hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉緑体DNA分子系統樹に基づくサトイモ科アルム亜連の系統分類学的研究

アルム亜連各属(Eminiumを除く)の代表的植物12種から葉緑体DNAを抽出し、20酵素についてDNA切断断片の電気泳動を行った。これにOncidium excavatumから調整したプローブをサザンハイブリダイズし得られたバンドから切断断片のサイズを求めた。この結果を基にPAUPのワグナーパーシモニープログラムを用いて系統樹を描いた。またその信頼度をブートストラップ法により確かめた。この結果近縁度の低い部分については信頼度の高い関係が得られなかったが近縁度の高い部分については高い信頼度で二つの単系統群が認められた。これら二つの単系統群は邑田(1990)が地下茎のシュート構成に基づいて認めた群に対応しており、この結果を支持するものであった。この研究結果はすでに論文で発表した。さらに中国産のリュウキュウハンゲ属植物について新たにシュート構成や染色体数を調べたほか主要なハーバリウムの標本を用いて形態形質の検討を行いこれらの形質を分岐分類学的に解析して属間の系統関係を求めた。この結果従来のリュウキュウハンゲ属は単系統ではなく、以下の4群に分割する必要がある。第一は狭義のリュウキュウハンゲ属Typhoniumで、ほこ型の葉身、基本染色体数X=8および9、地下茎タイプDで特徴づけられ、Theliophonumと近縁と考えられる。第2は鳥脚状の葉身、雄花群の上の退化花、基本染色体数X=13、地下茎タイプC、で特徴づけられるもので命名上はHeterostalisに当る。第三はTyphonium hirsutumからなる単系群で植物体に毛が密生することで特徴づけられる。第四はTyphonium giganteumで、基本染色体数X=13、地下茎タイプBで特徴づけられBiarumおよびSauromatum属と同一とみるのが適当と考えられる。アルム亜連は系統的にArum,Dracunculus,Helicodicerous,Eminiumを含むヨーロッパ群とTyphonium,Sauromatum,Heterostalis,Theliophonum,Lazarumを含むアジア群に大別するのが妥当と考えられる。
K^+チャネル電位依存性制御の分子機構解明と電位依存性K^+チャネル開口薬の探索

本年度の研究実施計画では、「K^+チャネル電位依存性制御の分子機構解明」と「電位依存性K^+チャネル開口薬の探索」に主眼をおき、次の検討事項を掲げた。1.高効率薬物探索系における電位依存性K^+チャネル開口薬の探索2.電位センサー変異体による開口薬作用部位の同定1については、研究代表者が樹立した電位依存性Ca^<2+>活性化K^+チャネル定常発現細胞株を用いて開口薬の候補化合物を探索した。電気生理学的手技により解析した結果、脳内化学物質であるアナンダミドや樹脂酸誘導体がK^+チャネル開口作用を有することを明らかにすることができた(研究業績参照)。また、これまで分子実体が不明であったミトコンドリアCa^<2+>活性化K^+チャネルの分子実体の一部(mitoK_<Ca>-β1)を明らかにし、ミトコンドリア内膜においてmitoK_<Ca>-β1とシトクロムc酸化酵素が複合体を形成する可能性を示した(研究業績参照)。本研究では、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア呼吸の可視化解析や実験的虚血心筋細胞モデルによりK^+チャネル開口薬による心筋細胞保護作用の機構の一部も明らかにした。2については、遺伝子改変技術により電位依存性K^+チャネル、Kv1.1チャネルの点変異体を複数作成し、樹脂酸誘導体によるK^+チャネル開口作用や電位依存性制御の分子機構ついて検討した。その結果、樹脂酸誘導体による電位依存性制御に関与する部位をある程度同定することができた(学会発表済、投稿中)。最近では消化管間質細胞腫におけるK^+チャネル遺伝子発現解析を行い、電位依存性K^+チャネルが腫瘍増殖に関与している可能性を示した(研究業績参照)。当該年度において、新規電位依存性K^+チャネル開口薬の電位依存性K^+チャネル(Kv1.1-1.6、Kv4.2-4.3)に対する作用を検討し、電位依存性をはじめとする各種生物物理学的パラーメータに対する作用を電気生理学的手法により詳細に検討した(投稿中)。また、電位依存性K^+チャネルのうち早期不活性化K^+チャネルKv1.4の不活性化ポリペプチドを欠損した変異体を作成し、同様の検討をした。米国ネバダ大学生理学教室との共同研究により、早期不活性化K^+チャネル、Kv4.3チャネルのCaMキナーゼII(CaMKH)推定リン酸化部位の点変異体を作成し、薬理学的、電気生理学的手法によりKv4.3チャネルのCaMKIIリン酸化部位を同定するとともに、CaMKIIのKv4.3チャネル電位依存性、不活性化機構に及ぼす影響について検討した(研究業績参照)。名古屋大学大学院医学研究科中山助教授や米国カリフォルニア大学サンディエゴ校生物工学部のGiles教授との共同研究ではそれぞれ消化器ペースメーカー細胞や心筋繊維芽細胞に電位依存性K^+チャネルが機能発現することを見出した(研究業績参照)。
農業企業形態の転換に関する理論的実証的研究―日本と欧米との比較―

本研究は、日本の多様な農業経営体を企業形態論から類型化し、その類型間の転換メカニズムを分析することによって、今後の農業経営の主要な担い手の育成対策を検討することを第一の目的とした。すなわち家族農業経営体においても、世帯主の単独所有のもとでの家族協業である「個人経営」形態、家族の共同所有・協業労働・構成員間の平等な負債責任と収益配分権利をもつ「パートナーシップ共同経営」、および資本所有・経営管理・雇用労働力による作業労働体制が分離されている「会社経営」形態の諸形態があり、その異なる経営構造と発展論理を把握することによって今後の日本の家族農業経営の育成対策を検討した。第二に、家族農業経営以外の複数の農業者が組織する農業経営体を対象として、その「共同経営(営農集団)」形態と、「会社経営」形態の相互の経営構造の比較分析を行い、協同化、会社化の転換メカニズムを明らかにした。第三に、農業者のみならず農協や自治体、消費者団体が協同して組織化する第三セクター農業経営体の多角的な経営目的や経営事業を分析して、その経営体の経済論理を把握するとともに地域農業の組織化における機能と役割を明らかにした。第四に、農業経営体の法律的企業形態の変化と農地法等の法的規制の問題を検討した。家族農業経営においても農事組合法人、有限会杜、株式会社などの法人化が進んでおり、その法律形態の選択条件を分析して今後の農業法人育成のための法的政策的体系の整備の方向を検討した。第五に、1990年代後半に至って食品企業、商社、卸・仲卸業、外食企業、スーパーマーケット、生協などの消費者団体が経営規模の大きい農業生産法人と有機農産物・特別栽培農産物の契約栽培を核とするアグリフードチェーンを形成しており、それらの農外企業との連携による新しい農業経営体の設立を分析した。第六に、欧米などの先進国においても個人経営形態の家族農業経営(農家)の減少が著しく、一方で家族パートナーシップ共同経営や家族会社経営の増加が見られるなど、企業形態の選択・転換によっては家族農業経営の育成強化が可能であることを実証した。第七に、EUの農家家族の多様就業プルリアクティビティ論がこの10年間、CAP政策担当者によって主要な論議対象とされ、それは減少する農業所得を補充するための一つの有効な手段としてとらえられるとともに、非農家を含む農村住民の所得改善のために農村地域での多様就業機会の創出=「農村の多様産業化」を助成振興する政策として位置づけられつつある。そのような欧米の分析を通して家族農業経営における多様就業政策が今後の先進国の重要な農政課題であることを指摘した。日本と欧米の農業経営体の類型とその発展段階を比較検討するために、その類型化の理論的方法として企業形態論を応用開発した。そしてとくに家族農業経営における「個人経営]「パートナーシップ共同経営」「会社経営」の各類型が日本およびEUとアメリカにおいて展開している実態を統計的に把握分析した。また、その類型の経営構造の分析を行い、類型間の転換メカニズムを明らかにするために実態調査を行った。

また、農家以外の農業経営体の企業形態の展開を重視して、株式会社の農業参入の萌芽的進展を実態調査で把握し、その農地利用の構造と多角的経営事業の意義を分析した。山村における農業・農村社会の担い手の高齢者化と後継者不足の状況を解決する方策の一つとして、第三セクターの組織化が進んでいるが、行政と農協、林業事業体、個別農林家などが資金と労働力を集め地域の新たな担い手として多角的経営事業体を設立しつつある。その経営体内部の経営管理方式と地域資源の利用方式を統合化するコーディネイト力を評価した。農産物の世界的市場に巻き込まれた日本の農業経営体は直接国内の消費者の需要に対応するために多様なマーケティング・チャンネルを開発しつつある。まだ、国際的な品質管理の基準が策定され、それらに対応したアグリフードシステムの開発が重要となっている実態の国際的比較分析をおこない、研究代表者がその成果の一端をヨーロッパ農業経済学会のセミナーで招待講演をした。2000年センサスの概要が公表され、農家数の減少が一層進行していることが明らかになった。日本の農業経営の担い手として家族経営形態が中心ではあるが、その構造を見ると農業就業家族員が少なくなり、世帯の少子化とともに農業後継者の確保が出来なくなっており、農業従事者のいっそうの高齢化が強まっている。家族経営の構造的脆弱性は否定できないものであり、その構造改革が緊急の課題といえる。家族経営においても家族関係の近代化=パートナーシップ協定などの改革や、法人化が行われているところでは、経営の拡大や企業化などの発展がみられている。そこで、日本農業の経営主体として家族経営の企業形態的分析と家族経営以外の農業経営体の実態を分析して、現在の危機的な農業担い手不足を解消する方策を検討した。欧米などでも世帯主が農地などの生産手段を単独所有し、かつ経営の意志決定と管理を単独で行い、経営収支の配分を単独で行っている慣行的な「個人経営」では日本と同様に存続が困難になっている現実から、その企業形態的転換の必然性を実態分析によって行っている。また、2000年の農地法改正による株式会社の農業生産法人への参入緩和措置をふくめて、今後多様な農業企業形態の発展に対応する農政の変革課題を整理した。多様な家族農業経営の持続性と柔軟性の展開を企業形態類型と家族協業労働による農業専従経営類型によって主として統計的分析によっておこなった。また、類型別の事例研究によって家族経営構造の多様化を実証的にみた。その日本の農業経営の中心的担い手としての家族農業経営の底力には2つの展開論理が認められる。一つは従来からの農政や経営研究で軽視あるいは度外視されてきた高齢者農業専従経営や女性農業専従経営のサステイナビリティである。これは家計を充足する農家所得を実現するために夫の兼業所得を計算に入れた農業所得目標を設定する女性農業専従経営の経営論理と、年金を基盤所得として農業所得目標を設定している高齢者農業専従経営の論理が家族農業経営の展開において重要な位置を占めているという事実認識である。
遺伝性蓄積症の神経症状の発見機構に関する研究

遺伝性蓄積症には内蔵臓器にのみ蓄積する型と同時に神経症状を呈して死亡する型があり、ニーマンピック病も該当する型がある。後者についての治療法は現在までなく何故脳障害が発症するものとそうでないものがあるのかの機構は殆ど解明されていない。この成因が明らかとされることで神経症状を呈する蓄積症の治療法の糸口がつかめると考える。幸い私達はヒトニーマンピック病のモデル動物で肝脾腫と神経症状を呈して死亡するマウスを見出しており、肝・脾へのスフィンゴミエリンとコレステロールの著明な蓄積と酸性スフィンゴミエリネース活性の低下を明らかとした。このマウスの肝と脳の細胞分画での活性は、特にミトコンドリア・ライソゾーム分画で酸性スフィンゴミエリネース活性が著しく低下していた。又、電子顕微鏡による形態学的検討の結果、肝および脳ともにミトコンドリア・ライソゾーム分画で、ミトコンドリアとライソゾームの膨張、変形が著名であった。また最近、微量の組織や細胞を分析する手段として、細胞膜のみ破砕する窒素圧縮法が開発され、これを用いた細胞分画法が行われている。ヒトニーマンピック病A型とC型の皮膚腺維芽細胞およびニーマンピックマウスの皮膚腺維芽細胞と脾臓を用いて、ライソゾーム酵素の細胞内局在を調べて、培養神経細胞に応用すべく検討を加えた結果、この方法はライソゾーム蓄積症の病因解析に有用であり、組織細胞のライソゾーム酵素の分析や変動をよく反映するという成績を得た。今後、微量の神経組織やその培養細胞にも応用でき、神経症状発現の病態解明に役立つものと考えられた。次に神経症状発現に対する治療の可能性についてもニーマンピックマウスにDMSOを経口投与して研究を進めた。DMSOを投与したマウスでは寿命が延びたが、神経症状の発現は阻止出来なかった。神経症状を示すヒトの蓄積症の生化学的、組織学的な詳細な検討とその発現機構についての研究は制約が大きい。ニーマンピック病の神経症状発現の研究も、同一条件下で同一疾患の再検討を行うのは困難である。しかしニーマンピック病のモデルマウスを用いることで、その成因を探ることが可能である。従来このマウスは、発症時期と残存酵素活性から、ヒトニーマンピック病C型に該当すると考えていた。しかし今回、肝および脳のライソゾーム画分での酸性sphingomyelinose(SMase)の著明な活性低下から、むしろA型の遅発型の可能性が強い。従来ニーマンピックマウスの全脳を用いた酸性SMase活性および蓄積脂質分析の結果では、正常対照との差は顕著でなく、その神経症状の発現の機構は不明であった。細胞分画法を用いた脳の細分画画分のSMase,その他の酸性水解酵素および蓄積脂質を測定したところ、脳のミトコンドリア・ライソゾーム分画での酸性SMaseが著しく低下し、SMaseや他の酸性水解酵素活性がニーマンピックマウスのmyeline membrane fragmentで高く、同時に蓄積脂質の増加を認めた。しかし他の酸性水解酵素とSMase活性との比でみると、ニーマンピックマウスのSMase活性は著明に低下していた。また肝のミトコンドリア・ライソゾーム分画,脳のミトコンドリア・ライソゾーム分画の電顕像で、膨張・変形したミトコンドリアおよびライソゾームとmembrane cytoplasmicbodyを認めた。

これらの結果は、本症では膜の保持や形態維持が損われて膜が脆弱となり、容易に壊されてライソゾームに蓄積した脂質や酵素が逸脱したために生じている可能性が強く、脳におけるミトコンドリア・ライソゾーム分画での酸性SMase活性低下が神経症状の発現にも強く関係していることが示唆された。遺伝性蓄積症には内臓臓器にのみ蓄積する型と同時に神経症状を呈して死亡する型があり,ニーマンピック病もこれに該当する型がある.後者についての治療法は現在までなく何故脳障害が発症するものとそうでないものがあるのかの機構は殆んど解明されていない.この成因が明らかとされることで神経症状を呈する蓄積症の治療法の糸口がつかめると考える.幸い私達はヒトニーマンピック病のモデル動物で肝脾腫と神経症状を呈して死亡するマウスを見出しており,肝・脾へのスフィンゴミエリンとコレステロールの著明な蓄積と酸性スフィンゴミエリネース活性の低下を明らかとした.このマウスの肝と脳の細胞分画での活性は,特にミトコンドリア・ライソゾーム分画で酸性スフィンゴミエリネース活性が著しく低下していた.又,電子顕微鏡による形態学的検討の結果,肝および脳ともにミトコンドリア・ライソゾーム分画で,ミトコンドリアとライソゾームの膨張,変形が著明であった.以上の結果から,本症では酸性スフィンゴミエリネース活性の低下により,膜構成に重要なスフィンゴミエリンとコレステロールの代謝が障害され,膜の保持や形態維持が損われたものと考えられた.この減少は生体内に於ても同様に生じており,脳におけるミトコンドリア・ライソゾーム分画での酸性スフィンゴミエリネース活性の低下が神経症状の発現に強く関係しているのではないかと考えられた.得られた酸性スフィンゴミエリネースの精製を行い,抗体作製を試みた.得られた家兎抗血清はオクタロニー法及びwestem blotting法でヒト胎盤およびマウス肝の酸性スフィンゴミエリネースと交叉反応を示したが,試験管内での免疫沈澱物は得られなかった.中枢神経症状を伴うニーマンピック病は、ヒトでは発生頻度が低く、その神経症状発現機構の解明は容易ではない。またヒトでは新鮮な組織を用いた研究は不可能で、一般には皮膚線維芽細胞を用いた研究が行われる。しかし皮膚線維芽細胞が脳神経細胞の機能を正しく反映するとは限らず、生体内での動態を調べるにはニーマンピックマウスを用いて神経症状発現の機構を探ることで、ヒトの神経症状発現機構についても検討する事が可能と考える。最近、微量の組織や細胞を分析する手段として、細胞膜のみを破砕する窒素圧縮法が開発され、これを用いた細胞分画法が行われる様になった。今年度、この窒素圧縮法とパーコール濃度勾配法により、ヒトニーマンピック病A型とC型の皮膚線維芽細胞およびニーマンピックマウスの皮膚線維芽細胞と脾臓を用いて、ラインゾーム酵素の細胞内局在を調べて、培養神経細胞に応用すべく検討を加えた。その結果、この方法はラインゾーム蓄積症の病因解析に有用であり、組織細胞のラインゾーム酵素の分布や変動をよく反映するという成績を得た。今後、微量の神経組織やその培養細胞にも応用でき、神経症状発現の病態解明に役立つものと考えられた。次に、神経症状発現に対する治療の可能性についても研究を進めた。ニーマンピック病C型の皮膚線維芽細胞にDMSOを添加して、残存酵素活性の上昇を認める報告があるので、追試した所、上昇傾向を認めた。そこでニーマンピックマウスにDMSOを経口投与して治療を試みた。従来の骨髄移植療法では、罹患マウスの寿命に対する効果はなかったが、DMSOを投与したマウスでは寿命が延びた。しかし骨髄移植療法とは違って、マウスの肝・脾の酸性スフィンゴミエリネース活性の上昇は認めなかった。
ヒトゲノムのコピー数変異における配列多様性の解明

ヒトゲノムのコピー数変異(CNV)は、ゲノム配列が重複・欠失することで配列の多様性を与える変異であり、薬剤代謝酵素などの重要な遺伝子の発現量や、様々な疾患のリスクに関係していることが知られている。本研究では配列の違いも含めたCNVの多様性解明を目指し、シークエンス技術やマイクロアレイのデータを用いてCNV同定手法の開発を行った。今年度は、主に短鎖型シークエンスデータのバイアス補正手法とコピー数定量手法、および配列差の推定手法の開発を行うことを計画していた。まず、従来のCNV同定アルゴリズムを改良し、ゲノム配列のGC含量と集団データのトレンドに基づくコピー数予測の手法を開発した。国際リファレンスゲノムに含まれない新規配列を検出する研究において、本手法を用いたコピー数定量解析を行い、論文投稿を行った。また、GC含量以外の情報を含めたリード定量のバイアスを補正するため、シークエンスリードの周辺配列を入力としたバイアス予測手法を開発した。この方法は集団データを利用しないため、変異の境界が一定でない領域や低頻度のCNV検出への活用が見込まれる。今後CNVの多様性が形質に与える影響を調べる上で、形質の関連解析のために多数のサンプルの遺伝子型を同定できることが重要である。そこでSNPアレイを用いたCNV推定アルゴリズムの開発も行った。特に、長い重複変異のインピュテーションが難しいことが明らかになったが、インピュテーションとジェノタイピング手法を相補的に用いる新規手法を提案し、復元精度が大きく改善することを示すことができた。また、提案手法の有効性を検証した結果について、国際学会での発表を行った。本研究の結果、より正確な配列の解読、コピー数定量、および未観測の遺伝子型の推定を可能にする成果が得られた。本研究の目的は、ヒトゲノムに存在するコピー数変異(CNV)の多様性を配列レベルで解明することである。二倍体のゲノムは通常相同なゲノム配列を2コピーずつ持つが、CNV領域ではコピー数が増減する。CNVは全ゲノムの約5-10%に存在すると見積もられており、個人差や精神疾患などの形質に大きく寄与していることが知られている。従来の解析ではアレイCGHやSNPアレイによるコピー数推定が行われてきたが、配列の違いを区別することは難しい。CNVを配列レベルで解析することは、形質への影響や変異メカニズムを理解する上で重要である。そこで、本研究では短鎖型・長鎖型のシークエンス技術による配列情報を用いることで、CNVの塩基配列を特徴づける方法を開発する。初年度には、長鎖型シークエンスデータによる正解配列の構築を行った。特に、ヒトゲノムで多様性が高く、コピー数変異の存在するHLA遺伝子に着目し、208検体の日本人サンプルを用いてHLA-A, HLA-B, HLA-CおよびHLA-H遺伝子の配列データベースを構築した。その際、既存のPacBio社のアセンブリ・パイプライン(SMRT Analysis)を発展させた形で、長鎖型・短鎖型双方のシークエンスデータを用いる新規の計算機手法(PSARP)を開発し、高品質な配列の復元に成功した。また、短鎖型のシークエンスデータを用いたCNV同定手法開発のため、多層の畳み込みニューラルネットワークを用いたモデル構築とTensorFlowによるプログラム実装を行い、特徴的な配列モチーフの検出に必要な準備を行った。本年度は、ヒトゲノムに存在するコピー数変異(CNV)の多様性を配列レベルで解明する研究課題に向け、長鎖型シークエンサによる正解データの構築、および構築のための情報解析手法の開発を行い、計画通りに進行した。また、実施計画通りにGPUを搭載したデスクトップ型のマシンを導入し、次年度で行う開発の環境構築と予備解析を行った。今年度は、主に長鎖型シークエンサによる正解データ構築のための技術開発と、HLA領域での正解配列の構築を行った。

次年度は短鎖型シークエンサを用いたCNVの定量と配列解析のアルゴリズムを開発し、性能評価を行う予定である。また、長鎖型シークエンサによる正解配列をより広いゲノム領域に渡って作成し、配列復元の評価に用いることも検討する方針である。
ウサギ咽頭筋および口蓋筋支配運動神経細胞の中枢局在および軸索末梢経路

1.ウサギ咽頭収縮筋を構成する上咽頭収縮筋、中咽頭収縮筋、あるいは甲状咽頭筋や輪状咽頭筋にHorse-radish peroxidase(HRP)またはNuclear yellow(NY)を注入し、これら各筋の運動神経細胞の疑核内局在を検討した。ウサギ疑核は、吻側半の高さで細胞の密集するCompact cell group(CoG)、その外側と内側にそれぞれ散在するLateral and Medial scattered cell groups(SGIとSGm)、および尾側2/3の高さで細胞が散在するDiffusecell group(DiG)の4細胞群よりなる。咽頭収縮筋運動神経細胞はobexの吻側0.5-2.9mmでCoGの背内側部に見られ、obexの吻側1.2-2.9mmのCoGの腹外側部を占める食道筋支配運動神経細胞とは明瞭な分離を示した。上咽頭収縮筋、中咽頭収縮筋、甲状咽頭筋、および輪状咽頭筋の各運動神経細胞は位置的に大きく重複するものの、上記領域内でこの順に勿尾方向に配列する傾向を示した。2.ウサギ口蓋帆張筋にHRPを注入した。同筋運動神経細胞はobexの吻側6.0-8.5mmで三叉神経運動核の吻側の2/3の高さにあり、同核の背外側亜核の腹内側で、腹内側亜核の腹側に存在した。3.ウサギ軟口蓋にHRPを注入し、口蓋筋運動神経細胞の疑核内局在を調べた。運動神経細胞はobexとその吻側1.9mmのCoGにあり、咽頭収縮筋運動神経細胞存在域とは一部重複するもののその尾側につづく細胞群を構成し、食道筋運動神経細胞存在域とは明瞭に分離した。口蓋筋のうち口蓋咽頭筋運動神経細胞は上記の口蓋筋支配域でobexの吻側0.5-1.9mmに存在した。4.神経へのHRP注入、あるいは当該神経のみを残した口蓋-咽頭筋や迷走神経下神経節へのHRP注入により、舌咽神経、迷走神経各枝、および副神経延髄根の各起始細胞の疑核内局在を検討した。その結果、疑核の咽頭収縮筋および軟口蓋筋支配域は迷走神経咽頭枝起始細胞により占められ、さらにごく少数の上喉頭神経起始細胞が咽頭収縮筋支配域に含まれることが明らかになった。雄性家ウサギを用い、咽頭収縮筋を構成する上咽頭収縮筋、中咽頭収縮筋、あるいは下咽頭収縮筋である甲状咽頭筋や輪状咽頭筋にHorseradish peroxidase(HRP)またはNuclear yellow(NY)を注入して、これら各筋の運動神経細胞の疑核内局在を検討した。注入にはマイクロシリンジを用いた。注入後、2448時間動物を生存させて後、潅流固定を行い、ついでHRP注入例については、テトラメチルベンチジンを用いて運動神経細胞を標識せしめた。標識細胞の検索には光学顕微鏡を用いた。NY注入例については、螢光顕微鏡を用いて螢光標識細胞を観察した。

ウサギ疑核は、吻側半の高さで細胞が密集するCompact cell group(CoG)、その内方および外方にそれぞれ散在するMedial and Lateral scattered cell group(SGmとSG1)、および尾側2/3の高さで細胞が散在するDiffuse cell group(DiG)の4細胞群よりなる。咽頭収縮筋運動神経細胞は同側性に存在し、ウサギ疑核の4亜核中のCoGに存在した。同筋運動神経細胞は、obexの吻側500ー2900μmにわたるCoGのほぼ全長で、CoGの背側よりにみとめられた。CoGの腹側部にはobexの吻側1200ー1900μmにかけて食道筋運動神経細胞が密集するが、咽頭収縮筋運動神経細胞はこれとは明瞭に分離し、細胞の密集度はこれより小さい。上咽頭収縮筋、中咽頭収縮筋、甲状咽頭筋、および輪状咽頭筋の各運動神経細胞は、それぞれobexの吻側1100ー2900,850ー2900,550ー2500,500ー2400μmに存在し、位置的に大きく重複するものの、この順に吻側から尾側に配列する傾向を示した。また、頭蓋腔内で迷走神経根を切断の後、全ての咽頭収縮筋にHRPを注入した例では、標識細胞は出現しなかった。すなわち、咽頭収縮筋運動神経細胞の軸索は迷走神経根を経由することが示唆された。1.雌性家ウサギを用い、一側の迷走神経根を頭蓋腔内で切断の後、両側の全ての咽頭収縮筋にHRPを注入した。注入にはマイクロシリンジを用いた。注入後2448時間動物を生存させた後、潅流固定を行い、テトラメチルベルチジンを用いてHRP標識細胞を検出した。神経根切断側では標識細胞はみとめられず、咽頭収縮筋運動神経細胞の軸索が迷走神経根を経由することが示された。2.ウサギ口蓋物張筋運動神経細胞の中枢局在を検索すべく、口蓋物張筋にHRPを注入した。注入後の操作は1と同じである。標識細胞はohexの吻側6.08.5mmで三又神経運動核の吻側2/3に出現した。運動核内での出現位置は同核の最腹側部の内側領域で、松田の分類(広大歯誌、1979)による背外側亜核(咬筋、側頭筋および内側翼究筋を支配)の腹内方、かつ腹内側亜核(顎二腹筋前腹や顎舌骨筋を支配)の腹方、すなわち外側翼究筋支配領域に散在性に存在した。標識細胞数の平均は50個であった。切片(60Mm)毎の標識細胞数は111個で、吻尾方向での細胞数の分布に明瞭なピ-クは見られなかった。核小体のみとめられる細胞体に最大限に内接する楕円体の長径と短径の和の1/2で表わした標識細胞の大きさは23.8±3.1Mm(長径29.1±5.2,短径18.9±2.9)で、単峰性の分布を示した。細胞の大きさは背外側亜核の細胞と比べて小さく、外側翼究筋領域や腹内側亜核の細胞とほぼ同じであった。1.雄性家ウサギを用い、5μ1のHorseradish peroxidase(HRP)生理食塩水溶液をマイクロシリンジを用いて経口的に軟口蓋に注入した。注入後2448時間動物を生存させた後、潅流固定を行い、テトラメチルベンジンを用いてHRP標識細胞を検出した。HRP標識細胞はobexとその吻側1.9mmの間の高さにみとめられ、尾形らの区分(歯基礎誌,29:652-663,1987)による疑核のCompact cell group(CoG)で、食道筋運動神経細胞の存在するventromedial subgrpup(北村ら,解剖誌,66,412,1991)とは明瞭な分離を示した。一方、咽頭収縮筋運動神経細胞の存在するdorsomedial subgroup(Anat.Rec.,229:399-406,1991)とは一部重複し、最吻側の高さでは同subgroupの腹内側部に出現するが、しだいにこのsubgroupを侵蝕し、やがてこれに置き換わるようになる。細胞数は157-196で、obexの吻側0.5-1.6mmで多い。
微小重力場の点火メカニズム解明による宇宙環境における火災安全性向上

本研究は,通常重力環境(1g)と微小重力環境(μg)において可燃性混合気の点火実験を行い,点火現象に及ぼす重力の影響を調査するものである.これまで,航空機による微小重力実験により,μgでは最小点火エネルギー(MIE)が低下することを明らかにした.また,火炎核が成長する過程において,特に燃料希薄混合気の場合,1gでは火炎核下部が浮力の影響により消炎する傾向を確認した.航空機実験は実験回数に限りがあるため,これまでの実験結果では重力影響を定量的に評価することが難しい.そこで本年度は簡易落下塔を構築し,それを用いて微小重力点火実験を行った.静止混合気の点火実験では,これまでに得た実験結果と同様,μgではMIEが低下することが明らかとなった.その低下量は,燃料が希薄になるほど増加する傾向にあった.これは,燃料が希薄になるにつれて燃焼速度が低下するため,μgにおける浮力抑制の影響が相対的に大きくなるためだと推察される.流動混合気の点火実験では,MIEが流速に大きく依存することが明らかとなった.50cm/s以下の低流速では,流速の増加と伴にMIEは低下したが,それ以上に流速を増加させると流速に比例してMIEは増加した.これは,重力レベルに依らず,1gとμgの両方で確認された.低流速では,火炎核に未燃の混合気が供給されるため,燃焼が促進されMIEが低下したと考えられる.一方で,流速の増加は火炎核から周囲への熱損失の増加と等価であるため,ある流速以上では未燃混合気の供給効果よりも熱損失の影響が勝り,MIEが増加したと推察される.以上,本年度は落下塔を用いて静止混合気と流動混合気の微小重力点火実験を行い,上記に述べた結果が得られた.今後は,数値解析やスケール解析などにより,実験では特定することが困難な物理量を評価し,重力そして流動の影響をより詳細に調査,解明する.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
細胞膜の水透過性に及ぼすアクアポリンの消失と葉菜類の貯蔵性に関する研究

水分損失の原困である気孔蒸散やクチクラ蒸散は外部環境以外にも植物体内の水の動的状態や生体膜の状態が深く関わる。植物体内においては細胞膜や液胞膜が水移動の抵抗として果たす役割が大きいので、生体膜の水透過性を制御することができれば水移動を減速させ、蒸散を抑制することができると考えられる。ここで、細胞膜の水透過には水チャネルタンパク質が大きく寄与しているが、水チャネル(アクアポリン)は環境ストレスに応答する。従って、適切な環境ストレスを与えることにより水チャネルを減少させ、細胞膜水透過性を低下させることで蒸散の抑制が可能であると考えられる。そこで、18°Cで28日間養液栽培されたホウレンソウを使用して、収穫初期の低温が細胞膜水透過性及び貯蔵性に及ぼす影響について検討した。貯蔵期間を96時間とし、低温区では、初期の24時間を低温(2°C)とし、その後20°Cで貯蔵した。低温暴露の24時間は、ホウレンソウの代表的なアクアポリンであるPM28Aが収穫後12日で半減するという本研究結果を基に決定した。また、対照区として20°C一定温度による貯蔵を行った。低温区の試料の浸透水透過係数は24時間後に対照区よりも低い値を示した。また、目減り(初期質量の減少割合:水分損失)は低温区において抑制されており、その時点における目減りの差が貯蔵終期まで維持された。これは、低温区においてアクアポリンが速やかに減少し、その結果、浸透水透過係数が低く抑えられたことによると推察される。以上、本研究により、初期の低温ストレスがアクアポリン発現量の減少に寄与し、代表的な葉菜であるホウレンソウの細胞膜水透過性を低く抑えることが示され、低温処理による貯蔵性の向上が期待される結果を得た。ホウレンソウ葉部の浸透細胞膜水透過係数L_pを測定し、貯蔵中の経時変化を明らかにした。水透過係数の測定には、葉細胞から単離したプロトプラスト内外に浸透圧差を与えたときのプロトプラスト体積変化を利用した直接測定を用いた。直接測定では、プロトプラスト外溶液の浸透圧を瞬時に変化させることが測定法の前提条件である。そこで、マイクロチャンネル内にプロトプラストをトラップし、そこに浸透圧の異なる溶液を2層流として流し、液流量の制御により両液の境界面を瞬時に移動させる方法を考案し(2層流法)、これを用いた。研究室内で養液栽培したホウレンソウ(メガトン,タキイ種苗)を収穫後、2°C及び20°Cで保存し、1日ごとに細胞膜水透過係数L_pを測定して、経時変化を求めた。その結果、2°Cで保存したホウレンソウのL_pは1.5x10^<-13>m s^<-1>Pa^<-1>程度で保存中に大きな変化を示さなかった。一方、20°C保存の場合は、収穫直後に1.5x10^<-13>m s^<-1>Pa^<-1>程度であったL_pが5日後には3.5x10^<-13>m s^<-1>Pa^<-1>を超える値まで増大した。L_pが増大する原因には水チャネルの発現量の増加に伴う水輸送活性の促進、または、リン脂質二重膜のパッキングが不完全となって生じる細胞内水の漏出が挙げられる。実験に用いたホウレンソウに関して、水チャネルの一つであるPM28AのmRNA生成量が、収穫されてから1日後に収穫直後の約50%に減少したことが認められたので、20°C保存におけるL_pの増加は、主にリン脂質二重膜の劣化の進行によるものと考えられる。
熱ショックタンパク質等を用いたモノクローナル抗体の効率的生産

超好熱始原菌のシャペロニンのうち、βサブユニットは特に蛋白質に対する親和性が高く、蛋白質をリフォールドするとき重要な役割を果たすと考えられる。我々はPyrococcus sp.KOD1株のβサブユニットに相当する遺伝子cpkBを大腸菌で発現、精製し、その機能を検討した。酵母のアルコール脱水素酵素(ADH)の熱処理による活性の消失をCpkBを添加することで防いだ結果が得られた。さらに興味深いことにCpkBは標的となる酵素に対して高濃度で作用させると、ATPは必ずしも必要ではなかった。次に、CpkBが不溶性顆粒(inclusion body)を可溶化する効果について調べた。大腸菌を宿主にして物質生産を行なう場合、過剰合成された蛋白質は不溶性顆粒を形成し、沈殿することがある。このことは大腸菌で外来の蛋白質を大量に生産するときに直面する大きな問題のひとつとなっている。CpkBを併せて発現させたところ、不溶性顆粒低減に非常に効果的であることが解った。この可溶化効果はアミラーゼのような細菌型蛋白質から抗体のような真核生物特有のものに至るまで幅広く認められた。目的細胞内(in vivo)タンパク質フォールディングに関与するタンパク質因子の具体的な役割の解析を行う。次いで、フォールディングに関与する各因子の相互関係を解明すること、また得られた知見をもとにして、遺伝子組換え法により生産された産物の効率的な試験管内、および細胞内巻き戻し法を確立することを目的とした。タンパク質の材料として、マウスハイブリドーマ細胞由来のモノクローナル抗体タンパク質を大腸菌内で高発現させることによって生ずるインクルージョンボディーを設定し、フォールディングに関わる因子として、耐熱性及び耐化学薬品性に優れた好熱菌(Bacillus stearothermophilus)由来のHSP,PPIase,PDIを解析に用いる点で特徴を有している。【1】各種因子の性格づけBacillus stearothermophilus由来の耐熱性ペプチジルプロシルシス-トランスイソメラーゼ(PPIase)遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。また、フォールディングに関与するタンパク質(Dnak,GroES,GroEL,PPIase,PDI)を遺伝子組換え体等を用いて精製した。耐熱性を含む諸特性について解析した結果、酵母由来の、アルコールデヒドロゲナーゼのフォールディングに寄与し、混合状態で同酵素の熱安定性向上に寄与することが解った。特に、GroELにおいて良好な効果が認められた。【2】細胞内における組換え遺伝子産物のフォールディング細胞内における遺伝子産物のフォールディングについて解析した。モノクローナル抗体遺伝子と、HSP遺伝子を同時に大量発現させる系を、T7RNAポリメラーゼ遺伝子発現系にの基づいて構築した。Dnakと抗体タンパク質の同時発現により、インクルージョンボディーの細胞内での巻き戻しが促進されて、可溶性画分に回収される抗体タンパク質量が増加した。可溶性画分からの抗体は、正しくフォールディングしており、同時発現の有効性が示された。(1)各種タンパク質因子の遺伝子クローニング及び組み換えタンパク質の解析好熱菌Bacillus stearothermophilus由来の、GroES,GroEL,PPlase、超好熱菌ゆらい、熱ショックタンパク質などの遺伝子について、クローニングと塩基配列決定を終了した。大腸菌を宿主とした大量発現を行った結果、フォールディングに関わるタンパク質は大腸菌にとって異種タンパク質であるにも拘わらず、細胞内で安定に、そして大量に発現しており抗体タンパク質の場合のようにインクルージョンボディー(不溶性顆粒)を形成することは無かった。このことは、これら、フォールディングに関わるタンパク質は自らの巻き戻しにおいてもポジティブな役割を演じているのではないかと考えられた。(2)抗体タンパク質とシャペロンタンパク質の同時発現抗体タンパク質とGroESLタンパク質の細胞内同時発現を行った。その結果、不溶性顆粒の出現を抑えることができ、単独発現の場合とは明らかに異なる画分から回収できた。シャペロンなどのタンパク質によりin vivo巻き戻しを促進することは、可能であると考えられた。(3)超好熱菌熱ショックタンパク質と異種タンパク質の同時発現我々が独自に分離した超好熱菌Pyrococcus KODl株由来の熱ショックタンパク質の遺伝子クローニングによりアミノ酸配列が明らかとなり、相同性検索により、真核生物型であることが示された。

同タンパク質は、非常に高い熱安定性を示し、単独で効果を示すことが解った。そこで、抗体等の異種タンパク質との同時発現を試みた。その結果、一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)の場合、可溶性画分から取得できる目的タンパク質の顕著な増加が認められた。
中・近世における寝殿造理解の研究－源氏物語に示された住宅観と後世の考証研究－

今年度は、『源氏物語』に登場する儀式や遊興が、後の時代にどのように継承され、変容したかを明らかにすることを目的に、『源氏物語』の次世代にあたる11世紀、藤原頼通時代の皇后や内親王を主催者とする歌合に着目した。歌合は、天皇・后・内親王を主催者とし、貴族と女房が和歌の優劣を競い合った平安時代の催しであり、『源氏物語』には絵合として登場する。まず、平安時代の歌合の全記録のうち、『類聚歌合』『栄花物語』『袋草紙』などの文献により、会場の記録が現存する全12回の歌合の空間を検討した。結果、『源氏物語』が参照した天徳内裏歌合(960年)では、清涼殿西廟に女房、渡殿に公卿、賓子に殿上人が左右対称に分かれて着座したが、11世紀前半の頼通時代になると、多様な展開がみられる。1056年(天喜4年)皇后宮寛子春秋歌合では、里内裏一条院に、女房が南廟(春5人・秋5人)と東廟(春5人・秋5人)に分かれて座り、大臣は南渡殿、大臣以下公卿は東渡殿に座り、女房が打出した装束を鑑賞し、殿上人は賓子に座るなどの、空間構成が明らかとなった。今後は、さらに11世紀における後冷泉朝の裳着、算賀などの通過儀礼の空間を検討し、『源氏物語』に示された住宅観、さらに後世における変容過程とその要因を明らかにしていきたい。いっぽう、前年度に検討した19世紀に制作された『源氏物語』住宅考証書について、日本文学・服飾史の研究者と翻刻・公開しだ。17世紀に描かれた「うつほ物語絵巻」(国文学研究資料館蔵・九州大学図書館蔵)の住空間表現については、同時代的な数寄屋風書院造の表現の混在を指摘し、論文にまとめた。また、2011年6月7月ライデン国立民族学博物館、2011年9月2012年3月コロンビア大学東アジア言語文化学部にVisiting Scholarとして滞在し、『源氏物語』関連史料調査を推進した。特別研究員辞退の為記載なし特別研究員辞退の為記載なし本研究は、古代から近世までの上流階級が理想とし「寝殿造」と定義した古代住宅像の実態とその変容過程を、古代貴族文化の象徴・規範として読み継がれた『源氏物語』とその注釈書、絵画史料等から総合して明らかにする。第1に、19世紀の有職故実家が、寝殿造をいかに学習したのかを視点に、『源氏物語』に関わる住宅考証書の探索・調査を推進した。とりわけ、江戸在住の国学者・松岡行義の資料に着目し、行義が寛政度内裏復古造営に関与した裏松固禅の『大内裏図考証』『院宮及私第図』を根拠に、『源語図抄』(宮内庁書陵部蔵)・『源氏類聚抄』(宮内庁書陵部蔵)を制作し、それが『源語図集』(川越市立図書館蔵)・『源氏物語考証釈図』(国会図書館蔵)へと派生し、明治期における国文学研究へと継承された過程を明らかにした(日本建築学会計画系論文集、651号)。第2に、近世を通じて『源氏物語』の有職故実書として規範にされた、14世紀『河海抄』15世紀『花鳥余情』に示された寝殿造理解の水準を検討した。『河海抄』は物語中の住宅・しつらい等を歴史資料と照合した。『花鳥余情』は具体的な復原を試みたが、同時代の建築的理解に基づき、寝殿の西側を指す空間を西対の南側と理解している。また、源氏の邸宅・六条院がいかに作図化されたかを視点に、15世紀『源氏物語人々居所』(東海大学桃園文庫蔵)及び17世紀『十帖源氏』に着目した。両者は、寝殿と対からなる構成を理解できていないために、記述を図面に落とす際に、矛盾が生じている(『源氏絵集成』)。第1と第2より、『源氏物語』を通した寝殿造に対する理解は、18・19世紀における裏松固禅が関与した寛政度内裏復古造営が転換期となったが、17世紀以前においても考証が試みられたことを明らかにした。さらに次年度に向けて、『源氏物語』『枕草子』『栄華物語』『宇津保物語』中の建築の記述をデータ化し、研究の基礎史料とした。1056年(天喜4年)皇后宮寛子

春秋歌合では、里内裏一条院に、女房が南廟(春5人・秋5人)と東廟(春5人・秋5人)に分かれて座り、大臣は南渡殿、大臣以下公卿は東渡殿に座り、女房が打出した装束を鑑賞し、殿上人は賓子に座るなどの、空間構成が明らかとなった。今後は、さらに11世紀における後冷泉朝の裳着、算賀などの通過儀礼の空間を検討し、『源氏物語』に示された住宅観、さらに後世における変容過程とその要因を明らかにしていきたい。いっぽう、前年度に検討した19世紀に制作された『源氏物語』住宅考証書について、日本文学・服飾史の研究者と翻刻・公開しだ。17世紀に描かれた「うつほ物語絵巻」(国文学研究資料館蔵・九州大学図書館蔵)の住空間表現については、同時代的な数寄屋風書院造の表現の混在を指摘し、論文にまとめた。また、2011年6月7月ライデン国立民族学博物館、2011年9月2012年3月コロンビア大学東アジア言語文化学部にVisiting Scholarとして滞在し、『源氏物語』関連史料調査を推進した。特別研究員辞退の為記載なし特別研究員辞退の為記載なし
生体内ＦＲＥＴ計測によるドラッグデリバリーシステムの系統的動態評価

核酸内包薬物送達システム(Drug Delivery System; DDS)開発では、細胞外環境における高い安定性と標的細胞内における効率的な核酸分子の放出という二律背反的な性能が要求される。本研究では生体内における蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)計測を行った。DDSの血中安定性、組織移行性、細胞内安定性、核酸放出といった評価法を確立した。核酸内包DDSは血液中に豊富に存在する分解酵素から核酸を守り、安定に血中に滞留し、標的組織へ集積することが求められる。本研究ではin vivoでFRETを計測することにより、核酸の局在だけでなく凝縮・脱凝縮状態を観察・定量する。これにより今までに得られなかった生体内でのDDSの動態・状態に関する知見をDDSデザインに反映させることが可能となる。平成23年度は高速in vivo FRETを用いた核酸内包DDSの血中安定性・組織移行性の検討を行った。まず生体顕微鏡に単純な光学ミラーを数枚追加して最大4つの蛍光分離を可能にした。プラスミドDNAおよびsiRNAのFRET蛍光ペアの最適化を経て、血流などの速い動きでもFRET測定が可能であることを確認した。ひき続いて蛍光強度の比をFRETの指標として血中における核酸の凝縮状態を測定している。平成24年度はsiRNAを2色の蛍光色素で標識し、32チャンネルスペクトル検出器を用いて蛍光スペクトルを検出した。蛍光スペクトル画像に演算処理を行い、FRETペアの蛍光を分離し、生きたマウスの血中・組織・細胞内におけるsiRNAの分解について評価した。siRNA送達ナノキャリアを数種類比較検討し、血中におけるsiRNAの分解(または安定性)、組織移行、腎糸球体濾過、尿細管における再吸収、再吸収後のsiRNAの分解(または安定性)について評価した。現在論文を執筆中である。本研究ではin vivoでFRETを計測することにより、拡散の局在だけで無く凝縮・脱凝縮状態を観察・定量した。siRNA送達ナノキャリアを数種類比較検討し、血中におけるsiRNAの分解(または安定性)、組織移行、腎糸球体濾過、尿細管による再吸収、再吸収後のsiRNAの分解(または安定性)について評価した。平成25年度は特に腫瘍集積、腫瘍細胞への取込、内包siRNAの放出について評価した。初年度は高速in vivoFRETを用いた核酸内包DDSの血中安定性・組織移行性の検討を行った。これまでのプラスミドDNA(pDNA)を用いた実績を踏まえ、当初はFluorescein標識siRNAとCy3標識siRNAを混ぜた上でDDSに内包させ同様の検出を行った。しかしながら蛍光強度が低く検出困難な事例が多発したため、Fluorescein/Cy3ペア、Cy3-Rhodamineペア、Cy3-Cy5ペア、Alexa488/Alexa547ペアなどを次々と検証した結果、in vivo用のFRETペアとして最終的にAlexa488/Alexa547ペアを、Donor:Acceptorの標識比率を1:1で使用すると比較的良い結果が得られることが判明した。このようにして血流などの速い動きでもFRET測定が可能であることを確認した。おおむね順調に進展している。平成24年度ではsiRNA内包DDSの生体内分布だけでなく、siRNAが安定に存在しているのか既に分解されているのかを弁別できる新しいDDS評価方法を開発するに至った。平成25年度はこの評価手法を応用し、さらに他種類のDDS評価に応用するとともに、観察対象とする部位を血管、腎臓、肝臓、皮下腫瘍などに拡げる。核酸内包DDSは、標的細胞内における効率的な核酸分子の放出が求められる。つまり細胞室内でのsiRNA放出、核内でのpDNA放出である。

細胞内・核内の評価を行うためには、GFPなどの蛍光タンパク質あるいはヘキストなどの試薬を用いて細胞や核を蛍光標識しなければならない。すなわちFRETペアに用いた2種類の蛍光標識以外に、他の蛍光が追加される。生体顕微鏡では最大4チャンネルの多色蛍光イメージングが可能だが、前述の如く単純な光学ミラーで分光するため各チャンネル間の漏れこみが問題となる。それぞれの蛍光を正確に分離するため、32チャンネルスペクトル検出器を用いる。演算処理によって細胞・核・FRETペアに用いた蛍光を分離し、生きたマウスの細胞内・核内における核酸の凝縮・脱凝縮を評価する。顕微鏡周囲の物品(マウス固定器具・ガラス器具・レンズ・パソコン・ストレージなど)を購入する。生体顕微鏡における長時間撮影では得られるデータ量は膨大になる。具体的には6ヶ月の実験で4TBのハードディスクが埋まるため、その都度データストレージを増設する。Dorsal Skinfold Chamberは初期に購入した金具が想定通り徐々に曲がって来たため、交換時期と考えている。6個追加する。蛍光標識siRNAあるいはマウスなど消耗品の購入も見込んでいる。顕微鏡周囲の物品(マウス固定器具・ガラス器具・レンズ・パソコン・ストレージなど)の購入に活用する。多色高速撮影、あるいはスペクトル撮影を行うため、得られるデータ量が膨大である。1日の実験で100GBを超えることもしばしばである。経験上、6ヶ月の実験で4TBのハードディスクが埋まるため、その都度データストレージを増設する。平成24年度に追加を見込んでいる。現在使用しているデータ取得用パソコンは平成21年3月導入した当時の最新式であるにも関わらず、撮影中にデータ処理が追いつかず時々フリーズする。平成24年度に最新式のパソコンに取り替えて、本来ならば不要なはずの再実験の数を減らす。現有のパソコンはデータ取得後の解析用として活用する。
摂食障害の病態解析研究-低栄養がひきおこす脳神経回路網障害と嗜癖行動の関連性-

本研究では、摂食障害患者において、血清BDNF(brain-derived neurotorophic factor)値と体重ならびにBMI(Body Mass Index)の間に有意な正の相関関係を認めた。血清BDHF値の低下に関しては、抑うつ症状との関連性が既に報告されており、今回の結果でも患者の血清BDNF値とHDSR(Hamilton Depression Rating Scale)の点数の間に有意な負の相関関係を認めた。加えて、HDSRの点数とEDI-2(Eating Disorder Inventory-2)の全点数の間に有意な正の相関関係がみられたことからは、病状による抑うつ症状の増悪が、摂食障害患者の血清BDNF値の低下に、何らかの影響を及ぼしているものと思われた。しかし、その一方、抑うつ症状と無関係にEAT-26(Eating Attitudes Test)の下位尺度のOC(oral control)と血清BDNF値が有意な負の相関関係を示していることからは、摂食障害患者における食に関するコントロールが、血清BDNF値の低下に重大な影響を及ぼしている可能性があると考えられた。また、入院治療中にBMI値の有意な増加を認めたAN患者群で、血清BDNF値の増加傾向を認めたが,その変化は有意なものではなかった。しかしながら、同患者群のBMI値とBDNFの変動率は有意な正の相関を示したことから、摂食障害の回復の過程にBDNFの増加が、何らかの影響を及ぼしていることが推察される。BDNFは、生体内で食事摂取やエネルギー消費、体重等の恒常性に関与していることが報告されているが、近年、認知障害、抑うつ症状との関連も多数報告されており、今後、摂食障害の回復の過程における認知の異常、抑うつ症状の変化との関連解析等を実施し、病態におけるBDNF変動の生物学的意義について検討を続けていきたいと考えている。現在,摂食障害の治療は,専らアルコールなどの薬物依存症に対するアプローチと同様の取り組みがなされており,より生物学的な病態理解と発症予防や治療法の開発が求められている。我々は,摂食障害では食事制限にともなう低栄養状態により2次的に脳内神経回路の維持修復過程に変化が生じ,その結果,行動のコントロール障害として嗜癖行動が出現する可能性を想定している。脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor ; BDNF)は脳内で発見された神経栄養因子の一つであり、その減少が記憶や学習機能の低下につながることが動物やヒトでの研究で報告されており、脳内神経回路網の形成・維持に重要な役割を担うと考えられている。そのため、血清BDNFを測定することで脳内神経情報伝達系の状態を把握することが可能となり、状態評価や薬物療法への応用が期待される。はじめに,このBDNFが神経細胞や神経幹細胞におよぼす影響について,またBDNFの発現変化に関わるメカニズムについて解析を進め,抗うつ薬や脳由来神経栄養因子(BDNF)を神経幹細胞へ処置することで,神経細胞への分化が促進されることを示すとともに,抗うつ薬の処置で神経幹細胞でのBDNF産生が増加することを明らかとした。さらに,摂食障害の治療において,現在用いられている抗うつ薬について,薬剤の違いによる臨床効果の差異があることについて,種々の神経栄養因子,抗うつ薬,気分安定薬を処置した際の神経幹細胞から新生される神経細胞フェノタイプの発現変化についての解析を行い,各薬物の処置が分化増強する神経細胞が異なるフェノタイプであることを明らかとした。現在,血中のBDNF量の変動,また血小板を用いたCa2+流入,BDNF放出機能動態について解析を進め,摂食障害の病態と脳内神経回路網の障害,修復機構変化のメカニズム解明を実施中である。

摂食障害患者(神経性無食欲症;AN,神経性大食症;BN)では血清BDNF値が健常者に比べて有意に減少しており、BMIとBDNF値に有意な正の相関があることが報告され、記憶・認知機能との関連が深いBDNFの異常と摂食障害の病態との関連が考察されている。そのため、BDNF値の改善は、治療経過に重要な影響を及ぼすと考え、今回我々は,摂食障害患者の末梢血のBDNFを経時的に測定し、その濃度変動が患者の治療経過と、どのように関わるかについて検討を行った。対象は、札幌医科大学附属病院神経精神科摂食障害専門外来を受診し、DSM-IVによる摂食障害の診断基準を満たした症例のうち、食行動の改善目的に入院加療(行動制限療法)となった7症例[AN5名,BN2名,年齢:29.3±11.6才(17-47)]である。患者7名のBMIと血清BDNF値の間には、入院直後・退院直前ともに有意な相関は認めなかった。BN患者2名では過食嘔吐の頻度は減少したものの、体重にはほとんど変化は認めなかった。AN患者5名では治療中断例を含め全例で体重の増加を認め、入院直後のBody Mass Index(BMI)は平均12.7±2.0から退院直前には14.5±1.3と回復を認めた。血清BDNF値に関しては、平均14.2±6.9ng/mlから19.4±6.5ng/mlと上昇したが、有意差は認めなかった。AN患者5名の入院期間中の、BMIの変動率とBDNFの変動率の間に有意な正の相関を認めた(r=0.884,p<0.05)。本研究では、入院治療中にBMI値の有意な増加を認めたAN患者群で、血清BDNF値の増加傾向を認めたが,その変化は有意なものではなかった。しかしながら、同患者群のBMI値とBDNFの変動率は有意な正の相関を示したことから、摂食障害の回復の過程にBDNFの増加が何らかに意味があることが推察された。