hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔粘膜由来ｉＰＳ細胞を用いたセメント質・歯根膜再生型インプラントの開発

由来iPS細胞を用いた実験系においても、1)エムドゲイン®がMsx1およびLhx6の発現を誘導すること、2)マトリゲル®がMsx1の発現を誘導すること、3)GFRマトリゲル®(含まれる生理活性物質を除いたマトリゲル®)は誘導活性を失っていること、4)Pax9はHAT-7細胞の共存下のみに誘導されること、5)HAT-7の培養上清中には誘導活性が認めらないことが明らかとなった。また、エムドゲイン、マトリゲル、HAT-7それぞれの分化誘導能については骨髄由来生体幹細胞の場合と同様に口腔粘膜由来iPS細胞においても差を認めた。以上の結果より、口腔粘膜由来iPS細胞は歯原性間葉細胞への分化能を有しているとともに、エムドゲイン®、、マトリゲル®中およびHAT-7細胞表面に幹細胞を歯原性間葉細胞へ分化誘導する因子が含まれていることが強く示唆された。本研究は、ドナー側に比較的制限がなく、負担が軽いと考えられる口腔粘膜から採取した組織から樹立したiPS細胞を用いて、エムドゲインおよびマトリゲル中や、HAT-7細胞表面上に存在している歯原性間葉細胞分化誘導因子を利用して、口腔粘膜由来iPS細胞のセメント芽細胞、歯根膜細胞への分化誘導を試みるとともに、その成果を応用してセメント質・歯根膜再生型インプラントの開発につなげようとする新しい研究である。本研究により、口腔粘膜由来iPS細胞を用いたセメント質・歯根膜再生型インプラントが可能となれば、歯原性細胞のない無歯顎患者においてもより理想的な咬合・咀嚼機能の回復が可能となるものと考えられる。本研究においては、エムドゲインおよびマトリゲル中に含まれている歯原性間葉細胞分化誘導因子、HAT-7細胞表面上に発現していると考えられる分化誘導因子の同定し得たことから、口腔粘膜由来iPS細胞の歯原性間葉細胞への分化誘導を行うことが可能となったことからセメント質・歯根膜再生型インプラントの開発の基盤は確立できたものと考える。骨髄間質由来成体幹細胞の歯原性細胞への分化誘導についての研究から、エムドゲイン、マトリゲルの存在下にHAT-7細胞との共培養を行い、歯の発生過程で発現する転写因子であるMsx1、Pax9、Lhx6の発現を口腔粘膜由来iPS細胞でも同様に認めたことから、口腔粘膜由来iPS細胞を用いた検討でもセメント芽細胞、歯根膜細胞への分化誘導が可能と考えられ、その成果を応用してセメント質・歯根膜再生型インプラントの開発につなげられると考える。前年度までに同定された分化誘導因子を、Terminal-modified poly(ethylene glycol)法(Biomaterials 30:1281-1286, 2009)あるいはトレシルクロリド法により、チタン表面への固定する(図8)。誘導因子を固定化したチタン表面上で口腔粘膜由来iPS細胞を培養し、細胞接着を走査型電子顕微鏡観察およびCrystal violet染色法により評価する。また口腔粘膜由来iPS細胞の歯原性間葉細胞、セメント芽細胞、歯根膜細胞への分化状態をRT-PCR法、Western blot法により検討する。さらに、前項と同様の方法で表面を処理した円筒状チタンの表面で口腔粘膜
神経回路特異的なシナプトソーム調整法の確立

大脳皮質など、多様な細胞の複雑な回路からなる脳組織の機能や、その発達・可塑性を支える分子機構を理解するためには、特定の神経回路での機能分子の振る舞いを単離して吟味する必要がある。そのため、対象とする神経投射をあらかじめ標識しておき、標識されたシナプス結合部位を含むシナプトソーム標本を調製することを試みた。大脳皮質視覚野に種々の蛍光トレーサを注入し、皮質より調整したシナプトソーム標本をフローサイトメトリー解析により蛍光強度依存的に分離した。その結果、カルボシアニン系色素DiIによって標識した標本で、蛍光強度が強く、かつシナプスマーカー蛋白陽性の、蛍光標識シナプトソームを得ることができた。神経回路の機能やその可塑性を理解するには、シナプスでの分子変化に注目する必要がある。シナプスを構成する機能分子群は、それぞれの神経結合で異なっているが、脳組織全体よりサンプルを調製すると、シナプス部分だけでなく神経細胞の様々な部分が含まれてしまう。さらに、全ての神経結合に由来する成分が混在するため、特定のシナプスにおける変化は確認しがたい。そこで、あらかじめ標識しておいた特定の神経結合に由来するシナプトソームを単離することで、これらの問題の解決を目指す。本課題では、視覚野への入力軸索をモデル系とし、以下の2段階に分けて研究を遂行する。1)蛍光蛋白質標識を用いた特定シナプトソームの回収法を確立する。2)視床ニューロンを標識し、視床-皮質シナプス由来のシナプトソームを回収する方法を確立する。初年度は、GFP発現動物を用いて、蛍光標識を指標にシナプトソームを単離・回収するプロトコルを検討した。大脳皮質のV/VI層ニューロンに選択的にGFPを発現する遺伝子改変マウスを用いて、GFP発現ニューロンと発現していないニューロンに由来するシナプトソームの混合標本を調製した。その標本より、蛍光シグナルを手掛かりとして、GFP発現ニューロンに由来するシナプトソームを、セルソーターを用いて分離、濃縮することを試みた。この過程で、シナプトソームが会合して塊になっていないかなど、セルソーターでの分離に適した標本を得るための条件検討を行った。本年度は、この成果を土台として、実際に蛍光トレーサーを視床に注入して視床-皮質投射軸索を標識した動物よりシナプトソームを調製し、標識投射に由来するシナプトソームを分離することを試みる予定である。2)脳に蛍光標識したトレーサーを注入することでニューロンを標識し、標識されたシナプス由来のシナプトソームを回収する方法を確立する。昨年度に確立したシナプトソーム回収法を基に、本年度は、実際に蛍光トレーサーを脳に注入して軸索を標識した動物よりシナプトソームを調製し、標識投射に由来するシナプトソームを分離することを試みた。蛍光標識したデキストランアミンなど数種類の神経トレーサーを大脳皮質に注入し、シナプトソーム標本を調製したところ、カルボシアニン蛍光色素DiIによって標識したシナプトソーム標本において、蛍光強度の強い顆粒群を検出した。次に、DiIを注入した大脳皮質についてシナプス前終末のマーカー蛋白の免疫染色を行い、DiIが軸索末端部分を標識していることを確認した。その後、注入部位より得られたシナプトソームを、フローサイトメトリー解析を用いて蛍光強度依存的に分離した。蛍光陽性集団と蛍光陰性集団について免疫染色を行い、標識シナプトソーム標本が単離できているかどうかを確認した。その結果、蛍光陽性集団に標識シナプトソーム標本が多く見られた。
野生動物(野鳥)を用いた環境モニタリング法の検討。(重金属の生体影響)

Cdに汚染された動物と非汚染の動物の比較からCd標準回帰直線(CSRL)の有効性が示された。CSRLと類似したPb標準回帰直線が得られ、Tlを含む有害元素の幾つかがこの2つの線上にあった。Tiは細胞内Cd含量を減少させ、TiとCdの同時処置により肝臓と腎臓のCd比がCSRLの等確率楕円内に戻ることが示された。Cdによる染色体DNAの変異はListeria monocytogensの血清型と関連することが示唆された。本研究の目的は、(1)カドミウム(Cd)非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)の有効性を検証すること、(2)バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(Tl)でも汚染判定指標を作成すること、(3)動物実験によりTiが他の有害重金属元素の毒性を軽減するか否かを検討すること、および(4)細菌L.monocytogenes(L.m.)に対するCdとVの影響(増殖性と変異原性)を検討することである。本研究の目的は、(1)カドミウム(Cd)非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)の有効性を検証すること、(2)バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(Tl)でも汚染判定の指標を作成すること、(3)動物実験によりTiがCd、VおよびMo毒性を軽減するか否かを検討すること、および(4)細菌であるL.monocytogenes(L.m.)対して、CdとVがどのように影響するかを増殖性と変異原性の両面から検討すること、の4項目である。(1):重原油汚染野鳥(第33回鳥類内分泌研究会)では急性中毒に近いdata、野鳥の雌雄(第147回獣医学会報告)では雄の上方移行と雌の下方移行、すなわち性差を示すdataが得られた。これらは、いずれもCSRLの有効性を示す成績と考えられる。(2):V、MoおよびTlの3元素については、予定通り各種の相関関係が腎臓と肝臓、および元素間で得られ、The 5^<th> International conference on energy,environment,ecosystems and sustainable development(2009.9)で報告予定である。このうちのMoの相関については、21年度中に動物に投与を行って汚染との関係を判断することになっている。(3)の動物実験では、TiがCdの毒性を軽減する成績が得られ、in vitroで得られた成績と矛盾しないことが示された。(4):CdがL.m.(L98-82B1株)で染色体DNAに影響を与えている成績を得た(第147回獣医学会報告)。本研究の目的は、(1)カドミウム(Cd)非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)の有効性を検証すること、(2)バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(T1)でも汚染判定の指標を作成すること、(3)動物実験によりTiが他の有害重金属元素の毒性を軽減するか否かを検討すること、および(4)細菌であるL.monocytogenes(L.m.)に対してCdとVがどのように影響するかを増殖性と変異原性の両面から検討すること、の4項目である。本研究の目的は、(1)カドミワム(Cd)非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)の有効性を検証すること、(2)バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(Tl)でも汚染判定指標を作成すること、(3)動物実験によりTiが他の有害重金属元素の毒性を軽減するか否かを検討すること、および(4)細菌L.monoeytogenes (L.m.)に対するCdとVの影響(増殖性と変異原性)を検討することである。本研究の目的は、(1)カドミウム(Cd)の非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)について、その有効性を検証すること、(2)バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(Tl)でもCSRLと同様な汚染判定指標を作成すること、(3)動物実験によりTiが他の有害重金属元素の毒性を軽減するか否かを検討すること、および(4)細菌L.monocytogenes(L.m.)に対するCdとVの影響(増殖性と変異原性)を検討することである。(1)(2)の成績:22年度までにCSRLの検証および対照とした4元素を包含するPb指標(Mochizuki-Uedaline)の作成を終了した。23年度は、総計40匹のマウスに200ppm40000ppmのPbを0.02mlずつ12回腹腔内投与して1週間1ヶ月後に、肝臓と腎臓中のPb量を原子吸光法で測定し、現在、成績をまとめているところである。

(3)の成績:22年23度は、モルモット摘出臓器標本(血管、盲腸紐、肝臓)を用いて、各種濃度の硫酸TiとCdを投与した場合の影響を検討すると共に総計30匹のICR♂マウスにCdとTiを飲水で投与して肝臓と腎臓中のCd含量を検討した。この結果、摘出臓器では低濃度Ti(10^<-5>M以下)による細胞内cd含量の有意な変化は得られなかったが、高濃度Ti(10^<-4>M以上)では細胞内Cd含量の減少が認められた。また、血管と盲腸紐を用いて平滑筋の張力試験を行ったところ、盲腸紐ではcdによる高濃度カリウム収縮の抑制がTiにより抑制される成績が得られた(J.Toxicol.投稿準備中)。これに対して、マウスで行ったin vivoの実験では、Tiによる肝臓と腎臓組織中Cdの有意な変化は得られなかった。現在、得られた両臓器のCd含量をCSRLに当てはめて検討しているところである。(4)の成績:23年度はCdとVを含む培養液中で培養したL.mから抽出した染色体DNAを用いて、どのような変異が起こっているのかを電気泳動法を用いて解析した。現在、Cdによる染色体DNAへの影響とL.m.の血清型との関連を検討しているところである。本研究の目的は、1カドミウム(Cd)の非汚染対照であるCd標準回帰直線(CSRL)について、その有効性を検証すること、2バナジウム(V)、モリブデン(Mo)、タリウム(Tl)でもCSRLと同様な汚染判定指標を作成すること、3動物実験によりTiが他の有害重金属元素の毒性を軽減するか否かを検討すること、および4細菌L.monocytogenes(L.m.)に対するCdとVの影響(増殖性と変異原性)を検討することである。12の成績: 22年度までにCSRLの検証および対照とした4元素を包含するPb指標(Mochizuki-Ueda line)の作成を終了した。24年度は、23年度に行ったマウスへのPb腹腔内投与の成績、および不足部分の追加実験を行いそれらの成績をまとめた。3の成績: 22年24年度で、モルモット摘出臓器標本(血管、盲腸紐、肝臓)を用いて、各濃度の硫酸TiとCdを投与した場合の影響を検討すると共に総計30匹のICR♂マウスにCdとTiを飲水で投与して肝臓と腎臓中のCd含量を検討した。この結果、摘出臓器では低濃度Tiによる細胞内Cd含量の有意な変化は得られなかったが、高濃度Tiでは細胞内Cd含量の減少が認められた。また、盲腸紐でCdによる高濃度カリウム収縮の抑制がTiにより抑制される成績が得られた(Biol.Trace Elem.Res.,2012)。また、マウスで行ったin vivoの実験では、Tiによる肝臓と腎臓組織中Cdに有意な変化は得られなかったが、両臓器のCd含量をCSRLに当てはめて検討したところ、Tiが存在する場合にはCSRLの等確率楕円内のより正常値に戻ることが示された。4の成績: 23年度はCdとVを含む培養液中で培養したL.mから抽出した染色体DNAを用いて、電気泳動法を用いて解析したところ、血清型4bと変異との関連生が示唆された。本研究は、本年度で終了となるが、既にカドミウム(Cd)の非汚染指標(CSRL)についての有効性の検討を終えて学術誌に公表している。さらに、鉛の非汚染指標(Mochizuki-Ueda line)が作製できたため、当初の計画では、タリウム、バナジウムなど4元素についても指標を作製するとしていたが、砒素などを含む8元素についての指標となる可能性が示唆されている。細菌L.monocytogenes(L.m)の染色体DNAに対するCdの影響でも、Cdが無作為に変異を起こさせるのではなく、血清型との関連がある結果を得ている。
アルツハイマー病における小胞輸送障害機構の解明

近年,アルツハイマー病(AD)の初期病態として,アミロイドβ(Aβ)の前駆体であるAPPカルボキシル末端断片・βCTFの蓄積による小胞輸送障害が注目されている.しかしその分子機構は明らかでなく,有効な測定系もないため,治療薬の開発は困難であった.当研究室では,Aβ配列を介してβCTFと結合する事で小胞輸送障害に関与するTMEM30Aを見出している.そこで本課題では,1両者の結合による小胞輸送障害機構の解明,2小胞輸送の経時的観察と定量評価法の開発,3小胞輸送障害を改善できる候補化合物の探索,以上3点を目指して研究を行う.近年,アルツハイマー病(AD)の初期病態として,アミロイドβ(Aβ)の前駆体であるAPPカルボキシル末端断片・βCTFの蓄積による小胞輸送障害が注目されている.しかしその分子機構は明らかでなく,有効な測定系もないため,治療薬の開発は困難であった.当研究室では,Aβ配列を介してβCTFと結合する事で小胞輸送障害に関与するTMEM30Aを見出している.そこで本課題では,1両者の結合による小胞輸送障害機構の解明,2小胞輸送の経時的観察と定量評価法の開発,3小胞輸送障害を改善できる候補化合物の探索,以上3点を目指して研究を行う.
島皮質におけるプロポフォールの局所神経回路制御メカニズムの解析

本研究は,大脳皮質におけるプロポフォールの作用について,ニューロンの組み合わせに着目し,単一シナプス応答性抑制性シナプス後電流の解析を行なった。その結果,(1)プロポフォールは,シナプス後細胞のGABA(A)受容体に作用し,抑制性介在ニューロンよりも錐体細胞を強く抑制する,(2)プロポフォールは大脳皮質において,抑制性シナプスのうち,シナプス前細胞がfast-spiking細胞,シナプス後細胞が錐体細胞のシナプスに対して最も強く作用することを見いだした。以上の結果からプロポフォールは,錐体細胞を選択的に抑制することにより,皮質からの出力を抑制して鎮静作用を発揮している可能性が考えられる。Propofolは,調節性に優れた静脈麻酔薬であり,全身麻酔の導入・維持や歯科治療時の静脈内鎮静法に頻用されている。これまでに,propofolはGABA(A)受容体に作用し,抑制性シナプス伝達効率を増加させることにより,その鎮静効果を発揮することが知られている。一方,大脳皮質は,興奮性細胞である錐体細胞と十数種類の抑制性介在ニューロンで構成されており,さらに,抑制性介在ニューロンの種類によりGABA(A)受容体のサブタイプの構成が異なることが報告されている。このことから,propofolの効果は,ターゲットとなるニューロンの種類により異なる可能性が考えられる。そこで本研究は,大脳皮質において,シナプス結合を有する複数のニューロンから同時ホールセル記録を行い,抑制性シナプス伝達に対するpropofolの効果について,ニューロンの組み合わせに着目し,単一シナプス応答性抑制性シナプス後電流(uIPSC)の解析を行ない,以下の結果を得た。1Propofolは,シナプス後細胞のGABAA受容体に作用し,抑制性介在ニューロンであるfast-spiking細胞(FS)ならびにnon-FSよりも錐体細胞を強く抑制した。2Propofolは大脳皮質において,抑制性シナプスのうち,シナプス前細胞がFS,シナプス後細胞が錐体細胞のシナプスに対して最も強く作用した。3Propofolは,大脳皮質のFS-FSの電気的シナプスに対して調節作用を示さなかった。以上の結果から,propofolは,抑制性介在ニューロンと比較して錐体細胞を強く抑制することにより,皮質からのoutputを抑制する事でその鎮静作用を発揮している可能性が考えられる。1. Propofolは,シナプス前細胞がfast spiking細胞(FS),シナプス後細胞がFS,non-FSまたは錐体細胞(Pyr)のシナプスに対して,シナプス後細胞のGABA(A)受容体に作用してuIPSCの持続時間を延長させた。2.シナプス後細胞がFSおよびnon-FSと比較してPyrのシナプスにおいて,propofolによるcharge transferの増大の絶対値は大であった。以上の結果から,propofolは,抑制性細胞と比較して錐体細胞を強く抑制することにより,その鎮静作用を発揮している可能性が考えられる。本研究は,大脳皮質において,シナプス結合を有する複数のニューロンから同時ホールセル記録を行い,抑制性シナプス伝達に対する静脈麻酔薬propofolの効果について,ニューロンの組み合わせに着目し,単一シナプス応答性抑制性シナプス後電流(uIPSC)の解析を行ない,以下の結果を得た。1,propofolは,シナプス後細胞のGABA(A)受容体に作用し,抑制性介在ニューロンであるfast-spiking細胞(FS)ならびにnon-FSよりも錐体細胞を強く抑制した。2,propofolは大脳皮質において,抑制性シナプスのうち,シナプス前細胞がFS,シナプス後細胞が錐体細胞のシナプスに対して最も強く作用した。

Propofolは,脳波を覚醒時の低振幅速波から高振幅・徐波化させ,アルファ周波数帯を増強することで意識消失をひき起こす可能性が近年になって複数示された(Feshchenko et al., 2004; Ching et al., 2010; Andrada et al., 2012)。脳波は大脳皮質における錐体細胞の活動性を反映していると考えられていることから,propofolは,錐体細胞に対する抑制性シナプス伝達を増強することで,錐体細胞の発火タイミングを調節し,結果としてアルファ周波数帯を増強することで意識消失をひき起こす,という仮説が考えられる。この仮説を証明するために,ホールセル・パッチクランプ法を用いて,同一の抑制性介在ニューロンから投射を受ける2つ以上の錐体細胞の発火タイミングに対するpropofolの影響を検討した。その結果,propofol適用により,シナプス後細胞に相当する錐体細胞は,シナプス前細胞であるFSからの抑制性入力を受けることで同期性発火を示すことを見出した。この成果は,国際学会である第9回麻酔と意識国際シンポジウムでポスター発表を行った。麻酔学本研究の目的であった,uIPSCに対するpropofolの修飾作用について,シナプス前細胞および後細胞の種類を同定して,網羅的に解明することができた。これまでに得た結果は,国際雑誌である「Anesthesiology」での掲載が決定している。さらに,これまでに得られたpropofolの抑制性シナプス伝達増強作用が,結果として大脳皮質ニューロンの活動性にどのような影響を及ぼすことで,その麻酔薬としての作用を発揮するのかについて,ホールセル・パッチクランプ法を用いて,同一の抑制性介在ニューロンから投射を受ける2つ以上の錐体細胞の発火タイミングに対するpropofolの影響について検討を行う準備を始めている。uIPSCに対するpropofolの修飾作用について,シナプス前細胞および後細胞の種類を同定して,網羅的に解明することができた。現在その結果を国際雑誌に投稿するための準備を進めている。これまでに得られたpropofolの抑制性シナプス伝達増強作用が,結果として大脳皮質ニューロンの活動性にどのような影響を及ぼすことで,その麻酔薬としての作用を発揮するのかについてはいまだ不明である。脳波は大脳皮質における錐体細胞の活動性を反映していると考えられていることから,propofolは,錐体細胞に対する抑制性シナプス伝達を増強することで,錐体細胞の発火タイミングを調節している,という仮説が考えられる。この仮説を証明するために,今後は,ホールセル・パッチクランプ法を用いて,同一の抑制性介在ニューロンから投射を受ける2つ以上の錐体細胞の発火タイミングに対するpropofolの影響を検討する。単一シナプス応答性興奮性シナプス後電流(uEPSC)に対するpropofolの修飾作用について,シナプス後細胞の種類を同定して解明するととともに,免疫組織化学的に形態学的解析を行う。
葉緑体DNAのRFLPsを用いた褐藻ホルダワラ類の種間の系統関係の解明

日本産のホンダワラ類の系統関係を解析する目的で,本研究では形態分類学的手法と分子系統学的手法の両方を用いて研究をおこなってきた本研究ではまずDNA抽出が難しいと言われる褐藻類からのDNA抽出法としてオスの生殖器床からDNAを抽出する方法を確立した。この方法を用いて日本各地から採集または提供された材料について分子系統学的な解析をおこなった。ホンダワラ類の所属するヒバマタ目全体の系統関係を明らかにするために,本目に属する6属10種について18SrDNAの全塩基配列を明らかにした。その結果,形態形質ではウガノモク科に所属するジョロモク属が分子系統解析では高い確率でホンダワラ類と姉妹群になることが示された。また,独立した属として扱われるヒジキ属はホンダワラ類のクレードに入るらしい(つまり独立性は疑わしい)ことが示唆された。分子系統解析の結果をもとに科レベルの形態形質として適当な形質を探索したところ,卵形成の様式が分子系統解析の結果とよく一致するこたがわかった。ホンダワラ類(属)内の種間の系統関係についてはより進化速度の早いリボソーマルRNA遺伝子のITS領域を用いて解析した。その結果,ジョロモクやヒジキの位置に関しては,18SrDNAと同じ結果を得た。また,ホンダワラ属の中では,いくつかのクレードに分かれることが明らかとなった。このクレードと形態形質との関連については検討中である。形態学的研究から今まで,フシスジモクと混同されていた北方産の種が,フシスジモクとは異なることが示された。また,本種の分子系統学的な解析もフシスジモクとは離れていることを示している。従って,本種を新種ホッカイモク(Sargassum boreale)として発表することとした。日本産ホンダワラ類の種間の系統関係を解析する目的で,本研究では形態分類学的手法と分子系統学的手法の両方を用いて研究をおこなっている。形態分類学的な研究の成果として,3種類の新種の発見が挙げられる。これらは,和歌山県南部からみつかったナンキモクSargassum wakayamaense Yoshida,佐渡島より採集されたエチゴネジモクS.araii Yoshida,そして兵庫県浜坂町大槌島深所で採集されたタマエダモクS.bulbiferum Yoshida,である。これら3種類は限られた分布域をもつことが明らかとなっており,今後の分子系統学的研究の材料としても興味深いものである。一般に褐藻類の分子系統学的研究は世界的に見てもあまり進んでいない状況であるが,当研究室においてもその研究を開始したばかりであり,当初の計画通り平成6年度は基礎技術の確立に努めた。北海道沿岸より採集した海藻類(ホンダワラ類やその他の褐藻類,紅藻類,緑藻類など)を5種類の全DNA抽出法により処理し,DNAの抽出方法の検討をおこなった。その結果,抽出緩衝液にプロテアーゼを加えておこなう方法が比較的有効であることが明らかとなった。また,抽出したDNAを用いて,ゲノムの中の小さな逆向き反復配列部分をザイモリアクターによって増幅するRAPD法を試したところ,種類によって異なるバンドが得られることが明らかとなった。しかしながら,抽出したDNAの純度は未だ高いとは言えずPCRの結果も安定していないことなどから,今後もさらにDNA抽出方法の改善を続ける必要がある。本年度以降はこれら確立した手法を用いて,実際のホンダワラ類の個体群間・種間の遺伝的変異の検出に応用していく予定である。日本産のホンダワラ類の系統関係を解析する目的で,本研究では形態分類学的手法と分子系統学的手法の両方を用いて研究をおこなっている.

一般に,海藻類からの純度の高いDNAの抽出は困難であると考えられており,特に本研究で対象としている褐藻類はDNA抽出が難しいグループとされている.本研究では分子系統学的研究の導入の為の基礎研究としてホンダワラ類からのPCR品質のDNAの抽出方法の確立をまず目指してきた.その結果,ホンダワラ類の場合には雄の生殖器床を用いることがもっとも効率よくDNAを大量に回収出来ること,またそれにGENECLEANIIを併用することにより純度の高いPCR品質のDNAが抽出できることを明らかにした.このような手法で抽出されたDNAを用い,ホンダワラ類の属するヒバマタ目内の系統関係を明らかにし,現行の科レベルの分類を再検討することを目的に,18Sリボソーム遺伝子の全塩基配列をホンダワラ属(アカモク,フシスジモク類似種),スギモク属(スギモク),ウガノモク属(ウガノモク)の4種類について決定した.これらの配列をすでに公表されているコンブ目の配列を外群として系統解析(最節約法)をおこなったところ,ホンダワラ属の2種類と他の2属がそれぞれcladeを形成し,これらは互いにヒバマタより近縁であった.当初の目的である科レベルの再検討にはさらに異なった属の同様の解析が必要であると考えられる.また,種レベルの系統関係の解析としては,PCRにより増幅したITS領域のRFLP解析をおこなった.材料はフシスジモクと厚岸産のフシスジモク類似種である.これらは,形態的に類似するもののいくつかの違いが指摘されていた.今回の調査により,厚岸産のフシスジモク類似種は他地域のフシスジモクとは異なるバンドパターンが得られ,形態的研究の結果を支持する結果が得られた.日本産のホンダワラ類の系統関係を解析する目的で,本研究では形態分類学的手法と分子系統学的手法の両方を用いて研究を行ってきた。本年度は3年計画の最終年度にあたり,昨年度に引き続きデータの蓄積を進めるとともに,研究全体の総括をおこなった。本研究ではまずDNA抽出が難しいと言われる褐藻類からのDNA抽出法としてオスの生殖器床からDNAを抽出する方法を確立した。この方法を用いて日本各地から採集または提供された材料について分子系統学的な解析をおこなった。ホンダワラ類の所属するヒバマタ目全体の系統関係を明らかにするために,本目に属する6属10種について18SrDNAの全塩基配列を明らかにした。その結果,形態形質ではウガノモク科に属するジョロモク属が分子系統解析では高い確率でホンダワラ類と姉妹群になることが示された。また,独立した属として扱われるヒジキ属はホンダワラ類のクレードに入るらしい(つまり独立性は疑わしい)ことが示唆された。分子系統解析の結果をもとに科レベルの形態形質として適当な形質を探索したところ,卵形成の様式が分子系統解析の結果とよく一致することがわかった。ホンダワラ類(属)内の種間の系統関係についてはより進化速度の早いリボソーマルRNA遺伝子のITS領域を用いて(特にITS2)解析した。その結果,ジョロモクやヒジキの位置に関しては,18SrDNAと同じ結果を得た。また,ホンダワラ属の中では,いくつかのクレードに分かれることが明らかとなった。このクレードと形態形質との関連については検討中である。形態学的研究から今まで,フシスジモクと混同されていた北方産の種が,フシスジモクとは異なることが示された。
インフルエンザ感染システムの統計科学的研究

インフルエンザ感染システムを長期(20年)に亘るのサーベイランスデータ分析と説明変数(原因と成りえる項目)が結果に与える影響評価のための統計的方法の開発の両面から研究を行った。1999年から本邦で観測されている週報データによる分析を行い、インフルエンザワクチン接種量の増加に対して、報告患者数が増加傾向にあることを統計的に結論付けた。また、RSウイルス感染症とインフルエンザの感染での干渉の研究成果も得た。これらの成果からインフルエンザ感染対策に向けた研究課題を示唆する結論が得られた。説明変数が応答変数に与える統計的方法の研究ではパス分析の基礎的方法を提唱した。本年度は2009年の新型インフルエンザ流行の世界的な差についての検討を行ってきた。新型インフルエンザは2009年は4月にメキシコで発生し、日本には5月の上旬に、神戸で感染者が報告され、全国に感染が拡散した。日本を地域別に見ても、沖縄では6月下旬に新型インフル感染者の報告があり、これは他の地域よりおよそ2ヶ月遅いものであったが、既に夏のインフルエンザ期であったので、第34週に流行のピークを迎えた。他の地域では第43週から49週目に流行のピークが観測された。インフルエンザウイルスの遺伝的な検出では、季節性インフルエンザを新型インフルエンザが駆逐するような現象が見られた。この現象は北半球で見られ、アメリカ、イギリス、ヨーロッパ、カナダなどと共通である。一方、南半球では通常のインフル流行期にあり、季節性インフルエンザと新型インフルエンザが共存する形での流行が報告された。このような地理的な感染現象の特徴から、インフルウイルス同士が結果的に競争関係をもち、流行すると仮定できる。この現象を説明するために、複数のインフルエンザ型の共存を前提にした微分方程式モデルの研究に着手している。通常のモデルでは感染可能(Susceptible state)、感染(=発病, Infected state)、治癒(隔離, Remival state)の3状態に基づく、SIRモデルでインフルエンザ流行現象を説明するが、これを複数のインフルエンザ型が共存するモデルとして構築して、その特徴の研究を行っている。この新しいモデルではインフルエンザ間の競争関係をどのように構築するかが、大きな課題である。また、他のウイルス流行との関連性で、HTLVー1感染などについての研究も行い、ラクトフェリンの抗ウイルス性についての研究も始めた。インフルエンザ患者数(正確には定点医療機関受信者数)と地域、気象条件などとの因果関係の分析のための(i)パス解析法の理論研究と(ii)インフルエンザ型同士およびRSウイルス感染症の発生との関連性を国立感染症研究所からの公開データに基づいた統計分析を行った。(i)については線形回帰モデルを含む一般化線型モデル(Generakized Linear Models; GLMs)の再帰的システムに関するパス解析法を考究した。まずGLMsの性質について考察し、GLMsにおける説明変数の効果を、オッズ比で表現できることを明らかにした。その上で、対数オッズ比がシャノン情報の変化を表していることを示した。この観点から説明変数が応答変数に与える全効果(total effect)を定義し、全効果を対象とする説明変数の直接効果と他の説明変数を経由する間接効果に分解する方法を提唱した。この分析法は誤差が非正規および応答変数がカテゴリ変数である場合を念頭に開発した分析法であるが、特に応答変数がカテゴリの場合はカテゴリ数の増加に対して、パス分析は複雑さを増加させる。このためにその効果を要約するために、平均効果を提唱し、平均全効果、平均直接効果および平均間接効果がカルバック・ライブラー情報で表現できることを示した。数値例を用いた実証例も例示した。(ii)では2009年の新型インフルエンザ流行時の感染症データの統計解析を行い、互いの干渉について現在まとめている。世界的な共通現象として、新型インフル流行がRSウイルス感染症流行を遅らたことが報告され、本邦でも同様であることを解析した。さらに、本邦は北海道から沖縄まで南北に長く、その流行の多様性についての解析も行い、インフルとRSウイルス感染症の相互干渉現象を示した。二年間の研究で応答変数と説明変数の因果関係を分析するパス解析法が提唱でき、Eshima et al. (Entropy 2015, 17(7), 5117-5132;doi:10.3390/e17075117)に発表できたこと、およびインフルエンザ型と他の感染症との干渉関係の統計解析を終え、論文として執筆中であることから、研究計画の進捗を概ね良好と判断している。地理的および時間的な観点からパンデミックインフルエンザ(pdmAH12009)の日本における流行状況は多様であった。2009年のインフルエンザpdmAH1の流行をサーベイランスデータ報告を下に、世界的に調べた結果、季節性インフルエンザAおよびiBとpdmAH1が競争関係にある可能性を考究した。熱帯地域を除いて北半球では季節性インフルエンザは早い段階で駆逐され(driving-out phenomenon)、他方南半球ではpdmAH1は季節性インフルエンザと共に流行していた(co-circulation phenomenon)。pdmAH1流行のコミュニティへの持続的定着について調べると、熱帯および南半球では最初の感染の検出後、1ヶ月から2ヶ月遅れていた。日本では感染者が神戸で検出されてときには既に流行の定着が確認されている。

熱帯および亜熱帯地域はインフルエンザの流行が一年を通して、あるいは複数回の流行期があり、また、南半球では2009年5月は流行期であったことが、pdmAH1の持続的定着を遅らせ、さらには季節性インフルエンザと共に流行した原因と考えられる。他の感染症を調べるとRSVの流行が例年の11月から12月に対して、1月から2月へと遅れて観測されている(pdmAH1の干渉)。日本でも沖縄は亜熱帯に属し、インフルの流行が夏および冬の二峰であるために、同様の現象は確認される。このような現象を総括して、感染症同士の流行における干渉および競争の存在を結論付けることができる。現象面から見た感染症の干渉や競争が、インフルエンザの型や感染症間における共通免疫によって引き起こされる可能性の仮説を導出した。日本のインフルエンザデータは感染者報告と流行の型に関して2001年から2014年に亘り調査し、その動態に対して統計解析を加えた。日本は温帯から亜熱帯(沖縄)までの南北に長い国土があり、感染者報告データを県別に解析することで、流行の多様性が解明できた。沖縄を除けばその流行は単峰性であるが、亜熱帯の沖縄地方ではインフルエンザの流行が二峰であるか、または収束の明確でない年もある。このことが沖縄地方の流行が温帯の属するその他の地域と異なる点と考えられる。世界規模で2009年流行のパンデミックインフルエンザ(pdmAH1)のサーベイランスデータ解析の論文を調べ、日本の流行の地理的多様性と矛盾しないことを確認できた。沖縄の流行は地理的に近い台湾に類似し、共通の要因があると考えられ、今後の課題となった。このような感染の多様性が他の感染症、例えばRSウイルス感染症にも見られ、インフルエンザと合わせて流行の動態を調べ、異なるウイルス同士の干渉あるいは競争の考え方が導出できた。流行に関してはウイルス独自集団免疫の蓄積および減少伴う変化と見る考え方が一般的であるが、競争や干渉の観点から感染症流行を再考する必要性が提案でき、論文にまとめ投稿準備中である。インフルエンザのサーベイランスデータを1999年から2017年度に亘って収集し、報告患者数の増加傾向を統計的に明らかにした。この研究はインフルエンザワクチン接種データとともに比較検討した結果であり、ワクチンの接種量は1999年から2008年にかけて、およそ150万回接種から2200万回接種に飛躍的に増加し、その後は2500万回接種で安定的に実施されてきた。そのような背景に照らして、インフルエンザ患者データを1999年から2008年と2009年から2017年度に2分割して、それぞれ増加傾向の傾向性検定を行った結果、非常に強い有意な結果を得た。インフルエンザ患者の報告数は1999年に現在のサーベイランスシステムが確立されて以来、1999年がおよそ84万人であったものが、最近5年は患者数が定常的におよそ150万人で、特に2017年はおよそ208万人になっている。2017年の報告患者数は2009年の新型インフルエンザパンデミック時の216万人に匹敵し、感染現象を深く考究する必要性が示唆される。
哺乳類減数分裂における相同染色体間の結合を確立する仕組み

近年,姉妹染色分体の接着を担うコヒーシンの研究により,減数分裂の染色体分離を制御する分子メカニズムの概要はわかってきたが,減数分裂において相同染色体がどのようにお互いを認識し,結合を確立するか,そのメカニズムは解明されていない。本申請課題では,申請者が発見したRAD21LとREC8の2種類の減数分裂特異的コヒーシンサブユニットに着目して,相同染色体間の結合の分子基盤を明らかにすることを目的としている。本年度は,連携研究者の堀居(群馬大学)との共同研究により,RAD21L, REC8のコヒーシンサブユニットに3×FLAGタグが付加された状態で発現するノックインマウスの作製を試みた。CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を利用してStopコドン近辺に二本鎖切断を誘導し,ssODNにより3×FLAGタグをコードする塩基配列をゲノム上の目的の位置に挿入した。シークエンス解析の結果,数匹のファウンダーマウスにおいて,デザイン通りに3×FLAGをコードする塩基配列の挿入が確認された。現在,野生型マウスとの交配により,ノックイン系統の樹立を図るとともに,REC8-3×FLAGタンパク質やRAD21L-3×FLAGタンパク質の発現状態を調べている。また,体細胞における減数分裂特異的コヒーシンサブユニットの異所発現の影響を調べるために,複数のサブユニットを同時に発現させる実験系の立ち上げを試みた。手法としては,複数のプラスミドの同時トランスフェクション,単一プラスミドによる複数遺伝子の発現を検討中だが,十分な発現効率の得られる系の立ち上げまでには至っていない。ゲノム編集によるノックインマウス作製後の一次スクリーニングとその後の系統の確立のための交配などに,予想以上に時間と労力がかかったため。今後,研究課題の推進のために,作製したノックインマウスにおける3×FLAGタグ付きタンパク質の発現状態を調べ,野生型と同様の発現および機能を示す場合には,抗FLAG抗体を使用してノックインマウスの精巣からコヒーシン複合体を精製し,電子顕微鏡による観察やLC-MS/MS解析による相互作用分子の同定を行う。また,同抗体を使用した全ゲノムクロマチン免疫沈降シークエンス法により,ゲノム上のコヒーシンタンパク質の局在位置の特定を試みる。
憲法規範の具体化過程の臨床憲法学的研究――生存権具体化過程を中心に

憲法規範が立法・行政・司法作用を通じ、「社会的なもの」、憲法上の権利侵害等を争う当事者や支援者、法律家の積極的関与のもとに具体化していく過程を、憲法25条生存権と生活保護法との関係に焦点を当てて研究してきた。憲法規範具体化過程を通じて、憲法規範が個々の法律や処分によって具体的なものとして実現されるということは、抽象的権利に過ぎないと解されている権利も、最終的には個々の国民の具体的な権利や利益として確定されることになる。つまり、憲法を具体化する法令は、一見曖昧に見える場合であっても、憲法の趣旨を踏まえて体系的に解釈することにより、具体的かつ明確な意味内容、規範を持つものとして解釈され得る。憲法規範、特の生存権規定の具体化過程の臨床憲法学的研究の第1年度においては、日本における憲法と生活保護法との関係を中心に研究を行った。また、フランスにおけるRSAを中心とした社会権の具体化過程の研究を並行して行った。生活保護法が日本国憲法25条の生存権規定を具体化するものだとの認識は一般的なものであるが、なぜいかなる意味で生活保護法は憲法を具体化しているのかについては、十分明らかにされていないどころか、両者の関係把握については極めて混乱したものとなっている。その混乱を示すものであり、かつ生活保護法適用において最大の問題となってきたのが、4条1項の稼働能力活用要件の解釈適用のあり方と大臣による生活扶助基準設定・改訂権限の法的統制の問題である。この両者に関する静岡市内の事件を臨床憲法学的方法により研究を進めたのが2015年度の成果である。フランスでの研究調査、国内での調査等も予定通り完了し、順調に進行している。本年度は日本における生活保護基準引下げに伴う保護費減額処分取消訴訟に焦点をあて、臨床憲法学的研究を行った。その過程で鮮明となったのが、憲法規範とは何であり、いかにして具体化されるのかという認識そのものが争訟の行方を大きく左右する可能性があると言うことである。本訴訟は全国的に生活保護引下げ違憲訴訟と呼称されるが、その趣旨は本件保護費引下げにより生存権が侵害されたと言うことである。しかし、結果として生存権を侵害されたからといって、すべて違憲訴訟として争われねばならないわけではないのは明らかなことである。例えば生活困窮者が生活保護申請処分を却下された場合、これが生存権を侵害するものであることは明らかである。しかし、これを違憲訴訟として争う必要は全くない。生活保護補う4条1項の資産能力活用という保護の要件に照らして適法な処分であったか否かが争われるのみであり、単純に生活保護法違反が問われる事例である。それでは、本件基準引下げによる保護費減額取消処分はどうか。これは、生活保護法に照らして、処分庁の処分が適法であったのか、処分庁が処分の根拠とした大臣の基準改定が適法であったのか否かがとわれる事案であり、端的にいって憲法25条違反が問われる事案ではない。大臣の基準改定権限は生活保護法8条1項により授権されており、同条2項によって基準設定に置いては要保護者の必要な事情を考慮すべき義務が課され、その裁量権は大きく制限されている。つまり本件における大臣の基準引き下げは生活保護法8条2項に違反するか否かこそが争点なのである。しかしながら、憲法25条生存権への執着により、肝腎な争点が見失われることになっているのである。憲法学説、司法・法実務家、市民運動が一体となって憲法25条という壁を築き、争訟の核心を覆い尽くしているのである。この憲法規範具体化過程の認識論的障害物の発見が最大の成果である。研究当初想定していた課題に加えて新たな課題、すなわち憲法規範の具体化過程を阻害するものとしての認識論的障害物を発見するにいたったことが理由である。憲法規範が立法、行政、司法作用を通じ、さらに「社会的なもの」としての憲法上の権利侵害等を争う当事者や支援者、法律家の積極的関与のもとに具体化していく過程を、とりわけ憲法25条の生存権と生活保護法との関係に焦点を当てて研究してきた。その過程で最も重要なのが老齢加算削減廃止事件の一連の裁判である。最高裁第2小法廷2012年4月2日判決は基準改定に対する生活保護法56条の適用を否定し、堀木訴訟最大判を引用しつつ生活保護法8条2項等における「最低限度の生活」という概念は抽象的かつ相対的であるから大臣の裁量は広範であるとしつつ、他方、高齢者の特別な需要に関する統計等との合理的関連性や専門的知見との整合性の有無等など判断過程の過誤・欠落の観点から審査すべきであるとして原審を破毀し、福岡高裁に差し戻した。最高裁第2小法廷が、大臣の基準改定行為に対して、なぜこのような判断過程による審査を行ったのか、憲法及び生活保護法をいかに解釈適用したのか本判決からは十分明らかではない。しかし、この点を解明するヒントを、同じ最高裁第2小法廷による国公法違反2被告事件判決に見出すことができる。同判決補足意見で千葉裁判長は、法律は憲法の趣旨を踏まえ体系的に解釈すべきであり、これが「通常の法令解釈のあり方」で、合憲限定解釈とは異なるとした。これは、法令が合憲であることを前提に、法令の趣旨を憲法に照らしてより明確なものとし、より具体的な規範として認識する手法としてしられるドイツの憲法志向的解釈(憲法適合的解釈の一種)に近い。

この手法を用いれば生存権の具体化としての生活保護法のより具体的解釈を導出し行政裁量の厳格な統制が可能となろう。憲法規範具体化過程論と憲法志向的解釈とを接合することにより、憲法規範とりわけ生存権など社会権の具体化と立法及び行政裁量の憲法的統制の可能性を切り拓いたのが本研究の最大の意義である。憲法規範が立法・行政・司法作用を通じ、「社会的なもの」、憲法上の権利侵害等を争う当事者や支援者、法律家の積極的関与のもとに具体化していく過程を、憲法25条生存権と生活保護法との関係に焦点を当てて研究してきた。憲法規範具体化過程を通じて、憲法規範が個々の法律や処分によって具体的なものとして実現されるということは、抽象的権利に過ぎないと解されている権利も、最終的には個々の国民の具体的な権利や利益として確定されることになる。つまり、憲法を具体化する法令は、一見曖昧に見える場合であっても、憲法の趣旨を踏まえて体系的に解釈することにより、具体的かつ明確な意味内容、規範を持つものとして解釈され得る。生存権を中心とした憲法規範具体化過程に関する研究の2年度目も、昨年度に引き続き、わが国における生存権の具体化としての生活保護法をめぐる争訟の調査分析に焦点を当てて研究を進める。また、フランスにおける社会権の具体化過程に関する研究も引き続き並行して進める。フランスにおいては、労働法典改正をめぐって厳しい対立が続いているが、これが社会権の具体化過程に及ぼす影響等も合わせて検討したい。憲法規範がいかにして具体化されるのかという観点のみならず、その具体化を妨げる、あるいは具体化されているにもかかわらずその認識を妨げるものとしての認識論的障害物の究明という新たな段階に研究を発展させていくことに力を注ぎたい。憲法学昨年度の予算中、最大金額のフランス調査経費について予定した金額よりも少額で完了したため、ごくわずかであるが年度使用額が生じた。フランス調査が年度末になってしまったのは、昨年11月にパリでの同時多発襲撃事件発生により同時期の調査が困難になったためである。購入予定物図書の金額が残額を若干超えていたため次年度に購入することとしたことによる。本年度はフランスにおける調査を早期に完了し、余裕を持って調査を進めることとした。約7千円の次年度使用額についても、図書購入や調査旅費等として使用する予定である。購入予定図書の経費に充てる予定である。
イネミトコンドリアゲノムの機能解析による分子育種学的研究

ミトコンドリアは呼吸を通して、貯蔵エネルギーを生物が利用しやすいATPに変換する。しかし高等植物のミトコンドリアゲノムは構造が複雑で、ゲノムの分子構造と機能の関係が余り解明されておらず、育種へ応用が限定されている。本研究ではイネのミトコンドリアゲノム全体の遺伝子の位置を特定し、転写を調べ、それから遺伝子発現の制御因子についても解明し、その改変による育種への応用の基礎データを得ることをめざした。ミトコンドリアゲノム全体の転写領域を特定し、詳しく解析しゲノムの物理地図上に位置を示した。その過程で、ABC型ヘム輸送タンパク質の遺伝子であるhelC(orf240)とNADH脱水素酵素のサブユニット6の遺伝子であるnad6をtrnN遺伝子の近傍に新たに見つけ、遺伝子の塩基配列を決定した。次に転写単位の転写開始点を、in vitroキャッピング法とRNaseプロテクション法で調べた。その結果、イネにおいてもCRTAがミトコンドリアのプロモーターの中心配列であることが明らかになった。さらにミトコンドリアゲノムにおける遺伝子発現を解析した結果は、その機構は非常に柔軟であることを示している。たとえば、trnfM遺伝子はrrn26の上流から複製された76塩基の共通配列をプロモーターにして転写される。また葉緑体から転移したtrnHの転写にミトコンドリア特異配列がプロモーターとして働いたり、葉緑体転移配列がミトコンドリア固有の遺伝子であるnad9を発現させていたことも明らかになっている。これらはゲノムの構造変異に対応して遺伝子発現も柔軟になっていることを示している。ミトコンドリアはエネルギーの消費器官であり、その活動は必要最小限に限られるべきである。これらの機構は微妙な発現制御を可能にし、移動の自由がない植物が種々の環境かで生き延びるための戦略であると思われる。高等植物ミトコンドリアゲノムはサイズが大きく、複数の環状DNAから構成されているなど構造が複雑である。そのためゲノムの分子構造と機能の関係を解明するためまずイネ(O.sativa cv.Nipponbare)のミトコンドリアゲノムの転写地図の作製を試みた。材料には暗黒下で発芽させた幼植物を用い、ミトコンドリアRNAを抽出した。最初に、大まかな転写を見るために、ゲノム全体をカバーする42個のλファージクローンのDNAをそれぞれDIGでラベルしたものをプローブに用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、大部分のプローブで1数本のシグナルが見られた。これは、一つのプローブがカバーしている約15kbの範囲内に存在する転写領域はせいぜい数個以下であることを示している。そこで、より詳しく転写されている領域を絞り込むために、シグナルの見られたλファージクローンの断片をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行い、より詳細な転写地図を作製した。高等植物のミトコンドリアゲノム上には頻繁に相同組換えをする反復配列のほかに、時折、低頻度に組換えを起こす数bpから数百bpの短い反復配列が存在する。イネミトコンドリアゲノム上には60-66塩基対の反復配列が少なくとも10コピー存在する。この反復配列は安定なステム-ループ構造を形成できるので、PRS(Palindromic Repeated Sequence)と名付けた。このPRSがイネのrps3のイントロンや葉緑体様trnNの隣接領域に存在することが明らかとなり、PCR法を用いた解析によりOryza属植物が他のイネ科植物より分岐したあとにこれらの領域に挿入したことが示唆された。またサザン法とPCR法を用いた解析より、進化の過程に別々の領域に存在するPRS間で相同組換えをした結果、現在のBBゲノムとBBCCゲノムの配列になったことが示唆された。

高等植物ミトコンドリアゲノムはサイズが大きく、複数の環状DNAから構成されているなど構造が複雑である。そのためゲノムの分子構造と機能の関係を解明するためイネ(O.sativa cv.Nipponbare)のミトコンドリアゲノムの転写制御について調べた。トウモロコシなどのミトコンドリアDNA上では、rps3-rpl16とnad3-rps12がお互い離れた領域に存在し、それぞれの転写単位を持っている。イネでは4遺伝子が、ミトコンドリアDNA上の約7kbの範囲内にrps3-rpl16-nad3-rps12の順序で存在していた。ゲノム構造の変化が機能に与える影響を調べるためこれらの遺伝子の転写様式を明らかにした。ノーザン解析を行ったところ4遺伝子に特異的なプローブを用いた場合、共通する約6.6kbのシグナルが検出された。さらに、それぞれrpl16とnad3のコード領域に特異的なプライマーを作製しRT-PCRを行ったところ、予想される断片が増幅され、rpl16とnad3の間のスペーサー領域も転写されていた。これらの結果より、rps3-rpl16-nad3-rps12の4遺伝子は共転写されていることが明らかとなった。次にこの転写単位の転写開始点を、in vitroキャッピング法とRNaseプロテクション法で調べた。その結果、rps3の上流域およびrpl16-nad3間の少なくとも2カ所に転写開始点が存在した。rps3の上流域の転写開始点をプライマー伸長法で調べたところ、rps3の翻訳開始コドンの320塩基上流に転写開始点が存在した。この転写開始点付近に、トウモロコシやコムギで提唱されているプロモーターの配列と類似した配列が見いだされた。なお、他の転写開始点はnad3の翻訳開始点から422/423塩基上流にあることが示された。すでに示した2種類の遺伝子に加え、5種類のイネミトコンドリア遺伝子(atpA,atp9,rrn26,rrn18,trnfM)の転写開始点を、上述の手法で決定したところCRTAが転写開始に重要であることが明らかになった。ミトコンドリアはエネルギー産生の場で、すべての真核生物において重要な働きをしている。しかし高等植物のミトコンドリアゲノムは構造が複雑で、ゲノムの分子構造と機能の関係が余り解明されておらず、育種へ応用が限定されている。本研究ではイネのミトコンドリアゲノム全体の転写地図を作製し、転写部分の塩基配列を調べ、それから有用遺伝子を特定するとともに、遺伝子発現の制御因子についても解明し、その改変による育種への応用の基礎データを得ることをめざしている。昨年度に引き続き、さらに転写領域を特定し、詳しく解析しゲノムの物理地図上に位置を示した。その過程で、ABC型ヘム輸送タンパク質の遺伝子であるhelC(orf240)とNADH脱水素酵素のサブユニット6の遺伝子であるnad6をtrnN遺伝子の近傍に新たに見つけ、地図上の位置を決めると共に、遺伝子の塩基配列を決定した。両遺伝子の発現を調べたところこの2遺伝子は一つの転写開始点より共転写されていた。