hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グレリンの抗炎症-抗凝固作用の細胞内シグナリング解明と静脈血栓塞栓症治療への応用

THP-1細胞、及びマウス単球-マクロファージを用いて、グレリン受容体(GHS-R),レプチン受容体(Leptin-R)の遺伝子ノックダウンにてグレリン、レプチン各々の作用が抑制され、また細胞内シグナリングにおいて、ERK1のノックダウンで炎症-凝固に関するシグナリングが抑制され、AKTのノックダウンで炎症-凝固系のシグナリング(具体的にはトロンビン刺激に対して組織因子の発現)の活性化が抑制された。また、薬剤及び抗体によりマウス血中の単球と好中球数を抑制後、Vitroで遺伝子ノックダウンした単球及び好中球をマウスに静注後の実験的肺梗塞の生存率、塞栓率の変化を観察したところTissue Factorの発現が抑制されることで、生存率、塞栓率の改善を見た。詳細に関しては、更なる検討を予定している。単球系培養細胞(THP-1細胞)、初代細胞(ヒト又はマウス単球及び好中球)を用いてグレリン及びレプチンの相反する炎症-凝固系に及ぼす作用を、細胞内シグナリング及びサイトカイン産生の変化を定量する事で評価し、更にRNA干渉法による遺伝子ノックダウン法を用いて分子生物学的に検討した。(In Vitro)細胞培養液中にレプチン(10^<-6>-10^<-9>M)、及びグレリン(10^<-6>-10^<-9>M,アシル型及びデスアシル型)を添加し、トロンビン刺激及び無刺激による反応(以下の測定項目)を観察した。1.サイトカイン発現の定量(Flow Cytometery法、又はELISA法)2. Tissue Factor Procoagulant Activityの定量(吸光度測定)プロトコール(American Diagnositca社)通り、サンプルにFVII, FXを添加後、FXaを加え405nmの吸光度測定。3.細胞内シグナリングの解析(ELISA法、又はFlow Cytometry法)細胞の核抽出物を用いて行う。以上のトロンビン刺激により亢進した反応が、グレリン添加により減弱した。これらの結果はグレリンの抗血栓性を示唆するものである。当研究室にて確立した肺梗塞動物モデルを用い、グレリン(アシル型及びデスアシル型)及びレプチンを投与したときの実験的肺梗塞の生存率および肺組織における塞栓率の変化を、末梢血の単球、好中球の活性、凝固反応等のパラメーターと共に観察する。また薬剤及び抗体によりマウス血中の単球と好中球数を抑制後、Vitro実験で遺伝子ノックダウンした(及びNegative ControlのsiRNAを遺伝子導入した)単球、好中球を尾静脈より静注後、肺梗塞の生存率、塞栓率の変化を観察した。(In Vivo系)(肺梗塞動物モデルの作成)Ketamine/Xylazine (150/15mg, ip)麻酔下の雄CD-1マウス(20-25g)に尾静脈より1250U/kgのヒトトロンビン(80%のマウスが30分以内に死に至る量)及びコントロールとして生理食塩水を投与する事を基にして実験を行った。(生存率)血小板凝集薬剤を投与してからの時間軸で見た生存率に関して、レプチン又はグレリン投与時の生存率の変化を検討した。(肺梗塞重症度の定量化)肺組織は、気管より10%ホルマリン投与により固定し24時間後に5-6μmスライスのパラフィン切片を作りphosphotungstic acidにて血管内フィブリンを染色する。最低10視野程度の鏡検で視野中に存在する血管でフィブリンが栓塞している割合を確認する事で肺梗塞の重症度を定量化したところ、グレリン投与により肺梗塞所見が抑制された。
チベット・ポタラ宮所蔵梵本『維摩経』に基づく総合的研究

研究成果の概要:チベット・ポタラ宮の完本『維摩経』サンスクリット語写本からチベット語訳・漢訳三本を対照しながら、仏教学者の注目の的であるサンスクリット語「校訂テキスト」を出版した。また、日本印度学仏教学会第57回学術大会において「『維摩経』の思想と文化」と題してパネルディスカッションを開催し、インド・中国・日本における維摩経の思想と文化に関して、活発な意見交換を行った。『維摩経』は中国や日本において研究が続けられ,種々の註釈書や研究書が存在し、佛教美術にも多大な影響を与えてきた文献である。2004年に大正大学綜合佛教研究所より「梵蔵漢対照『維摩経』」が出版されるまでは、『維摩経』は主に漢訳及びチベット訳によって知られているだけで梵文原文については現存していないと考えられ,一部の文献に貧用されるものによって知られるのみであった。「梵蔵漢対照『維摩経』」の出版以降、新しい『維摩経』研究の基礎資料となる『維摩経』梵文原典校訂テキストの作成をすすめてきた。本研究では中国・日本・佛教美術等に広がる『維摩経』の思想や文化を理解するためには,梵文原典校訂テキストの出版が急務となり,本年中に完成させた。校訂テキスト出版をもって、新たに梵文『維摩経』を含めた総合的な研究が可能となった。本研究の第一の成果としての梵文『維摩経』校訂テキストの作成については梵文写本の明らかな誤りについては訂正し,チベット訳や漢訳諸本との比較によって補うべき箇所は補ったが,梵文写本の特徴的な読みをできる限り尊重しながら校訂テキストを作成した。平成17年7月に第1回共同研究者会議を行い、その際、共同研究者による総合的研究を行うための研究方針についての検討が行われた。平成18年3月には第2回共同研究者会議で梵本研究を中心とした発表が行われた。梵文校訂テキストの出版にあたり,研究協力者によって校訂テキストの作成過程にあらわれた『維摩経』梵文写本の筆写等に関わる問題点と校訂に際しての問題点,梵文原文と蔵漢諸訳との関係について研究発表が行われた。次年度は中国系研究者による研究発表を予定している。2004年に「梵蔵漢対照『維摩経』」が出版されるまでは、『維摩経』は主に漢訳及びチベット訳によって知られているだけで梵文原文については現存していないと考えられ、一部の文献に引用されるものによって知られるのみであった。本研究では中国・日本・佛教美術等に広がる『維摩経』の思想や文化を理解にするにあたり、梵文原典校訂テキストの出版とともに,新たに梵文『維摩経』を含めた総合的な研究を行う。本研究の第一の成果としての梵文『維摩経』校訂テキストの作成については,梵文写本の明らかな誤りについては訂正し、チベット訳や漢訳諸本との比較によって補うべき箇所は補い、梵文写本の特徴的な読みをできる限り尊重し、ついに平成18年3月に刊行した。平成18年7月に平成18年度第1回共同研究者会議を行い、同年9月13日に開催された第57回日本印度学仏教学会公開パネルディスカッションについて打ち合わせが行われた。公開パネルディスカッションでは、研究代表者である多田孝文及び、研究分担者の高橋尚夫・平井宥慶・佐久間秀範・吉津宜英・渡辺章吾の6先生と木村清孝日本印度学仏教学会理事長・斎藤明東京大学教授の2先生がパネリストとして参加された。研究分担者多田孝正先生の司会より、2時間半に渡り行われ、250人以上の方が参加された。平成19年3月には第2回共同研究者会議を行い,パネルディスカッション講演録出版に向けての話し合い,また来年度の研究方針について話し合いが行われた。講演録の出版は平成19年度夏頃を予定し、作業を進めている。本研究では中国・日本・佛教美術等に広がる『維摩経』の思想や文化を理解にするにあたり、新しい『維摩経』研究の基礎資料となる『維摩経』梵文原典校訂テキストの作成・出版とともに、『維摩経』の総合的な研究を行う。

本年度は平成18年9月に開催された、日本印度学仏教学界公開パネルディスカッション講演録の出版作業を進めることを柱として、全体的にはその校正作業に重点を置いた。また全体会議において、当研究会インド部門の米澤嘉康・長島潤道の両氏が梵文校訂に関する研究発表を行った。目的は、当研究会に関連して出版された『梵本維摩経』(2006)出版後の研究動向の調査のためである。米澤氏は大正大学『維摩経』テキストにおける文献学的特徴とそれに準拠して進められた諸研究の比較調査を行い、パワーポイントによって写本画像を鮮明に示しつつ、当写本が読みを尊重するテキストであることが再確認された。長島氏は、最近発表された岩松浅夫氏の三論文に関する語義解釈および訳文の再検討を行い、1・7章の偈頌の申1-6、1-7、7-2の三偈について詳細な考究を進め、テキストの進展が見られたわけである。また、本年度の研究成果の一部として、当研究会中国部門の坂本廣博氏が雑誌論文へ寄稿(下記参照)している。本研究も最終年度となった。2004年に「梵蔵漢対照『維摩経』」が出版され、その後2006年に出版された「『梵本維摩經』-ポタラ宮所蔵写本に基づく校訂-」によって写本校訂作業は終了した。本年度は前年度に引き続き、シンポジウム録の校正を行うと同時に『維摩經』訳に注目して研究を進めた。研究分担者である坂本廣博氏が支謙訳の『維摩経』を試訳した。広く読まれている鳩摩羅什訳『維摩詰所説経』との比較研究が期待される。その試訳が「支謙訳『維摩経』試訳(一)」として『叡山學院研究紀要第31号』に所収されている。また、ベルギーの大仏教学者であるラモット博士による物“L' Enseignement de VimalakIrti"(Louvain,1962)は「維摩経」のフランス語訳として非常に高い評価を受けたばかりでなく、「維摩経」の研究書としても多岐にわたる詳細な研究に基づく正確無比な内容で知られ、今なお「維摩経」研究書の頂点に立つ。とりわけ、その序論は「維摩経」の歴史、教理など一切を網羅すると言って過言ではない。このラモット博士のフランス語訳「維摩経」の「序論」(“INTRODUCTION")を、Sara Boinによる英語訳をベースに、研究協力者である西野翠氏が翻訳したものを基に研究を進めた。この訳に関しては郭忠生氏による中国語訳も出版されており、中国語訳本には郭氏の追跡研究の結果が加えられているばかりでなく、仏訳・英訳の要約が示され、箇所のみが挙げられている漢訳経文については、その全文を提示し、あるいは引用経典を大正蔵経で検索しやすいように、経典番号だけでなく、巻数と頁数を明記するといった工夫が随所に見られた。この中国訳本を参考に研究を進め、幅広い知見を得ることができた。以上のように上記2つの訳を中心に研究を行い、現在までの『維摩経』研究の成果を踏まえつつ新しい視点から翻訳研究に取り組んだ。
肝移植における栄養・肝ミトコンドリア機能・免疫機能の相関に関する基礎的臨床研究

1)これまでの生体肝移植後の免疫機能の研究から、肝移植後の成績を大きく左右する感染症の進展にはCD8(+)T細胞の中のeffector T細胞(Te)の機能が重要であり、Teの分布から患者の術前リスクを評価できること、Teの有効な機能回復にはcentral memory T細胞(Tcm)のIL-12受容体の発現が重要であることを見いだした。本研究においては、術前high riskグループであるGroup III症例においてTcmのIL-12受容体の変動を検討したが、通常の免疫抑制療法であるタクロリムスとステロイドの併用療法では術後には著しくTeが長期間低下し,またIL-12受容体の発現亢進もなく、種々の合併症を伴い,死亡率も高く,その生存率は6年後では50%に低下した。一方、タクロリムスとMMFの併用療法では,IL-12受容体の発現亢進を認め、Teが維持され、合併症も少なく6年生存率は100%であった。2)栄養療法に関しては、術前のアミノレバン投与、移植後の特殊な抗炎症経腸栄養剤投与が、統計学的に有意に肝移植後の敗血症の発症を抑制し、肝移植後の成績向上に寄与することを確認した。同時に、これらの栄養介入を行った患者群ではTeが維持され、TcmのIL-12受容体の発現も亢進している傾向が見られている。一方、AKBRに関しては安定したデータを得ることができない結果であり、今後の研究課題として残った。
ホヤから発見した新規ペプチド、Ci-YFV/Lの生物学的役割の解明

本年度は、まず、昨年度までに構築した機械学習装置、Peptide descriptor (PD)-incorporated support vector machineを用いて、カタユウレイボヤ特異的遺伝子19種類と、リガンドが未同定のGタンパク共役型受容体160種類を入力し、全ての組み合わせについて相互作用予測を行った。その結果、特異的な相互作用を70%以上の確率で行うと予測された組み合わせを7種類検出した。次に、この予測結果に基づき、各受容体をG16タンパクと融合した組換えタンパクを構築し、Sf9細胞で発現させて、特異的リガンドと予測させたペプチドを反応させた。その結果、Ci-GALP, Ci-NTLP2, Ci-LF2,および、Ci-YFV-1とそれぞれの受容体の相互作用が実験的に証明された。さらに、これらの実証結果をPD-incorporated SVMにフィードバックして、再度、相互作用予測を行ったところ、新たに、12種類のペプチド-受容体ペアが70%以上の確率で相互作用するという予測結果を得た。一度目と同様に、各受容体のG16タンパク融合体をSf9細胞に発現させて、特異的リガンドと予測させたペプチドを反応させたところ、Ci-LF1, 5, 6, 7, 8, Ci-YFV3といった各ペプチドと特異的に反応する受容体を決定することができた。これは、機械学習法で新規ペプチド-受容体ペアの予測、および、それらを実験的に証明した初めての研究である。また、Ci-YFV1と3の受容体の発現分布をリアルタイムPCRで調べた結果、両者とも中枢神経と出水口で共通して発現が認められたが、後者は内柱や入水口でも高い発現が認められた。今後は、これらの実験成果に基づき、ホヤ特異的ペプチドの生物学的役割を解明する。これまでに、我々は、カタユウレイボヤの中枢神経から、どの生物でも発見されていない新規ペプチドをpeptidomicisで多数発見し、さらに、そのcDNA配列、ゲノム構造、および、中枢神経における遺伝子発現分布を明らかにしてきた。本研究では、その中でも、ホヤ新規ペプチドのCi-YFL1, 2, 3, Ci-YFV,および、Ci-LF1-8の生理機能を解明することに焦点を当てている。これらの生理機能を解明するには、各ペプチドの受容体の同定とその発現分布の解明が不可欠である。しかし、このような新規ペプチドの受容体を、既知需要た配列との相同性から判断することは不可能であり、また、従来のreverse pharmacologyの手法では、多大な時間、労力、および、実験コストを要することが予測された。そこで、我々は、機械学習法を用いて、Ci-YFL1, 2, 3, Ci-YFV,および、Ci-LF1-8の受容体候補を3種類ずつ予測した。次に、それらをHEK293細胞やSF9細胞用発現ベクターに挿入し、発現体を構築した。また、これらの受容体は、シグナル伝達の検出を簡略化するために、すべてG15タンパクとin-flameで融合してある。さらに、この融合体が細胞膜上に局在していることを確認した。現在、上記予測結果に基づき、各受容体の発現体にペプチドを投与し、細胞内カルシウム動員を指標としたアッセイを行っている。全て、研究計画通りに進行できている。29年度は、ペプチドの記述子をオリジナルに作製し、脊椎動物や昆虫のペプチドとGPCRを数値化して、独自に作製した機械学習モデル、PD-incorporated SVMを構築した。これに、当研究室で同定したホヤ特異的ペプチド25種とリガンドが不明なGPCR140種類を入力し、ペプチド-受容体ペアの予測を行った。その結果、29種類のペプチド-受容体ペアの候補が導き出された。次に、この予測結果を実験的に実証するために、各GPCRをSf9細胞に導入し、細胞内カルシウム動員を指標としたレセプター結合実験を行ったところ、Ci-YFV1とCi-YFV-3にそれぞれ特異的に結合するGPCR、Ci-YFV-1-RとCi-YFV-3-Rを同定できた。これらの受容体は、Ci-YFV1とCi-YFV-3とnMベースのEC50で反応するのに対し、他のペプチドとは全く反応しなかった。また、ペプチドとCi-YFV-1-RとCi-YFV-3-Rの分子進化を分子系統樹で解析したところ、これらの受容体はホヤで独自に進化したGPCR群であること、および、他の生物のペプチドのGPCRとは全く相関性を持っていないこと、強いて言えば、ヒトやショウジョウバエの機能不明のオーファンGPCRと緩い相関性を有していることが明らかになった。Ci-YFV-1-RとCi-YFV-3-Rのホヤ体内における発現分布をRT-PCRで調べたところ、これらの受容体は中枢神経、消化管、入水口、および、卵巣で発現していることが明らかになった。現在、これらの受容体の卵巣における発現部位をin situ hybridizationで特定しつつある。発現部位を特定後、卵巣や卵胞にペプチドを投与し、トランスクリプトームを行い、変動する遺伝子群を同定し、これらのペプチドの生物学的役割を解明していく予定である。これまで不明だったCi-YFV-1とCi-YFV-3の受容体を決定し、発現組織を計画通りに特定できたことで、Ci-YFV-1とCi-YFV-3の生物学的役割の解明に大きく前進した。

本年度は、まず、昨年度までに構築した機械学習装置、Peptide descriptor (PD)-incorporated support vector machineを用いて、カタユウレイボヤ特異的遺伝子19種類と、リガンドが未同定のGタンパク共役型受容体160種類を入力し、全ての組み合わせについて相互作用予測を行った。その結果、特異的な相互作用を70%以上の確率で行うと予測された組み合わせを7種類検出した。次に、この予測結果に基づき、各受容体をG16タンパクと融合した組換えタンパクを構築し、Sf9細胞で発現させて、特異的リガンドと予測させたペプチドを反応させた。その結果、Ci-GALP, Ci-NTLP2, Ci-LF2,および、Ci-YFV-1とそれぞれの受容体の相互作用が実験的に証明された。さらに、これらの実証結果をPD-incorporated SVMにフィードバックして、再度、相互作用予測を行ったところ、新たに、12種類のペプチド-受容体ペアが70%以上の確率で相互作用するという予測結果を得た。一度目と同様に、各受容体のG16タンパク融合体をSf9細胞に発現させて、特異的リガンドと予測させたペプチドを反応させたところ、Ci-LF1, 5, 6, 7, 8, Ci-YFV3といった各ペプチドと特異的に反応する受容体を決定することができた。これは、機械学習法で新規ペプチド-受容体ペアの予測、および、それらを実験的に証明した初めての研究である。また、Ci-YFV1と3の受容体の発現分布をリアルタイムPCRで調べた結果、両者とも中枢神経と出水口で共通して発現が認められたが、後者は内柱や入水口でも高い発現が認められた。今後は、これらの実験成果に基づき、ホヤ特異的ペプチドの生物学的役割を解明する。本年度は、予測結果に基づいたペプチド-受容体ペアを実証し、各新規ホヤ神経ペプチドの受容体を決定する。その後、それらの卵巣における発現分布研究に移行する。卵巣のCi-YFV-1-RとCi-YFV-3-Rの発現部位を特定後、そこにCi-YFV-1とCi-YFV-3を投与して、変動する遺伝子群をRNA-seqで特定する。また、卵胞や卵巣の形態学的・発生生物学的変化を検出する。
ソノポレーション法を用いた骨誘導における新たな治療法の開発とそのメカニズムの解明

骨延長術は骨の造成のみならず周囲の骨膜、筋、神経脈管などの軟組織も同時に延長されることから,従来の骨欠損部位に対する自家骨移植術にはない利点を有する.しかしながら骨移植法に比べ治療期間の長期化が大きな欠点とされている.近年,骨延長術の治療期間の短期化を目的とした骨硬化促進の研究がなされている.そこで本研究では顎骨に骨延長術を行い,延長部に対しbFGFを超音波遺伝子法にて骨芽細胞に導入し,創傷治癒促進,骨硬化促進度合を解析したところ,新規骨誘導療法の実現に向け多くの知見を得ることができた.骨延長術は骨の造成のみならず周囲の骨膜、筋、神経脈管などの軟組織も同時に延長されることから,従来の骨欠損部位に対する自家骨移植術にはない利点を有する.しかしながら骨移植法に比べ治療期間の長期化が大きな欠点とされている.近年,骨延長術の治療期間の短期化を目的とした骨硬化促進の研究がなされている.そこで本研究では顎骨に骨延長術を行い,延長部に対しbFGFを超音波遺伝子法にて骨芽細胞に導入し,創傷治癒促進,骨硬化促進度合を解析したところ,新規骨誘導療法の実現に向け多くの知見を得ることができた.骨延長術は骨の造成のみならず周囲の骨膜、筋、神経脈管などの軟組織も同時に延長されることから、従来の骨欠損部位に対する自家骨移植術にはない利点を有する.しかしながら骨移植法に比べ治療期間の長期化が大きな欠点とされている.近年、骨延長術の治療期間の短期化を目的とした骨硬化促進の研究がなされている.骨硬化期間に骨延長部へ刺激を与え、創傷治癒促進、骨硬化促進を獲得する方法である.この刺激としては、骨形成因子(BMP、bFGFなど)の局所注入、低出力超音波刺激(LIPUS)などがある.LIPUSでは安定した骨硬化促進作用を確認できたが、bFGFの注入に関しては、局所に安定して作用する担体を必要とし、結果が不安定であった.これらの結果から、bFGFを安定して延長部に作用させる方法が必須となっていた.申請者は顎骨に骨延長術を行い、延長部骨芽細胞にbFGF発現プラスミドを安全で効果の高い超音波遺伝子導入法(ソノポレーション法)で導入し、創傷治癒および骨硬化を促進することにより、骨延長期間を短縮できると考えた.平成19年度は、In vitroの実験系における骨芽細胞への導入効率の検討を行った.超音波遺伝子導入装置を用いマウス正常骨芽細胞MT3T3 cellおよびヒト由来骨芽細胞様細胞Saos2にβ-galactosidase発現遺伝子を導入し、導入効果が高い条件を検討した.β-gal発現遺伝子とマイクロバブル溶液(Sonovue)を混合し、遺伝子/マイクロバブル複合体溶液を調製する.この溶液を細胞懸濁液に加え、さまざまな条件で超音波照射した.24時間培養後、β-gal染色したところ、超音波強度2.0W/cm2、照射時間20秒、DUTY比50%で最も高い導入効果が得られた.また近年、細胞レベルの精度で遺伝子導入を"狙い撃ち"できるナノバブルも出現し、その研究開発が盛んになっている.そこで、次世代マイクロバブルとして帝京大学薬学部からバブルリポソームを供与した.上記実験をバブルリポソームを用いて検討を行い、導入効率が向上するかどうかを現在調べている.骨延長術は骨の造成のみならず周囲の骨膜、筋、神経脈管などの軟組織も同時に延長されることから,従来の骨欠損部位に対する自家骨移植術にはない利点を有する.しかしながら骨移植法に比べ治療期間の長期化が大きな欠点とされている.近年,骨延長術の治療期間の短期化を目的とした骨硬化促進の研究がなされている.骨硬化期間に骨延長部へ刺激を与え,創傷治癒促進,骨硬化促進を獲得する方法である.この刺激としては,骨形成因子(BMP, bFGFなど)の局所注入,低出力超音波刺激(LIPUS)などがある.LIPUSでは安定した骨硬化促進作用を確認できたが,bFGFの注入に関しては,局所に安定して作用する担体を必要とし,結果が不安定であった.申請者は顎骨に骨延長術を行い,延長部骨芽細胞にbFGF発現プラスミドを超音波遺伝子導入法で導入し,創傷治癒および骨硬化を促進することにより,骨延長期間を短縮できると考えた平成20年度は,臨床への応用を目指し,動物実験での成績評価を行った.まず,Wister系ラットを用い,全身麻酔下に下顎骨皮質骨骨切り後,自作の延長装置を装着し,ラット下顎骨延長モデルを作成した.実験動物を対照群(単純骨延長群),超音波単独照射群,bFGF発現プラスミド単独投与群,bFGF発現プラスミド投与+超音波遺伝子導入群の四群に分けた.術後7日間の待機期間の後,0.5mm/日の割合で骨延長を行った.総延長距離は3.5mmとし,7日間の延長を行う.延長終了後,延長部に対して以下の刺激を加える.実験群:延長終了時,延長部にナノバブル/bFGF遺伝子混合溶液をインジェクションし,ソニトロン2000の超音波プローブを当て超音波照射した.以上の経過で延長終了後1週,2週,4週で安楽死させ,試料を採取した.RT-PCR法にて仮骨周囲組織にbFGF遺伝子の発現が観察され,bFGFタンパクも検出された.組織学的には,HE染色およびToluidine Blue染色にて導入群仮骨に軟骨の消失と骨架橋が見られ,治癒の促進が観察された.
光合成酸素発生系Mnクラスターの構造と機能の研究

酸素発生系Mnクラスターの磁気構造解析:第1段階として、EPRマルチライン信号の磁気的性質とXAFS実験から報告されているMnクラスターの性質を考慮して、一般的なMn4核錯体の可能な磁気相互作用の全ての組み合わせについて数値計算を行い、クラスターが示す磁気的性質(S_2状態)を満足する磁気構造を抽出した。第2段階として、4核錯体の各Mnの酸化状態と有効的超微細結合テンサー(Ehfc)をより正確に決定するため、薄膜上に配向した光化学系II膜断片についてチラコイド膜法線方向にたいする角度依存性S_2マルチラインスペクトルを精密に測定し、得られた角度依存性スペクトルについてMn(III)イオンの異方性を考慮にいれた非線形最小2乗法によるシュミレーション解析を行った。酸化状態はMn(III-IV,IV,IV)、EhfcはMn(III)が8.56×10^<-3>cm^<-1>、Mn(IV)が3.70×10^<-3>cm^<-1>、8.07×10^<-3>cm^<-1>、9.93×10^<-3>cm^<-1>と決定された。第3段階として、Mnの持つ実効的超微細結合テンサーの範囲(6.5×10^<-3>cm^<-1>8.5×10^<-3>cm^<-1>)でクラスターの各MnのEhfcを再現するプロジェクションファクターを示す磁気構造を酸素発生系Mnクラスターの構造として選択した。Mn原子間のEhfcの値より、クラスターを構成するMn間の化学結合の有無、種類についての議論が可能となった。
染色体構築に関与する蛋白質複合体の制御機構の解明

すべての生物では、SMC(structural maintenance of chromosomes)とよばれる一群の蛋白質が、染色体の維持や分裂に深く関わっている。本申請では、バクテリアのコンデンシンと呼ばれるSMC蛋白質複合体の制御サブユニットが、どのようなシグナルを介して、SMC蛋白質のATP加水分解反応を制御しているか、構造生物学的及び分子生物学的アプローチによって理解することを目的とした。この申請研究で、SMC制御サブユニットScpA-ScpB複合体を調製し、その結晶構造を決定し、ScpAの可変構造を制御するための特異的なScpBのシャペロン様構造を明らかにした。ScpAはScpBと巻き付くように複合体を形成しており、どのようなステップを経てこの複雑な構造が形成されているのかを明らかにすることができた。ScpBは安定な二量体をそのN末端ドメインで形成していた。この二量体ドメインと結合するScpAペプチドの複合体の結晶構造を決定することによって、ScpA-ScpB複合体の形成過程で、一時的に取り得ると考えられる安定構造も明らかにした。これらの立体構造を基にして制御サブユニットの変異体を作製し、SMCのATPase活性に与える影響を調べた結果、複合体中では隠されているScpAの中央領域の一部がSMCのATPase活性の促進化に重要な役割をもつことが判明した。すなわち、SMC複合体には、制御サブユニットの内部構造変化と同期して、SMCのATPaseドメインの会合が誘起される機構が備わっていると推測された。上記の結果をまとめて論文化し、Structureに投稿した。24年度が最終年度であるため、記入しない。原核生物は、核膜をもたず、その染色体DNAは核様体と呼ばれる構造体を形成している。枯草菌を初めとする多くのバクテリアでは、SMC(Structural Maintenance of Chromosomes)複合体が存在し、核様体の構築と分離に関与している。本申請の大きな研究目的は、まず、このバクテリア型のコンデンシン複合体の制御サブユニット(ScpAとScpB)のどのようなシグナルが、SMC蛋白質の加水分解反応過程を制御しているかを理解することにある。そのため、立体構造解析を行い、生化学的実験による検証を行う。さらに、このバクテリア型での複合体調製のノウハウを生かし、真核生物のコンデンシンの機能ドメインを同定することを目指す。本年度は、SMC蛋白質のATPase活性ドメイン及び、ScpA-ScpB複合体を調製し、様々な条件下で結晶化を試みた。結晶化が成功したものについては、高輝度X線源を用いて回折実験を行い、三次元構造を決定した。ScpA-ScpB複合体の構造解析から、ScpAの可変構造を維持するための特異的なScpBのシャペロン様構造を明らかにすることができた。この構造情報から、SMC蛋白質の加水分解活性を制御すると考えられる部位に、特異的に変異を導入することができた。このScpA、ScpB変異体を用いた生化学的実験の結果から、いくつかの部位が機能的に重要であることが検証できた。また、このバクテリアの共発現系と調製のノウハウを生かし、真核生物型のコンデンシン複合体の解析へと発展させるため、その制御サブユニットとSMC蛋白質のATPase活性を担うドメインをクローニングし、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞による発現系を構築することができた。分光器等の不調で蛋白質濃度調製がうまく行かなかったトラブルはあったが、当初の目的の半分は計画的通りに進行させることができた。ここまでの構造解析の結果については、来年度の早い段階で論文化を進める。

また、真核生物のコンデンシンについては、昆虫細胞のスケールアップを計り、1Lスケールで大量発現可能なシステムを構築し、コンデンシン制御サブユニットの構造的安定性を生化学的に調査する。
ヒト心筋Kチャネルの薬理および分子生物学的研究

現在までに様々な動物種を用いて,心筋細胞の膜イオン電流の解析が行われてきたが,実際にヒト心筋細胞においても他動物種と同様なイオン電流によって活動電位が構成されているか否かの検討は十分に行われていない。これらの電流系が解明された場合には,不整脈の発生機序や抗不整脈薬の効果を予測することが可能になると考えられる。そこで。我々は単一ヒト心筋細胞にパッチクランプ法を応用して,whole-cell電流を記録した状態で,心筋細胞の膜イオン電流として重要と考えられるK電流およびCa電流を解析した。この結果,K電流に関してはヒト心筋細胞に特異的なultra rapid型のK電流(IKur)および一過性K電流(Ito)が確認され,ヒト心筋細胞の再分極相に重要な役割を果たしている事が確認された。また,これらのK電流の抗不整脈薬による抑制機序も解明されつつあり,各種抗不整脈薬の中でも,Itoのみに有効な薬物や,ItoおよびIKur双方に有効な薬物なども解明されるようになった。今後はK電流のみを特異的に抑制する抗不整脈薬を検討する予定である。また,ヒト心筋Ca電流に関してはphosphodiesterase(PDE)の中でも,特にPDEIIIおよびIV型が,Ca電流の調節により重要な役割を果たしていることが確認されたため,心不全の治療薬を考慮する上でも重要な所見と考えられたため,今後は臨床応用が可能なPDE抑制薬のヒト心筋膜電流に対する効果を検討する予定である。そこで。そこで。本年度は単一ヒト心筋細胞にパッチクランプ法を応用して,whole-cell電流を記録した状態で,心筋細胞の膜イオン電流として重要と考えられるK電流およびCa電流を解析した。この結果,K電流に関してはヒト心筋細胞に特異的なultra rapid型のK電流(IKur)および一過性K電流(Ito)が確認され,ヒト心筋細胞の再分極相に重要な役割を果たしている事が示唆された。また,これらのK電流の抗不整脈薬による抑制機序も解明されつつあり,今後は種々の抗不整脈薬によるK電流の修飾機序を検討する予定である。また,ヒト心筋Ca電流に関してはphosphodiesterase(PDE)の中でも,特にPDE IIIおよびIV型が,Ca電流の調節により重要な役割を果たしていることが確認されたため,心不全の治療薬を考慮する上でも重要な所見と考えられた。そこで。本年度は単一ヒト心筋細胞にパッチクランプ法を応用して,whole-cell電流を記録した状態で,心筋細胞の膜イオン電流として重要と考えられるK電流を解析した。昨年度の本研究費による研究で,ヒト心筋細胞に特異的なultra rapid型のK電流(IKur)および一過性K電流(Ito)が確認されたが,これらのK電流に対してI群の抗不整脈薬であるpropafenoneが双方のK電流を有効血中濃度の範囲で特異的に抑制することが確認された。この作用は他の抗不整脈薬であるflecainideやquinidineとも異なっており,心房性の不整脈を抑制する機序として重要な所見と考えられた。

また,ヒト心筋細胞のK電流として重要と考えられるrapid型遅延整流性K電流(IKr)の構造および変異株の構造,機能も解明されつつあり,今後はこれらのK電流の臨床不整脈症例における役割を検討する予定である。
表情筋活動・下顎運動に着目した調音教示法の構築と発音訓練における効果の検証

発音訓練では、所望の音韻を生成するための調音器官(舌・口唇)の形状を的確に制御できるようにする調音教示を、訓練者に与えることが必要である。本研究では、言語によって発話に使われる調音器官周りの筋肉の使い方が異なることに着目し、調音動作の口唇・下顎運動を司る筋肉に意識を向ける発音教示法を構築することを目的とする。顔の筋肉は直接見て触ることができるため理解しやすく、筋肉の動きの連動を利用して適切な筋肉を意識させることが可能である。口唇・下顎運動に関わる筋活動と、調音器官の形状を介して発音音声の音響学的特徴変化との関係について定量的な数理関係を見いだし、発音訓練促進という観点から体系化する。
幹細胞発生・分化におけるオートファジーチェックポイント機構

本研究では、オートファジーが、どのように成体型造血幹細胞の成立に寄与するのか、また、関連した研究として、腫瘍幹細胞におけるオートファジーの意義を明らかにすることを目標とした。本年度は、オートファジーと深く関与するmTOR複合体1 (mTORC1)の生体内での造血幹細胞の自己複製能の役割を明らかにするため、Rheb変異マウス(Rheb f/f CreER)の骨髄細胞を放射線照射マウスに移植し、骨髄再構築が完了した後に、タモキシフェンを投与し、野生型造血細胞との競合状態を評価した。その結果、Rheb欠損による明確な造血幹細胞異常は認められないことが判明した。さらに、マウスに低線量のX線を照射しても、その結果には影響をしていなかった。したがって、定常状態および傷害ストレス下においてもRheb依存的な幹細胞の異常は認められなかった。一方、Raptor欠損に関しては顕著な造血幹細胞の現象が認められることから、mTORC1自体は造血幹細胞の自己複製に必須であるが、PI3K-AKT以外の上流の重要性が示唆された。また、オートファジーの活性化による造血幹細胞保護作用の可能性が示された。以上のように、本研究成果は、オートファジーの役割を明確にするための意義ある情報となった。また、脳腫瘍幹細胞において、ATG5遺伝子を破壊し、未分化性に関する指標を解析した結果、オートファジー不全状態は、通常状態では何ら影響を及ぼさないものの、ミトコンドリア傷害性の抗がん剤に対する感受性の亢進に寄与することが判明した。本成果により、将来、臨床的に有用な治療法の開発に寄与する可能性が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、発生・発達期に生じるようなオートファジーが、どのように成体型造血幹細胞の成立に寄与するのか、生理的意義を明らかにすることを目標とした。まず、薬剤誘導的Atg5欠損マウスの造血組織を解析したところ、8-12週齢では、顕著な幹細胞集団への影響は認められないこと、一方、胎児期より血液細胞においてAtg5を欠損(Atg5flox/flox;vav-Creマウス)させることにより、その後の成体では、顕著な幹細胞の機能低下と数の減少を伴う造血不全が生じることを確認した。このことから、造血幹細胞の維持におけるオートファジーの役割は、これまで考えられてきた成体型造血幹細胞というより、それまでの発生・発達時期での重要性が大きいのではないかと考えられた。そこで、Atg5flox/flox;Vav1-Creマウスの造血幹細胞を用いて、E13.5, 18.5,P0, P7, P21での移植実験を行い、どの段階でオートファジーが重要であるか検討した。その結果、出生1週間以降に明確な移植能の低下が認められるものの、それ以前では顕著な低下は認められないこと、一方で、生後3週齢以降では極めて重篤な幹細胞機能障害が認められたことから、発生・発達段階でオートファジーの機能不全が、その後の成体型幹細胞の成立(発生)に大きく影響すると考えられた。今後、造血幹細胞の発生におけるオートファジーの新たな分子制御機構の解明に大いに寄与するものと期待される。予備的実験で得られた成果や材料を十分に活用し、解析を進めることができたため、順調に研究が進展していると考えられる。発達期造血幹細胞におけるオートファジーを誘導する上流因子および下流因子の特定を進め、幹細胞制御におけるオートファジーの生理的意義を明らかにする29年度が最終年度であるため、記入しない。
放射線治療を受ける頭頸部癌患者への口腔ケアの介入効果

背景:癌で放射線治療を受けると口腔粘膜炎が発症し、重症化すると放射線治療完遂に影響を及ぼすことがある。それにも関わらず、口腔粘膜炎の予防と治療方法は確立されてなかった。目的:癌で頭頸部に放射線治療を受ける場合の口腔管理の方法を確立し、重度の口腔粘膜炎をどの程度抑制できるかを明らかにすることであった。方法:耳鼻咽喉科、放射線科と口腔外科の癌で頭頸部に放射線治療を受ける患者に対して独自のプロトコール「頭頚部がん放射線治療時の有害事象予防バンドル」を作成し、口腔管理を行った。成果:口腔または中咽頭癌の患者30名うち5名(17%)が重度の口腔粘膜炎を発症し、過去の報告と比較して低い割合を示した。本研究の目的は、頭頸部がんで放射線治療を受ける患者に対して放射線治療開始前から口腔管理を行い、予定通りの放射線治療を完遂させ放射線治療による有害事象の口腔粘膜炎を予防あるいは重症化を抑制するかを検討することである。本研究における放射線治療中の口腔管理の方法は、1口腔ケア2スペーサー作成3ピロカルピン塩酸塩の投与4口腔粘膜炎へのステロイド軟膏塗布である。放射線科や耳鼻科からほぼ全例頭頸部がんで放射線治療を受ける患者の紹介を受け、平成23年10月から平成25年3月まで78名の患者への口腔管理を行ってきた。その中でも特に30名の口腔・中咽頭がんの患者に注目し、口腔ケアの効果を評価した。その結果、重度の口腔粘膜炎を発症した割合は17%(30名中5名)であった。Nicolaou-Galitisら(The open cancer Journal,2011,4,7-17)の報告では、放射線治療中に口腔ケアみを行ったところ135名の頭頸部がんで放射線治療を受け重度の口腔粘膜炎を発症した割合は57%であった。本研究の結果から放射線治療中に口腔管理を行うことで重度の口腔粘膜炎の発症を抑制できることが示唆され、論文発表した(KawashitaらJournal of Cancer Research & Therapy, 2(1): 9-13, 2014)。本研究の目的は、頭頸部がんで放射線治療を受ける患者に対して放射線治療開始前から口腔ケアを行い、予定通りの放射線治療を完遂させ放射線治療による口内炎などの有害事象を予防あるいは緩和し、感染症の発症を抑制する効果があるのかどうかを評価することである。放射線科や耳鼻科からほぼ全例頭頸部がんで放射線治療を受ける患者の紹介を受け、平成23年10月から平成25年3月まで78名の患者への口腔ケアを行ってきた。コントロール群を平成23年9月から1年間さかのぼり頭頸部がんで放射線治療を受けかつ歯科受診を受けていない者で、重度の口腔粘膜炎の発症率は37%(27名中10名)であった。また、Nicolaou-Galitisら(The open cancer Journal,2011,4,7-17)の報告では135名の頭頸部がんで放射線治療を受け重度の口腔粘膜炎を発症した割合は57%であり、口腔ケアを行うことで重度の口腔粘膜炎を抑制することができることが示唆された。また、放射線治療中の口腔ケアの方法は現在のところ十分に確立されておらず、さらに、施設間での口腔ケアの内容に違いがあることが2012年8月に歯科を併設するすべての106大学病院に対するアンケート調査で分かった。我々は、放射線治療中の口腔ケアは保清と保湿を原則としスペーサーの作成、サラジェンの投与やステロイド軟膏による口腔粘膜炎の治療を含めた「口腔粘膜炎の予防バンドル」として行う必要があると認識し、書籍分担担当「頭頸部がん放射線治療と口腔管理」において口腔ケア方法を執筆した。頭頸部への放射線治療による有害事象には、口腔粘膜炎、口腔乾燥、味覚異常、放射線骨壊死がある。特に口腔粘膜炎は、疼痛とそれによる食事摂取量の減少を生じ、QOLの急激な低下を招き患者の闘病意欲を減退させ、やむなく放射線治療中止に至ることがある。そのため、医科との連携を図り、放射線治療前から口腔管理を行うことで、放射線治療による口腔内の有害事象を予防あるいは緩和し、効果的な医科歯科連携システムを構築することを本研究の目的であった。本研究の方法は、耳鼻咽喉科、放射線科と口腔外科において癌で頭頚部に放射線治療を受ける患者に対して独自のプロトコール「頭頚部がん放射線治療時の有害事象予防バンドル」を用いて放射線治療前から口腔管理を行った。口腔管理の内容は1スペーサー作成2ピロカルピン塩酸塩の投与

3保清と保湿に重点をおいた口腔清掃4口腔粘膜炎へオリブ油で溶いたデキサルチン軟膏塗布であった。その結果、当院にて頭頚部に放射線治療を受ける患者のほぼすべてを登録することができ、年間60名程度の新患を管理することができた。また、放射線治療中の口腔管理の介入効果については、口腔・中咽頭がん患者30名のうち重度の口腔粘膜炎の発症を17%(5名)に抑えられ過去の報告と比較して低い割合を示した(Kawashita et.al., Journal of Cancer Research & Therapy, 2014)。現在この口腔管理の方法が口腔粘膜炎の重症化抑制効果があるか「多施設共同前向きランダム化比較試験(UMIN登録番号:000011254)にて検証している段階である。予防歯科学30名の口腔・中咽頭のがん患者に放射線治療中の口腔管理を行うことで重度の口腔粘膜炎の発症率抑制することが示唆され、この結果を2013年の頭頸部癌学会で報告し、さらには論文報告(KawashitaらJournal of Cancer Research & Therapy, 2(1): 9-13, 2014)した。また、本研究分担者である梅田正博が編著となり、「周術期口腔機能管理の基本がわかる本」(2013年12月、クインテッセンス出版株式会社)を執筆した。その一部である「頭頸部がん放射線治療と口腔管理」を分担執筆した。平成23年10月から開始され平成25年3月まで78名の患者に関わった。そのうち、30名の口腔・中咽頭のがん患者に注目し、重度の口腔粘膜炎の発症率を評価し、コントロール群として平成23年9月から1年間さかのぼり口腔・中咽頭のがん患者で放射線治療を受けかつ歯科受診を受けていない者27名と比較検討した。今後は、症例数を増やして口腔ケアによる重度の口腔粘膜炎の抑制効果を検討する必要がある。頭頸部に放射線治療を受ける患者への口腔管理の効果を論文報告(KawashitaらJournal of Cancer Research & Therapy, 2(1): 9-13, 2014)した。当初、本研究のコントロールを放射線治療中の口腔管理の介入前の平成23年9月から1年前にさかのぼり口腔・中咽頭のがん患者で放射線治療を受けかつ歯科受診を受けていない者27名とした。ところが、コントロールに選んだ患者の口腔粘膜炎の評価は複数の担当医によって行われており評価基準が整っていなかったためにコントロール群としての口腔粘膜炎の重症度を評価することができなかった。そこで今度は、口腔外科で口腔癌の診断を受け、放射線治療を受ける患者を対象にして口腔管理群と口腔ケアのみのコントロール群にランダムに割り付け、長崎大学病院のみの症例では限られているので多施設共同研究ランダム化比較試験を開始するに至った。本研究における口腔粘膜炎の評価はNCI-CTCAE v4.0とv3.0の評価方法に基づいている。v4.0は患者の自覚所見による機能評価(疼痛と摂食状況)をもとにしているため、十分な疼痛コントロールがなされていれば実際の重症度よりも軽症に判断される。さらに口腔癌では術後に経管栄養が行われていることもあり、さらに判定が困難になることもある。そこで他覚所見に基づく判定であるv3.0も用いているが、v3.0でも診査者によって評価にばらつきが出ていることが分かった。
500kV電子ビームによる金属溶射微細皮膜の改質に関する研究

アーク,レーザが表面熱源であるのに対して,電子ビームはビーム加速電圧に応じた浸透深さを有する所謂,浸透熱源と考え,鉄の場合で最大0.2mmの浸透深さとなる500kV電子ビームによる溶射用80%Ni-20%Cr合金粉末を用いた溶融表面改質の実施結果を以下に示す。1.10mm厚さのSUS304ステンレス鋼,SS400鋼及び、SK4工具鋼に厚さ0.10.2mmのNi-Cr合金粉末のガスフレーム溶射を行い,500kV電子ビーム照射による溶融ビ-ドを形成した場合,溶融膜厚が0.100.15mmの範囲で溶射のみに比べて気孔,未溶融などの欠陥が皆無で、粉末成分の均質固溶の新しい合金層が得られている。合金粉末を0.20.4mmの溝を刻んだSK4鋼母材上に置いた試料に対し,ビーム成形スリットを用いて均一密度分布の電子ビームを造出し,照射を行い,スパッタリングの極めて少ない溶込み深さの均一な溶融ビ-ドが形成されている。ビーム捜査速度1mm/s,ビーム出力600Wの場合,最大0.5mm厚さの合金皮膜が得られ,その成分分析でNiは3544%、Crは810%、Feは4455%と粉末成分が多量に固溶している。耐食試験ではSUS310sステンレス鋼とほぼ同等の結果となっており,さらに大気中及び減圧中で施工された各種溶射の結果と比べ,電子ビーム照射は高真空中のため真空精錬の効果が十分発揮され,特に酸化,窒化の影響を受けない皮膜組織が観察されている。以上,浸透熱源作用を有する超高電圧電子ビームを溶融表面改質適用すれば,良好な結果が得られる可能性を明らかにした.これらの成果は平成8年度秋期高温学会等で講演発表の予定である。
誘電泳動を応用した筋組織および神経筋接合部の組織再生医工学

ネガティブ誘電泳動を利用して様々な細胞のラインパターニングを行った.マウス繊維芽細胞(3T3swiss albino),マウス筋芽細胞(C2C12),ヒト白血病Tリンパ腫細胞(Jurkat),ヒト単球性白血病細胞(THP-1)および神経モデル細胞であるラット褐色細胞腫(PC-12)のパターニングが可能であった.この中で, 3T3およびC2C12細胞について詳細に誘電泳動特性を評価した.印加する交流電圧を変化させ交差周波数の溶媒導電率依存性を調査した.溶媒の導電率を増加させると交差周波数が増加することがわかった.これらの細胞の培地の導電率(2 S/m)の場合には計測に要する全ての周波数領域にてネガティブ誘電泳動が作用することがわかった.溶媒導電率の増加に伴い,パターニングに要する時間も増加した.しかし,パターニングに要する時間は最大で1-2分程度で,十分迅速性を保てた.また,印加電圧に対するパターン形成率および細胞の生存率を調べた.印加電圧の増加に伴い,パターン形成率も増加した.しかし,生存率は,12 Vp-pが最大でそれ以上の電圧を印加すると強い電場ストレスにより細胞が増殖できず死滅することがわかった.最適電圧(12 vp-p)を3-5分間程度印加し続けると細胞は,基板上に付着して配列パターンを保持したまま固定化された.この配列化微粒子上で細胞を培養すると細胞は配列化微粒子上に選択的に付着し成長した.また,直接固体基板上に配列化された細胞のほとんどが,増殖,伸展し,約1日後にはランダムな状態の戻った.このことから,誘電泳動による電場の印加が細胞のバイアビリティーにほとんど影響を及ぼさないことがわかった.4極独立型マイクロバンドアレイ電極を用いると,迅速で簡便な異種細胞の交互ラインパターンの構築が可能であった.ポジティブ誘電泳動を利用し,微粒子や細胞の海島状構造を作製することができた.透明電極(ITO)基板を用いて交互くし型マイクロバンドアレイ電極を作製し,細胞培養基板と組み合わせることにより細胞配列用デバイスを作製した.デバイスに種々の濃度の微粒子および細胞を導入し,くし型電極に逆位相の交流電圧を印加することにより,細胞の誘電泳動特性の評価について詳細に検討した.電極の溶液への露出面積を規定することにより高導電率(数S/m)の培地中において誘電泳動を作用させることが可能になった.細胞には数十kHzからMHz領域の周波数においてネガティブ誘電泳動が作用し,溶媒導電率の増加に伴って高周波数側にシフトした.ネガティブ誘電泳動を利用すると細胞は電場強度の弱い方向に移動するため,電場強度の強い電極表面へ接触することなく配列させることが可能であった.細胞配列における印加電圧、印加周波数、印加時間などの条件の最適化を行った.その結果,12Vpp,1MHz,5minでネガティブ誘電泳動による細胞の大量一括で迅速なライン配列を達成した.電極に交流電圧を印加して1分程度での細胞ラインの形成が可能であった.また,3-5分間電圧印加状態を保持すると細胞は基板表面に付着した.さらに,デバイスを電極基板と細胞配列基板に分離し,配列化細胞を培養することができた.配列した細胞は増殖するため,誘電泳動によるダメージは極めて少ないと予測された.細胞配列に要する印加電圧,周波数および印加時間と細胞のバイアビリティーの関連について詳細に評価できた.電極のデザインを工夫することにより,細胞のドット上配列,グリッド配列を達成した.さらに,これらの細胞の3次元包埋培養を目指して,光硬化性ゲル中への捕捉を行った.ネガティブ誘電泳動を利用して様々な細胞のラインパターニングを行った.マウス繊維芽細胞(3T3swiss albino),マウス筋芽細胞(C2C12),ヒト白血病Tリンパ腫細胞(Jurkat),ヒト単球性白血病細胞(THP-1)および神経モデル細胞であるラット褐色細胞腫(PC-12)のパターニングが可能であった.この中で, 3T3およびC2C12細胞について詳細に誘電泳動特性を評価した.印加する交流電圧を変化させ交差周波数の溶媒導電率依存性を調査した.溶媒の導電率を増加させると交差周波数が増加することがわかった.これらの細胞の培地の導電率(2 S/m)の場合には計測に要する全ての周波数領域にてネガティブ誘電泳動が作用することがわかった.溶媒導電率の増加に伴い,パターニングに要する時間も増加した.しかし,パターニングに要する時間は最大で1-2分程度で,十分迅速性を保てた.また,印加電圧に対するパターン形成率および細胞の生存率を調べた.印加電圧の増加に伴い,パターン形成率も増加した.しかし,生存率は,12 Vp-pが最大でそれ以上の電圧を印加すると強い電場ストレスにより細胞が増殖できず死滅することがわかった.最適電圧(12 vp-p)を3-5分間程度印加し続けると細胞は,基板上に付着して配列パターンを保持したまま固定化された.この配列化微粒子上で細胞を培養すると細胞は配列化微粒子上に選択的に付着し成長した.また,直接固体基板上に配列化された細胞のほとんどが,増殖,伸展し,約1日後にはランダムな状態の戻った.このことから,誘電泳動による電場の印加が細胞のバイアビリティーにほとんど影響を及ぼさないことがわかった.

4極独立型マイクロバンドアレイ電極を用いると,迅速で簡便な異種細胞の交互ラインパターンの構築が可能であった.ポジティブ誘電泳動を利用し,微粒子や細胞の海島状構造を作製することができた.