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1920年代、北京を中心とした文学結社の活動

これと合わせて、日本国内では容易に目睹できない、胡也頻『聖徒』、『四星期』、『詩稿』の民国時期に出版された版本の精読を行い、これまで革命烈士として取り上げられていた胡也頻の、近代化を進める1920年代の北京におけるモダン・ボーイとしての側面に光を当てつつ、論考をまとめるべく準備を行った。このほかに資料の収集を行い、1.秦方奇校注『徐玉諾詩文輯存』(河南大学出版社、2008年)、2.王統照『王統照全集』(中国工人出版社、2009年)、3.王風編『廃名集』(北京大学出版社、2009年)、4.鍾叔河編訂『周作人散文全集』(広西師範大学出版社、2009年)などの全集を中心に購入した。これらの徐玉諾、王統照、廃名、周作人らは、当時の北京にあって活躍し、また文学青年たちの間で人気のあった詩人・文学者である。1の秦方奇校注『徐玉諾詩文輯存』については、徐玉諾が沈従文や干〓虞といった文学青年たちに大きな影響を与えたにもかかわらず、これまでなかなか作品を目にすることができなかったが、同書によって彼の作品のあらましがようやく知れるようになった。徐玉諾の詩文の詩文についても、今後、精読を行ったうえ、論考をまとめてゆきたいと考えている。このほか24の全集・作品集についても、周作人のものを除き、初めての全集、大規模な作品集であり、当時の文学的な環境を知るためには、不可欠な書物である。また日本における沈従文研究の論文目録を、小島久代氏との共著で『お茶の水女子大学中国文学会報』第29(2009年4月刊行)に掲載する予定である。本年度の成果としては、本研究によって、これまでに行った研究の成果をまとめて、報告書として印刷・配布を行った。
超重力理論におけるインフレーションの最前線

研究実施計画の内、「インフラトンの散乱振幅のユニタリティからの制限」や「原始ブラックホール(PBH)及びその生成に伴う重力波」についての研究が進展した。以下、これらを順番に報告する。超対称性理論で超対称性を自発的に破る模型では、ケーラー曲率と呼ばれる、場の高次項補正を適切な符号で導入する必要がある場合がよくある。その項が、超対称性を破る真空の安定性や、宇宙のインフレーションの予言に影響を与えるからである。ある条件の下では、量子論的に確率解釈が成り立つという要請(ユニタリティ)からケーラー曲率の符号が決まってしまう事を示した。これにより、研究の目的である超重力理論におけるインフレーションに対する理論的制限が得られた。ただし、これは高エネルギーで有効理論がどのように基礎理論に補完されるかという仮定に強く依存し、又、具体的なインフレーション模型に直接応用できるとも限らない成果である事に注意する必要がある。次にPBHに関連した重力波の研究の成果について述べる。PBHはその質量に応じて、暗黒物質の候補であり、重力波の直接検出事象に繋がった連星ブラックホールの起源の候補でもある。PBHが生成する為には大きな原始曲率揺らぎが必要で、それは一般相対論の効果により重力波も生み出す。この原始曲率揺らぎに由来する重力波スペクトルの模型非依存の部分について、解析的な計算を行った。数値計算に頼らない事によって、各種パラメターへの依存性も一目瞭然となり、より簡単にスペクトルを計算する事ができるようになった。PBHが作られた後、連星を形成し、最終的に衝突合体する際にも重力波が放出される。曲率揺らぎ由来の重力波と併せて、将来の重力波観測によりどれだけPBHの存在量を制限できるかの予測も行った。これら重力波の研究は、研究の目的でも触れた様に超重力理論に限らず成り立つ汎用性の高い成果である。研究実施計画のうち複数の項目について研究成果があり、複数の論文としてまとめる事ができた。幾つかは、特別研究員申請時など初期の研究計画では具体的に計画していなかったような成果でもあり、期待以上に進展したと言える。その代わり、当初の研究計画の内のいくつかは進展していないものもあるので、上記の区分が適切であると判断した。例を挙げると、グラヴィティーノの散乱振幅のユニタリティーから冪零超場を使った理論の有効なスケールに制限を与えるという計画の代わりに、一般的なカイラル超場に含まれるスカラー場の散乱振幅のユニタリティーからケーラー曲率の符号に制限を与えるという進捗を得た、といった具合である。二年度目の研究の目的で記した様に、現状でLHC実験(現在最大の加速器実験)から標準模型を超える物理への明示的なヒントは得られておらず、超対称性理論・超重力理論に限った事ではないが、従来考えられていなかったような幅広い可能性も検討していく事が求められている。その為、研究課題の「超重力理論におけるインフレーションの最前線」について研究を推進しつつも、より広範の理論に当てはまる一般的な成果も同時に出す事ができれば有用である。そのような成果として、今年度に重力波に関する研究が著しく進展した。この成果は更に拡張・発展が可能であり、最終年度の推進課題の一つとする。その一方で、やはり超重力理論に根ざした宇宙論的な考察についても行う。特に、超重力理論や超弦理論では指数関数型のスカラーポテンシャルが頻繁に現れる。また、超対称性の破れが無ければポテンシャルはゼロか負の値をとり、超対称性の破れを取り入れても全領域でポテンシャルが非負になるとは限らない。このような状況でインフレーションの前の超初期宇宙、あるいは第二のインフレーション期とも言える現在の暗黒エネルギー期の後に訪れる未来の宇宙において、どのような現象論的・宇宙論的帰結が得られるかという研究を推進する。これを執筆中の時点では、正の空間曲率(とポテンシャルが負の場の領域)があれば、宇宙が膨張から収縮に転じ、また膨張に戻り、かつインフレーションを起こすといった極めて非自明なダイナミクスが起こり得る事が研究成果として判明している。ここに指数関数ポテンシャルを適切に組み合わせれば、更に非自明・複雑な膨張・収縮史が得られると考えられる。また、このような宇宙の収縮も含めた時間発展の際にヒッグス場やアクシオン場などのスカラー場がどのように時間発展するのか、そして素粒子現象論的に意味のある効果を生み出すかといった観点からも、このシナリオの帰結を調べたい。超重力理論は素粒子の標準模型を超える理論の一つであり、様々な理由から研究されている。超重力理論では理論の整合性からグラヴィティーノ(重力微子)という粒子が存在し、宇宙論的に問題を起こす程長寿命であり、宇宙初期の生成量に観測的な制限がつけられている。近年、超対称性の非線形表現の場を用いたインフレーション模型が研究されていた。非線形表現の場は超対称性の破れと密接な関係がある。単純な場合、物理的には、超対称性の破れよりずっと低いスケールでそういった非線形表現が実現されると考えられる。その内ある種の模型では、先行研究の問題解決の為など積極的な理由で、非線形表現の場とインフレーションを起こす場(インフラトン)の相互作用を導入し、それによってインフレーションを引き起こすインフラトンポテンシャルを構築していた。私は共著者と共に、この種の模型で長寿命粒子であるグラヴィティーノが大量に生成されることを指摘した。前述したように、宇宙論的に生成される長寿命粒子には宇宙観測で厳しく制限がついている。

この研究によって、より「普通の」インフレーション模型が好ましいことが明らかになった。本年度は他にも超重力理論でのインフレーション後の宇宙史における物理で当初予定していたよりも広範なトピックについて研究成果が得られた。一部の結果は超重力理論に限らず一般相対論の範囲で成り立つ一般的な結果である。これらは雑誌未掲載なので詳細は来年度の報告に載せる。受入教員と議論をしながら研究を進めていき、当初計画していた内容より広範なトピックで研究課題を研究している。また、その中で偶然発見した内容についての研究も行なった(雑誌未掲載)。これらの理由により当初計画していた「グラヴィティーノ散乱振幅のユニタリティーからの制限」や「超重力理論でのマルチフィールドインフレーションを用いた宇宙マイクロ波背景放射の特徴の説明」といったトピックについての進捗は遅れている。科研費申請時点で計画していたグラヴィティーノ問題に関する研究では査読付き論文に掲載される成果が出せた。一方、冒頭で述べたトピックとして原始ブラックホールや重力波に関する研究が進展しているので、総合的にはおおむね順調に進展していると結論できる。研究実施計画の内、「インフラトンの散乱振幅のユニタリティからの制限」や「原始ブラックホール(PBH)及びその生成に伴う重力波」についての研究が進展した。以下、これらを順番に報告する。超対称性理論で超対称性を自発的に破る模型では、ケーラー曲率と呼ばれる、場の高次項補正を適切な符号で導入する必要がある場合がよくある。その項が、超対称性を破る真空の安定性や、宇宙のインフレーションの予言に影響を与えるからである。ある条件の下では、量子論的に確率解釈が成り立つという要請(ユニタリティ)からケーラー曲率の符号が決まってしまう事を示した。これにより、研究の目的である超重力理論におけるインフレーションに対する理論的制限が得られた。ただし、これは高エネルギーで有効理論がどのように基礎理論に補完されるかという仮定に強く依存し、又、具体的なインフレーション模型に直接応用できるとも限らない成果である事に注意する必要がある。次にPBHに関連した重力波の研究の成果について述べる。PBHはその質量に応じて、暗黒物質の候補であり、重力波の直接検出事象に繋がった連星ブラックホールの起源の候補でもある。PBHが生成する為には大きな原始曲率揺らぎが必要で、それは一般相対論の効果により重力波も生み出す。この原始曲率揺らぎに由来する重力波スペクトルの模型非依存の部分について、解析的な計算を行った。数値計算に頼らない事によって、各種パラメターへの依存性も一目瞭然となり、より簡単にスペクトルを計算する事ができるようになった。PBHが作られた後、連星を形成し、最終的に衝突合体する際にも重力波が放出される。曲率揺らぎ由来の重力波と併せて、将来の重力波観測によりどれだけPBHの存在量を制限できるかの予測も行った。これら重力波の研究は、研究の目的でも触れた様に超重力理論に限らず成り立つ汎用性の高い成果である。研究実施計画のうち複数の項目について研究成果があり、複数の論文としてまとめる事ができた。
生体内遺伝子導入法による薬剤投与システムを応用した新生骨誘導法の開発

生体内遺伝子導入技術は、疾患に対する組換え治療蛋白を効率的に体内で産生させることができる、有望な薬剤投与システムである。我々は、本技術を用いて、強力な骨誘導作用を持つ増殖因子である骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2;BMP-2)を生体内で高発現させることによって、骨欠損の治療目的に足る十分な量の骨を誘導することができるのではないかという仮説を立てた。本仮説を検証するために、まず、ヒトBMP-2遺伝子をコードする非増殖型アデノウイルスベクターを作製し、これを成獣ラットの下腿ひらめ筋にウイルス液を直接注入することによってBMP-2遺伝子を導入した。BMP-2遺伝子のひらめ筋内における過剰発現は、RT-PCR法によって確認されたものの、本導入によって標的筋内あるいはその周囲に骨形成は全く生じなかった。そこで次に、骨前駆細胞を局所に誘導するために、BMP-2遺伝子導入と同時に、筋を同所性に遊離移植することにより阻血変性を生じさせたところ、筋全長にわたって著名な骨化が生じた。一方、筋の移植操作のみ、あるいは移植操作とリポータ遺伝子LacZ導入の組合せでは、全く骨化は起こらなかった。この、移植筋にBMP-2遺伝子を導入することによって生じた骨化の過程は、軟X線写真上のひらめ筋相当部位における不透過像の形成、および組織切片におけるvon Kossa染色によって確認された。また、骨格筋の遊離移植後には阻血変性に引き続いて筋線維の再生が起こるが、移植筋に導入されたBMP-2遺伝子は、移植に伴う筋線維の再生を抑制した。さらに、移植筋におけるBMP受容体の発現を免疫組織化学的に検索したところ、BMPタイプI受容体A発現細胞の増加が認められ、本モデルにおける移植筋の骨化に対する同受容体の動態の関与が示唆された。結論として、遊離移植により阻血変性をきたしている骨格筋にBMP-2遺伝子を過剰発現させることによって、広い範囲にわたって異所性骨化を引き起こすことができることが示された。遺伝子工学的手法を用いて、供与されたヒト骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein-2;BMP-2)遺伝子(cDNA)を発現プラスミドあるいは非増殖型アデノウィルスに組み込み、遺伝子導入用ベクターを作製した。これらを、さまざまな経路(経静脈的、経動脈的、局所滴下、筋肉内注射)を通じてラット下腿ひらめ筋に投与してBMP-2遺伝子を発現させた。しかしながら、これらのいずれの投与方法によっても標的器官のひらめ筋には骨形成が生じなかった。生体内における筋肉内での骨形成には、BMP-2遺伝子の発現以外に別の因子が必要であると考え、遺伝子導入に加えさらに標的のひらめ筋に、局所麻酔薬リドカイン局注、圧挫損傷、同所性移植による血流遮断等を加えて筋の変性および再生を引き起こした。その結果、ひらめ筋に対し、同所性移植による血流遮断と非増殖型アデノウィルスの直接筋注によるBMP-2遺伝子の導入を同時に行った場合に、ひらめ筋全体の強い骨化が起こることが確認された。筋の同所性移植操作のみや、移植操作に加えリポーター遺伝子を組み込んだ非増殖型アデノウィルスの筋注を行っただけでは、骨形成は全く起こらなかった。この骨化はきわめて再現性が高く、また標的のひらめ筋に限局していた。これらの結果より、非増殖型アデノウィルスベクターを用いた生体に対するBMP-2遺伝子治療の有効性が証明された。

さらに、本モデルにおける骨化機構を解明するために、(1)リポーター遺伝子LacZのアデノウィルスベクターによる遺伝子導入における導入効率の検定、(2)RT-PCR法によるBMP-2遺伝子の発現の確認、(3)移植筋におけるBMP受容体の検索を行い、それぞれ、(1)本遺伝子導入法の高い導入効率、(2)BMP-2遺伝子導入筋に限ったBMP-2遺伝子の発現、(3)移植に伴う筋肉内のBMP受容体の誘導、が証明された。生体内遺伝子導入技術は、疾患に対する組換え治療蛋白を効率的に体内で産生させることができる、有望な薬剤投与システムである。我々は、本技術を用いて、強力な骨誘導作用を持つ増殖因子である骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)を生体内で高発現させることによって、骨欠損の治療目的に足る十分な量の骨を誘導することができるのではないかという仮説を立てた。本仮説を検証するために、まず、ヒトBMP-2遺伝子をコードする非増殖型アデノウイルスベクターを作製し、これを成獣ラットの下腿ひらめ筋にウイルス液を直接注入することによってBMP-2遺伝子を導入した。BMP-2遺伝子のひらめ筋内における過剰発現は、RT-PCR法によって確認されたものの。本導入法によって標的筋内あるいはその周囲に骨形成は全く生じなかった。そこで次に、骨前駆細胞を局所に誘導するために、BMP-2遺伝子導入と同時に、筋を同所性に遊離移植することにより阻血変性を生じさせたところ、筋全長にわたって著明な骨化が生じた。一方、筋の移植操作のみ、あるいは移植操作とリポーター遺伝子LacZ導入の組合せでは、全く骨化は起こらなかった。この、移植筋にBMP-2遺伝子を導入することによって生じた骨化の過程は、軟X線写真上のひらめ筋相当部位における不透過像の形成、および組織切片におけるvon Kossa染色によって確認された。また、骨格筋の遊離移植後には阻血変性に引き続いて筋線維の再生が起こるが、移植筋に導入されたBMP-2遺伝子は、移植に伴う筋線維の再生を抑制した。さらに、移植筋におけるBMP受容体の発現を免疫組織科学的に検索したところ、BMPタイプI受容体A発現細胞の増加が認められ、本モデルにおける移植筋の骨化に対する同受容体の動態の関与が示唆された。結論として、遊離移植により阻血変性をきたしている骨格筋にBMP-2遺伝子を過剰発現させることによって、広い範囲にわたって異所性骨化を起こすことができることが示された。
マメ科植物共生窒素固定系成立に関する宿主植物側因子の解明

Ljsym102は劣性単一遺伝子支配であり、根粒菌感染により根粒形成は誘導されるが、ピンク色を示さず、ニトロゲナーゼ活性が非常に低いという症状を呈する。根粒菌感染後16日目の根粒断面の観察を行ったところ、根粒の組織分化およびバクテロイドは見られたが、すでに大部分の感染細胞の顆粒化、崩壊が生じていた。以上から、本変異体は根粒の組織分化は進むが、機能的な共生窒素固定系が成立しない変異体であると考えられた。Miyakojimaと交配して作成したF2及びF3植物1644個体を用いた高精度マッピングと近傍マーカーを起点としたTACおよびBACコンティグを用いて第1連鎖群TM0349(11.3cM)近傍の約180kbの領域に遺伝子座乗領域を絞り込み、その領域に存在するORF26個について塩基配列の解読を行って、候補遺伝子を特定した。得られた候補遺伝子に関し、RACE法によりcDNAの構造を明らかにするとともに、3個のアリルで変異を同定して、本候補遺伝子がSym102原因遺伝子であることを確認した。SYM102は推定アミノ酸配列からATP依存性膜局在型金属プロテアーゼをコードしていると予測された。マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、農業上重要な役割を果たしており、その有効利用は持続的農業技術開発の中心課題の一つであり、そのためには、共生窒素固定系成立・維持の分子機構を明らかにすることが重要である。近年、マメ科モデル植物ミヤコグサやタルウマゴヤシの共生変異体を用いた分子遺伝学的研究により根粒菌感染初期過程に関わる植物側因子が明らかにされつつあるが、感染から宿主細胞内への侵入、共生窒素固定系成立とその活性維持に至る後期過程の解明はこれからの課題である。本課題では、ミヤコグサ有効根粒形成不全(Fix-)変異体Ljsym102を用いて、未解明な後期過程に関わる植物側因子を明らかにする。本年度は、表現型解析による変異体の異常を来している過程の推察と、原因遺伝子単離に向けたマッピングを行った。Ljsym102は劣性単一遺伝子支配であり、根粒菌感染により根粒形成は誘導されるが、ピンク色を示さず、ニトロゲナーゼ活性が非常に低い、Fix-変異体であることが示された。根粒菌感染後16日目の根粒断面の観察を行ったところ、根粒の組織分化およびシンビオソーム形成は見られたが、観察時にすでに大部分の感染細胞の顆粒化、崩壊が生じていた。Miyakojimaと交配して作成したF2植物1096個体を用いた高精度マッピングにより、原因遺伝子を第1連鎖群上流のTM349-TM1507間0.8cMの領域に位置づけた。さらに近傍マーカーからTAC及びBACクローンを用いてコンティグを作成し、遺伝子座乗領域の絞り込みを行ったところ、TM349付近の約60kbの領域に範囲を特定することが出来た。マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、農業上重要な役割を果たしており、その有効利用は持続的農業技術開発の中心的課題の一つである。このため、共生窒素固定系成立・維持の分子機構を明らかにすることが重要である。本年度は、原因遺伝子単離に向けた高精度マッピングと遺伝子領域をカバーするDNAクローンのコンティグ作成を行った。Ljsym102は劣性単一遺伝子支配であり、根粒菌感染により根粒形成は誘導されるが、ピンク色を示さず、ニトロゲナーゼ活性が非常に低い、Fix-変異体である。今年度はイオンビーム照射系統から新たに1系統のアリルを見いだすとともに、そのほかアリルの候補変異体を1系統単離した。MiyakojimaとのF2植物1457

個体を解析した結果、原因遺伝子は昨年度推定した領域とは異なり、第1染色体TM0671(8.8cM)とTM0349(11.3cM)間に存在すると考えられた。近傍組み換え個体の遺伝子型から、原因遺伝子はTM0349側に近い領域に存在すると思われたので、南側からTACクローンのウォーキングを開始し、TM0349マーカー北側TACクローン1つ分の距離に組み換え無しのDNAマーカーをみいだした。現在、遺伝子座乗領域をカバーするため、そのDNAマーカーからさらに北側のTAC/BACクローンの単離を試みている。マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、農業上重要な役割を果たしており、その有効利用は持続的農業技術開発の中心的課題の一つである。このため、共生窒素固定系成立・維持の分子機構を明らかにすることが重要である。近年、マメ科モデル植物ミヤコグサやタルウマゴヤシの共生変異体を用いた分子遺伝学的研究により根粒菌感染初期過程に関わる植物側因子が明らかにされつつあるが、感染から宿主細胞内への侵入、共生窒素固定系成立とその活性維持に至る後期過程の解明はこれからの課題である。本課題では、ミヤコグサ有効根粒形成不全(Fix-)変異体Ljsym102を用いて、未解明な後期過程に関わる植物側因子を明らかにする。本年度は、高精度マッピングにより昨年度までに作成したDNAコンティグ上に遺伝子座乗領域を絞り込み、原因遺伝子を特定することに成功した。Ljsym102は劣性単一遺伝子支配であり、根粒菌感染により根粒形成は誘導されるが、ピンク色を示さず、ニトロゲナーゼ活性が非常に低い、Fix-変異体である。今年度は相補性検定により3つのアリルを同定した。また、第1連鎖群TM0349(11.3cM)近傍の約180kbの領域に遺伝子座乗領域を絞り込み、その領域に存在するORF26個について塩基配列の解読を行って、候補遺伝子を特定した。得られた候補遺伝子に関し、5'-RACE及び3'-RACEによりcDNAの構造を明らかにするとともに、アリルでの変異を同定して、本候補遺伝子がSym102原因遺伝子であることを確認した。
プロテオミクス解析を応用した歯髄前駆細胞／静的幹細胞の恒常性維持と活性化の解明

我々は、「象牙芽細胞下層と歯髄中央部の血管周囲に前駆細胞/静的幹細胞(長期ラベル細胞:LRCs)が配置しており、歯髄の恒常性を維持している」という仮説を提唱した。本研究課題では、ドキシサイクリン(Dox)投与ですべての細胞をGFPでラベルした後、細胞分裂回数に応じて細胞ラベルが減弱するノックインマウス(TetOP-H2B-GFPマウス)を用いた。歯の損傷実験には、上顎第一臼歯の歯冠部が舌下部に移植および歯の再植実験を行った。歯髄中央部および象牙芽細胞下層の細胞は生後4週にIGFBP5/Igfbp5強陽性を示した。H2B-GFPラベル維持細胞(LRC)は歯髄中央部に加え象牙芽細胞下層に分布していた。歯の損傷後37日で、LRCは歯髄に維持されており、核にIGFBP5強陽性を示し、TUNEL陰性であった。RT-PCRおよびISHは歯髄におけるIgfbp5発現を確証した。以上より、IGFBP5は歯の発生および歯の損傷後の歯髄治癒過程において歯髄幹細胞の生存とアポトーシスの制御因子として重用な役割を果たすことが示唆された。最近我々は、Nestin-EGFP遺伝子改変マウスを用いて、生後の歯髄Nestin mRNAとタンパク質発現は象牙芽細胞に、GFP陽性発現は象牙芽細胞下層に限局し、象牙芽細胞下層細胞と象牙芽細胞との相違が伺われた。歯の切削後1日で損傷を受けた象牙芽細胞が変性しNestin反応を消失したが、術後35日にNestin陽性象牙芽細胞様細胞が歯髄・象牙質界面に配列し、修復象牙質形成を開始した。GFP陽性細胞が象牙芽細胞様細胞にコミットされており、静的状態でNestinタンパク発現が抑制されていた象牙芽細胞下層細胞が外的侵襲によりNestinタンパクを発現し象牙芽細胞様細胞に分化することが明らかになった。TetOP-H2B-GFPマウスを用いた歯の損傷後の歯髄LRCsの動態の解析が予定通り進行している。さらに、Nestin-EGFP遺伝子改変マウスを用いて、象牙芽細胞下層の歯の損傷後の歯髄治癒過程における役割解明も進めている。TetOP-H2B-GFPマウスを用いた歯の再植後の歯髄LRCsの動態の解析を行う。DoxをE14E15に一度飲ませてすべての細胞をGFPでラベルし、生後2週に歯の再植手術を行い、経時的な歯髄LRCsの系譜を術後1日2週まで標本を採取し、歯髄LRCsの局在・蛍光強度ならびに数の変化、象牙芽細胞分化マーカーであるネスチン、IGFBP5、Gli1、Ptch1免疫組織化学・多重蛍光解析を引き続き行い、リアルタイムPCRでIGFBP5、Shhシグナルの定量解析を行う。さらに、TetOP-H2B-GFPマウスと低酸素プローブを用いた歯の再植に対する歯髄前駆細胞と静的幹細胞の活性化の違いと低酸素との関連の解析、プロテオミクスを用いた切歯形成端と臼歯歯髄タンパク質の網羅的・定量的解析を進める。非対称分裂を利用して、歯が損傷を受けた時にだけ活発な細胞増殖をする静的幹細胞(長期ラベル細胞:Label-retaining cells [LRCs])に関して、ドキシサイクリン(Dox)ですべての細胞をGFPラベルした後、細胞分裂回数により細胞のラベルが減弱するノックインマウス(TetOP-H2B-GFPマウス)を用いて解析をした結果、これまでの歯髄中央部血管周囲の細胞に加え、象牙芽細胞下層に強い蛍光強度をもつLRCsが存在する事が明らかになった。さらに、拒絶反応の有無に関わらず歯の他家移植後に歯髄静的幹細胞がアポトーシスを起こすという現象から、マイクロアレイによる網羅的解析により前駆細胞/静的幹細胞の生存に関わるインスリン様成長因子結合タンパク質5(IGFBP5)を特定しが、IGFBP5の局在がTetOP-H2B-GFPマウスを用いたLRCsの局在と一致することを明らかになり、このIGFBP5が歯髄前駆細胞/静的幹細胞維持に重要な役割を果たすことが推察された。Nestin遺伝子のsecond intron enhancerにリポーター遺伝子としてEGFPを結合させたNestin-EGFPトランスジェニックマウスを用いて解析したところ、Nestin-GFP発現が主に歯冠部象牙芽細胞下層に限局していたのに対し、NestinタンパクとmRNAは分化した象牙芽細胞に強く発現していた。象牙芽細胞下層の役割については、さらに解析をする予定である。胎生期歯胚を上皮と間葉に分け、プロテオミクス解析をした結果、上皮特異的または間葉特異的なタンパク質に着目して、歯の発生過程に於けるタンパク質発現パターンを解析中である。切歯形成端の上皮幹細胞に関して、低酸素環境がマウス切歯apical bud内エナメル上皮幹細胞の未分化性を制御していると考えられた。プロテオミクス解析に関して、共同研究先の機器の更新に伴い機器の利用ができない期間ががあったため、当初予定していた切歯形成端と外的刺激後の歯髄タンパク質の網羅的・定量的解析が次年度の解析となった。

本研究課題では、ドキシサイクリン(Dox)投与ですべての細胞をGFPでラベルした後、細胞分裂回数に応じて細胞ラベルが減弱するノックインマウス(TetOP-H2B-GFPマウス)を用いた。歯の損傷実験には、上顎第一臼歯の歯冠部が舌下部に移植および歯の再植実験を行った。歯髄中央部および象牙芽細胞下層の細胞は生後4週にIGFBP5/Igfbp5強陽性を示した。H2B-GFPラベル維持細胞(LRC)は歯髄中央部に加え象牙芽細胞下層に分布していた。歯の損傷後37日で、LRCは歯髄に維持されており、核にIGFBP5強陽性を示し、TUNEL陰性であった。RT-PCRおよびISHは歯髄におけるIgfbp5発現を確証した。以上より、IGFBP5は歯の発生および歯の損傷後の歯髄治癒過程において歯髄幹細胞の生存とアポトーシスの制御因子として重用な役割を果たすことが示唆された。最近我々は、Nestin-EGFP遺伝子改変マウスを用いて、生後の歯髄Nestin mRNAとタンパク質発現は象牙芽細胞に、GFP陽性発現は象牙芽細胞下層に限局し、象牙芽細胞下層細胞と象牙芽細胞との相違が伺われた。歯の切削後1日で損傷を受けた象牙芽細胞が変性しNestin反応を消失したが、術後35日にNestin陽性象牙芽細胞様細胞が歯髄・象牙質界面に配列し、修復象牙質形成を開始した。GFP陽性細胞が象牙芽細胞様細胞にコミットされており、静的状態でNestinタンパク発現が抑制されていた象牙芽細胞下層細胞が外的侵襲によりNestinタンパクを発現し象牙芽細胞様細胞に分化することが明らかになった。TetOP-H2B-GFPマウスを用いた歯の損傷後の歯髄LRCsの動態の解析が予定通り進行している。さらに、Nestin-EGFP遺伝子改変マウスを用いて、象牙芽細胞下層の歯の損傷後の歯髄治癒過程における役割解明も進めている。TetOP-H2B-GFPマウスを用いた異なる歯の損傷後の歯髄LRCsの動態の解析、TetOP-H2B-GFPマウスと低酸素プローブを用いた異なる歯の損傷に対する歯髄前駆細胞と静的幹細胞の活性化の違いと低酸素との関連の解析、プロテオミクスを用いた切歯形成端と外的刺激後の歯髄タンパク質の網羅的・定量的解析を進める予定である。TetOP-H2B-GFPマウスを用いた歯の再植後の歯髄LRCsの動態の解析を行う。DoxをE14E15に一度飲ませてすべての細胞をGFPでラベルし、生後2週に歯の再植手術を行い、経時的な歯髄LRCsの系譜を術後1日2週まで標本を採取し、歯髄LRCsの局在・蛍光強度ならびに数の変化、象牙芽細胞分化マーカーであるネスチン、IGFBP5、Gli1、Ptch1免疫組織化学・多重蛍光解析を引き続き行い、リアルタイムPCRでIGFBP5、Shhシグナルの定量解析を行う。さらに、TetOP-H2B-GFPマウスと低酸素プローブを用いた歯の再植に対する歯髄前駆細胞と静的幹細胞の活性化の違いと低酸素との関連の解析、プロテオミクスを用いた切歯形成端と臼歯歯髄タンパク質の網羅的・定量的解析を進める。
3d遷移金属高濃度系透明ガラスセラミックスの創製

ナトリウムイオン電池正極用結晶化ガラスの研究を推進する過程で、透明な結晶化ガラスの創製に成功した。電池の用途では特に光透過性は必要とされないが、驚くことに鉄、マンガン酸化物が多量(約20 mol%)に含有しているにも関わらず可視光透明性を示すのである。熱力学的に準安定な結晶が形成し、透明性以外にもアルカリイオン伝導性、着磁など興味深い物性が明らかになりつつある。そこで本研究では可視域で透明を有する遷移金属酸化物を高濃度で含有する新奇な酸化物ガラスおよび結晶化ガラスの創製とその光学的・電気的特性の評価を目的とする。
人間教育としての音楽教育―ハンガリー・ドイツ語圏の理論・方法論と実践の研究―

日本における人間教育としての音楽教育を構築するために、すでに実績をもつハンガリーとドイツ語圏の理論と方法論を実践的に研究した。ハンガリーからは、アーブラハーン・マリアン、パヨル・マールタ女史を招聘し、日本の研究者とともに研究協議を行い、その成果を学会等で発表し、東京、仙台、福島、広島等各地で講座を開催した。わらべうた等から自国の伝統のアイデンティティを育てることの重要性を再確認し、更に、即興演奏によって創造性を育み、美術や文学など学際的なアプローチによって音楽を学ぶことによって、生涯にわたって豊かな人生を送ることを可能にする日本の音楽教育の構築について具体的な示唆を得ることができた。平成24年度は、ハンガリーの音楽教育の理念と指導法の研究のため、10月にハンガリーからペーチ大学教育学部元副学部長であるパヨル・マールタ氏を招聘し、2種の講演及びワークショップを行った。これに先立って、9月に研究代表者の降矢がハンガリーに赴き、パヨル氏招聘のための打ち合わせ及び研究協議を行った。パヨル氏は、東京音楽大学(日本音楽教育学会第43回大会共同企画VI)、実践女子学園中学校高等学校、宮城教育大学、福島にて、講演「民族音楽からクラシック音楽へ」と、ハンガリーのわらべうたワークショップを行った。また、聖和学園短期大学においてハンガリーのわらべうたワークショップを行った。福島では、コダーイの理念から最近の脳科学の成果までを取り上げたもう1種の講演「音楽教育による人間性の育成」を行った。これらの講演及びワークショップは、広く日本の教育者に影響を与えた。日本音楽教育学会第43回大会においては、共同企画IX「人間教育としての音楽教育IIー教材と指導法を考えあうー」として、パネルディスカッション(企画・コーディネイター:降矢)を行い、小学校から大学、特別支援の現場でそれぞれ優れた教育実践を行う教員が、優れた教材と指導法によって、子どもたちの人間性が豊かに育つという実践報告を行った。以上の講演とワークショップ、日本における実践に共通する視点は、伝統的な教材の重要性、創造性の育成、総合化、といえよう。さらに、多様で即興性を持ち、子ども同士で学び合い発展させることのできるような指導によって、子どもたちの豊かな感性を育み、広い視野を持ち学問や芸術で人生を豊かに生きることのできる人間へと成長すると考えられる。これらは今日の日本の教育全般にとって大変示唆的であり、重要な視点である。以上の研究により得られた知見を、帝京平成大学紀要第24巻第1号に論文としてまとめ、成果を発表した。平成25年度は、本研究の初年度より研究を続けてきたハンガリーの画期的なピアノ教科書、アパジ・マーリア著『ピアノの夢ー創造的なピアノ学習』の理念と指導法を踏まえ、アパジのピアノ指導の柱である即興演奏指導法に焦点を絞って研究を進めた。具体的には、平成25年8月9月に研究代表者がハンガリーに赴き、アパジ・マーリアのピアノ即興演奏指導法について詳細な聴き取りと撮影を行った。また、『ピアノの夢』に示された287の即興演奏課題の全訳を行い、それらの課題に基づいて、日本の子どもを対象に即興演奏指導の実践を行った。これらの研究成果に基づいて、日本音楽教育学会第43回大会において口頭発表を行い、仙台白百合女子大学紀要第18号に論文を掲載した。三年間の研究の結果は以下のようにまとめられる。アパジのピアノ教育の目的は人間教育であり、楽器演奏を通して幅広い視野を持った豊かな人間性を養うことである。その特徴は、多様な分野との連携を基礎とする学際的なプログラムを用いること、たった一音の吟味に始まり、音楽史上のあらゆる様式や音階を用いて系統的・段階的に指導を行うこと、即興、作曲、解釈(演奏)の三つを統一して扱うことが、即興演奏指導を中心としたアパジのピアノ教育である。このような指導法は、再創造演奏指導が中心的な日本のピアノ教育ではまだ一般的ではないため、アパジの指導法に学び、実践することは、コミュニケーション力不足や社会性の欠如などが指摘されている日本の子どもの人間的な発達を促し、「生きる力」を育む音楽教育のために大変有益である。なお、研究協力者の小山英恵は本年度のアパジの研究にも大きく影響し、研究成果をまとめ『フリッツ・イェーデの音楽教育「生」と音楽の結びつくところ』(京都大学学術出版会:2014)を出版し、音楽教育界に貢献した。豊かな人間性や創造的な考え方の育成を目的におくハンガリーのピアノ教科書『ピアノの夢ー創造的なピアノ学習』の理念と指導法について研究し、人間教育としての音楽教育の在り方を探求した。具体的には、平成23年89月に降矢がハンガリーに赴き、ピアニストでありピアノ教育者であるアーブラハーン・マリアンとともに『ピアノの夢』の著者アパジ・マーリアによるピアノ指導実践の様子を観察・記録した。10月にはアーブラハーンを招聘し、16日東京において「人間教育としてのピアノ教育」と題してパネルディスカッションを開催した。

パネルディスカッションでは、アーブラハーンと降矢によるハンガリーのピアノ教育と『ピアノの夢』についての講演を、ハンガリーで撮影した映像を交えて行い、研究協力者の加藤富美子、宮本賢二朗、小山英恵、粕谷雪子、粕谷正一が、人間教育の視点からそれぞれ教育・研究活動について発表を行った。10月18日広島大学、20日京都、21日大阪にてアーブラハーンによるリサイタルと講演を行い、22日には日本音楽教育学会第42回大会において、降矢、アーブラハーン、宮本、小山が共同企画にて発表を行った。平成24年2月11日には、研究協議会「人間教育としての音楽教育」を開催し、東京、千葉、金沢、福島、仙台の教員も参加して、人間教育の視点から日本の教育現場の実態について発表した。以上の研究から、ハンガリーでは音楽を教えることを通して、自立した大人になるための人間教育を行っていること、自然や詩、絵画や科学等と音楽に共通する根っ子である構造原理を発見するという、学際的なアプローチによってピアノ教育が行われていることが分かった。音楽教育の効果研究からも、音楽教育は子どもの発達を多面的に促進するものであることが分かった。人間教育としての音楽教育の理念は日本の教育全般に関しても大変示唆的であり、その重要性は極めて大きい。本研究の目的は、豊かな人間性の育成を目的とするハンガリー及びドイツ語圏の音楽教育の研究を行い、人間教育としての音楽教育の在り方を探り、日本の学校教育におけるモデルを提唱することである。平成23年度は、アパジ・マーリア著『ピアノの夢ー創造的なピアノ学習』の理念と指導法の研究を行い、音楽と自然・美術・科学・文学・数学などの様々な分野とを関連させた学際的なアプローチによってピアノ教育を行うことが、子どもの豊かな人間性の育成につながることが明らかになった。また、音楽教育の効果研究から、音楽教育は子どもの発達を多面的に促進するものであることが分かった。平成24年度は、パヨル・マールタによる講演とハンガリーのわらべうたのワークショップ、そして日本の小学校から大学、特別支援の教員による実践報告を行い、子どもたちの豊かな人間性を育てる人間教育としての音楽教育は、優れた教材と指導法によって可能であることが確かになった。以上の研究成果から、人間教育としての音楽教育のあり方は、ある程度その理論と方法論の形が見えてきており、研究は当初の計画以上に進展していると考えられる。平成23年度は、ハンガリーのピアニストでありピアノ教育の第一人者であるアーブラハーン・マリアンを招聘し、豊かな人間性や創造的な考え方の育成を目的とするハンガリーのピアノ教科書『ピアノの夢ー創造的なピアノ学習』とその指導法について東京・広島・奈良等で講演を行い、またハンガリー・ドイツ語圏の人間性の育成に重点を置く音楽教育研究の成果についても東京・奈良で発表し、総合的に「人間教育としての音楽教育」の在り方に迫ることができた。学習者と教師の信頼関係を築くこと、そして、学習の始めから、音楽と自然・美術・科学・文学・数学などの音楽以外の様々な分野と関連させた学際的なアプローチを行うことが、学習者の豊かな人間性の育成につながることが明らかになった。
新規抗ＧＰＩｂ抗体（ＨＵ－１２）の活性化血小板マーカーとしての有用性に関する研究

本研究では、ヒト血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)に対する新規マウスモノクローナル抗体であるHU-12の活性化血小板マーカーとしての有用性を検討した。本抗体は各種血小板刺激剤や高ずり応力刺激後の血小板に高い結合を認めた。また、脳梗塞および心筋梗塞発症直後の患者血小板に有意な結合増加を認めたことから活性化血小板検出の有用なマーカーであることが示唆された。本研究に必要なヒト血小板膜GPIbに対するマウスモノクローナル抗体(HU-12)を十分量精製し、本研究に必要な抗体を凍結乾燥後保存した。本抗体の特徴を明らかにするため、各種血小板刺激物質(ADP,コラーゲン,リストセチン等)でのHU-12の血小板膜への結合を刺激前後で比較したが、刺激前後でHU-12の結合には有意な変化はみられなかった。その一方ずり応力刺激によるHU-12の血小板膜への結合を検討した結果では、HU-12の結合が有意に高いことが証明された。これらの結果より高ずり応力により血小板膜上のGPIbに何らかの構造変化が生じ、HU-12はそのGPIbの立体構造変化部位を認識するモノクローナル抗体であることが強く示唆され、高ずり応力が関与する血栓性疾患における活性化血小板検出マーカーとしての有用性期待される。つぎに高ずり応力がその病態に強く関与すると考えられる血栓性疾患での臨床例での検討を行った。対象として心筋梗塞急性期3例、腹部大動脈2例とし、患者より静脈血を採血後ホルマリン固定し、HU-12の血小板膜への結合をフローサイトメトリー法にて検討した。コントロールとして年齢、性別の一致した健常者の血液を用いた。心筋梗塞急性期(発症2時間以内)の3例ともコントロールに比し有意のHU-12の血小板膜への結合の増加がみられ、この増加は既知の活性化血小板マーカーのひとつであるPAC-1より明らかに強いことが証明された。本研究ではヒト血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)に対する新規マウスモノクローナル抗体であるHU-12の活性化血小板マーカーとしての臨床的有用についてあきらかにした。これまで本研究の遂行に必要なHU-12を精製することができた。さらにHU-12は各種血小板刺激物質(ADP、コラーゲン、エピネフリン、アラキドン酸、リストセチン)による活性化血小板に強い結合を示すことを証明した。また本抗体の特徴として、高ずり応力刺激による活性化血小板にも強い結合を認めた。すなわち、各ずり応力(0200dyne/cm2)を加えた血小板へのHU-12の血小板への結合を検討した結果、高いずり応力(108dyne/cm2)刺激後の血小板への結合がきわめて強いことをあきらかにした。アテローム性動脈硬化症を基盤とする動脈血栓症発症の機序としてずり応力による血小板活性の関与が注目されており、HU-12が血栓症症例において活性化血小板検出の有用なツールとなることが示唆された。最終年度では、HU-12の血小板活性化マーカーとしての臨床的有用性をあきらかにする目的で血栓症症例での活性化血小板の検出をHU-12を用いて検討した。動脈硬化性血栓症の代表的疾患である心筋梗塞8例、脳梗塞12例を対象として発症後から経時的の採血し、フローサイトメトリー法によりHU-12結合血小板を測定した。その結果、血栓症発症後の症例では有意に活性化血小板であるHU-12結合血小板の増加がみとめられ本抗体が活性化血小板検出のための有用なマーカーであることを示した。1.本研究に必要な血小板膜GPIbに対するマウスモノクローナル抗体(HUー12)を精製した。凍結保存されたHUー12産生細胞をマウス腹腔内で増殖させ腹水より本研究遂行に必要であると推定される約5500mgの抗体をアフィニティーカラムを用いて精製することができた。精製したHUー12抗体は今後の研究のため凍結乾燥保存した。また一部の抗体は酵素処理によりFab部分を作成精製した。2.各種血小板刺激物質(ADP,コラーゲン、アラキドン酸、リストセチン、トロンビン)による刺激後の血小板へのHUー12結合能をフローサイトメトリーにより測定した。またずり応力を変化させ低ずり応力下と高ずり応力下の刺激後の血小板へのHUー12の結合を同様にフローサイトメトリー法にて測定した。その結果、高ずり応力刺激後の血小板へのHUー12の結合が他のADP、コラーゲン、リストセチンなどの刺激後血小板への結合に比べ有意に高いことを明らかにした。3.ずり応力を変化させHUー12の結合能を検討した結果では、低ずり応力刺激に比し高ずり応力刺激によりHUー12の結合が明らかに高いことを認めた。すなわち、HUー12の血小板への結合はずり応力依存性であることを明らかにした。

このことからHUー12は既存の抗GPIbと異なる特異的なモノクローナル抗体であることを証明した。次年度以降の研究に必要なモノクローナル抗体(HUー12)は凍結乾燥して保存している。本研究遂行に必要な十分量のHU-12を精製・保存することができた。またHU-12が高ずり応力刺激血小板に有意に結合することをあきらかにした。また臨床例(心筋梗塞急性期)での活性化血小板検出マーカーとしてのHU-12の有用性をあきらかにした。本研究遂行に必要である十分量の抗体を精製することに成功した。また本抗体(HUー12)が本研究の目的である血小板活性化マーカーをしての特徴を有することが明らかになった。アテローム性動脈硬化症基盤とする動脈血栓症の対象症例を増やしてHU-12の活性化血小板マーカーとしての有用性をあきらかにする。対象疾患として心筋梗塞急性期以外に脳梗塞急性期、血管病変を有する糖尿病を加え、症例数を増やして検討する予定である。また抗血小板薬投与例での検討も行う。アテローム性動脈硬化症を基盤とする動脈血栓症の機序としてずり応力による血小板凝集の関与が注目されており、これらの血栓症では高ずり応力刺激後の活性化血小板が循環血液中に認められると推定される。しかし、これまでの研究はPACー1などの既存の血小板活性化マーカーを用いたものであり、その臨床的有用性には問題点が多い。そこで新規の血小板活性化マーカーであるHUー12の臨床的有用性を証明する。動脈硬化性血栓症の代表的疾患である心筋梗塞と脳梗塞症例を対象に発症直後から経時的に採血し、フローサイトメトリー法によりHUー12の血小板への結合を検討し、HUー12結合血小板測定の臨床的意義を明らかにする。予定より効率的に抗体の精製が可能であったため当該研究費が生じた。次年度では当初の計画より症例数を増やし、さらに臨床応用が可能な活性化血小板検出キットの開発のために研究費を使用する計画である。当初予定したより効率的に抗体を精製することができたため次年度への繰越が生じた。次年度では当初の計画より対象症例を23倍に増やして研究費を使用する計画である。
TALEN法によるオオムギの標的遺伝子への変異挿入

アントシアニン合成に関与するCHS遺伝子ならびにDFR遺伝子を標的としたTALENベクターをそれぞれ構築し、オオムギに導入した。形質転換体を作製することができたが、いずれの個体においても標的遺伝子に変異を挿入できなかった。一方、ゲノム編集での利用を目的として、オオムギのカルス特異的プロモーターを4つ単離した。これらをEGFP遺伝子につなげて、発現解析を行った。全てのプロモーターにおいてカルスでの一過的EGFP発現が観察された。さらに、形質転換カルスにおいて、2つのプロモーターで安定したEGFPの発現が確認できた。【アントシアニン合成酵素遺伝子を標的とするTALENの構築とオオムギへの導入】アントシアニン合成に関与するCHS遺伝子ならびにDFR遺伝子を標的として、それぞれ4組ならびに3組のTALEN遺伝子を構築した(CHS-TALならびにDFR-TAL)。それらのTALEN遺伝子ペアを、オオムギ由来ユビキチンプロモーターによって両遺伝子を同時に発現できるバイナリベクターpPZP2-HvUbi12に挿入した。これらをアグロバクテリウム法によって形質転換可能なオオムギ品種「Golden Promise」に導入した。その結果、61のCHS-TAL導入個体ならびに14のDFR-TAL導入個体を作製することができた。しかしながら、いずれの個体においても標的遺伝子に変異を挿入できなかった。【カルス特異的プロモーターの単離】上記個体において変異挿入に至らなかった理由の一つとして、ユビキチンプロモーターによるTALEN発現が適当ではない可能性がある。それを克服するために、カルス誘導型の遺伝子発現領域の単離を試みた。マイクロアレイ解析によって見いだされた、オオムギカルスで高発現する遺伝子を抽出し、そのプロモーター領域とターミネーター領域をクローニングした。これまでに、3つのカルス誘導遺伝子のプロモーター領域と2つのターミネーターをクローニングできた。【背景と目的】カルス特異的プロモーターは、カルスでは働くが再分化後の植物ではほとんど活性が無いと考えられるので、ゲノム編集における人工制限酵素(TALEN)遺伝子への適用が期待できる。本年度は、オオムギゲノム編集での利用を目的として、オオムギのカルス特異的プロモーターの単離および一過的発現解析を行った。【材料と方法】オオムギ品種「Golden Promise」と「はるな二条」の未熟胚からカルスを誘導し、増殖培地に継代したカルス(CI)と再分化を誘導したカルス(RG)を採取した。それぞれのカルスからRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。得られた情報を基に、CIでシグナルが強かったプローブを抽出し、その中からCI/RGの比率が5倍以上のものを選抜した。選抜したプローブに付随するゲノム情報からプロモーター領域を推定し、PCRにて1,500 bp程度のDNA断片をクローニングした。得られた領域は、EGFP発現ベクターのプロモーター部分に組み込み、アグロバクテリウム法で「Golden Promise」に導入した。【結果】マイクロアレイの結果、CIでシグナルが強い20のプローブを抽出し、そのうちCI/RGの比率が平均5倍以上の6つのプローブを選抜した。アノテーションが明確な4つのプローブについて、プロモーター領域のレポーターアッセイを行った。その結果、4つ全てのプロモーターにおいてカルスでのEGFP発現が観察された。このことから、これらのプロモーターがカルスで活性を持つことが確認できた。ハイグロマイシンで選抜後、耐性カルスの蛍光量を測定したところ、2つのプロモーターでEGFP高発現が確認できた。変異挿入に至らなかったものの、オオムギ遺伝子を標的とするTALENsを複数構築し、それらをオオムギに導入することができている。作製した形質転換個体(CHS-TALあるいはDFR-TAL導入個体)の後代種子を得ているため、再カルス誘導による変異挿入など、次年度の研究に展開できる材料は揃った。また、オオムギゲノム編集用のベクター作製の一部であるプロモーターの単離も着実に進めている。農学一般的に、カルスの状態(脱分化時)においてTALENの活性が高まると言われている。そのため、本年度に作製したCHS-TALならびにDFR-TAL導入個体から未熟胚を抽出し再度脱分化して変異挿入を誘導することを試みる。また、CHSやDFRの別の遺伝子領域標的とした新たなTALENを設計することやCHIなどの他のアントシアニン合成系遺伝子を標的とするTALENの設計も試みる。一方で、本年度クローニングしたカルス特異的遺伝子発現領域の評価を行う。それらの活性が確認でき次第、新たに構築するTALENベクターに利用する。
ラット実験腫瘍の染色体遺伝子背景についての研究

最近,癌の遺伝子研究は急速であるが,化学発癌剤の遺伝子標的,遺伝子異常の重積機構,癌症候群の実験モデルなどの研究では,我国で開発された豊富なラットの実験系が有用である.本班では遅れているラットの遺伝子研究の活性化も視点において研究を進めた.その結果,樋野,小林らにより,Ekerラット遺伝性腎癌ヒト結節性硬化症の原因遺伝子TSC2に対応するラット遺伝子での挿入変異が原因があることが示された.このラットでは,腎癌以外にも子宮肉腫,脾臓肉腫,下垂体腫瘍が発生し,ヒトの癌症候群のモデルとして意義が大きいと考えられた.また,この異常はknudsonの2ヒットモデルに沿った遺伝性を示す新しい癌抑制遺伝子であることが示された.将来の研究の進展が期待される.杉山らはDMBAの静脈内投与で誘発した白血病の15例全例にN-NASの特異的変異(61番目コドンの,2番目の塩基のA→T transversion)を発見した.この異常は,鋭敏なMASA(=mutation allele specific polymerization)法によりDMBA投与後,2日には多数生じていること,この異常がDMBA白血病の特異的染色体重複部の2番染色体の末端部に存在することが明らかになり,この異常の増量効果が白血病の骨髄での増殖に貢献している可能性が示唆された.吉田はLEC肝癌の原因としてウイルソン病遺伝子に対応するラット遺伝子に欠失を明らかにした.これは銅の代謝異常の研究に貢献すると考えられる.志佐はPNU胸腺白血病発生と病系決定遺伝子の部位を明らかにした.芹川はラットのマイクロサテライト(ms)を補強してラット遺伝子地図を作る基礎を築いた.最近,癌の遺伝子研究は急速であるが,化学発癌剤の遺伝子標的,遺伝子異常の重積機構,癌症候群の実験モデルなどの研究では,我国で開発された豊富なラットの実験系が有用である.本班では遅れているラットの遺伝子研究の活性化も視点において研究を進めた.その結果,樋野,小林らにより,Ekerラット遺伝性腎癌ヒト結節性硬化症の原因遺伝子TSC2に対応するラット遺伝子での挿入変異が原因があることが示された.このラットでは,腎癌以外にも子宮肉腫,脾臓肉腫,下垂体腫瘍が発生し,ヒトの癌症候群のモデルとして意義が大きいと考えられた.また,この異常はknudsonの2ヒットモデルに沿った遺伝性を示す新しい癌抑制遺伝子であることが示された.将来の研究の進展が期待される.杉山らはDMBAの静脈内投与で誘発した白血病の15例全例にN-NASの特異的変異(61番目コドンの,2番目の塩基のA→T transversion)を発見した.この異常は,鋭敏なMASA(=mutation allele specific polymerization)法によりDMBA投与後,2日には多数生じていること,この異常がDMBA白血病の特異的染色体重複部の2番染色体の末端部に存在することが明らかになり,この異常の増量効果が白血病の骨髄での増殖に貢献している可能性が示唆された.吉田はLEC肝癌の原因としてウイルソン病遺伝子に対応するラット遺伝子に欠失を明らかにした.これは銅の代謝異常の研究に貢献すると考えられる.志佐はPNU胸腺白血病発生と病系決定遺伝子の部位を明らかにした.芹川はラットのマイクロサテライト(ms)を補強してラット遺伝子地図を作る基礎を築いた.