hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
γ-セクレターゼ非依存的なβAPP膜内切断機構の解析

この細胞にタンパク分解酵素の阻害剤であるTPEN(膜透過性金属キレート剤)、Bafilomycin A(エンドソーム/リソソーム酵素阻害剤)、Lactacystin(プロテアソーム阻害剤)を作用させると、TPENで2倍、Lactacystinで1.3倍β-CTFが増加していた。しかし、TPENとLactacystinをswAPP/HEK細胞に作用させてもあまり増加しなかった。この事から、β-CTFの大部分はγ-セクレターゼによって切断されているが、一部はメタロプロテアーゼ及びプロテアソームで分解されることが示唆された。現在、TPENとLactacystinを作用させたswAPP/PSDKOHEK細胞のβ-CTFが膜内で切断されているかを調べるため、膜貫通領域中の断片ペプチドを調製している。γ-セクレターゼの基質であるβ-CTFがメタロプロテアーゼとプロテアソームで分解される可能性を発見した。TPENとLactacystinを作用させた時にswAPP/PSDKOHEK細胞のβAPPが膜内で切断されるのかを調べるため、膜貫通領域の断片ペプチドを液体クロマトグラフ質量分析装置(LC-Ms/Ms)で定量する予定であった。しかし、今まで使用していたLC-Ms/Msが使えなくなり、別の装置で測定できるように設定し直したため時間がかかってしまった。γ-セクレターゼ非依存的なβAPPの膜内切断メカニズムを解析するため、Aβ産生を増加させる家族性アルツハイマー病変異体(スウェーデン変異)のβAPPを発現させたHEK細胞(swAPP/HEK)を作製し、γ-セクレターゼ複合体の主要構成タンパクであるプレセニリン1及びプレセニリン2をCRISPR/CAS9法を用いてノックアウトした(swAPP/PSDKO HEK細胞)。この細胞にオートファジー/リソソーム酵素阻害剤であるクロロキンを作用させると、γ-セクレターゼの基質となるα-またはβ-セクレターゼでβAPPが切断されたC末端断片(α-CTF、β-CTF)が1.3倍増加していた。しかしリソソーム酵素を阻害しないオートファジー阻害剤(Wortmannin)ではCTFの量は変化しなかった。この結果から、CTFの分解には非オートファジーのリソソーム分解系が関与していることが示唆された。クロロキンによってswAPP/PSDKOHEK細胞のCTFの膜内切断が阻害されているかを調べるため、細胞内のオリゴペプチドを調製し、βAPPの膜貫通領域内の3-6アミノ酸のペプチドをLC-Ms/Msで定量した。その結果、βAPPの膜貫通領域由来と考えられる3アミノ酸のペプチド8種類が減少していた。しかし、カテプシンB、H、L、Sを阻害するLeupeptinやカテプシンDを阻害するPepstatin Aでは変化は見られなかった。この事からβAPPの膜貫通領域はリソソームに存在するTripeptidyl peptidase Iの様なペプチドを3アミノ酸ずつ切断するペプチダーゼによって分解されることが示唆された。
幼児の園生活における場のあいまい性の意味に関する研究

本研究の目的は、幼稚園や保育所に存在するあいまいな場所、とりわけ屋内と屋外の間に存在するテラスやベランダ等に着目し、そうした場所が子どもの生活に対して有する意味を明らかにすること、特徴の異なる保育施設間でのそれらの共通性や多様性を捉えることである。研究では、施設の特徴がそれぞれ異なるA保育所、B幼稚園、C保育所における観察を実施した。観察は約1年間行い、3施設で合計185の子どもがあいまいな場所を使用した際のエピソードを収集した。これらに、課題申請以前に観察を終了していたX幼稚園の80エピソードを加えた。エピソードの分析には、修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチの「概念」および「カテゴリー」生成の手順(木下、2003)を用いた。分析により、4施設のあいまいな場所の用途は、8機能(「カテゴリー」)に整理され、さらに【生活・活動のジャンクション】、【つかず離れずの関係性】、【柔軟な生活・活動場所】、【生活・活動の周縁】という4特質(「コア・カテゴリー))に集約された。以上より、4施設のあいまいな場所は、多かれ少なかれ8つの機能に関連する用い方がなされており、共通して4つの特質を有することがわかった。これら4つの特性は個別に存在するのではなく、複合的に作用することで、1つの場所で多様な機能や用途を成立させていると考えられる。加えて、各施設の状況に応じてあいまいな場所の意味が多様化するプロセスの検討を行った。その結果、あいまいな場所の意味は、子どもがその施設で生活・活動を展開する上で直面する空間的・時間的な制限などと関連して発生すること、施設間での制限の差異が、場所の意味の多様化をもたらすことがわかった。あいまいな場所は、保育室や園庭からあふれた子どもや保育室や園庭だけでは満ち足りない子どもの要求に順応し、生活上の制限や問題の克服を援助する役割を担うことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、幼児が幼稚園および保育所のあいまいな場所に見いだす意味を探るために、次の3つの施設のテラスにおいて観察を実施した。観察の際には、幼児がテラスで過ごしている場面を、メモとビデオカメラにより記録し、後にエピソードとして詳細に書き起こした。・A保育所(私立)テラスが2階に位置するなど独特の環境を有する。合計観察日数23日・B保育所(公立)都心部にあり、空間的制約が大きい。合計観察日数13日・C幼稚園(公立)クラス活動が中心の保育を実施している。合計観察日数14日これらのエピソードをもとに、各園のテラスの用途および機能について検討した。うち、A園については、テラスが幼児によって、多目的空間や生活の接続のための場所として用いられる他、ルールや物理的な制約などから逃れられる場所として機能しているという結果が得られた。この結果は、テラスのようなあいまいな場所が、幼児の園生活におけるアジールとして機能していることを意味しており、保育室などの保育環境が幼児にとって制約的な環境であるという見方を示すとともに、そのなかでの幼児の自己実現の方略としてあいまいな場所を位置づけたといえる。他2園については、現在分析中である。加えて、生態学的心理学の理論の一つである情報ピックアップ理論(Gibson1966)の視点を取り入れた、幼児と環境の相互作用の分析にも試行的に着手した。これまでの分析により、幼児の行為に影響を与えるテラスの環境要素の抽出と類型化、および、幼児の行為が変化していくプロセスの一例を捉えることができた。こうした成果は、今後の分析の指標になるとともに、幼児と環境の関係性を記述する上での一つの方法の提示であるといえる。

あいまいな場所は、保育室や園庭からあふれた子どもや保育室や園庭だけでは満ち足りない子どもの要求に順応し、生活上の制限や問題の克服を援助する役割を担うことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。分析や結果の論文化は当初の予定より遅れてはいるものの、データは順調に収集できている。また、データがもつ豊かさも、対象園ごとの分析によりわかってきている。計4つの対象園から収集したデータの総合的な分析方法についても、具体化されつつあり、26年度の早々には、投稿論文の執筆に移ることができる見込みである。引き続き観察を継続しつつ、データの分析作業および論文執筆作業に移行する。まず、残るB園とC園の観察データを分析し、各園のテラスの用途と機能を明らかにする。同時に、各園のテラス、および、保育の特徴を見いだす。次に、過去に扱ったD園も加えた4園の観察データを総合的に分析し、保育環境におけるあいまいな場所の中核的な性質や、その多様性の類型について明らかにする。方法としては、質的研究の方法論であるM-GTAに依拠し、各園のデータから生成した概念をもとに、あいまいな場所の機能と用途に関する構造モデルを描き出していく。以上、二つの分析の成果は、継続的に学会にて発表するとともに、5月および10月を目処に、論文として投稿する予定である。
HSV-1ワクチンの開発

研究期間の前半で、眼科領域におけるHSV-1感染実験マウスモデルの構築を行い、後半ではHSV-1潜伏感染・再活性化時の三叉神経に浸潤する炎症細胞の解析を行った.潜伏感染モデル作成において、現在の時点で最適と思われる感染条件を決定した.三叉神経に浸潤している免疫細胞(制御性T細胞)の分離技術の確立には至らなかった.しかし、免疫細胞の分離技術を他の炎症細胞に応用出来る可能性があり、今後も解析を継続していく予定である.研究期間の前半で、眼科領域におけるHSV-1感染実験マウスモデルの構築を行い、後半ではHSV-1潜伏感染・再活性化時の三叉神経に浸潤する炎症細胞の解析を行った.潜伏感染モデル作成において、現在の時点で最適と思われる感染条件を決定した.三叉神経に浸潤している免疫細胞(制御性T細胞)の分離技術の確立には至らなかった.しかし、免疫細胞の分離技術を他の炎症細胞に応用出来る可能性があり、今後も解析を継続していく予定である.1.HSV-1潜伏感染モデルマウスの作成HSV-1潜伏感染マウスモデルを、より人間に近い条件に近づける為、ウイルスの感染経路とウイルス接種回数の検討実験を行った。(1)角膜に接種するHSV-1の力価を(0・10^3・10^4・10^5pfu/eye)の4点設け、感染4週後の三叉神経節を取り出し、real time PCRを施行した。ウイルス感染4週後の生存率は100%・80%・80%・20%(0・10^3・10^4・10^5pfu/eyeの順で)であった。real time PCRで三叉神経中にHSV-1DNAを検出できた割合は0%・25%・14%・100%(同上)であった。これらの結果より、この実験系での角膜経由のウイルス感染力価は10^4と10^5の間、すなわち5x10^4が最適であると考えられた。(2)ウイルスの経口による潜伏感染効率を調べた。人間のHSV-1潜伏感染の成立は経口感染が最も多くの割合を占めると考えられる。(1)で施行したウイルス力価(0・10^3・10^4・10^5pfu/mouth)を用い、感染回数も1回の群と3回の群を設けた。感染4週後の生存率はどの群も8090%で大差は無かった。感染4週後に採取した三叉神経中のHSV-1DNAの検出率は、一番多く検出されたのが10^5pfuを3回感染させた群で、約3割であった。これらの結果より、三叉神経へHSV-1を潜伏感染させるのは経角膜が今のところ効率的な方法であると結論付けた。引き続き感染経路の条件設定を変えることにより、より効率よく三叉神経ヘウイルスを定着させる条件を検討していく予定である。2.HSV-1再活性時の三叉神経におけるケモカイン動態変化の検討ケモカインの検討をする前に、HSV-1潜伏感染時の三叉神経への浸潤細胞の検討をする事とした。浸潤している免疫細胞をある程度限定することにより、三叉神経内で分泌されるサイトカインもある程度限定することが出来ると考えられる。現在、三叉神経節から浸潤細胞を分離し、フローサイトメトリーでの解析を進めているところである。HSV-1再活性時の三叉神経におけるケモカイン動態変化の検討ケモカインの検討をする前に、HSV-1潜伏感染時の三叉神経への浸潤細胞の検討をする事とした。数ある免疫担当細胞のなかで、本研究では制御性T細胞(regulatory T cells)にターゲットを絞って解析を行った。制御性T細胞は「免疫応答を抑制する機能をもち、免疫寛容を担うT細胞」と定義することが出来る。近年、制御性T細胞は自己免疫のみならず、アレルギー、炎症、移植片拒絶、感染免疫、腫瘍免疫等のほとんどあらゆる種類の免疫反応を抑制する能力を持つことが示され、免疫系の恒常性維持に重要な役割を担っていることがわかってきた。制御性T細胞はCD25分子を発現するCD4陽性T細胞で、転写因子Foxp3がこの細胞群の特異的マーカーである。HSV-1潜伏感染マウスに、ウイルス再活性化(heat shockストレス(42°C、10分))刺激を加え、ストレスを加えない群との三叉神経内の免疫担当浸潤細胞数の差を比較検討する実験を行った。三叉神経採取時に神経線維が切断されることにより、神経細胞はアポトーシスにより死滅する。採取した三叉神経節組織を酵素反応によりsingle cellを浮遊液にし、死細胞以外の細胞を磁気ビーズを用いてnegative selectionした。得られた細胞をフローサイトメトリーを用いて、CD4陽性、CD25陽性の細胞群をカウントした。残念ながら、各群の比較を出来るのに十分な細胞が得られず、三叉神経細胞から直接的に免疫細胞を採取する方法は解析方法としては適さなかった。
生活習慣改善が動脈伸展性を増大させる器質的機序の解明 : フィブリン5へのアプローチ

今年度は、肥満者における食事改善と運動が動脈伸展性に与える影響を明らかにし、これらの併用が動脈伸展性を増大させる器質的機序を解明するために動脈壁の器質分解・合成に関与するタンパク質(MMPおよびTIMP)に着目して検討を行った。これらの検討を行うために以下の3つの検討を行った。(1)肥満男性における食事改善、有酸素運動,およびそれらの併用が動脈伸展性に与える影響肥満者における食事改善や運動トレーニングがそれぞれ動脈伸展性を増大させる機序の詳細は不明であったため、成人肥満男性においてこれらの生活習慣改善方法の違いが動脈伸展性に与える影響を検討した。この結果、食事改善と運動トレーニングは、異なる機序により動脈伸展性を増大させることを示し、それらの併用により、相加的効果があることを示した。(2)肥満男性における食事改善および運動トレーニングの併用がMMP9およびTIMP-1の血中濃度に与える影響肥満男性における12週間の食事改善および運動トレーニングの併用は、IMTを有意に低下し、血中MMP-9およびTIMP-1濃度を有意に減少させることを示した。(3)中高齢女性における有酸素性運動トレーニングがMMP9およびTIMP-1の血中濃度に与える影響非肥満中高齢女性における12週間の有酸素性運動トレーニングは、IMTを有意に低下し、血中TIMP-1濃度を有意に減少させることを示した。しかし、MMP-9濃度は、有意に変化しなかった。今年度は、肥満者における食事改善や運動トレーニングが動脈伸展性を増大させる機序を明らかにし、食事および運動が動脈壁器質のうち、コラーゲンやエラスチンの代謝に影響を与えることを明らかにした点で新たな知見を得たと考えられる。(抄録なし)今年度は、肥満者における生活習慣改善が中心動脈伸展性を増大させる器質的メカニズムを解明するために動脈の伸展性を決定する弾性線維の形成に不可欠なフィブリン5タンパク質に着目して検討を行った。すなわち、(1)成人肥満男性における食事改善が血中フィブリン5濃度に与える影響、(2)成人肥満男性における食事改善と習慣的な有酸素性運動の併用が血中フィブリン5濃度に与える影響、(3)中高齢女性おける有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響について検討した。(1)成人肥満男性における食事改善が血中フィブリン5濃度に与える影響肥満者における減量が血中フィブリン5濃度に与える影響を明らかにするため、肥満男性における12週間の食事改善が血中フィブリン5濃度に与える影響を検討した。介入後、血中フィブリン5濃度の有意に減少した。(2)成人肥満男性における食事改善と習慣的な有酸素性運動の併用が血中フィブリン5濃度に与える影響食事改善および有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響を検討するために肥満男性における12週間の食事改善および有酸素性運動トレーニングの併用が血中フィブリン5濃度に与える影響を検討した。介入後、血中フィブリン5濃度の有意な変化は認められなかった。(3)中高齢女性おける有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響を検討するために非肥満者である中高齢女性における12週間の有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響を検討した。介入後、血中フィブリン5濃度の有意な増加が認められた。今年度は、肥満者や中高齢者における生活習慣改善が血中フィブリン5濃度に与える影響を明らかにした点で新たな知見を得たと考えられる。今年度は、肥満男性における食事改善、または肥満男性における食事改善と有酸素性運動トレーニングの併用が血中フィブリン5濃度に与える影響を検討した。さらに、中高齢女性おける有酸素性運動トレーニングが血中フィブリン5濃度に与える影響についても検討した。

この結果、肥満者や中高齢者における生活習慣改善が動脈伸展性に関与する弾性線維形成必須因子であるフィブリン5に影響を与える可能性を示した。当初の予定では肥満男性における食事改善が血中ブィブリン5濃度に与える影響についてのみ検討する予定であったが、その他に2つの介入研究を行うことができた。このことから今年度の結果は、当初の計画以上の成果であると考えられる。今年度の研究より、肥満者および中高齢者における有酸素性運動トレーニングは、動脈の伸展性を決定する弾性線維の形成に不可欠なフィブリン5タンパク質を減少させないために重要である可能性が示唆された。しかし、動脈壁において過剰に弾性線維が構築されると動脈伸展性は逆に低下する可能性がある(Arribas et al. Am JPhysiol;295:H2299-307)。動脈壁における弾性線維は、分解と合成のバランスを適切に保持することが重要である。また、弾性線維だけでなく、コラーゲン線維も動脈伸展性に影響を与える器質的因子である。今後は弾性線維およびコラーゲン線維の合成や分解について検討を行う必要がある。次年度は、弾性線維合成指標であるフィブリン5だけでなく、弾性線維およびコラーゲン線維の分解指標であるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)およびコラーゲンの生成・蓄積に関連するit阻害因子(TIMP)などについてヒトを対象として引き続き検討を行う予定である。また、動脈壁の肥厚度に与える影響を検討するために内中膜複合体厚などを計測することを予定している。(抄録なし)
量子トンネル効果の非摂動繰り込み群による評価

量子トンネル効果の全く新しい理論的解析方法として、非振動くりこみ群を用いるというのが本研究計画の目的である.本年度は,まず最も簡単な系として1次元の量子力学系を考え,対称及び非対称な非調和振動子系について,トンネル効果と関係する物理量を非摂動くりこみ群で評価し,それをシュレディンガー方式による結果や通常のインスタントン希ガス近似による結果を比べた.まず,対称な非調和振動子の系については,基底状態と第一励起状態のエネルギーギャップ及び有効4次相互作用の大きさについて局所ポテンシャル近似非摂動くりこみ群で評価した.2次の質量項が正の正常な系では,我々の結果は,非調和相互作用の大きさの全領域で非常に良く,きちんと相互作用定数の無限次までの非摂動効果を取り入れていることがわかった.2次の質量項が負のいわゆる2重井戸型ポテンシャルの場合には、領域を3つに分けて考える.非調和相互作用が十分大きく基底状態が中央の山より上に来る領域と,基底状態が中央の山より下に潜り,第一励起状態はまだ山の上にある中程度の非調和相互作用の領域では,我々の結果はほぼ正しい値を出している.第一励起状態も山の下に潜る弱非調和相互作用の領域では,我々の結果は徐々に悪くなり,インスタントンによる結果とのクロスオーバーが起こる.この領域が,ダイナミックなトンネル現象にとって重要な領域であるが,我々の方法は,インスタントンの希ガス近似が悪くなる領域で十分な結果を出しいる.次に,非対称な場合に進んだ,インスタントンの方法はこの場合には使えず,工夫がいるが,非摂動くりこみ群の方法では,対称な場合と全く同様に扱うことが可能であり,その結果も,対称な場合とほぼ同等であった.また,多自由度系,多次元系への拡張に際しても,くりこみ群の方法は同様に適用可能であり,トンネル効果を扱う汎用の新しい方法となりうることがわかった.量子トンネル効果の全く新しい理論的解析方法として、非振動くりこみ群を用いるというのが本研究計画の目的である.本年度は,まず最も簡単な系として1次元の量子力学系を考え,対称及び非対称な非調和振動子系について,トンネル効果と関係する物理量を非摂動くりこみ群で評価し,それをシュレディンガー方式による結果や通常のインスタントン希ガス近似による結果を比べた.まず,対称な非調和振動子の系については,基底状態と第一励起状態のエネルギーギャップ及び有効4次相互作用の大きさについて局所ポテンシャル近似非摂動くりこみ群で評価した.2次の質量項が正の正常な系では,我々の結果は,非調和相互作用の大きさの全領域で非常に良く,きちんと相互作用定数の無限次までの非摂動効果を取り入れていることがわかった.2次の質量項が負のいわゆる2重井戸型ポテンシャルの場合には、領域を3つに分けて考える.非調和相互作用が十分大きく基底状態が中央の山より上に来る領域と,基底状態が中央の山より下に潜り,第一励起状態はまだ山の上にある中程度の非調和相互作用の領域では,我々の結果はほぼ正しい値を出している.第一励起状態も山の下に潜る弱非調和相互作用の領域では,我々の結果は徐々に悪くなり,インスタントンによる結果とのクロスオーバーが起こる.この領域が,ダイナミックなトンネル現象にとって重要な領域であるが,我々の方法は,インスタントンの希ガス近似が悪くなる領域で十分な結果を出しいる.次に,非対称な場合に進んだ,インスタントンの方法はこの場合には使えず,工夫がいるが,非摂動くりこみ群の方法では,対称な場合と全く同様に扱うことが可能であり,その結果も,対称な場合とほぼ同等であった.また,多自由度系,多次元系への拡張に際しても,くりこみ群の方法は同様に適用可能であり,トンネル効果を扱う汎用の新しい方法となりうることがわかった.
鳥類の季節性測時機構の解明

動物の繁殖、代謝、換羽(毛)などの生理機能は日長の変化によって変化することが知られており、これを光周性と呼ぶ。光周性の脳内制御機構は長年の謎であったが、我々は最近、視床下部内側基底部(MBH)における甲状腺ホルモンの活性化が重要であることを明らかにした(Yoshimura et al., Nature 2003)。この甲状腺ホルモンの活性化には2型脱ヨウ素酵素(Dio2)の光誘導が重要であるが、光誘導は光感受相と呼ばれる限られた時間帯にしか起こらない。つまり、Dio2遺伝子の時刻依存的な光誘導のメカニズムを解明すれば、生物が季節を感知しているメカニズムを解明できる。そこで本研究ではDio2遺伝子のプロモーター解析を行った。まずDio2遺伝子の上流領域約3kbpの塩基配列をinverse PCR法により決定したところ、二つのcAMP responsive element (CRE)配列を発見した。このCRE配列にcAMP responsive element binding protein (CREB)が結合するか否かゲルシフトアッセーにより確認したところ、二つの配列ともCREBが結合することを確認した。また光感受相と光感受相以外の時間のMBHの核抽出物が二つのCRE配列に結合するか検討したところ、どの時間においても核抽出物がCRE配列に結合することを明らかにした。これらの結果からDio2の時刻依存的な光誘導はCREBの存在の有無に起因しないことが判明した。またCREBはリン酸化を受けて転写活性を持つことが知られているので、次にCREBのリン酸化についてpCREBの抗体を用いて検討したが、pCREBの免疫陽性反応は時刻や光刺激に関係なく確認され、CREがDio2の時刻依存的な光誘導には関与していないことが明らかになった。次世代が餌の豊富な季節に生まれるように、妊娠あるいは孵卵期間を逆算して、決まった時期に交尾行動を起こすメカニズムを季節繁殖という。温帯に住む鳥類は日長が長くなると、性腺が発達するという明瞭な光周反応を示す。古くから甲状腺除去が季節繁殖に異常を来すことが様々な脊椎動物において知られており、甲状腺ホルモンは何らかのレベルで光周性の制御に関与するといわれていたが、我々は甲状腺ホルモン活性化酵素(Dio2)の光誘導が光周性の制御に重要であることを明らかにした。しかし、生物がいかにして季節(日長)を測っているのかという本質的な疑問は未解決のままである。これまでにDio2遺伝子の光誘導は、夜間のある限られた時間帯(光感受相)にのみおこることを報告しており、この時刻依存的な光誘導のメカニズムの解明から季節性測時機構の本質を明らかにすることが可能になった。そこで本研究ではDio2遺伝子のプロモーターの解析を通じて時刻依存的な光誘導のメカニズムを検討している。まずinverse PCR法によりウズラのDio2遺伝子のプロモーター領域約2.7kbをクローニングし、ルシフェラーゼアッセーに使用するコンストラクトを作成した。その後、JEG-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセーを行なった。また鳥類において光周性の中枢が存在することの知られている視床下部内側基底部(MBH)から得た核抽出物を用いてゲルシフトアッセーも行ない、Dio2の光誘導に関与するシスエレメントの同定に成功している。今後、時刻依存的な光誘導のメカニズムの解明に取り組んでいく。
転写は相同組換え経路のスイッチになりえるか

DNA二本鎖切断(DSB)は、相同組換え経路(HR)か非相同末端連結経路で修復されるが、その選択機構は明らかになっていない。これまでの報告から、DNA切断端での一本鎖DNAの露出(DNA end resection)が、HR経路へ進む最初のステップと考えられている。しかし、resectionが起こるきっかけについては分かっていない。研究代表者らは、転写およびDNA-RNA hybrid構造がHRに重要であることを見出しており、DSB周辺でRNA分子により形成されるループ構造(R-loop)がresectionを促進している可能性が考えられる。本研究では、DSB周辺のR-loopがresectionの引き金となりうるかどうか、明らかにすることを目的としている。転写阻害剤を用いて検証した結果、HR経路の責任因子Rad51のDNA損傷への集積に、DSBに加え、シスプラチンでも強い影響が見られた。さらに、DNA損傷応答因子である53BP1の集積にも影響が見られたことから、シスプラチンによるDNA鎖間架橋(ICL)に対しては、HRのみならず損傷応答そのものにも転写が影響しうることが示唆された。そこで、ICL応答への転写阻害剤による影響の解析を進めたが、転写阻害剤がDNA複製を抑制してしまうことが明らかとなり、DNA複製依存的に引き起こされるICL応答では、転写阻害剤による解析が困難となった。そこで改めてDNA損傷をDSBへと絞って解析を進めており、Rad51以外の因子の集積も転写依存的であることを示唆するデータを得ている。現在は、これらの影響がR-loopの形成に依存するか検証するため、RNaseH1を人為的に発現誘導できる細胞株の樹立を進めている。ICL応答において、転写との興味深い関連の可能性が示唆されたため解析を進めたが、転写阻害剤処理により、DNA複製そのものが低下してしまうことが明らかとなった。ICLはDNA複製の進行を阻害することでDNA損傷応答を引き起こし、HRにより修復および複製の再開が行われる。したがって、DNA複製自体が抑制されてしまう条件下では、そもそものDNA損傷応答が弱い可能性が考えられ、結果の評価ができなくなってしまった。様々な条件検討を行ったが、現状では転写抑制の影響と、複製抑制による影響とを区別できておらず、研究の進捗としてはやや遅れている。転写阻害剤を用いて得られている結果が、R-loopを介したものであるかどうか検証するため、DNA-RNA hybridを消化するRNaseH1の過剰発現をテトラサイクリンで誘導できる細胞株の作成を進めている。RNaseH1を一過性に誘導することで転写阻害剤と同様の影響が確認されれば、R-loopの形成が重要であると考えられる。また、DSBを細胞内のテトラサイクリン誘導性プロモーターの下流で人為的に誘導できる実験系を用い、そのDSB部位へのHR関連因子、およびresection関連因子の集積と転写との関連を調べていく。

また、DSBを細胞内のテトラサイクリン誘導性プロモーターの下流で人為的に誘導できる実験系を用い、そのDSB部位へのHR関連因子、およびresection関連因子の集積と転写との関連を調べていく。
前方後円墳の三次元計測とそれにもとづく設計原理の検討

本研究は、三次元レーザー計測などの新しい技術を用いて前方後円墳の正確な三次元的形態を復元しようとするものである。はじめに、大阪や岡山における4基の大規模古墳について解析を行い、その基本設計を確立した。斜面の傾斜を決定するために直角三角形が用いられており、長さには中国由来の尺度が使用されていると推定した。続いて、それをより小規模な古墳や他地域の古墳に適用しようと試みた。4基の古墳の解析結果に基づく論文と、レーザー計測を実施した結果の報告書を刊行した。1.宮城県柴田郡村田町愛宕山古墳を対象として三次元計測を実施した。また、計測結果にもとづいてGIS等を用いた詳細な墳形の検討を実施した。2.岡山市片山古墳の三次元計測を実施した。片山古墳に加えて、岡山県内でこれまでに三次元計測を実施した古墳について、岡山市津倉古墳、総社市一丁グロ古墳、総社市秦茶臼嶽古墳の比較検討を行った。これにより、岡山県内の初期の古墳について、形態から変遷過程を追及する良好な手がかりが得られた。3.百舌鳥・古市古墳群においてレーザー計測が実施された7基の前方後円墳の設計原理の詳細な検討を行った。こうした資料にもとづき、誉田御廟山古墳の設計原理について、論文の形で研究成果の公表を行った。また、仲津山古墳、上石津ミサンザイ古墳、造山古墳、誉田御廟山古墳の4基について、設計原理の変遷を検討し論文を投稿した(編集作業の遅延のため未刊行)。4.岡山市佐古田堂山古墳の三次元計測のための事前調査を実施した。当初は平成27年度と平成28年度で分割して計測する予定であったが、平成28年度にヘリコプターまたはドローンによって一括計測する方法に変更した。5.三次元計測のデータを処理するためのプログラムについて、これまでは古墳ごとに作成してきたが、汎用的に利用できるよう改善を進めた。1.三次元計測を予定していた古墳について、対象の多少の変更や実施年度の変更はあったが、最終的に計画を達成できる形で作業を進めることができた。2.当初は対象として候補にあげていなかった岡山市片山古墳の三次元計測を実施し、岡山県内の初期の前方後円墳・前方後方墳の変遷過程を墳形から追求できる可能性が出てきた。これは、当初の予想を大きく上回る成果につながるものと予想される。3.研究成果について、順調に論文の形で公表できるように作業を進めることができ,1論文は掲載、1論文は編集作業の遅れから未公表となっている。(1)当該年度に実施した最も中心的な成果は、岡山市佐古田堂山古墳の後円部の三次元計測である。樹木の伐採や撤去などに予想以上の資金と労力を要したが、ほぼ理想的な計測を実施することができた。また、測量業者との連携もスムーズとなり、安定した形で納品された計測データを使用できる条件が整った。設計原理の本格的な検討は、次年度の前方部の計測を経てのこととなる。(2)昨年度までに実施した、古墳時代前期の小規模前方後円墳の三次元計測結果をまとめる作業を実施した。まだ、この時期の小規模前方後円墳の設計原理を完全に読み解くまでには至っていないが、墳形の変化のプロセスをある程度整理することができた。今後は、共同研究者による別の研究課題ではあるが、岡山市津倉古墳の調査成果や、倉敷市楯築弥生墳丘墓の三次元計測との比較検討を行う見通しが得られた。(3)ドローンによる三次元計測のための準備を進めた。デモ飛行への立ち会いや、遺跡での予備的計測を行っており、課題が明確となってきたため、次年度に地上レーザー計測と平行したドローンによる計測を実施できる条件が整った。対象は熊本県岩原双子塚古墳を予定している。(4)前方後円墳の設計原理について、畿内や吉備の大型古墳にとどまらず、中小規模の古墳や地方の古墳について検討すること、および前方後方墳についても手がかりを得ることを大きな目的としているが、いずれも大きく研究は進んでいるが、確定的な結果を得られるまでには、あと少しの作業が必要である。資金や地権者との交渉などの問題で、佐古田堂山古墳の三次元計測が1年度分ずれ込んでいるが、次年度で完了の予定である。地方における設計原理の検討は、段築が良好であると予想した古墳が計測の結果、必ずしもそうではないことが明らかになった。次年度の熊本県内の古墳で成果を期待したい。岡山市津倉古墳の三次元計測とその後の発掘調査は、共同研究者の別の研究課題によるものであるが、きわめて良好な段築の状況が明らかになり、小規模古墳の設計原理を解明できる可能性をもつ例として次年度の研究の課題となる。前方後円墳の設計原理について、新たに古墳の三次元計測を実施することにより研究を進めた。これまでに、畿内や吉備地域の大規模前方後円墳については、その主要部分において設計原理を解明し、「前方後円墳の設計原理と墳丘大型化のプロセス」で内容を公表した。本研究の主要な目的は、これまでに明らかになった設計原理をもとに、(1)東北地方や九州など他の地域でも検討を行うこと、(2)前期古墳など他の時期の古墳でも検討を行うこと、(3)中小規模の古墳の設計原理を解明すること、(4)前方後方墳の設計原理を明らかにすること、であった。そのために、期間中に4基の古墳の地上三次元計測を実施し、それまでに実施した古墳も加えて検討を行った。

なお、三次元計測を実施した古墳の詳細な等高線測量図を公表している(『前方後円墳の三次元計測』)。宮城県愛宕山古墳・熊本県岩原双子塚古墳は、良好な測量図が作成できたものの、段築の本来の形を正確に把握することは難しかった。岡山県内では佐古田堂山古墳の計測が終了したが、まだ最終的な測量図を作成するにはいたっていない。その他の岡山県内の中小規模の前方後円墳・前方後方墳については、いずれも良好な測量図を完成させることができ、設計原理についての一定の情報は得ることができたが、まだ全体的な設計原理を復元するまでには至っていない。しかし、近畿地方などでしだいに三次元計測を実施する古墳が増えてきており、そうした例と組み合わせることによって、本研究課題の成果を今後活用し、全体的な設計原理の解明に向かっていくことが可能であると思われる。本研究は、三次元レーザー計測などの新しい技術を用いて前方後円墳の正確な三次元的形態を復元しようとするものである。はじめに、大阪や岡山における4基の大規模古墳について解析を行い、その基本設計を確立した。斜面の傾斜を決定するために直角三角形が用いられており、長さには中国由来の尺度が使用されていると推定した。続いて、それをより小規模な古墳や他地域の古墳に適用しようと試みた。4基の古墳の解析結果に基づく論文と、レーザー計測を実施した結果の報告書を刊行した。1.これまでに明らかになってきた大型古墳の設計原理について、a)中小規模古墳の場合、b)地方の古墳の場合、c)前期古墳の場合にどのような状況にあるかが、今後の研究の課題である。地方の古墳についてのデータが少ないが、進展しつつある地方自治体での計測とも連携しながら、研究を進めていきたい。2.新たな研究の進展が期待できる初期の古墳の形態的変遷については、この時期の古墳に焦点を絞って三次元計測を行うなどの重点的な研究を実施したい。3.三次元計測の手法について、ドローンの利用を含めて、計測業者や処理ソフトウェア開発業者と連絡を取りながら、開発を進めていきたい。4.計測データの処理プログラムについて、改善をはかるとともに、他の研究者への提供が可能となるよう、汎用化をはかりたい。5.現在までに蓄積してきた三次元計測のデータが、造山古墳・作山古墳を除いても6基に達してきているので、平成28年度末を目途に、等高線図の形で公表し、情報の共有をはかりたい。佐古田堂山古墳の三次元計測を完成させることが大きな課題である。下草や樹木の伐採にかなりの予算を必要とするために、他の活動に多少影響が出てきている。時間的な余裕をもって計画を推進することや、自力による伐採など、必要経費の削減などに努め、計画を完遂させる予定である。ドローンを用いた三次元計測については、計画段階では可能性にとどまっていたが、現実化させることが可能となった。単なる実施にとどまらず、精度検証などをおこなうことにより、今後の適用の可能性を探りたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。考古学29年度が最終年度であるため、記入しない。
プロジェクト形成手法に関する研究

本研究では、プロジェクト・アイデンティフィケーションあるいはプロジェクト・ファインディングと総称されるプロジェクト形成の方法論について問題を明確化し、適切なプロジェクトを選定していくプロセスを、システマティックに行う方法を確立することを目的とした。その具体的な枠組みは、プロジェクト形成のプロセスの各段階を、プロジェクト発想法・構成法・診断法の各手法に割り当て、計算機を用いてシステムとして統合する方法の開発を試みた。1.プロジェクトの発想法・構成法の開発(1)プロジェクトの発想法・構成法としてのISM法・AIDAを取り上げ、プロジェクトを構成する要素をアルゴリズム的に階層化、集約化し、グラフ論理的に表現する方法について検討した。(2)プロジェクト要素と地域およびその地域で入手可能なプロジェクト要素を特定化する統計とを関連づける関連表を作成し、グラフ論理的手法によって地域とプロジェクトとの結び付きの強さおよび必要な統計データの関連を表現する手法を開発した。(3)鉄道や道路などの交通施設の必要性を表現する地域関連リンク強度表を、グラフ理論における中心度関数の概念を応用した手法を用いて作成する手法を開発した。プロジェクト診断法の開発プロジェクト・カルテを前述した項目、すなわち、(1)プロジェクトの内容、(2)推進条件、(3)プロジェクトの条件、(4)実行条件、(5)不確実性について、その細分類で評価するための簡便なグラフ的手法、評点法を開発した。用地収得や利害対立のある参加者があるプロジェクトの問題解決のため、協力ゲームを用いた利害調整法を開発した。マニュアル化(1)手法の効率的運用を図るために、プロジェクト構成法と診断法をコンピュータ化し、結果についてもグラフィック表現できるプログラムを開発したが、まだ、不完全な段階にある。手法全体のマニュアル化については、完成するまでには至らなかった。
バイリンガルの言語と認知：二言語の習得と認知プロセスの変化の多角的研究

本研究は、バイリンガル認知が二言語の言語知識、言語習得時期、言語使用度によってどのように変わるのかを、さまざまな二言語の組み合わせのバイリンガルを対象として実験を行いマルチコンピテンスの観点から調査した。日本人英語使用者、韓国人留学生、日本手話話者、日英バイリンガルを対象に、多読と眼球運動、感情語の心的反応、読み書きの習得、二言語の流暢性と脳側性について調査した。結果、表出するバイリンガルの言語状態(熟達度)は個人の言語環境と経験および現在の言語使用に影響されながら成立していることが示唆され、認知プロセスは二言語のプロセスを効率的に統合したかたちで確立されると推定される。二つの言語の習得と認知プロセスの変化の関係性に言語学的な観点から焦点を当てる本研究では、日英バイリンガルと、更に多角的な二言語の組み合わせの使用者の実験データ収集を行い、二言語の言語知識、言語習得時期、使用環境によってどのように認知プロセスが変わるのかを科学的に分析することを試みている。2年目(平成25年度)の研究実績としては、大きく以下の4項目があげられる。1.ロンドン大学University College LondonのMacSweeneyらとロンドン在住の日英バイリンガル34名について日本語と英語のプロセスの違いを調査するために、意味および音韻流暢性課題を用いて脳側性を測定した。英語圏在住3年以上で英語を日常使用している方を対象とした。流暢性課題のデータおよび脳側性データをもとに現在分析中である。2.日本手話母語話者の日本手話における指文字の使用と、日本語の読み書きの学習についてろう者10名にインタビューを行った。結果、ろう者の言語学習において指文字は日本語のかなの学習より遅れて学ぶ傾向があることがわかった。その理由は、インタビューを行った方々の子ども時代に建設的に手話を学ぶ教育環境がなかったという点もあげられる。漢字の指文字の調査も行い、日本手話と日本語のレキシコンにおける指文字について考察する。4.8月にアムステルダムで行われたヨーロッパ第二言語学会に参加し、第二言語習得研究者と意見交換を行った。二つの言語の習得と認知プロセスの変化の関係性に言語学的な観点から焦点を当てる本研究では、これまでの研究を継続・発展させ、日英バイリンガルと、更に多角的な二言語の組み合わせの使用者の実験データ収集を行い、二言語の言語知識、言語習得時期、使用環境によってどのように認知プロセスが変わるのかを科学的に分析する。1年目(平成24年度)の研究実績としては、大きく以下の4項目があげられる。1.英語多読による日本人英語学習者のリーディングスキルの変化について眼球運動およびワーキングメモリの実験を行った。眼球運動データは膨大なため実験用ノートパソコンを新調し、分析ソフトウェアTobii Studioのアップデート(2.2.8)も行った。多読前のデータ収集は7月、英語10万語多読後は12月に行った。また眼球運動データの保存方法について考慮した。2. 9月にポーランドで行われたヨーロッパ第二言語学会(EUROSLA)で日英バイリンガルの体の部位のカテゴリー認知と語彙の影響について共同ポスター発表を行った。3.同じく9月にポーランドにて英ニューカッスル大学のVivian Cook教授および武庫川女子大学の村端佳子氏とMulti-Competence Workshopを開催し、ワークショップにはMulti-Competence Modelを支持する著名な言語学者が参加した。韓日バイリンガルの感情語の認知について口頭発表を行い、バイリンガル感情研究のJean-Marc Dewaele教授と意見交換ができた。4.日本手話母語話者と韓国人日本語話者の日本語の読みと視覚単語実験について、10月に米イェール大学ハスキンズ研究所で発表を行った。またコネティカット大学およびMITを訪問し、さまざまな言語学者との意見交換をすることができた。本研究は、日英およびその他の二言語の組み合わせをもつバイリンガルの言語習得と認知プロセスの違い・変化について心理・神経言語学的な観点から実験データ収集を行った。3年計画の最終年度は日英バイリンガルを中心に研究を進めた。1)昨年度、英University College London(UCL)にてfTCDを使って収集した日英バイリンガルの脳側性データと意味性および音韻性流暢性課題の結果についていくつかの分析方法を試みた。この機器を使っての言語研究はまだ発展途中のため、UCLの神経科学の研究者と論文発表にむけて準備中である。2)バイリンガルの二言語のバランスの変化を調査する指標としての意味性・音韻性流暢性課題の有効性を調査するため、日英バイリンガル児に当課題を改良し実施した。語産出は大人に比べて個人差が大きいが、長期的なデータ収集では一定の変化をみることができる。3)日英バイリンガルおよび英語母語話者が意味理解を重視しながら英語の文章を読む場合どのように単語レベルの誤り(スペリング・語形)または文レベルの誤り(文法)を処理するか眼球運動を測定した。

2グループとも単語レベルには気づかないまたは無意識に反応する傾向があるが、文法の誤りには母語話者の方が反応する傾向が見られたが、バイリンガルの英語の習熟度に配慮する必要があり、結論づけるにはより多くの被験者を測定する必要がある。本研究期間全体を通して調査した多様なバイリンガルについて総括すると、予測どおり言語習得時期、使用環境が認知プロセス(二言語の使用や流暢性)に影響を与えることが示唆された一方、二言語の言語知識が融合し影響しあうと仮定するマルチコンピテンスを支持する二言語の言語知識の度合いも要因と考えられる。しかし、指標となるタスクが存在しないため、二言語の能力やそのバランスの変化について測定できるタスクの開発を進めていきたい。第二言語習得・心理言語学本研究では、日英バイリンガルと、更に多角的な二言語の組み合わせの使用者の実験データ収集を行い、二言語の言語知識、言語習得時期、使用環境によってどのように認知プロセスが変わるのか分析をしている。日英バイリンガルのデータとしては、ロンドン在住の日英バイリンガルの言語流暢性課題データおよび脳側性データを収集できた。神経科学的なアプローチでバイリンガルの言語と認知について調査する実験を、方法論を学びながらfTCDという言語研究においてまだ新しい機器を使用したために、準備に時間がかかり実験課題も当初予定していたものとは違うが、予定通り30名以上のデータを収集することができた。多角的な二言語の組み合わせという意味では、日本人ろう者の指文字と日本語と読み書きの習得について基礎データとなるインタビューを行うことできた。またロンドン大学滞在中に欧米での最先端の研究に触れる機会が多くあり、特に現在の脳科学におけるバイリンガル研究およびろう者の読みに関する分野の理解が深まった。読みの発達においてアルファベット言語使用者の場合、リップリーディング(読唇)のスキルを重要視する傾向があるが、日本語においてはどのくらい影響があるのか検証が必要である。また、研究発表として日本人学習者の眼球運動データを読みの発達と関連づけた検証を行った。このようなアプローチは新しく今後データを追加していきたい。本研究では、日英バイリンガルと、更に多角的な二言語の組み合わせの使用者の実験データ収集を行い、二言語の言語知識、言語習得時期、使用環境によってどのように認知プロセスが変わるのか分析をしている。日英バイリンガルのデータとしては、日本人英語学習者の英語の読みの発達を眼球運動データで収集した。眼球運動のデータは膨大でありまた個人差やデータの質の差に幅があるために、分析に時間がかかるが、実験デザインとしては結果が見えるデータが取れているといえる。多角的な二言語の組み合わせという意味では、韓国人留学生の日本語について、感情語の研究と単語認知実験で分析している。更に、日本人ろう者の第二言語としての日本語の読みについて、データ分析、発表を行い、現在、論文を執筆中である。
単結晶光学素子の複屈折現象解析コードの開発

フッ化カルシウム単結晶について、ひずみ速度一定条件下で行った高温圧縮試験結果を用いて、定常クリープ構成式の定式化を行った。この構成式を用いてフッ化カルシウム単結晶のアニール工程後の残留応力を非線形有限要素解析により求め、さらにこの応力値から複屈折計算を行い光路差を計算した。光路差分布についての解析値を実験値と比較した結果、両者に良好な一致が見られ、残留応力評価サブシステムを検証することができた。完成した半導体リソグラフィー用光学素子評価システムを用いて半導体リソグラフィーに用いられている、波長193 nmのArFエキシマレーザー光源用のフッ化カルシウム単結晶窓材の複屈折評価を行った。本研究では、単結晶育成から素子形成までの全プロセスにおける複屈折現象を定量的に評価するための解析システム、すなわち半導体リソグラフィー用光学素子評価システムを構築することを研究目的する。そのために平成24年度には、半導体リソグラフィー装置の光学素子として用いられるフッ化カルシウム単結晶を対象として、単結晶インゴットアニール工程の残留応力を評価するサブシステムの構築を行い、インゴットアニール後の複屈折に関して、シミュレーション結果を実験結果とを比較することによりシミュレーション手法の妥当性を検証した。平成25年度には、前年度の研究成果をもとに、下記の研究項目を実施した。(1)前年度に開発した単結晶インゴットアニール工程における残留応力評価するサブシステムを、他のサブシステム(単結晶育成工程における残留応力評価サブシステム、素子切り出し工程における残留応力評価サブシステム、複屈折評価サブシステム)を直列に連結して、必要な情報のやり取りをするためのインターフェースを整備することによって、半導体リソグラフィー用光学素子評価システムを完成させた。(2)開発した半導体リソグラフィー用光学素子評価システムを検証するために、フッ化物単結晶製造メーカと共同研究を実施して、インゴットおよび素子の光路差分布の解析値と実験結果を比較した。このような、半導体リソグラフィー用光学素子評価システムを用いて、各工程のプロセス温度、プロセス時間に関する情報を与えた。本研究では、単結晶育成から素子形成までの全プロセスにおける複屈折現象を定量的に評価するための解析システム(半導体リソグラフィー用光学素子評価システム)を構築することを研究目的する。当該研究年度には単結晶の複屈折現象を引き起こす単結晶中の残留応力を評価するサブシステムの構築を主に行った。解析対象は、半導体リソグラフィー装置の光学素子として用いられるフッ化カルシウム単結晶とした。残留応力は単結晶引き上げ中あるいは単結晶インゴットアニール中の高温状態で単結晶中に生じるクリープ変形により生じる。そのため、本科学研究費補助金受け入れ以前に実施したひずみ速度一定条件下で行った高温圧縮試験結果を用いて、定常クリープ構成式の定式化を行った。フッ化カルシウム単結晶の場合は高温状態で多数のすべり系が同時に活動することが知られているので、残留応力サブシステムにおいては結晶塑性理論をベースとした結晶異方性を考慮したクリープ変形解析を行う必要はなく、等方性を仮定したクリープ解析で十分である。ただし、単結晶が有する弾性係数の異方性を考慮する必要があるため、単結晶の形状が軸対称であっても三次元解析が必要である。このような考え方のもとに、残留応力評価サブシステムを新たに開発した。このサブシステムと既に開発済の複屈折評価サブシステムを組み合わせ解析により、実際のインゴットアニール後の複屈折の測定結果と比較して、解析結果の妥当性を検証した。半導体リソグラフィー用光学素子評価システムの構築に当たって最も問題となるのは、単結晶育成過程、インゴットアニール過程等の各プロセス中で単結晶体中に生じている残留応力をいかにに見積もるかである。この点に関しては過去の研究では、応力フリー温度を仮定して残留応力を算出することがもっぱら行われてきたが、これでは物理的に意味のある普遍的な応力フリー温度を見いだすことができないという重大な欠陥あった。当該年度の研究成果により、単結晶体のクリープ構成式を用いた非線形解析により残留応力を評価することが可能になったことは大きな研究の進展であり、本研究課題の大きな山を越えたと自己評価している。残された課題は、半導体リソグラフィーシステム中に光学素子としてフッ化カルシウム単結晶を使用したときの複屈折評価である。平成25年度にはこのような解析を行うことを考えている。具体的には、光学素子として用いるときには残留応力に加えて、装置への取り付けによる機械的応力、高エネルギーレーザー光照射による発熱等を考慮する必要がある。また最近の半導体リソグラフィーではArFエキシマレーザーのような短波長レーザー光が用いられるが、このような場合にはフッ化カルシウムでも真性複屈折が問題となる。上記のような現象を考慮した解析システムのバージョンアップが必要となる。研究費の使途の主なものは、プログラム開発に伴う、計算機用消耗品費(ソフト、記憶媒体等)、研究発表のための経費(旅費、会議登録料、論文投稿料等)、および複屈折測定実験に必要な消耗品費である。
瞬目反射条件付けの分子神経機構の解明

瞬目反射学習と小脳プルキンエ細胞内のシナプス可塑性に関与する機能分子との因果関係を、5種の遺伝子変異マウスを用いて追究し、小脳LTDと学習能の間の強い相関性を明らかにした。条件によっては、小脳以外の上位中枢に強く依存し、小脳に依存しないメカニズムも示唆された。学習と脳波との関係や学習中の小脳神経活動の記録等、新しい実験系の開発を行った。瞬目反射学習の、老化や認知症研究における有用性が示された。本年度は以下のような研究を行った。1.小脳皮質における可塑性に与える海馬の影響を調べることを目的として、まず、海馬から小脳への入力をラット麻酔標本において検討した。Wistarラットをウレタン麻酔し、海馬を電気刺激したところ、瞬目反射学習に関わる小脳半球部の脳表より誘発電位が記録された。現在、この誘発電位が小脳の自発活動(麻酔下)に与える影響を検討している。2.学習中の脳のin vivoイメージング法の検討を行うことを目標として、浜松ホトニクス社の高感度冷却CCDカメラを購入し、マウスの脳における内因性蛍光(フラビン)の測定が可能であるかどうか検討した。麻酔下のマウスの大脳皮質視覚野において、視覚刺激時に一過性の蛍光上昇が記録されたことから、本測定法がin vivoイメージング法として有効であることが確かめられた。3.学習関連遺伝子の発現変化を網羅的に調べるために、条件付けたマウスの脳を取り出して凍結保存した。現在、DNAマイクロアレイによる解析を行っている。4.ラット前頭前野の可塑性が長期記憶の形成に果たす役割を明らかにするために、記憶獲得後のラットの前頭前野に浸透圧ポンプを用いてNMDA受容体アンタゴニストであるAPVを注入し、6週間後の記憶の保持を調べた。獲得直後から2週間APVを投与した場合には長期記憶の形成が顕著に障害されたが、記憶獲得2週間後から4週間後までAPVを投与した場合には長期記憶の形成は障害されなかった。このことは、記憶獲得直後の2週間における前頭前野におけるNMDA受容体依存的なシナプス可塑性が長期記憶形成に重要な役割を果たす可能性を示唆している。本結果により、獲得後直後2週間の内側前頭前野の遺伝子発現変化を調べることの重要性が示唆された。1.GluRδ2欠損マウスにおける小脳依存性GluRδ2欠損マウスに短トレース課題を学習させた後、両側の小脳を吸引破壊した。2週間の回復期間後に再び条件付けを行い、記憶保持と再学習能力を調べたところ、再条件付け開始1日目の記憶が大きく障害されていた。しかしながら、その後次第に条件応答を再獲得したことから、小脳皮質に異常があるGluRδ2欠損マウスにおいても小脳に依存して学習が行われることが示唆された。2.小脳におけるin vivoイメージング小脳を露出させてフラビン蛍光をビデオカメラを用いて測定し、さまざまな刺激を与えたときの変化を測定した。その結果、前足に電気刺激を与えたときに、一部の個体で一過性の蛍光の増加がみられた。3.小脳運動学習および海馬依存性学習の分子メカニズム瞬目反射条件付け学習において、脳内マリファナとして知られる内在性カンナビノイド受容体CB1が、小脳依存性の記憶獲得に必須であることを示した。また、海馬CA3領域の錐体細胞に存在するNMDA受容体が海馬記憶のタイミングに必須であることを示した。4.In vivo一酸化窒素(NO)測定系の構築微小電極法をマウス小脳に適用してNO測定を行う実験系を構築した。電極法はNOの酸化電流値を連続的に記録することで、測定系のNO濃度をリアルタイムに直接調べることのできる唯一の方法である。5.肥満モデル動物における瞬目反射条件付け学習障害肥満マウスを作成して瞬目反射条件付けを行ったところ、遅延条件付けにおいて記憶の保持に障害が見られた。この障害はカンナビノイドレセプター阻害剤を学習前に投与しておくと軽減されたことから、この学習障害にはカンナビノイド系の関与が示唆された。またトレース条件付けにおいては、記憶の獲得過程で障害が認められた。1.小胞体膜を貫通し細胞膜と結合することにより,結合膜構造の形成に寄与するタンパク質であるJunctophilinが小脳のシナプス可塑性および運動学習の成立に必須であることを示した(EMBO J 26,1924-1933,2007)。また,グルタミン酸受容体δ2サブにユニットとの機能的結合が示唆されている新規ホスファターゼPTPEMGが小脳長期抑圧および瞬目反射条件付けの記憶成立に関写していることを明らかにした(Eur J Neurosci26,2269-2278 2007)。[岸本]2.マウスを顕微鏡下に固定し,音刺激に対する小脳の応答を自家蛍光を用いて測定した。その結果,小脳虫部を中心に,蛍光の増大と減少からなる2相性の応答が記録された。