hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RSウィルス下気道炎発症予測のための疾患特異的microRNAの有用性の検討

RSV感染症に対する治療として1クラリスロマイシン(CAM)、病状評価として2疾患特異的microRNAに着目した。CAMはRSV誘導性type I, III IFNsの産生を抑制した。転写因子活性を検討したところIFN-β,IRF-3制御下の転写因子活性がCAM処置により抑制された。さらに免疫染色を用いてIRF-3の細胞内局在を検討した結果,CAMはRSV誘導性IRF-3の核移行を抑制することで、RSV誘導性type I, III IFNsの産生を抑制していた。RSV感染特異的に発現上昇する分泌型miRNAを同定した。鼻汁の分泌型miRNAのhousekeeping geneを同定した。RSウイルスが誘導するmicroRNAの役割を評価するために,様々な上皮細胞におけるRSウイルス感染系,real-timePCRによるコピー数,ウイルスタイター測定の適正化などを行った.さらにRSウイルスが気道上皮細胞に感染を引き起こすことに伴って誘導される宿主細胞の自然免疫応答を担うシグナル伝達経路に関して検討を行った.hTERT導入ヒト鼻粘膜細胞において,RSV感染によりIL-6, 8, CCL5の産生が誘導され,肺胞上皮細胞株であるA549細胞ではRSV感染によってtype I, III interferon(IFN)-β,-λ1,-2,-3が誘導された.これらのサイトカイン産生はCAM投与によって有意に抑制された.転写因子活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子法を用いて検討した。A549にRSV感染を行うと,IFN-βP-125(IFN-βプロモーター領域)とPRD III-I(IRF-3の結合領域の制御下にあるレポーター遺伝子)は活性化され,CAMによって有意な抑制された.そこで,これまで報告のないCAM投与によるIRF-3活性化への抑制効果に焦点をあてて検討を行った.IRF-3はRSV感染にリン酸化を受けるが,CAM処置はこのリン酸化に影響を与えなかった.次にIRF-3の細胞内局在をRSV感染の有無とCAM投与の影響に分けて免疫染色で検討した.RSV感染によりIRF-3の細胞質から核への移行が観察されたが,CAM処置によりIRF-3の核移行が有意に阻害された.さらにIRF-3の二量体形成に関するCAM投与の影響を検討した.RSV感染により二量体形成の誘導が見られたが,CAM処置により二量体形成は抑制された.これらの結果から,CAMはRSVにより誘導されるIRF-3の二量体形を抑制することで,それに伴う核移行を抑制しシグナル伝達経路を止めていることが示唆された.鼻汁中のRSウイルス量とmicroRNAの関係を検討するために、鼻汁中のRSウイルスのコピー数を定量PCRを用いて算出する系を確立した。またRSウイルスの定量はプラーク法(PFU/ml)を用いて行うことが一般的であるが、手技が比較的難しく、施設間でのばらつきも大きい。そのためコピー数をもとにPFU/mlを算出する系を確立した。これらの系を用いて、提供された鼻汁検体から定量PCR法を用いて、推定PFU/mlを算出しプラーク法の適正評価を行った。またmicroRNA検討においてmicroRNA arrayの結果をもとに、reference microRNAとなる候補microRNAを選出し、鼻汁における分泌型microRNAのreference microRNAとなりうるか検討を行った。この結果をもとに検体量、濃度に差異のある臨床検体を画一的に定量できる系を確立した。microRNAarrayで上昇が見られたmicroRNAを実際的に定量していく。あくまで臨床検体であることから、実験的に用いる際の実際的な濃度や、検体量に関して検討を重ねていく必要がある。疾患特異的なmicroRNAの候補を検討するためにRSウイルスのほかにmumpsウイルスなども検討を行う予定である。また、これまで確立させたウイルス量との関係を明らかにしていきたい。上気道感染症・計画が順調に遂行できているため、試薬類については予定通りの使用額となっている。・成果発表が地元での開催であったため、旅費について計上した予算以下で成果発表が可能であったため。・新たな候補となりうるmicroRNA、real-timePCRの試薬購入費に充てたい・国内学会での成果発表を予定しており、旅費を経費として計上する。・成果を論文としてまとめて報告するにあたり、英文校正料、国際学術誌への投稿料に充てる。
表面ゾル-ゲル法を利用した多糖系遺伝子診断システムの開発

シゾフィランは溶媒の極性変化に伴い一重鎖【double half arrows】三重鎖の超構造変換を示す。我々は、一重鎖から三重鎖への巻き戻り過程において核酸が共存すると、シゾフィラン三重鎖の一本が核酸に置き換わった新規な生体高分子複合体が生成することを見いだした[J.Am.Chem.Soc.,2000,122,4520]。本研究は核酸と複合化した多糖の高次構造を表面ゲル-ゾル法を用いて無機物に記憶させ、有機・無機複合型の全く新しい核酸分離システムを開発することが目的である。前年度の成果を受け、本年度は以下の方針で研究を進めた。1)アルギニン、リジン、セリン修飾シゾフィランの核酸に対する相互作用能や選択性の評価を行い、特定核酸分離剤としてのリードシゾフィランのライブラリーを構築する。2)リードシゾフィランの還元末端にエチレングリコールをスペーサーとしてスルフィド基を導入し、酸化処理するこで含ジスルフィドシゾフィラン二量体を得る。3)ジスフィルド基を足がかりとして、リードシゾフィランを金基板上へ結合させ、水晶発振子により担持量に関する詳細な知見を得る。4)さらに、金基板上に担持した修飾シゾフィランに対し、表面ゾル-ゲル反応を施し、基板上への担持に関する最適条件を探索することを行った。その中でも核酸-シゾフィラン複合体へのゾルゲル反応の反応条件を種々探索した結果、アミン:スペーサー:グアニジウム塩を有する化合物がシリカのゾル-ゲル反応の良い触媒になりうることを見出した。これはグアニジウム塩が核酸のリン酸基と水素結合し、残ったアミン部位が表面選択的に核酸のまわりでのゾル-ゲル反応を促進したためと考えられた。またシゾフィラン内部に於いてシリカゲルの伸長反応が進行すること、有機分子の一次元配列およびその重合が可能なことを見いだすことに成功し、一次元ホストとしてのシゾフィランの有効性を示すことに成功した。本研究は核酸と複合化した多糖の高次構造を表面ゾル-ゲル法を用いて無機物に記憶させ、有機・無機複合型の全く新しい核酸分離システムを開発することが目的である。計画初年度である本年度は、核酸との親和性向上を目的とした多糖への選択的化学修飾法の確立と、多糖の予備組織化のための還元末端へのチオール基の導入について検討を行った。一部の多糖誘導体については金基盤上への固定化を行い、その最適条件の検索を行った。1.側鎖の選択的酸化による化学修飾シゾフィランの合成核酸との親和性向上を図るため、カチオン性残基をシゾフィラン側鎖に導入することを検討した。特に、生体物質との適合性という観点から天然のアミノ酸であるアルギニン残基の導入を検討することにした。過ヨウ素酸による側鎖ジオールの選択的酸化と続く還元的アミノ化を経て、目的とするアルギニン修飾シゾブィランを合成することができた。また、同様の手法でリジンやセリン修飾シゾフィランも得ることができた。2.スルフィド結合によるシゾフィラン2量体の合成得られたアミノ酸修飾シゾフィランの還元末端にエチレングルコールをスペーサーとしてスルフィド基を導入した。得られたスルフィド化シゾフィランを酸化処理することによって糖鎖2本が予備組織化されたシゾフィラン2量体を得ることができた。ゲルカラムクロマトグラフィーによる分子量測定と元素分析によって目的物であることを確認した。3.スルフィド結合を介した金基盤への固定化スルフィド基を導入したシゾフィランと1-ブチルスルフィドの混合膜を金基盤上に作成することを検討した。まずはじめに、金表面の被覆率と混合膜中のシゾフィランの割合を正確に評価するために、水晶発振子を基盤として用いた。シゾフィランと1-ブチルスルフィドの割合を連続的に変化させながら振動数変化を測定することにより、混合比と実際の担持比の相関関係を得ることができた。今後このデータを基に表面ゾルゲル反応を行い、核酸との高い親和性を持った有機-無機ハイブリッドシステムの構築を目指す。シゾフィランは溶媒の極性変化に伴い一重【double arrow】三重鎖の超構造変換を示す。2)リードシゾフィランの還元末端にエチレングリコールをスペーサーとしてスルフィルド基を導入し、酸化処理することで含ジスルフィドフィラン二量体を得る。3)ジスルフィド基を足がかりとして、リードシゾフィランを金基板上へ結合させ、水晶発振子により担持量に関する詳細な知見を得る。

4)さらに、金基板上に担持した修飾シゾフィランに対し、表面ゾル-ゲル反応を施し、基板上への担持に関する最適条件を探索することを行った。その中でも核酸-シゾフィラン複合体へのゾルゲル反応の反応条件を種々探索した結果、アミノ:スペーサー:グアニジウム塩を有する化合物がシリカのゾル-ゲル反応の良い触媒になりうることを見出した。これはグアニジウム塩が核酸のリン酸基と水素結合し、残ったアミン部位が表面選択的に核酸のまわりでのゾル-ゲル反応を促進したためと考えられた。シゾフィランは溶媒の極性変化に伴い一重鎖【double half arrows】三重鎖の超構造変換を示す。我々は、一重鎖から三重鎖への巻き戻り過程において核酸が共存すると、シゾフィラン三重鎖の一本が核酸に置き換わった新規な生体高分子複合体が生成することを見いだした[J.Am.Chem.Soc.,2000,122,4520]。本研究は核酸と複合化した多糖の高次構造を表面ゲル-ゾル法を用いて無機物に記憶させ、有機・無機複合型の全く新しい核酸分離システムを開発することが目的である。前年度の成果を受け、本年度は以下の方針で研究を進めた。1)アルギニン、リジン、セリン修飾シゾフィランの核酸に対する相互作用能や選択性の評価を行い、特定核酸分離剤としてのリードシゾフィランのライブラリーを構築する。2)リードシゾフィランの還元末端にエチレングリコールをスペーサーとしてスルフィド基を導入し、酸化処理するこで含ジスルフィドシゾフィラン二量体を得る。3)ジスフィルド基を足がかりとして、リードシゾフィランを金基板上へ結合させ、水晶発振子により担持量に関する詳細な知見を得る。その中でも核酸-シゾフィラン複合体へのゾルゲル反応の反応条件を種々探索した結果、アミン:スペーサー:グアニジウム塩を有する化合物がシリカのゾル-ゲル反応の良い触媒になりうることを見出した。またシゾフィラン内部に於いてシリカゲルの伸長反応が進行すること、有機分子の一次元配列およびその重合が可能なことを見いだすことに成功し、一次元ホストとしてのシゾフィランの有効性を示すことに成功した。
外来遺伝子DNA導入による新しいモデル動物の開発

1.研究の目的本研究は、バイオサイエンスの基礎研究にとって重要な役割を果す生物機能モデルおよびヒト疾患モデル動物の開発を、発生工学、遺伝子工学等の方法を駆使して開発し、様々な遺伝子機能を個体レベルで解析する実験系を確立することを目的とする。2.研究実績遺伝子DNAを受精卵に導入し、個体にまで発生させると、個体の全細胞に導入遺伝子をもつトランスジェニック動物を得ることができる。この方法を用いて、今年度は、いくつかの生物機能モデル動物が得られた。(i)トランスサイレチン(TTR)遺伝子は点突然変異を起すと家族性アミロイドポリニューロパチーを発症する。この遺伝子をマウスに導入したところ、特定の組織にアミロイドの沈着が認められた。(ii)アンチセンスRNAを発現する遺伝子を構築し、トランスジェニックマウスを作成したところ、特定遺伝子の発現が抑制され、優性形質の抑制にも遺伝子導入法が有効であることが確認された。(iii)ラットレニンおよびアンジオテンシノーゲン遺伝子をそれぞれ導入したマウスを作成すると、それぞれのマウスでは血圧は正常であった。ところが、これらを交配して得られたレニンとアンジオテシシノーゲンの双方の遺伝子をもつマウスは、高血圧症を呈した。(iv)HIV、HTLVIなどのウイルス遺伝子導入マウスが得られ、病理症状を示した。以上の結果から、遺伝子導入によって外来性の遺伝形質を発現させ個体での生物現象の変化から、導入遺伝子の機能を解析する方法が確立したといえる。今後は、欧米諸国で成功した遺伝子標的導入法を確立し目的の遺伝子を、計画的に変異させることによって、生物機能モデルを作り、解析していきたいと考えている。
ボルネオ熱帯林における生態系サービスの変化要因：大規模社会学調査データによる検討

この研究では、生態系サービスの利用と社会的・生態的要因との関係を明らかにすることを目的に、聞き取り調査による社会学データと衛星データに基づいた土地被覆データを分析した。調査対象地域は、マレーシア・サラワク州である。聞き取り調査は91村で村長と20世帯に行われた。分析の結果、林産物の利用は森林被覆によって影響を受けていることが明らかになった。一方で、村に居住していない村人の数も森林被覆と関連していることが示され、これは村外の資源を利用することで森林利用が減っているためだと推測された。また、政治力など、村外とのつながりが、森林被覆に寄与している可能性も示唆された。H25年度の主な研究実績は、データ整理、データの予備的検討、統計手法の検討、国際学会での発表である。1)データ整理:原票をスキャンして電子化するとともに、すべての入力についてチェックし、間違いを直した。その上で、各々の変数について、村ごとの代表値を地図上にプロットした図を作成し、サラワク州関連機関へ提出する報告書を編集した。2)予備的検討:ボルネオの熱帯林が住民にもたらす重要な生態系サービスとして、焼き畑を行うための調整サービス、薪、野生果実、狩猟動物(イノシシ)の供給サービスを選び、これらの利用と村周辺の森林被覆との関係について分析を行った。各世帯の経済状況や就労機会なども考慮にいれたGLMMを用いた検討の結果、焼き畑をのぞくこれらのサービスについて、森林面積が利用の強さに影響を与えているとの示唆を得た。ただし、多くの変数について地理的な相関が見られたが、これは考慮できていない。3)統計手法の検討:上に述べたとおり、本研究課題で分析対象とするデータは強い空間的自己相関をもっている。空間構造に配慮して分析を行う必要がある。空間構造のあるデータに対して使われるいくつかの方法を検討した。その結果、まず空間的自己相関の生じている空間スケールを特定し、相関が見られた距離より近い距離にある村すべてから平均的な影響を受けると仮定して、周辺の村の効果として扱うこととした。森林被覆と林産物利用の結果の分析については、最近の類似の論文から示唆を得て、年齢及び家族員数のデータを追加して再解析を行った。林産物のうち狩猟獣については、森林被覆、世帯主の年齢、経済的豊かさが影響を与えていることがわかった。森林があることばかりでなく、狩猟をする体力のある若い世帯主であること、狩猟を行うにはボートや鉄砲など高い機材を購入する必要があることがその理由と考えられる。一方、薪については、町から遠くガスなどの燃料が購入しにくい村で、購入する経済力がない世帯が利用している傾向が見られた。他の資源(キノコ、山菜、果実)に関しては森林面積や他の要因と明確な傾向はみられなかった。森林面積の減少が非木材林産物利用に与える影響は林産物によって大きく異なることがわかった。その一方で、人口の増減に関する分析の結果では、森林被覆が経済的豊かさや人口と並んで重要な要因となっていることが示唆された。林産物利用が森林の有無と関係がなかったのにも関わらず(すなわち、森林が残っているからといって林産物利用をするとは限らないのに)、森林が村へ籍を残す理由となっているとすると興味深い。今後慎重に検討していく必要があるが、森林のセーフティーネットとしての意義などがその説明として考えられる。これらの結果については、3月の日本生態学会の企画集会で報告することができた。また、次年度5月の地球惑星科学連合大会でも発表予定である。森林利用が社会ネットワークに与える影響については、ベイジアンネットワークを使うことを想定して、モデルの検討を開始している。研究代表者にとっては未知の分析法だが、専門家にアドバイスを受けることができた。焼き畑が村人間の人間関係に影響を与えているのではないかという予備的な結果を得ている。本研究では、総合地球環境学研究所プロジェクト「人間活動下の生態系ネットワークの崩壊と再生」で収集されたサラワク州の主要河川バラム川・ラジャン川流域の89村における質問票調査のデータセットと、公開されている衛星データに基づく土地被覆図を解析して、周辺の生態系の状況と住民の生業や暮らしとの関係を明らかにした。(1)非木材産物の利用について非木材林産物は、森林によって供給される重要な生態系サービスの一つだが、その利用は世界のいろいろな地域で減少している。森林生態系の減少や劣化などがその潜在的要因の一つだが、貨幣経済の拡大など社会・経済的要因も深く関連している。森林の減少・劣化が住民に与える影響を評価するためには、生態的要因と社会的要因を同時に検討する必要がある。本研究では、調査地域において、非木材林産物利用の有無や頻度のばらつきがどのような要因で説明できるのか分析した。その結果、いくつかの林産物では森林面積が減少すると利用が減っていた。世帯の経済状況など、そのほかの社会・経済的要因も影響していたが、その影響の大きさ、影響の仕方は林産物の種類によって異なっていた。例えば、経済的に豊かな世帯では狩猟動物、野生果実の利用は増えるが、薪の利用は減る。このような違いは、住民にとっての林産物の価値と関連している。(2)人口の増減について世界の多くの地域同様、サラワク州でも都市への人口集中が急速に進行している。これに伴い、人々の生活における森林の役割は小さくなったと考えられがちである。しかしながら、都市化の実態を調べてみると、都市と地方の二重生活を送る人々が少なくない。

本研究の解析から、二重生活を送る人々を含む地方(村)の人口増減は、村周辺の森林面積と正の相関があることが明らかとなった。人々の潜在的な森林への依存度は、人口統計から推測されるほどは減少してはいないことが示唆される。生態系劣化が社会に及ぼす影響を明らかにするためには、自然科学と社会科学の研究者の共同研究が必要であることは認識されているが、研究手法の違いなどから必ずしも簡単ではない。本課題では生態学を研究してきた代表者が社会学など文系の研究者と議論を重ねてデータを分析してきた。報告書の出版、学会やシンポジウムでの発表、論文執筆、投稿と順調に成果の公表を進めてきた。したがって、おおむね順調に進展したと判断した。本研究では、総合地球環境学研究所プロジェクト「人間活動下の生態系ネットワークの崩壊と再生」で収集されたマレーシア・サラワク州の89村における質問表調査のデータセットと、公開されている衛星データに基づく土地被覆図を解析して、周辺の生態系状況と住民の生業や暮らしとの関係を検討した。非木材林産物は、森林の重要な生態系サービスだが、その利用は世界のいろいろな地域で減少傾向にある。森林の減少や劣化がその潜在的要因の一つだが、貨幣経済の拡大など社会・経済的要因も深く関連していると考えられる。森林の減少・劣化が住民に与える影響を評価するためには、定量的なデータを用いて、生態的要因と社会的要因を同時に検討する必要がある。本研究のデータセットを用いて分析した結果、森林が減少すると利用が減ることが、いくつかの林産物で示された。また、経済的要因も重要だったが、その影響は林産物の種類によって異なった。例えば、豊かな世帯がより狩猟動物を利用する傾向があった。これは、森林減少や動物の密度の減少が進んだことを背景に、森林にアクセスできる交通手段や効率よく狩猟ができる道具(銃など)を持つ世帯のみが、狩猟をしているためだと考えられる。この研究により、林産物利用に、社会的・生態的要因双方が影響を与えていることがデータから明らかになった。この結果については、8月にスイスのモンテ・ヴェリタで行われた国際シンポジウムでの招待講演で発表を行い、またBiological Conservation誌に投稿し掲載された。また、村落の人口動態と自然及び社会的要因の関連を調べたところ、村外に住んでいる村人の割合は、村の外との人的ネットワークと強い関連があり、また人口増の要因となっていることが示唆された。この結果については、3月に日本生態学会において発表した。この研究では、生態系サービスの利用と社会的・生態的要因との関係を明らかにすることを目的に、聞き取り調査による社会学データと衛星データに基づいた土地被覆データを分析した。調査対象地域は、マレーシア・サラワク州である。聞き取り調査は91村で村長と20世帯に行われた。分析の結果、林産物の利用は森林被覆によって影響を受けていることが明らかになった。一方で、村に居住していない村人の数も森林被覆と関連していることが示され、これは村外の資源を利用することで森林利用が減っているためだと推測された。また、政治力など、村外とのつながりが、森林被覆に寄与している可能性も示唆された。
水稲の穂培養法を用いた籾中の窒素代謝と炭水化物代謝との関連性の解明

水稲の穂へ供給する窒素と炭素の量を任意に制御できる実験系を用いて、それらと粒重増加との関係を検討した。高濃度の窒素を穂に供給すると、玄米中にアンモニア態窒素が蓄積し、それが糖代謝を阻害して、粒重増加が緩慢となった。一方、炭素の供給量が多いほど粒重増加は大であるが、同じ炭素量であれば太陽光を照射した穂の粒重がより増大した。この増大は、籾殻の光合成の寄与と日射が直接糖代謝を活性化させたためと推察した。水稲多収性品種タカナリは、m^2当たり籾数が増大しても高い登熟歩合を維持するが、この原因を登熟期の乾物増加量の多少および輸送系器官の特性から究明した。材料および方法:コシヒカリ、タカナリ、アケノホシおよびあきたこまちの計4品種を大学圃場に移植し、生育させた。3種の処理をして、登熟期に定期的に粒重を測定し、穂首節や枝梗の横断面を観察した。また、切り穂を液体培地に挿してソース能力を一定にした穂培養法を用いて、粒重増加を調査した。結果:最も多収はタカナリN区で756g/m^2、次いでアケノホシN区の646g/m^2であった。タカナリは5万/m^2を超える籾数でも約80%の高い登熟歩合を示した。5万粒/m^2以上の籾数を得たコシヒカリ、タカナリ、アケノホシの登熟期間乾物増加量を比較すると、最大はコシヒカリの819g/m^2で、タカナリは568g/m^2と最低だった。登熟期間の穂重増加は3品種とも大差なく、約770g/m^2であり、タカナリは計算上、199g/m^2が茎葉から穂へ移行したことになる。従って、タカナリの出穂期の乾物重が大であったことが高い登熟歩合となった一因であると推察された。培養期間中の吸収した培地量が同じであっても、タカナリは穂重(新鮮重)増加量が他の品種よりも高い傾向にあった。培地はスクロース117mM溶液であることより、タカナリは糖からデンプンへの転換効率が高いことが示唆された。間茎重減少量が大であったタカナリは、1次枝梗の大維管束導管部直径の総和が他品種よりも大で、輸送器官と同化産物輸送能力は密接な関係にあった。以上より、タカナリは出穂期までに多量の炭水化物を蓄積させ、発達した輸送系、もしくは糖からデンプンへの高い転換効率を持っことで高い登熟特性を示すと推察された。水稲の穂を切断し、液体培地に挿してソース能力を任意に定めることができる培養方法(以下穂培養法と記載)を用いて、穂部の窒素代謝と炭水化物代謝との関連性の解明を試みているが、その実験過程で、太陽光が穂に当たると粒重増加が増大することがわかった。【材料と方法】圃場で生育させた水稲6品種をそれぞれを穂培養し、培地の炭素源(スクロース2%,同4%,フルクトース2%,同4%)およびNH_4NO_3濃度(18,36,72mM)ならびに培養環境(室内、野外、遮光)を変えて粒重増加を調査した。【結果】1.液体培地の炭素源と窒素濃度が粒重増加に及ぼす影響:培地の炭素源としてスクロースとフルクトースを検討した結果、両者に明確な差は認められなかったが、両炭素源とも2%よりも4%の方が、籾千粒重の値が大であった。一方、登熟初期に玄米中のアンモニア態窒素濃度が高いと登熟不良となることを穂培養法で確かめた。明らかに培地の窒素濃度が高いものほど粒重増加が緩慢となり、穂培養法においても窒素代謝が炭水化物代謝に影響を及ぼすことが示唆された。なお、穂培養の粒重増加は培地の吸収量に支配されていた。2.培養環境が粒重増加に及ぼす影響:アキヒカリでは蒸散抑制処理の有無に関係なく、太陽光に当てた穂の粒重が明らかに室内の穂よりも増大した。培地吸収量は培養期間が長くなると減少していくが、穂自身の蒸散量は太陽光が当たった穂よりも遮光した穂の方が大であった。しかしながら、同じ培地吸収量でも太陽光が当たった穂の粒重増加が大であった。水稲の穂首節下第1節間で切断した穂を液体培地に挿して、ソース能力を任意に定める穂培養法を用いて、穂部の窒素代謝と炭水化物代謝との関連性の解明を試みている。液体培地のアンモニア態窒素濃度が高いものほど穂重増加が緩慢で、穂の含水率が高く、液体培地の吸収量は低い値であった。

この原因は、過剰なアンモニア態窒素を吸収したことにより、玄米で糖からデンプンへの合成が抑制されたことで、穂重増加が緩慢であったこと、籾中に蓄積した糖のために穂の含水率が維持されて、液体培地の吸収が抑制されたものと推察した。また、前年度の実験で、穂培養法実験下で穂に太陽光が当たると粒重増加が増大する現象を認めたため、この現象の原因解明を行った。太陽光を遮り、LED光(青色光および赤色光)を照射して粒重増加を検討したが、いずれのLED光でも粒重増加に差は認められなかった。これより、粒重の増大には太陽光の照射が有効であると言えた。日射による粒重増大の原因として、籾殻の光合成が粒重増加に寄与している可能性および日射が穂部での糖代謝に関与している可能性が推測できた。籾殻光合成の粒重増加への寄与率(籾殻増加量/籾増加量×100)は最大で23%であった。一方、日射が穂部での糖代謝に関与している可能性について検討するために、籾殻に含まれる全糖含有率を調査した。遮光下の籾殻中全糖含有率は日射下よりも若干低いものの、玄米で合成されるデンプンの基質として十分にあると考えられた。これより、日射が籾殻から玄米への糖の移行に関与している可能性は低く、玄米中のデンプン合成に日射が関与していることが示唆された。これらより、日射による籾千粒重の増大は、籾殻の光合成による増加と、玄米中での糖からデンプンへの転換が活性化されたことに起因しているのではないかと推察された。
リチウムドリフト法とイオン注入法を組み合わせた新型シリコン検出器の開発 -長期安定で厚肉な宇宙重粒子線検出器を目指して-

周囲環境に弱い金蒸着電極を使用した従来のLiドリフト法による検出器に代わって、本研究ではSi表面にボロン(B)を高濃度にドープし、Liドリフト法と組み合わせることによってPN接合をSi内部に作り、厚肉でしかも表面安定なSi検出器(B-Si(Li)と呼ぶ)を製作することを目的としている。昨年度は、この製作方法が有効であることが立証できたが、漏れ電流増加が認められたので、今年度はこの問題に対して試作検討を行なった。用いた方法は、検出器の周囲にリング状に数本のP層を形成し、透き間をLiがドリフトされたN層として表面をPNPNという構造にしたことである。このPリング電極をガードリングとして使用したところ、3インチφで4mmtの検出器において数μAという体積漏れ電流と一致した良好な値が得られた。しかし、この方法ではガードリングと検出器中心の放射線に対して有感な部分に別々に電圧を印加しなければならず、実用上はリード線や抵抗が増えるなど不都合な場合が多い。この対処法としては製作したPリング電極と共に、最も外側の部分にNリング電極を付けた、PストップおよびNストップ法によって電流を減少させていく方法が有効だと考えられ、今後はこの方法を試してみる予定である。また、放射線医学総合研究所(HIMAC)で800MeV/nのエネルギーを持ったSi重粒子入射によるテストを行ない、B-Si(Li)検出器の全面を突き抜けさせた際に付与されたエネルギー損失として4.5%(FWHM)の幅が得られた。この結果はB-Si(Li)検出器によって作られた空乏層の厚さの精度を表しており、ストラグリングが3%程度あることも含めて、Bドープを行なった内部に厚さのむらの無い空乏層が形成されていることがわかった。従来のLiドリフト型Si検出器では周囲環境に弱い金蒸着電極が表面障壁を作るために使用されていたが、本研究ではSi表面に高濃度ボロンドープを行い、Liドリフト法と組み合わせる事でPN接合をSi内部に作り、厚肉でしかも安定なSi(Li)検出器を作ることを目的としている。高濃度ボロンドープを行う方法は、当初イオン注入法を使う事を考えていたが、ラディエーションダメ-ジの心配のあるこの方法に代わって、イオン拡散法で高濃度ボロンド-ブを行うことに変更した。通常の拡散法は100μm程度に深くボロンが侵入してしまい、この層が放射線に対して不感領域となることで本研究の目的には合わないと考えていたのだが、1μm程度の薄さに、しかも10^<20>[cm^3]程度の高濃度ドープが出来る塗布材を見つけたことで拡散法に変更したのである。また、原理的にイオン拡散法は高温処理が必要であるが、高温にSiウェハ-をさらすとキャリアのライフタイムが減少してしまうことが様々な実験で分かり、結果としてSiが相転移を起こさない900度以下の温度では、安全にイオン拡散を行うことができることが分かった。実際にこの拡散法を試し、直径3インチφで厚さが4mmtの素材に対して表面(1μmt)を高濃度にボロン・ドープした後で逆側の面からLiドリフトを行ったところ、従来よりも安定なドリフトを行う事ができ、比抵抗も100kΩcmを越える素材を作る事ができた。しかも得られた検出器にアルファ線を照射した結果、この大面積な検出器に対して140keV(FWHM)の良好なエネルギー分解能が得られた。ただし、現在の検出器の漏れ電流は100μAと大きいが、これは側面リ-クであると思われ、今後はP+またはNストップの漏れ電流防止処理を行って更に良好な検出器を製作していきたいと考えている。
現地調査を踏まえた「荒ぶる神」の鎮祭伝承の共同研究

本研究は、各国風土記(逸文を含む)にみえる「荒ぶる神」の鎮祭伝承に焦点をしぼり、現地調査を踏まえた分析をおこなうことにより、古代国家形成期の広域権力や倭王権による地域編成のあり方の具体的解明をめざす点にある。研究の最終年度は、合同現地調査と研究会を各4回、各自が個々の資料調査を数回ずつ、また学会発表を3回、科研調査の成果発表シンポジウムを1回実施した。その成果は以下の通りである。(地域社会研究チーム)研究代表者の坂江渉が、1各地で「荒ぶる神」祭祀を司った一族は、自発的に移住してきたのではなく、倭王権や広域的権力によって、戦略上・物流上の要地に向けて計画的に派遣されたと考えられ、その時期はおおむね6世紀半ば以降であること、2その前提には、朝鮮半島における対外的危機が横たわっていたこと、などを明らかにした。これらの成果を、4回の研究会と『島根県古代文化センター研究論集』22などに公表した。さらに坂江は、3現地調査を通じて、「荒ぶる神」の伝承比定地では多くの場合、地方寺院の痕跡(廃寺・瓦散布地・肥前国の橋寺など)を見いだせることに気づき、その成果を第29回出雲古代史研究会で報告した。研究分担者の高橋明裕は、神話・伝承の分析を通じて、56世紀の播磨の地域勢力の交替を分析し、その成果を「伊和大神信仰の諸相」として発表した。(氏族研究チーム)研究分担者の古市晃は、従来の研究蓄積を踏まえつつ、『古事記』『日本書紀』及び『播磨国風土記』などの氏族伝承にもとづき、56世紀の倭王権の地域支配のあり方について、総合的な解明を試みた。その成果を1冊の本としてまとめ上げた(『国家形成期の王宮と地域社会』。今後、「荒ぶる神」の伝承比定地のような、交通の難所でかつ軍事的・経済的な要地において、神祭りの場と仏教寺院が並存する理由を明らかにすることが、大きな研究課題として浮かび上がってきた。本研究の目的は、各国風土記(逸文を含む)にみえる「荒ぶる神」の鎮祭伝承に焦点をしぼり、現地調査を踏まえた分析を行うことにより、従来の屯倉制や国造制論とも関連付けながら、古代国家形成期の広域権力や倭王権による地域編成のあり方の具体的解明をめざす点にある。研究初年度にあたる平成28年度は、合同現地調査を3回、研究分担者会議を3回、また各自が個々の現地調査を実施することにより、以下の成果を得た。(地域社会研究チーム)1研究代表者の坂江が、国文学者によって説かれる『播磨国風土記』の「口承文学」について、歴史学の立場から捉え直しをおこなった。それが定期的な地域の祭りの場で、支配ー庇護関係を確認する目的で開かれていた口頭祭祀儀礼で語り聞かされていたものであることを明らかにした。その成果を2つの論考として公表した(専修大学古代東ユーラシア研究センター年報、歴史と神戸など)。2研究分担者の高橋が播磨諸郡の地域的特性を踏まえて、水系・交通路に即した王権との関わり、地域間関係の解明を進め、その成果を「播磨国風土記」関連の事典に反映させた。(氏族研究チーム)1研究代表者の坂江が、各国風土記の「荒ぶる神」の鎮祭伝承が、倭王権によって各国の戦略的の要地に派遣された個別氏族の、居住・祭祀の縁起や妥当性を語ろうと口承であったことを明白にし、その成果を関連学会などで報告した(ひょうご歴史文化フォーラム、明治大学日本古代学研究所公開シンポジウムなど)、2研究分担者の古市が、『古事記』『日本書紀』各国風土記にみえる鎮祭伝承と倭王権・氏族との関係を検討し、その成果を関連学会などで報告した(島根県・島根県教育委員会主催シンポジウム、明治大学日本古代学研究所公開シンポジウムなど)。「荒ぶる神」の鎮祭伝承の現地調査が、地元研究者の援助・協力によって円滑に進み、さまざまな知見を得られたので。本研究は、各国風土記(逸文を含む)にみえる「荒ぶる神」の鎮祭伝承に焦点をしぼり、現地調査を踏まえた分析をおこなう。それを通じ、屯倉制論や国造制論とも関連付けながら、古代国家形成期の広域権力や倭王権による地域編成のあり方の具体的解明をめざす。研究2年目にあたる平成29年度は、合同調査を3回、合同研究会を2回、また各自が個々の現地調査を実施することにより、以下の成果を得た。(地域社会研究チーム)研究代表者の坂江渉が、1古代の神話(神語り)の目的が、現実の祭りの「諸事」の縁起を説くことにより、聞き手をして、その実修に向かわせる点にあり、「荒ぶる神」の伝承がその一環をなすこと、すなわち「荒ぶる神」の鎮祭を司る特定一族の本縁譚として捉えられることを明らかにした。2ただし個々の神話の内容は、祭儀の何らかの縁起について、一対一で固定的に対応するのではなく、複数のものに掛かる点なども指摘した。3さらに従来、単なる開発伝承としてみられてきた『常陸国風土記』の箭括氏麻多智の説話についても、「祟り神」鎮祭の始祖伝承の一類型という、基本的に1の枠組で捉えられる神話断片だと提起した。これらの成果を『ひょうご歴史研究室紀要』3号と『古代史料を読む(上)』にて発表し、関連する講演会で報告した(「淡路島古代史の魅力を探る」シンポジウム)。

また研究分担者の高橋明裕は、『播磨国風土記』の「鴨追い伝承」の遺称地が、賀毛郡内の重要遺跡近辺に集中する点に注目し、当該地において、郡ないし里の中心施設が存在したことを論じた(『わたしたちの小谷』)。(氏族研究チーム)研究分担者の古市晃が、『古事記』『日本書紀』及び『播磨国風土記』「国造本紀」などの氏族伝承を中心に分析をすすめ、氏族伝承の基層に存在する地域社会と中央支配者集団の関係性の析出に務めた。その成果を『古代出雲ゼミナールIV』などに発表した。「荒ぶる神」の伝承比定地の現地調査が、各地の地元研究機関の協力を得て順調にすすんだこと、また『古事記』『日本書紀』『常陸国風土記』などの「祟り神」伝承についても、基本的に本研究の方法・視角で理解できる可能性があるという、当初想定していなかった着想を得たため。本研究は、各国風土記(逸文を含む)にみえる「荒ぶる神」の鎮祭伝承に焦点をしぼり、現地調査を踏まえた分析をおこなうことにより、古代国家形成期の広域権力や倭王権による地域編成のあり方の具体的解明をめざす点にある。研究の最終年度は、合同現地調査と研究会を各4回、各自が個々の資料調査を数回ずつ、また学会発表を3回、科研調査の成果発表シンポジウムを1回実施した。その成果は以下の通りである。(地域社会研究チーム)研究代表者の坂江渉が、1各地で「荒ぶる神」祭祀を司った一族は、自発的に移住してきたのではなく、倭王権や広域的権力によって、戦略上・物流上の要地に向けて計画的に派遣されたと考えられ、その時期はおおむね6世紀半ば以降であること、2その前提には、朝鮮半島における対外的危機が横たわっていたこと、などを明らかにした。これらの成果を、4回の研究会と『島根県古代文化センター研究論集』22などに公表した。さらに坂江は、3現地調査を通じて、「荒ぶる神」の伝承比定地では多くの場合、地方寺院の痕跡(廃寺・瓦散布地・肥前国の橋寺など)を見いだせることに気づき、その成果を第29回出雲古代史研究会で報告した。研究分担者の高橋明裕は、神話・伝承の分析を通じて、56世紀の播磨の地域勢力の交替を分析し、その成果を「伊和大神信仰の諸相」として発表した。(氏族研究チーム)研究分担者の古市晃は、従来の研究蓄積を踏まえつつ、『古事記』『日本書紀』及び『播磨国風土記』などの氏族伝承にもとづき、56世紀の倭王権の地域支配のあり方について、総合的な解明を試みた。その成果を1冊の本としてまとめ上げた(『国家形成期の王宮と地域社会』。今後、「荒ぶる神」の伝承比定地のような、交通の難所でかつ軍事的・経済的な要地において、神祭りの場と仏教寺院が並存する理由を明らかにすることが、大きな研究課題として浮かび上がってきた。地域社会研究チームと氏族研究チームの情報交換を緊密に行い、その成果を、全体として学会等に情報発信していく必要がある。地域社会研究チームと氏族研究チーム相互間の情報交換を密にとることと、各メンバーが関連する学会や合同研究会などで研究報告をおこなうことにより、研究最終年度に相応しい成果を得られるようつとめる。年度末に、出雲国風土記に関する新資料の調査をおこなう予定だったが、調査先の関係者の都合により、実施できなかったため。1『肥前国風土記』と『尾張国風土記』(逸文)の「荒ぶる神」伝承比定地の現地調査と資料調査をおこなう予定であったが、地元受け入れ先の調査機関の都合、および気象状況の悪化のため(大雪)、実施できなかったことによる。2平成29年度末、書籍購入をするため、納品書兼請求書を事務に提出したが、事務方のミスで執行されず、次年度執行に回ったため。1について、新年度の早いうちに、当該比定地の現地現地調査と資料調査をおこなう予定である。2について、新年度に入り、執行手続きがおこなわれる予定である。
細胞分裂中期の染色体整列におけるＮＤＲキナーゼの機能

当研究室においてNDR1が哺乳類細胞の染色体整列に必須のキナーゼであることが明らかとされた。しかし、分裂期におけるNDR1の生理的基質は不明であり、NDR1による染色体整列の制御機構は不明である。最近、NDRキナーゼの新規基質としてAAK1やRabin8、PI4KBなどの蛋白質が同定された。そこで、本年度はNDRキナーゼの新規基質として同定された蛋白質の細胞分裂における機能を解明することを目的として、以下の二点について研究を行った。1,哺乳類細胞の核形態に対するNDRキナーゼ新規基質の発現抑制の効果検討。紡錘体形成の異常は不均等な染色体分配を引き起こし、微小核と呼ばれる小さな異常な核の断片の形成を誘発する。また、細胞質分裂における異常は細胞の多核化を引き起こすため、核形態によるスクリーニングは細胞分裂にとって重要な因子を探索するうえで強力な手法である。NDRの新規基質として同定された蛋白質のsiRNAを作成し、HeLa細胞の核形態に対する発現抑制の効果を検討したところ、AAK1の発現抑制は細胞の多核化を、Rabin8の発現抑制は微小核の形成を誘発した。したがって、AAK1は細胞質分裂において、Rabin8は染色体整列において必須の因子であることが示された。2,染色体整列に対するNDRキナーゼ新規基質の発現抑制の効果検討。核形態の観察結果から、Rabin8が染色体整列に寄与することが示唆されたので、紡錘体形成におけるRabin8の発現抑制の効果を検討した。その結果、Rabin8の発現抑制細胞は染色体整列異常が誘発されており、Rabin8が染色体整列にとって必須の因子であることが明らかとなった。以上の研究結果より、NDR1の下流因子であるRabin8が染色体整列に寄与することが示され、NDR1とともにRabin8が協調的に染色体整列を制御する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当研究室において、NDR1が哺乳類細胞の染色体整列に必須のキナーゼであることが明らかとされた。さらに、最近、上流キナーゼであるMSTIとともにNDR1がAurora Bの活性を抑制することで染色体整列に寄与する可能性が報告された。しかし、分裂期におけるNDR1によるAurora Bの活性抑制機構は不明である。本研究ではMST1、NDR1のAurora Bの活性抑制が染色体整列に果たす役割を細胞レベルで解明することを目的とし、本年度は以下の2点について研究を実施した。さらに、最近、上流キナーゼであるMST1とともにNDR1がAurora Bの活性を抑制することで染色体整列に寄与する可能性が報告された。本研究ではMST1、NDR1のAurora Bの活性抑制が染色体整列に果たす役割を細胞レベルで解明することを目的とし、本年度はNDR1アナログ感受性変異体の作成について研究を実施した。これまでに、siRNAによるNDR1の発現抑制が哺乳類細胞の染色体整列を阻害することを明らかとしてきた。しかし、siRNAによる発現抑制は目的遺伝子の機能阻害に長い時間を要するということから、NDR1が細胞分裂のどの時期に機能しているのかという詳細について解析することは困難であった。そこで、NDR1キナーゼ活性を時期特異的に阻害する目的で、1-NM-PP1感受性のNDR1アナログ感受性変異体を作成し、in vitroキナーゼアッセイによる1-NM-PP1の活性阻害効果を評価した。ATPアナログ低分子化合物である1-NM-PP1は野生型NDR1のキナーゼ活性に対して影響をもたらさないが、ATP結合部位の166番目のメチオニンを置換したNDR1 (Ml66A)変異体の活性を効果的に抑制することが確認された。次に私は細胞分裂に対するNDR1活性阻害の効果を検討するため、HeLa細胞を用いNDR1 (M166A)恒常発現細胞株を樹立した。現在は樹立したNDR1 (M166A)恒常発現細胞株を用いて、細胞分裂におけるNDR1の時期特異的な阻害効果を検討中である。

NDRの新規基質として同定された蛋白質のsiRNAを作成し、HeLa細胞の核形態に対する発現抑制の効果を検討したところ、AAK1の発現抑制は細胞の多核化を、Rabin8の発現抑制は微小核の形成を誘発した。したがって、AAK1は細胞質分裂において、Rabin8は染色体整列において必須の因子であることが示された。2,染色体整列に対するNDRキナーゼ新規基質の発現抑制の効果検討。核形態の観察結果から、Rabin8が染色体整列に寄与することが示唆されたので、紡錘体形成におけるRabin8の発現抑制の効果を検討した。その結果、Rabin8の発現抑制細胞は染色体整列異常が誘発されており、Rabin8が染色体整列にとって必須の因子であることが明らかとなった。以上の研究結果より、NDR1の下流因子であるRabin8が染色体整列に寄与することが示され、NDR1とともにRabin8が協調的に染色体整列を制御する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。MST1によるAuroraBのN末端非触媒領域のリン酸化がAuroraBのキナーゼ活性に対して与える影響を明らかにした。さらに、AuroraBとNDR1の結合領域を明らかにした。NDR1の時期特異的な活性阻害の方法を確立した。さらに、1-NM-PP1によるNDR1アナログ感受性変異体の特異的な阻害効果を確認した。MST1によるAuroraBのリン酸化が染色体整列に対して与える影響を解析するために、非リン酸化型AuroraB(TA)変異体、擬似リン酸化型AuroraB(TE)変異体発現細胞における細胞分裂中期の染色体整列を観察する。また、NDR1欠失変異体を利用して、NDR1との結合がAuroraBのキナーゼ活性に対して与える影響を検討する。作成したNDR1アナログ感受性変異体恒常発現細胞株を用いて細胞分裂におけるNDR1の活性阻害の効果を解析していく。細胞分裂時のNDR1(M166A)変異体恒常発現細胞株に対する1-NM-PP1添加の効果を共焦点レーザー顕微鏡による経時観察により解析していく予定である。
概日リズム中枢を司る神経細胞ネットワークの作動基盤

ほ乳類の概日リズムは脳視床下部の視交叉上核に存在する中枢時計により調節される。視交叉上核は約2万個の神経細胞がネットワークを形成し、睡眠覚醒やホルモン放出などの生理機能を調節するが、神経細胞の集団レベルでの現れてくる機能やその背後にあるメカニズムの多くは不明である。本研究課題では、概日リズム観察に特化した長期蛍光タイムラプスイメージング法を用いて、神経細胞ネットワークレベルでで概日リズムを高空間分解能にかつ網羅的に可視化解析した。さらに時計遺伝子発現や神経細胞発射活動、膜電位の概日リズムを同時に捉えることに成功し、概日リズムの神経細胞ネットワークレベルでの発振機構の一端を解明した。哺乳類の中枢時計は脳視床下部の視交叉上核に存在し、約2万個の神経細胞がネットワークを形成する。視交叉上核はネットワーク内に複数の領域振動体を形成し、振動体同士が連絡する階層的な多振動体構造を有する。個々の細胞におけるリズム発振のメカニズムについては時計遺伝子発現の転写翻訳ループが想定され、特に近年詳細な分子機構の解明が急速に進んでいる。一方で、神経細胞集団での現れてくる機能やそのメカニズムについては殆ど分っていない。本研究課題では、独自に開発した長期蛍光タイムラプスイメージングにより、神経細胞ネットワークにおける概日カルシウムリズムを“高空間分解能"に、また数百1,000個規模の神経細胞の活動を“網羅的"に可視化解析することで、概日リズム中枢を司る神経細胞ネットワークの作動基盤を解明することを目指している。本年度は、時計遺伝子の緑色レポーターマウスから視交叉上核切片を作成し、アデノ随伴ウイルスにより多色カルシウムプローブを発現させることで、時計遺伝子とカルシウムの同時測定を行なった。得られた画像データから、概日リズムの主要パラメーターである頂点位相・振幅・最低値・周期を解析プログラムを用いて自動計算により求め、空間マッピングを行なうことで、両者の時間および空間的差異を詳細に解析している。また時計遺伝子とカルシウムの機能連関を明らかとする為、主要な時計遺伝子を欠損する遺伝子改変動物や、シグナル分子/受容体の阻害薬・促進薬を用いて、両者の時空間パターンの変動を観察している。哺乳類の中枢時計は脳視床下部の視交叉上核に存在し、約2万個の神経細胞が階層的なネットワークを形成する。個々の細胞における概日リズム発振のメカニズムは、時計遺伝子発現の転写翻訳ループが想定され、詳細な分子機構の解明か急速に進んでいる。一方で、神経細胞集団レベルで出現する機能やそのネットワークの作動メカニズムについては殆ど分っていない。本研究課題では、これまで独自に開発した長期蛍光タイムラプスイメージング法により、神経細胞ネットワークにおける概日カルシウムリズムを“高空間分解能"かつ“網羅的"に可視化解析することで、概日リズム中枢を司る神経細胞ネットワークの作動基盤を解明する事を目指している。前年度までに時計遺伝子発現とカルシウムリズムを1細胞レベルで同時計測する多色イメージング計測を可能とした。本年度は、Cre-LoxP組み替え法を用いた細胞種特異的な神経ネットワークの計測法を確立した。神経ペプチドを発現する細胞に組み替え酵素Creを発現する遺伝子改変マウスを用い、マウスから視交叉上核の組織培養切片を作成し、アデノ随伴ウイルスによりCre依存的に高感度カルシウムセンサーを感染発現させることで、特定の神経細胞集団からのカルシウムリズムを計測することを可能とした。さらに異なる蛍光色のレポーターを用いることで、神経細胞ネットワーク全体の中での特定の細胞種の働きを選択的に可視化すること出来た。さらに得られた細胞種特異的なイメージングデータから、概日リズムの主要パラメーター(頂点位相・振幅・最低値・周期)を解析プログラムを用いて自動計算により求めて、その空間情報をマップとして表示することで、特定の細胞の空間的なリズムの差異を詳細に解析することができる。現在は、シグナル分子/受容体の阻害薬・促進薬を用いて、両者の時空間パターンの変化を観察している。哺乳類の生物時計中枢である視交叉上核の作動原理を理解するため、高解像の大規模光イメージングによる神経細胞ネットワークの可視化解析を行った。これまでに細胞内カルシウム濃度変化を指標に、視交叉上核の神経回路レベルの活動を捉えることを可能としているが、本研究ではさらに、細胞種ごとの活動や膜電位変動を捉えることを可能とした。また、時計遺伝子レポーター動物(PER2::LUC)から作成した視交叉上核に、アデノ随伴ウイルスを用いて高感度カルシウムセンサー(GCaMP6s)を感染発現させ、多電極ディッシュアレイ上に静置培養することで、時計遺伝子・カルシウム・神経発射活動の3機能を同一サンプルの同一領域から計測することに世界で初めて成功し、野生型動物において明瞭な3機能の概日リズムを観察した。特に各リズムの周期、振幅、位相差などの空間分布を詳細に解析し、Cryptochrome二重欠損動物の比較したところ、3機能全てにおいて振幅が減弱し、周期や位相差が不安定なリズムが観察された。特に各位相関係に特徴的な差異が観察された結果より、概日カルシウムリズムは時計遺伝子からの制御による制御と、細胞間連絡に由来する2種のカルシウム流入源があることが分かった。

本研究課題では、概日リズム観察に特化した長期蛍光タイムラプスイメージング法を用いて、神経細胞ネットワークレベルでで概日リズムを高空間分解能にかつ網羅的に可視化解析した。さらに時計遺伝子発現や神経細胞発射活動、膜電位の概日リズムを同時に捉えることに成功し、概日リズムの神経細胞ネットワークレベルでの発振機構の一端を解明した。3カ年計画の2年目である本年度は、特定の細胞種からの概日カルシウムイメージングを達成し、神経細胞ネットワークにおける時空間的な差異を観察することを可能とした。これまでに、細胞種特異的な機能を示すプレリミナリーな実験データを得ており、同細胞種内でのリズム位相差や、細胞の微小区画でのカルシウムリズムなどを観察している。今後も計画通りに着実に実験を進めることで、細胞ネットワークとしての機能を明らかに出来ると考えている。神経生理学これまでに、時計遺伝子とカルシウムの時空間パターンの差異(初年度)、特定の細胞種からのカルシウム変動を観察しており(2年次)、生物時計中枢の細胞ネットワークの差作動基盤解明を目指して、今後は特にこれらのイメージングデータの詳細な解析を進めて行く。3カ年計画の初年度は、本研究の中心的課題である「時計遺伝子とカルシウムの同時イメージング」を達成し、両者の時空間的な差異を観察することを可能とした。これまでに幾つかのプレリミナリなデータを得ており、1視交叉上核の吻側の背側領域においてカルシウムリズムの位相が約12時間反転する部位が存在すること、2カルシウムリズムは時計遺伝子発現に比べてリズム位相が3時間程度前進していること、3カルシウムリズムのピーク位相は動物の主観的昼の中央付近であること、4主要な時計遺伝子欠損動物ではカルシウムリズムが消失すること、などを観察している。平成26年度では、29,471円の未使用額が発生した。これは平成26年度末に購入した物品の支払が平成27年4月に支払われる為の他、米国出張費の返納金が発生し年度末に返金された為に生じたものである。時計遺伝子とカルシウムの時空間パターンの差異をさらに詳細に観察し、今後も細胞ネットワークとしての機能を解析してゆく。またCre-LoxPシステムを用いることで、神経細胞集団の細胞種特異的可視化を可能とする。既にこれまでに視交叉上核の主要な神経ペプチドであるAVPおよびVIPのCre発現マウスを入手しており、視交叉上核切片にアデノ随伴ウイルスを感染発現させることで、AVPやVIP陽性細胞に特異的なカルシウムイメージングを可能とする。本年度の予算とあわせて、主に細胞培養ための消耗品として使用する。平成25年度では、21,409円の未使用額が発生した。これは平成25年度末に購入した物品の支払が平成26年4月に支払われることになったため、生じたものである。平成26年5月現在では未使用額はない。