hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高二酸化炭素環境下における二酸化炭素透過性アクアポリンの活性制御

アクアポリンは水などの非イオン性極性低分子の生体膜透過性を司るチャネルタンパク質であり,CO2を透過する分子も存在する.アクアポリン遺伝子はひとつの植物ゲノム上に30以上あるが,CO2を透過する分子種は未だ不明だった.本研究では,アクアポリンのCO2透過性および非透過性分子種を同定するとともに,CO2透過性に関わるアミノ酸のひとつを同定した.本研究以前は,PIP1型アクアポリンが主にCO2を透過するとされていたが,昨年度の本研究によりPIP2型アクアポリンに二酸化炭素透過性の高い分子が多数存在することを発見していた.本年度はさらにオオムギの二酸化炭素透過性を詳細に解析した結果,PIP2;1, PIP2;2, PIP2;3, PIIP2;5はCO2を透過し,PIP2;4はCO2を透過しないことが確定した.PIP2;3とPIP2;4はアミノ酸がわずかに6つ異なることから,相互にアミノ酸置換を行うことでCO2透過性の差異に関わるアミノ酸を決定した.PIP2;3の254番目のイソロイシン残基がPIP2;4のようにメチオニンに変わるとCO2透過性を喪失するが,水透過性には違いが見られなかった.この研究はアクアポリンのCO2透過性の分子構造的機構を明らかにした世界初の例である.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。アクアポリンは水などの非イオン性極性低分子の生体膜透過性を司るチャネルタンパク質であり,CO2を透過する分子も存在する.アクアポリン遺伝子はひとつの植物ゲノム上に30以上あるが,CO2を透過する分子種は未だ不明だった.本研究では,アクアポリンのCO2透過性および非透過性分子種を同定するとともに,CO2透過性に関わるアミノ酸のひとつを同定した.本研究以前は,PIP1型アクアポリンが主にCO2を透過するとされていたが,昨年度の本研究によりPIP2型アクアポリンに二酸化炭素透過性の高い分子が多数存在することを発見していた.本年度はさらにオオムギの二酸化炭素透過性を詳細に解析した結果,PIP2;1, PIP2;2, PIP2;3, PIIP2;5はCO2を透過し,PIP2;4はCO2を透過しないことが確定した.PIP2;3とPIP2;4はアミノ酸がわずかに6つ異なることから,相互にアミノ酸置換を行うことでCO2透過性の差異に関わるアミノ酸を決定した.PIP2;3の254番目のイソロイシン残基がPIP2;4のようにメチオニンに変わるとCO2透過性を喪失するが,水透過性には違いが見られなかった.この研究はアクアポリンのCO2透過性の分子構造的機構を明らかにした世界初の例である.アクアポリンは水および非イオン性極性低分子の生体膜透過性を司るチャネルタンパク質であり,二酸化炭素もその透過基質であると考えられている.アクアポリン遺伝子は植物ゲノム上に30以上あることが知られているが,二酸化炭素透過性の解析方法が煩雑であるために,どの程度のアクアポリン分子が二酸化炭素を透過するのかは未だ不明である.そこで本研究では,アクアポリンの二酸化炭素透過性をハイスループットに評価する方法の開発を進めた.出芽酵母にpH感受性GFPを構成的に発現させ,アクアポリン遺伝子を誘導的に発現させる実験系を用いて,効率的にシロイヌナズナ,イネ,オオムギのアクアポリンのCO2透過性を半定量解析した.これまでは,主にPIP1型のアクアポリンがCO2を透過すると予想されていたが,この解析によりPIP2型に属するアクアポリンに二酸化炭素透過性の高い分子があることが明らかになった.シロイヌナズナにおいてはPIP2;5のCO2透過性が高いことが示唆された.葉肉細胞(MCP)と孔辺細胞(GCP)のプロトプラストを調製し,半定量RT-PCR法によりPIP2;5のmRNA蓄積量がGCPで高いことが分かった.この結果を踏まえ,現在pip2;5ノックダウン株の気孔のCO2応答性および光合成特性を気孔コンダクタンスに着目して評価している.野生型とpip2;5変異体のA/Ciカーブは非常に似通っており,PIP2;5の葉肉コンダクタンスへの貢献はないもしくは非常に小さいと考えられる.これはMCPとGCP間の発現様式を考慮すると合理的な結果である.出芽酵母を使ったCO2透過性実験において,PIP2;4はCO2透過性を示さなかったが,葉肉細胞で卓越して発現していることが示された.pip2;4破壊株の光合成特性を葉肉コンダクタンスに着目して解析した結果,光合成特性が著しく低下していることが分かった.二酸化炭素を透過するアクアポリン分子の解析が進み,関連する遺伝子破壊株を得て,生理学的な解析が進んだことは予定通りである.遺伝子破壊株のうち,PIP2;5が気孔コンダクタンスに異常があることが分かった.これも本研究課題の仮説を指示する結果であり,当初の目的を達成していると考えられる.さらに,PIP2;5は葉肉コンダクタンスには影響しないことが明らかとなり,PIP型アクアポリン間での機能の組織間での分化があることが示唆され,今後の研究の展開に予想以上の成果が得られた.

本研究の早い段階で二酸化炭素を透過しないことが分かったPIP2;4について,同領域のたの班員からの示唆により,さらに研究を進めた結果,PIP2;4遺伝子破壊株の葉肉コンダクタンスに異常が見られたことから,当初の研究目的以上の成果が得られた.一方,高二酸化炭素条件でのアクアポリンの挙動の解析については本年度手が付けられなかったが,上述の成果はこれを補ってあまりある成果だと考えている.葉肉コンダクタンスに異常があると予想されたpip2;4遺伝子破壊株について,さらに詳細な解析を加える必要がある.葉肉コンダクタンスの測定が可能な研究室は世界にも多くないが,同領域の班員に協力を求めた.今後,精緻な葉肉コンダクタンスの測定を行うことにより,光合成への二酸化炭素供給におけるアクアポリンの役割を解明する.さらに,高二酸化炭素環境下でのPIP2;4の消長を解析することで,植物が高二酸化炭素環境下で,翻って低二酸化炭素環境下においても,二酸化炭素透過型のアクアポリンがどのように貢献しているかが明らかとなる.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。
PETを用いたヒトのレム睡眠時の夢見体験に関連した神経回路網の解明

本研究では、国立精神・神経センターの超高解像度ポジトロンCTを用い、最新の画像処理技術を駆使し脳の機能画像を三次元的に再構成し、レム睡眠における神経回路網を明らかにする。健康な右利き男子大学生を18名を被験者とした。被験者には、PET測定台上で十分な睡眠をとれるように試験前日に全断眠を行わせた。試験当日は,19時より電極装着,動静脈の血管確保,頭部固定のためのマスク装着などの準備を行い,22時に消灯し,翌朝8時まで終夜睡眠ポリグラム記録を行った。PETスキャンは、NREM睡眠で4回,REM睡眠で4回,その後覚醒させ安静時に4回の最高で合計12回行うこととした。睡眠前半部でNREM睡眠の画像をとり,睡眠中間部はポリグラフを参照して選択的REM睡眠断眠を行い,朝方にREM睡眠の画像をとるプロトコルを用いた。標識薬物としては,超短時間放射性同位元素でラベルされたH_<215>O(半減期約2分)を用い,高解像度PET(シーメンス社ECAT EXACT HR)で,各スキャン90秒間における局所脳血流の画像を得た。1被験者あたり総被爆量は1mSv以下とした。これら局所脳血流データの解析にはstatistical parametric mapping(SPA)を使用し、安静覚醒閉瞼時(覚醒時)の画像とREM睡眠時の画像を比較した。REM睡眠の画像が得られた6例におけるREM睡眠時の画像(11スキャン)と覚醒時の画像(15スキャン)を用い検討した。全脳平均血流量を比較すると、REM睡眠時と覚醒時では、有意差がみられなかった。そこで、全脳平均血流をcovariateとしてREM睡眠時と覚醒時の局所脳血流を検討した。その結果、覚醒時に比べREM睡眠中は、両側一次視覚野、両側帯状回、両側扁桃核、右側海馬で局所脳血流の増加がみられ、前頭前野では局所脳血流の低下がみられた。以上より、安静覚醒閉瞼時に比べREM睡眠中の脳の活動は、辺縁系と一次視覚野の賦活、および前頭前野の抑制により特徴づけられることが明らかになった。このことから、辺縁系および一次視覚野の賦活はREM睡眠中の夢見体験と、前頭前野の抑制は軽度の意識水準の低下に対応する所見と考えられた。本研究では、超短時間放射性同位元素でラベルされた水を用いることで安全に繰り返しPETイメージを得るとともに、最新の画像処理技術を駆使して国立精神・神経センターの超高解像度PETで得られた脳の機能画像を三次元的に再構成し、レム睡眠中の機能状態を覚醒時およびノンレム睡眠との比較から各皮質野の活動として特徴抽出し、レム睡眠における視覚連合野および記憶領野の動態をを明らかにする。同時測定した睡眠ポリグラフ記録から、PETイメージに反映された時間(約30秒)の眼球運動数(夢見と強く関連する)と関心領野の賦活度を定量的に解析し夢見に関与した神経回路網を明らかにする。

1)超高解像度PET装置(国立精神・神経センター武蔵病院に平成7年に設置)のベット上で被験者を安定して眠らせるため、放射性物質を用いた実験と同じ条件で放射性物質を用いず、健康若年男性5名に対し予備実験を行った。すなわち、脳波電極、動脈ライン及び静脈ラインを確保した状態でPET装置のベットで終夜睡眠ポリグラフ記録を行った。この結果、前日に全断眠し、22時からの3時間のうちにノンレム睡眠のイメージをとり、その後5時まで終夜睡眠ポリグラフを観察しながら選択的レム断眠を行い、5時から7時までの間にレム睡眠中の画像を得る方法を確立した。2)この睡眠操作法を用い、健康成人5例に対して睡眠ポリグラフ同時記録による超短時間放射性酸素でラベルした水による睡眠中のPETによる脳血流測定を行った。生理学的データはすべて多チェンネルデジタルデータレコーダーに記録し保存した。この睡眠操作法により60%70%の成功率でターゲットとした画像採取ができた。得られた画像のSPMによる定量解析を進めているが、現在のところ定性的画像では、レム睡眠中に橋網様体、後頭葉、及び側頭葉の血流が上昇することが確認された。本研究では、国立精神・神経センターの超高解像度ポジトロンCTを用い、最新の画像処理技術を駆使し脳の機能画像を三次元的に再構成し、レム睡眠における神経回路網を明らかにする。健康な右利き男子大学生を18名を被験者とした。被験者には,PET測定台上で十分な睡眠をとれるように試験前日に全断眠を行わせた。試験当日は,19時より電極装着,動静脈の血管確保,頭部固定のためのマスク装着などの準備を行い,22時に消灯し,翌朝8時まで終夜睡眠ポリグラム記録を行った。PETスキャンは,NREM睡眠で4回,REM睡眠で4回,その後覚醒させ安静時に4回の最高で合計12回行うこととした。睡眠前半部でNREM睡眠の画像をとり,睡眠中間部はポリグラフを参照して選択的REM睡眠断眠を行い,朝方にREM睡眠の画像をとるプロトコルを用いた。標識薬物としては,超短時間放射性同位元素でラベルされたH_2^<15>(半減期約2分)を用い、高解像度PET(シーメンス社ECAT EXACT HR)で,各スキャン90秒間における局所脳血流の画像を得た。1被験者あたり総被爆量は1mSv以下とした。これら局所脳血流データの解析にはstatistical paramitric mapping(SPM)を使用し、安静覚醒閉瞼時(覚醒時)の画像とREM睡眠時の画像を比較した。REM睡眠の画像が得られた6例におけるREM睡眠時の画像(11スキャン)と覚醒時の画像(15スキャン)を用い検討した。全脳平均血流量を比較すると、REM睡眠時と覚醒時では、有意差がみられなかった。そこで、全脳平均血流をcavariateとしてREM睡眠時と覚醒時の局所脳血流を検討した。その結果、覚醒時に比べREM睡眠中は、両側一次視覚野、両側帯状回、両側扁桃核、右側海馬で局所脳血流の増加がみられ、前頭前野では局所脳血流の低下がみられた。以上より、安静覚醒閉瞼時に比べREM睡眠中の脳の活動は、辺縁系と一次視覚野の賦活、および前頭前野の抑制により特徴づけられることが明らかになった。このことから、辺縁系および一次視覚野の賦活はREM睡眠中の夢見体験と、前頭前野の抑制は軽度の意識水準の低下に対応する所見と考えられた。
ウォーミングアップによって遅発性筋痛を軽減させる方法の提案

一般に「筋肉痛」と呼ばれる遅発性筋痛(DOMS)は,運動後1日3日後にピークに達する筋痛を指し,伸張性収縮筋活動後に生じる.本研究ではW-upがDOMS軽減につながるかどうかを実験的に検討した.研究1では上腕屈筋群の短縮性収縮によりW-upを行った条件と,一切のW-upを行わない条件でそれぞれ上腕屈筋群の伸張性収縮を行い,DOMSの程度を比較した.結果として,上腕二頭筋の筋温はW-upによって有意に上昇しが,伸張性収縮筋活動中のiEMGやDOMSの指標については条件間に有意な差が認められなかった.研究2では腕クランキング運動によってW-upを行った条件と,一切のW-upを行わない条件でそれぞれ上腕屈筋群の伸張性収縮を行い,DOMSの程度を比較した.結果として,W-upを行うことで伸張性収縮筋活動直前の上腕二頭筋温は有意に上昇した.しかし,DOMSによる痛みや筋損傷の指標では条件間における差が認められなかった.しかし,伸展痛については痛みのピークがW-upによって有意に軽減されていた.これら結果から,本研究で行ったW-upではDOMSを明らかに軽減することはできなかったが,W-upの行い方によっては伸張性収縮によるDOMSを軽減することが示唆された.一般に「筋肉痛」と呼ばれる遅発性筋痛(DOMS)は,運動後1日3日後にピークに達する筋痛を指し,伸張性収縮筋活動後に生じる.本研究ではW-upがDOMS軽減につながるかどうかを実験的に検討した.研究1では上腕屈筋群の短縮性収縮によりW-upを行った条件と,一切のW-upを行わない条件でそれぞれ上腕屈筋群の伸張性収縮を行い,DOMSの程度を比較した.結果として,上腕二頭筋の筋温はW-upによって有意に上昇しが,伸張性収縮筋活動中のiEMGやDOMSの指標については条件間に有意な差が認められなかった.研究2では腕クランキング運動によってW-upを行った条件と,一切のW-upを行わない条件でそれぞれ上腕屈筋群の伸張性収縮を行い,DOMSの程度を比較した.結果として,W-upを行うことで伸張性収縮筋活動直前の上腕二頭筋温は有意に上昇した.しかし,DOMSによる痛みや筋損傷の指標では条件間における差が認められなかった.しかし,伸展痛については痛みのピークがW-upによって有意に軽減されていた.これら結果から,本研究で行ったW-upではDOMSを明らかに軽減することはできなかったが,W-upの行い方によっては伸張性収縮によるDOMSを軽減することが示唆された.一般に「筋肉痛」と呼ばれる遅発性筋痛(DOMS)は,運動後1日3日後にピークに達する筋痛を指し,伸張性収縮筋活動後に生じる.その原因のひとつに,伸張性収縮筋活動は等尺性収縮や短縮性収縮と比較して活動する筋線維数が少ないためである.主運動時の筋線維動員はウォーミングアップ(W-up)によって変化する.したがって,伸張性収縮筋活動前のW-upは筋線維動員形態を変化させ,DOMSの緩和につながる可能性がある.そこで,本研究ではW-upがDOMS軽減につながることを実験的に検討した.本研究では健康な男子大学生8名を対象として実験を行った.実験はW-upを行ってから伸張性収縮筋活動を行う条件(WU)と,W-upを行わずに伸張性収縮を行う条件(NW)の2条件であった.全ての被験者は方腕ずつ両条件を行った.WU条件は肘関節屈曲伸展運動によってW-upを行い,その後上腕二頭筋の伸張性収縮筋活動を行うことでDOMSを発生させた.NW条件は一切のW-upを行わずにWU条件と同負荷の伸張性収縮筋活動を行ってDOMSを生じさせた.両条件共に伸張性収縮筋活動時に上腕二頭筋より筋電図を導出し,積分筋電図(iEMG)を算出することで筋の活動状態を把握した.また,実験前と伸張性収縮運動直後,1日後5日後まで毎日DOMSの指標として等尺性肘屈曲最大筋力,肘屈曲角,肘伸展角,圧痛を測定した.結果として,上腕二頭筋の筋温はW-upによって有意に上昇した(WU>NW,p<0.001).しかし,W-up効果が十分に得られる筋温と比べると低い温度であった.また,伸張性収縮筋活動中のiEMGやDOMSの指標については条件間に有意な差が認められなかった.本研究でのW-upは準備運動として行われているW-upと比較しても強度の底いものであったため,今後はW-upの内容を変えて実験を行う必要がある.一般に「筋肉痛」と呼ばれる遅発性筋痛(DOMS)は,運動後1日3日後にピークに達する筋痛を指し,伸張性収縮筋活動後に生じる.その原因のひとつに,伸張性収縮筋活動は等尺性収縮や短縮性収縮と比較して活動する筋線維数が少ないことが考えられている,主運動時の筋線維動員はウォーミングアップ(W-up)によって変化する.したがって,伸張性収縮筋活動前のW-upは筋線維動員形態を変化させ, DOMSの緩和につながる可能性がある.そこで,本研究ではW-upがDOMS軽減につながることを実験的に検討した.本研究では健康な男子大学生12名を対象として実験を行った.

実験はW-upを行ってから伸張性収縮筋活動を行う条件(WU)と, W-upを行わずに伸張性収縮を行う条件(NW)の2条件であった.全ての被験者は方腕ずつ両条件を行った. WU条件はハンドエルゴメータによって心拍数が毎分120拍になるW-upを10分間行い,その後上腕二頭筋の伸張性収縮筋活動を行っことでDOMSを発生させた.NW条件は一切のW-upを行わずにWU条件と同負荷の伸張性収縮筋活動を行ってDOMSを生じさせた.実験前と伸張性収縮運動直後, 1日後5日後まで毎目DOMSの指標を測定した.結果として, W-upを行うことで伸張性収縮筋活動直前の上腕二頭筋温は有意に上昇した(WU vs. NW : 36.8°Cvs. 35.4°C).しかし, visual analog scaleによって測定したDOMSによる痛みは,伸展痛・屈曲痛・筋腹圧痛のいずれにおいても条件×経過時間(日数)に交互作用は認められず,またWUとNWの水準間における主効果も認められなかった.この結果から,本研究で行ったW-upでは,伸張性収縮筋活動によるDOMSを軽減することはできないといえる.
鮮黄色フラボノイドであるブテイン生合成機構の解明

ブテインはフラボノイド系色素の中では珍しく鮮黄色を呈する色素であり,将来の黄色花の分子育種の標的として有望である.しかし,ブテインを生合成できるのはダリアなど一部の植物のみに限定され,その生合成に関わる遺伝子は未解明のままである.本研究では,花弁にブテインを蓄積するダリア`祝盃'(花色:赤)と,枝変わりにより花弁のブテインを完全に喪失した`凜華'(花色:紫)を供試し,ブテイン生合成の決定因子であるカルコン還元酵素(CHR)の遺伝子と,その他のブテイン生合成に関わる遺伝子を特定することを目的とする.将来的には,鮮黄色品種がないフラボノイド系色素のみを蓄積する植物において,ブテイン発現による鮮黄色品種の分子育種用のベクターとダリアの黄色花選抜マーカーの開発を行う.2018年度は,CHRの候補遺伝子であるc25599について詳細に解析を行った.花弁のステージ別発現解析,組織ごと(花弁先端部・花弁基部・葉など)の発現解析を行うと,c25599の発現量は黄花ダリアの主要色素であるブテイン4'-マロニルグルコシド(Bt4MG)の蓄積量と概ね相関がみられた.品種別の発現解析においてもc25599の発現量とBt4MGの蓄積量に相関がみられた.ブテインあるいはカルコンの有無に差異にあるキク科の植物に関してc25599のヘテロプローブRNAゲルブロットを行ったところ,ブテインあるいはカルコンを蓄積する植物からのみバンドが検出された.したがって,c25599はCHRとしての機能を有する可能性が高いと考えらえた.`祝盃'および`凜華'のプロモーター領域を含むゲノム配列を単離し比較したが,配列の差異は確認されず,枝変わりの原因となる変異はc25599にはないと考えられた.RNA-seq・花弁の発達ステージ別発現解析・部位別の発現解析・品種間の発現解析・キク科植物間の発現解析などのデータはすべてc25599がCHR遺伝子であることを示唆するものであった。したがって、本研究課題はおおむね順調に進展しているとした。c25599の機能を調査するためにタバコにおいて過剰発現する形質転換体を作出する.合わせて今後の研究の準備、あるいはポジティブコントロールとしてDvCHS2, DvCH3H, GmCHR5, GmCHR6あるいはAmC4'GTを過剰発現するタバコの形質転換体も作出する.これらの過剰発現系統について,花弁における色素組成を調査し,上記の遺伝子が色素の生合成に及ぼす影響を調査する.また,ダリアには花弁の黄色の濃淡に差異がある品種群が存在するが,原因となるメカニズムに関しては明らかではない.そこで、黄色花品種群および白色花品種群を供試し,ダリアの鮮黄色に寄与する要因を探索する.ブテインはフラボノイド系色素の中では珍しく鮮黄色を呈する色素であり,将来の黄色花の分子育種の標的として有望である.しかし,ブテインを生合成できるのはダリアなど一部の植物のみに限定され,その生合成に関わる遺伝子は未解明のままである.本研究では,花弁にブテインを蓄積するダリア`祝盃'(花色:赤)と,枝変わりにより花弁のブテインを完全に喪失した`凜華'(花色:紫)を供試し,ブテイン生合成の決定因子であるカルコン還元酵素(CHR)の遺伝子と,その他のブテイン生合成に関わる遺伝子を特定することを目的とする.将来的には,鮮黄色品種がないフラボノイド系色素のみを蓄積する植物において,ブテイン発現による鮮黄色品種の分子育種用のベクターとダリアの黄色花選抜マーカーの開発を行う.2018年度は,CHRの候補遺伝子であるc25599について詳細に解析を行った.花弁のステージ別発現解析,組織ごと(花弁先端部・花弁基部・葉など)の発現解析を行うと,c25599の発現量は黄花ダリアの主要色素であるブテイン4'-マロニルグルコシド(Bt4MG)の蓄積量と概ね相関がみられた.品種別の発現解析においてもc25599の発現量とBt4MGの蓄積量に相関がみられた.ブテインあるいはカルコンの有無に差異にあるキク科の植物に関してc25599のヘテロプローブRNAゲルブロットを行ったところ,ブテインあるいはカルコンを蓄積する植物からのみバンドが検出された.したがって,c25599はCHRとしての機能を有する可能性が高いと考えらえた.`祝盃'および`凜華'のプロモーター領域を含むゲノム配列を単離し比較したが,配列の差異は確認されず,枝変わりの原因となる変異はc25599にはないと考えられた.RNA-seq・花弁の発達ステージ別発現解析・部位別の発現解析・品種間の発現解析・キク科植物間の発現解析などのデータはすべてc25599がCHR遺伝子であることを示唆するものであった。c25599の機能を調査するためにタバコにおいて過剰発現する形質転換体を作出する.合わせて今後の研究の準備、あるいはポジティブコントロールとしてDvCHS2, DvCH3H, GmCHR5, GmCHR6あるいはAmC4'GTを過剰発現するタバコの形質転換体も作出する.これらの過剰発現系統について,花弁における色素組成を調査し,上記の遺伝子が色素の生合成に及ぼす影響を調査する.また,ダリアには花弁の黄色の濃淡に差異がある品種群が存在するが,原因となるメカニズムに関しては明らかではない.

そこで、黄色花品種群および白色花品種群を供試し,ダリアの鮮黄色に寄与する要因を探索する.実験内容を一部変更し、次世代シークエンスによる網羅的な解析などを見送ったためその分に余剰が出ているが、その分はタバコでの形質転換体作出に関わる実験に用いる予定である。
〈平和都市〉未完のプロジェクト：近現代広島の「都市」化と「復興」を検討主題として

2011年の東日本大震災以降、国内外問わず多くの領域で「復興」研究がなされてきた。その参照項として言及されるのが、〈平和都市〉広島である。本研究ではこの〈平和都市〉と復興の問題系を紐解くべく、戦略的に射程を戦前から戦後までに延伸し、複数のメディアイベント・都市運動・都市計画思想を検討主題としたい。というのも本研究は、〈平和都市〉を戦後の産物としてではなく、近現代を通じた「都市・広島」の理念的産物として位置づけるためである。
発達期大脳皮質体性感覚野可塑性におけるコリン作動性神経系の役割

マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に電気的障害を加えると、大脳皮質の一過性コリン作動性神経系細胞の消失と、大脳皮質神経細胞構築の永久的な改変、認知能力の永続的な変化を来すことが我々の以前の研究によって明らかになってきた。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に障害すると、大脳皮質可塑性にどのような影響を及ぼすか、について調べた。新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の障害により、大脳皮質のAChE染色性の低下を認め、コリン作動性神経線維の一過性の消失を認めた。それと同時に、バレル可塑性は低下した(Johnstom, et al.,2001,Nishimura, et al.,2002)。また、生後6か月には前脳基底部コリン作動性神経系起始核のニューロンが変性し始めるTs65Dnマウス(Holtzman, et al.,1996)のバレルの面積低下が判明した。これらの結果から、コリン作動性神経系入力が大脳皮質バレル野の発達と可塑性に重要な役割を演じていることが示唆された。さらに、SSRIの一種であるparoxetineをラットの周産期に投与した実験では、体性感覚野のおけるセロトニン量・patchのサイズ・正向反射について検討し、生後一過性に視床皮質線維に発現するセロトニントランスポーターの役割について考察した。結果は、セロトニン量の低下、patchの面積の低下および、正向反射の成立遅延を認めた。このことから、発達期大脳皮質体性感覚バレル野の形態学的発達にとってセロトニンの視床皮質線維への取り込みが重要な役割を演じていると思われ、この際、セロトニン含有量が減少していることが判った。こういった、モノアミンやアセチルコリンなどの神経伝達物質を量的に変化させたときに、大脳皮質の発達が改変を受け、ひいては、可塑性も変化する可能性があると考えられた。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に障害すると、大脳皮質の一過性のコリン作動性神経系の消失と、大脳皮質神経細胞構築の永久的な改変、認知能力の永続的な変化を来すことが我々の以前の研究によって明らかになってきた。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生子期に障害すると、大脳皮質可塑性に影響を及ぼすかどうかについて、ゲッ歯類の体性感覚路のバレル・システムをモデルに用いてバレル可塑性を調べた。また、ダウン症候群のモデル動物のTs65Dnマウスの大脳皮質の生後発達に異常がないかどうかについても検討した。チトクロームオキシダーゼ染色で生後8日目のマウスで、新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の電気的焼灼障害により、ヒゲC列のみを毛根から引き抜く障害を与え、その結果、C列に相当する大脳皮質バレルの面積が減少し、隣接するD或いはB列に相当するバレルの面積が増大するというバレル可塑性に影響があるかどうかを調べた。結果は、新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の障害により、大脳皮質におけるAchE染色性が低下し、コリン作動性神経線維の一過性の消失が確認された。それと同時に、バレル可塑性は低下した[Nishimura, et al., 2002]。

また、生後6か月には前脳基底部コリン作動性神経系起始核のニューロンが変性しはじめるTs65Dnマウス[Holtzman, et al., 1996]のバレルの面積が低下していることが判明した。これらの結果、コリン作動性神経系入力がバレル皮質の発達と可塑性に重要な役割を演じていると言える。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に障害すると、大脳皮質の一過性のコリン作動性神経系の消失と、大脳皮質神経細胞構築の永久的な改変、認知能力の永続的な変化を来すことが我々の以前の研究によって明らかになってきた。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に障害すると、大脳皮質可塑性に影響を及ぼすかどうかについて、ゲッ歯類の体性感覚路のバレル・システムをモデルに用いてバレル可塑性を調べた。また、ダウン症候群のモデル動物のTs65Dnマウスの大脳皮質の生後発達に異常がないかどうかについても検討した。チトクロームオキシダーゼ染色で生後8日目のマウスで、新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の電気的焼灼障害により、ヒゲC列のみを毛根から引き抜く障害を与え、その結果、C列に相当する大脳皮質バレルの面積が減少し、隣接するD或いはB列に相当するバレルの面積が増大するというバレル可塑性に影響があるかどうかを調べた。結果は、新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の障害により、大脳皮質におけるAchE染色性が低下し、コリン作動性神経線維の一過性の消失が確認された。それと同時に、バレル可塑性は低下した[Nishimura, et al.,2002]また、生後6か月には前脳基底部コリン作動性神経系起始核のニューロンが変性しはじめるTs65Dnマウス[Holtzman, et al.,1996]のバレルの面積が低下していることが判明した。これらの結果,コリン作動性神経系入力がバレル皮質の発達と可塑性に重要な役割を演じていると言える。さらに、SSRIの一種であるparoxetineを周産期に投与することで、ラットバレルの形成が変化するが、酵素組織化学、HPLC法を用いての分析化学、などの方法を駆使し、現在、新たな展開をしつつある。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に電気的障害を加えると、大脳皮質の一過性コリン作動性神経系細胞の消失と、大脳皮質神経細胞構築の永久的な改変、認知能力の永続的な変化を来すことが我々の以前の研究によって明らかになってきた。マウス前脳基底部コリン作動性神経系起始核を新生仔期に障害すると、大脳皮質可塑性にどのような影響を及ぼすか、について調べた。新生仔期の前脳基底部コリン作動性神経系起始核の障害により、大脳皮質のAChE染色性の低下を認め、コリン作動性神経線維の一過性の消失を認めた。それと同時に、バレル可塑性は低下した(Johnstom, et al.,2001,Nishimura, et al.,2002)。また、生後6か月には前脳基底部コリン作動性神経系起始核のニューロンが変性し始めるTs65Dnマウス(Holtzman, et al.,1996)のバレルの面積低下が判明した。これらの結果から、コリン作動性神経系入力が大脳皮質バレル野の発達と可塑性に重要な役割を演じていることが示唆された。さらに、SSRIの一種であるparoxetineをラットの周産期に投与した実験では、バレルの面積低下がみられたが、他の研究者らによって、バレルの癒合が報告があるが(Xu, et al.,2004)、我々の実験結果では、明らかなものは認めなかった。また、HPLCにより、モノアミンの含有量を検討したところ、大脳皮質の5-HTが低下していた。
生体防御因子としてのハト由来生物種特異的糖鎖遺伝子の同定と利用

ガラビオース配列(Galα1-4Gal)は、哺乳類では糖脂質上に存在し尿路感染性大腸菌や志賀毒素が細胞に付着する際の標的分子となる。一方、ハトなどの鳥類ではガラビオース配列は糖タンパク質上に存在する。本研究では、糖タンパク質上のガラビオース配列を生成する新規のハト由来α1, 4-ガラクトース転移酵素遺伝子を同定した。類似の配列を持つ酵素はヒトやニワトリにも存在するが、ハト由来の酵素は基質特異性が異なることを明らかにした。生物種間で構造の異なる糖鎖は、生物が進化・多様化する過程で微生物などの感染を防ぐために変化し選択された糖鎖遺伝子の産物であると推測されている。しかしながら、現在のところヒトや全ゲノム解析の終了した動植物以外から糖転移酵素遺伝子の同定はほとんど行われておらず、生物種特異的な糖鎖多様性が生物界でどのように分布しているのかもほとんど調べられていない。そこで本研究では、ハトなどある種の鳥類が生物種特異的に発現するα-1,4-ガラクトース転移酵素(以下α-1,4-GalTと略す)を遺伝子クローニングにより同定し、生物種特異的な糖鎖がどのようなメカニズムで構築されたのか遺伝子レベルで解析することを目的としている。1.ハト由来α-1,4-GalTの酵素活性測定法の確立β-ガラクトース残基の付加した二本鎖のN型糖鎖をブタチログロブリンから精製し、2-アミノピリジン(PA)で蛍光標識した。ハトの様々な組織の可溶化抽出液をこの基質と一定時間反応させ、反応液を順相および逆相HPLCで分析して反応生成物を検出した。反応生成物の割合から、α-1,4-GalTの組織分布を調べたところ、様々な組織において活性が検出された。2.ハトα-1,4-GalTの発現クローニングハトの肝臓からcDNAライブラリーを作製し、哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。次に、293T細胞に、cDNAライブラリーをリポフェクトアミンで導入し、抗P_1抗体(Galα1-4Galβ1-4GlcNAc-特異的)および蛍光標識した二次抗体で細胞を染色し、セルソーターでGalα1-4Galを発現している細胞を選別し、プラスミドを回収した。大腸菌で増幅させたプラスミドを再度293T細胞に導入し、陽性細胞からプラスミドを回収した。この操作を3回繰り返し、最終的に単一の大腸菌コロニーからcDNAを単離した。本研究では、ハトなどある種の鳥類が生物種特異的に発現するα-1,4-ガラクトース転移酵素(以下α-1,4-GalTと略す)の遺伝子を発現クローニングにより同定し、生物種特異的な糖鎖がどのようなメカニズムで構築されたのか遺伝子レベルで解析することを目的としている。本年度は単離したcDNAの遺伝子発現を行い、in vitro(細胞外)およびin vivo(細胞内)において、その酵素活性を測定して基質特異性を解析した。1.可溶性組換体の作製とハトα-1,4-GalTのin vitroの基質特異性の解析酵素の活性部位をコードすると推定されるC末端側の領域をPCRによって増幅し、哺乳動物発現用のベクター(pFLAG-CMV)に組み込んだ。293T細胞で可溶性のα-1,4-GalTを大量に発現させ、培養上清から可溶性のα-1,4-GalTを抗FLAG抗体カラムで精製した。Galβ1-4Glc(NAc)を非還元末端に持つ糖鎖に対し、この酵素はGalをα-1,4-の結合様式で転移させることをHPLC、NMR、およびメチル化分析により確認した。また、様々な構造の糖鎖を基質として、3[H]-標識したUDP-Galを用いて酵素活性を測定し、この酵素の基質特異性を決定した。2.哺乳動物細胞内におけるハトα-1,4-GalTのin vivoの基質特異性の解析全長をコードするハトα-1,4-GalTを293T細胞に発現させると、細胞表面上にGalα1-4Galが発現することをFACSにより確認した。また、このGalα1-4Galは、糖タンパク質上の糖鎖に存在することをウェスタンプロット法により確認した。本研究では、ハトなどある種の鳥類が生物種特異的に発現するα-1, 4-ガラクトース転移酵素(以下α-1, 4-GalTと略す)の遺伝子を発現クローニングにより同定し、種特異的な糖鎖がどのようなメカニズムで構築されたのか遺伝子レベルで解析することを目的としている。本年度は単離したハト由来cDNAの配列と相同性のある遺伝子をヒトやニワトリから単離して発現を行い、in vivo(細胞内)およびin vitro(細胞外)において、その酵素活性を測定して基質特異性の比較解析を行った。1.乳動物細胞内におけるハト、ヒト、ニワトリα-1, 4-GalTのin vivoの基質特異性の比較解析全長をコードするハトα-1, 4-GalTを293T細胞に発現させると、細胞表面上にGalα1-4Galをもつ糖タンパク質が発現することをFACSおよびウェスタンブロット法により確認した。

一方、ヒトおよびニワトリα-1, 4-GalTを同様に発現させるとGalα1-4Galは、糖脂質上の糖鎖に存在することをFACSにより確認した。すなわち、ハトα-1, 4-GalTはヒトやニワトリ由来のものと基質特異性が異なることを明らかにした。2.可溶性組換体の作製とハト、ヒト、ニワトリα-1, 4-GalTのin vitroの基質特異性の比較解析酵素の活性部位をコードすると推定されるC末端側の領域をPCRによって増幅し、哺乳動物発現用のベクター(pFLAG-CMV)に組み込んだ。293T細胞で可溶性のα-1, 4-GalTを大量に発現させ、培養上清から可溶性のα-1, 4-GalTを抗FLAG抗体カラムで精製した。Galβ1-4GlcNAcを非還元末端に持つ糖鎖に対し、ハト由来の酵素はヒトやニワトリ由来のものと比べ10倍くらい高い活性でGalを転移した。
歯科的観点からの構音障害治療法の確立を目指した構音及び口腔形態の調査研究

【研究目的】本研究では健常幼児の構音障害の発現率,ならびに構音障害と咬合・歯列の関係を明らかにし,歯科の観点から見た構音障害の治療法を考案することを目的とする.【研究方法】大阪府下の保育園の協力を得て4-6歳健常児の構音と歯列・咬合の評価を行って得られたマスデータを用い,構音障害と歯列・咬合の関係を検討する.【研究成果】平成23年に105名の幼児と面接を行い,そのうち101名より有効なデータが得られた.本年度は得られたデータを整理し,解析することを主に行った.明らかな構音の異常は24例に認められた.側音化構音が18例と最多で,次いで口蓋化構音が3例,カ行ガ行の前方化が3例であった.明らか異常では無いが,歯間化構音が22例に見られた.歯列・咬合については反対咬合が10名,開咬が22名,過蓋咬合は20名,叢生は2名,歯牙の位置異常は10名に認められた.これらの有無と構音障害の有無について,統計的分析(x2検定,多重ロジスティック回帰分析)を行ったが,有意差および有効な関連性はみとめられなかった.本研究にて測定した歯列・咬合の項目と構音障害の有無については関連が認められなかった.この結果は歯列の不正が構音に悪影響を及ぼすかどうか,まだエビデンスが十分でない現状に一石を投じるものであると考えられる.しかしながら歯列と構音が無関連であると結論づけるにはまだ不十分であり,本研究では測定していない口腔形態の項目については,今後の詳しい検討を継続し,歯列・咬合と構音の関係性を探る必要があると考えられる.なお,構音の分析結果については,平成24年日本口蓋裂学会学術集会にて口演発表を行った.【研究目的】本研究では健常幼児の構音障害の発現率,ならびに構音障害と咬合・歯列の関係を明らかにし,歯科の観点から見た構音障害の治療法を考案することを目的とする.【研究方法】大阪府下の保育園の協力を得て4-6歳健常児の構音と歯列・咬合の評価を行って得られたマスデータを用い,構音障害と歯列・咬合の関係を検討する.【研究成果】平成23年に105名の幼児と面接を行い,そのうち101名より有効なデータが得られた.本年度は得られたデータを整理し,解析することを主に行った.明らかな構音の異常は24例に認められた.側音化構音が18例と最多で,次いで口蓋化構音が3例,カ行ガ行の前方化が3例であった.明らか異常では無いが,歯間化構音が22例に見られた.歯列・咬合については反対咬合が10名,開咬が22名,過蓋咬合は20名,叢生は2名,歯牙の位置異常は10名に認められた.これらの有無と構音障害の有無について,統計的分析(x2検定,多重ロジスティック回帰分析)を行ったが,有意差および有効な関連性はみとめられなかった.本研究にて測定した歯列・咬合の項目と構音障害の有無については関連が認められなかった.この結果は歯列の不正が構音に悪影響を及ぼすかどうか,まだエビデンスが十分でない現状に一石を投じるものであると考えられる.しかしながら歯列と構音が無関連であると結論づけるにはまだ不十分であり,本研究では測定していない口腔形態の項目については,今後の詳しい検討を継続し,歯列・咬合と構音の関係性を探る必要があると考えられる.なお,構音の分析結果については,平成24年日本口蓋裂学会学術集会にて口演発表を行った.
原虫感染に対するCARD9を介した新規自然免疫活性化経路の解析

本研究では、原虫感染に対するCARD9依存性自然免疫経路の関与を解析した。原虫Leishmania majorをCARD9欠損マウスに感染させたところ、感染抵抗性の減弱を認め、感染初期には感染部位における炎症性サイトカインの発現低下を、感染後期においては、Th1型の免疫反応の誘導に障害を認めたため、CARD9は自然免疫と引き続くTh1型免疫の誘導に重要な役割を担っていることが示された。原虫認識受容体に関しては、ITAM受容体の可溶型蛋白ライブラリーを用いて候補を同定した。このうち一つの受容体に関して解析を進め、この受容体は原虫表面の糖鎖を認識している可能性が示された。本研究では、寄生虫のうち、原虫を認識する自然免疫受容体とそのリガンドの同定を目指した。原虫としてLeishmania majorを用い、これをITAM受容体の下流でアダプター分子として機能するCARD9欠損マウスに感染させたところ、感染抵抗性の減弱を認めたため、この経路がL. major感染に対する自然免疫を担っていることが確認された。CARD9欠損マウスでは、感染初期には感染部位における炎症性サイトカインの発現低下を認め、また感染後期においては、Th1型の免疫反応の誘導に障害を認めたため、CARD9に依存する自然免疫が引き続くTh1型免疫の誘導に重要な役割を担っていることが示された。CARD9の上流に位置する受容体に関しては、ITAM受容体の可溶型蛋白ライブラリーを作成し、この原虫への結合能を指標に候補受容体を検索したところ、複数の受容体の結合が確認された。このうち一つの受容体に関して解析を進めたところ、この受容体は原虫表面の糖鎖を認識している可能性が示された。現在、リガンドの同定を目指すとともに、この受容体の自然免疫活性可能、およびTh1型免疫誘導能などを解析している。CARD9は、ITAM含有受容体の下流で機能し、新しいタイプの自然免疫活性化経路に必須のアダプター分子である。本研究では、このCARD9依存性経路の寄生虫(原虫)感染における役割を解析した。CARD9欠損マウスは、原虫Leishmania majorに対しる感染抵抗性が減弱していた。この原虫の排除は主としてTh1型免疫反応に依存するが、CARD欠損マウスでは感染中期後期にTh1型免疫反応の減弱が認められた。また、感染初期には、感染局所における炎症性サイトカインやケモカインの発現の減弱も認められた。これらのことから、CARD9は、L. major感染に対する初期自然免疫の活性化と引き続くTh1型免疫の誘導に重要な役割を果たしている事が示された。CARD9の上流で原虫由来のPAMPsを認識すると考えられる受容体に関して検索を行ったところ、L. majorの生活環の特定のステージのものに対して結合を示す受容体を見出した。この受容体欠損マウスは感染抵抗性の減弱は認められなかったが、他の受容体はその機能を相補しているものと推察される。現在この受容体の会合する分子(PAMPs)や下流のシグナル伝達経路の全貌を解析している。前年度までに、ITAM受容体の下流でアダプター分子として機能するCARD9に依存する自然免疫活性化経路が原虫Leishmania major感染に対する抵抗性に関与することを確認した。今年度は、CARD9の上流に位置するSykキナーゼ欠損マウスを用いて、同様の結果を得、この経路がL. major感染抵抗性に関与していることを確認できた。CARD9の上流に位置する受容体に関しては、ITAM受容体の可溶型蛋白ライブラリーを用いて、認識受容体の候補を得た。これらの原虫への結合は確認できたが、認識するリガンドの同定には至っていない。本研究の目的である、原虫感染におけるCARD9依存性自然免疫経路の重要性に関しては、期待通りの成果を達成した。また、自然免疫受容体の候補も同定できた。しかしながら、引き続き必要となる、受容体の機能解析に関して、十分な成果が得られていない。感染免疫CARD9の上流でL. major由来のPAMPsを認識すると想定される受容体の機能解析を続け、また同受容体が認識するリガンドの同定を引き続き行う。機能相補のために同受容体の重要性が確認できない場合も想定されるが、リガンドはCARD9異存経路を活性化するアジュバントとしての応用も考えられるため、リガンド・受容体・シグナル伝達経路の全貌を明らかにする。L. major感染に対する初期防御の一部をCARD9依存性経路が担っていることが確認され、原虫感染には細菌やウイルス感染とは異なる自然免疫が重要であることが示された。

さらに、この原虫の排除に重要であることが示されている、Th1型免疫の誘導にCARD9依存性経路が重要な役割を果たしていることも確認できた。認識受容体に関しては、候補受容体が複数同定された。ただし、用いたITAM受容体ライブラリーは完全な物ではない(受容体はきわめて多数存在する)ため、また、原虫は生活環におけるステージごとに異なる分子(または、同一分子上に異なるエピトープ)を表面に発現している可能性が高いため、ライブラリーの拡充と、さらなる受容体の同定が必要である。同定された受容体候補に関しては、糖鎖を認識する可能性が示されており、これは当該受容体のこれまでに報告されたリガンドの性質と合致するため、この受容体が原虫上の糖鎖(を持つ分子)を認識している可能性が高いと考えられる。成果・達成度に示したように、L. major感染におけるCARD9依存性自然免疫活性化経路の重要性が示された。本経路の詳細について、受容体以下のシグナル伝達経路を解明するため、Sykなどのリン酸化酵素やMAPキナーゼ・NF-kBの活性化などを解析し、また欠損マウスを用いるなどして、シグナル伝達経路を解明する。また、感染初期における炎症性サイトカインやケモカインの産生・発現を解析することにより、本経路の機能を明らかにしていく必要がある.具体的には、引き続くTh1型免疫を誘導するために必要なサイトカイン・ケモカインや、これらの発現に関わるシグナル伝達経路を明らかにしていく。受容体に関しては、ライブラリーの拡充を図り、また原虫の生活環(宿主に侵入するステージ、また宿主内で増殖するステージ、宿主内で播種されるステージ)を視野に入れて受容体とリガンド候補の同定をさらに進める。L. majorはTh1型免疫を誘導することで実験的によく用いられている原虫であるが、これら以外の原虫、マラリア原虫やトキソプラズマ原虫などを用いて、同様のアプローチによりCARD9経路、あるいはそれ以外の自然免疫活性化経路の関与を検索、また受容体やリガンドの同定を進める必要がある。
非アルコール性脂肪肝炎発症における自然免疫機構の解明 -新規治療法の開発に向けて

非アルコール性脂肪性肝炎(以下NASH)はメタボリック症候群の肝臓での表現型とされる。現在、NASHに対する有効な治療法はなく、分子メカニズムに基づいた新規治療法の開発が求められている。我々はメタボリック症候群に伴う自然免疫の異常、特に細菌構成成分を認識する受容体Toll-like receptor(以下TLR)がNASH発症や進展に関与しているとの仮説を立て、コリン欠乏食によるNASH動物モデルを用いて研究を行った。遺伝子改変マウス(以下KOマウス)を用いた結果から、TLR2, TLR4, TLR9はNASHに促進的に作用することが判明した。また炎症性サイトカインはTLRの下流に位置する分子であるが、NASHでは各種炎症性サイトカインが増加した。TLR2 KO, TLR4 KO, TLR9 KOの各KOマウスではNASHの軽減と伴に、炎症性サイトカインの低下を認め、特にIL-1.の低下は共通した所見であった。実際、IL-1R KOマウスでもNASHの改善を認めた。またこれらTLR KOマウスに共通するのは炎症性サイトカインの低下とともに、炎症細胞浸潤の軽減であり、これら細胞の一部はLy6c陽性の骨髄由来マクロファージであることが判明した。それら炎症性細胞の誘導に重要な役割を果たすケモカインMCP-1とその受容体CCR2はNASH動物モデルでは増加していた。そこでCCR2 KOマウスにNASH誘導食であるコリン欠乏食を投与したが、NASHの進展は軽微であった。さらにコリン欠乏食長期投与でNASHを完成させた状態で、CCR2阻害剤を投与したところNASHの改善が認められた。これらの成果は現在までに計7本の論文として受理されていることから注目度の高い研究と考えられ、今後治療応用へ向けた研究へ発展させる予定である。メタボリック症候群の肝臓での表現型とされる非アルコール性脂肪性肝炎(以下NASH)に対する有効な治療法は現在なく、分子メカニズムに基づいた新規治療法の開発が求められている。我々はメタボリック症候群に伴う自然免疫の異常、特に細菌構成成分を認識する受容体Toll-like receptor(以下TLR)とその下流分子がNASH発症や進展に関与しているとの仮説を立て、研究を行っている。遺伝子改変マウスを用いた結果からTLR2,TLR4,TLR9はNASHに促進的に作用することが判明した。またTLRの下流に位置する炎症性サイトカインがNASHでは増加し、TLR KOマウスではNASHの軽減と伴に、炎症性サイトカインの低下を認めた。またこれらTLR KOマウスに共通するのは炎症性細胞浸潤の軽減であり、これら細胞の一部は骨髄由来マクロファージであることが判明した。代表的ケモカインMCP-1やその受容体CCR2はNASH動物モデルでは増加していたことから、CCR2 KOマウスにNASH誘導食を投与したところ、NASHの改善が認められた。さらにCCR2阻害剤をWTマウスに経口投与したところNASHの改善が認められた。現在、これらの成果は投稿中である。よってTLRとその下流分子である炎症性サイトカインおよびケモカインはNASH治療においてテーゲットなりうる分子であり、現在引き続き解析を進めている。

遺伝子改変マウスを用いた結果からTLR2,TLR4,TLR9はNASHに促進的に作用することが判明した。またTLRの下流に位置する炎症性サイトカインがNASHでは増加し、TLRKOマウスではNASHの軽減と伴に、炎症性サイトカインの低下を認めた。実際、IL-1R KOマウスでもNASHの改善を認めた。またこれらTLR KOマウスに共通するのは炎症性細胞浸潤の軽減であり、これら細胞の一部は骨髄由来マクロファージであることが判明した。代表的ケモカインMCP-1やその受容体CCR2はNASH動物モデルでは増加していたことから、CCR2KOマウスにNASH誘導食を投与したところ、NASHの改善が認められた。さらにCCR2阻害剤をWTマウスに経口投与したところNASHの改善が認められた。現在、これらの成果は投稿中で、一部はrevision中となっている。非アルコール性脂肪性肝炎(以下NASH)はメタボリック症候群の肝臓での表現型とされる。現在、NASHに対する有効な治療法はなく、分子メカニズムに基づいた新規治療法の開発が求められている。我々はメタボリック症候群に伴う自然免疫の異常、特に細菌構成成分を認識する受容体Toll-like receptor(以下TLR)がNASH発症や進展に関与しているとの仮説を立て、コリン欠乏食によるNASH動物モデルを用いて研究を行った。遺伝子改変マウス(以下KOマウス)を用いた結果から、TLR2, TLR4, TLR9はNASHに促進的に作用することが判明した。また炎症性サイトカインはTLRの下流に位置する分子であるが、NASHでは各種炎症性サイトカインが増加した。TLR2 KO, TLR4 KO, TLR9 KOの各KOマウスではNASHの軽減と伴に、炎症性サイトカインの低下を認め、特にIL-1βの低下は共通した所見であった。またこれらTLR KOマウスに共通するのは炎症性サイトカインの低下とともに、炎症細胞浸潤の軽減であり、これら細胞の一部はLy6c陽性の骨髄由来マクロファージであることが判明した。それら炎症性細胞の誘導に重要な役割を果たすケモカインMCP-1とその受容体CCR2はNASH動物モデルでは増加していた。そこでCCR2 KOマウスにNASH誘導食であるコリン欠乏食を投与したが、NASHの進展は軽微であった。さらにコリン欠乏食長期投与でNASHを完成させた状態で、CCR2阻害剤を投与したところNASHの改善が認められた。これらの成果は現在までに計7本の論文として受理されていることから注目度の高い研究と考えられ、今後治療応用へ向けた研究へ発展させる予定である。本科研費援助により、すでに論文3編が受理されており、また本研究課題として挙げた残り一つの論文も現在投稿中であることからおおむね順調に進展していると考えられる。
高齢者の腸内環境改善に関する研究-真空調理を用いた高食物繊維食品の開発

本研究は施設入所高齢者の便秘の実態を明らかにした上で、高食物繊維食を摂取し、下剤に頼らない腸内環境改善を目的としている。平成17年度に引き続き、高齢者の便秘の実態調査を行い、その後寒天ゼリーおよびオリゴ糖摂取による腸内環境の変化を検討した。また、真空調理による料理開発についても検討を行った。1.高齢者の便秘に関する実態調査施設入所高齢者80名を要介護度別に分類し、食事形態、摂食量、排泄方法、排便回数、下剤服用回数を調査した。その結果、介護度が高くなる程、咀嚼・嚥下機能低下により「きざみ食」「経管栄養」が増加していた。下剤は21名が毎日服用、59名は23日排便がなかった場合に服用するという結果であった。排便回数は、介護度が高くなる程、下剤の服用量が増加するにもかかわらず、少なくなっており、全体では5.7回/7日、介護度5では4.0回/7日であった。2.寒天ゼリーおよびオリゴ糖摂取による腸内環境改善の検討寒天ゼリー(寒天0.5g)を毎朝食時に連続5ヶ月間摂取してもらった。その結果、排便回数は80名全体で6.8回/7目に増加し、便中水分もゼリー摂取前は81%であったものが、75%に改善した。さらに、腸内細菌はゼリー摂取に伴って総菌数が対数で7.9から8.6に増加した。この後10名には4ヶ月間寒天ゼリーにオリゴ糖3gを添加して摂取してもらったところ、ビフィズス菌が2.0から6.4に増加し、腸内環境がさらに良好になったことが示唆された。3.真空調理による食材ごとの条件検討根菜類、魚、肉について加熱条件、大きさを変化させながら、通常調理と物性を比較した。その結果、真空調理を用いると食品の形状をくずすことなく、やわらかく仕上がることがわかった。平成17年度は、高齢者の便秘の実態調査を中心に研究を行った。1.高齢者の便秘に関する実態調査施設入所高齢者を要介護度別に分類し、排便や食事について調査した。その結果、要介護度が高い程、咀嚼・嚥下機能低下が著しく、経管栄養やきざみ食の割合が多かった。喫食量は全員がほぼ全量摂取であったが、要介護度が高い程、提供栄養量が低くなっていた。排便は、要介護度3以上で、ほぼ全員が1周間のうち、1回以上下剤を使用しており、使用回数や使用量は要介護度5が最も多く、続いて要介護度4であった。排便回数は、下剤の使用が多かったにも関わらず、要介護度5で4.8回/7日間と最も低くなった。逆に、要介護度4では、7.3回/7日間と多くなったが、毎日排便があるわけではなく、23日排便がなく、下剤を投与すると翌日は5回程度排便するという人ばかりで、状態も軟便で、介護者の負担も大きくなっていることが明らかになった。2.高齢者の腸内環境の検討(1)腸内細菌叢要介護度別の平均値で細菌数を算出した。その結果、要介護度が高い程、総菌数が少なかった。