hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発光特性と機械特性に優れた被覆共役高分子の開発

高分子主鎖が被覆された共役高分子の効率的な合成法を確立し、その光機能材料としての応用展開を行った。共役系主鎖を立体的に孤立させ、励起状態の無輻射失活を抑制することによって、薄膜状態で高い発光特性有する高分子材料の開発に成功した。これらの高分子は、ブレンド性や機械特性において、一般的な共役高分子とはまったく異なる特性を示した。このような利点を生かして、有機発光デバイスへの応用を展開した。本研究は、独自の精密分子設計に基づいて、発光性と機械特性に優れた共役系高分子を合成することを目的とする。平成25年度は、環状側鎖で覆われたモノマー分子の効率的な合成経路の確立を目標とした。分子設計と反応条件を最適化することによって、グラムスケールでのモノマー合成を実現した。このモノマーを用いて、紫、緑、黄、赤色の蛍光性共役系高分子を合成することができた。種々のスペクトル測定、蛍光量子収率測定、蛍光寿命測定などから、我々が新規に設計・合成した共役系高分子が、薄膜状態で優れた発光特性を示すことを明らかにした。非常に興味深いことに、これらの共役系高分子は互いに相分離することなく、任意に混和し、ブレンド膜を形成した。この結果、先の4種類の蛍光色を混合することによって、様々な蛍光色を発する高分子薄膜を作製することができた。高分子のブレンドにおいて、相分離の制御は極めて重要である。我々が設計した高分子は、異なる共役系を持っているにもかかわらず、全てが共通の環状側鎖によって被覆されているため、互いを区別すること無く混和できると考えられる。したがって、高分子の物性(相溶性)と機能(発光性)を独立に設計できる新しい共役系高分子として非常に興味深い。本研究では、高分子主鎖が被覆された共役高分子の効率的な合成法を確立し、その光機能材料としての応用展開を目的とした。共役系主鎖を立体的に孤立させ、励起状態の無輻射失活を抑制することによって、薄膜状態における高い発光特性を期待した。平成25年度までに蛍光性の共役系高分子の合成を確立し、光物性や機械特性について詳細に評価した。その際に、被覆共役系高分子同士はブレンド性が良く、任意に混和し、様々な蛍光色を合成できることを見いだした。そこで平成26年度は高分子ブレンドについて詳細に評価した。青色の蛍光を発する被覆共役系高分子1と黄色の蛍光を発する被覆共役系高分子2のブレンド系について吸収スペクトル、蛍光スペクトル、蛍光寿命測定、および蛍光量子収率測定を行った。ブレンド中では、1から2への効率的な蛍光共鳴エネルギー移動が起こることを確かめた。非常に興味深いことに、ブレンドすることによって全体としての蛍光量子収率が向上することを明らかにした。これは相分離しない被覆共役系高分子に特有の利点であると考えられる。すなわち、相分離しないことによってエネルギーアクセプターである2は1のマトリックスの中で希釈された状態となっており、蛍光量子収率が低減されない。また、本年度新たに被覆共役系高分子のブロックコポリマーを展開した。このブロックコポリマーは、被覆されたブロックと被覆されていないブロックからなり、被覆されたブロックは高分子主鎖間の分子間相互作用によって自己集合する。この結果、ブロックコポリマーで一般的に見られるミクロ相分離構造を形成した。これまでの研究で明らかな通り、被覆されるか、されないかによって、共役高分子はまったく異なる物性・機能を示す。本研究のように、分子間相互作用を精密設計することは新しい高分子電子材料の創製につながると期待される。高分子化学平成25年度は、環状分子で覆われたモノマー分子の効率的な合成経路の確立を目標としたが、これについては年度の早い段階で達成できた。複数の合成経路を同時進行で進めたことが功を奏した。また、得られたモノマーをベースに、様々な発光色を有する共役系高分子の合成に成功した。さらに、予想外の結果として以下の2つの興味深い現象を見いだした。(1)これらの共役系高分子は、互いに相分離すること無く、任意に混和可能であった。これは高分子ブレンドにおいて、非常に珍しい挙動である。これによって合成した蛍光性共役系高分子を混合し、様々な蛍光色を合成できることを実証した。(2)これらの共役系高分子のガラス転移温度は異常に低かった。これは、共役系高分子間の相互作用が阻害されたためと考えられる。これによって、発光性の共役系高分子を容易に熱成形できることを見いだした。いずれも、本研究で得られる共役系高分子を有機エレクトロニクスデバイスへと応用する上で非常に重要な知見となる。得られた共役系高分子を用いたデバイスの作製、特に有機エレクトロルミネッセンスデバイスの作製を目標とする。まず、共役系高分子のブレンド膜について詳細な光物性評価を行う必要がある。これらは量子収率測定や蛍光寿命測定から行う。ブレンドした場合に、異なる共役系高分子間で励起エネルギー移動が起こっていると考えられる。

蛍光共鳴エネルギー移動のメカニズムに基づいて、ブレンド膜中でのエネルギー移動効率と発光色の相関を明らかにする。以上の光物理特性をもとに、共同研究もあわせてデバイス応用を目指す。
長期記憶の多様性と再構成を担う機能的神経回路の解析

本研究は、一旦憶えると長期間続く記憶、すなわち長期記憶が、脳内でどのように形成され変化するのかについて、実験的に調べることを目的とした。そのため、独自の電気生理学的記録法とデータ解析法を開発し、動物が長期記憶を形成し活用する際の神経細胞(ニューロン)集団の活動を記録し解析した。その結果、記憶が形成され働く時、海馬と前頭前野内で局所的な神経回路が活動すること、また、さらに記憶の内容が変わると、海馬と前頭前野を結ぶマクロな神経回路が働き出すことがわかった。長期記憶の形成と保持に関する認知心理学的研究は、人間を対象とした多くの実験から、記憶情報が多様で重複したネットワークとして形成され、それが新たな記憶の形成に伴いさらに変化し再構成されることを示してきた。またそのような情報ネットワークの多様性と再構成が、無限ともいわれる長期記憶の容量、記憶情報の変容、新たな情報の生成、などを可能にしていると唱えてきた。しかし、そのように柔軟な長期記憶の形成と保持を担っている神経回路網の実態は、まだわかっていない。特に、実際に長期記憶を形成し処理している脳を対象として解析した実験研究は、ほとんどない。脳内には実際に記憶情報のネットワークに対応するような機能的神経回路が存在し活動しているのであろうか?また、そのような機能的神経回路は、形成する記憶情報の違いに応じどのように形成され変化するのであろうか?さらには、そのように形成された機能的神経回路は、新たな長期記憶の形成に伴いどのように再構成され、その活動や構造を変化させるのであろうか?本研究は、これまで認知心理学や情報科学が示してきた長期記憶の形成と保持に関するモデル、すなわち、多様で重複した情報ネットワークの形成や、新たな記憶形成に伴う情報ネットワークの再構成を、実際の機能的神経回路の活動として検出することを目指す。それは、独自の電気生理学的記録法とデータ解析法を駆使することで、かつて心理学者D.O.Hebbが唱えた機能的神経回路(セル・アセンブリ)を実証することでもある。同時に本研究は、セル・アセンブリの単なる実証にとどまらず、記憶情報に対応し柔軟に活動するセル・アセンブリの実態を実験的に明らかにすることで、既存の認知心理学・情報科学的モデルに新たな神経科学的知見を提供することも目指す。長期記憶形成のプロセスを捉えるため、ラットによる遅延条件性音-位置連合記憶課題を開発した。この課題は、音の高低と反応する穴の位置の関係に関する長期記憶を形成する課題である。また、行動と神経活動のより明確な相関関係を調べるためのコントロール課題として、運動テスト課題と感覚テスト課題も開発した。運動テスト課題により、遅延条件性音-位置連合記憶課題の反応期間中の神経活動が右または左の単純な特定の空間的位置への運動成分を反映しているのか、それとも連合記憶の情報処理を反映しているのかを判断することが可能となった。また感覚テストでは、本課題中での音呈示期間中の神経活動が単純な感覚応答によるものか、それとも連合記憶の情報処理を反映しているのかを判定することが可能となった。次に、遅延条件性音-位置連合記憶課題の訓練の手続きを確立し、まず運動テストをラットに学習させた後に弁別の要素を加えた本課題を学習させた。この手続きでは、約3から5日程度でラットの正答率は漸近値に達することが分かった。この期間では同じニューロン集団からの神経活動を記録し続けることが可能であり、長期記憶形成中の海馬や大脳皮質のニューロン活動の変化を解析することが出来ることがわかった。さらに、海馬と大脳皮質のニューロン活動の記録をする実験システムについて、個々の電極を独立に操作可能なマイクロドライブ(ラットの頭部に取り付けた電極のマニュピレータ)の改良を行った。その結果、14本のテトロード電極(記録電極12本、基準電極2本)を独立に操作可能なマイクロドライブを作製できた。この方法により、異なる部位にある大きなニューロン集団からの同時記録が可能となった。昨年に引き続き、長期記憶形成のプロセスを捉えるため、ラットに遅延条件性音-位置連合記憶課題を訓練した。この課題は、音の高低とノーズポーク反応する穴の位置の関係に関する長期記憶を形成する課題である。また、行動と神経活動のより明確な相関関係を調べるためのコントロール課題として、これまでの運動テスト課題と感覚テスト課題に加え、全ての条件を課題と同じにして報酬も与えながら、ノーズポーク反応はさせない無反応課題も開発した。この無反応課題により、遅延条件性音-位置連合記憶課題の反応期間中の神経活動が、特定の運動成分を反映しているのか、特定の感覚成分を反映しているのか、あるいは連合記憶の形成を反映しているのか、より正確に解析するすることが可能となった。次に、遅延条件性音-位置連合記憶課題の訓練の手続きをより効率化するため、まず運動テストと感覚テストをラットに学習させた後、弁別の要素を加えた本課題を学習させ、最後に無反応課題を学習させることにした。

この手続きにより、約45日程度でラットの正答率は漸近値に達することが分かった。またニューロン活動の大規模な同時計測のために、昨年に引き続き、記録電極を独立して操作可能なマイクロドライブの改良を行った。直径12.5μmのタングステン線を4本巻くことにより作製されたテトロード電極を改良型マニュピレータへ複数本取り付け、個々の電極を微細に調整することにより、大規模なニューロン集団からの同時記録を可能とした。特に電極の設置点を海馬と前頭前野の脳座標の2カ所に分岐することで、海馬と大脳皮質のニューロン集団から同時記録する方式を確立した。すでに開発した遅延条件性音-位置連合記憶課題をさらに改良した。具体的な方法は以下のとおりである。(1)ラットが中央の穴へノーズポークすることにより試行が開始し、1秒間その反応をホールドすると10kHzもしくは1kHzの音が1秒間呈示された。(2)音の呈示後に1秒間の遅延期間をはさんだ後の反応期間において、10kHzの音が呈示された時は右の穴へ反応することにより報酬が与えられ、1kHzの音が呈示された時は左の穴へ反応することにより報酬が与えられた。(3)この課題の訓練に先立ち、運動発現や刺激提示に対するニューロンの応答を検出するため、運動発現課題と刺激弁別課題を学習させる手続きを確定した。マルチニューロン活動を記録するシステムについては、昨年度開発した多数ニューロン活動の同時記録システムをさらに改良した。具体的には以下のとおりである。(1)長期間記録の方法を確立するため、単一ニューロン活動に分離したスパイク波形の類似性および日ごとのスパイク波形の変化を追跡した。(2)マイクロドライブの電極装着箇所を海馬と前頭前野など離れた複数箇所に分岐させることにより、異なる部位から多数ニューロンを同時記録し相互作用を解析した。記録したマルチニューロン活動の解析については、昨年度に引き続き、解析システムのハードウエアとソフトウエアを共に改良した。(1)記録したマルチニューロン活動を個々のニューロン活動にリアルタイムで正確に分離するプログラムのアルゴリズムを改良し、さらに高性能コンピュータの導入によりその精度と処理速度を上げた。(2)ニューロン集団を構成するための機能的シナプス結合とその変化については、相互相関解析以外に、多数のニューロン間の機能的結合をそのまま視覚化し、機能的神経回路の動作を一気に表す方法について検討した。昨年までに開発し最適化した遅延条件性音-位置連合記憶課題をラットに訓練し、課題遂行中のマルチニューロン活動を記録し解析した。具体的な手順は以下のとおりであった。(1)ラットがオペラントボックス右側中央の穴へノーズポークすることにより試行を開始し、6kHzもしくは4kHzの音を呈示した。(2)音の呈示中に左側の壁へ移動し、6kHzの音では右の穴へ反応することに報酬を与え、4kHzの音では左の穴へ反応することに報酬を与えた。(3)この課題の訓練終了後、外科的な手術により、海馬と前頭前野にマルチニューロン活動記録用のテトロード電極を3本ずつ埋め込み、マイクロドライブにより自由に上下できるようにした。
日本の動植物における生物季節の変化と温暖化影響評価

地球温暖化の影響により、世界各地で開花や紅葉などの生物季節の変化が観測されている。しかし、長期的な生物季節観測が行われている地域は世界的にも限られており、地理的要因や構造的要因を含め、生物季節の反応の違いに関しては、未解明の部分が多い。本研究では、日本全国で1953年以降観測されている長期的な生物季節観測記録を用いて、近年の日本における生物季節変化を、広域かつ多種を対象に明らかにする。そして、地理的要因や構造的要因と生物季節変化との関連を分析する。さらに、最新の温暖化シナリオ(RCP)を用いて2100年までの生物季節変化を予測し、地球温暖化の影響を評価する。
再生不良性貧血における免疫抑制療法の効果予測法の確立

再生不良性貧血患者の治療前血液を用いて、(1)PNH型血球の増加、(2)抗DRS-1抗体および(3)抗モエシン抗体の有無を検索し、これらのマーカーと免疫抑制療法に対する反応性との関係を明らかにするための多施設共同臨床試験を実施した。PNH型血球陽性例と陰性例で、治療開始から6ヵ月後の治療効果を比較したところ、両群に有意な差は認められなかったが、自己抗体陽性例では陰性例に比べて奏効率が高い傾向が得られた。再生不良性貧血(再不貧)は原因不明の症候群であるが、実際には約7割の患者がATGとシクロスポリンの併用療法によって改善することから、多くの例の発症に免疫病態が関与していると考えられている。しかし、このような免疫病態を反映する良いマーカーが確立されていないため、再不貧と診断された骨髄移植適応のない患者に対しては無条件に免疫抑制療法が行われているのが実情である。我々がこれまでに提唱してきたPNH型血球の微少な増加は、免疫抑制療法に対する高反応性を示唆する重要な予測因子の一つである。しかし、このマーカーを持たない例でも約4割は改善することから、これのみでは不十分である。最近我々は、免疫病態の新たなマーカーとして抗DRS-1抗体や抗モエシン抗体を見出した。再不貧患者の治療前の血液について、これら三つのマーカーの有無を検索し、免疫抑制療法の共通プロトコールによる治療反応性とこれらのマーカーとの関係を前方視的に観察することにより、免疫抑制療法に対する反応性の予測方法の確立を目指す。本年度より研究分担者である中尾を試験責任者として、「成人再生不良性貧血における免疫病態マーカーの意義を明らかにするための多施設共同前方視的臨床試験」を開始した。本試験への参加に文書で同意が得られた症例より検体を収集する。PNH型血球は抗CD11bモノクローナル抗体(赤血球に対しては抗glycophorin-A抗体)とCD55およびCD59の各モノクローナル抗体を同時に用いたtwo-colorの高感度フローサイトメトリ法により検出する。抗DRS-1抗体および抗モエシン抗体はELISA法によって検出する。本臨床試験には全国で29施設が参加予定であり、すでに18施設が施設IRBの承認を得ている。また、これまでに8例の登録を得ている。来年度も引き続き症例数を増やし解析を続ける予定である。(786文字)再生不良性貧血(再不貧)は原因不明の症候群であるが,実際には約7割の患者がATGとシクロスポリンの併用療法によって改善することから,多くの例の発症に免疫病態が関与していると考えられている。しかし,このような免疫病態を反映する良いマーカーが確立されていないため,再不貧と診断された骨髄移植適応のない患者に対しては無条件に免疫抑制療法が行われているのが実情である。我々がこれまでに提唱してきたPNH型血球の微少な増加は,免疫抑制療法に対する高反応性を示唆する重要な予測因子の一つである。しかし,このマーカーを持たない例でも約4割は改善することから,これのみでは不十分である。最近我々は,免疫病態の新たなマーカーとして抗DRS-1抗体や抗モエシン抗体を見出した。再不貧患者の治療前の血液について,これら三つのマーカーの有無を検索し,免疫抑制療法の共通プロトコールによる治療反応性とこれらのマーカーとの関係を前方視的に観察することにより,免疫抑制療法に対する反応性の予測方法の確立を目指す。平成18年度より研究分担者である中尾を試験責任者として,「成人再生不良性貧血における免疫病態マーカーの意義を明らかにするための多施設共同前方視的臨床試験」を実施している。本試験への参加に文書で同意が得られた患者より検体を収集した。PNH型血球は抗CD11bモノクローナル抗体(赤血球に対しては抗glycophorin-A抗体)とCD55およびCD59の各モノクローナル抗体を同時に用いたtwo-colorの高感度フローサイトメトリ法により検出した。抗DRS-1抗体および抗モエシン抗体はELISA法によって検出した。本臨床試験には全国で既に32施設が施設IRBの承認を得ている。また,これまでに45例の登録を得ている。(777文字)再生不良性貧血(再不貧)は末梢血の血球減少と骨髄の低形成を特徴とする原因不明の症候群であるが、約7割の患者がATGとシクロスポリンの併用療法によって改善することから、多くの例の発症に免疫病態が関与していると考えられている。ところが、このような免疫病態を反映する良いマーカーが確立されていないため、骨髄移植の適応がない再不貧患者に対しては無条件に免疫抑制療法が行われているのが実情である。

最近我々は、免疫病態の新たなマーカーとして抗DRS-1抗体や抗モエシン抗体を見出した。そこで、再不貧患者の治療前の血液について、これら三つのマーカーの有無を検索し、免疫抑制療法の共通プロトコールによる治療反応性とこれらのマーカーとの関係を前方視的に観察する多施設共同臨床試験を実施した。本試験への参加に文書で同意が得られた患者より検体を収集した。PNH型血球は抗CD11bモノクローナル抗体(赤血球に対しては抗glycophorin-A抗体)とCD55およびCD59の各モノクローナル抗体を同時に用いたtwo-colorの高感度フローサイトメトリ法により検出した。抗DRS-1抗体および抗モエシン抗体はELISA法によって検出した。本臨床試験には47施設から99例の登録があった。男女比は42:57。年齢の中央値は59才(16才75才)。PNH型血球陽性率は74%であった。重症度別陽性率はstage 3が89%、stage 4が74%、stage 5が53%であった。一方、53例の検体を用いて自己抗体を調べたところ、抗DRS-1抗体は25%、抗モエシン抗体は19%が陽性であった。
雪崩発生原因解明に用いる積雪断面調査用ゾンデの開発に関する研究

本研究は研究計画に沿って以下の手順で行なわれ、それぞれ当初の目的に沿った知見が得られた。なお、開発機器をコンパクトにまとめ上げる作業は、これからの課題である。1.秋田県における過去の雪崩災害資料、約1000件を収集し災害の地域特性について多変量解析を行なった。新規購入のパソコンが本解析のために使用された。解析によると雪崩発生に関与するパラメ-タのうち雪質に深くかかれる気象因子の寄与は、有意に大きく本研究の方向に確信を与えた。2.積雪特性項目のうち雪崩に関与する剪断強度の測定センサ-を試作した。従来のものは積雪断面を層ごとにはぎ取って測定したが、今回試作したものは積雪断面を保存した形態で測定できるので、より正確な値を得ることになる。なお、この冬は積雪量が少なく、従来型の剪断強度測定センサ-との比較が十分にできなかった。一方、積雪断面の可視記録を得るためビデオカメラを円とう形に作ったゾンデ内に収納しテストを行なった。撮られた映像は必ずしも良好ではなかったが画像処理をして雪の層、結晶化した雪片の検出が可能となった。3.地中ボ-リング孔を利用した模擬実験で確認できない点があることが判った。これは、冬期実験ではゾンデ内外の温度差による結露が無視しえないほど生ずる点で、今後の課題となった。4.観測装置を東成瀬村のフィ-ルドに設置し観測を始めた。デ-タはモデムを介して電話回線を通じ収集しているが順調である。観測を始めて期間は短いが、山岳部では極めて集中的に降雪がみられることや雪温が降雪時の気温を記憶するようであることなど興味のあるデ-タが蓄積されつつある。
犬の播種性血管内凝固症候群(DIC)の治療に関する基礎的研究

犬にエンドトキシン1.5mg/kgB.W.を点滴静注することにより、DICを発現させうるが、これに対し蛋白分解酵素阻害薬の投与がどのような効果を持つかを血液凝固系(PT,APTT,Fbg量,血小板数)、線溶系(FDP,SFMC)、補体価(CH50)、血液一般検査、肝機能検査、腎機能検査のほか、病理組織学的検査を行い比較検討した。(材料と方法)各群ともアセプロマジンによる鎮静ののち、蛋白分解酵素阻害薬、メシル酸ナファムスタット(FUT-175)あるいはメシル酸ガベキサート(FOY)を用い、これらをエンドトキシン投与30分前から終了後30分まで6時間にわたって点滴静注した。FUT-175は1.8mg/kg投与群(D群)を中心に、その半量(C群)および2倍量(E群)の3群に分けた。FOYはこれまでの報告を参考に50mg/kg投与量(F群)で実験をを行った。また、鎮静剤と生理食塩液のみの投与群(A群)およびエンドトキシンのみの投与群(B群)と各群とを比較した。(成績)エンドトキシン注射の24時間後における生存率は、B、C、D、E、Fの各群で、それぞれ、2/6(33.3%)、5/6(83.3%)、6/7(85.7%)、3/6(50.0%)、4/6(66.7%)であった。また、各検査項目についてみると、C群ではB群に比べFbg量の増加が有意に抑制された。E群では、PCV,GOTおよびAPTTの増加が有意に抑制された。F群では、PCV,総蛋白量,GPT,BUNの増加に対する有意な抑制と血小板数の減少の阻止が認められた。病理組織学的には、B群よりD群の方が組織障害の程度は軽度であり、F群ではエンドトキシンによる障害はほとんど認められなかった。以上のことから、蛋白分解酵素阻害薬には、エンドトキシン-DICの発現に対しある程度の抑制効果が認められたので、今後はこれらの投与法の検討や他の薬剤と併用することで、さらに好結果が期待できるものと考える。
高切断能率を有するダイヤモンド電着ワイヤ工具の開発と長寿命化に関する研究

本申請課題においては、高切断能率を可能にするダイヤモンド電着ワイヤ工具の開発とその長寿命化に関する検討として、(1)芯線となるピアノ線(φ0.2mm)表面にスパイラル状にダイヤモンド砥粒を電着させる方法(スパイラル電着ワイヤ工具)、(2)2本のピアノ線(φ0.1mm)を縒り合わせたものを芯線としてその表面にダイヤモンド砥粒を一様に電着させる方法(縒り線ワイヤ工具)を創案並びに試作して各種の検討を行った。以下に、申請期間中において得られた結果を述べる。1.試作したワイヤ工具の破断強度を検討した結果、通常のワイヤ工具(芯線:φ0.2mm)と比較してスパイラル電着ワイヤ工具は同一な値を示したが、縒り線ワイヤ工具は工具断面積が約50%となることに起因して破断荷重は低下した。しかしながら、芯線自体の強度が向上することから、その低下割合は約30%にとどまることが明らかとなった。2.試作したワイヤ工具のねじり強度を検討した結果、スパイラル電着ワイヤ工具、縒り線ワイヤ工具ともに破断ねじり角は向上することが分かった。3.加工特性に関して切断能率の観点から試作した双方のワイヤ工具を用いて検討した結果、通常のワイヤ工具と比較すると、最大でスパイラル電着ワイヤ工具では約1.8倍、縒り線ワイヤ工具では約2倍の切断能率を示すことが明らかとなった。また、この効果はワイヤ表面に螺旋状のチップポケットが形成されていることから、通常のワイヤ工具と比較して加工液の流入出並びに切粉の排出が促進されるためであることが分かった。4.工具寿命の観点からも、縒り線ワイヤ工具においては通常のワイヤ工具と比較して格段に向上することが明らかとなった。5.試作したワイヤ工具の加工精度について切断面のチッピングやウエハの表面粗さの観点より検討し、通常のワイヤ工具と比較した結果、スパイラル電着ワイヤ工具においては若干ながら悪化する傾向を示すが、縒り線ワイヤ工具においては通常のワイヤ工具とほぼ同等な結果が得られることが分かった。平成8年度は芯線であるピアノ線ワイヤの表面にスパイラル状の絶縁被膜を形成して,その導電部のみにダイヤモンド砥粒を電着する方法を中心にそのワイヤ工具を用いた時の加工特性を検討した.具体的には,本方法では芯線に10μm程度のニッケルメッキをダイヤモンド砥粒を電着する際の下地として行う.次にスパイラル状にテフロンコーティングした後,導電部のみ陽極溶解法により表面の熱影響部を除去し,ダイヤモンド砥粒を電着してワイヤ工具の作製を行った.今年度得られた主な成果を以下に述べる.1.試作ワイヤ工具(スパイラル電着ワイヤ工具)の引張試験を行った結果,テフロンコーティングする際の焼成温度が250°C以下の場合には引張破断荷重の低下は見られず,芯線のみの引張破断荷重より大きくなることがわかった.2.試作ワイヤ工具のねじり強度を評価するために、破断ねじり角の挙動を実験した.その結果,全面にダイヤモンド砥粒を電着したワイヤ工具に比して最大3倍程度まで破断ねじり角が向上することが明らかとなった.3.試作ワイヤ工具を用いて切断実験を行った結果,全面にダイヤモンド砥粒を電着したワイヤ工具に比して約1.8倍まで切断能率は向上した.

4.試作ワイヤ工具を用いて加工精度に関する検討を行った結果,加工面の表面粗さは試作ワイヤ工具の表面に電着されているダイヤモンド砥粒が減少するために全面に電着したワイヤ工具より増加する結果を得た.また,加工面のエッジ部で生じるチッピングは全面に電着したワイヤ工具に比して試作ワイヤ工具では若干増加する傾向を示した.平成9年度は,ダイヤモンド電着ワイヤ工具のさらなる高性能化を目的として,2本のピアノ線(φ0.1mm)をねじり応力の発生を伴うことなく縒り合わせたものを芯線として用いて,その表面にダイヤモンド砥粒を電着させたワイヤ工具(縒り線ワイヤ工具)を試作し,その加工特性に関して実験的に検討を行った.以下に,今年度において得られた結果を要約する.1.縒り線ワイヤ工具の材料強度特性として引張試験及びねじり試験を行ったが,その結果,縒り線ワイヤ工具は工具断面積が通常のワイヤ工具と比較して小さくなることに起因して,破断荷重は通常のワイヤ工具の70%程度となるが,破断ねじり角は3倍程度にまで向上することが分かった.2.縒り線ワイヤ工具は通常のワイヤ工具と比較して高い切断能率を示し,さらには縒り線ピッチを細かくすることによって切断能率は向上し,その値は最大で通常のワイヤ工具の2倍程度となる.3.縒り線ワイヤ工具の加工メカニズムを幾何学的に検討し,また,加工後のダイヤモンド砥粒のSEM観察やEDS分析を通じて,縒り線ワイヤの効果は加工部への加工液の流入出や切粉の排出を促進させるチップポケット効果であることが明らかとなった.4.縒り線ワイヤ工具の加工精度に関して検討を行った結果,通常のワイヤ工具と使用する砥粒が同一であることから,切断溝表面に発生するチッピングや作製されるウエハの表面粗さは通常のワイヤ工具と同程度であることが明らかとなった.
胃癌腹膜播種関連分泌型microRNAの同定と進展機構の解明

胃癌細胞株由来のexosomeの添加によって、中皮細胞と各種胃癌細胞株との接着能の亢進を認めた。胃癌細胞株由来exosomeの添加の前後における中皮細胞中の分子変化についてのPCR-array解析を行い、exosome添加後に有意にFibronectin-1(FN1)ならびにLaminin gammma-1(LAMC1)の発現上昇を認めた。蛋白レベルでも同様にFN1ならびにLAMC1の発現亢進を認めた。高度進行胃癌の患者から得た悪性胸水から抽出したexosomeを用いた検討でも、同様に中皮細胞株におけるFN1ならびにLAMC1のmRNA・蛋白レベルでの発現上昇を認めた。中皮細胞株(Met-5A)ならびに胃癌細胞株(KATOIII、MKN45、MKN74)の培養液中から超遠心法でexosomeを分離し、PKHによるラベリングを行った。中皮細胞・胃癌細胞株の培養液中への同exosomeの添加を行い、exosome顆粒の培養細胞株内への取り込みを確認した。続いて、中皮細胞ならびに胃癌細胞株の培養液中へのexosome添加の有無による各種機能解析を行い、その結果について比較検討を行った。中皮細胞と各種胃癌細胞株との接着能の解析においては、各胃癌細胞株由来のexosome添加によって、中皮細胞との接着が亢進されたが、中皮細胞株由来のexosome添加では同接着の亢進は認めなかった。Boyden chamber assay法による癌細胞の遊走・浸潤能の解析においては、胃癌細胞株由来のexosome添加によって浸潤能の亢進を認めたが、中皮細胞株由来のexosome添加では浸潤の亢進は認めなかった。中皮細胞株へのexosome添加の前後における接着関連分子の変化について、PCR-arrayを用いた解析を行い、幾つかの分子における発現変化を確認しており、今後、更なる機能解析ならびに発現メカニズムについても解析を進める予定である。一方で、腹水サンプルを用いたexosome解析も試みたが、術中出血等による血球成分由来のexosomeの混入が問題となり、臨床サンプルでの検討は困難であった。中皮細胞株(Met-5A)ならびに胃癌細胞株(KATOIII、MKN45、MKN74)の培養液中から超遠心法でexosomeを分離した。中皮細胞・胃癌細胞株の培養液中への同exosomeの添加を行い、exosome顆粒の細胞株内への取り込みを確認した。同様に血管内皮細胞への取り込みも確認した。続いて、中皮細胞ならびに胃癌細胞株の培養液中へのexosome添加の有無による各種機能解析を行った。中皮細胞と各胃癌細胞株との接着能の解析において、各胃癌細胞株由来のexosome添加によって、中皮細胞と胃癌細胞との接着の亢進が確認された。Boyden chamber assay法による癌細胞の遊走・浸潤能の解析でも、胃癌細胞株由来のexosome添加によって浸潤能の亢進を認めたが、中皮細胞株由来のexosome添加では浸潤の亢進は認めなかった。中皮細胞株へのexosome添加の前後における接着関連分子の変化について、PCR-arrayを用いた解析を行い、分子XならびにYを接着関連分子の候補として選定した。同分子について、exosome添加後のmRNAならびに蛋白レベルでの発現亢進も確認した。同様に胃癌細胞株に対するexosome添加前後のサンプルを用いた、転移・浸潤関連分子に関するPCRアレイも施行したが、発現の変化が各種胃癌細胞株によって異なり、特定の分子を候補とすることは困難であった。一方、胃癌細胞の中皮細胞への接着能の亢進に関連して、exosomeの添加前後でのmicroRNAの発現変化についてmicroRNAmicroarrayを用いた解析を行ったが、各細胞株に共通した同関連microRNAの同定には至らなかった。胃癌細胞株由来のexosome添加による接着関連分子の探索においては、既に候補分子の同定も行っている。しかしながら、浸潤関連分子については、PCR-arrayの結果が細胞株間で異なっており、今後は各々の細胞株について検討を進める予定である。中皮細胞株(Met-5A)ならびに胃癌細胞株(KATOIII、MKN45、MKN74)の培養液中から超遠心法でexosomeを分離し、PKHによるラベリングの後、中皮細胞・胃癌細胞株の培養液中へのexosome顆粒の細胞株内への取り込みを確認した。続いて行った機能解析で、胃癌細胞株由来のexosomeの添加によって中皮細胞と各種胃癌細胞株との接着能の亢進を認めた。これら接着能に関与する分子について、中皮細胞株への胃癌細胞株由来exosomeの添加の前後におけるPCR-array解析結果の比較検討を行った。MKN45ならびにMKN74細胞株を用いた両解析において、exosome添加後に有意に発現上昇を認める分子としてFibronectin-1(FN1)ならびにLaminingammma-1(LAMC1)を同定した。蛋白レベルでの発現変化についてもWestern blottingで検討したが、同様にFN1ならびにLAMC1の発現亢進を認めた。高度進行胃癌の患者から得た悪性胸腹水から抽出したexosomeを用いた検討でも、中皮細胞株への添加によって同様に中皮細胞株におけるFN1ならびにLAMC1のmRNA・蛋白レベルでの発現上昇を認めた。

また、胃癌患者の腹膜を用いた解析で、肉眼的に播種を認めない腹膜上でも、腹膜播種陽性症例の腹膜上では、腹膜播種陰性症例に比較して有意にFN1ならびにLAMC1両分子の発現亢進を認めることも確認した。胃癌細胞株由来のexosomeの添加によって、中皮細胞と各種胃癌細胞株との接着能の亢進を認めた。胃癌細胞株由来exosomeの添加の前後における中皮細胞中の分子変化についてのPCR-array解析を行い、exosome添加後に有意にFibronectin-1(FN1)ならびにLaminin gammma-1(LAMC1)の発現上昇を認めた。蛋白レベルでも同様にFN1ならびにLAMC1の発現亢進を認めた。高度進行胃癌の患者から得た悪性胸水から抽出したexosomeを用いた検討でも、同様に中皮細胞株におけるFN1ならびにLAMC1のmRNA・蛋白レベルでの発現上昇を認めた。中皮細胞株ならびに胃癌細胞株へのexosomeの取り込みが推論通り確認されたため、それに基づくrecipient cellsの機能解析へ進むことができた。実際に幾つかの機能について変化が認められており、予定通りの解析を進める予定である。前年度の成果を基に研究を進める予定である。前述の研究実績の概要で記載した如く、腹膜播種関連microRNAの候補の選定には至らなかったが、胃癌細胞株の中皮細胞への接着に関連してexosomeの添加によって中皮細胞で発現亢進する分子を同定しており、同分子について更に解析を進める予定である。具体的には、これまで患者の同意の上、採取・保存してきた胃癌患者の腹水中ならびに腹膜細胞中の同接着関連分子XならびにYの発現について解析し、これらの結果と手術時の腹膜播種転移の有無や、術後再発など臨床経過との比較検討を行い、腹膜播種転移の予測バイオマーカーとしての有用性について検討する予定である。消化器外科前年度の成果を基に研究を進める予定である。遊走・浸潤能関連分子の変化についてPCR-arrayを用いた解析を行い、exosome添加によって胃癌細胞株内(23株を予定)で共通に変化する責任分子の同定を試みる。一方で、接着能ならびに遊走・浸潤能解析におけるexosomeの添加前後でのmicroRNA変化について、microRNAmicroarray解析を行い、関連microRNAの同定を試みる。関連microRNAの探索において、候補microRNAの同定に至らない場合には、exosome内に含有されるmRNAや蛋白についての解析も考慮する予定である。これら同定された分子については、胃癌腹膜播種細胞株における発現を解析し、高発現細胞株を用いてmicroRNA inhibitorによる発現抑制を行う。親株から得られた培養液中のexosomeと、これら発現抑制によって得られたanti-miR-X exosomeとを用いて、前年度と同様の解析を行い、阻害程度の解析から腹膜播種関連microRNAの同定を行う。一方で、上記によって得られた腹膜播種関連microRNAについて、P(ー)CY(ー)漿膜浸潤陽性胃癌症例の、漿膜面癌組織内ならびに腹腔内洗浄液中microRNAの測定を行い、これらの結果と術後再発など臨床経過との比較検討を前向きに行い、腹膜播種転移の予測バイオマーカーとしての有用性に関する検討にも着手する予定である。
膀胱腫瘍に対するBCG療法の効果増強に関する基礎的検討とその臨床応用

BCGが膀胱腫瘍に対して抗腫瘍効果を示すのは宿主免疫系、特に細胞性免疫を介しているといわれている。この細胞性免疫を主に担っているTリンパ球やNatural Killer細胞は1つにはFas抗原を介して標的細胞を傷害する。抗Fas抗体はFasリガンドと同様、Fas抗原を提示している細胞にアポトーシスを誘導する。そこで今回我々は種々の抗癌剤により抗Fas抗体の膀胱腫瘍細胞対する細胞傷害活性が増強されるのかどうかをT24,J82,HT1197,KK47膀胱腫瘍株化細胞、4人の患者より手術時に採取した新鮮膀胱腫瘍細胞を用いて24時間のMTT試験にて検討した。用いた膀胱腫瘍細胞は抗Fas抗体に対して比較的抵抗性であった。膀胱腫瘍に対してよく用いられる種々の抗癌剤(Adriamycin【ADR】, Mitomycin C【MMC】, S-Fluororacil【S-FU】, Methotrexate【MTX】)に抗Fas抗体を併用したところ、ADRとの組み合わせのみT24細胞に対して相乗的な殺細胞効果を示したが、MMC, 5-FU, MTXとの組み合わせでは相加的な殺細胞効果を認めた。この抗Fas抗体とADRとの組み合わせによる相乗的な殺細胞効果はADR耐性株であるT24/ADR細胞に対しても観察された。さらに他の膀胱腫瘍株化細胞であるJ82, HT1197, KK47細胞や、4人の膀胱腫瘍患者より手術時に得た新鮮膀胱腫瘍細胞を標的細胞に用いても同様に相乗的殺細胞効果が認められた。ADRの誘導体であるEpirubicinやPirarbicinと抗Fas抗体との併用によってもT24細胞に対して相乗的な殺細胞効果が認められた。以上の実験は抗Fas抗体と抗癌剤とで膀胱腫瘍細胞を同時に処理したが、その処理の順序を変えても相乗的な殺細胞効果が認められるのかどうかを検討したところ、膀胱腫瘍細胞の抗Fas抗体とADRとの処理の順序にかかわらず相乗的細胞効果が認められた。次にこの抗Fas抗体とADRとの組み合わせによる相乗的な殺細胞効果のメカニズムに関して検討した。T24細胞をADRで処理するとT24細胞上のFas抗原の発現が増強された。抗Fas抗体とADRとの併用時におけるT24細胞のアポトーシスをアクリジン-オレンジ染色にて検討すると、抗Fas抗体単独またはADR単独処理に比較して、明らかにアポトーシスを起こしている細胞が増加していた。以上の結果から、膀胱腫瘍においてADRはFas抗原の発現を増強することにより、リンパ球のFas抗原を介した腫瘍細胞傷害機構を増強する可能性が示唆された。また、BCGとADRとを併用することにより、治療効果を増強できる可能性が示唆された。

そこでまず我々は細胞性免疫の重要な指標であるリンパ球の腫瘍細胞傷害活性について検討した。多くの研究は腫瘍細胞傷害活性の標的細胞としてK562細胞などの株化細胞を用いている。しかし、株化細胞は培養などにより種々の影響を受けているため、株化細胞に対する細胞傷害活性が自己腫瘍細胞傷害活性を必ずしも反映しているとは限らない。そこで今回、膀胱腫瘍患者において末梢血リンパ球のK562骨髄性白血病株化細胞、T24膀胱腫瘍腫瘍株化細胞、新鮮自己腫瘍細胞に対する腫瘍細胞傷害活性の相関関係、さらにはそれらの腫瘍細胞傷害活性と予後との関係について検討した。K562細胞傷害活性とT24細胞傷害活性との間には強い正の相関関係が認められたが、自己腫瘍細胞傷害活性とK562細胞傷害活性、T24細胞傷害活性との間には相関関係が認められなかった。腫瘍細胞傷害活性の高低を平均値で2群に分け、膀胱腫瘍患者の予後との関係を検討した。K562細胞、T24細胞に対する腫瘍細胞傷害活性のレベルと膀胱腫瘍患者の5年生存率、5年無再発率との間には相関関係が認められなかった。しかし、高い自己腫瘍細胞傷害活性を有する膀胱腫瘍患者の予後は低い自己腫瘍細胞傷害活性を有する患者の予後に比べ、有意に良好であった。また、高い自己腫瘍細胞傷害活性を有する患者と低い自己腫瘍細胞傷害活性を有する患者との間には膀胱腫瘍のStage, Gradeなど背景因子には特に有意差を認めなかった。以上の結果から、膀胱腫瘍患者において自己腫瘍細胞傷害活性は重要かつ独立した予後因子の1つであり、細胞性免疫の指標である腫瘍細胞傷害活性の測定には株化細胞でなく、新鮮自己腫瘍細胞を用いるべきであると考えられた。以前の我々の報告によると、BCGはこの自己腫瘍細胞傷害活性を増強する作用を示しており、この作用が膀胱腫瘍に対してBCGが有効であるひとつのメカニズムであることが示唆された。BCGが膀胱腫瘍に対して抗腫瘍効果を示すのは宿主免疫系、特に細胞性免疫を介しているといわれている。この細胞性免疫を主に担っているTリンパ球やNatural killer細胞は1つにはFas抗原を介して標的細胞を傷害する。抗Fas抗体はFasリガンドと同様、Fas抗原を提示している細胞にアポトーシスを誘導する。そこで今回我々は種々の抗癌剤により抗Fas抗体の膀胱腫瘍細胞対する細胞傷害活性が増強されるのかどうかをT24,J82,HT1197,KK47膀胱腫瘍株化細胞、4人の患者より手術時に採取した新鮮膀胱腫瘍細胞を用いて24時間のMTT試験にて検討した。用いた膀胱腫瘍細胞は抗Fas抗体に対して比較的抵抗性であった。膀胱腫瘍に対してよく用いられる種々の抗癌剤(Adriamycin[ADR],Mitomycin C[MMC],5-Fluorouracil[5-FU],Methotrexate[MTX])に抗Fas抗体を併用したところ、ADRとの組み合わせのみT24細胞に対して相乗的な殺細胞効果を示したが、MMC,5-FU,MTXとの組み合わせでは相加的な殺細胞効果を認めた。この抗Fas抗体とADRとの組み合わせによる相乗的な殺細胞効果はADR耐性株であるT24/ADR細胞に対しても観察された。さらに他の膀胱腫瘍株化
卓上型次世代シーケンサーを用いた AMLの迅速かつ安価な予後予測システムの開発

質の高い臨床研究は、多数の遺伝子解析が必須であり、迅速かつ安価な遺伝子解析法の開発が急務である。本研究では、小児急性骨髄性白血病(AML)の予後に関連性の高い遺伝子を選別し、卓上型次世代シーケンサーを用いて、予後予測パネルの作成を行った。小児AMLの初発、寛解、再発検体よりDNAを抽出し、Agilent社のHaloplexカスタマイズドパネルを用い、約150遺伝子を選定した。8例を解析し、4例からIKZF, KRAS, GATA1, KIT, PU.1の遺伝子異常が検出され、残りの4例からもSH2B3, SMARCB2のlarge deletionが検出された。今後、多数例で解析を行う。卓上型次世代シーケンサー(MiSeq, Ilumina)を用いて迅速かつ安価な予後予測システムの開発をめざし、白血病パネルの確立を試みた。方法:急性骨髄性白血病(AML)の初発、寛解、再発検体よりDNAを常法通り抽出し、以後の検討に用いた。白血病パネルはAgilent社のHaloplexカスタマイズドパネルを用い、約150遺伝子を選定した。実際の解析は、卓上型次世代シーケンサー(MiSeq, Ilumina)を用い、現在8例のAML検体で検討が終了した。考案:このパネルの利点はわずか225ngのDNAから解析可能、実際の解析は1-1.5日で終了、専用解析ソフトを用いるため、bioinfomaticsに詳しくない研究者でもデータ解析可能な点にある。1検体の解析費用は3万円程度と安く抑えられる点は有益であった。今後、AML診断後早期に、予後予測を可能とし、実臨床への応用も可能ではないかと考えられた。病態検査学
しらが病菌によるアワの穂の葉化メカニズムの解明

アワしらが病菌の全ゲノム解読とRNA-seq解析を行った結果、ゲノムサイズは約360Mbであり、推定の遺伝子数は16736個だった。推定の分泌タンパク質は1220個あり、既知のエフェクター様タンパク質に加えてJacalin様タンパク質を多くコードしていた。Jacalin様タンパク質は感染初期に遺伝子発現が誘導され、感染時のアポプラスト画分に検出されたことから、感染初期に植物の防御応答を抑制することが示唆された。罹病した穂では花成の負の制御因子であるMADS47の発現が増加していた。一方、正の制御因子の一部はタンパク質の蓄積が減少することがわかり、これが葉化病徴の引き金になっていると考えられた。アワしらが病は、卵菌類の一種(Sclerospora graminicola (Sacc.) Schroet.)によって引き起こされるアワの重要病害である。しらが病菌に感染したアワは生育不良となり、穂では特徴的な葉化病&#24501;が誘発される。この表現型の変化には病原菌が生産するエフェクター等の関与が考えられるが、詳細はほとんど研究されていない。本研究では、しらが病菌の全ゲノム解読およびトランスクリプトーム解析を行い、しらが病菌が分泌するエフェクターを同定・解析することにより、葉化病&#24501;の発病機構の解明を最終目標とする。初年度は、しらが病菌の研究基盤の整備を目的として、しらが病菌の全ゲノム解読および感染植物のRNAseq解析を行った。アセンブルされたゲノム配列は、真核生物に広く保存された遺伝子セットを95%以上カバーしており、エフェクター単離に用いるのに十分なドラフトゲノムが完成したと考えられた。しらが病菌の推定ゲノムサイズは約360 Mbであり、全ゲノム配列が公開されている卵菌類では最大級であったが、約73%はリピート配列と予測された。RNAseq解析と遺伝子予測ソフトによる解析から16,736遺伝子が予測された。エフェクター候補となりうる推定の分泌タンパク質をコードする遺伝子は1,220個あり、そのうち305個が感染にともない発現誘導された。これらをエフェクター候補として今後の解析に用いる。また植物側のRNAseq解析を行った結果、花成の抑制因子と考えられているSVP MADS-boxの一つであるMADS47のホモログ遺伝子の発現量が罹病穂で顕著に増加することが明らかとなった。一方、花成の正の制御因子については、A-classのMADS-box遺伝子以外はほとんどが減少していた。以上から、しらが病菌のエフェクターは、A-class MADS-box遺伝子の誘導からSVP MADS-box遺伝子抑制の間のいずれかのシグナルを撹乱している可能性が考えられた。研究基盤となるしらが病菌の全ゲノム解読と感染植物におけるRNAseq解析を行うことができた。しらが病菌に感染したアワは生育不良となり、穂では特徴的な葉化病ちょうが誘発される。本研究では、しらが病菌の全ゲノム解読およびトランスクリプトーム解析を行い、しらが病菌が分泌するエフェクターを同定・解析することにより、葉化病ちょうの発病機構の解明を最終目標とする。平成28年度は、前年度得られたRNAseq解析の結果からエフェクター候補の解析を行った。エフェクター候補のうち、卵菌類に特有のRXLRモチーフを持ち、感染時に発現が確認されたタンパク質遺伝子について、過剰発現イネ植物を作出して機能評価を行った。現在までに、生育の亢進、生育抑制、細胞死の誘導といった表現型が得られている。しらが病菌と他の卵菌類との比較ゲノム解析を行った結果、しらが病菌ゲノムには、Jacalin様レクチンドメインを含むタンパク質が多くコードされていることが明らかとなった。さらにその多くがN末端に推定の細胞外分泌シグナルをもち、アワ葉感染初期に発現が誘導されていた。以上から、Jacalin様レクチンドメインを持つタンパク質はしらが病菌の感染初期に機能する可能性が考えられた。前年度、植物側のRNAseq解析から罹病穂で顕著な発現増加が認められたSiMADS47のプロモーター領域をクローニングし、レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を連結したキメラ遺伝子を作製し、イネに導入して形質転換培養細胞を作出した。これを材料とし、SiMADS47プロモーター活性に作用するしらが病菌因子のスクリーニングを開始した。NGS解析の結果を基盤としてエフェクター候補因子の解析に用いる材料の作出および解析を開始した。また、比較ゲノム解析から、しらが病菌に特徴的なJacalin様レクチンドメイン遺伝子を見出した。アワしらが病菌は、卵菌類の一種(Sclerospora graminicola (Sack.) Schroet.)によって引き起こされるアワの重要病害である。しらが病菌に感染したアワは生育不良となり、穂では特徴的な葉化病徴が誘発される。この表現型の変化には病原菌が生産する因子(エフェクター)の関与が考えられるが、詳細はほとんど研究されていない。

本研究では、しらが病菌の全ゲノム解読およびトランスクリプトーム解析を行い、しらが病菌の病原性エフェクターを同定・解析することにより、葉化病徴の発病機構の解明を最終目標とする。平成29年度は、病原性機能解析のために作出したエフェクター過剰発現イネから培養細胞を誘導し、基礎的抵抗反応に対する影響を評価した。その結果、キチン処理に応答して誘導される活性酸素生成は抑制する一方、同時期に誘導されるMAPK活性には影響しない因子が見つかった。しらが病菌を感染させたアワ葉からアポプラスト溶液を調整し、感染現場で分泌されているタンパク質を質量分析で解析したところ、7種のJacalin様レクチンドメインをもつタンパク質(JRL)が同定された。JRLはしらが病菌のゲノム解析から、他の卵菌類と比較して特徴的に多くコードされていた遺伝子である。これらをベンサミアーナ葉に一過的に発現させ、植物の抵抗反応に対する影響を調べたところ、flg22処理に対する活性酸素生成を抑制し、ベンサミアーナに感染する卵菌類であるPhytophthoraの感染を亢進した。以上より、JRLは感染現場であるアポプラストに分泌されて抵抗反応を抑制することが示唆された。アワしらが病菌の全ゲノム解読とRNA-seq解析を行った結果、ゲノムサイズは約360Mbであり、推定の遺伝子数は16736個だった。推定の分泌タンパク質は1220個あり、既知のエフェクター様タンパク質に加えてJacalin様タンパク質を多くコードしていた。Jacalin様タンパク質は感染初期に遺伝子発現が誘導され、感染時のアポプラスト画分に検出されたことから、感染初期に植物の防御応答を抑制することが示唆された。罹病した穂では花成の負の制御因子であるMADS47の発現が増加していた。一方、正の制御因子の一部はタンパク質の蓄積が減少することがわかり、これが葉化病徴の引き金になっていると考えられた。しらが病菌の全ゲノム解析とRNAseq解析から予測されたエフェクター候補をクローニングし、形態変化をもたらす因子をスクリーニングする。スクリーニングの評価方法は以下の通りである。1)イネで過剰発現体を作出し、穂および植物体全体の形態変化、出穂の遅延、病原菌に対する応答を解析する。2)SiMADS47プロモーターをクローニングし、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを連結したキメラ遺伝子を作製し、イネに導入して形質転換体を作出する。それを材料にプロトプラストを作製し、クローニングされたしらが病菌エフェクター候補を一過的に発現させることにより、SiMADS47プロモーター活性を解析し、その発現変化でスクリーニングを行う。3)しらが病菌と同じ卵菌類であり、形質転換が可能なPhytophthora parmivolaにエフェクター候補遺伝子を発現させ、穂孕み期のアワに感染させることにより穂の形態変化をもたらすかを評価する。Jacalin様レクチンドメインタンパク質遺伝子は、感染初期に発現が多く認められることから、病原性因子として機能する可能性が考えられた。そこで、感染初期に誘導されるプロモーターの制御下でいもち病菌に発現させ、病原性の機能解析を行う。また、いくつかの病原性エフェクターはPAMP応答を抑制することが報告されているため、ベンサミアーナタバコ葉に一過的に発現させ、flg22によるROS生成等のPAMP応答に対する影響を評価する。SiMADS47