hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
純チタン陶材焼付冠の焼付機構の明解および臨床的強度の改善

現在市販されている陶材焼付用合金には力学的な問題や生体適合性の問題等がある.そこで強度が高く,生体為害作用の少ないと言われているチタンを陶材焼付冠に使用することは有益である.しかし,チタンと陶材の接合強度は従来の陶材焼付用合金に比較して劣っており,その原因の一つとして,陶材焼成時にチタン表面に過剰に生成されるチタン酸化物が考えられる.本研究では,陶材焼成時,界面の過剰なチタン酸化物の生成量を減少させるために,チタンに前処理を行ってチタン表面に水素との化合物を作り,その上に陶材を接合させて,陶材との接合強度を測定した.さらに,チタンと陶材との接合界面の反応生成物を分析することにより,両者の接合機構について考察した.その結果水素雰囲気中にて500°Cまで加熱処理を施したTiと陶材との接合強度は4.38±0.816MPaであり,これはコントロール群の接合強度,1.99±0.479MPaの約2倍の強度であった.450°Cで処理した試料群の接合強度は2.10±0.318MPaであり,平均値ではコントロールを上回ったが,有意差はなかった.550°Cで処理した試料群の強度測定不可能であった.接合界面のSEM像観察の結果,水素雰囲気中にて500°Cまで加熱処理を施した試料では陶材と金属は密に接合しており,界面に約1μmの反応層が観察された.金属表面のX線回折ではいずれの試料においてもTiO2のピークが検出された.コントロールの試料に比べて,加熱処理をした試料ではTiO2のピークの強度が小さかった.550°Cの試料ではTixHyのピークが検出された.以上の結果より500°Cで加熱処理した試料はサンドブラスト処理などによって機械的な接合をも期待できる条件下では臨床的に問題のない強度を得られる可能性が示唆された.また,接合強度を改善するためには,TixHy層の厚さを至適な厚さに制御する必要があることが明かとなった.現在市販されている陶材焼付用合金には力学的な問題や生体適合性の問題等がある.そこで強度が高く,生体為害作用の少ないと言われているチタンを陶材焼付冠に使用することは有益である.しかし,チタンと陶材の接合強度は従来の陶材焼付用合金に比較して劣っており,その原因の一つとして,陶材焼成時にチタン表面に過剰に生成されるチタン酸化物が考えられる.本研究では,陶材焼成時,界面の過剰なチタン酸化物の生成量を減少させるために,チタンに前処理を行ってチタン表面に水素との化合物を作り,その上に陶材を接合させて,陶材との接合強度を測定した.さらに,チタンと陶材との接合界面の反応生成物を分析することにより,両者の接合機構について考察した.その結果水素雰囲気中にて500°Cまで加熱処理を施したTiと陶材との接合強度は4.38±0.816MPaであり,これはコントロール群の接合強度,1.99±0.479MPaの約2倍の強度であった.450°Cで処理した試料群の接合強度は2.10±0.318MPaであり,平均値ではコントロールを上回ったが,有意差はなかった.550°Cで処理した試料群の強度測定不可能であった.接合界面のSEM像観察の結果,水素雰囲気中にて500°Cまで加熱処理を施した試料では陶材と金属は密に接合しており,界面に約1μmの反応層が観察された.金属表面のX線回折ではいずれの試料においてもTiO2のピークが検出された.コントロールの試料に比べて,加熱処理をした試料ではTiO2のピークの強度が小さかった.550°Cの試料ではTixHyのピークが検出された.以上の結果より500°Cで加熱処理した試料はサンドブラスト処理などによって機械的な接合をも期待できる条件下では臨床的に問題のない強度を得られる可能性が示唆された.また,接合強度を改善するためには,TixHy層の厚さを至適な厚さに制御する必要があることが明かとなった.
ジヒドロピリジン化合物の新展開:T型CaおよびClチャネル阻害の有用性

ジヒドロピリジン化合物は高血圧や狭心症の治療に汎用されており、その作用点はL型カルシウムチャネルであると信じられてきたが申請者はそれ以外の作用と薬物のプロフィールとの関係に注目している。エホニジピンに関しては、ジヒドロピリジン系降圧薬の最大の副作用である反射性頻脈がきわめて少ないという優れたプロフィールが臨床の場でも高く評価されているが、この性質はT型カルシウムチャネル抑制作用で説明できた。心筋および強制発現系を用いて類縁化合物の中からT型カルシウムチャネルをより強力かつ選択的に阻害するものを探索した結果、エホニジピンの光学異性体、R(-)-エホニジピン[R(-)-EFO]を見いだした。クロライトチャネル阻害に関しては申請者はジヒドロピリジン化合物AHC-52およびPAK-200が冠動脈灌流モルモット心室筋標本の虚血再灌流後の収縮力回復を著明に促進することを発見した。同様の作用はβ遮断薬やカルシウム拮抗薬、カリウムチャネル開口薬にも見られる。しかし、これらカチオン系を就職する薬物達が心臓収縮力を著明に抑制するのに対して、AHC-52およびPAK-200は心抑制を伴わずに心筋を保護するという優れた特徴を有していた。これはAHC-52およびPAK-200がジヒドロピリジン化合物であるにもかかわらずL-型カルシウムチャネル抑制作用を持たないことで説明できた。AHC-52およびPAK-200は虚血時のミトコンドリア機能およびATP量を維持する作用を有していたが、これは申請者らが最近見出したナトリウムカリウム交交換機構阻害薬SEA0400の心筋保護作用と共通する性質であった。本研究が端緒となり、ジヒドロピリジン系化合物のL型カルシウムチャネル阻害以外の薬理学的プロフィールが明らかになり、新しい作用機序を持った心筋保護薬が開発されることを期待する。まず多くのジヒドロピリジン化合物のイオンチャネルに対する作用を単離心筋細胞およびパッチクランプ法を用いて検討し、T型カルシウムチャネルやクロライドチャネルに特異的に作用するものの探索を行った。T型カルシウムチャネルに関してはジヒドロピリジン環の5位の置換基に注目し、ホスホン酸残基を持つエホニジピンと、嵩高い置換基を持つシルニジピンが、抑制作用を有することが判明した。これらの薬物はいずれもウサギ洞房結節活動電位波形の緩徐脱分極相を選択的に延長することがわかった。この延長はニッケルの存在下では観測されなかったため、T型カルシウムチャネル阻害によるものである。クロライドチャネルに関しては1位の置換基を大きくしたPAK200やP糖タンパク阻害剤として知られていたAHC-52に抑制作用が認められた。これらの化合物に関して次にL型カルシウムチャネル、カリウムチャネル、ナトリウムチャネルに対する作用の有無をパッチクランプ法およびガラス微小電極法により検討したところ作用がみとめられないか、きわめて弱いものであった。すなわち、これらの薬物・化合物はT型カルシウムチャネルあるいはクロライドチャネルに対して特異性の高いものであった。また、摘出心筋組織標本の収縮力、活動電位波形など、心筋の基本的な機能に対しては作用がみとめられないか、きわめて弱いものであった。また、蛍光プローブを用いた単離心筋細胞のカルシウムトランジェントに対する作用の検討でも同様の結果であった。以上の結果から、T型カルシウムチャネルあるいはクロライドチャネルに対して特異性の高い薬物・化合物が見出され、それらは心臓循環系に対して悪影響は及ぼさないことが明らかになった。次年度以降にこれらの薬物・化合物による心筋保護効果について詳細に検討する予定である。T型カルシウムチャネルおよびクロライドチャネルの生理的意義を明らかにし、治療応用への可能性を探るのが本研究の目的である。

共焦点顕微鏡と蛍光プローブを用いた画像化法を心筋細胞に適用し、心筋の各部位や各発達段階でのカルシウムイオン制御を詳細に検討した。心房筋・心室筋ともに小胞体からのカルシウム放出を惹起するためのカルシウムは細胞外からL型カルシウムチャネルを通って流入し、T型は関与していなかった。一方洞房結節では心拍数を決定する緩徐脱分極相にT型カルシウムチャネルが関与していることが明らかになった。ジヒドロピリジン系化合物に関して詳細に検討し、エホニジピン、シルニジピンなどジヒドロピリジン環の5位に嵩高い置換基を有する薬物にL型・T型両カルシウムチャネルを阻害する作用があることを発見した。これらの薬物はいずれも強い徐脈作用と血管弛緩作用を有する一方で心筋抑制作用はそれほど強くないという期待通りの性質を有することも判明した。臨床でもエホニジピン長期投与により心拍数が低く抑えられ、心拍出量が維持されるという好ましい結果が得られている。さらに興味深いことに、T型カルシウムチャネル阻害作用はエホニジピンの両光学異性体に共通しているのに対し、L型カルシウムチャネル阻害作用は(+)体のみに備わっていた。すなわち、R(-)-エホニジピンは世界初の選択的なT型カルシウムチャネル阻害薬である可能性が示された。さらにR(-)-エホニジピンは心室筋の収縮力やカルシウムトランジェントには影響しないことも判明した。R(-)-エホニジピンをもちいてT型カルシウムチャネル生理的・病態生理的意義が確定するとともに、この化合物を出発点としてT型カルシウムチャネル阻害やクロライドチャネル阻害に基づく治療薬が開発されると期待される。
原始卵胞卵子からの産仔発生システムの開発

卵巣に存在する原始卵胞卵は雌側の遺伝情報を伝える重要な資源であるが、未だ活用されていない。この研究では、ブタをモデルとして異種間移植、体外培養および顕微操作を組み合わせて、原始卵胞卵を人為的に発育させ、さらに初期胚へと発生させることに成功した。これら一連の成果は、稀少な動物あるいは家畜の原始卵胞卵から個体を再生する上で、必要不可欠な手法である。大型哺乳動物の原始卵胞卵母細胞に胚発生能を付与する手法の開発の一環として、初年度は、ブタ卵巣を移植したヌードマウスに性腺刺激ホルモンを投与し卵胞発育を促進することによって、原始卵胞卵母細胞に胚発生能を付与できるかを検討した。原始卵胞から成る生後20日齢のブタ卵巣を卵巣摘出ヌードマウスの腎皮膜下に移植した。膣開口後60日に、マウスに妊馬絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)の投与,またはブタFSHを充填した浸透圧ポンプの皮下留置を行った。移植卵巣および末梢血をeCG投与2日(eCG-2)または3日後(eCG-3)、FSH投与7日間(FSH-7)または14日間後(FSH-14)に採取した。またLHサージを抑制する目的で、FSH処理開始7日後に抗エストラジオール血清を投与した(FSH-14AS)。その結果、ホルモン処理群、特にFSH-14AS群では胞状卵胞の発育が顕著であったが、FSH-14群では胞状卵胞の多くが血腫となった。マウスの血中インヒビン濃度は胞状卵胞の発育状況に対応して上昇した。直径115μm以上の卵母細胞のマウス1匹あたりの採取数は,eCG-3(68±11個),FSH-7(60±11)およびFSH-14AS群(49±9)において,性腺刺激ホルモンを投与しなかった対照群(18±5)に比較して明らかな増加を示した。体外成熟後,上記3処理群(eCG-3;13±3,FSH-7;21±4およびFSH-14AS;16±5)では対照群(4±1)に比較して多数の卵母細胞が成熟した。さらに100個前後の成熟卵子を体外受精し7日間の体外培養した結果,eCG-3、FSH-7およびFSH-14AS群においてそれぞれ1卵子ずつ胚盤胞へと発生した。以上の結果から,マウスに適切なホルモン処理を施すことによって,移植したブタ原始卵胞卵母細胞に胚発生能を付与できる可能性が示された。ブタ原始卵胞を移植したヌードマウスに卵胞刺激ホルモン(FSH)を投与することによって、ブタ原始卵胞由来の卵母細胞に低率(1%)ながらも胚発生能を付与できた(Kaneko et al.2006)。胚発生率が低い原因は、移植組織から回収した卵母細胞の細胞質成熟が不十分であるためと推定される。そこで、胚発生率の向上を目的としてホルモン処理法の改良による細胞質成熟の向上を試みた。さらに、原始卵胞由来の成熟卵母細胞の核と、別途準備した成熟卵母細胞の細胞質とを融合させる手法(核置換)の基礎実験として、屠場由来の卵母細胞を用いて再構成卵を作出した。1.ヌードマウスへのホルモン処理法の改良による胚発生率の向上の試み:原始卵胞から構成される生後20日齢のブタ卵巣皮質をヌードマウスの腎皮膜下に移植した。移植後120日前後に、プロジェステロンチューブをマウスの皮下に留置した。チューブの留置1週間後にブタFSHを充填した浸透圧ポンプを皮下に留置し、3週間後に移植卵巣を回収した。11匹のヌードマウスから210個の直径115μm以上の卵母細胞が回収された。体外成熟後115個がMII期に移行し(55%)、移行率(成熟率)は無処理(25%)あるいはFSH単独処理(35%)に比べて改善した。しかし、体外受精後の初期胚への発生は2卵子のみで(2%)、その他の卵子は28細胞で停止し、さらなる手法の改善が必要である。2.核置換を利用した再構成卵の作製:屠場卵巣由来の成熟卵母細胞をパーコール溶液内で遠心し小片化した。核板を含む細胞質小片と、核板を含まない細胞質小片とを、電気融合させ、再構築卵を作出した。活性化刺激後6日間培養した結果、40個のうち2個が胚盤胞へと発生した。次年度は、この手法を用いて、原始卵胞由来の成熟卵母細胞の核と、別途準備した成熟卵母細胞の細胞質とを融合させて初期胚の発生能を解析する。ヌードマウスに移植したブタ原始卵胞から回収した卵母細胞の胚発生能を改善する目的で、1)回収卵母細胞からの再構成卵の作成、および2)マウスの内分泌的環境の修飾によるブタ卵母細胞成熟の促進、を試みた。1.原始卵胞

卵母細胞由来の再構成卵の作成と初期発生能原始卵胞から構成される生後20日齢のブタ卵巣をヌードマウスの腎皮膜下に移植した。移植後120日前後にヌードマウスにブタ卵胞刺激ホルモンを12日間投与した後に、移植卵巣から卵母細胞を回収した。回収卵母細胞を体外成熟させた後、パーコール濃度勾配溶液内で遠心し小片化した。一方、胚発生能を持ち得る屠場卵巣由来の成熟卵母細胞も同様に小片化した。原始卵胞卵母細胞由来の核板を含む細胞質小片1個と、屠場卵母細胞由来の核板を含まない細胞質小片3個を電気融合させ、再構成卵を作出した。56個の再構成卵を電気刺激後7日間培養した結果、4個が胚盤胞へと発生し(胚発生率:7%)、胚盤胞の平均細胞数は13.6±1.8個であった。無操作のブタ原始卵胞由来の成熟卵母細胞が体外受精・発生系では1%しか胚盤胞に到達しなかった結果(Kaneko et. al.2006)に比べて、再構成卵の作製によって、ブタ原始卵胞卵母細胞からの胚発生率が改善されることが明らかとなった。2.ブタ下垂体と卵巣の同時移植後による移植卵母細胞の成熟上述の卵巣移植と同時にブタ下垂体をヌードマウスの腎皮膜下に移植し、ブタ移植卵胞の発育に適した内分泌環境を作り出すことを試みた。同時移植群では体外成熟に供した437個の卵母細胞のうち170個が成熟し(成熟率39%)、一方、下垂体を移植しなかった対照群では成熟率が33%(290/878個)であったことから、下垂体の同時移植による卵母細胞成熟の改善傾向がうかがわれた。原始卵胞に含まれる卵(原始卵胞卵)は畜産領域において重要な遺伝資源である。これまで原始卵胞卵をヌードマウスに移植し卵を発育させ人為的に受精能を付与することに成功した。しかしヌードマウスの体内で発育したブタ卵は胚発生能が低く、卵の細胞質成熟が完全でないと推察された。そこで平成20年度では、ヌードマウスから回収したブタ卵に、ブタ体内で通常に発育した卵(細胞質の成熟度が高く個体発生能を有する)の細胞質を融合させて、胚発生能を高めることを試みた。原始卵胞から構成される生後20日齢のブタ卵巣を細切しヌードマウスの腎皮膜下に移植した。マウスに浸透圧ポンプを用いてブタ卵胞刺激ホルモンを12日間持続的に投与し、原始卵胞を胞状卵胞にまで発育させた。移植卵組織から発育卵を回収し、体外培養系で第二減数分裂中期(MII期)まで成熟させた。別途、屠場から入手した通常の発育卵をMII期に成熟させた後、パーコールの濃度勾配溶液内で遠心することによって小片化した。核板を含まない細胞質小片を選び、上記のブタ原始卵胞由来の成熟卵に3個ずつ電気融合した(融合卵の作製)。融合卵に体外受精を行い、培養後7日目に胚への発生状況を観察した。142個の融合卵を作製し、体外培養の結果21個が胚盤胞へと発生した(胚発生率14.8%)。胚盤胞の細胞数は10から128であった(平均細胞数;29.7±6.0(標準誤差)個)。無操作のブタ原始卵胞由来の成熟卵が体外受精・発生系では1%しか胚盤胞(平均細胞数20個)に到達し得なかった結果(Kaneko et al.2006)に比べて、屠場由来の成熟卵の細胞質小片を付与することによって、ブタ原始卵胞卵からの胚の発生率および質(細胞数)は格段に改善された。
小・中学校インフルエンザ流行阻止対策への地理情報システムによる居住空間解析研究

1.背景:小児患者からのインフルエンザウイルスの長期間大量排出から、特に小・中学校での措置の重要性が、特に新型インフルエンザ流行時の重要な対策として脚光を浴びつつあるが、これまでの意義、評価は不十分なままであり、早急に検討すべき分野である。2.目的・方法:インフルエンザの地域内伝播状況について地理情報システム(GIS)を用い解析すべく、インフルエンザによる新潟県内小中学校の学校・学級閉鎖情報、新潟県佐渡市と長崎県諌早市では患者発生の学校区別推移を用い検討した。また、新潟県内小中校における措置の実態も調査した。3.結果・考察:1)インフルエンザによる学級閉鎖などの措置校数と患者数との強い相関があった。2)インフルエンザ流行伝播様式とし、流行は近県から入り、新潟市、長岡市、上越市と約10万以上の都市に入ると爆発的に近郊の市町村にから交通網に沿って北上、南下して県内に広がった。3)インフルエンザへの措置として学校、学年、クラス閉鎖、午後のクラス閉鎖、クラブ活動中止など様々な措置があり、学校閉鎖などの強い措置は少なかった。措置には中学校と比較し小学校で消極的であり、これには家庭での子供の扱いの差に起因する可能性が示唆された。4)毎週県内新潟県内小中学校(約900校)の学校・学級閉鎖状況をGISにより図式化し、本教室のホームページを介しインターネット発信は有効であった。5)佐渡市と諌早市の流行曲線の年齢層別検討により、成人、小中学校生、乳幼児の順に流行が移動し、教科書的な小中学校からとの定説とは異なった挙動が見られた。6)長崎県諌早市におけるインフルエンザ患者情報と小中学校区別の患者動向検討し、B型流行の解析から、中学校での流行が小学校へと推移して行くことが明確に示された。7)インフルエンザの流行開始は、10°C以下の気温と10g以下の絶対湿度が必要条件と思われた。1.背景:社会の流行には、小児におけるインフルエンザウイルスの長期間大量の排出から、特に小・中学校での措置の重要性が言われ、ワクチン投与が高齢者の超過死亡を抑制したとの報告もあり、学校閉鎖などの措置の評価は不十分なままであり、早急に検討すべき分野である。2.目的・方法:過去10年の流行時におけるインフルエンザの地域内伝播状況の空間的、時系列的に解析について、インフルエンザによる新潟県内小中学校の学校・学級閉鎖情報に基づいて地理情報システム(geographic information system、GIS)を用い検討した。これらの解明により、今後の感染制御、パンデミックでの危機管理の一端としての資料作成を目指すことも視野に入れている。再措置は学校、学年閉鎖群では、他と比較し少なく、措置は患者発生早期に行うべきであることも示唆された。4)本年から、毎週県内新潟県内小中学校(約900校)の学校・学級閉鎖状況をGISにより図式化し、本教室のホームページを介しインターネット発信を行い、好評を博している。5)インフルエンザの流行開始は、10°C以下の気温と10g以下の絶対湿度が必要条件と思われた。以上、GISを用いた本研究により、特に交通と人口密度との強い関連が示され、気温は流行の必要条件と思われた。流行と関連する学校との関連を検討し、午後の休みなどの中途半端な措置が多く、休校措置などが不十分で今後の基準の措置基準の見直しが急務と思われた。
RNAiスクリーニング法にて同定された肝癌における新規癌関連遺伝子の機能解析

平成29年度は、EpCAM陽性肝癌細胞および陰性肝癌細胞にPMPCB-shRNAを導入し、EpCAM陽性細胞でのみアポトーシスが誘導されることを示した。また、肝癌細胞Huh-1にPMPCB-shRNAを導入し、ヌードマウスに皮下移植したところ、アポトーシスが誘導され、腫瘍が縮小することが明らかとなった。平成30年度は、EpCAM陽性肝癌細胞(Huh-1, Huh-7)にPMPCB shRNAを導入し、ミトコンドリア機能に及ぼす影響について検討した。細胞酸素消費速度、ATP合成能、活性酸素量を測定し、コントロール群と比較検討したところ、PMPCB shRNA導入群では、細胞酸素消費量の減少およびATP合成能の低下が認められ、活性酸素量は増加していた。以上より、PMPCB shRNAを導入することにより、ミトコンドリア機能が低下することが、細胞増殖に抑制的に作用している可能性が示唆された。一方、EpCAMはWnt/beta-catenin pathwayの下流に位置する分子であることから、PMPCB-shRNAがWnt/beta-catenin signalingに及ぼす影響について検討したところ、shRNA導入群では同経路の活性が低下していることがluciferase assayより示された。その一方で、shRNA導入群におけるbeta-cateninの細胞局在はコントロール群と比較し変化を認めず、beta-cateninの転写活性を阻害する分子がPMPCB shRNAの導入により誘導される可能性が示唆された。RNAiスクリーニングにより、PMPCBを肝癌幹細胞の維持に重要な役割を果たす分子として選出した。主に細胞実験により、PMPCB発現がミトコンドリア機能の維持とWnt/beta-catenin pathwayの活性化に関わっていることが示された。しかしながら、具体的な分子メカニズムについては不明な部分も多く、さらなる詳細な解析が必要と考えている。PMPCBがWnt/beta-catenin pathway活性を維持するメカニズムについて、ミトコンドリア機能の観点より解析を進める予定である。また、肝幹細胞特異的にPMPCBをノックアウトするマウスモデルの作成についても継続する予定である。Global RNAiスクリーニング法の結果を参照し、EpCAM陽性肝癌細胞の維持に重要な役割を果たす遺伝子の候補として、PMPCBを選出した。5種類のPMPCBshRNAをレンチウイルスベクターを用いてEpCAM陽性のHuH1細胞およびHuH7細胞に感染させたところ、いずれのshRNAを導入した群においても、qRT-PCRおよびflow cytometryにてEpCAM発現の有意な低下が認められた。また、上記2種類の細胞株にPMPCB shRNAを導入し、colony formation assay, spheroidformation assayおよびcell titration assayを施行したところ、PMPCB-shRNAが細胞コロニー形成の抑制、スフェロイド形成抑制、細胞増殖の抑制に強く関与していることが判明した。一方、PMPCBがミトコンドリア機能の維持における役割を明らかにするため、上記と同様にHuH1細胞およびHuH7細胞にPMPCB-shRNAを導入し、ミトコンドリア機能の指標である酸素消費率・ATP産生能・活性酸素産生量について検討したところ、PMPCB-shRNA導入群においては酸素消費率とATP産生の低下を認め、活性酸素産生量については上昇を認めた。これらの結果はミトコンドリア機能がPMPCB-shRNAによって障害されていることを表しており、PMPCBがミトコンドリア機能の維持に必須の分子であることを示唆するものと考えられる。平成28年度は、PMPCBとEpCAMの発現の相関関係およびEpCAM陽性細胞の増殖におけるPMPCBの役割を示すことを第一の目標としていたが、in vitroの実験でPMPCBがEpCAM陽性細胞の維持およびその増殖に必須であることを示すことができたため、研究計画は概ね順調に進展しているものと考えている。また、ミトコンドリア蛋白の処理に関わる本分子がミトコンドリア機能の維持に強くかかわることを示すことができたのも大きな進展と考える。平成29年度は、EpCAM陽性肝癌細胞株であるHuH1細胞およびHuH7細胞およびEpCAM陰性肝癌細胞株であるSK-Hep1細胞およびMHCC97細胞にPMPCB-shRNAを導入し、細胞死の有無について7-AAD染色を用いたflow cytometryで解析を行った。その結果、EpCAMy陽性の前者の2種類の細胞でのみ細胞死が認められ、EpCAM陽性細胞でのみPMPCB-shRNAがアポトーシスを誘導することが示唆された。また、ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだHuH1-ffluc2細胞にPMPCB-shRNAを導入し、ヌードマウスの皮下に移植して経過観察したところ、コントロール群と比較しルシフェラーゼのシグナルがPMPCB-shRNA導入群では明らかに減弱していた。また、皮下移植して8週後にマウスをsacrificeし腫瘍を解析したところ、PMPCB-shRNA導入群の腫瘍はコントロール群と比較し優位に小さく、TUNEL染色にて陽性細胞が多いことが分かった。以上より、PMPCB-shRNAはEpCAM陽性肝癌細胞にアポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑えることがin vivoの解析でも明らかとなった。平成29年度はPMPCB-shRNAがEpCAM陽性細肝癌細胞にどのようなメカニズムで関与しているのかについて、in vitro, in vivoの両面で検討を行うことを目標としていたが、いずれの検討でもPMPCB-shRNAがEpCAM陽性肝癌細胞特異的にアポトーシスを誘導することを示すことができたため、研究計画は概ね順調に進展しているものと考えている。

平成29年度は、EpCAM陽性肝癌細胞および陰性肝癌細胞にPMPCB-shRNAを導入し、EpCAM陽性細胞でのみアポトーシスが誘導されることを示した。また、肝癌細胞Huh-1にPMPCB-shRNAを導入し、ヌードマウスに皮下移植したところ、アポトーシスが誘導され、腫瘍が縮小することが明らかとなった。平成30年度は、EpCAM陽性肝癌細胞(Huh-1, Huh-7)にPMPCB shRNAを導入し、ミトコンドリア機能に及ぼす影響について検討した。細胞酸素消費速度、ATP合成能、活性酸素量を測定し、コントロール群と比較検討したところ、PMPCB shRNA導入群では、細胞酸素消費量の減少およびATP合成能の低下が認められ、活性酸素量は増加していた。以上より、PMPCB shRNAを導入することにより、ミトコンドリア機能が低下することが、細胞増殖に抑制的に作用している可能性が示唆された。一方、EpCAMはWnt/beta-catenin pathwayの下流に位置する分子であることから、PMPCB-shRNAがWnt/beta-catenin signalingに及ぼす影響について検討したところ、shRNA導入群では同経路の活性が低下していることがluciferase assayより示された。その一方で、shRNA導入群におけるbeta-cateninの細胞局在はコントロール群と比較し変化を認めず、beta-cateninの転写活性を阻害する分子がPMPCB shRNAの導入により誘導される可能性が示唆された。RNAiスクリーニングにより、PMPCBを肝癌幹細胞の維持に重要な役割を果たす分子として選出した。主に細胞実験により、PMPCB発現がミトコンドリア機能の維持とWnt/beta-catenin pathwayの活性化に関わっていることが示された。しかしながら、具体的な分子メカニズムについては不明な部分も多く、さらなる詳細な解析が必要と考えている。次年度以降はPMPCBAがEpCAM陽性細胞の維持にどのように関わっているのか、そのメカニズムに関してin vitroおよびin vivoの両面より検討を行う予定である。平成30年度は、PMPCBがEpCAM肝癌細胞の維持にどのように関与しているのか、その分子機構についてさらなる解析を行う予定である。PMPCBがWnt/beta-catenin pathway活性を維持するメカニズムについて、ミトコンドリア機能の観点より解析を進める予定である。また、肝幹細胞特異的にPMPCBをノックアウトするマウスモデルの作成についても継続する予定である。
養殖クロマグロに寄生する住血吸虫の感染予防に向けての基礎研究

クロマグロ住血吸虫(Cardicola orientalis)の中間宿主であるフタエラフサゴカイおよび非中間宿主のフサゴカイ類(ニッポンフサゴカイ、ヒャクメニッポンフサゴカイ)を最長で半年間の飼育に成功した。感染ゴカイから採集したC. orientalisのスポロシストを注射によってこれらゴカイの体腔内に移植した結果、フタエラフサゴカイ54個体のうち32個体、ニッポンフサゴカイ10個体のうち6個体、ヒャクメニッポンフサゴカイ5個体のうち1個体でスポロシストの増殖を確認した。移植したスポロシストはセルカリアのみを含むスポロシストであったが、増殖中のスポロシストは、セルカリアと小型のスポロシストを内包するスポロシストや小型のスポロシストのみを内包するスポロシスト(娘スポロシスト)であった。すなわち、増殖時にはセルカリア内包スポロシストがスポロシスト内包スポロシストに変態することが示された。産生されたスポロシスト数は種によってかなり異なった。すなわち、中間宿主のフタエラフサゴカイでは最大1000個程度のスポロシストが産生されたが、ニッポンフサゴカイでは最大でも77個、ヒャクメニッポンフサゴカイでは400個程度にとどまった。今年度に行った実験によって、中間宿主、非中間宿主に関わらずフサゴカイ類を用いた住血吸虫スポロシスト期の維持や発育・増殖の観察が可能となった。また、スポロシストは2週間程度で増殖開始が確認され、1週間に約0.1 mm成長することがわかり、本種の増殖について基礎的知見が得られた。H29年度に、クロマグロ養殖場やその周辺で、クロマグロ住血吸虫(Cardicola orientalis)の中間宿主であるフタエラフサゴカイをできる限り除去したところ、クロマグロにおける住血吸虫感染率を低下させることができた。この成果は逆に、自然感染した中間宿主ゴカイに依存した実験系を維持することが困難になる可能性も持っていた。そのため、中間宿主ゴカイのin vivo培養系を確立し、住血吸虫の幼虫を安定的に供給するシステムを構築する必要があった。中間宿主のフタエラフサゴカイおよび非中間宿主のニッポンフサゴカイとヒャクメニッポンフサゴカイはほぼ人工飼育が可能となった。今年度は、自然感染ゴカイから得たスポロシストを注射することによって、中間宿主、非中間宿主を問わず、無感染ゴカイ体内でスポロシストを増殖させることに成功した。このことによって、実験感染系でスポロシスト期の維持や発育・増殖の観察が可能となった。本種の増殖について基礎的知見が得られた。前年度に引き続きフィールド調査を実施し、ゴカイの生息場所や密度、住血吸虫感染率の推移等を調べ、養殖場からの効率的な除去法を策定する。前年度に開発した中間宿主ゴカイの人為感染系を用いて、ゴカイ体内におけるスポロシストの増殖能力、増殖の季節性、セルカリアの放出などの知見を得て、クロマグロ養殖場における住血吸虫Caridicola orientalisの感染環の詳細を明らかにする。また、クロマグロの鰓から得たミラシジウムを飼育ゴカイに暴露して、ミラシジウムの行動、寿命、侵入機序、ゴカイ内の増殖過程を観察する。駆虫に頼らない対策の確立には、中間宿主に関する多角的な研究が必要である。上記の実験を踏まえて、住血吸虫のふ化幼生ミラシジウムの中間宿主への感染実験や感染した中間宿主を飼育の飼育を通して、中間宿主への感染様式や中間宿主内のスポロシストの生物学的・生態学的特性を把握する。これらを総合して、より有効で効率的な中間宿主対策を提案していきたい。養殖場での野外調査・試験:クロマグロ住血吸虫(Cardicola orientalis)の中間宿主であるフタエラフサゴカイの生態を把握し、感染ゴカイ出現の季節性を調べるため、2017年6月から原則毎月1回、クロマグロ養殖場の生け簀ロープに生息するフサゴカイ類を調べた。その結果、感染ゴカイは夏季に多く出現する、という季節性が見られた。しかし、2015年には最大18.8%であった寄生率は6.6%と大幅に低下したのみならず、11月翌4月には感染ゴカイが1個体も確認されず、中間宿主における寄生が著しく減少した事が明らかとなった。その理由として、生け簀構造物の清掃によるゴカイ類の駆除により、住血吸虫の生活環が一旦途切れたとも考えられ、新たな防除法として有望である可能性が示された。一方、フサゴカイ類の生息数は冬季に増加しており、付着生物が多く発生する低水温期にゴカイも成長することが示唆された。野外試験ではフサゴカイの生殖時期を把握するため、ケイ酸カルシウム板(付着板)を水深0ー4mに垂下し、ゴカイ幼生の着定状況を調べた。付着板は毎月回収、ホルマリン固定しており、後日環形動物の専門家のアドバイスを仰ぎフサゴカイの幼生を識別する予定である。これらの調査から、これまで不明であった中間宿主ゴカイの生殖・生態に関する基礎的知見が集積される見通しである。室内実験:試験用ゴカイを維持するため、水槽での飼育方法を検討した結果、流水飼育と粉末魚類用飼料により、健全な状態で半年以上の飼育が可能となった。飼育ゴカイは自然下と同様に営巣し、目立った衰弱や死亡は見られなかったが、繁殖は確認されていない。

本年度は感染ゴカイの確保が困難であったため、住血吸虫のセルカリア幼虫を使用した感染実験等が実施できなかった。そこで、幼虫の安定供給を目的にゴカイを使った移植in vivo培養を試みたところ一定の増殖を確認した。今後は条件を検討し、成功率を高める予定である。本年度はマグロ養殖場で住血吸虫に自然感染したゴカイの割合が著しく少なく、試験に使用できる程の感染ゴカイを確保できなかった。そのため、当初予定していた住血吸虫の幼虫を使用した感染実験等が実施できなかった。また、養殖マグロでの住血吸虫感染も少なかったため、ふ化幼虫の実験に必要な虫卵も確保できなかった。これは研究の最終目的であるマグロ養殖場での寄生予防がある程度成功したため、とも考えられるが、実験計画の見直しが必要となった。クロマグロ住血吸虫(Cardicola orientalis)の中間宿主であるフタエラフサゴカイおよび非中間宿主のフサゴカイ類(ニッポンフサゴカイ、ヒャクメニッポンフサゴカイ)を最長で半年間の飼育に成功した。感染ゴカイから採集したC. orientalisのスポロシストを注射によってこれらゴカイの体腔内に移植した結果、フタエラフサゴカイ54個体のうち32個体、ニッポンフサゴカイ10個体のうち6個体、ヒャクメニッポンフサゴカイ5個体のうち1個体でスポロシストの増殖を確認した。移植したスポロシストはセルカリアのみを含むスポロシストであったが、増殖中のスポロシストは、セルカリアと小型のスポロシストを内包するスポロシストや小型のスポロシストのみを内包するスポロシスト(娘スポロシスト)であった。すなわち、増殖時にはセルカリア内包スポロシストがスポロシスト内包スポロシストに変態することが示された。産生されたスポロシスト数は種によってかなり異なった。すなわち、中間宿主のフタエラフサゴカイでは最大1000個程度のスポロシストが産生されたが、ニッポンフサゴカイでは最大でも77個、ヒャクメニッポンフサゴカイでは400個程度にとどまった。今年度に行った実験によって、中間宿主、非中間宿主に関わらずフサゴカイ類を用いた住血吸虫スポロシスト期の維持や発育・増殖の観察が可能となった。また、スポロシストは2週間程度で増殖開始が確認され、1週間に約0.1 mm成長することがわかり、本種の増殖について基礎的知見が得られた。H29年度に、クロマグロ養殖場やその周辺で、クロマグロ住血吸虫(Cardicola orientalis)の中間宿主であるフタエラフサゴカイをできる限り除去したところ、クロマグロにおける住血吸虫感染率を低下させることができた。この成果は逆に、自然感染した中間宿主ゴカイに依存した実験系を維持することが困難になる可能性も持っていた。そのため、中間宿主ゴカイのin vivo培養系を確立し、住血吸虫の幼虫を安定的に供給するシステムを構築する必要があった。中間宿主のフタエラフサゴカイおよび非中間宿主のニッポンフサゴカイとヒャクメニッポンフサゴカイはほぼ人工飼育が可能となった。今年度は、自然感染ゴカイから得たスポロシストを注射することによって、中間宿主、非中間宿主を問わず、無感染ゴカイ体内でスポロシストを増殖させることに成功した。このことによって、実験感染系でスポロシスト期の維持や発育・増殖の観察が可能となった。本種の増殖について基礎的知見が得られた。自然感染ゴカイに頼った実験系は今後も実施が困難になることが予想されるため、in vivo培養系を確立し、住血吸虫の幼虫を安定的に供給するシステムを構築する必要がある。
分解過程を制御する落葉の質の多様性が森林生態系栄養塩循環に影響を与える機構の解明

植物は植物間同士の資源獲得競争や植食者への被食防衛機構により、葉の性質を様々に進化させている。生葉の被食防衛と落葉の分解過程を制御する葉の性質は似ていると考えられており、地上部の植食者が植物の質を介して生態系の栄養塩循環に影響を与える可能性がある。今回はそのメカニズムを解明するために、1.異なるタイプの植物の食われにくさと分解されにくさに関わる葉の性質2.異なるタイプの植物の被食に対する反応と土壌微生物群集活性に与える影響の2点を、ニュージーランドの河畔林に同所的に存在し様々な植物機能グループ(在来植物、外来植物、窒素固定植物)に属する低木40種を用い明らかにした。その結果、1.に関しては、非窒素固定植物のほうが窒素固定植物より食われにくく分解されにくいが、在来植物と外来植物の間には、食われにくさと分解されにくさにおける違いがないということが明らかとなった。また全部の種をプールして解析した場合、食われにくさには葉の総フェノールや繊維含有量が高いことと窒素濃度が低いこと、分解されにくさには葉のリグニン濃度が高いことと面積あたりの重量が重いこと、というようにそれぞれに関わる葉の性質は少しずつ異なっていたが、食われにくさと分解されにくさの間には有意な正の相関関係があることが明らかとなった。このことから被食圧によって生み出された葉の質の多様性が、対象とした生態系の栄養塩循環に影響すると考えられた。2.に関しては、ポットに植えた各植物を定期的に一定量切り取り、植物の成長と性質の変化およびその変化が土壌微生物群集活性に与える影響を明らかにするための実験が終了したところで、植物の種によって被食に対する反応や土壌微生物群集活性に与える影響が顕著に異なることがわかりつつある。今後は結果をさらに詳細に解析し、植物の質の違いがどのように栄養塩循環に影響するかを明らかにする予定である。本研究の目的は、落葉分解過程を制御する葉の性質の多様性が、生態系の栄養塩循環に影響を与えるメカニズムを解明することである。本年度は主に、この分野で最先端を行くニュージーランド・ランドケアリサーチの土壌生態学研究室で、落葉分解にかかわる土壌動物・微生物群集の活性測定や群集構造解析を行った。ニュージーランドの河畔林に、ある特定の植物機能グループを人為的に除去してある(つまり植物の質の多様性が異なる)調査区が設置されており、そこで植物群落の生産性や機能グループの多様性と、土壌分解者群集(Nematodes, Collembola, Mite, Fungi, Bacteria)の活性(土壌呼吸)と群集構造、そして土壌栄養塩濃度(窒素、リン)とその動態(窒素無機化速度)との関係を解析している。今までのところ、植物群落生産性、土壌化学分析、土壌分解者群集活性分析は終了し、現在、土壌分解者群集の構造解析を行っている。データの解析はまだ進行中だが、植物群落生産性と、土壌分解者群集の活性の指標である土壌呼吸や窒素無機化速度の間には関係性が見られるものの、植物群落生産性と土壌栄養塩濃度との間には関係性が見られない、という傾向を見出している。今後さらに、植物機能グループの多様性と土壌分解者群集の多様性、および土壌栄養塩動態との関係を解析することにより、植物の質の多様性が生態系栄養塩循環に影響を与えるメカニズムを明らかにする予定である。落葉分解過程を制御する葉の性質とその多様性が、生態系の栄養塩循環に影響を与えるメカニズムを解明するために、ニュージーランドの河畔林に設置されたある特定の植物機能グループ(土着の窒素固定低木,外来種の低木,外来種の草本類)を人為的に除去してある調査区(つまり植物の質やその多様性が調査区毎に異なる)において、植物群落の生産性や機能グループの多様性と、土壌分解者群集(Nematodes, Collembola, Mite, Fungi, Bacteria)の活性(土壌呼吸)と群集構造、そして土壌栄養塩濃度(窒素、リン)とその動態(窒素無機化速度)との関係を解析した。その結果、地上部バイオマスの大きい(つまりリター生産量の多い)低木種よりも、バイオマスの小さい外来草本類の方が、土壌分解者群集構造や現存量に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。外来草本類は多くの窒素固定植物を含み、それらの葉は低木種に比べて薄く窒素をより多く含む。これらの性質は、植物の速い成長速度や、速いリターの分解速度に関連しており、地下部にインプットされるリター量は少なくとも、土壌微生物群集を活性化させると考えられた。さらに、植食者が植物の成長及び質に与える影響と、植物の質及び被食による質の変化が土壌微生物群集や栄養塩循環に与える影響を検討するために、この河畔林に同所的に存在し、様々な植物機能グループ(土着種、外来種、窒素固定植物等)に属する低木20種を用い、苗畑実験を行っている。2土壌栄養塩段階に植えられた植物を、定期的に一定量切り取っている。現在1成長シーズン終了したところで、成長速度における被食に対する反応が、植物種によって顕著に異なることが明らかとなった。今回はそのメカニズムを解明するために、1.異なるタイプの植物の食われにくさと分解されにくさに関わる葉の性質

2.異なるタイプの植物の被食に対する反応と土壌微生物群集活性に与える影響の2点を、ニュージーランドの河畔林に同所的に存在し様々な植物機能グループ(在来植物、外来植物、窒素固定植物)に属する低木40種を用い明らかにした。その結果、1.に関しては、非窒素固定植物のほうが窒素固定植物より食われにくく分解されにくいが、在来植物と外来植物の間には、食われにくさと分解されにくさにおける違いがないということが明らかとなった。また全部の種をプールして解析した場合、食われにくさには葉の総フェノールや繊維含有量が高いことと窒素濃度が低いこと、分解されにくさには葉のリグニン濃度が高いことと面積あたりの重量が重いこと、というようにそれぞれに関わる葉の性質は少しずつ異なっていたが、食われにくさと分解されにくさの間には有意な正の相関関係があることが明らかとなった。このことから被食圧によって生み出された葉の質の多様性が、対象とした生態系の栄養塩循環に影響すると考えられた。2.に関しては、ポットに植えた各植物を定期的に一定量切り取り、植物の成長と性質の変化およびその変化が土壌微生物群集活性に与える影響を明らかにするための実験が終了したところで、植物の種によって被食に対する反応や土壌微生物群集活性に与える影響が顕著に異なることがわかりつつある。今後は結果をさらに詳細に解析し、植物の質の違いがどのように栄養塩循環に影響するかを明らかにする予定である。
配位結合ナノチューブの自己組織化における精密構造制御とその機能化

特異な分子包接能を有する中空ホスト化合物は、イオンや分子などの物質貯蔵や、化学反応場としての利用など、様々な応用が期待されている。しかしながらホスト分子の内部空間を用いた高度な機能化学を行うためには、空間の精密構造制御が不可欠である。そこで、パネル状の有機配位子と金属イオンとの自己集合により、様々な形状の中空錯体を簡便に構築する手法が注目されている。本研究ではこれまでに、配位子の合理設計により、3.5nmの単一有限長を有する配位結合ナノチューブの定量的合成や、チューブに内包したゲスト分子が示す特異な反応性を活用した動的酸化還元システムの構築を達成している。今回、精密構築した自己組織化ナノ空間を反応場として用いることで、既存の反応開発の設計指針では達成できない、有益な物質変換手法の開拓を行った。パネル状配位子とPd錯体から自己組織化構築した、かご状、椀状、チューブ状のホスト分子を用いてTTF包接錯体を合成した。それらの電気化学応答性をサイクリックボルタンメトリーによって測定した結果、内包されたTTFの酸化電位はホストの形状に大きく依存し、特にチューブ状錯体内では反応が強く抑制されることを見出した。一方、かご状錯体を用いて、共役カルボニル化合物の選択的分子間光反応を行った。共役カルボニル化合物は通常、光照射により複数の反応が同時に進行してしまい、所望の反応のみを選択的に行うことは困難である。これに対し、自己組織化孤立空間内ヘオルトキノン類とトルエン誘導体を同時に包接し、基質の配向を制御することで、分子間光反応を定量的かつ速やかに達成した。各種NMR、X線結晶構造解析、吸収スペクトル測定による解析から、ホストの立体的制約と電子的な相互作用の協奏効果によって、通常溶液中における反応では全く得られない1,4付加体が一義的に生成することを明らかにした。チューブ状化合物はその形状の特異性から、イオンや分子などの物質輸送や特異的な反応場への応用などが期待される。このような高度な機能を達成するためには、チューブの長さや直径を精密に制御することが重要である。本研究では2つのトリスピリジン単位をビフェニレン基で連結した配位子とPd錯体から、長さ3.5nmの配位結合ナノチューブ1が定量的に自己集合することを報告している。今回、1を用いた形状選択的ゲスト認識を達成した。2つのビフェニル基をテトラエチレングリコール鎖で連結した紐状分子2と、ペンタエチレングリコールを用いた3を共存させた場合、2を取り込んだ包接錯体1・2のみが生成することがNMR測定から示された。次に非対称なゲストを用いて包接錯体の動的挙動を観測し、ゲストの選択性について検討した。チューブ内に包接されたゲスト分子は、一次元のシャトリング運動によってチューブから出入りする。また、室温ではチューブ内で安定に留まっている分子でも、高温条件下ではシャトリング運動を起こすと予想される。したがってこのようなゲスト分子の挙動を観測できれば、包接錯体のゲストによる安定性の違いを評価できると考えた。4-ヒドロキシビフェニル基とビフェニル基をペンタエチレングリコール鎖で連結したゲスト3'を包接したチューブ錯体についてNMRを測定したところ、室温においてホスト骨格のシグナルが非対称化して観測された。続いて測定温度を上昇させていくと、これらのピークが次第にシフトし、およそ54°Cでコアレスした。一方テトラエチレングリコールをリンカーとして用いた紐状分子2'について同様の検討を行ったところ、79°Cでピークの平均化が起こった。2つのゲスト分子の相違はリンカーの長さのみであることから、チューブ錯体1は分子の長さを認識し、チューブ長に応じてゲストを選択的に取り込むことを明らかにした。チューブ状化合物はその形状の特異性から、イオンや分子などの物質輸送や貯蔵、反応場としての利用など、様々な応用が期待される。しかしながら分子性ナノチューブの高度な機能化のためには、化学的手法を用いた精密構造制御が不可欠である。本研究ではこれまでに、合理設計したパネル状配位子とPd錯体とを自己集合させることにより、3.5nm長の一義構造を有する配位結合ナノチューブを定量的に合成し、チューブ錯体を用いた形状選択的ゲスト認識を報告している。今回、チューブに内包された酸化還元活性な有機分子の新規な性質を明らかにし、特異的酸化還元システムの構築を達成した。チューブ錯体は外界から孤立した一次元空孔を有しており、そこに強く補足されたゲスト分子は、外的刺激に対して通常とは異なる性質を示すことが期待される。そこで酸化還元活性なテトラチアフルバレン(TTF)包接錯体を新たに合成し、電気化学応答性を測定した。あらかじめ調製したチューブ錯体水溶液にTTFを加え室温で15分撹拝すると、速やかにゲスト交換反応が進行し、TTF包接チューブを得た。続いてこの包接錯体に関してサイクリックボルタンメトリーの測定を行ったところ、1つの大きな酸化ピークと2つの還元波が観測された。TTFは通常、安定なカチオンラジカルを経てジカチオンへと段階的に酸化されるため、2組の可逆な酸化還元波を示す。一方チューブ内では第一酸化電位は+500mVシフトし、カチオンラジカル状態を経ずに一気にジカチオンまで2電子酸化されることがわかった。続いて電位を還元側に掃引することで、1電子還元を繰り返して中性構造に戻ることが示された。

配位結合ナノチューブはカチオン性ホストであるため、酸化と同時にカチオン種となったゲスト分子がチューブの外に飛び出し、引き続きチューブ外で還元が起こるためと考えられる。特異な分子包接能を有する中空ホスト化合物は、イオンや分子などの物質貯蔵や、化学反応場としての利用など、様々な応用が期待されている。しかしながらホスト分子の内部空間を用いた高度な機能化学を行うためには、空間の精密構造制御が不可欠である。そこで、パネル状の有機配位子と金属イオンとの自己集合により、様々な形状の中空錯体を簡便に構築する手法が注目されている。本研究ではこれまでに、配位子の合理設計により、3.5nmの単一有限長を有する配位結合ナノチューブの定量的合成や、チューブに内包したゲスト分子が示す特異な反応性を活用した動的酸化還元システムの構築を達成している。今回、精密構築した自己組織化ナノ空間を反応場として用いることで、既存の反応開発の設計指針では達成できない、有益な物質変換手法の開拓を行った。パネル状配位子とPd錯体から自己組織化構築した、かご状、椀状、チューブ状のホスト分子を用いてTTF包接錯体を合成した。それらの電気化学応答性をサイクリックボルタンメトリーによって測定した結果、内包されたTTFの酸化電位はホストの形状に大きく依存し、特にチューブ状錯体内では反応が強く抑制されることを見出した。一方、かご状錯体を用いて、共役カルボニル化合物の選択的分子間光反応を行った。共役カルボニル化合物は通常、光照射により複数の反応が同時に進行してしまい、所望の反応のみを選択的に行うことは困難である。これに対し、自己組織化孤立空間内ヘオルトキノン類とトルエン誘導体を同時に包接し、基質の配向を制御することで、分子間光反応を定量的かつ速やかに達成した。各種NMR、X線結晶構造解析、吸収スペクトル測定による解析から、ホストの立体的制約と電子的な相互作用の協奏効果によって、通常溶液中における反応では全く得られない1,4付加体が一義的に生成することを明らかにした。
歯周病原性細菌の付着因子複合体を構成する蛋白質の分子生物学的解析

歯周病原性細菌Eikenellacorrodensは、菌体表層のレクチン様付着因子(LS)を介してヒト類粘膜上皮細胞への付着、口腔内異種細菌との凝集、B細胞の活性化を行う。よってLSは歯周病の発症・進行に関与すると考えられる。近年、LSが外膜に強固に結合した高分子量の複合体であることがわかった。そこで、LS構成蛋白をコードする遺伝子をクローニングし、その構造および機能を推察した。E corrodens 1073の精製LSを還元下でSDS-PAGEを行うと約300kDaと45kDaの二つのバンドに分離した。そこでこの45kDaの蛋白のN末アミノ酸配列を決定し、これを基にPCR法およびコロニーハイブリ法により、遺伝子クローニングを行った。この遺伝子のDNA塩基配列を決定し、さらにT7発現系を用いて大腸菌内で大量発現、精製した。その予想アミノ酸配列は病原性Neisseriaのポーリン蛋白と高い相同性が見られ、付着因子本体を菌体表層に固定化することが示唆された。また数種のEikenella臨床分離株について調べたが、本遺伝子は強い付着性と病原性を示す1073株においてのみ認められ、本遺伝子と歯周病原性との関連性が示唆された。一方、付着・凝集活性を阻害する抗LSモノクローナル抗体を用いたイムノスクリーニングにより、遺伝子ライブラリーから数個の陽性クローンを得た。これらのクローンからはいずれも抗LS抗体と強く反応する25kDaの蛋白が大量に発現していた。また、その予想アミノ酸配列は膜結合型蛋白のトポロジーを有しており、この蛋白は外膜上でLS複合体の糖鎖認識部位の近傍に位置することが示唆された。今回、分子生物学的手法により解析した2つの蛋白質はLS複合体を構成し、E.corrodensによる歯周病の発症と進行に深く関与することが示唆された。