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骨伝導音検査法の開発と臨床応用

われわれは骨の打聴診とも言うべき骨伝導音検査の手抜を確立し,さまざまな応用に関して長年研究を続けている.本年度の研究は,昭和59年度科学研究費一般研究Bの助成以来の一貫したものであるが,骨折の治癒過程における骨癒合強度を本法を用いて推定することを動物実験ならびに臨床例に関し行なった.また,変形性股関節症の治療法の一つである人工股関節全置換術後の経過を本法により検〓し,人工間接と骨との固着強度を推定する試みを継続して行なった.これらの結果,創外固定器を用いた骨折の治療においては,創外固定器の除去時期の判定に有用であることを知った.そして,セメントレス人工股間接の固着強度を検〓した結果では,術直後より歩行を開始する時期の方が固着強度は低下しており,その後再び徐々に固着強度を上昇してくることを動物実験ならびに臨床例において証明した.これらの結果は,第2回日本整形外科基礎学術集会,第36回東日本臨床整形外科学会等に発表した.さらに昭和63年4月に第61回日本整形外科学会総会に「骨伝導音検査の臨床的応用」の演題にて発表予定である.骨折の診断に単純X線写真が欠くことの出来ない有力な武器であることは言うまでもない。しかしX線像のみでは骨折の治癒過程を完全に把握出来ないことはしばしば経験する。そこで骨を伝導する音波を分析することにより、骨折の治癒過程あるいは偽関節を診断し、そこに一定のパターンが得られれば、日常の診療においてこれを十分に活用できると考え、基礎的・臨床的研究をおこなった。その結果、創外固定器を用いた実験的骨折では、骨折後週数とピーク周波数の間には有意の相関がみられ、骨癒合強度とピーク周波数値は明らかな相関を示した。また内副子固定例では伝導音波形、ピーク周波数ともにX線所見との対応がつかず、骨癒合強度とピーク周波数値との間にも著明な相関性は得られなかった。そして動物実験・臨床例ともに骨折後週数とピーク周波数間には有意の相関がみられた。また臨床例における経時的観察より、週数の経過とともにピーク周波数が漸増する「漸増型」、一旦ピーク周波数は低下し、その後再び上昇する低下・再上昇型、ピーク周波数に変化を認めない無変化型、ピーク周波数は一時漸増傾向を示すかあるいは変化を認めないが、その後次第に低下してくる低下型の4型があることが分った。漸増型と低下・再上昇型は保存的治療群と創外固定群に多く認められ、骨癒合過程が本検査により診断可能な例であり、無変化型は髄内釘や内副子などの内固定材を用いた臨床例に多くみられ、本検査による診断が困難な例であることが分った。さらに低下型は偽関節あるいは遷延治癒骨折例であることを明らかにした。そして骨伝道音検査による創外固定器の除去時期の判定基準を定めた。
毛細胆管膜よりのビリルビン分泌機序について

ラット肝臓より実質細胞の類洞膜側と毛細胆管膜側の膜を分離採取した。精度は前者で95%以上、後者で85%以上であった。vesicleを作製後内外の無機イオンを変化させ、胆汁酸(タウロコレ-ト)とビリルビンの移送を検討した。膜移送には無機イオンとの共軛移送が関与するとされているが、我々は電位感受性色素3-3Dipropylthiocarbocyanine iodideを用いて検討した。類洞膜側vesicleでは胆汁酸はナトリウムとCotransportすることが以前の報告と同様に明らかであった。一方、ビリルビンはナトリウム濃度との関係はえられなかった。毛細胆管膜vesicleではNa、K濃度とは無関係に胆汁酸、ビリルビンは移送された。現在、他の無機イオンについても検討中である。我々は近年遺伝性胆汁うっ滞ラットを見出した。外口ではJansenらの報告がみられるのみであるが、現在両者の違いについて検討中である。本ラットは小胞体より胆汁分泌に至る有機陰イオンの移送障害と考えられるが、細胞骨格系に異常は認められない。現在ビリルビン、ICGの肝での除去能、ポルフィリン代謝、胆汁酸(主としてタウロコ-ル酸)の肝除去能について検討し、同時に形態学的検討も行なっている。現在迄のところJanssenラットとほぼ類似の胆汁うっ滞ラットと考えられる。現在このラットについて同様に類洞膜、毛細胆管膜を分離し、Uesicleを作製。さらに正常のラットvesicleとの差異について検討している。
ナノフローLC/MSを用いたGPIアンカー型タンパク質の糖鎖の構造と機能解析

GPIアンカー型タンパク質は,リン酸エタノールアミンを介してトリマンノース,グルコサミン,及びホスファチジルイノシトールが結合した膜タンパク質で,脳・神経系では,神経網形成などにおいて重要な役割を担っていると考えられている.GPIアンカー型タンパク質には複数のN結合型糖鎖が付加し,発生や成長に伴って変化することが示唆されているが,膜タンパク質のため精製が難しいことや,分子構造が複雑であることなどから,糖鎖構造が明らかにされているタンパク質は少ない.そこで,本研究では,ラット脳より脂質部分を切り離した可溶性GPI結合タンパク質をSDS-PAGEで分離し,LC/MS^nを用いてThy-1,LAMP,OBCAM,NTM,kilonの部位特異的糖鎖構造を解析した.生後3週間のラットの脳からGPI結合タンパク質を分画してSDS-PAGEを行い,20-25kDaのバンドにThy-1,また,45-85kDaのバンドにLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonが泳動されていることを確認した.はじめに,20-25kDaのバンドから1%SDSを用いてThy-1を抽出し,トリプシンで消化した後,LC/MS^nを行い,Asn23及び98には高マンノース型糖鎖,混成型,及び2本鎖を中心とした複合型糖鎖,またAsn74にはフコシル複合型糖鎖が主に結合していることを明らかにした.つぎに,45-85kDaのバンドからLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonをまとめて抽出し,混合物のままトリプシン消化した。タンパク質混合物消化物のLC/MS^nを行い,各タンパク質の糖鎖付加部位ごとの糖鎖の特徴を明らかにすることができた.その結果,この4つのタンパク質はペプチド部分だけでなく,糖鎖付加も類似していることが明らかになった.例えば,N末側には共通して高マンノース型糖鎖,また,C末にはルイス型糖鎖が集中して結合していた.今後は,病態マウス,または成長段階の異なるマウスのLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonの糖鎖を解析し,疾患や神経網形成と糖鎖の関係の解明につなげたいと考えている.また,今回確立したSDS-PAGEとLC/MS^nを用いた部位特的糖鎖解析法を,他のGPI結合タンパク質を含む様々な糖タンパク質の糖鎖構造解析に利用していきたい.GPIアンカー型タンパク質は,リン酸エタノールアミンを介してトリマンノース,グルコサミン,及びホスファチジルイノシトールが結合した膜タンパク質で,脳・神経系では,神経網形成などにおいて重要な役割を担っていると考えられている.GPIアンカー型タンパク質には複数のN結合型糖鎖が付加し,発生や成長に伴って変化することが示唆されているが,膜タンパク質のため精製が難しいことや,分子構造が複雑であることなどから,糖鎖構造が明らかにされているタンパク質は少ない.そこで,本研究では,ラット脳より脂質部分を切り離した可溶性GPI結合タンパク質をSDS-PAGEで分離し,LC/MS^nを用いてThy-1,LAMP,OBCAM,NTM,kilonの部位特異的糖鎖構造を解析した.生後3週間のラットの脳からGPI結合タンパク質を分画してSDS-PAGEを行い,20-25kDaのバンドにThy-1,また,45-85kDaのバンドにLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonが泳動されていることを確認した.はじめに,20-25kDaのバンドから1%SDSを用いてThy-1を抽出し,トリプシンで消化した後,LC/MS^nを行い,Asn23及び98には高マンノース型糖鎖,混成型,及び2本鎖を中心とした複合型糖鎖,またAsn74にはフコシル複合型糖鎖が主に結合していることを明らかにした.つぎに,45-85kDaのバンドからLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonをまとめて抽出し,混合物のままトリプシン消化した。タンパク質混合物消化物のLC/MS^nを行い,各タンパク質の糖鎖付加部位ごとの糖鎖の特徴を明らかにすることができた.その結果,この4つのタンパク質はペプチド部分だけでなく,糖鎖付加も類似していることが明らかになった.例えば,N末側には共通して高マンノース型糖鎖,また,C末にはルイス型糖鎖が集中して結合していた.今後は,病態マウス,または成長段階の異なるマウスのLAMP,OBCAM,NTM,及びkilonの糖鎖を解析し,疾患や神経網形成と糖鎖の関係の解明につなげたいと考えている.また,今回確立したSDS-PAGEとLC/MS^nを用いた部位特的糖鎖解析法を,他のGPI結合タンパク質を含む様々な糖タンパク質の糖鎖構造解析に利用していきたい.GPIアンカー型タンパク質は、リン酸エタノールアミンを介してトリマンノース、グルコサミン、及びホスファチジルイノシトールが結合した膜タンパク質で、脳・神経系では神経網形成などにおいて重要な役割を果たしていると考えられている。GPIアンカー型タンパク質のタンパク質部分には複数のN結合型糖鎖が付加しており、発生や疾患に伴って変化することが示唆されているが、膜タンパク質のため精製が難しいことや、分子構造が複雑であることなどから、糖鎖の構造や機能については明らかにされていない。そこで我々は、脳に発現するGPIアンカー型タンパク質の糖鎖の構造と神経網形成などにおける役割を明らかにする目的で、GPIアンカー型タンパク質を粗分画後、2次元電気泳動で分離し、質量分析法を用いて解析する方法を検討した。生後5日のラットの脳をホモジネートし、TritonX114処理により膜画分を可溶化した後、温度依存性相分離を利用して膜画分を分画した。

アセトン沈殿後、得られた膜画分から、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼC消化にようてGPIアンカー部分を切り離し、可溶性のタンパク質部分を回収した。この可溶性膜画分を2次元電気泳動で展開したところ、糖タンパク質に特徴的なトレイン状スポットが複数組確認され、ゲル内トリプシン消化後、capillary-LC/MS/MSで分析した結果、免疫グロブリン様ドメインを有するGPIアンカー型細胞接着分子IgLONファミリー分子(OBCAM,LAMP,NTM,kiron)、NCAM、及びThy-1と同定された。つぎに、神経網形成に伴うGPIアンカー型タンパク質の発現量と糖鎖構造の変化を調べるため、3週齢ラットの脳を同様に処理し、生後5日のラットから得られた泳動像と比較したところ、3週齢ではIgLON、NCAM、及びThy-1が増加し、グライコーム分布も変化していることが明らかになった。現在、変化した糖鎖の構造を明らかにするため、各グライコームスポットから切り出した糖鎖をグラファイトカーボンカラムを用いたCapLC/MSで解析中である。GPIアンカー型タンパク質は,リン酸エタノールアミンを介してトリマンノース,グルコサミン,及びホスファチジルイノシトールが結合した膜タンパク質で,脳・神経系では神経網形成などにおいて重要な役割を果たしていると考えられている.GPIアンカー型タンパク質のタンパク質部分には複数のN結合型糖鎖が付加しており,発生や疾患に伴って変化することが示唆されているが,膜タンパク質のため精製が難しいことや,分子構造が複雑であることなどから,糖鎖の構造や機能については明らかにされていない.本研究の目的は,脳に発現するGPIアンカー型タンパク質の糖鎖の構造と,神経網形成などにおける糖鎖の役割を明らかにすることである.そこで本研究では,電気泳動等を用いたGPIアンカー型タンパク質の簡便な単離とLC/MS/MSを用いた糖鎖解析からなる脳に発現するGPIアンカー型タンパク質の糖鎖解析法の開発,並びにその分析法を用いた病態に伴う糖鎖構造変化の解析を行う.本年度は,イオントラップ型MS及び高分解能MSのハイブリッド型MSを用いた糖鎖解析法を開発し,ラット脳からSDS-PAGEで単離したThy-1の糖鎖構造解析を行った.生後3週間のラットの脳をホモジネートし,TritonX114処理により膜画分を可溶化した後,温度依存性相分離を利用して膜画分を分画した.アセトン沈殿後,得られた膜画分から,ホスファチジルイノシトールポスホリパーゼC消化によってGPIアンカー部分を切り離し,可溶性のタンパク質部分を回収した.この可溶性膜画分をSDS-PAGEで展開し,ゲル内トリプシン消化及びLC/MS/MS分析を行い,20-25kDaのバンドをThy-1と同定した.Thy-1のバンドからゲル内PNGaseF消化によりN-結合型糖鎖を遊離させた後,NaBH_4で還元化糖鎖とした。そして,グラファイトカーボンカラム-LC/リニアイオントラップMS/高分解能MSを用いて,Thy-1由来糖鎖の解析を行った.その結果,Thy-1に結合する糖鎖の単糖組成はNeuAc_<0-3>dHex_<0-3>Hex_<3-8>HexNAc_<1-5>HexNAcNAcol_1と決定された.
ダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータを用いた両心室補助人工心臓

ダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの開発と,開発したモータを用いた遠心型血液ポンプの開発を行った。まず,提案する磁気浮上モータの開発を行い,開発した磁気浮上モータが人工心臓に適用可能な性能を有することを明らかにした。次に,両心室補助人工心臓ポンプの開発に取り組み,開発した磁気浮上モータをベースに,ポンプ全体の設計と製作を行った。そして,製作した磁気浮上ポンプが,揚程100 mmHgのとき,流量5.8 L/min(回転数1800 r/min)の流量特性を有することを確認した。これにより,製作した磁気浮上ポンプが両心室補助可能なポンプ性能を有することを明らかにした。本磁気浮上モータは片側に2極の永久磁石を持つロータを,8突極を有するステータで挟み込む構造とした。軸方向に配置した変位センサによりロータの軸方向変位と傾きを検出し,ステータ突極間に配置したエンコーダによりロータの回転速度と角位置を検出する。検出した信号をフィードバックすることにより,回転トルク・軸方向変位・傾きを能動的に制御する。また,提案する人工心臓は体内埋込を目的としているため,装置の高さは80 mm以内,装置外径はφ80 mm以内を目標とした。消費電力は定格回転速度2500 /minにおいて10W以下を目標とした。安定な磁気浮上回転制御を達成するため,有限要素法磁場解析により,永久磁石・ステータ形状・コイル巻数などを詳細に検討した。そして,磁場解析結果に基づき,目標サイズを満たす実験装置を設計,製作した。実験装置の製作と並列して,磁場解析結果を元に,提案する磁気浮上モータの数値モデルを作成し,数値解析ソフトを用いて動特性のシミュレーションを実施した。試作機が完成した後,制御器を実装し,磁気浮上回転制御を実施した。安定した制御を実施した後に試作機の静特性・動特性を測定し,磁気浮上モータとしての基本性能を明らかにした。次のステップとして,ロータの両面にインペラを設置し,両心臓補助用磁気浮上ポンプを設計・製作する予定であったが,既存装置では両心用ポンプの評価が難しいため,予定を変更し,まずは上下のロータディスクの中央にクローズドインペラを設置し,左心室のみを補助するタイプの磁気浮上ポンプの製作に取り組んだ。現在までに,ロータインペラ,ポンプケーシングを製作した。そして,ケーシング内に水を満たし,水中においてロータを磁気浮上回転させることにより,水中における動特性を明らかにした。本申請では,研究期間内にダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの開発と,開発したモータを用いた遠心型血液ポンプの開発を目的としている。平成27年度は,平成26年度の開発したダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの高性能化と両清室補助人工心臓用血液ポンプの性能を評価を計画していた。しかし,両清室補助人工心臓用血液ポンプの製作は難易度が高いと判断したため,まずは左心室補助用血液ポンプの開発を行った。水を用いてポンプ特性を評価し,開発した磁気浮上モータが左心室補助用血液ポンプとしての性能を有することを明らかにした。当初の計画では,平成27年度中に全人工心臓用血液ポンプの開発が完了することを予定していたが,現在は実験装置は完成したものの,性能評価には至っていないため,研究の進捗状況はやや遅れている。平成28年度においては,早急に実験装置を製作し,磁気浮上制御を実施する。そして,両心室補助用血液ポンプの性能評価を行う。そして,問題点を明らかにし,試作機2号機を設計・製作する。この時,人工心臓用ポンプの設計・製作経験がある地元企業と連携し,効率的に磁気浮上ポンプの設計・製作に取り組む。そして,製作した血液ポンプが両心室補助人工心臓に適用可能な性能を有することを明らかにする。さらに,血液ポンプへの応用に適したコントローラを設計し,血液ポンプを高性能化する。さらに開発した血液ポンプを製品化するための設計指針を作成する。そして平成27年度は,平成26年度の開発したダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの高性能化を行うこと,製作した磁気浮上モータを基にポンプを製作し,性能を評価することを研究計画としていた。当初,全人工心臓の開発を目的にロータの上下にRVAD用・LVAD用のインペラを取り付ける予定であったが,難易度が高いと判断したため,まずは左心室補助用血液ポンプの開発を行った。製作した磁気浮上モータに,3Dプリンタを用いて製作したポンプケーシングを取り付け,磁気浮上ポンプを製作した。そして,水を用いてポンプ特性を評価し,ロータの回転速度r/minにおいて,最大揚程175 mmHg,最大流量6 L/minを達成した。開発した磁気浮上モータが左心室補助用血液ポンプとしての性能を有することを明らかにした。また,両心室補助用血液ポンプの開発に取り組んだ。磁気浮上モータの高性能化を目的に,ロータ永久磁石の極数とステータ突極の極数を変更した磁気浮上モータを設計・製作し,ポンプケーシングも新たに設計・製作した。当初の計画では平成27年度中に両心室補助用血液ポンプの開発が完了することを予定していた。しかし,現在は実験装置の部品は完成したものの,磁気浮上制御の実施と性能評価には至っていない。研究の進捗状況はやや遅れているといえる。

本申請では,研究期間内にダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの開発と,開発したモータを用いた遠心型血液ポンプの開発を目的としている。平成27年度までに,提案する磁気浮上モータの開発を行い,開発した磁気浮上モータが人工心臓に適用可能な性能を有することを明らかにした。そして,開発した磁気浮上モータを元に左心室補助用の小型ポンプを開発し,左心室補助に適用可能な性能(水を用いた実験において,揚程100 mmHg,流量4.5 L/min)を有することを明らかにした。平成28年度は,ダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの高性能化と,両心室補助人工心臓ポンプの開発に取り組んだ。まず,磁気浮上モータの高性能化を目的に,ロータ永久磁石の極数とステータ突極の極数を変更した磁気浮上モータを設計・製作した。これにより駆動アンプの個数を16個から10個に減少することができた。また,浮上回転制御時の安定性を向上させることができた。さらに,開発した磁気浮上モータをベースに,ロータの上下に設置する左心用・右心用のインペラとインレット・アウトレットを含むケーシング全体の設計と製作を行った。そして,インペラとケーシングを磁気浮上モータに組み込み,小型ポンプを製作した。そして,製作した磁気浮上ポンプが両心補助可能な性能を有しているかを確認するために流水実験を行った。実験は右心側のポンプを完全に開放した状態で,左心側のポンプ性能を評価した。結果,最大流量は8.3 L/min,最大揚程は170 mmHgを得た。また,揚程100 mmHgのとき,流量4.0 L/min(回転数1800 r/min)を得た。これにより,製作した磁気浮上ポンプが両心室補助可能なポンプ性能を有することを明らかにした。ダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの開発と,開発したモータを用いた遠心型血液ポンプの開発を行った。まず,提案する磁気浮上モータの開発を行い,開発した磁気浮上モータが人工心臓に適用可能な性能を有することを明らかにした。次に,両心室補助人工心臓ポンプの開発に取り組み,開発した磁気浮上モータをベースに,ポンプ全体の設計と製作を行った。そして,製作した磁気浮上ポンプが,揚程100 mmHgのとき,流量5.8 L/min(回転数1800 r/min)の流量特性を有することを確認した。本申請では,研究期間内にダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータの開発,また,開発した磁気浮上モータを用いた遠心型血液ポンプの開発を研究目的としている。そして,平成26年度はダブルステータ型アキシャル磁気浮上モータを開発し,その動特性を明らかにすることを研究計画としていた。この計画に対し,現在までに試作機と制御器を製作し,磁気浮上回転制御を実施した。そして,安定した制御を実施した後に試作機の静特性・動特性を測定し,磁気浮上モータとしての基本性能を明らかにした。したがって,研究計画に沿って,おおむね順調に研究が進展しているといえる。平成27年度後半において,両心室補助用血液ポンプの実験装置の部品が完成した。
森林から大気へのアミン発生とその新粒子生成への寄与

地球気候を左右するエアロゾル個数濃度は、気体分子からの新粒子生成反応により増加する。近年、新粒子を安定的に生成する重要な化学種としてアミンが注目されている。では、アミンの大気圏への発生源は何か?全球的な気候を考える上では海洋上や森林域などの清浄大気における発生源が重要だが、その理解は不十分である。特に森林から発生するアミンに関する研究例は極めて少ない。本研究では、森林フィールドにおいてエアロゾル及びガス相中アミンの高精度な分離・捕集を行ない、アミンと関連物質を定量する。そのデータを基に、森林から大気圏へのアミンの発生量と発生プロセスを解明し、森林由来アミンの新粒子生成への関与を検証する。
エネルギー資源ガス生産反応を高効率で触媒する低炭素型微生物電極システムの創出

バイオ電気化学的システムで、メタンと水素の生産を触媒するバイオカソードを、好熱性微生物を菌源として構築、性状と触媒機構を解析した。メタン生産を触媒するバイオカソードは既往研究中で最も高い電気化学的メタン生産速度を示し、電流-メタン変換効率は95%以上だった。同バイオカソードの電気化学的特性を解析したところ、電位に依存して異なる経路で反応が起こっている可能性が示唆された。水素生産を触媒するバイオカソードでは、電流-水素変換効率は約80%であり、希金属触媒に匹敵する触媒活性が示された。これらバイオカソード上の微生物叢解析から、多様な好熱性微生物が電気化学反応の触媒能を持っている可能性が示唆された。前年度に構築した電気化学的メタン生成活性を持つ好熱性バイオカソードに関して詳細な解析を行った。メタン生成バイオカソードの電気化学的特性をCyclic Voltammetry法を用いて解析した。メタン生成バイオカソードにおける電気化学的メタン生成反応には、電圧印加培養により集積された微生物系が触媒として強く関わっており、さらに電位に依存して異なる経路で反応が起こっている事が示唆された。同時に、下水処理場の高温消化汚泥に由来する微生物群を電気化学的培養リアクターに植菌し、嫌気条件下でFed-batch方式の電圧印加培養を繰り返す事で、電気化学的水素生成活性を持つ好熱性バイオカソードの構築に初めて成功した。この水素成バイオカソードにおいて、電流-水素変換効率を計算したところ60%から80%に近い値をとった。金属触媒を用いていない通常の(非生物的)電気化学的な水素生成の電流-水素変換効率が10%近辺であることを考慮すると、バイオカソードによる変換効率は顕著に高いと言える。さらに、Linear Sweep Voltammetryによるバイオカソードの電気化学的特性を解析した。バイオカソードは強い還元活性を示し、電圧印加培養により集積された微生物系が電気化学的水素生成反応に触媒として強く関わっていることが示された。また、プロトンの還元反応が起こるまで電流がほとんど流れなかったことから、水素生成を触媒する微生物(群)がカソード電極から直接電子を受け取ってプロトンを還元する反応機構が示唆された。バイオカソード表面上の微生物群の菌叢解析を行ったところ、これまで電気化学的活性が報告されたことの無い微生物種が主に検出され、これまで電気化学的活性が知られていなかった好熱性微生物が水素生成バイオカソード上で触媒活性を担っている可能性が示唆された。本研究で構築した好熱性のメタン生産バイオカソードは、既往研究中で最も高いメタン生成速度を有し、反応の電子利用効率は96%以上という顕著に有望な特性を示した。そこで、同バイオカソードの電気化学的メタン生成(EM)反応の触媒機構を詳細に解析した。二槽式の電気化学的培養セルに同バイオカソードを移植し、ポテンショスタットにより定電位(-0.5 V vs. SHE)を与えて培養したところ、EM反応の触媒能が培養継続により向上した。触媒能が向上した同バイオカソードでの電気化学的反応をCyclic Voltammetryにより解析した結果、電位に依存した2種類の反応経路が存在する事が示唆された。詳細な反応実験から、-0.32から-0.6 V (vs. SHE)の電位では「直接的なEM反応(CO2 + 8H+ + 8e- →CH4 + 2H2O)」が、-0.6 V (vs. SHE)より低い電位では水素分子の生成を介した「間接的なEM反応(2H+ + 2e- →H2およびCO2 + 4H2 →CH4 + 2H2O)」が起こっている事が示唆された。これらはバイオカソードのEM反応の電気化学的特性を明らかにした初めての知見である。バイオカソードにおけるエネルギー資源ガス(水素とメタン)生産の微生物的背景を理解し、バイオカソードで水素とメタンの生成反応をそれぞれ触媒する機能性微生物系を特定するために、以下の実験を行った。まず、電解培養セル(金属触媒非添加)で、バイオカソードを作製、解析対象とした。微生物源として常温性微生物群(消化汚泥由来)と高温性微生物群(地下水由来)の二つをそれぞれ電解培養リアクターセルに植菌し、電圧印可培養を行った。リアクターセルで発生した電流とガス生産を定期的に観測したところ、常温性消化汚泥を微生物源とするリアクターセルでは培養開始後初期には水素が、それ以降はメタンが生成し、その生成量は発生した電流の量に対応していた。また高温性消化汚泥を微生物源とするリアクターセルでは電流量に対応したメタンの発生が観察された。2種類のリアクター共、電流(電子)のバイオガスへの変換効率はほぼ100%であり、高機能のバイオカソードが形成されていることが示唆された。

そこで活発にメタンを生成している両バイオカソードからそれぞれDNAを抽出、16S rRNA遺伝子を指標に微生物叢の群集構造を分子系統学的手法で解析した。その結果、両方のバイオカソード上で、電気化学的活性の高い細菌種と水素資化性メタン生成古細菌の優占化が示唆された。この結果から、バイオカソードのおけるガス生産反応では、電気化学的活性の高い細菌種がカソードからの電子の受容を仲介している事が示唆された。本年度の研究の結果、それぞれメタンと水素を電気化学的に生産する2種の好熱性バイオカソードの構築を達成した。さらにそれらバイオカソードのバイオガス生産活性に関わる微生物的また電気化学的な機構を明らかにしつつある。バイオガス生産に関わる遺伝子群の特定には至っていないが、次年度に予定していた電気化学的特性解析の一部をすでに行っている。平成23年度の結果から、バイオカソードのおけるガス生産反応は、電気化学的活性の高い細菌種がカソードからの電子の受容を仲介している事が示唆された。この知見は、既知の電気化学的活性の高い細菌種の純粋培養株とメタン菌の共培養系を用いて、比較的簡易にバイオカソードが構築出来る可能性を示している。これは次年度以降の研究において、(研究立案時に想定していたよりも)スマートな研究モデルを提供するものとして、今年度の目標を達成するものである。さらに、平成23年度の研究の副産物的な成果として、これまで知られていなかった電気化学的活性の高い細菌種を発見している。「2種のバイオカソードの電気化学的特性と微生物系の環境応答解析」:2種類のバイオカソードのガス生産活性、電気化学的特性、触媒微生物系の環境条件(電圧、栄養、基質濃度、培養条件等)に対する応答を解析し、ガス生産効率が向上する環境条件を決定し「バイオカソードの高効率化」達成への道標とする。異なる環境条件下におけるバイオカソードのガス生産活性と電気化学的特性(ボルタメトリー法)を測定する。「バイオカソードの高効率化手法の確立」:これまでの解析から得られた知見を統合し、2種類のバイオカソードのガス生産の効率向上化手法を検討、実験実証し「次世代バイオカソードの高効率化」を達成する。環境応答の解析結果を基に、不足している栄養素、培養条件等を検討する。また、微生物群集構造の比較から異なる代謝活性を持つ微生物種の添加、またリアクターやカソードのデザインや材料等の工学的改良により次世代バイオカソード高効率化を達成、発展研究で他の関連技術と融合する。「機能性微生物系の選択的増幅による次世代バイオカソードの構築」まず、「水素とメタンのみをそれぞれ安定して生産する2種類の次世代バイオカソードの並行構築」を行う。これは、平成23年度に得られた知見を基に、微生物株の共培養系を利用することで、より確実に達成できると考えられる。微生物種としては、より新規性の高い知見が得られると期待される高熱性微生物種を優先して実験に供する。
東アフリカ北部における生業牧畜と地域商業網に関する人類学的研究

本研究の目的は,エチオピア,ソマリア,ケニアの三国国境に位置するガリ・ランドとその周辺地域を対象として,個々の社会における家畜の取引様式と仲介商人の活動を生態学的視点と社会史的視点から分析して,生業牧畜と仲介商業網の複合的構造をあきらかにすることにある。1.調査地域の社会史的背景:三国国境は,歴史的には,ガダ教,ウシ遊牧,ボラナ語などで特徴づけられるボラナ文化,エチオピア正教,城塞都市,アムハラ語などで特徴づけられるアムハラ文化,そしてイスラム教,ラクダ遊牧,ソマリ語などで特徴づけられるソマリア文化が複雑に絡み合ってきた。しかし,ソマロイド系の諸民族(レンディーレ,グラ,ガリ,ガブラ,サクエ,ガリマロそしてアジュラン)は,これら三つの文化の狭間で,個々の民族集団の分裂と分裂集団間の再統合を余儀なくされてきた。2.地域商業網の構造:三国国境の地域商業網は,域外交易,域内商業,生業牧畜の三つのセクターから構成されているが,アディスアベバにつながる北方交易,ナイロビにつながる南方交易,インド洋沿岸につながる東方交易の重要な中継地である。ここから大都市にむけてトラックで商品を直接運搬するという域外との長距離交易は資力のあるソマリやガリの大商人によって独占されている。かれらは,各地の町に一族の者を分住させて広域商業網の拠点をつくり,同業者間の双方的な婚姻連合に基づく同族経営によって商業活動を展開している。ここには,家族集団の個別性を保持しつつ部族や出自の論理よりも商業の論理を優先させるという特徴がみられるが,イスラム教徒という帰族感と連帯感を共有して連合しあっていることがそれを可能にしているのである。域内商業の担い手は田舎商人であり,かれらは田舎町の店を拠点として,キャラバン隊やトラックによって物資を運搬する。キャラバン隊には未去勢のラクダが駄用ラクダとして使用される。レンディーレやガブラのようなラクダ遊牧民は,去勢ラクダを駄用に使用しているが,キャラバン交易に深く関わってきた経験をもつガリは去勢されたラクダには力がないといって,未去勢ラクダを駄用ラクダとして調教するのである。このような田舎商人の家族は,町場と牧野に分住して,遊牧と商業を同時におこなっている。かれらは,田舎町と牧野を連続したものとみなして,商業と遊牧を複合化した生活様式をつくりあげているのである。ガリの牧野の集落は,定着的傾向の強いものから,一時的に家族が寄り集まっただけのものまでみられるが,いずれも田舎町と密接な関係を維持しつつ遊牧を行う拠点となっている。3.商業牧畜:本研究をすすめるうちに,生業牧畜民(トゥルカナ,サンブル,ガブラ,レンディーレ)というよりも商業牧畜民(ソマリ,ガリ)というべき民族を見いだすことができた。前者は,遊牧という生業をアイデンティティの重要な要素として,牧野に埋没するかのような生活様式をつくりあげている。生業牧畜民にとって,町は家畜を売却して農産物,雑貨,現金などの不足を充足する場所であり,しかも家畜は市場価格を考慮することなく,当座の必要物を充足するために売却されるだけである。むしろ,家畜は,かれらの社会における連帯感を表出し維持するために取引される。かれらは,家族全員が遊牧に従事して,あたかも牧野に埋没するかのように独自の共同体的社会をつくりあげている。ここには,町と村を複合させるという前提が欠落している。しかし,後者は,イスラム教的価値を共有しあって遊牧と商業を複合化した生活様式をつくりあげている。ガリの商業牧畜民は,商業に特化した町商人ほどには商業の論理に徹しているのではない。かといって,生業牧畜民ほどには地縁や出自の論理に拘束されているわけではない。かれらの生活には,両方の論理が組み込まれているのである。このような生活様式を両者の折衷されたものとして理解すベきではなく,むしろ独自の生活様式として理解すベきである。商業牧畜という概念を設定することによって,牧畜的地域社会の複合構造をより一層解明できるものと思われる。

かれらは,各地の町に一族の者を分住させて広域商業網の拠点をつくり,同業者間の双方的な婚姻連合に基づく同族経営によって商業活動を展開している。ここには,家族集団の個別性を保持しつつ部族や出自の論理よりも商業の論理を優先させるという特徴がみられるが,イスラム教徒という帰族感と連帯感を共有して連合しあっていることがそれを可能にしているのである。域内商業の担い手は田舎商人であり,かれらは田舎町の店を拠点として,キャラバン隊やトラックによって物資を運搬する。キャラバン隊には未去勢のラクダが駄用ラクダとして使用される。レンディーレやガブラのようなラクダ遊牧民は,去勢ラクダを駄用に使用しているが,キャラバン交易に深く関わってきた経験をもつガリは去勢されたラクダには力がないといって,未去勢ラクダを駄用ラクダとして調教するのである。このような田舎商人の家族は,町場と牧野に分住して,遊牧と商業を同時におこなっている。かれらは,田舎町と牧野を連続したものとみなして,商業と遊牧を複合化した生活様式をつくりあげているのである。ガリの牧野の集落は,定着的傾向の強いものから,一時的に家族が寄り集まっただけのものまでみられるが,いずれも田舎町と密接な関係を維持しつつ遊牧を行う拠点となっている。3.商業牧畜:本研究をすすめるうちに,生業牧畜民(トゥルカナ,サンブル,ガブラ,レンディーレ)というよりも商業牧畜民(ソマリ,ガリ)というべき民族を見いだすことができた。前者は,遊牧という生業をアイデンティティの重要な要素として,牧野に埋没するかのような生活様式をつくりあげている。生業牧畜民にとって,町は家畜を売却して農産物,雑貨,現金などの不足を充足する場所であり,しかも家畜は市場価格を考慮することなく,当座の必要物を充足するために売却されるだけである。むしろ,家畜は,かれらの社会における連帯感を表出し維持するために取引される。かれらは,家族全員が遊牧に従事して,あたかも牧野に埋没するかのように独自の共同体的社会をつくりあげている。ここには,町と村を複合させるという前提が欠落している。しかし,後者は,イスラム教的価値を共有しあって遊牧と商業を複合化した生活様式をつくりあげている。ガリの商業牧畜民は,商業に特化した町商人ほどには商業の論理に徹しているのではない。かといって,生業牧畜民ほどには地縁や出自の論理に拘束されているわけではない。かれらの生活には,両方の論理が組み込まれているのである。このような生活様式を両者の折衷されたものとして理解すベきではなく,むしろ独自の生活様式として理解すベきである。商業牧畜という概念を設定することによって,牧畜的地域社会の複合構造をより一層解明できるものと思われる。佐藤、篠原、広谷(研究協力者)の3名は、それぞれエティオピア南東部のガレ族、アファル族、ボラナ族の3民族の生活領域に住み込み、一方、研究協力の曽我と湖中は、それぞれケニア北東部のガブラ族とガレ族の生活領域に住み込んで、地域の概況と調査地の選定を行った。この過程で、以下の知見を得ることができた。1)地域の歴史的背景:エテイオピア、ソマリア、ケニアの3国国境は、ボラナ族を中心にしたオロモ系諸民族の南下とダ-ロ-ド族とオガデン族を中心にしたソマリ系諸民族の北上と西方移動により、激しい民族抗争が繰り返されてきた地域であり、2つの大勢力の狭間に、レンディ-レ、ガレ、ガブラなどの少数民族が、いずれかの勢力と対立したり、連合したりして生存を図ってきた。
理科教育からみた児童期の特質に関する調査

従来のカリキュラム研究においては、児童の認識発達の段階を心理学的に明らかにした上で、それにもとづいて、学校教育における科学教育あるいは理科教育はおよそ何歳から開始することが可能になるかを判断するという方法がとられてきた。ところが、最近の心理学の進歩によって、社会的な交渉の場面から切り離して個々の児童の認識を調べても認識発達の水準を明らかにすることは不可能であることがわかってきた。一般に、(ビアジェが発達研究で用いたような)個人を隔離しておこなうテスト場面では、日常生活の具体的体験の中で示す知的能力や、理科の授業場面のように具体物を前にして社会的な交渉をおこないながら問題解決をおこなう状況で発揮される知的能力よりもはるかに低い知的能力を示すと言える。このような問題に関して調査をおこない、つぎのような知見を得た。(1)日本の理科授業の特徴に関する比較文化的調査:カリフォルニア大學バークレー校のマ-シャ・リン教授および発達教育研究所(オ-クランド市)のキャサリン・ルイス博士とともに小学校の理科授業の観察と教師インタビューをおこなって、わが国の小学校理科の授業が米国のそれにくらべて社会的交渉を重視しており児童の科学的探求活動に適していること、知的活動の水準も高いことを明らかにした。(2)小学校低学年の理科授業記録の分析によるわが国の理科授業の特徴と、児童の知的活動水準に関する調査:上の知見にもとづいて、過去の小学校低学年の授業記録を分析し、低学年においても理科授業は児童の知的活動に適した状況を設定しており、そこでは、過去の発達段階説がえがいていたよりはかなり高い水準の認識活動がおこなわれていたことが明らかになった。(3)最新の文献にもとづく認識心理学説の比較分析とその教育上の意味付けに関する調査:個人心理学的なビアジェの発達理論と最近の社会心理学的な認識研究(状況の中での認識やいわゆる個人の心以外の道具や記号、グラフ表現、言語表現の中に分散された認識に注目する研究)の比較分析、ならびに個人的・社会心理学的双方の認識発達研究の比較分析をおこない、この問題に関する将来の研究の枠組みの整理を試みた。その成果の一部は2冊の啓蒙的な図書として発表した。詳細は後日論文として発表する予定である。平成8年度には次の研究をおこなった。(1)児童期の理科教育についての制限条件としての認識発達の限界に関する理論上の整理(文献研究)。ピアジェが中心になっておこなった認識の発達に関する研究では、幼児や小学校低学年児童の論理的思考力が非常に低くみられている。一時期、ピアジェの発達理論が学界において優勢になり、その発達段階説を前提として教育課程を編成しようとする動きがでてきたが、その後、ピアジェの発達段階説には、いろいろな批判も出てきて、発達段階説に対する反証も数多く出されている。そこで、それらの諸論文の内容を整理して、現在の発達心理学的研究からみた、理科教育の可能性を探った。その結果、十数年前とは違って、小学校低学年でも理科教育が可能な認識発達の水準に達しているというのが一般的な見解であることが、明らかになった。(2)児童の科学観の調査。カリフォルニア大学バークレー校のマ-シャ・リン教授の調査にならって、同様の調査を行った。その結果、リンが調べた米国の中学生よりも、我が国の小学生の方が、確かな科学観をもっているらしいということが分かった。(3)授業という集団的探究場面における児童の科学的探究活動の実態についての調査。授業の観察記録をつくることと、(低学年については理科の授業が現在はないので)すぐれた教師が残している、過去の理科授業における児童の探求活動を分析することの両方のやり方で、心理学者の調査では得られない、集団的探求活動の実態を分析した。集団場面では、一段と高いレベルの認識活動を行っている様子が明らかになった。(3)最新の文献にもとづく認識

心理学説の比較分析とその教育上の意味付けに関する調査:個人心理学的なビアジェの発達理論と最近の社会心理学的な認識研究(状況の中での認識やいわゆる個人の心以外の道具や記号、グラフ表現、言語表現の中に分散された認識に注目する研究)の比較分析、ならびに個人的・社会心理学的双方の認識発達研究の比較分析をおこない、この問題に関する将来の研究の枠組みの整理を試みた。その成果の一部は2冊の啓蒙的な図書として発表した。詳細は後日論文として発表する予定である。
遍歴電子の強磁性における多バンド効果の理論的研究

以下の研究が行われた1.一次元の二重縮退のあるハバード模型の基底状態を、有限サイズ密度行列繰り込み群を用いて計算し、基底状態の相図を求めた。この結果と昨年行われた無限大次元における研究を比較することにより、金属強磁性に対するフロント結合の効果がかなり明らかになった。1サイト当たりの電子数密度をnとすると、1【less than or equal】n<2では強磁性が次元によらずフント結合によって安定化される事がはっきりした。一方n<1では一次元と無限大次元の結果が異なっており、さらに2次元3次元での研究が必要である。この結果は平成11年度中2.無限大次元単純立方格子上の二重縮退のあるハバード模型を動的平均場の方法を用いて調べ基底状態の相図を求めた。この結果n<1の場合は強磁性が現れないが、n【greater than or equal】1の場合は広いパラメータの領域で強磁性が現われる事が、明らかになった。又、n=1とn=2の近傍で相分離が現わ1.と2、の研究により、n>1の場合、二重交換相互作用により金属強磁性が次元性によらず安定に現われる事が明らかになった。3.一般の大きさSのスピンを持つ二重交換模型の1電子グリーン関数に対する単サイト近似を構築し、それを用いてこの系の電子状態及び電気抵抗を計算した。4.S=1/2のスピンを持つ二重交換模型の基底状態の相図を無限大次元単純立方格子において計算した。この結果強磁性、反強磁性、相分離の出現が確かめられた。また古典スピン系との比較により、スピンの揺らぎの量子効果が明らかになった。結果は現在投稿準備中である。平成9年度は以下の研究が行われた。1.無限大次元単純立方格子上の二重縮退のあるハバ-ド模型を動的平均場の理論を用いて調べ、基底状態の相図を求めた。1サイト当たりの電子数密度をnとすると、n=1の場合異なる軌道が交互にならんだ強磁性状態、n=1.2の場合は軌道のない強磁性状態が実現するが、n=0.8の場合は強磁性状態が実現しない事が分かった。この結果は、金属強磁性の実現にいわゆる二重交換相互作用が重要な効果を持っていることを示している。この結果は平成9年7月にオーストラリア国ケアンズ市で開催された磁性国際会議(ICM'97)において発表された。また平成10年度中に論文刊行予定。2.一般の大きさSのスピンを持つ二重交換模型の1電子グリーン関数に対する単サイト近似を構築し、それを用いて、この系の電子状態および電気抵抗を計算した。これにより、スピンの量子ゆらぎの電子状態にたいする影響を調べた。(ロンドン大学D.M.Edwards教授および大学院生A.Greenとの共同研究、平成10年度中に論文刊行予定)。3.S=1/2のスピンを持つ二重交換模型の帯磁率を無限大次元単純立方格子において計算した。かなり大規模な量子モンテカルロ計算を行ったが、種々の困難があり、まだ十分低温まで計算ができていないため、来年度に継続する。4.一次元の二重縮退のあるハバ-ド模型の基底状態を、有限サイズ密度行列繰り込み群を用いて計算し、基底状態の相図を求めた。この研究は来年度に継続する。平成10年度は以下の研究が行われた。1.一次元の二重縮退のあるハバード模型の基底状態を、有限サイズ密度行列繰り込み群を用いて計算し、基底状態の相図を求めた。この結果と昨年行われた無限大次元における研究を比較することにより、金属強磁性に対するフント結合の効果がかなり明らかになった。1サイト当たりの電子数密度をnとすると、1【less than or equal】

n<2では強磁性が次元によらずフント結合によって安定化される事がはっきりした。一方n<1では一次元と無限大次元の結果が異なっており、さらに2次元3次元での研究が必要である。この結果は平成11年度中2.平成9年度に無限大次元単純立方格子上の二重縮退のあるハバード模型を動的平均場の理論を用いて調べ、基底状態の相図を求めたがその際十分調べなかった相分離の可能性について詳しく調べた。その結果、n=1及びn=2の近傍で相分離が起こる事が確かめられた。3.昨年度一般の大きさSのスピンを持つ二重交換模型の1電子グリーン関数に対する単サイト近似を構築し、それを用いて、この系の電子状態および電気抵抗を計算したが、さらに磁気的性質を調べた。4. S=1/2のスピンを持つ二重交換模型の基底状態の相図を無限大次元単純立方格子において計算した。この結果強磁性、反強磁性、相分離の出現が確かめられた。また古典スピン系との比較により、スピンの揺らぎの量子効果が明らかになった。結果は現在投稿準備中である。
ニュ-ナルネットによる複合反応システムのダイナミックモデルの作成と最適化への応用

(1)充填層反応器のニュ-ラルネットモデルの作成:外部加熱型触媒充填層反応器による軽質ナフサの改質反応を対象として、ダイナミックモデルを作成し、シミュレ-ションを行なった。本反応は、原料が多成分で、複数の素反応が同時に進行し且つ、運転時間の経過に伴って触媒活性の劣化が起こり、目的成分の収率も変化するという複雑なものであるが、本モデルでは、関与する化学種を7成分に簡略化し、目的成分をベンゼンのみとし反応器内で起こる素反応を重要なものの8つとし、触媒活性の劣化のダイナミックスも考慮に入れた。次に、反応器の熱媒温度や触媒の劣化を入力とし、一定時間後の生成物成分を出力とするニュ-ラルネットモデルを構築し、シミュレ-ションデ-タを用いて、バックプロパゲ-ションによりニュ-ラルネットの学習を行なった結果、精度良くダイナミックスを表現できることが確認できた。なお、ニュ-ラルネットは3層からなり、入力層、中間層、出力層のセル数はそれぞれ22,20,27である。(2)反応システムの最適化:上記のニュ-ラルネットモデルを用いて、反応器一個の場合のベンゼン収率を一定に保つための熱媒温度の時間軌跡を求める問題を解いた。ニュ-ラルネットモデルにより求めた熱媒温度の時間軌跡は、シミュレ-タ-により最適化計算で求めたものとほぼ一致しており、良好な結果を得た。また、ニュ-ラルネットモデルによる最適化計算は、シミュレ-タ-によるものと比べて計算時間が非常に短いので、種々の最適化問題を解く場合には優れた方法であるといえる。多段反応器の熱媒温度の最適化および一定の運転時間内のベンゼン収率を最大とする場合の熱媒温度の最適化については、現在検討中である。なお、以上の結果をまとめて、公表の準備をしている。
物理刺激と生物学的分子認識の統合による高効率・細胞選択的遺伝子デリバリー

プラスミドDNAの全身動態ならびに細胞内動態は、プラスミドDNA/キャリア複合体に適当な物理化学的・生物学的特性を賦与することにより制御可能である。我々はこれまでに、構造中に糖を導入した高分子性および微粒子性キャリアを開発し、肝細胞あるいは肝類洞血管内皮細胞・Kupffer細胞を対象とした細胞選択的遺伝子発現システムの開発に成功してきた。しかしながら発現効率は他の非ウイルス型キャリアシステム同様低く、標的細胞へ到達後のプラスミドDNAの分解が問題であると考えられた。そこで本研究では、細胞選択的遺伝子デリバリーのための化学的アプローチとしてガラクトースを導入した高分子性キャリアを用いて遺伝子デリバリーを行い、標的細胞到達後の遺伝子発現を電気パルス(エレクトロポレーション)により改善することを試みた。肝細胞への選択的なキャリアであるガラクトース修飾ポリ-L-リジンあるいはガラクトース修飾ポリエチレンイミンとプラスミドDNAとの複合体投与により、これまでの報告通り肝臓での遺伝子発現が認められた。複合体を投与したマウスの肝臓表面に一定条件の電気パルス(250V/cm、5ms、12パルス、4Hz)を与えたところ、最大で100倍以上遺伝子発現は増大した。一方、静脈内投与のみでは全く遺伝子発現を示さないプラスミドDNA単独を投与後の肝臓に電気パルスを与えたところ、100,000倍以上遺伝子発現が増大した。この時の遺伝子発現は、複合体投与とエレクトロポレーションを組み合わせた場合よりも有意に高く、電気パルスのような物理刺激を用いる場合にはDNA単独が適していることが示された。この時の遺伝子発現は肝細胞においてより高く、また局所注射と比較して約2倍多数の細胞への遺伝子導入が実現された。我々はこれまでに、構造中に糖を導入した高分子性および微粒子性キャリアを設計し、肝細胞あるいは肝血管内皮細胞・Kupffer細胞を対象とした細胞選択的遺伝子発現システムの開発に成功してきた。一方、DNAを局所投与後に電気パルスを与えた場合にはプラスミドDNA単独投与により場合によってはウイルスベクターに匹敵するほどの高効率な遺伝子発現が得られている。これは、電気刺激により細胞膜の物質透過性が上昇し、プラスミドDNAが直接細胞質内へ移行するためと考えられるが、遺伝子導入の対象をコントロールすることが困難であり、対象組織全体への遺伝子導入、あるいは標的細胞への選択的導入などは達成されていない。そこで本研究では、細胞選択的遺伝子デリバリーのための化学的アプローチとしてガラクトースあるいはマンノースを導入した高分子性ならびに微粒子性キャリアを用いて遺伝子デリバリーを行い、標的細胞到達後の遺伝子発現を電気パルス(エレクトロポレーション法)により改善することを試みた。通常の条件下では、naked DNAの門脈内投与では肝臓での有意な遺伝子発現は認められないが、投与直後に電気パルス(250mV/cm、5msec、12パルス、4Hz)を肝臓に加えることにより遺伝子発現が大幅に増大した。従って、エレクトロポレーション法が、局所投与されたDNAに対してだけでなく血管内に投与されたDNAに対してもその肝細胞内へのデリバリーを促進することが明らかとなった。しかしながら、投与後5分の時点で同じ条件の電気パルスを与えた場合には遺伝子発現レベルは1オーダー低く、Kupffer細胞などによる取り込みあるいは血中での分解等によるDNAの消失によるものと推察された。肝細胞への選択的なキャリアであるガラクトース修飾ポリ-L-リジン(Gal-PLL)との複合体の投与時にもエレクトロポレーションによる遺伝子発現の改善が認められた。この場合には、投与5分後に電気パルスを与えた場合にも発現が増強する傾向があり、Gal-PLLによりDNAが肝細胞へ送達され、そこで電気パルスにより細胞質内への放出が促進されたものと思われる。今後、キャリアの物理化学的性質、電気パルスの強度・タイミング等の最適化を行い、高効率で細胞選択的な遺伝子導入法の確立を目指す。

この時の遺伝子発現は、複合体投与とエレクトロポレーションを組み合わせた場合よりも有意に高く、電気パルスのような物理刺激を用いる場合にはDNA単独が適していることが示された。この時の遺伝子発現は肝細胞においてより高く、また局所注射と比較して約2倍多数の細胞への遺伝子導入が実現された。
トランスポゾンによる植物のエピゲノムと遺伝子発現の制御

アサガオの主要な突然変異原であるTpn1ファミリーのトランスポゾンが関わるエピ変異と花色遺伝子の抑制機構の解明を試みている。野生型で340コピーあるTpn1ファミリーのトランスポゾンはその殆どが非自律性トランスポゾンであり、転移酵素をコードするTpnA2により転移が制御されていることが示唆されている。そこでまず、転移酵素遺伝子を発現するTpnA2について解析した。すでにトランスポゾンが不活性な野生型と、活性かつトランスポゾンが誘発したエピ変異により花に模様をもつ刷毛目絞変異体について、次世代シーケンサーで調べた結果をもとにTpnA2の内部配列のDNAメチル化を比較検討した。その結果、野生型でも変異体でも内部配列が高度にDNAメチル化されているが、転移酵素遺伝子のプロモーター配列では、野生型の方がよりDNAメチル化レベルが高いことを確認した。つづいて、全ゲノムレベルのヒストン修飾情報について比較検討したところ、変異型でのみ転移酵素遺伝子のプロモーター領域にアセチル化ヒストンが観察できた。以上の結果から、TpnA2にコードされた転移酵素遺伝子は、野生型ではDNAメチル化により発現抑制されていることと、刷毛目絞変異体ではヒストンのアセチル化を伴うDNAの脱メチル化により発現抑制が解除されていることが示唆された。一方、刷毛目絞に関わる花色遺伝子の抑制機構を調べるために、抑制的なヒストン修飾に関わる遺伝子をゲノム編集で破壊する準備を行った。刷毛目絞変異体を形質転換するための培養条件を検討し、ゲノム編集用のバイナリーベクターの作成に着手した。また、花色遺伝子のプロモーター配列と転写因子の相互作用とエピ変異の関連をクロマチン免疫沈降法で調べるために必要な、タグ付き転写因子を発現するバイナリーベクターを作成している。アサガオのトランスポゾンによるエピ変異の制御を知る上で重要な、TpnA2の転移酵素遺伝子の発現抑制について知見が得られた。また、花色遺伝子の抑制機構の解析も順調に進んでいる。トランスポゾンについては、TpnA2の転移酵素遺伝子の発現をRT-qPCRなどにより調べ、近傍配列のDNAメチル化とヒストン修飾も次世代シーケンサーの結果を情報解析することで調べる。花色遺伝子の抑制機構については、バイナリーベクターを完成させてアサガオを形質転換して変異体を得る。(理由)トランスポゾンのDNAメチル化とヒストン修飾について調べるため、試薬類の購入を必要としない次世代シーケンサーの配列情報解析に注力したため。(使用計画)情報解析の結果をもとにRT-qPCRなどの解析が必要になっており、そのための試薬類などを購入して研究を進める予定である。