hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ショウジョウバエにおける内因性リガンド・病原体センサーによる恒常性維持機構

本研究では、ショウジョウバエを用いて、3つの研究項目(1)新規受容体Gyc76Cとその内因性リガンドによる恒常性維持機構の解明(2)病原体センサーPGRP-LEにより恒常的に誘導されている自然炎症の制御機構の解明、(3)病原体センサーPGRP-LEによるオートファジー誘導に見られる動的移行機構の解明を行い、病原体センサーが病原体成分に限らず自己由来内因性リガンドにも応答し、恒常性維持機構としての自然炎症を誘導しており、その破綻が病態へつながることを示すと共に、その分子的基盤の一端を明らかにした。本研究では、ショウジョウバエを用いて、病原体センサーが病原体成分に限らず自己由来内因性リガンドにも応答し、恒常性維持機構としての自然炎症を誘導しており、その破綻が病態へつながることを明確に示すと共に、その分子的基盤を明らかにすることを目的としている。これまでに、ショウジョウバエを用いた機能獲得型ゲノムワイドスクリーニングにより、自然免疫を制御する新規受容体を同定している。本研究では、この新規受容体とこれまで明らかとなっている自然免疫機構,特に、哺乳動物では病原体センサーとして機能し、ショウジョウバエでも自然免疫受容体として機能するToll受容体が制御している機構との関係を調べた。その結果、新規受容体は、Toll経路で働くdMyD88,Tube,Pelle,Drsal/Difを介して抗菌ペプチドの産生を誘導しているものの、Toll受容体そのものとは独立して機能していることが明らかとなった。また、その際、cGMPを介して作用していることも明らかとなった。さらに、DNAマイクロアレイの解析により、新規受容体は、抗菌ペプチドだけでなく、セリンプロテアーゼなど他の多くの遺伝子の発現誘導を制御していることが明らかとなった。これらの結果は、自然免疫を制御するcGMPを介した新規なシグナル伝達系が存在していることを示している。今回同定した新規シグナル伝達経路もToll経路と同様に、種を超えて存在し、自然炎症の制御を行っている可能性を指摘できた。本研究では、ショウジョウバエを用いて、病原体センサーが病原体成分に限らず自己由来内因性リガンドにも応答し、恒常性維持機構としてめ自然炎症を誘導しており、その破綻が病態へつながることを明確に示すと共に、その分子的基盤を明らかにすることを目的としている。これまでに、病原体センサーであるPGRP-LEの制御が破綻すると、非感染時においても炎症反応であるメラニン化が誘導され、その個体が死に至ることを示している。本研究では、この恒常的に誘導されている自然炎症の制御機構を明らかにするために、二つの遺伝学的スクリーニングを行っている。第一のスクリーニングは、PGRP-LEの過剰発現で誘導されるメラニン化を掬制する染色体欠失変異体のスクリーニングであり、第2染色体左腕88%、第2染色体右腕82%、第3染色体左腕88%、第3染色体右腕85%の領域を欠失する染色体欠失変異体ライブラリー158系統をスクリーニングした。これにより11系統を同定した。さらに、これらの系統で欠失している領域内の、より小きな欠失を有する変異体46系統を解析し、同様の抑制がみられる4系統を同定した。これらの領域には、55遺伝子が存在しており、原因遺伝子の同定を進めている。第二のスクリーニングは、RNA-iにより発現抑制を行った際に、感染が無くともメラニン化を誘導する遺伝子の探索である。これにより、大腸菌のDnaJ(Hsp40)様のシャペロンDroJ2と、それと相互作用するHsc70-4が同定されている。本研究では、ショウジョウバエを用いて、3つの研究項目(1)新規受容体Gyc76Cとその内因性リガンドによる恒常性維持機構の解明(2)病原体センサーPGRP-LEにより恒常的に誘導されている自然炎症の制御機構の解明、(3)病原体センサーPGRP-LEによるオートファジー誘導に見られる動的移行機構の解明を行い、病原体センサーが病原体成分に限らず自己由来内因性リガンドにも応答し、恒常性維持機構としての自然炎症を誘導しており、その破綻が病態へつながることを明確に示すと共に、その分子的基盤を明らかにすることを目的としている。今年度は、研究項目(3)において、次の様に研究を進めた。哺乳動物でオートファジーの誘導に関わる事が示されているp62のホモログであるRef(2)Pは、酵母のtwo-hyblid系でPGRP-LEと相互作用する。今年度PGRP-LEとRef(2)PがショウジョウバエS2細胞内で複合体を形成することが明らかとなった。さらに、免疫染色により、S2細胞内で、感染したリステリア菌、PGRP-LE、Ref(2)P、ユビキチン化タンパク質、そしてオートファジーのマーカーであるLC3が共局在することが明らかとなった。

加えて、Ref(2)Pが、PGRP-LE依存のオートファジー誘導に必要であり、さらに細胞内寄生細菌リステリア菌に対する宿主の感染抵抗性の発現に重要であることを明らかにした。これらの結果は、PGRP-LEによるオートファジー誘導において、Ref(2)Pが重要な役割を果たしていることを示しており、Ref(2)Pがアダプター分子として機能している可能性を示唆している。オートファジーは、ウイルスに対する感染抵抗性にも重要であることが示されている。今年度、Ref(2)Pが、細胞内寄生細菌のみならず、ウイルスに対する宿主の感染抵抗性の発現に重要であることが明らかとなった。したがって、Ref(2)Pは細胞内感染によるオートファジー誘導のプラットフォームとして機能している可能性が考えられる。本研究では、ショウジョウバエを用いて、3つの研究項目(1)新規受容体Gyc76Cとその内因性リガンドによる恒常性維持機構の解明(2)病原体センサーPGRP-LEにより恒常的に誘導されている自然炎症の制御機構の解明、(3)病原体センサーPGRP-LEによるオートファジー誘導に見られる動的移行機構の解明を行い、病原体センサーが病原体成分に限らず自己由来内因性リガンドにも応答し、恒常性維持機構としての自然炎症を誘導しており、その破綻が病態へつながることを明確に示すと共に、その分子的基盤を明らかにすることを目的としている。今年度、研究項目(1)では、Gyc76CがcGMP非依存に誘導する細胞性免疫応答に必要なGyc76Cのドメインを同定した。この領域は、Gyc76CがcGMP依存に誘導する液性免疫応答に必要なドメインとは異なることが明らかとなった。研究項目(2)では、恒常的に自然炎症を誘導するDroJ2の哺乳動物ホモログを同定し、そのホモログが自然炎症の誘導に重要なNF-kB経路を活性化するかどうか調べた。その結果、DroJ2の哺乳動物ホモログも、ショウジョウバエと同様にNF-kB経路の活性化に関わる事が明らかとなった。研究項目(3)では、オートファジー誘導に必要なPGRP-LEの機能ドメインと、Ref(2)Pの機能ドメインを同定した。さらに、Ref(2)PがPGRP-LEに結合する際に重要なドメインを同定した。今年度、研究項目(1)では、Gyc76Cの内因性リガンドを同定するために、Gyc76Cを発現しているS2細胞を用いて、Gyc76Cを活性化しcGMPの産生を誘導する活性を指標に、ショウジョウバエ個体から内因性リガンドを生化学的手法により精製することを試みた。
新手法を用いたラインガンマ線用コンプトンカメラによる宇宙暗黒物質の探索

511keVのラインガンマ線は、暗黒物質の対消滅反応の際に生成される陽電子が電子と対消滅することで放射されるため、暗黒物質の起源に制限をかけることができると考えられる。本研究では、シンチレーター結晶を用いた511keVのガンマ線に特化したコンプトン型の高感度カメラの実現可能性の検証を目的とした。様々なシンチレーター結晶と光検出器によるエネルギー分解能、角度分解能の実測を行い、その結果を用いて検出器シミュレーションによって性能を評価した結果、有効面積や角度分解能としては期待されるものが実現できる可能性は示唆できたが、チャンネル数が膨大になってしまうという課題が残った。511keVのラインガンマ線は、暗黒物質の対消滅時に生成される陽電子が電子と対消滅する際に発生が期待されるため、空間分布を精度よく測定することにより暗黒物質の起源に制限をかけることができると考えられる。本研究では先行研究で開発した手法を用い、シンチレーター結晶を用いた511keVのガンマ線に特化したコンプトン型の高感度ガンマ線カメラの実現可能性を検証する。点源寄与の陽電子と分離するため、角度分解能はσで1度を目指す。このようなコンプトンカメラの実現可能性を評価するには、結晶が持つ特性をシミュレーションに入れて検出感度、角度分解能を評価する必要がある。平成26年度は、候補となる様々な結晶の特性を評価し、現実的に実現可能な角度分解能を評価した。コンプトンカメラにおける角度分解能は、ドップラーブロードニング限界と呼ばれる原理的な限界の他に様々な要素があるが、シンチレーターを用いる場合は、そのエネルギー分解能がカメラの角度分解能を支配する。特に先行研究の手法を用いるためには、結晶に吸収されるエネルギーが低い場合のエネルギー分解能が重要になるので、候補となる結晶を選定し、いくつかの形状の結晶でエネルギー分解能を評価した。光検出器としては、現状で最良のエネルギー分解能を得るために、量子効率が高く結晶の大面積を容易にカバーすることが可能なスーパーバイアルカリ光電面を持つ光電子増倍管を使用した。実験の結果、NaI(Tl)結晶が低エネルギー側でも良好なエネルギー分解能が得られた。この結果から、511keVのガンマ線に対する角度分解能を算出したところ、ガンマ線の散乱角33度(1srの視野に対応)で1.1度の角度分解能が得られることが分かった。より視野を制限すれば、1度を切る角度分解能も現時点の技術で実現可能であることが、実験的にも検証できた。本研究では、511keVのガンマ線に特化したコンプトン型の高感度ガンマ線カメラの実現可能性を検証する。このようなコンプトンカメラの実現可能性を評価するには、シンチレーター結晶が持つ特性をシミュレーションに入れて検出感度、角度分解能を評価する必要がある。本年度は次の2つを主にやった。(1)様々なシンチレーター結晶と光検出器によるエネルギー分解能、角度分解能の実測角度分解能が実際にどの程度であるのかを調べるために、平成26年度に引き続き、NaI(Tl), CsI(Tl), GAGG(Ce)、LuAGなどの候補結晶といくつかの光検出器(PMT, MPPC)を組み合わせてエネルギー分解能を実測し、それによって決まる角度分解能を評価した。その結果、散乱角による角度分解能の依存性が実測として得られた。1インチのNaI(Tl)をスーパーバイアルカリ光電面を持つPMTで読み出すと最も角度分解能が良好で、散乱角を24度以内に限定すれば1度以下(σ)の分解能が期待される。(2)GEANT4を用いた検出器シミュレーションによる有効面積および視野の評価結晶数を変化させながらコンプトンカメラのシミュレーションを行った。1層目としては、原理的に実現可能な角度分解能が高いNaI(Tl)を仮定し、2層目には吸収効率が高いBGOを仮定した。銀河面放射を測定することを仮定し、角度分解能を敢えて犠牲にすれば(σ10度)、小型衛星搭載程度の重量でもSΩ(有効面積×視野)としては提案される将来計画を凌ぐものが実現可能であることが分かった。平成27年度の研究の結果、検出器シミュレーションにより、感度計算に重要なSΩ(有効面積×視野)の評価をした。ここから現実的な感度を導出するためには、大気上空の現実的なバックグラウンド粒子をシミュレーションに組み込む必要があるが、シミュレーションに組み込むまでには至っていないため。511keVのラインガンマ線は、暗黒物質の対消滅時に生成される陽電子が電子と対消滅する際に発生が期待されるため、暗黒物質の起源に制限をかけることができると考えられる。本研究では、シンチレーター結晶を用いた511keVのガンマ線に特化したコンプトン型の高感度ガンマ線カメラの実現可能性の検証を目的とする。実現可能性を評価するには、結晶が持つ特性を検出器シミュレーションに入れる必要がある。平成26年度平成27年度には、候補となる様々なシンチレーターと光検出器による実測を行った。その結果、NaI(Tl)結晶をスーパーバイアルカリ光電面のPMTで読み出すと最も角度分解能が良好で、コンプトン散乱角を24度以内に限定すれば1度程度(σ)の分解能が期待できることが分かった。

この結果を受けて、平成27年度にGEANT4を用いたシミュレーションによる有効面積および視野の評価を行った。銀河面放射分布を測定することを想定し、角度分解能を敢えて犠牲にすれば(σ10度)、小型衛星搭載程度の重量でSΩ(有効面積×視野)としては提案されている将来計画を凌ぐものが実現可能であることが分かった。これらの結果を受けて現在、大気バックグラウンドのシミュレーションを組み込んで、より現実的な感度を求めようとしているところである。一方、これまでのコンプトンカメラの開発・設計検討を基に、SOI技術を用いた10μm程度のピッチを持つ半導体検出器を用いたコンプトンカメラの検討もKEK、京都大学と始めた。この位置分解能を利用すれば、コンプトン散乱を起こした時の反跳電子の飛跡をとらえられる可能性があり、角度分解能の向上およびバックグラウンドの低減が期待できる。さらに半導体の高エネルギー分解能を生かせば、サブMeV領域のラインガンマ線観測に最適化できる可能性がある。511keVのラインガンマ線は、暗黒物質の対消滅反応の際に生成される陽電子が電子と対消滅することで放射されるため、暗黒物質の起源に制限をかけることができると考えられる。本研究では、シンチレーター結晶を用いた511keVのガンマ線に特化したコンプトン型の高感度カメラの実現可能性の検証を目的とした。様々なシンチレーター結晶と光検出器によるエネルギー分解能、角度分解能の実測を行い、その結果を用いて検出器シミュレーションによって性能を評価した結果、有効面積や角度分解能としては期待されるものが実現できる可能性は示唆できたが、チャンネル数が膨大になってしまうという課題が残った。コンプトンカメラの実現可能性を評価するには、結晶が持つ特性をシミュレーションに入れて検出感度、角度分解能を評価する必要がある。平成26年度は、候補となる様々な結晶の特性を評価し、現実的に実現可能な角度分解能を評価できた。この時点で、シミュレーションに必要な情報は一応得ることができているが、この評価には、シンチレーター結晶の光を読み出すために光電子増倍管を用いている。計画では低エネルギー側のエネルギー分解能をさらに向上させるため、結晶の全面から隙間なくSiPM(固体シリコン光電子増倍管)アレイで読みだすようにすることで、どこまでエネルギー分解能が改善するか試験する予定であった。現在、実験準備は進行中であるが、こちらの方はまだ結果を出すには至っていない。よって、「おおむね順調に進展している」という評価とした。以下の二点を中心に行う。(1)現実的な大気バックグラウンドのシミュレーション前年度まででSΩの評価をしたが、ここから現実的な感度を導出するためには、現実的なバックグラウンドをシミュレーションに組み込む必要がある。本年度は、気球搭載型機器を仮定して、大気上空バックグラウンドを仮定してシミュレーションに組み込む。既にある程度の実観測が存在しているが、海外での気球実験現を経験しており、現時点でシンチレーター型検出器に対するバックグラウンドに熟知している広島大のPogoLiteチームに協力して頂き、バックグラウンドのモデル化を行う。現時点で、既に打診をして有用な助言を頂いている。これらの助力のもと、実際に宇宙線研究所の大型計算機を用いてシミュレーションを行う。
脳ペリサイト由来神経幹細胞の継代条件の検討

目的脳梗塞領域の虚血負荷がかかったペリサイト(虚血ペリサイト: iPC)は多能性幹細胞であり、その後、障害誘導性神経幹細胞(iNSPC)としての特性を獲得して神経再生機構に関与する。しかし、継代培養したiPCは神経への分化能に差があることが考えられる。本実験では、複数回継代培養したiPCと、そこから作製したNeurosphereの特性を検討し、安定した神経分化能を維持できる諸条件を決定することを目的とする。方法再現性の良いCB17マウスの脳梗塞モデル(J Exp Stroke Transl Med 2010 ; 3:28)を用い、脳梗塞組織からiPCを作製して5回継代培養を行い、(1)各継代細胞の増殖能や形態観察、(2)各継代細胞の神経マーカーやペリサイトマーカー、幹細胞関連マーカーなどの遺伝子発現、および(3)各継代細胞の神経分化能を、免疫染色やPCRで確認した。結果5継代すべての細胞において、iPCはペリサイトマーカーであるPDGFRβやNG2、αSMAとともに、神経幹細胞マーカーであるnest inを発現維持していることがPCRと免疫染色にて確認された。一方、神経細胞マーカーのTuj1は1-2継代目と比べ、3-5継代で発現が増加した。また成熟神経細胞マーカーであるMAP2は4継代目以降で新たな発現がみられることから、継代により自然に神経細胞への分化が進んでいることがわかった。また、継代ごとの細胞からニューロスフェアを作製して分化させると、1-2継代目のiPCからは神経細胞への分化が見られたがそれ以降のiPCは神経への分化が観察できなかった。考察iPCは5継代しても神経幹細胞マーカーを発現しているが、継代毎に少しずつ成熟神経細胞の形質を獲得し、反対に幹細胞としての分化能が低下することが示唆された。したがって、iPCを多能性幹細胞として安定して使用するには2継代までに使用するのが妥当であることがわかった。今後は、より神経への分化能を維持した状態で細胞継代できる条件を検討したいと考えている。
犬でのポリフェノールを用いた同種神経移植の実験的研究

ポリフェノール中で1ヶ月間保存した同種神経片は免疫抑制に有効量のFK506を投与することにより、自己神経移植とほぼ同等の神経再生を認めた。FK506投与量とポリフェノール処理同種神経片内の神経再生には、再生神経軸索数、muscleevoked action potentialで正の強い相関が認められた。結論として、高等動物であるイヌでも、ポリフェノールの抗虚血作用は神経片保存に有効であったが、抗免疫抑制作用に関しては、同種神経移植を抑制するほどの効果はなかった。雄1頭より採取した坐骨神経を直径1mm-1.4mmのfuniclesに分割し、ポリフェノール液中に摂氏4度で28日間保存し、DMEMに2日間浸漬させてポリフェノールを洗い流し、移植直前に長さ3cmに切断した。雌犬6頭の長さ3cmの右尺骨神経片を切除してできた神経欠損をポリフェノール処理した坐骨神経片funicles 1-2本で架橋した(ポリフェノール同種神経移植モデル)。その後手術当日よりFK506を毎日1回0.02mg/Kg術後12週間筋注した。移植後12週で、右尺骨神経の神経伝導速度および短小指外転筋のM波振幅を測定した。さらに移植神経を遠位神経縫合部の1cm遠位の尺骨神経まで含めて採取した。左尺骨神経に作製した3cm自家新鮮神経移植モデルについても同様の電気生理学的的検査と神経組織の採取を行った。また屠殺時に各犬の静脈血を採取し、FK506濃度を測定した。移植神経の遠位神経縫合部の1cm遠位の尺骨神経断面の組織形態学的検索を行った。移植神経は直ちに凍結保存して、分子生物学的検索用に保存した。結果:最初の4頭の結果を示す。ポリフェノール同種神経移植モデル群の神経伝導速度と小指球筋のM波振幅は、それぞれ自家新鮮神経移植モデル群の平均87.3%と70.5%であった。またFK506濃度は11-16.5ng/mlであった。考察:ポリフェノール同種神経移植群でも新鮮神経移植群の70-80%の成績を得ることが出来た。犬同種組織移植でのFK506の有効血中濃度は16-26ng/mlと報告されており、4頭中2頭でこの値を越えていた。5頭目以降FK506の1日筋肉注射量を当初の0.02mg/Kgより0.01mg/Kgに引き下げて実験を行っている。雌犬10頭の長さ3cmの右尺骨神経片を切除してできた神経欠損をポリフェノール処理した坐骨神経片funicles 1-2本で架橋した(ポリフェノール同種神経移植モデル)。その後手術当日よりFK506を毎日1回4頭に0.02mg/Kg、4頭に0.01mg/Kg、2日に1回2頭に0.01mg/Kg術後12週間筋注した。結果:ポリフェノール中で1ヶ月間保存した同種神経片は免疫抑制に有効量のFK506を投与することにより、自己神経移植とほぼ同等の神経再生を認めた。結論:高等動物であるイヌでも、ポリフェノールの抗虚血作用は神経片保存に有効であったが、抗免疫抑制作用に関しては、同種神経移植を抑制するほどの効果はなかった。

さらに移植神経を遠位神経縫合部の1cm遠位の尺骨神経まで含めて採取した。左尺骨神経に作製した3cm自家新鮮神経移植モデルについても同様の電気生理学的的検査と神経組織の採取を行った。また屠殺時に各犬の静脈血を採取し、FK506濃度を測定した。移植神経の遠位神経縫合部の1cm遠位の尺骨神経断面の組織形態学的検索を行った。移植神経は直ちに凍結保存して、分子生物学的検索用に保存した。結果:ポリフェノール中で1ヶ月間保存した同種神経片は免疫抑制に有効量のFK506を投与することにより、自己神経移植とほぼ同等の神経再生を認めた。結論:高等動物であるイヌでも、ポリフェノールの抗虚血作用は神経片保存に有効であったが、抗免疫抑制作用に関しては、同種神経移植を抑制するほどの効果はなかった。
細胞膜カベオラと細胞内カルシウム調筋機構に関する研究

1)カルレティキュリン(CRT)に対するポリクローナル抗体が細胞膜カベオラの細胞質側表面を標識することを見出した。この標識は培養ヒト線維芽細胞やヒト卵管組織内の線維芽細胞、平滑筋細胞で観察された。細胞膜標本に対して周辺性膜蛋白質を遊離させる処理を行った場合でも、抗CRT抗体による標識は残存した。同抗体を用いてヒト線維芽細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、CRT以外の複数の蛋白質についての実験を継続中である。2)カベオラに集中するとされているGi2aについて、詳細な局在解析を行った。密度勾配超遠心法ではカベオリンとGi2aは異なる挙動を示した。また免疫電顕法により、カベオラにおけるGi2aの密度はカベオラ以外のそれの2.29倍程度であることが明らかになった。これらの結果はGi2aのカベオラへの集中が従来の生化学的方法から結論されるよりも遙に低いことを示す。3)培養細胞を急速凍結し、凍結レプリカを作製することにより、広範囲の細胞膜を観察する方法を考案した。この方法によりカベオラや細胞膜抗原の分布を二次元的に解析することが容易になった。蛍光抗体法や凍結超薄切片を用いた金コロイド免疫電子顕微鏡法により、カルレティキュリン(CRT)に対するポリクローナル抗体が細胞膜カベオラの細胞質側表面を標識することを見出した。この標識は培養ヒト線維芽細胞やヒト卵管組織内の線維芽細胞、平滑筋細胞で観察されたが、同組織内の内皮細胞では見られなかった。培養線維芽細胞の上部を剥離して作製した基底部細胞膜標本に対して周辺性膜蛋白質を遊離させる処理を行いF-actinが完全に脱落した場合でも、抗CRT抗体による標識は残存した。またヒト線維芽細胞の急速凍結割断レプリカをSDS処理する方法でも、抗CRT抗体による標識が細胞膜P面のカベオラ付近に観察された。我々はカベオラの限界膜にイノシトール3燐酸リセプターとカルシウムポンプが存在することを報告し、カベオラが細胞膜を介したカルシウムの流入と排出に関与している可能性を提唱してきた。CRTは小胞体内腔のカルシウム結合蛋白質として知られているが、今回の結果はカベオラのCRTが内在性膜蛋白質として存在することを示す。カベオラの直下では細胞質に比較してカルシウム濃度の変動が大きいことが予想され、その部位のカルシウム濃度が過度に上昇することを防ぐためにCRTはバッファーとして機能しているのかも知れない。カベオラにCRTが存在することは、カベオラがカルシウムのホメオスタシスに関連する構造であることをさらに支持する所見であると考えられる。カルレティキュリン(CRT)に対するポリクローナル抗体が細胞膜カベオラの細胞質側表面を標識することを見出した。同抗体を用いてヒト線維芽細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、CRT以外の複数の蛋白質をコードするcDNAが得られた。現在、これらのcDNAを解明し、カベオラにある蛋白質についての実験を継続中である。カベオラにはイノシトール3燐酸リセプターとカルシウムポンプが存在しており、細胞膜を介したカルシウムの流入と排出に関与していると考えらている。今回の結果はカルシウム結合能を持つCRTに類似した分子がカベオラの内在性膜蛋白質として存在することを示す。カベオラの近傍にはeNOSなどカルシウムによって活性調節を受ける分子が多数存在しており、カルシウム濃度の制御がどのように行われているのかを追究することは重要である。カベオラのCRT類似蛋白質はこの部位でのカルシウム濃度の急激な変動に対するバッファー作用を持つものと思われる。この蛋白質の存在は、カベオラがカルシウムのホメオスタシスに関連する構造であることを示唆する新たな所見である。
定圧分子動力学法による液晶相転移の解明

本研究は,複雑液体の一つである液晶を取り上げ,構成する要素が形状の異方性を持つという特徴だけで多体系の効果により,どこまで複雑な液晶を発現しうるかを明らかにすることを目的としている。モデルとしては,斥力ポテンシャルによって記述される並進および回転の自由度をもつ冠球円柱粒子系を用い,圧力一定の分子動力学シミュレーションを行った。ここでは,静水圧状態を実現するために筆者らが提案した手法を用い,高密度領域から低密度領域まで系統的にシミュレーションすることにより,結晶相-スメクテイック液晶相(Sm相)-ネマティック液晶相(N相)-等方性液体相間の一連の相転移を考察することができた。考察した物理量としては,体積やエンタルピーなどのマクロな物理量に加え,ミクロな構造解析,配向秩序パラメータ,平均分子軸方向および垂直方向の拡散定数などがあげられる。液晶相の一つの特徴として異方的な拡散があげられるが,我々のモデルではSm相,N相の両方において平均分子軸方向の拡散が垂直方向の拡散に比べて大きい。これは,並進の自由度のみを考慮したモデル粒子系においてSm相における拡散が平均分子軸方向より垂直方向に多く拡散するのと対照的である。現実のSm液晶相では,この二通りの異方的拡散が観測されており,その拡散の仕方によって回転の自由度の束縛の度合いを予測することができるかもしれない。今後,液晶相の構造およびダイナミックス,液晶相転移のメカニズムに関する詳細な考察を行っていきたい。
運動制御におけるfastおよびslow運動単位の役割に関する基礎的研究

本研究の目的は単シナプス性EPSPs(mno-EPSPs)を手がかりとして運動制御機構におけるfastおよびslow運動ニューロン(MN)の役割を明らかにすることである。このために麻酔ネコを用いてMNの細胞内電位を記録し、内側腓腹筋(MG)およびヒラメ筋(sol)MNに誘発されるIa EPSPsあるいは前庭神経外側核(Diters核)刺激により誘発されるmono-EPSPs(DN-mono-EPSPs)について分析した。(1)収縮特性から運動単位のタイプを同定して調べると、同名、異名いずれもIa EPSPsの振幅はS>FR>FFの順に大きかった。(2)Ia EPSPsの振幅はMNの軸索伝導速度、AHPの持続時間および筋単位の単収縮時間との間に有意な相関関係がみられた。しかし、MNの細胞体の平均直径との間には有意な相関関係は見られなかった。(1)本実験で得られたDN-mono-EPSPsは軸索伝導速度90110m/sのDiters核細胞に由来すると推定さる。(2)DN-mono-EPSPsの振幅はMG-MNで1.33±0.67mV、Sol-MNでは1.51±0.7lmVであり、両者の間に有意差は認められなかった。(3)MG-MNにおいてはAHPの持続時間とDN-mono-EPSPsの振幅の間に有意な相関関係が認められた。しかし、Sol運動ニューロンではそのような関係は見られなかった。(4)Sol-MNではDN-mono-EPSPsの振幅と立ち上がり時間との間に高い相関関係が認められた。(5)Diters核に2発刺激を加えて、第2発目の刺激で誘発されるDN-mono-EPSPsの振幅の平均値は第1のそれの2.28倍であった。以上の所見は姿勢制御機構などの解明のために重要な意味を持つと考えられる。姿勢制御など身体の平衡機能は筋紡錘由来のIa線維と前庭脊髄路の入力が強く関与することが知られている。本研究の第1の目的はIa線維の単シナプス性EPSP(IaEPSP)と外側前庭核(DN)の単シナプス性EPSP(DNmonoEPSP)をα運動ニューロン(MN)のタイプ別に比較することによって運動制御、特に平衡能調節におけるFastおよびSlow運動単位の役割を明らかにする基礎的データを得ることである。第2の目的はDNおよびIaEPSPの可塑性を調べ、平衡機能の学習に関連する基礎的データを得ることである。このために、麻酔したネコを用いて下腿三頭筋を支配するMNの膜特性とIa線維あるいはDN刺激によって得られたIa EPSPおよびDNmonoEPSPとの関係を調べた。1.基電流の小さいMNは後過分極電位(AHP)の持続時間が長く、IaEPSPの振幅が最も大きかった。一方、基電流の大きいMNにはAHPの持続時間が短いものと長いものが見られ、前者はIaEPSPの振幅が最も小さく、後者のIaEPSPは中間の大きさであった。2.膜抵抗の大きいMNはIaEPSPの振幅が大きかった。一方、膜抵抗の小さいMNではIaEPSPの振幅が小さいものと比較的大きいものがみられた。3.DNmonoEPSPの振幅はIaEPSPに比較してかなり小さく、Ia線維とは異なり、DN刺激では単シナプス性EPSPの誘発されないMNも見られた。4.AHPの持続時間が長く基電流が小さいMNではDNmonoEPSPの振幅は大きく、AHPの持続時間が短いMNは基電流の大きさに関わらずその振幅は小さい傾向にあった。

5.現在、DN刺激によって単シナプス電位の誘発されないMNについて検討するために脊髄前索部刺激によって得られたシナプス電位とDN刺激で誘発されたシナプス電位とを比較検討中である。ネンブタールで麻酔したネコを用いて、Ia EPSPsおよび前庭神経外側核(Diters核)刺激により誘発された単シナプス性EPSPs(DN-EPSPs)とMGおよびSol運動ニューロンの電気的性質との関係について検討した。Ia EPSPsについて調べる場合には筋単位の機械的特性と運動ニューロンの細胞体直径との関係についても検討した。1.MG運動ニューロンにおいてはAHPの持続時間と単シナプス性DN-EPSPsの振幅の間に統計的に有意な関係が見られた。しかし、Sol運動ニューロンではそのような関係は見られなかった。MGと異なり、Sol運動ニューロンにおいて単シナプス性DN-EPSPsの立ち上がり時間はAHPの持続時間と高い相関関係を示した。2.Diters核の2発刺激を加えて、第2発目の刺激で誘発される単シナプス性DN-EPSPsの振幅の平均値は第1のそれの2.28倍であり、促通効果が認められた。第1と第2の刺激で誘発される単シナプス性DN-EPSPsの振幅の間に有意な相関関係は見られなかった。3.同名、異名のいずれのIa EPSPsの振幅もS>FR>FFタイプの順に大きかった。4.IaEPSPsの振幅は運動ニューロンの軸索伝導速度およびAHPの持続時間との間に有意な相関関係が認められた。さらに筋単位の単収縮時間との間にも有意な相関関係が見られた。しかし、運動ニューロンの細胞体の平均直径とIa EPSPsの振幅の間には有意な相関関係は見られなかった。本実験から少なくとも下腿三頭筋に関しては単一刺激で誘発される単シナプス性DN-EPSPsの振幅はIa EPSPsよりかなり小さく、運動単位のタイプとの関係はIa EPSPsほど明確でなかった。しかし、促通効果によってそれが明確になる可能性も十分考えられるのでこの点は今後詳細に検討する必要がある。
表面増強赤外吸収・ラマン散乱の比較による増強機構の検討

表面増強赤外吸収(SEIRA)と表面増強ラマン散乱(SERS)の比較によりそれらの増強機構を考察するとともに、応用を検討した。1.燃料電池触媒反応の解析:メタノールならびにギ酸は燃料電池の燃料と期待され、Pt表面におけるこれら化合物の酸化反応が古くから検討されてきた。しかし、その反応機構は現在でも解決されていない、SEIRA分光を用いて、われわれは、反応が起こっている電極触媒表面にギ酸イオンが吸着していることを初めて見出し、反応の中間体であることを示唆した。これに対して、ドイツのグループは、ギ酸イオンは単に吸着しているだけで反応を妨害していると主張した。そこで、時間分解SEIRA分光によるより詳細な解析を行い、我々が以前から主張しているように、吸着ギ酸イオンを経由して反応していることを証明した。2.陽イオンの水和構造と荷電固体表面との相互作用解析:固液界面反応を理解するうえで分子ならびにイオンの水和構造と表面との相互作用を理解することが必須である。電極電位で表面の電荷量を制御することによりイオン濃度を増加させ、SEIRASを用いて界面を選択的に測定するという新しいアプローチを提案し、陽イオン(金属イオンならびにテトラアルキルアンモニウムイオン)の水和構造を明らかにした。また、強い界面電場中で水和イオンを電極表面に強く押し付けることにより、水和イオンと表面の相互作用を詳しく検討し、一定以上の力を加えると水和殻が崩壊すること、崩壊の程度が水和殻の構造に依存すること、疎水性水和殻と疎水表面の間に4kcal/mol程度のエネルギー障壁があることなどを初めて明らかにした。3.半導体表面でのSERSとSEIRAの理論解析:SERSとSEIRAは、実験的には金属表面でのみ観測されているが、理論計算の結果、半導体表面でも起こり得ることを理論的に示した。表面増強ラマン散乱(SERS)と表面増強赤外吸収(SEIRA)はともに光と分子の強結合によって生じるが、増強機構はまだ十分に理解されていない。本年度は、SEIRAの電磁気学的増強機構理論の再検討を行い、下地基板の強増効果を考慮することにより、スペクトルの変形が起こり、実測結果をよく説明することを示した。また、Ag表面に吸着したp-aminothiophenolのSERSとSEIRAの比較を行った。SERSスペクトルは固体試料と全く異なったスペクトルを与えるが、表面と吸着分子間のCTに起因する増強効果(Herzberg-Teller効果)と、光化学反応によるアゾ化の2つの解釈がある。この問題を解決すべく、同一条件下でSEIRAスペクトルを測定したが、固体試料とほぼ同一のスペクトルを与え、アゾ化の可能性は低いことが分かった。また、観測されたSERSスペクトルを量子力学計算で再現することを試みているが、まだ成功していない。その他、SEIRAの応用展開を図り、Pt電極表面でのギ酸からCO_2への電気化学酸化という燃料電池に直結した反応の解析を行った。従来、フォルメートを経る反応と、反応中間体を経ないで直接酸化されるという2つのモデルが提案されている。時間分解スペクトルと酸化電流の詳細な解析によって、この反応はフォルメートを経て起こることを明らかにした。さらに、いくつかの反応系で可視光照射によるプラズモン励起を介した反応促進の可能性を検討したが、現在のところ期待した効果は観測されていない。
南アフリカに進出したアジア系企業における人材育成に関する質的研究

グローバルビジネスを展開する上で最初の課題となるのは、難しい「専門技術や経営」ではなく、事業の成功や発展に欠かせない「人材確保」と言われている。アフリカは日本にとって、地理的にも文化的にも遠い地域であるため、現地の人事管理は容易ではなく、特に高い離職率が多くの投資者を戸惑わせる課題となっている。本研究では、南アフリカに進出したアジア系企業における人事管理体制と人材育成の過程を明らかにすることを通して、アジア企業のアフリカにおける長期雇用のあり方を検討し、人事管理を支援するための提言を行うことを目的とする。
早期工業化と非登録徒弟―世帯解体の比較地域史との関連でー

The Decine of theGuildsをネット版で公開した。その要旨紹介とともに、それに先立つ二つの論争とともに、和文雑誌論文「エクセタ縮重工ギルドの衰退のメカニズムー最近の二つの論争との関連でー」として公開した。そこで提示した仮説の一つ「イギリスのギルドの直系家族抑制的効果」を検証するために、グロスタ市の徒弟登録簿と市民認可簿の照合を作業に基づくデータベースの作成を開始しつつある。近刊の英文拙稿The Decine of theGuildsは、イギリス・エクセタ市の縮絨工ギルドの産業革命前の変質過程をその内部資料で描いたものである。このギルドでは、17世紀半ばに独占的営業権が失われていく一方、加入者が増加していった。さらにその紹介としてこの一見奇妙な状況の背後にあるメカニズムを、和文雑誌論文「エクセタ縮重工ギルドの衰退のメカニズムー最近の二つの論争との関連でー」ではそれに先立つ次のような二つの論争との関連で読み解く。第一に、イギリスのギルドはいつ崩壊したのかという問はわが国でも古典的なものであった。イギリスでは90年代以降現実政治的背景もあり職業訓練機関としてのギルドが残存したという主張がなされこれをめぐる論争があった。第二に、なぜイギリスは大陸と異なり産業革命期以降急成長したのかというやはり古典的な問をめぐって、その基礎に家族構造の相違をみる主張とギルドなどの相違を見る主張との対立が、21世紀に入り続いている。拙稿では、エクセタにおける職業訓練機関としてのギルドの存続とそれに先立つギルドと家族の大陸からの分岐を論じている。引き続き、イギリスにおける核家族が工業化に果たした役割について実証的に研究成果を英文で公開する。現在作成中のデータベースを用いた実査法研究をするととも、産業革命以前の18世紀前半までの工業化における地域間競争の視点もできれば加え考察を進めていきたい。本研究の課題は,非登録徒弟の存在が、早期工業化(いわゆるスミス的成長期における工業化)において世帯単位の生産を解体させる際に重要な役割を果たしたことを示すことにある。しかし。これらはいずれもイングランド西南部の都市であった。そのため本研究においては他の地域の地域中心都市の非登録徒弟の資料の収集に努めた。具体的には、イングランド東部のNorwich市と中北部のShrewsbury市に関して徒弟登録簿と市民権承認簿を入手しできたので、続いてデータベース化した。さらに、非登録徒弟析出の基礎作業である、姓名照合分析を開始したところである。基本方針は変えない。資料の収集と英語圏での発表を続ける。資料のDB化に予想以上の時間がかかったため当初計画していたPCの購入が遅れ、また椅子の購入が認められなかったため。
天蚕の前幼虫態休眠における新内分泌系の機能解析と分子機構

イミダゾール化合物で天蚕の人工ふ化に成功している。また実験形態学的手法により、この前幼虫態休眠は中胸に存在する抑制因子(RF)で維持され、第25腹節に存在する成熟因子(MF)で後休眠期が進行すると考えられている。本研究は、これらの全貌を理解するために、RFとMFを単離し、イミダゾール系化合物処理と結合するタンパク質の解析から検討することにした。また、二つの因子の分泌器官を推定するために、数種の抗体を利用し免疫組織化学的に観察した。その結果,(1)FMRFamide抗体に反応する口胃神経系のニューロン前腸と中腸の境界部で、また分泌細胞は中腸皮膜細胞で観察された。この結果、RFとMFの分泌部分にはペプチド分泌細胞の存在が示唆された。(2)これまでの方法(1994)を改変し、酸メタノール溶液で両因子を抽出し、逆相HPLCで分析したところ、従来より簡便で多量の活性画分を得ることができた。このことから、両因子の単離の可能性が一層高まった。(3)休眠期に特異的な7.5kDa(N末端ブッロク)、休眠覚醒にともなっては6.2kDaと5.6kDaのペプチドが強く発現することが明らかになり、それぞれを単離することができた。また、休眠期からはKK-42結合タンパク質を単離することができた。さらに、前幼虫でも活性を有するAny-PPを5齢幼虫血液から単離し構造決定した。これによって、イミダゾール化合物や長期低温による休眠覚醒機構の糸口をとらえることができた。以上のことから、前幼虫態休眠の制御系には上述した分子群が深く関与するものと考えられる。
脳中脳:脳機能発達のチェック機構

ラット脳室内に生後直後に,5,7-dihydroxy-tryptamine (5,7-DHT),6-hydroxy-dopamine (6-OHDA)をそれぞれ投与し,セロトニン低下モデルとドーパミン低下モデルを作成した。これらの処置ラットは外見上異常なく発達するものの,生後4週齢で観察したオープンフィールドにおける行動量は,前者は行動低下,後者は多動が認められた。即ち,自閉症的モデルと注意力欠陥多動障害(ADHD)様モデルができる。これらのモデルでは,当該アミンの投射・終末部位では80%以上にもなる大きな低下が見られた。セロトニン低下モデルでは,調べたセロトニン受容体2A,2Cの量・分布は殆ど変化がない。また,DNA arrayを用いた解析では,種々のトランスポーターやシナプス要素関連遺伝子がそれぞれの低下モデルに選択的に変化するデータが得られ,現在,定量的PCR等で解折中である。一方,FDGを投与し,microPETやautoradiography法でグルコース取り込みの変化部位を探ると,複数の脳部位でコントロールに比し取り込み低下が見られた。このようなモデルを用いて,昨年度に行った脳局所破壊を施行し,Fos蛋白の発現やFDGの取り込みで検出された「局所破壊による他の脳部位への情報伝播パターン」が変化するものかどうか検討し,脳中脳の本質とモノアミン系との関連を突き詰めていく所存である。この生後発達時のモノアミン低下モデルに対して,モノアミン系生合成の律速段階の酵素であるチロシン水酸化酵素,及び,トリプトファン水酸化酵素に共通の補酵素であるテトラハイドロバイオプテリンやセクレチンが行動異常を是正するので、それらを用いた治療機転についても研究を進めている。小児自閉症やADHDにはまだ確固たる治療法がないので,本研究を基盤にして,新規治療法の開発を行いたい。
接地式海洋(石油掘削)構造物の最終強度に関する研究

接地式海洋構造物の安全性を検討するために必要な最終強度解析法を理想化構造要素法を基にして開発し、種々の荷重状態の元での最終強度に至る挙動を検討した。対象の構造物を階層的に(1)格点部,(2)格点間パイプ要素,(3)これらの合成された構造に分割して取扱った。格点部に関しては、コードとブレースのT型格点部を基本継手と考え、ブレースから軸力及び曲げモーメントが作用する状態での剛性・強度を理論的及び実験的に系統的に究明し、剛性及び最終強度の簡易推定式を導出した。また、これらの知見を基に、格点部における局部的な剛性・強度を全体構造解析に取入れるために、T,Y,K型継手に対して剛体・バネからなる格点部要素を開発し、計算効率を飛躍的に向上させた。格点部間のパイプ部材が軸力、曲げモーメント、横荷重を受ける場合の弾塑性大たわみ挙動を理想化して、理想化パイプ要素を開発した。これによって、パイプの座屈,座屈後,大たわみ,弾塑性挙動を簡単に精度よく取扱えるようになった。また、デントが生じたパイプ部材に対しても同様の要素を開発した。以上の3理想化要素を基に、ジャッキアップリグを対象に構造全体の最終強度解析を実施して次の知見を得た。(1)プラットホームの水平荷重により構造全体が剪断型の崩壊をする場合では、格点部が弱い場合には格点部を塑性関節として、他方、強い場合には圧縮側のブレースの座屈崩壊により最終強度に達する。(2)格点部の剛性は構造全体の剛性に大きく影響するが、その値のバラつきに対しては、それ程敏感ではない。更にSurvival及びPunch-through conditionにおける最終強度を解析し、構造物の安全性も検討した。
鉄ポルフィリン錯体の酸化還元反応機構

ヘム蛋白質は生体における主要な酸化還元反応に関与している。その活性の中心はヘム、すなわち鉄ポルフィリン錯体である。鉄ポルフィリン錯体においても生体系にミミックな酸化還元系を構成する。その系の要素である各物質種の構造と各要素間の変化過程である反応の機構に関する理解を深めることが本研究の主な課題であった。このためポルフィリンとその金属錯体について電子状態と立体構造を重視しながら初年度においてポルフィリン分子の合成と精製,単離を主体とした研究を行った。単離可能であったポルフィリンについては結晶構造解析を行った。使用したポルフィリン分子はメソ位に複数のオルト置換フェニル基をもつテトラアリルポルフィリンである。このようなポルフィリンは位置異性体及び回転異性体を含むため数度にわたる分離精製が必要であった。まずアミノ基を置換基とするものについて5α,10βーbis(aminophenyl)ー1S,20ーdipheny lporphyrinがキラルな対称性を示す興味深い立体構造をとることから結晶構造による確認を行なった。(発表準備中)さらにシアノ基を置換体とする回転異性体についても合成、構造決定を行なった。これらのポルフィリンの鉄錯体も合成したが、合成反応中における異性化という新たな困難に遭遇している。一方、異性化反応の心配ないTet【ra_λ】【^(kis)(z、6ーdichlorophenyl)】porphyrinの鉄錯体について【H_2】【O_2】等を用いて酸化還元反応を行なったところこの錯体自身の分解は遅くなるが、生成物は単純でなく数種から成り単離は困難であった。以上のことなどから酸化還元反応構の理解にはさらに基礎的な物質を用いた実験を確立しておく必要が生じた。そのため昭和61年度にはoctaethy lporphyrinの鉄錯体を用い、配位子として置換基の種類を多様化できるピリジン類を用いた配位反応の研究を行なった。特に注目される反応として3ーピュリルアミンを用いた時には中心鉄の3価から2価への還元が認められた。詳細は薬学会107年会で発表する。
大腸菌染色体分配に関与する遺伝子群及び細胞増殖に必須なFtsH蛋白の研究

大腸菌の染色体分配の分子機構およびATP依存性FtsHプロテアーゼについて研究し、以下の成果を得た。染色体分配に必須の機能を持つmukF,mukE,mukB遺伝子がオペロンを形成していることを明かにした。これらの蛋白の機能や細胞内分布を調べるため、それぞれにHisタグやT7タグを付け精製した。精製したMuk蛋白の相互作用を免疫共沈法で調べたところ、MukB,MukEおよびMukF蛋白間に相互作用があることが分かった。このうちMukBとMukFの相互作用は酵母two-hybrid系でも確認した。大腸菌における蛋白の細胞内分布を調べるため、新しい蛍光抗体顕微鏡法を開発した。その方法によりMuk蛋白群の細胞内分布を調べたところ、MukE蛋白は細胞の長軸に沿って片側の細胞周辺部にフィラメント状に分布することが分かった。種々の蛋白について調べた結果、EF-Tuなどの細胞質蛋白やTolC、Lppなどの外膜蛋白もMukEと同様の分布を示し、多数の蛋白から構成される膜会合細胞骨格様構造(MACS: membrane-associated cytoskelton-like structure)が存在することを発見した。MACSは細胞周期に伴ってその構造を変化させ、細胞分裂時には隔壁形成部位周辺に集まる。この構造体はMukBモーターが染色体DNAを運ぶときレールの役割をするのではないかと考えている。mukB106変異のサプレッサー変異smbBはプロセッシングエンドヌクレアーゼRNaseEのC末端側の欠失した変異であることが分かり、ポリヌクレオチドホスフォリラーゼとの結合能を失っていることが明らかになった。Muk蛋白と相互作用する蛋白をスクリーニングする系を確立し、分配装置を構成する蛋白の探索が可能になった。熱ショック転写因子σ32を特異的に分解するFtsHプロテアーゼの機能をさらにin vivo,in vitroで解析した。σ32の分解反応系においてシャペロン蛋白DnaK,DnaJ,GrpEが果たす役割を解析し、これらのシャペロンを加えてもσ32の分解促進は起らず、むしろ阻害的に働くことが分かった。In vivoでσ32の安定性に関与することが示唆されているσ32のC領域に相当するペプチドを合成し、これを基質としてFtsHによる分解を調べたところ、このペプチドはATP依存的に複数箇所切断されることが分かった。In vivoでFtsHプロテアーゼを阻害するICIII由来のペプチドは、in vitroでもFtsHのプロテアーゼ活性を強く阻害した。FtsHの各ドメインの機能を解析するため部位特異的変異を導入して変異蛋白を作製した。ATPaseドメインの中でよく保存されたWalkerモチーフとSRH領域、及びZn結合モチーフ(プロテアーゼ活性ドメイン)がプロテアーゼ活性に重要であることを明らかにした。ΔftsH変異の致死性を抑制するsfhC変異はリン脂質合成経路の酵素FabZの活性が上昇した変異であることが判明し、さらにftsH変異株ではリポ多糖合成経路の酵素EnvAのレベルが上昇して、リポ多糖が過剰生産され、ペリプラズムに異常な膜構造が形成されることが分かった。FtsHは主要膜構成成分であるリン脂質とリポ多糖の合成調節因子と考えられる。枯草菌の胞子形成に関わる遺伝子spoVMの変異のサプレッサー変異としてftsH変異を同定し、ftsHが胞子形成に関与することを明かにした。SpoVM蛋白はわずか26アミノ酸残基からなり、これを化学合成してin vitro系で大腸菌FtsHプロテアーゼ活性に及ぼす効果を調べた。その結果、SpoVMはFtsHを特異的に阻害するとともにそれ自身基質として分解されることが明らかとなった。

熱ショック転写因子σ32を特異的に分解するFtsHプロテアーゼの機能をさらにin vivo,in vitroで解析した。σ32の分解反応系においてシャペロン蛋白DnaK,DnaJ,GrpEが果たす役割を解析し、これらのシャペロンを加えてもσ32の分解促進は起らず、むしろ阻害的に働くことが分かった。In vivoでσ32の安定性に関与することが示唆されているσ32のC領域に相当するペプチドを合成し、これを基質としてFtsHによる分解を調べたところ、このペプチドはATP依存的に複数箇所切断されることが分かった。In vivoでFtsHプロテアーゼを阻害するICIII由来のペプチドは、in vitroでもFtsHのプロテアーゼ活性を強く阻害した。FtsHの各ドメインの機能を解析するため部位特異的変異を導入して変異蛋白を作製した。ATPaseドメインの中でよく保存されたWalkerモチーフとSRH領域、及びZn結合モチーフ(プロテアーゼ活性ドメイン)がプロテアーゼ活性に重要であることを明らかにした。ΔftsH変異の致死性を抑制するsfhC変異はリン脂質合成経路の酵素FabZの活性が上昇した変異であることが判明し、さらにftsH変異株ではリポ多糖合成経路の酵素EnvAのレベルが上昇して、リポ多糖が過剰生産され、ペリプラズムに異常な膜構造が形成されることが分かった。FtsHは主要膜構成成分であるリン脂質とリポ多糖の合成調節因子と考えられる。枯草菌の胞子形成に関わる遺伝子spoVMの変異のサプレッサー変異としてftsH変異を同定し、ftsHが胞子形成に関与することを明かにした。SpoVM蛋白はわずか26アミノ酸残基からなり、これを化学合成してin vitro系で大腸菌FtsHプロテアーゼ活性に及ぼす効果を調べた。その結果、SpoVMはFtsHを特異的に阻害するとともにそれ自身基質として分解されることが明らかとなった。1.mukF,mukE,mukB遺伝子はオペロンを構成しており,それぞれ染色体分配に必須であることが明らかになった。2.MukE蛋白の過剰産生が細胞分裂に及ぼす影響とMinCDE蛋白との関連について解析を進めている。3.大腸菌における蛋白質の細胞内分布を調べるための蛍光抗体顕微鏡法を開発した。4.MukE,MukE,MukB蛋白にT7タグを付けた遺伝子を作製した。T7モノクローナル抗体を使ってこれらの蛋白の細胞内分布を調べる計画である。5.MukF,MukE,MukB蛋白の精製を容易にし,さらにその精製蛋白を32Pで標識するために,種々のタグを付けた遺伝子を作製した。6.mukB106変異のサプレッサー変異smbBはプロセッシングエンドヌクレアーゼRNaseEの遺伝子(rne/ams)の変異であることがわかった。smbB変異株ではRNaseE蛋白のC端側の半分が欠失しており,ポリヌクレオチドホスフォリラーゼとの結合能を失っていることが明らかになった。σ32を特異的に分解するFtsHプロテアーゼについて以下の点を明らかにした。