hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Porphyromonas gingivalisにおけるへミン結合性外膜蛋白の役割及びその輸送機構の解明

Porphyromonas gingivalisにおけるHBP35蛋白の性状解析:局在化、チオレドキシン活性、ヘム利用の役割Porphyromonas gingivalisにおけるHBP35蛋白の性状解析:局在化、チオレドキシン活性、ヘム利用の役割成人性歯周炎の主要病原細菌として、Porphyromonas gingivalisが知られている。我々は本菌の主たる病原因子として、強力な蛋白分解酵素であるジンジパインの解析を行ってきた。またジンジパインが外膜表面で局在化する分子機構についても解析中であり、ジンジパインが外膜に輸送される為には、PorT蛋白が必須であること、また外膜上で適切にアンカーされるためにはPorR蛋白が必須であることを報告してきた。近年、ジンジパインのC-terminaldomain(80アミノ酸)は高度に保存されており、輸送と局在化の両方に寄与していると報告されている。その報告はジンジパインに含まれるRgpB分子の解析から明らかにされている。しかしながら、RgpB分子以外のC-terminal domainを有する分子についての解析は未だない。また、本菌は発育素としてヘムを要求する。我々は本菌のヘムの取込み機構についても解析を進めており、C-terminal domainを有しておりまた組換え蛋白がヘミン結合性を有するHBP35蛋白について解析を行い以下の知見を得た。2. hbp35転写産物より、40-, 29-, 27-kDaの翻訳産物を産生する。3. 29-, 27-kDa分子は主に細胞質内に局在する。一方、40-kDa分子はPorT依存性に外膜に輸送され、PorR依存性のシステムで外膜に局在化される。上記の知見より、RgpB分子以外のC-terminal domainも同様な輸送・局在化機構を有することが予想される。C-terminal domainを有する分子は病原因子と関連する事から、PorTなどの輸送分子は本菌の制圧を目標とした場合の標的として、よい候補となると期待される。前年度、抗HBP35抗体はDiffuse 50-90 kDa, 40-kDa, 27-kDa蛋白を検出し、そのうち、27-kDa蛋白は135番目のメチオニンから開始されること、また、hbp35遺伝子はmonocistronicに1.1kbの転写産物を産生すること、さらに菌体分画解析より、27-kDa蛋白は細胞質内にDiffuse 50-90 kDaは外膜に40-kDaは全ての画分に局在し、Diffuse 50-90 kDaはPorT依存性の輸送機構で外膜に輸送され、PorR依存性に糖鎖の修飾が起きることを明らかにしていた。本年度、組換え蛋白を調製し、40-kDa、27-kDa蛋白は共にヘミン結合性があること、組換え40-kDa蛋白はチオレドキシン活性を有し、活性部位の48番目と51番目のシステイン依存性であることを確認した。また、野生株、変異株および相補株を作製し、ヘミン制限液体培地による増殖抑制が相補株で部分的に相補されたことから、HBP35蛋白はヘムの利用、獲得に関与していると示唆された。一方、HBP35蛋白が抗酸化ストレス因子としての機能を担っているという直接的な結果は得られなかった。次に、CTDの最後の5個のアミノ酸領域を欠失する蛋白を発現する変異株を作製し、その株では、Diffuse bandsは検出されず、輸送の途中で蛋白分解が起こり、およそ30-kDaの分子が検出された。このことは、CTDは輸送シグナルであると示唆された。今後、CTDを直接認識する分子を同定することで病原性を減弱化させるような開発が期待される。
金属ガラスの電子線イメージング

本研究では金属ガラスの構造ゆらぎに関連した中距離秩序構造を明らかにするため、透過電子顕微鏡を用いたイメージング技術の検討を行った。具体的には、極小の集束絞りを使って電子線を0.4nm以下に絞り、その電子線を走査することにより金属ガラスの各局所領域からの電子回折パターンを取得した。得られたデータを解析することによって中範囲秩序領域の広がり、形状、構造の特徴などが明らかとなった。本研究の目的は、金属ガラスの原子構造マッピング法を開発することであり、今年度は特にオングストロームサイズの電子線を用いたディフラクションマッピングに焦点を置き、研究を行った。従来、ガラス構造の解析にはX線・中性子線回折法などの平均構造解析の手法が用いられてきたが、実際のガラス構造を明らかにするには局所構造の情報も必要であると考えられる。本研究では、オングストロームスケールの局所回折をマッピングすることにより、局所構造の空間分布を検討し、局所情報とマクロ情報を繋ぐことを試みている。具体的には、Zr基金属ガラス試料の電子顕微鏡用薄片を用意し、球面収差補正器と極小集束絞りを備えた走査型透過電子顕微鏡により、連続するオングストロームスケール領域(34Å)からの電子回折の撮影を試みた。本年度は主に撮影条件の最適化に焦点を絞り研究を行い、最終的には2Åステップの2次元電子回折マップを得ることができた。しかし試料ドリフトの問題が十分に解決できていないため、現段階では比較的狭い領域でのマッピングのみ可能である。得られたマップから、観察した金属ガラス中にはサイズ1nm以下の規則領域が多く存在することが明らかとなった。このような情報は平均構造情報から得ることは難しく、ガラス構造を包括的に理解するために有益なものであると考えられる。今後はより精度の高いマップの取得や、他の合金系への適用を検討していく予定である。本研究の目的は、金属ガラスの原子構造マッピング法を開発することであり、今年度も昨年度に引き続き、オングストロームサイズの電子線を用いたディフラクションマッピングに焦点を置いた研究を行った。昨年度の課題であったデータ取得時のドリフトの問題など、概ね解決できたため、今年度は比較的広い領域から良好な電子回折マッピングを取得できるようになった。具体的なサイズはおおよそ10nm×10nmである。この手法をバルク金属ガラス試料に応用するため、現時点で最高のガラス形成能を示すPd-Cu-Ni-P金属ガラス試料を入手し、電子回折マッピングの取得を試みた。マップ中には同方向の回折波を生じさせる1nm程度の領域が多く観察された。このような領域の構造を理解するため、第一原理分子動力学法を用いて作製した構造モデルとの比較検討を行った。分子動力学モデルから抜き出した原子数およそ50個の配列から得られた一連の電子回折パターンは、実験により得られたものと良い一致を示した。本手法によって、これまでより長範囲の局所構造について議論することが可能となってきた。金属ガラスのような非晶質物質の構造解析は、これまで試料全体からの回折曲線等を測定して得られる平均的な構造情報を使って行われてきた。しかし、平均情報だけでは非晶質構造を理解するには十分でなく、局所的な構造データを相補的に組み合わせることが必要である。本研究の目的は、金属ガラス試料に対してオングストロームサイズの電子線を用いた電子回折マップの撮影を行い、1nm以上に広がる中範囲秩序構造の特徴を明らかにすることである。これまでに金属ガラスの10nm四方程度の領域から0.2nmのステップで局所電子回折を1000-2000枚程度撮影することに成功しており、26年度はこれまでに得られた実験データを再現する中範囲秩序構造のモデル構築を試みた。しかし、大量に撮影された電子回折パターンのほとんどは方位のずれのため、対称的なパターンになっておらず、ある一部分からしかモデル構築に適したデータが得られないこともわかった。また、この電子回折の方法では元素種の区別がつかないため、短範囲の局所構造は第一原理分子動力学法で得られたものを使用する必要があった。このような困難さはあるものの、各領域から得られる電子回折パターンを再現する局所構造を見出し、それらを組み合わせることで全体のデータと矛盾のない中範囲秩序構造を構築することができた。今回行ったモデリングは実空間での位置情報を含んでいるため、局所構造の空間的な広がりが正確に反映されており、より詳細な金属ガラスの構造的特徴を捉えられる手法であると思われる。26年度が最終年度であるため、記入しない。材料科学26年度が最終年度であるため、記入しない。

本年度は、ほぼ当初の計画通り、ディフラクションマッピングの適切な実験条件の探索を行い、実際にある程度信頼できるマッピングを得ることができたため。昨年度の課題であった技術的な問題がクリアでき、良好な電子回折マップを広範囲から得られるようになったため。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り、次年度は深さ分解STEMマッピング法の開発へ移行する。これと並行して、本年度取り組んだディフラクションマッピングの精度の向上にも注力する予定である。次年度は、電子回折マッピングをもとにした構造モデリングを引き続き行う。それと並行して深さ分解STEMマッピング法の開発も進める予定である。本年度の使用額が予定をわずかに下回ったため、翌年度に充当することとなった。大幅な予定の変更はないが、翌年度の研究費と合わせて、小額物品費、消耗品費、および旅費に充てる予定である。端数の106円の用途がなく使いきれなかったため。次年度予算と合わせて購入希望物品に使用する。
水中ランニングの運動処方に関する学際的研究

本研究では、種々の歩数条件下および最大運動条件下での、水中および陸上ランニング時の生理学的応答、生体力学的応答および主観的運動強度に関する研究を実施した。その結果、水中ランニング時の歩数の変化は、下肢筋活動動態(大腿直筋、大腿二頭筋、前脛骨筋および腓腹筋)に影響を及ぼす可能性が示唆された。さらに、運動負荷試験を実施する環境(水中および陸上)の変化は、最大運動時の生理学的応答(酸素摂取量や心拍応答)および生体力学的応答(下肢筋活動および歩数)に影響を及ぼす可能性が示唆された。平成25年度には、水中および陸上ランニング時の生体応答に関する以下の研究を行った。本研究の目的は、最大運動条件下での、水中ランニング時のバイオメカニクス的応答、生理学的応答および主観的運動強度(Rating of Perceived Exertion (RPE))を、陸上ランニング時のそれらと比較検討することであった。健常成人11名に対して、プールおよび陸上トレッドミルにおいて、運動負荷試験を実施した。各被験者における最大運動条件下での水中および陸上ランニング時の生理学的応答(酸素摂取量および心拍数)、RPE、バイオメカニクス的応答(筋活動および関節角度)、速度および歩数を測定した。筋活動測定での被験筋は、右側の大腿直筋、大腿二頭筋、前脛骨筋および腓腹筋の4筋であった。また、運動試験実施前に、各筋の最大随意収縮の測定を実施した。その結果、最大運動条件下での、水中ランニング時の酸素摂取量、心拍数、下肢筋活動量および歩数は、陸上ランニング時と比較して、有意に低かった。しかしながら、最大運動時でのRPEには、水中および陸上ランニング間で、有意差はみられなかった。これらのことから、運動負荷試験を実施する環境(水中や陸上)は、最大運動時の生理学的応答およびバイオメカニクス的応答に影響を及ぼす可能性が示唆された。本研究結果は、現在、詳細な解析を進めており、学術論文として国際誌に投稿準備中である。また、平成25年度には、平成24年度に実施した、種々の歩数条件下での、水中および陸上ランニング時のバイオメカニクス的応答およびRPEに関する研究論文の執筆も行った。本研究成果は、既に国際誌に投稿中である。平成24年度には、水中ランニングの運動処方に関する以下の研究を行った。本研究の目的は、種々の歩数条件下での、水中ランニング時の筋活動を、陸上ランニング時のそれと比較検討することであった。健常成人11名に対して、プールおよび陸上トレッドミルにおいて運動試験(ランニング)を実施した。はじめに、被験者の自己選択速度・ペースでの水中および陸上ランニング時の歩数(PSF)を測定した。得られたPSF値に基づいて、種々の歩数条件下(PSF、PSF ±5%、10%および15%)での各運動中の筋活動を測定した。被験筋は、右側の大腿直筋、大腿二頭筋、前脛骨筋および腓腹筋の4筋であり、運動試験実施前に各筋の最大随意収縮の測定を実施した。その結果、水中ランニング時のPSFは、陸上ランニング時よりも低かった。また、水中におけるPSFでのランニング時の下肢筋活動量は、陸上におけるPSFでのランニング時と比較して、低い傾向がみられた。さらに、水中および陸上ランニング時の歩数の変化は、下肢筋活動量に影響を及ぼす可能性が示唆された。また、平成24年度には、同一の歩数条件下での、水中ランニングおよび陸上ランニング時の筋活動に関する研究論文の執筆も行った。本研究成果は、Gait and Posture誌に掲載された。さらに、平成24年度には、平成23年度に実施した同一の生理学的条件下(同一の心拍数)での、水中ランニングおよび陸上ランニング時の筋活動動態に着目した研究のデータ解析および論文の執筆も行った。本研究成果は、既に、International Journal of Sports Medicine誌に掲載が受理されている。本年度に実施した研究結果に関しては、データ解析が完了しつつあり、既に、学術論文として国際誌への投稿準備を進めているため。今後も、継続して、水中ランニングの運動処方の開発に寄与するための学術的研究を実施する。該当なし
卵膜ライシンの作用機構およびその種特異性について

バテイラの卵膜ライシンについては,全アミノ酸配列およびそれより推定された二次構造,さらに化学修飾法によって決められた活性部位が明らかにされている.これに加えて,この卵膜ライシンの卵膜における結合部位の構造の決定を行なうために次のような実験を試みた.アルカリ分解によって可溶化された卵膜はライシンの卵膜に対する溶解反応を完全に阻害する.この阻害活性を指標にして,この可溶化した卵膜をStaphylococcus aureus V8プロテアーゼ・キモトリプシン消化とトリフロロメタンスルホン酸での脱糖処理によって細分画した結果, N-アセチルグルコサミンと比較的に疎水性のアミノ酸を多く含む分子量90,000の糖蛋白分画が得られた.プロナーゼ消化とグリコペプチダーゼA消化によって,この分画の阻害活性が失われるので,この結合部位にはN-グリコシド結合によるN-アセチルグルコサミンとアスパラギンを含む特異的なアミノ酸配列が必須と思われる.更に細分画したのち,溶解阻害活性をもつ最小の分画を決めてこの一次構造を明らかにする予定である.又,ライシンの抗体を用いて,プロティンA-ゴールド法により免疫細胞組織化学的に卵膜上のライシンの結合部位を決める.これらのデータを総合して,バテイラのライシンの作用機構が分子レベルでどのように考えられるかを検討する予定である.軟体動物の卵膜ライシンは、受精の際に精子の先体反応に伴って溶出されて卵膜を非酵素的に溶解する。最もよく研究の進んでいるバティラの卵膜ライシンは、我々の手で全アミノ酸配列を決定され、活性部位も含めた立体的配置も明らかにされている。卵膜上のライシンの結合部位を明らかにする事でライシンの卵膜溶解機構を分子レベルで明らかにしようとして、次のような実験を行なった。バテイラライシンは、卵膜と化学量論的に反応し、不可逆的に結合する事が知られているので、この性質を利用して卵膜のライシン結合活性とした。バテイラ卵膜は、アルカリ分解する事によって可溶化される。この可溶化された卵膜は元の卵膜と同様にライシンと不可逆的に結合する能力をもつ。この可溶化された卵膜をプロナーゼ消化するとこの結合活性は消失し、Staphylococcus aureus V8プロテアーゼ消化、過沃素酸々化及びアーモンドのGlycopeptidase消化ではこの活性は保持された事から、卵膜のタンパク部分がライシン結合部位である可能性が高い。V8プロテアーゼ処理した卵膜を細分画し、それぞれの分画が結合活性を持つか否かを検べ、このうちの活性を持つ分画をプロナーゼ処理する事でそのペプチド部分のちがいを明らかにしたいと思っている。卵膜中の糖部分も何らかの働きをしているように思われるので、これについても詳しくデータを検討中である。バテイラの卵膜ライシンについては,全アミノ酸配列およびそれより推定された二次構造,さらに化学修飾法によって決められた活性部位が明らかにされている.これに加えて,この卵膜ライシンの卵膜における結合部位の構造の決定を行なうために次のような実験を試みた.アルカリ分解によって可溶化された卵膜はライシンの卵膜に対する溶解反応を完全に阻害する.この阻害活性を指標にして,この可溶化した卵膜をStaphylococcus aureus V8プロテアーゼ・キモトリプシン消化とトリフロロメタンスルホン酸での脱糖処理によって細分画した結果, N-アセチルグルコサミンと比較的に疎水性のアミノ酸を多く含む分子量90,000の糖蛋白分画が得られた.プロナーゼ消化とグリコペプチダーゼA消化によって,この分画の阻害活性が失われるので,この結合部位にはN-グリコシド結合によるN-アセチルグルコサミンとアスパラギンを含む特異的なアミノ酸配列が必須と思われる.更に細分画したのち,溶解阻害活性をもつ最小の分画を決めてこの一次構造を明らかにする予定である.又,ライシンの抗体を用いて,プロティンA-ゴールド法により免疫細胞組織化学的に卵膜上のライシンの結合部位を決める.これらのデータを総合して,バテイラのライシンの作用機構が分子レベルでどのように考えられるかを検討する予定である.
メタゲノム解析を応用したインプラント周囲炎の病態解明

細菌叢(細菌の多種多様な集合)の解析はすべての細菌、特に培養することが出来ない細菌の検出および遺伝子情報を入手することが可能であり、その菌種組成および細菌叢機能解析を行うことが出来る非常に有効な方法である。したがって、細菌が原因である感染症の一つであるインプラント周囲炎の病態を明らかにするため、インプラント周囲の細菌叢の解析を行った。しかし、本研究においてインプラント周囲炎に特徴的な細菌の組成及び機能を発見するには至らなかった。口腔内細菌叢(マイクロバイオーム)のシークエンス解析はすべての細菌、特に培養することが出来ない細菌の検出およびゲノム情報を入手することが可能であり、その菌種組成および細菌叢機能解析を行うことが出来る非常に有効な方法である。インプラント周囲炎は細菌が原因である感染症の一つであり、その病態や治療法は明らかとなっていない。したがって、本研究の目的は健常成人におけるマイクロバイオームのシークエンス解析を行い、その菌種組成および細菌叢機能を明らかにすることである。さらに、それらをインプラント周囲炎の罹患者におけるマイクロバイオームの解析結果と比較して特徴を明らかにし、その病態を解明することである。H26年度は正常歯周組織および正常インプラント周囲組織のマイクロバイオーム解析を行うことを目的として研究を行った。被験者として健常成人10名をそれぞれ選択し、歯周組織もしくはインプラント周囲組織からプラークを回収し、核酸の抽出を行った。その後のマイクロバイオームの解析は未だ途中であり、結果は出ていない。口腔内細菌叢(マイクロバイオーム)のシークエンス解析は全ての細菌、特に培養することの出来ない細菌の検出及びゲノム情報を入手することが可能であり、その菌種組成及び細菌叢機能解析を行うことが出来る非常に有効な方法である。インプラント周囲炎は細菌が原因である感染症の一つであり、その病態や治療法は未だ不明な点が多く存在する。したがって、本研究の目的は健常成人におけるマイクロバイオームのシークエンス解析を行い、その菌種組成及び細菌叢機能を明らかにすることである。H27年度はH26年度に引き続き、正常歯周組織及び正常インプラント周囲組織のマイクロバイオーム解析及びインプラント周囲炎組織のマイクロバイオーム解析を行うことを目的として研究を行った。被験者としてインプラント周囲炎患者8名を選択し、インプラント周囲組織からプラークを回収し、核酸の抽出を行った。その後のマイクロバイオームの解析は未だ出来ておらず、結果は出ていない。H26年度に予定していたサンプルの回収は概ね終了したが、次世代シークエンサーの使用が困難であり、マイクロバイオームの解析結果がうまく得られていないため。申請者は口腔内細菌叢(マイクロバイオーム)に関連したインプラント周囲炎の病態解明を目指している。マイクロバイオームのシークエンス解析はすべての細菌、特に培養することが出来ない細菌の検出およびゲノム情報を入手することが可能であり、その菌種組成および細菌叢機能解析を行うことが出来る非常に有効な方法である。米国国立衛生研究所が設立した研究者らからなるコンソーシアムにより、健常者の正常微生物群の構成が初めて明らかにされ、ほぼ全てのヒトは、病原性をもつ微生物を保持しているが、健常者において病原微生物は疾患を引き起こすことはなく、単に宿主に生存するマイクロバイオームと共存するだけであることが明らかになった。本研究では、患者のプラークを採取して核酸を採取し,菌種組成解析と細菌叢機能解析から、下記のことを明らかにできた。1健常な歯周組織およびインプラント周囲組織のマイクロバイオームの分析を行って、菌種組成および細菌叢機能の検索を行った。2炎症のあるインプラント周囲組織のマイクロバイオームの分析を行い、菌種組成および細菌叢機能を検索した。H26年度に予定していたサンプルの回収は概ね終了したが、次世代シークエンサーの使用が難しく、未だマイクロバイオームの解析がうまくできていないため。当初の計画通りサンプルの回収を行うと同時に、次世代シークエンサーの使用方法の習熟に努める。インプラント周囲の侵出液中に含まれるタンパク質についても分析を行う。補綴・理工系歯学当初の計画通りサンプルの回収を行うと同時に、次世代シークエンサーの使用方法の習熟に努め、研究を進めていく。計画通り、使用したが少額の残金が発生したため次世代シークエンサーに関わる経費をあまり使用しなかったため。従来の計画通り使用するH26年度に使用できなかった経費はH27年度における次世代シークエンサーの使用に関わる経費に使用する予定である。
敗血症性脳症の非侵襲計測と分子病態の統合解析による積極的治療介入の再考察

本研究の目的は救急医療の現場において重症敗血症の生存者におこる敗血症性脳症に焦点を当てる。有効な生体指標を見出し、敗血症性脳症の積極的治療介入方法を探索することにより、従来の対症療法を主とした治療法を再考察する。本年度は、当初の研究計画に基づき、敗血症性脳症の網羅的統合解析から敗血症性脳症の分子病態解明に役立つ新たな生体指標を見出した。具体的には下記の実験を行った。マウスを正常群、病態群、治療介入群にわけ、脳の海馬を摘出した。脳の海馬は敗血症患者がしばしば呈するせん妄症状において変化が顕著という先行研究がある。本研究では病態誘導、治療介入は炎症誘発物質を腹腔内投与し24時間後に治療介入を加えた。各々の標本群からタンパク質を抽出し、溶解液に懸濁させる。各標本の基準タンパク質量をそろえたのち、脱塩処理、フィルター処理等を経て質量分析計(LC-MS;サーモサイエンティフィック社製、QExclusive)を用いて病態および治療介入により顕著にタンパク質量が変動する分子群を測定した。その結果、2014種類の変動するタンパク質を見出した。標準タンパク質によりデータをノーマライズした結果、98種類のタンパク質群が病態誘導によりその発現量を顕著に変化させることがわかった。またそれらのタンパク質群は治療介入により正常群と同じレベルに回復することも分かった。98種類のタンパク質群は、それぞれ脳のイオンチャネル制御、可塑性の制御、オートファジー制御などの分子群を含んでいた。さらに、これらのタンパク質群の中にはこれまでの研究で着目されなかった多くのタンパク質群を含み、新しい生体指標が見出されることが期待される。以上の測定および解析は理化学研究所脳神経科学センター(CBS)のRRDユニットの支援を受けて行った。最後に本年度の研究に関わる報告は原著論文3報、総説1報、学会発表2報を国際誌等に報告した。本年度は研究課題2年目である。当初の研究計画では敗血症性モデルマウスを用い、超音波などによる迷走神経刺激により脳症の治療介入効果を検討し、さらにmRNAあるいはタンパク質等の網羅的分子機能解析から新しい治療介入に関わる生体機能分子を探索するというものであった。本年度は、まず治療介入効果を炎症時に体内で上昇する炎症性サイトカイン(インターロイキン1,インターロイキン6など)の数値変化から確認した。次に、生体機能分子は最終的にタンパク質の異常という形で脳機能障害を引き起こすと仮説を立て、その仮説を検証するため、タンパク質分子の網羅的機能解析を行った。研究実績の概要の欄でも述べたが、最終的に98種類の新しい機能候補分子が見出され、現在、共同研究者とともに議論を重ねつつ、最も有効な機能分子群を選定する段階まで来ている。以上の状況を鑑みるに現在までの進捗状況は極めて順調であるといえる。これまでの研究により、非侵襲による生体の観察手段、治療介入の有用性、また治療加入による生体機能分子群がわかりつつある。今後はこれらの研究成果に基づき、3つの研究構想を考えている。一つ目は非侵襲計測の適用可能性である。しかし、これについては現段階ではこれ以上の進展は難しいと言わざるをえない。その理由は、現時点では空間解像度やシグナルノイズ比の問題からこれ以上の計測精度を上げることが難しいからである。二つ目は、治療介入の有用性である。本治療介入方法は、迷走神経を非侵襲で刺激し、過剰な炎症反応を抑えつつ、機能回復を測る手段を重層化していくというものである。すでに抗炎症効果は見出されているが、最終的にヒトの患者さんに応用することを想定することを鑑みるに、様々な角度から安全性を検討する必要があると考える。例えば、迷走神経反射による徐脈がおこらないかどうかなどを心電図などで慎重に検討する必要があると考えており、本年度はそれらを含めて検討を重ねていく予定である。最後に、3つ目であるが、敗血症性脳症に関わる新しい機能分子を(もし可能であれば)、活性制御し、実際に治療介入効果が同等にあるのかどうかを検討していく。仮にもし現時点で(最適な薬剤がないなどの理由により)難しいのであれば、既知の炎症性分子を可視化し、脳または腹腔内の免疫細胞において治療介入前後で炎症マーカーが実際に変化しているかどうかの検討を重ねていく。腹腔内を想定したのは、敗血症モデルマウスの原発巣は腹腔内にあることが多く、そこからの多種多様な免疫細胞群の動態が病態を引き起こしていると考えられているためである。このように、今後の推進方策としては当初の研究計画書で示した通り、「転んでもただではおきない」を念頭に置き、多種多様な研究手法を組み合わせて相乗的な研究成果を実現していくつもりである。H29年度は、研究計画の最初の事業年度である。そのため、前年度の研究準備状況に基づき、まず第一に敗血症性脳症の病態をマウスで再現し、実験系において再現できるかどうかを検証し、その後の研究の進展が可能かどうかを検討した。一つ目としては、研究計画書にも記載された通り、敗血症性脳症に関わる病態の可視化をin vivoで可能かどうか調べた。その結果、敗血症を誘導し、20hrを経過したマウスにおいて、ELISA法にて測定したところ、炎症のマーカとなるインターロイキン1、またインターロイキン6が増加し、敗血症が起きており、その経時的変化から敗血症性脳症が起きていることが考えられた。

次に、当初の研究計画書に基づき、近赤外領域の蛍光発光を示す量子ドットを病態マウス尻尾の静脈より注入し、脳血管の状態を可視化した。その結果、敗血症脳症時に起こると考えられる播種性血管内凝固症候群(DIC)が観測され、血栓様の構造に関して、顕著な増加が見出された。以上のことから、本実験系は過去の結果を十分に再現しており、この後の研究計画の進捗に有意な結果であることが示唆された。そこで二つ目の実験を行った。分子病態の網羅的な解析からヒトの病態を反映した敗血症性脳症の新しいバイオマーカーの探索を行うべく、ヒト人工性多能性幹細胞(human ips cell)を用い、リポポリサッカライド(LPS)を投与群と非投与群を対象にmRNAの網羅的解析を行った。しかし、得られた結果は当初の予想に反し、炎症以外の未知のマーカーが顕著に変化し、解釈が難しい状態である。本結果については、次年度以降、別の系を導入し、検討を加える予定である。当初の研究計画書に書かれた通り、本年度においては当初の研究計画が有効かどうかを検証し、さらに分子病態の可視化につながる検討を行う予定であった。しかし、本年度は予想外のことが多く重なり、研究代表者が所属先を理研から大阪大学に変更すること、また、研究分担者の大幅変更を余儀なくされたため、一時的に研究の進展が見込めないと予想された。しかし、結果としては、二つの大きな実験系の検討を行うことができた。そのため、自己点検としてはおおむね順調に進展していると判断した。本研究の目的は救急医療の現場において重症敗血症の生存者におこる敗血症性脳症に焦点を当てる。有効な生体指標を見出し、敗血症性脳症の積極的治療介入方法を探索することにより、従来の対症療法を主とした治療法を再考察する。本年度は、当初の研究計画に基づき、敗血症性脳症の網羅的統合解析から敗血症性脳症の分子病態解明に役立つ新たな生体指標を見出した。具体的には下記の実験を行った。マウスを正常群、病態群、治療介入群にわけ、脳の海馬を摘出した。脳の海馬は敗血症患者がしばしば呈するせん妄症状において変化が顕著という先行研究がある。本研究では病態誘導、治療介入は炎症誘発物質を腹腔内投与し24時間後に治療介入を加えた。各々の標本群からタンパク質を抽出し、溶解液に懸濁させる。各標本の基準タンパク質量をそろえたのち、脱塩処理、フィルター処理等を経て質量分析計(LC-MS;サーモサイエンティフィック社製、QExclusive)を用いて病態および治療介入により顕著にタンパク質量が変動する分子群を測定した。その結果、2014種類の変動するタンパク質を見出した。標準タンパク質によりデータをノーマライズした結果、98種類のタンパク質群が病態誘導によりその発現量を顕著に変化させることがわかった。またそれらのタンパク質群は治療介入により正常群と同じレベルに回復することも分かった。98種類のタンパク質群は、それぞれ脳のイオンチャネル制御、可塑性の制御、オートファジー制御などの分子群を含んでいた。さらに、これらのタンパク質群の中にはこれまでの研究で着目されなかった多くのタンパク質群を含み、新しい生体指標が見出されることが期待される。
線虫C.elegansの嗅覚学習をモデルとした忘却の制御メカニズム

動物の神経系では、入手した情報の重要性に応じて記憶の形成・保持・忘却が適切に制御されている。必要な記憶を保持する一方で、不必要な記憶を忘れることは、常に変化する環境に適応するためのみならず、不必要な記憶の蓄積により必要な記憶の想起が阻害されることを防ぐためにも重要である。本研究では線虫C.elegansの嗅覚学習を用いて、忘却の制御メカニズムの解析を行った。カルシウムイメージングや行動解析により、シナプス放出に関わる分子が神経回路上で嗅覚学習の忘却を制御していることが明らかになった。線虫C.elegansを用い「記憶の忘却」のメカニズム解明に向けて、SNT-3が神経回路上で忘却を制御する仕組み、特に感覚神経と介在神経の間でやりとりされる神経伝達に注目し、SNT-3による忘却制御に関わる神経回路を明らかにすることを目的としている。野生型個体を用いたカルシウムイメージングでは、ブタノンエンハンスメントにより誘起されたAWC感覚神経の強い感覚応答が記憶を忘れさせた後も維持されていたことから、ブタノンを感知するAWC感覚神経より下流の神経で可塑的な変化があると予想された。また、snt-3変異体ではブタノンエンハンスメントの記憶が野生型に比べ長く続くが、これが感覚応答の変化によるものかをカルシウムイメージングにより解析した。その結果、snt-3変異体でもAWC感覚神経の感覚応答は野生型と同様の傾向を示すことが分かった。さらに、ブタノンエンハンスメントの記憶が消去されない条件下で飼育した線虫の感覚応答を解析したところ、記憶の有無に関わらずAWC感覚神経の感覚応答に違いは認められなかった。このように、行動レベルと感覚応答レベルで異なる結果が得られており、ブタノンを感知するAWC感覚神経より下流の神経で可塑的な変化があることが強く示唆された。現在、ブタノンエンハンスメントの記憶を制御する神経回路を明らかにするため、AWC感覚神経の下流にある介在神経についてカルシウムイメージングを行っている。カルシウムプローブの種類、匂い物質の濃度や刺激時間等を変化させ最適なイメージングの条件設定を行い、忘却が起きた際に可塑的な変化を示す神経細胞の同定を試みている。また、人為的に介在神経の神経活動を操作した遺伝子導入個体を作成し、その行動測定を行った。神経活動の操作が記憶の忘却に与える影響を解析し、ブタノンエンハンスメントの忘却に関わる介在神経の候補を推測している。カルシウムイメージングでは、ブタノンエンハンスメントにより誘起されたAWC感覚神経の強い感覚応答が記憶を忘れさせた後も維持されていたことから、ブタノンを感知するAWC感覚神経より下流の神経で可塑的な変化があると予想された。本年度は、SNT-3変異体の別アリル株を用いてカルシウムイメージングを行った。その結果、これまでの結果と同様の傾向が得られ、SNT-3の忘却に対する働きが神経回路の中にあることを確かめることができた。また、細胞特異的レスキュー実験により、SNT-3が頭部神経細胞で機能することも明らかとなった。線虫C.elegansを用い「記憶の忘却」のメカニズム解明に向けて、SNT-3が神経回路上で忘却を制御する仕組み、特に感覚神経と介在神経の間でやりとりされる神経伝達に注目し、SNT-3による忘却制御に関わる神経回路を明らかにすることを目指した。カルシウムイメージングにより、AWC感覚神経下流のいくつかの介在神経で野生型とsnt-3変異体で神経応答に差が見られる場所の探索を行った。このうち、AIB介在神経においては、野生型もsnt-3変異体も同様の応答が観察された。さらに、AIB介在神経の神経活動を人為的に抑制した線虫では、snt-3変異体のように記憶が長続きする傾向があることが明らかとなった。以上より、AIB介在神経が忘却において重要な働きをすることが示唆され、より下流の神経細胞で可塑的な変化があることが予想された。ブタノンエンハンスメントの忘却には「餌シグナル」の関与が重要であることが示唆されていたため、餌の有無による感覚応答の変化をカルシウムイメージングにより解析した。その結果、snt-3変異体では餌の感知が異常になっている可能性があると考えられたが、pumping回数を指標に餌の感知の有無を解析したところ、snt-3変異体でも正常に餌を感知していることが明らかとなった。続いて、snt-3変異体が、他の行動においてもブタノンエンハンスメント記憶のように記憶が長く続くか否かを解析した。

匂い物質イソアミルアルコール、ジアセチルに対する嗅覚順応および、塩走性学習の記憶の保持時間は野生型と同様で、snt-3変異体で忘却異常は観察されなかった。これまでのところsnt-3変異体においてブタノンエンハンスメントの記憶の保持時間以外の異常は見つかっておらず、SNT-3がブタノンエンハンスメントの忘却に関わる情報処理においてユニークなシナプス放出制御を行っていることが予想された。動物の神経系では、入手した情報の重要性に応じて記憶の形成・保持・忘却が適切に制御されている。必要な記憶を保持する一方で、不必要な記憶を忘れることは、常に変化する環境に適応するためのみならず、不必要な記憶の蓄積により必要な記憶の想起が阻害されることを防ぐためにも重要である。本研究では線虫C.elegansの嗅覚学習を用いて、忘却の制御メカニズムの解析を行った。カルシウムイメージングや行動解析により、シナプス放出に関わる分子が神経回路上で嗅覚学習の忘却を制御していることが明らかになった。カルシウムイメージングと遺伝学的解析により、忘却を制御する神経回路の解析を進めている。生物学カルシウムイメージングと分子遺伝学的解析を用いて、SNT3によるブタノンエンハンスメントの忘却の制御機構を明らかにしていく。また、餌と忘却の関係性について解析を行う予定である。計画通りカルシウムイメージングと遺伝学的解析により、忘却を制御する神経細胞の同定を進めている。おおむね順調に進展していると考えている。当該年度は所属研究室にある設備を利用できたため、差額が生じた。また、育児により出張が制限されたため、旅費を使用できなかった。引き続きブタノンエンハンスメントの忘却を制御する神経回路の同定を行う。また、SNT-3が忘却過程で制御する標的分子をサプレッサースクリーニングにより探索する。新しく実験室を整備するため、顕微鏡等の設備購入を考えている。消耗品として実験動物の飼育道具や分子生物学用試薬の購入を予定している。当該年度は既に所属研究室にある装置を使用でき、消耗品のストックが十分にあったため、新たに購入する必要がなかった。また、出産育児のために実験を中断した期間があり、旅費を使用できなかった。実験サンプル数が増えるため、低温インキュベーターを購入予定である。また、消耗品として実験動物の飼育道具や分子生物用試薬の購入を予定している。
ホルモン依存性プログラム細胞死の開発と応用

1研究目的本研究は、プログラム細胞死を脂溶性ホルモンにより自由にコントロールしうるシステムを作り出すこと、更にこのシステムを応用発展させることにより、全く新しい癌の遺伝子療法を確立することを目的としている。2研究成果fas抗原受容体のプログラム細胞死に必須な蛋白領域とエストロジェンホルモン受容体もしくはレチノイン酸受容体のリガンド結合領域を結合した融合蛋白質をコードする融合遺伝子を作出し、fas抗原に感受性があることが知られているL929細胞及びHeLa細胞に恒常的に発現するように導入した。得られた細胞株に、導入した融合遺伝子の受容体部分に対応するリガンド(エストラヂオール、レチノイン酸)を加えたところ、どちらの細胞においても0.1nMのエストラヂオール、10nMのレチノイン酸で処理後3時間ですべての細胞が死滅することが観察された。つまり、現時点で少なくとも培養細胞レベルにおいて脂溶性ホルモンによりプログラム細胞死を自由にコントロールしうるシステムの確立に成功した。現在、遺伝子導入したL929細胞及びHeLa細胞をヌードマウスに移植しin vivoにおいても細胞死が脂溶性ホルモンにより誘導されることを確認する実験を行っている。また、このシステムに感受性のあるヒト癌細胞株を系統的にスクリーニングしているところであり、これにより将来的に治療の標的となりうる癌の種類が特定できると考えている。さらに、in vivoの癌細胞に効率よく融合遺伝子を導入するために、レトロウイルスおよびリポゾームを用いる方法を検討している。
脂肪由来細胞を用いた腎疾患治療の開発-再生促進作用と免疫抑制作用の融合-

我々の研究の最終ゴールは脂肪由来間葉系幹細胞(ASC=adiposetissue-derived stem/stromal cell)の再生促進作用と免疫抑制作用を融合し腎疾患に対する新たな細胞治療を開発することである。本研究はそのための基盤研究と位置づけられる。In vitroでのT細胞抑制およびin vivoでの異種抗原に対する抗体産生といったモデル、つまりLASCの免疫抑制作用を定量する系が確立された。このことは、今後LASCの免疫抑制作用に関する分子機序を解析を加速するものと期待される。脂肪には多くの幹細胞が存在することが明らかとなり、再生医療における細胞ソースとして脂肪組織が注目されている。我々は脂肪由来幹細胞を含む細胞集団(SVF=stroma vascular fraction)を培養せずに腎局所に投与することで腎再生が促進されることを見出した。また我々は、低血清培養法を用いることで、脂肪から高い増殖能を有する間葉系幹細胞(MSC=mesenchymal stem cell)を選択的に培養することに成功した。この細胞は動物実験において良好な腎再生促進効果を示す。さらに我々は脂肪由来MSCが強い免疫抑制作用を有することを見出した。本研究の最終的なゴールは脂肪由来幹細胞の再生促進作用と免疫抑制作用を利用し、腎臓病に対する新たな細胞治療を開発することである。今年度は以下のような研究成果を得た。(1)SVF細胞の治療効果の解析:シスプラチン腎症においてSVFが腎機能を改善させるが、その際の再生促進分子を検討したところ、VEGFやHGFが同定された。特に脂肪由来細胞はHGF分泌を介して、尿細管細胞に対する増殖促進作用、抗アポトーシス作用を呈することが明らかとなった。(2)AKIモデルでの培養脂肪由来MSCの治療効果:AKIモデル(葉酸腎症)での治療的効果につき、腎臓再生促進因子に関して解析した。低血清MSCは高血清MSCと比較して、有意に腎機能を改善させた。この腎保護作用にはVEGFとHGFが有効に作用していることが明らかとなった。(3)糸球体腎炎モデルでの培養脂肪由来MSCの治療効果:抗糸球体腎炎モデルに低血清MSCを投与したところ、腎機能が有意に改善した。この作用には、免疫調整作用が関与していることが明らかとなった。(4)免疫抑制に関するin vivo解析:異種抗原に対する免疫反応を検討したところ、低血清MSCは異種抗体産生を強力に抑制することが明らかとなった。この作用には、T細胞抑制を介したB細胞機能抑制が関与していることがわかった。我々は、低血清培養法を用いることで、脂肪から高い増殖能を有する間葉系幹細胞(MSC : mesenchymal stem cell)を選択的に培養することに成功した。この細胞は各種のモデル動物において良好な臓器再生促進効果を示すとともに、強力な免疫抑制作用を有する。我々の研究の最終的なゴールは脂肪由来幹細胞の再生促進作用と免疫抑制作用を利用し、腎臓病に対する新たな細胞治療を開発することである。本研究はそのための基礎的検討を行うことを目的としている。まず、ラットの葉酸腎症(急性腎障害モデル)を用いて治療実験を行った。その結果、低血清培養脂肪由来MSC(LASC)は高血清培養脂肪由来MSC(HASC)や骨髄由来MSC(BMSC)よりも強力に腎機能障害を抑制した。腎病理の検討でも、尿細管障害の抑制およびマクロファージ浸潤の軽減効果が観察された。さらに2週間後の腎線維化をLASCはHASCよりも強力に抑制した。投与ルートに関しても検討したところ、静脈内では有意な効果が得られず、腎被膜下投与でのみ有効であった。続いて、腎保護効果の分子機序を明らかにするための実験を行った。我々はこれまでにin vitroの系でLASCではHASCと比較してHGFとVEGFの分泌量が格段に高いことを見出している。今回は治療実験の腎組織を用いてHGFとVEGFの発現量をEUSAで検討した。LASC投与群ではHASC投与群と比較してHGFとVEGFが有意に高い値を示した。次に、VEGFとHGFに対するsiRNAを用いてノックダウン実験を行った。HGFをノックダウンしたLAscを投与すると治療効果が有意に抑制された。一方、VEGFをノックダウンしたLASCでは抑制は軽度であった。このことから、このモデルではLASCの腎保護作用の少なくとも一部はHGFを介していることが明らかとなった。免疫抑制能に関しては、LASCがHASCと比較してより強力にT細胞増殖を抑制するという結果を得ている。今後、LASCの再生促進作用と免疫抑制作用を有効に利用し、各種腎炎モデルでの検討を進めていく予定である。近年、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC=mesenchymal stem. cell)が組織再生促進作用および免疫抑制作用を有することが明らかとなり臨床応用が進んでいる。我々は、骨髄よりも採取が容易で増殖力も強い脂肪由来間葉系幹細胞(ASC=adipose tissue-derived stem/stlomal cell)に着目して検討を進めてきた。

我々の研究の最終ゴールはASCの再生促進作用と免疫抑制作用を融合し、腎疾患に対する新たな細胞治療を開発することである。本研究はそのための基盤研究と位置づけられる。今回は特にAscの免疫抑制能に関して検討した。In vitroの系では、Ascを高血清(20%)および低血清(2%)条件で培養してリンパ球抑制能につき検討した。末梢血単核球分画をPHAで刺激し、低血清培養ASC(LASC)および高血清培養ASC(HASC)を投与したところ、LASC群ではT細胞増殖抑制作用が観察されたが、HASC共群ではこうした効果は認められなかった。Transwellを用いた検討では、T細胞抑制作用が液性因子に起因することが明らかとなった。一方、B細胞増殖に対する抑制効果はLASC、肌SCともに認められなかった。In vivoの系は、ラットにブタ赤血球を投与する異種移植モデルを用いた。このモデルに対し、骨髄由来MSC、HASC、LASCを経静脈的あるいは腹腔内に投与した。静脈内に投与したLASCのみが有意な異種抗体産生抑制効果を呈した。本研究では、in vitroでのT細胞抑制およびin vivoでの異種抗原に対する抗体産生といったモデル、つまりLASCの免疫抑制作用を定量する系が確立された。このことは、今後LASCの免疫抑制作用に関する分子機序を解析する上で大きな意義を持つ。今後網羅的な解析により得られた候補分子は、今回の研究で確立した系で評価することが可能となる。このことは今後の研究を加速するものと期待される。
高エネルギーエレクトロンとラジカルによる水中環境汚染物質の分解除去

平成1113年度の研究によって次のような成果が得られた。(1)低導電率水溶液中で二段階放電破壊現象が生ずることを発見した。コンデンサに蓄積された電荷が放電する際に、いったん生じたストリーマ放電が休止し、ある時間をおいて次の放電が再び生ずる現象である。この現象は水の導電率に大きく影響し、導電率が15μScm^<-1>以下でコンデンサ容量が4nF以上の時に観察された。また、ある範囲内の印加電圧の場合でのみ発生した。一回の放電で二段階のラジカル生成が期待でき、有機物質の分解に有効に作用するものと思われる。(2)水中パルス放電は電極間距離と水の導電率によってモードが異なることを発見した。電極間距離を変化することによって、ストリーマ、スパーク、スパークとストリーマ混合放電の三つのモードが観察され、それぞれのモードでのメカニズムの違いから、結果として活性種と紫外線の生成量が大きく異なることを、発光分光分析とフェノール分解の結果から明らかにした。(3)三つの水中パルス放電モードを用いて、有機物質としてのフェノールの分解と染料の脱色を試みた。フェノールの分解では放電モード、印加電圧、ガスバブリング及び過酸化水素の添加効果について検討した。さらに、染料の脱色では放電モード、染料の濃度、水溶液のpH、及び過酸化水素添加の脱色率への影響について検討し、それぞれに最適値があることを明らかにした。(4)反応有効容積を広くするために、リングと円筒電極を使用した新しい放電反応器を開発し、反応器の特性と有機物質分解への応用について検討した。有機物質の反応特性については、電極構成、印加電圧極性と水溶液の導電率に大きく影響された。本電極形状を用いることにより、広域にストリーマ放電を生成することができ、リングの本数と円筒の長さを増加することにより、今後の実用的プラズマ反応器としてのスケールアップが期待できる。水中プラズマによって生成する高エネルギーエレクトロンと各種ラジカルによる、水中微量環境汚染物質の分解除去に関する実験的研究を行った。水中プラズマは、高電圧パルスを水中におかれた針対平板、ならびにその発展した形状として強度な不均一電界を形成する形状の電極に印加し、ストリーマコロナ放電およびスパーク放電を生じさせる。本研究においては、それら活性種を高いエネルギー効率で発生させるための放電形式と、有機物質の分解除去を目的としている。本年度においては、水中パルス放電形式として、スロリーマコロナ、スパーク、ならびにスパーク・ストリーマ放電の水中微量フェノールの分解に関する比較検討を行い、三者のそれぞれの特徴を明らかにした。ストリーマ放電においては、放電炉が長く延び、処理体積が大きいという特徴があるが、電子エネルギーが小さく、フェノールノ分解効果が他に比較して低い。一方、スパーク放電では発生する紫外線の効果の割合が大きくなり、紫外線は大きなエネルギーを有するため、分解効果は高いが放電炉が短く処理範囲が狭い。スパーク・ストリーマ放電は、両者の組合わせであり、放電炉を長くとれるとともに、発生する高エネルギーの電子と紫外線を効果的に有機分解に利用することができることがわかった。以上の実験効果を基に、今後は、さらに電界集中の可能な、放電領域を広く取れる形状の電極システムを試作し、さらなる容積効果ならびにエネルギー効率の向上を図り、水環境浄化の先端的な方法のひとつとすることを目指しさらなる開発を進める。水中パルス放電による微量有機物質の分解に関する実験的研究を行った。前年度から引き続き行っている、放電形態による分解速度の変化をさらに詳細にわたって追及した。

すなわち、3つの放電形態、ストリーマ、スパーク、スパーク・ストリーマ放電のうちで、スパーク・ストリーマ放電が水中のフェノールに対して最も大きな分解効果をもつことがわかった。また、現在環境問題としての重要なもののひとつ、染料廃水を模擬した溶液に対しても検討を行った。その結果、染料の種類により分解速度は異なるが、用いた染料5種類すべてについて脱色効果があることがわかった。脱色速度の更なる向上を目指して、過酸化水素を少量添加した。過酸化水は紫外線によって分解され、多量のOHラジカルを発生するためと考えられるが、脱色効果に格段の向上が見られた。フェノール分解の場合には、上記スパーク・ストリーマ放電の形態が最も効果的であったのに対し、染料の場合には、特に格段の効果が見られた過酸化水素添加の場合に、スパーク放電形態が最も脱色が速かったことから、染料の脱色機構はフェノールの場合と異なっているものと考えられ、来年度に向けてのテーマとして進行中である。さらに、物理的現象としてのスパーク・ストリーマ放電の観察により、一回の放電中にストリーマが二段階に進展することを見出した。これは新現象であり、液体の物性や、電源の電気的特性によって変化するが、発光分光を用いた観察により、一回目の放電はストリーマ放電であること、二回目はスパークにいたっていることなどを突き止めた。この現象を利用すれば、有機物の分解効果を向上させることにもつながるため、さらに追求する予定である。本年度においては、水中パルス放電による微量有機物質の分解に関する実験的研究を、実用化の見地から行った。前年度から引き続き行っている、3つの放電形態による分解速度の変化、ならびに物理的現象としての二段階放電に関して、結果の整理を行い、国際学会および国内学会での発表と、論文の投稿を行った。本年度は、実用化に向けての装置条件と操作条件の検討を主として行い、以下に示すような結果を得た。すなわち、従来の針対平板形状電極に替わる新しい形状として、リング対円筒電極を開発した。これは、放電路が一カ所に集中してしまう針対平板型に比較して、リング周辺にわたってより広範囲のプラズマ領域を得ようとするものであり、その効果は十分にあることがわかった。リング対円筒形状電極を用いて、従来法との比較のためにフェノールの分解と染料の脱色を試みた。この電極形状においてもスパーク・ストリーマ放電形態が有機物質の分解に最もエネルギー効率がよいことがわかった。さらに工夫して、円形リングの形状をいくつか変化させた実験的検討を行った。リング周辺形状を円形から星形、すなわち周辺を削り取って210個の突起を持たせた。この突起はプラズマ生成のきっかけを与えるものであり、突起先端の電界強度が増すために放電開始電圧を低下させ、プラズマ領域を広げる効果があった。直接撮影による写真と、有機物質の分解実験結果より、リング対円筒形状電極よりもさらに大幅なエネルギー効率の向上が図れた。3年間にわたる本課題研究によって、水中パルス放電の基礎としてのメカニズムと作用が明らかにされ、環境改善への応用の可能性を示唆した。