hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクションリサーチに基づく教師の力量発達を支援するメンタリングに関する研究

授業設計段階における目標分析過程におけるメンターの役割を探った。目標分析においては、教師の経験知をゆさぶるような問いを投げかけることが教師自身の成長を促すことが示された。また、幼稚園教育実習におけるメンタリングのプロセス及び実習生の教師としてのアイデンティティ、教師としての自己認知に関しての保育観や子ども観などの変容を分析した。また、教師の力量形成の観点から指導教師及び実習生間の情報交流を促進することをねらいとして導入したメーリングリストの有効性について検討した。教育実習にいては、指導教師と実習生との徒弟的関係が教師の力量形成に関してモデルとしての教師としての意義はあるが、それが障害となり実習での学びを狭くしていることが示唆された。中学校教育実習において大学研究者と経験教師とがメンターとして教育実習にかかわり、ビデオによるリフレクションを行なう中で教育実習におけるメンターの役割を明らかにした。さらに、わが国におけるアクション・リサーチやメンタリングの障害として指摘される教師の自己開示に関して、教師の自己開示が生徒にどのような影響を与えるかという調査研究を行なった。また、メンター制を新任教師の研修に位置づけているイギリスにおけるメンタリングとその改善に関して、わが国における校内研究がもつ利点に関して、3年間にわたりイギリス研究者と研究交流をもち、その成果の一部はイギリス教育学会において発表を行なった。メンタリングにおける基本的な研究方法としてのアクションリサーチに関しては、研究プロセスにおいて重要なポイントである授業実践の問題の確定に関して、オン・ゴーイング認知法を用いて教授経験の差による授業認知のあり方を実証的に明らかにした。また、教育研究におけるアクションリサーチに関して歴史的に、また現在の動向についてのまとめを行なった。以上の研究成果を報告書としてまとめた。本年度は、主として以下の3つの研究を行なった。それらは、アクションリサーとメンタリングとを結合した視点からの研究である。(1)実践者との対話をベースに、研究者と実践者との共同という研究形態での研究者の役割もしくは経験教師の役割の分析を行なった。ここでは、完全習得学習の導入という授業の改善を進める際に、完全習得学習の鍵である目標分析という基本的な考え方の説明と目標を分析するプロセスにおける経験教師の問いかけおよび助言の機能を分析した。必ずしも、実践者が目標分析に関するノウハウを獲得したという明確な証拠を得ることはできなかったが、少なくとも、実践者の授業および子どもをとらえる認知枠組みの変化と教育観の問い直しは生じたことは自己報告と変化した目標分析表、指導案によってとらえることができた。また、目標分析を進める上での実践者自身による課題から問題の同定のプロセスにおいてメンター(経験教師)の役割とともに、授業ビデオによるリフレクションは有用であることが示唆された。その成果の一部は、3月末には出版予定である。(2)アクションリサーチおよびメンタリングにおいては、授業実践のアセスメントが重要であるため、そのアセスメント方法としてのポートフォリオの研究をはじめ、評価法の研究を行なった。特に、コンピュータの活用によるデジタル化の有用性を実践研究として検証した。(3)メンタリングおよびアクションリサーチは、実践研究として位置づけられる。しかしながら、必ずしも実践現場で十分に認識されているわけではない。そのため、次年度の研究の基盤として、アクションリサーチの考え方に基づく、授業実践から改善というプロセスを試行的に行なった。教育臨床学という観点からの対話型アクションリサーチや授業カンファランスを活用したアクションリサーチ研究を実施した。そこでは、実践者と研究者との関係が対等性を持つこと、それが授業改善の新たな知識を産み出すことなどが示唆された。本年度は、3つの研究を行なった。1つは、目標分析におけるメンタリングの実施である。浜松及び福岡において教師の研究グループを組織し、メンターである経験教師の指導による目標分析過程を記述した。その多くの成果は、「悠」(ぎょうせい)に12回の連載において、公表した。また、目標分析を行なうことの教師教育における有効性と目標分析を教師が獲得していく過程は、必ずしもブルームらの提案したプロセスとは異なることも明らかになった。

そして目標分析を行なうことは、校内研究での主たるプログラムとして重要であることが示唆された。授業の認知をはじめ教師の授業という枠組みを交えることにつながることが示されたからである。次に、教育実習におけるメンタリングの機能に関する研究を行なった。神戸大学附属幼稚園及びお茶の水女子大学附属中学校においてメーリングリスト(ML)を活用しながら、指導教官のメンターとしての機能を探索した。MLの活用は、指導教官及び教育実習生間の情報の共有化を意図したが、教育実習が行なわれた同一の学校空間では対面式対話が有効に作用し、必ずしもMLは機能したとは言えなかった。しかしながら、インフラストラクチャーの整備とともに社会的相互作用による教育実習指導の有効性はあると示唆された。最後に、幼小連携におけるメンタリング機能の分析である。神戸大学附属明石小学校、幼稚園での新単元開発過程において、幼小連携経験者によるメンター的機能の分析、同時にML上でのメンター的機能の相互交換過程を探った。空間的には分断された教師間の相互作用をMLは促進するとともに、情報の共有化など、MLは教師間の知識交流の道具としてはかなり有効に機能することが示唆された。さらに詳細な分析を行ない、メンター機能を明確にすることができると考えられた。また、副校園長など経験者であり管理者の関与の在り方も明らかにされた。本年度は、幼稚園教育実習におけるメンタリングのプロセス及び実習生の教師としてのアイデンティティ、教師としての自己認知に関しての保育観や子ども観などの変容を分析した。また、教師の力量形成の観点から指導教師及び実習生間の情報交流を促進することをねらいとして導入したメーリングリストの有効性について検討した。教育実習にいては、指導教師と実習生との徒弟的関係が教師の力量形成に関してモデルとしての教師としての意義はあるが、それが障害となり実習での学びを狭くしていることが示唆された。中学校教育実習において大学研究者と経験教師とがメンターとして教育実習にかかわり、ビデオによるリフレクションを行なう中で教育実習におけるメンターの役割を明らかにした。ここでは、教育実習におけるリフレクションの意義とそれを支えるメンターの役割があきらかにされた。さらに、わが国におけるアクションリサーチやメンタリングの障害として指摘される教師の自己開示に関して、教師の自己開示が生徒にどのような影響を与えるかという調査研究を行なった。
成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発にむけた研究

本研究の目的は、成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発を目的とし、平成27年度に国内外の文献および研修会を通してアセスメント項目を抽出した。平成28年度はその項目の妥当性と信頼性を高めるべく専門家会議を実施した。それにより、1患者の病気とその予防に対する理解(18項目)、2患者の病気や治療に関連したセルフケア行動(15項目)、3大人になるための準備(13項目)、4患者の周囲のサポートを求め、意思決定する能力(8項目)、5親の移行準備状況(13項目)の5つの項目、67の下位項目を抽出した。平成29年度は先天性心疾患の移行期支援を行っている看護師3名に面接調査を行い、上記項目は変わらず下位項目の内容を精選した。さらに追加で7名の医療者に内容妥当性と表面妥当性を確認した。また、インタビューの質的分析より移行期支援のきっかけや、看護師の役割、思春期の特徴を踏まえたかかわり、移行期支援に対する困難感が抽出され、移行期支援の実際が示された。成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発にむけた研究ついて、平成28年度の実態調査にむけた調査票作成ための文献検討と、国内調査を行った。1文献検討では、移行期支援として患者、家族、親子関係への支援があり、それに対する要因として、患者では、a.病気・治療に関連する事として、病態・治療・将来への影響の理解、病気に対する不安・心配事、肯定感、レジリエンス、b.親からの自立として、自立に向けた行動(受療行動・日常生活)、自立に対する認識、c.移行に対する期待と不安、d.ソーシャルサポートの獲得(自己開示・情報収集)があげられた。また、家族については、親が主体で行っている事と自立への支援があり、子どもの自立や移行に対する認識があった。さらに、親子の関係性として、病気のとらえ方と説明の仕方が抽出された。2国内調査準備では、日本小児看護学会への参加と、成人移行期支援フォローアップ講座を開催した。加えて、成人先天性心疾患や移行期支援に関わる医師・看護師・看護教員との会議を数回実施した。それにより、移行期支援における臨床における困難感や家族を含めた支援の必要性について示唆を得た。前者については、小児型医療から成人型医療への「診療の場」の移行におけるシステムの問題、多職種チームとしての支援が不足している問題があげられた。後者については、親の自立への認識・支援が子どもの自立に影響する可能性があげられた。それらを基に、患者・家族への調査票原案を作成した。今後、プレテストを実施・精選し本調査に向ける事とする。昨年度、学会・講演会より、10代後半20代の患者・家族への移行期支援の実際と、看護職を中心とした関連職種の役割および連携体制について資料収集を行った。また、国内外の文献より、成人先天性心疾患をもつ患者・家族への移行期支援の内容と関連要因に関して分析した。その分析結果より、研究協力者との会議により助言・指導を複数回得て、調査票原案を作成したのみで、研究協力施設との関係上プレテストの実施が困難であった。そのため、今年度の調査に向け、当大学・研究協力施設の倫理審査委員会への申請を実施しプレテスト及び本調査を行っていく予定。成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発を目的とし、平成27年度に国内外の文献及び研修会を通しアセスメント項目を抽出した。平成28年度はその項目の妥当性と信頼性を高めるべくアンケート調査および専門家会議を実施した。それにより、1患者の病気とその予防策に対する理解(18項目)、2患者の病気や治療に関連したセルフケア行動(15項目)、3大人になるための準備(13項目)、4患者の周囲のサポートを求め、意思決定する能力(8項目)、5親の移行準備状況(13項目)の5つの概念67項目を抽出した。しかし、成人先天性心疾患の移行期支援を行っている施設そのものが少なく、上記疾患におけるアセスメント項目という点での妥当性の検証が不十分である。よって、先天性心疾患の移行期支援を行っている看護師に面接調査を行い妥当性の検証を行っていく事とする。先天性心疾患の移行期支援を行っている研究対象者が少なく、量的研究だけでは内容妥当性、構成概念妥当性が確保できない為、質的調査を追加する必要があるため。成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発を目的として、平成27・28年度に作成したアンケートを実施したものの回答率が低く、項目の妥当性の検証が不十分であった。よって、今年度は3名の高度実践看護師にインタビューを実施し、看護における患者家族に対する認識と行動から、【患者の病気に対する認識】【将来の合併症とその予防に対する認識】【患者の病気や治療に関連したセルフケア行動】【大人になるための準備】【患者の周囲のサポートを求める能力】【患者の意思決定する能力】【親の移行準備状況】の7つのカテゴリーを抽出した。今後は、さらにインタビューを重ね、アセスメント項目の妥当性を検証していきたい。さらに、患者家族のアセスメントに向けた国内外の文献検討として、患者家族中心の移行期支援の内容を抽出した。1尊厳と尊重として【患者と家族の尊厳と多様性の尊重】、2情報の共有と意思決定として【患者のライフイベントに合わせた情報提供(移行準備)】【ケアに関する患者・家族と医療者間の情報共有】【多職種・他部門間の情報共有】

【患者と家族の意思決定支援】、3協働として【医療者及び関係機関担当者との良好なパートナーシップに基づく協働】【多様な医療・社会福祉サービス】、4参加として【患者が自分自身の健康に興味関心をもち自ら健康を維持・予防する】【健康的に生きるための知識や経験を育む】【患者本人が希望する社会活動に参加する】【家族の子どものケアへの参画をエンパワメントする】が抽出された。アセスメント項目とともに支援の実際についてさらなる分析を行い、患者家族中心の移行期支援に関する看護を考察していきたい。質的調査に関する研究対象者の確保に時間がかかっているため。本研究の目的は、成人先天性心疾患患者と家族の移行期支援におけるアセスメントツール開発を目的とし、平成27年度に国内外の文献および研修会を通してアセスメント項目を抽出した。平成28年度はその項目の妥当性と信頼性を高めるべく専門家会議を実施した。それにより、1患者の病気とその予防に対する理解(18項目)、2患者の病気や治療に関連したセルフケア行動(15項目)、3大人になるための準備(13項目)、4患者の周囲のサポートを求め、意思決定する能力(8項目)、5親の移行準備状況(13項目)の5つの項目、67の下位項目を抽出した。平成29年度は先天性心疾患の移行期支援を行っている看護師3名に面接調査を行い、上記項目は変わらず下位項目の内容を精選した。さらに追加で7名の医療者に内容妥当性と表面妥当性を確認した。また、インタビューの質的分析より移行期支援のきっかけや、看護師の役割、思春期の特徴を踏まえたかかわり、移行期支援に対する困難感が抽出され、移行期支援の実際が示された。学会・講演会への参加および開催を計画し、移行期支援に携わる医療者(医師または看護師)の意見を情報収集する。また、今年度の調査に向け、当大学・研究協力施設の倫理審査委員会への申請を進めプレテスト及び本調査を実施していく予定。これまで先天性心疾患に関する移行期支援のアセスメントツールとして、項目を作成してきたが、対象者が少なく、妥当性の検証には不十分である。そのため、インタビューデータを収集し項目の妥当性と信頼性を確保していく。その上で、先天性心疾患の移行期支援を先駆的に行っている専門家の方に構成概念の妥当性を調査していき、アセスメントツールの完成に向けていきたい。今年度インタビューデータを収集し、文献検討に加えて新たな項目が抽出されており、より実践に即したアセスメントツールを作成するために、さらなるデータの積み重ねを行っていく。その上で、移行期支援を先駆的に行っている専門家の方に構成概念の妥当性を調査していき、アセスメントツールの完成に向けていきたい。プレテストの実施が遅れた事、スケジュール調整が困難で関連学会への参加が2か所にとどまった事、さらに調査に必要な機器等の購入が遅れているため。研究対象者が少なくアンケート調査の実施が遅れている事と、分析に必要な物品の購入が遅れているため。当該助成金が生じた状況としては、研究対象者へのインタビューの実施が遅れているため、謝金・交通費、分析および研究成果の公表にかかる費用の使用が遂行できていない。
吸収上皮細胞増殖におけるFru2,6・P2,SGLT1発現調節の解明

ラット小腸切除後のadaptationにおける吸収上皮細胞のグルコース吸収とグルコース代謝を検討するため以下の実験を行った。ラットをペントバルビタール麻酔下に開腹、小腸を近位側から85%切除して吻合し閉腹した。手術後1、3、5、7日目に残存回腸より粘膜を剥離しAGPC法でtotal RNAを抽出、アガロースゲル泳動後ナイロンメンブランに転写した。まず、グルコース輸送担体SGLT1にてノーザンプロットを行ったところ・術後1日目からmRNAのシグナルは軽度増強し7日目まで持続した。しかし、バンドが不鮮明なため、SGLT1の異なる部分から作成したプローブを用いてノーザンブロットを再度行う予定である。現在さらに2個のプローブを作成し、結果を比較検討した。一方、グルコース代謝を調節するFru2,6-P2はアイソザイムがあり、心、肝、睾丸、脳で各々異なっている。このためまず、小腸のFru2,6-P2を同定するためにラット小腸total RNAより共通部分をRT-PCRにて増幅したところ単一バンドが得られた。これをTAクローニングベクターに挿入し大腸菌JM109にて増幅、得られたプラスミドより約500bPのプローブを作成した。ラット近位小腸を大量切除すると、残存小腸では絨毛の増大、腸管内腔の拡大など吸収面積を増加させる変化、すなわちadaptationが生ずる。このとき、吸収上皮細胞では細胞増殖が亢進するだけでなく、細胞単位での各種栄養素の吸収能増加が見られる。しかし、吸収上皮としてのグルコース吸収と細胞のエネルギー源として必要なグルコース代謝との関係は明らかではなかった。そこで、ラット小腸の50%切除を行って1、3、5、7日後に残存小腸を取り出し、グルコース代謝を促進するFru2,6-P2の合成酵素であるFru 6-P,2-Kinase:Fru 2,6-bisphosphataseと、グルコース能動輸送担体であるSGLT1のmRNA発現の経済的変化を測定している。SGLT1mRNAの発現は切除後より増加し、単位面積あたりのグルコース吸収も増加する。しかし、Fru6-P,2-Kinase:Fru 2,6-bisphosphataseは、現在までに小腸上皮細胞で発現しているアイソザイムの同定がなされていないため、ノーザンブロットでmRNAの検出が困難であり、改良を加えている。また、Fru 6-P,2-Kinase:Fru2,6-bisphosphataseの酵素活性も低いため、検出感度を上げる方法を検討中である。Caco-2細胞増殖におけるFru 6-P,2-Kinase:Fru 2,6-Pase、SGLT1のmRNA発現の調節を検討するため、Caco-2細胞の増殖期とconfluent期、それに続く吸収上皮細胞に分化する時期において、SGLT1のmRNAを測定しているが、吸収上皮細胞に分化しはじめてようやくSGLT1活性がみられるため、他の細胞でも検討する予定である。
半導体ヘテロ構造中の低次元スピン偏極電子系の輸送現象

本年度はモンテカルロシミュレーションを使った輸送現象の数値計算法の確立と、測定系の整備を行なった。モンテカルロシミュレーションは運動量空間におけるキャリアーの緩和現象の計算には使われていたが、今回は輸送現象を見るために実空間分布の変化を計算できるような方法を開発し、テストとして非平衡2次元電子系および励起子系(但し非偏極)に適用し、これらの輸送特性を様々な初期条件の元に計算することが出来た。(裏面論文リスト)計算結果より粒子の運動量分布の初期条件がその後の拡散に大きく影響することが示され、また拡散速度を制限している要因としては電子系の場合は電子-電子散乱であるのに対し、励起子系では量子井戸の界面揺らぎによる散乱であることがわかり、この違いのため2つの系では輸送現象に大きな違いがあることがわかった。この結果からただちに言えることは、期待しているスピン偏極系の輸送特性の特異な振舞いは2つの同種粒子間の衝突に起因するのであるから、これを実験で観測するためには粒子間衝突が支配的な電子系でなければならないことで、そのためには直流バイアスをかけた2重量子井戸サンプルを使い光励起された電子と正孔を分ける必要がある。スピン偏極系の輸送では同種粒子であることを正しくモデルに取り入れる必要があり、完全に量子力学の枠組みの中で計算しなければならない。現在このためにこの系に対してKadanoff/Baymの方法に基づいて非平衡系グリーン関数から量子力学的輸送方程式(Boltzmann方程式)を求めることを検討中である。研究代表者は本年半年間文部省在外研究でカリフォルニア大学の半導体結晶成長・評価法を研究しているグループに派遣されることになり、ここで本研究を更に進めるために成長および評価の技術を得ることが出来ると期待している。
水溶性金属ポルフィリン触媒を用いる新しい光酸化反応の開発

本研究の究極の目標は、水を電子供与体とし炭酸ガスを電子受容体とする種々の有機光触媒反応の発見、及び、そのための金属錯体系光増感剤の構築である。本研究課題では、この第一段階として、水溶性鉄ポルフィリンの水溶液と可視光を用いて、水を電子源・酸素源とした新しい活性酸素種生成光反応の開発を目指した。ポルフィリンは種々の反応により活性酸素種を発生させうることが報告されている。これらのうち、酸素分子の存在を必要としないヒドロキソ錯体の光反応が、新しい光触媒有機反応の開発という観点から興味深い。このために私は、カチオン性テトラ(4ーNーメチルピリジル)ポルフィリン鉄錯体Fe(III)TMPyPを触媒量含む1,2ージオ-ル類やスチルベン類の含水アセトニトリル溶液の可視光照射を行い、これらの基質が高収率で酸化されることを見つけた。Fe(III)TPPを含む有機溶媒中ではこれらの反応は起こらない。本反応は非常に短寿命な鉄ポルフィリン錯体による増感反応であるから光化学的には予想外の反応であり、また、水溶液中の有機反応という点で生物化学的にも多くの知見を与える反応である。C1置換基を有するビスポケット型のFeTMPyP誘導体を初めて合成し、本触媒はFeTMPyPよりも耐久性を有し、しかも、基質特異性即ち分子認識能も優れている事が明らかになった。本反応は主として基質から鉄ポルフィリン錯体への電子移動を経る機構と考えられるが、一部、水からの電子移動、或は、高反応性のオキソ鉄錯体の生成を示唆する実験結果も得られているので尚検討中である。更に、本触媒系を用いて多電子酸化還元や高度の分子認識を達成するために、新しいFeTMPyP誘導体の合成、ヌクレオシドなどの選択的開裂反応、シリカゲル担持FeTMPyP触媒による酸化反応などを研究している。以上のように、本年度は所期の目的に向かってかなり前進ができ、それには本科研費の援助により購入したキャピラリ-ガスクロが多大な助けになった。
気相塩基性物貭の連続定量法の開発とその脱硝過程最適化への応用

前年度の基礎的な検討結果に基づいて微量アンモニアの定量法について以下の4点を検討した。1)炭酸ガス、窒素酸化物、硫黄酸化物の干渉の除去炭酸ガスの干渉は臭素および次亜塩素酸水溶液のpHを12以上にすることによって除去できた。また排ガス中に共存する窒素酸化物、硫黄酸化物の干渉も同様に溶液のアルカリ濃度の増加によって除去できた。2)排ガスおよび雨、霧中のアンモニアの定量1)で検討した結果に基づき排ガス、雨、霧中のアンモニアを定量した。化学発光法で測定した結果は、従来よりアンモニアの定量として用いられているイオンクロマトグラフィ-、インドフェノ-ル法(吸光光度法)と良く一致した。化学発光法は再現性が優れており、測定時間が短いことから極めて有用な測定法であることがわかった。3)アンモニアの化学発光フロ-インジェクション分析法の開発。1)2)の検討結果から、さらに再現性が良く、より微量の測定を可能にするために臭素とアンモニアの化学発光法を用いるフロ-インジェクション分析法の開発を検討した。その結果ppbの濃度の水中のアンモニウムイオンが極めて再現性良く定量出来ることが明らかとなった。4)尿素の化学発光フロ-インジェクション分析法の開発上記の化学発光法が尿素の定量にも応用出来ることを見いだし、アルカリ領域での尿素の化学発光分析法の基礎的検討を行った。尿素と臭素の化学発光は近赤外領域のスペクトルを示し、尿素の分解によって生ずるアンモニアと臭素との反応によると考えられた。尿素は生体と関連の大きい化合物であり、その微量定量法の開発が重要であるのでさらに詳しい検討を続ける予定である。1)大気中に主な塩基性物質であるアンモニアの化学発光法による微量定量法の開発のためアンモニアと塩素の化学発光反応の基礎的検討を行い以下の成果が得られた。a)液相のアンモニウムイオンろ塩素ガスから生ずる化学発光はアルカリ濃度が高いほど、塩素濃度が濃いほど強いことが分かった。b)気相のアンモニアを定量する場合は次亜塩素酸ナトリウム水溶液に塩酸を加えて酸性にすると発光強度が増加する事が明かとなった。c)アンモニアは塩素の代わりに臭素を用いても強い化学発光を生ずる事を見いだした。d)塩素の場合の最大発光強度が690nmで臭素の場合の850nmと異なることから、化学発光に寄与する励起種は塩素または臭素を含むアンモニアの酸化生成物であろうと考えられた。2)以上の基礎的検討に基づいて開発した化学発光アンモニア定量法によると10ppbの気相アンモニアと、100ppbの液相アンモニウムイオンがそれぞれ1分以内で定量することができた。これらの試料を5回繰り返し定量した時、前者の相対標準偏差は5.8%で、後者のそれは3.6%であった。3)開発した測定法により大阪府下の雨および霧中のアンモニウムイオンを定量し、イオン選択性電極法およびイオンクロマトグラフィ-による測定結果と良い一致が得られた。4)開発した測定法により尿素分解を利用する脱硝過程からリ-クする気相アンモニアを定量した。窒素酸化物共存下で1ppm以下のアンモニアを迅速に定量出来ることが分かった。
タンパク質翻訳後修飾による末梢神経機能調節

本研究は、末梢神経髄鞘のparanode部分にneddylation関連分子が集積していることから、この部分におけるneddylationなどの翻訳後修飾の役割を明らかにすることを目的としている。このため研究期間内に、1)末梢神経内でneddylationされる分子の同定、2)neddylation阻害による髄鞘および軸索機能変化の解析、3)脱髄モデルの病態へのneddylationの影響の解析を行うことを予定して研究を実施してきた。このような翻訳後修飾の解析を行う上で、解析に適したモデルマウスの作製は欠かせない。末梢神経髄鞘タンパク質の約50%を占める主要接着分子であるP0の遺伝子は、ヒトでは脱髄あるいは軸索変性を主体とするCharcot-Marie-Tooth病(CMT)の責任遺伝子として知られている。また、P0遺伝子異常を伴うCMTの病態形成にユビキチンープロテアソーム系が関与することが最近報告されている(VerPlank et al, 2017)。neddylationはユビキチン系の調節に関わる可能性があることから、昨年度CRISPR- Cas9を用いたゲノム編集技術によって作製したP0遺伝子改変マウスが髄鞘の翻訳後修飾を調べる上で適しているかどうかを明らかにするために昨年度に引き続きさらに検討を行なった。その結果、成熟ヘテロ接合体では髄鞘形態の異常が見られるほか、ホモ接合体では髄鞘形態異常とともに顕著な脱髄が認められ、それらの変化は加齢により進行することがわかった。さらに、発達段階のホモ接合体では髄鞘形成が遅れることがわかった。このように翻訳後修飾に関わると考えられている髄鞘タンパク質P0の遺伝子改変マウスでは様々な段階の髄鞘形成異常および脱髄が生じることから、髄鞘における翻訳後修飾の役割を明らかにしていく上で有用なモデルが作製できた。本研究は、髄鞘paranode部分にneddylation関連分子が集積していることから、この部分におけるneddylation等の翻訳後修飾の役割を明らかにすることを目的としている。このため研究期間内に、1)末梢神経内でneddylationされる分子の同定、2)neddylation阻害による髄鞘および軸索機能変化の解析、3)neddylation阻害による脱髄モデルの病態変化の解析を行うことを予定している。本年度は1)の分子を同定する目的で、まずマウス末梢神経全画分、膜あるいは細胞質画分を用いたウエスタンブロット解析を行うとともに2)のneddylation阻害に関する検討を行った。neddylation阻害には、NEDD8-activating enzyme (NAE)阻害剤MLN4924の神経内投与を行うことから、この検討を行った。また1)では、抗NEDD8抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、全画分では分子量約5570 kDa付近および40 kDa付近に各々複数の特異的バンドが認められた。各画分と抗体との反応生からこれらの分子は膜および細胞質画分の両方に認められる分子と細胞質のみにあるものに分けられた。陽性バンドはいずれも主な既知の髄鞘構成タンパク質と一致しないため、これらを同定するために膜タンパク質の分離にも優れる陽イオン界面活性剤を用いた2次元電気泳動法(CTAB/SDS-PAGE)およびウエスタン解析を行い陽性スポットを確認し、それらをパンチアウトしてMASS解析を試みた。しかし、免疫染色では明らかなスポットとして同定できたが、実際のタンパク質量が少なくMASS解析では分子の同定に至らなかったことから、現在これらの分子の濃縮方法を試みている。本研究者は、これまでにCTABのような陽イオン界面活性剤を用いた2次元電気泳動法においてすでに主な末梢神経髄鞘タンパク質のスポットを同定している。今回の2次元電気泳動解析では、NEDD8陽性スポットはいずれもこれらの既知のスポットとは一致しなかった。量的には比較的少ないためにこれまでに同定されていなかった可能性があることからこれらの分子を同定し、それぞれの役割を明らかにすることが重要であると考えている。パイロット実験において免疫染色上では十分に同定可能と考えていたため、当初の予定と比較して多少時間がかかっている点はあるが方策はすでに考えられていることから、おおむね順調に進展していると考えている。本研究は、髄鞘のparanode部分にneddylation関連分子が集積していることから、この部分におけるneddylationなどの翻訳後修飾の役割を明らかにすることを目的としている。このため研究期間内に、1)末梢神経内でneddylationされる分子の同定、2)neddylation阻害による髄鞘および軸索機能変化の解析、3)脱髄モデルの病態へのneddylationの影響の解析を行うことを予定している。昨年度のウエスタンブロット解析により、正常末梢神経組織では分子量約55-70 kDa付近に複数の特異的バンドが認められた。そこで、本年度は1)および3)を目的として、この解析に適した脱髄病態関連モデル動物の解析を行った。末梢神経髄鞘タンパク質の約50%を占める主要接着分子であるP0の遺伝子の異常は、ヒトにおいて脱髄あるいは軸索変性を主体とするCharcot-Marie-Tooth病(CMT)を引き起こすことが知られている。そこで、CRISPR- Cas9法によるゲノム編集技術を用いて作製されたP0遺伝子改変マウスに対して、表現型を解析した。その結果、この遺伝子改変マウスにおいて顕著な脱髄が生じ、ヒトCMTと類似の末梢神経の形態異常、神経伝導速度の低下および神経症状が出現することを明らかにした。最近、P0遺伝子異常を伴うCMTの病態形成にユビキチンープロテアソーム系が関与することが報告されている(VerPlank et al, 2017)。

neddylationはユビキチン系の調節に関わる可能性があることから、計画3)に掲げた脱髄におけるneddylationの役割を解析するのに適した動物モデルを準備することができた。本年度の研究成果は次年度に開催される国内および国際学会に発表する予定であり、論文も現在準備中である。研究の目的を達成するには、適した動物モデルを持つことが必須であり、その点では本年度新たに解析した「P0遺伝子改変による脱髄マウス」という最適なモデルマウスを手にできたことは大きな収穫と考えている。また、解析に必要な動物数を十分に供給できる体制も準備することができた。次年度にはこれらの遺伝性あるいは炎症性脱髄疾患モデルを用いてneddylationを中心とした翻訳後修飾がどのように脱髄病態に関係するか解析を進めていく予定であり、進捗状況としてはおおむね順調に進展していると考えている。本研究は、末梢神経髄鞘のparanode部分にneddylation関連分子が集積していることから、この部分におけるneddylationなどの翻訳後修飾の役割を明らかにすることを目的としている。このため研究期間内に、1)末梢神経内でneddylationされる分子の同定、2)neddylation阻害による髄鞘および軸索機能変化の解析、3)脱髄モデルの病態へのneddylationの影響の解析を行うことを予定して研究を実施してきた。このような翻訳後修飾の解析を行う上で、解析に適したモデルマウスの作製は欠かせない。末梢神経髄鞘タンパク質の約50%を占める主要接着分子であるP0の遺伝子は、ヒトでは脱髄あるいは軸索変性を主体とするCharcot-Marie-Tooth病(CMT)の責任遺伝子として知られている。また、P0遺伝子異常を伴うCMTの病態形成にユビキチンープロテアソーム系が関与することが最近報告されている(VerPlank et al, 2017)。neddylationはユビキチン系の調節に関わる可能性があることから、昨年度CRISPR- Cas9を用いたゲノム編集技術によって作製したP0遺伝子改変マウスが髄鞘の翻訳後修飾を調べる上で適しているかどうかを明らかにするために昨年度に引き続きさらに検討を行なった。その結果、成熟ヘテロ接合体では髄鞘形態の異常が見られるほか、ホモ接合体では髄鞘形態異常とともに顕著な脱髄が認められ、それらの変化は加齢により進行することがわかった。さらに、発達段階のホモ接合体では髄鞘形成が遅れることがわかった。このように翻訳後修飾に関わると考えられている髄鞘タンパク質P0の遺伝子改変マウスでは様々な段階の髄鞘形成異常および脱髄が生じることから、髄鞘における翻訳後修飾の役割を明らかにしていく上で有用なモデルが作製できた。本年度に明らかになった点として、末梢神経内でneddylation修飾を受けている分子が比較的限定されていることが挙げられる。
ヨウ素結合を利用した多孔性π電子システムの構築とその熱電材料への応用

ヨウ素結合を利用した新規π電子システムについて、主に以下の成果を得た。(1)(EDO-TTF-I)2ClO4の相転移機構:ヨウ素結合能を有するEDO-TTF-I分子からなる(EDO-TTF-I)2ClO4について、300 Kから5 Kまでの広い温度領域に及ぶX線構造解析とそれに基づくバンド計算を行い、構造、電子状態の変化について検討した。EDO-TTF-I分子の積層方向の重なり積分に着目すると、190 K以上では結晶学的に1種類の2量体が形成されていたが、190 K以下で2種類の2量体に変化し、さらに温度が下がるにつれて徐々に2種類の2量体から4量体へと変化していくことが分かった。また、190 K以下では4量体の内側と外側のEDO-TTF-I分子のHOMOのエネルギー差が増大していき、4量体の内側のEDO-TTF-I分子のHOMOのエネルギーが高くなる、すなわちよりイオン的になることを示唆する結果を得た。この温度領域のEDO-TTF-I分子とClO4陰イオンとのヨウ素結合に着目すると、4量体の内側のEDO-TTF-I分子とClO4陰イオンとのヨウ素結合が強くなる、すなわち、4量体の内側のEDO-TTF-I分子上の正電荷を安定化するようにヨウ素結合が働いていることが分かった。一方、190 K以上で実効的にハーフフィルドとなっているモット絶縁体的なバンド構造は、190 K以下で半金属的なバンド構造に変化し、さらに温度低下に伴って徐々にバンド絶縁体へと変化していくことが分かった。以上より、本相転移ではヨウ素結合を媒介として、分子内・分子間の自由度が協同的に働いていることが明らかになった。(2)I2BTBT分子の合成と構造:既知の合成法を見直し、BTBTを鉄触媒存在下、臭素で臭素化してジブロモ体Br2BTBTを得た後、ヨウ化銅、ヨウ化ナトリウムでヨウ素化することによりジヨード体I2BTBTを得ることに成功した。X線構造解析の結果、I2BTBTはBr2BTBTと同形であったが、ヨウ素化により融点が高くなっており分子間相互作用が増大したと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ヨウ素結合を利用した多孔性π電子システムを構築し、それを熱電材料へ応用するため、平成29年度は以下の研究を行った。(1)ヨウ素結合能を有する4,5-ethylenedioxy-4'-iodotetrathiafulvalene (EDO-TTF-I)からなる(EDO-TTF-I)2ClO4について、PF6、AsF6、SbF6、NO3、C3(CN)5塩と同様にEDO-TTF-I分子がβ'型分子配列をとること、室温付近ではダイマーモット絶縁体と考えられることを明らかにした。またClO4塩は、冷却すると190 Kで格子の2倍化を伴った相転移を示し、金属的挙動を示すこと、さらに95 K以下では、再び半導体的挙動を示すようになり、非磁性化することを明らかにした。新学術領域内で共同研究を実施し、赤外反射スペクトルを測定したところ、ダイマーモット絶縁体に特徴的なバンドが観測され、そのスペクトルの温度依存性は導電挙動を反映したものであった。また、5 Kにおいて放射光を用いたX線構造解析を実施したが、明確な超格子反射を確認することはできなかった。ClO4塩は半金属状態から絶縁化していると考えられ、今後、励起子絶縁体の可能性を検証する。ヨウ素結合能を有するEDO-TTF-Iからなる(EDO-TTF-I)2ClO4について、当初予定していなかった共同研究を新学術領域内で推進することができ、相転移機構の理解をさらに深めることができた。物質開拓面では、従来のBTBT-I2の合成法の問題点を見出し、より簡便な合成法を確立しつつある。また、電解法、混合法等により、DHex-I24Tの電荷移動錯体の作製を進めており、粉末ではあるが試料が得られている。微小、かつ脆い有機結晶試料の熱電特性評価のために、Lake shore社製Cernox温度センサーを組み込んだ試料ホルダを作製したが、年度の途中で試料ホルダが破損し、修復作業を進めている。また、新学術領域外の熱電特性評価の専門家とも共同研究を開始し、有機結晶試料の熱電特性評価について見通しを立てることができた。以上のように、熱電特性評価についてはやや遅れているが、当該分野の専門家と共同研究を開始することができ、測定上の困難を克服しつつあること、また、当初の計画になかった共同研究を新学術領域内で推進できたこと等を考慮すると、研究の目的達成に向けて着実に前進していると判断される。

EDO-TTF-I分子の積層方向の重なり積分に着目すると、190 K以上では結晶学的に1種類の2量体が形成されていたが、190 K以下で2種類の2量体に変化し、さらに温度が下がるにつれて徐々に2種類の2量体から4量体へと変化していくことが分かった。また、190 K以下では4量体の内側と外側のEDO-TTF-I分子のHOMOのエネルギー差が増大していき、4量体の内側のEDO-TTF-I分子のHOMOのエネルギーが高くなる、すなわちよりイオン的になることを示唆する結果を得た。この温度領域のEDO-TTF-I分子とClO4陰イオンとのヨウ素結合に着目すると、4量体の内側のEDO-TTF-I分子とClO4陰イオンとのヨウ素結合が強くなる、すなわち、4量体の内側のEDO-TTF-I分子上の正電荷を安定化するようにヨウ素結合が働いていることが分かった。一方、190 K以上で実効的にハーフフィルドとなっているモット絶縁体的なバンド構造は、190 K以下で半金属的なバンド構造に変化し、さらに温度低下に伴って徐々にバンド絶縁体へと変化していくことが分かった。以上より、本相転移ではヨウ素結合を媒介として、分子内・分子間の自由度が協同的に働いていることが明らかになった。(2)I2BTBT分子の合成と構造:既知の合成法を見直し、BTBTを鉄触媒存在下、臭素で臭素化してジブロモ体Br2BTBTを得た後、ヨウ化銅、ヨウ化ナトリウムでヨウ素化することによりジヨード体I2BTBTを得ることに成功した。X線構造解析の結果、I2BTBTはBr2BTBTと同形であったが、ヨウ素化により融点が高くなっており分子間相互作用が増大したと考えられる。(1)相転移を示す(EDO-TTF-I)2ClO4については、室温付近から極低温までの広い温度範囲にわたる詳細な構造データが明らかになりつつある。赤外分光による結果やEDO-TTF-Iの他の錯体の結果を総合的に解析することにより、相転移機構を明らかにする。(2)DHex-I24Tの電荷移動錯体の作製を進めるとともに、BTBT-I2や他のヨウ素導入分子の合成とその電荷移動錯体の作製を行う。得られた分子の中性状態やその電荷移動錯体の構造と物性を明らかにする。(3)新学術領域内外で共同研究を展開することにより、微小、かつ脆い有機結晶の熱電特性評価技術を確立し、本研究で得られた物質の熱電特性を明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
時計遺伝子の遺伝子多型による正常眼圧緑内障の眼圧日内変動の予測

眼圧日内変動は緑内障の発症・進行に影響し、治療方針決定に重要である。緑内障患者では正常人よりも変動幅が大きく、変動パターンが多様である。一方、眼圧日内変動は概日リズムを呈する生体現象の一つであり、我々は概日リズムを発振する時計遺伝子であるCry1Cry2が眼圧日内変動形成に不可欠であることを初めて報告した。しかし、時計遺伝子が眼圧日内変動を形成する機序は現在のところ不明である。本研究では無治療広義原発開放隅角緑内障(POAG)の眼圧日内変動をコンタクトレンズセンサー(Triggerfish, CLS)によって詳細に検討し、CLS日内変動パターンについて関連する臨床パラメータの探索と時計遺伝子の遺伝子多型(SNP)との関連性を調べた。研究期間内に無治療広義POAG 83例83眼に対してCLS測定を施行した(目標症例数100例)。コサイン近似したCLS変動パターンのパラメータの中で、頂点相が視野MD値と負の相関があること、CLSパラメータと前日の眼圧値を組み合わせることが眼圧日内変動予測に有用であることを報告した。CLSと24時間血圧計の同時測定を行った症例では、平均血圧がCLS測定値に有意な正の関連を示すことを報告した。以上のように、本研究によって広義POAGにおいてCLS測定は緑内障診療に有用な情報を提供できる可能性があること、CLS変動パターンに時計遺伝子であるPER2のSNPが関連していることを明らかにすることができた。1)緑内障患者(無治療・正常眼圧緑内障)の日内変動パターンの解析緑内障患者の眼圧日内変動パターンの解析のために、無治療の原発開放隅角緑内障(広義)患者(高眼圧症含む)17例17眼に対して、コンタクトレンズセンサー(CLS, Triggerfish, Sensimed社)を24時間装着して電位変動(mvEq)を測定した。CLS装着前眼圧は、14.6±3.1mmHg(1022mmHg)であった。CLSの電位変動のamplitudeは、110.0±46.2mvEq、acrophaseは、22時から4時にみられた。acrophaseが2時以前にみられた9例と2時以降にみられた8例では、ハンフリー視野のMD値がそれぞれ-3.3±1.2dB、-9.7±4.0dBであり、視野の悪い眼では有意にacrophaseが遅かった(p=0.002,t検定)。装着から21時までの電位変動幅は、中心角膜厚と有意な負の相関(r=-0.714, p=0.002)があった。一方、21時から取り外しまでの電位変動幅は、前日の眼圧日内変動幅(9時から24時)と有意な正の相関を示した(r=0.668, p=0.005)。今後、症例数をさらに増やして、これらの新しい知見の確証を得る必要がある。2)時計遺伝子群の遺伝子多型の解析当初の研究計画では、平成28年度にコンタクトレンズセンサーによる眼圧日内変動のデータ取得を25例において予定していたが、17例にとどまった。時計遺伝子の遺伝子多型については、予定通りタイピング法を確立できた。1)緑内障患者(無治療・正常眼圧緑内障)の日内変動パターンの解析緑内障患者の眼圧日内変動パターンの解析のために、無治療の原発開放隅角緑内障(広義)患者(高眼圧症含む)33例33眼に対して、コンタクトレンズセンサー(CLS, Triggerfish, Sensimed社)を24時間装着して電位変動(mvEq)を測定した。2016年度と併せて50例50眼のうち、43眼が解析可能であった。対照眼についてCLS測定前日の眼圧日内変動測定(3時間毎、午前9時午後12時まで)の6つの眼圧値のうちの1つとCLSの全測定値を用いて、眼圧が20 mmHgを超えるかどうかについての予測可能性を評価した。眼圧変動幅を5mmHgと仮定し、CLSの変動幅に対応させ(変動幅100%=5 mmHg)、当該時刻でのCLS値を%で表示し、当該時刻での眼圧値からCLSが100%(CLSのピーク値)となる眼圧値と20 mmHgとを比較した。その結果、午後3時での眼圧値では、感度100%、特異度95%と良好な結果であった。2)時計遺伝子群の遺伝子多型の解析時計遺伝子の遺伝子多型のタイピングについて、実験担当者の離職に伴い、実験の進行が遅れている。

コサイン近似したCLS変動パターンのパラメータの中で、頂点相が視野MD値と負の相関があること、CLSパラメータと前日の眼圧値を組み合わせることが眼圧日内変動予測に有用であることを報告した。CLSと24時間血圧計の同時測定を行った症例では、平均血圧がCLS測定値に有意な正の関連を示すことを報告した。以上のように、本研究によって広義POAGにおいてCLS測定は緑内障診療に有用な情報を提供できる可能性があること、CLS変動パターンに時計遺伝子であるPER2のSNPが関連していることを明らかにすることができた。1)緑内障患者(無治療・正常眼圧緑内障)の日内変動パターンの解析平成28年に引き続き、コンタクトレンズセンサーによる眼圧日内変動パターンのデータ収集を行う。平成29年度には、新たに約40例のデータ取得を予定する。2)時計遺伝子群の遺伝子多型の解析と多型による眼圧日内変動パターンの予測平成28年度に得られた結果を基にして、候補遺伝子多型について、多型のタイピングを行い、眼圧変動パターンと時計遺伝子群の遺伝子多型の関連を統計学的に検討し、遺伝子多型によって眼圧変動パターンを予測できるかどうか決定する。1)緑内障患者(無治療・正常眼圧緑内障)の日内変動パターンの解析平成29年度に引き続き、CLSによる眼圧日内変動パターンのデータ収集を行う。平成30年度には新たに約30例のデータ取得を予定する。2)時計遺伝子群の遺伝子多型の解析と多型による眼圧日内変動パターンの予測平成29年度と同様に候補遺伝子多型について多型のタイピングを行い、全症例についてタイピングを完了させる。眼圧変動パターンと時計遺伝子群の遺伝子多型の関連を統計学的に検討し、遺伝子多型によって眼圧変動パターンを予測できるかどうか決定する。
ＧＮＥ遺伝子異常に伴う遠位型ミオパチーの病態解析と治療法の開発

変異GNE遺伝子導入細胞及びGNEノックダウン細胞では、rimmed vacuoleの過剰形成はみられず、オートファジー・リソソーム系列関連構造物にも形態的変化はなかったが、mTORのリン酸化がみられ、GNEがmTORを介してオートファジー・リソソーム系を調節している可能性が推察された。Rimmed vacuolesの過剰形成にVCP/p97-Nfd1-Npl4複合体も関与するが, IGF-1、サルブリナールは各々mTOR及びelF2の活性化(リン酸化)によって過剰形成を抑制する。GNE遺伝子異常による縁取り空胞(RV)を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)の病態解析と治療法の開発を目的として、GNE結合蛋白の検索及び変異GNE遺伝子、GNEノックダウン細胞を用いたGNEの機能解析を行った。野生型及び変異GNEを過剰発現させたNUGC細胞では、内因性GNEのみの細胞に比べてリソソームは形態的に特に変化なく、GNE発現抑制細胞でも野生型と比べて同様に異常を認めなかった。SiRNA法によりGNEの発現を抑制したマウス筋芽細胞由来のC2細胞の網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、GNE発現抑制細胞では、野生型に比べ発現量が2倍以上変化した遺伝子を116遺伝子認めた。このことよりGNEは、シアル酸合成のみならず種々の遺伝子発現に関与していることが推測された。一方、筋細胞で発現している蛋白質において、GNEと相互作用する蛋白質、ヒト骨格筋cDNAライブラリーを用い酵母ツーハイブリッド法を行い、GNEと相互作用する蛋白質を12候補スクリーニングした。今後、それらを同定し、GNEとの結合を確認する。また、クロロキン(CQ)添加したC2やHEK細胞では、オートファゴゾームやミトファジィーの過剰形成、LC3-IIの発現増加がみられ、LysoSensorによるリソソームのpH測定では、6.0を示し、これによるリソソームの機能障害がRVの過剰形成の原因であることが示唆された。さらにRVを過剰形成するCQ投与ラットの脱神経筋(モデル筋)におけるvalocin/p97 (VCP)及びその関連蛋白質について検討した。VCPはヒトと同様にラット筋線維と同様に核、細胞質に局在し、さらにRVにも認められた。しかし、モデル筋では、VCP及びVCP関連蛋白質の発現量は対照筋と有意差を認めず、CQはVCP-SVIP-Npl4/Ufd1システムには影響しないことを明らかにした。GNE遺伝子異常による縁取り空胞(RVs)を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)の病態解析と治療法の開発を目的として、GNEノックダウン細胞の機能解析を行った。RVsは自己貪食胞であり、その形成にオートファジー・リソソーム系の関与が示唆されていることから、GNE発現抑制細胞におけるオートファジー系を抑制的に調節する蛋白質の一つであるmTORの活性化について検討した。陰性コントロールsiRNAを導入した細胞(野生型)と比較して、GNEをノックダウンした細胞では、リン酸化mTORのリン酸化は1.46±0.38倍増加する傾向を示した。Aktのリン酸化は変わらなかった(0.94倍, 1.17倍)。本研究結果より、マウス筋芽細胞由来C2細胞においてGNEの発現抑制によってmTORが活性化する可能性が示唆された。一方、GNEによるmTORのリン酸化はAkt経路を介していない可能性が示唆された。mTORはオートファジー系を抑制的に調節する蛋白質の一つであることから、GNEがmTORの活性化を介してオートファジー・リソソーム系を調節している可能性が推察された。また、クロロキン投与によるRVs過剰モデル筋について以前に行った網羅的遺伝子解析後で変化がみられた遺伝子のうち、モデル筋ではeLF2alphaのリン酸化及びATF4の減少を認めたことから、eLF2alpha脱リン酸化酵素を選択的に阻害するsalubrinalを投与した。モデル筋では対照に比べ、eLF2alphaのリン酸化は1.3倍に増加傾向を認め、筋線維断面積は不変だったが、RVsを有する筋線維は有意に減少した。現在、さらに細胞モデルにて検討を行っている。GNE遺伝子異常による縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)の病態解析と治療法の開発を目的に、GNE結合蛋白の検索および変異GNE遺伝子、GNEノックダウン細胞を用いたGNEの機能解析を行っている。日本人DMRVに最も多いV572L変異のヒトGNE遺伝子を作製し、GFP融合発現ベクターに挿入した。リポフェクション法で培養細胞に導入し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内局在を調べた。また、Lysotrackerを用いて変異GNE過剰発現細胞、またはsiRNA法によるGNE発現抑制細胞におけるリソソームを観察した。その結果、GFP融合野生型GNEは主として細胞質にびまん性に局在した。GFP融合V572L変異のヒトGNE遺伝子の細胞内局在はGFP融合野生型GNEと変わらなかった。

また、Lysotrackerで標識されたライソゾームは、V572L+A82V変異GNE過剰発現細胞あるいはGNE発現抑制細胞において形態的に特に変化を認めなかった。また、縁取り空胞(RV)を伴うクロロキン(CQ)投与ラット筋における小胞体ストレスの検討では、CQ投与ラットの筋組織では多数のRVがみられ、オートファジー・リソソーム系列の関与が示唆されている。ラットの右坐骨神経を結紮後、CQ、または生食水を腹腔内に14日間投与した。組織学的に脱神経筋は有意に筋線維が萎縮し、CQ投与ラットの脱神経筋では多数のRVを認めた。生食水およびCQ投与ラットの脱神経筋では、非脱神経筋に比べ、eIF2αのリン酸化およびATF4蛋白質の発現量が有意に減少した。GRP78蛋白質の発現量は有意差を認めなかった。以上より、生食水およびCQ投与ラットの脱神経筋では、小胞体ストレスシグナル伝達経路の一つであるPKR-like kinase-eIF2α-ATF4経路が抑制されている可能性が示唆された。平成24年度は、V572L変異遺伝子導入細胞、siRNA法を用いたGNE過剰発現、GNEノックダウン細胞では、リソソームの形態学的検討は概ね出来たが、形態的には野生型細胞との間に有意差が得られなかった。そのためubiquitin-proteasome系列(UPS)及びVCP-SVIP-Npl4-Ufd1及び小胞体ストレス関連の検討の前に、これらの細胞について網羅的遺伝子発現解析及びGNEと相互する蛋白質の検索を行っているが、前者実験はやや遅れ気味である。一方、平成24年度行う予定のRVを過剰発現するモデル筋について、VCPとその関連蛋白質の解析を行うことができ、研究はおおむね順調に進展していると思われる。平成23年度は、V572L変異遺伝子導入細胞を用いた研究では、ユビキチン-プロテアソーム系列およびVCP/p97および小胞体ストレス関連の検討はできず、やや遅れ気味だが、一方、平成24年度行う予定のCQ投与ラットについて、オートファジー・リソソーム系列、ユビキチン-プロテアソーム系列、小胞体ストレス、VCP/p97の解析を行うことができ、研究はおおむね順調に進展していると思われる。交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」に従って、研究を推進する。すなわち平成24年度から始めたGNE遺伝子異常細胞の網羅的遺伝子発現解析を進めると同時に、UPS、VCPシステムと小胞体ストレスについて解析し、平成25年度に行う予定のラット及びヒト筋を用いた研究の残りを完遂する。すなわち平成23年度に行うべき遺伝子導入細胞を用いた研究及び平成24年度に行う予定のラットを用いた研究の残りを完遂する。具体的には、変異GNEおよびwild-type GNE遺伝子導入細胞について、ユビキチン-プロテアソーム、VCP/p97、さらに小胞体ストレスの各系列の関連蛋白およびmRNA発現量を測定し、比較検討する。