hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
岩石の超臨界水誘起割れを利用した超臨界貯留層の設計と亜臨界領域との融合

連続注水に伴う透水挙動の変化特性(4時間まで)に関する実験的研究を行い、注水流量に依存して浸透率が増大あるいは減少する場合のあることを明らかにし、これは溶解の流量依存性と石英の沈積現象により説明できることを示した。今後、今年度に取得した葛根田の深部地熱調査井WD1-aから採取された花こう岩を用いることによりさらに検討を継続する。平成15年度には以下の研究を行うことにより,超臨界水環境下における応力腐食割れの基礎特性に関する知見を得た.研究1.超臨界水誘起微視割れの透水特性に及ぼす影響:花こう岩を対象に,露頭岩石として飯館,筑波,滝谷産の3種類の花こう岩ならびに葛根田地熱フィールドの5つの異なる深度から採取された深部花こう岩を用い,円筒試験片による透水実験を実施した.3種類の露頭花こう岩ならびに5深度から採取された深部花こう岩については岩種によらず,水の臨界点を超えた温度条件で微視割れが誘起され透水率が上昇することを示し,超臨界水誘起微視割れが花こう岩一般に観察される現象であることを見出している.ただし,深部花こう岩においては,水の臨界点を超えた条件での透水率は露頭花こう岩に比較すると小さな値であった.この実験結果は,超臨界水誘起微視割れ現象は化学的な効果に応力効果が重畳して発生していることを示唆しているものと考えている.研究2.超臨界水環境下における応力腐食割れの破壊力学的解明:英国で開発されたHigh Temperature Bridge Cellを利用し,超臨界水環境下における応力腐食割れ実験を行うための装置の整備ならびに予備的実験を行った。高温高圧水環境下で一定の負荷を安定的に作用させられるように油圧制御部の改良を行い,ショートロッド破壊靭性試験片を用いた応力腐食割れ実験を実施した.これにより,本システムを用いることにより超臨界水環境下においてき裂進展データを取得できることを示した.系統なデータの取得を今後も継続し,破壊力学的パラメータに基づくき裂進展速度線図を作成する.本研究課題の検討を支援するために,円筒内圧試験片を用いた模擬水圧破砕実験を行い,超臨界水環境下では亜臨界水環境下では見られない注入井から複数個の巨視き裂が発生することを見出している.平成16年度には以下の研究を行うことにより,超臨界水環境下における応力腐食割れに関する知見を得るとともに,超臨界貯留層と亜臨界貯留層の融合効果を検討するための数値シミュレーションコードの基礎を構築した.1.露頭花こう岩(飯館花こう岩)を用いて3軸圧縮試験を行い,せん断破壊のき裂面近傍と遠方領域のき裂密度を測定することにより,平成15年度までの研究により見出していた超臨界水誘起微視割れに加えて,応力作用効果により微視割れが促進される現象のあることを新たに見出している.この,化学的ならびに力学的作用の重畳効果は,亜臨界水条件に比較して超臨界水条件で格段に大きいことを明らかにしている.上述の知見を,き裂密度に加えて破壊特性に及ぼす影響の観点から検討することを目的とした,ひずみ速度を変化させた3軸圧縮試験を実施した.用いたひずみ速度の範囲内では,亜臨界水条件では顕著なせん断破壊特性のひずみ速度依存性は小さいことに対して,超臨界水条件においてはひずみ速度が減少するに従いせん断破壊強度が小さくなることを示している.これは,超臨界水環境下において応力腐食割れが顕著になることを示しており,本研究ではじめて見出された現象である.2.水の超臨界状態を考慮し,さらに超臨界貯留層と亜臨界貯留層の融合効果を検討するために2相流状態における流動を考慮した循環による熱抽出シミュレーションコードを作成した.これにより,抽熱性能を向上させるための超臨界貯留層条件に関する基礎的な知見を提供している.
骨髄不全における微小PNH血球のフローサイトメトリーによる検出とその意義

【研究目的】本研究ではより精度の高い高感度フローサイトメトリー法を検討し、微少なGPI欠損細胞を正確に検出可能とすることを目的に,免疫抑制療法選択の指標となりうる臨床検査項目として臨床応用が可能かどうか検討を行なった.【研究方法】好中球および赤血球細胞を目的細胞とし,CD55(DAF)とCD59(GPIアンカー)を同じ標識(FITC)で同時に染色,またデブリス細胞を区別するために好中球ではCDllb,赤血球ではCD235aを染色,溶血剤にて溶血(目的細胞が赤血球の場合は溶血操作なし),PBSにて洗浄遠心し上清を除去後残りのサンプルをフローサイトメトリーにて測定した.【研究結果】1.健常者20例における赤血球と好中球の平均PNH血球比率はそれぞれ0.024±0.012,0.0092±0.005となり,PNH血球陽性を赤血球では0.04%以上好中球では0.02%以上とした.PNH血球検出には赤血球,好中球を同時測定をし,一方または両血球にPNH血球を認めた場合PNH血球陽性症例とした.2.再生不良性貧血(AA)患者では,17中9例にPNH陽性血球を認めた.AA患者でPNH陽性血球を認めた9例中6例に免疫抑制療法が施行され5例にヘモグロビン(Hb)または血小板数に改善を認めた.またPNH血球陰性の3例に免疫療法を施行されたがいずれの症例もHb,血小板数に改善はみられなかった.3.骨髄異形成症候群(MDS)患者では,20例中10例にPNH陽性血球を認めた、MDS患者で.PNH血球を認めた10例中8例に免疫抑制療法が施行され5例にヘモグロビン(Hb)または血小板数に改善を認めた.またMDS症例においてPNH血球陰性での免疫療法が行なわれた症例はなかった.4.今回の検討においてPNH血球陰性例での免疫抑制療法症例が少なく比較対象とはならないが,骨髄不全においてPNH陽性血球を認めた症例に対し免疫抑制療法が行われたAAで83%,MDSで62.5%にHbまたは血小板数の改善がみられたことより,PNH血球の検出は免疫抑制療法選択の指標として有用であると思われた.【研究目的】本研究ではより精度の高い高感度フローサイトメトリー法を検討し、微少なGPI欠損細胞を正確に検出可能とすることを目的に,免疫抑制療法選択の指標となりうる臨床検査項目として臨床応用が可能かどうか検討を行なった.【研究方法】好中球および赤血球細胞を目的細胞とし,CD55(DAF)とCD59(GPIアンカー)を同じ標識(FITC)で同時に染色,またデブリス細胞を区別するために好中球ではCDllb,赤血球ではCD235aを染色,溶血剤にて溶血(目的細胞が赤血球の場合は溶血操作なし),PBSにて洗浄遠心し上清を除去後残りのサンプルをフローサイトメトリーにて測定した.【研究結果】1.健常者20例における赤血球と好中球の平均PNH血球比率はそれぞれ0.024±0.012,0.0092±0.005となり,PNH血球陽性を赤血球では0.04%以上好中球では0.02%以上とした.PNH血球検出には赤血球,好中球を同時測定をし,一方または両血球にPNH血球を認めた場合PNH血球陽性症例とした.2.再生不良性貧血(AA)患者では,17中9例にPNH陽性血球を認めた.AA患者でPNH陽性血球を認めた9例中6例に免疫抑制療法が施行され5例にヘモグロビン(Hb)または血小板数に改善を認めた.またPNH血球陰性の3例に免疫療法を施行されたがいずれの症例もHb,血小板数に改善はみられなかった.3.骨髄異形成症候群(MDS)患者では,20例中10例にPNH陽性血球を認めた、MDS患者で.PNH血球を認めた10例中8例に免疫抑制療法が施行され5例にヘモグロビン(Hb)または血小板数に改善を認めた.またMDS症例においてPNH血球陰性での免疫療法が行なわれた症例はなかった.4.今回の検討においてPNH血球陰性例での免疫抑制療法症例が少なく比較対象とはならないが,骨髄不全においてPNH陽性血球を認めた症例に対し免疫抑制療法が行われたAAで83%,MDSで62.5%にHbまたは血小板数の改善がみられたことより,PNH血球の検出は免疫抑制療法選択の指標として有用であると思われた.
後縦靭帯骨化症の骨化機序に関する分子生物学的解析-TGF-β、BMPの役割-

手術時に頚椎OPLL患者の骨化組織を採取、またコントロールとして頚椎椎間板ヘルニア患者の後縦靭帯を採取し、病理組織学的および免疫組織学的観察を行った。その結果、OPLLの非骨化靭帯部には紡錘形細胞や卵円形細胞が、また骨化移行部には成熟・肥大軟骨細胞が存在し、内軟骨性骨化を介した骨化機序が考えられた。さらにこれらの細胞でBMPレセプター(BMPR)の発現を観察すると骨化移行部の軟骨細胞のみならず非骨化靭帯部の細胞でもBMPR-LA、-IB、-IIの発現が認められた。一方、これらの所見はコントロールの靭帯では認められなかった。これらの事実は、OPLL患者の靭帯細胞がBMPに対して高い反応性を有しており、造骨系細胞へと形質転換していることを示唆している。さらに、骨・軟骨形成におけるBMP_sの役割を詳細に検討するためにラット骨折治癒過程と関節軟骨においてBMP-2/-4、BMP-7/OP-1とこれらのレセプターであるBMPR-LA、-IB、-IIおよびアクチビンレセプタータイプI、II(ActR-I,II)の発現を免疫組織学的に観察した。その結果、膜性骨化および内軟骨性骨化の様々なステージにおいてBMP_sとそのレセプターの発現が認められ、様々なレセプターの組合せにより、BMP_sの多様なシグナルを受けていることが示唆された。またラット関節軟骨でも、BMP-2/-4、BMP-7/OP-1とそのレセプターの発現が観察された。この一連の研究によって、BMP_sとそのレセプターが生理的な骨・軟骨形成過程における様々な細胞現象において中枢的な役割を担っており、さらに病的異所性骨化であるOPLLにおいてもその骨化の発生および進行に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。またこれは、将来、異所性骨化の抑制における分子生物学的アプローチを行う上でも大変意議深い結果であると考える。手術時に頚椎OPLLの組織を周囲の非骨化靱帯部を含めて採取,またコントロールして頚椎椎間板ヘルニア患者の後縦靱帯を採取した。OPLL5例,コントロール2例のパラフィン標本作成し,H.E.染色,アルシアン・ブルー染色,エラスティカ・ヴァン・ギ-ソン染色を行い病理組織学的に検討した。OPLLの非骨化靱帯は,コラーゲン線維が粗でその配列は乱れており,アルシアン・ブルーで微慢性に薄く染まった事から細胞外基質の変性示唆された。そしてその中には,線維芽細胞様の紡錘形の細胞や軟骨芽細胞様の卵円形の細胞が多数存在しており,細胞の形質転換,即ち造骨形細胞への分化が起こっていると考えられた。骨化組織に隣接した骨化移行部には成熟,肥大あるいは変性した軟骨細胞が存在しており,主に内軟骨性骨化を介した異所性骨化機序が考えられる。これらの事実は我々がこれまで証明してきたOPLL患者由来の培養靱帯細胞での結果と合致している。さらにこれらの組織においてBMPレセプターの発現を免疫組織学的に検討した。その結果,BMPタイプIA,IB,IIレセプターは骨化移行部の軟骨細胞のみならず,その周囲に存在する繊維芽細胞や繊維芽細胞様の紡錘形細胞あるいは軟骨芽細胞様の卵円形の細胞において発現が認められた。一方,コントロールの靱帯細胞ではBMPレセプターの発現は認められなかった。

これらの事実は,OPLL患者の靱帯細胞が潜在的に高い骨誘導活性を有していることを示しており,遺伝子的背景を基盤に加齢変性などの環境因子の影響を受けながらこれらの細胞の形質転換が進行して行くものと推移される。そしてBMPは正常な骨形成のみならず病的異所性骨化においても重要な役割を果たしている事が示唆され,将来分子生物学的レベルで骨化を抑制すると言う観点からも多くの所見が得られたと考えている。骨・軟骨形成におけるBMPの役割を検討するために以下に示す2つの組織を準備した。1)骨折治癒における骨形成過程のモデル生後14週から16週の雄のウィスターラットの大腿骨に実験的に骨折を作成し、骨折後1、3、5、7、14、28日目の化骨を含む大腿骨を10%中性緩衝ホルマリンで灌流固定後、一塊として採取した。これらの組織をEDTAにて脱灰後、パラフィン切片を作成した。2)関節軟骨成長過程の経時的変化同様の手法にて、ウィスターラット生後2、4、6、12、24週の脛骨関節軟骨のパラフィン切片を作成した。上記の標本をH.E.染色し、組織学的観察を行った後に、BMP-2/-4、BMP-7/OP-1とこれらに対するレセプターであるBMPレセプタータイプIA、タイプIB、タイプIIおよびアクチビンレセプタータイプI、タイプIIの発現を免疫組織学的に観察した。骨折治癒過程においては、BMP-2/-4、BMP-7/OP-1は膜性骨化や内軟骨性骨化の様々なステージで発現していた。しかし、BMP-2/-4は初期に強く漸次その発現が低下していくが、BMP-7/OP-1は、膜性骨化の新生骨骨芽細胞や肥大軟骨細胞に特に発現しているという相違点が認められた。一方、レセプターの方は、骨膜の骨原性細胞や骨芽細胞、内軟骨性骨化部の線維芽細胞様の紡錘形細胞や軟骨細胞においてBMPレセプタータイプIA、タイプIB、タイプIIの発現が認められた。アクチビンレセプタータイプI、タイプIIの発現も同様の細胞に認めされたが、新生骨では弱く、ステージが進行し骨が成熟してくると増強する傾向にあった。これらの結果より、骨・軟骨形成の様々な分化段階に応じて、各々の細胞が異なったレセプターの組合わせにより、BMPの多様なシグナルを受けていると考えられる。また、関節軟骨でも、BMP-2/-4、BMP-7/OP-1とそのレセプターの発現が観察されたが、加齢とともに軟骨の発達が衰退してくるとこれに相関してその発現も低下していく傾向にあり、関節軟骨の発育とその代謝にBMPが重要な役割を果たしていることが示唆され、今後の更なる研究の基礎データとなるものと考えられた。
大規模GPSログによるグローバリゼーションに潜む孤立主義化の見える化

モビリティに関するビッグデータを用いて,(1)ビッグデータの整備と可視化,(2)手法開発「グローバルな社会ネットワークにおけるコミュニティ間の階層構造の抽出」,(3)手法適用1,(4)手法適用2,(5)政策立案の科学的支援について研究を進め,社会ネットワークの中での各コミュニティの孤立主義化の動向をとらえる.平成30年度は,(2)を除く次の研究項目を実施した.(1)では,実証の基となるビッグデータとネットワーク科学によるグローバル化の可視化に取り組んでいる.難民・移民政策の異なるヨーロッパの各都市について,スマートフォンの移動履歴を大規模に整備した.(3)では,モビリティネットワークによるコミュニティの孤立化や融合,空間・情報格差の見える化に取り組んでいる.位置情報を投稿したTwitterユーザーを使用言語別に分け.世界の主要都市における観光客を除く地元住民のTwitterユーザーの空間分布を,1週間毎に観測した.ISISの勢力拡大とともに,パリ及び,パリ近郊におけるアラビア言語を利用するTwitterユーザーが,他言語のユーザーに比べて,昼間の孤立化が進んでいることを可視化した.(4)では,労働市場におけるコミュニティの孤立化と就職格差の見える化に取り組んでいる.1億人を超える世界の会社役員等のデータを整備し,名前から民族を推定するRNNモデルを構築した.米国における産業別の民族の偏り,および,その年次変化を明らかにした.(5)では,格差を抑制して孤立主義化が弱まるネットワーク構造の提案に取り組んでいる.実務者と意見交換をおこない,位置情報に関する公的統計と大規模GPSログから得られる統計との比較をおこない,公的統計との違いを明らかにした.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。モビリティと労働市場に関するビッグデータを用いて,(1)ビッグデータの整備と可視化,(2)手法開発,(3)モビリティへの手法適用,(4)労働市場への手法適用,(5)政策立案の科学的支援について研究を進め,社会ネットワークの中での各コミュニティの孤立主義化の動向をとらえる.平成29年度は,(1)から(3),及び(5)について次の研究を実施した.(1)ビッグデータの整備と可視化では,テロ事件や難民問題を抱えるヨーロッパを中心にしつつ,全世界を対象にエリア間のモビリティに関するデータを整備した.主要なエリア間の移動に重みを付けたネットワークの粗視化手法を提案し,ノード(経済主体)とリンク(経済主体間の繋がり)によるグローバルな人々の移動の可視化をおこなった.(2)手法開発では,時空間ビッグデータにおける異常値検出と,異常値のクラスタリングによる時空間イベントの検出技術を構築した.人々の移動履歴を加味した2次のマルコフ過程でのコミュニティ抽出手法を構築した.しかし,本手法は少数データへの適用が困難であり,その結果,コミュニティの時間変化を高解像度で観測することができない.この問題は,(1)の粗視化により解決できることが見込まれている.(3)モビリティへの手法適用では,フランスのパリ郊外における多民族地域に着目し,(2)で構築した2次のマルコフ過程によるコミュニティ検出の手法を用いて,地域住民の日常生活におけるコミュニティ空間を抽出した.これにより,様々な場所で発生した社会イベントにおいて,出身コミュニティの偏りが発生していることを観測できるようにした.(5)政策立案の科学的支援では,モビリティに関するビッグデータを用いた政治的なデモ等の特徴分析を通じて,将来予測されるデモ等に関する分析技術の発展が生み出す倫理的な問題と,それを解決するための集団に対する情報保護の重要性を指摘した.当初の研究実施計画に比べて,労働市場に関する研究に遅れがある一方で,モビリティに関しては当初の計画以上に進んでおり,総合的に考えると(2)おおむね順調に進展していると考えられる.モビリティに関するビッグデータを用いて,(1)ビッグデータの整備と可視化,(2)手法開発「グローバルな社会ネットワークにおけるコミュニティ間の階層構造の抽出」,(3)手法適用1,(4)手法適用2,(5)政策立案の科学的支援について研究を進め,社会ネットワークの中での各コミュニティの孤立主義化の動向をとらえる.平成30年度は,(2)を除く次の研究項目を実施した.(1)では,実証の基となるビッグデータとネットワーク科学によるグローバル化の可視化に取り組んでいる.難民・移民政策の異なるヨーロッパの各都市について,スマートフォンの移動履歴を大規模に整備した.(3)では,モビリティネットワークによるコミュニティの孤立化や融合,空間・情報格差の見える化に取り組んでいる.位置情報を投稿したTwitterユーザーを使用言語別に分け.世界の主要都市における観光客を除く地元住民のTwitterユーザーの空間分布を,1週間毎に観測した.ISISの勢力拡大とともに,パリ及び,パリ近郊におけるアラビア言語を利用するTwitterユーザーが,他言語のユーザーに比べて,昼間の孤立化が進んでいることを可視化した.(4)では,労働市場におけるコミュニティの孤立化と就職格差の見える化に取り組んでいる.1億人を超える世界の会社役員等のデータを整備し,名前から民族を推定するRNNモデルを構築した.米国における産業別の民族の偏り,および,その年次変化を明らかにした.(5)では,格差を抑制して孤立主義化が弱まるネットワーク構造の提案に取り組んでいる.実務者と意見交換をおこない,位置情報に関する公的統計と大規模GPSログから得られる統計との比較をおこない,公的統計との違いを明らかにした.平成30年度も,社会ネットワークの中での各コミュニティの孤立主義化の動向をとらえるために,モビリティと労働市場に関するビッグデータを用いて,(1)ビッグデータの整備と可視化,

(2)手法開発,(3)モビリティへの手法適用,(4)労働市場への手法適用,(5)政策立案の科学的支援の順に研究を進めていく.具体的には,(1)ビッグデータの整備と可視化では,直近のデータの更新をおこないつつ,社会ネットワークの中でのコミュニティ間の協調と排他的行動を可視化する.(2)手法開発では,ネットワークを粗視化することにより,少数データでのコミュニティ検出が可能な技術を構築する.(3)モビリティへの手法適用では,(2)で開発した技術を用いて,生活コミュニティ間での住民の協調と排他的行動が変化する事件や政策変更等のイベントを検出する.(4)労働市場への手法適用では,(2)で開発した技術を用いて,労働市場におけるコミュニティを抽出し,コミュニティ間をまたぐ転職の困難さが事件や政策変更等により,どのように変化しているのかを示す.(5)政策立案の科学的支援では,生活コミュニティ間の協調の強化と転職格差の是正が進んだ政策について示す.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
組織特異的転写因子Ｍｉｔｆが破骨細胞分化ならびに機能において果たす役割とその機構

マウスならびにイヌ骨髄細胞、およびマウスRAW264.7細胞をRANKL処理すると破骨細胞に分化する。破骨細胞分化過程においてMitf isoformの発現を調べたところ、いずれの細胞においてもRANKL処理24時間以内にMitf-E発現は誘導された。Mitf-E siRNA処理した後、RANKL処理しても、破骨細胞の形成は有意に減少した。また、マウス細胞にRANKL処理の際にTGF-βを共処理すると、破骨細胞形成がさらに亢進した一方、イヌ細胞の場合、破骨細胞形成は抑制された。破骨細胞は骨吸収の責任細胞であり、この破骨細胞の数と機能の制御の破綻が骨代謝異常に繋がる。本研究では、破骨細胞を始めとした幾つかの組織(細胞)でしか発現していない転写因子であるMitfが破骨細胞の分化・機能で果たす役割とその機構を明らかにすることを第一の目的としている。研究初年度に、RAW264.7細胞及びマウス骨髄初代培養細胞を用いて、RANKL刺激による破骨細胞分化過程におけるMitf-Eの誘導と分化マーカー遺伝子の発現量や形態変化を示した。続いて、TGF-βには、Mitf-Eの遺伝子発現増を介してRANKL誘導性の破骨細胞形成を高める活性があり、さらに細胞接着・融合に関与する各種遺伝子の発現促進や骨吸収能の増強を示した。平成25年度は、このTGF-β刺激におけるMitf-Eの発現促進機序を細胞内シグナル伝達経路から解析した。Mitf-Eプロモーター領域を用いたレポーターアッセイ法による解析から、TGF-βは、通常のSmad経路というよりは非Smad経路であるJNKの活性化、続いて活性化されたc-JunによってMitf-Eの発現を正に制御している可能性を示した。本研究では、伴侶動物の長寿化に伴う病気にも注目し、イヌの破骨細胞形成におけるMitfの発現・機能を解明することを第二の目的としている。平成25年度は、イヌの大腿骨より採取した骨髄由来単球細胞を用いて、M-CSFとRANKLのそれぞれの濃度を検討し、破骨細胞を確実に形成する系を確立した。形成された細胞はTRAP陽性多核巨細胞で機能的にも骨吸収能を有し、mRNAレベルでも破骨細胞分化関連遺伝子(TRAP、CtsKなど)が有意に増加していることを確認した。また、Mitf-Eの遺伝子発現はマウスと同様に破骨細胞分化初期に大きく増加していた。研究初年度である平成24年度は、当初の課題であった「破骨細胞分化におけるMitfの機能」を、RAW264.7細胞を用いて、RANKL刺激による破骨細胞分化過程におけるMitf-Eアイソフォームの一過性の誘導を確認し、さらに、Mitf-E特異的なsiRNA導入によるMitf-E遺伝子発現抑制を通して、細胞分化が抑制されることを形態学的及び分子マーカー(Trap、Ctsk、Oscarなど)の定量的遺伝子発現量から確認した。Mitf-E遺伝子を安定的に導入したRAW264.7細胞も作製した。次に、マウス骨髄初代培養細胞及びRAW264.7細胞を用いて、RANKLとともにTGF-βを添加し、破骨細胞分化ならびにMitf-Eの発現誘導を調べた。その結果。TGF-βには、Mitf-Eの遺伝子発現増を介してRANKL誘導性の破骨細胞形成を高める活性があることを示した。さらに、TGF-β添加で形成したRANKL誘導性破骨細胞は、細胞接着や細胞融合に関与する各種遺伝子の発現が促進していることや骨吸収能が増強していることがわかった。H24、25年度に、RAW264.7細胞及びマウス骨髄初代培養細胞を用いて、RANKL刺激による破骨細胞分化過程におけるMitf-Eの誘導と分化マーカー遺伝子の発現量や形態変化を示した。続いて、TGF-βには、Mitf-Eの遺伝子発現増を介してRANKL誘導性の破骨細胞形成を高める活性があり、さらに細胞接着・融合に関与する各種遺伝子の発現を促進し、骨吸収能を増強することを示した。また、このTGF-β刺激におけるMitf-Eの発現促進機序を細胞内シグナル伝達経路から解析した。これらのデータの一部は、国際雑誌に論文発表した。

平成25年度に確立したイヌ骨髄由来初代培養細胞による破骨細胞分化系を用いて、Mitf-EとTGF-βの役割を、形態学的、分子生物学的に調べた。その結果、マウスと同様にイヌでも破骨細胞分化過程でMitf-Eが強く発現しており、破骨細胞分化におけるMitf-Eの重要性が示唆された。一方、破骨細胞形成において、マウスとは異なり、イヌでは形態的にも分化マーカー遺伝子レベルにおいてもTGF-βが濃度依存的に抑制的に働くことを見つけた。イヌでは、TGF-β刺激でMitf-E発現を抑制した。破骨細胞分化におけるMitf-Eの重要性と、分子メカニズムは不明であるもののTGF-βの動物種間での役割の違いを明らかとした。分子生物学平成25年度までに予定していた破骨細胞分化におけるMitfの機能や発現制御に関する分子生物学的解析は、ほぼ終了した。即ち、マウスのマクロファージ系株化細胞RAW264.7細胞および骨髄由来初代培養細胞を用いて、2本鎖RNA干渉法によるMitf遺伝子の発現ノックダウンやMitf-E遺伝子を強制発現した安定株を利用して解析し、破骨細胞分化におけるMitf-Eの重要性を示した。次に、RANKL誘導性破骨細胞分化系におけるTGF-β刺激では破骨細胞分化が促進することを形態及び遺伝子発現レベルで調べ、さらにMitf-Eの遺伝子発現の上昇を示した。これらのデータは、国際雑誌に発表できた。さらに、分化過程の分子機序解明に関してより深化させた研究として、TGF-β刺激におけるMitf-Eの発現促進機序を細胞内シグナル伝達経路から解析できた。また、平成26年度に予定していた、基礎的知見がほとんどないイヌの骨髄由来初代培養細胞による破骨細胞分化系を平成25年度に確立できた。平成24年度に予定していた破骨細胞分化におけるMitfの機能や発現制御に関する分子生物学的解析は、ほぼ終了し、さらに分化過程の分子機序解明に関してより深化させたデータも得られた。Mitfの条件的遺伝子発現を可能にするTet-on vectorを利用した安定株の作製までは至らなかったが、破骨細胞分化におけるMitf-EやTGF-βの役割に関するデータは十分に得られており、現在国際雑誌に投稿する準備を進めている。また、平成26年度に予定しているイヌ骨髄細胞からの破骨細胞分化法の確立に向けて、予備的検討を始めた。マウスでの手法をアレンジすることにより、ビーグル犬から採集した骨髄細胞を、形態学的に破骨細胞様細胞に分化させられることを確認した。平成25年度に確立できたイヌの骨髄由来初代培養細胞による破骨細胞分化系を用いて、イヌの破骨細胞分化系におけるMitf-EとTGF-βの重要性と役割を、形態学的、分子生物学的に解析する。イヌ用プライマーの設定や抗体の入手など遺伝子発現レベルでの分子機序を解析するための準備を整える。マウスでこれまでに得ているデータとの比較を行い、イヌでの破骨細胞分化の特徴付けを行う。イヌにおける破骨細胞分化系が当初の予定よりやや早く確立できたため、遺伝子レベル及びタンパク質レベルの両方からイヌの破骨細胞分化におけるMitfの遺伝子発現制御機構や細胞内情報伝達因子との相互作用、TGF-βの役割を明らかにするように、当初の目的をいくらか発展させる。
可塑的な葉緑体分化の分子機構

本研究で可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明に取り組んだ。地上部から切り離された根で、オーキシンとサイトカイニンにより緑化が誘導されるを見出した。そのメカニズムとして、地上部を喪失した根ではオーキシンによる抑制が減少し、さらに傷害部におけるサイトカイニンシグナルが活性化され、緑化が誘導されることを明らかにした。この葉緑体分化は光合成関連遺伝子群の協調的な転写活性化を伴っており、転写因子のHY5とGLKが、相互作用しながら光合成関連遺伝子の発現を活性化させることを明らかにした。さらに、GLKを過剰発現した根では葉緑体の分化が強く誘導され、野生株と比べ高い光合成活性を有することを明らかにした。本研究では可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明を目的としている。非光合成器官・組織の色素体は潜在的に光合成を行なう葉緑体に分化する能力を維持しているが、通常の生育条件での葉緑体分化は抑制されている。この可塑的な葉緑体分化の制御機構を解明できれば、葉緑体分化ならびに光合成光化学系構築の分子機構を明らかにできるだけでなく、シンク器官を非光合成器官をソース器官に変換することで、光合成生産効率を向上した作物の育種に繋がることが期待できる。本研究ではシロイヌナズナの根をモデルとして、可塑的な葉緑体分化のメカニズムの解明に取り組む。今年度は4つの研究課題(1.葉緑体分化抑制機構の解明、2.葉緑体分化に関わる転写因子の同定・遺伝子導入、3.葉緑体分化に伴う光合成能力の評価、4.非光合成組織における特異的発現プロモーター系の開発と生育環境の最適化)のうち、1, 2, 3について主に取り組んだ。1.については、葉緑体チラコイド膜形成に伴う葉緑体遺伝子の発現誘導機構について解析を行ない、その業績がPlant Journal誌に掲載された。2.については、緑化される根で誘導される転写因子をリスト化し、複数の転写因子を同時に植物細胞内で発現誘導することが可能なPRESSOsystemを用いた発現系を構築している段階である。また3.については、緑化誘導したシロイヌナズナの根における光合成能力を詳細に解析した論文がPlant Cell Physiology誌に掲載された。またセイヨウタンポポとシロイヌナズナの根において、地上部切除により誘導される葉緑体分化および光合成能力の評価について解析を行なった。この結果は先の1.の結果と合わせて論文を投稿準備中である。今年度は2.の研究課題を中心に進展させながら、残る4.の課題にも取り組んでいきたいと考えている。本研究では、可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明を目的とする。非光合成器官・組織の色素体は、潜在的に光合成を行なう葉緑体に分化する能力を維持しているが、通常条件で葉緑体への分化は抑制されている。この可塑的な葉緑体分化制御機構を解明出来れば、葉緑体分化および光合成光化学系装置構築の分子機構を明らか出来るだけでなく、将来的にシンク器官である非光合成器官をソース器官に変換し、光合成生産効率を向上した作物の分子育種にも繋がることが期待される。本研究では、シロイヌナズナの根をモデルとして、可塑的な葉緑体分化のメカニズムの解明に取り組む。今年度は4つの研究課題(1.葉緑体分化抑制機構の解明、2.葉緑体分化に関わる転写因子の同定・遺伝子導入、3.葉緑体分化に伴う光合成能力の評価および4.非光合成組織における特異的発現プロモーター系の開発と生育環境の最適化)のうち、1と3を中心に行なった。1については、葉緑体分化抑制に関わるシグナル伝達系について、地上部を切除した根における葉緑体分化誘導を指標に、そのシグナル伝達系の解析を行なった。その結果、傷害シグナルの転写因子であるWIND1の活性化により生成されたサイトカイニンが、Response regulatorであるARR1/12を介してGLKやGNC/CGA1の転写活性化を誘導していることが明らかとなった。また、3について、緑化した根における光合成装置の形成について詳細に解析を行なった。その結果、反応中心に対してアンテナ系が発達していること、光化学系IIの量子収率は低いものの、光合成によりその重量を維持できること等を明らかにすることが出来た。残る、2, 4の研究課題についても準備中である。本研究では、可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明を目的としている。平成26年度までに、葉緑体分化に関わる光合成遺伝子の共発現機構の存在を明らかにするとともに、葉緑体分化に伴う光合成能力の評価についての研究を行い、報告を行った。平成26年度は可塑的な葉緑体分化に関わる転写因子の同定を目的として、緑化した根において発現が亢進されている転写因子の発現解析を行った。マイクロアレイ解析により見出した転写因子の発現について、qRT-PCR法で詳細に解析するとともに、その誘導のシグナル伝達経路の解明を行った。本研究では、可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明を目的とした。シロイヌナズナの根は炭素源をソースである地上部に依存しており、通常緑化は抑制されている。

我々は、地上部から切り離された根では葉緑体分化が誘導され、光照射下で新たな光合成組織の構築が促進されることを見出した。この葉緑体分化誘導にはオーキシンとサイトカイニンが関与していることを明らかにした。通常、根では地上部から輸送されるオーキシンにより葉緑体分化が強く抑制されている。しかしこの抑制は、地上部を喪失した根で減少し、同時に傷害部におけるサイトカイニンシグナルの促進により、葉緑体分化が誘導されることを明らかにした。実際、根での葉緑体分化の誘導により、葉緑体チラコイド膜が発達すると伴に、光合成電子伝達反応が増大することを明らかにした。さらに、この光合成光化学系の構築には、核コードの光合成関連遺伝子の協調的な転写活性化を伴うことを明らかにした。実際、光シグナルの転写因子HY5と植物ホルモンシグナルの転写因子GLKが、これら遺伝子の協調的な転写活性化に関与していることを見出した。驚くべき事に、GLKの過剰発現により、根の維管束周辺細胞において顕著な葉緑体分化が誘導され、新鮮重辺りで葉の約10%に達するクロロフィルを蓄積できることを明らかにした。以上のように、我々の解析により、非光合成器官である根においても、葉緑体分化を誘導できることが明らかとなってきた本研究で可塑的な葉緑体分化の分子機構の解明に取り組んだ。地上部から切り離された根で、オーキシンとサイトカイニンにより緑化が誘導されるを見出した。そのメカニズムとして、地上部を喪失した根ではオーキシンによる抑制が減少し、さらに傷害部におけるサイトカイニンシグナルが活性化され、緑化が誘導されることを明らかにした。この葉緑体分化は光合成関連遺伝子群の協調的な転写活性化を伴っており、転写因子のHY5とGLKが、相互作用しながら光合成関連遺伝子の発現を活性化させることを明らかにした。さらに、GLKを過剰発現した根では葉緑体の分化が強く誘導され、野生株と比べ高い光合成活性を有することを明らかにした。研究目的に掲げた、葉緑体分化抑制機構の解明、葉緑体分化に関わる転写因子の同定、葉緑体分化に伴う光合成能力の評価については、既に一定の成果を得ており、目標を達成している。植物分子生理学今後、プロモーター解析や同定した転写因子の遺伝子導入により、残る研究目的の達成を目指す。研究は概ね順調に進展している。今年度、研究課題の1.がPlant Journal誌に掲載され、また研究課題の3.がPlant Cell Physiology誌に掲載された。また研究課題1.および3.についての論文を現在投稿準備中である。また研究課題2.についても順調に進展している段階である。既に3の研究課題については、論文投稿を行ない現在審査中である。平成26年度に葉緑体分化に関わる転写因子の解析を終える予定であったが、新たなにプロモーター解析を行うことが有効であると考えられた。そこで、計画を変更して、プロモーター・レポーター解析を行うこととした。当初の計画通り遂行していく予定であるが、研究課題3.の進展が重要になってきたため、研究課題4.よりも優先度を上げて取り組んでいく予定である。当初の研究計画通り遂行していく予定である。
自律分散型コンテンツ配信システムに関する研究

従来,サーバ・クライアント型のような,いわゆる集中型システム構成により実現されてきたコンテンツ配信システムを,本研究ではモバイルエージェント技術を積極的に利用して,分散型構成により実現する手法を開発した,開発したシステム構成によると,種々のモバイルエージェントが自律的に,複数の計算機上に分散配置されることにより,たとえシステムを構成する一部の計算機に不具合が生じた場合にでも,システム全体を停止する必要はなく,サービスを提供し続けるなど様々な特徴がある従来,サーバ・クライアント型のような,いわゆる集中型システム構成により実現されてきたコンテンツ配信システムを,本研究ではモバイルエージェント技術を積極的に利用して,分散型構成により実現する手法を開発した,開発したシステム構成によると,種々のモバイルエージェントが自律的に,複数の計算機上に分散配置されることにより,たとえシステムを構成する一部の計算機に不具合が生じた場合にでも,システム全体を停止する必要はなく,サービスを提供し続けるなど様々な特徴がある開発を試みたシステムは,コンテンツを保持するコンテンツ・エージェント,そのバックアップを保持するバックアップ・エージェント,利用者ヘコンテンツを表示したり利用者からの要求を受け取ったりするユーザインターフェイス,およびユーザインターフェイスーコンテンツ・エージェント間のデータの授受を行うユーザエージェントにより構成した.その際,ユーザインターフェイスーエージェント間,あるいはエージェント間の情報のやり取りは,Maglogフレームワークが持っフィールドと呼ばれる環境を経て行うこととした.コンテンツ・エージェント群が自律的にシステムに参加している複数の計算機上に分散配置する具体的な仕組みとして,以下を考案した.すなわち,すべてのコンテンツの名前からそれぞれのハッシュ値を求め,2次元の領域に配置する.初期状態としてシステムに1台の計算機のみ参加している状態を考え,コンテンツを配置した2次元領域のすべてをその計算機が管理することとした,その後1台づつ計算機がシステムに参加してくるたびに,2次元領域を分割しながらその分割領域に配置されたコンテンツ・エージェントを受け取る動作を繰り返す.一方,システムに参加していた計算機がシステムから離脱する際には,その計算機が管理する領域と同じ形状の領域を管理する計算機を探索し,それと領域を結合させながらコンテンツ・エージェントを引き渡す動作を行う.以上の動作により,システムへの計算機の参加離脱が繰り返された場合でも,コンテンツ・エージェントを自律的に分散管理することが可能となった.平成21年度で計画2年目を迎える開発目的のシステムは,以下のモバイルエージェントからなるコンテンツ配信システムである.すなわちコンテンツを保持するコンテンツ・エージェント,そのバックアップを保持するバックアップ・エージェント,利用者ヘコンテンツを表示したり利用者からの要求を受け取ったりするユーザインターフェイス,およびユーザインターフェイス-コンテンツ・エージェント間のデータの授受を行うユーザエージェントにより構成した.その際,ユーザインターフェイス-エージェント間,あるいはエージェント間の情報のやり取りは,Maglogフレームワークが持つフィールドと呼ばれる環境を経て行うこととした.昨年度開発したコンテンツ・エージェント群が自律的にシステムに参加している複数の計算機上に分散配置する具体的な仕組みを元に,具体的なシステムの開発を試みた.すなわち,モバイルエージェント技術の特徴を積極的に利用したe-Learningシステムと人物追跡システムである.初期状態としてシステムに1台の計算機のみ参加している状態を考え,コンテンツを配置した2次元領域のすべてをその計算機が管理することとした.例えばe-Learningシステムでは,1台づつ利用端末がシステムに参加してくるたびに,2次元領域を分割しながらその分割領域に配置されたコンテンツ・エージェントを受け取る動作を繰り返す.一方,システムに参加していた計算機がシステムから離脱する際には,その計算機が管理する領域と同じ形状の領域を管理する計算機を探索し,それと領域を結合させながらコンテンツ・エージェントを引き渡す動作を行う.以上の動作により,システムへの計算機の参加離脱が繰り返された場合でも,コンテンツ・エージェントを自律的に分散管理することが可能となった.このような動作は,モバイルエージェント技術特有の性質を利用したものであり,システム自身の新規性とともにモバイルエージェント技術に対する新しい知見を与えるものと考えている.本研究計画の最終年度にあたる平成22年度には,これまでの研究を継続しモバイルエージェント群からなるコンテンツ配信システムの完成を目指した.その際,ユーザインターフェイス-エージェント間,あるいはエージェント間の情報のやり取りは,Maglogフレームワークが持つフィールドと呼ばれる環境を経て行うこととした.これまでの研究により開発したコンテンツ・エージェント群が自律的にシステムに参加している複数の計算機上に分散配置する具体的な仕組みを元に,具体的なシステムの開発を行った.すなわち,モバイルエージェント技術の特徴を積極的に利用したe-Learningシステムと人物追跡システムである.昨年度までの研究成果による,モバイルエージェントがシステム内に自律的に分散管理される仕組みに加え,本年度はコンテンツ・エージェントが大きなデータを保持する場合について研究を進めた.例えば,e-Learningシステムで音声や動画を用いる場合である.この場合には,音声や画像データあるいは動画データをコンテンツ・エージェントが保持する必要があり,その大きさは非常に大きなものとなってしまう.それにともない,そのエージェントがシステム内を移動するための所要時間も大きなものとなってしまい,システムとしての機能を妨げてしまうことになる.本研究では,このようなコンテンツ・エージェントを複数のメディア・エージェントとして管理し,必要に応じてこれらを連続的に移動させることにより,システム全体としての応答速度の問題を解決を図った.以上の動作においてもこれまで研究を重ねてきたように,システムへの計算機の参加離脱が繰り返された場合でも,コンテンツ・エージェントあるいはメディア・エージェントを自律的に分散管理することは可能である.このような動作は,モバイルエージェント技術特有の性質を利用したものであり,システム自身の新規性とともにモバイルエージェント技術に対する新しい知見を与えるものと考えている.
インターネットを利用した高齢者向け生涯教育の試み

昨年度までの研究において比較的小規模のクラスにおける講義には遠隔講義も数回であれば実施可能であることが示唆された。今年度はさらにこれを発展させ、自宅における在宅学習において利用可能であるかを検討することとした。ハードについては自宅でもっているものはそれを利用し、機器を所有していないものにはノートPCを貸し出して実施する。接続回線については、昨今のプロバイダの料金定価や電話会社の固定料金制などによるISDNを利用してのインターネットアクセスを利用した。また、一般社会人や高齢者向けの在宅学習の可能性を検討するために、ビデオ教材の配信についても提示を行った。これらをすべてISDNによる配信でどの程度自習可能であるか、また教材の作成方法についても検討を行った。特に教材の作成については、デジタルビデオによる動画教材をデジタルでキャプチャし、編集して作成を行った。そのための記録媒体としては、DVDなどの大容量の媒体が必要であった。また、時間的に長いものの作成は、技術的にも困難であり、今回は10分以内の教材を試作して配信を行った。実際の講義などに用いる場合には、50分から60分程度の長さが必要になると思われる。そのためには動画の圧縮技術などが今後進歩することにより、簡単に実現することが考えられる。さらに、地方行政による情報インフラの整備として広島県も情報トライアングルという高速情報ネットワーク利用プロジェクトを実施している。接続可能であるなら、高速ネットワーク上でも同様の教材を提示し、その差を比較することが可能である。今年度は、接続申請などの関係で実現できなかったが、今後は各県が実施しつつある情報ハイウェイなどにより、安価で高速のネットワーク環境を利用可能になる可能性は高いと思われる。その際に配信できるような教材を開発・蓄積し高齢者などを含めた社会人教育に利用可能である遠隔教育を検討しておくことが今後の課題であると思われる。本研究は、高齢者の生涯教育に対してインターネットを利用した遠隔教育の実施が可能かについて検討する目的で実施する。高齢者におけるインターネットの利用率はいまだに高いとはいえない割合である。それには、情報機器に対する高齢者の不安や拒否の態度が考えられる。また、社会参加を拒否する態度なども検討が必要であると思われる。本研究では、高齢者に興味がもてる学習方法や教育のコンテンツなどについて具体的に検討を加える。実際に生涯教育を受講し、アンケート調査により高齢者の特質が見出せれば、さらに具体的な教育方法の改良が加えられると考える。1)高齢者向け生涯教育のコンテンツ作成:大学で実施した生涯教育に関する講座などをビデオ編集し、教材として作成しなおし、新たにWEBなどで教材が配信できるような内容(コンテンツ)を検討して作成した。2)高齢者向け生涯教育用配信サーバの構築:無線のLANによって高齢者向け集合住宅「ケアハウス安芸中野」に向けて配信を行うためのネットワーク構築を行う。現在、ケアハウスと本学はISDN回線で接続可能であるが、画像などの教材を配信する場合、高速の伝送が必要になる。そのため、無線LANにより、大学から直接ケアハウスに教材を配信可能にするためのアンテナを設置し、ケアハウス内のLANとの接続を行う。これらの接続設備は大学からの貸し出しとした。3)高齢者向け生涯教育WEBぺージ作成:1999年の調査より、現在1cm程度の大きさにボタンを表示し、文字も20ポイントまで大きくすることで読みやすいとする結果を得ている。これらを考慮した教材WEBぺージを作成した。4)生涯教育実施:試験的生涯学習プログラムを作成し、都合の良い時間に講義を受講した。5)アンケート調査実施、分析・集計:講義や情報機器に関する意見や感想などを面接方式のアンケートで調査。WEBによるアンケートは高齢者には困難である。

本研究は,高齢者においてインターネットを利用した遠隔生涯学習が受講できるかについて検討した。昨年度は,実際の本学における公開講座をデジタルビデオ入力による,大学構内のサーバにおいて,無線LANおよびISDNによって高齢者の方々に視聴して評価をもらった。その結果,自分の興味あるものについては生涯教育として遠隔教育を受講してもよいとする結果を得た。また,Webページについては,高齢者の方にも使いやすいよう,できるだけ大きなボタンとして文字も大きくして提示したため,すべての高齢者にとって読むことができる表示となった。また,アンケート調査については,面接方式の調査でなくては回答してもらうことができなかった。これは今後も同様の調査方法をとっていく必要があることを示唆している。さらに高齢者に興味がもてる学習方法や教育のコンテンツなどについて具体的に検討を加えた。コンテンツについては,動きのあるものや画面で変化があるものも必要であるとする意見もあった。そのため,簡単な英会話の教材を外国人と日本人で作成した。しかし,教材そのものの作成に時間と労力がかかり,大量に作成していくにはさらに工夫が必要であることが認められた。画質や本質については,無線LANを用いることで快適にアクセスできた様子であった。職員の方々にとったアンケートでは,遠隔講義はまた早いのではという意見もあったが,無線LANや最近普及しているブロードバンドを利用することで,画質や音質についてはよりよいものが簡単・安価に構築できると考えられる。
肺がん治療を目的とした遺伝子ドライパウダーの開発と有効性の評価

超臨界二酸化炭素晶析(SCF)法は,近年製剤学分野で機能性微粒子の製造手段として注目されている.我々は平成16年度科学研究費補助金による研究で,SCF法により調製したキトサン-インターフェロンβ遺伝子製剤をマウス肺転移癌モデルにより投与し,遺伝子微粒子が高い転移癌抑制効果と生存日数延長効果を示すことを明らかにした.本年度は,遺伝子製剤の安定性を検討し,またさらに有効性の高い遺伝子微粒子を得るために,異なる処方の製剤の有用性を検討した.プラスミドDNAとしてルシフェラーゼをコードするpCMV-Lucを選択し,非ウイルス性ベクターとしてキトサンを用いた.エタノールを補助溶媒として,キトサン-DNA水溶液をSCF中に分散させることでDNA微粒子製剤を調製した.遺伝子製剤の安定性は,電気泳動法及び遺伝子ドライパウダーをマウス肺内投与後のフシフェラーゼ活性により評価した.遺伝子溶液を25もしくは40°Cで保存すると2週間後には電気泳動法で遺伝子が確認できなくなったが,微粒子製剤では4週間後でも遺伝子が残っていた.さらに,微粒子製剤では4週間保存後にマウス肺内に投与しても,高いルシフェラーゼ活性が得られた.微粒子の賦形剤をこれまでのマンニトールから乳糖に変えて微粒子化した。マンニトールの場合は長さ十数μmの針状結晶であったが,乳糖では直径10μm前後のウニ状粒子が得られた.マウス肺転移モデルは,マウス結腸癌細胞CT26をCDF1マウスに尾静注することにより作成した.調製した製剤をマウス肺内に投与したところ,乳糖を賦形剤とする製剤投与時は,マンニトール製剤投与時と比較して,腫瘍組織及び正常組織中でのルシフェラーゼ活性が増加した.超臨界二酸化炭素晶析(SCF)法は,近年製剤学分野で機能性微粒子の製造手段として注目されている.我々は平成16年度科学研究費補助金による研究で,SCF法により調製したキトサン-インターフェロンβ遺伝子製剤をマウス肺転移癌モデルにより投与し,遺伝子微粒子が高い転移癌抑制効果と生存日数延長効果を示すことを明らかにした.本年度は,遺伝子製剤の安定性を検討し,またさらに有効性の高い遺伝子微粒子を得るために,異なる処方の製剤の有用性を検討した.プラスミドDNAとしてルシフェラーゼをコードするpCMV-Lucを選択し,非ウイルス性ベクターとしてキトサンを用いた.エタノールを補助溶媒として,キトサン-DNA水溶液をSCF中に分散させることでDNA微粒子製剤を調製した.遺伝子製剤の安定性は,電気泳動法及び遺伝子ドライパウダーをマウス肺内投与後のフシフェラーゼ活性により評価した.遺伝子溶液を25もしくは40°Cで保存すると2週間後には電気泳動法で遺伝子が確認できなくなったが,微粒子製剤では4週間後でも遺伝子が残っていた.さらに,微粒子製剤では4週間保存後にマウス肺内に投与しても,高いルシフェラーゼ活性が得られた.微粒子の賦形剤をこれまでのマンニトールから乳糖に変えて微粒子化した。マンニトールの場合は長さ十数μmの針状結晶であったが,乳糖では直径10μm前後のウニ状粒子が得られた.マウス肺転移モデルは,マウス結腸癌細胞CT26をCDF1マウスに尾静注することにより作成した.調製した製剤をマウス肺内に投与したところ,乳糖を賦形剤とする製剤投与時は,マンニトール製剤投与時と比較して,腫瘍組織及び正常組織中でのルシフェラーゼ活性が増加した.超臨界二酸化炭素晶析(SCF)法は,近年製剤学分野で機能性微粒子の製造手段として注目されている.我々はすでに,ベクターとしてキトサンを用い,SCF法により遺伝子溶液を微粒子化することで,遺伝子の発現が増大し,発現時間が持続することを報告した.そこで本研究ではSCF法により,キトサン-インターフェロンβ遺伝子製剤を調製し,マウス肺転移癌モデルにより,その治療効果について検討した.プラスミドDNAとしてマウスインターフェロンβをコードするpCMV-Muβを選択し,非ウイルス性ベクターとしてキトサンを用いた.エタノールを補助溶媒として,キトサン-DNA水溶液をSCF中に分散させることでDNA微粒子製剤を調製した.マウス肺転移モデルは,マウス結腸癌細胞CT26をCDF1マウスに尾静注することにより作成した.調製した製剤をマウス肺内に投与し,肺重量,肺転移性結節数,生存日数について検討した.SCF法により調製した製剤投与時は,キトサン-DNA溶液の肺内投与時と比較して,より少ない投与量において肺重量,肺転移性結節数が減少し,生存日数は延長した.キトサン-DNA溶液尾静注時と比較しても,同様の結果が得られた.したがって,超臨界二酸化炭素晶析法により調製した遺伝子微粒子製剤は,マウス肺転移モデルにおいて.高い治療効果を持つことが示唆された.また,レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコードするpCMV-Lucの微粒子製剤をマウス肺転移モデルに投与し,肺組織内でのフシフエラーゼ発現を検討した.正常組織に比べ,癌組織でのルシフェラーゼ活性が高い傾向が認められ,遺伝子微粒子製剤の吸入により,効率よく遺伝子が肺癌組織に送達され,癌抑制効果を発揮するものと考えられた.超臨界二酸化炭素晶析(SCF)法は,近年製剤学分野で機能性微粒子の製造手段として注目されている.

我々は平成16年度科学研究費補助金による研究で,SCF法により調製したキトサン-インターフェロンβ遺伝子製剤をマウス肺転移癌モデルにより投与し,遺伝子微粒子が高い転移癌抑制効果と生存日数延長効果を示すことを明らかにした。本年度は,遺伝子製剤の安定性を検討し,また,さらに有効性の高い遺伝子微粒子を得るために,異なる処方の製剤の有用性を検討した.プラスミドDNAとしてルシフェラーゼをコードするpCMV-Lucを選択し,非ウイルス性ベクターとしてキトサンを用いた.エタノールを補助溶媒として,キトサン-DNA水溶液をSCF中に分散させることでDNA微粒子製剤を調製した.遺伝子製剤の安定性は,電気泳動法及び遺伝子ドライパウダーをマウス肺内投与後のフシフェラーゼ活性により評価した.遺伝子溶液を25もしくは40°Cで保存すると2週間後には電気泳動法で遺伝子が確認できなくなったが,微粒子製剤では4週間後でも遺伝子が残っていた。さらに,微粒子製剤では4週間保存後にマウス肺内に投与しても,高いルシフェラーゼ活性が得られた.微粒子の賦形剤をこれまでのマンニトールから乳糖に変えて微粒子化した,マンニトールの場合は長さ十数μmの針状結晶であったが,乳糖では直径10μm前後のウニ状粒子が得られた.マウス肺転移モデルは,マウス結腸癌細胞CT26をCDF1マウスに尾静注することにより作成した.調製した製剤をマウス肺内に投与したところ,乳糖を賦形剤とする製剤投与時は,マンニトール製剤投与時と比較して,腫瘍組織及び正常組織中でのルシフェラーゼ活性が増加した.