hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2次元イメージ撮像型X線偏光検出器によるLHDプラズマの測定

ガス増幅度の試験では高圧分配機を自作し、最大5.0kVの印加電圧を2段に配置したGEMフォイルに与え、X線電子の電子増幅度の試験を行い検出に十分な2次電子の電子増幅度が得られる事を確認した。さらに、核融合科学研究所大型ヘリカル装置(LHD))に取り付けるための偏光検出器用真空槽の製作を行い真空試験の後、GEMフォイルとCMOS検出器と組み合わせた偏光検出器としての動作試験を行った。偏光検出器用のガスにはArガスに放電を抑制するためにCO_2ガスを30%を加えたガスを使用した。ガス増幅デバイスと組み合わせた検出器は、X線検出用半導体に改造を加え電化読み出し型CMOS検出器として使用した。検出面積は、5.0×5.0cm^2。ピクセルサイズは、48×48um^2。LHDプラズマの2次元イメージ検出には、ピンホールカメラの原理を採用し検出器から9m先のプラズマが十分な分解能で検出できるようピンホールを配置した。また、LHD本体のプラズマ炉の真空保持と可視光、低エネルギーX線をカットするためにピンホール手前に0.5mm厚のBe膜を配置している。実験室レベルでのX線入射試験では偏光の検出に成功し装置の有効性を実証できたが、LHD取り付け直前に検出器が放電により故障、修理が間に合わずLHDプラズマの偏光測定に関しては実施できなかった。
スピーチコミュニケーションの学習指導を支援する,授業分析システムの開発

1授業観察計画を立て授業分析方針について協議・決定した。2小学校6校で、国語・算数・理科・社会・道徳・音楽の授業観察を行いその結果をビデオ収録した3ビデオ収録した授業の一部分について,文字化原稿を作り,研究分担者と協議を重ねて会話分析を行った。このシステムは,授業の文字化原稿の任意の文字をクリックすると,その映像を瞬時に検索できる。5マクロメディア社のマクロメディアディレクターによってマルチメディアの分析システムを開発した。このシステムは,パソコンの画面上に,ビデオ映像・音声と文字化原稿を同時に取り込むことができる。さらに,取り込んだ映像・画像・音声を編集して,次のような作業を行って分析に役立てることができる。(1)取り込んだ映像を分析に必要な速度に変えたり繰り返して見ることができる。(2)取り込んだ映像を一こまずつ見ることができる。これによって,教師と生徒の会話を詳細に分析できる。(3)取り込んだ映像を見ながら,音声を聞くことができる。これによって,視線や非言語的なコミュニケーション活動を詳細に分析できる。(4)取り込んだ映像を見ながら,音声を聞き,同時に音声を文字化した画面を見ることができる。(5)画面上にボタンを作って,分析の必要な別の画面に瞬時にジャンプして分析することができる。(6)様々な映像と音声を蓄積したデータベースを作って,メニューから検索することができる。6各教科ごとに,収録した授業について授業分析を行い,その結果について研究会議で発表し,報告した。
揮発性有機塩素化合物を無害化するための光触媒の開発

我々は,ゾルーゲル法で合成した多孔質な二酸化チタンペレットを用いてエチレン,塩化ビニル,トリクロロエチレン(TCE),テトラクロロエチレンの光触媒分解反応を研究し,反応の途中で反応中間体から脱離した塩素ラジカルが付加反応を起こし,有害な塩素系副生成物が生成するという反応機構を提案している。この機構に基づけば,塩素ラジカルの触媒表面での生成を抑制できれば,有害な副生成物の生成を抑えることができると考えられる。そこで,本研究では,塩素ラジカルをトラップすると考えられる種々の金属粉を二酸化チタン粉末と均一に混合し触媒層の長さを固定して,流通型装置を用いてTCEの光触媒分解実験を行った。反応効率,無害化効率,副生成物であるホスゲンやクロロホルムの生成量,および触媒表面に残るジクロロ酢酸や塩化物イオンの生成量について調べた結果,銅粉を共存させることにより副生成物の抑制効果が顕著に観察できた。すなわち,銅の添加量が増加すると,トラップされる塩素の量が増大し,40wt%以上の銅の存在下ではほぼ100%塩素がトラップされることがわかった。さらに,銅の添加量の増加とともに,TCEの反応効率はわずかに減少するが,二酸化炭素への分解効率は増大し,副生成物であるジクロロ酢酸の生成量は低下した。これは,銅の共存により,塩素ラジカルの付加反応が抑制されたことを意味する。また,生成したホスゲンとクロロホルムの量は,銅を約50wt%共存させることにより,添加しない場合の50%に低下させることができた。銅の代わりに水酸化カルシウムを用いても同様な結果が得られたが,特にホスゲンの生成が大きく抑制できることがわかった。以上のように,有害な塩素系副生成物の生成を抑制するためには,銅や水酸化カルシウムを共存させることが必要であることがわかった。本研究結果は,我々が提案している反応機構の妥当性を示す結果でもある。
細胞膜動態を解析するための新規機能性マイクロ電極の開発

走査型電気化学顕微鏡(SECM)は、マイクロ電極をプローブとすることで生きている細胞を評価することができる。本研究では、細胞膜の状態を評価するための機能性マイクロ電極および、一細胞を長時間、連続観察可能なSECMシステムの開発を行った。開発したシステムでは、細胞を対象に3分間隔で24時間以上の連続した観察が可能となり、低温下における細胞高さの経時変化を測定できた。SECMはマイクロ電極をプローブとし,試料表面に接近させて2次元的に走査することによって表面の局所領域における電気化学反応を検出・誘起することが可能なシステムである.SECM測定において、親水性電子メディエータを利用すると一細胞を対象に細胞の状態(大きさや膜の透過性)を観察することが可能となる。しかしながら、観測される電流値はプローブ電極・試料間の距離に依存するため、長時間の測定は振動や温度変化が原因となり困難であった。そこで、本研究では、低温下の細胞の状態を連続測定するために、温度制御化で長時間連続測定可能なSECMシステムの開発を行った。また、細胞の状態を詳細に解析するために、酵素を用いたマイクロ電極の機能化を検討した。1.温度制御下で細胞を連続観察可能なSECMの開発プローブであるマイクロ電極の走査方法を複数組み合わせることで、測定系を安定させた独自の制御技術を構築し、さらに、温度性制御機構を導入した新しいSECMを開発した。このSECMを用いることで、24時間以上連続して低温下の細胞を観察可能になった。低温化(4°C)に置いた細胞は一定の状態を保った後、急激に膨潤して破裂する様子が観察され、低温ストレスが細胞に与える影響を評価することができた。本システムを用いることで、細胞保存液の開発などへの応用が期待できる。2.高機能マイクロ電極の開発細胞から放出される乳酸脱水素酵素(LDH)の活性を測定することで、細胞が受けた障害を測定することができる。LDH活性を測定可能なマイクロ電極を開発するために、今年度は、酵素系の検討を行い、LDH活性の電気化学的な測定を実現した。SECMはマイクロ電極をプローブとし,走査することによって局所領域における電気化学反応を検出・誘起することが可能なシステムである。他のプローブ顕微鏡と異なり対象とプローブの距離が1μm以上離れていても観察できるため、細胞などの生体試料を対象とした応用が期待されている。しかしながら、観測される電流値はプローブ電極-試料間の距離に依存するため、振動や温度変化が原因となり長時間の測定は困難であった。そこで、本研究では、一細胞を長時間、連続観察可能なSECMシステムの開発を行った。開発したシステムを用いて、培養条件下および低温下において一細胞を長時間連続観察した。1.温度制御下で細胞を連続観察可能なSECMの開発:プローブであるマイクロ電極の走査方法を複数組み合わせることで、測定系を安定させた独自の制御技術を構築し、さらに、温度性制御機構を導入した新しいSECMを開発した。本システムでは、一細胞を対象に3分間隔で24時間以上の連続した観察が可能となり、この時、イメージングだけではなく細胞高さの経時変化を50nm以下の解像度で測定できた。このSECMを用いることで、細胞分裂の様子や、薬物により刺激を受けた細胞の形状変化などが観察できた。2.低温保存された細胞が受けるダメージの評価:開発したシステムを用いて、低温下(4°C)の細胞を観察したところ、一定の状態を保った後、急激に膨潤して破裂する様子が観察され、低温ストレスが細胞に与える影響を評価することができた。また、低温において細胞保護効果を有する物質を保存液に添加した結果、保護効果を解析することができた。
高圧力が引き起こす有機物の重合反応：氷衛星・氷惑星内部は化学進化の場となるか？

科研費が採択されて2018年6月までの約2ヶ月間で以下の研究を行った。採択後直ちに本研究を遂行する上で基盤となる分析装置であるLC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析計)、紫外可視分光装置などを導入した。一般的には硫酸触媒を加えて加熱条件下でメチルアルコールと酢酸との間で進むエステル化反応が、無触媒、室温高圧下で大きく促進されることを見いだした。さらに出発物質に過剰な水を加えることにより、高圧下で氷VII相(高圧相)が析出し、反応が100%の収率で進行する現象を見いだした。同様にリン酸と酢酸との反応においても、高圧下で反応が促進すること、水が氷高圧相として晶出することでさらに反応が進行することが明らかになった。これらの研究では、本科研費によって導入されたLC-MSを用いて反応生成物の精密解析を行った。かねてより研究していたアミノ酸の高圧下における脱水縮合反応について、光学選択性について研究を進めた。まだ不明な点も多いが、高圧下で二量体から三量体が生成する過程で、明らかな光学選択性が見られた。以上の研究結果から、氷惑星・衛星内部に存在しうる氷の高圧相の周辺で、重要な有機化学反応が起こっている可能性を示すことができた。今後は反応速度の精密解析、反応過程におけ光学選択性などをより詳細に検討していく予定である。本科研費の支援は終了するが、本研究計画の分担者と協力しながら、今後も継続して高圧力下での有機化合物(特に生命の材料となりうるアミノ酸に着目する)の挙動について研究を進めていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
認知行動療法の効果基盤となる注意制御プロセスの解明

認知行動療法(CBT)の効果基盤となる注意制御プロセスを解明するために、注意制御を促進する訓練の効果がCBTの効果に及ぼす影響について検討した。強迫性障害または社交不安障害のそれぞれの症状が臨床群と同程度の大学生を対象に注意訓練を実施した後に、従来型CBTを実施するパッケージ介入(PT)を実施した。その結果、PTはそれぞれの技法を単独で介入した群よりも高い効果を示した。それぞれの群における介入前後の注意様式を両耳分離聴課題や視線追尾装置を用いて測定した結果、注意制御能力は思考の自己制御能力を促進することで症状を軽減していることが示された。制御の問題が指摘されている社交不安障害(SAD)傾向を有する大学生と強迫性障害(OCD)傾向を有する大学生を対象に、Wells(2009)が開発した「状況への再注意法(SAR)」と「注意訓練(ATT)」に準じた実験を実施し、注意制御様式の異同について検討を行った。その結果、SADにおいては情報入力系に関する注意制御に障害が認められた。また、OCDにおいては入力された情報を処理する際の注意制御に障害が認められた。つまり、SADにおいては、スピーチ時における聴衆に関する情報を適切に入力できていないことが、後の認知的事後処理(PEP)に影響を及ぼしていることが明らかとなった。また、OCDにおいては、ネガティブな自己関連刺激に関する入力処理に関する注意制御の問題よりも、入力後の情報処理に関する注意制御(心配・反芻への集中)に問題があることが明らかにされた。これらの知見から、SADにおいては、情報入力系に関する注意制御の促進を目的としたSARの適用が効果的であり、OCD傾向者においては、情報操作系に関する注意制御の促進を目的としたATTの適用が効果的であることが示唆された。SADにおける注意制御様式の移動に関する知見をふまえて、SAD傾向の大学生を対象にSARの介入効果の検討及びその作用機序の検討を行った。視線追尾システムを用いて、SAD傾向者における情報入力に関する注意制御様式を把握するとともに、SARにおける「スピーチ時において聴衆の顔をよく観察する」という注意操作の確認を行った。その結果、SAD傾向者は健常者と比較して、顔表情を見る回数が少ないことに特徴があるのではなく、注視時間の短さに特徴があることが明らかとなった。SARを適用することでSADが改善した者においては、聴衆の表情に対する注視時間が長くなり、適切なオンライン処理が実行されていることが確認された。本研究は、CBTの効果基盤となる注意制御について検討することであった。まず、注意制御機能と症状との関連について検討するために強迫観念症状が高い大学生(強迫観念傾向者)と社交不安症状が高い大学生(社交不安傾向者)において実験を実施した(実験参加者の症状はいずれも準臨床レベル)。具体的には、強迫観念傾向者には汚物(に似せた物)を目前にしている状況を設定し、社交不安傾向者にはスピーチ場面の状況を設定したうえで、各傾向者における対象物への視線注視様式と前頭前野背外側部(DLPFC)の賦活性を測定した。各傾向が低い大学生(健常大学生)と比較した結果、いずれの傾向者においても、脅威対象物(汚物や聴衆者の顔)を注視する時間は短かった。ただし、脅威対象物を見る回数については、健常大学生との差が見られなかった。同様に、DLPFCの賦活性をNIRSを用いて比較した結果、各傾向者とも健常大学生と比較して、コントロール課題(強迫:花瓶を見る/社交不安:人形を見る)よりも賦活性が低いことが示された。次に、これらの傾向者に「注意の再集中法(Situational Attention Refocusing(SAR))」という注意訓練を用いた介入研究を実施した。SARは、脅威対象物を直視しながら、その際の心的イメージ・思考・感情から距離をとる心的態度を獲得する技法である。介入の結果、各傾向者における症状は健常大学生程度にまで軽減した。また、視線注視様式を測定した結果、脅威対象物への注視時間が介入前よりも長くなることが示された。また、DLPFCにおける賦活も介入前よりも高いことが示された。一般大学生を対象に、注意制御機能と精神障害(強迫性障害:OCD、社交不安障害:SAD)の関連と、注意制御機能を土台とする介入技法(ATT・DM・SAR)の作用機序に関する検討を行った。【注意と精神障害との関連性1】注意制御機能を多面的に測定する尺度(ACQ;今井, 2009)を用いて、OCDやSADの症状との関連を検討した。その結果、OCDは注意制御機能の中でも特に、「注意の転換」において機能不全を示していることが明らかとなった。また、SADにおいては、「注意の転換」と「注意の分割」における機能不全が示された。

OCDやSADと関連する症状(特性不安・抑うつ)においては、「注意の転換」における機能不全は示されなかった。この結果から、本研究が対象とするOCDやSADの特徴として、「注意の転換」における機能不全が示唆された。【注意と精神障害との関連性2】注意制御課題の遂行中における脳血流を測定し、OCDやSADの症状との関連を検討した。脳血流の測定においては、「注意の転換」などの注意制御を担っているとされている前頭前野背外側部(DLPFC)を測定箇所とし、NIRSを用いて測定した。その結果、OCDとSADの傾向が高い者は、その傾向が低い者に比べ、脳血流の賦活が低い傾向が示された。【注意介入技法の作用機序】本研究が研究対象としている注意介入技法の効果性を測定する尺度(DMS)を開発し、CBTが対象としている認知的対処変数(確証型・反証型・問題解決型)との関連性を検討した。その結果、注意制御機能を土台とした介入は、OCDやSAD症状の維持要因である確証型認知的対処の影響を低減することが明らかとなった。以上の研究結果をまとめると、OCDやSADの介入においては、その持続要因である確証型認知的対処に固定されている注意を転換することの必要性が明らかになり、臨床的にも有益な知見が示された。本研究は、介入に関する作用機序を把握するための実験研究と、それらの知見を活かした介入研究で主に構成されており、一定の期間を要する研究で構成されている。また、臨床心理学的研究という性質上、それぞれの実験および介入においては、安全性の確保などを考慮して、予備実験などを経た後に、本実験に着手する手続きをとっている。3.11震災の影響で、実験及び介入に必要な視線追尾システムの購入において半年程度の遅延が生じたため、全体の計画も半年程度遅れている。しかしながら、実験研究と介入研究において、同時に進行できる部分においては適宜研究を遂行した部分もあるため、「やや遅れている」という達成度である。研究内容においては、これまでの先行知見について新たな観点から裏付けるエビデンスが得られたことや、効果増強につながる新たな注意制御のメカニズムに関する知見が得られたため、十分な達成が得られていると考えている。初年度においては、視線追跡装置を用いた実験などを行う予定であったが、震災に伴う予算額の縮減などの通知があってからは、視線追跡装置を購入する予算の不足を考慮して、それらの装置を使用しない研究から実施する必要性が生じた。したがって、当初の研究計画の進行順とは異なる順序で進行したため、研究内容の重複などが一部で生じ、効率が若干悪い状況があった。視線追跡装置が2月に購入できてからは、研究に必要なパイロットを多くこなすことができ、計画の進捗は安定してきている。当初の計画進行に十分に追いつける程度ではあるが、若干の遅れが現状として確認できる。現在進行中の実験研究を継続しながら、介入研究におけるエビデンスを頑健なものにするために、多くの実験参加者を対象に研究を進めていきたい。これまでの研究においては、介入にともなう実験的な性質をもった研究と、介入に関する研究のそれぞれを独立させて研究(予備実験・本実験または介入)を実施してきた。
カチオン性シアニン色素のミトコンドリアに対する光増感作用と抗がん活性

カチオン性シアニン色素tri-S-C_4(5)の分子設計を行い、これらのミトコンドリアに対する特異的反応性の機構及び抗がん活性、光増感作用のメカニズムを細胞生化学的に解明することを目的とし、以下の知見を得た。1.カチオン性シアニン色素tri-S-C_4(5)を中心に有効な構造因子を知るために、まずアルキル鎖長を変化させた誘導体について、ミトコンドリアに対す影響をみた。〈計画1),5)〉2.単離方法の確立されていないAH-130腹水癌細胞からのミトコンドリアの単離を検討した結果、ジキトニン処理による方法が最良であることを見い出した。光の非照射下においてtri-S-C_4(5)は、このミトコンドリアのATP合成阻害活性を正常のミトコンドリアに対するそれの約半分の濃度で示し、癌細胞ミトコンドリアに対する優位性を持つことを明かにした。また正常細胞で明かにしたミトコンドリアのADP/ATP透過担体に対するこれらの色素の関与を癌細胞でも検討中である〈計画2),3)〉3.またAH-130細胞(5×10^8cells)に対して25μMtri-S-C_4(5)を作用させ、取込み量の10分間での経時変化を調べた結果、tri-S-C_4(5)は時間依存的に取込まれることが分かった。さらに脱共役剤SF-6847の前投与によるtri-S-C_4(5)の取込み阻害は、濃度依存的であった。この結果より、tri-S-C_4(5)は非エネルギ-下状態の細胞もしくは死細胞に対し細胞膜から脱離していくことが示唆された。〈計画4)〉4.以上の結果から、tri-S-C_4(5)は癌細胞に対して親和性を持ち、正常細胞のミトコンドリアより低濃度でATP合成を阻害することが分かった。またエネルギ-下状態により、細胞に対する結合性が変化してゆくことも明かとなった。今後これらの成果に基づいて、カチオン性シアニン色素の光増感作用と抗がん活性のメカニズムについて、さらに詳細に検討を加え、新しい機能をもった抗がん剤を開発するつもりである。
漢字音の長音教材開発－漢字音対照と音符を用いて－

長音に限らず、漢字音学習に音符がどのくらい活用できるのかについて、音符の50音順に常用漢字の字音を網羅的に調査し、そのうち、カガ・タダ・ナ・ハバ・マ行の結果の報告を学会発表および論文の形で行った。804字の形声文字を249の音符グループに分類したが、音符字と同音の字は584字に及ぶ。中国語の頭子音が、より単純な音韻構造を持つ日本語に入って、有気無気などの違いが失われたり、中国語中古音の有声音が写された呉音でなく、その後無声化が進んだ長安音を反映した漢音を採ったため、日本語で同音になった字音も多い。こうした同音符同音の字について、字音語の学習レベル別に導入する例を示した。これは、前年度、欧州の学会で、学習者が上級に至る前の段階で、音符が活用できないのかという質問を受けたことに応えたものである。字音語のレベルをjReadabilityによって判定し、音符と字音語を1初中級(例長:社長、出張、手帳) 2中級(例亢:航空、抵抗、炭坑)3上級以上(例畜:貯蓄、家畜)の3段階に分けた。1の音符数は44で3の45より少ないが、漢字数は135字で、3の108字よりも多い。1の音符当たりの漢字数は3.1字で2、3の2.4字より多く、早い段階での音符学習の効果がより大きいことを示している。一方、呉音か漢音かによって、同じ音符グループの字にも清濁(例:奉、棒)や鼻音・非鼻音(例:妄、望)の違いが生じた。そのほか、中国語上古音から中古音への変化が音符グループ内に複数の字音をもたらしたものもある(例:各、絡)。調査した範囲では、字音1種類の音符グループが117あって最も多く、次いで字音2種類が98、3種類23、4種類以上11であった。字音1種類のものが半数近く、字音2種類までで全体の約86%を占める。二つ目の字音と字の組み合わせまで覚えれば、大多数の漢字の字音が類推できると言える。平成30年度の計画通りではないが、字音語の学習レベル別に同音符同音の字音を持つ形声文字を分類することによって、当初考えていた上級より早く、初中級の段階から音符学習のできる教材にする準備が整いつつある。また、平成29年度の報告で改善点として挙げた「音符のうち、それを持つ漢字グループの字音が同じで活用度が高いものを先に学習し、複数の字音に分かれるものを後で学習するように、提出順序を工夫する」ことにも適う。これは、中国語母語話者だけでなく、母語の知識に頼ることのできない非中国語母語話者がより効果的に漢字音を学習できるものとすることをも意味している。1音符基礎調査(対象:常用漢字中、1音符に2字以上の字を持ち、現行字体で音符が見分けられる形声文字)の結果全体を分析する。2これまでの試用結果に基づいて、中国語母語話者向けの字音対照教材を改訂する。3音符基礎調査の結果に基づき、同音符同字音の字について、その字を含む字音語の学習レベル別に分けた音符活用教材を拡充する。4複数の字音を持つ音符グループの字については、頭子音の調音点や母音など、異音間の共通点を活かして学習できるよう工夫する。平成28年度までの調査および教材の試用から明らかになっていたのは、中国語母語話者(C)の場合、母語字音と対応する字音については長短が類推できる一方、字音全体として誤読するのは、ピンインに頼りすぎたり、中国語の有気音を日本語の無声音と同じと見なす誤解のためだということであった。その結果、頭子音の清濁等をまちがえることが少なくなかったため、平成29年度は、清濁はピンインから判断できず(例:dao4到トウ、道ドウ)、音符から類推することが有効だと認識できる教材の作成と試用を行った。中国語母語話者(C)は、まずピンインから日本語の清濁が判断できないこと、次に既知の字が共有する音符をヒントに未知の字音が類推できることを学習する。非中国語母語話者(NC)も音符から清濁を類推する方法を学ぶ。長音・清濁学習後のテストでは、平均的学習者が未知字音の約8割に正答した。Cの誤読の主因はピンインに頼ったことにあった。例えば、Cの全員が「侍」を「し」と誤読したが、テスト後のインタビューではピンインのshiからそう考えたと答えている。ピンインがshiの字には「使、始、氏、市、試」など、「し」と読む字も多いが、「じ」と読む「事、時」もある。そして、音符「寺」を共通して持つ「時、持」にも誰一人として気がつかなかったのである。これは、漢字を見たときのピンインへのアクセスがより自動的で強力でもあることを示している。一方、NCの場合は音符の利用のしかたが主な誤読の原因だった。例えば、「臆」を「い」としたのは、同じ音符「意」を含む「億」「憶」を思い出さず、「意」の字音をそのまま読んだためである。未知字音を類推する際の音符の活用度はC 56%に対し、NC 90%と、NCのほうがはるかに高かった。

それは、ほかに頼るものがないことから、音符が有効だと認め、利用しようとする意志が生じたためと考えられる。平成29年度の計画通り、字音対照教材を補う音符活用教材(中国語母語話者対象・非漢字圏学習者対象)を増補・試用した(中国語母語話者(C)用教材253字、非中国語母語話者(NC)用教材215字。学習後テストC 61字、NC 46字)。また、網羅的な音符基礎調査(音符になる要素とそれを含む字のリスト作成)を頭子音別で、カ・ガ・タ・ダ・ナ・ハ・バ・マ行音について行った(198の音符グループ、計673字を含む)。長音に限らず、漢字音学習に音符がどのくらい活用できるのかについて、音符の50音順に常用漢字の字音を網羅的に調査し、そのうち、カガ・タダ・ナ・ハバ・マ行の結果の報告を学会発表および論文の形で行った。804字の形声文字を249の音符グループに分類したが、音符字と同音の字は584字に及ぶ。中国語の頭子音が、より単純な音韻構造を持つ日本語に入って、有気無気などの違いが失われたり、中国語中古音の有声音が写された呉音でなく、その後無声化が進んだ長安音を反映した漢音を採ったため、日本語で同音になった字音も多い。こうした同音符同音の字について、字音語の学習レベル別に導入する例を示した。これは、前年度、欧州の学会で、学習者が上級に至る前の段階で、音符が活用できないのかという質問を受けたことに応えたものである。字音語のレベルをjReadabilityによって判定し、音符と字音語を1初中級(例長:社長、出張、手帳) 2中級(例亢:航空、抵抗、炭坑)3上級以上(例畜:貯蓄、家畜)の3段階に分けた。1の音符数は44で3の45より少ないが、漢字数は135字で、3の108字よりも多い。1の音符当たりの漢字数は3.1字で2、3の2.4字より多く、早い段階での音符学習の効果がより大きいことを示している。一方、呉音か漢音かによって、同じ音符グループの字にも清濁(例:奉、棒)や鼻音・非鼻音(例:妄、望)の違いが生じた。そのほか、中国語上古音から中古音への変化が音符グループ内に複数の字音をもたらしたものもある(例:各、絡)。調査した範囲では、字音1種類の音符グループが117あって最も多く、次いで字音2種類が98、3種類23、4種類以上11であった。字音1種類のものが半数近く、字音2種類までで全体の約86%を占める。二つ目の字音と字の組み合わせまで覚えれば、大多数の漢字の字音が類推できると言える。平成30年度の計画通りではないが、字音語の学習レベル別に同音符同音の字音を持つ形声文字を分類することによって、当初考えていた上級より早く、初中級の段階から音符学習のできる教材にする準備が整いつつある。また、平成29年度の報告で改善点として挙げた「音符のうち、それを持つ漢字グループの字音が同じで活用度が高いものを先に学習し、複数の字音に分かれるものを後で学習するように、提出順序を工夫する」ことにも適う。これは、中国語母語話者だけでなく、母語の知識に頼ることのできない非中国語母語話者がより効果的に漢字音を学習できるものとすることをも意味している。1音符基礎調査・教材の拡充2網羅的な音符基礎調査を進める。(サ・ザ行音)音符基礎調査および29年度に教材を試用した結果に基づき、字音対照教材と音符活用教材を改訂・試用する。3改善点音符のうち、それを持つ漢字グループの字音が同じで活用度が高いものを先に学習し、複数の字音に分かれるものを後で学習するように、提出順序を工夫する。1音符基礎調査(対象:常用漢字中、1音符に2字以上の字を持ち、現行字体で音符が見分けられる形声文字)の結果全体を分析する。2これまでの試用結果に基づいて、中国語母語話者向けの字音対照教材を改訂する。
オニヤブソテツを中心としたヤブソテツ属植物のフラボノイド変異と種分化

ヤブソテツ属はヒマラヤから日本にかけての日華植物区系区を中心に20種余りが分布している。このうち日本にはオニヤブソテツ(広義)、ヤブソテツ、ヒロハヤブソテツ、クマヤブソテツなど12種類が分布している。これらは特にオニヤブソテツを中心に形態や染色体レベルで多型であり、分類を困難にしている。本研究では、これらの日本産ヤブソテツ属に加え、中国産の4種、さらには関連するCyrtogonellum属3種およびPhanerophlebia属2種も含めた植物種のフラボノイド化合物を分離同定し、さらにHPLCなどによってその組成も調査した。分離されたのはフラボノール、C-グリコシルフラボン、フラバノンであった。主要化合物として分離されたのはフラボノールのKaempferolとQuercetinの3-O-glucosideであった。またこれらに伴って、以前にこれらの属から報告されていなかったKaempferolとQuercetinの3-O-galactosideおよび3-O-rutinosideも検出された。さらに、狭義のオニヤブソテツからKaempferol3-O-glucoside-7-O-rhamnosideも分離された。C-グリコシルフラボンとして、Orientin, Isoorientin, Vitexin, Isovitexin, Vicenin-2とそれらのO-glucosideが分離されたが、多くの種では微量成分であり、その分布は散在的であった。自然界でも非常に稀なフラバノンであるFarrerolとCyrtominetinの7-O-glucosideは狭義のナガバヤブソテツとテリハヤブソテツから分離された。この化合物は以前には、広義のオニヤブソテツに含まれると報告されていたが、本研究において、これらはその中の狭義のナガバヤブソテツのみが合成することができ、狭義のオニヤブソテツには合成能力のない事が判明した。本年度はすでに細胞学的解析を行ってあるオニヤブソテツ類のオニヤブソテツ、ムニンオニヤブソテツ、ヒメオニヤブソテツ、ナガバオニヤブソテツ約500個体、ミヤコヤブソテツ、ヤブソテツ、クマヤブソテツ、ツクシヤブソテツ、ミヤジマシダなど約200個体について、フラボノイド組成を調査するための二次元ペーパークロマトグラフ(PC)分析および高速液体クロマトグラフ(HPLC)分析を行った。これらの結果、それぞれの種の中では微小な変異を除いて基本的に組成の変化はなく、各種はそれぞれに固有のフラボノイド組成を有している事が判明した。これとは別に本年度は、細胞学的解析を行っていないものについてはこれを引き続き行った。さらに、これらの分析と平行して、まだ採集を行っていない地域の植物については補足的な研究材料の収集も行った。上記PCおよびHPLC分析によって同一組成とみなされた個体の抽出物は一括してフラボノイドの分離・定性に用いられた。本年度にフラボノイドの分離・定性を行ったのは広義のオニヤブソテツ類であるオニヤブソテツ、ムニンオニヤブソテツ、ヒメオニヤブソテツ、ナガバオニヤブソテツで、それぞれからフラボノールのkaempferol 3-O-glucoside, quercetin 3-O-glucosideなど、フラバノンのcyrtominetinやfarrerol、C-グリコシルフラボンのvitexinやorientinなどのフラボノイドが分離された。また、ヒロハヤブソテツ、ツクシヤブソテツ、イズヤブソテツ、ミヤコヤブソテツなどでは従来ヤブソテツ属のシダ類では報告されていないと推定されるフラボノイドの存在も明らかとなった。

本年度は昨年度に引き続き、オニヤブソテツ、ムニンオニヤブソテツ、ヒメオニヤブソテツ、ナガバオニヤブソテツ、ミヤコヤブソテツ、ヤブソテツ、クマヤブソテツ、ツクシヤブソテツ、ミヤジマシダ、ホソバヤブソテツ、イズヤブソテツ、メヤブソテツ、テリハヤブソテツなどについて、フラボノイド組成を調査するための二次元ペーパークロマトグラフ(PC)分析および高速液体クロマトグラフ(HPLC)分析を行った。さらに中国に研究分担者の松本を派遣して採集した近縁のCyrtogonellum属の3種についてもそのフラボノイド組成の調査を行った。これらの調査によって同一組成とみなされた個体の抽出物は一括してフラボノイドの分離・定性に用いられた。その結果、ヤブソテツ類に含まれるフラボノイドは大きくフラバノン、フラボノール、C-グリコシルフラボンに分けることが出来た。この中で特にフラバノンの分布は特異的で、広義のオニヤブソテツ類のうち、ナガバヤブソテツのみがこのグループの化合物を合成する能力を持ち、フラボノールを主成分とするオニヤブソテツ、ムニンオニヤブソテツ、ヒメオニヤブソテツとは明らかに異なっており、この種をCyrtomium devexiscapulaeとして独立させる見解と一致した。その他の種についても多くのものが極めて稀な構造のフラボノイドを数多く有しており、現在これらの化学構造を解明中である。
サーモグラフィー及びストレスホルモン測定法を用いた乳児の情動反応に関する研究

本研究は従来捉えることが困難であった乳児の情動変化を情動に伴う生理的変化を指標として客観的、定量的に解明しようとする試みである。情動は、心の内面で感じる「情動体験」、自律神経系や内分泌系の「生理的変化」、表情、発声、態度などの「表出行動」を伴う。自律神経系の指標としてサーモグラフィーにより顔面皮膚温を、内分泌系の指標として唾液中のコルチゾルを測定する。これら方法は非接触、非侵襲の自然な状態で測定することができるため、心理的変化の測定には適しており、新しい研究分野の展開につながる成果が期待できるものである。今年度は、サーモグラフィーを用いて解析した。「快」「不快」情動の表出行動である「笑い」「泣き」時の鼻部皮膚温変化とその月齢による特徴を明らかにする。月齢2か月から10か月の健常な乳児11名を対象とし、赤外線サーモグラフィー(NEC三栄)を用いて顔面皮膚温を測定した。乳児の「笑い」「泣き」の表出場面を2分間抽出し、その間の鼻部皮膚温変化について分析した。その結果、「笑い」表出時の鼻部皮膚温は表出前と比べて、23か月児ではほとんど変化はみられなかったが、410か月児で約1°Cの低下が認められた。この鼻部皮膚温の低下は交感神経系の活動促進にともなう皮膚血管の収縮に起因すると考えられる。「泣き」表出時には、そのような変化は認められなかった。一方、乳児の唾液を採取し、ストレスホルモンとして知られるコルチゾール濃度を測定し、情動との関係を検討した結果、不快時に上昇することが明らかになった。以上のことから、これらの測定法が乳児の快・不快の客観的な評価に有効であることが明らかになった。その結果、「笑い」表出2分目の鼻部皮膚温は表出前と比べて、23か月児では0.1±0.4°Cの上昇を示し、ほとんど変化はみられなかった。46か月児では1.1±0.3°C、810か月児では1.0±0.7°Cの低下が認められた。一方、「泣き」表出時には、そのような変化は認められなかった。
ほ乳類のエピゲノム性差とその構築因子の機能の解明

ヒストンの化学修飾によるエピジェネティックな制御は、高等真核生物の様々な生命現象に密接に関わっている。我々は、ヒストンのメチル化修飾の除去がほ乳類の性分化に重要な役割を担っていることを報告した。この知見に基づき、マウスの性分化に関わるエピジェネティック制御についてさらに研究を進めたところ、ほ乳類の性決定遺伝子は、ヒストンの脱メチル化とヒストンのメチル化の拮抗した作用によってその発現が緻密に制御されていることを明らかにした。多細胞生物の発生・分化の過程は、様々な細胞種における遺伝子発現プロファイルの経時的な変化として捉えることができる。発生・分化段階特異的な遺伝子群が時間的・空間的に正しく発現するためには、クロマチンの構造変換によるエピジェネティック制御系が重要な役割を果たしている。中でもヒストンのテール部分の共有結合修飾は、エピジェネティック制御の中心的な役割を担っている。ほ乳類の性分化過程におけるエピジェネティック制御系の役割については不明な点が多くため、これを解明することを目的として研究を進めた。申請者は、これまでにヒストン脱メチル化酵素であるJmjd1aが、XYマウスの胎児期性腺において性決定遺伝子であるSry(Sex-determining region Y)のH3K9メチル化を外すことを明らかにしている。H3K9のメチル化は、発現が抑制されたクロマチン(ヘテロクロマチン)の代表的なエピジェネティックマークである。Jmjd1aはSry遺伝子座のヘテロクロマチン化を防ぎ、転写可能な状態にすると考えられる。その一方で、Sry遺伝子座のH3K9のメチル化を触媒する酵素は不明であった。申請者の過去の研究により、G9a/GLP複合体は染色体の広範な部分のH3K9メチル化に寄与することを明らかにしている。GLPがSry遺伝子座のH3K9メチル化を触媒しているという仮説を検証するため、Jmjd1a欠損による性転換の表現型が、GLP欠損でどのように変化するのかを、主に遺伝学的な解析によって検討した。ヒストンH3の9番目のリジン(H3K9)のメチル化修飾は、遺伝子発現が抑制されたクロマチンのエピジェネティックマークである。以前私はH3K9を脱メチル化する酵素の1つであるJmjd1aのノックアウトマウスを作製したところ、性染色体がXYであるにもかかわらず雌化する個体が出現することを見いだした。さらに、Jmjd1a-KOマウス胎仔の生殖線では、ほ乳類性決定遺伝子であるSex-determining region Y(Sry)の発現が低下しており、これが性転換の引き金であることを明らかにした(Kuroki et al, Science 2013)。Jmjd1aを欠損するとH3K9メチル化が亢進し、Sryの転写が抑制されることから、Jmjd1aの機能に拮抗するH3K9メチル化酵素が存在するはずである。この点を踏まえ、本研究課題ではJmjd1aによるH3K9メチル化に拮抗するH3K9メチル化酵素の同定を試みた。H3K9メチル化酵素のうち、G9a/GLP複合体が染色体の広範な領域のメチル化に寄与するドミナントな酵素であることが、私の過去の研究によって明らかになっている。このことからG9a/GLP複合体がJmjd1aに拮抗して作用するH3K9メチル化Writerの第一の候補として考えられた。GlpとJmjd1aの遺伝的相互作用を調べるため、交配によって双方の欠損アリルを有するマウスを作製した。Glpホモ欠損マウスは胎生致死であるため、Glpへテロ欠損アリルをJmjd1a-KO遺伝子背景に導入したマウス(Jmjd1aΔ/Δ; Glp+/Δ)を作製し、その表現型を解析した。Jmjd1aを欠損したXYマウス中の、およそ7割の個体で性分化の異常が観察された。これに対し、Jmjd1aをホモで欠損し、かつGLPをヘテロで欠損したXYマウスは、全て雄への性分化が正しく進行していた(n=7)。G9a/GLP複合体は、Jmjd1a欠損による雄から雌への性転換に抑制的に働くこと、且つその作用点は性決定遺伝子Sryの転写調節であることから、G9a/GLP複合体がSry遺伝子座のH3K9メチル化酵素であることが強く示唆された。Jmjd1aに拮抗するH3K9メチル化酵素の同定に関する研究は、予想以上に明確な結果を得ることができた。研究計画当初は、G9aあるいはGLPのホモ欠損変異を導入しないことには、Jmjd1a欠損による性転換の表現型をレスキューするかどうかの判定が困難である、と予想されたからである。この予想に反し、GLPのヘテロ欠損を導入したJmjd1a欠損個体は、得られた7例が全て雄に分化していた。また、GLPのタンパク量の半減はH3K9の低メチル化をもたらすことを明らかにすることができた。これらの研究結果は、実際にG9a/GLP複合体が極めて効率的にJmjd1aによるH3K9の脱メチル化に相対する機能を有していることを示すものであった。ヒストンH3の9番目のリジン残基(H3K9)のメチル化修飾は、遺伝子発現の抑制に相関するエピジェネティックマークである。

ヒストン修飾によるエピジェネティック制御には、修飾を付加する酵素(Writer)、修飾を除去する酵素(Eraser)、修飾を読み取る分子(Reader)の3者が密接に関わっている。発生段階特異的遺伝子は、この3者の協調的な作用によって発現の時期が厳密に制御されていると考えられる。我々は、H3K9の脱メチル化酵素であるJmjd1aがマウスの性決定に重要な役割を担っていることを見いだした。Jmjd1aはXYマウスの胎児期性腺において性決定遺伝子であるSry(Sex-determining region Y)のH3K9メチル化を外すことを明らかにした。この事実は、SryのH3K9メチル化エピゲノムのEraserがJmjd1aであることを意味する。SryのH3K9メチル化エピゲノムの構築に関わるWriterとReaderはまだ分っていない。本研究では、Sryの発現制御に関わるH3K9メチル化エピゲノムのEraser/Writer/Readerを同定し、これらがどのようにSryの発現制御に関わっているのかについて明らかにする。本研究の推進により、ほ乳類性決定遺伝子のエピゲノム制御についての新たな知見がもたらされた。すなわち、Sryの発現調節には、H3K9メチル化エピゲノムのWriterはG9a/GLP複合体で密接に関わっていることを明らかにした。G9a/GLP酵素複合体によるH3K9メチル化活性とJmjd1aによるH3K9脱メチル化活性の拮抗した作用によって、Sry発現のファインチューニングが行なわれていることを明らかにした。ヒストンの化学修飾によるエピジェネティックな制御は、高等真核生物の様々な生命現象に密接に関わっている。我々は、ヒストンのメチル化修飾の除去がほ乳類の性分化に重要な役割を担っていることを報告した。この知見に基づき、マウスの性分化に関わるエピジェネティック制御についてさらに研究を進めたところ、ほ乳類の性決定遺伝子は、ヒストンの脱メチル化とヒストンのメチル化の拮抗した作用によってその発現が緻密に制御されていることを明らかにした。平成26年度の計画に掲げた「性腺機能における抑制的エピゲノムの役割」に関する研究で一定の成果が得られている。具体的には以下のとおりである。1)Jmjd1a欠損によるXY雄が雌へ性転換する表現型が、GLPの欠損でレスキューされるかどうかを調べた。Jmjd1a欠損でGLPのヘテロ欠損を導入したXY個体では、雄の性腺体細胞マーカーであるSox9の発現が亢進し、雌の体細胞のマーカーであるFoxl2の発現は逆に減弱していた。この結果は、予想した通りにG9a/GLP複合体がSry遺伝子座のH3K9のメチル化を触媒しているという仮説に矛盾しないものであった。2)H3K9メチル化酵素であるEsetを雄性生殖腺体細胞であるセルトリ細胞で条件的に欠損するマウスを作製した。Eset欠損の雄マウスにおいて、精巣の矮小化が観察された。さらに詳細な解析を行った結果、当該マウス雄において、未分化な生殖細胞の減少が観察された。ヒストン修飾によるエピジェネティックな遺伝子発現制御は、修飾酵素(Writer)、脱修飾酵素(Eraser)、修飾読み取り分子(Reader)の3者の協調作用によって成立する。平成27年度までの研究成果は、マウスの性決定(=性決定遺伝子の活性化)に寄与するH3K9メチル化Eraser、H3K9メチル化Writerの同定に大きな進展をもたらした。
植物細胞のシンク・ソース機能の分子的基礎

植物細胞が示すシンク・ソース機能は、細胞分化とは関連しつつ発揮する機能ではあるが、同じ細胞が時にはシンク機能を、時にはソース機能を発揮し、極めて可変性に富むことが特徴的で、動物細胞ではみることのできない特種な機能であることが確認された。植物のソース機能については、光合成や窒素同化など世界的に早くから注目されており、その分子レベルでの研究が多い。しかしながら、ソース機能およびシンク・ソース機能の相互転換の分子機構はあまり注目されていない。最近の分子生物学および分子レベルでの細胞生物学の発展は、こうした植物細胞のシンク機能およびシンク・ソース機能の可変性の分子機構を解明する道を切り開いていると判断された。わが国における植物を対象とした分子生物学および分子レベルでの細胞生物学的研究は国際的にみても高いレベルに達しており、植物細胞のシンク機能およびシンク・ソース両機能の分子機構解明にむけての研究組織を確立することが可能であり、世界に先がけて研究を展開すべきであるとの結論に達した。植物細胞のシンク機能は有用物質生産と密接な関係があり、従来の農業生産のみならず、最新の植物バイオテクノロジーにとっても、植物細胞のシンク機能の分子機構解明は極めて重要かつ緊急を要するものと判断された。以上のような検討をふまえ、平成2年度発足の重点領域研究として「高等植物における物質集積機能とその発現の分子機構」と題する研究計画を、京都大学農学部山田康之教授を研究代表者として申請した。
糖尿病患者の心理社会的ストレッサーのアセスメントツールの開発

本研究の目的は、糖尿病の患者教育にメンタルヘルスケアからアプローチするために、糖尿病患者が日常生活で認知している心理社会的ストレッサーを計量的にアセスメントするための、自記式のアセスメントツールを開発することである。まず、昨年度作成した糖尿病に関連したストレッサーのアイテムプールの内的整合法、ならびに再検査法による項目の信頼性を検討し、10項目からなる糖尿病ストレッサー・アセスメントツールを作成した。今年度は、作成したアセスメントツールの信頼性と妥当性の検討することを目的に、質問紙調査を行った。T病院の糖尿病外来の患者87名を対象に、糖尿病ストレッサー・アセスメントツールを含んだ質問紙を配布し、診療録よりIIbAlc、合併症、デモグラフィックデータを収集した。有効な回答を得た71名のデータをもとに、糖尿病ストレッサー・アセスメントツールの内的整合法による信頼性の確認と、基準関連妥当性および構成概念妥当性の検討を行った。10項目の信頼性係数はα=.85と十分高く、内的整合性は保証された。続いて、基準関連妥当性を検討するために、各項目と、糖尿病ストレス度との相関の比較を行ったところ、8項目において相関係数r=.26.46の有意な相関があった。構成概念妥当性の検討のために行ったバリマックス法による因子分析の結果、仮説通り「心配に思うこと」「負担に思うこと」の2因子が抽出された。各項目とIIbAlcとの間に有意な相関があったのは、「自己管理がうまくいっているか心配」「治療がうまくいっているか心配」のみであった。開発したアセスメントツールは、10項目と簡便なものであり、臨床において使いやすいものであると考える。今後糖尿病外来で用いつつ、妥当代の検討を加えていく必要がある。S病院の糖尿病外来の患者96名を対象に、15項目のアイテムプールを含んだ質問紙を配布し、90名から有効な回答を得た。「糖尿病を持つことで日常生活が変わったことをつらいと思う」「現在おこなっている自己管理がうまくいっているか心配に思う」「食事療法をしなければならないことを負担に思う」ことをストレスに思う割合が高く、「自分が糖尿病とみなされるのは恥ずかしいと思う」「低血糖がおきるのではないかと不安に思う」の割合は低かった。今後の課題は、2回目の標本調査を行い、今回作成したツールの信頼性・妥当性の検討を行うことである。
直接観察法による蝸牛側壁血流の測定:レーザドプラ法との比較

平成6年度の研究においては、蝸牛血管条の血流を色素を使わずに観察する方法を試み、研究分担者の田村俊世による画像解析プログラムを用いて蝸牛血流測定を行った。この方法は蝸牛第2回転の骨を内耳を損傷しないように除去し、膜迷路を露出させ,オリンパス実体顕微鏡(SZ6045,TRPT)により直接観察する方法であった。このテクニックはかなり困難であったが,その習熟効果により3匹中2匹において観察が可能であった。しかしながら,画像解析は一応可能であるが,常に一定の条件下で記録しないと画像処理したデータの信頼性に欠けるということが明らかになった。そこで平成7年度の目標として、造影剤を使用して赤血球のコントラストをより一層鮮明にすることを試みた。蛍光色素の赤血球への付着,あるいは色素静注により赤血球のコントラストを増強させることを今回検討したが,これらを用いないで直接観察する方法と比べて,特に優れたデータを得ることができなかった。そこで,造影剤を用いずに実体顕微鏡による直接観察法としレーザドプラ法による血流測定との比較を行った。その結果,ノルアドレナリンを例にとった場合,直接観察法により有意な蝸牛血流の変化を認めるためには,大量のノルアドレナリン投与が必要となり、測定感度の点ではレーザドプラ法の方が優れていることが示唆された。しかしながら、直接観察法は、血流状態を総合的に観察できるため、赤血球のコントラストを上げる工夫ができれば、その価値は高いと考える。モルモットをネンブタール麻酔し、気管切開を行った後、中耳骨胞を開け、中耳粘膜を除去し蝸牛骨壁を露出した。蝸牛第2回転の骨を内耳を損傷しないように除去。膜迷路を露出させた。このテクニックはかなり困難であったが、その習熟効果により3匹中2匹において膜迷路を露出させるテクニックを確立した(研究代表者:長谷川誠)。モルモットを固定台(成茂製)の上に固定し、オリンパス実体顕微鏡(SZ6045,TRPT)により蝸牛血管条の血流を色素等を使わずに観察し、これをビデオカメラ(池上通信製,CFO-10)により記録した。測定した血流の解析は、浜松ホトニクス血流測定システムC5003をベースに画像解析プログラムを作成した(研究分担者:田村俊世)。また大腿動脈にカニューレを挿入し血圧を連絡的に測定した。まずモルモットをネンブタール30mg/kgにて麻酔し、ノルアドレナリン250μg/kgを腹腔内に注射し、蝸牛血流の変化を観察した。投与したノルアドレナリンが致死量であったため蝸牛血流は注射直後時上昇したがその後は低下傾向を示した。本年度の研究の主目標は造影剤を使用しないで血流を記録し、それを画像解析により測定が可能であるかどうかという点にあった。今年度の研究結果では、画像解析は一応可能であるが、常に一定の条件下で記録しないと、画像処理したデータの信頼性に欠けるというとが判明した。造影剤を使用しないことにより、より生理的条件に近いデータを得ることを目標としたので、次年度の課題としては、両者の利点、欠点を検討し、レーザドプラ法との比較を行いたい。この方法は蝸牛第2回転の骨を内耳を損傷しないように除去し、膜迷路を露出させ、オリンパス実体顕微鏡(SZ6045,TRPT)により直接観察する方法であった。このテクニックはかなり困難であったが、その習熟効果により3匹中2匹において観察が可能であった。しかしながら、画像解析は一応可能であるが、常に一定の条件下で記録いないと画像処理したデータの信頼性に欠けるということが明らかになった。

そこで平成7年度の目標として,造影剤を使用して赤血球のコントラストをより一層、鮮明にすることを試みた。螢光色素の赤血球への付着,あるいは色素静注により赤血球のコントラストを増強させることを今回検討したが、これらを用いないで直接観察する方法と比べて、特に優れたデータを得ることができなかった。そこで、造影剤を用いずに実体顕微鏡による直接観察法とレーザドプラ法による血流測定との比較を行った。その結果、ノルアドレナリンを例にとった場合,直接観察法により有意な蝸牛血流の変化を認めるためには大量のノルアドレナリン投与が必要となり、測定感度の点ではレーザドプラ法の方が優れていることが示唆された。しかしながら、直接観察法は、血流状態を総合的に観察できるため、赤血球のコントラストを上げる工夫ができれば、その価値は高いと考える。
キラ-T細胞による免疫学的ヒト自家癌認識破壊機構

(a)自家癌特異的CTLクロ-ンと標的癌細胞のペアの確立:昨年度はHSTー2、HOT、TOCー2などのペア確立に成功した。今年度はSCC、NICなど8つのペアの確立を行った。即ち、癌性胸腹水からは、10ー20%の症例から自家癌とそのCTLのペアを確立することに成功した。(B)HSTー2(胃印環細胞癌)破壊機構:RーPCRを用いてCTLクロ-ンTcHSTー2のTCRVα、Vβのusageを解析したところ、Vα7かVα12、またVβ20と判明した。次にTcHSTー2によって認識される抗原(T cell epitope)が内在性由来か否かを検討した。ERでMHC classI分子と抗原ペプチドの会合を阻止するbrefeldein A(BFA)でHSTー2を処理したところ、TcHSTー2の細胞障害性が抑制された。一方、クロロキン等では全く効果はなかった。また、BFAで処理されたHSTー2のclass I分子の細胞表面での発現に変化はなかった。即ち、自家癌抗原ペプチドは内在性蛋白由来であり、BFAは細胞表面上のclass Iに会合している抗原ペプチドをempty outする効果をもと理解された。現在、trifluoroacetic acidを用いた抗原抽出とRーHPLCを組あわせ、抗原ペプチドのアミノ酸配列固定を行っている。(c)HOT(卵巣癌)破壊機構:このCTL(TcHOT)はγδ型T細胞でVδ1(+)である。TcHOTはHOTおよびHeLaに障害性を示したが、他の多くのallogeneic linesには効果を示さなかった。MHC拘束性はない。興味あることにBFA処理で細胞障害性が抑制された。現在heat shock proteinを含めたligandの固定と、それらのpresenting moleculeとしての役割、あるいは抗原ペプチドの関与の有無を解析している。(d)CTLのRーPCRによるTCRV region usageの解析:HSTー2および別な胃印環細胞癌であるSSTWでVα7のcommon usageがみられた。そこで、この腫瘍型の手術材料からTlLを分離しRーPCRを行ったところ、いくつかの症例でVα7 usageがみられた。このことはtissue originが同一の場合、CtLのTcell epitopeである抗原ペプチドはある一定の分子であることを推測させた。MHC拘束性はない。