hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳腫瘍における癌遺伝子増幅の免疫組織化学的研究

63年度当研究課題の主眼は、精製された癌遺伝子cDNA probeをビオチンラベルし、histo-in situ hybridization法にて細胞形態を温存しながら癌遺伝子mRNAを組織学的に検出する、その方法論の確立と手技の熱練にあった。癌遺伝子DNAはJCRBより提供を受け、遺伝学教室を通じて安定して供給された。研究の出発点は、cーmyc mRNAを脳神経外科教室に継代されているグリオーマ培養細胞内に組織染色で証明するところから始まった。ビオチンラベルはnick translationで行い、ヒトc-myc cDNA probeはEcoR1-EcoR1断片(2.2Kb)をそのまま使い、histo-in situ hybridizationの固定条作やhybridizationの条件は中根等の方法に準じ、検出はHRP標識ABC法を用いた。グリオーマ培養細胞は、ヒト及びラット由来の5種類で、結果は全ての細胞系においてc-myc mRNAの発現を細胞内に証明し、発定した再現性を獲得することができた。P^<52>標識probeを用いたSouthern blotの結果は、ヒトグリオーマ2系では、リンパ芽球に比し1.8倍程度のc-myc遺伝子の増幅が認められNorthern blotではβ-actinをコントロールとしてc-myc mRNAの発現を確かめた。一方ラットグリオーマでは、両blot共に弱く検出され、使用したprobeかヒト由来のためhomologyの違いが弱く検出された原因ではないかと推測された。c-myc遺伝子産物に対する市販並びにロッシュ社提供の単クローン抗体で、培養細胞を免疫染色すると、ヒトグリオーマでは核が、ラットグリオーマではむしろ細胞質が染色された。我々は、現在これらの手技を、他の癌遺伝子c-H-ras、c-erbB2、EGFRgene、V-sisにも適用し、また術中切除標本を対象として応用することを目標に、更に研究を推進中である。以上の結果の一部は、順次、日本癌学会、ヨーロッパ神経病理学会、日本脳神経外科学会に報告した。
リサイクル・廃棄資源の飼料化による小型肉草食家畜の活用体系の確立

現在未利用のまま廃棄されている資源を飼料化して多産な小型草食獣に与え、食肉を効率よく生産する体系を確立すべく、生体の様々な物質の構造解析が可能で、生命現象をリアルタイムに検出できる核磁気共鳴装置(生体NMR)を駆使して消化管や筋の生理機能を解析し、飼料の有効性を評価する手法を確立するために本研究を進めた。その過程で、廃棄資源の多くが様々な環境ホルモン様の汚染物質を含むことが分かってきた。単に食資源を増産するのみならず、得られた食料が安全であることが現在社会の大きな要求であることから、動物性食品の安全性を非破壊的に検出評価する手法をも新たに開発した。すなわち、核磁気モーメント原子(^1H、^<31>P等)を含む物質を検出し3次元解析できる生体NMRを駆使し、草食動物の消化器官、肝、筋の高エネルギーリン酸代謝物やリン脂質を検出定量し、従来法では明らかに出来なかった数々の生理現象を可視化した。リアルタイムに消化管内のグルコピラノース鎖数と量を計測し、空間配置を視覚化することによって、セルロースやヘミセルロースが消化管内でグルコースまで分解され、腸管から吸収され、肝へ移行して代謝される過程を体外から経時的に観測できるよう、プロトンシグナルから糖鎖構造を解析するプログラムを修正して、生体消化管内の多糖の可視化を図った。さらに^<31>Pシグナルから筋と肝のエネルギー代謝などの生理機能を3次元空間配置を保持しながら生化学的方法より100倍以上高感度に検出し、粗食でより効率良く産肉しかつ多産である小型草食獣を育種する系を確立する基礎データを集積した。併せて、本手法を応用して様々な環境ホルモン様汚染物質を、非破壊的に空間情報を保って検出できる分析法を確立した。このようにして、リサイクル・廃棄資源の飼料としての活用体系構築の基板を築いた。廃棄されている未利用のセルロースなどの多糖資源を飼料化して多産な小型草食獣に与え、食肉を効率よく生産する体系を確立するべく、生体の様々な物質の構造解析が可能で、生命現象をリアルタイムに検出できる核磁気共鳴装置(生体NMR)を駆使して消化管や筋の生理機能を解析し、飼料の有効性を評価する手法を確立する。核磁気モーメント原子(1H、31P等)を含む物質を検出し3次元解析できる生体NMRを駆使し、草食動物の消化器管、肝、筋の高エネルギーリン酸代謝物やリン脂質を検出定量し、従来法では明らかに出来なかった数々の生理現象を可視化できた。さらに、31Pシグナルから筋と肝のエネルギー代謝などの生理機能を3次元空間配置を保持しながら生化学的方法より100倍以上高感度に検出することで、粗食でより効率良く産肉しかつ多産である小型草食獣を育種する系を確立すべく、農業生産未利用資源を動物に給与してNMRにて飼料としての優劣を評価するための評価選抜パラメターの選定を進めた。機器操作、計測手技に関わる基礎検討は概ね予定通りの成果のもと終了できたので次年度以降はさらに研究を物質レベルで深く掘り下げ、多面的かつ総合的に消化管内で糖質代謝、即ち分解と吸収を制御している機構を解明し、それに基づいて、リサイクル、廃棄資源の飼料としての活用体系を構築する。

食糧確保の問題は人類にとって地球規模で急ぎ解決しなくてはならない最重要課題である。特に優良な蛋白質を供給する食資源動物の効率的な増産は、植物と比較して改良に時間を要するのでより難しい課題である。一方で様々な化学物質による食糧汚染が人類と動物の生存を脅かす要因となってきているが、人類はいつの時代にもその時代の先端技術を取り入れて食糧増産を実現してきた。食糧危機と食糧汚染を克服するために廃棄されている未利用セルロース資源を飼料化し、多産な小型草食獣に与えて食糧を効率よく生産する体系を確立すべく本研究を進めている。すなわち大型家畜に専用飼料を給与して食肉を生産するのとは逆に小規模な余剰物利用型食肉生産系で環境を破壊せずに人と食を競合しないエコシステムを開発し、食糧として安全性に注目して新たに飼料化したものが食糧汚染の原因となって人を汚染しないことを調べることで畜産物の安全性を保証する技術を確立しようとしている。本年度は主に家畜の体内に取り込まれた環境汚染物質を生体核磁気共鳴装置(NMR)を用いて非破壊的にリアルタイムに検出解析できる手法を開発した。実験動物や小型草食動物を用いて環境汚染物質の解毒を一手に引き受ける肝におけるin vivoおよびin vitro両系で環境汚染物質をNMRにて検出・解析する観測条件を決定した。続いてこの観測データをイメージングワークステーションにて3次元立体画像として構築できるプログラムを完成させることができた。この3次元イメージング型NMRを用いる方法を利用すると、経口的に摂取される天然物を含む各種の催奇形性物質に起因する胎児奇形を妊娠早期から画像データとして容易に検出できることを実証できた。このことは当初予定していた以上の成果で、発生生物学全般にも貢献すると考える。現在未利用のまま廃棄されている資源を飼料化して多産な小型草食獣に与え、食肉を効率よく生産する体系を確立するべく、生体の様々な物質の構造解析が可能で、生命現象をリアルタイムに検出できる核磁気共鳴装置(生体NMR)を駆使して消化管や筋の生理機能を解析し、飼料の有効性を評価する手法を確立するために本研究を進めた。その過程で、廃棄資源の多くが様々な環境ホルモン様の汚染物質を含むことが分かってきた。単に食資源を増産するのみならず、得られた食料が安全であることが現在社会の大きな要求であることから、動物性食品の安全性を非破壊的に検出評価する手法をも新たに開発した。すなわち、核磁気モーメント原子(^1H、^<31>P等)を含む物質を検出し3次元解析できる生体NMRを駆使し、草食動物の消化器官、肝、筋の高エネルギーリン酸代謝物やリン脂質を検出定量し、従来法では明らかに出来なかった数々の生理現象を可視化した。リアルタイムに消化管内のグルコピラノース鎖数と量を計測し、空間配置を視覚化することによって、セルロースやヘミセルロースが消化管内でグルコースまで分解され、腸管から吸収され、肝へ移行して代謝される過程を体外から経時的に観測できるよう、プロトンシグナルから糖鎖構造を解析するプログラムを修正して、生体消化管内の多糖の可視化を図った。さらに^<31>Pシグナルから筋と肝のエネルギー代謝などの生理機能を3次元空間配置を保持しながら生化学的方法より100倍以上高感度に検出し、粗食でより効率良く産肉しかつ多産である小型草食獣を育種する系を確立する基礎データを集積した。
モンテカルロ法・分子動力学法融合型次世代電子線リソグラフィシミュレーションの開発

電子散乱のモンテカルロ法と分子動力学法を組み合わせることにより、分子レベルでパターン形成過程を再現できる電子線リソグラフィシミュレーションを開発した。電子線露光過程はモンテカルロ法により求めたレジスト中の吸収エネルギー分布に基づきレジスト分子の主鎖を切断することで再現した。現像過程は電子線露光により切断された分子切片を小さなものより順に表面から除去して行くことで再現した。開発したシミュレーションにより、パターンの形成過程、ラインエッジラフネス、有機高分子試料の電子線照射損傷を解析することが出来た。電子散乱のモンテカルロ法と分子動力学法を組み合わせた電子線リソグラフィシミュレーションの開発を行った。電子線露光過程は非弾性衝突の結果としてのポリマーの主鎖切断を導入することによりモデル化を行なった。また、その後の現像過程をモデル化した。電子線レジストはポジ型のポリメタクリル酸メチルを対象とした。まず、従来型の電子散乱のモンテカルロ法により、電子照射によるレジスト薄膜中のエネルギー吸収分布を求めておき、分子動力学法の一定の時間ステップごとにその空間分布で重みを付けてレジストを構成するポリマー分子の主鎖切断をランダムな位置に導入することでレジスト薄膜の露光過程を再現した。次に、リソグラフィにおける現像過程を電子照射後のレジスト薄膜内の分子量分布を基にモデル化した。電子照射後のポジ型のレジスト薄膜は電子照射の及んだ領域のみ分子量の低下が見られる。電子線リソグラフィでは、この分子量の低下した領域が現像過程によって除去される。そこで、分子量の小さな分子から順に除去しながら、分子動力学法により構造緩和することで現像過程を再現した。開発した電子線リソグラフィの分子シミュレーションによりレジストパターンの形成過程を解析したところ、分子レベルのラフネスをもつパターン構造を再現することができた。また、電子線露光で形成されるレジストパターンの加速電圧依存性の解析においては、加速電圧によるラインエッジラフネスの大きさの違いが確認された。開発したシミュレーションは電子線リソグラフィにおけるナノスケールのパターン形状評価に有力な解析ツールとなることが期待できる。電子散乱のモンテカルロ法と分子動力学法を組み合わせた電子線リソグラフィシミュレーションの開発において、本年度は現像過程のモデルの改良を行った。また、開発したシミュレーションにより、露光条件と現像条件をパラメータとし、形成されるパターン形状やラインエッジラフネスの解析を実施した。本手法では、分子動力学法の一定の時間ステップごとにモンテカルロ法により求めたレジスト薄膜中のエネルギー吸収分布で重みを付けてレジストを構成するポリマー分子の主鎖切断を導入することでレジスト薄膜の露光過程を再現する。続く現像過程のシミュレーションでは、昨年度までは分子の現像液界面からの距離は考慮せず、分子量の小さい順にレジスト中の分子を一斉に除去していたが、本年度は現像液界面からの距離に依存した溶解モデルを導入することにより改良を行った。すなわち、レジスト分子を現像液との界面に近い分子から順に除去して行き、現像が進行して新たな界面が形成されるとその形成された界面に近い分子を次に除去することでレジストの溶解過程を再現した。これによりレジスト現像の深さ方向への進行を再現することが可能となった。開発した電子線リソグラフィの分子シミュレーションにより形成されるレジストパターンのラインエッジラフネスの加速電圧依存性と露光量依存性の解析を行ったところ、電子散乱の影響が抑制される高加速電圧やショットノイズ効果が抑制される高露光量でラインエッジラフネスが小さくなり、実験と整合性のある結果が得られた。電子散乱のモンテカルロ法と分子動力学法を組み合わせた電子線リソグラフィシミュレーションの開発を目的に、電子線照射下のレジスト薄膜の構造変化を分子レベルで解析した。電子衝突過程は大きく分けて弾性衝突と非弾性衝突からなり、まず、弾性衝突過程のみを導入したレジスト薄膜への電子照射の分子シミュレーションを実施した。入射電子から衝突原子への運動量移行は微分衝突断面積に基づく二体衝突理論より求めた。入射電子の衝突するポリマー構成原子はランダムに選択した。試料サイズが小さいため、レジスト中での電子の多重散乱や基板からの後方散乱は導入していない。一定の時間ステップごとに電子衝突による運動量移行をポリマー構成原子に与えながら、ポリマー分子の運動を分子動力学法により追跡し、電子線照射下のレジスト薄膜の構造変化を再現した。分子動力学法では原子結合間距離、原子結合角、結合のねじれに依存する結合力と、分子間のファン・デル・ワールス力を表すポテンシャルを用いて分子挙動を計算した。開発した分子シミュレーションにより収束電子線照射によるシリコン基板上のレジスト(ポリメタクリル酸メチル)薄膜の構造変化を解析した結果、加速電圧が大きくなるほど、照射領域のレジスト構成分子の数はより大きく減少したが、電子照射の影響を受けた領域の横方向の広がりは小さくなった。また,照射領域におけるポリマー分子の挙動を可視化し、弾性衝突によりポリマー分子の絡まりが解けて行く過程を示すことができた。これらの結果は、電子線リソグラフィだけでなく、有機高分子材料の電子顕微鏡観察における照射損傷理解のためにも重要な基礎的知見となる。

二年目の実施項目として掲げたポリマー分子の主鎖切断導入による電子線露光過程とその後の現像過程のモデル化は終了した。開発したシミュレーションを用い、電子線リソグラフィの分子レベルのパターン形成解析を行い、成果を学会において報告した。初年度の実施項目として掲げた電子の弾性衝突過程の導入はほぼ終了した。開発したシミュレーションを用い、基板上レジスト薄膜の弾性衝突による構造変化の解析を行い、電子加速電圧依存性についてのデータを得た。この成果は学会において報告を行なった。最終年度は現像過程のモデルの改良とシミュレーション実施によるデータの蓄積を行なう。現在の現像過程モデルでは分子の現像液界面からの距離は考慮せず、分子量の小さい順にレジスト中の分子を同時に溶解させている。そこで、レジスト分子の現像液界面からの距離に依存した溶解モデルを導入することにより改良を行う。すなわち、レジスト分子は現像液との界面に近い分子から順に溶解して行き、現像が進行して新たな界面が形成されるとその形成された界面に近い分子が次に溶解することになる。この現像液界面から順にレジスト分子が溶解するモデルを導入することにより現像シミュレーションの精度を改善する。次に開発したシミュレーションにより、露光条件(加速電圧や露光量など)と現像条件(現像液の溶解性と現像時間など)をパラメータとし、形成されるパターン形状やラインエッジラフネスの解析を実施し、データの蓄積を行う。弾性衝突過程に引き続き、非弾性衝突過程の結果としてのポリマーの主鎖切断過程を導入する。電子線レジストはポジ型を対象とする。まず、従来型の電子散乱のモンテカルロ法により、電子照射によるレジスト薄膜中のエネルギー吸収分布や非弾性衝突位置の分布を求めておき、この分布を利用してレジストを構成するポリマーの主鎖切断領域の広がりと切断量の見積りを行なう。一定の時間ステップごとに非弾性衝突による主鎖切断を、見積もられた広がりと切断量を用いて確率論的にポリマー分子に導入しながら、個々のポリマー分子の運動を分子動力学法により追跡し、電子照射によるレジスト薄膜の分子量変化を再現する。次に、リソグラフィにおける現像過程を電子照射後のレジスト薄膜内の分子量分布を基にモデル化する。電子照射後のポジ型のレジスト薄膜は電子照射の及んだ領域のみ分子量の低下が見られる。電子線リソグラフィでは、この分子量の低下した領域が現像過程によって除去される。そこで、分子量に現像閾値を仮定し、その分子量以下の分子を除去し、分子動力学法により構造緩和することで現像過程をモデル化する。開発したシミュレーションにより、基板上のレジスト薄膜に対して電子線照射による構造変化とその後の現像過程の再現を行い、形成されたパターン形状やラインエッジラフネスについて照射条件依存性を解析する。
新たなビタミンＥ生合成遺伝子の同定と、そのトコトリエノール生産への応用

ビタミンEは、トコフェロールとトコトリエノールの2種類の分子を総称した名称である。両者はビタミンEとして一括りにされているが、トコトリエノールとトコフェロールの機能性には大きな違いがあることが明らかになっている。トコトリエノールは、特にイネに特徴的に多く含まれていることが知られている。我々は新規なビタミンE生合成遺伝子を同定して、その遺伝子の発現を制御することで、トコフェロールを生産せずトコトリエノールだけを生産するイネカルスを作製した。従来トコトリエノールを精製する際には、トコフェロールの夾雑が問題になっていたが、トコフェロールを含まない原料からであれば、トコトリエノールを簡便に精製できる。ビタミンEは、トコフェロールとトコトリエノールの2種類の分子を総称した名称であり、トコトリエノールにはトコフェロールにはない重要な機能性があることが知られている。野生型のイネカルスは、トコフェロールとトコトリエノールの両方を生産している。既知のビタミンE合成遺伝子を欠いたイネ変異体カルスに対して、さらに我々が同定した新規遺伝子の発現の抑制を行ったダブルミュータント型のイネカルスを作製して解析を行った。新規遺伝子の発現抑制は、RNAi技術を用いて、5'非翻訳領域と翻訳領域の一部をターゲット領域として用い、アグロバクテリウム法を用いた形質転換法を用いて行った。その結果、トコフェロールを生産せずに、トコトリエノールのみを生産するイネカルスを作製できることを明らかにした。トコフェロールとトコトリエノールは分子構造が類似しているため、分離精製を行うことがこれまで非常に困難であった。しかし我々の作出したカルスを原料に用いれば、始めからトコフェロールを含有していないため、トコフェロールとトコトリエノールを分離する必要がなくなり、簡便にトコフェロールフリーのトコトリエノールを生産することができるため、この技術について特許出願を行った。また、生産コストを下げるために、組換え体のセレクションに必要な抗生物質の添加を工夫した培養条件等を検討することで、T3を生産する際のコストを削減するための検討も行った。本研究では、イネにおいてこれまでに報告されていない遺伝子が、ビタミンEの合成に関与している可能性を示唆する結果を得た。そのため、イネにおいてこれまでに報告されていない新しい遺伝子が、ビタミンEを合成しているかどうかについての詳しい解析を行った。イネの組織からRNAを抽出精製してcDNAの合成を行い、新たな遺伝子についてイネの様々な器官における発現解析を行うと共に、遺伝子全長のクローニングを行った。さらに、PCRによる遺伝子解析法や、HPLC分析、LC/MS/MS分析等の機器分析法を用いることによってビタミンEの定量分析を行うことによって、その遺伝子について詳細な機能の解析を行った。その結果、新規遺伝子がビタミンEを合成する機能を有しているということを明らかにすることができた。ビタミンEの一種であるトコトリエノールは、様々な植物の中でも、イネの米ぬか部分において特異的に多く蓄積しており、非常に強力な抗がん活性(血管新生抑制作用)をもつという数多くの報告が存在する。さらに、トコトリエノールは血清脂質代謝調節作用ももつため、今後医薬品として活用されることが期待されている。これまでの本研究を通じて、新たな遺伝子の機能を明らかにすると共に、その遺伝子を利用することによって、トコトリエノールを生産する際に、その生産工程に利点をもたらす可能性があることについても、同時に明らかにすることができた。本研究では、イネにおいてこれまでに報告されていない新しい遺伝子が、ビタミンEを合成しているかどうかについての詳しい解析を行った。まず、イネにおいて新規な遺伝子の全長のクローニングを行った。次に、クローニングした遺伝子について、PCRによる遺伝子解析法や、HPLC分析、LC/MS/MS分析等の機器分析法を用いた、ビタミンEの定量分析を行うことによって、その遺伝子について詳細な機能の解析を行った。さらに、新たな遺伝子を利用することによって、今後医薬品として活用されることが期待されている、ビタミンEの一種であるトコトリエノールを生産する際に、その生産工程に利点をもたらす可能性があることについても、同時に明らかにすることができた。これらのことは、当初計画に書かれていることを実行できたものであり、おおむね順調に進展していると判断することができる。本研究で機能を明らかにした新たな遺伝子について、イネの植物体において、実際に植物が生育する際に、どのような役割を担っているのかを詳細に解析する。ビタミンEの一種であるトコトリエノールは、様々な植物の中でも、イネの米ぬか部分において特異的に多く蓄積しており、非常に強力な抗がん活性をもつことが知られている。そのため、今後医薬品として活用されることが期待されている。

本研究で明らかにした、新たな遺伝子の機能を活かすことで、トコトリエノールを生産する際に、その生産工程に利点をもたらすための、最適条件を検討する。各種HPLCカラムを用いたトコトリエノールの精製をラボスケールで実施し、ラボスケールからパイロットスケールへのスケールアップを検討し、問題点を検証すると共に、トコトリエノール生産への応用研究を進める。次年度使用額89,971円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度の研究費と合わせて、研究費遂行のために使用する。具体的には、前年度と同様、試薬やキットなどの試薬購入、プラスティックシャーレやチップやエッペンチューブ等の消耗品購入、植物細胞培養用の培地購入、イネ育成用の培土の購入、HPLC分析用のカラムや溶媒の購入、プライマー合成や遺伝子配列解析等の外注委託等に使用する。こうした試薬や消耗品を利用して、植物細胞を培養したり、イネ植物体を栽培し、そこからサンプルを採取する。採取したサンプルについて、購入した試薬やキットを用いることで、トコトリエノールを合成する遺伝子の遺伝子配列の解析を行ったり、遺伝子発現状態を調べる。また、トコトリエノールの含量を定量するためには、HPLC分析や、LC/MS/MS分析を行う必要があるが、そうした分析を行うためには、サンプルを抽出するための試薬が必要であったり、HPLC分析用の分離カラム、サンプルを流すHPLC分析用の溶媒が必要になるので、そうしたことにも研究費を投入して、研究を推進する。
コンクリートの乾燥収縮ひびわれ試験方法とその実構造物のひびわれ予測への応用

一軸拘束ひびわれ試験、壁拘束ひびわれ試験・その応用解析、ならびに実構造物のコンクリートの乾燥収縮ひびわれの発生に関する拘束率の算定を行った。その概要は以下の通りである。1.一軸拘束ひびわれ試験ひびわれ発生に及ぼす水セメント比、セメントの種類およびスランプ(単位水量)の影響を調べた。水セメント比の小さい方がひびわれ発生日が遅くなった。セメントの種類に関しては、高炉B種、早強ポルトランド、普通ポルトランド、フライアッシュセメントの順にひびわれ発生日が遅くなった。また収縮量が小さくても早期にひびわれが発生する場合もあり、自由収縮ひずみ量だけからひびわれ抵抗性を判断できないことが示された。スランプ(単位水量)に関しては、スランプ8cm21cm(単位水量169202kg/m^3)の範囲で乾燥収縮ならびにひびわれ発生日に及ぼすスランプの影響は小さいことが示された。2.周辺拘束されたRC壁体の収縮ひびわれ試験スランプ8cmと18cmのコンクリートについて、RC壁体と一軸拘束ひびわれ試験体のひびわれ性状を調べた結果、両コンクリートのひびわれ発生日がほぼ同じであるという点が、両試験体において一致していた。また、拘束ひびわれ試験体においては、収縮応力解析値が割裂引張強度とほぼ等しくなった時期にひびわれが発生した点が一軸試験の場合と異なっている。3.実構造物の拘束率一軸拘束ひびわれ試験から、乾燥収縮による収縮変形の拘束の程度を表す拘束率を媒介として、実構造物のひびわれ予測を行う。そのための資料として1層スパンから3層6スパンまでのモデル架構の拘束率を有限要素法によるクリープ解析によって算出した。層数、スパン数と拘束率との関係、基礎の拘束条件の影響についても検討した。1.一軸拘束ひびわれ試験方法の検討実験(1)試験結果の変動ならびに引張強度との関係:コンクリートの乾燥収縮ひびわれ試験方法(JIS原案)に基づき,供試体20個の試験を行い,ひびわれ発生日数等の各種測定結果の変動状況を把握するとともに,静的引張強度との関係及びひずみ測定方法の検討を行った.その結果,ひびわれ発生日数の変動係数は19%であった.(2)拘束の程度,スランプ値とひびわれ発生日との関係:コンクリートのスランプの影響および実構造物のひびわれ発生予測の基礎資料を得るために,拘束板の厚さとスランプを実験変数として,一軸拘束ひびわれ試験を行った.2.一軸拘束ひびわれ試験と実構造物のひびわれとの対応性検討の実験(1)周辺拘束されたRC壁体モデルのひびわれ発生実験・収縮低減剤を用いた乾燥収縮量の異なるA,B2種類のコンクリートについて, 1軸拘束ひびわれ試験と2m×2.6mの壁試験体の拘束ひびわれ試験を行った.その結果,コンクリートA,Bの一軸拘束試験体のひびわれ発生日は,それぞれ壁試験体のひびわれ発生日とよく対応していた.・スランプ値が8と18cmのコンクリートについて上記と同じ寸法の壁試験体の拘束ひびわれ試験を行い, 1.(2)項のひびわれ試験結果との対応を調べた.(2)実構造物の収縮応力のFEM解析1層1スパンから3層8スパンまで壁体のFEM解析を行い,層数,スパン数基礎地盤の拘束と収縮応力の関係,ならびにプレストレッシングの効果について検討・把握した.3.ひびわれ標準試験方法の検討と実構造物におけるひびわれ予測以上の結果に基づき,ひびわれ試験方法の標準比と実構造物のひびわれ予測手法について研究を進めている.一軸拘束ひびわれ試験、壁拘束ひびわれ試験・その応用解析、ならびに実構造物のコンクリートの乾燥収縮ひびわれの発生に関する拘束率の算定を行った。
有毒ミクロキスティス殺滅ファージの感染に関する生理・分子生態学的研究

本研究は、アオコ防除へ向けた基礎的研究として、分子生物学的手法を用いて、環境中におけるミクロキスティス個体群の消長に及ぼす本種感染性ファージ(以下、ファージ)の影響を評価することを目的としている。昨年度明らかとしたファージ感染サイクルや娘ファージの挙動を踏まえて、本年度は、ファージの遺伝的多様性および季節変動を調査し、ファージ感染を受けている宿主細胞数を推定することで、ファージ感染が宿主動態へ及ぼす影響について評価した。京都市広沢池において、2006年から2011年までのアオコ発生時期に計23回、Ma-LMM01タイプファージ尾部遺伝子(g91)の多様性を調査した。計810クローンの塩基配列を決定し、それらは100%塩基配列相同性で419遺伝子型に分類された。最節約ネットワークを構築した結果、それらの遺伝子型はグループI-IIIに分けられた。各グループは、それらの出現頻度に応じて分類された5つの主要型、6つの準主要型、および408つの希少型から構成された。多様性解析の結果、ファージの高い多様性が維持されていることが示され、これは主要および準主要型の1塩基多型である希少型が多数存在したことに由来した。また、調査期間を通して共存する主要型の経時的変動、および希少型の出現パターンから、ファージの遺伝的多様性は、頻度依存選択が働くことにより維持され、宿主との軍拡競争型共進化により創出されることが明らかとなった。これまで、最も小さなグループIIIに属するファージのみを定量していたことが明らかとなった。そこで、グループI-IIIのファージすべてを定量することで、Ma-LMM01タイプファージに感受性である宿主の被感染率を算出したところ、それは0.05-36%だった。従って、ファージ感染は宿主個体群組成の変動のみならず、本ファージ感受性宿主動態へ影響を及ぼす可能性が示された。本年度は、ミクロキスティス感染性ファージの遺伝的多様性を明らかにするとともに、その創出および維持についても言及することができた。また、前年度の結果および明らかとなったファージ遺伝的多様性を踏まえて、自然環境中における本ファージ感受性宿主の被感染率を算出したところ、それは0.05-36%と高かった。これにより、ファージ感染は宿主個体群組成の変動のみならず、本ファージ感受性宿主動態へ影響を及ぼす可能性を提示し、おおむね最終目標に達した。本年度、実験室内においてミクロキスティス・エルギノーサNIES298株-ミクロキスティス感染性ファージMaLMM01の感染系を用いて、環境因子(UV、栄養塩、照度)がファージ感染能消失へ与える影響を評価することができなかった。本実験は、現場環境において行う必要があると考えられ、今後は、その影響を組み込んでファージ感受性宿主の被感染率算出を行うことが必要であると考えられる。本研究は、アオコ防除へ向けた基礎的研究として、分子生物学的手法を用いて、環境中におけるMicrocystisファージが、M.aeruginosa個体群の消長に及ぼす影響とそれに関わる環境因子を評価することを目的としている。本年度は、自然環境中における、シアノファージの感染パターン、宿主への量的影響について、調査・解析を行った。まず、ファージの感染パターンを明らかにするため、京都市広沢池において、3時間間隔で24時間採水し、Microcystisファージ尾部遺伝子(g91)を標的としたリアルタイムPCR法を用いて、宿主画分(試水を遠心分離して得たペレット)およびウイルス画分(0.2μmフィルターでろ過した試水)に含まれる、Microcystisファージ粒子数の経時変化を調査した。さちに、転写レベルでもファージ感染を評価するため本ファージ遺伝子の相対転写量も調べた。その結果、ウイルス画分(浮遊ファージの指標)と宿主画分(宿主細胞内でのファージ複製の指標)のファージ粒子数、およびファージ相対転写量は日中に高く夜間に顕著に低下した。さらに、それぞれの画分のファージ遺伝子タイプを調べた結果、1つのタイプ(G1タイプ)が全ての画分に共通してみられた。従って、Microcystisファージ感染は、光周期に関連した日周性を示すことが明らかとなった。一般的に、自然環境中におけるウイルス粒子数を定量する際、0.2μmフィルターによるろ液を「ウイルス画分」として用いる。従来、ファージが宿主へ及ぼす影響を定量的に評価する際、「ウイルス画分」のファージ粒子数からファージ感染を受けた宿主細胞数を推定することで評価されてきた。本研究結果より、宿主画分のg91は、ウイルス画分のそれらより数百倍高く、これは一年を通して観察された。このことから、従来のように、ウイルス画分のファージ粒子数を基にして推定したファージが宿主へ及ぼすインパクトは過小評価されている可能性がある。

計810クローンの塩基配列を決定し、それらは100%塩基配列相同性で419遺伝子型に分類された。最節約ネットワークを構築した結果、それらの遺伝子型はグループI-IIIに分けられた。各グループは、それらの出現頻度に応じて分類された5つの主要型、6つの準主要型、および408つの希少型から構成された。多様性解析の結果、ファージの高い多様性が維持されていることが示され、これは主要および準主要型の1塩基多型である希少型が多数存在したことに由来した。また、調査期間を通して共存する主要型の経時的変動、および希少型の出現パターンから、ファージの遺伝的多様性は、頻度依存選択が働くことにより維持され、宿主との軍拡競争型共進化により創出されることが明らかとなった。これまで、最も小さなグループIIIに属するファージのみを定量していたことが明らかとなった。そこで、グループI-IIIのファージすべてを定量することで、Ma-LMM01タイプファージに感受性である宿主の被感染率を算出したところ、それは0.05-36%だった。従って、ファージ感染は宿主個体群組成の変動のみならず、本ファージ感受性宿主動態へ影響を及ぼす可能性が示された。本年度は、Microcystisファージの感染が光周期に関連した日周性を示すこと、さらに、Microcystisファージは水中に浮遊するよりも宿主コロニーあるいは懸濁物などに付着する方が12桁多いことを示した。これらの結果は、自然環境中におけるMicrocystis aeruginosa個体群動態へのシアノファージの影響を評価するための基礎的知見となるもので、最終目的に向けて順調に進展しているものと考えている。本年度は、ミクロキスティス感染性ファージの遺伝的多様性を明らかにするとともに、その創出および維持についても言及することができた。また、前年度の結果および明らかとなったファージ遺伝的多様性を踏まえて、自然環境中における本ファージ感受性宿主の被感染率を算出したところ、それは0.05-36%と高かった。これにより、ファージ感染は宿主個体群組成の変動のみならず、本ファージ感受性宿主動態へ影響を及ぼす可能性を提示し、おおむね最終目標に達した。今後は、Microcystis aeruginosa NIES298株-MicrocystisファージMa-LMM01の感染系を用いて、宿主生理状態の変化をもたらす環境因子(水温、栄養塩、照度)のバーストサイズ(宿主1細胞から放出される娘ファージの数)への影響およびシアノファージ感染能消失に対する環境因子(水温、栄養塩、照度)、の影響を明らかにする。さらに、これらを加味した環境中での、M.aeruginosa個体群の消長に対する、Microcystisファージのインパクトを解明する。本年度、実験室内においてミクロキスティス・エルギノーサNIES298株-ミクロキスティス感染性ファージMaLMM01の感染系を用いて、環境因子(UV、栄養塩、照度)がファージ感染能消失へ与える影響を評価することができなかった。本実験は、現場環境において行う必要があると考えられ、今後は、その影響を組み込んでファージ感受性宿主の被感染率算出を行うことが必要であると考えられる。
電子サイクロトロン共鳴スパッタ成膜法を用いた超高密度磁気記録媒体の作製法の研究

次世代の超高密度磁気記録用媒体には、磁性領域と非磁性領域がナノメーターオーダーで分離した磁気的微細構造を持つことが必要である。本研究は、従来の平行平板型のスパッタ成膜法に代えて、電子サイクロトロン共鳴(ECR)マイクロ波プラズマを用いたスパッタ法(以下、ECRスパッタ法という)を用いて、前述した磁気的微細構造をもつCo-Cr垂直磁気異方性媒体の作製法を確立することを目指した。ECRスパッタ法においてプラズマ中のArイオンは、プラズマの電位と基板の電位との差(イオン加速電圧)によって加速され、成膜中に基板を衝撃する。Arガス圧を高め(8×10^<-2>Pa)とし、ターゲットと基板との間の距離を長め(230mm)とすることで、このイオン加速電圧20V以下にすることができる。この条件で成膜すると、50nmという薄い膜厚の場合でも、優れた結晶配向性(X線回折でのロッキングカーブの半値幅5゚以下)と、4KOeを超える大きな垂直磁気異方性磁界、1400Oe以上のや高い垂直方向保持力を持つCo-Cr膜を実現できた。プラズマ生成室から成膜室にかけて通常は自然に発散している磁場を、補助コイルを用いてカスプ磁界分布とすることで、イオン加速電圧をさらに低領域に拡張することができた。イオン加速電圧を11Vまで低減した条件で作製したCo-Cr媒体では、直径数十nmの結晶粒内に寸法が数nmに揃った明確な磁気的微細構造が発現することを見出した。記録特性を評価したところ、この磁気的微細構造を持つ媒体は低い媒体ノイズと高い記録分解能を示し、総合的にみて、現在内外の研究機関で研究開発中のCo-Cr媒体の中でもトップクラスの超高密度記録性能をもっていることが明らかになった。このように記録媒体の結晶粒内の磁気的微細構造を高度に制御することは、ECRスパッタ法を本研究で導入したことによって初めて可能になった。磁気ディスクに用いられる垂直磁気異方性記録層の作製法について、従来とは異なる新しい作成法の可能性について検討した。垂直磁気記録媒体の磁性層であるCo-Cr垂直磁気異方性膜は従来、平行平板型のスパッタ装置で作製されていた。これに対して本研究では、電子サイクロトロン共鳴マイクロ波プラズマを用いたスパッタ成膜法(ECRスパッタ法)を用いた方法を新たに導入した。本法は、プラズマ生成と成膜プロセスを独立に制御でき、しかも成膜中に基板へプラズマイオンを照射できるという、従来の平行平板型のスパッタ法にない特徴をもっている。これらを最適化することで、従来法よりもいっそう高密度記録に適した記録媒体を作製できる可能性がある。従来法で作製したCo-Cr膜では、基板上に堆積した約20nm程度の厚みの部分には、結晶配向の良くないいわゆる初期成長層が存在してしまい、これが高密度記録を妨げる原因となっていた。ところがECRスパッタ法ではこの初期層を無くすことに成功し、堆積初期から結晶学的特性および磁気特性に優れたCo-Cr膜を作製できることを見いだした。プラズマ診断によって、スパッタ成膜におけるプロセスパラメータとプラズマパラメータおよび成膜されたCo-Cr膜の物性との関連性について調べた結果、成膜中に基板に照射するArイオンのエネルギーがCo-Cr膜の物性に極めて大きな影響を与えていること、垂直磁気異方性膜として優れた結晶性、結晶配向性、磁気特性のCo-Cr膜を実現するには、照射イオンのエネルギーを約20eV以下に制御することが必要である、などのことが明らかになった。

この研究成果は、今回、プラズマ生成とスパッタと成膜を分離して行えるECRスパッタ法を導入したことによって本研究によって初めて解き明かされたものである。磁気記録媒体に、磁性部分と非磁性部分がナノメーターオーダーの寸法で分離した磁気的微細構造を持たせることが、高密度記録と低い媒体ノイズの実現に結びつく。従来から記録媒体の製造に用いられてきた平行平板型のスパッタ成膜法での限界を打破するため、本研究では、電子サイクロトロン共鳴(ECR)マイクロ波プラズマを用いたスパッタ法に着目し、前述した磁気的微細構造をもつ記録媒体の作製法について調べた。昨年度の研究結果に基づき、Co-Cr垂直磁気異方性媒体のECRスパッタ成膜中に、基板を照射するArイオンのエネルギーをさらに低領域に拡張するために、プラズマ生成室から成膜室にかけて通常は自然に発散している磁場を強制的にカスプ磁界分布とした。その結果、Arイオンの加速電圧を通常の1/2に低減でき、この条件で作製したCo-Cr垂直磁気異方性媒体では、直径数十nmの結晶粒内に寸法が数nmに揃った明確な磁気的微細構造が実現されることを見出した。さらに、この磁気的微細構造を持つ記録媒体は、低い媒体ノイズと高い記録分解能を示し、総合的にみて、現在内外の研究機関で研究開発中のCo-Cr垂直磁気異方性媒体の中でもトップクラスの超高密度記録性能をもっていることを、実際の記録再生評価によって確認した。なお、このような記録媒体の結晶粒内の磁気的微細構造を高度に制御することは、本研究において、プラズマ生成と成膜が分離し、プラズマの制御性に優れたECRスパッタ法を導入したことによって初めて可能になった。
脳神経系の初期パターンをつくるシグナル伝達機構の遺伝学的解析

生物の発生において,脳神経系の初期パターン形成は様々のシグナル分子の作用によってコントロールされている。その中でも脊椎動物の脊索,フロアープレート(ミッドラインと総称する)は,神経管のパターン形成と細胞の分化を支配し、後には神経回路形成をガイドするするシグナリングセンターとして重要な働きをしている。当研究では,ミッドラインからの神経管への誘導シグナルの作用を分子レベルで明らかにするために,ゼブラフィッシュを用いて遺伝学的なアプローチを行ってきた。ゼブラフィッシュで同定された多数のミッドラインシグナリングに欠損を持つミュータントを用いて,その解析を通じて,シグナル伝達のカスケードをあきらかにし,分子間の相互作用,調節機構を解明することを目指している。本年度は、海外出張先のニューヨーク大学医学部から国立遺伝学研究所への異動に伴って飼育設備やセットアップに多くの時間を費やしたが、本年度はミッドラインミュータント、chameleon(con)について分子マーカーを用いた表現型の詳細な解析を行い、ミッドラインシグナルの重要な因子のひとつであるヘッジホッグシグナルとの関わりについて調べた。conミュータントの神経管のパターン形成,神経細胞の分化における表現型を分子マーカーの発現パターンを比較して調べた結果、腹側の脳神経系に特異的に欠損が起きていた。直接に作用していると考えられる領域はフロアープレートに隣接する領域のみであり、シグナルはそれより遠い領域には及んでいないことが示唆された。con遺伝子とヘッジホッグシグナルの関わりを調べるため、ソニックヘッジホッグ分子をconミュータントに導入発現させた。すると、ミュータント表現型はレスキューされた。従って、con分子はヘッジホッグシグナルのコンポーネントである可能性が高いことがわかった。しかも、その作用は、シグナル分子ヘッジホッグと同列か上流で働いていることが示唆された。
卵巣癌の薬物応答に関与する新規バイオマーカーの特定

本研究は1一塩基多型(single nucleotide polymorphism, SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法の効果予測2卵巣癌への分子標的治療薬効果予測マーカーの開発を目的とした。1は癌症例の血中リンパ球の網羅的SNP解析により、化学療法の好中球減少の程度で有意差を認めるSNPを5種、および判別分析にて20種抽出した。これらの中に予後と相関を認めたSNPが認められた。2は卵巣癌組織においてFGF3, FGF4遺伝子のコピー数増幅が7%,12%で認められ、細胞株ではES2細胞株で増幅が認められた。ES2細胞株でソラフェニブのIC50値が他の卵巣癌細胞株に比べ、有意に低値であった。本研究では、1卵巣癌に対する化学療法について、Single mucleotide polymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムの開発、2卵巣癌に対する分子標的治療薬の関連経路の異常を探索することによる、適応決定のバイオマーカーの開発を目的とした。1については、卵巣癌および子宮体癌症例(63症例)の血中正常リンパ球から抽出したDNAを用いて網羅的SNP解析を行い、TC療法時の好中球減少の程度で分けた2群間で統計学的有意差が認められたSNPを選別した。これらのうち5つのSNPではPFSにおいても相関を認めた。また、好中球減少を予測するSNPの組み合わせを判別分析にて抽出した結果、20種のSNPが抽出された。これらについても、予後との相関を検討中である。次に、卵巣癌の代表的な組織型である漿液性腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌の細胞株14種における上記遺伝子のcopy numberassayを行った。FGF3の増幅が認められた細胞株が1種、FGF4の増幅が認められた細胞株が1種、PIK3CAの増幅が認められた細胞株が3種確認された。本研究では、1卵巣癌に対する化学療法について、single nucleotide polymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムの開発2卵巣癌に対する分子標的治療について、分子標的治療薬の関連経路の異常を探索することによる、適応決定のバイオマーカーの開発を目的とした。1については、標準治療を行い、術後化学療法としてTC療法を施行した卵巣癌および子宮体癌計100例よりリンパ球を採取し、DNAを抽出した。そのうち、解析に適切な症例と考えられる64例を選択し、リンパ球より抽出したDNAを用いて網羅的SNPアレイ解析を実施した。アレイチップはHuman OmniExpress Exome BeadChips(イルミナ社)を用いた。術後化学療法後の有害事象の代表的有害事象である好中球減少の重症度により2群に分け、2群を選別できるSNPの抽出を行い、統計学的解析を行っている。これらの結果より、効果判定に有用な診断キットの構築を行っている2については、標準治療を行い、十分なフォローアップがなされており、予後が判明している卵巣癌症例139例の原発巣のHE染色標本を鏡検し、本研究に適した119例を選別した。その連続切片であるパラフィン切片の癌部からDNAの抽出を行った。これらのDNAを用いて、FGF3, FGF4, FGFR1, FGFR2, PIK3CAの5種の遺伝子についてreal time PCRによるcopy number assayを行った。解析可能だった85例のうち、24例(28.2%)でいずれかの遺伝子のcopy数の増幅が認められた。本研究では、1卵巣癌に対する化学療法について、Single nucleotide polymorphism (SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムの開発、2卵巣癌に対する分子標的治療薬の開発経路の異常を探索することによる、適応決定のバイオマーカーの開発を目的とした。1については、卵巣癌および子宮体癌症例(63症例)の血中正常リンパ球から抽出したDNAを用いて網羅的SNP解析を行い、TC療法じの好中球減少の程度で分けた2群間で統計学的有意差が認められたSNPを選別した。これらのうち5つのSNPではprogression free survival (PFS)においても相関を認めた。予後との相関を検討したところ、2についてはFGF3, FGF4, FGFR1, FGFR2, PIK3CAの5種の遺伝子のコピー数増幅について、卵巣癌患者の癌組織より抽出したDNAで検討した。FGF3, FGF4についてそれぞれ7%、12%の症例でコピー数増幅が認められた。これらと臨床病理学的因子や予後との相関を検討したが、有意な相関は認められなかった。

次に、卵巣癌14細胞株を用いて、上記5遺伝子のコピー数増幅を検討したところ、FGF3, FGF4遺伝子はES2細胞株で、PIK3CA遺伝子はJHOS2, JHOC8細胞株で増幅が認められた。これらの細胞株を用いてSorafenib、Everolimus, Temsirolimusの細胞傷害性試験を行ったところ、SorafenibのIC50値がES2細胞株では有意に低値であり、FGF3, FGF4コピー数増幅がSorafenibの効果予測マーカーとなりうることが示された。婦人科腫瘍学1についてはSingle mucleotidepolymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムとして有用と思われる候補SNPを複数個抽出できており、また予後との関連性は確認されているので、概ね目的は達成されていると考えられる。2については、本年度遺伝子増幅を認める卵巣癌細胞株を同定し、その薬剤感受性まで調べる予定であったが、基礎実験が難航したため、そこまで到達できなかった。現状において、術後化学療法の効果予測を目的としたSNP解析は終了しており、また、分子標的治療薬の効果予測を目的とした候補遺伝子のReal time PCRは終了しているため、おおよそ順調に進展していると考える。次年度は、1single nucleotide polymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムの開発については、本年度までに抽出した候補SNPについて、化学療法の効果および毒性や予後との関連性について臨床データと検証し、効果予測システムとして有用なSNPの組み合わせを確立する予定である。2卵巣癌に対する分子標的治療適応決定のバイオマーカーの開発については、copy number assayにより候補遺伝子の遺伝子増幅を認めた卵巣癌細胞株について、それぞれに対応する分子標的治療薬の効果についてin vitro、in vivoの系にて検証を行う。また、FISH法により、実際に遺伝子増幅があるかどうかを確認する予定である。次年度以降は、1single nucleotide polymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後化学療法(TC療法)の効果予測システムの開発については、SNPアレイにて選別したSNPについて、新規症例を用いてvaridation assayを行う。新規100症例を選択し、手術摘出検体のパラフィン切片の非癌部よりDNAを抽出し、PCRでこれを増幅する。これをdirect sequence法にて選別したSNPについて解析し、化学療法の効果および毒性との関連性を検証し、効果予測システムを確率する。2卵巣癌に対する分子標的治療適応決定のバイオマーカーの開発については、FISH法を用いて、遺伝子増幅の確認を行う。また、卵巣癌細胞株よりDNAを抽出して上記と同様にreal time PCRを行い、候補遺伝子のcopy number多型を解析する。増幅を認めた細胞株についてin vitro、in vivoの系にて、効果の判定を行う。本年度は、1single nucleotide polymorphism(SNP)に基づいた卵巣癌術後
異なる成熟表現型ブドウを用いたノンクライマクテリック型果実の成熟制御機構の解明

本研究の研究計画では、平成30年度にこれまでの各種処理実験で得られた成熟・着色表現型の異なる果実における成熟・着色に関連遺伝子の発現解析とRNA-Seq解析を行い、表現型の異なる各種果実に特化した関連遺伝子群をリスト化し、成熟・着色の起因となる候補遺伝子や、果実成熟の進行に関与すると考えられる因子とMybAの発現を誘導する上流の制御因子を探索する予定であった。本年度で実施した研究内容および得られた主な結果は以下の通りである。1`ルビーロマン'ポット栽培樹を用いた温度処理試験の果実サンプルにおける内生ABA、IAAとサイトカイニン及びそれぞれの代謝物の含量を測定し、また2アントシアニン生合成関連遺伝子(MybA1-2, MybA1-3, UFGT, F3'H, F3'5'H)とABA代謝関連遺伝子(NCED1, ABA-BG, ABA-GT, CYP707A, ABF2)の発現解析を行った。その結果、昨年度で果粒を用いた温度処理実験と同様な結果が得られ、即ち、高温条件下でアントシアニン生合成が抑制されたが、内生ABA含量とMBYA遺伝子の発現が促進された。これらの結果から、アントシアニン生合成においてABAを介したMYBA転写因子による調節とは異なる機構が存在する可能性が示唆された。34種類の台木(半わい性台木`5BB'と強勢台木`Hybrid Franc'およびそれらの4倍体)に接木した`ルビーロマン'の異なる生育段階の果皮サンプルを用いてトランスクリプトーム(RNA-Seq)解析を行い、また、果粒を用いた温度処理の果皮サンプルのRNAーSeq分析のため、Total RNAを抽出し、cDANライブラリーを作成している。1成熟・着色表現型の異なる果実の材料収集:`ルビーロマン'、`安芸クイーン'地植栽培試験、異なる樹勢の台木に接木した`ルビーロマン'の栽培試験、ポット`ルビーロマン'の温度処理試験、`ルビーロマン'、`安芸クイーン'果粒を用いた温度処理実験を行い、果実生育を調査し、成熟表現型の異なる果実サンプルを取得した。2植物ホルモン含量の測定:上述処理試験で得た果実における内生ABA、IAAとサイトカイニン及び代謝物の含量を測定し、果実成熟過程における内生植物ホルモンの動態変化を調査し、果実成熟・着色に果たす役割を検討した。4網羅的の発現解析による未知の成熟制御因子の探索:一部の処理試験の果実を用いてRNA-Seq解析を行っている。以上一連の研究により、植物ホルモンによる成熟・着色の調節は、ABAを介したMYBA転写因子によるアントシアニン生合成系の調節以外に決定的な制御が存在する可能性が示唆された。現在、果粒による温度処理試験で得た果実サンプルを用いて、RNA-Seq解析を行うとともに、シークエンシングデータの解析を行っている。2019年度では、上述のRNA-Seqのシークエンシングデータを解析し、これら表現型の異なる果実に特化した関連遺伝子群をリスト化し、ベレゾーンの起因となる候補遺伝子や、果実成熟の進行に関与すると考えられる因子とMybAの発現を誘導する上流の制御因子を探索し、候補遺伝子の機能解析を行う。また、植物ホルモン、特にABAが果実成熟における役割を明らかにするため、ABA応答関連遺伝子や受容体、シグナル伝達系遺伝子の発現解析も行う。本研究はブドウを用いてノンクライマクテリック型果実の成熟・着色制御機構の解明を目的とする。研究計画では、平成29年度中各種の処理実験で得られた成熟・着色表現型の異なる果実と栄養器官内における植物ホルモンの動態変化、関連遺伝子の発現解析を行う予定であった。14種類の台木(半わい性台木`5BB'と強勢台木`Hybrid Franc'およびそれらの4倍体)に接木した`ルビーロマン'ブドウの果実(果皮)、芽と根における内生ABAおよび代謝物、IAAおよび代謝物・中間体、サイトカイニン等植物ホルモンの含量を測定し、果実内生植物ホルモン含量における台木の影響を明らかにした。2これら接木樹の果実(果皮)におけるアントシアニン生合成関連遺伝子(MybA1-2, MybA1-3, UFGT, F3'H, F3'5'H)とABA代謝関連遺伝子(NCED1, ABA-BG, ABA-GT, CYP707A, ABF2)について定量PCR法により発現解析を行い、アントシアニン生合成関連遺伝子とABA代謝関連遺伝子の発現は一致しないことが分かった。3`ルビーロマン'と`安芸クイーン'果粒を異なる温度条件下で処理し、果皮における内生植物ホルモン含量を測定した結果、温度処理に対する内生植物ホルモンの変化は品種によって異なり、また、4これら果皮におけるアントシアニン生合成関連遺伝子とABA代謝関連遺伝子の発現解析では、アントシアニンの蓄積は内生ABA生合成と必ずしも一致しないことが分かった。これまでに当初の研究計画通りおおむね順調に進展していって、一部の研究内容について計画以上に進展している。当初の計画の1平成29年度では2倍体と4倍体台木に接木した`ルビーロマン'樹の果実と栄養器官(葉と根)の植物ホルモン含量を測定することと、2これら樹の果実におけるアントシアニン生合成関連遺伝子とABA代謝関連遺伝子の発現解析を予定通り実行した。また、3温度処理実験を行い、処理後果実の成熟・着色状況、植物ホルモン含量と関連遺伝子の発現解析も行った。