hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食品のトライボロジーおよびレオロジーと咀嚼・嚥下との関係

また、食品の種類に関わらず、食塊の静止摩擦係数がある一定値になるまで咀嚼が行われることが示唆された。さらに、食品表面の静止摩擦係数は、咀嚼回数、食塊中の粒子の平均断面積と負の相関、食塊中の粒子数と正の相関が認められたことから、食品表面の静止摩擦係数の大きい食品は咀嚼によって細かい粒子にして嚥下が行われていることが分かった。ねばりと付着性において、咀嚼回数、食塊中の粒子の平均断面積、唾液分泌量と正の相関が認められたことから、ねばりや付着性が高い食品は噛み切られにくいため、食塊中の粒子の平均断面積が大きく、かつ多くの咀嚼回数を要し、そのため、口腔内での滞留時間が長くなり、唾液分泌量が多くなったと言える。平成29年度は、動的粘弾性測定および動摩擦係数測定を実施する計画であったが、測定装置を借用させていただく研究機関との使用スケジュール調整等の連絡のすれ違いがあり、平成29年度中に測定を実施することができなかったため。平成30年度は前年度の結果を受けて、スポンジ状食品および餅に焦点を当てて摩擦特性、レオロジー特性と咀嚼行動との関係を調べた。静止摩擦係数は咀嚼前の食品表面は試料間に有意差が認められたが、人工食塊では有意差が認められず、一定の静止摩擦係数で嚥下していることが明らかとなった。例外として、ハンペンの人工食塊の静止摩擦係数は大きな値となり、有意差が認められた。この理由については今後の検討課題となった。動摩擦測定は、平成28年度と同様にカマボコおよび寒天ゲルを試料とし、試料を細断して人工唾液を添加した人工食塊について実施したところ、動摩擦力の変化は、寒天ゲルは食塊中の粒子サイズに依存する傾向が認められ、一方、カマボコでは粒子サイズ依存性は認められなかった。このことと嚥下衝動との関連については今後の検討課題となった。スポンジ状食品では水分含量、圧縮破断強度および破断に要するエネルギーが、食塊中の粒子数および平均粒子断面積を支配するパラメータであることが示された。水分含量の違いはタンパク質の三次元網目構造の程度の違いに起因しており、食品の破壊のしやすさにつながったと考えられた。また、咀嚼による食品の圧縮が破断強度を高める結果となり、食塊中の粒子断面積に影響を及ぼしていた。餅を試料とした場合には、テクスチュア・プロファイル・アナリシスから得られるかたさ、付着性および引っ張り測定時の破断伸びが咀嚼回数、咀嚼時間、咀嚼速度、唾液分泌量、食塊中の粒子数および平均粒子断面積と相関する傾向が認められた。ただし、付着性が小さく、ヤング率および破断時伸びが大きい試料は相関から外れた。このことと窒息事故の関連も含めて、今後、詳細に検討していく。平成28年度にトライボロジー測定法を確立できたので、各種食品について、トライボロジー、レオロジー、NMR、官能のデータを蓄積していき、咀嚼・嚥下行動に関わる要因パラメータを特定していく。各試料について、応力緩和測定を行い、試料の粘弾性パラメータ(弾性率、粘性率、緩和時間)を得る。また、・プロファイル・アナリシス分析を行い、テクスチュアパラメータを得る。次いで、動的粘弾性測定から、貯蔵弾性率、損失弾性率を得る。これらのパラメータからテクスチュアおよび食品の構造については、応力緩和測定データを用いたゴム弾性理論による三次元網目構造解析(網目密度、網目鎖数の算出)と動的粘弾性測定データから架橋点間分子量の算出による構造解明が可能となる。統計解析の手法を用いて、機器測定パラメータと官能パラメータから、統計解析ソフトを用いた主成分分析による咀嚼・嚥下行動に関わる要因パラメータを特定する。また、国内学会および国際学会での発表と同時に投稿論文の執筆を行っていき、最終年度には報告書の作成に取り掛かる。
ＥＢウイルス由来機能性ＲＮＡを標的としたホジキンリンパ腫の実験的分子標的治療

エプスタインバールウイルス(EBV)の潜伏感染に対する自然免疫が、ホジキンリンパ腫の新たな治療戦略となる可能性がある。EBV感染を伴うホジキンリンパ腫の腫瘍微小環境では、制御性T細胞が増加し細胞傷害性T細胞は減少していた。パターン認識分子であるRIG-Iは、EBVの潜伏感染に伴って発現が増加していたが、下流のIRF3の活性化とインターフェロンの発現は見られず、EBV由来の最初期遺伝子が阻害している可能性が考えられた。EBV感染は自然免疫のシグナル経路を変化させ、腫瘍微小環境の免疫反応を抑制していることが示された。自然免疫の活性化が、ホジキンリンパ腫の新しい治療戦略となる可能性が確認された。ホジキンリンパ腫では、Epstein Barr virus (EBV)の感染が腫瘍発生や病態形成に関与していると考えられているが、その機序は明らかではない。我々は、これまでにEBV感染を伴うホジキンリンパ腫では、自然免疫応答分子のRIG-Iが高発現しているものの、IRF3のリン酸化と核移行が阻害されていること、またCCL20の発現が亢進していることを明らかにした。今回、IRF3の下流にあるtype 1 interferonの発現の有無を確認するとともに、interferonやCCL20の発現の変化が、腫瘍細胞周囲の腫瘍微小環境の細胞構成に影響を与えるのか高齢者のホジキンリンパ腫において検討を行った。高齢者のEBV感染を伴うホジキンリンパ腫では、CCL20の発現の増加が見られ、IRF3の不活性化と相応して、interferonβの発現は認められなかった。一方、腫瘍微少環境の細胞構成を形態計測したところ、EBV感染症例ではCCL20に誘導されるFOXP3陽性の制御性T細胞が多く、interferonにより誘導される細胞障害性T細胞は少なかった。これらのことから、高齢者のホジキンリンパ腫においては、EBV感染は腫瘍細胞内での自然免疫応答を減弱させ、ケモカインやインターフェロンの発現を変化させ、腫瘍微小環境の免疫状態をさらに抑制していることが示唆された。ホジキンリンパ腫では、Epstein Barr virus (EBV)の感染が認められ、腫瘍発生に関与していると考えられているが、その分子機構は十分明らかでない。我々は、EBV感染ホジキンリンパ腫において、自然免疫関連分子であるRIG-Iの発現が増強しているものの細胞死は誘導されていないことを見出した。このことから、自然免疫の経路を活性化することで、ホジキン細胞の細胞死を誘導する、ホジキンリンパ腫の新たな治療法の開発を目指し、自然免疫経路の異常の解明と実験的治療を目指している。今回の検討では、ヒトホジキンリンパ腫17例において、RIG-Iを介した自然免疫のシグナル経路について検討を行った。その結果、EBV感染ホジキンリンパ腫において、RIG-Iの発現はEBV非感染ホジキンリンパ腫に比較して増強しているものの、RIG-Iの下流に位置しtype 1 interferonを誘導するIRF3が、細胞質に発現しているものの、活性化されておらず、核内に移行していないことを見出した。さらに、EBV感染ホジキンリンパ腫では、EBV由来のEBNA1により発現が誘導され、制御性T細胞の浸潤に関わるCCL20の発現の増強も確認された。EBV感染ホジキンリンパ腫の腫瘍微小環境では、EBV非感染ホジキンリンパ腫に比較して制御性T細胞が多く、細胞傷害性T細胞が少ない。以上の結果から、EBV感染ホジキンリンパ腫においてRIG-Iの下流のシグナル経路のIRF3が非活性化されており、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を減弱させる一因となっていることが考えられた。IRF3を活性化することが、自然免疫経路を活性化し腫瘍細胞の細胞死を誘導するホジキンリンパ腫の新しい治療となる可能性が考えられた。ホジキンリンパ腫では、Epstein Barr virus (EBV)の感染が腫瘍発生や病態形成に関与していると考えられている。我々は、これまでの研究により、EBV感染ホジキンリンパ腫の腫瘍細胞において、自然免疫応答分子であるRIG-Iの発現の増加が見られるものの、その下流でインターフェロンの発現に関与する、IRF3の核移行が阻害されていることを見いだしている。IRF3の核移行の阻害は、CCL20の発現増加とインターフェロンβの発現の低下を来たし、腫瘍微少環境における制御性T細胞の増加と細胞障害性T細胞の低下を来たしていることが明らかにされた。IRF3は細胞内における自然免疫応答において重要な役割を果たす。一方、EBV由来の溶解関連分子はIRF3の機能を阻害することが知られている。そこで今回の検討では、IRF3の阻害メカニズムを明らかにするため、腫瘍細胞内におけるIRF3阻害物質の解析を行った。

検討には高齢者のホジキンリンパ腫18例を用い、EBV感染症例が9例、非感染症例が9例であった。溶解関連分子としてBRLF1とBZLF1の発現を、免疫組織学的に検討した。その結果、BRLF1の発現はEBV感染症例の9例中7例(78%)で、EBV非感染症例の9例中2例(22%)で認められた。また、BZLF1の発現はEBV感染症例の9例中7例(78%)で、EBV非感染症例の9例中1例(11%)で認められた。ホジキンリンパ腫の腫瘍細胞内においては、EBV感染により自然免疫経路の自然免疫の経路が減弱しており、その一因として、ウイルス由来の溶解関連分子が関与している可能性が考えられた。本研究結果から、EBV陽性ホジキンリンパ腫のより効果的な治療には、腫瘍細胞内における自然免疫経路の活性化が必要と考えられた。これまでの検討から、RIG-Iを中心とする自然免疫のシグナル経路が不活性化されていることが明らかとなっている。シグナル経路の不活性化をきたす因子が存在する可能性があり、この因子の抑制が新たな治療戦略となると考えられる。より詳細にRIG-Iのシグナル経路を解析し、不活性化の機序を明らかにするため、EBERのみを発現するホジキン細胞株の樹立を目指している。EBER発現ベクターの調整は終わったものの、ホジキンリンパ腫由来細胞株への導入が遅れている。適切な治療標的分子の選定のために、ヒトホジキンリンパ腫において、RIG-Iを中心とする自然免疫のシグナル経路の解析を行った。その結果、RIG-Iのシグナルの下流の分子であるIRF3の非活性化を確認した。当初、Epstein Barr virus由来の機能性RNAで、RIG-Iと結合するEBERを標的分子と考えていたが、シグナル経路の解析からEBERは必ずしも適切な標的分子ではないことが明らかとなった。このため、標的分子の選択とその実験的治療戦略の見直しが必要となり、培養細胞を用いた実験的治療の準備が遅れている。しかしながら、ヒトホジキンリンパ腫における自然免疫経路のシグナル経路解析を十分行ったことで、より適切な治療標的分子が探索できており、実験的治療への準備が整った。これまでのホジキンリンパ腫のRIG-Iシグナル経路の解析から、EBV感染症例ではIRF3の活性化が抑制されていることが病態形成に重要であることが推察された。このことから、ホジキンリンパ腫の実験的治療の戦略として、IRF3の活性化を考えている。1) RIG-Iシグナル経路の解析と、シグナル経路を不活性化する因子の同定のため、EBERを発現するホジキン細胞株の樹立を目指している。ホジキンリンパ腫の腫瘍細胞内において、IRF3の活性化を阻止する分子の同定し、治療標的の可能性を探る。2)同定された不活性化分子に対する、実験的遺伝子治療として、siRNAによるノックダウン治療を試みる。3) IRF3をリン酸化し活性化する分子の発現から、RIG-Iの自然免疫経路を活性化する治療戦略も考慮する。IRF3の活性化から、腫瘍細胞内における自然免疫応答が活性化し、腫瘍細胞のアポトーシスや、化学療法薬に対する感受性の増加が期待される。ヒトホジキンリンパ腫におけるIRF3の非活性化が明らかとなっており、IRF3の活性化を誘導する治療戦略や、IRF3により誘導される
「多様な家族」の法的保護を可能とする家族形成権と生命に対する権利の日仏比較研究

本研究は、伝統的な家族概念とは異なる「多様な家族」に対する法的保護を、「家族形成権」と「生命に対する権利」の保障の側面から考察したものである。フランスにおいては、主としてヨーロッパ人権条約8条「家族生活の尊重の権利」により、非嫡出子相続分差別の廃止、同性愛者の養子の権利が実現した。日本においても、最高裁の2013年9月4日「非嫡出子相続分違憲判決」では、外国法及び国際人権条約の影響を立法事実を支える「環境」の変化として位置付けている。すなわち、人権条約による「外的な」保障が、国内の多数派民主主義を基盤とする「伝統的な」家族観を変更する可能性をもつことが明らかになった。平成22年度は、「多様な家族」の法的保護の基盤となる権利の一つである「生殖の権利・自由」のうち、「生命に対する権利」および「身体の自己決定権」についての理論と判例研究を中心に、下記のような成果を得た。1.日本および国際法における「生命に対する権利」が究極の状況で問われる呼和的生存権」は、平時における諸権利特に生命に対する権利の反映であるという結論を得た。⇒成果:論文「『平和的生存権』と国際人権保障-自衛隊イラク派兵差止訴訟における『基底的権利』保護をめぐって-」(後掲)。2.「生命に対する権利」を「刑事法」との関連で検討。国際刑事裁判所規程の批准により、日本は「人道に対する罪」を国内法の犯罪概念とするため「生命に対する権利」概念も変容。⇒成果:学会報告(後掲)。Paul Cezanne大学、Table ronde「憲法と刑法」において、「日本における死刑制度、国際刑事裁判所の批准」について報告。3.日本における「憲法と条約」についての考察。「多様な家族」の基盤となる権利は、ヨーロッパでは国際人権保障によって形成されつつあるが、日本ではなぜ国際人権法の国内適用が消極的かを国際法の導入の歴史から考察し、国際法の導入が常に国家主権や国のアイデンティティとの相克の中で行われたことが、国際法の国内適用に影響を及ぼしているのではという仮説が提示。2010年12月のメキシコシティで開催された国際憲法学会において、「国際化と国家主権との間-日本における憲法と国際法の関係」のテーマで報告。4.「身体の自己決定権」の考察。「多様な家族」の法的承認に不可欠な「身体の自己決定権」がヨーロッパ人権裁判所において形成されてきた歴史に関する論文を翻訳し、さらに人工妊娠中絶の合法化によって「身体の自己決定権」が出現した経緯について「覚書」において明らかにした。⇒成果:論文「『身体の自己決定権』と人格の尊重-ヨーロッパと日本における法的保護に関する覚書」(後掲)、翻訳「ヨーロッパ人権裁判所判例における身体の自己決定原則」(後掲)。23年度は、以下の二つの主題に関して研究した。1.ヨーロッパレベルの人権規範であるヨーロッパ人権条約が、フランスの国内における人権に対してどのような影響があるのかに関する検討この検討に関する研究成果として、次の論文がある。(1)「フランス2008年憲法改正における違憲審査と条約適合性審査-人権保障における憲法とヨーロッパ人権条約の規範の対立の逆説的な強化-(1)」、法学志林109巻3号,1-54頁。(2)「人権保障における憲法裁判所とヨーロッパ人権裁判所-総論」、比較法研究73号、p.166-171.(3)「人権保障におけるフランス憲法院とヨーロッパ人権裁判所」、比較法研究73号、p.181-192.これらの検討の結果、人権条約に関する監督機関、特に裁判所型の監督機関が存在する場合、最終的な判決は国際人権裁判所となるため、対象となる権利が私生活の尊重のような各国の裁量権限の強い領域であっても、国内の人権規範を変更していく影響力が顕著であることが指摘できる。2.「生まない権利-人工妊娠中絶」に関する、女性の人権の観点からの検討(1)「女性の『人格の尊重』と中絶の権利-ヨーロッパにおける憲法裁判所とヨーロッパ人権裁判所判決に関する検討-」、建石真公子ほか編『身体・性・生-個人の尊重とジェンダー』尚学社、近刊。この検討は、「中絶」の権利を「女性の人格権」の観点から人権論を確立する可能性を、歴史、学説、ジェンダー論、判例等から考察したものである。中絶は、女性の人格権、カップルの権利、子どもの権利、生命の尊重等、多様な権利が錯綜しているが、今まで検討されることの少なかった「女性の人格権」は、ヨーロッパ諸国およびヨーロッパ人権裁判所の判決においては、1970年80年代から散見することのdできる権利であり、その観点が「身体の自己決定権」の中核の権利であるという25年度は、「『多様な家族』の法的保護を可能とする生命に対する権利及び家族形成権に関する日仏比較」に関して、特にフランスの憲法院による権利保護に関して検討した。

フランスはヨーロッパ人権裁判所判決の影響で、非嫡出子相続分差別を定める民法の廃止などを行っているが、憲法上は、家族に関する権利に関しては子どもの保護と社会保障の側面から家族の保護を定めているのみである(1946年憲法前文。しかし、近年、ヨーロッパ人権裁判所から条約違反判決を下されるのを避ける目的で、憲法解釈によって「家族生活の尊重」の保護をおこなうようになっている。その方法は、違憲審査においてヨーロッパ人権裁判所の条約適合性を判断する方法である「比例原則」の導入により、権利を制約する立法に関して制約目的との比例性を問うという方法で、たとえば良心の自由を根拠として同性婚(2013年同性婚法制定)実施に反対する行政処分を、憲法上の平等違反を根拠として違憲としている。こうしたフランスの伝統的な家族法政からの変化は、人権概念の進展とともに、ヨーロッパ人権条約という国際規範、およびヨーロッパ諸国の法制度という比較法的な影響が指摘できる。そうした観点から、フランスの人権保障における国際人権法(ヨーロッパ人権条約)の影響や条約の国内適用に関して検討した結果、人権保障分野における人権条約と憲法の競合関係において形式的には憲法が優位するものの、人権条約(ヨーロッパ人権裁判所判決)における権利解釈と相互影響関係は継続することが確認された。家族に関する法制度について、国際人権条約は家族の形成に関する自由権としての保護(国の介入の禁止)という面と、社会権として家族の維持の両面を有しており、フランスにおいては国内法制度における人権条約の適用により多様な家族の法的保護の進展が確認された。平成24年度は、研究課題である「多様な家族の法的保護を可能とする家族形成権と生命に対する権利に関する国際比較研究」のうち、「生命に対する権利」に関して、ヨーロッパ諸国の憲法裁判所、およびヨーロッパ人権裁判所の各判例を取り上げて検討した。成果は、編著『身体・性・生ー個人の尊重とジェンダー」というタイトルで出版した。この本の中では、序文にあたる「プロローグ」と「女性の『人格の尊重』と中絶の権利ーヨーロッパにおける『憲法』および『ヨーロッパ人権条約』による保障」を執筆した。本論文では、ヨーロッパにおいて中絶を合法化する過程で、憲法上の生命及び人格権との関係で合憲性が審査された国が多く、それらの憲法裁判所判決について、権理論の観点から、中絶がどのような権利として主張され、どのような権利と対立したのかを検討した。結果として、第1に、憲法が「生命に対する権利」を保護している国々と、憲法に「生命に対する権利」が規定していない国との間で、審査内容に違いがみられること、第2に、しかし、「生命に対する権利」保護の有無にかかわらず、女性の「人格権」保護を根拠として、中絶を認める国々が増加していること、第3に、女性の「自由」、「自己決定権」を理由とする中絶の権利性を容認する国は、当初の予想とは異なり少ないことが明らかにされた。また、ヨーロッパ人権裁判所の判例では、胎児の「生命に対する権利」が認められるか否かについては判断が保留され、直接に中絶法の条約適合性について判断を避けているが、他方、中絶法が制定されている国では、女性が中絶にアクセス可能か否かという観点から、女性が中絶を実施できない場合に、条約違反判決が出されていることが明らかになった。
始新世/漸新世境界における海洋沿岸域での一次生産者の交代事変の解明

本研究の目的は,「温室地球」から「氷室地球」への転換点である始新世/漸新世境界(以下E/O境界と記載)付近で,珪藻Chaetoceros属が渦鞭毛藻類に替わって沿岸生態系の主要な一次生産者と進化していった過程を解明することである.申請者の研究により,約4000万年前から,現在までの珪藻休眠胞子化石の分類が行われてきた.その結果,約3400万年前のE/O境界付近で,Chaetoceros属休眠胞子の多様性と産出頻度が激増する「Chaetoceros爆発」イベントが起きたことが解明された.一方,渦鞭毛藻類の休眠シスト群集は,逆に多様性と産出量が急減しており,沿岸域における主要な一次生産者がこの時期に渦鞭毛藻類からChaetoceros属に急激に交代した可能性が示唆された.しかし,研究した試料間隔の制約から,正確な数値年代が明らかにできなかったため,これはあくまで仮説である.さらに,Chaetoceros属と渦鞭毛藻類の激変が本当に対応しているのかも確かめられていない.また,「Chaetoceros爆発」とOi1イベントとの対応関係や,もう1つの重要な一次生産者である石灰質ナノプランクトンの群集変化との関係も全くわかっていない.そこで,現在,E/O境界をまたぎ,かつChaetoceros属・渦鞭毛藻類・石灰質ナンノプランクトンをすべて含み,さらに酸素同位体比の測定用の有孔虫化石をも含有する連続コアサンプル(アフリカ南東沖,DSDP369および南極沖ODP689)を高時間分解能で分析することにより,同一コアを高時間分解能で分析し,事変の正確な年代と各タクサ間および酸素同位体イベントとの対応関係を明らかにすることを試みている.そして,これを基にこの事変の詳細な変遷過程を解明し,その原因を考察する予定である.本研究の目的は,「温室地球」から「氷室地球」への転換点である始新世/漸新世境界(以下E/O境界と記載)付近で,珪藻Chaetoceros属が渦鞭毛藻類に替わって沿岸生態系の主要な一次生産者と進化していった過程を解明することである.申請者の研究により,約4000万年前から,現在までの珪藻休眠胞子化石の分類が行われてきた.その結果,約3400万年前のE/O境界付近で,Chaetoceros属休眠胞子の多様性と産出頻度が激増する「Chaetoceros爆発」イベントが起きたことが解明された.一方,渦鞭毛藻類の休眠シスト群集は,逆に多様性と産出量が急減しており,沿岸域における主要な一次生産者がこの時期に渦鞭毛藻類からChaetoceros属に急激に交代した可能性が示唆された.しかし,研究した試料間隔の制約から,正確な数値年代が明らかにできなかったため,これはあくまで仮説である.さらに,Chaetoceros属と渦鞭毛藻類の激変が本当に対応しているのかも確かめられていない.また,「Chaetoceros爆発」とOi1イベントとの対応関係や,もう1つの重要な一次生産者である石灰質ナノプランクトンの群集変化との関係も全くわかっていない.そこで,現在,E/O境界をまたぎ,かつChaetoceros属・渦鞭毛藻類・石灰質ナンノプランクトンをすべて含み,さらに酸素同位体比の測定用の有孔虫化石をも含有する連続コアサンプル(アフリカ南東沖,DSDP369および南極沖ODP689)を高時間分解能で分析することにより,同一コアを高時間分解能で分析し,事変の正確な年代と各タクサ間および酸素同位体イベントとの対応関係を明らかにすることを試みている.そして,これを基にこの事変の詳細な変遷過程を解明し,その原因を考察する予定である.
韓国及び中国東北地方におけるダニ媒介性動物原虫感染症の分子疫学的調査研究

本研究は、日本と地理的にもっとも近い韓国及び朝鮮半島と国境を接している中国東北地方におけるダニ媒介性動物原虫感染症の流行の実態を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と韓国及び中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを目的として実施した。得られた主な成果として、(1)新規血清・遺伝子診断法の確立、(2)新規治療・予防法の開発、(3)韓国・中国の一部地域における牛・馬・犬などのバベシア原虫感染症の流行実態の解明、(4)韓国・中国の動物検疫関係機関への技術移転などが挙げられる。本研究は韓国及び中国東北地方におけるダニ媒介性動物原虫感染症の浸潤・流行状況を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と韓国及び中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを目的として実施する。本年度に実施した研究内容と得られた研究成果は以下の通りである。1.バベシア原虫cDNAライブラリーの構築:ウシ・ウマ・イヌバベシア原虫よりそれぞれmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築した。2.バベシア原虫の主要抗原遺伝子の同定:ウシ・ウマ・イヌバベシア原虫感染血清を用いたcDNAラブラリーのイムノスクリーニングを行い、各原虫の主要抗原遺伝子の同定とクローニングを行った。3.組換え抗原の作製と血清診断法の確立:上記で得られた各種原虫の主要抗原遺伝子を大腸菌で大量に発現・精製した。得られた組換えタンパク質を抗原としたELISA法或いはICT法を確立した。4.韓国における疫学調査:韓国全州地域における牛、犬の血清を採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とイヌバベシア原虫特異抗体が検出された。5.北朝鮮と広く国境を接している中国東北地方吉林省における牛・馬・犬の血清サンプルを採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とウマバベシア原虫特異抗体が検出された。1.原虫ESTデータベースの構築:イヌバベシア原虫より完全長cDNAライブラリーを構築し、約1万クローンの塩基配列を決定し、ESTデータベースを作成した。2.診断用抗原遺伝子の同定:ウシ・ウマ・イヌバベシア原虫感染血清を用いたcDNAラブラリーのイムノスクリーニングを行い、診断用抗原遺伝子の同定とクローニングを行った。3.血清診断法の確立:上記で得られた各種原虫の主要抗原遺伝子を大腸菌で大量に発現・精製した。4.韓国における疫学調査:韓国晋州地域における牛、犬の血清を採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とイヌバベシア原虫特異抗体が検出された。5.中国における疫学調査:中国東北地方黒竜江省と西部新彊自治区における牛・馬の血清サンプルを採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とウマバベシア原虫特異抗体が検出された。6.ダニワクチン開発:ダニ媒介性原虫感染症を制御する上でダニの駆除が不可欠である。そこで、ダニの唾液腺よりmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを構築した。特異血清を用いたcDNAライブラリーのイムノスクリーニングにより幾つかのワクチン候補遺伝子のクローニングに成功した。本研究は韓国及び中国東北地方におけるダニ媒介性動物原虫感染症の浸潤・流行状况を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と韓国及び中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを目的として実施する。1.診断用抗原遺伝子の同定:ウシ・ウマ・イヌバベシア原虫感染血清を用いたcDNAラブラリーのイムノスクリーニングを行い、診断用抗原遺伝子の同定とクローニングを行った。2.血清診断法の確立:上記で得られた各種原虫の主要抗原遺伝子を大腸菌で大量に発現・精製した。得られた組換えタンパク質を抗原としたELISA法・ICT法を確立した。3.遺伝子診断法の確立:ウシ・ウマ・イヌバベシア原虫特異遺伝子を増幅できるPCR法・LAMP法を確立した。4.韓国における疫学調査:韓国済州島における牛、犬の血液サンプルを採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とイヌバベシア原虫特異抗体が検出された。また、PCR法によりウシバベシアとイヌバベシア特異遺伝子の増幅が認められた。

5.中国における疫学調査:中国東北地方吉林省における牛・馬の血液サンプルを採集し、ELISA法或いはICT法による抗体調査を行ったところ、ウシバベシア原虫とウマバベシア原虫特異抗体が検出された。また、PCR法によりウシバベシアとウマバベシア特異遺伝子の増幅が認められた。6.ダニワクチン開発:プロテオーム解析法によりフタトケチマダニの唾液腺由来タンパク質の網羅的同定を行った。さらに、マダニの吸血を受けた動物血清と反応する抗原タンパク質の同定に成功した。本研究は韓国及び中国東北地方におけるダニ媒介性動物原虫感染症の浸潤・流行状況を明らかにし、日本の輸入検疫体制強化と韓国及び中国の原虫病診断技術の向上と普及に資することを目的として実施してきた。本年度に実施した研究内容と得られた研究成果は以下の通りである。1.タイ国における疫学調査:中国と国境を接しているタイ国北部の42箇所の牧場より642頭の牛の血液サンプルを採集し、組換え抗原を用いたELISA法にて抗体検査を行ったところ、B. bovisとB. bigeminaに対する抗体保有率がそれぞれ73.8%と69.1%であった。この結果より、ウシバベシア症はタイ国北部地域広く流行しており、本症の制圧対策は当地域の牛の生産性向上に重要であることが示唆された。2.バベシア症に対する治療法の開発:バベシア原虫のESTデータベースを作製し、原虫の葉酸代謝経路の必須酵素として知られるDihydrofolateReductase-Thymidylate Synthase(DHFR-TS)同定し、その性状解析を行った。また、ジヒドロ葉酸レダクターゼの抑制剤(葉酸拮抗剤)として知られているピリメタミン(PYR)、メトトレキセート(MTX)、トリメトプリム(TMP)などを用いてDHFR-TSの酵素活性抑制能を調べたところ、濃度依存性の酵素抑制活性が認められた。さらに、これらの酵素抑制剤の抗原虫作用をin vitro培養系で調べたところ、いずれも原虫増殖抑制効果を示したが、特にMTXがバベシア症の治療薬として有望であることが示唆された。3.バベシア症に対する予防法の開発:人獣共通バベシア症を引き起こすB. microti虫体から,ワクチン候補分子としてBmPO遺伝子をクローニングし、組換えBmPO試作ワクチンのマウスにおける感染防御効果を確認した。
気相接触を必須とする培養表皮の形成機構と羊水由来の形成促進因子探索

ヒト表皮組織を模倣できる細胞培養系は特異な培養条件でのみ達成される。その過程として、未分化な表皮(基底)細胞を高いカルシウム濃度で培養すると同時に、「空気暴露」という刺激が必須となる。この時、下部からの浸潤はあるものの、細胞にとってはストレスのかかる状態であるが、そのメカニズムは不明である。本研究課題ではこのメカニズムの解明と同時に、これを解消できる表皮分化促進を行える因子を探索して、この特異な培養系での分化刺激メカニズムを解明しようとするものである。昨年度までに空気暴露後と浸潤状態の細胞での、形態学的な変化を詳細に確認した。経時的により詳しく形態比較を行ったうえで、昨年度は空気暴露の有無で遺伝子発現パターンの違いがあるかどうかについて検討した。方法としてはRNAーSeq解析によっての転写産物比較(トランスクリプトーム解析)を行った。空気暴露後、形態に差異の現れ始める開始2日後の時点での空気暴露のもの、液相のままのもの、未分化状態の3種について転写産物の網羅的データを得て比較した。その結果、いくつかの分化マーカーを始めとして、従来の表皮分化では考えていなかった転写因子、酵素群が検出された。またタンパク質レベルの差異を二次元電気泳動で比較することも検討して比較追跡が可能であることを示せた(国際会議にて8月に発表予定)。一方、もう一つの課題である、羊水からの有効な分化促進成分についても検討した。マウスは21日間の胎生日数で出生するが、この期間で羊水が採取できる11日目から18日の間で、経日的に羊水および胎児の皮膚表皮を採取した。羊水成分を質量分析にて解析し、数日の違いで含有されるタンパク質成分が大きく異なることを見出した。羊水成分についても、表皮細胞に添加して培養したところ、形態に変化はないものの表皮分化マーカー遺伝子に分化を促す変動がみられる結果を得ることができた。昨年までに空気暴露後と浸潤状態の細胞での、形態学的な変化を認めて、浸潤状態では角化の特徴である脱核が起こらず、また細胞の増殖度合いも著しく低いことが示された。このように経時的により詳しく形態比較を行ったうえで、空気暴露の有無(気相および液相培養)で、遺伝子発現パターンの違いがあるかどうかについて検討した。空気暴露開始2日後と液相のままのもの、未分化状態の3種について、RNAーSeq(次世代シークエンサーによるcDNA群のデータ解析)によって、転写産物比較(トランスクリプトーム解析)を行った。その結果、いくつかの分化マーカー(ケラチン)に明確な差が見られた。有意にいくつかの分化マーカーを始めとして、転写因子、酵素、サイトカインなどが同定された。昨年度のRNA-seq探索は一点(空気暴露後の2日)であったが、得たいくつかの遺伝子についてRNAの変動を解析した結果、この傾向はそれ以降も続いた。また今後、RNAレベルの解析に加えて、タンパク質レベルで網羅的に解析するにあたり、細胞抽出液から効率的に調製することを条件検討して、二次元電気泳動を行った。その結果、いくつかの変化のあるタンパク質スポットを確認した。さらに、羊水中の有用因子の探索も見据えて、胎児の表皮形成度合いと、羊水含有成分の質量分析による経日的な変動解析を行った。並行して、表皮の形成が盛んになる時点を形態学的に評価するとともに、分化マーカーの発現度を解析した。また、羊水そのものの、表皮培養系への表皮分化への促進能の有無を調べた。ただしこの場合には、表皮分化が本来は不十分になる、空気暴露を行わない培養系に添加してその能力を評価した。その結果、形態学的に変化に至らなかったが、細胞を抽出して解析したところ、明確に分マーカーの発現が上昇し、羊水中に表皮の分化促進を行う成分がある可能性が示された。表皮細胞形成において、空気暴露と液相培養での発現遺伝子群にいくつかの重要な変化があることを見出した。すなわち液相のみ、空気暴露のみで、それぞれ特異的に発現する遺伝子を見出した。今後はこの中で得られた遺伝子の幾つかが、支配的な作用をするのかどうか、発現を経時的に観察するとともに、それがどのような生化学的役割を持つのか、明らかにしたい。またタンパク質抽出液を解析してその差異を明らかにできることがわかり、課題として感度上昇のために、今後は、タンパク質を2種類以上の蛍光標識を施して画像解析を行うことで、差のあるタンパク質を追跡したい。その後は質量分析も活用して、発現されている分子群の違いを詳細に検討する。羊水中に分化刺激を与える成分が含まれることが判明したので、すでに行っている精製をさらに進展させる。培養細胞系に添加して、細胞内に発現するマーカータンパク質の発現量をもって分化促進能を評価している。しかしながら、培養系での評価に時間がかかりすぎることが今後の解決すべき課題である。これをより鋭敏に早く判定できるよう、遺伝子レベルでの少量の細胞で行えるようなシステムを構築する。本年度はさらに大量にマウス羊水を取得し、いくつかの精製段階を経た後で数種類のタンパク質に絞れれば、質量分析を行って特定する。本年度は最終年度であり、学会発表や論文作成を行い、これまでの結果への批評を仰ぐとともにより継続的に行えるよう、精製と分化促進メカニズムの解析戦略を考える。表皮細胞の培養系は長年開発利用されているが、実際の表皮組織を模倣できる培養系は限定された条件のみでなければ達成されない。すなわち、未分化な表皮細胞をカルシウム高濃度の培地で生育させ、空気暴露することが必須であることは、かねてより知られているものの、そのメカニズムは不明である。

本研究ではこのメカニズムを解明すると同時に、表皮分化促進を行える因子をこの培養系の分化メカニズムを解明して進めたいとするものである。まず、実際に自身が行おうとする立体培養系において、空気暴露を行うことでどの程度の表皮形成の遅れがみられるのか、の解析から開始した。表皮分化において空気暴露の有無における表皮形成の程度を、固定染色によって比較したところ、明確に最外層の形成が遅れた。そこから細胞抽出物を様々に解析できる十分量は回収できなかったが、その状態を観察することができた。そのため、これに加えて立体培養に関してのより効率的な方法を見出すために、種々の化学物質を添加しつつ、タンパク質架橋化酵素の活性や表皮構造タンパク質の発現パターンを指標にして検討した。得られた抽出物を用いて、本年度の計画としてあげていた、培養時の空気暴露の有無で、タンパク質発現パターンの変動を検討した。表皮分化の鍵酵素となるタンパク質架橋化酵素について調べた。予想に反して、分化段階初期においてはあまり明確な変動がなく、初期段階では空気暴露がなくとも分化したが、成熟する最終分化には空気暴露は必要であった。その後の段階で違いが生まれることが判明した。空気暴露が表皮の最終分化に必須であることを組織染色方法を用いて確認し、さらにタンパク質架橋化酵素の発現量について解析した。また、今後の解析のために、培養した表皮細胞からより大量にタンパク質を取得する目的で、細胞抽出の効率の良い培養方法についても検討した。空気暴露のメカニズム解明は全く新規な分化誘導機構を追求するもので、参考にするような先行研究例はない。そのため、まず表皮立体培養方法の効率化を検討し、また実際に空気暴露の有無でどの程度の形成表皮の再現に差があるのかを調べた。その結果、明確な差を認め、今後遺伝子並びにタンパク質レベルで網羅的に解析する意義を認め、当初の計画を実施した。さらに、立体培養系でのメカニズム解明と並行し、促進因子の探索もめざした。次年度より予定した促進因子の検索については具体的には進めていない。ヒト表皮組織を模倣できる細胞培養系は特異な培養条件でのみ達成される。その過程として、未分化な表皮(基底)細胞を高いカルシウム濃度で培養すると同時に、「空気暴露」という刺激が必須となる。この時、下部からの浸潤はあるものの、細胞にとってはストレスのかかる状態であるが、そのメカニズムは不明である。本研究課題ではこのメカニズムの解明と同時に、これを解消できる表皮分化促進を行える因子を探索して、この特異な培養系での分化刺激メカニズムを解明しようとするものである。昨年度までに空気暴露後と浸潤状態の細胞での、形態学的な変化を詳細に確認した。経時的により詳しく形態比較を行ったうえで、昨年度は空気暴露の有無で遺伝子発現パターンの違いがあるかどうかについて検討した。方法としてはRNAーSeq解析によっての転写産物比較(トランスクリプトーム解析)を行った。空気暴露後、形態に差異の現れ始める開始2日後の時点での空気暴露のもの、液相のままのもの、未分化状態の3種について転写産物の網羅的データを得て比較した。
最新携帯情報端末を 用いたモチベーションビデオ視聴効果の 実証と実践のリンク

本研究は、オリンピックアスリートを対象としたモチベーションビデオの効果を検証したものである。介入研究を行う前に、オリンピックアスリートに対して、モチベーションビデオの構成要素並びにモチベーションビデオの期待する効果についてインタビュー調査を行った。その結果、先行研究とは異なる効果の期待として「イメージ能力」の向上が明らかになった。そのため、先行研究で使用した尺度にイメージ能力の項目を追加して、モチベーションビデオの介入研究を行った。介入研究の結果、オリンピックの舞台であっても、先行研究と同様の効果が得られ、アスリートのパフォーマンス発揮に大いに寄与することが明らかになった。平成27年度は当初の研究計画よりも早期に予備実験を開始することが可能となった。本予備実験は、平成28年度に予定しているオリンピック時のモチベーションビデオ介入調査のために,柔道の世界選手権において,日本代表選手のモチベーションビデオの予備実験を行うことができた。予備実験のデータを統計分析した結果,モチベーション因子ならびに効力感因子で有意な向上が確認され、従来のモチベーションビデオ研究と同様の結果を得ることができた。しかしながら、これまでのモチベーションビデオの介入研究と異なる部分が、国を代表する選手を対象としているところである。現時点で、様々なプレッシャーや環境的要因によって、競技パフォーマンスへの影響が考えられるため、平成28年度分の研究内容には、日本代表選手を対象としたモチベーションビデオ効果のメカニズム検証を行うため、質的な研究から仮説を生成し、どのようなメカニズムで効果が生起し、どのようなモチベーションビデオの作り方が効果的であるのかを導き出した上で、オリンピック時のモチベーションビデオ視聴へのオリンピック代表選手の視聴効果について検討することとする。平成27年度は、予定していた計画よりも早く研究計画が進行していたため、平成28年度に予定していた研究に必要な機材を前倒しで購入することが可能になった。これにより、平成28年度の研究計画については、予定より早く準備できており、オリンピックでの介入研究に向けて準備期間を設けることが可能となった。当初は平成28年度のオリンピック時の介入調査を1回とした研究計画であったが、先方の理解や研究の準備状況の順調さから、平成27年度に予備実験を行うことが可能となり、その結果をもとに、平成28年度の研究計画を余裕を持って実行することが可能になった。オリンピック競技を対象としていることから、本研究は,研究成果を出すだけではなく、介入調査を行った選手への結果も求められることになる。こうした状況下でオリンピックのときに一発勝負ではなく、当初予定していなかった予備実験を行い、研究遂行上の問題点を洗うことができた点で非常に意味がある.平成28年度の研究実績については、予定通りに行うことができた。その理由として、平成27年度に世界選手権を対象としたパイロットスタディを実施したため、パイロットスタディから見えてきた課題をクリアするために、モチベーションビデオの作製段階において、オリンピックアスリートに対して、インタビュー調査を行い、オリンピックアスリートが考えるモチベーションビデオの構成要素を明確にすることが可能となった。このインタビュー調査から、オリンピックアスリートの考えるモチベーションビデオの構成要素については、自分自身の試合の映像のみならず、オリンピックまでの道のりでお世話になった指導者の方、練習に付き合ってくれた仲間の存在が浮き彫りとなり、これらの要素を入れたモチベーションビデオを作製することが望まれた。また、これまでのモチベーションビデオの心理的側面の評価基準であったPCI forモチベーションビデオの質問紙4因子(一般的活気・技術効力感・闘志・競技失敗不安)16項目の質問項目に加えて、新たに表出されたイメージ因子(4項目)を加えて、計5因子20項目の質問紙調査によって、オリンピック時に使用したモチベーションビデオの心理的側面の評価をすることが可能となった。また、心理的側面以外に、試合の実力発揮度(主観的評価)、モチベーションビデオの有効性についての主観的評価、結果に対する目標の到達度(主観的評価)を加えて調査することより、オリンピックという通常ではない試合形態の調査をより詳細に行うことができた。これらの調査の結果については、第43回日本スポーツ心理学会にて研究発表として行い、多くの聴衆者にオリンピック時データを発表することによって、詳細なディスカッションをすることによって、論文執筆への意見をいただくことができた。今年度までの研究の進捗状況については、概ね順調に進展している。今年度は、オリンピックという大舞台でオリンピックアスリートに対して、モチベーションビデオを提供して、オリンピックアスリートの実力発揮に少なからずサポートの力を発揮し、その科学的データを収集することであった。モチベーションビデオを作製するにあたり、機材が必要となったが、モチベーションビデオを作製するためのPC、オリンピックアスリートにモチベーションビデオを視聴してもらうためのiPadmini、素材を撮影するためのビデオカメラ、現地で調査をするために質問紙を印刷するプリンター等の機材を4月の早い段階ですべて購入することができたため、モチベーションビデオの素材集め、オリンピックアスリートへのインタビュー調査、モチベーションビデオの作製を予定通り進めることが可能であった。オリンピックでは、柔道競技のサポートスタッフの一員として帯同することにより、オリンピックアスリートへのモチベーションビデオの提供、質問紙調査の調査用紙の配布・回収も現地で滞りなく行うことができた。このオリンピックでの貴重なデータは、第43回日本スポーツ心理学会で研究発表し、論文執筆に向けた意見交換をすることができた。今年度は、研究を予定通りに進めることができたため、次年度に向けて論文執筆をすることが社会的発信になると考えられる。データの貴重度を踏まえて、論文執筆をしていくことが望まれる。また、今年度得られたデータについては、日本国内だけではなく、国際学会での発表もスポーツ科学の研究の発展に大きく寄与すると考えられるため、国際学会での発表も予定している。本研究は、オリンピックアスリートを対象としたモチベーションビデオの実践と実証のリンクを行った研究である。

実際にオリンピックの現地にて、日本代表のオリンピックアスリートに対してモチベーションビデオを提供し、その効果を心理的側面と自己のパフォーマンス評価から検証した。モチベーションビデオの作成については、オリンピック前に日本代表のオリンピックアスリートにインタビュー調査を行い、どのような視点でモチベーションビデオを作成するのかについて検討を行った。その結果、これまでの先行研究と同様の効果を期待されていることに加えて、イメージ能力の向上に対して、効果を期待している選手が多かったため、心理的側面の効果検証については、イメージ能力を加えた項目で検証を行うこととした。また、モチベーションビデオの中身については、アスリートごとに内容が異なったため、それぞれのアスリートに対して個別のモチベーションビデオ提供を行った。これまでの先行研究と異なる点については、自身の試合や練習の映像コンテンツのみならず、一緒に戦ってきた仲間の映像コンテンツが求められた。このようにインタビュー調査から得られた結果をもとにモチベーションビデオを作成し、オリンピック時に現地にて提供を行った。視聴時間や視聴回数は現場でのサポートであることを考慮して、アスリートの感覚に委任した。こうして提供されたモチベーションビデオの効果を心理的側面と自己のパフォーマンス評価から検討した結果、心理的側面ついては、これまでの先行研究と同様の効果が確認された。加えて、自己のパフォーマンス評価については、オリンピックの結果に依存しており、必ずしもモチベーションビデオの効果であるとは言い切れない部分があった。オリンピック現地にてサポートとしてモチベーションビデオを提供した本研究の知見は非常にオリジナリティがあると考えられる。本研究は、オリンピックアスリートを対象としたモチベーションビデオの効果を検証したものである。介入研究を行う前に、オリンピックアスリートに対して、モチベーションビデオの構成要素並びにモチベーションビデオの期待する効果についてインタビュー調査を行った。その結果、先行研究とは異なる効果の期待として「イメージ能力」の向上が明らかになった。そのため、先行研究で使用した尺度にイメージ能力の項目を追加して、モチベーションビデオの介入研究を行った。介入研究の結果、オリンピックの舞台であっても、先行研究と同様の効果が得られ、アスリートのパフォーマンス発揮に大いに寄与することが明らかになった。
遺伝子欠損動物を用いた微小脳血管の血流維持機構と麻酔薬作用に関する研究

麻酔下にラットあるいはマウスの脳を摘出し,約150μmのスライス標本を作成した.この標本を観察用チャンバーに入れ,顕微鏡で内径5-10μmの脳実質内微小血管を観察した.血管画像をCCDカメラからコンピュータに取り込み,解析ソフトで測定した.収縮させた脳スライス標本内動脈を高炭酸ガス(PCO_2=50mmHg)に暴露すると,約20分で脳微小動脈は最大限に拡張した.この拡張は,グリベンクラミドでほぼ完全に抑制された.麻酔薬リドカインは,レブクロマカリムによる拡張反応を抑制したが,KClによる血管拡張反応には影響しなかった.これらより,炭酸ガスによる脳実質内細動脈拡張反応には,ATP感受性カリウムチャネルが重要な役割を果たすこと,また,リドカインは,ATP感受性カリウムチャネルを介する脳実質内微小血管拡張作用を抑制するが,内向き整流性カリウムチャネルによる拡張反応には影響しないことが明らかになった.次に,内向き整流性カリウムチャネル開口薬KClによる血管拡張反応を正常血圧ラットと高血圧ラットで比較検討した.高血圧動物の脳微小動脈では,内向き整流性カリウムチャネルによる拡張反応が増強していることが明らかになった.さらに,正常(C57BL/6)および神経型一酸化窒素合成酵素遺伝子欠損(nNOS-KO)マウスの脳で,揮発性麻酔薬イソフルランによる脳血管拡張作用を観察した.イソフルランは,C57BL/6マウスでもnNOS-KOマウスでも,同様に脳実質内動脈を拡張させた.したがって,イソフルランの脳血管拡張作用には,神経型一酸化窒素合成酵素活性は関与していないものと考えられた.以上より,脳実質内微小細動脈での血管拡張反応にカリウムチャネルは重要な役割を果たしており,麻酔薬はその機能を修飾する可能性があることが明らかとなった.また,一酸化窒素合成酵素活性は,一部の麻酔薬の作用には大きく関与しないことが推察された.麻酔下にラットあるいはマウスの脳を摘出し,約150μmのスライス標本を作成した.この標本を観察用チャンバーに入れ,顕微鏡で内径5-10μmの脳実質内微小血管を観察した.血管画像をCCDカメラからコンピュータに取り込み,解析ソフトで測定した.収縮させた脳スライス標本内動脈を高炭酸ガス(PCO_2=50mmHg)に暴露すると,約20分で脳微小動脈は最大限に拡張した.この拡張は,グリベンクラミドでほぼ完全に抑制された.麻酔薬リドカインは,レブクロマカリムによる拡張反応を抑制したが,KClによる血管拡張反応には影響しなかった.これらより,炭酸ガスによる脳実質内細動脈拡張反応には,ATP感受性カリウムチャネルが重要な役割を果たすこと,また,リドカインは,ATP感受性カリウムチャネルを介する脳実質内微小血管拡張作用を抑制するが,内向き整流性カリウムチャネルによる拡張反応には影響しないことが明らかになった.次に,内向き整流性カリウムチャネル開口薬KClによる血管拡張反応を正常血圧ラットと高血圧ラットで比較検討した.高血圧動物の脳微小動脈では,内向き整流性カリウムチャネルによる拡張反応が増強していることが明らかになった.さらに,正常(C57BL/6)および神経型一酸化窒素合成酵素遺伝子欠損(nNOS-KO)マウスの脳で,揮発性麻酔薬イソフルランによる脳血管拡張作用を観察した.イソフルランは,C57BL/6マウスでもnNOS-KOマウスでも,同様に脳実質内動脈を拡張させた.したがって,イソフルランの脳血管拡張作用には,神経型一酸化窒素合成酵素活性は関与していないものと考えられた.以上より,脳実質内微小細動脈での血管拡張反応にカリウムチャネルは重要な役割を果たしており,麻酔薬はその機能を修飾する可能性があることが明らかとなった.また,一酸化窒素合成酵素活性は,一部の麻酔薬の作用には大きく関与しないことが推察された.平成13年度は、マイクロベッセル観察システムを用いてラット脳新皮質内の微小血管を観察し、高炭酸ガスによる血管弛緩反応のメカニズムを薬理学的に検討した。1)ハロセン麻酔下にウィスターラットを開胸し、左心室から人工脳脊髄液を潅流させながら右心房を切開脱血し、迅速に脳を摘出した。4°C人工脳脊髄液中でビブラトームを用いて厚さ約150μmの新皮質を含む脳スライス標本を作成した。この標本を酸素93%+炭酸ガス7%で通気した37°C人工脳脊髄液で満たした観察用チャンバーに入れ、倒立顕微鏡にて脳実質内の微小血管を観察した。血管平滑筋が壁在する内径3-10μmの微小血管を観察した。これらの血管はその径から毛細血管直前の抵抗血管であることが推測された。顕微鏡画像はビデオカメラで取り込み、デジタル変換した後コンピュータ画面上で解析ソフトを用いて血管径を計測した。2)酸素93%+炭酸ガス7%(PCO_2=40mmHg)にて30分間通気した脳スライス標本にプロスタグランディンF_<2α>を加え、標本内動脈を収縮させた。その後酸素90%+炭酸ガス10%(PCO_2=50mmHg)の通気を行い、高炭酸ガスの状態にした。約20分で脳微小動脈は最大限に拡張した。

選択的ATP感受性カリウムチャネル拮抗薬であるグリベンクラミドを前処置し、上記と同様の実験を行ったところ、高炭酸ガス下において血管拡張はほぼ完全に抑制されたが、選択的カルシウム依存性カリウムチャネル拮抗薬であるイベリオトキシンは、全く影響しなかった。以上の結果から、炭酸ガスによる脳実質内微小血管の弛緩作用において、ATP感受性カリウムチャネルは重要な役割を果たしていることが明らかになった。今後は低酸素における脳血管弛緩反応についてイオンチャネルの役割を明らかにし、さらに高炭酸ガスや低酸素時に各種揮発性麻酔薬が及ぼす影響について明らかにする予定である。平成14年度は、マイクロベッセル観察システムを用いてラット脳新皮質内の微小血管を観察し、高炭酸ガスによる血管弛緩反応のメカニズムとこれら血管に及ぼす局所麻酔薬の影響を薬理学的に検討した。1)ハロセン麻酔下にウィスターラットの脳を摘出し,4°Cの人工脳脊髄液中でビブラトームを用いて厚さ約150μmの新皮質を含む脳スライス標本を作成した。この標本を酸素93%+炭酸ガス7%で通気した37°C人工脳脊髄液で満たした観察用チャンバーに入れ、顕微鏡にて脳実質内の微小血管を観察した。血管平滑筋が壁在する内径5-10μmの微小血管を観察した。顕微鏡画像はビデオカメラで取り込み、デジタル変換した後コンピュータ画面上で解析ソフトを用いて血管径を計測した。2)プロスタグランディンF_<2α>で脳スライス標本内動脈を収縮させ。酸素90%+炭酸ガス10%(PCO_2=50mmHg)の通気を行い、高炭酸ガスの状態にした。高炭酸ガス,選択的ATP感受性カリウムチャネル開口薬であるレブクロマカリム,および内向き整流性カリウムチャネル開口薬KCIによる血管拡張反応を観察し,局所麻酔薬リドカインが及ぼす作用を検討した.リドカインは,レブクロマカリムによる拡張反応を抑制したが,KCIによる血管拡張反応には影響しなかった.この局所麻酔薬の高炭酸ガスによる血管拡張に及ぼす作用は現在検討中である.以上の結果から,リドカインは,ATP感受性カリウムチャネルを介する脳実質内微小血管拡張作用を抑制するが,内向き整流性カリウムチャネルによる拡張反応には影響しないことがを明らかになった。今後は,一酸化窒素合成酵素遺伝子欠損マウスでの高炭酸ガスによる脳実質内微小血管拡張反応を観察し,それらに各種麻酔薬が及ぼす影響について検討する予定である。平成15年度は、マイクロベッセル観察システムを用いてラット脳新皮質内の微小血管を観察し、正常血圧と高血圧での低濃度カリウムによる血管弛緩反応のメカニズムを薬理学的に検討し,一酸化窒素合成酵素遺伝子欠損マウス購入準備を行なった.1)ハロセン麻酔下にウイスター京都および自然発症高血圧ラットの脳を摘出し,4°Cの人工脳脊髄液中でビブラトームを用いて厚さ約150μmの新皮質を含む脳スライス標本を作成した。内向き整流性カリウムチャネル開口薬KClによる血管拡張反応を観察した.KClは,正常血圧および高血圧ラットの脳微小血管を拡張したが,高血圧ラットで有意に拡張反応が強かった.これらの拡張反応はいずれも,内向き整流性カリウムチャネル拮抗薬