hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ライブセルイメージング技術を用いた一次精母細胞顕微授精技術の改善

一次精母細胞注入胚の低産仔率の原因の一つとして、第一減数分裂時の姉妹染色体の早期分離が示唆されている。ライブセルイメージング技術を用いて一次精母細胞顕微注入直後から卵子内の雌雄染色体の挙動について解析した結果、雌性染色体の分離が開始しているのに雄性染色体が凝集状態であるなど、雌雄両染色体の分裂スピードが一致していないことが明らかとなった。そこで両染色体分裂時期の同期化を図るため、チューブリンの重合促進剤であるタキソールを胚に作用させて雌性染色体の分離抑制を試みたが、効果は観察されなかった。また一次精母細胞顕微注入胚のヒストンアセチル化に関する免疫染色を行った結果、通常の受精では精子侵入後に卵子のヒストンアセチル化レベルは低下するところ、一次精母細胞顕微注入胚では高アセチルを維持している胚が多く観察された。ヒストンアセチル化酵素阻害剤を利用して一次精母細胞顕微注入胚のアセチル化を低下させたところ、産仔が得られた。去年度と本年度で一次精母細胞注入胚のライブセルイメージングとホールマウント標本により一次精母細胞注入胚の発生時に起こる異常現象の把握を行うことができた。本年度ではさらに細部まで把握するため、免疫染色法の精度と抗体の選抜を確実にしてきた。それと平行して一次精母細胞注入胚で観察される姉妹染色分体の早期分離の自然状態でのモデルとして、老齢マウス由来の卵子による観察も行っている。次年度は本年度までに得られた情報を元にメカニズムの解明および改善を試みる予定である。一次精母細胞注入胚のライブセルイメージング、免疫染色法による観察等により一次精母細胞注入胚の発生時に起こる異常現象の把握を行うことができた。本年度で得られた結果を元に次年度以降、メカニズムの解明および改善を試みる予定である。去年度と本年度の研究により一次精母細胞注入胚の注入直後からの卵子内での挙動とその化学修飾状態について、ライブセルイメージング技術、あるいは免疫染色法を利用しての細部までの理解が進んだ。次年度では一次精母細胞顕微注入胚での姉妹染色分体の状態を観察するために、姉妹染色分体の結合をつかさどるコヒーシンの動態についての解析も行う。これらの解析によって得られた情報により、卵子あるいは一次精母細胞に化学的修飾状態や顕微注入の時期を操作して改善条件を検索する。さらに、一次精母細胞顕微注入胚の解析で得られた技術をもとに老齢マウス由来の卵子の解析も現在平行して進めている。本研究と同時に老化卵子の低受精率の改善についても取り組んでいく予定である。本年度の研究により一次精母細胞注入胚の注入直後からの卵子内での挙動とその化学修飾状態についての大まかな理解が進んだ。次年度はそれをベースにして特に雌雄両染色体の分離時期の同期化およびヒストン脱アセチル化の正常化を最大の目的としてライブセルイメージング技術、免疫染色法を利用してより詳細な解析を行う。この解析によって得られた情報により、卵子あるいは一次精母細胞に化学的修飾状態や顕微注入の時期を操作して改善条件を検索する。また一次精母細胞顕微注入胚では姉妹染色分体の早期分離が多く観察されることから、一次精母細胞顕微注入胚での姉妹染色分体の結合をつかさどる分子(Rec8)の動態についての解析も行う予定である。次年度使用額:730,698円次年度使用額が生じた理由:研究が順調に進み、マウスや消耗品の使用が少なく済んだ為。本研究では共焦点レーザー顕微鏡やマイクロマニピュレーター装着倒立顕微鏡、ライブセルイメージングシステムなどの実験器具はすでに申請者が所属する研究室が所有しているもの、もしくは導入予定のものを使用する。
気孔の光合成依存的二酸化炭素応答メカニズムの解析

1.ツユクサ表皮のプロトンポンプのWestern blotting気孔開口を促進する葉肉シグナルは孔辺細胞膜プロトンポンプをリン酸化して活性化する可能性がある.ツユクサ表皮が葉肉組織と接触している場合に,孔辺細胞膜プロトンポンプがリン酸化されるかを解析するため,プロトンポンプのリン酸化レベルの解析を行うことにした.ツユクサの剥離表皮を集め,プロトンポンプのWestern blottingを試した.名古屋大学の木下研究室では,孔辺細胞プロトプラストを用いたプロトンポンプのWestern blottingが盛んに行われている(e.g. Hayashi et al., PCP,2010)この手法を参考にして,ツユクサのプロトンポンプのWestern blottingを行うことにした.ツユクサには,丁寧に表皮を剥離すると,剥離表皮に葉肉組織が混入しないという利点がある.したがって,ツユクサの場合には,剥離表皮でWestern blottingを行うことで,孔辺細胞膜プロトンポンプのリン酸化レベルを解析できると期待される.Western blottingを行うことで,ツユクサの細胞膜プロトンポンプを検出できるようになった.2.葉肉アポプラストシグナルの分子サイズの推定ツユクサの剥離表皮と葉肉組織の間に,透析膜を挟み,気孔の応答を観察した.透過可能な分子の分子量の上限が,100500の範囲にある透析膜を挟んだ場合には,気孔開口は抑制されなかった.一方,気孔閉鎖は抑制され,閉鎖速度が遅くなった.したがって,気孔開口を促進する葉肉シグナルの分子量は100よりも小さく,気孔閉鎖を促進する葉肉シグナルの分子量の範囲は100500であると推定された.この研究結果から,葉肉シグナルの同定を行う上で,葉肉シグナルの候補物質を大幅に絞り込こめるようになると期待される.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。私が修士課程在籍時に行った研究から,葉肉組織から放出される気孔開度調節物質(葉肉シグナル)はアポプラストに存在することが明らかになっている.平成24年度は葉肉シグナル同定にむけて,以下2点のアポプラスト液成分解析手法の検討を行った.1.純水中で表皮を洗って採取した表皮アポプラスト液から葉肉シグナルを絞り込む手法葉肉シグナルは葉肉組織から表皮に移動して孔辺細胞に作用する物質であるため,表皮アポプラストに含まれるはずである.そこで,表皮を純水中で洗い,表皮アポプラスト液を溶出させる手法を試した.溶出させたアポプラスト液を濃縮してからCE-MSを使用して代謝産物解析を行ったところ,リンゴ酸,クエン酸,コハク酸,乳酸が相対的に多く含まれることが分かった.同様の手法を用いて表皮アポプラスト液を調製して植物ホルモン解析を行ったが,ホルモン濃度が検出限界以下であり解析できなかった.表皮を純水中で洗う際に,アポプラスト液が十分に溶出していない可能性がある.2.葉片の表皮と剥離表皮の成分の含有量を比較して葉肉シグナルを絞り込む手法葉肉シグナルは葉肉組織から表皮に供給される物質であるため,「剥離表皮」と「葉片の表皮」で含有量を比較すると,葉片の表皮に高濃度で含まれるはずである.気孔開口の条件である「低CO_2処理・赤色光照射」を行った後,それぞれの試料から表皮を採取し,破砕した表皮の代謝産物をCE-MSで解析した.葉片の表皮からは,剥離表皮よりもリンゴ酸,クエン酸,コハク酸,cis-アコニット酸が高濃度で検出された.したがって,これらの物質が気孔開口を誘導する葉肉シグナルの候補物質であることが示唆された.破砕した表皮の成分を分析する手法を用いれば,試料中の植物ホルモン濃度を溶出させたアポプラスト液よりも濃くすることが可能である.したがって,植物ホルモン解析等も可能な汎用性の高いアポプラスト解析手法であると期待している.●CAM植物の気孔は,夜間に開口し,昼間に閉鎖するといった, C3植物とは異なる特徴的な気孔開閉の日周性をとる. CAM植物でも葉肉組織による気孔開閉制御があるかを検討するため,コダカラベンケイソウ(Kalanchoedaigremontiana)を用いた解析に着手した.明期の背軸側表皮を暗期の葉肉組織に移植,もしくは,暗期の背軸側表皮を明期の葉肉組織に移植することで,孔辺細胞にある概日リズムと葉肉組織のどちらが気孔開閉に対して強い制御を行っているかを検討した.交換移植の結果から,葉肉組織による気孔開閉制御が,孔辺細胞の概日リズムによる制御に勝ることが示唆された.●葉肉シグナルの同定にむけて研究を行う過程で,マルバツユクサ(Commelina bengbalensis)も実験材料として用いた.マルバツユクサは挿し木で容易に増やせるため,遺伝的背景が同一の個体を大量に安定供給できるといった利点がある.マルバツユクサの気孔のCO_2応答を解析したところ,赤色光照射時の気孔開口速度には匹敵しないものの,暗所でも,低CO_2で葉片の気孔は大きく開口し,高CO_2で速やかに閉鎖することが観察された.剥離表皮の気孔も,暗所でCO_2濃度を変化させると開閉したが,開閉の速度は葉片のものよりも遅かった.したがって, CO_2濃度に依存した気孔開閉には光に依存しない経路もあり,葉肉組織は光に依存しない気孔開閉も誘導することが示唆された.

●24穴シャーレが入れられる大きさの,ガス組成を制御可能なチェンバーと,このチェンバー全体に光照射を行えるLED光源を作製した.これらを用いることで,一度に大量のサンプルにCO_2濃度制御下で光照射を行えるようになった.1.ツユクサ表皮のプロトンポンプのWestern blotting気孔開口を促進する葉肉シグナルは孔辺細胞膜プロトンポンプをリン酸化して活性化する可能性がある.ツユクサ表皮が葉肉組織と接触している場合に,孔辺細胞膜プロトンポンプがリン酸化されるかを解析するため,プロトンポンプのリン酸化レベルの解析を行うことにした.ツユクサの剥離表皮を集め,プロトンポンプのWestern blottingを試した.名古屋大学の木下研究室では,孔辺細胞プロトプラストを用いたプロトンポンプのWestern blottingが盛んに行われている(e.g. Hayashi et al., PCP,2010)この手法を参考にして,ツユクサのプロトンポンプのWestern blottingを行うことにした.ツユクサには,丁寧に表皮を剥離すると,剥離表皮に葉肉組織が混入しないという利点がある.したがって,ツユクサの場合には,剥離表皮でWestern blottingを行うことで,孔辺細胞膜プロトンポンプのリン酸化レベルを解析できると期待される.Western blottingを行うことで,ツユクサの細胞膜プロトンポンプを検出できるようになった.2.葉肉アポプラストシグナルの分子サイズの推定ツユクサの剥離表皮と葉肉組織の間に,透析膜を挟み,気孔の応答を観察した.透過可能な分子の分子量の上限が,100500の範囲にある透析膜を挟んだ場合には,気孔開口は抑制されなかった.一方,気孔閉鎖は抑制され,閉鎖速度が遅くなった.したがって,気孔開口を促進する葉肉シグナルの分子量は100よりも小さく,気孔閉鎖を促進する葉肉シグナルの分子量の範囲は100500であると推定された.この研究結果から,葉肉シグナルの同定を行う上で,葉肉シグナルの候補物質を大幅に絞り込こめるようになると期待される.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。CE-MSを用いたアポプラスト液成分解析に着手し,解析手法の検討とCE-MS操作の習得に多くの時間を費やしたが,いまだに解析手法を確立できていない.葉肉シグナルを含むアポプラスト液を大量に採取するための手法として,葉肉組織や単離した葉肉細胞に緩衝液中で光合成を行わせた後,葉肉シグナルを含む緩衝液を得ることを研究計画に書いていた.しかしながら,採取した緩衝液を剥離表皮に処理することを試したが,気孔開度の変化を引き起こす効果がなく失敗に終わっている.CE-MSを用いた代謝産物の網羅的解析を行えるようになったが,葉肉シグナルの候補を絞り込めたとはいえないため,研究計画の練り直しが必要である.ツユクサ(Commelina communis)の葉肉アポプラスト液を,複数の手法を用いて採取した.しかしながら,採取したアポプラスト液をツユクサ剥離表皮に処理しても気孔開口が誘導されなかったため,採取方法の再検討が必要である.シロイヌナズナのT-DNA挿入変異体を複数購入して気孔のCO_2応答を解析することも行ったが,野生型と異なるCO_2応答性を示さず,葉肉シグナルの候補が得られていない.
マルチスケール・フィジィックスの概念を導入した衝撃解析による砂防構造の性能照査

昨今の異常気象による集中豪雨の発生頻度の増加とともに土石流災害の危険性は増大しているにも関わらず,災害予防的な予算は削減傾向にある.本研究では,砂防構造物の耐衝撃性能を正確に評価し,ムダのない合理的な設計法の確立に寄与する解析手法を提示することを目的としたものである.そのため,従来の設計法の問題点(土石流荷重の適切なモデル化に関する問題,構造物と土石流の相互作用に甚つく動的応答特性が反映されていない点)を踏まえ,現実に忠実なモデル化に基づく数値解析を行い,砂防構造物の安全性照査法の精度を飛躍的に向上することを目指したものである.具体的には,本研究の成果として以下の内容を得た.1)粒状体として理想化可能な土石流と構造物の動的応答を統一的にモデル化・解析するためのべ一スとなる「粒子法」を固体に適用した衝繋応答解析プログラムを完成させ,RCはりモデルの衝撃応答シミュレーションを実施した.その結果,RCはりの曲げやせん断破壊を「粒子法」を用いて良好に再現できることを確認した.2)2次元粒子法による弾性衝撃応答解析により,固体の動的応答における自由表面境界の取り扱いと解析精度の関係を明らかにした.さらに,弾塑性応答解析を試みて塑性の取り扱いに関する収束性・精度上の問題点を明確にした.3)実構造である「鋼製枠砂防えん堤」の衝撃応答解析を例題として3次元粒子法を適用し,本研究の目的である土石流と砂防構造の一体解析が可能であることを確認した.これらの成果をもとに,土石流の砂防構造物への衝突を再現した耐衝撃性能照査シミュレーションソフトの開発を行う予定である.昨今の異常気象による集中豪雨の発生頻度の増加とともに土石流災害の危険性は増大しているにも関わらず,災害予防的な予算は削減傾向にある.本研究では,砂防構造物の耐衝撃性能を正確に評価し,ムダのない合理的な設計法の確立に寄与する解析手法を提示することを目的としたものである.そのため,従来の設計法の問題点(土石流荷重の適切なモデル化に関する問題,構造物と土石流の相互作用に甚つく動的応答特性が反映されていない点)を踏まえ,現実に忠実なモデル化に基づく数値解析を行い,砂防構造物の安全性照査法の精度を飛躍的に向上することを目指したものである.具体的には,本研究の成果として以下の内容を得た.1)粒状体として理想化可能な土石流と構造物の動的応答を統一的にモデル化・解析するためのべ一スとなる「粒子法」を固体に適用した衝繋応答解析プログラムを完成させ,RCはりモデルの衝撃応答シミュレーションを実施した.その結果,RCはりの曲げやせん断破壊を「粒子法」を用いて良好に再現できることを確認した.2)2次元粒子法による弾性衝撃応答解析により,固体の動的応答における自由表面境界の取り扱いと解析精度の関係を明らかにした.さらに,弾塑性応答解析を試みて塑性の取り扱いに関する収束性・精度上の問題点を明確にした.3)実構造である「鋼製枠砂防えん堤」の衝撃応答解析を例題として3次元粒子法を適用し,本研究の目的である土石流と砂防構造の一体解析が可能であることを確認した.これらの成果をもとに,土石流の砂防構造物への衝突を再現した耐衝撃性能照査シミュレーションソフトの開発を行う予定である.昨今の異常気象による集中豪雨の発生頻度の増加とともに土石流災害の危険性は高まっているにも関わらず,災害予防的な予算は削減されつつある。本研究では,砂防構造物の耐衝撃性能を正確に評価し,ムダのない合理的な設計法の確立に寄与することを目的としたもので,従来の設計法の問題点(土石流荷重の適切なモデル化に関する問題,構造物と土石流の相互作用に基づく動的応答特性が反映されていない点)を,現実に忠実なモデル化を試みた数値解析によって克服し,砂防構造物の安全性照査法の精度を飛躍的に向上することを目指している。具体的には,平成17年度において以下の成果を得た.1)粒状体として理想化可能な土石流と構造物の動的応答を統一的にモデル化・解析するためのベースとなる手法として,「粒子法」を固体に適用した衝撃応答解析プログラム(2次元・3次元)を完成させた.2)2次元粒子法による弾性衝撃応答解析により,固体の動的応答における自由表面境界の取り扱いと解析精度の関係を明らかにした.さらに,弾塑性応答解析を試みて塑性の取り扱いに関する収束性・精度上の問題点を明確にした.3)実構造である「鋼製枠砂防えん堤」の衝撃応答解析を例題として3次元粒子法を適用し,本研究の目的である土石流と砂防構造の一体解析が可能であることを確認した.現時点では,巨礫単体の衝突を想定しただけのものであるが,平成18年度に土粒子の力学特性を持たせた「粒子」モデルを考案し,土石流の衝突を考慮した砂防構造物の衝撃解析へと拡張することを予定している.昨今の異常気象による集中豪雨の発生頻度の増加とともに土石流災害の危険性は増大しているにも関わらず,災害予防的な予算は削減傾向にある.本研究では,砂防構造物の耐衝撃性能を正確に評価し,ムダのない合理的な設計法の確立に寄与する解析手法を提示することを目的としたものである.

そのため,従来の設計法の問題点(土石流荷重の適切なモデル化に関する問題,構造物と土石流の相互作用に基づく動的応答特性が反映されていない点)を踏まえ,現実に忠実なモデル化に基づく数値解析を行い,砂防構造物の安全性照査法の精度を飛躍的に向上することを目指したものである.具体的には,平成18年度の研究成果として以下の内容を得た.1)粒状体として理想化可能な土石流と構造物の動的応答を統一的にモデル化・解析するためのベースとなる「粒子法」を固体に適用した衝撃応答解析プログラムを完成させ,RCはりモデルの衝撃応答シミュレーションを実施した.その結果,RCはりの曲げやせん断破壊を「粒子法」を用いて良好に再現できることを確認した.2)「粒子法」を用いて固体の動的応答解析を行う場合,自由表面の適切なモデル化が良好な解析精度を得るためには必要であることを確認した上で,コンクリート材料を対象とした弾塑性応答解析手法を完成させた.3)実構造である「鋼製枠砂防えん堤」の衝撃応答シミュレーションを行い,3次元粒子法ベースに土石流と砂防構造の一体解析が可能であることを確認した.これらの成果をもとに,平成19年度中に土石流の砂防構造物への衝突を再現した耐衝撃性能照査シミュレーションを実施予定としている
非線形発展方程式系に現れるパターンダイナミクスと相互作用について

当研究期間内の成果を順にあげると,まず第1に,1次元フロント進行波解のダイナミクスに関して,その分岐構造を完全に決定するとともに,空間的に非一様性が入った場合の挙動を力学系的視点から整頓できたことをあげることができる.これにより,フロント進行波解が障壁に対して反射したり通り抜けたりする現象が,不安定多様体のどの側を解軌道が通るかという問題に帰着され,力学系的観点から明快に説明されることとなった.これらの結果に基づき,複数のフロント解の相互作用も解析できた.一般にパルス解の挙動を解析することは困難なことが多いが,2つのフロント解を組み合わせて安定パルス解を構成し,2つのフロント解の相互作用によるダイナミクスとして解析が可能となりつつある.こうした方向の研究は今後の進展が期待される.次に2次元有界領域上におけるスパイク解の挙動に関しては,その取り扱いに関して一般的な枠組みを与えるとともに,応用例としてGierer-Meinhardtモデル,およびその簡易版であるshadow systemに適用し,これまで得られていた結果をすべて包括することができた.具体的には,領域の境界上にあるスパイク解が境界の曲率にしたがって運動し,結果として曲率極大の位置に向かって進むことをダイナミクスの観点から証明した.また曲率極大の点の近傍において,その点を挟む格好の,2つのピークを持った安定スパイク解が存在することも示すことができた.これはこれまで得られていなかった新しい形の解である.こうして単独のスパイ解,および複数のピークを持つスパイク解の運動に関する一般的枠組みを構築できたことが大きな成果の一つしてあげることができる.但し,この理論は2次元空間に限定されているため,今後はその一般次元空間への拡張が求められ,次年度以降の新しい研究計画に引き継ぐ予定である.最後に,以上の結果を2次元反応拡散方程式系の界面ダイナミクスに適用することは当初からの目標の一つであったが,当研究期間内に完成することができなかったことは反省すべき点である.ただ大きな問題の一つとなっていた,界面ダイナミクスを数値シミュレーションするためのプログラムは完成し,特にスパイラル運動の中心部分の運動を視覚化する作業を終了することができた.既に形式的議論による理論的考察がこの研究期間内で行われているので,理論とシミュレーション結果との対応を明らかにすることが当面の残された課題である.当研究期間開始当初は,こうした問題を解析するための漠然とした方向性が見えていただけであったが,当研究期間内に,この問題の難しさの原因や解決に向けた明快な方向性,さまざまな思考実験を行うために必要な道具等がすべて整ったことは一つの成果といえ,次年度以降のさらなる進展が期待される.当研究期間内の成果を順にあげると,まず第1に,1次元フロント進行波解のダイナミクスに関して,その分岐構造を完全に決定するとともに,空間的に非一様性が入った場合の挙動を力学系的視点から整頓できたことをあげることができる.これにより,フロント進行波解が障壁に対して反射したり通り抜けたりする現象が,不安定多様体のどの側を解軌道が通るかという問題に帰着され,力学系的観点から明快に説明されることとなった.これらの結果に基づき,複数のフロント解の相互作用も解析できた.一般にパルス解の挙動を解析することは困難なことが多いが,2つのフロント解を組み合わせて安定パルス解を構成し,2つのフロント解の相互作用によるダイナミクスとして解析が可能となりつつある.こうした方向の研究は今後の進展が期待される.次に2次元有界領域上におけるスパイク解の挙動に関しては,その取り扱いに関して一般的な枠組みを与えるとともに,応用例としてGierer-Meinhardtモデル,およびその簡易版であるshadow systemに適用し,これまで得られていた結果をすべて包括することができた.具体的には,領域の境界上にあるスパイク解が境界の曲率にしたがって運動し,結果として曲率極大の位置に向かって進むことをダイナミクスの観点から証明した.また曲率極大の点の近傍において,その点を挟む格好の,2つのピークを持った安定スパイク解が存在することも示すことができた.これはこれまで得られていなかった新しい形の解である.こうして単独のスパイ解,および複数のピークを持つスパイク解の運動に関する一般的枠組みを構築できたことが大きな成果の一つしてあげることができる.但し,この理論は2次元空間に限定されているため,今後はその一般次元空間への拡張が求められ,次年度以降の新しい研究計画に引き継ぐ予定である.最後に,以上の結果を2次元反応拡散方程式系の界面ダイナミクスに適用することは当初からの目標の一つであったが,当研究期間内に完成することができなかったことは反省すべき点である.ただ大きな問題の一つとなっていた,界面ダイナミクスを数値シミュレーションするためのプログラムは完成し,特にスパイラル運動の中心部分の運動を視覚化する作業を終了することができた.既に形式的議論による理論的考察がこの研究期間内で行われているので,理論とシミュレーション結果との対応を明らかにすることが当面の残された課題である.当研究期間開始当初は,こうした問題を解析するための漠然とした方向性が見えていただけであったが,当研究期間内に,この問題の難しさの原因や解決に向けた明快な方向性,さまざまな思考実験を行うために必要な道具等がすべて整ったことは一つの成果といえ,次年度以降のさらなる進展が期待される.2次元領域における鎬状パターンの相互作用を解析するために,今年度は無限に長い帯状領域を考え,その無限の両端で異なる定常状態をとる解を考察した.こうした状況に対して,扱う系が何らかの意味でエネルギーを有する場合は既にいくつかの結果が知られている.

しかし生物モデルや化学反応系などではエネルギー,またはそれに類するものさえ存在しない場合が一般的であり,エネルギー構造を持たない系に対する解析手法を確立することは応用上重要な問題の一つである.そのための足がかりとして,今年度はチューリング不安定の近傍を考察し,分岐理論を用いて解の構成を試みた.ここでいうチューリング不安定性とは,安定定数平衡点をx-軸全体で考えたとき,拡散まで込めた線形固有値問題のフーリエ変換がある正のフーリエモードに対して実部正の固有値を持つ場合をいう.我々は更にその特殊な場合として,最大固有値が実軸に接する場合を考察することにした.これにより安定定数平衡点から分岐した平面解が2次元解として安定になり得ること,また符合の異なる2種類の平面解を構成できることなどを示すことが出来た.こうして構成した2つの異なる安定平面解を2次元帯状領域の無限の両端で満たすような解を,分岐理論を用いて構成することが出来た.現段階では近似解のレベルであるが,そうした複数の平面解を連結する解のダイナミクスを本質的に支配する方程式として,ある種の4階の放物型方程式を導出することが出来た.それは弾性体における座屈を記述した方程式と類似のものであり,平面解同士のつなぎ目部分に現れる特徴的な空間パターンの由来を理論的に説明できたことになる.また連結する平面解の安定性に強さの違いがある場合は,ある方向に一定速度で進行する,いわゆる進行波解が出現するが,帰着された4階の方程式の解析により,進行波解の進行速度がある種のポテンシャルエネルギーの差により決定されることが分かった.今年度の当初目的の1つであった反応拡散方程式系のフロント解に対し,そのダイナミクスを詳細に調べるためのさまざまな解析結果を得ることができた.これに関しては,これまで著者により,フロント進行波解やパルス進行波解及びそれらの相互作用を調べるための一般論が開発されていたが,実際に適用するためには固有関数の具体形などの情報を解析的に得ることが必要である.しかしそれは殆どのモデル方程式系に対して現在の解析手法を持ってしては不可能であり,数値シミュレーションの併用が必要不可欠であった.それに対して全ての必要情報を解析的に得ることのできる例を与えることにより,数値シミュレーションだけでは分からない,より詳細な運動を調べることを可能となった.具体的には特殊な非線形項を持つモデル方程式系を考えることにより,フロント解とその分岐構造を完全な形で得ることができた.また分岐点における固有関数や共役作用素の固有関数なども特異摂動理論を用いることにより高い精度の近似まで具体的に構成した.こうした情報を用いることにより,まずフロント解及びそれらの相互作用を記述する運動方程式を陽に書き下すことができた.つぎにそれらの応用として,不均一媒質中のフロントの運動を考察した.ここではより具体的は運動の解析を行うために,最も単純な階段型の不均一性を考察したが,結果として,フロントの速度を速める効果しか持たない不均一性を入れたにもかかわらず,フロントが不均一性に反射して逆走する可能性があることが理論的に示された.
溶射を利用したすみ肉溶接部の疲労強度改善の試み

橋梁などの鋼構造物には十字、T字、面外ガセットなどのすみ肉溶接継手が多用されているが、疲労損傷の多くはこのすみ肉溶接の止端から生じている。特に面外ガセット継手は疲労強度が低く、疲労損傷が生じやすいとされている。このような疲労損傷を防止するための有効な方法の一つとして、溶接止端に何らかの処置を施すことにより応力集中を緩和し疲労強度を向上させることが考えられる。その方法としては、グラインダーやTIGなどで溶接止端を仕上げて曲率半径ρを大きくすることにより止端形状を滑らかにするのが一般的である。また、曲率半径ρではなく、既存の溶接止端に付加溶接を行い、フランク角θを大きくすることにより止端形状を滑らかにして応力集中を緩和する方法もある。本研究では、このような従来の方法ではなく、既存の溶接止端に異種金属材料を溶射被覆して溶接止端の応力集中を軽減することによる疲労強度改善の可能性について、面外ガセットすみ肉溶接継手(As-Weld)とその溶接止端に4種類(Zn、Ni-Al、Cu-Al、Ti)の溶射を施したモデル試験体を用いた疲労試験と3次元有限要素応力解析を行うことにより検討し、以下の結果を得た。(1)4種類の溶射試験体の疲労強度にほとんど差はなかった。また、それらはAs-Weld試験体と同程度であった。(2)このように溶射による疲労強度の改善が認められなかった原因は、溶射部のヤング率が低く、早い段階で溶射部に亀裂が発生して溶射による応力伝達機能が失われたためと考えられる。(3)溶射により疲労強度を改善するためには、溶射の厚さを3mm程度以上とし、またそのヤング率を鋼の0.5以上とする必要がある。鋼橋の中で疲労強度上の弱点である面外ガセット溶接継手を対象とし、その溶接止端を異種金属で溶射被覆することによる疲労強度の向上効果についてモデル試験体を用いた疲労試験と有限要素応力解析を行うことにより検討する。疲労試験には、溶接のままの面外ガセットすみ肉溶接継手試験体、その溶接止端をガスフレーム溶射で亜鉛被覆した試験体、プラズマ溶射でNi-Al、Cu-AlあるいはTiを溶射被覆した試験体の計5種類の試験体を用いる。ここで得られた結果は以下のようである。(1)疲労試験を行った結果、いずれの溶射試験体においても疲労強度にさほど違いが認められず、As-Weld試験体とほぼ同じであった。すなわち、溶射による疲労強度改善効果が認めらなかった。(2)溶射試験体の疲労破壊の起点としては溶接止端と溶射止端が考えられたが、すべての試験体で溶接止端から疲労破壊に至った。(3)有限要素応力解析を行った結果、ガスフレーム溶射試験体の溶射部のヤング率が鋼材の0.15程度以下、プラズマ溶射試験体の溶射部のヤング率が鋼材の0.4程度以下であれば、As-Weld試験体の溶接止端の疲労亀裂発生よりも早い段階で溶射部から疲労亀裂が発生する可能性が高い。(4)溶射による疲労強度改善効果が認められなかった原因は、溶射部のヤング率が空孔混入などにより溶射用金属単体よりも大幅に低下し、溶射部から早い段階で疲労亀裂が発生して溶射部の応力伝達機能が失われ、As-Weld試験体以上の高い応力集中が溶接止端に生じたことにあると考えられる。(5)溶射により疲労強度を向上させるには、溶射部のヤング率を高くし、溶射層を厚くする必要がある。

鋼橋に用いられる継手の中で疲労強度上の弱点とされている面外ガセット溶接継手を対象とし、その溶接止端を異種金属で溶射被覆することによる疲労強度の向上効果についてモデル試験体を用いた疲労試験と有限要素応力解析を行うことにより検討する。疲労試験には、溶接のままの面外ガセットすみ肉溶接継手試験体、その溶接止端をガスフレーム溶射で亜鉛被覆した試験体、プラズマ溶射でNi-Al、Cu-AlあるいはTiを溶射被覆した試験体の計5種類の試験体を用いる。ここで得られた主な結果は以下の通りである。(1)疲労試験を行った結果、いずれの溶射試験体においても疲労強度にさほど違いが認められず、As-Weld試験体とほぼ同じであった。すなわち、溶射による疲労強度改善効果が認めらなかった。(2)溶射試験体の疲労破壊の起点としては溶接止端近傍と溶射止端が考えられたが、すべての試験体で溶接止端近傍から疲労破壊に至った。(3)有限要素応力解析より、ガスフレーム溶射試験体の溶射部のヤング率が鋼材の0.15程度以下、プラズマ溶射試験体の溶射部のヤング率が鋼材の0.4程度以下であれば、As-Weld試験体の溶接止端の疲労亀裂発生よりも早い段階で溶射部から疲労亀裂が発生する可能性が高いという結果が得られた。(4)溶射による疲労強度改善効果が認められなかった原因は、溶射部のヤング率が空孔混入などにより溶射用金属単体よりも大幅に低下し、溶射部から早い段階で疲労亀裂が発生して溶射部の応力伝達機能が失われ、As-Weld試験体以上の高い応力集中が溶接止端に生じたことにあると考えられる。(5)溶射により疲労強度を向上させるには、溶射部のヤング率を高くし、溶射層を厚くする必要がある。
ショウジョウバエの匂い記憶情報処理の時空間ダイナミズムの解明

ショウジョウバエの匂い罰/報酬連合学習による2時間記憶形成において、3次嗅覚神経であるキノコ体KCsは中心的な役割を担っている。KCsのγ細胞群はCREでラベルされる細胞(CRE-p)と残りの細胞(CRE-n)に2分され、罰記憶の獲得、維持(固定)、想起のすべてのステージにおいて必要であり、報酬記憶ではCRE-nが必要である。本年度は特に記憶の維持に注目し、この回路機能にドーパミン作動性神経群が必要であるかどうかを調べた。PPL1ドーパミン作動性神経群は罰記憶の強化子として働きPAMドーパミン作動性神経群は報酬記憶の強化子として働くことが知られている。そこで、記憶の維持のステージにおいてCRE-pあるいはCRE-nと共にこれらのドーパミン作動性神経群の出力を抑えてその効果を解析した。その結果、CRE-pとPPL1ドーパミン作動性神経群の出力を同時に抑えた時には、罰記憶は阻害されず、またCRE-nとPAMドーパミン作動性神経群の出力を同時に抑えた時には、報酬記憶は阻害されなかった。KCsとドーパミン作動性神経群の逆の組み合わせではこのような補償は見られなかった。以上のことからCRE-pはPPL1ドーパミン作動性神経群を抑制することにより罰記憶を維持し、CRE-nはPAMドーパミン作動性神経群を抑制することにより報酬記憶を維持していると結論づけた。行動実験をより定量的に行うために、Janelia Campusの麻生博士の作製したアリーナを応用し、ドーパミン神経群を青色感受性のChronosで、匂い受容体を緑赤色感受性のChrimsonで活性化するようデザインし、ハエの行動をビデオで撮影し、機械学習により解析することで罰及び報酬記憶において安定した0.3-0.4のスコアを得ている。これにCa2+変化を測定できるGCaMPをKCsで発現させる系を組み合わせることも可能である。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。ショウジョウバエの記憶形成機構の研究を行った。(1)ショウジョウバエの3次嗅覚系神経KCsにCaリポーターGCaMPを発現させて、細胞体および軸索束を4次元イメージングで観察することにより匂いコーディングや記憶痕跡を解析することができると考えている。軸索束でのシグナルを取得し、主成分分析を行うことによって、異なった匂いに対する神経応答パターンを解析する方法を確立し、発表した。個体の観察法を改良することにより、顕微鏡下で匂いと電気ショックの連合学習を行い学習前後で異なる応答パターン(記憶痕跡)をより安定に検出できるようになった。(2)CREBの結合配列を持つリポーター遺伝子の導入によりCRE細胞をラベルし、またその細胞で様々な遺伝子を発現することができるトランスジェニック系統を作成した。この系統を用いて匂い罰/報酬連合学習による記憶形成におけるCRE細胞の機能を探った。CRE細胞は長期記憶の誘導とともに増加するが、長期記憶形成前からKCsの中にも存在する。特にKCsのgamma神経の中のCRE細胞は機能的に他のKCsと異なり、2時間記憶の獲得、固定、想起、すべての過程に必要であることがわかった。(3)KCsで発現する遺伝子の記憶形成における機能を調べ、記憶形成の分子メカニズムを明らかにするために、KCsで特異的に発現する2遺伝子を新たに同定し、その機能を調べた。少なくともそのうちの1つのGTPaseは麻酔耐性記憶に必要であることがわかった。(4)オスの求愛意欲を抑制するフェロモン成分cVAの長時間曝露により、cVA存在下においても活発な求愛を示す「匂いの馴化」が起こる事を新たに見いだした。神経活性マーカーGCaMPを用いてcVA応答嗅神経の活性を測定したところ、cVAの長時間刺激により嗅神経の感受性が低下している事が明らかになった。(1)顕微鏡下で匂いと電気ショックの連合学習を行い学習前後で異なる応答パターン(記憶痕跡)を検出するために、学習したことを示す独立した指標が必要である。KCsのアウトプット神経群(MBONs)が全て同定されたことを利用して、その神経群から代表的なもの2種を選んで、記憶痕跡の解析を行った。通常の行動実験装置で学習させ、ショックと連合させた匂いCS+及び連合させなかった匂いCSーに対する応答を計測する。これらは片半球1ないし2つの神経細胞だけからなり、容易に識別できるので、異なった個体間でもCS+とCSーの差をとることで記憶前後の差(記憶痕跡)を検出することが可能であり、事実2種の神経で記憶痕跡を同定した。顕微鏡下での連合学習によっても再現されたことから、顕微鏡下で記憶を形成することが可能となった。(2)匂い罰/報酬連合学習による記憶形成におけるCREB応答細胞の機能を探った。その結果、KCsのg細胞群はCREでラベル細胞(CRE-p)と残りの細胞(CRE-n、前述のgdを含む)に2分され、2時間罰記憶の獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-pが必要であり、CRE-nは阻害的に働くことがわかった。逆に、報酬記憶では獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-nが必要であり、CRE-pは阻害的に働く。このように相反するvalenceに機能する記憶スイッチを見出した。哺乳類の扁桃体にも類似の気候があるかもしれない。(3)KCsで強く発現するrgk1はGTPaseをコードし、2時間記憶形成に必要であり、過剰発現によりcAMP経路とは独立に記憶形成が亢進することを見出した。

(4)ショウジョウバエオスの求愛意欲を抑制するフェロモン成分cVAへの「匂いの馴化」の神経生理学的解析を行った。神経活性マーカーGCaMPを用いたリアルタイムイメージングにおける薬理学的スクリーニングにより、抑制性神経伝達物質GABAの関与を明らかにした。(1)MBONsの応答を指標とすることによって顕微鏡下で匂い学習が形成されうることを示すことができたのは懸案を解決し、大きな進歩であった。異なった波長特性のGCaMPを発現させることで、複数の神経群の応答を識別できる。MBONsの応答を内部標準とすることで個体ごとに回路が異なるKCsの応答を解析し記憶痕跡を解析することが可能になった。(2)bidirectional switch(2時間罰記憶の獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-pが必要であり、CRE-nは阻害的に働き、逆に、報酬記憶では獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-nが必要であり、CRE-pは阻害的に働く)を発見したことは記憶形成機構の研究一般に大きな貢献ができるのではないかと考えている。(3)rgk1がcAMP経路と独立に機能している可能性を示したことは重要であると考える、加えて過剰発現により記憶が亢進することも注目に価する、記憶形成機構の新たな面を明らかにできるかもしれない。(4)関与する神経伝達物質を同定には、当初RNAiを用いた遺伝学スクリーニングを予定していたが、手法を変更し、阻害剤を用いた薬理学的スクリーニングにより目的を達成した。(1)匂い罰/報酬連合学習による記憶形成におけるCREB応答細胞の機能を探った。その結果、KCsのg細胞群はCREでラベル細胞(CRE-p)と残りの細胞(CRE-n、前述のgdを含む)に2分され、2時間罰記憶の獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-pが必要であり、CRE-nは阻害的に働くこと、逆に、報酬記憶では獲得、固定、想起、すべての過程にCRE-nが必要であり、CRE-pは阻害的に働く。このように相反するvalenceに機能する記憶スイッチを見出した。この機構のさらに下流の神経回路の機能を明らかにすべく、5つの細胞種が同定されているKCsのg細胞のoutput神経(MBON)の解析を行った。その結果、g5MBONはCRE-pと同様に2時間罰記憶の獲得、固定、想起、すべての過程に必要であった。またg2MBONはCRE-nと同様に2時間報酬記憶の獲得、固定、想起、すべての過程に必要であった。(2)上記(1)のvalenceをコードする回路の機能を理解するために機能イメージングを行なった。CRE-nあるいはCRE-p細胞に温度制御によって神経出力を正に制御するTrpA1あるいは負に調節するshiを発現させ、CRE-nあるいはCRE-p細胞のシナプス出力を人為的に制御する。この個体にg2MBONあるいはg5MBONの細胞にカルシウム指示タンパク質GCaMPを発現させ、回路の機能結合を探った。その結果、g2MBONおよびg5MBON共にCRE-nとCRE-p細胞から正の制御を受けているらしいことがわかった。
神経内分泌腫瘍の系統的統合的解析－疾患概念の整理と診断基準確立

全身諸臓器に発生する神経内分泌腫瘍/癌(NET/NEC)について臓器による相同性の検索および予後因子の探索を行った。結果:NEC/NETの原発臓器は肺、消化管に多いが多岐にわたる。原発臓器により性差、発生年齢、危険因子、組織型の分布が異なった。臨床予後は、発生臓器によらず組織形態像、増殖能により分類する組織型と関連する傾向が確認された。発生臓器により免疫組織化学的形質、すなわち神経内分泌、細胞分化マーカーの発現や増殖能が異なり、その程度と予後との関連が示唆された。miRNA発現解析では、高悪性度と低悪性度NECは別個に群別され、肺と消化管では発生臓器を超え組織型が共通する傾向が示された。神経内分泌癌(NEC)は、肺、消化管に多く発生するが、全身諸臓器に発生し、肺では喫煙者で多いことが知られている。本研究は、全身諸臓器に発生するNECについて、肺と他臓器との相違点を明らかにする目的で、臨床病理学的背景、免疫染色による蛋白発現プロファイル、miRNA発現の網羅的解析、ISHおよび臨床予後について検索した。対象と方法:がん研で収集されたNECについて、発生年齢、性別、喫煙歴の有無、病理診断名を検索し、臨床経過を追跡した。腫瘍組織のFFPE検体を用いて、免疫染色、ISHで発現を検討した。肺および消化管発生NECで、miRNA発現解析を行った。結果:NEC症例381例を収集した。原発巣は、肺96、消化管(GI)82、胆膵14、頭頸27、婦人科33、泌尿器7を含む。年齢の平均は60歳、男性にやや多く、胃、直腸、婦人科臓器では若年発生、肺、食道、胆嚢では高齢発生の傾向があった。喫煙指数は、臓器により差があり、肺、食道、下部GIなどでは高かった。NECの診断名は多彩であった。免疫染色の結果、小細胞癌のなかには、臓器により神経内分泌、細胞分化マーカーの発現程度や増殖能が異なっていた。肺NECにおいて、ASCL1などの遺伝子発現をISHで検討したところ、タンパク発現と関連する傾向があった。miRNA発現解析の結果、低悪性度NECは高悪性度NECや腺癌とは異なる発現パターンが見られ、発生臓器を超え共通していた。臨床予後は、発生臓器によらず組織形態像、増殖能により分類する組織型との関連が確認された。考察:NECは、発生臓器によらず組織像と免疫染色を組み合わせた分類が臨床予後とも関連性があり、共通の疾患単位として分類可能である可能性が示された。しかし、臓器により臨床背景や腫瘍細胞形質が異なるものが存在しており、腫瘍発生母地や発生機序についてはさらなる検討が必要である。概要:全身諸臓器に発生する神経内分泌癌(NEC)について、肺と他臓器との相違点を明らかにする目的で、臨床病理学的背景、免疫染色による蛋白発現プロファイル、miRNA発現の網羅的解析、ISH、RT-PCRおよび臨床予後について検索した。対象と方法:がん研で収集されたNECについて臨床病理学的因子を収集、臨床経過を追跡した。免疫染色、ISHで分化マーカーの発現の臓器による特性、予後との関係を検討した。肺と消化管発生NECでのmiRNA発現様式を比較検討した。結果:1)臨床病理学的検討:NEC症例381例を収集した。原発巣は、肺96、消化管(GI)82が多く、胆膵、頭頸、婦人科、泌尿器を含んだ。男性にやや多く、胃、直腸、婦人科では若年発生、肺、食道、胆嚢では高齢発生の傾向があった。喫煙は、肺、食道、下部GIで関連が強かった。NECの診断名は多彩で、臨床予後は、発生臓器によらず組織形態像、増殖能により分類する組織型との関連が確認された。2)免疫染色:小細胞癌のなかには、発生臓器により神経内分泌、細胞分化マーカーの発現程度や増殖能が異なっていた。形態学的に類似していても、臓器特性があった。肺の高悪性度NECの中ではNEマーカー陽性群の予後が不良であった。3)ISH:肺NECのASCL1遺伝子発現をISHで検討し、タンパク発現と関連した。日常診断には免疫染色がより簡便で適切と考えられた。4)miRNA発現解析の結果、高悪性度と低悪性度NECは異なる発現様式であり、肺と消化管では発生臓器を超え共通する傾向があった。考察:NECは、発生臓器によらず組織像と免疫染色を組み合わせた分類が臨床予後とも関連性があり、共通の疾患単位として分類可能と考えられる。しかし、臓器により臨床背景や腫瘍細胞形質が異なるものが存在しており、腫瘍発生母地や発生機序については、さらなる検討が必要である。

神経内分泌癌(NEC)は、肺、消化管に多く発生するが、全身諸臓器に発生し、肺では喫煙者で多いことが知られている。本研究は、全身諸臓器に発生するNECについて、肺と他臓器との相違点を明らかにする目的で、臨床病理学的背景、免疫染色による蛋白発現プロファイルを解析した。対象と方法:がん研で収集されたNECについて、発生年齢、性別、喫煙歴の有無、病理診断名などを検索した。腫瘍組織のFFPE検体を用いて、肺のNECで組織型により発現の異なる蛋白(神経内分泌分化マーカー、細胞分化マーカー、細胞増殖能マーカーなど)について免疫染色、ISHで発現を検討した。結果:NEC症例256例を収集した。原発巣の内訳は、肺96、上部消化管31、下部消化管51、膵臓12、胆嚢2、頭頸部27、子宮頸部25、子宮体部5、卵巣3、膀胱7である。年齢の平均は60歳、胃、直腸、婦人科臓器では若年発生、肺、食道、胆嚢では高齢者発生の傾向があった。男性にやや多い傾向があった。喫煙指数は、臓器により差があり、肺、食道、下部消化管、頭頸部、膀胱では高いが、その他では比較的低い傾向があった。NECの診断名は多彩であった。免疫染色の結果、小細胞癌のなかには、臓器により神経内分泌分化、細胞分化マーカーの発現の程度や増殖能が異なっていた。TTF1は肺発生症例で発現が認められたが、他臓器NECで発現があることは例外的であった。肺NECにおいて、ASCL1の遺伝子発現をISHで検討したところ、タンパク発現と関連する傾向があった。考察:NECの臨床背景には、臓器のより喫煙と関連の強いものと、弱いものがあった。NECには種々の病理組織像のものが含まれ、悪性度も様々であった。NECは、同じ診断名でも臓器により臨床背景や腫瘍細胞形質が異なるものが存在した。現在までに、過去の症例381例の収集を完了し、臨床背景、予後の収集を行った。このうち肺、消化管発生症例のFFPE検体を中心に、免疫染色、ISH、miRNA発現解析を行った。タンパク発現に関しては、代表的な神経内分泌分化マーカー、細胞増殖能(Ki67)、臓器特異分化マーカーについて検索を行った。NECの臨床背景、病理組織像のものが含まれ、悪性度も様々であった。NECは、同じ診断名でも臓器により臨床背景や腫瘍細胞形質が異なるものが存在することを臨床病理学的に明らかにした。組織形態像は臨床予後と関連したが、発生臓器による違いは少なかった。組織形態と増殖能を組み合わせた分類が、臨床予後と関連することが確認され、発生臓器には依存しない傾向があった。しかし、組織像が類似していても、発現タンパクは発生臓器により異なるものがあること、悪性度により神経内分泌マーカーの発現程度が異なることも同時に認められ、生物学的性格については、さらなる検索の必要性が認識された。遺伝子発現解析は、FFPEを用いたISHによる検索に加え、miRNA網羅的発現解析を行った。miRNAはmRNAに比較して、FFPE検体での保存が良好であり、FFPE検体を用いた解析が可能であることが確認された。鑑別に有用な候補遺伝子を解析し、検出方法を検討中である。
重症筋無力症における特異的免疫抑制療法の確立-抗原ペプチド・アナログによるアプローチ-

重症筋無力症(以下、MG)は、イコチニック・アセチルコリンレセプター(以下、AChR)に対する自己抗体の出現により神経筋接合部のAChRが破壊され、全身の筋肉に易疲労性および筋力低下をきたす難治性の神経・筋疾患である。拡大胸腺摘出術はMGに対する外科治療として確立されており、当教室では術後1年・5年での改善率を80%、90%と報告してきた。しかしながら難治性症例やクリーゼを繰り返す症例も一部に存在し、そのような症例ではステロイドホルモン剤の経口・経静脈投与、血漿交換療法が行われるのが一般的であるが、特に最近ではアザチオプリン等の免疫抑制剤の投与も試されている。当教室においてもサイクロスポリンAによる免疫抑制療法を積極的に行っており、1年以上の長期使用(最長6年)における有効性と副作用などの問題点に関して報告した(第52回日本胸部外科学会総会平成11年10月仙台)。しかしながら、長期の非特異的免疫抑制療法には全身的な副作用併発の可能性、日和見感染の危険性が内在しており、このような"非特異的"免疫抑制療法に代わって、自己抗原反応性の免疫担当細胞だけを抑制する、いわゆる"特異的"免疫抑制療法の開発が望まれる。MGにおける自己抗体産生はT細胞依存性であるので、今回、我々はAChRを認識するT細胞を抑制することによる特異的免疫抑制法の開発を検討した。まず、AchRを特異的に認識するT細胞のクローニングを試みた。そのため、AChRαサブユニットのアミノ酸配列を元に、約20アミノ酸残基長のペプチド35種類を作成した。これらを用いてMG患者2例から手術により切除された胸腺由来リンパ球を刺激し、AChRαサブユニットを認識するT最房のクローニングを行った。1例の患者において、AChRαサブユニットのMain immunogenic region(MIR,α90-100付近)の配列を含む21アミノ酸残基長の合成ペプチド(NLKWNPDDYGGVKKIHIPSEK)を認識するT細胞クローンを確立した。今後、このアミノ酸配列の内、1残基を他のアミノ酸残基に置換した合成ペプチドを用いてその反応性を抑制するペプチドアナログを特定する。重症筋無力症(以下、MG)の治療法として拡大胸腺摘出術は既に確立されているが、約10%の症例で拡大胸腺摘出術が無効であり、ステロイドやアザチオプリンによる免疫抑制療法を行う必要がある。これらの複合治療に対しても抵抗性の難治性MGでは、クリーゼ・呼吸不全に至る可能性が高く、アセチルコリンレセプター(以下、AChR)を認識するT細胞を特異的に抑制することが本研究の目的である。そのため今回、我々はアセチルコリンレセプターの抗原エピトープを元にアナログペプチドを作成し、AChRを認識するT細胞をアナジーに至らしめる方法を採用した。AChR反応性T細胞をクローニングすることが本研究にとって最も重要な段階である。まず、AChRαサブユニットのアミノ酸配列をもとに、20アミノ酸残基長のペプチドを35種類作成し、精製した。現在これらoverlappingペプチドを抗原として、2例のMG患者から摘出された胸腺由来のリンパ球を刺激し、AChR反応性T細胞のクローニングを行っている段階である。

今後、クローニングされたT細胞が認識する抗原エピトープを決定し、このT細胞にアナジーを誘導するアナログペプチドをデザインする予定である。重症筋無力症(以下、MG)は、ニコチニック・アセチルコリンレセプター(以下、AChR)に対する自己抗体の出現により神経筋接合部のAChRが破壊され、全身の筋力低下をきたす難治性の神経・筋疾患である。拡大胸腺摘出術はMGに対する外科治療として確立されているが、難治性症例やクリーゼを繰り返す症例も一部に存在し、そのような症例ではステロイドホルモン剤投与、血漿交換治療法が行われるのが一般的である。特に最近当教室においては、サイクロスポリンAによる免疫抑制療法を積極的に行っており、その長期使用における有効性を確認している。しかしながら、長期の非特異的免疫抑制療法には全身的な副作用併発の可能性、日和見感染の危険性が内在しており、このような"非特異的"免疫抑制療法に代わって、自己抗原反応性の免疫担当細胞だけを抑制する、いわゆる"特異的"免疫抑制療法の開発が望まれる。MGにおける自己抗体産生はT細胞依存性であるので、今回、我々はAChRを認識するT細胞を抑制することによる特異的免疫抑制法の開発を検討した。まず、AChRを特異的に認識するT細胞のクローニングを試みた。そのため、AChRαサブユニットのアミノ酸配列を元に、約20アミノ酸残基長のペプチド35種類を作成した。これらを用いてMG患者2例から手術により切除された胸腺由来リンパ球を刺激し、AChRαサブユニットを認識するT細胞のクローニングを行った。1例の患者において、AChRαサブユニットのMain immunogenic region(MIR,α90-100付近)の配列を含む21アミノ酸残基長の合成ペプチドを認識するT細胞クローンを確立した。今後、このAChR特異的T細胞クローンが認識する抗原エピトープを決定し、このT細胞をアナジーに誘導するペプチドを決定する。