hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫の湿度感覚に関わる前大脳高次情報処理についての生理学的形態学的研究

ワモンゴキブリの前大脳の同定可能ニューロンの湿度応答について細胞内記録・染色法によって調べた。その結果、触角葉マルチ出力ニューロン、キノコ体出力ニューロンおよび中心体ニューロンが湿度応答を示し、前大脳側角の局所および出力ニューロンには多様な湿度・温度応答パターンを示した。側角後腹領域の外縁部にも湿度・温度刺激に応答するニューロンがあり、この部分も湿度・温度情報処理の中枢機能をもっていることが示唆された。このほか触角葉糸球体の分布なども明らかにした。本研究は、昆虫脳のおける湿度感覚情報処理の高次神経機構を明らかにすることを目的としている。具体的には、ワモンゴキブリを実験材料として、湿度情報処理に関わる前大脳高次ニューロンを生理学的および形態学的に同定し、その機能的特徴および脳内の経路と投射部域を明らかにすることを目指している。平成22年度に実施した研究の成果は次の通りである。ワモンゴキブリの前大脳ニューロンのうち相対湿度情報がどのように処理されているかを細胞内記録法によって解析した。同定可能ニューロンから湿度刺激・温度刺激・匂い刺激に対する応答を記録し、合わせて細胞内染色によってその形態も調べた。その結果、得られたデータから次のことがわかった。(1)以前にNihinoら(2003)が報告したニューロン以外にも多数の糸球体から情報を受ける触角葉マルチ出力ニューロンが湿度に応答することが明らかになり、その応答パターンは匂いに対する応答パターンとは異なっていた。(2)キノコ体出力ニューロンにも湿度応答を示すものがあった。(3)中心体ニューロンにも相対湿度応答を示すものがあった。(4)前大脳側角局所介在ニューロンや前大脳側角出力ニューロンには多様な湿度・温度応答パターンを示しものがあり、応答特異性が高い傾向が見られた。(5)Nihinoら(2003)に報告されている湿度温度中枢(前大脳側角I、II、III)以外にも側角後腹領域の外縁部にも湿度・温度刺激に応答するニューロンがあり、この部分も湿度・温度情報処理の中枢機能をもっていることが示唆された。平成23年度までの研究においてワモンゴキブリ前大脳にはいくつかの温度・湿度刺激に応答する同定可能ニューロンがあることがわかった。触角葉の出力ニューロンには多くの糸球体から入力を受けるマルチモーダルな出力ニューロンは湿度応答を示し、その応答パターンは匂い刺激に対する応答パターンとは異なる傾向が見られた。また、キノコ体出力ニューロンには明瞭な湿度応答を示すものもあったが、それらのニューロンの応答様式と形態的特徴をもとに分類するまでには至らなかった。23年度の研究では、もう一度原点に戻って、先ず触角葉糸球体の詳細な分布図を作成すると同時に、触角上感覚子の嗅受容ニューロンの軸索投射先である糸球体と湿度受容ニューロンの軸索投射先である糸球体との場所的関係を調べ、糸球体からの前大脳への投射ニューロンの投射先との関係を調べた。その結果、次のことが明らかになった。ワモンゴキブリでは触角神経が2本あるが、その2本の触角神経は触角葉では分枝するので、それぞれの分枝と糸球体との関係に注目しながら、触角葉糸球体地図を試みた結果、糸球体の数は雌雄とも同数で約205個であった。雄には性フェロモン受容ニューロンが投射する大糸球体複合体があるが、雌においても雄の大糸球体複合体と同位置に対応する糸球体があった。このように糸球体の数においては性的な違いはなかった。そのほかの糸球体においても位置に大きな個体差はなく、全糸球体の地図を作成することができた。これは今後の研究を進める上で重要な知見となる。更に、各糸球体に投射する触角感覚子の受容ニューロンとも関係を調べるために、触角感覚子から蛍光染料を取り込ませた。その結果、湿度・温度受容ニューロンだけでなく一部の嗅受容ニューロンと糸球体との関係も明らかになってきた。これは今後更に研究を進める計画である。平成23年度の研究では次のことを明らかにしていた。触角葉糸球体の数は雌雄とも同数で約205個であった。このように糸球体の数には性的な違いはなく、位置にも大きな個体差はなく、全糸球体の地図を作成できた。平成24年度は、糸球体のそれぞれの糸球体に投射する触角上の嗅感覚子の受容ニューロンの投射先を調べた。触角には形態的に区別できる数種類の嗅感覚子があり、それぞれの感覚子に含まれる嗅受容ニューロンの匂い応答スペクトルは、過去の我々の研究わかっていた。各感覚子から蛍光色素を注入し、LSMで観察・撮影し画像処理ソフトで画像処理を施し、各感覚子に含まれる嗅受容ニューロンが投射する糸球体を同定することができた。

嗅感覚子にはクチクラ装置の表面が滑らかなものと縦溝のあるものにわけられ、この外部構造とその感覚子に含まれる嗅受容ニューロンの応答物質の間には一定の関係がある。その投射先もこれに対応して糸球体の大きさと触角葉内での分布域が2群に分かれていることが明らかになった。また、湿度・温度受容ニューロンの投射先の糸球体との関係について調べたところ、この2群の糸球体とはその輪郭が異なり、分布域も2つの糸球体群の中間に位置するなどの特徴があった。これらの糸球体に樹状突起をもつ投射ニューロンなどの投射経路と投射先について異なる個体で得た知見を統合するために、標準脳を作製した。個体が異なると脳の形態にも差がある。これを解消するために数個体の脳の構造を画像処理によって平均化することによって標準化したものを標準脳という。この標準脳にニューロンの投射経路や投射先などの形態学的知見を埋め込むことによって、各ニューロン間の関係を個体差を超えて明らかにすることができる。本研究は、昆虫の湿度感覚に関わる前大脳高次情報処理について明らかにすることを目指す研究であるが、湿度刺激に応答する前大脳のニューロンは湿度刺激だけに応答するものは少数で、マルチモーダルなものが多い。そのため本研究では原点に戻って触角葉糸球体とその投射ニューロンとの関係を見直す必要が生じたため、そのために研究に多くの時間を割かざるを得なかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までに研究で明らかにした触角葉全体の糸球体地図上に各糸球体が処理する匂い情報の種類および湿度・温度情報を対応させる。前大脳の側葉とキノコ体を結ぶニューロンおよびキノコ体の出力性のニューロンのうち、湿度変化の応答するニューロンについて細胞内記録法と細胞内染色法を併用して、その神経回路の解明を目指す。
赤外シュタルク分光法を用いた巨大分子の構造-機能相関の解明

外部電場の印加に伴う赤外吸収スペクトルの変化を検出する赤外電場吸収スペクトル測定システムを製作し,タンパク質をはじめとする凝縮系の巨大分子に応用することを目的としている。本年度は,昨年度測定したα-ヘリックスを示すポリペプチドであるポリ-γ-ベンジル-L-グルタメート(PBLG)の高分子薄膜の赤外電場吸収スペクトルの理論解析を行なった。またPMMAなど他の高分子薄膜の赤外電場吸収スペクトルの測定も同様に行い,さらに赤外電場吸収用の溶液セルを製作し,溶液系への応用も行った。PBLGの赤外電場吸収スペクトルにおいて,各振動バンドは,ゼロ次微分,一次微分,二次微分の線形結合の形を示し,Liptayらによる理論式を用いて再現することができた。振動励起に伴う双極子モーメントの変化(Δμ)は,二次微分の項から求めることができる。N-H伸縮(アミドA)振動,アミドI振動,側鎖のC=0伸縮振動バンドのΔμ値は,それぞれ0.11,0.05,0.06Dであった。他の振動バンドのΔμ値は0から0.03Dの範囲であり,アミドA振動のΔμ値が非常に大きいことがわかる。振動の非調和性の理論から,アミドA振動の大きなΔμ値は,アミドA振動の非調和性に由来することがわかった。一次微分の項から振動励起に伴う分子分極率の変化(Δα)を求めることができ,側鎖のC=0伸縮振動バンドが最も大きく約2.0Å^3であった。このC=0伸縮振動バンドの大きなΔα値は,PMMA薄膜においても同様に観測された。ゼロ次微分の項は外部電場による高分子の配向変化を表しており,PBLGについては,側鎖の振動バンドが骨格の振動バンドよりも大きな値を持つことがわかった。この結果は,電場によって骨格よりも側鎖が大きく配向しているを示している。この電場による配向変化が高分子の配向分極となることから,側鎖の配向変化が,PBLGの誘電率の値に大きく寄与していることがわかる。赤外電場吸収スペクトルの測定は,高分子の誘電率を分子レベルで調べる有効な手法であることがわかる。本研究の目的は,外部電場印加に伴う赤外吸収スペクトルの変化を高感度に検出する赤外シュタルク分光システムを製作し,凝縮系の巨大分子に応用することにある。本年度は,購入したフーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR)に電場変調システムを導入し,赤外シュタルク分光システムの製作を行った。電場変調測定は,位相変調方式と電場のオン・オフによる強度差方式の両方の方法を用いることができるようにした。位相変調方式は,波形発生器と電圧増幅器を用いて,10kHzの繰り返し周波数を持つAC変調の外部電場を試料に印加する。試料を透過した赤外光をMCT検出器を用いて検出し,ロックインアンプに入力する。外部電場に同期した電場変調成分をとりだし,FT-IRに再入力することによって,外部電場による赤外シュタルクスペクトルを得る。電場のオン・オフによる強度差方式は,波形発生器と電圧増幅器を用いて,DC電場を0.1Hzの繰り返しでオン・オフを行う。同期回路を用いて,外部電場とFT-IRの干渉計の移動との同期をとるようにしている。電場オンの赤外吸収スペクトル,オフの吸収スペクトル,その強度差を交互に繰り返し測定・積算し,積算された強度差から赤外シュタルクスペクトルを得ることができる。試料はXYθ軸ステージに固定し,入射角度を任意に変更できるようにし,外部から電場を印加できるように分光器を改良した。また赤外シュタルクスペクトルを自動測定できるように,FT-IR測定プログラムに一部変更を加えた。試料として,タンパク質と同じくペプチド基を骨格に持つポリ(γ-ベンジル-L-グルタメート)(PBLG)の配向膜を用い,ITOとアルミニウムで挟み外部電場を印加した。現在,PBLGのアミドバンドの赤外シュタルクスペクトルを測定し,性能評価を行っている。本研究の目的は、外部電場の印加に伴う赤外吸収スペクトルの変化を高感度に検出する赤外電場吸収測定システムを製作し、タンパク質をはじめとする凝縮系の巨大分子に応用することにある。本年度は、昨年度製作した赤外電場吸収測定システムを用いて、様々な高分子の赤外電場吸収スペクトルの測定を行った。赤外電場吸収測定システムは、rapid-scan型FT-IRを用いて製作し、DC電場(0.2-1.5 MV cm^<-1>)がONの時とOFFの時の差スペクトル(ON-OFF)から赤外吸収スペクトルの電場効果成分(赤外電場吸収スペクトル)を得ることができる。高分子試料は、半透明アルミニウムが蒸着されたCaF_2基板上にランダム配向となるように作成し、その上にさらに半透明アルミニウムを蒸着し、2つのアルミニウム間に外部電場を印加した。赤外電場吸収の強度は印加電圧に対して2乗の変化を示し、ランダム配向の電場効果の理論と一致した。タンパク質のモデルとして、タンパク質と同じくペプチド基を骨格に持ち、α-ヘリックスの立体構造を示すポリ-γ-ベンジル-L-グルタメートの赤外電場吸収スペクトルの測定を行った。各振動バンドは、1次微分、2次微分または1次微分と2次微分の線形結合の形を示し、振動準位におけるシュタルクシフトが電場吸収スペクトルに反映されていることがわかった。アミドI振動とN-

H伸縮振動の電場吸収スペクトルは2次微分の形を示し、振動励起に伴う双極子モーメントの変化が非常に大きく、電場によるスペクトル変化に対して支配的であることがわかる。一方C=0伸縮振動は1次微分の形を示し、振動励起に伴う分子分極率の変化が非常に大きいことがわかった。電場効果は近傍の官能基の影響を強く受けることから、赤外電場吸収スペクトルを解析することによって、タンパク質の詳細な構造情報を得ることができると期待される。外部電場の印加に伴う赤外吸収スペクトルの変化を検出する赤外電場吸収スペクトル測定システムを製作し,タンパク質をはじめとする凝縮系の巨大分子に応用することを目的としている。本年度は,昨年度測定したα-ヘリックスを示すポリペプチドであるポリ-γ-ベンジル-L-グルタメート(PBLG)の高分子薄膜の赤外電場吸収スペクトルの理論解析を行なった。またPMMAなど他の高分子薄膜の赤外電場吸収スペクトルの測定も同様に行い,さらに赤外電場吸収用の溶液セルを製作し,溶液系への応用も行った。PBLGの赤外電場吸収スペクトルにおいて,各振動バンドは,ゼロ次微分,一次微分,二次微分の線形結合の形を示し,Liptayらによる理論式を用いて再現することができた。振動励起に伴う双極子モーメントの変化(Δμ)は,二次微分の項から求めることができる。N-H伸縮(アミドA)振動,アミドI振動,側鎖のC=0伸縮振動バンドのΔμ値は,それぞれ0.11,0.05,0.06Dであった。他の振動バンドのΔμ値は0から0.03Dの範囲であり,アミドA振動のΔμ値が非常に大きいことがわかる。振動の非調和性の理論から,アミドA振動の大きなΔμ値は,アミドA振動の非調和性に由来することがわかった。一次微分の項から振動励起に伴う分子分極率の変化(Δα)を求めることができ,側鎖のC=0伸縮振動バンドが最も大きく約2.0Å^3であった。このC=0伸縮振動バンドの大きなΔα値は,PMMA薄膜においても同様に観測された。ゼロ次微分の項は外部電場による高分子の配向変化を表しており,PBLGについては,側鎖の振動バンドが骨格の振動バンドよりも大きな値を持つことがわかった。この結果は,電場によって骨格よりも側鎖が大きく配向しているを示している。この電場による配向変化が高分子の配向分極となることから,側鎖の配向変化が,PBLGの誘電率の値に大きく寄与していることがわかる。赤外電場吸収スペクトルの測定は,高分子の誘電率を分子レベルで調べる有効な手法であることがわかる。
認知リハビリテーション時の動機づけ低下の解明と、動機づけ向上を目指した手法の開発

高次脳機能障害では、障害の評価やリハビリテーションへの動機づけが低いケースが多く(山口、2011)、このことが認知リハビリテーションの効果を低減させていると言っても過言ではない。また、近年、回復のごく初期段階での認知リハビリテーションの必要性が指摘されているが(大橋、2007)、亜急性期では動機づけの低下が顕著な症例も多数存在することから、認知機能回復訓練時の動機づけの向上は大きな課題である。そこで本研究では、研究1として亜急性期の認知機能回復訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発、研究2として回復期以降の代償手段獲得訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発研研究3として研究1に基づいたPCによる認知課題訓練の開発を目的として行われた。3年間の研究を通じ、研究1においては、近年のリハビリテーション課題について資料収集を行い検討を重ねた結果、ゲーミフィケーションの要素の取入れやより日常生活に即したオーセンティックなリハビリテーション課題の作成、あるいは患者の自己選択性が高い課題を作成することが望ましいという結論に至った。そこで、研究3として患者の好みをふまえた日常的な刺激をアップロードすることで、その患者に合った刺激を提示できる課題や年賀はがきのお年玉当選番号を弁別するための視覚的注意訓練課題、そして日常生活音を弁別するための聴覚的注意課題を作成した。また、研究2については、心理療法の一つである動機づけ面接が種々の認知リハビリテーション導入時に有効であること考え、臨床実践を重ねたほか、共著の一章に内容をまとめた。最終年度の2018年度には、高次脳機能障害を抱えつつもタレントとしての活動を行っているTASKEさんほか、地域で就労する当事者を招いて日常生活やリハビリテーション場面においての動機づけの高め方について講演会及びパネルディスカッションを行った。本研究では,研究1として亜急性期の認知機能回復訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発,研究2として回復期以降の代償手段獲得訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発,研究3として研究1に基づいたPCによる認知課題訓練の開発という3つの内容を進めている。平成28年度は、研究1と2について、リハビリへの動機づけの低下の要因を明らかにするために,高次脳機能障害を補償する手段の一つとしてのICT機器の利用実態を質問紙とインタビュー内容から検討した。調査の結果,携帯電話の所有率は高いものの支援技術としての利用はほとんどなされていないこと,高齢者であったり支援技術や補償手段の利用経験がない場合は,支援技術の導入に抵抗があること,心理的な適応の程度は支援技術の導入に影響しないことなどが明らかになった。さらに,当初の計画にはなかったものの,カナダで開発された神経科学的なアプローチによる気質検査の日本語版STQ77の作成を進めており,今後は動機づけとの関連性についても検討していく。また、研究2としてアルコールの問題や薬物障害の治療のために開発された動機づけ面接に着目し,高次脳機能障害後の心理的問題への適応可能性に関する文献調査を行った。その結果,CBTの導入として行った報告や受傷後の薬物・アルコール乱用への適用などの報告が示された。それらの内容から,動機づけ面接は,患者の問題を解決するためのメインの手段ではなく,手段へ向かうための準備を整えるものとして機能するということが示唆された。そして,研究3として遂行機能障害を評価する検査の一つであるBADSの動物園検査について、より現実場面に近い課題を目指すため,PCによる2次元および3次元課題を作成した。3次元課題では,被験者の視点で園内を移動することができ、それぞれの動物が立体的に示される。今後,この課題を臨床現場において試行していく。昨年度から研究責任者が申請時の勤務校とは異なる大学に所属しているため,共同研究者と物理的な距離が生じている状況である。しかしながら,月1度のミーティングは維持されており,そのほかの情報交換はメール等のやり取りでカバーしている状況である。動機づけという本研究の大きなテーマに沿って,計画時には含まれていなかった動機づけ面接や神経科学的なアプローチによる気質検査といった新たな知見も盛り込まれてきており,おおむね順調に推移しているといえる。平成29年度は、研究1および2において,H28年度の調査研究から得られた動機づけ面接に着目し、その技法を取り入れた課題作成について検討する予定であったが、近年のリハビリテーション課題について資料収集を行い、検討を重ねた結果、ゲーミフィケーションの要素の取入れやより日常生活に即したオーセンティックなリハビリテーション課題の作成、あるいは患者の自己選択性が高い課題を作成することが望ましいという結論に至った。そこで、研究3として患者の好みをふまえた日常的な刺激をアップロードすることで、その患者に合った刺激を提示できる注意訓練課題を作成した。今後は、この課題を臨床現場において試行していく。また,患者の課題遂行を支える自己調整力については、文献検索を行い、その内容を整理した結果、高等教育において用いられるメタ認知の向上をふまえたワークシートが有効であることが明らかとなり、現在、その内容について精査しているところである。さらに、評価課題においても日常生活状況に近いものを作成するべく、欧米で利用されている日常注意検査(Test of Everyday Attention (TEA))を購入し、その内容について分析するとともに、新しい注意機能の評価課題の作成について検討を始めた。

昨年度より検討している神経科学的なアプローチによる気質検査の日本語版STQ77については、翻訳を終え、健常者でのデータ取得を行っている。申請時の予定では、動機づけを低下の要因を質問紙調査から探り、それらをもとにその向上を目指す手法を開発するとしていたが、研究を進めるに従い、内的な要因としては自己選択性や自己調整力の獲得が、外的な要因としてはゲーミフィケーションの要素が重要であることが分かってきた。調査研究の結果ではないものの、従来の研究や異分野の先行研究の知見を掘り起こすことで、リハビリテーションにおける動機づけ向上の方法を具体的に示すことができてきている。また、これからの結果に基づいて、動機づけ向上のしかけをふまえた課題も作成できており、研究の目的は達成されつつあると考える。高次脳機能障害では、障害の評価やリハビリテーションへの動機づけが低いケースが多く(山口、2011)、このことが認知リハビリテーションの効果を低減させていると言っても過言ではない。また、近年、回復のごく初期段階での認知リハビリテーションの必要性が指摘されているが(大橋、2007)、亜急性期では動機づけの低下が顕著な症例も多数存在することから、認知機能回復訓練時の動機づけの向上は大きな課題である。そこで本研究では、研究1として亜急性期の認知機能回復訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発、研究2として回復期以降の代償手段獲得訓練時の動機づけ向上を目指した手法の開発研研究3として研究1に基づいたPCによる認知課題訓練の開発を目的として行われた。3年間の研究を通じ、研究1においては、近年のリハビリテーション課題について資料収集を行い検討を重ねた結果、ゲーミフィケーションの要素の取入れやより日常生活に即したオーセンティックなリハビリテーション課題の作成、あるいは患者の自己選択性が高い課題を作成することが望ましいという結論に至った。そこで、研究3として患者の好みをふまえた日常的な刺激をアップロードすることで、その患者に合った刺激を提示できる課題や年賀はがきのお年玉当選番号を弁別するための視覚的注意訓練課題、そして日常生活音を弁別するための聴覚的注意課題を作成した。また、研究2については、心理療法の一つである動機づけ面接が種々の認知リハビリテーション導入時に有効であること考え、臨床実践を重ねたほか、共著の一章に内容をまとめた。最終年度の2018年度には、高次脳機能障害を抱えつつもタレントとしての活動を行っているTASKEさんほか、地域で就労する当事者を招いて日常生活やリハビリテーション場面においての動機づけの高め方について講演会及びパネルディスカッションを行った。H29年度では,まず研究1及び2について,課題の難易度やフィードバックの仕方など,課題の特性が動機づけに及ぼす影響について明らかにする。H28年度の調査研究から得られた動機づけ面接に着目し,その技法を取り入れた課題作成について検討する。
カーネルグラスマン表現の計量構造及び脳信号処理 への応用

パターンが作るグラスマン多様体上に識別に最適な計量を導入し,脳コンピュータインターフェースに応用する研究を行った.公開ベンチマークを利用して識別実験を行ったところ,共空間パターンやその拡張手法を同時に利用することにより,提案手法は従来手法単体で用いたときよりも有意に高い識別性能を示した.特に共空間パターン法の拡張であるCSSSP法と提案法を組み合わせたものが最も高い性能を示した.また,脳信号識別問題において,識別問題の最適解とベイズ識別に基づくスパース最適化を同時に行うことで,電極選択と識別器の設計を同時に行うアルゴリズムを提案した.グラスマン多様体に埋め込まれた脳信号などのパターンを識別するための計量学習法を提案した.運動想起型脳コンピュータインターフェースなどに用いられる特徴抽出法である共空間パターン法やその拡張手法は,脳波信号(EEG)から分散共分散行列を推定し,これに白色化,固有空間抽出を行い,ベクトルに変換されることに相当する.すなわち,これらの特徴抽出は分散共分散に計量を与えていることに相当する.脳コンピュータインターフェース以外のパターン識別問題,例えば,顔画像識別問題や,手書き数字識別問題などの多くも分散共分散構造を用いて表現することで,パターンが本質的に持つ変動を表現することができ,高精度に識別を行うことができることが示されている.本研究では,パターンが作るグラスマン多様体上に識別に最適な計量を導入し,脳コンピュータインターフェースに応用する研究を行った.公開ベンチマークを利用して識別実験を行ったところ,共空間パターンやその拡張手法を同時に利用することにより,提案手法は従来手法単体で用いたときよりも有意に高い識別性能を示した.特に共空間パターン法の拡張であるCSSSP(Common Sparse Spatio Spectral Pattern)法と提案法を組み合わせたものが最も高い性能を示した.また,脳信号識別問題において,識別問題の最適解とベイズ識別に基づくスパース最適化を同時に行うことで,電極選択と識別器の設計を同時に行うアルゴリズムを提案した.これにより脳コンピュータインターフェースなどでの電極数と計算量を削減しつつ,高精度な識別を行うことができた.実験により提案アルゴリズムの有効性が示された.結果を国際会議や学術論文として投稿し採択されたため.前年度までに多チャンネル計測脳波計から得られる脳信号をGrassmann多様体の元である部分空間に埋め込み,分布に基づく計量を求める手法を提案した.本年度は,識別性能を最大化する計量を求める手法を提案した.2クラスの脳信号識別問題において,同じクラスに属するパターン同士の距離をなるべく近く,異なるパターン同士の距離をなるべく遠くするような計量をGrassmann多様体とその拡張である0以上1以下の固有値を持つ正定値行列の集合に対して定義し,そのパラメータを標本から学習し,閉じた形式で解を与える手法を提案した.公開データによる実験の結果,脳信号識別問題で用いられている共空間パターンフィルタ(CSP)やその拡張手法である共時空間パターンフィルタ(CSSP)や共時間-スペクトルフィルタ(CSSSP)を併用することで,従来法よりも高い識別性能を示した.また,脳信号処理問題への応用として,符号変調視覚誘発BCIにおいて,観測された多チャンネル脳波を入力符号へ逆変換する手法を提案した.これまで,符号変調視覚誘発BCIでは,観測脳信号の平均と個々の観測脳信号の誤差を小さくする正準相関(CCA)フィルタが用いられていたが,観測脳信号を目標信号とする根拠はない.入力された符号系列と観測脳信号の相関を最大にすることは観測信号に含まれる入力信号成分を最大限に取り出すことであり,最も妥当な特徴抽出方法であると考えられる.提案手法では,多層ニューラルネットやl1ノルム正則化を導入した特徴抽出法を提案した.実験の結果,提案法は従来法のCCAフィルタよりも高い識別性能を示し,また,これまでのBCIで最大の情報転送量を持つ位相つき定常視覚誘発電位(SSVEP)BCIよりも高い情報転送量を示した.前年度までに提案したMahalanobis距離のカーネル化にとどまらず,識別を最適化する方針の下で計量を求めることに成功した.さらにブレインコンピュータインターフェースへのフィードバックも順調であることから,概ね順調に進展していると判断する.前年度までに多チャンネル計測脳波計から得られる脳信号をGrassmann多様体の元である部分空間に埋め込み,分布に基づく計量と,識別性能を最大化する計量を求める手法を提案した.本年度は,引き続き,2クラスの脳信号識別問題において,同じクラスに属するパターン同士の距離をなるべく近く,異なるパターン同士の距離をなるべく遠くするような計量を再生核ヒルベルト空間上のGrassmann多様体とその拡張である0以上1以下の固有値を持つ正定値行列の集合に対して求める手法を提案した.また,脳信号処理問題への応用として,多チャンネル脳波から感情や嗜好に関する特徴を抽出し,順位付けを行う手法を提案した.この手法と,これまでに提案されている協調フィルタリングなどの手法を組み合わせることで,脳信号から自動で個々人の嗜好に合わせたアイテムを自動で推薦するシステムを構築することが可能となる.多層ニューラルネットによる深層学習を拡張し,ランキング学習で用いられているペアワイズ学習を多層ニューラルネットに組み込み,一部の結合係数を固定したままパラメータを学習することでランキングに最適なパラメータと特徴抽出を同時に学習できるネットワーク構造を提案した.固定する結合係数を変えることで3種類のネットワーク構造を提案し,比較を行った.これにより,従来のランキングSVMよりも高精度な識別率を実現した.Grassmann多様体による特徴抽出と組み合わせることで,さらに高精度な識別率を達成できると考えられる.パターンが作るグラスマン多様体上に識別に最適な計量を導入し,脳コンピュータインターフェースに応用する研究を行った.

公開ベンチマークを利用して識別実験を行ったところ,共空間パターンやその拡張手法を同時に利用することにより,提案手法は従来手法単体で用いたときよりも有意に高い識別性能を示した.特に共空間パターン法の拡張であるCSSSP法と提案法を組み合わせたものが最も高い性能を示した.また,脳信号識別問題において,識別問題の最適解とベイズ識別に基づくスパース最適化を同時に行うことで,電極選択と識別器の設計を同時に行うアルゴリズムを提案した.提案アルゴリズムに当初の目的であるカーネルトリックを適用する.学習アルゴリズムや基底ベクトルの効率的な選択方法,多カーネル学習器について研究を行う予定である.提案した識別性能を最大化する計量は,すべての入力パターンのペアについて,同じクラスに属するパターン同士の距離をなるべく近く,異なるパターン同士の距離をなるべく遠くするような計量を求めていた.しかしながら,パターン識別において,重要なのは,識別しやすいパターンを精度よく識別することである.例えば,サポートベクタマシンは識別境界から最も近い標本と識別境界の距離をマージンと定義し,マージンを最大化するような識別器を構成する.Grassmann多様体上においても同様にすべてのパターンを考慮するのではなく,ヒンジ損失のような評価関数を導入し,誤識別を起こしやすいような標本を精度よく識別できるような評価基準を導入する.また,その手法についてカーネル化を行う.このとき,識別境界は少数のパターンによって構成することができるため,サポートベクタマシンのように効率よく識別の計算を行うことができると考えられる.得られた手法をブレインコンピュータインターフェースなどの脳信号処理アプリケーションへ応用し,その性能を評価する.生体信号処理当初計画していた旅費等が安く済んだため.成果発表のための旅費に充てる.
新規糖尿病マーカーとしてのニトロ化ＩＬ－１８の評価とＥＬＩＳＡの確立

本研究では、糖尿病において構造変化を生じると考えられるIL-18の機能変化を解析し、糖尿病との関連を明らかにして、疾患マーカーとしての有用性を評価するものである。本研究において、糖尿病で生じるパーオキシナイトライトがIL-18のチロシンをニトロ化し、IL-18の機能であるインスリンシグナル伝達やIFNγの産生誘導活性を抑制することを見出した。さらに、ニトロ化IL-18は糖尿病モデルマウスにおいて検出されたことより、糖尿病の病態との関与が示唆された。ニトロ化IL-18という特殊な構造が糖尿病で増加することから、糖尿病の疾患マーカーとして利用できる可能性が示唆された。インターロイキン18(IL-18)は炎症性サイトカインであるが、感染症だけでなく糖尿病でもその増加が認められ、糖尿病性腎症などの合併症の発症などに関わっていると考えられる。一方で、一酸化窒素(NO)は糖尿病のインスリン抵抗性を引き起こすと考えられている。本研究の目的は、NOとIL-18との関連を解明し、糖尿病との関連や新たな糖尿病疾患マーカーとしての有用性を検討するものである。平成24年度は、IL-18をリコンビナントタンパク質として大腸菌から精製する方法を確立し、NOと反応させ、その影響をウエスタンブロッティング法やフローサイトメトリー法にて解析した結果、IL-18はニトロ化を受けることを明らかとし、さらに変異を導入したIL-18の解析から、ニトロ化を受けやすいアミノ酸を同定することができた。また、NOによりニトロ化されたIL-18は、重要な機能であるインターフェロンγの産生誘導活性などの作用の変化が認められた。また、NOはIL-18の直接的な修飾だけでなくIL-18の発現にも関与している可能性を示唆するデータが得られている。平成25年度は、ニトロ化されやすいアミノ酸を含むIL-18ペプチドを合成し、ウサギに免疫して抗体を作成した。得られた抗体は若干特異性が低く、現在も作成中である。また、前年度得られた解析結果をもとに肥満糖尿病マウスを用いたニトロ化IL-18の解析で、糖尿病との関与を示唆するデータを得ている。本研究の目的は、糖尿病のインスリン抵抗性を引き起こすと考えられている一酸化窒素(NO)とIL-18との関連を解明し、糖尿病との関連性や新たな糖尿病疾患マーカーとしての有用性を検討するものである。平成24年度の計画では、NOのIL-18に及ぼす影響を主に解析した。具体的にはIL-18をリコンビナントタンパク質として大腸菌から精製する方法を確立し、in vitroの系においてNOと反応させ、その影響をウエスタンブロッティング法やフローサイトメトリー法にて解析した。その結果、IL-18はニトロ化を受けることを明らかとした。次にニトロ化される部位の同定を行った。新たに変異を導入したIL-18を5種類作成し、同様に大腸菌から精製して実験に用いた。その結果から特にニトロ化を受けやすいアミノ酸を同定することができた。NOによりニトロ化されたIL-18の生物学的機能の変化についても検討を行った。解析にあたってはまず培養細胞を用いて、基礎的な検討を行った。培養細胞はマウスプライマリー細胞や細胞株を用いた。IL-18のもつ重要な機能であるインターフェロンγの産生誘導活性などにおいて、ニトロ化を受けることによりその作用の変化が認められた。平成24年度の計画では、IL-18をリコンビナントタンパク質として大腸菌から精製する方法を確立し、NOのIL-18に及ぼす影響を主に解析した。in vitroの系においてNOと反応させ、その影響をウエスタンブロッティング法やフローサイトメトリー法にて解析した結果、IL-18はニトロ化を受けることを明らかとした。

さらにNOによりニトロ化されたIL-18の生物学的機能の変化についてマウスプライマリー細胞や細胞株を用いた検討を行ったところ、IL-18のもつ重要な機能であるインターフェロンγの産生誘導活性などにおいて、その作用の変化が認められた。平成25年度は、ニトロ化される部位をペプチドとして合成し、ウサギに免疫して抗体を得た。いくつかIL-18を認識する抗体が得られたが、特異性が低く、実験には用いることができなかった。また、前年度の解析結果をもとに肥満糖尿病マウスを用いてニトロ化IL-18と考えられるタンパク質を得た。平成26年度は糖尿病モデルマウスを用いてニトロ化IL-18の影響を検討したところ、糖尿病性腎症に関わるRAGEの発現増加が認められた。また、このマウスにおいてはニトロ化IL-18と考えられるタンパク質が腎臓に蓄積していることが認められた。生化学研究の最終的な目的は糖尿病におけるIL-18の役割を解明し、臨床検査項目としての有用性を評価することにある。そのために本研究では、1糖尿病におけるIL-18の機能評価2活性酸素種によるIL-18構造変化の化学的解析3ニトロ化IL-18抗体の作成4ニトロ化IL-18抗体を用いたELISAなどの検出系の確立5糖尿病モデルマウス及び糖尿病患者の血清を用いた検討を行いたい。平成24年度および25年度は上記目的のうち、1糖尿病におけるIL-18の機能評価2活性酸素種によるIL-18構造変化の化学的解析については当初の計画通りにほぼ完了している。34は現在進行中であり、当初の計画通り検討していく予定である。5糖尿病モデルマウスの解析結果もほぼ計画どうりに進行しており、抗体が作成でき次第、詳細な解析を行い、結果を論文としてまとめる予定である。以上のことより、研究はほぼ予定通りに進行しているものと考える。研究の最終的な目的は糖尿病におけるIL-18の役割を解明し、臨床検査項目としての有用性を評価することにある。平成24年度は上記目的のうち、1糖尿病におけるIL-18の機能評価2活性酸素種によるIL-18構造変化の化学的解析については当初の計画通りに進行している。34は現在進行中であり、当初の計画通り平成25年度以降の研究項目として検討していく予定である。5については糖尿病モデルマウスの血清を入手でき次第、予備的な検討として3の抗体が作成できるまでは、既存の市販抗体を数種類組み合わせて検討していく予定である。平成26年度は、ニトロ化されたIL-18に反応する抗体を作成し、ELISAなどの検出系を確立することである。すでに標的とする部位の同定および抗原部位としての有用性検索は終了しており、作成を行っている状況である。
金属錯体へテロ積層型超分子を基盤とする特異なπ電子系の自在構築

二重鎖形成型ポルフィリンアレーを階層的超分子構造構築のためのビルディングユニットとして設計した.天然光合成の光捕集アンテナ錯体がもつ連続的スリップ積層したπ電子系と同様に,ポルフィリンアレー二重鎖中ではポルフィリン環同士がスリップ積層した積層π電子系を構築する.この剛直な積層π電子構造を基盤とする巨大な形態制御した階層構造として,主に領域内の共同研究を通じて超分子ポリマーヘの研究展開を行った.とくに元素ブロック高分子特有の構造構築,およびその特異構造に起因する新規物性開拓を主眼に研究を推進した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。配位子とポルフィリン金属錯体が交互配列したポルフィリンアレー二重鎖構造の構築を行った。熱力学的に再安定構造である二重鎖を選択的に形成することができ、しかも二重鎖中では励起子相互作用によってパイ電子系が拡張することを見出した。さらにこれを構成ユニットとした超分子ポリマーの構築を行った。溶液中および薄膜中において、著しく拡張したパイ電子系を構築する新規手法について検討を行った。この結果、溶液中で非常に低濃度においても高分子量の超分子ポリマーを構築することに成功し、この構造は外部から競争的配位子を添加することによって自在に構造制御可能であった。さらに溶液中で高分子量化が困難な場合でも、薄膜化することによって近赤外領域まで非共有結合を介してパイ電子系を拡張することに成功した。さらに、ポルフィリンと種々の機能団をヘテロ積層した超分子元素ブロックの構築に関しても、種々の構造体の構築の検討を行った。このうちBODIPYアレーとポルフィリンアレーをハイブリッド化すると、光キャリア生成できるという予備的知見を得た。さらに、新規パイ電子系として超分子これに関しては、前駆体合成を行った。当初の目的としている元素ブロックの合成に向けた原料合成を行った。これに関しては、合成上の問題に直面したが、これを克服できる見通しである。他方で新規に合成を行った分子に関して、超分子ポリマー化を行うための新規手法の検討の結果、結合定数に関係なく薄膜化することによって、近赤外波長領域にまで吸収帯が伸長した狭バンドギャップ構造を構築できることが判った。この結果から、当初の目的化合物の合成後の検討条件について、適切な条件を得ることができており、目的化合物の合成後の物性評価に速やかに移行できる見通しである。初年度に合成上の問題点が明らかとなったが、これを解決して目的化合物の合成を引き続き続ける。さらに初年度に成功した新規超分子ポリマー化手法によって、この材料機能の評価を行う。とくに領域内の共同研究を通じて、超分子元素ブロック高分子構造を基盤とする、新しい機能開拓に挑戦する。
象牙質・歯髄複合体に関する国際研究集会の企画

2.シンポジウム内容について、研究代表者の下野正基と分担者の前田健康が10月終わりから11月初めにかけてフインランドに渡航し、同国クオ-ピオ大学Matti Narhi教授(前I.A.D.R.Pulp Biology会長)と打ち合わせを行い、シンポジウムの基本的考え方として形態学、機能学、臨床研究の3つを勘案した概念で検討をすすめることを了解を得た。3.平成9年12月5日徳島市において徳島大学吉山昌宏講師を幹事として、班会議を開催し、シンポジウム内容ならびに開催場所について検討を行い、I.A.D.R.が開催される千葉市近郊であることならびに宿泊費用などの面から、千葉県かずさアカデミアを開催場所とすることを了承した。
協働システムの研究:グループウェアとハイパーメディアによる経営教育環境の構築

本研究は人間の協働活動をコンピュータにより支援するために必要な実システムの実現と利用実験を行った。ならびに、内外のコラボレーションに関する理論的、工学的な展開について調査を行った。1.協働支援システム(もんじゅと呼ぶ)のLAN上への移植作業を行った。協働支援システム(もんじゅ)はわれわれの考えるグループウェアの基礎となるシステムであり、サーバ/クライアント方式を採用した。2.リアルタイム・グループライティング&ドローイング本格的なグループウェアとしてリアルタイム・グループライティング&ドローイングはネットワーク上で共有ウィンドウを使って共同執筆を試みるプログラムであり、これをわれわれの手でワークステーション上に開発した。このグループライティングの特徴は応答性能に優れ、WYSWISが満たされ、利用者はいつでも書込みが可能な点である。現在さらにシステムの機能を充実する作業を続けている。3.グループウェア利用実験学生を対照にシステムを実際に利用し実験データを集め、分析を行い、システムの改良を続けている。協働を対象とする研究にあっては、実践を目指し、それに対して検討がなによりも重要である。4.内外の文献を調べた後、市販されているグループウェア商品を導入している企業を訪問し、その利用形態、状況を実態調査した。協働についての研究のサーベイの結果、協働は学際的な研究対象であり、経営組織論、相互作用的状況論、メディア論、分散協調システム、分散人工知能、ネットワーク論などを含む広範囲な研究領域と関係することがますます明確になった。本研究の目的は人間の協働活動をコンピュ-タにより支援するために必要な理論的探求、実システムの実現、利用実験を行うことである。本年度中に達成された成果を以下に述べる。1.協働支援システム(もんじゅと呼ぶ)のLAN上への移植作業協働支援システム(もんじゅ)はグル-プウェアの基礎となるシステムであり、サ-バ/クライアント方式を採用している。このシステムをベ-スにユ-ザ-インタ-フェ-ス、AV、イメ-ジ、グル-ププラン、サ-チなどの各プロセスを作成する。本年度はとくにグル-プウェアのなかでブレ-ンスト-ミングできる環境を作り上げた。2.リアルタイム・グル-プライティングの構築リアルタイム・グル-プライティングはネットワ-ク上で共有ウィンドウを使って共同執筆を試みるプログラムであり、これをわれわれの手で開発した。このグル-プライティングの特徴は応答性能に優れ、WYSWISが満たされ、利用者はいつでも書込みが可能な点である。次年度ではこのシステムの本格的な利用実験を行い成果を公表したい。3.グル-プウェアの理論的研究内外のコラボレ-ションに関する理論的な展開について、実態調査、研究者との打つ合わせを度々重ねた。この資料・成果については第2年度目に発表する予定である。
バクテリアのゲノムデザインに向けた、複製制御機構の開発

本研究課題では、環状染色体を持つバクテリアを対象とし、ゲノム対称構造と複製効率の関係性を解明することで、人工的に制御された複製機構を維持したゲノムデザインを目指した。その結果、情報学や遺伝学などにおける様々な技術を横断的に用い、ゲノム構造が複製挙動に与える影響を詳らかにし、ゲノム構造の観点からバクテリアゲノムの進化を議論する事で、複製効率を視野に入れた人工ゲノムのデザインへの足がかりを築き上げる事に成功した。平成26年度ではゲノム構造のみを改変した遺伝子改変を伴わない変異株の作成を行い,複製挙動との関係性を明らかにする技術開発及び,ゲノム構造が複製挙動に与える影響の調査を行った.ゲノム構造改変株の作成では,対象種に遺伝学的手法が確立されている枯草菌を用い,ゲノム構造の改変にはne-eoシステムを用いた.ne-eoシステムとは相同組換えを利用したゲノム逆位技術であり,プラスミドの複製開始点を利用する事で対象領域を分断後独自複製させる事で第二染色体化する事も可能である.この技術を用いて研究代表者は枯草菌の約2Mbpに渡る逆位変異株10株と,300-800Kbpの分断変異株2株の作成に成功した.次にゲノム全体の複製挙動を観察するために,大量並列シーケンサーを用いた技術の開発を行った.増殖がある程度早い環状染色体を持つバクテリアでは,対数増殖期に複製開始点と終結点付近との間でゲノムのコピー数に大きな差が生じる事が知られている.大量並列シーケンサーを用いた複製挙動観察は対象種のゲノムDNAを大量にシーケンスし,リファレンスゲノムにマッピングする事で,このコピー数差を計算し,複製開始・終結点を観察する手法である.本年度ではまず枯草菌に適した本手法の条件を決定する為に,コピー数差が顕著に現れるサンプリング時期やDNA抽出量,コピー数差を検出する事が出来るシーケンサー及びシーケンスカバレッジに関して検討し,プロトコル整備を行った.シーケンシングは主に外注し,データ解析は研究代表者が行った.最期に複製挙動観察技術を用いて,構築したゲノム構造改変株の複製挙動を観察し,ゲノム構造と複製挙動の関係性を理解する事ができた.その結果,複製終結関連因子を利用する事で,人工的に複製挙動を操作する事に成功し,本研究成果をJournal of Molecular Biology誌に発表した.平成27年度は本研究課題の最終年度である為、昨年度整備した枯草菌の変異株作成技術を用いたゲノム構造改変株の作成、複製挙動観察プロトコルの整備、そしてゲノム構造毎の発現量解析及びゲノムのドメイン構造解析を行い、キメラゲノム構築に向けた基盤情報を揃えまとめた。ゲノム構造改変株としてはゲノム逆位変異株とゲノム分断変異株を作成した。逆位変異株は染色体内の特定の領域を逆転させた変異株であり、分断変異株は特定領域を第二染色体として抜き出した構造変異株を意味する。分断変異株はこれまでにも作成して来たが、約300-800 kbpの分断領域それぞれで複製システムの異なる第二染色体を新たに作成する事に成功し、コピー数の異なる染色体を維持した変異株を得る事が出来た。複製挙動観察プロトコル整備では、対象菌種毎に必要最低限のシーケンスリード数を算出し、コストパフォーマンスの最大化を目指した。この結果これまでより数十倍のサンプル数を処理出来る様になった。発現量解析は新たに作成した変異株に対して大規模に行い、ゲノム構造が変化した株毎にゲノム上各箇所でどのように遺伝子発現が変化しているのかを解析した。その結果、ゲノム構造の改変によって影響を受ける領域と、発現変動があまり起きない領域とを観察する事ができ、ゲノム構造の恒常性を発現変動解析から見いだす事に成功した。平成26年度の研究計画では「大規模なゲノム改変株の構築」及び「複製機構観察のための複製プロファイル技術の開発」を挙げていた.「大規模なゲノム改変株の構築」では約2Mbp以上の領域を逆位させた変異株及び,800Kbp以上の領域を第二染色体化させた変異株の作成に成功した.「複製機構観察のための複製プロファイル技術の開発」では枯草菌の複製開始・終結点を観察するのに相応しい条件検討をサンプリング時期,DNA抽出量,そしてシーケンスカバレッジに関して行い,解析パイプラインの開発を行った.その結果,枯草菌の複製プロファイル技術を確立する事ができた.これらに加え,実際にゲノム構造改変株に対して複製プロファイル技術を用いてゲノム構造と複製挙動の関係性を解明した.またその結果をもとに,人工的に複製挙動を制御する技術も開発する事が出来た.この研究成果は「人工的な複製挙動制御」は平成27年度の研究計画の一部を含んでいる.以上の成果に加えて,国際学術誌に一報発表したため,本年度の達成度は当初の計画以上に進展していると言える.合成生物学大規模なゲノム変異株の構築及び複製プロファイル技術の確立が終了したため,平成27年度では主に「変異株における複製挙動観察及び,非対称なゲノム構造における複製の安定化実験」及び「ゲノムデザイン」を行う予定である.

平成26年度の成果により,枯草菌のゲノム構造改変株を対象に,複製終結点関連因子を操作する事で人工的に複製挙動を制御する事ができるようになった.しかしながら,ゲノム構造改変株は,複製挙動が正常に戻ったとしても増殖効率が野生株と同等になる事は無かった(Kono, et al., 2014).これは複製挙動の変化に伴う遺伝子発現の影響が考えられる.そこで平成27年度ではまず,枯草菌のゲノム構造改変株を対象に複製挙動と発現量の関係性を調査する為に,発現量解析を行う.これにより,複製挙動を人工的に制御した事で引き起こされている不自然なゲノム状態を観察することが出来るため,ゲノム構造と複製挙動の関係性に増殖効率という新たなパラメータを追加した多変量解析を行っていく.次に,得られたゲノム構造,複製挙動,そして増殖効率の関係性をもとに,複製機構を制御する事で完全なキメラゲノムの完成を目指す.これまでの先行研究では,ゲノム構造やそれによる複製挙動が不安定になるという理由から,完全なキメラゲノムは作成されておらず,片方のゲノムを数断片に分割して挿入するだけに留まっている.そこで,人工的な複製挙動制御技術を用いる事で,二つのゲノムが半分ずつ連続して融合しているキメラゲノムの構築を行う.この技術が確立されると,人工的に合成された大規模な長鎖DNAをゲノムに安定してクローニングする事が可能になり,ゲノムデザインの大きな礎となるだろう.
腫瘍免疫におけるRegulatory B細胞の役割についての解析

本研究では、制御性B細胞が増加しているマウス(B細胞特異的PTEN欠損マウス)を用いて悪性黒色腫の増生および腫瘍浸潤細胞を解析した。B細胞特異的PTEN欠損マウスでは悪性黒色腫が有意に増大し、腫瘍に浸潤する制御性B細胞が増加していた。一般に制御性B細胞はMarginal zoneB細胞とB1 B細胞の2つのサブセットから成るが、腫瘍に浸潤している制御性B細胞はB1 B細胞であった。そこでB1 B細胞を悪性黒色腫細胞と混合して野生型マウスに移入したところ、非混合群および非B1 B細胞混合群と比べ腫瘍増生が増大した。以上より制御性B細胞は悪性黒色腫に対する腫瘍免疫反応を抑制していると考えられた。腫瘍(悪性黒色腫)に浸潤するB細胞、T細胞、NK細胞についてフローサイトメトリーによる解析を行った。B細胞に関しては、B細胞特異的PTEN欠損マウスでは野生型マウスと比較してより多くのB細胞が浸潤していた。また、IL-10を産生する制御性B細胞に関しても、B細胞特異的PTEN欠損マウスでは野生型マウスと比較して有意に多かった。さらに、腫瘍に浸潤していた制御性B細胞のサブセットに関しては、B細胞特異的PTEN欠損マウスおよび野生型マウスいずれにおいても80%以上がB1a細胞であった。T細胞に関しては、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、制御性T細胞いずれの細胞数においても、B細胞特異的PTEN欠損マウスと野生型マウスの間に有意差はなかった。一方、サイトカイン産生能については、CD8陽性T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生がB細胞特異的PTEN欠損マウスにおいて有意に減少していた。CD4陽性T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生能に有意差はなかった。NK細胞に関しては、腫瘍に浸潤している細胞数およびグランザイムBの産生能いずれにおいてもB細胞特異的PTEN欠損マウスと野生型マウスの間に有意差はなかった。次に、磁気細胞分離装置を用いてB細胞特異的PTEN欠損マウスの脾臓からB細胞を抽出し、メラノーマ細胞とともに野生型マウスに移入する実験を行った。その結果、B1a細胞とメラノーマ細胞を移入したマウスでは腫瘍増生がコントロール群(メラノーマ細胞単独投与)に比べ増悪し、B1a細胞を除いたB細胞とメラノーマ細胞を移入したマウスではコントロール群と比べ腫瘍増生に変化はなかった。以上の実験結果より、制御性B細胞はCD8陽性T細胞のTh1サイトカイン産生を抑制することによって腫瘍免疫反応を抑制している可能性が示唆された。B細胞特異的PTEN欠損マウスおよび野生型マウスの腫瘍(悪性黒色腫)に浸潤しているB細胞、T細胞、NK細胞それぞれのリンパ球サブセットおよびそれぞれのサブセット毎のサイトカイン産生能の解析は予定通り遂行することができた。また、B細胞特異的PTEN欠損マウス由来B細胞の移入実験も遂行することができた。これらの実験結果により、制御性B細胞はCD8陽性T細胞のTh1サイトカイン産生を抑制することによって腫瘍免疫反応を抑制している可能性を示唆する知見を得ることができた。一方、マウスの成育が予定より遅れたため、B細胞特異的PTEN欠損マウスのリンパ組織におけるリンパ球のサブセット解析は次年度に行うこととなり、計画の達成度はやや遅れていると自己評価した。B細胞特異的PTEN欠損マウスではコントロールマウスと比較して悪性黒色腫が有意に増大し、腫瘍に浸潤する制御性B細胞が増加していた。腫瘍に浸潤するリンパ球をフローサイトメトリーで解析したところ、B細胞特異的PTEN欠損マウスでは、コントロールマウスに比べて腫瘍に浸潤するB細胞が比率・絶対数ともに有意に増加していた。一方、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD25+制御性T細胞、NK1.1+CD3- NK細胞の絶対数に関しては、いずれも有意差がなかった。B細胞特異的PTEN欠損マウスでは、コントロールマウスに比べて腫瘍に浸潤しているCD8+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生能が有意に低下していた。一方、腫瘍に浸潤しているCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生能、腫瘍に浸潤しているNK細胞におけるGranzyme Bの産生能に有意差はなかった。一般的に制御性B細胞はCD1d hi Marginal zoneB細胞とCD5+ B1 B細胞の2つのサブセットから成るが、腫瘍に浸潤している制御性B細胞はCD5+ B1 B細胞であった。そこでCD5+ B1B細胞を悪性黒色腫細胞と混合して野生型マウスに移入したところ、非混合群および非B1 B細胞混合群と比べ腫瘍増生が増大した。以上より、制御性B細胞は悪性黒色腫に対する腫瘍免疫反応を抑制していると考えられ、その機序として腫瘍組織に浸潤するCD8+T細胞のIFN-γおよびTNF-αの産生を抑制する可能性が示唆された。B細胞特異的PTEN

欠損マウスでは悪性黒色腫が有意に増大し、腫瘍に浸潤する制御性B細胞が増加していた。一般に制御性B細胞はMarginal zoneB細胞とB1 B細胞の2つのサブセットから成るが、腫瘍に浸潤している制御性B細胞はB1 B細胞であった。そこでB1 B細胞を悪性黒色腫細胞と混合して野生型マウスに移入したところ、非混合群および非B1 B細胞混合群と比べ腫瘍増生が増大した。以上より制御性B細胞は悪性黒色腫に対する腫瘍免疫反応を抑制していると考えられた。平成28年度では行うことのできなかったB細胞特異的PTEN欠損マウスのリンパ組織におけるリンパ球のサブセット解析を行う予定である。また、腫瘍組織におけるケモカイン(特に、B細胞特異的ケモカインであるCXCL13)産生の評価を行う。腫瘍組織におけるCXCL13の産生量が健常皮膚に比べて増加していることが確認できれば、CXCL13を抑制することにより腫瘍増生がどのように変化するのかを検討する。腫瘍免疫学