件で、ホウレンソウのAPXは失活したが、らん藻のAPXは失活しなかった。2)らん藻細胞にH_2O_2を添加したときの光依存H_2O_2消去活性は、粗抽出駅APXによる消去活性の10倍以上であった。3)アスコルビン酸オキシダ-ゼによっても、また、酸抽出液を逆相HPLCで分離する方法でも、アスコルビン酸は検出できなかった。以上のことから、らん藻のAPXはホウレンソウの酵素と異なり、生理的な電子供与体はアスコルビン酸ではないことが分かった。4)現在、酸抽出液中に、HPLCで電気化学的に検出できる3種の酸化還元物質が、らん藻ペルオキシダ-ゼの真の電子供与体となるかどうか検討中である。2.このペルオキシダ-ゼの性質を明かにするため、精製を行っているが、現在までに、1)この酵素は、AsAを基質とし得るが、グルタチオン、チトクロムcは基質としないこと、2)0.4mMのKCNで阻害されることが明らかになった。1.光化学系Iで光還元され、酸素を自動酸化することにより、らん藻に光・酸素ストレスをもたらすメチルヴィオロゲン(MV)に耐性をもつScynechocystis PCC6803の突然変異株を選抜した。

エチルメタンスルフォン酸で突然変異処理した細胞をMV30μMを含む培地で弱光下(1500 lx)で培養した。生育が良好なMV耐性株184株を単離した。野生株はMV10μM存在下で死滅するが、耐性株は、株により20ー60μM MVに耐性であった。クロロフィル蛍光を測定したところ183株は野生株に類似した蛍光のパタ-ンを示したが1株は蛍光収率が野生株に比べ高かった。この株は電子伝達系を含めた光合成または呼吸に変異があるものと思われる。またすべての株は野生株と同様なMV取り込みを示した。過酸化水素に対する耐性は野生株と同程度であった。現在、活性酸素消去酵素の活性測定、二次元電気泳動による特異的な発現タンパク質の分析等によりMV耐性の分子機構を解析している。2.光・酸素ストレス下では、電子伝達系で過剰な還元力が生成し、細胞成分に障害をもたらすが、らん藻の呼吸伝達鎖は、光合成電子伝達鎖と共役しているため、過剰な還元力が生じた際の還元力の消去に機能している可能性がある。こうした光合成と呼吸の相互作用を解析するため、分光法による分析手段を開発した。Synechococcus PCC7002,Synechocystis PCC6803では、呼吸基質の酸化分解による還元力のプラストキノンプ-ルへの流入が大きく暗所でもプラストキノンが還元状態にあることが光化学系I反応中心P700の吸光度変化から推定された。またNADPHプラストキノン還元酵素が呼吸ばかりではなく、循環的電子伝達にも機能していることが明らかになった。
流れ現象の高速ＣＧ映像生成技術に向けた多角的アプローチ

水流,炎,煙,および布の揺らぎなどの流体現象の高速なアニメーション技術の開発を目的として,以下のような手法開発を行った.(1)短時間での水流シミュレーションをもとにエンドレスなアニメーションを生成するためのマルコフ型ベクトル場法;(2)フラクタルブラウン運動により構成された風速場による炎・煙などの流体現象のアニメーション法;(3)2次元の水流シミュレーションから3次元アニメーションを生成する方法および3次元水流シミュレーション計算を小規模化する方法;(4)揺らぎ運動する曲線群を用いた布や炎などの揺らぎ現象のアニメーション法水流,炎,煙,および布の揺らぎなどの流体現象の高速なアニメーション技術の開発を目的として,以下のような手法開発を行った.(1)短時間での水流シミュレーションをもとにエンドレスなアニメーションを生成するためのマルコフ型ベクトル場法;(2)フラクタルブラウン運動により構成された風速場による炎・煙などの流体現象のアニメーション法;(3)2次元の水流シミュレーションから3次元アニメーションを生成する方法および3次元水流シミュレーション計算を小規模化する方法;(4)揺らぎ運動する曲線群を用いた布や炎などの揺らぎ現象のアニメーション法水流,炎,煙,風などの流体の高速なアニメーション技術を開発するために,以下のような多角的なアプローチに基づく手法開発を並行して行った.1.MTVFについて:(1)シミュレーション空間全体について,マルコフ型速度場MTVFを構築する方法に対する改良として,流れの表面に対応するMTVFのみを求め,流れアニメーションを実現する効率的な方法を開発した.また,(2)(1)のMTVF構築の基礎となる流体シミュレーション法と比較し,MTVF自体のパラメタの制御により,流れの印象がよりよく表現されることが分かった.さらに,(3)局所的なMTVFをプリミティブとして,規模の大きな流れを実現するための手法の有効性を確認できた.2.fBmについて:(1)既存のクロスモデル(拘束粒子モデル)に既開発のfBmによる非凍結型風速場を適用し,提案風速場の効果を確認した。また,(2)炎や煙の表現を可能とするため,粒子群によるトレース技術とその粒子群に対するレンダリング技術を開発した.3.HDEXについて:(1)海波,砕波,滝,および渦潮などについて,fBmを用いた次元上げのアイデアの適用法と,合成水面形状にガウスフィルタを効率的に適用する方法を開発した.また,(2)渓流など複雑な地形における流れに適用可能な,層状シミュレーションからなる次元上げ技術の開発を試み,その効率性について,一部確認できた.さらに,(3)粒子ベースアニメーション法に適する表面の生成法に関する既存手法のインプリメントによる比較調査を行った.4.SSDEXについて:(1)フーリエ記述子とfBmによる,カーテンや旗のはためきの表現技術と,その応用として,テクスチャ生成技術とを融合させ,効率的な炎のアニメーション技術を開発した.また,(2)燃料が定義された空間での延焼可能な表現技術を開発した.水流,炎,煙,風など流体の高速なアニメーション技術を開発するために,以下のような多角的なアプローチに基づく手法開発を並行して行った.1.MTVFについて:(1)前年度開発の流れの表面のみに対応するマルコフ型ベクトル場MTVFによる流れのアニメーション法について,著名国際会議と学術誌に発表した.また,(2)流れの表現のためのMTVFの特性を検証するために,1次元MTVFについて調査実験を行い,今後の展開に有効な知見を得た.さらに(3)布のはためきなど他の揺らぎ現象への適用拡大を試みるためのMTVF作成の基本的なアルゴリズムを考案した.2.fBmについて:(1)既存のクロスモデルにピンクノイズであるfBmによる非凍結型風速場を適用し,はためきのリアリティに関する風の場の有効性について確認した.また,(2)インパクトある噴出煙の表現のために,トレーサプリミティブの形状や運動モデルについて検討を行い,その有効性を確認した.さらに,(3)fBmによる風速場では障害物とのインタラクションが表現できないという欠点に対して,簡便な流れシミュレーション法を重畳させることにより,インタラクションの実現の可能性が確認できた.3.HDEXについて:(1)渓流など複雑な地形における流れの表現に向く,流れシミュレーションと流れの底上げを行う積層型の次元上げ技術の開発に向けた基礎的な検討を行い,実現に有効な知見を得た.また,(2)その技術を効率的に開発するために,川底を壁粒子で表現するための粒子の配置生成アルゴリズムを開発した.さらに,(3)SPH法による複雑な流れを対象とした飛沫・泡沫・気泡を含む表現法を2次元MPS法に適用し,独自の表現法の開発に向けた検討を行った.また,粒子群から良好な流体表面を生成するためのスプライン型のアルゴリズムを考案した.水流,炎,煙,風などの流体の高速なアニメーション技術を開発するために,以下のような多角的なアプローチに基づく手法開発を並行して行った.1.MTVFについて:(1)流れの表現を豊かにするためにMTVFの特性を詳しく解析し,流れの乱れの大きさを制御する方法,また飛沫の発生を判断する指標となるパラメタを定めた.(2)局所MTVFによる大域MTVFの合成を可能とするために,異なるMTVFの連接と重畳について検討を行い,自然な合成を可能とするための判定条件の候補を求めた.2.fBmについて:

(1)蒸気機関車の煙のようなインパクトある噴出煙の表現法について,拡散過程の表現法やレンダリング法など,映像としての表現能力の改良を行った.(2)fBmによる風速場生成法に対して,障害物周りに流れ関数を与えることにより,障害物と気流のインタラクションを可能とした方法の有効性を炎のアニメーションにより示した.3.HDEXについて:(1)粒子法による流れシミュレーションの効率化のために,流れの底上げを行う積層型の次元上げの検討を行うなかで,川底全体ではなく流れの安定した層流部分を静止粒子群とするトンネル型の削減手法が発案された.(2)水流のリアルな映像表現のために,粒子群から良好な流体表面を生成するためのスプライン型の表面生成アルゴリズムのアイデアを発案した.4.SSDEXについて:(1)その場生成の可能な(擬似)fBmを生成するマルコフ型のノイズ生成法のアイデアに基づき,ランダムさのパラメタを自由に変化させることのできる1次元ノイズの生成法を開発した.(2)規模の大きな2次元fBmから,小規模な長方形窓から見る長周期(エンドレス)の流れる凍結型2次元fBmを作成し,滝の表現への応用可能性を確認した.26年度が最終年度であるため、記入しない。総合領域26年度が最終年度であるため、記入しない。研究協力者(ポスドク)の雇用が遅れたこともあり,1と2についての成果発表時期に遅れがあるが,1についてはすでに著名国際会議に採択されており,2については国際会議および国内会議への投稿準備がほぼできている.一方,1のMTVFについては,アニメーションの表現としての制御能力において,予期しなかった優れた性質があることが分かった.3のHDEXについては予定通りであり,4のSSDEXについては予定以上の進捗である.研究協力者(ポスドク)の事情により雇用時間を予定通り取れなかったこともあり,2についての成果発表時期に遅れがあるが研究推進に障害はない.一方,1については,基礎的な検討を行う中で,流体表面のMTVFによる表現と,2でのfBmによる非凍結型風速場の生成法との類似性が新たに着目され,有効なノイズ生成手法の開発につながるよう検討を進めている.3については,ほぼ予定通りである.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究協力者として,1のMTVFと2のfBmについてはポスドクを,3のHDEXについては博士後期課程の学生を雇用して進める.なお,4のSSDEXについては,展開課題として,これまでに想起された興味深い手法について,博士前期課程生などと検討を行う.課題は明確であり,プログラミングと計算機実験が研究作業の中心となることから,研究協力者として,ポスドク2名,大学院生3名,および博士課程前期修了生1名など延べ約6名を雇用して推進する.26年度が最終年度であるため、記入しない。3名の研究協力者の雇用のために,人件費を使用する.また,成果発表時期の遅れから,使用が遅れていた旅費と校正費用について,繰り越し分を含めて使用する.
剛直な環状ジアルキル基を有する安定な14族二価化学種の化学

本年は独自に開発した剛直な置換基である1,1,4,4,-テトラキス(トリメチルシリル)ブタンジイルをもつケイ素二価化学種シリレン1の特異な反応性を明らかにした。シリレン1と安定ラジカルである2,2,6,6-テトラメチルピペリジニルオキシ(TEMPO)との反応ではTEMPOの酸素原子がシリレン上に移動しすることで、Si=O二重結合化合物を生成し、これが二量化したと考えられるSi-O-Si-Oからなる4員環化合物が生成することを見出した。この反応は未だ単離されていないSi=O二重結合化合物を与える新しい反応として期待される。シリレン1の二価ケイ素が求電子性と求核性を合わせ持つことをハロメタンとの反応から明らかにした。通常のハロメタンとの反応では、シリレン1はハロメタンの炭素ー塩素結合に挿入した生成物を与えた。ところがジクロロメタンやクロロメチルシクロプロパンとの反応ではこれらのハロメタンに対してシリレン1が2分子付加した生成物のみが得られた。この反応はシリレン1がルイス酸およびルイス塩基として作用する機構で説明できる。さらにシリレン1の光反応を明らかにした。シリレン1はベンゼンと光反応しシラシクロヘプタ-2,4,6-トリエン(シレピン)を与えた。このシリレン1の光科学的付加反応は置換ベンゼンの場合でも一般に進行し、同様な置換シレピン誘導体を定量的に与えた。1,3,5-トリメチルベンゼンの場合にはシレピン誘導体は得られず、シリレン1がC-H結合に挿入した生成物が得られた。これらの化合物の生成は励起状態のシリレンが1,1-ビラジカルとして反応していることを示している。さらにベンゼン中での1の蛍光寿命の測定から、この反応がシリレン1の一重項励起状態からの反応であることをつきとめた。剛直な環状ジアルキル配位子で速度論的に安定化されたシリレン1を用いて初めてシリレンの励起状態の反応性を明らかにすることができた。本年は独自に開発した剛直な環状ジアルキル置換基、1,1,4,4-テトラキス(トリメチルシリル)ブタン-1,4-ジイル基R_2をもつプルンビレンPbR_2(1)の合成を検討した。安定な2価鉛であるPbCl_2やPb[N(SiMe_3)_2]_2に対する1,4-ジリチオ試薬R_2Li_2(2)や1,4-ジグリニヤール試薬R_2(MgBr)_2(3)の求核置換による1の合成を試みたが、いずれも金属鉛と2の分解物が得られるのみであった。これは2や3から二価鉛に電子移動したためと考えられた。4価のジハロプルンバンR_2PbX_2(4,X=Cl,Br)の還元的脱ハロゲン化でも1は得られなかった。1の合成にはスタンニレン等で用いた合成法が適応できず、他の合成法が必要であることが分かった。安定なジアルキルカルベンの合成に向けて、R_2のシリル基をより転位能の低いアリール基で置換した1,1,4,4-テトラアリールブタン-1,4-ジイル基R'_2(アリール=メシチルなど嵩高い芳香族基)を新規に開発した。対応する1,1-ジアリールエテンと金属リチウムの反応から1,4-ジリチオ体R'_2Li_2(5)がほぼ定量的に生成することを見出し、5とジクロロシランとの反応で、対応するシラシクロペンタンR'_2SiH_2を高収率で合成した。現在、R'_2を骨格に持つカルベン6の合成を検討中である。来年度は1および6の合成を継続するとともに、申請者が既に単離したR_2基を有するシリレンR_2Si:(7)の反応性を明らかにする。これに関連し、7が種々の芳香族化合物と光反応し、[1+2]環化付加体シラノルカラジエン8、あるいは7-シラシクロへプタトリエン9をほぼ定量的に与えることを見出した。化合物8や9の生成は励起状態のシリレンが1,1-ビラジカルとして反応していることを示しており興味深い。これはシリレンの光反応を明確に観測した初めての例である。

さらにシリレン1の光反応を明らかにした。シリレン1はベンゼンと光反応しシラシクロヘプタ-2,4,6-トリエン(シレピン)を与えた。このシリレン1の光科学的付加反応は置換ベンゼンの場合でも一般に進行し、同様な置換シレピン誘導体を定量的に与えた。1,3,5-トリメチルベンゼンの場合にはシレピン誘導体は得られず、シリレン1がC-H結合に挿入した生成物が得られた。これらの化合物の生成は励起状態のシリレンが1,1-ビラジカルとして反応していることを示している。さらにベンゼン中での1の蛍光寿命の測定から、この反応がシリレン1の一重項励起状態からの反応であることをつきとめた。剛直な環状ジアルキル配位子で速度論的に安定化されたシリレン1を用いて初めてシリレンの励起状態の反応性を明らかにすることができた。
ヒ素汚染土壌のバイオレメディエーション

ヒ素は天然の土壌水において、ヒ酸(H_2AsO_4^-,HAsO_4^<2->)、亜ヒ酸(H_3AsO_3,HAsO_3^-)のような動的なオシキアニオンとして存在し、移流、機械的拡散、分子拡散によって輸送される。地下水中ヒ素のレメディエーションの第一歩は、これを不動化することにある。一般的な不動化の考え方としては、金属酸化物を使って、表面の水酸基との交換反応により、ヒ酸、亜ヒ酸のオシキアニオンをより酸性側で吸着させることである。本研究では、嫌気環境にある土壌水が一定の移流速度をもつと仮定し、原位置処理のひとつの方法として、透過型浄化バリア、およびその予備試験としての回分試験によって、メカニズムおよび処理効率を検討した。鉄粉への吸着機構では、ヒ酸の場合は酸化還元反応を伴うことなく、単純に吸着していることがXPSより確認できた。亜ヒ酸の場合は、LC-ICP-MSによる溶存態の形態別定量分析、および反応後の鉄粉のXPS分析から、溶液中、あるいは鉄粉の表面で酸化反応が進み、一部はヒ酸として吸着していることがわかった。本研究では、金属酸化物としては鉄粉を用いたが、ヒ素の除去効率は、鉄粉の性質によって変動があり、0.402.7mg-As/g-Fe(0)の幅があった。ヒ素の除去効率が比較的低い鉄粉では、微生物による不動化の影響はわずかに見られたが、ヒ素の除去効率が高い鉄粉では、微生物による不動化の影響はほとんど見られなかった。このことから、微生物機能によるヒ素の不動化法は、化学的手法をとることができない、あるいは化学的手法の範囲に制約を受けるケースにおいて、意味をもつようになることがわかった。本研究において、反応活性が高い鉄粉を混ぜ込んだ透過型浄化壁カラムを作成し、亜ヒ酸の除去挙動を調べた結果、1mの厚さの壁を使えば、200ppbの亜ヒ酸を含む地下水をおよそ100年間環境基準以下に処理し続けることができると試算された。地下水・土壌の原位置処理であるバリア処理のモデルとして、PRBカラムを作成し、ヒ素に汚染された実際の地下水を用いて、実際の地下水流速に近い条件にて、5ヶ月間連続通水実験を行った。バリア内容物として、鉄粉、木屑、コンポストリーフ、小石、シリカ砂を混合し、空隙率30-35%のカラムを作成した。試薬を溶かしてヒ素濃度をあらかじめ高濃度に上げて、効果を検出しやすくしたところ、ヒ素は一定の期間一定効率でバリア内に不動化されることがわかった。一般的な地下水流速、採水地における最大ヒ素濃度、バリア厚さ100センチメートルと仮定した場合、このバリアは約30年の寿命を持つことが推定された。不動化のメカニズムは鉄との相互作用、たとえば、スコロダイトのようなヒ素を含む鉱物の析出、バリア内容物表面への吸着などが考えられるが、カラム内容物に対するヒ素の固定量が小さすぎで、X線光電子分光法でヒ素の化学状態に関する情報を得るには十分な量ではなかったため、直接証拠となるデータが得られていない。また、硫酸還元菌のような嫌気性菌がヒ素の不動化に寄与することを予測したが、今回のカラム実験では、小石からの溶出物が水質のアルカリ度を上げ、硫酸還元菌の活性を低減させる方向へ作用した。しかし、人為的に硫酸還元菌を接種しない条件のものとはヒ素除去量に2倍近くの差が生じたため、化学反応が飽和したあとも微生物反応が持続しているものと推定される。そのほか、この通水実験では同時にリン酸イオンの除去に効果が認められた。カラムからの微量の溶出物質のなかには、環境基準をわずかに超えるものがあり、カラム内容物の選定に関しては今後の検討課題として残された。

このことから、微生物機能によるヒ素の不動化法は、化学的手法をとることができない、あるいは化学的手法の範囲に制約を受けるケースにおいて、意味をもつようになることがわかった。本研究において、反応活性が高い鉄粉を混ぜ込んだ透過型浄化壁カラムを作成し、亜ヒ酸の除去挙動を調べた結果、1mの厚さの壁を使えば、200ppbの亜ヒ酸を含む地下水をおよそ100年間環境基準以下に処理し続けることができると試算された。
頭部外傷後の脳浮腫進行におけるVEGF,MMP-9の役割に関する研究

近年、脳浮腫に関わるメディエーターとしてmatrix metalloproteinase (MMP)-9の役割が重要視されている。しかし、頭部外傷後に、どのような機序でMMP-9が損傷周囲に上昇するのか、よく解明されていない。我々は、脳挫傷マウスモデルを用いて、挫傷後の脳内細胞と血中細胞をフローサイトメトリーで解析し、どのような特徴を持つ細胞がMMP-9を分泌しているかを同定することを目的とした。これまで、脳内の細胞がMMP-9を分泌すると考えられていたが、我々の研究により骨髄由来抑制細胞(CD11b+/Gr-1hi)と呼ばれる細胞がMMP-9を分泌していることがわかった。目的:我々は、血清中のMMP-9値が脳浮腫悪化の因子として注目しているが、頭部外傷後に血中でMMP-9が上昇するメカニズムは解明されていない。骨髄由来抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells: MDSC)は担癌時に、病巣部位や循環血中で増加し、腫瘍浸潤を関与するが、近年、外傷においても炎症を制御することがわかっている。我々は、このMDSCがMMP-9を分泌していると仮説を立てた。動物モデルを用いて、1挫傷脳にMDSCが集積するか、2MDSCが脳浮腫増悪因子matrix metalloproteinase(MMP)-9を分泌するかを明らかにした。方法:C57/BL6Jマウスの左側大脳皮質をimpactorで損傷させ脳挫傷モデルとした。損傷後1・3・5・7日目に挫傷脳からパーコール法で単核球層を分離した。損傷側大脳皮質と脾臓の免疫細胞の発現を、Gr-1+/CD11b+をMDSC、CD11b+/CD45highをマクロファージ、CD11b+/CD45lowをミクログリアと定義して、Flowcytometryで経時的に定量した。Gr-1+/CD11b+とT細胞を共培養して、T細胞の増殖抑制試験を行った。また細胞内染色を行い、どの免疫細胞がMMP-9を分泌しているか分析した。結果:脳組織におけるMDSCの発現はsham群で1%であったが、損傷一日目には17.5%に増加し、その後徐々に減少し7日目には12.1%となった。損傷後、脾臓で増加したMDSCはCD4細胞の増殖を抑制した。また挫傷脳内のMDSCはMMP-9を分泌していた。脳実質内のMMP-9陽性細胞は、84%がMDSCであり、次にミクログリア(12%)だった。血中MDSCもMMP-9陽性細胞であることを確認した。考察:挫傷による血液脳関門の破壊により、循環血液中のMDSCが脳内に集積・組織浸潤し、MMP-9を分泌して挫傷周囲に浮腫を引き起こす可能性が考えられた。外傷後の脳浮腫において、MDSCは新たな治療標的となりうる。現在、ヒトの血中MDSCとMMP-9の測定を行っている。【背景】骨髄由来抑制細胞(MDSC)は炎症時や担がん状態で、病巣部位のみならず循環血中においても増加することが報告されている。脳は免疫特権の器官と考えられていたが、近年、脳における免疫反応が明らかにされつつある。【目的】脳挫傷動物モデルを用いて損傷後、脳にMDSCが集積するかを明らかにする。【方法】C57/BL6J・8週齢雄マウスの左側大脳皮質をimpactorで損傷させ脳挫傷モデルとした。MDSCと脳の免疫を担当するミクログリア・マクロファージはCD11b等の同じ抗原を発現しており、組織免疫染色法では三者を見分けることが困難である。よって、flow cytometoryを用いて、損傷脳内のMDSCs(CD11b+/Gr-1+)ミクログリア(CD45low/CD11b+)・マクロファージ(CD45high/CD11b+)、血中のMDSCsを継時的に定量した。また細胞内染色を行い、これらの免疫細胞のいずれからmatrix metalloproteinase(MMP)-9が分泌されているかを定量した。【結果】MDSCの発現はsham群で<1%だったが、損傷後1日目には12.1%に増加していた。損傷脳におけるMDSCの増加は損傷後4週目までも見られた。これに反して血液中のMDSCは損傷後、減少した。MMP-9陽性細胞は、ほぼMDSCsの分布と一致していた。また挫傷脳・血液中のMDSCともにMMP-9を分泌していた。【考察】脳挫傷後、急性期だけでなく慢性期にもMDSCsが発現していることが分かった。

脳血管門の破綻により循環血流中のMDSCsが挫傷脳に浸潤したと考えられる。分泌されたMMP-9は、脳挫傷後急性期は血管原性浮腫、亜急性期から慢性期には挫傷周囲の血管新生を促し機能回復に関与することが考えられた。【結論】脳挫傷後、MDSCが挫傷脳に集積し、MMP-9を分泌することを示した。頭部外傷後の炎症制御当初の計画通り、動物モデルを使った実験でMMP-9を分泌している細胞を同定できた。また、院内の倫理委員会の承認をうけ、頭部外傷患者の血液のサンプリングも開始できている。同方法でVEGFを分泌している細胞を同定する。ヒトでの測定値とアウトカムの相関関係を確かめる。おおむね計画通り実験が進行できたため。ELISAや抗体の消耗品を購入する予定。
超高温高圧下でのマントル鉱物の熱膨張率測定によるマントルの断熱温度勾配の見積もり

大型放射光施設SPring-8に設置されている大容量高温高圧X線その場観察装置SPEED-Mk.IIを用いて、主要マントル構成鉱物であるカンラン石・ワズレアイト・ペロフスカイトの高温高圧下での比体積測定を行った。得られた比体積から、これらの鉱物のミイ=グリュナイゼン=デバイ型状態方程式を構築した。状態方程式構築に当たり、体積弾性率・その圧力微分・デバイ温度は既存のデータを用いた。今回のデータによりグリュナイゼンパラメータγとその対数体積微分qを見積もった。見積もったパラメータは以下の通りである。カンラン石:γ=1.40(1).q=2.2(1);ワズレアイト:γ=1.64(1),q=1.5(1),ペロフスカイト:γ=2.66(2),q=1.9(1)。今回得られたデータとKatsura, et. al.(2004)のリングウッダイトに関するデータから、マントル上部の主要構成鉱物の熱膨張率を見積もった。断熱温度勾配を仮定すると、カンラン石の熱膨張率は地球表層では4×10(-5)/K程度であるが、深さとともに急激に減少し、深さ410kmでは2.6×10(-5)/Kとなる。カンラン石-ワズレアイト転移で熱膨張率は少し増加し、2.9×10(-5)/Kとなる。ワズレアイト-リングウッダイト-ペロフスカイトの安定領域では、熱膨張率は深さとともに少し減少するが、各相転移に伴って少し(23×10(-6)/K)熱膨張率は上昇する。そのため、マントル上部では熱膨張率はほぼ一定である。断熱温度勾配も熱膨張率と同様の振る舞いをする。マントル上部の断熱温度勾配は約0.4K/kmである。今回の研究では、まず、高圧X線回折の手法を改良し、圧力を0.03GPa、格子定数を0.0003オングストロームの精度で決定することを可能にした。この手法を用いて、以下の三つの物質に対して高圧熱膨張率測定を行った。第一に、下部マントル主要構成鉱物であるMgSiO_3ペロフスカイトに対して、温度圧力条件300-2300K・17-30GPaで測定を行った。下部マントル最上部の温度圧力条件(24GPa・1800K)では、この鉱物の熱膨張率は3.5×10^<-5>/Kである。マントル遷移層下部を構成するリングウッダイトの熱膨張率(2.4x10^<-5>/K)よりかなり大きい。その圧力依存性は大きく、熱膨張率の対数体積微分は10.6である。次に、上部マントル主要構成鉱物であるMg_2SiO_4カンラン石に対して、温度圧力条件300-1900K・3-16GPaで測定を行った。その圧力依存性は比較的大きく、対数体積微分は5.6である。そして、マントル遷移層上部の主要構成鉱物であるMg_2SiO_4ワズレアイトに対して、温度圧力条件300-1700K・11-19GPaで測定を行った。常圧での熱膨張率はa_0=1.97X10^<-5>+1.32X10^<-8>(T-300)と見積もられ、その対数体積微分は4.4(2)であった。マントル遷移層中部の温度圧力条件(15GPa&1700K)では熱膨張率は2.8x10^<-5>/Kである。

これは、リングウッダイトの熱膨張率(2.4x10^<-5>/K)よりやや小さい。高温高圧実験の圧力測定の信頼性の検討を行った。この実験では、試料は、半円盤のMgO焼結体を円筒レニウムヒーターの中にいれ、その残りの半円盤状の空間にダイヤモンドを混合したMgOを詰めた。ダイヤモンドとMgOの体積比は1:1、MgOの粒径は数10μmであり、ダイヤモンドの粒径は数100nmである。試料は、まず19GPa付近まで室温で加圧した。この時点で、ダイヤモンドを混ぜたMgOは純相のMgOより1.2GPa高い圧力を示した。次に200Kステップで加熱した。温度上昇に伴い、両者とも圧力は低下した。また、圧力さも縮まり、1700Kでほぼゼロとなった。この後、室温まで400Kステップで冷却した。温度効果に伴い、両者とも圧力はさらに低下したが、ダイヤモンドを混ぜたMgOの示す圧力は、単相のMgOより相対的に大きく圧力が低下した。室温では、ダイヤモンドを混ぜたMgOの示す圧力は、単相のMgOの示す圧力より1.2GPa低かった。このように、予想された通り、圧力標準物質に他の物質を混合させると正しい圧力値は得られないことが分かった。この結果を踏まえ、正しい圧力値が得られるような試料デザインを行い、フォルステライト、Mg2SiO4ワズレアイト、MgSiO3ペロフスカイトの温度-圧力-体積データの取得を行った。これらの実験は、主に超硬アンビルを用いて行ったが、超硬アンビルで得られる圧力範囲は、MgSiO3ペロフスカイトの安定領域のごく一部しかカバーできないため、更に高い圧力を発生できる焼結ダイヤモンドを用いた実験を行った。本年度は、MgSi03ペロフスカイトに対して、焼結ダイヤモンドアンビルを装備した川井型超高圧発生装置により、40万気圧までの圧力で、高温高圧X線その場回折実験を行った。超高圧発生装置としては、大型放射光施設SPring-8に既設のSPEED-Mk.IIを用いた。高圧セルのヒーター材には、X線を透過するTiB2を用いた。ヒーターは円筒形であり、タンタルとモリブデンを電極として用いた。X線はヒーターに垂直方向に入射した。ヒーターの前後には、ボロン粉末を入れた。出発物質はMg2Si04フォルステライトとMg0ペリクレスの混合物である。Mg2Si04フォルステライトは高温高圧下でMgSi03ペロフスカイトとMg0ペリクレスに分解する。試料圧力はMg0ペリクレスの体積と熱電対で計測した温度から求める。試料はまず30GPaまで加圧し、その後1700Kまで加熱して、MgSi03ペロフスカイトを合成する。そこからさらに加圧し、所定の圧力まで達した後、試料を1500-1900Kまで加熱する。その後200Kステップで冷却し、各ステップで試料と圧力マーカーの回折パターンを取得する。得られた回折パターンからペロフスカイトとペリクレースの格子体積を求め、ペロフスカイトのP-V-Tデータを得た。まず、常温のデータをバーチ=マーナガンの状態方程式にフィッティングし、体積弾性率をK=261GPaと仮定して、体積弾性率の圧力微分K'=3.2(1)をえた。次に高温データをミィ=グリュナイゼンの状態方程式にフィッティングし、デバイ温度をθ=980Kと仮定し、グリュナイゼンパラメータγ=2.66(2)とその対数体積依存性1.9(1)を得た。
生分解性バイオポリマーハイブリッド材料の開発

1.糖質に由来する新規芳香族系ポリエステルの合成と生分解性グルコースから容易に誘導される1,4:3,6-ジアンヒドロ-D-グルシトールをジオール成分として用い、フルフラールから誘導される1,1-ビス(5-メトキシカルボニル-2-フリル)エタンと7種の脂肪族ジカルボン酸とをジカルボン酸成分に用いた塊状重縮合により、分子量12万の一連の含フランコポリエステルを合成した。これらのコポリエステルについて4種の酵素を用いてリン酸緩衝液中で酵素分解試験を行い、酵素の種類とコポリエステルの分子構造との間に興味深い相関があることを認めた。またこれらのコポリエステルのフィルムについて、抗生物質を添加した土中で分解試験を行い、含フランコポリエステルが土中では主として放線菌によって分解を受けることを明らかにした。2.タンパク質・核酸・多糖含有ポリマーハイブリッドの相溶性と生分解性キチン-graft-ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)とポリビニルアルコール(PVA)とのブレンドを調製した。このブレンド系は全組成範囲にわたって相溶性であった。ブレンドフィルムの土中埋没試験を行った結果、PVA単独に比べて生分解が促進されること、バクテリアと放線菌によって生分解が進行していることがわかった。このほかポリサルコシンとPVAとのブレンド系では、少量のポリサルコシンのブレンドによってPVAの熱安定性が向上することが認められた。またサケの白子から得たDNAとPVAとのブレンド系では、PVAのマトリックス中でもDNAは二重らせん構造を形成し、その立体配座はPVA含量に依存して変化することがわかった。1)糖質に由来する新規芳香族系ポリエステルフルフラール誘導体から1,1-ビス(5-(メトキシカルボニル)-2-フリル)エタン(1)を合成し、チタンイソプロポキシド触媒の存在下で1,4:3,6-ジアンヒドロ-D-グルシトール(2)と重縮合させて、主鎖にフラン環を有するポリエステルを合成した。また、ジオール成分には2を用い、ジカルボン酸成分として1と脂肪族ジカルボン酸ジメチルとを併用して、コポリエステルも合成した。酵素分解試験および土中埋没試験によれば、これらのポリエステルのうちではセバシン酸単位を含むコポリエステルが比較的高い生分解性を示した。土中での埋没試験と電子顕微鏡観察の結果から、1を含むコポリエステルには主に放線菌によって分解されることがわかった。2)タンパク質・核酸・多糖含有ポリマーハブリッド側鎖の鎖長および導入率の異なるキチン/ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)グラフト共重合体およびキチン/ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)グラフト共重合体を合成した。これらのグラフト共重合体とポリビニルアルコール(PVA)とのブレンドフィルムを作成して土中埋没試験を行った。FT-IR分析および電子顕微鏡観察により、キチンとブレンドすることによりPVAの分解が促進されること、バクテリアおよび放線菌による分解が起こることなどを明らかにした。このほか、DNAとPVAとから相溶性のブレンドフィルムを調製し、その力学的性質や表面特性を調べた。
Er:YAGレーザーによるレーザーエッチング効果とシーラントの接着性

実験1.レーザー照射面とシーラントの接着界面の観察被験歯は新鮮ヒト上顎第三大臼歯を用いて,頬舌側面を研削し,露出したエナメル質面に先端出力15mJ,25mJで注水下接触照射を行い,シーラントを填塞した.次に試料をエポキシ樹脂に包埋して縦断し,その接着界面をSEMにて観察した.実験2.非接触照射条件がエナメル質に及ぼす形態変化次に,さらに接着力を向上させるための照射条件の検索を行う.今回は非接触照射に条件を絞って実験を行った.実験1と同様に露出したエナメル質面に先端出力30mJ,40mJ,50mJ,60mJで非接触(歯面からチップの距離1mm)注水下の条件で照射を行い,その表面をSEMにて観察した.結果および考察1. 15mJにおいて,弱拡大では25mJに比べ比較的平坦な像を呈しており,これはエナメル質表面形態からの観察と同様の結果であった。強拡大ではシーラントがエナメル小柱鞘部へ網目状に浸入している像が認められた。一方,25mJにおいて,弱拡大で接着界面は荒波状の像を呈しており,15mJに比べ凹凸が顕著で,マイクロクラックも認められたが,そのすべてにシーラントの浸入が認められた。強拡大では15mJと同様に網目状にシーラントの浸入が認められた。このシーラントの網目状の浸入は,すべての試料に認められ,レーザーに特有のものと思われる。2.先端出力30mJでのエナメル質の形態変化は照射野全体には及ばず,亀裂を有するエナメル質研磨面が多く残存していた。蒸散された部分ではエナメル小柱や結晶構造に基づく微細な凹凸が明瞭に認められた。これは低エネルギー非接触照射の特徴と考えられる。また,照射エネルギーが30mJから60mJに増加するとともにエナメル質研磨面の残存は減少し,照射野は均一に蒸散された。しかし,その表面形状は荒波状を示した。実験1.低出力レーザー照射エナメル質の観察被験歯は新鮮抜去ヒト上顎第三大臼歯を用いて,頬舌側面を研削し,露出したエナメル質面に先端出力15mJ,25mJで,注水下接触照射を行った。その後,各試料をSEMにて観察を行った。なお,コントロールには40%正リン酸ゲルで40秒間処理したものを用いた。実験2.レーザー照射面に対するシ-ラント接着試験実験1と同条件でレーザー照射を行い,シ-ラントを填塞したものを用いて, crosshead speed 0.5mm/minの条件下で剪断接着試験を行った。なお,リン酸処理したものをコントロールとした。結果および考察1.SEM観察より,レーザー照射後のエナメル質表面は15mJ,25mJともに表層エナメル質の蒸散消失が認められ,照射面には蒸散粉はほとんど存在していなかった。照射面の形態変化は,15mJでは,エナメル質表層が一層消失し,比較的平坦な像を呈しており,結晶構造に基づく微細な凹凸が認められた。25mJでは,小柱単位の小塊からなる層板状の表面形態を呈しており,15mJに比べ蒸散量も多くなっていた。以上より,15mJのレーザーエッチングでは,25mJに比べ,比較的リン酸エッチングに近い表面形態が得られており,シ-ラントの前処理としては有効であると考えられる。2.剪断試験の結果,シ-ラントの接着力は,15mJでは8.5MPa,25mJでは6.6MPaであり,コントロールのリン酸処理の16.3MPaに比べ,低い値を示した。

また,照射エネルギーが30mJから60mJに増加するとともにエナメル質研磨面の残存は減少し,照射野は均一に蒸散された。しかし,その表面形状は荒波状を示した。
新たな糖質マテリアルの創製に向けた新規配糖化反応の開発と酵素の性質解明

アルキルアルコールを配糖化する微生物反応について、活性微生物の探索と得られた活性株による各種基質の配糖化検討、および配糖化酵素の性質解明を進めている。得られた活性株Agrobacterium sp. M-12株を用いてネロールの配糖化反応を行った。ネロール1g/Lとマルトース100g/Lを仕込んだ反応により72時間で1.8 g/Lのネロール配糖体が生成した。ネロールに対するモル収率は87.6 %で高収率となった。反応中に少量のゲラニールとその配糖体の蓄積も確認された。ネロールの異性化反応の存在によりゲラニオールが生成し(大腸菌等にネロール異性化酵素反応の報告有)、その配糖体が蓄積したものと推測している。酵素の性質を検討するため配糖化活性を持ちゲノム情報公開株のEnsifer adhaerenceNBRC100388から遺伝子のクローニングを行った。制限酵素配列を付加したα-グルコシダーゼ遺伝子の配列をPCRで増幅し、制限酵素処理後、pETベクターに挿入した。クローニングしたα-グルコシダーゼの遺伝子(EaG遺伝子)を大腸菌に形質転換し、IPGによる誘導で活性組換え菌を得た。現在は、組換え菌からの酵素精製と酵素の諸性質の検討を進めている。3級アルコールであるリナロールの配糖化において、ラセミ体リナロールの配糖化物はα-アノマーと糖アルコール側(アグリゴン側)が不斉炭素となることからジアステレオマーが生成することになる。ラセミ体リナロールの配糖化反応の結果、HPLCにて二つの生成ピークが得られたことからジアステレオマーの蓄積が確認できた。今後は酵素によるアルコール側の立体選択についても検討を進める予定である。酵素による糖転移反応は3級アルコールは基質にならないと言われていたが、本検討で見出した酵素により配糖化が可能であることが判明し(2018年度は菌体反応による確認)、非常に大きな成果が得られたと考えている。配糖化反応のアルコール側の選択性(立体、位置など)をリパーゼなどと同じように議論できることになる。また、遺伝子のクローニングと大腸菌での発現が順調に進展したことから2019年度の成果も期待できると考えている。当初の計画通りに取得微生物や酵素による反応検討と性質解明を進める。具体的な検討内容は以下の項目となる。・不斉炭素を持つアルコール基質に対する反応・組換え菌による酵素の性質解明・他の有用基質(ポリフェノールなど)に対する配糖化反応アルキルアルコールを配糖化する微生物反応について、活性微生物の探索と得られた活性株の培養・反応検討、基質特異性の確認、および配糖化酵素の性質解明を進めている。活性株の探索については、土壌からの分離や微生物保存機関からの活性株の16S-rDNAとの類似性の高い菌株の取得により進めている。その結果、従来株よりも高活性な菌株の取得でき、今後の配糖体生産検討や酵素の性質解明に大いに役立つ見込みである。また、これまでの活性株(Ensifer sp. M-261やAgrobacterium sp. M-12株)を用いてのジャーファーメンターを用いた培養条件や反応条件の確立も行った。6-ジンゲロールについては、高価な試薬ではなく実用的な生姜搾汁液中に存在する6-ジンゲロールの配糖化反応を行い、原料として使用可能であることを確認した。また、菌体反応の基質特異性の確認においては、これまでに報告した6-ジンゲロールやゲラニオール、エタノールといった1級、2級アルコール以外に、3級アルコールのリナロールに対しても配糖化可能であることを見出した。これまでの糖転移酵素(β-グルコシダーゼなど)では3級アルコールには配糖化できないことが報告されていたが、本反応では生成物を確認できた(NMRにて構造確認済)。今後の反応メカニズム解明に大きな興味が持たれる結果が見出された。活性株であるEnsifer sp. M-26株からの酵素精製を進めている。本酵素はカチオンにより活性化され、GlucosidaseのGH Families 13との類似性を示した。酵素の精製と酵素遺伝子の類似性からの遺伝子のクローニングを進める予定である。アルキルアルコールは生理機能を持つ化合物が多いことから産業的な利用が可能となる技術としても検討を進めたい。この点から本研究課題開始時よりも高活性な微生物菌株が得られたことは大きな進歩と考えている。基質特異性の確認においては、これまでに酵素による配糖化例の無い3級アルコールへの配糖化が可能であることを確認したのが大きな成果である。H30年年度から反応メカニズムの解明など進めていくが、学術的に大きな成果が期待できる。

酵素の性質を検討するため配糖化活性を持ちゲノム情報公開株のEnsifer adhaerenceNBRC100388から遺伝子のクローニングを行った。制限酵素配列を付加したα-グルコシダーゼ遺伝子の配列をPCRで増幅し、制限酵素処理後、pETベクターに挿入した。クローニングしたα-グルコシダーゼの遺伝子(EaG遺伝子)を大腸菌に形質転換し、IPGによる誘導で活性組換え菌を得た。現在は、組換え菌からの酵素精製と酵素の諸性質の検討を進めている。3級アルコールであるリナロールの配糖化において、ラセミ体リナロールの配糖化物はα-アノマーと糖アルコール側(アグリゴン側)が不斉炭素となることからジアステレオマーが生成することになる。ラセミ体リナロールの配糖化反応の結果、HPLCにて二つの生成ピークが得られたことからジアステレオマーの蓄積が確認できた。今後は酵素によるアルコール側の立体選択についても検討を進める予定である。酵素による糖転移反応は3級アルコールは基質にならないと言われていたが、本検討で見出した酵素により配糖化が可能であることが判明し(2018年度は菌体反応による確認)、非常に大きな成果が得られたと考えている。配糖化反応のアルコール側の選択性(立体、位置など)をリパーゼなどと同じように議論できることになる。また、遺伝子のクローニングと大腸菌での発現が順調に進展したことから2019年度の成果も期待できると考えている。当初の計画通りに取得微生物による配糖化反応検討および酵素の性質解明を進める。具体的には、以下の項目となる。・高活性株による6-ジンゲロールやネロールに対する生産性の確認。・遺伝子のクローニングや酵素の精製による配糖化酵素の性質解明・キラルなアルコール(3級アルコールのリナロールや2-ペンタンオール)に対する配糖化酵素の選択性を確認する。当初の計画通りに取得微生物や酵素による反応検討と性質解明を進める。具体的な検討内容は以下の項目となる。・不斉炭素を持つアルコール基質に対する反応・組換え菌による酵素の性質解明・他の有用基質(ポリフェノールなど)に対する配糖化反応次年度使用額の発生は少額の予算残が発生したため。当初の予定通りの助成金の使用を計画している。酵素精製用資材や微生物探索資材、遺伝子組換え試薬で予定通り支出する予定。
複雑流体のエントロピー消散構造と数理解析

複雑流体に関わる様々な非線形偏微分方程式系を対象に、その数学的エントロピー、系に内在する非線形構造および消散構造に着目し、数理解析研究の新たな展望を開くことを目指して研究を行い、次のような成果を得た。1.記憶型消散項を持つ対称双曲系の消散構造を,空間1次元で記憶核が指数減衰関数である場合に考察した。その消散構造は、対称な記憶型拡散項を持つ場合には標準型の(1,1)型であること、対称な記憶型緩和項を持つ場合には可微分性損失型の(1,2)型であることを示した。また、解の低周波域、高周波域での漸近形を与えることで、得られた結果の最適性を確認した。さらに、対応する解の減衰評価を与えた。記憶型消散効果の数学解析に寄与する成果である。2.複雑流体の1次元モデルは双曲型平衡則系の形を取るが、その際簡約版モデルとして、単独の双曲型保存則とCattaneo則の連立系である双曲型平衡則系を考察した。そのモデル方程式系に対し、衝撃波形の進行波の存在とその漸近安定性を示し、摂動部分の減衰評価を与えた。また、全空間と半空間の場合に希薄波の漸近安定性を示した。これらは複雑流体の非線形波の安定性解析に繋がる研究成果である。3.非対称な緩和項を持つ対称双曲系に対し、可微分性損失型消散構造の特徴付けを一般の枠内で考察した。消散構造が可微分性損失型の(1,2)型または(2,3)型であることを特徴付ける構造条件の定式化に成功し、対応する解の減衰評価を与えた。可微分性損失型消散構造の数学解析に寄与する成果である。当初から研究対象としていた複雑流体の最簡約モデルの衝撃波、希薄波の安定性解析、記憶項を持つ系の消散構造、低階の緩和項が非対称の場合の系の消散構造等、多くの事項について進展があった。研究は順調に進展しており、今後も当初の計画通り研究を進める予定である。
発現系を用いたAMPA型グルタミン酸受容体に対する麻酔薬の効果と作用機序の解明

1分子生物学的研究LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として組み込んだ欠損型ヘルペスウイルスベクターを作成し、PC12細胞、ラット大脳皮質初代培養細胞に感染させ、その感染効率が非常に高く、ウイルスベクター系で問題となる細胞傷害についても感染早期では少ないことを明らかにした。また、AMPA型グルタミン酸受容体とともに重要なグルタミン酸受容体であるNMDA型受容体を組み入れた組換え型ヘルペスウイルスベクター系を構築し、ラット脳初代培養細胞への導入し、発現を確認した。2電気生理学的研究1)揮発性麻酔薬の細胞膜への非特異的作用をあらかじめ検討し、揮発性麻酔薬は細胞膜の脂質二重層のイオン透過性を非特異的に増加させ、その程度は麻酔薬、膜脂質の種類により異なるが、大きな増加ではないことを報告した。2)AMPA型グルタミン酸受容体と類縁のligand-gated ion channelに対する麻酔薬の作用を研究する目的で、PC12細胞の神経型ニコチン様アセチルコリン受容体およびプリンP2x受容体に対する静脈麻酔薬の作用を検討した。その結果、バルビツレート、プロポフォール、ケタミンは、いずれもニコチン受容体を介する応答電流を強く抑制するのに対して、プリンP2x受容体を介する反応はほとんど抑制せず、後者には麻酔薬が高親和性に結合する部位が欠けていると考えられた。3)NativeのAMPA型グルタミン酸受容体に対するバルビツレートの作用を大脳皮質一次培養ニューロンを用いて検討した。サイオペンタールは臨床濃度で応答電流を抑制するが、麻酔作用を欠き、中枢神経刺激作用をもつバルビツレートも応答電流を抑制することから、AMPA受容体の抑制作用はバルビツレートの麻酔作用には貢献していないと考えられた。発現系の作成:LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として組み込んだ欠損型ヘルペスウイルスベクター(Herpes Simplex Virus type1,HSV)を作成し、PC12細胞、ラット胎仔大脳皮質初代培養細胞に感染させ、その感染効率および、ウイルスベクター系で問題となる細胞傷害について検討した。lacZ産物であるβ-galactosidaseの発色反応から、発現は非常に速やかで感染後数時間で目的蛋白を確認でき、その感染効率がほぼ100%であることを確認している。さらに感染細胞について、パッチクランプ法によりニコチン様アセチルコリン受容体を介する電流応答が得られ、細胞の受容体機能が影響を受けていないことを確かめた。また、高濃度、長時間の感染では、細胞傷害がみられるが、培地にacyclovirを1mg/ml添加することによって細胞への影響を減弱しうることを見出した。AMPA受容体α1、α2サブユニットの発現については発現条件の最適化を進めている。電気生理学:PC12細胞にNMDA型グルタミン酸受容体が存在することが最近報告されたため、AMPA型受容体の有無を電気生理学的に検討した。すなわち、ウィルスベクターを感染させていないPC12細胞で高濃度のカイニン酸による電流応答がみられるかどうか検討した結果、すべての細胞で電流応答はみられず、機能的なAMPA型受容体は存在しないことを確かめた。また、使用する予定の揮発性麻酔薬の細胞膜への非特異的作用をあらかじめ検討し、報告した。すなわち、揮発性麻酔薬は細胞膜のイオン透過性を非特異的に増加させ、その程度は麻酔薬、膜脂質の種類により異なるが、大きな増加ではないと考えられる。分子生物学的研究AMPA型グルタミン酸受容体とともに重要なグルタミン酸受容体であるNMDA型受容体を組み入れた組換え型ヘルペスウイルスベクター系を構築し、ラット脳初代培養細胞への導入を試みた。lacZ組換え型ヘルペスウイルスを用いたラット大脳皮質初代培養細胞への標識実験では、ほぼ100%の遺伝子導入効率であった。NMDA受容体ζ

1サブユニット組換え型ヘルペスウイルスを用いた発現実験では、Vero細胞では感染後約3時間で本受容体を確認し、48時間後に最大となった。ζ1サブユニット組換え型ヘルペスウイルスを用いてラット大脳皮質初代培養細胞にζ1サブユニットを過剰発現させた。また、感染後24時間ではζ1サブユニットの過剰発現は、内因性に発現している他のサブユニットには影響を与えなかった。電気生理学的研究1)AMPA型グルタミン酸受容体と類縁のligand-gated ionchannel対する麻酔薬の作用を研究する目的で、PC12細胞に内因性に発現している神経型ニコチン様アセチルコリン受容体およびプリンP2x受容体に対する静脈麻酔薬の作用を検討した。その結果、バルビツレート、プロポフォール、ケタミンは、いずれもニコチン受容体を介する応答電流を強く抑制するのに対して、プリンP2x受容体を介する反応はほとんど抑制せず、後者には麻酔薬が高親和性に結合する部位が欠けていると考えられた。2)NativeのAMPA型グルタミン酸受容体に対するバルビツレートの作用を大脳皮質一次培養ニューロンを用いて検討した。サイオペンタールは臨床濃度で応答電流を抑制するが、麻酔作用を欠き、中枢神経刺激作用をもつバルビツレートも応答電流を抑制することから、AMPA受容体の抑制作用はバルビツレートの麻酔作用には貢献していないと考えられた。
光誘起電位のオペランドマッピングによる光触媒反応の解明

持続可能な人類社会形成には太陽光照射により水からクリーンな燃料である水素を得ることがきわめて有効であるが、これを目指す光触媒の光変換効率は低く、この向上には不均一水光分解反応機構の本質的な理解が不可欠である。この反応には、「光吸収により生じた電荷により光触媒粒子が分極し、いわば小さな電池となりその表面で電気化学反応を進行させる」という簡便な説明が成されている。しかし、動作中の光触媒において光誘起電位の表面分布と反応速度との相関を解明した例は皆無である。そこで、本研究では、光誘起された電荷、表面電位、反応中間体を空間マッピングし、光誘起電位と反応性の相関から不均一光触媒反応機構の本質を解明する。