hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高テロメラーゼ活性循環癌細胞と遊離DNAの総合的解析による超早期癌診断技術の確立

がんはわが国の死因の多くを占める重要な疾患です。がんの治療成績を向上させるためには、早期発見と早期治療がとても重要です。わが国にはがん検診という優れた仕組みがありますが、さらなるがん診断の精度向上を目的に、血液の中を流れるがん細胞とがんに関連した核酸を検出することによる簡便ながん早期診断技術の開発を行いました。ラマン散乱分光法という分析法を応用することで、血液中のがんに関連した核酸やタンパクを検出し、がんでない人と比較して、がん(胃がん、大腸がん)患者さんでより多く含まれることが分かりました。また、この分光法を応用して、抗体などで標識をしなくても細胞の質を評価するための基本技術を確立しました。本研究では癌の超早期診断技術の確立を目標とし、1癌の血行性転移の主因と考えられる血液中の循環癌細胞(Circulating Tumor Cells、以下CTC)と予後の相関を幅広い癌種で確認することと、2CTCがほとんど存在しない早期癌も網羅した癌の超早期診断法を開発することを目的とした。1これまでの自験結果から、テロメラーゼ活性を指標としてCTCを検出したが、癌種により疑陽性細胞が多く検出されることが分かった。そこで、より精度の高い検出法として、分光法を用いた無標識CTC検出技術を開発した。本法で採取されたCTCは生体内と近い状態であるため、次世代シークエンサーによる遺伝子解析等のダウンストリームの解析に非常に適している。現在、臨床サンプルの解析データを蓄積中である。2われわれが開発したバイオチップ(リン青銅素材の金属チップ)上に銀ナノ錯体を作成、癌患者血清を滴下することにより、癌関連遊離核酸と銀の複合体が形成される。レーザーを照射すると、癌患者血清に特有の表面増強ラマン散乱光が検出され、精度の高い癌診断が可能と考えられた。現在、臨床サンプル数を増やして、解析データを蓄積中である。がん患者、非がん患者から採取した血清の解析結果から、バイオチップを用いた遊離核酸検出技術の臨床的貢献の可能性を示しました(学術論文として投稿、すでに受理され公開済み)。その後、より簡便かつ再現性良く、精度の高い解析技術の確立を目指して、分光法を用いた遊離核酸、細胞、組織を含めた幅広い生体材料を変性を伴わずに解析できる技術の開発を開始しています。循環がん細胞に関しては、検出、採取後に次世代シーケンサー等を用いた遺伝子変異解析、細胞機能解析に利用するため、細胞変性を伴わない無標識検出技術の開発を行っています。培養細胞を用いた評価では良好な結果が得られており、今後、がん患者、非がん患者の血液を用いて、技術の評価と改善を行います。それらの結果を活用し、がんの早期診断、治療効果判定を目的とした先端医療機器の開発を行う計画です。また、同様の技術を応用して、ハードウェア・ソフトウェアの両方からなる組織標本の診断支援システムの確立を目指し、研究を開始しています。医療現場での病理組織診断能向上、希少疾患や診断困難例に対する診断支援、へき地や離島、発展途上国など病理医不在環境での医療支援を目的として開発を進めています。現時点で、培養細胞、胃がん・大腸がん実臨床組織標本の解析結果から、細胞の無標識・無修飾生物学的・形態的解析に関する2件の特許の出願を完了しました。今後は、臨床研究として、さらに多くの実臨床検体(血液、組織)の解析を行い、技術の評価と改善を進めていきます。バイオチップによる遊離核酸検出技術の臨床的意義に関して学術論文を投稿、既に受理され公開されています。現在はバイオチップを用いず、さらに簡便、かつ精度の高い解析法を開発中です。循環がん細胞検出に関しては、検出、採取後の細胞機能解析への応用も視野に入れ、分光法を用いた細胞変性を伴わない革新的な無標識循環がん細胞検出技術を開発中です。研究実績の概要に記載した通り、細胞の生物学的・形態的解析に関する2件の特許の出願を完了しました。1血液によるがん診断:胃がん、大腸がん、良性疾患患者計36名から採取した血清に対してレーザーを照射、表面増強ラマン散乱光を検出することで血清中の遊離核酸を定量的に検出しました。この結果から、血液のみで簡便迅速にがん診断が行える可能性を示しました(3件の英語学術論文を国際学術誌で発表済み)。現在、解析試料数を増やして精度を確認するとともに、技術改良を行っています。2細胞の無標識評価技術:細胞毒性の弱い超低出力レーザーを用いて、コヒレント反ストークスラマン散乱分光による無標識細胞評価の基礎技術を確立しました。この技術により、抗体等で標識を行うなど修飾を加えることなく、血液中の循環がん細胞を無標識で検出、採取するための基礎技術が確立されました。すでに、2件の特許を出願しており、さらに、現在、培養細胞の解析結果をまとめ、国際学術誌への投稿を準備しています。3組織の無標識評価技術:上記の無標識細胞評価技術を応用して、がん患者の未染色病理組織プレパラートの質的評価を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色による一般的な病理組織学的診断能と同等の評価精度が得られました。生検により得られた生体材料をもとに、簡便、迅速、高精度に疾患の診断を行うための基礎技術が確立できました。この成果をもとに、人工知能と深層学習を活用した自動病理組織診断支援システム(ハードウェア・ソフトウェアを含む)の開発に着手いたしました。4生体のリアルタイム評価

技術:前述の生体毒性のない超低出力レーザーによる分光法を応用した低侵襲無標識生体評価技術の開発に着手いたしました。将来的には、医療現場での内視鏡検査や内視鏡治療にリアルタイムに活用できる診断機器としての認可をめざして開発を進めております。がんはわが国の死因の多くを占める重要な疾患です。がんの治療成績を向上させるためには、早期発見と早期治療がとても重要です。わが国にはがん検診という優れた仕組みがありますが、さらなるがん診断の精度向上を目的に、血液の中を流れるがん細胞とがんに関連した核酸を検出することによる簡便ながん早期診断技術の開発を行いました。ラマン散乱分光法という分析法を応用することで、血液中のがんに関連した核酸やタンパクを検出し、がんでない人と比較して、がん(胃がん、大腸がん)患者さんでより多く含まれることが分かりました。また、この分光法を応用して、抗体などで標識をしなくても細胞の質を評価するための基本技術を確立しました。1循環癌細胞の検出法として、テロメラーゼ活性を指標とした検出法よりも精度の高い検出法として、分光法を用いた無標識CTC検出技術を開発した。本法で採取されたCTCは生体内と近い状態であるため、次世代シークエンサーによる遺伝子解析等のダウンストリームの解析に非常に適している。現在、臨床サンプルの解析データを蓄積中である。2われわれが開発したバイオチップ(リン青銅素材の金属チップ)上に銀ナノ錯体を作成、癌患者血清を滴下することにより、癌関連遊離核酸と銀の複合体が形成される。レーザーを照射すると、癌患者血清に特有の表面増強ラマン散乱光が検出され、精度の高い癌診断が可能と考えられた。また自家蛍光強度を比較することでも簡便に癌が診断できる可能性が示された。現在、臨床サンプル数を増やして、解析データを蓄積中である。分光法を基本として、遊離核酸、細胞、組織を含めた幅広い生体材料を変性を伴わずに解析できる技術を開発中であり、研究実績の概要に記載した通り、細胞の生物学的・形態的解析に関する2件の特許の出願を完了しました。今後は、さらに多くの実臨床検体の解析を行い、技術の評価と改善を行っていきます。腫瘍外科学1分光法による無標識CTC検出技術を用いて、より多くの臨床サンプルの解析を進める。2われわれのバイオチップを用いて、レーザーによる表面増強ラマン散乱光と、自家蛍光の両方を記録する。臨床サンプル数を増やして、解析データを蓄積する。次世代シーケンサーによる解析が予定より遅くなったため、主に次世代シーケンサー解析に伴う費用分が当該助成金となりました。循環癌細胞の検出方法を変更したため、必要試薬代金に変更が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせて次世代シーケンサー解析に伴う費用として使用予定です。研究が順調に進んでおり、当初の予定を上回る数のサンプルを解析できる見込みとなったため、必要研究費総額には大きな変更が生じない予定である。
極低温・高圧力下中性子散乱法の開発とf電子系の磁性と超伝導の相関の研究

UGe_2は圧力下で超伝導と強磁性が共存する。圧力温度相図の中で、強磁性相に内包する形で所謂T_X(P_X)と呼ばれるもうひとつの特性温度が存在する。P_Xを中心とする圧力範囲で超伝導が生ずることから、T_Xの理解によって超伝導に関する知見を得られるものと考えられる。そこで、高圧力下と希釈冷凍機を組み合わせた極端条件下中性子散乱研究によって、UGe_2における超伝導の発現機構に関する知見を得ることを目的とする。本年度の具体的な研究実績は以下の通りである。(1)UGe_2の強磁性ブラッグピークの精密な温度依存性は、ストーナーモデルによってうまく解析可能であることが分かった。ストーナーモデルによる解析によると、T_X(P_X)以下の領域では、有限のエネルギーをもつストーナーギャップをもつ完全強磁性体であり、重い準粒子バンドが完全に偏極した状態であるとの結論を得た。T_X(P_X)以上の領域では、二通りの解釈を試みている。T_X(P_X)以下のストーナーギャップが壊れてゼロになり重い準粒子バンドが常磁性を示す可能性と、より大きなストーナーギャップをもつ可能性である。これらの結果は各種学会にて発表後、2つの論文として出版された。(2)超伝導の発現機構として、CDWとSDWが結合したモデルが提唱されており、T_X(P_X)以下の領域でCDWがたつとされている。このため、この超格子反射を捉えるため、初めて圧力下での放射光X線回折実験を行ったが、基本反射に対して1×10^<-4>の強度の精度で、特に新たな反射は見つからなかった。これらは、理論に一定の制限を与える結果であり、現在投稿中である。(3)UGe_2に加えて、超伝導と反強磁性が共存するCeRhIn_5も中性子散乱研究を開始した。この圧力下中性子散乱研究が出来るように、2.5GPaまで加圧可能なNiCrAl-CuBeの二重圧力セルを開発した。以上。反強磁性の場合と異なり、内部磁場が超伝導コヒーレンス長程度のスケールでキャンセルされることはない。強磁性と超伝導が如何に住み分けているかを明らかにし、さらに反強磁性と共存するUPd_2Al_3等と比較検討を行うことは、強磁性と超伝導の相関を明らかにする上で大きな意義を持っている。そこで、高圧力下と希釈冷凍機を組み合わせた中性子散乱研究法を開発した上で、UGe_2における超伝導の発現機構に関する知見を得るために、強磁性と超伝導の共存が空間的に不均一であるか否かについて実験的に決着をつけることと、理論との比較のため、強磁性相の相境界線(1次転移か2次転移か?)を明らかにすることを目的として研究を進めた。(1)研究協力関係にある名古屋大学理学研究科の佐藤憲昭助教授のグループと協力し、UGe_2の純良単結晶を育成した。(2)希釈冷凍機用の小型(外形14mm程度)の最高到達圧力2GPa程度の銅ベリリウム製汎用型の圧力セルを物性研上床美也助教授と協力して作成した。(当初、よりSNのよい中性子に対して透過し易いアルミニウム系合金を用いる計画であったが、なかなか2GPaを到達するアルミニウム系合金の探索には至っていない。)(3)UGe_2における強磁性と超伝導の共存が空間的に不均一であるか否かについて実験的決着をつけるために、高圧下(1.6GPa)における中性子散乱を希釈冷凍機温度域で行った結果、現時点では、強磁性相、及び内包するTx相、超伝導相において、強磁性ブラッグピークに相関長などに顕著な変化は見られていない。測定した圧力点数がまだ限られるため、より多くの圧力での測定が望まれる。以上。得に、強磁性相に内包する形で所謂T_x(P_x)と呼ばれるもうひとつの特性温度が存在する。P_xを中心とする圧力範囲で超伝導が生ずることから、T_xの理解によって超伝導に関する知見を得られるものと考えられる。(1)UGe_2の強磁性ブラッグピークの温度依存性の精密に測定した。これらの圧力依存性より、温度-圧力測定相図を決定できた。Huxleyらが以前報告していたように、強磁性相の相境界線が絶対零度付近で1次転移であることを支持する結果となった。(2)また、強磁性ブラッグピークの温度依存性を幾つかのモデルによる解析を試みた。その中でも、ストーナーモデルによる解析が、実験との一致がよい結果となった。ストーナーモデルによる解析によると、T_x(P_x)以下の領域では、有限のエネルギーをもつストーナーギャップをもつ完全強磁性体であり、重い準粒子バンド完全に偏極した状態であるとの結論を得た。T_x(P_x)以上の領域では、二通りの解釈を試みている。

T_x(P_x)以下のストーナーギャップが壊れてゼロになり重い準粒子バンドが常時性を示す可能性と、より大きなストーナーギャップをもつ状態なのか、どちらであるかはまだ結論できていない。(1)(2)の結果は現在投稿中である。(3)超伝導の発現機構として、CDWとSDWが結合したモデルが提唱されており、T_x(P_x)以下の領域でCDWがたつとされている。このため、この超格子反射をとられるため、初めて圧力下での放射光X線回折実験を行ったが、特に新たな反射は見つけられなかった。以上。UGe_2は圧力下で超伝導と強磁性が共存する。圧力温度相図の中で、強磁性相に内包する形で所謂T_X(P_X)と呼ばれるもうひとつの特性温度が存在する。P_Xを中心とする圧力範囲で超伝導が生ずることから、T_Xの理解によって超伝導に関する知見を得られるものと考えられる。そこで、高圧力下と希釈冷凍機を組み合わせた極端条件下中性子散乱研究によって、UGe_2における超伝導の発現機構に関する知見を得ることを目的とする。本年度の具体的な研究実績は以下の通りである。(1)UGe_2の強磁性ブラッグピークの精密な温度依存性は、ストーナーモデルによってうまく解析可能であることが分かった。ストーナーモデルによる解析によると、T_X(P_X)以下の領域では、有限のエネルギーをもつストーナーギャップをもつ完全強磁性体であり、重い準粒子バンドが完全に偏極した状態であるとの結論を得た。T_X(P_X)以上の領域では、二通りの解釈を試みている。T_X(P_X)以下のストーナーギャップが壊れてゼロになり重い準粒子バンドが常磁性を示す可能性と、より大きなストーナーギャップをもつ可能性である。これらの結果は各種学会にて発表後、2つの論文として出版された。(2)超伝導の発現機構として、CDWとSDWが結合したモデルが提唱されており、T_X(P_X)以下の領域でCDWがたつとされている。このため、この超格子反射を捉えるため、初めて圧力下での放射光X線回折実験を行ったが、基本反射に対して1×10^<-4>の強度の精度で、特に新たな反射は見つからなかった。これらは、理論に一定の制限を与える結果であり、現在投稿中である。(3)UGe_2に加えて、超伝導と反強磁性が共存するCeRhIn_5も中性子散乱研究を開始した。この圧力下中性子散乱研究が出来るように、2.5GPaまで加圧可能なNiCrAl-CuBeの二重圧力セルを開発した。以上。
統計的予測問題の尤度解析に関する基礎的研究

統計的予測においても、モデル構築の便宜上、パラメータを含むいわゆるパラメトリックモデルを想定することが多い。しかし本来の解析目的は、観測対象の将来の実現値であり、仮に導入したパラメータではない。この仮のパラメータをどう処理するかが、統計的予測論の大きなテーマの一つである。簡便な方法として、パラメータをデータから推定し、その値が真であるものとしてモデルを確定し、予測を行うことが考えられる。しかしこの方法には、モデルを厳格に規定してしまうことから来る、予測性能の悪さという欠陥がある。そこで最近では、モデルにある意味の柔軟性を持たせて予測を行うという考え方が中心になって来ている。そのような方法論の代表がベイズ予測法であるが、近年注目を集めているのは、予測尤度法とサンプルリユーズ法(ブートストラップ法)である。本研究の代表者も、この分野の研究にこの数年取り組んできた。そして一つの方法論を提唱した。その概要は以下の通りである:1)パラメトリックブートストラップ法で、観測できない変数値の出現確率に関する事前情報を集める。2)観測データを用い、この事前情報を予測尤度で改善し、推測分布を構成する。3)この推測分布を使い、予測分布を構成する。4)数値実験では、このようにして得られる予測分布は、従来の方法で作られる予測分布と比べて、良い予測結果を与える。5)以上の方法は、Jeffreysの事前情報を用いるベイズ予測法と、密接に関係している。この成果は学術誌に掲載された。現在、この方法論をさらに改良発展させることをめざしている。
ニュートリノ質量を説明する最小超対称標準模型の構築

本年度は、ミラージュ伝達から予言されるゲージーノの質量比によって、超対称標準模型が現実的な真空構造を自然に説明できる事を明らかにした。この結果は論文にまとめ、研究発表を行った。更に、高エネルギーでパリティを保存する模型、第4世代に相当するベクトル型フェルミオンを導入した模型についての結果も発表した。最小超対称標準模型には、ヒッグシーノの質量項が自然に説明できないという問題がある。ヒッグシーノはレプトン数を破った際にニュートリノとの混合を起こすため、ニュートリノ質量と強く関連づいている。当初の計画では、この質量項は何らかの機構で説明できたと仮定し、ニュートリノ質量に着目する予定であった。しかし、想定していたゲージーノ質量比がこのヒッグシーノ質量生成機構を与えうる、という興味深い事実を発見したため、その解析を行った。一重項ヒッグス粒子の真空期待値によるヒッグシーノ質量項生成機構が知られていた。この場合、新たなヒッグス粒子も含めたポテンシャルが観測と整合する真空構造を持つ必要があるが、その起源を与える事は困難であった。本研究では、ミラージュ伝達で予言されるゲージーノ質量比によって、現実的な真空構造が導ける事を示した。更に、加速器実験・直接探査実験での検証可能性も明らかにし、論文としてまとめ、国内外の研究会・セミナーで発表した。標準模型における強いCP問題を解決する模型として、高エネルギーでパリティを保存する模型を構築し、ニュートリノ、暗黒物質の性質や加速器実験での検証可能性を明らかにし、結果を論文を発表した。標準模型には3世代のフェルミオンが存在するが、ベクトル型の4世代目のフェルミオンを加える事で、近年のLHCb実験等で報告されている標準模型の予言からのずれを説明する模型を構築し、結果をアメリカの研究会で発表した。本研究課題の前提となるヒッグシーノ質量項の生成機構について、計画で想定していたゲージーノ質量のパターンが有効な効果を与える事を示した。ニュートリノ質量との関連については解析を進めている段階であり、結果を得られていないが、既に課題に関連した興味深い結果が得られ、論文を公表、国内外の研究会で成果を発表できたため。ニュートリノ質量との関連について引き続き解析を進め、現在の観測結果を再現するパラメータ領域を特定し、伝達機構との関連を明らかにしていく。更に、LHC実験等の加速器実験での直接探査やフレーバーの破れによる、模型の検証可能性について解析していく計画である。それに加え、今年度に解析を進めた一重項ヒッグスが存在する場合についても考察し、ニュートリノ質量等とヒッグスポテンシャルの持つ真空構造の関連を探る事も考えている。必要な物品購入・旅費を支払った後、端数が発生したため。来年度の旅費にあてる。
高分子間静電相互作用の共有結合変換に基づく多環高分子トポロジーの精密設計

環状トポロジー構造高分子の一般的かつ高効率合成の鍵となる、低濃度の高分子鎖末端を連結し大環状構造を効率的に形成する新たな戦略として、高分子前駆体の静電相互作用に基づく自己組織化と共有結合への変換・固定化を統合した逐次プロセス(Electrostatic Self-Assembly and Covalent Fixation)を創案し、研究を展開した。本研究によって、従来実用的スケールで得ることが困難であった多環状構造を含む新奇高分子化合物群を高効率に合成する新反応システムを開発することに成功した。これら単環状および複環状構造を含む非線形高分子トポロジーは、幾何学的な知的好奇心の対象となるだけでなく、"分子デバイス"・"分子マシン"と総称される次世代新材料を実現するための基礎としても重要な意義を持つものと考えられる。また、単環状および複環状構造を含む高分子群では、末端が存在しないという直鎖状・分岐状高分子とは異なるトポロジーに起因する新奇な物性を発現することから、これまで直鎖状および分岐状高分子を基礎としてきた高分子材料開発のパラダイムの転換にもつながる革新的技術となると期待される。本研究は、大環状構造を基本単位とする新奇トポロジカル高分子群を、申請者らが独自に開発した末端に環状オニウム塩基を有する高分子前駆体(テレケリクス)の高分子間静電相互作用による自己組織化とその共有結合変換に基づく効率的合成システム(Electrostatic Self-Assembly and Covalent Fixation)よって設計・合成するものである。本年度は以下の項目について研究を行った。1.単環および多環高分子トポロジーの構築N置換-アルキルおよびフェニルピロリジニウム(5員環アンモニウム)塩基のテレケリクス末端への導入を行い、次に環状オニウム塩型テレケリクスの対アニオンとしてビフェニルカルボン酸アニオンまたはテレフタル酸アニオンなどのジカルボン酸アニオンを導入した後、適当な希釈条件下で過熱処理して環状オニウム塩の定量的な開環反応を行い、イオン結合を共有結合に変換することによって、単環状高分子の高効率合成に成功した。さらに多環高分子トポロジーの構築を目的として、上記環状オニウム塩型直鎖および分岐テレケリクスと多官能カルボン酸塩による反応を希釈条件で行い、分子内環化反応を優先させることによって、環状構造を含む種々の高分子群の合成を試みた。2.トポロジカル異性体の合成と分離および相互変換環状オニウム塩型直鎖および分岐テレケリクスと多官能カルボン酸塩による複環状構造高分子群の合成システムの中から、2官能ー3官能の組合せに着目し、化学構造がまったく同一でそのトポロジー形態のみが異なる、高分子トポロジカル異性体の合成を行った。さらにこれら異性体の分離にも成功した。1.メタセシス縮合を用いる単環および双環高分子トポロジーの構築、本研究では、これまでに種々の官能基を持つ環状高分子前駆体(kyklo-Telechelics)の効率的合成に成功している。この結果をさらに進めて、アリル基を持つ3種の環状高分子前駆体からの8の字型高分子の合成を行った。この際、Grubbs触媒を用いるメタセシス縮合を適用すれば、低濃度条件でも極めて選択的に分子内縮合が進行することが示された。これにより」単環状高分子だけでなく8の字型双環状トポロジー高分子の高効率合成に成功した。さらに高度な多環高分子トポロジーの構築を目的として、対照型カップリングプロセスであるメタセシス縮合反応に加えて、非対称型カップリングプロセスとしてSonogashira反応に着目し、水酸基型環状高分子前駆体を臭化アリール基およびアセチレニル基型前駆体に変換するプロセスについても検討した。2.3種の双環状トポロジー高分子の設計と構築双環状トポロジーには、8の字型の他にθ型と手錠型トポロジーが存在する。

このうち後の二つを直鎖状テレケリクスと3官能カップリング試薬との組み合わせによって同時に生成するトポロジー異性体として、また、θ型高分子を3官能星型テレケリクスと3官能カップリング試薬との組み合わせによって選択的に合成することに成功した。本研究では、大環状構造を基本単位とする新奇トポロジカル高分子群を、申請者らが独自に開発した末端に環状オニウム塩基を有する高分子前駆体(テレケリクス)の高分子間静電相互作用による自己組織化とその共有結合変換に基づく効率的合成システム(Electrostatic Self-Assembly and Covalent Fixation)よって設計・合成した。この反応システムは、直鎖高分子の適切な位置に導入した、低濃度のイオン性官能基のクーロン引力による自己組織化と、さらにこのイオン性集合状態を、環歪みを持つオニウム塩の対アニオンによる求核的開環反応を利用して共有結合固定するという、全く新しい2段階・逐次高分子反応プロセスであり、これにより従来実用的スケールでの入手が困難であった多様な多環状トポロジーを有する新奇高分子化合物群を提供できる。本年度は、前年度までの成果を基礎に以下の項目について研究を展開した。1.縮合型およびスピロ型多環高分子トポロジーの構築、多官能カルボン酸対アニオンを有する環状オニウム塩型直鎖および分岐型テレケリクスを合成し、希釈条件での共有結合化によって分子内環化反応を優先させ、環状構造を含む種々の高分子群を合成する。特に、相補的な官能基対を含む単環状および多環状反応性高分子(多環状テレケリクス)を合成し、これらを利用する高選択的縮合反応(Suzuki-coupling反応、Metathesis反応等)を用いて縮合型(θおよびα,β,γ,δ型トポロジー)、およびスピロ型(8および3連環型トポロジー)多環高分子トポロジーの構築を試みた。さらに、高分子-高分子型自己組織化集合体を経由するK_<3,3>型トポロジーについても検討した。2.トポロジカル異性体の合成と分離、および構造決定と相互変換これまでに、化学構造がまったく同一でそのトポロジー形態のみが異なる、高分子化合物に特異的な異性体(トポロジカル異性体)の合成と分離に成功しているが、本年度はその直接的な構造同定を行い、さらに相互変換(異性化)プロセスについても検討した。以上に加えて、3.環鎖複合トポロジー(トポロジーブロック)の構築および、4.単一サイズ大環状分子の合成についても実施し、これらを総合して「高分子トポロジー化学」の体系化を進めた。
キノンをシグナル発生タグとして用いるＨＣＶ抗原の非酵素的化学発光イムノアッセイ

本研究の目的は、化学発光イムノアッセイにおける検出手段として一般的な酵素標識法に代わる新たな手段として、キノンをシグナル発生タグとして用いる非酵素的超高感度化学発光法を開発し、HCVコア抗原に対する化学発光イムノアッセイへの応用することにある。本研究ではアビジン-ビオチンシステム及びデンドリマー技術を組み合わせた手法により抗体へのキノン標識を行う。最初に、1,2-ナフトキノン-4-スルホン酸とビオチンヒドラジドを結合させることにより、ビオチン化ナフトキノンを合成した。ビオチン化ナフトキノンに還元剤ジチオスレイトールと化学発光試薬ルミノールを添加することで、ビオチン化ナフトキノンの濃度に応じた強い発光が観察されることが確認できた。したがって、ビオチン化抗体とビオチン化キノンとをアビジンを介して結合させる手法により、抗体に捕捉した抗原量を化学発光強度として測定可能な方法へと展開できると考えられた。次に、より強い発光を与えるようなビオチン化キノンを開発するために、第3世代ポリリジンデンドリマーの合成を試みた。第3世代ポリリジンデンドリマーは構造中に8残基のアミノ基を有しているが、このアミノ基すべてにナフトキノンを導入後にビオチン化することで、1つのビオチンに対して8分子のキノン部位を有するビオチン化キノンを得ることができ、これまでに作成したビオチン化キノンよりも更に強い発光を与えることが期待された。既報にしたがってt-Bocリジンを原料としてポリリジンデンドリマーの合成を行なった。しかしながら、第2世代までの時点での合成の収率は3.5%と非常に低く、第3世代ポリリジンデンドリマーの合成は困難であることが予想された。抗体の標識に利用可能なビオチン化キノンを一段階の反応により容易に合成する手法を開発することができた。さらに、合成したビオチン化キノンは還元剤と化学発光試薬を添加することで長時間持続する安定な化学発光を与えることを確認できた。また、ビオチン化キノンデンドリマーの開発のために、ポリリジンデンドリマーの合成を試みたが反応収率が低く、目的とする第3世代ポリリジンデンドリマーの合成は現在までのところ達成できていない。本年度に合成したビオチン化キノンを市販のELISAキットと組み合わせて化学発光イムノアッセイを開発し、ビオチン化酵素を用いる従来のイムノアッセイとの性能比較を行う。また、合成が困難であったポリリジンデンドリマーに代えて、市販のポリリジンポリマーを原料として合成を行うことにより、1つのビオチンに多数のキノンを結合させた化合物の作成を検討する。さらに、ビオチン化キノンを用いる化学発光イムノアッセイに適した化学発光試薬として、N-(4-アミノブチル)-N-エチルイソルミノール(ABEI)と還元剤α-リポ酸を直接結合させた化合物の合成を行う。将来的には、本研究で開発した手法をエジプトで罹患率の高い疾患の診断法へと展開していきたい。

また、合成が困難であったポリリジンデンドリマーに代えて、市販のポリリジンポリマーを原料として合成を行うことにより、1つのビオチンに多数のキノンを結合させた化合物の作成を検討する。さらに、ビオチン化キノンを用いる化学発光イムノアッセイに適した化学発光試薬として、N-(4-アミノブチル)-N-エチルイソルミノール(ABEI)と還元剤α-リポ酸を直接結合させた化合物の合成を行う。将来的には、本研究で開発した手法をエジプトで罹患率の高い疾患の診断法へと展開していきたい。
不活性高質量原子による超低軌道環境における衝突励起材料劣化現象に関する包括的理解

本研究では超低軌道複合宇宙環境下でのN2衝突によるフッ素系高分子劣化に関する包括的理解を目的とした。宇宙材料劣化評価におけるリファレンス試料であるポリイミドでは原子状酸素とAr(N2と同等の不活性、高質量分子)の同時照射では複合照射効果が発現したが、FEP/Agでは各単独照射の劣化量を足し合わせた結果となり、複合効果は見られなかった。これはフッ素系材料では原子状酸素とArが独立した反応系を有することを示している。本研究の結果より超低軌道宇宙環境でフッ素系材料の劣化現象を評価する場合には、原子状酸素のみならずN2の高エネルギー衝突による影響を考慮する必要があることが初めて明らかになった。これまで30年以上にわたり宇宙環境における主要な材料劣化要因としては化学的に活性な原子状酸素の影響が考慮されてきたが、昨年、化学的には不活性な高質量原子の衝突が一部材料の質量損失に対して大きな影響を及ぼしている可能性が本申請者と米国研究者の研究により独立に明らかにされた。これを受けて、本研究ではN2やCO2など高質量分子衝突による劣化現象に対して、影響を受ける材料の範囲、紫外線、温度などのシナジー効果の有無と発現条件を明確化し、宇宙工学上のインパクトを定量的に精査することを目的とする。さらにNASA研究者の協力により、過去の宇宙実験結果を本研究により得られた結果に基づいて再検証し、これまで宇宙曝露実験と地上試験結果の不整合として知られていた宇宙材料工学上の問題を、高質量原子衝突現象およびそのシナジーを考慮することにより解決することを目指すものである。平成25年度には装置のトラブルがあったものの、N2ビームフラックス測定方法の確立するために飛行時間(TOF)スペクトルからビームパルス中のN2フラックスを計測する方法の確立を行った。このために必要となる四重極質量分析管における検出効率の決定を、既知の組成のN2+ArガスとO2+Arガスを用いることで、Arを基準としてO, O2等の相対検出感度をTOFスペクトル強度から測定する事に成功した。これにはビーム形成条件の最適化によりO2が完全に解離したArとOのみの組成を有するビームの形成に成功したことが大きい。次年度以降はこの手法を適用してN2やArなどの不活性高質量ビームの宇宙環境材料劣化への効果について検証を行う。これまで30年以上にわたり宇宙環境における主要な材料劣化要因としては化学的に活性な原子状酸素の影響が考慮されてきたが、近年、化学的には不活性な高質量原子の衝突が一部材料の質量損失に対して大きな影響を及ぼしている可能性が本申請者と米国研究者の研究により独立に明らかにされた。これを受けて、本研究ではN2やCO2など高質量分子衝突による劣化現象に対して、影響を受ける材料の範囲、高質量原子衝突と原子状酸素、紫外線、温度などのシナジー効果の有無と発現条件を明確化し、宇宙工学上のインパクトを定量的に精査することを目的とする。平成25年度にビーム中のAr、N2と原子状酸素、酸素分子の定量化手法を確立したのに引き続き、平成26年度には温度可変ステージを用いて+70°Cにおける紫外線同時照射効果について原子状酸素とArビームについての個別照射実験を実施し、複合効果における温度依存性に関する解析を行った。平成26年度には温度可変ステージを用いて+70°Cにおける紫外線同時照射効果についての実験を行うのと並行して、原子状酸素とArビームについての個別照射実験を実施し、複合効果における温度依存性に関する解析を行った。平成27年度にはAO+Ar混合同時照射効果について実験を実施するとともに、クロスビーム実験装置への装置改造を行った。実験の結果、原子状酸素と真空紫外線を同時照射した場合には、温度が高い条件下で複合効果が顕著に確認されること、Arビームを単独照射した場合の材料劣化は原子状酸素単独照射による劣化量と比べて小さいこと、AO+Ar同時照射時には質量減少が加速される可能性があること等が明らかになり、最終年度のクロスビーム複合照射試験に向けての準備がほぼ整った。

その結果、FEP/Agに原子状酸素を単独照射した場合にはフィルムの変色が生じ、高温ほど質量損傷率が増大することが明らかになった。原子状酸素と真空紫外線を同時照射した場合には、温度が高い条件下で複合効果が顕著に確認され、低温時には負の複合効果(反応抑制効果)が確認された。これらの実験結果は原子状酸素と紫外線の複合効果が温度に敏感であること、すなわち、熱活性化過程を伴う化学反応が律速していることを示唆するものである。一方、Arビームを単独照射した場合の材料劣化は原子状酸素単独照射による劣化量と比べて小さいことが実験の結果示され、低地球軌道における材料劣化反応は、酸化反応、主鎖切断反応、光励起脱離反応、衝突励起脱離反応、昇温脱離反応等が同時に生じる複合反応系であり、質量減少というマクロな評価では律速過程が複雑に変化することから、全体の劣化現象の理解には個々の反応を定量的に評価する必要性があることが明らかになった。さらに平成26年度にはレーザーデトネーション装置を2基組み合わせた世界初のクロスビーム装置を実現するための装置変更がほぼ終了した。これまで30年以上にわたり宇宙環境における主要な材料劣化要因としては化学的に活性な原子状酸素の影響が考慮されてきたが、昨年、化学的には不活性な高質量原子の衝突が一部材料の質量損失に対して大きな影響を及ぼしている可能性が本申請者と米国研究者の研究により独立に明らかにされた。これを受けて、本研究では窒素分子や二酸化炭素など高質量分子衝突による劣化現象に対して、影響を受ける材料の範囲、高質量原子衝突と原子状酸素、紫外線、温度などのシナジー効果の有無と発現条件を明確化し、宇宙工学上のインパクトを定量的に精査することを目的とする。さらにNASA研究者の協力により、過去の宇宙実験結果を本研究により得られた結果に基づいて再検証し、これまで宇宙曝露実験と地上試験結果の不整合として知られていた宇宙材料工学上の問題を、高質量原子衝突現象およびそのシナジーを考慮することにより解決することを目指すものである。平成26年度には温度可変ステージを用いて+70°Cにおける紫外線同時照射効果について原子状酸素とアルゴンビームについての個別照射実験を実施し、複合効果における温度依存性に関する解析を行った。平成27年度には原子状酸素とアルゴンの混合同時照射効果について実験を実施するとともに、簡易型クロスビーム実験装置への装置改造を行った。それに引き続き、平成28年度には簡易型クロスビーム実験装置を用いて、原子状酸素とアルゴンの照射タイミング、アルゴン衝突エネルギーに対する依存性、アルゴンビームフラックスの効果について明らかにした。その結果、これまで宇宙環境における材料劣化に対して無害と考えられてきた高エネルギー窒素分子衝突(実験ではアルゴン衝突で模擬)が、複合効果により原子状酸素誘起材料劣化に大きな影響を与えることを見出した。平成25年度にビーム中のアルゴン、窒素分子、原子状酸素および酸素分子の定量化手法を確立したのに引き続き、平成26年度には温度可変ステージを用いて複合効果における温度依存性に関する解析を行った。その結果、FEP/Agでは高温ほど質量損傷率が増大すること、原子状酸素と真空紫外線を同時照射では温度が高い条件下で複合効果が顕著に確認されること等が確認された。
Il-23/Th17による慢性炎症の制御機構の解明とがん治療への実用化

IL-23の全身投与により、Th1細胞ならびにTh17細胞が有意に増強されることを明らかにし、このうちTh1細胞については、内因性IL-12を介して、抗腫瘍効果に深く関わっていることを示してきた。しかしながら、Th17細胞の抗腫瘍効果への関与については未だ不明である。そこで、wildtypeおよびIL-17遺伝子欠損マウスを用いて、IL-23の全身投与により増強されるTh17細胞の抗腫瘍免疫における役割について検討した。IL-23の全身投与により、Th1細胞ならびにTh17細胞が有意に増強されることを明らかにした。このうちTh1細胞については、内因性IL-12を介して抗腫瘍効果に深く関わっていることを示してきた。Th17細胞は、慢性炎症において、マクロファージや樹状細胞が抗原刺激により産生するIL-23を介しIL-17産生を促進させる。IL-17はT細胞応答を亢進させ、さらにIL-1、IL-6、IL-8およびTNFなどの炎症性メディエーターを誘導することにより炎症応答を引き起こすことが知られている。そこで、本研究課題において、野生型およびIL-17遺伝子欠損マウスを用いてin vitroならびにin vivoにて、IL-23により誘導されるTh17細胞の抗腫瘍免疫における機序、およびIL-23のTh1細胞の抗腫瘍効果にTh17細胞が及ぼす影響について検討した。手法としては、マウス皮下腫瘍モデル(腫瘍:MCA205、MC38、B16F10)に、IL-23-cDNAをIVE法による遺伝子導入によりIL-23を全身発現させ、3週間後に腫瘍浸潤リンパ球、所属リンパ節、ならびに脾臓における抗腫瘍免疫応答に関して各種免疫学的解析を行った。同時に、慢性炎症疾患の発症に関して、免疫学的解析をおこなった。IL-23の全身投与により、Th1細胞ならびにTh17細胞が有意に増強されることを明らかにし、このうちTh1細胞については、内因性IL-12を介して抗腫瘍効果に深く関わっていることを示してきた。Th17細胞は、慢性炎症において、マクロファージや樹状細胞が抗原刺激により産生するIL-23を介し、IL-17産生を促進させる。IL-17は、T細胞応答を亢進させ、さらにIL-1、IL-6、IL-8およびTNFなどの炎症性メディエーターを誘導することにより炎症応答を引き起こすことが知られている。そこで、wild typeおよびIL-17遺伝子欠損マウスを用いてin vitroならびにin vivoにて、IL-23投与により誘導されるTh17細胞の抗腫瘍免疫における機序およびIL-23のTh1細胞の抗腫瘍効果にTh17細胞が及ぼす影響について検討した。手法としては、マウス皮下腫瘍モデルに、IL-23をIVE法による遺伝子導入により全身発現させたのち、腫瘍浸潤リンパ球、所属リンパ節ならびに脾臓における抗腫瘍免疫応答に関して各種免疫学的解析を行った。同時に、大腸における腸管慢性炎症に関して、免疫染色法で解析した。本研究課題の23年度の研究目的である、IL-23投与により誘導されるTh17細胞の抗腫瘍免疫応答機序およびIL-23の抗腫瘍効果にTh17細胞が引き起こす慢性炎症が及ぼす影響の解明に関する検討がほぼ終了している。本研究課題の24年度の研究目的である、IL-23による腫瘍抗原を用いたDNAワクチンの増強効果に関する研究に着手し、有効ながん免疫療法の開発を進めていく。腫瘍抗原を蛋白として発現できるDNAワクチンの評価が可能な腫瘍系を構築する。まず、マウスのメラノーマ抗原として同定されたTRP2の塩基配列を基にしたPCR用プライマーを設計し、B16マウスメラノーマ細胞株より採取したmRNAをテンプレートとしてTRP2の全長cDNAを得る。これを発現プラスミドに組み込みワクチン用プラスミドとする。そして、この発現プラスミドをマウス筋肉内に投与し、有効なTRP-2特異的免疫反応および抗腫瘍効果を惹起できるか否かを検討する。その後、IL-23をIVE法による遺伝子導入により全身発現させ、DNAワクチンの増強効果について検討する。IL-23発現プラスミドのIVE併用投与量は、予備検討を行い、単独投与で移植腫瘍の完全消失が認められない量とする。TRP-2特異的な抗腫瘍免疫応答に関しては、腫瘍浸潤リンパ球、所属リンパ節ならびに脾臓を用いて各種免疫学的解析を行う予定である。
舞踊家邦正美のオーラル・ヒストリーによるライフ・ヒストリー構築へ向けた調査研究

本研究は平成30年度の研究計画として、舞踊家邦正美(韓国名:朴永仁)オーラル・ヒストリーと邦に関する現地の調査での資料・情報収集の対象を国内に絞り、「1,資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)、2,邦の元弟子、舞踊家能藤玲子氏へのオーラル・ヒストリー、3,資料収集(旗野恵美・由記子創作舞踊研究所・東京)、4,邦が旧制松江高校に進学した際にドイツ語を師事したフリッツ・カルシュ博士について研究をする若松秀俊氏(東京医科歯科大学大学院教授)へのインタヴュー調査、5,邦の妻、江原冨代氏(現、邦正美創作舞踊研究所代表)へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集」を予定していたが、残念ながら、研究代表者の体調不良および育児を理由に本年度をもって廃止することとなった。研究計画のうち、「1,資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)」については、次の二点を収集した。1,朴永仁(1930年)「映画音楽に就いて」,『校友会雑誌』16号,旧制松江高校2,朴永仁(1930年)「映画音楽の実際」,『校友会雑誌』17号,旧制松江高校これらの論考は、邦が旧制松江高校在学中に執筆したものであり、管見の限りでは初めて掲載された邦の論考である。この論考から、旧制松江高校在学中に邦は、映画音楽に着目していたことが分かるが、その着眼点が舞踊分野へと推移していった経緯は、いまだに解明されていない。既に、邦の舞踊との出会いが旧制松江高校時代であることが分かっているため、邦のライフ・ヒストリーを解明するにあたり、この着眼点の推移は重要な課題である。それゆえ、今後舞踊家邦正美を扱う研究者には、邦の活動の舞踊分野への推移についての解明を求めたい。舞踊家邦正美(1908-2007)に関するオーラル・ヒストリー・アーカイヴ構築へ向けた調査研究を目的としている。本研究では、文献資料のみでは得られない生前の邦を知る人たちを中心としたオーラル・ヒストリー、及び邦が関わった国々の調査から国内外に分散している資料や情報・記録の収集をし、将来的なアーカイヴ化も視野に入れ、その基礎となる邦のライフ・ヒストリー構築のための調査研究を行う。平成28年度の研究実施計画として、オーラル・ヒストリーと邦に関する現地の調査での資料・情報収集の対象を国内に絞り、「1、邦の出身校である旧制松江高校、現・島根大学での資料・情報収集、2、邦の元弟子、舞踊家能藤玲子氏へのオーラル・ヒストリー(北海道)、3、邦の元弟子、舞踊家旗野恵美へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集(東京)、4、邦が旧制松江高校においてドイツ語を師事したフリッツ・カルシュ博士を研究している若松秀俊氏(東京医科歯科大学名誉教授)へのインタヴュー調査(東京)、5、邦の妻、江原冨代氏(現、邦正美創作舞踊研究所代表)へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集(東京)」を計画していたが、研究代表者の出産に伴い、産前産後の休暇及び育児休業を取得したため、15の実施計画はこのまま平成29年度に持ち越すこととする。平成28年度の研究成果としては、舞踊家能藤玲子氏、舞踊家旗野恵美氏、若松秀俊氏へオーラル・ヒストリー及びインタヴュー調査の打診をしたほか、文献資料をもとに現段階までの邦についてまとめた論考を「舞踊家邦正美の足跡を辿る」(『ダンスワーク』ダンスワーク舎(75),2016.9.25)と題し執筆した。平成28年度は、舞踊家能藤玲子氏、舞踊家旗野恵美氏、若松秀俊氏へオーラル・ヒストリー及びインタヴュー調査の打診をしたほか、文献資料をもとに現段階までの邦についてまとめた論考を「舞踊家邦正美の足跡を辿る」(『ダンスワーク』ダンスワーク舎(75),2016.9.25)と題し執筆し、研究を進めていったが、研究代表者の出産に伴い、産前産後の休暇及び育児休業を取得し補助事業を一時中断した。これにより、当初平成28年度に予定していた調査研究を計画通りに実施できなかった。本研究では、文苑資料のみでは得られない生前の邦を知る人たちを中心としたオーラル・ヒストリー、および邦が関わった国々の調査から国内外に分散している資料や情報・記録の収集をし、将来的なアーカイヴ化も視野に入れ、その基盤となる邦のライフ・ヒストリー構築のための調査研究を行う。平成29年度の研究実施計画として、オーラル・ヒストリーと邦に関する現地の調査での資料・情報収集の対象を国内に絞り、「1,資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)、2,邦の元弟子、舞踊家能藤玲子氏へのオーラル・ヒストリー、3,邦の元弟子、舞踊家旗野恵美へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集、4,邦が旧制松江高校に進学した際にドイツ語を師事したフリッツ・カルシュ博士について研究をする若松秀俊氏(東京医科歯科大学大学院教授)へのインタヴュー調査、5,邦の妻、江原冨代氏(現、邦正美創作舞踊研究所代表)へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集」を挙げていたが、オーラル・ヒストリーを充足させるべく海外の資料の翻訳などを優先的に行った。

また、調査対象であった旗野氏へオーラル・ヒストリー調査を打診し準備を進めていたが、残念ながら物故したため聞き取り調査は断念することとなった。その他の未実施計画については、平成30年度に持ち越すこととする。平成29年度の研究成果としては、日本大学大学院における平成29年度舞台芸術専攻第2回(修士論文)研究中間発表会内で設けられた研究員特別中間発表にて「舞踊家邦正美のライフ・ヒストリー構築へ向けた調査研究」と題し、中間報告を発表したほか、同専攻発刊の紀要『Performing Arts Studies /舞台芸術研究』23号にて研究報告を投稿した。オーラル・ヒストリー調査を充足させるべく海外の資料の翻訳などを優先的に行ったこと、また、調査対象であった旗野氏へオーラル・ヒストリー調査を打診し準備を進めていたが、残念ながら物故したため聞き取り調査は断念することとなった。旗野氏は邦の弟子のなかでもより密に邦と関わっていたため、本研究のオーラル・ヒストリー調査において根幹のひとつであったといえる。その他のオーラル・ヒストリー調査への影響も考えられるが、本研究実施前に収録したインタヴュー調査を文字起こしするなどして補っていきたい。上記を平成30年度内に終え、随時インタヴュー内容の確認や確認作業や収集した資料の整理を行い、得た証言、資料から邦のライフ・ヒストリー解明に取り組む予定である。また、新たにオーラル・ヒストリーの対象となる人物が出てくることも予測されるので、彼らへのインタヴューも検討する。本研究は平成30年度の研究計画として、舞踊家邦正美(韓国名:朴永仁)オーラル・ヒストリーと邦に関する現地の調査での資料・情報収集の対象を国内に絞り、「1,資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)、2,邦の元弟子、舞踊家能藤玲子氏へのオーラル・ヒストリー、3,資料収集(旗野恵美・由記子創作舞踊研究所・東京)、4,邦が旧制松江高校に進学した際にドイツ語を師事したフリッツ・カルシュ博士について研究をする若松秀俊氏(東京医科歯科大学大学院教授)へのインタヴュー調査、5,邦の妻、江原冨代氏(現、邦正美創作舞踊研究所代表)へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集」を予定していたが、残念ながら、研究代表者の体調不良および育児を理由に本年度をもって廃止することとなった。研究計画のうち、「1,資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)」については、次の二点を収集した。1,朴永仁(1930年)「映画音楽に就いて」,『校友会雑誌』16号,旧制松江高校2,朴永仁(1930年)「映画音楽の実際」,『校友会雑誌』17号,旧制松江高校これらの論考は、邦が旧制松江高校在学中に執筆したものであり、管見の限りでは初めて掲載された邦の論考である。この論考から、旧制松江高校在学中に邦は、映画音楽に着目していたことが分かるが、その着眼点が舞踊分野へと推移していった経緯は、いまだに解明されていない。既に、邦の舞踊との出会いが旧制松江高校時代であることが分かっているため、邦のライフ・ヒストリーを解明するにあたり、この着眼点の推移は重要な課題である。それゆえ、今後舞踊家邦正美を扱う研究者には、邦の活動の舞踊分野への推移についての解明を求めたい。平成29年度はオーラル・ヒストリーと邦に関連する現地の調査での資料・情報収集の対象を国内に絞り、候補を次のように挙げる。1資料・情報収集(旧制松江高校、現・島根大学)校史などをもとに記録を参照し、邦が受けた教育体制や当時の様子を探る。2舞踊家能藤玲子氏へのオーラル・ヒストリー(北海道)能藤氏は邦が舞踊の普及のために設立した教育舞踊研究会の出身であり、現在も自身の創作舞踊研究所にて邦のメソッドをもとに舞踊家の育成をしている。3舞踊家旗野恵美へのオーラル・ヒストリーおよび資料収集(東京)
ICC発生調節機構の解析とICC幹細胞の探求

消化管筋層にはカハール介在細胞(ICC)と呼ばれる特殊な細胞が存在し、これは腸蠕動運動の歩調とり(ペースメーカー)細胞と考えられている。本研究では胎生期におけるICC前駆細胞を単離し分子生物学的解析を行い、当該細胞の発生に関わる分子機構について示唆することができた。さらに胎生期におけるICC前駆細胞を、セルソーターを用いてより特異的に単離する方法の確立に成功した。マウス胎生後期のカハール介在細胞(ICC)発生に関わる遺伝子の同定のため、本年度は胎生後期のc-KIT発現細胞(ICCおよびその前駆細胞に相当する)における遺伝子発現の変化についてmicroarray法により検索を行った。具体的には胎生16,17,18日マウスの遠位回腸を酵素処理して細胞分散し、c-KIT発現細胞を磁気標識した後細胞分取を行った。その後、各サンプルよりRNA抽出、c-DNA作成後、microarrayによる遺伝子発現解析を行った。その結果、胎生16日以後に発現量が顕著に増加する遺伝子群を見出した。一つは骨形成因子(BMP)シグナリングに関連する遺伝子であり、BMP受容体タイプ1B、BMP inducible kinase、SMAD1の各遺伝子である。また、TGFβシグナル関連遺伝子にも顕著な発現量の増加が見られた(TGFβ受容体、smad 3)。細胞接着因子として、カドヘリン1、cadherin associated protein deltal、mucin-like protocadherinなどの発現も増加していた。また、ICCとしての機能発現を裏付ける各種遺伝子(cGMP-dependent protein kinase type II、アデニル酸シクラーゼ等)の発現も上昇しており、これらはいずれも生後のICCにて発現が報告されている遺伝子であった。胎生後期c-KIT発現細胞におけるBMP/TGFβシグナル関連遺伝子および各種細胞接着因子の発現量の増加は、この時期のICCの発生にこれらの遺伝子が関与することを示唆するものであり、ICCの発生調節機構の解明に必要なデータを与えることができた。次年度はこれら各遺伝子の役割について検討するとともに、別の方法での遺伝子発現解析も行う予定である。マウス胎生後期のカハール介在細胞(ICC)発生に関わる遺伝子の同定のため、昨年度はICC特異マーカーであるc-KITを標的とした磁気ビーズ標識抗体による細胞分取を行った。同法により胎生期における当該細胞を単離し、microarray法による検索を行った結果、いくつかの候補遺伝子を得ることができた。しかしながら消化管では、ICCの他にもマスト細胞や胎生期における腸上皮細胞がc-KITを発現することが想定されるため、本年度はより特異的にICCを分取するためにセルソーターによるICC分取法の確立を目指して実験を行った。マウス胎生期小腸を酵素処理し細胞分散した後に、蛍光標識c-KIT抗体およびCD45抗体(マスト細胞特異マーカー)で染色し、セルソーターによりc-KIT^+CD45^-細胞としてICCの分取を試みた。その結果、E15では全細胞数3×10^6個に対しc-KIT^+CD45^+細胞は4.5×10^2個、c-KIT^+CD45^-細胞は2.5×10^3個、E16では全細胞数1×10^7個に対しc-KIT^+CD45^+細胞は1.3×10^3個、c-KIT^+CD45^-細胞は1×10^4個、E17では全細胞数4×10^7個に対しc-KIT^+CD45^+細胞は4.0×10^4個、c-KIT^+CD45^-細胞は1.4×10^4個、E18では全細胞数5×10^7個に対しc-KIT^+CD45^+細胞は2.5×10^4個、c-KIT^+CD45^-細胞は1.2×10^4個であった。c-KIT^+CD45^-細胞に関するこの結果は、胎生期におけるc-KIT免疫染色の結果ともほぼ一致するものであった。さらに分取する細胞の精度を上げるため、上皮特異的マーカーであるE-cadherin抗体を加えた3種類の蛍光抗体により染色を行い、c-KIT^+CD45^-E-cadherin^-細胞の分取を行い、良好な結果が得られた。現在までに、同方法を用いて胎生15日の胎仔62匹の小腸からの1.9×10^5個のc-KIT^+CD45^-E-cadherin^-細胞を分取した。同方法によって得た細胞からRNA抽出し検定したところ、以後の解析に進むのに十分な質のRNAが得られていることが確認された。