hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多振動体時計の統合:時計遺伝子のinvivo-exvivoイメージング

SCNにおける時計遺伝子発現のin vivo解析:光ファイバーをSCN直上に固定し、発光活性を指標にPer1発現, PER2、Bmal1発現を3種のレポーターマウスを用いて30日以上計測した。3遺伝子発現リズムの位相関係はex vivoとin vivoでほぼ一致しており、in situ hybridizationの結果ともよく一致し、優れた測定系であることが実証された。SCN内の部位特異的振動体を結合する分子機能:細胞内Ca++レベルを1週間連続計測し,すべてのSCN細胞がCa++レベルに明瞭な概日リズムを示すこと、部位特異的振動体内と振動体間の同期メカニズムが異なることを明らかにした。無周期変異と言われたCry1/Cry2欠損マウスのSCN細胞はすべての年齢で概日リズムを発振すること、新生児期のみPER2発現と自発発火活動にSCN内で同期したリズムが確認されることを発見した。新生児期にはCRY非依存性ネットワークが存在し、生後2-3週にCRY依存性の成獣型ネットワークに移行する事が分かった。一方、VPAC2欠損マウスでは、行動には複数のリズム成分があるが、SCNではリズムが持続した。SCN内部位特異的な出力経路:薬理的実験と共培養により、新生児期の細胞リズム同期には神経性と液性因子が関与することを示唆した。新生児の温度同調:レポーターラットを用い、個体への温度サイクルがリズム位相を変位させること、低温では、振動を減速ないし停止させる可能性を示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ファイトアレキシン合成系遺伝子のプロモーター解析

ジャガイモ組織に疫病菌が感染を試みると、オキシダティブバーストなど多岐に渡る防御応答が誘導される。ジャガイモ塊茎組織では、ファイトアレキシンであるリシチン蓄積が防御反応の主役を演じている。リシチンはイソプレノイド合成系で生産され、セスキテルペンシクラーゼが鍵酵素であると考えられている。エリシターで誘導したcDNAライブラリーからセスキテルペンシクラーゼを単離したところ、ジャガイモのセスキテルペンシクラーゼは、PVS(potato vetitispiradine synthase)であることが示された。さらに、ジャガイモゲノムライブラリーをスクリーニングしたところ、PVSは多重遺伝子族(PVS1PVS4)を形成していることが明らかになった。ジャガイモ葉組織においては、これらPVS遺伝子メンバーの中でPVS3のみがジャガイモ疫病菌の非親和性および親和性レース接種により顕著に誘導されることユニークな遺伝子であることがこれまでの研究で判明している。本遺伝子の発現制御機構を探る目的で、PVS3ゲノムクローンの塩基配列を決定し、さらに推定プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したベクターを構築してプロモーター活性を調べた。エレクトロポレーションによりベクターを導入したジャガイモ培養細胞プロトプラストをジャガイモ疫病菌菌体壁成分エリシターで処理したところ、ルシフェラーゼ活性の増加が認められた。この結果は、本領域内にエリシター応答に関与するシスエレメントが存在することが示すものである。本結果は、このプロモーターを利用することにより、ジャガイモ疫病菌に耐性を示すジャガイモ植物の作出に有用であることを示した。エリシター誘導したcDNAライブラリーから数クローンを単離し、予想されるアミノ酸配列を解析したところ、ジャガイモのセスキテルペンシクラーゼはvetispiradiene synthase(VS)であることが明らかになっている。VS遺伝子の発現を解析したところ、ジャガイモ疫病菌親和性レースを接種した場合においても誘導され、病害シグナルに特異的な制御を受けるユニークな遺伝子であることが判明した。VS遺伝子は多重遺伝子族から成っており、ジャガイモ疫病菌非親和性レースの感染に応答して少なくとも4種類のVS遺伝子が誘導される。それぞれのVS mRNAに対応するゲノムDNAをクローニングする目的で、各クローン特異的な塩基配列をプローブにゲノミックライブラリーからVS遺伝子を単離した。その結果、塊茎のみで誘導されるVS1、VS4、および葉においても発現誘導されるVS3に相当するゲノムクローンが得られた。これらゲノムDNAの塩基配列を決定したところ、VS1およびVS4はいずれもVS遺伝子の発現を制御する推定プロモーター領域を含んでおり、類似していた。一方、VS3はプロモーター領域を含んでいなかったので、inverse PCR法により、プロモーター領域を得た。このDNA断片をプローブに用いて、再度ゲノミックライブラリーからVS3遺伝子をクローニングし、プロモーター領域を得ることができた。平成13年度は、全塩基配列が決定されたVS遺伝子の発現を制御するプロモーターの解析を通して、転写レベルで病原菌の攻撃に応答する領域(シス領域)を決定する予定である。これまでに、エリシターで誘導したcDNAライブラリーからセスキテルペンシクラーゼを単離したところ、ジャガイモのセスキテルペンシクラーゼは、PVS(potato vetitispiradine synthase)であることが示されている。さらに、ジャガイモゲノムライブラリーをスクリーニングしたところ、PVSは多重遺伝子族(PVS1PVS4)を形成していることが明らかになっている。

本年度は、PVS3ゲノムクローンの塩基配列を決定し、さらに推定プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したベクターを構築してプロモーター活性を調べた。エレクトロポレーションによりベクターを導入したジャガイモ培養細胞プロトプラストをジャガイモ疫病菌菌体壁成分エリシターで処理したところ、ルシフェラーゼ活性の増加が認められた。この結果は、本領域内にエリシター応答に関与するシスエレメントが存在することが示すものである。現在、このプロモーターを利用することにより、ジャガイモ疫病菌に耐性を示すジャガイモ植物の作出を試みている。
柔軟な面状圧力センサを用いた多関節ロボットのインピーダンス制御

形状計測と最適化手法から成るシリアルリンク型ロボットの関節配置決定法を構築した。体幹部のように対応する関節が定まらない部位でも、装着に適したロボットの構造が求まるようになった。面接触情報に基づくインピーダンス制御法を検討し、既存の枠組みを拡張したパラメータ設計が容易な制御法と、関節間を協調させた発展的な制御法を提案した。直接人体に加わる力に基づく制御法の枠組みができ、装着型ロボットの安全性向上に繋がる可能性が見えた。「体幹部アシストに適した機構決定法の提案」と「アシスト機構の決定」、および、「圧力分布に基づくインピーダンス制御のための制御系構成の提案」が主な成果である。これらの成果を国内1件(査読無)、国際1件(査読有)で発表した。またオープンキャンパス・大学祭・フロンティア21エレクトロニクスショーでも成果を紹介した。目的達成のための大きな課題である「アシスト機構の決定」に対し、特定個人に適したロボットの機構を明らかにした。具体的には、特定個人の屈曲運動中の体幹部の姿勢を点群形状データとして取得、形状データに対するロボットのリンクモデルの最適化手法を提案した。4関節でリンク長が腰側から順に{40,320,120,320}[mm]となる構造により、特定個人の屈曲運動に追従できることを明らかにした。個人差の検討は今後の課題(本研究では扱わない)とするものの、提案した最適化手法に基づき個人差を考察できるため、本成果が大きく寄与する。「決定した機構を持つロボットの試作」について、ロボットは次年度初期に完成予定である。圧力分布に基づくインピーダンス制御の実現を目指し、基本的な制御系構成を提案した。圧力モデルを用いたシミュレーションで、直接人体に加わる力を既存法より低減できる可能性を示した。具体的には、プロトタイプとなる制御系構成として、既存の「外乱トルクに基づく位置ベースインピーダンス制御法」を拡張し、「面状圧力センサから生成した擬似外乱トルクに基づく位置ベースインピーダンス制御法」を提案した。装着者とロボット間の現実的な接触状態に基づく制御の枠組みを提案した意義は大きいと考える。シミュレーションでは、次年度実施予定であった「所望のインピーダンスを実現する制御」のための制御系の基礎検討も行った。次年度は速やかに実機に手法を実装し、シミュレーションと実機の両面から制御法を検討する予定である。「圧力分布に基づくインピーダンス制御法の提案」と「検証用実機の製作と手法評価」が主な成果である。これらの成果を国内会議4件(査読無)、国際会議1件(査読有)で発表した。また、名古屋大学オープンキャンパス・名古屋大学ホームカミングディ・フロンティア21エレクトロニクスショーにて一般向けに成果を紹介した。既存の「外乱トルクに基づく位置ベースインピーダンス制御法」も、昨年度提案した「面状圧力センサから生成した疑似外乱トルクに基づく位置ベースインピーダンス制御法」でも、関節ごとに独立に制御する手法となっていた。機構全体で大きな圧力を低減するために、逆運動学を利用した新たな制御法を検討した。具体的には、面状圧力センサから得た圧力分布を減らすリンク位置・姿勢を算出、逆運動学を利用して関節指令値に変換し、機構全体(多軸)を制御する手法に拡張した。機構の自由度を活かした制御により安全性が向上した。昨年度・今年度の手法共に関節ごとにインピーダンス特性を反映したフィルタを設計することで、部分的に異なるインピーダンスを実現できる可能性が見えた。運動に応じた適切なインピーダンスの設計は十分検討できてないものの、当初目標としていた単一のコントローラでも部位ごとに異なるインピーダンスが制御できる枠組みを構築した意義は大きい。検証用実機を製作して手法の評価を行った。昨年度明確にした4関節4リンクのアシスト機構の試作機を製作、試作機表面に柔軟な面状圧力センサを配置し、圧力分布情報に基づく手法を実装して検証した。予算の都合上、直接装着可能な試作機として製作することが困難であり、官能試験による主観的な性能評価は行えなかった。しかし、人体モデルを用いた基礎的検討により、実機においても圧力分布情報に基づく制御法の有効性を示した。本研究の申請時に設定した目標は概ね達成できた。研究目的である「実世界での接触と同等な面での接触、および、多関節構造の駆動機構を対象としたインピーダンス制御法の提案」に対し、「人間の屈曲運動に追従可能なロボットの機構の決定」と「多関節駆動機構に対する面状圧力センサを用いたインピーダンス制御の実現の基礎となる制御系構成の提案」を概ね達成した。研究実施計画においては、「ロボットの機構の決定」,「ロボットの試作」,「シミュレーションにおけるゼロインピーダンス制御法の検討」が平成26年度の大きな課題であった。「ロボットの機構の決定」と「シミュレーションにおけるゼロインピーダンス制御法の検討」はほぼ検討が済み、各々「最適化手法を用いた機構決定法の提案」と「インピーダンス制御の制御系構成の提案とシミュレーションによる検証」により、概ね課題は解決した。

研究実施計画において10月完成を目指していた「ロボットの試作」は遅れており、平成27年度初期に試作ロボットが完成する見込みである。そのため、実ロボットにおける既存手法の評価、ゼロインピーダンス制御の実装は行えていない。一方で、シミュレーション上においては、ゼロインピーダンスに限らず部位ごとに異なるインピーダンスを設定できる枠組みが整った。当初、部位ごとに異なるインピーダンス制御の実現には、部位ごとのインピーダンスに応じた理想的な圧力分布の推定が必要となると見込んでいたが、部位ごとに異なるインピーダンスパラメータが設定できれば十分制御できる見込みが立った。当初の予定よりもシミュレーションによる検討は進んだ。実際に実機への実装を予定するインピーダンス制御法は、シミュレーションの知見が利用できるため、スムーズに実装が行える見込みである。全体を統括すると、計画の部分的な前後はあるものの、おおむね順調に進んでおり、平成27年度中には研究目的が達成できると考えている。知能情報処理当初の予定に対して、シミュレーションによる検討は進んでいるが、実機の試作と実験が遅れている。平成27年度初期にハードウェアが完成予定の実機を早急に立ち上げ、実機とシミュレーションの両面から手法を検討する。これまでの知見に基づき、制御アルゴリズムを速やかに実装し、6月中に実機の立ち上げと手法の実装を目指す。前期中にシミュレーションと実機の両面から、圧力分布に基づく制御法を検討する。具体的には、平成26年度に提案した制御系構成の枠組みにおいて、擬似外乱トルクの生成法と制御パラメータの設定法を検討する予定である。また、10月を目処に官能試験にも取り組み、接触力に基づく評価のみならず、人間の感覚に基づく評価も行う予定である。平成27年度は最終年度に当たるため、国内会議・国際会議・論文執筆などを行い、研究成果の取りまとめと対外発表を積極的に行う予定である。加えて、研究室ホームページや対外公開イベントなどを利用し、研究成果を広く社会に発信する予定である。ロボットの試作費用として見積もっていた額が、次年度使用額として生じた。ロボットの構造決定に時間がかかり、発注処理が予定より遅れたためである。ロボット自体の費用が約100万円であり、ロボットを動作させるために必要なケーブルやソフトウェアなどの付随品で30万程度見積もっていたため、次年度使用額が生じた。ロボットは100万円で発注済であり、平成27年度初期に納品予定である。納品に合わせて現在付随品の選定・発注を進めており、平成27年度前期において繰越分は使用する予定である。
因果性の識別と社会厚生の最大化を両立させたフィールド実験の理論・実証研究

本研究は、節電に対する効果的な介入方法を実証的に明らかにする研究であり、電力小売全面自由化後の節電行動変容を促して、フィールド(社会)実験を用いて結果を検証します。フィールド実験では、因果性の識別のために、無作為比較対照法という手法を用います。しかし、この手法は介入の効果の最大化を保証せず、「誰が介入を受けるべきか」の問題を解決できません。本研究では北川透等が考案した実証的厚生最大化メソッドを用いて、因果性の識別と社会厚生の最大化の問題を双方あわせて吟味検討します。
『大峯縁起』の成立と享受についての研究　―修験から修験道、そして教団へ―

至高の霊山、大峯の由来を語る『大峯縁起』は、修験道の祖、役行者から脈々と受け継がれた書物として、平安時代後期、突然、大和国に現れた。室町時代前期、聖護院門跡が熊野三山検校職を兼帯するようになって以降、その正統性を証明する秘書として『大峯縁起』は重用され、修験道教団の形成に大きく寄与したが、鎌倉時代後期にはそうした情況は確認できず、天台宗寺門派ではなく、むしろ東大寺東南院など真言宗寺院において『箕面寺縁起』とともに重用されたことを解明した。当該課題について、主に1『大峯縁起』の記述内容の研究、23『大峯縁起』を生み出した時代背景と関連する縁起の研究を行った。1後白河院政期に現れた『大峯縁起』には、白河院金峯山御幸の事蹟が独自の文脈で書き換えられ、意味づけられている。その記述の背景と飛躍を精確に測るべく、上記御幸の実体と記録、及び記憶に関わる文献資料を再確認し、その成果を説話文学会例会(4月、慶應義塾大学)においてシンポジウム形式で報告した。研究代表者がコーディネーター、研究協力者1名が報告をつとめた。2『大峯縁起』は、修験道の祖、役行者から伝えられた点が強調されており、それゆえ、縁起の持主はもとより、他者も否定しがたい書物として機能した。それは『大峯縁起』固有の特徴ではあるが、それに類する現象、すなわち役行者の事蹟を霊山や寺院の由来として表明する現象が院政期にはいくつか認められる。そのひとつが奈良時代の公的文書の体をとる『当麻寺流記』の出現である。研究代表者が同書出現の経緯と仕掛けを解明し、中世文学会秋季大会(10月、ノートルダム清心女子大学)で発表した。3院政期、役行者の祖師化が、山伏の間だけでなく、日本の仏法・王法を支える天皇家・摂家及び京・南都の大寺院をも巻き込むかたちで進められた。その結果、『大峯縁起』『当麻寺縁起』『箕面寺縁起』以下、役行者の事蹟を喧伝する縁起が次々と世に現れた。その運動を京・南都の寺院と霊山との間の双方向的運動として捉え、全体の見取り図を示した。研究代表者が、国際研究集会(10月、米国イリノイ大学)で報告した。1本研究計画の予備報告として、日本仏教の事象に関わる諸分野の国内外の研究者が参加する国際研究集会(2013.5.17-18、ハーバード大学、アメリカ)で、『大峯縁起』に関する従来の研究成果を報告をした。国際的、学際的な視野から従来の研究成果を検証し、課題を浮き彫りにするためであった。文献学の立場から修験道を解明する方法は新鮮だとの評価を得た一方で、通史的な視野をもち、古代の山林修行との関係も提示すべきだとの批判を受けた。2『大峯縁起』享受史上最大の問題である、白河院の『大峯縁起』御覧説の出現(『熊野権現金剛蔵王宝殿造功日記』ほか)の背景を解明する作業の一環として、寛治六年の金峯山御幸の記録を整理、分析した。とりわけ、研究協力者のヘザー・ブレアが再発見した、大江匡房(この御幸に供奉し、願文を草した)の参詣の記録(宮内庁書陵部蔵『不知記』の一部)に注目し、ブレアを中心に学際的な共同研究の体制を整えた。ブレアと川崎のほか、上島享氏、近本謙介氏、馬耀氏に協力を仰いで、原本調査、翻刻、読解を行い、基本的な位置づけを了えた。2013年4月にシンポジウムを開く予定である。3役行者の事績を含む院政期の縁起・記録群を概観し、それらのなかで『大峯縁起』を相対化する作業を始めた。その一環として、『当麻寺縁起』『箕面寺縁起』の基礎研究に着手した。4真福寺展(名古屋市博物館)の図録を執筆し、『大峯縁起』と関連の深い熊野金峯縁起群六軸(国重要文化財)について、最新の研究成果を社会に向けて発信した。主に1『大峯縁起』の享受史の研究、2関連する縁起の研究、3平安・鎌倉の山岳信仰史の研究に大別して、研究実績の概要を報告する。1後白河院政期に現れた『大峯縁起』の享受史に関する資料は収集したが、その整理と成果の公開には至らなかった。2従来、『大峯縁起』は他本にない特異な内容の記事をもつ点で注目されてきたが、本研究の成果によって、日本仏法史の枠組みのなかで、修験道の祖、役行者を顕彰する基本姿勢については、似通った性格をもつ縁起が他にも存することが判明してきた。そこで、まず『当麻寺縁起』について、次に『箕面寺縁起』について検討し、平安時代後期から鎌倉時代にかけて、役行者が日本仏法史上の正統に位置づけられていたことを解明した。よって以後、そうした考えが浸透していたことを前提に、『大峯縁起』の偽撰と享受について評価する必要がある。3平安・鎌倉期の修験道史については、それを修験道に限定せず、山岳信仰史として捉えなおすことが有効だと考え、主張してきた。そうした立場から、9・10世紀、当時第一級の神像群が熊野早玉社に奉納された事実に注目し、仏教史・美術史の研究者と協力して、この現象を再評価するシンポジウムを開催した(2014.11.9、和歌山県立近代美術館)。

本研究事業の1年延長が認められたことによって、長谷川賢二ほか編『修験道史入門』岩田書院)、「聖護院門跡の名宝」展(京都)の貴重な成果を踏まえて、修験道史上における『大峯縁起』の評価をまとめることができた。室町時代以降、熊野三山検校職を兼帯した聖護院門跡が自らの正統性の支証の一として『大峯縁起』を用いたことはよく知られるが、そうした状況が鎌倉時代にまで遡りえないことが判明した。すなわち、鎌倉後期、『大峯縁起』が日本仏教史の叙述と関わってくるのは、真言宗における東大寺と醍醐寺との本末相論がきっかけであったと推定される。同時期、天台宗寺門派は熊野三山検校職を再び掌中に納め、「顕・密・修験」兼修を標榜するようになるが、その支証として『大峯縁起』が用いられた形跡はなく、上皇の熊野御幸の再興がその動きの中核に据えられていたことを確認した(「学会発表」参照)。上記のうち本末相論について補足すると、東大寺の主張の一つの核となったのが、役行者の山林修行の事蹟を、日本における空海以前の密教史と見る考え方であり、その考え方が『箕面寺縁起』に由来することも判明した(「雑誌論文」参照)。以上、研究事業当初は、室町時代はもとより、鎌倉後期、天台宗寺門派による修験の興隆のなかでも『大峯縁起』が重要な機能を果たしたと予想していたが、事態はそのように単純なものではなく、上述の通り、真言・天台の大寺院を巻き込んだ、より大規模な修験の興隆が進んでおり、その一脈を『大峯縁起』が担っていたことを解明した。至高の霊山、大峯の由来を語る『大峯縁起』は、修験道の祖、役行者から脈々と受け継がれた書物として、平安時代後期、突然、大和国に現れた。室町時代前期、聖護院門跡が熊野三山検校職を兼帯するようになって以降、その正統性を証明する秘書として『大峯縁起』は重用され、修験道教団の形成に大きく寄与したが、鎌倉時代後期にはそうした情況は確認できず、天台宗寺門派ではなく、むしろ東大寺東南院など真言宗寺院において『箕面寺縁起』とともに重用されたことを解明した。個々の成果(江記逸文の研究、当麻寺縁起の研究、箕面寺縁起の研究ほか)を見ると、当初の予想を上回る点も多々あったが、それら個別研究に大きな時間と力をさかざるをえなかったため、またそこで得た新たな成果を消化するだけの時間的余裕がなかったため、総体的な情報の整理と公開、総論の記述にまでは至らなかった。日本古典文学1年の期間延長を認められたので、この期間内に、研究の目的に照らして達成度が不十分であった、「大峯縁起」の享受に関する情報の整理と公開、研究課題と密接に関わる総論的記述を行う。1白河院金峯山御幸の記録と記憶に関する研究の成果を、4月のシンポジウムで公表し、有益な批正と助言を賜った。その報告に基づく論文2点(研究代表者、研究協力者)が『説話文学研究』に掲載される予定である(入稿済)。2院政期における役行者の祖師化に関する研究の成果を、10月の国際研究集会及び中世文学会で発表した。異なる視点からそれぞれ有益な助言を賜った。後者の報告に基づく論文1点が『中世文学』に掲載される予定である(入稿済)1海外研究集会での報告は、予想通りの成果を収め、今後の課題が浮き彫りになった。国際的、学際的な視野から、その課題を克服する最適の方法を模索している。2研究協力者のヘザー・ブレアを中心に進めた、白河院金峯山御幸の「江記逸文」に関する共同研究は順調に進み、第一級の文献資料の基礎研究として、日本文学、日本史学、宗教学など、諸学界に提示できる水準に達した。3『当麻寺流記』『箕面寺縁起』の基礎研究は順調に進展しており、成果報告の場も確定している。4『大峯縁起』関連資料の収集、整理作業を予定通り進めてきたが、古代・中世の新資料の発見には至っていない。
肺癌、ことに腺癌の組織型と遺伝子変化

肺癌の個性を明らかにし予防と治療に役立たせる為、以下の4項目につき検討した。1)発癌原因のことなる2つの腺癌亜型間で生物学的特性に差があるか否かを検討した結果、喫煙が原因で発生するcolumnar type(col)と、自然突然変異が原因と考えられるhobnail type(hob)では、前者の方が増殖速度が早く、予後も悪い傾向が得られた。2)腺癌の発生・進展に関与する内因の一つとしてエストロゲンレセプタ(ERa)に着目し、腺癌の細胞亜型とERの発現の有無、強弱との関係を検討した結果、ERaのmRNA発現は扁平上皮癌で低下し、腺癌で増加していた。腺癌の亜型では、プロモーターの使い分けが異なり、hobは乳癌に似たパターンを示し、colはそれとは異なっていた。3〉17番染色体短腕上に存在するHIC-1遺伝子発現抑制が肺癌の予後に関連があるか否か、及び同遺伝子の抑制の原因を検討した結果、腫瘍でのHIC-1遺伝子mRNAの発現が正常肺組織の半分以下に抑制された症例は、術後生存期間が有意に短かかった。HIC-1DNAのメチル化とmRNAの発現量との相関は認めなかった。4) 1997年に単離・同定されたp73遺伝子はp53と蛋白レベルで相同性が高く機能的にも類似している。肺癌組織型別(腺癌では亜型別)の臨床病理学的特徴とP73遺伝子異常との関連を検討した結果、p73遺伝子のmRNA発現量は、95%の症例において肺癌部で亢進し、特に扁平上皮癌や高齢者の腫瘍で高かった。しかし、p53遺伝子変異の有無とは相関がなかった。以上より、肺腺癌は発癌原因の異なる亜型により遺伝子発現や生物学的特性が異なること、HIC-1遺伝子発現抑制は予後と関連すること、肺癌の発生・増悪にp73発現増加が関与する可能性、などが明らかとなった。第17番染色体短腕(17p)上に肺癌の発生・増殖と関係する新しい癌抑制遺伝子が存在する可能性を検討し、その候補癌抑制遺伝子と腺癌の病理組織学的特徴との関係を検討した。検索材料は切除肺癌145例(偏平上皮癌35、腺癌110)である。癌及び正常肺組織よりDNAを抽出し、...マイクロサテライトマーカー8個とVNTRマーカー1個の計9個のマーカー(セントロメアからテロメアに向かって、TP53,S513,ENO3,S1566,S379,YNZ22,S525,S1574,ABRの順に配列)を用いて染色体欠失頻度を検索し、欠失地図を作成した。腺癌はWHO分類に基ずき分化度、組織亜型に分類し、病理病期はStageIとStageII以上に分類した。結果:YNZ22の欠失頻度は60%と高頻度で、欠失地図の検討からTP53とは異なる欠失領域であったことから、この領域に癌抑制遺伝子の存在が推測された。更に、S379の領域が61%と高頻度に欠失しており、TP53,YNA22領域の欠失と比較したところ、それら領域から独立した欠失領域であったことから、S379領域にも新たな癌抑制遺伝子の存在が推測された。腺癌との関係では、YNZ22の欠失頻度は低分化腺癌で有意に高く、病理病期がStageIIの症例で高い傾向が見られた。以上より、肺癌においては、TP53(p53遺伝子が存在)よりテロメア側のS379およびYNZ22の領域に、それぞれ異なった癌抑制遺伝子の存在が示唆され、YNZ22領域の癌抑制遺伝子は腺癌の分化度及び予後と関連する可能性が示唆された。肺腺癌の発癌機序を明かにするため、腺癌を5つの細胞亜型<Hobnail(Hob)、Columnar(Col)、Mixed(HobとColが混在したもの)、Polygonal(pol)、Goblet(Gob)>に分類し、p53遺伝子変異、FHITmRNA異常、及び喫煙との関係を検索した。その結果、1)亜型の半数を占めるHobはp53の変異とFHITmRNA異常の頻度が低く,喫煙量が少なく、p53のCpG sitesのC*TTransitionの割合が高いことから、発癌にはendogenousな要因が重要な役割を占め、2)亜型の約20%を占めるColでは、p53変異とFHITmRNA異常の頻度が高く、p53のG*T Transversionの割合が高く、喫煙量が多かったことから、発癌には喫煙が重要な役割が占める事が明かとなった。第17番染色体短腕のp53遺伝子存在部位よりもテロメア側のLOHを11個のマーカーを用いて検索した結果、2ヶ所に新たな癌抑制遺伝子が存在する可能性が得られた。これらの部位の欠失と腺癌の病期との関係では、D17S379あるいはD17S956の欠失が病期の進んだものに有意に多かった。以上より同領域の欠失が腺癌の増悪と関連する可能性が得られた。D17S379近傍に存在するHIC-1遺伝子の発現量を検索した結果、肺癌で発癌が抑制されていた。今後、同遺伝子と予後との関連を検索する予定である。

1)発癌原因のことなる2つの腺癌亜型間で生物学的特性に差があるか否かを検討した結果、喫煙が原因で発生するcolumnar type(col)と、自然突然変異が原因と考えられるhobnail type(hob)では、前者の方が増殖速度が早く、予後も悪い傾向が得られた。2)腺癌の発生・進展に関与する内因の一つとしてエストロゲンレセプタ(ERa)に着目し、腺癌の細胞亜型とERの発現の有無、強弱との関係を検討した結果、ERaのmRNA発現は扁平上皮癌で低下し、腺癌で増加していた。腺癌の亜型では、プロモーターの使い分けが異なり、hobは乳癌に似たパターンを示し、colはそれとは異なっていた。3〉17番染色体短腕上に存在するHIC-1遺伝子発現抑制が肺癌の予後に関連があるか否か、及び同遺伝子の抑制の原因を検討した結果、腫瘍でのHIC-1遺伝子mRNAの発現が正常肺組織の半分以下に抑制された症例は、術後生存期間が有意に短かかった。HIC-1DNAのメチル化とmRNAの発現量との相関は認めなかった。4) 1997年に単離・同定されたp73遺伝子はp53と蛋白レベルで相同性が高く機能的にも類似している。肺癌組織型別(腺癌では亜型別)の臨床病理学的特徴とP73遺伝子異常との関連を検討した結果、p73遺伝子のmRNA発現量は、95%の症例において肺癌部で亢進し、特に扁平上皮癌や高齢者の腫瘍で高かった。しかし、p53遺伝子変異の有無とは相関がなかった。以上より、肺腺癌は発癌原因の異なる亜型により遺伝子発現や生物学的特性が異なること、HIC-1遺伝子発現抑制は予後と関連すること、肺癌の発生・増悪にp73発現増加が関与する可能性、などが明らかとなった。
再生医療における血管新生に及ぼす血管プレコンディショニング効果の検討

再生医療における血管新生が周術期の血管プレコンディショニング(低酸素プレコンディショニングとリモートプレコンディショニング)に影響されるかどうかを基礎研究(in vitro & in vivo)と臨床研究を組み合わせ、様々な角度から検討した。動物実験と臨床研究により、血管プレコンディショニングの血管新生に及ぼす影響は少ないことがわかった。基礎実験により、FBS刺激により細胞遊走は増加したが、血管プレコンディショニングの細胞遊走に及ぼす影響は少ないことがわかった。血管新生に及ぼす血管プレコンディショニングの影響が解明されることにより、周術期管理法の新たな指標となることが期待される。近年の分子生物学や分子発生学などの生命科学の進歩により、組織の発生が解明されるようになり、障害された臓器の再生が実現可能になりつつある。とりわけ血管新生は、再生医学の分野で大きな進歩を遂げ、臨床応用の段階に至った再生医療の一つである。本研究の目的は、再生医療における血管新生が周術期の血管プレコンディショニング(低酸素プレコンディショニングとリモートプレコンディショニング)に影響されるかどうかを基礎研究(in vitro & in vivo)と臨床研究を組み合わせ、様々な角度から検討することである。コントロール群と低酸素群では、いずれもFBS刺激により,細胞遊走は増加した。しかし,両群で有意な差は認められなかった。細胞増殖に関しても両群で,72時間後の吸光度に有意な差は認められなかった。本年度は臨床研究を行った。研究内容を説明し同意の得られた成人予定手術患者を対象とした。血流遮断を伴わない下腹部手術患者を対象とするコントロール群と腹部大動脈瘤手術、人工膝関節置換術等を対象とする血流遮断群で検討した。麻酔前投薬は投与せず、プロポフォール、レミフェンタニルにて麻酔導入、麻酔維持は酸素・空気・セボフルランにて行った。気管挿管・人工呼吸下に管理し、筋弛緩薬は通常量使用した。モニターは通常手術に準じ、静脈ライン、動脈ラインを確保した。麻酔導入前に採血し、以後手術中は1時間毎に手術終了時まで採血した。血流遮断群は血流遮断前後の採血も行った。VEGF enzyme-linked immunosorbentassay kitでVEGFを測定した。各群における血中VEGF濃度を時間ごとにプロットし、ANOVAで統計処理した。目標症例数にはまだ到達していないが、現時点ではコントロール群と血流遮断群での群間比較、また群内比較においても有意な差は認められていない。更に症例を重ねる予定である。本年度はin vivo実験を予定しており、ラット虚血(全身・上肢または下肢)モデルを作成し、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の変化を観察する計画であった。しかし、開始直後に動物実験装置の不調が認められた。修理・オーバーホールが必要となったため、実験内容を変更し、来年度に予定していた臨床研究を先に行うことにした。途中からの変更のため臨床研究の進行に若干の遅れが生じた。本年度は臨床研究を継続すると共に、in vivo実験を行った。ラット虚血(全身・上肢または下肢)モデルを作成し、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の変化を観察した。オスのWister系ラット(250-300 g)を吸入麻酔薬(セボフルラン)により麻酔導入・維持し、気管切開、人工呼吸管理下に大腿動静脈よりカニュレーションし、輸液ルート、動脈圧測定・採血用とした。コントロール群は通常の酸素投与下に正常酸素分圧(PaO2 80 mmHg以上)を12時間維持した。低酸素群は血行動態を記録しながら全身性の低酸素負荷(PaO2 50mmHg以下)または上肢・下肢60分の血流遮断を行い、12時間麻酔維持した。2時間毎に採血し、VEGF enzyme-linked immunosorbent assay kitを用いマイクロプレートリーダーでVEGFを測定した。現在、in vivo実験の最終段階施行と結果のまとめ、研究総括を行っている。

基礎実験により、FBS刺激により細胞遊走は増加したが、血管プレコンディショニングの細胞遊走に及ぼす影響は少ないことがわかった。血管新生に及ぼす血管プレコンディショニングの影響が解明されることにより、周術期管理法の新たな指標となることが期待される。本年度は正常ヒト皮膚繊維芽細胞と臍帯静脈血管内皮細胞から構成された血管新生キット(クラボウバイオメディカル社製)用いたin vitro実験で管腔形成初期段階として枝分かれした管腔ネットワークを直接観察し、低酸素刺激の影響を定量評価する計画であった。しかし、使用を予定していた血管新生キット(クラボウ)が販売停止のため入手困難となったため、実験内容を変更した。細胞遊走と血管内皮細胞増殖は,それぞれ血管新生の重要な課程であるため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cells)を用いて低酸素刺激が細胞遊走と血管内皮細胞増殖に対する影響を評価する研究に変更した。プロトコール変更、実験ノウハウ確立に若干の時間を要した。次年度は臨床研究を継続すると共に、in vivo実験を開始する。ラット虚血(全身・上肢または下肢)モデルを作成し、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の変化を観察する。オスのWister系ラット(250-300 g)を吸入麻酔薬(セボフルラン)により麻酔導入・維持し、気管切開、人工呼吸管理下に大腿動静脈よりカニュレーションし、輸液ルート、動脈圧測定・採血用とする。コントロール群は通常の酸素投与下に正常酸素分圧(PaO2 80 mmHg以上)を12時間維持する。低酸素群は血行動態を記録しながら全身性の低酸素負荷(PaO2 50mmHg以下)または上肢・下肢60分の血流遮断を行い、12時間麻酔維持する。2時間毎に採血し、VEGF enzyme-linked immunosorbent assay kitを用いマイクロプレートリーダーでVEGFを測定する。医歯薬学次年度はin vivo実験を計画している。使用を予定していた血管新生キット(クラボウ)が販売停止のため入手困難となったため、実験内容を一部変更した。
ＢＲＣＣ３６複合体によるＫ６３結合型ユビキチン鎖特異的切断メカニズムの解明

BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素複合体は,K63結合型ユビキチン鎖(K63鎖)を特異的に切断する活性を持ち,DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を制御する.本研究では,BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析により決定し,複数の制御サブユニットによって担われるK63鎖特異的な切断機構を解明することを目的とした.初年度にBRISC複合体の結晶化条件と発現コンストラクトの検討により再現性を高めることができたが,高分解能のデータセットを収集するには至らなかった.そこで,昨年度は,結晶の凍結条件の再検討や生物種の変更による分解能の向上を目指したが,構造決定に適する分解能の回折データを得るには至らなかった.結晶構造解析に加えてクライオ電子顕微鏡解析による構造決定も試みたが構造解析に適する粒子像は観察できなかった。今年度は,数残基レベルで発現コンストラクトを調節することでの分解能の向上を試みたが,分解能は改善しなかった。一方で,BRCC36複合体が関与するDNA損傷応答経路で機能するユビキチン結合酵素RNF168によるK63鎖選択的な認識機構の研究も行った.RNF168には2箇所のK63鎖選択的な結合領域が存在することを示し,その認識機構を複合体の結晶構造解析と変異体の相互作用解析により明らかにした(Takahashi et al., Nat. Commun., 2018).29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素(DUB)複合体は,K63結合型ユビキチン鎖(K63鎖)を特異的に切断する活性を持ち,DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を調節する.本研究では,BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析の手法を駆使して決定し,複数の制御サブユニットに依存したK63鎖特異的な切断メカニズムを解明する.BRCC36のみならず,DUBの多くは複合体を形成して機能するが,複合体内で触媒活性や基質特異性が制御されるメカニズムは全く分かっていない.本研究で明らかとなるBRCC36 DUB複合体の活性制御メカニズムは,複合体として機能するDUBの活性制御メカニズムの理解にも役立つことが期待される.今年度は,BRISC複合体の結晶化条件(沈殿剤濃度,pH,温度,添加剤など)や発現コンストラクト(機能に不要な不安定な領域の除去など)を再検討し,結晶化の再現性を向上すると共に,回折測定に適する大きさに結晶を成長させることに成功した.しかし,分解能は構造決定に十分な高さに達しなかった.一方の電子顕微鏡(EM)による解析では,理化学研究所との共同研究でBRISC複合体の負染色像の観察とcryoEMによる氷包埋像の観察を行ったが,高分解能解析に適する像を得るには至らなかった.BRISC複合体の結晶化では,結晶の大きさと再現性に問題があったが,今年度は結晶化条件や発現コンストラクトを再検討することで,これらの問題を解決することができた.この改善により構造決定に適する分解能の回折データが得られることが期待されたが,残念ながら分解能の大幅な改善が見られなかった.一方,理化学研究所との共同研究での電子顕微鏡(EM)による解析でも,高分解能解析に向けた試料調製法を確立することができなかった.実験自体は計画どおりに行うことができたが,得られた結果は期待どおりとはいかなかったので,全体的にはやや遅れていると判断した.BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素(DUB)複合体は,K63結合型ユビキチン鎖(K63鎖)を特異的に切断する活性を持ち,DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を制御する.本研究では,BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析により決定し,複数の制御サブユニットによって担われるK63鎖特異的な切断機構を解明する.BRCC36のみならず,DUBの多くは複合体を形成して機能するが,複合体内では触媒活性や基質特異性が制御されるメカニズムは全く分かっていない.本研究で明らかとなるBRCC36 DUB複合体の活性制御メカニズムは,複合体として機能するDUBの活性制御メカニズムの理解にも役立つことが期待される.初年度は,BRISC複合体の結晶化条件と発現コンストラクトの検討により再現性を高めることができたが,高分解能のデータセットを収集するには至らなかった.また,理化学研究所との共同研究で行ったクライオ電子顕微鏡解析でも立体像を得るには至らなかった.今年度は,結晶の凍結条件の再検討などによる分解能の向上を目指したが,構造決定に適する分解能の回折データを得るには至らなかった.また,これまで結晶化を行ってきたマウス由来の複合体に加えて,ヒトおよびゼブラフィッシュ由来の複合体の発現系を構築し,結晶化に適する量と質の複合体を調製した.結晶化スクリーニングを行ったが,結晶は得られなかった.K63結合型ジユビキチンとBRISC複合体との複合体のクライオ電子顕微鏡解析においても立体像を得るには至らなかった.

初年度に行ったマウス由来BRISC複合体の結晶化条件や発現コンストラクトの検討により,結晶化の再現性や大きさを改善するノウハウが得られた.それに基づいて,ヒトおよびゼブラフィッシュ由来のBRISC複合体の発現系を短期間に構築することができ,精製と結晶化スクリーニングまで順調に進んだが,残念ながら結晶は得られなかった.また,マウス由来のBRISC複合体の結晶についても,結晶凍結条件の再検討による分解能の向上を図ったが効果は見られなかった.K63結合型ジユビキチンとBRISC複合体との複合体のクライオ電子顕微鏡解析でも立体像を得るには至らなかった.実験自体はスムーズに進めることができたが,得られた結果は期待どおりとはいかなかったので,全体的にはやや遅れていると判断した.BRCC36を触媒サブユニットとする脱ユビキチン化酵素複合体は,K63結合型ユビキチン鎖(K63鎖)を特異的に切断する活性を持ち,DNA損傷応答や炎症・感染応答においてK63鎖を介した分子シグナル経路を制御する.本研究では,BRCC36複合体の一つであるBRISC複合体とK63鎖との複合体の立体構造をX線結晶構造解析や電子顕微鏡解析により決定し,複数の制御サブユニットによって担われるK63鎖特異的な切断機構を解明することを目的とした.初年度にBRISC複合体の結晶化条件と発現コンストラクトの検討により再現性を高めることができたが,高分解能のデータセットを収集するには至らなかった.そこで,昨年度は,結晶の凍結条件の再検討や生物種の変更による分解能の向上を目指したが,構造決定に適する分解能の回折データを得るには至らなかった.結晶構造解析に加えてクライオ電子顕微鏡解析による構造決定も試みたが構造解析に適する粒子像は観察できなかった。今年度は,数残基レベルで発現コンストラクトを調節することでの分解能の向上を試みたが,分解能は改善しなかった。一方で,BRCC36複合体が関与するDNA損傷応答経路で機能するユビキチン結合酵素RNF168によるK63鎖選択的な認識機構の研究も行った.RNF168には2箇所のK63鎖選択的な結合領域が存在することを示し,その認識機構を複合体の結晶構造解析と変異体の相互作用解析により明らかにした(Takahashi et al., Nat. Commun., 2018).BRISC複合体の結晶は再現よく調製できるようになったので,結晶の凍結条件の検討や脱水処理などの結晶化後処理を行うことで分解能の向上を目指す.構造決定に十分な分解能の結晶を作製できた場合は,最近報告されたBRCC36-Abraxas複合体の構造をサーチモデルとした分子置換法による構造決定を行う.分子置換法による構造決定に至らない場合は,セレノメチオニンで標識したBRISC複合体の結晶を調製して異常分散法による構造決定を行う.また,様々な生物種のBRISC複合体の発現,精製,結晶化を試みることでも分解能の向上を図る.BRISC複合体の結晶は,基質であるK63結合型ジユビキチンが結合した複合体で得られており,全体構造が安定化していることが予想される.この基質が結合したBRISC複合体を用いてEMによる解析を試みる.ヒトおよびゼブラフィッシュ由来のBRISC複合体の結晶化については,スクリーニングを開始したばかりであるので,結晶化条件や発現コンストラクトには改善の余地がある.
線虫を用いた細胞特異的遺伝子発現プロファイルと細胞機能相関の研究

線虫C.エレガンスは細胞の機能とその細胞での全遺伝子発現とを対応づけて理解するための理想的なモデル生物である。線虫の生殖腺と神経系をモデルとして組織特異的遺伝子発現を基盤にした遺伝子機能解析のアプローチを確立することを目的として研究を進め、以下の成果を得た。生殖腺形成に必須な遺伝子の解析:ESTマクロアレイ解析により同定した生殖腺特異的に発現するcDNAのうち約170クローンについてRNAi法を用いた機能阻害を施し生殖に必須な遺伝子を見い出している。同定した生殖必須遺伝子のうち、eIF-5A相同遺伝子とATP合成酵素b鎖相同遺伝子の解析を行った。ゲノム上に2つあるeIF-5A相同遺伝子のうち、一方(iff-1)が生殖腺特異的に発現、機能する。mRNA制御に関わると予想されるiff-1の欠損により、線虫の生殖顆粒であるP顆粒の構成因子の局在が乱れ、生殖細胞の増殖のステップに欠損が生じることが分かった。一方、ATP合成酵素b鎖の相同遺伝子もゲノム上に2つあるが一方(asb-1)が生殖腺特異的である。ASB-1はミトコンドリアに存在し、減数分裂のパキテン期の進行にras-MAPキナーゼ経路とともに働くことが明らかになった。特定の細胞における遺伝子発現を検出する方法の開発:特定の細胞からのRNAを単離するため、ポリA結合蛋白質(PABP)を用いた方法を開発している。すなわち、特定の組織にタグをつけたPABPを発現させ、細胞内mRNAをin vivoでこれとクロスリンクしたのちPABPとともに精製する。これまでの研究経過でクロスリンク依存的にmRNAが回収されることを確認していたが、回収の定量性に欠けていたため、ブロトコールの改良を試みた。PABPの精製条件をさらに検討し、特異性よくPABPを回収する条件を見い出した。また、タグの種類と位置についても検討を加え、組織特異的にタグ付加PABPを発現する株を作成した。化学走性行動の可塑性のアッセイ系の作成:神経系における遺伝子機能の解析のために、神経高次機能のアッセイ系が必要である。そのようなアッセイ系として水溶性物質への化学走性に関する連合学習の系を開発した。
細胞増殖因子の徐放化による機能性チタンインプラントの開発

1.ポリ乳酸系高分子低結晶性ポリ乳酸誘導体,ポリエーテルセグメントを導入した親水化ポリ乳酸,側鎖官能基導入型ポリ乳酸誘導体を合成し,チタンとの接着性を評価した結果,いずれの共重合体もチタン表面に対して強固な結合を得ることはできず,容易に剥離することが示唆された。2.異なる官能基を有する分子のチタン表面への吸着特性評価リン酸系分子とカルボン酸系分子を用いて,官能基の違いがチタン表面への吸着特性に及ぼす影響を検討した結果,リン酸系の分子の方がカルボン酸系分子に比べて強固に吸着することが示唆された。さらにXPSにより詳細に分析した結果,チタンに吸着したリン酸系分子のP2pは未反応の分子に比べて低エネルギー側に化学シフトしており,リン酸系分子が化学的に吸着していることが示唆された。また,前処理として塩酸を用いることにより,チタン表面への吸着性が向上することも示唆された。3.ポリリン酸チタン表面に骨形成促進因子の吸着させる担体としてポリリン酸を選択し,細胞実験ならびに動物実験によりその効果を検討した。ヒト骨髄由来幹細胞ならびにマウス骨芽細胞様細胞株の細胞動態をMTS法により評価した結果,両者ともに初期細胞接着は,チタン表面へのポリリン酸吸着により有意に亢進された。また,細胞増殖に関してはチタン表面に吸着したポリリン酸の吸着量依存的に亢進された。さらにラット脛骨に埋入したチタン周囲の骨形成能を組織学的に評価した結果,ポリリン酸処理により周囲骨が良好に形成されることが示唆された。4.リン酸化糖リン酸化多糖を合成し,チタン表面処理に応用した。その結果,リン酸化されていない天然多糖類がチタン表面から容易に剥離するのに対し,リン酸化糖はチタン表面に強固に吸着することが示唆された。さらに,細胞実験の結果,今回用いたリン酸化多糖はポリリン酸に比べて,優れた細胞増殖能を有することが示唆された。インプラント周囲より細胞増殖因子などの生理活性物質を徐放させるためには,担体となる生体吸収性の高分子をインプラント周囲に吸着させる必要がある。さらに,担体に用いる高分子材料は機械的性質に優れ,かつ,インプラントの母体であるチタンに強固に結合している方が望ましい。そこで,強度的に優れた生体吸収性高分子であるポリ乳酸系高分子について,低結晶性ポリ乳酸誘導体,ポリエーテルセグメントを導入した親水化ポリ乳酸,側鎖官能基導入型ポリ乳酸誘導体を合成し,チタンとの接着性を評価した。その結果,今回合成したポリ乳酸系機能性共重合体はチタン表面に対して強固な結合を得ることはできず,容易に剥離することが示唆された。また,天然多糖類であるプルランおよびその混合物は金属への接着性が良く,金属表面で強固な皮膜を形成することが報告されているが,チタン表面へは強固な結合が得られなかった。リン酸基を有する分子はチタン表面に強固に結合することに着目し,リン酸系高分子とチタンとの結合特性について評価した。ポリリン酸の吸着は0.1,1,10wt%の溶液中に24時間浸漬した純チタン表面についてXPSにて分析した。その結果,洗浄後のチタン表面にはPが検出され,ポリリン酸がチタン表面に強固に結合していることが示唆された。以上の結果を基に,本研究ではチタンインプラント表面に骨形成促進因子の吸着させる担体としてポリリン酸を選択した。

ポリリン酸にて表面修飾されたチタンは負に帯電することから,等電点が約9.6であるbFGFをチタンインプラント表面に吸着させ,徐放させることにも有用であると考えられる。そこで,1wt%ポリリン酸水溶液による処理ならびに未処理チタンセンサー表面へのbFGFの吸着特性をSPRならびにQCMにて評価した。その結果,ポリリン酸前処理によってbFGFのチタン表面への吸着量が増大し,細胞増殖因子の徐放を制御できる可能性が示唆された。本年度は,以下の項目について検討した。1.異なる官能基を有する分子のチタン表面への吸着特性評価リン酸系分子とカルボン酸系分子を用いて,官能基の違いがチタン表面への吸着特性に及ぼす影響を検討した。XPSおよびQCMによる分析結果より,リン酸系の分子の方がカルボン酸系分子に比べて強固に吸着することが示唆された。さらにXPSにより詳細に分析した結果,チタンに吸着したリン酸系分子のP2pは未反応の分子に比べて低エネルギー側に化学シフトしており,リン酸系分子が化学的に吸着していることが示唆された。また,前処理として塩酸を用いることにより,チタン表面への高分子の接着耐久性が向上することも示唆された。2.ポリリン酸昨年度の結果をもとにチタンインプラント表面に骨形成促進因子の吸着させる担体としてポリリン酸を選択し,細胞実験ならびに動物実験によりその効果を検討した。ヒト骨髄由来幹細胞ならびにマウス骨芽細胞様細胞株の細胞動態をMTS法により評価した結果,両者ともに初期細胞接着は,チタン表面へのポリリン酸吸着により有意に亢進された。また,細胞増殖に関してはチタン表面に吸着したポリリン酸の吸着量依存的に亢進された。さらにラット脛骨に埋入したチタン周囲の骨形成能を組織学的に評価した結果,ポリリン酸処理により周囲骨が良好に形成されることが示唆された。3.リン酸化糖リン酸化多糖を合成し,チタン表面処理に応用した。その結果,リン酸化されていない天然多糖類がチタン表面から容易に剥離するのに対し,リン酸化糖はチタン表面に強固に吸着することが示唆された。さらに,細胞実験の結果,今回用いたリン酸化多糖はポリリン酸に比べて,優れた細胞増殖能を有することが示唆された。
ヒメミカヅキモの異性細胞間認識、融合機構の分子生理学的解析

本研究では、ヒメミカヅキモの接合時のアロ認証に関わると思われる遺伝子群を単離し、配偶子間認識、融合における役割を形質転換体作出、表現型解析を通して明らかにすることを目指した。有性生殖期に発現する受容体型キナーゼであるCpRLK1について、内在性高発現プロモーター(pCpHSP70)下流に候補遺伝子群をアンチセンス方向に挿入したコンストラクトを作製し、ヒメミカヅキモへ遺伝子導入したところ、2株で、ペア形成までは進行するものの、その後のプロトプラスト放出過程などが完全に停止する表現型が得られた。このCpRLK1は、被子植物の生殖における花粉管伸長制御に関わるCrRLK1L-1サブファミリーと近縁であり、細胞壁センサーとして,有性生殖における細胞融合過程を制御していることが示唆された。同様に有性生殖期に発現するファシクリン遺伝子(CpFAS1およびCpFAS3)について、発現を抑制するコンストラクトを作成し、本来これらの遺伝子が発現する+型細胞に導入した。これらの形質転換株を、ー型細胞と混合し有性生殖を誘起したところ、野生型どうしの混合と比較し、有性生殖過程へと進んだ細胞数が減少した。有性生殖を誘起した後の培地に含まれるPR-IP InducerおよびCpFAS3タンパク質を検出したところ、CpFAS3抑制形質転換株だけでなくCpFAS1抑制形質転換株でも、野生型と比べCpFAS3タンパク質の蓄積量は低下しており、一方で両株ともでPR-IP Inducer量の増加傾向が見られた。また、PR-IP Inducerにより発現誘導されるはずのPR-IP遺伝子等の発現量も両形質転換株で著しく低下していた。以上のことより、少なくともCpFAS3は、PR-IP Inducerの受容と有性生殖過程を正常に進めるための情報伝達に関与することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。単細胞接合藻類ヒメミカヅキモは、遺伝子導入による形質転換系が確立し、ゲノム情報も利用できるモデル植物細胞としての特性を持つ。この種では、遺伝的に異なる+、ー型細胞の間で容易に有性生殖を行い、接合子を形成する。これまでの研究により、有性生殖過程の成立に必要な性フェロモンを介した細胞間コミュニケーションの実体が示され、さらに接合型特異的ないくつかの遺伝子群が単離されている。本研究では、これまでに明らかにした接合型特異的な遺伝子群に加えて、RNAseq、プロテオミクスなどを駆使して、接合時のアロ認証に関わると思われる遺伝子群を単離し、配偶子間認識、融合における役割を形質転換体作出、表現型解析を通して明らかにすることを目的としている。本年度は、以下の解析を進めた。ヒメミカヅキモの栄養増殖期(+型、-型それぞれ)、性分化期(+型、-型それぞれ)、有性生殖初中期、後期、接合子発芽期の計7種からRNAを調製した。これらを、Illumina HiSeq2000を用いたtranscriptome解析に供した。現在、解析結果を待っている。ヒメミカヅキモの内在性高発現プロモーター(CpHSP70)下流にCpRLK1遺伝子をアンチセンス方向に挿入したコンストラクトを作製し、ヒメミカヅキモへ遺伝子導入した。現在、ハイグロマイシン耐性遺伝子による耐性株確立を進めている。これまでのところで確立された形質転換体系統株の数は多くないものの、定性的、定量的な評価に耐えうるまでになりつつある。