hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規表面抗原ＥＳＡＭを指標とした造血幹細胞の生理的特性の解析と白血病診断への応用

本研究では、定常状態および骨髄障害時の造血幹細胞におけるESAMの生理的機能を明らかにし、ヒトの造血幹細胞や白血病細胞の研究にも応用可能かどうかを明らかにすることを目的に解析を行った。特に本年度は、ヒトの白血病細胞におけるESAMの発現と腫瘍の性質の関連に関する解析を進めた。白血病細胞株を用いた検討では、赤芽球・巨核球系の腫瘍細胞がESAM陽性、リンパ球性白血病細胞株はESAM陰性、骨髄性白血病細胞株にはESAM陽性・陰性両方が認められた。ヒト急性骨髄性白血病の初発症例においてはESAMの発現は一様でなく、同一の病型(例えば急性前骨髄性白血病)でも陽性の症例と陰性の症例が存在した。ESAMの発現と治療反応性・予後との関連について、現在解析中である。興味深いことに、ESAM陰性の急性骨髄白血病細胞株であるKG1aを免疫不全マウスに移植し、生着して白血病を発症させることを繰り返すと、KG1aの腫瘍活性の増加とともにESAMの陽性化が観察できた。これらの結果は、ESAMが急性白血病の系統診断においてに有用であるのみならず、骨髄性白血病において腫瘍細胞の性質を評価する上でも有用である可能性を示唆している。今後さらに白血病細胞におけるESAM発現の意義について解析を進める予定である。血液内科学交付申請書では、造血幹細胞の生理的機能におけるESAMの発現の意義を明らかにし、ヒトの白血病の診断・治療に繋げていくことを本研究の目的として掲げた。研究期間の初年の段階で、造血幹細胞の活性化に伴うESAMの発現上昇の分子生物学的機序と生理的意義に関して多くの研究結果が得られた。本年度は、当初の予定通りヒトの造血幹細胞・白血病細胞におけるESAMの発現に関して解析を進めることが出来た。以上の状況を総合すると,本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。交付申請書では、造血幹細胞の活性化に伴うESAMの発現上昇の生理的意義を明らかにし、さらに白血病幹細胞のマーカーとしての有用性と治療標的としての可能性を解析して、ヒトの血液病の診断・治療に繋げていくことを本研究の目的として掲げた。骨髄抑制からの回復時、造血幹細胞は骨髄内で血管内皮細胞近傍に移行する学説が提唱されてきたが,私達の研究成果はそれを実証的に裏付けた。造血幹細胞内部においては,骨髄抑制後の造血幹細胞におけるESAM発現上昇が、NF-kBとトポイソメラーゼIIの阻害剤の投与によって抑制されるというデーターを得た。さらにESAM遺伝子のプロモーター領域を解析し,NF-kBやトポイソメラーゼIIの作用がESAMの発現上昇に重要であり,その結果誘導される造血幹細胞の増殖においても極めて重要であることを明らかにした。これらの成果は、学会報告だけでなく一つの論文としてまとめることが出来た。ヒトの造血幹細胞におけるESAMの発現と増殖・分化能力の関連や、ヒト白血病症例におけるESAMの発現に関しても、関連法規を遵守しインフオームドコンセントのもとで得られた検体を用いて解析を進めている。
成長速度に異方性をもつ結晶を利用した微小部品の作製

最近,mumオーダの機械部品の作製が注目を浴びている.これらの研究は半導体リソグラフィの技術を応用したシリコンでできたマイクロストラクチュア作製がその始まりとされている.これらの部品を実用に供する場合,シリコン以外の素材でできた高いアスペクト比(高さ/幅)をもつ微小部品の作製が必要になることがある.このような目的に合致した方法として,SOR光を利用したLIGAプロセスがあるが,この方法では,作製のための設備が高価になり,手軽に使用できない欠点がある.本研究では,高いアスペクト比をもつ微小部品を簡便に作製する方法を開発することを目的とした.そのための手法として,まず最初に,結晶方向によって成長速度に大きな差をもつ単結晶を使って高アスペクト比の型を作る.次に,この型を基にして電鋳加工などを行うことによって高アスペクト比をもつ微小金属部品を作製する方法を使用した.本年度は,これらの工程のうち,高アスペクト比の型を作る工程について検討し,方向によって成長速度が著しく異なる単結晶として,ヨウ素酸リチウムを使用した.結晶端面に写真製版法を応用してパターンを描き,その後,ヨウ素酸リチウムを飽和させた水溶液中で結晶を成長させて,結晶端面と垂直な方向に高いアスペクト比をもつ構造の作製が可能かどうかを検討した.その結果,結晶端面と垂直な方向にはパターンの形状のまま成長することはなく,六角柱状の単結晶として成長する.しかし,かなりアスペクト比の高い構造の作製が期待できることがわかった.そこで,最大成長速度をもつ方向をそろえた多結晶の端面にパターンを描き,パターン形状のまま,最大成長速度の方向に高いアスペクト比をもつ構造を作製することを検討している.最近,mumオーダの機械部品の作製が注目を浴びている.これらの研究は半導体リソグラフィの技術を応用したシリコンでできたマイクロストラクチュア作製がその始まりとされている.これらの部品を実用に供する場合,シリコン以外の素材でできた高いアスペクト比(高さ/幅)をもつ微小部品の作製が必要になることがある.このような目的に合致した方法として,SOR光を利用したLIGAプロセスがあるが,この方法では,作製のための設備が高価になり,手軽に使用できない欠点がある.本研究では,高いアスペクト比をもつ微小部品を簡便に作製する方法を開発することを目的とした.そのための手法として,まず最初に,結晶方向によって成長速度に大きな差をもつ単結晶を使って高アスペクト比の型を作る.次に,この型を基にして電鋳加工などを行うことによって高アスペクト比をもつ微小金属部品を作製する方法を使用した.本年度は,これらの工程のうち,高アスペクト比の型を作る工程について検討し,方向によって成長速度が著しく異なる単結晶として,ヨウ素酸リチウムを使用した.結晶端面に写真製版法を応用してパターンを描き,その後,ヨウ素酸リチウムを飽和させた水溶液中で結晶を成長させて,結晶端面と垂直な方向に高いアスペクト比をもつ構造の作製が可能かどうかを検討した.その結果,結晶端面と垂直な方向にはパターンの形状のまま成長することはなく,六角柱状の単結晶として成長する.しかし,かなりアスペクト比の高い構造の作製が期待できることがわかった.そこで,最大成長速度をもつ方向をそろえた多結晶の端面にパターンを描き,パターン形状のまま,最大成長速度の方向に高いアスペクト比をもつ構造を作製することを検討している.
麻酔覚醒と疼痛評価を目的とした非装着型瞳孔計を用いた瞳孔ゆらぎに関する基礎的研究

本研究は,浅麻酔覚醒領域での視床、視床下部等を含めた上位中枢活動を、瞳孔ゆらぎから捉えることを目的とした。健常者における断眠ストレス負荷では、瞳孔ゆらぎ変動量が断眠開始からの時間に伴って増大することが示された.この時の瞳孔ゆらぎの周期は約1Hzであった。一方、健常者における情動負荷テストにおいては、瞳孔ゆらぎの有意な変化は認められなかった.麻酔覚醒過程の瞳孔変動は、GABA作動薬である静脈麻酔薬(プロポフォール)や揮発性麻酔薬(セボフルラン)による差異は明らかでなかったが、NMDA拮抗薬であるケタミンでは、覚醒過程において、眼球運動そのものに不安定性が認められた。意識状態は、脳の活性化レベル(活動レベル)の他に、情報源、即ち入カ-出力のゲーティング(処理される外的情報と内的情報の相対的なバランス)や神経修飾作用(コリン作動性神経修飾に対するアミン作動性神経修飾の割合,記憶の容量を決定)の神経プロセスにも左右される。このうち、入出力ゲーテイングの因子は、臨林的にPGO(橋-膝状体-後頭葉)波の代用としての眼球運動から捉えることができるので、この結果は、NMDA拮抗薬が、入出力ゲーテイングに影響を及ぼす可能性があるものとして興味深い。更に、並行して行った脳波の周波数解析において、ケタミンは、GABA作動薬による睡眠紡錘波のα領域のピークを約4Hz、上昇させることがわかった。この時の、位相カップリングの状態を、位相解析から調べたところ、bicoherence値のピークも同様に3-4Hz、高周波数側へ変異する現象が明らかとなった。この結果は、ケタミンが意識の支持系統としての視床網様系に作用することを示唆するものである。これらの結果から、瞳孔及び眼球運動の計測が、脳波から得られる情報と併せて統合的に覚醒意識を検討するのに重要であることが結論できた。瞳孔径が麻酔深度や疼痛により自律神経介在ニューロンにより制御されることはすでに明らかにされているが、麻酔深度、覚醒や疼痛に対する、上位中枢も含めた瞳孔径変化のメカニズムの詳細は明確ではなく、その臨床的応用は限られている。近年、瞳孔は光,その他の刺激がない場合にも変動することが知られ,こうした瞳孔の「ゆらぎ」は中枢性であると考えられ、交感神経による介在が示唆されているが,現在のところ,明確な瞳孔のゆらぎの機構は解明されていない。本研究は,浅麻酔覚醒領域での視床、視床下部等を含めた上位中枢活動を自律神経活動介して、高時間・高空間分解能な非装着型瞳孔径を用いて、瞳孔ゆらぎから捉えることを目的とする.平成16年度は,健常者における断眠ストレス負荷下,及び,健常者における情動負荷テスト下の瞳孔ゆらぎ計測を施行した.その結果,断眠負荷状態においては,瞳孔ゆらぎ変動量が断眠開始からの時間に伴って増大することが示された.この時の瞳孔ゆらぎの周期は約1Hzであった.情動負荷テストでは,瞳孔ゆらぎに関しての有意な変化は認められなかった.現在,麻酔覚醒過程の瞳孔変動計測を麻酔薬(静脈麻酔薬:プロポフォール、揮発性麻酔薬:セボフルラン等)による差異も含めて検討している。瞳孔パラメータ計測と同時に並行して,心拍数、血圧、体温等の一般的循環動態の計測、心拍数変動(システム本体既存),及び,脳波解析(システム本体既存),更に大脳皮質の覚醒度の評価として、記憶、健忘効果,認知能力についても検討中である。

今後,瞳孔計測データ解析を、これら脳波から得られる情報、心拍変動からみた自律神経活動、更に短期記憶,認知能力と併せて統合的に解析し、覚醒と瞳孔変動について解析検討する予定である。本年度は、種類の異なる麻酔とその覚醒過程を研究対象とした。麻酔覚醒過程の瞳孔変動は、GABA作動薬である静脈麻酔薬(プロポフォール)や揮発性麻酔薬(セボフルラン)による差異は明らかでなかったが、NMDA拮抗薬であるケタミンからの覚醒過程における瞳孔パラメータ計測においては、眼球運動そのものに不安定性が認められた。意識状態は、脳の活性化レベル(活動レベル)の他に、情報源、即ち入力-出力のゲーティング(処理される外的情報と内的情報の相対的なバランス)や神経修飾作用(コリン作動性神経修飾に対するアミン作動性神経修飾の割合,記憶の容量を決定)の神経プロセスにも左右される。このうち、入出力ゲーテイングの因子は、臨牀的にPGO(橋-膝状体-後頭葉)波の代用としての眼球運動から捉えることができるので、この結果は、NMDA拮抗薬が、入出力ゲーテイングに影響を及ぼす可能性があるものとして興味深いと考える。更に、並行して行った脳波の周波数解析において、ケタミンは、GABA作動薬による睡眠紡錘波のα領域のピークを約4Hz、上昇させることがわかった。この時の、位相カップリングの状態を、位相解析から調べたところ、bicoherence値も同様に3-4Hz、高周波数側へ変異する現象が明らかとなった。この結果は、ケタミンが意識の支持系統としての視床網様系に作用することを示唆するものである。これらの結果から、瞳孔及び眼球運動の計測が、脳波から得られる情報と併せて統合的に覚醒意識を検討するのに重要であることが結論できた。
TNF-SF15は腸管上皮細胞にオートファジーを誘導する

小胞体ストレス応答やオートファジーは、多くの細胞の生存に不可欠の機構であり、生体の恒常性維持に寄与していると考えられている。しかしながら、腸管上皮細胞におけるこの2つの機構のクロストークは、良く分かっていない。本研究者らは、小胞体ストレス応答が、主にIRE1αを介し2種類の腸管上皮培養細胞においてオートファジーを誘導し、アポトーシス抵抗性、細胞の生存率に関わっていることを見出した。クローン病は、消化管に潰瘍を形成する原因不明の慢性特発性炎症性腸疾患である。民族により発病率が異なること、高家族内集積性が認められること、二卵性双生児よりも一卵性双生児において疾患の一致率が高いことなどから、遺伝的素因が関与する多因子疾患と考えられている。最近クローン病の疾患感受性遺伝子として、ATG16L1遺伝子、IRGM遺伝子があらたに感受性遺伝子として同定された。このATG16L1遺伝子、IRGM遺伝子は、オートファジー機構に係る遺伝子であるが、本研究者らは、日本人クローン病の発症にTNF-SF15遺伝子が関わることを報告し、またその研究途上で、TNFSF-15遺伝子が腸管上皮培養細胞のオートファジー現象に関わることも新たに見出した。そこで本年度は、オートファジーを検出できる腸管上皮培養細胞系を確立し、TNFSF-15遺伝子がどのような機序でオートファジーに関わるか検討を開始した。ヒトLC3B遺伝子cDNAを得るため、消化管より抽出したmRNAを鋳型としてRT-PCR法により単離した。この時リンカープライマーは、各々EcoR I制限酵素部位を有するよう設計した。次に、クローンテック社の緑色蛍光蛋白EGFP発現プラスミドEcoR I部位に、ヒトLC3B遺伝子cDNAをインフレームとなるよう組み込み、GFP-LC3発現ベクターを作成した。このベクターをコンピテントセルに遺伝子導入し、対数増殖期の大腸菌からQIAGEN Plasmid Kitを用いてプラスミドDNAを抽出した。最終濃度は、24μg/μlになるよう調整した。このベクターをリポフェクション法により、ヒト大腸上皮細胞株のSW480細胞、HT-29細胞へ遺伝子導入し、限界希釈法にて安定導入株を得た。本研究の目的は、腸管上皮培養細胞系を用いて、どのような機序でTNF-SF15がオートファジーに関わるか明らかにすることである。昨年度はリポフェクション法と限界希釈法を用いて、オートファジーのマーカーであるGFP-LC3を安定発現する細胞株SW480とHT-29を得ることができた。本年度は樹立した細胞株の性質を明らかにし、TNF-SF15刺激による、オートファジー現象を確認する予定であった。しかしながら、東日本大震災により培養環境が損なわれ、ディープフリーザーの電源喪失により細胞株も失った。そのため、再度培養株の樹立から再開する必要が生じた。幸いにも安定発現株を得ることができたため、オートファジー刺激である飢餓負荷と、mTOR阻害剤のラバマイシン負荷実験を施行した。その結果、オートファジー刺激に応じ、ウエスタンブロッティングにてGFP-LC3の発現が増強し、蛍光顕微鏡にてGFP-LC3のドット数の増加が確認された。さらに現在電子顕微鏡によるオートファゴソーム二重膜構造の確認を行っている。民族により発病率が異なること、高家族内集積性が認められること、二卵性双生児より一卵性双生児において疾患の一致率が高いことなどから、遺伝的素因が関与する多因子疾患と考えられている。本研究者らは、以前日本人クローン病の発症にTNF-SF15遺伝子が関わることを報告したが、本研究目的は他のクローン病感受性遺伝子であるATG16L1遺伝子、IRGM遺伝子の機能(オートファジー)とのクロストークを明らかにすることである。本年度は、オートファジーのマーカーであるGFP-LC3を安定発現する2種類のヒト腸管上皮培養細胞株に、飢餓等のオートファジー刺激を負荷し電子顕微鏡によるオートファゴソーム二重膜構造の確認を行った。

その実験途上で、小胞体ストレスに関与するXBP1遺伝子が日本人クローン病の感受性遺伝子であることが判明したため(本研究グループの成果)、樹立培養細胞株に小胞体ストレスを負荷したところ、オートファジーが誘導された。すなわち腸管上皮細胞において、小胞体ストレス応答とオートファジーとの関わりが見出された。さらに小胞体ストレス応答の中で、IRE1αをノックダウンするとオートファジーの亢進が抑制された。他の応答経路に関わるPERKやATF6のノックダウンではオートファジーの亢進が抑制されることは無かった。小胞体ストレス応答とオートファジーを結びつけるシグナル伝達経路には、Aktのリン酸化が関わっており、オートファジーの亢進が抑制されると、細胞の生存能力が低下し、アポトーシスが促進されることも明らかとなった。本研究成果は、体裁を整えた後欧文誌に投稿を予定している。東日本大震災により培養環境が損なわれ、ディープフリーザーの電源喪失により細胞株も失った。そのため、再度培養株の樹立から再開する必要があり、大きな時間的ロスにつながった。24年度が最終年度であるため、記入しない。東日本大震災で失った細胞株は、再樹立により得ることができたため、現在予定していた実験を再開している。ロスした時間に関しては、培養環境の整備、作業量の効率化を図ることで挽回したい。
マイトトキシンの完全構造決定

マイトトキシンは、植物プランクトンである渦鞭毛藻が生産する分子量3422のポリエーテル化合物であり、天然物中最大の分子量と非常に強い毒性によって、現在最も注目されている海洋天然物である。われわれは、1993年にマイトトキシンの平面構造とエーテル環が連続している部分の立体化学を明らかにしたが、その他の鎖状部分に関しては未解明の部分が多い。本一般研究Bにおいて、エーテル環をつなぐ部分の立体配座(F-G環の間の2個の不斉炭素とM-N環の間の2個の不斉炭素)を主に有機合成化学的手法により決定することができさらに、C1-C14とC134-C142の側鎖部分に関して立体化学と回転配座を求めた。新たに開発したNMRのスピン結合定数(^<2,3> J_<C,H>と^3 J_<H,H>)と分子力場計算を併用した方法をこの部分に適用した結果、側鎖に存在するすべての不斉炭素を推定することができた。さらに、推定立体構造を有する合成フラグメントと天然物のNMRデータを比較することによって確認作業を進め、同時に、エナンチオ選択的なフラグメントCの合成を行ない、天然の分解物と比較することによって絶対構造を決定することができたので、ここにマイトトキシンの完全構造決定が完成した。マイトトキシンは、植物プランクトンである渦鞭毛藻が生産する分子量3422のポリエーテル化合物であり、天然物中最大の分子量と非常に強い毒性によって、現在最も注目されている海洋天然物のひとつである。われわれは、平面構造を1993年に明らかにしたが、立体化学に関しては未解明の部分が多い。エーテル環が連続している部分については平面構造の決定と同時に立体化学も帰属できたが、分子両端の側鎖とエーテル環を繋ぐ部分の立体化学に関しては不明である。本研究では、残る立体配置と絶対配置を決定してマイトトキシンの構造を完全に決定することを目的とした。構造決定には、NMRのスピン結合定数と分子力場計算を併用した方法を開発し、おもにC1-C14とC134-C142の側鎖部分に関して立体化学と回転配座を求めた。すなわち、スピン結合定数(^<2,3>J_<C,H>と^3J_<H,H>)から求めた2面角の情報と、不斉炭素間や隣接するメチレンの回転配座とを可能なジアステレオレオマ-について比較し、最も一致したものを天然物の立体構造とした。その結果、側鎖にある11個の不斉炭素のうち9個の帰属に成功した。また、エーテル環をつなぐ部分の立体配座(F-G環の間の2個の不斉炭素とM-N環の間の2個の不斉炭素)については、合成により推定することができた。今後、可能性のあるジアステレオマ-を合成して確認して行く予定である。また、絶対構造決定に向けてフラグメントCの合成にも着手した。昨年度の本一般研究Bにおいて、エーテル環をつなぐ部分の立体配座(F-G環の間の2個の不斉炭素とM-N環の間の2個の不斉炭素)を主に有機合成化学的手法により決定することができた。今年度は、残るC1-C14とC134-C142の側鎖部分に関して立体化学と回転配座を求めた。昨年度開発した、NMRのスピン結合定数(^<2,3>JC,Hと^3JH,H)と分子力場計算を併用した方法をこの部分に適用した結果、側鎖に存在するすべての不斉炭素を推定することができた。

さらに、推定立体構造を有する合成フラグメントと天然物のNMRデータを比較することによって確認作業を進め、同時に、エナンチオ選択的なフラグメントCの合成を行ない、天然の分解物と比較することによって絶対構造を決定することができたので、ここにマイトトキシンの完全構造決定が完成した。
テロメアの1本鎖DNA領域に結合する蛋白質の高次構造とテロメア調節機構

真核生物の染色体末端のテロメアDNAの長さは、テロメアDNA結合蛋白質によって調節されており、細胞の老化や癌化と密接な関係にある。テロメアDNA結合蛋白質の一つであるPot1蛋白質はテロメアの3'末端の1本鎖DNA領域に特異的に結合し、染色体の構造維持などに寄与するが、詳細な分子機構は不明である。そこで、Pot1のテロメア1本鎖DNA結合領域(Pot1DBD)中の、テロメア1本鎖DNA認識に必須なアミノ酸を明らかにすることで、Pot1の詳細なテロメア1本鎖DNA認識機構の解明を目的とした。まず、既報のPot1とG2:d(GGTTAC)との複合体のX線結晶構造解析の知見を用いて、G2の塩基と水素結合を介して結合する9っのアミノ酸残基(S58,T62,D64,K90,T111,Q120,S123,K124,D125)とG2の塩基とスタッキングを介して相互作用する3つのアミノ酸残基(F88,Y115,U22)に変異を導入し、点変異型Pot1(1-182)を作製した。続いて、ゲルシフト法と等温滴定型熱量計によるG2への結合能及び、熱力学的パラメーターの解析を行ったところ、T62V, D64A, K124A, F88A, L122A, L122FのみがG2への結合能を顕著に消失した。また、G2との結合能が低下すると、ΔHとΔSの絶対値に大きな減少が見られることが明らかとなった。よって、この5個のアミノ酸残基がテロメアDNA認識に顕著に寄与することが示唆された。以上の解析から、X線結晶構造からテロメアDNA認識に関与すると判断されるアミノ酸残基の中でも、テロメアDNA認識への寄与の程度は大きく異なることを見出した。DNA認識機構の理解のためにはX線結晶構造解析のみでは必ずしも十分ではなく、点変異型蛋白質による解析が必須であることを、示唆している。本研究では、Pot1蛋白質とテロメア1本鎖DNAとの相互作用を解析している。テロメア1本鎖DNA領域との結合に必要なPot1蛋白質のN末端側の最小DNA結合ドメインを特定するために、Pot1蛋白質のC末端側を欠損した一連の部分欠失変異体をコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌内で蛋白質を発現した。これらの蛋白質とテロメア1本鎖DNAとの結合能の解析より、N末端182残基が1本鎖DNA結合ドメイン(DBD)であることを明らかにした。このPot1 DBDの高次構造を円偏光二色性(CD)で解析した結果、αヘリックスとβシート構造を有していた。また、Pot1 DBDと分裂酵母及びマウスのテロメア1本鎖DNAとの結合能をゲルシフト法で解析したところ、Pot1 DBDは分裂酵母テロメア1本鎖DNAには特異的に結合するが、マウステロメア1本鎖DNAにはほとんど結合しないことが明らかとなった。更に、Pot1 DBDと分裂酵母テロメア1本鎖DNA配列d(GGTTAC)との相互作用を等温滴定型熱量計(ITC)により詳細に解析した。これより、温度の上昇に伴って結合定数が減少することが明らかとなった。また、イオン強度の上昇に伴って結合定数が減少することも明らかとなった。Pot1のテロメア1本鎖DNA結合領域(Pot1DBD)中の、テロメア1本鎖DNA認識に必須なアミノ酸を明らかにすることを目的とした。本研究では、既に報告されているPot1 DBDとテロメア1本鎖DNAとの複合体のX線結晶構造解析の結果に基づき、テロメア1本鎖DNAとの結合に関与していると考えられるPot1 DBDの一連のアミノ酸残基に変異を導入した。作製した変異体とテロメア1本鎖DNAとの結合能をゲルシフトにより解析した。S58、K90、D125に変異を導入したものは、複合体のバンドの濃さが野生型と変わらなかったが、Q120に変異を導入したものは、テロメア1本鎖DNAとの結合能が半減した。これより、アミノ酸残基により結合への寄与の度合が異なることが明らかとなった。分裂酵母のテロメアDNA配列はGリッチであることから、4本鎖DNA構造を形成し、生物学的に重要な役割を持つことが考えられる。本研究では、分裂酵母のテロメア1本鎖DNA配列がNa+及びK+イオン存在下において、Gn(n=4-6):d(G_nTTAC)は平行型4本鎖DNA構造を、4Gn(n=3,4):d[(G_nTTAC)_4]は反平行型4本鎖DNA構造を形成することを明らかにした。

また、Pot1DBDとG6(平行型)及び4G4(反平行型)の4本鎖DNA構造との相互作用をCD及びFRETにより解析したところ、Pot1DBDは4本鎖DNA構造をほどく活性を有することを見出した。真核生物の染色体末端のテロメアDNAの長さは、テロメアDNA結合蛋白質によって調節されており、細胞の老化や癌化と密接な関係にある。テロメアDNA結合蛋白質の一つであるPot1蛋白質はテロメアの3'末端の1本鎖DNA領域に特異的に結合し、染色体の構造維持などに寄与するが、詳細な分子機構は不明である。そこで、Pot1のテロメア1本鎖DNA結合領域(Pot1DBD)中の、テロメア1本鎖DNA認識に必須なアミノ酸を明らかにすることで、Pot1の詳細なテロメア1本鎖DNA認識機構の解明を目的とした。まず、既報のPot1とG2:d(GGTTAC)との複合体のX線結晶構造解析の知見を用いて、G2の塩基と水素結合を介して結合する9っのアミノ酸残基(S58,T62,D64,K90,T111,Q120,S123,K124,D125)とG2の塩基とスタッキングを介して相互作用する3つのアミノ酸残基(F88,Y115,U22)に変異を導入し、点変異型Pot1(1-182)を作製した。続いて、ゲルシフト法と等温滴定型熱量計によるG2への結合能及び、熱力学的パラメーターの解析を行ったところ、T62V, D64A, K124A, F88A, L122A, L122FのみがG2への結合能を顕著に消失した。また、G2との結合能が低下すると、ΔHとΔSの絶対値に大きな減少が見られることが明らかとなった。よって、この5個のアミノ酸残基がテロメアDNA認識に顕著に寄与することが示唆された。以上の解析から、X線結晶構造からテロメアDNA認識に関与すると判断されるアミノ酸残基の中でも、テロメアDNA認識への寄与の程度は大きく異なることを見出した。DNA認識機構の理解のためにはX線結晶構造解析のみでは必ずしも十分ではなく、点変異型蛋白質による解析が必須であることを、示唆している。
ビスフォスフォネート関連顎骨壊死の診断・予防に骨代謝マーカーを応用する研究

研究の基礎となるBPs(ビスフォスフォネート)製剤による顎骨壊死モデルの作成を図った。一方、臨床への応用を鑑み、大規模な前向き疫学研究である京都ながはまプロジェクトへの参画により実際の歯科疾患と各種全身疾患の関係を調査し、顎骨壊死の予防や治療における指標として有用であるか検討した。マウスに対し、BPs製剤投与による顎骨壊死モデルの開発外科手術後7日、17日で、骨量(TAV(mm^2)、骨空胞がコントロール群との間に有意差を認めた。また、破骨細胞については4日、7日でコントロール群との間に有意差を認めた。顎骨への侵襲的な外科処置後に生じる壊死骨の残存がBRONJ発症の契機となる可能性が考えられた。II臨末試験京都ながはまプロジェクトへの参画滋賀県長浜市との協力による長浜市およびその近隣住民10000人規模のコホート研究において全身的および歯科疾患罹患患者の登録、統計解析を行ったところ、歯科疾患による喪失歯数とCAVI(Cardio-Ankle Vascular Ihdex)で表せる動脈硬化罹患との間には統計的有意差を認めた。動脈硬化や喪失歯数は年齢とともに増加するが、中でも女性は骨粗鬆症と喪失歯数の増加が関連している事が報告されている。男性に比べ炎症の蓄積を反映していない可能性があった。
心筋傷害分子としての細胞外ヒストンの基礎研究と臨床展開

敗血症患者の血中ヒストン濃度を測定したところ、健常人と比べて有意に高かった。マウスの血中にヒストンを投与して、重症敗血症患者と同程度まで血中ヒストン濃度を上昇させると、心電図検査、心エコー検査、血液検査にて、心筋傷害の所見を認めた。敗血症に伴う血液凝固異常の治療薬として臨床応用されている遺伝子組換え型トロンボモジュリン製剤をマウスに投与すると、ヒストンによる心筋傷害を軽減し、生存率を改善することができた。以上のことから、敗血症の際に血中濃度が上昇するヒストンは、心筋傷害因子として作用する可能性が示唆され、遺伝子組換え型トロンボモジュリン製剤によってそれを軽減しうる可能性が示唆された。敗血症では、しばしば心筋障害を併発する。敗血症患者の血中には何らかの心筋抑制因子が含まれていると考えられているが、その全貌はわかっていない。本研究課題では、「敗血症における致死性メディエーターとして近年注目を集めている細胞外ヒストンが、敗血症患者の血中に含まれている心筋抑制因子であり、細胞外ヒストンの心筋傷害性によって心臓の収縮能が低下する」、という仮説について、臨床検体、動物実験、培養細胞を用いて検証した。まず、臨床検体中の血漿ヒストン濃度を測定したところ、健常人ではほぼゼロだったのに対し、敗血症患者では有意に高値を示していた。特に、死亡例において、高い傾向を示した。また、敗血症以外でも、外傷や腫瘍崩壊症候群などによって非感染性に細胞が傷害される病態においても、血漿ヒストン濃度の上昇を認めた。マウスにヒストンを投与すると、心電図にてST低下、R波の減高の所見を認め、心エコーでは右室の拡張、左室収縮能の低下を認めた。血液生化学検査では、CK、AST、LDHの上昇を認め、心筋などの細胞が傷害されていると考えられた。また、培養細胞を用いた実験でも、ヒストンによって細胞が傷害され、アポトーシスおよびネクローシスに陥る様子が観察された。播種性血管内凝固症候群(DIC)治療薬として現在広く使われている遺伝子組換え型トロンボモジュリン製剤はヒストンと結合してヒストンの毒性を中和し、ヒストンを投与したマウスの心筋傷害を軽減し、生存率を改善した。以上のことから、敗血症の際に血中濃度が上昇する細胞外ヒストンは、心筋傷害因子として働く可能性が示唆され、また、遺伝子組換え型トロンボモジュリン製剤によってそれを軽減しうる可能性が示唆された。
土壌微生物による亜酸化窒素ガス吸収能力の解析と制御

亜酸化窒素(N_2O)ガスは、温室効果ガスであると同時にオゾン層破壊の原因物質であることが見い出され、近年の大気中濃度の上昇が大きな注目を集めている。食糧増産にともなって使用量が急増してきた農耕地での窒素肥料の施用が、重要な亜酸化窒素発生源として指摘されている。本研究は、まず土壌中で亜酸化窒素ガスの吸収が起こっていることを明らかにし、その作用が土壌微生物活動によることを確認して、当該微生物の単離と生理的特徴を明らかにしたのち、この微生物を用いて土壌からの亜酸化窒素ガス放出量を制御することが可能かどうかを検証するための、基礎的知見を集積することを目的とした。また大気への亜酸化窒素放出量が土壌中での亜酸化窒素生成量と消費量の差であることに注目し、本年度は土壌中での亜酸化窒素生成量に及ぼす各種土壌因子の影響についても検証した。得られた成果は以下の通りである。1)土壌中で亜酸化窒素ガスの吸収を行なう土壌微生物の同定を試みた。2)土壌水分、塩類濃度が亜酸化窒素生成量に及ぼす影響を解析した。乾燥土壌やハウス土壌を想定した室内培養実験で、窒素肥料のモデルとして硫酸アンモニウムや硝酸カリウムなど塩類溶液・粉末を添加して、亜酸化窒素ガス濃度の変化を経時的に測定した。その結果、土壌中の亜酸化窒素生成が土壌水分と塩類濃度に大きく支配され、特に土壌塩類濃度が00.1Mでは亜酸化窒素生成が促進されることを初めて明らかにした。本年度に得られた成果は以下の通りである。土壌の中で亜酸化窒素ガスの吸収が起こっていることを明らかにした。畑土壌を酸素濃度および水分条件を35段階に変化させ、密閉系に亜酸化窒素濃度を3レベルで変化させ培養し、培養期間中の各ガス濃度を高性能キャピラリーガスクロマトグラフで追跡した。さらに、土壌への亜酸化窒素の吸収現象を代表的畑土壌のアロフェン質および非アロフェン質黒ボク土壌6種類を用いて、確認した。2)その作用が土壌微生物活動によることを確認した。複数の抗生物質を添加したりオートクレーブで処理をして土壌殺菌した後に、上記と同様な培養実験を行ない、対照区と亜酸化窒素濃度の変化を比較することで、亜酸化窒素吸収が土壌微生物活動によることを確認した。次に、土壌微生物のなかで、まず細菌のどの属が寄与するかも明らかにした。窒素肥料のモデルとして硫酸アンモニウムや硝酸カリウムなど塩類溶液・粉末を添加して、亜酸化窒素ガス濃度の変化を経時的に測定した。さらに、有機物などの添加効果を調べ、アセチレンなどの阻害が起こることを確認した。
殺虫タンパク質とその殺虫メカニズムに関する研究

本研究では、昆虫の日和見感染菌であるセラチア菌が分泌するメタロプロテアーゼに起因する殺虫メカニズムについて研究を推進している。これまでの研究からメタロプロテアーゼが宿主昆虫アワヨトウの体液ドーパミン濃度の上昇をもたらし、このドーパミンが脳内へ流入し、神経細胞のアポトーシスを誘導していることが明らかとなっている。しかし、メタロプロテアーゼによるドーパミン合成・分泌の誘導機構は明らかではない。ドーパミン合成・分泌を誘導できる分子として成長阻害ペプチド(GBP)がある。これまでにGBPの体液濃度の上昇はメタロプロテアーゼ注射により引き起こされていることを明らかにした。そこで、メタロプロテアーゼによる体液GBPの増加のメカニズムの解明を目的とした実験を行った。GBPは前駆体proGBPとして体液中に存在し、その活性化は内在性の活性化酵素により生じる。本研究でカイコのGBP活性化酵素の解析を行った結果、GBPの活性化にはいくつかのセリン型プロテアーゼが関与していることが明らかとなった。そこで、メタロプロテアーゼによるGBP活性化がこれらの活性化酵素群を介した反応によるものかを明確するために熱処理により体液の酵素群を失活させた後にメタロプロテアーゼを加える実験を行った。その結果、proGBPが経時的に減少することが観察でき、GBPの活性化がメタロプロテアーゼによるものであることが明らかとなった。本年度の結果とこれまで得られている知見から殺虫タンパク質であるメタロプロテアーゼはGBPを活性化することにより体液ドーパミンの濃度上昇をもたらし、同時に細胞外マトリックスと細胞間接着分子を分解することにより脳内へのドーパミン流入を引き起こし、その結果、神経細胞のアポトーシスが生じ、昆虫に死をもたらしているものと考えられる。本研究では、セラチア菌由来メタロプロテアーゼによるアワヨトウの殺虫メカニズムについて、1.成長阻害ペプチド(GBP)の活性化機構、2.ドーパミン分泌誘導と殺虫の分子機構の2つの見地から研究を行なっている。1.GBPの活性化機構に関しては、セラチア菌由来のメタロプロテアーゼのクローニングをセラチア菌のゲノムDNAより行なった。その結果、全長1440bpの塩基配列が得られ、さらにこの配列を大腸菌発現系のベクターに組み込んで大量発現を試みている。また、GBP前駆体(proGBP)のcDNAをバキュロウイルスベクターに組み込んで組み換えバキュロウイルスを作製した。GBPのホモログ(麻痺ペプチド、PP)は同じ鱗翅目昆虫であるカイコにも存在していることが知られており、この麻痺ペプチド前駆体についても精製を行い、ほぼ完了した。一方、GBP活性化の中心的な役割を果たすGBP活性化酵素に関してはアワヨトウの脂肪体内に存在するGBP活性化酵素以外に体液中にもGBP活性化酵素が存在していることを確認した。同様にカイコでもPP活性化酵素が体液中に存在しており、体液の活性化酵素はそのアフィニティークロマトグラフィーでの吸着特異性から考えて脂肪体内に存在する酵素とは異なる酵素であることが濃厚となった。2.ドーパミン分泌誘導と殺虫の分子機構に関しては、ドーパミン合成経路を阻害する実験を行なった。殺虫効果と高ドーパミン濃度が互いに関連したものであるかをアワヨトウにチロシンハイドロキシラーゼ(TH)阻害剤を投与して検証した。その結果、TH阻害剤を投与した場合ではドーパミン濃度が低く抑えられ、アワヨトウの死に至るまでの期間も数倍長くなった。また、メタロプロテアーゼ注射後12時間目で見られる脳細胞のアポトーシス像もTH阻害剤を投与することにより見られなくなった。これまでの研究からこのメタロプロテアーゼが宿主昆虫アワヨトウの体液ドーパミン濃度の上昇をもたらし、体液中のドーパミンが脳内へ流入し、脳・神経細胞のアポトーシスを誘導していることが明らかとなっている。また、ドーパミン合成経路の酵素の一つであるチロシン水酸化酵素を阻害することにより、アワヨトウの生存期間が大幅に延びることも示されている。これらのことから、ドーパミンはメタロプロテアーゼによる殺虫機構に重要な因子の一つであることが明らかだが、メタロプロテアーゼによるドーパミン合成・分泌誘導機構は明らかではない。そこで、ドーパミン上昇の機構を明らかにする目的で、メタロプロテアーゼ注射後の体液ドーパミン量の変化を測定した。ドーパミン量は注射直後の変化では緩やかであったが、約2時間後から急激に上昇した。このことから、メタロプロテアーゼとドーパミン上昇の間には少なくとも一つの因子が関与しているものと考えられた。この因子として、類似のドーパミン上昇を示す成長阻害ペプチド(Growth-blocking peptide, GBP)が考えられる。GBPは多機能性の昆虫サイトカインで、最近、L-ドーパ脱炭酸酵素(dopa decarboxylase, DDC)の発現及びドーパミンの分泌を誘導することが明らかとされた。このことからも、メタロプロテアーゼによるドーパミン分泌がGBPを介して起きている可能性がある。そこで、メタロプロテアーゼ投与後のGBP前駆体およびGBPの変化をウェスタン解析ならびにELISA法によって調べた。メタロプロテアーゼ投与後、GBPの前駆体は徐々に減少し、GBPが増加していることが明らかとなった。

以上のことから、メタロプロテアーゼによる殺虫機構はGBPの活性化を介したドーパミン分泌誘導が関与していることが示唆された。本研究では、昆虫の日和見感染菌であるセラチア菌が分泌するメタロプロテアーゼに起因する殺虫メカニズムについて研究を推進している。これまでの研究からメタロプロテアーゼが宿主昆虫アワヨトウの体液ドーパミン濃度の上昇をもたらし、このドーパミンが脳内へ流入し、神経細胞のアポトーシスを誘導していることが明らかとなっている。しかし、メタロプロテアーゼによるドーパミン合成・分泌の誘導機構は明らかではない。ドーパミン合成・分泌を誘導できる分子として成長阻害ペプチド(GBP)がある。これまでにGBPの体液濃度の上昇はメタロプロテアーゼ注射により引き起こされていることを明らかにした。そこで、メタロプロテアーゼによる体液GBPの増加のメカニズムの解明を目的とした実験を行った。GBPは前駆体proGBPとして体液中に存在し、その活性化は内在性の活性化酵素により生じる。本研究でカイコのGBP活性化酵素の解析を行った結果、GBPの活性化にはいくつかのセリン型プロテアーゼが関与していることが明らかとなった。そこで、メタロプロテアーゼによるGBP活性化がこれらの活性化酵素群を介した反応によるものかを明確するために熱処理により体液の酵素群を失活させた後にメタロプロテアーゼを加える実験を行った。その結果、proGBPが経時的に減少することが観察でき、GBPの活性化がメタロプロテアーゼによるものであることが明らかとなった。本年度の結果とこれまで得られている知見から殺虫タンパク質であるメタロプロテアーゼはGBPを活性化することにより体液ドーパミンの濃度上昇をもたらし、同時に細胞外マトリックスと細胞間接着分子を分解することにより脳内へのドーパミン流入を引き起こし、その結果、神経細胞のアポトーシスが生じ、昆虫に死をもたらしているものと考えられる。
正常眼データベースとの比較による網膜疾患の眼血流動態の解明

本研究では,網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすること,網膜疾患における自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的として研究を進めてきた.視神経乳頭部における眼圧上昇時の血流動態についてレーザースペックルフローグラフィー(LSFG)を用いて詳細に検討した.視神経乳頭部では30mmHgの眼圧上昇直後には血流が低下するが,眼圧上昇1分後より血流が回復し10分後には上昇前と変わらないほどに回復しするという,強い自己調節機能が存在することを見出し報告した(Scientific report, 2018).糖尿病網膜症に対する通常とパターンスキャンレーザーによる網膜光凝固後の血流動態について,LSFG用いて検討した.前増殖糖尿病網膜症に対して網膜光凝固を行うと術後3ヶ月まで通常の光凝固とパターンスキャンレーザーともに経時的に血流が低下し,有意差がないことを見出し報告した(Scientific report, 2018).さらに網膜光凝固を行った部位の血流動態について光干渉断層計アンギオグラフィーを用いて検討し,網膜光凝固直後にはchoriocapillarisの血流は途絶しているが経時的に回復する部位があることを見出し報告した(Medicine, 2018).種々の条件下における眼循環動態の変化について調べ,さらに多くのデータを蓄積することができた.また網膜疾患においては糖尿病網膜症眼のみならず,多くの種類の網膜疾患おいても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.これらの結果は順次,学会で報告し,論文として投稿する予定である.網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすることや,自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的としている.本年度には眼圧上昇時の自己調節機能について詳細に調べることができ,論文にまとめることができた.また,種々の条件下において眼循環動態がどのように変化するかについて調べることができ,それらのデータを蓄積することができた.また糖尿病網膜症に関する循環動態を詳細に調べることができ論文にまとめることができた.網膜静脈閉塞症などの疾患においても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.当初の目標を達成できているものと考えられる.正常人眼における自己調節機能を眼圧上昇時のみならず,酸素投与時や血圧上昇時などの負荷時においても解明し,論文としてまとめる.さらにそれらの自己調節機能が網膜疾患でどのように正常眼と異なる変化と呈しているのかを解明し,網膜疾患の早期発見や予後を調べる方法について検討する.また,網膜疾患における血流動態と機能的・形態的な変化との関連についてデータを蓄積していく.動物実験においてもヒトにおいては負荷を行うことができないような自己調節機能についての研究をすすめていく.本研究では,網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすること,網膜疾患における自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的として研究を進めてきた.眼圧上昇時には,脈絡膜血流動態には存在しないと考えられてきた自己調節が存在すること,および,血流動態と形態学的な変化との関連として,脈絡膜血管成分と血流変化との間には有意な関連があることを見いだし報告した(IOVS, 2017).研究代表者は眼血流においては視神経乳頭部で女性では男性より有意に血流が速いことを初めて報告したが(IOVS, 2015),本年度にはその原因を解明し,論文としてまとめた(Scientific report, 2017).すなわち,ヘモグロビン量が少ない人では血流が速くなるメカニズムが存在し,女性では男性よりもヘモグロビン量が少ないので,結果として女性では血流が速いことを報告した.さらに,網膜疾患における血流動態として,網膜剥離に対する強膜内陥術後の詳細な血流変化ならびに形態変化との関連について論文としてまとめた(Scientific report, 2017).網膜剥離眼では眼血流が正常眼に比べて低下している.これは剥離眼では視細胞が機能しないので,血流の需要が減っているが,剥離網膜が復位することで,視細胞が機能することで血流動態が回復することを見出した.また,種々の条件下における眼循環動態の変化について調べ,データを蓄積することができた.また網膜疾患においては網膜剥離眼のみならず,多くの種類の網膜疾患おいても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.これらの結果は順次,学会で報告し,論文として投稿する予定である.本研究では,網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすることや,自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的としている.本年度には自己調節機能に対する論文を報告することができ,また今まで不明であった,眼血流における男女における血流動態の解明を行い,論文として報告することができた.また,種々の条件下において眼循環動態がどのように変化するかについて調べることができ,それらのデータを蓄積することができた.また網膜剥離,網膜静脈閉塞症などの疾患においても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.当初の目標を達成できているものと考えられる.本研究では,網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすること,網膜疾患における自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的として研究を進めてきた.視神経乳頭部における眼圧上昇時の血流動態についてレーザースペックルフローグラフィー(LSFG)を用いて詳細に検討した.

視神経乳頭部では30mmHgの眼圧上昇直後には血流が低下するが,眼圧上昇1分後より血流が回復し10分後には上昇前と変わらないほどに回復しするという,強い自己調節機能が存在することを見出し報告した(Scientific report, 2018).糖尿病網膜症に対する通常とパターンスキャンレーザーによる網膜光凝固後の血流動態について,LSFG用いて検討した.前増殖糖尿病網膜症に対して網膜光凝固を行うと術後3ヶ月まで通常の光凝固とパターンスキャンレーザーともに経時的に血流が低下し,有意差がないことを見出し報告した(Scientific report, 2018).さらに網膜光凝固を行った部位の血流動態について光干渉断層計アンギオグラフィーを用いて検討し,網膜光凝固直後にはchoriocapillarisの血流は途絶しているが経時的に回復する部位があることを見出し報告した(Medicine, 2018).種々の条件下における眼循環動態の変化について調べ,さらに多くのデータを蓄積することができた.また網膜疾患においては糖尿病網膜症眼のみならず,多くの種類の網膜疾患おいても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.これらの結果は順次,学会で報告し,論文として投稿する予定である.網脈絡膜循環の自己調節機能を明確にすることや,自己調節機能の異常も含め網脈絡膜循環の変化との関連を調べることを目的としている.本年度には眼圧上昇時の自己調節機能について詳細に調べることができ,論文にまとめることができた.また,種々の条件下において眼循環動態がどのように変化するかについて調べることができ,それらのデータを蓄積することができた.また糖尿病網膜症に関する循環動態を詳細に調べることができ論文にまとめることができた.網膜静脈閉塞症などの疾患においても眼循環動態の変化のデータを蓄積することができ.当初の目標を達成できているものと考えられる.正常人眼における自己調節機能を眼圧上昇時のみならず,酸素投与時や血圧上昇時などの負荷時においても解明し,論文としてまとめる.さらにそれらの自己調節機能が網膜疾患でどのように正常眼と異なる変化を呈しているのかを解明し,網膜疾患の早期発見や予後を調べる方法について検討を進めていく.また,網膜疾患における血流動態と機能的・形態的な変化との関連についてデータを蓄積していく.動物実験においてもヒトにおいては負荷を行うことができないような自己調節機能についての研究を進める.正常人眼における自己調節機能を眼圧上昇時のみならず,酸素投与時や血圧上昇時などの負荷時においても解明し,論文としてまとめる.さらにそれらの自己調節機能が網膜疾患でどのように正常眼と異なる変化と呈しているのかを解明し,網膜疾患の早期発見や予後を調べる方法について検討する.また,網膜疾患における血流動態と機能的・形態的な変化との関連についてデータを蓄積していく.動物実験においてもヒトにおいては負荷を行うことができないような自己調節機能についての研究をすすめていく.本年度において,論文校正費を節約することができたため次年度使用費が生じた.次年度では引き続き,研究に関する論文校正費や投稿料に使用する予定である.本年度において,より安価な論文校正先で校正を行うことで論文校正費を節約することができたため次年度使用費が生じた.次年度では引き続き,研究に関する論文校正費や投稿料に使用する予定である.
情報化による日本的取引慣行の変化に関する研究

今回の研究で明らかにしようとした仮説的枠組みの概要は、以下のとおりである。1.日本の系列店制度は、基本的には,人的で緊密な協調的関係に基づく分権的なチャネル管理に依存しており,その管理様式の特徴のために,需要不確実性への適応や効率的な情報・物的処理において限界が生じてきている。2.そのために近年の情報処理の技術改新を取り入れた情報化とともに,チャネル管理を集権的なものに転化する傾向が顕著となった。3.このことが分権的なチャネル管理を支えてきたリベート,派遣店員,再販売価格維持,返品制度などの系列店制度の主要な特徴を縮小,撤廃させる傾向をもたらす原因となっている。4.さらに系列店との協調的関係の後退から,大規模小売業者との取引拡大が許容され,小売段階における価格競争が促進される傾向にある。以上のように日本における系列店制度,およびそのもとでの日本的取引慣行の変化を説明し,これらの仮説に関わる過去の経済学的研究や行動科学的なチャネル研究の理論を整理,統合するとともに,これらの仮説を統計的データに基づいて検証した。そして流通段階における情報化が系列店制度における企業間関係や取引慣行を変えることや,小売段階の価格競争を促進させること,および,流通構造を大規模小売業者比率の高い段階数の少ない構造にすることを明らかにした。
有機金属による炭素-フッ素結合活性化を伴う含フッ素ペプチドイソスターの合成研究

フルオロアルケン型ジペプチドイソスターに比べ、より大きな双極子モーメントを有するトリフルオロメチルアルケン型ジペプチドイソスターのジアステレオ選択的合成を目的として、鍵反応となるトリフルオロメチル化反応について精査した。アミノ酸から誘導したγ-ケト-α,β-不飽和エステルに対し、触媒量のアルコール存在下、トリフルオロメチルトリメチルシランおよび炭酸カリウムを作用させることで、トリフルオロメチル化体が高収率で得られることを見出した。また、Lys-Lysアルケン型およびフルオロアルケン型ジベプチドイソスター含有SC29EKアナログの構造活性相関研究を行い、イソスター導入に伴う抗HIV活性およびα-ヘリックス構造の安定性について精査した。その結果、SC29EKに存在する4つのLys-Lysペプチド結合のアルケンまたはフルオロアルケンヘの置換は全ての場合において活性の低下を導くことが示唆された。また、CD測定による構造解析を行った結果、N末端またはC末端側にイソスターを有するアナログは、アルケンおよびフルオロアルケン両アナログともSC29EKと同様にα-ヘリックス構造を有していることが明らかになった。さらに、イソスター化学における新展開として新規アミノ酸等価体合成および新概念に基づくペプチド合成について研究を行った。D-Gulose誘導体を用いてアミノ酸等価体を合成し、α-ケト酸との開環反応を伴うBode ligationによりα-ケト酸前駆体へと誘導した。その後、α-ケト酸への変換について精査した結果α位不斉点のラセミ化を伴わない酸性条件での変換に成功した。ペプチドリード創薬において有用なペプチド結合等価体である含フッ素ジペプチドイソスターの立体選択的かつ大量合成が可能な合成ルートの開発を目的として、合成中間体であるフルオロアルケン型ジペプチドイソスターの新規合成法を開発した。具体的には、種々のアルデヒドから容易に誘導可能なアリルジフルオリドに対し、エタノール溶媒、触媒量のトリエチルアミン存在下、アリルパラジウムクロリドダイマー/1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン及びフェニルシランを作用させることで、脱フッ素化を伴いながらフルオロアルケン型イソスターが化学選択的に高収率で得られることを見出した。またフルオロアルケン型イソスターをケモカイン受容体CXCR4アンタゴニストである環状ペンタペプチドFC131に応用し、官能基を有するフルオロアルケン型イソスターの合成とペプチド固相合成法への適用を検証した。以前に報告したトランスメタル化を経由する還元/不斉アルキル化反応を鍵反応として、オルニチン-オルニチン型イソスターを合成、保護基変換の後、ペプチド固相合成法によりイソスター骨格をペンタペプチド誘導体に導入した。樹脂から保護ペプチド切り出した後、環化、脱保護反応、グアニド化を経てアルギニン-アルギニン型イソスターを含むFC131誘導体(FCN001)を合成した。さらに得られたFCN001及びFC131についてCXCR4アンタゴニスト活性を評価したところ、FCN001はFC131に比べ約1/20程度ではあるが、297nMのアンタゴニスト活性を示した。本年度の研究により、環状ペプチドにおいてフルオロアルケン型イソスターはペプチド結合等価体として有用であることが示唆された。