hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特別支援学校管理職の職能に関する調査研究に基づく教職大学院での研修モデルの検討

また,ミドルリーダーがその力量形成が管理職拝命後の研修会としているのに対し,特別支援学校学級担任経験のある管理職はその形成時期は勤務後10年前後に学級担任としての勤務の中で形成すべきとする者が有意に多数であった。これらのことから,教職大学院における特別支援学校管理職候補者の研修には,小・中・高校の研修内容に教育課程編成や授業開発の内容を付加する必要性が明らかになった。悉皆調査の結果を踏まえ,教職大学院における特別支援学校管理職候補者の研修モデルを検討し,特別支援学校管理に関する科目群,特別支援学校教育課程・授業開発に関する科目群,学校経営に関する科目群,特別支援学校管理職臨床実習群の4群20科目3実習からなる研修モデルを構築した。教職大学院での特別支援学校管理職候補者研修モデル構築を目的とした。2015年9月,特別支援学校管理職,ミドルリーダー対象の悉皆調査を行い,管理職1146名,ミドルリーダー1246名の回答を得,分析した。特別支援学校学級担任経験有管理職は学級担任無管理職と比べて,授業実践に関する専門性が必要とする者が有意に多かった。力量形成を学級担任経験有管理職は勤務後10年前後の学級担任勤務の中で形成とする者が有意に多かった。これら結果等から,特別支援学校管理に関する科目群,特別支援学校教育課程・授業開発に関する科目群,学校経営に関する科目群,特別支援学校管理職臨床実習群からなるモデルを構築した。平成28年4月に,3年次計画の初年度に実施した質問紙調査の回答データを心理学統計にて処理できるようにデータ加工を行う。そして,平成28年5月からデータを分析し,マネジメント力を有する特別支援学校の管理職の職能に関する特別支援学校管理職,ミドルリーダーの課題意識等について検討を加える。さらに,分析検討の妥当性を高めるため,平成28年9月に日本特殊教育学会第54回年次大会でポスター発表,平成28年8月に日本発達障害学会第51回年次大会,平成28年10月に日本教育心理学会第58回年次大会で資料収集を行う。岐阜大学教育学研究科教職実践開発専攻(教職大学院)において,本研究課題での検討結果を反映させたカリキュラムを平成29年度入学生から適用しており,実際に運用し,その成果と課題を分析して,研究課題の解決を行う。そして,その成果を学会発表,報告書送付等にて社会に還元していく。特別支援教育学初年次で行った調査の回答データの一次処理(粗集計)の結果をみて,二年次で行う統計分析に使用する統計処理ソフト(SPSSの追加ソフト等)を検討・購入するため2年次に行った実習科目の一部試行の成果を踏まえ,3年次に講義科目において特別講師を招聘する計画を新たに立案したことにともなう経費を次年度の繰り越した。SPSS追加ソフト等の統計処理ソフトを購入する科目「特別支援学校教育課程の理論と実践」における特別講師の旅費等に使用する。
Co-stimulatory相互作用を介した免疫反応の正と負の制御

1)セマフォリン分子CD100のT細胞活性化における役割:CD100欠損マウスにおいては、抗原特異的T細胞の出現が有意に低下しており、実験的自己免疫性脳脊髄の発症も有意に低下していた。可溶性CD100は、抗CD40抗体による骨髄由来樹状細胞のIL-2産生誘導や補助刺激分子、クラスII分子発現誘導を著明に増強した。一方、CD100欠損樹状細胞の抗CD40抗体や、LPSに対する反応性波有意に低下していた。以上の結果から、CD100とその受容体CD72を介したT細胞と抗原提示細胞の相互作用がT細胞の活性化に重要であることが明らかになった。2)樹状細胞上に発現するSema4Aの機能:樹状細胞からSema4Aを単離し、そのリコンビナント可溶性分子やモノクローナル抗体を作成した。Sema4Aは樹状細胞やB細胞に恒常的に発現するが、休止期のT細胞には発現していないことがわかった。リコンビナント可溶性Sema4Aは試験管内におけるT細胞の増殖や、エフェクター細胞への分化を有意に亢進した。また、抗Sema4A抗体はMOG誘導性の実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症をも抑えた。すなわちSema4Aは、T細胞の活性化分化に必須の分子であることが明らかになった。3)T細胞上に発現するSema4A受容体の同定:T細胞株から、Timファミリーに属するTim2をSema4A結合タンパクとして単離した。可溶性Sema4AはTim2発現細胞には結合したが、Timファイミリーの他のメンバーを発現する細胞には結合しなかった。さらに、Tim2発現細胞を可溶性Sema4Aで刺激すると数分以内にTim2の細胞内領域のチロシンリン酸化が誘導された。これらの結果から、Tim2はSema4Aの活性化シグナルをT細胞に伝達していると考えられる。研究実績の概要1.セマフォリン分子CD100のT細胞活性化における役割を解析した。CD100欠損マウスに蛋白抗原やMOG(ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク)由来ペプチドを免疫しても、抗原特異的T細胞の出現が有意に低下しており、MOGペプチドを免疫したマウスでの自己免疫性脳脊髄の発症も有意に低下していた。さらに、抗CD72抗体はこれらの可溶性CD100の作用をミミックすることが明らかになった。また、CD100欠損樹状細胞の抗CD40抗体や、LPSに対する反応性も、野生型マウス由来の樹状細胞に比して低下していた。2.マウス樹状細胞から、新たなセマフォリンSema4Aをクローニングし、そのリコンビナント可溶性分子およびモノクローナル抗体を作成した。抗Sema4A抗体を用いた解析から、Sema4Aは樹状細胞に多く発現するが、T細胞には発現しないことが明らかになった。また、種々の細胞への可溶性Sema4Aの結合解析から、Sema4A受容体が活性化T細胞上に発現していることが明らかになった。

可溶性Sema4Aは抗CD3抗体で誘導されるT細胞の活性化や、試験管内におけるTh1、Th2細胞への分化を有意に増強するとともに、Sema4Aをin vivoに投与した場合も抗原特異的Th1、Th2の誘導を促進した。さらに、抗Sema4A抗体は、MOGペプチドで誘導されるEAEの発症をも阻止することが明らかになった。以上の結果から、Sema4AはT細胞-樹状細胞相互作用において樹状細胞からT細胞への刺激を伝達する分子と考えられた。1)樹状細胞上に発現するクラス4セマフォリンSema4Aを単離し、そのリコンビナント可溶性分子や抗sema4Aモノクローナル抗体を作成した。抗Sema4Aを用いたフローサイトメトリー解析から、Sema4Aは樹状細胞やB細胞に恒常的に発現するが、休止期のT細胞には発現していないことがわかった。リコンビナント可溶性Sema4Aは抗CD3抗体と抗CD28抗体によるT細胞の増殖や、エフェクター細胞への分化を有意に亢進した。また、抗Sema4A抗体はin vitroのMLR反応を抑制するとともに、in vivoに投与した場合も抗原特異的T細胞の出現を阻害するだけでなくMOG誘導性の実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症をも抑えた。すなわちSema4Aは、T細胞の活性化分化に必須の分子であることが明らかになった。2)種々の細胞に対するリコンビナント可溶性Sema4Aの結合を解析したところ、活性化T細胞とEL-4などのT細胞株の表面に、Sema4A受容体が発現していることが明らかとなった。次に、EL-4細胞から発現型cDNAライブラリーを作成し、発現クローニングを行い、Timファミリーに属するTim2をSema4A結合タンパクとして単離した。可溶性Sema4AはTim2発現細胞には結合したが、Timファミリーの他のメンバーを発現する細胞には結合しなかった。また、可溶性Tim2と可溶性Sema4Aの分子間結合も表面プラズモン共鳴法を用いて確認した。さらに、Tim2発現細胞を可溶性Sema4Aで刺激すると数分以内にTim2の細胞内領域のチロシンリン酸化が誘導された。これらの結果から、Tim2はSema4Aの活性化シグナルをT細胞に伝達していると考えられる。
間質性膀胱炎モデルにおける膀胱イメージング

GFP陽性の骨髄細胞を移植したキメララットを用いて、膀胱炎モデルにおける骨髄由来細胞の役割について検討を行ったが、骨髄由来細胞の膀胱への遊走は認めるものの、膀胱組織細胞への分化は認められなかった。続いて、ルシフェラーゼアッセイによる測定法、フローサイトメトリーによるEGFPシグナルの測定法用いたNF-KB活性の定量を行うためにNF-KB Tgマウスの作成を行ったが、安定した結果が得られず、十分な成果が得られなかった。一方、下部尿路閉塞モデルでは、下部尿路閉塞後の膀胱の末期の状態としての膀胱壁の線維化においてもIL-1βが役割を担う可能性が考えられた。今後のさらなる検討が必要である。間質性膀胱炎は、頻尿、尿意切迫感、蓄尿時の恥骨上部の痛みを主症状とする症候群の原因疾患のひとつであり、膀胱の非特異的な慢性炎症を有しているが、根治的な治療法はいまだなく治療に難渋するケースも少なくない。本研究では、NF-kB活性レベルをイメージングによって測定可能なモデルを作製し、間質性膀胱炎モデルにおける様々な薬剤効果の評価をリアルタイムに行うことを目的としている。膀胱上皮における生理的な細胞外からの刺激に対するNF-KBシグナル変化の検出するために、NF-KB Tgマウスの膀胱を摘出し膀胱上皮を培養・継代し、NF-KBシグナル経路を活性化するリポポリサッカライドで刺激を行い、ルシフェラーゼアッセイによる測定法、フローサイトメトリーによるEGFPシグナルの測定法用いてNF-KB活性の定量を行う予定であった。現在、膀胱上皮の初代培養を行っているが、現段階ではNF-KB Tgマウスでの安定した尿路上皮の培養を行うことができていない。そのため、シグナルの測定法用いて再現性のあるNF-KB活性の測定ができていない。今後、膀胱上皮の初代培養の精度をあげて再現性のあるNF-KB活性の定量を行う予定である。2化学刺激によって誘発された膀胱炎のイメージング塩酸による膀胱炎モデルを作製し、紫外線照射によるGFPの蛍光、または腹腔内へのルシフェリンを注射する事による発光を利用して、in vivoイメージング装置を用いて膀胱におけるNF-KB活性シグナルの変化を体外から観察し、定量化する予定であった。現段階では、in vivoでの発光が不十分でin vivoイメージング装置によるNF-KB活性シグナルの定量が十分に行えていない。今後はより発光シグナルの強いマウスを作製し、また測定方法を改良することで再度検討を行う予定である。間質性膀胱炎は膀胱内への尿の貯留に伴う強い膀胱痛を来す疾患であるが、その発生機序は不明な点が多い。まず、GFP陽性の骨髄細胞を移植したキメララットを用いて、塩酸による膀胱炎モデルを作製し、膀胱炎モデルにおける骨髄由来細胞の役割について検討した。膀胱炎モデルでは、骨髄由来細胞の膀胱への遊走は認めるものの、膀胱組織細胞への分化は認められなかった。以前の検討から、骨髄由来細胞の膀胱への遊走にはSDF-1などのサイトカインが関与しているものと考えられた。一方、下部尿路機能障害のモデルの一つである下部尿路閉塞モデルと用いて、代表的な急性期の炎症性サイトカインであるIL-1βが下部尿路閉塞後の膀胱の形態学的・機能的変化に関与について、IL-1βノックアウトマウスを用いて検討した。下部尿路閉塞膀胱ではIL-1βがIGF-1発現亢進を通して膀胱平滑筋の過形成に関わっており、膀胱機能検査においても膀胱容量や排尿時圧といった尿流動態のパラメータに変化を及ぼすことが明らかになった。また、IL-1βはTGF- βの発現を亢進させており、TGF-βは後述するように臓器の線維化にかかわる成長因子であることから、下部尿路閉塞後の膀胱の末期の状態としての膀胱壁の線維化においてもIL-1βが役割を担う可能性が考えられた。以上より、本来の目的であった膀胱炎の状態をNF-KB活性レベルを検出する膀胱イメージングによってリアルタイムに観察することができなかった。間質性膀胱炎は、頻尿、尿意切迫感、蓄尿時の恥骨上部の痛みを主症状とする症候群の原因疾患の一つであり、膀胱の非特異的な慢性炎症を有しているが、根治的な治療法はいまだなく治療に難渋するケースも少なくない。(1) NF-kBTgマウス膀胱上皮におけるNF-kBシグナル

活性:膀胱上皮における生理的な細胞外からの刺激に対するNF-KBシグナル変化の検出するために、NF-KB Tgマウスの膀胱を摘出し膀胱上皮を培養・継代し、NF-KBシグナル経路を活性化する刺激である腫瘍壊死因子、リポポリサッカライド、Substance Pで刺激を行い、ルシフェラーゼアッセイによる測定法、フローサイトメトリーによるEGFPシグナルの測定法用いてNF-KB活性の定量を行う予定であった。膀胱上皮の初代培養を行っているが、現段階では安定した尿路上皮の培養を行うことができず、シグナルの測定法用いて再現性のあるNF-KB活性の測定ができていない。今後、膀胱上皮の初代培養の精度をあげて再現性のあるNF-KB活性の定量を行う予定である。(2)化学刺激によって誘発された膀胱炎のイメージング:塩酸及びサイクロフォスファミドによる膀胱炎モデルを作製し、紫外線照射によるGFPの蛍光、または腹腔内へのルシフェリンを注射する事による発光を利用して、in vivoイメージング装置を用いて膀胱におけるNF-KB活性シグナルの変化を体外から観察し、定量化する予定であった。現段階では、in vivoでの発光が不十分でin vivoイメージング装置によるるNF-KB活性シグナルの定量が十分に行えていない。今後はより発光シグナルの強いマウスを作製し、再度検討を行う予定である。おおむね予定通りに進捗している。安定した膀胱上皮の初代培養が不十分である。NF-kBTgマウスの刺激に対する発光が不十分であり、定量化を行うことができない。膀胱炎のイメージングによる薬剤治療効果の評価を行う。NF-kBTgマウスに間質性膀胱炎に有効であると考えられる薬剤を投与した後に、昨年度の実験と同様に塩酸または際サイクロフォスファミドを投与し、代謝ケージによる排尿状態、GFPによる蛍光、ルシフェリンによる発光を用いて膀胱におけるNF-kB活性シグナルを経時的に観察する。使用する薬剤としては、すでに我々の研究室で効果があったNK1受容体阻害薬、NMDA受容体阻害薬、PDE-4阻害薬などが上げられるが、そのほかにも数多くの薬剤の効果が文献上確認されており、それらの薬剤も同様に検討する。薬剤投与によって、塩酸、サイクロフォスファミドで誘発された膀胱の炎症は抑制されることから、NF-kB活性シグナルも減少すると考えられる。膀胱上皮の培養については、他施設の培養法を参考にして、新しい培養法を試みる。より精度の高い発光をすることができるようにNF-kB Tgマウスに改良し、作製する。該当なし
ヒト子宮および腎臓の発生に協調的に関与する遺伝子群の変異/欠損の同定

本研究では遺伝子解析の方法として次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンスを行う予定としている。全ゲノムシーケンスでは、予期していなかった情報を得る可能性がある。遺伝子情報は重要な個人情報であり、研究を進めるための倫理審査に向けた準備を慎重に行っている。また熊本大学病院産科・婦人科および連携研究機関である熊本中央病院小児科において、子宮に形態異常が認められる症例の抽出・収集および家系図作成を進めている。症例に対しては研究責任者が個々に問診を追加し、研究の趣旨の説明を行い、十分な理解と同意を得ていく必要がある。研究では遺伝子情報を扱うため、その漏出等には十分に注意する必要があるとともに、症例から遺伝カウンセリング等の希望があった場合に対応するための体制について検討している。また本研究に付帯する臨床研究として、熊本大学病院産科において妊娠・分娩管理を行った子宮に形態異常が認められる症例の転帰の解析を行っており、本研究に合わせて報告するべく準備を進めている。本研究では、熊本大学病院産科・婦人科および連携研究機関である熊本中央病院小児科において症例の集積を進めている。しかしながら、担当者に異動が生じたために、研究が十分に進捗しなかった。また、症例の抽出・収集および家系図作成を研究責任者が担当していたが、外来受診時における担当者の異動があり、症例の収集の機会を逸することがあり、症例を確実に収集できる体制の構築が不十分であった。さらに、本研究は遺伝子解析を伴っているため、倫理的に十分に配慮する必要があり、時間をかけて準備を行っている。研究責任者が熊本大学病院産科・婦人科において症例を確実に収集できる体制を構築し、家系図の作成および研究に関する説明を行い、同意取得を行っていく。外部委託機関で全ゲノムシーケンスを行う場合には複数の検体を採取してから依頼する必要があるため、スケジュールを検討していく。熊本中央病院小児科と連携して行ってきた先行研究を投稿を完了し、熊本大学病院産科・婦人科における臨床研究の結果も加えて本研究の意義を高めていく。また熊本大学医学部付属病院産科・婦人科および連携研究機関である熊本中央病院小児科において、子宮に形態異常が認められる症例の抽出・収集および家系図作成を進めている。さらに本研究に先行して熊本中央病院小児科と連携して行ってきた尿路発生異常に伴う子宮奇形の頻度に関する研究について、更なる症例の収集が進んだために、解析を加えて報告する準備を行ってきた。研究では、片側腎欠損や腎低形成などの尿路発生異常が認められる症例18例中11例(61%)に子宮低形成や双角子宮などの子宮奇形が認められた。本研究では、熊本大学医学部附属病院産科・婦人科および連携研究機関である熊本中央病院小児科において症例の集積を進めている。しかしながら、担当者に異動が生じたために一時的に連携が十分に取れていない時期があり、研究が十分に進捗しなかった。また、症例の抽出・収集および家系図作成を研究責任者が担当していたが、外来受診時における担当者は別にいたため、症例の収集の機会を逸することがあった。研究責任者が熊本大学医学部附属病院産科・婦人科において症例を確実に収集できる体制を構築し、家系図の作成および研究に関する説明を行い、同意取得を行っていく。

外部委託機関で全ゲノムシーケンスを行う場合には複数の検体を採取してから依頼する必要があるため、スケジュールを検討していく。現在進めている倫理審査の申請を速やかに終了し、遺伝カウンセリング体制の構築も合わせて行う。熊本中央病院小児科と連携して行ってきた先行研究を投稿を完了し、本研究の意義を高めていく。研究責任者が熊本大学病院産科・婦人科において症例を確実に収集できる体制を構築し、家系図の作成および研究に関する説明を行い、同意取得を行っていく。熊本中央病院小児科と連携して行ってきた先行研究を投稿を完了し、熊本大学病院産科・婦人科における臨床研究の結果も加えて本研究の意義を高めていく。研究の進捗状況が遅れており、遺伝子解析への提出ができていない。実験の準備のための物品の用意に予算を用いており、ゲノムシーケンスはまだ動いていないため、次年度使用額が生じた。繰越金と次年度の助成金を用いて、ゲノムシーケンスを進めていく。
電子移動制御に基づく長波長応答性がん選択的光増感剤の創成

がん細胞選択的に治療効果を示す光増感剤を創成することを目標に研究を進めた。光増感剤の注射と内視鏡による可視光照射でがんを治療する光線力学的療法は、活性酸素によるがん細胞の酸化を原理としているため、低酸素状態のがんには効果が限られている。そこで、酸素がなくても電子移動で酸化ダメージを与える光増感剤を設計し、メソ位のベンゼン環をメトキシ基で置換したポルフィリンのリン錯体を合成した。およそ650 nmの可視光照射でタンパク質のアミノ酸残基を電子移動で酸化損傷することを確認した。また、ヒト皮膚由来の培養細胞には、ほとんど光毒性を示さず、ヒト子宮頚部がんと肺がんに由来する細胞には、顕著な光毒性を示した。さらに、動物実験でも従来薬以上の抗腫瘍効果を確認した。昨年度、これらのポルフィリンの置換基を替えたポルフィリンを合成し、吸収波長と酸化還元電位(光酸化力)との関係を実験で明らかにした。また、軸配位子にエトキシ基をもつポルフィリンとそのフッ素導入化合物の自己凝集を利用したがん細胞選択性の制御を分光学的測定とタンパク質の光酸化損傷の評価で明らかにした。引き続き、上記リンポルフィリンとカチオン性のフリーベースポルフィリンに電子ドナーを導入し、pHで活性制御可能となる光増感剤を設計・合成した。がん細胞内は、正常細胞内よりもわずかに酸性(低pH)であることを利用し、がん選択性を実現するアプローチである。昨年度合成した光増感剤では、実際のがん細胞と正常細胞の境界に近いpH 57付近で活性酸素生成作用や電子移動を引き起す作用を制御できることを励起状態の寿命測定、一重項酸素由来の発光測定で明らかにした。これらのポルフィリンでは、高pH(中性付近)において、分子内電子移動による励起状態の失活が完全ではないが、電子移動速度定数や量子収率等の今後につながる物理化学的な物性値を明らかにできた。本研究の目的は、長波長可視光を吸収し、低酸素でも有効な電子移動で作用するがん光線力学的療法用光増感剤の創成である。昨年度、培養細胞におけるがん細胞選択性と、マウスを用いた実験で従来薬以上の抗腫瘍効果を示す光増感剤を報告した。当該年度、そのポルフィリン光増感剤を基に新たな光増感剤を合成し、自己凝集により活性がOFFとなり、ターゲットとなるタンパク質に結合すると活性をONにできることを明らかにした。また、これらの光増感剤は、ヒトの皮膚に由来する不死化細胞(正常細胞モデル)に対し、暗所毒性を示さず、光照射下でのみ細胞毒性を示すことを明らかにした。この光毒性のメカニズムは、細胞内DNA損傷ではないため、正常細胞をがん化する可能性は低く、安全性が期待される。さらに、リンポルフィリンの吸収波長と酸化還元電位における置換基効果、ポルフィリン多量体の物性を分光学および電気化学的測定で評価し、今後につながる分子設計の指針を得た。また、引き続き、電子ドナーを結合したポルフィリン光増感剤の改良型を合成し、がん細胞内のわずかな低pH環境を利用した活性制御を検討した。フリーベース型ポルフィリンでは、pH 5付近での活性制御が可能なことを確認し、リンポルフィリンでは、pH 7付近での活性制御を確認した。いずれも電子移動を利用した活性のOFF→ON制御であり、がん細胞内のpH付近で活性制御が可能となる原理を確認できた。しかし、中性領域でも活性が完全にOFFにすることができず、今後、電子移動を利用した励起状態の完全な失活を目指して研究する必要がある。本研究の最終的な目標に向かって得られた成果は、査読付き論文や著書、学会で発表し、順調な進捗状況といえる。現在、電子移動を利用した活性制御では改良の余地があり、以上の成果は、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。今後の目標は、さらに長波長域の可視光に応答して電子移動機構で作用する、より治療効果が高い光増感剤を創成することである。さらに、腫瘍(がん)選択性を向上した光増感剤を開発する。昨年度までの研究で、リンポルフィリンの置換基による、吸収波長と光酸化力への効果を明らかにした。そこで、現在までの知見で最も長波長に応答し、電子移動酸化が可能と考えられるリンポルフィリン誘導体とカチオン性のフリーベースポルフィリンを基にして、活性制御を研究する。また、基礎研究のため、ハロゲンを導入した亜鉛ポルフィリンを合成し評価する。昨年度、単量体だけでなく、がん細胞への取込促進が期待できる三量体や五量体を合成したが、励起状態の短寿命化が課題であった。長寿命化が期待できる二量体と三量体の設計を進めており、今年度合成する。また、積極的ながん選択性実現のため、pH応答性を利用した活性制御を引き続き推進する。これまでの研究で、電子ドナーを利用した活性制御を試みてきた。活性が切り替わるpHは、順調に制御できているが、活性のOFFの状態が不完全なため、さらに分子内電子移動を促進して効率的に消光できる電子ドナーの導入を行う。そこで、電子ドナーには、これまでのピリジンに替え、置換基をもつピリジンやアニリン誘導体を利用する。昨年度、計算機シミュレーションによる物性予測を高精度で行えるようにしており、これを活用して効率的に設計を進める。合成した光増感剤の評価は、タンパク質の酸化損傷、酵素活性の失活評価や活性酸素の定量を中心に行う。

昨年度までと同様に、分子レベルで優れた作用を確認できた光増感剤は、培養細胞レベルで評価する。細胞レベルでは、活性制御を決める因子が複雑になるため、基礎物性との相関の解析やシミュレーションによる研究も併用する。これらの研究で、効果が確認できた光増感剤を用い、動物実験による評価へつなげる。がん細胞選択的に長波長可視光照射で治療効果を示す光増感剤を創成することを目標に研究を進めた。光増感剤の注射と内視鏡による可視光照射でがんを治療する光線力学的療法は、活性酸素によるがん細胞の酸化を原理としているため、低酸素状態のがんには効果が限られている。そこで、酸素がなくても電子移動で酸化ダメージを与える光増感剤を設計し、メソ位をメトキシ基で置換したポルフィリンのリン錯体を設計し、合成した。その内、3種類は臨床応用で必要な波長630 nm以上を吸収し、およそ650 nmの可視光照射下でタンパク質のアミノ酸残基を酸化損傷することを確認した。そのメカニズムを分光学的に解析し、ほぼ電子移動のみで作用していることを確認した。培養細胞レベルの実験では、ヒト皮膚由来の正常細胞モデルに対して、ほとんど光毒性を示さなかったが、ヒト子宮頚部がんと肺がんに由来する細胞には、顕著な光毒性を示した。また、子宮頚部がんに由来する腫瘍をマウス皮膚に移植し、これらの光増感剤の効果を評価した。内一つの光増感剤は、比較的速やかに排出され、正常組織と腫瘍組織との差別化が3倍以上であった。また、可視光照射による抗腫瘍作用は、従来の光増感剤タラポルフィンナトリウムによりも優れた作用を確認した。同様の光増感剤を用いて、酵素活性を阻害することを明らかにした。そのメカニズムには、本研究の目標としている電子移動が主に寄与していることを証明した。また、上記ポルフィリンをベースにpHで活性制御可能となる光増感剤を設計、合成した。がん細胞内は、正常細胞内よりもわずかに酸性(低pH)であることを利用し、がん選択性を実現するアプローチである。合成した光増感剤の光化学的物性評価により、活性酸素生成作用や電子移動を引き起す作用は、pHで制御できることを明らかにした。本研究の目的は、長波長可視光を吸収して電子移動で作用するがんの光線力学的療法用光増感剤の創成である。最終的には、副作用なく、従来よりも高い腫瘍選択性(がん細胞選択性)をもち、効率的に治療可能な光増感剤の開発を目標とする。まず、これまでに合成したリンポルフィリン誘導体の光増感剤は、臨床で要求される波長630 nm以上の可視光を吸収して、およそ目標の波長となる650 nm程度でも応答でき、電子移動でタンパク質の光酸化作用を示した。当該年度に合成した光増感剤の研究により、目標となる波長を決める因子が明らかとなり、まず必要となる波長の目標は、ほぼ達成できたといえる。続いて、これらの中で3種類の光増感剤は、ヒトの皮膚に由来する不死化細胞(正常細胞モデル)には、ほとんど光毒性を示さなかったが、がん細胞モデルとなる子宮頚部がんと肺がん由来の培養細胞には、顕著な光毒性作用を示した。特に、一つの光増感剤(ポルフィリンの中心リン原子にメトキシ基を結合したタイプ)では、子宮頚部がん細胞に対する半致死量が極めて小さくナノモル/リットルのオーダーであった。このようにがん細胞選択的に、極めて低濃度で作用することを証明できた結果は、予定以上の成果といえる。
Telomeraseによる口腔領域前癌病変の早期評価と治療への応用の検討

口腔粘膜上皮に発生する前癌病変、特に白板症・紅板症等に注目しTelomerase活性と関連遺伝子などを調べ組織学的所見と対比して良・悪性の境界病変の判定にどのように役たつか検討した。またTelomeraseを標的したそれら前癌病変の治療の可能性を検索した。ヒト口腔領域原発の前癌病変組織において、(1)Telomerase活性の有無と発現強度を調べた。(2)Telomerase関連遺伝子の(hTERT遺伝子など)発現を見た。(3)In situ PCRによるTelomerase活性の微量検出法を試みた。(4)アポトーシス関連遺伝子(p53遺伝子・bcl-2遺伝子)の発現を見た。病理組織学的診断と対比することより、口腔領域に発生する前癌病変の良・悪性の早期診断に役立つものはどれかを、明らかにした。1)生検および手術にて得られた口腔領域の前癌病変組織を、病理組織学的に判定した。2)同時に採取した各新鮮組織よりDNA・RNAを抽出し、また核抽出液も作製した。これを用いて、(a)Telomere長TRFをサザンブロット法にて測定した。(c)PCR-プライマーエクステンションによるTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay法でTelomerase活性を測定するしたitu TRAP法を行いTelomerase活性の細胞レベルでの発現の有無を調べた。口腔領域白板症・紅板症等においてTelomerase活性と組織学的所見と対比して良・悪性の境界病変の判定に有用で早期前癌病変の治療への可能性が期待できる事を示唆した。我々は口腔癌において癌に特異的にTelomerase活性が認められることをすでに報告してきた、口腔粘膜上皮に発生する前癌病変、特に白板症・紅板症等に注目しTelomerase活性と関連遺伝子などを調べ組織学的所見と対比して良・悪性の境界病変の判定にどのように役たつか検討する。またTelomeraseを標的したそれら前癌病変の治療の可能性を検討する。ヒト口腔領域原発の前癌病変組織において、1.生検および手術にて得られた口腔領域の前癌病変組織を、病理組織学的に判定した。2.同時に採取した各新鮮組織よりDNA・RNAを抽出し、また核抽出液も作製した。4.免疫組織染色やフローサイトメトリーにより細胞増殖率や細胞周期を測定した。5.口腔腫瘍細胞を用いてTelomerase逆転写酵素阻害剤(AZTなど)やアンチセンス(TERT発現ベクターの変異導入など)の細胞内導入を試み、細胞増殖やTelomerase活性の発現の変化を検討した。
分子生物学的手法に基づく新規骨形成誘導剤・遺伝子治療の開発と骨再生システムの確立

1.マウス臨界骨欠損モデルの確立マウス頭蓋部に直径4mmの円形骨欠損を作製し、放射線学的(X線写真・CT)に6ヶ月まで経時的に観察し、その自然経過に関する基礎データを蓄積した。術後2ヶ月より、欠損辺縁部から少量の骨形成を認めたことから、術後2ヶ月以内であれば本モデルは臨界骨欠損モデルとして利用できることが示唆された。2.細胞シート工学を利用した再生骨移植法の検討caALK6+Runx2をマウス背部より分離・培養した皮膚線維芽細胞に導入し、アテロコラーゲン膜・PLGAといった足場材料上に播種して培養した。導入後玉週間で石灰化と骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現上昇が認められたことから、これらの細胞が足場材料上で骨様組織を形成したことが示唆された。次にマウス頭蓋部に直径4mmの円形臨界骨欠損を作製し、上記の骨様細胞シートを欠損部へ移植したところ術後4週で骨再生が認められた(Ohba S. et al. FASEBJ, in press)。3.新規骨形成誘導剤・人工ウィルス遺伝子治療による生体内骨再生・骨修復療法の検討新規骨形成誘導剤としてヘリオキサンチン誘導体を同定した(Ohba S. et al. Biochem Biophys ResCommun, in press)。本剤をα形リン酸3カルシウムに混和して局所投与用製剤を作製し骨欠損モデルマウスに移植してその治療効果を判定したところ、術後7週で骨再生が認められた(投稿準備中)。さらに、caALK6+Runx2の遺伝子導入用人工ウィルスをα形リン酸3カルシウムに混和して骨欠損モデルマウスに移植したところ、術後4週で骨再生が認められた(投稿中)。1.最小かつ十分な骨芽細胞分化シグナルユニットの絞り込みとその分子メカニズムの解明BMPシグナル、Hhシグナル、Runx2シグナル、Wntシグナル、IGF-1シグナルをそれぞれ活性化あるいは抑制する遺伝子を持つ10種のアデノウィルスベクターの全組合せをCol1GFP-ES細胞に導入し、GFPの蛍光発色を指標に1週間以内に骨芽細胞分化を誘導するシグナルのスクリーニングを行った。その結果、BMPシグナルとRunx2シグナルを活性化した組合せ(caALK6+Runx2)が上記の条件を満たす最小の組合せであった。更に、caALK6+Runx2は幹細胞のみならずヒト線維芽細胞等の終末分化成体細胞をも骨芽細胞に分化させることが確認された。またその作用機序としてはRunx2によるCbfb(Runx2の転写共役因子)の安定化とBMPシグナルによるRunx2-Cbfb複合体の形成促進及び複合体のDNAへの結合促進を介することが明らかとなった。さらに、BMP2・BMP6ダブルノックアウトマウスの解析からBMP2・BMP6が骨発生に関与することが確認された。2.最小シグナルユニットを活性化する合成低分子化合物・天然低分子化合物の検索合成低分子化合物・天然低分子化合物ライブラリーのスクリーニングの準備段階として、Col1GFPを有する2つの細胞株(Col1GFP-C3H10T1/2,Col1GFP-MC3T3E1)を樹立した。また、兔疫抑制剤として市販されているFK506が骨芽細胞分化促進作用を有することも明らかとなった。3.人工ウィルスによる遺伝子導入法の開発caALK6+Runx2を人工ウィルス(PEG-DET)によりマウス初代骨芽細胞へ導入したところ、in vitroで骨芽細胞分化が誘導された。
マクロファージにおけるp27kip発現調機序の解明と動脈硬化症発症における意義

マクロファージ(Mφ)特異的にサイクリン依存性キナーゼ阻害因子p27kipを発現するMφ特異的増殖抑制マウス(Tgマウス)を作成した。TgマウスにApoEKOマウスを交配し、動脈硬化病変の発症・進展を検討した。Mφ増殖抑制により大動脈弁輪部におけるプラークおよびネクローシス面積割合が減少、プラーク内のコラーゲン含有量低下抑制、Fibrous Cap菲薄化抑制を認めた。また大動脈弁輪部プラーク及び頚部胸部大動脈における炎症性サイトカインのmRNA発現の減少を認めた。以上よりMφ増殖能のみを抑制したマウスを用いて動脈硬化症発症・進展におけるMφ増殖の直接的で病態生理学的な意義を評価できた。各種増殖誘導刺激によるSkp2発現およびSkp2活性の定量をおこなった。細胞はマウス腹腔マクロファージ(Mφ)および骨髄由来Mφを用いた。増殖誘導刺激(Ox-LDL、GM-CSF)によるSkp2発現およびp27kipの発現、Mφ増殖能との関連を解析した。1細胞増殖の評価を、[3H]チミジン取り込み法、細胞数算定法を用いて行った2細胞周期の評価を、Propidium iodideを用いたFlow cytometry法で行った。3Skp2の発現をタンパクレベル(western blot法)とmRNAレベルで定量化を行った。4p27kipの発現をタンパクレベル(western blot法)とmRNAレベルで定量化を行った。動脈硬化モデルマウスの動脈硬化巣でのp27kipおよびSkp2の発現評価をするために、1動脈硬化モデルマウス(アポE欠損マウス)の大動脈弁輪部の組織薄切切片及び大動脈全体をenfaceした組織サンプルをOil-red O染色し粥状動脈硬化病変のサイズを定量化を行った。2大動脈弁輪部の連続切片を用いてMφの表面抗原マーカー(CD11b)と細胞増殖のマーカー(PCNA)およびp27kip抗体Skp2抗体で多重免疫染色を行い増殖細胞と一致の程度を評価した。マクロファージ特異的Skp2トランスジェニック(mac-Skp2TG)マウスを作成する計画に関しては、ヒトスカベンジャー受容体のプロモーター下にSkp2を配したコンストラクトベクターの作成まで終了している。スカベンジャー受容体のプロモーター制御下にサイクリン依存性キナーゼ阻害因子p27kipを発現するマクロファージ特異的増殖抑制マウスを作製し、GM-CSFやOxLDLをマクロファージ特異的増殖抑制マウスの腹腔マクロファージに投与し、腹腔マクロファージの増殖効果を評価した。Cell counting assayを使用し、GM-CSF及びOxLDL投与後のTg群の方が有意に増殖抑制されていることを確認した。また、このマウスの骨髄マクロファージにLPSを加え、それに対する炎症サイトカインの反応を観察したが、IL-6、MCP-1ともに有意差を認めず、増殖抑制で炎症サイトカインが変化するわけではないことが確認された。次に動脈硬化へのマクロファージ増殖の影響を評価するため、マクロファージ特異的増殖抑制マウスに動脈硬化モデルマウスであるApoEKOマウスを交配し、動脈硬化病変の発症・進展を検討した。マクロファージ増殖抑制により、16週齢及び20週齢、24週齢ApoE-/-マウスの大動脈弁輪部におけるプラーク面積が減少した。20週齢と24週齢ApoE-/-マウスにおける大動脈弁輪部プラークのネクローシス面積割合が減少した。マクロファージ増殖抑制により、プラーク内のマクロファージ減少をmRNA発現及び免疫染色にて認めた。マクロファージ増殖抑制により、プラーク内のコラーゲン含有量低下の抑制、及びFibrous Cap菲薄化の抑制傾向を認めた。大動脈弁輪部プラーク及び頚部胸部大動脈における炎症性サイトカインのmRNA発現が減少した。以上の研究によりマクロファージの基本性質(単球数、遊走能、接着因子、炎症活性)は変えず、直接的にマクロファージ増殖能のみを抑制することで、動脈硬化へのマクロファージ増殖の病態生理学的な意義を評価できたと考える。予定通りマクロファージ特異的Skp2トランスジェニック(mac-Skp2TG)マウスを作成する。mac-Skp2TGマウスとアポE欠損マウスと交配しmac-Skp2TG・アポE欠損マウスを作成し、動脈硬化モデルマウス(アポE欠損マウス)の大動脈弁輪部の組織薄切切片及び大動脈全体をenfaceした組織サンプルをOil-red O染色し粥状動脈硬化病変のサイズを定量化し、比較検討する。医歯薬学ほぼ予定通りの支出があったが物品の節約などにより残額が生じたもの。

消耗品費として、引き続き培養細胞の確立・維持のための細胞培養液・細胞調節液、Western blot用の各種抗体や試薬、mRNA抽出用試薬、Real-time RT-PCR用試薬、ELISA用の各種抗体や試薬などに使用予定。
東アジア言語の破裂音の相互類似性と言語習得への干渉

日本語・北京語・上海語・韓国語について、MRIやEGGなどの分析尺度で、東アジア言語の破裂音の相互類似性について分析した。MRIの結果、日本語の有声破裂音及び韓国語の語中の平音には、声帯振動時の開口度や持続時間に類似性が観察された。また、韓国語の濃音、北京語の無声無気音、日本語の無声破裂音に、声帯振動を早く終了させて声帯の動きを停止させる傾向が観察された。EGG分析においても、日本語、上海語の有声破裂音、韓国語の平音に、声帯接触による振動が見られるなど類似性がうかがわれた。東アジアの言語を母語とする日本語学習者は共通して破裂音の習得が困難である。特に日本語の無声破裂音は、破裂音の立つ位置によつて中国人日本語学習者および韓国人学習者には有声破裂音と誤聴される。その誤聴はなぜ起きるのか、これまでの習得研究の成果により日本語の無声破裂音がその鍵を握ると思われる。本研究では、日本語話者の無声破裂音、中国語話者の無声無気音、韓国語話者の濃音の喉頭筋電図、MRIの実験データを採取し、各言語の破裂音の特徴を調べるとともに、特に第2言語習得に言語干渉を及ぼす言語音間の類似性を探ることを目的としている。初年度は、先ず(株)国際電気通信基礎技術研究所ATR脳活動イメージセンターに申請し、MRIの使用許可を得た。次に、先行研究を収集し、実験における調査項目をリストアップした。東京を方言とする日本語話者男性2名、上海出身の上海語話者男性1名女性3名、北京出身の北京語話者男性2名、ソウル出身の韓国語話者男性2名に実験協力を仰いだ。そのうち実験に適性のある被験者を同研究所で実験を行ない、音声および画像によるデータを得ることができた。今後、追加実験を行なっていく予定である。平成19年度は,昨年度に引き続き(A)MRIを使ったデータを収集するために,倫理委員会の再申請を経て実験を行なった。昨年度上海語と東京語話者の良好と思われるデータが得られなかったため,再度別の被験者を探し,MRI実験を行った。その結果良好なデータが得られ,現在分析を行っている。(B)の喉頭筋電図の実験は,実験協力者の協力の下に本学および実験校での倫理委員会による審査を経て実験を行った。許可を得るまでに時間がかかったにもかかわらず,被験者に1名実験当日辞退者が出たため,本年度の実験は来年度再度行うこととなった。研究成果としては,三重大学紀要に「韓国人日本語学習者のアクセント習得における母語干渉」というテーマで論文を書き,語頭破裂音とその後続母音の基本周波数に関する韓国語と日本語の比較を行い,母語干渉について考察した。以下,本年度の実施内容である。(A)MRI(平成19年度からの継続)(1)先行研究の整理:北京語、上海語、韓国語、日本語破裂音のMRIの研究報告の整理,(2)実験:上海語、日本語破裂音のMRIの実験,(3)データの分析、整理,(4)考察:(1)データの分析結果から4言語破裂音の特徴についての考察,(2)北京語、上海語の無声無気破裂音,韓国語の濃音,日本語の無声破裂音の類似性の考察,(3)上海語の有声破裂音の生理学的特徴についての考察,(4)上海語と韓国語と日本語の有声破裂音の類似性についての考察,(5)MRIによる(1)(4)の研究結果の発表と論文化への準備(B)喉頭筋電図(平成19年度より着手)(1)先行研究の整理:北京語、上海語、韓国語、日本語破裂音の喉頭筋電図の研究報告の整理,(2)実験:北京語、上海語、韓国語、日本語破裂音の喉頭筋電図の実験平成20年度は、下記の実験を継続し分析を行った。(1)実験概要:〔A〕MRI実験では、昨年度新たに得られた被験者データを分析し、北京語・上海語・ソウル語・日本語の破裂音について、横断的に分析を行った。〔B〕喉頭の筋電図実験については、昨年度実験当日に辞退者が出たため、倫理委員会による審査を経て、再度被験者に実験協力を仰ぎ、協力実験大学において実験を行い、データを分析した。(2)研究成果と分析結果:〔A〕MRI研究:北京、上海、ソウル方言話者が北京語・上海語・ソウル語・日本語の破裂音を発音している喉頭のMRIデータを横断的に分析した結果、日本語話者の有声破裂音及び韓国語話者の語中の平音には、声帯の開口度に類似性が観察された。

〔B〕喉頭筋電図実験:EGG(electroglottogram)による分析の結果、日本語、上海語の有声破裂音、韓国語の平音の筋電図に、共通の声帯接触による振動が見られた。また、日本語の無声破裂音においても、上海語の無気音、韓国語の濃音と共通したEGGの結果が見られ、日本語の無声破裂音の類似性がうかがわれた。
高周期不飽和クラウンエーテルの合成と包接挙動

申請者は今までに、クラウンエーテルの酸素を全て硫黄またはセレンに置き換え、また炭素-炭素単結合を全てcis-炭素-炭素二重結合に置き換えた不飽和チアおよびセレナクラウンエーテルの合成に成功している。本研究では、更に炭素-炭素単結合とcis-炭素-炭素二重結合を併せ持つ飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルの合成に成功すると共に、これらの反応性およびアルカリ金属イオンとの錯形成反応について検討した。チアクラウンエーテルの全ての炭素-炭素単結合をcis-炭素-炭素二重結合に置き換えた不飽和チアクラウンエーテルでは、m-CPBAおよびt-BuOClで低温で酸化することにより硫黄原子上が酸化された対応するスルホキシドを得ることができた。また、光反応および室温でのt-BuOClあるいはNBSとの反応により、cis-trans異性化反応が進行することを明らかにした。不飽和セレナクラウンエーテルでは、電気的な酸化還元において対応する不飽和チアクラウンエーテルとは異なる挙動を示すことがわかり、また錯形成において、員数の異なる化合物ごとに、分子内に取り込む銀イオンの数が異なることが明らかになった。飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルでは、今までの不飽和系および飽和系の場合とは異なり、段階的な合成経路を経て12,18,24員環化合物の合成に成功し、その熱異性化、酸化還元挙動および錯形成挙動を調べ、不飽和系および飽和系との類似点および相違点を明らかにすることができた。以上の成果を得ることにより、本研究の目的を達成できたものと考えている。柔軟な炭素-炭素単結合と柔軟性が抑制された炭素-炭素二重結合とが同一分子内に混在する飽和不飽和混合系チアおよびセレナクラウンエーテルの合成を試みた。その結果、段階的合成法を用いることにより、12,18,24員環飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルと、11,14,22員環飽和不飽和混合系セレナクラウンエーテルの合成に成功した。CV法を用いて酸化還元挙動を調べたところ、いずれの場合も非可逆な酸化波が観測され、チアおよびセレナクラウンエーテルいずれの場合も、環の員数が少ないほど酸化され易いことが明らかになった。また、得られたクラウンエーテルのいくつかについては、X線結晶構造解析によりその結晶構造を明らかにすることができた。その結果、いずれの化合物も環歪みのない構造を持ち、分子内に空孔を有する構造であることがわかった。これらのクラウンエーテルと各種銀塩との反応を行なったところ、24員環飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルではトリフルオロ酢酸銀と1:1錯体を効率良く形成することがわかった。また、11員環飽和不飽和混合系セレナクラウンエーテルの場合にもトリフルオロ酢酸銀との1:1錯体を与えるが、この場合には銀イオンはクラウンエーテルの空孔内には入らず、二分子に配位した構造をしていることが明らかになった。更に、11員環飽和不飽和混合系セレナクラウンエーテルでは、塩化水銀とも錯形成し、安定な錯体を与えることがわかった。また、溶媒中でのチアおよびセレナクラウンエーテルと銀イオンとの錯形成挙動を重アセトン中での^1H NMRによるtitration plotsを行うことにより明らかにした。炭素-炭素単結合と炭素-炭素二重結合で交互に架橋した飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルの段階的合成を試み、水素置換およびメトキシカルボニル基で置換した14および28員環飽和不飽和混合系チアクラウンエーテルの合成に成功した。CV法を用いて酸化還元挙動を調べたところ、いずれの場合も非可逆な酸化波が観測され、水素置換の系では環の員数が少ないほど酸化され易いことが明らかになった。また、得られたそれぞれのチアクラウンエーテルの結晶構造を、X線結晶構造解析により明らかにすることができた。その結果、いずれの化合物も環歪みのない構造を持ち、28員環化合物は分子内に長径約15A、短径約5Aの細長い構造であり、空孔を有することがわかった。

これらとトリフルオロ酢酸銀との錯形成反応を行なったところ、水素置換の14員環チアクラウンエーテルは1:1錯体を与えることがわかった。また、これらのチアクラウンエーテルと銀塩との溶液中での錯形成挙動をJobs Plotにより検討したところ、14員環チアクラウンエーテルは溶液中でトリフルオロ酢酸銀と1:1錯体を、28員環チアクラウンエーテルは溶液中で1:2錯体を選択的に形成していることがわかった。以上のように、本年度の計画であった分子修飾した飽和不飽和混合系カルコゲノラウンエーテルの合成に成功すると共に、銀イオンとの錯形成挙動を明らかにすることができ、当初の計画をほぼ達成することができた。これらの結果は、不飽和結合を有する高周期クラウンエーテルの合成法と基本的性質を明らかにしたものであり、新しい機能を指向した今後の高周期不飽和クラウンエーテルの化学の礎を築いたものと考えている。
Axamノックアウトマウスの作製とその解析

体軸形成等の発生分化や発癌に関与するWntシグナル伝達系において中心的な役割を果たす分子群であるβカテニン、APC、GSK-3βというタンパク質と会合するAxinは、さらにAxam(Axin Associated Molecule)という分子に会合する。そこで我々はこのAxamが発生分化のコントロールや発癌に対してどのような作用を有するかを調べるため、Axamノックアウトマウスを作製し、その表現型を調べることを目的としている。ノックアウトマウスは、Axamゲノム遺伝子より機能領域を欠失させるターゲティングベクターを構築した。これをES細胞にトランスフェクションしてAxam遺伝子の相同組換え体をPCRにてスクリーニングする方法を確立し、相同組換えはサザンブロッティングで確認した。そのES細胞をマウス胚盤胞にマイクロインジェクションした。この胚を偽妊娠させた仮親の子宮に移植し、キメラマウスを得、さらにキメラマウスとC57B1/6マウス(野生型)を交配し、Axam遺伝子の一つのアリルが変異したマウス(Axamヘテロノックアウトマウス)を作製し、現在ヘテロマウス同士を交配することによってノックアウトマウスの作製を試みている。また、Axamは、そのC末端側にSUMO化を引き起こす酵素に類似のアミノ酸配列を持つことが明らかになった。そこで、マウスcDNAを哺乳類発現ベクターに組み込み過剰発現によって、SUMO化が促進するかどうか、すでにSUMO化されることが明らかとなっているp53を基質に調べた。また、大腸菌における蛋白産生ベクターにAxamのマウスcDNAを組み込み、大腸菌でAxam蛋白を産生精製することを試みた。この精製蛋白とp53を試験管内で混合することによって、試験管内SUMO化反応の構築を試みた。
圧力ジャンプを用いた高分子液体の動的階層構造の研究

近年、動的に非対称な二成分混合系(高分子準希薄溶液など)においては、濃度揺らぎに伴う応力の空間不均一性により、応力と拡散のカップリングが生じることが明らかにされいる。このカップリングは相分離過程や濃度揺らぎの緩和過程においていわゆる「粘弾性効果」を引き起こす。この粘弾性効果は、高分子溶液のみならず、ゲルやコロイド分散系などの相分離過程にも影響を及ぼすと考えられ、粘弾性効果の解明は複雑液体一般の相転移のダイナミックスの理解へと繋がると考えられる。そこで、本研究では高分子準希薄溶液の相分離初期過程における粘弾性効果を明らかにし、土井・小貫(DO)理論を用いてそのダイナミックスの解析を行った。これにより、粘弾性効果が濃度揺らぎの成長にどのように影響を与えるかを定量的に示すことができる。DO理論の有効性を示すために、本研究ではViscoelastic length(Ve)に着目した。Veは粘弾性効果の及ぶ特徴的な長さであり、それより短い長さスケールでは粘弾性効果により濃度揺らぎのダイナミックスが抑制される。本研究では、相分離初期過程における濃度揺らぎのダイナミックスの測定によりVeを求め、一相領域の濃度揺らぎの緩和過程のダイナミックスと粘弾性側定より求めたVeと比較することにより、理論の有効性を調べた。その結果、粘弾性効果は成長速度を抑制するばかりでなく、初期の支配的な濃度揺らぎの波長にも影響を与えることが分かった。また、一相領域の濃度揺らぎの緩和過程のダイナミックスと粘弾性側定より求めたVeと比較した結果、よい一致を示し、DO理論が動的な非対称二成分混合系の相分離過程をうまく記述することが分かった。研究実績は以下のとおり.本年度は、圧力ジャンプによる瞬間的なクエンチによって、温度ジャンプによる実験が不可能なA/B二成分高分子混合系の一相領域における速い濃度揺らぎのダイナミックスの観測を行った。用いた混合系は、重水素化ポリブタジエン(DPB,Mω=3.74×10^4,Mω/Mn=1.28)/ポリイソプレン(PI,Mω=8.5×10^4,Mω/Mn=1.1)混合系である。Mwは重量平均分子量、Mnは数平均分子量である。この混合系は下限臨界共溶温度型及び上限臨界共溶圧力型の相図を持つ。このDPB/PIを重量分率50/50で混合したサンプルを309.0°Cで圧力P=80MPaを加え、30分保持し、系をその状態で平衡状態にもたらした後、圧力を0.1MPaにクエンチして、その後の小角中性子散乱の散乱光強度の時間変化の測定をおこなった。測定は東大物性研のSANS-Uで行った。測定時間は1スキャンあたり400秒である。測定結果は各種補正の後、絶対強度に換算した。圧力ジャンプに伴い、どの観測された波数qにおいても散乱光強度が増加し、大きなqほど速くt=∞の散乱光強度に近付くことがわかった。この散乱光強度の時間変化はCahn-Hilliard-Cook理論によりうまく表すことができ、成長速度のq-依存性およびオンサーガー係数のq-依存性を求めることができた。オンサーガー係数は、粘弾性効果によりDPBの慣性半径の約4倍の長さのスケールからq^<-2>-依存性をもつことがわかった。また、Cahn-Hilliard-Cook理論に粘弾性効果を取り入れたDoi-Onukiの理論式を用い、粘弾性測定よりオンサーガー係数のq依存性を計算した結果、圧力ジャンプにより求められたオンサーガー係数のq依存性と一致し、Doi-Onukiの理論の妥当性を証明した。研究実績は以下のとおり.近年、動的に非対称な二成分混合系(高分子準希薄溶液など)においては、濃度揺らぎに伴う応力の空間不均一性により、応力と拡散のカップリングが生じることが明らかにされいる。

この粘弾性効果は、高分子溶液のみならず、ゲルやコロイド分散系などの相分離過程にも影響を及ぼすと考えられ、粘弾性効果の解明は複雑液体一般の相転移のダイナミックスの理解へと繋がると考えられる。そこで、本研究では高分子準希薄溶液の相分離初期過程における粘弾性効果を明らかにし、土井・小貫(DO)理論を用いてそのダイナミックスの解析を行った。これにより、粘弾性効果が濃度揺らぎの成長にどのように影響を与えるかを定量的に示すことができる。DO理論の有効性を示すために、本研究ではViscoelastic length(Ve)に着目した。Veは粘弾性効果の及ぶ特徴的な長さであり、それより短い長さスケールでは粘弾性効果により濃度揺らぎのダイナミックスが抑制される。本研究では、相分離初期過程における濃度揺らぎのダイナミックスの測定によりVeを求め、一相領域の濃度揺らぎの緩和過程のダイナミックスと粘弾性測定より求めたVeと比較することにより、理論の有効性を調べた。その結果、粘弾性効果は成長速度を抑制するばかりでなく、初期の支配的な濃度揺らぎの波長にも影響を与えることが分かった。また、一相領域の濃度揺らぎの緩和過程のダイナミックスと粘弾性測定より求めたVeと比較した結果、よい一致を示し、DO理論が動的な非対称二成分混合系の相分離過程をうまく記述することが分かった。研究実績は以下のとおり.近年、動的に非対称な二成分混合系(高分子準希薄溶液など)においては、濃度揺らぎに伴う応力の空間不均一性により、応力と拡散のカップリングが生じることが明らかにされいる。このカップリングは相分離過程や濃度揺らぎの緩和過程においていわゆる「粘弾性効果」を引き起こす。そこで、本研究では高分子準希薄溶液の一相領域の濃度揺らぎの緩和過程における粘弾性効果を明らかにし、土井・小貫(DO)理論を用いてそのダイナミックスの解析を行った。これにより、粘弾性効果が濃度揺らぎの緩和過程にどのように影響を与えるかを定量的に示すことができる。試料としては、ポリスチレン(PS)/ジオクチルフタレート(DOP)準希薄溶液を用い、濃度揺らぎの緩和過程を動的光散乱法(DLS)で測定を行った。その結果、動的構造因子は単一の指数関数ではなく、大きく分けて速いモードと遅いモードが存在し、粘弾性効果によるモードが表れるのがわかった。そこで、Doi-Onuki理論が、この緩和過程をうまく表すかどうかを、Doi-Onuki理論により動的構造因子を計算して、実験結果と比較することによって調べた。計算結果は測定結果と良い一致を示しており、Doi-Onuki理論がPS/DOP系における一相領域における濃度揺らぎの緩和過程をうまく記述することが分かった。