hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
男性不妊症疾患関連遺伝子の同定とそのメカニズムの解析

我が国や欧米諸国では、10組に1組が不妊症に悩まされており、その半数が男性不妊症によるものであるが、その大部分が原因不明である。更に、高齢少子化に向かう我が国では、不妊の問題はその根本的解決策にとっても大きな障害の一つとなる。我々は、1)80種以上の精子細胞特異的遺伝子をクローニングし、これら遺伝子の機能解析を進めている。今回我々のクローニングした80種の遺伝子を、ヒトゲノムDNAシークエンスデータベースで解析した。この遺伝子群及び、すでに公表された精細胞特異的遺伝子の中で、イントロンを含まない、もしくは染色体上の小さな領域に局在する遺伝子15種についてヒトゲノムDNAからPCR法を用いて直接、DNA一次構造を決定できるプライマーを設定した。(2)インフォームドコンセントを得て収集した男性不症患者の血液300例、妊よう性の確認されたボランティアの男性300例の血液からゲノムDNAを抽出した。(ここでもちいる血液DNAの情報が外部に漏れ出すことはないように厳重に保管し、またデータから個人の特定はできない。)(3)血液DNAサンプルからのダイレクトシークエンス法によって、15種類の精子細胞特異的遺伝子についてSNPs解析を行い、精子の核の凝縮に重要であるProtamine1,2、Transition protein 1,2および精子細胞の代謝に重要であると考えられるSCOT-t遺伝子と男性不妊症の関係について解析を行い、日本人男性における、SNPs、DNA変異と、男性不妊症関連遺伝子を見つけだした。精子細胞の形態形成期は、精子形成過程の約1/3の長期間を要する重要且つ特異的な過程であり、この時期にのみ発現している遺伝子群の網羅的クローニングにも成功し、これら遺伝子の多くがイントロンを持たないか、非常に小さいサイズで染色体DNA上に存在することを突き止めた。(1)これら特異的発現をする遺伝子ゲノムのSNPsや変異を、男性不妊症患者の血液と妊よう性の確認された男性の血液から直接、PCRダイレクトシークエンス法をもちいてORF上のDNAシークエンスを調べ、男性不妊症関連遺伝子を同定した。(2)精細胞特異的遺伝子の遺伝子破壊マウスを作成し、その解析から生殖細胞分化のメカニズムを紐解き、得られた実験動物を男性不妊症モデルマウスとして用い、男性不妊症の迅速診断・治療や環境ホルモンの作用メカニズムについて解析する。従来半数体精子細胞に分化した後、新たに起こる転写は精子の等価性を保つ上でも、非常に少ないと考えられていた。しかし、我々はマウスを実験動物とし、精細胞特異的モノクローナル、ポリクローナル抗体を作成、それらを用いた精細胞特異的遺伝子のクローニング法や、新たに開発したサブトラクションクローニング法によって、80種以上の精子細胞特異的遺伝子を単離することに成功した。一方、技術の進歩によって、ICSIによる不妊治療法が確立されたが、これによって生まれた人に不妊症が遺伝することが最近明らかとなってきた。これらの事実は、男性不妊症は遺伝子変化によって引き起こされ、精細胞特異的遺伝子は、その発現の特異性から精細胞分化においてのみその役割を果たしており、それらの欠失・変異が男性不妊症の原因になっていることが示唆される。最近我々は、精子細胞特異的遺伝子群が全染色体DNA上に、イントロンを持たないか、非常に小さなゲノムとして散在することを突き止めた。これらの特色をいかし、血液から抽出したゲノムDNAをもちい、直接これら遺伝子のDNAシークエンスを調べ、その変化を同定することができる。上記の方法で男性不妊患者と妊よう性の確認された男性でのこれら特異的発現遺伝子の変化を調べた。また、得られた精細胞特異的に発現する80種以上の遺伝子のうち10遺伝子について機能を欠失させたマウスを作成し、男性不妊のメカニズムを個体レベルで解明し、男性不妊症疾患モデル動物として確立した。
耳介軟骨細胞を利用した再生軟骨による顎関節再建に向けた戦略的研究

ラットの耳介軟骨細胞およびATDC5細胞には脂質性二次メッセンジャー代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)アイソザイムのうちDGK..が高い発現を認めた。.ATDC5細胞の分化過程におけるDGK..のmRNAおよび.タンパク発現は分化の進行に従って減少した。また、ラット耳介軟骨細胞の脱分化過程におけるDGK.の発現は増加することが明らかとなった。近年、顎骨再生医療(再建治療)は長足の進歩を遂げ、以前は困難とされていた下顎において大きな骨欠損でも本来の形態に近似した骨を再建することが可能となっている。しかし、関節軟骨を再生する手法が確立されていないため、今日においてもなお、顎関節を含む下顎頭欠損例の再建治療は極めて困難である。顎関節の再建では、線維軟骨を再生することにより、本来の下顎窩、関節頭を形成しなければならない。本研究では、軟骨としての性質を保ちながら効率よく細胞を増殖しうる細胞培養法と、脱分化により部分的に失われた軟骨形質を回復する再分化誘導法を開発し、近い将来における顎関節領域での臨床応用を目指した再生軟骨の作製と軟骨生物学に関する基礎研究を主たる目的とする。本年度は軟骨細胞の増殖および分化を制御する細胞内情報伝達機構に着目し、脂質性二次メッセンジャー・ジアシルグリセロール(DG)の代謝酵素DGキナーゼ(DGK)の発現を検討した。軟骨細胞としての性質を内在するATDC5細胞は、培養系において増殖および軟骨細胞への分化誘導が可能な細胞系であり、軟骨の研究によく用いられる。これまでの研究により、DGKは複数のアイソザイムから構成され、各々が特有の細胞現象に関与することが明らかにされていることから、まず、ATDC5細胞におけるDGKアイソザイムの発現様式を解析した。DME/F12培地を用いて培養したATDC5細胞から全RNAを抽出し、DGKアイソザイムの発現をRT-PCR法により検討したところ、8種類のDGKアイソザイムの内、DGKδ,DGKε,DGKζ,DGKθの4種類の発現が認められた。今後、軟骨細胞への分化誘導におけるDGKアイソザイムの発現変化および各アイソザイムのsiRNAを用いたノックダウンによる増殖・分化への影響等を精査する予定である。近年顎骨再生医療(再建治療)は長足の進歩を遂げ、以前は困難とされていた下顎においてかなり大きな骨欠損でも本来の形態に近似した骨を再建することが可能となっている。しかし、関節軟骨を再生する手法が確立されていないため、顎関節を含む下顎頭欠損例の再建治療は極めて困難である。そこで本研究では、耳介軟骨を用いて軟骨としての性質を保ちながら効率良く細胞を増殖しうる細胞培養法と、脱分化により部分的に失われた軟骨形質を回復する再分化誘導法を開発し、近い将来における顎関節領域での臨床応用を目指した再生軟骨の作成と軟骨生物学に関する基礎的研究を推進することを目的とする。本年度は、軟骨細胞の増殖および分化を制御すると考えられる細胞内情報伝達機構に着目して、脂質性二次メッセンジャー代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)アイソザイムの、軟骨分化過程におけるmRNA発現解析を行った。軟骨芽細胞のモデル細胞株と考えられるATDC5細胞をインスリン添加培地で28目間培養し、DGKアイソザイムの発現をRT-PCRで検討した。インスリン添加培地におけるATDC5細胞では、培養7日目頃からアルシアンブルー染色によって軟骨基質が検出されるようになった。また、分化の進行に従って軟骨分化マーカーtype II collagen, aggrecanの増加が認められた。このとき、ATDC5細胞において最も強い発現が認められるDGKζのmRNA発現は、経時的に減少することが明らかとなった。今後、軟骨細胞への分化誘導におけるDGKζタンパクの発現変化および、DGKζのsiRNAを用いたノックダウンによる増殖・分化への影響を精査する予定である。本年度は、脂質性二次メッセンジャー代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)アイソザイムのうち、軟骨芽細胞のモデル細胞株と考えられるATDC5細胞に最も高い発現が認められるDGKζについて検討を行った。ATDC5細胞をインスリン添加培地で28日間培養し、DGKζをRT-PCRで検討した結果、DGKζのmRNA発現は経時的に減少することが明らかとなった。

さらにWestern Blotで検討した結果DGKζタンパクは分化刺激後7日目に最も高い発現を認め、その後減少することが明らかとなった。また、軟骨細胞への分化誘導におけるDGKζタンパクの機能を検討するために、ATDC5細胞にレトロウイルスベクターを用いたDGKζ安定発現細胞株を作製した。今後、DGKζ過剰発現およびDGKζのsiRNAを用いたノックダウンによる増殖・分化への影響を精査する予定である。当初の計画より若干の修正はあったが、その後順調に進展し、その成果を二度に渡って国内学会にて報告した。今後さらに本研究を発展させ、最終的には国際学術誌に投稿・発表する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究のために必要な設備、備品はほぼ確立されており、これまで山形大学と東京大学の各研究者間で密な情報交換体制が保たれている。また、当初の研究計画には記載されていないが、研究の進展度合いにより、ノックアウトマウスを使用した実験も視野に入れて準備を整えながら本研究を進めて行く予定である。
ダイヤモンド・グラファイトのハイドロサーマル条件下の生成

平成5年度は、以下のような実施計画をたてて研究を行った。1)熱力学計算、設定状態図の詳細な考察および意見交換と討議を行う2)上記討議結果を基礎とした予備的なハイドロサーマル反応の実施と結果の考察a)マイクロ波を負荷したハイドロサーマル反応の検討b)超音波を負荷したハイドロサーマル反応の検討c)アーク放電を用いた溶液中反応の検討d)HIPを用いたハイドロサーマル反応の検討、有機物質の共存効果の検討、および無機物質の共存効果の検討3)ハイドロサーマル反応生成物の分析法の検討4)その他:文献調査等であった。上記の実施計画のうち、1)、2)-(a),(b),(c)をアメリカ合衆国のグループが、また2)-(d)、3)を日本側(西東京科学大学グループ)で担当し、4)については、日米双方で実施した。マイクロ波または超音波を用いて水熱反応を促進させた実験報告およびアーク放電を用いた溶液中の反応については、アメリカ合衆国のグループによってJournal of Materials Research 8巻p.31763183(1993年)に報告された。西東京科学大学グループは、ハイドロサーマル反応の炭素源に各種の炭素原料を用いた。つまり、a)固相炭化型としてフェノール樹脂系のベルパール(東海カーボン製)を5001050°Cで熱処理した原料で、熱処理温度の違いにより樹脂中に含有される酸素および水素原子の量が異なる。b)液相炭化型としてコ-クスピッチ(東海カーボン製)、c)気相炭化型としてポリエチレン(三井石油化学製)の3種類を使用した。また触媒にはCaCO_3またはCaSO_4を用い、炭素原料に対して1050wt%範囲で添加した。先ず、炭素原料と触媒を所定の割合で混合した後、白金製の小管、2.8mmΦ×4.0mmL、に微量の水と共に封入・密閉した。この白金製小管をHIP装置内に設置し、10001400°C、1kbarの圧力で約16時間保持してハイドロサーマル反応を行わせた。反応後の生成物については赤外線分光分析法、x線回折法およびラマン分光分析法を用いて同定を行った。その結果固相炭化型のフェノール樹脂を炭素源とした場合、以下のことが明かとなった。1)炭素原料の熱処理温度の違いにより黒鉛の生成温度及び生成量に変化が見られた。つまり、炭素原料の熱処理温度500°Cのものでは水熱合成温度1250°C以上で黒鉛が生成するのに対し、1050°Cで熱処理した炭素原料では1100°Cの水熱合成温度でも黒鉛の生成が確認でき、その量も多かった。2)水熱合成温度を上昇させると黒鉛化が促進されることが明らかとなった。3)炭素原料に対する触媒添加量が10から50wt%へと増加するに従い黒鉛化が促進された。4)水熱合成処理時間は9時間まででは処理時間の増大に伴い黒鉛化度も増大した。5)本水熱合成条件においてはダイヤモンドの生成は確認できなかった。また、気相炭素型のポリエチレンを炭素源とした結果についてもほぼ上記の場合と同様の結果が得られた。そしてポリエチレンを炭素源とすると黒鉛化が比較的容易に起こることが明かとなった。しかし、この実験については再現性も含めて現在詳細に検討をしているところである。以上平成5年度は、以下のような実施計画をたてて研究を行った。

この白金製小管をHIP装置内に設置し、10001400°C、1kbarの圧力で約16時間保持してハイドロサーマル反応を行わせた。反応後の生成物については赤外線分光分析法、x線回折法およびラマン分光分析法を用いて同定を行った。その結果固相炭化型のフェノール樹脂を炭素源とした場合、以下のことが明かとなった。1)炭素原料の熱処理温度の違いにより黒鉛の生成温度及び生成量に変化が見られた。つまり、炭素原料の熱処理温度500°Cのものでは水熱合成温度1250°C以上で黒鉛が生成するのに対し、1050°Cで熱処理した炭素原料では1100°Cの水熱合成温度でも黒鉛の生成が確認でき、その量も多かった。2)水熱合成温度を上昇させると黒鉛化が促進されることが明らかとなった。3)炭素原料に対する触媒添加量が10から50wt%へと増加するに従い黒鉛化が促進された。4)水熱合成処理時間は9時間まででは処理時間の増大に伴い黒鉛化度も増大した。5)本水熱合成条件においてはダイヤモンドの生成は確認できなかった。また、気相炭素型のポリエチレンを炭素源とした結果についてもほぼ上記の場合と同様の結果が得られた。そしてポリエチレンを炭素源とすると黒鉛化が比較的容易に起こることが明かとなった。しかし、この実験については再現性も含めて現在詳細に検討をしているところである。以上西東京科学大学山田教授,木暮助教授,栗林助教授,浅賀助教授,高木助教授,宗宮(団長)らは,1992年4月,米国ペンシルバニア州立大学を訪問,ダイヤモンド合成関連の研究設備を見学,日米両国における関連研究の状況を討議報告した。すなわち日本側は,ダイヤモンドの原料としての炭素源(山田),日本における無機物質を触媒としたダイヤモンドの核成長および合成(宗宮)について,また米国側は,R.Roy,Devries,D.M.Roy,Badzian,Komaneniらの教授からそれぞれ米国におけるダイヤモンド研究の現状について報告があった。これらをふまえ,今後の研究方針および役割分担を討議決定した。この結果,西東京科学大学側は高温高圧装置(HIP)を用い炭素源としては,(1)固相炭化型,(2)液相炭化型,(3)気相炭化型等のそれぞれの原料を検討するとともに,触媒共存効果についても検討を行う。一方米国側は,マイクロ波,超音波あるいはアーク放電などを利用したハイドロサーマル反応を検討することとなった。11月にはD.M.Roy教授,12月にはA.Badzian教授が来日し,本学において,日米双方におけるのハイドロサーマル・カーボンおよびダイヤモンド研究の進捗状況,および今後について討議した。また両教授は関連分野に関する講演も行った。1993年3月にはR.Roy教授およびR.C.Devries教授が来日し,日米双方の研究結果について討議し,そして来年度以降の研究方針を確認し合った。また,両教授訪学に際し“ダイヤモンドの科学"と題した科学講演会を3月9日に本学にて開催した。講演内容は,(1)ダイヤモンド合成の歴史(宗宮),(2)HIP装置による実験(木暮),(3)炭素原料(山田),(4)鉱物合成(Roy),(5)ダイヤモンド合成(Devries)であり,活発な質疑応答があった。この講演会には40名もの出席者があり盛況のうちに終了した。
Btkを標的としたSLEの新規治療開発および同分子による分子生物学的評価法の確立

研究目的のため、健常人末梢血より採取したB細胞を用い、in vitroにて解析を行った。(1)末梢血B細胞のAICDAの発現は、BCR架橋刺激およびsCD40L/sBAFF刺激、または、IL-21の各単独刺激では、わずかに誘導されるのみであった。(2)しかし、BCR、sCD40L/sBAFF、sIL-21の3者の刺激の共存により、強力に誘導された。(3)BCL-6、XBP-1の発現、IgG抗体産生もBCR、sCD40L/sBAFF、sIL-21の3者の刺激共存により、強力に誘導された。(4)誘導されたAICDA、BCL-6、XBP-1、IgG抗体産生は、Btk特異的阻害剤により、濃度依存性にIL-21単独刺激と同程度まで抑制された。(5)B細胞株BJABではsIL-21刺激後、細胞質、核内ともにSTAT1とSTAT3のリン酸化を認めるが、Btkをknock downすると、細胞質ではSTAT1、STAT3のリン酸化を認めたが、核内ではSTAT1のリン酸化が認められなかった。ヒトB細胞は、BCRを介する抗原シグナルとCD40などの共刺激シグナルの共存により活性化される。しかし、今回の結果より、BCR/CD40/BAFFのBtkリン酸化を介したシグナルは、IL-21の効率的なシグナル伝達を誘導し、B細胞に最大限の活性化が誘導された。即ち、B細胞の分化、活性化誘導には、BCR/CD40/BAFF-Btkを介するシグナル伝達経路、及び、それによるIL-21-JAKI/3-STAT1経路の増幅回路が介在することが明らかとなった。一方、BtK阻害薬などによりこれらのシグナル伝達経路を阻害し、B細胞活性化が完全に制御できた。以上より、Btkを標的とした低分子量化台物を用いたB細胞活性化の制御を介したSLEやRAへの治療応用が示唆された。
遺伝性血管性浮腫におけるブラジキニン分解酵素活性の解析により病態解明を目指す研究

遺伝性血管性浮腫は、遺伝子変異に伴うブラジキニンの過剰産生により、局所に発作性浮腫を生じる常染色体優性遺伝性疾患である。しかし、同一の遺伝子変異であっても異なる病態を呈するため、遺伝子変異以外の要因が浮腫の消褪や重症度に関与していることが予想される。浮腫の主体であるブラジキニンの血行動態に着目したが、これを直接的に測定することは困難なため、ブラジキニン分解酵素群活性を測定することにより、浮腫消褪や重症度を規定する病態を解析することを目的とする。
新規ドラッグデリバリーシステムを用いたKv7チャネル開口薬膀胱内注入の確立

本研究では、従来の薬物療法では改善できない過活動膀胱の症状(頻尿、尿意切迫感など)に対する新しい薬剤の膀胱内注入療法を確立するために、実験動物を用いた基礎研究を行う。使用する薬剤はKv7チャネル開口薬で、膀胱に尿をためやすくする作用があることは分かってきているが、その作用機序は十分には解明されていない。また膀胱内に注入した場合の効果も不明な点が多い。膀胱内に注入する薬剤の膀胱組織への吸収効率を改善するため、注入前に薬剤を特殊処理し実験を行う予定である。
ゲル中アニーリング法の開発によるタンパク質結晶のX線回折能の改善

本課題は,タンパク質結晶をアニーリングして結晶性すなわちX線回折能を改善するという新しい発想を実現することを目指した.本年度は2年計画の2年目として,研究実施計画に基づき以下の研究を実施した.1.ゲルの種類と濃度等,結晶化手法の確立アガロースゲルとシリカゲルに関しては,他の研究者による実施例の蓄積もあることから,本年度は,特に化学ゲルであるアクリルアミド系のゲルについて,各種モノマーと重合開始剤の組み合わせで結晶化用の環境としての使用可能性を検討した.その結果,アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの系に沈殿剤NaClを用いた場合,標準タンパク質とした卵白リゾチームでは2mm程度の大きさの結晶を容易に得ることに成功した.2.アニーリング手法と条件の確立昨年度報告したように,結晶の融解温度が予想外に高く,当初計画していた昇温,降温によるアニーリングでは,使用するゲルの耐熱温度範囲外となってしまうため,結晶周辺の湿度を調節することでアニーリングする方法の検討を実施した.しかし,試料結晶周辺を閉鎖環境にすることが出来ないため,95%程度以上の相対湿度を安定して作成することに成功しなかった.パラフィンオイルで皮膜を作成する方法も検討したが,現在のところ成功していない.そのため,ガラスキャピラリー中にゲルとタンパク質溶液をあらかじめ封入しておき,沈殿剤の濃度勾配を作ることで,結晶性を最適化する手法の検討を開始した.本課題は,タンパク質結晶をアニーリングして結晶性すなわちX線回折能を改善するという新しい発想を実現することを目指している.本年度は2年計画の1年目として,研究実施計画に基づき以下の研究を実施した.1.ゲル中タンパク質結晶化条件の確立アガロースゲル,シリカゲル,アクリルアミドゲルを用いて,卵白リゾチームとタウマチンの結晶化を行い,タンパク質結晶をゲル中で再現性良く成長させるための手法を検討した.シッテイングドロップ法よりも比較的容易にゲル中で結晶化し,より大きい結晶を成長させる手法として「ゲルサンドイッチ法」を考案し日本結晶学会年会で報告した.2.結晶アニーリング条件の確立本計画では,結晶の環境の温度を変化させることにより結晶のアニーリングを予定していたため,予備実験としてリゾチーム結晶を昇温しつつ偏光顕微鏡で観察した.これにより,リゾチーム結晶は150度以上に昇温しても複屈折性を失わないことが分った.当初はPCR装置を改造して安価に安定なアニーリング装置を製作しようと予定していたがPCR装置は100度以上に昇温出来ないため中止し,別途試作することとした.現在の試作装置は温度安定性に改良が必要である.なお,来年度は,結晶の環境温度だけではなく,湿度を変化させることによりアニーリングすることの可能性も同時に検討する予定である.本課題は,タンパク質結晶をアニーリングして結晶性すなわちX線回折能を改善するという新しい発想を実現することを目指した.本年度は2年計画の2年目として,研究実施計画に基づき以下の研究を実施した.1.ゲルの種類と濃度等,結晶化手法の確立アガロースゲルとシリカゲルに関しては,他の研究者による実施例の蓄積もあることから,本年度は,特に化学ゲルであるアクリルアミド系のゲルについて,各種モノマーと重合開始剤の組み合わせで結晶化用の環境としての使用可能性を検討した.その結果,アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの系に沈殿剤NaClを用いた場合,標準タンパク質とした卵白リゾチームでは2mm程度の大きさの結晶を容易に得ることに成功した.2.アニーリング手法と条件の確立昨年度報告したように,結晶の融解温度が予想外に高く,当初計画していた昇温,降温によるアニーリングでは,使用するゲルの耐熱温度範囲外となってしまうため,結晶周辺の湿度を調節することでアニーリングする方法の検討を実施した.しかし,試料結晶周辺を閉鎖環境にすることが出来ないため,95%程度以上の相対湿度を安定して作成することに成功しなかった.パラフィンオイルで皮膜を作成する方法も検討したが,現在のところ成功していない.そのため,ガラスキャピラリー中にゲルとタンパク質溶液をあらかじめ封入しておき,沈殿剤の濃度勾配を作ることで,結晶性を最適化する手法の検討を開始した.
肝癌発生過程におけるグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子の特異的発現調節機構

グルタチオントラスンフェラーゼP(GST-P)遺伝子の発現は,ラット肝化学発癌において顕著に上昇する。その機構を解明するため,5′上流領域を解析しエンハンサーとサイレンサーの機能について以下のことを明らかにした。1)エンハンサーGPE1にはプロトオンコジーンc-junが密接に関わっていることをすでに報告しているが,これとは異なる蛋白質もGPE1に働いていることを見いだした。2)GPE1は調べた全ての培養細胞で強い活性を示すが,この遺伝子は正常肝では発現していない。初代培養肝細胞を用いて検討した結果,GPE1をプロモーターの近くにつなぐと活性を示すが.nativeな位置では不活性であった。すなわち,正常肝においてはGPE1エンハンサーがあらわれない何らかの機構があると思われた。3)サイレンサー結合蛋白質SF-Bをクローニングしたが,興味あることにIL6誘導性の転写活性化因子NF-IL6と同一の遺伝子であった。一つの遺伝子より活性化因子と不活性化因子ができることは非常に興味深くこの現象が発癌過程におけるGST-P遺伝子の活性上昇にどのように関わっているかは今後の課題である。4)GST-P遺伝子の発現様式にはつぎの2つの可能性が考えられる。一つはある癌関連遺伝子のそばにGST-P遺伝子があり,この癌関連遺伝子の活性化に伴いGST-P遺伝子もいっしょに活性化される可能性,もう一つは,染色体上の位置には全く関係なく共通の転写因子によって活性化されるというものである。トランスジェニックラットを作製し化学発癌実験を行ったところGST-P遺伝子の5′制御領域は染色体の位置に無関係に癌化に伴い活性化されることが明らかになった。この結果は,GST-P遺伝子の発現に関与する転写因子が癌化の機構に深く関わっている可能性を強く示唆している。ラット肝化学発癌過程で生じる過形成結節及び肝癌において、胎盤型グルタチオンSートランスフェラ-ゼ(GSTーP)遺伝子の発現が著明に上昇する。この変化は肝臓において特異的であり、さらに正常肝では全く発現していないため、すぐれた腫瘍マ-カ-の一つであるとともに、発癌のメカニズムを解明するための最も良い材料の一つと考えられる。代表者らは、分子生物学的な面からアプロ-チするため、GSTーP遺伝子の解析を行ってきた。その結果、GSTーP遺伝子の5'上流領域には、遺伝子発現の活性に正に働くエンハンサ-と負に働くサイレンサ-が複数存在することが明らかとなった。本年度は、これに一連の解析をさらに押し進めエンハンサ-とサイレンサ-の機能を詳細に検討することを目的とした。その結果、以下のことを明らかにした。1。GPE1エンハンサ-について、プロトオンコジ-ンjun/fos(AP1)の関与を検討した結果、その関与が確認された。即ち、アンチセンスのjunまたはfosの発現ベクタ-を用いることにより、GPE1の活性は一部低下した。しかし、AP1活性を欠くといわれるF9細胞においては、低下しなかった。これらの結果はAP1以外の関与を示唆している。そこで、ゲルシフト法等を用いてF9細胞核抽出液中のGPE1結合タンパク質を検索したところ新たな核タンパク質の存在が明らかとなった。2。サイレンサ-については、SFーA(Silencer Factor A)のDNAアフィニティ-カラムによる部分精製を行いSFーAはサイレンサ-中の数カ所に結合することを見いだした。SFーBについてはそのクロ-ニングに成功した。興味深いことにSFーBは転写活性化因子として同定されたLAP/IL6ーDBPと同じかまたは類似のクロ-ンである可能性が示唆された。

一つまたは類似のタンパク質が正負両方の機能をもつとすれば非常に重要でありその解析は今後の課題である。グルタチオントランスフェラーゼP(GST-P)遺伝子の発現は、ラット肝化学発癌において顕著に上昇する。その機構を解明するため、5'上流領域を解析し強力なエンハンサーGPE1を-2.5Kbに、サイレンサーを-300bpにみいだした。本年度はこれら一連の解析をさらに推し進め以下のことを明らかにした。1。GPE1は調べた全ての培養細胞で強い活性を示すが、この遺伝子は正常肝では発現していない。初代培養肝細胞を用いて検討した結果、GPE1をプロモーターの近くにつなぐと活性を示すが、nativeな位置では不活性であった。すなわち、正常肝においてはGPE1エンハンサーがあらわれない何らかの機構があると思われた。2。GST-P遺伝子は腫瘍マーカーとしてしられているが、この発現様式を考えると大きくわけてつぎの2つの可能性が考えられる。一つはある癌関連遺伝子のそばにGST-P遺伝子があり、この癌関連遺伝子の活性化に伴いGST-P遺伝子もいっしょに活性化される可能性、もう一つは、染色体上の位置には全く関係なく共通の転写因子によって活性化されるというものである。これらの可能性を検討するためにトランスジェニックラットを作製し化学発癌実験を行った。その結果、GST-P遺伝子の5'制御領域は染色体の位置に無関係に癌化に伴い活性化されることが明らかになった。すなわち、GST-P遺伝子の発現に関与する転写因子は癌化の機構に深く関わっている可能性が強い。現時点では、それらの有力候補は、GPE1結合蛋白質およびサイレンサー結合蛋白質であり、これらをさらに詳細に検討することが必要である。
変分モンテカルロ法を用いた励起子凝縮状態の研究

本年度は昨年度に引き続き,変分モンテカルロ(VMC)法を用いた励起子絶縁体の安定性とメカニズムの解明を目指した理論研究を行った。VMC法の最適化の改良としてSR(Stochastic Reconfiguration)法の導入を行ったが,結果については未だ不完全であり,本年度の学会・論文発表に間に合わせることができなかった。しかし,励起子絶縁体の関連物質である有機化合物κ-(BEDT-TTF)塩について,一定の成果を挙げることができた。平成28年度は交付申請時の研究計画に基づき,変分モンテカルロ法を用いて励起子絶縁体の実現性を調べる解析を行った。本研究は,未だ実験的に実現の確証を得ていない励起子秩序の普遍性を明らかにするため,物質によらない格子模型として電子相関(電子間のクーロン相互作用)とサイト間の飛び移り積分のみを考慮した2軌道ハバード模型を採用し,軌道間の準位差と電子相関強度のパラメータ変化のもとで解析を行った。平成28年度前半(49月)は,変分モンテカルロ法を用いて2軌道ハバード模型で起こりうる電子状態の解析を行い,軌道間の準位差と電子相関強度の広いパラメータ領域で,スピン3重項の電子-ホールペアによる励起子絶縁体が普遍的に実現する結果を得ることができた。変分モンテカルロ法は電子相関強度によらず金属絶縁体転移を評価するため,金属からの励起子秩序を伴う絶縁化を評価することができた。この結果は,励起子秩序を伴う金属絶縁体転移が電子デバイスとしての応用化に繋がるか否かの議論を可能にすると考えられる。平成28年度後半(103月)は,前半で得た励起子秩序の補足計算と,κタイプのBEDT-TTF有機錯体における電子状態の理論研究を行った。BEDT-TTF有機錯体の電子状態を作る伝導面では,2つのBEDT-TTF分子がダイマーを形成しており,ダイマー内軌道に対して励起子秩序の変分モンテカルロ解析で用いた2軌道ハバード模型がほぼ同じ形で適用できる。特に,BEDT-TTF有機錯体に適用した試行波動関数の相関関数は長距離の相関効果を含んでおり,今後この計算で用いた試行波動関数を,励起子秩序解析の結果の補強に用いる予定である。この結果は平成28年度,論文として発表した。本年度(平成28年度)の当初の計画である,「変分モンテカルロ法を用いた励起子絶縁体の実現状況の解析」について,本申請で購入した高いCPU性能をもつワークステーションを使用することで遂行することができた。本研究により,励起子秩序を伴う絶縁体が一般的な電子状態を扱う格子模型(2軌道ハバード模型)で普遍的に現れることが明らかとなり,この結果は先行するスピン波近似を用いた有効模型の理論結果とも一致する。しかし,本研究の変分モンテカルロ法の変分原理で用いた試行波動関数について,最適化する変分パラメータの自由度は未だ制約が多く,十分な改良の余地がある。特に,変分モンテカルロ法で競合する理論グループは多いため,変分原理の最適化解については強固なものを追求する必要がある。現在は変分パラメータのいくつかの制約を補うべく,変分モンテカルロ法の最適化部分・試行波動関数の改良を進めており,論文として発表すべく計算を急いでいる。今後,変分モンテカルロ法による計算結果をまとめるための補足計算として,具体的には以下の課題が残っている。(1)電子相関(電子間のクーロン斥力)の効果を評価する試行波動関数の相関因子について,これまでの短距離相関から長距離相関に拡張する。(2)これまで考慮していなかった電子相関によるエネルギーバンドの変形効果を,変分パラメータの導入により評価する。(3)上記の計算を遂行するためにはこれまで以上の数の変分パラメータを最適化する必要があるため,最適化部分の改良を行う。以上の補足計算は速やかに遂行し,論文として発表する予定である。平成29年度も当初の研究計画に基づき,変分モンテカルロ法による励起子絶縁体の安定性と発現機構を調べる研究を継続して行った。励起子絶縁体の直接的な実験による証拠は未だほとんど報告されていないが,本研究はこの電子状態についての物質によらない基礎的なメカニズムを理論的に明らかにすることを目的に,2軌道ハバード模型と呼ばれる一般的な格子模型を用いた理論解析を行った。本年度はこの模型を解析するために使用する変分モンテカルロ法の改良と高速化に重点を置いたため,学会・論文発表に値する研究成果を上げることができなかったが,次年度の成果報告に向けて一定の進展を遂げることができた。平成29年度前半(49月)は,2軌道ハバード模型での励起子秩序状態の安定性に対する,長距離クーロン相互作用とバンド繰り込みによる効果を変分モンテカルロ法により調査した。ただし,現在の変分モンテカルロ法で使用する長距離クーロン相互作用とバンド繰り込み効果を含んだ試行波動関数は,クーロン相互作用であれば格子サイズ全体にわたる長距離パラメータを,バンドであれば関数そのものを再現すべく100を超える多数の変分パラメータを最適化する計算手法が必須となっている。平成29年度前半に行った計算ではこれらの変分パラメータを考慮していなかったため,平成29年度後半(10月3月)は変分モンテカルロ法の最適化アルゴリズムを改良し,準ニュートン法とSR(Stochastic Reconfiguration)法を導入することで,これら多数の変分パラメータを最適化することが可能なプログラムを作成した。

現在まで,本年度(平成29年度)と昨年度(平成28年度)に本研究課題で購入した高性能CPUをもつ2台のワークステーションを使用することで,励起子絶縁体の実現状況の解析について一定の成果を上げることができた。昨年度は本研究により,励起子秩序を伴う絶縁体が物質に依らない一般的な多軌道模型である2軌道ハバード模型において,普遍的に安定化することが明らかとなったが,この結果をより強固なものにするためには,現実の物質で起こりうる長距離クーロン相互作用とバンドの繰り込み効果を考慮する必要があった。これらを考慮するために,いまの変分モンテカルロ法で100を超える多数の変分パラメータを最適化することが必須であったため,本年度は準ニュートン法とSR法の双方の最適化アルゴリズムを採用することで,磁性,常伝導,超伝導のいずれの試行状態にも長距離クーロン相互作用とバンドの繰り込み効果を導入できるプログラムを作成した。ただし,励起子秩序がこれらの相関効果によってどのような影響を受けるかについては,まだ十分なデータを得られておらず,これらの計算を継続することが次年度の課題である。上記の進捗状況に基づき,次年度遂行する課題を以下に挙げる。(1)長距離クーロン相互作用が励起時秩序や磁性に与える効果の計算。(2)電子相関によるバンドの繰り込み効果(変形効果)が励起子秩序の安定性に与える影響の調査。(3)励起子秩序の安定性の結果を踏まえた励起子絶縁体の応用化の議論。以上の課題を速やかに遂行し,その成果を学会・論文として発表する予定である。本年度は昨年度に引き続き,変分モンテカルロ(VMC)法を用いた励起子絶縁体の安定性とメカニズムの解明を目指した理論研究を行った。VMC法の最適化の改良としてSR(Stochastic Reconfiguration)法の導入を行ったが,結果については未だ不完全であり,本年度の学会・論文発表に間に合わせることができなかった。しかし,励起子絶縁体の関連物質である有機化合物κ-(BEDT-TTF)塩について,一定の成果を挙げることができた。次年度前半(平成29年度49月)は,本年度(平成28年度)に行った励起子秩序の実現状況についての計算結果を,補足計算を含めて論文としてまとめる。次年度後半(平成29年度103月)は当初の研究計画に基づき,「励起子絶縁体の発行デバイスとしての可能性」の理論研究に移行する。平成28年度の研究により,一般的な2軌道ハバード模型において,電子とホールがペアを組む励起子秩序を伴う絶縁体状態が,電子相関のみの効果により普遍的に実現することが明らかとなった。このような,電子-ホールペアのボーズ・アインシュタイン凝縮による絶縁体ギャップは,従来のモット絶縁体やバンド絶縁体の電荷ギャップと比べるとはるかに小さいことが予想されるため,発光などによる感度の良いスイッチングが期待できる。しかし,平成28年度に行った変分モンテカルロ法による理論解析では,同一サイトの電子-ホールペアのみを試行波動関数の中で考慮しており,長距離間(離れた2サイト間)で生じるペア形成の可能性については議論していなかった。
代謝とポリコーム群によるがん制御

がん細胞は自己増殖に必要なエネルギーを確保するために解糖系を活性化させている。一方、ポリコーム群タンパク質による遺伝子抑制機能はがん化の原因要因の1つと考えられている。我々は、過去の研究結果から「がん細胞ではエネルギー代謝とポリコーム群機能は相互依存している」という仮説を立てた。本研究では本仮説の確度を得ることを目的とした。研究成果として、3種の代謝系キナーゼがポリコーム群機能に関わっていることが示唆された。これは我々の仮説を支持するものであった。今後、本研究を前進させることで生物学的のみならず医学的貢献を図りたいと思う。がん細胞が増殖するためのエネルギー源は主として解糖系から供給されている。事実、がん細胞の解糖系はそのオリジナル正常細胞と比べて200倍以上も活性化していると言われている。なぜエネルギー生産率の低い解糖系を選ぶかは長年の謎であるが、その理由がわかれば今後のがん治療の発展に大きく貢献することは疑いもない。一方、ポリコーム群と呼ばれるクロマチン作用タンパク質は、主要癌抑制遺伝子Cdkn2aの発現を抑える働きを持つことから癌化の原因因子の1つと考えられている。我々は、ポリコーム群機能に影響するキナーゼsiRNAライブラリの探索研究から、エネルギー代謝に関与する9種のリン酸化酵素を選別していた。そこで作業仮説として、エネルギー代謝系リン酸化酵素がポリコーム群機能を活性化し、効率的にCdkn2a遺伝子が抑えられ、癌増殖を促進すると考えた。本研究ではその仮説の確度を知ることを目的とし、その期間は1年間とした。(1)マウス胚繊維芽細胞に解糖系阻害剤(2-DG、Bromopyruvateなど4種)を添加し、ポリコーム群によって抑制されているCdkn2aの発現変化を調べた。数回のテストを行ったが、結果のばらつきが非常に大きく、阻害剤の効果を判断することができなかった。この不明瞭さは阻害剤の作用範囲の大きさによるものかもしれない。(2)候補9遺伝子の確度を高めるためにその遺伝子産物とポリコーム群とを免疫沈降解析した。その結果、3つの遺伝子産物が弱いながらもポリコーム群と結合することがわかった。一般的にキナーゼと基質タンパク質との相互作用は一時的であることから、この弱い結合能はむしろリーズナブルであると考えている。本年度の研究から9種のうちの3種の代謝系キナーゼがポリコーム群機能に直接的に作用する可能性が示唆された。この絞り込みは、今後の詳細な検証のために重要な前進であると考えている。
ピロリ菌と胃粘膜萎縮発生における遺伝子環境交互作用に関する研究

本研究において、日本人の胃粘膜萎縮発生におけるPTPN11イントロン3 G/A遺伝子多型の重要性を再確認し、TLR4の新多型、TLR4+3725G/C遺伝子多型と重度胃粘膜萎縮の関連を明らかにし、また、胃粘膜上皮の分化に関与する遺伝子、RUNX3の遺伝子多型が胃粘膜萎縮発生に関与することを世界に先駆けて明らかにした。本研究により、日本人の胃粘膜萎縮予防に有用な情報を提供できたと考えている。本研究では、胃がんの前がん病変である胃粘膜萎縮の発生リスクにおける種々の遺伝子多型とピロリ菌感染の有無、喫煙、飲酒などの生活要因との遺伝子・環境交互作用について解析を行い、日本人における個々人の体質に合った胃粘膜萎縮・胃がんの予防法を確立することを目的としているが、研究代表者らは本研究において、これまでにピロリ菌毒素であるcag Aに関連する遺伝子PTPN 11の遺伝子多型、PTPN 11 G/A at intron 3のAアレルを持つ群で有意に重症胃粘膜萎縮のリスクが低下する事を多数例において確証し(投稿中)、また、ピロリ菌毒素cag Aと結合し、がん遺伝子・がん抑制遺伝子の変異を起こす事が報告されたAICDA遺伝子の7888 C/T多型のTアレルを持つ群で有意に萎縮が起こりにくい事を見出した(投稿中)。また、ピロリ菌が結合する自然免疫に関わる受容体、TLR4の+3725 G/C多型のCアレルを持つ群で有意に重症萎縮のリスクが高いことを報告した(Hishida A, et al., Helicobacter 2009 ; 14 : 47-53)。また、この他にも胃がんの発症においてメチル化が認められ、マウスの胃がん発生との関連が報告されているRUNX3遺伝子の多型についても検証し、胃粘膜萎縮発生リスクとは関連が無い事を見出し、投稿中である。今後、各種の生活要因との関連も含め、ピロリ菌関連胃粘膜萎縮発生リスクに関する遺伝子多型について更に検討していく予定である。本研究では、胃がんの前がん病変である胃粘膜萎縮の発生リスクにおける種々の遺伝子多型とピロリ菌感染の有無、喫煙、飲酒などの生活要因との遺伝子・環境交互作用について解析を行い、日本人における個々人の体質に合った胃粘膜萎縮・胃がんの予防法を確立することを目的としているが、研究代表者らは本研究において、これまでにピロリ菌毒素であるcagAに関連する遺伝子PTPN11の遺伝子多型、PTPN11 G/A at intron 3のAアレルを持つ群で有意に重症胃粘膜萎縮のリスクが低下する事を多数例において確証し(Hishid a A, et al., BMC Gastroenterol 9 : 51, 2009)、また、ピロリ菌毒素cagAと結合し、がん遺伝子・がん抑制遺伝子の変異を起こす事が報告されたAICDA遺伝子の7888 C/T多型のTアレルを持つ群で有意に萎縮が起こりにくい事を見出した(Hishida A, et al., Gast ric Cancer 2010 (in press))。また、胃粘膜上皮の発生・分化に関与する遺伝子、RUNX 3の遺伝子多型(RUNX3 T/A polymorphism at intron 3)が胃粘膜萎縮の発生に関与することを世界に先駆けて明らかにした(Hishida A et al., J Gastroenterol 44 : 1165-71, 2009)。また、この他にも14遺伝子、18多型について遺伝子型決定を既に終了している。
尿中薬剤耐性菌の迅速遺伝子検査法の開発と検証

尿路感染症は、ヒトの細菌感染症として頻度が高いが、この主要な原因菌である大腸菌に対する治療薬であるフルオロキノロンと第3世代セファロスポリンへの耐性菌が急増している。しかし、これら耐性菌をその場で検査し判定する迅速診断法が存在しない。本研究では、臨床現場で簡便に実施可能かつ精度の高い、尿検体中のフルオロキノロン耐性大腸菌および第3世代セファロスポリン耐性菌の迅速遺伝子検査法を開発し、実際の臨床現場での性能を確認することを目的とする。
全芳香族剛直高分子の分子量分別と構造形成

Poly(p-phenylene benzobisthiazole)(PBZT)などの全芳香族剛直高分子は硫酸やメタンスルホン酸などの強酸にしか溶解せず,屈曲高分子のように有機溶媒を展開液として用いた分子量分別法は適用できない.本研究ではメタンスルホン酸を展開溶媒とし,多孔性シリカゲルを充填剤としたカラム分別装置を作製した.カラム分別では溶解した分子鎖がシリカゲルの細孔に出入りしながら流下していく.その際,細孔内に入ることのできる短い分子鎖とできない分子鎖とが徐々に分離されていく.この場合にはシリカゲルの細孔の大きさと分別しようとする分子鎖の大きさの関係が重要となる.そこで充填剤として用いるシリカゲルの種類,カラム温度,流下速度などが分離能に及す影響について検討した.また分子鎖長の揃ったPBZTを用いて希薄溶液からの結晶化を行い,分子量分布が結晶化におよぼす影響などについて検討した.得られた知見を以下に示す.・充填剤に用いるシリカゲルの種類と分別可能な分子鎖長の関係を明らかにした.この結果により,目的に応じて最適な充填剤(シリカゲル)の選択が可能となった.・分子鎖長が揃った試料を希薄溶液から結晶化させると,棒状晶の両側から突出した分子鎖部分が短くなり,基本的には単独の棒状晶となることがわかった.・剛直高分子では分別することにより,形態学的に分子量分布を評価することが可能である.・PBZTのMSA溶液は黄色を呈し,可視吸収スペクトルでは440nm付近に極大を示した.この吸収スペクトル強度の濃度依存性,分子量依存性を検討し,カラムから溶出してきた分別されたPBZTの濃度を測定する方法を確立し,未分別PBZTの分子量分布を明らかにした.・分子鎖長のそろったPBZTを用いて,分子鎖長の違いが結晶成長速度に与える影響を検討した.PBZTの結晶成長速度(G)はG∝exp(-C/ΔT)C:定数の関係が成り立ち,結晶成長が二次核形成過程律速型であることが明らかになった.またPBZTの結晶化においては結晶成長表面に分子鎖の配向をそろえる回転拡散が支配的であることも判明した.Poly(p-phenylene benzobisthiazole)(PBZT)などの全芳香族剛直高分子は硫酸やメタンスルホン酸などの強酸にしか溶解せず,屈曲高分子のように有機溶媒を展開液として用いた分子量分別法は適用できない.本研究ではメタンスルホン酸を展開溶媒とし,多孔性シリカゲルを充填剤としたカラム分別装置を作製した.カラム分別では溶解した分子鎖がシリカゲルの細孔に出入りしながら流下していく.その際,細孔内に入ることのできる短い分子鎖とできない分子鎖とが徐々に分離されていく.この場合にはシリカゲルの細孔の大きさと分別しようとする分子鎖の大きさの関係が重要となる.そこで充填剤として用いるシリカゲルの種類,カラム温度,流下速度などが分離能に及す影響について検討した.また分子鎖長の揃ったPBZTを用いて希薄溶液からの結晶化を行い,分子量分布が結晶化におよぼす影響などについて検討した.得られた知見を以下に示す.・充填剤に用いるシリカゲルの種類と分別可能な分子鎖長の関係を明らかにした.この結果により,目的に応じて最適な充填剤(シリカゲル)の選択が可能となった.・分子鎖長が揃った試料を希薄溶液から結晶化させると,棒状晶の両側から突出した分子鎖部分が短くなり,基本的には単独の棒状晶となることがわかった.・剛直高分子では分別することにより,形態学的に分子量分布を評価することが可能である.・PBZTのMSA溶液は黄色を呈し,可視吸収スペクトルでは440nm付近に極大を示した.この吸収スペクトル強度の濃度依存性,分子量依存性を検討し,カラムから溶出してきた分別されたPBZTの濃度を測定する方法を確立し,未分別PBZTの分子量分布を明らかにした.・分子鎖長のそろったPBZTを用いて,分子鎖長の違いが結晶成長速度に与える影響を検討した.PBZTの結晶成長速度(G)はG∝exp(-C/ΔT)C:定数の関係が成り立ち,結晶成長が二次核形成過程律速型であることが明らかになった.またPBZTの結晶化においては結晶成長表面に分子鎖の配向をそろえる回転拡散が支配的であることも判明した.Poly(p-phenylene benzobisthiazole)(PBZT)などの全芳香族剛直高分子は硫酸やメタンスルホン酸などの強酸にしか溶解せず,屈曲高分子のように有機溶媒を展開液として用いた分子量分別法は適用できない.本研究ではメタンスルホン酸を展開溶媒とし,多孔性シリカゲルを充填剤としたカラム分別装置を作製した.カラム分別では溶解した分子鎖がシリカゲルの細孔に出入りしながら流下していく.その際,細孔内に入ることのできる短い分子鎖とできない分子鎖とが徐々に分離されていく.この場合にはシリカゲルの細孔の大きさと分別しようとする分子鎖の大きさの関係が重要となる.そこで充填剤として用いるシリカゲルの種類,カラム温度,流下速度などが分離能に及す影響について検討した.続いて分別して得られた試料の分子量分布を測定し,その結果をもとに未分別PBZTの分子量分布について検討した.

また分子鎖長の揃ったPBZTを用いて希薄溶液からの結晶化を行い,分子量分布が結晶化におよぼす影響について検討した.得られた知見を以下に示す.・充填剤に用いるシリカゲルの種類と分別可能な分子鎖長の関係を明らかにした.この結果により分別にあたっての系統的な指針が得られ,目的に応じて最適な充填剤(シリカゲル)の選択が可能となった.・分子鎖長が揃った試料を希薄溶液から結晶化させると,棒状晶の両側から突出した分子鎖部分が短くなり,基本的には単独の棒状晶となることがわかった.・剛直高分子では分別することにより,形態学的に分子量分布を評価することが可能である.・得られた分別物の分子量分布は比較的せまくMw/Mnは1.04程度であった.分別物をキャラクタリゼーションした結果から未分別PBZTの分子量分布を考察したところ,長さが3倍以上も異なる分子鎖が混在していることが明らかとなった.・各分別物の分子鎖長分布曲線を合成することにより,未分別PBZTの分子量分布を明らかにした.Poly(p-phenylene benzobisthiazole)(PBZT)などの全芳香族剛直高分子は硫酸やメタンスルホン酸(MSA)などの強酸にしか溶解せず,屈曲高分子のように有機溶媒を展開液として用いた分子量分別法は適用できない.昨年度までの研究で,MSAを展開溶媒とし,多孔性シリカゲルを充填剤としたカラム分別装置を作製し,充填剤として用いるシリカゲルの種類,カラム温度,流下速度などが分離能におよぼす影響について検討した.この結果により,分別にあたっての系統的な指針が得られ,目的に応じて最適な充填剤(シリカゲル)の選択が可能となった.本年度は,分別して得られた試料の分子量分布を測定することを目的とし,可視吸収スペクトルを用いてカラムから溶出してきた分別されたPBZTの濃度を測定する方法を確立した.また,分別して分子鎖長の揃ったPBZTを用いて結晶化を行い,分子鎖長の違いが結晶成長速度におよぼす影響について検討した.得られた知見を以下に示す.・PBZTのMSA溶液は黄色を呈し,可視吸収スペクトルでは440nm付近に極大を示した.この吸収スペクトル強度の濃度依存性,分子量依存性を検討した結果,分子鎖長の違いにかかわらず,濃度0.8×10^<-3>g/l(溶液濃度cと光路長dの積cd=0.8×10^<-4>g・cm/l)までの領域ではPBZT濃度と吸光度の間に直線関係が成り立つことがわかった.この結果を利用してカラムから溶出してきた分別されたPBZTの濃度を測定する方法を確立し,未分別PBZTの分子量分布を明らかにした.・分子鎖長のそろったPBZTを用いて,分子鎖長の違いが結晶成長速度に与える影響を検討した.PBZTの結晶成長速度(G)はG∝exp(-C/ΔT)C:定数の関係が成り立ち,結晶成長が二次核形成過程律速型であることが明らかになった.またPBZTの結晶化においては結晶成長表面に分子鎖の配向をそろえる回転拡散が支配的であることも判明した.
植物の病害真性抵抗性遺伝子に支配された蛋白性物質とその機能の解析

ジャガイモ植物のジャガイモ疫病菌の感染に対する真性抵抗性の発現は,感染細胞のNADPH依存O^-_2生成反応の活性化に起因する.この活性化は,親和性レースの感染では見られず菌由来のβ-グルカンにより抑制される.この事象を基礎に真性抵抗性遺伝子に支配された機能蛋白質の分離とその性質を解析する一環として下記の解析をし結果をえた.1.それぞれ4種の真性抵抗性遺伝子(R_1, R_2, R_3, R_4)をもつジャガイモ塊茎を供試し,それぞれよりミクロソーム画分および水性二層分配法でえた原形質膜画分を調製し,無細胞系でのNADPH-O^-_2生成反応の活性化を検討した.ミクロソーム画分では,過敏感反応の誘導活性をもつ菌体壁成分およびジギトニンでその活性化に成功したが,原形質膜画分では不成功に終った.しかし,すでに活性化させた組織より分離した原形質膜画分ではその活性が検出された.このことより, NADPH-O^-_2生成系は原形質膜画分に存在することを示唆した.2.ミクロソーム画分でのO^-_2生成反応の活性化と原形質膜画分でのO^-_2生成反応は,レース・品種特異的関係をもって, β-グルカンにより阻害されたので, O^-_2生成系に真性抵抗性遺伝子に関連した機能物質の存在することが示唆された.3.原形質膜画分の蛋白質成分を可溶化し, HPLCおよびゲル電気泳動法で分離したが,分離様相から品種特異的な蛋白質の存在は確認できなかった.しかし, β-グルカンをあらかじめ混合した可溶化膜蛋白質の分離では,親和性菌由来のグルカン混合の場合に,電気泳動パターンが変化する23の蛋白質を確認した.4.供試したβ-グルカンの純度が問題となり,菌が感染した後に生産するβ-グルカンの分離を検討した.透析膜に感染させた内液より,比活性の強いグルカンが分離された.5.今後,精製したβ-グルカンを用いて,これと反応する原形質膜画分の蛋白性成分の分析をし,真性抵抗性遺伝子支配物質を確定してゆく.ジャガイモ植物のジャガイモ疫病菌の感染に対する真性抵抗性の発現は,感染細胞のNADPH依存O^-_2生成反応の活性化に起因する.この活性化は,親和性レースの感染では見られず菌由来のβ-グルカンにより抑制される.この事象を基礎に真性抵抗性遺伝子に支配された機能蛋白質の分離とその性質を解析する一環として下記の解析をし結果をえた.1.それぞれ4種の真性抵抗性遺伝子(R_1, R_2, R_3, R_4)をもつジャガイモ塊茎を供試し,それぞれよりミクロソーム画分および水性二層分配法でえた原形質膜画分を調製し,無細胞系でのNADPH-O^-_2生成反応の活性化を検討した.ミクロソーム画分では,過敏感反応の誘導活性をもつ菌体壁成分およびジギトニンでその活性化に成功したが,原形質膜画分では不成功に終った.しかし,すでに活性化させた組織より分離した原形質膜画分ではその活性が検出された.このことより, NADPH-O^-_2生成系は原形質膜画分に存在することを示唆した.2.ミクロソーム画分でのO^-_2生成反応の活性化と原形質膜画分でのO^-_2生成反応は,レース・品種特異的関係をもって, β-グルカンにより阻害されたので, O^-_2生成系に真性抵抗性遺伝子に関連した機能物質の存在することが示唆された.3.原形質膜画分の蛋白質成分を可溶化し, HPLCおよびゲル電気泳動法で分離したが,分離様相から品種特異的な蛋白質の存在は確認できなかった.しかし, β-グルカンをあらかじめ混合した可溶化膜蛋白質の分離では,親和性菌由来のグルカン混合の場合に,電気泳動パターンが変化する23の蛋白質を確認した.4.供試したβ-グルカンの純度が問題となり,菌が感染した後に生産するβ-グルカンの分離を検討した.透析膜に感染させた内液より,比活性の強いグルカンが分離された.5.今後,精製したβ-グルカンを用いて,これと反応する原形質膜画分の蛋白性成分の分析をし,真性抵抗性遺伝子支配物質を確定してゆく.