hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体光フェーズドアレイを用いた高速イメージング

本研究は、半導体チップに集積した大規模光フェーズドアレイを用いた高速かつ実用的なイメージング手法を構築することを目的としている。そのために、ゴーストイメージング手法を光集積フェーズドアレイ素子に導入することで、半導体チップ内での光位相の精密制御が必要なく、素子の作製誤差や環境変化に依存しない計測手法を新しく提案し、研究開発を進めている。より具体的に、シリコンもしくはインジウムリンに集積した光フェーズドアレイ素子を用いて、これらの手法の有効性を実証すると同時に、半導体のキャリア効果を利用した高速かつ小型なイメージング素子の実現を目指している。平成30年度には、まず、シリコンチップ上に128本の熱光学型光位相制御器を高密度に集積した大規模光フェーズドアレイ素子を設計・試作し、これを用いることで1次元のゴーストイメージング機能を実証した。さらに、素子の出力に回折格子を配置して波長を掃引することで、2次元イメージング機能の実証にも成功した。一方、高速化に向けては、シリコン中のキャリア効果を利用した素子を設計・試作し、評価を開始した。さらに、3次元ガラス導波路と多モード光ファイバを用いる方法を考案し、数値解析によりその有効性を実証した。また、限られた本数のフェーズドアレイを用いて、高い空間分解能を得るために、最適なアレイ配置を考案した。これらと並行して、インジウムリン上に試作した素子についても評価を進めている。シリコン光フェーズドアレイ素子を用いた1次元ゴーストイメージング実験、および、波長掃引手法を組み合わせた2次元イメージング実験については、当初の予定通り、良好な実験結果を得ることができた。また、インジウムリン型の素子についても、計画通り、検証を進めている。その上で、光ファイバ型イメージング手法の検討や、高空間分解能アレイ配置手法など、当初想定していなかった期待以上の結果も得られた。本研究で目標とする大規模光フェーズドアレイによる高速イメージング手法の構築に向けて、本年度は以下の研究開発項目を並行して進める。・多モード光ファイバを用いたイメージング手法について、詳細な解析と原理検証実験を行う。・高空間分解能アレイ配置手法の正当性を検証するための光フェーズドアレイ素子を作製し、原理検証実験を行う。・シリコンキャリア引き抜き型光フェーズドアレイ素子を用いて、高速イメージング機能を実証する。・インジウムリン型光フェーズドアレイ素子のイメージング機能を検証する.本研究は、半導体チップに集積した大規模光フェーズドアレイを用いた高速かつ実用的なイメージング手法を構築することを目的としている。・インジウムリン型光フェーズドアレイ素子のイメージング機能を検証する.
啓蒙期におけるフィクション使用の多様な形態と機能に関する総合的研究

本研究は、18世紀を中心とするいわゆる「啓蒙の時代」のヨーロッパを対象として、多様な形態で使用されたフィクションの諸事例を検討し、当時の政治的・社会的・文化的背景との関連で体系的に分析・考察する試みである。狭義の文学や演劇にかぎらず、宗教・形而上学・自然科学・法・政治などさまざまな領域で見られた虚構の対話・書簡・日記が、18世紀のコミュニケーション・プロセスのなかで担った意味や機能を解明するとともに、そうしたフィクショナルな言説に関する現在の諸理論を包括的に検討しつつ、思想史的研究に適用しうる概念的枠組を整理した。2013年度は、共同研究の2年目にあたったが、1)思想史研究におけるフィクション概念を深化させつつ、研究メンバーの間で共有するという理論的課題と、2)それぞれの担当するテーマについて個別的問題を継続して研究するという歴史的課題の両面において、大きな進展が見られた。1)については、サール、ジュネット、デリダ、シェフェール、ツィプフェル、清塚などの代表的著作を踏まえつつ、検討を進めている。特にサールのいわゆる「ふり(pretense)理論」における「著者の意図」の問題を(著者が確定できない場合や意図が定かでない場合を含め)思想史的研究においてどのようにあつかうべきか、また、書かれたテクストでないようなフィクション(劇の上演など)をどう考えるべきかという具体的なテーマの考察を進めた。具体的には、2013年11月9日の定例研究会において、齋藤渉がツィプフェルのサール批判について報告し、研究メンバー間のディスカッションを深めたほか、12月22日のシンポジウム「フィクションと出来事」において久保昭博がシェフェールのフィクション理論を踏まえた発表を行なっている。2)の歴史的課題については、研究メンバー各自が担当するテーマに継続して取り組んでいる。特に今年度は、新たに研究分担者となった菅利恵が11月9日の研究会でA. W.イフラントの演技論について発表をおこなった。この報告にもとづき、18世紀ドイツにおける演劇の観点から、フィクションの問題について議論を深めることができた。初年度は、全部で3回の会合(7月1日/大阪、11月25日/東京、12月1516日/大阪)を実施し、共同研究メンバーの間では緊密な連携をとりつつ、研究を進めた。第1回会合では、研究代表者・研究分担者・連携研究者の7名が顔を合わせ、共同研究の基本コンセプトを確認するとともに、それぞれの専門から研究計画の可能性を話し合っている。第2回会合は、今年度の課題となっていた宗教および教育の言説におけるフィクションの問題にしぼり、後藤正英(研究分担者)がレッシング『賢者ナータン』、齋藤渉が敬虔主義・ゴットシェート・カンペをテーマに発表をおこなった。第3回会合では、日本ヘルダー学会との共催でシンポジウム「18世紀における〈ロビンソン物語〉」を開いた。武田将明(研究分担者)がデフォー『ロビンソン・クルーソー』、齋藤渉がカンペ『新ロビンソン』について報告したほか、京都大学人間・環境学研究科の大川勇氏を招き、シュナーベル『フェルゼンブルク島』について講演していただいた。シンポジウムでは多数の参加者とともに活発なディスカッションがおこなわれた。今年度のもう一つの課題としてフィクション概念の再検討が予定されていたが、これについても、久保昭博(研究分担者)の参加していた京都大学人文科学研究所の共同研究「虚構と擬制」の成果をまとめた大浦康介『フィクション論への誘い』(世界思想社)が刊行されたのを機に、大浦氏の協力を得て合評会を開催した(3月16日/京都)。このほか、日本独文学会主催第55回ドイツ文化ゼミナールのために来日中のウーヴェ・ヴィルト教授(ギーセン大学)を迎え、ヴィーラントのフィクションに関する講演会「翻訳者/著者としての編者」を開催した(3月22日/京都)。本年度は研究の3年目にあたっていたが、共同研究の成果を問う場として、日本18世紀学会の共通論題として「啓蒙とフィクション」を企画・実施した。コーディネーターを務めた齋藤渉による趣旨説明に続き、久保昭博「フィクション使用の動態構造ー近年のフランスにおけるフィクション理論の展開」、大崎さやの「ゴルドーニ作品における「戦争」」、隠岐さや香「古典確率論の描く人間像と哲学的フィクションの関係」、武田将明「名誉革命とフィクション:ダニエル・デフォーの場合」の各発表があったが、多数の参加者による密度の高いディスカッションがおこなわれた。この共通論題の討議を踏まえて一層発展させる形で、次年度に予定されている国際18世紀学会へのエントリー準備を進めた(エントリー受付済。「今後の研究の推進方策」欄を参照)。この過程で海外の研究者とのコンタクトも生まれ、2015年7月の国際会議では共同セッションも企画されている。さらに、18世紀におけるフィクションの理論を考察する目的で、2015年2月28日には共同研究会を実施した。高田梓氏(東京大学)「ヴィーラント『アガトン物語』における虚構とナラトロジー真実と虚構としての「生の模範」について」と桑原俊介氏(東京大学)「詩における真理・真実らしさ・可能性ーアリストテレス、フランス古典主義演劇理論、ゴットシェート、スイス派をめぐって」という発表の後、科研共同研究のメンバーを交えた討議をおこない、知見を深めた。共同研究の最終年度にあたり、これまでの研究を継続・発展させるとともに、その成果を発表し、新たな課題にも取り組んでいった。計画当初の予定通り、国際18世紀学会の第14回国際大会(ロッテルダム・エラスムス大学)にて2つのセッションを開催した(いずれも2015年7月31日実施)。

このほか、18世紀に展開されたフィクション(特にドイツ語圏の小説)理論を考察する研究会(発表:北原寛子(小樽商科大学客員研究員)「18世紀ドイツの小説論争ーゴットハルト・ハイデッガーとブランケンブルクを中心に」2015年6月25日)、18世紀に先立つ17世紀の演劇批判をあつかう研究会(発表:森元庸介(東京大学)「フィクション、このどうでもよいもの:キリスト教決疑論のなかの演劇」ほか、2016年2月23日)、さらに、18世紀以降の言語思想・解釈学をテーマとする講演会(発表:ヘンドリック・ビールス教授(Jacobs University Bremen)「Die Aufgaben der Interpretation - nach Schleiermacher」2016年3月22日)など、多くの研究会・講演会を開催し、考察を深めた。本研究は、18世紀を中心とするいわゆる「啓蒙の時代」のヨーロッパを対象として、多様な形態で使用されたフィクションの諸事例を検討し、当時の政治的・社会的・文化的背景との関連で体系的に分析・考察する試みである。狭義の文学や演劇にかぎらず、宗教・形而上学・自然科学・法・政治などさまざまな領域で見られた虚構の対話・書簡・日記が、18世紀のコミュニケーション・プロセスのなかで担った意味や機能を解明するとともに、そうしたフィクショナルな言説に関する現在の諸理論を包括的に検討しつつ、思想史的研究に適用しうる概念的枠組を整理した。日本18世紀学会での共通論題は無事に実施し、研究期間前半(2012・13年度)の成果をまとめることができた。多くの参加者による討議を経て、これまでの考察を深める機会が得られたことも、大きな成果といえる。これにより、本研究が当初からかかげていた目標の一つを無事に達成することができた。この成果を引き継ぐ形で、次の大きな目標である国際18世紀学会でのセッションも着実に準備が進んでいる。当初は予期していなかった海外の研究者の参加が得られたことも重要な進展であった。18世紀のフィクション使用のさまざまな実例を考察するなかで、同時代の著作家・理論家たちがフィクションの現象をどのように考えていたのかという問題も検討する必要が出てきた。これについては、共同研究会を実施することで一定の成果を収めているが、今後も引き続き多くの機会を設けることで、研究を深めていきたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。哲学、思想史本研究も最終年度を迎え、これまでの考察をさらに深めつつ、研究成果の発表を進めていきたい。具体的には、1)国際18世紀学会の主催する第14回国際18世紀研究会議(オランダ・ロッテルダム・エラスムス大学、2015年7月27日31日)に研究メンバー全員で参加し、2つの共同セッションで研究発表をおこなう予定である。武田将明を責任者とするセッション「Fiction and Perception: the Novel and the Theatre as Devices for the Enlightenment」では、久保昭博、大崎さやの、菅利恵が報告する。
赤外線連続照射による気液界面での分子内振動の緩和と溶剤乾燥に効果的な吸収帯の解明

本研究では、溶剤が吸収する赤外線を気液界面の溶剤分子に連続照射して分子内振動を励起し、分子内振動が分子間振動へ変換(緩和)される挙動を、赤外線照射実験により明らかにする。さらに、得られた緩和挙動を組み込んだ分子動力学解析と分子動力学解析によって得られた境界条件を用いたボルツマン方程式解析と、溶剤の乾燥実験によって、溶剤の蒸発量を求め、溶剤乾燥に効果的な溶剤の赤外線吸収帯を溶剤(水、IPA、トルエン)ごとに解明する。また、解析結果と実験結果を比較し、分子内振動の励起・緩和が溶剤乾燥に及ぼす効果を定量的に明らかにする。
生命科学におけるモデルとしてのメダカに関する研究動向調査

わが国では、メダカに関する研究の歴史も古く、実験動物として、遺伝学、染色体学、放射線生物学、発生生物学、生化学、形態学、実験腫瘍学、系統進化学などの分野で活用されてきた。また、最近では、メダカを含む一部の小型魚類が、ヒトを含む脊椎動物のモデルとして注目され、生活環が短いこと、体外発生であること、性転換可能であること、ゲノムサイズが小さいこと、等を考慮にいれた遺伝子レベルでの研究がなされるようになっている。現在、メダカを用いた論文は、日本の研究者によるものばかりでなく、年々、欧米やアジア諸国の研究者による論文数も急増している。本研究では、17名の研究者がそれぞれの専門分野を分担範囲とし、そこでの研究全般の趨勢とその中でのメダカを使った研究成果の位置づけ、さらに今後メダカを使うことによってどのような問題の解決が期待できるかについて調査を行った。その結果、メダカにおいては、実験室内での交配が可能な近縁種があること、地域による様々な亜種があることなどの点が他の実験脊椎動物に対して優位であり、脊椎動物の種分化の分子メカニズムを解明するモデル動物として有用であるとの結論を得た。生命の成立と存続の基盤となる種分化と維持のしくみは、現存する生物を理解する上で重要な段階であると同時に、環境変化などによると考えられている生物相の変遷とその意義を知るためにも重要な課題である。そこで、この研究方針を積極的に推進すべく、平成10年度特定領域にメダカ研究を主体とした、14名の研究代表者からなる「実験分子生物学による脊椎動物の種分化機構研究」を申請した。
非線形光リソグラフィを駆使した立体的表面加工手法の高度化とマイクロ流体素子応用

立体的表面加工手法の高度化のため,フォトレジストおよび金属ナノ構造と,フェムト秒レーザとの相互作用について研究を行った.低開口数レンズでレジスト内に集光したフェムト秒レーザパルスは,特異的にチャネル伝搬し,その起源が,高繰り返しパルス由来の蓄熱効果であることを明らかにした.また,ある種の金属ナノ構造上では,フェムト秒レーザ光がプラズモンモードに結合し,局所的に強電場を生み出し,金属上の光還元反応に強く影響することを実験と理論両面から明らかにした.立体的表面加工手法の高度化のため,フォトレジストおよび金属ナノ構造と,フェムト秒レーザとの相互作用について研究を行った.低開口数レンズでレジスト内に集光したフェムト秒レーザパルスは,特異的にチャネル伝搬し,その起源が,高繰り返しパルス由来の蓄熱効果であることを明らかにした.また,ある種の金属ナノ構造上では,フェムト秒レーザ光がプラズモンモードに結合し,局所的に強電場を生み出し,金属上の光還元反応に強く影響することを実験と理論両面から明らかにした.本年度は,マルチスケール構造を集積化した立体微細素子実現のため,フェムト秒レーザ光とフォトレジストの特異的相互作用の解明とプラズモン共鳴素子の設計・特性評価を行った.高繰り返し周波数を有するフェムト秒レーザ光を低開口数レンズでフォトレジスト内に集光すると,特定の条件下でチャネル状伝搬が生じ,同時に露光分解能が著しく劣化する.光改質部の屈折率変化量を見積もったところ,光回折実験から10-3オーダと非常に大きな値となる.実験で用いた化学増幅型レジストでは,露光だけでは通常,屈折率変化を伴う架橋反応はほとんど生じることはない.しかしながら,高繰り返しレーザ照射では熱蓄積効果によって二光子プロセスによる光反応とそれに続く架橋反応が照射だけで生じたと考えられ,このことを赤外分光法によって確認した.理論解析から,入射レーザ光は,この光改質部で導波モードに高効率に結合し,チャネル伝搬することが明らかとなった.また,同様の解析から,入射光と導波モード間の電界分布を変調することで,結合効率を大きく抑制し得ることが分かった.実際,高開口数レンズで集光した際には,チャネル伝搬は観測されなかった.この機構解明の他,金属周期構造を作製し,その光学特性評価を行った.厳密結合波解析から周期500nm,溝深さ30nmのAu周期構造が伝搬型プラズモン生成に最適と考え,リソグラフィによるその作製を行った.フェムト秒レーザでの光学特性評価を行ったところ,波長分散による見かけ上の結合効率低下が見られたが,設計値に近い特性を確認した.今後,このAu周期構造の構造パラメータを制御し,プラズモン電場の更なる増強を試みる.本年度は,マルチスケール構造を集積化した立体微細素子実現のため,フェムト秒レーザ光とフォトレジストの特異的相互作用の解明とプラズモン共鳴素子の設計・特性評価に取り組んだ.これまでの研究から,非線形光リソグラフィは従来法では困難な立体基板上での微細構造形成を可能にすることを明らかにしてきた.これまで透明誘電体内あるいは近傍でのフェムト秒レーザ非線形リソグラフィは多く報告されているが,電界集中が起こりやすい金属構造の影響は知見がほぼなく,その探索が必要である.フェムト秒レーザの発振波長オーダの周期を有するAu構造上では多光子反応が進行しやすく,数百倍程度の局所的電場増強を確認した.また,その起源は,理論解析から表面プラズモン共鳴と推察された.硝酸銀水溶液中での多光子還元をモデル反応として検証したところ,金属薄膜上ではレーザ集光部の電場分布が支配的となるが,周期構造上では,レーザ集光部の電場分布よりは,表面プラズモン共鳴で生じた電場分布が重要であることが強く示唆された.表面プラズモン共鳴の角度依存性を検証するため,多光子造形法によって電場可変プラズモン共鳴素子の開発に取り組んだ.外部電場によって変調可能な樹脂製3Dマイクロスプリングを搭載したマイクロ金属グレーティングを形成した.これは静電力による励起レーザ光の入射角を実効的な変調を可能とする.今後,これまでに得られたフェムト秒レーザ光と強く相互作用するプラズモン場の設計指針をもとに,増強基板の作製を試みるとともに,その機能検証ならびに非線形光リソグラフィの高度化を進める.マルチスケール構造を集積化した立体微細素子実現のため,フェムト秒レーザ光とフォトレジストおよび金属構造との相互作用の特性評価に取り組んだ.単なる光造形とは異なり,立体化によって優れた素子機能を生み出すには,金属構造上での多光子リソグラフィが必要である.しかしながら,これまで透明誘電体内あるいは近傍でのフェムト秒レーザ多光子リソグラフィは多く報告されている一方で,電界集中を起こしやすい金属構造周辺での知見はほぼなく,その探索が必要である.硝酸銀溶液にAuおよびAg金属周期構造を浸し,フェムト秒レーザ照射を行った.金属構造サイズは,100500 nm程度とした.金属平板上では容易にマイクロ粒子に成長析出したのに対し,析出物のサイズは12ケタ程度小さくなり,析出量や位置はレーザ照射条件によって制御することが出来た.

液中でのゼロ次反射率測定および理論解析から,金属構造上でのこのような特異な光挙動は,表面プラズモン共鳴によって金属構造上で生じた強電場によって多光子還元反応が進行したためと考えられる.金属構造の形状によってプラズモン波の共鳴状態が変化するが,本研究でのプラズモン援用多光子還元では,析出した金属ナノ粒子は,元の金属構造に固定付着し,結果として金属形状が変化する.その光学特性に与える影響を検討するため,落射蛍光観察を行い,金属構造周辺の蛍光強度分布を測定した.レーザ照射によって金属ナノ粒子が析出した付近では,周辺部より強い蛍光が観察され,より効果的にプラズモン共鳴が起きることが示された.26年度が最終年度であるため、記入しない。光工学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に従い,非線形リソグラフィにおけるフェムト秒レーザとフォトレジストの特異的相互作用の解明とその抑制手法を提案した.また,計画にあったプラズモン共鳴素子の設計と試作を行うなど,順調に進展していると考えている.当初目的であった,非線形光リソグラフィにおける重合部での光熱反応の影響ならびに金属ナノ構造の影響について重要な知見を得ることに成功しているため.26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に得られた成果をもとに,金属表面状態がレジスト感光特性に与える影響を検討するとともに,高感度なプラズモンセンサーの作製を行う、これまでに得たフェムト秒レーザ光と強く結合する金属ナノ構造の探索を更に進めるとともに,非線形光リソグラフィの更なる高度化を検討する.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究は概ね順調に推移しているが,H25年度5月に大学異動があり,研究計画の若干の変更が生じている.より研究スケジュールの実態に合わせた研究経費使用のため,H25年度予算の一部(消耗品購入費)を次年度へと送ることとした.H25年度に行う予定であった実験の一部を次年度へと送り,試薬などの消耗品購入に使用する予定である.
肺気腫の新規発症機序：接着分子CADM1の細胞内断片による肺胞上皮アポトーシス

肺気腫の原因である蛋白分解酵素活性上昇と肺胞上皮アポトーシスを結び付ける分子機序は不明であった。肺胞上皮の接着分子CADM1の機能的制御に細胞外切断(shedding)がある。ウエスタン法にて肺気腫ではsheddinが亢進し、TUNEL法にて肺胞上皮アポトーシスの上昇が判明した。ヒト肺上皮細胞株NCI-H441細胞においてCADM1のsheddingを惹起させた所、shedding産物であるαCTFがミトコンドリアに局在し、アポトーシスが上昇することを見出した。肺気腫ではCADM1のsheddingが亢進し、αCTFがミトコンドリアに集積して肺胞上皮アポトーシスを促進していると考えられた。肺気腫は慢性閉塞性肺疾患の一種で、プロテアーゼの絶対的或いは相対的な上昇による肺胞壁の破壊的変化を特徴とする。肺気腫の肺胞上皮アポトーシスと肺胞上皮接着分子CADM1の細胞外切断(shedding)との間の因果性について調べる。肺気腫及び健常肺病理組織のパラフィン包埋ブロックの薄切切片をTUNEL法(アポトーシスの検出)に供し、肺気腫においてTUNEL陽性細胞の割合が有意に高いことを明らかにした。また肺気腫と健常肺の肺組織ライセートを調整し、CADM1抗体でのウエスタンブロットに供し、症例ごとに全長型に対する切断産物の量比をCADM1 shedding率として算出したところ、肺気腫におけるCADM1 shedding率が健常肺に比べて有意に高いことが示された。CADM1 sheddingと肺胞上皮アポトーシスの関連性を調べるため、次の実験を行った。肺胞上皮細胞株NCI-H441細胞をTPAとトリプシン処理によってCADM1のsheddingを亢進させ、MitoTracker(ミトコンドリアの検出)とCADM1抗体にて二重染色すると、CADM1のシグナルがMitoTrackerと共局在するのが観察された。sheddingを亢進させた上記細胞からミトコンドリア分画を抽出し、CADM1抗体でのウエスタンブロットに供したところ、α切断産物(αCTF)が濃縮して存在していた。NCI-H441細胞にαCTFを外来性に発現させたところ同様の結果が得られ、さらにミトコンドリア膜電位測定用蛍光色素JC-1を用いてミトコンドリア膜電位が低下することを明らかにした。以上の結果より、肺気腫の肺胞上皮ではCADM1のsheddingが亢進状態にあり、αCTFがミトコンドリアに移行し、ミトコンドリア膜電位を低下させ、その結果として肺胞上皮の病的なアポトーシスが惹起されている可能性が示唆された。肺気腫は慢性閉塞性肺疾患の1つで、肺胞の破壊と拡張した気腔形成を特徴とする。原因の1つとして、局所の蛋白分解酵素活性上昇が考えられているが、肺胞上皮アポトーシスと結びつける分子機序は不明であった。IgCAM型の接着分子CADM1は、肺胞上皮の側方細胞膜に発現し、上皮細胞の極性の維持を司っている。CADM1の機能制御機構としてプロテアーゼによる細胞外領域の切断(shedding)がある。肺組織を抗CADM1 C末抗体によるウエスタン法にて解析した所、全長型の100 kDaの他に、35 kDaと25 kDaの2つのバンド(β切断とα切断)が検出された。健常肺と肺気腫を比較したところ、肺気腫では全長型に対してshedding産物(βCTFとαCTF)の量が相対的に増加しており、CADM1 sheddingが亢進していることを見出した。肺組織切片をTUNEL法に供すると、健常肺ではほとんど全ての上皮細胞がTUNEL陰性であったが、肺気腫では10%以上の細胞がTUNEL陽性であった(P < 0.01)。CADM1 sheddingはTPA(ホルボールエステル)とトリプシン処理によって誘導される。肺胞上皮細胞株NCI-H441細胞において、CADM1 sheddingを惹起するとshedding産物であるαCTFがミトコンドリアに集積することを蛍光免疫染色によって明らかにした。またTUNEL法に供し、通常培養の細胞と比較すると、TUNEL陽性細胞の割合が約5倍増加した(P < 0.01)。以上の結果から、肺気腫ではCADM1 sheddingが亢進状態にあり、その結果過剰に産生される細胞内断片がミトコンドリアに集積して肺胞上皮のアポトーシスを促進している可能性が示唆された。実験病理肺気腫の肺胞上皮でアポトーシスとCADM

1のsheddingが亢進していることを明らかにした。肺胞上皮アポトーシスとCADM1 sheddingとの間の因果性について、sheddingの最終産物として細胞内に産生される細胞内断片(ICD)の機能解析の観点から調べる予定であった。しかし、少量かつ分解が速いためかICDの発現量は極めて低かった。肺胞上皮細胞株であるNCI-H441細胞をTPAとトリプシン処理によってCADM1のsheddingを亢進させたところ、CADM1のシグナルがMitoTracker(ミトコンドリアの検出)と共局在するのが観察され、そのミトコンドリア分画にα切断産物(αCTF)が濃縮して存在していることを明らかにした。上記細胞にαCTFを外来性に発現させたところ同様の結果が得られ、ミトコンドリア膜電位測定用蛍光色素JC-1を用いてミトコンドリア膜電位の変化を介したアポトーシスが誘導されている可能性が示唆された。以上より、CADM1のsheddingと肺胞上皮細胞のアポトーシスの関連性を示し、肺気腫発症の新しい分子機序を提案することができたため。CADM1 sheddingの最終産物である細胞内断片(ICD)の機能解析を行う。肺気腫と対照肺の肺組織ライセートをCADM1 C末抗体にて免疫沈降し、続いてウエスタン法に供してICDの検出を試みた。肺気腫にのみICDを検出することはできたが、ICDが少量かつ分解が速いためか、その発現量は極めて低かった。今後、症例数を増やして検証する。ICDペプチドを多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置にて合成し、生細胞においてライブイメージングでの検出を可能にするため、ICDペプチドを蛍光色素(FITCなど)で標識する。蛋白トランスフェクション試薬にて肺胞上皮細胞(RLE-6TN、NCI-H441など)にICDペプチドを導入し、1ICDペプチドはミトコンドリアに局在することを確認する、2TUNEL陽性細胞が増加するか調べる。対照ペプチドとして、「WoLF PSORT」での細胞内局在の予測がミトコンドリアから細胞質に変化するようにアミノ酸変異を導入したペプチドを合成し同様の実験を行う。本研究課題では、肺気腫の肺胞上皮におけるアポトーシスの実態とCADM1のshedding亢進の有無を病理組織学的及び分子生物学的に解析し、肺胞上皮アポトーシスとCADM1 sheddingとの間の因果性について、sheddingの最終産物として細胞内に産生される細胞内断片(ICD)の機能解析の観点から調べる予定であった。肺気腫と対照肺の組織ライセートをCADM1抗体のウエスタンブロットに供したところ、肺気腫にのみICDを検出できたが、ICDが少量かつ分解が速いためか、その発現量が極めて低かった。そのため、ICDペプチドの合成及びそのライブイメージを次年度に積極的に行う予定に変更したため。また、本研究の実施に当たって現有の設備を少し拡充したいと考えていたが、実施環境を整理するのに時間がかかり次年度に行う予定にしたため。本研究の実施に当たって、申請書の通り現有の設備を少し拡充する。CADM1 sheddingの最終産物として細胞内に産生される細胞内断片(ICD)の機能解析を行う。ICDは約50アミノ酸残基よりなるペプチドと予想される。そのペプチドを多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置にて合成する。
低酸素傷害に対する麻酔薬の神経保護―バイオイメージングによる残存神経細胞の解析

動物実験において発達中の脳では麻酔薬投与がアポトーシスの増加や樹状突起の形態変化を引き起こすことが報告されている。妊娠17日目のラットより胎児脳を取り出し、大脳皮質神経細胞の初代培養を行った。培養直後から72時間、培養液中に数種類の麻酔薬を暴露した。培養13または14日目に神経細胞に対しグルタミン酸を暴露しカルシウムイメージング法にて反応を測定比較した。その結果、麻酔薬であるチオペンタールを暴露した場合、カルシウムイメージングでの反応性には有意差がみとめられなかったが、ケタミンではカルシウムの流入が増強することが確認された。今回の我々の研究では、ウイスターラット妊娠16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離した初代培養神経細胞に対してグルタミン酸を付加し、人工的に脳虚血状態モデルを作成した。培養神経細胞に対し、静脈麻酔薬ケタミンを付加した場合において、人工脳虚血状態を発生させ、形態学的に生存と判定された脳神経細胞に対してカルシウムイメージングを行い、細胞の分子生物学的特徴を明らかにすることを目標とした。目標通り、平成24年度においては、ラット16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離し、硝子ボトムディッシュ(松浪硝子D111505)上に初代培養を行った。培養液の組成や交換方法などに改良を加えた結果、非常に良好かつ安定的な培養神経細胞が作成可能な状態となった。この細胞を利用し、14日間の培養後、Ca2+感受性インディケーター及び共重合型界面型活性剤プルロニックF-127を暴露し、油浸対物レンズFlour (Carl-Zeiss)を装着した倒立顕微鏡Axiovert 200 (Carl-Zeiss)、CCDカメラ(Orca FR,浜松フォトニクス)、画像イメージ処理用のAquacosmos (浜松フォトニクス)の設備を利用し、蛍光励起(fluorescence excitation)のための150Wのキセノンランプを暴露することにより、GABAやグルタミン酸などの神経刺激物質を加えた際の蛍光強度の上昇を細胞内カルシウム濃度の変化として測定している。その際に、グルタミン酸付加前に静脈麻酔薬ケタミンを加えることにより、細胞生存率やカルシウム濃度の変化にどのような影響を与えるかのデータを収集している。現在、概ね順調にデータが収集されつつある。今回の我々の研究では、ウイスターラット妊娠16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離した初代培養神経細胞に対して高濃度のグルタミン酸を付加し、人工的に脳虚血状態モデルを作成した。培養神経細胞に対し、静脈麻酔薬ケタミン、チオペンタールナトリウム並びにプロポフォールを付加した場合において、形態学的に生存と判定された脳神経細胞に対してカルシウムイメージングを行い、細胞の分子生物学的特徴を明らかにすることを目標とした。目標通り、平成25年度においては、ラット16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離し、硝子ボトムディッシュ(松浪硝子D111505)上に初代培養を安定的に培養神経細胞が作成している。この細胞を利用し、14日間の培養後、Ca2+感受性インディケーター及び共重合型界面型活性剤プルロニックF-127を暴露し、油浸対物レンズFlour (Carl-Zeiss)を装着した倒立顕微鏡Axiovert 200 (Carl-Zeiss)、CCDカメラ(Orca FR,浜松フォトニクス)、画像イメージ処理用のAquacosmos (浜松フォトニクス)の設備を利用し、蛍光励起(fluorescence excitation)のための150Wのキセノンランプを暴露することにより、GABAやグルタミン酸などの神経刺激物質を加えた際の蛍光強度の上昇を細胞内カルシウム濃度の変化として測定し、データを収集、解析を加えている。現在、きわめて順調にデータが収集され、解析を加えている。虚血モデル暴露後の生存脳神経細胞については形態学的検査には一様でも、細胞死に至る細胞と麻酔薬等薬物療法・低温療法によりレスキューされる細胞の分子細胞生物学的特徴は不明である。今回の我々の研究では形態学的に生存と判定された脳神経細胞に対してカルシウムイメージングを行い、細胞の分子生物学的特徴を明らかにすることを目標とした。平成23年度においては、岡山大学の小阪准教授との協力の上、油浸対物レンズFlour (Carl-Zeiss)を装着した倒立顕微鏡Axiovert 200 (Carl-Zeiss)、CCDカメラ(Orca FR,浜松フォトニクス)、画像イメージ処理用のAquacosmos (浜松フォトニクス)の設備の移送を行った。また、ウイスターラット妊娠16日目の胎児から大脳皮質神経細胞ならびに海馬神経細胞を分離し、硝子ボトムディッシュ(松浪硝子D111505)上に初代培養を行った。当初、プラスチック培養皿に比べ、培養状況が安定しなかったものの、培養液の組成や交換方法などを調節した結果、概ね良好な結果が得られるようになった。

そこで、14日間程度培養された神経細胞に対し、Ca2+感受性インディケーター及び共重合型界面型活性剤プルロニックF-127を暴露し、蛍光励起(fluorescence excitation)のための150Wのキセノンランプを暴露することにより、蛍光強度の上昇を細胞内カルシウム濃度の変化の測定を見ることとした。今年度はラット初代培養神経細胞におけるチオペンタール暴露はグルタミン反応性に影響を与えるかをカルシウムイメージングを用いた研究にて調べた。動物実験において発達中の脳では麻酔薬投与がアポトーシスの増加や樹状突起の形態変化を引き起こすことが報告されている。以前の我々の研究ではNMDA拮抗薬であるケタミンを胎生17日目の培養大脳皮質細胞に暴露した場合、13-14日後にグルタミン酸を暴露すると細胞内カルシウムの有意な上昇が見られた。しかしながら、GABAA作動薬であるチオペンタール(TPS)ではどのような反応を示すか不明である。妊娠17日目のウイスターラットより胎児脳を取り出し、大脳皮質神経細胞の初代培養を行った。培養直後から72時間、培養液中にTPSを1-100 mMにて暴露した。対照群にはTPSを含まない同量のdistilled waterを投与した。培養13または14日目にFluo-4AMを神経細胞に投与しインキュベートを行った後に、NBSに溶解した1 mMのグルタミン酸を暴露しカルシウムイメージング法にてFmax/Fo値を測定比較した。TPSを暴露しなかった培養神経細胞におけるFmax/F0値を基準値=1.0とした場合、TPSを1, 10, 100 mM暴露した群ではそれぞれFmax/F0 Ratioはそれぞれ0.889(0.051), 1.051(0.068), 0.894(0.161): means(SEM)であった。胎生17日目のラット神経培養細胞に臨床使用濃度TPSを暴露した場合、初代培養13-14日後のグルタミン酸暴露に対するカルシウムイメージングでの反応性には有意差がみとめられなかった。胎生期のTPS暴露が、その後のグルタミン酸負荷に対して反応が増強したことを示唆する所見は見られなかった。麻酔学初代培養神経細胞をカルシウムイメージングのため、硝子ボトムディッシュ上で観察に適切なように培養するのは非常に困難であると思われたが、培養液の組成や交換頻度の工夫により概ね良好な結果が得られるようになり、来年度以降の研究に好ましい影響を与えられると思われた。以上の事よりおおむね順調に進行していると考えている。初代培養神経細胞をカルシウムイメージングのため、硝子ボトムディッシュ上で安定的に生育することが考となった。また、静脈麻酔薬ケタミン、チオペンタールナトリウム、プロポフォールをあらかじめ投与し、人工脳虚血状態に暴露した上で、生存脳神経細胞に対素、グルタミン酸を付加し細胞内カルシウム濃度を測定することに成功した。以上の事より極めて順調に進行していると考えている。
非対称性ジメチルアルギニンが脳血管反応性へ及ぼす影響と術後早期 高次脳機能障害

内因性NO合成阻害物質非対称性ジメチルアルギニン(ADMA)の脳血管炭酸ガス反応性(CO_2R)への影響と術後高次脳機能障害(POCD)との関連を腎障害患者36例と人工心肺を用いない冠動脈バイパス術100例で検討した。腎障害患者ではCO_2Rは尿素窒素濃度に依存して障害され、液性因子の関与が示唆された。ADMAのCO_2Rへの影響は明確でなくPOCDの発生への関与は発生症例が少なく検討できなかった。Off-pump CABG症例ではおよそ12%にPOCDが発生しCO_2Rの低下がPOCDに関連していることがわかった。腎障害患者同様ADMAのCO_2RやPOCDへの関与は明らかでなかった。【対象と方法】慢性系球体腎炎による腎障害(RF)における腎移植症例36例(RF群:血液又は腹膜透析30例、透析直前6例)と非RF13例(C群)で、脳血管CO_2反応性(CO_2R)を比較検討した。麻酔導入2-3時間後の手術侵襲が少ない時点で呼気イソフルラン1%、亜酸化窒素50%とし、PaCO_2 35mmHgで中大脳動脈血流速度(V35)を測定後、PaCO_2 45mmHgで再度測定した(V45)。CO_2Rは1mmHg PaCO_2に対するVの変化(△V/△PCO_2;絶対変化)と、対V35比(△V/△PCO_2/V35:相対変化)で評価した。【結果】RF群/C群(年齢40±14/47±11歳)で、術前の尿素窒素(BUN:56±16/13±3mg/dl)、クレアチニン(10.2±3.2/0.7±0.1mg/dl)はRF群で高かった。PaCO_2 35mmHgでの平均血圧(83±12/74±11mmHg)、V35(51±23/46±14cm/sec)に差はなく、ヘモグロビン(8.7±1.3/10.5±1.7g/dl)はRF群で低かった。V45はRF群/C群76±30/69±15cm/secで、絶対、相対変化に群間差はなかった。ただしRF群内では、絶対、相対変化ともBUN値と負の相関を示し、透析患者よりも透析前患者でBUNは高く(53±14/72±17mg/dl)相対変化は小さかった(5.7±2.6/2.6±2.1%/mmHg)。【まとめ】RFではCO_2Rは大きくは障害されないが、RFが高度になるとCO_2R障害を起こす可能性が示唆された。BUNとの関連から液性因子の関与が示唆された。非対象性ジメチルアルギニンとL-arginineを測定し、CO_2Rとの関連を検討中である。また神経心理学検査から術後高次脳機能障害(POCD)の発生を調べており日常生活動作の障害についても調査中である。対象:人工心肺を使用しない冠動脈バイパス術(off-pump CABG)40例を対象とした。結果:対象症例の15例が術後1検査以上の神経心理学検査で20%以上の低下を生じた(低下群)。低下群の脳血管炭酸ガス反応性は非低下群に比べて相対的、絶対的CO2Rとともに低い傾向にあった。ADMA、L-Arginineの測定と術後の日常生活動作に関しては現在解析とデーターを集積している。ADMA、L-Arginineの測定と解析には時間を要し、術後の日常牢活動作に関しては手術後3ヶ月以後の確認となるため、23年度症例の完全なデーターの解析には至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度も前述同様の内容で症例を重ねていく予定である。
加熱壁面上のマイクロバブルとマランゴニ対流発生が流体加熱効率に与える影響の解明

現代の産業全般において,水冷技術は非常に重要な役割を担っている.特に,宇宙空間に漂う機器類や高集積化する電子デバイス内での熱のマネジメントは急務となっている.水冷技術において鍵となるのは加熱壁面から流体への熱伝達率と流体中の熱伝導・熱輸送である.本研究では,加熱壁面上に生成するバブルとその周辺に発生する対流が,壁面から流体への熱の移動にどのように影響を与えているかを明らかにすることを目的としている.本年度は,バブルの挙動に大きな影響を与える水中溶存気体量を調節し,その場でバブルの観察を行う手法を確立した.また,水中溶存空気量を2 mg/L以下まで下げ,その場でバブルの生成を試すことに成功した.この装置を用いて,バブルの中に取り込まれる気体の量を調節し,バブルの大きさや周辺に発生する対流のと関係を明らかにした(論文準備中).この結果は,加熱壁面上のバブルが急激な対流を伴うメカニズムの解明に貢献する.また一方で,バブルの周りに生じる対流の向きを制御することは,加熱壁面の効率的な冷却に欠かせない.そこで,レーザー多点同時照射法を用いてバブル周辺の温度勾配を変化させて,対流の向きを制御する方法を明らかにした(論文発表済).この方法を用いることで,マイクロ流路内に壁面に平行な向きの流れを発生させることができる.小型デバイスの冷却においては,このようなマイクロ流路を用いた冷却方法の確立が望まれており,本成果はその実現に貢献する.本年度は当初の研究計画に基づいて,光熱流体現象観察用実験系の製作及び局所加熱されたマイクロバブル周辺の温度に関する研究を行った.まず,前年度の試みから,流体中の溶存気体量を保つことが光熱流体現象観察を行う上で重要であることがわかっていた.そこで,流体の脱気を行なったのち,その場で光熱流体現象を観察できるように設計した装置を作製した.ガスクロマトグラフィーを用いて,装置内の脱気水中に残存する溶存気体量の定量し水を一度大気暴露した時と比較して溶存気体量を低減できることがわかった.また,準備した脱気水の圧力を4kPaから100kPa程度で任意に設定し,その場で光熱流体現象を観察することに成功した.開発した装置を用いて,水中溶存気体量がバブルの成長と対流発生に与える影響を明らかにした.さらに,レーザー多点同時照射法を用いてバブル周辺の温度勾配を変化させて,対流の向きを制御する方法を明らかにした.一方で,マイクロバブルの周辺の温度を調べることは,対流の発生に関する理解を深め,冷却効果を明らかにする上で重要である.そこで,小型の温度計,熱流束計,および感温薄膜を用いたバブル周辺の温度・温度変化の定量を試みた.まず,小型の温度計および熱流束計を用いた実験では,バブルの大きさに比べてそれらのセンサーが大きかったため,その周りの熱の移動を測定することが困難であった.そこで,室温から70°C程度で相転移することが知られているWドープVO2薄膜を作製し,バブルの極近傍の温度を可視化することを試みた.その結果,緩やかな流れを伴う空気バブルと激しい流れを伴う水蒸気バブルとの間で,バブル周辺の温度分布に著しい差が見られることがわかった.そして得られた結果から,水蒸気バブルの高い冷却効果が明らかになった.本年度は,前年度に作成した光熱流体現象観察用実験系を用いて,加熱壁面から流体への熱伝達効率の評価及びバブルを用いた熱伝達効率向上をめざす.具体的な研究計画は以下の通りである:前年度は光熱流体現象観察用実験系の改良と熱伝達効率測定のための予備実験を行なった.その結果,タングステンドープした酸化バナジウム薄膜を使ってバブルのごく近傍の温度分布を測定できることがわかった.本年度は熱流束計を用いた評価に加えて,微小領域温度分布測定を利用して熱伝達効率の評価を行う.前年度までの取り組みの結果,バブルの大きさや周辺に発生する対流の強さは,レーザー強度,強度空間分布,液体中溶存気体量,液体の種類などによって大きく変化することがわかっている.そこで,これらの要素が加熱壁面から液体への熱伝達効率にどう影響しているかを調べる.そして熱伝達効率向上に最適な条件を明らかにする.特に,強度空間分布によってバブルの周りの流れの向きを様々に変化できることがわかっている.そのため,マイクロ流路を使って微小領域の冷却を行う手法として最適化することにも取り組む.また,流体の種類の最適化については,すでに水ーアルコール混合液について大まかに最適な濃度の範囲がわかっている.しかし,なぜこの範囲でバブルの大きさや周辺対流速度に大きな変化が現れるのかが明らかになっていない.そこで,熱伝達効率向上のための水ーアルコールの混合比最適化と並行して,なぜそのような変化が現れるかをより詳しく明らかにする.現代の産業全般において,水冷技術は非常に重要な役割を担っている.特に,宇宙空間に漂う機器類や高集積化する電子デバイス内での熱のマネジメントは急務となっている.水冷技術において鍵となるのは加熱壁面から流体への熱伝達率と流体中の熱伝導・熱輸送である.加熱壁面上に生成するバブルとその周辺に発生する対流は,これらの熱の移動に対して大きな影響を与えることが知られている.しかし,加熱壁面上のランダムな位置に発生する小さなバブルを観察することは容易ではなかった.また,沸騰に伴って生じるバブルは非常に複雑な温度勾配下に置かれており,その挙動を理解するのは困難であった.

これに対して,本研究は金ナノ粒子薄膜の局所的な光熱変換特性を導入することで,バブルの生成やその周辺の温度勾配の積極的な制御を目指している.本年度はこのようなバブルと流れの発生の制御を行うための観察系のプロトタイプをいくつか作製した.また,これらの観察系を用いて,室温の脱気水および水ーアルコール混合液中で局所加熱を行なった場合に発生するバブルと流れについて調べた.その結果,非常に強い流れを伴う蒸気バブルが発生する水中溶存気体量の範囲を明らかにすることに成功した.また,アルコールの添加によって生じる濃度勾配マランゴニ対流を熱的にコントロールする方法を確立した.この成果はすでに論文として報告している.本年度の成果は加熱壁面近傍に発生するバブルと流れを理解する上で重要な知見を与える.本年度は当初の研究計画に基づいて,流体沸騰観察系の構築と室温の脱気水および水ーアルコール混合液を局所加熱した場合に発生するマイクロバブルと流れに関する研究を行った.流体沸騰観察系を構築するために,いくつかの流体観察用セルの試作を行った.本実験においては,水中の溶存気体量を調節し,さらにそれを一定に保つことが非常に重要である.これまでに作製した流体観察用のセルは密閉型ではなかったため,水中溶存気体量を一定に保つ上で問題があった.さらに,水中溶存気体量を調整した水を観察用のセルに移す際に,水に気体が再溶解することも問題であった.そこで,溶存気体量を調整した水を真空中で密閉型観察用セルに移送できる系を作製した.そして作製したセル中の水の溶存気体量を,ガスクロマトグラフィーを用いて調べた.また,溶存気体量の制御とは別に,加熱流体中でのマイクロバブル及び対流の挙動を明らかにするために,温度調節機能つきの流体セルを作製した.作製した観察系を用い,セル内の溶存気体量をガスクロマトグラフィーで定量的に測定することで,水中溶存気体量とバブル生成との関係を明らかにした.さらに,水ーアルコール混合液中で発生する対流に関する研究では,興味深い結果が得られた.温度勾配下にあるマイクロバブルでは,表面張力に勾配ができ,通常高温部から低温部に向かって力が働く.しかし,水ーアルコール混合液中ではバブル表面にアルコールの濃度勾配ができ,低温部から高温部に向かって力が働くと考えられていた.本研究では,これらの力が釣り合うアルコール濃度を実験的に明らかにすることに成功した.水ーアルコール混合液中での沸騰を考える上で重要な知見を得ることができた.現代の産業全般において,水冷技術は非常に重要な役割を担っている.特に,宇宙空間に漂う機器類や高集積化する電子デバイス内での熱のマネジメントは急務となっている.水冷技術において鍵となるのは加熱壁面から流体への熱伝達率と流体中の熱伝導・熱輸送である.本研究では,加熱壁面上に生成するバブルとその周辺に発生する対流が,壁面から流体への熱の移動にどのように影響を与えているかを明らかにすることを目的としている.本年度は,バブルの挙動に大きな影響を与える水中溶存気体量を調節し,その場でバブルの観察を行う手法を確立した.また,水中溶存空気量を2 mg/L以下まで下げ,その場でバブルの生成を試すことに成功した.
イネ種子中のプロラミン分子種がプロテインボディIへ局在化するミクロな制御機構

本研究では、イネ種子のPB-I内部における各プロラミン分子種の詳細な局在化機構を明らかにした。プロラミンの局在化には、プロラミンプロモーターの制御と、タンパク質間の相互作用(ジスルフィド結合、疎水結合など)が重要な役割を担うことが明らかになった。イネ種子貯蔵タンパク質は、プロラミン、グルテリン、グロブリンに分類され、それぞれ複数の分子種より構成される。プロラミンはPB-Iへ、グルテリンとグロブリンはPB-IIに特異的に集積するが、その細胞内輸送機構の解析は、合成・集積には複数の段階があり、PBの形成機構の詳細は未だに不明な点が多い。PB-Iは人の消化管ではほとんど分解されないが、何故消化されにくいのかは不明であった。申請者は、プロラミン分子種の多様性がPB-I形成に重要な役割を担う可能性を見出した。そこで、本研究では、ヒト消化管においてPB-Iが難分解性となる原因がPB-Iの構造上の特徴にあるという仮説を立て、イネPB-Iの形成機構に焦点を絞り、イネ種子におけるPB-Iの形成機構を分子生物学的、細胞生物学的手法で解析することを目的とした。本年度は、複数種類からならのプロラミン分子種をそれぞれ区別して認識する抗体を作製し、各抗体に直接蛍光色素を標識し、免疫蛍光顕微鏡観察を行い、PB-I内部におけるプロラミン分子種の局在性を明らかにした。また、イネの開花後の登熟種子よりtotal RNAを抽出し、各プロラミン遺伝子の発現時期および量をRT-PCR法によりプロラミン分子種ごとに明らかにした。更に各プロラミンをコードするcDNA配列をGFP遺伝子に接合し、イネに遺伝子導入し、プロラミン+GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを作出した。1)プロラミン分子種を区別する抗体を用いたPB-I内部におけるプロラミンの局在性の解析これまでの研究で確立したイネ種子に対する樹脂切片作製法と蛍光標識抗体法を組合せ、S-S結合に関わる配列上の特徴が異なる4種類のプロラミンポリペプチド(10kDaプロラミン、13kDaプロラミン(Cys rich)、13kDaプロラミン(Cys poor)、16kDaプロラミン)の胚乳組織における局在性や蓄積量の違いを明らかにした。また、それぞれの抗体を組合せることで、二重免疫による電子顕微鏡観察を詳細に実施し、同一PB-I上における10kDaプロラミン、13kDaプロラミン(Cys rich)、13kDaプロラミン(Cys poor)、16kDaプロラミンの4種類のプロラミンポリペプチドのPB-I内部における局在性を明確にした。2)プロラミン分子種ごとの発現時期、発現量の解析6種類のプロラミン遺伝子(10kDaプロラミン2種類、13kDaプロラミン(Cys rich)、13kDaプロラミン(Cys poor)2種類、16kDaプロラミン)を区別可能なプライマー配列を用い、開花後の経時変化におけるプロラミン遺伝子の発現解析をより詳細に行った。その結果、胚乳組織の発達段階と部位によるプロラミン分子種の発現の違いが明らかになった。3)プロラミン+GFP融合タンパク質を用いたPB-Iの構成ポリペプチドの解析プロラミン+GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを用いて、1)で使用する各種プロラミン抗体とGFP蛍光を用いた蛍光組織観察を行ったところ、プロラミン分子種の違いにより、GFP蛍光を示す部位と、蛍光標識抗体で観察されるPB-Iとの局在部位に類似性が見られた。1)プロラミン分子種を区別する抗体を用いたPB-I内部におけるプロラミンの局在性の解析これまでに作製した5種類のプララミンに対する抗体(全13kDa,10kDa,13kD-a(Cys rich),13kD-b(Cys less),16kDaプロラミン抗体)を用い免疫蛍光組織観察、免疫電子顕微鏡観察を行い、プロラミン分子種のPB-I内における局在化様式を明らかにした。その結果、PB-Iの中心部に10kDa,その周囲に13kD-b,中間層には13kD-aおよび16kDa,最外周層には再び13kD-bが局在化している事が明らかになった。また、溶媒分画法を用いることで、13kD-bプロラミンがPB-I内から遊離し易い事が明らかになった。2)プロラミン分子種ごとの発現時期、発現量の解析これまでに作製した各プロラミン遺伝子を区別可能なプライマー配列を用い、開花後の経時変化における各プロラミン遺伝子の発現解析を行ったところ、各プロラミンmRNAの発現ピーク時期の順番が、PB-I内部から外周部へ向かうタンパク質の局在化の順番と同様であることが判った。即ち、遺伝子発現の順番とタンパク質の局在化する順序はほぼ一致していた。3)プロラミン+GFP融合タンパク質を用いたPB-Iの構成ポリペプチドの解析プロラミンプロモーター制御下で発現したプロラミン+GFP融合タンパク質が種子中のPB-Iに合成・集積する形質転換イネを用いて、各種プロラミンとGFP融合タンパク質の局在部位を明らかにした。

その結果、PB-I中の内在性プロラミンの局在部位とプロラミン+GFP融合タンパク質の局在性が一致した。即ち、各プロラミンがPB-Iに局在化する機構にはプロラミンプロモーターの制御が強く関与していることが判った。以上の結果より、PB-I内部における各プロラミン分子種の詳細な局在化機構が明らかになり、プロラミンの局在化には、プロラミンプロモーターの制御と、タンパク質間の相互作用(ジスルフィド結合、疎水結合など)が重要な役割を担うことが明らかになった。