hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲーム理論を用いて通信品質の均質化を行うルータに関する研究

メディアによって異なる要求遅延品質を各通信ごとに満たす制御を実現する、ルーチングおよび網制御アルゴリズムを実現することを目標に、本年度は理論解析の継続及び実装実験を行った。アルゴリズムとしては、次の2つの方式を主に検討した。1.ゲーム理論を用いたコネクション型ネットワーク制御方式ネットワークプレイヤー(ノード)とコネクションプレイヤー(パケット)の相対するプレイヤーを設定し、互いにmini-max原理にしたがって行動する方式である。本方式によりネットワーク全体の通信品質を均質化でき、パケットの廃棄率を大幅に低減できる。本方式は国際会議にて発表、及び論文誌に投稿し、論文として採録された。2.ARQプロトコルに着目した優先制御タイムアウト発生により再送が生じるARQを対象にして、優先制御によりそのタイムアウトを減少させることにより、再送減少により有効となった帯域を他のトラヒックに割り当てることで、優先・被優先クラス同時に通信品質を向上させる方式である。2通信が1リンクを共有するモデルを用いて、昨年度よりもより厳密に理論解析を行い、両優先度クラスの通信ともにノードにおける待ち行列遅延が減少する条件式を導出した。さらに、実装実験により(鹿児島大学、東工大大岡山キャンパス、東工大長津田キャンパスの3点)両通信のスループットが同時向上する動作を実際に確認した。メディアによって異なる要求遅延品質を各通信ごとに満たす制御を実現する、ルーチングおよび網制御アルゴリズムを実現することを目標に、本年度はアルゴリズムの提案及びその理論解析とシミュレーションを行った。アルゴリズムとしては、次の3つの方式を提案し、検討した。1.ゲーム理論を用いたコネクション型ネットワーク制御方式ネットワークプレイヤー(ノード)とコネクションプレイヤー(パケット)の相対するプレイヤーを設定し、互いにmini-max原理にしたがって行動する方式を提案した。計算機シミュレーションによりその有効性を確認した。2.ネットワークに優しいパケットシェーピング方式単位時間あたりのデータ量は多いが一定時間以内に送信が完了すればよいというリアルタイムメディアデータの特性に着目し、データを細かいパケットに分割して、パケット間の間隔をあけて送信することにより、他のトラヒックの廃棄率やノードでの待ち行列遅延を低減させる方式を提案した。本方式では、必要以上に分割を行うとパケットヘッダによりオーバーヘッドが生じるためかえって通信品質が悪化する。そのため、待ち行列遅延を最小とする最適な分割数を理論的に導出した。3. ARQプロトコルに着目した優先制御タイムアウト発生により再送が生じるARQを対象にして、優先制御によりそのタイムアウトを減少させることにより、再送減少により有効となった帯域を他のトラヒックに割り当てることで、優先・被優先クラス同時に通信品質を向上させる方式を提案した。さらに、2通信が1リンクを共有するモデルを用いて、理論解析を行い、両優先度クラスの通信ともにノードにおける待ち行列遅延が減少する場合が存在することを確認した。
アジア中間層における日本製文化コンテンツの不正利用行動に関する理論的実証的研究

アジア諸国のインターネット利用人口の増加にともない、デジタル海賊版や不正利用行動が増加している。知的財産権侵害問題に対する解決策を見出すために、「なぜアジア中間層ではコンテンツ不正利用に対する選好が高いのか」という行動科学的問いを解明することが緊要な課題である。本研究は日本製文化コンテンツのデジタル不正利用行動モデルを構築し、アジア中間層で海賊版ソフトウェア購入経験者を対象に実証性を検証した。平成20年度の主な研究実績は以下のとおりです。本年度は一年目にあたり、文献調査および現地調査を集中的にすすめた。1)文献調査:台湾・中国・タイの3ヵ国における日本アニメの海賊版ソフトの流通状況および消費者購買行動に関する資料収集を行った。現在、文献整理作業をすすめている。2)現地調査:●台湾(台中市周辺)での現地調査:台湾中間層の日本文化コンテンツ不正利用状況と知識財産権に対する意識調査を行った。中間層でデジタルコンテンツ利用層である大学生を対象に、アンケート用紙を配布し回答を得た。また、流通状況を把握するため、大学周辺の繁華街・商店街・台湾系スーパーマーケット(Taisuco)・日系デパート(新光三越)などを視察した。●中国(北京市)での現地調査:デジタルコンテンツ利用層である中間層が多く居住する中間村周辺にて、インターネットカフェなどを視察し、日本コンテンツの海賊版ソフト販売業者などの情報を収集した。また、海賊版ソフトの流通状況を把握するため、王府井・海淀区周辺などの商業施設内インターネットカフェ、商店街などを視察した。●タイ(バンコク)での現地調査:中間層でデジタルコンテンツ利用層である大学生を対象に、ヒアリング調査を行い情報収集した。また、日本文化コンテンツ不正利用の流通状況を把握するため、Maboonklong、Siam Square, Discoveryの商業施設内インターネットカフェ、商店街、フランス系ディスカウント・ストア(Carrefour)・イギリス系ディスカウント・ストア(Tesco)などを視察した。平成21年度の主な研究実績は以下のとおりです。本年度は2年目にあたり、文献調査および現地調査を集中的にすすめるとともに、研究成果の一部を論文にまとめ発表した。1)海外・資料調査:日本アニメの海賊版ソフトの流通状況および消費者購買行動について、タイとシンガポールの2カ国にて調査活動を実施した。シンガポールでは、地元大学と国立図書館にて情報を収集した,大学周辺のインターネット・カフェや小売現場などをまわり、日本ゲームソフト・日本アニメキャラクター商品の利用状況を観察した。また、大学生利用者数名に不正利用の経験などをインタビューした。タイではバンコクの商業施設周辺に位置するインターネットカフュを中心にまわり、海賊版日本ゲームソフト品の利用状況について、高校生数名にインタビューした。現在、調査内容を整理し分析中である。平成22年度は最終年度(3年目)であり、文献調査および海外調査を集中的にすすめるとともに、研究成果の一部を論文にまとめ3本発表した。1)海外調査:タイ・シンガポール・ベトナムの3カ国にて調査活動を実施した。昨年度に続く継続調査である「日本文化コンテンツの利用行動に関する調査」をタイとシンガポールで実施した。ベトナム(ホーチミン)では、インターネット・カフェの利用はまだ一般的ではなくCD・DVDを店頭で購入する利用スタイルが主流である。日本製文化コンテンツが中小規模のショッピングセンター内で販売されていることを確認した。2)研究成果の発表:平成21年22年度の間に実施した現地調査の成果は「拡張型技術受容モデルを用いた違法ダウンロード行動のメカニズムアジア中間層の日本ゲームソフト利用を事例として」、「内発的外発的動機によるネットユーザーの違法ダウンロード行動シンガポールの事例研究」、「日本製ソフトコンテンツの違法ダウンロード行動パターンの国際比較分析」と題した論文にまとめた。1本目は、拡張型技術受容モデルを展開した違法ダウンロード行動モデルを作成した。知覚された利便性(perceived ease of use)と知覚された楽しさ(perceived enjoyment)などの非価格要因がアジアのインターネット・ユーザーの違法ダウンロード行動に大きな影響を与えていることが確認された。3本目は、違法ダウンロードを体験したユーザーを対象とするタイ・台湾・シンガポールの3カ国調査結果を比較分析した。違法ダウンロード行動パターンを分析し、各国の違法ダウンロードパターンと特徴を明らかにした。最後に、ベトナム(ホーチミン)の現地調査については、現在、調査内容を分析中である。
光触媒によるメタンおよび水の活性化と表面科学

天然ガスの主成分であるメタンの化学的転換の技術が求められている。我々は、紫外光照射でメタンからアルカンを高い量子収率で得る反応を見出した。石英製反応管(7ccおよび40cc)に少量の水を導入し、CH_4を流しながら紫外光(200W低圧水銀ランプ(λ=185nm,254nm)を照射すると、連続的に炭化水素が生成することを見出した。生成物はエタン、プロパン、ブタンなどのアルカンのみが生成した。量子収率は0.1である。この反応は、水が紫外光を吸収し、OHラジカルとなり、メタンの水素を引き抜きメチルラジカルが生成し、メチルラジカルのカップリングによってエタンが生成する。さらにアルカンからアルキルラジカルが生成しアルカンが生成する。熱的触媒反応ではメタンからエチレンなどのオレフィンが生成するので、アルカンのみの生成物分布は気相反応であることを意味する。エタンのカップリング反応を調べたところ、ブタン、ヘキサンなどが生成し、カップリング反応が進行することが明らかとなった。次に、触媒の効果を調べた。すなわち、水からOHラジカルを生成させ、メタンからメチルラジカルを導くところまでは同じであるが、このメチルラジカルを固体触媒の表面で反応させることにより、生成物分布を制御できないかと考えた。MoO_3、Mo_2Cを触媒に使うと効果は見られないが、Cu触媒ではエチレンが生成した。エタンやプロパンは生成しない。Cu触媒ではCH_2種の熱的2量化によってエチレンが生成することが知られているので、本研究ではメチルラジカルが解離してCH_2種が生成し、熱的にエチレンが生成したものと考えられる。すなわち、気相光反応と熱的触媒反応組み合わせによるメタンのカップリングが実現したことを示唆する。TiO_2では、メタンが異常に反応し完全酸化が起こったことが示唆された。本研究では、紫外光照射によりメタンからエタン・プロパン等の炭化水素を室温で合成することが狙いである。石英製反応管に水を数滴共存させ、CH_4を流しながら紫外光を照射し、生成物をガスクロマトグラフで分析した。光源には200W低圧水銀ランプ(λ=185nm,254nm)を用いた。紫外光照射時の反応温度や水の量などの反応条件を変えて実験を行い、結果を比較した。CH_4と水を共存させると紫外光照射によりCH_4からC_2H_6、C_3H_8が高い収率で生成することが明らかとなった。C_3H_6やC_4H_<10>、C_4H_8の生成も確認された。反応管を加熱するとC_2H_6、C_3H_8の収率は増加した。光照射を止めると同時にC_2H_6、C_3H_8の生成は停止し、再度光照射を行うとC_2H_6、C_3H_8も生成し始めた。高圧水銀ランプ(λ>254nm)を用いると、C_2H_6、C_3H_8等は生成しなかった。したがってλ=185nmの光が有効であると云える。水の影響を調べるために、反応前に反応管を焼成(Heを流しながら673K・100min)し、紫外光照射を行ったが、C_2H_6、C_3H_8等の気体は生成しなかった。反応機構として、紫外光によって水分子が解離してOHラジカルを生じ、これがメタンの水素を引き抜きメチルラジカルが生成し、さらにカップリングによってエタンが生成するものと考えられる。エタンもOHラジカルによってエチルラジカルが生成し、メチルラジカルまたはエチルラジカルと反応してプロパンやブタンを生成するものと考えられる。FT合成に見られるようなオレフィン生成が観測されなかった事実はこのメカニズムを裏付けている。また、エタンと水との反応を調べたところ、C4およびC6のアルカンが生成することが明らかとなり、一般的に、アルキルラジカルのカップリングを起こすことが可能であると言える。

Cu触媒ではCH_2種の熱的2量化によってエチレンが生成することが知られているので、本研究ではメチルラジカルが解離してCH_2種が生成し、熱的にエチレンが生成したものと考えられる。すなわち、気相光反応と熱的触媒反応組み合わせによるメタンのカップリングが実現したことを示唆する。TiO_2では、メタンが異常に反応し完全酸化が起こったことが示唆された。
アクチビンのシグナル伝達におけるアクチビン結合タンパク質の役割

TGF-βスーパーファミリーに分類されるアクチビンは多彩な生理作用を持つことが明かにされて,注目されつつある。本課題ではアクチビンの多様な作用の発現機序を理解するために,アクチビンのシグナル伝達の分子機構を解明することを目的とし研究を展開して次の成果を得た(1)マウス胚性癌細胞(EC細胞)からアクチビン受容体タンパク質を単離することに成功して,それが自己リン酸化能を有するSer/Thr及びTyr kinaseであることを発見した。EC細胞からクローニングした同受容体をCOS細胞に一過性に発現させ,同様に精製取得した受容体標品も同じようにdual kinase活性を持つことを確認することができた。このようなkinase活性を持つ受容体はこれまでに報告例はなく,アクチビンのシグナルは未知の経路を経て細胞内へ伝達されている可能性が示唆された。本年度に作製した抗受容体を用いて,受容体kinaseの細胞内基質の同定を進め,細胞表層から細胞質に至るシグナルの実体を明かにすることが今後の課題である。(2)アクチビンとホリスタチン(アクチビン結合タンパク質)との結合比はゲルろ過法により1:2(モル比)であることがわかった。この値はホリスタチンのアクチビン作用抑制活性の測定によっても確認された。この結果から,2個のサブユニットから成るアクチビン分子の各サブユニットにホリスタチン一分子が結合して,アクチビンの作用を中和するものと考えられる。また,ブタ卵胞液から6種類のホリスタチンを単離し,いずれの分子種もアクチビン結合活性はほぼ同じであるが,C末端領域を多く欠落した分子種ほど細胞表層へパラン硫酸側鎖に対して高い親和性を示すことを明らかにした。この結果は細胞表層でのアクチビンとその受容体との相互作用の調節に,ホリスタチンのC末端領域の構造が重要な役割を果たしていることを示唆している。アクチビンの多様な作用の分子機構を知ることを目標に,本課題では,アクチビンのシグナル伝達に及ぼすアクチビン結合タンパク質(ホリスタチン)の役割を明らかにすることに焦点を当てて研究を展開して,本年度は次の成果を得た。1.アクチビン結合タンパク質(ホリスタチン)の動態C末欠落ホリスタチンが細胞表面のヘパラン硫酸残基に高い親和性を示すことを確認するために,その遺伝子をCOS細胞に発現させ,その挙動を検討した。COS細胞で合成,分泌されたC末欠落分子は細胞表面に選択的に結合したのに対し,インタクト分子は殆ど結合しなかった。この結果からも,ホリスタチンのC末領域の構造がその細胞接着に重要な役割を果たいていることが示唆された。2.アクチビン受容体のキナーゼ活性マウス胚性癌細胞から単離したアクチビン受容体のキナーゼ活性を検討した。その結果,精製受容体はカゼイン,エノラーゼ,ヒストンなどのタンパク質基質をリン酸化するとともに,受容体タンパク質自身をリン酸化する活性(自己リン酸化能)を持っていることを知った。リン酸化されたタンパク質のリン酸化アミノ酸を二次元電気泳動により解析したところ,セリン,スレオニン,チロシン残基がリン酸化されていることが判明した。即ち,アクチビン受容体はセリン/スレオニン/チロシンキナーゼであることが明らかにされた。こうしたタイプの受容体はこれまでに報告例はなく,アクチビンのシグナルが未知の経路を経て細胞内へ伝達されることが推測される。

アクチビンのシグナル伝達機構を分子レベルで理解することを目的に,本年度は,特に、アクチビン受容体のkinase活性の確認とアクチビンとその結合タンパク質であるホリスタチンとの化学量論的結合特性に検討を加えて,次のような成果を得た。(1)マウス胚性癌細胞(EC細胞)からクローニングしたアクチビン受容体(タイプII)をCOS細胞に一過性に発現させ,同受容体タンパク質を精製して,in vitro系においてそれが自己リン酸化能を有するSer/Thr及びTyr kinaseであることを確認した。この結果はアクチビン受容体が少なくともin vitro系ではdual kinase活性を持つ新しいタイプの受容体であることを強く支持しており,アクチビンのシグナルがこれまでにない未知の経路を経て細胞内へ伝達されていることを示唆している。また,アクチビン受容体kinase domainに対するウサギポリクローナル抗受容体抗体を作製した。(2)アクチビンとホリスタチン(アクチビン結合タンパク質)との結合比はゲルろ過法により1:2(モル比)であることがわかった。この値はホリスタチンのアクチビン作用抑制活性の測定によっても確認された。この結果から,2個のサブユニットから成るアクチビン分子の各サブユニットにホリスタチン-分子が結合して,アクチビンの活性発現部位が完全にマスクされるものと考えられる。また,ブタ卵胞液には細胞表層のヘパラン硫酸側鎖に対する親和性を異にするホリスタチンが少なくとも6種類存在することを明かにして,ホリスタチンによる卵巣での複雑なアクチビン作用調節機構の存在することを提案した。
免疫複合モデルを用いた腫瘍免疫制御機構の解明

本研究では、自己免疫疾患モデルマウスに腫瘍を移植することで、新規の腫瘍免疫制御機構を解明することを目的とした。悪黒色腫細胞株B16F10をB6及び自己免疫疾患モデルであるB6/lprマウスに移植したところ、腫瘍重量に差は見られなかったが、B6/lprマウスの移植B16F10腫瘍組織中への(抗腫瘍)M1マクロファージの集積はB6マウスに比較し有意に低下していた。さらに、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF過剰発現B16F10(B16f10/mGM)を移植に用いた結果、移植B16F10/mGMの重量はB6マウスに比較しB6/lprマウスで有意に亢進した。また、M1マクロファージとM2マクロファージの比率M1/M2比はB6/lprマウスで有意に低下していた。さらに、腫瘍細胞と脾細胞を共培養すると、B6/lprマウスではB6マウスに比較してM1マクロファージへの分化が減弱していることが認められた。一方、脾細胞をGM-CSFを添加した培地を用いて培養した場合ではB6及びB6/lprマウス間にM1マクロファージへの分化に差は認められなかったことより、B6/lprマウスにおけるM1マクロファージの減少に重要な因子はGM-CSFだけでなく、それ以外の因子も関与することが示唆された。加えて、B16F10/mGM腫瘍組織中の血管数及び血管内皮増殖因子VEGFの発現量はB6マウスに比較しB6/lprマウスで有意に増加していた。B6/lprマウスにおける移植腫瘍組織中のVEGF発現の亢進は、腫瘍組織の低酸素状態及び転写因子HIF-1α発現の亢進に相関していた。また、移植腫瘍の大きさにB6及びB6/lprマウス間に差が出る以前の段階でも腫瘍血管新生はB6/lprマウスで亢進していることが確認された。以上のことから、自己免疫状態での抗腫瘍免疫の不全と血管新生の亢進が腫瘍増殖に影響を与えることが示され、自己免疫疾患患者では自己免疫状態をコントロールすることで、腫瘍の増殖や進展を抑制できる可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、自己免疫疾患モデルマウスを用いて腫瘍移植実験を行うことにより、新規の腫瘍免疫制御機構を明らかにすることを目的とする。コントロールとしてC57BL/6 (B6)マウスを、自己免疫疾患モデルとしてB6/lprマウスを用い、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)強発現悪性黒色腫細胞(B16F10/mGM)を皮下移植し3週間後に解析を行ったところ、B6/lprマウスに移植したB16F10/mGMの重量は有意に亢進し、B6/lprマウスの生存率の低下が観察された。放射線照射を行ったB6/lprマウスに対し、B6及びB6/lprマウスの骨髄細胞を移植し、骨髄キメラマウスを作成した。これらのマウスにB16F10/mGMの移植を行うとB6BMCキメラマウスに比較しB6/lpr BMCキメラマウスで腫瘍重量の有意な亢進が認められたため、B6/lprマウスの血球系細胞の関与が示唆された。移植腫瘍中の各免疫細胞数をflow cytemetryにて解析を行うと、対照群に比較しB6/lprマウスにおけるF4/80+CD11b+CD11c+CD206-のM1マクロファージ数の有意な減少が認められたことより、B6/lprマウスでは腫瘍中におけるM1マクロファージ数が低下しているため、腫瘍の増殖が亢進したと考えられる。

加えて、B16F10/mGM腫瘍組織中の血管数及び血管内皮増殖因子VEGFの発現量はB6マウスに比較しB6/lprマウスで有意に増加していた。B6/lprマウスにおける移植腫瘍組織中のVEGF発現の亢進は、腫瘍組織の低酸素状態及び転写因子HIF-1α発現の亢進に相関していた。また、移植腫瘍の大きさにB6及びB6/lprマウス間に差が出る以前の段階でも腫瘍血管新生はB6/lprマウスで亢進していることが確認された。以上のことから、自己免疫状態での抗腫瘍免疫の不全と血管新生の亢進が腫瘍増殖に影響を与えることが示され、自己免疫疾患患者では自己免疫状態をコントロールすることで、腫瘍の増殖や進展を抑制できる可能性が示唆された。当該年度において、新規の腫瘍免疫制御機構解明を目的に自己免疫疾患モデルマウスに腫瘍を移植した免疫複合モデルを用い、腫瘍組織中の免疫動態を詳細に検討し研究を精力的に遂行した。結果、自己免疫疾患モデルに移植した腫瘍の増殖は亢進すること、腫瘍組織中に浸潤しているM1マクロファージ数が減少すること、腫瘍組織中で腫瘍血管の増生が見られることを見出した。さらに自己免疫疾患モデルでは腫瘍組織は低酸素状態にあり、転写因子HIF-1α及び血管内皮細胞増殖因子VEGF-Aの発現が亢進していることを見出した。これらは自己免疫疾患罹患者における癌高罹患率を説明し得る知見となる可能性がある。以上より当初の研究計画をおおむね順調に遂行していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はB6/lprマウスにおけるM1マクロファージ数の減少についての詳細を検討していく予定である。B6/lprマウスにおいて、単球のM1マクロファージへの分化が阻害されているのか、若しくは腫瘍組織中へのM1マクロファージの浸潤能が低下しているのかどうかの検討を行う。B6/lprマウスにおける腫瘍血管の増生が、HIF-1α及びVEGFAの発現亢進に起因することは確認されたので、B6/lprマウスでは腫瘍増生の亢進により低酸素が誘導されHIF-1αの発現が亢進したのか、若しくはB6/lprマウスの免疫細胞からの何らかの因子により腫瘍細胞のVEGFAの発現が亢進したのかどうかを検討する。さらには今回確認された腫瘍増殖能の亢進が他の自己免疫疾患モデルマウスでも同様であるかどうかを比較検討する。
配偶子分化に伴う放射線突然変異感受性変動機構の解析

雄配偶子が、分化するときに、放射線(ガンマー線)突然変異感受性がどのように変動するかを詳しく調べ、さらに優性致死突然変異体ではどのようなDNA変異が起こっているかをAP-PCR法によるDNAフィンガープリントによって解析した。そのために、8年の歳月をかけて自家開発してきたメダカ特定座位法を用いた。1。遺伝学的指標として優性致死突然変異を用いると、野性型雄メダカに致死量以下のガンマー線を照射後13日間に得られる受精卵の優性致死率が最も高く、以後日にちを経るに従って単調に減少した。このことは、ガンマー線による優性致死突然変異誘発に関しては、精子が最も感受性が高く、以下精細胞-精母細胞-分化精原細胞-精原細胞と細胞が未分化になるほど単調に感受性が低下することを示している。2。総突然変異誘発に関しては、精子期と精細胞期で感受性が最も高く、両者間で有意な差はない。精母細胞期、分化精細胞期では感受性が低下し、精原細胞期になるとさらに著しく低下した。3。生存突然変異誘発に関しては、統計的には有意とはいえないが精細胞期で精子期・精母細胞期に比べて約2倍以上高い値が得られた。分化精原細胞期は多少感受性が上がるが、精原細胞期になると極めて低い値しか得られなかった。4。DNAフィンガープリントで遺伝的な多型が見られる1組の雌雄メダカ系統を使い、野性型雄メダカをガンマー線で照射し、正常雄メダカと交配して受精卵を得た。個々の優性致死胚と同朋正常胚からゲノムDNAを抽出し、pBRを任意プライマーとするAP-PCR法で個々の胚のフィンガープリントをえ、雄親由来バンドの変化を定量的に比較した。その結果、優性致死胚のDNAでは雄親由来DNAバンドの消失頻度が、正常同朋胚DNAに比べてより高いことが明らかになった。1。2。3。4。精子、精細胞期における放射線誘発DNA変異感受性を定量的に調べる新しい方法を開発した。メダカ近交系HNI雄成魚に4.75Gy,9.5Gyまたは19Gy(O.95Gy/min.)のγ線を照射しメダカ近交系Hd-rR雌と交配した。照射が精細胞期と精子期に相当した受精卵を集め観察し、優性致死胚は死ぬ直前に、生存胚は孵化後2日以内に各々の個体からゲノムDNAを抽出した。直径約1mmのメダカ胚の各々からゲノムDNAを抽出する方法として、塩-クロロフォルム法を改良した。次に多数の試料でDNA変異を検出する系として、AP-PCR(arbitrarily primed PCR,Welsh & McClelland,1990)を用いたフィンガープリンティングを利用した。AP-PCRの特徴は、任意に選んだプライマーを多数の箇所にアニールさせPCRを行う点である。親として用いた2つの近交系HNIとHd-rRは各々メダカの北日本集団、南日本集団由来でAP-PCRフィンガープリンティングで両糸統間に明確な多型が確認された。この2系統のF_1のフィンガープリントは親のそれの和になっていた。雄を照射する実験から得られたF_1で、照射によるDNA損傷がHNI系統由来のバンドの変化として検出された。pBRプラスミドの一部分(15mer)をプライマーとして用いたフィンガープリントから、γ線によって精子、精細胞期の雄生殖細胞に誘発されたDNA変異の頻度を求めた。照射線量が増すと消失するバンド数も増加していた。

このことは胚ゲノムDNAのAP-PCRフィンガープリンティングによって、雄生殖細胞でのγ線誘発DNA変異が検出でき、さらにDNA変異を負った、減数分裂を終了した雄生殖細胞は受精には参画できるが、生じた胚の多くは発生の途中で線量に応じて致死となり、集団中から排除されることがDNAレベルで確認されたことを示している。一方、生存胚におけるバンド消失の頻度も、線量が増すと多くなっていることから、生殖細胞DNAが、生存に直接には影響は与えないような多くの突然変異を照射線量に応じて次世代に伝えていくことを示唆している。雄配偶子が、精原細胞-分化精原細胞-精母細胞-精細胞-成熟精子という一連の過程を経て分化するときに、突然変異感受性がどのように変動するかを解析した。そのために、8年の歳月をかけて自家開発してきたメダカ特定座位法を用いた。1。遺伝学的指標として優性致死突然変異を用いると、野生型雄メダカに致死量以下のガンマー線を照射後13日間に得られる受精卵の優性致死率がもっとも高く、以後日にちを経るに従って単調に減少した。このことは、ガンマー線による優性致死突然変異誘発に関しては、精子が最も感受性が高く、以下精細胞-精母細胞-分子精原細胞-精原細胞と細胞が未分化になるほど単調に感受性が低下することを示している。2。総突然変異誘発に関しては、精子期と精細胞期で感受性が最も高く、両者間で有意な差はない。精母細胞期、分化精原細胞期では感受性が低下し、精原細胞期になるとさらに著しく低下した。3。生存突然変異誘発に関しては、統計的には有意とはいえないが精細胞期で精子期・精母細胞期に比べて約2倍以上高い値が得られた。分化精原細胞期は多少感受性が上がるが、精原細胞期になると極めて低い値しか得られなかった。
TDP-43結合mRNAとその翻訳産物を標的にした孤発性ALSの病理及び治療研究

筋萎縮性側硬化症(ALS)の大部分は、特定の遺伝子変異を伴わない孤発例が占めている。生化学的解析から、核に存在するRNA結合タンパク質TAR DNA binding protein of 43 KDa (TDP-43)が、病巣部において高度なタンパク質の修飾を受けた形で核から細胞質に異所性に蓄積されることが報告されており、この異常なタンパク質の細胞質への蓄積とTDP-43の核からの消失が、疾病の発症・進行に重要な役割を担っているものと考えられている。このうち、私はTDP-43の核から消失、即ちTDP-43の機能消失によるALS発症メカニズムに着目し、siRNAにより内在性TDP-43の発現を抑制させたヒト株化細胞における遺伝子発現プロファイルの解明を進め、TDP-43の発現抑制により、mRNA及びその翻訳産物の発現が劇的に低下する遺伝子、TDP-43 regulated gene (TRG、仮称)を同定した。本研究は、TRGの分子性状並びに機能を明らかにし、ALS発症における位置付けを明確にすることを目的としている。平成30年度は、1)特異抗体を持ちいた免疫組織学的解析から、TRG発現パターンはマウスから、サル、ヒトに至るまで比較的保存されており、特にALSの標的細胞である脊髄運動ニューロンで強く発現している事、2)TRGはミスフォールド化した全長TDP-43、及びALS病巣で観察されるN末側がタンパク質切断により欠損するC末フラグメントに結合し、これらミスフォールド種のユビキチン化を誘導する事、3)C末フラグメンの大部分は、難溶性タンパク質として存在するが、TRGはこの難溶性フラグメントの除去に重要な役割の担っている事を明らかにした。TRGの発現がTDP-43により制御されているのみならず、TRG自体もTDP-43由来のミスフォールド種のtrunoverを制御し得る結果を培養細胞の過剰発現の実験から得ることができた事は大きな進展であるが、TRG機能欠損変異体の効果や、遺伝子欠損細胞の表現系との整合性がまだ完全に解明できておらず、また、モデル動物やALS患者標本の染色結果を出すまで至らなかった事から、研究はやや遅れている判断した。今年度は、ALSモデル動物や患者標本を用いたTRGタンパク質の発現を免疫組織学的に進め、ALS発症におけるTRGの位置付けを組織学的見地から検討を行う。また、TRGによるTDP-43由来ミスフォールド種の発現制御機構の解明を進め、これまで蓄積した結果と合わせて誌上発表を目指す。その上で、TDP-43によるTRG遺伝子の発現制御や、TRGによるTDP-43由来ミスフォールド種除去を模似する低分子のスクリーニングを進め、治療薬候補の検索を進める。孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病巣部では、核蛋白質であるTAR DNA binding protein of 43KDa (TDP-43)が核から消失し細胞質内で凝集する事が報告され、TDP-43の機能低下が孤発性ALSの発症要因の一つである事が強く示唆されて来た。私はこれまでに、ALS病態における細胞内メタボリズムとりわけ小胞体環境やオートファジーの変化に着目し、TDP-43により発現制御を受ける遺伝子TDP-43 regulated gene(TRG、仮称)を同定し、ALS発症における分子学的位置づけの解明を進めてきた。平成29年度は、当初の計画通り、1)培養細胞並びにマウス胎仔大脳皮質における野生型及び変異型TRGの強制発現及びそれに伴う表現型の解析、2)新規TRG結合蛋白質の解明、以上2点の研究を中心に解析を進めた。この内、一過性にTRG遺伝子を強制発現させた細胞を用いた生化学的解析から、TRG蛋白質は、TDP-43によりその遺伝子発現が制御されるのみならず、TDP-43そのもの、とりわけ分子内システインブリッジ形成に必須なシステイン残基をセリンに置換しmisfoldingを誘導したengineered misfolded TDP-43 (emTDP-43)に非常に強く会合する事を見いだした。また、emTDP-43によるALS様封入体をHEK293A細胞で再構築し、内在性TRG蛋白質の局在を調べた結果、TRGはemTDP-43陽性凝集体と共局在し、凝集体の一部として存在する事を明らかにした。更に、ALS病巣ではTDP-43が限定分解を受け、そのC末断片が強い病原性を発揮する事が示唆されているが、TRGはこのC末断片とも強く結合する事を見いだした。当初の報書計画通り、新規TRG結合蛋白質の同定や強制発現に伴う表現型の解析が進んでいる事から、昨年度の進捗は概ね順調に進展していると判断した。

本研究は、TRGの分子性状並びに機能を明らかにし、ALS発症における位置付けを明確にすることを目的としている。平成30年度は、1)特異抗体を持ちいた免疫組織学的解析から、TRG発現パターンはマウスから、サル、ヒトに至るまで比較的保存されており、特にALSの標的細胞である脊髄運動ニューロンで強く発現している事、2)TRGはミスフォールド化した全長TDP-43、及びALS病巣で観察されるN末側がタンパク質切断により欠損するC末フラグメントに結合し、これらミスフォールド種のユビキチン化を誘導する事、3)C末フラグメンの大部分は、難溶性タンパク質として存在するが、TRGはこの難溶性フラグメントの除去に重要な役割の担っている事を明らかにした。TRGの発現がTDP-43により制御されているのみならず、TRG自体もTDP-43由来のミスフォールド種のtrunoverを制御し得る結果を培養細胞の過剰発現の実験から得ることができた事は大きな進展であるが、TRG機能欠損変異体の効果や、遺伝子欠損細胞の表現系との整合性がまだ完全に解明できておらず、また、モデル動物やALS患者標本の染色結果を出すまで至らなかった事から、研究はやや遅れている判断した。TRGはTDP-43による発現制御を受けるにとどまらず、正常な構造を大きく逸脱したemTDP-43や野生型TDP-43の病原性に関わるC末断片に選択的結合する事から、孤発性ALSの病態に大きく関与する事が強く推測された。今後は家族性ALSとの関連性にも着目し、家族性ALSの原因となるTDP-43の変異体や、Superoxide dismutase 1、Fused in Sarcome等その他の家族性ALSの原因遺伝子産との関連についても培養細胞を用いた研究を進めつつ、ALS患者標本のTRGの発現を免疫組織染色により解明する予定である。それに加えて、当初の計画に記した通り、TDP-43によるTRG遺伝子発現制御の分子機構の解析並びにTRG遺伝子発現安定化因子の検索を進める事により、TRGを標的としたALSの治療法に関わる研究を進める。今年度は、ALSモデル動物や患者標本を用いたTRGタンパク質の発現を免疫組織学的に進め、ALS発症におけるTRGの位置付けを組織学的見地から検討を行う。また、TRGによるTDP-43由来ミスフォールド種の発現制御機構の解明を進め、これまで蓄積した結果と合わせて誌上発表を目指す。その上で、TDP-43によるTRG遺伝子の発現制御や、TRGによるTDP-43由来ミスフォールド種除去を模似する低分子のスクリーニングを進め、治療薬候補の検索を進める。年度内に予定していた学会発表を取りやめた為、8万円程の未使用額が生じた。新年度の研究の方向性から、試薬・消耗品の増加や研究関連機器の購入が見込まれる事から、繰り越した8万円はこれら研究関連の物品費に全額使用する予定である。計画していた鶏での抗TRG抗体の納期を、免疫のスケジュールから平成31年4月に設定した為。
法整備の包括的枠組み(2)司法制度改革の現状と課題

近年、社会主義体制から市場経済体制に移行しつつあるアジア諸国は、市場経済化に相応しい法体制を整備するために、外国とりわけ日本の知的・人的支援を求めている。日本政府は1996年以降、ベトナム、ラオス、カンボジアなどに対する法整備支援を開始したが、その法整備支援の実際のなかで、法整備支援の理念とは何か、どのような法分野に対して支援を行うべきか、というような基本的な諸問題が問われてきた。本領域研究においては、実際に行われつつある法整備支援事業を学問的に検討し、法整備支援学の構築を目指してきた。本班では、アジアの体制移行諸国の法整備、司法制度改革の現状と課題を、土地私有・利用をめぐる問題を通して解明することを目標とし、アジア諸国の学術機関との共同研究、国際シンポジウムの開催、現地調査の実施などを行ってきた。これらの研究の過程で明らかになった問題や研究成果を報告書『法整備支援と市場経済化(土地と利用)』(戒能通厚、松本恒雄、糊沢能生編)として刊行した。本書は、ベトナムおよび中国における土地利用をめぐる法律問題の現状と課題を明らかにしたものである。今後、これらの成果を踏まえて、さらなる研究が展開されることが期待される。非法律的で複数中心的な政策決定の問題に裁判所がいかに対処すべきかいう問題は、「市場経済への移行国」では中心的な課題ですらある。グローパリゼーションの下での司法改革とは、要するにローカリティの再発見であり、グローパリゼーショーンによって破壊されていくものの復元とそれの社会への埋め戻しに重点を移動すべきであり、その意味ではグロパリゼーションとは逆説的コンテクストでの考察を必要としている。自国法への反省的契機と法整備支援のパラダイム転換に向け、これまでの法整備支援の到達点をベトナムにそくして研究協力者から報告を受けた。立憲主義的な枠組の中に伝統的価値体系を併存させている「オセアニア方式」がこの関連で注目されるが、これからの法整備支援においては、これにも依拠しつつ人権観念の脱国民国家化や総じて国民国家型統治様式の正統性の揺らぎの反面で展開する多中心主義的な法の機能の探求に向けた考察を深化させていく必要がある。人権や価値体系の問題は避けて通るべきではないが、そのための方法論的検討を行っている。さらに法整備支援を学問的ディシプリンとして植立する必要があることから比較研究に着手している。ここから、法と政治の関係、固有法と移植法、伝統と近代の二項対抗形式の考察だけでなく、それ自体が対象国の社会に内在するシステムに対応できる「等身像」の枠組が必要であるとの認識が生まれつつある。以上の問題意識から法整備支援に一定の方法論的蓄積があるオーストラリアのシドニー、メルボルン、オーストラリア国立大学の法学部等において意見交換と今後の研究上の協力を求めるための打ち合わせを行った。また早稲田大学比較法研究所とも共同しつつこの研究のための拠点とするためのコンピュータ整備等を行った。研究協力者の協力を得て目下、ベトナムに関しての法整備状況と慣習法の関係を調査するための準備的な検討を行っている。市場経済化の影響に伴う「体制移行国」において司法がどのような条件と社会の構造変容に規定されつつ生じてくるかの問題に、「司法改革」の「発生論的」分析は帰着しよう。そこには社会主義システムの構造を維持しようという「政治力」と、権利実現システムに純化しようとする司法の「権利形成力」が複雑に絡み合う関係が認められるのであり、しかもこの対抗においてしばしば、当該社会に伝統的に内在していた「伝統力」が、前者を補完する関係で現れつつ、未だ個人が法主体たり得ていない当該社会で、それはまた、「権利形成」促進的にもその逆にも作用する。このような観点から、今年度は、現在、民法典の改正作業が本格的に展開しているベトナムにおいて、土地法が認める土地使用権について調査研究を実施した。すなわち、「政治力」と「権利形成力」および「伝統力」の相互の関係を具体的に探り、市場経済化によって司法がベトナムの固有の文脈においてその自立性を確立する可能性を探ることにしたのである。

そしてhousehold単位に認められた土地使用権がとりわけ都市部において高度に商品化し、「政治力」に抗して使用価値支配的にではなく、たんに交換価値支配の権能に転じていくとき、司法が未だなお「政治力」の下にあって自立性をも持ち得ていない状況下で発生する「土地問題」の固有の論理を解明しようと試みた。ことに、人民委員会(行政ないし政治)と人民裁判所の管轄権やその相互の関係が司法改革の大枠における進展といかなる関係を有するかを見てきたわけであるが、ここで地域的な住民の共同性を担保するものが、社会主義的なシステムに代わって生成する可能性があるか否かを解明することの重要性が明らかになった。司法改革が住民主体の地域性と結合する可能性はほとんど認められないが、土地使用権の「私権化」の確立のありようによっては、両者の結合が生まれる可能性は皆無ではないであろう。今年度はベトナムにおける土地使用権と司法改革の関連性を追求した。このため、中国、ロシア、ウズベキシタンなどの中央アジアの諸国における土地法の改革について専門家からのヒアリングを実施し、昨年末には、ハノイでベトナム国家と法研究所との共催シンポを開催、また、カントー大学のディエン教授との間で農地関連でのセミナーを開催し、多くの成果を得た。そもそも、「法整備支援」の課題は、今日、世界の様々な地域で活発な論議が行われている法の移植や法の「共通化」といった課題と密接に関わっている。例えば、1900年にパリで開かれた比較法国際会議を記念して各地でその100周年記念の行事がいくつか行われたが、連合王国のケンブリッジ大学で開かれたその一つの国際会議では、法の普遍主義的な立論の伝統と法の機能主義的な立論の伝統という相反的な立場から興味深い論議が行われているが、nation stateの揺らぎのなかで、法を改めて異なる社会における機能的な等価物として論じる立場が有力に打ち出されている。もっとも、法の移植の可能性がすぐれて現代的なコンテクストで論じられるようになったのは、言うまでもなく、冷戦構造崩壊後の世界を席巻する「市場」化の故である。この研究が「司法改革」という主題を土地における事実上の私権の成立を意味する土地使用権との関係で論じるのは、それが、体制移行国に展開する「市場化」の直接的な反映を論じるのに適合的であるとの想定からであるが、「市場化」によって加速される市場媒介法の「普遍化」とともに、その機能的等価物が必ずしも当該の社会に受容されることにならない側面に注目したいからでもあった。ハノイシンポではこのような課題を論じた。法整備支援とは、資本移転のための法の平準化・共通化という「戦略的」課題への対応という側面を有するが、「法整備支援」につきまとう一方向的「援助」という視点ではなく、法の移植に関わる問題を双方向的に捉えつつ、比較法学による「総合化」がなされる必要がある。その際、ヨーロッパにおける法の調和的発展が「人間の尊厳」を価値的な基盤として展開しつつあることが、批判的視点を含めて参照されるべきであろう。この意味ではこの課題は、ヨーロッパ発信の比較法学の「普遍主義的」潮流の延長にあるが、比較法の理論の関係では、法と社会との全体的、部分的、断片的なカプリングの有り様にしたがって法の移植は可能である場合とそうでない場合があるのであって、一義的な説明は適切ではないであろう。また、そこでは歴史・地域研究の成果とそれとの協働が不可欠となるのであって、わが国ではその面でユニークな理論を構築できる研究上の基盤がある。
神経系,筋肉,循環器,呼吸器など各種疾患における睡眠呼吸障害の実態に関する研究

アプノモニタ-による睡眠呼吸障害のスクリ-ニングは、従来法による精密睡眠ポリグラフィ-法による成績との比較検討により、睡眠無呼吸の頻度を検出する方法として、多くの症例ではほぼ一致した成績がえられたが、症例によって多かったりあるいは少ない結果がえられることがあり、臨床診断上にかなり問題の多いことが判明した。試作睡眠呼吸障害スクリ-ニング装置は、パルスオキシメ-タ-による酸素飽和度およびサ-ミスタ-による両鼻孔と口の呼吸気流を連続記録できる装置として組んだ。一応臨床応用の可能な装置を作成し、各種症例について検討した結果、睡眠無呼吸の検出がより正確であり、かつ無呼吸を伴わない睡眠呼吸障害(酸素飽和度の低下)を検出できるため、臨床応用上の価値が高いことが判明した。しかし、パルスオキシメ-タ-を組み入れたために携帯性において問題があり、外来患者にまで広く応用するにはなお改良の余地があり検討を要することが明かとなった。今後さらに、臨床応用の拡大、対象症例の集積とともに携帯性の優れた試作装置の完成に向けて研究を継続したい。酸素飽和度の測定の項目に取り入れた睡眠呼吸傷害のスクリーニング検査を多数の症例を対象として実施し、各種の基礎疾患における睡眠呼吸傷害の実態解明を行う予定であったが、作成した検査システムの臨床検査における応用段階での調整作業に手間取り、本年度はあまり多数の症例についてデータを得ることはできなかった。まずアプノモニター(チェスト社製)のスクリーニング検査への応用について検討した。本装置はサーミスターによる鼻孔における呼吸気流と頚部気管部皮膚面に装着したアイクロフォンによる呼吸音をピック・アップし、両者の10秒間以上の停止をもって無呼吸として検出するように作られた睡眠無呼吸検出の精度、有用性を検討するために、従来の睡眠ポリグラフィーの成績と比較検討した。症例1は58歳の女性で肥満と日中傾眠を訴え、中枢型と閉塞型の無呼吸が混在して認められた症例である。症例2は51歳の男性で、子供の頃から睡眠中の鼾が激しく、約6年前に急性呼吸・循環不全を起こし、気管内挿管と人工呼吸によって救命し得た重症の閉塞型睡眠無呼吸の症例である。その結果、症例1では無呼吸回数、無呼吸指数がそれぞれ従来法で391(回)、52.5(回/時)、アプノモニターでは402、53.9と比較的よく一致したが、症例では2では同じく従来法では324、48、アプノモニターでは111、16.4と大きく差が認められた。症例によって問題点のあることが判明した。さらに、閉塞型睡眠無呼吸6例、混合型睡眠無呼吸2例、じん肺症1例、陳旧性肺結核症1例、慢性肺気腫2例、神経・筋疾患2例、その他12例について従来法による検討を中心として実施した。次年度は本年度作成したスクリーニング検査装置を用い、できる限り多数例のデータを集め、睡眠呼吸傷害の実態解明に努める予定である。アプノモニタ-と精密睡眠ポリグラフィ-を睡眠無呼吸症候群(SAS)2例と肺気腫1例に対して同時に実施した。両装置の成績を比較すると、おおむねアプノモニタ-でも無呼吸をよく検出するが、全く一致しない症例も認められた。さらに当然ではあるが無呼吸を伴わない酸素飽和度低下を検出することができないことが判明した。試作睡眠呼吸障害スクリ-ニング装置(試作装置)は、パルスオキシメ-タ-によるSaO_2およびサ-ミスタ-による両鼻孔と口の呼吸気流を一括して連続記録できる装置を組んだ。SASI例と肺結核後遺症(右胸郭成形術後)1例を対象として精密睡眠ポリグラフィ-と同時に実施した。両装置の成績を比較すると、無呼吸に関する成績はよく一致した。さらに試作装置は酸素飽和度低下に関する成績が得られるため、アプノモニタ-ではできなかった無呼吸以外の睡眠呼吸障害の検出もできた。かつ精密法の結果と極めて良好な一致を示した。試作装置とアプノモニタ-による検査を、正常者5例、SAS疑い13例および無呼吸を伴わない睡眠呼吸障害疑い5例を対象として実施した。正常者群の成績は、両装置ともよく一致していた。SAS疑い群では10例が実際にSASであり、診断については両装置間で一致していた。しかし、無呼吸回数ないし無呼吸指数を個々に検討すると、アプノモニタ-では無呼吸中に拾う雑音(体動によるものと思われる)を気管音と誤認するために無呼吸を過小評価し、あるいは逆に長く続く低換気を無呼吸と認識して過大評価したと推定される場合が認められた。

さらに、当然ながら試作装置では無呼吸を伴わない酸素飽和度の低下も感知するため、無呼吸以外の睡眠呼吸障害の検出が可能であることが判明した。対象症例数がまだ少なく、また試作装置のさらに小型軽量化などの課題も残しており、今後も研究を継続して実施する予定である。
骨芽細胞インスリン様増殖因子遺伝子の発現と使用プロモーターの変動

ヒトインスリン様増殖因子(IGFs)遺伝子の発現と使用プロモーターの変動に対するRNase保護アッセイ(RPA)法による定量解析法の開発が、マウス骨芽細胞株を用いる当初計画を一部変更して、ヒト軟骨肉腫由来軟骨様細胞株HCS-2/8で試みられた。当申請研究の主目的であるRPA用のプローブ作製は、IGF-2の4種のプロモーター(2P-1, 2P-2, 2P-3, 2P-4)のうち2P-2以外に対して、IGF-1の2種のプロモーターに対して、それぞれ成功した。現在、それらのプローブを用いたRPA法の適用範囲、限界を骨芽細胞、軟骨細胞等で調べている。また、転写産物の非常に少量であった2P-2のPCR産物を集積しており、クローニングに必要な量になり次第そのプローブ作製を行う予定である。今回の開発研究に関連した基礎的研究で以下の新事実を究明、発見し、現在それらの論文を作成中である。1. IGF-2の4種のプロモーターの同時発現をHCS-2/8、ヒト正常軟骨細胞において初めて見いだした。2. HCS-2/8のIGF-2の2P-4からの転写産物の複写開始点のすぐ上流の4塩基の欠損を見いだした。この欠損は染色体レベルでは起こっていなく、おそらくその肉腫由来細胞での特異的な選択的スプライシングに起因した欠損であるものと思われる。3. HCS-2/8とヒト正常軟骨細胞の比較において、ともにインプリンティング遺伝子であるIGF-2とH19(癌抑制遺伝子)のそれぞれの発現量の間にパラレルな相関関係が存在していた。4. HCS-2/8のIGF-2の制限酵素断片長多型の研究は、インプリティング型母親アレルはなく、父親由来のアレルだけの存在を示していた。このことが、軟骨肉腫形成に関連していると思われる。インスリン様増殖因子(IGF)遺伝子発現の際に、特にIGF-II遺伝子では種特異的・時期特異的にエクソン使い分けによるプロモーター変動が起きている。IGF-II遺伝子での4個のプロモーター(IIP1,IIP2,IIP3,IIP4)およびIGF-I遺伝子での2個のプロモーター(IP-1,IP-2)が同時発現する骨系細胞を使ってプロモーター変動に対する定量的解析法をRNase Protection Assay(RPA)を用いて確立すること(本年度)とその方法を骨肉腫・軟骨肉腫に適用して臨床検査的応用の可能性を検討すること(次年度)とが本申請研究の目的であり、次のような本年度の結果を得て学会発表(第36回基礎歯科医学会学術大会・総会、第36回日本生化学会中国四国部会例会)と雑誌への投稿を行った。(1)IGF-II遺伝子のIIP1プロモーターが欠損するマウス骨芽細胞から4個のうちの3個の対応したプローブを作る最初の計画を変更してヒト軟骨肉腫由来HCS-2/8細胞から予定した4個のプロモーター領域のRT-PCR産物すべてとIGF-I遺伝子での2個のプロモーター領域のRT-PCR産物を得ることができた。(2)それらのRT-PCR産物のうちIIP2に対応したしたもの以外はすべてそのシークエンス解析から目的のものが得られていることを確認した。IIP2に対しては、再度,RT-PCR産物から検討しなおしている現状である。(3)IGF-II遺伝子およびIGF-I遺伝子に対するIIP2以外のプロモーターに対するプローブを作製し、現在、それらを用いてRPA法による定量的解析法を検討中である。

さらに、上記のIGF-II遺伝子での4個のプロモーター発現と関連したその遺伝子のインプリンテイングの問題において、ヒト軟骨肉腫由来のHCS-2/8細胞で発現している各種プロモーターに対するアレル(alleles)の組み合わせは正常細胞に見られるような組み合わせ(Vu and Hoffman:Nature 371,714-717,1994)とは少し異なったパターンが観測された。この問題は次年度の臨床検査的応用の可能性の検討においての主要なテーマの一つであるので、現在、各種の細胞株あるいは組織での比較実験を準備中である。マウス骨芽細胞株(MC3T3-E1)、ヒト軟骨肉腫由来軟骨細胞様培養細胞株(HCS-2/8)等を用いてインスリン様増殖因子(IGF)遺伝子発現でのエクソン使い分けに基づいたプロモータ変動に対する定量的解析法を確立し、その方法を正常軟骨細胞、骨肉腫、軟骨肉腫に適用して比較検討したところ以下のような結果が得られ、臨床検査的応用の可能性も多いにあるものと思われる。それらの結果を学会で発表するとともに現在論文投稿準備中である。2)マウス由来MC3T3-E1からのIGF-II遺伝子の発現はP-1を除く3個のプロモータからであったが、ヒト正常軟骨細胞からはHCS-2/8細胞と同様に4個のプロモータから発現しているという新規の事実を見い出した。HCS-2/8細胞と比較するとヒト骨肉腫由来SaOS細胞からの発現はごくわずかであったが、4個のプロモータから発現していた。(第13回日本骨代謝学会抄録号(1995)13(2),307)。2)HCS-2/8細胞からのIGF-II遺伝子の全体的な発現は、ヒト正常軟骨細胞からの発現よりも約5倍近くであった。その各プロモータからの内訳は、P-2では正常軟骨細胞の方が多かったが、P-1,P-3,P-4では軟骨肉腫由来のHCS-2/8細胞の方が数倍から10倍多かった。(第68回日本生化学会大会発表抄録号(1995)67(7),670)。3)軟骨細胞の増殖分化に関与するアスコルビン酸のIGF-II遺伝子発現に対する効果は、P-1,P-2,P-3,P-4のすべてのプロモータで1.2倍から1.5倍程度の発現増加を示していて、全体的には約1.8倍であった。(第18回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集(1995)p446)。