hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺動脈平滑筋細胞の小胞体の機能とCa結合タンパクの発達に伴う変化

本研究では、未熟肺動脈平滑筋細胞を用いて、1)脱分極やイノシトール3燐酸刺激による細胞内Ca濃度変化と小胞体からのCa放出を調べ、2)小胞体においてCa制御に関わっている蛋白質(リアノジン受容体、Ca-ArPase, Calsequestrin, Phospholamban)のmRNA発現、蛋白発現を調べた。実験動物:胎生31日の胎仔家兎、生後5日の新生仔家兎、生後6-12ヵ月の成獣家兎を用いた.実験標本:肺動脈単離平滑筋細胞をもちいた.各年齢群の肺動脈で径200ミクロン以下の血管よりコラゲナーゼを用い細胞を単離した.細胞内Ca分布:共焦点蛍光顕微鏡を用い、小胞体のCa分布を調べた.細胞内のCa貯蔵器官からCaを放出させる働きをもつ、カフェインやノルアドレナリンを使用して細胞内Ca貯蔵量を変化させ、細胞内Ca貯蔵量を測定した.小胞体のCaは胎仔、新生仔で、成獣に比べおおかった。カフェインで放出されるCaの量も未熟平滑筋でおおかった。本研究では、未熟肺動脈平滑筋細胞を用いて、1)脱分極やイノシトール3燐酸刺激による細胞内Ca濃度変化と小胞体からのCa放出を調べ、2)小胞体においてCa制御に関わっている蛋白質(リアノジン受容体、Ca-ATPase, Calsequestrin, Phospholamban)のmRNA発現、蛋白発現を調べ、3)小胞体の微細構造の発達、特に細胞膜との連関について明らかにした.実験動物:胎生31日の胎仔家兎、生後5日の新生仔家兎、生後6-12カ月の成獣家兎を用いた.実験標本:肺動脈単離平滑筋細胞をもちいる.各年齢群の肺動脈で径200ミクロン以下の血管よりコラゲナーゼを用い細胞を単離した.細胞内Ca分布:共焦点蛍光顕微鏡を用い、小胞体のCa分布を調べた.細胞内のCa貯蔵器官からCaを放出させる働きをもつ、カフェインやノルアドレナリンを使用して細胞内Ca貯蔵量を変化させ、細胞内Ca貯蔵量を測定した.小胞体のCaは胎仔、新生仔で、成獣に比べおおかった。
伸展刺激による血管内皮細胞リモデリングの分子機構

血管内皮細胞は紡錘形を呈し、血管走行に対してその長軸を平行に配列している。この形態や配列には内皮細胞の血管壁からの剥離を防ぐという大切な意義がある。この形態と配列は血管の周期的伸展刺激で生じることが分かっている。本研究の最終目的は、培養内皮細胞を用いて伸展刺激による形態配列応答の分子機構を解明することにある。我々はこれまでに、{一軸周期伸展刺激→SAチャネル活性化→細胞内Ca上昇→カルシニューリン活性化→srcの脱燐酸化とその活性化→接着斑蛋白質チロシン燐酸化→接着斑と細胞骨格の再編成→形態応答}という細胞内シグナルカスケードの存在を明らかにしてきた。しかしながら細胞内Ca^<2+>濃度の空間分布はほぼ均一で、伸展軸に依存した偏りは見られなかった。そこで細胞形態応答の極性(伸展軸に対して垂直に配列する性質)は、伸展刺激を直接受容するインテグリン/細胞骨格系に基づくという仮説を立てるに至った。本研究の目的は、この仮説を検証するためにインテグリンの動態をライブ観察する実験系を開発することである。その結果、1)インテグリンの細胞外ドメインを特異的に認識するFITC標識抗体で標識することにより、インテグリンの長時間ライブ観察が可能になった。2)全反射型近接場顕微鏡を製作し、細胞膜-基質の接着面に分布する標識蛋白質(インテグリン)のみを極低背景光の元で高精度に観察できるようになった。3)微分干渉検鏡、位相差検鏡、通常蛍光検鏡、共焦点検鏡、反射干渉検鏡、全反射近接場検鏡、フォトブリーチングが可能な光学顕微鏡を開発し、インテグリンの代謝や移動をリアルタイムで観察できるようになった。予備的観察によって、インテグリンによる接着斑の形成速度が約0.15um/分、その交換は約15分程度であることなどが分かった。今後伸展刺激を与えたときのインテグリンの動態を解析して上記の仮説を検証する予定である。
肝細胞癌転移におけるトロンボスポンジンの役割に関する臨床的実験的検討

1)免疫組織学的検討:ヒト原発性肝細胞癌切除標本60例について免疫組織化学染色を行い、Thrombospondin発現の検討を行った。その結果、約50%の症例において肝癌細胞にTSPの発現が認められた。また、全症例において肝癌細胞周囲の間質組織中にTSPが発現しており、癌近位部では癌遠位部に比べ強くその発現を認めた。2)免疫電顕法による局材部位の検討:光顕観察にてTSPの発現を認めた細胞につき、その細胞内局材を検討した。その結果、肝癌細胞、および癌近位部の線維芽細胞、血管内皮細胞の粗面小胞体にTSPの局材を認めた。この事よりTSPはこれらの細胞により産生され、癌周囲間質組織のTSP発現には癌細胞と同様に間質系の細胞の働きが重要である事が判明した。2原発生肝細胞癌患者における血中Thrombospondin値の測定:肝癌患者30人、健常者30人につきELISA法を用いそれぞれ血中TSP濃度の測定を行った。その結果、担癌患者における血中TSP値は健常人に比べ高値を示し、特に転移を伴う患者では有意に高値を示すことが判明した。3肝癌培養細胞における検討:1)肝癌培養細胞株においてTSPおよびそのレセプターの発現が光顕および電顕的に認められ、レセプターの発現率には相違がみられた。2)抗TSP抗体加およびTSP加で肝癌培養細胞増殖に及ぼす影響について検討したところ、使用した全細胞株で増殖抑制を示し、2倍体細胞HuH-7を用いた核DNA蛍光定量でも濃度依存性にS-G2M期細胞の減少を認めた。またTSP加では一部の細胞株において細胞増殖促進を認めた。3)抗レセプター抗体による増殖阻害実験で、レセプターの発現率と増殖阻害効果の間に相関が認められた。この事によりヒト肝癌培養細胞の増殖においてTSPは増殖因子として作用していることが示唆された。臨床面では、手術切除標本によるTSPの局在部位を検討し、間質組織にTSPの発現を全例(21/21)に認めた。また一部の肝癌細胞にもTSPを認め、現在その解析のため研究を続行している。担癌患者の血中TSP値は特に転移を伴う患者で1,000ng/ml以上の高値(正常値200ng/ml以下)を示すことが判明し、これも継続中である。培養細胞実験では現在までに4種類の肝癌培養細胞のTSP,receptorの発現を検討したが、ともに全例に認められた。receptorは癌種によりその発現率に相違がみられた。また抗TSP receptor抗体による増殖阻害実験ではreceptor発現率と、増殖阻害効果との間に相違が認められ、現在実験を継続中である。抗receptor抗体の細胞回転周期に及ぼす影響の検討ではS-G_2M期の減少が認められた。以上のごとく、初年度としてはほぼ計画どおりに達成された。特に重要な所見としては臨床面で癌転移患者における血中TSP値の上昇で今後転移の予知マーカーとして、あるいは血中TSPの作用抑制による転移阻止への方向性が示されたものと思われる。その際、低分子量で生物学的特性の少ない我々の抗receptor抗体の作用が重要なものと考えられる。またTSPおよび抗体の精製も順調に進んでいるが、その分析面でしばらく時間が必要と思われる。(特にDr.Tuszynski所有の抗体との比較)電子顕微鏡分析では培養細胞では順調であるが、病理組織では固定、染色を含めて難航している。

本年度は,In Situ HibridizationによるThrombospondinのm-RNA発現の検討を予定していたが,その進行が遅れがちであったため,原発性肝細胞癌組織,肝細胞癌培養細胞を用いた免疫電子顕微鏡法による研究を中心に,肝癌におけるThrombospondinの発現様式およびその発現機序の検討を行った.我々はThrombospondinの肝癌転移,浸潤にはたす役割の解明を進めており,これまでの免疫組織学的検討により肝細胞周囲の間質組織中にThrombospondinの発現が認められ,全症例において癌近部位では癌遠部位よりも強く発現していること,肝癌細胞では約60%の症例に発現していることを報告してきた.今回の免疫電子顕微鏡法を用いた検討により.肝癌培養細胞ではその粗面症胞体にThrombospondinの局在を認めた.また肝癌組織中のThrombospondinの産生,分泌細胞の同定を試みたが,その結果,癌近部位における間質系細胞(線維芽細胞,血管内皮細胞)と肝癌細胞の粗面症胞体にThrombospondinの発現を認めた.そのことから,癌周囲のThrombospondinの発現には癌細胞と同様にこれら間質系細胞の働きが重要であることが判明した.さらに癌遠位部ではこれら間質系細胞中のThrombospondinの発現の程度が低かったため間質系細胞のThrombospondin産生亢進に癌細胞のはたす役割の重要性が示唆され,今後,癌周囲におけるThrombospondin産生亢進をつかさどるメカニズムを解明する必要性が示唆された.
関東平野直下の地震活動及び地震動予測についての基礎的研究

研究成果は以下の3つに大別される。第1には、関東平野に内在する断層の調査やさらに大規模な構造の調査から関東周辺のテクトニクスを明らかにすることである。まず、五日市地域に分布する新第三系の断層系を分析し、この地域の応力場を明らかにした。さらに別の調査によってこの新第三系の構造が三つのプレートの相互作用に影響され複雑な応力場を形成していることが判明した。また、中新世火成岩の年代測定を行ない活動の年代も同定した。さらに、古代に発生した地震に伴う噴砂等の震害も調査した。第2には観測された地震活動からその発生機構や、関東平野直下に測想される断層面を設定した。まず、関東平野内陸部沿岸部に発生した深さ4080kmの地震の震度-M-震央距離の関係式を求めるとともに、過去80年間の地震発生の推移も明らかにした。さらに南関東地下の5つの地震の巣における地震活動を調べ、この部分のプレート間のサイスミックカップリングがわかった。このことからさらに、東京直下のプレート間に予想される断層による地震動と地殻変動の検討を行なった。第3には、地震工学的立場から地表の地震動予想に関するものである。まず、アレー観測を行ない、地震動予想を行なうには基盤構造の影響が極めて大きいことを確かめた孰さらに深さ30mまでの地盤のS波速度と地盤の増幅度の関係を調べ、このS波速度分布と対応している地質区分によって地盤モデルを設定した。このモデルによって1931年西埼玉地震での地表での地震動の強さを予想し、モデルの妥当性を確めた。以上が本年度の研究成果の重要な部分である。
超臨界溶体急速膨張法による微粒子形成のための基盤構築

本研究では,超臨界溶体急速膨張(RESS)法に着目し,難溶性薬物の微粒化手法としての適用性について検討した.溶質には,超臨界二酸化炭素中での溶質濃度条件により,異なる形態の微粒子が得られるとの報告例のあるケトプロフェンを採用した.RESS法による微粒子の生成において、超臨界二酸化炭素中での溶質濃度が、生成する粒子の形態に与える影響についてSEMによる粒子の形態観察と粒度分布の測定,モデル式を用いた粒子生成メカニズムの考察を行った.その結果,高濃度域では粗大な結晶状粒子が,低濃度域では球形の微小粒子の生成が確認され,表面反応律速モデルと拡散律速モデルにより,粒子形態の変化を説明できた.本研究では,既往の研究において,低溶解度条件下で数百ナノメートルオーダーの微粒子凝集体の生成が報告され,高溶解度条件下で数ミクロンオーダーの結晶性粗大粒子の生成が報告されているケトプロフェンを採用した.RESS法による微粒子の生成において,超臨界二酸化炭素に対する溶質の溶解度が,生成する粒子の形態に与える影響について検討するために,走査型電子顕微鏡(SEM)による粒子の形態観察と粒度分布の評価,モデル式を用いた考察,光散乱式粒子計数器(OPC)による粒度分布測定を行った.まず,SEMによる観察結果より,既往の研究の間の中間程度の溶解度において微粒子と粗大粒子が混在した状態を観察できた.これにより,溶解度の増加に伴い,粒子生成のメカニズムが変化し,生成する粒子が,微粒子から粗大粒子へと変化していることが示唆された.この現象を理論的に考察するために,拡散律速と表面反応律速を仮定した粒子生成・成長モデルを用いて,粒子径を算出した.この結果,低溶解度では拡散律速状態が支配的となり,高溶解度では表面反応律速状態が支配的なると仮定することで,溶解度によって微小粒子から粗大粒子へと変遷する粒子径の実測値の変化を定性的に表現可能であった.さらにOPCを用いた粒度分布の計測において,SEM画像では計測できない微小粒子が存在する可能性が示唆され,超微粒子生成の可能性が示された.また,超臨界流体を用いた新たな材料創製手法として,超臨界レーザーアブレーションの手法を用い,可視窓付きセルにより,超臨界二酸化炭素雰囲気下において,カーボンターゲットへのレーザー照射実験を行った.低圧および高圧条件化では,大気圧下でのレーザーアブレーション同様にアモルファス凝集体が得られたのに対し,臨界密度を呈する圧力条件において,結晶性の高い球形ナノカーボン微粒子が多数生成されることを確認した.本研究では,超臨界溶体急速膨張(RESS)法に着目し,難溶性薬物の微粒化手法としての適用性について検討した.溶質には,超臨界二酸化炭素中での溶質濃度条件により,異なる形態の微粒子が得られるとの報告例のあるケトプロフェンを採用した.RESS法による微粒子の生成において、超臨界二酸化炭素中での溶質濃度が、生成する粒子の形態に与える影響についてSEMによる粒子の形態観察と粒度分布の測定,モデル式を用いた粒子生成メカニズムの考察を行った.その結果,高濃度域では粗大な結晶状粒子が,低濃度域では球形の微小粒子の生成が確認され,表面反応律速モデルと拡散律速モデルにより,粒子形態の変化を説明できた.本年度は,染料や薬剤の溶解度を測定するとともに,超臨界溶体急速膨張法を用いる際に重要となる,高圧二酸化炭素存在下での染料や薬剤の融点降下を測定するための装置を新たに設計した.特に,溶質に混合物を用いた場合には二酸化炭素で加圧することで,共融点が大幅に減少することもあり,高圧二酸化炭素存在下で相状態を検討するには,融点降下を定量的に把握することが必要である.また,同時に捕集容器に大型の耐圧容器を用いて,実際に薬剤を用いた超臨界溶体急速膨張法による微粒子創製実験を行った.微粒種創製実験においては,溶解部の温度・圧力やノズル出口から微粒子捕集面までの距離などを変えて実験を行い,フィルタ上に捕集された微粒子の粒度分布および平均粒径などへの影響を検討した.この結果,溶解部の温度・圧力により溶解度すなわち過飽和度が決まり,過飽和度が大きいほど平均粒径の小さな微粒子が得られることが示唆された.また,ノズル出口から微粒子捕集面までの距離が長いほど,平均粒径の大きな微粒子が得られる傾向があったことから,この短い間でも粒子の成長が続いている可能性が示された.一方で,大型の耐圧容器は容量が大きいことと温度制御機能がないことでから,ノズル出口でのジュールートムソン効果による温度低下の影響をかなり受けていることが判明した.このため,容積の小さく温度制御可能でかつノズル出口の様子が可視化できるような微粒子回収装置を設計し,製作することとした.さらに,過飽和度の大きさによって微粒子創製の支配過程が核化,凝集,凝縮と変化する粒子成長モデルを仮定し,ノズル内部から溶体噴出後の状態を計算することで,微粒子の成長過程をモデリングた.上記の3つの各過程が支配的となる過飽和度の境界を調整することで,計算で得られる粒径は実測値の平均粒径を良好に再現することが可能であることが示された.超臨界溶体急速膨張法は,超臨界状態にある溶媒に溶質を溶解させた後,その溶体をノズルを介して急速に減圧・膨張させることで高い過飽和度を発生させ,微粒子を得る方法である.

この方法により得られた微粒子の粒径や結晶形態などの物性には,超臨界状態の条件が大きく影響しており,これまでに温度・圧力の影響が検討されてきた.その結果,特に超臨界流体中の溶質濃度が,過飽和度を決定する重要な因子であり,得られる微粒子に大きく影響することが明らかとなった.しかしながら,既往の研究では溶質濃度を制御するのに,温度あるいは圧力のいずれかを固定して行っており,同程度の溶質濃度を呈する条件における,温度・圧力を同時に変更した場合の検討は行われていない.また,昨年度までの検討により,溶質濃度により得られる微粒子の形態が変化する可能性が示唆されている.本年度は,温度35,45,55°Cの条件において,圧力を714MPaまで変化させて実験を行った.その結果,比較的大きな結晶状粒子と微小な球形粒子の生成が確認された.結晶状粒子は数ミクロン程度まで成長しており,同じ溶質濃度でも温度の高い条件(低密度)において生成した粒子のほうが粒径が小さくなった.なお,球形粒子は結晶成長に消費されなかった過飽和状態のケトプロフェンが,フィルタ表面において凝縮したものと考えられる.さらに,温度が35°Cの条件では溶質濃度の増加に伴い球形粒子が観察されなくなり,結晶成長が促進されたのに対し,温度が45と55°Cの条件では,溶質濃度を増加しても球形粒子が観察され,結晶成長が阻害された.また,粒子生成過程の解析のため,ノズル内における状態量変化と核生成速度を計算した.求めた核生成速度からノズル出口までの積算により核生成量を求め,生成粒子径を算出し,実験値の球相当径と比較したところ,計算値は実験値のおよそ1/3程度となった.化工物性,エアロゾル科学本年度は,既往の研究による報告例で,超臨界溶体急速膨張法により生成した微粒子の粒径に大きな差のあったケトプロフェンを対象に,溶解度条件を変化させて実験を行い,粒径変化に及ぼす溶解度(過飽和度)の影響について考察するとともに,粒子生成メカニズムの変化について検討を行った.回収部に恒温槽の水を循環させることで,粒子生成部の温度制御を可能にしたことで,安定して微粒子を生成できるようになった.これまで,生成微粒子の粒径には溶解度(過飽和度)が大きく影響しており,同じ圧力での実験においては温度が高く,溶解度が大きい条件でより微小な粒子が生成されていた.しかしながら,同一温度において圧力を上げて溶解度を増加させた場合には,溶解度(過飽和度)が大きくなるにつれ得られる粒子径も増大し,特に多数の微小粒子を得るために溶解度を極端に増加するような温度,圧力条件に設定したところ,微小粒子の数が増えるのではなく,結晶状粗大粒子が出現することが判明した.ケトプロフェンにおいては,微小粒子と粗大粒子の生成条件の境目としては,溶解度で10-6程度以上であり,モデルによる計算でも,この溶解度領域において粒子生成のメカニズムが拡散律速から表面反応律速へと変化することが示唆された.このように,急速膨張法における粒子生成条件の検討およびメカニズムの提案ができた.一方,新規無機微粒子材料創製場として超臨界流体中でのレーザーアブレーションによるカーボン微粒子の創製実験においては,新たに実験装置を作成し,様々な条件においてカーボン微粒子の生成を試みた.再現性や得られた微粒子の物性評価等の課題はあるものの,臨界点近傍において,結晶性の高い球形ナノカーボン微粒子が得られる可能性が示唆された.流通型の測定装置による溶解度の測定はおおむね良好に行えているが,融点の測定はまだ常圧下でしか行えておらず,高圧下での適用にはいろいろと課題が多い.
エネルギーシミュレーションに用いる気象モデルの開発とその応用に関する研究

地球温暖化問題に対する建築環境シミュレーション分野の取り組みとして、国際的に利用されているエネルギーシミュレーションプログラムに、(1)天空放射輝度分布、(2)天空輝度分布、(3)波長別日射量、(4)紫外域日射量の影響を考慮する手法を組み込むことで、詳細・精密な環境予測を可能とすることを目的として、天空放射輝度分布の考慮手法、波長別日射量の観測データの分析と既往推定モデルの検討、及び、紫外域日射量推定モデルの開発検討を行った。1)天空放射輝度分布を考慮した壁面日射計算法天空放射輝度分布を考慮した壁面日射計算法について、計算精度、計算時間の再検証を行い、精度、計算時間ともに充分なものであることを確認した。2)EnergyPlusへの天空放射輝度分布・輝度分布モデルの組み込み通常の建築熱環境シミュレーションでは一様と仮定されている天空放射輝度分布を、建築エネルギーシミュレーションソフトウェアEnergyPlusに組み込む手法を検討した。併せて、現状のEnergyPlusにおける、照明計算時の天空輝度分布の考慮手法(Clear Sky、Clear Turbid Sky、Intermediate Sky、Overcast Skyの4つの天空状態の組み合わせから、天空の輝度分布を求めるPerezの手法)を拡張するために、晴天空から曇天空までを15の天空状態(天空タイプ)で表すCIE標準一般天空モデルのEnergyPlusへの組み込みを検討した。組み込みを行うために、EnergyPlusソースコードより、照明計算・壁面日射量計算に関するファンクションの洗い出しを行い、コードの変更の方針を検討した。3)波長別日射量測定データの整理と既往の日射の波長別日射モデルの分析所属機関で測定した波長別日射量データの品質チェック・欠測処理を行い、モデル化に先立つ、データ整備を行った。整備した測定データを季節・天候、晴天指標、可降水量といった気象指標で分類したうえで、その傾向把握を行った。さらに、晴天時を想定した波長別日射モデルであるBirdモデルを用い、混濁因子の最適値を同定し、その際のモデルの適応性を検討したn晴天時については、混濁因子の最適値を用いることで、Birdモデルにより波長別日射量を精度よく推定できることを明らかにした。1)天空放射輝度分布を考慮した壁面日射量計算法博士学位研究で行った天空放射輝度分布を考慮した壁面日射量計算法について、再検証を行った(パラメータの再確認、推定誤差の確認、計算時間)。検証結果は十分なものであると判断したため、論文執筆を行い、日本建築学会環境系論文集に投稿し採用された(2012年5月号)。2)波長別日射量推定モデルの検討前年度に観測した波長別日射量の単年度データに加え、継続して観測した本年度データの整備を行った。独自モデルの開発にはデータ量が十分でないと判断したため、前年度データに加え、本年度観測データを用いて、既往モデルの適用性を検討した。晴天時については、混濁因子の最適な推定を行うことができれば、Birdの推定モデルにより波長別日射量を精度よく推定できることを明らかにしたが、全ての天空状態への適用を考え、他の既発表推定モデル(田中ら、曽我ら、永田)についても比較検討を行った。3)紫外域日射量推定モデルの検討当初予定していなかったが、併せて観測を行っている紫外域日射量についても、その室内への影響を考慮する為、推定モデルの検討を行った。既発表モデル(UV-A、UV-B)の比較検討を行った。比較した結果、精度が最も高いと判断した推定モデルについて、パラメータの再同定を行った。4)EnergyPlusソースコードの確認天空放射輝度分布、輝度分布、波長別日射量、紫外域日射量を考慮するためのファンクションをEnergyPlusソースコードに組み込むことを考え、ソースコードにおけるファンクション組み込み箇所、方法の検討を行った。
食品に含まれる抗酸化物質の機能解析と新規生体防御物質の設計

要旨:食品に含まれる種々の抗酸化物質およびそれらの類縁化合物、新規化合物の抗酸化作用について検討し、以下に示すような結果を得ている。(1)カレー粉に含まれるカーキュミンをはじめコーヒー酸など数種の天然フェノール化合物の抗酸化活性を求めたが、α-トコフェロール(ビタミンE)を超えるものはなかった。(2)β-カロテンをはじめとするカロテノイド類の抗酸化作用について基礎的検討を行ない、β-カロテンの抗酸化活性が、均一溶液中よりは膜中で、また酸素圧の低いほど抗酸化活性が大きいことを認めた。(3)チオール化合物の抗酸化作用について研究をはじめた。(4)トコフェロール、ヒドロキシカルバゾール、および2,6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシトルエン(BHT)など合成抗酸化物の膜における抗酸化作用について詳細に検討し、これらの相対的な活性や水相にあるアスコルビン酸との反応が、これらの膜内での存在位置、その場での動きやすさ、ラジカルの生成場に依存することを実験的に明らかにした。(5)低比重リポタンパク質(LDL)の脂質の酸化、アポリポプロテインB100の変性に対する抗酸化物の抑制作用について検討し、不均一な場であるLDLの酸化に対しては、特に抗酸化物の存在場と動きやすさが重要な因子であることを明らかにした。(6)これらの知見をもとに、現在新規の抗酸化物の開発、評価を行なっている。
ファンクショナルミュータジェネシスによる原虫変異体バンクの開発

遺伝子機能変異体を用いた方法論は感染症研究において極めて有用であり、バベシア・タイレリア・コクシジウムなど獣医学上重要な原虫病研究に対しても応用が期待される。しかしながら、複雑な真核細胞体からなる原虫に対しては、ゲノムワイドな機能的変異体作製技術は存在しない。そこで研究代表者はトランスポゾンを用いた、原虫機能変異体ライブラリーの作製を試みた。その結果、マラリア原虫遺伝子機能増強型変異体ライブラリーの作製に成功した。また、このライブラリーをスクリーニングすることでベクター媒介性に関与する遺伝子座を数種類同定することに成功した。本研究は、網羅的な遺伝子機能減衰型・増強型変異体原虫の作製技術を基盤として原虫変異体ライブラリーを作製しようとするものである。また、その応用により原虫病研究全体のボトムアップを目指すものである。1.機能変異体原虫バンクのモデル解析得られた変異体バンククローンより、各種の遺伝学的性状解析を行い、本実験システムによって得られる変異体バンクの有用性の検証を行った。サザンハイブリダイゼーション法をベースとした、トランスポゾンエレメントの原虫ゲノム挿入部位のバリエーション解析を行ったところ、1バッジあたり25から50の変異体が分離されることが推定された。インバースPCR法とゲノムデータベースの比較解析により、ゲノム上のトランスポゾンエレメント挿入部位の同定を行い、遺伝子制御領域への導入を確認した。2.遺伝子機能変異体スクリーニングシステムの開発1バッジに様々な変異体を含む網羅的変異体原虫ライブラリーを作製し、特異的な選択圧に対する抵抗性を持つ変異体のスクリーニングを行った。プライマリー変異体プールを機能減衰型・増強型それぞれ75ロットを等量ずつ混合後、一個体のマウスに感染することにより得られた原虫群を、機能減衰型原虫ライブラリー・機能増強型原虫ライブラリーとした。これらの原虫を用いた変異体スクリーニングシステムを実験的に運用した。ベクターを用いた変異体群の選択を行ったところ、ハマダラカに対して高感染性を示す変異体原虫群の分離に成功した。本年度における研究では作製した変異体ライブラリーについて、分子生物学的手法を用いた解析により、変異の導入部位、発現変動のレベルを個々に解析した。これらの情報を基に試験的なデータベースを構築した。この結果、多数の双方向性に機能するプロモーター領域が存在する可能性が示唆され、本法における変異体ライブラリー作製法は機能増強型ライブラリー用としてより適していることが示唆された。1.機能減衰型・増強型プライマリー変異体プールの網羅的作製現在までの研究成果によって構築された、機能減衰型・機能増強型それぞれのターゲティングプラスミドとヘルパープラスミドをエレクトロポレーション法によりマラリア原虫に導入し、薬剤選択を行った。この作業によって分離される原虫群、すなわち機能変異体原虫群を"プライマリー変異体プール"とした。このプライマリープールの最小単位は一度の遺伝子導入実験から分離され、およそ20種類程度の変異体を含むことが申請者の現在までの研究により明らかになっている。本計画ではモデルとして機能減衰型・増強型それぞれ500クローンの作製を目標とし、各25回の遺伝子導入実験を行いプライマリー変異体プールを作製した。このプライマリー変異体プールは-80°Cにて保存した後、次段階の実験に供した。2.機能変異体原虫の網羅的クローン化による変異体バンクの作製1によるプライマリー変異体プールから原虫のクローン化を行った。マウスを用いたin vivo限界希釈法により、機能減衰型・機能増強型それぞれのプライマリープールより、クローニングを行った。約100系統の変異体クローンの分離に成功した。ほぼ当初の年次計画通りに研究が実施されており、期待と同程度、またはそれ以上の研究結果が順調に得られている。研究期間の延長を行ったが、これは研究進展の結果、新規のマラリア原虫媒介関連遺伝子群の同定に成功したことから計画を変更し、この同定遺伝子群の詳細な性上解析を行ったためであり、研究計画の順調な進展を裏付けるものである。ほぼ当初の年次計画通りに研究が実施され、期待と同程度の研究結果が順調に得られているため。原虫変異体群は、研究者コミュニティーに公開され、広く利用されることで初めて研究リソースとしての真価を発揮し、研究領域全体の活性化に寄与する。そこで、将来的な原虫変異体バイオリソースとして資するために、試験的に変異体バンクデータベースを作成する。

各クローン・変異体群について、インバースPCR法、リアルタイムPCR法等の分子生物学的手法を用いた解析を行い、ターゲット遺伝子情報・遺伝子発現変動レベルなどの情報をまとめ、試験的なデータベース運用を試みる。1.機能変異体原虫バンクのモデル解析得られた変異体クローンより、機能減衰型・増強型それぞれ50クローン、計100クローを目処として、各種の遺伝学的性状解析を行い、本実験システムによって得られる変異体バンクの有用性を検証する。サザンハイブリダイゼーション法をベースとして、トランスポゾンエレメントの原虫ゲノム挿入部位のバリエーション解析を行う。申請者が開発した実験システムによる原虫変異体バンクのゲノムカバレージモデル解析を行い、全遺伝子変異体バンクの作製に必要なクローン数を算定する。またインバースPCR法とゲノムデータベースの比較解析により、ゲノム上のトランスポゾンエレメント挿入部位の同定を行うことにより、機能減衰・増強のターゲットとなっている遺伝子を同定する。この情報をもとに、リアルタイムPCR法により、ターゲット遺伝子発現変動状態を解析し、本法により樹立された変異体の性能データを抽出・解析する。2.遺伝子機能変異体スクリーニングシステムの開発1バッジに様々な変異体を含む網羅的変異体原虫ライブラリーを作製し、特異的な選択圧に対する抵抗性を持つ変異体のスクリーニング・同定システムを構築する。(1)によって得られたプライマリー変異体プールを機能減衰型・増強型それぞれ75ロットを等量ずつ混合後、一個体のマウスに感染することにより得られた原虫群を、機能減衰型原虫ライブラリー・機能増強型原虫ライブラリーとする。これらのライブラリーは計算上約1,500種の機能減衰または増強された原虫群を含む。これらの原虫を用いた変異体スクリーニングシステムを実験的に運用し、その性能を評価する。ライブラリー感染マウスに対し様々な阻害剤を投与することで増殖選択圧を加え、耐性原虫を分離する。分離原虫をクローン化し、責任遺伝子の同定を行う。得られた結果の解析により、本スクリーニングシステムの実用性を評価する。H25年度においては現在までの研究により分離した変異体原虫群・変異体クローンの遺伝学的情報の解析とデータベース化を計画している。したがってこれらの実施に必要となる分子生物学的解析に関する消耗品費用としての研究費の使用を計画している。また、データベース構築のための人件費、得られた研究成果公表のための学会参加旅費等の支出を予定している。H24年度においては、主として、H23年度において得られたライブラリークローン変異体原虫の、サザンブロット、インバースPCR、リアルタイムPCR、DNAシーケンスなどの方法によって行う分子生物学的実験による解析に関する消耗品費用として研究費の使用を計画している。また、それにともなう研究補助者人件費等に対する支出を予定している。さらに、得られた研究成果を発表するための学会参加旅費等の支出を予定している。
配向蛋白質系の動態の高速光学解析

1.配向系偏光解消システムの開発回転式試料ホルダーを内臓した大型キュベットを試作し,任意の方向に配向させた試料を対象に蛍光偏光解消,燐光偏光解消の測定を行なえるようにした.空間的一様性の保証されない配向試料に対処するため, 2本の光電子増倍管で偏光成分を多重測定することにより系統誤差を除去する方法を考案し,そのためのデータ解析プログラムを完成させた.2.収縮装置の研究筋線維中のミオシン分子頭部を色素エオシンで選択的にラベルし,上記システムで解析を行なった.まず硬直状態の筋では,ミオシン頭部の長軸がアクチン線維に約48度の角をなして結合していること,その結合は固く,ミオシン・アクチン両フィラメントが10nmずれる程度引張ったのでは結合角が変わらないこと,などがわかった.次に弛緩状態では,すでに合成ミオシン線維,筋原線維につき報告したものとよく似た頭部の揺動が見られた.配向試料ではこの揺動の軸が筋線維内でどちらを向いているかという情報が得られるが,予想に反して,この軸は全くランダムに分布しているように見えた.これが唯一の解釈であるかどうか,今検討中である.張力発生中の筋からの信号は,硬直状態と弛緩状態の中間であった.3紫膜の構造解析配向紫膜上での蛍光エネルギー移動速度の解析により,紫膜中のプロトンポンプ蛋白質バクテリオロドプシンの活性中心レチナールが,紫膜の細胞質側表面から1.0±0.3nmにあることを示した.1.配向系偏光解消システムの開発回転式試料ホルダーを内臓した大型キュベットを試作し,任意の方向に配向させた試料を対象に蛍光偏光解消,燐光偏光解消の測定を行なえるようにした.空間的一様性の保証されない配向試料に対処するため, 2本の光電子増倍管で偏光成分を多重測定することにより系統誤差を除去する方法を考案し,そのためのデータ解析プログラムを完成させた.2.収縮装置の研究筋線維中のミオシン分子頭部を色素エオシンで選択的にラベルし,上記システムで解析を行なった.まず硬直状態の筋では,ミオシン頭部の長軸がアクチン線維に約48度の角をなして結合していること,その結合は固く,ミオシン・アクチン両フィラメントが10nmずれる程度引張ったのでは結合角が変わらないこと,などがわかった.次に弛緩状態では,すでに合成ミオシン線維,筋原線維につき報告したものとよく似た頭部の揺動が見られた.配向試料ではこの揺動の軸が筋線維内でどちらを向いているかという情報が得られるが,予想に反して,この軸は全くランダムに分布しているように見えた.これが唯一の解釈であるかどうか,今検討中である.張力発生中の筋からの信号は,硬直状態と弛緩状態の中間であった.3紫膜の構造解析配向紫膜上での蛍光エネルギー移動速度の解析により,紫膜中のプロトンポンプ蛋白質バクテリオロドプシンの活性中心レチナールが,紫膜の細胞質側表面から1.0±0.3nmにあることを示した.
積層・切削のワンプロセス加工によるパーシャルデンチャーのフルデジタル製作

本年度は,昨年度までと同様なエーカースクラスプの設計を行い,金属光造形複合加工機(Lumex Avance-25)を使用して,Co-Cr合金粉末から積層・造形ワンプロセス加工によりクラスプ試料の製作を行った.その際に造形角度を変化させた試料を製作した.同様にエーカースクラスプの設計を行い,金属積層造形機(EOSIT M290,EOS社製)を用いた金属レーザー焼結により純チタン2種,Ti-6Al-4V合金で製作したクラスプ試料と鋳造によりTi-6Al-4V合金とTi-6Al-7Nb合金を使用して製作したクラスプ試料の製作後,レストとクラスプアーム内面の表面粗さを既存の形状測定機(NH-3N)により測定した.その後,クラスプ試料を適合精度と初期維持力を測定し,比較検討した.さらに,当講座で開発した繰り返し着脱試験機(JM100-T)を使用して,10万回までの着脱試験を行い,エーカースクラスプにおける,表面性状,加工精度と維持力の変化および耐久性について造形角度の相違,製作方法の相違によるクラスプの補綴学的評価を行った.パーシャルデンチャーのフルデジタル製作においては,(株)コアデンタルラボ横浜の協力のもとにアセンブリ式による技工術式を完成させた.すなわち,片側性の中間欠損および両側性の多数歯欠損の2症例に対して,フレームワーク,義歯床基底面,床翼歯槽部,人工歯部の4要素をCADにてデザイン後,金属構成要素はCo-Cr粉末より積層造形,その他のレジン部はPMMAディスクからミリング加工にて造形し,各パーツを3D Printed作業用模型上にて一体化させた.実際の口腔内に試適したところ,従来のアナログ義歯に比較して十分な適合精度を確認でき,臨床応用の限りない可能性が示唆された.また,全てのデジタルデータが保存されていることから,同一の義歯の複製も可能であった.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,積層造形と切削のワンプロセス加工法を用いて,表面性状および加工精度と機能性の大幅な向上を図れるパーシャルデンチャーのエーカースクラスプを製作し,適合精度と物性の検証を行った.第一大臼歯を想定した樽状金型支台をデジタルデータ化し,既存の専用デジタル設計システム(DWOS)を使用してエーカースクラスプの設計を行った.(株)松浦機械製作所の技術協力のもとに最新の金属光造形複合加工機(Lumex Avance-25)を使用して,Co-Cr合金粉末から積層・造形ワンプロセス加工によりクラスプ試料の製作を行った.サポート部の切断後に,フレームワークの非破壊検査を行い,レストとクラスプアーム内面の表面粗さを既存の形状測定機(NH-3N)により測定した.その後,クラスプ試料を金型模型に5kg荷重下で設置し,適合精度と初期維持力を測定し,比較検討した.さらに,当講座で開発した繰り返し着脱試験機(JM100-T)を使用して,10万回までの着脱試験を行い,維持力の変化と耐久性を測定し,新規製作法によるクラスプの補綴学的評価を行った.一方,CAD/CAMデンチャーは既存ソフトにて人工歯排列,歯肉形成が実施されており,実際の口腔内のデンチャースペースを義歯形態に組み込むことは不可能であった.そこで,ピエゾグラフィーを用いてデンチャースペースを採得し,スキャン後,CAD上でスーパーインポーズすることによりニュートラルゾーンに合致した人工歯排列,歯肉形成を行った.製作したCAD/CAMピエゾグラフィックデンチャーを口腔内に装着したところ十分な維持,安定,高い装着感と使用感を得ることができた.当初の計画では積層造形・切削のワンプロセス加工によるクラスプの適合精度と物性の検証をCo-Cr合金,純チタン,Ti-6Al-7Nb合金の3種類で行うはずであったが,Co-Cr合金による適合試験と維持力の測定までしか達成できなかった.しかしながら,積層造形・切削のワンプロセス加工による複数のエーカースクラスプを設置した小型フレームワークを製作し,実際の口腔内に試適し,適合,維持力の両面から十分臨床応用可能なことを確認した.次年度は引き続きCo-Cr合金,純チタン,Ti-6Al-7Nb合金におけるクラスプの精度と維持力,耐久性の検証を行う予定である.また,積層・造形ワンプロセス加工による大型フレームワークの製作に着手できなかったため,次年度は大型フレームワークの製作に着手する.その際には,両側性遊離端欠損の歯列模型をデジタルデータ化し,既存の専用デジタル設計システム(DWOS)を使用してパーシャルデンチャーフレームワークの設計を行う.フレームワークデータをもとに,前述の金属光造形複合加工機によりフレームワークを製作するが,実際の製作に要する時間を測定し検証する.さらに,大型フレームワークの精度と全体の維持力を前述の試験機により測定し,3種類の金属による検討を行う.加えて,前年度製作した鋳造,ミリング,積層造形の3種類の大型フレームワークと比較検討し,同加工法の最終的な補綴学的評価を行う.昨年度行った積層造形と切削によるワンプロセス加工法を用いて製作したエーカースクラスプにおいて,表面性状,加工精度と維持力の変化および耐久性を明らかにした.しかしながら,支台歯金型の鉤体からレストへの移行部が鋭角であり,切削バーの直径の大きさに依存して,十分な適合を得ることは困難であった.そこで本年度は,エーカースクラスプの設計を行う際に,既存の専用デジタル設計システム(DWOS)を使用して鉤体ーレスト移行部をデジタルリリーフし,適合精度の向上を目的とした新たな検証を行った.

第一大臼歯を想定した樽状金型支台をデスクットプスキャナーにて読み込みデジタルデータ化し,デジタルリリーフ後,エーカースクラスプの設計を行なった.(株)松浦機械製作所の技術協力のもとに最新の金属光造形複合加工機(Lumex Avance-25)を使用して,Co-Cr合金粉末から積層造形・切削ワンプロセス加工によりCo-Cr合金クラスプ試料の製作を行った.サポート部の切断後に,フレームワークの非破壊検査を行い,レストとクラスプアーム内面の表面粗さを既存の形状測定機(NH-3N)により測定した.その後,クラスプ試料を金型模型に5kg荷重下で設置し,適合精度と初期維持力を測定した.さらに,当講座で開発した繰り返し着脱試験機(JM100-T)を使用して,10万回までの着脱試験を行い,維持力の変化と耐久性を測定し,新規製作法によるクラスプの補綴学的評価を行った.その結果,デジタルリリーフにより適合精度の向上が確認でき,維持力および耐久性にも問題ないことを検証した.当初の計画では積層造形・切削のワンプロセス加工によるクラスプの適合精度と物性の検証をCo-Cr合金,純チタン,Ti-6Al-7Nb合金の3種類で行うはずであったが,Co-Cr合金による適合試験と維持力の測定までしか達成できていない.しかし,臨床での設計に近いリリーフをデジタル上で行うことができ,適合精度と物性の検証ができた.一方,積層造形・切削のワンプロセス加工による複数のエーカースクラスプを設置した小型フレームワークを製作し,実際の口腔内に試適し,適合,維持力の両面から十分臨床応用可能なことを確認した.次年度は引き続きCo-Cr合金,純チタン,Ti-6Al-7Nb合金におけるクラスプの精度と維持力,耐久性の検証を行う予定である.また,積層・造形ワンプロセス加工による大型フレームワークの製作に着手できなかったため,次年度は大型フレームワークの製作に着手する.その際には,両側性遊離端欠損の歯列模型をデジタルデータ化し,既存の専用デジタル設計システム(DWOS)を使用してパーシャルデンチャーフレームワークの設計を行う.フレームワークデータをもとに,前述の金属光造形複合加工機によりフレームワークを製作するが,実際の製作に要する時間を測定し検証する.さらに,大型フレームワークの精度と全体の維持力を前述の試験機により測定し,3種類の金属による検討を行う.加えて,前年度製作した鋳造,ミリング,積層造形の3種類の大型フレームワークと比較検討し,同加工法の最終的な補綴学的評価を行う.本年度は,昨年度までと同様なエーカースクラスプの設計を行い,金属光造形複合加工機(Lumex Avance-25)を使用して,Co-Cr合金粉末から積層・造形ワンプロセス加工によりクラスプ試料の製作を行った.その際に造形角度を変化させた試料を製作した.同様にエーカースクラスプの設計を行い,金属積層造形機(EOSIT M290,EOS社製)を用いた金属レーザー焼結により純チタン2種,Ti-6Al-4V合金で製作したクラスプ試料と鋳造によりTi-6Al-4V合金とTi-6Al-7Nb合金を使用して製作したクラスプ試料の製作後,レストとクラスプアーム内面の表面粗さを既存の形状測定機(NH-3N)により測定した.その後,クラスプ試料を適合精度と初期維持力を測定し,比較検討した.
分散ネットワークにおける新しい適応推定アルゴリズムの開発と性能解析に関する研究

センサーネットワークなどの分散ネットワークにおける適応推定問題は,将来の信号処理ネットワークにおける重要な問題として位置づけられており,世界的に研究が進められている.本研究では,適応推定問題に対する「拡散アルゴリズム」と呼ばれるクラスの分散アルゴリズムのための省電力化に関する研究を行った.主要結果は,任意の拡散アルゴリズムに対して,推定すべき未知パラメータの推定精度を劣化させることなく,より省電力なアルゴリズムへと拡張することが可能な省電力化アルゴリズムを提案している.提案法では,隣接ノードと情報交換をランダムに行う「確率的拡散方式」を用いることで,長時間ネットワークを稼働した際の平均的な通信回数を削減し,通信に要する電力を削減することで省電力化を行っている.この確率的拡散方式では,情報交換の起こる頻度を「接続確率」によって制御することが可能であり,本研究では,「与えられた平均消費電力制約(または通信頻度制約)の下で,平均二乗誤差の意味で推定誤差を最小化する最適化問題」を世界に先駆けて定式化しており,この問題に対する凸緩和問題および逐次近似アルゴリズムを,凸最適化理論や不動点理論に基づき提案している.提案法は,非拡大写像の不動点集合上で凸関数を最小化可能な「ハイブリッド最急降下法」(山田2001年)を応用したアルゴリズムである.また,アルゴリズムの実装に必要なパラメータを適応的に学習する方式も提案しており,提案法と組み合わせることにより,接続確率を適応的に制御する手法の開発にも成功している.これら提案法の有効性を,包括的な計算機シミュレーションにより確認している.センサーネットワークなどの分散ネットワークにおける適応推定問題は,将来の信号処理ネットワークにおける重要な問題として位置づけられており,世界的に研究が進められている.本研究では,適応推定問題に対する「拡散アルゴリズム」と呼ばれるクラスの分散アルゴリズムのための省電力化に関する研究を行った.主要結果は,任意の拡散アルゴリズムに対して,推定すべき未知パラメータの推定精度を劣化させることなく,より省電力なアルゴリズムへと拡張することが可能な省電力化アルゴリズムを提案している.提案法では,隣接ノードと情報交換をランダムに行う「確率的拡散方式」を用いることで,長時間ネットワークを稼働した際の平均的な通信回数を削減し,通信に要する電力を削減することで省電力化を行っている.この確率的拡散方式では,情報交換の起こる頻度を「接続確率」によって制御することが可能であり,本研究では,「与えられた平均消費電力制約(または通信頻度制約)の下で,平均二乗誤差の意味で推定誤差を最小化する最適化問題」を世界に先駆けて定式化しており,この問題に対する凸緩和問題および逐次近似アルゴリズムを,凸最適化理論や不動点理論に基づき提案している.提案法は,非拡大写像の不動点集合上で凸関数を最小化可能な「ハイブリッド最急降下法」(山田2001年)を応用したアルゴリズムである.また,アルゴリズムの実装に必要なパラメータを適応的に学習する方式も提案しており,提案法と組み合わせることにより,接続確率を適応的に制御する手法の開発にも成功している.これら提案法の有効性を,包括的な計算機シミュレーションにより確認している.
細胞性粘菌遺伝子の発生分化における発現ネットワーク解明

昨年度までに、細胞性粘菌の日本cDNAプロジェクトおよびゲノムプロジェクトの塩基配列デーダより、他生物の転写因子遺伝子に相同遺伝子55個に注目し、これらの遺伝子破壊株の作製を進めてきた。今年度は、これらのうち36遺伝子について、発生過程における発現パターンをリアルタイム定量PCRにより解析した。その結果を用いて、発生開始後に発現が誘導される遺伝子7個、破壊株作製済の遺伝子2個、計9個の転写因子遺伝子について遺伝子ネットワークの解析を行った。遺伝子ネットワーク解析の第一歩として、三菱スペース・ソフトウェア株式会杜との共同研究でS-systemを用いたネットワークの推定を試みた。現在まで、S-systemを用いた手法では仮想的なタイムコースデータでの有効性が示されているに過ぎず、実験データを用いた例はなかったので、細胞性粘菌の発生過程における転写因子遺伝子の発現パターンをタイムコースデータを用いて行うことにした。タイムコースデータは、野生株と2株の転写因子遺伝子破壊株、計3株における9個の転写因子遺伝子の発生時の発現データを、信頼性の高いリアルタイム定量PCRにより測定した。また、再現性を確認するため、"RNAサンプリング、定量PCRによる発現パターン解析、S-systemによる遺伝子ネットワーク推定"という二連の実験を複数回行った。その結果、複数回のネットワーク推定実験での主な共通箇所は、遺伝子破壊株で影響を受けていてその下流にあることが予想される遺伝子への正の制御関係であったが、それ以外にも遺伝子破壊株以外の遺伝子間での制御関係も推定された。このような遺伝子破壊の影響だけではない制御関係が、異なるタイムコースデータで再現性を持って推定されているのは興味深い。現在、既に得られている別の遺伝子破壊株を用いて、推定されたネットワークの検証を行っている。最近のマイクロアレイを用いた遺伝子発現の大規模解析により、細胞性粘菌の発生過程において細胞が集合する時期を境に、発現される遺伝子が大きく変わることが示された。これは、単細胞から多細胞へ移行する時期に遺伝子発現を制御する因子が大きく変化すること、似たような発現パターンを示す遺伝子グループは共通の転写制御因子に支配されていることを示唆する。私は、発生過程における遺伝子発現に、どのような転写制御因子が『いつ・どこで』遺伝子発現に関与しているのかを明らかにし、最終的に細胞性粘菌における多細胞体形成における遺伝子発現のネットワークを明らかにすることを目標として解析を行っている。昨年度までに、日本cDNAプロジェクトおよびゲノムプロジェクトの塩基配列データより、他生物の転写制御遺伝子に相同性な遺伝子を55個抽出し、(1)遺伝子破壊株の作製(2)転写制御因子遺伝子の時間的発現プロファイル解析(3)転写制御因子遺伝子の空間的発現プロファイル解析を網羅的に行っている。(1)については昨年・今年とPCR法による効率的破壊株作製法の開発と破壊株作製を行った。作製方法については1本のチューブ内で極めて効率的に遺伝子破壊用DNAを作製する方法を開発し発表した(BIOTECHNOLOGY LETTERS 24(16):1307-1312 2002)。これらの方法を用い現在までに16遺伝子の破壊株を得ている。(2)については転写制御遺伝子の発生過程における時間的発現プロファイル解析をリアルタイム定量PCR法を用いて行い、現在までには55遺伝子中38遺伝子の解析を終了している。(3)についてはin situハイブリダイゼーションによる空間的発現プロファイル解析を行い55遺伝子中26遺伝子の解析を終了している。今後(1)(2)(3)について55遺伝子全てでの解析を終了し、また遺伝子破壊株を用いたマイクロアレイ解析を行う予定である。
2次元手動制御系を用いた運動機能障害の計算機診断システムの開発研究

近年、パーキンソン病・小脳性運動失調症・筋ジストロフィー・脳卒中後遺症などの、運動機能の障害を伴う難病治療に対する関心が高まり、早期診断のための新しい運動機能検査方法の開発が望まれている。本研究では、運動機能障害者に対する薬物治療やリハビリテーションの効果の定量的かつ客観的な評価と、パーソナルコンピュータによる鑑別診断を可能にするための、2次元手動制御系を用いた新しい運動機能検査システムの開発を目的とした。まず、パーキンソン病と小脳性運動失調症の2つの疾患が随意運動の予測制御機能に及ぼす影響を、1次元手動制御系において明らかにした。その結果、学習過程、操作量の速度のパワースペクトルやコヒーレンシィに注目すれば、疾患の鑑別診断にとって有効な指標となることが明らかとなった。ついで、1次元手動制御系における目標入力に対する適応性に関する研究を行ない、これまで提案されているモデルによっては説明しにくい周波数応答を、むだ時間を含む線形系に対する出力レギュレータ・モデルを構成することによって非常によく近似できることを示した。また、信号の上下および左右方向の極性を反転させる要素を制御対象とする2次元手動制御系を用いた実験を行ない、人間オペレータには、制御対象の極性反転の方向によってその動特性が異なること、すなわち異方性が存在することを明らかにした。本研究で提案したような2次元手動制御系を用いた検査システムは、従来の臨床神経学的検査方法にはなかった視覚情報と体性感覚情報の統合機能の定量的・客観的な検査が実行でき、計算機による自動診断アルゴリズムを導入することにより、さらに実用的な検査システムとなることが期待される。