hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経線維の興奮の分子機構の光学的方法による研究

この原因として、神経線維膜の表面に溝やくびれがあり、興奮性膜がこれに対し直角に軸を持っているため、光線の軸と分子の軸とのなす角度の分布が標本によって一定しないためということが考えられる。この考えを検証するため、神経をチェンバーに張る時の張力をかえて旋光性シグナルを記録したところ、右旋性増加のシグナルが張力の増加により左旋性増加のシグナルに変化することがみとめられた。2.イカ巨大線維を用いた実験現在、イカの巨大線維からの旋光性シグナルのS/Nの向上につとめている。1.エビ神経束を用いた実験(1)神経の興奮の伝導方向と旋光性シグナルはその符号が一定せず,標本によって右旋性増加の場合と左旋性増加の場合とがある.符号を決定する要因の1つとして,インパルスの伝導の方向が関係することが見出された.多くの神経においては,中枢端を刺激することにより右旋性増加,右旋性減少の二相性の応答が得られるが,末梢端刺激により,これを反転させた応答が得られた.この応答は,偏光子の軸を神経に対し反対側におくと反転するので電気的アーテファクトではない.また,この応答は, 1μMのテトロドトキシンにより消失するか強く減少し, KCIにより消失するので,電極反応ではない.旋光性変化のシグナルには,しばしば複屈折性変化が,重畳してくるが,この変化は,興奮伝導の方向に関係なく一定の符号を保つ.以上の結果から現象的には,旋光性シグナルの符号は,膜電位の空間的な勾配によって定められる,と言えることがわかったが,分子的な発生機構はまだ解明されていない.(2)神経の張力と旋光性シグナル.旋光性シグナルの形および方向は,神経に与える張力により強く影響される.神経が弛緩している時には,旋光性シグナルは経過の長い多相性の変化であるが,神経に張力を与えると,旋光シグナルは持続が短くなり,複屈折性変化に先行する鋭いシグナルに変化した.更に張力を高めると,シグナルの形は変化して二相性となり,時には全くその方向を変化させた.旋光性シグナルの方向は,少くとも上記(1), (2)の2つの要因に支配されていることが明らかとなったが,その機構についてはまだ解明されていない.2:イカ巨大線維を用いた実験.装置のS/Nの向上によりシグナル検出頻度は高まったがまだ充分といえない.
診療所における臨床教育を拡充するための方策に関する調査研究

1.診療所における医学生の実習を支援するための参考資料の公開の継続昨年度に作成した参考資料は冊子体に印刷して関係者に配布すると共に、プライマリ・ケア教育連絡協議会のホームページにダウンロードして印刷が可能な資料として掲載した。また、この資料について医学教育関係者やプライマリ・ケア関係者の会合などで紹介した。2.ワークショップの準備ワークショップ(下記3)の企画を提案すると共に必要物品の購入などの準備をした。3.診療所実習・研修について検討するワークショップの開催日本家庭医療学会の第14回家庭医の生涯教育のためのワークショップ(平成18年11月11日大阪市)で診療所実習・研修について検討するワークショップを開催し、下記の各項目を実施した。(1)アイスブレイクと参加者自己紹介(2)冊子「医学生を育てる」の紹介(3)診療所実習の問題点と対策に関する小グループでの話し合い(4)各グループで話し合った内容の全体発表と話し合い(5)まとめ4.メーリングリストの有用性に関する診療所などでプライマリ・ケアを担当している医師の生涯学習手段としてのメーリングリストの有用性について、アンケート調査により検討した。211名から回答が得られ、教科書などとは異なる事項が学べる、症例検討や医学的話題のアップデートに有用、質問に対して回答が得られる討論形式が理解を深める、など、具体的な有用性が明らかになった。5.書籍化の準備過去のワークショップの記録と上記1の参考資料を編集し、書籍として出版する準備を開始した。1.関連資料の収集診療所での臨床教育に関する調査報告などを国内外から広く収集した。2.診療所で教育すべき内容(学習目標)の検討上記1の資料を基に、診療所で教育すべき内容(学習目標)について検討した。3.プライマリ・ケア教育連絡協議会との共同研究計画プライマリ・ケア領域の教育に関係する5つの学会の集合体である「プライマリ・ケア教育連絡協議会」が、会の活動としての一環として、卒前教育における診療所実習の拡充を目指して本研究と同様の調査研究を計画中であることがわかったため、同会の担当者と協議した結果、共同研究として研究活動を開始することで合意した。4.研究計画の再検討共同研究になったことを踏まえて研究計画を再検討し、当面は卒前教育における診療所での臨床実習を拡充するための方策を探求することにした。5.大学医学部および実習受け入れ診療所医師への聞き取り調査診療所での臨床実習を行っている大学医学部およびその実習を受け入れている診療所医師を対象に、本研究への協力を呼びかけ、聞き取り調査(半構造化面接)を行った。6.実習を導入するための参考資料の開発調査した結果をもとに、実際に実習にかかわっている大学関係者や診療所医師を含む検討会を開催し、診療所での実習を開始する場合に役立つ参考資料の編纂を開始した。1.プライマリ・ケア教育連絡協議会との共同研究の継続昨年度の活動の中で開始した、プライマリ・ケア領域の教育に関係する五つの学会の集合体である「プライマリ・ケア教育連絡協議会」との共同研究活動を、今年度も継続した。2.診療所における医学生の実習に関する聞き取り調査データの分析の継続昨年度に実施した、診療所での実習を行っている大学医学部およびその実習を受け入れている診療所医師を対象とした聞き取り調査(半構造化面接)で得られたデータの分析を継続した。3.診療所における医学生の実習を支援するための参考資料の作成その分析結果を参考に、診療所での実習を行おうとする大学医学部およびその実習を受け入れようとする診療所医師を支援するための参考資料に必要と思われる項目をリストアップした。そのリストを目次として、参考資料の原稿を関係者で分担執筆し、編集した。内容の大半は、実習を充実させるための具体的なノウハウである。4.診療所における医学生の実習を支援するための参考資料の公開作成した参考資料は冊子体に印刷して関係者に配布すると共に、プライマリ・ケア教育連絡協議会のホームページにダウンロードして印刷が可能な資料として掲載した。5.診療所実習・研修について検討するワークショップの開催日本総合診療医学会の年次集会(平成18年3月5日宇部市)で診療所実習・研修について検討するワークショップを開催し、下記の事項について参加者と検討した。(1)送り出す側と受け入れ先との間でカリキュラムのすりあわせ(2)各施設の担当者との接触する機会(3)学生に対する評価(4)指導の時間の確保(5)研修医にさせる医療行為の範囲(6)費用の確保1.診療所における医学生の実習を支援するための参考資料の公開の継続昨年度に作成した参考資料は冊子体に印刷して関係者に配布すると共に、プライマリ・ケア教育連絡協議会のホームページにダウンロードして印刷が可能な資料として掲載した。(1)アイスブレイクと参加者自己紹介(2)冊子「医学生を育てる」の紹介(3)診療所実習の問題点と対策に関する小グループでの話し合い(4)各グループで話し合った内容の全体発表と話し合い(5)まとめ

4.メーリングリストの有用性に関する診療所などでプライマリ・ケアを担当している医師の生涯学習手段としてのメーリングリストの有用性について、アンケート調査により検討した。211名から回答が得られ、教科書などとは異なる事項が学べる、症例検討や医学的話題のアップデートに有用、質問に対して回答が得られる討論形式が理解を深める、など、具体的な有用性が明らかになった。5.書籍化の準備過去のワークショップの記録と上記1の参考資料を編集し、書籍として出版する準備を開始した。
Oct-3/4による初期分化決定機構の解析

(1)Oct-3/4による未分化状態維持機構を明らかにするために、薬剤投与によりOct-3/4の発現が消失して100%栄養外胚葉に分化するES細胞ZHBTc4を用いて、その未分化状態を維持するために必要なOct-3/4の機能ドメインの検索を行った。この結果、機能的DNA結合ドメインと一つの機能的転写活性化ドメインの組み合わせで十分であることが明らかになった(図参照)。このとき、Oct-3/4のC末転写活性化ドメインとDNA結合ドメインからなる変異型分子で未分化状態を維持されたES細胞では、Oct-3/4の下流遺伝子の一つであるlefty-1の発現が殆ど消失していた。このことは、一部の下流遺伝子の発現には特定の転写活性化ドメインが必要であること、またこれらの遺伝子の発現はES細胞の自己複製には必要がないことを示す。(2)Oct-3/4の発現増加による原始内胚葉への分化誘導機構を明らかにするために、そのために必要なOct-3/4の機能ドメインの検索を行った。この結果、未分化状態維持と同様に、DNA結合ドメインと一つの機能的転写活性化ドメインの組み合わせで十分であることが明らかになったが、興味深いことにDNA結合能は必要ではなかった。このことは、この分化誘導現象が、これらのドメインが他の蛋白と相互作用することによって引き起こされていることを示唆している。(3)Oct-3/4の発現減少による栄養外胚葉への分化誘導機構を明らかにするために、この現象への関与が考えられる転写因子Cdx-2との相互作用について解析を行った。Cdx-2の発現は未分化ES細胞では全く検出されないが、Oct-3/4の発現が減少すると速やかに検出されるようになる。そこで、この遺伝子の発現制御領域を解析したところ、この遺伝子の発現が、自身の産物で自己活性化されうること、およびこの活性化をOct-3/4が阻害しうることを見いだした。更に、ES細胞におけるCdx-2の強制発現は、部分的にではあるが栄養外胚葉への分化を誘導した。これらのことは、Oct-3/4がCdx-2の発現を抑制することにより、栄養外胚葉への分化を阻止している可能性を示唆している。
骨細胞の機能を利用したレーザー刺激による顎骨再生医療の開発

骨組織はメカニカルストレスに対して敏感に反応する組織である。本研究の狙いはメカニカルストレスと同様な作用をレーザー照射によって骨形成を誘導できるかを検証することである。低エネルギーのレーザー照射が骨細胞に対してsclerostinとDmp-1という骨代謝調節因子の合成に作用することが分かっている。そこでこれまでに本研究では臨床応用を考慮に入れ、インプラント治療に対してレーザーが有効であるかを骨代謝に対する影響を中心に検証した。特に最終目的であった閉経後骨粗鬆症を示す骨組織におけるインプラント治療にレーザーが有効であるかを組織学的に調べることができた。閉経後骨粗鬆症のモデル動物として卵巣を摘出したラット(OVXラット)と対照群としての正常ラット(Shamラット)を使用した。OVXラットは骨組織に閉経後骨粗鬆症の症状が現れることを確認し、脛骨に対してチタン製のインプラントを埋入した。Shamラットに対しても同様にインオウラントを埋入した。その後半導体レーザーを2W、60秒、総エネルギー量120Jの条件で照射した。インプラントを埋入したOVX, Sham群のラットに対してレーザーを照射した群と非照射群でのインプラント周囲の骨形成とオッセオインテグレーション(骨とインプラントが接合する度合い)に対するレーザーの影響を調べた。その結果、OVX,Sham群ともにレーザー照射したインプラントの周囲には骨細胞を有する健康な骨組織が誘導され、インプラントをしっかり支える組織像が得られた。また、インプラントの除去を行うトルク値(オッセオインテグrーションの目安になる)はレーザー照射によって有意に増加した。しかもOVX群とSham群ともにレーザー照射によって亢進したトルク値はほぼ同じ値を示した。これらの結果は閉経後骨粗鬆症患者のインプラント治療に対してもレーザー照射が有効であることが示された。ラットの脛骨にチタン製のインプラントを埋入し、その後半導体レーザー(波長808nm)を照射した。照射条件はトータルエネルギー量が0J,40J,80J,120J,200Jになるように7日間毎日レーザーを皮膚の上から照射した。照射後4週間そのまま放置し、その後のチタンインプラントを脛骨から除去し、その時の除去トルク値を計測して骨形成とオッセオインテグレーションに対するレーザーの作用を評価した。また、これらの骨組織から連続切片を作成して、ヘマトキシリンーエオジン染色を行い骨形成状態を顕微鏡下で形態的に評価した。結果として最も高いトルク値を示したのは、120Jのエネルギーでレーザー非照射の0J群に比較して平均50%の高いトルク値を示した。一方、40J,80J照射群ではやや高いトルク値は示すものの、統計学的には有意差は見られなかった。興味あることに200Jのエネルギーでは0J群に比較して有意に低い値を示した。組織学的観察からもインプラント周囲に多く新生骨が認められたのは120J群の脛骨であり、200J群の脛骨では新生骨の形成が著しく減弱していた。40J,80J群ではインプラント周囲に形成された骨組織はコントロール群と変化は見られなかった。これらの結果は半導体レーザーの照射刺激がインプラント周囲に骨形成を誘導することが示され、その適正な条件として120Jのエネルギーが適切であることが示唆された。また、過度のレーザー照射では骨形成が抑制されることも分かった。骨組織において物理学的な刺激を認識するのは骨細胞であることが知られているが、半導体レーザー照射刺激が骨細胞に影響し骨代謝をコントロールしていることが十分に考えられる。本年度の最も重要な目標は、骨組織に対して骨形成を誘導する照射条件を決定することであった。半導体レーザー(808nm)は深部到達型レーザーであることから骨組織に対して、皮膚の上から照射することが可能である。従ってこれらの照射条件が決定されれば今後骨疾患モデル(骨粗鬆症)に応用する次年度からの計画に有用なデーターとなった。これまでに骨細胞に対するレーザーの作用を検討する目的で、ラットの脛骨にチタン製のインプラントを埋入し、その後レーザーを照射したところオッセオインテグレーションを早める結果が得られた。使用したレーザーは半導体レーザーで、照射トータルエネルギーが120Jが最も骨代謝に作用して骨形成を促進することが示された。そこで今回はさらに超高齢者を想定して、骨粗鬆症のモデルラット(OVXラット)を作成し、同様に脛骨にチタン製のインプラントを埋入した。その後レーザーを照射し4週間放置した。照射条件はトータルエネルギー40J, 80J, 100J, 120Jで行い、照射後2週、3週、4週間後にインプラントの除去トルク値を測定し、その試料を固定して脱灰したのちにパラフィンに包埋してH-E染色を行い骨形成の形態的な観察を行った。結果としてOVX郡、Sham群ともに3週後からはレーザー照射によって有意に除去トルク値が亢進していた。また、組織学的な観察においてもレーザー照射した骨組織の方がインプラント周囲に骨形成が多く認められた。最も顕著な変化が見られたのは120Jのエネルギー量であった。これらの結果はエストロゲン欠乏状態で引き起こされる骨粗鬆症の状態においてもレーザー照射の刺激が骨形成を誘導することが示された。これまでの研究結果と照らし合わせると、レーザー刺激が骨細胞に作用して、sclerostinno発現が減弱され、その結果骨形成が誘導されることが予想される。

本研究結果は今後需要が増える超高齢者の顎骨再建ならびに口腔機能回復にレーザーが有用であることを示している。骨組織においてレーザー刺激(半導体レーザー)が骨代謝に影響することを突き止めた。さらに骨粗鬆症の骨代謝にもレーザー刺激が有効であり、顎骨の再建にレーザーが有効であることが示された。平成28,29年度の予定に従い研究は進行しており、レーザーの照射条件や骨代謝に作用することが明確になった。骨補填剤の使用も計画にはあったが、これまでには使用していない。しかし、疾患モデル動物(OVXラット)を使用したインプラントとレーザー実験が行われたことから、進捗状況は概ね順調に進行していると考える。骨組織はメカニカルストレスに対して敏感に反応する組織である。本研究の狙いはメカニカルストレスと同様な作用をレーザー照射によって骨形成を誘導できるかを検証することである。低エネルギーのレーザー照射が骨細胞に対してsclerostinとDmp-1という骨代謝調節因子の合成に作用することが分かっている。そこでこれまでに本研究では臨床応用を考慮に入れ、インプラント治療に対してレーザーが有効であるかを骨代謝に対する影響を中心に検証した。特に最終目的であった閉経後骨粗鬆症を示す骨組織におけるインプラント治療にレーザーが有効であるかを組織学的に調べることができた。閉経後骨粗鬆症のモデル動物として卵巣を摘出したラット(OVXラット)と対照群としての正常ラット(Shamラット)を使用した。OVXラットは骨組織に閉経後骨粗鬆症の症状が現れることを確認し、脛骨に対してチタン製のインプラントを埋入した。Shamラットに対しても同様にインオウラントを埋入した。その後半導体レーザーを2W、60秒、総エネルギー量120Jの条件で照射した。インプラントを埋入したOVX, Sham群のラットに対してレーザーを照射した群と非照射群でのインプラント周囲の骨形成とオッセオインテグレーション(骨とインプラントが接合する度合い)に対するレーザーの影響を調べた。その結果、OVX,Sham群ともにレーザー照射したインプラントの周囲には骨細胞を有する健康な骨組織が誘導され、インプラントをしっかり支える組織像が得られた。また、インプラントの除去を行うトルク値(オッセオインテグrーションの目安になる)はレーザー照射によって有意に増加した。しかもOVX群とSham群ともにレーザー照射によって亢進したトルク値はほぼ同じ値を示した。これらの結果は閉経後骨粗鬆症患者のインプラント治療に対してもレーザー照射が有効であることが示された。次年度からは、レーザーの作用のメカニズムを解析したい。その他には骨疾患モデル(OVXラット:骨粗鬆症モデル動物)を作成して、チタン製インプラントを埋入してレーザー照射してオッセオインテグレーションへの作用を調べる。また、骨細胞の機能に注目してin vivo, in vitroの両方からレーザー照射の影響を調べる。特にSclerostin,FGF23,Dmp-1の発現に対する影響を調べる予定である。平成30年度は最終年度となるため、最終目的であるレーザー照射がもたらす骨形成亢進のメカニズムに迫る。
炭酸ガスレーザー極細化法で作製した超極細繊維による高機能・高性能不織布の創製

本研究課題では、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、生分解性であるポリ乳酸(PLLA)および生体吸収性であるポリグリコール酸(PGA)繊維に炭酸ガスレーザー極細化法を適用し、PET、PLLAおよびPGA極細線維から構成される不織布を作製し、その作製条件および得られた不織布の特性について検討した。本方法は、極細繊維の不織布を作製する既存の方法(メルトブロー法やフラッシュ紡糸法など)とは異なり、均一な繊維径から構成される不織布を無溶剤で作製することができる。以下にその成果を述べる。1.PLLA不織布では、繊維供給速度を0.150.75m/min、エアージェットへの空気供給量を1040L/minと変え、綿状の極細繊維(Web)を作製した。その結果、供給速度が遅く、空気供給量が30L/min付近で繊維径が最も細くなり、複屈折は細い繊維ほど高くなる傾向にある。繊維供給速度0.1m/min、空気供給量30L/minにおいて、もっとも細い繊維径3.4μmの超極細繊維が得られ、この副屈折は20.5×10^<-3>であった。2.PGA不織布では、PLLAと同様、PGAにおいても繊維供給速度とエアージェットへの空気供給量を変えてwebを作製したところ、遅い供給速度、空気供給量30L/minの条件下で得られたwebの繊維径は約3μmであった。3.炭酸ガスレーザー極細化装置で作製したWebを不織布化するためにPLLAおよびPGAのWebをシート状に形成し、このシートを100200の熱処理音頭範囲で、処理時間を変えて真空オーブン中で熱処理した。この熱処理により均一な不織布を作製できる。処理温度と処理時間を変えることにより、不織布の強度や結晶性を制御できる。4.PER不織布では、細胞培養の培地としての可能性を検討するために、マウスの線維芽細胞培養を行った。その結果、線維径が細い線維から作られる不織布ほど、細胞の生着性が良好であることを確認した。5.真空中で高出力レーザーを繊維に照射し、安定して繊維を引き出すことで、ナノオーダーの繊維が得られることを見出した。この方法でPET、PLLAやPGA繊維のナノファイバー化を試みたところ、PLLAでは平均繊維径約100nm(最小径:54nm)のナノファイバー、PETでも平均繊維径313nm(最小径;177nm)のナノオーダーの繊維が得られた。また、これら繊維径分布はきわめて狭く、均一な繊維径のナノファイバーである。本研究課題では、炭酸ガスレーザー極細化法による不織布の作製法を確立した。さらに、本研究課題を進める課程で、ナノファイバーの新たな作製法を見出した。この方法は、トップダウン型のナノファイバー作製法である複合紡糸法やボトムアップ型のエレクトロスピニングとは全く異なり、溶剤を使用せず、ほとんど全ての熱可塑性高分子材料に適用でき、高い原料利用効率で連続したモノフィラメントのナノファイバーとして得られ、新規なナノファイバー作製法として期待できる。

また、これら繊維径分布はきわめて狭く、均一な繊維径のナノファイバーである。本研究課題では、炭酸ガスレーザー極細化法による不織布の作製法を確立した。さらに、本研究課題を進める課程で、ナノファイバーの新たな作製法を見出した。この方法は、トップダウン型のナノファイバー作製法である複合紡糸法やボトムアップ型のエレクトロスピニングとは全く異なり、溶剤を使用せず、ほとんど全ての熱可塑性高分子材料に適用でき、高い原料利用効率で連続したモノフィラメントのナノファイバーとして得られ、新規なナノファイバー作製法として期待できる。既に炭酸ガスレーザー極細化法で作製した繊維径3から5μmの超極細繊維を不織布化する方法を開発している。この方法では、極細繊維の不織布を作製する既存の方法(メルトブロー法やフラッシュ紡糸法など)とは異なり、均一な繊維径から構成される不織布を無溶剤で作製することができる。本研究課題では、この方法をポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、生分解性であるポリ乳酸(PLLA)および生体吸収性であるポリグリコール酸(PGA)繊維に適用し、PET、PLLAおよびPGA極細繊維から構成される不織布を作製するために条件およびその特性について検討した。炭酸ガスレーザー極細化装置では、繊維供給速度、レーザー出力、繊維を引き出すためのエアージェットに供給する空気量で得られる繊維径や高次構造(結晶性や配向性など)が決まる。まず、それぞれの繊維でレーザー極細化条件を種々変えて綿状の極細繊維を作製し、その繊維の直径および複屈折を求め、示差走査熱量計および熱機械測定を用いて熱的性質(融点、融解熱畳、熱収縮率など)を評価した。さらに、広角X線回折測定などから結晶性および結晶の配向性についても検討した。1.PLLA不織布繊維供給速度を0.150.75m/min、エアージェットへの空気供給量を1040L/minと変え、綿状の極細繊維(Web)を作製した。その結果、供給速度が遅く、空気供給量が30L/min付近で繊維径が最も細くなり、複屈折は細い繊維ほど高くなる傾向にある。繊維供給速度0.1m/min、空気供給量30L/minにおいて、もっとも細い繊維径3.4μmの超極細繊維が得られ、この複屈折は20.5x10^<-3>であった。PLLAと同様、PGAにおいても繊維供給速度とエアージェットへの空気供給量を変えてwebを作製したところ、遅い供給速度、空気供給量30L/minの条件下で得られたwebの繊維径は3μm程度であった。炭酸ガスレーザー極細化装置で作製したwebを不織布化するためにPLLAおよびPGAのwebをシート状に成形し、このシートを100200°Cの熱処理温度範囲で、処理時間を変えて真空オーブン中で熱処理した。この熱処理により均一な不織布を作製できる。処理温度と処理時間を変えることにより、不織布の強度や結晶性を制御できる。今後、さらに不織布の諸特性を評価するとともに、不織布の生分解性、プラズマ処理による表面改質などについて、検討する予定である。本研究課題では、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、生分解性であるポリ乳酸(PLLA)および生体吸収性であるポリグリコール酸(PGA)繊維に炭酸ガスレーザー極細化法を適用し、PET、PLLAおよびPGA極細繊維から構成される不織布を作製し、その作製条件および得られた不織布の特性について検討した。
下肢運動障害者の歩行補助ロボットにおける転倒予防制御に関する研究

本研究では,転倒を予防するための歩行補助ロボットのセンサ・制御系の開発を行った.最初に歩行のダイナミクスを単純化した倒立振子モデルから後方にバランスを崩さないために必要な重心位置と速度の条件を解析に求めた.また,モデルシミュレーションと歩行計測実験によりその妥当性を検証した.次に,後方転倒防止の条件を基に,ロボットの歩行パターンを生成する手法を構築した.また,ユーザの重心移動や接地状態をリアルタイムで検出できる薄型の3軸床反力センサを開発した.開発した転倒防止制御はゼロモーメントポイントの安定性に基づいてスイング動作を開始する.本システムを平地歩行および段差歩行に適用し,転倒することなく歩行できることを確かめた.本研究では,転倒を予防するための歩行補助ロボットのセンサ・制御系の開発を行った.最初に歩行のダイナミクスを単純化した倒立振子モデルから後方にバランスを崩さないために必要な重心位置と速度の条件を解析に求めた.また,モデルシミュレーションと歩行計測実験によりその妥当性を検証した.次に,後方転倒防止の条件を基に,ロボットの歩行パターンを生成する手法を構築した.また,ユーザの重心移動や接地状態をリアルタイムで検出できる薄型の3軸床反力センサを開発した.開発した転倒防止制御はゼロモーメントポイントの安定性に基づいてスイング動作を開始する.本システムを平地歩行および段差歩行に適用し,転倒することなく歩行できることを確かめた.本年度における第1の成果は,歩行中の転倒リスクを定量的に評価する指標である身体の重心位置と速度に関する条件から,歩行補助ロボットの歩行パターン生成アルゴリズムを開発したことである.本手法では,重心位置と股関節位置がほぼ同じであることに着目し,歩行時に足が床面から離れる瞬間の股関節位置と速度を経由点として,躍度最小軌道によって股関節軌道を生成する.また,爪先の軌道についても床面と接触しないように経由点を設定して軌道を生成する.本手法を用いて下肢麻痺者による動作試験を実施し,転倒することなくスムーズに歩行できることを確かめた.第2の成果は、歩行中の重心位置を高い精度で推定するために,姿勢と床反力の計測に基づいて各身体部位の質量と重心位置に関連するパラメータ値を推定するアルゴリズムを開発したことである.本手法では,静止中の圧力中心が重心の鉛直投影点が一致することと重心加速度と身体質量の積が床反力と一致することを利用して,個々の身体部位質量や重心位置に適合したパラメータを推定することで精度よく重心位置を算出する手法である. 5名の被験者に対して重心位置の推定精度を検証し, 4種類のすべての姿勢に対して推定誤差が1cm以下となり,体重や身長を基に算出する従来の手法よりも精度が高いことが分かった.さらに身体の左右対称性に基づいて,左右対称な起立動作から推定したパラメータ値から左右非対称なステップ動作に適用する方法を考案し,起立動作と同様に高い精度でその重心位置を推定できることを示した.今後、歩行補助ロボットの転倒防止制御のセンシングシステムとして適用していくために,身体に装着可能な姿勢計測センサと床反力センサの開発を進める予定である.本年度における第一の成果は,歩行補助ロボットに搭載可能な薄型の床反力センサと姿勢センサを開発したことである.アルミプレートの間に4つの3軸力覚センサを配置し,厚さ15mmのセンサ機構を制作した.センサの特性試験を行い,市販されている床反力計の測定値と開発したセンサの出力信号を比較した結果,3軸の力と圧力中心位置に関して決定係数0.99と高い精度で測定できることを確かめた.また,成人男性の平均体重程度の荷重(600700[N])に対しても正確に計測できることを確認した.また,歩行補助ロボットにセンサを搭載して,ロボットを用いて歩行している間の床反力を計測する実験を行った.その結果,脚のスイングとスタンスに応じて力のプロファイルは妥当な波形を示した.また,姿勢センサとして,3軸加速度/ジャイロ/磁気方位センサからなるセンサーユニットを開発した.また,このセンサ信号から3次元空間内のセンサの姿勢を計算するアルゴリズムについて検討を行った.本年度における第二の成果は,床反力センサに基づく歩行補助ロボットの転倒防止制御を試作したことである.床反力計から,歩行ロボットの安定性の指標として用いられるゼロモーメントポイントをリアルタイムに計算し,特にスイングの開始において安定に動作するように制御する方法を開発した.昨年度に開発した歩行補助ロボット用の床反力センサを応用し,本年度は段差歩行および傾斜面上での立位維持における転倒防止の制御システムの開発を行った.歩行補助ロボットにおける段差歩行の実現に向けて,転倒予防に関する3つの要素技術を開発した.(1)スイング脚が段差と衝突しないように爪先と足部の角度の軌道を決定する方法を開発した.(2)着地時に作用する床反力の作用中心から段差端に対する接地時の足部の位置を検出する方法を開発した.(3)離脚時の重心位置と速度の条件制約として安定な動作パターンを生成する方法を開発した.上記のシステムを歩行補助ロボットの制御システムに組み込んで動作試験を実施した.動作試験から,歩行補助ロボットを用いて転倒することなく昇段・降段動作を実行できることを確認した.傾斜面上での立位維持について,ロボットの関節角度を傾斜勾配に応じて調整しなければ重心が支持基底面から外れて転倒する.

そこで,ユーザの自発的な動作による足底の圧力中心位置と垂直床反力の変化から,傾斜面上で直立姿勢が維持できるよう足首関節を調整する制御システムを開発した.開発した制御システム動作試験を行い,使用者が傾斜面上で直立姿勢となるように足首角度を調整出来ることを確認した.また,腕にかかる力を解析した結果,足首を調整しない場合と比較して開発したシステムで足首を調整したほうが腕にかかる力が大幅に小さくなることが分かった.
金属化合物の発がん機構の解明とがん予防のための基礎研究

発がん性重金属化合物は動物や培養細胞に投与するとDNA損傷をもたらすが、その機構は解明されていない.これまでに単離したヒトがん原遺伝子で明らかにした様に、発がん性重金属化合物による活性酸素生成およびDNA損傷が細胞内でも起こるという可能性を裏付けるために、培養細胞および動物を用いて突然変異や発がんにつながる8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)の定量をニッケル化合物について行った.8-OH-dGの定量には電気化学的検出器と連結させたHPLCを用いた.その結果、培養細胞の実験では、Ni3S2および金属ニッケルで処理したHeLa細胞において8-OH-dG量が増加した.一方、動物実験では、ラットに種々のニッケル化合物(緑色NiO,黒色NiO,NiS,ni3S2)および金属ニッケルを経気道的に投与し、肺の8-OH-dG量を定量した.その結果、いずれの場合にも8-OH-dG量は増加していた.したがって、実験動物でも活性酸素種による直接的な酸化的DNA損傷が起こると考えられる.しかし、ニッケル化合物による炎症が間接的な酸化的DNA損傷に寄与している可能性もある.最近我々は、炎症に伴って生成する一酸化窒素(NO)およびスーパーオキシド(O2^-)が反応してペルオキシナイトレート(ONOO^-)を生成し、それによって、8-OH-dG生成がもたらされることを明らかにした.発がん性重金属化合物によるDNA損傷機構についても、直接的あるいは間接的な酸化的DNA損傷のいずれもが重要であることを示した.以上の結果は1986年に我々が提唱した「金属発がんの活性酸素説」がより確かなものになったことを示している.また、発がんを軽減する効果の大きい活性酸素スカベンジャーを検索することにより、がん予防が可能になることを示している.発がん性重金属化合物は動物や培養細胞に投与するとDNA損傷をもたらすが、その機構は解明されていない.これまでに単離したヒトがん原遺伝子で明らかにした様に、発がん性重金属化合物による活性酸素生成およびDNA損傷が細胞内でも起こるという可能性を裏付けるために、培養細胞および動物を用いて突然変異や発がんにつながる8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)の定量をニッケル化合物について行った.8-OH-dGの定量には電気化学的検出器と連結させたHPLCを用いた.その結果、培養細胞の実験では、Ni3S2および金属ニッケルで処理したHeLa細胞において8-OH-dG量が増加した.一方、動物実験では、ラットに種々のニッケル化合物(緑色NiO,黒色NiO,NiS,ni3S2)および金属ニッケルを経気道的に投与し、肺の8-OH-dG量を定量した.その結果、いずれの場合にも8-OH-dG量は増加していた.したがって、実験動物でも活性酸素種による直接的な酸化的DNA損傷が起こると考えられる.しかし、ニッケル化合物による炎症が間接的な酸化的DNA損傷に寄与している可能性もある.最近我々は、炎症に伴って生成する一酸化窒素(NO)およびスーパーオキシド(O2^-)が反応してペルオキシナイトレート(ONOO^-)を生成し、それによって、8-OH-dG生成がもたらされることを明らかにした.発がん性重金属化合物によるDNA損傷機構についても、直接的あるいは間接的な酸化的DNA損傷のいずれもが重要であることを示した.以上の結果は1986年に我々が提唱した「金属発がんの活性酸素説」がより確かなものになったことを示している.また、発がんを軽減する効果の大きい活性酸素スカベンジャーを検索することにより、がん予防が可能になることを示している.発がん性重金属化合物は動物や培養細胞に投与するとDNA損傷をもたらすがその機構は解明されていない。本研究の目的は、これまで単離したヒトがん原遺伝子で明らかにした銅および発がん性重金属化合物による活性酸素生成およびDNA損傷が細胞内および生体内でどの程度起こるかを解明することである。本年度は次のような成果を得た。(1)ヒト培養細胞(HeLa、Raji細胞)を硫化ニッケル(NiS、Ni_3S_2)で処理すると酸化ニッケル(緑色NiO、黒色NiO)、金属ニッケル及びNiSO_4では認められないような強い二本鎖DNA切断が認められた。アルカリ処理でDNA切断が増加することから、一本鎖DNA切断や塩基の修飾や遊離があるものと推定された。(2)カタラーゼ阻害剤、GSH合成阻害剤やGSH消去剤で、NiSによる二本鎖DNA切断の増加が認められたことから、過酸化水素の関与が示唆された。(3)HeLa細胞でNi_3S_2、金属ニッケルによりDNAの8-OH-デオキシグアノシンが増加した。(4)ラットにニッケル化合物を気管内投与した結果、投与したいずれのニッケル化合物でも肺の8-OH-デオキシグアノシンの増加が認められた。これまで単離したヒトがん原遺伝子で明らかにしたニッケル化合物による活性酸素生成およびDNA損傷がヒト培養細胞やラット肺で起こることが示唆された。ニッケル化合物その他の金属化合物は生体内で炎症をもたらすが、炎症により生じる一酸化窒素(NO)ラジカルの発がんへの関与も示唆されているのでNOと他の活性酸素との相互作用によるDNA損傷についても検討を加えたい。発がん性重金属化合物は動物や培養細胞に投与するとDNA損傷をもたらすが、その機構は解明されていない。これまでに単離したヒト

がん原遺伝子で明らかにした様に、発がん性重金属化合物による活性酸素生成およびDNA損傷が細胞内でも起こるという可能性を裏付けるために,培養細胞および動物を用いて突然変異や発がんにつながる8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)の定量をニッケル化合物について行った.8-OH-dGの定量には電気化学的検出器と連結させたHPLCを用いた.その結果,培養細胞の実験では,Ni_3S_2および金属ニッケルで処理したHeLa細胞において8-OH-dG量が増加した.一方,動物実験では,ラットに種々のニッケル化合物(緑色NiO,黒色NiO, NiS, Ni_3S_2)および金属ニッケルを経気道的に投与し,肺の8-OH-dG量を定量した.その結果,いずれの場合にも8-OH-dG量は増加していた.したがって,実験動物でも活性酸素種による直接的な酸化的DNA損傷が起こると考えられる.しかし,ニッケル化合物による炎症が間接的な酸化的DNA損傷に寄与している可能性もある.最近我々は,炎症に伴って生成する一酸化窒素(NO)およびスーパーオキシド(O_2^-)が反応してペルオキシナイトレート(ONOO^-)を生成し,それによって,8-OH-dG生成がもたらされることを明らかにした.発がん性重金属化合物によるDNA損傷機構についても、直接的あるいは間接的な酸化的DNA損傷のいずれもが重要であることを示した.
地球規模の大気海洋相互作用の研究

本研究計画はWCRP(世界気候研究計画)の一還であるTOGA(熱帯海洋と全球大気研究計画)に関連する大気海洋相互作用のモデル研究を国際共同で推進するものである。したがってTOGA数値実験グル-プ(NEG)の国際メンバ-と国内の主要研究者から構成されている。初年度は北村がドイツのマックス・プランク研究所を訪問し、気象研究所の海洋及び大気海洋モデルとの比較研究を行なうとともにエル・ニ-ニョの前年にいかにして暖水のアノマリ-が西太平洋に蓄積するかを明らかにした。山形、馬谷はコスタリカ沖の大気海洋変動(コスタリカ・ド-ム)を海洋大循環モデルを用いて国際的に初めて再現することを成功し、この成果を米国の対応諸機関、とくにGFDLにおいて討議した。この研究プロセスにおいてGEDLのPacanowski博士を招聘し、モデルの技術的側面を検討している。コスタリカ・ド-ムの研究及びENSOと西太平洋の先駆現象との関連をさらに探るためにMcCerary教授を招聘し討論会を行なった。Oxford大学からはDavey博士を招き、大気海洋モデルに現われる季節内振動や熱帯大気海洋変動の階層構造について比較、検討を行なった。轡田は米国NMCにおいて今後海洋大循環モデルや大気海洋大循環モデルを実用化するために不可欠なデ-タ同化技術の進展状況の調査を行なった。2年度には山形が再びGFDLを訪問し、Philander教授らと西太平洋の海洋変道(ミンダナオ・ド-ム)及び大気海洋結合モデルを用いたENSO研究について討議した。西平洋のミンダナオ・ド-ムの研究は低緯度の西岸強化流の気候変動への役割を明らかにするための国際研究チ-ムの結成を促すことになり、Lukas博士の提唱により1991年2月にホノルルで第1回の会合がもたれている。北村、蒲地はTOGA会議の機会を利用してオペレ-ショナルな海洋モデルと海洋デ-タ・アシミレ-ションについて海外の共同研究者と研究討論を行なった。新たにTOGA議長となったOXford大のAnderson博士、TOGA/NEGのフランス代表のDelecluse博士を招聘し、それぞれ大気海洋研究の今後の研究協力について実務的な討議を行なった。今脇は、将来計画につなげるために、長い時間スケ-ルを持つ大気海洋相互作用、特に海洋の深層の循環の気候に及ぼす役割についてOxford大学のグル-プと研究討論を行なった。またこの関連でCushmanーRoisin教授を躍層理論の熱帯循環への適用可能性の議論のために招聘した。最終年度は遠藤がOxford大学を訪問し、日英のエル・ニ-ニョに関する大気海洋大循環モデルの相互比較を行なった。またTOGA/NEGのもと日、英、米、独、仏5ヶ国で行なった海洋大循環モデルを用いた海面フラックスの比較研究の結果についてもウイ-ンの気候会議において討議を行なった。12月にニュ-ヨ-クで開催されたTOGA/NEGの本会議で本研究グル-プの海洋シミュレ-ション結果が極めて上位にランクされたことを特記したい。これは本研究計画により欧米諸国との情報交換、人事交流を推進したことの成果である。山形は6月に開催されたCCCO会議において、10年スケ-ルり大気海洋相互作用に関するAd Hoc Panelを設置することを提案し、認められた。この新しい方向を推進するために事前に(4月)Nof博士を招聘し、とくに海洋部分(インドネシア通過流)の力学的問題を議論した。市川はウッズホ-ル海洋研究所を訪問し、長期的な大気海洋相互作用による海洋変動、特に北太平洋亜熱帯循環系における渦位の連続性等について議論を行なった。さらにLukas博士を11月に招聘し、大気海洋相互作用のフィ-ルド実験計画の討議、モデリングのための海洋デ-タの情報交換を行なった。最終年度のまとめとして、相手国代表者であるプリンストン大学のPhilander教授を別予算で招聘し、日本学術会議等の後援で気候変動と海洋に関する東京シンポジウムを4月に150名の参加者を得て開催した。ここでは全成果の検討と今後の大気海洋相互作用研究の方向性に関する有意義な討論を行なうことができた。

西平洋のミンダナオ・ド-ムの研究は低緯度の西岸強化流の気候変動への役割を明らかにするための国際研究チ-ムの結成を促すことになり、Lukas博士の提唱により1991年2月にホノルルで第1回の会合がもたれている。北村、蒲地はTOGA会議の機会を利用してオペレ-ショナルな海洋モデルと海洋デ-タ・アシミレ-ションについて海外の共同研究者と研究討論を行なった。新たにTOGA議長となったOXford大のAnderson博士、TOGA/NEGのフランス代表のDelecluse博士を招聘し、それぞれ大気海洋研究の今後の研究協力について実務的な討議を行なった。今脇は、将来計画につなげるために、長い時間スケ-ルを持つ大気海洋相互作用、特に海洋の深層の循環の気候に及ぼす役割についてOxford大学のグル-プと研究討論を行なった。またこの関連でCushmanーRoisin教授を躍層理論の熱帯循環への適用可能性の議論のために招聘した。最終年度は遠藤がOxford大学を訪問し、日英のエル・ニ-ニョに関する大気海洋大循環モデルの相互比較を行なった。またTOGA/NEGのもと日、英、米、独、仏5ヶ国で行なった海洋大循環モデルを用いた海面フラックスの比較研究の結果についてもウイ-ンの気候会議において討議を行なった。12月にニュ-ヨ-クで開催されたTOGA/NEGの本会議で本研究グル-プの海洋シミュレ-ション結果が極めて上位にランクされたことを特記したい。これは本研究計画により欧米諸国との情報交換、人事交流を推進したことの成果である。山形は6月に開催されたCCCO会議において、10年スケ-ルり大気海洋相互作用に関するAd Hoc Panelを設置することを提案し、認められた。この新しい方向を推進するために事前に(4月)Nof博士を招聘し、とくに海洋部分(インドネシア通過流)の力学的問題を議論した。市川はウッズホ-ル海洋研究所を訪問し、長期的な大気海洋相互作用による海洋変動、特に北太平洋亜熱帯循環系における渦位の連続性等について議論を行なった。さらにLukas博士を11月に招聘し、大気海洋相互作用のフィ-ルド実験計画の討議、モデリングのための海洋デ-タの情報交換を行なった。最終年度のまとめとして、相手国代表者であるプリンストン大学のPhilander教授を別予算で招聘し、日本学術会議等の後援で気候変動と海洋に関する東京シンポジウムを4月に150名の参加者を得て開催した。ここでは全成果の検討と今後の大気海洋相互作用研究の方向性に関する有意義な討論を行なうことができた。研究代表者はプリンストン大学GFDLを訪問し、G.Philander教授らと大気海洋結合モデルの進展状況について、特に西太平洋の海洋変動を重視する立場から研究討論を行なった。さらに九州大学モデルを用いた西太平洋の季節変動の解析結果を討議し、ミンダナオ・ド-ムの消長と準二年振動の関連についても議論を行なった。この研究成果は低緯度の西岸強化流の解明を目指す新しい国際研究プロジェクト・チ-ムの結成を促すことになり、平成3年2月にホノルルに於て第1回の研究集会がもたれたところである。
コレステリック液晶の光スクリュー運動による表面動的変形と物質移動に関する研究

低分子ネマチック液晶にアゾベンゼン誘導体を添加した混合液晶を、パラレル配向処理したガラス基板上に塗布することで液晶薄膜を作製し、そこにポリスチレン(PS)微粒子を散布した。この試料にAr+レーザー光(488nm)および半導体UVレーザー光(375nm)を用い、PS微粒子に光が直接当たらないようにしながら、PS微粒子近傍に光照射した。Ar+レーザー光照射下では、PS微粒子は光から逃げるように動き、UVレーザー光照射では、光に近づくように動くことがわかった。用いた照射光のビームサイズは直径12mmであり、直径数ミクロンの対象物質に対してはかなり大きいものであった。そこで、より精密にコントロールするために、対象物質と同程度のサイズのビームを用いた。約8ミクロンのPS微粒子に対して、40ミクロン程度に絞ったUVレーザー光を照射したところ、レーザー光から微粒子が逃げるように運動する場合と、レーザー光照射域内にPS微粒子が捕捉できる場合があることがわかった。メカニズムは明らかではないが、どちらの状態でもレーザー光の移動とともに、微粒子も移動することがわかった。
甘味抑制物質およびすっぱいものを甘くする蛋白質の構造決定および作用機作の解明

1.本研究では、多数のギムネマ酸同族体の中から強い甘味抑制作用を示す2種類のギムネマ酸(1)および(2)を単離した。この試料を用いて、ギムネマ酸(1)および(2)の構造を決定した。これによると、ギムネマ酸(1)および(2)は、アグリコン部分の21位の水酸基のみがそれぞれチグリン酸、2ーメチル酪酸でエステル化されている。すなわち、(1)および(2)の構造の違いは、アシル基に存在する二重結合の有無のみである。(1)の0.1mM溶液は0.2Mショ糖溶液の甘味を抑制し、(2)の同濃度溶液は0.4Mショ糖の甘味を抑制した。このことは、アシル基の構造の違いが甘味抑制効果に関与することを示唆している。さらに、加水分解してエステル基をはずすと、効果がなくなることが明らかになった。2.ジジフィンはジュジュボゲニンをアグリコンとするトリテルペン配糖体であり、糖の水酸基が2個所だけアセチル化されている。ジジフィンを温和な条件で加水分解しアセチル基だけを取り除いた化合物は、全く甘味抑制効果を示さない。このことは、先のギムネマ酸の21位のエステル基をはずした化合物が活性をもたないことと類似の知見であり、興味ぶかい。3.精製ミラクリンをトリプシン、Vー8プロテアーゼ等を用いて断片化し、得られた各ペプチドをHPLCで分画した後、アミノ酸配列を決定した。その結果、ミラクリンは191個のアミノ酸からなる一本のポリペプチド鎖から構成されていることが明らかになった。1.(1)甘味抑制物質ジジフィンの精製は,これまでHPLCにより行われたが,構造決定及び活性テストのためにはより多量の試料が必要となる.そこで本年は,シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製法を検討し,極めて簡単に,且つ収率良く純品を単離する方法を確立した.(2)得られたジジフィンを用い,化学構造の決定を行った.すなわち,昨年までの研究でジジフィンはラムノースおよびアラビノースを持つjujubogenin配糖体であることがわかっている.今回,各種NMRスペクトルデータ等の解析によって,糖の結合部位およびラムノースの2, 3位水酸基がアセチル化されていることを明らかにした.(3)温和な条件でアセチル基をとりのぞいた化合物はは,甘味抑制活性を持たない.このことは,糖の水酸基が甘味抑制に関与していることを示唆する.また,ジジフィンは,シヨ糖意外の全ての甘味物質(アスパルテーム,ステビオシド,サッカリン等)の甘味を抑制することが明らかになった.2.ギムネマ酸には多くの同族体が存在するため,これまでのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる単離方法で純品を得ることは,不可能である.本研究では,逆相カラムを用いたHPLCによって精製を行い, 5種類のギムネマ酸同族体を得ることに成功した.これらのうち,甘味抑制活性の強い二種類の化合物について,各種スペクトルを測定し,その構造を最終的に決定することができた.さらに化学的方法によっても,この構造を確認した.3.ミラクリンをトリプシン,リシルエンドベブチターゼなどの酵素により断片化し,得られた各ペプチドを逆相HPLCにより分画し,ミラクリンの全アミノ酸配列順序を決定した.1.ミラクリンの全一次構造の決定精製したミラクリンを用いて、ミラクリンのアミノ酸配列順序の決定を行った。まず、S-カルボキシアミドメチル化したミラクリンを用いて、N末端から46番目までのアミノ酸配列を自動アミノ酸シークエンサー(Applied Biosystem Protein Sequencer,model 470A)により決定した。

次に、lysyl endopeptidase,TLCK-chymotrypsin,V8-protease等を用いて、ミラクリン分子の切断を行った。生成したペプチドをHPLCで分画し、各ペプチドをアミノ酸シークエンサーにかけた。また各ペプチドのアミノ酸組成を測定し、アミノ酸シークエンサーで得られた結果の確認を行った。2.ミラクリンは191箇のアミノ酸からなる一本のボリペプチド鎖から構成されている。また、ミラクリンは、14%の糖を含んでおり、2本の糖鎖が存在する。これらは、N末端より42番目および186番目のアスパラギン残基と結合している。ミラクリンのアミノ酸配列および糖含量から、ミラクリンの分子量は24,600と計算された。3.ミラクリンの糖組成および糖鎖構造ミラクリンにはグルコサミン、マンノース、ガラクトース、キシロース、フコースがそれぞれ3.03、3.00、0.69、2.12、0.96のモル比で含まれていることが確認された。さらに糖鎖はキシロースを含む複合型糖鎖構造をしていることが明らかになった。
酵素の立体構造に基づくスフィンゴ脂質生合成と分解の制御機構の解明

セリンパルミトイル転移酵素(SPT)はスフィンゴ脂質生合成の初発かつ律速段階の反応を触媒する.SPT活性の変動が細胞内スフィンゴ脂質の種類と総量に直接影響するため,本酵素の活性制御機構の解明は重要である.(1)スフィンゴ脂質含有細菌のSPT遺伝子をクローニングし,大腸菌ないでの大量発現系を構築し,組換え酵素の精製方法を確立した.(2)非反応性の基質誘導体S-2-オキソヘプタデシル-CoA(以下誘導体と略)を合成し,組み換えSPT精製標品を用いて,SPT・L-セリン・アシル-CoA誘導体の三者の反応を詳細に解析した.SPTにL-セリンを加えるとミカエリス複合体を経由して外アルジミン中間体を生じた.SPT-L-セリンニ者複合体に誘導体を添加しても最終生成物である3-ケトジヒドロスフィンゴシンへは変換されなかったが,吸収スペクトルにおいてキノノノイド中間体の新たなピークが観測された.この三者複合体の時間分解スペクトルの速度論的解析の結果,誘導体の結合によってキノノイド中間体の生成・蓄積が誘起され,キノノイド中間体と外アルジミン中間体の平衡状態で反応が停止していることが示された.(3)SPTによるL-セリンCα位の脱プロトン反応の速度(キノノイド中間体生成の反応速度に対応する)をNMRによって解析した.NMR解析はSPT二者複合体におけるL-セリンのCα位の水素-重水素交換は非常に遅いが,誘導体の添加によって100倍加速することを示し,SPTにおけるsubstrate synergismを示した.(4)SPT・L-セリン外アルジミン複合体の立体構造を2.3〓の分解能で決定した.このデータに基づき,SPTの触媒作用における保存されたアミノ酸残基の役割についての議論が可能になった.セリンパルミトイル転移酵素(SPT)はスフィンゴ脂質生合成の初発かつ律速段階の反応を触媒する.SPT活性の変動が細胞内スフィンゴ脂質の種類と総量に直接影響するため,本酵素の活性制御機構の解明は重要である.(1)スフィンゴ脂質含有細菌のSPT遺伝子をクローニングし,大腸菌ないでの大量発現系を構築し,組換え酵素の精製方法を確立した.(2)非反応性の基質誘導体S-2-オキソヘプタデシル-CoA(以下誘導体と略)を合成し,組み換えSPT精製標品を用いて,SPT・L-セリン・アシル-CoA誘導体の三者の反応を詳細に解析した.SPTにL-セリンを加えるとミカエリス複合体を経由して外アルジミン中間体を生じた.SPT-L-セリンニ者複合体に誘導体を添加しても最終生成物である3-ケトジヒドロスフィンゴシンへは変換されなかったが,吸収スペクトルにおいてキノノノイド中間体の新たなピークが観測された.この三者複合体の時間分解スペクトルの速度論的解析の結果,誘導体の結合によってキノノイド中間体の生成・蓄積が誘起され,キノノイド中間体と外アルジミン中間体の平衡状態で反応が停止していることが示された.(3)SPTによるL-セリンCα位の脱プロトン反応の速度(キノノイド中間体生成の反応速度に対応する)をNMRによって解析した.NMR解析はSPT二者複合体におけるL-セリンのCα位の水素-重水素交換は非常に遅いが,誘導体の添加によって100倍加速することを示し,SPTにおけるsubstrate synergismを示した.(4)SPT・L-セリン外アルジミン複合体の立体構造を2.3〓の分解能で決定した.このデータに基づき,SPTの触媒作用における保存されたアミノ酸残基の役割についての議論が可能になった.セリンパルミトイル転移酵素(SPT)の触媒反応における外アルジミン中間体生成以降の過程を解析するために,非分解性アシルCoA誘導体を合成した.この誘導体をSPT外アルジミン中間体に添加しても反応生成物であるKDSは生じず,代わりに新たな吸収スペクトルの変化が観測された.速度論的解析から,アシルCoA誘導体の結合によってキノノイド中間体の生成・蓄積が誘導され,キノノイド中間体と外アルジミン中間体の平衡状態で反応が止まっていることが示された.そこで,重水中でのL-セリンの^1H-NMRを測定することにより,SPTによるL-セリンCα位の水素-重水素交換速度を解析した.L-セリンにSPTとアシルCoA誘導体の両者を加えた場合の交換速度は,SPTのみを加えた場合に比べ100倍以上増加した.すなわち,アシルCoA誘導体の結合によってL-セリンα位脱プロトン反応(キノノイド中間体形成)が著しく促進されることが確かめられた.以上の実験結果に基づいて,下記のような反応制御機構を想定することが可能となった.基質遊離型の酵素においては,活性中心のLys残基とPLP間で分子内シッフ塩基が形成されている.アミノ酸基質のL-セリンが酵素に結合すると,イミノ基転移によって基質のアミノ基とPLP間に新たなシッフ塩基が形成される.次に基質α位の脱水素により,反応性の高いキノノイド中間体になる.