hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子認識光固定法を利用した生体分子型アクチュエーターの創製

光誘起変形による生体分子の基板上への固定技術をコア技術として,生体内分子モーターの構成タンパクであるアクチンとミオシンを人為的に配向・配列制御して運動を制御できるアクチュエーターの創製を試みた.キャップタンパク質を利用することにより,アクチンフィラメントの極性を揃えて基板上に配列,配向させることに成功した.また,光誘起変形で形成されたテンプレートを用いてミオシンフィラメントの配向固定化にも成功し,その表面でのアクチンフィラメントの方向制御された運動を実現した.光誘起変形による生体分子の基板上への固定技術をコア技術として,生体内分子モーターの構成タンパクであるアクチンとミオシンを人為的に配向・配列制御して運動を制御できるアクチュエーターの創製を試みた.キャップタンパク質を利用することにより,アクチンフィラメントの極性を揃えて基板上に配列,配向させることに成功した.また,光誘起変形で形成されたテンプレートを用いてミオシンフィラメントの配向固定化にも成功し,その表面でのアクチンフィラメントの方向制御された運動を実現した.1.Fアクチン相構造の評価:Fアクチンの会合体の相構造が2価カチオンMg2+の濃度に応じて変化する様子を,光固定法を利用して評価した.カチオン高濃度側では各種Fアクチンのバンドルがコイル状に三つ編みに構造を形成していることが,中間濃度では2次元のネマチックラフト構造を形成していることが明らかとなった.これまで小角X線を利用した研究で発見されていた構造を直接観察することができた.2.Fアクチンの配向・固定化:アゾポリマー上に光固定したアクチンモノマーからの重合の証明を行う為、固定部以外のアゾポリマー表面へのフィラメントの吸着を抑制する条件について検討した結果、BSAによるブロッキング処理および界面活性剤の添加の有効性が見出せた.しかし課題としてアクチンを重合する条件、タンパク質変性に気をつける必要性があることがわかった.アゾポリマー上に光固定したアクチンモノマーからの重合では、溶液中に生成する様々な重合度のアクチンフィラメントが表面からの重合に影響を与えることがわかった.そこでアクチンフィラメントの極性の一方に特異的に結合するキャップタンパク質を利用した新たな配向固定法を考察し、キャップタンパク質の一種であるGelsolinを用いた検討で有効性を見出した.(発表準備中)3.ミオシンの配向・固定化:干渉光を用いて表面凹凸構造を形成したアゾポリマ表面上にアクチンフィラメント溶液を滴下・乾燥することで,凹凸構造に沿ってアクチンフィラメントが自己組織的に配向することを見出した.約10種のミオシン(類)を入手し,アゾポリマ上でのアクチンフィラメントのすべり運動を比較検討した.東大豊島研より入手したヘビーメロミオシンが最も良いすべり運動性を示すことを見出した.その表面では,すべてのフィラメントがすべり運動していることがわかった.(発表準備中)1.F-アクチンの配向・固定化ならびに固定化表面でのミオシンの運動観察(1)F-アクチンフィラメントの超遠心分離による精製法を確立した.これによりディップ法によるアゾポリマー上へのF-アクチンの配向吸着を良好な再現性で行うことが可能となった.(2)アゾポリマー上に光固定したキャップタンパク質(ゲルゾリン)の濃度に応じてF-アクチンの数が増加すること,ディップ法でせん断方向に配列した状態で変化する様子を蛍光顕微鏡で捉えることができた.非特異吸着ではないゲルゾリンによる反応であることが検証された.(3)配列したアクチンをさらに光固定を行うことによりさらに光照射を行うことでアゾポリマー上へ安定的に固定できることを見出した.2.ミオシンの配向固定化ならびに固定化表面でのアクチンの運動観察(1)アゾポリマーにカルボキシル基,アミド基,アルキル基,アミノ基,PEG鎖を導入した共重合体をミオシン固定化用基板として検討を行った.カルボキシル基を導入した基板にミオシンを固定するとアクチンフィラメントの運動が高効率に生じることを見出した(2)アゾポリマに格子構造を作製することでミオシンの運動方向を溝方向に沿った方向に制御できることを見出した.(Fアクチンの運動が平行方向で優勢になることを確認).また,生体分子モータをミオシンからヘビーメロミオシン(HMM)に変更し,アクチンの運動速度が8nm/sまで向上することを確認した.アゾポリマにPEG鎖を導入することでアクチンの運動速度がさらに10%程度向上することを確認した.(3)運動性の高ヘビーメロミオシンを活用するため液体窒素による運搬,保存が重要であることを確認した.1.F-アクチンの配向・固定化基板の作製前年度まで,アゾポリマー上にキャップタンパク質(ゲルゾリン)光固定し,さらにゲルゾリンによりF-アクチンを補足,切断後,基板をせん断方向に配列させることに成功してきた.本年は2種類の蛍光色素染色F-アクチンによるアゾポリマー基板上への極性配向固定の検証を行った.(1)2蛍光染色F-actin(AAABBBタイプ)を選択性良く重合する条件を見出した.(2)2蛍光染色F-actinをアゾポリマー上に配向固定した基板について配向性解析の為の基板作製条件および観察条件を見出し,解析が可能となった.(3)配向状態を確認したところ9:1の割合で方向性が揃って配向していることを確認した.2.ミオシン配向構造体の作製

(1)ミオシンを自己組織化して,ミオシンモノマー,ミニフィラメント,巨大フィラメントを作製し,それぞれアゾポリマ上に固定化することに成功した(2)光固定プロセスの基礎的知見を得るため,アゾポリマ上のタバコモザイクウイルスが光照射時間に応じてアゾポリマに埋設・固定化していく様子を分子レベルで確認できた.3.配向・固定化基板上での一方向運動の観察(1)運動を観察するため,アゾポリマービーズを作製し,その表面ヘヘビーメロミオシン(HMM)を固定化した.HMMの活性を保持した状態で吸着したHMM-アゾポリマービーズの作製条件を見出した.(2)アゾポリマー上に吸着させたF-アクチン上での滑り運動を行う様子を観察した(3)HMM-アゾポリマービーズを用いて上述F-アクチン配向固定した基板上での運動を検討したところ,ほとんど運動が観察されなかった.配向プロセスに劣化,光固定プロセスでのアクチンの運動阻害の可能性が考えられる.
学びの場としての「トン」-マリ共和国における子どもの在来組織と学校の比較研究

これまでの現地調査で入手したデータの整理・分析を進めた。その成果は、「マリ農村における子どもと女性による共同労働組織-その変遷と経済活動の比較」(『アフリカ研究』84号)という論文や「「こども/おとな」であることをするところ-マリンケの子どもの集会における会話場面の分析から」(日本文化人類学会第47回研究大会)という学会発表を通じて発表した。前者の論文では、マリ南西部の農村において植民地期以前からある「トン」という共同労働組織が、市場経済化を背景として現在みられる子どもと既婚女性のトンへと変遷していく過程を示した。加えて、既婚女性のトンとの比較から子どものトンの経済活動の特徴を明らかにした。平成25年12月26年3月には、ギニア共和国とマリ共和国において現地調査を実施した。平成26年2月まではマリが情勢不安定で入国不可能であったため、対象の民族であるマリンケが居住する隣国のギニア共和国カンカン州シギリ県内で実施した。その結果、ギニアの農村においても子どものトンの存在を確認することができた。そこで、「研究実施計画」における1トンの個人の移動歴と学歴との関連性、2トンの階層構造について調査をおこなった。マリのものと比較した結果、活動やトンに入会する多くの子どもが公立の小中学校にも通っている点などに類似性がみられた。しかし、個人の移動歴や組織構造の点では相違点がみられた。マリでの調査は、「研究実施計画」における3集会における話し合われ方やその作法の身につけ方などの情報伝達や学習のあり方の検討、4懲罰のあり方の検討を中心におこなった。その結果、集会における学習は、罰金のような懲罰を伴って生起していることがわかった。そこでは、懲罰をおこなう集会の司会進行役であるガルディと呼ばれる幹部役職が、場の規範を管理する者として重要な役割を担っていることがわかった。(抄録なし)・2011年2月に提出した博士予備論文(修士論文相当)の一部をもとに、5月のアフリカ学会において「民主化後マリ農村部における青少年組織の動態」という演題の口頭発表をおこなった。この発表では、在来組織「子どものトン」の形態と活動の変遷を、1992年の民主化以降に焦点を当てて考察した。子どものトンは、民主化以降に急増し、変化しているのにかかわらず、近年の状況を報告する通時的な研究はなかった。本発表は、先行研究のように「子どものトン」を伝統的なものとして固定的にとらえるのではなく、その動態を明らかにした点で意義がある。・2011年11月に博士予備論文の一部を加筆、修正して「マリンケにおける年齢組織の衰退とアソシエーティブな再編-「子どものトン」の組織化に注目して-」という投稿論文を発表した。この論文では、年齢組織の衰退と子どものトンの活発化の過程を通時的に示した。かつて年齢組織が担っていた年齢に基づく認識の枠組みという社会的機能が近年の「子どものトン」の組織化においてもみられ、その点で子どものトンの組織化は年齢組織の再編ととらえることができるという視座を提示した。先行研究においてみられる年齢組織から学校への移行を説く単線的な近代化論とは異なる複線的な視座を、民族誌的な記述によって示した点に意義がある。・同10月15日から3月24日にかけてマリ共和国において学術調査をおこなった。調査は、「研究実施計画」における(1)トン間の移動の経歴と学歴の把握、ないし(2)トンと学校の階層構造の比較を中心におこなった。同時に子どものトンの集会をビデオ撮影し、会話の分析もおこなった。また、調査村の小中学校において日本でいう学級委員にあたるような生徒の組織「子どもの政府governemnt des enfants」を子どものトンの比較対象として定め、参与観察を中心とした調査を実施した。これらのデータの整理は現在進行中である。・昨年度の調査(2011年10月2012年3月)で収集したトンと学校のデータ、特にトンにおける若者の携帯電話利用に関するデータから、「農村の若者集団とケータイー社会とメディアの個人化について考える」という論文を執筆した。この論文は2012年9月15日出版の『メディアのフィールドワークーアフリカとケータイの未来』(羽渕一代・内藤直樹・岩佐光弘編、北樹出版)の第3章として掲載された。・昨年度の調査で収集した調査村における学校化についての小論「マリ農村の「学校化」一学年をめぐるやりとりから」を『アジア・アフリカ地域研究』第12-2号に投稿した。調査地であるマリの農村における幼稚園、小中学校、成人学校、コーラン学校など多様な学校を含む「学校化」がどのように進行し、それらが現在どのように共存しているのかを描いた。・2012年10月から2013年3月に予定していた現地調査はマリ共和国の情勢悪化を理由に中止した。しかし、昨年度の現地調査において当初予定されていた以上のデータが得られていたので、この期間はその成果の学会での発表に従事した。第10回アフリカ教育研究フォーラムにおいては、「学校教育が地域の青少年組織にもたらしたものーマリ南西部農村の事例」という題目で、学校教育の普及によってもたらされたノートとペン、それから基礎的なリテラシーがトンの組織化に与えた影響について考察した。

第18回生態人類学会研究大会においては、「トンの民主性再考ー集会の会話構造と参与枠組の検討から」という題目で、先行研究において民主的であると表象されてきたトンの「民主性」について集会の会話構造と参与の構造の側面から再考した。国際人類学民族科学連合の中間会議においては、「マリ南西部農村における近年の子ども組織の急速な増加」という題目で、トンの通時的な変化を労働や消費などの経済的な側面に注目して考察した。これまでの現地調査で入手したデータの整理・分析を進めた。その成果は、「マリ農村における子どもと女性による共同労働組織-その変遷と経済活動の比較」(『アフリカ研究』84号)という論文や「「こども/おとな」であることをするところ-マリンケの子どもの集会における会話場面の分析から」(日本文化人類学会第47回研究大会)という学会発表を通じて発表した。前者の論文では、マリ南西部の農村において植民地期以前からある「トン」という共同労働組織が、市場経済化を背景として現在みられる子どもと既婚女性のトンへと変遷していく過程を示した。加えて、既婚女性のトンとの比較から子どものトンの経済活動の特徴を明らかにした。平成25年12月26年3月には、ギニア共和国とマリ共和国において現地調査を実施した。平成26年2月まではマリが情勢不安定で入国不可能であったため、対象の民族であるマリンケが居住する隣国のギニア共和国カンカン州シギリ県内で実施した。その結果、ギニアの農村においても子どものトンの存在を確認することができた。そこで、「研究実施計画」における1トンの個人の移動歴と学歴との関連性、2トンの階層構造について調査をおこなった。マリのものと比較した結果、活動やトンに入会する多くの子どもが公立の小中学校にも通っている点などに類似性がみられた。しかし、個人の移動歴や組織構造の点では相違点がみられた。マリでの調査は、「研究実施計画」における3集会における話し合われ方やその作法の身につけ方などの情報伝達や学習のあり方の検討、4懲罰のあり方の検討を中心におこなった。その結果、集会における学習は、罰金のような懲罰を伴って生起していることがわかった。そこでは、懲罰をおこなう集会の司会進行役であるガルディと呼ばれる幹部役職が、場の規範を管理する者として重要な役割を担っていることがわかった。博士予備論文(修士論文)の成果を学会発表と投稿論文という形でまとめ、かつ交付申請書にある、「研究の目的」に沿う形で現地調査が予定通り遂行できたから。2012年10月から2013年3月に予定していた現地調査は現地の情勢悪化というやむを得ない理由から中止したが、その期間を研究発表に費やすことで、交付申請書にある「研究の目的」に沿う形で成果を挙げることができたから。基本的にはこれまでの計画通りに推進していく。ただし、23年度の調査において「子どものトン」の集会の会話データを集めたところ予想以上に豊富な示唆が得られたので、このデータの分析に当初想定していたよりも力点を置きたい。なお、マリ共和国は2012年3月下旬のクーデター以降政情が不安定であり、今後しばらくのあいだ学校が開かれない可能性もある。その場合は、在来組織の調査・分析を進める。次年度の前半は投稿論文の執筆に、後半は前年度中止した現地調査を中心に研究課題を推進させる。フィールドであるマリ共和国の情勢が引き続き好転しない場合は、隣国であるギニア共和国での調査を実施する。(抄録なし)
健康及び病態時の中枢神経系における細胞内カルシウム依存性蛋白質リン酸化反応の役割

細胞内情報伝達の概念が一般化しつつある現在、その中心的役割を担っていると考えられる蛋白質リン酸化酵素の機能研究が、正常及び病態時の細胞機能の解明に必須であると考えられる。本研究に於ては、脳腫瘍細胞における微量のCキナ-ゼアイソザイムの発現とその含量を解析する目的で、3種のアイソザイムを特異的に認識するモノクロ-ナル抗体を用いた非競合固相型エンザイムノアッセイ法(EIA法)を開発した。その結果、Cキナ-ゼアイソザイムが脳腫瘍の細胞型の評定に役立つ可能性と、その際このEIA法が有益な方法になり得ることを示唆した。また、従来のtype I,II,IIIに対する抗体に加えて、δ型及びξ型と呼ばれるCキナ-ゼ亜種(nPKC)に対するペプチド抗体を作製し、その組織及び細胞特異的発現を調べた。その結果、両生類の網膜では哺乳類のようにtype II及びIII Cキナ-ゼは存在せず、δ型及びξ型特異的ペプチド抗体に反応するCキナ-ゼが発現していた。またξ型Cキナ-ゼは、哺乳類では小脳プルキニエ細胞の核内に局在することが判明した。これらに加え、蛋白質リン酸化酵素自身の生理的意義を検討するため、カルモデュリンキナ-ゼII,cAMP依存性蛋白質リン酸化酵素、カゼインキナ-ゼIの特異的阻害剤(KNー62,Hー89,CK17)を創製した。これら特異的阻害剤を用いて種々の細胞応答とそれに関与する蛋白質リン酸化酵素について検討したところ、GABAの放出反応、海馬における長期増強とカルモデュリンキナ-ゼII、神経突起の伸長、immediately early geneの発現とcAMP依存性蛋白質リン酸化酵素との関係が明かとなった。脳腫瘍細胞における微量のCキナ-ゼアイソザイムの発現とその含量を解析する目的で、3種のアイソザイムを特異的に認識するモノクロ-ナル抗体を用いた非競合固相型エンザイムイムノアッセイ法(EIA法)を開発した。このEIA法にてtypeI Cキナ-ゼは4.1ng,typeIIは0.65ng,typeIIIは2.5ngまで測定可能となった。このEIA法を用いて神経膠芽腫細胞株(Aー172,SKーMGー1,SKーMGー4)に含まれるCキナ-ゼアイソザイムを検討したところ、これらの細胞株は全てtypeIII Cキナ-ゼのみを発現し、定量値は各々127.6,248.8,148,5ng/mg蛋白であった。一方神経芽細胞腫においては、typeIIのみを発現し389.5ng/mg蛋白であった。この結果は従来の定性的解析法(ウェスタンブロット・カラムクロマト法)の結果と一致しており、Cキナ-ゼアイソザイムが脳腫瘍の細胞型の評定に役立つ可能性と、その際このEIA法が有益な方法になり得る事を示唆した。一方カルモデュリンキナ-ゼIIに関しては、特異的阻害剤KNー62の開発に成功した。KNー62はカルモデュリンキナ-ゼIIをki値0.9μMで阻害するが、他のキナ-ゼについては100μMで全く阻害活性を認めなかった。阻害機構を検討したところ、KNー62はカルモデュリンと拮抗し、さらにKNー62アフィニティ-カラムにカルモデュリンキナ-ゼIIが結合する点とあわせ、キナ-ゼIIのカルモデュリン結合部位に作用して阻害活性を現わすと考えられた。

^<32>P正リン酸でラベルしたPCー12D細胞株をイオノファ-で刺激するとキナ-ゼIIの自己リン酸化が認められるが、KNー62は濃度依存的性にこの自己リン酸化を阻害した。KNー62はin vitro,in vivoのいずれにおいても非常に有用なtoolとなると考えられる。本年度は、研究実施計画通りCキナ-ゼアイソザイム正常組織及び腫瘍特異的発現の検索と、カルモデュリンキナ-ゼIIの中枢神経系における機能の分子薬理学的検討を行った。Cキナ-ゼについては、前年度までにI(γ)型、II(β)型、III(α)型アイソザイムに対する特異的モノクロ-ナル抗体を用いてその発現量を明らかにしてきた。今回新たに網膜内のCキナ-ゼアイソザイムの分布を調べ、哺乳類ではII型とIII型が網膜で発現し、特にII型はmop bipolar cellに特異的に発現し、視覚機能にもCキナ-ゼが関与することが明らかとなった。また、従来のI型、II型、III型に対する抗体に加えて、本年度はδ型及びζ型と呼ばれるCキナ-ゼ亜種(nPKC)に対するペプチド抗体を作製し、その組織及び細胞特異的発現を調べた。その結果、両性類の網膜では哺乳類のようにII型及びIII型Cキナ-ゼは存在せず、δ型及びζ型特異的ペプチド抗体に反応するCキナ-ゼが発現していた。またζ型Cキナ-ゼは、哺乳類では小脳プルキニエ細胞の核内に局在することが判明した。また3Y1細胞では、ζ型が主要なCキナ-ゼであることも判明し、その部分精製にも成功した。カルモデュリンキナ-ゼIIに関しては、特異的阻害剤KNー62を用いることによって海馬における長期増強現象にカルモデュリンキナ-ゼIIが関与していることを分子薬理学的手法によって初めて証明し得た。また、KNー62を髄腔内に投与すると、髄液中へのGABA分泌が阻害され、血圧と拍動数の上昇を認めた。このことから、GABAの分泌もしくは合成にカルモデュリンキナ-ゼIIの関与が考えられる。更に、我々が独自に精製したカルモデュリン結合蛋白(ACAMPー81)が、Cキナ-ゼの脳における主要基質蛋白MARCKSと非常に類似していることが判明し、カルモデュリン系とCキナ-ゼ系の相互作用の接点になる可能性がある。種々の細胞応答における蛋白質リン酸化酵素の生理的役割について、特異的阻害剤を用いて検討した。その結果、PC12細胞においてカルモデュリンキナ-ゼIIの特異的阻害剤であるKNー62は高カリウム刺激により惹起するチロシン水酸化酵素のリン酸化反応を抑制し、DOPA生成をも抑制する。しかし、Forskolinによって上昇するチロシン水酸化酵素のリン酸化およびDOPA生成には影響を与えないことからも、細胞内カルシウム濃度の上昇に伴うチロシン水酸化酵素のリン酸化および活性化機構にはカルモデュリンキナ-ゼIIが関与していることが明かとなった。また、cAMPー依存性蛋白質リン酸化酵素(Aーキナ-ゼ)の特異的阻害剤であるHー89を用いた実験結果から、PC12細胞においては細胞内カルシウムおよびcAMPにより上昇するimmedeately early genes(IEGs)の発現はともにAーキナ-ゼが関与していることが明かとなった。これら蛋白質リン酸化酵素阻害剤を用いることが蛋白質リン酸化酵素の生理的役割解明の良い手段であろうと考えられる。さらに、ウサギ脳より分子量80kDaのカルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素をrenaturation blotting assay(RBA法)により見いだした。本酵素はその分子量、基質特異性、KNー62,MLー9,Wー7を用いた阻害剤感受性から、新しいタイプのカルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素と考えられた。
脳組織構築過程で移動する神経細胞と取り巻く場の可視化と光操作

本研究では、場(細胞外環境)と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展に不可欠な、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を捉えるライブイメージングツールの開発を行なっている。研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして、小胞体等の高Ca2+濃度の細胞内小器官でのイメージングに適した低親和性の化学発光Ca2+センサー、および光刺激により活性酸素種を産生して近傍のタンパク質を破壊する緑色蛍光タンパク質に関する論文を発表した。また、蛍光と化学発光のどちらの検出モードにおいてもCa2+濃度変化を観測することのできるバイモーダルセンサーに関して本年度から開発を開始した。蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの両末端に、分割した化学発光タンパク質の片側ずつをそれぞれ融合したコンストラクトをデザインして開発を進めた。ドメイン間のリンカーアミノ酸配列を改良して、蛍光モードでは既存の蛍光Ca2+センサーと同様の、化学発光モードでは既存の生物発光Ca2+センサー中で最大のダイナミックレンジを示すセンサーを得た。領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについて、分割したニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質UnaGをカドヘリンに挿入したプローブを検討していた。HEK293T細胞内でカドヘリンと融合させた各断片を共発現させた場合にはシグナルを確認することができたものの、各断片を別々の細胞に発現させて細胞間相互作用の検出を試みた場合にシグナルを検出することが出来なかった。そこで、二量体形成により蛍光発光するようになるβバレル型蛍光タンパク質のペア(ddGFP)を用いたプローブを新たに作製し、細胞間相互作用を検出することに成功した。低親和性の化学発光Ca2+センサー、光刺激により活性酸素を産生する緑色蛍光タンパク質といった新規プローブに関して論文発表に至っている。本年度から開発を開始した蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、予定通りに、精製タンパク質を用いたアッセイで蛍光モード・化学発光モードのいずれにおいても大きなシグナル強度変化を起こすセンサーを得ることができた。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、昨年から開発を進めていたニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を用いたプローブを検討していたものの検出がうまくいかなかった。しかし、新たに二量体形成により発光する蛍光タンパク質のペアを用いることによりそれを克服することに成功している。以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。蛍光・化学発光バイモーダルセンサーに関しては、本年度の精製タンパク質を用いたアッセイで、蛍光・化学発光モードのいずれにおいてもCa2+の有無で大きな蛍光強度変化を起こしたコンストラクトについて細胞内での評価を行う。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブに関しては、本年度にプロトタイプの作製に成功した、二量体形成により蛍光発光することのできる蛍光タンパク質のペアを用いたプローブのさらなる改良を行い、さらに分散培養した神経細胞やスライスカルチャー内での評価を行う。場(細胞外環境)と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展には、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を視覚化するイメージング手法が不可欠である。本研究では、領域内研究でのライブイメージングに有用なツールの開発を行なっている。研究グループの着想に基づいたイメージングツール開発として、化学発光タンパク質と蛍光タンパク質の間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用し、化学発光タンパク質領域からの発光と蛍光タンパク質領域からの発光の強度比の変化によりCa2+濃度を検出するセンサーを開発した。発光領域として化学発光タンパク質NanoLucと黄色蛍光タンパク質Venusもしくは緑色蛍光タンパク質mNeonGreenおよびそれらの変異体を用い、Ca2+検出領域としてCalmodulin-M13もしくはトロポニンCおよびその変異体を用いてスクリーニングを行なった。その結果、N末端側より、VenusのC末端欠失変異体、トロポニンC変異体、NanoLucの順に融合することにより、これまでの化学発光Ca2+センサーで最大のダイナミックレンジ(350%)を示すセンサーを開発することに成功した。しかし、同様のセンサーが別のグループから発表されてしまったため、赤色蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの開発に移行し、tdTomatoを用いたダイナミックレンジ250%の赤色化学発光Ca2+センサーを開発した。領域研究者メンバー同士の情報交換で着想を得たイメージングツールとして、N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブを仲嶋班との共同で開発している。プローブのデザインと遺伝子コンストラクトの作製を行なった。N-カドヘリン挿入により蛍光タンパク質蛍光強度が大きく減少することが明らかになった。FRETを利用した化学発光Ca2+センサーの開発は当初順調に進んで論文発表を行う段階にまで到達していたが、平成28年10月末、同様のCa2+センサーに関する研究成果が他の研究グループからNature communications誌に発表されてしまったため、発表の機会を逸してしまった。しかし、Ca2+センサーのデザインを再検討し、赤色蛍光タンパク質を用いたCa2+センサーの開発に移行し、スクリーニング実験によりtdTomatoを用いたダイナミックレンジ250%の化学発光Ca2+センサーを開発するに至った。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては予定通り仲嶋班との共同開発に着手している。

場(細胞外環境)と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展には、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を視覚化するイメージング手法が不可欠である。本研究では、領域内研究でのライブイメージングに有用なツールの開発を行なっている。研究グループの着想に基づいたイメージングツールとして昨年度に開発した、化学発光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して発光強度比の変化によりCa2+濃度を検出するセンサーについて、生細胞内でのイメージングに使用可能であることを検証した。また、ハナガサクラゲから遺伝子クローニングした蛍光タンパク質を改良することにより、リソソーム・液胞・分泌小胞・エンドソームなどの酸性細胞小器官(pH=4.5から5.5)内で蛍光を失わない耐酸性緑色蛍光タンパク質を開発し、細胞内でのイメージングに応用することに成功した。領域研究者同士の情報交換から着想を得たイメージングツールとして開発中のN-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、発現に用いるプロモーター領域、異なる蛍光タンパク質の検討を行なったが発現レベルの向上は見られなかった。また、ウエスタンブロッティングでの解析により、蛍光タンパク質の挿入によりN-カドヘリンの発現量が低下していることが分かった。そこで、挿入する蛍光タンパク質をこれまで用いていたβバレル構造をとる蛍光タンパク質からサイズの小さいニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質UnaGに変えたところ、顕著な蛍光強度の改善が見られた。FRETを利用した化学発光Ca2+センサーの開発は、他グループからの同様のセンサーの発表に伴う昨年度からの軌道修正が順調に進み、新たに開発したシアン-赤色センサーが細胞内で機能することを検証するまでに至っている。また、別の視点から開発を進めていた、ハナガサクラゲ由来の耐酸性緑色蛍光タンパク質については、ライブイメージングへの応用に十分な蛍光強度を持つ改変体を得ており、今後酸性オルガネラ内のライブイメージングの汎用ツールとして広く用いられることが期待される。N-カドヘリンを介した細胞間相互作用を可視化するプローブについては、蛍光タンパク質発現量に関して問題に直面しているが、ニホンウナギ由来の蛍光タンパク質を用いることによって解決する兆しを得ている。以上は当初の計画と異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。本研究では、場(細胞外環境)と神経細胞の連携という新たな視点で脳発生時間の制御機構を解明することを目的とした本領域の研究の発展に不可欠な、神経細胞のダイナミックな移動に伴う分子・細胞機能の変化を捉えるライブイメージングツールの開発を行なっている。
大規模5'端配列を用いた転写制御の解明及びデータベースの構築

研究者らは、オリゴキャッピング法によって作られたcDNAに基づき転写開始点が決められている転写開始点データベースDBTSSを構築してきた。本研究では、まず大規模シークエンサーによって配列決定されたデータを約3億配列追加することにより、DBTSSの拡充を試みた。また、これらの転写開始点とRNA polymerase・ヒストン修飾のChIP-seq情報、MNasaeIによるヌクレオソーム情報、ポリソーム分画によるRNA-seq情報などと比較を行った。この結果、転写開始点付近には特徴的なヌクレオソーム構造、ヒストンのH3K4me3修飾、RNA polmeraseの集積が観察され、その傾向は発現量の多いものほど強かった。以上のことから、本研究で作成したデータベースDBTSSが転写制御解析に非常に有用であることが示唆された。本研究では、大規模シークエンサー(SOLEXA)由来の5'端EST配列を用いて、転写開始点データベースDBTSSのさらなる拡張とそれを利用したヒトの転写制御情報の網羅的解析を目的としている。平成21年度は、データ処理のパイプラインの作成とデータベースの拡充に重点を置いた。まず、短い配列のマッピング方法と整理方法のパイプラインを作成し、それに基づき12細胞種・実験条件由来の大規模5'端EST配列をゲノムにマッピングした。このEST配列の5'端のゲノム上座標から転写開始点を同定した。これらの転写開始点を500bp内に存在するものは、一つの転写開始点クラスターを成していると見なし、転写開始点クラスターと定義した。転写開始点クラスターが既知遺伝子の第一エクソン以外のエクソン上のみに存在する場合には、完全長ではないmRNAを取った可能性がある。従って、そのようなデータをnon-confident、それ以外をconfidentな転写開始点クラスターとしてアノテーションした。さらに、一つのTSC内に存在する配列数をそのTSCの発現量と定義し、mRNAの発現量を見積もった。これらの転写開始点クラスターを各データセットに対して対応付けを行い、実験条件や細胞の違いによって発現量の比較を容易にできるようなテーブルを作成した。この転写開始点クラスターが既知のmRNA上に観察されない例が6309存在し、これらは別途解析を行い、近傍の遺伝子との発現相関を見いだした。また、既知のnon-coding RNAとその上流付近に存在する転写開始点クラスターの対応付けを行い、non-coding RNAの転写開始点の推定を行った。これらの結果はデータベースDBTSSに統合し、一般に公開している(http://dbtss.hgc.jp)。平成22年度は前年度に構築したデータ処理のパイプラインを利用して、DBTSSに細胞・組織・実験条件の異なる31種類のサンプルから得られた5'端配列を合計約3億追加した。さらに、細胞種や実験ごとに転写開始点が比較できるようなviewerを構築した。加えて、既知遺伝子だけでなく、miRNA等のnon-coding RNAの転写開始点・プロモータ配列の検索も出来るような機能を追加した。(Yamashitaetal 2010)さらに、DBTSSに登録された転写開始点の情報を元に、各組織で選択的プロモータを同定したそしてその選択的プロモータに関して、RNA polymerase,ヒストン修飾のChlP-seq情報、MNaseIによるヌクレオソーム情報、ポリソーム分画によるRNA-seq情報などと比較を行った。この結果、転写開始点付近に特徴的なヌクレオソーム構造、ヒストンのH3K4me3修飾・RNA polymeraseの集積が観察された。また、ある組織で発現が見られないが別の組織での発現が認められる転写開始点では、RNA polymeraseが有意に存在していることがわかった。これら傾向は一つの遺伝子にいくつかの選択的プロモータがある場合、発現量が最も高いプロモータ(alternative promoter 1)とその次に高いプロモータ(alternative promoter 2)でも同様に観察された。また、発現量の高い遺伝子のうち80%近くがポリソームでのmRNAの存在が確認され、ほとんどの遺伝子が翻訳されている可能性を示唆していた(Sathira et al 2010,Yamashita et al 2011)。しかしながら、一部のmRNAでは転写されているのにもかかわらず、ポリソームへの移行が見られない物が観察された。これらに関してはmRNAからタンパク質に向かう部分での翻訳制御が起きていると考えられ、今後その制御機構について解析を進めていきたい。
発達過程における逃避運動回路の活動依存的再編成

成熟した硬骨魚の後脳に左右1対存在するマウスナー(M)細胞の最大の特徴は,単発の活動電位を発生して逃避運動をトリガーすることである.M細胞を発火させる強力な感覚入力は聴覚である.しかし,発達期のM細胞の機能は不明であった.本研究では発達期の逃避運動におけるM細胞の役割とM細胞を駆動させる聴覚入力の投射を調べ,機能的な回路の発達機構を理解すること目的とした.ゼブラフィッシュ胚および稚魚を用いた生理学的・形態学的実験を行い以下の知見を得た.(1)ゼブラフィッシュのM細胞の単発発火特性は受精後90時間以降で獲得される.(2)それに対応して,低閾値型カリウムチャネルKv1がM細胞の軸索初節部の膜に表出する.(3)M細胞の破壊の効果は受精後80時間以降ではじめて有意に現れた.すなわち,M細胞は受精後80時間以降で逃避運動に大きな役割を果たすことが示された.(4)M細胞の活動にとって,もっとも重要な入力である聴覚入力の発達について,M細胞や感覚神経にGFPを発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを活用して,電気生理学的・形態学的に調べた結果,M細胞が音に応答するよりずっと前に,機能的な聴覚回路は形成されていて,内耳の有毛細胞が音による振動を電気信号に変換する過程が,M細胞の聴覚獲得の時期を決めることを見出した.成果の(3)と(4)については2報のJ. Neurosci.に発表した.本研究は,発達初期のゼブラフィッシュの逃避運動における後脳マウスナー(M)細胞と,その主要感覚入力の役割を調べ,機能的な回路の発達機構を理解すること目的とする.ゼブラフィッシュ稚魚の逃避運動に寄与するニューロンを,カルシウムイメージングと選択的ニューロン破壊の効果から調べた.最も早い逃避運動は,受精後80時間以降では聴覚入力によって発火するM細胞によって駆動され,それ以前では触覚入力によってM細胞以外の後脳ニューロンが活動して起こることを見出した.発達期の回路構成を調べるために,M細胞のn vivo whole-cell記録と聴神経の投射の解析を行った.ゼブラフィッシュ胚のM細胞が聴覚応答を獲得する以前に,耳胞の有毛細胞からM細胞への聴神経の投射が認められ,聴覚獲得の細胞メカニズムに新たな知見を与えた.また,聴覚獲得時期に一致して,M細胞の発火特性が大きく変わることを見出し,活動依存的な膜の興奮性の変化を示唆した.M細胞の興奮性を左右する低閾値型カリウムチャネルのサブユニットをクローニングし,発達過程での発現をin situ hybridizationと抗体による免疫染色で確認した.成熟した硬骨魚の後脳に左右1対存在するマウスナー(M)細胞の最大の特徴は,単発の活動電位を発生して逃避運動をトリガーすることである.M細胞を発火させる強力な感覚入力は聴覚である.しかし,発達期のM細胞の機能は不明であった.本研究では発達期の逃避運動におけるM細胞の役割とM細胞を駆動させる聴覚入力の投射を調べ,機能的な回路の発達機構を理解すること目的とした.ゼブラフィッシュ胚および稚魚を用いた生理学的・形態学的実験を行い以下の知見を得た.(1)ゼブラフィッシュのM細胞の単発発火特性は受精後90時間以降で獲得される.(2)それに対応して,低閾値型カリウムチャネルKv1がM細胞の軸索初節部の膜に表出する.(3)M細胞の破壊の効果は受精後80時間以降ではじめて有意に現れた.すなわち,M細胞は受精後80時間以降で逃避運動に大きな役割を果たすことが示された.(4)M細胞の活動にとって,もっとも重要な入力である聴覚入力の発達について,M細胞や感覚神経にGFPを発現するトランスジェニック・ゼブラフィッシュを活用して,電気生理学的・形態学的に調べた結果,M細胞が音に応答するよりずっと前に,機能的な聴覚回路は形成されていて,内耳の有毛細胞が音による振動を電気信号に変換する過程が,M細胞の聴覚獲得の時期を決めることを見出した.成果の(3)と(4)については2報のJ. Neurosci.に発表した.
グローバル化に伴う議会権限の現代的変容

本研究は、多国間の政策決定における「議会留保」を考察する試みである。その好適な素材として、ギリシャの債務危機をきっかけに設けられた超国家的な緊急融資の枠組を挙げることができる。かかる仕組みの下で、債務超過にあえぐ加盟国のために債務保証を引き受ける場合に、政府は国内議会の個別的な承認を得るよう義務づけられるのかどうか。この種の問題は、多国間安全保障の領域においても存在する。本研究では、ドイツの裁判例や学説を参照しながら、グローバルな政策決定に議会を関与させることの意義と限界を考究した。前年度から引き続き、<グローバルな政策決定と議会留保>に関するドイツ公法学の最新の議論を追いかけた。とりわけ欧州債務危機を契機とする議論が、本研究に重要な素材を提供することとなった。ユーロ通貨危機を抑止すべく、ユーロ圏加盟国が共同で債務過重国に対する緊急融資の枠組みを設けたところ、かかる融資制度の創設および運用にあたって各国の議会をどれだけ関与させるべきかが、論争の的となった。殊にドイツにおいて、この問題は重大な議論を巻き起こし、連邦憲法裁判所は再三にわたって実に注目すべき判断を下している。平成23年度は判決の言い渡しからまだ時間が経過しておらず、文献の収集にも限界があったのに対して、平成24年度にはこれらの判決の評価をめぐって学界の議論も大きな盛り上がりをみせ、それらの収集と分析に注力することができた。その結果、(1)上述の国際的な融資決定に際しては、きわめて強力な議会関与を求めるのが連邦憲法裁判所の一貫した要請であり、学説もおおむねこれを支持していること、(2)その基底には議会の予算権限を重視する視点が垣間見えること、すなわち上述の融資決定は財政上の重大な決定に他ならず、そうであるからには財政権限の一次的な主体である議会の関与が憲法上不可欠と考えられていること、以上二点を確認することができた。これと同様の図式は、国際的安全保障の平面にも看取される。多国間安全保障システムの下でドイツ連邦国防軍(の兵士)を海外に派遣する場合、当該決定に議会の承認は必要か否かの問題がそれである。両者の異同を明らかにする作業に着手したところである。最終年度にあたって、3年間の研究成果を公表することに主眼を置いた。第一の主題は、いわゆる「議会留保」の範囲と強度である。基本権の実現と直截的には関わらない政策決定であっても、国政上のその重要性に鑑みて、議会による事前の承認が義務づけられ得る。そうした議会の承認権について、憲法上の論拠を明らかにしつつ、その範囲を画することが一次的な課題となった。本研究の比較対象国であるドイツにおいては、EUをはじめとする多国間の政策決定と関わって、この問題が近時注目を浴びている。なかでもユーロ圏の債務危機を克服するために設立された多国間融資の枠組をめぐって、たとえば融資対象国の選定や融資条件の策定に際して、ドイツ国内の議会をどの時点でいかに参画させるべきか、公法学の議論は活況を呈した。かような「財政的な議会留保」と並んで、同様の問題構造が従来指摘されてきた軍事の領域(なかんずく多国間安全保障をめぐる議会留保)にも視野を広げ、両者の比較を通じて上述の問題を明らかにしようと努めた。第二の主題は、「議会留保」の担い手である。すなわち、上述の意味での「議会留保」が認められるとして、そこでの承認権は常に本会議によって行使されなければならないか、それとも委員会による行使も容認されるべきか、という問いが本研究の新たな課題として浮上した。いわゆる「グローバル化」に伴って、政策決定のいっそうの迅速性や秘匿性が求められるとすれば、委員会の活用は一考に値するだろう。その一方で、国民代表たる議員の対等な審議参画権を保障する必要も無視することはできず、両者の調和を図る方策が検討の俎上に載せられることとなった。申請者の比較研究対象国・ドイツにおいては、このところ重要な政策決定が国際的な舞台へ移行するなかで、議会権限の空洞化が深刻な課題として議論されている。なかでも連邦憲法裁判所は、かかる議会の権限喪失に歯止めをかけるべく、超国家的な政策形成における議会権限の強化を志向しているようにみえる。その典型例と言ってよいのが、連邦国防軍の海外派兵に関わる一連の判決である。そこでは、多国間安全保障の枠組みに沿って連邦国防軍の兵士を海外に派遣する場合に、連邦議会の事前の承認を求めるべきかどうかが争われたところ、連邦憲法裁判所はこれを正面から肯定している。他方、同様の判示傾向は、欧州債務危機への対応をめぐる近時の判決にも看取されうる。財政上の危機に瀕するユーロ加盟国に対して、同加盟国間の取り決めに従って国庫から資金を醵出する場合、連邦議会の承認はどこまで必要とされるかが本件の争点であった。連邦憲法裁判所はここでも、連邦議会の関与を憲法上の要請として肯定している。

以上をまとめるならば、国際的な安全保障も、欧州の統合も、いずれも基本法が容認する事象でありながら、そこでの議会権限の維持(というより強化)もまた基本法の要請として強調されてきたと言えるだろう。このような連邦憲法裁判所の基本的な姿勢は、2009年のいわゆる「リスボン判決」にすでに顕れている。ただ、議会権限の強化を求める理由づけに着目するならば、国防軍の域外派兵の場合と、ユーロ危機への対応の場合とでは、その行論が同一でないようにも思われる。今後はそうした細かな分析を進めることによって、グローバルな政策決定における議会の役割とその理論的な根拠を明らかにしたい。本件課題の遂行にとってきわめて重要な判決(ドイツ連邦憲法裁判所)が、平成23年から平成24年の初頭にかけて立て続けに下されたところ、これを契機として、議会留保をめぐるドイツ公法学界の議論が大きな盛り上がりをみせた。そうした重要文献の収集と分析がほぼ計画どおりに進んだこともあり、近日中に研究成果の一部を公表できる見込みである。現在進行形の事象を追いかけていることもあり、文献の蒐集が思うようには進んでいない(たとえば注目すべき判決が下された後、一定期間が経過しなければ、評釈等が公刊されない)。また、最終的な論文の構想も、現時点では不明確なままである。議会留保の外にも、たとえば「議会における審議手続き」「本会議と委員会との間の権限配分」が、政策決定のグローバル化にともなっていかなる変容をこうむるか、考察対象をさらに拡げたいと考えている。また、研究成果の公表にも積極的に取り組みたい。欧州の債務危機が深刻化するなかで、ドイツでは、国際的な平面における政策決定(たとえば資金拠出決定)のあり方、なかでも議会関与の範囲と強度が活発な議論を巻き起こしている。この点に関する重要な論稿は、むしろこれから本格的に刊行されると思われるので、そうした最新文献の研究に注力したい。次年度は(前年度までとは異なり)ドイツへの渡航を計画している。具体的な訪問地はベルリン。フンボルト大学および政府機関を訪ね、現在進行形の議論を聴取する予定である。このインタビューは、本研究の総仕上げにとって必須である。上記の研究計画にかんがみて、次年度は、新しく刊行される書籍(雑誌を含む)の購入に大半の研究費を充てるつもりである。
新超伝導物質合成技術の開発

特異な物性を示す化合物群について、特殊條件下での合成、および単結晶育成技術を確立し、超伝導発現々象究明のための種々の物性測定を行ない、新超伝導物質探索のためのいくつかの指針を得た。(1)多元系超伝導物質の合成(武居):前年度合成されたHo【Mo_6】【S_8】単結晶につき、【Tc_2】以下での強磁性はその回復過程に非常に大きな時間依存性を持つことが見出された。Er【Rh_4】【B_4】に衝撃波超高圧を加えると、【Tc_1】は減少し【Tc_2】は増加することがわかった。新超伝導体としてY【Rh_3】B,【Nb_5】【Sn_2】Gaが見出された。(2)希土類金属間化合物(関沢):Ir-Lu系ではラーベス相Lu【Ir_2】に非常に大きな非化学量論比があり、それによって超伝導転移が影響を受ける。La【Rh_2】【Si_2】は超伝導とはならないことが判明した。(【La_2】【Rh_3】【Si_5】は超伝導)。(3)結晶完全性(小松):トップシード法によりA15型【Nb_3】Sn単結晶を育成し、その際不純物(Ti,Ta)の効果や融液対流の効果を検討した。トップシード法では最高のTc=18.59Kを得たが、Ti添加はTcを減少させた。(4)希土類化合物単結晶(小松原):Ce【Cu_2】【Si_2】の単結晶をチョクラルスキー法で育成した。純良結晶を得るための條件、特にCu組成によるTc変化、残留酸素の効果等について詳細に検討を加えた。(5)MOCVD(北沢):プラズマ励起MOCVD法によりVN薄膜を合成した。これはTc=9.3Kの第二種超伝導体で、MOCVDによる世界初の超伝導薄膜の合成に成功したことになった。(6)多層薄膜(青木):ホットウォール法によるTl添加PbTe膜の単結晶化に成功した。この膜(Tc=1.9K)のトンネル効果からキャリヤ濃度を測定した。(8)金属水素化物(森):NbHx,NbDxスパッタ膜の同位体効果を調べた。(9)糸状金属(後藤):高TcPb-Bi系糸作成。
側鎖にビオロゲン構造を有するセルロース誘導体の合成

ビオロゲン構造を有するセルロール誘導体は、合成高分子のビオロゲン誘導体に比べて親水性であり、安定な親水性膜を形成し、良好な高分子電子キャリヤ-となることが期待される。そこで、セルロースの側鎖にできるだけ多くのビオロゲン構造を導入し、その酸化還元挙動を検討するとともに、各種センサー、光電変換素子などの応用をはかることを目的とする。本年度は、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)およびヒドロキシプロピルセルロース(HPC)から、そのトシル化誘導体(OTs)を中間体として、その側鎖にビオロゲン構造を導入するための反応条件を検討するとともに、得られたビオロゲン誘導体の酸化還元挙動について検討した。得られたHEC-OTsを用いて、非プロトン性極性溶媒を用いる均一系で、ペンダント型(1)および架橋型(2)のビオロゲン誘導体を合成するとともに、クロロホルムを溶媒に用いて成膜と同時に四級化反応を行ない、ビオロゲン誘導体膜(3)の合成を行なった。ビオロゲン誘導体(1)は、Na_2S_2O_4水溶液で還元することによってビオロゲンカチオンラジカル(V^+)の生成にもとづく青色を呈し、その電子スペクトルには664nmにV+にもとずく極大が観察される。598nmに吸収が現れることから、ビオロゲンカチオンラジカル(V+)は会合しないで単量体を形成していることを示している。また、ビオロゲン誘導体(2)、(3)においても同様なスペクトルが観察されている。これらの膜は、空気中で太陽光により瞬時に還元され、青色の膜に変化し、光を遮断すると空気中の酸素で酸化され、色が消えた。
音声処理と言語処理の融合に基づく大規模音声ドキュメントの内容検索

大規模な音声ドキュメントを対象とした内容検索の研究開発を行った。まず、音声ドキュメントの中に検索語がそのまま表れる位置を検出する音声検索語検出の問題に対して、検出閾値を用いずにもっともらしい候補から順番に高速に検出する手法を開発した。最終的に、ベースラインの連続DPマッチング法とほぼ同等の検出性能を維持したまま約70倍高速な検出を達成した。次に、自然言語で表現した検索要求に適合する音声区間を検索する音声内容検索の問題に対して、音声検索語検出を前処理に用いた誤認識や未知語に頑健な手法を開発した。提案法は、クエリに未知語が含まれている場合に効果があること、大語彙連続音声認識を用いた従来法と混合することで相補的に検索性能を向上させること、が分かった。検索語検出タスクについて、新しい索引付け手法であるMetric Subspace Indexing法を開発した。本手法は、画像中の直線検出手法であるハフ変換を検索語検出タスクに適用した方法である。オンライン処理を前提とした画像処理と異なり、音声ドキュメントを対象とする場合は検出処理前にドキュメントが既知であるために、オフラインでの効率的な索引付けができる点に着目し、高速な検出法を実現した。従来の索引付け法と異なり、尤もらしい候補順に結果を出力できる点、認識結果に現れる複数代替候補を直接扱うことができる点、が大きな特徴である。音声内容検索タスクについて、パッセージ検索手法の開発および言語モデルに基づく検索手法の適用を行った。音声認識結果に対する検索は、誤認識の影響を受けるため、検索クエリや対象文書を関連語で補完する手法が有効と考え、適合性モデルをパッセージ検索に適用した。また、Webの関連文書を利用するように適合性モデルの拡張を行った。また、2つのタスクを統合して音声ドキュメント検索を行うための予備調査を行った。統合手法は、まず検索クエリから検索語を抽出し、対象音声ドキュメントに対して音声検索語検出を行う。次に、この検出結果を語の出現と見て、文書検索を実行する。本手法を講演の検索タスクに適用したところ、高速なサブワード認識結果を使っているのにも係らず、従来の大語彙連続音声認識とテキスト検索を組み合わせる手法の検索性能を改善できることが分かった。音声ドキュメントを対象とした検索について、検索語が音声データ中のどこに現れたかを検出する検索語検出タスク(Spoken Term Detection)と、検索要求に合致する音声区間を特定する音声内容検索タスク(Spoken Document Retrieval)の2つの問題を設定し、それぞれ手法の開発を進めるとともに、両者の統合手法を検討した。検索語検出タスクについて、開発したMetric Subspace Indexing法の性能向上と効率化を行った。予備実験により、これまでの単純な実装では正しい検出より先に誤検出が起り易いことが明らかになった。そのため、厳密に距離順に検出結果を出力するアルゴリズムを実装し、検出性能の大幅な向上を達成した。また、実装した厳密アルゴリズムを効率化するため、近似的に距離順に出力するアルゴリズムを実装し、性能を落とすこと無く従来の単純アルゴリズムに匹敵する高速化を達成できた。また、音声認識誤りの影響を抑えるための代替距離尺度や継続時間情報を導入する手法を導入し、高再現率領域での検出性能を改善した。音声内容検索タスクについては、文書の一部にアクセスすることを可能にするパッセージ検索手法を拡張し、可変長の区間をそのまま検索する手法の開発を行った。また、音声認識誤の辞書未登録語や音声認識誤りによる検索性能の劣化を直接扱うために、音声検索語検出手法を内容検索システムに組み込む統合手法を開発した。本手法は、検索トピック中の語それぞれに対し検索語検出を行い、その結果の統計量を内容検索に用いることで、未登録語や認識誤りの影響を受けにくいことが特徴である。評価実験により、未登録語に頑健な本手法の利点を確認した。また、本手法の検索語検出の高速化を行い、本枠粗みに文書拡張手法を適用するための準備を進めた。音声ドキュメントを対象とした検索について、(A)検索語が音声データ中のどこに現れたかを検出する検索語検出タスクと、(B)検索要求に合致する音声区間を特定する音声内容検索タスクの2つの手法の開発を進めるとともに、(C)両者の統合手法、を検討した。(A)の音声検索語検出については、開発したMetric Subspace Indexing法に対し2つの方法で性能の向上を図った。第1に、これまでの音節系列を対象とした検出方法に対し、音節毎に継続時間長を考慮することによって検出性能を改善する手法を開発し、高再現率領域での性能改善を達成した。第2に、これまでの直線検出の枠組みに代えて、任意の挿入・脱落誤りを扱い可能なDynamic Time Warping法を導入し、距離順・高速な検出を保ちながら連続DPマッチング法と理論上検出性能を同じにする手法を開発した。