hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内遺伝子検出システムを用いる薬剤高速スクリーニング系の構築

細胞適合性を有し、リアルタイムな遺伝子発現解析が可能な遺伝子検出法の構築を新たな課題として、特定核酸配列結合型蛍光分子の開発と遺伝子検出への応用を試みた。DNA、RNAを選択的に染色する膜透過性蛍光色素は多く知られている。従来用いられてきた核酸選択的蛍光色素を改変し、より高次な核酸の"特定配列/構造"に結合した揚合にのみ蛍光を発する機能性蛍光分子の開発を行った。天然型核酸プローブと蛍光色素が独立した遺伝子検出系を構築出来れば、細胞内での応用を容易にするのみでなく、コスト面でも有利である。具体的には、よく知られる蛍光核染色剤Hoechstの合成ルートを検討し、Hoechst類似体ライブラリを作成した。分光学的、熱力学的評価を行い、ライブラリの中から蛍光性を維持しながらも、B型DNAには結合しないHoechst誘導体の探索に成功した。次に、SELEX法を用いて、Hoechst誘導体.に特異的に結合し蛍光発光を誘起するDNA配列(DNA-aptamer)の選抜を実施した。選抜してきたDNA-aptamerを加えたところ、Hoechst誘導体は200倍近くの蛍光増幅が観測され、特定DNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-Up蛍光色素/DNA-aptamerペアの探索に成功したことが示された。得られたDNA-aptamerを、loop部位で2つに分割し、夫々に標的配列と相補的な配列の結合部位を持たせたbinary probeを作成した。binary probeとHoechst誘導体を系中に含ませ、標的配列存在下、及び非存在下において蛍光発光を観測すると135倍程度のIon/loffを示し、さらに、本系が1塩基識別可能であることも確認している。同様にして、Hoechst誘導体に特異的に結合し蛍光発光を誘起するRNA-aptamerの選抜を実施し、特定RNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-up蛍光色素/RNA-aptamerペアの探索にも成功している。得られたRNA-aptamer配列を融合させたmRNAを転写することにより、目的とするmRNAの転写モニタリングが可能であることを確認している。今年度は、生細胞内における遺伝子発現を高精度で識別・高速検出する活性分子スクリーニング系構築実現に向け、細胞外で行われていた遺伝子検出・診断を、全て生細胞内で行おうとする"細胞内遺伝子検出"の開発を試みた。生体等温条件下にて酵素・試薬等を必要とせず、細胞内での遺伝子を認識、シグナル増幅、さらに診断を行うことのできる生細胞内遺伝子検出・診断法の構築を行った。私が設計・合成した自己切断型遺伝子診断プローブ(TASCプローブ)は生体等温条件下にて酵素・試薬等を必要とせず、遺伝子を認識、シグナル増幅、さらに診断を行うことのできる画期的な手法であったが、生細胞内遺伝子検出に用いるために、蛍光・消光分子からの脱却が必要であった。そこで、細胞自身の蛋白質翻訳システムを用いた遺伝子検出・診断系の構築を目指した。具体的には、標的遺伝子存在下においてのみmRNA自身が高次構造変化を起こし、レポーター蛋白質発現が開始されるようなリボレギュレーターを構築した。レポーター蛋白質として酵素活性を有するルシフェラーゼを採用することで、二段階の触媒的検出を試みた。HIV関連遺伝子であるケモカインCCR5遺伝子を標的としたリボレギュレーターをデザインしたところ、50fmolの検出感度で標的遺伝子を検出できることが確認された。さらに一塩基変異の識別も可能であった。本系は細胞内のシステムを用いた遺伝子診断法であり、細胞膜内への展開も期待できる。また、本系にRNaseHを作用させることで、三段階の触媒的検出をも可能とし、in-vitroにおいて9fmolの検出感度を実現するとともに、遺伝子配列検出シグナルの可視化にも成功した。生細胞内における遺伝子発現を高精度で識別・高速検出する活性分子スクリーニング系構築実現に向け、細胞外で行われていた遺伝子発現検出・診断を全て生細胞内で行おうとする"細胞内遺伝子検出"の開発を引き続き行った。細胞膜内でのS/N比が克服すべき問題であると考え、当初、酵素活性を有するシグナル増幅型遺伝子診断プローブ(TASCプローブ)を考案・作成し、良好な結果を得た。しかし、"細胞適合性"という興味深い課題点を追求すべく、新たに"非修飾RNAを用いた遺伝子診断"というコンセプトを提案し、現在、下記2課題を同時に展開している。1;in-vitroにおいて良好な結果を得たMB-mRNAプローブ(標的遺伝子存在下においてのみmRNA自身が構造変化を起こしてレポーター蛋白質発現が開始される)の生細胞内利用に向け、ランダム配列をORF上流に導入したMB-mRNAプローブ転写用プラスミドを用意し、現在in-vivo selectionを行っている。さらに、真核細胞内での"細胞内遺伝子検出"に向け、新たな細胞適合型遺伝子検出系の構築を実施、検討を行っている。2;特定核酸配列結合型蛍光性小分子の開発と遺伝子発現検出への応用を試みた。核酸選択的蛍光色素を改変し、より高次な核酸の"特定配列/構造"に結合した場合にのみ蛍光を発する機能性蛍光分子の開発を行った。特定の配列を有するDNA, RNAの蛍光検出を可能とするだけでなく、認識核酸配列をうまく設計することで非修飾核酸を用いた標的核酸配列の検出への応用も可能である。従来法とは一線を画し、天然型核酸プローブと蛍光色素が独立しており、細胞内での応用を容易にするのみでなく、コスト面でも有利である。

具体的には、よく知られる蛍光核染色剤Hoechstの類似体ライブラリを作成した。分光学的、熱力学的評価を行い、ライブラリの中から蛍光性を維持しながらも、B型DNAには結合しない類似体の探索に成功している。現在、SELEX法を用いて、探索したHoechst類似体に特異的に結合し蛍光発光を誘起するRNA配列(aptamer)の選抜を実施している。細胞適合性を有し、リアルタイムな遺伝子発現解析が可能な遺伝子検出法の構築を新たな課題として、特定核酸配列結合型蛍光分子の開発と遺伝子検出への応用を試みた。DNA、RNAを選択的に染色する膜透過性蛍光色素は多く知られている。従来用いられてきた核酸選択的蛍光色素を改変し、より高次な核酸の"特定配列/構造"に結合した揚合にのみ蛍光を発する機能性蛍光分子の開発を行った。天然型核酸プローブと蛍光色素が独立した遺伝子検出系を構築出来れば、細胞内での応用を容易にするのみでなく、コスト面でも有利である。具体的には、よく知られる蛍光核染色剤Hoechstの合成ルートを検討し、Hoechst類似体ライブラリを作成した。分光学的、熱力学的評価を行い、ライブラリの中から蛍光性を維持しながらも、B型DNAには結合しないHoechst誘導体の探索に成功した。次に、SELEX法を用いて、Hoechst誘導体.に特異的に結合し蛍光発光を誘起するDNA配列(DNA-aptamer)の選抜を実施した。選抜してきたDNA-aptamerを加えたところ、Hoechst誘導体は200倍近くの蛍光増幅が観測され、特定DNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-Up蛍光色素/DNA-aptamerペアの探索に成功したことが示された。得られたDNA-aptamerを、loop部位で2つに分割し、夫々に標的配列と相補的な配列の結合部位を持たせたbinary probeを作成した。binary probeとHoechst誘導体を系中に含ませ、標的配列存在下、及び非存在下において蛍光発光を観測すると135倍程度のIon/loffを示し、さらに、本系が1塩基識別可能であることも確認している。同様にして、Hoechst誘導体に特異的に結合し蛍光発光を誘起するRNA-aptamerの選抜を実施し、特定RNA配列/構造に結合した場合にのみ蛍光を発する新たなLight-up蛍光色素/RNA-aptamerペアの探索にも成功している。得られたRNA-aptamer配列を融合させたmRNAを転写することにより、目的とするmRNAの転写モニタリングが可能であることを確認している。
アジアネットワークの形成によるフードサプライチェーンのライフサイクル環境影響評価

フードサプライチェーンのシナリオ分析に取り組み、肥料製造シナリオ、土地利用変化シナリオ、輸出入シナリオ等が環境に与える影響の検討を継続して実施した。肥料製造に関しては、オイルパーム生産を対象とし、最近の研究動向に関する追加のサーベイを実施した上で、シナリオの空間的非整合性がもたらす不確実性(ヨーロッパのデータを代用する場合等が相当)、ならびにシナリオの時間的非整合性がもたらす不確実性(30年前の製造技術を想定する場合等が相当)を推計した。土地利用変化シナリオについては、ゴム農園から転換した場合と2次林から転換した場合の2種類のオイルパームプランテーションを比較し、シナリオ(土地利用の前歴)が温室効果ガス排出量に与える影響を検討した。その中で、インベントリデータのモデリング上の問題点も示した。輸出入シナリオに関しては、アジア地域における農産物を仮想的に日本に輸入した場合の環境影響を推計した。コメ、パームオイル等を事例として取り上げた。食品の生産と流通に関する上記の検討を踏まえ、水稲作(ベトナム、インドネシア等)、オイルパーム生産(インドネシア、マレーシア)、肥料製造(インドネシア、ベトナム)等のインベントリデータにおいて、シナリオ整合性を改善した。影響評価に関しては、LCAにおける生物多様性の評価手法に焦点を当てた。地域(WWFのエコリージョン)と土地利用類型を指定することにより生物多様性への影響を評価する方法により得られた指標と実際の圃場における指標(種多様性)との相関係数を求め、前者の方法の問題点を示した。圃場レベルでの生物多様性評価手法の検討を継続し、音響的非類似性によりオイルパームプランテーションと周辺の森林がどの程度識別されるかを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。水稲作を中心としたライフサイクルインベントリ(LCI)データを構築するため、海外共同研究者とともに開催した農業におけるLCIデータベースに関するワークショップの成果等を踏まえ、関連するデータの収集とデータベースの構築を行った。まず、1エネルギー、一般工業製品等のLCIの精査に取り組み、電気、燃料等のエネルギー、農業生産で利用されている工業製品・サービスのLCIデータがその国でどの程度収集されているか、また現実に収集できるかを検討した。(本研究プロジェクトは、10の研究項目からなり、以下それらの項目に丸付数字を付けて示す。)次いで、2投入財に関する文献・現地調査とLCIの構築を行った。すなわち、農業生産のLCAを実施するため、その上流である投入財(肥料、農薬、農業機械等)のインベントリデータを文献・現地調査に基づいて作成した。さらに、3水稲を中心とした農業生産のLCI構築を行った。LCI構築にあたっては、ワークシート形式でのデータ収集を行うとともに、既往のLCIデータベース(ecoinvent等)で用いられている方法を参照しつつ、LCAソフトウェア(SimaPro)を利用した。さらに、5LCIにおける農業生産からの直接排出の精査を行った。本年度はフィリピンの事例を中心に検討し、統計データ等に基づき稲栽培過程(播種収穫)における温室効果ガス排出量を算定した。GHG排出量のうち大きな割合を占めるのは土壌からのメタンおよび亜酸化窒素であり、これらは灌漑と雨期の影響を大きく受けていることが示された。水稲を中心とした農業生産のインベントリデータ構築に関する前年度の取組みを継続した。海外共同研究者とともに開催したワークショップにおいて、生産費統計等を用いた作成方法によっては作物栽培技術が適切にモデル化できないこと、また実際の栽培シナリオに基づいて作成する方法に可能性があることが示された。紅河デルタおよびメコンデルタ(ベトナム)、西ジャワ(インドネシア)、ルソン島(フィリピン)における水稲作等のインベントリデータを作成した。また、農業投入財については、インドネシア(国営企業傘下の5事業会社)およびベトナム(1社)における肥料製造プロセスを取り上げ、尿素製造、アンモニア製造等のユニットプロセスデータを作成した。本年度は、新たに副産物・廃棄物利用のインベントリに関する検討を開始した。東南アジア諸国におけるバイオマス資源の賦存状況は日本とは著しく異なるため、まず、フィリピン(ルソン島San Jose市)における籾殻ガス化発電プラントの現地調査を行った。同市の精米業者から持ち込まれた籾殻が1日当たり300350t処理され、発電された電力12MWのうち、プラント運転分を除いた10MWが売電されていた。保管期間中の籾殻の劣化による廃棄が少なくなく、また焼却灰は廃棄物として処理されていることも明らかとなった。また、東南アジア地域の現状調査から、重要な未利用資源として、マレーシアおよびインドネシアのオイルパームトランクの存在が浮上し、次年度以降にパームオイル生産における多財産出過程として取り上げる必要性が示された。影響評価手法については、現地における農業の実態を踏まえ、地球温暖化(温室効果ガス排出量)以外にどのような評価項目(影響領域)が必要とされるかを検討した。その結果、生物多様性への影響等、土地利用および土地利用変化を評価することの重要性が示された。本研究は、(1)耕種部門を中心としたインベントリデータの構築、(2)インベントリの拡張と評価方法の開発、(3)フードサプライチェーンのシナリオ分析という3つのステップに沿って推進する計画である。

平成27年度は、(1)および年度後半から(2)に取り組み、1エネルギー、一般工業製品等のLCIの精査、2投入財に関する文献・現地調査とLCIの構築、3水稲を中心とした農業生産のLCI構築、5LCIにおける農業生産からの直接排出の精査、6副産物・廃棄物利用のLCI構築、9影響評価手法の開発の6つの研究項目を検討することとしていた(丸付数字は研究項目番号を示す)。「研究実績の概要」の個所で説明したように、各研究項目の進捗状況はほぼ予定通りであり、おおむね順調に進展していると判断した。耕種部門を中心としたライフサイクルインベントリ(LCI)データの構築(第1ステップ)に関しては、現地調査や海外共同研究者から提供されたデータに基づき、メコンデルタ等における水稲生産プロセス、および肥料等関連する投入財製造プロセスのLCIデータを構築した。また、本年度から、熱帯地域における重要品目であるオイルパームも検討対象に加え、その生産プロセスならびに投入財製造プロセスのLCIデータを作成した。その際には、共同研究先であるインドネシアオイルパーム研究所が運営するプランテーションにおいて得られたデータ等を使用した。パームオイル生産プロセスは多財生産プロセスであるため、副産物・廃棄物利用プロセスに関する検討を同時に行った。さらに、海外共同研究者の協力により、ベトナムにおける畜産に関するLCIデータの収集を行った。インベントリの拡張と評価方法の開発(第2ステップ)における影響評価手法に関しては、アジア地域の農業生産を評価する上で重要であると考えられる生物多様性を中心に検討を行った。現時点での到達点であると考えられる評価方法(UNEP/SETACライフサイクルイニシアティブが推奨する方法)が、本プロジェクトが想定している評価には適さないことが示されたため、代替的方法として現場における多様性を簡単にモニタリングする方法(音響的多様性の活用)の可能性を検討した。第2ステップに関しては、さらに、平成29年度より開始予定のシナリオ分析(第3ステップ)を念頭におき、アジア地域における農産物輸出入プロセスのLCIデータを作成した。本研究は、(1)耕種部門を中心としたインベントリデータの構築、(2)インベントリの拡張と評価方法の開発、(3)フードサプライチェーンのシナリオ分析という3つのステップに沿って推進する計画である。平成28年度は、このうちの(1)および(2)に取り組み、該当するライフサイクルインベントリデータの作成、影響評価手法の開発を行うこととしていた。平成29年度は、インベントリの拡張と評価方法の開発(第2ステップ)ならびにフードサプライチェーンのシナリオ分析(第3ステップ)に取り組んだ。まず、インベントリに関しては、農業投入財に関するインベントリの拡張の一環として、インドネシアにおいてオイルパーム生産に用いられている化学肥料製造に関する調査等を行い、肥料製造業者ごとにインベントリを作成した。また、共同研究先であるインドネシアオイルパーム研究所が運営するプランテーションの実績データを再収集し、インベントリデータの整合性を高めた。
サクラマスの降河回遊行動におけるストレスホルモンの関与

(1)サクラマス銀化魚の降河回遊行動に及ぼすコルチゾルおよびテストステロン投与の影響を、水産総合研究センター中央水産研究所日光庁舎の実験水路内で調べた結果、降河回遊行動はコルチゾルの投与量依存的に促進されること、またコルチゾル投与による降河回遊行動促進作用は、性ホルモンであるテストステロンの投与によって打ち消されることが明らかとなった。このことから、サクラマスでは河川で孵化したのち、河川内で性成熟に向かう場合にはテストステロン等の性ホルモンによって降河回遊行動が抑制され、性成熟に向かわない銀化魚の場合には、コルチゾルの働きによって川から海への降河回遊行動の発現が促進されると考えられた。(2)平成18年3月に岩手県気仙川においてサンプリングしたサクラマスの銀化魚および河川残留魚の血中ホルモン量をEIA法により測定した結果、前年と同様、主に上流域で採捕される河川残留魚では血中コルチゾル量が低く、川から海に降る過程にあると考えられる銀化魚では、血中コルチゾル量が高いことが明らかとなった。そこで、この2年間と同様の結果が得られるかどうかを確かめるため、平成19年3月にも三度、同様のサンプリング調査を行った。現在、ホルモン量を測定している。(3)春に特異的に起こるサクラマス銀化魚の降河回遊行動を誘起する外部環境要因を明らかにするため、気仙川ならびに宮城県広瀬川の上・中・下流域に水温計測ロガーを設置し、周年にわたって温度変化をモニターした。今後さらに、気象庁や国土交通省の気象・水質データを加えて、サクラマス銀化魚のコルチゾル量変動や降河回遊行動発現のメカニズムを解析する計画である。(1)平成16年度は、サクラマスの血中ホルモン量変動を解析するため、ELISA法によるコルチゾル、テストステロン、エストラジオール-17β、11-ケトテストステロン、および17,20β-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オンの測定系を構築した。(2)共同研究機関である水産総合研究センター中央水産研究所日光支所において、コルチゾルの投与(2mg/尾)がサクラマス銀化魚の降河行動に及ぼす影響を実験水路内で行動学的に調べた結果、銀化魚の降河尾数の割合はコルチゾル投与群(76%)が対照群(23%)よりも高くなることが判明した。そこで実験魚の血中コルチゾル量を測定したところ、対照群が平均約5ng/mlであったのに対して、コルチゾル投与群では平均約20ng/mlと増加していた。このことから、銀化魚の降河行動の発現がコルチゾルによって促進されたことが考えられた。(3)平成16年から17年にかけて、岩手県気仙川(全長約44km)等の河川においてサクラマス銀化魚(ヒカリ:降河型)および河川残留魚のフィールド観察・サンプリング調査を行った。気仙川では河口から約10km(下流)、20km(中流)、30km(上流)に調査点を設定し、採捕を行った。その結果、下流では銀化魚の特徴を呈する降河魚と思われる魚が、上流では早熟個体等の河川残留型魚が、また中流では両者が混在して採捕されることが明らかとなった。各調査点の採捕魚の血中コルチゾル量を測定したところ、下流ならびに中流で採捕された銀化魚のコルチゾル量は、上流域に生息する河川残留型魚よりも高くなる傾向が明らかとなった。以上の結果から、サクラマスの銀化魚では降河回遊期にコルチゾル量が増加すること、このホルモンの上昇が降河回遊行動の発現促進に関係することが示唆された。(1)平成17年3月、岩手県気仙川(全長約44km)の河口から35km(上流域)、20km(中流域)、および7km(下流域)の3調査地点を設定し、それぞれの地点において8:00時から18:00時までサクラマスを観察するとともに一部を採捕し、血中コルチゾル量をEIA法により測定したところ、下流域で採捕された銀化魚(平均約19.4ng/ml)では上流域(平均約4.3ng/ml)で採捕された河川残留型魚よりも血中コルチゾル量が高いことが明らかとなった。また各個体のコルチゾル量を比べたところ、特に下流域の銀化魚の血中コルチゾル量は、昼間採捕された個体では低く、夕方に採捕された個体では高くなる日内変動を示す傾向が見られた。また行動観察の結果、下流域では夕方になると銀化魚と考えられる個体が淵下流の浅瀬に集群する様子が観察された。(2)そこで平成18年4月、水産総合研究センター中央水産研究所日光庁舎において、FRP艀化水槽にサクラマスの銀化魚および河川残留型魚(早熟雄)を収容し、14:00、18:00、22:00、2:00、6:00、および10:00時にそれぞれ5尾ずつをサンプリングして血中コルチゾル量の変動を調べた。その結果、銀化魚では夕方から深夜にかけて血中コルチゾル量が上昇する変動を示したのに対して、早熟雄では観察されなかった。以上の(1)と(2)の実験結果から、サクラマスの銀化魚では昼から夕方にかけてのコルチゾル量上昇があること、またこのようなコルチゾル量の日内変動が夕方から夜にかけての銀化魚の降河回遊行動を誘起するものと考えられた。

(3)平成18年3月にも岩手県気仙川において上記(1)と同様の研究を行い、現在血中コルチゾル量を測定している。(1)サクラマス銀化魚の降河回遊行動に及ぼすコルチゾルおよびテストステロン投与の影響を、水産総合研究センター中央水産研究所日光庁舎の実験水路内で調べた結果、降河回遊行動はコルチゾルの投与量依存的に促進されること、またコルチゾル投与による降河回遊行動促進作用は、性ホルモンであるテストステロンの投与によって打ち消されることが明らかとなった。このことから、サクラマスでは河川で孵化したのち、河川内で性成熟に向かう場合にはテストステロン等の性ホルモンによって降河回遊行動が抑制され、性成熟に向かわない銀化魚の場合には、コルチゾルの働きによって川から海への降河回遊行動の発現が促進されると考えられた。(2)平成18年3月に岩手県気仙川においてサンプリングしたサクラマスの銀化魚および河川残留魚の血中ホルモン量をEIA法により測定した結果、前年と同様、主に上流域で採捕される河川残留魚では血中コルチゾル量が低く、川から海に降る過程にあると考えられる銀化魚では、血中コルチゾル量が高いことが明らかとなった。そこで、この2年間と同様の結果が得られるかどうかを確かめるため、平成19年3月にも三度、同様のサンプリング調査を行った。現在、ホルモン量を測定している。(3)春に特異的に起こるサクラマス銀化魚の降河回遊行動を誘起する外部環境要因を明らかにするため、気仙川ならびに宮城県広瀬川の上・中・下流域に水温計測ロガーを設置し、周年にわたって温度変化をモニターした。今後さらに、気象庁や国土交通省の気象・水質データを加えて、サクラマス銀化魚のコルチゾル量変動や降河回遊行動発現のメカニズムを解析する計画である。
溶鉄-溶融スラグ間の界面張力に及ぼす化学反応の影響に関する機構解明

高清浄鋼を連続鋳造する場合に、溶鋼の上に溶融スラグを静置して鋼を鋳造するが、溶鋼-溶融スラグ間の界面が乱れると、スラグの小滴が溶鋼に巻き込まれ、介在物等の鋼の欠陥になる。そのため、平滑な界面を維持するために溶鋼-溶融スラグ間の界面張力を高く設定するように溶融スラグの組成が設計されている。しかしながら、溶鋼-溶融スラグ間に化学反応が生じる際には、界面張力が低下することが古くから報告されているが、界面張力の化学反応による動的変化の機構は未だ詳細は不明である。本研究では、上記現象の機構解明のために、主として酸素の界面への過剰吸着に着目し、界面張力の低下を説明できる定量モデルの導出を試みる。
衛星海面高度計データを用いた全球における絶対海面力学高度場と流速場の推定と評価

人工衛星海面高度計のデータから海面高度の時間変動成分の時系列を作成し、別に求めた海面力学高度の時間平均場と組み合わせることにより、全球における絶対的な海面力学高度場を求めた。平均海面高度場(海面流速場についても同様)として、気候学的な密度場に基づいて求めた平均場(以下、気候学平均場)と、最新のジオイドモデルを用いた平均場(以下、ポテンシャル平均場)を作成した。気候学平均場については、Teagueら(1991)の1000db準拠のもの、World Ocean Atlas94の1000db・2500db準拠のものを用い、ポテンシャル平均場についてはTOPEX/POSEIDON-JGM3モデルを用いた。時間平均場の精度を評価するため、海面高度の格子点データから求めた平均流速場について、ドリフタ-ブイの軌跡から求められた平均海面流速場との比較を行った。その東西流速については、南北20°C以内の低緯度域と南大洋において両者間の差が大きい。低緯度域では、気候学平均場を用いた方が差が小さい。地衡流を考えた場合、ジオイドの誤差の影響は低緯度ほど相対的に大きく現れる。南大洋では、東西流速についてはポテンシャル平均場の方が差が小さく、ポテンシャル平均場の方がよい精度を与える可能性を示唆している。また、気候学平均場についても、1000db準拠のものより2500db準拠のものの方が差が小さく、全球について一律の無流面を仮定することが適当でないことを示唆している。南大洋における流速場の性質を詳しく調べるため、3年間のアルゴスブイデータと絶対流速場との比較を行った。東向き流速については、系統的にドリフタ-ブイの方が非常に速い場合が多く、フロントに伴う強い流れが再現されていないことが分かる。現実の東西流速を十分に表現するためには、緯度方向に密な平均場の精度の向上が必要である。
ボトムライン・メンタリティが個人の学習行動に与える影響に関する理論的・経験的研究

本研究の目的は、ボトムライン・メンタリティ(Bottom-Line Mentality以下BLM)が、個人の学習行動に与える影響を検討することである。1年目は、文献調査をもとにしたBLMに関する理論的研究と、本調査に向けた予備的分析を行った。理論的研究では、既存のBLM研究の視点が、個人の非倫理的行動にのみ、焦点を当てていることを指摘し、BLMが個人に与える影響について、幅広い視点から検討を行った。理論的な検討の結果、BLMが個人の中で強まると、個人は組織における自らの生存を追求するような行動をとることを指摘した。そのため、BLMは、個人の自らの成果に直結するような行動を促すことが考えられ、その結果、個人のプロアクティブ行動に影響を与えると予想されることを指摘した。これらの理論的枠組をもとにしながら、個人のBLMが、彼/彼女らの行動にいかなる影響を及ぼすかを検討するため、オンライン調査から得られたデータをもとに、分析を行った。分析の結果、個人のBLMが強まることにより、自らの成果向上に繋がりうる、自己志向的行動をとりやすくなる一方、他者志向的行動は減少しやすくなることが示唆された。本研究の成果は、2018年度組織学会研究発表大会(東京大学)にて発表した。1年目は、BLMと学習行動に関する理論的研究、および2年目に控えた調査に向けた準備を中心に研究を進めてきた。理論的研究に関しては、BLMと個人の行動の関係を説明する理論や、学習行動の促進要因と低減要因を検討した。また二年目のの調査に向けた準備に関しては、オンライン調査から得られたデータをもとに、ボトムライン・メンタリティと、学習行動や援助行動の関係について分析を行った。複数時点におけるデータの入手については、引き続き調査協力者と調整を行っている。2年目に向けて、ボトムライン・メンタリティの理論的な整理は進んできており、本調査のための予備的分析も完了しているため、本研究は概ね順調に進展していると言える。最終年度となる2年目では、本調査の実施及び、査結果の分析と考察が中心となる。当年度は、1年目の理論研究の成果及び、先行研究の問題点を踏まえた分析枠組みのもと、質問紙調査を通じた経験的研究を行う。なお、経験的調査では、オンライン調査と、企業に対する調査の両方を予定している。また、神戸大学の鈴木竜太教授や、椙山女学園大学の砂口文兵講師とともに、ボトムライン・メンタリティに関する実験も予定している。それらの調査と分析の結果を踏まえ、学会報告と国際雑誌への投稿を行う予定である。勤務校における、入試業務、学生の海外引率等の業務により、研究費の十分な執行が果たせなかったためである。ただし、論文やデータ分析のソフトについては、フリーソフトを使用していたため、研究の推進自体には問題は生じなかった。今回発生した助成金は、今年度におけるデータの入手や調査費として執行される予定である。

具体的には、オンライン調査にて複数時点におけるデータの入手や、個別企業への質問紙の配布や、調査訪問費として使用する。また、本研究の成果をもとにした論文執筆、英文校正、さらには学会発表のための交通費等に使用する。
震災体験は3年後の子どもの社会生活能力に影響を及ぼすか

三陸沿岸部で出生コホート調査を進めており、その途中で大震災を体験した。震災時は社会生活能力を調べる5歳半調査を進めていたが、震災前に調査を終了した群(震災前群)と震災後に実施した群(震災後群)が生じた。この2群を比較したところ、震災後群で社会生活能力の低下が示された。そこで、本申請では、震災から3年後の社会生活能力を調べ、比較を行った。10歳児を対象とした結果から、震災前群と震災後群で統計学的な差異は観察されなかった。我々は、周産期における環境由来化学物質が出生児の成長や発達に及ぼす影響を調べるために、気仙沼市で2003年より出生コホート調査を進めてきた。生後66ヶ月調査を進めている途上で東日本大震災が発生した。この東日本大震災は、気仙沼市に甚大な被害をもたらした。そのため、これらの調査は、震災前に調査を実施した群と震災後に調査を実施した群が発生した。震災前までに全対象児で調査が終了している基礎属性などに関しては、これら2群間に差異は認められなかったにもかかわらず、生後66ヶ月調査結果には差異が認められ、震災後に実施した群の生後66ヶ月調査の得点が有意に低くなった。これは、東日本大震災は子どもの発達に影響を及ぼしたと考えられた。そこで、震災から3年が経過した生後120ヶ月時の社会生活能力及び震災後のストレスを評価し、震災が子どもに及ぼす影響を調べることとした。平成26年度は、120ヶ月調査を進めてきた。ここでは継次的な変化を調べるために、生後66ヶ月調査で実施した新版S-M社会生活能力検査を実施することとした。現在、データを集計中であるため途中経過ではあるが、平成26年12月31日までに421名を対象に質問票を送付し、337名から回答を得ており、回収率は80%を維持することができた。現段階では新版S-M社会生活能力検査の得点が著しく低い対象児や震災後ストレスの得点が異常値を示す対象児は確認されていない。調査は順調に進行しており、追跡率も高い推移を担保することができた。平成27年度も同様の方法で調査を進めていく計画である。我々は、胎児期における環境由来化学物質が出生児の成長や発達に及ぼす影響を調べるために、気仙沼市で平成15年より出生コホート調査を進めてきた。生後66ヶ月(5歳半)調査を進めている途上で東日本大震災が発生した。震災前までに情報の収集が完了した基本属性については、これらの群間に差異は認められず、同様の集団であると思われたにもかかわらず、生後66ヶ月調査結果には差異が認められ、震災後に実施した群の生後66ヶ月調査の得点が有意に低くなった。以上より、東日本大震災は生後66ヶ月調査に影響を及ぼしたと考えられた。そこで、震災から3年が経過した生後120ヶ月時にも生後66ヶ月調査と同様の調査を実施し、震災が子どもの発達に及ぼす影響を検証することとした。平成27年度は、平成26年度と同様に生後120ヶ月調査を継続した。平成27年度には、197組の母子が対象となり、150組より回収が得られた(追跡率76.1%)。生後120ヶ月調査は今年度で完了しており、総合的な追跡率をみると、713名を対象に質問票を発送し、568名から回収を得た(追跡率79.7%)。平成28年度は、これまでの調査結果を入力し、震災の影響を解析する計画である。平成27年度は、これまでの調査を続けて継続し、研究実施計画通りに生後120ヶ月調査を進めることができた。ここでは生後66ヶ月調査の結果から継次的な変化を調べるために、生後66ヶ月調査で用いた新版S-M社会生活能力検査を実施した。平成27年度で調査が完了しており、全体として79.7%の追跡率を維持することができ、目標とした75%を上回る回収率であった。新版S-M社会生活能力検査の得点が著しく低い対象児や震災後のストレス得点が異常値を示す対象児は確認されなかった。データ入力がまだ未完了であることから、平成28年度にはデータ入力やダブルチェック、データの電子化を進めていく計画である。また、生後66ヶ月調査の結果を論文化する計画であったが、投稿できなかったため、平成28年度には論文を投稿する予定である。我々は、東日本大震災が発生する前からメチル水銀の曝露影響を検証するために、前向き出生コホート調査を進めてきた。その途上で東日本大震災を経験したため、震災発生前に質問票を実施した子どもと東日本大震災が発生後に質問票を実施した子どもの2群が生じた。東日本大震災が発生した当時には、子どもたちが生後66ヶ月(5歳6ヶ月)時の調査を進めており、ここでは新版S-M社会生活能力検査を実施してきた。新版S-M社会生活能力検査では、社会生活能力指数(子どもが自立した生活を送るために必要な能力)が算出されるが、この2群の社会生活能力検査の結果を比較したところ、統計学的に有意な差が認められ、震災後に調査を実施した群で得点が低くなることが示された。

そこで、本研究では、対象児が10歳のときにも同じ調査を実施し、震災直後に見られたその差がどのように変化しているかを検証することとした。平成27年度までに全対象児で新版S-M社会生活能力検査の実施を終えており、平成28年度には収集したデータの整理を行い、入力を行うことができた。計画では、データの精査、統計解析および学会などでの発表を予定していたが、研究代表者が東北大学から秋田大学に移動することとなったため、研究が計画通りには進まなかった。そこで、平成29年度まで研究機関の延長を申請した。平成29年度には、入力データの精査、統計解析を行い、研究をまとめていく計画である。平成28年12月より東北大学から秋田大学に所属を変更することとなり、そのため入力されたデータの精査及統計解析、また学会発表などに関する部分の遅れがある。所属を変更したため、一年間の延長をご許可いただいたため、平成29年度に解析や発表を進める計画である。なお、調査によるデータ収集は問題なく終了しており、研究目的は達成できる。我々は、2003年より三陸沿岸部で出生コホート調査を進めており、その後、大震災を体験した。震災時は社会生活能力を調べる生後66ヶ月(5歳半)調査を進めていたが、震災前に調査終了した群と震災後に実施した2群が生じた。その2群を比較したところ、震災後群で社会生活能力の低下が示された。震災等の異常な出来事の後に、PTSD様症状や過度のストレス症状を示す子どもがいることは周知の事実であるが、出来事から数年後に現れる子どもの存在が指摘されている。本申請では、1.震災から3年後の社会生活能力を調べ、震災影響を調べるとともに、2.出生コホート調査で収集した出生時からの過去データを用いて、震災影響を受けやすい子どもの特徴を明らかにすることを目的とした。調査は計画通りに順調に終了することができ、追跡率は8割を越えており、コホートとしての機能を十分に維持できていると考えられた。調査は、計画通りに進めることができたが、最終年度に研究代表者が所属を変更したために研究期間を延長し、平成29年度に解析を進めた。解析結果として、生後120ヶ月児(10歳)を対象として推定した社会生活能力指数は、震災前群と震災後群で統計学的な差異は観察されなかった。生後66ヶ月時には差異が認められたことから、震災後数年の間に子どもたちがキャッチアップしたか、もしくは、震災前群も被災を受けたことから社会生活指数が低下したかが考えられた。また、社会生活能力指数には、育児環境や親のIQが関連していることが示された。三陸沿岸部で出生コホート調査を進めており、その途中で大震災を体験した。震災時は社会生活能力を調べる5歳半調査を進めていたが、震災前に調査を終了した群(震災前群)と震災後に実施した群(震災後群)が生じた。この2群を比較したところ、震災後群で社会生活能力の低下が示された。そこで、本申請では、震災から3年後の社会生活能力を調べ、比較を行った。10歳児を対象とした結果から、震災前群と震災後群で統計学的な差異は観察されなかった。平成26年度は、研究実施計画どおりに生後120ヶ月調査を進めることができた。ここでは生後66ヶ月調査の結果から継次的な変化を調べるために同様の新版S-M社会生活能力検査を実施した。平成26年12月31日までに421名を対象に質問票を送付し、337名から回答を得た(回収率80%)。
エチオピア先天異常児の実態調査-いわゆる嬰児「まびき」撲滅を目指して-

1.平成31年2月22日3月8日まで、研究分担者夏目長門、西原一秀、高橋直樹、岐部俊郎、久高南美子がアジスアベバ及びブタジラにて現地調査及びアンケート調査を行った。3.「ライプチヒコンセンサス」として、本研究成果をもとにいわゆる嬰児「まびき」撲滅を目指したコンセンサスを行った。エチオピアでは先天異常児への対応は遅れており、また、患児の母親への正確な知識がない事のみならず、医療者自身も専門的な知識が不足していることが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.平成27年2月9日から14日大谷浩(島根大学)がアワサ大学において、平成27年2月16日から25日まで西原一秀(琉球大学)ら10名がアジスアベバおよびブタジラにて、平成27年3月23日から29日まで夏目長門(愛知学院大学)ら4名がアジスアベバおよびオロミア州にて現地調査およびヒアリングを行った。2.先天異常の出生数、医療施設専門病院の実態調査を行った。1.平成28年2月20日から27日まで、古川博雄、夏目長門がアジスアベバおよびアジスアベバ大学において、平成28年2月20日から28日まで、西原一秀、岐部俊郎、高橋直樹、古波蔵大祐がブタジラにて現地調査およびヒアリングを行った。また、エチオピア人遺伝子サンプル18名分入手した。2.アジスアベバ大学歯学部講師Samson Negussie Garedewを10月1日から12月3日まで招聘し、研究分析会議および口唇口蓋裂を中心とした先天異常発生頻度および口唇口蓋裂の治療に関するエチオピアと日本の比較研究を行った。4.本学倫理委員会に研究調査の申請を行った。2月の派遣訪問で口唇口蓋裂医療状況の概要の再把握ができ、今後の調査を行う上での基盤ができた。1.平成29年2月6日から14日まで、西原一秀、鈴木聡、西亨啓、坂元結、Muhammad Subhan Amir、Tran Le Duyがアジスアベバ大学およびブタジラにて現地調査及びヒアリングを行った。また、平成29年2月7日から14日まで大谷浩がアワサ大学において現地調査を行った。3.研究成果の一部を第40回日本口蓋裂学会および歯科保健医療国際協力協議会において発表した。研究目標であるエチオピアの医療に適した先天異常治療プロトコール作成と調査実施は、現地アワサ大学Dr. Zenebe Wolde Jijoらとも綿密、緊密な連絡を取り協力を得られて、調査は順調に推敲できている。また、技術移転の効果の評価のための調査も順調に進んでいる。研究成果をもとにエチオピアの先天異常、特に口唇口蓋裂についての正しい知識を提供すべく研究成果公開促進費『Understing for care of cleft lip and palate in Ehiopia』(研究代表者:夏目長門)を得て、エチオピア語に翻訳して2017年度に出版を予定している。1.平成30年1月28日2月7日まで、西原一秀、岐部俊郎、高橋直樹、新崎章がブタジラにて現地調査及びヒアリングを行った。また、ボンガとジーマにおいてアンケート調査を行った。研究目標であるエチオピアの医療に適した先天異常治療プロトコール作成と調査実施は、現地アワサ大学Dr.Zenebe Wolde Jijoらとも綿密、緊密な連絡を取り協力を得られて、調査は順調に遂行できている。しかし、同国でデモ等国内政情が不安定で、これがリスク要因となっている。2、3月の派遣訪問で口唇口蓋裂医療状況の概要の把握ができ、今後の調査を行う上での基盤ができた。2月の調査概要を第40回日本口蓋裂学会総会・学術集会で報告。アワサ大学において先天異常発生率を調査していく。1.エチオピアにおける先天異常児の出生数、先天異常治療の実態調査、平均寿命、口唇口蓋裂治療など疾患別の治療に携わる施設数、専門家人数、歯科医療教育の実態調査などの実態調査をアワサ大学で行う。2.昨年度に収集したデータを入力、分析する。3.エチオピアのアジスアベバ、ブタジラ等にて現地調査を行う。(2018年2月を予定)4.エチオピアの「まびき撲滅」のためのセンター設立のための外務省日本NGO連携無償資金協力を行う。5.国内外の学会にて成果を発表する。

また、5年間のデータの分析を行う。3.エチオピアのアジスアベバ、ブタジラにて現地調査を行う。(2019年2月予定)4.エチオピアの「まびき」撲滅のためのセンター設立のための外務省日本NGO連携無償資金協力を行う。5.日本先天異常学会および12th ICPF Congress(ドイツ・ライプチヒ)において成果発表を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2月の調査概要を第39回日本口蓋裂学会総会・学術集会で報告。3月の調査概要もしかるべき学会で報告予定である。近々の本学倫理委員会に今回の研究調査の申請を行い、エチオピアではアディスアベバほか地方各地でも口唇口蓋裂医療現状を調査していく。
微小管変性を中心としたタウオパチー神経変性機序の解明

高齢者に見られる認知症の大多数は、タウオパチーと呼ばれる特徴的な病理像を呈する。タウオパチーの発症機構については諸説有るものの、実際の病理変化を十分に説明できるものは無かった。本研究において、主要な細胞骨格である微小管を構成するタンパク質・チューブリンの消失を起点と考えることにより、タウオパチーの病理変化をよどみなく説明できることがわかった。これは認知症の解明、または新たな治療法開発につながるものである。タウオパチーとは変性神経細胞内に微小管結合タンパク・タウからなる封入体を形成する疾患の一群である。タウオパチー脳にみられる変性神経細胞ではタウの蓄積以外の主要な病変として微小管の消失が知られている。このタウの蓄積と微小管の消失には何らかの関連が疑われているものの、その因果関係については不明であった。本研究では実験的な微小管変性状態がタウによる神経毒性に与える影響について検討した。微小管は細胞内における主要な骨格タンパクであり、細胞の構造の維持、細胞分裂、細胞内輸送など多くの重要な生命活動を担っている。そのため、個体レベルでのチューブリン発現低下は不可能であった。一方、Mec-12は線虫のtouch neuronに特異的に発現するチューブリンであり、その神経機能以外には影響を及ぼさないことが知られている。また、この神経の機能異常はタッチアッセイによって簡便に検出できる。さらに、線虫はフィーディングRNAi法による特異的な遺伝子発現抑制が可能であり、本研究の目的を遂行できる唯一のin vivo実験系といえる。コントロール線虫に対するMec-12の不完全な発現抑制は中程度の神経機能障害を呈した。一方、タウを発現する線虫では、mec-12RNAiによる機能障害がより強く惹起された。これより、チューブリンの発現低下により、タウの神経毒性が惹起されることがあきらかとなった。つぎに、タウ発現により機能異常を呈する線虫にヒトチューブリンを発現させた結果、タウによる機能異常が軽減された。以上より微小管の消失自体がタウオパチー発症の鍵であり、タウ/チューブリンの発現比を正常な範囲にとどめることがタウオパチー予防に重要であると考えている。現在これらタウ線虫を用いた生化学的解析をすすめ、神経障害時のタウ、チューブリンの挙動、さらには治療へ向けた薬物スクリーニングを進めている。本研究では、タウオパチー変性神経細胞の普遍的特徴である、微小管変性の位置づけについて解析したものである。前年度のタウ発現線虫を用いた解析により、2つの異なる方法におけるチューブリンの発現低下が、いずれもタウオパチーを惹起する事が示された。また、この神経変性がタウの発現量に厳密に依存することから、タウ/チューブリンバランスの異常な上昇がタウオパチー神経変性のきっかけになると考えた。本年度はさらに生化学的解析を進め、本仮説の焦点となりうるタウ/チューブリン複合体の同定、およびチューブリン過剰発現による症状改善の可能性について検討した。生化学的解析の結果、線虫に発現させたタウは高度にリン酸化されており、微小管への結合活性が失われていた。一方、微小管非結合画分に回収されるリン酸化タウは、これまでの想定に反し、チューブリンダイマーと安定な複合体を形成していることが明らかとなった。これより、タウオパチー発症にかかわるタウ/チューブリンバランスはこの可溶性の複合体がターゲットであると結論づけた。さらにin vitroの解析により、チューブリンの存在により、タウの重合、不溶化が抑制されることを見出した。これより、可溶性のチューブリンに替わるタウの結合パートナーがタウオパチーを抑制する可能性が考えられた。現在、mCherryにα-tubulinのC-末端51残基を結合させた融合タンパクmCh-C51が、タウと複合体を形成すること、培養細胞等において十分な発現が得られる事を確認している。さらに線虫神経系に対する発現ベクターの構築を終え、本仮説検証の最終段階である、レスキュー実験を進めているところである。本研究により、高齢者認知症の大多数を占めるタウオパチー発症について、新たな発症メカニズム、および新規治療法の可能性を提唱できたと考えている。
ケラタン硫酸分解による脊髄損傷治療-臨床に直結した新規治療法の開発-

生体内で安定したケラタン硫酸(KS)分解酵素の安全性確認後、ラット胸髄圧挫損傷モデルを作成して酵素投与を行い、下肢運動機能の回復や感覚機能回復、組織学的回復を、神経保護作用とともに確認した。脊髄損傷による下肢麻痺回復後にアロデニアを認めなかった。骨髄幹細胞移植やリハビリテーションとの併用効果は、損傷後2週からの亜急性期以降に効果がみられたが、下肢関節拘縮の個体ではリハビリテーションの効果がなかった。KS分解酵素は脊髄再生においてアロデニアを生じない運動機能回復効果とともに、神経保護や痕抑制効果により、細胞移植やリハビリテーションに適した環境が整えられると考えられ、今後の臨床応用が期待できる。当初の予定通りラット脊髄圧挫損傷モデルを作成し、ケラタン硫酸分解酵素を投与した。IHインパクター使用と200kdynの圧挫設定により、圧挫後は完全麻痺の脊髄損傷を惹起し安定した脊髄損傷モデルを作成できることが確認された。酵素を投与した治療群と、生理食塩水を投与したcontrol群で、脊髄損傷後の生存に差はなく、治療群で明らかな副作用を認めなかった。治療群とcontrol群の脊髄損傷後下肢運動機能回復をBBBスコアを用いて測定すると、治療群ではcontrol群に対し有意に良好な回復を示した(治療群のBBBスコア平均8.5、control群は平均4.5)。Von freyfilamentを用いた知覚試験と圧、熱感覚試験では治療群でアロデニア症状を認めないことが確認され、知覚の回復も良好であった。電気生理学的検査では、経頭蓋刺激で下肢腓腹筋のモニタリングを行った(MEP)。MEPにおける振幅の評価では、治療群で有意に振幅の回復を得ており、前述の脊髄損傷後下肢運動機能回復を裏付ける結果であった。SpSCEPは感覚系神経回復を確認可能な脊髄モニタリング検査であるが、SpSCEPでも治療群で有意な潜時の回復を得た。免疫組織染色では神経系染色として、Gap43、5-HT染色にて、治療群で有意に多いpositive fiberを認めた。またCollagen IVで染色した脊髄損傷部の瘢痕面積は、治療群で有意に小さかった。以上より、治療群では軸索再生を抑制する瘢痕形成が有意に小さく、神経fiberが有意に多く、脊髄損傷後の運動機能、知覚ともcontrolに比べ有意に良好な回復を示すことが確認された。ラット脊髄損傷モデルにトレーサーを用いたKS分解酵素による軸索再生促進の評価を行った。脊髄損傷後8週間で、麻酔下に脳へ10%BDA(Invitrogen社)を左右3.5μlずつ注入し、その2週間後sacrificeし、蛍光画像解析システムにて新生軸索のFiber countや軸索再生、sproutingの形態などを解析した。Countは、metamorphソフトを使用して客観的な定量を行い、損傷部位から頭側10mmのBDA陽性線維数に対する、損傷部位から尾側10mmのBDA陽性線維数の比で評価した。治療群では有意に尾側10mmでのBDA陽性線維数比が高かった。また、骨髄間質細胞移植とKS分解酵素の併用を行った。骨髄由来幹細胞の抽出培養と遺伝子導入法のヌクレオフェクション法、そして遺伝子移入した骨髄幹細胞を損傷亜急性期に細胞移植した。KS分解酵素は損傷直後からくも膜下腔に2週間連続投与した。併用療法を行った動物と行わなかった動物では併用療法群で多い軸索を認めているが、個体数を増やし今後も検討を継続する予定である。運動機能回復についてはラット脊髄損傷モデルに骨髄間質細胞移植とKS分解酵素併用でよい運動機能回復傾向にあるが、個体数を増やし検討を要する。KS分解酵素により細胞移植に適した環境が整えられると考えており、これらの併用療法が脊髄損傷治療に、より高い効果を発揮する可能性が示唆されている。平成27年度はトレーサー試験、細胞移植との併用療法が前述の通り、当初計画書に予定した通り進捗しているため。生体内で安定したケラタン硫酸(KS)分解酵素の安全性を検証するとともに、in vivoではラット脊髄損傷モデル、特に臨床に近い胸髄圧挫損傷モデルを作成して酵素投与を行い、下肢運動機能の回復や感覚機能回復、組織学的検討を行い、その効果とメカニズムを検証した。下肢運動機能、下肢感覚機能回復、酵素投与後に異常痛覚(アロデニア)を生じていない検証に関しては、より客観的な指標である電気生理学的検査も行った。その結果、脊髄圧挫損傷後の運動機能回復はsproutingを含めた軸索伸長効果が確認され、BDAやDiIを用いたトレーサー実験でも、損傷尾側脊髄への有意に多い軸索が観察された。同時にLFB染色の結果などから神経保護作用もみられた。脊髄損傷による下肢麻痺回復後の感覚障害に関してはアロデニアを認めず、感覚神経に関しても神経保護効果が確認された。電気生理学的検討では、下肢の前脛骨筋、腓腹筋のcompound muscle potentialはKS分解酵素投与群で有意に回復し、感覚神経を評価可能なSEPも同様の効果を示した。トレッドミルを用いたリハビリテーションとの併用効果は、損傷後2週からの亜急性期以降に効果がみられた。しかし脊髄損傷後の下肢関節拘縮の個体ではリハビリテーションの効果がなく、組織学的検討でも損傷部の瘢痕組織が形成され、軸索伸長が阻害されていた。KS分解酵素は脊髄再生においてアロデニアを生じない運動機能回復効果に寄与することが示されたが、その投与タイミングやリハビリテーション併用タイミングも重要であり、今後のさらなる研究を要する。

現在研究をまとめる最終段階に入っている生体内で安定したケラタン硫酸(KS)分解酵素の安全性を検証するとともに、in vivoではラット脊髄損傷モデル、特に臨床に近い胸髄圧挫損傷モデルを作成して酵素投与を行い、下肢運動機能の回復や感覚機能回復、組織学的検討を行い、その効果とメカニズムを検証した。下肢運動機能、下肢感覚機能回復、酵素投与後に異常痛覚(アロデニア)を生じていないことを検証するため、より客観的な指標である電気生理学的検査も行った。その結果、脊髄圧挫損傷後の運動機能回復はsproutingを含めた軸索伸長効果が確認され、BDAやDiIを用いたトレーサー実験でも、損傷尾側脊髄への有意に多い軸索が観察された。同時にLFB染色の結果などから神経保護作用もみられた。脊髄損傷による下肢麻痺回復後の感覚障害に関してはアロデニアを認めず、感覚神経に関しても神経保護効果が確認された。電気生理学的検討では、下肢の前脛骨筋、腓腹筋のcompound muscle potentialはKS分解酵素投与群で有意に回復し、感覚神経を評価可能なSEPも同様の効果を示した。骨髄幹細胞移植やトレッドミルを用いたリハビリテーションとの併用効果は、損傷後2週からの亜急性期以降に効果がみられた。しかし脊髄損傷後の下肢関節拘縮の個体ではリハビリテーションの統計学的有意な効果がなく、組織学的検討でも損傷部の瘢痕組織が形成され、軸索伸長が阻害されていた。KS分解酵素は脊髄再生においてアロデニアを生じない運動機能回復効果とともに、神経保護や痕抑制効果により、細胞移植やリハビリテーションに適した環境が整えられると考えられ、今後の臨床応用が期待できる。生体内で安定したケラタン硫酸(KS)分解酵素の安全性確認後、ラット胸髄圧挫損傷モデルを作成して酵素投与を行い、下肢運動機能の回復や感覚機能回復、組織学的回復を、神経保護作用とともに確認した。脊髄損傷による下肢麻痺回復後にアロデニアを認めなかった。骨髄幹細胞移植やリハビリテーションとの併用効果は、損傷後2週からの亜急性期以降に効果がみられたが、下肢関節拘縮の個体ではリハビリテーションの効果がなかった。当初の計画通り、ラット脊髄損傷モデルの確立、治療群での副作用確認、治療群とcontrol群での運動機能、知覚の比較、電気生理学検査、免疫組織学的検討などが達成され、現在ケラタン硫酸のmolcule分析を行っており、おおむね順調に進展している。計画書の予定通り、平成28年度は細胞移植併用のエビデンスを確立するとともに、リハビリテーションの効果を検討し、実証する予定である。現在順調に進捗しており、特に支障はない。今後は複数動物種に対する治療効果や治療介入のタイミングを計る研究をすすめていく。整形外科引き続きプロテオグリカンのコアタンパクなど分子生物学的検討を行う。さらに今後は当初の計画通り、トレーサーによる軸索再生の評価や細胞移植併用との比較検討を行う。現在のところ、特に克服すべき問題や課題はない。