hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規の薬剤膜輸送制御機構の解明に基づく抗癌剤耐性克服治療薬の開発のための基盤研究

REIC/Dkk-3タンパク質は、癌細胞に過剰に発現させることにより、小胞体における細胞ストレスが誘導され、抗癌剤耐性の解除に関与することが明らかになっている。我々は本研究で、尿路性器癌における抗癌剤耐性を、P-glycoprotein(P-糖蛋白)を含むABCトランスポータースーパーファミリーの制御の観点から解明し、REIC/DKK-3遺伝子治療の新しいタイプの抗癌剤耐性克服治療薬としての有用性を検証した。我々のこれまでの研究により、アドリアマイシン耐性膀胱癌細胞株であるKK47/ADMにおいて、アデノウィルスベクターでREIC(Reduced Expression in Immortalized Cells)遺伝子(Ad-REIC)を強制発現させることによりアポトーシスが誘導されることが確認されている。またAd-REIC治療後のKK47/ADMにおいて、抗癌剤であるドキソルビシンによる殺細胞増強効果が認められ、ABCトランスポーターファミリーであるP-glycoprotein(P-糖蛋白)の発現抑制も認められている。加えて、この際に小胞体ストレス応答の下流に存在するJNK(c-jun N-terminal kinase)をJNK inhibitorであるSP600125で抑制することにより、P-glycoprotein発現の回復を認めている。この様に、小胞体ストレス応答周辺における分子シグナリングが、癌治療における各種抗癌剤に対する薬剤耐性に密接に関与している可能性が高い。これらの基盤データをもとに本年度は、小胞体ストレス応答の下流に存在する薬剤膜輸送制御機構の解明の為に、小胞体ストレス応答に密接に関与する3つの分子の細胞質側領域の発現システムを構築した。また本年度の研究により、細胞質内の存在するタンパク質複合体による特定のレセプターの核内への輸送の一旦が解明されつつあり、当該レセプターに特異的な薬剤耐性機構を克服する為の基盤研究を併せて実施している。膀胱癌細胞株を用い、アデノウィルスベクターREIC/Dkk-3遺伝子(Ad-REIC)を強制発現させ、アポトーシス誘導の有無をチェックした。通常の細胞株培養条件ではKK47、RT4およびアドリアマイシン耐性細胞株であるKK47/ADMにおいてAd-REIC感受性あり、アポトーシス誘導を確認したが、T24、J82、TccSupではAdREICアポトーシス誘導を認めなかった。細胞株条件を、より臨床的な条件に近い、細胞浮遊の条件下でAd-REICを強制発現させたところ、通常の細胞培養条件下ではアポトーシスの誘導が認められなかった。T24、J82、TccSupにおいてもCell viabilityの低下が認められた。またAd-REIC治療後のKK47/ADMにおいて抗癌剤であるドキソルビシンによる殺細胞効果が認められた。これまでの研究により、アドリアマイシン耐性膀胱癌細胞株KK47/ADMにおいて、アデノウィルスベクターでREIC(Reduced Expression in Immortalized Cells)遺伝子を強制発現させることによりアポトーシスが誘導されることが確認され、Ad-REIC治療後のKK47/ADM細胞株においてドキソルビシン抗癌剤による殺細胞効果の増強ならびにP-glycoproteinの発現抑制を確認した。さらに小胞体ストレス応答の下流に存在するJNK(c-jun N-terminal kinase)をJNK inhibitorであるSP600125で抑制することにより、P-glycoprotein発現の回復を認めた。このことから小胞体ストレス応答周辺における分子シグナリングが、ドキソルビシン抗癌剤に対する薬剤耐性に密接に関与している可能性が高いことが示唆された。H26年度の研究では、ヌードマウスを用い、小胞体ストレス応答とドキソルビシン抗癌剤の薬剤耐性に関するin vivo実験を行った。具体的にはkk47/ADM細胞株をヌードマウス皮下に移植し、担癌マウスにドキソルビシン抗癌剤を投与し、腫瘍縮小効果を確認した。さらに担癌マウスにドキソルビシン抗癌剤ならびにJNK inhibitorであるSP600125を腹腔内投与し、ドキソルビシン抗癌剤による腫瘍縮小効果を解析するとともに、残存腫瘍サンプルを用い、腫瘍内でのP-glycoproteinタンパク発現量を解析した。泌尿器科学本研究により、小胞体ストレス応答の下流に存在する薬剤膜輸送制御機構の解析が順調に進捗している。各種膀胱癌細胞株におけるREIC/Dkk-3遺伝子によるアポトーシス誘導が確認できた。また臨床において、膀胱癌に対する経尿道的膀胱腫瘍切除術後の抗癌剤膀胱内注入療法を想定した、細胞浮遊条件下における抗癌剤に対する殺細胞効果が認められたことで、今後の研究推進もスムースに行えるものと評価する。平成25年度に新規に見出した薬剤耐性機構について、小胞体ストレス応答との関連を解析する。KK47/ADMにおいてAd-REICによる抗癌剤治療感受性の克服と抗癌剤耐性に関与するP-glycoprotein(P-糖蛋白)を含むABCトランスポータースーパーファミリーとの関連を検討する。また抗癌剤感受性が克服された状況におけるアポトーシス関連分子を検討し、REIC/Dkk遺伝子によるアポトーシス誘導との関連を検討する。当初の予定より物品を安く購入できたため、未使用額が生じた。

平成26年度は、平成26年度支払い請求分に本年度未使用分を宛がい、引き続き研究計画に基づき有効に適正に使用する。具体的には、今年度の実験計画に含まれる、遺伝子発現実験関連試薬や、各種試薬・化合物、各種細胞ならびにヌードマウス等の購入に使用する。昨年度の研究費において、各種細胞・試薬の購入に費やされたが、約31万円の差額が生じた。次年度においては、遺伝子発現実験関連試薬や、各種試薬・化合物、各種細胞ならびに細胞培養に必要な試薬、各種抗体など、実験における試薬の使用が昨年に比して増加しており、差額が生じた昨年の研究費に次年度の研究費を加えて使用する。
地域環境データベースを用いた環境評価手法の開発

本研究は,地域環境情報に関するメッシュデータベース(地域環境データベースと呼ぶ)を用いて,合理的な環境計画を策定するための評価手法を開発しようとするものである。初年度の平成4年度には,首都圏,東京都,逗子市を事例に,地域環境データベースの構築を行った。具体的には,既存のデータベース(国土数値情報,細密数値情報など)にオリジナルなデータを加え,またデータベース利用が容易なように,データベース・マネジメントシステム(DBMS)の開発を行った。その結果,たとえば首都圏では,地価と環境評価の関係,東京都では,環境改善効果の評価,逗子市では,宅地開発における評価指針が得られるような,データベースの整備を行うことができた。また,土地環境,生物環境,アメニティ環境について,既存モデルの改善や,アンケートによる新たなモデルの作成などを行い,汎用性のある評価式を開発した。最終年度の平成5年度には,平成4年度結果を基礎に,環境計画への応用について研究をすすめた。土地環境,生物環境,アメニティ環境を総合化した総合評価のあり方について検討した結果,レーダーチャート式の表示が最も妥当であると判断した。また,地域環境評価モデルを用いて,今後の環境悪化の進展を予測し,それを防止するためにはどういう施策が必要かを示すための「将来環境の予測と評価」手法を開発し,さらにシナリオライティング手法による政策オプションの効果を見積もる手法について具体的に検討した。結果はきわめて良好であった。以上の研究結果に加えて,研究代表者,分担者らがこれまで行ってきた研究成果にもとづき,総合検討を行い,報告書を作成するとともに,「環境資源と情報システム」の成書にまとめ,広く公表することにした。本研究は、地域環境情報に関するメッシュ・データベース(地域環境データベース)を用いて、合理的な環境計画を策定するための評価手法を開発しようとするものである。研究の初年度である本年は、首都圏、東京都、逗子市を事例に、地域環境データベースの構築を行った。具体的には、既存のデータベース(国土数値情報、細密数値情報など)に、オリジナルなデータを加え、またデータベース利用が容易なようにデータベース・マメジメントシステム(DBMS)の開発を行った。その結果、たとえば首都圏では、地価と環境評価の関係、東京都では、環境改善効果の評価、逗子市では、宅地開発における評価指針が得られるような、データベースの整備を行うことができた。また、土地環境、生物環境、アメニティ環境について、評価手法を開発した。土地環境については、国土保全機能を評価する既存モデルを改善し、汎用性のある評価式を開発した。生物環境については、生態系の合理性、多様性に注目した評価基準を作成するとともに、それと動物分布の関係を明らかにした。さらに、アメニティ環境評価については、逗子市の住民、東京都民を対象に、アンケートを行い、住民によるアメニティ環境の評価と物的環境要因との関連を明らかにした。また、逗子市では視認性(市街地からみえる山林の眺望性)を評価し、景観的価値に基づく評価のあり方を検討した。以上、今年度は、データベースの構築と、評価式の開発に重点を置いて研究をすすめた。次年度は、これを基礎に、環境計画への応用について研究を行いたいと考えている。本研究は、地域環境情報に関するメッシュ・データベース(地域環境データベース)を用いて、合理的な環境計画を策定するための環境評価手法を開発しようとしたものである。すなわち、地域環境データベースを活用して、地域環境の現状の評価から、将来環境の予測およびその評価を経て、適切な政策オプションの選択に至るまでの、客観的な環境評価手法を開発することを目的とした。初年度の平成4年度は、首都圏、東京都、神奈川県逗子市を対象に、地域環境データベースの構築とデータベース・マネージメントシステム(DBMS)の開発を行ない、(1)土地環境、(2)生物環境、(3)アメニティ環境の現状を評価し、総合化する手法と、それらの将来変化を予測・評価し、総合化する手法を開発した。最終年度の平成5年度は、平成4年度の研究成果をふまえて、総合評価手法の開発を試みた。開発された三つの環境評価を総合化する方法として、レーダーチャートによる総合表記を提案した。

また、地域環境評価モデルを用いて、今後の環境悪化の進展を予測し、それを防止するためにはどういう施策が必要かを示すための「将来環境の予測と評価」手法を開発し、さらにシナリオライティング手法による政策オプションの効果を見積もる手法について具体的に検討した。結果はきわめて良好であった。以上の研究成果をまとめ、さらに研究代表者、分担者らがこれまで行ってきた研究成果を加えて、総合検討を行い、研究成果報告書を作成するとともに、「環境資源と情報システム」の成書をまとめ、広く公表することにした。
HRP.Biocytinを用いた後肢感覚神経-尾筋運動ニューロン経路に関する研究

本年度はすでに一部は雑誌、また学会において発表を行った後肢感覚神経-尾筋運動ニューロンへの経路を解剖組織学的に研究を行い、その結果経路が明らかとした。今回の研究課題にたいする実験は次の2つの実験により構成される。2、第4-6脊髄に存在する後肢皮膚感覚神経より単シナプス性反応を示す介在ニューロンに微小電極を刺入し通流によりBiocytinを注入する。さらに尾筋(ECL)または尾筋神経にHRPを注入する。今回以上の実験を行い以下のことが明らかとなった。1、後肢皮膚神経に反応を示す感覚神経が尾髄に神経軸索(axon)をのばす脊髄固有ニューロンにシナプスを形成している。2、後肢皮膚神経から単シナプス性に入力を受けている介在ニューロンが尾筋運動ニューロンに単シナプス性、また多シナプス性シナプスを形成している。以上の実験結果により後肢感覚神経の尾筋ニューロンへの経路がすでにおこなっている生理学的実験の結果を組織解剖学的にもほぼ明らかに示した。今後さらに電子顕微鏡を用いてシナプスの確認を行う。またさらに脊髄の部分切除法を用いてさらに後肢感覚入力の尾髄への経路の生理学的同定も行った。その結果後肢感覚入力の両側性経路の存在が明らかとなった。
Cキナーゼ活性の新規化合物による分子制御機構の細胞生物学的解析

運動系における情報の受容変換機構において最も重要な酵素の一と目されるCキナーゼの役割を分子生物学,分子免疫学,分子薬理学の3つのアプローチにより検討した.まずウサギ脳より精製したCキナーゼをもとに,都立臨床研の鈴木部長らと共同でCキナーゼのCDNAを解析し,その全一次構造を解明した.またこのクローニングの課程でCキナーゼにはα, β, γ, δの4種の分子種が存在することを発見した.次にこのCキナーゼの4種の遺伝子が,ハイドロキシアペタイトクロマトグラフィーにより分離されたI型, II型, III型のどのCキナーゼアイソザイムをコードするのかを明かにするため,それぞれのアイソザイムを特異的に認識するモノクロナール抗体, MC-1a, MC-2a, MC-3aを作製し得た.これらの抗体を用いて中枢神経系の免疫組織化学的検索を行ったところ, I型Cキナーゼは小脳のプルキニエ細胞,海馬の錐体細胞等に, II型は小脳の顆粒細胞等に, III型は白質のオリゴデンドログリア細胞等に特に豊富に分布することが判明した.また脾臓や造血組織にはI型は存在せず, II型及びIII型のみが分布することが発見された.これらの結果とノーザンブロッティングによるCキナーゼのmRNAの臓器特異的発現の検討から, I型はδ, II型はα及びβ, III型はγによりコードされていると考えられた.また各抗体のエピトープ分析の結果,これらのモノクローナル抗体はいずれもCキナーゼの調節部位を認識していることが明かとなった.運動系における情報の受容変換機構において最も重要な酵素の一と目されるCキナーゼの役割を分子生物学,分子免疫学,分子薬理学の3つのアプローチにより検討した.まずウサギ脳より精製したCキナーゼをもとに,都立臨床研の鈴木部長らと共同でCキナーゼのCDNAを解析し,その全一次構造を解明した.またこのクローニングの課程でCキナーゼにはα, β, γ, δの4種の分子種が存在することを発見した.次にこのCキナーゼの4種の遺伝子が,ハイドロキシアペタイトクロマトグラフィーにより分離されたI型, II型, III型のどのCキナーゼアイソザイムをコードするのかを明かにするため,それぞれのアイソザイムを特異的に認識するモノクロナール抗体, MC-1a, MC-2a, MC-3aを作製し得た.これらの抗体を用いて中枢神経系の免疫組織化学的検索を行ったところ, I型Cキナーゼは小脳のプルキニエ細胞,海馬の錐体細胞等に, II型は小脳の顆粒細胞等に, III型は白質のオリゴデンドログリア細胞等に特に豊富に分布することが判明した.また脾臓や造血組織にはI型は存在せず, II型及びIII型のみが分布することが発見された.これらの結果とノーザンブロッティングによるCキナーゼのmRNAの臓器特異的発現の検討から, I型はδ, II型はα及びβ, III型はγによりコードされていると考えられた.また各抗体のエピトープ分析の結果,これらのモノクローナル抗体はいずれもCキナーゼの調節部位を認識していることが明かとなった.
アルツハイマー病治療を目指した近赤外光で励起可能なAβ選択的光酸素化触媒の開発

昨年度までに、試験管内での選択的なアミロイドβ(Aβ)の酸素化触媒の開発に成功していた。今年度はさらに合成法の改良による収率の向上やより選択性の高い触媒の開発を行なった。具体的にはメチレンブルー(MB)に対し炭素リンカーを介してアニリンを導入することで、Aβ選択的な光酸素化を試みた。触媒が疎水的Aβと相互作用することで、光誘起電子移動(PeT)が抑制され、酸素化活性がONになるという設計である。各種炭素長C1, C3, C5のリンカーを持つ触媒を合成したところ、C1リンカーではほぼ選択性を示さなかったものの、C3、C5とリンカー長が長くなるにつれて高い選択性を示した。オフターゲット基質として、トリプトファンを持つブラジキニン誘導体およびソマトスタチンを用いた。Aβに対して同程度の酸素化収率を示すよう触媒濃度をコントロールし、その濃度でオフターゲットに対する酸素化収率が低い方をAβ選択性が高いものとした。また、電子ドナー性をより強めたMeC5ではさらに若干のAβ選択性の向上が見られ、これを試験管内反応における最適触媒とした。しかしながらMeC5は光照射なしでもPC12細胞に対してチュ良い細胞毒性を示した(LD50=0.3uM)。この毒性を減ずるべく、生理的条件でアニオンとなる官能基を触媒に導入し、有効電荷を打ち消す方向での構造展開を行なった。最終的にカルボン酸の疎水性生物学的等価体であるテトラゾールを導入した触媒を創製し、細胞毒性を大幅に減弱させることに成功した。本触媒を用いて凝集Aβに対しわずか1分の655nm光照射を行なうことで、Aβの酸素化による細胞毒性の減弱、細胞生存率の有意な増加を達成した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
グラフのゼータ関数とその拡張

我々は、先ず、いろいろなグラフや有向グラフのゼータ関数の一般化として、有向グラフのweighted Bartholdiゼータ関数を導入して、その行列式表示を与え、系として、いろいろなグラフのゼータ関数の行列式表示を導いた。また、グラフや有向グラフの第2種weighted(Bartholdi)ゼータ関数を取り扱った。次に、被覆グラフの概念を有向グラフに拡張して、有向グラフの分岐被覆の特性多項式、ゼータ関数、Bartholdiゼータ関数の分解公式を導いた。また、スターク&テラスの被覆グラフのガロア理論を、voltage assignmentの立場から再考し、グラフの正則被覆グラフの商グラフのweighted Bartholdiゼータ関数に関する分解公式を与え、有向グラフに拡張した。さらに、Guido, Isola & Lapidusによつて得られた、無限グラフ(periodic simple graph, periodic graph, fractal graphs)の伊原ゼータ関数に関する結果を、Bartholdiゼータ関数に拡張した。また、hypergraphのBartholdiゼータ関数を定義し、その行列式表示を与えた。Smilanskyによって定式化された、グラフの散乱行列に関する結果について、グラフの第2種weightedゼータ関数の行列式を用いた別証明を与えた。最後に、有向グラフのweighted complexityに関する結果を、有向グラフのweightedゼータ関数を用いて導いた。(1)digraphの重み付きBartholdiゼータ関数や重み付きBartholdi L-関数を導入し、その行列式表示を与える。(2)隣接行列を(1)とは異なるweighted matrixで置き換え、新たなゼータ関数、L関数を導入する。(4)hypergraphのIharaゼータ関数を、Bartholdiゼータ関数に拡張し、新たなゼータ関数に一般化したい(5)グラフの重み付きゼータ関数、重み付きL関数に関するセルバーグ型の跡公式を、正則グラフ、半正則2部グラフについて求め、極の偏角の分布について、考える。本年度は、グラフと被覆グラフのゼータ関数について、以下の結果を得た。(1)Stormのhypergraphのゼータ関数の結果を元に、Bartholdiゼータ関数を導入し、その行列式表示を与えた。また、半正則2部グラフのBartholdiゼータ関数の分解公式を導き、半正則hypergraphのBartholdiゼータ関数の分解公式を与えた。論文として、Electronical Journal of Combinatoricsに掲載された。(2)infinite tree T上のtorsionを持つ、群Γに対する、X=Γ\Tのゼータ関数についてのBassのimplicitな分解公式を明確化し、隣接行列をweigthed matrixで置き換えて、グラフに付いて、新たな(Bartholdi型の)ゼータ関数、L関数を導入し、その行列式表示を与えた。正則被覆グラフの新たなゼータ関数を、basegraphのL関数の積で表した。論文として、International Journal of Algebraに掲載された。(3) (2)と同じ背景の元で、digraphに付いて、新たな(Bartholdi型の)ゼータ関数、L関数を導入し、その行列式表示を与えた。正則被覆グラフの新たなゼータ関数を、base digraphのL関数の積で表した。論文として、Linear Algebra and its Applicationsに掲載された。(5)本研究のテーマから、幾分、離れるけれども、幾つかの一般のcoveringsに分割される、digraphの特性多項式の分解公式を与えた。論文として、European Journal of Combinatoricsに掲載された。(2) quantum graphの概念である、グラフGのscattering matrixのある行列式を、GのLaplacianの特性多項式で表示するSmilanskyの公式を、GのBartholdi型ゼータ関数の行列式表示を用いた新しい証明を与え、Smilanskyの公式の重み付き版についても、グラフゼータにおける手法を使って、別証明を導いた。(4)幾つかの一般のcoveringsに分割される、グラフの重み付きBartholdiゼータ関数の分解公式を導いた。論文として、Far East Journal of Mathematical Sciencesに掲載された。

(1)無限グラフの一種であるfractal graphのBartholdiゼータ関数を導入し、有限グラフのゼータ関数における手法を使って、von Neumann環の作用素に関する行列式を用いる、行列式表示を与えた。論文として、Electronic Journal of Combinatoricsに掲載された。(3)hypergraph HのIharaゼータ関数について、edge matrixの変形による新しい行列式表示を与え、Stormの定理の別証明を与えた。また、HのBartholdiゼータ関数について、edge matrixの変形と、Hのoriented line graphのPerron-Frobenius行列による行列式表示を与えた。。(5)quantum graphの概念である、グラフGのscattering matrixのある行列式を、GのLaplacianの特性多項式で表示するSmilanskyの公式のGのregular coveringへの拡張を考え、GのBartholdi型ゼータ関数の行列式表示を用いて、Gのregular coveringのscattering matrixのある行列式の分解公式を導いた。また、Gのregular coveringのscattering matrixの重み付き版についても、その分解公式を得た。論文として、Discrete Mathematicsに掲載された。本年度は、グラフと被覆グラフのゼータ関数について、以下の結果を得た。(1)グラフGの正則被覆グラフHの、被覆変換群Aの部分群Bによる商グラフH/Bをvoltage assignmentの立場から考察し砂田のリーマン多様体のガロア理論並びに、Stark&Terrasの被覆グラフのガロア理論のvoltage assignment版を展開し、その応用として、商グラフH/Bの第1種重み付きBartholdi L関数を、Gの第1種重み付きBartholdi L関数による表示を与えた。また、被覆グラフのガロア理論のvoltage assignment版をdigraphのcoveringに拡張して、digraphの第1種重み付きBartholdi L関数に適用した。論文として、Advances in Mathematicsに掲載された。
刺激誘導による脊髄内一酸化窒素合成酵素に関する研究

疼痛刺激は、脊髄内のC-fosなどの酸素誘導を来すことが知られているが、一酸化窒素合成酵素を誘導し、疼痛記憶に関与している可能性がある。疼痛刺激のみならず、温熱、冷却、電気的刺激などの各種刺激を用いて一酸化窒素合成酵素含有細胞数の変化を観察し、刺激の種類によって酵素誘導が生じるか否かを組織科学法によって明らかにする事を目的として以下の研究を行った。ラット36匹を各群12匹とし、1、2、3群とした。1正常ラットの足底部に生理食塩水10μlを注入し対照モデルとする。2右下肢に、ドライアイスをのせ、寒冷刺激を与えた。3右下肢を、53度の温水し浸し温熱刺激を与えた。上記1、2、3のモデルに対し、刺激投与6時間、24時間後、各6匹に対し、ペントバルビタール麻酔下に脊髄を生理食塩水、脱血還流後採取し、4%ホルマリン液で24時間固定した後、10%蔗糖液で凍結保護を行い、矢状面で切片を作成し、NOSをHADPH-diaphoraseを用いた組織化学法で染色した。正常コントロールと電気刺激モデルのNOS含有細胞の増減を比較した。結果:正常群では脊髄後角のNOS(HADPH-diaphorase)陽性細胞数は1-3層で19-23が観察されたのに対し、ドライアイス、温熱刺激ともに20-25で増加は見られなかった。以前のホルマリン刺激では32まで増加しているのが観察されており、刺激法の違いによる差異が認められた。疼痛刺激は、脊髄内のC-fosなどの酵素誘導を来すことが知られているが、一酸化窒素合成酵素を誘導し、疼痛記憶に関与している可能性がある。疼痛刺激のみならず、温熱、冷却、電気的刺激などの各種刺激を用いて一酸化窒素合成酵素含有細胞数の変化を観察し、刺激の種類によって酵素誘導が生じるか否かを組織化学法によって明らかにする事を目的として以下の研究を行った。ラット24匹を各群12匹とし、1、2群とした。2下肢に、50Hz,9Vの電気刺激を10分間行い電気刺激モデルを作成する。上記1、2のモデルに対し、刺激投与6時間、24時間後、各6匹に対し、ペントバルビタール麻酔下に脊髄を生理食塩水、脱血環流後採取し、4%ホルマリン液で24時間固定した後、10%蔗糖液で凍結保護を行い、矢状面で切片を作成し、NOSをNADPH-diaphoraseを用いた組織化学法で染色した。結果:正常群では脊髄後角のNOS(NADPH-diaphorase)陽性細胞数は1-3層で19-23が観察されたのに対し、電気刺激モデルでは20-25で増加は見られなかった。以前のホルマリン刺激法では32まで増加しているのが観察されており、刺激法の違いによる差異が認められた。3右下肢を、53度の温水に浸し温熱刺激を与えた。

上記1、2、3のモデルに対し、刺激投与6時間、24時間後、各6匹に対し、ペントバルビタール麻酔下に脊髄を生理食塩水、脱血還流後採取し、4%ホルマリン液で24時間固定した後、10%蔗糖液で凍結保護を行い、矢状面で切片を作成し、NOSをNADPH-diaphoraseを用いた組織化学法で染色した。正常コントロールと電気刺激モデルのNOS含有細胞の増減を比較した。結果:正常群では脊髄後角のNOS(NADPH-diaphorase)陽性細胞数は1-3層で19-23が観察されたのに対し、ドライアイス、温熱刺激ともに20-25で増加は見られなかった。以前のホルマリン刺激法では32まで増加しているのが観察されており、刺激法の違いによる差異が認められた。
DV・虐待にさらされた母子へのケアー-愛着形成を中心として-

DV被害を受けた母子へのケアを検討するため、CAREプログラムを母子生活支援施設入所者に試みた。トラウマ症状を抱える参加者に対して、プログラムの提供の仕方を工夫することにより、プログラムを修了することができるようになった。プログラムの効果を検証した結果、CAREは母親の子どもに対する否定的な認知を減少させ、子どもとの関係を良いものにしていた。これらのことからCAREはDV被害母子への有効なケアの一つになる可能性が見られた。本研究は母子生活支援施設入所者を対象として母子関係修復プログラムの実施及び効果の測定を行い,ケアのあり方の検討し,具体的支援方法を提案することを目的とする。今年度は母子生活支援施設職員を対象にヒアリングを行い,入所者が抱えている育児困難と子供への影響を確認した。またアメリカで先行的に行われている母子相互交流セラピィプログラム(PCIT:Parent-Child Interaction Therapy)およびCAREプログラム(Child Adult Relationship Enhancement)を実践してきた研究者にヒアリングを行い、母子生活支援施設での実戦可能の是非について検討を行った。その結果PCITは短期間(だいたい1週間に1時間を10週から16週)で、エビデンスに基づいた、問題行動を示している2歳から6歳の子どもの家族のためのプログラムで、親に効果的なペアレンティグのスキルを習得してもらうのが中心であること。プログラムの経過は(1)治療前の親子のアセスメント(2)アセスメントのフィードバック、CDIスキルの教示、そしてコーチ(3)PDIスキルの教示、そしてコーチ(4)スキルを汎かしていく教示(5)治療後の親子のアセスメントとかなりスタッフ及び資材の準備が必要で、母子生活支援施設のような生活の場での実施は難しいことが判明した。一方CAREはシンシナティ子ども病院TTTC(Trauma Treatment Training Center)において現場での体験を踏まえPCITを基にした改良が行われたものである。継続的な心理療法の困難なケースや養育者以外の、子どもと関わる大人へのプログラムの必要から開発され、適応年齢も思春期の子供までと範囲が広く、より簡便に実践することが可能なことがわかった。これらの成果をもとに次年度は母子生活支援施設において実際にCAREを実施し、その効果検証を行うこととした。昨年度はアメリカで先行的に行われている母子相互交流セラピィプログラム(PCIT : Parent-Child Interaction Therapy)とCAREプログラム(Child Adult Relationship Enhancement)を比較し,母子生活支援施設での実践可能性について検討を行った。その結果PCITは親の育児行動が変化し,生活の場で確実に汎化されるまで継続的に通う必要があること,スタッフ及び資材の準備が必要で、母子生活支援施設のような生活の場での実施は難しいことから,PCITを基にしてより簡便に行えることを目指して考案されたCAREプログラムから試みることとした。K母子生活支援施設に依頼し,プログラム受講希望者を募り,ワークショップを開催した。回数はCAREプログラムのマニュアル通り,1セッション4回を1クールとし,2時間枠で行った。参加者は当初4名いたが,PTSD症状のため,2名が途中で参加できなくなり,残り2名がプログラムを修了した。終了した参加者からは「わかりやすく明確な方法なので良かった」とプログラムへの評価は高かったが,うつや不安感などPTSD症状が重篤な人には参加すること自体が難しく,頻度や期間など検討しなければならないことがわかった。これらのことを踏まえ,精神症状を抱える母親ヘプログラムを導入する際の配慮など,様々な工夫をする必要性が見出され,今後の課題となった。PCITを基にした心理教育プログラム「CARE(Child-Adult Relationship Enhancement)」を母子生活支援施設に入所中で,子どもとの関係に困難を抱えている母親を対象に,プログラム受講希望者を募り,ワークショップを試みた。初回参加希望者は当初4名いたが,PTSD症状のため,2名が途中で参加できなくなり,残り2名がプログラムを修了した。この経験からトラウマによるうつや不安感など精神症状を抱える母親へプログラムを行う際,多くの配慮や工夫が必要であることが課題となった。参加者および母子生活支援施設職員へのヒアリングを行い,どのような配慮や工夫が必要かの検討を行った結果、グループより個別に近い形で行うことで,参加継続が可能であることが想定された。そのためスタッフ2名で参加者2名というスタイルをとることで,2回目以降は参加者が途中で脱落することなく,最後まで参加することが可能となった。またPCITで使用しているECBI(親からの子どもの問題行動)およびSESBI(スタッフが見る子どもの問題行動)の両尺度を用い,CAREプログラム実施前後で測定したところ,プログラムに参加するたびにECBI得点が低下し,参加者からも「子どもへの対応が楽になった。

子どもとの関係が良くなってきた」という感想と一致することが見られた。これらのことからCAREがPTSDなどトラウマ症状を抱える母親でも,母子関係の修復を促進することが可能であり,有効であることが理解された。
藍藻由来の鉄キレート物質(シデロフォア)の探索と鉄取り込み機構に関する研究

原核生物である藍藻類は、酸素発生型の光合成以外に鉄酵素nitrogenaseを用いて窒素固定も行うため、過剰の鉄が必要とされる。藍藻類はシデロフォアによる鉄獲得機構を備えるとの報告が過去に数例あるが、藍藻種間のシデロフォア産生能に関しても統一的な報告はない。これらの観点から藍藻類のシデロフォア産生能の評価およびその化学的性状に関する研究を行い、以下の知見を得た。1.藍藻類のシデロフォア産生能のスクリーニングを行い以下の結果を得た。ブルーム形成の代表種であるMicrocystis aeruginosa、Oscillatoria agardhiiは活性を全く示さなかった。一方、窒素固定能力をもつヘテロシスト形成糸状性藍藻は強力なシデロフォア産生活性を示した。また嫌気的条件下のみで窒素固定を行うとされるPlectonema boryanum等のヘテロシスト不形成糸状性藍藻の一部も活性を示した。2.窒素固定種の代表種であるAnabaena cylindrica NIES-19からシデロフォアanachelin-2およびanachelinを単離・構造決定した。3.A.variabilis M-204およびヘテロシスト不形成変異株であるNIES-23の両株のシデロフォアは、クエン酸を中心に左右対称な構造を持つヒドロキサム酸系の既知シデロフォアschizokinenであることが判明した。3.ヘテロシスト不形成糸状性藍藻の1種であるO.tnuiseUTEX1566からhydroxypyridinone構造を有する新規シデロフォアoscillabactinを単離・構造決定した。以上、本研究において、ほとんど未開拓であった藍藻シデロフォアの構造解析の結果、藍藻類は極めて新規かつ複雑な構造を有するシデロフォアを産生していることが明らかにされた。鉄は全ての生物において必須な金属原子であるが、近年、水中の鉄濃度が微細藻類の消長に強く関わっているとして微細藻類の鉄獲得機構が注目されている。鉄欠乏下において細菌やカビ類はシデロフォアと呼ばれる強力な低分子キレーターを放出し、その鉄錯体を特異的レセプターから細胞内に取り込む機構を備えている。藍藻類もシデロフォアによる鉄獲得機構を備えるとの報告が過去に数例あり、湖沼での藍藻ブルーム形成の一因は、シデロフォアによる鉄の独占によるとの推測もなされている。しかしながら、単離・構造決定された藍藻シデロフォアは僅か一例のみであり、藍藻種間のシデロフォア産生能に関しても統一的な報告はない。またシデロフォア自身は金属過剰症への対症薬剤として使用されており、薬理学の面からも新規シデロフォアの知見は重要である。これらの観点から藍藻類のシデロフォア産生能の評価およびその化学的性状に関する研究を行った。ブルームに関わる淡水産藍藻種を中心に41株の藍藻類を鉄欠乏下で培養し、それらのシデロフォア産生能をCAS法による鉄キレート活性によって評価した。その結果、ブルーム形成の代表種であるMicrocystis aeruginosa、Oscillatoria agardhiiは予想に反して産生活性を全く示さなかった。また単細胞性のSynechocystis sp.、Synechococcus leopoliensisも同様に活性を示さなかった。

一方、Anabaena cylindrica、A.variabilis、Nostoc sp.、Scytonema hofmanni、Fischerella ambigua、Calothrix brevissima等の窒素固定能力をもつヘテロシスト形成糸状性藍藻は強力なシデロフォア産生活性を示した。また嫌気的条件下のみで窒素固定を行うとされるPlectonema boryanum等のヘテロシスト不形成糸状性藍藻の一部も活性を示した。これはシデロフォア産生能力がブルーム形成と関係がないことを示すと同時に、窒素固定能力との強い相関を示唆するものであった。鉄は全ての生物において必須な金属原子であるが、近年、水中の鉄濃度が微細藻類の消長に強く関わっているとして微細藻類の鉄獲得機構が注目されている。原核生物である藍藻類は、酸素発生型の光合成以外に鉄酵素nitrogenaseを用いて窒素固定も行うため、過剰の鉄が必要とされる。藍藻類もシデロフォアによる鉄獲得機構を備えるとの報告が過去に数例あり、湖沼での藍藻ブルーム形成の一因は、シデロフォアによる鉄の独占によるとの推測もなされているが、詳細は不明である。これらの観点から藍藻類のシデロフォア産生能の評価およびその化学的性状に関する研究を行い、以下の成果を得ることができた。1.窒素固定種の代表種であるA.cylindrica NIES-19を鉄欠乏合成培地中で大量培養し、培地上清よりODSカラムおよび逆相HPLCを用いて2つのシデロフォアanachelin-2およびanachelinを単離できた。両物質の構造を1次元および各種2次元NMR解析、MS分析、アミノ酸分析を用いて決定した。2.A.variabilisは嫌気下においては栄養細胞内にnitrogenaseを発現させる特異なヘテロシスト形成種である。そこでA.variabilisの産するシデロフォアの単離・構造決定を行った結果、A.variabilis M-204およびヘテロシスト不形成変異株であるNIES-23の両株のシデロフォアは、ヒドロキサム酸系の既知シデロフォアschizokinenであることが判明した。
ドナー特異的抗体（DSA）制御に向けたHLA産生B細胞への多角的アプローチ

免疫抑制剤の進歩により腎移植ではT細胞性拒絶反応はほぼ克服されたが、長期生着については改善傾向にない。特に慢性抗体関連型拒絶反応の早急な対策が求められ、ドナー特異的抗HLA抗体(DSA)の早期検出は臨床的に重要な課題となっている。この問題を解決するために、末梢血B細胞から形質細胞までの分化誘導するin vitro培養システムの樹立とDSA産生マウスモデルの作製することが本研究の目的である。まず、培養系で末梢血単核細胞(PBMC)から形質細胞まで分化誘導を試みた。健常人PBMCにおいてIL-2,IL-10, IL-21,R848を用いた培養法により、培養上清にIgG産生を認めた。さらに、移植患者PBMCでは、Luminex法によりHLA抗体を検出することができた。血清と同程度のMFI値を示す症例も存在した。HLA抗体は血清中MFI高値の移植患者PBMCを用いたin vitro培養系で検出される傾向があった。しかし、すべての移植患者でHLA抗体が検出されるわけではなかった。そこで次に免疫不全マウスを用いてDSA産生ヒト化マウスモデルを作製し、DSAの早期検出・診断法の確立を開始した。健常人PBMCを尾静脈より移入し作製した。ヒト細胞の生着はflow cytometryで、マウスの生存は体重減少と脱毛を判定指標とした。マウス末梢血中のヒトCD3陽性細胞が著明に増え、GVHD発症との関連を認めた。一方、CD19陽性細胞は顕著な増加はみられなかった。PBMC移入によりヒト免疫細胞の再構築が確認されたマウスにおいて、HLA型の異なる健常人PBMCで感作したところ、全例でヒトIgG抗体が検出された。その一部は、DSAであった。現在、検出されたHLAアリルの解析を行っている。in vitro末梢血B細胞培養系によるDSAの検出は健常人検体での検討のみならず、多くの患者検体を用いた測定を行い、血清と同程度のMFI値を示すHLA抗体を検出できるレベルまで検出法を向上できた。DSA産生ヒト化マウスの作製においては当初の計画より少し時間がかかったが、一部、DSAが検出されたことから、現在、その再現性とHLAアリルの解析を行っている。DSAを産生するヒト化マウスの作製に成功した。しかし、その再現性が安定しないことが予想される。その理由としては、免疫細胞の成熟に重要な役割を果たす微小環境はマウス由来であることが考えられるため、PBMCをあらかじめ培養を行い、マウス内へ移入する方法を計画している。また、マウス体内でのヒト免疫細胞の再構築は造血幹細胞を移入、分化させることにより高率的に生着がみられるとの報告があることから、レシピエントCD34陽性細胞を移入する方法も模索していく予定である。

また、マウス体内でのヒト免疫細胞の再構築は造血幹細胞を移入、分化させることにより高率的に生着がみられるとの報告があることから、レシピエントCD34陽性細胞を移入する方法も模索していく予定である。B細胞培養に必要な培養液に加える各種サイトカイン、またヒト化マウス作製に必要な免疫不全マウスの購入、飼育に必要な食餌、B細胞分化(活性化B細胞、形質芽細胞、形質細胞)を検出するFlow cytometryに用いる蛍光標識された抗CD38、CD138抗体、IgG抗体の検出(ELISA)、血清中のHLA抗体特異性検査(Single antigen beads)の試薬購入費に充当し、精力的に検体の解析を進めていく予定である。
ローレンツ電子顕微鏡法によるナノ磁性粒子内部の磁区構造決定

電子顕微鏡法の一種であるローレンツ顕微鏡を用いると、磁化測定では得られない個々の粒子の磁区構造や磁化に関する情報を取得できる。磁性体全体が持つ磁性と個別の磁性粒子が持つ磁化との兼ね合いを電子顕微鏡とSQUID、VSM測定により明らかすることを目標とした。本研究では、銅中のコバルト微粒子、鉄微粒子、鉄-コバルト微粒子を作製し、SQUID、VSM測定などによる物性評価とローレンツ法を含む電子顕微鏡法を適用して以下の知見を新たに得た。(1)ローレンツ電子顕微鏡法及び明視野電子顕微鏡法ナノサイズの磁性微粒子にローレンツ電子顕微鏡法を適用し、磁性体粒子による極めて鮮明な電子線偏倚を得た。この結果を理論計算値と照合したところ、実験値は計算値の約2倍の大きさを持つことが分かった。この計算値は磁性体内部でのみローレンツ力が作用するという仮定のもとに算出されていることを考えると、実測値が大きめに出ることは説明できる。またローレンツ電子顕微鏡法では磁化の大きさと共に磁性微粒子の磁区構造と磁化方向の分布を調べることが可能であることが確認された。このことは今後ローレンツ電子顕微鏡法が積極的に磁性微粒子研究に適用され、実験的な研究の可能性が大きく広がることを示唆している。(2)SQUID測定及びVSM測定磁性体が実際に利用されるのは磁性材料全体の性質により、またそれは個別特性の総和にならない。粒子間相互作用などが磁性微粒子では特に重要である。この点を考えて、磁性微粒子のサイズや分散状況を系統的に変えて磁化測定を行った。幾つかの重要な知見が得られている。Cu-Fe合金の磁性粒子分布を変えていくとM-H曲線にメタ磁性的な変化が見られることが分かった。一連の測定により電子顕微鏡による組織とかなり緊密な対応関係を持つことが分かったが、特に保持力と飽和磁化に関しては磁性元素の組成依存性も大きい。組織学的にも磁性微粒子の双対化発言などで磁化がはっきり変化していることが確認された。鉄微粒子はこれまでも構造相転移やマルテンサイト変態等との関係が問題になっており、今後更に詳細な研究を行う基盤としても重要な到達点と考えられる。Cu-Co合金に関する昨年までの研究において、析出を用いることによりナノCo磁性粒子の形成状態を広範囲に変えることができ、それを用いて磁性微粒子の組織形態と磁性の関連を詳細に調べられる可能性があることを明らかにした。また2次元イジング模型と2つの相互作用をモンテカルロ法計算に適用することによってCo微粒子の特異な組織形態の定性的説明が可能であることも指摘した。今年度の研究では、以下の点について検討を行なった。(1)ナノ磁性微粒子のローレンツ顕微鏡法観察ナノ粒子の双対化現象が反平行スピン対によるCo磁性粒子の非接触配列であることが濃厚であることが一連の研究で明らかにされたが、直接的な実験検証としてローレンツ顕微鏡法による観察が考えられる。本年度この手法をCu-Co合金、Cu-Fe合金等に適用することを研究の課題としてを立案した。本科学研究費により電子線照射角偏向装置の導入が可能になった。

微粒子系のローレンツ顕微鏡法では、バルク試料とは異なって磁化が小さいため電子線の偏向量も極めて小さい。このような小さな磁化の変化を捉えるためには磁化の方向を電子線に合わせることが重要であるために種々の原料を用いて単結晶作製を試みた。単結晶は東大物性研において試作を行なった。これらの合金は包晶系状態図を持つために条件設定に時間を要したが、ほぼ目標に近い結晶を得るに至っている。小角電子回折パターン等を観察した。(2)SQUIDによる磁化測定磁性についてはSQUID装置を用いた磁化測定をCu-Co合金、Cu-Fe合金及びCu-Fe/Co合金についてM-T測定とM-H測定を行なった。TEM観察でも見られるようにCu-CoとCu-Feで組織変化には共通点と相違点がある。磁化組織の違いにおいても幾つかの特徴的違いがあったが、SQUID測定結果でも相違点が観察された。(3)モンテカルロ法計算の拡張2次元イジング模型を用いたモンテカルロ法計算により、組織発展の定性的解釈が可能であることを明かにしたが、さらにモンテカルロ法計算を3次元化し、現実に近いシミュレーションを行なうことを検討した。現在、視覚化を含めた基本的骨格を構築した。なお、現在、本研究結果の一部について特許申請の可能性を検討中である。近年、情報記録担体として磁性微粒子の挙動や制御がきわめて重要な研究課題になっている。従来の磁性微粒子研究は物性面からのアプローチが多く、組織と物性との対応関係に関する詳細な検討は必ずしも十分でない。磁性微粒子にとっては組織や組成の均一性が性質を大きく変えることが認識されつつある。本研究は固相相変態を利用して、銅中に磁性微粒子を分散させ、組織と物性を電子顕微鏡レベルで調べようとしたものである。電子顕微鏡法の一種であるローレンツ顕微鏡を用いると、磁化測定では得られない個々の粒子の磁区構造や磁化に関する情報を取得できる。本研究では磁性体全体が持つ磁性と個別の磁性粒子が持つ磁化との兼ね合いを電子顕微鏡とSQUID、VSM測定により明らかすることを目標とした。本研究では、銅中のコバルト微粒子、鉄微粒子、鉄-コバルト微粒子を作製し、SQUID、VSM測定などによる物性評価とローレンツ法を含む電子顕微鏡法を適用して以下の知見を新たに得た。(1)ローレンツ電子顕微鏡法及び明視野電子顕微鏡法ナノサイズの磁性微粒子にローレンツ電子顕微鏡法を適用し、磁性体粒子による極めて鮮明な電子線偏倚を得た。この結果を理論計算値と照合したところ、実験値は計算値の約2倍の大きさを持つことが分かった。この計算値は磁性体内部でのみローレンツ力が作用するという仮定のもとに算出されていることを考えると、実測値が大きめに出ることは説明できる。またローレンツ電子顕微鏡法では磁化の大きさと共に磁性微粒子の磁区構造と磁化方向の分布を調べることが可能であることが確認された。このことは今後ローレンツ電子顕微鏡法が積極的に磁性微粒子研究に適用され、実験的な研究の可能性が大きく広がることを示唆している。(2)SQUID測定及びVSM測定磁性体が実際に利用されるのは磁性材料全体の性質により、またそれは個別特性の総和にならない。粒子間相互作用などが磁性微粒子では特に重要である。この点を考えて、磁性微粒子のサイズや分散状況を系統的に変えて磁化測定を行った。幾つかの重要な知見が得られている。
新規ユビキチン類似タンパク質MNSFβによるアポトーシス調節機構の解明

ユビキチン類似タンパク質MNSFβが細胞内でアポトーシス促進因子Bcl-Gと共有結合し、フラボノールの一種、ケルセチン(quercetin)がこの複合体形成を調節することを明らかにした。ケルセチンはアポトーシス誘導を制御することで知られるが、その機序にMNSFβ/Bcl-G複合体形成が関与していると考えられ、実際にsiRNAによるノックダウン実験でこれを証明した。新規ユビキチン類似タンパク質であるMNSFβのアポトーシス調節機構を明らかにする目的で、マクロファージ系細胞株Raw264.7における調節機能の基礎検討を行った。Raw264.7細胞に種々の刺激でアポトーシスを誘導させて、その過程でMNSFβRNA干渉による効果を検討した。1)最初に最適条件下でMNSFβsiRNAによりノックダウンできるようトランスフェクション試薬を比較検討した。その結果、従来の50倍以下の濃度でMNSFβの発現(mRNA/タンパク質レベル)を低減できる条件が求まった。2)Raw細胞をLPSとIFNγで刺激を加えてアポトーシスを誘導したところ、MNSFβsiRNAM処理したRaw264.7細胞は対照(control siRNA)に比べてアポトーシス(DNAラダーおよび核のDAPI染色による観察)が抑制された。これはMNSFβがアポトーシス誘導過程において正に制御していることを強く示唆する。MNSFβsiRNAMで処理したRaw264.7細胞ではp53の発現が抑制されることを確認した。加えて、カスパーゼ3の活性化についても抑制されることを認めた。3)Raw細胞をGSNOで刺激を加えてアポトーシスを誘導したところ、MNSFβsiRNAM処理したRaw264.7細胞は対照(control siRNA)に比べてアポトーシスが抑制された。これは、NO誘導性のアポトーシスにMNSFβが関与していることを示している。この観察結果はSNAPで刺激じた場合も同様であった。ユビキチン類似タンパク質MNSFβが、マウスマクロファージ系細胞株Raw264.7内でアポトーシス促進因子Bcl-Gと共有結合し、フラボノールの一種、ケルセチン(quercetin)がこの複合体形成を調節することを明らかにした。ケルセチンはアポトーシス誘導を制御することで知られるが、その機序にMNSFβ/Bcl-G複合体形成が関与していると考えられた。そして、MNSFβが実際にアポトーシスの制御に関与することをMNSFβsiRNAによるノックダウン実験で証明した。MNSFβsiRNA処理したRaw264.7細胞では、NOドナーであるGSNOのアポトーシス誘導が低減していることを、DNAラダー形成を指標にして実証した。この結果は、MNSFβがアポトーシスを正に調節すること、さらに/Bcl-Gが関与している可能性があることを示唆する。さらに、MNSFβsiRNAをトランスフェクションしたRaw264.7細胞において、p53やPARPさらにカスパーゼ3等の発現パターンの変化に整合性があることを認めた。これらの現象は、リポポリサッカライド(LPS)とインターフェロγン(IFNγ)によるアポトーシス誘導においても全く同様に観察された。MNSFβのアポトーシス調節機能を解明する過程でMNSFβがエンドサイトーシスに関与するエンドフィリン2と細胞内で共有結合し、貧食作用を制御することを証明した。アポトーシス制御機構との関連を検討中である。尚、マクロファージによるザイモサン(βグルカン)の貪食能を評価する上で有用な、酸化亜鉛ナノ粒子を蛍光剤として独自に開発した。