hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キゴキブリ集団間における細胞内共生系とセルロース消化共生系との代謝競合

昨年度の研究の結果、米国東部ノースカロライナ州に分布するキゴキブリ(Cryptocercus punctulatus)の細胞内共生細菌において、システイン合成酵素遺伝子の有無に顕著な違いが認められた。今年度はその地理的要因を考慮するため、本種をノースカロライナ州周辺各州でもサンプリングし、比較ゲノム解析を行った。また、系統的に広範な種でゲノム進化を検討するために、カリフォルニア州北部でC. clevelandiをサンプリングし、韓国においてC. kyebangensisをサンプリングした。これらの比較ゲノムの結果、システイン合成関連酵素の欠落はキゴキブリの系統関係と密接に関連するものの、C. punctulatusにおいて2度独立に失われたと考えられた。さらに、キゴキブリとムカシシロアリの共通祖先の細胞内細菌で失われたと考えられていたアミノ酸生合成遺伝子の多くが韓国産キゴキブリの細胞内共生細菌には残っており、米国西部のキゴキブリの細胞内共生細菌においてもC. punctulatusよりわずかに多く残っていた。この結果、これらの遺伝子が共通祖先からではなく、キゴキブリの進化の途上で細胞内共生細菌から徐々に失われ、平行進化の結果として一部のキゴキブリとムカシシロアリの細胞内共生細菌において失われることになったと考えられた。これらに加えて、腸内微生物の関与を検討するために、オオゴキブリ(Panesthia angustipennis)と韓国産キゴキブリ、および米国東部のキゴキブリにおいて後腸内に遊離するアミノ酸量をHPLCによって測定したところ、オオゴキブリ及び韓国産キゴキブリに対して、米国東部産キゴキブリの後腸では顕著にアミノ酸量が増加していた。このことは、腸内共生系と細胞内共生系の間においてアミノ酸生産をめぐる代謝競合か存在する可能性を示唆していると考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は予定通り、アメリカ・アパラチア山脈においてキゴキブリのサンプリングを実施した。ノースカロライナ州立大学のChristine A. Nalepa准教授の指導の下、当初予定していた2タイプの染色体数のキゴキブリだけではなく、これまで報告されている染色体数の異なる4タイプのキゴキブリを採集することができた。これらのキゴキブリの脂肪体からDNAを抽出し、MiSeqを用いてシーケンスした。De novoでアセンブルした後、共生するブラタバクテリウムのコンティグ断片をTBLASTXによって選別し、これに対してリードをマッピングし、伸長することでアセンブルを実施した。最終的に得られたコンティグについて、独自のスクリプトを用いてアノテーションを行った。その結果、これらのゲノムサイズは約607 kb613 kbであり、543547個のCDSをコードしていた。詳細な比較解析の結果、これらのブラタバクテリウム間で大きな遺伝子レパートリーの違いは認められなかったが、主にシステイン生合成関連遺伝子の有無(欠落や偽遺伝子化)に顕著な違いが認められたほか、2つのトランスポーターと考えられる遺伝子の有無にも差が認められた。キゴキブリの系統関係と照らし合わせた結果、これらの遺伝子の欠落や偽遺伝子化はキゴキブリの進化の過程で2度独立に起きており、地理的な分布と何らかの相関がある可能性が示唆された。また、いずれのブラタバクテリウムも硫酸還元に必要な生化学経路を欠落していたことから、ブラタバクテリウムと腸内の硫酸還元細菌との競合が存在する可能性も考えられた。さらに代謝物解析については酢酸菌によるセルロース合成を開始し、摂食条件について予備実験的な検討を開始した。予備的な解析では個体間のばらつきが大きく、さらに慎重な条件検討が必要であろうと考えられた。

予定していたキゴキブリ(C. punctulatus)についてはNalepa准教授の指導の下、全ての染色体数のキゴキブリをサンプリングすることができ、当初の計画以上の成果をあげることができた。反面、アウトグループに予定していたキゴキブリ(C. clevelandi)のサンプリングについては分布域の特定が難しく、予定していたサンプリング期間内で十分な成果をあげることができなかった。ただ、サンプリングできた種類については順調に比較ゲノム解析をこなすことができ、当初は想定していなかった地理的分布に対応したゲノム進化の仮説を導くことができた。代謝物解析についても予定通り予備的実験を開始しており、研究は概ね順調に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究から、各宿主のブラタバクテリウムにおいてシステイン生合成関連遺伝子の有無(欠落・偽遺伝子化)について顕著な差が認められたことに加え、これが地理的な分布と関連している可能性が浮かび上がってきた。この仮説を証明するためには、今回採集ができなかった地理的に隔離されたキゴキブリについても解析する必要があるだろう。また、アウトグループとなりうる別種のキゴキブリについても採集し、これらにはシステイン生合成経路が存在することを確認する必要がある。また、遺伝子の有無と代謝物の有無との関連を証明するためには、当初の予定通りメタボローム解析を進める必要があることに加え、必要に応じて腸内微生物叢や地理的に異なる地域の土壌微生物叢の比較解析についても検討する必要があると思われる。
海岸クロマツ林における外生菌群集の遷移機構と実生更新に果たす菌根機能の解明

我が国の海岸林はマツ材線虫病により枯損衰退しており,防災上,景観上の機能の劣化が懸念される.海岸林の維持促進を効率的な実生植栽により達成させるための基礎として,クロマツに共生する外生菌根群集を菌根の形態的,遺伝的に調べた.その結果,海岸地域は内地に比べて外生菌根菌の種数が少ない傾向にあり,不完全菌類Cenococcum geophilumにより寡占される単純な群集構造であることが示唆された.我が国の海岸林はマツ材線虫病により枯損衰退しており,防災上,景観上の機能の劣化が懸念される.海岸林の維持促進を効率的な実生植栽により達成させるための基礎として,クロマツに共生する外生菌根群集を菌根の形態的,遺伝的に調べた.その結果,海岸地域は内地に比べて外生菌根菌の種数が少ない傾向にあり,不完全菌類Cenococcum geophilumにより寡占される単純な群集構造であることが示唆された.海岸クロマツ林の外生菌根菌群集を明らかにするための調査手法を確立するため,本年度は細根,外生菌根の垂直分布を調べるとともに,外生菌根を形成する菌種を調べた.海岸クロマツ林1ケ所に調査地を設定し,単木的に生育するクロマツ成木5本を調査木とした.各調査木の樹幹から160cm離れた海側の地点において土壌断面を作成し,4段階の土壌深;0-15cm,30-45cm,60-75cm,90-105cmから土壌ブロック(横×奥行き×深さ:10×10×15cm)を採取した.各土壌ブロック200mlから3種類の篩(上から2.0,1.0,0.5mm)を用いてクロマツ根系を抽出し,細根部分を実体顕微鏡下で観察した.細根は外観から非菌根と菌根に大別し,後者はさらに顕微鏡を用いた菌根の色や菌鞘表面構造にもとづく菌根タイプに大別した.各菌根タイプの一部は核リボソームDNAのITS領域を対象としたRFLP解析とDNA塩基配列解析に用いた.さらに,各土壌ブロック中に含まれる黒色菌核を抽出するため,土壌20mlを篩0.5mmに流水中で通過させた後,篩に残った土壌から菌核を拾い出した.その結果,形態類別に供試した細根は1719根端,そのうち98.8%が外生菌根であった.土壌深度に伴い細根数は減少した.顕微鏡によりクロマツ細根に形成された菌根は7タイプに類別された.そのうち,形態的特徴からCenococcum geophilum, Clavrinaceae sp.1, DNA塩基配列からベニタケ属やTrichophaea sp.1の定着が示唆された.深度とともにSimpson指数,RFLPタイプ数は減少傾向を示したが,Trichopaea sp., C. geophilumは,どの深度においても出現した.菌核量は細根数と同様な傾向を示した.以上から,調査した海岸クロマツ林における外生菌根菌群集は単調であると考えられた.細根と外生菌根タイプの垂直分布を考慮すると,外生菌根菌の群集構造を把握するためには,表層の0-15cmもしくは0-30cmまでを対象にすることが有効であると推察された.本年度は,地理的に異なる海岸クロマツ林の外生菌根菌群集構造を明らかにするため,太平洋側と日本海側のクロマツ林分の外生菌根群集を調べた。調査は,三重県南牟婁郡紀宝町と石川県能美市山口町のクロマツ林で行ない, 10m 10mの方形プロットを各1ヶ所設定した。プロット内から土壌コア(直径3cm深さ30cm)を計30個得て,そこからクロマツ細根をすべて回収した。顕微鏡観察にもとづき外生菌根の形態タイプ分けをしてから,核rDNAのITS領域を対象としたAlu IとHinf IによるRFLP解析を行った。ただし, Cenococcum geophilum菌根は顕微鏡観察のみで同定を行った。識別されたRFLPタイプにもとづき外生菌根菌種の多様性をS_<obs>, Simpson指数(1/D)などにより算出した。紀宝町のプロットから回収されたクロマツ細根は3684根端であり,全てが外生菌根化していた。それらは18タイプに識別され,外生菌根数が多かったのはRFLPタイプ1(31.9%), C. geoqhilum (25.4%)であった。出現頻度が高かったのはC. geophilum(90.0%), RFLPタイプ1(40.0%)であった。S_<obs>によるRFLPタイプ数は19.0タイプと推定され, Simpson指数は4.9であった。山口町のプロットから回収されたクロマツ細根は2947根端であり,外生菌根形成率は99.9%であった。それらは16タイプに識別され,外生菌根数はC. geophilum(69.5%), RFLPタイプ5(11.7%)の順に高かった。出現頻度が高かったのはC. gephilum(96.7%), RFLPタイプ5(40.0%)であった。S_<obs>によるRFLPタイプ数は16.2タイプと推定され, Simpson指数は1.9であった。

以上より,海岸クロマツ林の0.01 haプロットにおいて20種程度の外生菌根菌が生息すると考えられた。その中でC. geophilumは両プロットで外生菌根数,出現頻度ともに優占していたことから,土壌中で優占する菌種の1つと考えられた。RFLPタイプの出現頻度分布は調査地間で類似しており, Simpson指数の値も考慮すると海岸クロマツ林に生息する外生菌根菌の群集構造は単純なものであると推察された。海岸クロマツ林における菌根菌群集の遷移を明らかにするため,樹齢の異なるクロマツ林分における菌根調査を行った.三重県津市栗真町屋町の海岸クロマツ林において,2008年7月に樹高の異なる3林分(5年生,8年生,11年生)を各3か所,合計9か所設置した.各林分から土壌(φ3cm×30cm)を5サンプルずつ採取した.クロマツ根端は顕微鏡観察を行い,菌根であったものは菌根の形態類別を行った.Cenococcum geophilumは顕微鏡観察により同定した.形態類別された菌根は核rDNAのITS領域のRFLP解析(Alu I,Hinf I)を行い,各RFLPタイプの代表サンプルのシークエンス解析を行った.各林分から採取したクロマツ根端は,578から1263根端であり,合計9312根端を検鏡した.そのうち,91.2%から100%の根端が菌根化していた.黒系菌根の菌鞘表面構造はnet synenchymaであり,そのすべてがC.geophilumであった.5年生林分では白系菌根が48%を占めていたが,8,11年生林分ではC.geophilumがそれぞれ72%,56%を占めていた.クロマツ菌根から菌由来のゲノム抽出に供試した354サンプルのうち,201サンプルがITS領域の単一バンドの増幅に成功し,119サンプルをRFLP解析用いた.48RFLPタイプに識別されもののうち,34RFLPタイプのから塩基配列が得られ,推定分類群はAtheliaceae,イボタケ科,Pyronemataceae,ショウロ属,ヌメリイグチ属,ベニタケ属などであった.5,8,11年生林分から16,23,26のRFLPタイプ検出され,クロマツの樹齢に伴い関与する種数は増加傾向にあった.5年生ではショウロ属,ヌメリイグチ属の菌根の出現が,11年生ではイボタケ科,Atheliaceaeの菌根の出現が顕著であり,各樹齢で優占する菌根菌種が異なる傾向を示した.以上より,海岸クロマツ林において共生する菌根菌はクロマツと密接に関わっており,それゆえ菌の遷移の可能性が示唆された.
歯根膜を有した次世代型人工歯根の開発

天然歯に近い歯根膜組織を有した次世代型インプラント体の開発を目的とした。本研究において、カルシウム刺激が当研究室で樹立した2種類の未分化なヒト歯根膜細胞株の増殖と骨系細胞への分化誘導作用があることを明らかにした。そこでラット脛骨骨窩洞内へハイドロキシアパタイトの円柱(HAp)とともに未分化なヒト歯根膜細胞を移植した結果、HAp周囲に、移植細胞に由来した骨様硬組織形成とその周囲に歯根膜様線維組織の形成が観察された。つぎに同ラットの抜歯窩骨窩洞内に埋入した結果、歯根膜様組織の形成が認められた。以上より、HApおよび未分化な歯根膜細胞との骨への移植によって歯根膜様組織を有した人工歯根を具現化可能な結果と手段が得られたと考えられる。(1)ヒト歯根膜幹細胞株由来のタンパクのプロテオーム解析とアミノ酸解析私たちの研究室で樹立した2種の未分化な歯根膜細胞株(1-11細胞株ならびに1-17細胞株;特に分化度は1-17細胞株がより低い)を用いて、プロテオーム解析を行っている。その結果、現在のところ、1-11細胞株により発現量の多いタンパクが幾つか検出されており、現在その解析に取り組んでいる。(2)歯根膜幹細胞分化誘導因子の同定上記(1)と並行しながら、1-11細胞株ならびに1-17細胞株が発現する遺伝子解析を進めている。その結果、1-11細胞株には、細胞増殖またはアポトーシスに関連した遺伝子発現が強いことが明らかになった。さらに私たちは、歯胚形成期に発現が強く、歯冠形成の進行とともに発現が減少するタンパクを検出しており、現在、これらの因子が歯根膜細胞の分化に及ぼす影響についても解析を進めている。(3)人工歯根の足場材の検討私たちは1-11細胞株ならびに1-17細胞株を用いて、足場材に有用な成分について検討を行った結果、カルシウムに細胞の増殖ならびに骨原性細胞分化を促進する働きがあることを明らかにした。そこで当研究機関で開発された炭酸アパタイトの上で、1-11細胞株の培養を行った結果、細胞の接着ならびに増殖を観察することができた。したがって、現在、私たちは、歯根の形状をした炭酸アパタイトの作製に取り組んでおり、その3次元的形状が1-11細胞株またはH7細胞株の接着ならびに増殖与える影響、そして効率的な細胞の接着を惹起する方法について検討している。(1)象牙質基質タンパクの歯根膜幹細胞に及ぼす影響象牙質タンパクの1つであるdentin sialophosphoprotein (DSPP)から分離したDSPおよびDPPペプチドを用いて、当研究室で作製したヒト歯根膜幹細胞株の分化に及ぼす影響について検討したが、骨系細胞への分化は観察されなかった。そこでDSPPをコードしたGFP発現ベクターを、この細胞株にレトロウィルスを用いて遺伝子導入し、パーマネントに発現する細胞の樹立に成功した。DSPPが細胞株の分化に及ぼす影響に関しては、現在解析を進めている。(2)人工歯根に適した足場材の開発これまでの結果より、炭酸アパタイトが歯根膜幹細胞の接着に適していることを報告したことから、これを用いて人工歯根の作製を試みたが、物理的強度が低く、足場材としての機能に問題があることが判明した。そこで、ハイドロキシアパタイトを用いそ試みた結果、ラットの歯根のサイズに近い形状のものを作製することができた。方法は、先端直径が1ミリのパスツールピペットの先の内部に、????を填入し、???度で焼成することによって、形態や強度に問題がないものが得られた。これをHAP-人工歯根として、以下の実験に用いた。(3)人工歯根材と歯根膜幹細胞との3次元培養法の開発(2)で作製した、人工歯根周囲にヒト歯根膜細胞株を3次元的に貼りつかせることに成功した。方法は、細胞株シートを作製するために、セルシード社の培養皿を用いて、播種する細胞数そして培養期間を検討し、さらにシート状に分離する条件について、プロトコールを修正した。またHAP-人工歯根上に巻いた細胞を生着させるため、培養を行った。検討の結果、細かい金属のメッシュ上にこれを静置し、培養液にやや浸る程度の状態で培養することで、24時間培養後も細胞を生きた状態でアパタイト表面に細胞を生着することができた。現在臨床で使用されているインプラント体に代わって、より天然歯に近い歯根膜組織を有した次世代型インプラント体の開発を目的とした。

私たちは4-META/MMA-TBBレジンに生体親和性があることを以前報告しており、さらに本研究において、カルシウム刺激が、当研究室で樹立した2種類の未分化なヒト歯根膜細胞株の増殖と骨系細胞への分化誘導作用があることを明らかにしたことから、CaCl2添加型4-META/MMA-TBBレジン(Ca/SB)を作製した。その結果、10 w/w% CaCl2を含有した同レジン(10%Ca/SB)には、カルシウムならびにリンの存在下で、その表層にハイドロキシアパタイト沈着効果があり、さらにヒト歯根膜細胞との培養により、増殖および骨系細胞への分化誘導があることを明らかにした。加えて、10%Ca/SB周囲では、歯根膜細胞によるBMP2の発現が亢進し、細胞はレジンに対して垂直方向に延びた像を呈し、歯根膜様の構造が観察された。つぎに同レジンをラット脛骨窩洞(径1.5ミリ)内への填入して、4ヶ月には同レジンの周囲に骨形成が観察されたが、生体内では歯根膜様組織形成は観察されなかった。そこで、ハイドロキシアパタイト円柱(径1ミリ)上に生着させた1-11細胞株ならびに1-17細胞株を、ラット脛骨骨窩洞内に移植した結果、4週間後にアパタイト周囲に、これらの細胞株由来の骨様硬組織形成とその周囲に歯根膜様線維組織の形成が観察された。つぎに同ラットの上顎右側第1臼歯を抜歯して2週後、抜歯窩が治癒した部位に、細胞株が生着したアパタイトを埋入した。4週間後、埋入したアパタイト周囲に骨から伸張した歯根膜様線維組織の形成が認められた。以上より、ハイドロキシアパタイトと未分化な歯根膜細胞との移植によって歯根膜様組織を有した人工歯根を具現化可能な結果と手段が得られたと考えられる。DSPPが歯根膜幹細胞の分化に及ぼす影響に関する解析は、ペプチドの合成や条件設定などで期間を要したが顕著な結果が得られなかった。しかしながら、DSPP-GFPベクターの遺伝子導入によって修正対応ができたと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、DSPPを発現するヒト歯根膜幹細胞株の分化について研究を進める。また3次元培養が成功したHAP人工歯根の、免疫不全ラットへの移植によって、歯根膜組織形成能について検討する。さらにDSPP発現細胞による細胞シートを作製し、同様の実験を行い、歯根膜組織を有した人工歯根の作製実験を推進する計画である。
肥満関連腎臓病の発症基盤となる炎症応答におけるオートファジーの役割の解明

肥満関連腎臓病の発症要因となる腎組織における自然炎症応答の亢進には、自然免疫を担当するミエロイド系細胞のオートファジー障害が関与するとの仮説に則り、平成30年度はミエロイド系細胞特異的にオートファジー機能異常を来す遺伝子改変マウスでの解析を進めた。当該マウスに脂肪酸結合アルブミンを投与する尿細管障害モデルを解析した。組織化学観察から、当該マウスでは強く尿細管障害が惹起されることを確認している。また、当該マウスの尿と腎臓についてプロテオミクスを行い、複数の障害マーカーや自然免疫担当細胞が放出する複数の組織障害誘導因子の上昇を確認した。自然免疫担当細胞におけるオートファジーは、脂肪酸負荷による尿細管障害を和らげる役割を果たしていることを見出している。自然免疫担当細胞におけるオートファジーが自然免疫応答に及ぼす作用を、マウスから単離した腹腔マクロファージ(PEC)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)を用いた細胞レベル、および遺伝子改変マウスを用いた個体レベルの系を確立し、それぞれのレベルで実験が進行中である。申請時の作業仮説に加えて、これまで注目されていない新しいメカニズムが明らかになりつつある。令和元年度は、平成30年度の確立した細胞レベルおよび個体レベルの系を用いて、引き続き自然免疫担当細胞におけるオートファジーが自然免疫応答に及ぼす作用を検討する。さらに、プロテオミクスにより同定したタンパク質に着目し、オートファジー不全により当該炎症応答が亢進する原因を探る予定である。
致死性正中肉芽腫症における免疫学的、EBウイルス学的解析

本研究では本疾患18例について免疫学的およびEBウイルス学的研究を行った.表面形質の解析では18例全てがT細胞抗原(MT1またはCD2)が陽性であった.免疫遺伝子学的には検索した10例全てにT細胞受容体遺伝子の再構成が認められた.EBウイルス学的にはEBER-RNAが16例に検出され,EBNA1とlatent membrane proteinが検索した全例に証明された.さらにSouthern blot法にてEBV遺伝子のclonalityを検索したところ,検索した7例全てに単一のバンドが認められ,EBVゲノムのclonotypicな増殖が生じたことが示された.EBV陽性例では検索した9例全てがNK細胞のphenotypeであるCD56が陽性で,5例にδまたはγ鎖の再構成と発現が認められた.組織におけるICAM-1の発現を検索したところ,血管内浸潤部位(angiocentric region)に極めて強い発現が認められた.さらに血清中の可溶性ICAM-1値は他の頭頸部悪性リンパ腫に比較して有意に高値を示た.以上の成績から本症の多くはEBVがγδT細胞またはNK様T細胞に感染し,クローナルな増殖し,腫瘍化したものであることが証明された.さらに本疾患の転移や免疫能の低下に可溶性ICAM-1の高値が関与している可能性が考えられた.臨床的には早期から肺,皮膚および消化管に浸潤する例が多く,18例中14例が0.831ヶ月で死亡した.3年生存率は9.4%であり,他の頭頚部非ホジキンリンパ腫に比較して有意に生存率が低下していた.本研究では本疾患18例について免疫学的およびEBウイルス学的研究を行った.表面形質の解析では18例全てがT細胞抗原(MT1またはCD2)が陽性であった.免疫遺伝子学的には検索した10例全てにT細胞受容体遺伝子の再構成が認められた.EBウイルス学的にはEBER-RNAが16例に検出され,EBNA1とlatent membrane proteinが検索した全例に証明された.さらにSouthern blot法にてEBV遺伝子のclonalityを検索したところ,検索した7例全てに単一のバンドが認められ,EBVゲノムのclonotypicな増殖が生じたことが示された.EBV陽性例では検索した9例全てがNK細胞のphenotypeであるCD56が陽性で,5例にδまたはγ鎖の再構成と発現が認められた.組織におけるICAM-1の発現を検索したところ,血管内浸潤部位(angiocentric region)に極めて強い発現が認められた.さらに血清中の可溶性ICAM-1値は他の頭頸部悪性リンパ腫に比較して有意に高値を示た.以上の成績から本症の多くはEBVがγδT細胞またはNK様T細胞に感染し,クローナルな増殖し,腫瘍化したものであることが証明された.さらに本疾患の転移や免疫能の低下に可溶性ICAM-1の高値が関与している可能性が考えられた.臨床的には早期から肺,皮膚および消化管に浸潤する例が多く,18例中14例が0.831ヶ月で死亡した.3年生存率は9.4%であり,他の頭頚部非ホジキンリンパ腫に比較して有意に生存率が低下していた.本年度は進行性鼻壊疸組織のICAM1の発現と血清中の可溶性ICAM-1を測定し,他の頭頸部悪性リンパ腫と比較,検討した.組織内のICAM-1の発現強度はICAM1に特異的に反応する単クローン抗体を用いて免疫組織学的に反定量的(0+3)に同定した.進行性鼻壊疸10例と他の頭頸部悪性リンパ腫16例を比較すると,全ての症例の腫瘍細胞にもICAM-1の発現(+1+2)が認められたが,進行性鼻壊疸と他の悪性リンパ腫の間では差を認めなかった.しかしながら,進行性鼻壊疸組織の血管内浸潤部位(angiocentric region)ではICAM-1の極めて強い発現(+3)が認められた.血清中の可溶性ICAM-1をELISAにて測定したところ,進行性鼻壊疸患者では他のB細胞型およびT細胞型頭頸部悪性リンパ腫に比較して有意に高値を示していた.また,本年度に経験した進行性鼻壊疸2例についてもEBウイルス学的,免疫遺伝子学的解析を行った.phenotypeはいずれもCD2とCD56が陽性であった.GenotypeはT細胞受容体β鎖の再構成が2例共に,γ鎖とδ鎖の再構成がそれぞれ1例に認められた.さらに2例ともにEBER-RNAとEBNA1が陽性で,しかもクローナルなEBウイルス遺伝子の存在が証明された.本研究のまとめとしてその研究成果を2誌に投稿し,掲載予定となった.
超高輝度超新星の爆発機構を解明し、宇宙の初代星の超新星爆発との関係を探る

宇宙の初代星がどのような質量関数を持ち、どのような進化・爆発・元素合成をしたかを解明することは、現在の天文学の焦点の一つである。最近になって、発見され始めた超高輝度超新星(Superluminous Supenova)は、通常の重力崩壊型超新星の10-500倍という明るさを示しており、その母銀河が低金属量の銀河であることともあり、巨大質量の星の爆発が示唆されている。本研究では、未解決である超高輝度超新星の爆発機構、親星の質量範囲などを、光度曲線などのモデルから特定することを第一の目的とした。そして、その元素合成と極端な金属欠乏星の元素組成比を比較することによって、超高輝度超新星と初代星の関係があるか、大質量の連星ブラックホールの起源と関係するか、r-processとの関連はあるかという問いを解明することを第二の目的とした。30年度は、LIGO等による重力波の検出でその存在が明らかになった重いブラックホールの親星が初代星かもしれないという推測があることに鑑み、80-140太陽質量の星に着目した。この質量範囲の星が、電子対生成に起因する大規模な脈動を起こす過程のsimulationを行い、ヘリウム層のみならず炭素・酸素のコアの一部をも放出した後に重力崩壊することを確認した。このような放出による大量の星周物質が存在する環境での爆発計算を行い、超高輝度超新星になることを示した。同時に、重いブラックホールの質量の上限が50太陽質量程度であることを示した。また、この電子陽電子対生成脈動モデルを、その特異な振舞いで注目されているAT2018cowという超新星に適用し、説明可能という経過的な結果を得ている。実際の星の進化計算により、80 - 130 Msunの星の電子陽電子対生成脈動により大量の星周物質を形成することを示すことができ、LIGOによる重力波観測によって新たにもたらされたブラックホールの質量との比較が可能になったこにより、これまで推測による議論の多かった超高輝度超新星の起源やブラックホール形成の定量的な議論を、当初の計画以上に大きく前進させることができた。超高輝度超新星の光度形成の有力モデルの一つである、超強磁場を持つ中性子星「マグネター」の性質の解明に焦点をあてる。特異な超新星AT2018cowのX線放射との関連を調べる。より基本的な問題として、マグネターの電磁エネルギーがガスの熱・運動エネルギーに有効に転換されるかどうかは未解明のままなので、その基礎過程の研究を平行して進める。中性子星に関連した元素合成過程として、r-過程元素の合成の研究を推進する。これらが、矮小銀河の化学進化の理解の鍵となる。最近になって、発見され始めた超高輝度超新星(Superluminous Supernova)は、通常の重力崩壊型超新星の10-500倍という明るさを示しており、その母銀河が低金属量の銀河であることともあり、巨大質量の星の爆発が示唆されている。29年度は、超高輝度超新星の有力モデルの一つである「星周物質との衝突モデル」に対して光度曲線を計算し、水素のない超高輝度超新星の観測された光度曲線と詳細な比較を行った。まず、超新星の親星として、80 - 130 Msunの星を設定し、それが電子陽電子対生成脈動を起こして星周物質を形成する過程を計算した。その結果、この質量範囲の上限130 Msunに近い場合、10 - 30Msunという大量の星周物質が形成されるという結果が得られた。このような大量の星周物質に対する超新星の衝突を計算し、光度曲線をよく説明できることを見出した。特に観測された紫外線の増光がよく説明できる。超高輝度超新星の光度曲線が、大量の星周物質があれば、星周物質との衝突モデルによって説明できることを理論計算によって明らかにできたこと、そのような大量の星周物質が実際に80 - 130 Msunの星の電子陽電子対生成脈動により形成されることが計算できたことにより、これまで推測による議論の多かった超高輝度超新星の起源の定量的な議論を、当初の計画以上に大きく前進させることができた。

30年度は、LIGO等による重力波の検出でその存在が明らかになった重いブラックホールの親星が初代星かもしれないという推測があることに鑑み、80-140太陽質量の星に着目した。この質量範囲の星が、電子対生成に起因する大規模な脈動を起こす過程のsimulationを行い、ヘリウム層のみならず炭素・酸素のコアの一部をも放出した後に重力崩壊することを確認した。このような放出による大量の星周物質が存在する環境での爆発計算を行い、超高輝度超新星になることを示した。同時に、重いブラックホールの質量の上限が50太陽質量程度であることを示した。また、この電子陽電子対生成脈動モデルを、その特異な振舞いで注目されているAT2018cowという超新星に適用し、説明可能という経過的な結果を得ている。実際の星の進化計算により、80 - 130 Msunの星の電子陽電子対生成脈動により大量の星周物質を形成することを示すことができ、LIGOによる重力波観測によって新たにもたらされたブラックホールの質量との比較が可能になったこにより、これまで推測による議論の多かった超高輝度超新星の起源やブラックホール形成の定量的な議論を、当初の計画以上に大きく前進させることができた。超高輝度超新星の光度形成の機構として、超強磁場を持つ中性子星「マグネター」も有力モデルの一つである。紫外線の増光が説明できるかどうかを調べる。より基本的には、マグネターの電磁エネルギーがガスの熱・運動エネルギーに有効に転換されるかどうかは未解明のままなので、その基礎過程の研究を進める。中性子星に関連した元素合成過程として、r-過程元素の合成の研究を推進する。これが、矮小銀河の化学進化の理解の鍵となる。超高輝度超新星の光度形成の有力モデルの一つである、超強磁場を持つ中性子星「マグネター」の性質の解明に焦点をあてる。特異な超新星AT2018cowのX線放射との関連を調べる。より基本的な問題として、マグネターの電磁エネルギーがガスの熱・運動エネルギーに有効に転換されるかどうかは未解明のままなので、その基礎過程の研究を平行して進める。これらが、矮小銀河の化学進化の理解の鍵となる。理由:本年度は既存の計算機が活用できたが、次年度はさらに大規模なモデル計算を必要とするので、計算機を増強する必要がある。また本年度の招待講演の旅費は主催者負担であったが、次年度は、本年度に得られた結果を、より多くの国際会議で発表するための旅費を必要とする。使用計画:モデル計算を拡大するために、計算機を購入する。本年度に得られた結果を、国際会議で発表し、新たな情報を得る。そのための国外旅費を使用する。理由:次年度もモデル計算を必要とするので、計算機の増強とデータ処理のための謝金がが必要となる。また、本年度に得られた結果を、次年度に国際会議で発表するための旅費を必要とする。使用計画:モデル計算を拡大するために、計算機を購入し計算処理のための謝金を支払う。
細胞外マトリックスを標的とした新しいバイオターゲティング技術の開発とその応用

様々な機能蛋白質を細胞表層の細胞外マトリックスにターゲティングため、フィブロネクチンの自己会合ドメインを利用した新しい方法の開発を行った。具体的には、ターゲティングする蛋白質として細胞増殖因子TGFα(transforming growth factor α)を選び、これをフィブロネタチンの自己会合に必要なN末端70kD領域とC末端37kD領域の間に挿入したキメラ蛋白質(以下TGF-miniFNと記載)を遺伝子工学の手法を用いて作成した。キメラ蛋白質は組換え遺伝子を導入したハムスター由来CHO細胞の培養上清より調製した。得られたTGF-miniFNは、細胞表面のフィブロネタチンマトリックスへの自己組織化能を保持しているとともに、TGFαのもつ細胞増殖刺激活性、細胞遊走促進活性、細胞形質転換活性を保持していた。さらにTGF-miniFNとインタクトなTGFαとの生理活性を比較検討した結果、キメラ蛋白質はインタクトなTGFαに比べ、低濃度での細胞形質転換活性が有意に亢進していることを見いだした。これはキメラ蛋白質が細胞表層に不溶化・濃縮された結果と考えられる。細胞表層組織化型の増殖因子の有用性をさらに検討するため、家兎角膜の創傷治癒モデルを用いて両者の治癒促進活性を比較検討した。その結果、1日2回、1μMのキメラ蛋白質あるいはインタクトTGFαの点眼を行った場合、インタクトTGFαではほとんど治癒促進が認められなかったが、キメラ蛋白質を点眼した場合は有意な治癒の促進が観察された。以上の結果は、細胞外マトリックス自己組織化型の増殖因子が創傷の治癒促進に有用であることを示している。
光化学とリポソーム技術を融合した抗癌剤ドキシフルリジン放出剤の構築と能力評価

癌の化学療法は有効であるが、多くの場合正常組織への攻撃に伴う副作用を生じる。この問題を最小化するために、ドキシフルリジン(DF)を光化学的に放出する分子の構築を行った。光反応は照射条件を制御することで、望む時間と位置で反応を誘起することができる。またDFは癌細胞内で高発現される酵素によって抗癌剤へと変換される薬剤である。従って、このような光反応とDFの性質を融合することで劇的な副作用の軽減化が期待される。本研究では、ニトロキノリル基を有する新規光DF放出剤を合成し、それらの光反応性を定評のあるニトロベンジル保護基を有する放出剤と比較した。更に細胞への導入実験を行い光照射に伴う致死効果を調べた。5-フルオロウラシル(5-FU)は代表的な代謝拮抗剤であり、抗癌剤として利用されている。また、そのプロドラッグであるドキシフルリジン(DF)は、癌細胞内で活性な酵素により5-FUへと変換され、抗癌剤としての効果を発揮する。しかし、その癌細胞選択性は完全なものではなく、少なからず正常細胞への攻撃に伴う副作用を生じる。本研究では、DFを光化学的に発生できる新規な分子を設計・合成し、その光反応の効率を溶液中および細胞中で詳細に調べることで、抗癌剤の投与を時間的・空間的に制御できる分子を構築することを目的としている。これまでに、まずニトロキノリル骨格を有する新しい光DF放出剤(1)の合成ルートおよび反応条件を検討し、20%程度のトータル収率での合成を達成した。また、比較物質として代表的な光分解性保護基であるニトロベンジル基(2)およびそこにメトキシ基やクロロ基を導入した放出剤も合成した。合成した各種DF放出剤について、溶液中での光反応を高速液体クロマトグラフィーおよび積算光量計を用いて追跡し、光を吸収する能力Aおよび吸収した光量に対するDFの放出量Bを求めることで、DFを放出する能力(A×B)を算出した。その結果、新規DF放出剤1は2に比べて16倍程度の能力を有することが分った。また、反応機構と骨格の立体構造の違いから考察したところ、放出能力はメチレン水素とDFのカルボニル酸素間のCH/O相互作用によって影響されることが示された。なお、この光反応では購入した液体クロマトグラフィー用データ取込解析装置がその威力を発揮し、再現性と信頼性の高い結果を得ることが可能となった。また、ニトロキノリル骨格に細胞内導入率と細胞内滞留性の向上が期待されるアセトキシメチル基を連結した分子の合成も行った。リポソーム化についてはレシチンを購入し、超音波処理法による封入条件の検討を現在行っている。癌治療において薬剤を用いる化学療法は有効であるが、多くの場合正常組織への攻撃に伴う副作用を生じる。この副作用の問題を最小化するために、プロドラッグ技術と光化学を融合した新しい戦略を探索することを目的とした研究を展開した。プロドラッグとは、癌細胞内で高発現される酵素によって抗癌剤へと変換される薬剤である。代表的なものとしてドキシフルリジン(DF)があるが、細胞選択制は完全なものではない。しかし、これらを光照射により放出の場所を制御できれば劇的な副作用の軽減化を期待できる。本研究では、種々の光DF放出剤を設計・合成し、それらの光反応効率を調べ、さらに細胞への導入実験も行った。溶液中の光反応では、新規に合成した光分解性ニトロキノリル基を有する光DF放出剤(1)が、代表的な光分解性保護基であるニトロベンジル基を持つ放出剤(2)よりも極めて高い量子収率で分解し、DFを放出できることが判明した。また、励起光の吸収量と量子収率の積で見積もられるDF放出能力を比較したところ、1は2の約20倍であり、優れた放出剤であることがわかった。量子収率に差を与える要因を光反応機構と分子構造の観点から議論したところ、立体効果によりメチレン連結部位の回転運動が抑制されると、ニトロ基酸素へのメチレン水素の移動が容易になり、量子収率の向上を招くと推察された。続いて、1とそのアセトキシメチル置換体の生細胞への導入実験を行った。それぞれの分子を含む培地で細胞培養しHPLCおよびMSを用いて分析したところ、後者でのみ細胞膜透過性を示すことがわかった。その際、細胞内エステラーゼにより加水分解を受け、アセトキシメチル基からカルボキシ基へと変換された構造で滞留していた。また、この細胞への光照射を行ったところ、DFの放出とそれに起因すると考えられる細胞死も観測された。

有機光化学現在のところ、リポソーム化は達成できていないものの、新規DF放出剤の合成が達成され、更にそのDF放出能力が、よく用いられる光分解性保護を有する分子と比較して極めて高い値を有することが分った。また、クリーンベンチ等の設備を整えると共に、申請者および修士課程学生が細胞培養に関する講習を受け、DF放出剤の細胞内導入実験を行うための準備が出来ている。薬物の取込に関する研究において実績のあるヒト臍帯静脈内皮細胞等を用いて、細胞内導入実験を行う。方法としては、培養細胞にDF放出剤の溶液(ジメチルスルホキシドー水混合溶液)を添加し、一定時間後にwash outと界面活性剤による細胞破壊を行い、その混合溶液を高速液体クロマトグラフィーで分析をすることで細胞内導入率と滞留性を評価する。導入を確認した後、光照射下および未照射下でのDF放出率や細胞毒性をTrypan Blue染色ー計数法で調べる。細胞死が観測された場合、それが光化学的に放出された抗癌剤(DF or 5-FU)によるものか、あるいは脱離したキノリル基の断片(副生成物)によるものかを明確にするために、生体に害のないウラシルを放出する分子を合成し、同様の細胞内実験を行うことで検証する。光反応および光分解性保護基に関する情報の収集を目的として、「反応中間体および異常分子の国際会議(平成26年度4月1日)」に出席するための旅費とするために次年度に繰り越しさせていただいた。また、平成26年度以降に本格的に行う細胞内導入実験のための細胞の購入費用に一部あてるつもりであったが、細胞の選択を十分検討するために、次年度に繰り越しさせていただいた。上記の(理由)に記述した通り、「反応中間体および異常分子の国際会議」への旅費および細胞内導入実験に用いる細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞など)の購入に使用する。
Entamoeba gingivalisの特異的検出法の確立とその応用

プラーク中の歯肉アメーバEntamoeba gingivalisをPCR法により特異的に検出するシステムを開発するため,以下の実験を行った.Entamoeba gingivalis ATCC30927株,ATCC30928株のSrRNA遺伝子の塩基配列と既報の近縁真核生物や真菌のそれらとをコンピューターを用いて比較し,歯肉アメーバに特異的と考えられる配列を見いだして,1対のPCR用プライマーを設計・合成した.PCRの条件は,熱変性94°C,1分,アニーリング60°C,1分,伸長反応72°C,1分を1サイクルとし,これを40サイクル行い,設計したプライマーを用いて,PCRを行ったところ,歯肉アメーバ由来の精製DNAからのみ特異的に,約1.4kbのPCR産物が得られた.近縁の原虫,口腔内の原虫・真菌・細菌,ヒト白血球由来の精製DNAからは,増幅産物が認められなかった.熱処理とクロロホルム処理から得られた粗DNA抽出物を鋳型として用い,PCRを行ったところ,約20コの歯肉アメーバ細胞がPCR反応液中に存在していれば,確実に検出できた.又,歯周秒患者の縁下プラークから,歯肉アメーバ特異的なPCR産物が得られ,プラーク中の歯肉アメーバも同様に,直接検出可能であった.今回,歯肉アメーバのSrRNA遺伝子の可変領域の塩基配列をもとにPCRプライマーを設計し,歯肉アメーバの同定,検出報を確立した.このPCR法の主な利点は,特に熟練した技術を必要とすることもなく,簡易で,迅速に,口腔内の歯肉アメーバを同定・検出できることである.歯周組織の微生物叢は,非常に複雑であり,これらの多くは,まだ正確に報告されていない.特に,原虫は細菌と違って分離が難しく,見落とされがちである.今回の検出法は,ヒト口腔内における歯肉アメーバの疫学的解析,口腔疾患との関わりを解明する手段の一つとして応用できると考えられる.プラーク中の歯肉アメーバEntamoeba gingivalisをPCR法により特異的に検出するシステムを開発するため,以下の実験を行った.Entamoeba gingivalis ATCC30927株,ATCC30928株のSrRNA遺伝子の塩基配列と既報の近縁真核生物や真菌のそれらとをコンピューターを用いて比較し,歯肉アメーバに特異的と考えられる配列を見いだして,1対のPCR用プライマーを設計・合成した.PCRの条件は,熱変性94°C,1分,アニーリング60°C,1分,伸長反応72°C,1分を1サイクルとし,これを40サイクル行い,設計したプライマーを用いて,PCRを行ったところ,歯肉アメーバ由来の精製DNAからのみ特異的に,約1.4kbのPCR産物が得られた.近縁の原虫,口腔内の原虫・真菌・細菌,ヒト白血球由来の精製DNAからは,増幅産物が認められなかった.熱処理とクロロホルム処理から得られた粗DNA抽出物を鋳型として用い,PCRを行ったところ,約20コの歯肉アメーバ細胞がPCR反応液中に存在していれば,確実に検出できた.又,歯周秒患者の縁下プラークから,歯肉アメーバ特異的なPCR産物が得られ,プラーク中の歯肉アメーバも同様に,直接検出可能であった.今回,歯肉アメーバのSrRNA遺伝子の可変領域の塩基配列をもとにPCRプライマーを設計し,歯肉アメーバの同定,検出報を確立した.このPCR法の主な利点は,特に熟練した技術を必要とすることもなく,簡易で,迅速に,口腔内の歯肉アメーバを同定・検出できることである.歯周組織の微生物叢は,非常に複雑であり,これらの多くは,まだ正確に報告されていない.特に,原虫は細菌と違って分離が難しく,見落とされがちである.今回の検出法は,ヒト口腔内における歯肉アメーバの疫学的解析,口腔疾患との関わりを解明する手段の一つとして応用できると考えられる.
全固体式真空紫外レーザーの実現

二次高調波結晶、アップコンバージョン結晶等による固体式真空紫外レーザーダイオード実現のため、III族窒化物半導体レーザーダイオードの高性能化について検討した。AlInNはInNモル分率0.17でGaNと格子整合するため、新しいヘテロ接合用混晶として有望である。本研究では、組成の異なるAlInNをGaN上に成長し、格子整合する付近でモザイク性が最も減少し、高い結晶品質を有するAlInNの成長が可能であることをはじめて見出した。また、同混晶系からの室温でのフォトルミネッセンスを始めて観測した。活性層として用いられるGaInNの組成とバンド構造の関係を変調反射分光法を用いて精密に測定した。III族窒化物半導体レーザーダイオードは、通常サファイア上に作製されており、壁開性がないため、他の化合物半導体と同様の方法では共振器ミラー面を作製することは出来ない。本研究では、集束イオンビーム(FIB)加工装置を用いて共振器ミラーの作製を行った。その結果、FIBは有用であり、またミラー同士の回転角依存性やあおり角依存性に関して、新たな知見を得ることが出来た。また従来、光閉じ込め不足によるビームの多峰性が大きな問題であったが、AlGaNn型導電層を用いた新しい構造により単峰性ビームを実現した。現在、高出力化について検討を進めている。更に、二次高調波結晶やアップコンバージョン結晶とのカップリングについては今後の課題である。現在、研究室レベルで実現可能な真空紫外域(波長200nm以下)のコヒーレント光源(レーザー)は、ArFか、またはArClなどの気体エキシマーレーザーのみであり、しかもパルス動作である。本研究では、本申請者等が開発したIII-V族窒化物半導体を用いた紫外レーザーダイオードを励起光として、二次高調波発生結晶やアップコンバージョン結晶を用いて、コヒーレント真空紫外光(188nm)、しかも連続光を得る事を目的とする。III族窒化物半導体によるレーザーダイオードは、現在ではまだ安定して作製できるとは言い難い。そこで本年度は、励起光源としてのハイパワーIII族窒化物レーザーダイオードの作製について検討を行った。その結果、1.リッジ導波型とする事により、比較的安定してレーザーダイオードの作製が可能であること、2.放熱の工夫により、長パルス化が可能である事、3.共振器ミラー面の作製にFIB加工を施す事により、低閾値化が図られる事などを見出した。
ドーパはグルタミン酸遊離-神経細胞死の上流因子か? ドーパ新競合的拮抗薬の保護作用

[1]ラット線条体微量透析ドーパのグルタミン酸遊離:(1)ドーパ1-100nMの用量依存性グルタミン酸遊離増大,(2)6-OHDAi.v.t.処置パーキンソン病モデルにおけるドーパ10nMの同感作作用を再検討したが,確認に至らず,切片でみられた100-300μMドーパの同遊離増大の確認に止まった.(3)6-OHDA内側前脳束投与は,ドパミン(DA)を著減したが,nM用量ドーパのグルタミン酸遊離を確認できず(分担三須).[2]胎仔線条体神経培養系ドーパ自体による神経細胞死:(1)10日培養系における,ドーパ100μMによる立体特異性,NMDA-拮抗薬MK-801,非-NMDA-拮抗薬CNQX-感受性の神経細胞死は,(2)24時間インキュベーション時,Mg^<2+>,TTX添加,Ca^<2+>除去により保護され,ある種伝達物質神経性遊離を示唆しドーパ100-300μMはグルタミン酸を遊離した.(3)同遊離は強力,比較的安定な新競合的ドーパ拮抗薬DOPAcyclohexyl ester(CHE)300μMにより拮抗された(五嶋,佐々木).[3]4血管閉塞脳虚血線条体微量透析系と再交通後病理検索:(1)10分間虚血は,ドーパをDA,グルタミン酸と共に誘発,虚血後10分の各最大遊離は6,220,8倍,各増大は虚血60分後に回復.(2)再交通24時間後,線条体,海馬は神経細胞死を示さず.(3)再交通96時間後,遅発性神経細胞死は線条体軽度中等度,海馬の場合重度.(4)虚血開始10分前のAADC阻害薬NSD-1015 30μM線条体内灌流は,虚血によるドーパ遊離を著増(虚血後10分,50倍),DA遊離を減少傾向(160倍),グルタミン酸遊離を増大(22倍),線条体遅発性神経細胞死を増悪.(5)CHE10,30,100nM線条体内灌流は,虚血によるDA遊離を無修飾,用量依存性にグルタミン酸遊離に拮抗(最大80%抑制),同神経細胞死を保護.(6)CHE100nMは脳温を低下せず.(7)CHE0.1-1μM後灌流の作用を検討中.(8)両薬物は海馬神経細胞死に影響せず.(9)CHE i.p.3-100mg/kg投与は神経細胞死を保護せず(宮前,古川).[1]ラット線条体微量透析ドーパのグルタミン酸遊離:(1)ドーパ1-100nMの用量依存性グルタミン酸遊離増大,(2)6-OHDAi.v.t.処置パーキンソン病モデルにおけるドーパ10nMの同感作作用を再検討したが,確認に至らず,切片でみられた100-300μMドーパの同遊離増大の確認に止まった.(3)6-OHDA内側前脳束投与は,ドパミン(DA)を著減したが,nM用量ドーパのグルタミン酸遊離を確認できず(分担三須).[2]胎仔線条体神経培養系ドーパ自体による神経細胞死:(1)10日培養系における,ドーパ100μMによる立体特異性,NMDA-拮抗薬MK-801,非-NMDA-拮抗薬CNQX-感受性の神経細胞死は,(2)24時間インキュベーション時,Mg^<2+>,TTX添加,Ca^<2+>除去により保護され,ある種伝達物質神経性遊離を示唆しドーパ100-300μMはグルタミン酸を遊離した.(3)同遊離は強力,比較的安定な新競合的ドーパ拮抗薬DOPAcyclohexyl ester(CHE)300μMにより拮抗された(五嶋,佐々木).[3]4血管閉塞脳虚血線条体微量透析系と再交通後病理検索:(1)10分間虚血は,ドーパをDA,グルタミン酸と共に誘発,虚血後10分の各最大遊離は6,220,8倍,各増大は虚血60分後に回復.(2)再交通24時間後,線条体,海馬は神経細胞死を示さず.(3)再交通96時間後,遅発性神経細胞死は線条体軽度中等度,海馬の場合重度.(4)虚血開始10分前のAADC阻害薬NSD-1015 30μM線条体内灌流は,虚血によるドーパ遊離を著増(虚血後10分,50倍),DA遊離を減少傾向(160倍),グルタミン酸遊離を増大(22倍),線条体遅発性神経細胞死を増悪.(5)CHE10,30,100nM線条体内灌流は,虚血によるDA遊離を無修飾,用量依存性にグルタミン酸遊離に拮抗(最大80%抑制),同神経細胞死を保護.(6)CHE100nMは脳温を低下せず.

(7)CHE0.1-1μM後灌流の作用を検討中.(8)両薬物は海馬神経細胞死に影響せず.(9)CHE i.p.3-100mg/kg投与は神経細胞死を保護せず(宮前,古川).
ＭＨＣクラスＩ分子を介したヘルペスウイルス細胞内侵入機構の解明

細胞表面に発現するウマ主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIがウマヘルペスウイルス4型(EHV-4)のエンベロープ糖タンパクgDと結合し、EHV-4の細胞内侵入を誘導するレセプターであることを明らかにした。また、ウマMHCクラスIを標的とする感染阻害法がウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)とEHV-4両ウイルス感染を同時に阻害することを明らかにした。加えて、ウサギMHCクラスIのEHV-1レセプター機能を解析し、ウマ培養細胞とウサギ培養細胞におけるEHV-1感染機構の違いについて考察した。本年度は、EHV-4糖タンパク質glycoprotein D (gD)の可溶化組換えタンパク質の作製を行った。作製したEHV-4 gD組換えタンパク質がウマMHCクラスI分子発現細胞に特異的に結合することをフローサイトメトリーにより確認した。この結果から、MHCクラスI分子のリガンドとして新たにEHV-4 gDが同定された。次に、MHCクラスI分子のリガンドであるgDの結合領域を探索する目的で、遺伝子工学的手法を用いてgDの部分欠失変異体を複数種類作製し、各変異体を細胞に導入、発現させ、可溶化組換えウマMHCクラスIタンパク質の結合をフローサイトメトリー法により評価した。しかし、作製した全ての欠失変異体が可溶化組換えウマMHCクラスIタンパク質との結合を示さなかった。また、一部の欠失変異体は細胞表面に発現せず、変異体の作製法等の見直しが必要と考えられた。また、感染細胞に緑色蛍光蛋白質であるGFPを発現するEHV-4レポーターウイルス(EHV-4 GFP)を使用して、各種培養細胞に対するEHV-4の感染性とMHCクラスI分子のEHV-4レセプター機能を解析した。他の研究グループからEHV-4はウサギ腎臓由来培養細胞株RK13の細胞内に侵入できず感染が成立しないことが報告されている。しかし、EHV-4 GFPをRK13細胞に接種したところ細胞はGFP陽性を示し、過去の報告と異なりEHV-4はRK13細胞に感染することが明らかとなった。また、EHV-4非感染細胞であるハムスター卵巣由来CHO細胞にウサギMHCクラスI分子を発現させると、細胞はEHV-4感受性を示した。これらの結果からEHV-4はウサギMHCクラスI分子をレセプターとしてRK13細胞に感染することが示唆された。本研究では、馬鼻肺炎の原因ウイルスであるウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)とウマヘルペスウイルス4型(EHV-4)のMHCクラスI分子を介した細胞内侵入機構を明らかにし、得られた基礎的知見に基づいて新たなウイルス感染症阻害法の開発を試みる。まず、ウマMHCクラスI分子が有するウイルスレセプター機能について解析を行った。ウマMHCクラスI分子のEHV-4レセプター機能を解析するため、EHV-4感受性であるウマ真皮由来E.Derm細胞におけるMHCクラスI分子の細胞表面発現をshRNA導入により抑制したところ、細胞のEHV-4感受性が顕著に減少した。したがって、EHV-1同様、EHV-4のE.Derm細胞内侵入にウマMHCクラスI分子が重要な機能を担っていることが明らかになった。EHV-4 gDとMHCクラスI分子の結合を確認するため、組換えEHV-4 gDタンパク質の作製を開始している。つぎに、ウサギMHCクラスI分子が有するウイルスレセプター機能について解析を行った。ウサギ腎臓由来RK13細胞へのEHV-1感染におけるMHCクラスI分子の関与を検討するため、ウサギMHCクラスI分子をクローニングし、EHV-1非感受性NIH3T3細胞に発現させたところ、細胞はEHV-1感受性を示した。また、ウサギMHCクラスI分子と組換えEHV-1 gDタンパク質の結合をフローサイトメトリーにより確認した。従って、ウサギMHCクラスI分子もEHV-1レセプターとして機能することが明らかとなった。本年度は昨年度に作製した可溶化EHV-4 gD組換えタンパク質(sgD4)と可溶化EHV-1 gD組換えタンパク質(sgD1)を用いて、EHV-1とEHV-4の細胞内侵入機構に関して更なる解析を実施した。ウマ培養細胞株E.Dermでは、sgD1またはsgD4の前処理によりEHV-1とEHV-4の細胞内侵入が阻害された。したがって、EHV-1とEHV-4は共通のレセプター分子を介してE.Derm細胞内に侵入することが判明した。一方、ウサギ培養細胞株RK13とチャイニーズハムスター培養細胞株CHO-K1ではsgD1はEHV-1の細胞内侵入を阻害したものの、sgD4はEHV-1の細胞内侵入を阻害せず、これらの細胞におけるEHV-1独自の細胞内侵入機構の存在が示唆された。昨年度までにウサギMHCクラスI遺伝子クローンA31がウマMHCクラスI遺伝子クローンA