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日本中世芸能「能」の音楽研究-能管の音楽伝承とその変容-

本年度は、能管の音楽伝承の研究をさらにすすめた。具体的な作業としては、明治時代以降から現在までに記された一噌流の伝書の収集・解読・分析、および現行伝承の音源資料調査・分析、能管奏者(実演家)へのインタビュー、などを行い、能管の音楽伝承の歴史的な変容を、唱歌と音楽実体の連関性という新しい視点から追究した。その成果は、東洋音楽学会東日本支部第39回定例研究会のラウンドテーブル「唱歌研究の射程」にて発表し、実証的な新見解として大きく評価された。また、学校教育における日本の伝統的な音楽の教材化研究についても新たに研究を着手し、その成果は、「歌唱指導における方法論的課題-日本の伝統的な歌唱の指導方法を考える-」(東京学芸大学重点研究費研究報告書『音楽の入り口を探そう-リズム・学習法・声-』所収、東京学芸大学加藤富美子研究室編)として発表した。本年度は、おもに、唱歌付資料の所蔵調査、音源資料の所蔵調査、そして能楽師への聞き取り調査を中心に進めた。まず所蔵調査は、主として首都圏の各所蔵機関(早稲田大学演劇博物館、法政大学能楽研究所・国立国会図書館、国立能楽堂、武蔵野大学能楽資料センターなど)で行った。こうした公的機関に加えて、能楽師個人が所蔵する貴重資料についても調査を行った。詳細な分析が必要と判断された資料については、購入したデジタルカメラを用いて、電子複写をおこなった。音源資料については、音を五線譜に採譜して、目に見える形に書き起こす作業を進めた。個人蔵の音源資料については複写の許可を得ることができたので、CD、VHSあるいはDVDに複写した。能楽師への聞き取り調査は、京都にて4回、金沢にて1回、の計5回行った。京都では二人の能楽師の稽古場を訪れ、稽古風景を観察しながら、伝承の方法やあり方、問題点、などについて、インタビューを行った。金沢では、国認定の能管製作者の製作現場を訪れ、いまや伝承が途絶えてしまう可能性を孕んでいる能管製作の、制作方法や原材料、技術的な難易点・問題点、製作の伝承問題、などについてご教示をいただいた。このほか、研究成果を広く一般に発信することを意図して、能楽の楽器を二種類(大鼓・小鼓)購入した。これらの楽器を用いて研究発表を行うことによっては、発表により具体性や現実性が付加されたものと考えている。本年度は、能管の音楽伝承のうち、主として現行伝承に着目して研究を進めた。現行伝承の特色として、技法に流儀としての規範が確固として確立しているにも関わらず、その内部では演奏者が個をより主張することに重きを置いているという実態が指摘できる。実際の演奏に、いわばヴァリエーションともいえるような違いが生じているのであり、これは、流儀の規範が構築されている現状に一見矛盾しているようにも見受けられるのである。こうした現行の演奏および伝承実態を解明するために、主として、東京・大阪・京都で行われた舞台を可能な限り観劇して、実演のフィールドワークを行って分析した。フィールドワークで補いきれない点に関しては、補助資料として、すでに販売されている映像資料や音源資料を購入して使用したり、必要に応じて能楽師にインタビューを行ったりもした。その結果、同一流儀であっても、例えば関東と関西といった地域によって技法の細部が異なっており地域差としての特徴が存在すること、あるいは同一流儀の中でも、演奏者の属する「家(系統)」さらには演奏者個人によっても、個性とも呼べるような技法が工夫されて編み出されていること、そして、こうした工夫を施すことができるのは、技法の流儀の領域に相当する部分ではなく、そこから外れたかなり細部の箇所に限られていることなどを、具体的な音レベルから解明した。調査を進める中で、詳細な音響分析が必要であると判断されたので、SDレコーダー等を購入したまた、必要とされた映像資料・音源資料についても、CD/DVD/VHS等に複写する作業も同時に行った。
格子スピン系の非平衡緩和現象の数値的研究

本研究代表者らによるこれまでの研究の結果、非平衡緩和現象の解析は平衡統計力学的な大自由度系の動的振舞いを研究する手法として注目すべきものであることが明かとなっていた。この方法は、強磁性イジングモデルに対して非常に有効であった。本研究ではこの方法の、様々な格子スピン系の動的振舞いへの応用を試みた。その結果得られた主な結果は下記の2つである。・2次元ポッツモデルによる動的臨界現象の普遍性について:非平衡臨界緩和の解析により、3状態および4状態2次元ポッツモデルのグラウバ-型ダイナミクスの動的臨界指数zを評価した。その結果は、研究代表者によって得られていた2状態(イジング)モデルについての結果と併せて、以下のようになった:この結果から、動的臨界現象のいわゆる弱普遍性(weak universality)は成立していないことが推定される。・3次元±Jイジングスピングラスモデルの非平衡緩和について:このモデルについては、2つのレプリカの重なりの非平衡緩和を調べた。しかし、羃関数型の非平衡臨界緩和は明らかとはならなかった。これはスピングラスモデルの動的な振舞いの特徴として新しい知見と言えよう。その原因として、(1)緩和の指数が小さく今回の試行では捉えられなかった、あるいは(2)複雑な緩和モードが重複しており最も長い羃関数の振舞いが隠れてしまった、の2つが考えられる。現在も注意深い解析を続けている。この2つの結果については現在、投稿論文、国際会議での発表を準備している。他に剛体球系ほかの粒子系の非平衡緩和の様子についても観察した。
胸腺Tーcellの分化・成熱に及ぼす性ホルモンの効果

我々はこれまでに、ラット胸腺の細網上皮細胞(RE細胞)に性ホルモンレセプタ-(SR)が存在し、同じRE細胞に胸腺ホルモンが局存することを確認済みである。そこで本研究では性ホルモン(SH)が胸腺細胞(T細胞)の分化・成熟に及ぼす効果を、マウスT細胞表面抗原に対する抗体(Lyt_2とL_3T_4)を用いて解析し、同時に胸腺ホルモンの一つとしての血清胸腺因子(FTS)投与後のT細胞分化・成熟の動態についても検べてみた。動物はC57BL/6系雌マウスを去勢対照群とエストラジオ-ルベンゾエ-ト(E_2B)投与群に分け、それぞれの胸腺を採集して、1.スキャチャ-ドプロット法によるSRの定性・定量、2.抗FTS抗体による免疫組織化学染色、3.細胞自動解析(FACscan)によるT細胞サブセット解析をそれぞれ行なった。その結果、1.マウス胸腺には、ラット同様にエストロゲン(E)とプロゲスチン(P)に対するレセプタ-が存在し、そのうちERは特にRE細胞に局在する、2.胸腺ホルモンの一つであるFTSはERと同じRE細胞に局在する、3.EおよびFTSは、胸腺重量の増減に大きく影響し、その内訳は主にT細胞(とりわけヘルパ-T細胞数)の増減に関与することがわかった。以上のことから、SH,とりわけEは胸腺RE細胞内ERを通じて、胸腺ホルモン(FTS)の産生・放出を調節し、さらにFTSはT細胞の分化・成熱に深く関与していると結論された。妊娠中や性ホルモン(SH)投与により胸腺が退縮することはよく知られており、SHが胸腺機能に作用しているのは明らかである。そこで、マウス胸腺T細胞の分化にSHがどう影響しているか、胸腺ホルモン(FTS)を仲介にして検討した。方法と結果:動物は7週令雌マウスを用い、卵巣摘出ののち、エストロゲン(E)またはFTSを投与して、胸腺を採集した。(1)まず胸腺組織中のSHレセプタ-をスキャチャ-ドプロット分析で調べてみると、ラット同様にEおよびプロゲステロン(P)に対するレセプタ-の存在が明らかになった。(2)免疫組織化学的に、EおよびPレセプタ-とFTSを染めてみると、胸腺上皮にE,Pレセプタ-とFTSが同時に局在するのがわかった。(3)EおよびFTSの胸腺T細胞分化への関与をFACScanで分析してみると、E投与で未熟な二重染色される細胞が減少し、ヘルパ-T細胞が増加すること、一方FTS投与によりヘルパ-T細胞が有意に増加することがわかった。結論:以上のことから、(1)マウス胸腺には、ラット同様にSHに対するレセプタ-が存在し、そのうちEレセプタ-はFTSとともに胸腺上皮に局在する。(2)EおよびFTSはT細胞の分化に関与し、そのうちでも特にヘルパ-T細胞の分化に大きく影響する。(3)これらは、SH、特にEが胸腺上皮内のレセプタ-を介して胸腺ホルモンの産生・放出を調節し、ひいてはT細胞の分化・増殖に深く関わっていることを示唆するものである。我々はこれまでに、ラット胸腺の細網上皮細胞(RE細胞)に性ホルモンレセプタ-(SR)が存在し、同じRE細胞に胸腺ホルモンが局在することを確認済みである。動物はC57BL/6系雌マウスを去勢対照群とエストラジオ-ルベンゾエ-ト(E_2B)投与群に分け、それぞれの胸腺を採集して、1.スキャチャ-ドプロット法によるSRの定性・定量、2.抗FTS抗体による免疫組織

化学染色、3.細胞自動解析(FACscan)によるT細胞サブセット解析をそれぞれ行なった。その結果、1.マウス胸腺には、ラット同様にエストロゲン(E)とプロゲスチン(P)に対するレセプタ-が存在し、そのうちERは特にRE細胞に局在する、2.胸腺ホルモンの一つであるFTSはERと同じRE細胞に局在する、3.EおよびFTSは、胸腺重量の増減に大きく影響し、その内訳は主にT細胞(とりわけヘルパ-T細胞数)の増減に関与することがわかった。以上のことから、SH、とりわけEは胸腺RE細胞内ERを通じて、胸腺ホルモン(FTS)の産生・放出を調節し、さらにFTSはT細胞の分化・成熟に深く関与していると結論された。
遊泳魚の誘導を取り入れた多管型ヘルムホルツ共鳴器による体積計測

本研究では多管型水中ヘルムホルツ共鳴器を利用し,魚の体積を計測することにより,そのサイズに合わせた給餌を可能とする精密養魚を目標としている。そのためには,魚を共鳴器に誘導する技術も必要となることから,音刺激による誘導を試みた。その結果,音刺激と給餌の関係を学習して浮上させ,パイプを通過させることが可能であった。さらに多管型共鳴器による共鳴にも成功し,共鳴器の材質による違いも明らかにしたことより,将来的に水中で生簀の間に共鳴機能を有するパイプを設けて魚を仕分ける可能性を示せた。しかし,多管型共鳴器のネックの寸法,数と音圧レベルの関係を明らかにして,実用化のためのデータ提供には課題が残った。養殖業において,養殖魚の寸法や成長に影響を与える給餌状況などのデータを取得,利用することで高品質・高収量を目指す「精密養魚」の需要が高まっている。養殖魚の寸法の計測として,ヘルムホルツ共鳴を用いた水中体積測定やステレオカメラを用いた体長測定の研究が行われているが,養殖魚を測定場所へ誘導することが問題となる。本研究では誘導方法として魚の学習能力を用いることを考え,先行研究においてすでに行われているウグイ(Tribolodon hakonensis)が音刺激と給餌の関係を学習することによる給餌場への浮上の条件付けを行った.この条件付けを行ったウグイ(学習個体)と行わなかったウグイ(未学習個体)に対して,ヘルムホルツ共鳴装置への導入部を想定したパイプを通過させる条件付けを行うことが可能であるかどうか検証した。一方,多管型ヘルムホルツ共鳴器を作成し,その理論式を導出しているところで,それに基づいて寸法の違いによる共鳴のレベルを考察中である。現在までに落とし劇を用いた魚の浮上条件付け実験を行っており,適切に刺激を与えれば,学習することがわかった。一方,魚の体積計測に関しては,ウォーターリード(水流)法により共鳴可能な多管型ヘルムホルツ共鳴器を作成し,その計測精度を調べている。水中における多管型共鳴器の理論的な考察も進みつつあり,大型の共鳴器の作成を行おうとしているところであるため。ただ,群れをなす魚はそれぞれ役割分担をし,共鳴器の配置の方法によっては時間をかければ,少ない数の魚を誘導することも可能という知見を得た。また,小型の魚はこのような体積計測を必要としないことより,方針を大型の魚種に絞ることとして,今までよりも大きな多管型共鳴器の製作を行っている。その製作に時間を要している状況である。本研究では,水中ヘルムホルツ共鳴を利用し,大きさの異なる魚体を用いて周波数計測を行い,体積弾性率の違いを評価した.また,生魚を鰾とそれ以外の部位に分け,それぞれの体積弾性率について同様に評価した。実験にはウグイを用い,ウオーターリード法で共鳴させ,生魚,魚体および鰾に分けて体積弾性率を計測したところ,生魚,鰾の体積弾性率は成長に伴い増加したが,魚体については成長に伴う相関は見られず,体積弾性率が他と比べて非常に水に近いことがわかった.体内空気比率については,成長と共に高くなった.このことから,魚の成長に伴う体積弾性率の上昇の原因は,体積の増加よりも高い割合で鰾内の空気が増加し,鰾内の圧力が高くなったためであると考えられた.また,共鳴器として1つのネックならびに2つのネックを有するものを作成し,共鳴現象を確認したところ,2つのネックでは音圧レベルが小さいながらも共鳴させることに成功した。それらを用いて,ガラス球,空気,そして魚(メダカ,ウグイ,およびイワナ)を対象としてヘルムホルツ共鳴で体積計測を行うことが可能であった。その際にも魚には損傷が与えられていないことを確認した。考察として,複数のネックを有する共鳴器によってネックの寸法,数と音圧レベルとの関係を明らかにすること,また,ウォーターリード法でなく,水中スピーカーを用いて周波数を変化させることにより,共鳴周波数を得る方法を開発することが実用化への近道と考えられた。本年,共鳴器の大型化が可能になると,本研究も大きく前進することになる。最終的にはマグロ,ブリ等の大型魚の体積計測を行うことを目標としており,大型の共鳴器が理論的に動作するかが本年のポイントになる。現在もその点に絞って研究を推進しているが,なるべく早く共鳴する大型の共鳴器の製作を行い,その共鳴音を拾い上げるシステムを構築ことに集中する予定である。生物センシング工学小型の魚の体積計測は実用的に利用困難であることより,大型の共鳴器の製作に方針変換し,そのテストのための共鳴器に関する支出が平成28年度になったため。

本年度に種々のタイプの大型共鳴器に関する支出を行うこと,また昨年購入を踏みとどまったセンサ類の購入を行い,実験を遂行していく予定である。
キイロショウジョウバエの光同調に関する脳時計神経ネットワークの解明

キイロショウジョウバエの概日時計機構は複数の光入力系を持ち、その中でもCRYタンパク質を介する光入力は最も重要な光同調経路である。本研究ではハエが時差ボケから回復するまでの日数を解析し、CRYタンパク質がどの神経細胞で働いているのかを調べた。我々は脳内の時計細胞の一群である背側に位置するLN細胞でCRYが発現することで、時差ボケの回復が早まることを見出した。このことより、ショウジョウバエには時差ボケから早く回復するための神経機構があることが明らかになった。Cryptochrome(CRY)はショウジョウバエの脳内時計細胞で発現している光受容に関わるタンパク質である.平成23年度はまずCRYを特定の時計細胞にのみ発現させるためのトランスジェニック系統の作製を行った.Cryの発現にはGAL4-UASシステムを用い,時計細胞特異的に発現するGAL4系統にはtim-GAL4,cry-GAL4,Mai179-GAL4,Pdf-GAL4,npf-GAL4,trpA1-GAL4,R6-GAL4,c929-GAL4を用いた.これらのGAL4をCryのノックアウト系統のcry^<01>に,交配実験により組み入れた.またCryを発現させるためのUSA-cryも同様にcry^<01>系統に組み入れた.Clk4.1M-GAL4は第三染色体上にあり,cry^<01>と同じ染色体に存在することから,染色体組換え実験を現在行っている最中である.これらのトランスジェニック系統の概日時計における光同調能を解析するために,LEDを用いた光照射装置を開発した.これにより様々な光波長を用いた研究が可能となった.このLED照射装置により光条件を制御し,Trikinetics社のDrosophila activity monitor(DAM)を用いて上記のトランスジェニック系統の歩行活動リズムの計測を開始した.10 lux程度の光照度の下では,cry^<01>の光同調には7日程度必要であることが分かった.tim-GAL4やcry-GAL4を用いて,Cryを本来発現している時計細胞にCryをレスキューすると光同調能はほぼ野生型まで回復した.一方,時計細胞の一部だけにしかCryをレスキューしないと光同調の改善はほとんど見られなかった.このことからショウジョウバエ概日時計の光同調にはCryが本来発現している細胞で発現する必要があることが示唆された.しかし,現在のところ10 luxにおける光条件下でのみ実験を行っていることから,今後はもう少し光照度を上げた場合の実験データが必要とされる.キイロショウジョウバエ概日時計の光同調には青色光受容分子Cryptochrome(CRY)が大きく関与している.CRYはハエ脳内の時計細胞の一部で発現しており,時計タンパク質TIMELESSと相互作用して,概日時計の光リセットを行う.本研究では,脳内時計細胞群のどの細胞でCRYが発現することが光同調において重要であるかを明らかにするために,時計細胞の一群にのみCRYをレスキューした系統を作製し,行動実験によってCRY依存的な光入力に重要な時計細胞を同定することを試みた.平成23年度より,実験に使用する系統の作製が終わり,平成24年度では本格的に行動実験を行った.光源には白色LEDを用いて,100 luxの光照度における光サイクルの8時間の位相シフトを行い,ハエに8時間の時差ボケを引き起こした.その後,新しい光サイクルに同調するために必要な期間を観察し,それぞれの系統の光同調能を解析した.その結果,時計細胞群の中でもLNdと5th s-LNvと呼ばれる細胞群にCRYがレスキューされると,光同調のスピードが速まることが分かった.つまりLNdと5th s-LNvはCRY依存的な光同調に重要な役割を担っている細胞であることを示唆している.ショウジョウバエの概日時計は複眼からの光入力も重要であることから,上記の実験を眼の持たない突然変異体を用いて行った.CRY突然変異体と眼がない変異体の二重変異体は光に同調ができない.しかし,s-LNvとl-LNvにCRYが発現すると眼がなくても光同調が行えることが分かった.一方,LNdや5th s-LNv時計細胞群にCRYを発現させても光同調性は回復しなかった.このことは,LNdや5th s-LNvは眼からの光入力と相互作用して,概日時計の光同調を促進させていることを示している.研究計画に予定していたトランスジェニック系統の作製はほぼ終了し,LEDを用いた光照射装置も完成している.歩行活動リズム計測のための装置も設置が完了し,現在活動リズムの計測を行っている.すべて予定通りに研究が進んでいる.24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の研究計画には変更がない.今後も研究計画通りに,平成23年度から継続する活動リズムの計測,また神経ペプチドPDFの光同調機構への関与,さらに時計タンパク質TIMLESSの光同調などを推進していく予定である.
DNAセンシングシステムの開発

本研究ではまず蛍光偏光解消を応用したDNAの検知システムについて検討した。蛍光色素として、テトラメナルロ-ダミン、フルオレッセイン、およびエオシンンのそれぞれイソチオシアネ-ト誘導体(TRITC、FITC、EITC)を用いたDNAへの標識は、まずプロ-ブとなる一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端に、(NH_2ーdATP)あるいは、NH_2ーdVTPを重合させた。これを精製した後、先の蛍光色素を反応させることにより標識を行った。まずオリゴアデノシン(n=12ー18)を基質としてaminoーATPを重合させ、さらにFITCで標識した場合のTdTの反応時間に対する蛍光強度変化を調べたところ、反応時間の増加につれてaminoーATPの重合度が増し、標識された蛍光強度が増加した。次にこの標識したDNAをプロ-ブとして、相補鎖をもつポリチミジン(n=ca、240)との二本鎖形成後、偏光異方性の変化を調べた。その結果、各プロ-プともポリナミジンの添加により大きな偏光度が得られた。これは短い一本鎖プロ-ブDNAに標識された蛍光色素がサンプルDNAと相補的な二本鎖を形成し、これによって生じた回転ブラウン運動の緩和によるものと考えられた。次にハイブリダイゼ-ションの過程でどのように偏光度が変化していくかを調べた。その結果、偏光解消は時間とともに増加していき、しだい定常値に達することがわかった。いま、タ-ゲットとなるDNAとして、PBR322プラスミドDNAを540bp断片中の3個あるいは6個のシトシンをナミンに変化させた試料を用いて、これにプロ-ブDNAを作用させ、ハイブリダイゼ-ションの時間経過を調べた。その結果、ミスマッチの塩基数が増加することにつれ、蛍光解消度の増加率が小さいことが明かになった。
慢性重症アレルギー性結膜炎におけるIL-25とiILC2の機能解析

IL-25、IL-33、TSLPと2型自然リンパ球(ILC2)がアレルギー性炎症の成立に重要であることが広く認知されてきた。一方、IL-25がILCを刺激するとIL-17産生を伴うiILC2を誘導すること、IL-25が組織リモデリングを伴う慢性重症アレルギー性炎症の成立に必須であることが報告されており、IL-25ならびにiILC2が慢性重症アレルギー性角結膜炎の成立に重要であるとの仮説を立てた。本研究ではIL-25/ILC2シグナルを増強することで、マウス慢性重症アレルギー性角結膜炎モデルの樹立し、IL-25/ILC2シグナルが慢性重症アレルギー性角結膜炎の発症に果たす役割を明らかにする。
電子線超音波顕微鏡を用いた弾性表面波非破壊評価の研究

近年電子デバイスの飛躍的な発展に伴い、その素材となる電子材料の評価法に強い関心が向けられている。種々の評価法のうち、電子線を試料表面に断続的に照射し、熱弾性効果によって生ずる弾性波を検出して非破壊的に材料の評価を行う電子線超音波顕微鏡は他の顕微鏡では得られない情報を知ることができることから有用である。従来の電子線超音波顕微鏡では、超音波としてバルク波を利用し、その検出に圧電トランスジューサが用いられている。これに対し我々は電子線照射によってバルク波よりも弾性表面波が効率良く発生し得ることに着目し、評価の手段として表面波を利用するとともに表面波の検出手段として光ファイバセンサを用いた高性能電子線超音波顕微鏡を実現するために種々の研究を行っている。本研究の特長として、(1)表面波はバルク波よりも試料表面及び近傍の材質変化、欠陥に敏感であるから表面及び表面下の評価に適する。(2)光ファイバセンサは電磁場の影響を受けないのでこれまでの方式のように誘導障害の問題が解消され高感度でS/N比の良い検出が行える。(3)表面波の検出を非接融状態で行える、などがあげられる。本年度は前年度に引きつづき、励振源としての電子線照射による弾性表面波発生の実験と理論解析を行うとともに、検出器としての光ファイバによる弾性表面波検出の実験を行い、高感度で弾性表面波を検出できることを確認した。更に、電子線超音波顕微鏡のシステムの試作を進めた。
トルコ古代都市テオスのディオニソス神殿に関する建築学及び考古学的国際共同調査

近年、ギリシアとローマの二大文明の端境期にあたるヘレニズム期の建築が注目されている。とくにギリシアの伝統が強い東地中海の古代都市では、ギリシアの建築文化がヘレニズムを通してローマ時代にまで影響さしたとされ、盛んに調査研究がおこなわれている。こうした中、本研究ではトルコ古代都市テオスのディオニソス神殿の現地調査を行う予定であったが、調査直前になってトルコ政府の許可が下りないことが判明した。そこでヘレニズム遺跡として関連が深い、ギリシア古代都市ペラの王宮建物の建築調査を行うこととなった。王の住まいである宮殿は、ヘレニズム期になって初めてギリシア世界に登場し、帝政ローマ時代にかけて発達した建築タイプの一つで、当該王宮はその起源の一つとされる。アレキサンドロス大王の故郷として知られるペラは、古代マケドニア王国の首都で、平原を見下ろすアクロポリスの丘陵には、総面積約8万平米の建物群(IVII)が残る。H29年度の第一次調査では建物Iの遺構の現状平面図(縮尺:1/50)と、博物館所蔵の柱頭部材の調査を行った。H30年度の第二次調査では、考古局の発掘が進展したことから、改めてドローンを用いた最新の写真測量技術によってオルソ画像を作成し、CADで平面図を作成した。また1980年代の発掘時に保存されていた建物Iの建築部材が現場倉庫より見つかり、部材片を含め全65個の存在が確認できた。このうち19個の部材については、詳細な実測図(縮尺:原寸1/10)を作成した。資料の分析を進めた結果、建物Iは中庭(28×32.5 m)を四方から列柱廊が取り囲むペルスタイル形式であることが確認できた。博物館や倉庫等で発見された建築部材は、多様な形をした半円柱の部材が多く、その特徴から分類・整理を行った。このうち、博物館に残るドリス式柱頭は、各部の比例関係から前4世紀後半の製造であることが判明した。H29年度の第一次調査(H29年8月18日9月17日、31日間)では、研究代表者1名、大学院生5名、研究協力者の松尾登史子氏の合計7名で現地調査を行った。調査のカウンターパートであるペラ考古局長のツィガリディス氏との協力関係が確立し、テッサロニキ大学の測量学者トクマキディスの協力も得られて、順調なスタートを切った。H30年度の第二次調査(H30年8月6日8月31日、26日間)では、研究代表者1名、大学院生3名の合計4名で現地調査を行った。第二次調査ではペラ考古局の発掘調査が進んだことから、ドローンを用いた写真測量でオルソ画像を作成し、これをトレースして平面図を作成できた(CADデータ)。また長年の発掘経緯に不明な点が多かったが、発掘日誌の解読、新たな建築部材の確認などによって、建物にまつわる資料が充実した。その結果、部材片58個を含む65個の建築部材を確認することができ、19個の建築部材を詳細な実測図や断面プロフィール図によって記録を作成できた。これらの建築部材は、多様な形をした半円柱の部材が多く、その特徴から分類・整理を行った。とくに博物館に残るドリス式柱頭は、各部の比例関係から前4世紀後半の製造であることが判明した。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。H31年度は、科研費の最終年度であることから、王宮建物のうち、建物Iの調査に集中する。H30年度の発掘調査は、建築調査が終わった夏以降も継続され、11月まで続いたことから、遺構の平面図を追加するとともに、特徴的な建築部材の実測図による記録作成を行う。このために、H31年度も夏季休業中の約5週間に、代表者および学生による現地調査を計画している。当該王宮建物は、いくつもの建設フェーズがあり、遺構と建築部材がどのフェーズに属するのかを解明する必要がある。そのためには、ドリス式柱頭と同様の手法で、建築部材の年代推定が有効である。また、ローマ時代以後建物が略奪を受けて現存する建築部材がやや少ないことから、関連するペリスタイル形式の住居、王宮建物との比較を通して、建物の推定復元を行う。具体的には、イオニア式の付柱に付属する半柱頭は、建物上階の窓や、ペリスタイルのストア二階の列柱に用いられた例があることから、大まかながら原位置を推定する手立てとなる。このように、現地調査で得られるオリジナル資料に加え、関連建物との比較分析によって研究を推進させる。近年、ギリシアとローマの二大文明の狭間にあたるヘレニズム時代が注目されている。とりわけヘレニズムから帝政ローマまで繁栄した東地中海の古代都市では、ギリシアの建築文化がヘレニズムを通してローマ時代にまで影響が見られ、盛んに調査研究が行われている。そこでヘレニズム遺跡として関連が深い、ギリシア古代都市ペラの王宮での調査を行うことになった。王の住まいである宮殿は、ヘレニズム時代にはじめてギリシア世界に登場し、ローマ時代に発展した建築タイプの一つで、当該王宮はその起源の一つとされる。本研究ではギリシア考古局と共同で現地調査を行うと共に、建築史的な価値を明らかにし、ヘレニズム建築の一端を解明することを目的とする。アレキサンドロス大王の故郷としても知られるペラは、マケドニア王国の首都で、平原のほぼ中央に位置する。

王宮建物が位置するアクロポリスの丘陵は、市域を南側に見下ろす位置にあり、王国の権力が座すには絶好の立地であった。この丘陵のやや北側には東西約400 m、南北約200 m、総面積8万平米の比較的平らな土地があり、ここで王宮遺構が発見された。王宮建物は少なくとも7つの建物群(IVII)からなる。H29年度の第一次調査ではこの王宮建物のうち建物Iを中心に実測調査を行った。実測にあたっては、ドローンを用いた写真測量によってオルソ画像を作成し、現地で手書きのスケッチを加える方法で平面図(縮尺1/50)を作成した。またペラ考古学博物館に保存されている王宮の柱頭部材の存在を確認し、その一部を詳細な実測図(縮尺1/10)を作成して記録した。本研究では、ヘレニズム時代の代表的な神殿として知られるトルコ古代都市テオスのディオニソス神殿の現地調査を行う予定であったが、第一次調査直前になってトルコ政府の許可が下りない旨、共同研究者であるアンカラ大学のムサ教授より連絡があった。昨今のトルコ情勢からみて、今後もテオス遺跡での調査の継続が困難と判断し、ヘレニズム遺跡として関連が深い、ギリシア古代都市ペラの王宮での調査を行うことになった。ペラ遺跡は、ギリシア北部のマケドニア平原の中央に位置する首都で、アレキサンダー大王の郷里として知られる著名遺跡である。北側の丘陵に位置するアクロポリスには、その王宮遺構が残っている。王宮の発掘は部分的には終了しているが、詳細はまだこれからである。そこで、ペラ考古局とテッサロニキ大学との共同研究として、H29年度夏から王宮の建築調査を行うことになった。第一次調査として、H29年8月18日から9月17日までの31日間の日程で、ペラの王宮建物のうち建物Iの現地調査を行った。調査メンバーは、代表者の吉武隆一のほか、大学院生5名および研究協力としてマケドニア考古学の松尾登史子の合計7名であった。研究協力者であるペラ考古学局長のツィガリディス氏と面会し情報交換を行うとともに、テッサロニキ大学の測量学者トクマキディス教授の協力を得てドローンを用いた写真測量を行い、建築の実測図面を作成した。また、ペラ博物館に保存されている王宮から出土した建築部材の実測図を作成した。さらに研究分担者のまた太田明子は、ヘレニズムからローマにかけての建設技術の観点から分析を行った。このように、H28年度にはやや停滞していた研究プロジェクトが大幅に前進し、H29年度の予算と併せて調査研究を行った結果、H29年度末までにおおむね順調に進展した。近年、ギリシアとローマの二大文明の狭間にあたるヘレニズム時代が注目されている。とりわけヘレニズムから帝政ローマまで繁栄した東地中海の古代都市では、ギリシアの建築文化がヘレニズムを通してローマ時代にまで影響が見られ、盛んに調査研究が行われている。こうした中、本研究ではトルコ古代都市テオスのディオニソス神殿の現地調査を行う予定であったが、調査直前になってトルコ政府の許可が下りないことが判明した。そこでヘレニズム遺跡として関連が深い、ギリシア古代都市ペラの王宮での調査を行うことになった。王の住まいである宮殿は、ヘレニズム時代にはじめてギリシア世界に登場し、ローマ時代に発展した建築タイプの一つで、当該王宮はその起源の一つとされる。本研究ではギリシア考古局と共同で現地調査を行うと共に、建築史的な価値を明らかにし、ヘレニズム建築の一端を解明することを目的とする。
コプロポルフィリンを用いた非侵襲的羊水塞栓症診断法の開発

Zn-コプロポルフィリン簡易測定法の開発HPLC法によるZn-コプロポルフィリンの測定はやや煩雑であるためベットサイドでは行いにくい。そこでC_<18>カートリッジカラムを用いてZn-コプロポルフィリンの迅速抽出系の確立を検討した。また,紫外線ランプ等を用いた簡易検出系も作成した。胎便・羊水中Znコプロポルフィリンの生理的意義の解明Zn-コプロポルフィリンは胎便・羊水中の特異物質であるが,その濃度は症例により異なる。Zn-コプロポルフィリンを母体血中で測定し,羊水塞栓症の診断を行う。本研究にとって羊水・胎便でのZn-コプロポルフィリンの動態を見ることは必須である。多数例の羊水・胎便を集め,Zn-コプロポルフィリンの濃度を測定しZn-コプロポルフィリンの羊水中,胎便中での意義を検討した。C_<18>カートリッジカラムによる簡易測定キット開発高速液体クロマトグラフィーの原理を用いたC_<18>カートリッジカラムを利用した血清中のZn-コプロポルフィリンの溶出条件を調べた。血清に一定量のZn-コプロポルフィリンをくわえそれをC_<18>カートリッジカラムに添加しアセトニトリル:燐酸緩衝液=1:4で溶出すると滴下3滴-6滴でZn-コプロポルフィリンが溶出されそれを濾紙に吸着させ紫外線ランプをあてるとZn-コプロポルフィリン特有のオレンジ色の蛍光が観察された。70nmol/l位の感度であり,さらに条件を工夫すれば血清中Zn-コプロポルフィリンの簡易測定法が可能と考えられた。胎便中Zn-コプロポルフィリンと出生時体重の間に正の相関を認めた。また生後早期に便中のZn-コプロポルフィリンは低値となる事が明らかになった。アルカリフォスファターゼ値と胎便中Zn-コプロポルフィリンの間にも正の相関を認められZn酵素の活性化にZn-コプロポルフィリンが関与している事が示唆された。また胎便中Fe動態とZn-コプロポルフィリン量が関連することが明らかになり,今後胎便中Zn-コプロポルフィリンが胎児におけるヘム及びZn動態の指標になる物質である事が予想された。今年度は亜鉛コプロポルフィリンによる羊水塞栓症診断の臨床応用を主な研究主題とした。高速液体クロマトグラフィ-とC_<18>カ-トリッジカラムによる測定方法を検討した。1.高速液体クロマトグラフィ-による亜鉛コプロポルフィリン測定短時間で精度良く亜鉛コプロポルフィリンが溶出する条件を検討したところ、アセトニトリルと燐酸緩衝液の混合液が亜鉛コプロポルフィリンを正確に他のポルフィリンと分離させることが判明した。またその比が1:4のときに短時間(retension time4分)で亜鉛コプロポルフィリンのピ-クが得られることがわかった。羊水塞栓症の4例の血清をミニポアフィルタ-で濾過後高速液体クロマトグラフィ-に添加し上記の緩衝液で溶出するとすべての例で36nmol/l以上の亜鉛コプロポルフィリンが検出された。

それに対して正常妊婦の血清中亜鉛コプロポルフィリンは殆どは検出感度以下で、検出されても36nmol/l未満であった。このアッセイ系を用いて現在他病院も含めてフィ-ルドトライアル中である。2.C_<18>カ-トリッジカラムによる簡易測定キット開発高速液体クロマトグラフィ-は測定機器が高価でありまた使用法は必ずしも容易ではない。そこでベットサイドでも使用可能なキットの開発を試みた。高速液体クロマトグラフィ-の原理を応用しC_<18>カ-トリッジカラムを利用し血清中の亜鉛コプロポルフィリンの溶出を調べた。血清に一定量の亜鉛コプロポルフィリンをくわえそれをC_<18>カ-トリッジカラム添加しアセトニトリル:燐酸緩衝液=1:4で溶出すると滴下3滴ー6滴で亜鉛コプロポルフィリンが溶出されそれを濾紙に吸着させ紫外線ランプをあてると亜鉛コプロポルフィリン特有のオレンジ色の蛍光が観察された。70nmol/l位の感度であり、さらに条件を工夫すれば血清中亜鉛コプロポルフィリンの簡易測定法が可能と考えられた。今年度は亜鉛コプロポルフィリンによる羊水塞栓症診断のフィールドトライアル、及びニアミス症例の検討を研究主題とした。また簡易キットの測定も試みた。1、亜鉛コプロポルフィリンによる羊水塞栓症診断のフィールドトライアル全国8施設から25例の妊産婦ショック症例の血清を得た。亜鉛コプロポルフィリン値をHPLC法にて測定した。そのうち、亜鉛コプロポルフィリンは4例に高値(36pmol/ml以上)を示し、内3例は臨床的にも羊水塞栓症と思われ、1例は死亡した。亜鉛コプロポルフィリンの測定感度が高いことが示唆された。2、血清亜鉛コプロポルフィリン測定と羊水塞栓症ニアミス例の検出の診断分娩直後母体血を採血し亜鉛コプロポルフィリン値をHPLC法にて測定した。約150例を検討したところ、5例に亜鉛コプロポルフィリン値が8pmol/ml-35pmol/mlの境界値を示した。それらの内訳は羊水混濁(2例)、過強陣痛(陣痛促進剤による)(2例)、遷延分娩→帝王切開(1例)、遷延分娩+骨盤位分娩(1例)であった。いづれも産科的合併症をもった症例で、殊に羊水内圧が上昇するような状態で羊水が母体血中に流入しているのではないかと考えられた。分娩時、亜鉛コプロポルフィリンを測定することにより羊水塞栓症の予知、予防が可能ではないかと考えられた。3、C_<18>カートリッジカラムによる簡易測定キット開発羊水塞栓症の診断は急を要すのでベッドサイドで測定できることが肝要である。そこでベッドサイドでも使用可能なキットの開発を試みた。高速液体クロマトグラフィーの原理を応用しC_<18>カートリッジカラムを利用し血清中の亜鉛コプロポルフィリンの溶出を調べた。血清に一定量の亜鉛コプロポルフィリンをくわえそれをC_<18>カートリッジカラム添加しアセトニトリル:燐酸緩衝液=1:4で溶出すると滴下6滴-10滴で亜鉛コプロポルフィリンが溶出されそれをPVP膜に吸着させ紫外線ランプをあてると亜鉛コプロポルフィリン特有のオレンジ色の蛍光が観察された。70nmol/1位の感度であり、さらに条件を工夫すれば血清中亜鉛コプロポルフィリンの簡易測定法が可能と考えられた。胎便・羊水中Znコプロポルフィリンの生理的意義の解明Zn-コプロポルフィリンは胎便・羊水中の特異物質であるが,その濃度は症例により異なる。Zn-コプロポルフィリンを母体血中で測定し,羊水塞栓症の診断を行う。本研究にとって羊水・胎便でのZn-コプロポルフィリンの動態を見ることは必須である。
一般国際法規則の認定による国際法体系への実質的価値の組み入れ

2年目にあたる今年度は、前年度の研究を前提として、引き続き、非国際環境法レジームによる国家の環境保全義務の内在化が、結果として普遍的な妥当の様態を作り出すという一般国際法の形成現象に着目し、こうした現象を説明するための理論的枠組みを明らかにすることを目指して研究を遂行した。具体的な内容としては、前年度の実証部分の研究において明らかとなった通り、内在化現象が参加の原則(手続的環境権の保障)と環境影響評価(科学的リスク評価)の2つの規範について生じていたことを踏まえ、1これらの規範が分類される国際環境法の諸原則の規範的性質と一般国際法との関係について法源の視点からの考察、2国際環境法の諸原則のうち参加の原則と環境影響評価の規範内容が有する特殊性および内在化の現象の発生を可能にする要因の明確化、3内在化現象と一般国際法としてのこれらの2つの手続的規範を接合する理論的枠組みとしてのグローバル法概念の検討、の3点を相互に関連付けながら行った。以上の検討の結果として、内在化現象による2つの規範の普遍的な妥当の様態は、先行研究が想定していたような、普遍的に妥当する単一の一般国際法規範の効力の一環としてではなく、多元的かつ重層的な法体系と複数の法規範の集合体に遍在する規範として、従来とは異なる新たな様態で実現されているとの仮説を持ちつつある。今後は、この仮説の妥当性を確保するため、実証との整合性に配慮して説明的正当化を行うとともに、規範的正当化も並行して、当該仮説を発展させていく予定である。以上の研究の成果はそれぞれ、研究会および国際ワークショップにて報告し、有益な示唆を受けた。一般国際法の定立、解釈、適用の全ての局面において中心的役割を果たしてきた慣習国際法の成立要件の検討は、本研究の総論部分において不可欠であり、ICJの実行を評価する学説の検討を共著の書評論文にまとめたことは、本研究を進める過程での思考整理の一助となった。また、1月に参加したハーグ国際法アカデミーでは、国際環境法を専門とする研究者、ならびに他大学の博士課程院生からは、本研究に対して非常に有益なレビューを受ける機会を得た。以上から、今年度の目標として設定した総論部分の検討について、先行研究の分析および本研究で目指すべき新たな理論的枠組みの構築作業が順調に進行していると評価する。ただし、個々の非国際環境法レジームにおいて、国家の環境保全義務の内在化現象自体は同種であるとしても、現象の発生を可能にする要因がそれぞれ異なっているため、検討の対象としている現象への画一的な理論的枠組みのあてはめが困難となっており、当初予定していた分野横断的な研究として成立させることの妥当性に揺らぎが生じている。この点については、来年度、理論的枠組みを適宜修正しつつ、研究の射程の拡縮を再検討する必要があると考えている。最終年度にあたる来年度は、本研究の総括として、今年度中心的に検討した総論部分の理論的枠組みと実証部分とを統合し、博士論文へとまとめ上げていくことを目指す。今年度は総論部分における理論的検討に注力した一方で、実証部分が手薄となりがちであったため、来年度は蓄積された新しい実行を補填しつつ、それと整合するように理論的枠組みの再構成を行う。さらに、総論部分について、国際環境法という限定を解き、国際法一般における本研究の位置づけを探ることにより、インパクトの拡大を試みる。以上を改めて整理・分析したうえで、全体的な整合性と円滑な流れを意識しながら、博士論文の執筆を進める予定である。本研究は、グローバル規模での実質的価値の基準の調和が、国際法の立法・解釈・適用の法現象において達成されるメカニズムを解明するため、非国際環境法レジームによる国家の環境保全義務の形成現象を分析することで、環境という実質的価値を保全する調和的かつ普遍的な義務が形成されるメカニズムを実証的に解明することを目的としている。この目的を達成するため、平成29年度は、先行研究の分析(総論)と、実践的論点の把握・理解(各論)の両方について研究を遂行した。まず、総論として、加盟国の交渉により締結される多数国間環境条約の「上からの法秩序形成」に対置され、国家の環境保全政策の意思決定の在り方を規律することで「下からの法秩序形成」を促進する新しいタイプの環境条約として、オーフス条約とエスポー条約に着目した。その上で、これらの条約の「憲法的(constitutional)」構造という特徴に鑑み、その新規性を説く学説を検討した。この間、国家の環境保全を義務付ける一般国際法とその特徴について、修士課程より継続して検討を行っている。次に、各論として、国際人権法における手続的環境権の内容の変遷と、貿易協定における科学的リスク評価の要件について、それぞれ、欧州人権裁判所の判例とWTOのSPS協定の解釈・適用をめぐる小委員会および上級委員会の報告書を用いて、近年の傾向を分析した。これらの検討を通じて、非国際環境法レジームが加盟国に課す、いわば間接的な環境保全義務は、手続的環境権の保全による意思決定プロセスの改善と、普遍的基準としての科学への厳格な依拠から成る、という仮説が浮かびありつつある。今後は、これら2つの傾向を包括する枠組みを模索するべく、総論のさらなる拡充を中心に研究を進める予定である。とりわけ各論について、研究成果を発表する多くの機会に恵まれたこともあり、一定の具体的検討を行うことができた。

また、総論に該当する先行研究の分析がいまだ不十分であるが、各論の分析を進めて継続的な思考整理を行ったことにより、総論に繋がる一般的理論的知見について示唆を得ることで、次年度で解決するべき課題をより明確にすることができた。ただし、異なるレジームを横断的に検討するという本研究の特徴から、総論の拡充において検討するべき先行研究の射程をさらに広げる必要性が生じた。次年度は、個別の実践的論点を包括的に俯瞰するための理論的視野を広げるとともに、本研究が国際法研究全体というより大きな文脈においてどのように位置付けられるか、という課題により意識的に取り組む予定である。2年目にあたる今年度は、前年度の研究を前提として、引き続き、非国際環境法レジームによる国家の環境保全義務の内在化が、結果として普遍的な妥当の様態を作り出すという一般国際法の形成現象に着目し、こうした現象を説明するための理論的枠組みを明らかにすることを目指して研究を遂行した。具体的な内容としては、前年度の実証部分の研究において明らかとなった通り、内在化現象が参加の原則(手続的環境権の保障)と環境影響評価(科学的リスク評価)の2つの規範について生じていたことを踏まえ、1これらの規範が分類される国際環境法の諸原則の規範的性質と一般国際法との関係について法源の視点からの考察、2国際環境法の諸原則のうち参加の原則と環境影響評価の規範内容が有する特殊性および内在化の現象の発生を可能にする要因の明確化、3内在化現象と一般国際法としてのこれらの2つの手続的規範を接合する理論的枠組みとしてのグローバル法概念の検討、の3点を相互に関連付けながら行った。以上の検討の結果として、内在化現象による2つの規範の普遍的な妥当の様態は、先行研究が想定していたような、普遍的に妥当する単一の一般国際法規範の効力の一環としてではなく、多元的かつ重層的な法体系と複数の法規範の集合体に遍在する規範として、従来とは異なる新たな様態で実現されているとの仮説を持ちつつある。今後は、この仮説の妥当性を確保するため、実証との整合性に配慮して説明的正当化を行うとともに、規範的正当化も並行して、当該仮説を発展させていく予定である。以上の研究の成果はそれぞれ、研究会および国際ワークショップにて報告し、有益な示唆を受けた。一般国際法の定立、解釈、適用の全ての局面において中心的役割を果たしてきた慣習国際法の成立要件の検討は、本研究の総論部分において不可欠であり、ICJの実行を評価する学説の検討を共著の書評論文にまとめたことは、本研究を進める過程での思考整理の一助となった。また、1月に参加したハーグ国際法アカデミーでは、国際環境法を専門とする研究者、ならびに他大学の博士課程院生からは、本研究に対して非常に有益なレビューを受ける機会を得た。以上から、今年度の目標として設定した総論部分の検討について、先行研究の分析および本研究で目指すべき新たな理論的枠組みの構築作業が順調に進行していると評価する。ただし、個々の非国際環境法レジームにおいて、国家の環境保全義務の内在化現象自体は同種であるとしても、現象の発生を可能にする要因がそれぞれ異なっているため、検討の対象としている現象への画一的な理論的枠組みのあてはめが困難となっており、当初予定していた分野横断的な研究として成立させることの妥当性に揺らぎが生じている。この点については、来年度、理論的枠組みを適宜修正しつつ、研究の射程の拡縮を再検討する必要があると考えている。
光音響法による実際の孔食の非破壊的映像化

本研究においては、実際の孔食を非破壊的に検出するために、光音響顕微鏡を用いて、その光音響像と位相像を評価、解析することを目的としている。アルミニウム平板に浸せき試験により生じた実際の孔食を光音響法(PAS)により映像化し、深さなどの情報を光音響信号強度から推定することを課題として研究を行った。具体的には、0.001mol1molの濃度の塩化ナトリウムあるいは塩化マグネシウムを別個に含むエタノール水溶液中に、純アルミニウム平板を144時間浸せきしたもののSEM写真と変調周波数fを90、180、360Hzの3種類で測定した光音響(PAM)像と位相の振幅像の信号強度の検討も行った。なおここで、エタノール水溶液の濃度は、20%おきに2080%で行った。その結果、光音響像と位相の振幅像の信号強度が表され、位相の信号分布より孔食が深くなるにつれて、位相の振幅像を得ることが出来た。本研究の備品として科学研究補助金で購入した、試料移動用に装置であるリニアモーターステージを光音響顕微鏡装置に組み込み、さらに、ソフトウェアの"LabView"を導入して測定系全体の自動化したものに改良を行った。また、以上の研究に加えて、本研究者らは内部欠陥の映像化を行うために、光音響顕微影像法による枝分かれ複合欠陥の欠陥検出と円筒型内部欠陥の映像化も行った。このように実際の孔食のその光音響像と位相像を評価、解析することが出来、国内の学会国内の学会では、日本機械学会年次大会などで発表し、仙台の国際会議(APCFS & ATEM'01)及び国際会議(Optical Engineering for Sensing and Nanotechnology (SPIE) ICOSN' 01)等で発表し、良い成果が得られた。今年度は、アルミニウム合金板などに生じた孔食((a)浸せき試験と(b)電気化学的に生じた孔食)を光音響法(Photoacoustic spectroscopy ; PAS)により映像化し、深さなどの情報を光音響信号強度から推定することを課題としている。具体的には、(a)の浸せき試験は、まず初めに、アルミニウム合金板を、具体的には、0.001mol1molの濃度の塩化ナトリウムあるいは塩化マグネシウムを別個に含むエタノール水溶液中に、純アルミニウム平板を144時間浸せきしたもの塩化ナトリウムあるいは臭化ナトリウムを含むアルコール水溶液中に約一週間浸した後、光学顕微鏡検査により形状及び深さを確認し、次に走査電子顕微鏡(SEM)により写真撮影なども行い、なお詳細な形状等を調べた。光音響顕微鏡(PAM)測定を行う。(b)の電気化学的方法は、電気化学的にポテンショスタットを用いて定電位電気分解して発生した孔食のPAM測定を行なった。また、本研究の備品として科学研究補助金で購入した、試料移動用に装置であるリニアモーターステージを装置に組み込み、光音響顕微鏡装置、つまり、2Wアルゴンレーザー、ロックインアンプ、コンピューター、ディスプレーなどを用いる。さらに、ソフトウェアの"LabView"を導入して測定系全体の自動化したものに改良中である。本研究においては、アルミニウム板に生じた孔食((a)浸せき試験と(b)電気化学的に生じた孔食)を光音響法(Photoacoustic spectroscopy ; PAS)により映像化し、深さなどの情報を光音響信号強度から推定することを課題とした。具体的には、(a)の浸せき試験は、まず初めに、アルミニウム板を、0.001mol1molの濃度の塩化ナトリウムあるいは塩化マグネシウムを別個に含むエタノール水溶液中に、純アルミニウム平板を144時間浸せきしたもの塩化ナトリウムあるいは臭化ナトリウムを含むアルコール水溶液中に約一週間浸した後、光学顕微鏡検査により形状及ぴ深さを確認し、次に走査電子顕微鏡(SEM)により写真撮影なども行い、なお形状等を調べた後、光音響顕微鏡(PAM)測定を行った。

(b)の電気化学的方法は、科学研究補助金で購入したポテンショスタットを用いて定電位電気分解して発生した孔食のPAM測定を行なった。また、以上の研究に加えて、本研究者らは内部欠陥の映像化を行うために、光音響顕微影像法による枝分かれ複合欠陥の欠陥検出と円筒型内部欠陥の映像化も行った。本研究の備品として科学研究補助金で購入した、試料移動用に装置であるリニアモーターステージを光音響顕微鏡装置に組み込み、さらに、ソフトウェアの"LabView"を導入して測定系全体の自動化したものに改良を行った。このように実際の孔食のその光音響像と位相像を評価、解析を行い、国内の学会では、日本機械学会年次大会などで発表し、活発な質疑が行われ良い成果が得られた。
細胞内シグナルの修飾による血管平滑筋細胞の増植・分化・脱分化の制御

ラット大動脈由来VSMCを用いて分化・脱分化・増殖という観点から定量性PCR(qPCR)、蛍光免疫染色、増殖解析、アポトーシス解析、flow cytometry等の方法を確立した。qPCRではSM1、SM2、SM22alpha、SMemb、calponin、caldesmonなど200種のプライマー設計・最適化に成功。免疫染色ではAlexa蛍光色素、デジタル画像処理技術を導入、蛍光顕微鏡下で共焦点画像取得を最適化した。分化型マーカー発現に寄与するAscorbic acid(AA)を10%FCS DMEM培地で再評価、刺激後4時間でSM1、calponinの遺伝子発現は上昇、SM2発現は認めず、SMemb発現を認めたことから、AA添加のみでは分化コントロールは困難と考えられた。培養皿コーティングの差に注目しplasma処理とgelatincoat培養皿でVSMCの反応を比較したが、ECMではcollagen typeIIIがコーティング群で増強。接着因子である、Integrin beta1、Integrin alpha5もコーティング群で上昇した。このコーティングに加えてAAの添加を検討。コーティングの有無によりAAに対する反応性も違うことを明らかにした。elastinはplasma処理では濃度依存性に発現が増強されたが、gelatinコーティングでは増強されなかった。細胞と培養皿の界面における反応性の違いがVSMCのECM産生に関与することが示唆された。更に理解をすすめ、組織工学におけるschafoldの表面設計の改善につなげたいと考えている。残念ながら、初代VSMC培養系への遺伝子導入は、実験に耐えうる導入効率に至らず、細胞内シグナルの修飾実験に至らず。しかし、磁気ビーズを用いることにより、初期培養系VSMCに対して2030%の導入効率を達成した。実験計画に沿って、本年は主に実験ツールの作成および解析系(in-vivoおよびin-vitro)の洗練に費やされた。特記すべき事項を列挙する。1)ラットを用いた血管平滑筋細胞の増殖モデルの開発:主にラットの頚動脈バルーン損傷モデルを作成。mRNAの抽出cDNA合成、タンパク質の抽出を行った。以下に示す測定系の確立により、本モデルにおける動脈硬化病変の発生機序を解析する予定である。2)血管平滑筋細胞初代培養の確立と細胞内シグナルの解析:ラット血管平滑筋細胞初代培養系は一般的に10%FCS加DMEMにより行われるが、FlowCytometryによると非常にheteroな細胞群と考えられた。しかし、ある種の増殖因子を加えることで比較的均質な細胞群となることを見いだした。今後、これらを解析して、血管平滑筋細胞の分化・脱分化について検討したい。3)YY1カスケードを応用した平滑筋細胞増殖抑制法の確立:Rb1,YY1についてはPlasmidを分与を受け、大量調整した。しかし、初代培養系に対する遺伝子導入は導入効率が数%であるため、実験におけるsignal/noise比が稼げない。これを解決し実験系をrefineするため、様々な導入法を検討中である。特に血管平滑筋細胞に特異的に遺伝子導入を現在検討中である。4)動脈硬化病変の場を作り出す平滑筋細胞の役割についての検討:本年度は特にこの細目について重点的に研究を進めた。サイトカイン・ケモカイン・増殖因子、転写因子、細胞内骨格、細胞外マトリックス等の遺伝子発現を解析するため、LightCycler Technologyを応用し、real-time PCRにより約150種類の遺伝子について定量的な測定系を確立した。以上の結果を踏まえ、来年度はさらに実験を進める予定である。特に、定量的PCRの系の確立は大きな前進と考えている。