hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ENFペプチドによる血球細胞活性化機構の構造生物学的解析

GBPはカリヤコマユバチに寄生されたアワヨトウ幼虫から単離された25残基のアミノ酸からなるサイトカインである。GBPの3次構造はしっかりした構造をもつコア領域とフレキシブルなN、C末端からなる。フレキシブルなN末端領域が活性発現に重要であることから、この領域に挿入、置換、削除した各種部位特異的変異体を構築して、GBPとその受容体の相互作用様式について検討を加えた。またc末端領域についても検討した。未寄生の幼虫では23残基のGBPが発現しているが寄生に伴って終止コドンがTyrに翻訳され28残基からなるC端の延長した1-28GBPとなる。1-28GBPは野生型の1-25GBPよりも高い活性を示すことからその機構を解明することは興味深い。我々はC端部分がレセプターとの結合に何らかの役割を果たしているのではないかと考え、疎水性溶媒中での1-28GBPの立体構造変化を検討した。疎水性環境ではF23,Y24,I27の側差間で新たなNOEが得られたことから、C端部分の活性への寄与はレセプターとの疎水相互作用であることが示唆された。更にDPCミセル中での1-28GBPの立体構造を検討したところ、C端部分がヘリックス構造を形成していることを見出した。またスピンラベルしたDPCを用いることにより、GBPはミセル表層に局在していることが明らかになった。以上より1-28GBPの高活性発現機構を議論した。昆虫サイトカインはGBPの他にも多数存在することが推定されるが、現在までほとんど発見されていない。本研究では、新規サイトカインを血球細胞活性化活性を指標として探索し、アワヨトウ幼虫外皮抽出液から、新規サイトカインの単離に成功した。cDNAのクローニングをも行い、32残基の全長配列を決定できた。合成ペプチドによっても血球活性化活性を確認できた。更に活性発現機構等について研究を進め、GBPとは異なる受容体をAGFが認識していることが示唆された。GBPはアワヨトウ幼虫から単離された25のアミノ酸からなるサイトカインである。GBPはいくつかの活性をもっており、幼虫の成長を制御したり、培養細胞の増殖を制御したり、プラズマ細胞と呼ばれる免疫細胞を刺激したりする。我々の以前の研究からコア領域以外にGlu(1)やPhe(3)がプラズマ細胞刺激活性に重要であることがわかっている。フレキシブルなN末端領域が重要であることから、さらにこの領域に挿入、置換、削除した各種部位特異的変異体を構築して、GBPとその受容体の相互作用様式について検討を加えた。特にGly(5)-Gly(6)の領域はN末端とコア領域を結ぶフレキシブルなリンカーとしての役割を果たしていると予想されるので、この部分のGlyの残基数を増減することにより運動の自由度を変化させたところ、増減により何れの場合も活性は低下した。またGlyをよりかさ高いPheやProに置換した場合も活性は低下した。これらの結果から、GBPと受容体の結合にはGBPのN末端領域とコア領域の相対的な位置関係が重要であること、それを実現するためにリンカー領域のフレキシビリティも重要であることが推定された。

またN末端からペプチド鎖を削っていくと、変異体は途中でアンタゴニスト活性を失うことから、コア領域の他にN末端領域、特にPhe(3)が受容体との結合に重要であることが明らかになった。GBPはカリヤコマユバチに寄生されたアワヨトウ幼虫から単離された25残基のアミノ酸からなるサイトカインである。GBPの3次構造はしっかりした構造をもつコア領域とフレキシブルなN、C末端からなる。昨年度は、フレキシブルなN末端領域が活性発現に重要であることから、この領域に挿入、置換、削除した各種部位特異的変異体を構築して、GBPとその受容体の相互作用様式について検討を加えた。今年度は、更にC末端領域について検討した。未寄生の幼虫では23残基のGBPが発現しているが寄生に伴って終止コドンがTyrに翻訳され28残基からなるC端の延長した1-28GBPとなる。1-28GBPは野生型の1-25GBPよりも高い活性を示すことからその機構を解明することは興味深い。我々はC端部分がレセプターとの結合に何らかの役割を果たしているのではないかと考え、疎水性環境での1-28GBPの立体構造変化を検討した。疎水性環境ではF23,Y24,I27の側差間で新たなNOEが得られたことから、C端部分の活性への寄与はレセプターとの疎水相互作用であることが示唆された。昆虫サイトカインはGBPの他にも多数存在することが推定されるが、現在までほとんど発見されていない。そこで今年度は、新規サイトカインを血球細胞活性化活性を指標として探索した。無脊椎動物では血液凝固系が発達していないことから、外皮には細胞免疫系を活性化する様々な因子が存在するとの仮説をたて、アワヨトウ幼虫外皮抽出液から、熱処理、粗精製、5段階の逆相HPLCを経て新規サイトカインを単離し、21残基の配列決定に成功した。更にcDNAのクローニングを行い、32残基の全長配列を決定できた。合成ペプチドによっても血球活性化活性を確認できた。次年度は更に組織特異性、活性発現機構等について研究を進める。我々は、新規サイトカインを血球細胞活性化活性を指標として探索した。無脊椎動物では血液凝固系が発達していないことから、外皮には細胞免疫系を活性化する様々な因子が存在するとの仮説をたて、アワヨトウ幼虫外皮抽出液から、熱処理、粗精製、5段階の逆相HPLCを経て新規サイトカインAGFを単離し、21残基の配列決定に成功した。この新規サイトカインAGFの発現系を構築することに成功し、15N均一標識したペプチドを得ることができた。ほぼ全てのシグナルを帰属することができたので、距離情報を収集して溶液中の立体構造解析を行った。得られたAGFの立体構造は相同性の低いアミノ酸配列をもつにも拘らずGBPの立体構造と高い相同性を示した。この結果は、レセプターがGBPと共通している可能性を含めてGBPの機能について示唆するものであった(投稿準備中)。またGBPと膜上のレセプターとの相互作用におけるGBPのN末端部分の役割を網羅的な変異体実験により明らかにした(研究発表3)。
グライコブロッティングを利用した多糖の選択的除去による膜ファウリングの効率的抑制

本研究では、生体内試料から糖鎖のみを選択的に回収するグライコブロッティングに着目し、膜処理において膜を閉塞させるバイオポリマーを効率的に除去できる前処理方法の確立を試みた。常温下ではグライコブロッティングによるバイオポリマーの除去は限定的であったが、アニリンなどの触媒あるいは酸化剤の併用により常温下でもバイオポリマーの除去が可能となった。バイオポリマーにはグライコブロッティングにより除去しやすいものとしにくいものが混在していることが分かり、バイオポリマーの細分類が必要となった。バイオポリマーの分析法として国際標準となっている方法を改良し、バイオポリマーを細分類して分析することに成功した。浄水膜ろ過処理において、深刻な膜ファウリングを引き起こす有機物として高分子バイオポリマー画分が指摘されている。バイオポリマーは2万100万Daの非常に大きな分子量を有し、多糖類を主成分としている。このバイオポリマーを効率的に除去する前処理が膜ファウリング発生の制御には重要となる。凝集や活性炭吸着のような一般的な前処理では、バイオポリマー以外の有機物成分も同時に除去する結果、バイオポリマーの除去が非効率的になるのが課題である。バイオポリマーの除去に特化した前処理技術を確立できれば、膜ファウリングの発生を効率的に抑制できる可能性がある。本研究では、血清などの生体内試料から糖鎖のみを選択的に回収するグライコブロッティングに着目した。ヘミアセタール構造を有する糖鎖は、水溶液中にて環状・鎖状構造の平衡状態にあり、鎖状構造においてアルデヒド基を含む。グライコブロッティングでは、生体内でアルデヒド基を含む分子は糖だけであることに着目し、このアルデヒド基と結合するアミノオキシ基を用いて糖鎖のみを選択的に回収する。本研究ではグライコブロッティングを水中から多糖を選択的に除去するための技術として用いることを試みる。着手段階として、グライコブロッティングを行うための市販ビーズを用い、河川水および生物処理上澄み水を試料としてバイオポリマー除去を検討した。多糖の回収・精製で設定するような高温条件(80度)ではバイオポリマーの除去が確認できたが、常温下ではほとんどバイオポリマーの除去が起こらなかった。多糖とグライコブロッティング反応に関与する官能基間の反応を加速するという報告のある触媒数種に着目し、アニリンおよび5-メチルアントラニル酸(以下5MA)を用いることで、常温下でもグライコブロッティング反応により水中からバイオポリマーの除去が可能となることを示した。常温下でのグライコブロッティング反応が可能となるような触媒数種を確認し、今後の研究展開可能性を大きく広げることができた。実用化を視野に入れた場合には市販ビーズの使用ではなく、安価な基材へグライコブロッティング反応に関与する官能基を導入して同様の反応を起こすことが望ましい。本研究ではアミノ基を有する市販イオン交換樹脂に必要な官能基を導入することに成功しており、市販ビーズと同等の性能を示すことを確認している。前年度までの検討においてグライコブロッティング法を用いた新水処理材を試作し、実水道原水と下水処理プロセス(膜分離活性汚泥法、MBR)より採取した上澄み液を対象として除去性を検討した。本研究で開発をしようとしている処理方法により良好な除去が見込める多糖と、除去が見込めない多糖が存在することが示唆されている。用排水処理の有機物分析において多用されるLC-OCDでは多糖がバイオポリマー画分として一括検出される。本年度はLC-OCD分析の改良を行い、バイオポリマー画分をより細分化して分画することを試みるとともに、膜ファウリング発生に重要となるバイオポリマー画分について検討した。通常のLC-OCD分析では、バイオポリマーは分子量10,000Da以上の成分として一括検出されるが、本年度検討した改良LC-OCD分析ではバイオポリマー画分が非常に幅広い分子量を有する成分から構成されることが明らかになった。すなわち、バイオポリマー画分の中には分子量が1,000,000Daを超える超高分子量画分が存在する一方で、分子量10,000程度の画分も存在し、これらは水処理過程において異なる挙動を示すと考えられる。MF膜のファウリング発生に重要な関与をするのは分子量>1,000,000Daの超高分子量画分であることが示された。この超高分子量バイオポリマーの通常の水処理プロセスによる除去性は低く、膜ファウリング制御の困難さが示された。アルミニウム塩を用いた凝集では超高分子量バイオポリマーが一部除去されるが、イオン交換処理による除去はほとんど見込めないことが明らかになった。グライコブロッティング法により除去しづらい多糖の存在が明らかになり、多糖のより細分化された分画が必要となった。多糖のより細かい分画には成功したが、分画された多糖それぞれの特性についてはほとんど知見がないため、通常の水処理プロセスにおける除去性、応答の検討に留まった。しかしながら、本研究で示された超高分子量バイオポリマー(多糖)の存在とこの画分の挙動把握は今後の膜ファウリング研究において極めて重要となる感触を得ているところである。当初計画の遂行はやや遅れる結果となっているが、今後も超高分子量バイオポリマーの存在を念頭においた研究の遂行が重要であると考えている。前年度までの検討においてグライコブロッティング法を用いた新水処理材を試作した。この新水処理材により良好な除去が見込める多糖と除去が見込めない多糖の存在が示唆された。

前年度にはLC-OCD分析の改良によりバイオポリマーを従来法よりも広い範囲で分離できるようになった。分子量1,000,000 Daを超える超高分子量バイオポリマーがMF膜における膜ファウリング発生に重要な働きをしていることが示唆された。本年度は実水道原水(河川表流水)を対象として定期的採水を行い、超高分子量バイオポリマー濃度の変動を追跡するとともに、PVDF製MF中空糸膜における膜ファウリング発生度との関連性について検討した。超高分子量バイオポリマー濃度は、全有機炭素濃度・フミン質濃度・全バイオポリマー濃度と比較して、膜ファウリング発生度とのより強い相関があった。超高分子量バイオポリマー濃度は有効なファウリング発生予測指標となる可能性が高く、新水処理材による除去性の検討も超高分子量バイオポリマー濃度に着目して行うべきであると言える。超高分子量バイオポリマーの重要性についてより一般的な検討を行うために国内各地の水道水源から水道原水を採水し、UF膜を用いてバイオポリマー成分を精製した。精製バイオポリマーを純水に溶解した水を原水として回分MF膜ろ過実験を行ったところ、超高分子量バイオポリマー濃度と膜ファウリング発生度との高い相関が認められた。超高分子量バイオポリマーが細孔内に侵入できないようなUF膜の使用により、膜ファウリングの発生は抑制できる可能性が高い。分画分子量100,000 DaのPVDF製UF膜を用いた実験では、不可逆的膜ファウリングの発生は抑制される一方で可逆的ファウリングの発生が促進される結果となった。本研究では、生体内試料から糖鎖のみを選択的に回収するグライコブロッティングに着目し、膜処理において膜を閉塞させるバイオポリマーを効率的に除去できる前処理方法の確立を試みた。常温下ではグライコブロッティングによるバイオポリマーの除去は限定的であったが、アニリンなどの触媒あるいは酸化剤の併用により常温下でもバイオポリマーの除去が可能となった。バイオポリマーにはグライコブロッティングにより除去しやすいものとしにくいものが混在していることが分かり、バイオポリマーの細分類が必要となった。バイオポリマーの分析法として国際標準となっている方法を改良し、バイオポリマーを細分類して分析することに成功した。生物処理上澄み水と比較して、水道原水を試料としてグライコブロッティング法を適用した場合にはバイオポリマーの除去率が顕著に低くなることが多いことを観察している。両種の試料において含まれるバイオポリマーの特性が大きく異なることを示唆する結果であり、本研究で提案する処理法の適用可能範囲を検討するためにはバイオポリマー特性に関する詳細な情報が必要であると考えている。生物処理系で発生するバイオポリマーと河川水中バイオポリマーの差異について検討するとともに、河川水中バイオポリマー除去率向上のための方策についても検討する。前年度までに得られた本処理法において有効な触媒に関する情報を活用し、グライコブロッティング法を有効に適用するための新規水処理材料の合成についても、実現の可能性を検討する。
外因性機能調節物質の化学合成

制癌,抗ウィルス作用をもつヌクレオシドとしてZ′-アルキルシチジンおよびチミジンの合成とZ′-デオキシーZ′-アルキルピリミジンヌクレオシドの合成を行った.殺細胞効果および抗ウイルス作用があった(上田).発癌性ワラビ成分プタキロサイドのアグリコンであるプタキロシンのラセミ型を合成した.これを脱水すると活性型ジェノン化合物となるはずである(山田).ポリエーテル抗生物質は複雑な構造のため,合成が困難であるが,高立体選択的全合成の一環としてラサロシドA,イソラサロシドAの主要部分であるラサロシドケトン,イソラサロシドケトンの合成を達成した(米光).生物活性凝似配糖体抗生物質やリポアルカロイドなどの複合脂質の合成を検討した.単糖から誘導してバリエナミンの合成を完成した.またアコニチンなど猛毒アルカロイドを交換してリポアルカロイドを合成し,生物活性を検討した.急性毒性に興味ある知見が得られ,また抗炎症および鎮痛活性についても検討した(北川).アスパラギナーゼがある種の白血病に著効を示すのは,白血病などの場合,アスパラギン合成酵素を欠損しているためである.したがってアスパラギナーゼが臨床に応用されたが,反復投与によりアレルギー反応を生ずる症例があり,利用が困難であった.これを改善するためポリエチレングリコール系鎖を分子中に導入し酵素を修飾する方法を開発しつつある(和田).有毒物質の一つ,微生物起源発癌プロモーターであるテレオシジン類の全合成を行った.放射菌の生産するテレオシジンは皮膚にひどいかぶれを生ずるだけでなく,ホルボールと並んで強い発癌プロモーター活性を示す特異なインドール系化合物である.従来困難とされていたインドール系化合物を原料に用いる方法でインドラクタムV,テレオシジンB-3, B-4を全合成した.まずインドール酢酸から出発してイソプレノイド部分を導入し,ラクタム部分を合成した(後藤).制癌,抗ウィルス作用をもつヌクレオシドとしてZ′-アルキルシチジンおよびチミジンの合成とZ′-デオキシーZ′-アルキルピリミジンヌクレオシドの合成を行った.殺細胞効果および抗ウイルス作用があった(上田).発癌性ワラビ成分プタキロサイドのアグリコンであるプタキロシンのラセミ型を合成した.これを脱水すると活性型ジェノン化合物となるはずである(山田).ポリエーテル抗生物質は複雑な構造のため,合成が困難であるが,高立体選択的全合成の一環としてラサロシドA,イソラサロシドAの主要部分であるラサロシドケトン,イソラサロシドケトンの合成を達成した(米光).生物活性凝似配糖体抗生物質やリポアルカロイドなどの複合脂質の合成を検討した.単糖から誘導してバリエナミンの合成を完成した.またアコニチンなど猛毒アルカロイドを交換してリポアルカロイドを合成し,生物活性を検討した.急性毒性に興味ある知見が得られ,また抗炎症および鎮痛活性についても検討した(北川).アスパラギナーゼがある種の白血病に著効を示すのは,白血病などの場合,アスパラギン合成酵素を欠損しているためである.したがってアスパラギナーゼが臨床に応用されたが,反復投与によりアレルギー反応を生ずる症例があり,利用が困難であった.これを改善するためポリエチレングリコール系鎖を分子中に導入し酵素を修飾する方法を開発しつつある(和田).有毒物質の一つ,微生物起源発癌プロモーターであるテレオシジン類の全合成を行った.放射菌の生産するテレオシジンは皮膚にひどいかぶれを生ずるだけでなく,ホルボールと並んで強い発癌プロモーター活性を示す特異なインドール系化合物である.従来困難とされていたインドール系化合物を原料に用いる方法でインドラクタムV,テレオシジンB-3, B-4を全合成した.まずインドール酢酸から出発してイソプレノイド部分を導入し,ラクタム部分を合成した(後藤).
日記、時政記史料から見た宋代政治構造

栄代の政治日記と時政記とを手掛かりに、3年にわたり宋代の政治構造について分析を進めてきた。その成果をまとめれば以下の通りである。(1)宋代の官撰史料は、起居注・時政記をもとに日暦が編纂され、旧暦をもとに実録が編纂され、実録をもとに国史が編纂される編纂過程となっている。これらの内、宰執が皇帝との政治会話を輪番で記録した時政記が最も重要な位置を占めた。(2)宰執は時政記と共に私的な日記を同時に付けていた。この日記は皇帝との政治的会話を主として記録する目的として作成され、多くの日記は官撰史料作成のため、政府に提出された。(3)時政記、日記に限らず、皇帝との会話を記録することが重要視され、政府に史料が集められた。これは、宋代に、官僚が直接皇帝に対面し意見を申し上げる、所謂「対」システムが広範に発達した結果である。(4)北宋の王安石『王安石日録』と南宋の周必大『思陵録』を比較すると、両者には基本的に宰執が皇帝との会話を主として記録した日記としての同じ性格を見いだすことができる。宰執から見た日記という限定性はあるものの、皇帝、宰執、侍従、台諫、宦官といった様々な官僚層がどのように宋代の政策決定に関わっていたかを如実に描き出している。(5)しかし、その一方、周必大は同時期に『奉詔録』を執筆している。『奉詔録』とは、皇帝から官僚へ直接送られる「御筆」とそれに対する返答を日記スタイルでまとめたものである。この「御筆」の発展が北宋末からであった事実と併せ鑑みると、皇帝との会話とともに「御筆」を残すことも重要視されるようになったことを示している。日記の記述スタイルの変化は、そのまま当時の政治構造の変化と見事に呼応している。本年度は、「日記、時政記史料から見た宋代政治研究」の研究課題に基づき、次のような研究活動を行った。(1)『続資治通鑑長編』その他の私撰の編年体史料の中に残されている時政記、日記史料を調査した。また、調査に当たっては、本年度予算で購入した『文淵閣四庫全書電子版』を活用し、『四庫全書』に残されている日記史料を網羅的に調べ上げた。(2)この調査並びに解析の中間的成果は、2000年8月、カナダ・モントリオールで開催された第36回国際アジア・北アフリカ会議にて発表した。また、報告内容を加筆訂正したものを『東洋史研究』59-4号に掲載する予定である。以上の研究成果をまとめれば次の通りとなる。(1)宋代の官撰史料の編纂過程は、起居注・時政記をもとに日暦が編纂され、日暦をもとに実録が編纂され、実録をもとに国史が編纂されるというものである。これらの史料の内、宰執が皇帝との政治的会話を輪番で記録した時政記が最も重要な位置を占めた。(2)宰執は時政記と共に私的な政治日記を同時に付けていた。この日記は、時政記と類似した内容を持ち、皇帝との政治的会話を主たる内容とした。これらの日記は、時政記を付けるための史料となると共に、政治の備忘録としての役割を果たした。また、政治日記は宰執に限らず、多くの高官が付けていたことが確認される。これは実録を編纂するなどの際に、政府への提出を求められたことと関係があると思われる。

(3)時政記、日記に限らず、当時の官撰史料に用いられた史料群は、当時の政治構造と密接に関係している。宋代は、官僚が直接、皇帝に意見を申し上げる「対」と呼ばれる政治システムが発達した時代である。このシステムの発達は、皇帝と官僚との政治的会話を残すことに大きな意味を持たせることとなり、そのことが宋代に特徴的に現れる、時政記、日記に代表される政治史料群を生むこととなったと考えられる。前年度は、宋代の時政記と政治日記史料に関する総合的調査を行った。本年度は、数多く存在する政治日記史料の内より、ケーススタディとして『王安石日録』を取り上げ、史料調査を行った。『續資治通鑑長編』、『四明尊堯集』の二つの史料に断片的に残されてい同史料について、両者を突き合わせながら、『王安石日録』の復元作業を進めると共に、具体的内容について分析を進めた。分析に際し、特に着目したのが、陳〓の『四明尊堯集』である。この史料は『四庫全書存目叢書』が1997年に中国で刊行され、ようやく日本で見ることができるようになったものであり、宋代政治史研究にとって極めて重要な意味を持っている。同史料を詳細に検討すると共に、版本の異なる史料が中国国家図書館(旧北京図書館)に残されているため、2月から5月にかけての中国滞在期間中と、11月上旬の中国出張の際、史料調査を試みた。また、本テーマに関わる関係史料を静嘉堂文庫、内閣文庫などより文献複写を行い入手した。一連の作業の結果、『王安石日録』の執筆動機、具体的内容、政治史研究を進める上での同史料の史料的価値などを明らかにすることができた。すなわち、『王安石日録』に代表される政治日記の解析は、皇帝と官僚が直接対面して意見交換を行う政策決定システムである「対」が重要な機能をなしていた宋代の政治の実態を知る上で有効なものであり、新たな宋代政治構造を明らかにしうるものである。なお、この成果は「『王安石目録研究』-『四明尊堯集』を手掛かりとして-」と題する論文として近々、公表する予定である。本年度は、当該テーマに関するまとめの作業を行った。前年度までに、宰相・執政が輪番で記した公的な記録である時政記と、私的な記録でありながら官撰史料の史料源ともなった政治日記との関係を明らかにした。本年度は、王安石の『王安石日録』と周必大の『思陵録』・『奉詔録』という北宋、南宋を代表する政治日記を比較検討し、日記から伺える政治構造の差異について考察を行った。その結果、『王安石日録』は、『煕寧奏対』という別名が示す通り、官僚が皇帝と直接対面し、意見交換を行う「対」を記すことを目的として書かれたもりであり、ここには<宰相>王安石と<皇帝>神宗との頻繁な意見交流、或いは王安石の神宗に対する指導的発言、新法に対する王安石の具体的な考え、歴代・当代の人物に対する評価など、他の史料には見えにくい生々しい政治の実態を垣間見ることができた。一方、『思陵録』は宰相周必大が南宋第2代孝宗朝の政治について記したものであり、基本的に皇帝と官僚との「対」を中心に記す政治日記としての性格は前者と同じであるものの、その分量は少なく、南宋期の皇帝と官僚間の直接交流の減少をうかがわせるものであった。南宋の場合、この「対」の部分を補う仕組みが御筆を介したやりとりとなり、その記録は『奉詔録』という形で残されている。御筆は北宋第8代徽宗朝において宰相蔡京が始めたものであり、行政府の中枢機関である三省六部を経過することなく、皇帝が直接官府あるいは官僚に文書を送るというものであった。『奉詔録』はそのいわば御筆システムというべき北宋末からの政治手法を体現するものであり、ここには宦官を介しながら皇帝、官僚問を文書が行き来し、政策が決定されていく様子が看取される。このように、南宋には「対」と「御筆」システムが政治の2つの柱として機能していたことがうかがえる。
ウニ胚発生過程におけるCa^<2+>輸送機構の変化と発生機構との関連に関する研究

ウニ胚発生過程での【Ca^(2+)】のとりこみを【^(45)Ca^(21)】を用いて測定した結果は、未受精卵では極めて低く、ほとんど零に近く、受精後数分間は高まり、その後末受精卵レベルに低下して、十数時間は低いままである。そして、その後原腸形成開始と共に高まる。この【Ca^(2+)】のとりこみは、【Ca^(2+)】アンタゴニスト及び陰イオン輸送阻害剤で阻害される。従って、【Ca^(2+)】チャンネルを通じてとりこまれ、【Ca^(2+)】流入はアニオン流入と共役して電気的中性を保っていると考えられる。1)本年度は原腸形成期における【Ca^(2+)】とりこみが特に【Cl^-】流入と共役しているように見えるのは、骨片へのCa【CO_3】沈着に必要なH【CO(^-_3)】と【Cl^-】の交換が【Cl^-】輸送阻害剤によって阻害された結果Ca【CO_3】の沈着が停止し、【Ca^(2+)】のとりこみが減少することを見出した。2)骨片形成期において、Ca【CO_3】の沈着は【Ca^(2+)】の流入、【Ca^(2+)】のミトコンドリアなど細胞内オルガネラによる濃縮、【4_2】-ブリン系による運般、骨片小胞への放出、そして細胞内での【CO_2】とH【CO(^-_3)】へのカーボニックアンヒドレースによる生成、【Cl^-】,H【CO(^-_3)】ATPaseによる小胞への放出によってCa【CO_3】の沈着がおこり、その際、【H^+】の細胞外への放出が必要であることを見出した。3)培養小割球からの骨片形成に伴う虚足の形成は、【Ca^(2+)】のとりこみ阻害による【Ca^(2+)】濃度低下で阻害されることを見出した。4)受精直後におこる【Ca^(2+)】のとりこみ又は細胞内【Ca^(2+)】濃度の増加によって、青酸不感性呼吸及び【H^+】の放出(カルモデュリン依存性【Na^+】/【H^+】交換であることを見出している)が引きおこされることを見出した。6)卵内の[【Ca^(2+)】]濃度増加をミトコンドリアの【Ca^(2+)】とりこみ阻害により引きおこし、カルモデュリン依存性の【H^+】放出(【Na^+】/【H^+】交換)を引きおこした。
小惑星探査高効率化のための形状・運動自動推定および自動画像航法

本年度は、小惑星探査を高効率化・高精度化することを目標とした小惑星形状、運動状態、探査機位置等の自動推定アルゴリズムについて、昨年度までに開発した基本的なアルゴリズムをもとにして、アルゴリズムのさらなる効率化をはかった改良などを施したうえで、実際の小惑星探査での使用に向けた性能評価やインタフェースの整備などを行った。特に、シミュレータを用いて生成した小惑星の模擬画像をもとにして複数の性能評価実験を行い、いずれの場合でもおおむね合理的な推定結果が得られることを確認した。特に、探査機がある一定の範囲にとどまり小惑星のなるべく多くの部分を観測しようとするフェーズ(ホームポジションにおけるフェーズ、小惑星探査初期)を模した状況についての実験では、上記の小惑星形状、運動状態、探査機位置を画像列からほぼ自動的に合理的な時間(標準的なラップトップで1時間程度の計算時間)で推定できることを確認した。また、探査機が小惑星に向かって降下していく場合(上記のフェーズの後に行われる)を模した状況についても同様の実験を行い、開発したアルゴリズムが動作することを確認した。さらに発展課題として、上記のような応用場面で登場する時系列データ(上記の場合には画像列)を効率よく解析する諸手法についての研究も行った。これらの方法は、画像列のような時系列データを解析して情報を得るうえで効率的な前処理手法として活用できると期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。小惑星探査を高効率化するための小惑星形状等推定アルゴリズムを開発するため、必要な基礎技術に関して調査を行い、比較的シンプルな手法による形状等推定を試した。その結果、実用的な精度を得るためには最適化方法などについて改善が必要であることがわかった。そこで、実際の小惑星探査ミッションでの使用をさらに考慮に入れたアルゴリズムを開発するため、次のような現実的な枠組みを想定した研究を行った。すなわち、小惑星の形状および自転パラメータ、ならびに小惑星探査機の相対位置および姿勢を、探査機に搭載された単眼カメラによる画像、姿勢センサ(スタートラッカ、太陽センサなど)の観測値、および慣性センサ(加速度計、ジャイロなど)の観測値を利用して推定するという問題設定を定義し、そのための推定アルゴリズムを開発した。また、正確な形状等の推定に必要な実際的状況に関する議論も行った(例えば、可観測性を満たすために小惑星表面の大部分が比較的短い時間で観測される必要がある、など)。具体的対外成果としては、2016年6月に中国・北京にて行われた宇宙ミッションでの人工知能等の利用に関する国際会議であるThe International Symposium on Artificial Intelligence, Robotics and Automation in Space (i-SAIRAS)において、上記アルゴリズムなどについて発表を行い、宇宙ロボティクスに携わる複数の研究者から有益なフィードバックを得た。さらに、上記アルゴリズムに基づく総合的な推定手法についてまとめ、論文を投稿した(現在、査読中)。また、上記アルゴリズムの実装をオンラインで公開するための準備を行っている。必要な基礎技術を調査し、比較的シンプルな手法によって改善が必要な点等の洗い出しを行うことができた。また、実際の小惑星探査ミッションを視野に入れたアルゴリズムの基礎となる計算手法を確立し、簡単な実験等を行うことができた。また、共同研究先との議論やデータ提供をうけ、提案アルゴリズムを詳細に検証する環境が整いつつある。本年度は、実際の小惑星探査ミッションでの使用をさらに考慮に入れたアルゴリズムを開発するため、次のような現実的な枠組みを想定した研究を行った。また、正確な形状等推定に必要な実際的状況に関する議論も行った(例えば、可観測性を満たすために小惑星表面の大部分が比較的短い時間で観測される必要がある、など)。本年度は、実際の小惑星探査ミッションを視野に入れたアルゴリズムのための基礎となる計算手法を確立し、簡単な実験等を行うことができた。

また、探査機が小惑星に向かって降下していく場合(上記のフェーズの後に行われる)を模した状況についても同様の実験を行い、開発したアルゴリズムが動作することを確認した。さらに発展課題として、上記のような応用場面で登場する時系列データ(上記の場合には画像列)を効率よく解析する諸手法についての研究も行った。これらの方法は、画像列のような時系列データを解析して情報を得るうえで効率的な前処理手法として活用できると期待される。これまでに開発したアルゴリズムは、人工的データによる精度検証等は行っているものの、実際の小惑星探査になるべく近いようなデータを用いるには至っていない。そのようなデータを生成するための高度なシミュレータが必要であり、さらなる検討が必要である。そこで、今後の研究の中心になる方策は、実際の小惑星探査の状況に近いデータをシミュレートし、提案アルゴリズムのフィージビリティを検証することである。そのようなデータを生成するためには高度なシミュレータが必要であり、さらなる検討が必要である。そこで、今後の研究の中心となる方策は、実際の小惑星探査の状況に近いデータをシミュレートし、提案アルゴリズムのフィージビリティを検証することである。29年度が最終年度であるため、記入しない。
変異γPKCによる脊髄小脳変性症の小脳選択的発症メカニズムの解明

脊髄小脳失調症14型を引き起こす変異γPKCにより、小脳プルキンエ細胞(PC)特異的な神経変性が引き起こされるメカニズムを解明するため、初代培養神経細胞のPCとPC以外の神経細胞に変異γPKCを発現させた。他の神経と比較して、PCに発現させた変異γPKCの流動性が著しく低下していた。続いて、PCにおいて変異γPKCに強く結合するタンパクとして、heat shock cognate protein 70 (Hsc70)が同定された。変異γPKCはPCにおいてHsc70と強く結合し、その機能を障害することによりPC特異的神経変性を起こすと示唆された。近年、神経変性疾患の1つである脊髄小脳失調症14型(SCA14)の原因がprotein kinase Cγ(γPKC)の遺伝子変異であることが明らかとなった。γPKCは神経細胞特異的なPKC分子種であり、大脳皮質・海馬・小脳など様々な部位の神経細胞に発現が見られるが、SCA14では変異γPKCにより小脳プルキンエ細胞が選択的に脱落し、他の部位の神経は影響を受けない。変異γPKCが小脳プルキンエ細胞特異的に神経変性を起こすメカニズムを解明するため、初代培養小脳プルキンエ細胞に発現させた変異γPKCと、小脳初代培養中のプルキンエ細胞以外の神経細胞や初代培養大脳皮質神経細胞に発現させた変異γPKCの間で分子特性に違いが見られるかどうかを検討した。FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)法を用いて細胞内での分子の流動性を検討すると、変異γPKCは初代培養小脳プルキンエ細胞において、流動性が野生型γPKCと比較して著しく低下していた。しかし、プルキンエ細胞以外の神経細胞に発現させた場合も、変異γPKCの流動性の低下は見られるものの、その程度は小さく、プルキンエ細胞においてよりも高い流動性を保っていることが明らかとなった。以上の結果は変異γPKCが小脳プルキンエ細胞で特異的にタンパク質との複合体を形成し、その結果流動性が低下したと示唆され、そのタンパク質の機能に影響を及ぼすこと臥床のプルキンエ細胞選択的な細胞毒性煮関与するのではないかと考えられる。今後はプルキンエ細胞内で変異γPKCと特異的に結合するタンパク質の同定を試み、変異γPKCの細胞毒性に及ぼす影響を検討していく予定である。
カタカナ教育の基礎的研究-日本語教育における分野の確立を目指して-

2ヵ年の研究期間において、初年度は教育現場の実態調査を、次年度は文献調査を実施し、それぞれの結果を中間報告書と成果報告書の2冊の報告書にまとめた。2ヵ年の調査結果から、次のような問題や課題があることがわかった。2.文字教育においては、カタカナ文字を実際に導入している教育機関の約4割はひらがな文字の目標とは異なる目標を設定しており、定着についても約4割の機関は「あまり定着していない」「そもそも定着を確認していない」と回答している(調査対象48機関)。3.語彙教育においては、多くは教材に出現するカタカナ語を導入するにとどまり、類義の和語・漢語との区別を教えるなど、しっかりとした語彙教育を行う教師は多くない。4.教授法においては、定着がなかなか図れないといわれる、ひらがな導入直後の導入時期を改善しないまま放置している。5.教材においては、基本カタカナ語がないため、それに基づいて語の選定をし、語義や用法、類語との比較など使用実態に基づいて多様な情報を付した教材が存在しない。6.教師用参考書においては、カタカナ指導に割くページは少なく、現代日本語におけるカタカナ語の重要性を説くものも少ない。7.従来カタカナについては、学習者の苦手意識ばかりが言及されてきたが、学習者は苦手意識を持ちながらも、カタカナの存在を容認しており、6割に上る学生は「もっとしっかり教えてほしい」という希望を抱いている(調査対象479人)。以上のことから、まずは教える側のカタカナ教育に関する問題を改めていくことが重要であり、教材や教授法の改善と同時に教師の意識改革をする必要があることが明らかになった。本年度は、「日本語教育におけるカタカナ教育」の実態調査を大学や日本語学校等の日本語教育機関(回収数58)、および日本語教師(同213)、日本語学習者(同479)への3者に対し実施した。その結果、日本語学習者の約8割が「カタカナ語がわからなくて困った」ことがあり、6割が日本語の授業でカタカナ語を「もっとしっかり教えてほしい」と思っているのに対し、日本語教育機関の8割が教育目標を決めておらず、自身の教育が「不十分である」とする日本語教師は7割近くに上り、その理由を「時間がないためにきちんと教えられない」とする教師が8割弱いることが分かった。このことは、日本語教育現場ではカタカナ教育に力が入れられていないという実態を示唆している。また、カタカナ語を教える際に専用教材を使用したことのある教師は少なく、多くは教材に出現するカタカナ語を教えるのみであるのに対し、新聞やニュースが分かる程度のカタカナ語を教えてほしいとする学習者が多いことも分かった。来年度は実際にどのようなカタカナ語がどのように教えられているのか、について教材等の文献における教育カタカナ語の実態を調べる予定であり、それに向けて文献の入手ならびに電子データ化に着手した。なお、本年度の調査結果は、学会誌等に報告する予定で現在執筆中である。また、3月に行われた国立国語研究所平成17年度日本語教育短期研修第5回の中山・桐生他の講義「日本語学習者が新聞を読むための基本外来語の選定」において引用した。さらに、2月に東京からカタカナ教育の専門家を招き、その豊富な実践経験から今後のカタカナ教育の方向性などについて多様な知見が得られた。2年目にあたる今年は、まず昨年度実施した現場調査の結果を中間報告書にまとめ、9月に刊行した。その作業と平行して、文献調査を2つの視点から行った。1つは、学習者が接するカタカナ教育の現状を知るためのもので、いわゆる総合教科書のカタカナ語彙、文字教材と語彙教材の練習方法や取り上げているカタカナ語彙について調べた。中級以降の総合教科書では、その単元のテーマに左右され、基本的な語彙を導入することが難しいことがわかった。もう1つは、教師が知識として得るカタカナ教育の現状を知るためのもので、教師用参考書にとりあげられている

カタカナ教育、また、カタカナ教育に関する論文を対象にして、そこでカタカナ教育がどのように言及されているのかを見た。概して言及が少なく、導入方法や定着に関しては、ひらがなや漢字のそれとは大きく異なった書き方をしているものがあることがわかる。以上の結果は3月(2007年)に刊行した成果報告書の「文献調査編」に掲載している。初年度の現場調査と研究会および、2年目の文献調査の結果から得た知見に基づき、研究グループの4名それぞれに論文を執筆した。4本の論文は同じく成果報告書の「論文編」に掲載した。本研究の目的であった「現場調査と文献調査を実施して、カタカナ教育の現状と問題点を把握し、日本語教育関係者の認識形成ならびに教材や教授法の開発のための基礎資料を作成」することは、成し遂げられた。今後はこの基礎資料を基に、日本語教育関係者の認識形成ならびに教材や教授法の開発を目指して、研究を継続していきたい。
ローズゼラニウムの香気成分生合成酵素遺伝子のクローニングと香りの分子育種への応用

本研究ではローズゼラニウムのモノテルペン系芳香成分であるシトロネロールの生合成遺伝子を単離するため若葉のトランスクリプトーム解析を行い、発現遺伝子データベースを構築した。次いで本データベースよりモノテルペン代謝酵素の候補遺伝子を得て組み換え酵素の活性を検討した。この結果、old yellow enzymeのホモログについてシトラールからシトロネラールへの二重結合還元反応を触媒することを確認した。ローズゼラニウムよりcitral代謝活性を有する酵素が得られたことは本植物のモノテルペン代謝機構を考える上で興味深く、また本酵素遺伝子はモノテルペン代謝の遺伝子工学的な改変に応用可能と考えられる。ローズゼラニウムに多量含まれるモノテルペン成分のcitronellolは、geraniolから二重結合の還元により生成すると考えられてきたが、詳細な解析は行われていない。本年度は二重結合還元酵素の候補としてshort-chainおよびmedium-chainタイプの還元酵素を想定し、合計5種類の遺伝子をクローン化して大腸菌で組み換え酵素の発現を行った。しかしながら酵素アッセイの結果、いずれもcitronellolが生成する還元反応を触媒しないことが確認され、仮説の見直しが必要となった。近年、酵母や異種植物を用いた検討から、フラビン酵素の一種であるold yellow enzyme(OYE)のモノテルペン代謝への関与を示唆する研究例がいくつか報告されている。またgeraniolからcitronellolに至る経路として、(1)geraniolは直接citronellolに還元される、という従来の説の他に、(2)本経路はcitralとcitronellalを経由し、OYEはcitralからcitronellalへの還元を触媒する、という二つの説が存在する。そこでローズゼラニウムにおいてもOYEのホモログがモノテルペン代謝に関与する可能性を考え、ESTデータベースのスクリーニングを基にOYEホモログのクローニングを行い、371アミノ酸からなるタンパク(OYE-1)をコードする遺伝子を得た。OYE-1を大腸菌で発現し、geraniolおよびcitralを基質としてアッセイを行った結果、geraniol→citronellolの反応は観察されなかったものの、OYE-1はcitral→citronellalの二重結合還元反応を触媒することが判明した。OYE-1が真にモノテルペン代謝に関与するかについて、基質特異性及び発現パターンなどを基に検証するため、現在さらなる解析を検討している。Citronellolはバラ花弁やローズゼラニウム(Pelargonium graveolens)に含まれる直鎖状モノテルペンの一種であり、特にローズゼラニウムは本成分を多量生産することが知られている。本植物の粗酵素液を用いた研究からcitronellolはgeraniolからNADPH依存型還元酵素により生合成されることが確認されているが、還元酵素の遺伝子は特定されていない。本年度は、ゲラニオール還元酵素の遺伝子を初めて同定することを目的とした検討を行った。先ずはじめに、ローズゼラニウム新鮮葉からRNAを精製し、所定の操作に従いcDNAライブラリーを調製して、次世代シークエンサーであるイルミナ社ゲノムアナライザーを用いてショットガンシークエンスを行った。得られた短鎖配列に関し、各種ソフトウェアを用いたアセンブルを行いうことで数万単位のコンティグを含むESTデータベースを構築した。次いで、NADPH依存型のモノテルペン還元酵素として知られる、ミントのpulegone reductaseおよびisopiperitenone reductaseなどとホモロジーを示す配列を検索した結果、5種のコンティグを特定し、それぞれについてRACE法を行うことにより、完全長の遺伝子配列を決定した。各遺伝子全長はRT-PCRにより増幅し、発現ベクターpQE-80Lに組み込み、大腸菌M15に形質転換して発現株を作製した。現在、各組み換え酵素の調製及びcitronellol合成活性の検出を検討している。Citronellolはモノテルペン系精油成分であり、特にローズゼラニウムは本化合物を多量含むことが知られる。本化合物はローズゼラニウムのバラ様の芳香と昆虫忌避作用を決定する分子として興味深いが、その詳細な生合成メカニズムは報告されていない。本研究では、ローズゼラニウム若葉のRNAseq解析により、94万種のコンティグを含む発現遺伝子データベースを構築し、本データベースより候補遺伝子を探索する手法によりcitronellol生合成遺伝子の単離を検討した。Citronellolは従来geraniolの二重結合の還元により生合成されると考えられていたため、始めに既知のモノテルペン還元酵素とホモロジーを示す遺伝子配列5種をデータベースよりセレクトし、これらを発現ベクターpQE80Lに組み込んで大腸菌で組み換え酵素を発現した。いずれも可溶性タンパクとして発現、精製できたものの、これらは所期のgeraniol還元活性を示さなかった。次いで、近年テルペン代謝への関与が示唆されているoldyellow enzymeのホモログについて三種の遺伝子をクローン化し、同様の手法により組み換え酵素を調製して代謝活性を測定した。

この結果、geraniol還元反応は確認できなかったものの、各酵素ともcitralからcitronellalへの二重結合還元反応を触媒することを確認した。酵母においてgeraniolはcitralとcitronellalを経由してcitronellolに代謝されることが確認されており、citralの還元にはold yellow enzymeが関わることが知られている。ローズゼラニウムよりcitral代謝活性を有する酵素が得られたことは本植物のモノテルペン代謝機構を考える上で興味深い結果であり、また本酵素遺伝子はモノテルペン代謝の遺伝子工学的な改変に応用可能と考えられる。植物生化学本研究では当初、geraniolを直接citronellolへと還元する二重結合還元酵素の存在を想定し、ミントなど異種植物のモノテルペン代謝経路に見られるようなshort-chainあるいはmedium-chainタイプの還元酵素である可能性を考えて研究を行ってきた。しかしながら、geraniolからcitronellolを生成する還元酵素遺伝子を得るには至らず、仮説の再検討が必要となった。当初の研究目的において、本年度は還元酵素の構造機能研究を完了し、プロモーター解析など代謝工学に向けた検討を行う予定であったため、研究の進捗は遅れていると判断している。その一方で、OYE-1の遺伝子をクローン化し、本酵素がcitralからcitronellalへの還元反応を触媒することを確認したことは、本植物におけるモノテルペン代謝にOYEが関与し、また代謝経路中間体としてcitralおよびcitronellalが存在する可能性を示唆するものとして重要な知見であると考えている。本年度はcitronellol合成酵素遺伝子を特定し、各種生化学的性質の解明までを目的としていたものの、現在候補遺伝子のクローン化にとどまっているため、やや遅れた進捗状況であると判断している。Geraniolを直接citronellolへと還元する遺伝子が得られなかったこと、及び、citralからcitronellalへの還元反応を触媒するOYE-1の存在を確認したことから、ローズゼラニウムにおけるモノテルペン代謝は従来の推定と異なり、geraniol→citral→citronellal→citronellolの3ステップを経て進行する可能性が考えられる。OYE-1に関しては、これがモノテルペン代謝に関与することを明確にするため、基質特異性及び発現パターンなどを詳細に検討する。また、これ以外の、geraniol→citralおよびcitronellal→citronellolの酸化還元反応を触媒する酵素遺伝子に関しても平成26年度に明確にする計画である。既にcitronellol合成酵素の候補
比較ゲノム解析による軸決定進化プロセスの解明

1、フグOtx2遺伝子座約70kb(-30+38kb)に渡って14種類のトランスジェニックマウスを作製し、レポーター遺伝子の発現を解析したところ、3'側約+13kb周辺の1.1kbゲノム断片がマウス胚臓側内胚葉の発現を支配する活性を担っていた。マウス、ニワトリ、ヒトのゲノム配列との比較解析及び詳細な塩基置換変異による発現解析を行うことで、フォークヘッド型転写因子の結合配列が活性に必須であった。次に、このフグ1.1kbゲノム断片がゼブラフィシュ胚においてどのような機能を担っているか検討するため、トランスジェニックゼブラフィシュを作製した。F0及びF1胚においてレポーター遺伝子の発現を解析したところ、sphere期から将来のshield部分で発現が認められ、原腸形成後では前方の中内胚葉で、最終的にはpolster及び心臓などで発現が認められた。更に内在性のOtx1,2,3遺伝子の発現と比較したところ、レポーター遺伝子の発現は内在性Otx遺伝子の発現ドメインに含まれていた。2、マウス前後軸形成過程で、カノニカルWntリガンドは将来の後側に限局して発現し、その拮抗因子であるDkk1は前側で発現することから、哺乳動物胚においても他の脊椎動物同様に、カノニカルWntシグナルの非対称な分布が軸決定に必須であることが示唆された。実際、標的分子である-cateninの発現を解析したところ、臓側内胚葉層の前側で強く後ろ側で弱く核内に局在していることを見いだした。更に、カノニカルWntリガンドとその拮抗因子が臓側内胚葉細胞の前側への移動に反発性及び誘因性のガイダンス分子として働くことを明らかにした。つまり、他の脊椎動物において見られたカノニカルWntシグナルの非対称な分布は哺乳動物への進化の過程でも保存され、体軸決定に利用されていることを明らかにした。
多変量非線形時系列モデルの統計的推測:シュミレーションベース・アプローチ

本年度は、まず閾値自己回帰モデル、指数自己回帰モデルなど離散時間-変量非線形時系列モデルを多変量へ拡張することを目的とし、多変量間の非線形関係をモデル化する際に利用するシミュレーションベースによるアプローチの応用可能性を研究するとともに、多変量化の一つの方向として、非線形モデルのよる予測値を結合する結合予測量を提案し、様々な経済時系列に適用してその有効性を確認した。具体的には、これまでの研究代表者が行ってきたガウス性検定に関する研究から、株価収益率や失業率など一部の経済時系列を除き、多くの経済時系列は、線形(ガウス)と非線形(非ガウス)の境界にあることが確認されている。それらは、観測期間によって線形と非線形の性質が混在しており、その典型的パターンは、ある時期を境にして線形(非線形)から非線形(線形)へ性質を変え、標本期間全体として不明瞭な性質を示す。これは経済あるいはマーケットの構造変化に対応した現象と理解できる。これに対応できる方法として、非線形性をある程度示す時系列に対して、周辺モデルである線形自己回帰モデルと非線形モデル(閾値自己回帰モデル、指数自己回帰モデル)を結合し、それぞれの特徴をポイント・ワイズに捉えることの出来る分析モデルを提案した。その際、結合係数が一定のモデルと時間と共に変化するモデルの両者を考え、前者は標本全体として各周辺モデルの優位性を評価でき、後者は各時点でモデルの役割を評価できるモデルを提供する。様々な経済時系列に対してこれらの方法を適用し、内挿においては結合予測量が周辺モデル予測量を一様に凌駕し、外挿においても結合予測量が有効な局面が多く存在することを確認した。本研究では、閾値自己回帰モデル、指数自己回帰モデルなど離散時間一変量非線形時系列モデルを多変量へ拡張することを目的とし、多変量間の非線形関係をモデル化する際に利用するシミュレーションべースによるアプローチの応用可能性を研究するとともに、多変量化の一つの方向として、非線形モデルのよる予測値を結合する結合予測量を提案し、様々な経済時系列に適用してその有効性を確認した。この他、連続時間で記述された多くのマクロ非線形経済動学モデルの"局所線形化"法による統計的推測を扱い、実際の経済データに応用し実証分析を行った。