hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
色素細胞のサブタイプを生み出す分化制御機構の解明

神経冠幹細胞の派生物である色素細胞は、メダカでは4種類(黒色および黄色、白色、虹色)存在する。これらは全て共通の幹細胞である色素芽細胞を経て発生する。色素芽細胞における運命決定は細胞の運命選択の分子メカニズムを研究する好適なモデルである。黄色素胞の欠損と白色素胞の過形成を示すメダカsox5変異体と、黄色素胞と白色素胞の両方が欠損するpax7a変異体を材料に、発生遺伝学的な解析をおこなった。メダカの色素芽細胞から黄色および白色素胞の系譜では、pax7aを発現する黄白共通前駆細胞のうちsox5を発現する細胞は黄色素胞へ、sox5を発現しない細胞は白色素胞への運命をたどることが示唆された。神経堤細胞の派生物である色素細胞は、その発生過程で異なるサブタイプが分化する。メダカには黒、白、黄、虹色の4サブタイプが存在するが、ゼブラフィッシュでは白色素胞がない。我々は最近、sox5変異がメダカの白および黄色素胞に発生異常をもたらすことを見出した。本研究では、分子遺伝学的な手法を用いて、神経堤細胞から色素細胞への発生分化の過程でSox5が果たす役割を明らかにする。Sox5はSoxDファミリーに属するが、構造的な特徴から、必ずしも直接的に転写活性化を担っておらず、類似のHMGボックスを持つSoxEファミリーの活性を調節して間接的に転写に関わることが示唆される。本研究では、Sox5とSoxEの相互作用が神経堤由来幹細胞の分化制御を行う可能性に注目して実験を行っている。本年度は以下の成果を得た。1)メダカTILLING変異体の単離: sox5の標的となるsoxE遺伝子を明らかにするため、TILLINGライブラリーをスクリーニングして新たにsox10bの変異体を得た。2)ゼブラフィッシュsox5の解析:昨年度、ゼブラフィッシュsox5のモルフォリノノックダウン個体において虹色素胞の発生異常をもたらすことを報告したが、その後Zinc Finger Nucleaseを使って作出されたゼブラフィッシュsox5変異体を入手し色素細胞の発生を観察したところ、上記の表現型は認められなかった。3)メダカTg(hsp70:sox5)の作製:熱処理によってsox5の発現を誘導できるトランスジェニックメダカを作製した。sox5の過剰発現によって、色素細胞の運命が変えられるかを調べる予定である。今後、これらの研究をさらに推進し、色素細胞におけるSox5とSoxEの相互作用および、異魚種の色素細胞発生におけるsox5の役割を追求する。本研究は、分子遺伝学的な手法を用いて、神経堤細胞から黄および白色素細胞への運命決定においてSox5が果たす役割を明らかにすることを目的とした。先行研究により、Sox5はSoxE(Sox10を含む)やPaxファミリー(Pax7を含む)など他の転写因子ファミリーと転写複合体を形成して下流遺伝子の転写を調節することが知られる。本年度は、Sox5がSox10およびPax7との相互作用を介して黄および白色素胞の運命決定を担う可能性に注目して研究を行い、以下の成果を得た。1)Sox5の機能が細胞自律的であることを細胞移植実験によって示した。2)メダカml-3/sox5ヘテロ接合変異体の表現型解析により、Sox5の機能が量依存的であることを示した。3)メダカpax7aが黄白共通前駆細胞の形成に必須であることを示した。4)メダカsox5とpax7aが黄白前駆細胞において相互作用する可能性を発現解析によって示した。5)TALEN技術を用いてメダカsox10a変異体を作製した。これらの結果から、pax7a陽性の黄白前駆細胞のうち、sox5を発現する細胞は黄色素胞に分化し、sox5を発現しない細胞は白色素胞に分化することを提唱した。また、Sox5の機能は量依存的であり、Sox10との競合的な作用によって黄色と白色の運命選択が行われている可能性が示唆された。

本研究では、神経堤細胞から色素細胞への発生分化の過程でSox5が果たす役割を明らかにする。Sox5はSoxDファミリーに属するが、構造的な特徴から、必ずしも転写活性化に担っておらず、類似のHMGボックスを持つSoxEファミリーのインヒビターとして機能することが示唆される。本研究では、Sox5とSoxEの相互作用が神経堤由来幹細胞の分化制御を行う可能性に注目して実験を行っている。本年度は以下の成果を得た。1)メダカTILLING変異体の単離: sox5の標的となるsoxE遺伝子を明らかにするため、TILLINGライブラリーをスクリーニングしてsox9およびsox10の変異体を得た。2)Tg(sox5:cre)トランスジェニックメダカの作製: sox5発現細胞を永続的に標識し、分化後の色素細胞サブタイプを同定するため、sox5プロモーターの支配下でcreリコンビナーゼを発現するメダカを作製した。これをTg(beta-actin:loxp-dsred2-loxp-egfp)と交配し、標識されたegfp陽性細胞を追跡したが、これまでのところ、色素細胞でegfpが観察されていない。3)ゼブラフィッシュのsox5: sox5変異がゼブラフィッシュにおいて虹色素胞の発生異常をもたらすことを明らかにした。今後、上記の研究をさらに推進し、Sox5とSoxEの相互作用が色素細胞やその他の器官において細胞のサブタイプの産生数を決定する可能性を追求したい。神経堤細胞の派生物である色素細胞は、その発生過程で異なるサブタイプが分化する。我々は、sox5変異がメダカの白および黄色素胞に発生異常をもたらすことを見出した。本研究は、分子遺伝学的な手法を用いて、神経堤細胞から黄および白色素細胞への運命決定においてSox5が果たす役割を明らかにすることを目的とした。昨年度までの結果から、白および黄色素胞の前駆細胞である黄白共通前駆細胞はpax7陽性であり、その発生にはpax7が必要であることが明らかとなっている。一方、sox5はpax7陽性細胞の一部において発現し、sox5陽性細胞は黄色素胞に分化する。そこで、組換え技術を用いて、黄色素胞を持たないsox5変異体のpax7陽性細胞にsox5を強制発現させたところ、黄色素胞の発生が回復した。このことは、メダカにおける黄色素胞への運命決定にpax7とsox5が協調的に作用していることを示唆する。先行研究により、Sox5は、Sox10との相互作用を通じて、様々な器官や組織の細胞分化を制御することが報告されている。メダカの色素細胞の発生におけるSox5の作用機序を明らかにするため、TALENおよびTILLING法によってsox10(aおよびb)変異体を作製した。sox5;sox10多重変異体における色素細胞の表現型を観察したところ、Sox5はSox10との競合的に働いて、黄色と白色のみならず、黒および虹色素胞の運命選択にも寄与していることが明らかとなった。発生遺伝学TILLINGスクリーニングにより、sox10b変異体は機能ドメインに有効なアミノ酸置換を持つものが見つかったが、sox10aについてはほぼすべてのコード領域をスクリーニングしたにもかかわらず機能欠損変異体が単離できなかった。現在、最近開発された新しい手法(TALEN)によってメダカsox10a変異体を改めて作出しているところである。このため、予定よりもやや遅れて、メダカsox10変異体(sox10a,b二重変異体)が完成する見込みとなった。ゼブラフィッシュsox
頭頚部癌に対する新規薬剤併用療法の開発-DNA脱メチル化剤と抗癌剤の併用-

1.抗癌剤である5-フルオロウラシル(5-FU)は癌細胞のNF-κB活性を抑制することにより抗腫瘍効果を発揮するが、シスブラチン(CDDP)はミトコンドリアの経路を介することを明らかにした(Oral Oncol,39:282,2003)。3.口腔癌細胞株(B88)に変異型IκB-α遺伝子を導入した細胞クローン(B88mI)はB88に比較してIL-1α,IL-6,IL-8,VEGF,MMP-9の産生抑制により、ヌードマウスでの造腫瘍性において著しい低下を示した。また担癌ヌードマウスを放射線や5-FUにて処理したところ、B88mI担癌マウスにおいてはB88担癌マウスに比較して、腫瘍抑制において著明な効果が確認された(Int J Cancer,108:912,2004)。4.口腔癌細胞をアルカロイド製剤セファランチンにて単独処理した場合、NF-κB活性を抑制することにより細胞増殖抑制効果を発揮した。またセファランチンは放射線によって誘導されるNF-κB活性を抑制することにより、腫瘍関連血管新生因子であるIL-8の産生を抑制する結果、放射線の腫瘍増殖抑制効果を増強することを明らかにした(日本口腔科学会雑誌,54:230-236,2005)。5.DNA脱メチル化剤であるデシタビンにて唾液腺導管細胞(NS-SV-DC)を処理した場合、発現の認められなかった水輸送膜蛋白であるアクアポリン5(AQP-5)の発現が誘導されることが確認された。この誘導はAQP-5遺伝子プロモーター領域内に存在するCpGアイランドでの脱メチル化に起因していることが明らかとなった(Lab Invest,85:342-353,2005)。1.抗癌剤である5-フルオロウラシル(5-FU)とシスプラチン(CDDP)の口腔癌細胞や唾液腺癌細胞に対する抗癌分子機構につき解析したところ、5-FUは癌細胞の転写因子NF-kBを抑制することにより、抗アポトーシス蛋白であるTRAF-2,cIAP-1,cFLIPの発現を抑制する結果、カスパーゼ8やカスパーゼ3を活性化することによりアポトーシスを誘導することを明らかにした。一方、CDDPはNF-kBには影響を及ぼすことなく、ミトコンドリアの経路を介してカスパーゼ9とカスパーゼ3を活性化させ、アポトーシスを誘導することを報告した(Oral Oncol,39:282,2003)。2.頭頸部癌治療に用いられるCDDPと5-FUの併用療法に関する抗癌分子機構について解析した。その結果、CDDPを先行投与し5-FUを投与する併用療法は、抗アポトーシスに作用するBcl-2を抑制することによりカスパーゼ8を活性化させ、またミトコンドリアからのcytochrome c遊離を促進させる結果カスパーゼ9を活性化させることにより、外因性・内因性経路を介してカスパーゼ3を活性化させアポトーシスを誘導することを明らかにした(Int J Oncol, in press)。3.口腔癌細胞のNF-kB活性を変異型lkBa cDNAを導入することにより抑制した場合、放射線や抗癌剤に対する感受性の増強が認められことを報告した(Int J Cancer,108:912,2004)。4.唾液腺導管細胞をDNA脱メチル化剤で処理した場合、水分泌に重要な機能を有するアクアポリン5の発現誘導が可能であることを明らかにした。1.口腔癌や唾液腺癌細施においては、転写因子NF-κBが正常細胞に比較して高発現していることから、頭頸部癌治療において分子標的に成り得ると考えられる。

そこで、口腔癌細胞株(B88)に構成的にNF-κB活性を抑制する変異型IκB-αcDNAを導入した細胞クローン(B88mI)を樹立した。B88mIはB88に比較してIL-1α,IL-6,IL-8,VEGF, MMP-9の産生抑制により、ヌードマウスでの造腫瘍性において著しい低下を示した。また担癌ヌードマウスを放射線あるいは5-Fluorouracil(5-FU)にて処理したところ、B88mI担癌マウスにおいてはB88担癌マウスに比較して腫瘍抑制において著明な効果が確認された(Int J Cancer,108:912-921,2004)。2.頭頸部癌治療においてシスプラチン(CDDP)と5-FUの併用療法は有効である。そこでB88細胞におけるアポトーシス誘導における至適併用療法をカスパーゼの活性化から解析した。その結果、CDDPを先行投与後5-FUを投与するレジメンは、同時に投与する方法や5-FU先行投与後CDDPを投与する方法に比較して、著しいcytochrome cの遊離とカスパーゼの活性化につながり、最も有効にアポトーシスを誘導することが明らかとなった(Int J Oncol,24:1449-1455,2004)。1.口腔癌や唾液腺癌細胞においては正常細胞に比較して、転写因子NF-κBの活性が著しく増強していることを明らかにし、頭頸部癌治療においてNF-κBが分子標的となりうることを報告した。そこで、頭頸部癌細胞に恒常的NF-κB抑制因子である変異型IκB-α遺伝子を導入することにより、担癌ヌードマウス腫瘍において腫瘍関連血管新生を抑制し、放射線治療および抗癌剤(5-フルオロウラシル)治療の感受性を増強させることを明らかにした(Int J Cancer,108:912-921,2004)。2.アルカロイド製剤であるセファランチンは唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるNF-κB活性を抑制することをすでに報告した(Arthritis Rheum,46:1585-1594,2002)。そこで口腔癌細胞のNF-κB活性におよぼすセファランチンの影響および放射線感受性の増強効果につき検討した。その結果、口腔癌細胞をセファランチン単独処理した場合、NF-κB活性を抑制することにより細胞増殖抑制効果を発揮した。また放射線の腫瘍抑制に対するセファランチンの影響につき検討したところ、セファランチンは放射線によって誘導されるNF-κB活性を抑制することにより、腫瘍関連血管新生因子であるIL-8の産生を抑制する結果、放射線の腫瘍増殖抑制効果を増強することを明らかにした(日本口腔科学会雑誌,54:230-236,2005)。3.DNA脱メチル化剤であるデシタビンにて唾液腺導管細胞(NS-SV-DC)を処理した場合、発現の認められなかった水輸送膜蛋白であるアクアポリン5(AQP-5)の発現が誘導されることが確認された。この誘導はAQP-5遺伝子プロモーター領域内に存在するCpGアイランドでの脱メチル化に起因していることが明らかとなった(Lab Invest,85:342-353,2005)。
レーダー降雪分類と雲物理過程に基づく新積雪物理量の時空間変化推定手法の開発

偏波レーダー観測に基づいて粒子形状の情報を分布として解析する手法、及び、気象モデルを改良して雲物理過程(上空の雲の中で降雪粒子が形状を変えながら成長する過程)を反映した降雪・新積雪物理量の時空間変化を予測する手法を開発する。新積雪物理量の測定を1時間間隔で行い測定データを蓄積するとともに、偏波レーダー及び気象モデルから得られた降雪形状情報の時空間変化と対応させる。それにより、レーダーや気象モデルによる上空の降雪データから、降雪起源の弱層形成について時空間的変化を追った検知、予測に利用できる技術を開発する。
液体Xe-TPCガンマー線望遠鏡による宇宙ガンマー線源の観測

地上テストのための試作モデルを制作した。この研究は米国のコロンビア大学およびニューハンプシャー大学との協同研究としておこなわれているが、システム全体のテストは主にコロンビア大学で行っている。日本からは班員や学生が交代でテストに参加しているが、1993年9月から1年間、高エネルギー研の俵氏が丁度留学の機会を得られたので、全面的に参加していただいた。これまでに得られた結果については、1994年7月24-29に開かれたSPIEの国際会議で発表したが、近日中に論文として出版する予定である。これまでのテストの結果からみた主な問題点は以下の通りであり、げんざいこれに対する対策を行っている。1)前置増幅器からの熱で液体Xe中で発生する泡が雑音の原因となる。今使用しているものは、このTPCのために制作されたものではないので、発熱を押さえるために電源電圧を下げて使用しているために必ずしも最適なものではない。そこで消費電力の少ない、かつ雑音の少ないタイプのものを現在開発中である。本年度中にはその試作品についてのテストを終える予定である。2)ワイア-の振動によって発生する低い周波数の雑音成分を押さえるためにワイア-を張るときのテンションの最適値を見つけることが必要である。3)2)の問題をのぞくためには、最後の電極ワイア-は平板電極とすることが一つの案であり現在検討中である。今後の問題として一つの大きな点は、エネルギー分解能をよくするためには、微量のTMEなどを混合して、電荷集収量を上げることが良い方法である。一方でこの場合はシンチレーション光が減少するために、他にトリガーの方法を考慮する必要がある。たとえばグリッドワイア-自身からの信号でよいトリガー信号が得られて、この点が解決できれば光電子増培管を必要としないなどのおおきな利点が得られることとなり、今後の重要な課題の一つである。現在これらのことを考慮にいれてフライトモデルの設計を行っている。
fMRIによる医師の主観的判断の探索～プレコックス感の脳活動～

本研究の目的は、「統合失調者に相対した時、観察者のうちに起こる一種言いようのない特有な感情」であり、病者の「対人接触本能」の減弱によって喚起される独特の「内的不確実感」であるプレコックス感を、機能的MRI(fMRI)を用いた客観的な指標として脳活動を探索することである。その解明のため1統合失調症患者および健常者からの動画データ収集、2プレコックス感課題の作成、3対象者へのfMRI撮像、4統計学的解析、の4段階を想定した。そのうち、本年度の計画としては1を達成するため、入院もしくは外来に通院している統合失調症患者、ならびに患者と年齢層ならびに性別をマッチングさせ、精神疾患の既往がない一般募集に応じた健常者からの動画データ収集を開始することであった。これまでに動画撮影の最適な条件や環境の調整を行い、試写することで種々の確認を行った。特に課題として話す言葉の選択や、光量や角度、背景などを吟味した結果、撮影ならびに動画課題作成の準備は整備された。現在、患者のリクルートを継続しており、次年度以降にはマッチングされた健常者のリクルートを開始し、動画収集を完成させ、fMRI用課題動画の作成、さらに行動試験の結果収集へと研究を進めていく。なお倫理申請については、動画とfMRIを撮像する駒木野病院にて倫理審査委員会にて承認された。今後、画像解析を行う慶應義塾大学病院においても倫理審査委員会における承認を得る手続きを進めていく。撮像条件や環境の整備に時間をかけ、最適な状況を調整することに注力したため、リクルートの開始時期を遅らせた。次年度については、1統合失調症患者および健常者からの動画データ収集、2プレコックス感課題の作成、3対象者へのfMRI撮像、4統計学的解析、の4段階のうち1を達成するため、患者群と年齢その他をマッチングした健常者のリクルートを開始し、動画収集を完成させ、fMRI用課題動画の作成、さらに行動試験の結果収集へと研究を進めていく。なお倫理申請については画像解析を行う慶應義塾大学病院においても倫理審査委員会における承認を得る手続きを進めていく。本年度のリクルートで使用するはずだった人件費を一部後ろ倒しさせ、次年度に使用するため。
不飽和有機分子ー金属複合系の反応選択性発現原理

アリル親電子剤と低原子価金属錯体との酸化的付加は、数多くの均一系触媒反応を組み立てる最も基本的な反応ステップであるが,過去の反応例のほとんどは、炭素ーヘテロ原子(ハロゲン,酸素など)結合の切断と、炭素ー金属結合の生成が互いに立体反転の関係で進むものであった。本年度の研究計画を実施したところ,いくつかの電子吸引性オレフィンが配位したゼロ価パラジウム錯体と5ー置換シクロヘキセニル誘導体(塩化物,臭化物)との反応が、ある条件下でまったく珍らしいシン付加(立体保持)で進行することが判明した。電子吸引性オレフィンとしては、ジベンジリデンアセトン,無水マレイン酸などが適当であり、5位の置換基としては、メトキシカルボニル基,メチル基などが使用された。反応の立体化学の決定には、反応溶媒の選択がきわめて重要な役割を果たし,ベンゼン,塩化メチレン,テトラヒドロフランなどの非極性溶媒中の反応でシン付加が生起し,アセトニトリル,ジメチルスルホキシド,ジメチルホルムアミド,アセトンなど極性の高い溶媒中の反応では、従来通りのアンチ付加が進行した。なお反応の立体化学の確認方法としては、生成物であるη^3ーシクロヘキセニルパラジウムハロゲン化物二量体を単離し,高磁場NMRスペクトルの解析,トリフェニルホスフィン付加物のX線構造解析を行なった。パラジウム錯体に類似のジベンジリデンアセトンー白金錯体と上記ハロゲン化アリルとの反応では、塩化メチレン中でも、高いシン選択性は発現しなかった。ホスフィン配位のゼロ価パラジウム錯体と上記ハロゲン化アリルとは、従来通りのアンチ付加で酸化的付加生成物を与えた。
イネ貯蔵タンパク質の生合成に伴うプロセシングとプロテインボディへの振り分け機構

植物細胞中でのタンパク質生合成・輸送・集積の一連の機構を理解する目的で、イネ貯蔵タンパク質の生合成から集積までの各ステップをモデルとして選んだ。即ち、登熟期イネ種実中でプロラミンはプロテインボディI(PBーI)へ、グルテリンはプロテインボディII(PBーII)へそれぞれ別々に分配される。この分配は非常に特異的でプロラミンとグルテリンが混在したPBは見られない。このことはイネ貯蔵タンパク質の生合成・集積の過程で、生合成される貯蔵タンパク質前駆体から成熟プロテイン形成のための細胞内部位(膜系)の選択が厳密に制御されていることを示している。本研究ではイネ貯蔵タンパク質前駆体が胚乳細部中で特定の膜を認識し、かつプロセシングされる分子機構を明らかにするため、各貯蔵タンパク質に対応するcDNA構造を明らかにする作業を継続してきた。その結果、これまでに10kDaプロラミンについて1ケ、13kDaについて4ケ、59kDaグルテリン前々区体について4ケ、26kDaグロブリンについて1ケのcDNA構造を得、その翻訳によるアミノ酸配列を得た。これらのアミノ酸配列を整理した結果、貯蔵タンパク質顆粒の形態とそこへ集積する貯蔵タンパク質前駆体のシグナル配列との間に強い相関が成立していることが判明した。即ち、PBーI、PBーIIに対応して、1924アミノ酸からなるシグナル配列が存在する。また、それぞれのシグナル配列は2種類のプロテインボディに対応する小胞体膜を別々に認識し、かつその上でプロセシングを受けてシグナル配列を除去されることも、in vitro実験により示された。イネの主要貯蔵タンパク質であるプロラミンおよびグルテリンがそれらの貯蔵部位であるプロテインボディーI(PB-1),(PB-2)へ正確に分配される機構とその間に進行する合成ポリペプチドのプロセシング機構を分子レベルで明らかにする研究を進めた。その結果、登熟期胚乳を乳鉢にて破砕後、200×g程度のゆるい遠心分離によりデンプンを除去しその上清を15,000×g程度で遠心分離して膜成分を集めることによりin vitroでグルテリン、プロラミンのプロセシングを進行させる膜線分が確保出来ることが判った。この手法は極めて単純なものであるが今後の研究進展に重要な知見を与えた。一方、登熟イネ種子のcDNAライブラリーより、プロラミンcDNA、グルテリンcDNAをそれぞれ2種同定し、その全塩基配列を決定した。得られたcDNA構造に基づきプロラミン、グルテリンの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、プロラミン前駆体のもつシグナル配列とグルテリン前駆体のもつシグナル配列が別々にグループ分け出来ることが判明した。このことは、プロラミンポリペプチドがPB-Iへ、またグルテンポリペプチドがPB-IIへそれぞれ正確に分配されるためにシグナル配列が重要な寄与をしていることを指唆した。
グルタミン酸受容体GluD1のシナプス形成機構および情動機能への関与

2つのデルタ型グルタミン酸受容体のうち、GluD2は小脳プルキンエ細胞に限局して発現しシナプスの形成と維持に重要な役割を担っている。一方、脳内におけるGluD1の分布やシナプス局在、機能については不明である。特異抗体を用いて局在を検討したところ、GluD1タンパクは脳内に広く分布し、小脳分子層では平行線維-介在ニューロンの細胞体シナプス後膜に局在が認められた。GluD1-KOマウスでは平行線維-介在ニューロンシナプスおよび介在ニューロン数が減少していた。以上の結果より、GluD1はGluD2と同様に、細胞種選択的・入力選択的に発現し、シナプス形成を促進する働きを持つことが示唆された。GluD1は、GluD2とともにデルタ型グルタミン酸受容体に属している。GluD2は小脳プルキンエ細胞に限局して発現し、シナプスの形成と維持に関与していることが明らかになっている。一方、GluD1の遺伝子であるGRID1は、双極性障害や大うつ、統合失調症、自閉症との関連性が強く示唆されているが、生体におけるGluD1の生理学的役割や、脳におけるシナプス局在はいまだ不明である。本研究課題は、GluD1の脳におけるシナプス局在を明らかにし、GluD1遺伝子欠損マウスおよびGuD1部位特異的遺伝子欠損マウスを用いてシナプス形成機構および精神疾患発現機序への関与を解明することを目的とした。平成25年度はGluD1の脳における局在を明らかにする目的で、GluD1 mRNAの詳細な空間発現パターンとその発現細胞の化学的特性をin situ hybridization法を用いて検討し、蛍光抗体法を用いてタンパクレベルでの分布を検討した。GluD1 mRNAは脳内に広く分布し、特に大脳皮質、大脳辺縁領域、小脳に強い発現が認められた。海馬では錐体細胞に、小脳では介在神経に強いことが明らかとなり、GluD1 mRNAの発現強度には細胞種選択性があることが判明した。GluD1タンパクの脳全体における分布はmRNAの発現パターンと一致した。小脳ではGluD1は平行線維と分子層抑制性介在神経の細胞体シナプス(PF-InS)のシナプス後膜に選択的に局在するとこが明らかとなった。さらにシナプス形成作用を調べる目的でGluD1欠損マウスを用いて検証した結果、野生型マウスに比べGluD1遺伝子欠損マウスではPF-InS数が半減していた。以上の研究結果より、GluD1は脳内に広く分布し、その局在はGluD2と同様に入力選択性が認められシナプス形成を促進する働きをもつことが明らかとなった。デルタ型グルタミン酸受容体はGluD1およびGluD2により構成されている。一方、GluD1の遺伝子であるGRID1はヒトの遺伝子研究から精神疾患との関連性が強く示唆されているが、シナプス発現から分子機能に至るまでこれまで全く不明な分子であった。そこで、神経解剖学的手法を用いてGluD1の細胞発現とシナプス局在を解析した。GluD1はmRNA、タンパクともに大脳皮質、海馬、線条体、扁桃体と分界条床核、小脳皮質などに豊富に発現し、発現細胞には細胞種選択性が認められた。次に、シナプス回路レベルでのGluD1の局在を明らかにする目的で、GluD2が豊富な小脳皮質を解析対象とし、両者の回路発現を比較した。その結果、GluD1は平行線維・介在ニューロンシナプスに選択的に発現していたことから、GluD1とGluD2は異なるニューロンに発現しているものの、どちらも平行線維シナプスに選択的であるという共通点も明らかになった。さらに、GluD1欠損に伴うシナプスの変化に着目して検討したところ、平行線維・介在ニューロンシナプスが著明に減少し、介在ニューロンの細胞数も有意に減少していた。以上の結果から、GluD2と同様に、GluD1にも細胞種選択的および入力選択的な発現特性が備わり、シナプス結合を強化する分子機能を有していることが明らかになった。GluD1は小脳皮質にとどまらず、認知や記憶、情動などの中枢である大脳にも豊富な発現していることから、これらの領域でのシナプス形成制御と精神神経疾患の発症との関係に焦点を当てて研究を展開することで、病因やその発症基盤の解明へとつながることが期待される。神経解剖学平成25年度の研究計画は順調に遂行でき、その結果を論文に投稿した。

GluD1の遺伝子であるGRID1と双極性障害や大うつ、統合失調症や自閉症といった精神疾患との関連性が報告されている。今後はGluD1の発現が強い大脳辺縁系領域に焦点をあて、GluD1部位特異的遺伝子欠損マウスを用いて、情動機能を評価する各種行動試験を行い精神疾患発症機序に関与するGluD1の機能を解明する。平成25年度に遂行した脳内における局在解析と平成26年度の研究計画であるGluD1部位特異的遺伝子欠損マウスの表現型解析を通して、GluD1の関与するシナプス回路形成と伝達機能の制御機構、そして精神疾患発現機序の分子基盤解明に関する包括的な研究成果が得られることが期待できる。平成25年度では、22594円の未使用額が発生した。これは平成25年度末に購入した物品の支払が平成26年4月に支払われることなったため、生じたものである。平成26年5月現在では未使用額はない。
チロシンおよびコリン誘導体によるpost FDGのPET癌診断の研究

新しいアミノ酸輸送のトレーサー、[11C]O-メチル-L-タイロシン(OMT)のPETによるがん診断を行うのが本研究の目的である。合成装置を既存の[11C]ヨウ化メチル自動合成装置に接続しOMTを合成した。所要時間は[11C]ヨウ化メチル導入時から12-3分、放射化学純度は99%以上、化学純度は99%以上で以降の実験、臨床に使用可能となった。OMTの腫瘍集積について、ラットAH109A腫瘍モデルを用いて体内分布実験、動物用PETによる撮影を施行した。投与50-60分の腫瘍・筋肉比は2,47、腫瘍・肺は2.98と良好な値を示し、PETにても腫瘍は明瞭に描出された。安全性試験は、ラットにコールド体の1万倍、9万1千倍を投与する実験、標識体の100倍を投与する実験として施行され異常はなかった。また変異原性試験でも異常はなかった。被曝線量についてはMIRD法により評価が行われ、全身の被曝線量は4.5μSv/MBq,であった。以上、十分な安全性が確認され臨床研究に移行した。健常者の画像では、腎および尿路、肝、脾、腸管が見えたがメチオニンよりは低く、膵臓は確認できなかった。正常脳の集積は低く、脳腫瘍は高いコントラストで描出され、FDGよりも明瞭であった。17人の種々の癌患者にOMT-PETを施行した。大腸がんの多発転移症例では、FDGと向様に多発転移が指摘できたが、腫瘍集積は低かった。食道がんの患者では、FDGで偽陽性となった炎症性リンパ節がOMTでは真陰性であった。24病巣の感度はFDG:94%(15/16),OMT:75%(12/16),特異度はFDG:43%(3/7),OMT:75%(6/8),正診率はFDG:78%(18/23),OMT:75%(18/24)であった。正診率ではFDGを超えることはできなかったが、偽陽性を減らし、特異度の向上でOMT-PETは特徴を発揮することができた。あたらしい[11C]O-メチル-L-タイロシン(OMT)の自動合成装置を試作した。この装置を既存の[11C]ヨウ化メチル自動合成装置に接続し、[11C]ヨウ化メチルを反応バイアルに導き、中のDMSA溶液中に溶解したL-タイロシンのナトリウム塩と反応させた。未反応の[11C]ヨウ化メチルをヘリウムで除去した後、混合液をディスポの固相抽出カラムBond Elute SCXとSep-Pak PlusC18に通し、不純物とタイロシン、DMSOを除去した。生食をカラムに通し、溶出するOMTのフラクションを放射能検出器でモニターしながら分取し、滅菌フィルターを通してバイアルに補集した。所要時間は[11C]ヨウ化メチル導入時から12-3分、放射化学純度は99%以上、化学純度は99%以上で生食以外は含まない、ヨウ化メチルからの放射化学的

収率は60-70%,pHは中性、約15mlの注射液が得られ、以降の実験、臨床に使用可能な実用的な装置となった。OMTの腫瘍集積について、ラットAH109A腫瘍モデルを用いて体内分布実験、動物用PETによる撮影を施行した。投与50-60分の腫瘍・筋肉比は2.47、腫瘍・肺は2.98と良好な値を示し、PETにても腫瘍は明瞭に描出され、全身および脳腫瘍の診断に使用できると考えられた。OMTの安全性および被曝線量の試験を行った。雄雌それぞれ5匹ずつのラットに臨床診断における投与量の1万倍、9万1千倍のコールドのOMTを投与し、14日まで経時的に観察したが、異常は認められず、15日目に行った病理学的検査にても異常はなかった。11C-OMTの臨床用注射液3ロットについて最大投与量の100倍を静注し同様に調べたが異常はなかった。また、臨床投与量のOMTは、LD50の1万分の1となり十分安全であると考えられた。更に、Ames試験による復帰突然変異原生は陰性であった。また全身の被曝線量は4.5μSv/MBq,最大被曝組織は卵巣で15.2μSv/MBq,次が副腎で6.2μSv/MBqであった。以上、臨床使用に十分な安全性が確認され臨床研究の準備がととのった。昨年度の研究で、新しいアミノ酸輸送のトレーサー[11C]O-メチルチロシン(OMTと略)の自動合成装置が完成した。ラットを用いた実験では、高い腫瘍集積性が示され、癌診断への応用が期待できる結果であった。被曝線量についてはMIRD法により評価が行われ、全身の被曝線量は4.5μSv/MBqとFDGよりも低かった。安全性試験は、ラットにコールド体の1万倍、9万1千倍を投与する実験、標識体の100倍を投与する実験として施行され異常はなかった。また変異原性試験でも異常はなかった。そこで、共同研究施設において、正常のサルを用いてPETによる撮像実験を行った。サルのPETにおいては、OMT投与早期から、腎が描出され、尿路排泄が高い薬剤であることが判明した。腎のほかには肝に中等度の集積があるものの、膵は描出されず、生理的なアミノ酸とは分布が異なることがわかった。脳への集積は低く、脳腫瘍の診断に有利な薬剤であると考えられた。これまでのデータを基に、共同研究施設(東京都老人総合研究所)および、国立国際医療センターの倫理委員会に臨床研究申請書を提出し、ヒアリング・審査をへて臨床研究が承認された。最初に健常ボランティア3名の撮影が施行された。腎および尿路以外には特別高い集積はなく、脳への集積も低かった。メチオニンとは異なり、唾液腺への集積も目立たなかった。メチオニンよりも血中プールがやや高く、ゆっくり低下するために心大血管などの縦隔影が良く見えていた。肝、脾、腸管なども見えてはいたがメチオニンよりは低く、膵臓は確認できなかった。動物実験で明らかになったのとほぼ同等の所見が人でも示され、特に種差はなく、非生理的なアミノ酸の体内分布の特徴が現れていた。臨床研究として、初めに脳腫瘍の患者のOMT-PETを撮影し、FDG-PETと比較したところ、OMT-PETでは、腫瘍は高いコントラストで描出され、FDGよりも明瞭であった。今後、他の疾患についての研究を予定している。昨年度までの研究で、新しいアミノ酸輸送のトレーサー[11C]0-メチルチロシン(OMTと略)の開発、自動合成装置の試作、ラット腫瘍モデルを用いた体内分布実験、サルを用いたPET撮像実験などが行われた。これによりPETによる腫瘍診断のトレーサーとしてOMTが有力な薬剤であることが判明した。また、被曝線量の評価、急性毒性試験、変異原性試験が行われ、臨床使用に問題がないことも判明した。これらを元に、ボランティアによるPET撮像実験を経て、倫理委員会に臨床研究申請書を提出し、臨床研究が承認された。
温度キャンセリング機構を備えた高速応答型感圧コーティングの研究開発

温度キャンセリング機構を備えた高速応答型感圧コーティングを研究し、その成果が得られた。このコーティングはピレンスルホン酸の2色発光を利用し、温度依存性をキャンセルする機構を持つ。この色素は2色発光での低波長側の発光ピークが温度増加とともに増加し、高波長側の発光ピークは温度増加とともに減少する傾向がある。2色発光が重なる波長領域は温度によらず発光量が一定となることに着目し、この領域で計測することで温度依存性をキャンセルし、かつ高速応答性が必要とされる非定常圧力分布の計測に成功した。温度依存性が対になる2色発光を用いた温度依存性キャンセリング機構を備えた感圧コーティングの研究とその実証試験を平成19年度,20年度の2年間で行う。低波長側の発光ピークは温度の増加とともに増加し,高波長側の発光ピーク温度の増加とともに減少する傾向がある。2色発光が重なる波長領域は温度によらず発光量が一定となることに着目し,この領域で計測することで温度依存性をキャンセルした圧力分布計測を可能にすることを目指す。平成19年度は2色発光を有する感圧コーティングの開発を行った。温度依存性をキャンセルするには,発光ピーク比を制御する必要がある。研究代表者は感圧コーティングに色素を付着するディッピング法のパラメータ(色素濃度,ディッピング温度と時間)とピーク比との関係を調べた。色素濃度,ディッピング温度と時間を増すと低波長側のピークが増加し,高波長側のピークが増加するにはその逆を行うことにより制御できることがわかった。2色発光が重なる波長領域では,単一の発光波長で計測した温度依存性に対し,最大で90%温度依存性を軽減することに成功した。圧力感度は若干減少してしまうという課題が見つかり,平成20年度は圧力感度を維持しつつ温度キャンセルを行うピーク比の決定法を求める。また,開発する感圧コーティングを用いて温度変化が無視できない圧力場での実証試験を行う。温度依存性が対になる2色発光を用いた感圧コーティングの研究とその実証試験を平成19年度、20年度の2年間で行った。このコーティングは2色発光を利用し、温度依存性をキャンセルする機構を持つ。用いた発光色素(ピレンスルホン酸)は、低波長側の発光ピークが温度の増加とともに増加し、高波長側の発光ピークは温度の増加とともに減少する傾向がある。2色発光が重なる波長領域は温度によらず発行量が一定となることに着目し、この領域で計測することで温度依存性をキャンセルした圧力分布計測の実証を行った。温度キャンセル機構を持つ感圧コーティングは、本研究成果より10°C40°Cの範囲で温度依存性を限りなく0にすることができた。温度依存性をキャンセルするには、発光ピーク比を制御する必要がある。ディッピング法での濃度、時間を最適化することによりこれを制御できることが分かった。ディッピング法とは発光色素をコーティング表面に適用する手法であり、その要素研究を行った例は本研究が初である。衝撃波管を使った応答性実験では、圧力のステップ応答に対し25μsで応答することがわかった。単純に逆数が周波応答と定義すると40kHzの応答性を持つ。実証試験では、温度変化をともなう10Hz50Hzの非定常現象に対し、温度キャンセルを備えた流れの可視化および圧力分布計測を行った。これ以上高い周波数で計測すると高速カメラに取得できる発光量が制限され、上記の周波数での非定常現象にとどまった。上記発光量の温度範囲であれば温度キャンセルを保ち可視化、圧力分布計測が行えることを示した。
シスタチン類の細胞内プロテアーゼに対する阻害機構の解明

シスタチン類の標的プロテアーゼに対する阻害機構を分子レベルで解明するため、ラット・シスタチンαの活性部位の検討を行った。シスタチンαの大腸菌による大量発現系を利用して第1ループの保存アミノ酸残基QVVAGの中央の54番V(バリン)に着目し,その疎水性側鎖を親水性側鎖,グルタミン酸,リジンに置換した変異体V54EおよびV54Kを調製した。精製した各変異体の諸性質を調べ野生型と比較した結果,野生型と殆んど変っていないことが判明した。これより,活性部位として重要であると推定されている第1ループの中で,54番残基に正,負の電荷を導入しても何ら影響を与えず,バリン残基と同等の崇高い側鎖が必要である可能性が示唆された。従って,グリシン残基などの置換変異体を調製することが計画されている。また,ヒト・シスタチンAについて,C-末端より,7,26および33残基を欠失させた各欠損変異体を調製し,C末端領域が立体構造の保持に重要な役割を果していると推定した。一方,シスタチン類は標的プロテアーゼとin vitroにおいて,非常に強く結合することにより,プロテアーゼ活性を疑似非可逆的に阻害する。しかし,インヒビターと標的プロテアーゼの複合体の存在を実証した研究は皆無である。そこで,ヒトシスタチンAの発現培養細胞のホモジェネートより顆粒画分を除いた上清液中に,シスタチンAとプロテアーゼの複合体の存在を調べるため,抗シスタチンA抗体沈降成分をイムノブロッティングした後,抗カテプシンB,HまたはL抗体によって解析した。現在までに,複合体の存在を示唆するデータは得られていないが,今後,複合体形成の検出最適条件などを見出すことを含め,種々詳細な検討を加える予定である。
ポジトロニウム・レーザースペクトロスコピーにおける電磁相互作用の精密検証

1)ポジトロニウム生成システム:都立大学に構築した低速陽電子ビーム生成装置を改良するため、メッシュモデレーターを開発し、陽電子ビーム強度を1オーダー以上向上させた。チョッパー・バンチンチャーにより、1nsのビームパルス化に成功した。また、レーザーとの衝突を効率よく実現するために、電場ポテンシャルにより陽電子を取り込み、磁場によって陽電子運動量ベクトルを回転させ縦成分を横成分に変換する、という新しい陽電子蓄積の方法を開発した。熱脱離による超低速陽電子生成の飛行時間測定装置を製作し、基礎実験を行い性能を評価した。Mo標的を1000Kまで熱することにより、生成効率の向上を図ることができた。2)レーザーシステム:ポジトロニウムのレーザー励起のためのCr:LiSAFレーザーを導入し、整備・調整を行った。これは、ポジトロニウムの寿命142ns以上の長パルス幅200ns、、1S→2S励起波長243nm,ドップラー広がりをカバーする発信線幅140pm、繰り返し25Hzという特殊な仕様のレーザーである。パルスエネルギー、スペクトル測定により、第2高調波、第4高調波発生システムの改良を行った。レーザー光をポジトロニウム発生部まで輸送し、照射テストを行った。3)ポジトロニウムの1S→2Sレーザー励起:モンテカルロシミュレーションにより、レーザー冷却のためのレーザーの幾何学的配置、強制冷却による寿命の変化、陽電子ビームとレーザービームのサイズとの相互関係などを詳細に調べた。1)ポジトロニウム生成システム:我々が都立大学に構築した偏極陽電子ビーム生成装置の改良を行った。ビームをバンチングするためのチョッパー・バンチャーシステムを製作し、電子銃からの電子ビーム(200eV)を用いて基礎実験を進め性能評価を行った。チョッパーではのビーム切りだしを実現し、それをバンチャーで2.8nsecに圧縮することができた。2)レーザーシステム:ポジトロニウムとレーザービームの衝突を効率よく行うために、オルソポジトロニウムの寿命、140nsec以上のパルス幅をもつレーザーの開発が必要である。レーザーに対する要求は、波長243nm,パルス出力10μJ以上、ドップラーシフトによる1S→2S励起励起エネルギーの変化を補償するためのバンド幅50pm以上、繰り返し25Hzである。これらの条件を満たすためのレーザーとして、Cr:LiSAFレーザー発振器を開発し製作した。3)ポジトロニウム・スペクトロスコピーの精度を向上させるためには、ドップラーシフトを極力抑制することが重要である。我々は、10meV程度の低いエネルギーを持つ熱脱離ポジトロニウムを生成し、それをさらにレーザーで冷却することを考えた。このため、低速ポジトロニウムのエネルギーを測定するための飛行時間測定装置および消滅ガンマ線測定装置を製作した。1)ポジトロニウム生成システム:我々が都立大学に構築した偏極陽電子ビーム生成装置TOPPSの改良により、ビーム広がりを3mmで、毎秒3万個の陽電子を生成することができた。チョッパー・バンチンチャーにより、2nsのビームパルス化に成功した。現在、1μsの蓄積時間で、10nsのパルスを生成し、蓄積効率は12倍であるが、磁場の改良により効率の向上を図っている。これは、ポジトロニウムの寿命142ns以上の長パルス幅200ns、IS→2S励起波長243nm,ドップラー広がりをカバーする発信線幅140pm、繰り返し25Hzという特殊な仕様のレーザーである。パルスエネルギー、スペクトル測定により、目標の性能を確認した。

レーザー光をポジトロニウム発生部まで輸送するために、紫外線に対して輸送効率の高い光ファーバーの導入を図り、基礎的測定を進めた。ワァイバーの利用により、衝突点でのレーザーのジッターを抑制することができた。3)ポジトロニウムの1S→2S、レーザー励起についてのモンテカルロシミュレーションを開発し、励起機構、閉じ込め機構の理論的研究を進めた。1)ポジトロニウム生成システム:我々が都立大学に構築した偏極陽電子ビーム生成装置TOPPSを改良するため、メッシュモデレーターを開発し、陽電子ビーム強度を1オーダー以上向上させた。チョッパー・バンチンチャーにより、1nsのビームパルス化に成功した。また、レーザーとの衝突を効率よく実現させるために、電場ポエテンシャルにより陽電子を取り込み、磁場によって陽電子運動量ベクトルを回転させ縦成分を横成分に変換する、という新しい陽電子蓄積の方法を開発した。熱脱離による超低速陽電子生成の飛行時間測定装置を製作し、基礎実験を行い性能を評価した。2)レーザーシステム:ポジトロニウムのレーザー励起のためのCr:LiSAFレーザーを導入し、整備・調整を行った。これは、ポジトロニウムの寿命142ns以上の長パルス幅200ns、IS→2S励起波長243nm、ドップラー広がりをカバーする発信線幅140pm、繰り返し25Hzという特殊な仕様のレーザーである。パルスエネルギー、スペクトル測定により、第2高調波、第4高調波発生システムの調整を進めた。3)ポジトロニウムのIS→2Sレーザー励起:モンテカルロシミュレーションにより、レーザー冷却のためのレーザーの幾何学的配置、強制冷却による寿命の変化、陽電子ビームとレーザービームのサイズとの相互関係などを詳細に調べた。
炭酸ガス溶解生理食塩水を用いた血管造影用陰性造影剤の基礎研究

昨年度のin vitroの実験で、炭酸溶解生理食塩水は造影剤として利用可能であり、炭酸ガスと遜色ない造影能を有していた。今年度は、動物実験において炭酸溶解生理食塩水を造影剤として使用し、炭酸ガスと比較、検討し、in vivoでの問題点を明らかにした。対象はウサギ10羽。大腿動脈をカットダウンして、4Frショートシースを挿入、4Frカテーテルから上部大動脈(腹腔動脈レベル)、中部大動脈(腎動脈レベル)、さらにシースより下部大動脈(大動脈分岐部レベル)を炭酸溶解生理食塩水5ml、炭酸ガス5mlを用いて、それぞれ5羽ずつDSA造影した。IVR専門医3人が血管造影をランダムに100段階のリッカート尺度を用いて、血管造影能を評価し、炭酸溶解生理食塩水と炭酸ガスの血管造影能を比較した。また炭酸溶解生理食塩水のin vivoでの使用において、問題が生じるかを確認した。血管造影能は、炭酸溶解生理食塩水では上中下部でそれぞれ、52.1 ±17.3, 56.3 ±12.9, 50.1 ±24.0であった。一方、炭酸ガスではそれぞれ、66.5 ±16.7, 77.3 ±15.4, 87.3 ±5.6であった。また炭酸ガス使用時には、ウサギに問題は生じなかったが、炭酸溶解生理食塩水の注入により、体動が多くなり、痛みを感じているウサギが見られた。炭酸溶解生理食塩水を用いた血管造影は、炭酸ガスに比べると、造影能は劣っていた。これは、炭酸溶解生理食塩水注入による刺激が生じるために、体動が多いためと考えられた。炭酸溶解生理食塩水から発砲する炭酸ガス自体は、生体刺激はないが、発砲すること自体が血管刺激になっていると思われた。動物実験を行い、陰性造影剤のgold standardである炭酸ガスと炭酸溶解生理食塩水との比較ができた。また炭酸溶解生理食塩水の生体使用における問題点が明らかになった。これは実際に血管内投与をしてみないとわからない問題であり、動物実験が有用であったためである。炭酸ガスの溶解を少なくした、弱炭酸溶解生理食塩水で血管刺激があるのかを確認する。また弱炭酸溶解生理食塩水の血管刺激が弱い場合、陰性造影剤としての十分であるかを確認する方針である。もし、弱炭酸溶解生理食塩水であっても、血管刺激が強く、陰性造影剤として使用不可と判明すれば、炭酸溶解生理食塩水から発生する炭酸ガスを陰性造影剤として用いるしかなく、炭酸ガスのgeneratorとして用いる方向を考えねばならない。造影剤のin vitro評価として、血管モデル(ARENA,株式会社ジャスト・メディカルコーポレーション)を用いた。使用する血管モデルは、3mm径、5mm径、8mm径とし、細血管大血管を評価できるようにした。模擬血液として、35%グリセリン(グリセリン「ヨシダ」ヨシダ製薬)を用い、専用ポンプで拍動させた。使用する造影剤は、1. 50%イオパミンロン370、2.炭酸ガス、3.炭酸水である。1. 50%イオパミンロン370;イオパミンロン370原液5mlと生理食塩水5mlを混和して作成。10mlシリンジを用いて注入。2.炭酸ガス;炭酸ガス注入器「ガスター」(旭計器社製)にフィリターをセットし、3包活線を装着した20mlシリンジをフィルターに押し付けて、炭酸ガスを吸引する。20mlシリンジを用いて注入。3.炭酸水;ソーダメーカー(ソーダストリームソースV3ソーダストリーム株式会社)を用いて作成。これにより、強炭酸(6000ppm程度)の炭酸生理食塩水(以後、炭酸水)が作成できる。結果:3mm血管モデル:コントロールとなる造影剤では描出されるが、炭酸ガス、炭酸水ともにカテーテルより噴出直後には描出されるが、中央部での描出は不良であった。5mm血管モデル:炭酸ガスでは、玉状にガスがかたまり、非連続的に血管モデルが描出されるが、炭酸水では良好な血管モデル描出を認めた。8mm血管モデル:炭酸ガス、炭酸水ともに部分的に玉状になり途切れる部位もあるが、良好な血管モデルの描出を認めた。以上より、細血管では、炭酸ガス、炭酸水ともに描出が劣るものの、中血管、大血管では炭酸水は、炭酸ガスと比べて、同等もしくは良好な血管描出能を有しているものと考えられた。今年度の予定は、動物実験までを行う予定であったが、in vitroの実験までしか行えておらず、予定よりは遅れている。しかし、in vitroの実験で、小血管、中血管、大血管とサイズの違う血管径で評価できたため、より多い基礎データを得ることができた。それをもとにして特許の出願を準備していたため、動物実験まで行えなかったが、本年度に全ての実験を終える予定である。対象はウサギ10羽。

大腿動脈をカットダウンして、4Frショートシースを挿入、4Frカテーテルから上部大動脈(腹腔動脈レベル)、中部大動脈(腎動脈レベル)、さらにシースより下部大動脈(大動脈分岐部レベル)を炭酸溶解生理食塩水5ml、炭酸ガス5mlを用いて、それぞれ5羽ずつDSA造影した。IVR専門医3人が血管造影をランダムに100段階のリッカート尺度を用いて、血管造影能を評価し、炭酸溶解生理食塩水と炭酸ガスの血管造影能を比較した。また炭酸溶解生理食塩水のin vivoでの使用において、問題が生じるかを確認した。血管造影能は、炭酸溶解生理食塩水では上中下部でそれぞれ、52.1 ±17.3, 56.3 ±12.9, 50.1 ±24.0であった。一方、炭酸ガスではそれぞれ、66.5 ±16.7, 77.3 ±15.4, 87.3 ±5.6であった。また炭酸ガス使用時には、ウサギに問題は生じなかったが、炭酸溶解生理食塩水の注入により、体動が多くなり、痛みを感じているウサギが見られた。炭酸溶解生理食塩水を用いた血管造影は、炭酸ガスに比べると、造影能は劣っていた。これは、炭酸溶解生理食塩水注入による刺激が生じるために、体動が多いためと考えられた。炭酸溶解生理食塩水から発砲する炭酸ガス自体は、生体刺激はないが、発砲すること自体が血管刺激になっていると思われた。動物実験を行い、陰性造影剤のgold standardである炭酸ガスと炭酸溶解生理食塩水との比較ができた。また炭酸溶解生理食塩水の生体使用における問題点が明らかになった。これは実際に血管内投与をしてみないとわからない問題であり、動物実験が有用であったためである。本年度の基礎実験より、炭酸水、炭酸ガスは、大血管には、あまり適していないため、ミニブタによる実験よりウサギによる実験を多くしたほうが、いいと考えられた。ミニブタの扱いは時間、労力を要するが、ウサギの実験は、少人数でも可能であるため、数をこなすことが可能と思われる。そのため、前年度の実験の遅れは、本年度で十分に取り戻せると考えている、。炭酸ガスの溶解を少なくした、弱炭酸溶解生理食塩水で血管刺激があるのかを確認する。また弱炭酸溶解生理食塩水の血管刺激が弱い場合、陰性造影剤としての十分であるかを確認する方針である。もし、弱炭酸溶解生理食塩水であっても、血管刺激が強く、陰性造影剤として使用不可と判明すれば、炭酸溶解生理食塩水から発生する炭酸ガスを陰性造影剤として用いるしかなく、炭酸ガスのgeneratorとして用いる方向を考えねばならない。動物実験を行わなかったため、予定額を使用できなかった。今年度、動物実験を行うためそのため、本年度分の助成金+約7万円で予定通りの使用計画を行う予定である。翌年度分の助成金と合わせて、追加の動物実験や研究発表の旅費として使用予定である。