hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳卒中患者の日常生活活動に関連する機能の全体像と各自立度に必要なカットオフ値

本研究の目的は、脳卒中患者の各日常生活活動の自立度と関連する心身機能の階層構造を明らかにし、また各活動が自立するために必要な心身機能のカットオフ値を算出することである。回復期リハ病棟の脳卒中患者の心身機能と日常生活活動自立度を後方視的に解析した。結果、脳卒中患者の更衣の自立度にはバランスと腹筋力が直接的な影響力があり、麻痺側下肢運動・感覚機能、非麻痺側下肢筋力、腹筋力、年齢がバランスを介して間接的に更衣自立度に関与することが示された。また、更衣を脳卒中患者が一人で安全に行うことができる基準として、Berg Balance Scaleで44点程度のバランスが必要であることが示唆された。【本研究の目的】脳卒中患者の日常生活活動(ADL)の自立度と心身機能の関連性を明らかにする。またADLと強く関連する機能について自立レベル、監視レベル、軽介助レベルなどADLが各自立度に至るためには、その機能がどの程度必要かという定量的指標(カットオフ値)を算出する。【今年度の計画】1データ収集、2「できるADL自立度」に関連する要因、およびカットオフ値を算出する。分析は多変量解析およびROC解析を用いる。【研究の進捗状況】1データ収集を予定通りに遂行し、データベースを作成した。2予定を変更し、「できるADL自立度」の分析に先んじて「しているADL自立度」と心身機能の関連性について分析を行った。分析の結果、軽症脳卒中患者では腹筋力が一部のADL自立度に影響することが明らかとなった。一方、脳卒中の重症度を多変量解析で調整した場合には、麻痺側上肢や体幹機能よりも、麻痺側下肢と非麻痺側筋力がADLに強く影響を与えることを明らかになった。これらの知見は脳卒中患者のADL自立度向上を目的としたリハビリテーションプログラムを検討する際の資料になることが期待される。【実績】論文1編脳卒中患者の日常生活活動の自立度と関連する心身機能を明らかにすることは、効果的なリハビリテーションや早期退院の支援を行う上で重要な情報となる。本研究の主目的は、脳卒中患者の各日常生活活動の自立度と関連する心身機能を特定し、また各活動が自立するために必要な心身機能のカットオフ値を算出することであった。今年度は、脳卒中患者において日常生活活動のなかで比較的難易度の高い更衣動作に着目し、関連する心身機能について以下の視点から分析し、知見を論文にまとめ公表した。1.回復期リハビリテーション病棟の入院時および退院時の更衣自立度と関連する心身機能を分析した。結果、入院時では麻痺側上肢機能とバランス、退院時ではバランスのみが更衣自立度と関連した。2.更衣自立度と関連する心身機能同士の階層構造および更衣自立度に対する各心身機能の直接的・間接的影響力をパス解析を用いて分析した。結果、バランスと腹筋力が更衣自立度に対して直接的な影響力を有し、麻痺側下肢運動・感覚機能と非麻痺側下肢筋力と年齢がバランスを介して間接的に更衣自立度に関与することが明らかとなった。3.更衣が自立するために必要なバランス機能を定量的に算出することを試みた。ROC解析の結果、更衣が一人で安全に自立するためにはBerg Balance Scaleで44点のバランスが必要であることが示された。4.更衣の“している"自立度の低下に関連する運動機能を解析した。傾向スコアマッチングにより交絡因子の影響を制御した分析を行った結果、バランスの低下が更衣の“している"自立度を低下させる要因となっていることが示唆された。予想以上にデータベースの作成を早期に完了することができたため、早く解析にとりかかることができた。現在、種々の解析を進めることができており、リハビリテーションの臨床場面で判断の材料となるような資料(カットオフ値)を作成中である。これまでに、その一部の研究成果を公表することができ、本研究は概ね順調に進展していると判断できる。一方、当初予定していたパス解析が、サンプル数の問題により信頼性の高い結果が得られない可能性があることがわかった。その点については、必要に応じて偏相関分析や傾向スコアによる分析を代替手段として用いることで対応が可能であると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学今後は食事、更衣、トイレ動作といった個別のADLの自立度と関連する心身機能を明らかにする。本研究は後方視的研究であるため、多変量解析(回帰分析、偏相関分析)や傾向スコアを用いた手法を用いて交絡を考慮しながら分析を進める。また各ADLについて自立レベル、監視レベルに至るために必要な諸機能のカットオフ値の解析を行う。また、並行して明らかとなった知見を公表する準備を進める。
食道静脈瘤の血行動態別治療に関する研究

経胸食道離断術を受け5年以上経過した肝硬変合併食道静脈瘤症例94例を対象とした。有効例と遺残再発例の術前肝機能、食道静脈瘤の状態、門脈血行動態、術中所見を比較し、また術後血管造影所見より静脈瘤遺残再発しやすい因子を検討した。94例中、術後遺残例5例、再発例12例であったが、F2以上あるいはRC陽性再発例は5例だけであった。術前ICG15分値の比較では、15分値25%以上の症例では24.6%に遺残再発をみたが、25%未満の症例では3.2%に過ぎなかった。内視鏡所見LsF3症例には26.9%の遺残再発をみたが、LsF3以外の症例では7.1%であった。術前血管造影、経動脈性門脈造影でみた左胃静脈の比較では直径6.5mm以上の症例では40.5%に遺残再発をみたが、6.5mm未満では2.2%であった。左胃静脈血流方向でみると遠肝性血流群で22.2%、他の血流群で9.7%の遺残再発であり、有意差は認めなかったが、他の血流群には術後血管造影で門脈閉塞を認めた症例が含まれていた。術中脾内圧が350mm水柱以上では24.4%、350mm水柱未満では16.7%の遺残再発率で差は認めなかった。非摘出重量は350g以上では25.5%、350g未満では8.8%の遺残再発率であった。術後血管造影では食道静脈瘤以外の側副血行路の温存が遺残再発予防に有意に作用している症例が見られた。(結論)LsF3症例、肝機能高度障害例、左胃静脈拡張例には4分の1の症例に術後遺残再発が見られたが、食道静脈瘤以外の側副血行路の温存に注意することで更に長期有効例の比率が増加すると思われた。
イネいもち病菌レースと抵抗性遺伝子との相互分化に関する研究

バングラデシュのイネいもち病菌レースとイネ遺伝資源における抵抗性変異との関係を検討し、いもち病菌レースと抵抗性遺伝子との相互分化について解明した。イネいもち病菌レースについては、331菌系を異なるイネの栽培形態や時期によりバングデシュ全域より採取し、判別品種群との反応パターンによりその病原性を解明した。その結果、菌レースの分化は、地理的な分布の違いよりもイネの栽培生態型により顕著に変化することを明らかにした。つまり、各生態型では異なるイネ品種が栽培されており、これに対応する形で異なるこれら品種の保有する抵抗性遺伝子も異なっていると推定した。さらに、広く在来から近代改良イネ品種までを各生態型より収集し、イネゲノム染色体上のに一定間隔で分布するDNAマーカーの多型情報を用いた分類により、これら遺伝資源をインド型と日本型品種に分類した。また標準判別いもち病菌菌系群を用いた抵抗性反応による遺伝的変異を解明し、インド型と日本型の分化、各生態型への適応と抵抗性変異との関係を明らかにした。最終的に、各生態型におけるいもち病菌レースの分布とイネ品種の抵抗性変異の関係を検討し、病原性と抵抗性が相互に対応しながら分化していることを明らかにした。また、南アジアに広く栽培されているバスマチ品種の抵抗性遺伝子型を推定するとともに、量的形質遺伝子座(QTL)解析によりその推定遺伝子を同定しすることにも成功した。以上の研究成果をもとに、バングラデシュにおけるいもち病菌レースの分化と抵抗性遺伝子の変異との関係を明らかにするとともに、今後、普及品種の遺伝的改良やいもち病菌レースのモニタリングや制御に向けての基礎知見を確保した。28年度が最終年度であるため、記入しない。バングラデシュにおけるいもち病菌レースおよびイネ品種の抵抗性を評価するための判別システムの開発を目指して、1)イネいもち病菌レースの多様性と分布の解明、2)イネ遺伝資源における抵抗性の遺伝的多様性の解明、3)イネいもち病菌レースとイネ品種の相互分化の解明、4)標準判別いもち病菌菌系の選抜による判別システムの確立、5)判別システムを用いた普及品種の抵抗性の遺伝的解明、6)それらの研究成果に基づく判別システムを用いた防除法開発ための提言をおこなうこととしている。2014年度は、バングラデシュにおけるイネいもち病菌レースの多様性と分布の解明、さらにはバングラデシュのイネ遺伝資源における抵抗性の遺伝的多様性の解明研究を進めた。いもち病菌レースの多様性解明研究では、バングラデシュ国内より収集した331菌系について、23の抵抗性遺伝子を対象とした一遺伝子系統群(判別品種)を用いた病原性研究を進め、地域間差や栽培シーズンにより変異が変わることを明らかにした。この結果をもとに、投稿論文作成の準備を始めた。またイネ遺伝資源の多様性解析では、バングラデシュ稲研究所より在来品種を中心とする327アクセッションの玄米種子を導入し、自殖種子の増殖を行い、イネゲノム染色体上に分布する約70のSSRマーカーについての多型情報を確保した。この多型情報に基づきクラスタ分析を行い、イネ遺伝資源の分類を行った。イネの品種におけるいもち病抵抗性と病原菌との相互分化を明らかにするため、バングラデシュを対象として、イネ遺伝資源の抵抗性変異と菌系の病原性変異を明らかにすることを目的とした。イネ遺伝資源の抵抗性変異解明のため、バングラデシュから導入した300アクセッションのイネ品種について70のイネゲノム染色体上に分布するSSRマーカーの多型情報による分類を行うとともに、20の標準いもち病判別菌菌系を用いた反応性の変異を明らかにした。SSRマーカーの分類によりインド型と日本型品種に分類することができたが、Aus, Amanon,Boro、Jhumのバングラデシュにおける栽培シーズンあるいは生態型間で、インド型と日本型品種が複雑に混合されて栽培されていることを明らかにした。また、栽培生態型間や近代品種と在来品種の間において、異なる抵抗性変異が存在することをも明らかにした。またバングラデシュ各地から、また異なる栽培生態型のイネより採取したいもち病菌菌系の病原性を明らかにした。栽培生態型により菌レースが顕著に変化するが、地域間ではほとんど変異による差異がないことを明らかにした。つまり、バングラデシュ全体では、多様ないもち病菌レースが分布しており、一方で同一の場所であっても、栽培シーズンが変わることにより菌レースの種類が変化することを明らかにした。つまり、栽培シーズンによりイネ品種が変わり、それに対応して罹病できるいもち病菌レースが変動する可能性を示すことができた。現在、抵抗性と菌レースの分化の詳細な関連性を検討しているところである。イン遺伝資源の変異およびいもち病菌レースの変異を、よく解析できてきたと考える。本情報は、学術的に新規性の高いものであるとともに、バングラデシュのいもち病防除のための基礎的知見として利用ができ、イネ栽培や品種開発に寄与することができる。

さらに、広く在来から近代改良イネ品種までを各生態型より収集し、イネゲノム染色体上のに一定間隔で分布するDNAマーカーの多型情報を用いた分類により、これら遺伝資源をインド型と日本型品種に分類した。また標準判別いもち病菌菌系群を用いた抵抗性反応による遺伝的変異を解明し、インド型と日本型の分化、各生態型への適応と抵抗性変異との関係を明らかにした。最終的に、各生態型におけるいもち病菌レースの分布とイネ品種の抵抗性変異の関係を検討し、病原性と抵抗性が相互に対応しながら分化していることを明らかにした。また、南アジアに広く栽培されているバスマチ品種の抵抗性遺伝子型を推定するとともに、量的形質遺伝子座(QTL)解析によりその推定遺伝子を同定しすることにも成功した。以上の研究成果をもとに、バングラデシュにおけるいもち病菌レースの分化と抵抗性遺伝子の変異との関係を明らかにするとともに、今後、普及品種の遺伝的改良やいもち病菌レースのモニタリングや制御に向けての基礎知見を確保した。バングラデシュからのいもち病菌菌系(輸入禁止品、農林水産大臣の許可)やイネ遺伝資源の導入(植物防疫所の検査)そのものに、生物多様性条約にも関連しスムーズに進まないことが懸念されたが、問題なく輸入することができ、評価や種子確保が可能となり、病原性評価のための一遺伝子系統群への接種試験やイネ品種のDNA解析が可能となった。特に、DNAマーカーを用いた解析実験は終了し、データの整理を進めており順調に研究が進められている。イネ遺伝資源の抵抗性については概略的な抵抗性の変異の解明にとどまっており、今後は高い抵抗性を示す品種や、逆に感受性となり問題となっている品種についての抵抗性の詳細な遺伝様式を解明するとともに、遺伝的改良に向けて手段を検討するための情報を集積する。28年度が最終年度であるため、記入しない。DNAマーカーの多型情報の解析を通して、バングラデシュイネ品種のインド型あるいは日本型への分化程度や生態型や地理的分布を明らかにする。またバングラデシュ産のいもち病菌レースの多様性解析をすすめるとともに、標準判別いもち病菌菌系の選定を行う。この判別菌系をもちいて、イネ遺伝資源の抵抗性の変異を明らかにしていく。このことを通して、いもち病菌レースの分化とイネ遺伝資源の変異との関連性を解明していく。
C_1化合物を原料にした共重合バイオポリエステル生合成のための微生物分子育種

メタノールを単一炭素源にして高物性共重合ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を効率的に生合成する株の取得を目的として、代表的なメチロトローフであるMethylobacterium extorquens AM1株の代謝改変を行った。その結果、野生株が合成するPHAは炭素数5のモノマーも共重合した共重合PHAであるという重要な事実を明らかにするとともに、メタノールを単一炭素源として炭素数4, 5, 6の3つのモノマーが共重合した珍しいPHAを効率よく蓄積する組換え株の取得に成功した。微生物がエネルギー貯蔵物質として体内に蓄積するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は生分解性、生体適合性を示すことからとして応用利用が期待されている。本研究では、石油の代替資源として有用かつ安価なメタンやメタノールといった還元型C_1化合物を原料にして、従来の微生物ポリエステルよりもしなやかで柔軟なC_4モノマーとC_6モノマーの共重合PHAであるポリ((R)-3-ヒドロキシブタン酸-co-(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸)[P(3HB-co-3HH_x)]を効率的に生産する微生物を育種することを目的としている。微生物育種の手法として、還元型C_1化合物を単一炭素源として生育することが出来る微生物(メチロトローフ)のうちPHA生産菌としてよく知られているMethylobacterium extorqens AM1株を元株にした代謝改変を用いた。平成21年度には、主にモノマーユニット供給の強化を目的とした代謝改変を行った。本菌がアセチル-CoAを前駆体としてC_6モノマーである3HHx-CoAを供給可能な酵素(チオラーゼやNADPH-レダクターゼ)を有しているものの、その活性が十分でないことが予想されたため、C_6基質に対しても活性を示す広基質特異性の酵素として、Escherichia coli由来FabG(NADPH-3-オキソアシル-ACPレダクターゼ)を導入することにより、アセチル-CoAの三量体化と還元による(R)-3HHx-CoA供給の効率化を図った。さらに、3HHx-CoAの前駆体となるButyryl-CoAの供給最とPHA重合能を向上させるために本菌由来クロトニル-CoAレダクターゼ(Ccr_<Me>)、Aeromonas caviae由来エノイル-CoAヒドラターゼ(PhaJ_<Ac>)、PHA重合酵素(PhaC_<Ac>)を高発現した。これらの改変の結果、FabG導入株では3HHxモノマー分率の向上は見られなかったが、Ccr_<Me>・PhaJ_<Ac>・PhaC_<Ac>導入株ではコントロール株に比べてPHA蓄積量、3HHx分率ともに1.5倍程度向上していた。メタノールを原料にして高物性共重合ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を効率的に生合成する株の取得を目的として、Methylobacterium extorquens AM1株を元株にした代謝改変を行った。申請者はこれまでにM.extorquens AM1株が染色体上に有しているPHA重合酵素遺伝子を広基質特異性PHA重合酵素をコードする遺伝子に置換した株(AM1CAc株)を構築し、この組換え株がメタノールを唯一の炭素源として、共重合PHAを合成すること、さらにAM1CAc株に第二モノマーユニット供給経路上の酵素遺伝子を導入することにより、第二モノマー分率が向上した菌株の取得に成功している。本年度は、PHAの前駆体供給の強化およびPHA分解の抑制によるPHA蓄積量の向上を目的として、1)PHAの前駆体を導く経路上の遺伝子および2)PHA分解酵素遺伝子の破壊を行った。1)PHAの前駆体である3-ヒドロキシブチリル-CoAは、PHA経路のほかに、エチルマロニル-CoA経路(EMCP)にも導かれる。そこで、EMCP上の酵素遺伝子を相同組換えにより破壊した。その結果、破壊株ではメタノール生育能を欠失したため、これを相補するために、C_1化合物を固定するための酵素遺伝子を導入した。しかし、現在までのところ、いずれの組換え株でもメタノール生育能は示していない。2)PHA分解酵素遺伝子では、depA、depBの二つが同定されているが、相同性検索の結果、さらにもう一つの遺伝子(depCと命名した)も分解酵素をコードしていることが予想された。そこで、これら三つの遺伝子の単独破壊株、二重破壊株、三重破壊株を先と同様に構築し、これらをメタノールを単一炭素源として培養した。その結果、予想に反していずれの破壊株でもPHA蓄積、生育能ともに宿主株と優位な差はみられなかった。

メチロトローフはこれまで、炭素数4のモノマーのみからなるP(3HB)しか生産出来ないと報告されてきた。申請者はこれまでに、物性向上を目的とした共重合化のため、野生株が有するPHA重合酵素遺伝子を広基質特異性の酵素遺伝子に置換した株(AM1CAc株)を得ており、メタノールから炭素数6のモノマーが共重合したPHAの合成に成功している。1)野生株や組換え株の凍結乾燥菌体をメタノリシスし、ガスクロマトグラフィーやガスクロマトグラフ質量分析計に供することで、野生株が合成するPHAは炭素数5のモノマーも共重合した共重合PHAであるという重要な事実を明らかにした。組換え株は、炭素数4,5,6の3つのモノマーが共重合した珍しいPHAを蓄積していた。2)本菌はグリオキシル酸の再生のためにエチルマロニルーCoA経路(EMCP)を有する。EMCP上には、第二モノマーの前駆体となるCoA中間体が存在するため、これらのCoA中間体を第二モノマー成分に導くための遺伝子をAM1CAc株内で高発現した。その結果、モノマー組成が異なったPHAを合成する菌株の取得に成功した。3)AM1CAc株内で、EMCP経路上の酵素遺伝子を相同組換えにより破壊した。破壊株はメタノール生育能を失うが、コハク酸を炭素源とした培地で生育させてからメタノールを加えた培地に植継ぐ二段培養を行ったところ、炭素数5のモノマーがAM1CAc株に比べて大幅に増加していた。また、この株のメタノール生育能を回復すべく他のC1化合物固定酵素遺伝子を導入したが、いずれの株もメタノール生育能は相補しなかった。
生体内で長時間の酸素運搬効力を有するヘモグロビン小胞体の構築

酸素を可逆的に結合するヘモグロビン(Hb)をリン脂質二分子膜小胞体(リポソーム)に内包したヘモグロビン小胞体(HbV)は、人工酸素運搬体として機能する。しかし、Hbは中心鉄が2価から3価に酸化(メト化)すると酸素結合能力を失う。この現象には、結合酸素に電子が一個移ることによるメト化(自動酸化)と、生じた活性酸素(過酸化水素)による更なるメト化が連動して起こっている。我々は、(メトHb/L-チロシン)系が過酸化水素を速やかに消去することを見出している。本研究では、L-チロシンを基質とするメトHbのペルオキシゲナーゼ活性を利用した過酸化水素消去系がメト化の抑制に効果的であることを確認し、この機構を解明した。また、この系を内水相に組み込んだHbVでは、過酸化水素を連続添加してもメトHbの生成は大幅に抑制されることから機能を確認できた。このHbVを20mL/kgラットに投与したところ、従来のHbVでは半分メト化する時間が14時間であったのに対し、44時間まで延長できた。更に、チロシン以外の14種類の候補基質に関してフェリルヘモグロビンラジカルと基質の反応速度の測定するスクリーニングにて、トリプトファンなどインドール環とカルボキシル基を持っ誘導体にてチロシンを上回る効果が見出された。他方、一酸化炭素化Hb(HbCO)は自動酸化によるメト化が起こらない。そして、循環血液中で少しずつHbO2に変換される現象を利用すれば、部分HbCOからなるHbVのメト化を抑制しつつ酸素運搬能力の持続が期待できる。本研究では、部分HbCOのメト化率の推移を測定したところ、CO化率に関わらず残りのHbO_2からのメト化速度はほぼ同じであったので、HbCOからのCOの脱離に伴って緩やかにメト化が起こる系の構築が示唆された。以上より、この二つのアプローチを組み合わせるとin vivoでHbVのメト化を効果的に抑制できると思われる。酸素運搬体であるHb小胞体の酸化(met化)の抑制には、チロシンを基質としたmetHbのペルオキシゲナーゼ活性を利用した過酸化水素消去系が効果的であることを、反応中間体であるferrylHbラジカルを単離して、UV-visスペクトルやESRスペクトル測定を行った。その結果、metHbは過酸化水素と反応してferrylHbラジカルとなり、過酸化水素は水となる。このferrylHbラジカルが二分子のチロシンと反応してmetHbに戻り、チロシンラジカルはジチロシンとなる。この反応が安定にサイクルして、過酸化水素が消去されジチロシンが生じることが明らかとなった。この過酸化水素消去系をHb小胞体内に組込み、met化挙動をin vitro, in vivo系にて評価したところ、過酸化水素を連続添加してもmetHbの生成は大幅に抑制された。更に、水に難溶なチロシンを予め中和した塩の状態で高濃度Hb溶液に高濃度に溶解させることに成功し、これをHb小胞体に導入してラットに20%負荷投与したところ、met化率が50%に到達するまでの時間が3倍延長した。

また、一酸化炭素化率の異なる部分一酸化炭素化Hbを調製する条件を確立し、それらを用いてmet化率の推移を測定したところ、一酸化炭素化率の関わらず残りの酸素化Hbのmet化率の推移はほぼ同じであった。従って、一酸化炭素化Hbからの一酸化炭素の脱離に伴って緩やかにmet化が起こる系の構築の可能性が示唆された。人工酸素運搬体であるヘモグロビン内包二分子膜小胞体(HbV)を構成するHbの酸化(met化)を抑制し、生体内で長時間酸素運搬体としての効力が持続する系の開発を目指す。小胞体にHbと共封入させる系として、チロシンを基質としたmetHbのペルオキシゲナーゼ活性を利用した過酸化水素消去系が効果的であることを明らかにした。metHbは過酸化水素と反応してferrylHbラジカルとなり、このferrylHbラジカルがチロシンニ分子と反応してmetHbに戻り、チロシンラジカルはジチロシンとなること明らかにした。また、この過酸化水素消去系をHbV内に組込み、in vitro、in vivo系にてmet化挙動を評価したところ、過酸化水素を連続添加してもmetHbの生成は大幅に抑制された。そこで、チロシン以外に類似の効果を持つ基質群をスクリーニングする系を立上げ、14種類の基質に関してフェリルヘモグロビンラジカルと基質の反応速度の測定し、基質の酸化体の構造とラジカル寿命の測定を行ったところ、トリプトファンなどインドール環とカルボキシル基を持つ誘導体にてチロシンを上回る効果が見出された。更に、一酸化炭素化Hb(HbCO)はmet化が起こらないことを利用して、部分一酸化炭素化Hb(HbCO)からなるHbVのmet化に対する安定性を期待した。部分HbCOのmet化率の推移を測定したところ、CO化率に関わらず残りの酸素化Hbのmet化率の推移はほぼ同じであったので、HbCOからのCOの脱難に伴って緩やかにmet化が起こる系の構築が示唆された。しかし、生体内で予備的にHbCO化したHbVを投与したところ、比較的速やかにHbCOからCOが解離してしまい、生体内ではCOを結合するヘムタンパク質が多く存在し、しかも閉鎖系ではないためにCO解離過程がmet化の律速段階には成り得ないことが明らかとなった。
RNA干渉伝播に必須な小胞輸送経路の役割の解析

我々はENTHドメインタンパク質RSD-3の欠損により全身性RNAiの効果が低下することを発見し、この変異体の抑圧変異体(サプレッサー)の分離を行い、そのうちの1つがZIPタイプの亜鉛トランスポーターであることを見出した。この遺伝子の変異は単独でも若干の全身性RNAiの効果が増強する傾向にあり、RSD-3と小胞輸送のどこかで拮抗的に働くと想像される。RSD-3は二本鎖RNAの取り込みに関わることが示唆されているので、亜鉛輸送体自体は、取り込みの抑制を行うか、細胞外への分泌を抑制していることが考えられる。このトランスポーターは主として後期エンドソームに局在し、細胞質に亜鉛を輸送すると考えられる。線虫に亜鉛キレーターを投与して全身性RNAiを作用させると、RNAiの効果が増強し、逆に、高濃度亜鉛処理後ではRNAi効果が減弱する。亜鉛輸送体は、RSD-3以外のRNAiに障害のある変異体との相互作用を調べたところ、sid-1、sid-2に対しては抑圧効果がなかったが、sid-3、sid-5に対しては抑圧効果が認められた。ドメインスワップを用いたコンストラクを用いたレスキュー解析により、C末端に近い膜貫通部位の細胞質付近のアミノ酸残基のモチーフによって後期エンドソームに局在する場合には機能があるが、その部位が別のアミノ酸に置き換えられると活性がないことが分かった。線虫ゲノムに存在する亜鉛トランスポーター28種類について単独のRNAi促進効果とrsd-3変異体への抑圧効果を調べたが、作用が認められたのが1遺伝子のみであったことなどから、この結果は、RNAi作用に置いて亜鉛濃度が重要な部位が限局していることを示していると考えられる。我々が発見した全身性RNA干渉に必要な分子RSD-3の抑圧遺伝子をスクリーニングで同定した。亜鉛輸送体の1つであることが判明し、その局在などの基本事項はほぼ解明できた。亜鉛が全身性RNA干渉の効率に影響することが亜鉛添加や亜鉛キレーターなどから分かったので、現象として間違いないと考えており、論文執筆中である。亜鉛輸送体と共に発見したrsd-3変異体の抑圧遺伝子の1つリン脂質輸送体の局在等の基本情報を取得済である。この分子の作用機序が解明できそうなので、2019年度に残りのデータを取得し論文投稿を行う。リン脂質輸送担体の変異体での全身性RNA干渉の効果を解析した。変異体を2alleles使用して、rsd-3変異体(既に我々が全身性RNA干渉の低下を見出しているもの)との二重変異体でのbli-3遺伝子に対するRNA干渉の表現型(表皮の水泡形成と致死)を調べた。二重変異体では、どちらのalleleを使用した場合でも、rsd-3変異体の表現型を抑圧(全身性RNA干渉が再び有効となる)した。rsd-3変異体以外にも他の研究室で見出された全身性RNA干渉の起こらない遺伝子が知られているが、それらのうち、sid-1は抑圧されなかったが、sid-3やsid-5は抑圧され、これらの抑圧された分子は同一パスウェイで働いていることが考えられる。その他に抑圧分子として同定した亜鉛輸送担体についての解析も進めている。亜鉛輸送担体は線虫でもヒトと同様に、多種類が知られている。細胞質の亜鉛濃度を上昇させるタイプはZIPファミリーに分類され、細胞質の亜鉛濃度を低下させるタイプはZnTファミリーに分類される。我々が発見した分子は、ZIP型であった。この分子がいつどこで働くかを絞り込むために、見つかった遺伝子の他の変異体allelesを分離して、rsd-3に対する抑圧効果を調べたところ、再現が見られたこと、トランスジェニックレスキューできることから、この遺伝子が原因であったことが確定した。また、他のZIPタイプやZnTタイプの遺伝子の変異体を分離して、単独での全身性RNA干渉の表現型、rsd-3との二重変異体での全身性RNA干渉の表現型を調べたが、最初に発見されたもの以外に明確な表現型は観察されなかった。よって、我々が発見したZIPタイプ輸送担体のオルガネラ特異的な局在や、特異的な会合分子が全身性RNA干渉を制御していると推測される。我々が発見したrsd-3変異体の抑圧分子の変異体の挙動が少しずつであるが、確実に解明されている。我々は線虫rsd-3遺伝子の変異により全身性RNAiが起こりにくくなることを見出した。この現象は、細胞外からのdsRNAの取り込みプロセスに関わっていると考えている。このメカニズムを解明するために、rsd-3変異体のサプレッサーをスクリーニングした結果、亜鉛輸送体(ziptタイプ)を見出した。亜鉛濃度検出用のFRETプローブを用いて体外に高濃度亜鉛を投与した時の腸管細胞内亜鉛濃度の時間経過を調べたところ、この遺伝子の変異体では、野生型とは異なる反応パターンを示すことが分かった(野生型で濃度が上昇する時に反応が遅いなど)。一方で、この輸送体には、ヒトでも、線虫でも多くのホモログが存在しており、各々の遺伝子の変異体をrsd-3変異体と交配して、抑圧効果を検証したが、見出した遺伝子以外の亜鉛輸送体では同様の表現型がなかった。亜鉛濃度が重要としても、単に細胞質での濃度に依存しているのではなく、より局所の濃度に依存して調節されている可能性が考えられる。そこで、亜鉛に結合するドメインを有するタンパク質などをデータベースで選別し、脂質輸送体関連分子も合わせて221個の遺伝子の変異体について、systemic RNAiの表現型を調べた。

15種類はRNAiが効きやすく、5種類はRNAi抵抗性が見られた。一部については、rsd-3抑圧効果も確認できた。これらのタンパク質のどれかが亜鉛輸送体で運ばれた亜鉛が制御しているタンパク質である可能性があり、局在や機能を絞り込む予定である。我々が発見したrsd-3変異体の抑圧分子の作用機序が少しずつ明らかになると共に、その関連分子の同定も前進した。我々はENTHドメインタンパク質RSD-3の欠損により全身性RNAiの効果が低下することを発見し、この変異体の抑圧変異体(サプレッサー)の分離を行い、そのうちの1つがZIPタイプの亜鉛トランスポーターであることを見出した。この遺伝子の変異は単独でも若干の全身性RNAiの効果が増強する傾向にあり、RSD-3と小胞輸送のどこかで拮抗的に働くと想像される。RSD-3は二本鎖RNAの取り込みに関わることが示唆されているので、亜鉛輸送体自体は、取り込みの抑制を行うか、細胞外への分泌を抑制していることが考えられる。このトランスポーターは主として後期エンドソームに局在し、細胞質に亜鉛を輸送すると考えられる。線虫に亜鉛キレーターを投与して全身性RNAiを作用させると、RNAiの効果が増強し、逆に、高濃度亜鉛処理後ではRNAi効果が減弱する。亜鉛輸送体は、RSD-3以外のRNAiに障害のある変異体との相互作用を調べたところ、sid-1、sid-2に対しては抑圧効果がなかったが、sid-3、sid-5に対しては抑圧効果が認められた。ドメインスワップを用いたコンストラクを用いたレスキュー解析により、C末端に近い膜貫通部位の細胞質付近のアミノ酸残基のモチーフによって後期エンドソームに局在する場合には機能があるが、その部位が別のアミノ酸に置き換えられると活性がないことが分かった。線虫ゲノムに存在する亜鉛トランスポーター28種類について単独のRNAi促進効果とrsd-3変異体への抑圧効果を調べたが、作用が認められたのが1遺伝子のみであったことなどから、この結果は、RNAi作用に置いて亜鉛濃度が重要な部位が限局していることを示していると考えられる。我々が発見した全身性RNA干渉に必要な分子RSD-3の抑圧遺伝子をスクリーニングで同定した。亜鉛輸送体の1つであることが判明し、その局在などの基本事項はほぼ解明できた。亜鉛が全身性RNA干渉の効率に影響することが亜鉛添加や亜鉛キレーターなどから分かったので、現象として間違いないと考えており、論文執筆中である。候補分子のrsd-3抑圧効果が種々の方法で確定したので、分子としての作用機序を明確にする実験を継続する。候補分子のrsd-3抑圧効果が他の全身性RNA干渉に関わる分子との関係で明らかになるつつある。さらに、関連分子の局在と亜鉛の濃度調節による活性制御の関係や、候補亜鉛輸送体の構造機能相関をキメラタンパク質発現を用いて明らかにする予定である。亜鉛輸送体と共に発見したrsd-3変異体の抑圧遺伝子の1つリン脂質輸送体の局在等の基本情報を取得済である。この分子の作用機序が解明できそうなので、2019年度に残りのデータを取得し論文投稿を行う。
多元金属ナノクラスターによる高機能協奏触媒の開発と連続流通システムへの展開

筆者らは既に、ポリスチレンを基盤とする高分子を一次担体、カーボンブラックを二次担体とした二元金属ナノクラスター触媒がアルコール類の酸素酸化反応に有効に機能すること、金属の組み合わせによって生成物を作り分けることが可能であることを見出しており、昨年度においては多段階反応の集積化を目的とし、本触媒系を連続流通システム、高温高圧系といった種々の反応場に適用した。一方、触媒の調製ロットによる活性の大きなばらつきが見られたことから、今年度はその解決に注力した。金-白金二元ナノクラスター触媒の調製では、従来は前駆体である金錯体と白金錯体の物質量比を1:1で混合し、担体である高分子存在下で水素化ホウ素ナトリウムによって還元的に二元金属ナノクラスタ「を調製し、空気中にて加熱架橋することで、クラスター中の金と白金の割合がほぼ1:1である触媒が得られ、高い触媒活性を示していた。しかし、クラスター中の金と白金の割合について再現が得られないことがあったことから触媒調製法の再検討を行った。その結果、1)前駆体である金錯体と白金錯体の物質量比を1:1.5とする、2)還元剤を水素化ホウ素ナトリウムからより強い還元剤である水素化ホウ素リチウムとする、3)加熱架橋をアルゴン雰囲気下あるいは水素雰囲気下で行う、ことでクラスター中の金と白金の割合がほぼ1:1である触媒が得られ、従来とほぼ同等の活性を示す触媒が安定して得られることが明らかとなった。これより、クラスターを構成する金属元素の電荷状態が触媒活性に影響を及ぼしていると推測される。金-パラジウム二元ナノクラスター触媒においても、加熱架橋における加熱温度を120°Cから150°Cとすることで、高活性の触媒が再現よく得られることが明らかとなった。筆者らは既に、ポリスチレンを基盤とする高分子を一次担体、カーボンブラックを二次担体とした二元金属ナノクラスター触媒がアルコール類の酸素酸化反応に有効に機能すること、金属の組み合わせによって生成物を作り分けることが可能であることを見出している。今回、多段階反応の集積化を目的とし、本触媒系を連続流通システム、高温高圧系といった種々の反応場に適用した。その結果、気相-液相-固相での多相系連続流通システムによるアルコール類の酸素酸化反応において、金/白金二元ナノクラスター触媒(PI-CB/Au-Pt)を用いることでアルコールから対応するアルデヒド、ケトンが、金/パラジウム二元金属ナノクラスター触媒(PI-CB/Au-Pd)を用いることで対応するメチルエステルが高選択的に得られることを見出した。連続流通システムを用いることでバッチシステムと比較して高い反応性、選択性を達成した。また、PI-CB/Au-Ptは長時間の使用において活性の低下がみられたものの簡便な洗浄によって再生が可能であり、PI-CB/Au-Pdは10日間以上の連続使用でも活性の低下は見られなかった。さらに、オートクレーブを用いた高温高圧系において、PI-CB/Au-Pdを触媒とする酸化的直接エステル合成が、塩基を添加することなく円滑に進行することを見出した。特にエタノールを出発原料とすることで、酸化的直接エステル合成による酢酸エチル合成が可能であることを見出した。エタノールは酢酸やアセトアルデヒドといった従来の酢酸エチル合成の原料と異なりバイオマス資源から容易に調達可能であることから、本触媒系はグリーンケミストリーの観点から有用な酢酸エチル合成法であるといえる.筆者らは既に、ポリスチレンを基盤とする高分子を一次担体、カーボンブラックを二次担体とした二元金属ナノクラスター触媒がアルコール類の酸素酸化反応に有効に機能すること、金属の組み合わせによって生成物を作り分けることが可能であることを見出しており、昨年度においては多段階反応の集積化を目的とし、本触媒系を連続流通システム、高温高圧系といった種々の反応場に適用した。多相系連続流通システムによるアルコール類の酸素酸化反応、オートクレーブを用いた高温高圧系反応のいずれにおいても、既存のバッチシステムを上回る反応性・選択性を達成した。

これは、研究の目的として挙げた4つの目的のうち、高機能協奏触媒の開発およびそれを用いた気相・液相・固相での多相系流通系システムの開発の2つを達成したといえる。更なる反応の集積化を目指し、これまでに開発した高分子固定化二元金属ナノクラスター触媒を基とした多元金属ナノクラスター触媒の開発、種々の遷移金属触媒やLewis酸触媒の導入を行う。同時に、ナノクラスター触媒の構造の解明を目指し、電子顕微鏡、エネルギー分散形X線分析、X線吸収微細構造解析などの分光学的手法およびクラスターの質量分析など物理的手法を用いて明らかとし、これらが触媒活性、生成物の化学選択性に与える効果を検証する。
燐光性白金錯体における配位平面のｄ－π共役変化に基づく発光制御

平面4配位型白金錯体の配位面のd-pai共役の程度が異なることによる発光挙動変化に関する知見を得るため、種々の長さのメチレン架橋部位を持つ錯体、および、種々の置換位置にメトキシ基を有する渡環型ビス(サリチルアルジミナト)白金錯体を用いて、分子間相互作用の影響を受けない希薄溶液中における発光挙動を調べた。その結果、金属錯体の配位面の折り曲げによって、d-pai共役の程度を精密に制御することで発光波長を制御することに成功した。種々の長さのメチレン鎖で渡環された構造を有するメトキシ置換型サリチルアルジミナト白金錯体を合成し、その構造に特異的な発光特性が発現することを明らかにした。メトキシ置換基の導入により、対応する無置換体に比べて、77Kの2-メチルテトラヒドロフラン溶媒中での発光強度が大きく向上することを見出した。サリチルアルジミン配位子の3-、4-、5-、6-位にメトキシ基を導入することにより、それぞれ黄色、緑色、オレンジ色、黄緑色に発光し、最大70nmの幅で発光波長を変化させることに成功した。さらに、同様条件下、メチレン渡環鎖長を8から13まで増加させることで、黄色から黄緑色まで33nmもの発光波長シフトが規則的に起こる新現象を見出した。本現象は、白金周りの配位平面の折れ曲がりの程度を変化させることで、d-π共役の変化を誘起するという、新形式の発光波長制御であると考えられる。本研究により、サリチルアルジミナト錯体の白金周りの配位平面の折れ曲がりの程度を変化させることで、d-π共役の変化を誘起するという、新形式の発光波長制御を実現することができた。2価白金を中心金属に有する平面4配位型錯体の配位面を、渡環鎖の導入により折り曲げることによる、ソルバトクロミズムおよび発光強度増大現象などの光学特性の新しい制御方法の開発に成功した。2つのサリチルアルデヒドヒドラゾンを配位子に有するトランス型の白金(II)錯体において、分子内水素結合や架橋構造に由来する構造的な束縛をかけることで、ヒドラゾン窒素のローンペアが中心金属に対して隣接基関与のような電子的影響を与え、光学特性が大きく変化することが明らかとなった。白金の配位面が折れ曲がった短いメチレン渡環鎖を有する錯体は、非常に束縛された構造に由来してヒドラゾン窒素と白金の間のd-π共役が強く、顕著なソルバトクロミズムを示す。それに対し、長いメチレン渡環鎖を有する白金錯体では、メチレン基の配座の自由度の高さから、白金の配位面の平面性が確保され、同時にヒドラゾン窒素のローンペアの配向自由度が高いために、ソルバトクロミズムが小さくなる傾向を示した。さらに、これらの渡環錯体において、酸添加による発光強度増大現象が観測され、渡環鎖の長い錯体では顕著な効果が見られるが、短い錯体ではそのような効果は小さくなることが明らかとなった。これらの結果は、平面4配位型白金錯体の配位面の平面性の変化、すなわち、d-π共役の程度により、光学特性に関連する挙動の感受性を変化させることができるという新しい知見を与えるものである。サリチルアルデヒドヒドラゾン配位子を有する平面4配位型の白金錯体に渡環鎖を導入することで、白金周りの配位面の平面性を制御し、折れ曲がりの程度を変化させることで、d-π共役の変化が誘起されること、それにより、ソルバトクロミズムや酸誘起発光強度増大における感受性が変化するという、基礎的な知見を得ることができた。本年度は、白金配位平面に対し垂直なアリール置換基を導入した新規な燐光性白金錯体の創製と、特定の分子内白金ー水素相互作用の関与した新しい固体発光制御に関する研究を行った。無置換、および、2位あるいは2,6位にアルキルおよびアミノ基を有するN-フェニル、あるいは、N-ナフチル基を有する一連のtrans-ビス(サリチルアルジミナト)白金錯体を合成し、結晶構造と固体発光特性の関係を精査したところ、N-アリール上のアルキル置換基と中心金属である白金との間の分子内相互作用の存在が明らかとなり、この相互作用が大きいほど室温の固体燐光に有利に働く重要な要因となることが明らかとなった。研究期間全体を通じて、燐光性白金錯体を中心に、新規3次元分子構造を有する機能性分子の創出を行った。置換基導入による分子軌道エネルギー制御の他、分子内水素結合や架橋構造に由来する構造的な束縛による発光色、発光強度変化が可能なことを明らかにした。平面4配位型白金錯体の配位面の平面性の変化、すなわち、d-π共役の程度により、光学特性に関連する挙動の感受性を変化させることに成功した。さらに、分子ユニットのデザインと結晶工学に基づいて、本質的に難しい高輝度に発光する分子集合体の創出に成功した。分子構造および分子内・分子間相互作用と発光特性に関するこれらの知見は、本質的に不可能とされつつも将来にその実現が渇望されている高輝度で高効率に発光する結晶やゲル、液晶等の集合体創製とその方法論のための重要な指標となると考えられる。

その結果、金属錯体の配位面の折り曲げによって、d-pai共役の程度を精密に制御することで発光波長を制御することに成功した。新しい骨格を有する有機金属錯体や単純有機分子を設計し、分子構造に依存した、d-π共役の変化を誘起することで、新しい発光制御法の開発を行っていく。分子構造に依存して、動的にd-π共役の変化を誘起させることのできる新しい構造を有する機能性白金錯体および有機発光性分子の開発を行っていく。有機化学初年度の研究は順調に進行し、予算の大部分を使用した。次年度も、備品購入のための大きな予算や、試薬購入などの消耗品費が必要であるため、少し余らせた分は、次年度使用額として利用することにした。今年度の研究は順調に進行し、予算の大部分を使用した。次年度も試薬購入などの消耗品費が必要であるため、少し余らせた分は、次年度の物品費(消耗品)として使用する。本研究課題を着実に推進していくために、備品として蛍光光度計の付属品である積分球の購入および、合成試薬の購入を行う予定である。本研究課題を着実に推進していくために、原料合成用の試薬の購入を行う予定である。
周期構造をもつプラズマ導波管中の遅波キャビトンの測定

管半径が,軸方向に正弦波状に変化し位相速度が光速よりも小さい遅波導波管中に,ゆるやかな密度勾配をもつプラズマを作り,大電力マイクロ波の入射によって発生する遅波キャビトンを観測するのが目的である。次の経過を述べる。しかし,まだ雑誌に未投稿なので公開しないでほしい。(1)キャビトンについての非線形シュレーディンガー方程式(モラレスの式)において,遅波入射(屈折率no〉1)の条件で,1次元問題を数値解析した。発生するキャビトンの位置は,noの連続関数として移動するという解析結果を得た。(2)実験に用いる波状導波管を3個製作した。その方法は,アルミ・ダイカスト法に依った。機械工作で作るよりも安価であった。平均半径および波形の振幅・ピッチは計算によって決めた。(3)製作した波状導波管のプラズマのない場合の分散特性を測定し,計算と比較した。1%以内で良い一致を見た。結果を雑誌に投稿した。(4)手持ちの放電プラズマ装置とマグネトロン発振器(周波数2.8GHz,出力150KW,時間幅1μs)を整備した。放電管中に波形導波管をセットした。従来使用している直円筒導波管の場合と比較する方法で,キャビトンの発生を測定した。(5)波状導波管中のキャビトンの発生位置は,屈折率noの連続的な関数として変化するのではなく,とびとびに変化することを見出した。(6)その理由としては,臨界密度で生ずる反射波と入射波で作る定在波の最大振幅の位置が,半径の最小位置,すなわちくびれた場所と一致する場合にポンデロモーティブ・フォースによりプラズマが排除されると推定している。現在,更に精しい測定を行っており,近く結果を雑誌(英文)に投稿する予定である。次の経過を述べる。
単離腎ネフロン分節からのトランスクリプトーム：広塩性のマスター分子解明に向けて

本研究は、軟骨魚類では数少ない広塩性種であるオオメジロザメをモデルに、広塩性と狭塩性の違いを決定する因子を見出すことを目的としている。オオメジロザメ腎臓のRNA-seq、de novoアセンブリによって非モデル生物である軟骨魚類のリファレンスコンティグセットを作成するとともに、海水・淡水環境で発現が変化する遺伝子を網羅的に同定した。後部遠位尿細管や集合細管が淡水移行により顕著な発現変化を引き起こす重要な分節であり、プロラクチンをはじめとする広塩性支配に関わる候補因子を複数同定することに成功した。本研究では、広塩性と狭塩性の違いを決定する因子を見出すことを目的とし、軟骨魚類では数少ない広塩性種であるオオメジロザメの腎臓の解析を進めている。複雑な腎ネフロンのうち、後部遠位尿細管は低塩分環境においてのみ特定のイオン輸送体を発現する。そこでこの後部遠位尿細管の機能を調節する因子を探している。1)非モデル生物である軟骨魚類は、リファレンスとなる大規模配列情報が存在しない。そこで、4個体のオオメジロザメ腎臓を用いてRNA-seqを行い、得られた配列をde novoアセンブリしてリファレンスコンティグセットを作成した。また、海水飼育と淡水飼育各2個体ずつの結果を比較し、サンプル間の発現量の違いを定量的に比較できることも確認した。2)特定のネフロン部位だけでRNA-seqを行うために、少量のRNAからでもオリジナルに近い発現プロファイルを維持したライブラリを作成できるQuartz-Seqプロトコルの改変を行った。以上の方法論の検討により、単離組織からのRNA-seqを行うための準備が整った。3)プロラクチンは、真骨魚類において淡水適応に重要なホルモンだが、これまで30年以上にわたる研究にもかかわらず軟骨魚類には見つからず、存在しないのではないかと考えられてきた。我々は本研究の過程で軟骨魚類にプロラクチン遺伝子が存在することを世界で初めて発見し、オオメジロザメの脳下垂体からプロラクチンならびにその受容体と考えられる遺伝子も見出した。本研究開始時には全く想定していなかった成果ではあるが、淡水環境において後部遠位尿細管の機能を調節する因子の候補を発見することができた。複雑な腎ネフロンのうち、後部遠位尿細管(LDT)は低塩分環境においてのみ特定のイオン輸送体を発現する。そこでこの後部遠位尿細管の機能を調節する因子の探索を目的とした。1)26年度には4個体(海水群と淡水群各2個体ずつ)の腎臓を用いてRNA-seqを行ったが、27年度は発現が異なる遺伝子の同定を進めた。インフォマティクス解析により、すでに発現が顕著に変化することを見出しているNaCl共輸送体以外にも、多数の電解質輸送体、水チャネルなどの発現が変化することがわかった。多くの場合、発現量の違いが統計的に有意であることがqPCRにより確認されている。2)淡水環境で重要なNaCl再吸収に関わる遺伝子について、腎ネフロンでの局在を調べたところ、LDT以外にも、集合細管において、NaCl共輸送体や上皮性ナトリウムチャネルなどの発現が淡水移行によって出現するようになることがわかった。我々の尿素再吸収モデルをもとに考えると、集合細管でのNaCl再吸収亢進は、最終的に尿素再吸収を促進することが目的であると示唆された。3)26年度に、真骨魚類において淡水適応に重要なプロラクチンが、軟骨魚類にも存在することを見出した。27年度には、プロラクチン受容体のクローニングにも世界で初めて成功した。さらにRNA-seqにより、真骨魚類のカルシウム調節を行うスタニオカルシンも軟骨魚類で初めて同定した。スタニオカルシンやインスリン様成長因子も腎臓での発現が淡水群と海水群で異なることから、プロラクチンを含め、広塩性の支配に関わる候補因子を多数同定することができた。オオメジロザメ腎臓全体に発現する遺伝子のリファレンスコンティグセットの作成が完了し、少量の特定部位からRNA-seqを行った時にも、遺伝子の同定と発現量比較を行うための基礎となる情報を得ることができた。また、世界で初めてプロラクチンとその受容体を軟骨魚類で発見するという、当初の想定を上回る成果をあげることができた。プロラクチンが軟骨魚類の腎機能を調節する可能性が十分に考えられる。一方で、固定組織からのRNA調整については、さらなる検討が必要である。RNAの調整ならびに発現量の多い遺伝子の増幅が可能であることは示せたものの、定量性を維持したRNA-seqを行うレベルにはまだ達していない。様々なメーカーから出されているapplication tipsを参考にすること、さらにはサメの体内には高濃度の尿素が含まれているため、緩衝液や精製段階などの検討も行う。魚類生理学、比較生理学、比較内分泌学当初の計画にしたがって研究を進めるとともに、世界で初めて軟骨魚類で発見したプロラクチンに注目した研究も行う。

(1)固定・染色組織からのRNA抽出・精製方法の検討を進める。(2)イオンポンプやイオン輸送体を染色することにより、後部遠位尿細管や近位尿細管を判別し、採取する。集めた尿細管からRNAを抽出し、Quartz-Seqなどの手法により微量のRNAを元にしたRNA-seqを行い、発現量に差がある遺伝子を同定する。(3)海水個体と淡水個体の脳下垂体でプロラクチン分泌活性を比較する。(4)プロラクチン受容体のクローニングを行い、腎臓に発現しているのかどうか、もし発現しているとしたら腎ネフロンのどのような分節に存在するのかを明らかにする。特定の尿細管分節から抽出した微量RNAを元にしたRNA-seqにおいて、オリジナルに近い発現プロファイルを維持したライブラリを作成できるQuartz-Seqプロトコルの改変を26年度は優先させた。また、固定・染色組織からのRNA抽出・精製方法の検討に時間がかかり、さらには理化学研究所におけるトラブルに対する検証データ解析への協力により分子配列比較解析ユニットでの作業にも遅れが生じた。以上の理由により、微量RNAからのRNA-seqを27年度に行うこととした。27年1月からは分子配列比較解析ユニットも通常の研究体制を回復しており、リファレンスコンティグセットの作成やQuartz-seqプロトコルの改変もすでに済ませている。そこで、27年度の早い時期に微量RNAを元にしたRNA-seqを行う。