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分割型積分を含む非線形積分の収束定理の摂動法による統一的解析

非加法的測度による積算概念である非線形積分の中でも,Choquet積分,Sipos積分,Sugeno積分,Shilkret積分などの分布型積分は,被積分関数の減少分布関数を用いて定義されるので,関数列の測度収束性と相性が良い.また,応用面でも,期待効用理論,可能性理論,証拠理論などで広く利用されている.2018年度はこれら分布型の非線形積分に対する有界測度収束定理とVitaliの測度収束定理を摂動性をもつ非線形積分汎関数に対して定式化し,個別の積分型によらない統一的な理論展開を行った.具体的な研究成果は以下の通りである.1.摂動的,上縁連続,水平劣加法的かつ生成的で,その生成器が極限保存的である積分汎関数に対してVitaliの収束定理が成立するための必要十分条件は非加法的測度の自己連続性であること示した.2.摂動的かつ生成的で,その生成器が極限保存的である積分汎関数に対して有界測度収束定理が成立するための必要十分条件も非加法的測度の自己連続性であることを示した.一方,有限な測度空間では,可測関数列の収束に関するLebesgueの定理とRieszの定理により,測度収束する関数列をp乗した関数列は測度収束する.しかし,非加法的測度に対しては,たとえそれが劣加法性などの強い擬加法的性質を満たしていても,この事実は一般には成立せず,上記の研究成果の直接の応用として,p乗関数列の積分収束定理は導けない.実際,p乗関数列に対する積分収束定理は今までほとんど議論されてこなかった.そこで,2018年度は,非線形積分汎関数の諸性質(摂動性,生成性,初等性,強単調性,上縁連続性,測度切断性,水平劣切断性など)のべき乗演算に対する頑健性を示し,その結果として,p乗関数列に対する種々の収束定理を確立した.また,応用として,非加法的測度を用いて定義されるLorentz空間の完備性を示した.他の研究計画についても予備的及び部分的な考察がおおむね順調に進展している.申請時の研究計画・方法に基づき研究を推進する予定であるが,分布型積分の収束定理についてはさらに深い研究成果が得られつつあることも鑑み,2019年度は下記の課題を重点的に研究する.1.非線形積分のなかでも特に重要なChoquet積分の優収束定理を,関数列が概収束,測度収束,概一様収束する場合に再検討し,それぞれの収束性に関して優収束定理が成立するために非加法的測度に課すべき必要十分条件を見出す(従来は十分条件しか知られていない).3.Lehrer積分(凹積分)などの分布型積分の収束定理に関して本格的な検討を開始する.一様可積分な関数列に対する非線形積分の収束定理(Vitaliの収束定理の非線形化)について,非線形積分の中でも特に重要なChoquet積分の場合を重点的に研究し,以下の結果を得た.1.Vitaliの定理の定式化に必須の概念である一様可積分性をChoquet積分に対して定式化し,一様可積分性は,一様積分有界性かつ一様絶対連続性と同値となることを示した.また,この事実は,他の非線形積分であるSipos積分やShilkret積分に対しても成立するが,Sugeno積分に対して成立しないことを示した.2.Vitaliの収束定理を被積分関数列が各点収束する場合,概収束する場合,測度収束する場合の3つに分けて考察し,以下の結果を得た.(1)各点収束の場合は,非加法的測度μに対してVitaliの収束定理が成立するための必要十分条件は,μが連続,すなわち上から連続かつ下から連続である.(2)概収束の場合の必要十分条件は,μが連続かつ零加法的である.(3)測度収束の場合の必要十分条件は,μが自己連続である.また,有界収束定理の成立性についても全く同様の結果が成り立つことも示した.3.Choquet積分に対するその他の収束定理として,単調増加/減少収束定理,優収束定理についても考察した.特に,優収束定理についても,被積分関数列の収束の種類に応じて次の結果が得られることを示した.(1)各点収束の場合は,μに対して有界収束定理が成立するための必要十分条件は,μが条件連続,すなわち上から条件連続かつ下から条件連続である.(2)概収束の場合の必要十分条件は,μが条件連続かつ零加法的かつ零連続である.(3)測度収束の場合の必要十分条件は,μが自己連続である.また,被積分関数列が測度収束する場合の単調増加/減少収束定理の成立性を考察するために,新たに上から(下から)単調自己連続性の概念を導入した.他の研究計画についても予備的考察が順調に進展している.非加法的測度による積算概念である非線形積分の中でも,Choquet積分,Sipos積分,Sugeno積分,Shilkret積分などの分布型積分は,被積分関数の減少分布関数を用いて定義されるので,関数列の測度収束性と相性が良い.また,応用面でも,期待効用理論,可能性理論,証拠理論などで広く利用されている.2018年度はこれら分布型の非線形積分に対する有界測度収束定理とVitaliの測度収束定理を摂動性をもつ非線形積分汎関数に対して定式化し,個別の積分型によらない統一的な理論展開を行った.具体的な研究成果は以下の通りである.

1.摂動的,上縁連続,水平劣加法的かつ生成的で,その生成器が極限保存的である積分汎関数に対してVitaliの収束定理が成立するための必要十分条件は非加法的測度の自己連続性であること示した.2.摂動的かつ生成的で,その生成器が極限保存的である積分汎関数に対して有界測度収束定理が成立するための必要十分条件も非加法的測度の自己連続性であることを示した.一方,有限な測度空間では,可測関数列の収束に関するLebesgueの定理とRieszの定理により,測度収束する関数列をp乗した関数列は測度収束する.しかし,非加法的測度に対しては,たとえそれが劣加法性などの強い擬加法的性質を満たしていても,この事実は一般には成立せず,上記の研究成果の直接の応用として,p乗関数列の積分収束定理は導けない.実際,p乗関数列に対する積分収束定理は今までほとんど議論されてこなかった.そこで,2018年度は,非線形積分汎関数の諸性質(摂動性,生成性,初等性,強単調性,上縁連続性,測度切断性,水平劣切断性など)のべき乗演算に対する頑健性を示し,その結果として,p乗関数列に対する種々の収束定理を確立した.また,応用として,非加法的測度を用いて定義されるLorentz空間の完備性を示した.他の研究計画についても予備的及び部分的な考察がおおむね順調に進展している.申請時の研究計画・方法に基づき研究を推進する.特に平成30年度は下記の課題を重点的に研究する.2.積分汎関数に対する単調増加/単調減少測度収束定理を,新たに導入する単調自己連続性の概念を用いて再度議論し,従来の結果をより精密化する.3.Lehrer積分(凹積分)などの分割型積分の収束定理に関して予備的研究を開始する.申請時の研究計画・方法に基づき研究を推進する予定であるが,分布型積分の収束定理についてはさらに深い研究成果が得られつつあることも鑑み,2019年度は下記の課題を重点的に研究する.1.非線形積分のなかでも特に重要なChoquet積分の優収束定理を,関数列が概収束,測度収束,概一様収束する場合に再検討し,それぞれの収束性に関して優収束定理が成立するために非加法的測度に課すべき必要十分条件を見出す(従来は十分条件しか知られていない).3.Lehrer積分(凹積分)などの分布型積分の収束定理に関して本格的な検討を開始する.
有機-無機共沈法で免疫関連タンパク質を集積する硬組織再生材料の開発

本研究ではマクロファージを遊走させる機能を持ち,骨芽細胞のRANKL発現促進を介した破骨細胞形成能を持つことを先行研究にて明らかにしたリン酸八カルシウムを含む独自合成のリン酸カルシウム材料を研究材料として用い,材料表面での結晶化が及ぼす生体応答を調べ,組織再生に寄与する材料の条件について研究することを目的に検討した.リン酸カルシウム材料は血清中から免疫関連分子を含むタンパク質群を特異的に吸着できることから,免疫関連分子のモデルタンパク質として,まず一般的なタンパク質(アルブミン)を用いて,カルシウムとリン酸の過飽和水溶液から,リン酸カルシウム材料を基材として,アルブミンが共析する溶液条件と析出結晶相の同定を検討した.まず,タンパク質非存在下における検討を行い,自発沈殿が生じる限界近くまで高い過飽和度を設定した水溶液中において,リン酸八カルシウム基材上で基材と類似の結晶相あるいはより結晶化が進んだリン酸カルシウムの析出が確認できた.これらは水溶液組成の化学分析および析出相の機器分析から確認できた.一方,シミュレーションによる過飽和度予測による結晶相を反映していると思われるが,析出相は結晶性が低く結晶相の同定にはさらなる検討が必要であることが明らかとなった.このため機器分析の手段を増やして検討中である.並行してアルブミン存在下における共析の促進,析出相の同定についても検討を開始し,過飽和度とタンパク質吸着量との関連性について分析を行っているところである.過飽和度の高さと共析の促進に関連性が示唆されたため,定量的測定により解析を進めている.リン酸カルシウムとタンパク質の共析出の研究で,たんぱく質を共存させない系において過飽和度設定と結晶成長速度の関連性について検討を重ねている.水溶液の過飽和度シミュレーターによる計算で,析出相の予測が可能であったが,実際の析出相の結晶性についての定量的評価が新たに必要となった.タンパク質共存下でリン酸カルシウムを析出させタンパク質の取り込みについて検討する.特に水溶液の過飽和度と析出相,またタンパク質吸着量を同定する.その上で,生体内での炎症性細胞侵潤とタンパク質吸着,また組織再生との関連性を検討し,材料の性質と生体応答について明らかにする.本研究ではマクロファージを遊走させる機能を持ち,骨芽細胞のRANKL発現促進を介した破骨細胞形成能を持つことを先行研究にて明らかにしたリン酸八カルシウムを含む独自合成のリン酸カルシウム材料を研究材料として用い,材料表面での結晶化が及ぼす生体応答を調べ,組織再生に寄与する材料の条件について研究することを目的に検討した.リン酸カルシウム材料は血清中から免疫関連分子を含むタンパク質群を特異的に吸着できることから,免疫関連分子のモデルタンパク質として,まず一般的なタンパク質(アルブミン)を用いて,カルシウムとリン酸の過飽和水溶液から,リン酸カルシウム材料を基材として,アルブミンが共析する溶液条件と析出結晶相の同定を検討した.まず,タンパク質非存在下における検討を行い,自発沈殿が生じる限界近くまで高い過飽和度を設定した水溶液中において,リン酸八カルシウム基材上で基材と類似の結晶相あるいはより結晶化が進んだリン酸カルシウムの析出が確認できた.これらは水溶液組成の化学分析および析出相の機器分析から確認できた.一方,シミュレーションによる過飽和度予測による結晶相を反映していると思われるが,析出相は結晶性が低く結晶相の同定にはさらなる検討が必要であることが明らかとなった.このため機器分析の手段を増やして検討中である.並行してアルブミン存在下における共析の促進,析出相の同定についても検討を開始し,過飽和度とタンパク質吸着量との関連性について分析を行っているところである.過飽和度の高さと共析の促進に関連性が示唆されたため,定量的測定により解析を進めている.リン酸カルシウムとタンパク質の共析出の研究で,たんぱく質を共存させない系において過飽和度設定と結晶成長速度の関連性について検討を重ねている.水溶液の過飽和度シミュレーターによる計算で,析出相の予測が可能であったが,実際の析出相の結晶性についての定量的評価が新たに必要となった.タンパク質共存下でリン酸カルシウムを析出させタンパク質の取り込みについて検討する.特に水溶液の過飽和度と析出相,またタンパク質吸着量を同定する.その上で,生体内での炎症性細胞侵潤とタンパク質吸着,また組織再生との関連性を検討し,材料の性質と生体応答について明らかにする.リン酸とカルシウムの水溶液からの過飽和度の析出の関係がシミュレーションから予想できたが,実際に合成した結晶析出相の同定が機器分析上,難しい点があった.そのため,既設装置による合成結晶の相の分析を実施し,今後の計画の準備を行った.そのため次年度使用額が生じた.
脱硫及びコンクリート廃棄物を利用した砂漠化及び酸性土壌改良剤の開発

中国での塩類土壌及び酸性土壌に対して、セメント微粉末、コンクリート廃棄物、路盤材及び石炭バイオブリケット燃焼灰による土壌改良効果を検討した。塩類土壌では、セメント微粉末、コンクリート廃棄物(粒径別)での化学性改良結果の論文報告後、路盤材での改良効果を検討した。路盤材では粒径0.6-4.75mmにて、小粒径(0.6mm以下)より施用量増加に伴いESPが低下したが、コンクリート廃棄物と比較して交換性Ca濃度が低いため他の改良材との混合の必要性が示された。更に塩類土壌改良における物理性の検討を行った。塩類リーチング効果をコンクリート廃棄物(1.0-2.0mm)3.0wt%施用にて検討したが、既報の脱硫石膏や石炭バイオブリケット燃焼灰と比較して塩類リーチングに時間を要した。粒径0.2-0.6mmでは、粒径2.0-4.75mmよりも水の初期浸潤過程における透水性は向上したが、土壌改良反応が進行するにつれ透水性が低下した。以上より、化学性のみならず物理性の改良のために他の改良剤などとの混合の必要性を提言した。酸性土壌改良では、酸性化が進行した土壌(pH4.2)に対して、コンクリート廃棄物、路盤材、石炭バイオブリケット燃焼灰に半乾式脱硫石膏を混合して検討した。その結果、pH、交換性Alイオン濃度において大幅に改良され、塩基バランスにおいても単体での施用より良い結果を得た。更に、新規混合改良剤中の重金属量評価では、中国の土壌改良剤基準値と比較して低い値であり安全性も確認することが出来た。最後に、酸性土壌地域での改良技術の導入の可能性を検討するため、四川省と雲南省を調査した。その結果、路盤材での利用の可能性はあったが、コンクリート廃棄物は現況では入手困難であった。また塩類土壌改良では石炭バイオブリケット燃焼灰での土壌中炭素量増加を確認出来たことから温暖化対策技術としての可能性も示された。砂漠化土壌における石炭バイオブリケット燃焼灰、コンクリート廃棄物の土壌改良効果を検討するため、中国都市部の天津市でのコンクリート発生状況及び利用状況の調査を行った。また砂漠化土壌調査のため黄河中流域にある銀川市郊外での塩類土壌調査及び採取と共同研究者らとの脱硫廃棄物利用での土壌改良試験区の調査を行った。改良対象土壌となる塩類土壌の粒径などの物理性及びpH、EC、各種イオン濃度、交換性ナトリウム量(ESP)などの化学性分析を行った後、新規塩類土壌改良資材として、石炭バイオブリケット燃焼灰、コンクリート廃棄物を利用して塩類土壌改良効果を検討した。土壌改良剤としては、原料となる低品位炭中の硫黄、灰分組成の異なる石炭、バイオマス(トウモロコシ茎)、脱硫剤を混合後、高圧成型して作製したバイオブリケットの燃焼灰2種、セメント微粉末、コンクリート廃棄物(粒径別3種、路盤材)及び脱硫石膏を利用した。改良剤における施用量検討のため、各種改良剤におけるpH、EC、Ca溶出量の経時変化を検討した結果、コンクリート廃棄物はpH12以上、EC3dS/m以上と高い値を示し、それに対して路盤材はpH910、EC0.5dS/m以下と低い値を示したが、塩類土壌改良に効果的な交換性Ca溶出量では、脱硫石膏やコンクリート廃棄物と比較して約1/10であった。またCaを中心とした陽イオン及びECにおける溶出挙動において、小粒径であるほど高い値を示す傾向を確認した。上記改良剤を利用した塩類土壌改良試験では、pHにおいては脱硫石膏、石炭バイオブリケット燃焼灰施用時と比較して高かったが、EC、ESPにおいては減少改良効果を確認できた。さらに中国南部広州市郊外における酸性土壌地域の土壌及びバイオマス発生状況を調査し、土壌採取後に化学性分析を開始し、上記改良剤における酸性土壌改良についても検討を開始することが出来た。研究実施計画では初年度は中国現地での塩類土壌採取及び塩類土壌改良効果の検討を行う計画であったが、当初の計画より中国での現地調査、改良試験が順調に進行したため、酸性土壌地域調査及び酸性土壌改良に関係する研究を開始出来たことから、当初の計画以上に進展していると判断をした。中国における劣化土壌のなかでも深刻な高塩類土壌(ESP50%以上)に対して、セメント微粉末、コンクリート廃棄物及び路盤材の土壌改良効果を検討した。高塩類土壌改良効果に対して実績を有する湿式脱硫石膏中の交換性Ca溶出量を基準として、各種土壌改良剤の施用量を決定して検討した。脱硫石膏施用量で1.0wt%、2.0wt%基準になるように土壌改良試験における化学性の検討を行った。その結果、pH変化においては、脱硫石膏の低下と比較して、セメント微粉末、コンクリート廃棄物では僅かな低下しか確認されなかったが、ESP変化においては、10%以下に改善するほど大幅な低下を確認することが出来た。またコンクリート廃棄物においては、粒径別で検討した結果、小粒径ほどESP低下における効果が高いことがわかった。さらに塩類土壌(ESP35%)に対して、コンクリート廃棄物のバイオブリケット燃焼灰施用の場合と比較した結果、透水性及び塩類リーチング速度が非常に低いことが確認され、化学性のみだけでなく物理性を考慮した改良剤開発の必要性が示された。

さらに、酸性土壌改良に関しては、非常に酸性化した中国にて採取した土壌(pH4.2)に対して、バイオブリケット燃焼灰、セメント微粉末、コンクリート廃棄物及び、バイオブリケット燃焼灰とセメント微粉末もしくはコンクリート廃棄物(粒径別)の混合改良剤における土壌pH矯正効果、塩基バランス、交換性Alイオン濃度の評価を行った。その結果、pH矯正において、バイオブリケット単体施用のみでは改良目標値に達しなかったが、混合改良剤施用により改良を達成出来た。塩基バランスにおいても混合改良剤にて単体施用より良い効果を確認することが出来た。さらに交換性Alイオン濃度の評価では、改良後には改良目標値を急激に下回り、pH上昇とともに交換性Al濃度の低下を確認することが出来た。塩類土壌及び酸性土壌に対して、各種改良剤評価において単体利用のみならず混合改良剤において化学性評価に関して成果を得ることが出来たこと、塩類土壌に関しては、化学性評価以外に塩類リーチング効果の検討においても知見を得られたこと、そして中国現地において、塩類土壌のみならず酸性土壌地域での改良方法に関して調査を進めることも出来、さらに塩類土壌と酸性土壌改良における成果を国際学会にて研究報告することも出来たことから、当初の予定より進行していると評価した。中国での塩類土壌及び酸性土壌に対して、セメント微粉末、コンクリート廃棄物、路盤材及び石炭バイオブリケット燃焼灰による土壌改良効果を検討した。塩類土壌では、セメント微粉末、コンクリート廃棄物(粒径別)での化学性改良結果の論文報告後、路盤材での改良効果を検討した。路盤材では粒径0.6-4.75mmにて、小粒径(0.6mm以下)より施用量増加に伴いESPが低下したが、コンクリート廃棄物と比較して交換性Ca濃度が低いため他の改良材との混合の必要性が示された。更に塩類土壌改良における物理性の検討を行った。塩類リーチング効果をコンクリート廃棄物(1.0-2.0mm)3.0wt%施用にて検討したが、既報の脱硫石膏や石炭バイオブリケット燃焼灰と比較して塩類リーチングに時間を要した。粒径0.2-0.6mmでは、粒径2.0-4.75mmよりも水の初期浸潤過程における透水性は向上したが、土壌改良反応が進行するにつれ透水性が低下した。以上より、化学性のみならず物理性の改良のために他の改良剤などとの混合の必要性を提言した。酸性土壌改良では、酸性化が進行した土壌(pH4.2)に対して、コンクリート廃棄物、路盤材、石炭バイオブリケット燃焼灰に半乾式脱硫石膏を混合して検討した。その結果、pH、交換性Alイオン濃度において大幅に改良され、塩基バランスにおいても単体での施用より良い結果を得た。更に、新規混合改良剤中の重金属量評価では、中国の土壌改良剤基準値と比較して低い値であり安全性も確認することが出来た。最後に、酸性土壌地域での改良技術の導入の可能性を検討するため、四川省と雲南省を調査した。その結果、路盤材での利用の可能性はあったが、コンクリート廃棄物は現況では入手困難であった。また塩類土壌改良では石炭バイオブリケット燃焼灰での土壌中炭素量増加を確認出来たことから温暖化対策技術としての可能性も示された。塩類土壌改良に関係する研究は初年度成果を引き継ぎ、継続して各種改良剤(バイオブリケット燃焼灰、セメント微粉末、コンクリート廃棄物、路盤材)及び新規改良剤による改良効果を検討し最良の改良剤開発を進展させる。酸性土壌改良においては、より酸性化の深刻化した地域調査と上記改良剤での酸性土壌改良効果について検討を行う。また最終年度における実地での改良試験評価のために黄河中流域での改良試験実施例を調査する。
正常ヒト神経幹細胞由来神経細胞における、低酸素状態下での遺伝子制御システムの解明

1.ヒトneurosphere内部の細胞状態の評価最大径500μm程度の浮遊細胞凝集塊(neurosphere)を形成して増殖するヒト神経幹細胞のneurosphere内部の細胞状態の評価を行った。細胞の低酸素状態をPimonidazoleを用いて評価した解析では、neurosphere中心部にはPimonidazole陽性細胞が多く見られ、これら細胞は低酸素状態にあると考えられた。分裂細胞の分布をBrdU取り込みで評価した結果、BrdU陽性細胞は凝集塊表面から低酸素状態にある凝集塊内部までほぼ均一に分布し存在していた。2.低酸素ストレスのヒト神経幹細胞の増殖速度へ及ぼす影響の検討高酸素(20%)と低酸素(5%)の状態でヒト神経幹細胞の細胞増殖を検討した結果、細胞増殖に大きな違いは無かった。3.マウス神経幹細胞とヒト神経幹細胞とでのLDH、PDHの発現検討マウス神経幹細胞とヒト神経幹細胞での遺伝子発現の比較を行った。その中でも特にエネルギー代謝系に重点を置き、嫌気的ATP合成に関与するLDH(乳酸脱水素酵素)とTCAサイクルでの好気的APT合成に関与するPDH(ピルビン酸脱水素酵素)の発現を比較した。その結果、ヒト神経幹細胞ではマウス神経幹細胞よりLDHの活性が高く、逆にマウス神経幹細胞で観察されるPDHの発現が殆ど見られなかった。以上の結果から、ヒト神経幹細胞は低酸素状態にあるneurosphere中心部においても分裂・増殖することが可能であり、低酸素ストレスに耐性を有することが示唆された。そのメカニズムとしては、マウス細胞と比較して嫌気的ATP合成が有意な状態にあり、低酸素ストレス下でもエネルギー合成が効率よく行えるためと考えられた。今年度は、本研究開発で使用する培養ヒト神経細胞のソースとなる培養ヒト神経幹細胞/前駆細胞の生物学的特性と、そこからのヒト神経細胞の分化誘導法の開発、および分化誘導されたヒト神経細胞の生物学的特性について検討した。1、培養ヒト神経幹細胞/前駆細胞の増殖率、分化率を約1年間におよぶ長期培養期間中を通じて、継続的に評価した。その結果、ヒト神経幹細胞/前駆細胞は、最速で80時間程度の細胞倍加速度で分裂することが判明し、理論値で100日間で少なくとも20回程度の細胞分裂を行い、約100万倍まで増殖する潜在性を有することを明らかにした。また約250日間の培養期間中、1%FBSを分化誘導因子として使用してヒト神経幹細胞/前駆細胞からの神経細胞の分化誘導率を検討した。その結果、ヒト神経幹細胞/前駆細胞からの神経細胞の分化誘導率は約20%程度でほぼ一定であり、長期培養でも多分化能に大きな変化がないことが判明した(J Neurosci Res 69,869-879,2002)。2、培養ヒト神経幹細胞/前駆細胞から1%FBSで分化誘導させたヒト神経細胞は、約90%の細胞がGABA作動性神経細胞であることが判明した。1%FBSの分化誘導効率を上げる方法として、All-trans retinoic acid (ATRA)と神経成長因子のBDNFの有効性の検討を実施した。培養ヒト神経幹細胞/前駆細胞からの神経細胞の分化誘導効率はATRAの添加によって約30%に有意に上昇した。また作成された神経細胞は、ATRA未使用時と同様に殆どがGABA作動性神経細胞であった。ATRAとBDNFを連続して使用した分化誘導法の検討では、ATRA単独使用時と神経細胞の分化誘導効率に大きな変化はなかった(投稿準備中)。
有機物質への10GPa級超高圧印加による新電子相の創生

2003年に小生を中心とする研究グループは、有機絶縁体に8GPa級の超高圧を印加するという手法で新規超伝導体を発見し、超伝導の転移温度の世界記録を更新した。この成果は、本科学研究費の研究機関中(2006年3月29日)に、第11回日本物理学会論文賞の表彰を受けたことをまず言及しておきたい。ここで超伝導を観測した物質は、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2という層状有機物質であったが、その後、この物質の関連物質(β'-型BEDT-TTF塩)の超高圧下物性を徹底的に調べ上げ、新超伝導体探索と、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2の超伝導の発現機構を調査した。本年度は、これらの研究成果を受けて、BEDT-TTFではない有機分子からなる層状絶縁体を取り上げ、本研究を締めくくることにした。これは、超高圧下での分子軌道の違いによる物性の振る舞いの違いを調査することにより、より超伝導化しやすく、さらには、より転移温度が高い物質の設計を目指したものである。このうち、我々は、BEDT-TTF分子の外側のS原子をSeに置き換えたBEDSe-TTF分子(既存分子)の合成に成功し、さらに、超伝導を示したβ'-(BEDT-TTF)_2ICl_2と同型の二つの物質β'-(BEDSe-TTF)_2ICl_2とβ'-(BEDSe-TTF)_2IBr_2の結晶合成に成功したことを言及しておきたい。これらの物質は、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2と同様、常圧下では、非常に強固な絶縁体であったが、8GPaの超高圧下で電気抵抗測定を行い、高温部の金属化に成功した。しかしながら、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2塩とは異なり、超伝導の出現には到らなかった。この事実は、我々を深く悩ますこととなった。しかし、同一の結晶構造で超伝導が出現しないという今回の発見は、超伝導の出現条件を考える上で、重要な因子を2,3の効果に絞られることを意味した。現時点では、我々は、Se置換によって、系の擬二次元性が抑制され、より3次元に近づき、このことが、超伝導を阻害していると考えている。これは、同一の結晶構造で、しかも、金属下に成功したにもかかわらず、超伝導が出現しない物質の発見により、初めて、明らかになることである。この成果は、今後の超高圧下超伝導探索において、物質選択または物質設計に重要な指針をあたえるものであり、実際に、この成果を受けて、新たな物質系の研究に移行しているところである。本年度は、まず、本研究において中心となる改良型ブリッジマンアンビルと呼ばれる特殊な圧力発生装置を開発している。この装置は、10GPa級の超高圧を、比較的小さなシステムで実現でき、ダイヤモンドアンビルにくらべ、その発生させる圧力の質がはるかに優れているという利点を持つ。この年度に購入した備品の大半はこのためのものであり、マグネット付きクライオスタットや30ton油圧プレス及びダイレクトピストンは装置の心臓部である。また、クライオスタットには、低インピーダンスの超伝導マグネットを付加させるが、これは、超高圧下での磁気抵抗やホール効果を測定するためのものである。特に、超高圧下でのホール効果測定は、有機導体においては、ほとんど例がないため、この分野での発展が期待できる。また、候補となる有機導体の単結晶試料の合成も平行して行い、次年度からの物性測定に備えている。候補物質としては、我々が超伝導を観測したβ'-(BEDT-TTF)_2ICl_2をはじめとするBEDT-TTF塩などであるが、多くの有機単結晶試料の合成に成功している。それらの準備的研究と平行して、本年度は、圧力下物性測定の成果も上がっている。我々が、転移温度世界記録の超伝導を観測したβ'-(BEDT-TTF)_2ICl_2と類似物質であるβ'-(BEDT-TTF)_2AuCl_2をキュービックアンビル型圧力発生装置を用いて超高圧下物性研究を行った結果、超高圧下では、分子間の相互作用よりもアニオンと分子の相互作用が重要であることが判明した。この成果は、超高圧下での構造変化を予測する上で需要な情報であり、今後の研究において重要な指針となる。2003年に小生を中心とする研究グループは、有機絶縁体に超高圧を印加するという手法で新規超伝導体を発見し、超伝導の世界記録を更新した。最初に発見した物質は、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2という層状有機物質であったが、本年度は、関連物質であるβ'-(BEDT-TTF)_2AuCl_2の超高圧下物性研究を展開し、比較研究を行った。AuCl_2塩はICl_2塩と同様の結晶構造と同様の常圧下物性を持つにもかかわらず、10GPaといった超高圧下まだ金属化されないという結果を得た。この結果をさまざまな角度から考察し論文にまとめた(この論文はJPSJ注目論文に選ばれた)。また、現在、さらに高い超伝導を実現させるべく、BEDT-TTF分子と類似のBEDSe-TTF分子からなるβ'-型物質に注目し合成を開始している。このうちβ'-(BEDSe-TTF)_2ICl_2については合成に成功し、8GPaの超高圧下で高温部の金属化に成功した。

さらに高い圧力印加で超伝導の出現が期待できる。また、べつの有機塩についても合成を開始している。以上のような物質は、分子のダイマー構造により、バンド充填率は1/2と見なせるわけであり、圧力印加はバンド幅制御によって金属化をめざそうとするものである。本年度は、1/2からわずかにずれたバンド充填率を持つ物質に注目し研究を行った。κ-(BEDT-TTF)_4Hg_<2.78>Cl_8の圧力印加実験により、大変興味深い結果が得られた。この物質の超伝導は圧力印加によって一旦消失(もしくは転移温度が極めてさがる)し、高圧下で再び再復帰した。現在、さらなる解析を行っている。2003年に小生を中心とする研究グループは、有機絶縁体に8GPa級の超高圧を印加するという手法で新規超伝導体を発見し、超伝導の転移温度の世界記録を更新した。この成果は、本科学研究費の研究機関中(2006年3月29日)に、第11回日本物理学会論文賞の表彰を受けたことをまず言及しておきたい。ここで超伝導を観測した物質は、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2という層状有機物質であったが、その後、この物質の関連物質(β'-型BEDT-TTF塩)の超高圧下物性を徹底的に調べ上げ、新超伝導体探索と、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2の超伝導の発現機構を調査した。本年度は、これらの研究成果を受けて、BEDT-TTFではない有機分子からなる層状絶縁体を取り上げ、本研究を締めくくることにした。これは、超高圧下での分子軌道の違いによる物性の振る舞いの違いを調査することにより、より超伝導化しやすく、さらには、より転移温度が高い物質の設計を目指したものである。このうち、我々は、BEDT-TTF分子の外側のS原子をSeに置き換えたBEDSe-TTF分子(既存分子)の合成に成功し、さらに、超伝導を示したβ'-(BEDT-TTF)_2ICl_2と同型の二つの物質β'-(BEDSe-TTF)_2ICl_2とβ'-(BEDSe-TTF)_2IBr_2の結晶合成に成功したことを言及しておきたい。これらの物質は、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2と同様、常圧下では、非常に強固な絶縁体であったが、8GPaの超高圧下で電気抵抗測定を行い、高温部の金属化に成功した。しかしながら、β'-(BEDT-TTF)_2ICl_2塩とは異なり、超伝導の出現には到らなかった。この事実は、我々を深く悩ますこととなった。しかし、同一の結晶構造で超伝導が出現しないという今回の発見は、超伝導の出現条件を考える上で、重要な因子を2,3の効果に絞られることを意味した。現時点では、我々は、Se置換によって、系の擬二次元性が抑制され、より3次元に近づき、このことが、超伝導を阻害していると考えている。これは、同一の結晶構造で、しかも、金属下に成功したにもかかわらず、超伝導が出現しない物質の発見により、初めて、明らかになることである。この成果は、今後の超高圧下超伝導探索において、物質選択または物質設計に重要な指針をあたえるものであり、実際に、この成果を受けて、新たな物質系の研究に移行しているところである。
ヒト胎便中に含まれる, 波長580umの蛍光物質に関する研究

○ヒト胎児便(胎便)由来の580nmの蛍光を出す物質(F580)を,未修飾のまま再現性よく,ほぼ単一成分として得る方法を確立した.すなわち, F580を胎便より酢酸/ブタノール(1:4)溶液で抽出後,シリカゲルカラム,フェニルセファロースCL-4Bカラム,およびセファデックスG-25カラムで精製できた.○逆相カラムを用いたHPLC法で,イソクラティックな条件により,様々なポルフィリン類と, F580とを分離,分析する方法を開発した(論文作成中).この方法により, F580はヘマトポルフィリン,コプロポルフィリン,ウロポルィリン等ではないことを確認した.○F580を重水,重メタノール,重アセトン,重ジメチルスルフォキサイド等に溶かし, 400メガヘルツープロトンNMRの測定を行った.しかし,積算を1万回以上行っても,解析可能なシグナルは得られなかった.この理由は, F580の各溶媒にたいする溶解度が, NMR測定可能なほど十分ではないと思われる.○ジアゾメタンを用いた, F580のメチル化を行った.F580は,光にたいして非常に不安定ゆえ,メチル化F580の回収はほとんどできなかったが,一応プロトンNMRをとってみたところ,ポルフィリン骨格由来のシグナルは確認できた.○精製F580の一部を用い,ウシ血清アルブミンを担体としてF580の抗体の作成を試みた.しかし,アルブミンの性質によると思われる, F580のアルブミンに対する非特異的吸着によって,抗体の作成は失敗した.現在,より優れた担体を探している.○MSによる測定は,現在依頼中である.○ヒト胎児便(胎便)由来の580nmの蛍光を出す物質(F580)を,未修飾のまま再現性よく,ほぼ単一成分として得る方法を確立した.すなわち, F580を胎便より酢酸/ブタノール(1:4)溶液で抽出後,シリカゲルカラム,フェニルセファロースCL-4Bカラム,およびセファデックスG-25カラムで精製できた.○逆相カラムを用いたHPLC法で,イソクラティックな条件により,様々なポルフィリン類と, F580とを分離,分析する方法を開発した(論文作成中).この方法により, F580はヘマトポルフィリン,コプロポルフィリン,ウロポルィリン等ではないことを確認した.○F580を重水,重メタノール,重アセトン,重ジメチルスルフォキサイド等に溶かし, 400メガヘルツープロトンNMRの測定を行った.しかし,積算を1万回以上行っても,解析可能なシグナルは得られなかった.この理由は, F580の各溶媒にたいする溶解度が, NMR測定可能なほど十分ではないと思われる.○ジアゾメタンを用いた, F580のメチル化を行った.F580は,光にたいして非常に不安定ゆえ,メチル化F580の回収はほとんどできなかったが,一応プロトンNMRをとってみたところ,ポルフィリン骨格由来のシグナルは確認できた.○精製F580の一部を用い,ウシ血清アルブミンを担体としてF580の抗体の作成を試みた.しかし,アルブミンの性質によると思われる, F580のアルブミンに対する非特異的吸着によって,抗体の作成は失敗した.現在,より優れた担体を探している.○MSによる測定は,現在依頼中である.
虚血再灌流障害皮弁モデルにおける抗接着分子抗体の炎症抑制効果に関する基礎的研究

【緒言】皮弁の生着・壊死において虚血再灌流障害で血管内皮細胞に起こる変化が生着を妨げ壊死をもたらす要因の一つになっていると考えられている。ラット皮弁の虚血再灌流障害モデルにおいて、セレクチンファミリー(LEACAM-1、ELAM-1、P-selectin)の抗体投与による虚血再灌流障害の炎症軽減の有無や程度について実験を計画実施した。【材料と方法】体重約250-300grの雄SDラットの右鼠径部に皮弁を作成し、9時間虚血の後再灌流を行う虚血再灌流障害皮弁モデルを作成する。それぞれの抗体投与の治療群と生食投与の対照群とに分け、抗体は再灌流15分前に尾静脈よりI.V.にて投与し、対照群は同一条件で生食水を投与した。経過観察は7日間で、皮弁の生着領域および組織学的検索にて各群を比較検討した。【結果】再灌流後7日目の皮弁生着領域の比較では、抗体投与群ではいずれも対照群に比べ皮弁生着領域の向上が認められた。組織学的所見の比較では、対照群で炎症細胞浸潤や浮腫、一部壊死に陥っており、強い炎症所見が認められたが、抗体投与群では炎症所見は認められるものの対照群より軽度であった。【考察】セレクチンファミリー(LEACAM-1、ELAM-1、P-selectin)は、一連の炎症反応において重要な役割を演じているとされている。特に、白血球が血管内皮細胞と接着を行う際に示す特殊な"白血球ローリング現象"を媒介しており、炎症作用へ関与が示唆されている。モノクローナル抗体投与により炎症軽減効果の可能性が期待され、今回われわれの実験モデルの皮弁においてLEACAM-1、ELAM-1、P-selectinに対する抗体投与により、炎症が軽減されたことから、抗炎症作用としての有用性さらに抗炎症薬としての可能性が示唆された。【緒言】皮弁の生着・壊死において虚血再潅流障害で血管内皮細胞に起こる変化が生着を妨げ壊死をもたらす要因の一つになっていると考えられている。研究代表者は、独自に開発したラット皮弁の虚血再潅流障害モデルにおいて、種々の接着分子のモノクローナル抗体投与による抗炎症作用を実験研究してきた。今回われわれは、種々の炎症に関与すると考えられるセレクチンファミリーに対する抗体投与により、虚血再潅流障害の炎症を軽減できる可能性があるか否かについて考え、実験を計画実施した。【材料と方法】体重約225-250グラムのオスのSDラットの右鼠径部に皮弁を作成し、9時間虚血の後再潅流を行う虚血再潅流障害皮弁モデルを作成する。抗体投与の治療群と生食投与の対照群とに分け、抗体は再潅流15分前に尾静脈よりI.V.にて投与し、対照群は同一条件で生食水を投与した。【結果】再潅流後7日目の皮弁生着領域の比較では、9時間虚血において抗体投与群で対照群に比べて、皮弁生着領域の向上が認められた。組織学的所見の比較では、対照群で、炎症細胞浸潤や浮腫、一部壊死に陥っており、強い炎症所見が認められたが抗体投与群では、炎症所見は認められるものの対照群より軽度であった。【考察】

セレクチンファミリーは、白血球と血管内皮細胞との接着の初期段階であるローリング現象などに関与することから、虚血再潅流障害など様々な炎症反応に対する抗炎症や移植などの分野で、その抗体による治療効果が期待されている。ELAM-1、P-selectinといったセレクチンに対する抗体投与による炎症作用の軽減により、抗炎症作用としてその治療効果が期待される。今回の研究でこれら抗体投与による抗炎症作用としての有用性が示唆された。【緒言】皮弁の生着・壊死において虚血再潅流障害で血管内皮細胞に起こる変化が生着を妨げ壊死をもたらす要因の一つになっていると考えられている。ラット皮弁の虚血再潅流障害モデルにおいて、セレクチンファミリーであるL-selectin、E-selectin、P-selectinの抗体投与による抗炎症作用が示唆されたが、シアロムチンファミリーであるCD34による抗体投与により虚血再潅流障害の炎症を軽減できる可能性があるかについて、実験を計画実施した。【材料と方法】体重約250-300グラムのオスのSDラットの右鼠径部に皮弁を作成し、9時間虚血の後再潅流を行う虚血再潅流障害皮弁モデルを作成する。抗体投与の治療群と生食投与の対照群とに分け、抗体は再潅流15分前に尾静脈よりI.V.にて投与し、対照群は同一条件で生食水を投与した。経過観察は7日間で、皮弁の生着領域および組織学的検索にて各群を比較検討した。【結果】再潅流後7日目の皮弁生着領域の比較では、9時間虚血抗体投与群では対照群に比べ皮弁生着領域の向上が認められた。組織学的所見の比較では、対照群で炎症細胞浸潤や浮腫に加え一部壊死に陥っており、強い炎症所見が認められたが、抗体投与群では、炎症所見は認められるものの対照群より軽度であった。【考察】シアロムチンファミリーであるCD34は、細胞間接着、白血球の血管内皮細胞への接着およびローリングを媒介することが知られ、炎症作用への関与の可能性やその抗体による治療効果が期待される。今回われわれの実験モデルの皮弁においてCD34に対する抗体投与により、炎症が軽減されたことから、抗炎症作用としての有用性が示唆された。ラット皮弁の虚血再潅流障害モデルにおいて、セレクチンファミリーであるL-selectin、E-selectin、P-selectinの抗体投与による抗炎症作用が示唆されたが、シアロムチンファミリーであるPSGL-1による抗体投与により虚血再潅流障害の炎症を軽減できる可能性があるかについて、実験を計画実施した。【考察】シアロムチンファミリーであるPSGL-
活動依存的アルファシヌクレイン放出解明に基づく新規パーキンソン病治療標的の探索

パーキンソン病、レビー小体型認知症で蓄積するα-synucleinは細胞質タンパク質でありながら、細胞外にも分泌される。しかしながらシグナル配列を有さないα-synucleinの分泌機構は不明である。本研究では、in vivo microdialysis法、初代培養神経細胞を用い、α-synucleinの分泌が神経活動特にグルタミン酸作動性の神経伝達によって制御されていることを明らかにした。またシナプス小胞の開口放出とα-synuclein分泌が密接に関連することを見いだした。さらに脳間質液中のα-synucleinが単量体とは異なる60kdaの高分子体として存在していることも明らかにした。パーキンソン病・レビー小体型認知症患者脳神経細胞においてレビー小体として凝集・異常蓄積するαシヌクレインが、神経細胞間で伝播する「細胞間伝播」という現象が見出されたが、その詳細な分子メカニズムは未だ不明である。そこで本研究では細胞間伝播における鍵経路であるαシヌクレインの細胞外放出を制御するメカニズムを明らかにすることを目標とした。その制御メカニズムとして、αシヌクレインの細胞外分泌が神経活動依存的に生じているという仮説をたて、平成28年度にはその実験的検証を行った。in vitro初代培養神経細胞を用いた実験で、標的機構の異なる複数の薬理学的処理による神経活動の亢進・低下に応じて、内因性αシヌクレインの分泌が変化することを明らかにした。またreverse microdialysis法を用いた検討で、神経活動の変化が分泌だけでなく、脳間質液中のαシヌクレイン定常状態に影響し、脳内における70%の細胞外αシヌクレイン量を左右する主要な制御メカニズムであることを明らかにした。さらに神経活動の中でも特にグルタミン酸作動性神経伝達に着目し、その亢進・低下がαシヌクレイン分泌と定常状態量を変化させるメカニズムであることを見出した。αシヌクレインの細胞外分泌はプレシナプスからのシナプス小胞放出と連動しており、α-Latrotoxinを用いたシナプス小胞の放出促進下では、活動電位発生とポストシナプスにおけるグルタミン酸受容体を抑制した状態でもαシヌクレイン放出が亢進し、神経活動がシナプス小胞放出を介し、αシヌクレイン分泌を制御している可能性が考えられた。平成28年度の研究実施計画では、内因性αシヌクレインの細胞外放出が神経活動依存的に生じているという仮説のもと、その実験的な検証をin vitroの初代培養神経細胞を用いた実験系と、in vivo microdialysis法を用いた実験系で行うことを主目的としていた。初代培養神経細胞を用いた実験、in vivo microdialysis法を用いた実験系で、上記の仮説を裏付ける実験結果を複数得ることができた。これに加えてグルタミン酸作動性神経伝達がαシヌクレイン分泌を調節することを明らかにし、プレシナプスからのシナプス小胞放出がαシヌクレイン分泌と相関することも見出した。研究代表者はアルツハイマー病患者で神経原線維変化として蓄積し、細胞間を伝播することが知られているタウタンパク質が、神経活動依存的に細胞外へ放出されることを報告しているが、本研究により、タウとαシヌクレインの細胞外放出機構に共通する制御機構があることが考えられた。脳内の70%の細胞外αシヌクレイン量を規定する主要な制御メカニズムを同定できたことに加え、αシヌクレインの分泌とプレシナプス活動との相関を示す結果も得られ、αシヌクレイン分泌解明につながる新知見が得られたことから、おおむね順調に進展していると判断した。パーキンソン病、レビー小体型認知症ではα-synucleinが凝集・異常蓄積している。近年凝集性を有したα-synucleinが細胞外腔を介し細胞間を移行する、細胞間伝播の現象が見いだされ、上記疾患における規則性をもったα-synuclein病理との関連が注目を集めている。α-Synucleinは正常には神経細胞のプレシナプスに局在する可溶性の高い細胞内タンパク質であるが、細胞外にも存在することが明らかになってきた。そこで研究代表者はこのようなα-synucleinの分泌機構を明らかにすることを目標として本研究を遂行した。研究代表者はこれまでに初代培養神経細胞、in vivo microdialysisの実験系において、神経活動を亢進あるいは抑制する薬理学的手法を適用し、内因性のa-synuclein分泌の大部分が神経活動依存的な制御を受けていること、特にグルタミン酸作動性神経伝達によって変動すること、プレシナプス活動と関連すること、を明らかにしてきた。これらの知見に加え平成29年度には活動依存的なa-synuclein分泌は海馬だけでなく、線条体においても生じていることを見いだした。またin vivo microdialysisを用いた実験において、脳間質液に分泌をうけたα-synucleinは単量体とは異なる、60kDa程度の大きさの高分子量体として存在していることも明らかにした。近年細胞外に存在するα-synucleinが細胞間伝播を生じたり、毒性を発揮したり、神経活動を制御することが明らかになりつつあるが、本研究成果はこのようなα-synucleinの細胞外機能が神経活動依存的に変化する可能性を示すものと考えられる。

またシナプス小胞の開口放出とα-synuclein分泌が密接に関連することを見いだした。さらに脳間質液中のα-synucleinが単量体とは異なる60kdaの高分子体として存在していることも明らかにした。本研究において神経活動依存的な機構は、in vivoにおいて細胞外のαシヌクレイン量を規定する主要な制御メカニズムであることが示唆された。そこで今後は神経活動依存的なαシヌクレイン分泌制御機構についてさらに詳細な検討を重ねる。また今後は凝集・蓄積を生じない内因性のマウスαシヌクレインだけでなく、凝集の核となり、細胞間を伝播する異常なαシヌクレインの分泌機構について検討可能な実験系の構築に着手する。病態神経科学
微量タンパン質の単離とアミノ酸配列の決定のシステム化

二次元アクリルアミドゲルで分画し単離した動物のリボゾール蛋白から蛋白を抽出して微量のシクエンサーでN末端附近のアミノ酸配列を決定することを試みた。小亜粒子1.8mgを大型の二次元アクリルアミドゲル電気泳動装置で分画したものを、ギ酸で抽出Biogel P-2で精製した21μgを微量のシクエンサーでN末端から32アミノ酸配列を決定しえてS26に対するcDNAのクローンの確認を用いた。蛋白に特異のcDNAの確認に蛋白のアミノ酸組成も重要である。そこで二次元アクリルアミドゲル電気泳動法で分画したArtemia salinaのリボゾーム蛋白0.1μg-1μgについて水解後、ダブシル誘導体に加え、逆相の高速液体クロマトグラフィーを用いることによってアミノ酸を分離定量してアミノ酸組成を測定した。この際微量定量の為蛋白の試量に外からのアミノ酸の爽雑が問題になるが、蛋白分子篩高速液体クロマトグラフィーで目的を達することができた。この様にしてえたアミノ酸組成をチトクロームC、Artemia salinaのリボゾーム蛋白S6、S8について従来のアミノ酸自動分析計によるものと比較したが、チロシンを除いて極めて近い価をえて信頼できる分析法であることがわかった。従来のものが蛋白30-40μg必要なのに0.1-1μgあれば充分である。尚アミノ酸組成をリボゾーム蛋白に対するcDNAの同定に使ったものとしてS11、S26、S35aがある。合成ヌクレオチドをプローブにしてcDNAのクローニングは最近多く行われているが、私共は牛のオプシンについての一次構造かつ18塩基のプローブを作成しcDNAをえることができた。これを組み合わせて、(1)二次元アクリルアミドゲルでの蛋白の分離とN末端附近のアミノ酸配列の決定、(2)それを基にした合成ヌクレオチドプローブの作成、(3)蛋白に対するcDNAのクローン化、(4)(1)又はアミノ酸組成からのクローンの確認、(5)クローンのヌクレオチド配列からの蛋白質のアミノ酸配列の推定というシステム化が考えられた。
くも膜下出血後早期脳損傷の病態解明

マウスに実験的くも膜下出血を導入することにより、大脳皮質に神経細胞のアポトーシスや炎症が生じ、その結果、神経症状が悪化することを明らかにした。さらに、同部にはマトリセルラー蛋白と呼ばれる特殊な細胞外マトリックス蛋白の1つであるテネイシンCが高発現していることを確認した。テネイシンCの発現をノックアウトすると、くも膜下出血後に生じるカスパーゼ-3依存性の神経細胞アポトーシスが抑制され、神経症状は改善した。また、テネイシンCのノックアウトによりToll様受容体4、nuclear factor-κBを介する炎症性サイトカインの発現が低下することが明らかになった。テネイシンCノックアウトマウスと野生型マウス(メス:20-25g)をそれぞれsham群とくも膜下出血群の2群づつの計4群にランダムに分け、Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR)が提唱する動物実験指針に準じ、評価項目は全て盲検的に検討し、本研究を実施した。くも膜下出血モデルは、臨床例と同様に、くも膜下出血後の頭蓋内圧亢進や脳循環障害、脳血管攣縮に加え、神経細胞のアポトーシスを再現できるくも膜下出血の急性期モデルとして確立している血管内穿通法により作成した。くも膜下出血後24時間、48時間、72時間後に致死率、体重変化率、くも膜下出血の重症度、神経症状、アポトーシスの程度を2重盲検的に評価し、テネイシンC発現抑制によりどのような影響を受けるか検討した。その結果、テネイシンCノックアウトマウスでは神経障害が有意に軽減し、また大脳実質内毛細血管内皮細胞のマイトジェン活性化蛋白質キナーゼの発現を抑制することで、血液脳関門障害を抑制し、脳浮腫を軽減させることを明らかにした。マイトジェン活性化蛋白質キナーゼの発現程度についてはウエスタン・ブロット法にて定量的評価もおこなった。また、ELISA法にて血液中のテネイシンC濃度を経時的に測定し、その濃度がくも膜下出血後のearlybrain injuryや遅発性脳障害の発生と相関して上昇する可能性を明らかにした。当初計画通り、順調に進んでいると考える。前年度に引き続き、テネイシンCノックアウトマウスと野生型マウス(メス:20-25g)をそれぞれsham群とくも膜下出血群の2群づつの計4群にランダムに分け、Stroke Therapy Academic Industry Roundtableが提唱する動物実験指針に準じ、テネイシンCがくも膜下出血後脳損傷に与える影響を盲検的に検討した。テネイシンCのノックアウトにより、神経症状が改善し、神経細胞のアポトーシス、血液脳関門障害、脳血管攣縮が抑制されることが明らかになった。さらにテネイシンCのノックアウトマウスではくも膜下腔の炎症細胞浸潤が抑制されること、野生型マウスでは炎症細胞にテネイシンCの発現亢進がみられること、およびインターロイキン-Iβが活性化されることが明らかとなり、テネイシンCの脳損傷発現機序に炎症反応が深く関与していることが明らかになった。また、テネイシンCが脳血管攣縮を引き起こす分子機構に、Toll様受容体4および上皮成長因子受容体を介するマイトジェン活性化蛋白質キナーゼの活性化が重要な役割を果たしていることが明らかになった。ELISA法による血液中テネイシンC濃度の経時的測定による検討では、テネイシンCが脳血管攣縮に加え、水頭症発生を介し脳損傷発生に寄与する可能性が示された。次年度はさらに詳細に炎症反応と神経細胞アポトーシスとの関連を検討することで、テネイシンCがくも膜下出血後脳損傷の発生・増悪に関与する機序を総合的に解明する予定である。神経細胞のアポトーシスはくも膜下出血後の早期脳損傷の代表的な病態の1つであることから、テネイシンCの発現を抑えることにより、神経細胞のアポトーシスが抑制できるか検討した。具体的にはテネイシンCの発現を遺伝子操作により欠失させたテネイシンCのノックアウトマウスを用いてくも膜下出血後の様々な反応がどのような影響を受けるか検討した。その結果、テネイシンCのノックアウトにより、カスパーゼ-3依存性に生じる神経細胞のアポトーシスが抑制され、神経症状が改善することが明らかになった。これらの研究成果は、テネイシンCがくも膜下出血後の早期脳損傷の発生機序において、極めて重要な役割を果たすことを初めて明らかにした世界初の直接的なエビデンスである。本研究成果は、くも膜下出血後の早期脳損傷に対する新たな治療薬の開発を目指していく上で、テネイシンCが重要な分子標的になりうることを示したものであり、今後の更なる研究の発展へと期待を持たせるものと考える。

テネイシンCの発現をノックアウトすると、くも膜下出血後に生じるカスパーゼ-3依存性の神経細胞アポトーシスが抑制され、神経症状は改善した。また、テネイシンCのノックアウトによりToll様受容体4、nuclear factor-κBを介する炎症性サイトカインの発現が低下することが明らかになった。当初計画通り、研究を進める予定である。今後は更に、Nを増やし、より研究成果を確かなものとすると共に、テネイシンCが神経細胞のアポトーシスを引き起こす分子機構を解明する予定である。特に、テネイシンCが神経細胞アポトーシスを起こす機序を炎症反応に着目し解明する予定である。脳血管障害
アンジュー帝国における諸宮廷の構造と機能

本研究の目的は、11541204年にブリテン諸島南部・フランス西部にわたり存在した、イングランド王国と複数の領邦の複合体である「アンジュー帝国」おいて、王家を構成する各王族の「宮廷」(=王・王族とその随行員からなり、所領内を移動しうる人的集合体)の移動経路や随行員及び機能について分析し、それらを相互に比較検討することで、帝国内の各時期における権力分掌体制の様相を明らかにすることである。本研究では、ヘンリー2世の家族を初めとする王族の発給証書を主な史料とし、それらの形式(書式)・内容・受益者・発給年・発給地・証人の詳細な検討を行うことで、各宮廷の性質・機能を分析・解明していく。