hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍浸潤リンパ球を体外で増幅して戻す養子免疫療法やキメラ抗原受容体(CAR)導入T細胞療法はがんの治療に有効であることが示されているが、T細胞の長期培養による疲弊化は避けられない。最近、新規メモリーT細胞サブセットである幹細胞メモリーT(Tscm)細胞が発見され新たなT細胞移入療法の素材として注目されている。我々はヒト末梢血よりEBウイルスや腫瘍抗原特異的T細胞あるいはCAR導入T細胞を増幅させたのち、Notch-ligand, hDLL1(OP9-hDLL1)を発現するOP9細胞と共培養することによりTscm様細胞(iTscm)に転換できることを示した。iTscm細胞はヒト化マウスモデルにおいて従来の活性化T細胞よりもはるかに強い抗腫瘍能力を示した。iTscm細胞の誘導機構や高い抗腫瘍性の原因を明らかにするために代謝特徴を検討した。ヒトiTscm細胞においてはグルコース取り込みが抑制される一方、ミトコンドリア酸化的リン酸化が増強された。ヒトiTscm細胞はまた、細胞内に中性脂肪滴を含み、脂肪酸代謝によって高い酸化的リン酸化を維持していることが示唆された。次にCD8陽性T細胞の疲弊化の分子機構の解明も行なった。我々は核内受容体NR4aファミリーがFoxp3の転写を直接活性化し制御性T細胞(Treg)の分化に必須の役割を果たすことを見いだした。Nr4aはTregのみならずPD-1陽性の疲弊したCD8陽性T細胞でも強く発現誘導されることがわかった。ゲノム解析の結果Nr4aはPDー1遺伝子のエンハンサー領域に結合しPDー1の発現を安定化することがわかった。NR4a欠損T細胞は疲弊化しにくく強い抗腫瘍効果を持っていた。Nr4aを阻害することによって、Tregの抑制とCD8T細胞の活性強化を介して抗腫瘍免疫を増強することが示された。CAR導入T細胞をiTscm化することに成功した。またCD8T細胞の疲弊化を起こす遺伝子としてNr4aを発見し、これが抗腫瘍免疫を増強させる重要な標的遺伝子であることを見出した。(1)iTscmにおいてミトコンドリア酸化的リン酸化(OXPHOS)が増強される分子機構および細胞内に中性脂肪滴を蓄える仕組みを明らかにする。(2)ヒトiTscmではテロメア長がナイーブT細胞レベルに回復している。これがiTscmの長寿性を担保していると考えられる。Notchシグナルによってテロメア長が回復するメカニズムを明らかにする。今年度はTERTなどテロメア関連の遺伝子発現を調べる。(3)iTscm誘導のフィーダーフリー化を行う。現在はOP9-hDLL1ストローマ細胞との共培養が必要であるが、品質を一定するためおよび臨床応用のためにはフィーダーフリー化が望まれる。現在組替えNotchリガンドなどを用いて条件検討を行なっている。(4)化合物ライブラリーからNr4a阻害剤をスクリーニングする。
Notchシグナルによってテロメア長が回復するメカニズムを明らかにする。今年度はTERTなどテロメア関連の遺伝子発現を調べる。(3)iTscm誘導のフィーダーフリー化を行う。現在はOP9-hDLL1ストローマ細胞との共培養が必要であるが、品質を一定するためおよび臨床応用のためにはフィーダーフリー化が望まれる。現在組替えNotchリガンドなどを用いて条件検討を行なっている。(4)化合物ライブラリーからNr4a阻害剤をスクリーニングする。
熱応力によるぜい性固体の割断法の開発研究

3次元固体として直方体と直円柱に注目し,表面の部分的な加熱による3次元非定常熱応力場を20節点アイソパラメトリック要素を用いた有限要素法により解析し,割断に有効な加熱法を検討した.1点加熱や円形領域加熱より,表面に帯状加熱源を置き,加熱領域長手方向の加熱していない部分の初期傷からき裂を発生・進展させる方法が加工面から有効である.2直方体の場合,加熱領域長手軸に垂直方向の熱応力が引張りになる領域は加熱帯幅にほとんど依存せず,端面近傍で高い引張り応力が発生する.3同一加熱時間では,加熱帯幅が狭いほど表面近くで応力が高くなるが,内部では逆に帯幅が広いほうが高い.加熱帯幅を板全幅の0.050.1とすると,板厚全体にわたってほぼ一様な引張り熱応力を発生する.4加熱は1面だけでなく,表裏2面を同時に行うと板厚中央での応力は2倍になり加工に有利となる.5き裂が端面からほぼ中央まで板厚全体に一様に入った状態では,板表裏面近くでモードIの応力拡大係数が負になる.このことから板厚中央部に比べ板表裏面近傍のき裂進展が遅れることが説明される.6直円柱の場合は円周を部分的に帯状加熱することで,非加熱部分に強い軸方向引張り垂直応力が発生する.7円柱の半径と高さの比が2以上のとき,非加熱角度を1520°,加熱幅を半径の0.20.3とすると,発生熱応力はガラス円柱表面の初期傷からき裂を発生させるに十分な大きさに達する.8球に近い形状ほど,外表面からの加熱により物体内部に熱応力を発生させる熱応力割断は困難になる.3次元固体として直方体と直円柱に注目し,表面の部分的な加熱による3次元非定常熱応力場を20節点アイソパラメトリック要素を用いた有限要素法により解析し,割断に有効な加熱法を検討した.1点加熱や円形領域加熱より,表面に帯状加熱源を置き,加熱領域長手方向の加熱していない部分の初期傷からき裂を発生・進展させる方法が加工面から有効である.2直方体の場合,加熱領域長手軸に垂直方向の熱応力が引張りになる領域は加熱帯幅にほとんど依存せず,端面近傍で高い引張り応力が発生する.3同一加熱時間では,加熱帯幅が狭いほど表面近くで応力が高くなるが,内部では逆に帯幅が広いほうが高い.加熱帯幅を板全幅の0.050.1とすると,板厚全体にわたってほぼ一様な引張り熱応力を発生する.4加熱は1面だけでなく,表裏2面を同時に行うと板厚中央での応力は2倍になり加工に有利となる.5き裂が端面からほぼ中央まで板厚全体に一様に入った状態では,板表裏面近くでモードIの応力拡大係数が負になる.このことから板厚中央部に比べ板表裏面近傍のき裂進展が遅れることが説明される.6直円柱の場合は円周を部分的に帯状加熱することで,非加熱部分に強い軸方向引張り垂直応力が発生する.7円柱の半径と高さの比が2以上のとき,非加熱角度を1520°,加熱幅を半径の0.20.3とすると,発生熱応力はガラス円柱表面の初期傷からき裂を発生させるに十分な大きさに達する.8球に近い形状ほど,外表面からの加熱により物体内部に熱応力を発生させる熱応力割断は困難になる.実験に使う厚板のガラスブロックを想定し,解析領域がL×W×bの直方体の3次元非定常熱応力場を20節点アイソパラメトリック要素と要素毎のユニット消去法を用いた有限要素法により解析した.その結果,1点加熱や,円形領域過熱より,表面(x-y面)内にx軸に沿ったH×Vの帯状加熱源を置き,端面(y-z面)の初期傷からき裂を発生・進展させる方法が加工面から有効である.2 σ_yが引張りになる領域は加熱帯幅Vにほとんど依存せず,端面近傍で高い引張り応力が発生する.3発生熱応力σ_yを最高到達温度T_<max>で除した値は加熱時間が短いほど大きくなるので,温度上昇を押えて割断加工をするためには,大量のエネルギを短時間に注入する割断法が効果的である.4無次元加熱時間κt/b^2=0.1では,加熱帯幅Vが狭いほど表面近くで応力が高くなるが,内部では逆に帯幅が広いほうが高い.板厚全体にわたって一様に高い応力σ_yを発生する加熱帯幅はV/W=0.050.1である.5加熱帯長さHについては,H=Lでは端面でのσ_yが表面近傍で落込む.H/L=0.90.95と加熱領域が端面近くに及ばないようにすると,表面近くでのσ_yの落込みがなくなる.6加熱は1面だけでなく,表裏2面を同時に行うとσ_y/T_<max>の値はほぼ2倍になる.7き裂が端面からほぼ中央まで板厚全体に一様に入った状態では,板表裏面近くで応力拡大係数が負になる.このことから板厚中央部に比べ板表裏面近傍のき裂進展が遅れることが予想される.次年度はガラスブロックを試験片にして,帯状加熱による割断実験を行い,解析結果を確認する計画である.3次元固体として直方体と直円柱に注目し,表面の部分的な加熱による

3次元非定常熱応力場を20節点アイソパラメトリック要素を用いた有限要素法により解析し,割断に有効な加熱法を検討した.1点加熱や円形領域加熱より,表面に帯状加熱源を置き,加熱領域長手方向の加熱していない部分の初期傷からき裂を発生・進展させる方法が加工面から有効である.2直方体の場合,加熱領域長手軸に垂直方向の熱応力が引張りになる領域は加熱帯幅にほとんど依存せず,端面近傍で高い引張り応力が発生する.3同一加熱時間では,加熱帯幅が狭いほど表面近くで応力が高くなるが,内部では逆に帯幅が広いほうが高い.加熱帯幅を板全幅の0.050.1とすると,板厚全体にわたってほぼ一様な引張り熱応力を発生する.4加熱は1面だけでなく,表裏2面を同時に行うと板厚中央での応力は2倍になり加工に有利となる.5き裂が端面からほぼ中央まで板厚全体に一様に入った状態では,板表裏面近くでモードIの応力拡大係数が負になる.このことから板厚中央部に比べ板表裏面近傍のき裂進展が遅れることが説明される.6直円柱の場合は円周を部分的に帯状加熱することで,非加熱部分に強い軸方向引張り垂直応力が発生する.7円柱の半径と高さの比が2以上のとき,非加熱角度を1520゚,加熱幅を半径の0.20.3とすると,発生熱応力はガラス円柱表面の初期傷からき裂を発生させるに十分な大きさに達する.8球に近い形状ほど,外表面からの加熱により物体内部に熱応力を発生させる熱応力割断は困難になる.
基底膜を利用したiPS細胞由来肺胞上皮細胞の分化培養法の開発

人工多能性幹細胞(iPS細胞)から標的細胞を調製し、創薬や毒性解析に利用するためには、より高い効率で分化誘導できるかが重要である。iPS細胞の分化培養には既製品の基底膜成分でのコーティング下で行うことが一般的だが、本研究では生体内における細胞の環境に近い状態をin vitroで再現することでiPS細胞の分化をより効率よく誘導することができるか、基底膜成分から形成させた擬似的な基底膜構造体上でiPS細胞を培養することで検討した。本研究では特に分化が難しい肺上皮細胞について検討した結果、特定の分化過程において基底膜構造体上で培養することにより、分化効率が高くなる可能性が示唆された。環境汚染物質に対する毒性評価は、これまで実験動物を用いた曝露実験と共に培養細胞によるin vitro評価法が実施されてきた。前者の曝露実験は正確性や緻密性に優れているが、動物愛護精神の高まりや実験費用を踏まえ、今後は後者のin vitro評価法をより正確且つ精密にin vivoを反映する培養系に発展させていくことが求められている。人工多能性幹細胞(iPS細胞)は生体内の各組織に分化できる能力を有することから、株化細胞に代わるツールとして着目されているため、新たなin vitro毒性評価系として応用できる可能性がある。本研究では、iPS細胞を用いた大気汚染物質に対する新たな毒性評価系の開発に着手すると同時に、細胞の発達や成熟に重要な役割を果たすことが知られている基底膜の有効性を調べた。iPS細胞から肺上皮細胞への誘導を行うため、まず、iPS細胞から内胚葉、前方前腸内胚葉、肺前駆細胞への段階的な分化誘導を行った。その結果、iPS細胞から高純度の内胚葉に誘導することがPCR法および免疫染色法による解析によって確認できたが、肺前駆細胞の誘導は認められたものの効率が低かった。次に、肺前駆細胞から肺胞上皮細胞および気道上皮細胞への分化を試みた。FGF10により肺胞上皮細胞への分化誘導を行った結果、II型上皮マーカーであるSFTPC発現量やクララ細胞マーカーであるCC10が誘導された。一方で肺上皮前駆細胞からFGF7、FGF10、FGF18等の刺激により気道上皮細胞の元となる基底細胞への分化を行った結果、基底細胞マーカーのKRT5の誘導が確認されたが、特に細胞を基底膜上で培養した条件で強く誘導された。iPS細胞から肺上皮細胞への分化誘導を行うためには、その前駆細胞である肺前駆細胞(NKX2.1+)を誘導する必要があるが、文献で報告されている方法では効率が低かったため、その後の各種肺上皮細胞への分化も効率が悪く、基底膜の有効性を示すことにも支障があった。そのため、この問題を解決するための検討に時間を要している。現在までのところ、内胚葉の誘導方法や内胚葉から前方前腸内胚葉への移行のタイミングが重要であることがわかったため、分化培養法を改善して検討しているところである。未分化状態のヒトiPS細胞から肺上皮細胞まで分化成長させるためには、内胚葉、肺前駆細胞を経て誘導されることが知られている。本年度は、基底膜(sBM)基質がこれらiPS細胞の分化に効果的かを検証するため、ラミニン111を主体としたマウス肉芽腫から調製されている市販のMatrigel(Corning)、ラミニン511の組換えタンパクであるiMatrix(Nippi)との比較を行った。フィーダー細胞フリーで培養した未分化ヒトiPS細胞(201B7)を各種コート上で内胚葉(definitive endoderm)および肺前駆細胞へ分化培養を行った結果、内胚葉マーカーのFOXA2およびSOX17、肺前駆細胞マーカーのNKX2.1の発現誘導はラミニン111のMatrigelコート条件が最も強く誘導された。これに比べるとラミニン511であるiMatrixやsBM上で培養した場合では低い結果となった。この結果から、肺前駆細胞までの分化過程ではラミニン111による刺激がより効率的であると推測され、基底膜基質の有効性は明らかではなかった。そこで、Matrigel上でiPS細胞から肺前駆細胞まで分化させた後、各種のコート上に継代して肺上皮細胞の元となる基底細胞まで分化を行い比較したが、基底細胞のマーカーであるTP63やKRT5の発現量はMatrigelとsBM間で差がなかったが、Matrigel中で3次元培養でspheroidを形成させて分化させてから各コート上に播種して更に分化させたところ、sBM上で培養させた場合において最もFOXJ1やP63が誘導された。iPS細胞から誘導した肺前駆細胞から、肺胞上皮細胞あるいは基底細胞への分化誘導を行う。必要の際には細胞を剥離し、細胞の純度を高める。

最終的に、細胞をマトリゲル、ラミニン511、基底膜下で培養する。基底細胞の場合は、各種の細胞外基質でコートされたセルカルチャーインサートに継代し、気層条件下で培養することで繊毛細胞および粘液分泌細胞への分化誘導を試みる。これらiPS細胞から誘導された肺上皮細胞について、大気汚染物質等の反応性について、初代細胞から得られたものと比較する。毒性学iPS細胞から肺前駆細胞に至るまでの途中段階で問題が生じていたため、進展がやや遅れている。そのため、iPS細胞から得られた目的の肺上皮細胞の分取にかかわる操作および解析等に必要な消耗品を次年度に繰り越している。iPS細胞から肺前駆細胞までの分化効率を高めるため、各種の内胚葉分化プロトコル間で分化誘導を免疫染色法やPCR法により比較を行う。また、分化誘導が十分ではなかった場合には、特異的抗体を用いた分取法や遺伝子操作により人工的に表面マーカーが誘導される系の検討を行う。更に得られた肺前駆細胞から肺胞上皮細胞や気道上皮細胞までの分化を検討し、効率的な分化誘導を基底膜を用いて検討する。また、iPS細胞から誘導した肺上皮細胞とヒト初代細胞間で、大気汚染物質(PM2.5を予定)による曝露影響を比較し、それぞれの反応性を調べる。
常磁性不安定化学種の構造ならびに生成と反応の動力学に関する研究

1.高時間分解ESR法による常磁性化学種の生成・反応動力学:時間分解ESR測定装置が各所で稼働するようになり、とくに光化学過程の研究に広く応用され、常磁性化学種間のスピン分極保持T-Tエネルギ-移動やCIDEP法による過渡的生成ラジカル対の直接観測は顕著な成果である。励起三重項状態の研究に不可欠の手段となり、含窒素芳香族化合物やカルボニル化合物の生成と減衰が広く研究された。光励起プロトン移動や水素移動、結合開裂の機構研究により、多数の成果を得た。2.常磁性励起分子の電子状態と緩和:時間分解ESR法と発光スペクトル、ODMR法を組み合わせ、とくにスピン副準位に関連した議論を含めたT_1状態の反応が数多く研究された。芳香族ニトロ化合物、含窒素芳香族化合物、オルトキノン類、カルボニル化合物が対象となった。さらに有機ラジカル結晶の電子スピン状態と磁性の研究がよい成果を得た。3.凝縮相捕捉不安定常磁性種の構造と反応:飽和炭化水素カチオンラジカルの電子状態、分子運動の研究、蛍光検出ESR法の新導入、強磁性高分子に焦点を合わせたスピン整列機構の研究や、包接されたラジカルの研究等に関して顕著な成果が得られた。4.錯体・有機金属常磁性種の構造と反応:多核錯体についてレニウム錐体の電子構造、コバルトクラスタ-錯体の金属原子置換による酸化還元電位の依存性、銅錯対のENDOR法による研究、シリル、ゲルミルラジカルの構造や錯体の光化学反応等の成果が得られた。5.生体関連常磁性種の生成、構造および反応:生体系における活性酸素のスピントラップ法の研究、脂質二分子膜輸送系のスピン標識キャリヤを用いた研究、UV照射水晶体タンパク質中の短寿命フリ-ラジカルの研究などで大きな進歩があった。1.高時間分解ESR法による常磁性化学種の生成・反応動力学:時間分解ESRシステムとしてパルスESR装置の積極的導入が計画されており,一方高速エンドール測定法が実験結果を生みだして,ESR高速測定への試みが順調に進んでいる.化学データとして励起三重項状態,フリーラジカルのCIDEPスペクトル,Kinetic ESR法のデータが数多く生みだされ,短寿命三重項,光励起の光物理と光化学,短寿命ラジカルに関する総合討論をふまえて,最先端の研究が進められている.2.常磁性励起分子の電子状態と緩和:この課題は,上述の時間分解ESR法の導入で分担領を越えて討論され,方法論として定着しつつある.一方素材化学の進歩に次元性結晶の常磁性研究が重要な役割を果すと期待され,伝導電子スピンの拡散と緩和の研究が進められ,成果を得ている.3.凝縮相補捉不安定常磁性種の構造と反応:中性ラジカル,シクロヘキサンアルキル誘導体力チオンラジカルなどを対象としたESR法による研究で多くの成果を得ている.メチルベンゼン水素付加体の構造研究のように,不安定化学種の研究はますます深みを帯びてくるであろう.4.錯体・有機金属常磁性種の構造と反応:高速掃引エンドール測定のシステムを完成して銅錯体を測定し,この方法がエンドールスペクトルの解析に有用であることを示した.ESR法によるジアルキル水銀カチオンなどの構造研究が成果を挙げ,全体として,有機遷移金属化合物の研究にESR法がどのように寄与できるかという討論は,今後のこの分野の実績に結びついてくるであろう.5.生体関連常磁性種の生成・構造および反応:モデル系としてミセル中のラジカル関与反応に対する磁場効果,スピントラップ法など理学的な成果を得ている.

1.高時間分解ESR法による常磁性化学種の生成・反応動力学:ピリジニルラジカルニ量体の光開裂過程の時間分解ESR、ラジカル対の時間分解ESR、不安定中間体解明へのCIDNP、CIDEPの応用、分子内暖和におけるスピン分極の反転等を課題とする研究が精力的に進められており、とくに非リン光性励起三重項状態の研究に時間分解ES法が不可欠の実験手段になってきた。装置面では200nsが一応の限度とされる現在の普及型を越える試みがなされており、パルスESR装置の普及が、実用面でとくに期待されている。2.常磁性励起分子の電子状態と緩和:芳香族ニトロ化学物や、ヘテロ芳香族化合物の励起状態の研究がリン光測定、ODMR、時間分解ESR法等の手段を用いて進められ、多くの論文が公表された。スピン副準位の状態に関する議論がとくに積極的に行われた。3.凝縮相捕捉不安定常磁性の構造と反応:高分子ラジカルのESE(電子スピンエコー)研究、ジメチルエーテルラジカルカチオンのメチル基の回転、高スピン有機分子のENDOR等を課題とし、凝縮相中に生成する具体的な常磁性化学種の構造と動的挙動をいろいろな実験法を採用して進めている。4.錯体・有機金属常磁性種の構造と反応:モリブデン、タングステン錯体の光反応によって生成するラジカルとキノン類との反応、ケイ素やゲルマニウム化合物から生ずるラジカルの構造化学、銅(II)錯体のENDORなど、磁気共鳴法の適用が盛んになっており、新しい分野が拓けつつある。5.生体関連常磁性種の生成・構造および反応:眠の水晶体タンパクに対する紫外線照射により生じるラジカルやモデル生体膜の遷移金属イオン輸送過程の研究などで成果を得、活発に討論された。1.高時間分解ESR法による常磁性化学種の生成・反応動力学:時間分解ESR法が光反応過程と勃起三重種項状態の研究に常套手段として用いられるようになり、研究対象が広がってトリメチレンメタン生成系、ポルフイリンとキノンとの電子移動反応、アルキルコバロキシムの光化学初期過程、塩化ベンジル類の光分解機構、ピリジン誘導体の光化学反応などの新しい成果が得られた。パルスESR法利用への期待は残されたが、時間分解ESR法による成果は確実は地盤をつくった。2.常磁性勃起分子の電子状態と緩和:芳香族カルボニル化合物やアザベンゼン類の勃起三重項状態が種々の実験結果をもとに、nπ^*とππ^*の混合の問題を中心に議論され、その解釈はほぼ完結した。三重項副準位のスピン分極、スピン分極保持T-Tエネルギ-移動は、勃起状態反応動力学として多くの例が示された。一方分子集合体の電子スピン状態との関連で、有機ラジカル結晶の磁性に関する研究が進展をみせた。3.凝縮相捕促不安定常磁性種の構造と反応:飽和炭化水素カチオンラジカルの電子状態や分子運動に関する研究、イオン対のダイナミックス有機強磁性体モデル分子の電子構造、ENDOR法ハバ-ドハミルトンアンに理論計算を用いたスピン整列機構の新しい解釈が成功している。4.錯体、有機金属常磁性種の構造と反応:銅(II)錯体など常磁性金属錯体を対象にしたENDOR法やラピッドスキャンENDOR法による錯体構造の研究やESEEM法など新しい方法を取り入れた研究成果が出ている。生体内遷移金属の挙動を意識した基礎研究は地道につついている。5.生体関連常磁性の生成、構造および反応:生体系活性酸素ラジカルのスピントラッフ法、紫外線白内障の成因となるフリ-
口腔領域腫瘍の形成・増殖における基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割

前年度において、基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカン・パールカンのスプライシング亜型を各種口腔腫瘍由来培養細胞株から二つのスプライシング亜型を見い出し、培養細胞株間におけるその発現傾向を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)およびRNase protection assayにて明らかにした。本年度は、さらにマウスにおいて上記exon 6'に相当する配列をもつスプライシング亜型を同定した。マウス全身臓器を用いたRT-PCRによる検索では、全ての臓器に発現が認められたが、心臓、胃、小腸、大腸、筋肉、子宮、舌のような筋組織が発達した臓器に高発現し、これら臓器では週齢とともに発現の亢進が認められた。また、これらのスプライシング部位の合成ペプチドもしくは大腸菌組み換え蛋白質でウサギポリクローナル抗体を作製し、マウス各種臓器のパラフィン切片、凍結切片にて免疫染色を行ったところ、第一のスプライシング亜型では、主に基底膜に認められる野生型とは異なり毛細血管に特異的な染色パタンが認められた。以上の結果から、ヒトでもexon6'をもつパールカン・スプライシング亜型が同部位に局在するものと考えられ、このスプライシング亜型が野生型と同様に様々な組織に存在し、毛細血管において野生型パールカンとは異なる生理的機能を果たしていることが示唆された。口腔領域腫瘍における基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカン・パールカンの機能を解明するために、これまでに樹立した各種口腔腫瘍由来培養細胞株からRNAを抽出し、パールカンの各ドメイン構造に特異的な約30種類のプライマーで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)をもちいて遺伝子発現型を解析し、スプライシング亞型を同定した。その結果、第一および第二ドメイン間に通常のパールカンには認められない、新たに挿入(splice-in)される新規エクソン(exon 6'と名づけた)をみいだした。exon 6'は51塩基の長さを持ち、推定アミノ酸配列は五つのプロリンが連続する特異な配列であった。また、培養細胞のゲノム塩基配列を解析したところ、exon 6'はパールカンの6番目イントロン下流に連続して存在し、イントロン・エクソン境界部位に保存配列が存在することが判明した。つぎに、exon 6'を有する亞型の発現を各種細胞間で比較すると、上皮系より間葉系細胞に34倍高発現していた。さらに、第四ドメインにおいて、exon 73 (205 bp)が欠失(splice-out)されている亞型を同定した。この欠失によって下流部位(exon 75)に停止コドンが導入される。この亞型はdyssegmental dysplasia等の疾患で報告されているものと同一で、上皮系培養細胞にやや高発現の傾向をしめした。現在、上記スプライシング部位の合成ペプチドでモノクローナル及び、ポリクロナル抗体を作製中であるが、来年度は抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチド導入法による同部位の機能検索を実施して、口腔腫瘍病変の発育進展におけるパールカン遺伝子表現亞型の役割を明らかにしたい。
酵母細胞壁変異株に関する研究

酵母は栄養学的には良質の蛋白質を含み,又グリコーゲン,各種ビタミン等多くの栄養素を含んでいる点で飼料及び食糧用として適したSingle Cell Proteinの材料といえる.酵母を飼料化あるいは食糧化する際の問題点は,強固な細胞壁の存在による消化効率の低さがあげられる.この問題を解決する手段として筆者らは細胞壁が物理的,化学的に弱い変異株をつくり出すことを考え,以下の結果を得た.1.酵母細胞壁変異株の取得パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)X2180-1A半数体野生株を親株として化学変異剤,ニトロリグアニジン処理により,上記目的に合った細胞壁変異株を得ることに成功した.この変異株は酵母細胞壁溶解酵素, Zymolyaseに対して強い感受性を示した.特にN3株, N3-8株, N3-24株の3株は菌の生育の各時期を通じて常に細胞壁溶解酵素に対する感受性が著しく強く,目的に沿った株といえる.2.酵母細胞壁変異株の諸性質得られた変異株細胞より蛋白質を2M, NaCl, 1%TriTouX-100, 1M, NaOH, 1M, NaOH, 1M, CH_3COOHにより段階的に抽出し,それぞれの画分の蛋白含量を比較したところ,最も緩和な条件である2M, NaCl抽出画分においてN3株は野生株の1.7倍, N3-8株は31倍, N3-24株は5.8倍という結果を得た.このような細胞内蛋白質の抽出量の著しい増加は当初目的としてあげた飼料化,食糧化という点で,より好ましい材料を提供するものと思われる.3.変異株細胞壁の科学的性質変異株細胞は表層に存在するmannanの側鎖欠損株であると同時に,細胞壁骨格多糖B-glucanの1, 3-結合, 1, 6-結合の割合が大きく変化していることが明らかにされた.酵母は栄養学的には良質の蛋白質を含み,又グリコーゲン,各種ビタミン等多くの栄養素を含んでいる点で飼料及び食糧用として適したSingle Cell Proteinの材料といえる.酵母を飼料化あるいは食糧化する際の問題点は,強固な細胞壁の存在による消化効率の低さがあげられる.この問題を解決する手段として筆者らは細胞壁が物理的,化学的に弱い変異株をつくり出すことを考え,以下の結果を得た.1.酵母細胞壁変異株の取得パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)X2180-1A半数体野生株を親株として化学変異剤,ニトロリグアニジン処理により,上記目的に合った細胞壁変異株を得ることに成功した.この変異株は酵母細胞壁溶解酵素, Zymolyaseに対して強い感受性を示した.特にN3株, N3-8株, N3-24株の3株は菌の生育の各時期を通じて常に細胞壁溶解酵素に対する感受性が著しく強く,目的に沿った株といえる.2.酵母細胞壁変異株の諸性質得られた変異株細胞より蛋白質を2M, NaCl, 1%TriTouX-100, 1M, NaOH, 1M, NaOH, 1M, CH_3COOHにより段階的に抽出し,それぞれの画分の蛋白含量を比較したところ,最も緩和な条件である2M, NaCl抽出画分においてN3株は野生株の1.7倍, N3-8株は31倍, N3-24株は5.8倍という結果を得た.このような細胞内蛋白質の抽出量の著しい増加は当初目的としてあげた飼料化,食糧化という点で,より好ましい材料を提供するものと思われる.3.変異株細胞壁の科学的性質変異株細胞は表層に存在するmannanの側鎖欠損株であると同時に,細胞壁骨格多糖B-glucanの1, 3-結合, 1, 6-結合の割合が大きく変化していることが明らかにされた.酵母は栄養学的には良質の蛋白質を含み、又グリコーゲン、各種ビタミン等多くの栄養素を含んでいる点で飼料及び食料用として適したSingleCell Proteinの材料といえる。酵母を飼料化あるいは食料化する際の問題点は、強固な細胞壁による消化効率の低さがあげられる。この問題を解決する一手段として細胞壁が物理的・化学的に弱い変異株を作ることが考えられる。本研究において当初の研究計画にあげた酵母細胞壁変異株の取得については計画どおりSaccharomyces cerevisiae X2180野生株より有望な変異株3株を単離することに成功した。1.酵母細胞壁変異株の単離酵母Saccharomyces cerevisiae X2180-1A半数体野生株及びCandidautilis ATCC-9226株を親株としてニトロソグアニジン処理により変異株を得た。細胞壁変異株の選別は酵母細胞壁溶解酵素2ymolyaseによる感受性の差を利用し、野生株に比して著しい感受性を示す株、N3,N3-8,及びN3-24の3株をS.cerevisiaeにより取得した。またC.utilisにも同様の処理を行ったが、現在有望株は得られない。2.酵母細胞壁変異株の性質の検討及び細胞からの蛋白質の抽出得られた変異株細胞より蛋白質を2MNaCl,1%Triton,1MNaOH,1M【CH_3】COOHにより段階的に抽出し、それぞれの画分の蛋白含量を比較したところ、2MNaCl抽出画分では野生株の抽出量を1とした時、N3株は1.7,N3-8は3.1,N3-24株は5.8という結果を示した。

同様に他の抽出溶剤においても、変異株からの抽出蛋白量が野生株からの抽出量の2倍から3倍という結果が得られた。このような細胞内蛋白質の抽出量の著しい増加は当初目的としてあげた酵母の飼料化、食糧化という点ではより好ましい材料を提供するものと考えられる。
分泌型ｍｉｃｒｏＲＮＡによる運動器疾患への治療戦略

分泌型microRNA(miRNA)を尿中から抽出し、変形性関節症といった運動器疾患の診断マーカーとなり得るかどうか検討した。健常人3名、初期変形性関節症患者(OA)6名、末期OA患者6名から、尿を採取した。超遠心法によって、尿中に含まれているベジクルを分離し、ベジクル量とmiRNAマイクロアレイによりOAにおいて特異的に変動するmiRNAの同定を試みた。ベジクル量は、末期OAで尿中に多く含まれていた。尿中に含まれるmiRNA-16, 24, 25, let-7bの発現を解析したところ、これらは初期で発現が高値であった。尿中miRNAは、OAの新たな診断マーカーとなる可能性がある。目的近年、約22塩基程度のnon-coding RNAであるmicroRNAが、様々な疾患に関与していることが明らかとなり注目されている。また、RNAであるにもかかわらずmicroRNAは体液中にも循環しており、細胞間、組織間の情報伝達等に重要な役割を担っているといわれている。分泌されたmicroRNAはがん等の疾患における診断マーカーとして有用であることが報告されている。本研究では、この分泌型microRNAを血清・尿中から抽出し、その機能を解析し、さらに、筋損傷・骨折・関節疾患といった運動器疾患モデルに投与することで、低侵襲で新しい運動器疾患の治療戦略に発展させることを目指す。方法健常人、変形性関節症患者、関節リウマチ患者から、尿を採取し、microRNAマイクロアレイを行い、網羅的解析を行うことで、変形性関節症、関節リウマチにおいて特異的に変動するmicroRNAの同定を試みた。結果健常人と比較し、変形性関節症患者、関節リウマチ患者において特異的に変動するmicroRNAをいくつか同定した。考察変形性関節症患者、関節リウマチ患者において特異的に変動するmicroRNAは、これまで報告されてきたものは少なく、その機能を今後解析していく必要がある。機能解析後、血管新生促進作用、分化促進作用、抗炎症作用等が確認されれば、これらに適した動物モデルに対して、尿中から抽出したこれらを多く含むmicroRNAを投与し、治療効果を検討していく予定である。目的近年、約22塩基程度のnon-coding RNAであるmicroRNA(miRNA)が、様々な疾患に関与していることが明らかとなっている。また、RNAであるにもかかわらずmiRNAは体液中にも循環しており、細胞間、組織間の情報伝達等に重要な役割を担っているといわれている。分泌されたmiRNAはがん等の疾患における診断マーカーとして有用であることが報告されている。方法健常人、変形性関節症患者(OA)患者から、尿を採取し、miRNAマイクロアレイを行い、網羅的解析を行うことで、変形性関節症において特異的に変動するmiRNAの同定を試みた。さらに、OAの重症度で、尿中のmiRNAの発現が変動するか検討した。結果健常人と比較し、変形性関節症患者において56種類のmiRNAが2倍以上発現が高くなっていた。これらの中で、発現が特異的と思われるmiRNA-16, 24, 25, let-7bについて、健常者、OA初期、OA末期患者の尿中での発現をreal time PCRにて解析した。これらのmiRNAは、OAの初期では、尿中の発現は高く、OAが進行するにつれて発現が低下していた。考察変形性関節症患者、関節リウマチ患者において、体液中に存在するmiRNAについて、これまで報告されてきたものは少なく、本研究では、尿中のmiRNAが重症度などの診断マーカーになる可能性が示唆された。今回解析した4つのmiRNAは、細胞増殖、筋分化などに関与していることが報告されており、尿中から抽出したこれらを多く含むmiRNAを投与し、治療効果が得られる可能性もある。方法健常人、変形性関節症患者(OA)、関節リウマチ患者から、尿を採取し、microRNA

マイクロアレイを行い、網羅的解析を行うことで、変形性関節症、関節リウマチにおいて特異的に変動するmicroRNAの同定を試みた。さらに、OAの重症度で、尿中のmiRNAの発現が変動するか検討した。結果健常人と比較し、変形性関節症患者、関節リウマチ患者において特異的に変動するmicroRNAをいくつか同定した。これらのmiRNAは、OAの初期では、尿中の発現は高く、OAが進行するにつれて発現が低下していた。考察変形性関節症患者、関節リウマチ患者において、体液中に存在するmicroRNAについて、これまで報告されてきたものは少なく、その機能を今後解析していく必要がある。機能解析後、血管新生促進作用、分化促進作用、抗炎症作用等が確認されれば、これらに適した動物モデルに対して、尿中から抽出したこれらを多く含むmicroRNAを投与し、治療効果を検討していく予定である。初年度の予定は、尿・血清から分泌型microRNAを抽出し、マイクロアレイを行うことで網羅的に解析を行うというものであったが、現在、尿中の分泌型microRNAのマイクロアレイは終了している。さらに、多くのサンプルの解析を行う必要があり、現在サンプル数を増やしている。25年度が最終年度であるため、記入しない。さらに、サンプルを集め、尿中の分泌型microRNAの発現パターンの解析が進んでいる。しかし、分泌microRNAの機能解析が当初の予定より遅れている。変形性関節症、関節リウマチ患者のサンプル数が増えれば、マイクロアレイの結果を用いて、これらmicroRNAの発現解析を行う。さらに、これらの分泌型microRNAの細胞増殖、分化に対する効果を検討・解析する。マイクロアレイの結果から同定された分泌型microRNAの細胞増殖、分化に対する効果など、機能解析を進めていく。
アドルノの音楽哲学研究

当該研究課題について筆者は2年間の科学研究費を得た。この間、平成4年度にはアドルノの『否定的弁証法』と『美学理論』との関係を中心に北海道哲学会会報に新たな論文を執筆し(「アドルノ思想における哲学と芸術」)、10月にはアメリカの国際民族音楽学会で、アドルノ理論と民族音楽学の接点についての発表を行った(CriticalTheory and fieldwork:Adorno's theory and Ethnomusicology)。平成5年3月にはイギリスの音楽分析学会でアドルノ理論にもとづく音楽時間論に関連するテーマについて発表を行った(Analysis in social meaning in music:Time structure of instrumental music as a way of recognition of the world)。平成5年12月には日本音楽学会・東洋音楽学会合同例会で「アドルノ理論と民族音楽学」と題する発表を行った。最後にまとめた研究成果報告書には、さらに「ヴァーグナー論における一つの流れ」と題する論文を新たに書いた。この研究成果報告書をもとに本年度もしくは来年度に研究書を仕上げて出版したいと考えているが、昨年アドルノの残したベートーヴェンに関する断片集が出版されたこともあり、出版までにはまだ課題が残っている。それは、後期ベートーヴェンに関するアドルノの理論を展開し論文を書くこと、アドルノと音楽との関わりを日本の読者にわかりやすくまとめ序論とすること、アドルノの初期の理論について論文を書くこと、などである。今後フランクフルト学派の〈批判理論〉の問題意識が現代の世界化の音楽状況の中でどのように生かされるか、ということについてさらに研究を重ねて行きたい。具体的には、第一にアドルノ、ベンヤミン、ハバーマスなどの芸術論を批判的に検討し、現代資本主義都市社会における芸術状況と人間の知覚行動についての研究を進めること、第二に、とくに非西欧世界の近代化・都市化・資本主義化に伴う音楽行動と音楽の意味の変化を、アドルノやベンヤミンの理論と民族音楽学や文化人類学の理論との双方の観点から捉えることである。以上の研究活動から次の成果が得られた。1.『美学理論』と『否定的弁証法』とを平行して読解することによりアドルノ思想における哲学と芸術との関係を明らかにした。2.SEMの発表は予想以上の反響を呼び、ドイツのフランクフルト学派の批判理論と民族音楽研究を結びつけようという筆者の意図は大いに注目された。従来非西欧社会を研究の主たる対象としてきた民族音楽研究は今日の国際化、都市化の中で、現代都市社会の音楽状況の呈する多くの問題に直面しており、アドルノの音楽理論はこの問題の研究に多くのインパクトを与えうることがわかった。3.イギリスの学会では、人間と自然との関係性が器楽の時間構造に読み取れる、というアドルノの命題を中心に、その比較文化的展開の可能性についての発表を行う。この内容は直後に論文として発表される予定である。以上、報告者としては来年度の研究の継続を大変楽しみにしている。当該研究課題について報告者は2年間の科学研究費を得た。平成4年度はアドルノの「否定的弁証法」と「美学理論」との関係を中心に新たな論文を執筆し、10月にはアメリカの国際民族音楽学会で、アドルノ理論と民族音楽学の接点についての発表を行った。また平成5年3月にはイギリスの音楽分析学会でアドルノ理論にもとづく音楽時間論に関連するテーマについて発表を行った。平成5年度のこの研究に関わる実績としては、第一に日本音楽学会・東洋音楽学会合同例会で「アドルノ理論と民族音楽学」と題する発表を行ったこと、第二に研究成果を書物にまとめるための素地を作ったことがあげられる。

この成果は別途報告書として提出する予定である。報告書をもとに本年度もしくは来年度に研究書を仕上げて出版したいと考えているが、昨年アドルノの残したベートーヴェンに関する断片集が出版されたこともあり、出版までにはまだ課題が残っている。それは、後期ベートーヴェンに関するアドルノの理論を展開し論文を書くこと、アドルノと音楽との関わりを日本の読者にわかりやすくまとめ序論とすること、アドルノの初期の理論について論文を書くこと、などである。今後はフランクフルト学派の<批判理論>の問題意識が現代の世界化の音楽状況の中でどのように生かされるか、ということについてさらに研究を重ねて行きたい。具体的には、第一にアドルノ、ベンヤミン、ハバーマスなどの芸術論を批判的に検討し、現代資本主義都市社会における芸術状況と人間の知覚行動についての研究を進めること、第二に、とくに非西欧世界の近代化・都市化・資本主義化に伴う音楽行動と音楽の意味の変化を、アドルノやベンヤミンの理論と民族音楽学や文化人類学の理論との双方の観点から捉えることである。大学の研究費ではとても足りないので、さらなる科学研究費の交付を望んでいる。
骨芽細胞分化制御におけるmicroRNAの関与とその応用

本研究において、骨芽細胞をBMP-2刺激することで9種類のmicroRNA(以下miRNA)の発現が変動することを突き止めた。それらのうち、miRNA-141/-200aがDlx5を、miRNA-208がEts1を、miRNA-370がBMP-2およびEts1をそれぞれ標的遺伝子としていることを明らかにした。以上のことから骨芽細胞の分化にはmiRNAが密接に関与していることが示唆された。近年microRNAやsiRNAなどの低分子の機能性RNAが遺伝子発現を制御し、様々な生理現象、疾患発症に関与することが明らかになっている。我々も骨形成を担っている骨芽細胞分化にmicroRNAが深く関与していることをarray解析により見出た。本年度は、microRNA-141-200aが骨分化において作用する転写因子Dlx5を標的としていることを以下に示した方法により検証した。【検証事項】(1)変動microRNAsのPrecursorまたにAntisense Inhibitorを導入することによる分化への影響(2)標的遺伝子の同定明らかにした。(3)初代培養細胞による実証検証された事項について初代培養系でも確認できるか検証した。以上の手法から、microRNA-141/-200aが骨芽細胞分化に関わる転写因子の1つであるDlx5を標的としていることを実証し、J. Bilo. Chem. (284,19272-19279(2009))に報告した。さらに、現在、microRNA-208が骨芽細胞分化にかかわる転写因子であるEtslを標的にしていることが明らかとなり、最終の確認作業を行っている。加えて、バイオインフォマティクスデータ解析により、microRNA-192,-370がIGF-IとATF1,BMP-2とEts1をそれぞれ標すとしていることが推測されたことから、次年度、これらmicroRNAの標的遺伝子の同定を進め、microRNAによる分化調節メカニズムの解明を行う。現在、3年間の計画のうち2年が経過したが、昨年度miR-141/-200aがDlx5を標的としていることを明らかにし、J.Biol.Chem.への報告(284(29),19272-19279(2009))、特許申請を行った。本年度も引き続き、アレイ解析で変動したmicroRNAの標的遺伝子について検討をを行った。その結果、BMP-2刺激することで変動した9種類のmicroRNAうちの一つであるmiR-208が骨分化に関与する転写因子Ets1を標的遺伝子としていることを明らかにした。以下、結果について示す。BMP-2刺激後、miR-208は分化に伴い発現を低下させた。そこで、miR-208のPrecursorを遺伝子にリポフェクション法により導入し、分化指標であるアルカリフォスファターゼ(以下ALPと省略)活性を検討したところ、有意にALPの活性が低下した。この結果、miR-208の発現低下が分化に関与していることがアレイ解析の結果を含め明らかとなったことから、Sangar miRbaseおよびTargetScan5.1などのバイオインフォマティックス解析を行った。解析の結果、標的遺伝子として、V-ets Erythroblastosis Virus E26 Oncogene Homolog 1(Ets1)が候補とあがった。その後、miR-208を導入した細胞では、Ets1のmRNA発現は変化しないが、タンパク発現は低下することが解り、mRNAの分解を伴わないタンパク発現制御がmiR-208によって行われていることが明らかとなった。また、標的遺伝子であるEts1の非翻訳領域にあるmiR-208の結合領域を組み込んだセンサーベクターを用いたルシフェラーゼアッセイの結果から、発光レベルが有意に低下したことから、miR-208がEts1を標的遺伝子としていることを同定した。本研究結果については、J.Biol.Chem.へ報告(285(36),27745-27752(2010))した。現在、さらにmiR-370,294,328がバイオインフォマティックス解析を行い、標的遺伝子候補をあげている。今後、これらについても標的遺伝子を明らかにし、miRNAによる骨芽細胞分化制御機構をさらに明らかにしていく予定である。前年度までの2年間でmiR-141/-200aがDlx5を、miR-208がEts1をそれぞれ標的遺伝子としていることを明らかにし、J.Biol.Chem.への報告(284(29),19272-19279(2009), 285(36), 27745-27752(2010))、特許出願を行った。本年度は、3年間の研究計画のうちの最終年にあたり、引き続きmiRNAアレイ解析で変動したmicroRNAの標的遺伝子の同定作業とともに今後の発展性、解明事項の確認を行なった。

その結果、BMP-2刺激することで変動した9種類のmicroRNAうちの一つであるmiR-370が強力な骨分化誘導因子であるBMP-2と骨分化に関与する転写因子Ets1のそれぞれを標的遺伝子としていることを明らかにした。以下、結果について示す。miR-370はBMP-2刺激24時間後まで発現が低下し、72時間後にはBMP-2刺激前の発現量に戻った。本現象から、標的とする遺伝子は、骨分化早期に関わる遺伝子であることが推測された。また、miR-370のPrecursorをリポフェクション法により導入し、骨分化指標であるアルカリフォスファターゼ(以下ALPと省略)活性を検討したところ、有意にALPの活性が低下した。以上の結果から、miR-370の発現低下が骨分化に関与していることが示唆された。そこで次に、miR-370の標的遺伝子を明らかにするため、Sangar miRbaseおよびTargetScan5.1を用いたin silico解析を行った。解析の結果、標的遺伝子として、BMP-2とEts1が候補とあがった。miR-208を導入した細胞では、BMP-2およびEts1のmRNA発現は変化しないが、タンパク発現は低下することが解り、mRNAの分解を伴わないタンパク発現制御がmiR-370によって行われていることが明らかとなった。さらに、標的遺伝子であるBMP-2およびEts1の非翻訳領域に存在するmiR-370の結合領域を組み込んだセンサーベクターを用いたルシフェラーゼアッセイを行なった結果、発光レベルが有意に低下したことから、BMP-2およびEts1がmiR-370の標的遺伝子としていることを同定した。本研究結果については、FEBS Letters.へ現在投稿中である。現在、さらにmiR-30b,294,328の標的遺伝子の候補を絞り、同定と標的分子による骨分化制御メカニズムについて検討中である。
新モデル植物ミズワラビにおける植物ホルモンによる細胞伸長制御機構の解析

本年度は、ミズワラビにおいて細胞の伸長方向制御が狂った突然変異体の単離を進めるとともに、突然変異体が単離できた際に植物ホルモンによる伸長制御が実際に異常になっていることを検定するために必要な、ミズワラビ配偶体の伸長に対する植物ホルモンの効果を検討した。まず、実験系を確立するため、配偶体の伸長様式と、伸長に対する植物ホルモンの効果を解析した。暗所で生長した配偶体は、先端部に頂端分裂組織と思われる細かい細胞、基部に徒長した細長い細胞を持っていた。細胞の伸長は、おのおのの細胞列において先端部と基部の中間の2-3個の細胞で起こることがわかった。表層微小管の配向は、伸長域では生長軸に直角、それより基部では生長軸に斜めか平行であった。生長に対する様々な植物ホルモンの効果を調べたところ、ジベレリン以外のホルモンは、従来茎や幼葉鞘で知られている効果と非常に似た効果を示した。外から与えたジベレリンは伸長に効果がなかったが、ジベレリン合成阻害剤ウニコナゾールは配偶体の伸長を抑制した。アブシジン酸による伸長抑制時の微小管の配向を調べたが、伸長域の微小管配向に顕著な変化はなかった。一方で、細胞の伸長方向制御が狂った突然変異体の単離を試みた。当初計画のアブシジン酸による伸長抑制が異常になった配偶体をスクリーニングする方法は失敗したので、ホルモン処理を使わずに35度の高温下で細胞が膨潤する配偶体を選び、培養した。6.5x10^5個の胞子から87個体の配偶体を選択した。多くの個体はうまく育たなかったが、生き残った突然変異体候補の系統を現在解析している。
DNA 5'末端結合蛋白質を指標とするファージ頭殻中のゲノム形態の解析

本研究は、バクテリオファージ頭殻中に取り込まれたDNAがどのように配位されているかを明らかにすることを目的とした。用いられた材料は、枯草菌ファージφ29およびM2であり、それぞれ約19kb、18kbの直鎖状二本鎖DNAをもっている。DNAの5'末端に約30kのタンパク質(TP, 266個のアミノ酸)を(232セリンのOH基と)共有結合したタンパク質・DNA複合体ゲノムを構成しファージ頭殻中に包み込まれている。TPは、タンパク質間の認識結合モチーフの一つであるRGD配列とRGD結合配列(KKIPPDD)を持っている。また、同一タンパク質中にRGDおよびRGD結合配列を持つ極めてユニークなタンパク質である。本研究は、ビオチン化RGDペプチドをプローブとして、ファージ頭殻中のDNAの両末端がどのように配位しているかを検討したものである。野生型φ29の及びM2ファージをカーボンコートした電顕メッシュグリッド表面に吸着乾燥後ビオチン化RGD溶液と反応させ、洗浄後、ストレプトアビン金粒子(直径20nm)を結合させることによりファージ中のDNAの両末端の位置を視覚化した。電顕像としてファージの頭殻と尾部の接続部にあるカラー構造に金粒子が結合した像が得られた。多くの電顕像は一つの金粒子のみが結合していたが、まれにカラー構造の二つの金粒子が検出された。この結果は、φ29・M2のDNA両末端はファージ頭殻と尾部接続部に位置するという仮説を指示すると考えられる。
自律無人飛行体を用いた遭難者救助支援システムの研究・開発

本課題では山岳や海上における遭難事故を想定し、遭難者を迅速に発見することで捜索救助を支援する自律無人飛行体の実用化に向け、試験機としてのテストベットシステムの開発および最良の捜索飛行を実現する誘導・航法・制御について研究・開発を行った。スマートフォンやタブレット等の移動型無線情報端末から発せられる電波は発信源を中心とする球面上に等電界面を形成する。こうした条件から端末の存在が識別できる閾値以上の等電界面群で構成される捜索域を最短時間でカバーする飛行体の航法として、地形に適応する最小高度飛行誘導法を開発し、飛行試験に適用した。本課題に関連し、当該年度は次の項目を研究・開発した。1)訓練機の導入と飛行訓練:本課題で想定している実用機と同じ機体型式を有するマルチコプター(multicopter)訓練機を導入し、室内・外で飛行訓練を行った。2)自律無人飛行体プラットフォームの導入:本課題で実用機として使われる自律無人飛行体のプラットフォームを2機導入し、現在任務遂行のために必要な改造を行っている。導入したプラットフォームのうち、1機はカメラを基本装備として搭載している小型のクワットコプター(quadcopter)で、他の1機は2kgまでのペイロードが搭載可能な中型のヘキサコプター(hexacopter)である。これらのプラットフォームは、何れも改造を経て山岳や海上の実験現場に投入される予定である。3)電波測位装置の開発: GPS測位と非GPS測位の両機能を兼ね備えた装置の開発に向け、フィジビリティ・スタディを行った。本スタディの結果に基づき、H27年度から電波測位装置の開発に本格的に乗り出す予定である。1)最短時間捜索飛行を実現する誘導・制御アルゴリズムの開発:風外乱中で目標位置までの最短時間移動を実現する飛行体の誘導航法を開発した。Pontryaginの最小原理に基づき、任意の非最適飛行の結果から最適飛行経路を導出する本手法は、変分法から求められる最適誘導則を用いており、GAや動的計画法等と比べはるかに短い計算時間で全域最適解を探索できる。2)低空飛行制御アルゴリズムの開発:地面や地上障害物との衝突を回避しながら、低空域で捜索飛行が行える低空飛行制御アルゴリズムを開発した。開発したアルゴリズムは飛行区域内の地形や地上障害物の情報をもとに、Gradient Descent Search (GDS)法を用い衝突を防止しながら定められた許容最小高度に最も近い高度で地上に接近する目標航路点(waypoint)を導出する。本研究課題の実施において当該年度はおおむね順調に進展したと自己評価している。各項目別の達成度は、1)最短時間捜索飛行を実現する誘導・制御アルゴリズムの開発: 90%2)低空飛行制御アルゴリズムの開発: 100%で、何れも当初計画していた目標をおおむね達成している。当該年度の研究・開発項目では何れも数値モデルの開発とそれを用いたシミュレーションが主たる実施内容となっており、項目2)においてはその成果を既に国際自動制御連盟(IFAC)主催の国際会議で発表した。また、項目1)と2)の成果は現在ともに国際学術雑誌への投稿に向け準備が進められている。本課題では山岳や海上遭難者を素早く発見することで人命救助活動を支援する自律無人飛行体の実用化に向け、試験機としてのテストベットシステムの開発および最良の捜索飛行を実現する誘導・航法・制御について研究・開発を行った。4枚の回転翼による制御で高い飛行安定性を有する2種類のクワドコプター(quadcoper)を導入し、ペイロード部に改造を加えることで試験機プラットフォームを構築した。スマートフォンやタブレットなど現在主流となっている移動型無線情報端末はギガヘルツ帯域の電波を用いていて、山岳地形に対する回折の影響は限定的である。従って任意の空中定点における電界強度は自由空間減衰に支配されることとなり、自由空間減衰ではあるソース(電波の発信源)から発せられる電波はそれを中心とする球面上に等電界面を形成する。こうした物理・環境条件から発信源の迅速な検知に向け最短時間で山岳の上空にある捜索域を全てカバーするには、地面との衝突が回避できる最小高度で飛行体を飛行させなければならない。本研究では地形情報と飛行体ダイナミクスをもとに、任意の高度制約条件を満たしながら最小高度で地面を追従できる飛行体の誘導法を開発した。最急降下法(steepest descent method)のアルゴリズムをベースとする本誘導法の適用で最適の航路点(waypoint)が導出されるが、この航路点を目標(reference)とし飛行体を誘導・制御することで上記の最小高度飛行が実現する。本研究では飛行シミュレーション数値計算モデルを開発し、シミュレーションから導出した最適解としての航路点を実際の飛行試験に適用した。飛行試験では地形に適応する安定した低空飛行が実現しており、開発した誘導法が実用飛行に対しても有効であることを実証した。