hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テトロドトキシンの生合成経路の解明－ＬＣ／ＭＳを用いた微量生合成中間体の探索－

更にTTXと化合物2の含有量を解析すると高い相関関係が示され、化合物2が重要な生合成中間体であることが示唆された。また、この相関関係と化合物2, 3の化学構造から、TTXの生合成の出発物質がモノテルペン(ゲラニル二リン酸)である可能性を示した。更に、TTXと化学的に等価な4,9-anhydroTTXを経由するTTXの生合成経路の最終段階についても考察した。2.イモリの毒の起源については内因性か、外因性か未だに議論中であるため、生合成研究の一環としてこの点についても追及した。研究室内で有毒イモリの卵を孵化させ、無毒の餌で70週齢になるまで飼育した後、毒量を調べた。その結果、幼体の飼育イモリからTTXは検出されず、毒の生産は確認できなかった。その一方で、同じ生息地で捕獲した野生のイモリ(幼体)からは、TTXとその類縁体が多量に含まれていた。これらの結果はイモリの毒が外因性であることを強く示唆していると考えられる。フグ毒テトロドトキシン(TTX)は強力な神経毒であり、世界中で食中毒事例が報告される。複雑な構造を有するTTXの生合成経路は未だ解明されておらず、起源生物の遺伝子解析から生合成経路に言及した研究もない。昨年度、特徴的な骨格構造を有するTTX類縁体を発見し、その構造からモノテルペンを出発物質とする生合成経路を提唱した。本年度は推定した経路を裏付けることを目的とし、推定生合成経路における中間体を質量分析器を用いて網羅的に探索した。検出された5つの候補化合物を単離し、NMRを用いて構造解析したところ、いずれも含グアニジン六員環を有する二環性の新規化合物だと同定された。得られた化合物群は推定した経路を支持する構造を有していた。これらの成分は複数の有毒イモリ(TTXを有するイモリ)に共通して存在する一方で、無毒のイモリからは検出されず、本化合物群がTTXの関連物だと示唆された。本研究結果は我々が唱えたモノテルペン説を支持しており、陸上生物におけるTTXの生合成経路解明への重要な知見を与えたと考えている。本内容の投稿論文が受理され、公表予定である。昨年度までに研究室で飼育したイモリに毒の生産能がないことを確かめ、本年度に投稿論文として公表した。本年度は得られた無毒のイモリを用いて、毒の蓄積能を調査した。TTXおよびその類縁体をそれぞれ無毒イモリに経口投与し、一か月後、皮や筋肉を含む身体組織と腹腔内の内臓に分け、LC-MSで解析した。その結果、主に身体組織からTTX、その類縁体が検出され、イモリが経口投与された毒を身体組織に蓄えることが明らかになった。野生のイモリにおいても皮に多く毒が含まれることが知られており矛盾しない。飼育イモリが毒の生産能を示さないことと併せて考えると、イモリの毒は外因性である可能性が高いといえる。長年議論されていたイモリにおけるTTXの起源解明に近づいた。目的としていた新規TTX類縁体を得た。特徴的な構造を有す10-hemiketl型のTTX類縁体が発見できたことは大きな収穫だったと捉えている。各地域、各種生物について詳細な毒成分の解析を行うことで、本研究で得られた10-hemikatal型のTTX類縁体(4,9-anhydro-10-hemiketal-5-deoxyTTX)が、日本、中国、アメリカなど世界中の有毒イモリに共通して存在することを示した。更に、有毒イモリにおいて本化合物とTTXの含有量の間で相関が認められ、生合成中間体であることを示唆する結果を得た。これらの毒成分の解析結果、また新規TTX類縁体の化学構造から、これまでとは異なる新たなTTXの生合成経路を推定することができ、目的であるTTXの生合成経路の解明に近づいたと考えている。
宇宙・上層大気中に存在する有機物の分光と反応性に関する共同研究

分子の回転スペクトルの観測によって、これまで約100種類の星間分子が発見されている。低温暗黒星雲が重力収縮により進化し、温度が上昇した星形成領域においては、サイズの大きな有機化合物が多く見いだされているが、そのスペクトル線の帰属および生成機構については説明できない部分が多く残っている。本研究ではサブミリ波・遠赤外から可視・紫外光領域における星間物質の候補となる分子スペクトルの正確な帰属を実験室で行い、宇宙における有機分子が星間雲の物理進化に伴って如何に生成しているかをミリ波・サブミリ波望遠鏡での観測によって調べた。野辺山ではCCラジカルの赤外スペクトルの解析により電波領域に現れる磁気双極子遷移の周波数を決定した。カルテックでは炭素鎖分子の電子遷移を測定するために前年度製作したOptical Parametric Oscillator、パルス放電ノズルの整備を行い実際のスペクトル観測ができるようにした。彗星は我々の太陽系が形成されたときの組成を保持していると考えられ、その観測は特に星形成領域の化学過程として提唱されているモデルの検証となる。前年度、野辺山45m電波望遠鏡を用いて観測したHale-Bopp彗星におけるHCN,HNCの分布に関する研究とCH_3OH分子の観測の研究をまとめた。HNCの生成機構について彗星から水分子とHNC分子の複合体として蒸発する可能性を検討し、低温マトリックス中でHNCをHCNへの紫外線照射により生成し、赤外スペクトルの温度変化を調べた。分子の回転スペクトルの観測によって、これまで約1OO種類の星間分子が発見されている。野辺山ではCH_2Dラジカルの赤外スペクトルの解析により純回転遷移の周減数を決定した。またCH_2OHラジカルのスペクトルを検討し、新しい吸収セルの製作を行った。カルテックでは発見以来50年以上経っても依然解決されていないDiffuse Interstellar Bands(DIB)の解明、星間分子として重要な炭素鎖分子の電子遷移を測定するためにOptical Parametric Oscillatorの整備、パルス放電ノズルの製作を行った。本研究では野辺山45m電波望遠鏡を用いてHale-Bopp彗星におけるHCN,HNCの分布に関する情報を得、CH_3OH分子の多くの回転遷移を観測し、励起温度の決定などを行った。カルテックでは電波干渉計により、HCN,HNCの分布の詳細を調べた。低温暗黒星雲が勧収縮により進化し、温度が上昇した星形成領域においては、サイズの大きな有機化合物が多く見いだされているが、そのスペクトル線の帰属および生成機構については説明できない部分が多く残っている。

前年度、野辺山45m電波望遠鏡を用いて観測したHole-Bopp彗星におけるHCN,HNCの分布に関する研究とCH_3OH分子の観測の研究をまとめた。HNCの生成機構について彗星から氷分子とHNC分子の複合体として蒸発する可能性を検討し、低温マトリックス中でHNCをHCNへの紫外線照射により生成し、赤外スペクトルの温度変化を調べた。
ヘテラコロネン類の合成と酸化還元活性色素系の構築

2, 3, 6, 7, 10, 11-ヘキサブトキシトリフェニレンを出発原料として、TMEDA存在下、8当量のn-BuLiを作用させ、3時間加熱かくはんしたところ、効率よくヘキサリチオ体が発生することを見いだした。続いて、発生させたヘキサリチオ体に過剰量の単体硫黄を反応させたところ、トリフェニレンの湾部に硫黄原子が導入されたと思われる化合物が得られた。この生成物をLiAlH4で還元し、ヘキサチアコロネンの前駆体である、ヘキサメルカプトリフェニレンへと誘導した。2,3,6,7,10,11-ヘキサプトキシトリフェニレンを出発原料として、トリチアコロネンの合成中間体であるヘキサリチオトリフェニレンの発生条件の検討を行った。TMEDA存在下、過剰量のn-BuLiを作用させ、24時間加熱かくはんし、重水で反応を停止し、生成物の重水素化率からヘキサリチオトリフェニレンの発生率を求めた。その結果、8当量のn-BuLiを用いた場合が、最も効率よくヘキサリチオ体が発生することを見いだした。n-BuLiの当量を増加させたところ、重水素化率は向上したものの、回収率が低下し、副成物の生成が示唆された。続いて、発生させたヘキサリチオ体に過剰量の単体硫黄を反応させて、生成物の解析を行った。その結果、トリフェニレンの湾部の1箇所、2箇所、および3箇所にそれぞれ硫黄原子が導入されたと思われる化合物が得られた。1^H NMRの結果、分子の対称性、芳香族プロトンの消失などから、トリフェニレンの3箇所の湾部に硫黄原子が導入されたと推察した。この生成物を水素化アルミニウムリチウムで還元し、ヘキサチアコロネンの前駆体である、ヘキサメルカプトリフェニレンへと誘導した。現在得られた生成物の単離、構造決定を行っているところである。また、トリフェニレン周縁のアルコキシ基をブトキシ基からエトキシ基へと変更した分子についても同様の検討を行い、効率よくリチオ化が進行することを見いだしている。前年度までの検討結果として、2,3,6,7,10,11-ヘキサブトキシトリフェニレンを出発原料として、発生させたヘキサリチオトリフェニレンに過剰量の単体硫黄を反応させた結果、トリフェニレンの3箇所の湾部に硫黄原子が導入されたと推察した。この生成物を水素化アルミニウムリチウムで還元し、ヘキサチアコロネンの前駆体である、ヘキサメルカプトトリフェニレンへと誘導した。また、導入する原子として、硫黄原子に代えて、リン原子を導入することも検討した。リン試剤として、ジクロロフェニルホスフィンを用い、ヘキサリチオトリフェニレンに対し、過剰量のリン試剤と反応させたところ、同様にトリフェニレンの湾部の3箇所に6つのリン原子が導入されたと考えられる分子をマススペクトルにて同定した。これらの生成物の酸化還元挙動についても併せて検討した。また硫黄類縁体については光学特性についても検討を行い、この分子が弱いながらも蛍光を発することを見いだしている。硫黄原子の導入に伴って、分子の平面性が大きく崩れていると予測されるが、このようにトリフェニレンの蛍光特性を維持していることは大変興味深い結果である。この分子はブトキシ体と比較し、溶解性に欠けるものの、結晶性が良く、化合物の単離には適していた。
転写制御における協同性の構造メカニズム

本年度は以下の項目について解析を行った。(1)蛋白質・DNA認識の特異性の定量化:蛋白質・DNA複合体の構造データを更新し、蛋白質・DNA認識における直接認識と間接認識に対応する統計ポテンシャルを更新した。また、更新した統計ポテンシャル用いて、直接認識と間接認識の特異性を計算した。(2)転写因子構造ネットワークの解析:これまでに開発した構造データに基づく分子相互作用ネットワークのデータベース/検索ツール、PDBnet、のデータを更新するとともに、構造中に含まれるドメインの相互作用を解析し、ドメインレベルでのネットワークが解析できるように機能を強化した。また、相互作用領域での構造特性、物理化学的特性、ネットワーク特性の間の関係について解析を行った。(3)転写因子の協同性の解析:転写因子・DNA複合体構造を解析し、転写因子によるDNA配列認識の協同性が認識の特異性を高め予測精度を上げることがわかった。(4)酵母ゲノムの転写制御情報のデータベース構築:これまでに開発をすすめてきた酵母の転写制御に関するさまざまな情報を集めたデータベースのデータ更新を行うとともに、転写因子やそのターゲットの予測結果もデータベースに統合した。(5)転写制御ロジックの解析:プロモータ上での転写因子の既知および予測された結合サイトを解析し、転写因子のコンテクスト(文脈)と遺伝子発現データなどとの比較を行い、転写制御ロジックの解析をすすめる。(6)転写制御ポータルの整備:転写制御に関係するデータベースや解析ツールのポータルサイトの更新と機能強化を行った。本研究では、転写制御の協同性を解析し、以下のような成果を得た。(1)蛋白質・DNA認識の特異性の定量化:まず、蛋白質・DNA複合体の構造データベースの更新を行った。蛋白質・DNA認識は、アミノ酸と塩基に直接相互作用による直接認識とDNAの構造や物性をとおして配列を認識する間接認識とがあるが、それぞれの統計ポテンシャルという量を計算し、蛋白質・DNA相互作用のエネルギー、蛋白質・DNA認識の特異性の計算などを行った。これらの更新にともない、蛋白質・DNA認識の特異性が全体的に高まった。間接認識では、DNAの計算機シミュレーションによるDNAコンフォメーションエネルギーと特異性の計算も行った。(2)転写因子構造ネットワークの解析:蛋白質構造データベース(PDB)に含まれるすべての分子についてお互いの相互作用の関係を解析し、それらの情報を検索・可視化するためのツール、PDBnet、を開発し公開した。これはいわば、構造空間(ストラクチュローム)を鳥瞰図として眺め、個々の分子構造と相互作用ネットワークでの位置づけを俯瞰することができるようになっている。転写因子などの蛋白質とDNAの相互作用ネットワークも含むので、これを用いて、DNAに結合したヘテロな転写因子複合体をすべてリストアップし、、注目する転写因子と相互作用する別の転写因子あるいは補助因子を構造データベースから容易に検索できるようにした。(3)転写因子の協同性と特異性の関係の解析:特異性を定量化する方法と転写因子のヘテロ複合体の構造データを用いて、転写因子の協同性が構造と特異性に及ぼす影響を調べた。(4)転写因子情報のデータベース化とコンテクストの解析:酵母について転写因子と結合サイト、ORFとプロモータなどの情報と付随する構造、機能など、転写制御に関するさまざまな情報を統合したデータベースを構築した。これをもとに、制御領域でのコンテクストの解析をすすめ、遺伝子発現の制御ロジックを考察している。また、転写制御に関する各種データベースや解析ツールなどを集めた転写制御ポータルサイトを作成し公開を始めた。
遷移金属イオンが関与する酵素反応とDNA損傷に関する理論的研究

1)還元型シトクロムc酸化酵素は酸素分子を水分子に4電子還元する機能を有していることが知られているが、その反応機構に対し実験サイドから多くの提案があるものの確定していなかった。我々は電子論的立場に基づき理論化学計算をもちいて、水分子の生成機構と反応にともなう電子状態の変化を明らかにした。反応機構をまとめると、a)His290とTyr244とに水素結合によって水分子が存在する。この水分子は、Tyr244、ファルネシルエチル、K-channelの末端であるThr316まで水素結合のネットワークが存在し、還元反応に必要なプロトンがこのネットワークを介してこの水分子まで移動する。b)プロトン移動によって水分子はヒドロニウムイオンとして、ヘム鉄に結合して酸素分子にプロトンを運び、プロトンをFeOOにわたした後、水分子として元の位置に戻ることが判った。すなわち、この水分子がプロトン供給に重要な役割を担っている。c)プロトン移動によってFeOOHが生成し銅原子からFeOOHへ電子が移動し、銅原子は1価から2価に変化する。d)酸素分子が存在しない時のプロトン移動の活性化エネルギーを12kcal/molと評価した。e)2個目のプロトンもこの水分子によって運搬される。f)これらのプロトン移動間にヘムaから2電子が移動し水分子が生成することがわかった。本研究によって、完全還元型シトクロムc酸化酵素による1個目の水分子の生成機構を理論化学計算から明らかにすることができた。2個目の水分子の生成機構を明らにすることが次の課題である。2)Cu(I)イオン存在下、5'-XG_1G_2G_3-3' (X=T or C)の1電子酸化による損傷は、G_1が選択的に損傷を受けることが実験サイドから報告されている。本研究では、Cu(I)イオンがGのN7位に配位した構造を基に、5'-XG_1G_2G_3-3'とそのラジカルカチオン状態の安定性と電子状態を量子化学計算から検討した。その結果、Cu(I)イオンが5'-XG_1G_2G_3-3'のG_2に選択的に配位することが一電子酸化のG_1の選択性の要因になっていることを解明した。1)還元型チトクロムc酸化酵素の構造を用いて、反応初期段階の中間体である(a_3-O_2,Cu_B)の構造、電子状態、スピン状態を量子化学計算から明確にした。まず、還元反応に対する水分子の関与の可能性を検討するために、反応活性部位における水分子の位置を最適化した。水分子の位置は、a)チロシン残基のフェノール部の酸素原子に水分子の水素原子が水素結合を形成する、b)ヘムa_3のファルネシルエチル基の酸素原子に水素結合を形成する、の2通りが得られ、X線構造解析から得られている酸素原子の位置を再現した。a)の位置の水分子はフェノールの酸素原子との水素結合だけではなく、Cu_Bに配位するヒスチジン290の水素原子と水素結合を形成することによって、ヘムa_3のファルネシルエチル基からヒスチジン290にわたって水素結合の橋掛け構造を形成することが確認された。

この橋掛け構造がプロトン供給の役割をになっているのか現在検討をすすめている。還元反応の初期段階の中間体(a_3-O_2,Cu_B)は、鉄原子と分子状酸素にそれぞれスピンが極在化した1重項ビラジカル状態が最も安定であることがわかった。2)Cu(I)イオン存在下、5'-XG_1G_2G_3-3'(X=T or C)の1電子酸化による損傷は、G_1が選択的に損傷を受けることが実験サイドから報告されている。本研究では、Cu(I)イオンがGのN7位に配位した構造を基に、5'-XG_1G_2G_3-3'とそのラジカルカチオン状態の安定性と電子状態を量子化学計算から検討した。その結果、Cu(I)イオンが5'-XG_1G_2G_3-3'のG_2に選択的に配位することが一電子酸化のG_1の選択性の要因になっていることを解明した。1)還元型シトクロムc酸化酵素の活性部位における、O_2分子の還元反応の機構および電子状態の変化を量子化学計算から解明を試みた。昨年度の報告では、ヒスチジン290からヘムa_3のファルネシルエチル基にわたって水素給合の橋掛け構造がある事、ヒスチジン290とチロシン244との間に水分子が存在する事を報告した。本年度この水分子の役割を明確にすべく理論的検討を行なった。水素給合の橋掛け構造がプロトンの供給源であると仮定し、この水分子をヒドロニウムイオンに変えて構造最適化を行った。その結果、ヒドロニウムイオンはFe-OOに近づき、プロトンをFe-OOに渡した後、元の位置にもどり、(Fe-OOH,Cu_B)が形成された。すなわちFe-OOHを形成するためにこの水分子がプロントを運搬する役割を担っている事がわかった。(Fe-OO,Cu_B)から(Fe-OOH,Cu_B)へと変化する際、Feは3価に保持されるが、Cuは1価から2価へと変化した。(Fe-OO,Cu_B)では鉄原子と分子状酸素にスピンが極在した1項ビラジカルであり、(Fe-OO,Cu_B)では鉄原子と銅原子にスピンが極在した1重項ビラジカルである。2)グアニンの1電子酸化に加えて、1重項酸素分子によるグアニンおよび8-オキソグアニンの酸化機構の解明を理論化学計算をもとに行っている。興味ある反応中間体、および遷移状態が得られつつある。3)Cu(I)イオン存在下、5'-XG_1G_2G_3-3'(X=T,C)の1電子酸化による損傷のG_1選択性は、Cu(I)イオンがG_2に選択に配位することが要因になっていることが解明された。1)還元型シトクロムc酸化酵素は酸素分子を水分子に4電子還元する機能を有していることが知られているが、その反応機構に対し実験サイドから多くの提案があるものの確定していなかった。我々は電子論的立場に基づき理論化学計算をもちいて、水分子の生成機構と反応にともなう電子状態の変化を明らかにした。反応機構をまとめると、a)His290とTyr244とに水素結合によって水分子が存在する。この水分子は、Tyr244、ファルネシルエチル、K-channelの末端であるThr316まで水素結合のネットワークが存在し、還元反応に必要なプロトンがこのネットワークを介してこの水分子まで移動する。b)プロトン移動によって水分子はヒドロニウムイオンとして、ヘム鉄に結合して酸素分子にプロトンを運び、プロトンをFeOOにわたした後、水分子として元の位置に戻ることが判った。すなわち、この水分子がプロトン供給に重要な役割を担っている。
校内授業研究会の事例をジョイント・アテンションに着目して分析するための基礎的研究

本研究の目的は、校内授業研究会の事例をジョイント・アテンション(以下JA)に着目して検討するための理論的な枠組みを明らかにすることである。JAとは、特に、二者が同じ物を連鎖的に注視することである。既に実証したことは、授業中のJAに着目すると授業中の言語(音声言語や文字言語)の生成過程と言語を扱う行為(会話や読み書き)の生成過程とが一体として検討されうるということである。本研究では、ここで検討対象を授業から授業研究会に変えるとどういえるかが分かる。学校現場等における教師教育の事例を、発話内容や筆記内容にだけでなく、行為や行為を構成している身体と空間にも着目して精緻に検討することを展望している。
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）における社会的行動のオペラント条件づけ

ゼブラフィッシュは遺伝子組換えが容易であることに加え、比較的高い学習能力と社会性を持つ魚類である。このうち学習について応募者はこれまでに3Dトラッキングで追跡する魚の動きを標的としたオペラント条件づけに成功している。現在1個体に限られている追跡対象を今回の研究計画で複数の個体へと拡大し、社会的行動の形成を明らかにするための研究基盤を確立する。将来的には社会性における遺伝と環境の相互作用の解明に取り組みたい。
デュアルエネルギーCTのエネルギー領域に対応した人体組織等価ファントム物質の開発

デュアルエネルギーX線コンピュータ断層撮影(DECT)のX線エネルギー依存性に対応した水等価及び人体組織等価ファントムは現在存在しないことから,数種の安定した物質(ポリプロピレン,アクリル,ハイドロキシアパタイトなど)を利用して,正確に人体と等価なエネルギー依存を示すファントム物質を本研究課題では開発する.平成29年度までに作成したシミュレーションソフトウェアにより実際のファントムに適した固形物質を作成するための化合物と混合比率を算出した.求めた化合物と混合比率に基づき,ファントムメーカに固形の水等価及び軟部組織等価物質の作成を依頼した.作成されてきた物質を,DECTが可能な2管球方式マルチスライスCT装置,シーメンス社製Somatom Definition Flash(所属大学の附属病院に設置)にてデータ収集を行った.この際,CT値の正確性を向上させるため,エネルギーセパレーション性能の高い80 kVと140 kV(Snフィルタ)のDECTモードを用い可能な限り高い線量を用いた.取得したローデータから40200 keVの仮想単色画像を再構成し,CT値を理論値と比較する.40200 keVの仮想単色画像を再構成しCT値を測定した.その結果,基準値より約34 HUより外れており,目標の2HU以内に収まらなかった.そのエネルギー依存曲線を元に,混合比率を補正し,再度メーカに作成依頼をした.作成した物質は,CT値誤差の許容値である2HUに近い34HUの誤差となっており,エネルギー依存曲線から混合比率の補正値が容易に算出できた.よって,少なくともあと1回の補正で目的地に達することが推測され,2019年度の早い時期に目的物質が完成することが見込まれる.ファントム物質を完成させ,それまでの経緯を元に研究論文を執筆し海外英文誌に投稿する.また,北米放射線学会にて研究発表を行う.デュアルエネルギーX線コンピュータ断層撮影(DECT)のX線エネルギー依存性に対応した水等価及び人体組織等価ファントムは現在存在しないことから,数種の安定した物質(ポリプロピレン,アクリル,ハイドロキシアパタイトなど)を利用して,正確に人体と等価なエネルギー依存を示すファントム物質を本研究課題では開発する.平成29年度では,NIST(National Institute of Standards and Technology)にて示される人体臓器(組織)のうち肝臓,血液についてエネルギー特性をデータテーブル化し,等価物質の作成に利用した.まず水溶液の作成に着手し,エネルギーの増加によってCT値が上昇する食塩水と,逆にCT値が低下するショ糖水のそれぞれの化合式から,エネルギー特性を算出した.目的組織(肝臓,血液)のエネルギー特性からこれらと等価となるような混合比率を算出できるアルゴリズム(シミュレーションソフトウェア)を考案し,計算した比率にて水溶液を作成した.これを樹脂製バイアルに封入し,直径20 cm円筒型水ファントム内に固定して,DECTが可能な2管球方式マルチスライスCT装置,シーメンス社製Somatom Definition Flash(所属大学の附属病院に設置)にてスキャンした.40200 keVの仮想単色画像を再構成し,CT値を理論値と比較した結果,±2 HUの許容誤差に対して,最大で+5HUと誤差が高かった.用いた混合比率とCT値差から,補正混合比率を算出して水溶液を作成し,CTスキャンおよび誤差測定を計測した.結果的に5回の補正操作により最終的に最大誤差が-1.5 HUとなるまで等価性を高めることができた.平成29年度の計画における水溶液による組織等価物質の作成には成功し,結果的に最大誤差が-1.5 HUとなるまで等価性を高めることができた.また組織混合率の算出と補正アルゴリズムも確立された.デュアルエネルギーX線コンピュータ断層撮影(DECT)のX線エネルギー依存性に対応した水等価及び人体組織等価ファントムは現在存在しないことから,数種の安定した物質(ポリプロピレン,アクリル,ハイドロキシアパタイトなど)を利用して,正確に人体と等価なエネルギー依存を示すファントム物質を本研究課題では開発する.平成29年度までに作成したシミュレーションソフトウェアにより実際のファントムに適した固形物質を作成するための化合物と混合比率を算出した.求めた化合物と混合比率に基づき,ファントムメーカに固形の水等価及び軟部組織等価物質の作成を依頼した.作成されてきた物質を,DECTが可能な2管球方式マルチスライスCT装置,シーメンス社製Somatom Definition Flash(所属大学の附属病院に設置)にてデータ収集を行った.この際,CT値の正確性を向上させるため,エネルギーセパレーション性能の高い80 kVと140 kV(Snフィルタ)のDECTモードを用い可能な限り高い線量を用いた.取得したローデータから40200 keVの仮想単色画像を再構成し,CT値を理論値と比較する.40200 keVの仮想単色画像を再構成しCT値を測定した.その結果,基準値より約34 HUより外れており,目標の2HU以内に収まらなかった.そのエネルギー依存曲線を元に,混合比率を補正し,再度メーカに作成依頼をした.作成した物質は,CT値誤差の許容値である2HUに近い34HUの誤差となっており,エネルギー依存曲線から混合比率の補正値が容易に算出できた.よって,少なくともあと1回の補正で目的地に達することが推測され,2019年度の早い時期に目的物質が完成することが見込まれる.平成30年度以降の計画では固形物質の作成を行うことになっている.考案した混合比率計算アルゴリズムにより実際のファントムに適した固形物質を作成するための混合比率を算出する.

固形物質には混練が可能な樹脂を選択し,微細粉末化が可能な物質(ハイドロキシアパタイトなど)も利用可能である.対象の人体臓器(組織)は,NISTによって公表されている血液,肝臓,脳実質,筋肉,乳房,及び脂肪とする.混合比率を算出した後ファントムメーカに製作依頼する.製作された物質をDECTでスキャンし,CT値誤差を測定する.測定誤差から補正混合比率を見積もり製作を再依頼するという,繰り返しを平成30年度内に行い,±2HUの許容誤差内に入るようにする.ファントム物質を完成させ,それまでの経緯を元に研究論文を執筆し海外英文誌に投稿する.また,北米放射線学会にて研究発表を行う.ファントムメーカへ作成依頼した固形物質の精度が予定より高く,依頼回数が予定より1回少なくなり,次年度使用額が生じた.平成31年度には追加物質を含めて2回の作成依頼をする予定であり,それに充当する予定である.
腫瘍内線維化巣陽性浸潤性乳管癌の悪性度基底因子の解明

浸潤性乳管癌における腫瘍内Fibrotic focus(FF、線維化巣)の存在は、浸潤性乳管癌患者の短期・長期予後を考える上で非常に重要な組織形態学的因子であることを後ろ向き研究並びに前向き研究により既に証明した。平成19年度では、FFの存在が術後加療なし群では、リンパ節転移陰性群、pTNM-I/II群において、FF径、FF線維性状が遠隔臓器転移再発、骨転移再発、肝転移再発と密接に関係していた。術後加療あり群では、リンパ節転移、pTNM病期に関係なく、FF径が遠隔臓器再発、骨転移再発、肝転移再発と密接に関係し、腫瘍壊死、N3(リンパ節転移個数10個以上群)が肺、肝転移と各々有意に相関した。研究の結果、FF性状は術後加療、リンパ節転移、pTNM病期に関係なく、遠隔臓器、特に骨、肝転移再発と密接に関係していることが明らかとなった。平成20年度では、FFに加え乳管癌リンパ管腫瘍塞栓を形成する腫瘍細胞の核分裂像、アポトーシス像に着眼したリンパ管組織異型度を考案した。393例の浸潤性乳管癌症例で検討した結果、術後加療の有無、リンパ節転移の有無、腫瘍径の違い等に関係なく、リンパ管腫瘍塞栓組織異型度は浸潤性乳管癌患者の腫瘍再発、腫瘍死と有意に関係することを既知臨床病理学的予後因子との多変量解析により明らかなものとした。この時、FFの存在もリンパ管腫瘍塞栓組織異型度と同様に優位な組織学的因子であることをあらためて確認した。平成19年度では、FFの存在が浸潤性乳管癌の遠隔臓器(骨、肝、肺)転移との関係に焦点を当て検討を行った。乳癌臓器特異的再発を推測する上で、有用な病理組織学的因子の解明を試みる検討は多く行われてきた。しかし、術後加療、リンパ節転移、pTNM病期等が考慮されておらず、さらに症例数が少ない、後ろ向き研究等より、不十分な研究が殆どである。今回、1044例の浸潤性乳管癌患者を対象とし、術後加療の有無により2群に分け、さらにリンパ節転移(N)の有無、pTNM病期別に層別化し、既知臨床病理学的因子、FFより、骨、肺、肝転移と密接に関連する因子を多変量解析により求めた。その結果、術後加療なし群では、リンパ節転移陰性群、pTNM-I/II群において、FF径、FF線維性状が遠隔臓器転移再発、骨転移再発、肝転移再発と密接に関係していた。

術後加療あり群では、リンパ節転移、pTNM病期に関係なく、FF径が遠隔臓器再発、骨転移再発、肝転移再発と密接に関係し、腫瘍壊死、N3(リンパ節転移個数10個以上群)が肺、肝転移と各々有意に相関した。研究の結果、FF性状は術後加療、リンパ節転移、pTNM病期に関係なく、遠隔臓器、特に骨、肝転移再発と密接に関係していることが明らかとなった。平成20年度では、FFに加え乳管癌リンパ管腫瘍塞栓を形成する腫瘍細胞の核分裂像、アポトーシス像に着眼したリンパ管組織異型度を考案した。393例の浸潤性乳管癌症例で検討した結果、術後加療の有無、リンパ節転移の有無、腫瘍径の違い等に関係なく、リンパ管腫瘍塞栓組織異型度は浸潤性乳管癌患者の腫瘍再発、腫瘍死と有意に関係することを既知臨床病理学的予後因子との多変量解析により明らかなものとした。この時、FFの存在もリンパ管腫瘍塞栓組織異型度と同様に優位な組織学的因子であることをあらためて確認した。
恋愛関係におけるストーキング・つきまとい行動の予測と対処に関する研究

本研究では、交際中のカップルにおけるデートバイオレンス・ハラスメントのうち、特につきまとい、ストーキングに関して、その実態を調査するとともに、交際初期に交際終了時におけるつきまとい・ストーキング行動を予測できるかどうかについて検討した。まず、1000組のカップルについて2年間の交際状況についての追跡調査を行った。その結果、349組のカップルについて2年間の追跡データを得ることができた。彼らに対して、現在の交際の有無を尋ねた結果、245名は交際継続中であった。2年間の間に交際が終結したと報告したのは104人であった。この104人について本研究では分析対象とした。分析対象者は、男性64名、女性40名であった。分析対象者に対し、交際終了の態様についての質問と26項目からなる交際終了後のつきまとい・ストーキング尺度を実施した。因子分析の結果、第3因子までで全分散の82.453%が説明された。第1因子は、つきまとい、監視などに関する項目から構成され「未練」因子と名付けた。α係数は0.958であった。第2因子は、脅迫や経費の請求などに関する項目から構成され「攻撃」因子と名付けた。α係数は0.957であった。第3因子は、身体的な接触やプライベートな情報の漏洩などの項目から構成され「なれなれしさ」因子と名付けた。α係数は、0.925であった。これらの各因子の得点が2年前の調査の成績から予測できるかについて重回帰分析、ロジステック回帰分析、機械学習等の方法を使用して、分析を行った。その結果、それぞれの因子とも「交際期間中のつきまとい・ストーキング行為」、「ギャンブル癖」、「社会的剥奪感」などが予測要因になっていることが示された。この結果をもとに、つきまとい・ストーキングについての予防策、防衛策について考察した。本研究は、カップルの追跡調査によってデートバイオレンス、とくにストーキングやつきまといの発生を予測することを目的としている。そのため、適切な調査対象選択や標本抽出作業、追跡調査のスケジューリング、アンケート実施手法の立案、アンケート項目の作成が極めて重要になってくる。研究初年度は、これらの問題について先行研究の結果を整理するとともに、最新の研究論文のレビューを行った。また、調査手法についてのウェブ調査会社との折衝、質問票の作成を十分に時間をかけて行った。これらの作業は年末におおむね終了したため、12月に1000組のカップルについてウェブでの質問紙調査を行った。ここでは先行研究で作成されたデートバイオレンス・ハラスメント尺度を実施したほか、交際状況や交際相手の特性について質問する複数の尺度を実施した。その後、年度末にかけてこの調査の基本的な集計を行ったほか、実施した尺度の信頼性について統計的な分析を行った。その結果、使用しているすべての尺度について統計的な信頼性が確認された。とくにデートバイオレンス・ハラスメント尺度については今後の研究を効率的に行っていくために統計的な手法を用いて短縮版尺度を構成した。この内容については論文化し、投稿中である。第1回調査のデータをもとにして、来年度後半に実施する第2回目の調査、再来年度に実施する予定の第3回目の調査で測定されるデートバイオレンス・ハラスメント、ストーキング、つきまとい行動が統計的に予測、制御できるかを検討していく予定である。また、ここでは、機械学習などの高度な統計的手法も用いるつもりであるため、この点に関して技術の習得、習熟を計画的に行っている。初年度の研究計画は、1)先行研究のレビュー、2)調査計画の立案、3)ウェブ調査の実施であったが、このすべてが予定通りに進行している。本研究は追跡調査なので、初年度の第1回調査結果のみからは主要な研究結果が得られることはない。しかし、初年度の調査結果の基本的な分析によって、研究に使用した尺度の信頼性や妥当性について確認でき、一定の成果を得ることはできた。また、実験に用いる短縮版尺度の作成を行った。最も重要なのは本年度後半(11月を予定している)に行う第2回調査なので、現在はその調査に向けて準備を行っている。恋愛関係にある二者間におけるドメスティックバイオレンス・ハラスメント、とくにストーキングやつきまといについての調査を行った。交際中のカップルについての面接調査と過去に交際経験のある調査対象者への面接調査を元につきまとい、ストーキングなどの行動に影響する可能性のある諸要因についてピックアップし、これを参考にして調査プラン(第2回調査)を作成した。昨年より追跡している1000組のカップルを対象にこの調査プランに従って、第2回調査を行った。調査内容は、現在および過去の本人および交際相手の属性、関係性、交際行動、心理特性、デートバイオレンスの状況等である。当初の予測通り、34割の回収率で1年後のデータを収集することに成功した。また、当初の予想通り、その約半数強が現在も交際を持続しており、半数弱が交際を終了していることが明らかになった。交際終了しているカップルにおいて、交際終了後にストーキング、つきまとい行動が発生したケースで、交際時のさまざまな属性、心理データなどをもとにして、その後のストーキング行動が予想可能かどうか、ロジスティック回帰分析、機械学習等の分析によって予測モデルを作成できるかどうかを検討した。また、交際継続中のカップルの中でもストーキング、つきまとい行動が増加しているケースについて、事前のデータからその状況を予測できるかについて検討し、モデルを作成した。現状でいくつかの予測モデルが構築されている。

今後はこれらのモデルをより詳細なものにしていく研究を進めていくとともに、別のカップルデータを使用してモデルの妥当性を確認していく。本研究のもっとも重要な部分である1000組のカップルの追跡調査が順調に推移している。とくに調査の結果、交際が継続しているカップルのデータと交際が終了しているカップルのデータ、つきまといやストーキングなどが発生しているカップルのデータが予想通りに収集できた点は大きく、本研究の最も困難な局面は乗り切った。また、カップルについての面接調査も一通り終了し、この結果は第2回目の調査に無事反映することができた。今後はこれらのデータの分析や、べつの調査サンプルについての調査を行うことになる。本研究では、交際中のカップルにおけるデートバイオレンス・ハラスメントのうち、特につきまとい、ストーキングに関して、その実態を調査するとともに、交際初期に交際終了時におけるつきまとい・ストーキング行動を予測できるかどうかについて検討した。まず、1000組のカップルについて2年間の交際状況についての追跡調査を行った。その結果、349組のカップルについて2年間の追跡データを得ることができた。彼らに対して、現在の交際の有無を尋ねた結果、245名は交際継続中であった。2年間の間に交際が終結したと報告したのは104人であった。この104人について本研究では分析対象とした。分析対象者は、男性64名、女性40名であった。分析対象者に対し、交際終了の態様についての質問と26項目からなる交際終了後のつきまとい・ストーキング尺度を実施した。因子分析の結果、第3因子までで全分散の82.453%が説明された。第1因子は、つきまとい、監視などに関する項目から構成され「未練」因子と名付けた。α係数は0.958であった。第2因子は、脅迫や経費の請求などに関する項目から構成され「攻撃」因子と名付けた。α係数は0.957であった。第3因子は、身体的な接触やプライベートな情報の漏洩などの項目から構成され「なれなれしさ」因子と名付けた。α係数は、0.925であった。これらの各因子の得点が2年前の調査の成績から予測できるかについて重回帰分析、ロジステック回帰分析、機械学習等の方法を使用して、分析を行った。その結果、それぞれの因子とも「交際期間中のつきまとい・ストーキング行為」、「ギャンブル癖」、「社会的剥奪感」などが予測要因になっていることが示された。この結果をもとに、つきまとい・ストーキングについての予防策、防衛策について考察した。現在は、本年度末(11月を予定)に実施予定の調査にむけて、ウェブ調査項目の精査を行っている。そのために第1回調査の結果をさまざまな観点から分析している。機械学習などの高度な統計手法について、第1回調査とは別のソースから得られたデータをもとに分析を行い、技術の習得、習熟に努めている。今後の研究は、実証的な部分に関しては、1)1000組のカップル追跡データのより詳細な分析と、2)新たな調査対象者についての調査と分析
核偏極技術を用いたスピンコントラスト変調中性子回折法の確立

タンパク質や薬,物質などの機能を決定する上で水素の位置が非常に重要であり,工学・化学・生物・製薬など広い分野で水素位置を特定したいという要望がある。水素位置を特定するのに中性子回折法と呼ばれるレントゲンのようなものを用いるが,位置情報を持つ信号は微小なものであり,特定が難しい。そこで原子核が持っている"スピン"と呼ばれる量を揃える核偏極という技術を用いることで位置情報を持つ信号を高感度で取得できる。本研究は核偏極技術を応用し,中性子回折法で水素位置の信号を高感度で取得する手法を確立する。
嫌悪刺激の各種情報の有無がラットの情動と行動に与える影響に関する実験的研究

1.ラットの摂水行動をベ-スラインとする条件性抑制場面において、グリッド電撃の長さに関する情報の有無と、信号ー電撃間隔が変動する場合と固定の場合について、2×2の要因計画によって次の4群を設け、事態の持つ不確かさ(情報欠如)が持続的情動を高めるであろうとするImada & Nageishi(1982)の仮説を、摂水行動の持続的乱れを持続的情動の指標として実験を行った。各群には12匹のラットを配置した。2.CF群:異なる長さの電撃が別個の信号と相関(correlated)しており、また信号ー電撃間隔は10秒に固定(fixed)された群。CV群:信号ー電撃間隔が5,10,15秒と試行によって変動(variable)する以外はCF群と同じ。UCF群:信号ー電撃間隔は10秒と固定されているが、二種の信号と電撃の長さが相関していない(uncorrelated)。したがって電撃の長さに関する情報が信号によって与えられていない。UCV群:信号ー電撃間隔が5,10,15秒と試行によって変動する以外はUCF群と同じ。3.信号には光(170 lx)と純音(1000Hz,84dB)を用い、電撃は短電撃は0.7秒に固定し、長電撃は初期には2.1秒、後には2.8秒とした。電撃強度は初期は100V、後には140Vとした。4.摂水行動の持続的乱れは、信号ー電撃変動条件の方が固定条件よりも著しく、これは仮説と一致した。しかし電撃の長さに関する情報が与えられていない条件において、それが与えられている条件におけるよりも顕著な摂水行動の乱れが見られるであろうとの仮説は支持されなかった。同様の実験を2度反復したが、得られた事実には変わりはなかった。また副次的に、長い電撃と相関した信号は、短い電撃と相関した信号よりも顕著な条件性抑制を引き起こすことが見いだされた。操作子を用いた実験は次年度に実施することとなった。
模型振動台実験による建築基礎構造物の地震時土圧分担機構の解明に関する研究

本研究の目的は、シリコン模型地盤を利用して、基礎種別、根入れの有無・上部構造の階数をパラメータとした模型振動台実験から、地震時地下部に作用する水平力や動土圧の耐震設計評価を実証的に確認することであった。動土圧計測装置が備わった根入れ部模型を作成して、基礎固定時の根入れ基礎、根入れの有るベタ基礎、根入れの有る杭基礎、で各種の実験を実施し、得られた結果を以下にまとめる。1.基礎の動的相互作用ばねは建物の固有周期・スウェイ率・ロッキング率などの振動特性に大きく影響を及ぼし、杭の効果は主にロッキング動に、根入れの効果は主にスウェイ動に対して大きいことが判明した。2.上部構造の固有周期が地盤より長い場合、地震力作用時の基礎部の水平力分担に対する根入れ効果は、主に前後面土圧が抵抗力として有効に作用し、ほぼ耐震設計指針どおりに杭頭に作用する水平力は低減することが確認できた。3.上記と逆に、表層地盤より上部構造の固有周期が短い場合、地盤の1次固有モードが支配的な長い周期域では、基礎根入れ部、特に前後面土圧は表層地盤の増幅により入力として基礎を押すように作用し、杭頭に作用する水平力は増大することが判明した。この結果は、従来の静的な解析で得られた耐震設計指針に記述していないものであった。4.上部構造の固有周期が表層地盤のそれと近接する場合には、上部構造の支配的な振動モードでも表層地盤の増幅効果によって、基礎根入れ部による杭頭に作用する水平力の低減効果は耐震設計指針よりも低減することが判明した。現在、この振動実験を有限要素法によってシミュレーション解析しており、両者の結果から、建築基礎形式の違い、根入れの有無、上部構造と表層地盤の固有振動数の大小関係、が建築物の振動性状や地震時の作用外力性状に及ぼす影響をより明確に把握することが可能になると思われる。
総合型地域スポーツクラブの成果と課題-特にクラブマネジメントとクラブライフについて-

1.NPO法人格を有する我が国の代表的な総合型地域スポーツクラブの事例分析により、クラブマネジメントの特質が明らかにされた。具体的には、1)会員の無関心体質とトップダウン型経営、2)自主運営に対する偏った解釈3)行政主導型からの自立困難性4)不明確なクラブ理念ゆえの短期的視野などがその特徴であった。2.346クラブのマネジャーを対象とした調査結果から、総合型地域スポーツクラブをめぐる組織マネジメントの現実と課題を検討した。1)タスクレベルにかかわらず全般的にクラブ運営に参加している会員の割合は少なく、特に一般会員の運営参加に対する意識が低い。2)運営参加の促進策としては、種目別部門化を図るなど自立的な運営単位を設けているクラブが多いが、クラブの理念・趣旨が入会段階から正しく伝えられていないことが運営参加を阻害している。3.クラブ会員への質問紙調査により、次のことが明らかにされた。1)会員のクラブ入会における生活行動の変容は、運動・スポーツの実施頻度の増加と地域におけるネットワーク拡大にとどまっており、スポーツ活動の多様化や地域活動への参加に対して大きな成果は認められない。2)会員自身による効果意識の分析から、「スポーツの個人的効果」と「世代間交流」は強く認識しているものの地域アイデンティティや家庭生活に対する影響はさほど高くなかった。4.クラブ創設に対する行政支援の現実、役割意識、行政支援の阻害要因等について、296の市町村行政を対象とした調査結果に基づき検討した。行政支援のための資源の不足等基本的条件の不足等共通課題があるものの、行政がクラブ育成に期待する便益によって支援への意識や行動に差異が生じていることが明らかとなった。本年度は、総合型地域スポーツクラブの質的な経営の実態を明らかにすることを目的とした。具体的にはNPO法人格の取得を果たした先進事例といわれる3つのの総合型SCを対象に、各クラブがNPO法という新しい制度の登場に対し、誰がどのような意思決定方式を経て対応していったのか、その取得過程(NPO法人格の認知から取得に至るまでの過程)を記述した。そしてその中から、1)なぜそのような取得に向けた意思決定方式が採られたのか、2)法人化の検討に中心メンバーとして参加した関係者たちが法人化というクラブの変革にどのような期待を込めたのか、また、そのような期待や動機が生じたのはなぜなのか、を明らかにすることにより、クラブ関係者たちが抱く総合型SC観や将来ビジョン、NPO法(特定非営利活動促進法)の制定というクラブ経営をめぐる新しい制度的環境の変化に対して、法人格認証団体となったクラブがたどった意思決定過程に焦点を当てた。3つのクラブへのインタビュー調査及び関連資料の収集により、総合型地域スポーツクラブにおける意思決定過程に共通するクラブ経営上の特徴が浮き彫りにされた。その第一は、クラブの重要な意思決定事項は、会員の僅か1%前後の運営役員によって進められ、他の会員には事後的報告がなされるのみというトップダウン型経営方式が採られていること、そしてそれは会員のクラブ経営に対する無関心さ故の対応であると考えられること。第二に、法人化過程においてスポーツ行政の意図が強く働いており、住民主導型経営への転換が困難であること、第三に、クラブの意思決定は当面の経営課題、特に経営資源の円滑な調達に関心が焦点化され、長期のビジョンや理念と照合しながらの議論がなされていないことなど、未だ脆弱な経営基盤にあることが明らかにされた。本年度は、総合型地域スポーツクラブに入会している会員の生活変容の実態から総合型地域スポーツクラブの有効性(成果)を明らかにすることを目的とした。そこで、4つのスポーツクラブの会員計1,774名を対象に質問紙調査を実施した。主要な結果は次の通りである。1)運動・スポーツの実施頻度については、全てのクラブにおいて加入前より高まっており、週1回以上の実施率が70%に達していた。

しかし、スポーツ参加の多様性(種目の多様性と事業の多様性)については顕著な効果は認められなかった。2)会員の運営参加については、約50%をこえる会員がクラブ運営に携わっていない状況が明らかとなった。また、運営参加者と非参加者の間に受益者負担意識や自主運営意識に差異が認められた。特に、クラブへのアイデンティティやクラブの社会的評価については、いずれの項目においても運営参加群の方が高い得点を示した。このことから、いかに多くの会員の経営参加を促すか、またどのような参加形態をどのように取り込んでいけばよいかなど、会員参加のシステム開発が求められる。3)地域生活に対する効果としては、地域活動への参加はほとんど変化が見られなかったのに対し、地域内の人的ネットワークを拡大するというインパクトは認められた。しかし、クラブ入会による知人・友人の増加数は数名程度に止まっており、その親密度も極めて低くなっていた。4)クラブ入会による生活や意識の変容については、因子分析の結果、「スポーツの個人的効果」「地域へのアイデンティティ」「スポーツ活動の多様化」「世代間交流」「家庭生活」「スポーツ指導」の6つの因子が確認された。このことから、クラブへの入会はスポーツの個人的便益だけでなく地域コミュニティへの社会的効果も期待することができると考えられる。本年度は、総合型地域スポーツクラブにおけるクラブマネジメントの課題を明らかにすることを目的とした。そこで、全国に既設されている504のスポーツクラブ(クラブマネジャー)を対象に質問紙調査を実施した(有効回答数346、回収率68.7%)。主要な結果は次の通りである。1)クラブへの運営参加に対する認識は、運営役員と一般会員では大きな隔たりがある。2)クラブにおけるマネジメントタスクを「クラブ理念・方針や事業計画の検討」「事務的活動」「個別事業の企画・運営」「経営資源の調達・整備」の4つに分類し、運営役員と一般会員の関与の状況を調べたところ、「クラブ理念・方針や事業計画の検討」及び「事務的活動」については、ほとんど一般会員の参加はなく、事業への運営参加や資源の調達に関わるタスクについては34割のクラブで会員の参加がみられた。3)クラブの意思決定については、大半のクラブで運営委員会が担っており、会員の参加はみられない。4)会員参加を促す方策を講じているクラブは、全体の38.3%と必ずしも多くない。しかし、「今後対策を練ろうとしている」クラブを含めると9割を超えており、会員の運営参加システムを模索している段階であると考えられる。5)会員の運営参加を阻害する要因については、時間的・労力手な負担感、会員の入会目的の割合が高い。会員の入会プロセスにおいて、クラブの理念や趣旨の説明が充分になされ、理念への賛同を取り付けるという手続きがとられていないクラブが多いと推察される。
白麹菌のクエン酸合成・分泌に関わる遺伝子クラスターの機能解明

本研究課題は、白麹菌のクエン酸高生産機構の一端を解明することを目的として行った。白麹菌のゲノムにおいてクエン酸合成酵素遺伝子(citA)の近傍に保存されているクエン酸-オキソグルタル酸対向輸送体遺伝子(yhmA)とRNA結合タンパク質遺伝子(nrdA)がクエン酸生産に関与すると推定し、これらの機能解析を行った。昨年度、yhmAとクエン酸-リンゴ酸交換輸送体をコードするctpAの二重破壊条件が最小培地では合成致死であり、リジン要求性となることを明らかとした。本年度は、ctpAとyhmAの二重破壊条件において、細胞質のAcetyl-CoAが顕著に減少することを明らかにした。この現象は、CtpAとYhmAによってミトコンドリアから細胞質に輸送されるクエン酸がATP citrate lyase(ACL)によるAcetyl-CoA合成に用いられているためと考えられた。また、リジン合成の初期反応にAcetyl-CoAが必要とされるために、ctpAとyhmAの二重破壊条件において細胞内リジン濃度が低下して、リジン要求性となったと考えられた。実際に、同条件において細胞内のリジン濃度が低下することを確認した。以上の結果から、CtpAとYhmAによるミトコンドリアから細胞質へのクエン酸輸送がAcetyl-CoAの合成に重要な役割をもつことが明らかになった。次に、白麹菌においてnrdA遺伝子の破壊株を取得できなかったことから、nrdA遺伝子は必須遺伝子であると考えられた。そこで、Tet-Onシステムを用いてSタグ融合nrdAのコンディショナル発現株を構築した。また、抗Sタグ抗体を用いたRNA immunoprecipitation解析を行い、取得されたRNAを次世代シーケンス解析に供した。これにより、NrdAと相互作用するRNA分子種の候補を得た。本研究は、白麹菌のクエン酸高生産機構を解明することを目的として行った。白麹菌を含む子嚢菌門のゲノムにおいてクエン酸合成酵素遺伝子(citA)の近傍に保存されている推定クエン酸-オキソグルタル酸対向輸送体遺伝子(yhmA)と推定RNA結合タンパク質遺伝子(nrdA)がクエン酸高生産に関与すると推定し、これらを解析対象とした。まず、白麹菌においてyhmA破壊株と推定クエン酸-リンゴ酸交換輸送体をコードするctpA遺伝子の破壊株を構築した。その結果、yhmA破壊株は野生株と比較して生育が遅延し、分生子形成能が低下した。また、ctpA破壊株は分生子形成能が低下し、加えて低温培養条件(25°C)において生育が遅延した。各破壊株の菌体量あたりのクエン酸生産量を比較したところ、yhmA破壊株では野生株の約30%、ctpA破壊株では約40%に低下した。以上の結果から、いずれもクエン酸高生産に関与することが示唆された。また、出芽酵母においてクエン酸輸送体をコードするyhm2(白麹菌yhmAホモログ)の遺伝子破壊株を構築し、白麹菌のYhmAを発現させたところ、yhm2破壊株の表現型である酢酸を炭素源とする最小培地での生育遅延が改善したことから、白麹菌のYhmAは出芽酵母のYhm2の機能を相補することが示唆された。さらに、各破壊株において、GFP融合タンパク質を発現させたところ、破壊株の表現型を相補し、YhmA-GFPおよびCtpA-GFPはいずれもミトコンドリアに局在することが示唆された。次に、白麹菌を宿主としてSタグを付加したYhmAとCtpAをTet-Onプロモーター制御下で発現し、タグ精製する系を構築した。さらに、白麹菌においてTet-Onシステムを用いたnrdA遺伝子のコンディショナル破壊株を構築した。来年度以降に予定していた推定クエン酸輸送体タンパク質の精製系の構築がうまくいったため“当初の計画以上に進展している。"とした。本研究は白麹菌のクエン酸高生産機構の一端を解明することを目的としている。白麹菌のゲノムにおいてクエン酸合成酵素遺伝子(citA)の近傍に保存されている推定クエン酸-オキソグルタル酸対向輸送体遺伝子(yhmA)と推定RNA結合タンパク質遺伝子(nrdA)がクエン酸生産に関与すると推定し、これらの機能解析を行っている。本年度は、まず、白麹菌のミトコンドリア局在型クエン酸輸送体(CtpAとYhmA)の諸性質を解析した。白麹菌からCtpAとYhmAを精製し、リポソームに再構成して14C標識クエン酸を用いてクエン酸輸送活性を測定した。その結果、CtpAとYhmAは交換輸送活性のみを示し、CtpAはリンゴ酸とcis-アコニット酸を対向基質としてクエン酸輸送活性を示し、一方、YhmAはリンゴ酸、cis-アコニット酸、オキソグルタル酸、オキサロ酢酸、コハク酸を対向基質としてクエン酸輸送活性を示した。次に、昨年度、白麹菌においてctpAとyhmAのそれぞれを破壊すると、菌体あたりのクエン酸生産量が減少することを報告した。そこで、本年度はctpAとyhmAの二重破壊株の構築を試みたが取得できなかったため、合成致死となることが示唆された。以上から、まず、Tet-Onシステムを用いてctpAのコンディショナル発現株を構築して、当該株のyhmA遺伝子を破壊した。