hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結晶相転移とプロトン移動互変異性化による結晶色調変化の解明

結晶周囲の環境である湿度や有機蒸気に応じて結晶が相転移し、色調変化を示すベイポクロミズム有機結晶の原理を明らかにし、さらに効率的に色変化を示す有機結晶を設計した。キノロン系抗生物質ピペミド酸三水和物結晶はアセトニトリル蒸気・水蒸気適用により、結晶相脱水和・水和を起こし、無水和物結晶・三水和物結晶に可逆的に転移する。この際に無色から黄色への色調変化をベイポクロミズムとして示す。粉末未知結晶構造解析法を駆使した結晶構造解析の結果、分子間水素結合の変化を引き金とする分子内プロトン転移が起こり、分子軌道のエネルギーレベルが変化して色調変化を引き起こすメカニズムが明らかとなった。本研究は、結晶周囲の環境である湿度や有機蒸気に応じて結晶が相転移し、色調変化を示すベイポクロミズム有機結晶に関するものである。この特異な現象の原理を明らかにし、さらに効率的に色変化を示す有機結晶を設計することを目的としている。特に三次元の詳細な分子構造変化を結晶解析により明らかにし色変化の原因を解明するが、そのなかでも粉末状態の結晶から構造解析を可能にする、粉末未知結晶解析法を重要な手法として用いる。本年は、ベイポクロミズムを示す系を広く探索した。有機物ではプロトン転移現象がしばしば見られる。これは分子内では互変異性や双性イオン形成、分子間では塩形成として知られている。この現象は分子軌道のエネルギーレベルに影響し色調変化を引き起こすだけでなく、結晶相転移のような比較的小さい結晶環境変化によって引き起こされる可能性があることに注目し、分子内プロトン転移の可能性がある物質系を探索した。その中でも双性イオン形成に注目し、分子内にプロトンソースとしてカルボキシ基と受容体である酸素または窒素原子をもつ化合物として、キノロン系抗生物質群を見出した。例えば、ピペミド酸は有機結晶の水和・脱水和に伴い双性イオン状態になり、末端のカルボキシ基からプロトンが転移する。その際カルボキシレートとなることにより、分子内水素結合による安定な擬六員環構造が破れ、キノロン部位の共役が変化することで可視吸収スペクトルが長波長シフトし、無色から黄色結晶へと色調変化することを見出した。特に三次元の詳細な分子構造変化を結晶解析により明らかにし色変化の原因を解明する。実施二年目は、前年度に新規なベイポクロミズム有機化合物として見出された、キノロン系抗生物質群に関して集中的に研究を行った。この系では、分子内プロトン転移による双性イオン形成が分子軌道のエネルギーレベルに影響し、色調変化を引き起こしている。プロトン転移が蒸気による結晶の溶媒和のような比較的温和な条件で可逆的に起きることは、この系の「蒸気センサー」としての応用を示唆しており興味深い。前年度は有機蒸気の接触により、脱水和転移、分子内プロトン転移を経て色調変化を示す系を見出したが、今年度は有機蒸気の選択肢を広げるために塩基性分子の蒸気に注目した。この分子を結晶内に吸収し共結晶形性をすると、キノロン系分子と塩形成が起こり、強制的に塩基へプロトン転移が起きることが期待される。このような積極的なプロトン転移系を探索することで、多様なの塩基性分子を検出する結晶を作成することが可能である。例えば、エンロフロキサシン無水和物結晶は黄色であるが、代表的な塩基性分子であるモルフォリンの蒸気と接触することにより、結晶内にモルフォリン分子を取り込む。この結果、エンロフロキサシンは末端のカルボキシ基からプロトンが脱離したアニオンとなり、分子内水素結合による安定な擬六員環構造が破れ、キノロン部位の共役が変化することで可視吸収スペクトルが長波長シフトし、黄色から無色結晶へと色調変化することを見出した。広範囲な物質探索の結果、キノロン系抗生物質結晶がベイポクロミズムを示すことを発見した。ピペミド酸三水和物結晶はアセトニトリル蒸気・水蒸気適用により、結晶相脱水和・水和を起こし、無水和物結晶・三水和物結晶に可逆的に転移する。エンロフロキサシン無水和物結晶は黄色であるが、代表的な塩基性分子であるモルフォリンやアンモニア蒸気と接触することにより、結晶内に蒸気中の分子を取り込む。結晶構造解析の結果、エンロフロキサシンは末端のカルボキシ基からプロトンが脱離したアニオンとなり、分子内水素結合やキノロン部位の共役が変化することで黄色から無色結晶へと色調変化するメカニズムを明らかにした。エノキサシンと安息香酸誘導体との共結晶結晶を設計・作成した。

この水和物結晶は薄茶色であるが、四種類のアルコール蒸気を結晶内に取り込み、黄色へと可逆的に変化する。この結晶構造変化により分子間のCT相互作用が変化し色調変化したことを明らかにした。本研究ではこれら3種類のベイポクロミズム結晶を設計し、蒸気による結晶構造変化をという温和な条件で可逆的な色調変化に成功した。有機結晶の「蒸気センサー」としての応用を示唆していることは重要である。結晶周囲の環境である湿度や有機蒸気に応じて結晶が相転移し、色調変化を示すベイポクロミズム有機結晶の原理を明らかにし、さらに効率的に色変化を示す有機結晶を設計した。キノロン系抗生物質ピペミド酸三水和物結晶はアセトニトリル蒸気・水蒸気適用により、結晶相脱水和・水和を起こし、無水和物結晶・三水和物結晶に可逆的に転移する。この際に無色から黄色への色調変化をベイポクロミズムとして示す。粉末未知結晶構造解析法を駆使した結晶構造解析の結果、分子間水素結合の変化を引き金とする分子内プロトン転移が起こり、分子軌道のエネルギーレベルが変化して色調変化を引き起こすメカニズムが明らかとなった。研究計画では、第二年度以降に(1)共結晶作成による新規ベイポクロミズム結晶の創製、(2)ベイポクロミズム反応後の粉末結晶解析、(3)まとめを行う、としている。(1)については、本年度に見出したエンロフロキサシン無水和物結晶はモルフォリン蒸気を吸収することで塩共結晶を形成し、黄色から無色へのベイポクロミズムを示したことから、目的を十分に達成したと言える。(2)の粉末結晶解析については、エンロフロキサシン・モルフォリン共結晶の粉末X線回折測定を行うとともに、共結晶の溶液成長を行い、それぞれのX線回折パターンを比較したところ、同一性が確認できたことから、単結晶構造解析法を使用することに切り替えた。ただし、蒸気反応による結晶性試料作成とその高分解能X線回折測定には高度な技術を必要とし、粉末結晶解析の経験が大いに生きている。(3)のまとめについては、着手しており、次年度に向けて着実に実行する予定である。以上より、計画は概ね順調に進展していると判断した。有機結晶化学今後の方針としては、さらに多様な有機蒸気によるベイポクロミズムの発現系の探索を行う。特に、より大きな有機分子によるベイポクロミズムを期待している。大きな分子を吸収するためには、比較的隙間がある結晶を必要とするため、クリスタルエンジニアリングを利用し、隙間のある結晶を設計する。実際には共結晶形成が有望であると考えている。安定な共結晶を作成するための分子は安息香酸誘導体を検討しており、強い酸・塩基相互作用による共結晶形成を行う。一方、吸収(検出)するより大きな分子については、多種のアルコール有機溶媒を検討する。またトルエンなど有害蒸気として検出方法の開発が望まれている物質があり、ターゲットとしてふさわしいと考えている。また、結晶構造の安定性を理論計算を用いて証明することを計画している。このためにはDFT-D法が適しており、予備的な調査を行った。この計算は結晶構造解析に誤りがないかどうかを保証する手法としても適しており、粉末結晶解析には必須の技術である。
大動物用レントゲン診療車による乳牛潜在疾患の集団検診に関する研究

乳牛の潜在病変を摘発し、生産者の経済的損失を最小限にとどめることを目的に、大動物用レントゲン車を利用して牛舎単位の乳牛に集団検診を実施し、集団検診の実施法の確立と、得られた透視所見による潜在病変に注目した予防獣医学の実施、さらに集団検診実施の意義と効果について総合的に検討を行った。材料は、研究期間に実施した集団検診症例1970頭と過去における集団検診所見を合わせた6968症例について検討した。1.集団検診には、電算処理集計のためのdata入力及び集計分類用プログラムの開発を行い、data bankの構築と集団検診の実施法を確立した。2.乳量および授精回数についての調査成績では、実施各牛舎の各年度における1頭当り平均年間乳量の増加と平均授精回数の減少傾向がみられた。3.病傷発生率の調査成績より、繁殖障害、妊娠(産前産後)疾患、循環器障害、消化器疾患の減少率が高い傾向を示した。この様に集団検診の実施により、実施地区の病傷発生率の低下があることが判明した。4.集団検診所見の分類集計の結果をもとに、体躯内の各部位のX線透視所見の特徴病変を収録することにより577例の病変像を新たな診断に際しての症例と比較することが可能となった。消化管内ガス像(第三胃、小腸、結腸)と胸腔内異常陰影像は集団X線検査によって初めて明らかにされた潜在病変であって、これらを異常所見とする判断は本研究により初めて成された。5.集団検診の実施効果については間接的効果が主体であるので生産環境内に集団検診の成績をいかに利用活用するかが問題になるが、集団検診の実施は生産者の疾病発症予防に対する啓蒙と臨床獣医師の再教育さらに学生教育に多大の効果があるものと判断された。今後、これらのdataを最大限に利用する獣医情報処理診断への拡大研究が必要とされる。昭和61年度大動物用レントゲン診療車による乳牛の潜在性疾患に対する集団検診実施頭数は、718頭で、実施町村は、別海町,足寄町,新得町,帯広市,浦幌町,広尾町,士別市の7カ市町村であった。本研究の目的は、日常飼育されている乳牛の潜在病変の摘発とその予防が大きなポイントであり、この目的に於て次の項目に関する問題点の解決を必要とする。1.多大な検診データーの個々の所見に対する電算処理集計のためのプログラムの開発2.潜在病変の摘発と、その原因の究明並びにその対策と実施3.個体毎におけるX線透視所見の解析と保存4.肝臓に対する超音波像の画像計測処理、以上の4点が本研究の遂行上重要な問題点となる。1の項目については、データー入力用及び集計分類用プログラムが完成し、その試行結果も非常に満足の行くものであった。即ち、入力されたデーターから8項目の所見を持つ頭数と比率を集計するのに205頭について試行した結果、計数時間は僅か3分弱であった。今後残る2ケ年度の実施頭数を加えて集計の予定である。2については本年度は第2胃内金属異物存在牛に対する予防措置を重要視し、別海町においては4064頭、足寄町においては204頭計4268頭の乳牛に創傷性疾患の予防のためのマグネットを投与し、次年度のその予防効果判定に備えた。3については、昭和61年度購入の光ディスクレコーダーにより個々の特色を有する所見を収録し、各々の所見の差異について現在比較検討中である。

4については、肝超音波エコーのヒストグラム計測を確立し、個々の病変における分類化を可能とした。この所見の一部については、第103回日本獣医学会において発表予定である。昭和62年度大動物用レントゲン診療車による乳車の潜在性疾患に対する集団検診実施頭数は, 634頭で,実施町村は,別海町,足寄町,帯広市,浦幌町,の4ヶ市町村であった.本研究の目的は,日常飼育されている乳牛の潜在病変の摘発とその予防が大きなポイントであり,昭和62年度に於いては,飼養管理状況の違いによる消化管潜在病変との関連について調査し,同時に足寄町内に於ける異常潜在病変を有する牛舎に対して荻剤投与による集団予防効果の検討を実施した.金属異物による消化管障害の予防のために実施しているマグネットの投与効果については,前年度以前投与農家の再検診によって, 80%以上のマグネット存在率で,マグネットに磁着している金属異物の状態から其の効果が充分にあると判断された.しかしこれらの詳細については,現在検討中である.X線検査により消化管の潜在病変が多くみられた2牛舎に対する薬剤投与にらる症状顕性化予防対策については,薬剤の投与前後において非投与牛群を含け延べ70頭の検査を行ない比較検討した結果, X線検査所見においては,薬剤投与,非投与群とも著名な差は認められなかったが,薬剤投与による繁殖成績,産乳量の変化については現在調査中である.本研究の実施において,創傷性疾患の予防を行なう上で概念として異物に対する積極的な対策に加えて, X線診療車を利用した牛舎単位の綿密な状況の把握が必要であることを明らかにした.其の概要については,第104回日本獣医学会において発表した.超音波診断装置を応用した乳牛の潜在病変の摘発には本年度は乳房炎について検討を行ない超音波所見より慢性券腺炎症例,急性出血性乳腺炎症例,正常乳腺について明確な区別が可能であり潜在病変の摘発に非常に有為な手段であることを確認した.昭和63年度の大動物用レントゲン車による乳牛の潜在性疾患に対する集団検診実施頭数は618頭で、実施町村は、帯広市、別海町、根室市、足寄町、中標津町、標津町、浦幌町の7ヵ市町村であった。本年度は、本研究の最終年であるので3カ年間集団検診を実施した地区、あるいは牛舎の産乳量、病傷発生率の変化を調査し、また現在までに得られたX線透視検査所見、および超音波所見を整理し乳牛の体腔内臓器病変の診断基準を確立した。さらに大動物用レントゲン車による乳牛の集団検診の効果について総合的に評価した。1.乳量および受精回数の調査成績では、各牛舎の各年度における1頭当り平均年間乳量の増加と平均受精回数の減少傾向がみられた。2.病傷発生率の調査成績より、地域の異なるA町およびB町の各病傷の発生率の昭和59年と昭和62年の変化率においては、繁殖傷害、妊娠(産前産後)疾患、循環器傷害、消化器疾患の減少率が高い傾向を示した。この様に集団検診の実施により、実施地区の病傷発生率の低下があることが判明した。3.集団検診所見の分類集計の結果をもとに、体躯内の各部位のX線透視所見の特徴病変を収録することにより、577例の病変像を新たな診断に際しての病例と比較することが可能となった。消化管内ガス像(第三胃、小腸、結腸)と胸腔内異常陰影像は集団X線検査によって初めて明らかにされた潜在病変であって、これらを異常所見とする判断は本研究により初めて成された。4.集団検診の実施効果については間接的効果が主体であるので、生産環境内に集団検診の成績をいかに利用活用するかが問題になるが、集団検診の実施は生産者の疾病発症予防に対する啓蒙と臨床獣医師の再教育さらに学生教育に多大の効果があるものと判断された。
大腸癌進展を負に制御するコレステロール酸化代謝物のメカニズムの解明

大腸癌細胞特異的にアノイキスを誘導する生理的分子である25-ヒドロキシコレステロール(25-HC)に対し、拮抗する効果をもつ化合物を探索するために、これまで利用していた足場非依存性増殖活性スクリーニング系に加え、三次元培養増殖活性スクリーニング系を確立した。三次元培養増殖活性スクリーニング系により、より生体内の環境に近い状態でのスクリーングが可能になったことに加え、データ間のばらつきを押さえ込むこと、また1アッセイに必要な日数を5日間から3日間に短縮することに成功した。これらを利用し、文部科学省新学術領域研究『がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動』班より配布された標準阻害剤キットを用いた探索をおこなった。その結果4種の候補化合物を選抜し、そのうちのひとつであるDFMOについては詳細な検討をおこなった(他の3種類についても引き続き検討中である)。DFMOはポリアミン合成酵素の阻害剤であるが、これまでにコレステロール代謝やシグナル伝達系に関与するという報告はなされていない。細胞内あるいは大腸管腔の食塊内に大量に存在するポリアミンとコレステロールの代謝系の接点として、25-HCによる大腸癌細胞のアノイキス誘導現象が起こる可能性がある。大腸管腔という身体内でも特異な環境において、食生活が多大な影響を与えることが判明している大腸がんの発症・進展のメカニズムにおいて新たな知見を開くものである。現時点で得られているデータを2018年3月の日本農芸化学会(名古屋)で報告した。家政学部から薬学部への異動にともなう諸事処理の対応により、研究時間が確保できなかった。そのため、研究期間の1年延長を申請し、受理された。大腸癌細胞特異的にアノイキスを誘導する生理的分子である25-ヒドロキシコレステロール(25-HC)に対し、化学的にリンカーを導入し、結合する分子を同定する計画を立案していた。しかし、リンカー導入25-HCの合成に困難が生じている。量的な確保も視野にいれ、現在コレステロールからの合成にトライしている。研究計画のフォローとして行なっていた阻害剤ライブラリからのスクリーニングにより、ポリアミン合成阻害剤DFMOが25-HCのアノイキス誘導活性と拮抗することを発見した。現在メカニズムを解析中である。引き続き、リンカー導入25-HCの大量合成の検討をおこなう。フォロー研究から発展したポリアミン合成阻害剤DFMOの25-HC誘導性アノイキスに対する拮抗効果についてメカニズム探索をおこなう。血球系以外の通常細胞は、生存・増殖のために「足場」を必要とし、足場が失われた場合にはアポトーシス(アノイキスと呼称)をおこす。一方、ほとんどの癌細胞ではアノイキスは強く抑制されている。この「癌細胞の足場非依存的増殖」のメカニズムは現時点でも不明な点が多いが、その性質上、細胞接着や細胞骨格に着目した研究が行われている状況である。研究担当者は、大腸癌細胞株DLD-1の強制浮遊培養系を用いたスクリーニングにより、生理活性物質である25-hydroxycholesterol(25-HC)がアノイキスを誘導すること、しかし、接着状態のDLD-1細胞にはアポトーシスを誘導しないことを見出している。本研究で25-HCの標的分子を同定することを主要な目的とし、その後の展開として、同定した分子を足掛かりに「癌細胞の足場非依存的増殖」メカニズムあるいは「癌細胞のアノイキス抵抗性獲得」メカニズムの解明を目指す。で25-HCの標的分子を同定するために、25-HCの分子骨格を維持したさまざまな分子ライブラリを構築し、それらに対してスクリーニング系を活用しつつ、標的タンパク質の釣り針に足る分子の探索・獲得を目指している。本年度においては、7-Keto-3,25-dihydoroxycholesterolという有望候補分子の同定に成功したため、引き続き研究計画の継続を進める。また、このスクリーニングの過程で、25-HCの3位に硫酸基を導入した25-HC-3-sulfateが25-HCと全く逆に、浮遊培養大腸癌細胞株DLD-1の増殖を加速させることを見出した。この発見は、酸化ステロール代謝ネットワーク環境が癌の悪性度に影響を与えることを示唆するものであり、余裕のある範囲で、検討を進めたいと考えている。当初計画のように目的分子の同定までには至っていないが、その前段階でもっとも困難が予想されていた「アノイキス活性を保持するリンカー導入25-HC」の作成に目処が立ち、「当初計画のように進まない場合の対策」に記載していた事項を実施する必要がなくなったと想定される点を最も自己評価している。また副次的に、生体内の酸化コレステロール代謝ネットワーク環境と癌の悪性度の関連を示唆するような知見が得られたことも大きい。血球系以外の通常細胞の多くは、生存・増殖のために「足場」を必要とし、足場が失われた場合にはアポトーシスをおこす。このアポトーシスは特別にアノイキスと呼称されている。この「癌細胞の足場非依存的増殖」のメカニズムは現時点でも不明な点が多いが、その性質上、細胞接着や細胞骨格に着目した研究が行われている。癌の転移は、さまざまなプロセスをクリアした結果に生じてしまう多段階的な現象であるが、この「癌細胞の足場非依存的増殖」は、その最も根本的な条件であるといえる。本研究では、大腸癌細胞株DLD-1の強制浮遊培養系を用いて、酸化コレステロールの一種である25-hydroxycholesterol(25-HC)がアノイキスを誘導するメカニズムについて、検討をおこなっている。

この過程で、25-HCの代謝産物である25-HC-3-sulfateが、大腸癌の足場非依存的増殖を25-HCとは逆に活性化していることを明らかにした。25-HCアナログを用いた標的タンパク質の探索は、アナログ種と条件の検討を継続しておこなっている。また25-HCこれまでにROCK1がアノイキス誘導におおきな役割を果たしていたことを明らかにしていたが、その直接の上流であるRhoそのものが直接活性化されていることを見出した。この結果は、25-HCが細胞膜-細胞骨格系の情報伝達システムに直接影響を与えうることを示唆するもので、最近報告が相次いでいる25-HCの免疫応答系への役割を理解するための新たな議論の土台となると考えられる。本年度より家政学部から薬学部へ異動となったため、事前の準備・対応が必要となり、研究時間の確保に苦慮したため。大腸癌細胞特異的にアノイキスを誘導する生理的分子である25-ヒドロキシコレステロール(25-HC)に対し、拮抗する効果をもつ化合物を探索するために、これまで利用していた足場非依存性増殖活性スクリーニング系に加え、三次元培養増殖活性スクリーニング系を確立した。三次元培養増殖活性スクリーニング系により、より生体内の環境に近い状態でのスクリーングが可能になったことに加え、データ間のばらつきを押さえ込むこと、また1アッセイに必要な日数を5日間から3日間に短縮することに成功した。これらを利用し、文部科学省新学術領域研究『がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動』班より配布された標準阻害剤キットを用いた探索をおこなった。その結果4種の候補化合物を選抜し、そのうちのひとつであるDFMOについては詳細な検討をおこなった(他の3種類についても引き続き検討中である)。DFMOはポリアミン合成酵素の阻害剤であるが、これまでにコレステロール代謝やシグナル伝達系に関与するという報告はなされていない。細胞内あるいは大腸管腔の食塊内に大量に存在するポリアミンとコレステロールの代謝系の接点として、25-HCによる大腸癌細胞のアノイキス誘導現象が起こる可能性がある。大腸管腔という身体内でも特異な環境において、食生活が多大な影響を与えることが判明している大腸がんの発症・進展のメカニズムにおいて新たな知見を開くものである。現時点で得られているデータを2018年3月の日本農芸化学会(名古屋)で報告した。家政学部から薬学部への異動にともなう諸事処理の対応により、研究時間が確保できなかった。そのため、研究期間の1年延長を申請し、受理された。大腸癌細胞特異的にアノイキスを誘導する生理的分子である25-ヒドロキシコレステロール(25-HC)に対し、化学的にリンカーを導入し、結合する分子を同定する計画を立案していた。しかし、リンカー導入25-HCの合成に困難が生じている。量的な確保も視野にいれ、現在コレステロールからの合成にトライしている。研究計画のフォローとして行なっていた阻害剤ライブラリからのスクリーニングにより、ポリアミン合成阻害剤DFMOが25-HCのアノイキス誘導活性と拮抗することを発見した。現在メカニズムを解析中である。
体液性調節因子の支配を受けない肝臓の自律的血糖調節機構と新規降血糖薬の開発

肝臓のグルコキナーゼ(GK)は血糖値を感知して、低血糖時には核へ高血糖時には細胞質へ移行する。このGKの細胞内移行によって、血糖値は調節されている。今回の研究で、ヒト腎由来細胞株HEK293には、グルコースを感知してGKを輸送する機構が欠損している明らかとなった。さらに、GKの移行に関与する蛋白質に対する抗体を作成し、蛋白質の局在性と蛋白質-蛋白質相互作用を測定できるようになった。平成24年度において、グルコキナーゼ(GK)と橙色蛍光蛋白質である単量体型Kusabira-Orange (mKO)との融合蛋白質を発現する細胞株の作成を試みた。その結果、ポジティブコントロールとして用いたヒト腎臓由来のHEK293細胞では、この融合蛋白質を安定に発現する細胞株の作成に成功したが、本来の研究目的であった肝臓由来のHepG2細胞においては発現が見られなかった。平成25年度は、HepG2細胞においてもこの融合蛋白質を発現させるために、発現ベクターの改良を行った。まずHepG2細胞の異種蛋白質分解系を回避する目的で、GKとmKOの間にグリシンに富む21アミノ酸残基のペプチドのリンカーを挿入した。これはGKとmKOとの間隔を広げて、相互の立体障害を軽減し、ユビキチンリガーゼから認識されにくくするためである。しかし、改良した発現ベクターを用いてもHepG2での融合蛋白質の発現はなく、逆にこのリンカー部分がプロテアーゼの標的となり、HEK293細胞においてもGKとmKOが分離した状態で細胞質に蓄積していた。現在この融合蛋白質がHepG2細胞において安定に発現する条件を探索している。これと並行して、抗体を用いてGKの細胞内局在性を明らかにする目的で、GK及びグルコキナーゼ調節蛋白質(GKRP)を単独で発現するベクターを各々pEBMulti-HygとpEBMulti-Neoを用いて構築し、HEK293及びHepG2の細胞に形質転換させた。現在Hyglomycin BとG418を選択マーカーにして、安定発現株の樹立をおこなっている。次に前回の実施状況報告書で述べたGKとmKOの融合蛋白質を発現するHEK293細胞を用いたグルコースセンサーのクローニングの計画であるが、ラット肝臓のcDNAライブラリーを構築し、スクリーニングの準備を始めている。グルコキナーゼ(GK)の細胞内局在性をハイスループットに測定するために、GKと蛍光蛋白質である単量体型Kusabira-Orange(mKO)との融合蛋白質を安定に発現する細胞株を作成した。ラット肝臓からGKのcDNAをPCR法で調製し、そのC-末端でmKOが融合する組換えDNAを作成した。これを真核細胞の発現ベクターであるpEBMulti-Hygにサブクローニングした後、ヒト肝臓由来のHepG2及び腎臓由来のHEK293細胞に遺伝子導入し、Hygromycinを用いて形質転換株を選択した。この結果、融合蛋白質を発現するHEK293細胞株を樹立したが、HepG2細胞においては、その発現量が極めて少ないため蛍光顕微鏡を用いた写真撮影の露光時間が著しく長引き、測定が行えなかった。この細胞において蛍光蛋白質の発現量が少ない原因は、おそらくHepG2の異種蛋白質の分解活性が高いためであると思われる。今後、GKとmKO間のリンカーの構造等を変えて分解を受けにくい融合蛋白質を設計することで、HepG2における蛍光蛋白質の発現量の増加させる。次に融合蛋白質の発現に成功したHEK293細胞を用いて、培地中のグルコース濃度の変化によるGKの細胞内局在性を観察した。この細胞株においては、意外なことにGKの核-細胞質間での局在性の変化が見られなかった。さらにこの細胞に、グルコキナーゼ調節蛋白質(GKRP)を共発現させても、同じ結果であった。このことは、通常の肝細胞に存在するグルコースの濃度変化を感知してGKの細胞内局在性を変化させる機構が、HEK293細胞では欠如していることを意味している。この知見を利用して、肝細胞のcDNAライブラリーをHEK293に発現させ、グルコース濃度の感知能が回復する細胞株をクローニングすれば、肝細胞のグルコースセンサーの正体を明らかにすることができる。肝臓のグルコキナーゼ(GK)は、低血糖時には核へ高血糖時には細胞質へと移動することで、血糖値を調節している。本研究の目的は、肝細胞がどのような機構で血中のグルコース濃度を検知して、核-細胞質間のGKの輸送を行っているのかを明らかにすることである。この目的のためにGKと橙色蛍光タンパク質である単量体型Kusabira-Orange(mKO)との融合タンパク質をヒト肝細胞由来のHepG2細胞に発現させ、ハイコンテンツ蛍光顕微鏡を用いて、その細胞内局在性をハイスループットに測定できる実験系の開発を検討した。しかしGK-mKOの融合タンパク質は、ポジティブコントロールとして用いたヒト腎臓由来のHEK293細胞での発現は見られたものの、本来の目的であるHepG2細胞内での発現は見られなかった。HEK293細胞での発現があることから、この発現ベクターそのものの構造は問題がないと考えられる。このことから融合タンパク質がHepG2細胞で発現が見られないのは、HepG2細胞特異的な異種タンパク質分解系によって分解を受けているためであると思われた。

そこでGKとmKO相互の立体障害を軽減してタンパク質を安定化する目的で、これらのタンパク質の間に21アミノ酸残基のペプチドリンカーを挿入するなどのベクターの改良を行ったが、発現効率の改善は見られなかった。このため、融合タンパク質を用いた高能率な実験系の作製を断念し、細胞内での安定性が良いGKを単独に発現させて、その特異的抗体を用いてその局在性を測定する方向に実験を方向転換した。平成26年度は、GK及びGKと結合するタンパク質を大腸菌を用いて発現させ、ウサギを用いて抗体を調製した。【研究期間全体を通じて実施した研究成果】肝臓のグルコキナーゼ(GK)は、低血糖時には核へ高血糖時には細胞質へ移行することで、血糖値を調節している。現在までの報告では、核に存在するグルコキナーゼ調節蛋白質(GKRP)と細胞質に存在するフルクトース6-リン酸2-キナーゼの肝臓型アイソザイム(RL2K)がGKと競合的に結合することでGKの細胞内局在性が決定されているといわれている。本研究の目的は、(1) GK、GKRP及びRL2Kの細胞内局在性とそれらの結合状態をハイスループットに計測できる実験系を確立すること、(2)この実験系を用いてグルコース濃度依存的にこれらの蛋白質間の局在性及び結合性を制御する因子を同定することであった。この目的のために、当初GK、GKRP及びRL2Kと蛍光蛋白質との融合蛋白質をヒト肝臓由来の細胞株であるHepG2に発現させようと試みた。しかし、これらの融合蛋白質は細胞内で非常に不安定であり、測定に必要な量が細胞に蓄積しなかった。そこで融合蛋白質を用いた高効率な実験系の作成を断念し、細胞内での安定性が良い非融合型の蛋白質を発現させ、特異的抗体を用いてこれらの蛋白質の細胞内局在性や結合性を測定する実験計画に方針を転換した。【最終年度に実施した研究成果】最終年度には、GKRP及びRL2Kに対する抗体の作成を行った。現在、GK、GKRP及びRL2Kの抗体の精製とAlexa Fluor 488及びAlexa Fluor 555による標識を行っている。この標識抗体を用いると各々の蛋白質の局在性の測定とFRETを用いた蛋白質間の結合状態の定量が同時に可能となる。すでにこれらの抗原を発現する細胞株の作成に成功しているので、今後細胞培養液中のグルコース濃度を変化させて、GKの細胞内局在性、GKRP及びRL2Kに対する結合状態を明らかにする。肝臓のグルコキナーゼ(GK)は血糖値を感知して、低血糖時には核へ高血糖時には細胞質へ移行する。このGKの細胞内移行によって、血糖値は調節されている。今回の研究で、ヒト腎由来細胞株HEK293には、グルコースを感知してGKを輸送する機構が欠損している明らかとなった。さらに、GKの移行に関与する蛋白質に対する抗体を作成し、蛋白質の局在性と蛋白質-蛋白質相互作用を測定できるようになった。GK-mKO融合タンパク質がHepG2細胞内では非常に不安定であるために、これを用いる実験系の作製を断念せざるを得なかった。そこでGK-mKOに代わってGKの細胞内局在性を測定する手段として、特異的抗体を用いる実験系を採用した。平成26年度は、GKとこれに結合するタンパク質するグルコキナーゼ調節タンパク質(GKRP)を大腸菌で発現させ、ウサギを用いて抗体を作成した。GK及びGKRPのcDNAを発現
高効率光デバイスの実現に向けた低欠陥量子ドットの特性解明に関する研究

量子ドットは各種半導体デバイスの性能を画期的に向上させる可能性がある。これまでに研究代表者らは独自開発技術であるBiサーファクタント成長により、優れた光学特性を有するIn(Ga)As量子ドットが得られることを報告してきた。本研究ではこれらの特性が得られるメカニズムの解明に向け、DLTS法(Deep Level Transient Spectroscopy)を主体とした評価を行った。その結果、量子ドット特有の捕獲キャリアの放出による信号の観察に成功するとともに、上記量子ドット試料中には点欠陥や転位等に起因するトラップが非常に少ないことが確認できた。本研究の目的はBiサーファクタント成長による低欠陥量子ドット(QD)に残存する欠陥並びにQDからのキャリア放出の特性を調べ、デバイス応用に向けた指針を得ることであり、前年度に引き続きDLTS法における評価並びにその手法の向上に関する検討を進めるとともに前年度新たに方針に加えたInAs以外の材料系によるQDの検討に着手した。前者のQDのDLTS評価に関しては前年度用いたレーザストライプ構造の試料に代え、DLTS測定に適したメサ構造の試料作成条件の検討を行い、QDのキャリア注入と放出の特性や欠陥に関する評価を行った。DLTS測定の結果、複数のピークが重畳した信号が観察され、これらのDLTS信号についてバイアス電圧依存性評価(逆方向の静的バイアスVB=-0.5-3.0V)を行ったところ、VBの絶対値が大きくなると(観測する空乏層幅が大きくなると)DLTS信号の強度が減衰し、VB=-3Vでは消滅するという、通常の半導体バルク中トラップとは正反対の特徴ある依存性が観察された。この依存性は、バイアス電圧が捕獲パルスバイアスVCからVBに切り替わった直後にQDに捕獲されたキャリアがトンネルによって放出されるという機構を考えると説明ができる。また、観察する空乏層幅が最大のVB=-3Vの条件において微小な信号しか残らないということは、QDの周辺において点欠陥や転位等に起因するトラップが非常に少ないことを示している。以上の通り、DLTS法による上記QDのキャリア捕獲・放出特性並びに欠陥の評価手法と測定結果の解釈において有意な進展が得られた。また、装置と測定手法に関してはGe-MIS構造の評価を通じて改良を進めた。後者のInAs以外の材料系によるQD作成の検討に関してはSi基板並びに石英基板上にGe-QDを形成する独自技術を新たに開発し、低温で高密度なQDが形成できる目途がついた。本研究の目的はBiをサーファクタントとして用いて形成した低欠陥量子ドット(QD)に残存する欠陥並びにQDからのキャリア放出の特性を調べ、デバイス応用に向けた指針を得ることであり、前年度に引き続きDLTS法における評価並びにその手法の向上に関する検討を進めるとともに一昨年度方針に加えたIV族材料系によるナノドットの作製手法の検討を行った。前者のQDの欠陥並びにキャリア放出の特性に関しては前年度に引き続き独自手法により形成したBiサーファクタント成長QDに対し接合容量の過渡応答特性を利用した深い準位の過渡応答スペクトル法(DLTS法)による検討を進め、特に捕獲バイアス電圧と定常バイアス電圧の依存性の詳細な評価と解析から、同QDとその周辺には欠陥が極めて少ないことが確かめられたことに加え、QDのキャリア捕獲・放出特性に関してはトンネル過程が関与したメカニズムによって説明が可能であることを明らかにした。なおこの間、DLTS評価手法の改良をGe-MIS構造を用いた評価を通じて進めた。また、電流の過渡応答を測定し、光パルスによるキャリア誘起も可能な電流・光DLTS評価法に関してもシステムの構築を進め、同DLTSスペクトルの測定が可能となったため、研究期間終了後も評価を継続して進めていく。後者のIV族材料系によるナノドットの作製手法の検討に関しては前年度開発したBiをサーファクタントとしてGeナノドットをSi基板上並びに石英基板上に形成する技術を進展させ、室温付近の低温においても高密度なGeナノドットが形成できる条件を見いだした。この知見を研究期間終了後は新たなテーマに引き継ぎ、その形成条件の検討とデバイス応用に向けた研究を行っていく。研究の目的はBiサーファクタント成長による低欠陥量子ドットに残存する欠陥並びに同量子ドットからのキャリア放出の特性を調べ、デバイス応用に向けた指針を得ることであり、平成23年度は同量子ドットの特徴的な成長特性について新たな知見を報告するとともに、DLTS法による評価を試みた。前者においてはQD成長過程の成長中断中におけるRipeningが一般的な成長に比べ急速に進行していること、この原因が結晶表面におけるBiの存在によることを明らかにし、さらにこの原因はBiの添加によるInの表面拡散速度の増大、あるいはマストランスポーテーションの促進によるものと考えられ、前者が作用していればBiの添加で発光効率が向上する点についても説明が可能であることを述べた。この結果は同量子ドットにおいて優れた光学特性が得られていることの解明を進める上で意義のあるものである。

また、後者においては歪補償層を介して積層した量子ドット構造について、キャリア注入と放出の特性をC-V特性並びにDLTS(Deep Level Transient Spectroscopy)法によって評価した。その結果、C-V特性には大きな周波数依存性と、容量にピークが現れるという特徴的な特性が得られ、DLTSにおいては大きなパルス幅依存性があり、キャリアの捕獲に長い時間を要していることがわかった。そこでこの捕獲過程をDLTS測定で観察する新たな手法を試み、その観察に成功した。さらに放出課程と捕獲過程における各種特性がほぼ等しいという事実から、これらの過程は共通のバリアとなる歪補償層によって律速されていることを考察した。上記結果は当初目的としていた量子ドットの欠陥やキャリア放出特性の評価に直結するものではないが、量子ドットレーザや量子ドット太陽電池において重要となるキャリアトランスポートの評価に結びつく意義のある結果と言える。前年度までの震災の影響等による遅れを引き継いだことの他、DLTS評価用サンプル作成における各種プロセス条件の検討において予想外のトラブルが多発した結果、当初計画に入れていた電流DLTS測定や光DLTS測定による評価にまで至らなかった。しかしながら前記(容量)DLTS評価においては当初予想していなかった特徴的な結果が得られ、その解析を進めた結果、当初は光DLTS測定等を用いた複合的な測定が必要と思われた欠陥評価に関しても、(容量)DLTS評価が有効であることが確認されるという予想外の進展もあった。また、前年度に新たに研究計画に加えたInAs以外の材料系によるQD作成の検討に関してもSi基板並びに石英基板上にGe-QDを低温で高密度に形成する独自技術を新たに開発できたことにより今後の研究に対する指針が得られた。以上を総合し、平成24年度の達成度は「やや遅れている」という自己評価となった。平成23年度の研究実施計画においては、(1) DLTS法による量子ドットの欠陥、並びにキャリア放出特性の評価、(2) DLTS装置への電流DLTS、並びに光DLTS測定機能の付与、(3) PLの温度依存性測定による量子ドットの欠陥評価を掲げていた。このうち、(1)に関しては成果欄に記した通り、当初の予想とは異なる結果が得られており、試料の構造によって評価できる内容に制約が存在するという知見も得られている。(2)に関しては概ね計画通りその準備を進めた。また、(3)に関しては昨年度の夏季に連携研究者が所属するNTT物性科学基礎研究所にて評価を行う予定であったが、昨夏の関東は厳しい節電要請のため研究設備の稼働ができなかった。また、全体を通し、東日本大震災によって故障した装置の復帰に時間がかかったために評価試料の準備に支障を来し、十分な測定が行えなかったという事情もある。以上を総合し、平成23年度の達成度は「やや遅れている」という自己評価となった。
造影剤の遅発性副作用発症の分子機構に関する研究

1年度目に、低浸透圧ストレスが、血管内皮細胞を活性化して、細胞表面に細胞接着因子p-セレクチンの発現を惹起すること、これに伴い、活性化内皮細胞と活性化単核球を共培養すると単核球が内皮細胞にp-セレクチンを介して粘着して、双方向にシグナルが伝達され、内皮も単核球も活性化されることを明らかにした。本年度はそれらの成果の上に研究を展開して、以下の結果を得た。1.p-セレクチンを介して活性化単核球が活性化内皮細胞に粘着して、双方の細胞ともにNF-κBが活性化される。2.その結果内皮細胞ではNOを産生する。3.おそらくこのNOの産生は、inducible NO synthaseの活性化によるものと考えられる。4.このNOが遅発性の低血圧の原因である可能性があることが示唆された。造影剤の副作用のうち、遅延型のものは重篤な低血圧性ショックなどであるが、これは数時間後に発症する。これは患者が医療機関を離れている時間帯であるため、社会的にも大きな問題となっている。我々の今回の研究で、造影剤は、培養血管内皮細胞を活性化し、P-selectin ,ICAM-1などを発現させ、これに白血球が接着することを証明した。結果、内皮細胞に接着した白血球と内皮細胞には接着因子を介してシグナルが入り、NF-κBが活性化されることが判明した。これらの一連に結果から、NF-κBの活性化は誘導型NO合成酵素(iNOS)遺伝子の発現を促進し、大量のNOが産生され、これが低血圧性ショックの病態発現に深く関わるものと考えられた。今回の研究からは非イオン性とイオン性の造影剤のうち、非イオン性の造影剤が白血球の活性化作用が強かったが、この機序の詳細は不明である。今回の研究はin vitroの実験であるが、今後in vivoでも同様のことが起こりうるのか否か検討を要する。
地方都市におけるホームレスの形成・脱却の過程と「自立支援」資源に関する研究

本研究では、ホームレス支援の資源が乏しい地方都市におけるホームレスの形成や脱却の過程に着目して、地域ごとの実態や特質を描き出すとともに、各地域のホームレス支援や社会福祉行政の抱える課題の所在・動向を明らかにし、現行のホームレス支援策の評価および課題析出を行った。具体的には、地方都市の事例として大分市をフィールドとして、ホームレスの実態や脱却支援に関する調査研究を行った。さらに、地方都市における調査研究の成果を全国的動向に位置づけ、日本のホームレス支援における政策的・実践的課題の検討を行った。本研究の主要な成果として、研究計画で成果目標に掲げた博士論文を作成し、博士(社会福祉学)の学位を取得した。本研究の目的は、ホームレス(野宿生活者、元野宿生活者)に対象を特化した支援資源(「自立支援」)資源が未整備な地域におけるホームレスの形成・脱却過程の実態や課題を明らかにするとにある。この目的を達成するために、本研究期間(平成2022年度)において、九州の地方都市における実態調査を実施し、分析結果を取りまとめる計画を設けた。本研究期間の1年目にあたる平成20年度、「自立支援」資源を持たない地方都市として大分市を位置づけ、同市におけるホームレスを対象とする聞き取り調査を実施した。大分市ではホームレスがテント等に定住しておらず、調査対象者へのアプローチが比較的困難であることから、大分市街での炊き出し等の機会を活用して、同一の調査対象者に対して複数回の聞き取りを実施した。なお、平成20年秋頃から大分県内で「派遣切り」・雇い止めに遭ってホームレス状態に陥った者も増えてきていることもあり、聞き取り調査は現在も継続中である。さらに、大分県・大分市内におけるホームレス支援の現状を明らかにするため、大分県内の福祉事務所や生活保護施設、大分市内の支援団体や医療・福祉機関に対して聞き取り調査を実施した。上記の通り、平成20年度は、主に大分市内のホームレスや関連機関を対象した聞き取り調査を実施した。調査の実施状況は、交付申請書に示した研究実施計画に比べて順調といえる。日本のホームレス研究において、地方都市を対象とした実態・支援のありようの本格的分析は手薄となっており、しかも大分市を対象とした調査研究は初めての試みである。研究成果の発表にむけて、調査結果の分析を進めているところである。調査や分析の結果について、その中間的な報告は、雑誌論文やいくつかの各種発表機会で行った。本研究の目的は、ホームレス支援に用いられる資源の乏しい地方都市におけるホームレスの形成や脱却の過程に着目して、地域ごとの問題状況の特質を描き出すとともに、各地城のホームレス支援や社会福祉行政の抱える課題の所在・動向を明らかにすることによって、ホームレス自立支援法の政策評価に資することにある。本研究期間の2年目にあたる平成21年度は、ホームレス支援資源の乏しい地方都市の事例として大分市を取り上げ、大分市内のホームレスの実態分析を行ったとともに、大分市におけるホームレス支援策の展開状況および支援課題を明らかにした。平成21年度の主な研究成果は、「地方都市におけるホームレスの実態と支援策の展開-支援資源の未整備な地域におけるホームレス問題」(大阪府立大学大学院社会福祉学研究科2009年度博士論文)である。本研究の成果を博士論文としてまとめることは、本研究計画の申請時の成果目標であり、それを達成することができた。本論文の主な意義は、第1に、これまで十分に解明されてこなかった地方都市のホームレス問題について、筆者が自らホームレス支援に携わりながらアクションリサーチの手法によって分析したことである。第2に、一地方都市もしくは一地域のホームレスの実態および支援策について、総合的に明らかにしたことである。第3に、日本のホームレス支援や社会保障のあり方について、一地域のホームレスやホームレス支援の実態をふまえて評価を行ったとともに、求められるホームレス支援の枠組みや支援課題を提示したことである。さらに、ホームレス支援における居住環境やケアの確保に関して、平成21年10月に厚生労働省に設けられた「無料低額宿泊施設等のあり方に関する検討チーム」を傍聴し、ホームレス支援の政策枠組みの検討を行った(成果は年度をまたいで、平成22年4月に刊行された)。それに関連して、首都圏の複数の支援団体を訪れて現場視察を行った。本研究で計画されている、九州等の他地域を対象とした調査研究については、最終年度である平成22年度に実施する予定である。本研究の目的は、ホームレス支援の資源が乏しい地方都市におけるホームレスの形成や脱却の過程に着目して、地域ごとの実態や特質を描き出すとともに、各地域のホームレス支援や社会福祉行政の抱える課題の所在・動向を明らかにし、現行のホームレス支援策の評価および課題析出を行うことにある。本研究期間の3年目(最終年度)にあたる平成22年度に行った研究の内容および成果は、次の通りである。第1に、平成22年度に行った研究の内容として、本研究期間の12年目に行った調査研究をふまえて、対象および視野を広げて実態調査を実施したとともに、政策的論議の検討を行った。

本研究期間の12年目においては、地方都市の事例として大分市をフィールドとしてホームレスの実態や脱却支援に関する調査研究を行った。3年目においては、その成果を全国的動向に位置づけ、日本のホームレス支援における政策的・実践的課題の検討を行った。さらに、他の共同研究プロジェクトともジョイントして、全国各地のホームレス支援活動および生活保護行政に関する現場視察や実態調査を行った。第2に、平成22年度に行った研究成果発表について、発表論文や国際会議での発表は次頁の通りである。さらに、本研究期間の12年目の研究成果として平成21年度末にまとめた博士論文「地方都市におけるホームレスの実態と支援策の展開-支援資源の未整備な地域におけるホームレス問題」(大阪府立大学大学院社会福祉学研究科2009年度博士論文)の単著出版に向けた作業を進めた。これは、平成23年5月に法律文化社より刊行予定となっている。以上のように、ホームレス自立支援法が平成24年に期限を迎えるこの時期に、本研究期間の3年間を通して、これまで十分に解明されてこなかった地方都市のホームレスの実態や支援課題を提示することができ、今後の政策論議の展開に向けて論文や著書を刊行することには一定の意義があると考えられる。
ダイオキシン類のゲノムネットワークかく乱作用解明のための肺由来細胞を用いる研究

ダイオキシン類のレセプターとして知られるAhRの細胞増殖における役割を検討する目的で以下の実験を行った。まずA549細胞をAhRのリガンドで処理したところ、細胞増殖が促進された。またこの増殖促進作用は、AhRアンタゴニストの存在下で消去された。次いでAhRの細胞増殖における直接的関与を検討する目的でAhRをA549細胞に過剰発現させ、その影響を検討した。その結果、AhR量に依存してA549細胞の増殖速度は亢進した。そこで細胞を細胞周期M期に同調し、その後の細胞周期の進行を放射性チミジンの取り込みならびにフローサイトメトリーを用いた検討により解析した。その結果AhRは細胞周期G1期を短縮し、細胞周期の進行を速めることを明らかにした。そこでAhRの標的遺伝子を検討する目的で、DNAアレイを用いてAhR過剰発現細胞における細胞周期関連因子の発現を検討した。その結果、AhR過剰発現細胞ではE2Fの標的遺伝子の発現が増加していることが明らかになった。またリポーター遺伝子を用いて検討を行ったところ、AhRの過剰発現あるいはAhRリガンドの添加はE2F依存的転写活性を高めることを明らかにした。次いでAhRと二量体を形成するArntの発現量をRNAi法を用いて低下させたところ、AhRの作用は消去され、AhRによる細胞増殖促進作用がAhR/Arnt複合体の作用であることが示唆された。またゲルシフト法により、ArntがE2Fと複合体を形成している可能性が示された。以上の結果より、AhRはE2Fの活性を高めることにより細胞の増殖速度を促進することが示唆された。本年度においてはダイオキシン類のA549細胞に対する細胞増殖促進作用のメカニズムをDNAアレイならびにRT-PCR法により検討を行った。[方法]コントロール細胞、AhR過剰発現細胞ならびにダイオキシン曝露細胞よりtotal RNAおよびpoly-A RNAを抽出した。得られたpoly-A RNAを[^<32>P]-dATP存在下において逆転写反応に供し、得られた[^<32>P]-cDNAをDNAアレイとハイブリダイズさせた。用いたDNAアレイは約110種の細胞周期関連因子をナイロンメンブラン上にブロットしたものである。一晩ハイブリダイゼーションを行った後、アレイを数回洗浄し、その後オートラジオグラフィーより各遺伝子の発現量を確認した。RT-PCR法においては、total RNAを逆転写した後、各遺伝子に特異的なプライマーを用いて[^<32>P]-dCTP存在下においてPCRを行った。得られたPCR産物を10%アクリルアミド電気泳動にて分離し、オートラジオグラフィーより各遺伝子の発現量を確認した。[結果・考察]DNAアレイを用いて細胞周期関連因子の発現におよぼすAhRならびにダイオキシン類の影響を検討したところ、コントロール細胞に比較してAhR過剰発現細胞ならびにダイオキシン曝露細胞においては、CDK4, PCNA, MM-1ならびにCDC10-like等のDNA複製に関与する因子の発現量の増加が認められた。その一方でG2/M期の調節に関与するサイクリン類ならびにそれ等に対するキナーゼ類にも差異は認められなかった。これらDNAアレイにおける結果はRT-PCR法によっても再確認された。以上の結果よりダイオキシン類はA549細胞においてDNA複製に関与する因子の発現量を増加し、その結果として細胞増殖を促進することが示唆された。まずA549細胞をAhRのリガンドで処理したところ、細胞の増殖が促進された。またこの増殖促進作用はAhRアンタゴニストの存在下で消去された。

次いでAhRの細胞増殖における直接的関与を検討する目的でAhRをA549細胞に過剰発現させ、その影響を検討した。その結果、AhR量に依存してA549細胞の増殖速度は亢進した。そこで細胞を細胞周期M期に同調し、その後の細胞周期の進行を放射性チミジンの取り込みならびにフローサイトメトリーを用いた検討より解析した。その結果AhRは細胞周期G1期を短縮し、細胞周期の進行を速めることを明らかにした。そこでAhRの標的遺伝子を検討する目的でDNAアレイを用いてAhR過剰発現細胞における細胞周期関連因子の発現を検討した。その結果、AhR過剰発現細胞ではE2Fの標的遺伝子の発現が増加していることが明らかにされた。またリポーター遺伝子を用いて検討を行ったところ、AhRの過剰発現あるいはAhRリガンドの添加はE2F依存的転写活性を高めることを明らかにした。次いでAhRと二量体を形成するArntの発現量をRNAi法を用いて低下させたところ、AhRの作用は消去され、AhRによる細胞増殖促進作用がAhR/Arnt複合体の作用であることが示唆された。またゲルシフト法より、ArntがE2Fと複合体を形成している可能性が示された。以上の結果よりAhRはE2Fの活性を高めることにより細胞の増殖速度を促進することが示唆された。