hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイルス病原性・細胞傷害性・持続感染樹立能の分子基盤と分子機構

4持続感染細胞は抗インターフェロン活性を有しない事が明らかになり、HPIV-L4はパラミクソウイルスでは抗インターフェロン活性を有しない唯一のウイルスである。パラミクソウイルスは自然宿主において持続感染することが多い。私たちはセンダイウイルスを用い、その持続感染成立の初期過程を解析し、持続感染成立の分子機構を明らかにしてきた。しかしながら、持続感染成立の初期過程の解析はセンダイウイルスの場合を除いて殆どされていない。センダイウイルスで得られた結果が普遍性を有するかどうかを確認する為にルブラウイルス持続感染細胞系を用いて,その成立過程を解析した。1)Mumpsウイルス、hPIV2(東芝株とCA株),SV5(WR株とT1株)、及びhPIV4A&4B持続感染細胞を樹立した。2)持続感染成立過程は多様性を示し、少なくとも5つに分類することができた。3)持続感染(Steady state)樹立効率を定量化する方法を確立した。4)ウイルスの持続感染樹立効率にはウイルス間で大きなばらつきがあった。5)hPIV2(CA株),SV5(T1株)及びhPIV4A&4B感染細胞は速やかにSteady stateの持続感染細胞が成立する。6)hPIV2(東芝株)およびSV%(WR株)感染細胞をそのまま継代培養すると,比較的速やかに持続感染細胞が成立するが、成立した持続感染細胞はSteady stateとCarrier stateのmixtureであった。7)センダイウイルスのM蛋白もF蛋白も持続感染成立の寄与していることを明らかにした.一方、意外なことに、HN蛋白はnegativeに作用していた。8)インターフェロンの持続感染樹立効率にたいする効果を定量的に解析したところ、インターフェロンの樹立効率増強作用が確認された。以上のように、持続感染成立過程の多様性が明らかになったので、今後その分子基盤について解析をする予定である。
既存木質建築物の残存性能評価法と耐力再生法の提案

既存の木造建築物が腐朽やシロアリなどの生物劣化を受けたのちにどれほどの耐震性能を有しているかを評価することを目的とし、その評価に必要な木材、釘や木ねじなどの接合部、耐力を負担する壁などが生物劣化を受けた場合にどれほど残存性能を有しているかに評価した。また、この残存性能を診断機器を用いて評価できるようにするための指標づくりや補修する際に必要となる生物劣化を受けた木材に新たに打ち込んだ接合部の性能評価などをおこない、データの蓄積をおこなった。その結果、木造建築物の残存性能を評価するために必要なデータベースが構築され、建物全体の評価も可能となった。住宅の超長期使用への取り組みの主要な構造形態の一つは木質構造である。木質構造の長期使用において、木材や木質材料の生物劣化と強度に関する評価が重要であるが、その体系的な研究例は少なく、また木造住宅や大規模木造で多く使用されている接合金物を用いた場合の生物劣化と接合部強度に関する研究例も少ないのが現状である。そのため、これらのデータの蓄積、診断・取替えの判断基準の確立、そしてシミュレーションによる木造建築物の残存性能の評価などの研究を体系的に推し進めることを目的としている。そこで、本研究では、課題1から4を設定して、この問題に対応している。本年度は、課題1として、既存の耐震診断プログラムに、生物劣化を仮定した荷重変形関係を接合部、耐力壁の値に入れることで、劣化をどこまで評価できるかについて検討し、耐力低下には耐力壁の値が占める割合が大きいことを明らかとした。今後、この耐力壁低下のモデル構築が重要となること、また課題2で準備を進めている耐力壁および接合部の劣化試験体との整合性を取ることが重要となることが確認された。課題2では実大試験体の生物劣化を始めており、試験体がある劣化状態になったところから随時試験を実施する予定である。課題3では、既往の文献調査をおこなっているが、事例が少なく、劣化した木材に新たに接合具を用いた場合についての実験的な評価が必要なことがわかった。課題4では、調査物件2棟しか得ることができなかった。来年度は、もう少し多くの事例を集められるようにしたい。特に、課題1について、実験データの再整理を実施したことで、劣化した場合の耐力低下を盛り込んだ耐震性能評価に関する検討が進んだ。また、生物劣化を受けた接合具単体の耐力推定に関する結果も蓄積できたので、これらを組み合わせて、生物劣化を受けた木造の耐震性能に関する研究をより進めていきたい。木質構造の長期使用において、木材屋木質材料の生物劣化と強度に関する評価は重要であるが、その体系的な研究例は少なく、また木造住宅や大規模木造で多く使用されている接合金物を用いた場合の生物劣化と接合強度に関する研究例も少ないのが現状である。そのため、これらのデータの蓄積、診断・取替え判断基準の提案、そしてシミュレーションを用いた現状評価などの研究を体系的に推し進めることを目的としている。そこで、本研究では、課題1から4を設定し、問題に対応している。本年度は、昨年度に引き続き、課題1として、既存の耐震診断プログラムに、生物劣化を仮定した荷重変形関係を入力するための接合具モデルの製作をおこなった。生物劣化の種類や状態により、荷重変位の関係に大きな違いがあることがわかった。今後、これらを用いて接合全体の評価につなげていく予定である。課題2として、実大の壁モデルとを用いた生物劣化を受けた耐力壁試験を実施した。その結果、ある程度の劣化による損傷は作りだせたが、大きく耐力が減少する試験体はみられなかったが、劣化度を用いて耐力壁性能を掲載したものとそん色ない結果となり、要素からの積み上げで、耐力推定の可能性を得た。来年度は、より耐力低下の大きなものを実施する予定である。課題3として、耐力壁実験時に、耐力要素である合板や筋かいを新しくした場合の実験を実施し、軸材の被害が軽微であれば、耐力がほぼ回復できることが確認された。最後に課題4として、本年度も調査を行う物件を得られず2棟のみの調査となった。そのため、来年度はもう少し多くの建物について実施したいと考えている。特に、課題1と2においては、十分な結果が得られており、今後取りまとめて論文等で報告し、啓蒙していく予定である。課題1については、プログラムを用いた解析および大壁耐力壁計算用のモデル化にも成功した。また、それぞれのモデルの整合性についても検討ができた。ただし、解析結果を活かした建物診断への提案までは進んでおらず、今後の課題である。課題2については、実大耐力壁や接合部の実験を実施することができた。また、課題1で示した耐力壁の計算モデルとの整合性も取れた。被害度の激しいものについては、実施できておらず、来年度へと持ち越しとなったが、もともとの計画通りであるので、問題ないと考えている。課題3については、接合具の結果について論文執筆なども進んでおり、順調である。加えて、耐力の回復方法や取替えの判断などについても知見が蓄積されてきているため、今後論文執筆をおこないたい。課題4については、調査物件をあまり得られず、2件のみにとどまった。この部分については、来年度もう少し力を入れたい。

木質構造の長期使用において、木材や木質材料の生物劣化と強度に関する評価が重要であるが、その体系的な研究例は少なく、また木造住宅や大規模木造で多く使用されている接合金物を用いた場合の生物劣化と接合部強度に関する研究例も少ないのが現状である。そのため、これらのデータの蓄積、診断・取替えの判断基準の確立、そしてシミュレーションによる木造建築物の残存性能の評価などの研究を体系的に推し進めることを目的としている。そこで、本研究では、課題1から4を設定して、この問題に対応している。本年度は、課題1については耐震診断プログラムに入力をするための生物劣化を受けた接合具の耐力モデルのデータベースの構築を図った。課題2については耐力壁が生物劣化を起こした場合の強度特性評価、および釘などの接合部の生物劣化試験を実施し、その低下度合いやデータの収集に努め、耐力壁においては耐力発現に関わる部分の劣化の影響度合いを明らかとし、釘のそれについては木ねじとは異なる性状を示すことを明らかとした。また、合板耐力壁については、軸材料の損傷が大きくない場合には、合板を取り換えることで体力の回復が可能であることを確認した。課題3については昨年度でほぼ調査が終わっているため、今年度は実施しなかった。課題4については、地震被害調査をおこなう機会が得られたため、熊本地域で特に多くの建物調査を実施することができ、水回りと玄関周りに劣化が多くみられること、また1回はリブまで被害が上がったいる場合は隅柱が多いことなどがわかった。これらの事例により、生物劣化個所が一部に集中する可能性があり、建物の返信に関わる可能性が高いことがわかった。今後、本成果で得られた生物劣化を受けた接合具単体、接合部、そして壁を組み合わせた高精度の耐震診断システムの構築に努めていきたい。既存の木造建築物が腐朽やシロアリなどの生物劣化を受けたのちにどれほどの耐震性能を有しているかを評価することを目的とし、その評価に必要な木材、釘や木ねじなどの接合部、耐力を負担する壁などが生物劣化を受けた場合にどれほど残存性能を有しているかに評価した。また、この残存性能を診断機器を用いて評価できるようにするための指標づくりや補修する際に必要となる生物劣化を受けた木材に新たに打ち込んだ接合部の性能評価などをおこない、データの蓄積をおこなった。その結果、木造建築物の残存性能を評価するために必要なデータベースが構築され、建物全体の評価も可能となった。課題1については、耐震診断用のプログラムへの導入を実施し、その結果を学会発表に供した。しかし、使い勝手の良いデータベースの構築まではいっておらず、今後改良を進め、実験データを基にした生物劣化を受けた際の荷重変位の関係のモデル化を進める。課題2については、実大耐力壁および接合部の生物劣化を始めており、予定通りである。今後、試験体の劣化が進んだところで実大強度試験に供する。課題3については、木ねじを用いた接合具の耐力評価について、検討を進めており、学会発表や論文等を執筆し、順調に進んでいる。課題4については、調査物件をあまり得られず2件の調査にとどまったが、文献調査を実施した。今後、より多くの調査ができるよう努力する。研究計画に大きな変更はなく、課題1については、入力方法も簡易になってきたため、より汎用しやすくなるように検討を続けたい。
小学生から高校生における疾走運動の学習指導に関する研究

本研究の目的は,小学1年生から高校3年生における疾走能力やその動作の発達と短距離走の授業の学習効果を明らかにすることであった.その結果は次のように要約される.小学1年生から高校3年生にかけて,疾走能力および疾走動作は,男女ともに形態および機能の両要素の発達によって向上することが示唆された.疾走動作の性差は,女子の方が男子よりも接地中の膝関節の屈曲伸展が大きい動作であることが示唆された.体育授業(中学校)において短距離走を学習した結果,男女とも100 m走タイムは短縮したことが示された.その要因は,男子では全速維持局面,女子では全力疾走および全速維持局面の疾走速度が向上したことであった.本年度は、高校生を対象として、疾走能力の水準を把握するために50m走中における全力疾走フォームを撮影した。また、一方では、体力要素の一つである瞬発力(立幅跳)もあわせて測定した。そして、両者の関係から、体力水準に相当した疾走能力を検討した。男女の50m走タイムを約20年前のものと比較すると、男女とも走タイムは、本研究で実施した生徒の方が遅いものであり、走能力の低下があることが示唆された。今後は、その要因について検討し、具体的な指導方法について提言するための知見を得る予定である。本年度の研究成果は、次の2つに分けることができる。1)男女中学3年生に短距離走の授業を実施し,授業前後における100m走の疾走能力を比較することによって,短距離走の適正距離について検討した.その結果は,次のように要約できる.加速疾走局面は,授業前後において男女ともスタートから20mであった.全速疾走局面は,男子では授業前が20ー50m区間,授業後が20ー60m区間であり,女子では授業前が20ー40m区間,授業後が20ー50m区間であった.全速維持局面は,男子では授業前が50ー100 m区間,授業後が60ー100 m区間であり,女子では授業前が40ー100 m区間,授業後が50ー100 m区間であった.最高速度を100 %とした時の相対速度が95 %以上で疾走している区間は,男子では授業前が60ー70 m区間,授業後が70ー80 m区間,女子では授業前が50ー60 m区間,授業後が60ー70 m区間であった.また,同年代の中学生スプリンターの100 m走タイムに相当する一般中学生の疾走距離は,男子が80m,女子が70mであった.2)一般中学生を対象として,100 m疾走中の30 mと80 mの両地点における疾走能力および疾走動作をキネマティクスの観点から比較することによって速度低下の原因に関する知見を得た.その結果は次のように要約される.男子では,疾走速度とピッチは80m地点の方が30m地点よりも有意に低下し,女子では疾走速度とピッチ,ストライドおよびその身長比は有意に低い値であった.30 mと80 mの両地点において,男女とも疾走速度と脚全体の最大スウィング速度と正の相関関係が認められた.男女ともに脚全体の最大スウィング速度は,80 m地点の方が30 m地点よりも有意に低い値であった.本研究の目的は,小学1年生から高校3年生における疾走能力やその動作の発達と短距離走の授業の学習効果を明らかにすることであった.その結果は次のように要約される.小学1年生から高校3年生にかけて,疾走能力および疾走動作は,男女ともに形態および機能の両要素の発達によって向上することが示唆された.疾走動作の性差は,女子の方が男子よりも接地中の膝関節の屈曲伸展が大きい動作であることが示唆された.体育授業(中学校)において短距離走を学習した結果,男女とも100 m走タイムは短縮したことが示された.その要因は,男子では全速維持局面,女子では全力疾走および全速維持局面の疾走速度が向上したことであった.本年度の目的は,一般中学生を対象として,30 m地点における疾走能力および疾走動作をキネマティクスの観点から分析することによって疾走動作の特徴を明らかにすることであった.その結果は以下のように要約される.1)疾走速度,ピッチ,ストライドよびその身長比は,男子では7.55±0.36m/s,4.29±0.32Hz,1.77±0.12,1.05±0.07,一方,女子では6.31±0.36m/s,4.00±0.30Hz,1.58±0.10,1.01±0.05であった,また,疾走速度と有意な相関関係がみられたのは,男子ではピッチ,女子ではピッチとストライドの両方であった.2)疾走速度と有意な相関関係にあった動作要因は,離地時の股関節角度(r=-0.402),膝関節の最大伸展角速度(r=-0.466),全体の最大スウィング速度(r=0.432)であり,女子では,最大膝引きつけ角速度(r=0.526),最大腿上げ角速度(r=0.476)および最大振り戻し角速度(r=0.666),接地中の足関節最大屈曲角度(r=0.412),股関節の最大伸展角速度(r=0.501),膝関節の最大伸展角速度(r=-0.432)

脚全体の最大スウィング速度(r=0.797)であった.以上のことから,一般中学生の疾走速度は,男子では,ピッチ,女子では,ピッチとストライドと関係があること,また動作要因では,男女とも脚全体の最大スウィング速度との間に相関があることが示唆された.本研究では、体力低下が指摘されている運動能力、とくに基礎的運動である50 m走を取り上げ、過去(1980年代)と現在(2000年代)の小学生から高校までの子ども達の疾走能力を比較し、発達バイオメカニクス的観点から、その能力の低下となっている要因を明らかにすることである。このことによって、小学生から高校生までの走運動の学習指導やスポーツのコーチングに役立てようとするものである。1)研究1疾走能力の横断的発達2)研究2走運動の学習効果研究1の結果から、小学1年生(7歳)から高校3年生(17歳)にかけて、疾走能力および疾走動作の発達は、男女ともに形態的な発達と機能的な発達の両要素によるものであることが示唆された。また、男女の疾走動作は、女子の方が男子よりも接地中の膝関節および足関節の屈曲伸展が大きい動作であることが示唆された。また、1980年代と本研究の子どもたちの疾走能力において、疾走中の支持時間が本研究の子どもたちの方が長くなっていることが明らかとなった。このことから、疾走動作が十分に習熟していないことが示唆された。研究2の結果から、中学3年生を対象として8時間の短距離走の授業によって男女とも100 m走タイムの学習効果を検討した。その結果、男女ともその学習効果が認められたことが明らかとなった。また、男子では全速維持局面、女子のでは全力疾走および全速維持局面の疾走速度を高めることができ、大きな効果があったことが示唆された。一方、連続写真を活用した学習では、「動作のポイント」の内容によって学習効果がみられた局面とみられなかった局面があり、その内容を十分に吟味して行うことが重要であると考えられた。発育発達本研究では、小学生から高校生までの疾走能力の発達をとらえ、その現状から現在の子どもたちの走運動指導の具体的な方法を提案することを目的としている。原時点では、小学生と高校生については、データを収集できているが、中学生についてはまだ、十分なデータが収集できていない。25年度は中学生を中心にデータ収集することと、データ分析を進める予定である。小学生から高校生までの疾走能力に関するデータは、ほぼ収集することができた。データ分析についても、小学生や中学生についてはおよそ順調に進んいる。また、中学生の結果については、学会誌にも公表することができた。平成23年3月の震災により、一時研究が滞ったが、少しずつ回復しつつ、実験を計画していた学校ではできなかったが、代わりの学校で研究を進めることができた。現在は、おおむね進展しているといえる。25年度は、中学生を対象にデータ収集を行う。加えて、できれば小学生についてもさらにデータを収集できればと考えている。分析が終了したものについては、テーマごとにまとめ、学会誌などに発表する予定である。26年度は、最終年度となる。データ収集は、すでに終えることができたので、引き続き、データの分析を進める。そして、小学生から高校生までの疾走能力の特徴を横断的に明らかにすることによってその指導方法に関して言及する予定である。学校種や被験者数を増やして今後取り組んでいきたい。研究に必要な消耗品やデータ分析に伴う謝金などの使用予定である。実験に必要な機材の購入と実験を手伝ってもらったり、分析に協力してくれる験者などの謝金などに使用する予定。
脂肪性肝疾患の肝線維化におけるB細胞活性化因子の役割

本研究は、脂肪性肝疾患の治療戦略となる病態の中で肝線維化に標的を当てて解析することを目的としている。申請者はB細胞活性化因子(BAFF)がインスリン抵抗性を誘導するアディポカインであることを見出し、脂肪性肝疾患の肝脂肪化と肝発癌に関与することを明らかにしてきた。今回の研究では、BAFFの脂肪性肝疾患の肝線維化への役割について、ノックアウトマウスを用いた動物モデルや細胞を用いて明らかにする。現在までの研究結果から、脂肪性肝疾患に対するBAFFの肝線維化への関与については、1.BAFFの肝星細胞への直接作用、2.肝脂肪化、肝細胞障害による細胞死、細胞ストレスから生じる星細胞活性化促進因子の産生、3.免疫担当細胞による産生されるサイトカイン、活性酸素などの影響、等の機序が想定される。本年度は1.肝星細胞の単離を行い、BAFF受容体の発現を行った。現在のところ星細胞でのBAFF受容体発現はみられないため、星細胞への直接の関与は考えにくい可能性がある。2.脂肪酸を負荷してマウス初代培養肝細胞の脂肪化誘導モデルを作成した。3.肝線維化モデルとして、四塩化炭素投与マウス、高脂肪食コリン欠乏メチオニン減量飼料投与マウスを作成した。これらのマウスモデルにおける肝線維化定量や機序の解析を行っているところであり、基礎データを集積している。また、現在はBAFFノックアウトマウス、BAFF受容体ノックアウトマウスを用いて上記モデルを作成中である。本年度行う予定であった基礎データの解析は比較的順調に経過している。来年度以降に行う予定のノックアウトマウスについても実験に供する状況が整えられた。C57BL/6マウス、BAFF-KOマウス、BAFF-R-KOマウスを用いて肝線維化モデルおよびNASHモデルを用いて、肝組織像を解析するとともに、各群の肝臓を用いて星細胞活性化、細胞ストレス、細胞死について検討する。また、各群の肝内浸潤細胞をFACSで解析するとともにマクロファージにも着目して検討を行っていきたい。また、最終的には臨床検体を用いた検討も予定しており、脂肪性肝疾患の診断や治療への臨床応用に展開する上での基盤となる研究成果を得られるように努力していきたい。遺伝子解析の一部が来年度に持ち越しになったために、次年度使用額が生じることとなった。次年度に行う遺伝子解析に充てる予定としている。
計算機シミュレーションによる核酸立体構造の安定性とダイナミクスの網羅的解析

dGC(GAA)GCおよびループ部の3塩基を置換したDNAミニヘアピン分子について、マルチカノニカル分子動力学法およびLocal Enhanced Sampling(LES)による網羅的な構造サンプリングを行い、核酸ヘアピン構造の安定性の配列依存性を解析した。マルチカノニカル分子動力学法では、GAAループについてアンフォールド状態からフォールド状態への遷移がみられたので、ヘアピン構造形成と崩壊の過程を詳細に解析した。その結果、12塩基から成るRNA4ループヘアピン分子について天然構造から通常の分子動力学シミュレーションによって崩壊を解析したSorinらの研究結果では、ヘアピンの形成・崩壊のパスウェイとして、zipping/unzippingとcompaction/expansionの2種類が提案されているが、dGC(GAA)GCの場合は、compactionによるヘアピンの形成であると結論付けた。また、1,2,6,7番目の塩基対を保持したうえで、ループ部に対してLESによるサンプリングを行った。対象は、安定なdGC(GNA)GC(N=A, G, T, Cの4通り)および不安定なdGC(GAG)GC, dGC(GAC)GCとし、約10nsのシミュレーションを各配列につき数回行った。その結果、安定なdGC(GNA)GCについて天然構造と類似の構造が得られた。また不安定なGACについては、一定の構造に収束しなかった。GAAのrefolding過程を詳細に解析したところ、N=A, G, T, Cによらず、5番目→3番目→4番目の順に塩基がステムの上にスタックする共通のパスウェイが観察され、塩基配列の違いによるヘアピン構造のとりやすさの違いのメカニズムの一端を明らかにすることができた。以上により、計算機シミュレーションにより核酸ヘアピン構造の安定性の配列依存性を解析する基盤を確立した。dGC(GAA)GCおよびdGC(GGA)GCのDNAミニヘアピン分子について、マルチカノニカル分子動力学法で出現確率をフラットにする温度幅を290-600K,290-700K,325-600K,340-500K,350-600Kとさまざまに変えて、アンフォールド状態から構造サンプリングを行い、それぞれの結果を比較することで、最良のシミュレーション条件を探索した。それぞれ数10ns程度のシミュレーションを行い、得られた構造アンサンブルに、ヘアピン構造の中に観測されるステム部の水素結合やloop closing base pairがどの程度形成されているかを解析した。その結果、出現確率をフラットにする温度の下限を290Kにした場合、シミュレーションの途中にエネルギーの谷に落ち込んで、そのままその谷の中に構造がとどまってしまうという現象がみられた。温度の下限を325K以上にした場合は、そのような現象はほとんど起きなかった。また温度の下限を340K以上にした場合は、ヘアピン構造に近い構造がほとんどサンプルされなかった。主なシミュレーション対象と考えているdGC(GNA)GCの4種類の融解温度が60°C以上であることを考え合わせると、低エネルギーのヘアピン構造をサンプリングするためには、温度の下限が高すぎると考えられた。以上より、マルチカノニカル分子動力学法で出現確率をフラットにする温度幅を、325K-600Kと決定した。また、ヘアピン構造を1回形成したdGC(GAA)GCについて、ヘアピン構造形成と崩壊の過程を詳細に解析した。具体的には、水素結合のパターンによって遷移状態を分類し、ヘアピン構造形成と崩壊のパスウェイをみた。12塩基から成るRNA4ループヘアピン分子について天然構造から通常の分子動力学シミュレーションによって崩壊を解析したSorinらの研究結果では、ヘアピンの形成・崩壊のパスウェイとして、zipping/unzippingとcompaction/expansionの2種類が提案されているが、dGC(GAA)GCの場合は、compactionによるヘアピンの形成であると結論付けた。

ヘアピン形成のシミュレーション結果の内容については、インドネシア・バイオテクノロジー・カンファレンス2004(IBC2004)における招待講演で発表した。本年度は、DNAミニヘアピン分子に対して、マルチカノニカル分子動力学法およびLES(Local Enhanced Sampling)法による網羅的な構造サンプリングを行い、ヘアピン構造の安定性の配列依存性を解析した。マルチカノニカル分子動力学法では、前年度で決定したシミュレーション条件(温度範囲:325-600K)を用いて、dGC(GGA)GCに対して200nsのサンプリングを行った。シミュレーション中に天然構造との重原子r.m.s.d.が1.75Åである構造を得たが、主鎖骨格は似ていたものの塩基対の掛け違えが起きた構造であることがわかった。さらに290-800Kでも低温部に至るまでフラットなエネルギー分布が得られることがわかったので、この条件下でdGC(GAA)GCに対して500nsのサンプリングを行い、天然構造との重原子r.m.s.d.が2.14Åである構造を得た。この構造も、主鎖骨格は天然構造と類似しているが、塩基対が完全ではなかった。さらに1,2,6,7番目の塩基対を保持したうえで、ループ部に対してLESによるサンプリングを行った。対象は、安定なdGC(GNA)GC(N=A,G,T,Cの4通り)および不安定なdGC(GAG)GC,dGC(GAC)GCとし、約10nsのシミュレーションを各配列につき数回行った。その結果、安定なdGC(GNA)GCについて天然構造と類似の構造が得られた。refolding過程を詳細に解析したところ、N=A,G,T,Cによらず、5番目→3番目→4番目の順に塩基がステムの上にスタックする共通のパスウェイが観察され、塩基配列の違いによるヘアピン構造のとりやすさの違いのメカニズムの一端を明らかにすることができた。以上の結果は、11月に札幌にて開催された生物物理学会年会にてポスター発表を行い、また現在投稿準備中である。
超解像からin vivoイメージングまで使える酸化ストレス分子マッピング法の開発

本研究では、各酸化ストレス関連分子(以下、ROS関連分子)の存在下でのみ特異的に活性化される生体分子修飾剤を基盤とし、細胞外流出や分子の拡散に左右されずに生体内のROS関連分子の発生を化学種特異的に蛍光マッピングできる新技術の確立を目指す。本手法ではシグナル分子が生体組織へと共有結合により定着するため、組織透明化や固定化等に耐えることが期待できる。また、ROS関連分子応答部位とシグナル分子がそれぞれ構造的に独立しているため、蛍光シグナル分子には近赤外蛍光団から超解像観察用蛍光分子にいたる任意の色素を導入でき、様々な蛍光観察法に対応可能なイメージング技術要素となると考えた。具体的には、強力な求電子剤であるキノンメチドを各種のROS選択的に発生させることで、標的とする化学種が発生している場所の近傍でのみ生体分子と共有結合を形成し、その場に滞留させる分子を設計した。前年度では、スーパーオキシドと二価鉄イオンに対するプローブを合成・評価し、蛍光応答は得られるものの、加水分解反応に伴う背景光の上昇が問題となることを報告した。そこで今年度は、キノンメチド発生部位の構造最適化研究を実施し、加水分解反応を抑え、かつスーパーオキシドとの反応による蛍光応答を確認できた。しかしながら、反応速度が十分でなく、細胞内での機能は認められなかった。さらに、酸化ストレスの根源であり、ごく短寿命なヒドロキシルラジカルを標的とし、より反応速度を追求したプローブ分子の開発を実施し、合成を達成した。一方、生体内鉄の中でも特に活性なヘム鉄を標的としたプローブ分子を開発し、低収率ではあるもののタンパク質への修飾反応を起こすことに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は酸化ストレスに関与する分子種を、化学種特異的に検出し、かつ超解像イメージングやin vivo、ex vivoイメージングにおいても高い空間分解能で観察可能にする技術を開発するものである。当該年度においては、化学種特異的に反応して、活性中間体であるキノンメチドを生成する反応を確立することを目標とし、研究を実施した。まず、標的分子としては鉄(II)イオンとスーパーオキシドを選択した。これまでに当研究室においてはN-オキシドの化学を利用した鉄(II)イオン選択的検出法を開発している。本反応を応用し、鉄(II)イオンとの反応に伴い、キノンメチドの生成とともに蛍光強度が増大する分子を開発した。本分子の鉄(II)イオンとの応答性に関して、蛍光スペクトル変化、HPLCおよび質量分析にて検討した。結果、鉄(II)イオンとの反応に伴い、所望の反応が進行し、蛍光強度の変化も確認できたが、反応速度が非常に遅く、かつ予想に反して蛍光が減弱するという結果となり、生体内での使用には至っていない。一方、スーパーオキシド検出分子については、これまでに報告されているスーパーオキシド蛍光プローブに倣いトリフラートを検出分子部位として利用し、反応に伴い、蛍光の増大とキノンメチドの発生が同時に起こる分子設計とした。これについてはいくつかの類縁体を合成し、蛍光測定、HPLC、およびLC-MSにてスーパーオキシドとの反応について検討した。その結果、反応速度は遅いながらもキノンメチドの生成とともに蛍光が増大する様子が観察された。当該年度の計画では各酸化ストレスプローブ分子のを開発し、その評価までを実施する予定であったが、合成・評価を達成したものが鉄(II)イオンとスーパーオキシドに関するもののみである。また、水溶液中での分解反応や蛍光消光が不十分であったことにより分子の再設計が必要であったことから、他の活性酸素種に関しては未達成である。現在構造最適化を実施しているところであるが、当該計画では次年度に細胞でのイメージングを実施することを計画していたことから、現状を「やや遅れている」と判断した。

今後、現在問題となっている水溶液中での加水分解反応を防止し、かつ標的活性酸素種に対する鋭敏な応答性を達成すべく、分子内の応答性部位の構造展開を実施し、効果的にキノンメチド中間体を生成する反応を見出す予定である。さらに、酸化ストレスに関連する金属種に関してはラジカル反応を経由する生体分子修飾反応の開発を検討し、細胞内で機能するプローブ分子群を確立し、超解像蛍光イメージングおよびex vivoイメージングへと展開していく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
磁気ナビゲーションを用いた診断支援型乳腺超音波イメージングシステムの開発

磁気位置センサーによる画像融合技術を応用し、超音波画像情報を位置情報とともにボリュームデータとして保存し、リアルタイムな超音波画像と時相の異なるバーチャル超音波画像を同期することができる診断支援型乳腺超音波イメージングシステム[US-real-time virtual sonography (US-RVS)]を開発した。超音波診断の客観性・再現性を確保でき、乳腺良性腫瘍の経時観察において有用であった。磁気ナビゲーションを用いて、超音波(US)とUS探触子断層面に一致したMRI/CT画像情報を同一モニターでリアルタイムに比較することができるreal-time virtual sonography (RVS)が開発された。RVS技術を応用し、US画像情報を位置情報とともにボリュームデータとして保存し、リアルタイムなUS画像と同一断面のバーチャルUS画像を同期することができる画像診断システム(US-RVS)の開発を行っている。今回、pilot研究として、BI-RADSカテゴリー3病変の経過観察におけるUS-RVSの有用性について検証した。日立アロカメディカル社と共同開発を行っている外付けtypeのRVS装置を用いて、23病変の病変(平均腫瘍径8.2mm)に対し6、12、24か月後に標的病変のUS形態像の比較および最大腫瘍径の計測を行った。RVSを用いることでリアルタイムなUS像と再構築US画像の直接比較ができた。病変の検出率は100%であり、baselineおよび6,12,24か月後の平均腫瘍径は8.2 ±4.2, 8.4 ±4.5, 8.1 ±4.5, 8.3 ±5.0 mm (p=0.785)であった。USボリュームデータが保存できたため、第3者判定も可能であった。放射線被曝や高磁場曝露・造影剤も不要であった。US-RVSは客観性・再現性が確保できる診断支援型USイメージングシステムであり、BI-RADSカテゴリー3病変の経過観察において有用なモダリティとなりうることが示された。以上の研究実績を英文雑誌に投稿し、採択された(Ultrasound Med Biol 40: 1049-1057, 2014)。Real-time virtual sonography (RVS)は超音波診断装置、磁気位置センサーユニット(センサー、発生器、検出ユニット)およびワークステーションにより構成される。MRIボリュームデータからmulti-planar reconstruction(MPR)画像を作成し、DICOM規格の画像情報として予めワークステーションに取り込んでおく。磁気発生器から発生した磁場を探触子の先端に取り付けられた磁気センサーが検出することにより、探触知の動きに一致した任意の多断面MRI画像を再構築して、これと超音波画像とを連動して表示すること(MRI-RVS)が可能となる。またRVS技術を応用し、US画像情報を位置情報とともにボリュームデータとして保存し、リアルタイムなUS画像と同一断面のバーチャルUS画像を同期すること(US-RVS)も可能である。我々はこれまでに乳腺良性腫瘍の経過観察、乳癌術前化学療法におけるUS-RVSの有用性について検討を行ってきた。今回、初回の乳腺USでは同定できずprone MRIにてはじめて検出される病変(MRI-detected lesion)のUSでの検出におけるMRI-RVSの有用性についてレトロスペクティブに解析を行った。Second-lookUSでも検出できなかった39例のMRI-detected lesionに対し、新たにsupine MRIを追加し、RVSを用いてMRI-detected lesionの検出を試みた。39例中、33例(85%)がRVSを併用することで、USにて病変が同定され、USガイド下生検を行うことが可能であった。うち24%が悪性であったが、76%は良性であった。欧米においてはMRI-detected lesionはMRIガイド下生検でサンプリングされるが、大掛かりな装置が必要で、また検査に時間がかかることが知られている。RVSを用いることで、多くのMRI-detected lesionがUSで検出できることより、MRIガイド下生検が不可欠な患者をより厳選できるようになり、MRIガイド下生検に伴う、医師、患者の負担を軽減できる可能性が示唆された。現在、研究計画書に示した研究計画に沿って研究が進んでいる。乳腺外科学1)乳癌術前化学療法治療効果判定におけるRVSの有用性についての検討を継続する。3)デジタル超音波診断装置Noblus(日立アロカメディカル)を用いた新たなRVS deviceの開発を行う。デジタル超音波診断装置Nobuls(日立アロカメディカル)を購入した。Nobulsを用いたRVS deviceを開発する。物品費として超音波診断装置、モニターを購入予定であったが、機種選定、価格交渉が難航し、平成25年においては購入できなかったため。代替え機を使用したため、研究進行には影響しなかった。
気管支組織Tリンパ球クローン化による内因性気管支喘息の発症機序に関する研究

気管支喘息は、気道粘膜における慢性好酸球性炎症である。好酸球を特異的に活性化するサイトカインIL-5を産生する活性化T細胞は、気道炎症の引き金を担う重要や役割を演ずることが推測されている。アトピー型、非アトピー型気管支喘息患者および健常者の末梢血単核球を、我国における最も主要なアレルゲンであるmite extractあるいは抗原非特異的刺激であるPMA+Ionomycinで刺激したところ、アトピー型、非アトピー型を問わず喘息患者末梢CD4陽性(ヘルパー)T細胞のIL-5産生は健常者のそれに比し、はるかに亢進していた。アトピー型喘息患者および非アトピー喘息患者の一部にmiteアレルゲンに反応してIL-5産生が認められた。さらにIL-5産生は、喘息の治療効果と相関することがわかった。好酸球活性化作用を有する他のサイトカインIL-3,GM-CSF産生には、喘息患者、健常者間で差はなかった。IL-5産生プロセスの解明は、喘息治療の可能性を開拓する見地から重要である。ダニmajor allergen Der f II特異的T細胞クローンを樹立した。抗原刺激、固相化CD3抗体、PMA+Ionomycin刺激により完全に阻害され、IL-5(Th2サイトカイン)産生が、IL-2(Th1サイトカイン)依存性に行われることが明らかになった。ヒトIL-5遺伝子上流約500bpのプロモーター-ルシフェラーゼ遺伝子コンストラクトPIL-5LUCはIL-5産生性クローンにおいてのみIL-2に反応して転写された。内因性喘息患者よりダニアレルゲン特異的T細胞クローンが樹立された。抗原刺激によりIL-5産生が誘導されることから内因性喘息の一部にダニアレルゲンの関与が示唆された。気管支喘息は、T細胞が中心的約割を果たしている好酸球性気管支炎であると理解されてきた。気管支喘息の病態を解明するうえで、T細胞の反応性およびT細胞由来の好酸球増殖、活性化因子であるInterleukin 5(IL-5)産生機序を明らかにすることは不可欠の課題である。アトピー性および内因性気管支喘息患者の末梢血リンパ球を、粗製ダニアレルゲン、精機ダニアレルゲン蛋白質Der f 1,Der f IIと混合培養し(抗原刺激)、細胞増殖反応およびIL-5産生を検討したところ、アトピー性、内因性の両者において、粗製アレルゲンおよびDer f 2に対し増殖を示す症例を認めた。アトピー性喘息患者において、ダニアレルゲン特異的にIL-5産生がみられた。次に、ダニアレルギーの喘息患者の末梢血リンパ球をin vitroで抗原と混合培養(一次抗原刺激)し、アレルゲン特異的T細胞ラインを作製した。さらにlimiting dilution法にて、1名の患者より4個のT細胞クローンを樹立した。このうち2個は、リコンビナントDer f II蛋白(rDer f II)に反応し、残る2個はDer f II以外のダニアレルゲンに反応するクローンであった。4クローンとも自己の抗原提示細胞と抗原の刺激にて、24時間後の上清中に50150 pg/mlのIL-5が検出された。Th2型のクローンであることが示唆された。別の患者からは、粗製ダニアレルゲンにて一次抗原刺激をしたT細胞ラインより、limiting dilutionにより8個のクローンが得られ、rDer f IIにて一次刺激を行ったラインより9個のクローンが得られた。各々のドナーより、末梢血リンパ球をEBウイルス混合メディウムと混合培養して、EB transformed

cell lineを作製し、抗原提示細胞として使用できることを確認した。気管支喘息は、好酸球性の慢性炎症性疾患であると理解される。その病態を解明するうえで、T細胞は免疫反応の抗原特異性を司る点、および好酸球特異的な増殖因子、活性化因子であるInterleukin-5(IL-5)を産生する点から、その役割を重視せざるを得ない。気管支喘息におけるT細胞の役割を詳細に検討する目的で、アトピー型気管支喘息患者よりダニ抗原を認識し、IL-5産生を行うT細胞クローンを樹立した。またmajor allergenであるDer f IIに対するT細胞クローンは、自己のEB virus transformedcell lineを抗原提示細胞(APC)として、Der f IIを抗原として刺激を行うと、抗原特異的に増殖し、かつIL-5産生を行った。デキサメサゾン、免疫抑制剤FK506は、用量依存的にIL-5産生およびIL-5遺伝子発現を抑制した。抗原刺激のかわりに、ホルボールエステルおよびカルシウムイオノフォアの二者の刺激にてIL-5の産生が誘導された。以上より、IL-5遺伝子活性には細胞内カルシウムの上昇とプロテインキナーゼC活性化に引き続く転写因子AP-1,NF-ATが必須であることが示唆された。これらのT細胞クローンは喘息治療薬開発のモデルシステムとしても有用であると期待される。さらにIgE抗体を認めない内因性気管支喘息患者のうち、ダニ抗原特異的T細胞増殖反応を示すドナーより、T細胞クローン樹立を目的として、APCとして用いるEB virus transformedcell lineを樹立した。気管支喘息は、気道粘膜における慢性好酸球性炎症である。好酸球を特異的に活性化するサイトカインIL-5を産生する活性化T細胞は、アトピー型、非アトピー型(内因性)を問わず、気管支喘息の病態に共通して認められ、気道炎症の引き金の役割を担うことが、我々の研究から明らかにされた。ヒトT細胞のIL-5産生のプロセスを解明することは、新たな喘息治療の可能性をひらく観点から重要である。喘息患者の末梢リンパ球を抗原刺激にて樹立した。ダニアレルゲン特異的T細胞クローンは、抗原刺激、固相化CD3抗体、ホルボールエステル(PMA)+イオノマイシン(IOM)等の刺激により活性化され、増殖・サイトカイン産生を行った。IL-5産生は、抗IL-2中和抗体によって完全に阻害された。すなわちT細胞のIL-5産生はIL-2依存性であることがわかった。さらに、ヒトIL-2単独の刺激に反応して、IL-5産生がみられた、ヒトIL-5遺伝子上流約500bpのプロモーターノエンハンサー領域をルシフェラーゼ遺伝子に接続したレポータープラスミド、pIL-5 LUCに起因するルシフェラーゼ活性がIL-2刺激により誘導されたことから、IL-2レセプターを介するシグナルによりIL-5遺伝子転写が誘導されることも明らかとなった。IgE抗体が認められない喘息患者においても、ダニアレルゲン特異的T細胞クローンが樹立され、IL-
半導体デバイスにおける光渦励起軌道角運動量のコヒーレント制御

本研究の目的は半導体デバイスを用いて光渦のらせん位相がもたらす軌道角運動量(OAM)を制御することである。半導体デバイスによる光OAMの制御は、OAMを用いた大容量光通信における光源や情報処理デバイスにつながる。本研究では、1.空間変調光帰還による面発光レーザーのOAM制御および2. GaN励起子系に対する光OAMのコヒーレント変換・保存を行う。1.について、本年度は面発光レーザーのシングルOAMモード発振に成功した。従来、空間変調光帰還によるシングルOAMモード発振は難しく、出射光には光通信の実装する際の弊害となる他モード成分が混在していた。本年度は、光帰還における戻り光の制御に用いるホログラム回折格子の最適化に努め、現実的な光通信に適用し得る他モード抑圧比で特徴付けられるシングルOAMモード発振を実現した。2.について、本年度はGaN励起子系におけるOAM緩和メカニズムを明らかにした。昨年度以前における光渦を用いたコヒーレント分光の成果から、フリースタンディングのGaN結晶において、励起子重心運動のOAMはサブナノ秒程度保持されることが分かっていた。これに対し、本年度はc面サファイア基板上GaN薄膜について同様の評価を行い、励起子重心運動のOAMが数ピコ秒程度で失われる(OAM緩和)ことを明らかにした。c面サファイア基板上GaN薄膜の特徴の一つとして大きな欠陥密度を有することが挙げられ、これにより励起子散乱の空間不均一性が顕著であることが考えられる。このような励起子散乱の空間不均一性はOAM緩和を生じるのみならず、そのOAM依存性(昨年度以前に報告)を生じることを理論的に明らかにした。また、以前から取り組んでいる偏光渦を用いたコヒーレント分光について、本年度は励起子異方性の測定精度、確度、および感度の向上に努め、新規の偏光分光法として確立した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、光渦のらせん位相がもたらす軌道角運動量(OAM)の半導体デバイスによるコヒーレント制御を目的とする。近年、光OAMを活用した光情報通信の多次元化が注目されており、半導体デバイスを用いた光OAMの保存・制御は、光通信の大容量化へとつながる。今年度は、1.面発光型半導体レーザー(VCSEL)に対する光帰還系の構築・出力OAM評価および2.縮退四光波混合による半導体電子系への多次元OAMのコヒーレント変換を行った。項目1では、VCSELに対する空間変調光帰還を実現するために、回折格子ホログラムを組み込んだ外部共振器を構築した。回折格子ホログラムによって光の強度や位相を空間制御することが可能であり、これによって制御されたレーザー光をレーザー媒質に戻す(光帰還)ことによって、媒質中の空間利得が変調され、出力OAMが変化することが期待できる。出力光のOAMを解析した結果、帰還光に付加された位相のらせん度に応じて、VCSELのOAMが変化することが明らかとなった。今後は、さらに自在にVCSELの出力OAMを制御するための帰還光の変調条件を理論・実験の両面から追及していく。項目2では、多次元OAMのコヒーレント変換を実現するために、複数のOAM成分を持つ複合光渦パルスを発生させた。この複合光渦パルスに対する半導体電子系の四光波混合応答を観測した結果、OAMコヒーレンス緩和時間は、らせん度が大きい場合、励起子位相緩和時間よりも2桁大きいサブナノ秒に達することが明らかとなった。位相緩和時間よりも長い時間スケールで励起子がOAMを保存することは、デバイス応用の観点からも重要である。今後はこれまでに得られたOAMコヒーレントダイナミクスを基礎とし、3パルス励起四光波混合によって半導体電子系を介した多次元OAMの全光コヒーレント制御を目指す。近年、光OAMを活用した光情報通信の多次元化が期待されており、半導体デバイスを用いた光OAMの制御は、OAM分割多重通信における光源や情報処理デバイスにつながる。本研究では、1.空間変調光帰還による面発光レーザーのOAM制御および2. GaN励起子系に対する光OAMのコヒーレント変換・制御を行う。本年度は、光注入による面発光レーザーのOAMモード利得変調特性の調査およびマルチOAMの同時コヒーレント変換を行った。項目1では、光注入同期によりシングルOAMモードに利得を集中する実験を試みた。シングルOAMモード発振は応用上の観点から重要であるが、光帰還ではシングルOAMモード発振は実現できておらず、この原因の一つとして帰還光がマルチOAMモードであることによるモード結合の影響が考えられた。実験では、シングルモードファイバと位相板によってシングルOAMモードに整形したレーザー光を用意し、このシングルOAMモードの注入光に対する面発光レーザーの発振モードの評価を行った。その結果、面発光レーザーのシングルOAMモード発振を確認できた。項目2では、複合光渦状態の光パルスを用いたコヒーレントOAM変換を行った。複合光渦はマルチOAMで特徴付けられる光渦であり、OAMと方位角の不確定性関係に基づき、光渦の方位角広がりを制限することで取得した。複合光渦パルスに対する励起子コヒーレント応答を観測した結果、コヒーレント応答は複合光渦パルス励起を反映したブロードなOAM分布を持つことを確認し、マルチOAMを同時コヒーレント変換可能であることを明らかにした。

また、マルチOAMの同時コヒーレント変換は、励起複合光渦パルスの中心OAMやOAM分布の広さに依らず実現できることを確認した。項目1について、面発光レーザーのシングルOAMモード利得変調が実現できたため。さらに、光注入同期の結果から光帰還においてシングルOAMモード発振を実現する方針が立ったため。また、項目2について、励起子系に対するマルチOAMのコヒーレント変換特性を明らかにし、OAMフリー成分の異常検出について、そのメカニズムを定量的に示すことができたため。本研究の目的は半導体デバイスを用いて光渦のらせん位相がもたらす軌道角運動量(OAM)を制御することである。半導体デバイスによる光OAMの制御は、OAMを用いた大容量光通信における光源や情報処理デバイスにつながる。本研究では、1.空間変調光帰還による面発光レーザーのOAM制御および2. GaN励起子系に対する光OAMのコヒーレント変換・保存を行う。1.について、本年度は面発光レーザーのシングルOAMモード発振に成功した。従来、空間変調光帰還によるシングルOAMモード発振は難しく、出射光には光通信の実装する際の弊害となる他モード成分が混在していた。本年度は、光帰還における戻り光の制御に用いるホログラム回折格子の最適化に努め、現実的な光通信に適用し得る他モード抑圧比で特徴付けられるシングルOAMモード発振を実現した。2.について、本年度はGaN励起子系におけるOAM緩和メカニズムを明らかにした。昨年度以前における光渦を用いたコヒーレント分光の成果から、フリースタンディングのGaN結晶において、励起子重心運動のOAMはサブナノ秒程度保持されることが分かっていた。これに対し、本年度はc面サファイア基板上GaN薄膜について同様の評価を行い、励起子重心運動のOAMが数ピコ秒程度で失われる(OAM緩和)ことを明らかにした。c面サファイア基板上GaN薄膜の特徴の一つとして大きな欠陥密度を有することが挙げられ、これにより励起子散乱の空間不均一性が顕著であることが考えられる。このような励起子散乱の空間不均一性はOAM緩和を生じるのみならず、そのOAM依存性(昨年度以前に報告)を生じることを理論的に明らかにした。また、以前から取り組んでいる偏光渦を用いたコヒーレント分光について、本年度は励起子異方性の測定精度、確度、および感度の向上に努め、新規の偏光分光法として確立した。今年度の研究計画に掲げた半導体電子系への多次元OAMのコヒーレント変換・コヒーレントダイナミクス観測が達成でき、さらに光帰還によるVCSELの出力OAM制御に関しても成果を得ることができたため。項目1について、帰還光をシングルOAMモードに変調し、この帰還光に対する面発光レーザーのOAMモードについて調査する。また項目2について、申請者が明らかにしたマルチOAMのコヒーレント変換特性を基礎とし、励起子系のコヒーレントOAM制御を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。現在よりも、さらに自在にVCSELの出力OAMを制御するための帰還光変調条件を実験・理論の両面から明らかにする。