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頭頚部癌における予後予測因子ＳＩＲＴ１の細胞内局在に依存した細胞生物的機能の解明

蛋白質脱アセチル化酵素SIRT1は癌の発生・進展に関与するが、促進的であるか抑制的であるかは癌の種類やSIRT1の細胞内局在によって異なっている。我々は頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)においてはSIRT1の核での高発現は予後良好に相関するが、SIRT1が細胞質に局在する場合は予後不良であることを見いだした。HNSCCでのSIRT1の癌抑制的機能の背景を検討し、SIRT1が癌抑制遺伝子であるTAp63遺伝子の発現に寄与している可能性があることを見いだした。SIRT1の核内移行シグナルに変異を導入し、HSC2細胞の細胞質に発現させて効果を検討したが、浸潤能などに大きな変化は認められなかった。25年度はSIRT1の高発現がHNSCC細胞の高分化に関係しているのではないかという前年度の観察と、SIRT1が上皮細胞の分化を促進するとの報告を考え合わせ、SIRT1はHNSCCにおいてがん幹細胞から増殖系列への分化に促進的に関与しうるのではないかという仮説を立て、HNSCC由来のがん細胞株でSIRT1の発現のノックダウンあるいはSIRT1の高発現ががん幹細胞あるいは上皮幹細胞のマーカーとされる遺伝子群の発現に及ぼす影響を検討した。1)SIRT1ノックダウンの効果:HSC2細胞でSIRT1の発現をRNAiによりノックダウンした場合、上皮幹細胞のマーカーとされるTAp63遺伝子の発現が低下することが見いだされた。一方、ES細胞あるいはがん幹細胞のマーカーとされる遺伝子群(nanog、oct-4等)については大きな変動は認められなかった。2)SIRT1高発現の効果: SIRT1蛋白のN末端側にEGFPを融合した発現ベクターを作成し、HSC2細胞に導入後、EGFPの蛍光が陽性の細胞群をセルソーターにて濃縮することを繰り返しEGFP-SIRT1を安定発現する細胞集団を得た。同様の方法によりEGFPのみを発現する細胞集団を取得した。なお、EGFP単体では細胞全体に分布するが、EGFP-SIRT1は核に局在し、これまでに細胞質に移行することは認めていない。通常の培養条件下においてはEGFP-SIRT1を高発現の細胞とEGFPの発現細胞との間でTAp63遺伝子の発現レベルに差はなかった。HSC2細胞でTAp63遺伝子の発現は5-aza-deoxycytidineにより増強されるが、その増強の度合いはEGFP-SIRT1を高発現させた細胞で高いことが認められた。以上の結果からHNSCC細胞においてSIRT1はTAp63遺伝子の発現を促進している可能性が示唆された。本年度は頭頚部がんにおけるSIRT1の発現ががん/がん細胞の特性にどのように結びついているのか検討した。1.頭頚部がんにおけるSIRT1の発現とがんの臨床病理学的特性および患者の生命予後との関係を検討した。その結果、SIRT1の発現が低い症例ではがんが未分化である割合が有意に高く、かつ患者の無再発期間の短縮・生命予後の短縮に有意に相関していることを見いだした。2.上記の観察とSIRT1が扁平上皮細胞の分化に促進的に関与するとの報告を考え合わせ、(1)扁平上皮組織では未分化な細胞でSIRT1の発現が低く、分化にともなってSIRT1の発現が上昇するかあるいはSIRT1の発現にともなって細胞が分化する、また(2)SIRT1の発現が低いがん細胞はSIRT1の発現が低い未分化な細胞に由来するか、あるいは細胞ががん化してから脱分化をおこしやすく、これがなんらか治療抵抗性に関係しているのではないか、という仮説を立てた。3.上記(1)に対する予備的な検討として、子宮外頚部扁平上皮組織でのSIRT1の発現を調べた。SIRT1 mRNAの発現は上皮幹細胞マーカーと考えられる神経成長因子受容体p75およびNotchリガンドのDLL1を発現している細胞群には認められたが、これら発現していない細胞群には認められなかった。このことは、当初の予想に反して扁平上皮組織においてはSIRT1は未分化な細胞に発現し、分化に伴って発現が低下するという可能性があることを示唆している。4.上記(2)について、頭頚部がん由来の細胞株HSC2においてRNA干渉法によりSIRT1の発現を抑制し、上皮細胞の分化に関わる遺伝子の発現の変動を毛検討した。その結果、SIRT1の発現抑制によってがん抑制的に機能するとされるTAp63の発現が低下することを見いだした。このことはSIRT1の低発現ががん化に寄与しうることを示唆している。1.頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)でのSIRT1の癌抑制機能の分子論的背景:SIRT1がHNSCCのがん幹細胞からの分化を促進するのではないかという仮説をたてて検討を行った。

上皮幹細胞あるいはHNSCC幹細胞の維持に関わると考えられる10遺伝子の発現を8種類のHNSCC由来の細胞株で検討し、それら遺伝子の発現とSIRT1の発現との相関、また遺伝子相互の発現レベルの相関を検討した。その結果、これらの遺伝子の発現パターンはHNSCC細胞の分化度を反映しうるが、SIRT1の発現はDNp63遺伝子との逆相関を示した以外はどの遺伝子の発現とも相関を持たないこと、さらにSIRT1の発現をノックダウンした場合に発現が変動(低下)するのはTAp63遺伝子のみであることが分かった。実際にHNSCCにおいてSIRT1の発現とTAp63遺伝子の発現が相関するかどうかを、HNSCCの生検組織のホルマリン固定-パラフィン包埋標本20検体よりRNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにより検討した。SIRT1 mRNAの発現とTAp63 mRNAの発現の間に有意な正の相関が認められた。TAp63は細胞の分化やアポトーシスの誘導に関わるほか、がん細胞の浸潤能を抑制するなどして癌抑制遺伝子として機能することが報告されている。これらの結果は、1SIRT1はHNSCC細胞においてがん幹細胞・がん細胞の分化に寄与するとは考えにくい、2SIRT1がHNSCCにおいて癌抑制的に機能する背景に癌抑制遺伝子であるTAp63遺伝子の発現を維持している可能性がある、ことを示している。2)SIRT1の細胞内局在と機能:SIRT1の核内移行シグナル(2カ所)に変異を導入した変異体にEGFPを融合した発現ベクターを作成し、HSC2細胞に導入して変異SIRT1蛋白の細胞内局在とその発現の効果を1)の結果より細胞の浸潤能に注目して検討を行った。HSC2細胞の浸潤能をコラーゲン3次元培養系で評価したが、SIRT1の細胞質への局在にともなって浸潤能が昂進するような傾向は認められなかった。分子細胞生物学EGFP-SIRT1の安定発現細胞株を取得することにより、SIRT1の細胞内局在が可視化できるようになったこと、また免疫組織化学染色・蛍光免疫染色法においてSIRT1の発現と局在を正しく評価できる抗体の検索が可能となった。またSIRT1の細胞学的機能について、遺伝子発現の面からSIRT1がTAp63をひとつの標的として上皮細胞の分化・がん化に関与している可能性が示され、これは想定以上の知見が得られたものと考えている。しかし、NOGマウスに頭頚部がんの組織片を移植してSIRT1の細胞内局在を検討するという実験にとりかかることができず、この点からやや遅れていると評価した。頭頸部がんにおいてSIRT1がどのようにがんの進展に関与しているのかはこれまで知られていなかったが、今回それを明らかにすることができた。また、SIRT1の細胞学的機能について、遺伝子発現の面からSIRT1がTAp63をひとつの標的として上皮細胞の分化・がん化に関与している可能性が示され、これは想定以上の知見が得られたものと考えている。しかし一方で、字数の制約上研究実績の概要の項には記載しなかったが、SIRT1の細胞内局在を決定する作業は、蛍光免疫染色法においては既製の抗体の反応性が現在の反応条件では低いために明瞭な染色シグナルが得られない、また生化学的分画法においてはSIRT1がおそらく他の核蛋白質に比べ核から漏出しやすい性質を持つらしく微妙な分画操作の差で細胞質/核画分のいずれに回収されてくるか再現性の良い結果が得られない、ことによって困難が続いているのが現状である。
化学物質による環境負荷とリスク削減のための洗浄プロセス知識基盤の構築

化学物質による環境負荷削減・リスク削減に関わる情報を統合した知識基盤を構築することによって、安全なプロセス設計を可能とし、化学物質を利用したプロセスによる環境負荷とリスクの削減を実現する。塩素系溶剤を使用する産業洗浄プロセスを対象として、化学物質の製造や物性などの知識、プロセス装置機器に関わる知識、プロセス装置運転・操作に関わる知識、化学物質の健康影響や環境挙動に関わる知識などをプロセス知識として収集・体系化し、情報基盤として集積し、プロセス設計に結びつける手法を開発した。(1)洗浄プロセスの設計作業のアクティビティモデル化洗浄プロセスにおける現状の設計作業を現瘍で聞き取り調査をしたり、現場で確認したりしながら解析し、要素作業に分割し、その要素間の情報の流れを解析し、IDEFOアクティビティモデリング手法によってモデル化した。その結果、設計作業に必要な情報やツールを明らかにすることができた。(2)洗浄に関する知識の収集と体系化これまでに開発された洗浄剤、洗浄装置、回収装置、廃液処理装置のデータ、および洗浄剤の変更、プロセスの改善、作業の変更などのリスク削減を目的とした実施例の情報を文献・特許・関連企業の情報によって調査した。また、協力研究者であるスイス連邦工科大学Konrad Hungerbuhler教授グループの開発した排出物質のリスク評価手法の適用について検討を開始した(3)化学物質の環境への排出量推定モデル(プロセスモデル)構築実験用に開発された3槽開放型洗浄装置を利用し、代表的な装置条件(例えば装置高さ)と運転条件(例えば冷却水温)による装置内液量変化を実測した。代表的な装置変数や操作変数と排出量との関係について、理論的な解析から物理モデルを構築し、実験結果による検証を行った。気相内の挙動を検討するために、実験と並行して数値流体力学シミュレーションを行った。混相状態のモデル化、蒸発・凝縮のモデル化を進め、モデルの正当性について検証を開始した。(4)情報基盤の設計と実装様々なデータとモデルを体系的に蓄積することが可能なデータベースと、そのデータベースから情報を取り出すエンジンの概念設計を行った。(1)洗浄プロセスの設計作業のアクティビティモデル化洗浄プロセスにおける現状の設計作業を解析し,要素作業に分割し,その要素間の情報の流れをIDEFOアクティビティモデリング手法によって作業モデル化した。10カ所以上の現場での実測調査および作業者へのヒアリングを行った。昨年度の実装置による実測結果と合わせて,定量的な詳細モデル化を行った。(2)洗浄に関する知識の収集と体系化これまでに開発された洗浄剤,洗浄装置,回収装置,廃液処理装置のデータを収集した。日本産業洗浄協議会の協力を得て,昨年度の成果に基づいて実際の企業に於いて削減対策を実施し,知識の検証と収集を行った。(3)化学物質の環境への排出量推定モデル(プロセスモデル)構築昨年度に続き,3槽開放型洗浄装置を利用し,代表的な装置条件と運転条件による排出量の変化を実測した。気相内の挙動を検討するために,数値流体力学シミュレーションを行い,冷却水温と外気温との大小関係によって,洗浄機内部の流動現象に違いがあり,また,これが洗浄剤蒸気の排出と大きく関連することを明らかにした。(4)環境,健康,安全リスク評価モデル構築スイス連邦工科大学グループがこれまでに体系的に整理した評価実施例を参考にし,対象としている化学物質および洗浄プロセスにおいて,実施すべきリスク評価を選定し,評価に必要な情報を抽出し,評価の結果を統合的に設計に利用するモデルを構築した。(5)情報基盤の設計と実装様々なデータとモデルを体系的に蓄積することが可能なデータベースと,そのデータベースから情報を取り出すエンジンについて,(1)のIDEFOモデルに加え, UMLモデルによって概念設計を行った。(1)要素作業における褒数間の関係のモデル専門家へのヒアリングによって洗浄プロセスの設計作業を解析し、作業モデルをIDEFOアクティビティモデリング手法によってモデル化した。ある作業を行うために他の要素作業から与えられる情報や外部から得られる情報を定義し、次の要素作業に引き渡される情報を決定した。(2)洗浄に関する知識の収集と体系化これまでに開発された洗浄剤、洗浄装置、回収装置、廃液処理装置のデータを集めデータベース化した。日本産業洗浄協議会の協力を得て、昨年度の成果に基づいて実際の企業に於いて削減対策を実施してもらいながら、知識の検証と収集を行った。(3)化学物質の環境への排出量推定モデル(プロセスモデル)構築3槽開放型洗浄装置を利用し、代表的な装置条件と運転条件による排出量の変化を実測し、気相内の挙動を検討するために、数値流体力学シミュレーションを行い、冷却水や外気温をパラメタとする排出量推定モデルを構築した。(4)環境・健康・安全リスク評価モデル構築対象としている化学物質および洗浄プロセスにおいて、これまでに実施したリスク評価のケーススタディを一般化し、統合的にリスク評価を実施し設計に利用するモデルを構築した。(5)情報基盤の設計と実装これまでにデータベース化した様々なデータと構築したモデルから、実際にプロセス設計を支援する情報基盤のプロトタイプを開発し、ワークステーション上に実装した。実務者に試用してもらい、設計に有効であることを確認した。
ターゲットの移動予測時における視線活動と脳活動様式の解明

本研究では,ターゲットの移動予測時の視線活動と脳波(EEG)をミリ秒オーダーで同時計測をすることで,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにする。本研究で得られる知見によって,移動するターゲットをどのような思考の下で見るべきか,「視線ストラテジー」を提示することで,円滑な球技スポーツの教育や指導が期待できる。ターゲットの移動を予測する際の視線活動に関するこれまでの研究の多くは,特定の位置に視線を向けた時間や回数,サッケードの回数を検討したものがほとんどである。また,視線活動と同様,ターゲットの移動予測に関する脳研究の多くは,一連の課題を通して活動する脳領域の解明にとどまっている。そこで本研究では,ターゲットの移動予測時の視線活動とEEGを,ミリ秒オーダーで同時計測をすることで,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにする。本年度は,等速で移動するターゲットと重力加速度が加わったターゲットを用いて,ターゲットを眼球で追跡している時にはどのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを検討した。視線活動の結果は,等速移動よりも重力加速度が加わったターゲットの方が,課題後期にターゲットに対する注視点の誤差が増加した。脳活動様式の結果は,等速移動よりも重力加速度が加わったターゲットの方が,課題後期に前頭と後頭領域で10 Hz未満の周波数活動が増加した。重力加速度によってターゲットが加速される中,眼球によるターゲットの追跡を反映しているものと考えられる。重力加速度が加わったターゲットを眼球で追跡している時の脳活動様式をさらに詳しく検討してみると,課題後期では前頭領域,側頭領域,視覚領域におけるθ・α波帯域の活動の増加によって,重力加速度に関する内部感覚を基に移動するターゲットを追跡していることが示された。また,移動ターゲットの加速途中では,側頭領域,頭頂領域におけるβ波帯域の活動の増加によって,ターゲットの動きを注意深く分析することによる視覚情報処理と,重力加速度に関する内部感覚の統合を計っていることが示された。本年度の目的は,1等速で移動するターゲットを用いて,ターゲットを眼球で追跡している時には,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにすること,2現実世界で物体が移動する時に受ける重力の影響を考慮して,重力加速度がある状況では,ターゲットを眼球で追跡している時に,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにすること,以上の2つであった。上記の目的を達成できるよう,早い段階で実験を行った。実験は14人の被験者がコンピュータディスプレイ上を移動するターゲットに対して眼球で追跡する課題であった。まず課題1として,等速で移動するターゲットを用いた。また課題2として,実際のターゲットが移動する時に受ける重力の影響を考慮して,重力加速度がある移動ターゲットを用いた。課題中の視線活動は,被験者から0.6m離れた19インチのコンピュータディスプレイタイプの視線計測装置であるGazefinderを用いて,サンプリング周波数50Hzで記録した。脳活動様式は,モバイル型多チャンネル脳波アンプeego sportsを用いて,頭皮上32ヵ所からサンプリング周波数1000Hzで記録した。その後,実験データの解析処理および統計処理を行い,論文投稿,査読対応,論文受理まで到達することができた。以上のことから,本年度の研究はおおむね順調に進展しているといえる。今後は,コンピュータディスプレイ上でターゲットが移動途中で遮蔽される中,眼球によってターゲットを追跡する課題時にどのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにする。まず4ー6月の期間に設備備品や実験に必要な機器備品を揃える。また同時期に実験の準備を行う。課題は,コンピュータディスプレイ上でターゲットが移動途中で遮蔽される中,眼球によってターゲットを追跡する課題を行う。まず課題1として,等速で移動するターゲットを用いる。また課題2として,実際のターゲットが移動する時に受ける重力の影響を考慮して,重力加速度がある移動ターゲットを用いる。課題中の視線活動は,被験者から0.6m離れた19インチのコンピュータディスプレイタイプの視線計測装置であるGazefinder (JVCKENWOOD社製)を用いて,サンプリング周波数50Hzで記録する。脳活動様式は,モバイル型多チャンネル脳波アンプeego sports (ant neuro社製)を用いて,頭皮上32ヵ所からサンプリング周波数1000Hzで記録する。次に7ー8月に15名の実験参加者の協力の下で実験を行う。また8ー11月に実験データの解析処理,統計処理を行う。ターゲットと視線の向けられた位置を基に,距離(=誤差)をミリ秒オーダーで求める。記録された脳波は,時間ー周波数解析を行う。これは,ターゲットと視線の向けられた位置関係に伴い,脳波のどの周波数成分が変化するかという脳活動様式を捉えることができる。11ー3月は論文投稿の準備,論文投稿,査読対応,査読結果によっては追加実験を行う。

また,視線活動と同様,ターゲットの移動予測に関する脳研究の多くは,一連の課題を通して活動する脳領域の解明にとどまっている。そこで本研究では,ターゲットの移動予測時の視線活動とEEGを,ミリ秒オーダーで同時計測をすることで,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにする。本年度は,等速で移動するターゲットと重力加速度が加わったターゲットを用いて,ターゲットを眼球で追跡している時にはどのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを検討した。視線活動の結果は,等速移動よりも重力加速度が加わったターゲットの方が,課題後期にターゲットに対する注視点の誤差が増加した。脳活動様式の結果は,等速移動よりも重力加速度が加わったターゲットの方が,課題後期に前頭と後頭領域で10 Hz未満の周波数活動が増加した。重力加速度によってターゲットが加速される中,眼球によるターゲットの追跡を反映しているものと考えられる。重力加速度が加わったターゲットを眼球で追跡している時の脳活動様式をさらに詳しく検討してみると,課題後期では前頭領域,側頭領域,視覚領域におけるθ・α波帯域の活動の増加によって,重力加速度に関する内部感覚を基に移動するターゲットを追跡していることが示された。また,移動ターゲットの加速途中では,側頭領域,頭頂領域におけるβ波帯域の活動の増加によって,ターゲットの動きを注意深く分析することによる視覚情報処理と,重力加速度に関する内部感覚の統合を計っていることが示された。本年度の目的は,1等速で移動するターゲットを用いて,ターゲットを眼球で追跡している時には,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにすること,2現実世界で物体が移動する時に受ける重力の影響を考慮して,重力加速度がある状況では,ターゲットを眼球で追跡している時に,どのような脳内処理の下で,どのような視線活動を遂行しているかを明らかにすること,以上の2つであった。上記の目的を達成できるよう,早い段階で実験を行った。実験は14人の被験者がコンピュータディスプレイ上を移動するターゲットに対して眼球で追跡する課題であった。まず課題1として,等速で移動するターゲットを用いた。また課題2として,実際のターゲットが移動する時に受ける重力の影響を考慮して,重力加速度がある移動ターゲットを用いた。課題中の視線活動は,被験者から0.6m離れた19インチのコンピュータディスプレイタイプの視線計測装置であるGazefinderを用いて,サンプリング周波数50Hzで記録した。脳活動様式は,モバイル型多チャンネル脳波アンプeego sportsを用いて,頭皮上32ヵ所からサンプリング周波数1000Hzで記録した。その後,実験データの解析処理および統計処理を行い,論文投稿,査読対応,論文受理まで到達することができた。以上のことから,本年度の研究はおおむね順調に進展しているといえる。
地域環境要因としての地下水

[霞ヶ浦]出島台地について地下水の三次元解析を行い、開析谷の地下水排水機能、台地地下水と湖水との関係を調べ、霞ヶ浦へ流出する地下水は全地下水流出量の6%にすぎないことが明らかになった。また地下水循環の過程における水質変化の実態も明らかになった。水田土壌では表層土の脱窒活性が極めて高く、下層における硝酸分布もみられなかった。畑土壌では下層12mまでの硝酸の分布が極めて高く、脱窒活性も認められた。また湖畔に繁茂するヨシなどの存在が湖の窒素負荷軽減に寄与している可能性があることも指滴された。台地地下水が谷地田へ流出する過程での【NO_3】-Nに関しては、地下水流動経路内に存在する酸化層内で濃度が大となるが、還元層を通過して浸出するとき脱窒しその濃度は急激に低下した。谷地田への流出解析によって、谷地田への地表水の直接流出が少ないことが明らかにされた。[びわ湖]シーページメータによる湖底漏出地下水の観測を継続し、その季節変化、離岸距離との関係、湖岸付近の地形地質との関係を明らかにしびわ湖全体の漏出地下水量を推定した。また野州川下流域については地下水流動解析を行い、灌漑期の地下水流動量の約60%、非灌漑期にはその約30%が湖底へ直接流出することが明らかになった。シーページメータを設置した湖底土中のU,Thの定量を行い、Raはその平衡量より少ないことがわかった。またそのRaから生じたRnが100%漏出地下水中に出現するとしても測定したRnはこれよりはるかに多いことを明らかにした。北湖西岸3地点において、湖底下20180cmの試水を採取し、その水質を漏出地下水および湖岸地下水と比較した。以上の結果に基づいて、地下水によってびわ湖へ運びこまれる栄養塩数の量を推定した。
超薄厚プラスチックシンチレータによる選別α-γ同時/反同時計数放射能測定法の開発

標的α線内用療法は、α線の特性ゆえ、腫瘍への強い攻撃効果が期待出来る上に健全細胞への影響が軽微で、近年がん治療の有力手段として世界的に注目を集め、臨床応用を目指した研究が世界的に広がっている。一方で対象のα核種には多数のα/β壊変生成核種が混在する上、複雑な分岐を伴うため、線源からエネルギーの異なる膨大な数のγ線が放出され、その放射能の定量測定には困難がある。本研究は、この困難を回避するため、超薄厚プラスチックシンチレータによりα線のみを確実に選択計数する方法とスペクトル測定手法組み合わせた、多数の壊変生成核種存在下での各核種の個別的α線検出効率評価の新手法を開発し、医療応用の発展に貢献する。
英語音声指導力の質的向上をはかる連携英語教員養成カリキュラムの開発・運用・評価

研究では、教員養成学部で、将来、小・中・高・特別支援学校の英語担当教員をめざす学生の英語音声・発音力、英語音声・発音指導力の向上を図る英語教員養成プログラムの開発と運用、運用を通じての開発したプログラムの評価・修正に取り組んだ。特に、英語音声・発音指導力の向上を図るプログラムについては、大学と地域の連携校との共同で研究を進め、開発したプログラムの実用化に向けた課題の検証を進めた。開発したプログラムは、2016年度から、大学機能強化事業の中で実用化を進め、大学を地域の中核とした教員養成・現職英語担当教員の指導力強化・地域に学ぶ児童・生徒の英語力強化プロジェクトの中で成果の利用を図っていった。本年度は、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員(小学校外国語活動、中学・高等学校英語科担当教員)を目指す1年次、2年次の学生を主な対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上、2)学生の実践的英語音声指導力の、それぞれの能力の向上をはかる、英語科教員養成カリキュラムの開発と開発のための実際の試行を進めてきた。学生の英語の発音力の向上については、これまでの研究資産を活かしながら、大学の授業を中心に、学生の英語の発音力向上のためのカリキュラム開発とそのための試行を進めた。実践的英語音声指導力の向上については、当該の学生が、大学の授業を中心に向上をはかってきた英語の発音力を活かして、附属学校・地域の連携校での実習(3、4年次)や教育参加体験プログラム(2、3、4年次)を通じて、英語音声指導力を実践的に伸ばせるような教育的な支援を、大学の授業、授業外の活動を通して進めてきた。併せて、学生の英語発音力の向上的変化が継続的に認められているかを測るために、学生の英語音声を定期的に計測・評価し、学生の英語の発音への意識調査を実施し、英語の発音力向上のためのカリキュラム開発資料として蓄積した。実践的な音声指導力の向上支援についても、学生に対して、英語の音声指導観、音声指導への意識の変化を継続的に調査し、英語音声指導力カリキュラム開発の資料として蓄積を図った。さらに、地域の学校(公立中・高併設校)と、学生の英語音声指導力の向上を支援するための教育連携を進めた。また、研究を進める一方で、中・高生の英語発音講座(公開講座)や小・中・高教員の研修会・研究会で、その都度の研究成果の地域への還元を進めた。本年度は、昨年度に引き続き、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員(小学校外国語活動、中学・高等学校英語科担当教員)を目指す1年次、2年次の学生を主な対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上、2)学生の実践的英語音声指導力の、それぞれの能力の向上をはかる、英語科教員養成カリキュラムの開発と、開発を進めてきた教育プログラムを利用しての実際の試行を進めてきた。学生の英語の発音力の向上については、これまでの研究資産を活かしながら、大学の授業を中心に、学生の英語の発音力向上のためのカリキュラム開発を進め、カリキュラムの試行を経て、現在、カリキュラムの骨格が出来上がってきた。また、研究を進める一方で、中・高生の英語発音講座(公開講座)や地域の教育委員会、教育センターの事業と連携して、小・中・高教員の研修会・研究会を通じて、研究途上段階から、継続的な研究成果の地域への還元を進め、一定の成果を上げることができた。1)学生の英語の発音力の向上をはかる教育プログラムの開発と開発を進めてきた教育プログラムの試行については、教育プログラムの骨格部分が出来上がるところまで、順調に研究が進んでいる。2)学生の実践的英語音声指導力の向上はかる教育プログラムの開発とそのための試行についても、研究は順調に進んでいる。連携校との研究については、研究推進のための地域連携を進め、研究を進める連携環境が整い、英語発音力向上支援、英語音声指導力向上支援のためのソフトウエアを導入しての研究が順調に進んでいる。3)本年度の研究の取りまとめも順調に推移し、出版物や報告書による研究成果の蓄積も進んできている。本年度は、英語音声指導力の質的向上をはかる連携英語教員養成カリキュラムの開発・運用を図るための研究を、大学と地域の教育機関と連携して実施した。また、大学内の教育プログラムの開発・運用の成果を生かして、地域の教育機関での教育体験を通じた実践的英語音声指導力の向上を図る大学・地域連携の英語指導力向上プログラムの試験的運用を進めた。

さらに、研究分担者が中心に進めてきた英語音声・発音力向上のための研究を、英語音声・発音力向上を図るソフトウェア・アプリとして具体化する研究も進めることが出来た。それぞれの研究の成果は、第42回全国英語教育学会全国研究大会、第16回小学校英語教育学会全国研究大会等での研究発表、大学と地域との連携による地域英語教育支援事業・支援プロジェクトの形で成果の公開と還元を進めた。こうした本年度の一連の研究と研究成果は、当該研究課題「英語音声指導力の質的向上をはかる連携英語教員養成カリキュラムの開発・運用・評価」の研究の目的と実施計画に沿った内容として実施・実現を図ってきたものである。折しも、昨年度末告示を迎えた次期学習指導要領の改定までの経緯からは、「小・中・高(・大)」で今後のグローバル化を視野に育成を図る次世代を担う若い世代の英語力・英語コミュニケーション力の実効的な育成がますます大きく求められている。そうした中、次の若い世代の英語教育を支える上で今後ますます求められる研究には、大学と地域が連携した英語教員養成・現職英語教員の指導力養成・地域の英語教育支援に資するためのカリキュラムや英語教育プログラムの研究があげられる。そうした見地からみて、一連の本研究課題に係る本年度までの研究は、社会的・教育的意義のある研究、研究成果と位置付けることができるものと考えられる。本年度が研究最終年度で、研究の取りまとめと成果の発信を予定していたが、研究代表者に所属機関で進めている英語教育関連プロジェクト3件のプロジェクトリーダーの用務が重なり、物理的な時間の確保が困難になり、研究最終年度の研究の取りまとめと研究成果の発信についての進捗に遅れがでた。これについては、最終年度の研究を1年延長することで、物理的な時間の確保を図り、当該の研究課題の研究計画の遂行に支障が出ない対応を行っている。本年度は、本研究課題である「英語音声指導力の質的向上をはかる連携英語教員養成カリキュラムの開発・運用・評価」の研究の、運用と評価の研究を中心に、大学と地域の教育機関(地域の公立中・高等学校)と連携して実施した。研究では、大学内を中心に進めてきた英語音声力・英語音声指導力の向上を図る教員養成教育カリキュラムの開発・試行運用・試行評価・試行結果からのカリキュラムの修正による改良の研究成果を生かし、研究最終年度版のカリキュラムを使用した、大学と地域の教育機関での教育体験を通じた実践的英語音声指導力の向上を図る大学・地域連携の英語指導力向上プログラムの本格的運用とその評価を進めた。さらに、研究分担者が中心に進めてきた英語音声・発音力向上のための研究を、英語音声・発音力向上を図るソフトウェア・アプリとして具体化する研究も本研究と相乗して進めることが出来た。それぞれの研究の成果は、第43回全国英語教育学会全国研究大会、第17回小学校英語教育学会全国研究大会等での研究発表、大学と地域との連携による地域英語教育支援事業・支援プロジェクトの形で成果の公開と還元を進めた。また、一連の研究成果は、文部科学省の委託事業として進めた、現職小学校教員を対象にした「中学校教諭二種免許状(英語)」の付与のための教員免許状認定講習事業の「英語音声学」の授業にも取り入れ、研究成果の社会的な還元にも生かすことができた。
免疫抑制剤を局所投与した移植骨の骨系細胞におけるNFATシグナルの解析

骨吸収を担う破骨細胞や骨形成を担う骨芽細胞の分化にNFATが深く関与していることが明らかにされ、関心が高まっている。本研究では自家骨移植と考えうる同系マウスの骨移植の実験モデルを作製し、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA(CsA)を移植骨に持続的に投与して、骨系細胞におけるNFATシグナルの解析を行った。摘出した移植骨を軟X線撮影して骨塩量を比較したが、CsA投与骨と生食を投与した対照骨で明らかな違いは見られなかった。CsA投与骨の破骨細胞数は減少していたが、骨芽細胞数にも減少傾向があり、NFATの抑制によるリモデリングの低下が生じていたことが推測された。また、Fas介在性アポトーシスにNFATが関与していることが示唆された。NFATは炎症性サイトカインの産生を促す転写因子として研究され、免疫抑制剤であるCsAやFK506はNFATの機能を阻害し、免疫抑制作用を起こす。我々は破骨細胞へのCsA投与がアポトーシスを誘導すること、破骨細胞にNFATが発現していること、破骨細胞分化因子であるRANKLによってNFATの発現が上昇すること、破骨細胞系株に活性型NFATを過剰発現させるとRANKL投与なしに骨吸収能を持つ破骨細胞へと分化することなどを発見した。本研究の目的は自家骨移植と同様とみなせる同系骨移植の実験系を用いて、局所投与したCsAによって抑制される各骨系細胞のNFAT活性が移植骨の骨吸収、骨形成に及ぼす役割を骨形態学的、免疫組織学的、分子生物学的に明らかにすることである。本年度は同系マウスを用い、donorマウスの両側脛骨を摘出し、一方の脛骨にCsAを、他方の脛骨に0.9%NaClを、オスモティックミニポンプを用いて持続的に投与できるようにし、recipientマウスの側背部両側皮下へ移植した。それぞれ濃度や投与期間の異なる群を作り、一定の投与期間の後、移植骨を摘出した。摘出した移植骨は固定後、実体顕微鏡を用いてマクロ写真撮影およびSOFTEXでの軟X線撮影を行った。その後、対であるCsA投与骨と対照骨の、同一部位から横断組織標本を作製し、移植骨の外骨膜側および骨髄腔内における新生骨(皮質骨)の面積を測定中である。軟X線写真では明らかな骨塩量の変化は認めていないが、今後引き続き各種骨形態計測を行う予定である。我々は破骨細胞へのCsA投与がアポトーシスを誘導すること、破骨細胞にNFATが発現していること、RANKLによってNFATの発現が上昇すること、破骨細胞系株に活性型NFATを過剰発現させると破骨細胞へと分化することなどを発見した。平成20年度は平成19年度の実験を継続しながら、同系骨移植の実験系として同系マウスであるC3H/HeJ-+/+マウス、およびFas欠損同系マウスであるC3H/HeJ-Ipr/lprマウスを用い、donorマウスの両側脛骨を摘出し、近遠心両骨端を切断の後、ポリエチレンチューブを介してオスモティックミニポンプを移植骨の骨髄腔内に接続、一方の脛骨にCsAを、他方の脛骨に0.9%NaClを持続的に投与した。これら一対の脛骨と、接続されたオスモティックミニポンプ(2個)は、同系統のrecipientマウスの側背部皮下の両側へ移植し、局所投与したCsAが移植骨に与える効果を解析した。一定の投与期間の後、移植骨を摘出、固定し、マクロ写真および軟X線撮影を行った。その後CsA投与骨と対照骨の、同一部位から横断組織標本を作製し、新生骨の面積の測定・比較を行った。また、TRAP染色陽性の破骨細胞数や骨芽細胞に覆われた骨面の長さの測定を行っている。また、摘出した骨組織をhomogenizeした後RNAを抽出し、今後PCRを行い、NFATやRANK(RANKLレセプター)、RANKL、OPG、COX1, 2、VEGF、Fas/FasLなどの発現量を定量する予定である。NFATは炎症性サイトカインの産生を促す転写因子として研究され、免疫抑制剤であるCsAはNFATの機能を阻害し、免疫抑制作用を起こす。我々は破骨細胞へのCsA投与がアポトーシスを誘導することや破骨細胞にNFATが発現していること、破骨細胞系株に活性型NFATを過剰発現させると破骨細胞へと分化することなどを発見した。

平成21年度は平成20年度までの実験を継続しながら、同系骨移植の実験系として同系マウスであるC3H/HeJ-+/+マウス、およびFas欠損同系マウスであるC3H/HeJ-lpr/lprマウスを用い、donorマウスの両側脛骨を摘出し、近遠心両骨端を切断の後、ポリエチレンチューブを介してオスモティックミニポンプを移植骨の骨髄腔内に接続、一方の脛骨にCsAを、他方の脛骨に0.9%NaClを持続的に投与した。これら一対の脛骨と、接続されたオスモティックミニポンプ(2個)は、同系統のrecipientマウスの側背部皮下の両側へ移植し、局所投与したCsAが移植骨に与える効果を解析した。一定の投与期間の後、移植骨を摘出、固定し、マクロ写真および軟X線撮影を行った。その後CsA投与骨と対照骨の、同一部位から横断組織標本を作製し、新生骨の面積の測定・比較を行い、CsA投与骨では破骨細胞数の減少を認めた。また、摘出した骨組織をhomogenizeした後RNAを抽出し、PCRを行い、NFATやRANK(RANKLレセプター)、RANKL、OPG、Fas/FasLなどの発現量を定量した。
文字列解析のための統計理論とその計算生化学への応用

本研究プロジェクトでは、まず、私達の以前の研究において文字列の非可換位相半群A*上で展開した確率論を拡張し、いくつかの極限定理を証明した。次に、これらの定理を用いて、A*においてマージン最大化原理の下で学習する学習機械の理論を構築し、それをRNAの2次構造とタンパク質間相互作用の予測問題に応用して、実際のデータ解析におけるその有用性を示した。更に、A*上で混合モデルの理論を構築して、文字列データの教師なしクラスタリング方式を導出し、上述の定理を用いて、その最適性を証明した。最後に、A*上の分布に対して中央及び中心文字列を定義し、それらを効率的に探索するアルゴリズムを構成した。[1]これまでデータと言えば、数や数ベクトルが大部分を占めていたが、近年、計算機科学や生物学において、テキストデータや生物配列など、大量の文字列データが生成されるようになり、文字列データの統計的な解析方法が、様々な領域で必要とされてきている。数データに対する統計学は、確率論に基づいて厳密に構築されている。これと同様に、テキストマイニングの手法やバイオインフォマティクスにおける生物配列解析の方法に対しても、文字列の集合上の確率論に基づいた新しい方法の開発や既存の方法の体系化が、今後求められるようになるだろう。[2]このような問題意識から、本年度、我々は、小谷野と彼の以前の共同研究者が展開した、あるアルファベット上の文字列の全体がなす位相半群上の確率論を拡張した。[3] [2]で得られた結果を応用して、文字列の位相半群上で動作する学習機械の理論を構築し、文字列データの識別方法を提案して、その漸近的な最適性を示した。[4]また、文字列の位相半群上で混合モデルとそれに対するEMアルゴリズムの理論を構築し、それに基づいた文字列データの教師なしクラスリング方法を提案し、その精度を漸近理論の枠組みで検討した。[5]アミノ酸配列を用いたタンパク質間相互作用の予測問題に[3]で述べた方法を応用して、実際のデータ解析におけるその有用性を示した。昨年度は、2014年度に得た文字列の非可換位相半群A*上の確率論における結果とそれに基づいて構築した文字列データを教師付きの仕方で識別する学習機械の理論を応用して、塩基配列を用いたRNAの2次構造の予測及びアミノ酸配列を用いたタンパク質間相互作用の予測の研究を行った。また、A*上で混合モデルとEMアルゴリズムの理論を展開することにより、文字列データを教師なしの仕方で分類する統計理論を構築した。これらの研究の結果を次の3本の論文にまとめた(3本目は査読中)。本研究プロジェクトは、[1]文字列の非可換位相半群A*上で確率論を整備する、[2] [1]の結果に基づいて、文字列データを教師付きの仕方で識別する学習機械の理論を構築する、[3] [1]の結果に基づいて文字列データを教師なしの仕方で分類する統計理論を構築する、[4] [2]の方法を応用して、アミノ酸配列を用いたタンパク質間相互作用の予測と塩基配列を用いたRNAの2次構造の予測の研究を行う、[5] [3]の方法を応用して、16SリボソームRNA遺伝子配列を用いたgamma多様性の測定の研究を行う、という5つの部分からなっているが、2014年度と昨年度までで[1]から[4]までが終わっているため。本研究プロジェクトでは、まず、私達の以前の研究Koyano and Kishino, Physical Review E, 2010において、生物配列の統計的な解析方法の開発のために構築した、アルファベットA上の文字列の全体が作る非可換位相半群A*上の確率論を拡張し、後で必要となる極限定理を揃えた。次に、これらの結果を応用して、A*においてマージン最大化原理の下で学習する機械学習の理論を構築した。ハードマージンとソフトマージンの場合の学習アルゴリズムを定式化し、それらの計算量を評価した上で、上述の極限定理を用いて、ある正則条件の下でその学習機械が漸近的に最適な仕方で文字列データを識別することを証明した。また、構築した学習機械を、塩基配列を用いたRNAの2次構造の予測問題とアミノ酸配列を用いたタンパク質間相互作用の予測問題に応用して、実際のデータ解析におけるその有用性を示した。次に、A*上にパラメトリックな分布を導入し、その基本的な性質を調べることから始めて、その混合モデルに対するEMアルゴリズムの理論を構築し、上述の極限定理を応用することにより、その混合モデルに基づいて、正しい分類を行う事後確率が最大化されるという意味で漸近的に最適な、文字列データの教師なしクラスタリング方式を構成した。現在、この方法を用いて相同遺伝子の集団のgamma多様性の解析を行っている。更に、A*上に分布に対して中央文字列と中心文字列を導入し、A*がLevenshtein距離によって距離空間をなしている場合にその探索問題を考察し、効率的にそれらを見つけるアルゴリズムを構成した。

最後に、A*上の分布に対して中央及び中心文字列を定義し、それらを効率的に探索するアルゴリズムを構成した。本年度は、「研究実績の概要」欄で述べたように、(i)文字列の位相半群上の確率論の拡張、(ii) (i)で得られた新しい結果を応用した、文字列の位相半群上で動作する学習機械の理論の構築、(iii)文字列の位相半群上の混合モデルとEMアルゴリズムの理論の構築、及び(iv) (ii)で提案した文字列データの識別方法の、計算生化学上の問題への応用に取り組めたため。本研究プロジェクトの最終年度である本年度は、上の【現在までの進捗状況】において述べた本プロジェクトの最後の部分である[5]の研究を行う。現在、林田が京都大学化学研究所のKEGGデータベースのデータの前処理を行っており、小谷野のデータ解析のためのプログラムを作成している。また、最後に3年間の研究の総括を行う。応用数学、数理統計学、バイオインフォマティクス[1]本年度は、「研究実績の概要」欄の[4]で述べた、文字列の位相半群上の混合モデルとEMアルゴリズムの理論に基礎を置く、文字列データの教師無しクラスタリングの方法を、計算生物学に応用することにより、実際のデータ解析におけるその有用性を立証し、生物学的に新しい知見を得る研究に取り組む。[2]また、必要な確率論上の結果を準備した上で、文字列データに対するデータ同化法を構築する研究に取り組む。この方法は、来年度、集団生物学の問題に応用する。昨年度投稿した論文の出版費用として計上していたが、現在査読中であり、出版に至らなかったため。投稿している論文がアクセプトされた場合の掲載料に備えて研究費を残していたが、年度内にはアクセプトに至らなかったため。今年度、論文の出版費として使用する予定である。投稿している論文の来年度の掲載料として使用する。
トリチウム水のマウスin vivo暴露におけるRBEの検討

1.B6C3F1マウスにトリチウム水を63.0MBq,126MBq,189MBq,252MBqを腹腔内投与した。2.新鮮尿を経時的に採取しトリチウム濃度を液体シンチレーションカウンターで測定し、吸収線量の評価を行った。その結果、投与40日目までの線量は、それぞれ0.92Gy,2.06Gy,3.29Gy,4.57Gyであった。3.トリチウム水投与4143日に、各群マウスを屠殺解剖し、脾臓リンパ球中のチオグアニン抵抗性突然変異誘発頻度を検討した。その結果、リンパ球100万個中の突然変異頻度は、線量に対し直線的な関係を示し、1Gy当り16.7個の増加を認めた。4.誘発突然変異頻度が100万個当り50個になる影響を指標として比較すると、X線1回急性照射の場合と比較し、トリチウム水β線のRBEは約0.67となった(含水率の補正は行わず)。5.本来は標準放射線としてトリチウムシュミレーターを使用する予定であったが、稼働が遅れたためX線急性照射の結果と比較した。トリチウムシュミレーターに関しては、現在照射中であり、今後、結果が出しだいRBEを再度検討する予定である。
イソプレニルトリプトファン含有ペプチドの探索

翻訳後修飾によるトリプトファン残基のイソプレニル修飾の普遍性を検証することを目的とした研究を行い、枯草菌由来のイソプレニルトリプトファン含有ペプチドであるComXフェロモンの前駆体であるComXペプチドと、その修飾酵素であるComQ、およびイソプレニル2リン酸、マグネシウムイオンのそれぞれを用いたinvitro酵素反応による修飾反応に成功した。枯草菌のComXフェロモン以外でトリプトファン残基のイソプレニル修飾が発見された例はない。しかし、システイン残基のイソプレニル修飾の普遍性が明らかにされていることなどを踏まえるとトリプトファン残基のイソプレニル修飾も普遍的に存在する可能性が高いと予想された。そこで、本研究ではComXフェロモンにおけるトリプトファン残基のイソプレニル修飾の普遍性を検証することを目的とした。まず、イソプレニルトリプトファンを含有したハプテンを合成した。これを基にポリクローナル抗体を作製したものの抗体価が低く、実際に検出に使用することは困難であると考えられた。そこで、RO-E-2株由来のComXRO-E-2フェロモンの修飾トリプトファン残基におけるゲラニル基が生理活性に必須であることを証明するために、有機合成により各種イソプレニル変異ComXフェロモンを合成し、それぞれの生理活性の比較を行った。その結果、ゲラニル基の2重結合を還元するだけでほとんど活性を消失することを見いだし、側鎖のゲラニル基の化学構造は活性発現に重要であることが判明した。次に、分子生物学的手法によりcomQの過剰発現大腸菌を作製した。得られた修飾酵素ComQの反応条件を検討し、この酵素が金属Mg2+を必要とすることを見いだし、in vitro ComQ酵素反応によるComXのイソプレニル化活性をLC-MSを用いて評価する条件を確立した。最後に、他の生物種からイソプレニルトリプトファン含有ペプチド候補を選別し、分子生物学的手法によりcomQX候補の過剰発現大腸菌を作製したが、両候補とも発現しなかった。今後はベクターの種類、配列などを検討し、comQX候補過剰発現大腸菌を作製し、その後、構築した検出法を適用する予定である。今後は、構築した検出法を基に他の生物種からイソプレニルトリプトファン含有ペプチドを探索する方法を検討する予定である。残念ながら、イソプレニルトリプトファン含有ペプチドをハプテンとしたポリクローナル抗体による新規イソプレニルトリプトファン含有ペプチドの探索は困難であったものの、本年度の研究成果により、ゲラニル基が活性発現に重要であることが判明した。また、LC-MSを用いた、in vitro ComQ酵素反応によるComXのイソプレニル化活性を評価する条件を確立でき、他の生物種からイソプレニルトリプトファン含有ペプチドを探索する新たな手法を構築することが出来た。なお、これらの成果は各論文に投稿し受理された、もしくは現在準備中である。以上よりおおむね順調に進展していると考えられる。構築したin vitroComQ酵素反応によるComXのイソプレニル化活性を評価する方法を基に、comX過剰発現大腸菌の各種comX変異体、もしくはペプチドシンセサイザーを用いて合成したComXペプチド変異体を用いて、基質であるComXの重要配列を探ることで、新規修飾ペプチドの探索に必要なアミノ酸配列を決定する。決定したコンセンサス配列を基にComXの相同性検索による新規修飾ペプチドの探索を行うことを試みる。これに並行して、comQ過剰発現大腸菌の各種comQ変異体を用いて、修飾酵素ComQの重要配列の解明を行うことで、新規修飾ペプチドの探索に必要なComQのアミノ酸配列を決定する。決定したコンセンサス配列を基にComQの相同性検索による新規修飾酵素の探索を行い、さらに新規修飾ペプチドの探索を行うことを試みる。

得られた候補生物の内、枯草菌以外のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌を中心に様々な微生物の培養を行い、申請者が構築したComXフェロモンの抽出方法に準じて抽出を行い、各検定溶液を調製する。得られた培養液を、LC-MS分析によりイソプレニルトリプトファン含有ペプチドが分泌されていることを証明する予定である。さらに直接的な証拠を得るために、イソプレニルトリプトファン含有ペプチド、もしくは酵素処理により得られる断片化ペプチドを化学合成し、両者を比較し、イソプレニルトリプトファン含有ペプチドであることを証明する。最終的に得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。平成24年度は、ペプチドを合成するための合成用試薬、合成ペプチドを精製するためのHPLC溶媒を購入する予定である。さらに、ペプチドを検出するためのUV検出器を購入する予定である。また、酵素反応の評価のための生化学用試薬や、コンセンサス配列決定のための分子生物学試薬を購入する予定である。続いて各種細胞培養用の試薬が必要になる。その他、論文作成のための、論文校閲費や、論文掲載費が必要となる予定である。また、最新の研究についての発表、情報交換のために国内出張費、海外発表を行う予定である。以上のように平成24年度は、全ての研究経費を適切に使用する予定である
膝蓋腱の基質再構築現象において外来性線維芽細胞が果たす役割の分離とその統合的解明

1.方法1)実験動物として雌成熟日本白色家兎72羽(体重:3.6±0.4kg,平均±標準偏差)を使用し,以下の3群に各24羽に分けた.2)I群の右膝蓋腱に対しては,in situ凍結解凍処理により膝蓋腱の内在性細胞を死滅させた後,pore size 193μmのnylon製filterにて膝蓋腱を2重に包むwrapping処理にて,周囲組織からの外在性細胞の侵入を抑止した.3)II群の右膝蓋腱に対しては,凍結解凍処理を行わずにI群と同じwrapping処理を施行した.4)III群の右膝蓋腱に対してはin situ凍結解凍処理のみを行った.5)各群とも術後,外固定を施さずにケージ内で飼育し,術後1,3および6週にて8羽ずつ屠殺し,各時期3羽に対しては組織学的観察を5羽に対しては力学的特性の検討を行った.2.結果1)組織学的観察ではI群は膝蓋腱実質部内に6週まで細胞は認められなかった.一方,II群は正常膝蓋腱同様と同様であった.III群は1週で膝蓋腱実質部の線維芽細胞は消失し,3週より腹側よりの多数の細胞浸潤を認め,6週においてその細胞数は増加していた.2)膝蓋腱の力学特性に関しては,III群の引張強度および弾性率はI群およびIIのそれに比し,有意に低値を示した.3.結論本研究により,外在性細胞侵入は内在性細胞壊死後膝蓋腱の引張強度および弾性係数を有意に低下させることが証明された.したがって,内在性細胞壊死後の膝蓋腱の力学強度の低下は内在性細胞壊死自体によるものでなく,外在性細胞の生体反応が原因と示唆された.1.方法1)実験動物として雌成熟日本白色家兎72羽(体重:3.6±0.4kg,平均±標準偏差)を使用し,以下の3群に各24羽に分けた.2)I群の右膝蓋腱に対しては,in situ凍結解凍処理により膝蓋腱の内在性細胞を死滅させた後,pore size 193μmのnylon製filterにて膝蓋腱を2重に包むwrapping処理にて,周囲組織からの外在性細胞の侵入を抑止した.3)II群の右膝蓋腱に対しては,凍結解凍処理を行わずにI群と同じwrapping処理を施行した.4)III群の右膝蓋腱に対してはin situ凍結解凍処理のみを行った.5)各群とも術後,外固定を施さずにケージ内で飼育し,術後1,3および6週にて8羽ずつ屠殺し,各時期3羽に対しては組織学的観察を5羽に対しては力学的特性の検討を行った.2.結果1)組織学的観察ではI群は膝蓋腱実質部内に6週まで細胞は認められなかった.一方,II群は正常膝蓋腱同様と同様であった.III群は1週で膝蓋腱実質部の線維芽細胞は消失し,3週より腹側よりの多数の細胞浸潤を認め,6週においてその細胞数は増加していた.2)膝蓋腱の力学特性に関しては,III群の引張強度および弾性率はI群およびIIのそれに比し,有意に低値を示した.3.結論本研究により,外在性細胞侵入は内在性細胞壊死後膝蓋腱の引張強度および弾性係数を有意に低下させることが証明された.したがって,内在性細胞壊死後の膝蓋腱の力学強度の低下は内在性細胞壊死自体によるものでなく,外在性細胞の生体反応が原因と示唆された.1.方法(1)雌成熟日本白色家兎64羽を以下の各16羽3群に分け右膝蓋腱に外科的処置を行ない,術後3および6週で各群とも8羽ずつ屠殺し,5羽を力学的解析へ3羽を組織学的観察へ供した.なお,外科的処置を施さない左膝蓋腱を正常対照とした.(2)I群:in situ凍結解凍処理により膝蓋腱線維芽細胞を完全に死滅させた後,「半透被膜処理」を加えて外来性細胞の侵入を阻止した。(3)II群:in situ凍結解凍処理により膝蓋腱線維芽細胞を完全に死滅させた後,「半透被膜処理」を行なわず外来性の細胞浸潤を許した。(4)III群:「半透被膜処理」が膝蓋腱に与える影響を検討するため,in situ凍結解凍処理を加えずに「半透被膜処理」のみを加えた.2.結果(1)IおよびIII群の弾性係数は正常膝蓋腱との間に有意差はないものの,II群は6週では正常膝蓋腱に比較し有意に低下した.(2)組織学的には処置後,6週までI群の膝蓋腱実質部には細胞成分が存在していなかった。II群の膝蓋腱は3週では表層1/3まで楕円形の核を有する線維芽細胞が浸潤し,6週では全層にわたり同細胞の浸潤を認めた。III群の膝蓋腱は正常対照の膝蓋腱と明らかな相違は存在しなかった。また,II群の膝蓋腱のコラゲン線維配列は不規則であるのに対し,IおよびIII群ではコラゲン線維配列は規則であった.3.結論:壊死後に外来性細胞浸潤を許した膝蓋腱ではマトリックスの力学的低下が認められたのに対し,少なくとも6週間は無細胞の環境下でも膝蓋腱マトリクスは力学的特性の低下は認められなかった。これら結果より,壊死後の膝蓋腱の力学的劣化には外来性細胞浸潤が関与していることが明らかとなった.