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ペプチド及び遺伝子導入抗原提示細胞(樹状細胞)による免疫療法の研究

ペプチド及び遺伝子導入抗原提示細胞(樹状細胞)による免疫療法の研究において、腫瘍抗原ペプチドとして従来同定されてきたMAGE-3遺伝子由来HLA-A2結合性ペプチド(FLWGPRALV,amino acids271-279)とヒト末梢血単球由来の樹状細胞とを用いて、食道癌術後長期生存患者の末梢血リンパ球との混合培養系でペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球の誘導と患者の自己腫瘍細胞(MAGE-3遺伝子陽性、HLA-A2陽性)に対する傷害活性を証明し、T細胞受容体の解析ではVb3& Vb7のオリゴクロナリティーを証明した.また遺伝子導入樹状細胞の特異的免疫誘導の検討のためモデル抗原遺伝子としてLacZ遺伝子を用いその標的蛋白としてβ-galactosidase及びH-2L^d結合性ペプチド(TPHPARIGL,amino acids876-884)に対する特異的免疫誘導の研究を進めている.その結果アデノウイルスベクターを用いる系で特異的な抗体産生とIFN-γ及びIgG2a産生を主とするTヘルパー免疫の動きを捉えることができた.この特異的液性免疫誘導を指標として、樹状細胞の培養条件(GM-CSF or IL-3)の違いによる免疫誘導機能の違いの解析を進めている.腫瘍抗原としての腫瘍抽出遺伝子(メッセンジャーRNA;mRNA)での既知の腫瘍抗原遺伝子(MAGE,K-ras,p53)の発現検討とともに免疫抑制蛋白に関する遺伝子(Fas,Fas ligand,TRAIL,TRAIL receptor)の発現検討も行い、免疫誘導やアポトーシス誘導などの機能検討を行っている.マウス腫瘍細胞抽出mRNA導入樹状細胞による特異的免疫誘導では腫瘍特異的なprotection immunityの誘導と担癌マウスの生存期間延長を証明し、腫瘍系によって誘導されるヘルパー免疫の機能の違いを証明した.更に抗癌剤治療における免疫誘導の1つの機序として、樹状細胞の関与を実証する研究への発展をめざし、ex vivoがらin vivoでの樹状細胞の動態と抗原の取り込みの検討を続けている.抑制系の免疫の動きと特異的免疫の指標の動きを同時に捉える検定系の確立を試みている.実際の臨床応用をめざしてさらに、症例を集積中である.ペプチド及び遺伝子導入抗原提示細胞(樹状細胞)による免疫療法の研究において、腫瘍抗原ペプチドとして従来同定されてきたMAGE-3遺伝子由来HLA-A2結合性ペプチド(FLWGPRALV,amino acids271-279)とヒト末梢血単球由来の樹状細胞とを用いて、食道癌術後長期生存患者の末梢血リンパ球との混合培養系でペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球の誘導と患者の自己腫瘍細胞(MAGE-3遺伝子陽性、HLA-A2陽性)に対する傷害活性を証明し、T細胞受容体の解析ではVb3& Vb7のオリゴクロナリティーを証明した.また遺伝子導入樹状細胞の特異的免疫誘導の検討のためモデル抗原遺伝子としてLacZ遺伝子を用いその標的蛋白としてβ-galactosidase及びH-2L^d結合性ペプチド(TPHPARIGL,amino acids876-884)に対する特異的免疫誘導の研究を進めている.その結果アデノウイルスベクターを用いる系で特異的な抗体産生とIFN-γ及びIgG2a産生を主とするTヘルパー免疫の動きを捉えることができた.この特異的液性免疫誘導を指標として、樹状細胞の培養条件(GM-CSF or IL-3)の違いによる免疫誘導機能の違いの解析を進めている.腫瘍抗原としての腫瘍抽出遺伝子(メッセンジャーRNA;mRNA)での既知の腫瘍抗原遺伝子(MAGE,K-ras,p53)の発現検討とともに免疫抑制蛋白に関する遺伝子(Fas,Fas ligand,TRAIL,TRAIL receptor)の発現検討も行い、免疫誘導やアポトーシス誘導などの機能検討を行っている.マウス腫瘍細胞抽出mRNA導入樹状細胞による特異的免疫誘導では腫瘍特異的なprotection immunityの誘導と担癌マウスの生存期間延長を証明し、腫瘍系によって誘導されるヘルパー免疫の機能の違いを証明した.更に抗癌剤治療における免疫誘導の1つの機序として、樹状細胞の関与を実証する研究への発展をめざし、ex vivoがらin vivoでの樹状細胞の動態と抗原の取り込みの検討を続けている.抑制系の免疫の動きと特異的免疫の指標の動きを同時に捉える検定系の確立を試みている.実際の臨床応用をめざしてさらに、症例を集積中である.ペプチド及び遺伝子導入抗原提示細胞(樹状細胞)による免疫療法の研究を行っている.腫瘍抗原ペプチドとして従来同定されてきたMAGE-3遺伝子由来HLA-A2結合性ペプチド(FLWGPRALV,amino acids 271-279)とヒト末梢血単球由来の樹状細胞とを用いて、食道癌術後長期生存患者の末梢血リンパ球の混合培養系でペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球の誘導と患者の自己腫瘍細胞(MAGE-3遺伝子陽性、HLA-A2陽性)に対する傷害活性を証明し、現在T細胞受容体の解析を行い論文投稿準備中である.また遺伝子導入樹状細胞の特異的免疫誘導の検討のためモデル抗原遺伝子としてLacZ遺伝子を用いその標的蛋白としてβ-galactosidase及びH-2L^d結合性ペプチド(TPHPARIGL,amino acids 876-884)に対する特異的免疫誘導の研究を進めている.その結果アデノウイルスベクターを用いる系で特異的な抗体産生とIFN-γ及びIgG2a産生を主とするTヘルパー免疫の動きを捉えることができた.この特異的液性免疫誘導を指標として、さらに樹状細胞の機能解析を進めている.

腫瘍抗原としての腫瘍抽出遺伝子(メッセンジャーRNA;mRNA)での既知の腫瘍抗原遺伝子の発現検討とともに免疫抑制蛋白に関する遺伝子の発現検討も行い、mRNA導入樹状細胞による特異的免疫誘導をマウス及びヒトの系で同定を行っている.マウスでは腫瘍特異的な増殖抑制を示し、腫瘍系によって誘導されるヘルパー免疫の機能の違いが示されている.樹状細胞への抗原誘導効率、遺伝子導入樹状細胞による抗原特異的免疫誘導の効率の検定系の確立を試みている.実際の臨床応用をめざして、特異的免疫誘導を阻害する因子を坦癌患者において検討しており、症例を集積中である.腫瘍抗原ペプチドとして同定されたMAGE-3遺伝子由来HLA-A2結合性ペプチド(FLWGPRALV,amino acids 271-279)特異的細胞傷害性Tリンパ球のT細胞受容体の解析ではVb3 & Vb7のオリゴクロナリティーを証明し、また遺伝子導入樹状細胞の特異的免疫誘導の検討のためモデル抗原遺伝子としてアデノウイルスベクターLacZ遺伝子を用いその標的蛋白としてβ-galactosidase及びH-2L^d結合性ペプチド(TPHPARIGL,amino acids 876-884)に対する特異的な抗体産生とIFN-γ及びIgG2a産生を主とするTヘルパー免疫の動きを指標として、樹状細胞の培養条件(GM-CSF or IL-3)の違いによる免疫誘導機能の違いの解析を進めている.腫瘍抗原としての腫瘍抽出遺伝子(メッセンジャーRNA;mRNA)での既知の腫瘍抗原遺伝子(MAGE,K-ras,p53)の発現検討とともに免疫抑制蛋白に関する遺伝子(Fas,Fas ligand,TRAIL,TRAIL receptor)の発現検討とともに免疫誘導やアポトーシス誘導などの機能検討を行っている.マウス腫瘍細胞抽出mRNA導入樹状細胞による特異的免疫誘導では腫瘍特異的なprotection immunityの誘導と担癌マウスの生存期間延長を証明した.更に抗癌剤治療における免疫誘導の1つの機序として、樹状細胞の関与を実証する研究への発展をめざし、ex vivoからin vivoでの樹状細胞の動態と抗原の取り込みの検討を続けている.抑制系の免疫の動きと特異的免疫の指標の動きを同時に捉える検定系の確立を試みている.実際の臨床応用をめざしてさらに、症例を集積中である.
myoseverinを用いた網膜神経細胞再生の試み

我々は多核筋管細胞C2C12細胞の単核細胞への分化を誘導するプリン誘導体であるmyoseverinの神経分化、再生に対する効果を検討した。昨年度報告した様にマウス褐色細胞腫PC12に神経栄養因子(NGF)とmyoseverinを共に添加したところ軸索の伸展が約15%の細胞で抑制されたが、細胞の分裂を誘導することなく、最終的にアポプトーシスを起こした。この時、Ral guanine nucleotide exchange factor (RalGDS)が誘導されることを見い出した。2.これらの単離された遺伝子の全長cDNAをクローニングして、発現ベクターに組み込み、PC12細胞に導入して安定発現細胞株を樹立した。これらの細胞株にNGFを添加して、分化誘導に対する反応を検討したが、コントロールの細胞に比べて有意な差は認められなかった。4.上記の培養開始後7日にダリア細胞への分化がおこっているかどうかを検討するためにglial fibrillary acidic protein (GFAP)の発現を定量性PCRで確認した結果、bFGF添加群ではその発現が認められたが、bFGF + myoseverin添加群では、認められなかった。myoseverin添加群では、培養後5日から、アポプトーシスを起こしはじめ、神経終末分化にはむしろ抑制的に働いていると推測された。以上の事実より、myoseverinはbFGFのRPEのtransdifferentiation能を初期には増強するが、後期ではむしろアポプトーシスを誘導し、その毒性が課題になると考えられた。我々は多核筋管細胞C2C12細胞の単核細胞への分裂を誘導するプリン誘導体であるmyoseverinの神経分化、再生に対する効果を検討した。1マウス褐色細胞腫PC12に神経成長因子(NGF)を添加して分化を誘導したのち、myoseverinを添加し、その形態にたいする影響を顕微鏡下で観察した。その結果、筋管細胞に見られる様な明らかな脱分化を観察することはできなかった。そこで、上記成長因子と共にmyoseverinを添加して、その分化に対する影響を観察したところ、軸索の進展の抑制が約15%の細胞において確認された。しかしながら、これらの細胞はmyoseverin無添加時と同様に分裂することなく最終的にはアポプトーシスを起こし,再生を誘導することは出来なかった。2これらのmyoseverinの部分的な分化抑制効果がどのようなメカニズムで誘導されるかを検討した。最近、他の研究者らにより、Ral Guanine Nucleotide Exchange Factor(RalGDS)がPC12細胞の軸索進展を抑制すること、myoseverinがC2C12myoseverinを添加後、RalGDSの発現をノーザンブロット法で検討した結果、これらの細胞においても誘導が確認された。これらの事実より、myoseverinの分化抑制効果はRalGDSの発現誘導に少なくとも部分的には因っている可能性が示唆された。さらに現在、myoseverin無添加、添加PC12細胞からcDNAライブラリーを作成し、サブトラクションクローニングを行い、myoseverinにより誘導される他の遺伝子の同定を試みている。この時、Ral guanine nucleotide exchange factor(RalGDS)が誘導されることを見い出した。

4.上記の培養開始後7日にダリア細胞への分化がおこっているかどうかを検討するためにglial fibrillary acidic protein(GFAP)の発現を定量性PCRで確認した結果、bFGF添加群ではその発現が認められたが、bFGF+myoseverin添加群では、認められなかった。myoseverin添加群では、培養後5日から、アポプトーシスを起こしはじめ、神経終末分化にはむしろ抑制的に働いていると推測された。以上の事実より、myoseverinはbFGFのRPEのtransdifferentiation能を初期には増強するが、後期ではむしろアポプトーシスを誘導し、その毒性が課題になると考えられた。
神経回路網の可塑性の研究

総括班事業として、第1回夏のワークショップ「脳の可塑性の物質的基礎」を昭和61年8月21日23日に名古屋市勤労福祉センターで行った。班員を含めて120名の出席があった。シナプス伝達と代謝節,学習と脳内変化,神経の成長促進にあずかる因子について11件の発表と討論が行われた(成果は来年度出版すべく準備中である)。第1回シンポジウムを昭和61年12月4日に大阪市大阪商工会議所で行い、6班員の研究発表を行った。約500名の出席があった。これらの集会の前後に計画研究班ごとの班会議が行われた。これらの集会の立案は研究計画委員会(委員長久保田競)が行ったが、合計5回の委員会を東京で開催した(61.8.23,61.9.27,61.12.20,62.1.31,62.3.23)。研究連絡委員会(委員長津本忠治)を組識し、可塑性神経回路ニュースを5回(B5判37ページ、2ケ月に1回の割合)発行し、班員相互の連絡をはかった。また成果報告書(1)を発行した。このため委員会は2回(61.8.21名古屋,61.12.4大阪)開催した。総括班会議は第1回を61.8.23名古屋で行い、第2回を62.3.23東京で行い、一年間の総括を行い、次年度以降の事業について意見交換をした。
急性及び慢性の右室圧上昇時の右冠動脈血流動態とその規定因子

正常の右冠動脈血流は左冠動脈と異なり収縮期にも充分流れる事が知られており、それは正常では右室圧が左室圧よりはるかに低い事が関係すると考えられている。一方小児の心疾患には右室圧が有意に上昇するものが多く正常の右冠動脈血流は維持出来なくなる筈で、負荷に対し右冠動脈がどのように適応し血流を維持増加させるかを体系的に検討した。1。急性開胸陽圧呼吸犬で心拍数と右室圧をそれぞれ独立に段階的に増加させ(ペイシング及び肺動脈絞厄術)、右室圧増加各段階で心拍数を変化させ右冠動脈総血流量(T/F)と収縮期と拡張期の血流分配比(D/T,diastolic/total phaseで表現した)を検討した。その間大動脈圧は一定値を保ち定常状態は維持された。心拍数増加も右室圧増加も共に右冠動脈血流を増加させる。しかし前者は主として収縮期の増加分により、後者は拡張期増加分の寄与によりもたらされる。急性実験の条件下では右室圧増加は右冠動脈血流動態の左冠動脈化様の適応を示し、増加した各右室圧レベルでの心拍数増加に対してみると拡張期血流の増加がより寄与している結果を得た。2。次のステップとしてより現実の状態に近い慢性(1-2か月)のは肺動脈絞厄による右室圧増加犬では右冠動脈の全体としての器質的分布の変化や右室筋肉量の増加もたらされると考えられるので慢性犬によるペイシング心拍数制御下の右冠動脈血流の対応を検討中であるがこの1年は一身上の理由による時間制約もあって充分な結果を得るに至っていないがこのまま継続して予定を完了したいと考えている。1。2。冠動脉の器質的病変なくしても冠不全がおこる事はBuckberg等により左冠動脉で実験的にも確認されたが、右冠動脉の右心負荷に対する適応の様相はいまだ明かとはいえない.小児では右心負荷疾患が多くこの点を明かにする事を試みた。リタイア・ビ-グル犬11頭を用いネンブタール麻酔,急性陽圧呼吸下に右冠動脈起始部血流をトランジフト・タイム型超音波血流計を直接装着し,肺動脉絞厄術による段階的右室圧上昇と、それと独立に右房ベーシングによる心拍数可変の條件下に右冠動脉血流の対応的変化を観察した。大動脉左閉流速,右室及び肺動脉圧も同時記録し,収縮期拡張期別の冠血流評価、状態のモニターに役立てた.結果として次の事が確認された.(1)正常右室圧下では心拍数増加により右冠血流は増加したが,主として収縮期血流の増加によった.(2)段階的右室増加も右冠血流の増加をもたらすが,主として拡張期血流の増加によった.(3)どの右室圧レベルでも心拍数増加で更に右冠血流は増加するが、微調製的で右室圧上昇による拡張期寄与が右冠血流レベルの寄与要因としてより大きい。従って急性実験条件下では特〓の右室圧上昇に対し右冠動脉はその血流増加反応としては、より左冠動脉的に適応する、或いはより左冠動脉的流れ方で適応するといえる。一方小児の心疾患には右室圧が有意上昇するものが多く正常に右冠動脈血流は維持出来なくなる筈で、負荷に対し右冠動脈がどのように適応し血流を維持増加させるかを体系的に検討した。1。

急性開胸陽圧呼吸犬で心拍数と右室圧をそれぞれ独立に段階的に増加させ(ペイシング及び肺動脈絞厄術)、右室圧増加各階段で心拍数を変化させ右冠動脈総血流量(T/F)と収縮期と拡張期の血流分配比(D/T,diastolic/total phaseで表現した)を検討した。その間大動脈圧は一定値を保ち定常状態は維持された。心拍数増加も右室圧増加も共に右冠動脈血流を増加させる。しかし前者は主として収縮期の増加分により、後者は拡張期増加分の寄与によりもたらされる。急性実験の条件下では右室圧増加は右冠動脈血流動態の左冠動脈化様の適応を示し、増加した各右室圧レベルでの心拍数増加に対してみると拡張期血流の増加がより寄与している結果を得た。2。次のステップとしてより現実の状態に近い慢性(1-2か月)の肺動脈絞厄による右室圧増加犬では右冠動脈の全体としての器質的分布の変化や右室筋肉量の増加もたらされると考えられるので慢性犬によるペイシング心拍数制御下の右冠動脈血流の対応を検討中であるがこの1年は一身上の理由による時間制約もあって充分な結果を得る至っていないがこのまま持続して予定を完了したいと考えている。
ニホンジカ寄生住肉胞子虫の下痢毒性因子の検出および毒性機序の解明

住肉胞子虫Sarcocytsis sp.は、馬刺しの食中毒事例により新規の食中毒病原体と認定され、近年ではシカ肉でも同様の食中毒を起こした。しかしその毒性因子、機序、種特異性は不明である。本研究では、野生ニホンジカに寄生するSarcocytsis sp.のヒトに対する腸管毒性因子と種間毒性の相違を解明する。国内の野生ニホンジカ亜種からSarcocytsis sp.虫体を分離し、分子量依存的に分画した虫体タンパク質を用いてin vitro、in vivo実験を行い、毒性因子を同定する。さらに、当該標的タンパク質について、Sarcocytsis種の違いに起因する毒性の相違を検討する。
高機能性流体を用いた新エネルギー変換装置の開発

最近,高い機能性を有する流体として,磁性流体やER流体,MR流体などに関する実験および,理論的研究が盛んに行われてきており,複雑な流体的振る舞いをすることから,複雑流体として位置付けられ,他分野にわたる応用研究が行われてきている.しかしながら,これらの流体は,複雑で多様的な特性を有するため,実用化にちなんだ応用開発研究において,解決すべき多くの点がある.この点を踏まえて,本研究では,高機能性流体を宇宙において利用する際に,最適な応用例の一つとして,高機能性流体エネルギー変換装置の開発研究を行った.まず,磁性流体を用いたエネルギー変換装置は,既に考案されているが,流体の飽和磁化が小さいことにより,エネルギー効率がそれほど高く望めなかったという背景から,磁性流体より大きな飽和磁化をもち,かつ,MR流体より流体的な安定性が良い,磁気混合流体(MCF)を開発した.次に,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際には,地上でのそれの特性と比較検討しておく必要がある.そこで,広範囲なグラスホフ数やレーリー数下で,そのエネルギー変換装置内における熱流動特性がどのように変化するかについて,数値実験を行い,宇宙で利用する際,生じるであろう熱流動特性の問題点を明らかにすることができた.また,実験においても,色々な流動様式によるエネルギー変換装置内における熱流動特性やエネルギー効率の変化について明らかにした.さらに,沸騰により気泡を含ませたエネルギー変換装置とし,気液二相流としての流動を持たせた.この熱流動特性について,理論解析と実験を行った.実験結果を理論は説明し得るものであった.以上の研究により,現段階で十分という訳ではなく,まだ多くの知見を得る必要があるが,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際の様々な検討を行った結果,設計指針において重要な知見を得ることができた.最近,高い機能性を有する流体として,磁性流体やER流体,MR流体などに関する実験および,理論的研究が盛んに行われてきており,複雑な流体的振る舞いをすることから,複雑流体として位置付けられ,他分野にわたる応用研究が行われてきている.しかしながら,これらの流体は,複雑で多様的な特性を有するため,実用化にちなんだ応用開発研究において,解決すべき多くの点がある.この点を踏まえて,本研究では,高機能性流体を宇宙において利用する際に,最適な応用例の一つとして,高機能性流体エネルギー変換装置の開発研究を行った.まず,磁性流体を用いたエネルギー変換装置は,既に考案されているが,流体の飽和磁化が小さいことにより,エネルギー効率がそれほど高く望めなかったという背景から,磁性流体より大きな飽和磁化をもち,かつ,MR流体より流体的な安定性が良い,磁気混合流体(MCF)を開発した.次に,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際には,地上でのそれの特性と比較検討しておく必要がある.そこで,広範囲なグラスホフ数やレーリー数下で,そのエネルギー変換装置内における熱流動特性がどのように変化するかについて,数値実験を行い,宇宙で利用する際,生じるであろう熱流動特性の問題点を明らかにすることができた.また,実験においても,色々な流動様式によるエネルギー変換装置内における熱流動特性やエネルギー効率の変化について明らかにした.さらに,沸騰により気泡を含ませたエネルギー変換装置とし,気液二相流としての流動を持たせた.この熱流動特性について,理論解析と実験を行った.実験結果を理論は説明し得るものであった.以上の研究により,現段階で十分という訳ではなく,まだ多くの知見を得る必要があるが,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際の様々な検討を行った結果,設計指針において重要な知見を得ることができた.最近,高い機能性を有する流体として,磁性流体やER流体,MR流体などに関する実験および,理論的研究が盛んに行われてきている.これらの研究においては,複雑な流体的振る舞いをすることから,複雑流体として位置付けられ,他分野にわたる応用研究が行われてきている.しかしながら,これらの流体は,複雑で多様的な特性を有するため,実用化にちなんだ応用開発研究において,解決すべき多くの点がある.中でも,21世紀におけるナノテクノロジーやバイオテクノロジー、さらには、宇宙開発において,これらの高機能性流体の利用は,大いに期待されているところであり,これに関する研究を推進しなければならないのが現状である.これらの点を踏まえて,本研究では,高機能性流体を宇宙において利用する際に,最適な応用例の一つとして,高機能性流体エネルギー変換装置の開発研究を行った.まず,磁性流体を用いたエネルギー変換装置は,既に考案されているが,流体の飽和磁化が小さいことにより,エネルギー効率がそれほど高く望めなかったという背景から,磁性流体より大きな飽和磁化をもち,かつ,MR流体より流体的な安定性が良い,磁気混合流体(MCF)を開発した.この流体を使えば,宇宙空間内におけるエネルギー変換装置の効率が格段に向上することが期待できる.次に,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際には,地上でのそれの特性と比較検討しておく必要がある.そこで,広範囲なグラスホフ数やレーリー数下で,そのエネルギー変換装置内における熱流動特性がどのように変化するかについて,数値実験を行い,宇宙で利用する際,生じるであろう熱流動特性の問題点を明らかにすることができた.また,実験においても,色々な流動様式によるエネルギー変換装置内における熱流動特性やエネルギー効率の変化について明らかにした.平成14年度における研究に引き続き,高機能性流体を宇宙において利用する際の最適な応用例の一つである,高機能性流体エネルギー変換装置の開発研究を行った.まず,磁性流体を用いたエネルギー変換装置は,既に考案されているが,流体の飽和磁化が小さいことにより,エネルギー効率がそれほど高く望めなかったという背景から,次の2点における研究を主に推進した.

(1)沸騰により気泡を含ませたエネルギー変換装置とし,気液二相流としての流動を持たせた.この熱流動特性について,理論解析と実験を行った.実験結果を理論は説明し得るものであり,また,宇宙空間内におけるエネルギー変換装置の効率を向上させるのに必要な知見を得ることできた.(2)次に,磁性流体より大きな飽和磁化をもち,かつ,MR流体より流体的な安定性が良い,磁気混合流体(MCF)を開発し,この流体を使えば,宇宙空間内におけるエネルギー変換装置の効率が格段に向上することが期待できるというコンセプトの下,その可能性について検討した.結果的には,流体中に含まれる鉄粒子のサイズにより,粒子沈降の問題が生ずるため,エネルギー変換装置に使用する際には,流体成分の選定が重要であることが判った.また,エネルギー変換装置において重要となる磁気圧について実験的に調べ,MCFや磁性流体の磁気圧の相違について実験的に評価した.以上の研究により,現段階で十分という訳ではなく,まだ多くの知見を得る必要があるが,高機能性流体エネルギー変換装置を宇宙で利用する際の様々な検討を行った結果,設計指針において重要な知見を得ることができた.
関節リウマチ特異的ノンコーディングRNA相互作用に関する研究

関節リウマチ(RA)の病態に、マイクロRNA(miRNA)が関与することが次第に明らかになってきているが、最近の研究からそのmiRNAと非翻訳長鎖RNA(lncRNA)とが相互に制御している可能性が指摘されている。われわれは、これまでにRA特異的に減少しているmiR-124aを発見しており、このmiR-124aを制御するlncRNAをスクリーニングし、lncRNAとmiR124aとの相互作用を試験管内やラット関節炎モデルを使って明らかにしたいと考えている。
地盤の破砕性を考慮した杭の支持力評価手法の提案

しらす,スコリア,まさ土などの火山性堆積物や風化残積土およびCalcareous Sediments,サンゴ礫混じり土などの生物の遺骸を起源とする海成堆積物は,ともに土粒子形状が角張っているため粒子破砕を生じやすく、粒子破砕に伴う支持力の低下および基礎の沈下の増大といったことが工学的な問題となっている.また,世界の情勢として,設計手法は従来の許容応力度設計法から限界状態設計法へと移行している.そのようなことを背景として,本研究は,顕著な変形性を示す破砕性地盤の破砕性を考慮した合理的な支持力評価手法の確立を目的とした.まず,破砕性地盤材料の強度・変形特性と粒子破砕の関わりを単粒子破砕試験,排水三軸圧縮試験によって検討した.そこでは,粒子破砕に着目したせん断強度特性を評価する手法を提案した.次に,破砕性地盤の杭の支持力を評価する際,地盤の強度の特殊性よりむしろ圧縮変形特性に大きな特徴があることを指摘し,支持力の発現形態を微小変形で強度を発揮する周面摩擦力と大きな地盤変形を要する先端支持力とに分離して評価することが合理的であることを示した.その中で,周面摩擦力の発現特性が初期応力状態と異種材料間の摩擦特性に起因することを指摘し,リングせん断試験および模型杭の載荷実験結果によって最大強度,残留強度ともに概ね水平応力に依存したクーロン則で評価できることを明らかにした.また,先端支持力の発現特性が地盤の圧縮性および初期平均応力に依存することに着目し、破壊モードを考慮した球状空洞理論の援用によって支持力式を提案した.その評価式の算定結果は杭の載荷実験によって材料毎のある地盤変形量に対応していることがわかった.これらの考察,実験結果にもとづき,地盤の破砕性,圧縮性,強度特性を考慮した合理的な支持力評価手法のフローを提示した.しらす,スコリア,まさ土などの火山性堆積物や風化残積土およびCalcareous Sediments,サンゴ礫混じり土などの生物の遺骸を起源とする海成堆積物は,ともに土粒子形状が角張っているため粒子破砕を生じやすく、粒子破砕に伴う支持力の低下および基礎の沈下の増大といったことが工学的な問題となっている.また,世界の情勢として,設計手法は従来の許容応力度設計法から限界状態設計法へと移行している.そのようなことを背景として,本研究は,顕著な変形性を示す破砕性地盤の破砕性を考慮した合理的な支持力評価手法の確立を目的とした.まず,破砕性地盤材料の強度・変形特性と粒子破砕の関わりを単粒子破砕試験,排水三軸圧縮試験によって検討した.そこでは,粒子破砕に着目したせん断強度特性を評価する手法を提案した.次に,破砕性地盤の杭の支持力を評価する際,地盤の強度の特殊性よりむしろ圧縮変形特性に大きな特徴があることを指摘し,支持力の発現形態を微小変形で強度を発揮する周面摩擦力と大きな地盤変形を要する先端支持力とに分離して評価することが合理的であることを示した.その中で,周面摩擦力の発現特性が初期応力状態と異種材料間の摩擦特性に起因することを指摘し,リングせん断試験および模型杭の載荷実験結果によって最大強度,残留強度ともに概ね水平応力に依存したクーロン則で評価できることを明らかにした.また,先端支持力の発現特性が地盤の圧縮性および初期平均応力に依存することに着目し、破壊モードを考慮した球状空洞理論の援用によって支持力式を提案した.その評価式の算定結果は杭の載荷実験によって材料毎のある地盤変形量に対応していることがわかった.これらの考察,実験結果にもとづき,地盤の破砕性,圧縮性,強度特性を考慮した合理的な支持力評価手法のフローを提示した.本研究は,石灰質地盤としらす地盤を主体とした粒子破砕の卓越した地盤における杭基礎の支持力特性を明確にすると共に,地盤の破砕性を考慮した実務上有益で,かつ一般性を有した支持力評価法の提案を目指したものである。本年度,具体的に行った研究内容と得られた結果をまとめると以下のようである。1)プラントル、カ-コット、スコルブスキー、水野、メイヤホッフ、テルツアッギ、ハンセン、山口といった先人達が示している古典的な支持力評価手注を整理し、それらの手法の特色を取りまとめるとともに、それらの手法が抱える問題点と適用限界を明確にした。2)球状押し広げの理論を考察することにより,土の強さ,地盤としての剛性と圧縮性および初期応力状態の評価が,地盤の破砕性を取り入れた支持力算定式を提示する上で,極めて重要であることを指摘した。3)大変形時の土の強さを明確にするために,リングねじりせん断試験装置を製作し,その性能試験を行い,今後の実験に利用できることを確認した。4)先端支持力と周面摩擦力を独立に測定でき、土中の水平応力と鉛直応力(上載圧)を制御或いは計測可能な小型の模型杭載荷装置を用いて、破砕性の異なる数種類の砂を対象として,初期応力状態を種々変えた模型杭の載荷実験を実施した。これにより破砕性の違いが,先端支持力の発現特性に顕著に表われることを示した。また,その発現メカニズムを視覚的に示すと共に,破壊モードの定式化を行った。来年度は,本年度の成果を踏まえて,鉛直支持力評価手法の確立と実際問題に適用するためのシステムの構築を行う予定である。しらす,スコリア,まさ土などの火山性堆積物や風化残積土およびCalcareous Sediments,サンゴ

礫混じり土などの生物の遺骸を起源とする海成堆積物は,ともに土粒子形状が角張っているため粒子破砕を生じやすく、粒子破砕に伴う支持力の低下および基礎の沈下の増大といったことが工学的な問題となっている.また,世界の情勢として,設計手法は従来の許容応力度設計法から限界状態設計法へと移行している.そのようなことを背景として,本研究は,顕著な変形性を示す破砕性地盤の破砕性を考慮した合理的な支持力評価手法の確立を目的とした.まず,破砕性地盤材料の強度・変形特性と粒子破砕の関わりを単粒子破砕試験,排水三軸圧縮試験によって検討した.そこでは,粒子破砕に着目したせん断強度特性を評価する手法を提案した.次に,破砕性地盤の杭の支持力を評価する際,地盤の強度の特殊性よりむしろ圧縮変形特性に大きな特徴があることを指摘し,支持力の発現形態を微小変形で強度を発揮する周面摩擦力と大きな地盤変形を要する先端支持力とに分離して評価することが合理的であることを示した.その中で,周面摩擦力の発現特性が初期応力状態と異種材料間の摩擦特性に起因することを指摘し,リングせん断試験および模型杭の載荷実験結果によって最大強度,残留強度ともに概ね水平応力に依存したクーロン則で評価できることを明らかにした.また,先端支持力の発現特性が地盤の圧縮性および初期平均応力に依存することに着目し,破壊モードを考慮した球状空洞理論の援用によって支持力式を提案した.その評価式の算定結果は杭の載荷実験によって材料毎のある地盤変形量に対応していることがわかった.これらの考察,実験結果にもとづき,地盤の破砕性,圧縮性,強度特性を考慮した合理的な支持力評価手法のフローを提示した.
超微量糖脂質の糖鎖構造解析のためのナノエレクトロスプレーLC/MS法の改良と応用

糖脂質糖鎖構造解析の迅速・簡便化を目指したナノエレクトロスプレーイオン化LC/MSの改良を試みた。従来用いられてきたFABMSあるいはSIMSによる糖脂質糖鎖の構造解析法は、MS/MSを用いることなく迅速に糖鎖構造情報が得られる点で常用手段となっている。しかしながら、近年イオントラップMSなどの登場により低価格で操作が容易なMS/MS装置を設置できるようになってきた。高感度なイオン化法であるナノエレクトロスプレーと組み合わせることができれば、現在のFABMSやSIMSに取って代われるとともに、単離精製まで至らない試料に対してもLC/MS/MSにより糖鎖構造解析の道が開けることになる。本研究ではハロゲン系溶媒を含むスプレー溶媒を用いて負イオンエレクトロスプレーを行うことが糖脂質分析に適していることがわかった。正イオンモードでは、分子関連イオンがプロトン化分子とナトリウム付加分子の二つに分かれてしまい高感度分析に不利であるが、負イオンモードでは脱プロトン化分子だけが現れるので高感度分析に適していることがわかった。負イオンモードのスプレー溶媒としては含塩素系溶媒が、グロー放電を引き起こしてエレクトロスプレーを不安定にするスプレー液滴中の電子を除去するのに有効であることがわかった。特にクロロホルムは糖脂質の順相系クロマトグラフィー溶媒としてよく用いられており好都合である。負イオンを効率よく生成させるためにはアンモニアやモノメチルアミンなどの塩基物質の添加も効果的であることがわかった。また、ナノエレクトロスプレーをLC/MSに適合させるにはLCの精確な流量制御が現状では困難なことや、内径がマイクロメーター程度のスプレーノズルの目詰まり対策が難しいことがわかった。実用的には、内径数十から50マイクロメートルのスプレーノズルがマイクロLC/MSに適しているようである。マイクロLCに用いるHPLCポンプはマイクロリッター送液に適した専用ポンプが必要となることもわかったが、現状ではコストの面で従来機種を用いることになった。LCカラムは溶融石英キャピラリーを用いて作成することで、カラム出口をスプレーチップ直前に配置し、溶出バンドの拡散を軽減させる計画であったが、ケイ酸カリウムを用いて形成するフリットの安定な作成ができず、現在も試行錯誤中である。糖脂質の質量スペクトルは、高速原子衝撃質量分析法(FABMS)あるいは二次イオン質量分析法(SIMS)によって糖脂質の構造解析法としての有用性が確固たるものとなっている。しかしながら、これらの方法により分析する際には分析対象の糖脂質を単離精製しなければならない点が欠点であり、構造研究の大きな負担となっている。特に生理活性を持つ非常に微量な糖脂質を分析しようとすると、単離精製操作における糖脂質の損失が大きくなることから、単離精製することなく糖脂質の質量分析が行える方法の開発が待たれている。本研究では液体クロマトグラフィーを直結した質量分析計を用いて、この問題の解決を試みる。特に、微量分析を達成するために、ナノエレクトロスプレーイオン化法を糖脂質の分析に適した形に改良することを第一の目的とする。まず、第一段階として、糖脂質の通常のエレクトロスプレーイオン化法による分析条件の検討を行った。スプレー溶媒としては、負イオンモードでは、グロー放電を引き起こしてエレクトロスプレーを不安定にする、スプレー液滴中の電子を除去する含

塩素系溶媒が有効であることがわかった。特にクロロホルムは糖脂質の順相系クロマトグラフィー溶媒としてよく用いられており好都合である。負イオンを効率よく生成させるためには塩基物質の添加も効果的であることがわかった。現時点では通常のエレクトロスプレーイオン源を用いて、数pmoleの牛脳由来ガングリオシドGM1が非常に感度良く測定できた。今後、マイクロスプレーからナノスプレーへと改良して行くと共に、生体組織から得られる微量糖脂質画分の分析に応用して行く予定である。昨年に引き続き、糖脂質糖鎖構造解析の迅速・簡便化を目指したナノエレクトロスプレーイオン化LC/MSの改良を試みた。従来用いられてきたFABMSあるいはSIMSによる糖脂質糖鎖の構造解析法は、MS/MSを用いることなく迅速に糖鎖構造情報が得られる点で常用手段となっている。しかしながら、近年イオントラップMSなどの登場により低価格で操作が容易なMS/MS装置を設置できるようになってきた。高感度なイオン化法であるナノエレクトロスプレーと組み合わせることができれば、現在のFABMSやSIMSに取って代われるとともに、単離精製まで至らない試料に対してもLC/MS/MSにより糖鎖構造解析の道が開けることになる。昨年は、ハロゲン系溶媒を含むスプレー溶媒を用いて負イオンエレクトロスプレーを行うことが糖脂質分析に適していることを明らかにした。溶媒へのアンモニアやトリメチルアミンの添加も効率的なイオン生成に効果があることがわかった。今年度の研究では、ナノエレクトロスプレーをLC/MSに適合させるにはLCの精確な流量制御が現状では困難なことや、内径がマイクロメーター程度のスプレーノズルの目詰まり対策が難しいことがわかった。実用的には、内径数十から50マイクロメートルのスプレーノズルがマイクロLC/MSに適している。マイクロLCに用いるHPLCポンプはマイクロリッター送液に適した専用ポンプが必要となることもわかったが、現状ではコストの面で従来機種を用いることになった。LCカラムは溶融石英キャピラリーを用いて作成することで、カラム出口をスプレーチップ直前に配置し、溶出バンドの拡散を軽減させる計画であったが、ケイ酸カリウムを用いて形成するフリットの安定な作成ができず、現在も試行錯誤中である。今後、引き続き糖脂質糖鎖構造解析の微量か分析に向けた研究を継続して行く計画である。
WntおよびBMPシグナルの相互作用による胃粘膜上皮分化制御機構

消化管上皮幹細胞の未分化性維持にはWntシグナルが重要な役割を果たしており、その分化誘導にはBMPシグナルが重要である事が示唆されている。Wntシグナルを異常亢進させる遺伝子変異は消化器癌の発生原因として知られており、また、BMP受容体の変異たよるBMPシグナル遮断は家族性腫瘍疾患の原因である。本研究では、WntとBMPシグナルの相互作用による胃粘膜上皮分化制御機構を明らかにする事を目的とし、Wntシグナル亢進によって胃がんを発生するK19-Wnt1/C2mEマウスを用いてBMPシグナルの変化について解析し、BMPシグナル抑制マウスモデルを新たに作製して胃粘膜上皮分化増殖への影響を解析した。遺伝子発現解析の結果、Wntシグナル亢進に起因して発生するマウス胃がんでは、BMP受容体発現の顕著な低下を認めた。この受容体発現低下による細胞増殖への影響を解析するために、コンディショナルにBMP受容体を発現する胃がん細胞を作製したが、増殖や腫瘍原性への影響は認められなかった。したがって、BMP抑制は腫瘍発生の初期段階に関与している可能性が考えられた。また、BMPシグナルの内在性抑制因子であるnogginを胃粘膜で発現するK19-Nogマウスを作製した。K19-Nogマウスの胃粘膜には変化が認められなかったが、胃炎を自然発症するK19-C2mEマウスと交配して作製したK19-Nogマウスの胃粘膜には変化が認められなかったが、胃炎を自然発症するK19-C2mEマウスと交配して作製したK19-Nog/C2mEマウスでは、約20%の個体で胃に腫瘍が発生した。組織学的にはWntに起因して発生した腫瘍よりも、未分化な上皮細胞で構成されていた。さらに、腫瘍組織ではWntシグナルが亢進している事も明らかになった。以上の結果から、WntとBMPはお互いに制御関係にあり、Wnt活性化とBMP抑制が同時に起こる事により、腫瘍発生作用している可能性が示唆された。腸管上皮幹細胞での未分化性維持にはWntシグナルが重要な役割を果たしており、その分化誘導にはBMPシグナルが重要である事が示唆されている。実際にWntシグナル亢進に作用する遺伝子変異は大腸癌発生の原因であり、BMPシグナル遮断に作用する遺伝子変異は家族性の腸管腫瘍疾患の原因として知られている。しかし、胃粘膜上皮の分化増殖や、胃癌発生過程でのBMPシグナルの役割については知られていない。そこで、以下の実験を行なった。(1)胃癌発生モデルマウス(K19-Wnt1/C2mE)を使って、胃癌組織で発現変化が認められるBMPシグナル関連因子をフィルターアレイにより網羅的に解析した。その結果、BMP受容体遺伝子の発現低下が認められた。そこで、9種類の胃癌細胞株を使って同じBMP受容体遺伝子発現をRT-PCRで解析した結果、6例で発現低下が認められた。(2)BMPの内在性阻害因子であるnoggin遺伝子をRT-PCRによりクローニングし、胃粘膜上皮細胞で転写活性のあるK19遺伝子プロモーター制御下に発現するベクターを作製した。このベクターを用いて、マウス受精卵にインジェクションし、トランスジェニックマウスを6系統作製した。現在、生殖系列での遺伝子伝達について解析を行なっている。(3)K19-Wnt1遺伝子を用いて、胃粘膜上皮でのWnt活性とBMPシグナルとの関係について免疫組織学的に検討した。その結果、β-cateninの細胞内蓄積で検出されるWntシグナルと、Id2発現で検出されるBMPシグナルはそれぞれ異なる領域で活性化している結果が得られた。今後、それぞれのシグナル活性化と細胞分化との相関関係について詳細な組織解析を進める。

組織学的にはWntに起因して発生した腫瘍よりも、未分化な上皮細胞で構成されていた。さらに、腫瘍組織ではWntシグナルが亢進している事も明らかになった。以上の結果から、WntとBMPはお互いに制御関係にあり、Wnt活性化とBMP抑制が同時に起こる事により、腫瘍発生作用している可能性が示唆された。
仮想現実感における対話型シナリオ記述に関する研究

本研究のバーチャルリアリティコンテンツのための記述方式を提案し,複雑で動的なコンテンツ生成を可能にすることである,VRはリアルタイム相互作用が可能なコンデンツを提供する先端メディアである.これまでも3次元グラフィックモデルを表現するためのさまざまな技術はあるが,VRにおいては対話型のコンテンツを生成するプラットフォームが必要になる.基本的にVRは3次元モデルだけではなくビデオ,オーディオなどのようなマルチメディアコンテンツを含み,ユーザとの相互作用のために多様な入出力インターフェース装置が存在する.本研究ではVRコンテンツ記述のために,既に標準化されている言語X3DとSMILを応用した。X3Dを用いて三次元モデルの空間的関係をScene Graphとして階層的に記述し,SMILを用いて3次元モデルを含むマルチメディアとインタフェースの時間的関係をTime Graphとして記述した.本研究で開発したプラットフォームは,カーネル,モジュール,Scene Graph, Time Graphから構成される.カーネルは3次元モデルのリアルタイムレンダリングを担当し,モジュールは機能拡張のために定義される。Scene GraphはX3D形式のファイルにより3次元のモデルを記述され,Time GraphはSMIL形式により記述されモジュールとScene Graph内のノードを時間制御する。Time Graphを通じてマルチメディアコンテンツの制御やインタフェース入力に対応するインタラクションを,Scene Graphやモジュールに直接記述することなく実現することが可能になる.開発したプラットフォームを用いることで,マルチメディアコンテンツとインタフェースを統合し複雑で動的な対話型シナリオを持つVRコンテンツを容易に制作することが可能になった.本研究は、バーチャルリアリティー技術を基盤とし、観衆に没入型リアルタイム仮想環境を提供するストリーテリングのためのフレームワークの設計を行なうことである。本フレームワーク設計の基本概念は、システム開発とコンテンツ開発を同時に考慮することである。具体的には、1)新たなインタフェース装置または映像效果などをシステムに追加する際にカーナルの修正なく、独立的なモジュールの形態で簡単に拡張すること、(開発者に独立的なモジュール開発を支援するだけでなく、システム性能に問題を起こすモジュールを簡単に把握できるようにすること)、2)各モジュールは、対応するXML(extensible Markup Language)基盤の明細を持つので、コンテンツ開発者はプログラムなしでストリーテリングのための必要なモジュールを選択してモジュールの属性を定義することができ、リアルタイム性能を要求する複雑なバーチャルリアリティーシステムでコンテンツを分離し、独立的な開発を支援すること、である。本研究では、フレームワークの主な特徴としてScene GraphとTime Graphのためのモジュールを提案した。ストリーテリングのための仮想環境はマルチメディア、3次元グラフィックだけではなく観衆との多重感覚インタフェースのための多様な装置で構成される。Scene GraphとTime Graphはこれら構成要素の空間関係と時間関係の定義と運営を行なう。Scene Graphは3次元グラフィックとマルチメディア、そしてこれらの属性とtransform hierarchyのような空間的な構成を表現するデータ構造として早くて效率的なレンダリングが行なえるように開発を行なった。Time Graphは複雑で相互作用が可能なストーリー制作を支援するために相対的、階層的、そして相互作用が可能なタイムラインを基盤とする。Time GraphはScene Graphのためのモジュール、そして装置、特殊效果などのためのモジュールの統合だけではなく時間によるこのモジュールの活性化をスケジュールするように設計を行なった。その結果、映画制作のように時間によって多数のScene GraphのCompositionを提供すること、また、複雑なストーリーのコンテンツ制作支援を可能とした。Scene Graphは、VRML(Virtual Reality Modeling Language)のXMLバージョンであるWeb3DのX3DをTime Graphはインターネット上でマルチメディアプレゼンテーションのためのW3CのSMIL(Synchronized Multimedia Integration Language)を利用・拡張し、それぞれ明細を定義する。バーチャルリアリティー基盤のストリーテリングのための本フレームワークは特にGame、博物館、テーマパークなどのようなエデュテインメント分野に応用が期待される。Time Graphを通じてマルチメディアコンテンツの制御やインタフェース入力に対応するインタラクションを,Scene Graphやモジュールに直接記述することなく実現することが可能になる.開発したプラットフォームを用いることで,マルチメディアコンテンツとインタフェースを統合し複雑で動的な対話型シナリオを持つVRコンテンツを容易に制作することが可能になった.
アミノ基・リン酸基無保護法による新規アンチセンス核酸の分子構築

核酸には水酸基、アミノ基、リン酸基といった種々の官能基が存在するために、化学合成に際してこれらの官能基に適当な保護基を導入しておく必要がある。特に、従来の核酸合成法ではアミノ基とリン酸基には塩基性条件下除去される保護基(ベンゾイル基やシアノエチル基など)が用いられているために、保護基の除去条件、すなわち塩基性条件下で分解してしまうようなDNAアナログ(アンチセンス核酸)は合成できなかった。本研究では、核酸のアミノ基およびリン酸基に保護基を導入することなく核酸分子を構築する新しい方法を開発することにより、これまで合成が不可能とされてきた種々の新規DNAアナログ(アンチセンス核酸)を合成することを目的とする。まず、アミノ基とリン酸基を無保護で核酸分子を構築するために、核酸塩基に対する種々の活性リン化合物の反応を^<31>P-NMRを用いて調べたところ、アミノ基に副反応の起こらない水酸基選択的なホスホリル化反応を見い出すことができた。この方法はリン酸よりも酸化度の低いホスホン酸誘導体を出発物質として用いるために、インターヌクレオチドのリン原子に保護基を導入する必要がない。さらに、この方法で得られるH-ホスホネートDNAは種々のDNAアナログ(アンチセンス核酸)合成における有用な合成中間体であると同時にそれ自身が最も単純な構造をもつ新規アンチセンス核酸である。このH-ホスホネートDNAは、従来の核酸合成法では塩基部の保護基を除去するアンモニア処理で瞬時に加水分解されるためにこれまで単離することができないと考えられてきた。本研究では、塩基部無保護の核酸合成法を用いて4-15量体のH-ホスホネートDNAを初めて単離することに成功した。
肝細胞癌早期再発マーカートランスグルタミナーゼ2の腫瘍生物学的意義と臨床的意義

肝細胞癌は再発率の高い予後不良の癌であり、再発制御因子を見つけその詳細なメカニズムを明らかにすることが治療戦略構築にとって重要である。申請者らは本研究に先立ち、早期再発する肝細胞癌ではトランスグルタミナーゼ2(TGM2)と呼ばれるタンパク質が高発現である事を明らかにした。しかし、TGM2が早期再発の肝細胞癌で高発現する意義及び再発のしやすさを規定するメカニズムには、未だ不明な点も多い。本研究では、TGM2がどのようなシグナル伝達系を介して肝細胞癌の早期再発に働いているのか、TGM2がヒト肝細胞癌の早期再発マーカーとなりうるか、を明らかにする。まずはTGM2高発現肝癌細胞株と低発現株を用いて、cell viability assayを実施した。結果、TGM2高発現細胞で細胞の増殖率が有意に高かった。更に、TGM2と連動して発現変化する一連の遺伝子群を明らかにするため、Gene Chip arrayによる遺伝子発現変化の網羅的解析を行った。TGM2の発現量に応じて1.8倍以上発現量が変化している遺伝子probeは1197個存在し、その中にはDKK family遺伝子群をはじめとする、Wnt/β-catenin signaling pathwayに関与する複数の遺伝子が含まれていた。β-catenin免疫染色の結果、TGM2高発現細胞ではβ-cateninのタンパク質発現が亢進しているようであった。更に、TGF-βスーパーファミリーに属するアクチビンを阻害するFollistatinのmRNA発現量にも変化が見られた。パスウェイ解析の結果からは、SWI/SNF complex機能に関するクロマチンリモデリングにTGM2発現が関与する可能性が示唆され、TGM2がこれらのシグナル伝達系を介して肝細胞癌の増殖・早期再発に働いている可能性が示された。本研究では、適切なTGM2高/低発現肝癌細胞株を用いることが必要である。そのため、まずは複数の肝細胞癌株に対し、リアルタイムq-PCR法によるmRNAの定量及び、ウェスタンブロット法によるタンパク質発現定量を実施してそれぞれの細胞株のTGM2発現量を検証した。これらの予備実験を行ったうえで、以後の実験に適した肝細胞癌細胞株を選定するまでに時間を要したため、当初の実験計画より遅れが生じている。当初は微小環境とTGM2発現量変化の関連性も明らかにするため、TGM2発現肝癌細胞と肝星細胞(線維芽細胞)の共培養も実施する予定であったが、TGM2高/低発現肝癌細胞株を単独で培養した場合の遺伝子発現変化をGene Chip arrayから見出すことができた。そのため、まずはこれら見出された一連の遺伝子の発現変化の意義を明らかにすることを優先する。TGM2発現に応じてmRNA発現量の変化するこれらの遺伝子群について、タンパク質レベルでの発現量・局在の変化等を確認する。必要に応じてこれらの遺伝子のノックダウン・ノックインを行い、細胞増殖能アッセイ、浸潤アッセイ等を行いながら、これらの遺伝子がTGM2と共に肝細胞癌の悪性化、早期再発に寄与するか検証する。更に、ヒト肝細胞癌組織を用いて、TGM2及び見出された遺伝子群が肝細胞癌再発マーカーとなりうるか、その病理学的意義を探る。

当初は微小環境とTGM2発現量変化の関連性も明らかにするため、TGM2発現肝癌細胞と肝星細胞(線維芽細胞)の共培養も実施する予定であったが、TGM2高/低発現肝癌細胞株を単独で培養した場合の遺伝子発現変化をGene Chip arrayから見出すことができた。そのため、まずはこれら見出された一連の遺伝子の発現変化の意義を明らかにすることを優先する。TGM2発現に応じてmRNA発現量の変化するこれらの遺伝子群について、タンパク質レベルでの発現量・局在の変化等を確認する。必要に応じてこれらの遺伝子のノックダウン・ノックインを行い、細胞増殖能アッセイ、浸潤アッセイ等を行いながら、これらの遺伝子がTGM2と共に肝細胞癌の悪性化、早期再発に寄与するか検証する。更に、ヒト肝細胞癌組織を用いて、TGM2及び見出された遺伝子群が肝細胞癌再発マーカーとなりうるか、その病理学的意義を探る。当初は、TGM2高/低発現肝細胞癌株及び線維芽細胞に対し、複数の条件下で培養を行ったうえで、TGM2発現量の違いがもたらす網羅的な遺伝子発現変化をGene Chip array解析により明らかにすることを予定していた。今年度ではTGM2高/低発現肝細胞癌株の単独培養時の遺伝子発現量解析を優先したために、次年度使用額が発生した。今後はarray解析からmRNA発現量の異なるものとして見いだされた一連の遺伝子に対し、タンパク質レベルでの発現解析によるvalidationが必要となる。また、これらの遺伝子と肝細胞癌の性質の変化を結び付けて検証する必要性があるため、次年度では多数の抗体・細胞アッセイキットを用意して解析を進める。