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リグナン類をモチ-フとする抗酸化剤の開発

リグナン類をリードとする抗酸化剤の開発を目指し, eupomatilone類とTHFリグナン類の不斉合成を検討した.鍵反応となる不斉[2, 3]-Wittig転位反応は, 88.91% ee程度のエナンチオ選択性で進行し, eupomatilones 1, 2, 5の不斉全合成を達成した.一方, THF-リグナン類は,転位反応後の合成経路を検討した結果,各種立体異性体を合成することができた.リグナン類をリードとする抗酸化剤の開発を目指し, eupomatilone類とTHFリグナン類の不斉合成を検討した.鍵反応となる不斉[2, 3]-Wittig転位反応は, 88.91% ee程度のエナンチオ選択性で進行し, eupomatilones 1, 2, 5の不斉全合成を達成した.一方, THF-リグナン類は,転位反応後の合成経路を検討した結果,各種立体異性体を合成することができた.1)Eupomatilone類縁体の合成研究Eupomatia bennettiiより単離されたeupomatilone類の合成法を確立するため,高度に酸素官能基化されたビフェニル構造の立体選択的な構築を目指して,鍵となる酸素官能基化されたビフェニルメチルエーテル誘導体の不斉[2,3]-Wittig転位反応を検討した.高度に酸素官能基化された基質においては,時として金属イオンを含む試薬の反応性の低下が観察されるが,幸い我々の基質ではそのような問題は起こらず,eupomatilone2の鍵中間体を収率よく合成することができた.しかし,成績体の光学純度は中程度にとどまり課題を残している.今後,この点の改善を検討する予定である.2)THFリグナン類縁体の合成研究クレオソートブッシュ(Larrea tridentata)より単離されたTHFリグナン類縁体の検討を行った.鍵反応となる不斉[2,3]-Wittig転位反応によって得られたα,β-不飽和γ-ラクトン体に対して,アリール基を導入し,得られるヘミアセタールの立体選択的な還元を種々検討した.その結果,還元条件を変えることによって,二組の立体異性体混合物ではあるが,共通の中間体からTHFリグナン類縁体の立体異性他全6種の各異性体を合成することができ,^1HNMRスペクトルによってこれらを同定した.選択性の改善と異性体の分離が今後の課題である.1) Eupomatilone類縁体の合成研究Eupomatia bennettiiより単離されたeupomatilone類の合成法を確立するため,鍵反応となる酸素官能基化されたビフェニルメチルエーテル誘導体の不斉[2,3]-Wittig転位反応の選択性を検討した.前年度,この鍵反応のエナンチオ選択性が中程度にとどまる点が課題となっていたが,塩基をt-BuLiからn-BuLiに変更し,溶媒系をヘキサンからヘキサンとエーテルの混合溶媒に変更することで克服することができた.さらに2工程を経てEupomatilone2の不斉全合成を達成することができた.より温和な条件でも選択的な転位反応が進行することを見出したことで,より不安定な官能基をもつ他のeupomatilone類縁体合成への応用が期待される.2) THFリグナン類縁体の合成研究昨年に引き続き,クレオソートブッシュ(Larrea tridentata)より単離されたTHFリグナン類縁体の検討を行った.昨年度,種々のTHFリグナン類縁体を二組の立体異性体混合物ではあるが,共通の中間体からTHFリグナン類縁体の立体異性他全6種の各異性体を合成することができた.今年度は課題となる選択性の改善を目指し,アセタールへの立体選択的なアリール化を経る別ルートを検討した.しかし,予期せぬ副反応が進行し,目的物を得ることはできなかった.今後は,以前の合成ルートをさらに精査してゆく予定である.昨年までの検討で確立されたeupomatilone 2の合成法に基づいて,γ-ラクトン環が置換していないベンゼン環側にメチレンジオキシ構造をもつeupomatilone 5の不斉合成を検討した.鍵反応となる不斉[2,3]-Wittig転位反応は問題なく進行し,良好なエナンチオ選択性(91% ee)を示した,さらに2工程を経てeupomatilone 5の不斉全合成を達成することができた.転位反応後の合成中間体においてビアリール構造に基づくアトロプ異性体の存在が^1H NMR及び^<13>C NMRスペクトルにおいて観察された.次に,γ-ラクトン環が置換するベンゼン環側にメチレンジオキシ構造をもつeupomatilone1の不斉合成を行った.予期せぬことに,これまで収率よく進行していた鈴木カップリングが低収率でしか進行しなかったが,基質の構造を変えることで克服することができた.また,不斉[2,3]Wittig転位反応が遅かったが,種々条件を検討した結果,収率は中程度(54%,原料回収考慮77%)ながら,良好なエナンチオ選択性(88%ee)まで改善することができた.さらに2工程を経てeupomatilone 1の不斉全合成を達成することができた,3)THFリグナン類縁体の合成研究

昨年に引き続き,クレオソートブッシュ(Larrea trldentata)より単離されたTHFリグナン類縁体の合成検討を行った.昨年度,アセタールへの立体選択的アリール化を経るルートを検討したが,副反応が課題となったため,アセタールの立体選択的還元反応を経る別経路について詳細な検討を行った.その結果,二つのメチル基がシスの関係にあるγ-ラクトン体を用いてTHFリグナン類縁体の各種立体異性体を合成し,その立体構造を決定した.
アメリカ合衆国における黒人文化と人種意識の史的検討

本年度の作業は、ひきつづきマイクロフィルム史料の解析と整理を進めることであった。これらの作業に際しては、文書館のレファレンス・アーキヴィストと面談の上、史料の背景や収録、目録化などの過程をリサ-チし、参考にした。また、そのなかで新たに米国議会図書館の稀少史料も収集した。研究内容の「黒人文化」と「人種意識」についての資料の整理と並んで、今年度は「人種」に関する近年の理論状況を整理検討し、『多文化主義のアメリカ』(東京大学出版会)に発表した。これは、文化と人種についての議論の前提を確保しておくという位置づけのもとにおこなった研究で、現代の人種理論の最前線を把握するうえで今後の研究にとって不可欠のものとなるものである。近年、「人種」を回避する議論が目立つなか、「人種」を論じる(あるいは論じない)ことの方法と意味についても、アメリカ史研究会例会(2000年1月29目)でその成果の一部を報告をした。また「人種意識」に関する研究については、「意識」を実証的に解明するという方法上の難しさを再認識し、民俗(folklore)についての分野について早急に人類学の方法を検討すると同時に、この方面の史料を検索収集することにした。この点については、黒人たちが自己をどのように認識したかを解明するさい、黒人に対する白人の認識がどのように黒人に投影されるか(再帰性reflexivity)を考察しておく必要がある。このような考えから、白人のもつ人種観についても民俗的なアプローチで検討する必要があることに行き着いた。この課題については、まだ十分な先行研究がないので、方法論と史料面を含めて本格的な研究にむけた準備を進めておきたい。本年度は、ショーンバーグ黒人文化研究センターから関係する資料コレクション(マイクロフィルム版)を購入し、アフリカ関係の記事と論文を集中的にリサーチした。具体的には1930年代の人種思想と、アフリカニズムの関連を探るために、マ-カス・ガ-ヴェイらの組織する全国黒人改善協会(UNIA)の資料の解析を進めた。とくに集中的に行ったことは、同コレクションのなかのWPA(Works Project Administration)によるプロジェクト「ハ-レム」の資料を解析したことである。ニューヨーク市における「アフリカ帰還運動」や黒人教育、黒人の社会化や混血、ハイチ革命の影響などに関する史料の分析から、黒人の意識のあり方を内面から考察することができた。ショーンバーグ・コレクションの史料については、下に示した国際シンポの報告時にニューヨーク公立図書館におもむき、ちょくせつブリーフィングを受けることができた。これによって史料の全貌をほぼ把握することができたといえる。他方、学会等での活動としては、11月にノースカロライナ大学(UNC)のSonja Haynes Stone Black Cultural Center主催の黒人文化史についての国際シンポジウムで発表したほか、国内では6月にアメリカ学会でポストコロニアルのアイデンティティ論を批判する報告した。10月には、日本政治学会の多文化主義のセッションで、人種文化と政治的統一性の問題について報告をした。この内、アメリカ学会での発表は、論文として公刊した。また、従来から進めていた19世紀の黒人史研究の成果を一書にまとめて東大出版会から刊行した。本年度は、19世紀末から20世紀初頭にかけてのアメリカ合衆国における黒人の人種意識についての検討を行った。主たる作業は、昨年度に引き続きWPA(Works Project Administration)と全国黒人改善協会UNIA(Universal Negro Improvement Association)のマイクロフィルム史料の解析を進めると同時に、マイクロ化された黒人新聞[The Washington Bee(1882-1922),The American Citizen(1889-1907),The Cleveland Gazette(1883-1945),Palmetto Leader(1925-1957)]を購入し、目録化を進めた。とくに、ヨーロッパからの移民が大量に流入したこの時期、アメリカナイゼーションの動きが強化される中で、人種についての認識が再定義され、アフリカ系アメリカ人の人種意識と国民意識も大きく変遷を遂げる過程に焦点を当ててリサーチした。「アメリカ」というディスコースの形成過程で、「アフリカ」というディスコースが具体的にどのように作用したかを今後も実証的に追跡して行く予定である。また、この作業を進めるなかで、「人種」という概念が歴史的にも動揺していたことを重視して、この時代の人種理論・人種思想についての文献を収集すると同時に、今日の人種理論を、とくにポストコロニアルの「人種」論を中心にして検討した。これらの研究成果の一部は、歴史学研究会1998年度年次大会の近代史部会「近代社会とマイノリティ」において報告した。さらに、アメリカの多文化主義に関する論文集(東京大学出版会から近刊予定)でも、「人種」についての諸パラダイムについて理論的な分析を試みた。

また「人種意識」に関する研究については、「意識」を実証的に解明するという方法上の難しさを再認識し、民俗(folklore)についての分野について早急に人類学の方法を検討すると同時に、この方面の史料を検索収集することにした。この点については、黒人たちが自己をどのように認識したかを解明するさい、黒人に対する白人の認識がどのように黒人に投影されるか(再帰性reflexivity)を考察しておく必要がある。このような考えから、白人のもつ人種観についても民俗的なアプローチで検討する必要があることに行き着いた。この課題については、まだ十分な先行研究がないので、方法論と史料面を含めて本格的な研究にむけた準備を進めておきたい。
シロアリ腸内原生生物の細胞内共生スピロヘータ細菌のゲノム動態と種分化

共生の初期進化過程にあると考えられる細胞内共生スピロヘータ細菌を有するシロアリ腸内のセルロース分解性原生生物において、細胞内共生細菌のシングルセルゲノム解析を行い、原生生物1細胞内の共生細菌のゲノム配列は相同性がきわめて高いことを明らかにした。また、細胞内共生スピロヘータ細菌とその宿主原生生物とシロアリの分子系統を比較解析して、3者間の共種分化関係を明らかにしたが、複数種の原生生物が1種のシロアリ腸内に生息する場合、比較的高頻度の細胞内共生細菌の交換があったと推定された。シロアリ腸内のセルロース分解性のEucomonympha属原生生物の細胞内共生スピロヘータ細菌のゲノム動態を解析するため、原生生物の1細胞内の複数の共生細菌のゲノム解読をめざす。このために、1細胞の原生生物をマイクロマニピュレータ装置によって分取して、セルソータ装置を用いて細胞内共生細菌をシングルセルに分離・分取することに成功した。4つの原生生物細胞からそれぞれ数細胞から十数細胞程度の細胞内共生細菌のシングルセルゲノム増幅産物を得て、16S rRNA遺伝子配列で確認後、ゲノム概要配列の解読に着手した。また、細胞内共生スピロヘータ細菌の種分化を検討するため、オオシロアリ腸内の3種のEucomonympha属原生生物、ヤマトシロアリ等5種のシロアリ腸内から細胞内共生スピロヘータ細菌を有するTeranympha属の原生生物をそれぞれ1種ずつ、1細胞に分離・分取した。分取した1細胞を用いて全ゲノム増幅後に、原生生物と細胞内共生細菌のrRNA遺伝子配列に基づく分子系統を解析した。細胞内共生細菌は、16S rRNA遺伝子に加えてgyrB遺伝子配列もPCR産物のクローン解析に供した。1細胞の原生生物からは、ほぼ同一の共生細菌の遺伝子配列が得られ、原生生物1細胞に共生するスピロヘータ細菌がきわめて均一な系統からなる集団であることが明らかにされた。各シロアリ腸内に1種のみが生息すると考えられているTeranympha属原生生物の系統関係は、宿主シロアリの系統および細胞内共生細菌の系統関係と有意に一致しており、3者が共種分化してきたものであることが示唆された。1細胞のEucomonympha属原生生物から細胞内共生スピロヘータ細菌細胞をシングルセルに分取することに成功し、全ゲノム増幅産物を確認して、ゲノム解析の準備が整った。解読ゲノム情報の詳細な解析までには至らなかったが、複数細胞の原生生物からそれぞれ複数の共生細菌のシングルセルゲノムDNAも準備することができ、ほぼ計画どおりに進めることができた。また、細胞内共生スピロヘータ細菌の原生生物1細胞内での系統多様性については、クローン解析でのレベルではあるが、これまで調べた限り、単一種からなることを明らかにできた。Teranympha属原生生物については、宿主シロアリも含めた3者間で共種分化の可能性を示すことができ、計画以上の成果となった。細胞内共生スピロヘータ細菌の種分化を検討するため、オオシロアリ腸内の3種のEucomonympha属原生生物、および、Reticulitermes属のシロアリ5種のTeranympha属の原生生物について、1細胞に分離・分取し、全ゲノム増幅後に原生生物と細胞内共生細菌のrRNA遺伝子配列等を決定して分子系統を解析した。各シロアリに1種のみが生息するTeranympha属原生生物では、宿主シロアリおよび細胞内共生細菌の系統関係がそれぞれ有意に一致する3者間の共種分化関係が推定され、Eucomonympha属原生生物の細胞内共生細菌とは異なる種として、Treponema teratonymphaeと暫定の学名を提唱した。一方で、Eucomonympha属原生生物の系統と細胞内共生細菌の系統は必ずしも一致せず、同一シロアリ種の腸内に複数種の原生生物が共存することから、共生細菌の交換が比較的高頻度に生じていると考えられた。細胞内共生細菌のゲノム動態を解析するため、Eucomonympha属原生生物を1細胞に分離・分取後、4から12の細胞内共生細菌のシングルセルゲノム解析を実施した。ゲノム完全率を算出すると1割強から7割程度までと、共生細菌サンプルによって相当に解読精度が異なり、単純な比較は困難であったが、同一原生生物細胞由来の共生細菌では極めて相同性が高い遺伝子配列が得られた。比較的ゲノム完全率の高い同一原生生物細胞由来のゲノム配列情報を合わせてアセンブルすると、9割程度までのゲノム完全率が得られ、ゲノムの均一性が示唆された。T. teratonymphaeについてもシングルセルゲノム解析を実施して、Eucomonympha属原生生物の細胞内共生細菌と同様に、水素と二酸化炭素からの還元的酢酸生成および窒素固定の機能が推定された。原生生物1細胞内の共生スピロヘータ細菌について、シングルセルで解読したゲノム配列情報を精査することで、原生生物1細胞内での共生細菌のゲノム動態や原生生物細胞間での共生細菌ゲノムの比較を行う。

細胞内共生スピロヘータ細菌に近縁な細胞表層共生スピロヘータ細菌についても、シングルセルゲノム解析を進めており、それぞれゲノム上のトランスポゾン等の可動性因子を中心にゲノム動態について解析する。細胞内共生スピロヘータ細菌の種分化について、現在、オオシロアリ腸内の複数種のEucomonympha属原生生物1細胞から共生細菌の遺伝子配列を取得・解析を実施している。Teranympha属とは異なり、1種のオオシロアリに少なくとも3種のEucomonympha属原生生物が共存しており、必ずしも共種分化した関係でない可能性を示す結果が得られつつあり、精査して細胞内共生細菌の種分化について考察をする。蛍光オリゴヌクレオチドプローブによるin situでの細胞内共生細菌細胞の検出も試みて、細胞形態や細胞内での局在・細胞数などの微生物生態学的データの取得も試みる。所属機関の広報誌、2018年4月号6-9ページに研究成果の紹介を掲載微生物学原生生物1細胞内の共生スピロヘータ細菌のゲノム動態を解析するために、多数のシングルセルゲノムシーケンスが必要で、Miseqシーケンサーのようなショートリードを多数解析する方法を予定していた。シングルセルからのゲノム解析に、PacBioシーケンサーのようなリード数は少ないがロングリードでの解析が可能な方法が良いかの検討に時間がかかってしまった。今年度、複数の原生生物細胞から共生細菌のシングルセルからの全ゲノム増幅DNAを調整することができたので、次年度にゲノムシーケンスを実施する予定である。上記理由に記したように、多数の細胞内共生スピロヘータ細菌のシングルセルゲノムシーケンスを実施する。シングルセルゲノム解析においては、微量のシングルセルゲノムの全ゲノム増幅DNAを解読するので、全ゲノム増幅初期段階で必ずしも相当に長いDNA断片が増幅されるとは限らず、PacBioでのロングリード解析の効果は限られたものである結果が得られている。一方で、ゲノム上に反復配列が多く、ゲノム配列アセンブリーが困難な場合には、Miseqシーケンサーでペアードエンドシーケンスに加えて、メイトペアシーケンスが有効と考えられ、これも合わせて実施することとしている。
損傷乗り越え複製酵素複合体のダイナミクス

本研究では損傷乗り越え複製を担う代表的な酵素群として知られるYファミリーDNAポリメラーゼ群(ヒトではPolη、Polι、Polκ、REV1)の細胞内での挙動を解析し、損傷乗り越えの全体像を解明することが目的である。我々はREV1がそのカルボキシル末端に於いてPolη、Polι、Polκと相互作用することを見いだし、報告した。これらの相互作用をRUBY法というDsRed融合タンパク質を用いる手法により生細胞内で定量的に解析することを試みたが、相互作用している細胞は現在非常に低い割合でしか観察されておらず、検討を要する状態である。また、損傷乗り越え複製酵素の複合体を丸ごと同定する目的でタグを付加したPolκを安定に適量発現する株を作成したが、経代するにつれて発現が減少するものがほとんどであり、大量に精製するには至っていない。一方、REV1と他のYファミリーDNAポリメラーゼ群の相互作用様式について新たな知見が得られている。我々はPolκのREV1との相互作用領域を560から575番目のアミノ酸56アミノ酸にまで限定しており、その領域を更に詳細に解析した。その結果、Polκの12アミノ酸の領域がREV1との相互作用に必要充分であり、その中に存在する連続する二つのフェニルアラニン(FF)が最も重要であることが明らかとなった。また、FF配列はPolηやPolιにも存在し、やはりREV1との相互作用に必須であり、これらのことからREV1との相互作用には共通のメカニズムが存在すると考えられた。このFF配列を両方アラニンに置換した変異Polκは核内で野生型Polκと同様にfociを形成したが、野生型Polκと異なりPolκ-/-細胞のベンツピレンや紫外線に対する抵抗性を相補できないことから、REV1とPolκとの相互作用がin vivoで重要な働きをしていることが明らかとなった。本研究では損傷乗り趨え複製酵素の代表例として知られるYファミリーDNAポリメラーゼ群(ヒトではPolη、Polι、Polκ、REV1)の細胞内での挙動を解析し、損傷乗り越えの全体像を解明することが目的である。我々はREV1がそのカルボキシル末端に於いてPolη、Polι、Polκと相互作用することを見いだし、昨年度に報告した。本年度はこれらの相互作用をRUBY法というDsRed融合タンパグ質を用いる手法により生細胞内で定量的に解析することを試みた。PolκとREV1が相互作用している細胞の割合がUV照射後に増加することを観察した。相互作用している細胞は現在非常に低い割合でしか観察されておらず、解析結果の判断が難しい。今後、相互作用している細胞をより効率的に検出することが課題である。また、損傷乗り越え複製酵素の複合体を丸ごと同定する目的でタグを付加したPolκを安定に適量発現する株を作成しているが、経代するにつれて発現が減少するものがほとんどであり、大量に精製するのに適したものを得るには至っていない。我々はこれまでにPolκのREV1との相互作用領域を560から575番目のアミノ酸56アミノ酸にまで限定しており、その領域を更に詳細に解析した。Polκの12アミノ酸程度の領域がREV1との相互作用に必要充分であり、その中に存在する連続する二つのフェニルアラニン(FF)が最も重要であることを明らかにした。FF配列はPolηやPolιにも存在し、やはりREV1との相互作用に必須であることが明らかになった。今後、フェニルアラニンをアラニンに置換した変異Polκが細胞内でどのような挙動を示すのかも含め、REV1とYファミリーDNAポリメラーゼの相互作用の生物学的意義に迫る。このFF配列を両方アラニンに置換した変異Polκは核内で野生型Polκと同様にfociを形成したが、野生型Polκと異なりPolκ-/-
小角散乱を用いた雪氷コア含有エアロゾルのマルチスケール定量解析技術の開発

気候に影響を及ぼすエアロゾル微粒子が積雪に取り込まれた後の挙動を知ることは、氷床コア解析による古気候復元や氷床モデリングで極めて重要である。本研究ではグリーンランドなど北極域で採取した積雪および氷床コア中のエアロゾル微粒子の定量評価を可能とするため、氷を融かすことなく測定可能なX線小角散乱(SAXS)法による測定技術を開発する。また、バルクの氷試料を薄片化することでX線の透過能をあげ、クリープ変形前後の微粒子の氷内部における挙動を定量評価し、クリープ変形に及ぼす微粒子の効果を明らかにする。気候に影響を及ぼすエアロゾル微粒子が積雪に取り込まれた後の挙動を知ることは氷床コア解析による古気候復元や氷床モデリングで極めて重要である。これまでの研究では、氷床コアから得られたエアロゾルの情報は、氷床コアを融解又は昇華した後の分析結果であり、in-situ状態のものではない。本研究では氷床コア中のin-situ状態での、エアロゾル微粒子の大きさ、形状、表面フラクタル(表面構造)、数密度、組成、結晶構造などをX線小角散乱(SAXS)および透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてマルチスケール(nmmm)で定量解析する先鋭的技術を開発する。平成27年度は実験室レベルのSAXS技術を確立するため、(1)シリカ(SiO2)単体、(2)氷単体および(3)氷床流動を模擬した変形前後の人工氷中のシリカの分散挙動の測定を可能とするため、SAXSの予備実験および冷却機能を有する試料ホルダーの開発を行った。試料ホルダーは低温室で試料の固定が可能で、持ち運びが可能なホルダーを開発した。SAXSのデータ収集およびデータの解析に少々時間を要した。オーストラリアのANSTOの専門家との議論や、実験データの解析を通して10-20nmの球状シリカのサイズの定量解析を試み、実物の寸法をTEMを用いた解析により定量評価し、同じシリカをSAXSで評価することで、SAXSによる粒径測定の妥当性を検証した。一方、冷却ステージの開発は、液体窒素温度での使用を可能とし、空気散乱の影響を妨げるため、低温室で真空引きが可能なホルダーを設計するのに議論を行ない、予算獲得後約1年後にホルダーの設計をほぼ確立することができた。これまでの研究では、氷床コアから得られたエアロゾルの情報は、氷床コアを融解または昇華した後の分析結果であり、in-situではない。本研究では、氷床コア中のin-situでのエアロゾル微粒子の大きさ、形状をX線小角散乱(SAXS)を用いてマルチスケール(nmmm)で定量解析する先鋭的技術を開発する。平成28年度は、平成27年度に開発した冷却機能を有する試料ホルダーを用いて人工氷中に分散させた1020nm程の直径を有するシリカの測定を行った。シリカの濃度は0.01、0.1、1wt.%を選択し、0.01wt%まではSAXSを用いてシリカの検出を行うことができることを確認した。SAXSデータの測定には汎用の計算用ソフトにプラグイン可能なIrenaパッケージを用いた。このソフトを用いて得られたSAXSデータを解析したところ、0.01、0.1、1wt.%シリカ添加氷中のシリカの凝集体の大きさが32、60、40nmに達することがわかった。ただし、1wt.%シリカ含有氷ではSAXSの測定上限と言われる100nm以上の大きさを有するシリカの凝集体が形成されるため、見かけ上の凝集体の大きさが小さくなる。比較のために、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた氷とシリカの表面の直接観察を行った。SAXSでは測定しえないマイクロメートルスケールの凝集体も生成しており、SAXSデータとの整合性が確認できた。クリープ変形後のシリカの挙動のSAXS測定も始めており、おおむね順調である。気候に影響を及ぼすエアロゾル微粒子が積雪に取り込まれた後の挙動を知ることは、氷床コア解析による古気候復元や氷床モデリングで極めて重要となる。これまでの研究では、氷床コアから得られるエアロゾルの情報は、氷床コアを融解または昇華させた後の試料を分析した結果であり、in-situで測定した結果はほとんどない。本研究では、氷床コア中のin-situでのエアロゾル、微粒子の大きさをX線小角散乱(SAXS)を用いて定量解析する先鋭的技術を開発した。平成27年度に氷のSAXS測定用のホルダーを完成させ、平成28年度は直径1020nmのシリカを人工氷中に分散させ、SAXSデータを取得することに成功した。シリカは人工氷中で凝集体を作り、SAXSで測定可能な粒径は、この凝集体の大きさを測定可能であることがわかった。その際、シリカ添加量が1wt.%を越えると、シリカの凝集体の大きさが、SAXSで測定可能な分解能である100nmを越えてしまい、測定ができなくなることもわかった。

平成29年度は、グリーンランドや南極で見られる氷床の変形を模擬するために、シリカ添加氷に圧縮荷重を加えることで氷床流動を模擬し、-5°C、0.5MPaの条件でクリープ変形を施し、ひずみの増加にともなうシリカ凝集体のサイズの変化を定量的に評価した。この結果、直径50μm程度の人工氷のクリープ変形では、応力指数が2程度となり、クリープひずみの増加とともにほとんど粒成長を起こさないことがわかった。その際、シリカの凝集体は主として粒界に偏析していることが粒成長挙動から予想され、なおかつ、ひずみ15%までは凝集体のサイズは緩やかに低下し、15%以上のひずみにより粗大化する様子が確認された。これは微細な人工氷のクリープ変形時に、粒界拡散および粒界すべりをともなう変形が生じることを示唆することがわかった。気候に影響を及ぼすエアロゾル微粒子が積雪に取り込まれた後の挙動を知ることは、氷床コア解析による古気候復元や氷床モデリングで極めて重要である。本研究ではグリーンランドなど北極域で採取した積雪および氷床コア中のエアロゾル微粒子の定量評価を可能とするため、氷を融かすことなく測定可能なX線小角散乱(SAXS)法による測定技術を開発する。また、バルクの氷試料を薄片化することでX線の透過能をあげ、クリープ変形前後の微粒子の氷内部における挙動を定量評価し、クリープ変形に及ぼす微粒子の効果を明らかにする。人工氷中に10-20nmの大きさのシリカ粒子を分散させ、その濃度を変更することで、SAXSで検出可能なシリカ濃度を定量的に評価する。また、既知のシリカ濃度の人工氷を、氷床流動を模擬したクリープ条件で圧縮変形させ、変形前後におけるSAXSのデータに変化が生じるか検討する。特に、ナノスケールのシリカ粒子が変形後に粒界に偏析するか否かを検証し、氷床中のエアロゾルや超微粒子が塑性流動に及ぼす影響を明らかにする。今後はクリープ変形後にいくつかのひずみを選択し、各ひずみにおけるSAXS測定を行う。同時にSEMに付随する後方散乱電子回折を用いた結晶粒径、ひずみ、極点図の測定を実現し、微細なシリカを分散した人工氷のクリープ変形挙動にともなう組織変化を理解する。雪氷学今年度は、TEMを用いて人工氷中に分散したシリカの直接観察を試みる。TEMの消耗品や維持費に使用する料金およびクリープ実験に使用する消耗品を新たに購入する必要が生じる。当初X線小角散乱専用の特殊ホルダー開発に多額の費用が発生することが危惧された。しかし、試行錯誤により比較的製作コストを低くすることに成功した。上記研究計画に基づき、氷試料を保持するための炭素支持膜付きメッシュやマイクロトーム用ダイヤモンドソーの購入、ロータリーポンプのオイル交換費用や窒素ボンベ取り付け工事および窒素ガス購入費、TEM試料の冷却および人工氷作成用の液体窒素の発注やシリカサンプルの購入などを計画している。透過型電子顕微鏡が瞬停により不具合を起こし、その修理費等に充てる。
血管新生を制御する血管内皮細胞特異的なシグナル伝達経路の同定

血管内皮細胞特異的な分子標的を対象とする新規の抗血管新生療法開発のため、血管内皮細胞の分化(管腔形成と毛細管形成)を制御するシグナル伝達経路と、内皮細胞に特異性の高いチロシンキナーゼFesを中心にした経路を検討した。1.繊維芽細胞増殖因子-2(FGF-2)による毛細管形成には、内皮細胞自身の分泌する血管内皮増殖因子-Aのシグナルが必要で、さらにFGF-2による一連のカスケード、Fynの活性化、Rho GAPのチロシンリン酸化と活性化、Rhoの活性抑制が接着斑の安定化を引き起こし、足場依存性の毛細血管様の形態を維持することが示唆された。これらの結果から、Fynは血管新生阻害のよい標的になること、Fesの活性は血管新生促進と抑制の両者に作用していることが示唆された。Fynは血管内皮細胞特異的ではなく、そのさらなる下流の、内皮細胞特異的な分子を同定する必要があること、また、Fesの活性化の仕組みを検討することで、血管新生阻害の標的となりうることが示唆された。しかし、FGF-2による分化には、内因性のVEGF-AによるVEGF受容体1とcalmodulinを介したc-Akt活性が必要であることが判明した。したがって、c-Aktの下流には様々な内皮細胞分化促進分子に共通のシグナル伝達経路がある可能性がある。一方、FGF-2による分化にはチロシンキナーゼc-Fynが関与していることを報告したが、今回の検討では、FGF-2刺激でc-Fynを介してβ-cateninとT cell factor-4の結合が増加し、fibronectin産生が促進されることが分化に関係していることがわかった。血管内皮細胞特異的な抗血管新生療法開発のため、分子標的探索目的で、内皮細胞の分化(管腔形成や毛細管形成)、およびチロシンキナーゼFesを中心としたシグナル伝達経路を解析した。(1)繊維芽細胞増殖因子-2(FGF-2)による内皮細胞の毛細管形成には、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体1を介する内因性のVEGF-Aが必要であった。(2)内皮細胞の毛細管形成は、細胞の運動や形態形成に関わるactinの重合化よりも、細胞と細胞外基質との結合部である接着班の安定化が重要で、低分子GTPaseのRho活性の抑制が関与していた。(3)色素上皮由来因子(PEDF)は、FGF-2による毛細管形成を抑制した。その機序として、Fesを介したFyn活性の抑制が認められた。FynはRhoGTPaseactivating proteinをリン酸化して、Rho活性を抑制することで、(2)の仕組みによる毛細管形成に関与していることが示唆された。(4)FGF-2による内皮細胞の管腔形成には、Fynの活性化が必要であるが、その下流のシグナルとして、Fyn依存性の転写因子T-cell factorによるfibronectin産生が重要であることがわかった。(5)以上により、内皮細胞の分化には、内因性のVEGF-Aのシグナルの存在化で、Fyn活性が重要な役割を果たしていることが考えられた。従って、VEGF-A、あるいはFynは、血管新生阻害療法のよい標的になりうるが、いずれの分子も血管内皮細胞特異的なものではないため、今後さらなる検討を続ける必要があると思われる。
抑制性シナプス可塑性の長期持続の分子機構

小脳プルキンエ細胞に形成される抑制性シナプスでは、プルキンエ細胞が強く脱分極するとGABA(A)受容体を介する応答が長時間にわたり増強する。本研究では、電気生理学実験や蛍光イメージングと計算機シミュレーションを組み合わせて解析し、脱分極がもたらすリン酸化酵素CaMKIIの持続的活性化と、その結果起こるGABA(A)受容体結合タンパク質GABARAPの状態変化が、増強の安定な発現維持に協調的に寄与することを明らかにした。本研究の目的は、この脱分極依存性増強を長期持続させる分子メカニズムを明らかにすることである。平成21年度は、まず一過的な細胞内Ca^<2+>濃度上昇により脱分極依存性増強が誘導されるときに、重要な役割を担うタンパク質リン酸化酵素CaMKIIがどの様な時間経過で活性化するかを検討した。初代分散培養プルキンエ細胞を用いてThr286残基がリン酸化された活性型CaMKIIを免疫蛍光染色すると、少なくとも2時間以上にわたりCaMKII活性が上昇することが分かった。そのメカニズムをシステム的に解析するために、細胞内情報伝達系のシミュレーションモデルを構築し、CaMKIIの自己リン酸化およびcAMP分解酵素PDE1のCaMKIIによる負の制御が、持続的CaMKII活性化および増強の安定な発現に重要であることが示された。したがって、増強を長期にわたり持続させる機構としてCaMKIIの持続的活性化が重要である可能性が示唆された。また、CaMKIIを持続的に活性化して増強を誘導するのに必要なCa^<2+>濃度上昇の閾値を、主にPDE1が制御することがモデルと実験を組み合わせることにより明らかになった。さらに、GABA(A)受容体に直接結合してその機能的特性や細胞内輸送を調節するGABARAPが、脱分極依存性増強にどのような役割を担うかについても検討し、GABARAP同士が重合すると示唆されているアミノ末端領域を欠失させると、増強誘導が障害されることが分かった。以上の結果から、CaMKIIの持続的活性化とGABA(A)受容体結合タンパク質の状態変化が、増強の安定な発現維持に協調的に寄与すると考えられた。平成21年度の研究により、リン酸化酵素CaMKIIが長時間にわたり活性化するか否かが、増強の発現に重要であることが示唆された。また、その長期CaMKII活性化に必要なCa^<2+>上昇の大きさを決定する仕組みが明らかになった。そこで22年度においては、Ca^<2+>上昇の時間パターンがいかにCaMKII活性の長期化に影響を与えるかを解析した。具体的には、細胞内情報伝達系のシミュレーションモデルを用いて、様々な時間パターンのCa^<2+>上昇を入力し、CaMKII活性がいかに調節されるかをシステム的に解析した。そして、その計算結果を電気生理学実験により検証した。こうした実験とシミュレーションの相補的解析により、Ca^<2+>上昇を時間積分的に累積することによりCaMKII活性化がもたらされ、増強が起こることが分かった。しかし一方で、CaMKII活性化を惹起する2パターンのCa^<2+>上昇を連続して起こすと、その順番に依存してCaMKII活性化はむしろ抑制され、可塑性発現がキャンセルされることが明らかになった。したがって、可塑性が長時間持続するか否かは、Ca^<2+>上昇の文脈により動的に制御されることが分かった。その分子メカニズムについても解析し、Ca^<2+>依存的なcAMP分解酵素PDE1と、CaMKIIのThr305/306残基の抑制的自己リン酸化が協調して、Ca^<2+>上昇の文脈を解釈し、可塑性成否を決定することが分かった。本研究で明らかにした文脈依存的な可塑性調節は、入力の因果関係を神経系で情報処理する基盤となるかもしれない。
新規な光捕集アンテナ機能を有する三次元分子フォトダイオード素子の創出

本研究では、ドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を非平面(直交)あるいは共平面に二次元的に配置した二次元D-preS系及びA-preS系分子を合成した。ポリピリジン金属錯体化のための高い金属配位能を有する4, 5一ジアザフルオレンとアクセプター部としてジシアノエチリデン等のシアノエチリデン部位を共平面上に配置した二次元A-preS系分子を、マイクロ波照射合成法により短時間かつ高収率で合成した。合成したA-preS分子では、分子内電荷移動相互作用及びエレクトロクロミズムを示した。また、4, 5-ジアザフルオレンとドナーであるTTF部位が共平面構造あるいは直交構造に配置した二次元D-preS系分子を配位子とするルテニウム(II)錯体を合成した。本研究では、剛直な基本構造シクロファンにドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を三次元的に配置した基本ユニットであるD-preS、preS-A系pre-分子フォトダイオードを開発し、ポリピリジン金属錯体化により光増感部(S)が構築可能なD-S-A三元系分子フォトダイオードデバイスを創出することを目的としている。剛直な基本構造シクロファンにドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を三次元的に配置した系を評価する上で、ドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を共平面上(二次元的配置)に配置した二次元preS-D系及びpreS-A系分子の開発が必要となる。ポリピリジン金属錯体化のための高い金属配位能を有するジアザフルオレンとアクセプター(A)部にジシアノキノジメタン及びシアノ酢酸ユニットを共平面上に配置した二次元preS-A系分子の合成に成功した。アクセプター(A)部にジシアノキノジメタンを導入する反応では、マイクロ波及び超音波を用いることで、従来の熱反応によりも反応時間を大幅に短縮でき更に収率も高収率な合成ルートが確立できた。合成したpreS-A系は、弱い分子内電荷移動相互作用が存在することが、電子スペクトルの結果より明らかになった。また、剛直な基本構造パラシクロファンにドナー(D:1,3-dithiole-2-ylidene、2-methylidene-1, 3-dithiolo[4,5-d]-tetrathiafulvalene)あるいはアクセプター(A: dicyanoethylidene、cyanoethoxycarbonylethylidene)を選択的に導入することに成功した。ポリピリジン金属錯体化のための高い金属配位能を有するジアザフルオレンとアクセプター(A)部にジシアノエチリデン(dicyanoethylidene)及びシアノ酢酸ユニット(cyanoethoxycarbonylethylidene)を共平面上に配置した二次元preS-A系分子の合成に成功した。アクセプター(A)部にシアノキノエチリデンを導入する反応では、マイクロ波及び超音波を用いることで、従来の熱反応によりも反応時間を大幅に短縮でき更に収率も高収率な合成ルートが確立できた。現在二次元preS-A系分子とのルテニウム(II)錯体を合成し、その電気化学的及び分光学的物性についても詳細を検討中である。また、剛直な基本構造であるパラシクロファンにドナー(D : 1, 3-dithiole-2-ylidene (DT)、2-methylidene-1, 3-dithiolo[4, 5-d]-tetrathiafulvalene(DT-TTF))あるいはアクセプター(A : dicyanoethylidene、cyanoethoxycarbonylethylidene)を選択的に導入することに成功した。

本研究では、剛直な基本構造シクロファンにドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)ωを三次元的に配置した基本ユニットであるD-preS、preS-A系pre-分子フォトダイオードを開発し、ポリピリジン金属錯体化により光増感部(S)が構築可能なD-S-A三元系分子フォトダイオードデバイスを創出することを目的としている。ドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を非共平面(直交)あるいは共平面に二次元的に配置した二次元preS-D系及びpreS-A系分子を開発し、ドナー(D)、光増感前駆体(preS)、アクセプター(A)を三次元的に配置した系との比較により、剛直な基本構造シクロファンが果たす役割を検証することにした。ポリピリジン金属錯体化のための高い金属配位能を有する4,5-ジアザフルオレンとアクセプター(A)部としてジシアノエチリデン(dicyanoethyhdene)等のシアノキノエチリデン部位を共平面上に配置した二次元preS-A系分子を、マイクロ波照射合成法により短時間且つ高収率で合成した.合成したpreS-A系は、弱い分子内電荷移動相互作用及びエレクトロクロニズムが存在することが、電解スペクトル測定より明らかになった。また、4,5-ジアザフルオレンとドナー(1))部としてTTF部位が平面構造あるいは直交構造に配置した二次元preS-D系分子を合成し、ルテニウム(II)錯体を合成し、その電気化学的及び分光学的物性についても測定した。ドナー(D)、アクセプター(A)を三次元的に配置した系として剛直な基本構造であるパラシクロファンにドナー(D:1,3-dithiole-2-ylidene(DT)、2-methylidene-1,3-dithiolo[4,5-d]-tetrathiafulvalene(DT-TTF))あるいはアクセプター(A:dicyanoethylidene、cyanoethoxycarbonylethylidene)を導入した三次元D-Spacer-A系分子を合成することに成功した。
精密コロナ放電と質量分析を用いたバイオモニタリングシステムの構築のための基礎研究

生体分子のその場分析技術の開発はオミクス計測科学分野の重要な課題であるが,未知試料の同定に及ぶ手法の確立には至っていない.本研究では,様々な気相酸性度を持つ負の反応イオンの大気圧下での制御生成が可能な「精密コロナ放電」と質量分析を結合し,動植物の分泌する分子および構成分子を各々の物性に応じて選択的にその場分析できる“シンプルなバイオモニタリングシステム"を構築した.本システムでは,試料の分子量と構造に関する情報が同時に得られ,その場分析における未知化合物の同定に極めて有効である.生体分子のその場分析技術の開発はオミクス計測科学分野の重要な課題であるが,未知試料の同定に及ぶ手法の確立には至っていない.本研究では,様々な気相酸性度を持つ負の大気反応イオンの制御生成が可能な「精密コロナ放電」と質量分析を結合し,種々の有機化合物を各々の物性に応じて選択的にその場分析する“バイオモニタリングシステム"の構築を目的とし,平成25年度は以下の研究項目を遂行した.大気反応イオンと有機化合物の選択的反応に関する基礎研究“バイオモニタリングシステム"の実用化に向けた評価研究のための準備1では,衝突誘起解離(collision-induced dissociation; CID)法を用いて,種々の有機化合物Mと大気反応イオンR-の付加体イオン[M + R]-のフラグメントイオンを観測した.その結果,R-と試料の脱プロトン化分子[M - H]-のプロトン親和力(PA)によって説明されるフラグメンテーション過程が見出された.すなわち,R-のPAが[M - H]-のPAより高い場合,R-によるプロトン引き抜き反応を伴う解離により,フラグメントイオンとして[M - H]-が生成する.一方R-のPAが[M - H]-のPAより低い場合は,単純解離により,R-がフラグメントイオンとして生成する.この過程はMとR-がどのような組み合わせでも共通して観測され,未知試料の分子量の決定に有用であることが示唆された.また,水素脱離による酸化反応は,1つの炭素にアミノ基およびカルボキシル基の両方を有する有機物(a-アミノ酸等)に対して特異的に起こることが判明した.2では,来年度行うその場分析に対する植物サンプルとして,ラベンダーとペチュニアを選定し,香気成分の同定や代謝経路の研究に関する知見を調査した.生体分子のその場分析技術の開発はオミクス計測科学分野の重要な課題であるが,未知試料の同定に及ぶ手法の確立には至っていない.本研究では,様々な気相酸性度を持つ負の反応イオンの大気圧下での制御生成が可能な「精密コロナ放電」と質量分析を結合し,動植物の分泌する分子および構成分子を各々の物性に応じて選択的にその場分析できる“シンプルなバイオモニタリングシステム"を構築した.本システムでは,試料の分子量と構造に関する情報が同時に得られ,その場分析における未知化合物の同定に極めて有効である.生体分子のその場分析技術の開発はオミクス計測科学分野の重要な課題であるが,未知試料の同定に及ぶ手法の確立には至っていない.本研究では,様々な気相酸性度を持つ負の大気反応イオンの制御生成が可能な「精密コロナ放電」と質量分析を結合し,種々の有機化合物を各々の物性に応じて選択的にその場分析する“バイオモニタリングシステム"の構築を目的とし,平成24年度は以下の研究項目を遂行した.大気圧下での精密コロナ放電による反応イオンの発生制御と質量分析計の接続大気反応イオンと有機化合物の選択的反応に関する基礎研究1では,平板電極上のオリフィスに対するニードル電極の角度およびコロナ直流電圧を可変とする「精密コロナ放電イオン源」を構築し,質量分析計に実装した.本装置では,大気成分(N2, O2, H2Oなど)をそのまま利用して,ニードル角度とコロナ電圧による電子の運動エネルギーの精密調整のみで,様々な気相酸性度を持つ負の大気反応イオンR-(NO3-, NO2-, HCO3-, O2-など)の生成制御を可能にした.さらに,マイクロセラミックヒーターを放電場近傍に設置することによって,アミノ酸等の低分子量の固体有機化合物を気化させ,大気反応イオンと試料分子の反応により生成した試料イオン(付加体イオン[M + R]-,脱プロトン化分子[M - H]-)を質量分析することに成功した.2では,衝突誘起解離(ollision-induced dissociation; CID)法を用いて,種々の有機化合物Mと大気反応イオンR-の付加体イオン[M + R]-のフラグメントイオンを観測した.その結果,R-と[M - H]-のプロトン親和力によって説明される規則的なフラグメンテーション過程が見出され,未知試料の分子量の決定に有用であることが示唆された.生体分子のその場分析技術の開発はオミクス計測科学分野の重要な課題であるが,未知試料の同定に及ぶ手法の確立には至っていない.本研究では,様々な気相酸性度を有する負の大気反応イオンの制御生成が可能な「精密コロナ放電」と質量分析を結合し,平成26年度は以下の研究項目を遂行した.1.アンビエントイオン化質量分析法の高感度化技術の開発2.“バイオモニタリングシステム"の実用化に向けた評価研究1では,大気圧化学イオン化法を基にしたアンビエントイオン化法,すなわちリアルタイム直接分析(DART: Direct Analysis in Real Time)法に精密コロナ放電を組み合わせることで,正負両イオンモードにおいて10倍以上(試料によっては1000倍)の高感度化が達成されることを見出した.

この高感度化は,DARTでイオン化されなかった中性の気体状試料分子を,精密コロナ放電で生成した大気イオンを利用してイオン化させていることに由来した.2では,昨年度選定した植物,すなわちペチュニア(Petunia mitchell)と精密コロナ放電を用い,植物の内生香気成分と大気中に放出された後に生成する成分(大気中香気成分)の関係を調査した.ペチュニアの大気中香気成分に由来する負イオンとして,m/z 151と184のピークが観測された.これらイオン種の衝突誘起解離および精密質量測定を行ったところ,m/z 151はバニリンの脱プロトン化分子,m/z 184はバニリンのO2-付加体と同定された.すなわち,ペチュニアの主な大気中香気成分はバニリンであることが示唆された.またバニリンは,ペチュニアの主な内生香気成分であるイソオイゲノールが大気中に放出された後にオゾン酸化を経て生成していることが示唆された.質量分析交付申請書に記載した「研究実施計画」に従い,平成25年度に遂行すべき研究項目は達成された.すなわち,種々の有機物と負の大気反応イオンの付加体イオンのフラグメンテーション過程を調査したところ,未知試料の分子量の決定に有用な情報を得ることができた.その他,平成24年度の研究で見出された水素脱離による酸化反応が観測される条件が明らかとなった.また,その場分析に適した植物サンプルを選定し,それらから放出される香気成分の知見を収集したため,来年度に計画されている研究をスムーズに進めることができる.交付申請書に記載した「研究実施計画」に従い,平成24年度に遂行すべき研究項目は達成された.すなわち,精密コロナ放電イオン源を質量分析計に実装し,種々の有機物と負の大気反応イオンの付加体イオンのフラグメンテーション過程を調査したところ,未知試料の分子量の決定に有用な情報を得ることができた.さらに,特定の有機物と大気反応イオンとの間で,水素脱離による酸化反応が観測された.どのような条件の場合に本反応が起こるのか,また,大気中で進行する他の特異的な反応を調査することが,今後の新たな研究の課題となる.交付申請書に記載した「研究実施計画」に従い,今年度は「“バイオモニタリングシステム"の実用化に向けた評価研究」を遂行する.昨年度選定した植物サンプル(ラベンダーおよびペチュニア)からは,香気成分として酢酸リナリルおよびイソオイゲノールが主に放出されることが知られている.まずはそれら試料の純品をスタンダードとして測定し,観測されるイオン種を調査する.その後,植物を様々な環境(昼夜間など)に置き,植物から放出される揮発性化合物のその場分析を試みる.具体的には,イオン源パラメーターのニードル角度とコロナ電圧を変化させながら,各種大気反応イオンと植物表面から揮発する化合物を反応させ,随時生成する試料イオンを質量分析していく.得られたマススペクトルを,上記スタンダードの測定で得られたスペクトルを基に解析し,植物のから放出される種々の揮発性有機化合物を同定する.交付申請書に記載した「研究実施計画」に従い,今度は以下の研究を推進していく.大気反応イオンと生体分子の選択的反応に関する基礎研究“バイオモニタリングシステム"の実用化に向けた評価研究
低濃度局所麻酔薬による増殖因子受容体におけるチロシンキナーゼ活性化作用の研究

局所麻酔薬は、ナトリウムチャンネルの非活性化ゲートに作用することにより、ナトリウムチャンネル遮断作用を来たすことが知られている。研究代表者の研究目的は、受容体型チロシンキナーゼ内の酵素活性部位における自己リン酸化部位周辺のアミノ酸配列の性質が、ナトリウムチャンネル非活性化ゲート周辺のアミノ酸配列の性質と非常に類似していることに基づき、局所麻酔薬のチロシンキナーゼに対する作用及びそのメカニズムを解明するものである。芳香環をもつアミンである局所麻酔薬が「静電気力、π-πスタッキング、cation-π結合、C-H-π結合を介して、芳香環アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸と相互作用を持つ」という仮脱のもとに、上皮増殖因子受容体(Epldermal Growth Factor Receptor, EGFR)、インスリン様増殖因子受容体(lnsulin-like growth factor receptor, IGFR)およびインスリン受容体における自己リン酸化に対するリドカインの作用を検討した。精製したEGFRを用いたin vitroにおける予備実験では、低濃度リドカインはEGFRのチロシンキナーゼ活性を増加し、高濃度では抑制した。しかしin vivoでは400μMのリドカインは、EGF刺激によるヒト角膜上皮細胞増殖を抑制し、EGF刺激によるEGFRの自己リン酸化も抑制した。局所麻酔薬は、ヒト角膜上皮細胞膜上のEGFRのチロシンキナーゼ活性を抑制することにより細胞増殖を抑制することが示唆された。リドカインは、インスリン受容体におけるインスリン刺激により自己リン酸化を抑制するのみでなく、自己リン酸化を受けたチロシン残基に対して脱リン酸化作用も有することを明らかにした。また乳癌細胞のMCF-7は、細胞増殖過程でIGFRが重要な役割をもつことが知られており、400μM以上のリドカインがMCF-7における細胞増殖作用を有することを明らかにした。IGFRの活性化ループは、インスリン受容体の活性化ループと同じアミノ酸配列を有することから、リドカインによるIGFRの脱リン酸化作用がMCF-7における細胞増殖を抑制した可能性が示唆された。これまでの研究で、局所麻酔薬はNaチャネルにおける不活性化ゲートにおける芳香族アミノ酸と陰性電荷アミノ酸が集まったアミノ酸配列に特異的に結合することから、同様のアミノ酸配列を活性化ループにもつチロシンキナーゼに対しても薬理作用をもつ可能性を検討してきた。細胞膜上の受容体型チロシンキナーゼである上皮増殖因子受容体(EGFR)も自己リン酸化部位で類似のアミノ酸配列が見られることから、局所麻酔薬がEGFRのチロシンキナーゼ活性に影響する可能性がある。本年度の研究では局所麻酔薬のリドカインのEGFR活性に対する影響を、ヒト角膜上皮細胞(HCEC)を用いてEGFおよび/またはリドカイン(4μM-40mM)を加えて細胞増殖に対する作用を検討した。またEGFR抗体による免疫沈降法とチロシンリン酸化抗体を用いたウェスタンブロット法により、HCECのEGFRにおけるチロシンリン酸化も調べた。結果は4μM,40μMのリドカインによる直接の細胞増殖作用は認められず、低濃度リドカインによる細胞増殖刺激作用は否定された。400μM以上の高濃度リドカインは、EGF刺激によるHCEC増殖を抑制し、EGF刺激によるHCECにおけるEGFRの自己リン酸化も抑制した。高濃度(臨床使用濃度)局所麻酔薬は、HCEC細胞膜上のEGFRのチロシンキナーゼ活性を抑制することにより細胞増殖を抑制することが示唆された。