hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無電解めっき法による超平滑・超薄膜設計のための微細構造の精密制御

機能性薄膜の作製法として高いポテンシャルを持っている無電解めっき法による機能性めっき膜形成時の、核発生と成長のプロセスを解明するため、触媒核の密度や活性、めっき膜中の微量元素導入と膜の粒子性との関連に注目した検討を行い、無電解めっき法による超平滑膜、超薄膜作成のための設計指針を得る事を目的として立案されている本研究のうち、本年度は昨年度の研究成果にもとづき、種々の触媒化プロセスの比較、膜の初期析出におよぼすめっき膜側の因子等を検討し、初期析出形態をモデル化し、めっき膜の微細構造の制御指針を得ることを目的とする以下の検討を行った。まず触媒化プロセスの違いが初期析出速度にどのように影響を及ぼすか検討した。濃度の異なる触媒化処理液や蒸着して作製した触媒核について初期析出速度に及ぼす影響を調べたところ、触媒核の密度が高いと思われる条件で、大きな初期析出速度が得られる事がわかった。次に核成長抑制因子の検討として、PやBといった不純物元素の含有量を変化させた無電解めっき膜について前項と同様の検討を行ったところ、不純物元素の含有量が少ない場合に大きな初期析出速度が得られる事がわかった。以上の検討で得られた初期析出膜の形態のモデル化を試みたところ、触媒化プロセスや不純物元素の含有量の違いはあまり形態に反映されないことがわかった。本研究より、高機能めっき薄膜を得るための最も本質的要素である、超平滑膜、超薄膜作成のための微細構造の制御指針としては、めっき触媒核を緻密に微細に付与することが最も重要である事が明らかとなった。機能性薄膜の作製法として高いポテンシャルを持っている無電解めっき法について、めっき触媒核の密度と初期析出膜の粒子径等との関連に注目した検討を行いめっき膜の初期形成プロセスを調べ、これを類別化して無電解めっき法による高機能薄膜設計、特に超平滑膜、超薄膜作成のための設計指針を得る事を目的として以下の検討を行った。1.基板の前処理条件の検討所望膜厚のNi系等の無電解めっき膜を、再現性良く作成する基板の前処理条件を調べた。2.初期析出膜、触媒核の顕微鏡観察蒸着装置を購入し、カーボン蒸着膜を作成する条件を確立し、前項で作成された基本的な系の膜の初期析出形態を観察する条件設定を行った。3.初期析出過程のシミュレーションの準備パーソナルコンピュータを購入し、前項の条件で観察される初期析出形態を再現するような膜成長のアルゴリズムを検討した。4.触媒化プロセスの検討様々な密度の触媒核を基板上に付与するような触媒化プロセスとして上記めっき膜の析出速度を大きく変化させる条件を探索したところ、触媒化処理液のうち塩化すずと塩化パラジウム溶液の濃度を変化させることにより、めっき膜の初期析出速度が大きく変化することがわかった。
実用的リアルタイムナノスコピーを実現する機能性色素・タグドメインシステムの開発

本研究は、提案する機能性色素とタグドメインの結合解離による蛍光明滅反応を利用した一分子位置決定法を基に、生きている細胞において目的分子のナノスケール動態を明らかにする超解像イメージング技術を開発することを目的とする。本年度は、前年度に開発した機能性色素・タグドメインのプロトタイプを基に、両者の結合解離特性の最適化を目的として2種類のスクリーニングを実施した。1つ目のスクリーニングとして、スキャニング変異導入法を用いた網羅的な解析を行い、タグドメインの色素結合に関わるアミノ酸について検証を行った。その結果、色素の結合が見られなくなるアラニン変異導入部位を見出し、その部位を他のアミノ酸で置換することにより、結合した機能性色素が高速に解離する変異タグドメインの同定および取得を達成した。また、2つ目のスクリーニングとして、機能性色素の構造展開を行い、合成した10種類以上の誘導体を対象としてタグドメインからの解離特性について評価した。その結果、元の機能性色素と比較して高速に解離する誘導体を見出し、さらに、先に取得した変異を導入したタグドメインと組み合わせることでより高速に解離することを明らかにした。続いて、開発した技術を生きている神経細胞に応用してイメージングの特性を評価した。タグドメインを付した標的タンパク質を発現させた神経細胞に機能性色素を負荷することで、標的タンパク質を特異的に蛍光染色することが可能であった。さらに、蛍光明滅反応を利用した一分子位置決定法により、生きている神経細胞において目的とするシナプス分子の超解像イメージングが可能であることを示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、提案する機能性色素とタグドメインの結合解離による蛍光明滅反応を利用した一分子位置決定法を基に、生きた細胞において目的分子のナノスケール動態を明らかにする超解像イメージング技術を開発することを目的とする。本年度は、機能性色素・タグドメインのプロトタイプ技術の開発を実施した。機能性色素は蛍光色素と消光団をリンカーで結合したハイブリッド分子を指し、複数の候補分子を合成して評価を行ったところ、単独で強く消光する機能性色素候補の取得に成功した。一方、タグドメインの開発では、低分子である消光団に対して特異的に結合する抗体を取得するため、消光団を複数標識したキャリアタンパク質を抗原としてマウスに免疫を行い、定法に従って抗消光団抗体を産生する細胞株を取得した。さらに、取得した抗体を一本鎖抗体へと変換してタグドメイン候補を取得した。培養細胞にタグドメイン候補を遺伝子導入し、機能性色素候補を用いて蛍光イメージングを行ったところ、タグドメイン候補を発現する細胞を特異的に蛍光染色することが可能であることを明らかにした。また、顕微鏡実験を通して機能性色素候補・タグドメイン候補により蛍光明滅反応が実現することを確認した。これらの成果は、本年度の目標を達成するものである。さらに検討を進め、ストップトフロー装置を用いて機能性色素候補とタグドメイン候補の結合解離特性の評価を行ったところ、当初予期していたことであるが両分子の解離速度は遅く、提案するリアルタイムナノスコピーの実現のため解離速度の高速化が必要であった。色素・タグドメインの結合解離特性の最適化のため、次年度の計画を前倒しして色素・タグドメインの遺伝学的/化学的スクリーニングについて検討を開始した。本年度に計画していた機能性色素・タグドメインのプロトタイプ技術の開発に成功した。また、次年度に計画していた機能性色素・タグドメインの遺伝学的/化学的スクリーニングについて前倒しして検討を開始することができた。本研究の最終目標である「生きた細胞において目的分子のナノスケール動態を明らかにする超解像イメージング技術の確立」に向けて、研究は当初の計画以上に進展していると判断できる。平成28年度における研究目標を順調に達成し、計画を前倒しして研究を推進することができた。平成29年度は、前年度に得た研究結果を基に、当初の計画通り研究を進めていく。
マグネシウムイオンによる脂肪細胞の生理機能調節メカニズムの解明

本研究ではまず初めに、生体から急性単離した脂肪細胞の細胞生理学的研究に適したプレパレーションの確立を行った。次にこのプレパレーションを用いて、白色脂肪細胞に容積感受性クロライドチャネルが発現しており、脂肪細胞の容積調節に重要な役割を果たしていること、また糖尿病マウスではこのイオンチャネルの発現量が減少していることを明らかにした。さらにマグネシウムによって活性が制御されるMICチャネルが白色脂肪細胞に発現していることを明らかにした。平成20年度は、「研究実施計画」に基づき、単胞性白色脂肪細胞の電気生理学実験向けのプレパレーションを確立した。これを用い、白色脂肪細胞の形質膜に発現するいくつかのイオンチャネルの存在が明らかにした。以前から発現が示唆されていた外向き整流性カリウムチャネルの他に、一過性カリウムチャネル、マグネシウムイオンによって抑制される非選択性カチオンチャネル、細胞膨張によって活性化される容積感受性アニオンチャネルである。本申請研究では、このうち、非選択性カチオンチャネルと容積感受性アニオンチャネルについて詳しく検討を行っている。容積感受性アニオンチャネルに関しては、薬理学的・電気生理学的性質を詳細に検討し、これまでにほかの細胞で報告されている容積感受性アニオンチャネルとの比較検討を行った。このチャネルの白色脂肪細胞での生理機能の一つが、低浸透圧負荷による細胞膨張後の容積調節であることも明らかにし、3月現在、論文投稿中である。また、非選択性カチオンチャネルに関しては現在実験中であるが、細胞内・外のマグネシウムイオンによって抑制されるチャネルであることを明らかにした。これについては生理機能なども含め、平成21年度も引き続き検討を行う。平成20年度のもうひとつの実施計画として白色脂肪細胞における蛍光イメージング技術を用いたマグネシウムイオン動態の解析を掲げていた。今までのところ白色脂肪細胞の蛍光イメージング向けの1プレパレーションの確立ができていない。電気生理実験には使えても、イメージングを行うとなると更に強固な細胞接着が必要であることが明らかとなった。これに関しては21年度も引き続き細胞接着のためのいろいろな基質を検討し、イメージングを可能にする予定である。本年度は、昨年度の研究によって急性単離白色脂肪細胞に機能的に発現することが明らかになった容積感受性クロライドチャネル及びマグネシウムイオンによって抑制される非選択性カチオンチャネルに関して、電気生理学的・薬理学的性質、病態への関与について検討した。糖尿病モデルマウスを用いた検討により、容積感受性クロライドチャネルは、糖尿病マウスの白色脂肪細胞で正常マウスの半分程度まで発現量が減少していることが明らかとなった。このチャネルの発現減少により、糖尿病マウスの白色脂肪細胞の細胞容積調節機能は傷害されていることも明らかとなった。糖尿病マウスを投薬によって治療すると、このチャネルの発現量が回復したことから、容積感受性クロライドチャネルの発現と糖尿病病態の関連が示唆された(論文発表)。白色脂肪細胞に発現する非選択性カチオンチャネルは、細胞内・細胞外のマグネシウムイオンを減少させることで活性化される。このチャネル電流は2-aminopridineによって抑制され(IC_<50>=92μM)、細胞内ATPの枯渇によってrun downする。これらの性質から、このチャネルの分子実体はTRPM7であると考えられ、白色脂肪細胞にTRPM7の発現していることをRT-PCRによって確認した。本年度予定していたsiRNAによる分子同定は、急性単離白色脂肪細胞への導入が成功しなかったため、今後は白色脂肪細胞の初代培養もしくは脂肪細胞株である3T3-L1を用いて検討する。また、細胞内イオンイメージングに関しても、これらの培養細胞を用いて行う必要がある。白色脂肪細胞においてこの非選択性陽イオンチャネルを活性化しうる生理刺激として、β受容体アゴニスト(エピネフリン、BRL37344)、インスリン、高グルコース、ATPを検討したが、ホールセルパッチクランプ下では、これらによる活性化は観察されなかった。
上丘の大規模シミュレーションに基づいた視覚的注意補綴

平成29年の主な実績はふたつあった。(1)上丘シミュレーションの現実化(細胞ひとつひとつのパラメター計測)と(2)ニューロ補綴の実践に必要なモデルの確認だった。(実績1)上丘シミュレーションに関しては、今まで計測していたのは、回路(システム)のパラメターだった。一方、今回はニューロン一つ一つのパラメターを計測してみた。スウェーデンの共同研究をしているKardamakis博士からヤツメウナギの細胞のデータを譲り受け、以前使用していた進化アルゴリズム・マルコフ連鎖モンテカルロ(DE-MCMC)でHodgkin-Huxleyモデルのパラメターを計測した。その結果、ヤツメウナギの実際の細胞と同じ行動を達するモデルを作ることができた。この手法をもって、マウスの上丘のシミュレーションのニューロンのパラメターも計測した。(実績2)視覚注意のニューロ補綴は、上丘を電極で制御する研究である。電気刺激によってもたらされる神経活動のモデルは(実績1)になる。一方、ある神経活動をもたらしたいときに必要な電気刺激の計算は、(実績2)になる。そのいわゆる逆モデルをquantized Kernel Least Mean Squares(qKLMS)をもって学習させた。結果に50ms間隔で上丘シミュレーションの神経活動を、精密的に再現できた。平均は0.92、最低の相関数値は0.81だった。29年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画のとおり、プロジェクトの最初の5ヶ月間は主に上丘のデータのフィッティングをおこなった。5ヶ月の研究の実績として、主にデータ・フィッティングをするソフトウェアのPsweep2と、ニューラルネットワークをGPUでシミュレーションするソフトウェアのNSIMer4を開発して、ソフトウェアを公開するサイトgithubで発表をした。さらにこのソフトウェアで、GPUワークステーションで上丘のスパイキング・ニューラル・ネットワークのシミュレーションをデータにフィッティングできることを実際確認した。このソフトウェアで、1回シミュレーションをする時間を約500倍減少することができた。このスピードアップにより、短時間でさらに正確なデータのフィッティングができることを確認した。微小電気刺激の強度を決定する計算アルゴリズムの開発も一段階した。アルゴリズムの再生核ヒルベルト空間法のソフトウェアを開発して、簡単なニューロンのスパイク列を再現することができることを確認した。研究計画のとおり、プロジェクトの最初の5ヶ月間は主に上丘のスパイキング・ニューラル・ネットワークのシミュレーションを使って、データのフィッティングをおこなった。最初の3ヶ月で、Psweep2のソフトを開発した。その次に、NSIMer4のソフトウェアを開発した。そのソフトウェアを使って、現在研究室にあるGPUワークステーションを使って、シミュレーションを開始した。このシミュレーションによって、実物の脳はある微小電気刺激に対してどんな反応をするかのモデルができた。現在、GPUワークステーションをもってさらにデータのフィッティングをしながら、28年度でおこなう予定の微小電気刺激の強度を決定する計算アルゴリズムの開発をおこなっている。予定より早く強度を決定するモデルの形ができてきて、簡単な複数次元のスパイク列を再生核ヒルベルト空間法で、再現することに成功している。研究計画のとおり、28年度の実績は主に二つある。実績の一つは、本プロジェクトで開発した上丘のスパイキング・ニューロン・ネットワークのシミュレーションを行うための逆問題推定アルゴリズムを開発することに成功した。再生核ヒルベルト空間法を応用した計算アルゴリズムを用いて、上丘の生理学的なデータにフィットしたシミュレーションの活動を再現させるための、最適な微小電気刺激のタイミングと位置を計算することに成功したことである。電気刺激によって誘発した活動と、アルゴリズムで計算した刺激に対して再現した活動の相関は0.98を越えた。開発したアルゴリズムとシミュレーション実験の結果を、本年の神経科学大会で発表する。主な実績のもう一つは、サリエンシー・マップで計算した視覚的な反応を、上丘のスパイキング・ニューロン・ネットワークのシミュレーションで、計算して微小電気刺激で再現させることに成功したことである。数少ない電極で再現させることが可能かが不明であるものの、多数のサリエンシー・マップに対しての反応と再現させた活動の相関は0.81を越えた。本プロジェクトで開発したアルゴリズムやソフトウェアで、さらなる実績が生じている。本プロジェクトで行った実験を参考して、サリエンシー・マップが脳のどこにあるかについての総説を発表した(Veale, Hafed, & Yoshida, 2017)。本プロジェクトで開発した、スパイキング・ニューロン・ネットワークのシミュレーションのパラメターを計測するためのPSWEEP2ソフトをもって、音声認識のためのスパイキング・ニューロン・ネットワークのパラメター計測にも成功して、発表した(Veale & Scheutz,2016)。本プロジェクトは現在までにおおむね順調に進捗している。28年度をもって、研究の計画にしたがって、提案の神経補綴システムに必要な二つの(a)上丘のスパイキング・ニューロン・ネットワークのシミュレーションと(b)逆問題推定のアルゴリズムの開発に成功している。この二つの正確さを確認するために、そして正確さをさらに向上させるために、シミュレーション実験をいくつか行った。その結果を、論文や学会で発表した。システムとして、最後のステップ(c)、(a)と(b)をつなげて、シミュレーションの動物(つまり、ロボット)に実行して、リアルタイムに問題なく動くかの確認を現在行っているところである。刺激に対して上丘がどう反応するかは、本プロジェクトで開発した実験とモデルでおおむね把握している。が、上丘がどういう仕組みで眼球を動かす、網膜からの上丘の入力と、上丘の浅層から深層への入力などの問題に関しては、モデルをつくるには、未だ実験データが不足している。

現在、上丘の浅層から深層へのつながりを明確するために、上丘の異なるスライス実験のデーターをもって、シミュレーションを行っている。平成29年の主な実績はふたつあった。(1)上丘シミュレーションの現実化(細胞ひとつひとつのパラメター計測)と(2)ニューロ補綴の実践に必要なモデルの確認だった。(実績1)上丘シミュレーションに関しては、今まで計測していたのは、回路(システム)のパラメターだった。一方、今回はニューロン一つ一つのパラメターを計測してみた。スウェーデンの共同研究をしているKardamakis博士からヤツメウナギの細胞のデータを譲り受け、以前使用していた進化アルゴリズム・マルコフ連鎖モンテカルロ(DE-MCMC)でHodgkin-Huxleyモデルのパラメターを計測した。その結果、ヤツメウナギの実際の細胞と同じ行動を達するモデルを作ることができた。この手法をもって、マウスの上丘のシミュレーションのニューロンのパラメターも計測した。(実績2)視覚注意のニューロ補綴は、上丘を電極で制御する研究である。電気刺激によってもたらされる神経活動のモデルは(実績1)になる。一方、ある神経活動をもたらしたいときに必要な電気刺激の計算は、(実績2)になる。そのいわゆる逆モデルをquantized Kernel Least Mean Squares(qKLMS)をもって学習させた。結果に50ms間隔で上丘シミュレーションの神経活動を、精密的に再現できた。平均は0.92、最低の相関数値は0.81だった。現在、GPUワークステーションで、Psweep2およびNSIMer4をつかって、上丘のシミュレーションのパラメータ計測を行っている。並行して、微小電気刺激の強度を決定する計算アルゴリズムの開発をおこなっている。次の段階は、再生核ヒルベルト空間法を使って、フィッティングした上丘のシミュレーションのニューロンのスパイク列を再現することに取り組む。今までのシミュレーションの結果を発表する論文の作文を、5月末までにおこなう。今後の研究を主に三つの方向に進める。第一に進める方向は、本プロジェクトの計画の最後の点、つまりサリエンシー・マップと上丘のシミュレーションで計算した電気刺激をもって、ロボットの目を動かすことである。既にiCubロボットのシミュレーションの目を上丘のモデルで動かすことには成功している。
ヒゲムシと化学合成細菌の共生:宿主細胞による細菌の支配の解明に向けて

口も消化管も無いヒゲムシにおいて栄養物を提供してくれる化学合成細菌を、共生させているバクテリオサイトと呼ばれる細胞において、それらの細菌が細胞内でどの場所を占めているかを調べた。その結果、それらの細菌のほとんどは、バクテリオサイトと、その外周にある栄養貯蔵細胞層との間に存在する毛細血管に向いて存在していることが明らかになった。これは細菌の生産物を栄養貯蔵細胞全体に行き渡らすに都合が良いと判断された。環形動物門Siboglinidaeのマシコヒゲムシにおける化学合成細菌との共生関係を明らかにする上で、本年は幾つかの基礎的な新知見を得た。まず、この細菌はエネルギーを得るための基質として硫化水素を必要とするが、それは全硫化物にして海底土壌中に0.5mg/gもあれば十分であること。この濃度は、魚の養殖池の土壌に比べると極めて低い値であることがわかった。また、これまで海底においてヒゲムシ類がどのように触手を出しているかは、想像の域をでなかったが、本研究において世界で初めて生態写真の撮影に成功した。これらの結果は、Zoological Science誌に掲載される。共生細菌は、ヒゲムシの体の後半部にある栄養体のバクテリオサイトに棲むことが電子顕微鏡による研究で知られていたが、栄養体の中でバクテリオサイトがどのように分布するかは不明であった。我々は、共生細菌の16S rDNAの配列を明らかにしてDDBJに登録(AB252051)し、この配列を基にRNAプローブを作成し、ホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、バクテリオサイトは栄養体において腹血管より背血管に向けて左右に立ち上がる羊歯の葉状の構造を取る事が明らかになった。これらの結果は、スエーデンのActa Zoologica誌に掲載される。さらに、本種の共生細菌の16S rDNAの塩基配列を詳細に調べると、ガンマープロテオバクテリアに属し、97.5%以上の相同性を有するが、少しずつ塩基が異なる7つのphylotypeがあることが明らかになった。それらは1個体には1つのタイプしか共生せず、感染の初期と想像されるが、何らかの機構によって共生する細菌は厳密に選択されることが明らかになった。これらの結果は、Microbes and Environments誌に掲載される。本年はタイトルにある通りの研究結果とその背景にある研究結果の2種類を得た。まず共生細菌は、ほとんどが生菌であり、それらは細菌を共生させているバクテリオサイトの細胞内でも栄養貯蔵細胞側にある毛細血管の近くに分布していることが明らかになった。また、リソゾームによって極く少数の共生細菌が消化されているが、それらも毛細血管の近くに認められた。すなわち,バクテリオサイトで起きる種々の化学反応はすべて毛細血管側で行われる可能性が高いと思われる。また、毛細血管そのものをインディアンインクによって立体的に浮かび上がらせることにも成功した。これらは現在、論文として発表すべく準備中である。またヒゲムシ類では共生細菌の数がハオリムシに比べて少なすぎることから、環境中から栄養を得ているのではないか、という説があった。本研究の一環として、それを調べると、体前半部で有機物の多い海底の泥に接している体表にα-グルコシダーゼ様活性を見出した。このことは、泥の中の多糖類をグルコースまで持って行き、それを体表から吸収する可能性を示唆している。この結果はZool.Sci.誌に投入稿し受理された。一方、共生細菌はこれまで16S rRNAの配列からはイオウ酸化細菌とは断言できなかったが、細菌のゲノム上にイオウ酸化に関わる塩基配列(aprA、soxB)を見出し、明らかにこの細菌がイオウ酸化細菌であることを証明した。但し、この細菌はヒゲムシの生息海底に自由生活をしているが、他の一般的な細菌と比べて分布や生息数がヒゲムシの分布と特定の関係にあるとは言えない結果を得た。このことは、ヒゲムシが発生初期にこの細菌と共生関係に陥る時は、それぞれが厳密に相手を区別していることを意味している。この結果は、Microbes Environ.誌に投入稿し受理された。他に、ヒゲムシのヘモグロビンに関する論文も発表した。マシコヒゲムシは、口も消化管も無いが、体に化学合成細菌を共生させて、それが作る炭水化物によって生きている。その細菌を匿っている細胞をバクテリオサイトという。本研究は、そのバクテリオサイトが、感染した細胞をすぐに支配下におき、細菌が必要以上に増殖することを許さないのではないか、宿主の為に働いている細菌には手をつけないが、老化した細菌は消化して栄養としているのではないか、バクテリオサイトは、細胞質における細菌の位置を制御しているのではないか、さらに遺伝子の発現を制御している可能性はないか、を解明するために行った。その結果、バクテリオサイトの中の細菌の数は必ず数個以下で、しかも細菌の細胞壁の一部は必ず、細菌を包んでいる膜に接着させられていた。

この事は、やはり宿主細胞が細菌の数を制御していることを示唆している。さらに、免疫蛍光法を用いるとバクテリオサイトにおけるチューブリンの位置と細菌の存在部位が一致した。さらに電子顕微鏡を用いて詳細に調べると、200個のバクテリオサイトにおいて、細菌の85%は、栄養貯蔵細胞側に偏って存在することが明らかになった。この事は、宿主側が、チューブリンに細菌を乗せてその位置を制御している可能性を示唆している。残りの15%は、おそらく老いた細菌でやがてリソゾームに消化される運命にあると思われる。また、この観察過程で、ほとんどの場合、共生細菌は栄養貯蔵細胞側の毛細血管に接していることがわかった。この事は、共生細菌が生産した物質あるいは老廃物を毛細血管を通して栄養貯蔵細胞側に渡すか、あるいは血流に捨てていることを示唆している。遺伝子を制御しているか田舎は研究を続けている。
MT1‐MMPの中心体制御を介した新規がん形質転換機構の解明

BRCA2はDNA修復、複製、中心体増幅、および細胞分裂において重要な多機能の腫瘍抑制タンパク質である。我々はヒト乳がん細胞株MCF7において、野生型BRCA2(分子量:384kDa)の他に分子量250kDaのBRCA2フラグメントを見出した。これは他の乳がん細胞株SK-BR-3や子宮頸がん由来のHeLaS3でも同様に観察されが,良性乳腺繊維嚢胞症由来のMCF10Aや正常乳腺上皮由来のHMECでは検出されなかった。我々は多重反応モニタリング法(MRM)によりこの250kDaのタンパク質がBRCA2であることを確認した。次にBRCA2を切断する可能性のあるプロテアーゼとして細胞膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼMT1-MMPを考え、BRCA2のN末から約250kDaの位置にMT1-MMPによる切断部位を見出し、この推定切断部位を含むリコンビナントタンパクを基質としたinvitro解析で、MT1-MMPによるリコンビナントタンパクの切断を確認した。この切断は、MT1-MMPの阻害剤によって抑制された。そこで、切断型BRCA2の機能を明らかにするために、BRCA2の切断端に対する抗体を作成し、各々N端側BRCA2フラグメント(N-BRCA2)、C端側BRCA2フラグメント(C-BRCA2)を特異的に認識することを確認した。これを用いて、C-BRCA2が核fociを形成すること、10Gyの放射線照射後、野生型BRCA2の核fociは核中心部から核膜に向かい蛍光強度が増加するのに対しC-BRCA2の核fociの蛍光強度は核内均一であった。以上より、我々はBRCA2がMT1-MMPの基質であり、切断型C-BRCA2が組換え修復や乳がん発生に重要な役割を果たす可能性を示した。我々はヒト乳がん細胞株MCF7において、野生型BRCA2(分子量:384 kDa)の他に分子量250 kDaのBRCA2フラグメントを見出した。これは他の乳がん細胞株SK-BR-3や子宮頸がん由来のHeLaS3でも同様に観察されが、良性乳腺繊維嚢胞症由来のMCF10Aや正常乳腺上皮由来のHMECでは検出されなかった。我々は多重反応モニタリング法(MRM)によりこの250 kDaのタンパク質がBRCA2であることを確認した。次にBRCA2を切断する可能性のあるプロテアーゼとして細胞膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼMT1-MMPを考え、BRCA2のN末から約250 kDaの位置にMT1-MMPによる切断部位を見出し、この推定切断部位を含むリコンビナントタンパクを基質としたin vitro解析で、MT1-MMPによるリコンビナントタンパクの切断を確認した。

我々はヒト乳癌由来のMCF7細胞の細胞調製液に対してBRCA2抗体によるイムノブロットを行った場合、野生型BRCA2(分子量:384 kDa)の他に分子量250 kDaに相当するバンドが検出されることを見出した。これは他の乳癌由来のSK-BR-3細胞や子宮頸癌由来のHeLaS3細胞でも同様に観察される。しかし、良性乳腺繊維嚢胞症由来のMCF10A細胞や正常乳腺上皮由来のHMEC細胞からは検出されなかった。本研究では、この250 kDaのタンパク質に注目し、これがBRCA2由来のタンパク質であることを検証し、その形成機序の解明を通してBRCA2の新しい生理的機能を見出すことを目的とした。初めに250 kDaのタンパク質の同定を行った。MCF7細胞の細胞調製液をSDS-PAGEに展開して250 kDaのタンパク質を抽出し、多重反応モニタリング法(MRM)を用いてBRCA2タンパク質を同定した。次にこの250 kDaの切断型BRCA2の形成機序について検討したところ、これまでの知見から、BRCA2を切断する可能性のあるプロテアーゼとして細胞膜結合型マトリクスメタロプロテアーゼMT1-MMPを候補に考えた。そこでBRCA2がMT1-MMPの基質であるかを検証するため、プロテアーゼデータベース検索を行いMT1-MMPによるBRCA2の切断部位を推定した。この切断部位は、BRCA2のN末から約250 kDaの位置に存在し、またこの推定切断部位を含む領域のリコンビナントタンパクを基質としたin vitroでの実験系で、MT1-MMPによるリコンビナントタンパクの切断を確認した。この切断は、MT1-MMPの阻害剤によって抑制され、さらに合成ペプチドを作製して詳細な切断部位の同定を行った。以上のことから癌細胞でBRCA2がMT1-MMPによって切断されることを明らかにした。これまでの研究成果と研究の背景をもとに、本研究はMT1-MMPによって切断されたBRCA2タンパク質の生理的機能を調べ、また、MT1-MMPの中心体での新しい基質を探索し、それらの情報を基盤にMT1-MMPの中心体での新機能の解明へと発展させる。研究期間内に以下のことを明らかにする計画であった。1) MT1-MMPによる切断BRCA2と結合するタンパク質を同定する。2) MT1-MMPによるBRCA2の切断部位を同定する。3) BRCA2の切断部位特異的認識抗体を作製し、細胞周期における細胞内の局在を観察する。4)上記抗体を用いて、正常と癌組織おいて切断型BRCA2の発現量を比較する。5)中心体におけるMT1-MMPの新しい基質を探索する。我々は、BRCA2の切断部位特異的認識抗体の作製を完了した。これより、研究計画は順調に進んでいると判断する。切断型BRCA2の発現、および機能解析のため切断部位のペプチドを抗原として作製した切断型認識抗体(ポリクローナル抗体)の特異性を確認後、組織アレイを用いて、正常と乳癌組織での切断型BRCA2の発現比較を行うため組織免疫染色を行う(正常、および乳癌組織での切断型BRCA2の発現の比較)。また、野生型をBRCA2と切断型BRCA2の局在の比較を行うため間接蛍光抗体法を用いて乳癌細胞株でその局在を観察し、また癌の浸潤に切断型BRCA2が影響を及ぼすのかを明らかにする(切断型BRCA2の細胞内の局在および機能解析)。
新しい離散剛要素法(DEM)お用いた地盤・岩盤の粒状体的挙動の解明

従来の粘弾性型DEMに代えて,要素間の接触による塑性エネルギ-消失と残留変形を定式化した弾塑性型DEMを開発し,さらに,固体要素間の接触力伝達を基本とするDEMに,要素間空隙を満たす間隙水の流動と水圧作用を取り込んだ連成型DEMを導入した.これを用いて地盤の圧密現象や液状化現象の機構の研究を進めた.しかしながら,弾塑性型DEMでは,塑性定数の決定に依存し過ぎる傾向があることが明らかとなった.そこで,円形要素の規則配列を基本にして,適当な要素の剛性を逓減することによって自由な空隙の創成と崩れ易い骨格構造のモデル化への発展を目指した.その結果,圧密におけるeーlogP曲線と繰返し荷重下の間隙水圧の上昇過程を再現し,飽和砂質地盤の解析法としての有効性を示した.一方,亀裂性岩盤への適用に対しては,割れ目粗さのフラクタル次元解析による評価を,導入した.さらに,不連続面の分布性状に単純化を施して不連続性岩盤斜面の崩壊形状を静的・動的な面から詳細に検討した.特に最終年度では,実際に生じた岩盤斜面崩壊に適用を試み,現場条件の変化にともない数種の崩壊パタ-ンが存在しうること.特に岩盤斜面特有のトップリング崩壊が生じた可能性が高いことを示した.このことは,DEMが岩盤斜面の崩壊様式と原因の推定に大きな役割を果たすことを示すものであり,斜面安定性評価法としての実用性を裏付けるものである.以上のような,DEMの基本的拡張と一般的な岩盤及び土質工学問題への粒状体的手法の適用と考察という本研究の主たる目的を達成したのち,DEMの基本原理を活かしながら,要素間の連続性を保持したまま,全体としての大変形から流動までを解析できる新たな手法“流動要素法"の定式化を示した.従来の粘弾性型DEMに代えて,要素間の接触による塑性エネルギ-消失と残留変形を定式化した弾塑性型DEMを開発し,さらに,固体要素間の接触力伝達を基本とするDEMに,要素間空隙を満たす間隙水の流動と水圧作用を取り込んだ連成型DEMを導入した.これを用いて地盤の圧密現象や液状化現象の機構の研究を進めた.しかしながら,弾塑性型DEMでは,塑性定数の決定に依存し過ぎる傾向があることが明らかとなった.そこで,円形要素の規則配列を基本にして,適当な要素の剛性を逓減することによって自由な空隙の創成と崩れ易い骨格構造のモデル化への発展を目指した.その結果,圧密におけるeーlogP曲線と繰返し荷重下の間隙水圧の上昇過程を再現し,飽和砂質地盤の解析法としての有効性を示した.一方,亀裂性岩盤への適用に対しては,割れ目粗さのフラクタル次元解析による評価を,導入した.さらに,不連続面の分布性状に単純化を施して不連続性岩盤斜面の崩壊形状を静的・動的な面から詳細に検討した.特に最終年度では,実際に生じた岩盤斜面崩壊に適用を試み,現場条件の変化にともない数種の崩壊パタ-ンが存在しうること.特に岩盤斜面特有のトップリング崩壊が生じた可能性が高いことを示した.このことは,DEMが岩盤斜面の崩壊様式と原因の推定に大きな役割を果たすことを示すものであり,斜面安定性評価法としての実用性を裏付けるものである.以上のような,DEMの基本的拡張と一般的な岩盤及び土質工学問題への粒状体的手法の適用と考察という本研究の主たる目的を達成したのち,DEMの基本原理を活かしながら,要素間の連続性を保持したまま,全体としての大変形から流動までを解析できる新たな手法“流動要素法"の定式化を示した.亀裂性岩盤や砂質地盤において、トンネル内空変位や地表沈下、あるいは斜面崩壊や地すべりの問題などを考えるとき、重力場における粒状体の流動現象としての考察が有効である。その際、それらの現象には種々の破断面の形成と回復あるいは大変形など応力や変位のジャンプを含むため、従来の塑性解析や有限要素法のような連続体的手法からの拡張では不十分であり、独立粒子(あるいはブロック)の集合体としての粒子の自由な離散化と回転運動を許すところの離散剛要素法(個別要素法、以下DEMと略す)にして初めて可能であると考えられる。本研究では、従来の粘弾性型DEMにかえて、要素間の接触による塑性エネルギ-消失と残留変形を定式化した弾塑性型DEMを開発し、さらに、固体要素間の接触力伝達を基本とするDEMに、要素間空隙を満たす間隙水の流動と水圧作用を取り込んだ連成型DEMを導入した。これを用いて地盤の圧密現象や液状化現象の機構の研究を進めている。一方、亀裂性岩盤にDEMを適用する際に重要となる割れ目粗さの評価法として、フラクタル次元解析の導入を検討している。その基礎として、今年度はフラクタル次元解析による粒状体のせん断特性の評価法について成果を取りまとめた。また,DEMの要素定数の検討と実岩盤への適用性に関連して、現在最も注目されている岩盤斜面の動的安定性の問題を採り挙げて、DEMの適用性を検討した。

前年度において,従来の粘弾性型DEMにかえて,要素間の接触による塑性エネルギ-消失と残留変形を定式化した弾塑性型DEMを開発し,さらに,固体要素間の接触力伝達を基本とするDEMに,要素間空隙を満たす間隙水の流動と水圧作用を取り込んだ連成型DEMを導入している.本年度においては,これを用いて地盤の圧密現象や液状化現象の機構の研究を進めた.しかしながら,弾塑性型DEMでは,塑性定数の決定に依存し過ぎる傾向があることが明らかとなった.そこで,円形要素の規則配列を基本にして,適当な要素の剛性を逓減することによって自由な空隙の創成と崩れ易い骨格構造のモデル化への発展を目指した.その結果,圧密におけるeーlogP曲線と繰返し荷重下の間隙水圧の上昇過程を再現し,飽和砂質地盤の解析法としての有効性を示した.一方,亀裂性岩盤へのDEMの適用に対しては,前年度の割れ目粗さのフラクタル次元解析による評価および不連続性岩盤斜面の崩壊形状の静的・動的な面からの検討に引き続いて,本年度は実際に生じた岩盤斜面崩壊に適用を試みた.そして,現場条件の変化にともない数種の崩壊パタ-ンが存在しうること,特に岩盤斜面特有のトップリング崩壊が生じた可能性が高いことが示された.このことは,DEMが岩盤斜面の崩壊様式と原因の推定に大きな役割を果たすことを示すものであり,斜面安定性評価法としての実用性を裏付けるものであろう.以上のような,DEMの基本的拡張と一般的な岩盤及び土質工学問題への粒状体的手法の適用と考察という本研究の主たる目的を達成したのち,DEMの基本原理を活かしながら,要素間の連続性を保持したまま,全体としての大変形から流動までを解析できる新たな手法"流動要素法"の定式化を示した.
欧米が日本から学ぶ金融危機への対策

本研究の目的は日本の金融危機の経験から欧米が学べることは何かを明らかにすることである。まず1990年代後半から加速している日本の銀行合併の効果の定量分析を行った。合併はコスト削減には効果があるが全体では利益を引き下げることが分かった。次にアメリカの公的資本注入を分析した。定量分析の結果、資本注入の効果は限定的であった。銀行の自己資本増強には効果があったが、不良債権処理には効果がなく、貸出は逆に減少した。アメリカの政府系研究機関からデータを集め、2008年にアメリカで起きた金融危機の主な出来事と、それに対する政府の対応を詳細に調査した。政府の対応策は主に、銀行の合併、資産買い取り、流動性供給、預金保険の引き上げなどである。この研究では、その柱になっている公的資金注入を定量的に分析し、日本政府が90年代後半に取った金融危機に対する対応策と比較することである。以下は、この研究で取り上げたアメリカ政府の公的資金注入政策である。なお、数字の部分はこれまで公表されておらず、過去一年間の研究の結果得られたものである。10月14日7,000億ドルの問題資産救済プログラム(TARP)の金額が資本注入。〓米国財務省の資本注入・10月14日・大手銀行:バンク・オブ・アメリカ銀行(250臆ドル)、JPモルガン(250臆ドル)、シティーバンク銀行(250臆ドル)、ウェルズファーゴ銀行(250臆ドル)、ゴールドマン・サックス(100億ドル)、モルガン・スタンレー(100億ドル)、バンク・オブ・ニューヨーク銀行(30億ドル)、ステート・ストリート銀行(20億ドル)〓米国財務省の資本注入・10月30日・地方銀行:PNC銀行(77億ドル)、キャピタルウォン銀行(35.5億ドル)、リージョンズ銀行(35.5億ドル)、ハンティントンナショナル銀行(14臆ドル)、ノーザン・トラスト銀行(15億ドル)、サントラスト銀行(35億ドル)、コメリカ銀行(22.5億ドル)、フィフスサード銀行(34億ドル)。現在、データ収集を続けているが、日米両政府が取った金融政策は共に非有効的であると明らかになりつつある。更に研究を続けることにより、明確な根拠を提示できると考えている。2007年の世界金融危機でアメリカを含む多くの国が行った政策は、1990年代後半の金融危機で日本が行った政策と幾つもの共通点がある。主な政策のうち銀行の合併と公的資本注入を分析した。まずアメリカは資本注入の前に合併促進を通して経営が悪化した銀行を救済しようとした。そこで本研究も1990年代後半から加速している日本の銀行合併の効果の分析から始めた。定量分析の結果、合併はコスト削減には効果があるものの、全体的にみると収入を引き下げることが分かった。コスト削減は規模の経済や商品の多様化などからきているようだった。日本と同様大手行が「メガバンク」に収束したアメリカでの合併も同様の効果を持つと考えられる。次にアメリカの公的資本注入を日本の過去の研究と照らし合わせつつ分析した。過去の研究のうちMontgomery and Shimizutani (2009)は(1)素早い実施(2)十分な規模(3)それぞれの銀行の資本査定、の重要性を指摘している。アメリカは約1カ月で資本注入を行い実施は早かった。しかし準備された金額はGDP比で日本の約70%弱と少なく、また主要銀行に対し一律に資本を注入した。定量分析を行った結果、アメリカでの資本注入の効果は予想通り限定的であった。銀行の自己資本比率の増加には一定の効果があったものの、不良債権の処理には効果がなく、貸出は逆に減少した。アメリカは2009年にも資本注入を行っている。2008年と違い規模も大きく、銀行の資産査定を実施したうえで行っているため、日本の経験に照らし合わせると大きな効果を期待できる。
新規環構築反応の開発と生理活性天然物合成への応用

立体かつ位置選択的な炭素-炭素結合の生成は有機合成化学において最も重要な課題である.そこで同一分子内に複数の官能基を配し,その軌導の再編成に基ずく新たな結合生成によって環構築を行い,立体かつ位置選択的な炭素-炭素結合の形成を検討した.その結果,次の三手法を開発することに成功した.1.分子内連続ミカエル・アルドール反応:同一分子内にケトンと不飽和エステル基を持つ化合物に対して,過去には不可能であった連続的なミカエル・アルドール反応を行う2種の反応条件を開発した.両反応条件は相補的に利用出来,多様な基質に対して応用が可能となった.本反応によって,他の方法では構築困難な四員環に縮環した多環性化合物を,立体選択的に一行程で合成することが出来,エンディアンドリン酸,イタリセン,フィリオホロン等の天然物の基本骨格の合成に成功した.2.イオウ原子媒介型分子内連続ミカエル反応:不飽和エステル基とβ位にスルフェニル基を持つ共役エノンが同一分子内に存在する化合物に対して,分子内の連続するミカエル反応を行って,多環性化合物を合成する新手法の開発に成功した.この結果,ステロイドあるいは種々のテルペンを合成する際の,重要合成中間体となるトランスヒドインダン類を立体選択的に合成した.さらに反応機構を明らかに出来た.3.連続酸無水物生成・ミカエル反応:キラルなモノ置換マロン酸の半エステルに対して塩基条件下に不飽和カルボン酸ハライドを作用させて,酸無水物生成にひき続くミカエル反応を行って,環状酸無水物を合成する新反応を開拓した.本反応はジアステレオ面選択的に進行し,新たな第四不斉中心を立体選択的に構築することが出来る.この手法によって種々のインドールアルカロイドの有用な合成中間体を光学活性体として製造した.立体かつ位置選択的な炭素-炭素結合の生成は有機合成化学において最も重要な課題である.そこで同一分子内に複数の官能基を配し,その軌導の再編成に基ずく新たな結合生成によって環構築を行い,立体かつ位置選択的な炭素-炭素結合の形成を検討した.その結果,次の三手法を開発することに成功した.1.分子内連続ミカエル・アルドール反応:同一分子内にケトンと不飽和エステル基を持つ化合物に対して,過去には不可能であった連続的なミカエル・アルドール反応を行う2種の反応条件を開発した.両反応条件は相補的に利用出来,多様な基質に対して応用が可能となった.本反応によって,他の方法では構築困難な四員環に縮環した多環性化合物を,立体選択的に一行程で合成することが出来,エンディアンドリン酸,イタリセン,フィリオホロン等の天然物の基本骨格の合成に成功した.2.イオウ原子媒介型分子内連続ミカエル反応:不飽和エステル基とβ位にスルフェニル基を持つ共役エノンが同一分子内に存在する化合物に対して,分子内の連続するミカエル反応を行って,多環性化合物を合成する新手法の開発に成功した.この結果,ステロイドあるいは種々のテルペンを合成する際の,重要合成中間体となるトランスヒドインダン類を立体選択的に合成した.さらに反応機構を明らかに出来た.3.連続酸無水物生成・ミカエル反応:キラルなモノ置換マロン酸の半エステルに対して塩基条件下に不飽和カルボン酸ハライドを作用させて,酸無水物生成にひき続くミカエル反応を行って,環状酸無水物を合成する新反応を開拓した.本反応はジアステレオ面選択的に進行し,新たな第四不斉中心を立体選択的に構築することが出来る.この手法によって種々のインドールアルカロイドの有用な合成中間体を光学活性体として製造した.
色受容細胞の多様化を担う転写因子とエンハンサーによる遺伝子発現制御

脊椎動物の視細胞である錐体は明るい場所での視覚を担う。特に、互いに異なる波長感受性を示す錐体サブタイプの組み合わせによって色覚が生じる。昨年度までの研究により、4種類の錐体サブタイプ(UV、青、緑、赤)を持つゼブラフィッシュにおいて、Six3サブファミリーに属する3種類の転写因子six6a,six6b,six7が青色・緑色感受性の錐体型光受容タンパク質(錐体オプシン)の発現に必須であると見出した。本年度は、これら転写因子の作用機序に迫るため、クロマチン免疫沈降と定量PCR(ChIP-qPCR)を用いて転写因子が相互作用するゲノム領域を探索した。FLAGタグ付きのsix6bとsix7それぞれが視細胞特異的に過剰発現する複数のトランスジェニック系統(昨年度に樹立)の網膜を用い、抗FLAG抗体を用いてChIP-qPCRを行った。その結果、青色感受性オプシンのプロモーターと、緑色感受性オプシンのプロモーターとエンハンサーそれぞれにsix6bやsix7が結合することを見出した。そこで、six6bやsix7が結合するDNA領域をゲノムワイドに同定し、six6bやsix7のターゲット遺伝子の網羅的な探索を試みた。共同研究により、免疫沈降したDNAサンプルを次世代シーケンサーに供してChIP-seq解析を行った。得られた結合領域から、それぞれの転写因子が標的とする遺伝子を算出した。さらに遺伝子オントロジーエンリッチメント解析(GO解析)を行い、これら転写因子が制御する遺伝子群の生物学的機能を類推した。その結果、錐体オプシンに加え、錐体型の光シグナリング分子や、さらには錐体の発生や分化に必須の分子をコードする遺伝子がsix6bとsix7のターゲット遺伝子であることを見出した。これらの結果よりsix6bとsix7は錐体オプシン遺伝子だけではなく、視細胞の分化や成熟に寄与する分子群を発現制御することによって、青・緑色感受性の錐体細胞のアイデンティティを規定すると考察した。29年度が最終年度であるため、記入しない。脊椎動物の視細胞である錐体には、互いに異なる波長感受性を示すサブタイプが複数存在し、これらの組み合わせによって色覚が生じる。4種類の錐体サブタイプ(UV、青、緑、赤)を持つゼブラフィッシュを用いた研究代表者の以前の研究により、転写因子six6bが青色感受性の錐体オプシンの発現に必要であることを見出した。本年度は、視細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモーターを用い、six6bを視細胞特異的に過剰発現するトランスジェニック系統を樹立した。さらに、青色感受性と緑色感受性の錐体オプシン両方の発現量が顕著に減少するsix7ノックアウト(KO)個体と樹立したトランスジェニック系統を掛け合わせ、six7 KO個体におけるsix6b過剰発現の効果を検証した。その結果、six6b過剰発現により、青色感受性と緑色感受性の錐体オプシンの発現量がともに有意に上昇し、six6bは中波長領域感受性の2種類の錐体オプシンの遺伝子発現に寄与することを見出した。真骨類や霊長類に属す複数の種において、局所的な遺伝子重複によって錐体オプシンの数が倍加している。それぞれの錐体オプシンは異なる光波長感受性を備えかつ別々の視細胞に発現し、色弁別能を向上させる。近年、倍加した錐体オプシンの発現を制御するエンハンサーの存在が示された。錐体細胞において遺伝子発現を担うエンハンサーの網羅的な同定を目指し、エンハンサー領域とプロモーター領域に生じるヒストン修飾に着目した。H3K27acとH3K4me3をそれぞれ特異的に認識する抗体を用い、ゼブラフィッシュ網膜をサンプルとしてクロマチン免疫沈降と定量PCRを行った。その結果、錐体特異的に発現する光シグナリング伝達タンパク質Gnat2のプロモーター領域において抗体特異的なシグナルが観察され、ゼブラフィッシュ網膜における転写活性化領域に特異的なヒストン修飾の検出に成功した。研究代表者の過去の研究により、six7遺伝子が緑色感受性オプシンの遺伝子発現を制御することを見出していた。six7遺伝子は条鰭類(スポッティッドガーや真骨類を含む分類)において保存されている一方、他の脊椎動物種において確認されていない。本年度の研究により、six7と同じSix3サブファミリーに属すsix6bが青色・緑色感受性オプシン両方の遺伝子発現を制御することを見出し、条鰭類以外の脊椎動物においてはsix6がこれら2種類の中波長領域感受性の錐体オプシンを制御する可能性を見出した。さらに今後、six6を認識する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、six6bが作用するゲノム領域を同定する。これより、six6bに発現制御されかつ、錐体オプシンの遺伝子発現に寄与する新規遺伝子の同定が期待できる。また、錐体オプシンの遺伝子発現制御に必要なエンハンサーやプロモーター領域の同定も期待できる。錐体に特異的に発現する光シグナリング伝達タンパク質Gnat2のプロモーター領域においてヒストン修飾を認識する抗体特異的なシグナルが観察された。さらに今後、免疫沈降を行なったサンプルを、超並列シーケンサーを用いて解読することにより、網膜において生じるエンハンサー領域を網羅的に同定することができる。さらに当研究室にて過去に同定された錐体特異的に発現する遺伝子セットに着目し、それらの周辺に存在するエンハンサー領域を先の網羅解析からあぶり出し、錐体特異的な発現を誘導するエンハンサー領域の同定が期待できる。一方、錐体サブタイプ

特異的に発現するそれぞれの錐体オプシン遺伝子の周辺において、ヒストン修飾抗体由来のシグナル検出には成功していない。錐体サブタイプ特異的なエンハンサーを同定するために、さらなる条件検討を行う必要がある。脊椎動物の視細胞である錐体は明るい場所での視覚を担う。特に、互いに異なる波長感受性を示す錐体サブタイプの組み合わせによって色覚が生じる。昨年度までの研究により、4種類の錐体サブタイプ(UV、青、緑、赤)を持つゼブラフィッシュにおいて、Six3サブファミリーに属する3種類の転写因子six6a,six6b,six7が青色・緑色感受性の錐体型光受容タンパク質(錐体オプシン)の発現に必須であると見出した。本年度は、これら転写因子の作用機序に迫るため、クロマチン免疫沈降と定量PCR(ChIP-qPCR)を用いて転写因子が相互作用するゲノム領域を探索した。FLAGタグ付きのsix6bとsix7それぞれが視細胞特異的に過剰発現する複数のトランスジェニック系統(昨年度に樹立)の網膜を用い、抗FLAG抗体を用いてChIP-qPCRを行った。その結果、青色感受性オプシンのプロモーターと、緑色感受性オプシンのプロモーターとエンハンサーそれぞれにsix6bやsix7が結合することを見出した。そこで、six6bやsix7が結合するDNA領域をゲノムワイドに同定し、six6bやsix7のターゲット遺伝子の網羅的な探索を試みた。共同研究により、免疫沈降したDNAサンプルを次世代シーケンサーに供してChIP-seq解析を行った。得られた結合領域から、それぞれの転写因子が標的とする遺伝子を算出した。さらに遺伝子オントロジーエンリッチメント解析(GO解析)を行い、これら転写因子が制御する遺伝子群の生物学的機能を類推した。その結果、錐体オプシンに加え、錐体型の光シグナリング分子や、さらには錐体の発生や分化に必須の分子をコードする遺伝子がsix6bとsix7のターゲット遺伝子であることを見出した。これらの結果よりsix6bとsix7は錐体オプシン遺伝子だけではなく、視細胞の分化や成熟に寄与する分子群を発現制御することによって、青・緑色感受性の錐体細胞のアイデンティティを規定すると考察した。エンハンサー領域とプロモーター領域の両方に生じるヒストン修飾H3K27acと、プロモーター領域において生じるヒストン修飾H3K4me3をそれぞれ特異的に認識する抗体を使用し、ゼブラフィッシュ網膜を用いてクロマチン免疫沈降を行う。超並列シーケンサーを用い、免疫沈降により得られたDNAを解読する。さらに錐体特異的に発現する遺伝子の周辺ゲノム配列に着目し、錐体におけるエンハンサーを網羅的に同定する。また、錐体サブタイプ特異的なエンハンサーを同定するため、錐体細胞が特異的に蛍光ラベルされた系統を用い、蛍光セルソーターにより錐体を分取した後にクロマチン免疫沈降を行う。ヒストン修飾を認識する抗体由来のシグナルが錐体オプシン遺伝子周辺において検出されるかどうかを調べる。