hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カスケード環化反応を基盤とする抗腫瘍性アルカロイドHaouamine類の合成研究

カスケード型溝呂木-ヘック環化反応を用いてインデノテトラヒドロピリジン骨格の簡便な合成法を見出し、ハオウアミンAの形式合成を達成することができた。一方、プメラー型環化反応を用いたハオウアミンBの骨格合成は困難であることが明らかとなったが、本合成研究をきっかけとして、鉄触媒を用いるヒドラジン化合物からの新規ラジカル発生法やアルケンのニトロ化反応等の有用な反応を見出すことができた。本年度はハオウアミン類のインデノテトラヒドロピリジン骨格の効率的な構築に取り組んだ。グリシン保護体から6工程で合成したスチレン部分とα,β-不飽和アミド部分をあわせ持つ溝呂木-ヘック反応の前駆体に対して、加熱ジメチルホルムアミド中でアミン存在下、触媒量のトリフェニルホスフィンとトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウムクロロホルム錯体で処理したところ、五員環形成に続く六員環形成というカスケード環化反応が進行して、ほぼ定量的にハオウアミンAのインデノテトラヒドロピリジン骨格を一挙に得ることができた。続いて、得られた化合物のオレフィン部分を足がかりとして、鈴木-宮浦カップリングを用いた2-プロモ-5-メトキシフェニル基の導入を行った後、ラクタムの還元と脱保護を経てバランらの合成中間体へと導くことによってハオウアミンAの形式合成を達成した。本合成法は一挙に複数の環構造を構築できるため、非常に効率的なものであると言える。一方、ハオウアミンBのインデノテトラヒドロピリジン骨格をプメラー型カスケード環化反応によって構築すべく、先の溝呂木-ヘック反応前駆体と類似の構造を持つα-チオアミド化合物を合成し、プメラー型反応を試みた。しかしながら、様々な反応条件および基質を用いたにも関わらず、目的のカスケード環化反応は進行せず、一段階目の環化のみ進行した生成物やプメラー中間体が芳香環と反応して生成したと考えられるベンズアゼピン誘導体が得られるのみであった。このように、プメラー型環化反応を用いたインデノテトラヒドロピリジン骨格の構築は困難であることから今後、ハオウアミンBの効率的な合成を達成するためにはラジカルやカルベン等の他の反応活性種を用いたカスケード反応の検討が必要であることが示唆された。プメラー型環化反応を用いたハオウアミンBのインデノテトラヒドロピリジン骨格の構築は困難であったこと、および、ハオウアミン類のビアリール部分を構築するために新規反応開発が必要であったことから、これらの目的を達成し得る新たなラジカル反応の開発を行った。最初にモデル基質として2-フェニルプロペンを設定し、種々のラジカル前駆体、反応剤および触媒等をスクリーニングした。その結果、酸素存在下、水を溶媒として用いフェロシアン化カリウム三水和物を触媒として芳香族ヒドラジンからアリールラジカルが発生し、アルケンとの付加反応によって2-アリールペルオキシド誘導体が高収率で得られることを見出した。さらに、本反応を直接的なビアリール合成に応用した。また、カルバジン酸エステルを空気中で触媒量のフタロシアニン鉄で処理することによってアルコキシカルボニルラジカルが発生し、アルケンとの付加反応によって2-ヒドロキシエステル誘導体が高収率で得られることを見出した。さらに、本反応はスルホニルラジカルのような他のラジカル種の発生にも応用することができた。また、新たなラジカル環化反応を見出した。例えば、1,6-ジエン化合物存在下で硝酸鉄を加熱すると、1,6-ジエンへのニトロ基の付加に続くラジカル環化反応が進行することを見出し、さらにこれを一般的なニトロ化反応に拡張するとともに、反応条件がより緩和な改良法も見出すことができた。これらの反応は安価で毒性の低い試薬を用いており、また反応操作も安全かつ簡便であることから、有用なラジカル反応であると考えられる。現在のところ、ハオウアミンBの合成には至っていないが、本合成研究をきっかけに多くの新しい反応を開発できたため、今後はこれらを応用することによって、ハオウアミン類の効率的な合成が達成されることが期待される。
分岐鎖アルコール・アミン類の超高感度絶対配置決定法の開発と天然物への応用

アルコールの蛍光不斉誘導体化試薬2-(2,3-anthracenedicarboximido)cyclohexanecarboxylic acid (1)を開発し、メチル分岐1級アルコール、及び2級アルコール類の^1H-NMR及び逆相HPLCによる分岐不斉識別能について評価した。^1H-NMRでは水酸基からメチレン鎖で8結合程度隔てられた分岐不斉を、また逆相HPLCでは14結合程度隔てられた分岐不斉を識別可能で、特にHPLC法では10^<-15>モルレベルでの検出が可能あった。更に、2級水酸基の不斉識別も可能で、分岐鎖2級アルコールの分岐、及び水酸基の同時に不斉識別ができた。この方法をアミノ化合物に適用するため、試薬1を酸塩化物とした試薬を合成し、分岐アミン類に適応した結果、アルコール類と同様に分岐、及びアミノ基の不斉識別が可能であった。この方法を用い、分岐不斉を有するNiphatesin Dの高感度不斉識別法を確立した。また、この方法を昆虫(ラセンウジバエ、穀ゾウムシの性フェロモン)の粗抽出物からの微量のフェロモンの検出などに応用し、LC-LC法及び試薬の両エナンチオマー体を用い標識するクロスチェック法により微量フェロモンの光学活性体の検出、組成分析を実現し、高い実用性を実証することができた。一方、D-グルコサミン骨格を有する試薬を設計・合成した。誘導体化はルイス酸を用いたグリコシル化反応により、糖の1位にβ選択的に導入することが可能であった。得られたジアステレオマー誘導体は、^1H-NMR、HPLC法では試薬1と同様、高い分岐不斉識別能を有し、特に、α-トコフェロールの8種の光学異性体を分離するなど、多分岐アルコールに対して高い不斉識別能を発揮した。シクロヘキサン骨格を持つ蛍光不斉誘導体化試薬2-(2,3-anthracenedicarboximide)cyclohexanecarboxylic acid(1)を用い、光学活性2級アルコール、及び分岐不斉を有する2級アルコール類の不斉識別について検討し、これまで不斉識別が困難と考えられてきたアルキル鎖の中央部分に水酸基を有し、アルキル鎖長が1炭素分のみ異なることにより不斉が生じるC30までの2級アルコール類をHPLCで分離することを可能とした。また、分岐鎖を有する2級アルコールに対して、可能な4種の立体異性体を分離することが可能であった。この方法は、非常に高感度で分析することが可能で、LC-LCシステムを用い、ラセンウジバエのフェロモンの分析に応用し、粗抽出試料より、微量のフェロモンを検出し、その絶対立体配置を決定することができた。また、本試薬は、NMR法による不斉識別にも有効で、水酸基から10結合程度までの不斉の認識が可能であった。また、本試薬をアミノ基の誘導体化に用いるため、カルボキシル基を酸クロリドに変換した試薬を合成した。一方、ガラクトースを出発原料とし、2位アミノ基をアントラセンイミドとし、水酸基全てをアセチル基(2)、ベンゾイル基(3)、あるいはメチル基(4)で保護した試薬を合成した。さらに試薬2,3に関しては、アノマー位をBrに代えた試薬も合成した。これらの試薬を用い、アルコールをLewis酸存在下でグリコシル化反応させ、β選択的誘導体に導くことができた。また、試薬4は電磁波を照射することによりβ選択的誘導体化が可能であることを見出した。これらに誘導体は、HPLCにより特に水酸基から遠隔位に分岐不斉を有する分岐アルコールに対し高い不斉識別能を有していた。

蛍光不斉誘導体化試薬としてD-グルコサミン骨格を有する試薬を設計・合成した。これの試薬の不斉識別能を、アンテイソ型1級アルコールを用いて評価した。誘導体化はルイス酸を用いたグリコシル化反応により、糖の1位にβ選択的に導入することが可能であった。得られたジアステレオマー誘導体は、^1H-NMRにより、11位までの分岐不斉を、またHPLC法では、少なくとも16位までの分岐不斉を識別することが可能であった。特に、これらの試薬は長鎖の分岐脂肪酸に対する不斉識別が、我々が開発したアルコール誘導体化試薬磁trans-2-(2,3-アントラセンジカルボキシイミド)シクロヘキサンカルボン酸(1)に比較し格段に向上しており、更に多分岐アルコールに対しても高い不斉識別能を発揮した。一方、試薬1の酸クロリドを用いキラルアミン類を誘導体化し、その誘導体化に対するHPLCによる不斉識別能を評価した結果、R-CHNH_2-R'型アミン(R,R'=アルキル)、R"-(CHNH_2)-(CH_2)n-CHCH_3-CH_2CH_3型アミン(R"=H orアルキル)のいずれに対しても、アルコールと同様、非常に高い不斉識別能を示し、本試薬が、光学活性アミンに対しても適用可能であることを実証した。更に、その絶対配置に疑問の残る天然アルカロイドNipahtesin Dを文献既知の方法で合成し、本法による不斉分離を検討した結果、Nipahtesin Dの両鏡像体の誘導体をHPLCで分離し蛍光検出により約10pg程度の高感度で検出可能であることを明らかとした。更に、LC-MSへの適用を目指し、trans-2-(2-キノリンカルボキシアミド)シクロヘキサノールを設計合成し、従来試薬と同様に遠隔位不斉識別能を有することを確認し、LC-ESI-SRM法による選択的検出が可能であることを明らかとした。前年度に開発したD-グルコサミン骨格を有し、2位にアントラセンイミド基を有し、1,3,4,6位をアセチル基で保護した蛍光不斉誘導体化試薬を用い、α-トコフェロールをグリコシル誘導体化し不斉識別能の評価を行った結果、全8種の光学異性体の分離を達成することができた。さらに光学活性体標準品を化学合成し、各異性体の溶出位置を決定した。天然物化合物への応用展開として、C29長鎖アルキル中に712個のメチレン鎖で隔てられた位置にアセトキシ基と分岐メチル基を有するラセンウジバエの性フェロモンの粗抽出液からの検出を行うため2-(2,3-anthracenedicarboximido)cyclohexyl carboxylic acidによる誘導体化と、精密分析のためのLC-LCシステムの構築を行った。その結果、LC-LCシステムにより來雑成分の影響を効率的に除去することができた。また、試薬の両エナンチオマー体をそれぞれ用い分析を行うクロスチェック法により、高精度で多量の不純物を含む粗抽出試料からの超微量な成分が含まれるか否かを決定する方法を確立し、それぞれ4種の立体異性体が存在する2種の構造異性体成分(計8種の異性体)の中から、3種の異性体が検出された。このLC-LC法とクロスチェック法の有効性をさらに実証するため、2-(2,3-anthracenedicarboximido) cyclohexanolを用い、アズキゾウムシの性フェロモンである2,6-dimethylcctadienoic acidの異性体分析に応用し、粗抽出液から4種の光学異性体を検出した。
高水準デ-タベ-ス応用のためのオブジェクト指向デ-タベ-スモデルの研究

デ-タベ-スの利用範図の拡大にともない、画像や音声、ソフトウェア、知識などといった高度なデ-タとそれらの間の関連を統一的に扱うことができ、生産の手段としても利用できるような高水準デ-タベ-スが必要になってきている。本研究ではこのような高度応用にのためのデ-タモデルの研究を行ってきた。平成元年度は、基本的な考察を行い、高度なセキュリティシステムの実現方式の開発、オブジェクトのクラス間遷移問題の明確化、意味制約をオブジェクト指向デ-タモデルで表現する際の実現法、マルチメディアデ-タベ-スのにおける表示形式の高速計算手法等で成果を得た。平成2年度は、主としてオブジェクト指向デ-タモデルの各種分野における適合性、表現能力の限界の検討、モデルの拡張について考察を行った。具体的には、利用者の利用形態とセキュリティという異なる階層を同時に実現する手法の開発、オブジェクト指向デ-タモデルによる意味表現、通常のテキストからハイパ-カ-ドの自動生成等である。平成3年度は、オブジェクト指向デ-タベ-スにおける多重ビュ-を一般化して、セキュリティ階層を実現する方式、オブジェクトのクラス間遷移とオブジェクトのスキ-マ遷移を扱えるモデルの検討、オブジェクト指向デ-タベ-スシステムの設計法、オブジェクト指向デ-タベ-スを各分担者の研究分野に適応した場合の、利点と欠点を考え、モデルの改良に関する提案などを行った。デ-タベ-スシステムの普及により、より高水準の利用形態に適したシステムが求められるようになってきている。平成元年度は、将来の社会において必要になると予想される多種多様な分野・用途に利用できる高水準のデ-タベ-スシステムについて、基本的な考察を行っている。平成元年度に得られた成果のうちの主なものは以下のとおりである。1.オブジェクト指向デ-タベ-スにおけるデ-タの更新とオブジェクトのクラス間遷移との関連について検討し、それによって生じる問題点を明らかにした。2.理論的に確立された設計手法を持つ関係デ-タモデルやネットワ-クデ-タモデルにおける意味制約をオブジェクト指向デ-タモデルで表現する場合の問題点を明らかにした。3.オブジェクト指向デ-タモデルの特徴の一つであるクラス階層をセキュリティレベルに対応させ、同モデルのもう一つの特徴である情報隠蔽機能をデ-タベ-スの利用権制御に応用した高度なセキュリティシステムの実現方法を開発した。4.形態の異なる多種の情報が混在するようなデ-タベ-ス利用形態に適したデ-タモデルおよびシステム実現技法を確立すための第一段階として、高水準利用者インタフェ-スを備えたマルチメディアデ-タベ-スシステムのプロトタイプを開発した。平成元年度は、高水準の利用形態に適合したデ-タベ-スシステムを実現するために必要と考えられる種々の技法の基礎的研究に着手した。これらの技法を統合してシステムを実用化するためには、個々の技法をさらに拡張する必要がある。そこで、平成2年度は、昨年度までの研究で明らかになった問題点を踏まえて、各技法の改良および拡張を継続して行った。これらの成果をまとめると以下のようになる。1.オブジェクト指向デ-タモデルの特色の1つであるクラス階層をデ-タのセキュリティレベルに対応させ、同モデルのもう1つの特色である情報隠蔽機能をデ-タベ-スの利用権制御に応用する方式の検討を行った。2.CAD(計算機援用設計)システムのためのオブジェクト指向デ-タベ-スを複数の利用者が共同利用することを考え、各利用者の要求にあったビュ-を提供する方式を求めた。3.オブジェクト指向デ-タベ-ス実現のための1手法として、プログラムの実行が終了した後も消去されずに保存されるような永続性デ-タの扱いを可能にするデ-タベ-スプログラミング言語について研究した。4.形態の異なる多様な情報が混在するようなデ-タベ-ス利用形態に適したデ-タモデルについて、昨年度までの基礎的研究の有効性を実証するための実験的システムの開発および改良を行った。平成3年度の主な成果は次のとおりである。(1)セキュリティ管理については、オブジェクト指向デ-タベ-スモデルでは限界があるため、複数の階層を実現できるように一般化し、それを利用した設計法を確立した。具体的には、関係デ-タベ-スの上に複数のセキュリティ階層を実現できるマルチプロジェクトモデルを提案した。

(2)オブジェクトのクラス間遷移、オブジェクトのスキ-マ遷移の両方を扱えるモデルを考えて、オブジェクト指向における履歴の問題を総合的に扱う方式を開発した。(3)オブジェクト内の関係をリンクないしは仮想リンクで実現することによる、オブジェクト指向デ-タベ-スシステムの設計法を開発し、複合オブジェクトを考えた設計法について論文をまとめた。(4)複合オブジェクトと知識との統合問題について検討し、新しいデ-タモデル提案の道をひらいた。この結果を国際会議で発表した。(5)オブジェクト指向デ-タベ-スを各分担者の研究分野に適用した場合の利点と欠点を考え、モデルの問題点について検討した。本年度は以上に示したように、オブジェクト指向デ-タベ-スの利用を考えた上で、モデルの設計方式の開発、高度の一貫性制約の実現、プロトタイプからの問題抽出などを行ない、今までの研究成果の統合を行った。
中面超平面配置とその応用

本研究では、本研究代表者が「中面超平面配置(mid-hyperplane arrangement)」と暫定的に命名している例を研究した。研究実績は、大きく分けて、以下の4つの部分から成る。1.「中面超平面配置」それ自体の数学的研究においては,「中面超平面配置」の、組合せ的、位相幾何学的、代数的等の数学的諸性質を調べ、様々な具体的不変量を明示的に計算することによって、数学的対象としての「中面超平面配置」を研究した。具体的には,組み紐超平面配置との関連を明らかにした.2.「中面超平面配置」の数学的諸性質、数学的不変量が、心理学、物理学、統計学、経済学等の諸科学の文脈でもつ意味を明らかにした.特に,「中面超平面配置」の部屋の体積と,人々の選好のランキングの確率分布との関係を論じた.3.「中面超平面配置」と深く関連する組み紐超平面配置の一般化であるルート系超平面配置の擬特性多項式を研究した(紙屋・竹村・寺尾).擬特性多項式は,有限環上の超平面配置の補集合の点の数を表すのであるから,一般の超平面配置であっても,正整数上で定義されている場合には,擬特性多項式が定まるので,その組合せ的意味付けは重要な問題である,と考えられる.4.一般の超平面配置について,擬特性多項式などの具体的不変量が,応用的意味付けを持つことが確認されたことは,今後の,超平面配置の理論の応用の可能性に大きな期待を抱かせるものであり,今後の新しい研究計画の出発点を確立した.18年度はこのような超平面配置の理論と社会科学との意外な関連をさらに追及した.その結果,ミクロ経済学の社会選択論(social choice theory)におけるK.Arrow(ノーベル経済学賞)の「不可能性定理」が組紐平面配置(braid arrangements)としての数学的formulationをもつことが明らかになった.しかも,その結果ははるかに一般に,すべての分解不能な超平面配置に対しての定理に拡張できることを証明することができた.(to appear in Advances in Math.).この数学的結果が社会選択論にどのような影響を与えうるかは,来年度以降の課題である.また,中面超平面配置の特性多項式を求める方法として用いられた有限体法は,素数を法として超平面配置を考えて,その補集合の点数を数えるという方法であるが,より一般に,任意の正整数を法とする超平面配置を考えることによって,より効率的に特性多項式が決定できる可能性がある.すなわち,補間法を用いるときに,実際に決定しなければいけない点数を大幅に減ずることが期待される.昨年度は,この方向の研究を進めて,擬特性多項式の概念に到達した.つまり,素数とは限らない正整数を法とする場合は,単一の多項式ではなく,有限個の多項式が周期をもって巡回的に出現する。この理論は,まだ発展途上であり,次年度以降に論文としてまとめる予定である.中面超平面配置は、整数上で定義されている超平面配置であり、整数上の超平面配置は以下の意味で特別な超平面配置である。すなわち、素数を法として考えることにより有限体上の超平面配置が得られる。この素数が十分大きい場合には、有限体上の超平面配置ともとの超平面配置は組合せ的に同値であることがよく知られている。このことは、中面超平面配置の特性多項式を求める方法として用いられる有限体法に,使われている。より一般に、任意の正整数を法とする超平面配置を考えることによって、より効率的に特性多項式が決定できる可能性がある。すなわち、素数とは限らない正の整数を法として、(整域とは限らない)有限環上の超平面配置を考えることにより、擬特性多項式が得られる。今年度は、この擬特性多項式を、ルート系から決まる超平面配置に場合に決定し、興味深い結果を得た。これは、Athanasiadis, Blass-Saganなどの先行研究を統一的にみる新しい視点を与えた。また、もともとの主たる研究対象である中面超平面配置の擬特性多項式については、次元が6以下の場合に、完全に決定することに成功した。この結果は、昨年のイスタンブールでの研究会の招待講演で発表されたので、近日中に、その会議録(査読付)に掲載予定である。本研究計画に至った経緯を思い起こしてみると、中面超平面配置(mid-hyperplane arrangements)が統計学および計量心理学におけるfolding modelの数学的解釈を与えていることが背景であったことを考慮するとき、中面超平面配置の擬特性多項式の統計学的、計量心理学的な意味付けは大変に興味深いが、次年度以降の大きな課題である。具体的には,組み紐超平面配置との関連を明らかにした.2.「中面超平面配置」の数学的諸性質、数学的不変量が、心理学、物理学、統計学、経済学等の諸科学の文脈でもつ意味を明らかにした.特に,「中面超平面配置」の部屋の体積と,人々の選好のランキングの確率分布との関係を論じた.

3.「中面超平面配置」と深く関連する組み紐超平面配置の一般化であるルート系超平面配置の擬特性多項式を研究した(紙屋・竹村・寺尾).擬特性多項式は,有限環上の超平面配置の補集合の点の数を表すのであるから,一般の超平面配置であっても,正整数上で定義されている場合には,擬特性多項式が定まるので,その組合せ的意味付けは重要な問題である,と考えられる.4.一般の超平面配置について,擬特性多項式などの具体的不変量が,応用的意味付けを持つことが確認されたことは,今後の,超平面配置の理論の応用の可能性に大きな期待を抱かせるものであり,今後の新しい研究計画の出発点を確立した.
十八世紀ドイツの市民劇史にみる市民意識の形成と問題性

1.Christian Weiseの戯曲は文学史的通説ではバロック演劇に数えられているが、学校劇としてもともと教育的機能をそなえており、むしろ観客の教化を意図した啓蒙主義市民劇につながる。しかし、Weise劇の教育内容は、当時の政治・社会体制の現実に「正しく」順応するよう促すもので、十八世紀半ば以降の市民劇に市民意識の立場から啓蒙絶対主義体制を批判するインパクトがみられるのとは異なる。2.Gottschedの悲劇“Sterbender Cato"は、主人公の共和主義的モラルにおいて後の市民劇にみられる理念を先取りしているとともに、そのモラルに固執して自殺に追い込まれるCatoの悲劇的最後を主題化、現実離れした道徳的厳格主義への批判を通じて政治的現実への賢明な対応を促している。3.イギリスで生まれた新しいジャンルとしての市民悲劇は、その発祥地では市民階級の実力と自負に裏打ちされて、市民社会における資本主義的合理性の論理と禁欲の倫理を鼓吹するが、ドイツに移入されると市民意識の形成そのものを意識化し、その自己批判と変革の可能性をひらくとともに、市民的理想の実現を阻む啓蒙絶対主義体制の構造的矛盾を暴露し、その変革の必要性を示唆する。4.GoetheやSchillerに代表されるSturm und Drang期から初期古典主義への市民劇の展開は、「人間性」の理念に集約される市民意識の理想を当時の歴史的現実において実現する可能性の問題というLessingの主題を引き継いでおり、特にGoetheの小説“Wilhelm Meisters Lehrjahre"では、主人公の意識がその自己形成の過程で、十八世紀における市民意識の形成史を個人において反復している。なお、将来の課題としては、これらの研究で確立された方法と観点を十九世紀から二十世紀初頭までのドイツ文学、特に市民的ジャンルである小説に適用して、「近代ドイツの市民意識史」へと発展させることが望まれる。1.ドイツ市民劇の前史についてはChristian Weiseの喜劇"Ba^^̈uerischer Machiavelli"(1679)と"Masaniello"(1683)を分析した。従来の文学史的常識ではバロック演劇に数えられるこれらの作品は、もともと学校劇として教育的機能を有していたが、それが十八世紀の啓蒙主義市民劇における観客の教化という機能に接続していることが明らかになった。この点でWeise劇が十八世紀半ばのLessingの初期喜劇をへて十八世紀後半の市民劇にまでつながっていることは特筆に値する。とはいえWeise劇が意図した教育内容を検討してみると、それは主として当時の政治・社会体制の現実に順応するために「正しい」政治的・道徳的行為を、それに反する主人公を戯画化することによって示しており、宮廷ないし貴族社会に対する反逆といういわば革命を題材にした"Masaniello"においても、むしろ革命の愚かさを例示する意図がよみとれる。その意味では、十八世紀半ば以降の市民劇に、市民意識の立場から啓蒙絶対主義体制の現実を批判するインパクトが認められるのと異なる。2.ここにみられる市民劇の機能転換の過程にあって、Gottschedの"Sterbenuer Cato"(1731)が丁度その転換点に位置しているというきわめて興味深い事実が認識された。現実の政治的力を体現するシーザーに抵抗するカトーの共和主義的モラルには後の市民劇を支える理念が先取りされていると同時に、その理念に固執して自殺に追い込まれる主人公の悲劇的最後を主題化することで、この作品は現実離れした厳格主義への批判を通じて政治的現実への賢明な対応(順応ではなくとも)を促してもいる。

Gottsched派ザクセン喜劇の傑作とされるLessingの処女作"Der junge Gelehrte"については論文を書いて、市民意識の構成要素を析出し、市民意識への批判的契機を賢明。その際、市民劇史における十八世紀前期から中期へのつながりが明らかになり、来年度の研究への準備作業ともなった。本年度は市民悲劇の成立とその社会的機能との関連を中心に研究。Gottschedが依拠するフランスの古典主義演劇論によれば、悲劇は公的領域に属する政治に関わる主題をもつ。その機能が人間存在の有限性の認識と人間の力を超越した運命の承認をせまる点にあるのに対して、古典詩学との対決から生まれたGeorge Lilloの市民悲劇“The London Merchant"(1731)は当時のイギリスにおける市民階級の実力と自負に裏打ちされて、市民社会における資本主義的合理性の理論と禁欲の倫理を鼓吹する。ところがイギリスに比べて市民階級とその意識の形成が遅れていたドイツにあって、Lessingはその市民悲劇“Miss Sara Sampson"(1755)で私的領域としての家庭における市民意識の形成そのものを意識化し、その自己批判と変革の可能性を開く。市民意識を構成する道徳理念とそれに基づく家庭の理想を宮廷の現実と対置する“Emilia Galotti"(1772)では、私的領域と公的領域との対立・相克を描くことにより、Lessingは市民的道徳理想の実現を阻む啓蒙絶対主義の構造的矛盾を暴露し、その変革の必要性を示唆する。このように市民悲劇がその発祥の地イギリスではなく、ほかならぬドイツにおいて開花した理由を、当時のドイツ特有の政治的・経済的・社会的構造に基づく必要性に求めるべきことが解明された。また、Lessingが独訳したDiderotの“Le Fils naturel"(1757)や“Le Pe^^`re de famille"(1757/58)にみられるように、フランスにおける市民劇は悲劇ではなく、むしろ喜劇型式をとるが、その理由は、そこに盛られた市民的諸理念が最終的には幸福をもたらすはずだというフランス市民階級の自己主張が喜劇形式を要求していると解釈すれば、説明できる。なお、Lessingの作品を代表する市民劇“Nathan der Weise"(1779)とも関わり当時の市民意識の重要な要素である宗教論・真理論については、別途に論文を発表した。本年度は研究の重点を十八世紀後期に移し、特にSchillerとGoetheについて、一方では十八世紀中期を代表するLessingの市民劇におけるテ-マとのつながりを、他方では両詩人のSturm und Drang期から初期古典主義への発展における一貫性を追跡した。Lessingの戯曲にあっては、その全作品にわたって「人間性」の理念に収斂する市民的理想を中核とする市民意識が育まれるとともに、また、その理想を当時の歴史的現実において実現する可能性が問われていたが、この市民意識の根幹にかかわる問題はSchillerの初期作品の主題を構成していることが解明された。
新規疾患「IgG4関連疾患」の病因・病態に迫る免疫遺伝学的アプローチ

1)典型的な病理組織像を呈するIgG4関連疾患(IgG4-RD)(N=5)とシェーグレン症候(SS)(N=5)、健常人(HC)(N=3)の口唇唾液腺を用いて、DNAマイクロアレイにより、遺伝子発現の違いを検討した。背景因子を統一するため、検体は全例女性とした。階層的クラスタリングおよび主成分分析の結果、IgG4-RD、SS、HCの口唇唾液腺における遺伝子発現のパターンは、互いに異なることが明らかとなった。臨床免疫学IgG4関連疾患、シェーグレン症候群、健常人より、必要数の口唇唾液腺を収集し、DNAマイクロアレイを行うことができた。さらに、Gene Ontology(GO)アノテーションによる機能分類解析、定量PCRによるValidationまで順調に進めることができた。今後は、定量PCRによるvalidationで、シェーグレン症候群と比較して、IgG4関連疾患の口唇唾液腺での有意な発現上昇が確認されたCCL18、Lactotransferrin(LTF)に関して、免疫染色によるタンパクレベルでの発現解析、発現細胞の同定、in vitroおよびin vivoでの機能解析を進める。
き裂系における地殻流体の流動ダイナミクスに関する研究

本年度は,まずフィールドスケールの単一き裂の間隙構造および流体流動の特性が封圧・せん断変位・寸法の各パラメーターにともないどのように変化するかを評価し,平均開口幅とき裂浸透率に関して定式化することに成功した.この成果を踏まえ,き裂型貯留層(勇払油ガス田)の精密なモデルを構築し,貯留層内の三次元チャネリングフロー(優先流路の形成)のモデル化を行った.貯留層モデルの構築において,臨界応力き裂(せん断変位の生じたき裂)に関して,せん断変位量とその寸法の間の比例関係を考慮したことが大きな特徴である.一連の解析結果から「隣接する二坑井間の生産能力が三桁(1,000倍程度)異なる」という観測事実は,「臨界応力き裂のせん断変位量はき裂寸法の約2%である」と仮定した際に再現できることが示唆された.さらに,「天然環境にあるき裂が長期間において繰り返してせん断滑りを経験し,総せん断滑り量が最終的にき裂寸法の2%程度になる」というモデル化は,現実とさほど乖離していないことも考察された.本研究では対象地域を勇払地域に限定しているが,今回用いた解析手法を適用することで他地域のき裂ネットワーク内のチャネリングフローの振る舞いを予測することは十分に可能である.すなわち,本研究は,「(フィールドスケールにおいて)き裂系での三次元チャネリングフローのモデルリング手法および特性評価手法の確立に,世界ではじめて成功した研究」と位置付けることができる.本研究成果は今後,工学技術(EGS,き裂型油ガス貯留層開発等)や環境技術(CCS,放射性廃棄物の地層処分等)に大きく貢献すると期待される。(抄録なし)本年度はまず,応力下におけるき裂の間隙構造および流体流動特性のマルチスケールモデリング法の確立に成功した,本手法は,上下二面のフラクタル数値き裂表面同士を接触面積がラボスケールで得られた値と一致するよう接触させるというもので,かみ合ったき裂をモデリングする場合は上下表面形状の微妙な違いを導入した.続いて,勇払油ガス貯留層を対象として,臨界応力き裂に対して不均質間隙構造を与えた精密DFNを構築した.このとき,間隙構造は寸法に応じたものとし,またそれらは本研究で確立した手法により決定した.精密DFN内の流体流動の解析にはGeoFlowを用いた.その結果,精密DFNであれば「二つの坑井間で生産能力に三桁近い差が生じる」という勇払での観察事実が再現可能であることが明らかになった,これはすなわち,勇払の貯留層内では三次元的な優先流路が形成されており(チャネリングフロー),坑井がこの流路をうまく貫通してはじめて高い生産能力が望めることを示唆する.フィールドスケールにおいてき裂ネットワーク内のチャネリングフローを考慮した研究は,世界的に見ても本研究以外にはない.そして,最後にGeoFlowに「DFN内の流体流動特性の経時変化」のコンセプト導入に向け,単一き裂内の流体流動特性の経時変化に関しての基礎的な知見を獲得した.例えば,炭酸塩岩においては力学的影響(接触点での圧力溶解)と化学的影響(自由表面溶解)の競合を考慮することが重要であることが明らかになった.き裂流動特性の経時変化に関する知見は不足しているのが現状であり,本研究のような基礎的検討というのは非常に重要である.本年度は,まずフィールドスケールの単一き裂の間隙構造および流体流動の特性が封圧・せん断変位・寸法の各パラメーターにともないどのように変化するかを評価し,平均開口幅とき裂浸透率に関して定式化することに成功した.この成果を踏まえ,き裂型貯留層(勇払油ガス田)の精密なモデルを構築し,貯留層内の三次元チャネリングフロー(優先流路の形成)のモデル化を行った.貯留層モデルの構築において,臨界応力き裂(せん断変位の生じたき裂)に関して,せん断変位量とその寸法の間の比例関係を考慮したことが大きな特徴である.一連の解析結果から「隣接する二坑井間の生産能力が三桁(1,000倍程度)異なる」という観測事実は,「臨界応力き裂のせん断変位量はき裂寸法の約2%である」と仮定した際に再現できることが示唆された.さらに,「天然環境にあるき裂が長期間において繰り返してせん断滑りを経験し,総せん断滑り量が最終的にき裂寸法の2%程度になる」というモデル化は,現実とさほど乖離していないことも考察された.本研究では対象地域を勇払地域に限定しているが,今回用いた解析手法を適用することで他地域のき裂ネットワーク内のチャネリングフローの振る舞いを予測することは十分に可能である.すなわち,本研究は,「(フィールドスケールにおいて)き裂系での三次元チャネリングフローのモデルリング手法および特性評価手法の確立に,世界ではじめて成功した研究」と位置付けることができる.本研究成果は今後,工学技術(EGS,き裂型油ガス貯留層開発等)や環境技術(CCS,放射性廃棄物の地層処分等)に大きく貢献すると期待される。研究計画に示した通り,応力下におけるき裂の間隙構造および流体流動特性のマルチスケールモデリング法の確立が完了した.また,勇払油ガス田の精密DFNに関しても,その構築及び流体流動を解析することに成功している.さらに,き裂流動特性の経時変化に関する基礎的知見は,(想定していたものとは異なるが)獲得されている.次年度は,まず応力下におけるき裂の間隙構造および流体流動特性のマルチスケールモデリング法に関して論文と1して発表する予定である.

また,精密DFNの解析に関しては,シミュレーションの数を増やし統計的処理を進めることが必要であるが,その方法論等はほとんどが検討済みであり,詳細を詰めた後はスムーズに研究が進められると考える.また,物質移動に加え,熱移動を解析することができるようにシミュレータを改良することを考えている.ここで,き裂流動特性の経時変化に関しては,計画ではX線CTスキャナを用いて間隙構造の経時変化の直接観察を目指したが,X線CTの分解能が十分ではなく,これを実現できるか不明である.対応策としては,X線CTで間隙を測定する代わりに,レーザー変位系を用いて測定した表面形状データを用いてはどうかと考えている.この点以外に関して,想定していた以上の知見の獲得に成功した.(抄録なし)
光学的非線形現象を用いた高分子の新規な時空間周期構造制御と光デバイスへの応用

本研究では,近年研究展開めざましい光学的非線形現象に基づく時空間制御を積極的に高分子の構造制御に応用した新規な構造性制御およびそれを用いた新規な周期的屈折率分布(屈折率変調)光デバイスの創製と構築を目指した。本研究の遂行によって,従来の手法では全く達成し得ない新規な光デバイスの創製が可能となり,以下の2つの研究成果が得られた。1.基本波と2倍波との干渉光の3次の非線形光学効果に基づく高分子の極性構造制御と,それによる位相整合した周期的χ^<(2)>構造制御により屈折率分布を制御させた光デバイスの創製や自己位相整合型光導波路の創製。2.ポリマーブレンドに光化学反応を導入して,変調紫外光(1Hz-200Hz)および紫外レーザー光の干渉縞(ミクロン域)を用いた時空間制御,さらに生成した秩序構造に基づく屈折率分布制御。本研究は,近年研究展開めざましい光学的非線形現象に基づく時空間制御を,積極的に高分子の構造制御に応用した新規な構造性制御とそれを用いた新規な周期的屈折率分布(屈折率変調)光デバイスの創製と構築である。本研究の遂行によって,従来の手法では全く達成し得ない新規な光デバイスの創製が可能となる。すなわち,干渉光の進行波自身が位相整合しながら構造形成を行っていくので,自己位相整合型光導波路の創製や,3次元的な屈折率制御型光デバイスの創製などの設計が可能である。本年度は,光学的非線形現象の理論・モデリング・基礎実験を高分子材料へ応用して,高分子での時空間周期構造制御を目指した。基本波と2倍波との3次の干渉光による高分子の極性構造制御と,それによる位相整合した周期的χ^<(2)>構造制御により屈折率分布を制御させた光デバイスの創製およびそのポリマー材料の光分極ダイナミクス評価およびの解析を行った。その結果,位相整合した周期的χ^<(2)>構造からの第2次高調波発生ならびにχ^<(2)>構造のテンソル成分解析を行った。
リン酸化ヒスチジン特異的抗体の開発と解析法の確立

ヒスチジン残基のリン酸化反応は、その化学的な不安定さより抗体が作製できず簡便な同定法が存在しない。本研究では化学的に安定なリン酸化ヒスチジンアナログを用いることにより抗リン酸化ヒスチジン抗体の作製を試みた。マウスをリン酸化ヒスチジンアナログ含有ペプチドで免疫し、リン酸化ヒスチジンとの反応が強いクローンを得たが、リン酸化ヒスチジンのみならず弱いながらもリン酸化セリン、トレオニン、チロシンとの反応がみられた。一方、ウサギで作製した抗体をリン酸化ヒスチジンカラムで精製することにより他のリン酸化アミノ酸との反応が低い特異的な抗体を得ることができた。ヒスチジン残基のリン酸化状態にはヒスチジンのN1位、N3位にリン酸が結合する2種類の状態が存在する。それぞれのリン酸化ヒスチジンに対するアナログをペプチドに導入し、免疫を行った。N1位、N3位ヒスチジンアナログペプチド、ATPにより自己ヒスチジンリン酸化を行うヌクレオシド2リン酸キナーゼ(NDPK)と反応するクローンのスクリーニングを行った。得られたクローンは自己リン酸化NDPKのみならずATPを加えてないNDPKにも結合するものが多数みられた。更に自己リン酸化部位である118HisをPheに置換したNDPK(H118F)に対しても結合するため、これらクローンのリン酸化ヒスチジンに対する特異性が低いこと考えられた。クローンの中よりNDPK(H118F)に比べ自己リン酸化NDPKに対する反応が強いクローンについてヒスチジンリン酸化部位をそれぞれリン酸化Ser、Thr、Tyr残基に置換したペプチドを用いて特異性を検討した所、リン酸化Ser、Thrとも弱く反応することが明らかになった。これに対し、同様にアナログペプチドを免疫して作製した家兎ポリクローナ抗体ではリン酸化ヒスチジン残基に対する特異性が高く、NDPKを用いたアフィニティカラムで精製することにより他のリン酸化アミノ酸とは殆ど反応しないポリクローナル抗体を得ることができた。また、抗リン酸化ヒスチジン抗体を用いたヒスチジンリン酸化活性の測定法の開発を行った。既知のヒスチジン残基がリン酸化されるタンパク質のリン酸化部位周辺配列を基質とし、家兎抗リン酸化ヒスチジン抗体を用い、ヒスチジン残基のリン酸化の検出を行った。コントロールに比べ明らかな差を示したことより本方法によりヒスチジンリン酸化活性の測定が可能であると考えられた。リン酸化による情報伝達機構は生命を理解する上で最も重要で普遍的な反応のひとつである。しかし、セリン、トレオニンやチロシンのリン酸化反応に比べ、哺乳類でのヒスチジン残基リン酸化反応の解析はまだ研究が少ない。これはリン酸化ヒスチジン残基が化学的に不安定なことと抗リン酸化チロシン抗体の様なリン酸化ヒスチジンを解析する良いツールがないことが原因である。そこで本研究ではこのリン酸化ヒスチジンに対する抗体の開発を目的とする。申請者らはリン酸化ヒスチジンのアナログとして化学的に不安定なN-P結合をC-P結合に置換した非水解性のリン酸化ヒスチジンアナログを含むペプチドをウサギに抗原として用いることにより抗リン酸化ヒスチジンアナログに対する抗体を得られることを明らかにしている。ヌクレオシド2リン酸キナーゼ(NDPK)はATPにより自己ヒスチジン残基をリン酸化することが知られている。前述の抗体はこのNDPKとATP依存的に結合すること、自己リン酸化部位のヒスチジンをフェニルアラニンに置換した変異体とはATP存在下に於いても結合しないことより、リン酸化ヒスチジンを特異的に認識すると考えられた。そこで、リン酸化ヒスチジンアナログ含有ペプチドを抗原としてマウスモノクローナル抗体作成を定法により行った。スクリーニングにはリン酸化ヒスチジンアナログを含むペプチドと自己リン酸化NDPKを用いた。得られた抗体の特異性を調べた所、リン酸化ヒスチジンアナログ含有ペプチドを強く認識し、リン酸化ヒスチジンアナログを他のリン酸化セリン、トレオニン、チロシン残基に置換したペプチドとの反応を調べると僅かにリン酸化セリン残基に対する反応がみられた。これに対し家兎抗リン酸化ヒスチジンンポリクローナル抗体は抗原にしたリン酸化ヒスチジンアナログ含有ペプチドのみに反応し、他のリン酸化アミノ酸とは反応しなかった。リン酸化ヒスチジンに対するモノクローナル抗体を得ているが、現時点ではリン酸化アミノ酸に対する特異性が、家兎ポリクローナル抗体に比べ低く、モノクローナル抗体を用いるメリットが少ない。得られた抗体とリン酸化ヒスチジンアナログ導入部位に他のリン酸化アミノ酸(セリン、トレオニン、チロシン)を導入したペプチドに対する反応性を検討した所、リン酸化セリンに対して弱い結合が見られたがリン酸化ヒスチジンアナログに対する結合に比べ低いためリン酸化ヒスチジアナログに対して特異的な抗体が得られているとは考えられた。

しかし、A自己ヒスチジン残基リン酸化を行うNDPKに対してATP存在下でその結合が増強されるもののATP非存在下でも弱く結合し、さらに自己リン酸化される118番目のヒスチジン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体(H118F)に対しても弱く結合するなど家兎ポリクローナル抗体に比べ特異性の問題がある。以上の事より、現在得られているクローンより特異性が高い抗体を得るべくスクリーニングを続行中である。現時点で得られた抗体の問題点は、その特異性である。リン酸化ヒスチジン残基に対する特異性を上げる為にスクリーニングに用いるリン酸化アナログペプチドの周辺配列を抗原に用いた配列と異なる配列にし、スクリーニングを行うことにより周辺配列による影響を下げる。また、この新しいペプチドを抗原として免疫に用い、新たなハイブリドーマの作製を行う。また、免疫期間の延長に伴い自己リン酸化NDPK特異的な反応の減少が何匹かのマウスで見られたので、NDPK-H118Fと自己リン酸化NDPKとの差が明確に出た時点で脾臓の回収を行い、バイブリドーマを作製する。哺乳類細胞でヒスチジン残基のリン酸化の報告がなされているタンパク質由来の配列にリン酸化ヒスチジンアナログを導入したペプチドの合成を行う。Ca-Kチャネル3.1もしくはヒストンH4で明らかにされているヒスチジンリン酸化部位周辺配列を用いる。これらは現在使用している三量体Gタンパク質β鎖由来の配列とは大きく異なるため、これらタンパク質の配列を用いることにより周辺配列の影響の少ないリン酸化ヒスチジン特異的な抗体を得られることが期待できる。このペプチド合成費として本年度残金を使用する。
フラーレンを組み込んだカテナン、ロタキサンの合成・機能と分子マシーンへの応用

本研究においては、ドナー-アクセプター相互作用を利用した新規含フラーレンカテナン、ロタキサンの創製と物性の解明を目的としている。前年度、アクセプター性のナフタレンテトラカルボン酸ジイミド部位を有し、種々の架橋鎖長を有するフラーレン付加体1a-cとドナー性のジナフトクラウンエーテル2を組み合わせることにより、ロタキサン3及びカテナン4の合成に成功した。すなわち、1a-cとC_<60>との分子間Bingel反応を、2の存在下、低温で行うと、ロタキサン3a-cが生成した。一方、1a-cの分子内Bingel反応を、2の存在下、低温で行うと、架橋鎖長の最も短い1aの場合カテナン4aは生成しなかったが、架橋鎖長のより長い1b,cの場合はカテナン4b,cが生成した。本年度は、これらの研究成果を発展させ、以下を明らかにした。・ロタキサン3のUV-Visスペクトルにおいては、400-500nm付近にCT相互作用に由来すると考えられる吸収帯が観測された。また蛍光スペクトルにおいては、ジナフトクラウンエーテル部位に由来する蛍光が著しく消光していることが分かった。・ナフタレンジイミドよりもアクセプター性の弱いピロメリットジイミド部位を有する付加体1dを用いた場合、Li^+イオンを添加することにより、室温においてもロタキサン3dが生成した。この結果は、ロタキサン3a-cが室温では生成しなかったのとは対照的である。・収率の向上を目指し、よりアクセプター性の強いペリレンテトラカルボン酸ジイミド部位を有するフラーレン付加体2eを用いたロタキサンの合成を検討しているが、現在のところ、その生成は確認されていない。また、副反応物の生成を抑える目的で、最終反応としてカルボキシル基などの官能基を有するフラーレン付加体を用いた合成経路についても併せて検討している。フラーレンを構成要素とする超分子の構築は、フラーレンの機能物質への応用の観点から興味深いが、これまでに、インターロック化合物、特にカテナンにフラーレンを組み込んだ例はほとんどない。本研究においては、アクセプター性のナフタレンテトラカルボン酸ジイミド部位を有し、種々の架橋鎖長を有するフラーレン付加体1a-cを用い、1、ドナー性のジナフトクラウンエーテル2、及びもう1分子のC_<60>らなるロタキサン3や、1に2を組み込んだカテナン4の合成に成功した。1a-cとC_<60>との分子間Bingel反応を5の存在下、室温で行ったところ、2を含まないダンベル型二量体6が得られたが、ロタキサン3の生成には至らなかった。しかし、同様の反応を低温で行うと、ロタキサン3a-cが生成し、その単離にも成功した。その構造は、MALDI-TOF MS及び^1H NMRにより決定した。^1H NMRスペクトルの芳香族領域においては、ジナフトクラウンエーテル2やダンベル型二量体に比べて高磁場シフトしたピークのみが観測されており、ロタキサン3の生成が明確に示された。また、1a-cの分子内Bingel反応を2の存在下、室温で行い、1a-cを二付加体とすることにより、カテナン4の合成を試みたが、その生成は確認されなかった。一方、ロタキサンの場合と同様、反応を低温で行ったところ、架橋鎖長の最も短い1aの場合カテナン4aは生成しなかったが、架橋鎖長のより長い1b,cの場合はカテナン4b,cの生成が確認された。

反応混合物をGPCにより分離すると、カテナン4b,cの位置異性体混合物が得られ、4bの場合、さらにHPLCにより3種類の位置異性体が単離された。これらは、MALDI-ToF MS、^1H NMR、UV-Visスペクトルにより同定され、それぞれ、trans-2,trans-3,e体であることが明らかとなった。本研究においては、ドナー-アクセプター相互作用を利用した新規含フラーレンカテナン、ロタキサンの創製と物性の解明を目的としている。前年度、アクセプター性のナフタレンテトラカルボン酸ジイミド部位を有し、種々の架橋鎖長を有するフラーレン付加体1a-cとドナー性のジナフトクラウンエーテル2を組み合わせることにより、ロタキサン3及びカテナン4の合成に成功した。すなわち、1a-cとC_<60>との分子間Bingel反応を、2の存在下、低温で行うと、ロタキサン3a-cが生成した。一方、1a-cの分子内Bingel反応を、2の存在下、低温で行うと、架橋鎖長の最も短い1aの場合カテナン4aは生成しなかったが、架橋鎖長のより長い1b,cの場合はカテナン4b, cが生成した。本年度は、これらの研究成果を発展させ、以下を明らかにした。・ロタキサン3のUV-Visスペクトルにおいては、400-500nm付近にCT相互作用に由来すると考えられる吸収帯が観測された。また蛍光スペクトルにおいては、ジナフトクラウンエーテル部位に由来する蛍光が著しく消光していることが分かった。・ナフタレンジイミドよりもアクセプター性の弱いピロメリットジイミド部位を有する付加体1dを用いた場合、Li^+イオンを添加することにより、室温においてもロタキサン3dが生成した。この結果は、ロタキサン3a-cが室温では生成しなかったのとは対照的である。・収率の向上を目指し、よりアクセプター性の強いペリレンテトラカルボン酸ジイミド部位を有するフラーレン付加体2eを用いたロタキサンの合成を検討しているが、現在のところ、その生成は確認されていない。また、副反応物の生成を抑える目的で、最終反応としてカルボキシル基などの官能基を有するフラーレン付加体を用いた合成経路についても併せて検討している。
構造情報に立脚した変異型IDH1/2抗体MsMab-1/-2の多重特異性の改良

1アミノ酸変異が生じたイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)1/2に対して多重特異性を有するMsMab-1、及び2に対する構造解析を試みた。MsMab-1の立体構造情報から、基質特異性に寄与するアミノ酸残基を同定し、変異導入を行ったところ、基質特異性の変化を確認した。一方、MsMab-2は生産性が悪く、構造解析実験まで至らなかった。変異型IDHに対して多重特異性を有するMsMab-3を新たに樹立した。この抗体は変異型IDHペプチドに対して反応するがタンパク質には反応しない抗体であった。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性中心アルギニン残基に変異が入り、酵素活性が変化することが、グリオーマの発生には重要である。これまで我々は、複数種のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性中心部位の変異を検出できる多重特異性抗体の樹立に成功している。その中でMsMab-2抗体の立体構造に着目して研究を始めている。平成26年度はMsMab-2の結晶化実験を行うため、MsMab-2の大量生産・精製とFabフラグメント調製の検討を行ってきた。通常行っている無血清培地培養から、得られる抗体収量は1mg/L以下と非常に低いものであった。そのため、ウシ由来アルブミンの混入があるものの血清含有培地培養により精製すると、抗体収量は5mg/L以上となったためこちらを採用した。しかし、抗体濃縮すると回収率が半分程度になってしまった。次に得られた精製抗体を用いて、パパイン消化によりFabフラグメント調製の検討を行った。SDS-PAGEによる純度検定から、Fabフラグメント以外のフラグメントが確認された。さらにゲルろ過クロマトグラフィーにより分析を行うと、パパイン消化が不十分で、(Fab)'2フラグメントが混入していることが示唆された。一方でイソクエン酸デヒドロゲナーゼの多重特異的抗体の立体構造例を増やすため、新たに抗体の樹立を行った。その結果、MsMab-2とは認識するアミノ酸が異なる多重特異性抗体MsMab-3が得られた。しかし、この抗体はペプチド抗原のみを認識する抗体であった。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)の活性中心アルギニン残基の変異により、酵素活性が変化することがグリオーマ発症の原因の一つである。これまで我々は、IDH変異を見分けるモノクローナル抗体をいくつか樹立しており、その中で1種類の抗体で複数種の変異を見分けることのできる多重特異性をもつ抗体MsMab-1,-2を樹立した。これらの立体構造を知ることで、さらに広範囲の変異を見分ける抗体への改変を目指し、研究を進めてきた。平成26年度では、MsMab-2の結晶化を重点的に行ってきたが、収量等に問題があり良好な結晶を得ることができなかった。同時に新たな多重特異性を持つ抗体樹立を目指し、MsMab-3を得たが、この抗体はペプチド抗原には反応するものの、タンパク質抗原には反応しなかった。平成27年度では、MsMab-2, -3の結晶化と、共同研究で先行しているMsMab-1の基質特異性改変を行った。MsMab-3は無血清培地から約15mg/mlと高収量で精製標品を得ることができた。MsMab-1は結晶構造解析の結果から、118残基目のヒスチジン残基がIDH1の132残基目のアルギニンがセリンに変異している部分に結合し、基質特異性を与えていることが示唆された。このことから、118残基目のヒスチジン残基をアラニン残基へと置換した変異体を作製して発現・精製を行い、基質特異性を検討したところ、多重特異性のバラエティが狭くなり、IDH1-R132S/G、およびIDH2-R172Mにのみ反応することが明らかとなった。以上のことから、多重特異性を有するMsMab抗体の構造解析を明らかにして比較することで、新たな基質特異性の抗体を理論的に作製できる可能性が示唆された。ハイブリドーマからMsMab-2抗体の大量生産・精製とFabフラグメントの調製の検討を行ってきたが、精製IgG抗体収量は目標値の3割(約30mg)、Fabフラグメントに至っては1割(約1mg)であり、結晶化スクリーニングまで到達していない。構造生物化学平成27年度はMsMab-2抗体の大量生産・精製とFabフラグメント調製を引き続き行い、早い段階で結晶化スクリーニングへ進む。ハイブリドーマからの生産量に関しては、これ以上の増収は見込めないため、精製以降のステップの回収率向上を目指す。特にパパインによる消化効率が低いので、添加する還元剤の検討を行って収率の改善を図る。一方でイソクエン酸デヒドロゲナーゼの多重特異的抗体の立体構造例を増やすため、新たにMsMab-3を樹立した。

このMsMab-3はペプチド抗原のみを認識する抗体ではあるが、MsMab-2とは認識するアミノ酸が異なるため、構造情報の比較としてとても興味深い。よって、MaMab-3抗体も構造解析の対象に含めることを予定している。MsMab-3は無血清培地培養で15mg/Lの収量があり、収量的には十分である。さらに、ペプチド抗原のみを認識する構造と、蛋白質を認識する構造として構造的に違いを見いだせれば、遺伝子工学的改変の一つの知見となり得ると考えている。結晶化実験の準備が遅れているため、必要物品の購入が遅れている。結晶化実験の準備ができ次第、購入を予定していた物品を購入し、結晶化実験を開始する。