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農家の家族関係の近代化と農業経営発展との関係解明

農家の家族関係が家父長的な性格から平等主義的な関係になるのに伴い、農業経営における女性の意思決定への参画が進み、責任分担が促進される傾向にあること、その結果、農業経営の多角化が進み、経営改善にプラスに働くことが明らかになった。韓国では、日本と非常に似通った状況が見られたが、オーストラリアでは、大規模化や機械化等の進展のため、女性の農業生産への関与は一般に小さく、家族関係の近代化と経営発展との関連を見いだすことができなかった。政策的支援としては、家族経営協定の推進や経営多角化を推進により多角化部門の担い手として女性を位置づけることが有効である。日本における女性の位置づけと農業経営発展との関係に関する実態調査については、家族社会学や一般組織論の枠組みを援用しつつ、家族構成員のライフコースと経営の展開過程について、経営内の(1)意思決定、(2)役割分担、(3)経営成果の配分、(4)経営資源の帰属の4つの要素に着目し、大規模稲作複合経営等を対象としてケーススタディを試みた。その結果、4つの要素のうち、特に(1)と(2)において、意思決定における経営主の妻の参画が進み、責任分担が確立されると、経営改善にプラスに働くことが把握された。今後、策定したフレームワークの改良を図り、ケーススタディの数を増やして検証を行いつつ、女性の位置づけの改善が経営発展に寄与するメカニズムや条件の解明が必要とされる。海外諸外国における女性農業者に関する法制度等政策的支援に関する情報収集および女性の位置づけと経営発展に関する実態把握については、オーストラリアと韓国を対象として実施した。ともに女性農業者の位置づけについては日本同様問題とされ、改善に向けた政策的支援が試みられているが、オーストラリアでは、代表的な作目の畜産や畑作経営の場合、大規模化や機械化等の進展に伴い女性の農業生産への関与は一般に小さく、パートナーシップ契約の締結等は女性の財産権等の確立には寄与するが、経営発展との関連については見いだすことができなかった。これに対して、韓国においては、農業をめぐる状況は日本と近く、女性の農業生産への関与も大きい。そのため、女性の位置づけの改善が経営改善にプラスに働く可能性が指摘できる。韓国では、政策的支援として日本の家族経営協定の推進に取り組みはじめており、大変注目される。しかし、ここで得られた知見は、資料や専門家から得た間接的なものやきわめて少数のケーススダディから導き出されたものであり、今後、慎重な検証が必要とされる。インテンシブなケーススダディの結果、日本に於いて家族経営協定の締結により経営内で女性の位置づけの明確化を図っている専業的農業経営では、協定締結のプロセスで経営内のコミュニケーションが十分に図られているか否かと家族における協定に関する理解度が高いか否かにより経営内の女性の位置つげの明確化のあり様が大きく異なり、その規定要因としては家族関係、特に経営主世代の夫婦関係がフラットであるか否か方が大きいことが示唆された。また、認定農業者の共同申請については、一般的に、家族経営協定の締結よりハードルが高いと農家には意識されており、共同申請に関する理解度が高い場合、経営内における女性の位置づけの改善効果は高く、経営発展につながりやすいことが示唆された。韓国においては、日本同様、経営形態の太宗を占める家族経営において、家族関係の近代化、特に経営内における女性の位置づけの改善は課題とされており、ケーススタディの結果、家族経営協定の締結や経営における加工・直売・農業体験部門の女性の責任分担の推進により、女性の位置づけの改善が女性の意欲の増大、さらには経営の多角化につながり、経営改善にプラスに働くことが示唆された。家族経営協定の締結や経営における女性の責任分担は、家族関係、特に経営主世代の夫婦関係がフラットであることであるか否かが大きいことが示唆され、日本との類似性が大きいことが推測された。経営類型による比較分析では、水稲作など土地利用型よりも園芸作など集約型で女性の位置づけが明確であり、責任分担が多く見られ、その結果として経営の多角化が晋傾向が見られたが、経営類型以上に、家族関係、特に経営主世代の夫婦関係がフラットか否かにより、女性の位置付けの明確化や責任分担が見られ、経営の多角化が進むことがわかった。家族関係の近代化と経営発展に関する公的支援については、主として農村女性対策のセクションで取り組まれてきたが、特に、1992年に農林水産省において農山漁村に関する中長期ビジョンが策定され、女性が農業・農業の担い手として農政で位置付けられ、家族経営協定の推進などにより女性の位置づけの明確化や経営参画などが進められるようになって本格化したといえる。そうした中で、家族経営協定の推進は専業的家族の烏業経営の家族関係の近代化と経営発展に寄与してきたといえる。しかし、家族経営協定の普及は先進的農業経営にとどまる傾向があり、また、家族経営協定の推進による効果の測定が難しいことなどの問題点を抱えていることが明らかになった。

韓国においては、日本同様、農村女性対策のセクションで家族関係の近代化と経営発展に関する公的支援について取り組まれてきた。そうした中で、家族経営協定の推進も実施されているが、それ以上に、6次産業化など、加工・販売や農業・農村体験などの農業経営への組み込みによる経営多角化の推進の中で、多角化部門の新たな担い手として女性を位置付け、そうした中で女性の位置づけの明確化や家族関係の近代化が推進されており、注目に値するといえる。
東アジアにおける地方財政制度の比較法学的研究-国・地方関係の憲法規律の視角から

地方財政制度は、住民の身近なところで地方が自治的に担うのに相応しい「事務・事業」によって設計されなければならない。このことは、地方自治が、基本的人権の発展と民主主義の成熟度の「要」になってきた先進国イギリスの「憲法」経験に基づいている。日本や台湾および韓国のような「単一国家における地方自治」のあり方に、この「法理」が通底していることを確認できたことが、本研究の成果である。また、規模から見て「連邦国家」に近い中国での有用性の課題が見えてきたことも、本研究の成果の一つである。本年度は、まず、前年度からすでに開始していた予備的研究ともいいうべき研究の整理と検討視角および対象の確定作業を先行させ、次に、同時並行的に、研究課題にかかわり、現地調査およびヒアリング調査を行った。当初、主には、中国と台湾の地方自治制度および地方財政制度の現地調査およびヒアリング調査(いずれも資料等収集も兼ねる)を予定していたが、研究補助者を通した関係機関等との折衝の結果、韓国についても実施することができた。その代わり、ヒアリング調査先の韓国法制研究院において、研究課題にかかわる報告を研究員スタッフ(財政法部会)のために行った(研究発表参照)。地方財政制度のあり方は、地方が自治的に担うのに相応しい事務・事業と担うべき事務・事業の「憲法規律(基本的人権保障のための統治機構の規律)」の究明によってしか(憲)法的には制度設計が不可能である、というのがこれまでの研究方法・視角であった。したがって、調査方法としては、この視角を具体的な共通のヒアリング調査項目として作成し、共通課題の把握に努めるとともに、各国の独自性や特色の把握を試みた。調査結果の分析は現在進行中で結論を得るにいたっていないが、東アジア諸国における「地方自治」と地方財政制度のありかたが、中国や日本も含めて総じて人権水準の向上とそのための協同(共同)および相互援助の基盤形成に不可欠であることの一端を再発見している。とくに、日本よりさらに(人口と面積において)小規模な国家である台湾でも、このことへの立法府と国民の関心が高まっている。たとえば、イギリスに見られるブロック・グラントのような地方向けの一般補助金制度が民進党政府によって導入されていることは興味深く、国民党に取って代わられた政府がどう対応するのかを観察してゆきたい。(1)本年度は、主要には、昨年度に行った中国、台湾および韓国の地方自治制度および地方財政制度の現地調査およびヒアリング調査の結果の分析作業を行った。くり返し言及してきたが、地方財政制度のあり方は、地方が自治的に担うのに相応しい事務・事業と担うべき事務・事業の「憲法規律(基本的人権保障のための統治機構の規律)」の究明によってしか(憲)法的には制度設計が不可能である、というのがこれまでの研究方法・視角であった。共通の課題を持つこれらの近隣東アジア諸国における地方財政制度の、「国・地方関係の憲法規律の視角から」する分析と比較研究を継続した。(2)昨年度の中国での現地調査およびヒアリング調査は、北京および上海で実施したものであり、都市部の地方政府を対象にした。中国の現況を見れば理解できるように、改革開放政策の展開によって都市部と農村部の間には、住民の所得および地方政府の財政規模でも目に見える格差がある。また、単一国家における地方自治制度を採る日本、韓国および台湾と異なり、中国は人口や面積の点で連邦国家に近い。そのために、本年度は中国の農村部の地方政府の現地調査およびヒアリング調査を計画し、調査対象地域の候補として、南部の四川省成都または雲南省昆明を予定したが、いわゆる四川大地震のため調査の条件が整わなかったので断念した。最終年度の21年度に実施したい。(3)なお、平成19年度の実績報告書にも記載したが、韓国では大統領が交代し、また、台湾では民進党から国民党への政権交代が実現した。そのため、地方財政制度のありうる改革の「動向」や「理論状況」について、追加的なヒアリング調査、および、新たに研究者や実務家(主に行政裁判所や憲法裁判所の裁判官)と、予め送付した課題にかかわるアンケートを基に意見交換を両国で実施した。(1)最終年度にあたる本年度は、昨年度までに行った中国、台湾および韓国の地方自治制度および地方財政制度の現地調査およびヒアリング調査の結果の分析作業を行った。地方財政制度のあり方は、地方が自治的に担うのに相応しい事務・事業と担うべき事務・事業の「憲法規律(基本的人権保障のための統治機構の規律)」の究明によってしか(憲)法的には制度設計が不可能である、という研究方法・視角から本研究課題を追究してきた。上記研究方法と視角の有用性は、少なくとも台湾と韓国についてはほぼ確認することができた。基本的人権の発展と民主主義の成熟度が相互に浸透・規定しあう「要」に位置づけうる地方自治の母国イギリスの「憲法」経験は、日本や台湾および韓国のような「単一国家における地方自治」のありかたにも通底してくる。

その意味から、これらの近隣東アジア諸国における地方財政制度に限定せず、「多面的」な比較研究の「視座」が確立できた。(2)一昨年度の中国での現地調査およびヒアリング調査は、北京および上海で実施したものであり、都市部の地方政府を対象にした。中国の現況を見れば理解できるように、改革開放政策の展開によって都市部と農村部の間には、住民の所得および地方政府の財政規模でも目に見える格差がある。また、単一国家における地方自治制度を採る日本、韓国および台湾と異なり、中国は人口や面積の点で連邦国家に近い。本年度の研究実施計画にも記載したが、南部の四川省重慶市、成都市および雲南省昆明市において、昨年度は四川大地震のために断念せざるを得なかった農村部の地方政府のヒアリング調査等を追加して実施した。
異種材料よりなる積層板の座屈に対する有利性の実証的研究

積層板(サンドイッチ板)は、一般に、比較的軽量で剛性の大きな材料を積層させることにより造られ、構造材料の低価格化・軽量化を計ることができるため、古くから航空機をはじめとして、車両、船舶、スポーツ用品などに広く利用されてきた。近年注目されている鋼板の間に減衰性能の大きな樹脂を挟んだ制振鋼板や、異なる金属と金属を張り合わせたクラッド材も一種の積層板と考えることができ、制振鋼板では騒音・振動の吸収という機能性が、クラッド材ではチタン等の材料を用いることによる優れた耐食性が期待できるなど、積層板にした有利性の一部が見て取れる。本研究では、薄肉鋼板の間に廉価な異種材料を挿入あるいは鋼種の異なる薄板を積層するなどして積層板(サンドイッチ板)を製作し、得られた積層板(サンドイッチ板)が板要素としてどの程度機能性を発揮するかについて座屈強度の面から検討することを目的としている。鋼構造物は薄板を利用することによって、軽量化が図れることは周知の事実であるが、その反面、座屈しやすくなるということも事実である。このため、鋼材を使用した構造形式としては、ハニカム構造や円筒シェル構造が採用され、板要素としては補強板や厚板要素が利用され、座屈に対する十分な配慮が常に必要であった。本研究の特色は単に同じ材料を用いて板厚を厚くするだけでは経済性が向上しないので、積層板(サンドイッチ板)の中間層の材料を廉価なものとした上で、比較的厚肉の板要素を作成し、座屈強度をそれほど低下させずに、板要素としての経済性を向上させる方策を検討した点にある。本研究では、積層板の代表であるサンドイッチ板に限定して考察を行ったが、本研究の成果により、異種材料よりなる積層板が構造物の軽量化・合理化・低価格化に果たす役割の一部を確認できたと思われる。阪神・淡路大震災では,落橋防止連結板の破壊による橋桁落下事故が生じた。その防止策として連結板装置に衝撃緩衝効果を持つゴムを利用することが提案されている。本研究では,落橋防止連結板を4枚の板の積層板とし座屈を防止した上に,形状をリング形状とし,中央部にゴムや鉛などの材料を緩衝材として用いたものを考案し,衝撃的な外力を受けた場合の挙動を観察することにより,異種材料の組合わせと積層構造の有利性を実験的に検討した。得られた結論を要約すると,緩衝材としての効果はゴムと鉛のように剛性や強度の異なる材料を適切な割合で積層することにより著しく向上することが分った。さらに,外側にゴムのような剛性の小さいものを用い,内側の層に鉛のようなある程度の剛性を持つ材料を用いることで衝撃力を緩和させる効果が期待できることが分った。今後の課題としては,異種材料の選択とその最適な組み合せを理論的に見出すことが挙げられる。これらの成果の一部を1997年11月にオーストラリアで開催された国際会議で発表した。異種材料よりなる積層構造の研究は、曲げに対する耐衝撃構造を中心にこれまで行われてきており、この方面での研究は設計基準類にも反映されるようになってきた。しかしながら、軸方向圧縮力を受け、座屈する部位での利用については、その力学的有効性が必ずしも明確にされておらず、本研究の主たる対象である地震時の橋桁の落下を防止するための落橋防止連結装置としての利用についても、研究の緒についたばかりの状況にある。積層板は、従来、土木分野ではそれほど大きな強度を要求されない箇所に使用されてきた経緯がある。したがって、主要部材ではない落橋防止連結装置に板構造を使用する場合、圧縮荷重下における軸方向の力学的挙動を注視する必要がある。

このため、衝撃的な荷重が作用する条件のもとで、落橋防止連結板の衝撃力緩衝効果を調べ、落橋防止連結板が圧縮荷重を受けるときの力学的な性質を実験的な面から把握することとした。通常、落橋防止連結板の耐衝撃性を確保するための一手段として、ゴムや鉛などの剛性の小さな構造材料を積層させることが考えられている。本年度の実験的な検討の結果、上記のゴムや鉛のような異種材料を適切に組み合わせることにより、落橋防止連結板の最大衝撃力をコントロールできることがわかった。さらに、適切な落橋防止連結板を用いることにより、大地震時における桁同士の衝突を防げることが確認できた。現在、この点を、2次元振動台を用いた模型実験により確認中である。なお、平成10年度の研究成果の一部は、「第4回構造物の衝撃問題に関するシンポジウム講演論文集」に発表している。
オーキシン不等分布に依存しない光屈性誘導機構の解明

シロイヌナズナの根は光源を避けて成長する負の光屈性を示す。屈性応答は環境刺激に応答して形成される植物ホルモン・オーキシンの不等分布が引き起こす偏差成長であると考えられている。しかしながら申請者のこれまでの研究から、シロイヌナズナの根の光屈性ではオーキシン不等分布形成が屈曲の誘導に必要ではないことが分かった。本研究では、根の光屈性に働くオーキシン不等分布に依存しない光屈性誘導機構の解明を目的としており、平成29年度は次の三点の課題について研究を行った。第一に、オーキシンシグナル伝達因子の根の光屈性における発現パターンを調べた。ARF7、ARF19、IAA17についてYFPとの融合タンパク質を自己プロモーターで発現する形質転換体を作成し、根の光屈性においてYFP融合タンパク質の発現解析を行った。しかし、光照射に応答した発現調節や細胞内局在調節は見られなかった。よって、フォトトロピン(phot)シグナルがオーキシンシグナル伝達因子を直接的に機能調節している可能性は低いと考えられた。第二に、前年度に同定したphot1の活性化に応答して発現調節を受ける遺伝子の根の光屈性における機能を、突然変異体を用いて解析した。しかし、根の光屈性の低下を示す突然変異体は見つからず、根の光屈性においてはphot1による遺伝子発現調節の重要性は低いと考えられた。第三に、光屈性誘導に働くphot1シグナル伝達機構の解明を目指して、シグナル伝達因子NPH3のリン酸化修飾の意義を分子遺伝学的に調べた。リン酸部位が置換された非リン酸化型NPH3はnph3突然変異体の根の光屈性の欠損をよく相補し、疑似リン酸化NPH3はほとんど相補しなかった。さらに詳細な解析を行った結果、NPH3が脱リン酸化されることで芽生えは安定的に光屈性を発揮できるようになることが分かった。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の光屈性では光に誘導される植物ホルモン・オーキシンの不等分布によって器官の屈曲が生じるという考えが定説であるが、シロイヌナズナの根の光屈性は屈曲誘導にオーキシン不等分布形成を必要としない。本研究では根の光屈性において働く未知の光屈性誘導機構を解明を目的とし、平成28年度は4つの小研究課題について研究を進めた。1)オーキシン不等分布比依存的光屈性誘導機構に働くphotシグナル伝達経路を解析するため、photシグナル伝達に働くタンパク質NPH3のリン酸化修飾の機能を遺伝学的に解析した。その結果、NPH3のリン酸化修飾はphot1の光感受性を調節していることが示唆された。2)オーキシンシグナル伝達系の根の光屈性における作用機序を明らかにするため、オーキシン受容体TIR1、オーキシン応答転写因子ARFについて、自己プロモーターによりYFP融合タンパク質を発現する形質転換体を作成した。TIR1-YFPについては顕微鏡観察とウエスタンブロッティングによる発現解析を行った。また、Aux/IAA転写制御因子の根の光屈性への関与を網羅的に解析したところ、1個のAux/IAA遺伝子について根の光屈性への関与が疑われた。この遺伝子の根の光屈性における発現解析に向けて、自己プロモーターによりYFP融合タンパク質を発現する形質転換体を作成した。3)根の光屈性において光受容体phot1により発現調節される遺伝子をRNA-Seq解析によって探索し、約50種類の候補遺伝子を同定することができた。4)根の光屈性に働く新規の因子や経路を明らかにするため、根の光屈性と性質が類似する胚軸二次正光屈性が欠損した突然変異体の根の光屈性を解析した。平成28年度に行った研究については、当初の計画に比べて進展の遅れや予想外の方向への展開があり、やや遅れていると判断した。1)根の光屈性に働くphot1シグナル伝達経路の解明を目指して解析したNPH3タンパク質のリン酸化修飾の機能が、研究当初に予想したものとは異なることが示唆されたため、計画していた生化学的解析は行わず、遺伝学的・生理学的解析を重点的に行った。2)根の光屈性におけるオーキシンシグナル伝達系の作用機序解析については、TRI1については予定通り解析を行うことができた。しかしARFについては、ARF-YFP発現形質転換体を作成したが、YFP融合タンパク質の細胞内局在に異常が見られ、予定していたARF-YFPの発現解析を行わなかった。3)根の光屈性におけるphot1発現調節遺伝子の探索については、当初の予定を変更し、先行研究で行った第1回目の解析から実験条件を再検討した上で再度RNA-Seq解析を実施した。その結果、期待通り新たにphot1発現調節候補遺伝子を同定することができた。4)根の光屈性に働く新規の因子や経路の発見を目的とした胚軸二次正光屈性欠損突然変異体の分子遺伝学的解析については、予定通り解析を進めることができた。

しかしながら申請者のこれまでの研究から、シロイヌナズナの根の光屈性ではオーキシン不等分布形成が屈曲の誘導に必要ではないことが分かった。本研究では、根の光屈性に働くオーキシン不等分布に依存しない光屈性誘導機構の解明を目的としており、平成29年度は次の三点の課題について研究を行った。第一に、オーキシンシグナル伝達因子の根の光屈性における発現パターンを調べた。ARF7、ARF19、IAA17についてYFPとの融合タンパク質を自己プロモーターで発現する形質転換体を作成し、根の光屈性においてYFP融合タンパク質の発現解析を行った。しかし、光照射に応答した発現調節や細胞内局在調節は見られなかった。よって、フォトトロピン(phot)シグナルがオーキシンシグナル伝達因子を直接的に機能調節している可能性は低いと考えられた。第二に、前年度に同定したphot1の活性化に応答して発現調節を受ける遺伝子の根の光屈性における機能を、突然変異体を用いて解析した。しかし、根の光屈性の低下を示す突然変異体は見つからず、根の光屈性においてはphot1による遺伝子発現調節の重要性は低いと考えられた。第三に、光屈性誘導に働くphot1シグナル伝達機構の解明を目指して、シグナル伝達因子NPH3のリン酸化修飾の意義を分子遺伝学的に調べた。リン酸部位が置換された非リン酸化型NPH3はnph3突然変異体の根の光屈性の欠損をよく相補し、疑似リン酸化NPH3はほとんど相補しなかった。さらに詳細な解析を行った結果、NPH3が脱リン酸化されることで芽生えは安定的に光屈性を発揮できるようになることが分かった。1)根の光屈性に働くphot1シグナル伝達経路の解析については、疑似リン酸化NPH3と疑似脱リン酸化NPH3を用いたin vivo結合因子探索を行い、phot1シグナル伝達に働く新規因子の同定を狙う。2)オーキシンシグナル伝達系の作用機序解析については、ARF-YFPおよびAux/IAA-YFP発現形質転換体T3種子を回収し、YFP融合タンパク質の細胞内局在解析と発現解析を進める。3)根の光屈性におけるphot1発現調節遺伝子の探索については、同定したphot1発現調節候補遺伝子のレポーター遺伝子発現株を用いて根の光屈性における発現解析を行う。青色光照射依存的な発現制御が見られた場合、定量的RT-PCRにより発現制御のphot1, ARFへの依存性の有無を調べる。また、T-DNA挿入遺伝子破壊株を用いて根の光屈性における機能解析も行う。4)根の光屈性に働く新規の因子や経路の発見を目的とした胚軸二次正光屈性欠損突然変異体の分子遺伝学的解析については、平成28年度に解析した2種類の突然変異体の突然変異原因遺伝子の解明を進める。先行研究において突然変異原因遺伝子候補がゲノムリシークエンスから見つかっており、この遺伝子のノッカアウト株の表現型解析を行う。また必要に応じて、候補遺伝子を二次正光屈性欠損突然変異体に発現させる相補実験の実施を検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
融体凝固制御法による高Tc超伝導線材の研究

本研究は酸化物超伝導体の線材化法として、酸化物を融点直下あるいは半溶融状態の加工しやすい高温で押出し加工することにより、配向性を有した酸化物超伝導体の作製を試み、臨界電流密度(Jc)の改善を目指している。本年度は、はじめにPb_<0.2>BiSrCaCu_<1.5>OyをAuテ-プ上で融体凝個させ、その凝個条件を適切にコントロ-ルすることにより配向性酸化物超伝導体-Au複相テ-プを作製した。得られたテ-プは約100μmの厚さのAuテ-プと約70μmの厚さ酸化物からなり、酸化物のC面がAuテ-プ面に平行に配向した組織を示した。また酸化物とAuとの密着性は良好であり、これによりテ-プの屈曲性が改善されることがわかった。このテ-プ材は凝固させたままでは超伝導性は得られないが、1118Kでの長時間熱処理により105Kに零抵抗を示す超伝導テ-プとなった。Jcは77K、O磁場で100A/cm^2であり、配向組織を示しているにもかかわらず低いが、これは酸化物中に第二相やボイドがあるためであり、今後、組成の最適化や凝固条件を制御することにより改善を行う予定である。次に、Pb_<0.2>BiSrCaCu_<1.5>Oyの粉末をAgシ-スに充填後、1118Kで高温押出しにより線材化を行った。押出し材は酸化物のC面が押出方向に平行に配向した組織を有し、その後スエ-ジング、圧延により0.1mm厚さまで加工したテ-プ材ではさらに配向度は上昇し、77K、零磁場で1500A/cm^2のJcが得られている。以上のように融体凝固を用いても機械的な方法を用いても配向性酸化物超伝導体が得られることが分かった。今後、この2つの方法を組み合せた半溶融状態での押出法を確立し、より配向度の高い酸化物超伝導体を作製し、Jcの改善を試みる予定である。
電気泳動エピタキシャル電着法によるナノ結晶チタン酸バリウム薄膜の合成

最終年度の研究で得られた成果を以下に記す。1)電気泳動電着(EPD)用BaTiO_3ナノ結晶サスペンションの作製2)EPDによるBaTiO_3ナノ結晶薄膜の作製と評価3)BaTiO_3セラミック薄膜の作製と評価4)ナノ結晶EPD法によるBaTiO_3ナノ結晶パターンの作製と評価1)2-メトキシエタノールを分散液として用い、高濃度のBaTiO_3ナノ結晶を単分散させたサスペンションの作製を行った。BaTiO_3ナノ結晶のゼータ電位制御にアセチルアセトンを用い、その添加量とサスペンションの光透過度(単分散度)の関係についての詳細な検討を行い、目的とするサスペンションの作製を行った。2)EPDによるセラミック薄膜の作製例は多数報告されているが、BaTiO_3ナノ結晶から成る緻密な薄膜の作製例はほとんどない。EPD条件を様々に変えることにより、均質かつ緻密なBaTiO_3ナノ結晶薄膜(AFMによる評価から、薄膜の表面は粒子のサイズレベルの粗さしかない)の作製に成功した。また、SEM,TEM観察から組織も非常に均質であることを確認した。3)作製したBaTiO_3ナノ結晶薄膜を600°Cの低温で焼成し、緻密な組織を持つセラミック薄膜が得られることを確認した。得られた薄膜の誘電率(1kHz-1MHz)及びD-Eヒステリシス特性の測定を行い、強誘電性を示すBaTiO_3セラミック薄膜が得られていることを確認した。ただ、誘電率は100-200程度と小さく、残留炭素や電極材料も含めた検討が必要であることが分かった。4)BaTiO_3ナノ結晶から成るセラミックピラー(直径400nm、高さ500nm)を400nmの間隔で2次元配列したフォトニック結晶の作製に初めて成功した。ピラー配列は乱れがほとんど無いことをSEM,AFMにより確認し、各ピラーは圧電性を示すことをSPMにより確認した。これにより、強誘電体セラミックフォトニック結晶の新しい作製法の確立に成功した。ナノ結晶粒子のエピタキシャル結合現象の有無についての検討は継続して行っている。高濃度ゾルーゲル法により合成した粒径10-15nmのBaTiO_3ナノ結晶を2-メトキシエタノール(EGMME)に分散させたナノ結晶単分散サスペンション(0.075mol/L)の作製を行い、電気泳動電着法(EPD)によりPt/Ti/SiO_2/Si基板上にBaTiO_3ナノ結晶薄膜を作製した。昨年度の研究において、1μm以下の任意の膜厚と10nm以下の表面粗さを持つ高品質薄膜の作製に成功しているが、本年度は、その成果を基に以下の実験を行った。1.EGMME-Acac以外の分散媒を用いたBaTiO_3ナノ結晶単分散サスペンションの作製2.BaTiO_3ナノ結晶EPD薄膜の800°C以下での焼成によるセラミック薄膜の作製1の実験:EGMMEの代わりにエタノールを分散媒に用いた透明BaTiO_3ナノ結晶サスペンションの作製に成功した。また、このサスペンションを用いたEPD薄膜作製実験を行い、良好な結果を得た。2の実験:BaTiO_3:EPD薄膜を600°C-800°Cの温度で焼成し、粒径100nm以下の緻密な組織を持つセラミックス薄膜の作製に成功した。3の実験:作製したBaTiO_3セラミック薄膜の結晶性、粒子組織、表面性状等について、XRD,FE-SEM,HR-TEM、及びAFMによるキャラクタリゼーション行った。4の実験:800°Cで焼成したBaTiO_3セラミック薄膜(一部焼結助剤を添加)の交流インピダンス測定を行い、作製した薄膜は周波数依存性の非常に小さな誘電率(100-130)と1%以下の小さな誘電損を示すことを確認した。

4)BaTiO_3ナノ結晶から成るセラミックピラー(直径400nm、高さ500nm)を400nmの間隔で2次元配列したフォトニック結晶の作製に初めて成功した。ピラー配列は乱れがほとんど無いことをSEM,AFMにより確認し、各ピラーは圧電性を示すことをSPMにより確認した。これにより、強誘電体セラミックフォトニック結晶の新しい作製法の確立に成功した。ナノ結晶粒子のエピタキシャル結合現象の有無についての検討は継続して行っている。
筋収縮運動系の確立と維持の分子機構

以下の様に、多様な視点で筋収縮運動系の確立と維持の分子機構を調べた。1.アクチン・ミオシン相互作用の役割培養筋細胞にアクチン・ミオシン相互作用を抑制する薬剤(BDM)を投与すると、アクチン、ミオシン繊維は形成されるが、横紋形成は抑制されること、また、既に形成された横紋構造が消失することを見出した。アクチン・ミオシン相互作用が筋原線維の形成と維持に不可欠と結論した。2.ミオシン結合蛋白質(C-蛋白質)の役割に関して1)マウス骨格筋C-蛋白質cDNAをクローニング、筋発生に伴うC-蛋白質の発現変化を解明した。2)マウス心筋C-蛋白質に、機能的に強弱の差がある2つの変異体の存在および、両者がマウスの月齢に依存して心筋での発現が変動することを見出した。3)C-蛋白質分子のN端領域にアクチンと相互作用する機能ドメインの存在を、C-蛋白質の断片の組み換え体蛋白質を作成して明らかにした。3.コフィリンの役割に関して1)筋に重要な筋型コフィリンの筋形成過程での発現特性を、cDNAプローブおよび特異抗体を用いて明らかにした。2)コフィリンの過剰、欠損、機能抑制の状態で筋に何が起こるかを調べ、適度なコフィリンの作用が筋原繊維形成と維持に不可欠と結論した。コフィリンの過剰状態をcDNA導入により導くと、アクチン緯緯の崩壊とロッド形成が導かれること、コフィリンの阻害因子PIP_2濃度をPIP5キナーゼのcDNA導入により高めると筋原繊維の形成阻害されること、マウスの胚操作によりコフィリン欠損筋細胞を導くと筋原線維が崩壊した筋細胞が生ずることなどを見出した。4.適度な機械的負荷が筋原繊維形成を促す仕組みについて培養筋細胞にストレッチング負荷を課すと細胞内Ca++が上昇、それに伴い最終的にはアクチン・ミオシン総合作用の促進により筋原繊維形成の促進に至る過程の概略を明らかにした。筋原線維形成と維持の仕組みについて以下のことを明らかにした。1)アクチン・ミオシン相互作用の役割ミオシンATPaseを阻害、かつアクチン・ミオシン相互作用を抑制する薬物であるBDM(2,3-butanedione 2-monoxime)を筋原線維形成を開始直前の培養筋細胞に投与し筋原線維形成への影響を調べたたところ、アクチン、ミオシン繊維は形成されるが、横紋(サルコメア)形成は抑制されることがわかった。また、筋原線維形成後の培養筋細胞に投与すると、サルコメアが徐々に消失した。これらの観察に基づき、アクチン・ミオシン相互作用が筋原線維の形成と維持に不可欠と詰論した。2)ミオシン結合蛋白質(C-蛋白質)に関してマウスの筋発生に伴うC-蛋白質のアイソフォームの変遷を明らかにした。また、マウス心筋C-蛋白質に2つのアイソフォームの存在を見出した。両者はマウスの月齢に依存して心筋での発現が変動、筋原線維への集合能にも差があることを見出した。さらに、C-蛋白質と別のミオシン結合蛋白質(H-蛋白質)との役割を解析するため、培養心筋細胞におけるC-蛋白質、H-蛋白質の発現量をcDNA導入により増加させてそれぞれの筋原線維への集合を比較検討の結果、両者の集合は競合することを見出した。

3)アクチン結合蛋白質(コフィリン)についてほ乳類に存在する2つのコフィリン(非筋かた、筋型)の内、筋形成に重要な筋型コフィリンの役割に迫るため、筋型に特異的なモノクローン抗体を作成して筋形成過程での発現、組織分布を明らかにした。筋原線維形成と維持を担う因子について以下のことを明らかにした。1)アクチン集合制御因子(コフィリン)について筋形成に重要と想定される筋型コフィリン(MCF)の役割に迫るため、マウス胎児の筋発生過程でのMCFの発現をin situ hybridization法により解析、筋節および肢芽の筋形成領域に、筋分化因子(myogenin)や筋原線維蛋白質と共に発現されることを見出した。また、骨格筋では新生児期まで非筋型コフィリン(NMCF)、MCFの両者が共存、筋成熟が進むとMCFのみになること、しかし、心筋では成体でも2つのコフィリンの共存が続くことを明らかにした。筋原線維形成期のアクチン集合制御へのコフィリンの関与を、蛍光標識コフィリンの注入、GFP付きコフィリンの発現誘導により調べた。培養筋細胞内で過剰なコフィリンは一過的にアクチン繊維の崩懐を導くが、やがてコフィリンの機能は既知のリン酸化による制御とは異なる機構で制御されることがわかった。2)ミオシン結合蛋白質(C-蛋白質)に関してC-蛋白質分子はC端領域でミオシンやコネクチンに結合、筋原線維形成に重要な役割を果たすほか、アクチンとも相互作用することが知られる。しかし分子内でアクチン結合を担う部位は不明であった。大腸菌発現系を用いて、C-蛋白質の断片の組み換え体蛋白質を作成して検計の結果、N端部位の断片がミオシン結合能およびアクチン結合能をもつことが解明された。N端側C-蛋白質の細胞内での機能は、cDNA導入により細胞に蛋白質を発現させて検討された。その結果、培養心筋細胞内で、筋原線維のミオシン存在部位(A帯)アクチン存在部位(I帯)いずれにも局在化できることが認められた。筋原線維形成と維持を担う因子について以下のように研究した1)細胞内でのアクチン集合に重要なコフィリンの筋原線維形成における役割に迫るために、筋で顕著に発現する筋型コフィリンの変異と筋形成の関連をマウスで実験的に検討した。即ち、筋型コフィリン遺伝子のコード域を相同組みかえ法によりLacZで置き換えて筋型コフィリン欠損ES細胞(MCF-/-細胞)を作成し、このES細胞をもつキメラマウスを作成した。MCF-/-細胞に由来する骨格筋をX-gal染色より顕在化し、その部位を組織学的に解析した。コフィリン欠損細胞を多くもつ部位(X-gal染色が強い部位)では、筋繊維の顕著な大小不同、単核細胞の集中がみられるなど、筋ジストロフィー筋に類似した筋組織の壊死・再生を示す所見が得られた。MCF+/-ES細胞由来の部位ではこの様な症状は観察されない。この結果は、コフィリンは筋の形成と維持に重要であり、その欠損は筋原線維形成にダメージをもたらすことを示唆している。2)マウスの老化に伴い発現上昇する変異型心筋C-蛋白質の同定と機能解析:C-蛋白質はミオシン結合蛋白質であるが、コネクチンとも結合し、ミオシンフィラメントをサルコメア内で正しく配置させる上でも重要な役割を果たすと考えられる。我々はマウス心筋C-蛋白質でコネクチン結合に関わる領域(ドメインIX)に10アミノ酸の挿入配列を含むC-蛋白質変異体を発見した。この変異体は単一心筋C-蛋白質遺伝子からスプライシング変異体として生ずるものと考えられる。挿入配列を含むC-蛋白質は主に心房に発現し、加齢に従ってその発現量が増えること、細胞内で横紋構造へは組み込まれにくいこと、ミオシンへの結合能が低いことが認められた。
疾患モデルマウスを用いたPLEKHA5、SLC19A3欠損症の病態解明

重度知的障害が見られる2疾患から2個の病因候補遺伝子(SLC19A3とPLEKHA5)を同定し、同遺伝子に変異を導入した疾患モデルマウスを作製して疾患発症機序の解明を行った。1)症例1には、PLEKHA5とSFRS18との間で相互転座が見られる。マウス海馬初代神経培養細胞を用いた発現実験よりPLEKHA5が病因候補と示唆されたので、エクソントラップ法で作製した(熊本大学)ホモのPlekha5欠失マウスを解析した。同マウスは1年以上生存し、脳にも明らかな異常は認められなかった。以上より、本症例では、PLEKHA5の欠損(ハプロ不全)だけではなく、染色体転座により作られる融合タンパク質の脳での発現が病態に関与していると考えられた。しかし、培養実験とマウス実験の結果が異なることより、Cre-loxP系を用いたPlekha5ノックアウトマウスの解析が必要である。2)症例2より同定したSLC19A3のE320Q変異と相同の変異を持つSlcl9a3ノックイン(NI)マウスを作製した。通常の食餌であるCE-2では、ホモNIマウスは野生型(WT)と同様に1年以上生存したが、食餌中のビタミンB1(以下、B1)量をCE-2の35%まで減量すると全てのホモNIマウスは24日前後で死亡した。以上より、症例ではB1に対する感受性が著しく亢進しており、大量の継続的なB1投与が治療法になることが示唆された。1.PLEKHA5とSFRS18の2個の遺伝子の間で相互転座が見られる最重度精神遅滞の病因を明らかにするために以下の研究を行った。作成した抗Sfrs18抗体を用いてマウス脳を解析し、Sfrs18は脳全体に幅広く発現していることを明らかにした。次に、熊本大学発生医学研究所で、遺伝子トラップ法を用いて作製したPlekha5変異マウスの解析を行った。本マウスは、Plekha5遺伝子の第3イントロンに大腸菌のβ-Galactosidase(β-Gal)遺伝子が挿入されている。C57BL/6Jと戻し交配を行ったマウス(P28)脳を解析した。マウスの遺伝子型はRT-PCR法で決定し、野生型、ヘテロ変異マウスおよびホモ変異マウスと判断されたマウス脳を病理学的に解析した。いずれのマウスにおいても、海馬の形態には異常は見られなかった。また、ホモ変異マウスと判断された海馬には、Plekha5の発現が見られた。以上より、以下の可能性が考えられた。1)RT-PCR法では正確な遺伝子型の判別が困難である。2)\ホモ変異と診断したマウスには、β-GAl遺伝子がスプライシングされず、第3と第4エキソンを含む正常のPlekha5 mRNAが作られ、海馬にPlekha5の発現が見られた。そこで、ゲノムDNAを解析し遺伝子型を決定すべく、β-Galの挿入部位の同定を開始した。2.家族性の進行性脳萎縮症の症例より同定した変異をノックインしたSlc19a3変異マウス(F1)は、交配によりCreを取り除く過程に入った。3.モーターニューロン症状を呈する成人型Sandhoff病の症例のHEXB遺伝子の解析を行い、新規のミスセンス変異を同定した。さらに、本変異がHexosaminidase Aを構成するα鎖とβ鎖の重合を阻害することを明らかにし、論文にまとめた。1) PLEKA5プロジェクト:熊本大学発生医学研究センターでβ-galactosidase遺伝子とneomycin耐性遺伝子の融合遺伝子を遺伝子領域に挿入するエクソントラップ法により作製されたPlekha5遺伝子改変マウスのゲノムDNAを解析し、融合遺伝子の挿入部位(第3イントロン内)を決定し、PCR法を用いて同マウス仔獣の遺伝子型を決定する手法を確立した。

ヘテロ変異マウスどうしの交配により得られた70匹のマウス仔獣の遺伝子型を解析したが、ホモ変異マウスは存在しなかった。そこで、一腹のE17.5の胎児マウスを解析し、その中に1匹のホモ変異マウスを同定した。すなわち、ホモ変異マウスは胎生致死、あるいは出生直後に死亡すると考えられた。そこで、遺伝的背景を変換することによりホモ変異マウス仔獣を得られないかと考え、本ヘテロ変異マウスとICRマウスとの交配を開始した。2) SLC19A3プロジェクト乳児期にspasmで発症し、著しい脳萎縮と対称性の視床・基底核病変が見られる家族性の重度精神遅滞の症例から同定したSLC19A3のミスセンス変異を有するヘテロのノックインマウス(以後、ヘテロ変異マウス)どうしの交配を行った。現在までに11匹のマウス仔獣が生まれたが、ホモ変異マウスは出生直後に死亡した1匹のみであった。今後、さらに交配を繰り返し、ホモ変異マウスの表現型を明らかにする予定である。また、上記症例は誌上で発表した。3)その他BRESEK症候群の病因遺伝子の解析、末梢神経障害を伴った副甲状腺ホルモン低下症の姉妹例の病因遺伝子の解析を行った。重度知的障害が見られる2疾患から新規の病因遺伝子を同定し、モデルマウスを作製して疾患発症機序の解明を行った。1)Plekha5欠損マウス:症例にはPLEKHA5とSFRAS18(PNISR)の相互転座があり、両側の海馬が低形成である。siRNAを用いたマウス胎児の海馬初代培養神経細胞の研究により、Plekha5の異常が病因と考えられた。Plekha5エクソントラップマウスよりホモのPlekha5欠失マウスを作製し、脳の病理学的解析を行ったが、症例と同様の海馬の異常は認められなかった。以上より、本症例では、PLEKHA5の欠損だけではなく、染色体転座により作られる融合タンパク質(SFRAS18プロモーターによって発現するC末端部分のPLEKHA5)の脳での発現も症例の病態に関与していると考えられた。2)Slc19a3ノックインマウス:出生後、著しく脳萎縮が進行し致死となる家族性の疾患において、SLC19A3のE320Q変異を同定した。SLC19A3はビタミンB1(以下、B1)のトランスポーターである。病態解明の目的でヒトと同じ変異を有するホモのノックイン(NI)マウスを作製し、様々なB1量の食餌で飼育した。通常の食餌であるCE-2では、ホモNIマウスは野生型(WT)と同様に1年以上生存したが、ホモNIマウスの血中のB1量(123ng/mL)は、WTの1/3以下に低下していた。B1量をCE-2の35%まで減量すると全てのホモNIマウスは24日前後で死亡した。以上より、症例ではB1に対する感受性が著しく亢進しているが、大量の継続的なB1投与が治療法になることが示唆された。高ビオチン食餌での飼育も行ったが、本NIマウスには、論文報告にあるような有効性は認められなかった。今後、本NIマウス以外にノックアウトマウスを用いたB1やビオチンの治療効果の判定など、本研究の継続が重要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
胎生期及び成人期血液前駆細胞の胸腺へのホーミング機構、胸腺内細胞移動機序の解明

胸腺微小環境においてT前駆細胞は皮膜下、皮質、髄質へと移行する過程で分化、増殖し、最終的に成熟T細胞となって末梢へ移行する。しかしながら、現在まで、この胸腺内細胞移動、分化を調節するケモカイン・ケモカインレセプターは明らかになっていない。本研究では、胸腺内細胞移動を制御すると考えられケモカインレセプターCCR9の細胞表面発現を抑制するintracellular chemokine "CCL25/TECK-intrakine(IK)"を発現する再構築マウスを作製し、その表現型を解析した。結果GFPおよびCCL25-IK導入マウス由来の末梢血、骨髄、胸腺および脾臓細胞は8090%以上のGFP陽性率が認められ、高い構築率を示した。また胸腺細胞のCCL25に対する走化能は著しく減少したが、胸腺、脾臓細胞ではCXCL12に対する走化能において量マウス間では変化は認められなかった。GFPおよびCCL25-IK導入マウス由来の末梢血、骨髄、胸腺および脾臓における総細胞数に顕著な変化は認められなかった。また、胸腺脾臓における各T細胞分画(CD4、CD8、TCRαβ)には変化は認められなかった。CCL25-IK導入マウスの小腸のIELに顕著な減少が認められた。さらに、CD8αα、CD4/CD8、TCRαβ、TCRγδ、CD3/αEβ7の各IELの著しい減少が認められたが、胸腺由来のCD8αβIELに変化は認められなかった。さらに免疫組織染色により小腸のCD8+IEL、胸腺非依存性IELの分化リンパ組織であるクリプトパッチの数および細胞数(c-kit+細胞)の著しい減少が認められた。蛍光免疫2重染色法によって、CCL25の発現が4週齢のC57/BL6マウス由来の小腸のクリプトパッチ中のCD11c+細胞に認められた。CCL25に対する走化性が骨髄のc-kit+Lin-細胞には認められたが、c-kit-Lin+細胞には認められなかった。また、RT-PCRによりCCR9の発現がc-kit+Lin-細胞に認められた。以上の結果から、CCL25/CCR9は小腸における胸腺非依存性IELの分化の場であるリンパ球集積組織クリプトパッチの形成、それに引き続いて出現してくるIELの分化を制御していることが強く示唆された。しかしながら、胸腺内細胞移動および分化には重要な役割を担っていないことが示唆された。
メタゲノム解析と難培養微生物利用を基盤とした有用な植物－複合微生物共生系の構築

2017年6月、および9月に調査地であるBoyd Deep Canyon Desert Research Instituteにおいて調査を行った。これまで継続してきたEncelia farinosaの根に共生する微生物の季節性について調べるため、葉の蒸散速度の測定、炭素同位体分析用の葉のサンプリング、および微生物相のメタゲノム解析用の根のサンプリングを行った。調査サイトで優占する9樹種の微生物群集に関するデータ解析を行い、研究対象であるEncelia farinosaが根圏微生物群集の観点で重要な植物であることや、それぞれの植物に特異的な微生物種や本生態系で重要な微生物種の推定を行うことができた。年間を通して放線菌と菌根菌が重要であることが示唆された。また、ポット実験によって、乾燥条件下でE. farinosaに重要な根圏微生物とその機能に関する研究を行った。この結果として、非根圏土壌や根圏土壌の微生物群集と内部根圏微生物群集が大きく異なること、そして内部根圏微生物については乾燥条件下と湿潤条件下で菌類と細菌の双方で異なる傾向が認められた。一方で、アーバスキュラー菌根菌については違いが認められなかった。機能性については、5種類の酵素活性を測定したところ、炭素および窒素分解に関わる酵素活性は乾燥条件下で増加し、一方でリンや硫黄吸収に関わる酵素活性は乾燥によって減少していた。これらのことから、微生物群集は乾燥条件下で変化し、その機能性についても変化していることが確認できた。また、根圏土壌のショットガンメタゲノム解析を行っており、今後、包括的なデータの理解を深める。ここで得られた、乾燥条件下で重要な微生物種と機能に関する知見は、今後の有用微生物探索に重要であり、今後の実際の微生物の分離培養に基づく機能解析とリンクさせることで、有用微生物探索方法の確立につなげていきたい。(1)根圏微生物の生態・機能的特性、複合微生物共生系を構成する微生物種の探索これまでに採取した内部根圏微生物に関するメタゲノム解析を進めることで、植物に重要な微生物とその相互作用に関する解析が可能となり、メタゲノム解析から重要微生物とその組合わせを推定する準備が整った。また、根圏土壌の酵素活性に関する解析から、機能性に関する解析が進んでいる。メタトランスクリプトーム解析については、根圏土壌から回収できたRNA量が少なかったため、条件を検討しなおしたが、解析に不安があったため、ショットガンメタゲノム解析を行うことで機能性に関する情報を得た。上のような状況から、根圏微生物の生態・機能的特性、複合微生物共生系を構成する微生物種の探索についてはおおむね順調に進んでいる。(2)難培養微生物を含む有用微生物の分離・培養昨年度の倒立顕微鏡に続き、本年度はマイクロマニュピレーターを導入できたため、難培養微生物を分離する基盤が整った。これらの機器を用いた分離・培養と接種試験はこれから行う状況であるが、メタゲノム解析から放線菌など調査対象微生物種の目星がついてきたため、今後、円滑に研究が進むことが期待される。(1)根圏微生物の生態・機能的特性、複合微生物共生系を構成する微生物種の探索ポット実験から回収した根圏土壌を用いたメタトランスクリプトーム解析については、RNA抽出を行ったものの回収量が少なかったため、ショットガンメタゲノム解析を代替方法として使用することで対応したが、メタトランスクリプトーム解析の予備試験を引き続き進めていくことで、機能解析に関する情報を充実させる。(2)難培養微生物を含む有用微生物の分離・培養微生物の分離・培養については、対象とする微生物群が絞れてきたため、選択培地を用いた培養、およびこれまでの報告から分離・培養が難しいと思われる微生物について、マイクロマニュピレーターを用いた分離を検討する。これらの微生物を用いて、まずは単独接種試験を行い、続いて、複数種を組み合わせた接種試験を行っていきたい。本年度は2017年2月3月に調査地であるアメリカ・カリフォルニア州に位置するDeep Canyon研究センターにおいて調査を行った。これまで継続してきたEncelia farinosaの根に共生する微生物の季節性について調べるため、葉の蒸散速度を測定するとともに、葉の炭素安定同位体比、根圏微生物のメタゲノム解析、メタトランスクリプトーム解析を行う目的で葉、根、土壌の採取を行った。本年度、明らかになったこととしては、調査サイトで優占する9樹種の干ばつ前後の生存率に関する比較から、研究対象としているEncelia farinosaは他の樹種と比べて耐乾性が低く、厳しい干ばつによって大部分が枯死するものの、その後の降雨によって実生更新が速やかに起こることで個体群を維持していることが分かった。このことから、この植物の定着を促す微生物に着目する際、実生更新に関わる微生物について調べる必要性が考えられた。また、Encelia farinosaの根の内生微生物に関するメタゲノム解析から、細菌と菌類ともに雨季の3月よりも乾季の6月、および9月における微生物群集の植物個体間でばらつきが小さく、乾季には乾燥ストレスに適応した微生物種に根内微生物が制限されてくる可能性が考えられた。夏の降雨後の短期的な土壌水分の変化に対応した土壌微生物相の変化を調査するために行った水添加試験のデータ解析を行ったところ、水添加から8日後に土壌微生物は一定の群集構造に収束していく傾向が認められた。以上のように、乾燥ストレス、あるいは乾燥後の降雨によって一定の微生物群集への収束が起こる可能性が考えられ、どのような微生物を中心としたどのような機能をもった群集への変化が起こっているのかについて調査とデータ解析を進める必要性が考えられた。(1)根圏微生物の生態・機能的特性、複合微生物共生系を構成する微生物種の探索

これまでに採取した根内微生物に関するメタゲノム解析は予定通り進んでいるものの、予算について検討した結果、当初予定していた6月と9月のアメリカ出張が難しく、2月に行う予定であった根圏土壌を用いたメタゲノムおよびメタトランスクリプトーム解析は予備試験を行う段階に留まっている。また、根内の細菌についてメタゲノム解析を行ったところ、植物の葉緑体DNAやミトコンドリアDNAのシーケンスが非常に多かったため、植物根中の細菌のメタゲノム解析についてプライマーの再検討の必要性が出てきた。採取土壌を用いた乾燥ストレス実験については、採取土壌を用いた予備試験を進めており、ほぼ予定通りに進んでいる。(2)難培養微生物を含む有用微生物の分離・培養本年度は倒立顕微鏡を導入したもの、マイクロマニュピレーターを導入できなかったため、こちらを利用した分離試験を行うことはできなかった。しかしながら、代用法としてゲランガムを用いた方法(Silvani et al., 2008 SBB)による難培養微生物の分離方法について検討を進めている。2017年6月、および9月に調査地であるBoyd Deep Canyon Desert Research Instituteにおいて調査を行った。これまで継続してきたEncelia farinosaの根に共生する微生物の季節性について調べるため、葉の蒸散速度の測定、炭素同位体分析用の葉のサンプリング、および微生物相のメタゲノム解析用の根のサンプリングを行った。調査サイトで優占する9樹種の微生物群集に関するデータ解析を行い、研究対象であるEncelia farinosaが根圏微生物群集の観点で重要な植物であることや、それぞれの植物に特異的な微生物種や本生態系で重要な微生物種の推定を行うことができた。年間を通して放線菌と菌根菌が重要であることが示唆された。また、ポット実験によって、乾燥条件下でE. farinosaに重要な根圏微生物とその機能に関する研究を行った。この結果として、非根圏土壌や根圏土壌の微生物群集と内部根圏微生物群集が大きく異なること、そして内部根圏微生物については乾燥条件下と湿潤条件下で菌類と細菌の双方で異なる傾向が認められた。一方で、アーバスキュラー菌根菌については違いが認められなかった。機能性については、5種類の酵素活性を測定したところ、炭素および窒素分解に関わる酵素活性は乾燥条件下で増加し、一方でリンや硫黄吸収に関わる酵素活性は乾燥によって減少していた。これらのことから、微生物群集は乾燥条件下で変化し、その機能性についても変化していることが確認できた。また、根圏土壌のショットガンメタゲノム解析を行っており、今後、包括的なデータの理解を深める。ここで得られた、乾燥条件下で重要な微生物種と機能に関する知見は、今後の有用微生物探索に重要であり、今後の実際の微生物の分離培養に基づく機能解析とリンクさせることで、有用微生物探索方法の確立につなげていきたい。(1)根圏微生物の生態・機能的特性、複合微生物共生系を構成する微生物種の探索