hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞間コミュニケーション可視化のための新規発光性プローブの開発

本研究では代表的な細胞間コミュニケーションである神経シナプスを可視化する指示薬の開発を行った。シナプス前、後膜に特異的に局在する分子を利用し、それぞれの外部に蛍光・発光性を有する分子を提示させた。まず培養細胞でそれぞれが密着した部分で作る擬似的なシナプスでのシグナルを観ることで指示薬の最適化を行った。最適化した指示薬をマウス胎児から調製した神経細胞に発現させたところ、前細胞の軸索と後細胞の樹状突起が交差する箇所でいくつものシグナルが観察された。タイムラプス観察によりシグナルができるところと消失も観察された。光遺伝学的手法により、観られたシグナルでシナプス前部から後部へのシグナル伝達を確認した。本年度は申請書の予定通りに、分子間BRET(bioluminescence resonance energy transfer)を利用したシナプス可視化指示薬の作成を行った。これは分子デザインとして、シナプス前細胞にカイアシ発光タンパク質(GLuc),後細胞にHaloTagを介して赤色蛍光色素が結合するようになっている。まずは神経接着因子の細胞外ドメインにそれぞれを結合し、これを基本となる分子として培養細胞発現用プラスミドベクターに導入した。これらをLipofectamine3000にて293細胞にトランスフェクションし、それぞれがきちんと細胞外に提示されるかどうか確認をおこなった。赤色蛍光色素はHaloTag結合型とし、HaloTagが発現した後に培地に添加し1時間程度37°Cでインキュベートする事で結合させ、その後に培地中の余分を洗浄した。GLucの方は基質であるcoelenterazineの添加により、赤色蛍光色素の方は励起光を与えてイメージングを行ったところ、それぞれ発現させた293細胞の細胞膜で発光・蛍光が確認できた。次にマウス初代海馬および皮質神経培養細胞への遺伝子導入法としてエレクトロポレーション(Nepa21,ネッパジーン)を用いた。まず使用する培地、電圧・パルス等の条件を詳細に検討し、60%以上の導入効率、80%以上の生存率で遺伝子導入ができることが確認できた。遺伝子導入条件が決まったので、先に行ったようにマウス初代海馬および皮質神経培養細胞に発現した際にGLuc,赤色蛍光色素が細胞外に提示されるか確認することができた。現在は基本となる分子のリンカー配列を最適化し、シナプス結合依存的に両者間で高効率のBRETが起こる指示薬の作成を行っている。「研究実績の概要」に記載したとおり、時間を要すると考えられていた(1)基本となる指示薬がそれぞれ細胞外へ提示されることの確認、(2)マウス初代海馬および皮質神経細胞の調製およびそれらへの遺伝子導入の条件、がスムーズに終了したため。前年度は、分子間BRET(bioluminescence resonance energy transfer)を利用した発光性のシナプス可視化指示薬の開発に取り組み、神経細胞への導入条件を検討した。本年度は指示薬の汎用性を高める観点から、発光性だけでなく蛍光性の指示薬開発に取り組んだ。シナプス前、後膜それぞれに特異的に局在するニューロリジン(NLG)、ニューレキシン(NRX)を蛍光分子と融合させた。この指示薬をそれぞれ発現した293細胞同士が密着した部分で作る擬似的なシナプスでのシグナルを確認できた。次に、単離したマウス胎児海馬神経細胞に上記の指示薬をそれぞれ発現させ、神経細胞同士が形成するシナプスを観察できるかどうか試みた。結果的に、2種の神経細胞間がシナプスを作る領域にシグナルが観察できた。ここで、観察されたシグナルが本当にシナプスに由来するかどうかを確認する必要がある。そこで、神経シナプスマーカー(シナプス前膜:シナプトフィジン、シナプス後膜:ホーマー1)との共発現を行った。結果として、観察されているシグナルとこれらシナプスマーカーが共局在しているのが確認できた。遺伝子導入は当初はエレクトロポレーションにて行ったが、高発現している細胞では擬似シグナルが発生しやすいことがわかった。そこで、発現量を一定にして真のシグナルだけを観察しやすくするため、アデノウィルスベクターを作成する予定でいる。発光性だけでなく蛍光性の指示薬開発を着手したため、指示薬最適化のための時間を十分に取れなかった。しかしながら、最初の試みで神経細胞でシナプスの箇所にシグナルが順調に観られたことについては想定以上の成果であり、計画は順調に進展していると考えている。前年度は指示薬の汎用性を高めるために行った蛍光性指示薬が、予想以上の成果を挙げたため、そちらを重点的に開発した。これは、シナプス前、後膜それぞれに特異的に局在するニューロリジン(NLG)、ニューレキシン(NRX)を蛍光分子と融合させたものである。観察されるシナプスと、神経シナプスマーカー(シナプス前膜:シナプトフィジン、シナプス後膜:ホーマー1)が共発現することまでは確認できている。そこで、今年度では、一歩進めて観察されているシナプスが機能的なシナプスであるかどうかを確かめた。方法としては、シナプス前細胞に光遺伝学ツールの一つであるチャネルロドプシンを発現させ、シナプス後細胞にはカルシウムイオン指示薬を発現させる。もし、シナプスとして観察されている箇所がシナプスとしての機能があれば、光刺激によりシナプス前細胞からの神経伝達物質の放出が起こる。シナプス後細胞で神経伝達物質が受容できれば、それに伴うカルシウムイオン上昇が確認できる。条件検討に時間を要したが、上記の予測どおり、光刺激に伴いシナプス後細胞でのカルシウム上昇が確認された。

前年度に計画したアデノウィルスマーカーに関しては、遺伝子サイズが大きくなりすぎたため作成がうまくいかず頓挫となった。サイズの大きいCAGプロモータを別の物に変えるか、ウィルス自体を別の物にして作成する必要がある。しかし、培養細胞レベルでは良好な結果が得られているため、今後は主に、個体レベルで指示薬の有効性を確認する。本研究では代表的な細胞間コミュニケーションである神経シナプスを可視化する指示薬の開発を行った。シナプス前、後膜に特異的に局在する分子を利用し、それぞれの外部に蛍光・発光性を有する分子を提示させた。まず培養細胞でそれぞれが密着した部分で作る擬似的なシナプスでのシグナルを観ることで指示薬の最適化を行った。最適化した指示薬をマウス胎児から調製した神経細胞に発現させたところ、前細胞の軸索と後細胞の樹状突起が交差する箇所でいくつものシグナルが観察された。タイムラプス観察によりシグナルができるところと消失も観察された。光遺伝学的手法により、観られたシグナルでシナプス前部から後部へのシグナル伝達を確認した。次年度は、本年度に作成した基本となる指示薬を改変し、最もBRET効率の高い指示薬を完成する。計画書には書かなかったが、その後に着想した大腸菌を利用した指示薬のスクリーニングについて試みる。うまくいけば進行を早くすることができ、また今後他の指示薬を作成する際にも有用となる。今後は、超解像顕微鏡や電子顕微鏡などを利用したシナプスの確認を予定している。また、観られたシグナルの箇所が、機能的なシナプスかどうかの確認も行う予定である。また、機能的シナプスであることを確認したのちに、シナプスの形成・消失を「可逆的に」観察可能であるかどうかを、タイムラプス観察などを通じて調査する予定である。さらに、単離した培養細胞だけでなく、海馬スライスカルチャーや動物に発現させて、より生体に近い環境での観察を行う予定でいる。細胞生物学プレートリーダーを予定していた金額よりも安く購入できたため、その分が未使用金額として残った。発光性だけでなく蛍光性の指示薬の開発を開始したため、当初予定していた予算を消化することなく今年度の研究を遂行することができた。次年度の予定に記載したとおり、指示薬を大腸菌でスクリーニングする実験を行うため、その分の消耗品として費用を計上する。次年度予定に記載したとおり、1)超解像顕微鏡や電子顕微鏡などを利用したシナプスの確認、2)シグナルの箇所が機能的なシナプスかどうかの確認、3)シナプスの形成・消失を「可逆的に」観察可能であるかどうかを、タイムラプス観察などを通じて調査、4)より生体に近い環境(動物など)での観察、に使用する。
表現の自由と人格権に関する調整法理と比例原則との親和性

本研究では、表現の自由と人格権との調整法理について、ドイツ連邦憲法裁判所の判例法理を中心に検討した。相互作用論などの調整法理は、これらが基本権の一方的な制限を許容しないものである点で、必要な限度を超えた基本権制限を禁止する比例原則と、その目的・機能の点で親和性を持つものであることを明らかにした。1.本研究は、ドイツにおける表現の自由と人格権との調整ルールと比例原則との親和性を解明することにより、ドイツの調整ルールのわが国への援用可能性を探るものである。2.まず、今年度は、調整ルールのうち「相互作用論」に焦点を当てて、ドイツの判例・学説を素材に、その内在的解明をおこなった。なぜ相互に制限しあうという作用が生じるのか、またそれはいかなる根拠によるものかを明らかにすることによって初めて、相互作用論の意義と効果を明らかにしうる。人格権保護すなわち一般的法律が、表現の自由に対する一方的な制限となることが否定されるのは、民主制にとって価値定立的な意義を表現の自由が有しているためであり、自由な民主制においては、あらゆる領域、とりわけ公的生活における表現の自由の原則的な推定が要請されるためである。このことは、表現の自由と人格権のいずれの基本権も他方のために犠牲となることがないよう配慮したものとみることができ、その意味では法益衡量が求めているものと変わりはないこと、法的三極関係における防御権と保護義務との調整とも近似していることが明らかとなった。3.上述のように、今年度は、相互作用の源流に遡ることによって、法益衡量との近似性を明らかにした。法益衡量は、わが国においても妥当する違憲審査基準であり、法益衡量との近似性は、相互作用のわが国への援用可能性に途を開くものと思われる。相互作用論は、表現の自由と人格権との調整についてさまざまな調整ルールを提供するが、相互作用の背後にある表現の自由の二重の価値はわが国の解釈にとっても整合的であり、他の調整ルールの援用可能性が高まれば、実際の裁判における判断の一貫性、予測可能性、透明性に資することになると思われる。2.今年度は、意見表明の自由と人格権との調整が問題となった事例の中から、相互作用論ではなく、比例原則と法益衡量を援用したものを素材とし、比例原則と法益衡量との異同および相互作用論との関係性について検討を行った。ドイツ連邦憲法裁判所は、意見表明の自由と人格権との調整に際し、意見表明の自由を制限する法律は、それ自体の側でもまた制限に服さねばならないとする「相互作用」が働くとしてきたが、最近の一部の判例においては、相互作用という言葉を用いることなく、比例原則や法益衡量により解決を図るものがある。相互作用論や法益衡量を、表現の自由の一方的な制限を禁止するもの、あるいは、意見自由を制限する法律の憲法適合的解釈を要求するものだとするならば、これらは、いわゆる「基本権の制限の制限」として必要な限度を超えた基本権侵害を禁止する「比例原則」の一つの現れであると評価しうることを明らかにした。3.相互作用論の内実が、意見自由を制限する法律の憲法適合的解釈の要求、あるいは比例原則の要請であるということになれば、それは、意見表明の自由に限らず、その他の自由権の制限一般に妥当する要請であるということができる。相互作用論の比例原則との親和性は、ドイツの調整ルールが、わが国にとっても援用可能であることの証左となりうるのであり、わが国の実際の裁判に際し種々のルールを提供することが可能になるものと予測される。本研究は、ドイツにおける表現の自由と人格権との調整ルールと比例原則との親和性を解明することにより、ドイツの調整ルールのわが国への援用可能性を探るものである。まず、今年度は、ドイツにおいて表現の自由と人格権との調整の際に用いられる、je-dest公式と比例原則との関係性について、ドイツ連邦憲法裁判所の判例を素材に検討した。基本権侵害の重大性、発生しうる損害の重大性、損害発生の蓋然性の均衡を求めるje-dest公式は、基本権の重要性に照らして制限の許容性を審査する比例原則の第三部分原則である、狭義の比例性にほかならず、je-dest公式は比例原則の一要素であること、また、両者の調整に際しては、je-dest公式は、損害発生の蓋然性ではなく、虚構性の程度として現れるが、それは、事案に特化した要素が、調整の際の考慮要素として現れたと評価しうることを明らかにしたことが今年度の成果である。研究期間全体を通して、表現の自由と人格権とを調整する相互作用論などの調整法理は、これらが基本権の一方的な制限を許容しないものである点で、必要な限度を超えた基本権制限を禁止する比例原則と、その目的・機能の点で親和性を持つものであること、また、連邦憲法裁判所の判例のなかには、両者の調整の際に、相互作用論ではなく、比例原則や法益衡量を用いるものがあるが、これらは法令の基本権適合的解釈を行っているものと評価しうること、それゆえ、表現の自由と人格権との調整に際しては、比例原則が、相互作用という特殊な形で現れたに過ぎないことを明らかにした。

相互作用論などの調整法理は、これらが基本権の一方的な制限を許容しないものである点で、必要な限度を超えた基本権制限を禁止する比例原則と、その目的・機能の点で親和性を持つものであることを明らかにした。1.ドイツにおける意見表明の自由と人格権との調整ルールと比例原則との親和性の解明が、本研究の目的であるが、今年度は、比例原則、法益衡量を用いた判例の法的構造を解明することにより、相互作用論を用いた場合との具体的差異について整理・検討し、比例原則と法益衡量との関係性を明らかにすることを目標とした。併せて、相互作用論が比例原則と親和性を持つことが、なぜわが国にとっても整合的でありうるのか、また、わが国における理論との近似性はどこに存するのかについて、ドイツの憲法学説の評価をてがかりに考察することを研究テーマとした。2.上述のように、相互作用論は、基本権の一方的な制限を否定するものであり、必要な限度を超えた基本権侵害を禁止する比例原則と、その意義・目的・機能の点において親和性を持つこと、相互作用論も、比例原則、法益衡量も、憲法適合的解釈に他ならないことを明らかにしたことが今年度の成果である。それぞれの根底にあるものが同一のものであることを明らかにすることができた点で、おおむね上記目標を達成しつつある。今年度は、比例原則、法益衡量を用いた事例の検証とそれに関する学説の整理・検討に終始したが、調査する中で、比例原則という文言は用いていないものの、比例原則の要素を汲み取ることができる判例が存在することが分かった。こうした判例の検証も併せて必要であると思われる。公法1.平成27年度は、ドイツの調整ルールとわが国の調整ルールとの異同の確認、具体的事案に照らした、ドイツの調整ルールのわが国への援用可能性について、ドイツと日本の憲法判例・憲法学説を素材に、整理・検討することにしたいと考えている。2.日独の調整ルールの異同については、いかなる調整法理がどのような事例において適用され、どのような基準がどの次元でいかなる意味を有したかについて、判例を素材に整理し、事例を比較することによりそれぞれの調整法理の適用の射程について確認することにしたい。3.わが国への援用可能性については、比例原則の意義および効果、解釈方法論としての位置づけについて整理・検討し、併せて、「相互作用論」以外の調整ルールが、「比例原則」といかなる関係に立つのかについて検討する。その他のルールが、「比例原則」と親和性を持つのかどうか、親和性を持つとすれば、審査のどの段階で、いかなる作用をもたらすのかについて、ドイツの憲法判例を素材に考察することにしたい。以上を踏まえて、「相互作用論」がわが国の事例に適合的かどうかを、具体的事例を素材に検討する。4.併せて、ドイツの憲法学者との意見交換を行うことにより、ドイツ憲法学から見た日本国憲法における表現の自由と人格権との調整という視点からも検討を加え、ドイツの調整ルールの日本法への援用可能性について考察したいと考えている。1.ドイツにおける表現の自由と人格権との調整ルールと比例原則との親和性の解明が、本研究の目的であるが、今年度は、相互作用論がどのように登場したのかについて、表現の自由の意義・特殊性、人格権の重要性およびその根拠から原理的に検討すること、比例原則の適用場面の考察から、比例原則の射程を明らかにし、その汎用可能性という特殊性から相互作用論との親和性を探ることを、研究の目標とした。
子どもの健全な発達のための親子支援―継続的介入と体験活動が及ぼす効果について―

本研究は、宿泊を伴う体験活動による継続的な研修プログラムを構成し、子どもと親に様々な環境因子の改善を促し、その過程で種々のパラメーターで測定した子どもの脳機能を検証して健全な発達に必要な要因を探ることを目的とした。成果は以下の通りである。1ASD児の段階的な脳機能発達の促進に効果がある。2自由な四肢の運動に伴う大脳皮質への刺激が、前頭葉における抑制機能の賦活に関与している。3ポジティブな情動想起の増加が、前頭葉抑制機能を効果的に上昇させる。4元来、良い睡眠の質や改善傾向のある親は、気分や不安の改善が促され子どもの情緒行動に対する捉えが良好になる。2描画法は子どの効果検証に有用性が高い。平成24年度実施した宿泊を伴う体験活動に参加した児童・生徒とその保護者(児童・生徒18名(平均年齢12.83歳,7歳23歳)、保護者15名)のデータを解析し、結果を報告をした。【学術論文】成田奈緒子、成田正明、田副真美.自閉症スペクトラム児における統合型HTP法を用いた描画の経時的変化、子どもの心とからだ22-3、175-182、2013【学会発表】北村くるみ、佐藤佳奈、小澤有希、小関英里圭、今泉奈津季、岡戸奈都子、樋口大樹、若林祐子、田副真美、成田正明、成田奈緒子キャンプを用いた発達障害児の家族支援(3)-継続施行による効果の総合的評価の試み-第48回日本発達障害学会研究大会2013.8.24-25東京また、継続施行による効果の総合的評価および、保護者における統合型HTP法を用いた描画の解析のデータを解析し検討中である。平成25年度調査では、12月7日に事前研修を行い、対象児童・生徒から生活調査票、心理検査より基礎データを採取した。また、自律神経分析加速度脈波計パルスアナライザープラスを用いた自律神経活動分析を行った。保護者からも同様の基礎データ採取し、SDS、STAI、POMSを実施した。この際に研究代表者・研究分担者が、研究と実践介入の内容につき詳細に説明し、同時に、その理論的根拠をわかりやすく講義をして意義を理解してもらった。実際の介入活動としては、体験活動を平成25年12月28日、あたご天狗の森スカイロッジにおいておいて宿泊を伴う体験活動を実施した。児童・生徒13名、保護者13名の参加であった。介入活動としては、1泊2日の宿泊と自然体験プログラムなどの体験活動を行い、児童・生徒は、学生ボランティアの協力で、体験活動の前後にPOMS、唾液アミラーゼ濃度変化測定、TAS9による自律神経活動測定を行い、体験活動の短期的影響を測定した。保護者は、研究代表者・分担者によるワークショップや認知行動療法プログラムの前後でのPOMS、STAIを実施した。事前研修では、7月28日・29日に対象児童・生徒から生活調査票、心理検査より基礎データを採取した。脳機能検索の指標は、近赤外線酸素モニターを用いた前頭葉賦活タスクを行った際の脳機能変化の測定と、自律神経分析加速度脈波計パルスアナライザープラスを用いた自律神経活動分析を行った。保護者からも同様の基礎データ採取し、特に親子関係についての詳細な検討を行うため、親子関係テスト、エゴグラムを行った。実際の介入活動としては、体験活動を8月27-28日に国立オリンピック記念青少年総合センターで実施した。介入活動としては、1泊2日の宿泊と自然体験プログラムなどの活用した体験活動を計画し、児童生徒は学生ボランティアの協力で、体験活動の前後にPOMS、唾液アミラーゼ濃度変化測定、TAS9による自律神経活動測定を行い、体験活動の短期的影響を測定した。保護者は、研究代表者・分担者によるワークショップやリラクセーションプログラムの前後でのPOMS,STAIの実施、希望者への個別相談会を行い、広く育児、医療、心理など多方面にわたる悩みについて研究代表者と分担者が応じた。また、親子同時にその時点までに得られたデータを基にした所見のフィードバックを行い、事後調査までの生活目標を提示した。実践介入の効果を実証するために、一定期間をおいて事後調査を実施した。事後研修は、10月13-14日の1泊2日で、国立オリンピック記念青少年総合センターを利用し、事前調査と同様の調査項目を実施した。得られたすべてのデータは被験者全体の平均値として傾向を検索すると同時に個別、定点別にも検討し、児童生徒を取り巻く環境としての多角的側面からの変化を分析していく予定である。平成医26年度はプログラムの開発を目的として、研究分担者の成田奈緒子の主催する機関子育てアクシスにて、治療教育、対人コミュニケーションの改善親子、夫婦関係の改善を目的した多くのワークを親子に実施した。研究代表者田副真美は、ゲームによって体験できる認知行動療法のツールを開発することを目的に、臨床心理学を専攻する大学院生に実施し、その感想をもとに修正を行い、現在も継続している。これまでの研究で得られた結果を講演や総説などで公開した。学会発表以外の講演は、下記の通りである。【講演】

子どもの心と生活習慣ー疲れない心とからだをつくるー西東京市立向台小学校2014.11.1、こころの問題を抱える子どもと家族支援:多問題家族、埼玉県子どもの心の地域子育て支援事業研修会、2015.1.18、イライラの消しゴム子どもを怒ってしまう前に:元気の素を引き出そう体内時計と生活リズム平成26年度貫井北分館成人学校子育て・子育ち支援、2015.2.27。研究目的本研究は、これまで研究代表者と分担者が共に、子どもの健全な発達に関わる因子を多角的に考え研究してきた経験から、子どもへの介入のみならず親支援にも力点を置いて、その効果を包括的かつ継続的に検証するものである。宿泊を伴う体験活動やリズム遊びを使った継続的な研修のプログラムを構成して、子どもたちとおやそれぞれに効果的に介入し、これにより子どもをとりまく様々な環境因子、すなわち家庭生活における生活習慣や心理状態、そして親子関係の改善を促し、結果として種々のパラメーターで測定した子どもの脳機能を検証して健全な発達に必要な要因を探る。そして、最終的にはその結果を広く社会に提言、還元することを目的とする。研究実施計画平成24年度、25年度に実施した宿泊を伴う体験活動、事前・事後研修で得られた結果を平成26年度は、結果を総合的にまとめ、学会発表や論文より公表するとととに、分担者の主催する機関で効果的な親支援を実施した。平成27年度も引き続き、結果から得られた知見を学会発表および論文での公表しl、さらに教育書、育児書の執筆や教師、保育士、医療関係者、一般の子育てをしている母親への講演活動を行った。主な講演活動は、小金井市公民館貫井北分館において、子育て中の母親に講演を行った。(タイトル「学校子育て・子育ち支援イライラの消しゴム、子どもを怒ってしまう前に元気のもとを引き出そうー体内時計と生活リズムー眠る・起きる・食べる」、「子育て・子育ち支援、実践!今の私をテストでチェック今より少し楽になる生活改善のヒント」)。埼玉県子どもの心の地域子育て支援事業研修会では、保育士や心理職に対して講演を行った。(タイトル「こころの問題を抱える子どもと家族支援:親のストレス対処「家族のストレスへの対処方法」」)。本研究は、宿泊を伴う体験活動による継続的な研修プログラムを構成し、子どもと親に様々な環境因子の改善を促し、その過程で種々のパラメーターで測定した子どもの脳機能を検証して健全な発達に必要な要因を探ることを目的とした。成果は以下の通りである。1ASD児の段階的な脳機能発達の促進に効果がある。2自由な四肢の運動に伴う大脳皮質への刺激が、前頭葉における抑制機能の賦活に関与している。3ポジティブな情動想起の増加が、前頭葉抑制機能を効果的に上昇させる。4元来、良い睡眠の質や改善傾向のある親は、気分や不安の改善が促され子どもの情緒行動に対する捉えが良好になる。2描画法は子どの効果検証に有用性が高い。平成26年度は、教員、保健師などの専門職や小・中学校の親に対する講演において、これまでの研究結果を公開することができた。また、研究分担者である成田奈緒子は研究から得られた有用性のあるワークや治療教育を自身の機関で実施している。その効果測定については検討中である。認知行動療法のゲームによる実施ができるツールの開発やなどを平成26年度は目的としていたが、ツールの開発がやや遅れている。そのため、学会などに公表できるデータの収集ができなかった。臨床心理学
高極性キサントフィルの吸収・体内動態と癌細胞増殖抑制作用に関する研究

緑葉野菜に含まれる高極性キサントフィルの消化管内変換を、ホウレンソウを用いてin vitoroの消化モデル系で解析した結果、代表的な高極性キサントフィルであるネオキサンチンはネオクローム(R/S体の混合物)に、ビオラキサンチンはルテオキサンチン(R/S)とアウロキサンチン(RR/RS/SS)にそれぞれ変換された。このことから、高極性キサントフィル中の5,6-エポキシドが、胃酸によって5,8-エポキシド(フラノイド)に変換される(エポキシド-フラノイド変換)ことが示唆された。エポキシド-フラノイド変換の程度は胃消化モデルのpHに影響され、低pH時ほど変換が進行した。また。ネオキサンチンを経口投与したマウスの小腸内容物、血漿および肝臓からネオキサンチンとともにネオクロームが検出され、in vivoにおいてもエポキシド-フラノイド変換が起こり、その代謝物が体内に吸収されることが示された。ネオキサンチンとネオクロームはいずれも20μM以下の濃度でヒト前立腺癌細胞PC-3に対して増殖抑制作用を示した。このときネオキサンチンはPC-3細胞にアポトーシスを誘導したが、ネオクロームでは顕著なアポトーシス誘導は認められず細胞周期停止による増殖抑制作用が示された。ネオキサンチンと、褐藻類に含まれるフコキサンチンについて、PC-3細胞に対する増殖抑制作用を詳細に検討し、そのメカニズムが、アポトーシス誘導によるものであることを明確にした。また、フコキサンチンの代謝物であるフコキサンチノールもPC-3細胞にアポトーシスを誘導することを明らかにした。クチナシ色素に含まれるアポカロテノイド配糖体クロシンとそのアグリコンであるクロセチンについて経口摂取時の吸収代謝をマウスを用いて解析した。食品中の代表的な高極性キサントフィルとして、褐藻類の主要なカロテノイドであるフコキサンチンをワカメから、緑葉野菜中の主要なカロテノイドであるネオキサンチンをホウレンソウから、それぞれ単離・精製した。フコキサンチンを経口投与したマウスの血漿と肝臓中にフコキサンチンの脱アセチル化体であるフコキサンチノールとともに構造未知の代謝物を見出した。この代謝物は、フコキサンチノールを静脈内投与したマウスの血漿と肝臓中にも認められた。肝臓ホモジネートを用いてフコキサンチノールからこの代謝物を合成した。LC/MS,NMRなどの機器分析を行い、この代謝物をアマロウシアキサンチンAと同定した。フコキサンチノールからアマロウシアキサンチンAへの変換反応は、補酵素の要求性やpH依存性などの反応特性からミクロソーム画分のデヒドロゲナーゼによるものと推定した。本研究によって、ほ乳類の体内でキサントフィル類の3位の水酸基が酵素的に酸化されることが初めて証明された。フコキサンチンとその代謝物(フコキサンチノールとアマロウシアキサンチンA)について、ヒト前立腺癌細胞PC-3を用いて増殖抑制試験を行い、フコキサンチノールとアマロウシアキサンチンAも、フコキサンチンと同様にPC-3細胞の増殖を強く抑制することを明らかにした。(Drug Metab.Dispos.誌に発表)ネオキサンチンを経口投与したマウスの血漿、肝臓および小腸内容物中にネオクロームを見出し、ネオキサンチンが胃酸によってネオクロームに変換されることを明らかにした。In vitroでの消化モデル反応によって、食品中のネオキサンチンのネオクロームへの変換率は胃内のpHに大きく影響されることが示唆された。ネオキサンチンとネオクロームが、20μM以下の濃度でPC-3細胞の増殖を抑制した。(投稿準備中)緑葉野菜に含まれる高極性キサントフィルの消化管内変換を、ホウレンソウを用いてin vitoroの消化モデル系で解析した結果、代表的な高極性キサントフィルであるネオキサンチンはネオクローム(R/S体の混合物)に、ビオラキサンチンはルテオキサンチン(R/S)とアウロキサンチン(RR/RS/SS)にそれぞれ変換された。また。
人と機械を感性でつなぐデータ指向型感性フィードバック制御システムの構築

「物の豊かさ」と「心の豊かさ」には大きなギャップが存在しており,そのギャップを埋めるためには,人の感性を考慮し,心の豊かさが向上するように「物」が動作すべきと考えられる.このような背景において,「感性」の可視化技術は,社会実装を想定した研究が行われている.しかしながら,感性に関するほとんどの研究は,製品のデザイン評価・設計など静的な分野を対象としており,感性を動的に制御する手法についての研究は,未だ進められていないのが現状である。そこで,本研究では感性を動的に制御する「感性フィードバック制御法」について,この3年間に亘り考察を行った。平成28年度と平成29年度では,主として理論構築を進めた。本研究で明らかになった内容は以下の通りである。1)感性フィードバック制御の基本構造として,機器の制御ループの外側に感性フィードバックループを付加したカスケード制御系を採用することが,制御系設計の簡便性から適切である。2)このとき,人の感性は,時変系や非線形系であると考えられる.このようなシステムのモデル化は困難であるため,研究者らが先に提案した「データベース駆動型制御」を採用することが適切である。上記の2点に着目し,平成30年度では,その社会実装の一例として,油圧ショベルへの実装を想定して考察を進めた。具体的には,外側の感性フィードバックループの目標値として「快適度」を与え,その目標値に追従するように,内側の油圧ショベルの速度制御ループが適切に制御されるようにカスケード制御系を構築した。実機(油圧ショベル)への適用については実現しなかったが,操作レバーの部分のみを取り出したシミュレータへの実装を通して,本研究で構築した「データ指向型感性フィードバック制御法」の有効性を検証することができた。実機への適用については,企業の協力を得て本研究の終了後も引き続き検証を行うことを予定している。コンピュータ技術,ならびに制御技術が進展し,機器・装置等については,容易に所望の制御性能が得られるようになってきた。一方で,身の回りには人間と機器の関わりが必要となる場面が多く存在する。人間が精神的豊かさをもって機器・装置を操作するためには,装置や機器の制御に留まらず,人間のもつ感性をフィードバックする機構を備えた制御システムを構築する必要がある。本研究では,人間と機器・装置を感性でつなぐことで,人間の精神的価値の向上を実現する『データ指向型感性フィードバック制御系』の設計法について考察を進めている。平成28年度では、感性フィードバック制御の基本構成となる「データ指向型カスケード制御系」の設計法について考察を進めた。具体的には,閉ル-プデータのみから、内側ループと外側ループの双方を設計する方法を新しく提案した。とくに,外側ループには,先に提案しいるデータベース駆動型制御器を適用しており,これにより,外側ループの制御対象が非線形性を有していても,良好な制御結果が得られることを数値例、ならびに液位制御系への適用を通して定量的に検証した。さらに,感性フィードバック制御系を前述のデータ指向型カスケード制御系として設計し,数値例によりその有効性を検証した。とくに,感性の個人差を外側ループにあるデータベース駆動型制御により十分に吸収できることを確認した。これらの研究成果は,国内の学会,国際会議で発表するとともに,特許申請を行っている。これまで,感性フィードバック制御系をデータ指向型カスケード制御系として実現し,個人差に対しても十分に対応できることを,数値例によって確認している。これは,当初の予定(平成29年度実施予定)よりかなり早く進んでいると言える。しかしその一方で,平成28年度中に設計する予定であった感性に対する「ソフトセンサ」に関わる研究が,予定より少し遅れている。これについては,本学医学部の協力を得ながら,データ取りまで行えたので,平成29年の上半期に設計できる見通しとなっている。したがって,本研究全体で考えた場合,概ね順調に進めることができていると評価している。また,予期しない大きな問題もこれまでの研究において生じていない。本研究は,人の感性を制御することを目的としているが,人の感性のモデル化は困難であると考え,データベースを用いたカスケード制御系を昨年度提案している。具体的なカスケード制御系としては,一次ループは機器・装置の制御ループとし,二次ループは人の感性の制御ループである。今年度は,昨年に引き続き,非線形システムに対して提案法の有効性を検証するために,プロセス制御装置において,データベースを用いたカスケード制御系の有効性を検証した。次に,人の感性を取り扱うために,歩行支援機器である短下肢装具を取り上げ,1数値シミュレーションによる提案法の有効性の検証,2歩行時の脳波データの解析を行った。具体的には,1短下肢装具をモデル化し,人の感性を非線形と捉え,数値シミュレーションを用いて適応的に制御パラメータが調整することを確認した。また,2脳波計(electroencephalogram: EEG)を用いて,実際の歩行時の脳波データを解析し,特定の脳波の周波数が歩行時の「快,不快」に関係することを示唆した。今後は,実用性を考慮して,脳波計に代わる代用特性による感性メータが構築できれば,実装可能な状態にある。その一方で,感性が「快」の方向に改善されるよう制御をしようとしたとき,「歩行をやめる」という動作も一つの解となりえることが分かった。これは歩行支援という意味において,大きな問題となる。感性フィードバックの適用例として,他のシステムを含めて再考する必要がある。感性フィードバック制御系の設計方法については,数値シミュレーションなど、概ね順調に研究が進められている。

その一方で,短下肢装具による歩行支援の問題に,この感性フィードバック制御が有効に機能するかどうかに疑義が生じ,適用対象の変更を含めて再考する必要が生じた。「物の豊かさ」と「心の豊かさ」には大きなギャップが存在しており,そのギャップを埋めるためには,人の感性を考慮し,心の豊かさが向上するように「物」が動作すべきと考えられる.このような背景において,「感性」の可視化技術は,社会実装を想定した研究が行われている.しかしながら,感性に関するほとんどの研究は,製品のデザイン評価・設計など静的な分野を対象としており,感性を動的に制御する手法についての研究は,未だ進められていないのが現状である。そこで,本研究では感性を動的に制御する「感性フィードバック制御法」について,この3年間に亘り考察を行った。平成28年度と平成29年度では,主として理論構築を進めた。本研究で明らかになった内容は以下の通りである。1)感性フィードバック制御の基本構造として,機器の制御ループの外側に感性フィードバックループを付加したカスケード制御系を採用することが,制御系設計の簡便性から適切である。2)このとき,人の感性は,時変系や非線形系であると考えられる.このようなシステムのモデル化は困難であるため,研究者らが先に提案した「データベース駆動型制御」を採用することが適切である。上記の2点に着目し,平成30年度では,その社会実装の一例として,油圧ショベルへの実装を想定して考察を進めた。具体的には,外側の感性フィードバックループの目標値として「快適度」を与え,その目標値に追従するように,内側の油圧ショベルの速度制御ループが適切に制御されるようにカスケード制御系を構築した。実機(油圧ショベル)への適用については実現しなかったが,操作レバーの部分のみを取り出したシミュレータへの実装を通して,本研究で構築した「データ指向型感性フィードバック制御法」の有効性を検証することができた。実機への適用については,企業の協力を得て本研究の終了後も引き続き検証を行うことを予定している。本研究では,平成28年度に構築した感性フィードバック制御を短下肢装具に適用し,使用者が不快に思わないような歩行支援を実現することを最終目的にしている。そのため,今後は,まず,平成28年度に購入した短下肢装具がコンピュータ制御できるよう改良する必要があり,これを平成29年度に実施する。さらに,平成30年度には改良した短下肢装具に感性フィードバック制御を実装するとともに,実験を通して有効性を検証する予定である。これまで,歩行支援機器を適用対象として取り上げ,歩行時の「体性感覚」を用いて感性を向上させるような制御系設計を進めた。しかしながら,「歩行をやめること」が感性を「快」の方向に向上させることが分かり,適用対象の変更について考察を重ねた。その結果,今年度は,より感性制御の精度を向上させるために,情報量が最も多い「視覚」を考慮した感性フィードバック制御の研究を進める。具体的な制御対象としては,油圧ショベル(コベルコ建機株式会社に協力を仰ぐ)とする。
金属元素を指標とした栄養機能成分の基原判別法の開発と評価

食品表示における不確かさを解消することは、食品の安全性を確保するために重要である。本研究では、炭酸カルシウムの基原(生物殻、合成品、鉱物など)を明らかとするために、試料に含まれる第2族元素の含有量とそれらの安定同位体比を、誘導結合プラズマ質量分析装置にて測定した。その結果、炭酸カルシウムは、生物殻とそれ以外の物に分別可能であること、合成品と鉱物由来の検体を分別可能であることが、それぞれ示唆された。本研究では炭酸カルシウム(CaCO3)を対象に、夾雑物として存在する第2族の元素組成とこれらの安定同位体をICP-MS (誘導結合プラズマ質量分析装置)にて定量化することにより、その基原の判別および当該成分を含んだ食品中からの基原を判別化する方法を確立することを目的とする。本年度は、以下の3項目に関して検討を行った。1. CaCO3の選定:市場流通品に関し調査した結果、合成品3種、既存添加物6種、石灰石3種、その他3種の計15種を入手した。ただし、そのうち1種は、ドロマイトである。2.測定対象元素およびその安定同位体の定量下限値(LOQ)の推定:第2属元素を測定対象としたICP-MSによる定量化では、Mg (24)、Ca (44)、Sr (88)、Ba (137)をそれぞれ選択し、内標準としてIn (115)、コリジョンガスとしてHeを用いて測定を行った結果、LOQ (ppb)は、Mg (45)、Ca (44)、Sr (1.9)、Ba (4.5)と推定された。その他安定同位体のLOQについては、現在検討中である。3.元素組成による基原判別:半定量分析による試料に含まれる73元素の存在確認を行った結果、約50種類の元素の存在が示唆された。現段階では存在する元素組成に基づいた判別化はできていないが、第2属元素を指標とした定量分別化では、MgとSrを選択することにより、海産物のみ特異的に分別化できることが示唆された。本研究では炭酸カルシウム(CaCO3)を対象に、カルシウム及び夾雑物として存在する第2族元素の組成とこれらの安定同位体を、誘導結合プラズマ質量分析装置にて測定することにより、その基原の判別及び当該成分を含んだ食品中からの基原を判別化する方法を確立することを目的とする。本年度は、以下の2項目に関して検討を行った。1.試料に含まれる各成分(Mg, Ca, Sr, Ba)の定量化:市場流通品CaCO3 21種を対象に測定を行った結果、Ba (質量数137)は定量下限値以下だった。Mg (24)は、含有量と基原の違いに傾向はみられなかった。他方、Ca (44)及びSr (88)は、前者において生物由来の検体で低値を、後者において海洋産物で高値を示す傾向にあることが明らかとなった。2.安定同位体比による基原判別:検体にほとんど含まれていなかったBaを除く、Mg (25/26)、Ca (42/44)及びSr (87/86)同位体比について、認証標準物質(NIST SRM 980、915b、987)を指標に、測定を行った。その結果、Sr同位体比と基原の違いに傾向はみられなかった。他方、Mg同位体比は、サンゴ由来の物で高くなる傾向が、Ca同位体比は、海洋由来の物で低くなる傾向が、それぞれ示された。上記の結果から、Ca及びSr含有量を指標にすることにより鉱物や化学合成品の物と天然由来の物を分別化できる可能性が、また、Sr含有量とCa同位体比を指標にすることにより、一部の貝殻由来の物を選択的に分別できる可能性が、それぞれ示唆された。今後、当該製品を含んだ食品の測定を行い、これらの指標を基に判別可能か検討を行う予定である。食品分析現段階では、第2族元素の定量に必要な検量線の作成が終了しておらず、各検体に含まれる元素の定量値については評価できていない。また、安定同位体の測定に関しては、実績概要に記した元素以外、検討できていない。計画の遅延については、昨年度9月より半年間、業務課題の受託事業を締結したことにより、本事業の進行が遅れているが、測定に必要な試薬等の収集は完了しており、今後速やかに検討を行う予定である。1.前年度未検討課題の検討:試料に含まれる各成分(Mg, Sr, Ba)の定量化に向けた条件検討を行い、数値化を行う。2.安定同位体比による基原

判別:今回測定対象とする第2族元素のうち、安定同位体は、Mg (3種)、Ca (4種)、Sr (4種)及びBa (7種)に複数存在することから、それぞれの同位体についてICP-MS測定を行う。測定した同位体比は、元素単独または複数を組み合わせることにより、さらに詳細な基原の判別が可能であるか検討を行う。同位体測定は、同位体数の少ないものから順次測定を行い、少ない変数での分別が可能であるか検討を行う。Sr及びMgについては、安定同位体比に対する認証標準物質(NIST SRM 987及び980)も存在することから、安定同位体の存在量についても精確に評価する。○加工食品中のCaCO3由来第2族元素及び安定同位体測定に関する検討CaCO3は、主に栄養強化の目的で使用されることが多い事から、成分表示にCaCO3の記載がある食品を購入する。ただし、食品の選定にあたっては、原材料表示に基原が記載されているものや、他の競合成分の添加がないものを優先的に選択する。測定試料の前処理は、測定対象元素の沸点が高いことから乾式灰化(550 °C, 6 hr)により、夾雑物を分解した後希酸に溶解させ、不純物をろ過し、試験溶液とする。なお、前処理法については、予め認証標準物質を用いた信頼性確認試験を行い、過不足なく測定対象成分が抽出できていることを確認する。第2族元素および安定同位体の測定は、これまでに構築した方法を用いて測定する。前年度、業務課題の追加検討により、本検討が十分に実施できておらず、残額を生じる結果となっている。残額分は、ICP-MSを使用することにより消費されるアルゴンガス量に換算した際300時間分に相当するが、前年度の未検討課題である定量化における条件検討(LOQの推定)において、消費されると考えられる。また、分別化の精度を向上させるため、評価試料については引き続き調査を行い、追加購入する予定である。
外有毛細胞に存在するモーター蛋白質プレスチンの変形量解析:一分子直接計測の試み

蝸牛内コルチ器に存在する外有毛細胞(Outer hair cell : OHC)は膜電位に同期した伸縮運動を示す.その伸縮運動により我々の聴覚の鋭敏さが実現されている.OHCの伸縮運動の源は,細胞側壁に存在するタンパク質モータプレスチン(prestin)の構造変化であると考えられている.プレスチンが膜電位を感知し,変形して2種類の形状,すなわち「小さい状態」と「大きい状態」を取り,その大きさの違いでOHCの細胞長を変化させていると推察されている.しかし現状ではプレスチンのような膜タンパク質の立体構造を計測する方法は確立されておらず,そのためプレスチンの構造変化メカニズムは解明されていない.本研究では,原子間力顕微鏡を用いてプレスチンの構造を一分子レベルで直接計測し,膜貫通構造の解明を目指す.モータ分子プレスチンの構造が明らかになれば,OHCの伸縮運動のメカニズムの解明が大きく前進すると考えている.その成果は,聴覚の鋭敏性すなわちOHCの伸縮による蝸牛増幅機構の全容解明へ発展すると期待できる.平成21年度は原子間力顕微鏡でプレスチン一分子の分子間力を計測することを目指し,下記の研究を行った.[1]Aviタグ融合プレスチンを発現させたChinese hamster ovary細胞(哺乳類由来細胞株)の細胞膜を単離しビオチン化する手法を確立した.[2]ストレプトアビジンで修飾した原子間力顕微鏡のカンチレバーを用いて,ビオチン化したプレスチンを一分子引張試験するために必要な実験条件の最適化を行った.[3]プレスチン一分子の分子間力計測を行い,プレスチンの膜貫通構造を解析した.蝸牛内コルチ器に存在する外有毛細胞(Outerhaircell : OHC)は膜電位に同期した伸縮運動を示す.その伸縮運動により我々の聴覚の鋭敏さは実現されている. OHCの伸縮運動の源は,細胞側壁に存在するタンパク質モータprestinの構造変化であると考えられている.Prestinが膜電位を感知し,変形して2種類の形状,すなわち「小さい状態」と「大きい状態」を取り,その大きさの違いでOHCの細胞長を変化させていると推察されている.しかし,現在までにprestinが変形し,サイズを変えているという証拠は皆無である.そこで本研究では,パッチクランプおよび原子間力顕微鏡を用いてprestinの構造を一分子レベルで直接計測することを目指す.モータ分子prestinの構造変化が明らかになれば, OHCの伸縮運動のメカニズムの解明が大きく前進すると考えている.その成果は,聴覚の鋭敏性すなわちOHCの伸縮による蝸牛増幅機構の全容解明へ発展すると期待できる.平成20年度はprestin一分子を原子間力顕微鏡のカンチレバーに吸着させることを目指し,下記の研究を行った.[1]C末端にAviタグを融合したprestinを哺乳類由来細胞株であるChinese hamsterovary細胞に発現させるため,その遺伝子を構築した.[2]Aviタグ融合prestinを安定に発現する細胞株を樹立した.[3]Aviタグ融合prestinはprestinの機能を有していることをパッチクランプ法により確認した.[4]Prestinを発現する細胞の細胞膜を単離し,細胞膜上のprestinを, Aviタグを利用してビオチン化した.[5]原子間力顕微鏡のカンチレバーをストレプトアビジンで修飾した.蝸牛内コルチ器に存在する外有毛細胞(Outer hair cell : OHC)は膜電位に同期した伸縮運動を示す.その伸縮運動により我々の聴覚の鋭敏さが実現されている.OHCの伸縮運動の源は,細胞側壁に存在するタンパク質モータプレスチン(prestin)の構造変化であると考えられている.プレスチンが膜電位を感知し,変形して2種類の形状,すなわち「小さい状態」と「大きい状態」を取り,その大きさの違いでOHCの細胞長を変化させていると推察されている.しかし現状ではプレスチンのような膜タンパク質の立体構造を計測する方法は確立されておらず,そのためプレスチンの構造変化メカニズムは解明されていない.本研究では,原子間力顕微鏡を用いてプレスチンの構造を一分子レベルで直接計測し,膜貫通構造の解明を目指す.モータ分子プレスチンの構造が明らかになれば,OHCの伸縮運動のメカニズムの解明が大きく前進すると考えている.その成果は,聴覚の鋭敏性すなわちOHCの伸縮による蝸牛増幅機構の全容解明へ発展すると期待できる.平成21年度は原子間力顕微鏡でプレスチン一分子の分子間力を計測することを目指し,下記の研究を行った.[1]Aviタグ融合プレスチンを発現させたChinese hamster ovary細胞(哺乳類由来細胞株)の細胞膜を単離しビオチン化する手法を確立した.[2]ストレプトアビジンで修飾した原子間力顕微鏡のカンチレバーを用いて,ビオチン化したプレスチンを一分子引張試験するために必要な実験条件の最適化を行った.[3]プレスチン一分子の分子間力計測を行い,プレスチンの膜貫通構造を解析した.
TGF-β/Smad3シグナル経路を介した創傷治癒における瘢痕形成抑制法の検討

口蓋の創傷治癒過程における瘢痕形成抑制のメカニズムを遺伝子レベルで図ることを目的として実験を行い、以下の研究成果を得た。(1)Smad3ノックアウト(KO)マウス由来のfibrocyteにTGF-・1を加えて、筋線維芽細胞に分化させた場合、Smad3シグナル経路が強く関与し、分化速度を有意に亢進した、(2)Smad3 KOマウスの口蓋粘膜に作成した創傷は、その治癒速度が野生型マウスと比較して有意に亢進し、創傷部の粘膜閉鎖が早期に生じることによって瘢痕形成が抑えられた。以上の結果から、TGF-・/Smad3シグナル経路が創傷治癒過程においてきわめて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。口唇口蓋裂患者の上顎骨の劣成長の原因となる口蓋の創傷治癒過程における瘢痕形成のメカニズムの解明と、その抑制を遺伝子レベルで図ることを目的として、成長因子TGF-βとその細胞内シグナル分子であるSmad3に着目した実験を行った。.結果として、(1)マウス末梢血由来のfibrocyteの培養実験系を確立した、(2)Smad3ノックアウトマウス由来のfibrocyteにTGF-β1を加えて、筋線維芽細胞に分化させた場合、Smad3シグナル経路が強く関与し、分化速度を有意に亢進した、(3)Smad3ノックアウトマウスの口蓋粘膜に創傷を作成した場合、その治癒速度がワイルドタイプマウスと比較して有意に亢進し、創傷部の粘膜による閉鎖が早期に生じることによって瘢痕形成が抑えられた。以上の結果から、TGF-β/Smad3シグナル経路が創傷治癒過程においてきわめて重要な役割を果たしていることが明らかとなったことより、Smad3を標的遺伝子としたsiRNA創薬が創傷の治癒促進効果および瘢痕形成抑制効果を有する優れた医療技術開発につながるものと考えられた。また、口蓋裂患者の口唇形成および口蓋形成術後の治癒促進を想定し、ワイルドタイプマウスの口蓋粘膜に創傷を作成し、Smad3のsiRNAの口蓋粘膜への局所投与を行い、その創傷治癒促進効果と瘢痕形成抑制効果についての検索を開始している。当該年度の研究目的として、口蓋の創傷治癒過程における瘢痕形成のメカニズムを解明と、その抑制を遺伝子レベルで図ることの可能性を開くことを挙げ、TGF-βとその細胞内シグナル分子であるSmad3に着目して、次の実験を行うこととしていた。1)マウス末梢血由来のfibrocyteの培養実験系を確立し、さらにSmad3ノックアウトマウス由来のfibrocyteの解析を行う、2)Smad3を標的遺伝子としたiRNA実験系を確立し、Smad3を標的遺伝子としたiRNAがfibrocyteの増殖および分化及ぼす影響について解析する、3)Smad3ノックアウトマウス由来のfibrocyteを野生型マウスの口蓋創傷部に移入し、治癒過程を解析することにより、瘢痕形成の抑制について検討する、4)Smad3を標的遺伝子としたiRNAを導入したfibrocyteを野生型マウスの口蓋粘膜に移入し、治癒過程を解析することにより、瘢痕形成の抑制について検討する。本研究の成果として、(1)マウス末梢血由来のfibrocyteの培養実験系を確立した、(2)Smad3ノックアウトマウス由来のfibrocyteにTGF-β1を加えて、筋線維芽細胞に分化させた場合、Smad3シグナル経路が強く関与し、分化速度を有意に亢進した、(3)Smad3ノックアウトマウスの口蓋粘膜に創傷を作成した場合、その治癒速度がワイルドタイプマウスと比較して有意に亢進し、創傷部の粘膜による閉鎖が早期に生じることによって瘢痕形成が抑えられた。そこで、予備実験として口蓋裂患者の口唇形成および口蓋形成術後の治癒促進を想定し、ワイルドタイプマウスの口蓋粘膜に創傷を作成し、Smad3をリン酸化の段階で抑制するSmad3リン酸化阻害剤(SIS3)の口蓋粘膜への局所投与を行い、その創傷治癒促進効果と瘢痕形成抑制効果について検索した。その結果、SIS3を導入したマウスの口蓋創傷部では再上皮化・結合組織の有意な修復促進効果が認められた。