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新規1分子可視化法によるイオンチャネル分子複合体機能とその調節機構の解明

(1)カベオリン3(cav3)は骨格筋において筋構造の形成・維持に重要な因子であり、肢帯型筋ジストロフィーの原因遺伝子となる。BKチャネルは近年、骨格筋において機能発現し、興奮性制御に寄与すると報告されている。本研究では、HEK細胞を用いて、BKチャネルとcav3の関係を解明することを目的とした。蛍光標識したBKチャネル(BKα-mCh)とcav3(GFP-cav3)をHEK細胞に共発現させTIRF顕微鏡で可視化解析したところ、両者が共局在し一体としての挙動を示した。また、BKα-YFPとCFP-cav3の間でFRETが観測された。BKαのC末端にあるcav1 binding motif(^<1072>YNMLCFGIY^<1080>)を欠損させた変異体(BKαΔCB-YFP)とCFP-cav3の間のFRET効率はBKα-YFPと比べて有意に減弱した。また、共免疫沈降の結果からも、両者がcavlbinding motifを介して分子間相互作用を有することが示唆された。以上より、cav1と同様、cav3もBKチャネルの細胞膜発現あるいは機能を修飾すると考えられる。(2)ヒト軟骨肉腫由来細胞から同定したBKチャネル新規バリアント体(BKαΔe2)の生理的機能を明らかにすることを目的とした。BKαΔe2及びBKαの細胞外N末端にFLAG、細胞内C末端にmCherryを融合させた変異体を作製した(F-BKαΔe2-mCh及びF-BKα-mCh)。これらをHEK細胞に発現させ、ホールセルパッチクランプ法によってBKチャネル電流を測定したところ、F-BKαΔe2-mCh発現細胞ではBKチャネル電流は観測されなかった。抗FLAG抗体でFLAGを検出し、各BKα変異体が細胞膜に発現するかを調べた。その結果、F-BKαΔe2-mChは細胞膜に移行しなかった。両者をHEK細胞に共発現させてホールセル電流を解析した結果、BKαΔe2はBKaのチャネル機能を抑制した。また、ヒト軟骨組織においてBKαΔe2のmRNA発現が示唆された。以上より、BKαΔe2は軟骨細胞においてBKチャネルの機能的発現量を抑制し、細胞内カルシウム動態を制御する可能性が示唆された。BKαΔe2が単独ではイオンチャネル機能を示さないこと、及び野生型のBKαと四量体を形成してその機能を抑制することが明らかとなった。また、ヒト由来の軟骨組織においてmRNAレベルで発現することも示唆された。以上のようにBKαΔe2の生理機能が明らかになりつつある。BKαΔe2の欠損領域のどの部分が細胞膜発現あるいは野生型BKαの機能修飾に重要であるか解明する。また、培養軟骨細胞を用いて、BKαΔe2が細胞増殖や基質産生のような軟骨細胞の機能に対して影響を及ぼすのか解明する必要がある。更に、変形性膝関節症や関節リウマチなどの疾患モデル動物または患者由来の軟骨組織において、BKαΔe2のmRNA量及びBKチャネル機能現が変化するか明らかにすることが重要である。近年、個々の単一チャネル分子に加えて、相互作用し合う輸送分子、機能修飾分子、足場タンパク質などから構成される分子複合体(トランスポートソーム)が生体膜輸送の機能単位であると提唱されている。足場タンパクの一種であるカベオリンは細胞膜表面にカベオラを形成し、イオンチャネルや機能分子を集積させる。そこで本研究では、TIRF顕微鏡による1分子可視化とパッチクランプ法によって、カベオラ内で構成されるトランスポートソームによるカルシウムシグナリング制御機構を解明し、より高度かつ組織特異的なイオンチャネル機能や薬物感受性あるいは病態形成の機序など、新たな知見を見出すことで新規創薬につなげることを目的とした。大コンダクタンスCa^<2+>活性化K^+(BK)チャネルは複合体を形成した電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)から流入したCa^<2+>によって直接活性化されることが神経細胞で報告されているが、平滑筋に関する報告は為されていない。そこで当該年度は、カベオリン1ノックアウトマウス(Cav1-KO)を用いて、平滑筋におけるBK-VDCC複合体の生理的意義とこれに対するカベオラの寄与の解明を目標とした。本研究により、腸間膜動脈平滑筋単離細胞において機能的BK-VDCC複合体が存在し、カベオリン1が複合体形成を促進することが明らかになった。複合体内のBKチャネル活性が活動電位の再分極相の形成に寄与すること、及びCav1-KOではBKチャネル活性が減弱することが示唆された。腸間膜動脈還流標本を作成して脱分極刺激に対する反応性を調べたところ、Cavl-KOではWTに比べてBKチャネル活性が抑制された。以上より、血管平滑筋ではBK-VDCC複合体はカベオラによって正に制御され、細胞膜脱分極時の活動電位の形成とVDCCに対するネガティブフィードバック機構を介して、平滑筋の興奮性制御に寄与すると推測される。血管平滑筋細胞において、BKチャネルとCav1.2の機能連関とそれに対するカベオリン1の寄与を調べるため、カベオリン1ノックアウトマウス(KO)とパッチクランプ法及びTIRF顕微鏡による1分子イメージング法を用いて実験を行った。パッチクランプ法による機能解析から、腸間膜動脈平滑筋単離細胞においてBKチャネル-Cav1.2複合体はカベオリン1によって正に制御されることが明らかになった。

また、BKチャネル及びCav1.2の蛍光タンパク質標識体を作製し、1分子可視化解析を行った結果、KO由来細胞において、(1)BKチャネル-Cav1.2複合体数の減少、(2)FRET効率の減弱、(3)1つの蛍光スポット中のCav1.2の減少が観察された。これらの結果から、カベオリン1は(1)複合体数の増加と(2)複合体内のCav1.2の増加をもたらし、BKチャネル活性を増大させることが示唆された。単離平滑筋細胞を用いて筋収縮力を調べたところ、KO由来細胞において40mMKClKreb's溶液による収縮反応が有意に増大していた。しかし、BKチャネル特異的阻害薬である1μMパキシリン存在下では両者の収縮力に有意な差はなかった。筋静止時に1μMパキシリンを投与したところ、KO由来細胞では筋収縮力が有意に減弱していた。これらの結果から、KO由来細胞において筋興奮時及び静止時におけるBKチャネル活性の減弱が示唆された。以上より血管平滑筋細胞において、BKチャネルとCav1.2は複合体を形成し、カベオラによって正に制御されることが明らかとなった。この複合体は(1)細胞膜脱分極時の活動電位の形成と(2)BKチャネル活性によるCav1.2活性に対する負帰還機構に関与すると考えられ、カベオラ及びその内部に形成されるBKチャネル-Cav1.2複合体は血管平滑筋機能制御において重要な役割を担うと推測される。(1)カベオリン3(cav3)は骨格筋において筋構造の形成・維持に重要な因子であり、肢帯型筋ジストロフィーの原因遺伝子となる。BKチャネルは近年、骨格筋において機能発現し、興奮性制御に寄与すると報告されている。本研究では、HEK細胞を用いて、BKチャネルとcav3の関係を解明することを目的とした。蛍光標識したBKチャネル(BKα-mCh)とcav3(GFP-cav3)をHEK細胞に共発現させTIRF顕微鏡で可視化解析したところ、両者が共局在し一体としての挙動を示した。また、BKα-YFPとCFP-cav3の間でFRETが観測された。BKαのC末端にあるcav1 binding motif(^<1072>YNMLCFGIY^<1080>)を欠損させた変異体(BKαΔCB-YFP)とCFP-cav3の間のFRET効率はBKα-YFPと比べて有意に減弱した。また、共免疫沈降の結果からも、両者がcavlbinding motifを介して分子間相互作用を有することが示唆された。以上より、cav1と同様、cav3もBKチャネルの細胞膜発現あるいは機能を修飾すると考えられる。(2)ヒト軟骨肉腫由来細胞から同定したBKチャネル新規バリアント体(BKαΔe2)の生理的機能を明らかにすることを目的とした。BKαΔe2及びBKαの細胞外N末端にFLAG、細胞内C末端にmCherryを融合させた変異体を作製した(F-BKαΔe2-mCh及びF-BKα-mCh)。これらをHEK細胞に発現させ、ホールセルパッチクランプ法によってBKチャネル電流を測定したところ、F-BKαΔe2-mCh発現細胞ではBKチャネル電流は観測されなかった。抗FLAG抗体でFLAGを検出し、各BKα変異体が細胞膜に発現するかを調べた。その結果、F-BKαΔe2-mChは細胞膜に移行しなかった。
好酸球性鼻副鼻腔炎におけるインターロイキン-18の関与について

平成17年4月から同19年3月までに兵庫医科大学耳鼻咽喉科において両側慢性副鼻腔炎で手術治療を行った症例は、141例あり、そのうち好酸球性あるいは喘息合併鼻副鼻腔炎手術例は31例(22.0%)であった。さらにアスピリン喘息と診断された症例は8例であった。対象となった31例の内訳は、男性19例、女性12例で、年齢は24-76歳(平均51.3歳)であった。対象症例の末梢血液中好酸球数は、平均11.8%(3.9-49,8%)(基準値2-7%)であり、ほとんどの症例において高好酸球血症をしめした。アレルギー性鼻炎の合併は19例(61.3%)に認め、これらは血液検査(lgE、RIST値、RAST値)にて確認した。症例は全例内視鏡下鼻内手術を行い、手術時に採取した鼻茸、鼻粘膜(下甲介粘膜・嗅粘膜)について組織学的に検討した。通常の光学顕微鏡による好酸球浸潤程度にくわえ透過型電子顕微鏡による好酸球の確認も行った。全ての症例において、鼻茸組織中には高度の好酸球浸潤を認めたが、下甲介粘膜には高度な好酸球浸潤を認めなかった。嗅裂にポリープ状病変を認めた症例での嗅裂粘膜所見でも、好酸球浸潤を認めたが、嗅細胞の存在する嗅粘膜下組織には、あまり高度な好酸球浸潤を認めなかった。鼻茸組織では、粘膜下のみならず、粘膜上皮内へも浸潤する好酸球を認めたが嗅上皮には、見られなかった。電子顕微鏡で確認すると、細胞体内に特徴的な穎粒を有する好酸球が集籏している所見が数多く認められた.IL・18との関わりを確認するため、鼻茸組織、下甲介粘膜に対する免疫組織化学をIL-18レセプターについて行ったが、今回採取した試料においては十分な確認が出来なかった。鼻茸組織のELISA法によるIL・4、5は3症例について検討したが、喘息非合併例と比較すると高値を示した。残念ながら、IL-18とのかかわりを十分証明することは行えなかったが、好酸球の高度な浸潤が好酸球性・喘息合併慢性鼻副鼻腔炎における鼻茸形成に深く関わっていること、嗅裂における好酸球浸潤による粘膜浮腫が、これらの症例の嗅覚障害の主な病態であり、嗅細胞の消失あるいは変性が嗅覚障害の主な病態ではないと考えられた。今後、IL-18の関わりについては、組織学的手法を見直し、好酸球との関わりも含め再検討する予定である。喘息合併あるいは高好酸球血症を有する慢性副鼻腔炎患者は、高率に鼻茸を合併する。

1995年より2005年末までに、115例の対象となる手術例を経験してきたが、血液中好酸球数は11.2%であり、109例(94.8%)に鼻茸を合併していた。鼻茸組織中には、高度の好酸球浸潤を認めている。平成17年度内に喘息合併あるいは高好酸球血症(血液中好酸球7%以上と定義した)を合併した慢性鼻副鼻腔炎で内視鏡下鼻内手術を行ったものは14例(平成18年2月まで)あり、そのうちアスピリン喘息をしめした症例は8例であった。いずれも、中鼻道に鼻茸を認め、上鼻道にも鼻茸を有するものが多く、14例中9例で嗅裂にも鼻茸を認めた。H&E染色での鼻茸組織検査では、程度の差はあれ好酸球の浸潤を高度に認めていた。同時期に行った、鼻茸を有する慢性鼻副鼻腔炎の手術例では、いずれも鼻茸への高度の好酸球浸潤はみられず、喘息合併例・高好酸球血症例での鼻茸の形成機序とは異なる可能性を示唆するものであった。これら組織中のIL-18レセプターなどについて、免疫組織化学、RT-PCR法などにて検討中である。喘息合併あるいは高好酸球血症を有する慢性副鼻腔炎患者は、高率に鼻茸を合併する。1995年より2006年末までに、145例の対象となる手術例を経験してきたが、血液中好酸球数は11.8%であり、121例(83.4%)に鼻茸を合併していた。平成18年度内に喘息合併あるいは高好酸球血症(血液中好酸球7%以上と定義した)を合併した慢性鼻副鼻腔炎で内視鏡下鼻内手術を行ったものは24例(平成19年3月まで)あり、そのうちアスピリン喘息をしめた症例は12例であった。いずれも、中鼻道に鼻茸を認め、上鼻道にも鼻茸を有するものが多く、24例中8例で嗅裂にも鼻茸を認めた。これら組織中のIL-18レセプターなどについて、免疫組織化学、また嗅粘膜への好酸球浸潤程度を電子顕微鏡なども用いて検討中である。
新規有機ハロシラン試薬の開発とポリマー材料への応用

本研究では、新規のヨードシラン、プロモシランの合成等価体を開発した。また、ヒドロシランから誘導できるジアルコキシヒドロシランなどを原料とする新規ケイ素系ポリマーの合成と、合成したポリマーの光学・熱特性を検討した。1.ジアミノシランとヨウ化メチルあるいはアリルブロミドの混合物がジヨードおよびプロモシランの等価体として働き、環状エーテルの開環ハロシリル化に利用できることを明らかにした。また、ヒドロシロキサンポリマーとアリルブロミドの混合物が、塩化パラジウム触媒存在下で、プロモシロキサンポリマーの等価体として環状エーテルと反応しハロアルコキシ-置換ポリシロキサンをあたえることを見出した。生成したハロアルコキシポリシロキサンの反応性も検討した。2.ジヒドロシラン、トリヒドロシランの選択的アルコキシ化を利用して、ビニレンフェニレンやアダマンタン骨格を主鎖に有する新規ポリマーの合成を行い、その光励起エネルギー移動、高耐熱性などの機能を明らかにした。3.アルコキシバロシランの電解反応による選択的なカップリング反応を検討し、アルコキシ置換のジシラン、トリシランの合成に応用できることを見出した。4.アルコキシ置換ポリシリレンフェニレンを原料として、ベンゾクラウン発色団を側鎖に有するポリマーを合成した。これらのポリマーは、選択的にアルカリ金属およびアルカリ土類金属イオンと反応し蛍光スペクトルの変化を見せるので、イオンセンサーとしての利用可能性があることがわかった。以上の結果は、ヨードシラン、プロモシラン、アルコキシシランが有機合成のツールとしてのみならず機能性ポリマーなどの出発物として有用であることを示している。本研究では、新規のヨードシラン、ブロモシランの合成等価体を開発した。また、ヒドロシランから誘導できるジアルコキシヒドロシランを原料とする新規ケイ素系ポリマーの合成と、合成したポリマーの光学特性を検討した。1)ジアミノシランとヨウ化メチルあるいはアリルブロミドの混合物が、用いるハロゲン化物の当量に応じて、相当するアミノハロシランあるいはジハロシランの等価体として働き、THF、プロピレンオキシド、シクロヘキセンオキシドなどの環状エーテルの開環ハロシリル化に利用できることを明らかにした。生成したハロアルコキシシランは、アミノ化によって、アミノアルコキシシランへと変換することが可能であった。2)ヒドロシロキサンポリマーとヨウ化メチルあるいはアリルブロミドの混合物をPdCl_2触媒存在下で、環状エーテルと反応させると、ポリマー上での環状エーテルの開環ハロシリル化が進行してシロキサンポリマーのケイ素上にハロアルコキシ基が導入できることが分かった。3)ジアルコキシヒドロシランをブロモフェニルアセチレンとヒドロシリル化して得られる(ブロモフェニルエテニル)アルコキシシランをマグネシウムでカップリングして重合するとケイ素上にアルコキシ基を一つ残して反応は選択的に進行し、ポリ(アルコキシシリレンフェニレンビニレン)が生成した。残ったアルコキシ基を、求核剤と反応させると、さまざまな置換基をケイ素上に導入できる。この手法でピレニルエチニル基を導入したポリマー主鎖のフェニレンビニレンを光励起すると、ピレニルエチニル基からの発光が観測された。光励起状態で、フェニレンビニレンからピレニルエチニル基へのエネルギー移動が起こっていることを示している。同種のケイ素系ポリマーで主鎖中でのπ電子系間でのエネルギー移動の報告はあるが、主鎖から側鎖へのエネルギー移動の例は初めてであり、興味深い。有機ケイ素化合物、およびポリマーは、有用な反応試剤または新規な機能材料として期待され、盛んに検討されている。しかし、そのもっとも基本的な出発原料であるハロシラン、アルコキシシランなどの簡便な合成法は限られており、また試剤自身の種類もそれほど多くない。

したがって、このような基本的な試剤の合成法を開拓していくことは、今後のケイ素かあくの発展を考える上で、非常に重要である。本研究では、このような観点から、新規なハロシラン試剤として、ジブロキシラン、ジョードシランなどの合成等価体の生成法の確立を図り、またこれらの試剤、および以前に開発したポリヒドロシランの選択的脱水素アルコキシ化反応を利用して、新しいケイ素化合物の合成反応の開発、および機能性ケイ素高分子の合成への展開をおこない、以下のような成果を挙げた。1.ジョードシラン、ジブロモシラン等価体、ヨード、およびブロモシロキサンポリマー等価体の反応挙動を検討するとともに、この反応を利用して合成したハロアルコキシ-置換ポーリシロキサンとアミンの反応から、アミノアルコキシ-置換ポリマーを得ることを見出した。2.ジヒドロシラン、トリヒドロシランの選択的アルコキシ化を利用して、ビニレンフェニレンやアダマンタン骨格を主鎖に有する新規ポリマーの合成を行い、その光励起エネルギー移動、高耐熱性などの機能を明らかにした。3.アルコキシハロシランの電解反応による選択的な変換反応を検討し、アルコキシ置換のジシラン、トリシランの合成に応用した。
アデノシンによる歯周組織メカニカルストレス応答機構の制御

本研究課題では、in vitro、in vivoの両面から歯周組織にメカニカルストレスを加えた際のアデノシンの役割について解析を行った。ヒト歯根膜細胞において伸展刺激下ではアデノシンレセプター(AdoR)の発現変化を認めなかったが、マウス矯正モデルでは牽引側において歯根膜組織におけるアデノシン産生酵素CD73分子の発現が上昇した。一方で、歯牙矯正力によって歯根膜組織が低酸素環境に誘導されること、さらに低酸素環境ではAdoRの発現が制御を受ける可能性が示唆された。本研究課題では、骨代謝の調節因子の一つであるアデノシンが、歯周組織の恒常性維持に担う役割について、メカノバイオロジーの視点から解析を進めている。平成25年度の研究成果について以下に報告する。まず、歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化過程におけるサブタイプ毎のアデノシンレセプターの発現を検討した。すなわち、ベータグリセロリン酸・アスコルビン酸含有の石灰化誘導培地にてヒト歯根膜細胞を培養し、経時的なアデノシンレセプターの遺伝子発現をPCR法にて解析した。その結果、培養7日目および培養14日目においてA1アデノシン受容体の遺伝子発現が上昇していることが明らかとなった。一方でA2aおよびA2bアデノシン受容体の発現に著明な変化は認められなかった。次に、ヒト歯根膜細胞にin vitroにて伸展刺激(30回/分伸展率10%)を24時間加え、アデノシン受容体の発現を解析した。その結果、いずれのサブタイプにおいても著明な変化を認めなかった。一方で、マウス矯正モデルを用いて、メカニカルストレスに対するアデノシン産生酵素CD73の発現変化について検討を行った。C57BL/6の上顎第一臼歯と第二臼歯の歯間部に厚み0.54mmのOリングエラスティックモジュールを挿入し、2日後の歯根膜組織におけるCD73分子の発現を免疫染色法にて検討した。その結果、CD73分子の発現は牽引側にて上昇していることが明らかとなった。我々はこれまでに同分子の発現がマウス骨芽細胞の分化に伴い上昇することを明らかにしており、同分子がメカニカルストレス応答性の骨形成においても重要な役割を担う可能性が示唆された。本研究課題では、骨代謝の調節因子の一つであるアデノシンが、歯周組織の恒常性維持に担う役割について、メカノバイオロジーの視点から解析を行った。平成26年度の研究成果について以下に報告する。これまでにアデノシンは虚血性疾患や腫瘍の研究から低酸素応答との強い関連性が報告されている。そこでH25年度に確立したマウス矯正モデルを用いて、歯牙矯正時の歯周組織が低酸素状態となるか否かについて検討を行った。すなわち、C57BL/6の上顎第一臼歯と第二臼歯の歯間部に厚み0.54mmのOリングエラスティックモジュールを挿入し、屠殺1時間前に低酸素部位に集積することが知られているピモニダゾールを腹腔内投与し、凍結切片を作成した後、免疫染色法にて同分子の集積部位を解析した。その結果、予想された通り、圧迫側における歯周組織が低酸素状態となっていることが示唆される染色像が得られた。そこで、歯根膜細胞あるいは歯肉線維芽細胞を低酸素環境下にて培養し、各アデノシン受容体とアデノシン産生酵素CD73の発現について解析を行った。すなわち、歯根膜細胞あるいは歯肉線維芽細胞を1%酸素濃度下にて12時間培養した際の各アデノシン受容体およびCD73の遺伝子発現を解析したところ、歯根膜細胞においてはA2bアデノシン受容体の発現のみが上昇する傾向を示した。一方で、歯肉線維芽細胞においては、A1アデノシン受容体の発現が低酸素で低下し、HIF-1a阻害剤存在下では、その低下が抑制された。同様の結果はdeferoxamine刺激によっても確認された。またA2bアデノシン受容体の発現は低酸素およびdeferoxamine刺激によって上昇し、同上昇はHIF-1a阻害剤存在下では有意に抑制された。以上の結果から、メカニカルストレスによって誘導される低酸素環境がアデノシンシグナルの制御に関与している可能性が示唆された。歯周病学in vitro、in vivoの両目から歯根膜組織におけるアデノシン関連分子の発現について解析を行い、研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。マウス歯根膜においてメカニカルストレス応答性にCD73分子の発現変化が見られたため、CD73ノックアウトマウスを用いて、同分子の機能解析を行う。また、in vivoにおけるアデノシン受容体の発現変化についても検討を行い、歯根膜組織におけるアデノシンシグナルのメカニカルストレス応答における役割を解析する。研究を遂行するにあたり、必要に応じて試薬やプラスチック器具等の消耗品購入のために研究費を執行しており、H25年度は当初の見込み額と執行額が異なる結果となった。
分子間距離で紐解く、遺伝子発現反応場の再構成

遺伝子発現機構の反応場を再構成するために、DNAナノ構造物(DNA origami)上に、転写酵素(T7 RNA polymerase、以下T7 RNAP)と基質遺伝子を集積化した"転写ナノチップ"を核に研究を進めた。本年度は主に、1材料調整、2観察系の構築、3ナノ反応場の更なる理解、に取り組んだ。1においては、T7 RNAPの代わりに、真核のRNA Polymerase II(Pol II)を集積化する実験に向け、真核転写に必要な酵母由来の主要因子の調整に取り組み、共同研究先から入手予定の超分子を除いた、因子の調整が完了した。2においては、ナノチップの転写活性を観察するために、半導体微細加工技術を用いて、微小開口チップの作製を行い、製作条件の最適化を行った。3においては、基質遺伝子部分に論理スイッチを組み込むことで制御が可能となった。ナノ反応場の理解においては、DNAナノ構造に固定した基質遺伝子とRNAP(T7 RNAPやPol II)がどのように振舞うのかを理解することが重要であるが、本年度において、論理スイッチ付の基質遺伝子の振る舞いを計測した事で、よりその理解が深まった。また、高効率な反応を実現できるナノ反応場は、産業応用も期待されるが、論理スイッチを組み込んだことで、センサー(論理スイッチ)とアクチュエーター(RNAP)が1つのチップ上に集積した事となり、1分子のチップで、検出・演算・出力の機能を併せ持つ、自律的ナノデバイス(論理チップ)の構築ができた。論理チップは、従来、多種・多数の生体分子を用いる必要があった論理機能の実現が、1分子のチップで実現できる事を示唆しており、従来作製することが難しかった複雑な遺伝子回路の構築に有用であると期待される。本年度は、計画した各項目について、進展が見られた。また、論理チップの構築においては、期待以上の進展が得られた。今後は、転写系の実験を進めると共に、翻訳系への展開も進める。微小開口チップ作製を促進するために、研究員の方を雇用した。この人件費、並びに、製作を行っている京都大学、ならびに、大阪大学のナノハブ拠点の使用料に支出予定である。本研究では、ナノ反応場の活性を測定するために、半導体微細加工技術を用いて、微小開口チップの作製を行っている。当該項目において、最適化の進捗の兼ね合いで、支出が予想より少なく、次年度使用額が生じた。
自己抗原ノックアウトマウスを用いた自己免疫疾患モデル動物の開発

自己免疫性疾患において実験動物モデルを作成することは、その発症メカニズムを知る上において極めて重要である。本研究の目的は、自己抗原ノックアウトマウスが、欠失している蛋白に対し免疫寛容が成立していないことを利用して、全く新しい方法により自己免疫モデルマウスを作成することにある。具体的には、自己免疫性水疱性疾患である尋常性天疱瘡に焦点を絞り、標的抗原であるデスモグレイン3ノックアウトマウス(Dsg3-/-)を用いて、天疱瘡モデルマウスを作成することにある。バキュウロウイルス発原型を用いて作製したマウスDsg3の組換え蛋白(マウスrDsg3)を用いて、Dsg3-/-マウスに免役したところ、in vivoでDsg3に反応できる抗体を産生した。さらに免役したマウスDsg3-/-の脾細胞を分離し、Rag2-/-マウスに移植したところRag2-/-マウス内にて、坑Dsg3IgG抗体が6ヵ月以上の長期間産生することが確認された。さらに移植後3週間後にて、Rag2-/-マウスの体重減少が認められ、口腔内には、尋常性天疱瘡に特徴的な所見である表皮基底細胞直上で表皮内水疱形成(Suprabasilar acantholysis)が認められた。さらに、詳しい病理学的検討により、頭部、四肢、躯幹の皮膚、舌、頬粘膜、食道上部などの重層扁平上皮のいかなるところにも同様の水疱形成が認められることが確認された。さらに、移植する際の脾細胞をT細胞、B細胞に分離後、種々の組み合わせて移植したところ、病的自己抗体産生に必要であることが示唆された。当研究で開発されたモデルマウスは、自己抗体産生機序の解明に有用であるばかりでなく、疾患特異的治療法の開発する上で重要なツールとなると考えられる。本研究の目的は、自己免疫性水水疱疾患である尋常性天疱瘡に焦点を絞り、標的抗原であるデスモグレイン3ノックアウトマウス(Dsg3-/-)を用いて、天庖瘡モデルマウスを作成することにある。抗原蛋白を遺伝子操作により欠失させてあるノックアウトマウス(-/-)においては、免疫系の発生過程において抗原蛋白によるT・B細胞の除去が起こらず、免疫寛容が成立していない。そこで、Dsg3-/-マウスにrDsg3を免疫することにより、効率よく病的活性を持つ抗体を誘導できると考えられる。本年度は、マウスDsg3の組換え蛋白(マウスrDsg3)をバキュロウイルス発現系を用いて作製した。種々のDsg3+/+野生型マウスでは、マウスrDsg3を免疫しても、マウスDsg3に対する抗体価は上昇しなかった。ところが、Dsg3-/-マウスにマウスrDsg3を免疫したところ効率よく、マウスDsg3に対する抗体を産生した。免疫したマウスDsg3-/-の牌細胞を分離し、Rag2-/-マウスに移植したところRag2-/-マウス内にて、抗Dsg3IgG抗体が持続的に産生することが確認された。さらに、移植後3週前後にて、Rag2-/-マウスの体重減少が認められ、口腔内を生検してみると、尋常性天疱瘡に特徴的な所見である表皮基底細胞直上で表皮内水疱形成(Suprabasil aracantholysis)が認められた。以上の結果より、2種のノックアウトマウスを使用することにより、天疱瘡のモデルマウスが作製されたことになる。

来年度は、さらに、抗体産生の持続性、各臓器の病理組織学的所見、抗体産主に関与するBおよびT細胞の検討を行う予定である。自己免疫性疾患において実験動物モデルを作成することは、その発症メカニズムを知る上において極めて重要である。本研究の目的は、自己抗原ノックアウトマウスが、欠失している蛋白に対し免疫寛容が成立していないことを利用して、全く新しい方法により自己免疫モデルマウスを作成することにある。具体的には、自己免疫性水疱性疾患である尋常性天疱瘡に焦点を絞り、標的抗原であるデスモグレイン3ノックアウトマウス(Dsg3-/-)を用いて、天疱瘡モデルマウスを作成することにある。バキュロウイルス発原系を用いて作製したマウスDsg3の組換え蛋白(マウスrDsg3)を用いて、Dsg3-/-マウスに免役したところ、in vivoでDsg3に反応できる抗体を産生した。さらに、免疫したマウスDsg3-/-の脾細胞を分離し、Rag2-/-マウスに移植したところRag2-/-マウス内にて、抗Dsg3IgG抗体が6ヶ月以上の長期間産生することが確認された。さらに、移植後3週前後にて、Rag2-/-マウスの体重減少が認められ、口腔内には、尋常性天疱瘡に特徴的な所見である表皮基底細胞直上で表皮内水疱形成(Suprabasilar acantholysis)が認められた。さらに、詳しい病理学的検討により、頭部、四肢、躯幹の皮膚、舌、頬粘膜、食道上部などの重層扁平上皮のいかなるところにも同様の水疱形成が認められることが確認された。さらに、移植する際の脾細胞をT細胞、B細胞に分離後、種々の組み合わせて移植したところ、T細胞のみならずB細胞レベルにおいても免疫寛容が成立していないことが、病的自己抗体産生に必要であることが示唆された。当研究で開発されたモデルマウスは、自己抗体産生機序の解明に有用であるばかりでなく、疾病特異的治療法の開発する上で重要なツールとなると考えられる。
液体燃料を用いた液滴パージ法による革新的実用型パルスデトネーションエンジンの実証

昨今の環境・エネルギー問題に対して、ブラッシュアップされた既存の推進・発電エンジンの飛躍的な性能向上は見込めない。最も激しい燃焼モードであるデトネーション波を利用したパルスデトネーションエンジン(PDE)は、既存のエンジンシステムを一新するポテンシャルを有する。PDEは、円筒形状の燃焼器内で、PDE1サイクル(推進剤の供給・デトネーション波の伝播・既燃ガスのパージ)を繰り返す。実用化の観点から、推進用PDEの次の明確な課題は、液体燃料・酸化剤の使用,高周波数作動による高推力重量比の実証である。本研究独自の手法である液滴パージ法の基礎実験(噴霧実験)を開始した。並行して、液体C2H4-液体N2Oを用いた回転バルブ式四気筒パルスデトネーションロケット(TODOROKI II)を構築した(全長1.9 m、全重量32.5 kg)。液体推進剤を使用した推力測定実験を行い、約400 Hzの高周波数作動および256 Nの時間平均推力の発生を確認した。本研究が2006年に構築したTODOROKIの推力重量比を大幅に向上させた。この結果、液体酸化剤を使用したPDE作動を実証し、さらに、世界発の飛行試験を実現性を確認した。2013年10月20日には、名古屋大学内実験室にて、打ち上げ角度約10°の飛行試験に成功した。さらに、2013年12月01日には、筑波大学構内において、打ち上げ角度90°(垂直打ち上げ)での飛行試験に成功した。この一連の飛行試験によって、液体推進剤を使用したPDEトータルシステムでの実飛行環境下(6自由度下)推力実証および飛行特性の把握を行った。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
二成分混合冷媒を用いるヒートポンプの高性能蒸発器の開発

1.R22-R114混合冷媒および各単一成分冷媒の水平平滑蒸発管内熱伝達に関する実験を前年度とは異なる条件で行い、混合冷媒の熱伝達係数は、核沸騰が伝熱に大きく寄与する領域では物性値が等価な単一成分冷媒より低くなるが、強制対流が支配的な領域では単一成分冷媒とほぼ等しいという前年度得た結果を再確認した。2.混合冷媒の管内流沸騰・蒸発熱伝達に関する従来の整理式では上述の特性を十分考慮していないため、実験データの示す傾向を表すことができず新たな整理式を作成する必要がある。3.管周方向に一様な厚さの液膜が形成される気液環状二相流の詳細な伝熱モデルを作成し、気相および液相中の成分冷媒の半径方向拡散が伝熱に及ぼす影響を計算して検討した結果、この影響は小さく、熱伝達係数がたかだか20%低くなる程度である。すなわち、核沸騰が生じていない強制対流支配域では、混合冷媒の蒸発管内熱伝達に及ぼす半径方向の物質拡散の影響は小さいことが理論的にも確認された。4.混合冷媒の水平管内環状二相流領域における熱伝達係数は、管周方向に幾分変化し、単一成分冷媒の場合とは逆に、管頂部で低く管底部で高くなる。この原因を調べるために、液膜厚さの管周方向の分布形を仮定し、管周方向の物質移動も考慮したモデルに基づいて計算した結果、管頂部ほど液膜が薄くなり、それに伴って低沸点成分の濃度が小さくなって気液面温度が高くなるためであることを明らかにした。5.内面にら旋状の微細な溝を加工した管を用いて、R22-R114混合冷媒および各単一成分冷媒の低流量域における沸騰・蒸発熱伝達の実験を行った結果、溝付管による伝熱促進の程度は、クオリティの低い領域で単一成分冷媒の場合より劣るが、高クオリティ域では単一成分冷媒の場合と同程度あるいはむしろ大きいということが明らかになった。
実数直線上の組合せ論と強制法理論の研究

今年度は、以下の研究を行った。2.P_<max>variation related to slaloms : Woodinにより導入され、Larson、Shelah-Zapletalにより発展されたP_<max>バリエーションについて研究した。ここでは、「ある順序集合のcofinalityがN_1である」ことのoptimal iteration lemmaを、特定の3種の順序集合について証明している。3.P_<max>variation of destructible gaps:これは、Miami UniversityのPaul B.Larson氏との共同研究である。Larson、およびShelah-Zapletalは、特殊な性質をもつSuslin treeのII_2-compactnessを研究している。すなわち、それらの存在に対するoptimal iteration lemmaを証明しているわけである。この研究で、我々は、Suslin treeが存在する、およびdestructible gapが存在することのsimple iteration lemmaを証明した。Shelah-Zapletalは、Suslin treeが存在することのoptimal iteration lemmaが成り立たないことを証明しているが、我々は、destructible gapが存在することのoptimal iteration lemmaが成り立たないことを、新たなP_<max>バリエーションを用いることにより証明した。P(ω)/fin上のgaps,特にdestructible gapsに関する研究を行った。Destructible gapsは,実数直線の特徴づけに関するSuslinによる問題と同類の特徴づけを持っており,いくつかの同類の結果がすでに知られていた。Brendleは,meager idealのcofinalityの値がN_1かつ〓が成り立つとき,Suslin treeが存在することを,宮元はmeager idealのcovering numberの値がN1かつ〓が成り立つとき,Suslin treeが存在することを証明しているが,研究代表者は両方の仮定とも,destructible gapの存在を導くことを証明した。また,強制概念Sについての考察を行うことにより,Paul Larsonが導いたSuslin treeに関する主張のdestructible gapに関するanalogyを導いた。
細胞移植治療法におけるグリア細胞の役割

パーキンソン病の薬物療法に代わる新たな治療法として、失われた神経細胞を補う細胞移植療法の開発を研究してきた。胚性幹細胞や人工多能性幹細胞から神経細胞を誘導する際に、これまでに開発された分化誘導法に神経細胞を保護する役割を持つと考えられているグリア細胞から分泌される因子を加えることで、分化誘導された神経細胞はこれまで誘導されていた神経細胞よりも治療効果の高い細胞に分化させることができた。パーキンソン病の治療は薬物療法や脳深部刺激療法が主に行われているが、パーキンソン病により減少しているドパミン神経細胞を補充している治療法ではないため、根本的な治療法ではないと考えられる。そこで、幹細胞からドパミン神経細胞を誘導し、脳内に移植することにより、失われた神経細胞を補充する細胞移植治療法が研究されている。ドパミン神経細胞の誘導には成功しているが、脳内に移植した後のドパミン神経細胞の生存率が低いことが問題となっている。そこで、神経細胞を保護すると考えられているグリア細胞に着目し、研究を行ってきた。前回はマウスES細胞から分化誘導したドパミン神経前駆細胞とマウス胎児中脳腹側部位の細胞から培養したグリア細胞をラミニンやファイブロネクチンでコートした培養皿で共培養することで、グリア細胞にはドパミン神経前駆細胞の生存と分化を促進する機能があることがわかった。そこで、これらの細胞をマウスの脳内に移植して、ドパミン神経の生存率が上がるかを試みたが、期待された結果が得られなかった。また、ヒトのiPS細胞においてもマウスのグリア細胞がヒトのドパミン神経前駆細胞の生存と分化を促進する機能があるかを調べた。本研究室で臨床応用に向けて開発された分化誘導法で誘導したドパミン神経前駆細胞とグリア細胞を共培養したところ、ドパミン神経のマーカーであるチロシン水酸化酵素(TH)を発現する細胞が減少してしまった。そこで、グリア細胞から分泌される因子を含んだ培地でドパミン神経前駆細胞を浮遊培養で培養したところ、THの発現する細胞が増加した。以上のことから、ヒトの分化誘導細胞において、マウスのグリア細胞から分泌される因子がドパミン神経前駆細胞の分化を促進する効果があることがわかった。胎児中脳腹側部位はパーキンソン病の細胞移植治療用の細胞となりうる細胞で、欧米で研究がされており、一定の効果が報告されている。パーキンソン病の細胞移植治療法で有効であるドパミン産生神経細胞を移植すると、患者の脳内で生着し、機能することも確認されている。しかし、生着する数が非常に少ないことが問題となっている。そこで、神経細胞を補助すると考えられているグリア細胞、特にアストロサイトに着目して研究を行った。まず、細胞移植治療用に使用されている胎児中脳腹側部位を解析した。この部位にはグリア細胞を示すGFAP陽性細胞は見られなかったが、グリア細胞の前駆細胞を示すGlast陽性細胞を確認した。このGlast陽性細胞をセルソーターで分離することができたが、E11のマウス胎児中脳腹側部位の全細胞数の10-15%(細胞数として1胎児脳あたり10000細胞)であった。この分離した細胞と分離しない細胞をグリア細胞へと分化させるための培地で培養したところ、神経細胞を示すTuj1陽性細胞は観察されず、どちらも全細胞数の40-50%でグリア細胞を示すGFAP陽性細胞に分化させることができた。しかし、Glastで分離させた細胞は分離過程を経ているため、得られたGFAP陽性細胞数が分離しない細胞と比べて非常に少なかったため、以後は分離しないで実験を進めた。次にこの分化させたグリア細胞の機能を調べた。胎児中脳腹側部位から分化誘導した細胞とマウスES細胞から分化誘導したドパミン前駆神経細胞を14日間共培養を行ったところ、ドパミン前駆神経細胞のみの培養と比べて、ドパミン神経細胞を示すTh陽性細胞数が2-3倍増加していた。したがって、胎児中脳腹側部位から誘導した細胞にドパミン前駆神経細胞の生存あるいは分化を促進させる機能があることがわかった。パーキンソン病の新たな治療法を目指して、本研究室ではこれまでに、幹細胞からドパミン神経細胞を誘導し、実験動物の脳内に移植することにより、失われたドパミン神経細胞を補充する治療法が有効であることを報告している。しかし、移植されたドパミン神経細胞の生着率が低いことが問題となっている。そこで、神経細胞を保護する働きをもつグリア細胞に着目し、移植後にドパミン神経細胞の生存率を上げることを検討してきた。前回までに、本研究室で開発された分化誘導法で、ヒトのiPS細胞からドパミン神経前駆細胞を誘導し、マウスの胎仔腹側中脳から誘導したグリア細胞が分泌する因子がドパミン神経細胞の分化を促進する効果があることがわかった。その因子を調べたところ、これまでに報告されている脳由来神経栄養因子やグリア細胞

株由来神経栄養因子に加えて、トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)も分化誘導因子として加えることにより、ドパミン神経の誘導効率が上昇した。さらに、TGFを加えて分化誘導した細胞は過酸化水素水による酸化的ストレスに対して抵抗性を示すことがわかった。ドパミン神経前駆細胞のマーカーとして知られているNurr1の発現が上昇していることにより酸化的ストレスに対して抵抗性を示したのではないかと考えられる。さらに、TGFを加えて分化誘導した細胞を実験動物の線条体に移植したところ、TGFを加えないで分化誘導した細胞を移植したときよりもドパミン神経細胞の生着率が上昇することがわかった。以上のことから、細胞移植前の分化誘導細胞を改良し、ドパミン神経細胞の生着率を上げることができたことにより、今までの分化誘導法にTGFβを加える分化誘導法が有効であることが示唆され、臨床試験に応用できることが期待される結果が得られた。脳神経外科学神経再生分野昨年のIn vitroでの結果から、マウスのES細胞から分化誘導したドパミン神経前駆細胞とグリア細胞をマウスの脳へ共移植することによって、ドパミン神経の生着率を上げることができると期待されたが、期待された結果が得られなかった。移植するときのグリア細胞の分化状態やドパミン神経前駆細胞との移植の方法を検討する必要がある。一方で、マウス胎児中脳腹側細胞から分化誘導したグリア細胞の分泌因子がヒトのドパミン神経前駆細胞の分化を促進する機能があることを示すことができた。また、昨年、マウスのES細胞から分化誘導したドパミン神経前駆細胞とグリア細胞をマウスの脳内に移植した際に、移植した細胞が増殖し、腫瘍化したような結果になり、問題になっていた。今回、本研究室で開発されたドパミン前駆細神経胞の分化誘導法を用いて分化誘導した細胞をソーティングすることで未熟な細胞を取り除くことができた。以上より、移植細胞の腫瘍化の問題は分化誘導した細胞をソーティングすることにより改善され、また昨年移植細胞のマーキングが問題となっていたが、ヒトの細胞が使えるようになり、ヒト特異的抗体を用いることで移植細胞を区別することができるようになった。現在は移植の方法を検討しているところである。マウスの胎児中脳腹側部位の初代培養からグリア細胞への分化誘導に成功した点や分化誘導したグリア細胞の機能の有効性を示せたところまでは順調に進んでいる。しかし、神経細胞と共培養した後に電気生理学な解析をする予定であったが、まだこの解析ができないでいる。技術的なことなので、電気生理学解析をしている方に相談しながら、進めていく予定である。また、グリア細胞とES細胞から分化した細胞を共培養することで細胞移植するときに懸念される未分化細胞が混入してくる可能性がでてきて、この未分化細胞を混入しないように分化誘導を工夫する必要が出てきた。また、移植するときに、移植した細胞が区別できるようにレンチウイルスベクターでマーキングをすることにも成功したが、すべての細胞にマーキングできているわけではなかった。マーキングできた細胞だけを選別する必要があるか、また、Hoechstなどウイルスベクターを利用しないでマーキングする方法を今後検討する必要がある。グリア細胞から分泌される因子の中で、脳由来神経栄養因子やグリア細胞株
インドの教育制度における『影の制度』に関する研究－無認可学校の機能と役割の検討

最終年度となる本年度は、『影の制度』の概念整理と、これまでの研究成果の発表に努めた。『影の制度』の概念整理にあたっては、Srivastavaの『影の規則枠組み』を参考にした。その成果は、研究課題の構想の基礎となった博士論文をまとめた著書「インドの無認可学校研究ー公教育を支える『影の制度』」にて発表した。ここでは、「影の制度」とは、無認可学校とそこに関わる各行為主体、および各行為主体が無認可学校の存続・発展のために用いる非公式の規則や手続きの総体であり、インドの公教育制度の矛盾や欠陥を反映しながらもこれを支える制度であると説明した。また、正規の大学の認可条件と高等教育機関を管轄する各種法定機関について分析し、無認可の教育機関が土地の敷地面積や生徒数等の認可条件を満たしていないこと、各種法定機関がその役割を果たしていないことを明らかにした。そしてその成果を、京都大学地域研究統合情報センター「相関地域研究」プロジェクト研究会、平成25年度「現代インド地域研究」国内全体集会等で発表し、研究課題を今後さらに発展させる上で有益な助言を得た。このほか、インドの高等教育に関する書籍"Timepass"の翻訳作業(明石書店より出版予定)を通じて、インドの高等教育における『影の制度』の事例を検討した。また、大学に関する事典作成作業(『大学を知る事典』平凡社より出版予定)を通じて、インドの認可大学の現状について理解を深めた。以上の成果は、インドの無認可の教育機関の実態や位置づけ、これらが存続・発展する背景やメカニズムを解明・説明する上で重要である。とりわけ、『影の制度』という概念を提唱できたことは、公教育制度とは異なる論理で展開するインドの非公式の制度の影響力を説明する上で大きな意義があったと考える。現地調査や文献・資料分析を通じて、インドの無認可の教育機関の実態や位置づけ、これらが存続・発展する背景やメカニズムを解明し、これを説明する上で重要な『影の制度』という概念を整理し、その意義や役割を提唱できたため。特別研究員としての研究活動は本年度で最後となるが、引き続き、インドの教育における『影の制度』の分析を進め、関連学会等でその成果発表に努める。インドにおける無認可の高等教育機関(政府から認可されておらず、それゆえ学位授与権を持たない教育機関)の機能と役割を解明するため、本年度はその中でもとくに外国の教育機関と提携する機関について調査をおこなった。本研究では国立教育政策行政大学(NUEPA)のBhushan教授に対する聞き取り調査および研究代表者による現地調査などの結果から、これらの無認可の教育機関は外国での学位授与権を持つ教育機関との提携によって、学位授与を実現していることを確認した。またインドでは高等教育の需要の高まりと多様化にともない民間の高等教育機開が拡大する一方、これらの教育機関に対して政府が適切な統制を行ってこなかったため、無認可の教育機関が発展してきたことを明らかにした。現地調査では無認可の教育機関に在籍する学生とその保護者に対する聞き取り調査を実施し、学生・保護者らは無認可の教育機関がこれまで政府の認可なしでも発展してきたという現状認識のもと、高等教育機関の教育の質は必ずしも認可の有無に左右されないと判断していることを確認した。外国の教育機関との提携によって学位授与を実現する無認可の教育機関は、グローバル化と急速な経済成長を背景に高等教育の量的拡大とその私事化・国際化が進むインドの教育動向を象徴するものであり、その実態解明は本研究のサブ・テーマでもあるインド政府の統制システムと教育の質保証の問題の解明にも貢献するものである。無認可の高等教育機関はアメリカやバングラデシュにも存在しており、本研究の成果は、これらの国の実態との比較によってインドの高等教育制度の特徴をより明確に理解するのにも役立つと考える。本年度は、まず、研究課題の構想の基礎となった博士論文「インドの初中等教育における『影の制度』一デリーの無認可学校の正当性の研究」を完成させ、その成果の一部をOxford Studies in Comparative Education(7.研究発表、2)で発表した。また、2月26日3月5日にかけてデリーを訪問し、インドの高等教育の専門家である国立教育経営大学のSudanshu Bushan教授および工学系・経営学系教育機関への進学支援をおこなう大手教育企業のスタッフに研究課題に関する聞き取り調査をおこなった。その結果、外国の教育機関が提供する無認可の教育プログラムの展望は、2014年の選挙で新たな教育省大臣が選出され、「外国大学法案」が国会で改めて審議されるまで明らかではないことが分かった。また無認可大学の中には、学生や保護者から支持を得る一方、運営の適正性をめぐって何十件もの係争案件を抱えているような大学もあり、高等教育の商業化や質保証のあり方を危惧してこれらの大学に批判的見解を持つ者もいることが明らかとなった。本年度はさらに、インドの就学前教育に関する論文(7研究発表、6)を執筆し、無認可の教育機関が当該教育段階にも多くみられることを確認した。これらの結果から、インドでは、就学前教育から高等教育段階に至るまで、政府の統制を受けない教育機関が『影の制度』として、教育の拡大と多様化を押し進めていることが分かった。また『影の制度』は、急速な経済発展が進む中、国際競争を視野に入れて教育の正規化を図ろうとするインドの葛藤や矛盾を象徴する制度であるという理解に至った。以上の研究成果は、インドにおける『影の制度』の位置づけや役割を理解するのに役立つ貴重な研究成果であるといえる。

『影の制度』の概念整理にあたっては、Srivastavaの『影の規則枠組み』を参考にした。その成果は、研究課題の構想の基礎となった博士論文をまとめた著書「インドの無認可学校研究ー公教育を支える『影の制度』」にて発表した。ここでは、「影の制度」とは、無認可学校とそこに関わる各行為主体、および各行為主体が無認可学校の存続・発展のために用いる非公式の規則や手続きの総体であり、インドの公教育制度の矛盾や欠陥を反映しながらもこれを支える制度であると説明した。また、正規の大学の認可条件と高等教育機関を管轄する各種法定機関について分析し、無認可の教育機関が土地の敷地面積や生徒数等の認可条件を満たしていないこと、各種法定機関がその役割を果たしていないことを明らかにした。そしてその成果を、京都大学地域研究統合情報センター「相関地域研究」プロジェクト研究会、平成25年度「現代インド地域研究」国内全体集会等で発表し、研究課題を今後さらに発展させる上で有益な助言を得た。このほか、インドの高等教育に関する書籍"Timepass"の翻訳作業(明石書店より出版予定)を通じて、インドの高等教育における『影の制度』の事例を検討した。また、大学に関する事典作成作業(『大学を知る事典』平凡社より出版予定)を通じて、インドの認可大学の現状について理解を深めた。以上の成果は、インドの無認可の教育機関の実態や位置づけ、これらが存続・発展する背景やメカニズムを解明・説明する上で重要である。とりわけ、『影の制度』という概念を提唱できたことは、公教育制度とは異なる論理で展開するインドの非公式の制度の影響力を説明する上で大きな意義があったと考える。現地調査の時間を十分に取ることが出来ず、無認可の教育機関のうち工学系の大学とニセ大学の調査、および保護者に対する質問紙調査を実施することが出来なかったが、先行研究の分析と現地調査によって無認可の教育機関が発展する基本的原理について理解を深めることが出来たため。研究課題の構想の基礎となった博士論文の執筆と修正、インドでの現地調査、そして就学前教育に関する論文執筆を通じて、非正規の教育施設が就学前教育から高等教育段階に至るまで存在することを確認し、インドの教育制度における『影の制度』の位置づけや役割、重要性について理解を深めることが出来たため。現地調査や文献・資料分析を通じて、インドの無認可の教育機関の実態や位置づけ、これらが存続・発展する背景やメカニズムを解明し、これを説明する上で重要な『影の制度』という概念を整理し、その意義や役割を提唱できたため。引き続き、現地の研究者や大学関係者らの協力を得て、インドの無認可の教育機関の実態解明に努める。ニセ大学に関しては調査協力を得ることが困難であることが想定されるが、大学関係者等の協力を得て情報収集に努める。『影の制度』の位置づけや役割について理解をより深めるため、今後は(1)認可された教育機関、(2)無認可の教育機関の卒業生を雇用する企業、(3)インドの無認可の教育機関と提携する外国の高等教育機関を訪問し、調査をおこなう。また就学前教育段階の無認可の教育機関に対する統制の動向を調査し、高等教育段階のそれとの比較検討をおこなう。