hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の移動に伴う歯根膜線維の形態変化と歯槽骨改造過程の関連性

本研究に先立ち,歯の移動に伴う移動後短期間の骨吸収と骨形成開始の様相を,走査電顕を用いて歯槽骨壁の広範囲を観察してきた.今回は,水酸化ナトリウムによって細胞成分を除去した非脱灰標本を用い,歯根膜線維の形状と形態を走査電顕を用いて観察し,歯の移動に伴う歯根膜線維と初期の骨改造現象との関連性について検討を行った.方法として,実験にはWistar系雄性ラット(250g【.+-。】20g)を使用し,上顎右側第一臼歯を,coil-springで初期荷重約10gで近心方向に牽引した.移動開始後より1週間まで経時的に屠殺し,5%グルタールアルデハイドにて固定した.その後,試料は非脱灰の状態で5%水酸化ナトリウム水溶液にて細胞成分を除去し,近遠心,頬舌側方向に割断し,カーボン,金二重蒸着後,走査電子顕微鏡(日本電子JCXA-733型)で観察した.結果として,圧迫側(近心面)では,移動数時間後より歯根膜の圧縮が歯頚側にみられ、経時的に根尖方向にもみられた.また歯根膜線維は屈曲し,歯槽骨壁付近で多数の血管腔を輪状に囲んだものや横断像等が認められた.移動24時間後には,屈曲した歯根膜線維に隣接した歯槽骨壁表面で,浅い吸収窩がみられ始め,この部位では歯根膜線維が断裂している像がみられ,吸収は経時的進行した.牽引側(遠心面)では,移動数時間後より歯槽頂線維束の歯根膜線維の伸展がみられ始め,経時的に根尖部においても伸展がみられた.移動24時間後には,吸収窩の窩底表面に石灰化構造物が次第に沈着しはじめ,これと同時に吸収窩付近の歯槽骨壁において歯根膜線維が確認され,伸展した歯根膜線維束の付近には細網線維と思われる網状構造も観察された.これらの歯根膜の伸展に伴う新しい骨の添加は経時的に増加傾向にあった.これより歯の移動に伴う骨改造は,歯槽骨表層に隣接した歯根膜線維の形態変化に密接な関係があることが示唆された.本研究に先立ち,歯の移動に伴う移動後短期間の骨吸収と骨形成開始の様相を,走査電顕を用いて歯槽骨壁の広範囲を観察してきた.今回は,水酸化ナトリウムによって細胞成分を除去した非脱灰標本を用い,歯根膜線維の形状と形態を走査電顕を用いて観察し,歯の移動に伴う歯根膜線維と初期の骨改造現象との関連性について検討を行った.方法として,実験にはWistar系雄性ラット(250g【.+-。】20g)を使用し,上顎右側第一臼歯を,coil-springで初期荷重約10gで近心方向に牽引した.移動開始後より1週間まで経時的に屠殺し,5%グルタールアルデハイドにて固定した.その後,試料は非脱灰の状態で5%水酸化ナトリウム水溶液にて細胞成分を除去し,近遠心,頬舌側方向に割断し,カーボン,金二重蒸着後,走査電子顕微鏡(日本電子JCXA-733型)で観察した.結果として,圧迫側(近心面)では,移動数時間後より歯根膜の圧縮が歯頚側にみられ、経時的に根尖方向にもみられた.また歯根膜線維は屈曲し,歯槽骨壁付近で多数の血管腔を輪状に囲んだものや横断像等が認められた.移動24時間後には,屈曲した歯根膜線維に隣接した歯槽骨壁表面で,浅い吸収窩がみられ始め,この部位では歯根膜線維が断裂している像がみられ,吸収は経時的進行した.牽引側(遠心面)では,移動数時間後より歯槽頂線維束の歯根膜線維の伸展がみられ始め,経時的に根尖部においても伸展がみられた.移動24時間後には,吸収窩の窩底表面に石灰化構造物が次第に沈着しはじめ,これと同時に吸収窩付近の歯槽骨壁において歯根膜線維が確認され,伸展した歯根膜線維束の付近には細網線維と思われる網状構造も観察された.これらの歯根膜の伸展に伴う新しい骨の添加は経時的に増加傾向にあった.これより歯の移動に伴う骨改造は,歯槽骨表層に隣接した歯根膜線維の形態変化に密接な関係があることが示唆された.
細胞外環境制御による脳・脊髄損傷後の再生治療とその機能回路回復

中枢神経系における細胞外マトリックス糖鎖発現を中心とした局所の細胞外環境制御によって、損傷神経の生理機能回復を目的として研究を進めてきた。技術面においては、本学術領域で確立した脊髄回路の再生再編のトレーシング技術を推進している。A)糖鎖構造発現に関わる酵素であるChGn1のKOマウスにおける脊髄損傷後修復は、現在知られる損傷回復モデルの中では最も回復が早い。このChGn1酵素はコンドロイチン硫酸(CS)の合成過程で重要かつ最初期に発現制御に関わる酵素である。CSは、細胞外マトリックスのうち中枢神再生にとって最大の再生阻害因子として知られている。CSが神経系組織で機能を果たすにあたって重要な存在の場としてペリニューロナルネット(PNN)という構造体に着目している。CSの発現量と局在と、PNNとの相関を中心に、中枢神経再生時の回路再編成との相関を、脊髄回路のトレーシング技術を用いて明らかにしつつある。ChGn1KOマウスとともにこのChGn1に対する遺伝子ノックダウン系を開発し、逆行性ウイルスベクターによる再生回路と、PNNの発現タイミングを可視化した。PNNにはNGFやセマホリンなどの遠位性因子がトラップされることで回路再編を制御していることも解った。B)PNNの糖鎖構造を維持するための骨格タンパク質であるアグリカンをノックダウンすることで、再生回路との関連を相関を調べた。PNNを骨格構造とともに消去すると、神経再生機能および回路再編のタイミングがずれることが解った。PNNは神経再生時のさまざまなゲート機能を果たしていることが解りつつある。3細胞外環境制御に起因する中枢回路再生と、iPS細胞はじめ再生治療に向けての細胞移植などによる神経自律的回復との違いの解析を進めた。今後の再生医療において、移植等による自律的回復だけではなく、再生環境整備の重要を示しつつある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞外マトリックス糖鎖構造発現を中心とした局所の細胞外環境制御によって、脊髄損傷後の再生神経回路はいかに再編成し、いかに機能シフトするかを解明することを目標にする。特に技術面において、本学術領域で確立した脊髄回路の再生再編のトレーシング技術を進める。さらに局所的遺伝子発現制御システムを立ち上げて、神経回路再生における機能シフトを遺伝子プロファイルから得た様々な分子との相関から検証することを目的とし研究を進めている。1糖鎖構造の発現に関わるChGn1KOマウスの脊髄損傷後修復は、現在知られる損傷回復モデルの中では最も回復が早い。このChGn1酵素はさまざまな器官でコンドロイチン硫酸(CS)の合成過程で重要かつ最も初期に発現制御に関わる酵素である。細胞外マトリックスのうち中枢神経再生にとって最も制御が必要かつ我々が特に注力している、このコンドロイチン硫酸(CS)が成体神経組織で機能を果たすにあたって重要な存在の場としてペリニューロナルネット(PNN)という構造体が着目されている。中枢神経再生に関わるCSの機能場であるこのPNNとの相関を中心に、CS発現とともにPNNと神経発芽回路再編成との相関を明らかにすることができた。PNNはたしかに神経再生にその発現が相関しており、PNNの組織内機能が神経発芽を抑制していることが分かった。2CS発現制御あるいは微細環境制御(回路再編)に関わる炎症性サイトカイン、さらにはPNN骨格のアグリカンをノックダウンコンストラクトを用いて局所にて抑制し、これらと再生の相関を調べた。再生過程の局所領域での回路再編を解析する方法を確立した。PNNによる回路再編にあたっての重要な知見を得るためのシステムを立ち上げることができた。3細胞外環境制御に起因する回路再編の違いと、iPS細胞はじめ再生治療に向けての細胞移植およびCS環境制御との併用による回路再編の解析系を立ち上げ、研究を開始することができた糖鎖構造の発現に関わるChGn1KOマウスの脊髄損傷後修復は、現在知られる損傷回復モデルの中では最も回復が早い。中枢神経再生に関わるCSの機能場であるPNNとの相関を中心に、我々の遺伝子改変マウスを駆使して、再生過程の神経回路可視化を可能としたこと、神経発芽回路再編成をPNNとの相関で捉えることを可能としたので、ほぼ当初目標を達成することができた。B)

PNNの糖鎖構造を維持するための骨格タンパク質であるアグリカンをノックダウンすることで、再生回路との関連を相関を調べた。PNNを骨格構造とともに消去すると、神経再生機能および回路再編のタイミングがずれることが解った。PNNは神経再生時のさまざまなゲート機能を果たしていることが解りつつある。3細胞外環境制御に起因する中枢回路再生と、iPS細胞はじめ再生治療に向けての細胞移植などによる神経自律的回復との違いの解析を進めた。今後の再生医療において、移植等による自律的回復だけではなく、再生環境整備の重要を示しつつある。細胞外環境制御に起因する回路再編の違いと、CS環境制御および細胞移植との併用による回路再編を解析を推進する。再生における積極的な神経発芽が、脊髄損傷後のCS環境制御や細胞移植において認められることなのか、さらにそれらが増強されているかを解析する。これまでの本領域での成果と併せて、組織解析とともに網羅的分子発現(RNAseq)解析など細胞分子生物学的手法も用いることで、脊髄損傷の再生回路再編(機能シフト)を捉える平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
政策的なジェンダーエンパワーメントはどこまで可能か?：バングラデシュの事例

本研究では、発展途上国の貧困解消政策として近年その(少なくとも短期的な)有効性が実証され、急速に普及している「条件付き現金給付」(CCT)に対する政策的知見を拡大することを主目的とする。CCT政策の草分けともいえるバングラデシュの女子中等教育奨学金プログラムを題材として、従来検証が十分になされてこなかった、CCTの長期的なインパクトおよび女性のエンパワーメント効果に焦点をあてる。政策介入によって女性のエンパワーメントを目指すことの可能性と限界について政策的な示唆を得ることを目指している。本研究では、バングラデシュの女子中等教育奨学金(FSSP)プログラムの長い歴史とそのデザイン上の特徴を最大限に活かしつつ、そのインパクトを自然実験的手法により検証する。FSSP実施の前後にわたる約20年間をカバーする家計パネルデータ(研究協力者により収集済)をベースとして、追加的データ収集を行う。それにより、FSSPによる人的資本形成や長期的な所得の向上のみならず、家計内の男女間の交渉のパターンにおける変化の有無も可能な限り検証する。基本的にはKhandker, Pitt and Fuwa (2003)のアプローチを踏襲し、1990年代から2010年にかけてKhandker氏によって収集された家計レベルのパネルデータを主要なデータベースとして使用するとともに、就学率に対するインパクトについては、FSAPプログラムの情報管理システム(MIS: Monitoring and Information System)による学校別の就学データも可能な限り活用する。本年度は、追加家計データ収集の前段階の作業として、追加的なデータ加工を行った。更に、ワシントンDCにて連携研究者のShahid Khandkerとの間で、追加データ収集のための準備作業・打ち合わせ等を行った。昨年度中に、追加家計データ収集を開始する予定であったが、その準備のための既存家計データ分析の過程で、データ中の調査対象家計及び個人の固有識別番号の振り方の不備が判明したため、既存家計データの各調査年次間で同一家計と個人をつなぐための追加的データ加工作業を行う必要が生じた。その作業に時間を要したため、追加家計データ収集は29年度に行うこととした。29年度は、上記家計パネルデータの分析を続けるとともに、28年度中にできなかった追加データ収集を行う。データ収集に当たっては、過去にKhander氏のデータ収集に関わったスタッフの協力を得ることを予定している。
Golod 性を中心としたトーリックホモトピーの展開

本研究は、数学のいろいろな分野(具体的には、代数幾何学、可換環論、トポロジー、組み合わせ論)に現われるモーメントアングル複体とその一般化に関する研究です。モーメントアングル複体は、単体複体とよばれる簡単な数学的対象で記述できます。その単体複体がGolod性という特別な性質をもつとき、モーメントアングル複体が非常に簡単な構造を持つことが今までの研究で予想されています。本研究は、単体複体がGolod性を持つ必要十分条件を、その組み合わせ構造を用いて記述することを目指しています。
走査トンネル顕微鏡を用いた振動励起で誘起される単一吸着分子運動の理論

研究計画で期待した以上の成果を挙げることができた。「振動励起で誘起される単一吸着分子運動の理論」において、トンネル電流が単一分子の運動や反応に関係した反応座標モードを直接励起する場合と、トンネル電子によって励起された振動モードが反応座標と相互作用して運動を誘起する場合の理論をまとめ上げることができた。さらに、今まで誰も検討することさえしなかった非弾性トンネル電流と運動や反応を誘起するための振動励起確率の微視的な相互関係を初めて理論的に明らかにした。さらに、日本学術振興会の外国人特別研究員(欧米・短期)事業と外国人招へい事業により、それぞれ共同研究者であるB.N.J.Persson博士(ユーリッヒ固体物理学研究所、ドイツ)とN.Lorente博士(Paul Sabatier大学、フランス)を富山大学に招き、本研究課題の遂行で実りある共同研究を行うとができた。この科学研究費の配分を得たことで、我々は"走査トンネル顕微鏡を用いた振動励起で誘起される単一吸着分子運動"に関する理論研究で世界のトップにある研究成果を挙げることができた。初年度の研究計画に基づき、予想以上の成果を挙げることができた。具体的には1)吸着分子の振動励起を介した非弾性トンネルの素過程を明らかにし、走査トンネル顕微鏡(STM)で観測される非弾性トンネルスペクトルがトンネル電子の経由する吸着分子電子状態によってどのように変化するか、さらに吸着分子の振動緩和がどのように非弾性トンネルスペクトルに反映されるかを明らかにした論文をPhysical Review Bで発表した。2)吸着分子の非弾性トンネル電流とトンネル電子による振動励起速度の関係を初めて理論的に明らかにした。非弾性トンネル電子に誘起された吸着子運動の素過程の理論と結合させることで、運動確率のトンネルバイアス電圧依存性で観測されるであろう振動緩和や温度の影響を理論的に明らかにした研究成果は現在Physical Review Bに投稿中である。3)走査トンネル顕微鏡を用いた振動励起で誘起される単一吸着原子・分子運動の運動や反応に関する先駆的な実験と理論の現状を総合的に概観したものとしては世界で初めての総合解説論文を出版した。4)2002年の3月に雑誌「サイエンス」で実験グループと共同で発表した"走査トンネル顕微鏡を用いた振動励起で誘起される単一吸着分子運動の理論"が世界的に高く評価され、9月にプラハで開催された第22回ヨーロッパ表面科学国際会議および11月に奈良で開催された原子制御表面・界面・ナノ構造に関する第7回国際会議で表面吸着分子の非弾性トンネル分光の理論と単一分子運動の理論に関する招待講演を行った。これらの講演に基づいて、単一吸着子の運動を誘起する素過程の理論の現状と今後の展望を中心とした招待論文がそれそれの国際会議のプロシーディングとして出版されることが決定している。これらの成果は6月6-10日にアメリカのBar-Haber(Maine州)で開催された第11回表面振動に関する国際会議での一般講演および9月7-11日にスペインのSan-Sebastianで開催された「分子-表面相互作用に関する国際ワークショップ」での招待講演として発表した。さらに、日本学術振興会の外国人特別研究員(欧米・短期)事業と外国入招へい事業により、それぞれ共同研究者であるB.N.J.Persson博士(ユーリッヒ固体物理学研究所、ドイツ)とN.Lorente博士(Paul Sabatier大学、フランス)を富山大学に招き、本研究課題の遂行で実りある共同研究を行うことができた。この科学研究費の配分を得たことで、我々は"走査トンネル顕微鏡を用いた振動励起で誘起される単一吸着分子運動"に関する理論研究で世界のトップにある研究成果を挙げることができたと確信している。(2003-2004の2年間で本研究成果に関して、3つの国際会議で招待講演を行った。)平成15年度から3年間に渡る研究計画の最終年度に当たり、今年度の研究成果に記載されているように、予想以上の成果を挙げることができた。

従来からの研究成果に加えて、これらの研究成果を受けて、平成18年9月に行われるアメリカ化学会年次総会を含め3つの国際会議から招待講演を依頼されており、走査トンネル顕微鏡を用いたトンネル電流による振動励起に誘起された吸着分子の運動と反応に関する理論研究では世界をリードする研究成果が得られた。具体的には1)単一分子の反応に直接関係する反応座標モードをトンネル電子が励起する時の、反応速度とトンネル電流の関係、特に温度と反応座標振動モードの緩和時間の影響を明らかにした。2)トンネル電子によって励起される振動モードが反応座標モードと非調和結合して単一吸着子の運動や反応が誘起される場合の一電子過程、二電子過程の理論的なシナリオを初めて構築した。3)上記の素過程の理論を銅表面に吸着したアンモニア分子の脱離の実験解析に適用し、密度汎関数理論を用いた数値計算により、二電子過程による脱離速度を求め、定性的に実験結果との良い一致を得た。4)銅と銀の表面に吸着した一酸化炭素分子の電子、振動状態を密度汎関数理論を用いて計算し、これらの金属表面で一酸化炭素分子がその振動励起によって表面ホッピングを起こす可能性を検討した。5)白金のステップ表面に吸着した一酸化炭素分子の表面ホッピングがフェムト秒可視レーザパルス照射によって誘起され、それには従来考えられていたような束縛並進モードではなく、束縛回転モードの励起が本質的な役割を果たすことが示唆する極めて興味ある研究成果がサイエンスに掲載されたが、これに関する展望記事を同じサイエンスに掲載した。
植物の成熟を制御するACC deaminaseの立体構造決定とその制御機構の解明

植物の成長ホルモンであるエチレンの生合成前駆体である1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)を脱アミノ化して,2-オキソ酪酸に変換する酵素ACC deaminaseの立体構造をX線結晶構造解析法により解明し,その反応機構を原子レベルで解明することを目的として研究を進めた.構造解析は,大腸菌で大量発現した酵母由来のACC deaminaseを用いて行った.シンクロトロン放射光を使って回折強度データ収集を行い,ネイティブ(分解能2.A),PHMBS共結晶の高分解能(2.5A以上)の回折強度データを得ることができた.本研究では,すべて結晶を100Kに冷却した条件でデータ収集を行ったため,結晶間での同型性が崩れ,また,PHMBS共結晶では,別の結晶系のものも得られた.このため,位相決定は,PHMBS共結晶を用いた多波長異常分散法により行い,さらに,同一結晶内での分子内および結晶系の異なる結晶間での非結晶学的な分子の対称性を利用した分子置換平均化法を用いて位相改良を行った結果,解釈可能な電子密度図を得ることができた.この電子密度図に基づいて,立体構造モデルを作製し,分子動力学的手法を用いた精密化を行った結果,水分子825個を構造因子の計算に含め,分解能8-2.0AでR-factorが24.9%、(R_<Free>=28.2%)の構造を得ることができた.酵母ACC deaminaseは,ホモ二量体として存在し,それぞれの単量体分子は,大小2つのドメイン構造をとっていた.大きな方のドメインは,N末端およびC末端の領域(1-57,170-341)から構成され,補酵母であるpyridoxal phosphate(PLP)が結合している.小さな方のドメインは,中央の領域(58-169)から構成され,基質結合に関与していると考えられる.酵母由来のACC deaminaseの立体構造をX線回折法により決定し,その反応機構を原子レベルで解明することを目的として研究を行った.Photon Factory(つくば),SPring-8(西播磨),ESRF(フランス)において,シンクロトロン放射光を使って回折強度データ収集を行い,ネイティブ,PHMBS共結晶の高分解能(2.5Å以上)の回折強度データの収集に成功した.また,北大・農学部において大量発現系が確立したので,セレノメチオニン置換体を作製し,結晶化を試みた.ネイティブとほぼ同様の条件で結晶が得られたが,ビームタイムの制限により,現在のところ良好な回折強度データは得られていない.本研究では,すべて結晶を100Kに冷却した条件でデータ収集を行なったため,データセット間での同型性が崩れ,また,PHMBS共結晶では,これまでと違った結晶系のものも得られた.このため,位相決定は,2つの異なる結晶系のPHMBS共結晶を用いた多波長異常分散法により行った.いずれのデータとも,Maximum-likelihoodを利用した位相決定を行った結果,2回軸で関係付けられる2量体のおおまかな構造(分子境界および一部の2次構造など)が明らかになった.現在,原子レベルでの解釈が可能な電子密度図を得るために,結晶間および結晶内の分子置換平均化法による位相改良を進めており,また,これと平行して,新たな位相情報を得るために,セレノメチオニン置換体結晶の回折強度データ収集,および,高圧下で希ガスをソ-キングする新しい重原子置換体結晶の作製を進めている.植物の成長ホルモンであるエチレンの生合成前駆体である1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)を脱アミノ化して,2-オキソ酪酸に変換する酵素ACC deaminaseの立体構造をX線結晶構造解析法により解明し,その反応機構を原子レベルで解明することを目的として研究を進めた.構造解析は,大腸菌で大量発現した酵母由来のACC deaminaseを用いて行った.シンクロトロン放射光を使って回折強度データ収集を行い,ネイティブ(分解能2.A),PHMBS共結晶の高分解能(2.5A以上)の回折強度データを得ることができた.本研究では,すべて結晶を100Kに冷却した条件でデータ収集を行ったため,結晶間での同型性が崩れ,また,PHMBS共結晶では,別の結晶系のものも得られた.このため,位相決定は,PHMBS共結晶を用いた多波長異常分散法により行い,さらに,同一結晶内での分子内および結晶系の異なる結晶間での非結晶学的な分子の対称性を利用した分子置換平均化法を用いて位相改良を行った結果,解釈可能な電子密度図を得ることができた.この電子密度図に基づいて,立体構造モデルを作製し,分子動力学的手法を用いた精密化を行った結果,水分子825個を構造因子の計算に含め,分解能8-2.0AでR-factorが24.9%、(R_<Free>=28.2%)の構造を得ることができた.酵母ACC deaminaseは,ホモ二量体として存在し,それぞれの単量体分子は,大小2つのドメイン構造をとっていた.大きな方のドメインは,N末端およびC末端の領域(1-57,170-341)から構成され,補酵母であるpyridoxal phosphate(PLP)が結合している.小さな方のドメインは,中央の領域(58-169)から構成され,基質結合に関与していると考えられる.
ES細胞由来タンパク質導入によるiPS細胞作製に関する研究

家畜などの大型哺乳動物を用いた疾患モデルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を再生医療に応用する際、安全性確認ののための前臨床試験に有用である。しかし、これらの動物種では、多能性を安定的に維持し、個体形成能を有する、マウスES細胞のような"真の"多能性幹細胞株の樹立は依然として困難である。本研究では、家畜を含む多様な哺乳動物で、"真の"多能性幹細胞を樹立するために、iPS細胞の樹立システムを利用してそれに必要な条件について検証した。レトロウイルスベクターを用いて、各種の哺乳動物の体細胞に多能性関連因子を導入し、ヒトiPS細胞に類似するiPS細胞株をブタ、イヌ、ウサギで樹立した。次に、エピジェネティック制御因子、分化抑制因子などをリプログラミングの過程で処理することにより、マウスES細胞様の形態を示すブタiPS細胞の作製に成功した。最後に、レトロウイルスベクターを用いた手法における問題点を解決し、外来転写因子の発現を人為的に制御、多能性細胞を効率的に選抜することを目的として、ドキシサイクリン誘導システムで発現制御を受ける多能性関連因子およびEOSレポーターシステムをpiggyBacトランスポゾンベクターに搭載した培養条件評価系を開発し、外来遺伝子の発現を人為的に抑制することにより、リプログラミングを制御する、簡便で、効率的なiPS細胞樹立系を開発した。この実験系を用いることで、今後、様々な動物種において"真の"多能性幹細胞を樹立するための新規の培養条件をスクリーニングできることが期待される。独自に構築した実験系を用い、一般的に広くiPS細胞株が樹立されているマウスやヒトに加え、ブタ・イヌ・ラットなどの大型動物種においてもiPS細胞を樹立することに成功した。これらの細胞株は、コロニー形態・増殖能・遺伝子発現・エピジェネティック修飾・FGFシグナリング経路に対する依存性・トリプシンによる単一細胞解離に起因する細胞死およびROCK阻害剤による細胞死の回避・胚様体形成を介した三胚葉由来組織への分化などの点で従来のヒト型ES・iPS細胞と類似していることが分かった一方、外来の多能性因子の発現抑制ができなかったり、テラトーマ形成できず十分な分化能を持たないなど、完全な多能性基底状態を有するiPS細胞ではないことも判明した。これらの問題点を解決するため、本研究では、樹立したiPS細胞株および樹立途中のiPS細胞に複数の増殖因子・化合物(LIF, bFGF, TSA, VPA, 5'-Aza)や化学的阻害剤(Mek/Erk阻害剤、GSK3阻害剤、Alk5阻害剤)を組み合わせて処理することによって、完全な多能性基底状態を有するiPS細胞を樹立することを試みた結果、ブタにおいて、多能性基底状態を有するマウスES細胞と類似した形態を示すiPS細胞が樹立できることを見出した。近年、マウス多能性幹細胞とヒト多能性幹細胞との違いに関する研究が世界中で興味を持って進められており、本研究で得られた成果はこれらの研究に対し、重要な示唆を与えるものであると考えられる。
腎糸球体の障害再生過程におけるＭ１・Ｍ２マクロファージの役割と再生促進因子の解明

腎障害時や腎炎罹患時のマクロファージの役割を明らかにするため、溶血性尿毒性症候群(HUS)マウスモデル、ヒトIgA腎症(IgAN)や紫斑病性腎炎(HSPN)患者の血清や腎組織を使用しM1M2マクロファージ活性との関連性を検索した。HUSのマウスモデルでは腎障害時の回復時期において、M2マクロファージ浸潤度が強く認められた。IgANでの腎内浸潤活性化マクロファージは、腎炎の活動性や腎組織硬化度の高い症例で高度であった。血清MRP8/14濃度が高いHSPN患児では腎組織障害度が高度であった。これらの結果からM2マクロファージは腎障害時の回復機序に強く関与し、硬化性病変との関連性が示唆された。[目的]私達は、慢性腎炎におけるマクロファージサブクラスの働きを解析するために、小児期発症慢性糸球体腎炎の代表的疾患であるIgA腎症における治療前後の臨床経過と腎生検組織を用いて、M1・M2マクロファージの浸潤度と臨床的パラメーター、腎組織硬化度と予後との関連性について検討した。[対象]2003年以降当科に入院加療した重症型IgA腎症50症例を対象とし、その治療反応性から治療反応群(1群)と治療不能群(2群)にわけ、その初回および再腎生検組織を用い活性化マクロファージであるMyeloid-related protein(MRP)陽性マクロファージマーカーとM2マクロファージマーカーであるCD204を免疫染色し、その染色度と臨床症状や検査成績、検尿所見と腎生検組織における急性変化、慢性変化、硬化性病変の指標であるαーSmooth muscle actin(SMA)の染色性に関し比較検討した。[結果]1)2群患児では1群患児と比較して、初回腎生検所見での糸球体内C3沈着度や再生検所見でのIgA沈着度が多く認められた。2)2群患児では1群患児と比較して再生検時の蛋白尿量や血清IgA濃度が高値であった。3)MRP陽性細胞やCD204陽性細胞の糸球体内や間質内浸潤が2群患児において多く認められた。4)糸球体内や間質内における活性化マクロファージやCD163陽性細胞の浸潤度は、慢性指数やαーSMA陽性細胞の浸潤度と正の相関性が認められた。[結語]補体活性や糸球体内IgA沈着度が腎炎の進展に強く関連し、特に間質内に浸潤した活性化マクロファージやM2マクロファージは、IgA腎症の活動性や腎組織の硬化性病変の進展と密接な関わりを有することが示唆された。[研究の目的・背景]腎障害からの再生過程とマクロファージとの関連性を明らかにするため、重度の腎障害モデルである(Hemolytic Uremic Syndrome:HUS)マウスモデルを使用した。特に、糸球体内皮細胞障害からの再生機序を明らかにするため、重症度の異なるHUS類似病変マウスを作製し、糸球体・尿細管障害とその回復過程における血管新生増殖因子(VEGF, Ang1)の発現度と組織内のマクロファージサブクラスの浸潤度およびその病態におよぼす役割に関して検討した。[研究の内容・方法]リポポリサッカライド(LPS)とShiga Toxin2を用いた軽症と重症のHUSマウスモデルの作製と腎障害からの再生過程における再生因子と腎組織内浸潤マクロファージサブクラスの役割に関する解析を行った。作製したHUSマウスモデルを、各々の腎組織的変化を光学顕微鏡や電子顕微鏡を用いて経時的に解析した。採取した血液検体を用いて、血清クレアチニン、アルブミン濃度に加え各種サイトカインやケモカイン濃度をELISA kitを用いて測定した。[研究の結果・成果]致死群マウスでは腎障害に対する回復機序はみられなかったが、軽症群マウスはメサンギオリーシスや内皮細胞障害後にメサンギウム細胞や内皮細胞の増殖が出現した。この時期にあわせて内皮細胞にVEGFとAngiopoietin1の発現が強くみられ、かつM2マクロファージの腎組織内浸潤が高度に認められ、血清中のMIP1alfa、MIP1beta、MIP2、MCP1、MIGなどのケモカイン高値であった。[結語]これらの結果よりVEGFとAngiopoietin1およびMIP1,2、MCP1、MIGなどのケモカインに加えM2マクロファージが糸球体内皮細胞障害からの回復機序に重要な役割を果たしていることが示唆された。[目的]

マクロファージは産生するサイトカインの種類により主に感染・免疫疾患に関与するM1マクロファージと組織修復に関連するM2マクロファージの2種類に分類されることが報告されている。しかしながら、実際の炎症性疾患、特に慢性腎炎をはじめとした腎疾患におけるM1、M2マクロファージの報告は少なく、ヒトの慢性糸球体腎炎におけるその役割は依然として不明のままである。私達は、小児期発症慢性糸球体腎炎の代表的疾患であるIgA腎症における治療前後の腎生検組織を用いて、M1・M2マクロファージの浸潤度と腎組織硬化度と予後との関連性について検討した。[対象]2003年以降当科に入院加療したした重症型IgA腎症50症例を対象とし、その治療反応性から治療反応群(1群)と治療不能群(2群)にわけ、その初回および再腎生検組織を用いM1マクロファージマーカーであるCD86とM2マクロファージマーカーであるCD163、CD204を免疫染色し、その染色度と臨床症状や検査成績、検尿所見と腎生検組織における急性変化、慢性変化、αーSmooth muscle actin(SMA)の染色性に関し比較検討した。[結果]1)2群患児では1群患児と比較して、CD163, CD204, CD86陽性細胞の糸球体内や間質内浸潤が多く認められた。2)糸球体内や間質内におけるCD204やCD163陽性細胞の浸潤度は、慢性指数やαーSMA陽性細胞の浸潤度と正の相関性が認められた。[結語]糸球体内に浸潤したCD204やCD163陽性細胞のM2マクロファージは、IgA腎症の活動性や腎組織の硬化性病変の進展と密接な関わりを有することが示唆された。ヒトの慢性糸球体腎炎における活性化マクロファージ(MRP8)、M2マクロファージ(CD204)の役割、特に疾患活動性や硬化性病変の進展への関与を明らかにすることができたので上記と判断した。ヒトの慢性糸球体腎炎におけるM1マクロファージ(CD86)、M2マクロファージ(CD163, CD204)の役割、特に疾患活動性や硬化性病変の進展への関与を明らかにすることができたので上記と判断した。Thy-1腎炎、硬化性腎炎モデルラットや溶血性尿毒症性症候群(HUS)モデルマウスを作成し、一過性メサンギウム増殖性腎炎、糸球体障害性腎炎や腎炎進行性硬化性腎炎における経時的腎障害とその後の回復・再生過程におけるマクロファージサブクラスの役割とそれらを誘導する各種サイトカインやケモカインについて検討する。さらに、IgA腎症以外の慢性腎炎に関しても、炎症進展におけるマクロファージサブクラスの関連性について評価する。1.作製したTh1腎炎と硬化性腎病変モデルおよびHUSモデルを、各々の腎組織変化を蛍光抗体法や光学顕微鏡や電子顕微鏡を用いることで経時的に解析する。2.特に蛍光抗体法では、マクロファージフェノタイプの浸潤の程度を検索し、これと組織学的急性変化や慢性変化および腎臓の硬化性病変の指標となるα-Smooth muscle actin、コラーゲンtype4、TNF-α、β-actinなどの染色性と比較する。4.と殺時に採取した血液や腎臓の単離糸球体を用い、血清クレアチニン、アルブミン濃度や各種炎症性サイトカインや炎症抑制性サイトカインおよびケモカイン,HGFやVEGFの出現と経時的なM1macrophages (CCR7+)、M2macrophages (CD168+)の比率についてFASCを使用して測定する。5.各種糸球体腎炎発症時から経時的に末梢血単球を採取し、MRP8、CD204をターゲットにしたFACS解析を行う。先天性免疫不全ラットからM1マクロファージ、M2
嫌気ベンゼン分解微生物の遺伝子解析による分解機構解明

本年度を通じて、ベンゼン分解集積培養系の維持と更なる集積を試みた。蓮田土壌等、嫌気環境における土壌にベンゼンを継続的に添加することで確立した集積培養系などに、継続してベンゼンを添加した。培養系の更なる大規模化に関しては、これまでの数十mL規模の培養系から、300mLの培養系を複数作成し、ベンゼン分解の維持を行うことに成功している。また、スポンジ担体に定着させたベンゼン分解微生物系についてはベンゼン分解活性を維持し続けることができなかった。その代わりに、改めて集積系の希釈植え継ぎにより、100倍希釈した培養系までベンゼン分解活性を維持できている。さらに、ベンゼン分解活性の向上を目指し、新たな培養条件の検討を行った。ベンゼン初発代謝経路の候補と考えられているUbiDカルボキシラーゼのコファクターとなるPrenolの添加や、マグネシウムやナトリウム塩の濃度を変更したもの、各種有機酸を添加したものについて検討を行った。その結果、培地成分としてwiddel培地を用いた植え継ぎにより、3-4 mg/L/dayと過去最速の分解速度が達成された。一方で、検討した添加物質いずれを用いても、この最速の分解速度をさらに向上させるものではなかった。これら分解が促進したものと分解が停滞したものについて、微生物群集構造の変化をアンプリコンシーケンス解析により比較したところ、分解促進した7条件すべてにおいてHasda-Aの存在割合が実験前の3-4%から15%程度と大幅に上昇しており、あらためてHasda-Aのベンゼン分解への強い関与が示された。上記実験において、ベンゼン分解が促進した培養系と集積培養系について、メタゲノム解析を行った。メタゲノム解析を行うために適したDNA抽出方法の検討を行ったのちに試料作成し、受託解析企業に送付して、年度末に生データを得ることができた。来年度にデータ解析を実施する。予定通り集積培養系を維持しつつ、更なる集積化を進めることに成功している。また、ベンゼン分解に明確な差を持つ培養系を作成し、比較メタゲノム解析を行うための試料の獲得にも成功した。メタゲノム解析のために必要な量と純度のDNAを回収するための抽出条件の検討に時間を要し、メタゲノム解析試料の送付までに時間を要したが、今年度中に解析データの生データを得るところまでは達成できた。メタゲノム解析については、これまでに我々が情報を得ている範囲での、ベンゼン分解に関与する遺伝子の探索などは我々でも十分可能であるものの、より広範な遺伝子の解析や、嫌気有機物代謝全体にかかわる解析については極めて専門的な知識を要する。このことから、嫌気性微生物群集の遺伝情報解析を専門としてきた産総研の延優研究員に研究協力を仰ぎ、遺伝子解析の方針をすでに昨年度から相談している。来年度早々、メタゲノムの生データを持参して解析に協力いただくことで、ベンゼン分解とその周囲にかかわる遺伝子を広く解析していく予定である。

このことから、嫌気性微生物群集の遺伝情報解析を専門としてきた産総研の延優研究員に研究協力を仰ぎ、遺伝子解析の方針をすでに昨年度から相談している。来年度早々、メタゲノムの生データを持参して解析に協力いただくことで、ベンゼン分解とその周囲にかかわる遺伝子を広く解析していく予定である。
成人T細胞白血病(ATL)における低酸素ストレス応答機構の解析

オートファジーはがんで異常を来し、がんの発達や進展に関与することが近年、明らかになりつつある。オートファジーはまた低酸素ストレス応答として活性化されること、またオートファジーの活性化は、NF-κB経路の活性化により促進されることが知られている。今回、成人T細胞白血病(ATL)におけるNF-κBの活性化機構として、NEMOの分解を促進するp47の発現低下がNF-κBの恒常的な活性化をもたらし、CADM1の転写活性化を誘導していることが明らかになった。ATL細胞においてオートファジーは活性化されており、p47発現低下はオートファジー・リソソーム経路に依存していることが示唆された。つまり、オートファジーとNF-κB経路は相互に活性化し、ATL細胞の増殖、生存を促進することが示唆された。これまでに、NDRG2はNF-κB経路を負に制御し、ATL細胞におけるNDRG2の発現回復はNF-κBの活性化を抑制することを報告した。また、NDRG2発現低下は、PI3K/AKT経路の活性化を介して低酸素環境下でのATL細胞の増殖抑制に抵抗性をもたらすことを明らかにしている。従ってNDRG2発現低下は、低酸素ストレスによる抵抗性を付与するともに、NF-κB活性化を介してオートファジー活性化を促進し、ストレス条件下での生存や増殖を促進している可能性が推測された。さらに、ATL細胞に対して、オートファジー阻害剤を投与したところ、オートファジーの抑制に伴い、ATL細胞のアポトーシスが誘導されることを見出した。このことから、オートファジー阻害薬は新規のATLの治療薬となる可能性が示唆され、更なるその詳細な解析が必要であると考えられる。N-myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2)は、成人T細胞白血病(ATL)で発現低下しており、PTENのC末端S380/T382/T383(STT)の恒常的リン酸化を介して、PI3K/AKT経路の活性化に寄与する。NDRG2は、PP2AをPTENにリクルートすることで、PTEN-STTの脱リン酸化を誘導し、PI3K/AKT経路を負に制御する。本研究では、NDRG2が種々の細胞ストレス時に誘導されることから、ストレス応答遺伝子としてATLの発がんに関与するのではないかという仮説を立て以下の解析を行った。ATL細胞において、NDRG2発現低下によるPI3K/AKT経路の負のフィードバック経路の破綻が、HIF-1の低酸素シグナル応答経路を不活化させていることを明らかにした。この低酸素応答の破綻は、ATL細胞に低酸素環境下における細胞増殖性を付与しており、ATLの発がん過程において何らかの役割を果たしている可能性が考えられた。次に、生体内におけるNDRG2による低酸素シグナルの制御の意義を明らかにするため、造血幹細胞(HSC)の機能におけるNDRG2発現の関与性を調べた。正常骨髄のHSCにおいてNDRG2の発現は上昇しており、NDRG2欠損マウスではKSL分画のHSC数が顕著に低下しており、特にc-kit陽性の細胞集団が減少していた。そこで、NDRG2-/-HSCの分化能について検討したところ、骨髄系前駆細胞、赤芽球系前駆細胞等においてコロニー形成が損なわれていたことから、NDRG2欠損は、HSCの維持や機能に影響を与えることが明らかになった。今後は、このHSCにおけるNDRG2の役割について、in vivoモデルや、白血病モデルにより解析を進め、HSCにおけるPI3K/AKT経路の制御とNDRG2発現との関連を明らかにする。ATL細胞において、低酸素環境下におけるNDRG2の発現低下及びPI3K/AKTシグナル経路の活性化を介した細胞増殖の制御を種々の方法及びATL細胞株にて確実に立証することができたことは、次に解析を予定している抗癌剤抵抗性等との関与を明らかにする上で、重要なことと考えている。また、本研究の主なテーマの一つでもある造血幹細胞におけるNDRG2の機能については、ノックアウトマウスを用いた解析から、今後の進展が期待できるNDRG2の関与性を見出すことができたことは、本研究を進める上で重要である。また、造血幹細胞の機能はNDRG2欠損マウスにおいて低下している一方で、末梢血の赤血球の数はNDRG2 KOと野生型と同程度であり、これはこの欠損マウスは明らかな造血系の異常を伴うことなく生育することと一致している。正常および白血病幹細胞において、種々のストレスに対する適応能も重要であることが明らかになってきており、今後、これらの点について検証していく必要がある。以上のことから、本年度は、概ねの成果が得られたものと考えている。我々はN-myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2)を成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)のがん抑制遺伝子候補として同定、ATLやその他の癌におけるNDRG2の発現低下がPTENのリン酸化を促進・不活化し、AKTの恒常的な活性化を来していることを同定した。NDRG2はPP2Aに結合、PTENへのリクルートメントを介し、PTEN- S380/T382/T383 (STT)の脱リン酸化を促進する。一方、NDRG2はPI3Kのフィードバックとして血清/糖質コルチコイド調節キナーゼ-1 (SGK1)によりS332残基のリン酸化修飾を受け、このS332リン酸化はNDRG2とPP2Aとの結合を促進する。

SGK1はNDRG2リン酸化制御を介し、癌細胞の低酸素応答に重要な役割を持つ可能性がある為、今回、ATLにおけるSGK1依存的なNDRG2リン酸化制御を詳細に解析した。ATLにおけるSGKファミリー(SGK1, SGK2, SGK3)の発現を解析した所、ATL細胞株及びATL患者由来白血病細胞において、SGK1が安定に発現することを同定した。SGK1はATL細胞株の多くでそのリン酸化が亢進、活性化されるが、SGK1阻害剤の投与は、多くのATL細胞株の増殖を抑制した。NDRG2とSGK1の結合を免疫共沈降実験により調べた所、ATL細胞株に導入したNDRG2はSGK1と結合した。さらにNDRG2とSGK1は細胞質で一部共局在したことから、SGK1は直接NDRG2のリン酸化を制御することが示唆された。ATL細胞は、低酸素刺激により低酸素誘導性因子(HIF-1α)を発現誘導するが、NDRG2の転写誘導は起こらず、AKT及びSGK1の活性も高い。一方、正常由来293T細胞では、低酸素によりHIF-1αが誘導され、NDRG2の発現上昇及びAKT、SGK1のリン酸化が減少する。SGK1はストレス応答で活性化されることが知られており、ATL細胞の細胞ストレスへの適応・抵抗性にNDRG2発現低下並びにSGK1活性化が関与している可能性が推測される。低酸素ストレスは癌の発達や進展に関わる。HIF-1αは低酸素シグナルのイニシエーターとして働き、低酸素環境に応答し様々な遺伝子の転写を活性化する。NDRG2のプロモーターには、HIF-1αの結合配列が存在し、低酸素に応答しNDRG2発現は活性化される。今回の研究から、SGK1はNDRG2の機能に重要な役割を持つことが証明された。SGK1はSGKファミリーに属し、その他には、SGK2とSGK3が存在する。ATL細胞では、SGK1が安定に発現していることがわかり、さらに、SGK1の恒常的なリン酸化及びSGK1阻害剤による増殖抑制効果を示し、SGK1はATLの新規の分子標的となる可能性を見出した。SGK1もまたストレス応答関連分子として知られ、低酸素でそのリン酸化は減少する。以上より、NDRG2発現低下とSGK1のリン酸化亢進は、ATL細胞の低酸素抵抗性に関わることが示唆され、現在、白血病発症マウスモデルにおいてSGK1とNDRG2の機能を解析中である。オートファジーはがんで異常を来し、がんの発達や進展に関与することが近年、明らかになりつつある。オートファジーはまた低酸素ストレス応答として活性化されること、またオートファジーの活性化は、NF-κB経路の活性化により促進されることが知られている。今回、成人T細胞白血病(ATL)におけるNF-κBの活性化機構として、NEMOの分解を促進するp47の発現低下がNF-κBの恒常的な活性化をもたらし、CADM1の転写活性化を誘導していることが明らかになった。ATL細胞においてオートファジーは活性化されており、p47発現低下はオートファジー・リソソーム経路に依存していることが示唆された。つまり、オートファジーとNF-κB経路は相互に活性化し、ATL細胞の増殖、生存を促進することが示唆された。これまでに、NDRG2はNF-κB経路を負に制御し、ATL細胞におけるNDRG2の発現回復はNF-κBの活性化を抑制することを報告した。
高性能レーザー多光子イオン化センサー

レーザー多光子イオン化法を一層高感度とし,また各方面へ応用した.1.ミクロセルの試作Free falling Jetセルの改良と液滴セルの試作を行い,それらの適用限界を検討した.前者はより高感度だが液流量が多く,後者は微量化に向く.2.液相での高感度分析二光子イオン化スペクトル(光イオン化電流のレーザー波長依存性)により高感度分析のための最適波長と信号雑音比を求める方式を確立した.これより検出限界をペリレンで50ppt(383nm),ナフタセンで20ppt(407nm)と定めた.イオン化効率と過剰エネルギーの関係を解析した.3.高速液体クロマトグラフ検出器への応用レーザーの絞りやすさを生かし,通常型高速液体クロマトグラフのほか,セミミクロ・ミクロカラムの高速液体クロマトグラフ検出器への応用を試みた.前者は液流量が多いのでFalling Jetセルと,後者は少ないので液滴セルと組合せた.三次元クロマトグラフより測定の最適波長を定めた.ピレンについて得られた検出限界は,通常型で0.5pg,セミミクロで8.4pg,ミクロで1.6pgであって,市販UV検出器より良好であった.4.表面吸着試料の高感度分析金属板に試料溶液を塗付風乾し,レーザーを照射し流れる電流を測定した.金属表面にイオンが生成すると仕事関数が低下し放出電子量が増大する.検量線は4桁以上で直線で,ピレンの検出限界は10^<-12>mol/cm^2であった.5.気相での高感度分析大気圧窒素気流中の芳香族分子や二酸化窒素の検出を試みた.芳香族分子で,ppbレベルの検出感度を得た.常温で固体の分子については熱気化法により検出した.レーザー多光子イオン化法を一層高感度とし,また各方面へ応用した.1.ミクロセルの試作Free falling Jetセルの改良と液滴セルの試作を行い,それらの適用限界を検討した.前者はより高感度だが液流量が多く,後者は微量化に向く.2.液相での高感度分析二光子イオン化スペクトル(光イオン化電流のレーザー波長依存性)により高感度分析のための最適波長と信号雑音比を求める方式を確立した.これより検出限界をペリレンで50ppt(383nm),ナフタセンで20ppt(407nm)と定めた.イオン化効率と過剰エネルギーの関係を解析した.3.高速液体クロマトグラフ検出器への応用レーザーの絞りやすさを生かし,通常型高速液体クロマトグラフのほか,セミミクロ・ミクロカラムの高速液体クロマトグラフ検出器への応用を試みた.前者は液流量が多いのでFalling Jetセルと,後者は少ないので液滴セルと組合せた.三次元クロマトグラフより測定の最適波長を定めた.ピレンについて得られた検出限界は,通常型で0.5pg,セミミクロで8.4pg,ミクロで1.6pgであって,市販UV検出器より良好であった.4.表面吸着試料の高感度分析金属板に試料溶液を塗付風乾し,レーザーを照射し流れる電流を測定した.金属表面にイオンが生成すると仕事関数が低下し放出電子量が増大する.検量線は4桁以上で直線で,ピレンの検出限界は10^<-12>mol/cm^2であった.5.気相での高感度分析大気圧窒素気流中の芳香族分子や二酸化窒素の検出を試みた.芳香族分子で,ppbレベルの検出感度を得た.常温で固体の分子については熱気化法により検出した.
概日リズムの変化がアレルギー疾患の発症と難治化におよぼす影響の分子機構の解明

本研究は、明暗サイクルの撹乱による「概日リズムの乱れ」がアトピー性皮膚炎を始めとするアレルギー疾患の発症と難治化におよぼす影響とその分子機構を究明するとともに、アレルギー疾患の新たな発症予防法や治療法の開発に貢献することが目的である。マウスを用いた検討により、仔マウスの概日リズムの変調は新生児免疫寛容を抑制すること、時計遺伝子改変マウスでも同様の現象がみられること、妊娠母マウスの概日リズムの変調は出生後の仔マウスの新生児免疫寛容を抑制することに加え、マウスの概日リズムの変調はハプテンによる接触過敏反応を抑制することが明らかになった。本研究は、明暗サイクルの攪乱による「概日リズムの乱れ」がアトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の発症と難治化におよぼす影響とその分子機構を究明するとともに、アレルギー疾患の新たな発症予防法や治療法の開発に貢献することが目的である。マウスを用いた検討により、明暗サイクルを乱したマウスでは接触過敏反応が増強することや、生後に生理的な明暗環境を乱した仔マウスでは、ハプテンに対する新生児免疫寛容が誘導されず炎症反応が増強すること、明暗サイクルを撹乱した妊娠母マウスから出生した仔マウスでも同様の現象がみられることなど、発生段階も含めた概日リズムの乱れがアレルゲンに対する感作や過敏反応の制御機構に影響をおよぼすことを示唆する知見を得た。この観察結果を発展させ、概日リズムの乱れがアレルギー反応や経皮感作、アレルゲンに対する耐性の獲得、表皮バリア機能、&#25620;き行動などにおよぼす影響を広くしかも詳細に解析することにより、アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の発症や難治化の機構の解明や治療、予防法の開発に貢献したい。概日リズムの乱れが接触過敏反応やアトピー性皮膚炎モデルマウスでのアレルギー炎症におよぼす影響の検討は、順調に進行しており、国際学術雑誌への投稿が可能な程度にデータが蓄積している。結果を要約すると、マウスを用いた検討により、明暗サイクルを乱したマウスでは接触過敏反応が増強することや、生後に生理的な明暗環境を乱した仔マウスでは、ハプテンに対する新生児免疫寛容が誘導されず炎症反応が増強すること、明暗サイクルを撹乱した妊娠母マウスから出生した仔マウスでも同様の現象がみられることなど、発生段階も含めた概日リズムの乱れがアレルゲンに対する感作や過敏反応の制御機構に影響をおよぼすことを示唆する知見が得られた。また、その現象に関する詳細な機序の検討も進展している。さらに、概日リズムの乱れがアレルゲンに対する耐性の獲得におよぼす影響の検討に関する研究や慢性時差モデルにおける同様の検討も順調に進展しており、今後の発展が期待できる。マウスを用いた検討により、仔マウスの概日リズムの変調は新生児免疫寛容を抑制すること、妊娠母マウスの概日リズムの変調は出生後の仔マウスの新生児免疫寛容を抑制することに加え、マウスの概日リズムの変調はハプテンによる接触過敏反応を抑制することが明らかになった。この研究結果をさらに発展させ、概日リズムの変調がアレルギー反応や経皮感作、アレルゲンに対する耐性の獲得、表皮バリア機能等におよぼす影響を広く詳細に解析し、アトピー性皮膚炎を始めとするアレルギー疾患の発症や難治化におよぼす概日リズムの影響を解明したい。概日リズムの変調が新生児免疫寛容におよぼす影響に関する研究成果は、国際学術誌に掲載された(Mizutani H, et al. J Dermatol Sci 86; 63-70, 2017.)。また、明暗サイクルの撹乱したマウスではハプテンに対する接触過敏反応が増強することを見いだし、国際学術誌に投稿した。現在、アレルゲンに対する耐性獲得の機序についてさらに詳細に検討をしている。生体は時計遺伝子が司る体内時計によって、概日リズムとよばれる約24時間周期の生命活動を営んでいるが、概日リズムの乱れが免疫反応やアレルギー反応におよぼす影響には不明な点が多い。そこで、本研究では、明暗サイクルの攪乱による「概日リズムの乱れ」がアトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の発症と難治化におよぼす影響とその分子機構を究明するとともに、アレルギー疾患の新たな発症予防法や治療法の開発に貢献することを目的とした。本研究計画では、概日リズムの乱れが接触過敏反応やアトピー性皮膚炎モデルマウスのアレルギー炎症におよぼす影響の検討、新生児免疫寛容におよぼす影響を、明るい環境と暗い環境が12時間ごとに変わる生理的環境(LD12:12)で飼育するマウスと、常に明るい環境(恒常明条件;LL)で4週間飼育するマウスを用いて比較検討した。仔マウスまたは母マウスにハプテンによる接触過敏反応やハプテン繰り返し塗布によるアトピー性皮膚炎モデル反応を惹起し、炎症の程度の病理組織学的な検討、皮膚炎局所に浸潤するT細胞のプロファイル、免疫担当細胞のサイトカイン産生能のフローサイトメトリーやELISAによる解析などを行った。