hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵炎関連コピー数変異の網羅的解析とスクリーニング系の確立

本邦の膵炎患者においてトリプシノーゲン遺伝子座のtriplicationやduplicationの有無を解析した。対象は慢性膵炎患者230例と急性膵炎患者180例とした。その結果、対象とした患者にこれらのコピー数変異を認めず、本邦では稀な遺伝子異常であると考えられた。またCGHアレイにより、遺伝性もしくは家族性膵炎患者を対象に網羅的なコピー数解析を行った。その結果、既知のコピー数多型とは異なる短い配列の欠失を複数個認め、一部はタンパク質コード領域内に存在していた。慢性膵炎は非可逆性、進行性の疾患と考えられており、その病態はいまだに不明である。また、膵炎関連遺伝子異常の保有者では膵癌発症の危険性が高まることが指摘されている。早期に診断し、その進行を抑制する治療法の開発が急務である。膵炎に関連する遺伝子変異としては、これまで一塩基置換に焦点が当てられ、いくつかの関連遺伝子が報告されている。アニオニックトリプシノーゲンのG191R多型は、多型の存在により易分解性となることで慢性膵炎に対し保護的に働くことが明らかにされた。我々は本邦で本多型が白色人種に比べ高頻度(378人中25人6.6%)に存在し、慢性膵炎(241人中3人1.2%)ならびにアルコール性の急性膵炎(59中0人0%)で低頻度であり、これらに対し保護的に作用することを報告した。また、もうひとつの遺伝子異常であるコピー数変異(CNVs)が近年注目されている。とりわけトリプシノーゲン遺伝子座のtriplicationやduplicationはフランスの複数の遺伝性膵炎家系あるいは若年性特発性膵炎患者において認められている。今回我々は本邦の慢性膵炎患者約200例と急性膵炎患者約180例を対象にトリプシノーゲン遺伝子座のtriplicationやduplicationの有無を解析した。その結果、本邦の膵炎患者にはこれらのコピー数変異は同定されず、本邦では稀な遺伝子異常である可能性が示唆された。膵炎に関連する遺伝子変異として、これまで一塩基置換に焦点が当てられ、カチオニックトリプシノーゲンや膵分泌性トリプシンインヒビターなどいくつかの膵炎関連遺伝子が報告されている。一方、もうひとつの遺伝子異常であるコピー数変異(CNVs)が近年注目されている。今回我々は本邦の膵炎患者においてトリプシノーゲン遺伝子座のtriplicationやduplicationの有無を解析した。対象は慢性膵炎患者230例(遺伝性膵炎11家系、家族性膵炎14家系、特発性71例、アルコール性108例、自己免疫性26例)と急性膵炎患者180例(特発性79例、アルコール性53例、胆石性29例、高脂血症性6例、その他13例)とした。その結果、対象とした患者にこれらのコピー数変異を認めず、本邦では稀な遺伝子異常であると考えられた.またCGHアレイにより、遺伝性もしくは家族性膵炎患者を対象に網羅的なコピー数解析を行った。その結果、膵炎関連遺伝子のコピー数異常は認めなった。しかし他の領域において既知のコピー数多型とは異なる短い配列の欠失を複数個認め、一部はタンパク質コード領域内に存在していた。同定されたコピー数異常が、遺伝子の機能に影響を与えるかどうか今後検証する必要がある。
B型肝炎ウィルス関連抗原に対する免疫応答の解析

先ず、マウスモデルを用いてHBV特異的CTL反応について検討した。HBs抗原(S)、HBc抗原(c)、HBe抗原の産生が可能なPreC/C(PC)をそれぞれ発現する組み換えワクシニアウイルス(RVV)を作製し、C3Hマウス(H-2^k)に各のRVVまたは野性株ワクシニアウィルス(WT)を感作した。7日後に脾細胞を採取、in vitro同系マウスtransfectantと共に培養後、effectorとした。L cell(H-2^k)に各のRVVまたはWTを感染させたものをtargetとし、^<51>Cr-release assayを行なった。PCのeffectorとtargetの組合せでcytotoxicityは71%(E/T=12.5)と最も高く、次いでCのeffector/targetで40%を示した。S effector/targetでのcytotoxicityは18%であった。これらのCTL活性は抗マウスCD8とMHCクラスI抗体により阻止され、PCとCとの間には交又反応性を認めた。したがって、HBVの核蛋白(とりわけHBeAg)がCTLの主要な抗原であると考えられた。次いで、ヒトのPre C/C領域の検討では、慢性肝炎(CH)のe抗原からe抗体へのseroconversion例でC領域に96-183bpの欠損を認め他の例ではpre Cの83番目の変異によりstop codonを生ずる変異株が検出された。pre S/S領域ではCHの2例ともpre S/Sの後半部位に129-189bpの欠損株を認めた。pre C/C、pre S/S領域ともCH例でのアミノ酸の変異率は、無症候性キャリアのそれよりも有意に高く、病態の活動性とウィルス株変異との関連性が示唆された。
ゲルのやわらかさによる反応場の構築と合成プロセス

ゲルを担体とする触媒の多孔固定化担体の開発を行った。オルガノゲル、ヒドロゲルの双方について開発を行い、有機反応への適用を図った。1)Pd触媒固定化ヒドロゲルのフロープロセスに関する検討:ポリN-イソプロピルアクリルアミドをベースとした多孔高分子ゲルを用いた固定化触媒、流通リアクターの開発を行った。アミノ基を固定化することで、イオン吸着法でPdを固定化した。ゲルの架橋密度を種々変化させた。このゲルに対して水溶液を流通させたところ、低い圧力損失で安定的なフローを確保することができた。フェニルボロン酸とブロモ安息香酸の鈴木カップリング反応を行ったところ、フロープロセス、高い収率で生成物を得ることができた。Pdはリーチングが見られず、粒径の増大も見られなかった。2)Pd固定化オルガノゲルの開発:ポリスチレンをベースとする網目状高分子は有機溶媒に膨潤してゲル性を呈する。トリフェニルホスフィンのスチレン誘導体を各種合成し、これを含むスチレンゲルを調製し、鈴木カップリング反応用の固定化触媒としての利用を検討した。ホスフィンリガンドを持つ高分子にPdを固定化させて、鈴木カップリング反応を行ったところ触媒の活性が向上し、芳香族塩素化化合物についても鈴木カップリング反応に用いることができた。また、種々の基質のビフェニル生成反応を触媒することがわかった。3)有機分子触媒固定化ヒドロゲルの開発:有機分子触媒であるL-プロリンは不斉触媒として機能することが知られている。そこで、プロリンのアクリレート誘導体を用いて、アクリルアミドゲルにこれを固定化した多孔体を調製して、アルドール反応の触媒として用いた。多孔ゲルの調製はアルコール存在下で行い、調製条件によって異なる多孔度を呈した。L-プロリン固定化多孔ゲルはアルドール反応を触媒し、L-プロリン担体に近い不斉触媒能を持つことが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。ポリNーイソプロピルアクリルアミドをベースとした高分子ナノゲル粒子、多孔高分子ゲル、を合成した。これらの高分子に対してPd(II), Pd(0)を固定化した、固定化触媒を開発し、クロスカップリングについて検討した。特に2つのゲルのやわらかさについての物性に着目して研究を進めた。Pdは、ジメチルアミノ基を導入して、イオン間相互作用を利用して固定化し、還元によってPd固定化触媒を得た。まず、高分子ナノゲルを用いた固定化触媒を検討した。高分子ナノゲルを100ー500nm程度の大きさに調製した。この時、高分子ナノゲルの架橋密度を5-30%まで変化させた。架橋密度が多いほどゲルは硬くなり、ゲルの内部空間は狭くなる。高分子ナノゲルを用いた触媒では、高分子の網目架橋密度に応じて、固定化Pd触媒の活性が変化した。網目架橋度を増大させた場合にのみ、Pdの反応中でのオストワルド成長、失活を防いで高い触媒活性を示すことがわかった。この高活性に基づいて、鈴木カップリング反応は30°C、水溶液条件下という温和な条件で効率的な反応を示した。高分子ナノゲル固定化担体の架橋密度が高いほど触媒活性が高くなることがわかった。また、高分子の多孔ゲルを調製して、多孔ゲルの内部空間を用いたフローリアクターの設計を行った。ポリNーイソプロピルアクリルアミドゲルは温度応答性があるため、高温で重合すると収縮して多孔ゲルを生じる。多孔ゲル内部にPdを固定化させて、更に孔を利用して基質を流通させることで、反応を検討した。多孔ゲルを固定化担体として用いた場合には、高い反応効率を示し、シリカゲルなどに比べて流通固定化担体として優れていることがわかった。この高い反応活性はPd触媒の安定性と基質の輸送拡散が円滑に行われていることに依存することがわかった。ゲルを固定化担体とする新しい有機合成を提案している。触媒自体よりも固定化担体のやわらかさ、物質の透過性、フロー反応などの化学工学に着目することで有機反応を大きく制御できることを新しく見出してきている。また、領域研究であることから他の研究者との融合による新たな有機プロセスの確立が必須であるが、複数の研究者とのコラボレーションが順調に進んでいる。

ホスフィンリガンドを持つ高分子にPdを固定化させて、鈴木カップリング反応を行ったところ触媒の活性が向上し、芳香族塩素化化合物についても鈴木カップリング反応に用いることができた。また、種々の基質のビフェニル生成反応を触媒することがわかった。3)有機分子触媒固定化ヒドロゲルの開発:有機分子触媒であるL-プロリンは不斉触媒として機能することが知られている。そこで、プロリンのアクリレート誘導体を用いて、アクリルアミドゲルにこれを固定化した多孔体を調製して、アルドール反応の触媒として用いた。多孔ゲルの調製はアルコール存在下で行い、調製条件によって異なる多孔度を呈した。L-プロリン固定化多孔ゲルはアルドール反応を触媒し、L-プロリン担体に近い不斉触媒能を持つことが明らかになった。今後の研究については、ゲルのやわらかさを生かして、フロー反応を中心にした研究を進めていく。研究は1)新しいリガンドを導入した固定化触媒、フロー反応、と2)酵素触媒を固定化したフロー反応、3)分子触媒を固定化したゲルモノリスの調製とフロー反応について検討を進めていく。これまでのゲルの固定化触媒では主にヒドロゲルを扱っており、水溶媒での反応のみを扱っていた。そのため反応が限られていた。そこで、ポリスチレン型のオルガノゲルリアクターを検討し、同時にトリフェニルホスフィンを側鎖に含むリガンドを導入した触媒について扱う。一般的な有機反応に用いることのできるフロー反応の確立を行う。また、酵素などの生体触媒を多孔ゲルに固定化したフロー反応の構築を行う。スクシイミド基を有する多孔ゲルを利用して、酵素を固定化するゲル、及びそれを用いた化学反応リアクターの創製を行う。これは領域内での酵素触媒の研究者との共同研究の予定である。新しい試みとして、分子触媒を固定化したゲルモノリスによるフローリアクター設計を計画している。高分子ではモノマーを設計することで、種々の官能基を高密度に配置することができる。有機分子触媒からなるフロー触媒空間による有機反応について検討を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
木材腐朽過程における担子菌類の三次元的量的動態の解析

前年度までに、木材腐朽菌の中で特に家屋に重大な影響を及ぼすと思われる、Serpula lacrymans, Coniophora puteana, Gloeophyllumsepiarium, G.trabeum,Trametes versicolorの6種について、それぞれの種を検出するためのプライマーを開発した。担子菌において種の同定に頻用されるリボソームのITS領域より、種に特異的な配列をもとに検出対象種でのみPCR増幅される種特異的プライマーを設計した。本年度はこれら種特異的プライマーを用いた定量PCRを行い、量的な検出および生物量評価法の開発を試みた。PCR反応を通して増幅されていくDNA量をモニターすることで鋳型DNA量を評価することができる定量PCR(リアルタイムPCR)において、開発して種特異的プライマーの増幅効率をユニバーサルプライマーによる増幅効率と比較し、定量性を評価した。検出対象種のゲノムに対する種特異的プライマーを用いた増幅効率は、ユニバーサルプライマーの増幅効率と一致したことから、種特異的プライマーを用いた定量的検出が可能であることが示された。また、プラスミドにクローニングしたITS断片をスタンダードの鋳型として用いることで、各腐朽菌の生物量を評価できることが明らかとなった。また、定量PCRを用いてプライマーの増幅効率を評価することができることが明らかとなった。この技術により種特異的プライマー開発において、その増幅効率を数値的に評価できることが示された。木材腐朽菌のうち、主に住宅などの腐朽に見られる家屋腐朽菌からSerpula lacrymans, Coniophora puteana, Gloeophyllumsepiarium, G.trabeum, Trametes versicolorの5種類について、これらを検出同定するための種特異的プライマーを設計した。データベースより供試菌のrDNA配列を参照して、ITS領域中で種に特異的である配列を選択し、種特異的プライマーとした。腐朽菌のゲノムDNAをテンプレートとして、特異的プライマーを用いたPCRを行なった。PCRの酵素、アニーリング温度、サイクルプログラムを検討し、信頼度の高い条件を検索した。木材腐朽菌のrDNAのITS領域をユニバーサルプライマー(ITS1およびITS4)でPCRを行なったところ、各供試菌のゲノムからそれぞれITS領域が増幅された。次に、フォワードプライマーにITS1、リバースプライマーに種特異的プライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行なった。開発したいくつかの種特異的プライマーの中から目的の断片のみを最も効率良く増幅するものを選抜した。開発したプライマーを用いて、目的担子菌のゲノムをテンプレートとして定量的PCRを行い、遺伝子量の定量性を検討した。その結果、ゲノム量が0.1ng/ulから検出することが可能であり、また多種のゲノムが混在している条件下でもその定量性が確認された。前年度、木材腐朽菌のうち、主に住宅などの腐朽に見られる家屋腐朽菌からSerpula lacrymans, Coniophora puteana, Gloeophyllum sepiarium, G.trabeum, Trametes versicolorについて、それぞれの種を検出するためのプライマーを開発した。今回はこの開発されたプライマーを用いた担子菌検出および同定法を確認するために、近縁種を集めてそのなかにおけるプライマーの特異性を確認した。また定量的PCRを行い、ターゲットであるDNA断片の量的評価を行うことを検討した。また、多種のゲノムが混合された条件から種に得意的なプライマーを使ったPCRによって目的のDNA断片を量的に検出することを確認した。これら開発されたプライマーを用いた担子菌の検出法を環境中より得た試料に対しての応用を検討するため、環境中により腐朽材を採取し、その中に生息する担子菌を単離した。その結果10株前後の担子菌を単離することが出来、継代培養により純粋培養であることを確認した。これらの株よりDNAを抽出し、rDNAのITS領域の配列を決定した。この配列情報に基づき既存データベース中の検索によって、種を同定した。また、環境中の試料から効率よくDNAを抽出する方法を検討した。その結果、物理的、科学的方法を組み合わせた方法が最も効果的にDNAを抽出できることが分かった。

また、プラスミドにクローニングしたITS断片をスタンダードの鋳型として用いることで、各腐朽菌の生物量を評価できることが明らかとなった。また、定量PCRを用いてプライマーの増幅効率を評価することができることが明らかとなった。この技術により種特異的プライマー開発において、その増幅効率を数値的に評価できることが示された。
先天性高度難聴の遺伝子スクリーニング法の開発

遺伝性感音難聴は、2000人の新生児に対して一人の割合で存在すると言われる比較的頻度の高い疾患の一つである。少なくとも欧米ではコネキシン26(ギャップ結合蛋白β2:GJB2)の遺伝子異常に起因すると想定される難聴が非常に頻度が高く、さらにその中でも一塩基の欠失に起因する変異が非常に多いことが知られている。日本における既報でも、235番目のシトシンが欠失する変異(235delC)が高頻度に報告されており、人種差はあるものの共通して一塩基欠失の頻度が高いことが知られている。本研究では、1)一塩基欠失の迅速診断法としてシークエンサーを用いた一塩基欠失診断法を、また2)一塩基伸長反応を用いたラベル方法による一塩基置換の迅速診断法を確立した。これらを用いて一般人口での遺伝子異常の頻度を検討したが、正常聴力を有した人口の4%が遺伝子異常をヘテロ接合体の形で有していることが示された。また、難聴児の人口中では30%に何らかのコネキシン遺伝子異常が検出され、日本でもその疫学的有用性は極めて高いことが示された。さらに小学校就学前の言語習得期前難聴の人工内耳装用児についてGJB2遺伝子異常の有無を検討した。就学前のレベルでの言語能力と認知能力について新版K式を用いて評価したが、GJB2遺伝子異常群では有意に優れた言語成績を示した。これらの結果よりGJB2遺伝子異常をターゲットとした遺伝子迅速診断法あるいはスクリーニング法の確立は臨床的にも非常に有益である可能性が示された。コネキシン26は言語習得期前難聴の最も頻度の高い原因と考えられており、一般人口中における頻度は約2%、先天性高度難聴の約30%をしめると考えられている。特に、この遺伝子変異にはすでに特定の変化が多数確認されることが報告されている。例えば地中海を中心とした欧米では35delGが広く報告されていることに対して、日本の難聴者を対象に行った報告では、233番目から235番目まで3つつながったCのうち、一つが欠失する235delCの頻度が変異全体の70%と圧倒的に高いことが報告されている。こうした頻度の高い一塩基欠失の報告がある一方で非常に多くの種類の一塩基置換の報告も知られている。こうした遺伝子異常解析の臨床的応用のためには比較的簡単な手技で迅速に行うことができる検査法を開発する必要がある。我々は直接塩基配列決定法と同等の精度と敏感度を持ちながら、より迅速、簡易、経済的な遺伝子診断法についての研究を行った。遺伝子解析についてのインフォームドコンセントの得られた、先天性高度難聴患者52人を対象にした。迅速診断の対象としたのは、235delC、30delG、Y136X、R143W、G45Eの5個所のGJB2遺伝子異常だった。ブラシで頬粘膜を擦過後、抽出用のバッファーの中で洗浄し、その洗浄液からDNAを抽出した。最初に、第一のPCRとして、GJB2のエクソン2全域を含む772bpの領域をPCR反応で増幅した。さらにそのPCR産物のうち35delGと235delCの領域を含む241bpの領域を増幅するために、蛍光標識したブライマーを用いてPCR反応を行った。GJB2遺伝子異常のうち、一塩基置換である、Y136X、R143W、G45Eを検出するために、一塩基プライマー伸長反応を行った。遺伝子迅速診断の結果を直接塩基配列決定法を用いて確認した。235delCのhomozygote4症例、heterozygote10症例が検出され、heterozygoteの内、2症例ではR143W、1症例ではY136X、1症例ではY136X+G45Eと、片方のアレルに頻度の高い一塩基置換を持つことが検出された。以上の結果は直接塩基配列決定にても正しいことが確認された。今回の迅速診断に要した時間と費用は直接塩基配列決定の約3分の1であった。
病理診断確定症例家系に依拠した紀伊ALS・パーキンソン認知症複合の疾患概念確立

現在までに、紀伊半島多発地区の筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン・認知症複合(ALS/PDC)18剖検例の病理学的検索が終了した(三室、葛原担当)。ルチーンの神経病理学的染色法に加えて行った免疫組織化学的検討で、ALS例、PDC例ともに共通していたのはタウ蛋白蓄積であり、TDP-43もほぼ全例に出現していた。つまり、臨床表現型の違いはあっても、病理学的には「タウ蛋白-TDP-43蛋白蓄積症」であるという、古典的な所見を確認した。この他に、約半数において、高度のα-シヌクレイン蓄積を示す例があることが判明した。生前の臨床症状はPDCであり、臨床症状とレボドパへの反応性からはパーキンソン病とは異なったが、幻覚が出ている例が多い印象があったので、詳細にカルテを見直す予定である。剖検症例の多くは家族性発症例であるので、剖検例を起点に臨床例リストから血縁者を抜きだせば、剖検例の数倍の患者について臨床所見や画像所見を検索できる可能性がある。臨床例については、50例を超す症例リストがあり、これらのかなりの者は剖検例と血縁関係があることが判明している。従って、剖検例を起点として家系図を作ることにより、臨床例を剖検例ごとにグループ化できる。臨床病歴から臨床症状を分析すること、画像や治療内容を調べることによって、同一家系内で臨床症状の共通性の有無、また、家系間での臨床病型の異同についても比較検討する。これによって、症状が多彩で概念化しにくい本疾患の臨床病理学的特徴を解明する。本研究の出発点となる剖検例18例の病理所見の検討はほぼ終了した。全例に共通するのは、臨床表現型を超えて見られる高度のタウオパチーと、程度はさまざまであるがALS病変とTDP-43病理であった。予想外であったのは、従来は注目されてこなかったα-シヌクレイン病理が顕著で、脳病理所見からはレビー小体型認知症(DLB)と区別がつかない症例があったことである。これらは、臨床的に見て、PDCかDLBかの検討が必要である。脳の病理所見検討は順調に進んでいるが、家系図作成と臨床病歴の検討では遅れが出ている。その理由は、残されているカルテや所見メモから該当部分を抜き出して、所見を埋める作業が手間どっているためである。この手間のかかる作業は、分担研究者との共同作業によって今年度中に終了して、家系ごとの症例を集約して、その特徴を解析できる予定である。1.18剖検例の病理所見を、タウ蛋白、TDP-43,α-シヌクレイン、アミロイドの出現様式によって分類し、臨床徴候と対比する。2.剖検例を起点として、多発地区臨床例レジストリの中から、病理確認症例の家系に含まれる症例を選び出しグループ化する。3.それぞれのグループに属す症例の臨床特徴を明らかにし、家系ごとの特徴と家系間の比較をする。4.ALS/PDCの病理学的臨床的特徴を明確にし、概念、病理、症状と病型、診断基準、できれば治療への反応性を明らかにし、今後の前向き研究に活かす。

脳の病理所見検討は順調に進んでいるが、家系図作成と臨床病歴の検討では遅れが出ている。その理由は、残されているカルテや所見メモから該当部分を抜き出して、所見を埋める作業が手間どっているためである。この手間のかかる作業は、分担研究者との共同作業によって今年度中に終了して、家系ごとの症例を集約して、その特徴を解析できる予定である。1.18剖検例の病理所見を、タウ蛋白、TDP-43,α-シヌクレイン、アミロイドの出現様式によって分類し、臨床徴候と対比する。2.剖検例を起点として、多発地区臨床例レジストリの中から、病理確認症例の家系に含まれる症例を選び出しグループ化する。3.それぞれのグループに属す症例の臨床特徴を明らかにし、家系ごとの特徴と家系間の比較をする。4.ALS/PDCの病理学的臨床的特徴を明確にし、概念、病理、症状と病型、診断基準、できれば治療への反応性を明らかにし、今後の前向き研究に活かす。物品購入費は、予定していた消耗品等の購買の必要がなくなったこと、謝金等は年度途中からの支出になったこと、分担研究者の分担金30万円が現時点での収支簿では未使用となっていること(これらは実際には既に使用されていて、報告書が未着であると思われる)が理由である。実際の残額は30万円程度であるので、今後、研究が進むにつれて、必要物品購入や論文作成・投稿の経費として速やかに使用する予定である。
ガス状エタノールで駆動する新規バイオ燃料電池の構築

現在までに数多くのバイオ燃料電池が報告されているものの、その実用化にはさらなる出力の増大が必要である。ほとんどのバイオ燃料電池の出力は燃料の物質拡散に支配されているため、高濃度で燃料を供給する方法論を確立すれば、電池出力の増大につながると考えられる。そこで本申請研究では、高濃度の燃料供給を期待して、ガス状エタノールを燃料として利用することを提案した。まず、ガス状エタノール駆動型バイオ燃料電池の作製に先立ち、常温よりも高い温度域で駆動するバイオ燃料電池の作製を検討した。これまでの研究で作製した、耐熱性アルコール脱水素酵素を固定した電極をアノードとし、カソード触媒には酸素の4電子還元反応を触媒するビリルビン酸化酵素を用いた。50°Cにおける電池出力は、常温の場合の1.5倍まで向上した。続いて、電極基板としてガス透過性の高いカーボンファイバーペーパーを用いて酵素電極を作製し、この酵素電極にガス状エタノールを供給する電気化学セルの設計を行った。酵素電極は一方の面を気相、もう一方の面を液相(電解質溶液)に接するように配置した。電解質溶液は、ガラスファイバーフィルターに浸潤させて、酵素電極と接触させる構造とすることによって、セルからの液漏れを防ぐことが可能であった。気相側からガス状エタノールを供給し、サイクリックボルタンメトリー測定を行った。その結果、エタノール供給時のみ触媒酸化電流が観測することができた。したがって、ガス状エタノールで駆動するバイオアノードを構築することに成功した。(抄録なし)これまでに数多くのバイオ燃料電池が報告されているものの、その実用化にはさらなる出力の増大が必要である。そこで本申請研究では、高濃度の燃料供給を期待して、ガス状エタノールを燃料として利用することを提案する。しかしエタノールがガスとなる80°C以上の高温条件で酵素を扱う場合には、熱による酵素活性の低下が起こる。また、電解液の水が揮発するという問題も生じる。これらの問題を解決するため、高温条件で酵素を安定に保持する手法の確立および熱により揮発しない電解液の探索を行う必要がある。まず、80°C付近の高温条件で機能する酵素電極の作製を目指した。本研究では、酵素触媒として耐熱性アルコール脱水素酵素を選択して酵素電極を作製した。この電極を用いると、80°C以下でエタノールの電気化学的酸化反応が進行することを明らかとした。さらに、ガス透過性のあるカーボンペーパーを電極基板として用いて、同様に酵素電極を作製した場合には、触媒酸化電流が向上した。次に、80°C付近の温度域においても揮発しない、イオン液体を電解質として用いて酵素電極の電気化学的性質を評価した。数種のイオン液体について検討を行い、疎水性の1-hexy1-3-methylimidazolium bis(trifluoromethanesulfbnyl)imide中で最も良好なエタノールの触媒酸化電流が得られることを明らかとした。一つ目の課題であった「熱安定性の高い酵素電極の作製」を達成した。さらに、次の課題である「イオン液体中における酵素電極反応の検討」に関して、酵素活性を維持できるイオン液体を数種見出すことができた。作製した熱安定性の高い酵素電極を用いて、高温条件・イオン液体中において電気化学的評価を行う。また、電極材料の選択や酵素の固定化法を検討することによって三相界面を制御し、ガス状エタノールを燃料とする酵素バイオ燃料電池を構築する。(抄録なし)
地下水位以浅に埋設されたパイプラインの新たな液状化被害メカニズムの解明と評価

液状化に起因する大規模な地盤変状は,埋設パイプラインの主要な破損原因である.パイプラインの埋戻し地盤が健全な場合においても,より下層の地盤の液状化に伴って被害が生じた事例が多数報告されており,今後の耐震対策を進める上で検討が求められている.本研究は,模型実験によって被害メカニズムを明らかにするとともに,合理的な安定性評価手法の提案を目指すものである.評価指標として液状化に伴う地盤ひずみに着目し,地盤ひずみが引き起こす埋設管の変位量とその関係性の定量化を試みる.液状化に起因する大規模な地盤変状は,埋設パイプラインの主要な破損原因である.パイプラインの埋戻し地盤が健全な場合においても,より下層の地盤の液状化に伴って被害が生じた事例が多数報告されており,今後の耐震対策を進める上で検討が求められている.本研究は,模型実験によって被害メカニズムを明らかにするとともに,合理的な安定性評価手法の提案を目指すものである.評価指標として液状化に伴う地盤ひずみに着目し,地盤ひずみが引き起こす埋設管の変位量とその関係性の定量化を試みる.
朝鮮王朝後期の葬喪礼教化史

李朝前期の主たる埋葬法は、上層階級が二重葬、庶民は死体遺棄であった。王朝権力は儒教の礼教を暴力的に教化することによって、埋葬を促進することを意図した。その結果、李朝後期に至ると上層階級は埋葬地を次々に変えるという「改葬」という手段を取って対抗し、庶民は王陵や権力者の墓に秘かに自家の棺を埋め込む「偸葬」という手段を以て対抗するようになる、ということが研究によって判明した。なぜ彼らが直接埋葬することを避けるかといえば、風水の良い土地に埋葬することによって自家の繁栄を図ろうとしたからである。また後期になると、上層階級では埋葬する墓地(墓山)を確保するため、互いに山争いを頻繁にするようになる。それが訴訟になった物を「山訟」という。王族や外戚では山裾の村を強制占拠し、そこに墓を建てる、ということを行った。李朝ではこれを統制しようと様々な法令を発し葬喪礼教化を行ったが、次々にザル法化し形骸化していった。18世紀になると山訟は恒常化し、訴訟の10件の内8件は山争いという状況に至った。本研究ではその訴訟を詳細に分析することにより、朝鮮王朝後期の葬喪礼教化史を明らかにした。朝鮮王朝後期の葬喪礼教化史に関して、第一年度目は外縁研究として共時的には霊魂観について他国との比較を行い、通時的には現代朝鮮における思想教化との連関性を探求した。その成果の学術論文として、前者では「欧州に端を発する韜晦的人間観の系譜」(『筑波法政』第21号、1996年9月)を発表し、後者では徐大粛著『金日成と金正日-革命神話と主体思想-』(岩波書店、1996年9月)を翻訳し出版した。学術発表は、「日韓共同研究フォーラム」で行った。当研究フォーラムは、前村山首相提言を受け、財団法人日韓文化交流基金が主催する、日本と韓国の学者700名による共同研究である。当国際研究学会の前近代史文科会が、1997年1月15日、品川プリンスホテル新館3階エメラルドの間において行われ、研究代表者古田博司は、「朝鮮後期喪礼教化における『強占』と『山訟』」と題して学術発表を行った。本発表は、朝鮮王朝後期葬喪礼教化史において、社会上層部による墓地のための土地の強制占拠がおこり、下層部からはこれに対抗する訴訟が頻繁に生じてくる、当時の葬礼に関する社会現象を取りあげたものである。研究の結果、その原因が朝鮮王朝の15世紀から始まる埋葬の教化にあることが分かった。王朝により埋葬が強制され、風水の良い地を求めて上層部の「強占」が起こり、他方庶民は上層部に土地を奪われて「山訟」という訴訟を起こしたことが史料により明確に裏付けられた。全体的に本研究の第一年度目の成果は、比較等の外縁研究と社会現象面の史的分析として得られた。第二年度目は、研究を制度と法令面で深化させ、核心研究へと進み、その成果を学術論文に結実させていきたい。朝鮮王朝後期の葬喪礼教化史に関して、第二年度目は外縁研究として朝鮮の宗教観について考察し、その学術論文として、「普遍的世界観の終焉と宗教ファシズムの冒険」(駒井洋編『社会知のフロンティア』新曜社、1997年11月)を発表した。当国際研究学会の前近代史文科会が、1997年7月27日、韓国ロッテ・ホテルにおいて行われ、研究代表者古田博司は、「朝鮮王朝後期の『占山』と『山訟』」と題して学術発表を行った。本研究発表は、18世紀の朝鮮で民衆と権力者間の墓所争いと、権力者同士の墓所争いに焦点を当てたものである。また、同年10月10日、韓国高麗大学仁村大講堂において、同フォーラム学術会議で前近代班代表として、「朝鮮の国家理念と民衆」について研究発表を行った。

全体的に本研究は、第二年度目の成果でほぼ完成に近いが、史料として朝鮮王朝の1719世紀の政務日記である『承政院日記』を通読する必要がある。幸い本史料は研究代表者の大学所蔵のものがあるため、その成果を学術論文に結実させていきたい。
非線形偏微分方程式に対する有限要素解の誤差解析

を考察してきた。ただし、a^^→,fは十分滑らかな関数とする。F(λ,u)を、上の問題から定義された非線形作用素とする。問題が発散形式で定義されているので、この問題に対する有限要素解(λ_h,u_h)は、自然に定義される。古典的なKantorovichの定理、あるいは誤差評価付の陰関数定理をもちいて以下のような結果を得た。もし、作用素F(λ,u)の真の解(λ,u)におけるuについてのFre^^'chet微分D_uF(λ,u)が適当な関数空間の間の同型写像になっているならば、真の解(λ,u)のごく近傍に有限要素解(λ_h,u_h)が存在し、さらに標準的な形の誤差評価が成り立つ。この結果は、いくつかの形で拡張することができる。解曲線が返り点(turning point)を持っていても、適当な方法で上と同様な結果を得ることができる。ただしこの場合は、有限要素解の誤差は|λ-λ_h|+||u-u_h||【less than or equal】C||u-II_hU||という形で評価される。また、誤差|λ-λ_h|は誤差||u-u_h||よりはるかに小さいことが、しばしば観察される。このことが数学的にきちんと説明できることを示した。方程式が移流項を持つ場合には、いわゆる風上型の近似スキームを用いる必要があるが、その場合離散化された作用素は微分可能でなくなる。この場合も、もし離散化された作用素が"擬微分"を持てば、上と同様な結果が得られることを示した。|λ-λィイD2hィエD2|+ ||u-uィイD2hィエD2||<_C||u-ΠィイD2hィエD2u||.を考察してきた。1998年度の研究により、非線形偏微分方程式に対する有限要素解の誤差解析の研究に、古典的なKantorovichの定理が有効であることが明らかになった。非線形境界値問題がパラメータを含む場合にも、上の結果を拡張した。解のブランチが正則な場合や、返り点(turning point)を含む場合にも、上と同様な結果がいえることを示した。さらに返り点の周辺で、パラメータについてより精密な評価が成り立つことを示した。工学や物理学などで現れる具体的問題では、返り点そのものを精度よく近似する必要がある場合がある。そのような場合、適当な補助方程式を使って返り点を与えるパラメータの値を精度よく近似できることを示した。これらの結果は、次の2つの論文にまとめ([1]Finite elementapproximations of parametrized strongly nonlinear boundary value problems,[2]Finite element analysis for parametrizednonlinear equations around turning points)投稿中である。1998年10月に、スイスの連邦工科大学を訪れ、これらの結果について1時間の講演を2回行った。を考察してきた。もし、作用素F(λ,u)の真の解(λ,u)におけるuについてのFrechet微分D_uF(λ,u)が適当な関数空間の間の同型写像になっているならば、真の解(λ,u)のごく近傍に有限要素解(λ_h,u_h)が存在し、さらに標準的な形の誤差評価が成り立つ。

ただしこの場合は、有限要素解の誤差は|λ-λ_h|+‖u-u_h‖【less than or equal】C‖u-Π_hu‖という形で評価される。また、誤差|λ-λ_h|は誤差‖u-u_h‖よりはるかに小さいことが、しばしば観察される。このことが数学的にきちんと説明できることを示した。方程式が移流項を持つ場合には、いわゆる風上型の近似スキームを用いる必要があるが、その場合離散化された作用素は微分可能でなくなる。この場合も、もし離散化された作用素が"擬微分"を持てば、上と同様な結果が得られることを示した。|λ-λィイD2hィエD2|+ ||u-uィイD2hィエD2||<_C||u-ΠィイD2hィエD2u||.
貧困対抗活動の生態系と福祉社会構築に関する社会学的研究

初年度の研究計画において枠組みを設定したように、本研究における貧困対抗活動の生態系は、「1ネットワーク系、2「草の根」連帯経済系、3グリーン/アース系、4ソーシャル系」に類型化できる。この枠組みを基礎とし、「貧困対抗活動の生態系と福祉社会構築に関する社会学的研究」の研究の趣旨にのっとり、社会学と社会福祉学の両者の方法論を架橋し、そのいわば二分法の総合を試みるものとして調査研究内容を再整理した。つまり社会学史を修正活用した【理論】(シカゴ学派の社会生態学)と【実証】(貧困対抗活動の生態系論)を往復する社会学的ループ、およびエビデンスを重視する【実証】と「【教育】(社会福祉士養成課程の取組みの分析へのフィードバック考察)【実践】(現代社会の家族福祉実践)」を往復する社会福祉学的ループを活用し、両者を絡み合わせる(entangle)「総合」的研究を志向することで、いわば、「総合的社会認識の社会学による福祉実践」をめざした。そのため、前年度に引き続き、法学や経済学、政治学などの社会科学の研究者が集う研究ネットワークも活用した。それらの結果、貧困対抗活動の生態系論などから、新たな時代の人権・福祉社会の構築に向けて、多くの人が現代社会において問題発見力とコントロール力を高められる方法として、シカゴ学派社会学等を通して再検討したソーシャルワークの手法をもつ可能性が浮かび上がってきた。公開講座においては、研究成果の一部を報告した。また、現代社会の家族福祉実践に関する論考を脱稿した。研究代表者が所属の研究機関において役職に就いたことに加えて、研究計画において、福祉社会の構築に向けたミクロ基礎づけ作業としてのソーシャルワークの社会学的理論化を継続的に行っていく必要性が生じたためである。平成30年度に作成した「総合的社会認識の社会学による福祉実践」の概念図にのっとり、貧困対抗活動の生態系に関するこれまでの研究を踏まえて、福祉社会の構築に関して、社会学的に再検討したソーシャルワークとその教育法の理論的かつ実践的な研究を推進していく。そのためには、文献・理論的検討に加えて、研究代表者が重点的に軸足を置いてきた社会学界のネットワークのみならず、社会科学に関する研究ネットワーク、さらには、平成27年度以降、本務校での事業・教育・研究を通じて築いてきた福祉(学術および現場の)のネットワークを活用する。本研究においては、国内の多様な貧困対抗活動を個人的/社会的レジリエンス(柔軟に組織化/再組織化していく力)を生む作用、すなわち社会生態学の観点から評価し、それぞれの活動の顕在的/潜在的社会的意義を明らかにすることで、新たな福祉社会構築への示唆を得ることを試みている。本年度の研究成果は、以下の3点に大別される。【1.貧困対抗活動の生態系の枠組みの再検討・洗練化】「1ネットワーク系、2草の根連帯経済系、3グリーン/アース系4ソーシャル系」の系の再検討・洗練化を行い、学会大会で報告した。貧困対抗活動は、一枚岩でとらえられるものではなく、従来の社会福祉学や社会諸科学が看過しがちな意義が認められうる可能性がある。【2.ひとり親家庭の貧困の生活史データの分析】貧困対抗活動を推進する活動団体の協力を得て、ひとり親家庭の貧困の生活史データの分析を行った。近代家族像やグローバル化の影響など、時間と空間の圧縮という現代的特質が、ひとり親の貧困に影を落としている側面について明らかにした。【3.家族における親と子どもの社会生活の再組織化の研究】育児する父親の研究を通じて、家族における親と子どもの社会生活の再組織化の研究を企画し原稿を執筆した(近刊)。【4.新たな福祉社会の構築にかんする理論的枠組みの整備】新たな福祉社会の構築および貧困対抗活動について、社会生活を組織化へと導く社会的相互作用および文化の観点から裏付けるための理論的整備を行った。社会生活の組織化を示唆する日本の文化的世界をゴフマンの演劇論的視点から分析する考察を行った(近刊)。これらの4点の研究を通じて、新たな福祉社会構築への示唆を得ることを試みてきた。研究を開始する年度において、前提となる貧困対抗活動の生態系の枠組みの再検討・洗練化について発表することができたことは、本研究のひとつの進捗状況を表していると考えられるため。平成27年度より開始した本研究は、日本国内のさまざまな貧困対抗活動を個人的/社会的レジリエンス(柔軟に組織化/再組織化していく力)を生む作用、すなわち社会生態学の観点から評価し、それぞれの活動の顕在的・潜在的社会的意義を明らかにすることで、新たな福祉社会の構築に向けた示唆を得ることを目的としている。とくに当該年度の研究成果は、以下の3点に大別される。【1.貧困対抗活動の生態系における「事業」的側面の検討】本研究における貧困対抗活動の生態系は、「1ネットワーク系、2草の根連帯経済系、3グリーン/アース系、4ソーシャル系」に類型化できるが、とくに事業的側面の特徴を有する2草の根連帯経済系、3ソーシャル系の実証的・理論的検討を進めた。たとえば各地区の社会福祉協議会や共同募金会などと連携しながら、寄付金等を貧困対抗などの社会貢献につなげる取組みについて調査を行い、分析と考察を進めている。【2.貧困対抗活動と社会保障】シカゴ学派社会学・社会生態学への非経済的・非政治的側面への批判を踏まえ、貧困対抗活動等と社会保障の関係を問う原稿を執筆し公表への準備を進めた。

【3.新たな福祉社会の構築に関する理論的整備と実践】困窮状態にあるひとり親家庭の研究、また、育児する父親の研究を通じて、家族における親と子どもの社会化と再組織化の研究の成果を発表した。これに関して、実際に福祉を利用している人たちなどを集めて、研究成果の一部の公表およびグループワークを行い、フィードバックを得ることができた。また社会生活の組織化を示唆する日本の文化的世界に関する研究成果も発表した。2年目にあたる年度において、貧困対抗活動の生態系における各系統の研究を進めることができたとともに、福祉社会の構築に関する論考を執筆・発表できたことは、本研究のひとつの進捗状況を表していると考えられるため。【1.貧困対抗活動の生態系における「『草の根』連帯経済系とソーシャル系の融合の可能性の検討】初年度の研究計画において枠組みを設定したように、本研究における貧困対抗活動の生態系は、「1ネットワーク系、2「草の根」連帯経済系、3グリーン/アース系、4ソーシャル系」に類型化できる。圏域的凝離の傾向にあった「『草の根』連帯経済系」と「ソーシャル系」の融合の可能性を探るべく、「寄付付き商品」を事例として各団体の活動を検討した。その結果、地域福祉の推進とソーシャルビジネスとの関係性の意義、地域貢献ビジネスとしての寄付付き商品の可能性、福祉施設支援の面において、募金が具体的にどのように活用されているか周知することの福祉的・社会的意義などにかかわる個人的・社会的レジリエンスを浮かび上がらせた。【2.「貧困対抗活動の生態系と個人的/社会的レジリエンス」を社会変動論の文脈でとらえなおす】当該年度は、関西地区における新たなフィールドでの調査を遂行しつつ、この枠組みから、それぞれの系統から生み出される個人的/社会的レジリエンスについて、社会変動論の文脈からとらえなおし、共著本を通じて発表した。【3.社会保障と貧困対抗活動】前年度の研究に引き続き、シカゴ学派社会学や社会生態学への非経済的・非政治的側面への批判を踏まえ、貧困に対抗する行政と民間の取り組みと、社会保障との関係性を問う論考が書籍に掲載された。【4.社会学的ソーシャルワークと福祉社会の構築】貧困等の福祉的課題に対抗する福祉社会の構築に向けて、社会福祉学に補足する課題として、社会生態学と相互作用秩序の問題を設定し、「社会学的ソーシャルワークとその教育法の開発」に向けた準備を進めた。この課題を追求する研究に向けて、学会大会で司会を務めたほか、法学や経済学、政治学などの社会科学の研究者が集う研究ネットワークに参加し組織化を試みた。3年目にあたる年度において、貧困対抗活動の生態系と個人的/社会的レジリエンスを社会変動論の文脈で検討する論文を共著本という形で発表することができたとともに、福祉社会の構築に関して、社会学の視点からの福祉実践、およびシカゴ学派社会生態学・相互作用秩序論などに基づく「社会学的ソーシャルワークとその教育法の開発」に関する課題設定が可能になったことは、本研究のひとつの進捗状況を表していると考えられるため。初年度の研究計画において枠組みを設定したように、本研究における貧困対抗活動の生態系は、「1ネットワーク系、2「草の根」連帯経済系、3グリーン/アース系、4ソーシャル系」に類型化できる。
樹木の健康診断のための抽出成分分析

外的ストレスに樹木が反応して生成する物質(ファイトアレキシン)解析することで、樹木の健康を診断する方法を検討した。衰弱樹と健全樹を選定し,樹幹流,枝葉揮発物質および溶剤抽出物、及び羅病組織の溶剤抽出物を分析した結果、(1)常緑針葉樹のスギ、アカマツにおける強い酸性樹幹流は樹木の健康を示す指標である。2)スギ稚病は衰弱(細断、赤ガレ病、およびエスレル投与)により、揮発性物質として、α-ピネン、β-ピネン、ミルセン、カンフェンなどをファイトアレキシンとして放出する。(3)スギ苗木の枯死(赤ガレ)は根の病気である。ヘキサン、酢酸エチルおよびメタノール抽出物量は茎幹では健全、黄変、枯死(赤ガレ)の順に減少し、根ではこの順で増加した。ヘキサン抽出部か弾離たモノおよびジテルペンはファイトアレキシン活性を示した。(4)生細胞(枝葉、形成層)のSDS-PAGE法によるペルオキシダーゼは、樹木の健康と関連する明確な関連を認めるに至らなかった。(6)材線虫病アカマツの罹病組織抽出物はα-ピネン、未同定セスキテルペン一種、デヒドロアビエチン酸を主成分とした。7)漏脂病琉球マツの場合、分泌樹脂はα-ピネン、β-ピネン、カンフェンを主成分とし,デヒドロアビエチン酸の他、イソピマール酸など多種の遊離ピマラン型樹脂酸類が存在した。主ファイトアレキシン疑惑物質の生物検定試験は、供試試料の入手が困難なため一部に留まっているが、テルペン化合物、特にモノテルペン類のカンフェン、α-およびβ-ピネン、β-ミルセン、ジテルペン類のフェルギノール,サンダラコ・ピマラジェン-19-オール、シス・コムニ酸に強いファィトアレキシン活性が認められ、これらの化合物は樹木の健康診断の指標物質となる可能性がある。平成12年度の研究は下記項目について実施した。1.病徴指標化合物の検出については(1)枯死木、罹病・衰弱木と健全木の枝葉、幹、根の溶剤(ヘキサン、酢エチ、メタノール)可溶成分の定量とGC-MS法による物質同定により相互比較の結果、罹病木は衰弱が進むにつれ、根の抽出物量が増加し、幹抽出物量が減少する傾向が認められた。枝葉ではヘキサン抽出物量に変化は少ないが、酢エチ、メタノール抽出物量は衰弱とともに増加することが分かった。罹病・衰弱でモノ及びセスキテルペン含有量が多くなり、枯死により減少するが、ジテルペン炭化水素成分については変化がほとんどないことが分かった。質的にはジテルペン成分に特異的挙動を示す化合物が観察されたが、モノおよびセスキテルペン成分には格別な特徴は把握できなかった。(2)罹病木と健全木形成層(樹幹流水)の成分分析の結果、罹病あるいは衰弱木において樹幹流水のpHが強く酸性化する傾向が認められた。(3)生細胞(枝葉、形成層)のSDS-PAGE法によるタンパク質(アイソザイムを含む)の相互比較は明確な相違を認めるに至らなかった。(4)罹病木は自然生態系において見いだされるものと、エチレン発生剤(エスレル)施用により人為的に衰弱化させたものとを用いたが、後者は施用時期に大きく影響されることがわかり、エスレル投与によるACC、エチレンの発生は認められなかった。2.主ファイトアレキシンのキノコ(担子菌など)類に対する菌糸伸張、子実体発生の阻害、あるいは促進活性の試験は現在進行中である。

外的ストレスに樹木が反応して生成する物質(ファイトアレキシン)を解析することで、樹木の健康を診断する方法を検討した。ファイトアレキシンの供給を枝葉からの揮発、林内雨や樹幹流などの給水、および罹病組織周辺への樹脂分泌に分け、病徴指標化合物の検出を目的に成分の比較を試みた。衰弱樹と健全樹の樹幹流、枝葉揮発物質および溶剤抽出物、及び罹病組織の溶剤抽出物を分析した結果、次の結論が得られた。(1)常緑針葉樹のスギ、アカマツにおける強い酸性樹幹流は樹木の健康を示す指標である。(2)衰弱(細断、赤ガレ病、およびエスレル投与)苗木の揮発性物質として、α-ピネン、β-ピネン、ミルセン、カンフェンなどが検出されたが、エチレン、エタノール等は観察できなかった。(3)スギ苗木のn-ヘキサン抽出物量は衰弱で減少し、成分的にはモノ及びセスキテルペン含有量が多くなるが、ジテルペン炭化水素成分については、ほとんど差がなかった。酢エチ、メタノール抽出物量は、フェノール成分を主体とし、衰弱とともに枝葉と根で増加し、茎幹で減少した。(4)材線虫病アカマツの罹病組織抽出物はα-ピネン、未同定セスキテルペン、ピノシルビン関連フェノール、デヒドロアビエチン酸を主成分とし、漏脂病琉球マツの場合、α-ピネン、β-ピネン、カンフェンを主成分とし、セスキテルペン類は、ほとんどないが、デヒドロアビエチン酸など多量の遊離樹脂酸類とともにイソピマール酸メチルエステルなどのメチル化樹脂酸が相当量存在した。(6)生細胞(枝葉、形成層)のSDS-PAGE法によるタンパク質の相互比較は明確な相違を認めるに至らなかった。(7)主ファイトアレキシン疑惑物質の生物検定試験は現在、未だ進行中であるが、存在の確認された、ほとんどの化合物、特にモノテルペン化合物には阻害活性が認められ、これらの化合物は健康診断の指標物質となる可能性がある。
組織トロンビンに関する研究

拡張型心筋症患者の血液では血液凝固カスケードの最終産物であるトロンビンが亢進している事が報告されている。そのため、拡張型心筋症ではこの組織トロンビンが亢進している可能性がある。そこで、我々は拡張型心筋症モデルマウス(&#8710;K210 knock-in mice (B6;129-Tnnt2 tm2Mmto))(DCMマウス)を用いて組織トロンビンが拡張型心筋症の病態に関与しているかどうかを検討した。DCMマウスに直接的トロンビン阻害薬であるダビガトランを投与すると心機能および生存率の改善が認められた。以上より組織トロンビンが拡張型心筋症の病態に関与している可能性が示された。今回、我々は拡張型心筋症モデルマウスにおいてαSMAを含む線維化マーカーが亢進する事を予想していた。しかし、予想に反してαSMAなどの線維化マーカーは上昇を認めなかった。心臓組織中のプロトロンビンの蛋白質量は拡張型心筋症モデルにおいて上昇しており、組織におけるトロンビンの関与が疑われる事を確認した。そこで、トロンビン抑制薬であるダビガトランを経口投与したところ、拡張型心筋症マウスにおいて心臓における心収縮能の改善が認められた。また、心重量の増加も抑制されており、生存曲線においてはダビガトランを投与した拡張型心筋症マウスにおいて有意に生存率の改善が確認出来た。トロンビンが拡張型心筋症の病態に関与している事が確認出来たが、このメカニズムをさらに追及した。ERK・p38・JNKのリン酸化、Aktのリン酸化を調べたが拡張型心筋症マウスでの上昇は見られなかった。同様にIκB、MCP-1の変化も見られなかった。トロンビンとアポトーシスの関与は既に報告があるためcleaved caspase 3、cleaved caspase 9を検討したところ、cleaved caspase 9は変化が無かったが、cleaved caspase 3において、拡張型心筋症マウスにおいて上昇が認められ、ダビガトラン投与にて有意に抑制された。そこでアポトーシスの関与を考えTUNEL染色を施行、ダビガトラン投与にて拡張型心筋症マウスにおけるアポトーシスは抑制される傾向にあった(統計学的有意差はなし)。さらに他の分子も検討するためマイクロアレイ解析を施行、Casq1・Postn・Myh7が拡張型心筋症マウスにおいて上昇しダビガトランで抑制されたが、蛋白質レベルの検討では有意差は認められなかった。血液凝固カスケードの最終産物であるトロンビンはprotease activated receptor-1を介して、胃の収縮、障害血管の修復、血小板凝集など様々な生理的作用を示すことが知られている。トロンビンは様々な組織に存在し内皮細胞や線維芽細胞でもその存在が確認されている。我々は心臓においても組織トロンビンが存在する事をヒトの剖検心を用いて免疫組織学的に証明した(Ito. K, PloS One, 2013)。一方、拡張型心筋症患者の血液では血液中のトロンビンが亢進している事が報告されている。心臓組織にもトロンビンは存在するため、拡張型心筋症ではこの組織トロンビンが亢進している可能性がある。そこで、我々は拡張型心筋症モデルマウス(B6;129-Tnnt2 tm2Mmto)を用いて組織トロンビンが拡張型心筋症の病態に関与しているかどうかを検討した。拡張型心筋症モデルマウス(DCM群)に対して、4週目から8週目まで直接的トロンビン阻害薬であるダビガトランを6g/日投与した群(DCM+D群)、およびwild type(Wild群)の3郡を比較検討した。DCM群ではWild群と比較して心重量の増加が認められたが、ダビガトラン投与により心重量の増加が抑制されていた。また、心臓超音波検査ではDCM群では左室収縮能の低下が認められたが、ダビガトラン投与により改善が認められた。そして、生存率もDCM+D群の方がDCM群と比較して改善されていた。心臓における蛋白質発現をウェスタンブロット法を用いて検討するとWild群と比較してDCM群では有意にトロンビンの発現が増加していた。TUNEL染色を行った結果、DCM群で見られたTUNEL陽性細胞がダビガトラン投与により抑制されておりアポトーシスの関与が示唆された。以上より拡張型心筋症の病態には組織トロンビンが関与していると考えられた。当初予定していなかった組織トロンビンの心機能に及ぼす影響について考察する事が出来た。そこで、次に心筋特異的プロトロンビン過剰発現マウスの作製を予定する事が出来た。

現在αMHC-prothrombin-SV40Aのコンストラクトは完成し、マウスを作製する段階である。そのため、当初の計画以上に進展していると言える。循環器内科学心臓特異的プロトロンビン過剰発現マウスを作製し、プロトロンビン過剰発現により心機能に影響が出るかどうかを検討していく。プロトロンビン過剰発現マウスを作製するので、業者にマウス作製委託をしなければならないため。プロトロンビン過剰発現マウス作製のために使用します。