hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FRET－GT － 細胞内情報伝達分子の活性に基づくトランスクリプトミクス技術

(1)腫瘍細胞の情報伝達系の確率論的・動的なゆらぎの実証Rac1,Cdc42,RhoA活性をモニターするFRETバイオセンサーを発現するグリオブラストーマ細胞をそれぞれ使用し、培養条件下で播種した細胞を顕微鏡下とセルサイトメーターにより集団として分子活性がどのくらい広がって分布しているのか検討した。その結果、どちらもRac1,Cdc42活性は幅広い分子活性分布を、RhoA活性は比較的狭い分子活性分布を示した。次にRac1活性の高い細胞と低い細胞をセルサイトメーターで分取して培養し、活性が元と同じ分布に回帰するかどうか検討した。1時間、1日後は活性が保たれているが、1週間後には元の分布に回帰した。よって、この活性の変化が動的・確率的に変化していること(ゆらぎ)が示唆された。また1細胞内でのRac1活性を5日間、タイムラプスFRETイメージングし活性がゆらいでいることを証明した。(2)FRET-GT法を用いたRac1分子活性の"ゆらぎ"の腫瘍の悪性度に及ぼす影響の解析Rac1活性の高い細胞と低い細胞をセルソーターによって分取し、次世代シーケンサを使ってRNAの発現量を解析(RNA-seq)した。同様に、Cdc42とRhoA活性の高い細胞群、低い細胞群もそれぞれRNA-seqを行った。その結果、活性の高い細胞群と低い細胞群を比較したとき発現変動の大きかった遺伝子は、Rac1とCdc42で似たような発現パターンを示した。一方、RhoA活性では似た発現パターンは確認できなかった。これらのことは、Rac1とCdc42の活性分布パターンが類似し、RhoAが異なることと一致している。さらに、遺伝子機能によって分類し統計処理したところ、Rac1活性の高い細胞群には細胞運動などRac1活性と関係する遺伝子が有意に存在することが分かった。Rac1活性と腫瘍の浸潤能を検討するため、上記方法でセルソーターを用いて分取した細胞の浸潤能を、BD社のマトリゲルインベージョンチャンバーを用いて実験を行った。Rac1活性の高い細胞のほうが、マトリゲル内を早く浸潤することが分かった。インベージョンチャンバーを用いて、Rac1活性の高い細胞群で発現変動の大きかった遺伝子の中で膜に存在する遺伝子16個が浸潤に及ぼす影響をそれぞれ調べた。siRNAを用いてノックダウンし、その細胞の浸潤能を検討している。16個の遺伝子の内、4個の遺伝子、MMP15,TSN17_RAT,Freq/NCS-1,Pstpip2において、ノックダウンによる浸潤能の低下がみられた。申請書に書いた通りの結果を得ることができ、進み具合も年次計画通りである。(2)FRET-GT法を用いた腫瘍細胞におけるRac1分子活性の"ゆらぎ"の発生機構の解析Rac1活性の高い細胞と低い細胞をセルソーターによって分取し、次世代シーケンサを使ってRNAの発現量を解析、(RNA-seq)した。現在この中に含まれる遺伝子に注目し解析中である。

また1細胞内でのRac1活性を5日間、タイムラプスFRETイメージングし活性がゆらいでいることを証明した。(2)FRET-GT法を用いたRac1分子活性の"ゆらぎ"の腫瘍の悪性度に及ぼす影響の解析Rac1活性の高い細胞と低い細胞をセルソーターによって分取し、次世代シーケンサを使ってRNAの発現量を解析(RNA-seq)した。同様に、Cdc42とRhoA活性の高い細胞群、低い細胞群もそれぞれRNA-seqを行った。その結果、活性の高い細胞群と低い細胞群を比較したとき発現変動の大きかった遺伝子は、Rac1とCdc42で似たような発現パターンを示した。一方、RhoA活性では似た発現パターンは確認できなかった。これらのことは、Rac1とCdc42の活性分布パターンが類似し、RhoAが異なることと一致している。さらに、遺伝子機能によって分類し統計処理したところ、Rac1活性の高い細胞群には細胞運動などRac1活性と関係する遺伝子が有意に存在することが分かった。Rac1活性と腫瘍の浸潤能を検討するため、上記方法でセルソーターを用いて分取した細胞の浸潤能を、BD社のマトリゲルインベージョンチャンバーを用いて実験を行った。Rac1活性の高い細胞のほうが、マトリゲル内を早く浸潤することが分かった。インベージョンチャンバーを用いて、Rac1活性の高い細胞群で発現変動の大きかった遺伝子の中で膜に存在する遺伝子16個が浸潤に及ぼす影響をそれぞれ調べた。siRNAを用いてノックダウンし、その細胞の浸潤能を検討している。16個の遺伝子の内、4個の遺伝子、MMP15,TSN17_RAT,Freq/NCS-1,Pstpip2において、ノックダウンによる浸潤能の低下がみられた。申請書に書いた通りの結果を得ることができ、進み具合も年次計画通りである。さらに、申請書にはRac1のみを書いたが、同じRho-family GTPasesのCdc42とRhoAについても解析を行えているので当初の計画以上に進展していると言える。今後は、FRETによって分けられた細胞で特異的に発現上昇していた遺伝子に注目し、過剰発現、ノックダウンを行い、それらの遺伝子がRac1活性や浸潤能に与える影響を調べる。論文として発表する準備も始めている。
ホルモン及びオータコイド受容体を介した薬物の輸送活性調節

腎有機アニオン輸送及びP-糖蛋白質介在性輸送の活性調節について、培養細胞系を用いたin vitroレベルおよびラットを用いたin vivoレベルでの解析を行った結果、以下の知見が得られた。腎有機アニオン輸送の活性調節:有機アニオン輸送を解析する上で有用なモデル細胞系である培養腎上皮細胞OKを用いて、有機アニオンp-aminohippurate(PAH)輸送に及ぼすアデノシンA_1レセプターアンタゴニストKW-3902の影響について検討した。その結果、OK細胞におけるPAHの側底膜側から頂側膜側への経細胞輸送(尿細管分泌方向に対応)及び側底膜輸送のいずれもがKW-3902処理濃度依存的に阻害されることを見出した。また、別のアデノシンA_1レセプターアンタゴニストDPCPXで処理した場合においても、側底膜PAH輸送は阻害されることを認めた。さらに、adenosine deaminase処理によっても側底膜PAH輸送は低下することから、腎尿細管においてオータコイドとして作用するアデノシンが腎有機アニオン輸送の活性調節に関与していることが示唆された。P-糖蛋白質介在性輸送の活性調節:グルココルチコイドであるデキサメタゾン(DEX)をラットに投与後3ないし4日目に、P-糖蛋白質基質ローダミン123(Rho123)の体内動態を解析したところ、対照群に比べ著しくRho123の全身クリアランス、腎クリアランス、消化管分泌クラアランス等が上昇していることが観察された。また、Western blot解析を行った結果、DEX投与によって腎皮質および小腸におけるP-糖蛋白質の発現量は増加しており、クリアランス実験で得られた結果と対応していることが認められた。以上、本研究において薬物輸送である腎有機アニオン輸送及びP-糖蛋白質介在性輸送活性がホルモンやオータコイドによって調節を受けることが示された。現在、主に培養細胞系あるいはラットを用い、腎有機アニオン輸送及びP-糖蛋白質介在性輸送の活性調節について解析を進めている。今年度の研究によって得られた知見及び今後の展開は以下のとおりである。腎有機アニオン輸送の活性調節研究:培養腎上皮細胞OKを用いて、有機アニオンp-aminohippurate(PAH)輸送に及ぼすアデノシンA_1レセプターアンタゴニストKW-3902の影響について検討した。その結果、OK細胞におけるPAHの経細胞輸送及び側底膜輸送のいずれもがKW-3902処理濃度依存的に阻害されることを見出した。また、別のアデノシンA_1レセプターアンタゴニストである8-cyclopenlyl-1,3-dipropylxanthine(DPCPX)も、側底膜PAH輸送を阻害することを認めている。さらに、adenosine deanminase処理によっても側底膜PAH輸送は低下することから、腎尿細管においてオータコイドとして作用しているアデノシンが腎有機アニオン輸送の活性調節に関与している可能性が考えられる。P-糖蛋白質介在性輸送の活性調節研究:この研究は、ラットを用いた全身レベルでの解析を進めている。チトクロームP4503A(CYP3A)を誘導するグルココルチコイドであるデキサメタゾン(DEX)をラットに投与後3ないし4日目に、P-糖蛋白質基質ローダミン123(Rh0123)の体内動態について解析したところ、対照群に比べ著しくRho123の全身クリアランス、腎クリアランス、消化管分泌クリアランス等が上昇していることが観察された。これらクリアランス上昇はDEXによってP-糖蛋白質が誘導された結果である可能性が考えられることから、Western blottingなどによる解析も開始している。
顎機能障害の診断、治療方針決定のためのデータベース構築

顎機能障害患者のデータベース構築にあたり、主訴、既往歴、現病歴および三大症候を把握するための質問表ならびに検査所見記入用のプロトコールを作成した。三大症候について顎関節雑音、疼痛、開口量を、顎運動に関して開閉口路、偏心運動量を、口腔内軟組織所見として頬粘膜ヒダ、舌圧痕を、咬合所見に関して欠損の有無、咬合状態、咬合様式、咬頭嵌合位や歯牙接触の異常の有無を、画像情報としてエックス線所見、MRI所見を、精神心理学的側面から不安-抑うつ傾向、性格傾向を、顎関節症の症型診断、治療方法および転帰を記入する項目を設けた。このプロトコールにリンクさせたデータベース入力用フォーマットを作成し、良好な治療成績の得られた患者のデータをパーソナルコンピュータに入力しデータベースを構築することができた。その結果、治療成績に関して7383%の有効率を示し、治療が有効であったものは患者教育および理学療法が共通して多く、それ以外にもI型、II型ではスプリント療法や薬物療法、IIIb型では薬物療法や外科的療法、IV型はスプリント療法も認められた。顎機能障害の診断はエキスパート・システムが顎機能障害に関する知識を処理する上で有用と考えられ、今回、データベースとして蓄積した知識ベースを、どのような症例でも共通に使用できる推論機構を用いて処理することにより問題解決を図っていくことができる。プロトタイプ・システムとして知識ベースは顎関節雑音ユニット、疼痛ユニット、開口量ユニット、画像検査ユニットおよび随伴症状ユニットを構成し、これらのユニットのどれに当てはまるかからルールを決め診断ユニットを製作する。そして、得られた異常所見から治療法を決定するルールを決めることが必要である。その後、人工知能に関する理論的基礎および知識工学に関する方法論的基礎を有する技術者によりエキスパート・システムが構築されると考えられた。データベースの構築にあたり、全国の顎関節専門外来で使用しているプロトコールに関して調査し、また、文献的に顎関節症のプロトコールに関して資料を収集し、プロトコールの必要な項目について準備段階で試験的に使用しているものを基本に再検討した。その結果、三大症候については顎関節雑音は種類を、疼痛は自発痛、運動痛および圧痛に分け、自発痛は部位と程度(VAS値)を、運動痛は運動の種類と疼痛発現部位および程度(VAS値)を、圧痛は部位と程度を、開口障害は無痛性最大開口量、有痛性最大開口量、強制最大開口量を記録する。また、咬合所見に関して、咬合様式、咬頭嵌合位や歯牙接触の異常の有無を記録する。さらに、精神心理学的側面から不安-抑うつ傾向を点数化し導入することにより、歯科において診療可能な患者であるかどうかの鑑別資料を記録する。以上の検査資料に加えて症型診断ならびに選択した治療方法および転帰の項目を設け顎機能障害診療用エキスパートシステムにつながるフォーマットを完成した。平成16年度に製作したデータベース入力用フオーマットに顎機能障害患者のデータの入力を行い、約150症例をデータベースに蓄積した。これらのデータを集計した結果、初発症状は雑音が46%、疼痛が43%と多かった。主訴は疼痛が71%と最も多かった。現症は疼痛が90%と最も多く、雑音が53%、開口障害が51%、他の訴えが47%認められた。自発痛は少なく、運動痛は顎関節で30%と多く、閉口筋で15%認められた。圧痛は閉口筋で33%と多く、顎関節で21%認められ、開口筋や胸鎖乳突筋でも10%以上認められた。雑音は単発性のクリックが62%と最も多く、レシプロカル・クリックが26%、クレピタスが12%認められた。

開口障害は約半数に認められ、3039mmが27%、2029mmが19%で、1019mmも4%認められた。他の訴えでは肩頸部のこりや痛みが31%、頭痛が29%と多く、耳の症状も19%認められた。エックス線検査による骨形態異常は7%と少なかったが、吸収性骨変化が最も多かった。咬合に関しては咬頭嵌合位の異常が11%、歯牙接触の異常が27%認められ、早期接触も咬頭干渉も大臼歯部に多く認められた。不安抑うつテストでは疑診・確診の判定が不安で34%、抑うつで15%認められた。顎関節学会の症型分類ではI型が26%、II型が13%、IIIa型が19%、IIIb型が21%、IV型が7%、V型が14%であった。治療法は生活指導と理学療法がそれぞれ58%と多く、薬物療法36%、スプリント療法28%であった。これらの結果より導き出された症型毎のルールに従い、顎機能障害の診査、診断用のプロトコールを作製した。顎機能障害を有する新患を対象に診査データをノート型パーソナルコンピュータにチェアサイドで直接入力し、診断および治療方針はデータベースの分析より求められたルールに基づいて実施し、治療結果はデータベースに蓄積した。平成17年度に改変した顎機能障害の診査、診断用のプロトコールに基づき、顎機能障害を有する新患を対象に診査データをノート型パーソナルコンピュータにチェアサイドで直接入力し、改変したデータベース入力用フォーマットに顎機能障害患者のデータの入力を行い、約404症例をデータベースに蓄積した。エキスパートシステムの構築に使用するデータベースを分析した結果、女性患者の割合は74%で、最も多い20歳代は23%、30歳代21%、50歳代13%、10,40、および60歳代12%、70歳以上7%であった。症状発現から来科までの期間は、1年以上が42%と最も多かった。主訴は疼痛69%、雑音24%および開口障害28%であった。現症は疼痛81%、雑音53%および開口障害46%であった。日本顎関節学会の症型分類はIIIa型37%、IIIb型20%、I型18%、IV型10%およびII型9%であった。不安抑うつテストでは疑診・確診の判定が不安で28%、抑うつで10%認められた。治療法は患者教育67%、理学療法64%、薬物療法28%、スプリント療法26%、不可逆的咬合治療4%および外科的療法2%であった。治療成績は症状の完全消失が42%、日常生活に支障がない状態まで改善が34%、変化なしが1%、治療中断が16%および未治療が7%であった。症型別治療成績はI型において症状の完全消失が50%、日常生活に支障がない状態まで改善が24%、II型において症状の完全消失が45%、日常生活に支障がない状態まで改善が34%、IIIa型において症状の完全消失が40%、日常生活に支障がない状態まで改善が34%、IIIb型において症状の完全消失が37%、日常生活に支障がない状態まで改善が47%、IV型において症状の完全消失が49%、日常生活に支障がない状態まで改善が28%であった。
ＤＮＡ修復を利用したエピミュータジェンのスクリーニング

エピジェネティックな形質発現変化は遺伝子プロモーター領域のメチル化の変化を伴う。エピジェネティックな変化を起こす外来化学物質をエピミュータジェンという。本研究では脱メチル化を起こすエピミュータジェンをスクリーニングする新規アッセイ系の作製を試みた。メチル化によってO6ーメチルグアニン修復遺伝子(MGMT)の発現が抑制されている癌細胞に5ーアザシチジンを処理して、MGMTの発現を緑色蛍光およびメチルニトロソウレア(MNU)耐性出現で検出する系を作製した。出現したMNU耐性細胞のMGMT発現をmRNAおよびタンパク質発現で確認した。本アッセイ系を用いて環境中のエピミュータジェンを検出できる。エピジェネティックな遺伝子の変化、すなわちシトシンのメチル化やヒストンのメチル化・アセチル化・リン酸化などによる遺伝子発現の変化は、発生・分化の異常や発がんに関わる。これらの変化は外来の化学物質によっても引き起こされると考えられる。本研究では、5ーメチルシトシンの脱メチル化を起こし、不活化していた遺伝子を発現させる化学物質、エピミュータジェンをスクリーニングできるバイオアッセイ法の樹立を目指した。DNA修復酵素であるO6メチルグアニンーメチルトランスフェラーゼ(MGMT)の発現を、プロモーターのメチル化によって欠損するヒトHeLaMR細胞とその発現が回復したHeLaNURを用いた。DNAアルキル化剤であるMNU処理した緑色蛍光レポータープラスミドpCMV-EGFP1を導入したHeLaMR細胞に、代表的エピミュータゲンである5-アザシトシン(AzaC)を処理し、24時間後に緑色蛍光を発する細胞の割合が最も多いAzaC濃度を決定することを試みた。しかしMGMT活性を回復する細胞の割合が少なく、この方法ではアッセイができないことがわかった。そこで細胞生物学的にエピミュータゲン活性を定量的に測定する方法の樹立を試みた。代表的エピミュータゲンであるAzaC処理し、その後通常培地で10日間培養後、NMU 1 mM 1時間処理し、MNU抵抗性コロニーの出現頻度を求めた。その結果、出現頻度は処理濃度依存的にそれぞれ4070倍上昇することがわかった。この方法は簡便ではないが、定量性に優れたエピミュータゲン活性測定法であるといえる。また出現したコロニーのMGMT発現を確認し、MGMTプロモーターの脱メチル化をバイサルファイトシーケンシングによって確認した。この方法でデシタビンの強力な脱メチル化作用を確認したが、トリコスタチンは脱メチル化作用は確認できなかった。今後この方法を用いて種々の物質のだ津メチル化作用を検討していく。DNA修復酵素であるO6メチルグアニンーメチルトランスフェラーゼ(MGMT)の発現を欠損するヒトHeLaMR細胞と(MGMT遺伝子プロモーターの複数のCpGサイトのシトシンの5位がメチル化されている)、その発現が回復したHeLaNURを用いた。緑色蛍光レポータープラスミドpCMV-EGFP1を処理するO6-メチル化剤であるN-メチル-N-ニトロソ尿素(MNU)の至適濃度を決定した。そのためにMNUの処理濃度を0.1 mM2 mMの間で変化させてpCMV-EGFP1を1時間37 °Cで処理した。処理後のpCMV-EGFP1を精製後、HeLaMR細胞に導入し翌日よりAzaC 10μMを24時間処理し、緑色蛍光を発する細胞の割合をイメージングサイトメーターで測定した。これによってMNUの濃度は0.1-0.2 mM処理のとき、緑色蛍光強度が細胞の修復MGMT活性を反映することがわかった。MNU処理したpCMV-EGFP1を導入したHeLaMR細胞に、代表的エピミュータゲンであるAzaC(140μM)を処理し、24時間後に緑色蛍光を発する細胞の割合が最も多いAzaC濃度を決定することを試みた。代表的エピニュータゲンであるAzaC(130μM)、AzadC(110μM)処理し、その後通常培地で10日間培養後、NMU 1 mM 1時間処理し、MNU抵抗性コロニーの出現頻度を求めた。その結果、出現頻度は処理濃度依存的にそれぞれ40倍、70倍上昇することがわかった。平成24年度の研究実施計画(14)のうち、1(MNU至適濃度決定)、2(AzaC至適濃度および至適処理時間)、3(緑色蛍光レポータープラスミドpCMV-EGFP1を用いたエピミュータゲンアッセイ)は実施を終えた。しかし3の結果は、緑色蛍光レポータープラスミド用いたアッセイの樹立が困難を示唆する結果であった。そのため、研究実施計画4(MGMT転写量)は実施しなかった。

その代わり、細胞生物学的にエピミュータゲン活性を定量的に測定する方法の樹立を試み、良好な結果を得た。そのため、達成度はおおむね順調に進展していると判断した。1 HeLaMR細胞に化学物質(エピミュータゲン)を処理し、1 mM MNU抵抗性細胞の出現頻度によって、化学物質のエピミュータゲン活性を定量的に測定する方法を確実なものとする。そのため代表的エピミュータゲンであるAzaC(115μM)およびAzadC(130μM)を細かい濃度間隔で細胞に処理し、エピミュータゲン活性の化学物質処理濃度依存性を求める。2ヒストン脱アセチル化阻害剤、トリコスタチンA(Trichostatin A)、酪酸(n-Butyrate)、アピシジン(Apicidin)、バルプロ酸(valproic acid)などがエピミュータゲン活性を有していないか、1で樹立した系で調べる。3環境化学物質、亜ヒ酸(selenite)、ビスフェノールA(Bisphenol A)などがエピミュータゲン活性を有していないか、1で樹立した系で調べる。4上記の処理によって得られたHeLaMUR細胞における、MGMTの遺伝子発現の活性化、およびMGMTプロモーターの脱メチル化を、分子生物学的方法で確かめる。25年度支出予定額は、様式F-6-1の表の次年度使用額(B-A)1,036,341円+25年度交付予定額1,950,000円=2,986,341円内訳は間接経費450,000円+直接経費2,536,341円25年度直接経費の内訳は、物品費1,286,341円+人件費1,000,000円+旅費150,000円+その他費100,000円物品費は試薬代、プラスチック・ガラス小器具代に使用する。人件費は実験補助者謝金1名分に使用する。旅費は学会発表および研究打ち合わせに使用する。その他費は学会参加費に使用する。
血管の老化と血漿中プロテオグリカンの質的量的変化

まず血漿グリコサミノグリカン(GAG)をプロテオグリカン(PG)として分離する簡便な分画法を確立した.検討の結果,0.1MNaClを含む50mMリン酸緩衝液(PH6.0)で平衡化したDEAE-Sepacelカラムに血漿を直接注入し、1.0MNaClを含む同緩衝液で溶出することによって,カラムベッド量の1/10容までの血漿から定量的に血漿中PGを分画できることが明らかになった.血漿中GAGを分析する前処理法として従来用いられてきた,プロナーゼ消化,エタノール沈殿,CPC沈殿を組み合わせた方法に比べると約50%増のGAGを回収することが可能であったことから,今後の血漿中PGの研究に有効利用されることが期待される.血漿中GAGの大部分は低硫酸化コンドロイチン4硫酸(LSC)であるがその起源物質は明らかにされていない.そこでPG画分から,各種クロマトグラフィーによってLSCプロテオグリカンを精製したところ,細胞増殖因子として最近注目されているインター-α-トリプシンインヒビターであることが明らかになった.さらに加齢との関係を調べるために平均年齢25および60才の健常ヒト血漿100μlを用いて分析した結果,血中濃度はLSCとしていずれも約10ppmであり,質的,量的変化を見いだすことはできなかった.続いて血管と密接な関係が予想される血漿中ヘパラン硫酸の分析を行ったところ、10mlの血漿を痕跡量のヘパラン硫酸(HS)由来不飽和二糖しか検出できないことがわかった.存在濃度は20ppb以下ときわめて微量であり,尿中に1ppm程度のHSが存在することから,尿中HSは血漿由来ではないことが予想された.今後血漿中HSのさらに詳細な分析を継続していく予定である.まず血漿グリコサミノグリカン(GAG)をプロテオグリカン(PG)として分離する簡便な分画法を確立した.検討の結果,0.1MNaClを含む50mMリン酸緩衝液(PH6.0)で平衡化したDEAE-Sepacelカラムに血漿を直接注入し、1.0MNaClを含む同緩衝液で溶出することによって,カラムベッド量の1/10容までの血漿から定量的に血漿中PGを分画できることが明らかになった.血漿中GAGを分析する前処理法として従来用いられてきた,プロナーゼ消化,エタノール沈殿,CPC沈殿を組み合わせた方法に比べると約50%増のGAGを回収することが可能であったことから,今後の血漿中PGの研究に有効利用されることが期待される.血漿中GAGの大部分は低硫酸化コンドロイチン4硫酸(LSC)であるがその起源物質は明らかにされていない.そこでPG画分から,各種クロマトグラフィーによってLSCプロテオグリカンを精製したところ,細胞増殖因子として最近注目されているインター-α-トリプシンインヒビターであることが明らかになった.さらに加齢との関係を調べるために平均年齢25および60才の健常ヒト血漿100μlを用いて分析した結果,血中濃度はLSCとしていずれも約10ppmであり,質的,量的変化を見いだすことはできなかった.続いて血管と密接な関係が予想される血漿中ヘパラン硫酸の分析を行ったところ、10mlの血漿を痕跡量のヘパラン硫酸(HS)由来不飽和二糖しか検出できないことがわかった.存在濃度は20ppb以下ときわめて微量であり,尿中に1ppm程度のHSが存在することから,尿中HSは血漿由来ではないことが予想された.今後血漿中HSのさらに詳細な分析を継続していく予定である.
幼児期から成人期までの他者理解の発達過程

本研究では,「その人らしさ」の推論、すなわち「性格特性(personality trait)」の推論の発達過程を明らかにすることを目的とし、幼児期(5・6歳)から大学生までを対象とした実験および観察による検討を行った。(1)他者の性格特性の理解の発達は、心の理論とどのように関連するのか?昨年度の予備実験に基づき材料を作成して、幼児から小学2年生計105名を対象とした実験を行った。具体的には、信念・欲求の理解と、性格特性の推論能力を調べる課題を、同一の被験者に行い、課題間の関連を調べた。その結果、性格特性の因果的な推論能力には,信念・欲求がどのように他の心的概念と関連しているかに関する理解が必要とされることが明らかになった。したがって、性格特性の推論は心の理論の発展として位置づけられることが示唆された。ただし,単に他者の行動から性格特性を推論するといった、性格特性の表面的理解には、信念・欲求の理解が必要とされなかったことから、幼児期には性格特性の推論能力と心の理論の発達はある程度独立に進み、児童期に入ってそれらの心的概念間の関連性の理解も含めたより因果的な心の理論へと発展していくと考えられる。(2)性格特性の理解は、日常的なコミュニケーションの中でどのように現れるか?学童クラブ(小学13年生)の自由遊びにおける対人葛藤場面の中で、どのように他者の性格特性を判断し、それに応じた他者の行動を予測するのかについて、事例分析を行った。また児童と大学生を対象とした個別面接により、仮設の対人葛藤場面を紙芝居形式で子どもに呈示して、性格特性が異なる他者がどのような対処方法をとるのかについて予測させた。その結果、児童は1年生においても成人同様、他者の性格特性に応じた対人葛藤方略を予測し、それにより自らの対処方法を調整することが示唆された。1年目である平成17年度は、幼児・児童と成人における性格特性の推論の発達過程について、2つの実験により検討を行った。(1)性格特性の理解はどのように発達するのか?方法:3歳6歳と成人(計約80名)を対象とした実験研究を行った。他者の性格特性(「意地悪な人」など)をその人の行動や動機から推論する能力が、どのように発達するのかを調べた。幼児に関しては、幼稚園において、紙芝居を使用した個別面接を行った。成人に関しては質問紙によって調べた。結果:3歳でも、行動から特性を推論することができる。しかし動機から特性を推論するのは、幼児にとっては難しい。ただし年長クラス(5・6歳)の子どもは、動機と特性の関係に気づき始めており、教示の仕方によっては(e.g.,動機を2度言う、動機を最後に示す、アメをいくつ友人にあげるかなど量的に表せる選択肢にする)、動機から特性を推論できることが示された。(2)他者の性格特性の理解の発達は、心の理論とどのように関連するのか?(予備実験)方法:4歳児3名を対象として、予備実験を行った。心の理論課題として典型的な課題である「誤信念課題」を実施し、子どもの持つ心の理論のレベルを調べた。そしてそのレベルによって、性格特性の理解能力がどのように異なるのかを調べた。結果:4歳はちょうど誤信念課題にパスし始める時期である。被験者がまだ少ないため、結果の傾向は明らかではないが、手続き上の改善点などが明らかになった。具体的には、スマーティ課題、マクシ課題、スポンジの岩課題など、誤信念課題の種類によっては同一の子どもでも回答の仕方が異なるため、複数の誤信念課題を行う必要があることが示された。今後は、手続きを改善した上で、4歳小2の全学年(計約60名)を対象として実験を行う予定である。
近代日本の米穀需要の構造と変容-主食消費と市場形成に関する実証的・総合的研究-

本研究の課題は、明治初年から1920年代に至る時期を対象に、都市・農村を通じた主食消費の実態を地域差に留意しながら把握し、その変化がもたらした多様な影響を実証的・総合的に明らかにすることである。特にこの時期に消費が急増した米に注目し、(a)主食の消費動向の実態とその変貌、(b)主食の質的向上の要因、(c)主食農産物流通の多様化・規格化・序列化、(d)主食消費とその変容の社会経済的な影響(大都市消費市場の形成と機能分化、産地の市場への対応、流通を実質的に担う商人の機能分化)、の4点から解明することを課題とした。研究課題に実証的に接近するため、まず各地の所蔵機関等に出張して資料調査・収集をすすめた。(a)米・麦・イモ類の生産・消費の実態を概観する諸統計資料、(b)農村の消費動向を示す村是調査や、婦人雑誌に掲載された都市の食生活に関する記事、(c)産地である山口県・青森県の産米改良、関東近県(群馬県・栃木県)の地回米に関する資料、(d)大消費地である東京、大阪、神戸・兵庫の米穀問屋の関係資料等、である。コピー複写、写真撮影などにより収集し、一部については解読・基礎データの入力等を行った。収集資料を分析し課題の解明を進めた結果、(a)米・麦・イモ類などの主食消費が、都市農村間、農業生産のあり方等により大きな地域差が存在したこと、(b)地域差を含みながら、都市・農村を通じて主食消費の質的向上が見られ、輸入米の消費も進んだこと、(c)防長米(山口県産米)の規格化を目的として同業組合が1880年代に発足したが、初期の事業には限界があったこと、(d)東京の廻米問屋、兵庫の米穀問屋が産地における規格化を奨励して全国的な市場形成を促したこと、等を明らかにした。以上の作業から、主食需要の構造的変化に伴う食糧農産物取引の拡大・円滑化とその限界、国内市場形成の促進、米穀問屋の機能の重要性を確認した。本研究の研究目的及び本年度の研究実施計画に従い、明治初年から1920年代を対象に、都市や農村を通じた主食「米」の消費実態とその変貌について社会経済史的な観点から実証的・総合的に接近するため、(1)消費動向の数量的把握、(2)その実態と変化の要因、(3)消費動向の多様化、(4)市場と担い手の変化の4点について、その基礎となる資料調査・収集に力点をおいて第1年度の作業を進めた。資料の調査・収集作業を能率的に進めるため、パソコン、デジタルカメラ等を購入し、次の作業に当たった。(1)大都市消費市場として大阪・神戸、また地方消費都市、農村消費地域として群馬県を取りあげ、大阪・神戸・前橋の各市に出張して取引市場の形成や消費状況の実態について、県・市等が刊行した調査資料、県庁文書等を調査・収集した。(2)その他、大都市や地方都市の消費市場形成に関する刊行資料を、国会図書館等の所蔵機関において複写等によって収集した(3)特に東京の市場形成については、大正期の『主婦の友』を調査して大都市の主食消費の実態を生活レベルで探り、また明治前期の東京を対象に大量取引を担う廻米問屋や地廻米を扱う米穀問屋について論文をまとめた。

(3)米穀産地における産米改良等の米商品化の実態や、地方における消費市場の形成とその実態については、山口・青森・茨城の各県を取りあげ、山口・青森・八戸・弘前・水戸の各市に出張して、図書館・文書館等が所蔵する刊行資料、県史収集資料、県庁文書、町村是資料等を調査収集した。収集した資料については分類・整理し、基礎的な資料についてはパソコンに入力する等の作業を開始した。本研究の研究目的及び本年度の研究実施計画に従い、明治初年から1920年代に至る時期の、都市や農村を通じた主食米の消費実態とその変貌について、社会経済史的な観点から実証的・総合的に接近するため、(1)消費動向の数量的把握、(2)その実態と変化の要因、(3)消費の多様化、(4)市場と担い手の変化の4点を主に、その基礎となる資料調査・収集に力点をおいて第2年度の作業を進めた。デジタルカメラ撮影で収集した多量の映像データの整理・保存・携帯のためポータブル・ハードディスク、それらを必要に応じて印刷するためカラー・プリンターを購入した。上記の(1)(4)に対応しては、(1)農村における米・麦・雑穀など穀類の生産とその消費との関係を解明するため、水戸に出張して明治末大正期茨城県下の「村是調査」を収集し、基礎データを入力した。(2)全国各ブロック別に、米・麦・雑穀・イモ類の消費動向の特徴を把握するため、生産量の推移を検討した。農商務統計表などの統計資料を収集してデータ入力し、叙述資料と突き合わせ、その結果を論文にまとめた。(3)都市・農村における外米消費の動向を探るため、国内の資料を収集するほか、米国ワシントンDCに出張し、米国国立公文書館所蔵の三井物産関係資料のなかから、社員による外米取引に関する報告書を調査・収集した。(4)神戸に出張して兵庫の米穀問屋の活動を検討し、その取引活動の変化について論文にまとめた。また産地における産米改良の組織化について、山口に出張して防長米改良組合などに関する資料を収集し、その解読とデータ入力を行った。なお、データ入力の多くはアルバイトによって行い謝金を使用した。本研究の研究目的・研究実施計画に従い、明治初年1920年代の都市・農村を通じた主食米の需要、消費の実態とその変貌について、社会経済史的な観点から実証的・総合的に接近するため、(1)消費動向の数量的把握、(2)その実態と変化の要因、(3)消費の多様化、(4)市場と担い手の変化の4点を解明する作業を進めた。まず、撮影資料の整理、データの分析等に使用する現有のノート型パソコンが故障し利用不能となったため物品費により購入した。本年度は、資料の調査・収集を補充し、収集した資料を整理・分析し、研究成果を論文・著書・報告書等の形に取りまとめる作業を中心とし、それぞれ旅費(資料調査・収集)と謝金(資料整理、データ入力作業等のアルバイト)を充当した。上記の(1)(4)に対応して、(1)前年度までの作業をふまえて論文を作成した。(2)米作地帯における酒造米生産の動向について栃木県の酒造家の資料を調査・収集した、(3)前年度に収集した三井物産の外米取扱に関する報告書等を整理しデータを入力した、(4)大阪に出張して米穀問屋に関する資料を収集し、また産地における産米改良の組織化について山口に出張して防長米改良組合などに関する資料を補充し、その具体的活動を示す農区ごとの報告書を解読してデータ入力し、初期の同組合の事業について論文をまとめた。なお、本研究の課題全体に沿って、近代日本の主食である米の生産と消費の実態、および流通(商品化と取引)についてまとめた、一般読者向けの著書を年度末に刊行した。(論文・著書については裏面を参照)
記号とパターンの統合によるin silicoバイオインフォマティックス

この研究は,計算知能理論に基づいて,DNA配列やアミノ酸配列が作りだすソフトなパターンを発見するための汎用アルゴリズムを開発し,生命情報配列中の特定機能部位をin silicoで予測することを目的とした.このとき,設定問題が単に計算機科学的な仮想問題に留まらないように,ウェットバイオロジーの研究者を構成員として加えた.生命情報をin silicoで扱うITおよび情報科学者と,それを試験管内で扱う生命科学者の融合にはまだ時間を要するが,下記のような成果を得てこの方向を推進することができた.(1)ヒトやE.coliのDNA配列を対象とし,遺伝子の直前にある転写開始点の位置を推定する方式を確立した.特にヒトに対しては,スペクトラムカーネルとよばれる転写開始点付近の特徴抽出法と隠れマルコフモデルによるプロモータモデルに加えて,高速フーリエ変換に基づいたノンプロモータモデルを導入し,最後にサポートベクトルマシンで判定結果を出すということを行ない,トップクラスの予測性能を示すROC曲線を得ることができた.(2)アミノ酸配列の多重アラインメントに対して新たなアルゴリズムを得た.この方法はアラインメントを施す時に複数の配列間で生じるギャップの重なりを少なく押さえ,かつギャップ延長を区分線形にしたものとして,ClustalWやT-Coffeeよりも実データに近い結果を与えるものとなっている.(3)ウェットバイオロジーの部分においては,Rad51という二本鎖切断を修復する遺伝子の結合部位が乳ガン患者において改変されていることを発見した.以上のように,この研究においては,ポストゲノムとしての主要テーマの一つであるプロモーターや転写開始点の予測,配列比較の中心課題である多重アラインメント,そして生命そのものに関連するRad51という分野において先端的な成果を得ることができた.この研究は,計算知能理論に基づいて,DNA配列やアミノ酸配列が作りだすソフトなパターンを発見するための汎用アルゴリズムを開発し,生命情報配列中の特定機能部位をin silicoで予測することを目的とした.このとき,設定問題が単に計算機科学的な仮想問題に留まらないように,ウェットバイオロジーの研究者を構成員として加えた.生命情報をin silicoで扱うITおよび情報科学者と,それを試験管内で扱う生命科学者の融合にはまだ時間を要するが,下記のような成果を得てこの方向を推進することができた.(1)ヒトやE.coliのDNA配列を対象とし,遺伝子の直前にある転写開始点の位置を推定する方式を確立した.特にヒトに対しては,スペクトラムカーネルとよばれる転写開始点付近の特徴抽出法と隠れマルコフモデルによるプロモータモデルに加えて,高速フーリエ変換に基づいたノンプロモータモデルを導入し,最後にサポートベクトルマシンで判定結果を出すということを行ない,トップクラスの予測性能を示すROC曲線を得ることができた.(2)アミノ酸配列の多重アラインメントに対して新たなアルゴリズムを得た.この方法はアラインメントを施す時に複数の配列間で生じるギャップの重なりを少なく押さえ,かつギャップ延長を区分線形にしたものとして,ClustalWやT-Coffeeよりも実データに近い結果を与えるものとなっている.(3)ウェットバイオロジーの部分においては,Rad51という二本鎖切断を修復する遺伝子の結合部位が乳ガン患者において改変されていることを発見した.以上のように,この研究においては,ポストゲノムとしての主要テーマの一つであるプロモーターや転写開始点の予測,配列比較の中心課題である多重アラインメント,そして生命そのものに関連するRad51という分野において先端的な成果を得ることができた.DNA配列はA,T,G,Cの4記号からなる配列であるが,この研究はソフトコンピューティングに基づく新たな手法を開発することを目的としている.そこで,平成17年度においては,次のような項目を実行した.[1:基本概念]解析の対象とするDNA配列はあくまでも単独のものであるが,この研究では,その存在環境や比較対象とする配列群の存在に依存して複数の意味をもちうると考えた.そこで,この研究では基本的な方法として,単独な配列でも隠れた部分配列に分解できるという考えを提案した.そして,以下の[2]と[3]にあるような方式を与えた.[2:数値化と独立成分分析](2-1)数値化を行う前に,同種のパターンを有する配列群とパターンを有していない配列群を用意する.(2-2)記号配列を数値化する方法として,位置依存型頻度を用いる.[3:主成分分析と独立成分分析]基本概念において示した隠れた成分への分解の手法として,独立成分分析を用いることにした.このとき,前処理として,主成分分析を用いた.これにより,次のような知見を得た.(3-1)独立成分に分解したときに,DNA配列の保存領域のパターンを反映している独立成分とノイズと見なせる成分が現れ,分解に意味のあることが判明した.(3-2)配列のパターンには二重構造があり,独立成分への分解はそれらを検出できるものであると判明した.[4:ヒトゲノムに対する検証]以上の知見に基づくアルゴリズム開発,ソフトウェア開発,実験により,ヒトゲノム中のプロモーターなどの保存領域を,従来の記号処理的手法に比べて優れた性能で検出できることを実証できた.この研究は,離散的な記号列とそれらが作り出すソフトなパターンを発見するための汎用アルゴリズムを開発し,それを用いてDNA配列あるいはアミノ酸配列中の機能部位を,in silicoにて予測することを目的としている.そして,その基本的な手法はソフトコンピューティングとなっている.ただし,重要な構成員として,ウェットバイオロジーの研究者が参加している.平成18年度においては,DNA配列中プロモータ予測とアミノ酸配列におけるドメインリンカーの位置予測において十分な成果を挙げることができた.

DNA配列中のプロモータ予測については,ヒトのDNAを対象とした,方法としては,まず,TrueとFalseの学習データとテストデータを用意し,True学習データについて「GC-rich」とそうでない場合とに分けた.次いで記号頻度を用いて数値化し,主成分分析による前処理を行った後,研究代表者らが開発した独立成分分析を適用し,定量的に{プロモータ有り,なし}を判定する機構を実現した.この性能は,{PREC,SPEC,SENS}={0.632,0.537,0.824}であり,2006年8月の時点で世界最高性能であった.ただし,この数値はさらに高度化できるはずであり,2007年度の研究に引き継がれている.ドメインリンカーの予測は,同程度に高度な問題である.この問題はタンパク質の3次元構造と関連している.タンパク質の3次元構造全体をいきなり推定することの成功度は低く,今のところ世界のどの機関も成功していない.この問題において,部分折りたたみ同士を結びつけるリンカーを予測して全体の構造予測法の複雑度を軽減させることに成算があるということが分かった.以上の成果に基づいて,2007年度にはサポートベクトルマシンを利用できる態勢が整い,さらに性能が上がる見込みがついている.[目的の概要]この研究は,計算知能理論に基づいて,ヌクレオチド配列やアミノ酸配列が作りだすソフトなパターンを発見するための汎用アルゴリズムを開発し,それを用いて生命情報配列中の特定機能部位をin silicoで予測することを主目的としている.このとき,設定している問題が単に計算機科学的な仮想問題に留まらないように,ウェットバイオロジーの研究者が重要な構成員として参加している.[成果]平成19年度においては,次のような三項目において成果が得られた.(1)ヒトのDNA配列を対象とし,遺伝子の直前にある転写開始点の位置を推定する方式を確立した.この方式においては,スペクトラムカーネルとよばれる転写開始点付近の特徴抽出法と隠れマルコフモデルによるプロモータモデルに加えて,高速フーリエ変換に基づいたノンプロモータモデルを導入し,最後にサポートベクトルマシンで判定結果を出すということを行なっている.その結果,トップクラスの予測性能を示すROC曲線が得られた.(2)次に得られた成果は,アミノ酸配列の多重アラインメントに対して新たなアルゴリズムを得たことである.この方法はアラインメント時に複数の配列間で生じるギャップの重なりを少なく押さえ,かつギャップ延長を区分線形にしたものとして,ClustalWやT-Coffeeよりも実データに近い結果を与えるものとなっている.
酵素免疫測定法の高感度化を目的とした酵素反応シンクロナイゼーション系の開発

酵素免疫測定法にカップルして、検出感度を増幅できる3酵素シンクロナイゼーション系の開発を検討した。alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH),diaphorase(DIA)の3酵素が効率よく作用するための条件を最適化した。DIAは不安定であり、適用できる温度、pH条件が狭いため、DIAの代わりに電子メディエータPMSを用いて再検討したところ、DIAより安価で、安定した触媒活性が得られた。DIAおよびPMSの基質としては、従来、INT(不溶性テトラゾリウム)が使用してきたが、不溶性の生成物フォルマザンが感度低下をもたらすため、今回、可溶性テトラゾリウム(WST-1)に変更した。WST-1を用いることにより、反応時間は30分から200分までのばすことができた。また、ALPの基質であるNADP+中に約0.1%のNAD+の混入が認められ、このことがバックグラウンドの原因となることが示された。HPLCによりNADP+を精製したところ、バックグラウンドを1/10に低減させることができた。ヒトのC反応性蛋白質(CRP)を抗原とするサンドイッチ酵素免疫測定法に、今回開発したシンクロナイゼーション系をカップルさせたCRP検出系を開発した。60分の反応で、50attomoleのCRPが検出可能であることが示された。本検出感度は臨床的に充分適用可能な感度である。p-ニトロフェニルホスフェートを基質とする従来法(1酵素系)に比べて、1000倍以上高感度であった。今後、ADH中にコンタミしているALPを除去することにより、より高感度化が期待される。酵素免疫測定法(EIA)は広く臨床診断に用いられているが、0.1mLの血清を用いて、1時間にattomoleレベルの測定が求められる。現状ではより好感度・迅速なシステムが求められている。本研究では簡便、迅速、高感度なEIAの開発を目的として、酵素反応シンクロナイゼーション系を構築しようとした。本システムはダイオキシンなどの環境汚染物質の測定にも利用できる。以下のような3酵素シンクロナイゼーション系を構築しようとした。アルカリホスファターゼ(ALP)でNADPをNADに変換し、このNADを用いてアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)によりエタノールをアセトアルデヒドへ変換する。このときNADはNADHへ還元される。ジアホラーゼ(DIA)よりNADHはNADへ酸化されるが、このときテトラゾリウム塩(TZ)を青色色素フォルマザンへ変換する。従来の酵素系では、ALPの活性に対し1当量の生成物しか生じないが、本システムでは、NADとNADH間の回転数に応じて、当量が増大する。3酵素シンクロナイゼーション系が効率よく回転し、最終産物であるフォルマザンが高収率で得られる反応条件を検討した。特に、3酵素の作用に最適なpH、温度、緩衝液組成、イオン強度、添加物濃度(グリセロール、金属、金属キレート剤)を検討した。その結果、100-200mMトリス・塩酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液、pH7-8、25°C、10mM EDTA、500mM程度のエタノール存在下で実施するのが効率的であることが明らかになった。また、可溶性フォルマザンを生じるTZは分光学的検出上便利ではあるが、不溶性(沈殿)フォルマザンを生じるTZの方が、3酵素反応系を回転させるのに有効であることが示された。
水熱合成BaTiO_3微粒子の誘電率測定

水熱法によって合成されたチタン酸バリウム微粒子は,粒径が小さくなるにつれてa軸とc軸の比が1に近づき,ある粒径よりも小さくなると室温においても立方晶のまま安定に存在することが報告されている.このような現象がサイズ効果にによるものなのかどうかを明らかにするために,本研究計画では水熱合成チタン酸バリウム微粒子をいくつかの温度で熱処理をして,主な不純物である水酸基を除いたものや粒径が大きくなったものを調整し,それらの熱容量を広い温度範囲にわたって測定を行い,相転移の有無を明らかにすること,それらの試料をプレスしたものについて誘電率を測定することを目的とした.また,以上の測定より得られた情報から,問題解決に決定的な情報を与えると予想された透過型電子顕微鏡を用いた微粒子一個一個の電子線回折を試みた.相転移の有無を判断するには,結果として熱容量の測定が最も有効であった.未処理の試料からは何の熱異常も観測されなかったのに対して,600°C以上の温度で熱処理を行った試料はバルクと同じ温度において斜方晶-正方晶の相転移が見いだされ,熱処理温度が高くなるにつれて転移のエンタルピー(エントロピー)が大きくなっていった。800°C以上の温度で処理した試料においては小さいながらも稜面体晶-斜方晶の相転移が観測された.このことは熱処理によって室温で立方晶である粒子が,バルク(と同じ挙動を示す)粒子へと変化したことを示している.室温での誘電率測定において700°Cで処理した試料が最も値が大きかった.770°Cで熱処理を行った試料の電子線回折の結果,原料とほとんど粒径が同じであるにも関わらず正方晶の粒子が見いだされた.以上のことからサイズ効果は完全に否定され,室温で微粒子が立方晶となる原因は他に求める必要があることが示された.水熱法によって合成されたチタン酸バリウム微粒子は,粒径が小さくなるにつれてa軸とc軸の比が1に近づき,ある粒径よりも小さくなると室温においても立方晶のまま安定に存在することが報告されている.このような現象がサイズ効果にによるものなのかどうかを明らかにするために,本研究計画では水熱合成チタン酸バリウム微粒子をいくつかの温度で熱処理をして,主な不純物である水酸基を除いたものや粒径が大きくなったものを調整し,それらの熱容量を広い温度範囲にわたって測定を行い,相転移の有無を明らかにすること,それらの試料をプレスしたものについて誘電率を測定することを目的とした.また,以上の測定より得られた情報から,問題解決に決定的な情報を与えると予想された透過型電子顕微鏡を用いた微粒子一個一個の電子線回折を試みた.相転移の有無を判断するには,結果として熱容量の測定が最も有効であった.未処理の試料からは何の熱異常も観測されなかったのに対して,600°C以上の温度で熱処理を行った試料はバルクと同じ温度において斜方晶-正方晶の相転移が見いだされ,熱処理温度が高くなるにつれて転移のエンタルピー(エントロピー)が大きくなっていった。800°C以上の温度で処理した試料においては小さいながらも稜面体晶-斜方晶の相転移が観測された.このことは熱処理によって室温で立方晶である粒子が,バルク(と同じ挙動を示す)粒子へと変化したことを示している.室温での誘電率測定において700°Cで処理した試料が最も値が大きかった.770°Cで熱処理を行った試料の電子線回折の結果,原料とほとんど粒径が同じであるにも関わらず正方晶の粒子が見いだされた.以上のことからサイズ効果は完全に否定され,室温で微粒子が立方晶となる原因は他に求める必要があることが示された.