hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
曲げた光ファイバを用いる屈折率計測とそのバイオ・ケミカル・分光センサ化への挑戦

曲げた光ファイバを用いた光センシング手法の開発を目的に、基本性能評価とバイオケミカルセンサとしての応用および分光センサ開発への挑戦を行った。糖-塩水溶液を用いた試験の結果、分光計測で重要なランバートベールの法則に準じた情報取得ができていることがわかった。つぎに、経時的な反応を伴う複雑系かつ希薄糖-塩混合系である植物細胞培養系について、実用的な測定が可能なセンサ回路を作成したところ、バイオケミカルセンサとしての性能も担保できることがわかった。最後に、色素溶液を用いて分光スペクトル情報の取得可能性も示された。提案する曲げた光ファイバを用いる光センシング手法の応用可能性が示された。曲げたプラスチック製光ファイバを用いた物質界面、屈折率(物質変化モニタリング、バイオケミカルセンサへの展開)、分光スペクトル計測への挑戦を目指し、初年度である平成25年度においては、その再現性と基本性能試験を実施した。1.基本性能試験1ファイバの細工方法(曲げ方)、曲率(曲げたときの幅)および複数本のファイバを細工した際のファイバ両端での光の減衰を測定した。小型万力による非加熱での細工法がセンサ先端を再現性良く形成できることがわかった。また、曲げ幅を5mm、ファイバ両端と光源・分光器ファイバの接続部をアルミパイプで固定化することで安定した測定が可能であることがわかった。その他、電源投入後の光源と分光器の安定化条件なども加味することで安定した計測系が確立できた。2.基本性能試験2食品モデルとして、濃度の異なる糖-塩水溶液を用いた。スクロース00.5およびNaCl 04.0Mの水溶液を調製して光の減衰率と物質量(濃度、密度)との関係を調べた結果、光の減衰率の対数値は糖の質量百分率および溶質の質量百分率に比例する関係が得られた。物質に対する光の相互作用(吸収など)は、ランバートベールの法則に見られるように対数の関係で表わされる。光ファイバを曲げただけで作成できる本センサは、光計測の原理原則に則った測定が行えていることがわかり、新規光計測法開発に向けて次のステップへの重要な知見が得られた。電気電子回路を利用した簡易計測法への進展も見込めるようになった(来年度計画に追加)。3.ファイバ表面への物質固定化来年度本格試行のための予備実験として、交互累積膜法によるブロモチモールブルー(BTB)の固定化を試みた。固定化自体は成功したが、色素の色変化が見られなかった。来年度は、膜に馴染みやすい物質であるフェニルボロン酸(糖に反応する)他数種類の色素固定化を試みる予定である。曲げたプラスチック製光ファイバを用いた物質界面,屈折率(物質変化モニタリング,バイオケミカルセンサへの展開),分光スペクトル計測への挑戦を目指し,平成25年度においてはセンサ部の再現性と基本性能試験を実施した。小型万力による非加熱での細工,φ1.5mmのファイバ,曲げ幅57mm ,ファイバ固定法や光源と分光器の安定化条件などを加味し,スクロース00.5およびNaCl 04.0Mの水溶液について光の減衰率と物質量との関係を調べた。その結果,ランバートベール則に準じた情報が取得できた。平成26年度では,バイオケミカルセンサへの展開および分光情報取得への挑戦を試みた。植物細胞培養系(複雑系かつ初発糖濃度0.01M程度がさらに細胞に消費される時系列系)への展開により実用化への問題抽出・解決法を検討した。光の減衰が僅かな濃度域において,ファイバ2本(対照と試料)とフォトダイオードで微弱な光量差を検出し,オペアンプを用いて作動増幅する回路を試作した。培養液中の糖濃度変化が生物反応速度論に基づくロジスティック曲線で捉えられ,速度パラメータの算出が可能なバイオケミカルセンサが構築できた。食品・医薬品製造,排水処理などのバイオプロセス計測制御への応用が期待できる(日本食品工学会2015年次大会にて発表予定,論文執筆予定)。さらなるセンサの拡張を目指し,相互膜集積法によりファイバ曲部に環境応答物質(色素)の固定化を試みた。色素の状態変化を検出するために上記のような工夫が必要であり,それは保留・今後の課題とした。最後に,曲げたプラスチック製光ファイバを用いたスペクトル計測に挑戦した。メチレンブルー(青)とローダミンB(赤色+蛍光)の色素溶液について,その特徴を良く捉えたスペクトルが得られた。バイオケミカルセンサの拡張性とともに,スペクトル測定器としての応用可能性も示された。生物化学工学本申請課題の特徴は、通信用に用いられている安価な光ファイバを曲げるだけでバイオ・ケミカルセンサへの進展が可能な物質感知センサが作成できることにある。

しかし、簡単であるがゆえに、ファイバの曲げ方や光源・分光器への光の通し方(ファイバ接続部)、そもそも光計測法として妥当性がある測定結果が得られるかなどの不確定要素が多い。それが、平成23年度A-STEP探索タイプにて採択された課題の延長であるにもかかわらず、挑戦的萌芽としての課題申請に至った理由である。A-STEPでは、主に電気電子センサ回路の改良をメインに試験を行ったが、光計測法としての不確定要素の多さは解決されなかった。本年度の基本性能試験によって、光計測法として安定した測定が行えるようになった。これにより、曲げた光ファイバの光量変化と物質量との間に明確な対数プロットが成り立つことが確認できた。つまり、この研究課題で提案したセンサは、光計測の原理原則に則った測定が行われていることが示されたことから、挑戦的萌芽課題としての本研究の目的の半分は十分に達成できたと思われる。光計測法の原理原則に則った測定データが得られることで、A-STEPにて示した簡易型回路をさらに改良したセンサへの展開も可能であり、分光計測への挑戦も意味のあるものとなってくる。たとえば、実際の発酵プロセスにおいては低濃度の範囲での測定になるが、電子回路でわずかな光量変化を検出する際に光計測の原理原則に則っていなければノイズに埋もれてしまうことが考えられる。以上のように、本年度の研究成果そのものは基本性能試験(センサの加工、測定器の安定化と比較的高濃度の糖-塩水溶液での測定)とセンサ先端への物質固定化の予備実験におわっているが、本年度の結果は、次年度への挑戦および以前の電気電子回路開発の成果を生かすための大きな成果であると考える。光計測の原理原則に則った測定結果が得られることがわかったので、26年度は当初の計画通りバイオケミカルセンサへの展開と分光計測への挑戦を行う。1.バイオケミカルセンサへの展開[発酵モニタリング]基本性能試験では、スクロース濃度0.5M(約180 g/ L)、塩化ナトリウム濃度約4.0M(約230 g/L)の比較的高濃度の糖-塩水溶液を用いて試験を行った。今年度は、実際の発酵食品プロセスを想定し、植物細胞培養液(スクロース30 g/L、混合塩濃度4.6 g/L)およびその発酵中の培養液(徐々に糖-塩濃度が減少する)の物質変化のモニタリングを試みる。その際、性能試験で用いた光源・分光器以外にも、電気電子回路と光センサ(フォトダイオード)を用いた微量な光量変化の検出も試みる。[ケミカルセンサへの挑戦]上記電気電子回路を用いたセンサを流用し、光ファイバ曲部先端に色素などの物質を固定化し、環境変化をモニタリングするセンサを試作する。物質としては、BTB以外のpH応答性色素や糖に反応するフェニルボロン酸などを試験する。2.分光計測への挑戦と本課題の総括曲げた光ファイバを逆型ATR(全反射減衰法)のような形で用いることにより、スペクトル測定に挑戦する。これまでの基本性能試験の結果を見る限り、複数波長の光で減衰量を精度よく測定する必要があり、かつ可視光では波長が短すぎてスペクトル測定は難しいように思われる。長波長側(近近赤外:1000nm)かつファイバの細工(表面コーティング除去)などを行い、分光計測への挑戦を含めて本申請課題の総括を行いたい。
フラビウイルスの非構造蛋白質NS3のもつATPase依存性ヘリカーゼに関する研究

フラビウイルス及びHCVのRNAヘリカーゼはSF2スーバーファミリーのDExHサブファミリーに分類される。このようなウイルス特異的酵素の構造と機能を解析することは、フラビウイルスの複製・増殖機構を明らかにするだけでなく、抗ウイルス科学療法剤の探索・開発に重要な情報を提供する。そこで我々はJEVのRNAヘリカーゼ、特にモチーフIIの機能について詳細な検討を行った。昨年度の研究で、JEVのNS3蛋白質を大腸菌の蛋白発現系を応用して単離精製し、NTPase活性及びRNAヘリカーゼ活性についてその至適反応条件の検討を行った。また、JEVのアミノ酸モチーフII(DExH)の1番目(Asp)、2番目(Glu)及び3番目(Ala)のアミノ酸部位の役割について解析を行った。今年度は、JEV NS3蛋白質のもつRNA結合活性、ATPase活性及びRNAヘリカーゼ活性における同アミノ酸モチーフIIの4番目(His)部位の役割についてより詳細な検討を行った。昨年度までの研究でJEVのDEAHモチーフのAspとGluはATPase及びRNAヘリカーゼ活性に必須であるがRNA結合活性には関与せず、AlaはRNAヘリカーゼのみに必須であることが明らかとなった。また、今年度の研究で、His部位はRNAヘリカーゼ活性には必須な配列であるが、ATPase活性においては必須ではないが最適なアミノ酸であることが判明した。ほとんどの変異蛋白質においてRNA結合活性の減少が認められたが、消失まで至らなかったことからHis部位はRNA結合活性に何らかの形で関与するものの、必須でないことが明らかとなった。ATPase活性が維持され、尚且つRNA結合が示された変異蛋白質でRNAヘリカーゼ活性が消失したことから、RNAヘリカーゼ活性の消失はRNA結合またはATPase活性の消失によるものではないことが明らかとなり、このことから、これらの3つの活性機能はそれぞれ異なるアミノ酸またはモチーフによって制御されていることが示唆された。現在、PCR法を応用したリコンビナントウイルスの作成法を用いて、DEAHモチーフに各種アミノ酸変異を導入した変異ウイルスを作成し、in vitro培養系でのウイルスの複製・増殖への影響の検討を行っている。日本脳炎ウイルス(JaOH0566株)の非構造蛋白質NS3のC末端領域457アミノ酸をコードする遺伝子領域を蛋白発現ベクター(pET-21b)に組み込み、N末端領域163アミノ酸を欠失するNS3蛋白質(NS3JEV-wild)を大腸菌で発現し、精製した。NS3JEV-wildはnucleoside triphosphatase(NTPase)活性及びRNAヘリケース活性が認められた。それぞれの酵素活性について至適反応条件について検討を行った。両酵素活性とも2価のイオン(MgCl_2またはMnCl_2)が必要であり、1価のイオン(K^+)及び2価のCa^<2+>の添加は逆に両酵素活性を抑制した。至適pHは約pH6.5、至適反応温度は40°Cであった。Site-directed mutagenesis法によりアミノ酸モチーフII(DExH)に変異を導入した、種々の変異体蛋白を作成しDExH配列のもつ酵素活性における役割について解析を行った。DExHの3番目及び4番目のアミノ酸置換はNTPase活性において低下が認められたものの、他のアミノ酸への置換が可能であった。

1番目(アスパラギン酸)及び2番目(グルタミン酸)のアミノ酸をアラニンに置換した変異蛋白質では両酵素活性が完全に失活したことから、この1・2番目の配列が両酵素活性に必須な配列であることが推測された。来年度は、デングウイルス感染性cDNAクローンを用いて本酵素活性遺伝子領域に変異を導入した変異ウイルスまたはキメラウイルスを作成し、ウイルスレベルでの影響について解析する予定である。昨年度の研究で、JEVのNS3蛋白質を大腸菌の蛋白発現系を応用して単離精製し、nucleoside triphosphatase(NTPase)活性及びRNAヘリカーゼ活性についてその至適反応条件の検討を行った。また、JEVのSF2スーパーファミリー・RNAヘリカーゼ・アミノ酸モチーフII(DExH)の1番目(Asp)、2番目(Glu)及び3番目(Ala)のアミノ酸部位の役割について解析を行った。今年度は、JEV NS3蛋白質のもつRNA結合活性、ATPase活性及びRNAヘリカーゼ活性における同アミノ酸モチーフIIの4番目(His)部位の役割についてより詳細な検討を行った。これまでの研究でJEVのDEAHモチーフのAspとGluはATPase及びRNAヘリカーゼ活性に必須であるがRNA結合活性には関与せず、AlaはRNAヘリカーゼのみに必須であることが明らかとなった。また、今年度の研究で、His部位はRNAヘリカーゼ活性には必須な配列であるが、ATPase活性においては必須ではないが最適なアミノ酸であることが判明した。ほとんどの変異蛋白質においてRNA結合活性の減少が認められたが、消失まで至らなかったことからHis部位はRNA結合活性に何らかの形で関与するものの、必須でないことが明らかとなった。ATPase活性が維持され、尚且つRNA結合が示された変異蛋白質でRNAヘリカーゼ活性が消失したことから、RNAヘリカーゼ活性の消失はRNA結合またはATPase活性の消失によるものではないことが明らかとなり、このことから、これらの3つの活性機能はそれぞれ異なるアミノ酸またはモチーフによって制御されていることが示唆された。JEVのRNAヘリカーゼの解析は他のフラビウイルスの複製・増殖機構の理解につながり、最終的にRNAヘリカーゼ特異的阻害剤などの治療薬の開発への応用も期待される。
病原遺伝子のアンチセンスRNA導入によるう蝕細菌の非病原化療法

平成9年度S.mutansで高い転写効率を示すプロモーター配列を調べたところ、これまでにS.mutansからクローニングされた遺伝子の中でもgtfB遺伝子の転写量が最も高いことが明らかとなった。また、gtfB遺伝子はTween80の存在下で転写レベルが著しく上昇することが明かとなった。平成10年度齲蝕経験の少ない者から唾液を採取し、S.mutansに感染するバクテリオファージの単離を試みたが、ファージの単離には至らなかった。一方、S.pyogenesの染色体遺伝子データベースからバタテリオファージ遺伝子と相同性を示す遺伝子の検索を行い、これらの相同遺伝子をプローブとして用いて、ファージが感染していると予想される10株のS.mutansが単離した。平成11年度平成10年度に単離した10株のS.mutansについて、ファージ誘導の検討を行った。しかし、いずれの条件を駆使しても、ファージを誘導することはできなかった。一方、S.mutansをTween80で誘導した場合としない場合の菌体破砕物を調製し、これらの破砕物中にgtfB遺伝子のプロモータ部と相互作用を示す物質が存在しているか否かを調べた。この結果、Tween80の添加によってgtfB遺伝子のプロモータ上流部に結合して転写レベルを調節する因子が存在することが明らかとなった。平成12年度S.mutans Xc株に自己溶解活性があることを認めたため、この活性をコードする遺伝子のクローニングを試みた。この結果、ブドウ球菌の自己融解酵素をコードする遺伝子と相同性の高い遺伝子が同定され、この遺伝子の近傍には他の連鎖球菌で既に同定されているファージの構成遺伝子と類似した遺伝子群が認められた。この結果、S.mutansの染色体遺伝子の自己溶解酵素をコードする遺伝子領域はファージが溶原化した部位と推察された。本年度の研究では、病原因子のmRNAに対するアンチセンスRNAを充分量発現させるため、S.mutansで高い発現効率を示すプロモーター配列を開発を進めてきた。まず、高分子量菌体表層タンパク質抗原(RAc)、非水溶性グルカン合成酵素(GTF-I)、非水溶性/水溶性グルカン合成酵素(GTF-SI)の各病原因子をコードするpac、gtfB、gtfC遺伝子のそれぞれの発現レベルを調べるため、各病原遺伝子と同方向にプロモーターを有しないクロラムフェニコールアセチル化酵素(CAT)遺伝子を結合させた。こうして得られたS.mutansの各形質転換株についてCAT活性を測定し、各病原因子のプロモーターの発現活性を比較した。この結果、gtfB遺伝子の発現が最も高く、gtfC遺伝子がこれに次ぎ、pac遺伝子の発現が最も低いことが明らかとなった。これと同様にしてこれまでにクローニングされているS.mutansの各遺伝子について、それぞれのプロモーターによる発現活性を調べ、病原遺伝子に比較して充分に高い発現活性を持つプロモーターを探したが、gtfB遺伝子よりも高い発現を示す遺伝子は見つからなかった。これらの結果を基に、上記実験で調べられたプロモーター配列についてコンピュータ解析を行い、より高い発現活性を示すプロモーター配列を想定し、このような配列を人工変異導入法により作成し、現在各プロモーターの発現活性を比較する段階を抑えている。一方、本研究では、アンチセンスRNAをS.mutansに導入するために、バクテリオファージを用いることを計画している。そこで、バクテリオファージを入手すべく、S.mutansに感染するバクテリオファージを既に分離している米国の研究者に、分与の依頼を行ったが、分与を拒否された。

そこで、現在我々の研究室独自でS.mutansに感染するバクテリオファージを分離しているところである。本年度の研究では下記の2つの方法を駆使することで、S.mutansに感染するバクテリオファージの分離を試みた。まず、唾液中からのバクテリオファージの分離を目的として齲蝕感染経験の少ない者から唾液を採取し、これをS.mutansの培養液に加えて培養して、バクテリオファージの増殖を試みた。なお、ファージが溶原性ファージであることを考慮して、S.mutansの培養に際しては、紫外線照射あるはマイトマイシンC処理を行った。これまでに100名程度の被験者から唾液を採取し、ファージの分離を試みたが、現在のところバクテリオファージの分離には至っていない。これと同時にS.pyogenesの染色体遺伝子データベースからバクテリオファージ遺伝子と相同性を示す遺伝子の検索を行い、これらの相同遺伝子をプローブとして、バクテリオファージが既に感染しているS.mutansの分離を試みた。つまり、口腔内から様々な菌株のs.mutans種を分離して、これらの染色体遺伝子を調製し、先に作成したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーショウンを行うことで、既に溶原化ファージが感染しているs.mutansの特定を行った。現在のところ、10株の溶原化ファージに感染しているs.mutansが分離されたが、紫外線照射あるはマイトマイシンC処理を行っても、培養上清中へのバクテリオファージの形成を誘導させることができなかった。今後は、バクテリオファージの誘導条件に工夫を加えて、これらの溶原化ファージに感染しているS.mutans株からバクテリオファージを効率良く誘導する条件を決定する。また、アンチセンスRNAを充分量発現させるために、発現効率の高いプロモーターの開発を進めているが、これまでの調べてきた遺伝子の中では、gtfB遺伝子のプロモータが最も発現効率が高いことが確認されている。さらに、この発現効率はTween80の添加によって大きく誘導を受けることが明らかにされており、現在この誘導機構の解明を進めている。1)ファージの誘導条件の検討昨年度の研究で溶原化ファージが既に感染しているStreptococcus mutansをサザンブロット分析で特定したところ、溶原化ファージが感染していると思われる10株のS.mutansが認められた。これらの菌株について、紫外線照射あるいはマイトマイシンC処理を行っても、培養上清中へのバクテリオファージを誘導することができなっかたので、バクテリオファージを誘導する際に、過去にランダプロファージの放出を誘導することが報告されているK_2CrO_4、Pb(NO_3)_2、MnCl_2、Ni(OOCCH_3)_2、CrCl_2、NaWO_4、Na_2MoO_4、KMnO_4などの金属を加えて、誘導条件の検討を行った。しかし、これまでの条件ではS.mutans株からバクテリオファージを効率よく誘導することはできなかった。2)Tween 80によるgtfB遺伝子の発現誘導機構の解明アンチセンスRNAを充分な量発現させるために、発現効率の高いプロモーターの開発が必要である。
高地温が助長するイネ幼苗の低温障害の発生機構の解明

地温が高いとイネ幼苗の葉に深刻な低温障害をもたらす。この時葉では先ず硝酸や亜硝酸が蓄積し、その後光化学系IIのQAからQBへの電子伝達が完全に遮断された。これに伴い、チラコイド膜内外のΔpHが消滅し、熱放散(活性酸素消去系)が機能しなくなり、光化学系IIが過剰還元状態となった。このことが、活性酸素や過酸化脂肪の発生等を経て、チラコイド膜、葉緑体包膜、細胞膜等の生体膜を破壊し、葉を枯死に至らせる原因と推定される。高地温が植物の葉の低温障害を助長するというこれまで全く知られていなかった現象の発生機構を明らかにする目的で、3葉期のイネ幼苗を用いて以下の様な研究を行った。低温下における光合成機能の比較解析:これまでに得た結果から、高地温・低気温では、光化学系IIとIの間で電子伝達が遮断され、非循環的電子伝達と循環的電子伝達の両方が機能しなくなり、チラコイド膜内外の水素イオン濃度勾配(△pH)が消滅し、△pHに依存した熱放散能力(熱放散に必要なzeaxanthinの再生能力)を喪失することが、高地温依存性低温障害の原因であると考えた。その検証の一環として、光合成解析装置(Dual-PAM)に新規購入のP515/535モジュールを接続して、暗黒下で低温処理中に葉に20分間光を当てて解析し、低地温・低気温では△pHが維持されzeaxanthin生成が著しく高まるのに対し、高地温・低気温ではいずれもほとんど消失することを示した。硝酸等の葉への転流に及ぼす高地温・低気温の影響:低温処理中の葉、根および水耕液における、無機イオンおよびアミノ酸の変動を調べたところ、低地温・低気温では根から葉へのいずれの転流も認められず、葉ではNO_3^-はほとんど、NO_2^-は全く検出できなかった。一方、高地温・低気温では25°Cの場合と同様の転流が認められた。高地温・低気温の葉ではNO_3^-の特異的な蓄積が葉に起こり、高地温・低気温の葉でのみNO_2^-が検出された。そのNO_2^-の変動パターンが、クロロフィル蛍光パラメータの一つ"Excess"の変動パターンと酷似していた。これは光化学系IIにおける過剰エネルギー蓄積を示すとされるパラメータであり、高地温依存性の低温障害における、電子伝達障害とNO_2^-の密接な関係が示唆される。植物ホルモン等の関与:植物ホルモンの関与の可能性は低いと判断し、今年度はその検討は見送った。低温下における光合成機能の比較解析:高地温に依存した低温障害の最初の反応を特定する目的で、暗条件で低温処理中の幼苗の葉について、クロロフィル蛍光(光化学系II、PSII)とP_<700>吸光度変化(光化学系I、PSI)の同時高解像度解析(Q_A decayとOJIP curveの解析)を行った。その結果、低温処理中で光が当った直後から、PSII複合体のQ_B付近で電子が遮断されること、PSIは光照射開始後10-200ミリ秒に酸化状態のまま(本来ならPSIIからの電子で著しく還元される)であることを示す結果を得た。これらは、光の有無に関わらず高地温低気温処理により、電子の流れがQ_B付近で遮断されることを示唆する。光化学系II複合体構成タンパク質に及ぼす影響:個々の主要構成タンパク質には量的変化がないことを示す予備実験結果をSDS-PAGEを用いたイムノブロッティング解析で得た一方で、複合体の構成に光に依存した変化があることがBlue-Native PAGEを用いたイムノブロッティング解析で明らかになった。低温処理(気温10°C/地温25°C)を暗黒下で24時間、照明下で4.5時間行ったところ、約630kDa、約300kDa、約240kDaの複合体の量が著しく増加し、後者2つはCP43を含んでいなかった。PSII二量体(約570kDa)とPSII単量体(約350kDa)には顕著な変化はなかった。またCP43、CP47、Cytb_<559>の両サブユニットは、いずれも単量体が増加した。これらの変化は高地温依存の低温障害に依存はしているものの、暗黒下では認められず二次的な変化と考えられる。しかし障害発生機構解明のための重要な手掛かりとなる。高地温依存の低温障害は、水耕液が硝酸を含む時に起こる(21年度)。しかし硝酸飢餓の幼苗を気温10°C+地温25°C処理(L/H処理)すると、より顕著な障害が起こることがわかった。

このような条件では、高親和性硝酸輸送体の誘導等により、L/Hに特異な葉への硝酸蓄積(21年度)がさらに促進されるためと考える。L/H処理を24時間行うと光化学系IIのQ_AからQ_Bへの電子伝達が完全に遮断される(22年度)。しかし、その葉から単離したチラコイド膜の電子伝達機能は低下しなかった。またその葉から抽出した光化学系構成タンパク質、およびその複合体の構成等に変化はなかった。そこに5時間程度光を当てると、単離チラコイド膜の光化学系IIの電子伝達機能が著しく低下し、抽出液中にCP43の欠如した光化学系H複合体が増加した。またCyt b_<559>のβサブユニットの欠落も認められた。L/L処理ではこのような変化はなかった。これらのことからL/H処理を24時間行った場合のQ_AからQ_Bへの電子伝達の遮断は、光化学系IIと硝酸や亜硝酸の可逆的な相互作用によるものと考えられる。またその後の光に依存した光化学系Hのin vitro活性の失活も、タンパク質の分解や複合体の解離等を伴わない光化学系H複合体の不可逆的失活の結果と考える。3年間の結果から、L/H処理では、低温の葉に蓄積した硝酸や亜硝酸と光化学系II複合体の間の直接あるいは間接的な作用により光化学系IIのQ_AからQ_Bへの電子伝達が完全に遮断され、その結果、熱放散(活性酸素消去系)が機能しなくなると共に光化学系IIが過剰還元状態となり、活性酸素や過酸化脂肪を生じ、これによりチラコイド膜、葉緑体包膜、細胞膜等の生体膜が破壊され、葉の枯死に至ると考えられる。葉への硝酸や亜硝酸の蓄積と光化学系IIの電子伝達遮断の関係は今後の課題である。その後の光に依存した光化学系II複合体の変化は電子伝達のin vitro活性の失活の原因としては小さいため、チラコイド膜損傷の結果と考える。
カロリン諸島出土の交易物資の比較研究

昨年度の助成では、ミクロネシアのフアイス島出土の土器にはヤップ島起源の土器とそれ以外の土器が混在していることが明らかになった。そこで今年度の助成ではアリゾナ大学のデイッキンソン博士に35片の土器の剥片資料を送付し、土器の粘土鉱物の鑑定をおこなってもらい、他のミクロネシア出土の土器および広くオセアニアの島々の土器に含まれる鉱物との比較を行った。その結果、35片中34片は、ヤップ島およびその南西にあるパラオ島産の土器であった。パラオの鉱物を含んだ土器片は、ヤップの土器とは異なった形質的特徴をもっているので、剥片資料にしなかった土器片からも抽出が可能である。鉱物分析と、形質分析の双方を用いて分類した結果、今から1900年前にフアイス島へ人間集団が拡散してきた時から、ヤップばかりでなくパラオからも土器が継続してフアイスに持ち込まれていたことが明らかになった。その割合は、ヤップ産が96%に対してパラオ産の土器が4%であった。全体に占めるパラオ産の土器片の量は少ないが、民族誌資料からは明らかにされていない先史フアイス島居住民のパラオとの交易が証明された。また、残り一片の土器片は、オセアニアの他の土器に含まれている鉱物成分とは合致しない。オセアニアの島以外から持ち込まれた可能性が考えられる。これらの結果は、デイッキンソンとの連名で、第47回日本人類学会、日本民族学会連合大会で発表した(印東道子、W.デイッキンソン「ミクロネシア・フアイル島出土土器の研究...交易相手の分析」)。
固有振動を利用した広帯域大電力ミリ波帯高速スイッチの開発

本研究では170 GHz帯MW級ミリ波の数kHzでの高速切替えを目指し、世界で初めての固有振動を用いた広帯域大電力ミリ波帯高速スイッチの開発を目指す。具体的には、円形コルゲート導波管で構成されたリング共振器のマイターベンドの反射板を、小型振動発生器により高速に振動させることでリング共振器の周長を変化させ切り替えを行う。その際、kHzオーダーの高周波数振動には非常に大きな加速度を必要とするため、振動鏡の固有振動を利用した高速振動反射鏡を開発する。そして最終的に、真空封止と水冷却が可能な固有振動反射鏡を用いた広帯域大電力ミリ波帯高速スイッチを開発する。
文副詞・連結副詞類の理論的考察と習得実験研究

本研究の目的は、多種多様な用法を有するactually, really, in fact, indeedなど、文副詞類・連結副詞類に関する理論研究と習得研究を連携して行うことにより、日本人英語学習者のこれら副詞類の習得実態の状況と問題点を明らかにし、円滑なコミュニケーションに不可欠なこれら副詞類の効率的な教育・学習方法の模索・提案をするとともに、習得実験の結果から理論的考察を再検証し、理論研究の精緻化をはかることである。本年度は、in fact, indeed, actuallyに焦点を当て、COCA, BNCの現代語コーパスなどからデータを収集し、会話、アカデミックライティング、小説などにおける使用について考察する。2年間でactually, reallyに関して、英語母語話者による第一言語習得の状況、および日本人英語学習者の習得状況について考察した。本年度は、研究計画に基づき、それ以外の副詞類(indeed, in factなど)について理論的考察・コーパス調査を進めていく予定である。まず、COCA, BNCなどの現代語コーパスや、COHAなどの歴史コーパスなどからデータを収集し、会話、アカデミックライティング、小説などで、どのように使われているか/使われてきたかについて考察し、明らかにしていく。その際、indeed, actuallyなどはイギリス英語に特徴的であるとされることから、特にイギリス英語とアメリカ英語の違いも考察していく。さらに日系イギリス人Kazuo Ishiguroの小説において、それら副詞類がどのように使われているかについても、考察していく。バイリンガルであるIshiguroによって、indeed, in fact, actuallyが創造的に使われていることを示していく。結果をまとめ、24th INTERNATIONALIAWE(World Englishes)CONFERENCE ( Uni. Of Limerick, Ireland 2019, 6/20-22)で、発表する予定である。今後、計画に沿って、以下の方向で進めていく予定である。(1)actually, reallyに関しては、日本人英語学習者コーパス(スポークンコーパス)のデータの考察の結果、英語の運用能力がある程度高くなると、英語母語話者と同じように連結副詞、文副詞、強調副詞、応答表現など間投詞の用法など、多様な使い方ができるようになることがわかった。今後、その結果を英語教育・英語学習へいかすべく、方法を模索・提案していきたい。(2) indeed, in factなどを中心に、簡潔で明快なwritingを書く際の鍵となる連結副詞類・文副詞類について、英語母語話者コーパス(written corpus)から実例を採集し、理論的考察を行う(一方で、文学や口語表現における用法も、併せて探っていく)。さらに日本人学習者コーパスからも実例を採集し、考察する。これらの考察をもとに、明快なパラグラフを書くのに必要であるが、日本人英語学習者にとり習得が難しいと予測される副詞類について、仮説をたてながら習得実験を策定し、実施する。その結果を英語教育・英語学習へいかすべく、方法を模索・提案していく。本研究の目的は、談話に関わる用法など、多種多様な用法を有するactually, really, in fact, indeed, apparently, no doubtなど、文副詞類・連結副詞類に関する理論研究と習得研究を連携して行うことにより、日本人英語学習者のこれら副詞類の習得実態の状況と問題点を明らかにし、それをもとに、円滑なコミュニケーションに不可欠なこれら副詞類の効率的な教育・学習方法の模索・提案をしていくことであり、さらには習得実験の結果から理論的考察を再検証し、理論研究の精緻化をはかることである。初年度は、actually, reallyの二つの副詞類について、第一言語習得(この場合、英語母語話者による母語習得)がどのように行われているかについて、母語コーパスCHILDESからデータを収集し、考察した。その結果、(1)reallyの方がactuallyより習得が早いこと、(2) actally, really共に早い時期から様々な用法を習得していることがわかった。一方、英語母語話者のスポークンコーパス(COCA)から収集したデータからは、(1)reallyの方がactuallyより約3倍生起数が多いこと、(2)両副詞類とも様々な用法が用いられていることがわかった。二つのコーパスデータの考察により、これらの副詞類の第一言語習得には、入力の量・質が大きく関与していることが示唆される。以上の考察をまとめ、論文にしたものを、『2017 ETAK Conference Proceedings: English Education: Today and Tomorrow』に掲載した。本年度は、先の考察に基に、(1) actually, reallyに関する日本人英語学習者の習得状況について、学習者コーパスデータによる考察、(2)それ以外の副詞類について理論的考察・コーパス調査、を進めている。昨年度はactually, reallyに関して、CHILDES母語コーパスからデータを収集し、第一言語習得の状況について考察したが、日本人英語学習者の習得状況についてのデータの収集・考察には至らなかった。本年度は、研究計画に基づき、(1) actually, reallyに関する日本人英語学習者の習得状況についての学習者コーパスを用いての考察、(2)それ以外の副詞類について理論的考察・コーパス調査、を進めていく予定である。まず、学習者コーパスThe NICT Japanese Learner English Cprpusからデータを収集し、actually, reallyについて日本人英語学習者の習得状況について考察する。現在、分析の途中ではあるが、(1)actually, reallyともに日本人英語学習者は、それぞれ多様な用法があるにも関わらず、代表的な用法一つを集中的に用いること、(2)それぞれの代表的な用法はコミュニケーションを円滑にする談話的な用法であることなどが、暫定的な考察として出てきている。これらの結果をまとめ、11th INTERNATIONAL

CONFERENCE OF ENGLISH AS A LINGUAFRANCA ( King's College London, 2018, 7/4-7)で、発表する予定である。またactually, really以外の文副詞類・連結副詞類について理論的考察を進めると共に、英語母語話者コーパスからデータを収集し、それらの用法の特定・分類を行う予定である。本研究の目的は、多種多様な用法を有するactually, really, in fact, indeedなど、文副詞類・連結副詞類に関する理論研究と習得研究を連携して行うことにより、日本人英語学習者のこれら副詞類の習得実態の状況と問題点を明らかにし、円滑なコミュニケーションに不可欠なこれら副詞類の効率的な教育・学習方法の模索・提案をするとともに、習得実験の結果から理論的考察を再検証し、理論研究の精緻化をはかることである。本年度は、in fact, indeed, actuallyに焦点を当て、COCA, BNCの現代語コーパスなどからデータを収集し、会話、アカデミックライティング、小説などにおける使用について考察する。2年間でactually, reallyに関して、英語母語話者による第一言語習得の状況、および日本人英語学習者の習得状況について考察した。本年度は、研究計画に基づき、それ以外の副詞類(indeed, in factなど)について理論的考察・コーパス調査を進めていく予定である。まず、COCA, BNCなどの現代語コーパスや、COHAなどの歴史コーパスなどからデータを収集し、会話、アカデミックライティング、小説などで、どのように使われているか/使われてきたかについて考察し、明らかにしていく。その際、indeed, actuallyなどはイギリス英語に特徴的であるとされることから、特にイギリス英語とアメリカ英語の違いも考察していく。さらに日系イギリス人Kazuo Ishiguroの小説において、それら副詞類がどのように使われているかについても、考察していく。バイリンガルであるIshiguroによって、indeed, in fact, actuallyが創造的に使われていることを示していく。結果をまとめ、24th INTERNATIONALIAWE(World Englishes)CONFERENCE ( Uni. Of Limerick, Ireland 2019, 6/20-22)で、発表する予定である。今後、計画に沿って、以下の2つの方向で進めていく予定である。
二次元駆動のためのリング巻線・永久磁石形同期モータの開発

二次元リニア同期モータの連続的な運転を模擬する試験装置として埋め込み磁石形の回転形試験機をリング巻線形の電機子6本を用いる構造で製作した。軸にスライド式リニアベアリングを採用することで二次元運動を可能とし、推力測定上障害となる可能性のある強い吸引力の問題を、軸まわりに点対称なリング巻線形を選ぶことで回避した。リング巻線により、界磁・電機子の実効的な対向面積が小さいという問題点を解決し、埋め込み磁石形の可動子構成を選ぶことで、磁気回路最適設計のための自由度を確保した。フーリエ級数法を応用した横方向ディテント力の解析から、今回の試験機の寸法は適正なものであることを確認した。DSPボードからの制御によるインバータを用いた駆動システムを構築し、同時にエンコーダからの情報の読み込みとデータ処理の環境を整えることで、様々な駆動実験を可能とする試験システムを構成することができた。実験の結果、当初意図した積層鉄心による電機子の構成を作業の複雑さから断念したことにより、意図しなかった三次元的磁路が構成され、定格電流の範囲では設計通りの横方向力が得られないことが判明した。しかし、本実験で用意した電源装置の定格には余裕があったので、一時的に大きな電流を流すことにより横方向の駆動ができることを同時に確認した。本年度中の作業として予定していた本格的な連続駆動試験、エンコーダによる回転子位置検知と横方向の駆動原理の実証は達成できた。今後の課題として、積層鉄心を用いて磁路の通り易さに積極的に不均一性を持ち込むことにより横方向力を容易に発生できる機械の構成の検討や、エンコーダからの情報を積極的に活用してdq軸分離を行うより高性能な駆動制御の実験が挙げられる。二次元リニア同期モータの連続的な運転を模擬する試験装置として埋め込み磁石形の回転形試験機をリング巻線形の電機子8本を用いる構造として設計した。軸にスライド式のリニアベアリングを採用することで二次元運動を可能とし、推力の測定上障害となる可能性のある強い吸引力の問題を、軸まわりに点対称なリング巻線形を選ぶことにより回避した。リング巻線により、界磁・電機子の実効的な対向面積が小さいという問題点を解決した。また、埋め込み磁石形の可動子構成を選ぶことで、磁気時期回路最適設計のための自由度を確保し、同時にリング巻線のためギャップ長が大きくなるという負の効果緩和した。この構成に対する理論的な磁気回路の解析により、永久磁石の性能を引き出し設計定数を導出した。その理論成果に基づいて、実機の寸法を決め、試験機を製作した。当初意図した積層鉄心による電機子の構成は作業の複雑さから断念せざるを得なかったが、低周波電源での駆動実験において問題はない。また、フーリエ級数法を応用して横方向ディテント力を解析し、円滑な二次元駆動の検討の基礎を導いた。本年度中の作業として当初予定していた本格的な連続駆動試験と、任意の電流波形を印加する電源の設計は、モータ本体の製作作業に予想以上の時間を要したため、次年度の課題となっている。
合意形成局面で住民が操作できるインタラクティブCGシステムの開発と実運用性の検証

都市整備の現場では、景観設計や合意形成の場面において、CGが頻繁に使われるようになってきた。一度データを入力すればわずかな変更で多様な計画案が作成できる操作性の高さ、視点移動の自由度が高いので計画案の検討がしやすいこと、さらに情報が正確に表現できる等の特質から、今後もCGの利用範囲や利用頻度はますます高まるものと考えられる。また、CGを用いることで、権利者の合意形成がスムーズに運ぶことが計画実務者の経験として報告されている。しかし、現在のCG分野の技術開発の動向には次の問題点が指摘できる。(1)GIS分野とCG分野の技術連携がなされておらず、データ取得に関しては個別対応となっている。(2)現存する汎用CG作成ソフトウェアでは、事業案検討の際の典型的な操作にしばしば煩雑な手続きを必要としている。本研究は、こうした背景をふまえ、まちづくりにおけるプレゼンテーションの重要性を事例研究を通して明らかにした後、土地区画整理事業における権利者合意形成に寄与することを想定した、以下のような機能を持つ3次元CG呈示システムを開発したり、方法論を確立し、その有用性を検証した。(1)従来の研究成果であるCD-ROM電子住宅地図からのデータ取得と加工の経験を活かし、抽出した地理的データからの半自動的な建物形状CGデータ作成の方法論を開発した。(2)土地区画整理事業での計画案変更を想定し、議論のなかで計画案を修正して即時に変更案を示すというフィードバックが可能になるような機能を開発した。このように本研究は、実際のまちづくりにおける方法に即した形での検討を行ったため、その成果は広く現実の計画実務に応用できると考えている。また、景観シミュレーションの枠を超えて、計画全体を通した効率的・体系的なCG活用の仕組みづくりへの寄与が期待される。本年度は、現実の事業と合意形成場面を重視した視点から、必要なCG画像の精度とデータ構造を検討し、それをもとに電子住宅地図からのデータ取得を行って、地理データベースを構築した。1.景観設計・合意形成に必要な画像の種類・視点・縮尺、及びデータ精度の検討:計画実務者へのヒアリング、事業権利者への協力を得て、計画策定時に必要十分なCG画像のレベルを同定した。対象とした項目は、背景画像のあり方等画像の種類、視点位置、縮尺、データ精度である。2.CGソフトウェアにおけるデータモデルの検討:地理情報システムからのデータ取得を前提として、CG画像の作成に必要な要素と精度をもち、かつ計画代替案の変更作業に適した機能をもつデータベースのデータ形式や構成の検討を行つた。特に、CG作成に有利でありしかも情報システム側の性能を阻害しないデータ構造(データモデル)について検討を加えた。地理情報システムでは3次元データを予定していない形式が多いが、この中でKIWIと名付けられた時空間データベース構造が、CGシステムとのデータ連携に適するとの知見を得た。3.データベースの構築:2で検討したKIWI形式により、CD-ROM住宅地図を有効に活用し、大阪市域の3地区を対象に地理データベースを構築する。そしてこれを用いて、実際にCG画像を作成して、その有用性を確認した。具体的には従来手法でCG画像を作成する場合との比較分析を、画像の質や作成労力等を評価基準として行った。なお、このデータ構造は高圧縮のため、都市情報システムの性能を阻害しないことも確認された。都市整備事業における住民合意形成に寄与する目的に特化した3次元CG呈示システムを開発し、住民の操作実験によりその有用性を検証することが、本研究の目的である。今年度は、計画実務者が実際に使用可能な、マンマシンインターフェイスに優れたCGシステムの開発を行った。開発したCGシステムの従来システムに比しての優位性の観点からみた主要な研究成果は以下の通りである。

(1)説明会の会場に搬入可能な機器・データのポータビリティを保つことができた。これは、(3)に関連してノートパソコンでも実用的な速度で描画可能となるようアルゴリズムを検討した成果である。(2)行政担当者や住民自身が簡便に操作できるような優れたマンマシンインターフェイスについて詳細な検討を行った。具体的には、街路幅、植栽、素材の変更など典型的な変更要求・代替案作成要求を想定して、これらに対してはタッチパネル上の指先の動きにより簡便な操作で対応可能とした。操作実験による実運用性の検証は来年度の課題であるが、実験に耐え得るインターフェイスの作成が行えたと考えている。(3)議論しながら即時に変更案を示すことができるよう、CG画像のリアルタイムな作成性能を向上させた。精度や物体数に依存するが、テスト画像では、実用性があると思われる数秒以内の再描画を可能とした。なお、今年度は当初の研究計画を変更し、2度にわたりトルコを訪問し、震災被害を受けた自治体における復興局面でのCGおよびGISの利用可能性に関する調査・研究を行った。当地では復興プランの合意形成が図られており、開発するCGシステムの実証に適した局面であると判断したためである。これは来年度予定している操作実験の先取りでもあり、さらにトルコ人の操作にも耐え得ることは一般性・汎用性の実証となる。本研究課題の最終年度であるため、今までに開発したシステムの実運用性の検証を中心的なテーマとし、その準備としての事業計画案・CG画像の作成と、これらを含めた研究全体のとりまとめ作業を行った。具体的には以下の3つが研究実績となる。1.事業計画案の作成とCG画像作成第1年度において地理データベースを構築した計画対象地区において、平面図上に事業計画案を作成した。次に、地理データベースに格納された家屋平面形状や地形などのデータをもとに、現況の家屋外観調査を行って、CG作成に必要な3次元データを収集し、計画案のCG画像作成を行った。2.実際の権利者説明過程に即した住民の操作実験権利者説明会を模擬的に開催した。会議ではビデオカメラ、テープレコーダを用いて、会議における被験者の行動を観察し、実際に参加者の意見に即して計画案を変更してもらい、再度CG画像を描画する方法をとった。参加者の希望に即した変更が可能であったか、再描画までに要する時間は参加者の納得のいく範囲のものであったか、等を観察し、また意見収集を行うことにより、システムの有用性を検証した。3.研究のとりまとめ研究で得られた成果・知見をとりまとめ、また実用化の見込み等の考察も加えて、研究報告書にまとめあげた。
複数識別器の時空間的統合利用に基づく人物頭部向きの計測と人物相互関係の理解

本研究では,カメラとレーザ測域センサと組合せた,頭部向きの計測を含む,人物行動計測手法を確立した.具体的には,レーザ測域センサを人の肩の高さ付近に設置し,人物の位置と身体の向きを計測する.同時に,レーザ測域センサの上部に設置した全方位カメラで人物の頭部の位置と向きの計測を行う.一般にミラー式全方位カメラでは,広範囲を観察できる半面,画像の解像度は低いが,レーザ測域センサと組合せ,身体の向きとの相互関係を考慮することで,低解像度で頭部が観察される場合でも,頭部の追跡や向きの計測が可能となった.開発した手法を美術館で絵の説明をするガイドロボットなどに応用し,その有効性を確認した.本研究では,カメラとレーザ測域センサと組合せた,頭部向きの計測を含む,人物行動計測手法を確立した.具体的には,レーザ測域センサを人の肩の高さ付近に設置し,人物の位置と身体の向きを計測する.同時に,レーザ測域センサの上部に設置した全方位カメラで人物の頭部の位置と向きの計測を行う.一般にミラー式全方位カメラでは,広範囲を観察できる半面,画像の解像度は低いが,レーザ測域センサと組合せ,身体の向きとの相互関係を考慮することで,低解像度で頭部が観察される場合でも,頭部の追跡や向きの計測が可能となった.開発した手法を美術館で絵の説明をするガイドロボットなどに応用し,その有効性を確認した.セキュリティやマーケティング, HCIなどの分野において,人物の注目方向の計測技術は重要な役割を果たす.これまでの映像からの視線や顔向きなどの計測は,比較的高解像度で撮影した映像を詳細に分析して得るものがほとんどであった.しかし,監視カメラなどの据え置き型カメラやロボットに搭載されたカメラによる広範囲の撮影では人物頭部が低解像度で観察されるなどの課題がある.そこで,本研究では,比較的低解像度で観察される人物頭部の向きを計測する技術を開発し,店舗内の監視カメラやサービスロボットなどに適用することをめざす.昨年度は,複数識別器の出力の分布を手がかりとして,低解像度画像か照,高精度に人物頭部の向きを計測する手法を開発した.これには, Haar-like特徴に基づいたAdaBoost学習による識別器を用い,識別器の出力を「対象らしさ」を表す値として得て,人物頭部の各方向に対応した複数の識別器の「対象照しさ」を表す値の分布に基づいて,人物頭部の向きを計測している.また,カメラによる追跡にレーザ測域センサか照得られる距離情報を統合することで,単眼カメラとレーザ測域センサの組合せで,複数人物を追跡する手法を開発した.平成21年度は,前年度の成果をさらに発展させるため,新たに全方位カメラを導入し,これとレーザ測域センサを統合した手法の確立を目指す.さらに,家族や友人などの人物グループでは,グループに所属する人物の注目方向がお互いの顔であったり,特定の対象であったりする場合が多いといった知見に基づいて,観察領域内の複数人物の注目方向や動き,それぞれの人物の被注目対象の分析により,人物グループの検出などを行う予定である.セキュリティやマーケティング,HCIなどの分野において,人物の注目方向の計測技術は重要な役割を果たす.これまでの映像からの視線や顔向きなどの計測は,比較的高解像度で撮影した映像を詳細に分析して得るものがほとんどであった.しかし,監視カメラなどの据え置き型カメラやロボットに搭載されたカメラによる広範囲の撮影では人物頭部が低解像度で観察されるなどの課題がある.そこで,本研究では,比較的低解像度で観察される人物頭部の向きを計測する技術を開発し,サービスロボットなどに適用した.初年度に開発した,複数識別器の出力を手がかりとした,低解像度画像から高精度に人物頭部の向きを計測する手法をさらに発展させ,今年度は低解像度ではあるが,より広範囲を観察可能な全方位カメラを用い,これに加えてレーザ測域センサを相補的に組み合せることで,全方位カメラからの映像をパノラマ展開した低解像度画像から23m離れた人物の追跡と頭部向きの計測を可能とした.また,低解像度画像からの顔向きの検出だけではなく,レーザ測域センサを統合することで身体の向きも計測可能とした.そして,この技術を,ミュージアムで作品の解説をするガイドロボットや,介護者と併走する車椅子ロボットに適用した.ガイドロボットでは,観客が今作品を見ているのか,ロボットを見ているのかを頭部の向きに基づいて判別し,適切な説明行動を可能とした.特に,質問時に顔をそむけた観客には質問しないなど,これまでヒューマンロボットインタラクションの分野でも試みられてない課題についても取組み,成果を挙げることができた.また,介護者と併走する車椅子ロボットでは,介護者の位置を頑健に追跡することで,安定して併走する車椅子ロボットを実現した.特に,介護者が進みたい方向を身体の向きや顔の向きから推定することで,従来は困難であった併進時の車椅子側への進路変更を可能とした.