hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境センサー向け超微細・超低電力アナログＬＳＩ複合評価技術の研究

評価結果においては、本研究で開発した計装アンプとADCの組合せの性能品質は、マイコンを利用した補正を導入することにより、実用的な品質が得られることを明らかにした。以上の研究成果により、センサーモジュールに利用される高利得・高信頼な計装アンプの実現する方法の一つとしてレイアウト依存性を考慮した統計的シミュレーション手法を導入することにより、製造前に製造性を考慮した性能品質が検討でき、低コストなセンサーIC開発が可能となることが実証できた。集積回路設計技術平成25年度の研究では、オペアンプ試作による耐ばらつき評価に加え、計装アンプに関して、チップの開発及び実測評価まで進めることができ、提案方式の優位性を確認することができる一方で、環境センサーへ応用する上での課題も見えてきた。この課題を研究にフィードバックし、あと1年の研究期間でさらにその克服のための改善に取り組むことができ、当初の計画より質的な向上が期待できる。当初の予定では、初年度はアナログICのプロトタイプ技術および基準回路の設計評価に留まっていたが、実際には環境発電システムの構成、及びナノワットクラスの基準回路、オペアンプの設計、測定環境のための計装オペアンプの設計まで進めることができた。これによりH25年度は、より具体的な環境センサーを対象として試作・評価が進められる。H26年度には、これまで開発してきた計装アンプとADCを1チップ化し、それらを組み込むアナログフロントエンドモジュールを搭載する環境センサーシステムとしての評価を進める。プロセスノードは、ディジタル部とのI/Fを考慮し180um/3.3Vを予定している。さらに、システム的な評価を行うためにディジタル信号処理によるノイズフィルタリングの適用も同時に進める。H25年度には、より具体的な環境センサー向けのアナログフロントエンドシステムの試作・評価が可能になる。しかし、これまで利用してきたCMOS 65nmプロセスが閉鎖されたため利用できず、試作する上での製造プロセスに選定には苦慮している。環境センサーを対象とするため、130nm、180nm製造プロセスでも十分に性能が期待できるので、そのプロセスノードの選択も検討している。2月の積雪の影響で、チップ評価ボードの開発が遅延し、3月に予定していたチップ評価のための作業が4月にずれたため、3月分の人件費の一部が残額として生じてしまった。次年度予算と合算して人件費として利用する。H25年度の人件費にあてる。
欧米に流出した河鍋暁斎作品の調査

1987年度、88年度の2年間に亘る調査によって、凡そ1,600点にのぼる河鍋暁斎の肉筆画を確認し、すべてをスライドに撮影した。その内訳は次のとおりである。イギリス、大英博物館に約100点、ヴィクトリア・アルバート美術館に約90点。フランスのギメ美術館では、約10点の肉筆画、3冊の画稿、40点の肉筆絵日記。イタリア・キヨソーネ美術館では、約10点の肉筆画、及び絵巻1巻。西ドイツのハイデルベルク大学では、整理中のベルツ・コレクション2,000点余を調査し、暁斎を30点余確認。オランダのライデン国立民俗学博物館では700点余を調査撮影。アメリカではメトロポリタン美術館で約50点、ボストン美術館で6点、フリア美術館で約200点、ピーボディー美術館で10点、シカゴ・フィールド博物館で3点。作品数とは、掛軸、下絵等は一点一点数え得るが、長尺の絵巻等は、描かれている主題により、一巻に数十点の作品が含まれており、これをスライドに撮影し、スライド数で数えた。ひと口に日本美術品の流出というが、短期間でこれだけ多量の暁斎が確認できたことは、予想以上に、欧米において暁斎の評価が高く、十分な保存の手が行き届いていた結果である。欧米における日本美術史では常に暁斎への言及があり、近世美術の巨匠と評価されながら、ひるがえって我が国においては、ほとんど無視されている現状は、当の作品が、欧米に偏在しているためであることがはっきりした。今後、これらの作品の目録作成を経て、明治美術史の修正を行ない、美術史の空白を補なうことが可能となろう。
歯周疾患発現におけるフリーラジカルの役割

Porphyromonas gingivalis(以下P.gingivalis)が菌体外に放出するベジクルによるフリーラジカル産生と歯周疾患の関係を明らかにする実験系確立を行ってきた。培養マクロファージをベジクルで刺激しその培養上清中に産生された活性酸素・フリーラジカルの量を測定した結果、その発現は極めて微量か手技が不確立のため確認することができなかった。またベジクルで刺激したヒト貧食細胞(THP-1)からtotal RNAを抽出しそれを出発材料としてRT-PCR法を行った結果、誘導NO合成酵素(iNOS)遺伝子の存在を明らかにするに到っていない。よって現在マクロファージ培養条件(培地、培養時間)の確立、マクロファージからのフリーラジカル(一酸化窒素)の発現・誘導を解析するための手技の確立および誘導NO合成酵素(iNOS)遺伝子発現の有無を確認するためのプライマー設計およびPCR条件の再検討を行っている。
リアルタイムの画像解析によるスカウティング分析の試み

本研究の目的は,バレーボールのサーブレシーブに着目し,リアルタイムでスカウティング分析できるプログラムを開発することであった。その際,画像解析を用いて正確なデータ収集や視覚的に分かりやすくグラフィック化して結果表示することを試みた。ビデオカメラとノート型パソコンをアルファデータ社製ビデオキャプチャー・アダプターで接続し,競技場面の映像をパソコンのスクリーン上に取り込んで分析した。バレーボールコート四隅を較正点として使用し,DLT係数を算出した後,競技場面の静止画像をもとに,レシーブ隊形やレシーブ位置を算出して図示した。そして選手別,ローテーション別にレシーブ回数やレシーブ成績を統計処理して表示した。作成したプログラムの動きは,World League男子大会,全日本大学女子選手権大会,中国四国学生選手権大会の録画ビデオを再生しながらテストした。その結果,1)全てのプレーを一人のスコアラーで分析するのではなく,分析課題ごとにスコアラーが分担するため,分析作業が容易である。2)競技中のデータの入力を主にマウスをクリックすることによりスカウティング分析を行うため,操作が容易である,その際タブレットペンを使用すれば分析スピードが更に増す。3)競技中の映像を,DLT法の画像解析理論を採用して定量分析するため,精度の高い位置データを得る事が出来る。しかし静止画像をもとに定量分析を行うため,静止画像を正確に取り込めなかった時は,算出結果の精度が下がることもある等が確認された。Visual Basicによりバレーボールのコンビネーション攻撃用偵察プログラムを考案した。主としてマウスをクリックしながら分析する方法を採用しているので,特別に訓練を積んだスコアラーに頼んで分析してもらうようなことをしなくても,ある程度パソコンが操作できる人であれば自分でスカウティング分析ができる。操作手順は,分析に先立って,登録選手の入力,出場選手の設定,リベロと交代する選手の設定等の準備を整える。分析項目は,アタック技能を4段階評価して選手別およびローテーション別に統計処理した。またバレーボールコートの任意の位置を目測座標検出して得られた位置データを使用して,コンビ攻撃の打球位置および攻撃パターンを算出した。このような位置の分析は,Data Volleyのエリア単位の位置分析においては求めることができなかった位置情報である。ノートパソコンのスクリーン上で分析作業と結果の表示を同時進行しながら行う。マウスの代わりにタブレットペンを使用すれば分析作業は更に早くなる。本プログラムを使用して,2003年ワールドカップ男子大会の日本対Serbia & Montenegro戦を撮影したビデオを再生しながら,Serbia & Montenegroチームの偵察をした。録画テープを再生しながら分析すれば,詳細なスカウティングデータを揃えることができる。そしてこのようなデータは,次回対戦に備えた相手対応の準備として役に立つ。

一方,本研究のスカウティング分析では分析項目別に分担してデータ収集する方法を採用しているが,分析対象をサーブレシーブからの攻防に絞ってデータ収集すれば,スコアラーの作業負担が更に軽減されて,リアルタイムでのスカウティング分析も可能になる。
アルギニンメチル化酵素PRMT8のホスホリパーゼ活性の発見と生物学的意義の解明

タンパク質アルギニンメチル化酵素(PRMT)ファミリーのうち、PRMT1は細胞内のアルギニンメチル化の85%を担っている酵素であり、細胞質と核に存在する。一方PRMT8は、PRMT1と83%の高いホモロジーを持ち、細胞膜に局在するが、その基質と細胞機能は不明である。本研究では、細胞膜に存在するPRMT8がリン脂質を基質とする酵素であるかを検討し、細胞機能の解明を試みた。申請者らは、アルギニンメチル化酵素(PRMT)ファミリーの一つとして同定された膜接合型PRMT8が、新規のリン脂質分解酵素(ホスホリパーゼ:PLase)活性を有していることを見出した(未発表)。そこで、本研究では、中枢神経系に特異的に発現するPRMT8に関して、(1)新規PLase活性の生化学的意義の検証、(2)PRMT8のもつ二重酵素活性の細胞生物学的意義の検証、(3)これら活性の個体発生や高次中枢機能に対する個体レベルでの機能の解析を行い、二重酵素活性(MTase+PLase)の生物学的意義の解明を目指す。22年度は、上記の目的に従い、以下のことを明らかにした。(1)PLaseファミリーであるPLDは、ホスファチジルコリン(PC)を基質として、コリンとホスファチジン酸を生成する。先ず、バキュロウイルスにおけるPRMT8の発現系を確立した。その系を用い、PRMT8の精製に成功した。コリン部位にラベルされたPCを用いて、精製PRMT8と反応させたところ、コリン産生を証明できた。以上のことから、PLD活性を有することが明らかとなった。(2)PRMT8が有するHKDモチーフのリジン残基をアルギニン残基に置換し、野生型と変異型をそれぞれPC12細胞にトランスフェクションした。その後、NGF刺激を加えて24時間観察した結果、野生型のみで突起進展が促進されることが明らかになり、PLD活性が必要であることが示唆された。PRMT8が有する2つの酵素活性(Mrase+PLase)の生物学的意義を、生化学・細胞生物学・発生工学の3つのアプローチから包括的に解明する。具体的には、以下の項目に従って研究を遂行した。(1)PRMT8の新規PLase活性の生化学的検証:バキュロウイルス発現系によるPRMT8のPLase活性の検証するため、バキュロウイルス発現系で大量調製したPRMT8を用いて、産生物・コリンを特異的オキシダーゼで変換し、PLase活性を測定した。また、HKDモチーフ変異体の酵素活性を測定するため、PLase活性に必須なHKDモチーフに一箇所ずつ変異を導入した変異型PRMT8タンパク質を調整し、上記の方法を用いて測定した。その結果、野生型でのみ有意な活性が確認された。さらに、PRMT8のダイマー形成をBiFC法で可視化したところ、ダイマー形成した野生型は膜局在を示した。一方、ダイマー形成するものの細胞質に局在する変異体や、ダイマー形成できない変異体を得ることができた。(2)PRMT8がもつ二重酵素活性の細胞生物学的意義の検証:NGF刺激依存的な細胞突起伸展におけるPLase活性の意義の検証を定量化する評価法を、細胞膜で産生されるPAに特異的に結合する蛍光プローブタンパク質(Spo20)を用いて、PC12細胞でPRMT8のPA産生能力を検証した。その結果、HKDモチーフ依存的にPRMT8が細胞膜でPAを産生することが明らかになった。また、PRMT8のSAM結合モチーフ変異体とPLase活性変異体の二重変異体は、野生型に比べてPC12細胞の突起伸展活性が減弱した。(3)MTase活性とPLase活性の個体機能の解析を行うため、全身性PRMT8ノックアウトマウスのヘテロ欠損を作製した。また、Cre組換え酵素を発現するマウスを用いて、組織特異的ノックアウトマウスを引き続き作製中である。PRMT8が有する2つの酵素活性(MTase+PLase)の生物学的意義を、生化学・細胞生物学・発生工学の3つのアプローチから包括的に解明する。1. PRMT8の新規PLase活性の生化学的検証: PLase活性を定量的に測定するため、先ずHA-PLD2をHEK293T細胞にトランスフェクションし、抗-HA抗体で免疫沈降して酵素を粗精製した。精製PLD2を用いて、フォスファチジルコリン(PC)を基質として酵素反応を行い、その生成物を質量分析計(MALDI-QIT-TOF MS)で測定した。その際に、精製標準品のコリンを同時に測定した。その結果、分子量104.30にピークを認め、コリンであることが判明した。PRMT8-HAも同様にHEK293T細胞にトランスフェクションし、抗-HA抗体で免疫沈降して酵素を粗精製した。また、19箇所のチロシン残基を1つずつグルタミン酸残基に置換した19個の変異体もそれぞれ精製し、PCを用いて酵素反応を行った。

現在、最適条件を検討中である。2. PRMT8がもつ二重酵素活性の細胞生物学的意義の検証:PRMT8依存的なPC12細胞の形態変化において、突起長・分岐数等の神経突起に関する定量的な評価を行うため、HCA-Visionソフトウェアを用いて解析を行った。その結果、PRMT8は突起の伸長ともに、分岐を顕著に促進することは明らかになった。また、PRMT8のSAM結合モチーフ変異体とPLase活性変異体の二重変異体は、野生型に比べてPC12細胞の突起分岐が減弱した。3. MTase活性とPLase活性の個体機能の解析を行うため、全身性PRMT8ノックアウトマウスのヘテロ欠損を作製した。この欠損マウス同士を交配し、ホモ欠損マウスを作製し、現在表現型を解析中である。(1)コリンオキシダーゼ活性を測定することで、PIM8の持つリパーゼ活性を検証することができたが、反応バッファーの組成によって、コリン産生検出感度が不安定であり、実験毎にバックグラウンドが変動した。(2)生細胞において、PA産生をリアルタイムでモニターできるシステムを確立した。この方法によって、さまざまなPRMT8変異体の酵素活性への影響を評価できるようになった。(3)PRMT8のヘテロ欠損マウスを得ており、これらのマウスを用いてホモ欠損変異体を得ることが可能となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。*PRMT8の酵素活性に影響の少ない、バックグラウンドが安定する反応バッファー系の確立を目指す。*全自動神経細胞解析ソフトであるHCA-Visionを用いて、NGF刺激による突起の形態変化の促進を評価する。*PRMT8の本ノックアウトマウスの脳から神経細胞を初代培養系を確立し、細胞レベルにおける機能的貢献を検討する。
高等植物根菜類貯蔵タンパク質の生合成とその制御機構

サツマイモ塊根及びジャガイモ塊茎の貯蔵タンパク質は、細胞の液胞中に蓄積していることが細胞分画法によって明らかになった。これらの貯蔵タンパク質は膜結合ポリソームで合成され、サツマイモ貯蔵タンパク質スポラミンは分子量が約4千大きな前駆体として合成される。大腸菌の発現ベクター上に作成したcDNA発現ライブラリーを、抗体を用いた免疫学的スクリーニングをすることによって、スポラミン、及びジャガイモの3種類の貯蔵タンパク質の全鎖長cDNAを単離・同定しそれらの全塩基配列を決定した。また、この方法により適した発現ベクターの改良も行った。塩基配列から推定されたジャガイモ貯蔵タンパク質前駆体のN末端には、いずれも典型的なシグナル配列が存在したが、スポラミン前駆体のN末端にはシグナル配列の後に更に成熟型にない荷電アミノ酸に富んだ配列が存在した。スポラミン多型成分を支配する多重遺伝子族のうち、これまでに決定した5種の遺伝子においてこの基本的構造は良く保存されていた。このN末端の余分な配列の内のシグナル配列だけがERにおいて除去されることが分かり、荷電アミノ酸領域は液胞へと輸送される過程、又は液胞で除去されると推定された。この前駆体N末端の基本構造と2段階のプロセシングによる除去は、動物リソゾームや酵母液胞に局在するタンパク質のプレプロ型前駆体のそれと類似している、酵母発現ベクターを使ってスポラミン前駆体を酵母中で発現させたところ、スポラミン前駆体の少なくとも一部は液胞に輸送されていることが示唆された。また、植物の強いプロモーターの下流に繋いだスポラミンcDNAをTiプラスミドペクターを使ってタバコに導入し、スポラミン前駆体を発現させたところ成熟型と同じ大きさのスポラミンが検出され、サツマイモ塊根と同様のプロセシングを受けたことが示唆された。
気候ダイナミックスの建設(1)ー地表面状態に応ずる大気大循環の形態の研究

昨年度にひきつづき、大陸と海洋が東西に並んでいる場合の大気大循環の形態を、特に降水域のパタ-ンに着目して調べた。昨年度より水平分解能の高いT42スペクトル・モデルを用い、海洋をはさんだ東西両側の大陸の地面の湿潤度を変えて数値実験を実行し、次の結果を得た。1.大陸の湿潤度にかかわりなく、海洋上西側では赤道をはさんで2本の降水帯を生じるが、東側では間隔が狭くなって1本にまとまり、U字形の降水域が生じる。これは海洋上で潜熱放出が大きい時の応答として理解できる。他方、大陸上では赤道沿いに1本の降水帯が作られた。これはケルビン波励起の結果と解釈できるが未検討である。2.大陸の湿潤度を変えると、海岸近くの流れの場が敏感に変化する。すなわち、湿っている場合には、大陸から海洋に向かう流れができ、逆に乾いている場合には、海洋から大陸に吹き込むようになる。この結果から、西太平洋域に西風が入るのは、東南アジアの陸地が充分に湿っているためと解釈される。上記の実験は、大気大循環モデルを用い、海面水温は固定して行ったものであるが、同様の実験を大気・海洋結合モデルを用いて海面水温をも計算する形で行った。その結果は、固定した場合と基本的に同じであった。海洋深層循環のメカニズムを理解するため、長方形海洋を想定し、その南西端(実際の海洋では南極周辺海域)に冷源を置き、そこで形成される冷水が、どのように循環して海洋全体を満たすようになるかを数値実験した。その結果、古典的なストンメル・アロンのパタ-ンは常に出現するわけではなく、密度の水平拡散が充分に小さいときに限られることが示された。理想的な地表境界条件のもとでの大気大循環モデルによる実験を行ない、百日オ-ダ-で時間平均した大気大循環・水循環の特徴が地表境界の状態を決めるパラメタの違いによりどのように変わるかを調べた。前の研究(昭和62・63年度1般研究C、代表者松野)と同様に、経度180度幅の陸と海をもつ境界条件を中心に実験を行ない、熱帯の降水と風のパタンに注目して解析した。前の研究では変えた境界パラメタは陸面の蒸発効率係数βのみであったが、本研究ではこのほか陸面のアルベド、海面水面も変えて、より広いパラメタ範囲で検討した。赤道上の降水パタンは、1)海上でその東端から約3000Kmのところに集中する2)陸上でその東端から約3000Kmのところに集中する3)海陸を問わず帯状に分布する。の3つの型が実現する。aはβの大きい場合に現われる。βの比較的小さい場合のうち陸面温度が海面温度よりも低いか同じ場合に2が、陸面温度の方が高い場合に3が現われる。2,3の場合、熱帯の風の場は、集中した降水域の加熱に対する線形応答(Gi11,1980)に近い。また、水蒸気分布は、基本的には海陸の形を直接に反映したものが、相互に180度位相のずれた2,3それぞれの風の場によって変形されたものである。このように、熱帯の大気循環と水循環の境界条件依存性を考える上で、陸と海の地表面温度の差がどのように決まるかが重要であることがわかった。
ポストＧＷＡＳ研究による心房細動の新規創薬標的の同定

コモン疾患の遺伝的リスクを調べ、個別化医療を展開する手段としてゲノムワイド関連解析(GWAS)が精力的に行われている。GWASの副次的成果として、新たな疾患経路が判明し、新たな創薬の標的が見つかることが期待された。我々は、最も頻度が高く、合併症の脳梗塞(心原性脳塞栓)による寝たきりが社会的問題となっている不整脈、心房細動を対象に3世代にわたりGWASを行い、14の心房細動感受性1塩基多型(SNPs)を同定した。これらの機能解析から、心房細動の新たな創薬標的の同定を目標に研究を行った。酸化ストレス、筋変性、交感神経の分化、などに関わるSNPsが新たな心房細動創薬のシーズであることが示唆された。1新規疾患発現経路解明を目指した機能解析:4q25領域と10q25領域の2つに関して機能解析を進めた。4q25領域には複数の独立した心房細動関連SNPsがあることが明らかとなった。Pitx2cの発現とは相関するが、ENPEPの発現との相関は見られなかった。4a25領域のヒストンコード解析から、エンハンサーとして作用するSNP領域とbivalentに作用するSNP領域が同定され、Super enhancerとしてPitx2cの発現を制御することが示唆された(論文投稿中)。10q25領域は、ユビキチン-プロテアゾーム系を介してサルコメアタンパク質の分解、ひいてはmyolysis、すなわち心房の構造的リモデリングと関係することが示唆された。2in vivo機能解析:Pitx2cのKOマウスと10q25関連遺伝子のKOマウスが作成され、解析を進めている。3遺伝-環境相互作用としてエピゲノム修飾の検討:6遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化のアッセイシステムを構築し、様々な刺激によるDNAメチル化の変化を検討した。思いのほか、高血圧・心不全・糖尿病・脂質異常症によるDNAメチル化の変化は見られず、遺伝-環境相互作用は心房細動の発症には強く関与していないことが判明した。4心房細動のマイクロRNA標的治療:動物モデルとして、糖尿病・脂質異常症で発現の変化するマイクロRNAを網羅的に探索し、それぞれ複数のマイクロRNAの発現が変化することが明らかとなった。それぞれ1つずつ、標的遺伝子の探索を行い、遺伝子改変マウスモデルを作製した。さらに、1つのマイクロRNAではトランスジェニックマウスを作製し、心房心筋症が惹起される可能性が示唆された。1. 10q25の解析:平成27年度はin vitro実験を主に行い、2つのことが明らかになった。10q25近傍遺伝子NeurlはユビキチンE3リガーゼで、heat shock protein 27(hsp27)をユビキチン化→タンパク質分解する。NeurlをKDすると筋変性が起こり、この時hsp27を同時にKDしておくと筋変性がレスキューされる。Hsp27はアクチン重合を阻害することから、neurl発現低下によりhsp27発現が増加し、これがアクチン重合阻害をすることにより筋変性が誘導されたものと考えた(論文作成中)。また、NeurlのKDによりオートファジーが誘導された。GWASに用いたSNPsすべてを使ったMGENTA解析によりmTOR経路が心房細動と関係することが示唆された。mTOR経路はオートファジーを負に制御することが知られているが、Neurl KD細胞ではmTORのリン酸化、すなわち活性化が抑制されていたことから、mTORによるオートファジーの脱抑制がオートファジー誘導につながったものと考えた。2.高脂肪食で誘導されるmiRNA27-b心房細動のリスク因子の1つに脂質異常症がある。そこで、高脂肪食で飼育したマウスでmiRNAアレイを行い、発現が変化するmiRNAを探索した。13 miRNAsで発現が2倍以上、17 miRNAsが1/2以下となり、またp値が0.01以下となった。この中で、バイオインフォマティクスで心房筋の電気的リモデリングに関係する遺伝子を標的とすることが示唆されたmiRNA27-bを標的に検討を進めた。その結果、miRNA27-bはCx40を標的とし、心房細動時にmiRNA27-b上昇がCx40の発現低下→心房の伝導障害をもたらし、これが心房細動発症と関連することが明らかとなった(論文発表)。本計画の主要な目的は、心房細動の全ゲノム関連解析(GWAS)で得られた情報を臨床応用するための橋渡しをすることにある。過去2年間の研究で複数の論文を発表することができ、また臨床への橋渡しをするためのシーズを複数見つけることができたことから、概ね順調に進展していると判断する。本研究計画と補完的な関係にあるAMED「個別化医療実現化プロジェクト-不整脈」で行っている心房細動関連遺伝子の探索で、新たに行った第3期genome-wide association study(GWAS)より新たに6つのコモン多型、exon-wide association study(EWAS)により2つのレア多型が同定された。特に、レア多型はエクソンにあることからタンパク質のアミノ酸を変異するSNPであり、オッズ比がそれぞれ3強、25弱と単一SNPとしては極めて高く、すなわち心房細動と関連が強いことが示唆された。そこで、平成28年度はこれらの遺伝子およびSNPの機能を心房筋由来細胞株HL-1を使ったin vitro実験で検討した、前者の分子は、アンジオテンシンII受容体ーNADPH

oxidaseの間に位置する分子であり、アンジオテンシンII刺激により活性酸素産生を増強すること、心房細動関連SNPを導入することによりアンジオテンシンII刺激による活性酸素産生がさらに増強することが明らかとなった。アンジオテンシンII刺激誘導活性酸素は心房細動発症と関連することがすでに明らかとなっており、有望な新たな創薬標的と考えられた。後者の分子は心筋にはほとんど発現せず心臓神経節に発現した。そこで、同遺伝子を神経細胞株Neuro2Aに導入すると交感神経への分化を意味するチロシンヒドロキシラーゼ(TH)発現が増加した。同分子に心房細動関連SNPを導入すると、TH発現がさらに増強した。自律神経も心房細動発症に関与することが明らかとなっているので。こちらも有望な新たな創薬標的と考えられた。本研究計画と補完的な関係にあるAMED「個別化医療実現化プロジェクト-不整脈」で行っている心房細動関連遺伝子の探索で、新たに行った第3期genome-wide association study(GWAS)より新たに6つのコモン多型、exon-wide association study(EWAS)により2つのレア多型が同定された。これらを本研究計画の検討標的に加えたところ、レア多型の1つは1つのSNPだけでオッズ比が3強、もう1つのSNPはオッズ比が25弱と心房細動との関連がより強いことから、心房細動の新たな創薬標的としてよりふさわしい可能性があると考え、その解析を進めた。その結果1つのSNPは酸化ストレスの新たな関連分子であることが示唆され、他は交感神経分化に関することが示唆され、心房細動の新たな創薬標的としてふさわしいことが示唆された。このように、補完的関係にある研究課題の新たな成果を取り入れることにより、心房細動創薬としてよりふさわしい標的が2つ同定されてきたことから、当初の予定に比べてより進捗していると考えられる。平成28年度までの研究で、exon-wide association study(EWAS)から同定された2つのレアSNPと心房細動との関連が心房筋由来細胞株HL-1を使ったin vitroの検討を行った。一方は、心筋細胞においてアンジオテンシン-II受容体ーNADPH-oxidaseの経路を介して活性酸素の産生に関与する分子で、心房細動感受性1塩基多型(SNP)があると、活性酸素の産生がより増加することが明らかとなった。また同分子は単球ーマクロファージ系にも発現しており、単球をフォルボールエステルで活性化すると発現が増加すること、スクラッチアッセイなどから単球の移動に関係すること、すなわち単球の組織に侵入する時に重要な働きをすることが明らかとなった。すなわち同分子は、心筋細胞と単球-マクロファージの両者で心房細動の発現に関与することが分かった。もう一方の分子を神経細胞に発現させると、チロシンヒドロキシラーゼの発現が増え、交感神経への分化を誘導することが分かった。さらに、心房細動感受性SNPを持つ同分子を発現させると、チロシンヒドロキシラーゼの発現がさらに増加することが分かった。そこで、同分子のノックアウトマウスをゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いて作製したが、繁殖に問題があった。これは、自律神経が繁殖に関係するためと考えられる。
ハイブリッドイオン磁化プラズマ生成・制御による速度シア研究の新展開

平成16-17年度の成果に基づき,ともに同心円状に3分割されたイオン源及び電子源を用いて,磁力線平行方向フロー速度シアに垂直方向フロー速度シアを制御しながら重畳することによって,これらの速度シアに起因するドリフト波不安定性の特性を詳細に調べた.また,これまでのカリウム正イオンプラズマに対して,異極性の負イオンを生成する六フッ化硫黄,及び同極性異質量の正イオンを生成するセシウムを導入し,速度シア駆動ドリフト波不安定性に対するハイブリッドイオン導入の効果を調べた.1.カリウム正イオンプラズマ中の平行シア存在下で励起された方位角方向モード数m=3のドリフト波が,垂直シア強度の増加によって周波数スペクトルが広帯域化した後,m=2のドリフト波へと遷移することが明らかとなった.乱流遷移との関連を含めて理論的な解析を進めている.一方,平行シア強度の増加に対しては,垂直シアにより決定されたモード数を維持しながら一度揺動が成長し,あるシア強度で最大値を示した後,抑制されることがわかった.さらに,m=2のドリフト波が,m=3のドリフト波に比べて励起させるために強い平行シアが必要であることがわかり,理論的に求めた成長率と定性的に一致する傾向を得た.2.カリウム正イオンプラズマ中に六フッ化硫黄負イオンを導入したところ,負イオン交換率(n_-/n_+)が10%を超える領域においては,さらなる負イオンの導入が平行シア駆動ドリフト波の成長率を減少させることを初めて実験的に観測した.さらに,負イオン交換率が50%を超えると,波動は完全に抑制され,プラズマが安定化することを観測した.3.カリウム正イオンプラズマ中にセシウム正イオンを導入し,それらの密度比を制御して速度シア駆動ドリフト波に対する効果を調べた.まず,カリウムのみ及びセシウムのみのプラズマ中でドリフト波に対するそれぞれのシア強度依存性を調べたところ,揺動強度が最大になるシア強度がイオン種によって異なることが明らかになった.これらのイオンを重畳させたところ,カリウムのみ,およびセシウムのみのプラズマの場合とは異なり,速度シア強度への依存性が小さくなり,広いシア強度の範囲で比較的弱い揺動強度のドリフト波が励起されることが分かった.すなわち,それぞれのイオンに起因するドリフト波の分散関係が結合して,新たなモードが励起された可能性がある.1、磁力線平行及び垂直フローの速度シアを精密制御できる新しいプラズマ源を製作した.まずイオン源用に外側最大直径が10cmの3分割型タングステン電極を製作した.更に,直径10cmのタングステン電極をイオン源同様に3分割して,電極表面に酸化バリウム又は六硼化ランタンを塗布することで電子源とした.これらを,現有の直線型接触電離プラズマ生成装置(磁場1-4kG)の両端に各々対向して設置し,イオン源前面には電子反射用の負電位印加グリッドを設置した.2、イオン源電極にカリウムの蒸気を吹きかけ,接触電離により正イオンを生成すると共に,対向の電子源電極より電子を放出することで,完全電離無衝突プラズマを生成した.イオン源及び電子源の各分割電極に印加するバイアス電位を変化させることで,イオン源電位制御により磁力線平行方向のフロー速度シアが,電子源電位制御により半径方向電位分布変化に起因するE×Bドリフト(磁力線垂直)フロー速度シアが形成されていることを観測した.さらに,イオン源・電子源電位を同時に制御することによって,平行フロー速度シアに垂直フロー速度シアを制御しながら重畳することに成功した.3、平行フロー速度シアを形成した場合,その平行シア強度がある閾値を超えるとドリフト波不安定性が励起されることが分かった.その時に,垂直フロー速度シアを重畳することによって,垂直シア強度が小さい場合には,上記の不安定性が一度抑制されるが,垂直シア強度を大きくしていくことによって,再び不安定性が励起されていくことが明らかになった.4、次年度に予定しているレーザー誘起蛍光法(LIF)フロー速度シア計測を今年度から実施した.まずは分割型イオン源電極のみをKoepke教授研究室(ウェストバージニア大学・米国)に持ち込み,LIF計測によって平行フロー速度シアが形成されていることを実証した.平成16年度の成果に基づき,ともに同心円状に3分割されたイオン源及び電子源を具備した,磁力線平行方向フロー速度シアに垂直方向フロー速度シアを制御しながら重畳することが可能な新しいプラズマ源を用いて,これらの速度シアに起因するドリフト波不安定性の特性を詳細に調べた.1.平行フロー速度シアにより励起されたドリフト波不安定性が,垂直フロー速度シアを制御しながら重畳することにより次第に抑制されるが,その抑制機構が垂直シアの符号により異なることが明らかとなった.また,垂直シア重畳の際に不安定揺動の周波数スペクトルが広帯域化する現象が観測されており,乱流遷移との関連を含めて理論的な解析を進めている.2.レーザー誘起蛍光法によるフロー速度シア計測を,前年度に引き続きKoepke教授研究室(ウェストバージニア大学・米国)で行い,磁力線平行方向と垂直方向のイオン速度分布関数を二次元的に精密に測定した.また,それらのシアの不安定揺動に対する効果を調べた結果,平行シアにより高次の周方向モード数をもつドリフト波不安定性等が励起され,さらにモード数によって励起に必要なシア強度の閾値が異なることが明らかとなった.3.ハイブリッドイオンを導入する実験として,現在のカリウム正イオンプラズマに対して,異極性の負イオンを形成する六フッ化硫黄を導入し,ドリフト波不安定性に対する効果を調べた.

負イオン交換率(プラズマ中の電子と負イオンの置換率)の上昇に伴い,不安定性の揺動レベルが上昇することが確認された.さらにこのとき,ドリフト波不安定性が励起される平行シア強度範囲が正・負両方向に拡張する現象が観測された.これらの結果から,プラズマ中の負イオン導入が,シア駆動支配下のプラズマの不安定化を促進させることが明らかとなった.4.負イオンプラズマ中でのドリフト波不安定性の周波数スペクトルを観測した結果,ある平行シア強度範囲において鋭利なスペクトルから広帯域なスペクトルへと遷移し,さらなるシア強度の上昇により再び鋭利なスペクトルへと遷移する様子を観測した.この現象は,負イオン及び平行シアが共存するときにのみ観測され,一般的に揺動レベルの強い場合に発生した.従って,このスペクトルのブロード化は「負イオン」及び「平行シア」の2つの事象に起因する非線形効果の発現により,元は正弦波的であった線形領域の波動が,乱流的なスペクトル特性を呈するようになったと考えることができる.平成16-17年度の成果に基づき,ともに同心円状に3分割されたイオン源及び電子源を用いて,磁力線平行方向フロー速度シアに垂直方向フロー速度シアを制御しながら重畳することによって,これらの速度シアに起因するドリフト波不安定性の特性を詳細に調べた.また,これまでのカリウム正イオンプラズマに対して,異極性の負イオンを生成する六フッ化硫黄,及び同極性異質量の正イオンを生成するセシウムを導入し,速度シア駆動ドリフト波不安定性に対するハイブリッドイオン導入の効果を調べた.1.カリウム正イオンプラズマ中の平行シア存在下で励起された方位角方向モード数m=3のドリフト波が,垂直シア強度の増加によって周波数スペクトルが広帯域化した後,m=2のドリフト波へと遷移することが明らかとなった.乱流遷移との関連を含めて理論的な解析を進めている.一方,平行シア強度の増加に対しては,垂直シアにより決定されたモード数を維持しながら一度揺動が成長し,あるシア強度で最大値を示した後,抑制されることがわかった.さらに,m=2のドリフト波が,m=3のドリフト波に比べて励起させるために強い平行シアが必要であることがわかり,理論的に求めた成長率と定性的に一致する傾向を得た.2.カリウム正イオンプラズマ中に六フッ化硫黄負イオンを導入したところ,負イオン交換率(n_-/n_+)が10%を超える領域においては,さらなる負イオンの導入が平行シア駆動ドリフト波の成長率を減少させることを初めて実験的に観測した.さらに,負イオン交換率が50%を超えると,波動は完全に抑制され,プラズマが安定化することを観測した.3.カリウム正イオンプラズマ中にセシウム正イオンを導入し,それらの密度比を制御して速度シア駆動ドリフト波に対する効果を調べた.まず,カリウムのみ及びセシウムのみのプラズマ中でドリフト波に対するそれぞれのシア強度依存性を調べたところ,揺動強度が最大になるシア強度がイオン種によって異なることが明らかになった.
イネいもち病菌の相同組換えと病原性変異機構の解明

イネいもち病菌の体細胞相同組換えを検証するために相同組換え検出系を構築した.本系を導入したいもち病菌に対し,ケミカルストレス等を処理すると高頻度で相同組換えが生じること,またその条件について明らかにした.非病原性遺伝子Avr-Pitaの遺伝的変異に相同組換えが関与していることを示した.メガヌクレアーゼI-Sce Iを用いて,DNA二本鎖切断を導入すると相同組換え頻度が上昇することを実証した.任意のゲノム部位に相同組換えを導入するために,糸状菌型人工ヌクレアーゼの構築を行った.以上から,体細胞相同組換えによるゲノム変異は本菌の病原性変異に寄与することを明らかにした.イネいもち病菌の変異機構として「相同組換え」に注目し,非病原性遺伝子の変異や準有性生殖による遺伝子交換および伝達に相同組換えが関与するかどうかについての検証を行っている.1)相同組換え検出系を利用した準有性生殖による組換え検出平成24年度は相同組換えを簡便に検出できる実験系を構築して,相同組換えの検出に適した諸条件について明らかにしたので,その成果について論文にまとめ,報告した(J. Gen. Plant Pathol. 79:422-430).今年度はそれらの条件に基づき設計したTG受容体配列とRS供与体配列をそれぞれ導入した菌株を複数系統準備して,それぞれ対峙培養または液体混合培養を行い相同組換えによるYFP蛍光の出現を調査した.その結果,3系統の組合せにおいてYFP蛍光が確認されたことから,RS供与体配列が一方の株に伝達され,同時にTG受容体配列への準有性生殖的組換えが生じることを確認することができた.2) Avr組換え検出系を用いた非病原性遺伝子の変異平成24年度にはイネいもち病菌の非病原性遺伝子として知られているAvr-pita遺伝子配列を受容体配列として,対応する供与体配列を人工DNA配列(Avr供与体配列)として構築し,イネいもち病菌北-1株に導入した.この供与体配列は点変異導入により不活性化したAvr-pita配列内に,解析用の制限酵素認識配列が付加してある.今年度は北-1菌の内生Avr-pitaと新たにゲノムへ挿入したAvr供与体配列間で相同組換えが生じたかどうかについて,非親和性品種ヤシロモチへの接種試験により検定した.接種葉上の病斑の有無による病原性の確認と病斑部より単菌糸または単胞子分離により取得した菌のゲノムを用いた遺伝子解析によって,元々ゲノム上に存在していた非病原性遺伝子に変異が生じたことを証明することに成功した.これらの成果は論文にまとめ報告した(J. Gen. Plant Pathol. 80:153-157).イネいもち病菌の体細胞相同組換えを検証するために相同組換え検出系を構築した.本系を導入したいもち病菌に対し,ケミカルストレス等を処理すると高頻度で相同組換えが生じること,またその条件について明らかにした.非病原性遺伝子Avr-Pitaの遺伝的変異に相同組換えが関与していることを示した.メガヌクレアーゼI-Sce Iを用いて,DNA二本鎖切断を導入すると相同組換え頻度が上昇することを実証した.任意のゲノム部位に相同組換えを導入するために,糸状菌型人工ヌクレアーゼの構築を行った.以上から,体細胞相同組換えによるゲノム変異は本菌の病原性変異に寄与することを明らかにした.イネいもち病菌の変異機構として「相同組換え」に注目し,非病原性遺伝子の変異や準有性生殖による遺伝子交換および伝達が,相同組換えによって生じるかどうかを検証する.その方法として,相同組換えを簡便に検出できるモニター系を用い,今年度はイネいもち病菌の相同組換えの諸条件を明らかにすると同時に,高頻度相同組換えの誘導を可能にするDNA二本鎖切断導入法の検討を行った.1イネいもち病菌における相同組換え検出系の最適条件検討イネいもち病菌の相同組換えを簡便に検出するために,申請者がすでに確立しているYFP::BSD融合マーカーを用いた相同組換え検出系を用い,複数の菌株を作出した.本検出系が相同組換えを検知できる諸条件を明かにするために,相同組換えが誘導されるストレスの種類や生育ステージ,ゲノム中の両配列のコピー数などの検討を行い,条件の洗い出しを行った.また,相同組換えに必要な供与体配列および受容体配列の長さについて,約15 bp間隔でサイレント変異を印として挿入した相同配列を用いることで,本菌の相同組換えが切断部位近傍において生じ易いことを見出した.2イネいもち病菌におけるDNA二本鎖切断導入系の構築高頻度の相同組換えを誘導するために,超低頻度切断の制限酵素I-Sce Iの認識配列(18bp)を受容体配列内に導入し,糸状菌用I-Sce Iによる二本鎖切断導入系の構築を行った.また,相同配列を持たない系統において二本鎖切断の導入により広範囲(約4000 bp )の欠失が高い割合で生じるのに対して,相同配列を有する系統では欠失の割合が減少し,大幅に相同組換え修復の割合が上昇することを明らかにした.イネいもち病菌の変異機構を解明するために「DNA二本鎖切断」と「相同組換え修復機構」に関する解析を進めてきた.これまでの知見から,本菌のゲノム多様性はトランスポゾンなどの反復配列を起点とした相同組換えによるゲノム再編により誘導される可能性がみえてきた.

1)糸状菌型人工ヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断導入系の構築初年度実施のI-Sce Iによる実験系を受け,トランスポゾン近傍など任意配列に二本鎖切断を導入するために,糸状菌型人工ヌクレアーゼPlatinum FungalTALENs(PtFg TALEN)の構築を行った.本系による標的遺伝子の破壊を確認するため,シタロン脱水素酵素遺伝子(SDH)を標的として,SDH上流および下流の領域間に薬剤耐性遺伝子を挿入したSDH破壊ベクターとPtFg TALENを本菌へ共導入した.得られた薬剤耐性菌ゲノムを解析したところ,すべての薬剤耐性菌において標的遺伝子が薬剤選抜マーカーと置換されていた.この結果は相同組換えを介した標的遺伝子置換効率が極めて高いことを示し,本菌の通常の遺伝子置換効率と比べ,大幅にその効率の向上に成功した.これらの成果は論文にまとめ報告した(DOI: 10.1002/bit.25559).2)相同組換え修復系に関わる基本因子の探索DNA二本鎖切断と相同組換え修復に関わる出芽酵母のホモログ情報などから,DNA修復・組換え経路の制御因子として知られているSrs2 DNAヘリカーゼのホモログ遺伝子を本菌より単離後,機能ドメインに分割して酵母ツーハイブリット法によって既知の組換えタンパク質との相互作用を確認した.続いて,欠損変異させた∆srs2株に対し,SDH破壊ベクターとPtFg TALENの共導入して,その標的遺伝子置換効率から相同組換え修復能を評価したところ,本菌Srs2ヘリカーゼは相同組換え修復に重要な役割を担っていることが示唆された.今後は病原変異の発生そのものを抑制するための足掛かりとして,Srs2の解析を進める予定である.植物病理学イネいもち病菌にTG受容体配列またはRS供与体配列を導入した複数の菌株を作出した.両菌株は3日間の液体混合培養後に,準有性生殖的組換えが生じた菌株を優先的に生育させるためにブラストサイジンを添加して,さらに3日間培養した.その後,ブラストサイジン含有プレートに塗布して薬剤耐性およびYFP蛍光を発する菌株を探索した.現在,取得したYFP蛍光クローンより菌糸分離を行い,遺伝的解析を進めている.2種類のDNA配列による相同組換え検出マーカーを用いた本実験において,YFP蛍光が観察されなかった場合に備えて,高頻度に相同組換えを誘導するための諸条件の決定と技術に関する準備を進めてきた.その中で糸状菌用I-Sce Iによる二本鎖切断導入系を用いた実験は,当初の予想を上回る成果,特にいもち病菌特有の相同組換え機構の一端を実証することができたことから,当該部分に関する知見を中心に論文としてまとめた(FEMS Microbiol. Lett. 352:221-229).さらに,任意の配列に対して二本鎖切断を導入するために遺伝子ターゲティングで用いられるようになってきたTALENをイネいもち病菌へ適応可能とするシステムの最適化を行った.構築したTALENシステムを用いた二本鎖切断導入技術は,高効率の遺伝子破壊法としても有用であることが明かとなり,今後の研究展開にも極めて有益である.次年度計画である「相同組換え関連因子および組換えメディエーターの探索」に関して今年度後半から前倒しで実験を開始した.具体的にはDNA修復・組換え機構に関与するDNAヘリカーゼに着目し,北-1株ゲノムより候補遺伝子と相互作用が予想されるカウンターパート遺伝子の単離をあわせて行った.
新規コーパスを利用したフィラーと話法の分析に基づくテクスト談話構成の日仏対照研究

日本語とフランス語の話法とフィラーに関する対照研究を行った。書き言葉に関しては,J.-M. Adamが提唱する発話レベルの4区分のスキーマが,話法との関連で親族名称名詞の多義性の説明に有効であることを示した。話し言葉に関しては,舌打ち音の談話機能を分析し,フィラーとの類似点を同定し,フィラーよりもさらに身体的表現寄りの要素であると結論づけた。主な資料としてオルレアン大学のESLOコーパスを初めとして,新規公開された大規模コーパスを使用した。これらの結果に基づき,日仏のテクスト構成の対照研究の基礎を築いた。本年度は,テクスト談話構成の日仏対照研究のうち,フランス語に関する部分を中心に検討した。書き言葉に関しては,Jean-MichelAdamの最新の著作Lalinguistique textuelle(テクスト言語学)では,フランス語の時制の分布を説明するために,Emile Benvenisteが発話レベルに関して提唱したDiscoursとHistoire(=Recit)の対立を発展させ,発話レベルを4つに分けている。本研究では,このAdamの4分法が,時制のみならず,話法に関連する他の言語現象の説明にも使えることを証明した。その中でも,遂行性が特に高い名詞である親族名称が,呼びかけとしてではなく,文の必要不可欠な要素として使われた時に持つ多義性に注目した。親族名称の指示対象の持つ多義性の分布は,Adamの発話レベルの4分法で説明できることがわかった。話し言葉に関しては,予定していた以上の対面調査を国内外で実施できた。特にフランスと日本の研究協力者のコラボレーションがうまくいったおかげで,フランスで約1ヶ月をかけて10件以上のインタビュー調査を行うことができ,来年度の目標を先取りできた。またフランスで最近公開されたオルレアン大学の有名な話し言葉コーパスESLOを用いて,フィラーに近い役割を果たすと思われる舌打ち音の分布と生起率を調べた。その結果,従来の予想に反して,生起率は100%に近く,話し手の年齢・性別・社会階層に関わらず極めて広い分布を示していることがわかった。舌打ち音がフィラーに近い役割を果たしていると同時に,無意識である点において,完全にはフィラーと同じとはいえないこともわかってきた。勤務先の予算や外部資金を利用して,フランスから研究協力者を招いて意見交換を行い,公開学術講演会を2回実施して国内の研究者との交流も行った。当初の計画通り,研究の中間段階の成果発表のために平成28年7月開催のフランス国フランソワ・ラブレー・トゥール大学での第5回フランス語学世界大会および,ベルギー国リエージュ大学での国際フランス語教授連合の第14回世界大会の研究発表申し込みが,いずれも審査の上受理されたので,翌年度の旅費を前払いするため,前倒し請求を行った。話し言葉に関しては,昨年度から引きつづいて対面調査を組織的に行った。特に国際学会での成果発表の機会を利用して,フランスだけでなくベルギーでインタビュー調査を行い,フランス以外でのフランス語の生のデータを得られた。これをもって海外対面調査を終了した。書き言葉に関しては,文体に変化を持たせるため,小説と,法令文の二種類を対象に,日本語,フランス語,英語のそれぞれで同じ内容を表すテクストを材料として,パラレル・コーパスで作成した。これで,データ収集はほぼ終えることができた。ベルギーにおける対面調査の結果,フランス以外のフランス語圏の話し手も,歯茎吸着音を組織的に使用していることが明らかとなった。さらにフランスで最近公開されたオルレアン大学の有名な話し言葉コーパスESLOコーパス(約8時間分),及び日本の国立国語研究所のコーパスを使って,吸着音の分布を調べた。大規模コーパスの利用により,データを飛躍的に増やすことができ,生起率と生起条件をかなり詳細に記述することができた。その談話機能の違いを考察すると,フランス語の場合は,フィラーそのものというよりは,フィラーと表情による感情表現の間に間に位置するのではないかという見込みが得られた。その一方,日本語では,必ずしも同様の機能は持たないのではないかという感触を得ている。書き言葉に関しては,親族名称を初めとする関係を表す名詞の,テクスト内での解釈に関して,話法との関連で記述した。日本語とフランス語で対応する語の解釈の違いを調べ,各言語の特徴付けを試みた。平成28年7月にフランス国トゥール市で開催されたフランス語学世界大会,及びベルギー国リエージュ市で開催された国際フランス語教授連合世界大会で,それぞれ中間段階の理論的成果と教育への応用の成果を発表した。研究協力者の2名もそれぞれの大会で一回ずつ発表した。リエージュでは3名がそろって研究交流を行い,意見交換を行った。コーパスを利用してデータ収集し,限定詞を持たないフランス語の名詞文について,その生起環境を精査した。そしてこの構文で使われる名詞の性質と,構文の統語的性質を同定した。さらに前後の文脈との関連を調べ,情報構造を明らかにした。この構文の研究から,将来的に内的独白および話法との結びつきを明らかできる見込みである。さらに本年度は日本語とフランス語の対照研究にも重点をおいた。その成果は,12月16日17日に名古屋大学でのシンポジウムで発表した。なおこの折の研究成果の一部は,2018年7月にベルギーのモンス大学で開催される第六回フランス語学世界大会で発表する予定で,同学会のジャーナルに掲載が決定している。これ以外に研究成果の一般公開及び学術交流の機会として,国際研究集会一回,講演会2回を大阪府立大学で開催した。

まず5月27日に「コーパス研究の現在ーデータから見る言語の実態」のテーマで研究集会を開催した。この会には研究協力者のガブリエル・ベルグニュを招へいし,国立国語研究所・専修大学准教授の丸山岳彦氏を迎えて,日仏の研究交流を促進した。7月27日には,リエージュ大学現代言語研究所講師のLaurence Wery氏を迎え,「ベルギーのフランス語」と題して,言語変異について,ベルギーのフランス語を例にとった講演会を行った。9月17日には,リエージュ大学現代言語研究所所長で,国際フランス語連合会長のJean-Marc Defay氏を迎え,「「テクスト言語・認知・社会文化」をテーマとして「言語学的・認知的・社会的アプローチの交差点としてのテクスト」のタイトルで講演会を行った。日本語とフランス語の話法とフィラーに関する対照研究を行った。書き言葉に関しては,J.-M. Adamが提唱する発話レベルの4区分のスキーマが,話法との関連で親族名称名詞の多義性の説明に有効であることを示した。話し言葉に関しては,舌打ち音の談話機能を分析し,フィラーとの類似点を同定し,フィラーよりもさらに身体的表現寄りの要素であると結論づけた。主な資料としてオルレアン大学のESLOコーパスを初めとして,新規公開された大規模コーパスを使用した。これらの結果に基づき,日仏のテクスト構成の対照研究の基礎を築いた。本研究の中間段階の成果を,平成28年7月にフランス国フランソワ・ラブレー・トゥール大学で開催される第5回フランス語学世界大会および,平成28年7月にベルギー国リエージュ大学で開催される国際フランス語教授連合の第14回世界大会で発表する。書き言葉における名詞句に関する考察を深め,Adamの発話レベルの4分法で説明できる他の現象を考察する。その際に,フランスで公開されている大規模書き言葉コーパスを,これまで以上に積極的に使用する。さらに日仏対照研究の観点から,日本語についての考察を深める。話し言葉のフィラーに関しては,成果のまとめに入る。最終年度となる平成29年度に,フランスから研究協力者を招聘し,日本のコーパス言語学の専門家も交えて,国際研究集会を開催する。本研究の総決算となる論文を執筆予定。フランス語学学会発表のための旅費で,海外での交通費のうち鉄道料金の支払いが年度内に間に合わなかったため,出張旅費の総額が確定できず,次年度の支出となった。研究協力者を招聘して行う研究集会が,招聘予定者の都合で平成二八年度3月末に日本滞在を開始する可能性が出てきたため,前倒し請求を行った。しかし,結局当初の予定通りに平成二九年度にこの研究集会を行えるようになったため,前倒し請求した分が,ほぼそのまま次年度使用に回ることになった。平成28年度4月に,遅延していた出張手続きを完了し予定していた使用額はすでに使った。当初の予定通りに平成二九年度に研究集会を行う。
癌化と感染防御におけるB細胞増殖限界制御の分子基盤

リンパ球不死化前後に発現量が著しく変動することを見出した細胞老化因子ArfとB細胞増殖限界制御との関係性を明らかにすることを目的として、抗原特異的B細胞が抗原応答による増殖を開始してからの分裂速度と分裂回数を調べた。分裂回数を追跡可能な色素を充填した抗原特異的B細胞をレシピエントマウスへ経静脈移植後に抗原投与し細胞分裂を誘導した。抗原投与5日目にはほぼすべての抗原特異的B細胞が7回以上分裂を終えていることがわかった。次に抗原応答を模倣したin vitroのB細胞培養系で細胞老化因子であるArfおよびInk4aの発現をmRNAおよび蛋白質レベルで調べたところ、一般的な予想に反しInk4aとArfの発現誘導のタイミングおよび発現のカイネティクスは互いに一致しないことがわかった。Arfのリンパ球癌化における役割を明らかにするため、C57BL/6マウス受精卵でArf蛋白質をコードするCdkn2a遺伝子エクソン1βをCRISPR/Cas9で切断しノックアウトマウスを樹立した。Arf蛋白質の発現を1細胞レベルで検出するためのArfレポーターマウスを樹立するために、C57BL/6マウス由来ES細胞株のArf遺伝子座にtdTomato蛍光蛋白質をコードする遺伝子をノックインした細胞を複数クローン単離し、現在キメラマウスの作成中である。S1pr2-CreERT2マウスは共同研究先からの入手および繁殖に成功し、これからリンパ腫ドライバーマウスとの掛け合わせが進行中である。リンパ腫細胞のArfゲノム遺伝子座の配列解析を行なったところ、Arfをコードするエクソンへの変異は検出されなかった。29年度が最終年度であるため、記入しない。