hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
琵琶湖北部流域の積雪と琵琶湖内密度流の関係

本研究では、琵琶湖集水域北部に位置する姉川流域(特別豪雪地帯)の融雪水が湖内に流入したときに、深層密度流となるかどうかを検討した。そのため、湖内に自記式の水温計、流速計、電気伝導時計、溶存酸素濃度系などを冬季を通して設置し、連続観測を行った。その結果、数日間にわたって湖底付近で低水温、高濁度、低電気伝導度の水塊が見られた。この水塊の特性から、沿岸密度流や地下水湧出は考えにくく、河川期減水である可能性が高いと結論づけた。平成22年度はまず、それまでの観測結果から、琵琶湖湖内における姉川流入水の証拠と考えられる現象を見つけ出すための検討を行った。その結果、河川水は電気伝導度の値が大きく変化するため、ほぼ一定の値を示す湖水と比べて、電気伝導度によって流入河川水の証拠とできることがわかった。また、湖底近傍で透明度が非常に高い水が入ってきていた可能性を示唆するADCPのエラー値は、湖底上34mまでの高さでみられることもわかった。そこで、本年の湖内観測は、ADCPによる計測を湖底上4mまでのごく薄い層を計測するものと比較的広範囲をみるための湖底上20mまでの計測との2種類行い、また流入河川水の証拠をとるための電気伝導度計も設置した。一方、流入水の特性を把握するため、河川においても電気伝導度、水位、濁度を連続計測し、ほぼ毎週河川の様子を観察している。湖内の観測は平成22年12月3日平成23年3月28日まで行い、現在データの整理中である。本研究では、滋賀県琵琶湖集水域の中でも、特に積雪の多い特別豪雪地帯に位置する姉川流域において溶けた融雪水が琵琶湖の中でどのような挙動をし、どのような影響を与えているのかを目的としている。近年の冬季の気温上昇により琵琶湖内での冬の循環が弱まっており、特に琵琶湖深層の溶存酸素濃度の低下が指摘されている。いっぽう、融雪起源の河川水は湖水よりも水温が低いと考えられるため深層密度流となり琵琶湖深層に酸素を供給するプロセスとなると考えられる。そこで、姉川の融雪河川水が深層密度流となっているのか、つまり深層へ酸素を供給するプロセスとなり得ているのかをこの研究によって明らかにしたいと考えている。このような姉川起源の密度流に関する研究としては、従来、3月のみの湖内係留観測による高濁度融雪水の観測報告と、河川水温と湖水温の比較から河川水が湖内に潜り込まないという報告がある。本研究では、冬季を通して湖内の多地点で係留観測を行うことにより、間欠的に発生すると考えられる密度流がどれくらいの期間、どれくらいの頻度で発生しているかを連続的に捉えようとした。その結果、1、2月に河川水温は湖水温よりも低くなっており、間欠的ではあるが、複数日にわたって深層密度流が発生していることが確認できた。この密度流は周りの湖水と比べて電気伝導度が低く、溶存酸素濃度が高かった。深層密度流の起源としては、河川水のみならず、沿岸密度流や地下水の流入も考えられる。沿岸密度流は明け方のみ発生するため、複数日連続することは考えにくく、また湖水が起源となるため、電気伝導度が周りの水塊より低くなることは考えられない。また、地下水の場合には還元状態になるため、溶存酸素濃度が高くなることは考えにくい。以上のことから、ここで観測された密度流は姉川起源のものであると考えられ、このことが本研究によって始めて確認できた。
象徴天皇制における国民統合の実態研究―戦後沖縄を事例として―

今上天皇の退位を2019年に控えながら、天皇が国民統合の象徴と位置づけられる意義については議論が深められていない。「国民統合の象徴」とは具体的に何を意味するのか。日本において異質な存在である沖縄を題材として、現地メディアにあらわれた皇室報道・皇室論を渉猟して分析することで、「沖縄にとって天皇制とは何か」という問いに答える。(1)沖縄のメディアにおける皇室報道(1945年8月1989年2月)の分析(2)復帰運動における皇室の位置づけと、住民の皇室に対する意識の検証(3)沖縄で皇室に対するイメージが変化する経緯の解明以上の作業により、国民統合の象徴としての天皇のあり方を歴史学的に解明する。
衝撃圧によって駆動される高速液体噴流の流動特性に関する研究

ピストン衝撃圧により駆動される200500m/s級の高速液体噴流について、ノズル内流れの数値解析と大気中の噴流挙動に関する実権を行ない、ノズル形状の影響を調べた。ノズルは、出口径510mmの同筒型、テ-パ型の物を用いた。数値解析では、差分法を用い、気中噴流については、Xeフラッシュ光とパルス・ルビ-レ-ザ-ホログラフィ-による高速瞬間撮影、He-Neレ-ザ-による噴流先端速度の測定、水晶圧電素子による噴流衝突圧力の測定を行った。以上より次のような成果が得られた。(1)ボイドの発生・消滅を伴う気液二相流の過渡現象に対し、二段階ラックス・ヴェンドロフ法に人工拡散を付加し、拡散係数をFCT法によって調節すれば、安定で鮮度的にも満足な数値解がえられる。(2)ノズル内流れは静止状態から短い立ち上がり時間の後、準定常流となり、ピストンの減速に応じてノズル出口速度が徐々に低下する。このとき円筒ノズルでは強い縮流が発生し、その周囲は高ボイド率の剥離領域になり、ノズル出口部では速度低下によって低ボイド率のボイド領域が発生する。テ-バ-ノズルでは円筒ノズルに比べ準定常になるまでの時間が長い、水柱内にもボイド領域が発生し、水領域との境界に不連続が発生する。(3)ノズル内流れが定常になるという仮定のもとに、噴流速度の最大値を予測する簡単な近似式を得た。近似式はテ-パノズルよりも円筒ノズルの場合によく成り立つ。(4)噴流先端速度は、円筒ノズルでは低い速度から増加し、テ-パノズルでは高い速度から減少する。これはテ-パノズルでは初期加速がインパルス的なのに対し、円筒ノズルでは、単調に増速するためである。(5)噴流の形成初期にはノズル出口の速度変動に基づき噴流同士の激しい衝突が生じ噴流中には笠状の乱れが生じる。(6)噴流の衝突圧力は噴流速度や距離ばかりでなく、ノズル形状の違いによる噴流の構造にも大きく依存する。衝撃圧によって駆動される高速液体噴流について,本年度は主にノズル内に生じる非定常流の詳細と噴流挙動の概要を実験と数値解析により明らかにし,ノズル形状の影響を調べた.実験では,開口面積比1/4,1/16のテーパノズルと円筒ノズルを用い,これにピストンの衝突によって得られる約100MPaの衝撃圧を入射させて,流速200500m/sの非定常噴流を発生させ,ノズル内の圧力,噴流の速度および衝撃力を測定し,計算値と比較した.その結果,以下のような成果が得られた.(1)ノズル内の非定常流の数値解析に関し,ノズル内の圧力波形と噴流速度の実験値との比較から, 2段階ラックスヴエンドロフ法の有効性が確認された.(2)ピストンと水柱の衝突後,ノズル内には有限振巾の圧力波が往復し,水柱を加速するが,その際ノズル出口部とピストン前断付近にキャビテーションが発生する.特にピストン前面のキャビテーション領域と水柱部分の境界には,衝撃波が発生し,その伝播速度はボイド率の増加と共に急激に低下する事が数値解析により明らかにされた.(3)円筒ノズルの断面急縮小部では縮流が発達するため流れの三次元性が無視出来ず,それにキャビテーションの発生が加わると,数値不安定が生じて数値解析が困難となる.

(4)同一開口比のテーパノズルと円筒ノズルを比べると,ノズル内の圧力上界の最大値は,テーパ効果によって前者が若干高く,噴流速度の最大値は,縮流効果によって後者の方がかなり大きくなる.(5)噴流の衝撃力は,水柱の非定常衝突によって生じるものと考えられ,ノズル出口の噴流速度が連続的に変化しているにもかかわらず,断続的なパルス状の変化になる.以上の成果にもとづき,63年度は,ルビーレーザボログラフィによる噴流の観測と噴流の数値解析により,噴流挙動の詳細を明らかにする.先細ノズルから噴出する非定常な高速液体噴流の流動特性を明らかにするため、本年度は立体静止画像を記録するホログラフィ光学系を製作した。光源として発光時間30ns、エネルギ約600mJのジャイアントパルスルビーレーザを用い、撮影法は光量上有利な透過式のOff-Axis型明視野法とした。また、ノズル内の非定常流を数値解析するため、2段階ラックスヴェンドロフ法と低次精度差分法をハイブリッド化して振動を抑えるFCT法を導入した。これを用いて、ボイド領域と水との境界に生ずる不連続面の伝播、およびテーパノズル内の流れの数値解を求めた。実験では、開口面積比1/4と1/16のテーパノズル、円筒ノズルを用い、これにピストンの衝突によって得られる約100MPaの衝撃圧を入射させて、流速200300m/sの非定常噴流を発生させた。そしてピストン入射速度、ノズル内の圧力、噴流の速度および衝撃力を測定し、計算値と比較した、圧力および衝撃力の測定には水晶圧電素子を用いた。その結果、以下のような事実が判明した。(1)パルスレーザ光では通常のXeフラッシュ光による撮影よりも輪郭の明瞭な画像が得られ、発生初期の空気中噴流がノズル出口直後で球状で膨らむ。この部分は、高エネルギーのレーザ光を透過しないことから粒度の細かい水滴が密集しているものと考えられる。(2)FCT法による数値解は、圧力波形の実験値とよく一致する。特にノズル内の不連続面について、伝播速度が水の音速の約30%程度まで安定な数値解が得られ、従来の2段階ラックスヴェンドロフ法よりも優れている。(3)物体に及ぼす噴流の衝撃力のオーダー近いことがわかった。平成元年度は引き続き、ホログラフィの撮影法を改良し、新たに噴流の数値解析にも着手して、噴流挙動の詳細を明らかにする。ビストンの衝突により駆動される高速液体噴流の流口特性とそれに及ぼすノズル形状の影響を明らかにするため、今年度は差合法によりノズル内流れの数値解析、Xeフラッシュ光(発光時間19μs)とパルス・ルビ-レ-ザ-ホログラフィ-(30ns)による空中噴流の高速瞬間撮影い、HeーNeレ-ザ-による噴流先端速度の測定、そして水晶電素子による噴流衝突圧力、ノズル内圧力の測定を行った。数値解析ではZalesa5のFCT差分法を軸対称二次元流に拡張して円筒ノズル内流れを解析した。ホログラフィ-は、従来のoffーAxis型明視野法においてレ-ザ-ビ-ムが空中噴流を十分透過しなかったため、フレネル反射型光学系による撮影を行った。噴流先端速度は、HeーNeレ-ザ-ビ-ムを空中噴流が遮断する所刻を高速フォトダイオ-ドで感知し求めた。以上の数値解析と実験から次のような成果が得られた(1)テ-バノズル内の流れは一次元波動が支配的で非定常性が強いのに対し、円筒ノズメ内流れは、短い過渡期の後、縮流をともなった準定常流となる。テ-バノズル
新規化学遺伝学ツールによる脳機能回復戦略の研究

パーキンソン病や認知症などの神経疾患では、特定の神経細胞種の変性により、脳機能の障害が発現する。最近、我々の研究グループは、昆虫の興奮性イオン透過型受容体を利用して目的の神経細胞種の活動を選択的に促進させる新規の化学遺伝学的技術の開発に成功した。本研究では、この化学遺伝学技術を応用して、パーキンソン病、認知症の病態モデル動物に対して、これらの症状の原因となるドーパミンやアセチルコリン神経細胞種の機能を亢進し、病態の改善・回復を目指す新たなストラテジーの開発に取り組む。
糖鎖認識抗体を用いたオーキシン作用機構の解析

種々の、それぞれ糖結合特異性の異なったレクチンの、オーキシンによるオートムギ子葉鞘、およびアズキ上胚軸の生長誘導に対する影響を調べたところ、オートムギの生長は、ConA,LCA,WGL,DBA,SBA,LPAなどにより抑制され、一方、アズキの生長誘導は、ConA,TEA,UEAIなどにて抑制された。特に、L-Fucoseに対するレクチン、TPA,WEAが単子葉、双子葉において異なる作用をしめした。このことから、レクチンのような糖残基に特異的に結合するタンパク質がオーキシンによる生長誘導を阻害すること、双子葉植物と単子葉植物とでは生長誘導を阻害するレクチンに違いがあり、両者の細胞壁構成多糖に相違があること、及び、生長調節に関与していると考えられる多糖成分が異なることが明らかになった。更に、ペクチン質、または、ヘミセルロースのArabinogalactanに含まれるα-L-Arabinofuranose残基に対する抗体のオーキシンによる生長誘導に対する影響を検討した結果、オートムギ子葉鞘、アズキ上胚軸の生長を抑制し、α-L-Arabinofuranoseを含む細胞壁成分が、単子葉、双子葉植物の生長調節にになんらかの役割を担っていることが推測された。更に、我々は植物細胞壁を構成するXyloglucanに注目し、その基本繰り返し単位である6-0-α-D-Xylopyranosyl-β-D-glucopyranosideのp-nitrophenyl誘導体を化学合成し、そのBovine Serum Albumin(BSA)複合体を調製して、兎に免疫することにより、二糖に対する特異抗体を得た。また、タマリンド種子より得られるXyloglucanをセルラーゼ処理して得られる、その反復単位である八糖に対する抗体も、八糖のBSA複合体を調製し、兎に免疫することによりえた。現在、これらのXyloglucanに対する抗体の免疫化学的性質を調べ、植物細胞壁のオーキシンによる細胞伸長への影響を検討中である。
微生物・電極間相互作用の解明と制御による微生物電気化学システムの高効率化

本研究では環境調和型のバイオプロセスとして期待される微生物電気化学システムの高効率化に向け、モデル電流生成細菌であるShewanella oneidensis MR-1株が電極と相互作用するメカニズム(電極上へのバイオフィルム形成や電流生成の制御機構)を解明することを目的とした。MR-1株が電極上に形成するバイオフィルムを電気化学フローセルを用いて観察した結果、本株が電極電位に応じて異なる構造のバイオフィルムを形成することを発見した。また電極電位がMR-1株の遺伝子発現と代謝プロファイルに与える影響を明らかにするとともに、電流生成遺伝子の発現制御機構と電極電位の認識機構を解明した。本研究では環境調和型のエネルギー生産・物質生産プロセスとして微生物電気化学システム(bioelectrochemical systems; BES)に着目し,その効率を決定する上で重要となる電極バイオフィルムの構造及び形成機構を解明することを目的としている。H26年度は申請書に記載した項目のうち,1.高電流生産MR-1変異株の電極バイオフィルム構造の解明,および2.電極バイオフィルムの形成と制御に関与する遺伝子の同定・機能解析について研究を実施した。これまでに共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いてグラファイト電極表面の微生物を観察可能なフロー式電気化学セルを構築するとともに,緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するモデル電流生成株(Shewanella oneidensis変異株)を作製し,本株の電極バイオフィルム構造を観察するためのシステム構築をほぼ完了した。さらに菌株の培養条件やCLSMの観察条件を検討し,予備的な培養条件においてバイオフィルム構造の観察に成功した。また電極バイオフィルム形成および電流生産に関与する遺伝子の解析を進めた結果,新たな遺伝子(活性メチルサイクル関連遺伝子)がMR-1株の電流生産に関与する遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしている可能性を見出した。これらの遺伝子機能とバイオフィルム形成,および電流生産能力との関係性を明らかにするため,関連する遺伝子の破壊株および過剰発現株を作製した。近年、電気化学的な活性を持ち、電極と直接的に電子授受を行う微生物(electrochemically active bacteria; EAB)が注目を集めている。EABは微生物燃料電池や微生物電気合成などへの応用が期待されており、その電流生成メカニズムや代謝機能の解明が望まれる。本研究では世界的に最もよく研究されているEABであるShewanella oneidensis MR-1株を用いて、本株が電極と相互作用するメカニズム(電極上へのバイオフィルム形成や電流生成の制御機構)を解明することを目的とした。申請書に記載した項目のうち,電極上へのバイオフィルム形成過程の解明については、MR-1株がグラファイト電極上で形成するバイオフィルムを共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する手法を確立し、本株が電流生成条件において他条件(好気条件等)とは全く異なる構造のバイオフィルムを形成することを明らかにした。またMR-1株の電流生成に関連する代謝制御機構についても解析を進め、本株が電極電位を認識し、呼吸鎖電子伝達系を切り替えるメカニズムを解明した。また本株が電極電位に応じて異なる呼吸鎖タンパクを使用し、エネルギーを保存することを明らかにしたまた電流生成関連遺伝子の転写調節機構についても解析を進めた結果、これらの遺伝子の発現制御に関与する新規因子を発見した。さらに特定の物質を添加することで電流生成遺伝子の発現を調節し、MR-1株の電流生成量を制御することに成功した。MR-1株の電極バイオフィルム形成過程の解明については、電流生成条件におけるバイオフィルム構造の観察に成功し、研究計画は順調に進展していると考えられる。また電流生成の制御メカニズム解明においては、電流生成に関与する新規因子を発見し、当初の期待を上回る結果を得た。そのため、研究計画は当初の計画以上に進展していると考えている。近年、電極との電子授受(電流)を介してエネルギーを獲得し、増殖する微生物(electrochemically active bacteria; EAB)が相次いで発見され、大きな注目を集めている。本研究では世界的に最もよく研究されているEABであるShewanella oneidensis MR-1株を用いて、本株が電極と相互作用するメカニズム(電極上へのバイオフィルム形成過程や電流生成の制御機構)を解明することを目的とした。電極上へのバイオフィルム形成過程の解明については、MR-1株が電極呼吸条件下で形成するバイオフィルムを共焦点レーザー顕微鏡と電気化学フローセルを用いて観察し、本株が電極に応じて異なる構造のバイオフィルムを形成することを明らかにした。また電極電位がMR-1株の細胞外多糖の合成量に影響を与えることを見出した。また電流生成関連遺伝子の転写調節機構についても解析を進めた結果、本株ではcyclic AMP receptor protein (CRP)が電流生成の電子源となる乳酸の異化代謝系と電極への電子伝達系(細胞外電子伝達系)を協調的に制御するための転写因子として機能していることを明らかにした。またCRPと競合的に働く新規転写抑制因子とそのDNA結合領域を同定し、MR-1株の電流生成関連遺伝子の活性化機構と抑制機構を解明した。

また電極電位がMR-1株の遺伝子発現と代謝プロファイルに与える影響を明らかにするとともに、電流生成遺伝子の発現制御機構と電極電位の認識機構を解明した。研究遂行に必要な変異株の作製とバイオフィルム観察のための基本的なシステム構築が完了したため,研究計画は概ね順調に進展していると考えられる。H28年度は、研究申請書に記載した計画に加え、新たに見出した因子がMR-1株の電流生成を制御するメカニズムについて、分子生物学的手法を用いて解明する。またMR-1が電流生成時に異なる構造のバイオフィルムを形成する機構についても着目し、原因となる分子メカニズムの解明を行う予定である。応用微生物学平成27年度以降は,研究申請書に記した計画に加え,新たに見出した遺伝子(活性メチルサイクル関連遺伝子)がMR-1株のバイオフィルム形成と電流生産においてどのような機能を担っているのかについて,バイオフィルム構造の観察および分子生物学的手法を用いた解析によって明らかにする予定である。遺伝子発現実験に必要な試薬の納期が国内在庫の不足によって大幅に遅れ、H27年度中の実験を行うことができなくなったため。論文掲載が遅れ,投稿料の支払いをH26年度中に行うことができなくなったため。当初予定していた遺伝子発現実験に必要な費用として使用する予定である。投稿予定の論文掲載料,もしくは投稿前の英文校閲代として使用する予定である。
微小表面接触疲労にもとづく修復用材料の表面劣化とその耐久性の改善

本研究では2種類のコンポジットレジン(ESとSD)およびアクリル系レジン(ACとSU)、3種類の人工歯材料(LPとSPとAT)に加え、3種類の歯科用貴金属系合金(T-1とT-4と12GS)を用い、比較的口腔内に近似した条件で各試料の表面接触疲労を調べた。ACとESとSDとSUの、本研究で定義した疲労限界は5.88×10^38.82×10^4回の範囲であり、LPとSPとATのそれは3.1×10^45.88×10^4回の範囲であった。陶歯(LP)を含む以上の7材料では、硬さが硬く、比較的流動性の悪い材料の疲労限界が短い傾向を示した。一方、溶体化処理後の3種の貴金属系合金の疲労限界は10^310^4回の範囲であり、それらの二次元断面形状は、前述した7材料では全く認められなかった延性的性質が顕著に現れた。平成19年度の課題は、本研究に必要な主要設備である表面接触疲労試験機、および劣化表面の3次元表面形状測定システムの設置完了を平成19年8月末日とし、その後、有機材料の表面接触疲労機構を検討することであった。しかしながら、3次元表面形状測定システム納入後の、構成部品の不調のため、交換および再調整に時間を要し設置完了日が約3ケ月ほど遅延した。したがって、この間に市販修復材料の動的粘弾性(すなわち、動的ずり弾性率、損失弾性率、損失正接)、物理的・機械的性質、耐摩耗性、重合率などについて検討した。光重合型の市販修復材、9種類の歯冠用硬質レジンの動的ずり弾性率は、ねじりを受ける材料がもつ貯蔵弾性率に匹敵するもので、この値は硬さ値とともに光照射時間の増加に伴い増大する傾向を示した。また、これらの材料のマトリックスレジンに使用されている多官能性モノマーの重合率が高いほど、動的ずり弾性率、硬さともに大きな値を示した。さらに、動的粘弾性の繰返し測定を行った後に、動的ずり弾性率と硬さの値は明らかに増大した。これは繰返し測定後の重合率の値が増大していることから、光照射後の材料中に存在する未重合の多官能性モノマーが、加熱により重合が進んだことによるものであることは明らかである。フィラー含有率の高いものはまた動的ずり弾性率も大きかった。メーカーにより光照射後に110°C前後の加熱を指示された材料は、37°Cおよび80°Cで、加熱の指示のない他の6種類の材料よりも有意に大きな動的ずり弾性率を示した。現在、これらの材料を用いて、予定より遅れた表面接触疲労の実験を進めているが、疲労試験には時間を要するため、総括できるまでの結果が得られておらず、必要な残りの測定を進行中である。測定試料は工業用アクリルレジン(SU)、歯科用加熱重合型アクリルレジン(AC)、歯冠用硬質レジン(2種類:ESとSD)の4種を用いた。試料表面上に対して、37°Cの注水下でルビーボール(φ2mm)に200gを負荷し、500rpmの回転数(モータ)において微小接触面の疲労を測定した。加えて、用いた試料の動的粘弾性(G'&η)、マイクロビッカース硬さ(Hv)および無機質フィラー含有率を測定した。ボールのころがり接触による試料表面の劣化の開始を、各試料の表面粗さを考慮して、5μmのくぼみが生じた回数とすれば、ES, SD, SUおよびACでは、5.88×10^38.82×10^4回の範囲であった。その後、繰返し接触回数の増加により、100μmのくぼみを生じるまでに、各試料ではそれぞれ2.94×10^54.10×10^6回を要した。各試料の37°CにおけるG'の値は、それぞれ1.4111.2GPaの範囲であった。また、そのη値は,1.33×10^73.61×10^7Pa・sの範囲であった。他方、37°C蒸留水中で保管した各試料のHvの値は、19.8184の範囲であった。各材料の無機質含有量は、2種類の歯冠用レジンで54.7±0.11(ES)と88.8±0.06(SD)であった。

本実験の結果、表面接触疲労により、4種の材料中でG'およびHvが最大値を示すESの損傷が激しく、今回、評価の基準とした同一繰返し接触回数で比較したくぼみも最大値を示した。平成21年度は本研究での要求設備である表面接触疲労試験装置により、人工歯材料(アクリルレジン歯、硬質レジン歯、陶歯)について、ルビーボールによる繰返し転がり接触試験(500rpm,200gf,37°C)を行い接触面の劣化について検討した。疲労寿命(5μmのwear trackを生じる繰返し数)は3.1×10^45.88×10^4回であった。これらの結果より20年度で得られたコンポジットレジンの結果と同様に、硬さ(Hv)の大きいものほど、すなわち、3種類の人工歯材料中で硬さが最大の陶歯の疲労寿命が最も短いことが明らかになった。したがって、表面接触疲労の耐久性は、材料として組成的にも機械的性質(弾性的および塑性的性質)の点でも均一な性質を有するものが大きく(疲労寿命が長い)、さらに脆性的な材料より、より流動性を示す材料の方が、疲労寿命が長くなる傾向を示すことが本研究の範囲内で明らかになった。さらに、本年度は歯科用貴金属系合金(タイプ1と4金合金と12%金銀パラジウムの3種類)についても、人工歯と同様な条件で表面接触疲労の検討を行った。その結果、各材料の疲労寿命は5.55×10^31.6×10^4回となり、平成19年度の有機系材料の結果や本年度前半に検討した人工歯材料の結果と比べ、これらの貴金属系合金の疲労寿命は比較的短い傾向を示した。しかしながら、疲労寿命の最も短い値を示したタイプ1金合金は繰返し表面接触で材料が摩耗するのではなく、その硬さが軟らかく延性が大きい為に、その結果、ルビーボールの接触部部分からはみ出す形で、幾重もの薄板状物の形成が観察されたことから、接触面での実際のwear trackの深さは浅いのではないかと考えられた。特にルビーボールによる面圧がより高い繰返し接触の初期の5μmの値によって疲労寿命を決定している本試験条件下での疲労寿命に及ぼす影響は、タイプ1のこの流動性の大きいことが他の材料よりも明確に表れ、そのため最も疲労寿命が短くなる結果になったものと思われる。また、wear track面では疲労破壊特有の表面から材料が部分的に剥離した多数のくぼみが各材料とも生じた。タイプ4と12%金銀パラジウム合金はほぼ同様な疲労寿命を示した。しかし、タイプ4のHvは12%金銀パラジウム合金より大きい値を示すものの、タイプ1で述べたような薄板状物の形成がタイプ4の方に比較的多く見られ、タイプ4の延性の大きいことが示唆された。
拡散画像によるヒト脳内グリンパティック系の非侵襲的評価とアルツハイマー病への応用

正常例、軽度認知機能低下症例、Alzheimer病症例を対象として拡散テンソル画像を撮像を続けている。各症例でMinimental state examination(MMSE)による重篤度の評価を行っているところである。撮像は3.0-T臨床用MRI装置を用いて行っている。拡散画像はEPI法を用いて撮像している。上記撮像により得られたデータから、拡散テンソル画像を、dTV.II.13k +ソフトウェア(広島市立大学大学院情報科学研究科)を用いて生成している。このソフトウェアは、拡散異方性マップおよび拡散率マップを含む拡散テンソルの計算画像を作成し、さらに、x軸、y軸およびz軸方向の拡散率を計算することができる。放線冠部で投射線維領域、連合線維領域、皮質下領域においたROIでそれぞれx,y,z方向の拡散能を測定している。現時点での結果として、投射線維領域、連合線維領域では、投射線維方向(z方向)、連合線維方向(y方向)の拡散能はMMSEスコアと逆相関して、ADが重篤であるほど拡散能が上昇するのに対して、血管周囲腔の走行方向(x方向)の拡散能は、MMSEスコアと相関して、ADが重篤であるほど拡散能が低下する傾向を示している。血管周囲腔の走行方向に限局した拡散能がGlymphaticシステムの活性に相関すると仮定して、血管周囲腔の方向の拡散能を、血管周囲腔、および主な白質線維の走行方向と直交する方向の拡散能との比(ALPS index)で評価している。引き続き症例も蓄積しつつある。MMSEスコアと投射線維や連合線維に沿った拡散率との間に有意な負の相関があることを示したが、これはADまたはMCIに起因する投射線維や連合線維における白質変性によって説明することができる。ALPS indexがGlymphaticシステムの機能を反映した指標となり得る可能性が示唆された。これまでの研究結果を、令和元年5月に開催される国際磁気共鳴医学会で発表の予定である。引き続き症例の蓄積を行う。臨床症状との関連を重点的に評価し、アルツハイマー病、その前段階とされる軽度認知障害(mild cognitive impairment :MCI)さらにその前段階といわれる主観的認知障害(subjective cognitive impairment :SCI)にもDTI-ALPSを応用して、アルツハイマー病の発症に関連したグリンパティック系の変化を探り、発症に至るまでの変化を明らかにしたい。正常例、軽度認知機能低下症例、Alzheimer病症例を対象として拡散テンソル画像を撮像した。症例は31例(男性14人、女性17人、年齢5189歳、平均75歳、中央値76歳)であり、AD患者16人、MCI患者9人、SCI患者6人であった。各症例でMinimental state examination(MMSE)による重篤度の評価を行った。撮像は3.0-T臨床用MRI装置を用いて行った。拡散画像はEPI法を用いて撮像した。上記撮像により得られたデータから、拡散テンソル画像を、dTV.II.13k +ソフトウェア(広島市立大学大学院情報科学研究科)を用いて生成した。放線冠部で投射線維領域、連合線維領域、皮質下領域においたROIでそれぞれx,y,z方向の拡散能を測定した。すると、投射線維領域、連合線維領域では、投射線維方向(z方向)、連合線維方向(y方向)の拡散能はMMSEスコアと逆相関して、ADが重篤であるほど拡散能が上昇するのに対して、血管周囲腔の走行方向(x方向)の拡散能は、MMSEスコアと相関して、ADが重篤であるほど拡散能が低下する傾向を示した。なお血管周囲腔と白質線維の方向の一致する皮質下領域ではすべての方向で逆相関を示した。血管周囲腔の走行方向に限局した拡散能がGlymphaticシステムの活性に相関すると仮定して、血管周囲腔の方向の拡散能を、血管周囲腔、および主な白質線維の走行方向と直交する方向の拡散能との比(ALPS index:mean(Dxproj,Dxaxxoc/mean(Dyproj,Dzassoc))で評価した。ALPS indexはMMSEスコアと有意に逆相関し、また年齢と有意に相関した。このことから、ALPS indexがGlymphaticシステムの機能を反映した指標となり得る可能性が示唆された。症例も蓄積しつつあり、初期の結果も得る事ができた。上記の結果は、MMSEスコアと投射線維や連合線維に沿った拡散率との間に有意な負の相関があることを示したが、これはADまたはMCIに起因する投射線維や連合線維における白質変性によって説明することができる。一方、血管周囲空間に沿った拡散性とMMSEスコアとの間には、上記とは逆に有意な正の相関を示し、投射線維、または連合線維が優位である領域で、血管周囲腔の方向における水分子の運動が低下していることを示した。このことから、上記のALPS indexがGlymphaticシステムの機能を反映した指標となり得る可能性が示唆された。

上記撮像により得られたデータから、拡散テンソル画像を、dTV.II.13k +ソフトウェア(広島市立大学大学院情報科学研究科)を用いて生成している。このソフトウェアは、拡散異方性マップおよび拡散率マップを含む拡散テンソルの計算画像を作成し、さらに、x軸、y軸およびz軸方向の拡散率を計算することができる。放線冠部で投射線維領域、連合線維領域、皮質下領域においたROIでそれぞれx,y,z方向の拡散能を測定している。現時点での結果として、投射線維領域、連合線維領域では、投射線維方向(z方向)、連合線維方向(y方向)の拡散能はMMSEスコアと逆相関して、ADが重篤であるほど拡散能が上昇するのに対して、血管周囲腔の走行方向(x方向)の拡散能は、MMSEスコアと相関して、ADが重篤であるほど拡散能が低下する傾向を示している。血管周囲腔の走行方向に限局した拡散能がGlymphaticシステムの活性に相関すると仮定して、血管周囲腔の方向の拡散能を、血管周囲腔、および主な白質線維の走行方向と直交する方向の拡散能との比(ALPS index)で評価している。引き続き症例も蓄積しつつある。MMSEスコアと投射線維や連合線維に沿った拡散率との間に有意な負の相関があることを示したが、これはADまたはMCIに起因する投射線維や連合線維における白質変性によって説明することができる。ALPS indexがGlymphaticシステムの機能を反映した指標となり得る可能性が示唆された。これまでの研究結果を、令和元年5月に開催される国際磁気共鳴医学会で発表の予定である。引き続き症例の蓄積を行うと共に、解析方法の改善を図る。アルツハイマー病、その前段階とされる軽度認知障害(mild cognitive impairment :MCI)さらにその前段階といわれる主観的認知障害(subjective cognitive impairment :SCI)にDTI-ALPS、QSI-ALPSを応用して、アルツハイマー病の発症に関連したグリンパティック系の変化を探り、発症に至るまでの変化を明らかにしたい。引き続き症例の蓄積を行う。臨床症状との関連を重点的に評価し、アルツハイマー病、その前段階とされる軽度認知障害(mild cognitive impairment :MCI)さらにその前段階といわれる主観的認知障害(subjective cognitive impairment :SCI)にもDTI-ALPSを応用して、アルツハイマー病の発症に関連したグリンパティック系の変化を探り、発症に至るまでの変化を明らかにしたい。物品費が当初の見込みよりも少なくてすんだため、次年度の旅費として使用したい。物品費が当初の見込みよりも少なくてすんだため、今年度の旅費として使用したい。
免疫異常が鍵を握る自律神経疾患における新規自己抗体の探索と病態解明

最終年度も前年度と同様に、Cell based assayの確立に時間を要し、依然として完成に至らなかった。ラット免疫組織染色による自己免疫性自律神経節障害の未知の抗体スクリーニングについては、マウス頸部交感神経節の切離技術を獲得し、現在は既製品抗体による免疫染色を行っている。しかしながら抗自律神経節アセチルコリン受容体抗体の臨床像の解析は継続して行っており、その中で本邦において上部消化管障害としてアカラシア、下部消化管障害として麻痺性イレウス、慢性偽性腸閉塞症などの重篤な消化管運動障害を来す症例があることがわかってきた。米国では自己免疫性消化管運動障害として2008年に提唱された概念であり、抗体介在性の自己免疫疾患である。抗自律神経節アセチルコリン受容体抗体も含まれる。これを踏まえ、消化器内科医師と協力体制を築き、本邦における自己免疫性消化管運動障害の調査に乗り出した。食道アカラシア症例、慢性偽性腸閉塞症症例の臨床評価を行い、血清を収集して抗自律神経節アセチルコリン受容体抗体測定を行ったところ、アカラシアでは21.4%、慢性偽性腸閉塞症では50%が本抗体陽性であった。自己免疫性消化管運動障害は自律神経障害を併せ持つことが知られているが、我々が調査した食道アカラシアと慢性偽性腸閉塞症の症例も多くは自律神経障害を有することが判明した。これは自己免疫性消化管運動障害と抗自律神経節アセチルコリン受容体抗体に関する本邦における初めての研究であり、これをJournal of Gastroenterology誌に論文として報告し、国内の複数の学会で発表した。第28回日本神経免疫学会学術集会ではYoung neuroimmunologist Awardを受賞した。当院における自律神経節アセチルコリン受容体(gAChR)α3とβ4サブユニットに対する抗体測定系をLIPS(ルシフェラーゼ免疫沈降法)で樹立した。LIPSの概要は以下の通りである。ヒトgAChRα3/β4のC末端にカイアシルシフェラーゼ(GL)が融合したリポーター(gAChRα3/β4-GL)を作成する.gAChRα3/β4-GL発現ベクターをヒト胎児腎臓由来株細胞HEK293に遺伝子導入し,gAChRα3/β4-GLを強制発現させる.gAChRα3/β4-GL発現細胞を可溶化した後にカラム操作にてgAChRα3/β4-GLを精製する.精製したgAChRα3/β4-GL,ヒト血清,そしてプロテインGセファロースの三者を混合し,カイアシルシフェラーゼ免疫沈降を実施する.得られた免疫複合体に含まれるルシフェラーゼ活性をルミノメーターにより測定し,得られた発光量を基に間接的にヒト血清中の抗体量(RLU)を算定する.当院でのLIPS樹立に際しては、自己免疫性自律神経節障害患者血清40例、健常者血清40例、対照患者血清20例を用いてgAChRα3とβ4サブユニットについてそれぞれLIPSを行い、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。得られたルシフェラーゼ活性についてROC解析を行い、最適なポジティブコントロール(カットオフ)を設定した。また、ヒト自己免疫性自律神経節障害患者剖検例および疾患対照患者剖検例において自律神経節や脳における免疫染色を実施した。2016年4月より現在の職場へ着任後、細胞培養の増殖不良、α3/β4-GL発現ベクターのHEK293への遺伝子導入効率の低下およびルシフェラーゼ活性の著しい低下があり、その原因検索に多大な時間を要した。昨年度当院における自律神経節アセチルコリン受容体(gAChR)α3とβ4サブユニットに対する抗体測定系をLIPS(ルシフェラーゼ免疫沈降法)で樹立した。今年度も引き続き全国からの検体を月30以上受け入れ抗体測定を行ってきた。またヒト自己免疫性自律神経節障害患者剖検例および疾患対照患者剖検例において自律神経節や脳における免疫染色を実施した。現在、gAChRを強制的に発現させたHEK293F細胞、自己免疫性自律神経節障害患者血清、既製品抗体を用いたCell-based assay法(免疫染色)にも着手し樹立を目指している。全国からの測定依頼が多いため、十分な研究時間を作ることが困難であること。Cellbased assayの技術確立に時間を要している。自己免疫性消化管運動障害は自律神経障害を併せ持つことが知られているが、我々が調査した食道

アカラシアと慢性偽性腸閉塞症の症例も多くは自律神経障害を有することが判明した。これは自己免疫性消化管運動障害と抗自律神経節アセチルコリン受容体抗体に関する本邦における初めての研究であり、これをJournal of Gastroenterology誌に論文として報告し、国内の複数の学会で発表した。第28回日本神経免疫学会学術集会ではYoung neuroimmunologist Awardを受賞した。自己免疫性自律神経節障害(Autoimmune autonomic ganglionopathy: AAG)では,抗gAChR抗体がその約半数で陽性となることが判明しているが、半数以上に上る本抗体陰性症例の原因・病態は不明である.我々が測定している抗gAChR抗体以外の病原性物質がseronegative AAG患者血清中には存在するため,これを探索し病態を解析する.今回の研究ではAAGで第二の自己抗体を見出し,その抗体陽性となる症例の臨床像を明らかにする。我々が集積したseronegative AAG症例血清約50サンプルでラット脳凍結切片を用いた免疫組織染色により未知の抗体の存在をスクリーニングする.またヒトneuronal cell line,DAラットの大脳・小脳・脊髄のlysateを用いてのウェスタンブロッティングも試みる.抗体の認識抗原の同定を二次元免疫ブロット法,もしくは免疫沈降法と質量分析法を組み合わせた手法により解析する.その後、新規自己抗体候補として挙げられたものについてLIPSによる測定系を樹立する.LIPSにより新規自己抗体陽性と診断された臨床像の解析を行い、論文報告,学会発表を行う.これまでseronegative AAGと診断されていた症例における血清中新規自己抗体測定を日本全国に呼びかけ,診断基準策定につなげる.未知の抗体特定,抗体の認識抗原同定に至らない場合には自律神経節に存在する他のニコチン作動性アセチルコリン受容体サブユニットであるα4/β2,α7に対する自己抗体を検出するLIPSの樹立を急ぐ本年度は新しい抗体測定系の樹立に取り掛かってはいるが、まだ軌道にのっておらず、むしろこれまでの測定結果を用いた後ろ向き研究を重点的に行った。そのために次年度使用額が生じたものと考える。現在まではCellbased assay法の樹立に重点を置いていることによる。今後の研究の進展によって助成金を計画的に使用できると考える。次年度では新しい抗体測定系の樹立を予定しており、この研究において使用することを計画している。
楕円型・放物型偏微分方程式の多面的研究

楕円型・放物型偏微分方程式を多面的に研究し、多くの研究成果が上がった。既に出版された研究成果だけを見ても以下の通りである。研究代表者(村田)は放物型偏微分方程式について研究し、一様制限付き放物型Hranack不等式、分離原理、放物型方程式に対する超縮小性について論文を発表した。またリーマン多様体上の熱方程式の正の解に対する、一意性、非一意性について論じた(アメリカ数学会より出版予定).高田は応用の立場(統計数学)から、予測極限についての論文をいくつか発表した。神島は幾何学への応用を用い、一定曲率を持つローレンツ多様体の完備性について論文を表した。原岡は特殊関数論との関連から、一般化された超幾何システムの合流性について論文を書いた。相川は楕円型方程式と密接に結びついたポテンシャル論において、容量の擬加法性と極小尖細性について論文を発表した。さらに正の優調和関数、劣調和関数の可積分性について研究した(アメリカ数学会より出版)。櫃田は楕円型・放物型偏微分方程式と関連の深い確率論においてガスウ過程について書籍を出版した。ロシア科学アカデミー、ステクロフ研究所にガウスマルチンゲールに関する論文を発表した。そのほか、研究代表者研究協力者による、出版済み及び、発表予定の論文も10編以上あり、楕円型・放物型偏微分方程式を多面的に研究する事ができた。
チオール類の自己集合単分子膜を用いたマイクロ電極集合体の調製と電気化学特性

金電極をチオール類の存在する溶液に浸漬すると,電極表面にチオール類が化学吸着して自己集合単分子膜を形成することが良く知られている.また最近の研究により,空気中で単分子膜に紫外光をを照射すると,チオール類が酸化されて有機スルホン酸となり,電極表面から脱離することが明らかにされた.本研究はそのような性質を利用して,信号/ノイズ比が極めて高く,高速の応答性を有するマイクロ電極の集合体を簡単に作成する方法を開発し,その基本的な電気化学特性を調べることを目的として行った.本年度の研究によって得られた成果の概要は以下の通りである.(1)ペンタデカンチオールまたはオクタデカンチオールの自己集合単分子膜を形成させた金電極を,K_4Fe(CN)_6を溶解した電解液中に浸漬しそれに光照射すると,紫外光のみならず可視光を照射してもチオールの脱離が起こることを見出した.そしてその脱離の速度は,空気中で紫外光を照射したときのそれよりも数倍速いものであった.また,単分子膜が被覆した電極は電気化学反応を全く行わないのに対し,光照射することにより露出した金表面では,電気化学反応が通常の金電極と全く同じように起こることを明らかにした.(2)上記の性質を利用して,電解液中に浸漬させた単分子膜被覆金電極に数十マイクロメーターの大きさのレーザースポット光を照射し,その部分のみの単分子膜を除去したものを電極として用いると,マイクロ単電極の特性を示すことがわかった.また,スポット光を電極表面の異なった位置に照射し,複数個のマイクロ電極を作成することにより,マイクロ単電極の特性を有し,なおかつ高感度な電極を作成することに成功した.(3)(2)と同様の原理によって,単分子膜被覆金電極の表面にフォトマスクを通した光を照射することによりマイクロ電極集合体を作成し,その電気化学特性を調べたところ,理論的に予測されている挙動と一致することを明らかとした.また,実用的に用いるのに充分な耐久性も備えていることも確認した.金電極をチオール類の存在する溶液に浸漬すると,電極表面にチオール類が化学吸着して自己集合単分子膜を形成することが良く知られている.また最近の研究により,空気中で単分子膜に紫外光をを照射すると,チオール類が酸化されて有機スルホン酸となり,電極表面から脱離することが明らかにされた.本研究はそのような性質を利用して,信号/ノイズ比が極めて高く,高速の応答性を有するマイクロ電極の集合体を簡単に作成する方法を開発し,その基本的な電気化学特性を調べることを目的として行った.本年度の研究によって得られた成果の概要は以下の通りである.(1)ペンタデカンチオールまたはオクタデカンチオールの自己集合単分子膜を形成させた金電極を,K_4Fe(CN)_6を溶解した電解液中に浸漬しそれに光照射すると,紫外光のみならず可視光を照射してもチオールの脱離が起こることを見出した.そしてその脱離の速度は,空気中で紫外光を照射したときのそれよりも数倍速いものであった.また,単分子膜が被覆した電極は電気化学反応を全く行わないのに対し,光照射することにより露出した金表面では,電気化学反応が通常の金電極と全く同じように起こることを明らかにした.(2)上記の性質を利用して,電解液中に浸漬させた単分子膜被覆金電極に数十マイクロメーターの大きさのレーザースポット光を照射し,その部分のみの単分子膜を除去したものを電極として用いると,マイクロ単電極の特性を示すことがわかった.また,スポット光を電極表面の異なった位置に照射し,複数個のマイクロ電極を作成することにより,マイクロ単電極の特性を有し,なおかつ高感度な電極を作成することに成功した.(3)(2)と同様の原理によって,単分子膜被覆金電極の表面にフォトマスクを通した光を照射することによりマイクロ電極集合体を作成し,その電気化学特性を調べたところ,理論的に予測されている挙動と一致することを明らかとした.また,実用的に用いるのに充分な耐久性も備えていることも確認した.
α,β-不飽和カルボニル化合物の新規代謝経路としての硫酸化

生体内における硫酸化は、薬物等の解毒代謝機構として知られ、硫酸転移酵素(SULT)が関与する。我々はα,β-不飽和カルボニル化合物が硫酸化を受けることを見出し、ナフトキノンなどが幅広いSULTにより硫酸化を受けることが明らかとなった。ナフトキノン骨格を基本構造として持つ生体分子であるビタミンKの硫酸化を発見し、リコンビナントSULTを用いてビタミンK硫酸化の酵素学的な諸性質を検討した。硫酸化反応産物の構造決定をNMRと質量分析により行った。これらの知見より、α,β-不飽和カルボニル基を有した医薬品候補分子の代謝機構として硫酸化を考慮した開発が求められることが示された。生体内における硫酸化は、ステロイドホルモン、神経伝達物質および薬物等の解毒代謝機構として知られ、硫酸転移酵素(SULT)がその反応を触媒する。これまでの研究から、硫酸化の標的となる分子は、フェノール性やアルコール性の水酸基または、芳香族アミンなどアミノ基を持つ化合物が広く知られている。本研究計画では、α,β-不飽和カルボニル構造を持った環状化合物が直接酵素的に硫酸化を受けるという新発見に基づき、その代謝機構の生理的意義、反応メカニズムの解明を目的とした研究を実施する。リコンビナント硫酸転移酵素SULTによる環状α,β-不飽和カルボニル化合物硫酸化:SULT7A1は、シクロペンテノンを最小基質として認識し、シクロペンテノン型プロスタグランジンを広く硫酸化するが、ナフトキノンの硫酸化には主としてSULT1ファミリー硫酸転移酵素が関与することが判明した。また、ケトステロイドの硫酸化には広くSULT2ファミリー硫酸転移酵素が関与することが判明した。これらの環状α,β-不飽和カルボニル化合物の硫酸化に関しては、生化学的諸性質を検討した。α,β-不飽和カルボニル化合物硫酸化に関与する触媒アミノ酸残基の推定:九州大学との共同研究でX線結晶構造解析によりSULT7A1の立体構造を明らかにした。その結果、触媒残基として予想していたHis94残基と側鎖同士が水素結合を形成するペアとしてCys234残基が反応に関与することが予想された。部位特異的変位導入実験の結果、His94をAlaに変位すると活性を消失することを確認した。生体内における硫酸化は、ステロイドホルモンや神経伝達物質および薬物等の解毒代謝機構として知られ、硫酸転移酵素(SULT)が関与する。これまでの研究から、硫酸化はフェノール性またはアルコール性の水酸基や芳香族アミンのアミノ基を標的とすることが知られている。我々はα,β-不飽和カルボニル化合物が硫酸化を受けることを見出し、その代謝機構の生理的意義、反応メカニズム解明を目的に研究を実施した。新規硫酸転移酵素SULT7A1は環状α,β-不飽和カルボニル化合物を特異的に硫酸化し、シクロペンテノン型プロスタグランジンの代謝に関与すると考えられた。同じく、環状α,β-不飽和カルボニル化合物であるナフトキノンは幅広いSULTにより硫酸化を受けることが明らかとなった。ナフトキノンをモデル化合物としてその硫酸化の反応機構を明らかにする目的のため、硫酸化反応産物の構造決定をNMRと質量分析により行った。また、ナフトキノン骨格を基本構造として持つ生体分子であるビタミンKの硫酸化を発見し、リコンビナントSULTを用いてビタミンKおよび関連化合物を基質として酵素学的な諸性質を検討した。これらの研究を通じて、幅広い環状α,β-不飽和カルボニル化合物が硫酸化による代謝を受けることが確認された。これらの知見より、医薬品開発においてα,β-不飽和カルボニル基を有した医薬品候補分子の代謝機構として硫酸化を考慮した開発が求められることが示された。応用生物化学シクロペンテノン型プロスタグランジン、ナフトキノン、ケトステロイドのそれぞれの硫酸化に関与するSULTを明らかにし、生化学諸性質を検討した。SULT7A1の構造解析の結果から、シクロペンテノンの硫酸化にはHis94とCys234の両方の触媒残基が必要なことを明らかにした。これらの成果により、平成25年度に関してはおおむね順調に進展していると判定した。SULT7A1の構造解析結果より、触媒残基としてHis94とCys234残基が関与する事が予想できるが、つじつまの合う反応メカニズムが提案できておらず、検討が必要である。そのためには、シクロペンテノンの硫酸化代謝産物の構造解析が不可欠である。同様に、ナフトキノンの硫酸化代謝産物の構造解析を進めているが、ナフトキノンは反応性が高く、想定外の反応が同時に進行している可能性があり、精製方法などの検討が必要である。
ペプチドを含む機能性食品開発法の創造に関する研究

ポリスチレンにスルフォン酸を導入した強カチオン交換樹脂を導入したスピンカラムを用い、て数mLのヒト末梢血中に存在する食事由来ペプチドのキャプチャリングに成功した。このペプチド画分を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーで分画後、フェニルイソチオシアネート(PITC)によりペプチドを誘導化した。この処理により親水性ペプチドの逆相HPLCによる分離が劇的に改善され、さらにフェニル基の存在に基づく254nmにおける特異的な検出が可能となった。この手法を用い、コラーゲンペプチドを摂取したヒト末梢血から主要な食事由来コラーゲンペプチドであるPro-Hypが妨害無く検出された。さらにこれまでは分離できなかった親水性ペプチドであるHyp-Glyも主要な食事由来コラーゲンペプチドとしてヒト末梢血中に存在することを明らかにした。さらに大豆たんぱく質分解物、エラスチン分解物を摂取したヒト末梢血からも食事由来ペプチドの分離に成功した。またアミノ末端がピログルタミン酸となったアミン末端閉鎖ペプチドを摂取したラットもン脈血から前述のスピンカラムによりアミノ基を持つペプチド・アミノ酸を除去した後、ピログルタメートアミノペプチダーゼで消化し、遊離してきたピログルタミン酸をジニトロヒドラジンと反応させ、反応物を逆相HPLCで分離することによりピログルタミン酸ペプチドがラット問脈血中に移行することを初めて証明した。ペプチドは摂取後大部分が短時間でアミノ酸にまで分解されるため、in vitroでの活性は直接生理体内での活性に結びつかない。そのため経口摂取後ヒトの末梢血に移行するペプチドの同定を試みた。コラーゲンには他のタンパク質にはほとんど分布していないハイドロキシプロリン(Hyp)が存在する。一晩絶食後のヒト末梢血中には有意な量のHypペプチドは存在しないが、10-25グラムのゼラチン酵素分解物を摂取したヒトの末梢血には20-100nmol/mlのHypを含むペプチドが存在するため、末梢血中に確実に食事由来コラーゲンペプチドが存在する。この末梢血から血漿を調製し、3倍量のエタノールを加え、内因性タンパク質を沈殿除去した。このエタノール可溶性画分を常法である、逆相HPLCで分画したところ、非常に多くの妨害ピークが出現し、食事由来ペプチドの同定は不可能であった。そのため、1.5ml容量の遠心チューブ上のカラムに強カチオン交換樹脂であるAGW50X8を充填したミニスピンカラムを調製した。エタノール可溶性画分を最大8mlまでカラムに注入し、吸着したペプチドを7.5Mアンモニア-50%メタノール溶液で溶出し、400ulに濃縮・清澄化することに成功した。このペプチド画分をゲル濾過クロマトグラフィーで分画後、逆相HPLCでの分離と検出の改善を目的としてフェニルイソチオシアネートで誘導化した。ペプチドの誘導化物は0.01%トリフルオロ酢酸とアセトニトリルのグラジエント溶出によりアミノ酸等の他の成分と分離することに成功した。分離されたフェニルチオカルバミルペプチドは、切断反応から開始するようにプログラムを変更したエドマン分解に基づくペプチドシーケンサーにより構造の同定も可能となった。以上の結果より、生体内で実際の活性を持つペプチドの候補を得ることが可能となった。