hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
共同作業型の多人数インタラクションを対象とした役割構造抽出の研究

リーダーの役割について、第三者評定の結果と、これまでに分析した言語・非言語情報との相関を調べたところ、(i)作業の進行に関わる発話の頻度・時間、(ii)全体の発話時間、(iii)完成図の視認時間と完成図までの対物距離が、リーダーの役割を担う人物を推定する特徴量として有用であるという可能性が示唆された。
初期太陽系年代学

初期太陽系年代学に関する本研究の最大の成果は^<60>Fe-^<60>Ni係の新たなデータを出したことだと思う。消滅核種を使った年代測定はこの10年で大きく進歩したが、大きな課題として残っているのが、消滅核種の起源とその太陽系内の分布である。これが解らないと、消滅核種を年代測定系として使えるかどうかが解らないのである。^<60>Feは超新星で作られ、他の星や、宇宙線との相互作用では作られないことがわかっているので、上述の課題を解決するために最も適した消滅核種ということができる。近年、^<60>Feの検出に関するいくつかの報告があるが、そのデータには一見矛盾するものも含まれており、^<60>Feの太陽系内の分布は一様であったのかどうか疑問が残っていた。本研究では年代の良くわかっている隕石について、^<60>Fe-^<60>Ni系の測定を行い、^<60>Feの量がこれまで考えられていたよりもかなり少ないことを見出した。この結果、これまで報告されている全てのデータが正しいとすれば太陽系の^<60>Feは非一様に分布していた、と考えることが必要になる。別の可能性としては報告されているデータに間違えがあって、実は^<60>Feの量はあまり多くなかったということもありえるが、これは今後の研究を待たなければならない。本研究では隕石の研究の技術的側面で、カソードルミネッセンスを使って構成鉱物を特徴付けるということをおこなった。これによって年代測定とは直接かかわらないものも含めておおくの新しい知見が得られた。実際に研究対象になったのは、コランダム、アメーバー状オリビン集合体、難揮発性オリビン、アノーサイトなどである。コランダムの観察から、その凝縮・集積に関する知見が得られた。アメーバー状オリビン集合体の分析から、オリビンの凝縮、母天体での変成に関する知見が得られた。難揮発性オリビンの分析から星雲中での変成に関する知見が得られた。またアノーサイトの分析によってカソードルミネッセンスを使うとAl-Mg系の年代測定に適当な粒子を容易に選択できることが解った。平成14年度は新たに導入したカソードルミネッセンス(以下CLと略す)の装置で隕石がどの様に見えるかを知ることが主な仕事となりました。隕石のCLに関してはこれまでいくつかのレポートがありますがまとまった研究はなかったのでどのようなものがどの様に見えるかは予想のできない状態でした。それで各種隕石の代表的試料をとりあえずCLで見てみました。その結果、隕石では主に、オリビン、アノサイト、スピネル等の鉱物が明るいCL発光をすることが解りました。CLにおいては良くあることですが、同じ鉱物でもCL発光をするものと、しないものがあり、オリビン、スピネルでは鉄の含有量が少ないものが強くCL発光することが確かめられました。隕石中のアノサイトでは何がCL強度を決めているかはまだ良く解っていません。以上のことからわかるように、CLは(鉄が主として金属として存在する)始原的隕石で良く発光し、その構成鉱物がどのように作られたか(成長したか)を教えてくれます。特にオリビンは粒子サイズが大きいのでその内部構造をCLで詳しく見ることができ、どの様に成長したかを知ることができます。

今後は主にオリビンとアノサイトについて発光のメカニズムを調べ、それを基に二次イオン質量分析への応用を考えて行くことになります。なお、CL装置の導入が遅かったのでまだ雑誌に発表された論文はありません。平成15年度の成果の1つはカソードルミネッセンス(以下CLと略す)に色をつけることに成功したことです。これは赤、緑、青の3枚のフィルターを付けて3枚のCLのイメージを取り、それらをコンピューターソフト(Photoshop)上で合成することによって得られます。このようにして得られたカラー画像は、フィルターの透過度等の要素によって自然なカラー画像とは色合いが異なるのが欠点ですが、逆に各色の明るさをソフト上で変化させることにより、色の違いを強調できるメリットがあります。上記のカラーCLイメージを使った研究成果の1つとして、隕石中のアメーバー・オリビン・アグリゲイトの変成度をCLカラーによって見分けることができることを示しました。これはオリビンでは主にMnとCrがCLの赤い発光を担っているのですが、これらの元素が変成によってオリビンに入るため、変成度の高いアグリゲイトでは赤い発光が強く、変成度の低いアグリゲイトとは色が異なって見えるためおきる現象と考えられます。また、隕石中のアノーサイトのCLが赤、青、緑などさまざまな色を示しその明るさも隕石によって異なることを見出しました。これらは隕石の熱履歴を反映するものと考えられます。これらの試料は今後二次イオン質量分析を行い年代を求めることになります。以上のようにCLが隕石の研究に大変役立つことが示されました。半減期の短い消滅核種を使って太陽系の初期の歴史を明らかにするのが本研究の目的でした。年代測定は二次イオン質量分析計を使って行うのですが、これを効率的に行うためにカソードルミネッセンスを使うのが本研究の特徴でした。実際にカソードルミネッセンスを使って効率的に年代測定ができる一例としてアノーサイトのAl-Mg年代測定があります。アノーサイトは白色包有物やコンドルールに入ってますが、コンドルール中では普通Al-Mg比が小さく有意な同位体比異常を検出することが難しいものがほとんどです。しかし中にはAl/Mg比の大きなものもありそれらはカソードルミネッセンスで明るく見えることが解りました。従って、カソードルミネッセンスでアノーサイトを見ることによりAl/Mg比の大きなアノーサイトを選んで、効率的に年代測定ができることがわかりました。また別の例としてコンドライト中のコランダムの測定をあげることができます。コランダムもAl-Mg系の年代測定を行なえるのですがコンドライト中の存在度が小さいため特にマトリックス中のコランダムについてはほとんど測定例がありませんでした。今回カソードルミネッセンスによりコランダムを検出することにより、存在する(変成されていない)コランダムをもれなく見つけることができることがわかり、効率的にコランダムの年代測定ができることが示されました。消滅核種を使った年代測定でしばしば問題になるのが消滅核種が本当に年代測定に使えるのかという問題です。これは年代測定に使えるためには原始太陽系が一様に混ざっている必要があるのですが、その保障がないことに起因しています。
非局在型クラスター描像に基づいたクラスター構造形成の動力学

1. ``container''描像に基づいた微視的クラスター模型波動関数の拡張軽い自己共役4n核の基底状態からクラスター構造を持った励起状態までを統一的に記述できる高い可能性を秘めたnα-THSR波動関数は、従来内部に正パリティ成分のみを含むものが考案され適用されてきた。この従来型THSR波動関数を、内部に負パリティ成分を含む形に拡張することに成功した。更に、12C核の励起状態に適用し、第一段階の計算結果を得た。特に角運動量・パリティが1^-の状態が、核半径が基底状態に比べ特に大きく、3つのαクラスターがガス的に配位した構造を持つことが示された。これはこの1^-状態が、α凝縮状態のファミリーであることを強く示唆する結果である。2α-THSR波動関数を基にして、それに余剰核子が付加された形にTHSR波動関数を拡張し、9B(2α+p),10Be(2α+nn),10C(2α+pp)に適用した。従来型の模型は、余剰核子の運動として、パイ軌道に対応する運動に制限されたものが考案され適用されてきた。これに対し、新たにシグマ軌道に対応する運動を含むように拡張した。これは余剰核子の運動する``container''の空間位置を、2つのαクラスター間でシフトすることを可能にする形で実現したものである。この拡張による効果は大きく、全体として束縛エネルギーに1MeV以上のエネルギー利得が得られ、より実験データに一致する結果が得られた。本研究課題の大きな目的の一つである、``container''描像に基づいた原子核クラスター構造の統一的記述に向けて、その``container''描像型模型波動関数である、THSR波動関数を適切に拡張し、負パリティ成分を含む形に定式化することに成功した。これを用いて12Cの負パリティ状態の計算の第一段階の結果を得た。これにより、次年度以降16O, 20Ne等より重い核を調べていくうえで大きな道筋をつけることができたため。1.負パリティ成分を含む形に拡張されたnα-THSR波動関数の12C、16Oへの適用。今年度新手に定式化した、負パリティ成分を含むTHSR波動関数を用いて、12Cの負パリティ励起状態の研究を推進する。及び16Oにおいて12C+α間に負パリティ成分を取り入れることにより、16Oの基底状態から4α凝縮状態へ至る状態間の構造変化のプロセスを調べる。2. 12C+2α、5α直交条件模型を用いた20Neの5α凝縮状態の研究。20Neの20MeVより上に存在することが実験で示唆されている5α凝縮状態を理論的に再現することを目的として、まずは12C+2α直交条件模型、そして5α直交条件模型をガウス基底関数法と組み合わせて調べていく。3. ``container''描像に基づいた、core+余剰核子系の研究。今年度拡張を行ったnα-THSR波動関数に余剰核子を付加させた模型波動関数を、Cアイソトープ系、つまり3α-THSR波動関数+余剰中性子、の形で適用し、``container''描像が中性子過剰核でどのように成立、または変更を受けるのかを明らかにする。

1.負パリティ成分を含む形に拡張されたnα-THSR波動関数の12C、16Oへの適用。今年度新手に定式化した、負パリティ成分を含むTHSR波動関数を用いて、12Cの負パリティ励起状態の研究を推進する。及び16Oにおいて12C+α間に負パリティ成分を取り入れることにより、16Oの基底状態から4α凝縮状態へ至る状態間の構造変化のプロセスを調べる。2. 12C+2α、5α直交条件模型を用いた20Neの5α凝縮状態の研究。20Neの20MeVより上に存在することが実験で示唆されている5α凝縮状態を理論的に再現することを目的として、まずは12C+2α直交条件模型、そして5α直交条件模型をガウス基底関数法と組み合わせて調べていく。3. ``container''描像に基づいた、core+余剰核子系の研究。今年度拡張を行ったnα-THSR波動関数に余剰核子を付加させた模型波動関数を、Cアイソトープ系、つまり3α-THSR波動関数+余剰中性子、の形で適用し、``container''描像が中性子過剰核でどのように成立、または変更を受けるのかを明らかにする。(理由)海外旅費使用の際の航空券代金が予約時期により多少前後するため、当初予定より余剰分が生じた。(使用計画)海外旅費使用の際の航空券代金に使用する。
ピセンのドーピング効果と電子物性

芳香族電子材料として注目されているピセンに対して、物理的・化学的ドーピングによる効果と電子物性の相関を明らかにした。物理的ドーピングでは、安定性、環境応答性、高ドープの実現に成功した。化学ドーピングでは、均質試料の合成、安定相の同定を行った。また、物性発現の根本的な起源となる結晶構造から、その機能起源に重要な構造的特徴を可視化する構造解析に成功し、クラスレート材料や有機硫黄分子の固体にも応用し、その有用性を実証した。本研究では、ピセンのドーピング効果と電子物性の相関を調べることを目的としている。初年度である平成22年度は、より効率的な電界効果による電子物性変調を第一の目的とした。具体的には、高い性能を持つ電界効果トランジスタの作製とその評価である。その結果、以下の成果を達成した。1.これまで、ピセンFETは、その動作においてヒステリシスが非常に大きく、基礎物性評価としても応用としても性能に問題があった。今回、疎水性の高い基板を用いてFETを作製することで、ヒステリシスを大幅に抑制することに成功した。2.高い性能を示すピセンFETは1ppmというわずかな酸素に応答することを明らかにした。酸素のみを選択的、かつ、高効率で検出できる特性は、センサへの応用が可能なことを示している。酸素暴露によるデバイス電流の増加はデバイス界面付近のトラップの現象と理解してきたが、今回のデバイスにおいて、酸素を暴露したFETでは、高電圧側で電流の抑制効果も見られ、酸素暴露による電流増加の起源と逆の効果の観測もされた。バルクの特性と、界面の特性の特長が表れたとして理解できる。3.ベンゼン環がアームチェア型に5個連なったピセンのFETが酸素に敏感なのに対して、7個連なった[7]フェナセンは、酸素暴露に対してデバイス特性が安定であることを発見した。今後の安定的なデバイス、再現性の高い物性評価に向けた新しい材料とフェナセン系分子の安定性に関する知見が得られた。初年度(平成22年度)には、疎水性基板を用いたピセンFETでヒステリシスの少ないデバイスの作製に成功するとともに、フェナセン系のFETにおいてベンゼン環5個のピセンが酸素敏感なのに対して、[7]フェナセンが空気中で安定なことを明らかにした。平成23年度は、より大きな電子物性の制御のために、活性層に単結晶ピセンを用いたデバイスやゲート絶縁層としてイオン液体をもちいたデバイスの作製を行った。1.単結晶ピセンFETを作製し、高易動度デバイスの作製に成功した。これまで、単結晶ピセンFETは、電極からのキャリア注入障壁が高かったためである。今回、金電極とピセン単結晶の間にテトラシアノキノジメタン(TCNQ)を挿入することで、キャリア注入障壁の低減に成功した。2.電子物性のより大きな変調のためには、より効率的な制御が必要である。ゲート絶縁膜を固体誘電体からイオン液体にすることで、低電圧で高キャリア層の実現が可能である。今回、[7]フェナセン薄膜、ピセン単結晶を活性層とし、ゲート絶縁層として1-ブチル-3-メチル-1H-イミダゾール-3-イウム・ヘキサフルオロホスファート(bmim[PF_6])を用いた定電圧駆動FETの作製に成功した。単結晶試料によるFET作製とイオン液体による定電圧での物性制御は、今後の高キャリア状態実現とその精密物性測定において非常に意義がある。初年度(平成22年度)は、空気中で安定な芳香族FETの作製に成功した。平成23年度は、単結晶ピセンFETによる高易動度デバイスの作製、イオン液体をゲート絶縁体に用いた低電圧駆動FETに成功した。平成24年度は、化学ドープしたピセン超伝導体の電子状態評価、圧力効果と溶液法によるピセン化合物の作成に成功した。さらに、分子性固体材料の機能可視化の手法を実材料に応用し、原理検証に成功した。具体的な成果を以下に示す。1)ラマン散乱法による特定のモードの変化からピセン分子の電子数を定量的に評価することに成功した。非常に複雑な構造を持つピセン化合物において、物性を議論するうえで非常に重要な情報を得た。2)ピセン化合物の超伝導体において、圧力印加によって、高伝導転移温度が上昇する相と低下する相があることを発見した。ピセン化合物で観測される超伝導体の発現機構を考慮するうえで、新しい知見を得た。3)均質試料の作製が困難なピセン化合物において、均質試料を作るのに有利な溶液法での試料作製に成功した。4)物性発現の根本的な起源となる結晶構造から、その機能起源に重要な構造的特徴を可視化する構造解析に成功し、クラスレート材料や有機硫黄分子の固体に応用し、その有用性を実証した。

以上の様に、3年間の本研究課題では、ピセンのドーピング効果と電子物性に関わる研究での直接的な研究進捗をしただけでなく、他の分子性固体、有機導体の構造、物性とそれらの相関の理解に有効な手法開発にも成功した。化学的な手法である金属ドープ、物理的手法であるいわゆる電界効果ドープ、さらには、その双方の可能性を秘めたイオン液体を用いた電界効果による物性変調に成功しており、様々なドーピング方法による研究が進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題が開始した平成22年から、ピセンの高易動度の電界効果トランジスタ特性、アルカリ金属ドープした試料での超伝導発現など新規な物性が報告されてきた。その結果、関連材料での研究が集中的に行われ、最近になって、関連物質で新しい超伝導体の発見も報告されている。この芳香族系半導体のドーピング効果を明らかにするためには、様々な金属ドープ試料の構造と物性を明らかにする必要が出てきた。申請者は、現在、大型放射光施設での構造物性研究を行うグループを組織しているため、現在課題となっている構造と物性の相関関係を明らかにする。ピセン関連芳香族のアルカリ金属化合物を対象とした放射光X線回折実験により、精密構造解析を行う。
抗体医薬開発のためのアフィニティー濃縮技術と新規プロテオーム解析技術の融合

最近ペプチドアフィニティーを利用して、メジャーなタンパク質を洗い流し、微量なタンパクを濃縮するキットが市販され始めた。このような濃縮手法を定量的に評価する技術を確立するため、高濃度の標準物質を二次元電気泳動で完全に分離する方法の確立と、新規画像解析気中によりよりタンパク質スポットの比較をより高精度に行う方法を検討した。さらにそれらの技術を抗体タンパク質生産培養に適応して、最適操作に対し重要な情報を与えられることを示し、プラスチックに特異的にくっつくタンパク質の探索にも有効であることを示した。本研究ではガンマーカーなど医療診断等に関係する重要な微量蛋白検出のためのアフィニティ担体の利用を検討する。そのため先ずランダムペプチドをアフィニティ担体としてもちいるバイオラッド社のproteo Miner Protein Enrichment Kitによりモデルタンパク質を濃縮し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離し、研究室で開発した画像解析システムを用いて、濃縮効果を定量的に検証した。同時にタンパク質の種類による濃縮効果の違いを観察し、分離したタンパク質が質量分析計を用いたPMF法により同定できるかを検討した。通常血清などに多量に含まれているアルブミンにたいし、はるかに少量で通常は測定できないようなタンパク質がこの濃縮操作を応用することにより測定できるように成るか調べるために、微量成分のモデル物質として、カルボニックアンヒドラターゼ(CAB)、トリプシンインヒビター(TI)、グルコースオキシダーゼ(GO)の三種類を用い、高濃度アルブミン存在下において実験を行った。その結果、たとえばアルブミン濃度を15倍しても、微量蛋白であるCABでは21%、TIでは36%、GOでは28%の現象にととまり、濃縮効果は十分果たせていることを確認した。なおこの測定ではSDS電気泳動のCBB染色画像を画像解析して用いたが、このときの各タンパク質スポットのvolume値と蛋白質量とは、濃度が薄いときはほぼ比例関係が保たれていることを実験で確認している。しかし微量タンパク質の成分により濃縮効果、ないしはタンパク質の回収率が異なっていた。これは微量タンパク質にたいし親和性を持つペプチドが、同時にアルブミンに対しても親和性を持つことにより生じた現象と考えれるが、この問題に対し、今後濃縮操作条件の検討や、異なったランダムペプチドから成るアフィニティー担体を使用し、その効果とメカニズムを検討する。昨年までの研究で濃縮効果をSDS電気泳動で確認できたが、実際微量成分を検出・同定するには二次元電気泳動で確認する必要がある。そのために標準タンパク質として、アルブミン、CAD,βーガラクトシダーゼ等を用いて検討を始めたのであるが、通常の方法で二次元電気泳動にかけたところ、一次元目の分離が悪く、横線が引いたような画像となり濃縮効率を定量的に解析することが困難となった。これは通常の大腸菌や、ガン細胞、酵母等から得られる画像とは全くことなり、その解明に時間がかかった。解明操作の結果、タンパク質の可溶化が不十分であることが原因の一つであることが明らかとなった。さらに、それを改善することにより、画像の横線の現象が軽減された。しかしまだ横線が少し残っており、この点の改善を試みている。さらに画像処理の改善を試みたところかなりの進展が見られた。すなわちPichia Pastorisにより、一本鎖抗体を生産する培養を行い、その増殖・生産フェーズの画像解析を行ったところ、増殖フェーズと生産フェーズのVolume値の相関係数がそれぞれのデータのみで得られた相関係数と比べて大きく低下することがわかった。又大腸菌BL21で遺伝子組み換え操作を行った際も、操作を行う前後の相関係数は0.85とそれぞれの相関係数(いずれも0.95程度)と比べて低下することを確認した。この相関係数を求める前に2つの画面を色違いで表示し、それぞれの対応関係を簡単に確認するなど、また相関係数表示画面でも対応するタンパク質スポットの確認をスムーズに行えるようにすることにより、目視判断より遙かに迅速かつ正確に全体の相関、および特異スポットの検出が可能となった。昨年度までに開発してきた二次元電気泳動解析用プログラムを改良し、2枚の電気泳動画面を比較して、対応するタンパク質スポットのボリューム値の比較が自動でできるようにし、ボリュームの相関係数を計算できるようにした。それを酵母による一本鎖抗体の生産に適用し、抗体の生産量は1.5g/Lに達し、増殖フェーズと生産フェーズで電気泳動結果が大きく異なることを確認し、、相関係数を用いて定量的に識別できることを示した。この結果をミネアポリスで開かれた2012年米国化学工学会(AIChE)年会で発表したところ好評でポスター賞を受賞した。さらにこの二次元電気泳動をプラスチック表面や半導体表面に特異的にバインドするペプチドのスクリーニングに適用した。これは抗体を半導体センサーやSPRセンサー表面に結合させ、疾患マーカーの新規検出システム開発に応用させようとしたものである。以上の研究は菌体内に存在するタンパク質の定量化や同定に関するもので、スポットの形状も円形に近く技術的にほとんど困難なく進められた。しかし昨年から問題となっている、大量の標準タンパク質を二次元電気泳動にかける実験はことごとくうまくいかなかった。

市販されているタンパク質はほとんど粉末の状態でリン酸バッファー等に溶かして二次元電気泳動にかけてもスポットが横線を引いてほとんど円形のきれいなスポットを得られなかったからである。二次元電気泳動について標準サンプルを用いて定量かを確認した論文が見つからないがその原因はこのようなところにあるのではと思われる。いろいろと原因を探った結果、粉末にされたタンパク質は可溶化が非常に難しいことがわかってきた。現時点ではビーズビーターなどで徹底的に可溶化させ、その後十分可溶化していないものを15,000rpmで取り除くなどの工程を経ることによってある程度改善されてきた。しかし高濃度のタンパク質を分析することは無理でさらなる分析方法の改良を試みている。
超高強度コンクリートを用いたPCおよびPRC部材のクリープ特性に関する研究

本研究では、圧縮強度100N/mm^2以上の超高強度コンクリートのクリープ・収縮特性を実験的に把握し、さらに超高強度コンクリートを用いたPCおよびPRC部材のプレストレス導入後から死荷重を受けた後の長期変形・ひび割れ幅のメカニズムとその解析法を検討するものである。平成8、9年度にかけて行った研究成果の概要は以下の通りである。1.重ね合わせの原理を用いれば、乾燥収縮は乾燥開始後から発生する自己収縮の約70%の割合で比例的に増加し、その比例定数は乾燥開始材齢に依存しない。2.載荷時材齢および乾燥開始材齢の異なる超高強度コンクリートのクリープ・収縮試験から得られた結果をもとにMC90の予測式を改良した。3.クリープの載荷時材齢を考慮した重ね合わせの原理に基づくクリープ解析は、超高強度コンクリートの材料特性を適切に取り込むことによって、自己収縮によって導入される鉄筋の拘束ひずみを精度良く予測できるとが認められた。4.実測された鉄筋ひずみの最大値から平均値を差し引くことによって求めた付着によるテンションスティフニング効果は、鉄筋比が0.370.64%、作用している最大鉄筋ひずみが6501000(×10^<-6>)の範囲では普通強度(45N/mm^2)コンクリートに比べ、超高強度(105N/mm^2)の場合は1020%程度大きい結果を示した。5.超高強度コンクリート部材の載荷後の経過400日における平均曲率は、普通強度コンクリート部材の場合の約63%であった。曲率におけるMC90によるテンションスティフニングの評価は、鉄筋応力の高い段階ほど精度がよいことが認められた。6.コンクリート標準示方書(平成8年制定)設計編の有効曲げ剛性式は上記の超高強度コンクリート部材に対して実用的には満足しうる精度であることがわかった。ただし、圧縮鉄筋のある場合には、変形を過小評価することを考慮しなければならない。7.RCおよびPRC曲げ部材のひび割れ間要素の時間依存性変形解析のための、コンクリートおよび付着すべり関係に重ね合わせの原理を適用した、付着に基づく基礎方程式を定式化した。本研究は100N/mm^2クラスの高強度コンクリートを用いて、プレストレス導入後から長期にわたるクリープ変形の特性をプレストレスレベルと関係付けながら、実験および解析の両面から明かにし、併せて長期曲げ剛性モデルの適用性向上を図るものである。平成8年度に行った研究成果の概要は以下の通りである。1.高強度コンクリートのクリープ特性を正確的に把握するために、載荷時有効材齢を0.44日,0.85日,1.74日,11.7日,28日の5種類変えたクリープ実験を行い、併せて自己収縮ひずみを測定した。実測値に基づいて、クリープの終局値および進行速度を明かにし、CEB-FIP Model Code 1990のクリープ予測式を高強度コンクリートに適用できるように改良した。2.PRC部材の自己収縮による鉄筋の拘束応力を定量的に把握するために、自己収縮ひずみによるPRC部材のひずみ等を計測し、重ね合わせの原理に基づいてクリープ解析を行って求めた変形、鉄筋応力の実測値と比較し、比較的良く評価できることを明らかにした。3.高強度コンクリートを用いたPRCはりのプレストレス導入

それに続く持続荷重載荷以降の変形挙動を実験により検討し、併せてクリープの載荷時材齢を考慮した重ね合わせの原理に基づくStep-by-Step法を用いて解析を行った。その結果、実測時間依存変形と解析値はおおむねよく一致した。しかし、ひび割れの分散が十分でない場合の変形挙動については、MC90によるテンションスティフニング効果の評価は過小であることが明かとなった。4.PCおよびPRCはりの持続曲げ載荷実験結果に基づいてコンクリート部材の長期の変位・変形量を算定するために長期有効曲げ剛性に及ぼすクリープ、収縮およびテンションスティフニングの影響を表現し、長期有効曲げ剛性の設計式を提案した。プレストレス量、引張鉄筋比および圧縮鉄筋比等の相違に関わらず、試験値と比較的良く一致し、高強度コンクリートの場合に対してその妥当性を示した。本研究では、圧縮強度100N/mm^2の超高強度コンクリートのクリープ・収縮特性を実験的に把握し、さらに超高強度コンクリートを用いたPCおよびPRC部材のプレストレス導入後から死荷重を受けた後の長期変形・ひび割れ幅のメカニズムとその解析法を検討するものである。平成8、9年度にかけて行った研究成果の概要は以下の通りである。1.重ね合わせの原理を用いれば、乾燥収縮は乾燥開始後から発生する自己収縮の約70%の割合で比例的に増加し、その比例定数は乾燥開始材齢に依存しない。2.載荷時材齢および乾燥開始材齢の異なる超高強度コンクリートのクリープ・収縮試験から得られた結果をもとにMC90の予測式を改良した。3.クリープの載荷時材齢を考慮した重ね合わせの原理に基づくクリープ解析は、超高強度コンクリートの材料特性を適切に取り込むことによって、自己収縮によって導入される鉄筋の拘束ひずみを精度良く予測できることが認められた。実測された鉄筋ひずみの最大値から平均値を差し引くことによって求めた付着によるテンションスティフニング効果は、鉄筋比が0.370.64%、作用している最大鉄筋ひずみが6501000(×10^<-6>)の範囲では普通強度(45N/mm^2)コンクリートに比べ、超高強度(105N/mm^2)の場合は1020%程度大きい結果を示した。超高強度コンクリート部材の載荷後の経過400日における平均曲率は、普通強度コンクリート部材の場合の約63%であった。曲率におけるMC90によるテンションスティフニングの評価は、鉄筋応力の高い段階ほど精度がよいことが認められた。コンクリート標準示方書(平成8年制定)設計編の有効曲げ剛性式は上記の超高強度コンクリート部材に対して実用的には満足しうる精度であることがわかった。ただし、圧縮鉄筋のある場合には、変形を過小評価することを考慮しなければならない。7.RCおよびPRC曲げ部材のひび割れ間要素の時間依存性変形解析のための、コンクリートおよび付着すべり関係に重ね合わせの原理を適用した、付着に基づく基礎方程式を定式化した。
衛星と地上観測による雷雲上方の放電発光現象の研究

1989年に雷放電による中間圏大気の発光現象スプライトが発見されて以来、この10数年間に地上観測が続々と行われ、スプライトの他にも様々な過渡発光現象(TLE)が存在することが分かってきた。しかしこれまでの地上観測は限られた地点での観測であり、海上での観測もなかったことから、グローバルな発生分布を知ることができなかった。本研究では、2004年5月に打ち上げられたFORMOSAT-2衛星に搭載ISUAL観測器による雷放電発光現象のグローバル観測に基づき、TLE発生を支配する気象および雷雲活動条件と、発生機構の詳細を明らかにする。そのために、気象衛星データおよび地上ELF/VLF・光学観測データの解析結果や数値シミュレーションの結果を統合していく。平成18年度は、以下の成果が得られた。1.衛星による発光現象のグローバル観測とデータ解析:FORMOSAT-2衛星搭載のアレイフォトメータの機能と取得データを定期的にチェックし、良好な観測データを得た。それらを解析した結果、TLEの世界発生分および雷放電数に対する発生確率分布を世界で初めて明らかにした。2.ELF/VLF観測とデータ解析:世界4カ所(女川観測所、南極昭和基地、北極のキルナ、米国カリフォルニア州)に設置・運用しているELF観測網と国内のVLF受信機を運用し、得られたELF/VLFデータの解析を行った。特に、落雷位置決定精度の向上に努め、4倍以上の改善を達成した。またISUALデータと比較し、ELF波形からみたTLE発生条件について考察を行った。3.地上光学観測装置の開発:地上観測を充実させるために、主に光学観測装置の開発を進めた。4.数値シミュレーション:観測データの解析から得られる発光現象の発生条件をパラメータとして用い、TLEの時空間構造と化学的効果についてシミュレーションを行い、NOXの異常増加を初めて示した。
ミクロとマクロをつなぐ脳モデルの構築とその展開

本研究プロジェクトは、挑戦的萌芽研究の合格に伴い最終年を残しての終了となる。本研究期間での主だった成果は以下の3点である:1.脳の広域ネットワーク上での電気伝達現象に関する解析を進めてきた。その際、脳広域の構造接続データ、脳広域で計測したECoGデータ、ニューロンのSpikeデータらを有機的に結びつけるスキームを構築し、その伝搬速度が約1.0-1.5m/sである事、電気伝搬は最短パスを95%程度の割合で用いている事などを明らかとした。2.ミクロ回路側でのネットワーク解析の研究も前進している。これまで電気生理学実験でのin vitroとin vivoのデータを対象としていた手法を、in vivoの蛍光イメージングデータにも適用して、行動パラメーターやマクロな接続構造との比較を行った[Nakamura, Shimono, 2017]。3.ミクロ回路のシミュレーションにおいて、多ニューロンのトポロジーもしくは皮質の層構造などの拘束条件を自然と与えた上で、発火率が対数正規(log-normal)分布に従う様なダイナミクスから非自明な他の動的特性が生じるメカニズムの解明を行った。1の成果は、国際学会であるNetSci2017学会においてfeatured talkとしての発表も行った。1, 2の成果は、国内学会、日本神経科学学会でのセッションを受け持ち口答発表を行い、国際学会OCNSでも発表を行った。また、1の成果は論文としてまとまり、bioArxivに公開した上で査読を進めており[Shimono, Hatano, 2017]、2,3の成果の論文を準備中である。総じて、数理シミュレーションの基盤の構築から非自明な発見への道筋が付けられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究活動スタート支援は、申請者が挑戦的研究(萌芽)へと以降するに当たり、途中での休止となった。本予算であるH29年度繰越金は、H29年度内で発表しきれなかった内容を公表する学会参加の旅費を主目的としていた。実際、H30年に大阪大学の学生とともに、欧州でのOrganization of Computational Neuroscience学会での2件のポスター発表、そして日本神経科学学会での2件のオーラル発表(オーラル採択は審査付き)を行った(業績[Nakamura,Shimono,2018]など)。それらで発表した内容は2点である;[1]脳広域での神経活動の伝搬が直接的経路と間接的経路を用いるバランスを定量的に評価するとともに、その代表的な伝搬速度を推定した。[2]蛍光計測から得られた局所的な多神経細胞活動の因果的な相互作用ネットワークを再構成するとともに、その局所領域間をつなぐ広域的な投射の様相を対比したものである。両者は、ミクロとマクロを最短距離でつなぐ着想での研究であり、挑戦的萌芽研究へと継続される研究基盤の生成に寄与した。前者の研究成果は、本予算の時点でBioAxivでの公開を行った。学会発表という繰越額の使用の主名目との合致している。その枠においても、成果発表内容のサイエンスとしての価値は、口頭発表採択されるなど評価を受けており、かつ論文発表の成果も得られているため、総合的に円滑に研究活動が促進されていると考えられる。本予算に関しては、主に大阪大学において消化されたが、申請者は、2017年の終盤より京都大学医学研究科へと異動した。京都では生理実験を行う環境の整備を着実に進めていっており、新規な着想を具現化した実験系を確立しつつある。そこで、自らのラボで得られるビックデータを元に、神経系の動的なネットワークアーキテクチャの解明を進めて、より精度の高いモデリングが臨める研究基盤を確立することが、次に続くべきよい選択と考えられる。
自閉スペクトラム症児への早期コミュニケーション発達支援ー国際連携研究ー

重度の自閉症児に対する包括的コミュニケーション発達支援プログラムを完成し,大学センター支援とウェブ支援の効果を大きく検討する。その支援の効果を行動指標,発達指標,工学的指標,神経科学的指標の変化から明らかにする。それらの指標で,成果を実証してきた支援プログラムを,日本,中国,米国で適用し,その成果を分析する。
後発白内障における水晶体上皮間葉系移行と水晶体再生制御機構の解明

本研究では、トロポミオシン(Tpm)1/2が、白内障術後の後嚢混濁(PCO)や創傷治癒など上皮間葉系移行(EMT)の発症に関与していることを証明した。本研究では、FGF2によるTpm1/2抑制機序の一つとして、Fibroblast growth factor (FGF)2-MAPK経路の活性化が関与していることを明らかにした。また、Tpm2ヘテロノックアウトマウスを作成し、Tpm2が,LECのEMTや創傷治癒、水晶体混濁に関与していることを証明した。Tpm1/2は、PCOや創傷治癒などEMTの発症に関与しており、Tpm1/2の抑制はその進行予防に有用である可能性がある。FGF2とトロポミオシン(Tpm)は、白内障術後の後嚢混濁(PCO)の発症に関与している。ラットPCOモデルにおける線維芽細胞増殖因子(FGF)2、FGFーレセプター(FGF-R)2, Tpmの局在変化を免疫組織化学染色により観察した。ラットPCOモデルでは、FGF発現が高い赤道部再生水晶体上皮部位で、Tpm発現は減少していた。次に、FGF2によるTpm発現抑制メカニズムを解明するために、FGF2-Ras-MAPKシグナル経路の活性化に注目して検討した。培養マウス水晶体上皮細胞(MLEC)とヒトLEC(HLEC:)をもちい、FGF2により誘導されるMAPKシグナルパスウェイをプロテインブロット法にて解析した。FGFの抑制薬(SU5402)とErk-MEK経路抑制薬(PD98059)をFGF2と同時投与し、Tpmと上皮間葉系移行(EMT)マーカーであるα平滑筋アクチン(αSMA)の発現の変化をプロテインブロット法にて解析し、細胞遊走アッセイとコラーゲンゲル細胞収縮アッセイも施行した。結果として、MLECとHLECともに、FGF2投与後10分でpErk発現が上昇し、MAPKシグナル経路の活性化が確認された。FGF2投与後24-48時間で、TpmおよびαSMAの発現は抑制されたが、SU5402とPD98059投与により発現抑制作用はみられなくなった。SU5402とPD98059投与により、FGF2とTGFβ2同時投与における細胞遊走と細胞収縮も抑制された。FGF2-MAPK経路はTpm抑制に関与しており、MAPKシグナル経路の抑制によりPCOにみられるLECの変化を抑制できる可能性がある。また現在、Tpm2ノックアウト(KO)マウスを、CRISPR-Cas9システム技術を用いて作成した。ホモは胎生致死になるためヘテロマウスを育成中である。眼球の組織は、ワイルドタイプのマウス眼球と差がなく、水晶体の形態異常は観察されなかった。今後これらマウスに水晶体摘出手術をし、PCO発生に差があるのか検討予定である。また、Tpm1 KOマウスは、現在水晶体特異的なコンディショナルノックアウトマウスを作成中である。マウス水晶体上皮細胞(LEC)は、TGFβ投与によりTpm発現は上昇し、EMTが誘導され、細胞内にストレスファイバーを形成する。このTpmの、細胞のストレスファイバー形成および遊走能との関与を証明するために、以下の実験を施行した。GFP-Tpm1αまたは2βプラスミドのマウスLECへのトランスフェクションによりTpmを過剰発現させ、細胞内ストレスファイバー形成を観察した。GFP- Tpm1αまたは2βの過剰発現のみではマウスLECのストレスファイバーの形成は見られず、同実験系にTGFβ2を添加した場合ストレスファイバーが誘導され、TGFβ2±FGF添加した場合ストレスファイバーは抑制された。また、マウスLECのGFP-Tpm1αまたは2βの過剰発現により、TGFβ2添加による細胞遊走が増加することが観察された。前年度、作成したCPSPR-CAS9システムゲノム編集技術によるTpm2βノックアウト(KO)マウスの実験を開始した。ホモのTpm2βKOは胎生致死であったため、ヘテロのTpβmKOマウス(Tpm2β+/-)を使用した。このTpm2β+/-の後発白内障(PCO)モデルとして、水晶体に針で穿刺をして上皮間葉系移行(EMT)を誘導する創傷治癒モデルを用いた。Tpm2β+/-の水晶体では、穿刺部位における線維芽細胞様増殖変化、EMTがワイルドタイプ(WT)に比べて少なく、その部位でのTpm2βとα平滑筋アクチン(EMTマーカー)の発現も減少していた。Tpm2β+/-の水晶体では、16週齢以降より水晶体上皮下の表層線維細胞の膨化と配列の乱れ、空隙が観察され、週齢が上がるにつれてその変化が進行した。Tpm1αは、現在水晶体特異的コンディショナルKO作成中で、現在産仔が2匹得られたため、次年度より解析を開始する予定である。当初の計画より、多少の変更部分はあるがおおむね順調に研究計画が進められている。トロポミオシン(Tpm)2は、水晶体上皮細胞(LEC)の上皮間葉系移行(EMT)や白内障術後の後発白内障発症に関与している。今回、Tpm2の水晶体における役割を解明するために、CRISPR-Cas9システムを用いた新しいゲノム編集技術によりTpm2ノックアウト(KO)マウスを作成し、水晶体におけるTpm2の役割を解析した。

7週齢のTpm2ヘテロKOマウス(Tpm2+/-)では、白内障の混濁や組織変化が生じていなかったが、24週齢のTpm2+/-では、水晶体中央の前嚢下混濁様変化や水晶体皮質浅層にリング状の混濁を認めた。HE染色では24週齢のTpm2+/-で、水晶体皮質浅層に線維の膨化や配列の乱れを生じていた。コントロールのワイルドタイプマウス(WT)水晶体では、7、24週齢ともに水晶体に変化は見られなかった。マウスにおけるTpm2のKOは、加齢による白内障を発症していた。この結果より、Tpm2は水晶体線維の分化に重要な働きをしている可能性が示唆された。さらに、水晶体の創傷治癒反応におけるTpm2の影響をみるため、角膜より31G針にて水晶体前面に穿刺を施行した。Tpm2, α平滑筋アクチン(αSMA)の発現を免疫染色で観察した。結果:Tpm2とαSMAは、Tpm2+/-, WTともに穿刺前の水晶体では発現が検出できない。穿刺後の創傷治癒部位のEMTを生じた伸長したLECにおいて、Tpm2とαSMA発現が上昇したが、Tpm2+/-では、創傷治癒部位における線維芽細胞様変化が、WTマウスに比べ少なく、Tpm2とαSMA発現も低かった。結論:CRISPR-Cas9を用いた新しい技術においてTpm2-KOマウスを作成することができた。Tpm2は、創傷治癒部位におけるEMT、線維芽細胞様増殖に関与しており、Tpm2の抑制は後発白内障を抑制できる可能性が示唆された。本研究では、トロポミオシン(Tpm)1/2が、白内障術後の後嚢混濁(PCO)や創傷治癒など上皮間葉系移行(EMT)の発症に関与していることを証明した。本研究では、FGF2によるTpm1/2抑制機序の一つとして、Fibroblast growth factor (FGF)2-MAPK経路の活性化が関与していることを明らかにした。また、Tpm2ヘテロノックアウトマウスを作成し、Tpm2が,LECのEMTや創傷治癒、水晶体混濁に関与していることを証明した。Tpm1/2は、PCOや創傷治癒などEMTの発症に関与しており、Tpm1/2の抑制はその進行予防に有用である可能性がある。平成(H)26年度に予定していたラットPCOのFGFレセプター抑制薬の投与実験はできなかったが、H27年度施行予定であった、FGF2によるTpm発現抑制メカニズムを解明するための、RAS-ERK, MAPK経路の活性化実験を施行しできた。またTpm2ノックアウトマウスをshRNAではなく、CRSPR-Cas9システムを用いることで当初予定より早く作成できた。よって、計画はおおむね順調に進展していると自己評価している。Tpm2β+/-の水晶体組織変化をより高齢のマウスで観察し、Tpm2βの正常水晶体線維細胞への分化との関わり、線維のヘキサゴン形成との関係などN-カドヘリン組織染色などを用いて観察する。現在56週齢まで確認しているが、今後より高齢の水晶体の変化を継時的に観察していく予定である。創傷治癒モデルのみではなく、実際に水晶体摘出術を行い、PCOの変化を観察する。Tpm1αコンディショナルKOマウスのジェノタイピング、解析を進める。Tpm2βKOマウスと同様に創傷治癒モデル、PCOモデルにおけるEMTの抑制効果を解析する。水晶体の組織像も観察する。これによりTpm1αとTpm2βの水晶体での機能解析及び後発白内障発症との関与が明らかになる。
消化管および肝臓におけるアルコール依存的炎症性障害の分子機構の解明と予防法の開発

アルコール性肝障害は我が国において増加の一途を辿っているが、その病態や新規治療法に関する知見は少ない。我々はヒトでのアルコール性肝障害に類似した病像を呈するPPARαノックアウトマウスを用い、その病態を解析した。本マウスでは酸化ストレス産生亢進に伴い肝炎・肝線維化が生じていた。脂肪肝の治療薬であるポリエンフォスファチジルコリン(PPC)は、酸化ストレス産生亢進を緩和することにより本マウスでの肝炎を軽減させた。これらの結果はアルコール性肝障害における酸化ストレスの重要性とともに、PPCの新規治療薬としての可能性を示唆している。昨年度の実験の結果、4%エタノールを長期間投与したPPARαノックアウトマウスでは野生型マウスに比しNF-κBの活性化が強力に生じていることが判明した。そしてNF-κBの活性化により誘導される炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1β,およびこれらの受容体)、ケモカインや炎症細胞接着因子(MIP-2, ICAM-1)、炎症促進因子(COX-2, iNOS)、酸化ストレスを産生するNADPHoxidase、エンドトキシンにより刺激されるToll-like receptor 4, CD14の発現もPPARαノックアウトマウスで顕著に増加していた。そしてphosphatidylcholine(PPC)の共投与にてエタノール投与PPARαノックアウトマウスで見られた肝障害は著明に改善し、前述の変化もアルコール非投与群と同程度まで改善していた。以上の結果はアルコールによる肝毒性に対してPPARαが保護的に作用していること、そしてPPCがアルコール性肝障害を軽減する薬剤である可能性を示唆している。これらはリアルタイムPCR法にて得られた結果であるため、本年度はイムノブロットや免疫染色法を用いてこれらをさらに確認する予定で、現在論文作成中である。同様に、PPARαノックアウトマウスでは野生型マウスに比しアルコール性胃炎を生じやすいことも発見した。リアルタイムPCR法を用いたmRNA定量により、PPARαノックアウトマウスでは胃粘膜においても前述の分子種が顕著に誘導されることが判明した。この実験結果はPPARαがアルコール毒性から胃粘膜を保護していることを示唆している。本年度はこれらの有意な結果をイムノブロットや免疫染色法を用いてさらに強化していく予定である。昨年度の実験結果で、4%エタノール経口投与を6ケ月間継続したPPARαノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ、NF-κBの活性化が強力に生じていることが判明した。そしてNF-κBの活性化により誘導される炎症性サイトカイン・ケモカインや細胞接着因子、酸化ストレスを産生するNADPHoxidase、エンドトキシンにより刺激されるToll-like receptor 4,CD14の発現がPPARαノックアウトマウスで顕著に増加していた。そしてpolyenep hosphatidylcholine(PPC)の共投与にて本マウスで見られた肝炎、肝細胞壊死、アポトーシス、肝線維化は著明に改善していた。以上の結果を受けて、本年度はPPCの肝保護作用を分子病理学的に解明することを目的とした。上記分子種に加え、アポトーシス・線維化関連遺伝子の発現を定量PCR法、イムノブロット法、免疫染色法を用いて解析した。一連の解析により、酸化ストレスの産生抑制がPPCの肝庇護作用の中枢であることが明らかとなった。また、その分子機構は従来の抗酸化剤であるビタミンEやSアデノシルメチオニンとは全く異なるユニークなものであった。より具体的には、SOD分子の発現誘導が主たる変化要因であった。酸化ストレスの様々な慢性肝疾患への関与が近年明らかになってきているが、これらの結果は、PPCがアルコール性肝障害の治療薬として、さらには様々な酸化ストレス関連肝疾患の治療薬として臨床応用できる可能性を示唆している。
歯周組織に存在する細胞に対する歯周病原性細菌LPSのRANKL誘導能の相違

歯周炎は歯周病原性細菌のLPSが、歯周病の発症に重要な因子であると認識されている。LPSは炎症性細胞を活性化し、IL-1、IL-6,TNF-αなどの炎症性サイトカインを産生する。これらのサイトカインにより歯周組織に存在する様々な細胞が活性化され、破骨細胞形成を誘導することが明らかとなっているが、骨吸収性サイトカインを産生する細胞は数多く存在するため、その特定はできていない。近年、破骨細胞の分化と機能は骨芽細胞や線維芽細胞の細胞膜上に発現するRANKLによって調節されていることが明らかとなった。そして歯周病原性細菌のLPSがRANKL発現を促進することにより破骨細胞の分化を誘導することが明らかになっている。またT細胞もRANKL.を発現し、可溶性RANKLを分泌することが知られており、炎症部位で破骨細胞の分化や機能の調節を行っていることが示された。これまでの研究で、歯周病原性細菌は菌種間でそのLPSの生物学的活性が異なることが報告されてきたが、異なる菌種のLPS刺激により誘導されたRANKL発現量の差異について報告した研究はない。マウス大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取後、骨髄マクロファージを回収し、これにM-CSFとRANKLを、上記実験で得られた濃度と同濃度になるように添加して5日間培養し、破骨細胞を形成した。形成された破骨細胞数を比較して、産生されたRANKLの濃度の相違が破骨細胞形成に関係するかを調査した。歯周炎は歯周病原性細菌の感染によって引き起こされ、グラム陰性嫌気性桿菌のLipopolysaccharide (LPS)が、歯周病の発症に重要な因子であると認識されている。LPSは好中球やマクロファージといった炎症性細胞を活性化し、IL-1、IL-6,TNF-αなどの炎症性サイトカインを産生する。これまでの研究で、これらのサイトカインにより歯周組織に存在する様々な細胞が活性化され、破骨細胞形成を誘導することが明らかとなっているが、骨吸収性サイトカインを産生する細胞は数多く存在するため、その特定はできていない。近年、破骨細胞の分化と機能は骨芽細胞や線維芽細胞の細胞膜上に発現する破骨細胞分化因子(RANKL)によって厳格に調節されていることが明らかとなった。そして歯周病原性細菌のLPSが骨芽細胞や線維芽細胞のRANKL発現を促進することにより破骨細胞の分化を誘導することが明らかになっている。またT細胞もRANKLを発現し、可溶性RANKLを分泌することが知られており、炎症部位で破骨細胞の分化や機能の調節を行っていることが示された。これまでの研究で、歯周病原性細菌は菌種間でそのLPSの生物学的活性が異なることが報告されてきた。しかしながら各種歯周病原性細菌のLPS刺激により誘導された骨芽細胞や線維芽細胞、T細胞、B細胞のRANKL発現量の差異について報告した研究はない。本研究では各種歯周病原性細菌(A actinomycetemcomitans、P. gingivalis、T. forsythensis)由来LPSによって、線維芽細胞、骨芽細胞、T細胞、B細胞を刺激して、細胞膜上のRANKL発現を解析し、菌種間の相違について検討する。さらにLPSで刺激した際のRANKL発現量を細胞間で比較し、破骨細胞誘導を調節している細胞を検索する。本年度はマウス大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取後、M-CSF存在下で24時間培養し、非付着細胞を回収し、ストローマ細胞を除去した。回収した非付着細胞をM-CSF存在下でさらに2日間培養し、付着した細胞をBone Marrow Macrophage (BMM)とした。これに25ng/mlのM-CSFと50ng/mlのRANKLを添加して5日間培養し、破骨細胞を形成することを確認した。
新規表面抗原ＥＳＡＭを指標とした造血幹細胞の生理的特性の解析と白血病診断への応用

成体の骨髄において造血幹細胞の多くが静止状態にあるが、骨髄抑制が生じると反応性に素早く増殖する。本研究において我々はEndothelial cell-selective adhesion molecule (ESAM)が静止期において発現が低く、活性化状態において発現上昇することを見出し、造血幹細胞の活性化をモニターできる有用なマーカーであることを明らかにした。また、ESAMはヒトにおいても臍帯血・骨髄・動員末梢血中のCD34陽性CD38陰性分画において高発現しており、さらにヒト急性白血病の系統診断においても有用であるのみならず、腫瘍細胞の性質を評価する上でも有用であることを明らかにした。申請者らは、マウスを用いた実験系で造血幹細胞の新規マーカーendothelial selective-adhesion molecule (ESAM)を発見した。継続した検討で、マウス造血幹細胞の活性化に伴い、ESAMの発現レベルが顕著に上昇することも明らかにした。そこで本研究では、造血幹細胞におけるESAMの発現の生理的意義を明らかにすることを目的に解析を行った。特に本年度は、ヒトの造血幹細胞におけるESAMの発現に関する解析を進めた。ヒト臍帯血において、造血幹細胞が濃縮されているCD34陽性CD38陰性分画のほとんどの細胞が、ESAMを高発現していた。各種培養系や免疫不全マウスへの移植実験にて機能解析を行った結果、長期造血再構築能力を持つ多能性造血幹細胞はCD34陽性CD38陰性ESAM陽性分画に存在することが明らかとなった。さらに成人骨髄やG-CSFによって末梢血中に動員されたCD34陽性CD38陰性も、その多くがESAMを発現しており、多能性前駆細胞はESAM高発現分画に濃縮されていることが分かった。これらの知見から、ESAMはヒトにおいても造血幹細胞のマーカーとして有用であり、そのソースとなる組織に関わらず、造血幹細胞を濃縮できる普遍的な指標となり得ると考えられた。この結果は2013年12月の米国血液学会で発表した。さらにヒト白血病細胞におけるESAMの発現に関しても解析を進めた。白血病細胞株を用いた検討では、骨髄球・赤芽球・巨核球系細胞でESAM陽性のものが多く、逆にリンパ球性白血病細胞株のほとんどがESAM陰性であった。ヒト白血病症例での検討も進めている。現段階では、病型間での差に関して知見を述べうるまでに至っていないが、少なくとも骨髄性白血病症例の多くにESAM発現陽性が確認できつつある。申請者らは、造血幹細胞の新規マーカーendothelial selective-adhesion molecule (ESAM)を発見した。継続した検討で、ESAMの発現レベルが、造血幹細胞の活性化に伴い、顕著に上昇することが分かった。そこで本研究では、ESAMの発現上昇の生理的意義を明らかにすることを目的に解析を行った。免疫染色を用いて、ESAM陽性造血幹細胞の存在部位を調べた。5-FU投与後5日目のマウスから大腿骨または脛骨を採取し、骨髄の凍結切片を作製した。切片作製には、非固定非脱灰骨組織からの標本作製技術を用いた。造血幹細胞の指標としてlineage-, Sca1+, ESAM+の他にCD150, CD48を組み合わせ、造血幹細胞の存在部位を精緻に探索した結果、5-FU投与後の活性化したESAM強陽性造血幹細胞は、そのほとんどが骨髄内で血管内皮細胞の近傍に存在することが分かった。造血幹細胞の活性化におけるESAMの生理的重要性を、ESAM欠損マウスを用いて解析した。ESAM欠損マウスは、定常状態では野生型と比較して造血機能に大きな異常を示さなかったが、5-FUを投与して骨髄抑制を加えると、強い汎血球減少を示した。特に貧血が重篤で,約30%のマウスが造血の回復前に死亡した。Flow cytometryやコロニーアッセイにて赤芽球系の前駆細胞数を評価したところ,造血幹細胞に近い極めて早期の段階が影響を受けていることが分かった。血液細胞とと血管内皮細胞のどちらのESAM発現が造血機能の回復に重要なのか、ESAM欠損マウスの造血幹細胞を移植した野生型マウスと、野生型の造血幹細胞を移植したESAM欠損マウスを作製して解析した結果,血液細胞側のESAM欠損の方が造血幹細胞の回復に大きな影響を与えることが分かった。申請者らは、血管内皮関連抗原であるendothelial selective-adhesion molecule (ESAM)が、造血幹細胞のマーカーとして発生期から老年期まで有用であり、また抗癌剤や放射線による造血障害によって惹起される造血幹細胞の活性化に伴って発現レベルが顕著に上昇することを、マウスを用いた実験系で明らかにしてきた。