hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域自治推進政策による住民参加拡大の可能性

今年度は、協議会型の地域組織の実態に関して、以下の自治体調査を実施し、研究を進めた。対象自治体は、いずれも独自に協議会型の地域組織を制度化している。制度的には地域自治区等の法律上の「地域自治組織」と比較すると相対的に市政への提案・参加よりも地域内連携に重点を置いていると特徴づけられる。協議会型の地域組織の市政への参加を、提案権等として自治基本条例内にていねいに規定した伊賀市への行政部署調査では、提案権の行使、まちづくり計画の改定といった参加に関する制度の運用は滞っており、前年の調査と同様、協議会型の地域組織に関する施策の力点が、地域の活動量増加であったことが確認できた。地域組織への調査からは、参加に関する制度を活用して地域の意向を実現する難しさについて、1行政側の情報提供の不備、2地域組織側の提案能力の2点が指摘された。また、前年度に続き、益田市、大阪市への調査を実施した。益田市については、地域組織代表と行政の双方が参加するラウンドテーブルを通じた政策形成の試みについて調査を行った。行政の設定した課題についての意見交換が行われ、行政計画策定にも参考にされている状況であるが、1地域からではなく、行政主導で課題設定がなされている、2ラウンドテーブルでの意見、結論の扱い(事業化を進めるかなど)が曖昧といった点が指摘された。大阪市に対しては、協議会型地域組織の活動実態と各区の中間支援事業者への調査を実施したが、どちらの調査についても、地域からの政策形成への関心は強いとは言えない状況である。今年度の調査からは、地域内連携と地域の活動量の拡大を志向する制度を持つ自治体での市政への参加は発展途上であるが、この背景には1地域の提案を政策過程に反映させるための行政内部での調整、2地域組織の組織的力量(事務局人員や議論の場の設定)について、十分ではない状況があることが明らかになった。今年度の調査で、独自制度を自治体で設け、地域内ネットワークの強化と地域の活動量の拡大を志向する自治体での調査を行い、検討を行った。地域内連携と活動量の拡大という観点から、地域組織の活動(事業)についての自治体と地域の間の連携が図られているが、その一方で、地域からの政策形成、政策に対する変更の実現については、進んでいるとはいえないことがわかった。要因は行政側、地域組織側の双方に要因があり、協議会型の地域組織が参加のツールとしては未だ十分に機能していない可能性があること、地域内ネットワークの強化や地域の活動量拡大が単純に市政への参加拡大に結び付くわけではないことが明らかになった。今年度までの研究では、近年のいわゆる「地域自治組織」の多数を占める、独自制度を自治体で設けている自治体での調査を進めてきたが、そこからは、地域内ネットワークの強化や地域の活動量拡大が、地域内でのサービス生産や社会参加にとどまり、単純に市政への参加拡大に結び付くわけではないことが明らかになった。今後は、公式の議論の場としての地域協議会制度を持つ自治体(地域自治区導入自治体)の調査を行い、制度的な違いが参加の拡大に結び付いているのかを検討する必要がある。今年度の調査では、自治体による公共施設の再編等のテーマで行政との交渉を行った事例を調査することができたが、こうした交渉は、地域の要望の一つの形態と見ることができるが、こうした地域負担のコントロールもまた、計画の策定、諮問への答申等と同様に参加の形態として本研究の中に位置づけておかなければならない。本研究では、欧米の諸理論と日本の実態との双方を参照しながら、近年広がりを見せている地域自治推進政策の住民参加拡大の可能性を検討するが、今年度は、日本の実態に関する以下の点についての検討を中心に研究を進めた。第一は、2000年以降において自治体間に広がってきた、地域自治推進政策についての政策論理とその変遷を、協議会型の地域組織(地域自治組織)の導入を推奨する主要な論考を素材に検討した。その結果、地域自治推進政策では、自己決定できる範囲を広げる「自由度拡充」の面は当初から小さく、そして、近年になるにつれてそれが縮小・消滅していくことが明らかになった。一方、この間一貫して強化されてきたのは、地域内ネットワークの強化を通じた活動量の増加を志向する「所掌事務拡張」の傾向である。それとともに、地域内ネットワークの強化については、「自治会・町内会のテコ入れ」としての性格が増していることも示された。政策論理の検討からは、地域自治推進政策が政策形成・意思決定局面への参加を拡大する方向ではなく、地域内での社会参加の拡大に焦点が当たりやすい可能性が示唆される。第二は、二つの自治体(益田市・大阪市)への質的調査をすすめ、地域自治推進の担当部署が、協議会型の地域組織を、政策形成への参加ツールと位置付けているかを検討した。二つの自治体とも、協議会型の地域組織への第一義的な期待は、地域の活動量増加であったことが確認された。一方、地域福祉計画見直しで、こうした地域組織を活用する動きも現れている。また、大阪市では、協議会型の地域組織を、地域代表性を持つ組織と位置づけ、行政区の区政の評価等の議論への参加を打ち出している。自治体側が、地域とのチャネルとして新たな地域組織をとらえ、政策形成への参加ツールとしての活用可能性を模索しているといえる。当初計画では、欧米の諸理論(ガバナンス論、コプロダクション論等)の参照と、日本での実態調査を並行して行う予定であったが、理論的な参照・整理の面で当初予定通りに進んでいないため、やや遅れているとの評価をしている。

今年度は、協議会型の地域組織の実態に関して、以下の自治体調査を実施し、研究を進めた。対象自治体は、いずれも独自に協議会型の地域組織を制度化している。制度的には地域自治区等の法律上の「地域自治組織」と比較すると相対的に市政への提案・参加よりも地域内連携に重点を置いていると特徴づけられる。協議会型の地域組織の市政への参加を、提案権等として自治基本条例内にていねいに規定した伊賀市への行政部署調査では、提案権の行使、まちづくり計画の改定といった参加に関する制度の運用は滞っており、前年の調査と同様、協議会型の地域組織に関する施策の力点が、地域の活動量増加であったことが確認できた。地域組織への調査からは、参加に関する制度を活用して地域の意向を実現する難しさについて、1行政側の情報提供の不備、2地域組織側の提案能力の2点が指摘された。また、前年度に続き、益田市、大阪市への調査を実施した。益田市については、地域組織代表と行政の双方が参加するラウンドテーブルを通じた政策形成の試みについて調査を行った。行政の設定した課題についての意見交換が行われ、行政計画策定にも参考にされている状況であるが、1地域からではなく、行政主導で課題設定がなされている、2ラウンドテーブルでの意見、結論の扱い(事業化を進めるかなど)が曖昧といった点が指摘された。大阪市に対しては、協議会型地域組織の活動実態と各区の中間支援事業者への調査を実施したが、どちらの調査についても、地域からの政策形成への関心は強いとは言えない状況である。今年度の調査からは、地域内連携と地域の活動量の拡大を志向する制度を持つ自治体での市政への参加は発展途上であるが、この背景には1地域の提案を政策過程に反映させるための行政内部での調整、2地域組織の組織的力量(事務局人員や議論の場の設定)について、十分ではない状況があることが明らかになった。今年度の調査で、独自制度を自治体で設け、地域内ネットワークの強化と地域の活動量の拡大を志向する自治体での調査を行い、検討を行った。地域内連携と活動量の拡大という観点から、地域組織の活動(事業)についての自治体と地域の間の連携が図られているが、その一方で、地域からの政策形成、政策に対する変更の実現については、進んでいるとはいえないことがわかった。要因は行政側、地域組織側の双方に要因があり、協議会型の地域組織が参加のツールとしては未だ十分に機能していない可能性があること、地域内ネットワークの強化や地域の活動量拡大が単純に市政への参加拡大に結び付くわけではないことが明らかになった。今年度の研究からは、地域自治推進政策は、地域内の協働による「活動量の増加」を強く志向していることが確認されたが、これにより、今後の研究では以下のような点に留意する必要がある。一つは、「活動量の増加」にはサービス生産を志向する部分と、交流などむしろ住民の社会参加を志向する部分とが混在しているが、この社会参加を理論的に位置づけることである。公共サービス供給を前提とするコプロダクション論だけでは必ずしもこの面はとらえきれず、ソーシャル・キャピタル論や社会学の知見を加味する必要があると考えられる。もう一つは、「活動量の増加」に焦点が当たっているために、調査対象(自治体や地域組織など)が、政策形成や意思決定への参加と地域自治推進政策との関連性を意識しにくくなっており、ヒアリング上の工夫が必要となる。
微粒子分散溶液構造と表面間力測定による混合微粒子分散系の安定性機構の研究

微粒子を用いた新機能性材料開発研究の基礎、混合微粒子分散系の安定性を支配する諸因子を、微粒子分散溶液構造との相関で、表面間力的に調べた。混合分散系の研究に先立って界面動電位法を用いて調べた、固体粒子への高分子電解質の吸着挙動は、種々表面電位の異なる固体粒子を混合分散するために、溶液pHに関係なく等しく高い電位を与へる吸着膜を作るのに効果的であることがわかった。このことは高分子電解質を使って、性質の異なる表面を同質化でき、安定分散のための静電的制御が容易になることを意味する。微粒子安定分散にはしばしば界面活性剤が使われる。そこで、固体表面を高分子電解質で飽和吸着状態に修飾し、その表面に及ぼす界面活性剤イオンの吸着効果を界面動電位と表面間力測定とから調べた。水中における界面活性剤イオンの効果は一般の無機電解質に比べ、対イオン的にはるかに高い吸着効果を示し、濃度とイオンの疎水性度の増加と伴に、高分子電解質で修飾された表面電荷を下げるだけでなく、過剰吸着によって電荷の反転をももたらす。このことは、界面活性剤の使用は安定分散と不安定化の両方の効果があることになり、その使用にあったって濃度と疎水性の両方考慮する必要があることを示す。一方、水の代わりに極性有機溶媒を用いると、界面活性剤イオンは水系で見られた特異な吸着活性はなくなり、むしろ水中における支持電解質と同様の役割を果たすことがわかった。このことは、極性溶媒中で微粒子安定分散に必要なイオン濃度の制御に界面活性剤イオンが使えることを示す。界面活性剤イオンミセルを共存させた、異種粒子混合の安定分散の表面間力的モデル実験では、20nm以下の比較的近接距離で、溶液中ミセル粒子の分散構造から、球状ミセル粒子の介在によると考えられる周期的立体障害反撥力が観察された。これは高分子吸着膜の立体障害力、表面電荷による静電反撥力に加え、別の反発力として使用できることになる。このように、混合分散系の安定性を図るには、表面の高い電位の均質化、適切な界面活性剤種の選択、ミセル粒子の共存による付加的安定化の活用などが重要であると結論できた。微粒子が安定分散するための様々な条件を定量的・溶液構造的に解明するため、1)粒子表面間相互作用のAFM的直接測定、2)溶液中の微粒子分散構造のCryo-TEM的評価、3)粒子間相互作用に関与するイオンの吸着・分配のNMR的研究と4)微粒子相互作用による分散溶液のレオロジー的研究が行われている。1)では溶液中の無機、有機、生体表面について相互作用が評価され、いずれの表面でも長距離力として電気二重層静電反撥力が常に作用しており、その作用力は、有機と無機表面系で、比較的低濃度であれば界面活性剤対イオンを含む対イオン種に殆ど支配されない。2)と3)では微粒子の分散は単純分散型と二次構造形成型に分かれ、それを支配する因子は粒子表面の極く近傍で働く、AFM表面間力的には検出しにくい、短距離力に原因があるらしい。4)二次構造形成型粒子分散溶液系は異常な粘弾性を示す事が多い。その粘弾性挙動は可逆的と不可逆的に形成された場合の二次構造体によって明らかな違いがあり、それには短距離的引力の強さを支配する対イオン結合力の差に原因があるらしい。

以上、これまでの単純分散系の結果を基に、微粒子分散系の安定性を支配する諸因子が濃厚分散系や混合分散系でも同様に説明されるか否かについて、表面間力法を中心に研究を進めている。分散系の安定性は静電反撥力、ファンデアワールス引力、吸着膜立体障害反撥力、液体構造形成による反撥と引力、水和反発力などに支配される。二体表面間力法はこれらの相互作用成分を直接測定できる唯一の方法である。ここでは、原子間力顕微鏡を使い、二体表面間力におよぼす表面電荷、対イオン結合、表面疎水化度の研究を基礎に混合微粒子共存系の溶液構造と粒子表面間相互作用成分の定量的研究を進めている。その結果、疎水性対イオンが粒子表面に結合すると、粒子表面電荷符号の反転が起こり、その近辺の対イオン濃度で表面間力は静電反撥力とファンデアワールス力に加え、表面の疎水化による疎水性引力が存在するを明らかにした。これらの成果は間もなく論文として公表する。同時に、本研究の目的、混合粒子系の表面間力測定が開始され、その系の分散安定性におよぼす相互作用成分の解析がなされようとしている。混合微粒子分散系の安定性を表面間力的に調べ、分散溶液構造との相関で安定分散の諸因子を明らかにした。混合分散系ではそれぞれの粒子表面特性が異なるため、表面改質して同質表面を作る必要がある。そこでまず、高分子電解質を用いてシリカ粒子表面を改質しその表面特性を界面電気化学的、表面間力的に調べた。その結果、高分子電解質は低い表面被覆率でも大きな静電反発力を与え、粒子を安定分散させ得ることがわかった。混合分散系でしばしば用いられるイオン性界面活性剤の安定分散に及ぼす効果も調べた。水中ではエントロピー的排除効果で、界面活性剤イオンは、その疎水性化度が大きいほど、反対符号の電荷を持つ表面に特異吸着する。これに対し、非水溶液エタノール中では界面活性剤イオンのエントロピー的排除効果が水中より弱くなるため、特異吸着せず、無関係塩と同じイオン挙動を示すことがわかった。ポリカチオンの高分子電解質と陰イオン性界面活性剤が共存すると、その混合比とともに異なった構造体から成る複合会合体が生成する。これら会合体が水溶液中に低濃度で共存した混合分散系では、無機固体表面間の相互作用に大きな変化はない。そこで、混合分散系安定性のモデルとして、水中に界面活性剤ミセル粒子が共存した系で、固体表面間相互作用に及ぼすミセル粒子濃度の効果を調べた。ミセル粒子濃度が低い場合、固体表面間力は静電反撥力のみで分散安定性が保たれる。ミセル粒子濃度が増すと、静電的表面間力は弱まるが、ミセル粒子が介在することによると考えられる立体反発力が新たに観測され、その遠達性はミセル濃度の増加と伴に静電反撥力よりも大きくなることがわかった。これらの研究成果から、混合分散系を定分散するには、1)粒子表面の電位を同符号でかつ大きくすること、2)その方法として高分子質を用いた表面改質法が有用であること、3)活性剤ミセルは立体障害的に安定分散を支え得ること、4)極性非水溶媒では界面活性剤イオンが支持電解質として使えること、5)無極性溶媒では立体障害力以外に安定分散を与えられないことが結論できた。
肺組織傷害と好中球に関する基礎的研究-肺胞由来の好中球抑制因子の分離・精製ならびに肺組織傷害に対する影響-

肺組織傷害の発症には、肺胞滲出好中球とそれが放出する組織傷害性のプロテアーゼや活性酸素などが深く関与している。現在までこれらに有効な治療薬が開発されておらず予後は依然として極めて不良である。我々は、肺胞領域に存在する好中球機能抑制因子に着目し研究活動を進めてきた。その研究成果として、肺サーファクタントおよび肺胞II型細胞がヒト好中球機能を抑制することを報告した。またラット肺胞洗浄液から遠心により細胞成分およびサーファクタント成分を除去した上清中にも、ヒト好中球のスーパーオキサイド産生および接着を抑制する生理活性物質が存在することを見い出し報告した。この抑制活性は、100°C、10分の熱処理にて失活したことから、蛋白性抑制因子であり、またSODのような消去剤とは異なる新種の活性物質と考えられ、好中球抑制因子として非常に期待される。平成8年度の研究計画では、この抑制物質とサーファクタント特異蛋白との因果関係を追求したが、相関関係は得られなかったことは、すでに報告した。平成9年度は、抑制性のサイトカインであるTGF-bataの関与の可能性について主に検討を行ってきた。TGF-bataの好中球抑制作用の有無、この可溶性分画中のTGF-bata含有、さらには抗TGF-bata抗体による中和試験などを行った。しかし、結果としては、ヒトとラットの動物種の違い、このサイトカインの高い非特異的吸着性などの諸問題が解決できず、このサイトカインの関与については結論を導き出すことはできなかった。また、この物質の分子量は200-300kDa付近と推定できたものの、精製過程で抑制活性が失われるなどの問題が発生し、単離には至らず、従って本研究期間内のモノクローナル抗体確立までは至らなかった。今後、さらに精製過程を吟味して行く予定である。その研究成果として、肺サーファクタントおよび肺胞II型細胞がヒト好中球機能を抑制することを報告した(研究実績参照)。またラット肺胞洗浄液から遠心により細胞成分およびサーファクタント成分を除去した上清中なも、ヒト好中球スーパーオキサイド産生および接着を抑制する生理活性物質が存在することを見い出し報告した。平成8年度の研究計画では、ラット肺から抑制物質を精製しそれをさらに特徴付けすることであった。肺洗浄液可溶成分中には遊離型SP-AやSP-Dが存在し、これらサーファクタント特異蛋白にも近年免疫調節作用が報告されていることから、まずこれらの好中球抑制作用について検討した。SP-AとSP-Dに対する中和抗体を用いて抑制阻止試験を行ったところ、肺洗浄液可溶成分による抑制効果は影響を受けなかった。従って、これらサーファクタント蛋白の関与の可能性は低いと考えられた。また、カラムクロマトグラフィーによる分子量の推定では抑制作用のピークは、200-300kDa付近にあり既存の蛋白とは異なる可能性が高い。

一方、抑制性のサイトカインであるTGF-βにも好中球抑制作用が報告されているので、現在は、TGF-βの好中球抑制作用の有無、この可溶性分画中のTGF-β含量、さらには抗TGF-β抗体により中和試験などを行っている。来年度はこの物質に対するモノクローナル抗体作製へ進展する予定である。肺組織傷害の発症には、肺胞滲出好中球とそれが放出する組織傷害性のプロテアーゼや活性酸素などが深く関与している。現在までこれらに有効な治療薬が開発されておらず予後は依然として極めて不良である。我々は、肺胞領域に存在する好中球機能抑制因子に着目し研究活動を進めてきた。その研究成果として、肺サーファクタントおよび肺胞II型細胞がヒト好中球機能を抑制することを報告した。またラット肺胞洗浄液から遠心により細胞成分およびサーファクタント成分を除去した上清中にも、ヒト好中球のスーパーオキサイド産生および接着を抑制する生理活性物質が存在することを見い出し報告した。この抑制活性は、100°C、10分の熱処理にて失活したことから、蛋白性抑制因子であり、また、SODのような消去剤とは異なる新種の活性物質と考えられ、好中球抑制因子として非常に期待される。平成8年度の研究計画では、この抑制物質とサーファクタント特異蛋白との因果関係を追求したが、相関関係は得られなかったことは、すでに報告した。平成9年度は、抑制性のサイトカインであるTGF-βの関与の可能性について主に検討を行ってきた。TGF-βの好中球抑制作用の有無、この可溶性分画中のTGF-β含量、さらには抗TGF-β抗体による中和試験などを行った。しかし、結果としては、ヒトとラットの動物種の違い、このサイトカインの高い非特異的吸着性などの諸問題が解決できず、このサイトカインの関与については結論を導き出すことはできなかった。また、この物質の分子量は200-300kDa付近と推定できたものの、精製過程で抑制活性が失われるなどの問題が発生し、単離には至らず、従って本研究期間内のモノクローナル抗体確立までは至らなかった。今後、さらに精製過程を吟味して行く予定である。
環境NPO(民間非営利組織)の制度化と機能に関する環境社会学的比較研究

1998年の「NPO法」の施行以来、日本においても、小規模な任意団体が主であった環境運動組織が環境NPOとして組織化、制度化され、政策決定に対する影響力や圧力行使、対抗的政策提言活動等を行う基盤が遅れ馳せながら整備された。本研究においては、環境NPOの公式的な組織化、制度化以降の環境運動組織の機能変容、政策提言(アドボカシー)能力や社会的影響力の増大等を、主として定性的に明らかにすることがめざされた。比較的NPOとしての公式化、制度化が進んだアドボカシー型環境NPOを中心として聞き取り調査を広範に進めた結果、以下のようないくつかの知見が得られた。第1に、NPOとしての組織化の経緯から、a)海外の既存の環境NPOの日本支部的に発展してきたもの、b)国内のおいて比較的長期間環境運動や消費者運動としての活動実績を持ち、NPO制度の確立とともにそれへと組織化されたもの、c)比較的最近の環境問題に対応して活動を開始し、当初から環境NPOの形態を採っているもの、といった類型が得られた。全体として、税制優遇や寄付控除制度等を欠いた日本の不十分なNPO制度ゆえに、財政基盤は脆弱であり、政策提言や政治的影響力行使に必要な専門的力量や人材も不十分である。しかしながら、こうした基盤の弱さにもかかわらず、NPOとして公式組織化しえたことで、自治体や企業セクターとのパートナーシップ形成は著しく進展した。事業化や活動の独自性を打ち出し、NPOとしての独自のニッチを見出す努力も見られる。たとえば、海外に本部を持つ既存の環境NPOや新興環境NPOで国際的な活動や国連等をアリーナとした活動が特徴的であったり、草の根的基盤を持っ環境NPOが地域レベルの政策提言等に関与する傾向などが見られる。1998年に「NPO法(特定非営利活動推進法)」が施行されて以来、日本においても、それまではほとんどが小規模な任意団体であった環境運動組織が「環境NPO」としてフォーマルに組織化、制度化され、自治体、企業、国際機関などとの協働、政策決定に対する影響力や圧力行使、対抗的政策提言活動等を行う基盤がささやかながらではあるが整備された。本研究においては、環境NPOとしての公式的な組織化、制度化以降の環境運動組織の機能変容、政策提言(アドボカシー)能力や社会的影響力の増大等を、主として定性的に明らかにすることがめざされた。本年度においては、主に、文献資料収集、ウェッブサイトからの資料収集、聞き取り調査を行った。特に本研究においては、これまで日本の環境運動の脆弱な側面であるといわれてきた専門的な分析調査能力、政策提言能力、国際的な活動能力等に特に着目し、さまざまな環境NPOの中から、聞き取り調査対象を選択した。また、比較対象として、同様の活動を行うアメリカの環境NPOも、聞き取り調査対象として選定を進めた。聞き取り調査の結果、いくつかの知見を得た。第1に、「NPO法」施行後、福祉やまちづくり分野に比べると団体数や規模において環境NPOは少数、小規模であるが、それ以前に比較すれば着実に、明確な組織のミッション(活動目標、社会的使命)の呈示、(目標達成や社会的支持調達に向けた)目的意識的資源動因、専任スタッフ、専門的スタッフ、ボランティアやインターンの活用等の点で、公式化、制度化が進みつつある。第2に、専門的スタッフや専門的政策提言能力の蓄積という点においては、まだ日本においてはNPOがキャリア形成の場になり得ていないことや専門的専任スタッフを雇用するだけの経済的基盤のないことなどのために、環境NPO先進国であるアメリカに比べて大きな格差が存在する。第3に、少数ではあるが、国連経済社会理事会の公式NGOとして認定を受けた「CASA」などの国際的な環境NPO・NGOが誕生しつつあり、今後の成長が期待されることなどである。

これらの知見は、次年度も継続してさらに聞き取り調査を行い、より精緻な分析を行っていきたい。1998年の「NPO法」の施行以来、日本においても、小規模な任意団体が主であった環境運動組織が環境NPOとして組織化、制度化され、政策決定に対する影響力や圧力行使、対抗的政策提言活動等を行う基盤がささやかながら整備された。本研究においては、環境NPOの公式的な組織化、制度化以降の環境運動組織の機能変容、政策提言(アドボカシー)能力や社会的影響力の増大等を、主として定性的に明らかにすることがめざされた。比較的NPOとしての公式化、制度化が進んだアドボカシー型環境NPOを中心として聞き取り調査を広範に進めた結果、以下のようないくつかの貴重な知見が得られた。第1に、NPOとしての組織化の経緯から、a)海外の既存の環境NPOの日本支部的に発展してきたもの、b)国内において比較的長期間環境運動や消費者運動としての活動実績を持ち、NPO制度の確立とともにそれへと組織化されたもの、c)比較的最近の環境問題に対応して活動を開始し、当初から環境NPOの形態を採っているもの、といった類型が得られた。NPO化に伴う国際化の進展は、主として活動課題に左右されるが、概して海外に本部を持つ既存の環境NPOや新興環境NPOで比較的進展が見られる。全体として、税制優遇や寄付控除制度等を欠いた日本の不十分なNPO制度ゆえに、財政基盤や政治的影響力は脆弱である。このこともあり、日本においては、まだ環境NPOの制度化とともに環境運動が運動的性格を減じ、事業化や政治的従属化はさほど進行していない。国際的な環境政策決定において環境NPOの影響力が大きい他の先進諸国と比較して、日本の環境NPOの基盤の脆弱さゆえに、環境政策決定において日本が国際的取り残されることを懸念するNPOの声も多く、より一層の基盤確立のニーズが認識されている。
脱窒脱リン細菌の単離とその生化学的情報の下水高度処理システム最適運転管理への応用

下水からの生物学的リン除去は、経験的に、嫌気-好気(A/O)過程により達成可能ではあるが、一方で、実際の処理場では、時としてその除去が不安定となるなど、経験的なプロセス管理だけでは不十分である。このような経験的なプロセス管理に頼らざるを得ない一つの理由はリン除去細菌の単離が未だになされていないためである。ここでは、良好なリン除去能を有する活性汚泥中での主流派の菌群である酢酸資化性リン除去純粋菌を対象とする。また、リン除去細菌の多くが脱窒能を有しており、下水処理システム内でのこの脱窒脱リン細菌の集積により、より質の高い高度処理が達成可能である。本研究では酢酸資化能を有する脱窒脱リン細菌の単離とその生化学的情報の下水高度処理システム最適運転管理への応用を試みた。本年度、下記の研究を実施した。(1)自作のスクリーニング装置内に集積された菌群を植種して平板寒天法により単離した。16S rDNAをシーケンスし、同定を行った結果、昨年度までの8種類の純菌に加えさらに1種の純菌が得られた。しかしながら、全ての純菌は、脱窒脱リン細菌が有すべき特性を定量的には示さなかった。(2)FISH法・DGGE法により、嫌気-無酸素連続スクリーニング装置内には、嫌気-好気法においてしばしば観察されるRhodocyclus属が3割ほど存在することを明らかにした。一方、このように高度にRhodocyclus属が集積されているにもかかわらず、それを単離できないということは、平板寒天法ではコロニー化できないという結論に達した。単離の条件を変えて、Rhodocyclus属の単離にターゲットを絞ったが、単離の成功には至らなかった。(3)従来のASMでは不十分であるため、脱窒脱リンプロセスをモデル化して下水処理水質を予測するモデルを構築した。脱窒脱リン菌の集積には「後脱窒システム」が有効であるとの結論に至った。下水からの生物学的リン除去は、経験的に、嫌気-好気(A/0)過程により達成可能ではあるが、一方で、実際の処理場では、時としてその除去が不安定となるなど、経験的なプロセス管理だけでは不十分である。また、研究代表者はリン除去細菌の多くが脱窒能を有することを証明し、下水処理システムへのこの脱窒脱リン細菌の集積により、より質の高い高度処理が達成可能であることを指摘し続けてきた。したがって、本研究では酢酸資化能を有する脱窒脱リン細菌の単離とその生化学的情報の下水高度処理システム最適運転管理への応用を試みることとした。本年度、下記の2点についての研究を実施した。(1)酢酸資化能を有する脱窒脱リン細菌の単離:フィルター・スクリーニング装置を作製し、単離操作に用いた。スクリーニング装置本体の他に、嫌気(酢酸)基質・洗浄用滅菌蒸留水・無酸素基質(硝酸)ボトルとポンプ類、排液バルブ等、および、それらを制御するシーケンスコントローラー(タイマー)から構成されている。本体はガラス製で特注し、オートクレーブ滅菌可能なものである。

装置内のフィルター上に形成されたコロニーのうち、明らかにコロニーの色・形態その他の違うものが存在すれば、複数個のコロニーを選択した。それらのコロニーを植種して平板寒天法により単離した。16S rDNAをシーケンスし、同定を行った結果、5種類の純菌が得られた。現在、脱窒脱リン細菌が有すべき特性が備わっているかどうかを定量的に検討している。(2)水質予測モデルの構築:IAWが提案しているASMでは不十分であるため、脱窒脱リンプロセスをモデル化し、下水処理水質を予測するモデルを構築した。下水からの生物学的リン除去は、経験的に、嫌気-好気(A/O)過程により達成可能ではあるが、一方で、実際の処理場では、時としてその除去が不安定となるなど、経験的なプロセス管理だけでは不十分である。このような経験的なプロセス管理に頼らざるを得ない一つの理由はリン除去細菌の単離が未だになされていないためである。ここでは、良好なリン除去能を有する活性汚泥中での主流派の菌群である酢酸資化性リン除去純粋菌を対象とする。また、研究代表者はリン除去細菌の多くが脱窒能を有することを証明し、下水処理システム内でのこの脱窒脱リン細菌の集積により、より質の高い高度処理が達成可能であることを指摘し続けてきた。したがって、本研究では酢酸資化能を有する脱窒脱リン細菌の単離とその生化学的情報の下水高度処理システム最適運転管理への応用を試みることとした。本年度、下記の3点についての研究を実施した。(1)酢酸資化能を有する脱窒脱リン細菌の単離:スクリーニング装置を自作し、単離操作あるいは集積操作に用いた。装置内に集積された菌群を植種して平板寒天法により単離した。16S rDNAをシーケンスし、同定を行った結果、8種類の純菌が得られた。しかしながら、全ての純菌は、脱窒脱リン細菌が有すべき特性を定量的には示さなかった。(2)ポピュレーションダイナミクス:FISH法により、嫌気-無酸素連続スクリーニング装置内には、嫌気-好気法においてしばしば観察されるRhodocyclus属が3割ほど存在することを明らかにした。一方、このように高度にRhodocyclus属が集積されているにもかかわらず、それを単離できないということは、平板寒天法ではコロニー化できないという結論に達した。したがって、新規の単離手法を確立したので、来年度、その手法を適用してRhodocyclus属の単離を試みる。(3)水質予測モデルの構築・検証:IAWが提案しているASMでは不十分であるため、脱窒脱リンプロセスをモデル化して下水処理水質を予測するモデルを構築し、その有用性を明らかにした。また、リン除去細菌の多くが脱窒能を有しており、下水処理システム内でのこの脱窒脱リン細菌の集積により、より質の高い高度処理が達成可能である。本研究では酢酸資化能を有する脱窒脱リン
腸炎ビブリオVNC菌のシグマファクター発現量と転写産物の解析

研究代表者等は、腸炎ビブリオの低温・栄養飢餓状態における生存に関わる遺伝子の発現制御を解析する目的で、環境適応に関連した遺伝子の発現に重要な役割を有するRNAポリメラーゼ構成タンパク質のシグマファクターに着目した。腸炎ビブリオは至適増殖条件では非常に強力な分裂増殖能力を示すが、逆に低温・栄養飢餓状態にさらすと菌形が桿菌状から球菌状に変化し、至適増殖条件に戻しても分裂増殖能力を失っていた。この状態の菌は適当な増殖条件下(抗酸化剤等の添加)では分裂増殖能を回復したので、球菌状の菌は生きているが培養不能状態であるVNC菌と判定された。この菌におけるシグマファクターの発現をRT-PCR法により調べた結果、大腸菌では環境適応に関係するタンパク質遺伝子の転写を制御しているシグマSが至適増殖条件での増殖の定常期に強く発現しており、低温・栄養飢餓状態にさらした後もかなり高いレベルで発言が継続していることが明らかになった。他のシグマファクターの発現は低温・栄養飢餓状態にさらすとほとんど観察されなくなり、低温・栄養飢餓状態での生存に必要な遺伝子の発現にはシグマSが重要であることが明らかになった。低温・栄養飢餓状態に適応した菌から抽出したmRNAから逆転写酵素により作成したcDNAを基に作成したライブラリーから選出した7種類の遺伝子について塩基配列の決定を行い、これら遺伝子の発現量をRT-PCR法により調べたがこれら遺伝子に関しては培養条件による遺伝子発現量の違いがほとんど認められなかった。今後は、低温・栄養飢餓状態において特異的に発現している可能性のある個々の遺伝子について詳細な検討を要する。本研究課題に関する科学研究費補助金は,平成12年10月に追加交付が認められたものである。従って,現在の段階は申請課題に関する各種実験の準備途上であるが,以下の知見に関しては若干の成果があった。1.すでにゲノム解析が終了しているコレラ菌シグマファクターの塩基配列を基にPCRプライマーを作製し,腸炎ビブリオ及び他のビブリオ属菌におけるストレス対応シグマファクター遺伝子(rpoS)の存在を確かめた。今回作製したPCRプライマーは腸炎ビブリオに特異的ではなかったが,RT-PCRによるmRNAの定量に使用可能であることが明らかになった。2.他のシグマファクター遺伝子の検出も試みたが,rpoH以外の遺伝子の検出は困難であった。現在これら遺伝子を特異的に検出できるプライマーの検討を継続している。3.腸炎ビブリオを低温・低栄養条件にてインキユベーションすることにより作成したVNC菌におけるrpoS遺伝子の存在も確認でき,その量は同じサンプルで観察される生菌数の100万倍以上のレベルであった。この結果は,かなりの数のVNC菌の存在を示唆していた。4.VNC菌におけるrpoS遺伝子の発現量をRT-PCRにより測定を行ってみたところ,インキュベーション期間により成績に変動がみられたが,少なくとも生菌数の1万倍から1千倍程度の生菌数に相当するmRNA量が観察された。現在,この結果を基にVNC菌の菌数測定系を作成することを試みている。
児童思春期精神科病棟退院後のアウトカムの縦断的予後調査

精神障害を持つ子どもへの集中的な治療法として入院治療があるが、その有効性は検討されていない。そこで、児童思春期精神科入院治療の予後を検討し、それにどのような要因が関連しているかを明らかにすることを目的に調査を実施した。追跡対象者は96名で、多くは重症であり、家族の問題も抱えていることが多かった。追跡期間は平均約3年であり、約32%が再入院、約30%が何らかの就労をしていた。再入院率は統合失調症圏および摂食障害において高く、発達障害において低い傾向があった。近年、子どものメンタルヘルスが危機に瀕している。少年犯罪、不登校、ひきこもり、自殺または自傷行為、学校での問題行動などが増加しており、そのうちのいくらかは精神的な障害によって引き起こされている。そのような子どもへの最も集中的な治療法として、入院治療がある。しかし、そのコストは高く、日常生活から子どもを引き離してしまうものでもあるため、入院治療の有効性を検討することが重要視されている。しかし、特に日本においては、児童思春期精神科病棟の治療効果などアウトカムに関する研究はあまり行われていなかった。そこで、児童思春期精神科入院治療の退院後の有効性を検討すること、およびどのような要因(入院前、入院中および退院後)が良いアウトカムに影響するかを明らかにすること、を目的とした研究を行う。本年度はベースラインである入院時、入院中および退院時のデータの整理および解析を行った。また追跡調査に必要な項目を絞るとともに研究計画について検討した。その結果、精神科病棟に入院する子どもの多くは重症であり、家族の問題も抱えていることが多く、入院治療は特に重症な子どもに効果的であることが明らかになった。入院治療にはおおむね満足しており、子どもの多くが入院治療に満足していると回答していた。追跡研究に必要な項目としては、診断、入院歴、入院日数、症状、QOL、不登校の有無、就労の有無などが考えられた。来年度はこれらの項目を含めた追跡調査を行う予定である。少年犯罪,不登校,ひきこもり,自殺または自傷行為,学校での問題行動などが増加しており,そのうちのいくらかは精神的な障害によって引き起こされている。そのような子どもへの最も集中的な治療法として,入院治療がある。しかし,そのコストは高く,日常生活から子どもを引き離してしまうものでもあるため,入院治療の有効性を検討することが重要視されている。しかし,特に日本においては,児童思春期精神科病棟の治療効果などアウトカムに関する研究はあまり行われていなかった。そこで,本研究では,児童思春期精神科入院治療の退院後の有効性を検討すること,およびどのような要因(入院前,入院中および退院後)が良いアウトカムに影響するかを明らかにすること,を目的とした調査を実施する。昨年度はベースラインである入院時,入院中および退院時のデータの整理および解析を行い,追跡調査に必要な項目を絞るとともに研究計画について検討した。その結果,精神科病棟に入院する子どもの多くは重症であり、家族の問題も抱えていることが多く、入院治療は特に重症な子どもに効果的であることが明らかになった。入院治療にはおおむね満足しており子どもの多くが入院治療に満足していると回答していた。追跡研究に必要な項目としては、診断、入院歴、入院日数,症状,QOL,不登校の有無,就労の有無などが考えられた。今年度はこれらの項目を含めた追跡調査を実施した。調査はカルテ調査にて行った。追跡対象者は109名,追跡期間は2年から5年と長期であった。調査は国立精神・神経センターの倫理委員会の承認を得て実施した。来年度は,データの収集を終了し,統計解析を実施し,その成果を順次発表していく予定である。近年、子どものメンタル-ルスが危機に瀕している。そこで、本研究では、児童思春期精神科入院治療の退院後の有効性を検討すること、およびどのような要因(入院前、入院中および退院後)が良いアウトカムに影響するかを明らかにすること、を目的とした調査を実施する。18年度は、ベースラインである入院時、入院中および退院時のデータの整理および解析を行い、追跡調査に必要な項目を絞るとともに研究計画について検討した。

また子どもの多くが入院治療に満足していると回答していた。19年度は、診断、入院歴、入院日数、症状、QOL、不登校の有無、就労の有無等の項目を含めた追跡調査を実施した。調査はカルテ調査にて行った。追跡対象者は109名、追跡期間は2年から5年と長期であった。調査は国立精神・神経センターの倫理委員会の承認を得て実施した。今年度は、追跡調査を終了し、その結果について検討を行った。その結果、約32%が再入院していることが明らかになった。また少なくとも30%が何らかの就労をしていた。再入院率は統合失調症圏および摂食障害において高く、発達障害において低い傾向が見うけられた。
ソーシャルメディアを活用した不妊治療を内包する生活の理解と社会的課題の検討

本研究の目的は、多様な立場に身を置く不妊治療当事者らのリアリティを明らかにすることである。この目的を通じて、公的事業を始めとする様々な支援のあり方について検討し、社会に提言する。この目的達成のため、不妊治療をテーマとしたソーシャルメディアのテキスト分析を通じて不妊治療当事者の日常と治療のリアリティを明らかにし、その結果を素地に不妊治療を計画中/実施中/終了後の当事者らにアンケート調査を行い、日常生活との関連から不妊治療についての幅広い支援のあり方を検討する。
植物におけるニコチアナミン分泌の分子機構とその役割の解明

1) A. halleriからのニコチアナミン分泌輸送体の同定これまでにA. halleriからニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。またGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを用いた局在解析の結果、このニコチアナミン輸送体候補タンパク質は、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを見出した。この未知オルガネラを同定しその動態を明らかにすることによって、新規の分泌経路の存在を明らかにできる可能性が示された。この未知オルガネラはトランスゴルジネットワークに関わることが示唆されており、現在さらに解析を続けている。(2)イネのニコチアナミン分泌膜輸送体の植物体における役割の解明形質転換イネを用いたプロモーターGUS解析の結果、ENA1は主に根で発現し、鉄欠乏によって強くその発現が誘導されることが明らかとなった。これまでに、GFP-ENA1融合タンパク質あるいはENA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを作出した。これらの形質転換イネを用いて、ENA1の細胞内局在解析を進めた結果、ENA1は主として細胞膜に局在すること、また細胞質内の未知の小胞状構造にも局在することが明らかになった。ENA1の発現過剰イネと発現抑制イネを形質転換法により作出した。ENA1発現過剰イネを通常培地で栽培すると、根の伸長が抑えられ、根端が膨らんで根毛が密集する特殊な表現型を示した。この表現型は培地に過剰の亜鉛を添加することにより解消された。ENA1が亜鉛の代謝と恒常性維持において重要な機能を果たすことが示唆された。さらに、イネのtos17挿入系統の中からENA1欠損イネを複数同定し、これらの表現型を解析した。欠損イネの生育に大きな違いは観察されなかった。しかし、マイクアレイ解析により詳細に遺伝子発現の差を調べたところ、ENA1欠損が根の色素体におけるストレス反応に影響することが明らかになった。計画通りに、A. halleriからニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。また、ニコチアナミン分泌輸送体の局在解析を行い、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを明らかにした。この未知オルガネラは、トランスゴルジネットワークに関わることが示唆された。GFP-ENA1融合タンパク質あるいはENA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを作出した。これらの形質転換イネを用いて、ENA1の細胞内局在解析を進めた。ENA1の発現過剰イネと発現抑制イネを形質転換法により作出して解析することにより、植物体におけるENA1の機能を推定した。A. halleriのニコチアナミン分泌において、これまで明らかになっている細胞内物質分泌経路とは全く異なる新規の分泌経路が存在する可能性について、さらに検証を進める。また、作出したイネニコチアナミン分泌膜輸送体ENA1の発現抑制イネと発現過剰イネ、あるいはtos17挿入によるENA1欠損変異イネについて、その表現型や生育検定などの解析をさらに進め、成果をまとめて論文にする。(1)A. halleriからのニコチアナミン分泌輸送体の同定A. halleriの根において、亜鉛過剰により発現が上昇する遺伝子群をマイクロアレイ解析により同定した。このトランスクリプトーム解析の結果から、A. halleriのニコチアナミン分泌輸送体の候補としてリストアップされた遺伝子と、イネのニコチアナミン分泌輸送体ENA1のA. halleriホモログのそれぞれについて、アフリカツメガエル卵母細胞を用いてニコチアナミン分泌機能を検証した。まず、大腸菌を用いて作成したリコンビナントニコチアナミン合成酵素により、市販の14C標識S-アデノシルメチオニンから14C標識ニコチアナミンを調製した。この14C標識ニコチアナミンを用いて候補タンパク質の分泌機能を検証した。アフリカツメガエル卵母細胞の実験については、東北大学工学部の魚住教授の施設に出向いて行った。その結果、候補遺伝子のコードするタンパク質の中から、ニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。このタンパク質について、GFPとの融合タンパク質を発現させ局在解析を行った。解析の結果、このニコチアナミン輸送体候補タンパク質は、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを見出した。この未知オルガネラを明らかにすることにより、これまでに知られていない新規の分泌経路を明らかにできると期待される。(2)イネのニコチアナミン分泌膜輸送体の植物体における役割の解明イネのニコチアナミン分泌膜輸送体ENA1の局在解析のために、GFP-ENA1の融合タンパク質を発現するイネと酵母を作成した。今後細胞内の局在解析を進める予定である。またENA1の発現抑制イネと発現過剰体をイネ形質転換法により作出した。ENA1の必須元素代謝における機能を明らかにする予定である。計画通りに、昨年度までにリストアップされた遺伝子の中から、ニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。イネのニコチアナミン分泌膜輸送体ENA1の局在解析のために、GFP-ENA1融合タンパク質を発現するイネと酵母を作成した。また、ENA1の発現抑制イネと発現過剰体を作出した。

1) A. halleriからのニコチアナミン分泌輸送体の同定これまでにA. halleriからニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。またGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを用いた局在解析の結果、このニコチアナミン輸送体候補タンパク質は、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを見出した。この未知オルガネラを同定しその動態を明らかにすることによって、新規の分泌経路の存在を明らかにできる可能性が示された。この未知オルガネラはトランスゴルジネットワークに関わることが示唆されており、現在さらに解析を続けている。(2)イネのニコチアナミン分泌膜輸送体の植物体における役割の解明形質転換イネを用いたプロモーターGUS解析の結果、ENA1は主に根で発現し、鉄欠乏によって強くその発現が誘導されることが明らかとなった。これまでに、GFP-ENA1融合タンパク質あるいはENA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを作出した。これらの形質転換イネを用いて、ENA1の細胞内局在解析を進めた結果、ENA1は主として細胞膜に局在すること、また細胞質内の未知の小胞状構造にも局在することが明らかになった。ENA1の発現過剰イネと発現抑制イネを形質転換法により作出した。ENA1発現過剰イネを通常培地で栽培すると、根の伸長が抑えられ、根端が膨らんで根毛が密集する特殊な表現型を示した。この表現型は培地に過剰の亜鉛を添加することにより解消された。ENA1が亜鉛の代謝と恒常性維持において重要な機能を果たすことが示唆された。さらに、イネのtos17挿入系統の中からENA1欠損イネを複数同定し、これらの表現型を解析した。欠損イネの生育に大きな違いは観察されなかった。しかし、マイクアレイ解析により詳細に遺伝子発現の差を調べたところ、ENA1欠損が根の色素体におけるストレス反応に影響することが明らかになった。計画通りに、A. halleriからニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定することができた。また、ニコチアナミン分泌輸送体の局在解析を行い、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを明らかにした。この未知オルガネラは、トランスゴルジネットワークに関わることが示唆された。GFP-ENA1融合タンパク質あるいはENA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換イネを作出した。これらの形質転換イネを用いて、ENA1の細胞内局在解析を進めた。ENA1の発現過剰イネと発現抑制イネを形質転換法により作出して解析することにより、植物体におけるENA1の機能を推定した。ニコチアナミン分泌輸送体と想定されるタンパク質を同定し、その局在解析の結果、ニコチアナミン分泌輸送体タンパク質が、細胞膜でも液胞膜でもない未知オルガネラに局在することを明らかにすることができた。これまで明らかになっている細胞内物質分泌経路とは、全く異なる新規の分泌経路が存在する可能性について検証を進める。また、作出したイネニコチアナミン分泌膜輸送体
トランスジェニックマウスを使ったヒスタミン産生細胞の病態解析

ヒスタミンの生体内での産生源を明らかにすべくヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子の発現をモニターするレポーターマウスを作製した。ヒスタミンは必須アミノ酸の一種であるヒスチジンから生体内唯一の酵素であるHDCを介して産生されるため、この遺伝子の発現をモニターすることによりヒスタミンの産生について考察できる。まずHDC遺伝子の含まれるBAC (bacterial artificial chromosome)クローンを鋳型として、HDC遺伝子の一部を増幅し、pGEM-T vectorに導入し、このプラスミッド内で遺伝子改変をおこなった。その後、BACとの間で相同組み換えを利用して、第一エクソン部位にGFPを挿入したBACを準備し、このコンストラクトをマウス受精卵に打ち込みトランスジェニックマウスを用意した。このマウスが脳視床下部や胃体部におけるGFP発現は免疫染色で確認しているがHDC産生細胞と一致しているかどうかについて確認が必要である。そこで本研究ではレポーターマウスから摘出した胃におけるGFPとHDCの免疫染色を遂行し、染色パターンはGFPとHDCで一致していることが判明した。また小腸壁での細胞においては、肥満細胞の他に、好酸球や好塩基球にも蛍光の発光がみられ、現在まで考えられていた以上に多種類の血液細胞にヒスタミンが存在する可能性が出てきている。このため、今後様々な病態モデルを使った実験においても新たなヒスタミン産生細胞を認める可能性が高いと考え、今後も引き続いて他施設にて評価されていくことになると考えている。ヒスタミンの生体内での産生調節機構については不十分な点が多く、本研究は産生源を明らかにすべくHDC遺伝子の発現をモニターするレポーターマウスを作製し、産生細胞および産生の調節機構を明らかにしようとしている。ヒスタミンは必須アミノ酸の一種であるヒスチジンから生体内では唯一の酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)を介して産生されるためこの遺伝子の発現をモニターすることによりヒスタミンの産生について考察することが可能である。交付申請書にも記載した通り、脳視床下部や胃体部におけるGFP発現は免疫染色で確認しているがHDC産生細胞と一致しているかどうかについて確認が必要であった。そこで本研究ではレポーターマウスから摘出した胃におけるGFPとHDCの免疫染色を遂行した。近接する切片を使ってGFPの一次抗体(Cell Signaling Technology)とHCDの一次抗体(Acris Antibody)を反応させ、その後、ペルオキシダーゼを標識した二次抗体と反応させ、DAB染色キットを用いて二次抗体が結合した部位を褐色に発色させた。染色パターンはGFPとHDCで一致していることが判明した。このため、今後様々な病態モデルを使った実験においても新たなヒスタミン産生細胞を認める可能性が高いと考えている。そこで、当該年度は2, 4, 6-trinitro-1-chlorobenzene (TNCB)を繰り返しマウス背部に塗ることによって、マウスに慢性アレルギー性接触皮膚炎を誘導し、皮膚におけるGFP陽性細胞を、抗GFP抗体を用いた免疫組織学的な染色方法と、蛍光顕微鏡による緑色蛍光の確認を行ない、慢性アレルギー性皮膚炎におけるHDCの発現細胞を観察する。さらに、その後、皮膚の構成細胞をFACSによって分画し、HDC陽性細胞の同定を行なう。交付申請書には研究の目的として、ヒスタミンの産生細胞の解明やHDC遺伝子の転写調節機構の解明が掲げられている。27年度はそのなかで、トランスジェニックマウスを用いた蛍光発光の確認を終了し、種々の病態モデルマウスにおける発現遺伝子の解析をすることとなっている。実績の概要で記載した通り、胃の染色においてはほぼ確実にGFP発現細胞とHDC発現細胞は一致した。ドイツのLeibniz-Center for Medicine and BiosciencesのDr. Zane Orinskaとのやりとりで、ヒスタミンを特異的に染色するHistamine Blueの存在が明らかになり、現在試薬を取り寄せたが、入手後この試薬ではHistamineが確実に染まらなことがわかった。

そこで、現在は2, 4, 6-trinitro-1-chlorobenzene (TNCB)を繰り返しマウス背部に塗ることによって、マウスに慢性アレルギー性接触皮膚炎を誘導し、皮膚におけるGFP陽性細胞を、抗GFP抗体を用いた免疫組織学的な染色方法と、蛍光顕微鏡による緑色蛍光の確認を行ない、慢性アレルギー性皮膚炎におけるHDCの発現細胞を観察する。さらに、その後、皮膚の構成細胞をFACSによって分画し、HDC陽性細胞の同定を行なう。この病態モデルを中心に、転写レベルでのコントロールとヒスタミン量との関連性も染色によって明らかにしようとしている。このことによって、転写のコントロールばかりではなく、ヒスタミン産生の多段階的なメカニズムに迫れる実験系を構築できる可能性が出てきている。ヒスタミンの生体内での産生源を明らかにすべくヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子の発現をモニターするレポーターマウスを作製した。ヒスタミンは必須アミノ酸の一種であるヒスチジンから生体内唯一の酵素であるHDCを介して産生されるため、この遺伝子の発現をモニターすることによりヒスタミンの産生について考察できる。まずHDC遺伝子の含まれるBAC (bacterial artificial chromosome)クローンを鋳型として、HDC遺伝子の一部を増幅し、pGEM-T vectorに導入し、このプラスミッド内で遺伝子改変をおこなった。その後、BACとの間で相同組み換えを利用して、第一エクソン部位にGFPを挿入したBACを準備し、このコンストラクトをマウス受精卵に打ち込みトランスジェニックマウスを用意した。このマウスが脳視床下部や胃体部におけるGFP発現は免疫染色で確認しているがHDC産生細胞と一致しているかどうかについて確認が必要である。そこで本研究ではレポーターマウスから摘出した胃におけるGFPとHDCの免疫染色を遂行し、染色パターンはGFPとHDCで一致していることが判明した。また小腸壁での細胞においては、肥満細胞の他に、好酸球や好塩基球にも蛍光の発光がみられ、現在まで考えられていた以上に多種類の血液細胞にヒスタミンが存在する可能性が出てきている。このため、今後様々な病態モデルを使った実験においても新たなヒスタミン産生細胞を認める可能性が高いと考え、今後も引き続いて他施設にて評価されていくことになると考えている。交付申請書には研究の目的として、ヒスタミンの産生細胞の解明やHDC遺伝子の転写調節機構の解明が掲げられている。26年度はそのなかで、トランスジェニックマウスを用いた蛍光発光の確認を終了し、腹膜炎モデルの解析や、高GFP細胞における発現遺伝子の解析をすることとなっている。実績報告書の項で記載した通り、胃の染色においてはほぼ確実にGFP発現細胞とHDC発現細胞は一致した。