hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代高速シーケンサーを用いたエクソーム塩基配列決定による家族性もやもや病の解析

最近、RNF213遺伝子変異R4810Kともやもや病との強い関連が複数報告されたが、この変異の生物学的意義は不明のため、単なる代理マーカーで、真の機能的変異が他に存在するという仮説を立て研究を行った。R4810K変異ホモの検体5例を対象にR4810K変異を中心に約1.5Mbの遺伝子領域のターゲットリシーケンスを行った。その結果、この変異を超える関連が、隣接のENDOV遺伝子およびそのテロメア側のハプロタイプで検出された(p=8.36×10-13)。ENDOV遺伝子と未知の遺伝子BC033347が5'側の転写エレメントを伴ってマップされたこの領域に、真の機能的変異の存在が示唆された。最近の複数の論文でもやもや病と強い関連が報告されたRNF213遺伝子変異p.R4810K (rs112735431)の追試を行い、我々のサンプルでも強い関連が確認された。この変異はアルギニンがリジンに代わる変異だが、ともに塩基性アミノ酸でPolyPhen2, SIFTなどのアミノ酸置換の障害度に基づく予測プログラムや、phastCons, PhyloPなどの塩基の保存度に基づく予測プログラムで機能的に重要な変異ではないと予想された。p.R4810K変異と連鎖不平衡にある機能的意義が明瞭な遺伝子変異を探すために、この変異のホモ接合のもやもや病5サンプルとこの変異を持たないコントロール1サンプルを対象に詳細なシーケンスを行った。具体的にはアジレント・テクノロジー社のSureSelectターゲットエンリッチメントシステムを用いてp.R4810K変異を中心に約1.5Mbをカバーする連鎖領域を濃縮し、ライフテクノロジー社の次世代シーケンサーSOLiDsystemによる高速ターゲットリシーケンスを行った。コントロール1例は陰性でもやもや病5例中3例以上は陽性、1例以上でホモとコールされ、一定以上のquality (novel allele mean QVが20以上)、1000人ゲノムでアレル頻度2%未満の条件を満たす変異を16個同定した。サンガー法によるvalidationを行い、16個中15個の変異が確定され、これらの変異について、もやもや病発端者102例とコントロール144例を対象に関連解析を行った。p.R4810K変異と極めて強い連鎖不平衡にある変異を複数同定したが、統計上p.R4810K変異より強い変異はなかった。現在、フィルターリングの条件を下げ、さらに多くの変異についてvalidationの作業を行っている。もやもや病と強い関連が最近報告されたRNF213遺伝子R4810K変異は、アミノ酸置換をきたすバリアントで高い有意差とオッズ比が観察されたことから、このバリアントを含むRNF213が疾患遺伝子であると結論された。しかしながら、このバリアントによりもたらされる生物学的意味合いについては未だ不明である。この遺伝子領域では、疾患特有の強固な連鎖不平衡が隣接する複数の遺伝子を巻き込んで存在している。このことから、本研究では、以下の可能性につき精査した。(1)R4810K以上に疾患リスクを説明しうるものは他に存在せず、この変異が真の病因変異。(2)R4810Kはマーカーで、真の病因変異が遺伝子発現調節領域等に存在。(3)R4810K変異は近傍の機能的バリアントとハプロタイプを形成し、synergic effectで疾患リスクに寄与。これらを検証するため、染色体17q25.3連鎖領域1.3MbについてR4810Kホモの検体5例のターゲットリシーケンシングを行った。1000Genomes Projectにおけるアレル頻度2%未満および新規のバリアントが3例以上で陽性であったものが15個検出された。TBC1D16RPTOR遺伝子582kb領域に相当し、いずれのバリアントにても関連解析(患者102人vs.対照142人)でP値が5×10-8未満の有意な関連を示した。今年度は、さらにターゲット領域の約30%に及んだオフベイト領域精査の目的で、アレル頻度閾値を20%未満に上げてマーカーを選定、ハプロタイプスキャンによる精査(患者101人vs.対照95人)を加えた。その結果、RNF213遺伝子R4810Kを超える関連のシグナルが、隣接のENDOV遺伝子およびそのテロメア側のハプロタイプで検出された(p=8.36×10-13)。このハプロタイプ領域にはENDOV遺伝子、そして現状では転写産物の存在のみが確認されている未知の遺伝子BC033347が5'側の転写エレメントを伴ってマップされており、上記仮説(2)、(3)の存在を支持した。ENDOV

遺伝子と未知の遺伝子BC033347が5'側の転写エレメントを伴ってマップされたこの領域に、真の機能的変異の存在が示唆された。我々が交付申請を行った後、もやもや病遺伝解析研究に重要な進展があった。つまり、2011年1月にゲノムワイド関連解析により、2011年7月にエクソーム塩基配列解析により、第17番染色体長腕(17q25.3)に存在するRNF213遺伝子変異がもやもや病の原因であると報告された。特に後者の報告は、我々が立案していた次世代高速シーケンサーを用いた全ゲノムエクソン配列解析法と同じ解析方法であったため、研究方法の再検討・大幅な変更が必要となった。一方、もやもや病とコントロールサンプルのDNA収集は順調に進み、現在、もやもや病102例(その内家族歴あり17例)、コントロール129例のDNAが解析可能となった。そこで先ず、報告されたRNF213遺伝子変異の追試実験を行った。その結果、我々のサンプルでももやもや病症例の実に3分の2で報告されたRNF213遺伝子変異を認め、コントロールの約1%の頻度と比べ、オッズ比70.7、p値3.4×10-26の極めて効果の高い関連が認められた。但し、報告されたRNF213遺伝子変異はアミノ酸置換を生じるものの、もやもや病発症に関するその機能的メカニズムは不明で、真の原因遺伝子変異と連鎖不平衡にある単なるマーカー変異の可能性もある。そこで、報告されたRNF213遺伝子変異をホモで持つ5サンプルで、次世代高速シーケンサーを用いて、この遺伝子近傍の約1.5Mbを対象としたターゲットリシーケンスを行い、RNF213遺伝子変異近傍の遺伝子構造を詳細に検討することとした。現在、ターゲット領域のDNAキャプチャーしシーケンス・解析作業を行っている。交付申請時予定していたエクソームシーケンスによる解析については、交付申請後に同様の方法による論文発表があったため、研究計画をターゲットリシーケンスによる解析方法に変更した。現在、その結果が得られ概ね予定通りの達成度と考えている。我々が交付申請を行った後、もやもや病遺伝解析研究に重要な進展があり、当初立案した研究計画の再検討・変更を要したため、研究目的の達成度にやや遅れを生じている。但し、もやもや病、コントロールサンプルのDNA収集は順調で、もやもや病の遺伝解析研究の進展を踏まえ研究は遂行されている。ターゲットリシーケンスで得られたデータのフィルターリングの条件を下げ、さらに多くの変異についてvalidationを行い、確定されたものについては関連解析を行う予定である。p.R4810K変異陰性22例を対象にRNF213遺伝子のすべてのエクソンを中心としたサンガー法によるシーケンスを行い、p.R4810K変異以外のRNF213遺伝子変異の検索も同時進行中である。報告されたRNF213遺伝子変異をホモで持つサンプルを用いて、この遺伝子近傍の約1.5Mbを対象としたターゲットリシーケンスを行い、RNF213遺伝子変異近傍の遺伝子構造を詳細に検討し、もやもや病発症の真の原因遺伝子変異がないかを調べる。現在、ターゲット領域のDNAキャプチャー、リシーケンス・解析作業を行っている。また、日本人およびコーカシアンもやもや病症例でRNF213遺伝子のすべてのエクソンのシーケンスを行い、この遺伝子に変異を持たない症例を選定し、RNF213遺伝子以外の原因遺伝子同定を目的に全ゲノムエクソン配列解析法を行う予定である。
有機非線形光学材料の探索及び評価

本研究は,分子の大きさと電荷移動の関連を理論的に明らかにし,コヒーレンス長の短い結晶にも適用できる粉末法の構築および静電場誘起光第2高調波法の改良など,実験による有機非線形光学材料の探索法を確立すると共に,多様な有機物質の2次の非線形光学定数および超分極率を測定し,巨大な非線形光学応答の起源の解明,デバイス化にとって有効な有機材料の探索さらにはその結晶育成の可能性を検討することを目的として行われた.具体的な研究内容は1.静電場誘起光第2高調波法の改良:従来法と比べて溶液セル構成が簡便かつセル・ガラスの3次の非線形性に起因する光第2高調波の影響を除去できる方式を開発し,それに伴って必要な理論式の導出を行った.本方法を用いて様々な有機分子の2次超分極率を測定した.従来法によるP-NA, MNAの測定結果と比べて本方法の有効性を確認し,未知のMBANP, PNPDANの測定を行い,分子軌道法による理論計算と良い一致を見た.2.粉末法の有効性に対する疑問の呈示:膨大な数,種類の有機結晶の2次の非線形性に対する性能評価に用いられてきた粉末法が実は,デバイス化に有効な有機材料を見出す上で全く役に立たないことを指摘した.ただ,粉末法に代わる簡便な性能評価法の開発あるいは粉末法の改良は今後の課題として残された.3.有機非線形光学材料探索手法の確立:2次超分極率がMNA並みで薄片結晶が得られる材料については,屈折率測定とメーカー・クリンジ法を組み合わせた方法あるいは良い分子配向の結晶を見出すためのX線構造解析が,その性能指数評価に有用であるとの結論を得た.本研究は,分子の大きさと電荷移動の関連を理論的に明らかにし,コヒーレンス長の短い結晶にも適用できる粉末法の構築および静電場誘起光第2高調波法の改良など,実験による有機非線形光学材料の探索法を確立すると共に,多様な有機物質の2次の非線形光学定数および超分極率を測定し,巨大な非線形光学応答の起源の解明,デバイス化にとって有効な有機材料の探索さらにはその結晶育成の可能性を検討することを目的として行われた.具体的な研究内容は1.静電場誘起光第2高調波法の改良:従来法と比べて溶液セル構成が簡便かつセル・ガラスの3次の非線形性に起因する光第2高調波の影響を除去できる方式を開発し,それに伴って必要な理論式の導出を行った.本方法を用いて様々な有機分子の2次超分極率を測定した.従来法によるP-NA, MNAの測定結果と比べて本方法の有効性を確認し,未知のMBANP, PNPDANの測定を行い,分子軌道法による理論計算と良い一致を見た.2.粉末法の有効性に対する疑問の呈示:膨大な数,種類の有機結晶の2次の非線形性に対する性能評価に用いられてきた粉末法が実は,デバイス化に有効な有機材料を見出す上で全く役に立たないことを指摘した.ただ,粉末法に代わる簡便な性能評価法の開発あるいは粉末法の改良は今後の課題として残された.3.有機非線形光学材料探索手法の確立:2次超分極率がMNA並みで薄片結晶が得られる材料については,屈折率測定とメーカー・クリンジ法を組み合わせた方法あるいは良い分子配向の結晶を見出すためのX線構造解析が,その性能指数評価に有用であるとの結論を得た.従来の静電場誘起光第二高調波法(dcSHG法)において用いられてきた溶液セルの構成における難点、セルガラスの三次の非線形光学効果に基因する光第二高調波の影響を除去するため、透明導電膜ガラスを採用し、dcSHG法の改良を行ないその有効性を確認する(昭和61年秋季応用物理学会)と共にその理論的解析を行なった(Jpn.J.Appl.Phys.投稿準備中)。具体的には、【u!】電子供給源およびドナー・アクセプターを有する有機分子に対して、誘電緩和法、ジェリーの屈折計を用いて基府状態の永久双極子モーメントΜπの測定、局所場補正のための誘電率、屈折率の測定を行ない、dcsHG法によるΜπと二次分子分極率βの積の測定結果からβを求めた。その結果、いくつかの有機分子でMNA(2-me+hyl-4-nitroaniline)に匹敵するβを有し、しかも吸収端が400nmをきる短波長側にあるものを見出した(特許出願を考慮中、その後、Chem.Phys.Lett.などに投稿予定)。一方、P-P-P法による分子軌道の理論計算を行ない、実験結果を説明する上で十分な計算結果を得た。また、キャピラリー内融液凝固法を改善して、簡単なブリッジマン法によるMNAの単結晶ファイバー化に成功しており(【II】、研究発表の項参照)、現在、薄膜単結晶化による結晶軸の配向制御に取り組んでいるところである(昭和61年秋季応用物理学会)。今後の課題として、dcSHG法を適用するための溶液化が困難な有機非線形光学材料に対する新しい分子分極率測定法の開発、種々の粉末粒径を用意する必要がある粉末法の改良、おそらく、理論的扱いの改良,融液を用いない結晶育成法(薄膜光導波路および光ファイバーとして)の開発などが挙げられる。すべて、昭和62年度の研究課題でもある。
ｍｔROSとNrf2を介した糖尿病大血管症発現機序解明と制御による治療への応用

本研究はヒト大動脈血管内皮細胞(HAEC)および申請者らが独自に作製した血管内皮特異的にMnSODを発現し、mtROSによる影響を除去するeMnSODTgマウス(BBRC 2008)を用い、in vitro研究、in vivo研究の両面から、糖尿病大血管合併症の発症機序を解明することにより、血管内皮細胞のmtROS産生増加を抑制すること、転写因子Nrf2を制御することが糖尿病大血管合併症の新規治療法となりうることを証明したいと考えている本研究はヒト大動脈血管内皮細胞(HAEC)および申請者らが独自に作製した血管内皮特異的にMnSODを発現し、mtROSによる影響を除去するeMnSODTgマウス(BBRC 2008)を用い、in vitro研究、in vivo研究の両面から、糖尿病大血管合併症の発症機序を解明することにより、血管内皮細胞のmtROS産生増加を抑制すること、転写因子Nrf2を制御することが糖尿病大血管合併症の新規治療法となりうることを証明したいと考えている
用例に基づく三次元形状再構成と完成に関する研究

本研究は非剛体形状の理論と時系列的に変化をする表面(Time-varying surface)の3次元モデルの再構築手法に注目する。自然物は複雑な形態を持っている上複雑な変形を受けるからリアルタイム三次元再構成が混乱である。平成21年度には3次元形状データ取得システムを開発し、スキャンデータから3次元モデルの検索手法と非剛体スキャンデータ間のレシズトレーションフレームワークも開発しました。このフレームワークは三次元データ検索に基づいて高レベル知識を再構成プロセスに取り込む。その結果は、カメラの数を最小限度にすることが出来、静止することが出来ない物も3次元取得ことが出来るようになった。平成21年度にも三次元形状データベースと検索ツールを開発しました。あと、次の研究ステップに使用するためにステレオと陰影からの形状の復元と構造化照明に基づいた三次元再構成システムを開発しました。
教室における子どもの学習プロセスを視座とする比例的推論の指導ユニットの開発

本研究の目的は,小学校高学年での指導の下での,子どもの比例的推論の変容の質とメカニズムを捉えることである。変容は,長期と短期の両面から捉えることを行った。5学年の1年を通して,3回に渡って,異なる小学校の3クラスの子どもに対して比例の問題の調査を行った。子どもは,倍比例や帰一法といった乗除ベースの方略を使うようになり,その一方で,ビルドアップや単位という加法的操作が中心となる方略を使わなくなった。また,クラスによる違いも分かってきた。あるクラスでは,子どもは有意味で多様な方略を使うようになっていた。そのクラスは,事例研究の対象として更なる考察を行った。ここでは,子どもの変容と,授業で導入されたり扱われたりした数学的表記との関わりを1つの焦点とし,以下の問いを探求した(i)子どもの比例的推論の変容に重要な関わりを持つ数学的表記は何か。(ii)その数学的表記は,授業でどのように現われ,子どもの変容に重要な関わりを持つようになるのか。この目的に対し,「数学的表記の内化」の枠組みを用いて,「単位量あたりの大きさ」の授業下での5名の注目児童の分析を行った。「数学的表記の内化」の枠組みとは,子どもによる表記の使用の発達を,「初期の使用」「基準の構築」「目的的使用」の3つの相から捉えるものである。指導の前後に行った調査の結果からは,児童が多くの同一問題で,思考方略を変容させていること,更に,児童がかき表す特定の表記がそこに重要な仕方で関わっていることがわかった。11時間にわたる「単位量あたりの大きさ」の指導中の考察からは,個々の児童が,授業で学ぶ様々な方法や数学的表記を積極的に自分の中に取り込んだり,修正や創造をしたりすることによって認知的変容を遂げるという変容のメカニズムの一端が示された。児童は,対象とする数学的表記に違いはあるものの,一人ひとりが授業で出会う表記に対する意味付けを変化させていた。彼らは,自分の認知的状況や算数の学習に対する構えに支えられ,特定の表記に関心を持ち,積極的に関与していた。更に,児童の変容には,授業における私的な場面と公的な場面の両者が関わっていた。私的な場面で児童のうちにある表記への意味づけが,公的な場面で問い直され,見直されて,それが次の私的な場面へと持ち込まれるというプロセスが繰り返された。得られた結果に基づき,指導に対する示唆とともに,「単位量あたりの大きさ」と「比例」の指導単元のデザインを提案した。今後の課題も明確にした。本年度の計画に対する実績は以下の通りである。比例的推論の発達に関わる文献を整理し,発達を特徴づける観点としての「ユニット」および「『比』から『比率』への移行」に注目した。

これらの観点の重要性は,我が国の数学教育研究者においても以前から指摘されている。しかし,比例に関わる内容を学んでいる途上にある小学生への調査からは,必ずしも児童がこのような発達を示していないこと,指導においても十分に配慮されていないようであることが分かってきた。このような観点を,指導ユニットの開発において取り入れていく必要がある。また,本研究のベースである「数学的表記の内化の過程」についても考察を進めた。特に,相から相への移行を促進する条件は何であるのかを,クラス内での児童間の比較およびクラス間の比較(児童の内化が比較的スムーズであったクラスとそうではないクラス)をすることで探った。児童間の比較からは,児童の比例的推論のレベルの他に,表記利用の特徴や除法等の知識の特徴が関わっているようである。クラス間の比較からは,児童の素朴な方法や表現様式を認めていくこと,考えの交流があること,児童の疑問が適宜取り上げられ議論されることなどが関わっているようである。一方,児童が用いる思考方略についての教師の理解や,発達を促すような問題の考案には改善の余地があることもわかってきた。これらについても,指導ユニットを考案する際に配慮していく必要がある。奈良県の公立小学校第5学年で行った「単位量あたりの大きさ」の授業を,様々なデータを駆使し,多角的に考察した:(1)同単元の別の学級での授業との比較(2)本学級の授業における注目児童の学習過程の質的な考察(3)本学級の児童の,1年間を通しての,比例の筆記調査問題に対するアプローチの変化その結果,次のようなことがわかった。(1)に関しては,本学級では,児童が教室に持ち込む様々なアプローチが一貫して重視され,児童による発表と交流がみられた。授業の中で,「1当りの大きさ」とそれを求める除法の手続きは,別の学級程の権威を有していなかった。(2)に関しては,11時間の授業の前後で行った注目児童の筆記調査の考察により,・児童の比例的推論のレベルは,指導の前後で大きな変化はみられない。・むしろ,児童の表記の使い方に変化がみられる。児童は,特定の表記を,思考を進める上で使うようになった。ことがわかった。更に,児童の授業中の活動の分析から,・授業の中で,表記を用いて思考を表現したり,表記を解釈したりすることが,児童の認知的変容に寄与している。・児童によって,思考の進展に寄与する表記(significant notation)が異なる。同じ授業を受けていても,表記に対する注目や関心,挑戦が異なる。・Significant notationの生起の過程の考察から,授業では,教師がどの程度意図しているかによらず,表記(方法)を媒介とするコミュニケーションがなされている。ことを指摘することができる。(3)に関しては,他の2学級に比べて,本学級の児童の正答率が徐々に,しかもコンスタントに増加し,また,複合ユニットを用いたアプローチが増加していた。研究のまとめを行い,得られた成果を学会や専門雑誌に発表することを行った。得られた主たる成果は,日野がこれまで構築してきた「数学的表記の内化の過程」の精緻化を行ったことである。「数学的表記の内化の過程」とは,児童が,授業で教師が導入する表記に対して行う意味づけの過程である。児童は,最初から正しい意味づけをしてはおらず,また,それは時間が経てば自動的に可能になるといった単純なものではない。
放射性セシウムの存在形態の解明～FDNPP近郊から採取された微粒子の場合～

◎放射性Csの存在状態および微視的局所解析手法の開発環境中に存在している微粒子中での放射性Csの存在形態(微視的局所構造)をモデル化するためには,解析の基礎になる土壌粒子や原子炉材料のマクロな結晶構造・化学組成を明らかにしておくことが必要である.土壌から選択的に採取した放射性Csを含む不溶性の微粒子の局所構造を解析する場合,前処理の段階での試料ダメージが問題になる.そこで,昨年度から開発している「試料ダメージの少ない」イオンビーム加工機(FIB)の加工条件を風化黒雲母だけでなく,不溶性粒子(鉄を含むケイ酸塩化合物など)の前処理にも適用し,STEMによる局所構造の評価を行った.その結果,断面加工の場合,最表面から0.3μmの範囲でのみ加工ダメージが見られ,それより深い領域ではダメージが起こらないことが明らかになった.また,風化黒雲母では,加工ダメージのない領域でも明らかな層間距離の拡大がみられ,前処理に依存せずに層間距離の拡大が発生することが明らかになった.これらの観察結果に基づいて,「Kイオンが脱離した風化雲母の層間にCsイオンが取り込まれることにより,層間構造の安定化が起こる」というモデルを検証するために,Gaussian16を用いて量子化学シミュレーションを行った.「黒雲母のSiO2層間にアルカリ金属の吸着サイトが存在する」と仮定して,層間に存在するアルカリ金属が,Kイオン,プロトン,Csイオンの場合の最適構造および自由エネルギーを計算し,Kイオンの脱離およびCsイオンの吸着の平衡定数を推定することにより,Csイオン吸着相が準安定状態になりうることを明らかにした.◎地表に存在する微粒子中の放射性Csの直接観察高濃度汚染地域外で採取された放射性Csを含む不溶性微粒子の場合も,XPS表面分析によって,750eV付近にCsに起因するピークを確認することができた.◎放射性Csの存在状態および微視的局所解析手法の開発ソフトな土壌試料をSTEM観察試料として用いる場合の重要な課題である.昨年度開発した「試料ダメージの少ない」イオンビーム加工機(FIB)での加工条件を用いて,粘土鉱物だけでなく土壌中の不溶性粒子の前処理加工が可能になり,最表面の加工ダメージを0.3μm以下の領域に限定することができた.この手法を用いることで,前処理加工のダメージの影響を受けないSTEM観察が可能になると考えられる.一方,モデル化された局所構造に基づいた量子化学的シミュレーションに関しては,黒雲母のSiO2層間にアルカリ金属の吸着サイトが存在すると仮定して,層間に存在するアルカリ金属が,Kイオン,プロトン,Csイオンの場合の最適構造および自由エネルギーを計算し,Kイオンの脱離およびCsイオンの吸着の平衡定数を推定し,Csイオン吸着相が準安定状態になりうることを明らかにした.この際,プロトンの水和エネルギーに実測値を使用し,自由エネルギーの計算精度を向上させることができた.◎地表に存在する微粒子中の放射性Csの直接観察XPS表面分析装置を用いて微粒子中の放射性Csの直接観察を試みた.高濃度汚染地域で採取した放射性Csを含む微粒子だけでなく,汚染状況の低い地域で採取した放射性Csを含む不溶性の微粒子でも750eV付近にCsに起因する光電子ピークを検出することができた.また,土壌中から放射性Csを含む不溶性の粒子を単離する場合,バックグランドレベルが低い土壌(低濃度汚染地域)の方が,放射性Csを含む微粒子を効率よく単離できることが明らかになった.汚染地域から採取された粘土鉱物粒子(層状化合物)だけでなく,放射性Csを含む不溶性の微粒子の微視的局所構造解析(格子像/EDX,電線回折像,放射性Cs吸着サイトの直接的観察)を行い,マクロな結晶構造解析結果を比較することにより,不溶性粒子の起源(原子炉材料との関連性)を明らかにすると共に,Cs吸着サイトの特徴(粘土鉱物の場合との相違点など)を明らかにし,モデル計算の精度を向上させる.また,モデル化された局所構造に基づいて,量子化学的シミュレーションを用いて,粘土鉱物および不溶性粒子のCs吸着サイトの最適化構造や自由エネルギーを推計し,粘土微粒子と不溶性微粒子のCs吸着機構の相違について検討する.これらのシミュレーション結果を「土壌粒子上でのCsの吸着・脱離モデル」にフィードバックさせることにより,環境実態に対応した放射性Csの吸脱着モデルを構築する.◎放射性Csの存在状態および微視的局所解析手法の開発環境中に存在している微粒子中での放射性Csの存在形態(微視的局所構造)をモデル化するためには,解析の基礎になる土壌粒子や原子炉材料のマクロな結晶構造・化学組成を明らかにしておくことが必要である.そこで,阿武隈山地(浪江町津島地区)の土壌から,粘土鉱物微粒子(風化黒雲母粒子)の選択的に採取し,イメージングプレートを用いて放射性Csを含む粒子を単離した.これらの微粒子の化学組成を蛍光X線分析およびX線単結晶構造解析・走査型透過電子顕微鏡を用いて解析し,放射性Csを含まない標準品の黒雲母微粒子と比較した.その結果,風化黒雲母では,黒雲母の層間に存在するKイオンが減少したために層間の相互作用が弱くなり,層間距離が長くなっていることが明らかになった.

このような観察結果を検証するために,Gaussian16を用いた量子化学シミュレーションを行い,SiO2クラスター(黒雲母のSiO2層をモデル化したもの)間の距離と層間の相互作用エネルギーの関係を推計した.その結果,SiO2クラスター間にK(+)やCs(+)などのアルカリ金属イオンが存在する場合,SiO2クラスター間の相互作用が大きくなり,安定化することが明らかになった.つまり,このシミュレーションの結果からも,「Kイオンが脱離した風化雲母の層間にCsイオンが取り込まれることにより,層間構造の安定化が起こる」という放射性Csの吸着モデルが支持された.◎地表に存在する微粒子中の放射性Csの直接観察高濃度汚染地域で採取した放射性Csを含む微粒子をイメージングプレートを用いて単離した.この微粒子(12Bq/個,直径50μm程度)をXPS装置(X線のビーム径20μm)を用いて分析し,750eV付近にCsに起因するピークを検出することができた.◎放射性Csの存在状態および微視的局所解析手法の開発放射性Csを含む粘土鉱物のモデルとして,阿武隈山地の土壌中に多量に存在する風化黒雲母に注目し,走査型透過電子顕微鏡(STEM)による微視的構造解析の手法を用いることで,風化黒雲母の微視的構造(heterogeneousな構造)の特徴を明らかにすることができた,また,この過程で,ソフトな土壌試料をSTEM観察試料として用いる場合の重要な課題である,「試料ダメージの少ない」イオンビーム加工機(FIB)での加工条件を確立することができた.一方,モデル化された局所構造に基づいた量子化学的シミュレーションに関しては,これまで申請者が行ってきた,有機金属錯体の量子化学シミュレーションの手法を粘土鉱物に応用することで,粘土鉱物中でのCsイオンの安定構造を推計するための予備検討を行うことができた.◎地表に存在する微粒子中の放射性Csの直接観察高濃度汚染地域で採取した放射性Csを含む微粒子をXPS装置(X線のビーム径20μm)を用いて分析することにより,750eV付近にCsに起因するピークを直接検出することができた.また,XPS装置に装着されている電子線ビームを利用して,微粒子の電子顕微鏡(SEM)による微視的観察を試みている.なお,土壌中からの放射性Csを含む微粒子の収集に関しては,微粒子の効率をより向上させるため,放射性Csを含む微粒子の単離手法についての検討を行っている.◎放射性Csの存在状態および微視的局所解析手法の開発環境中に存在している微粒子中での放射性Csの存在形態(微視的局所構造)をモデル化するためには,解析の基礎になる土壌粒子や原子炉材料のマクロな結晶構造・化学組成を明らかにしておくことが必要である.土壌から選択的に採取した放射性Csを含む不溶性の微粒子の局所構造を解析する場合,前処理の段階での試料ダメージが問題になる.そこで,昨年度から開発している「試料ダメージの少ない」イオンビーム加工機(FIB)の加工条件を風化黒雲母だけでなく,不溶性粒子(鉄を含むケイ酸塩化合物など)の前処理にも適用し,STEMによる局所構造の評価を行った.その結果,断面加工の場合,最表面から0.3μmの範囲でのみ加工ダメージが見られ,それより深い領域ではダメージが起こらないことが明らかになった.また,風化黒雲母では,加工ダメージのない領域でも明らかな層間距離の拡大がみられ,前処理に依存せずに層間距離の拡大が発生することが明らかになった.
中学校地域学習資料集『滋賀県の戦争の遺跡』の作成と活用実践

新学習指導要領は「身近な地域の歴史や具体的な事象の学習を通して歴史に対する興味・関心を高め,様々な資料を活用して歴史的事象を多面的・多角的に考察し公正に判断するとともに適切に表現する能力と態度を育てる」こととし,身近な地域や文化遺産に対する学習の充実を求めている。これを受けて,中学生用社会科資料『滋賀県の戦争遺跡』の作成を計画した。滋賀県に限らず旧軍跡地,防空壕といった戦争関連遺跡は戦後60年以上を経て撤去されたり,風化したりしている。都市化に伴って消滅したり,遺跡自体にマイナスのイメージがあったりして保存に否定的な地域や地権者もいる。このような状況の下,放置しておけばいずれ忘れられ,撤去されるであろう戦争関連遺跡について調査し,その遺跡が持つ意味を問い直し,当時の様子について学習することは意義のあることだと考えた。資料としては県内だけでなく,西日本各地の飛行場跡,掩体壕,資料館を中心に写真撮影,資料収集を行い,県内外の状況を比較できるようにした。研究授業では,ワークシートや作成した資料を配布した上で,全体で共有できるよう投影した。単に戦争の事実を知識として知るだけに終わらないよう,写真や資料から読み取れることや推測できることを各自ノートに書き上げた後,4人班で交流し発表させた。この授業はPISA型読解リテラシーの育成と学び合いによる思考の深まりを意識し,キー・コンピテンシーの考え方を授業に取り入れることを意図したものである。成果として,生徒たちは教科書に載っていない事実を知ることで,郷土の歴史遺産に対して関心を持ち,情報の読み取りに関しても資料を比較・検討する,資料の値打ちを見極め,批判的に読む,複数の資料を関連づける,といった姿勢を意識することができた。さらに思考に関しては,「自分の言葉で論述」することを強調したため,生徒たちは資料からの丸写しを避け,根拠に基づいた自分の意見を形成することができた。これは,単に戦争遺跡を調べて知る,まとめる,紹介するだけではなく,根拠に基づいて検証させた結果といえる。また,個人での思考,班の中での意見交換,学級全体での発表を通し,学び合いによる知識の再構成を図ることができた。この授業の指導案と考察は滋賀県中学校教育研究会社会科部会の研究紀要に掲載するとともに,写真と資料については同部会で配布した。
中学生の相談行動における教師の働きかけの影響プロセスの解明

本年度の目的は、教師に相談することを促すような教師の働きかけ、生徒同士で相談することを促すような教師の働きかけ尺度を作成することであった。先行研究をもとに、質問項目を作成し、教育心理学を専門とする研究者と筆者を含む2名で各項目について概念に照らし合わせて適切であるかどうか検討し,内容的妥当性を確認した。中学生を対象に質問紙調査を行い、本研究の尺度が一定の妥当性と信頼のあるものであることを確認した。そして、生徒の認知レベルでは、この2つの教師の働きかけが学級風土を媒介して、生徒の教師に対する相談意欲と他生徒に対する相談意欲を高めることが示された。教師に相談することを促すような教師の働きかけは、直接的に、生徒の教師に対する相談意欲を高めていた。学級レベルでは、この2つの教師の働きかけが、生徒の教師に対する相談意欲と他生徒に対する相談意欲を高めることが示された。今回、学級風土は学級内で相談を行いやすい学級であるかという視点で測定している。そのため、教師の働きかけ、学級風土ともに、生徒の周囲にある社会的要因であるといえる。日常的な教育指導の中で、生徒が相談しやすい雰囲気や環境をつくることの重要性が示されたと考えられる。また、学習面においても、教師に相談することを促すような教師の働きかけ、生徒同士で相談することを促すような教師の働きかけ双方が学級風土を媒介し、他生徒に相談(質問)する行動だけでなく、他生徒と共に学び合う行動、他生徒に教える行動も増加することが示された。これは,自分が援助要請を行ってもクラスメイトが受容的,肯定的に受け止めてくれるという認知が,クラスメイトとの教えあいや学び合いという自律的な学習行動を促す可能性を示した点で重要な意味をもつものといえるだろう。なお、以上の研究は、次年度以降学術論文として投稿予定である。質問紙調査を順調に行い、多くの研究成果を得た。当初の研究計画に記載した研究以外の調査も実施しており計画以上に進展しているものの、データ分析が十分といえないため。今後、今回の知見をもとに、相談を行いやすい学級風土の高い学級・低い学級における、教師に相談することを促すような教師の働きかけ、生徒同士で相談することを促すような教師の働きかけについて比較などを行い、より適切な教師の働きかけについて明らかにしていく。
遺伝的アルゴリズムを用いる音声認識モデルの構成法に関する研究

情報処理システムと人間との間で情報の授受を行うとき、音声言語を媒介とすることは、人間にとって最も根源的かつ高速で便利な手段である。本研究では、情報処理システムが音声言語を受理する機能である音声の自動認識について、その高性能化を目的として、遺伝的アルゴリズムを用いて認識モデルを構成する新しい手法を提案し、その有効性を実証する。具体的には、生物の個体に対応して種々のマルコフモデルを多数生成する。遺伝子コードとしては、マルコフモデルの状態数と状態遷移関係を採用し、モデルの適応度として、訓練用データに対するモデルの認識率を採用する。この方法では世代を経るに従い、認識率の低いモデルは淘汰され、より認識率の高いモデルが生き残るので、高性能音声認識モデルが得られる。本年度の研究は、以下のように行った。音声データの作成では、CD-ROMで供給されているNIST「TIDIGITS」から英語の数字および4桁数字単語を取り出し、大容量ハードディスクに格納した。プログラムの作成では、(1)状態数および状態遷移関係が可変のプログラムとした。(2)遺伝子コーディング部は、予備的にすでに作ってあるプログラムを参照して新たに作成した。認識実験での実験項目は、(1)多数状態マルコフモデルの性能評価、(2)遺伝子コーディング法の性能評価である。以上の実験により、その有効性が示された。
メカニカルストレスが惹起する細胞分化の分子調節機構

マウス歯根膜におけるメカニカルストレスが引き起こすRunx2とMsx2の発現状況の初期変化を免疫組織化学的に検討した.結果として,実験群では,Runx2とMsx2は20分で牽引側の歯根膜線維芽細胞に強い免疫陽性反応がみられた.さらにALPも同様の反応を示した.BMPやHSPの発現も上昇していた。これらの実験結果はRunx2が骨芽細胞分化の初期では分化を促進し,Msx2はRunx2の作用を活性化する方向に働いていること,またHSPが分子シャペロンとして働いている可能生を強く示唆した.マウス歯根膜におけるメカニカルストレスが引き起こすRunx2とMsx2の発現状況の初期変化を免疫組織化学的に検討した.結果として,実験群では,Runx2とMsx2は20分で牽引側の歯根膜線維芽細胞に強い免疫陽性反応がみられた.さらにALPも同様の反応を示した.BMPやHSPの発現も上昇していた。これらの実験結果はRunx2が骨芽細胞分化の初期では分化を促進し,Msx2はRunx2の作用を活性化する方向に働いていること,またHSPが分子シャペロンとして働いている可能生を強く示唆した.今年度実施した研究事項と得られた主たる研究成果は以下の通りである。1.実験的歯の矯正治療時に歯周組織等に誘導される骨芽細胞分化の研究上記事象の惹起には歯根膜線維芽細胞の分化が密接に関与していることは,昨年度の研究成果で明らかになっていたが,今年度のデータからいわゆる牽引側歯根膜線維芽細胞には刺激を受けた直後から細胞反応が生じ,刺激後20分で既にRunx2の活性化が起こる事が明らかになった。さらに,その促進因子としてMsx2の関与が示された。また,ALPについても同実験系において,Runx2の発現を裏付ける挙動を示したことから,牽引側歯根膜線維芽細胞の分化方向が“骨芽細胞へ向いていることが確認された。このことについては,数回の学会発表と1篇の論文として印刷公表した。2.傷害刺激因子に対する歯根膜におけるHSPの発現上記同様な実験系において,歯根膜細胞にその傷害性刺激への細胞反応としてHSPが発現していることを明らかにした。すなわち,いわゆる牽引側では骨芽細胞方向への細胞分化が起こるのであるが,同時に受けた牽引刺激は傷害刺激でもあるわけで,その修復に一役買っているであろう事は推察される。3.傷害刺激因子に対する歯髄組織でのHSPの発現上記同様な実験系において,歯根端孔を通っている脈管は相対的な位置移動によって傷害刺激を受け,その結果として歯髄細胞にもHSPが発現していることを明らかにした。歯科矯正学的治療の免疫組織化学的基盤,すなわち歯科矯正学的メカニカルストレスを付与したマウスの歯根膜組織を用いて,その初期における病理組織学的変化を調べるとともに,骨芽細胞分化関連因子であるRunx2とMsx2の免疫組織化学的発現の変化について追究した。当該の牽引側歯根膜線維芽細胞は,メカニカルストレスを受けた20分後には両者の強い発現があり,この傾向は時間の経過とともに増強していた。24時間後においては,歯根膜線維芽細胞,骨芽細胞,セメント芽細胞に強発現していた。また,ALPの発現も同様であった。以上の所見から,Runx2は初期の骨芽細胞への分化を誘導し,Msx2はその際の促進因子として働く事が強く示唆された。メカニカルストレス付加後に,牽引側において発現するBMPの発現状況についても追究した。実験にはddYマウスを用い,Waldo法によって行った。免疫組織化学的にBMP-2/4は,対照群ではいずれも極めて弱い発現であったのに対し,実験群においては20分と極めて初期に強い発現がみられた。これは,初期のメカニカルストレスは,BMPsの発現増強によってRunx2の発現を促し,骨芽細胞への分化を誘導する事を示すものであろう。熱ショックタンパク質(HSP)は熱ショックのみならず,メカニカルストレスに対しても発現する。歯科矯正治療は,関連する歯周組織にメカニカルストレスを負荷する。それを受けた後の歯周組織に発現するHSPの状況を調べる事は極めて重要である。そこで今回,歯科矯正学的メカニカルストレスをWaldo法によってddYマウスの歯根膜組織に与え,その後の変化を病理組織学的ならびに免疫組織化学的に検索した。その結果,対照群ではHSP27と70はともに極めて弱い発現であったのに対し,実験群の牽引側歯根膜組織にHSP27と70の両者の発現増強がみられた。これらの所見は,HSPsは歯根膜組織の恒常性の維持に寄与している事を示唆していた。メカニカルストレスが惹起する細胞分化の分子調節機構について,歯科矯正学細胞分化について検討した。すなわち,歯科矯正学的メカニカルストレスを付与したマウスの歯根膜組織の病理組織学的変化を調べるとともに,誘導されるHSP27とp-HSP27の初期における発現状況の変化を免疫組織化学的に検討したのである.実験動物としてddYマウスを使用し,Waldoの方法によりマウスの上顎臼歯間にセパレーターを挿入して矯正学的なメカニカルストレスの付与を行った.実験開始後10分,20分,1時間,3時間,9時間および24時間で当該部を切り出し,4%パラホルムアルデヒド0.05Mリン酸緩衝固定液にて固定した.

その後,パラフィン連続切片標本を作製し,病理組織学的に検討するとともに免疫組織化学的にHSP27およびp-HSP27の発現状況を検討した.なお,対照として無処置群を設定した.その結果,対照群の歯根膜線維芽細胞はその全周にわたってHSP27の活性がみられ,これは低い状態で保たれていた.p-HSP27の活性はそれよりもかなり低い状態で保たれていた.実験群では,HSP27は10分で牽引側の歯根膜線維芽細胞に免疫陽性反応の局在化がみられ,時間の経過とともにこれらの陽性反応は増強し,9時間では歯根膜線維芽細胞,骨芽細胞にも強く発現していた.p-HSP27も経時的に陽性反応の増強を示したが,HSP27の発現を追うように,若干遅れていた.これらの実験結果はメカニカルストレスによってHSP27のリン酸化が促進され、結果生じたp-HSP27は牽引側歯根膜線維芽細胞の活性化による組織の修復やホメオスタシスの維持,また骨芽細胞活性化による同部への骨添加傾向へのシャペロンとして働いていることを強く示唆した。
ガングリオシドによる神経細胞膜輸送系の調節の機構

1.神経細胞の膜輸送系におよぼすガングリオシドの効果について,神経芽細胞腫の培養細胞株を用いて解析するための,ひとつのアプロ-チとして,糖脂質合成酵素阻害剤threoーPDMP(1ーphenylー2ーdecanoylaminoー3ーmorpholinoー1ーpropanol)の添加培養による糖脂質生合成の阻害と,培養細胞におよぼす効果を検討した.2.マウス神経芽細胞腫の培養細胞株,NSー20Yについて,代謝標識により糖脂質生合成の解析を行った結果,PDMP(50μM)の添加によりガングリオシドの生合成は著しく阻害され,細胞膜糖脂質の量的変化を生じさせ得ることがわかった.ガングリオシド,中性糖脂質への^<14>Cガラクト-スの取り込みは,PDMPの存在により,それぞれ対照の12%,20%に減少した.PDMP添加24時間後では,細胞の中性糖脂質,ガングリオシドの存在量はそれぞれ32%,57%に減少した.3.神経芽細胞の増殖はPDMPによって濃度依存的に抑制されたが,低濃度ではその効果は細胞傷害的ではなく,可逆的であり,培養細胞系で細胞膜糖脂質のレベルを人為的に制御し得る可能性が示された.4.(1)神経芽細胞をserumーfree medium中で培養したときに起こる神経突起の伸展が,PDMPの存在によって強く抑制される現象がみいだされ,糖脂質生合成が神経突起の伸展に必要である可能性が示された.(2)PDMPによる神経突起の伸展の抑制は可逆的であり,またPDMPはすでに伸展した神経突起に対しても,その退縮をひき起こす効果を示すことが明らかとなり,その作用機序が興味ある問題点となった.(3)神経芽細胞をあらかじめGM1ガングリオシドを添加して培養することによって,PDMPによる神経突起の伸展の抑制が部分的に解消された.1.神経細胞の膜輸送系におよぼすガングリオシドの効果について,神経芽細胞腫の培養細胞株を用いて解析するための,ひとつのアプロ-チとして,糖脂質合成酵素阻害剤threoーPDMP(1ーphenylー2ーdecanoylaminoー3ーmorpholinoー1ーpropanol)の添加培養による糖脂質生合成の阻害と,培養細胞におよぼす効果を検討した.2.マウス神経芽細胞腫の培養細胞株,NSー20Yについて,代謝標識により糖脂質生合成の解析を行った結果,PDMP(50μM)の添加によりガングリオシドの生合成は著しく阻害され,細胞膜糖脂質の量的変化を生じさせ得ることがわかった.ガングリオシド,中性糖脂質への^<14>Cガラクト-スの取り込みは,PDMPの存在により,それぞれ対照の12%,20%に減少した.PDMP添加24時間後では,細胞の中性糖脂質,ガングリオシドの存在量はそれぞれ32%,57%に減少した.3.神経芽細胞の増殖はPDMPによって濃度依存的に抑制されたが,低濃度ではその効果は細胞傷害的ではなく,可逆的であり,培養細胞系で細胞膜糖脂質のレベルを人為的に制御し得る可能性が示された.4.(1)神経芽細胞をserumーfree medium中で培養したときに起こる神経突起の伸展が,PDMPの存在によって強く抑制される現象がみいだされ,糖脂質生合成が神経突起の伸展に必要である可能性が示された.(2)PDMPによる神経突起の伸展の抑制は可逆的であり,またPDMPはすでに伸展した神経突起に対しても,その退縮をひき起こす効果を示すことが明らかとなり,その作用機序が興味ある問題点となった.(3)神経芽細胞をあらかじめGM1ガングリオシドを添加して培養することによって,PDMPによる神経突起の伸展の抑制が部分的に解消された.
インスリン様活性を調節する新しい細胞内メカニズムの解明

本研究では、インスリン様成長因子(IGF)、インスリンの細胞内シグナル伝達に重要な役割を果たしているインスリン受容体チロシンキナーゼの基質IRSに相互作用し、自身のチロシンリン酸化や下流シグナルを修飾するタンパク質(IRSAP)が存在することを証明し、これらを同定することを目的とした。我々は、(1)IRSの分子質量は180kDaにも関わらず、細胞抽出液中の非変性状態のIRSは700kDa以上の分子質量を示す、(2)甲状腺刺激ホルモンで処理した甲状腺細胞FRTL-5、あるいはTNFαで処理した脂肪細胞3T3-L1・筋管細胞L6よりIRSを免疫沈降後、このIRSをIGF-I受容体/インスリン受容体でin vitroチロシンリン酸化反応を行ったところ、細胞系と同様にチロシンリン酸化が変化し、更にIRS免疫沈降物を高塩濃度の緩衝液で洗浄するなどしてIRSと相互作用するタンパク質を除去後in vitroリン酸化反応を行うと、このチロシンリン酸化の変動が観察されなくなる、(3)yeast two-hybridscreening及びIRSの共免疫沈降物のプロテオミクス解析で20種類ほどのIRSAPの同定に成功し、これらは性質や機能から、IRSの細胞内局在を決める輸送因子、IRSを介してインスリン様活性を発現する仲介因子、IRSのチロシンリン酸化や下流シグナルを修飾する修飾因子に大別される、(4)同定したIRSAPを強制発現したIGF/インスリン標的細胞では、IGF/インスリン刺激に応答したIRSを介したシグナル・生理活性が修飾される、(5)IRSの細胞内局在はIRSAPにより決定され、それぞれ細胞部位で異なる機能を発揮することなどを明らかにした。本研究では、IGF-I受容体/インスリン受容体チロシンキナーゼの基質であるIRS-1あるいはIRS-2に相互作用し、自身のチロシンリン酸化や下流シグナルを修飾する分子を網羅的に同定することを目的としている。本年度は、IRS-1をbaitとして、3T3-L1脂肪細胞をはじめとした種々の細胞のcDNA libraryをpreyとしたyeast two-hybrid screeningを行い、複数種のIRSと相互作用する分子をコードする遺伝子の取得に成功した。このうちいくつかの分子は、脂肪細胞をサイトカインで処理した際に、IRS-1のインスリン依存性チロシンリン酸化の抑制に関与することが示唆された。一方、トロピックホルモンによりIGFシグナルの増強が観察されるFRTL-5甲状腺細胞の抽出液より、抗IRS-2抗体を用いてIRS-2と共免疫沈降されるタンパク質を網羅的にMALDI-TOF MS分析で調べたところ、シャペロン分子や同時にIGF-I受容体とも相互作用する分子などが同定された。更に、L6筋管細胞の細胞抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、抗IRS-1抗体でimmunobloblottingを行ったところ、IRS-1は、自身の分子質量180kDaより高分子質量領域(700kDa付近)に溶出されることがわかり、細胞内でIRSが巨大な複合体を形成していることがあらためて明らかとなった。また、ラットのIGF/インスリンの標的臓器である肝臓、筋肉、脂肪組織などから抗IRS-1抗体で共免疫沈降されるタンパク質を二次元電気泳動で解析したところ、臓器によってIRSと相互作用するタンパク質のパターンは大きく異なることもわかった。以上の結果より、臓器特異的にIRSと相互作用するタンパク質は複数種あり、これらの組み合わせが刺激によって変動することにより、IGF/インスリンシグナルが修飾されると考えられた。

まず、本年度は、TNFα処理することによって引き起こされる3T3-L1脂肪細胞のインスリンシグナル抑制機構を明らかにするために、IRS-1をbaitに用い、TNFα処理した3T3-L1脂肪細胞のcDNA libraryをpreyとしたyeast two-hybrid screeningを行い、IRSと相互作用する分子、IRSAPをコードする複数の遺伝子の取得に成功した。同定したタンパク質のひとつ、GKAPは、3T3-L1脂肪細胞のTNFα前処理後のインスリン処理に応答してIRS-1とPKGと複合体を形成し、PKG活性を介してインスリン抵抗性を発生していることが明らかとなった。一方、トロピックホルモンによりIGFシグナルの増強が観察されるFRTL-5甲状腺細胞の抽出液より、抗IRS-2抗体を用いてIRS-2と共免疫沈降されるタンパク質を網羅的にMALDI-TOF MS分析で調べたところ、IRS-2と相互作用する複数種のタンパク質の同定に成功した。この中には、シャペロン分子HSP90が含まれ、FRTL-5細胞をトロピックホルモンで処理する際にHSP90のシャペロン活性を抑制する阻害剤を添加すると、IRS-2のIGF依存性チロシンリン酸化の増強が観察されなくなった。他の結果も併せ、他の細胞外因子によるIRSを介したシグナルの修飾には、IRSのセリン/スレオニンリン酸化のような分子内修飾と同時に、IRSとIRSAPとの相互作用、すなわちタンパク質-タンパク質相互作用が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本研究は、IGF-1受容体/インスリン受容体チロシンキナーゼの基質であるIRS-1あるいはIRS-2に相互作用し、自身のチロシンリン酸化や下流シグナルを修飾する分子を網羅的に同定することを目的としている。今回、IRSと相互作用する分子として、ゴルジ体からエンドソームへの移行に重要な役割を担うAP(adapter protein)複合体の構成分子、細胞膜からエンドソームへの移行に重要な役割を担うAP複合体の構成分子、膜ラフトへの局在に何らかの役割を果たしているNedd4、細胞質にとどまるために機能していると考えられる14-3-3、また核輸送を担っているimportinβなどの同定に成功した。これらの分子に結合したIRSは、それぞれエンドソームの回り、細胞膜付近、細胞膜ラフト構造、細胞質、核に局在していることが明らかになりつつある。これまで、IRSは細胞膜付近に存在し、IGF-1受容体/インスリン受容体チロシンキナーゼにチロシンリン酸化されることによって細胞内にシグナルを伝達すると考えられていたが、我々の研究成果も含め、インスリン/IGFの代謝制御活性の発現には、シグナルが細胞膜近傍だけではなく、エンドソームにも伝えられる必要があることが指摘されてきている。このように我々の研究成果は、細胞内でIRSは異なる細胞内トラフィッキングタンパク質と相互作用して特定の部位に輸送され、その部位に特徴的な複合体を形成、特異的な作用を発現・調節しているという全く新しい機構の存在の可能性を強く示している。IRSをbaitとしたyeast two-hybridscreening及びIRSの共免疫沈降物のプロテオミクス解析で20種類ほどのIRSAPsの同定に成功し,IRSAPは性質や機能から,IRSの細胞内局在を決める