hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炭化水素の酸化カップリングを利用した新しいスチレン合成プロセスの開発

トルエンの酸化カップリング反応はトルエンからのスチレン合成の第1段目として位置づけられ、触媒や反応装置の研究も行われている.本研究では検討した.本年度の課題は酸化鉛を利用してトルエンの酸化カップリングにおけるスチルベンおよびビベンジルなどの二量体の選択率の向上と担体の検討であった.反応器はステンレス鋼製の固定層管型反応器を用いた.原料のトルエンはマイクロフィーダーにより供給し、気化器において気化させキャリアガスの窒素と混合する.反応器からのガスはトラップで採取した後、ガスクロマトグラフにより分析を行った.主な生成物はスチルベン、ビベンジル、ベンゼンおよび二酸化炭素であった.二酸化炭素はトルエンのメチル基由来のものとトルエンの燃焼によるものの二種に区別して解析を行った.本研究においてはアルミナ、マグネシア、チタニアなどの担体を利用した.いずれの場合も担体を使用しない場合にくらべてスチルベンの選択率が著しく低下し、ベンゼンおよび二酸化炭素の選択率が高くなった.メタンのカップリングにおいてはγ-アルミナ担体はメタンの完全酸化を促進することが報告されているが、トルエンのカップリングにおいてもアルミナ担体は特に二酸化炭素の生成量が増加した.マグネシアの場合も担体を使わない場合よりもスチルベン選択率は低下した.表面積の極めて小さなα-アルミナを用いた場合にはスチルベンおよびビベンジルの選択率が50%を越えた.アルカリ金属を添加することによって副生成物であるベンゼンの生成が抑えられ、二酸化炭素への完全燃焼も小さくなった.特に硝酸リチウムを使用した場合には効果は劇的であり、燃焼による二酸化炭素の発生は見られなかった.本年度の成果をまとめると、担体は表面積の小さなアルミナが適当であり、リチウムを添加することにより副生成物の生成をかなり抑えることができることがわかった.トルエンの酸化カップリング反応はトルエンからのスチレン合成の第1段目として位置づけられ、触媒や反応装置の研究も行われている.本研究では検討した.本年度の課題は酸化鉛を利用してトルエンの酸化カップリングにおけるスチルベンおよびビベンジルなどの二量体の選択率の向上と担体の検討であった.反応器はステンレス鋼製の固定層管型反応器を用いた.原料のトルエンはマイクロフィーダーにより供給し、気化器において気化させキャリアガスの窒素と混合する.反応器からのガスはトラップで採取した後、ガスクロマトグラフにより分析を行った.主な生成物はスチルベン、ビベンジル、ベンゼンおよび二酸化炭素であった.二酸化炭素はトルエンのメチル基由来のものとトルエンの燃焼によるものの二種に区別して解析を行った.本研究においてはアルミナ、マグネシア、チタニアなどの担体を利用した.いずれの場合も担体を使用しない場合にくらべてスチルベンの選択率が著しく低下し、ベンゼンおよび二酸化炭素の選択率が高くなった.メタンのカップリングにおいてはγ-アルミナ担体はメタンの完全酸化を促進することが報告されているが、トルエンのカップリングにおいてもアルミナ担体は特に二酸化炭素の生成量が増加した.マグネシアの場合も担体を使わない場合よりもスチルベン選択率は低下した.表面積の極めて小さなα-アルミナを用いた場合にはスチルベンおよびビベンジルの選択率が50%を越えた.アルカリ金属を添加することによって副生成物であるベンゼンの生成が抑えられ、二酸化炭素への完全燃焼も小さくなった.特に硝酸リチウムを使用した場合には効果は劇的であり、燃焼による二酸化炭素の発生は見られなかった.本年度の成果をまとめると、担体は表面積の小さなアルミナが適当であり、リチウムを添加することにより副生成物の生成をかなり抑えることができることがわかった.
肺サーファクタントの脂肪酸バランスが呼吸器疾患の病態形成に及ぼす役割

我々はこれまで、飽和・不飽和脂肪酸の鎖長を伸長させる酵素Elongation of long chainfatty acid 6(Elovl6)がII型肺胞上皮細胞に発現し、特発性肺線維症患者ではこのElovl6の発現が著明に減弱していること、またElovl6欠損マウスにブレオマイシンの気管内投与を行うと、肺組織内で飽和脂肪酸であるパルミチン酸が過剰に増加し、酸化ストレスやアポトーシスが亢進して、肺線維症が増悪することを明らかにした[Sunaga H, et al. Nat. Commun. 2013]。さらに、野生型およびElovl6欠損マウスに喫煙曝露肺気腫モデルを作成したところ、Elovl6欠損マウスでは肺胞腔の拡大、弾性線維の破壊などが顕著で、肺気腫様の病変が増悪していた。両群における脂肪酸組成を比較したところ、Elovl6欠損マウスでパルミチン酸分画の減少、オレイン酸分画の増加を認めた。さらに喫煙曝露Elovl6欠損マウスでは、肺サーファクタントに必要なホスファチジルコリン生成に関わる酵素、LPCAT1、LPCAT4の発現が著明に低下していることを見出した。また、LPCAT1、LPCAT4の発現低下に伴い、肺傷害が増悪することが知られ、本研究でもこれらが肺気腫病変の増悪に寄与していることが示唆された。本研究成果から、我々は肺における飽和・不飽和脂肪酸組成の不均衡が肺線維症や肺気腫の病態形成に重要な役割をしており、その組成を調節しているElovl6は呼吸器疾患の重要な標的因子であることを明らかにした。今後は、脂肪酸組成の変化に伴う肺サーファクタントの量的・質的な変化と肺線維症・肺気腫との関わりや、Elovl6の発現や活性を制御する食事成分、薬剤の解明など、肺疾患予防・治療の新しいアプローチの可能性を検討していきたい。我々はこれまで、飽和・不飽和脂肪酸の鎖長を伸長させる役割を持つElongation of long chainfatty acid 6(Elovl6)がII型肺胞上皮細胞に強く発現し、特発性肺線維症患者ではこのElovl6の発現が著明に減弱していること、またElovl6欠損マウスにブレオマイシンの気管内投与を行うと、肺組織内で飽和脂肪酸であるパルミチン酸が過剰に増加し、酸化ストレスやアポトーシスが亢進して、肺線維症が増悪することを明らかにした[Sunaga H, et al. Nat. Commun. 2013]。さらに、マウスに喫煙曝露にさせることで肺気腫モデルを作成したところ、喫煙曝露2ヶ月のマウス肺では、Elovl6の発現増加を認め、パルミチン酸分画の減少とオレイン酸分画の増加が認められた。一方、喫煙曝露6ヶ月のマウス肺では、Elovl6の発現増加は認められず、パルミチン酸分画、オレイン酸分画ともに変化は認められなかった。以上の結果から、肺気腫の初期段階では、II型肺胞上皮細胞においてElovl6の発現が増加することで脂肪酸の鎖長伸長が進み、炭素数16の脂肪酸が減少、炭素数18の脂肪酸が増加することで、肺気腫の病態に影響することが推察された。一方、肺気腫の慢性期では、Elovl6は肺気腫発症前の発現レベルに戻り、肺組織における脂肪酸組成にも変化が認められないことが示唆された。現在、II型肺胞上皮細胞特異的Elovl6欠損マウスを作成し、Elovl6の発現変化と脂肪酸組成、病態形成との関わりについて、詳細に検討中である。以上より、肺における飽和脂肪酸・不飽和脂肪酸組成の不均衡が病態形成に重要な役割をしており、その組成を調節しているElovl6は呼吸器疾患の重要な標的因子であることが示唆された。喫煙モデルにおけるElovl6発現と脂肪酸組成、肺気腫との関連性に関して、着実に研究成果が出ており、モデル動物の作成に関しても順調に進んでいる。さらに、喫煙曝露による肺気腫モデルを検討したところ、喫煙曝露2ヶ月においてElovl6の発現増加を認め、肺線維症モデルとは逆の傾向を示すことを明らかにした。さらに、Elovl6欠損マウスに喫煙曝露を行ったところ、野生型マウスと比較して肺胞腔の拡大や弾性線維の破壊など、著明な肺気腫の増悪を呈することが明らかとなった。そのメカニズムを解明するため、喫煙に伴って発現が変化する遺伝子群をRNAシークエンスにより網羅的に解析したところ、病態形成に関わる重要な遺伝子群がピックアップできたことから、Elovl6欠損マウスにおける肺気腫の増悪を説明できるかどうか、現在、その意義について検討を行っている段階である。また、肺線維症、肺気腫患者の臨床検体を用いて、脂肪酸組成を測定し、Elovl6活性を検討したところ、重症度に応じてその活性が変化することから、病態マーカーとしての可能性も示唆された。以上より、肺線維症・肺気腫におけるElovl6の発現変化と脂肪酸組成の不均衡が、病態形成を決める重要な役割をしている可能性が示唆された。喫煙モデル、肺線維症モデルにおけるElovl6発現と脂肪酸組成との関連性に関して、着実に研究成果が出ており、臨床検体の解析おいても順調に進んでいる。我々はこれまで、飽和・不飽和脂肪酸の鎖長を伸長させる酵素Elongation of long chainfatty acid 6(Elovl6)がII型肺胞上皮細胞に発現し、特発性肺線維症

患者ではこのElovl6の発現が著明に減弱していること、またElovl6欠損マウスにブレオマイシンの気管内投与を行うと、肺組織内で飽和脂肪酸であるパルミチン酸が過剰に増加し、酸化ストレスやアポトーシスが亢進して、肺線維症が増悪することを明らかにした[Sunaga H, et al. Nat. Commun. 2013]。さらに、野生型およびElovl6欠損マウスに喫煙曝露肺気腫モデルを作成したところ、Elovl6欠損マウスでは肺胞腔の拡大、弾性線維の破壊などが顕著で、肺気腫様の病変が増悪していた。両群における脂肪酸組成を比較したところ、Elovl6欠損マウスでパルミチン酸分画の減少、オレイン酸分画の増加を認めた。さらに喫煙曝露Elovl6欠損マウスでは、肺サーファクタントに必要なホスファチジルコリン生成に関わる酵素、LPCAT1、LPCAT4の発現が著明に低下していることを見出した。また、LPCAT1、LPCAT4の発現低下に伴い、肺傷害が増悪することが知られ、本研究でもこれらが肺気腫病変の増悪に寄与していることが示唆された。本研究成果から、我々は肺における飽和・不飽和脂肪酸組成の不均衡が肺線維症や肺気腫の病態形成に重要な役割をしており、その組成を調節しているElovl6は呼吸器疾患の重要な標的因子であることを明らかにした。今後は、脂肪酸組成の変化に伴う肺サーファクタントの量的・質的な変化と肺線維症・肺気腫との関わりや、Elovl6の発現や活性を制御する食事成分、薬剤の解明など、肺疾患予防・治療の新しいアプローチの可能性を検討していきたい。今後も肺線維症、肺気腫とElovl6との関連性について、II型肺胞上皮細胞特異的Elovl6ノックアウトマウスや培養細胞を用いた基礎的な検討を進めていくとともに、臨床研究として、肺線維症、肺気腫の患者サンプルを用いて、脂肪酸分画の測定やElovl6の発現量・活性と病態との関わりについて、詳細に検討していく予定である。今後も肺線維症、肺気腫とElovl6との関連性について、RNAシークエンスで抽出できた遺伝子群をもとにして、基礎的な検討を進めていく。また、臨床研究として、肺線維症、肺気腫の患者サンプルを用いて、脂肪酸分画の測定やElovl6の発現量・活性と病態との関わりについて、さらに検体数を増やして検討していく予定である。平成28年度にII型肺胞上皮細胞特異的Elovl6欠損マウスの作成を行ったが、実験に十分なマウスを産出できなかったため、その際に使用できなかった当初の予定額を、次年度へ繰り越す予定である。(理由)平成29年度に肺気腫の病態に関わる遺伝子群の網羅的解析を行ったが、その解析に時間がかかり、病態への関与など詳細な解析が行えなかったため、当初の予定額を次年度へ繰り越す予定である。(使用計画)平成30年度に繰り越した研究費に関しては、平成29年度で解析しきれなかった肺気腫、肺線維症の病態解析に関する実験、および臨床検体の解析費用に充てる予定である。主な内訳としては、マウス飼育費、病態モデル動物の作成費、培養細胞の購入、ノックアウトマウスや呼吸器疾患患者における肺組織・血液・培養細胞サンプルにおける脂肪酸分画の測定、PCR用試薬、抗体などである。平成29年度に繰り越した研究費に関しては、平成28年度で解析しきれなかったII型肺胞上皮細胞特異的Elovl6欠損マウスにおける肺気腫、肺線維症の病態解析に関する実験、および臨床検体の解析費用に充てる予定である。
膜結合プロテアーゼ複合体とその多様な機能:大腸菌FtsH複合体の解析

大腸菌FtsHタンパク質はATP依存性プロテアーゼ活性を持つ内在性膜タンパク質であり、AAA(ATPase associated with various cellular activity)ファミリーと呼ばれる新奇ATPaseファミリーの一員である。AAAタンパク質は原核細胞から真核細胞まで広く存在し、タンパク質の小胞輸送、オルガネラ生成、タンパク質の分解など多様な細胞機能に関与している。我々はFtsHが複合体を形成出来なかった膜タンパク質SecYやF_0 subunit aの分解に関わることを見出し、またFtsHが分子シャペロンと類似した機能を持つことを示唆する結果も得、FtsHが膜タンパク質複合体の「品質管理」に普遍的重要性を持つのではないかと考えている。我々はSecYの分解が不全となる変異株の分離を行い、FtsH変異と共にhflK,hflCの変異を同定した。HflKHlCはともに膜タンパク質でお互い複合体を作るが、これらがFtsHとも複合体をつくることを見出した。精製したタンパク質を用いたin vitro実験や変異株を用いたin vivoの結果からHflK/CはFtsHによるSecYの分解に阻害的に働くことが分かり、FtsHの機能を負に調節する役割を持つのではないかと考えている。また、従来HflKCはλcIIタンパク質を分解するプロテアーゼ活性を持つと報告されているが、我々の得た結果はHflKHlCは自身ではその様な分解活性を持たないことを示唆するものであった。
アラキドン酸によるＭＮＵ誘発網膜色素変性症動物モデルの病態制御とその分子機構

アラキドン酸(AA)のMNU誘発網膜変性症モデルに対する疾病制御成果を妊娠期から授乳期ならびに離乳直後の1週間という若年期に限定して検討した。雌親は0.1、0.5、2.0%AA食又は基礎食(<0.01%AA)を摂餌させ21日齢の乳仔に50mg/kg・MNUを投与し、さらに雌親と同じ食餌を7日間与えた。MNU投与後24時間で視細胞アポトーシスを評価し、7日後の網膜を形態的に比較した。基礎食あるいは0.1%AA食群では後極部にアポトーシスに起因する網膜変性をみたが、≧0.5AA食群ではその限りではなく、用量依存性に病態抑制をみたことから、富AA食の若齢ラットの網膜変性制御作用を実証した。アラキドン酸(AA)食摂取のN-methyl-N-nitrosourea(MNU)誘発網膜変性症に対する影響をみるため雌雄のSprague-Dawley(S-D)ラットにAA量の異なる食餌(対照食,0.008%AA;低AA食, 0.13%AA;中等AA食, 0.50AA;高AA食, 2.01AA)を交配2週間前に開始し、妊娠期(3週間)、授乳期(3週間)と離乳後1週間継続し、生後21日齢の離乳時雄ラットに50mg/kg・MNUを腹腔内投与し、28日齢時に屠殺して網膜を観察した。いずれの食餌を摂取した群とも毒性はみられず、体重増加はAA食餌群が軽い傾向ではあったが有意差はみなかった。視細胞比率(視細胞厚/全網膜厚)と網膜傷害率(視細胞層が≦4層の網膜長/全網膜長)をみたところ、対照群(19.4%、39.5%)、低AA群(32.0%, 21.2%)、中等AA群(46.7%, 2.7%)、高AA群(43.6%、6.1%)となり、対照群中等ならびに高AA群では有意な傷害の軽減をみた。よって、周生期の≧0.5%のAA食餌添加はMNU誘発網膜変性を有意に抑制した。しかし、10週齢の雄S-Dラットに6週間上記のAA含有食を摂餌させ、15週齢時に60mg/kg・MNUを投与し16週齢時に屠殺して網膜を比較したところ、病態抑制はみなかった。よってAAの網膜に対する有効性は作用時期が重要と考えられた。以上、周生期のAA投与は内膜変性症に対して有効であるが、AAの周生期投与はMNUにより網膜変性症とともに誘発される小脳低形成や腎の前癌病変は抑制せず、膵の細葉過形成の出現に対してはむしろ促進した。アラキドン酸(AA)食摂取のN-methyl-N-nitrosourea(MNU)誘発網膜変性症に対する影響をみるため雌雄のSprague-Dawley(S-D)ラットにAA量の異なる食餌(対照食,0.008%AA;低AA食, 0.13%AA;中等AA食, 0.50AA;高AA食, 2.01AA)を交配2週間前に開始し、妊娠期(3週間)、授乳期(3週間)と離乳後1週間継続し、生後21日齢の離乳時雄ラットに50mg/kg・MNUを腹腔内投与し、28日齢時に屠殺してAA量を計測し網膜を観察した。血清AA組成は対照群(20.03mol%)、低AA群(22.66mol%)、中等AA群(33.37mol%)、高AA群(40.48mol%)であり(中等ならびに高AA群と対照群は各のp<0.01)、網膜AA組成は対照群(6.61mol%)、低AA群(7.58mol%)、中等AA群(7.36mol%)、高AA群(8.85mol%)であった(高AA群と対照群はp<0.05)。視細胞比率(視細胞厚/全網膜厚)と網膜傷害率(視細胞層が≦4層の網膜長/全網膜長)をみたところ、対照群(19.4%、39.5%)、低AA群(32.0%, 21.2%)、中等AA群(46.7%, 2.7%)、高AA群(43.6%、6.1%)となり、対照群と中等ならびに高AA群では有意な傷害の軽減をみた。

しかし、10週齢の雄S-Dラットに6週間上記のAA含有食を摂餌させ、15週齢時に60mg/kg・MNUを投与し16週齢時に屠殺して網膜を比較したところ、病態抑制はみなかった。よってAAの網膜に対する有効性は作用時期が重要と考えられた。、授乳期(3週間)と離乳後1週間継続し、生後21日齢の離乳時雄ラットに50mg/kg・MNUを腹腔内投与し、28日齢時に屠殺して網膜を観察した。いずれの食餌を摂取した群とも毒性はみられず、体重増加はAA食餌群が軽い傾向ではあったが有意差はみなかった。視細胞比率(視細胞厚/全網膜厚)と網膜傷害率(視細胞層が≦4層の網膜長/全網膜長)をみたところ、対照群(19.4%、39.5%)、低AA群(32.0%,21.2%)、中等AA群(46.7%, 2.7%)、高AA群(43.6%、6.1%)となり、対照群中等ならびに高AA群では有意な傷害の軽減をみた。よって、周生期の≧0.5%のAA食餌添加はMNU誘発網膜変性を有意に抑制した。以上、周生期のAA投与は内膜変性症に対して有効であるが、AAの周生期投与はMNUにより網膜変性症とともに誘発される小脳低形成や腎の前癌病変は抑制せず、膵の細葉過形成の出現に対してはむしろ促進した。なお、n-9系脂肪酸であるミード酸(MA)には網膜保護効果はみられなかった。実験病理学MNU誘発ラットモデルを用いてアラキドン酸の有用性につき実証した。特筆すべきは周生期には有用であったが成人期では無効であったという時期特異性を実証したことである。この事実を確証する上でもMNU誘発マウスモデルでの証明も必要と考える。MNU誘発ラットモデルを用いてアラキドン酸の有用性につき実証した。MNUはラットの網膜のみならず多臓器に病変を誘発する。網膜以外での病変のアラキドン酸の修飾作用(時期特異性も含め)に取り組んだが、さらに標的を広げる。網膜以外での病変のアラキドン酸の修飾作用(時期特異性も含め)に取り組む。初年度は効率よく研究が進めたので研究費を繰り越すことができた。アラキドン酸のMNU誘発病変への修飾につき、腎、膵、脳を標的として広範な検討を予定している。
Type B adverse drug reactionの診断に関する研究

目的:本研究は重篤な障害を生じるにもかかわらず予測不可能で確定診断が困難なType B adverse drug reaction(ADR)の発症機構と危険因子を薬物代謝から解析し、診断と予防に役立てることを目的とした。方法:薬剤性肺炎の文献検索と全国調査によって215の原因薬物リストを作成して、その代謝酵素の臓器特異性や遺伝多型から検討を開始した。しかし、薬剤誘起性肺炎の発症頻度は低く短期間に多くの症例から情報を収集することは困難であったので、対象をてんかん371例の低Na血症、白血球減少症、γGTP・GTP上昇、精神神経疾患335例のQT延長、テガフール製剤治療中の胃がん30例の下痢、白血球減少などに拡大した。結果:1.口腔粘膜細胞から簡便にゲノムDNAを抽出(スワブ法)して、多数の薬物代謝酵素の遺伝的多型を検討する方法を確立したことで、多くの対象者の協力を得ることができた。2.てんかん患者のType BADR発症に関する多変量解析では、カルバマゼピン(CBZ)服用、CBZの投与量とクリアランス、重症心身障害、経管栄養などを危険因子として特定した。さらに、NONMEM法によって導いたCBZの母集団薬物動態解析結果とADR発症との関連について考察した。また、CBZの代謝酵素cytochrome P450(CYP)3A5の変異アレルCYP3A5*3のCBZクリアランスへの影響をNONMEM法で数量化した。3.フルニトラゼパム使用によって有意にQT延長を生じることを示した。4.テガフール製剤治療時の有害作用予測に尿中5-FU/α-fluoro-β-alanine値が有用であることを示唆した。研究目的:本研究は重篤な障害を生じるにもかかわらず予測不可能で確定診断が困難なTypeB adverse drug reaction(ADR)の発症機構と危険因子を障害局所の薬物代謝から解析し、診断と予防に役立てることを目的とする。研究成果:1)これまでに呼吸器系ADRの原因として収集した原因薬物215種類(795症例)のリストを作成し、それらの薬理学的な特徴、肺局所での薬物代謝の可能性、肝障害性薬物との相違点、各薬物における呼吸器系ADRの臨床的な特徴等に関する情報を整理した。2)炎症性呼吸器疾患での肝外薬物代謝及びサイトカインや活性酸素の薬物代謝への影響について文献的に考察した。3)Type B ADRにおける薬物代謝酵素の遺伝的多型の関与を推定した。4)薬物によるリンパ球刺激試験の適応(疾患・薬物)と試験・判定方法について倫理的な事項の解決と、予備実験を行った。以上の結果を国際臨床薬理学会(July 15-20,2000.Florence,Italy)で発表し、現在論文作成中である。今後の計画:新たな診断方法として、従来被疑薬と患者リンパ球のみを混合培養して判定していた薬物によるリンパ球幼若化試験に薬物代謝酵素の発現系を添加する。これによってreactive metabolitesを有効に生成し、少ない血液で高い診断率を得ることを期待する。また、この発現系を免疫毒性試験に用いる具体的な方法や、Type B ADRの発症機構における薬物代謝酵素の役割や遺伝的多型の意義について解析するための実験システムを構築する。研究目的:本研究は重篤な障害を生じるにもかかわらず予測不可能で確定診断が困難なTypeB adverse drug reaction (ADR)の発症機構と危険因子を障害局所の薬物代謝から解析し、診断と予防に役立てることを目的とする。研究成果:昨年度は、呼吸器系ADRの原因薬物215種類(795症例)の解析を行ったが、本年度は視点を変えて1)特定の薬物:カルバマゼピン服用者294例の低Na血症56例、白血球減少症78例、γGTP上昇102例、GTP上昇78例を抽出して、それらの危険因子を解析した。

今後の計画:これまでの解析結果と収集症例の知見をもとに、新規Type B症例について新たな診断方法を試みる。すなわち本法では従来の薬物によるリンパ球幼若試験に薬物代謝酵素の発現系を添加することによってreactive metabolitesを有効に生成し、少ない血液で高い診断率を得ることを期待する。また、Type B ADRの発症機構における薬物代謝酵素の役割や遺伝的多型の意義について総合的に解析する。研究目的:本研究は重篤な障害を生じるにもかかわらず予測不可能で確定診断が困難なType B adverse drug reaction (ADR)の発症機構と危険因子を薬物代謝から解析し、診断と予防に役立てることを目的とする。研究成果:てんかん患者約400例の詳細な診療情報、薬物血中濃度測定結果約2,000ポイントと口腔粘膜細胞DNA約250検体を用いた薬物代謝酵素の遺伝多型解析を行った。Type BADR(低Na血症、白血球減少症、_YGTP・GTP上昇)に関する多変量解析では、カルバマゼピン(CBZ)服用、CBZの投与量とクリアランス、重症心身障害、経管栄養、併用薬などを危険因子として特定した。さらに、NONMEM法によって導いたCBZの母集団薬物動態解析結果とADR発症との関連について考察した。また、一方でCBZの代謝酵素cytochrome P450 (CYP) 3A5の変異アレルCYP3A5^*3のCBZクリアランスへの影響をNONMEM法で数量化した。現在、CBZについはCYP3A5の他glutathione S-transferase (GST)P1,GSTM1,epoxide hydrolaseの遺伝多型とADR発症の関係について総合的に解析中であり、同研究手法をバルプロ酸やゾニサミド等、複数の抗てんかん薬にも拡大して各薬物によるADRの発症機構を検討している。最終報告書までの計画:3年間の解析結果と収集症例の知見をもとに、Type B ADRの危険因子に関する解析方法、薬物代謝及び代謝酵素の遺伝的多型の意義、それらをどのように診断に応用すればTypeB ADRを回避できるのかについて統括して提言したい。
自己免疫疾患における臓器浸潤細胞障害性Tリンパ球の認識するEBウイルス抗原の解析

1.昨年度の研究で、まず、本研究の基幹を成す微小組織よりのT細胞の分離およびexpansionに関し基礎的実験を重ね、growthfactor、feeder細胞、レクチンの添加とT細胞の増殖状況を観察し、かなり安定した実験手技ならびに方法を確立することができた。そして、実際に、シェーグレン症候群の唾液腺よりT細胞株を、および同症候群の髄膜炎患者の髄液より多数のT細胞クローンを樹立することができた。2.本年度は、それらのT細胞のEBウイルス抗原に対する免疫応答に関して詳細な検討を行なった。まず、髄液由来のT細胞クローンは、全てCD3+,TCRα/β+,CD4+,CD8-,CD16-,CD56-,DR+であり形質的にhelper/inducerT細胞であった。当初、その中の一部のクローンは、EBウイルスでトランスフォームさせた自己B細胞に対してキラー活性を示したが、その後の詳細な検討によりこれはレクチン依存性でありウイルス特異的CTLである可能性は否定された。つぎに、唾液腺由来の短期培養T細胞に関しては、CD3+,TCRα/β+,CD4dominant,CD16-と、組織染色上の知見とパラレルな形質を示した。これを用いて、EBウイルス株化自己B細胞、およびコントロール自己細胞としてHTLV-1株化T細胞を標的に、ウイルス特異的細胞障害活性を測定したが、活性は検出されず、また、調製EBウイルス抗原で感作した自己細胞を用いてウイルス特異的細胞増殖反応を観察したが、特異的応答は認められなかった。3.EBウイルスに対する特異的T細胞応答は検出されなかったが、本研究で我々の行なったアプローチである組織よりのT細胞分離とin vitro expansionの方法論的確立は、自己抗原を病変組織T細胞免疫応答の観点から追及する上できわめて有用と考えられた。本研究は、自己免疫疾患であるシェ-グレン症候群におけるEBウイルスの病因論的関与について、T細胞とりわけ細胞障害性T細胞の観点から追究することを目的とする。1。まず、本研究の基幹をなすともいえる微小組織由来のT細胞クロ-ンの樹立とその維持について基本的実験を重ね、IL2、フィ-ダ-細胞、およびPHAの添加とT細胞の増殖の状況を観察し、T細胞クロ-ンの維持に関してかなり安定した実験手技ならびに方法を確立することができた。2。シェ-グレン症候群の唾液腺より5つのT細胞株、および同症候群による無菌性髄膜炎の髄液より多数のT細胞クロ-ンを樹立し、長期培養することが可能となった。3。現在、そのうち髄液由来のT細胞クロ-ンの解析をおこなっているが、これまでに検索した15クロ-ンはすべてCD3+,CD4+,CD8-,CD16-,CD56-であり形質的にhelper/inducer T細胞である。しかし、その中の3クロ-ンはEBウイルスでトランスフォ-ムさせた自己および非自己B細胞に対するキラ-活性を有することが明らかとなった。この細胞障害活性はEBウイルス抗原あるいはEBウイルス誘導抗原のなかのいずれかに向けられたものと考えられるが、これにのT細胞はシェ-グレン症候群の病態をひきおこしている重要な細胞群を代表している可能性があり、目下その認識抗原の同定をいそいでいる。4。以上、シェ-グレン症候群患者の病変部位由来のT細胞クロ-ンの樹立により、EBウイルスの病因論的関与を示唆する知見が得られつつあり、今後、さらに、そのT細胞の認識するエピト-プの検索を進めることにより、自己免疫疾患における組織障害の病因を抗原特異的T細胞のレベルで明らかにしてゆく方針である。
肝癌血管新生のメカニズムの研究

血管新生は固形腫瘍が増殖,進展する上で必要不可欠な重要なプロセスであり,この過程なしでは腫瘍な成長できない。VEGFはその活性から,腫瘍関連の最も有力な血管新生因子として注目されている。肝細胞癌(以下,肝癌)の生物学的特徴の一つとして,その血管新生が非常に強い点があげられる。したがって肝癌の血管新生においても肝癌細胞自身からのVEGFの発現が強く関与しているのではないかと考えられる。本研究では,ヒト肝癌の細胞株,臨床手術材料を用いてヒト肝癌組織においてもVEGFの発現が増強し,肝癌の進展に関与しているかどうかついて解析した。まず肝癌細胞におけるVEGFの発現を5種類の肝癌細胞株において試みた。これらの培養細胞よりmRNAを抽出し,またホルマリン固定を施し,Northen blot analysis,および免疫組織染色を施した。さらに培養肝癌細胞株の培養上清中へのVEGFの分泌をWestern blot法で解析した。次に,実際の生体における肝癌とそれ以外の非癌組織のVEGFの発現かどうかを比較検討するために,10症例の臨床手術材料をもとにして,VEGFの発現を同様の手法で検討した。5種類の肝細胞株を検討した結果では,どの肝癌細胞株においてもmRNA,蛋白レベルにおいてVEGFの高発現が,Northen blot analysisおよび免疫組織染色を用いた手法において認められた。また肝癌細胞株(Hep G2)の培養上清中にはVEGFの分子量42kDに合致する蛋白が分泌されているのが証明された。10症例の臨床材料を用いたNorthen blot analysisおよび免疫組織染色では,Northen blot analysisでも免疫組織染色においても同様に,癌部,非癌部ともVEGFの発現が認められた。しかしながらほとんどの症例において肝癌組織においてVEGFの発現増強が認められた。VEGFの血管内皮細胞への直接的,特異的な作用を考慮すると,VEGFが肝癌の発育,進展に伴う腫瘍血管新生因子の一つとして有力な役割を担っているのではないかと考えられた。肝癌の血管新生にVEGFが関与しているかを検討した。ノーザンブロット法および免疫染色法により検討したところ、肝癌組織や肝癌細胞株においてVEGFの強い発現をみとめ、肝癌血管新生へのVEGFの関与が示唆された。又、VEGFのレセプター(flt)の発現は、特殊染色法による検討では、肝癌部での発現はなく、非癌部肝組織での発現をみとめた。肝癌部でVEGFが強く産生され、非癌部でレセプターが発現して、血管新生が誘導され、肝癌が増殖していくものと考えられる。VEGFが肝で強く発現するようなトランスジェニックマウスを作成したところ、一部で腹水を発症するマウスが得られた。現在解析中である。一方、血管新生を抑制するアンギオインヒビンという物質が、肝癌の新しい治療薬となりうるかを検討した。ウッドチャック肝癌に局所投与を行なったところ、血管新生を著明に抑制して肝癌は縮少した。コントロール実験では薬剤の毒性はみとめられなかった。又、全身投与による検討も行なった。1cmの腫瘍の生じたウッドチャックに、アンギオインヒビン30mgを週に12回筋注したところ、6ケ月間たっても、腫瘍の大きさは、1.5cm程度におさえられており、全身投与も有効なことが確認された。又、アンギオインヒビンの油性製剤を開発し、肝動脈カテーテルをそう入し、肝動脈塞栓術(TAE)を行なって、治療効果があるか否かを現在検討中である。

以上、肝癌の血管新生へのVEGFの関与が強く示唆され、又、血管新生抑制物質であるアンギオインヒビンが肝癌の新しい治療薬となりうることが、考えられた。今後は、アンギオインヒビンのVEGFへの作用機序を検討していく予定である。肝癌の血管新生にVEGFが関与しているかを検討した。ノーザンブロット法および、免疫組織染色法により検討したところ、肝癌組織が肝癌細胞株において、VEGFの強い発現をみとめ、肝癌血管新生へのVEGFの関与が示唆された。又、ウエスタンブロッテイング法にて、肝癌細胞株からのVEGFの分泌が確認された。VEGFのレセプター(flt)の発現は、肝癌部では無く、肝非実質細胞で強い発現をみとめた。これらの結果から、肝癌の血管新生は、オートクライン機構ではなく、パラクライン機構でおこり、肝癌の増殖に関与していると考えられた。又、VEGFが肝で強く発現する様なトランスジェニックマウスを作成し、現在解析中である。又、VEGF遺伝子のノックアウスマウスの作成を準備中である。一方、血管新生を抑制するアンギオインヒビンが、肝癌の新しい治療薬となりうるかを、ウッドチャック肝癌の系を用いて検討した。局所投与及び全身投与で腫瘍の縮小効果があることが確認された。又、肝動脈を介しての栓塞療法でも効果のあることが判明した。以上、肝癌の血管新生へのVEGFの関与が強く示唆され、又、血管新生抑制物質であるアンギオインヒビンが、肝癌の新しい治療薬となりうることが考えられた。今後は、VEGFをブロックすることにより、肝癌の治療が可能とならないかを検討する予定にしている。ノーザンブロット法および免疫組織染色法により検討したところ、肝癌組織が肝癌細胞株において、VEGFの強い発現をみとめ、肝癌血管新生へのVEGFの関与が示唆された。現在、多数の肝癌組織を解析中で、臨床所見との対比を検討中である。又、VEGFのレセプター(flt)の発現は、肝癌部ではなく、肝の非実質細胞で発現を強くみとめた。肝癌細胞によりVEGFが強く産生され、肝の非実質細胞でVEGFのレセプターが発現して、血管新生が誘導され、肝癌が増殖していくものと考えられる。VEGFが肝で強く発現するようなトランスジェニックマウスを作成したところ、一部で腹水を発症するマウスが得られた。現在解析中である。一方、血管新生を抑制するアンギオインヒビンという物質が、肝癌の新しい治療薬となりうるかを検討した。ウッドチャック肝癌に局所投与を行なったところ、血管新生を著名に抑制して肝癌は縮少した。又、全身投与にても肝癌の増殖を抑制した。又、アンギオインヒビンの油性製剤を開発し、肝動脈カテーテルをそう入し、肝動脈塞栓術(TAE)を行なって治療効果のあることを確認した。
アデノシルコバラミンの補酵素活性の発現と維持に関わる蛋白質の機能解析

1.基質による酵素反応中の不活性化の電子常磁性共鳴(EPR)を用いた解析アデノシルコバラミン(ビタミンB_<12>補酵素)関与ジオールデヒドラーゼ(DD)の基質による酵素反応中の不活性化とEPRスペクトルとの関係を調べた。反応開始直後のスペクトルには、基質として用いた1,2-prooandiol、1,2-ethanediol、meso-2,3-butanediol、glycerolのいずれにおいても、cob(II)alaminのCo(II)由来の幅広いシグナルと、有機ラジカル由来の2重線がみられた。この2重線はCo(II)上の不対電子とのスピン-スピン結合によるもので、結合定数はこの順に減少した。一方、不活性化速度定数はこの順に増大した。結合定数は両スピン間の距離が長いほど減少することから、反応中の有機ラジカルとCo(II)には至適な距離があり、これよりも遠くなるほど酵素反応中のラジカル中間体の制御が困難となり、不活性化が起こり易くなることが示唆された。2.アデノシルコバラミン関与グリセロールデヒドラーゼ(GD)遺伝子のクローニングと塩基配列の解析および大量発現GDとDDとは、アデノシルコバラミンへの親和性や基質特異性などが異なるアイソザイムである。DDのみならず、GDについても作用機作を分子レベルで解明する目的で、Klebsiella pneumoniae GD遺伝子をKlebsiella oxytoca DD遺伝子とのクロスハイブリッド形成により単離し,大腸菌で大量発現させた。組換え体には親菌の14倍の酵素活性が認められた。得られた酵素は,諸性質が親菌のGDと一致し,61K(α),22K(β),16K(γ)のサブユニットから成ることが示された。塩基配列の解析により、3つの遺伝子(gldA,gldB,gldC)が連続して存在し,それぞれ,分子量60,659(α),21,355(β),16,104(γ)のポリペプチドをコードしていることが明らかとなった。塩基配列から推定されたアミノ酸配列はDDの対応するサブユニットと高い相同性を示した。
天然物リガンドを利用した間葉系幹細胞の分化制御機構の解析

平成25年度は、昨年度より扱っている2種のリガンドA及びBに加え、班員間の共同研究により見出したリガンドCについても作用機序の解析を行った。間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を誘導するリガンドAについては、平成24年度に引き続き化合物を結合させたアフィニティービーズ(半田ビーズ)を用いて結合タンパク質の探索を行った。リガンドA固定化ビーズだけでは候補のタンパク質を絞り込めなかったため、リガンドAの不活性類縁体を固定化したビーズも作成し、結合タンパク質を比較した。その結果、よりリガンドA固定化ビーズに結合するタンパク質の一つがHsp90であることが判明したため、Hsp90の阻害剤の間葉系幹細胞への影響を検討したが、骨芽細胞分化誘導活性は認められなかった。間葉系幹細胞には脂肪細胞分化を、また前骨芽細胞には骨芽細胞分化を誘導するリガンドBについては、新たに二つの類縁体を合成し、そのうち一つは活性がほぼ完全に消失することが判った。この不活性誘導体をコントロールとして、間葉系幹細胞の遺伝子発現に与える影響をマイクロアレイにより解析し、リガンドB処理群でのみ処理開始6時間以内に上昇する遺伝子を同定した。新たに見出したリガンドCは、間葉系幹細胞の脂肪細胞分化を誘導する。種々の検討の結果、転写因子Xのレポーター遺伝子を活性化することが判った。ウエスタンブロットを行ったところ、リガンドC処理した細胞ではDのタンパク量が増加していた。また、定量PCRにより、リガンドC処理細胞ではXの下流遺伝子のmRNAが増加していることが判明した。リガンドCの不活性類縁体では、上記の現象は見られなかった。さらに転写因子XのsiRNAノックダウンを行ったところ、リガンドCによる脂肪細胞分化は顕著に抑制された。以上の結果から、リガンドCが転写因子Xを介して脂肪細胞分化を誘導すると考えられた。25年度が最終年度であるため、記入しない。間葉系幹細胞は骨芽細胞や脂肪細胞など様々な細胞に分化する多能性を持ち、骨粗鬆症や再生不良性貧血等の疾患の病態に密接に関わることが知られている。本研究では、研究代表者が独自に見出した間葉系幹細胞の分化を誘導する2種の天然物リガンド(リガンドA及びB)について、その作用機序の解析を通じて間葉系幹細胞の分化制御機構の新知見を得ることを目指している。平成24年度は、リガンドAについてはマイクロアレイ解析と、化合物を固定化したアフィ二ティービーズを作成して結合タンパク質の探索を行った。マイクロアレイ解析では、リガンドA処理により骨芽細胞マーカーに加えて、複数の転写因子の発現変動が認められた。また、アフィニティービーズによる結合タンパク質の探索では、複数の結合タンパク質を見出しており、この中には骨芽細胞分化への関与の報告があるタンパク質も含まれていた。リガンドBについては計20種の類縁化合物を収集し、前骨芽細胞に対する骨芽細胞分化促進活性と、間葉系幹細胞に対する脂肪細胞分化誘導活性を測定し、構造活性相関を検討した。その結果、アフィ二ティービーズへの固定化のための修飾が可能と考えられる部位が見つかったので、この部位を修飾した化合物の合成を行った。また、新学術領域内の班員間の共同研究として、複数の研究者より天然物及びそれをベースにした合成化合物の提供を受け、間葉系幹細胞の分化に影響を与えるかを検討した。リガンドAについては、マイクロアレイ解析について顕著に変動する遺伝子群が見いだせており、その一部は特定の細胞応答系に関与する遺伝子群であった。

また、アフィニティービーズを用いて直接標的タンパク質を精製する方法の立ち上げも完了し、複数の標的タンパク質候補を見いだすことができている。リガンドBについては、類縁体ライブラリーを構築しビーズへの固定化のための修飾を入れた類縁体の合成に入っている。また、班員間の共同研究も複数件立ち上がっている。以上の状況から(2)おおむね順調に進展している、と自己評価した。今年度は、リガンドAについては、アフィニティービーズで得られた標的タンパク質候補の評価とともに、レポーター遺伝子を用いたシグナル伝達系への影響の検討を行う。リガンドBについては、マイクロアレイ解析とアフィ二ティービーズを用いた標的タンパク質の探索を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
幕末関東農村における剣術流派の存在形態に関する基礎的研究

本研究は、江戸幕末期、関東農村で農民の身体文化の一部と位置づけられる剣術の普及とその意義を明らかにすることを目的とする。とくに、上野国(馬庭念流)・下野国(神道無念流)農村における武術流派運営の実態を調査した。(1)上野国甘楽郡の馬庭念流門人調査上野国甘楽郡内の馬庭念流門人は78村域。門人は七日市藩士(前田家)、小幡藩士(織田家松平家)、「関守」「僧」「医師」「農民」などであった。とくに「砥石」「蒟蒻」信州米、上州絹の商取引で栄えた宿場町(下仁田町・一宮町・富岡町)に門人が多く確認された。また門人であった関守・神戸家、市川家は信濃国佐久郡への新田開発や藩への献金も行っており、馬庭念流が信濃国への門人を拡大する上で大きな役割を果たしたと考えられる。また馬庭念流が伊勢神宮へ姓名額を奉納した件では、18世樋口十郎右衛門定伊が七日市藩士として中山道の交通上の特権に恵まれ、滞りなく行われたことがわかった。このことは近世剣術流派の一事業である奉額活動が藩によって支えられた事実を示す初めての研究であった。(2)下野国太平山神社の奉納額の調査栃木県大平町にある太平山神社に奉納された武術姓名額(倉庫に保管)について枚数、姓名などにつき調査を行い、的確な番号付けと再配置を行った。作業は5日間合計作業人足は26名となった。合計84枚の額のうち剣術は、神道無念流(文政6年・嘉永7年・慶應丁卯年)の計3枚、弓術は日置流・大和流(明治28年)・奉納弓術会(明治35年)、砲術は、武衛流(慶応3年)、外記流(年代不明)であった。(1)越後高田藩士・倉地正久『劔術修業記』に記された諸剣術流派門人の調査(1)『劔術修業記』(熊本県・富永家蔵文書)によると、「直心影流」免許・越後高田藩士倉地正久が、弘化3年(1846)3月に出立して、嘉永7年(1854)まで18年間にわたり、越後国(水原、村上藩、新発田藩、長岡藩)信濃国(松代藩、上田藩、小諸藩)上野国(一宮、後閑村、安中藩、高崎)、武蔵国(本庄宿、熊谷宿、館林藩)下総国(古河藩、関宿藩)江戸市中、相模国(浦賀組屋敷)、上総国(園村、江見村、長者町、一ツ松、今泉、椎名内)下総国(小見川)、常陸国(水戸藩、笠間藩)、奥州(棚倉藩、白川藩、仙台藩)、下野国(花和)など11カ国を廻国修行し、49流派670名と接した様子がわかった。(2)倉地家(前橋市)蔵「手記」には、倉地正久が棚倉藩での試合で、「骸頭」「横にはずさん」「打ち込むいきおい」「逆胴」「竹胴」「はめ板」「都合五本」などの表現に、嘉永年間の試合場面の特徴をみることができた。(3)嶋村外也正武は藩命を受け、上段派直心影流として文化三年に新発田藩剣術師範として、試合は木刀に限った。安政五年(1858)男谷系直心影流晴眼派と対立し師範を免じられた頃の新発田藩におけるしない打ち込み稽古の普及の経緯を表す文書があった。次年度以降の課題である。

(2)岐阜県大垣市、および千葉県和田町の調査:岐阜県大垣市船町「全昌寺」で幕末の一刀流として名を馳せた古藤田勘解由(「全機院利剣報国居士」)、安養寺(大垣市荒尾町)で古藤田勘解由俊矩(古藤田勘解由俊直曾孫「心光利剣居士」享保十五年没)の墓石を確認した。古藤田勘解由は安房国里見氏家臣であり、外他一刀斎景久よりから剣術を学んだ。千葉県和田町には外他一刀斎景久より「里見八勇士」石田新兵衛へ連なった外他流文書(天正8年(1580)伝授)が発見された。(3)金沢市近世資料館:加賀藩における近世剣術に関する調査「中條流」「冨田流」「新陰流」「運籌流」などの文書があった。また無刀流山岡鉄舟関係文書が目録化(春風館関係文書)されており、次年度以降、熟覧をしたい。(1)外他流の安房国における展開千葉県南房総市の石田家所蔵・天正8年(1580)文書によれば、石田新一郎久房の子で「里見八勇士の一人」とされた石田新兵衛茂房へ、外他一刀斎景久より発給(「手続書」)および宇部壱岐守弘政より発給(「許状」)の「外他流」秘伝書が宛てられた。外他流は、戦国時代、里見氏の砦の役割を果たした保田妙本寺(千葉県安房郡鋸南町吉浜)で行われた可能性も考えられる。また外他一刀斎が、里見家家臣へ外他流を指導したことが理解できる。のちに一刀流の祖といわれる伊藤一刀斎は、当時外他一刀斎景久といっていた。門人には古藤田勘解由がおり、岐阜大垣で没している(2)中世・肥前国における新当流の展開肥前国平戸藩に伝わる新当流文書について調査を行った。松浦資料博物館所蔵の永禄2年(1559年)「塚原与助幹勝太刀免状(1通)」文書によれば、鹿島新当流塚原家の一族であろう与助幹勝が、鹿島から指導のため平戸を訪れ松浦肥前守隆信および実子ら3名へ「一太刀」の切紙を与えた様子がわかった。従来いわれている「極意は一太刀(いちのたち)」説へ疑問をなげかける文書である。また、長崎歴史文化博物館蔵・天正11年(1583)「新影流文書」には、上泉伊勢守から丸目蔵人を経て河尻左馬亮藤原資久(『信長公記』に名前あり)へ伝授された系譜が記されている。(3)古河藩『剣術修業記』の翻刻古河藩士・東軍流免許の千賀牧太が廻国修行英名録のうち、(1)安政2(1855)年4月安政5年(1858)(2)安政6年(1859)3月文久3年(1863)3月について翻刻した。(4)剣術加賀藩剣術指南役冨田越後守重政の所持した摩利文尊天の調査前田利家の祈願寺、石川県金沢市・宝泉寺は開基400年を迎え、武術中條流・富田流を継承した富田越後守重政(「名人越後」)が信仰した本尊・摩利支天がご開帳になった。写真撮影は不可能であったが、金色の光背の前に摩利支天の座像を見た。座像の足の上に、日本剣道の祖、念流創始者でもある念阿弥慈恩が所持し崇拝したと伝承される摩利支天像(一寸八分)の箱も確認できた。本研究は、江戸幕末期、関東農村で農民の身体文化の一部と位置づけられる剣術の普及とその意義を明らかにすることを目的とする。とくに、上野国(馬庭念流)・下野国(神道無念流)農村における武術流派運営の実態を調査した。(1)上野国甘楽郡の馬庭念流門人調査上野国甘楽郡内の馬庭念流門人は78村域。門人は七日市藩士(前田家)、小幡藩士(織田家松平家)、「関守」「僧」「医師」「農民」などであった。とくに「砥石」「蒟蒻」信州米、上州絹の商取引で栄えた宿場町(下仁田町・一宮町・富岡町)に門人が多く確認された。また門人であった関守・神戸家、市川家は信濃国佐久郡への新田開発や藩への献金も行っており、馬庭念流が信濃国への門人を拡大する上で大きな役割を果たしたと考えられる。また馬庭念流が伊勢神宮へ姓名額を奉納した件では、18世樋口十郎右衛門定伊が七日市藩士として中山道の交通上の特権に恵まれ、滞りなく行われたことがわかった。このことは近世剣術流派の一事業である奉額活動が藩によって支えられた事実を示す初めての研究であった。(2)下野国太平山神社の奉納額の調査
発がん過程におけるM期分裂異常招来の分子機構研究

我々は動物細胞の染色体分配過程に深く関与するセリン/スレオニン残基をリン酸化するAキナーゼの新しいサブファミリーを独自に発見した。このキナーゼ群の内で、動物細胞において最も解析の進んでいるAIM-1とその類縁キナーゼSTK15(AIM-2に同じ)におけるヒトがんとの関連について研究し、以下の諸点を明らかにした。1.AIM-1とSTK15は大腸がんを含む種々の培養ヒトがん細胞における試験管内での高発現のみならず、ヒト大腸がんの発症過程においてもmRNAレベルならびに蛋白レベルでの高発現が観察された。2.高発現の機構はAIM-1とSTK15で異なり、AIM-1では転写レベルの亢進が起こっており、遺伝子量の変動は観察されなかった。一方、STK15では転写レベルでの発現亢進に傾向のあるものの、AIM-1のように顕著では無く、遺伝子増幅が高発現の例で認められた。3.大腸がんのデュークス分類による悪性度と高発現の相関性はAIM-1で認められ、悪性度が増すにつれてAIM-1は発現レベルが高くなる傾向にあった。一方、STK15は悪性度と発現量とのはっきりとした相関性は認められなかった。4.大腸癌細胞株でCIN(染色体不安定性表現型)を示す細胞とMIN(マイクロサテライトDNA不安定性表現型)を示す細胞とに分類出来るが、CIN細胞においてSTK15が高発現傾向にあった。AIM-1にはCIN細胞とMIN細胞との間で、高発現のレベルに有意な差は無かった。AIM-1とSTK15は構造的に類縁であるM期キナーゼであるが、両者のM期進行過程での役割は異なっていることが我々の研究から明らかとなっている。ここで観察した高発現の機構の相違や、発がん過程における高発現の時期の違いなどから考えて、発がんに対して2つの遺伝子は同じ作用点で効果を発揮しているのではなく、互いに相加的あるいは相乗的に作用している可能性を強く示唆する。
上皮間葉移行による抗癌剤耐性能獲得機構と骨髄幹細胞

抗癌剤耐性ヒト大腸癌細胞株を作成するために細胞株を5-FUに暴露し耐性株を樹立した。親株と比較して5-FU耐性株は、約40倍の濃度において耐性となった。親株と5-FU耐性株を比較したところ、形態学的な変化は認めず、細胞増殖能にも差異を認めなかった。MMP、E-カドヘリン、ビメンチンのタンパク発現に関して、5-FU耐性株と親株を比較したが差は認めなかった。ヌードマウス移植モデルを用いて検討したが、腫瘍の増殖能、転移能において親株と5-FU耐性株に差は認めなかった。腫瘍内のSnail、Slug、Twist、MMP2、E-カドヘリン、ビメンチンを測定したが、マウス移植前の親株、5-FU耐性株と発現量に差は認めなかった。抗癌剤耐性と上皮間葉移行の明らかな関連はないと思われた。Epithelial-Mesenchymal Transition(EMT;上皮間葉移行)上皮細胞が間葉系様細胞に形態変化する現象であり、発生における原腸陥入、神経提細胞の運動や器官形成過程に重要と言われている。また、EMTが運動能の亢進や細胞外基質の蓄積をもたらすことから、癌細胞の浸潤や線維化との関連も数多く報告されおり、筆者も報告してきた(Clin Gancer Res. 10 : 7775-7784, 2004. Tsutsumi et al.)。我々は、抗癌剤感受性試験を行う際に、癌細胞に5-FUやタキサン系の抗癌剤を暴露するが、耐性を獲得した癌細胞は紡錘型細胞様形態に変化することを確認した。このことから、抗癌剤耐性は癌細胞レベルのEMTによって獲得される可能性があると考えた。さらにその結果、耐性癌細胞は細胞運動能や浸潤能が誘導され悪性度を増すと考えられる。しかし、一度転移が成立すると癌細胞はMesenchymal-Epithelial Transition(MET;間葉上皮移行)により上皮細胞の性格を取り戻し転移先で増殖するような可逆性を備え持っている。現在、新規抗癌剤の開発は進歩しているが、抗癌剤耐性獲得癌は難治性で多くの課題が残されている。今回、EMT-METとの双方関移行のメカニズム、細胞ストレス耐性との関係、骨髄幹細胞動因という観点から研究をデザインした。EMTとMETとの双方間に移行が存在するかを検討するため、我々が開発したヌードマウス移植モデル(Cancer Lett. 169 : 77-85, 2001. Tsutsumi et al.)を用いて直腸腫瘍と転移性肝腫瘍を作成した。腫瘍を病理組織学的に検討したが、形態学的にはEMTとMETとの双方に移行は確認できなかった。現在、腫瘍組織内のタンパクレベルでの変化が認められるか実験中である。また、EMTが運動能の亢進や細胞外基質の蓄積をもたらすことから、癌細胞の浸潤や線維化との関連も数多く報告されおり、筆者も報告してきた(Clin Cancer Res. 10 : 7775-7784, 2004. Tsutsumi et al.)。まず、抗癌剤耐性ヒト大腸癌細胞株を作成するためにSW480、HT29、HCT116細胞株を5-FUに暴露し耐性株を樹立した。またMMP、E-カドヘリン、ビメンチンのタンパク発現にも差は認めなかった。ヌードマウス移植モデルを用いて直腸に腫瘍を移植したが、腫瘍の増殖能、転移能において親株と5-FU耐性株に差は認めなかった。現在、腫瘍をでのSnail、Slug、Twistを測定中である。

抗癌剤耐性ヒト大腸癌細胞株を作成するためにSW480、HT29、HCT116細胞株を5-FUに暴露し耐性株を樹立した。親株と比較して5-FU耐性株は、約40倍の濃度において耐性となった。親株と5-FU耐性株を比較したところ、形態学的な変化は認めず、細胞増殖能にも差異を認めなかった。MMP、E-カドヘリン、ビメンチンのタンパク発現に関して、5-FU耐性株と親株を比較したが差は認めなかった。我々の開発したヌードマウス移植モデルを用いて直腸に腫瘍を移植したが、腫瘍の増殖能、転移能において親株と5-FU耐性株に差は認めなかった。また、脾臓転移モデルを用いても転移能に差は認めなかった。ヌードマウスへ移植した腫瘍の切除標本からマイクロダイセクションを持いてRT-PCRにより、腫瘍内のSnail、Slug、Twist、MMP2、E-カドヘリン、ビメンチンを測定したが、マウス移植前の親株、5-FU耐性株と発現量に差は認めなかった。HT29細胞株を用いたヌードマウス脾臓転移モデルにおいて、肝転移巣から腫瘍組織を採取しHT29転移株を樹立した。親株と比較したが、形態学的な変化、細胞増殖能、5-FU耐性能に差異を認めなかった。今回、5-FU耐性株を作成し上皮間葉移行との関連について検討した。5-FU耐性株と親株において、形態学的変化、細胞増殖能、転移能に差は認めなかった。また、上皮間葉移行と関連があると報告されている因子(Snail、Slug、Twist、MMP2、E-カドヘリン、ビメンチン)を測定したが、5-FU耐性株と親株の間に発現量の差は認めなかった。以上の結果から、抗癌剤耐性と上皮間葉移行の明らかな関連はないと思われた。