hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
BMP－2の環境選択的骨誘導/抑制メカニズムの解明・応用に基づく骨再生療法の開発

一方、申請者らは、骨髄腔内においては逆に、BMP-2が骨形成を著明に抑制する事を明らかにした。作用部位によって全く逆の効果を示すBMP-2の応用は、確実な骨造成を目指す上で問題がある。そこで、本申請研究の目的は、骨髄内でのBMP-2による骨誘導抑制メカニズムを解明することである。平成28-29年度は、BMP-2の骨誘導抑制メカニズムを明らかにするために、骨形成,吸収に関わっている骨芽細胞,破骨細胞がトラッキングできるマウス、造血幹細胞ニッチの形成に関わるCXCL12陽性細胞をトラッキング可能なマウスを入手し解析を行い、骨髄内に移植したBMP-2周囲の骨芽細胞数が低下していることを明らかにしてきた。平成30年度は、骨髄内に移植したBMP-2周囲のCXCL12陽性の間葉系幹細胞数に変化が生じないことを明らかにした。また、骨髄内のどの細胞が本BMP-2誘導性骨芽細胞分化の抑制に関わっているかをin vitroにて解析を行った。具体的には、磁性ビーズを用いた細胞分離用キットを用いて得た、CD11b陽性のMyeloid、CD4陽性のT細胞、CD19陽性のB細胞をそれぞれ除去した骨髄細胞、およびCD19陽性の骨髄B細胞をC2C12-BRE細胞と共培養し,BREに対するルシフェラーゼ活性を計測した。その結果、CD19陽性のB細胞を除去した骨髄細胞でのみ、BMP-2誘導性骨芽細胞分化抑制効果が有意に減弱した。また、CD19陽性の骨髄B細胞は、骨髄細胞と比較し、より強いBMP-2誘導性骨芽細胞分化抑制効果を示した。平成29年度は,平成28年度に入手したトランスジェニックマウスを用い,骨髄内に投与されたBMP-2が様々な細胞にどのような影響を与えているか明らかにする.また,Nude mice, Scid mice, Nod-Scid miceを用いた解析も実施し,BMP-2の骨髄投与により,骨髄内の様々な細胞が欠損したマウスにおいて,どの様の表現型を示すか明らかにする.平成30年度は,CXCL12-GFPマウスの解析を行い,骨髄内に投与されたBMP-2が骨髄内の造血幹細胞ニッチに与える影響を検討する予定である.また,現在骨髄細胞がBMP-2誘導性骨芽細胞分化を抑制していることを明らかにしており,今後骨髄のどの細胞が関与しているかを明らかにする予定である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
合成DNAを使用した微生物に対する新世代DNAワクチンの開発の研究

今回の研究において、DNAワクチンおよびウイルスベクターの、微生物感染症に対する予防ワクチンとしての重要性の検討を行った。まず、緑膿菌では、外膜タンパク(Opr F/I)および、III型分泌機構タンパク(Pcr V)、およびPiliの3つのDNAワクチンを作製し、各々のコンポーネント及び3つを混合したものをマウスに免疫した後、1x10^<10>CFUの高病原性緑膿菌D1株を用いてチャレンジしたところ、3つのワクチンの混合免疫では90%以上のマウスが生存し、単独ではPcr V、OprF/I、Piliの順で予防効果があった。また、非免疫マウスは2日で全部死滅した。このことから、我々の今回作製したワクチンは極めて強い感染予防効果があり、また、Pcr Vが非常に強い予防抗原として働くことも判明した。HIV-1の予防効果として、Gag・Pol、Envの遺伝子をCAGプロモーターの入ったDNAベクター及び5型アデノウイルスのファイバー部分を35型に置換したE1欠損型Ad5/35ウイルスベクターに組み込み、新しく開発したこれらのワクチンにて免疫し、次にSHIV_<89.6>を用いてチャレンジしたところ、DNAワクチン+Ad5/35ベクターワクチン免疫群では、25週までの検討では、ウイルス検出限界以下が続いた。今までの5型アデノウイルスベクターは、HIVでは肝障害やAd5に対する中和抗体が高いなど様々な欠点があった。しかし、Ad5/35は、ヒトのウイルスベクターとしては極めて優れていることが判明した。今後、緑膿菌ワクチンにおいては患者にとってより簡便な免疫方法を検討する。HIV-1については臨床第I相試験を行うよう、各種製薬会社などと開発を進めつつある。更に、O-157や、トリインフルエンザなど、重要な感染症の抗原をAd5/35に入れたもので予防性の検討も続け、最良のDNAワクチンまたはウイルスベクターワクチンを作製していく。ヒト型コドン化したDNAワクチンの開発をしており、改良されたものが作製されつつある。今回使用した微生物としては、緑膿菌、インフルエンザウイルス、及びHIVのDNAを使用した。これらのDNAは全てヒト型化したコドンにし、AUGの上流にコザック配列を入れ、CAGプロモーターを挿入した。作っているものにはCpGモチーフが多く入り、ヘルパーエピトープのDNAを挿入し、現在考えられている最良のDNAワクチンを作製した。また、IL-12、GM-CSFサイトカインの遺伝子、DNAワクチンに免疫グロブリン(Ig)Fc部分を結合させた発現プラスミドを作製し、それらを共に注入した場合極めて強い免疫原性を得ることが判明した。次に今回新しくE1欠損型アデノウイルス5/F35型ウイルスベクターワクチンを開発した。このワクチンは肝細胞障害が極めて低く、樹状細胞に感染効率が非常に高いことから強力な特異的免疫能及び感染防御能が誘導できる。よって、これらのワクチンの組み合わせで極めて強く有効性の高いワクチンが開発出来ると考えられる。いくつかの抗原を使用し、DNAワクチンprime、Ad5/F35ワクチンboostにより、テトラマーアッセイ及びICCS法において今までと比し、格段に高い抗原特異的T細胞が出現することを確認した。更に、インフルエンザおよび緑膿菌のタンパクをコードするDNAワクチンでprimeし、Ad5/F35でboostした場合にも、それぞれの微生物に対する強い免疫反応が誘導されることが明らかになった。Ad5/F35によるboostはどのDNAワクチンと組み合わせた場合にも大変有効性が高いことが示唆され、ウイルスベクターワクチンとしてベストであると考えられた。今後、改良したDNAワクチンとAd5/F35を組み合わせることにより、さらに有効性の高いワクチンレジメンを見出していく予定である。

今回の研究において、DNAワクチンおよびウイルスベクターの、微生物感染症に対する予防ワクチンとしての重要性の検討を行った。まず、緑膿菌では、外膜タンパク(Opr F/I)および、III型分泌機構タンパク(Pcr V)、およびPiliの3つのDNAワクチンを作製し、各々のコンポーネント及び3つを混合したものをマウスに免疫した後、1x10^<10>CFUの高病原性緑膿菌D1株を用いてチャレンジしたところ、3つのワクチンの混合免疫では90%以上のマウスが生存し、単独ではPcr V、OprF/I、Piliの順で予防効果があった。また、非免疫マウスは2日で全部死滅した。このことから、我々の今回作製したワクチンは極めて強い感染予防効果があり、また、Pcr Vが非常に強い予防抗原として働くことも判明した。HIV-1の予防効果として、Gag・Pol、Envの遺伝子をCAGプロモーターの入ったDNAベクター及び5型アデノウイルスのファイバー部分を35型に置換したE1欠損型Ad5/35ウイルスベクターに組み込み、新しく開発したこれらのワクチンにて免疫し、次にSHIV_<89.6>を用いてチャレンジしたところ、DNAワクチン+Ad5/35ベクターワクチン免疫群では、25週令までの検討では、ウイルス検出限界以下が続いた。今までの5型アデノウイルスベクターは、HIVでは肝障害やAd5に対する中和抗体が高いなど様々な欠点があった。しかし、Ad5/35は、ヒトのウイルスベクターとしては極めて優れていることが判明した。今後、緑膿菌ワクチンにおいては患者にとってより簡便な免疫方法を検討する。HIV-1については臨床第I相試験を行うよう、各種製薬会社などと開発を進めつつある。更に、O-157や、トリインフルエンザなど、重要な感染症の抗原をAd5/35に入れたもので予防製の検討も続け、最良のDNAワクチンまたはウイルスベクターワクチンを作製していく。
医療処置を受ける幼児の対処能力を高める感性的言語の研究

本研究では,小児医療現場で使用されているオノマトペの実態を明らかにし,医療処置に応じた説明モデルを作成し,その有効性を検討した。面接調査および全国調査の結果,医療従事者は幼児にオノマトペを用いて説明していることが多いということが明らかになった。本結果を受けて,オノマトペの説明モデルを作成し,採血を受ける幼児を対象に介入研究を実施した。結果,オノマトペで説明を受けた方が説明を受けなかった子どもより不安や恐れが低い傾向がみられた。今後,小児医療現場でのプレパレーションに有効活用できる可能性が示唆された。本年度は次の3点について計画を実施した。1)平成25年度の結果報告:平成24年度に実施した,先行研究の検討およびインタビュー調査の結果報告を行った。医療場面における看護師の対幼児発話には次の特徴がみられた。1オノマトペ表現が豊富にみられた。2「オノマトペ+する」動詞が多かった。3繰り返し表現のオノマトペが多かった。4オノマトペ語彙を係り元に,係り先を一般動詞とする端的な表現が多かった。オノマトペは,状況喚起力,身体性,心情融和性を持つ有用なことばである可能性が示唆された。学会発表3件(日本小児保健協会学術集会,大山人間科学研究会定例会,日本看護科学学会学術集会),論文発表1件(横浜創英大学研究論集)。2)調査研究-1:全国の病院施設リストから,総合病院,大学病院,小児専門病院,医院(総数:63施設)に依頼し小児科に勤務する看護師・医師(総数:540名)を対象に質問紙調査を実施した。調査の目的は,採血を受ける幼児に説明することばの把握であった。質問紙の内容は,採血手順に沿ったことばの選択式・自由記述式,および,職種,勤務施設,勤務年数,居住地など,ことばに影響を及ぼす要因を属性とした自記式質問紙を独自に作成した。実施にあたっては,各施設長に依頼文書を郵送し,看護師・医師宛の研究依頼文,質問紙,個別郵送用封筒の配布を依頼した。結果,看護師・医師230名の回答を得た(回収率42.6%)。採血場面における幼児への説明では,オノマトペを中心としたことばの特徴と傾向が示された。また,幼児に対してオノマトペを使用することによる長所,短所について多くの記述がみられた。引き続き,データ分析中である。3)調査研究-2:全国の看護系大学,短期大学,専門学校のうち,承諾が得られた教育機関(総数:10校)に依頼し,小児看護学実習前後の看護学生を対象に質問紙調査を実施中である(総数530名)。本研究の目的は,医療処置を受ける幼児への支援として,幼児が理解し受け入れられることばを調査し,個々に応じた望ましい説明モデルの開発を目指すことである。1)国内外の先行研究を検討し,これまでの研究成果をまとめた。2)研究倫理審査委員会において研究実施への承認を受け,研究協力者として,小児病棟看護師の協力を得た。3)総合病院小児病棟で5年以上の臨床経験をもつ看護師10名を対象とし,インタビュー調査を実施した。医療処置を受ける幼児のイラストをタブレット端末に設定し視覚刺激とした。看護師には端末に映し出されたイラストの幼児に向かい医療処置を説明するよう教示した。面接内容はICレコーダーに録音し逐語録に起こした。得られた看護師の対幼児発話データを分析した。分析にはテキストマイニングソフトを用いて形態素・構文解析を行った。その結果,看護師は難解な医療用語を幼児用に変化させている,オノマトペ(擬音語・擬態語)に代表される,感性的言語を多用していることがわかった。看護師が使用するオノマトペには[動き(動作)]と[音(聴覚)]を利用した働きかけが多くみられた。オノマトペを用いることによって,単語の示す行動の視覚的イメージが触発されことが予想された。オノマトペは「量と質」をあわせて指示できることから,過剰な情報量を防ぎ,幼児とのコミュニケーションに活用できる可能性が示唆された。さらに,個々の医療処置場面での対幼児発話に含まれる特徴語を分析中である。本研究の最終年度となる平成26年度は,これまでの調査結果をもとに,幼児用のオノマトペ説明モデルを作成し,その効果を検証した。1)介入実験:関東圏の総合病院小児科外来に依頼し,採血を受ける3歳から6歳の幼児とその保護者を対象とした。倫理的配慮として,研究者所属施設および病院の倫理委員会の承認を得て実施した。

期間は,平成26年8月平成27年1月であった。方法は,幼児用のオノマトペ説明モデルをオノマトペ群,オノマトペを用いない標準的な説明を非オノマトペ群とし,群間比較を行った。具体的には,小児科外来を訪れた診察順に,対象者を2群間(オノマトペ群と非オノマトペ群)に交互に割り当てる無作為化比較試験とした。結果,36組の調査協力が得られた。このうち,採血穿刺数2回以上,過去の採血経験1ヶ月以内の子どもを除外し,オノマトペ群13組,非オノマトペ群13組の有効データを得た。過去に採血経験がなかった子どもは8名いた。主観的評価であるFace Rating Scaleでは,オノメトペ群の方に痛みが弱い傾向が認められた。客観的評価であるFLACC得点では,オノマトペ群の方が採血前に不安や恐れが高い傾向がみられたが,採血後には非オノマトペ群より有意に低下することが示されたことから,オノマトペを用いた介入の有効性と考えられた。医歯薬学研究2年目にあたる平成25年度は,医療場面の中で最も頻繁に行われる採血場面に照準を当て,使用されているオノマトペの全国調査を実施した。さらに小児看護学実習前後の看護学生を対象に,対幼児発話におけるオノマトペ出現の有無および変化を把握する調査研究を新たに追加した。これまでの調査を通して,医療場面での対幼児発話に含まれるオノマトペの特徴が明らかとなり,幼児への説明モデル試作を検討するために必要な資料が整えられてきたことから,おおむね順調に進んでいると評価した。研究初年度にあたる24年度は,医療処置場面において,看護師が幼児に使用している感性的言語の実際を把握するため,10名の看護師に面接調査を実施することができた。分析は,テキストマイニングソフトを用いて形態素・構文解析を進めている。得られた結果を受けて,次年度取り組む方向性が明確になった。初年度の計画に沿って進行できたことから,概ね順調に経過したと評価している。最終年度にあたる平成26年度は,平成25年度に実施した全国調査を分析し,採血を受ける幼児への説明モデルを作成する。説明モデルの試作段階で,小児看護学教員,大学医療系教員,大学心理学系教員など,各分野の専門家と協議し検討する。最終的に作成された説明モデルを使用し介入研究を行う。また,先行研究の検討から,効果測定の妥当性を高めるため,参加観察法以外に追加指標が必要となった。そこで,生理学的指標の選定を新たに考えている。対象者は,採血を受ける幼児複数名を考えており,倫理的側面に配慮しながら慎重に進める予定である。25年度は,抽出された感性的言語を基に質問紙を作成し,研究倫理委員会における研究実施の承認を得ることが必要である。その後,郵送法による質問紙調査を実施する。倫理的配慮として,質問紙の返信をもって同意を得たとし,研究への依頼文には,任意参加であること,同意が得られなかった場合も対象者が不利益な対応を受けることはないことを明記する。対象者は,小児専門病院,総合病院の小児病棟に勤務する看護師など100名程度を考えている。集計結果から,医療処置場面毎の特徴語を抽出し整理する。今後,より詳細に幼児の支援に必要な感性的言語の評価を進めていく予定である。質問紙の返送は料金受取人払い郵便を利用しているため,支出は回答数により左右される。
古代出雲文化の展開に関する総合的研究ー斐伊川下流域を中心としてー

本研究は、斐川町荒神谷遺跡における弥生時代の各種青銅器の大量出土、松江市岡田山古墳出土大刀より銘文検出によって、近年改めて注目されてきた古代出雲文化の総合的な解明を目指すものである。その際、とくに西部出雲における地域史の展開に着目し、これに地質学、地理学、考古学、古代史学、社会・民俗学の各分野からのアプローチによる問題究明の方法をとった。このことは古代から現在まで出雲地方の主神として君臨してきている杵築大社の存在を初めとして顕著な古代遺跡の集中する西部出雲が、古代出雲の歴史的展開の一方の極を成したとされながらも、その具体的な解明は余りなされていないという事情によっている。問題解明の第一の焦点は出雲平野の形成過程とその画期を見出すことにある。自然研究グループの成果によれば、弥生時代には平野の骨格部分が出来上り、その後小規模な変化、例えば斐伊川の流路の変更、小海進を繰返えし、近世前期に今日的な平野の完成がみられたようである。第二の解明点は、このような平野の変遷と開拓史がどう対応するかにある。考古学、古代史研究グループによれば、開拓の第一の画期は弥生時代の後半期にあり、この段階で西部出雲にまとまった政治集団が誕生した。第二の画期は、6世紀7世紀にある。これも平野の可耕地拡大と関連するが、厳密な相関関係は未解明。少くとも神門臣等が主導する開発が想定されよう。そして第三の画期が杵築大社による古代末中世成立期の大開発で、神門水海の規模縮小、海の影響がほとんど断たれたことと符号する。第三の解明点は、当地の宗教事情が、このような地域史の変遷をどのように語り伝えているのかという問題にある。おそらく中世一宮制の成立・杵築大社の政治・経済・宗教の全面支配の確立が、宗教的伝統形成に決定的な意義を有しているとみることはできよう。考古学班は、主として出雲平野における原始・古代集落の変遷とその特徴を捉えることを主眼に調査研究を進めた。具体的には出雲市矢野遺跡を発掘調査し、出雲平野における弥生・古墳時代の中心的集落跡解明に一歩踏込んだ。成果としては集落が立地する基盤層の形成の時期と成因について解明の見通しを得たこと、特殊土器の検出によって弥生期の中心的集落としての性格の一端が捉えられたこと等である。古代史班では出雲国関係の古代末期の文書調査を悉皆的に実施し、千家文書・出雲大社文書に開発関係の史料が存することを突き止めた。また、正倉院文書(「出雲国大税賑給歴名帳」)の校訂を行い、中央政府における出雲国出身者の動向を探ぐった。社会学・民俗学班では、(1)美保神社・出雲大社の現行神事の溯源的研究を行い、前者の祭事に確実に古代に溯るもののあることを明かにしたこと,(2)田植歌の分布から出雲・石見の地域性の変遷と特性を追求したこと,(3)斐伊川流域における「風土記」記載の寺社の儀礼について全面的な資料収集を実施したこと等がある。自然班では、地理学的方法によって平野の形成過程を追求することと、沖積地の微地形および表層堆積層の解析により平野の形成史を明かにすること、神西湖の湖底堆積物の分析による神門水海の発達史の解明等を行った。これらによると中世末・近世初以降において出雲平野の様相に一つの形成画期があり、それが上流域における砂鉄生産と大きくかかわることが想定された。

本年度の研究概要は、以上のように、多面的なアプローチによる出雲平野の形成とそこでの歴史の展開に切り込んだが、成果はまだ部分的であり、特に平野の形成史については視点の検討も含めて、古代へどう溯源的究明の手を伸ばすかが大きな課題である。考古学班は先年度に続き出雲市矢野遺跡の発掘を継続する一方出雲平野の踏査を他の研究班と共同で実施した.矢野遺跡の調査では居住遺構の検出はできなかったが,弥生前期以降古墳時代までの土器が多量に出土して中心的集落の様相がさらに明確になった.また分布踏査の結果では,斐伊川・神戸川が形成した微高地上の古代集落の消長相と微高地ごとの特性の存在を捉えることができた.古代史班では六国史をはじめとして古代出雲国関係資料の蒐集と出雲大社関係史料(旧社家森脇文書)の蒐集・整理を行い,ほぼ必要とされるこの方面の作業を終えた.社会・民俗班は,(1)美保神社の祭祀研究(信仰伝承・古代習俗遺習の調査分析),出雲祭祀文化と越の国の祭祀文化の比較研究の続行,(2)斐伊川流域の寺社に関する資料のデーターベース化,湖陵町差海地区「神事華」の実態調査,(3)安来方面,益田方面の民話資料の蒐集と分析により「異類女房譚,に3類型が存すること,その3類型が出雲地方に集中することを把んだ.自然班は神西湖と菱根池(最終まで残った古宍道湾の残部)でボーリング探査を実施した.菱根池では良好なコアは採取できなかったが,少くとも奈良時代には斐伊川がこの部分に流入していた可能性は想定しえた.神西湖では水深1.5mの推積層が弥生時代古墳時代の海退期に相当する見通しをえた.またここで縄文海進層の存在も知られた.今年度は,以上の概要から知られるように課題がさらに絞り込まれ,テーマの解明に向けてさらに切り込みが行われたと総括できる.最終年の昭和63年度において、自然、考古学、古代史、社会、民俗各研究グループとも2年間にわたる研究・調査の補足と総括作業を行った。その取組み状況と成果は次の通りである。1)自然研究グループ;2年間に行ったボーリング調査の結果にもとづき、繩文時代奈良・平安時代の出雲平野形成過程の諸画期を探ることを課題に作業を進めた。その結果古墳時代に一時的に急速な海進現象が認められ、また奈良時代頃に斐伊川が一旦菱根池に流入後神門水海に注ぐという古地理上の推定を裏付ける資料を得た。2)考古学研究グループ;出雲市矢野遺跡の研究では、この遺跡において鋳銅が行なわれた可能性、玉作関係逆料の抽出等の成果があった。西谷弥生墳丘墓の第3号墓第4主体に大量の特殊土器がともなう事実を確認したことも大きな成果である。3)古代史研究グループ;古代末中世成立期における杵築大社の主導礎史料の「大税賑給歴名帳」の分析と、その過程での原史料校訂作業において従来の見解の修正点を検出するという成果を得た。4)社会・民俗研究グループ;「出雲国風土記」等の古代史料に散見する寺社で、名称が現存するもののありようや祭礼、儀式のデーターベス化完成を目指して作業を進めながら、そのことの中で問題となった機能神について考察を行った。以上、本年度の成果は、すべて報告書に収載した。要約を示せば、斐伊川・神戸川と神門水海の関係、菱根池・神西湖の形成等、出雲平野の変遷史と原始・古代中世成期に至る地域史の諸画期に一定の対応関係が存在することが推察できたことと、そうした自己完結的な地理的環境と地域的伝統の相関関係の解明にも一歩踏込むことができた。
炭酸ガスの促迫拡散による模型人工肺の性能改善

近年,急性呼吸不全に対して炭酸ガスのみを膜型人工肺により効率よく除去する方法が有用であると, Kolobowにより提唱され,炭酸ガス除去効率の高い人工肺が必要とされている.血液において大部分の炭酸ガスは重炭酸イオンの形で輸送され,重炭酸イオンの量が多い場合,物理的に溶存した炭酸ガスのみの分子拡散を比較すると,見かけの輸送量が増大する効果を生み,これを促進拡散という.本研究では,この現象を人工肺の炭酸ガス除去機能に利用することによって,人工肺の炭酸ガス除去性能を改善することが目的である.そこで炭酸ガス除去性能が促進拡散によってどのような影響を受けるかを実験的に調べた.血液中の炭酸ガスの促進拡散は,赤血球中に含まれる炭酸脱水酵素の作用のために顕著に表われる.炭酸脱水酵素は,溶存炭酸ガスを重炭酸イオンに変化する反応速度を高める作用を持つため,重炭酸イオンの量が増加するからである.そこで重炭酸脱水酵素の働きを顕著にするため,本研究では,イヌから採取された血液中の赤血球膜を浸透圧によって破壊し,内部の酵素を一様に血液中に分布させた状態で炭酸ガスの拡散係数を測定し,さらに微孔性ポリプロピレン中空系の人工肺に流して炭酸ガス除去量を測定した.溶血した血液試料の見かけの拡散係数は,低炭酸ガス分圧のもとで顕著な増加を示し,ヘモグロビン含有量約12g/dlの時,分子拡散の場合の約3倍以上に増加した.この結果をふまえて人工肺に溶血した血液を流して,炭酸ガス除去量を測定した結果,溶血していない血液の場合よりも約50%以上炭酸ガス除去量が増加した.しかしながら,実際に人工肺を臨床医学に用いる場合には,溶血した血液を用いることは出来ないため,精製された炭酸脱水酵素を血液に加えるなど,さらに工夫が必要と思われる.近年,急性呼吸不全に対して炭酸ガスのみを膜型人工肺により効率よく除去する方法が有用であると, Kolobowにより提唱され,炭酸ガス除去効率の高い人工肺が必要とされている.血液において大部分の炭酸ガスは重炭酸イオンの形で輸送され,重炭酸イオンの量が多い場合,物理的に溶存した炭酸ガスのみの分子拡散を比較すると,見かけの輸送量が増大する効果を生み,これを促進拡散という.本研究では,この現象を人工肺の炭酸ガス除去機能に利用することによって,人工肺の炭酸ガス除去性能を改善することが目的である.そこで炭酸ガス除去性能が促進拡散によってどのような影響を受けるかを実験的に調べた.血液中の炭酸ガスの促進拡散は,赤血球中に含まれる炭酸脱水酵素の作用のために顕著に表われる.炭酸脱水酵素は,溶存炭酸ガスを重炭酸イオンに変化する反応速度を高める作用を持つため,重炭酸イオンの量が増加するからである.そこで重炭酸脱水酵素の働きを顕著にするため,本研究では,イヌから採取された血液中の赤血球膜を浸透圧によって破壊し,内部の酵素を一様に血液中に分布させた状態で炭酸ガスの拡散係数を測定し,さらに微孔性ポリプロピレン中空系の人工肺に流して炭酸ガス除去量を測定した.溶血した血液試料の見かけの拡散係数は,低炭酸ガス分圧のもとで顕著な増加を示し,ヘモグロビン含有量約12g/dlの時,分子拡散の場合の約3倍以上に増加した.この結果をふまえて人工肺に溶血した血液を流して,炭酸ガス除去量を測定した結果,溶血していない血液の場合よりも約50%以上炭酸ガス除去量が増加した.しかしながら,実際に人工肺を臨床医学に用いる場合には,溶血した血液を用いることは出来ないため,精製された炭酸脱水酵素を血液に加えるなど,さらに工夫が必要と思われる.
アドレノメデュリンの分子生物学的及び発生工学的研究

アドレノメデュリン、PAMPは共通の遺伝子より産生される降圧ペプチドである。今回我々はこれらペプチドの生理作用を発生工学的手法を用いて検討した。アドレノメデュリンノックアウトマウスは胎生致死であったため、ヘテロ接合体を用いて検討した。昨年度、ヘテロ接合体において、酸化ストレスの増大と共に冠動脈内膜の増殖、外膜の増殖が著明となり、アドレノメデュリンは酸化ストレスに拮抗する内因性の物質であり、酸化ストレスによる臓器障害に防御的に作用する因子である可能性をしめした。本年度は1年齢のヘテロ接合体について検討したところ、やはり酸化ストレメの増大と共に、骨格筋におけるインスリン抵抗性が発症した。このインスリン抵抗性がアドレノメデュリン投与、抗酸化物質投与にて改善することを明らかにし、生活習慣病発症における酸化ストレスとアドレノメデュリンの関係について明らかにした。1 AMの血管平滑筋膜電位の調節に果たす役割血管平滑筋細胞に対するアドレノメデュリンの直接作用を検討するために、ラット大動脈平滑筋細胞を初代培養し、形質転換を起こす以前の時期に電気生理実験を行った。whole cell clamp法ではアドレノメデュリン(AM,10nM)は血管平滑筋細胞膜を、約5mV過分極した。アドレノメデュリンの作用機構としてcAMPなどのdiffusibleなセカンドメッセンジャーの関与が知られているので、これらの可溶性の因子が失われないで実験が行えるperforated whole cell clamp法に切り替えた。するとこの方法では同濃度のAMで約10-15mVの過分極反応が認められた。電流固定法で過分極反応のイオン機構を調べたところ、AMで活性化される電流はよわい内向き整流性を示し、反転電位はカリウムの平衡電位に近かった。細胞外Kイオン濃度を変化させたところ反転電位がカリウムの平衡電位にほぼ従って変化した。以上よりAMは血管平滑筋の弱い内向き整流性を有するカリウム電流を活性化して膜を過分極し、このことがAMによる血管の弛緩に関与すると考えられた。2ノックアウトマウスの作成組み替え遺伝子を作成し、TT2ES細胞にエレクトロポーレーション法にて導入し、ネオマイシンにて組み替え体を取得した。さらにCreを過剰発現した細胞と共存培養し、LoxPの組み替えを行いAM単独ノックアウトとプロアドレノメデュリンノックアウトに相当するES細胞を取得した。これらの3種のES細胞をCD-18細胞期卵細胞にアグリゲーション法にて導入し、擬妊娠マウスに卵移植し、キメラマウスを取得した。現在このキメラマウスをC57BL/6マウスと交配させ欠損マウスを取得する途上である。アドレノメデュリンをコードする遺伝子直前に停止コドンを挿入したターゲッティングベクターを作成し、従来の方法を用いてES細胞に遺伝子を導入した。このES細胞を受精卵に戻すことによりアドレノメデュリン単独ノックアウトのキメラマウスを作成した。さらにこのキメラマウスを交配させることでF1世代のヘテロ接合体を得、これらを交配させてホモ接合体の作出を行っている。また、雄ヘテロ接合体にアンジオテンシンII、8%食塩食負荷を8週齢より2週間行い、心臓の病理学的変化を検討した。負荷前の収縮期血圧はヘテロ接合体とワイルド間で差を認めなかった。(150±10 mmHg vs 142±8 mmHg)。負荷後1週間で血圧はヘテロ接合体で170±9 mmHgワイルドで168±10 mmHgと上昇したが2週間後にはヘテロ接合体で160±13 mmHgと低下傾向にあり、ワイルドでは173±9 mmHgで変化無かった。心重量/体重比はヘテロ接合体で0.0068±0.0003とワイルド(0.0061±0.0002)に比べ有意に大きかった。また、冠動脈は内膜の増殖、外膜の増殖が著明であった。腎臓の動脈系には異常を認めなかった。アドレノメデュリンノックアウトマウスは胎生致死であるが、器官形成に異常を認めず、胎盤血流にも異常は無かった。アドレノメデュリンは胎児発育に重要な役割を果たしているが、その詳細は不明である。

また、雄ヘテロ接合体にアンジオテンシンII、8%食塩食負荷にて心重量/体重比はヘテロ接合体で0.0068±0.0003とワイルド(0.0061±0.0002)に比べ有意に大きかった。また、冠動脈は内膜の増殖、外膜の増殖が著明であった。腎臓の動脈系には異常を認めなかった。ヘテロ接合体では酸化ストレスが著明に増加していた。またアドレノメデュリンは酸化ストレスにより増加するが、ヘテロ接合体ではアドレノメデュリンの欠乏が認められた。このことから、アドレノメデュリンは酸化ストレスに拮抗する内因性の物質であり、これら臓器障害に防御的に作用する因子である可能性が示唆された。アドレノメデュリン、PAMPは共通の遺伝子より産生される降圧ペプチドである。今回我々はこれらペプチドの生理作用を発生工学的手法を用いて検討した。アドレノメデュリンノックアウトマウスは胎生致死であったため、ヘテロ接合体を用いて検討した。アンジオテンシンII、8%食塩食負荷を行ったところ、冠動脈は内膜の増殖、外膜の増殖が著明であった。ヘテロ接合体では酸化ストレスが著明に増加することを電子スピン共鳴法、3-nitrotyrosine染色、尿中イソプロスタン排泄量、及び8OHdG排泄量にて確認した。またアドレノメデュリンはアンジオテンシン、食塩負荷により野生型では増加するが、ヘテロ接合体では増加しなかった。このことから、アドレノメデュリンは食塩、アンジオテンシン負荷による酸化ストレスに拮抗する内因性の物質であり、酸化ストレスによる臓器障害に防御的に作用する因子である可能性が示唆された。昨年度、ヘテロ接合体において、酸化ストレスの増大と共に冠動脈内膜の増殖、外膜の増殖が著明となり、アドレノメデュリンは酸化ストレスに拮抗する内因性の物質であり、酸化ストレスによる臓器障害に防御的に作用する因子である可能性をしめした。本年度は1年齢のヘテロ接合体について検討したところ、やはり酸化ストレスの増大と共に、骨格筋におけるインスリン抵抗性が発症した。このインスリン抵抗性がアドレノメデュリン投与、抗酸化物質投与にて改善することを明らかにし、生活習慣病発症における酸化ストレスとアドレノメデュリンの関係について明らかにした。
ナトリウム利尿ペプチド(ANPおよびBNP)のプロセシングおよび分泌機構の解明

BNPはANPと同様に心臓で合成され、血中に分泌されてホルモンとして機能することから、心臓内在性BNPおよび血中循環型BNPの同定を行ないプロセシング過程を検討した。その結果、ラットでは心房,心室中共にANPがγーANPとしてのみ存在するのに対して、BNPはγーBNPとBNPー45の2分子型で存在し、心房中ではBNPー45、心室中ではγーBNPが主成分であり対照的であった。一方血中ではBNPー45として存在した。ヒト心臓でもBNPはγーBNPとBNPー32の2分子型で存在し、心房中ではBNPー32,心室中ではγーBNPが主要分子型であった。しかし血中では、ラットの場合とは異なりγーBNPとBNPー32の2分子型で存在し、健常人ではγーBNPが主成分であった。ANPの場合αーANPとしてのみ存在することを考えると特徴的である。このように、BNPは種差による著しい前駆体構造の相違および特徴的なmRNA構造を反映して、ANPとは異なる生合成,プロセシングおよび分泌機構による調節を受けていると考えられ、現在病態との関連について検討中である。最近我々が発見した第3のNa利尿ペプチド;CNP(C型Na利尿ペプチド)の生体内分布と内在性分子型についても検討した結果、CNPは中枢神経系にANPやBNPに比べてかなり高濃度で分布するが、末梢組織では副腎髄質に検出される以外は心臓を含む他のいずれの部位にも検出されなかった。CNPは中枢神経組織中でCNPー22とCNPー53の2分子型で存在するが、CNPー53が510倍多く主要分子型であった。以上の結果、ANPとBNPが主に末梢で循環ホルモンとして働くのに対し、CNPは主に中枢神経系で作動するNa利尿ペプチドで、その発現およびプロセシング機序もANP,BNPとかなり異なるものと考えられる。Na利尿ペプチドに特異的なプロセシング酵素については、高感度で特異的な活性測定法を確立し、これを用いての精製が現在進行中である。ラットBNPおよびヒトBNPに特異的な高感度ラジオイムノアッセイ(RIA)法を用いて、ラットおよびヒト心房組織中より内在性BNPを単離構造決定すると共に、心臓におけるBNPのプロセシング過程(内在性分子型)および血中循環型BNPの分子型について検討した。その結果、(1)ラット心臓では、心房,心室中共にANPは高分子量型のγーANPとしてのみ存在するのに対して、BNPはγーBNPとBNPー45の2分子型で存在した。心房中ではBNPー45が主成分であるのに対し、心室中ではγーBNPが主成分であった。また、ラットBNPは血中ではBNPー45として存在することが明らかとなった。(2)ヒト心臓(剖検時の心臓)でも、BNPはγーBNPとBNPー32の2分子型で存在し、心房中ではBNPー32,心室中ではγーBNPが主要分子型であった。しかし、血中では、ラットの場合とは異なり、BNPはγーBNPとBNPー32の2分子型で存在し、高分子型のγーBNPを主成分とすることが明らかとなった。これは、ANPが血中では低分子型のαーANPとしてのみ存在することを考えると非常に特徴的である。ヒト血中におけるγーBNPの同定は、BNPの生理的意義を考える上で重要であり、今後病態との関連などについてさらに詳細検討が必要であると思われる。以上の結果は、ラットおよびヒトにおいてANPとBNPが異なる生合成,プロセシングおよび分泌機構による調節を受けることを反映したものと考えられる。ANPおよびBNPのプロセシング酵素については、現在心房顆粒の大量調整,ANPまたはBNPに特異的なプロセシング活性測定法の確立,非特異的プロテア-ゼ活性に対する種々のインヒビタ-の検討,酵素の安定性など、精製を進める上での基礎的検討を行っている。

最近我々が発見した第3のNa利尿ペプチド;CNP(C型Na利尿ペプチド)の生体内分布と内在性分子型についても検討した結果、CNPは中枢神経系にANPやBNPに比べてかなり高濃度で分布するが、末梢組織では副腎髄質に検出される以外は心臓を含む他のいずれの部位にも検出されなかった。CNPは中枢神経組織中でCNPー22とCNPー53の2分子型で存在するが、CNPー53が510倍多く主要分子型であった。以上の結果、ANPとBNPが主に末梢で循環ホルモンとして働くのに対し、CNPは主に中枢神経系で作動するNa利尿ペプチドで、その発現およびプロセシング機序もANP,BNPとかなり異なるものと考えられる。Na利尿ペプチドに特異的なプロセシング酵素については、高感度で特異的な活性測定法を確立し、これを用いての精製が現在進行中である。平成2年度の研究で、BNPは種差による著しい前駆体構造の相違および特徴的なmRNA構造を反映して、ANPとは異なる生合成,プロセシングおよび分泌機構による調節を受けていることを明らかにした。一方、本研究と並行して進めていた脳内生理活性ペプチドの検索研究において、平成2年度にブタ脳抽出物より22残基のアミノ酸よりなる新しいNa利尿ペプチドを単離.構造決定し、これが第3のNa利尿ペプチド;Cー型Na利尿ペプチド(CNPー22)であることを明らかにした。また続いてCNPー53の単離同定,cDNA解析によるブタ,ラットおよびヒトCNP前駆体構造解析にも成功し、哺乳類におけるNa利尿ペプチドファミリ-がこれまでのANP,BNPにCNPを加えた3種のペプチドにより構成されることを明らかにした。そこで本年度は、Na利尿ペプチドファミリ-全体のプロセシングを明らかにすることを目的とし、第3のNa利尿ペプチドであるCNPの体内分布と内在性分子型についてRIA法により検討し、以下の結果を得た。(1)CNPは脳内各部位に広く分布するが、ブタ脳内では0.79pmo1/gでANPの0.06pmo1/g,BNPの0.52pmol/gを上回り3種のNa利尿ペプチド中で最も高濃度であった。ヒトにおいても視床下部,橋ー延髄などでCNP濃度は1.04pmo1/gでANPの27倍,BNPの69倍と高濃度であった。(2)一方、未梢組織については、副腎髄質(ブタ)に0.70pmo1/g検出された以外は心臓を含む他のいずれにも検出されなかった。(3)中枢神経組織の各部分における内在性分子型について分析したところ、いずれの部位でもブタ,ヒト共にCNPー22とCNPー53の2種の分子型で存在するが、CNPー53の方が510倍多いことが明らかとなった。以上の結果、ANP,BNPが主に未梢で循環ホルモンとして働くのに対し、CNPは中枢神経系でのみ作動するNa利尿ペプチドで、その発現およびプロセシング機序もANP,BNPと大きく異なるものと考えられる。
強相関電子系の異常金属特性の理論研究

強相関電子系の典型例として、先ず銅酸化物高温超伝導物質を考える。銅酸化物高温超伝導物質は、母物質であるモット絶縁体に正孔(或いは電子)をドープしたものである。この物質に関する温度Tと正孔ドープ量δ(電子ドープの場合はδ<0)とで描かれるT-δ相図において、超伝導遷移温度T_cより高温側に異常金属相と呼ばれている領域が存在し、そこでは同物質は様々な異常な物性を示す。我々のシナリオによれば、異常金属相の高温側では、超交換相互作用J_sによって誘起された反強磁性揺らぎが主役を演じ、低温側では、超伝導揺らぎとそれによって誘起されたpseudogapが主役を演じる。主役の演じ手の入れ替わりが、異常金属特性を決めている。このようなシナリオを実証するために以下の考察を行った。強相関電子系の典型例として銅酸化物高温超伝導物質を考える。銅酸化物高温超伝導物質は、母物質であるモット絶縁体に正孔をドープしたものである。この物質に関する温度Tと正孔ドープ量δとで描かれるT-δ相図において、超伝導遷移温度T_cより高温側に異常金属相と呼ばれている領域が存在し、そこでは同物質は様々な異常な物性を示す。このようなシナリオを実証するための予備的考察の結果は、既に公表した.(Phys.Soc.Jpn.68No.8(1999)2506-2509)。今回は、先の考察の発展として、これまでの近似手法の不十分な点を改良し、結果を確たるものにすることを目指した。これまでの取り扱いの中、反強磁性揺らぎに関する部分が、必ずしも十分ではなかったので、それを改良した。実際にRPA近似をFLEX近似に置き換えた計算を行い、実験結果との比較をより定量的に行えるようにした。また、上述のシナリオにおいては、超伝導揺らぎの擬2次元性及び強結合性が重要な役割を果たしていると考えられており、それらを明らかにするため、より簡単な模型を用いた解析的な考察を行った。これらの考察と並行して、強相関電子系のもう一方の典型例であるCe,Yb,U等を含む金属間化合物(重い電子系と呼ばれる物質)の示す異常金属特性(特に、非Fermi液体的振る舞い)についての考察を行った。超伝導ゆらぎと反強磁性スピンゆらぎそれぞれの強さを表す感受率の計算に際して、自己エネルギー補正として超伝導ゆらぎと反強磁性スピンゆらぎの両者の効果を考慮した準粒子グリーン関数を用いる。(self-consistent t-matrix近似及びFLEX近似)大変な数値計算を遂行した結果、両感受率及び準粒子グリーン関数に関する自己無撞着解を得た。それらの結果より、実験結果をよく説明するT-δ相図を与えることができた。これによって、銅酸化物高温超伝導物質に関する最も基本的な問題は解決されたと確信する。(Kobayashi, Tsuruta, Matsuura and Kuroda, J. Phys. Soc. Japan 70(2001)1214.)これらの考察と並行して、強相関電子系のもう一方の典型例であるCe,Yb,U等を含む金属間化合物(重い電子系と呼ばれる物質)の示す異常金属特性(特に、非Fermi液体的振る舞い)についての考察を行った。

この物質に関する温度Tと正孔ドープ量δとで描かれるT-δ相図において、超伝導遷移温度T_cより高温側に異常金属相と呼ばれる領域が存在し、そこでは同物質は様々な異常な物性を示す。我々のシナリオによれば、異常金属相の高温側では、超交換相互作用J_sによって誘起された反強磁性揺らぎが主役を演じ、低温側では、超伝導揺らぎとそれによって誘起されたpseudogapが主役を演じる。主役の演じ手の入れ替わりが、異常金属特性を決めている。このようなシナリオを実証するために以下の考察を行った。これまでは、正孔ドープ(δ>0)の場合を考えてきたが、電子ドープ(δ>0)の場合についても同様なシナリオが成り立つことを確かめた。また、T-δ相図におけるδの正負に関する非対称は、準粒子状態の生い立ちの違いによって説明されることが判った。(Kobayashi, Tsuruta, Matsuura and Kuroda, J.Phys.Soc.Japan 71(2002)1640.)
コレステロール生合成の鍵酵素となるフラビン酸素添加酵素に関する生物有機化学的研究

ラット組み換え酵素を用いて、天然より酵素阻害剤のスクリーニングを行ったところ、これまでコレステロール低下作用が認められていた緑茶のカテキンEGCG(IC_<50>=0.69μM)や、生薬大黄由来のガロイルグルコースなどの没食子酸エステルに、強く選択的な阻害活性が認められた。ガロイル基の欠如した化合物はほとんど活性を示さず、従って活性の発現にはガロイル基の存在が不可欠であると考えられた。次に、鎖長の異なる一連のアルキルガレートについて阻害活性を検討したところ、アルキル鎖の長さに応じて強い活性が認められ、ドデシルガレート(DG)にEGCGを上回る最強の活性が認められた(IC_<50>=0.061μM)。これまで報告されている哺乳動物由来SE酵素の選択的阻害剤と比べても、これらガレートの酵素阻害活性はかなり強い部類に属する。また、さらに阻害活性の最適化をめざし、基質に類似したイソプレン側鎖やフェニルアルキル側鎖をもった一連のガレートを合成して活性を検討したところ、これら化合物も同様に強い活性を示した。SEによる酸素添加反応は、酵素活性中心におけるフラビンC(4a)-O-O-Hの生成を経て進行するものと考えられており、こうした阻害効果は没食子酸エステルの酵素活性中心への結合とガロイル基による活性酸素種のトラッピングによるものと推測された。既に結晶構造の報告され、SEとはアミノ酸レベルで約20%の相同性を示すシュードモナス由来のp-ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の結晶構造をもとに分子モデリングによる検討を行ったところ、実際に酵素活性中心のフラビン結合部位近傍にEGCGに特異的な結合サイトの存在が示唆された。最後に、これらガレートにはSE阻害活性以外にも、がん細胞におけるアポトーシス誘導活性が認められた。
アロステリック・リボスイッチの起源と進化

タンデムに繋がったグリシンを結合するアプタマーを有する枯草菌のグリシンリボスイッチは、グリシンの有無に応じて、転写を制御し、1つのアプタマーへのグリシンの結合がアロステリック効果を生み出す。本研究で、グリシンリボスイッチのグリシン依存性は、ポリエチレングリコールやエチレングリコールの存在によって失われることを明らかにし、スイッチのON/OFFがターミネータ構造の存在形態によってのみ変調することを示した。ターミネータ構造を含む共通プラットホームが先に生み出され、そこに多様なアプタマー部分が付け加わったというリボスイッチの進化とアロステリシティー獲得に関する知見が得られた。リボスイッチはmRNAの非翻訳領域に存在する機能性のRNAで、特定の物質を認識するアプタマーが、その分子の結合によって立体構造を変化させることによってmRNAにコードされているタンパク質の合成を制御している。当該年度においては、特に、枯草菌に存在するグリシンリボスイッチをターゲットに研究を行った。このリボスイッチはタンデムに繋がったグリシンを結合するアプタマー部位の後ろにへリックス構造を有し、グリシンの結合の有無によってグリシンを分解するタンパク質の合成を制御している。しかし、グリシンとの結合でどのように立体構造が変化するのか、スイッチ機構はどのような仕組みで働いているかなど、メカニズムの重要な部分はよく分かっていない。そこで、T7プロモーターの直後に、グリシンリボスイッチ、および、eGFP遺伝子を配したプラスミドを構築し、これを鋳型としたRNAの転写量を観測すると共に、このグリシンリボスイッチの機能の核と推測されるヘリックス構造に焦点を絞り、その物性について、FRETやTm測定をもとにして評価を行った。その結果、このヘリックス部分が、外部添加物質によって、構造を柔軟に変化させるということが明らかになった。また、面白いことに、エチレングリコールやポリエチレングリコールの存在によって、本来のこのリボスイッチが持つグリシン依存性が失われることも明らかになった。エチレングリコールとポリエチレングリコールは、前者が転写を促進し、後者が転写を制御する方向に機能していることが分かった。本研究では、枯草菌に見られるグリシンリボスイッチをメインの材料として、1.リボスイッチにおけるアロステリック効果の生成の分子機構の解明2.原始tRNAとしてのグリシン-リボスイッチとその機能の起源へのアプローチを目的として研究を推進した。先年度のpreliminaryな発見の解析を押し進め、この2つの課題が相互に関連する部分の解明に進展が見られた。リボスイッチは、発現制御に直接関連するexpressionplatformとリガンド分子を認識するaptamer部分に構造的に分けて考えることができるが、ポリオールの存在下ではグリシン依存性が失われることを明らかにした。このグリシンリボスイッチにおいて、ポリエチレングリコールは、グリシンの有無に関わらず、発現を抑えるように作用し、エチレングリコールは、グリシンの有無に関わらず、発現を促進するように作用することを解明した。また、この作用は、aptamer部分の存在には依存しておらず、単に、expressionplatform部分の仮想的なterminator stemの形成にのみ依存していることが明らかになった。この結果、リボスイッチの進化はexpression platformが先にでき、その後で、aptamerが付け加わったという進化仮説を創出した。リボスイッチは、mRNA中に存在する小分子を認識する天然のRNAアプタマーであり、遺伝子発現を制御している。当該年度においては、最小のアミノ酸であるグリシンを認識することにより、遺伝子発現をオンにし、かつ、天然のリボスイッチの中で、唯一、アロステリック制御を示す「グリシン-リボスイッチ」の最小構成要素の解明に焦点を当て研究を実施した。ステムとループから構成される構造体がタンデムにつながった形態をしているグリシン-リボスイッチのうち、これまでに、コレラ菌、枯草菌などのグリシン-リボスイッチでグリシンの協同的結合が報告されているが、遺伝子発現制御をタンパク質レベルで確認した例は、枯草菌のものに限られている。種々の生物のゲノム配列を解析した結果、既知のグリシン-リボスイッチ様配列中、最小のサイズを持つFusobacterium nucleatumのものに注目した。特にタンデムにつながったRNAの2番目の構造体の下流の10ヌクレオチド付近の注目し、これと相互作用する配列を持つスペーサーを付加した上で、eGFPの遺伝子をさらにその下流に繋げたモニター系を構築した。この系は、枯草菌の系のものと同様に、グリシンの有無によって、eGFPの発現を制御していることを示唆する結果を示した。Fusobacterium nucleatumのグリシン-リボスイッチ様配列は枯草菌のグリシン-リボスイッチに比べ、数十ヌクレオチドも小さいサイズなのにも関わらず、枯草菌のものと同様なメカニズムで動作している可能性が示唆された。昨年度の東日本大震災の影響でやや遅れていた研究の状況から回復の兆しが見られ、当該年度は、おおむね順調に進展していると言える。

特に、昨年度、焦点を当てていたFusobacterium nucleatumのグリシン-リボスイッチ様配列から、枯草菌のグリシンリボスイッチにメインの対象を移すことによって、スイッチのON/OFFのメカニズムに関する仮説の構築とその実験的検証に取り組む手がかりが得られた。また、グリシンリボスイッチをアプタマー部分と発現プラットホーム部分に分け、発現プラットホーム中のヘリックス構造の形成と、発現のON/OFFについての関係を明らかにすることができた。昨年度、未曾有の大震災のために、研究が思うように進まず、研究費に関しても繰り越しを余儀なくされていたが、当該年度は繰り越した研究費を有効に実験に使用することができた。当該年度は、東日本大震災の影響もあり、研究実施場所である東京理科大学基礎工学部生物工学科においても、度重なる節電対策、また入構制限が行われた。その結果、当初予定していた計画通りには、研究を実施できないという状況になり、現状はやや遅れている。研究費の使用額についても、当初予定していた額よりは少なくなってしまったのは、この未曾有の大震災の影響が否めない。しかしながら、当該年度の研究を開始するにあたり、既に、枯草菌のグリシン-リボスイッチの作用をeGFPの発現でモニターする実験系の構築が完了しており、この枯草菌の系を用いたグリシンの有無によるeGFPの蛍光レベル解析を進めることにより、Fusobacterium nucleatumのグリシン-リボスイッチ様配列の系を用いた同様のシステムの構築確立の点においては、順調なスタートが切れたと考え、「研究実績の概要」で示したレベルまでは達することができた。当該年度に、in vitroで明らかになったヘリックス部分の役割が、in vivoでも同様な働きをしているのかを解明するために、eGFPの発現モニタリングを行う。当該年度も同様な試みを行ったが、in vivoでの有効な結果はまだ得られていない。この理由の1つとして、枯草菌のグリシンリボスイッチにも関わらず、プロモーターとして、T7ファージのもの利用したコンストラクトに問題がある可能性がある。プロモーターの変換によって、当該年度の結果を、in vivoにまで拡張した実験を行う。また、本来の目的である、グリシンの認識部位と認識形態の解明のために、Fusobacterium nucleatumのグリシン-リボスイッチ様配列の系を用いた解析を進める。更に、エチレングリコールとポリエチレングリコールが果たす役割について、生命と細胞の進化の観点からのアプローチも行っていく。当該年度にeGFPの発現モニタリングによって動作が示唆されたFusobacterium nucleatumのグリシン-リボスイッチ様配列の系を用いて、グリシンの認識部位と認識形態を同定する。