hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
走査型電気化学顕微鏡による生体医療材料の動的変化追跡システム

本研究では、走査型電気化学顕微鏡-走査型イオンコンダクタンス顕微鏡システムにより細胞とバイオマテリアルを複合した生体医療材料を評価する。探針電極が100 nm以下のスケールに突入することによって顕在化してきた探針-基板間の相互作用、探針および試料表面の表面電荷について詳細に検討する。特に、異なる細胞種やタンパク質、細胞外マトリックスが混在する複雑な組織モデル系試料を対象に、nmスケールの形状と機能情報を集約し、生体材料の設計・選定、細胞-細胞間相互作用や微小環境の制御を通じて、新しい組織モデルの構築に貢献することを目標とする。探針電流値に対する探針内壁および細胞試料表面の電荷密度や探針近傍のイオン強度の影響を精査し、顕微鏡画像の解像度・品質向上に反映させることで、生体医療材料を形状と機能の両面から評価する。走査型プローブ顕微鏡SPMにより組織モデルの高解像度画像を取得し、標的細胞から極微量サンプルを回収して網羅的遺伝子発現解析を可能とする装置システムを開発するために、アプローチカーブの解析、形状画像と電気化学画像の干渉、プローブの化学修飾、表面電荷マッピング、培養細胞・細胞塊の評価、組織モデル系における生体材料-生体医療材料複合体の多項目分析、などの課題について重点的に取り組む。2018年度は、アプローチカーブの解析、形状画像と電気化学画像の干渉、プローブの化学修飾、表面電荷マッピングに取り組んだ。培養細胞・細胞塊の評価、組織モデル系における生体材料-生体医療材料複合体の多項目分析についても、前倒しで検討を開始することができた。測定システムの感度の問題などにより、当初の計画通りの結果が得られていない検討項目がある一方、先取りして実施できた項目もあり、総じて順調に進展していると判断した。1)アプローチカーブ解析:走査型電気化学顕微鏡-走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SECM-SICM)システムにより酵素固定化膜や酵素固定化微粒子を対象に、アプローチカーブを取得した。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)やマウス胚性幹細胞(mESC)の内在性酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)活性の評価を検討した。単層状に播種したhMSCシートに対してアプローチカーブを取得し、沖合に比べサンプル近傍でALP活性に起因する電流上昇が観測された。2)形状画像と電気化学画像の干渉:酵素固定化微粒子のSECM-SICMイメージングでは、数マイクロメートルサイズの微粒子形状を解像することに成功した。一方電気化学イメージでは、単一微粒子レベルの酵素活性を可視化することはできなかった。微粒子集合体に対して、酵素活性を電気化学的に可視化することに成功した。hMSCやmESCを対象に1細胞レベルで形状-ALP活性の同時イメージングを検討した。その結果、SICM画像として明瞭な形状イメージを取得することに成功したのに対し、SECM画像として酵素活性を検出することはできなかった。3)探針の化学修飾:酵素活性の検出感度を改善するために、SECM-SICM探針における炭素電極部分にPtを電解析出した。観測されるファラデー電流は増大し、SICM探針で観測されるイオン電流を妨害しないことを確認した。4)表面電荷マッピング:SICM探針に充てんする電解質濃度を低く設定することにより、イオン電流のアプローチカーブからサンプル表面の電荷を解析した。電解質中に粒子が存在する系で、イオン電流のスパイク形状からピペット外部に粒子が放出される挙動を解析できた。今後は、アプローチカーブによりイオン電流の距離依存性について引き続き詳細な検討を行う。SECM-SICMに加え、電気化学シリンジ-SICM探針におけるイオン電流挙動やアプローチカーブの検討を行う。組織モデル試料の機能評価を検討するために、多機能プローブをサンプルに近接させ、形状や電気化学的機能評価、遺伝子発現解析を検討する。hMSCやES細胞に加え、がん細胞や血管内皮細胞、繊維芽細胞などの複合試料を調製する。3次元培養系において、細胞と生体材料の相互作用、細胞間相互作用の評価を検討する。ナノマテリアルやハイドロゲル、エラストマー、多孔質膜など機能化学物質が共存する環境において、細胞形状、細胞機能に関する情報を取得し、培養組織モデルの品質向上やin vitroにおける生体内相互作用の再現・再構築にフィードバックさせる。培養細胞・細胞塊の評価、組織モデル系における生体材料-

生体医療材料複合体の多項目分析についても、前倒しで検討を開始することができた。測定システムの感度の問題などにより、当初の計画通りの結果が得られていない検討項目がある一方、先取りして実施できた項目もあり、総じて順調に進展していると判断した。1)アプローチカーブ解析:走査型電気化学顕微鏡-走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SECM-SICM)システムにより酵素固定化膜や酵素固定化微粒子を対象に、アプローチカーブを取得した。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)やマウス胚性幹細胞(mESC)の内在性酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)活性の評価を検討した。単層状に播種したhMSCシートに対してアプローチカーブを取得し、沖合に比べサンプル近傍でALP活性に起因する電流上昇が観測された。2)形状画像と電気化学画像の干渉:酵素固定化微粒子のSECM-SICMイメージングでは、数マイクロメートルサイズの微粒子形状を解像することに成功した。一方電気化学イメージでは、単一微粒子レベルの酵素活性を可視化することはできなかった。微粒子集合体に対して、酵素活性を電気化学的に可視化することに成功した。hMSCやmESCを対象に1細胞レベルで形状-ALP活性の同時イメージングを検討した。その結果、SICM画像として明瞭な形状イメージを取得することに成功したのに対し、SECM画像として酵素活性を検出することはできなかった。3)探針の化学修飾:酵素活性の検出感度を改善するために、SECM-SICM探針における炭素電極部分にPtを電解析出した。観測されるファラデー電流は増大し、SICM探針で観測されるイオン電流を妨害しないことを確認した。4)表面電荷マッピング:SICM探針に充てんする電解質濃度を低く設定することにより、イオン電流のアプローチカーブからサンプル表面の電荷を解析した。電解質中に粒子が存在する系で、イオン電流のスパイク形状からピペット外部に粒子が放出される挙動を解析できた。今後は、アプローチカーブによりイオン電流の距離依存性について引き続き詳細な検討を行う。SECM-SICMに加え、電気化学シリンジ-SICM探針におけるイオン電流挙動やアプローチカーブの検討を行う。組織モデル試料の機能評価を検討するために、多機能プローブをサンプルに近接させ、形状や電気化学的機能評価、遺伝子発現解析を検討する。hMSCやES細胞に加え、がん細胞や血管内皮細胞、繊維芽細胞などの複合試料を調製する。3次元培養系において、細胞と生体材料の相互作用、細胞間相互作用の評価を検討する。ナノマテリアルやハイドロゲル、エラストマー、多孔質膜など機能化学物質が共存する環境において、細胞形状、細胞機能に関する情報を取得し、培養組織モデルの品質向上やin vitroにおける生体内相互作用の再現・再構築にフィードバックさせる。
結核菌の新規防御抗原MPT51による免疫応答能の解析とヘテロワクチンの開発

この研究の目的はMPT51を用いて新規抗結核ワクチンを開発すること、及びMPT51のT細胞エピトープを同定することにある。1.第三世代レンチウイルスをベクターとした抗結核ワクチンの開発:MPT51防御抗原を発現するレンチウイルスベクターをBALB/cマウスに経気道免疫し、特異的CD8+T細胞の誘導をテトラマー法にて検討した。その結果、この免疫法により特異的T細胞が誘導されること、及びそのメカニズムを縦隔リンパ節、脾臓で検討し、明らかにした。また、この免疫マウスの結核菌の気道感染に対する感染防御能し、一定の防御効果を示すことを明らかにした。2.ケモカイン/MPT51融合ワクチンの有効性:MPT51をDCに効率良く取り込ませ、T細胞を感作するため、未熟DCに発現しているCCR5のリガンドであるCCL3とMPT51の融合蛋白ワクチンを作製した。まず、この融合蛋白ワクチンを発現するDNAワクチンを用いて、その有効性を示した。更に、融合蛋白そのものをアジュバントなしで免疫しその効果を検討した。その結果、この融合蛋白はテトラマーで検出できる特異的CD8+T細胞とエピトープ刺激でIFN-γを産生する特異的CD4+T細胞を感作することが判明した。3.MPT51のHLA拘束性T細胞エピトープの同定:ヒトのMPT51特異的T細胞を検出するため、HLAトランスジェニックマウスを用いて、T細胞エピトープの同定を行った。その結果、HLA-A^*0201拘束性エピトープは53-62の9-merであることが判明した。又、HLA-DR4拘束性エピトープは190-210に存在することが判明した。更に、ヒトの抹消血リンパ球を用いて研究を行った。その結果、(1)HLA-A^*0201をもつツベルクリン陽性健常者末梢単核球中にMPT51p53-62/HLA-A^*0201テトラマーに結合するCD8+T細胞が検出され、このペプチドがHLA-A^*0201拘束性ドミナントCTLエピトープであることが判明した。(2)細胞内IFN-γ染色によりCD4+T細胞がMPT51p191-202ペプチド存在下でIFN-γを産生することを確認した。このことはMPT51p191-202がHLA-DR4拘束性ドミナントT細胞エピトープであることを示す。1.ヘテロ免疫用新規ワクチンの開発(1)第三世代レンチウイルス・ベクターに結核菌由来のMPT51遺伝子を挿入した。これを経気道接種したところ、CD11c陽性の肺胞マクロファージ、縦隔リンパ節細胞に抗原が発現しており、主に縦隔リンパ節でT細胞が感作されるものと推察された。縦隔リンパ節にはMPT51

特異的CD8T細胞がワクチン接種後3週をピークとして出現することがテトラマー法で観察された。6週後には記憶T細胞のみを残した。一方、脾臓にはMPT51特異的CD8T細胞を観察出来なかった。このワクチンを接種後、2ヶ月にBCGを経気道的に感染させたところ、5日後の肺に多数のMPT51特異的CD8T^+細胞が検出された。このCD8T^+細胞はMPT51特異的キラー活性を示した。以上より、第三世代レンチウイルスによる抗結核ワクチンの経気道接種は肺結核の予防、治療に有効と考えられる。(2)ケモカイン/MPT51融合ワクチン:CCL3(MIP-1・)/MPT51融合DNAワクチンおよび融合蛋白ワクチンを作製した。両者のワクチンともマウスに接種したところ、MPT51単独のワクチンに比し、強い特異的IFN-γ産生T細胞、CTL活性を誘導できた。現在、その機序を検討中である。HLA-A*0201のトランスジェニック(Tg)マウスを用いて、既にこのT細胞エピトープは同定している。現在は、日本人で最も高頻度であるHLA-A*2402のTgマウスを作製したので、これを用いてT細胞エピトープの同定を行っている。3.結核患者における低分子結核菌分泌蛋白に対する免疫応答能の解析T細胞刺激能が強い15KDa以下の結核菌の分泌蛋白を6種選択し、ゲノム情報より、ペプチドライブラリーを作製した。今後、ヒトT細胞エピトープを同定する予定である。1)第三世代レンチウイルスをベクターとした抗結核ワクチンの開発MPT51防御抗原を発現するレンチウイルスベクターをBALB/cマウスに経気道免疫した。MPT51はBALB/cマウスにCD8+T細胞を誘導するため、感作T細胞の検出には主にテトラマー法を用いた。昨年度の研究より、この免疫法では主に縦隔リンパ節で感作が行われることが判明した。肺胞マクロファージはCD11cが陽性であるため、樹状細胞(DC)との識別が困難である。そこで、縦隔リンパ節中に移行したDCをMHCクラスII抗原で検出した。その結果、MPT51をT細胞に提示するDCは肺から縦隔リンパ節に移行することが明らかとなった。又、免疫2ヶ月後の記憶T細胞の動態を検討したところ、予想外にも縦隔リンパ節には存在せず、肺(BALTを含む)と脾臓に存在することが判明した。従って、このワクチンを接種したマウスに結核菌が経気道的に感染した際には、これらの記憶T細胞が動員されると考えられる。現在、この免疫マウスの結核菌の気道感染に対する感染防御能を検討中である。2)ケモカイン/MPT51融合ワクチンの有効性MPT51をDCに効率良く取り込ませ、T細胞を感作するため、未熟DCに発現しているCCR5のリガンドであるCCL3とMPT51の融合蛋白ワクチンを作製した。昨年度はこの融合蛋白ワクチンを発現するDNAワクチンを用いて、その有効性を示した。今年度は融合蛋白そのものをアジュバントなしで免疫しその効果を検討した。その結果、この融合蛋白はCD8+T細胞を感作するが、CD4+T細胞を感作する能力が弱いことが判明した。これは、この融合蛋白がDC中でクロスプライミングを効率よく誘導するという結果と一致する。3)MPT51のHLA拘束性T細胞エピトープの同定ヒトのMPT51特異的T細胞を検出するため、HLAトランスジェニックマウスを用いて、T細胞エピトープの同定を行った。その結果、HLA-A*0201拘束性
海産毒ステレッタマイドAの生理活性作用に関する研究

ステレッタマイドAはStelletta属の海綿から分離されたアルカロイドであり上皮細胞K562に対して毒性を示すことが知られている。そこで各種平滑筋を用いてこの化合物の作用およびその作用機序を検討し、以下の結果を得た。(1)ステレッタマイドAはラット大動脈の高濃度K^+(30.0mM、72.7mM)収縮をそれぞれ30μM、100μMで、ノルエピネフリン(0.1μM、1μM)収縮をそれぞれ100μM、300μMで完全に抑制した。またCa^<2+>除去液中においてプロテインキナーゼC活性化薬DPB(1μM)による収縮を300μMで完全に抑制した。(2)Ca^<2+>蛍光指示薬を負荷した標本において、ステレッタマイドA(100μM)は高濃度K^+(30.0mM)による細胞内Ca^<2+>濃度の増加をほぼ完全に抑制し、NE(1μM)による細胞内Ca^<2+>濃度の増加を一部抑制した。(3)モルモット盲腸紐にTritonX-100処理スキンドファイバーにおいて、ステレッタマイドAはCa^<2+>(3μM、10μM)収縮をそれぞれ100μM、300μMで完全に抑制した。(4)ニワトリ砂嚢より精製したミオシンBにおいて、ステレッタマイドAはミオシン軽鎖のリン酸化を100μMで完全に、さらにMg^<2+>-ATPase活性を300μMでほぼ完全に抑制した。(5)再構成系において、ステレッタマイドAはニワトリ砂嚢由来のミオシン軽鎖キナーゼ活性を300μMでほぼ完全に抑制した。(6)ステレッタマイドAはウサギ赤血球膜の(Ca^<2+>-Mg^<2+>)ATPase活性を300μMでほぼ完全に抑制した。(7)ステレッタマイドAはホスホジエステラーゼ活性を300μMでほぼ完全に抑制した。ステレッタマイドAは、これらのすべての実験系において抑制作用を示したため、ステレッタマイドAの主な作用部位はカルモジュリンであり、カルモジュリン阻害作用により上記の抑制作用を発現していることが示唆された。
急性感音難聴の分子病態と治療の動態的解析-次世代シークエンスでの統合遺伝子解析-

平成30年度には、平成29年度までに得られたデータを解析し、当研究計画の成果として2報目の英文原著論文を執筆、出版した。具体的には、1)C57BL/6系統マウスを、120dBオクターブバンドノイズに2時間暴露し、難聴を惹起した際の聴力データを出版した。2)またその際に蝸牛では炎症・免疫機能に関与する遺伝子群が変動することを示す、リアルタイムRT-PCRアレイのデータを論文として出版した。さらに、平成29年から30年にかけて、難聴発症直後のマウスに、ステロイド(デキサメタゾン)を腹腔内投与して、炎症性サイトカインCcl12と、細胞接着因子Glycam1の発現をリアルタイムRT-PCRで検討した。難聴発症後12時間の蝸牛において、Ccl12の発現は、騒音暴露したマウスでは、暴露していないマウスに比べて、3.29±0.24(mean±S.D.)倍に増加していたが、難聴発症時にデキサメタゾンを投与することにより、投与した群では、投与しない群に比べて、0.60±0.05倍まで、抑制されていた。同様にGlycam1の発現は騒音暴露によって、2.30±0.09倍に増加したが、難聴発症時のデキサメタゾン投与によって、投与していない群の0.14±0.02倍まで抑制されていた。Ccl12は好酸球、単球、リンパ球の遊走を導く分子である。またGlycam1はL-selectinをリガンドとする細胞接着分子であるが、血管内皮に発現して、毛細血管からのリンパ球の遊走を誘導する。Glycam1は蝸牛において、蝸牛外側壁(らせん靭帯)などに発現すると報告されている。したがって、騒音暴露による難聴発症の際には、蝸牛外側壁などにおいて、免疫、炎症反応が惹起され、デキサメタゾン投与によりその様な反応が抑制されると考えられる。当研究の目的は、騒音に暴露することにより難聴を発症するマウスをモデルとして、難聴発症とステロイド投与の際の蝸牛局所での遺伝子発現を、次世代シークエンサーとDNAマイクロアレイの併用により明らかにすることである。当研究では以下の様に、当初の目的を達成することができている。平成28年度には、難聴発症後12、24、48時間後の遺伝子発現を、これらの方法で、網羅的、経時的に検討し、平成29年度に英文原著論文として、下記の知見を報告した。1)難聴発症後12時間の蝸牛では、マウス全遺伝子を対象とする解析で、"chemokine-signaling activity", “cytokine-cytokine receptor interaction", “cell adhesion molecules in the immune system"といった、炎症、免疫機能に関係する遺伝子パスウェイが変動した。2)デキサメタゾンを難聴発症直後に投与することにより、これらの遺伝子パスウェイはさらに変動した。3)また、難聴発症24時間経過後には、これらの炎症、免疫反応は検出されなかった。さらに、平成29年度には、以上の結果を発展させ、炎症、免疫機能に関係する、個々の遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCRアレイで確認した。平成30年度には平成29年度に得られた知見から、下記の内容を2報目の英文原著論文として出版した。1)難聴発症12時間後の蝸牛で、84種類の炎症、免疫関連遺伝子の発現を検討したところ、その31.0%(26遺伝子)は有意に変動していた。2)その際、デキサメタゾン投与を行わない条件では、ステロイドシグナリングに関係する遺伝子のほとんどは変動しなかった。3)しかし、デキサメタゾン腹腔内を行えば、Ccl12や、Glycam1といった炎症、免疫関連遺伝子の変動を抑えることができた。現在までの進捗状況の項で述べた、次世代シークエンサーと、DNAマイクロアレイでの実験では、難聴発症時の蝸牛で変動する遺伝子として、300種類以上の遺伝子が同定されている。平成30年度末の時点で、学会、論文などで未報告の生データを所持しているので、平成31年度には、これらのデータの解析をさらに進め、次の段階の研究計画の立案に向けた基礎データとする。また、我々の実験室での、音響暴露による難聴モデルマウスの実験系の精度をさらに高めるため、難聴発症実験と、聴性脳幹反応による聴力確認実験を反復する。たとえば、当研究では、難聴発症時のマウス蝸牛では炎症、免疫機能に関係する複数の遺伝子パスウェイが変動することがしめされたが、これまでに報告書に記したパスウェイ以外にも、“インターフェロン誘導遺伝子群"、“インフラマソームパスウェイ遺伝子群"といった遺伝子発現の生データを所持している。これらの、次世代シークエンサー、DNAマイクロアレイ、リアルタイムRT-PCRアレイの生データを解析し、今後、どの様な炎症、免疫遺伝子の発現を解析するべきか検討する。また、当研究の次世代シークエンサーや、DNAマイクロアレイによる解析では、蛋白質をコードする遺伝子以外にも、蛋白質をコードしないRNA転写産物(非コードRNA)の発現データも得られた。近年、非コードRNAも、炎症、免疫機能に関係すると報告されている。これらの解析をすすめ、難聴発症時の蝸牛では、非コードRNA群がどの様に変動するか解析する。平成28年度の交付申請書および前倒し請求の際の計画は以下の様なものであった。マウスを騒音に暴露し、難聴を発症させる。

騒音暴露直後にデキサメタゾンを全身投与し、0-12、12-24、48時間後に、内耳での遺伝子発現をRNA-seqおよびDNAマイクロアレイで検討する。平成28年度には騒音暴露後12、24、48時間での実験を実行し、以下の様な有意なデータを得た。1)騒音暴露のみ、デキサメタゾン投与後12、24、48後に蝸牛で発現量が変動する遺伝子群を330、490、262、410種類検出した。2)これらの遺伝子群の機能をパスウェイ解析したところ、騒音暴露に起因する難聴でも、発症時には炎症、免疫機能が変動すると示された。また、デキサメタゾン投与により、投与12時間後に炎症、免疫機能が制御される。3)さらに48時間経過した時点では、デキサメタゾン投与群で、コントロール群にくらべて、神経伝達機能に関わる遺伝子群の変動を認める。4)これらの分子機能に加えて、デキサメタゾン投与12および24時間を通じて変動する聴覚関連遺伝子を10種類同定した(Trpa1、Trpv1、Ngb、Serpina3n、Ret、Prph、Insm1、Ngfr、Birc5、Ccnb1)。これらの知見は急性感音難聴における病態と治療の理解に役立つものである。当研究の目的はRNA-seqとDNAマイクロアレイを用いて、急性感音難聴の病態と治療の動態的かつ網羅的なデータを打ち出すことである。平成28年度にはこの目的にそったデータを得ることができた。平成28年度には、騒音暴露によって、急性感音難聴を発症したマウス蝸牛において、RNA-seqおよびDNAマイクロアレイで遺伝子発現を網羅的に検討し、難聴発症時には炎症・免疫機能の遺伝子パスウェイが変動することを明らかにした。以上の結果を踏まえ、平成29年度には、当内容の論文(平成28年度研究実績に記載)を、耳科学の専門誌に出版した。平成29年度の実験では、難聴発症時の蝸牛における炎症・免疫機能の遺伝子の変動を、RT-PCRアレイを用いて検討した。C57BL/6マウス(雌6週齢)を120dBオクターブバンドノイズに暴露して、難聴を惹起し、C57BL/6系統での、難聴発症マウスの聴力データを確認した。騒音暴露前、12時間後、24時間後、14時間後のABR閾値は36.6±6.1 dB SPL、171.1±17.6、62.8±12.8dB SPL (各群8-9匹)であった。我々の研究室のCBA/J系統、BALB/C系統マウスの実験と同様に、発症12-24時間での、有意な一過性聴力閾値上昇と、発症14日での、永続的な聴力閾値上昇を確認した。遺伝子発現解析の対象としたのは、ケモカイン(22遺伝子)、インターロイキン(12遺伝子)、その他のサイトカイン(8遺伝子)、サイトカイン・ケモカインレセプター(14遺伝子)など84の炎症・免疫機能関連遺伝子であるが、そのうち31.0%(84遺伝子中26遺伝子)は、難聴発症後12時間の蝸牛で、発現量が2倍以上または1/2以下に、有意に変動していた(p<0.01、n=3)。うち9遺伝子では発現量の増加を認め、17遺伝子では発現量の減少を認めた。またこれらのうち16遺伝子はケモカインをコードする遺伝子であった。上記のRT-PCRアレイと、RNA-seqおよびDNAマイクロアレイのデータを解析したところ、3者の実験法で一致して発現が増加する遺伝子として、Ccl12、Ccl2、Ccl4、Ccl7、Cxcl1、Cxcl10、Ptgs2を同定した。
細菌感染死亡者からの解剖後の起炎菌同定に関する研究

無菌的に実験動物の血液、鼻孔内ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、左右肺切開面ぬぐい液を採取し、細菌培養を行った結果、無菌的な各試料の採取方法が確立できた。左右肺の組織切片を作成し、細菌の死後感染と生前の感染の選別を試みたところ、グラム陰性桿菌の肺への感染において、興味ある知見が得られた。ジェネテイックアナライザーを用いて横行結腸内容の細菌DNAの分析、肺炎における肺ぬぐい液についても同様の試みを行ったところ、一部の細菌感染では、起炎細菌の同定が可能であり、血液培養を行わなくとも、ジェネテイックアナライザーを有効に活用することによって敗血症においても真の起炎細菌の同定が可能になることが示唆された。病院内における長期入院患者はその終末期には様々な感染症に罹患し、その感染症やさらに進んで敗血症により死亡することがある。また最近の医療事故、医療過誤事例の中には過失が疑われる行為があった後さらに、MRSAのような多剤耐性菌の病院内感染を起こし死に至ったのではないかと疑われる例がある。それらの解剖症例における死後の起炎菌の同定による感染症の診断は、生体と同様に解剖時に採取した血液やその他の資料の培養を行うとともに、病理組織学的に細菌感染があることを証明し、その感染病巣を特定して行ってきた。また全身の詳細な病理組織学的検査によりその感染程度、敗血症の有無を判断し、最終的に感染症が直接の死因であるか否か特定してきた。しかしそれだけでは感染時期の特定が不可能であり、多剤耐性菌感染による死亡例のように種々の紛争が起こる可能性のある敗血症への対応としては不十分である。そこでまず研究計画に沿って、ラットを用いて肺炎感染症を作成し、死亡直後および一定時間恒温環境下に放置した動物を実験材料とした。各ラットよりできる限り無菌的に血液、鼻孔内ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、左右肺切開面ぬぐい液を採取し、細菌培養を行った。その結果、無菌的な各試料の採取方法は確立できた。しかしながら、培養した細菌に多様性が見られ、どれが敗血症あるいは死亡の原因となった細菌かの同定が容易でなかった。特に、死後経過時間が数時間を超えた実験動物では、死後感染ないしは常在菌の死後全身への拡散による修飾のため、検出された細菌の評価が難しかった。そこで左右肺においては組織切片を作成し、従来の染色に加え、各種細菌染色を追加し、細菌の死後感染と生前の感染の選別を試みたところ、グラム陰性桿菌の肺への感染において、興味ある知見が得られた。解剖時の試料には死後変化のために多彩な細菌の混入が避けられず、必ずその影響が加わっており、また解剖における試料採取では無菌的な試料の取扱いは難しく、どうしても他の細菌の混入が避けられない。そのため死因となった感染細菌の正確な同定は非常に困難であり、ほとんどの例で不成功に終わるかあるいは同定された細菌も死因の特定にあたっては参考程度にしか利用されないのが現状である。このため諸外国では敗血症が疑われる症例においても、法医解剖後は感染細菌の同定は最初から行わず、免疫染色等を用いた病理組織学的診断のみで診断しようとする試みが一般的となっている。しかしながら病理組織学的所見の評価は個人によって差があり、起炎菌の同定がなされていないなかでの死因判定では、感染時期の特定が不可能であり、多剤耐性菌感染による死亡例のように種々の紛争が起こる可能性のある敗血症への対応としては不十分と言わざるを得ない。そこで、解剖時の試料を用いて感染細菌の同定を行うための予備実験として、ジェネテイックアナライザーを用いて横行結腸内容の細菌DNAの分析を行い、細菌同定を行った。各死因、特に敗血症と他の死因の際の同定細菌の違いを見出そうと試みたが細菌感染症死亡例における起炎細菌の同定には至らなかった。肺炎における肺ぬぐい液についても同様の試みを行ったところ、一部の細菌感染では、起炎菌の同定が可能であり、血液培養を行わなくとも、ジェネテイックアナライザーを有効に活用することによって敗血症においても真の起炎菌の同定が可能になることが示唆された。研究計画に沿って、ラットを用いて肺炎感染症を作成し、死亡直後および一定時間恒温環境下に放置し、実験材料とした。そこで左右肺においては組織切片を作成し、各種細菌染色を追加し、細菌の死後感染と生前の感染の選別を試みたところ、グラム陰性桿菌の肺への感染において、興味ある知見が得られた。解剖時の試料を用いて感染細菌の同定を行うための予備実験として、ジェネテイックアナライザーを用いて横行結腸内容の細菌DNAの分析を行い、細菌同定を行った。肺炎における肺ぬぐい液についても同様の試みを行ったところ、一部の細菌感染では、起炎細菌の同定が可能であり、血液培養を行わなくとも、ジェネテイックアナライザーを有効に活用することによって敗血症においても真の起炎細菌の同定が可能になることが示唆された。

さらに法医解剖時の横行結腸内容を用いて16S rRNAメタゲノム解析を行ったところ、Phylum(門)レベルにおいて、全例で生体において検出される一般的な腸内細菌であるBacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteriaが主に検出された。また、これらが検出された割合は試料によって異なっていた。以上より、腸内細菌叢は症例の死亡時の状況を反映しており、感染が疑われる場合にはFamily、Genus、Speciesレベルでの検討を血液や肺についても行うことが有用と考えられた。無菌的に実験動物の血液、鼻孔内ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、左右肺切開面ぬぐい液を採取し、細菌培養を行った結果、無菌的な各試料の採取方法が確立できた。左右肺の組織切片を作成し、細菌の死後感染と生前の感染の選別を試みたところ、グラム陰性桿菌の肺への感染において、興味ある知見が得られた。ジェネテイックアナライザーを用いて横行結腸内容の細菌DNAの分析、肺炎における肺ぬぐい液についても同様の試みを行ったところ、一部の細菌感染では、起炎細菌の同定が可能であり、血液培養を行わなくとも、ジェネテイックアナライザーを有効に活用することによって敗血症においても真の起炎細菌の同定が可能になることが示唆された。死後の解剖時、皮膚面の無菌的切開法について検討し、無菌的開頭法、胸腔、腹腔の無菌的切開法を完成させ、心臓血、末梢血、肺、肝臓、腎臓やその他の臓器実質内液体成分の無菌的採取法を完成させるとともに、各採取資料からDNA分析を行い、細菌同定を行うと共に、各臓器の病理組織学的検査を行い、同定した起炎菌の果たす役割と敗血症の程度について検討し、死因について考察する事を目標としていたが、各体腔の無菌的な切開法の開発が思うようにできず、本当に無菌的か否かの判定に苦慮しているため、DNA解析の結果の解釈が完全にはできていない。法医学法医解剖後は感染細菌の同定と共に、免疫染色等を用いた病理組織学的診断を併用する必要がある。そこで問題となる病理組織学的所見の評価を起炎菌の同定と一緒に行うことにより、死因判定や感染時期の特定を可能にしたい。また、多剤耐性菌感染による死亡例のように種々の紛争が起こる可能性のある敗血症への対応として、死後に血液だけでなく感染臓器から直接無菌的に試料を採取する方法を確立すると共に、炎症性疾患による死亡患者からの死後における確実な起炎菌の同定を可能にし、病理組織学的所見と併せて正確な死因判定できるようにする。ラットを用いて肺炎感染症を作成し、死亡直後および一定時間恒温環境下に放置した動物を実験材料としたが、肺炎感染症から敗血症への進行過程が十分に把握できていない。その主たる原因は採血血液量の少なさや溶血により、血清CRPなどの感染関連因子の値の正確な測定ができなかったこと、同様の理由により、一定時間後の血中薬物濃度の測定ができなかったことにある。また、ポリグラフにより、脳波、血圧、呼吸、脈圧を測定し、実験動物の病態の変化を感染直後から敗血症完成時、その後一定時間(ショックによる死亡時まで)観察する計画を立てたが、実験動物としてラットを用いたため血圧、呼吸、脈圧等の軽微な変化を十分に捕らえることができず、体温変化等の間接的な所見をもって判断せざるを得なかった。学会発表や研究打ち合わせのための旅費を全く使用しなかったため。死後経過時間が数時間を超えた実験動物で行った、左右肺の組織
伝統中国における土地保有諸制度の社会構造史的研究

本研究は、具体的な目標として:1)資料収集・海外の研究者と討論を行うこと;2)更には、幾つかの詳細な事例研究に基づく社会構造史的な見通し、を示す論文をまとめること、この二点を掲げた。平成14年度分について、その概要を記す。先ず資料収集については、本年度はアメリカ合衆国スタンフォード大学Hoover Institutionにおいて、East Asian Collection特に、香港新界の民間文書資料を集積したJames Hayes Collection及び台湾の民間文書・植民地行政文書を集めた「台湾公私蔵古文書彙編」を中心にぐ調査・分析を行った。海外の研究者との討論については、特に年度内二度のアメリカ合衆国出張においてこれを行った。その際スタンフォード大学のRamon Myers教授・コロンビア大学Myron Cohen教授等と討論し、本研究計画及び上記「台湾公私蔵古文書彙編」に関して得た知見を報告した。結果、200304年に香港中文大学及びスタンフォード大学が主催する学会において、"Institutional change in property rights and its dynamism in late Qing China"(清末中国における財産的諸権利に関わる制度的変容及びその動態)についての報告者としての招待を得た。論文発表については、スタンフォードで分析した台湾関係資料の知見を組みこむことで当初の予定以上に射程の長い議論が可能となる(特定の土地について19世紀初頭から20世紀前半に至るまでの長期間にわたる保有・取引の記録を跡付け得る外、更には植民地化前後を通じた取引実務の変化が看取される)と考えられ、その背景たる香港・台湾における植民地法制及び社会変動の諸過程に関する比較研究を付け加える必要が生じている。このため、実際の公表は次年度に持ち越しとなっている。二年間の研究計画の一年目にあたる本年度は、資料収集と基礎的な分析を主たる課題としていた。資料収集については、中国・英国でこれを行うことができている。中国においては、吉林省長春市の満鉄資料館・吉林省档案館等を訪れる機会があり、本研究の主題である伝統中国的土地保有・取引秩序研究にとって最も重要な基礎資料群の一つである『中国農村慣行調査』作成に関与した旧南満州鉄道株式会社北支経済調査所の関連資料を閲覧することが出来た。英国においては、オクスフォード大学Rhodes Houseにおいて、香港関連の幾つかのPrivate Papersを閲覧している。基礎的な分析としては、東京大学法学部で担当する「東洋法制史」講義中の土地法部分の準備過程において、清代中期档案資料に見られる「管業」概念に関するいくつかの知見をまとめるに至った。このため、次年度に計画している論文執筆へ向けての作業の内の一部を、前倒しで行うこととなった。そしてこの問題について、オクスフォード大学David Faure博士及び香港王立アジア学会会長Patrick Hase博士と、日英両国において集中的な討論を行うことが出来た。また、これまでの研究で用いてきた「伝統中国」というカテゴリーについて批判的に再検討する必要を見出し、この語が含意する先秦清代に至る時代における体制の「型」の不変について、この「型」の成立時期及びこの語が使われるに至った近現代日本における中国史学界の論争過程の両面から、史学史的(historiographical)な検討を行った。その作業過程の一部は、『国家学界雑誌』115巻1・2号に寄せた「学界展望」に現れている。
国際比較による小児の情緒行動障害に関する生物学的・社会精神医学的研究

まず最初に、ラターの作成した質問紙を用いて、日本と中国の小児の情緒・行動障害の疫学的研究を行った。対象は、日本の東京近郊の10小学校、3中学校に通学中の小児で、小学生2,638名、中学生1,091名の結果が得られた。さらに東京の精神科専門病院を問題行動を主訴に受診した小学生65名、中学生176名も調査した。中国では、北京の6小学校に通学中の小児で、2,432名の結果が得られた。日本の6小学校の小児については、二年後に同じ方法で追跡調査を行った。問題行動をもつと判定された高得点児の頻度は、両親の評価では日本の小学生12.2%、中学生6.6%、病院受診児では58.5%、中学生39.8%、中国の小学生では7.0%であった。一方教師の評価では、日本の小学生3.9%、中学生2.7%、病院受診児では小学生90.8%、中学生29.8%、中国の小学生では8.3%であった。一般小学生で、両親と教師が共に問題行動ありと評価した児童は極めて少なく、日本で1.4%、中国で2.1%であった。追跡調査の結果では、両親による問題行動があると評価された112名のうち、二年後にも高得点を示した例は35名(31.3%)であり、教師の評価では46名のうち10名(21.7%)のみであった。高得点児の頻度は日本、中国ともに男児で多く、学業成績の悪い小児で多かった。中国では片親家庭での頻度が高いなど、家庭背景と問題行動とが強い関連を示したが、日本ではこのような傾向はみられなかった。日本、中国ともに一人っ子など兄弟数や出生順位との関連はみられなかった。次に、一般通学児の中から正常児、問題行動をもつ高得点児、さらに病院受診児の中から注意欠陥障害児についての脳波学的研究を行った。対象数は日本ではそれぞれ30名、27名、21名、中国では27名、39名、41名であった。両国とも、周波数ヒストグラムパターンには正常児と高得点児の間に差がみられず、注意欠陥障害児ではピ-クが左方へ偏位していた。各種脳波要素についても、正常児と高得点児の間には差がみられず、注意欠陥障害児では徐波諸要素が高く、α波とβ波の諸要素が低かった。以上より、両国とも問題行動の成因については、高得点児は社会心理学的要因が大きく、注意欠陥障害児では脳の成熟遅延などの生物学的要因が大きいと考えられた。小児の精緒障害および行動障害を早期に発見し,有効な対策を検討するために,国際共同研究を実施し,小児の情緒行動障害の背景にある生物学的要因,心理学的要因,社会学的要因を明らかにする.日本では東京近郊の8つの小学校に通学中の2,533名の児童を,中国では北京近郊の6つの小学校に通学中の2,432名の児童を,社会精神医学的研究の調査対象とした.方法は, Rutterの作成した両親用および教師用の小児行動評価表を用い,過去一年間の児童の家庭および学校での問題行動についてアンケート調査し,両国の結果を比較検討した. Rutterの評価基準により行動障害の疑われた児童の比率は,日本では3.0%,中国では8.3%であった.行動障害の内訳は,両国とも反社会的行動が85%前後と多く,神経症的行動は7%と低かった.両国とも行動障害の比率は女児に比し男児で高く,日本では5.6倍,中国では4.9倍であった.日本では1人っ子,低学年の児童で問題行動が多い傾向があるのに対して,中国では兄弟数が3人以上と多い児童,高学年の児童で問題行動が多い傾向があった.農業の家庭の児童,片親の家庭の児童で,問題行動の比率が高い傾向があることは両国で共通していた.さらに,中国では父親と母親の学歴が低いほど,また両親の子供に対する期待が低いほど,問題行動が多かった.教師の評価と両親の評価を比較すると,多くの項目で教師よりも両親の方がより問題としてとりあげることが多かった.両者の評価の相関は,行動面の項目で高く,情緒面の項目で低く,両親は行動面だけでなく,より情緒的側面も問題にしていた.因子分析の結果,攻撃性の因子は都会よりも山村の児童で,女児よりも男児で高く,多動性の因子は男児で高く,不安の因子は高学年より低学年の児童で,男児より女児で高く,言葉の問題は男児で高く,神経性習癌は高学年より低学年の児童で高かった.次に,情緒行動障害の生物学的研究として,情緒行動障害をもち東京および北京の児童精神科専門施設を受診した児童の脳波を検討した.視察的な判定の結果,正常,境界,異常の割合は,東京では61%, 21%, 18%,北京では87%, 12%, 1%と差がみられた.この差は,視察的判定基準の差異に基づく可能性が疑われた.そこで,両国の患児の脳波をコンピュータによる波形認識法を用いて定量化し,健常児の脳波と比較したところ,患児ではδ波出現量が多くδ, θ, α波の平均振幅が高い点で両国とも共通しており,患児では年齢に比して脳波の未成熟が推定された.まず最初に、ラターの作成した質問紙を用いて、日本と中国の小児の情緒・行動障害の疫学的研究を行った。

対象は、日本の東京近郊の10小学校、3中学校に通学中の小児で、小学生2,638名、中学生1,091名の結果が得られた。さらに東京の精神科専門病院を問題行動を主訴に受診した小学生65名、中学生176名も調査した。中国では、北京の6小学校に通学中の小児で、2,432名の結果が得られた。日本の6小学校の小児については、二年後に同じ方法で追跡調査を行った。問題行動をもつと判定された高得点児の頻度は、両親の評価では日本の小学生12.2%、中学生6.6%、病院受診児では58.5%、中学生39.8%、中国の小学生では7.0%であった。一方教師の評価では、日本の小学生3.9%、中学生2.7%、病院受診児では小学生90.8%、中学生29.8%、中国の小学生では8.3%であった。一般小学生で、両親と教師が共に問題行動ありと評価した児童は極めて少なく、日本で1.4%、中国で2.1%であった。追跡調査の結果では、両親による問題行動があると評価された112名のうち、二年後にも高得点を示した例は35名(31.3%)であり、教師の評価では46名のうち10名(21.7%)のみであった。高得点児の頻度は日本、中国ともに男児で多く、学業成績の悪い小児で多かった。中国では片親家庭での頻度が高いなど、家庭背景と問題行動とが強い関連を示したが、日本ではこのような傾向はみられなかった。日本、中国ともに一人っ子など兄弟数や出生順位との関連はみられなかった。次に、一般通学児の中から正常児、問題行動をもつ高得点児、さらに病院受診児の中から注意欠陥障害児についての脳波学的研究を行った。対象数は日本ではそれぞれ30名、27名、21名、中国では27名、39名、41名であった。両国とも、周波数ヒストグラムパターンには正常児と高得点児の間に差がみられず、注意欠陥障害児ではピ-クが左方へ偏位していた。各種脳波要素についても、正常児と高得点児の間には差がみられず、注意欠陥障害児では徐波諸要素が高く、α波とβ波の諸要素が低かった。以上より、両国とも問題行動の成因については、高得点児は社会心理学的要因が大きく、注意欠陥障害児では脳の成熟遅延などの生物学的要因が大きいと考えられた。
成長ホルモン遺伝子族の進化

ソマトラクチン(SL)はわれわれが真骨魚類で発見したホルモンである。本年度は爬虫類(クロコダイル)と四肢動物との分岐点に近い軟質類(チョウザメ)、および真骨魚類(ヨ-ロパヘダイとコイ)の脳下垂体を試料とした。クロコダイルとチョウザメの、シロサケSL抗体と反応する物質を認めたが、極微量のため構造決定に到らなかった。その過程でクロコダイル成長ホルモン(GH)を単離し全一次構造を決定した。本GHと既知の38種のGHを合わせて、分子系統樹を提案した。一方ヨーロッパヘダイのSLとGHの全構造を決定した。また、米国産コイから、アミノ酸配列の異なる2種類のSL(SLIとSLII)を単離し、SLIについて144残基、SLIIについて199残基のアミノ酸配列を決定した。両者の相同率は約50%であった。SLIの方が他の魚類のSLに対して高い相同性を示した。一方、SL遺伝子の発現はGHの発現調節因子であるPit-1によって調節されることを示した。円口類(ヤツメウナギ)は現存する最も原始的な脊椎動物であり、GH分子族の起源を知るうえで極めて重要な動物である。各種脊椎動物のGH、PRLおよびSL抗体を用いてヤツメウナギGH分子族を検索したが、ウェスタンブロッティングで陽性な物質は認められなかった。この検索の過程で脳下垂体抽出物中の優勢なタンパク質を単離し、構造を決定した。これは121残基からなる糖タンパク質サブユニットで構成されるホモダイマーであった。アミノ酸配列には、既知の脳下垂体ホルモンとの間に全くホモロジーが認められなかった。そこで、抗体を作成して産生細胞を同定したところ、成魚において主葉前部の細胞に由来することがわかった。しかし、幼生においては嗅覚器官-嗅球-鼻脳下垂体管-腺性脳下垂体系で産生されていることがわかった。そこで、鼻性脳下垂体因子(nasohypophysial factor,NHF)と命名した。
新生児気管支肺異形成症の発生要因としての好中球機能亢進に関する研究

1.末梢血中の好中球活性酸素産生能についてオプソニン化ザイモザン(OZ)、ホルボールミリステート(PMA),走光性ペプチド(FMLP)などの刺激にて化学発光法で計測したところ、正常新生児とBPD新生児の間に有意な差は認められなかった。2.気道吸引液中好中球の活性酸素産生能について上記と同様に調べた結果、コントロールに比しBPD児では活性酸素産生量の上昇がみられ、OZ刺激で1.42倍、PMA刺激で1.28倍、FMLP刺激で1.35倍の増加が認められた。3.抹消血中好中球の遊走能についてFMLP刺激によりボイデンチャンバー法を用いて測定したところ正常新生児とBPD新生児の間に有意な差は認められなかった。4.気道吸引液中好中球の遊走能はコントロールに比しBPD児で高まっており、約20%の増加がみられた。BPD児1の気道吸引液中好中球機能は亢進しており局所での好中球機能亢進がBPDの発生に大きく関わっていると考えられた。5.BPDの重症度を示す指標として吸入酸素濃度および平均気道内圧を算出し、気道吸引液中好中球の活性酸素産生能の増加の程度と比較検討したところ明かな相関関係はみられなかった。6.in vitroで気道吸引液中好中球をド-バミンとincubateし、各種刺激を加えた後活性酸素産生量を測定したところ、活性酸素産生は抑制された。このことからド-バミンを投与することによりBPDの発生を防ぐあるいは軽減できる可能性が示唆された。
概日リズムを調節する天然化合物の探索

概日リズムは睡眠覚醒リズムのほか、代謝疾患や中枢性疾患、がん、あるいは動物の季節繁殖制御にも深く関わることが知られるため、概日リズムを調節する化合物の創製は動物の生産性向上や疾患治療に応用できることが期待できる。平成29年度では、640の食品関連化合物・天然化合物からなるケミカルライブラリーについて、培養細胞を用いたスクリーニングにより概日リズムを示す時計遺伝子の発現変動に対する影響を評価し、効果の大きさ・作用メカニズムの新規性・食品としての利用可能性の観点から選ばれた化合物について濃度依存性を検討した。平成30年度では濃度依存性が確認できた化合物について、mPer2Luc knockinマウス由来の肺組織を用いて、組織レベルで観察される時計遺伝子の概日リズムに与える影響を検討した。その結果、有意な周期延長作用が確認できた化合物を一つ同定した。この効果は概日リズムの中枢部位として機能する脳の視交叉上核を含んだ脳スライスでも確認された。この化合物について、恒暗条件下で観察されるゼブラフィッシュ稚魚の行動の概日リズムに与える影響を検討したところ、ゼブラフィッシュ稚魚が示す行動リズムの周期長に対しても有意な周期延長作用を示すことが確認された。次に、1%および2%の当該化合物含有餌をマウスに各濃度1周間与えたところ、恒暗条件下で示す回転輪活動の概日リズムに対して、2%で有意な周期延長作用が確認された。以上より平成30年度では、食品関連化合物・天然化合物を用いたスクリーニングの中から、マウス行動レベルで概日リズムに影響を与える食品関連化合物・天然化合物を見出すことに成功した。平成30年度終了時点ですでにマウス回転輪を指標にした行動リズムに影響を与える化合物の同定に成功した。現在、マウス行動レベルで概日リズムへ影響を及ぼすことが確認された化合物については、12時間明期12時間暗期の明暗サイクル条件下において明暗環境下で行動リズムに与える影響を評価するとともに、12時間明期12時間暗期の明暗サイクル条件下において、注目化合物投与後に明暗サイクルを8時間後退させた際に新規サイクルへの同調に必要な日数を評価することで注目化合物の機能性を検討を進めているため。現在実施中である、同定された化合物の機能性を評価するための複数の行動実験について評価を完遂するとともに、今後は分子生物学、生化学的な方法で当該化合物の概日リズムへの作用機構の検討していく。概日リズムは睡眠覚醒リズムのほか、代謝疾患や中枢性疾患、がん、あるいは動物の季節繁殖制御にも深く関わることが知られる。そのため、概日リズムを調節する化合物の創製は動物の生産性向上や疾患治療への応用が期待できる。平成29年度では時計遺伝子Bmal1プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結させたヒト骨肉腫細胞株を用いて、食品関連化合物などから構成される化合物ライブラリのスクリーニングを実施し、得られた各化合物の発光リズムから周期・位相を算出した。1次スクリーニングを実施した結果、全640化合物のうち、6.5%で周期延長効果、2%で周期短縮効果、1.3%で位相後退効果がみられた。ここで効果がみられた化合物のうち、効果の大きさ・新規性・食品としての利用可能性の観点から選ばれた31化合物について効果の濃度依存性を検討した。その結果、その約半数で効果の濃度依存性を確認できた。当研究室で実施した既存薬ライブラリのスクリーニングにおけるヒット率5.6%を(Tamai et al., 2018, EMBO Mol Med)、今回の1次スクリーニングのヒット率と比べると、食品関連化合物等を含んだライブラリは概日リズム調節化合物の探索に有用である可能性が示唆された。1次スクリーニングで効果が大きく既報でマウスへの投与歴があるRiboflavin、Berberine Chloride、Ergosterolの3化合物について、ゼブラフィッシュを用いた行動スクリーニングに先行してmPer2Luc knockinノックインマウス肺を用いた組織リズムスクリーニングおよび回転輪を用いたマウス個体行動リズムスクリーニングを行ったものの、すべての化合物において明確な効果を観察することはできなかった。今後は作用の濃度依存性が確認できた残りの化合物について、これらのスクリーニングを順に実施していく。平成29年度に予定していた1次スクリーニングの実施を計画通り終了した。次にそこから得られたヒット化合物について、濃度依存性の検討を実施し、当初の計画通り終了した。他の研究プロジェクトとの兼ね合いから、予定していたゼブラフィッシュ稚魚を用いた行動スクリーニングに先行するかたちで、1次スクリーニングで効果が大きく既報でマウスへの投与歴があるRiboflavin、Berberine Chloride、Ergosterolの3化合物については、mPer2Luc knockinノックインマウス肺を用いた組織リズムアッセイとそれに続く回転輪を用いたマウス個体行動リズムアッセイを実施した。

平成30年度では濃度依存性が確認できた化合物について、mPer2Luc knockinマウス由来の肺組織を用いて、組織レベルで観察される時計遺伝子の概日リズムに与える影響を検討した。その結果、有意な周期延長作用が確認できた化合物を一つ同定した。この効果は概日リズムの中枢部位として機能する脳の視交叉上核を含んだ脳スライスでも確認された。この化合物について、恒暗条件下で観察されるゼブラフィッシュ稚魚の行動の概日リズムに与える影響を検討したところ、ゼブラフィッシュ稚魚が示す行動リズムの周期長に対しても有意な周期延長作用を示すことが確認された。次に、1%および2%の当該化合物含有餌をマウスに各濃度1周間与えたところ、恒暗条件下で示す回転輪活動の概日リズムに対して、2%で有意な周期延長作用が確認された。以上より平成30年度では、食品関連化合物・天然化合物を用いたスクリーニングの中から、マウス行動レベルで概日リズムに影響を与える食品関連化合物・天然化合物を見出すことに成功した。平成30年度終了時点ですでにマウス回転輪を指標にした行動リズムに影響を与える化合物の同定に成功した。現在、マウス行動レベルで概日リズムへ影響を及ぼすことが確認された化合物については、12時間明期12時間暗期の明暗サイクル条件下において明暗環境下で行動リズムに与える影響を評価するとともに、12時間明期12時間暗期の明暗サイクル条件下において、注目化合物投与後に明暗サイクルを8時間後退させた際に新規サイクルへの同調に必要な日数を評価することで注目化合物の機能性を検討を進めているため。今後は作用の濃度依存性が確認できた化合物について、ゼブラフィッシュを用いた行動スクリーニングの他、mPer2Luc knockinノックインマウス肺を用いた組織リズムスクリーニングおよび回転輪を用いたマウス個体行動リズムスクリーニングを順に実施していく。現在実施中である、同定された化合物の機能性を評価するための複数の行動実験について評価を完遂するとともに、今後は分子生物学、生化学的な方法で当該化合物の概日リズムへの作用機構の検討していく。当初予定していたよりも迅速にスクリーニングを終えることができ、その分の培養・スクリーニングプラスチック器具について拠出を抑えることができたため、次年度使用額が生じる結果となった。一方で翌年度に実施するゼブラフィッシュ稚魚を用いた行動スクリーニングにおいて当初よりスクリーニングのスループットを上げることが技術的に可能になったが、その運用に掛かる費用も増額せざるを得ない可能性が高いため、今年度生じた次年度使用額をここに充てることとする。当初予定していたよりもマウス行動レベルに及ぼす化合物の同定数が少なく、組織実験、ゼブラフィッシュ稚魚実験、マウス行動実験に対する拠出を抑えることができたため。次年度では同定した化合物についてその機能性を評価する複数の行動実験とその作用メカニズム解明のための分子生物学実験および生化学実験を実施するため、今年度生じた次年度使用額をここに充てることとする。