hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気孔孔辺細胞におけるタイプ1プロテインフォスファターゼの機能に関する研究

一方、他のフォスファターゼPP2A、PP4、PP5、PP6、PP7とはまったく結合しなかった。3)組み換えタイプ1プロテインフォスファターゼに、組み換えインヒビター3を添加するとナノモルオーダでフォスファターゼ活性を強く阻害した。4)GFPとの融合タンパク質は核と細胞質の両方に発現していた。5)プロモータ解析よると維管束に、また、生化学的解析によって孔辺細胞には特に大量に、同時に葉肉細胞、茎、根にも発現が認められた。6)インヒビター3の破壊株を取得し、機能解析をおこなった。ホモの状態で初めて変化が見られたが、胚発芽の段階で、致死になった。従って、インヒビター3は胚発生の過程で何らかの重要な働きをしていることが推定されたが、気孔の働きの変化を見る事は出来なかった。現在、一過的な発現系、あるいは、誘導系を用いて気孔における機能解析を継続中である。タイプ1プロテインフォスファターゼの機能解析を行うため、Yeast two-hybridスクリーニングを行い複数の調節サブユニット候補を得た。その中で、インヒビター3は上記フォスファターゼ活性を強く阻害する事から、青色光情報伝達系に関与する有力候補として機能解析を行ったが、その変異体は致死になってしまった。これを詳しくみると、インヒビター3は胚発生において重要な働きを担っているが、このタンパク質が破壊されると脱リン酸化活性の制御が不能になり、植物が致死すると推定された。一方、その他の調節サブユニット候補のなかで、気孔の青色光情報伝達系に関与すると思われるものを見つけた。このタンパク質は、アミノ酸275個からなる小さなタンパク質でN-末にRVxFモチーフ、C-末にGRAMドメインを有していたが具体的な働きは不明であった。このタンパク質はタイプ1プロテインフォスファターゼと結合したが、その他のクラスのフォスファターゼ触媒サブユニットとは結合しなかった。次に、機能解析のためシロイヌナズナの変異体を用いた。シロイヌナズナにはこのタンパク質のオーソログが2つ存在した。これらにPRS2AとPRS2B(Rhosphatase Regulatory Subunit)と名づけた。この変異体の表現型を調べると、変異株prs2bでは青色光による気孔開口と孔辺細胞プロトプラストにおけるプロトン放出が約50%阻害されていた。しかし、変異株prs2aの表現型は野生型と大差なかった。二重変異体pzs2a prs2pはprs2bよりわずかに強く青色光依存の気孔開口が抑制された。以上から、PRS2AとPRS2Bはタイプ1プロテインフオスファターゼの調節サブユニットとして働き、孔辺細胞の青色光情報伝達系で機能していると推定された。しかし、二重変異体でも抑制が100%でないので、別のものが存在する可能性は否定できない。
第16番染色体に連鎖する常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症の原因遺伝子の解明

常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症には多数の疾患が混在しており、その多くが3塩基などの繰り返し配列の異常伸長を原因としている。我々はこれまで高齢発症と純粋小脳症状を特徴とする優性遺伝性脊髄小脳変性症の原因を解明するため、6家系を集積し連鎖解析を行い、これらの家系が第16番染色体長腕(16q13-q22)の約3cM領域に連鎖することを報告した。本年度、我々は原因遺伝子の同定を目的にポジショナルクローニングを更に進めた。まずこの領域についてBAC cloneによるcontigを構築した。これにより候補領域内の様々な遺伝子やDNAマーカーなどの位置関係が正確に判るようになった。遺伝子座内の多型性DNAマーカーの正確な配列によるhaplotypeを検討すると、候補領域は更に狭まり、D16S3019D16S3095を含む約4Mbほどの領域がmaximum candidate intervalと考えられた。この領域のゲノム解読情報を利用して、繰り返し配列を網羅的に検索した。その結果同定した繰り返し配列は100個近く、このうち不安定性を有すると予想される約50個の繰り返し配列について、患者での異常伸長の有無を解析したが、これまでのところ異常伸長は見出せていない。一方、連鎖不平衡解析を行い、候補遺伝子座内で最も不平衡値が高い領域を最も有力な候補領域とした。この領域には50近い遺伝子が存在することがわかった。これまで約20個の遺伝子について全exonの配列をDNA sequenceにより検索したが、点変異などの異常は認められなかった。今後この解析をさらに進め、原因となる遺伝子変異の同定を行いたい。
人工関節骨組織間の応力伝達様式の最適設計と固定法評価基準の構築

人工股関節ステム表面の応力が,骨にどのような影響を与えるかという問題は,長期に渡る緩みの予防,および,術後の大腿部痛の発生原因の推定と関連して重要である.本研究では,実験動物の大腿骨に形状記憶合金のピンを挿入することにより髄腔内から定常荷重を加える方法を考案し,定常荷重を受けた骨組織に生じる変化を調べた.6週間の経過観察の結果,荷重を加えたピンの表面と骨の間の界面においては,骨の降伏応力に近い応力に曝されているにも関わらず,数週間にわたって,変化がほとんど見られなかった.一方,皮質骨の外側では,髄腔内に高い応力あると,その影響により,骨肥厚が発生し得ることがわかった.人工股関節ステム表面の応力が,骨にどのような影響を与えるかという問題は,長期に渡る緩みの予防,および,術後の大腿部痛の発生原因の推定と関連して重要である.本研究では,実験動物の大腿骨に形状記憶合金のピンを挿入することにより髄腔内から定常荷重を加える方法を考案し,定常荷重を受けた骨組織に生じる変化を調べた.6週間の経過観察の結果,荷重を加えたピンの表面と骨の間の界面においては,骨の降伏応力に近い応力に曝されているにも関わらず,数週間にわたって,変化がほとんど見られなかった.一方,皮質骨の外側では,髄腔内に高い応力あると,その影響により,骨肥厚が発生し得ることがわかった.今年度は,人工股関節ステムを模擬した種々のモデルを構築し,3次元有限要素解析によって,発生する応力を求めた.解析対象を,1960年代に前澤により開発され,優れた臨床成績を有する近位プレートを有するステム,カラーのみを有するステムの2種類のステムとした.モデルの構築には既存の人工股関節ステムの外形に補正を加え8接点6面体要素により作成した.ステムの材料特性として,質量密度,弾性係数,ポアソン比を,それぞれ4510kg/m3,110GPa,0.29GPaとした.大腿骨モデルは成人右大腿骨のCT画像を基に自動メッシュ生成を行い,手作業で補正を加えることにより構築した.弾性係数は皮質骨15.5GPa,海綿骨1.00GPa,ポアソン比は皮質骨0.30,海綿骨0.33と仮定した.解析システムを,本予算で購入したワークステーション(Endeavor Pro-4500, EPSON)に動的三次元有限要素法解析ソフトウエア(LS-DYNA Ver.971, Livermore Software Technology)を組み込んで構築した.荷重条件として,人工股関節の耐久性試験で定められているISO7206に基づき,長軸方向に対して25度の角度で,骨頭頂部に1800Nの圧縮力を負荷した.ステム,大腿骨,プレート相互間の接触部でのすべり(摩擦係数0.3)を仮定した.解析の結果,破壊基準として一般に用いられているvon Mises相当応力は,プレートを有するステムの近位内側において11.3MPa,近位外側において14.2MPaだった.カラーのみを有するステムでは,近位内側において15.6MPa,近位外側において19.5MPaであった.よって,プレートの効果によりvon Mises応力が低下することが明らかになった.人工股関節の固定の際,緩みを防ぐために,ステム部分を強く打ち込む方法(プレスフイット固定)が一般に用いられている。その打ち込み力により発生する残留応力が,骨にどのような影響を与えるかという問題は,大腿部痛の発生原因とも関連して重要である.一方,骨には力学的刺激による骨形成や骨吸収が起きることが知られている.しかし,従来の研究では,力学刺激を生理的な変動荷重に依存しており,人工関節固定部に発生する定常荷重の骨への影響については推定できなかった.本研究では,実験動物の長管骨に形状記憶合金のピンを挿入して,その弾性力により髄腔内から定常荷重を加える方法を開発した.そして,一定期間の定常荷重が骨形態の変化や骨組織に与える生理的な影響を検討した.形状未記憶Ni-Ti合金線(アクトメント0.4φ)を,形状回復温度が体温より十分低い温度になるように熱処理を行って,荷重ピンを作成した.ネンブタール麻酔下で,9週齢Wistarラットの右足大腿骨顆間部より骨髄腔内に荷重ピンを挿入し,左足は顆間部に穴を開けるだけで非荷重とした.その後,挿入初日1,2,3週間目に軟X線撮影により、X線透過度,骨梁構造の変化などについて検討した.また,処置後3週の時点で安楽死させ,両側大腿骨採取後、骨組織の変化を観察した。ラット骨髄腔内において、1.04.0Nの負荷量を発生させる荷重ピンを作成できた.荷重ピン挿入処置後3週の時点において,皮質骨の非薄化,骨硬化像,骨透過像等のX線透過度変化,骨梁構造の変化に著しい変化は認められなかった.荷重群では形状記憶合金と骨幹部皮質骨の内環状層板の接触領域で金属表面に骨形成像らしきものが認められた.しかし、皮質骨における骨吸収像や骨層板の変化は認められなかった。荷重群のμ-CTにおいて骨形成像を確認することができた。人工股関節ステム表面の応力が,骨にどのような影響を与えるかという問題は,長期に渡る緩みの予防,および,術後の大腿部痛の発生原因の推定と関連して重要である.本研究では,実験動物の大腿骨に形状記憶合金のピンを挿入することにより髄腔内から定常荷重を加える方法を考案し,定常荷重を受けた骨組織に生じる変化を調べた。形状未記憶ニッケルチタン合金線を用いて,荷重ピンを作成した.9週齢

Wistar系ラット6頭をピンの挿入実験に用いた.ネンブタール麻酔下で,右足大腿骨顆間部より骨髄腔内に荷重ピンを挿入し荷重群とした.X線観察により,皮質骨と形状記憶合金の接触を確認した。反対足は顆間部の穴開けのみを行い,対照群とした.1週間ごとに軟X線撮影により骨梁構造の変化を観察した.3頭をピン挿入後3週で安楽死させ,両側大腿骨採取後、マイクロCTにより骨組織の変化を観察した.3頭については,6週間まで継続観察した.6週経過時点では,接触圧力97 MPaと109 MPaの例で,遠位部外側での骨肥厚が明らかになった.荷重を加えたピンの表面と骨の間の界面においては,骨の降伏応力に近い応力に曝されているにも関わらず,数週間にわたって,変化がほとんど見られなかった.これは,接触による力学刺激が,骨組織にとって特殊な環境であることを示した。また,人工関節ステムの固定力として働く,骨内部の応力が長期にわたって残留する可能性が示された.一方,皮質骨の外側では,髄腔内に高い応力あると,その影響により,骨肥厚が発生し得ることがわかった.この部分では,骨肥厚による断面積の増加による応力の緩和がリモデリング法則に従って起きたと考えられた.
コリネ型細菌による転写後制御によるアミノ酸生産への影響

本研究ではアミノ酸等の工業生産に広く利用されるコリネ型細菌について、RNA分解制御を中心とした転写後制御の研究を進めることで、アミノ酸代謝系遺伝子の発現制御を解明し、その知見を利用したアミノ酸生産向上を検討していくことを目標としている。今年度はリジン酸生産に関わるdapAとゲノム上でdapA遺伝子の直後に存在するRNA分解酵素rnjの遺伝子オペロン(dapA-rnjオペロン)の発現解析を行った。解析の結果、RNase EGをコードするrneG破壊株で発現上昇が見られたこと、dapA-rnjオペロン全長産物が特に増加したことから、RNase EGによるdapA-rnjオペロンの切断があることが示された。RNA安定性の検討から、RNase EGによる切断がdapA、rnjそれぞれのmRNA分解制御に関わることが示された。さらにRNase Jの活性部位に変異を導入した株を作井し、変異がdapA-rnjオペロンの転写産物の発現に及ぼす影響を調べた。変異株の解析結果から、dapA-rnjオペロンはRNase JによるmRNA分解を介した自己制御されていることを示すことが出来、リジン酸生産経路がRNase EG、RNase Jという2種のRNaseによる転写後制御を受けていることを明らかにした。またrnj遺伝子破壊株の解析から、RNAシャペロンであるCspAもmRNA分解の標的であることが判明した。cspA mRNAは通常33°Cの培養条件では速やかに分解されるが、この分解の主役がRNase Jであることを示した。さらに、相同性を持つcspA2 mRNAはrnj破壊の影響が小さいことから、それぞれ異なる分解制御を受けていることを示すことが出来た。本研究テーマでは、アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写開始後発現制御について明らかとすること、RNase Jをコードするrnj遺伝子等について転写後制御因子の発現制御解析を行うこと、そしてこれらの知見をもとにした転写後制御調節によるアミノ酸生産向上を目指している。今年度はこのうち、リジン生合成遺伝子をコードするdapAの転写後制御の解析を主に行った。これまでにdapA-rnj遺伝子クラスターについては主にrnj遺伝子についての発現解析を行っており、レポーター遺伝子の解析等からRNase J自身による自己制御を示唆する結果を得ている。今回dapA、rnj両遺伝子のプローブを用いたノーザンブロット解析からdapA-rnjがオペロンとして発現されていることを確認した。dapA遺伝子についてRNase Jによる分解制御を解析するため、RNase Jの活性部位に変異を導入した。この変異型rnj株ではdapAの発現がおよそ2倍上昇していた。また主要RNaseであるRNase EGをコードするrneG遺伝子の破壊株でもdapAの発現の上昇を観察した。ノーザンブロット解析から、dapA遺伝子内部にRNase EGの切断部位が存在することを示唆する結果も得られた。リファンピシン添加による新規mRNA合成阻害時のdapA mRNA量の経時的な計測から、RNase J、RNase EGの遺伝子破壊株でdapA mRNAが野生型よりも安定化していることを確認した。以上の結果からdapA遺伝子の発現が転写開始後に制御されていることを明らかにした。2018年度当初に計画していたアミノ酸合成遺伝子の発現に対する転写開始後制御の解析について当初の予定通り順調に進捗することができた。2018年度の研究の結果、dapAの転写後制御について詳細なデータを得ることができた。今後はdapA以外の遺伝子発現についても転写後制御に着目した解析を進める。アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写発現制御解析について。次年度以降はdapA以外のリジン生合成遺伝子にも対象を拡げる。この際、mRNAレベルの発現解析だけでなく、酵素活性測定等によるタンパク質レベルでの発現解析も行う。以上の実験は対数増殖培養時、アミノ酸飢餓時、リジン等のアミノ酸生産時等様々な培養条件で検討を行う。次に、転写後発現制御因子の制御について。これまでの解析からrnj遺伝子の発現が自身およびRNase EGによるmRNA分解段階での制御下にあることを明らかにしてきた。これがmRNA発現レベルだけでなく、タンパク質発現にも反映されていることを検討するため、抗RNase J抗体を作成し、ウエスタンブロッティングによる発現解析も行う。次にRNase Jと同様にRNA代謝に主要な役割を果たしているRNase EGについても同様な転写後制御が存在するか解析をする。具体的にはrnj遺伝子破壊がrneG発現に及ぼす影響を解析する。さらにRNase EGの活性部位に変異を導入した株を構築し、活性低下がrneG自身の発現にどのような影響を及ぼすのか、mRNA代謝に焦点を絞り解析を進めていく。転写開始後制御調節によるアミノ酸生産向上について。アミノ酸生産株にrnj変異を導入した株の構築を行う。アミノ酸生合成遺伝子の発現を野生株、RNase遺伝子破壊株など比較し遺伝子発現量の解析検討を行う。次年度では上記の研究を行い、コリネ型細菌におけるアミノ酸生合成遺伝子の転写後制御について2018年度までの研究からさらに発展させていく方針である。

解析の結果、RNase EGをコードするrneG破壊株で発現上昇が見られたこと、dapA-rnjオペロン全長産物が特に増加したことから、RNase EGによるdapA-rnjオペロンの切断があることが示された。RNA安定性の検討から、RNase EGによる切断がdapA、rnjそれぞれのmRNA分解制御に関わることが示された。さらにRNase Jの活性部位に変異を導入した株を作井し、変異がdapA-rnjオペロンの転写産物の発現に及ぼす影響を調べた。変異株の解析結果から、dapA-rnjオペロンはRNase JによるmRNA分解を介した自己制御されていることを示すことが出来、リジン酸生産経路がRNase EG、RNase Jという2種のRNaseによる転写後制御を受けていることを明らかにした。またrnj遺伝子破壊株の解析から、RNAシャペロンであるCspAもmRNA分解の標的であることが判明した。cspA mRNAは通常33°Cの培養条件では速やかに分解されるが、この分解の主役がRNase Jであることを示した。さらに、相同性を持つcspA2 mRNAはrnj破壊の影響が小さいことから、それぞれ異なる分解制御を受けていることを示すことが出来た。本研究テーマでは、アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写開始後発現制御について明らかとすること、RNase Jをコードするrnj遺伝子等について転写後制御因子の発現制御解析を行うこと、そしてこれらの知見をもとにした転写後制御調節によるアミノ酸生産向上を目指している。今年度はこのうち、リジン生合成遺伝子をコードするdapAの転写後制御の解析を主に行った。これまでにdapA-rnj遺伝子クラスターについては主にrnj遺伝子についての発現解析を行っており、レポーター遺伝子の解析等からRNase J自身による自己制御を示唆する結果を得ている。今回dapA、rnj両遺伝子のプローブを用いたノーザンブロット解析からdapA-rnjがオペロンとして発現されていることを確認した。dapA遺伝子についてRNase Jによる分解制御を解析するため、RNase Jの活性部位に変異を導入した。この変異型rnj株ではdapAの発現がおよそ2倍上昇していた。また主要RNaseであるRNase EGをコードするrneG遺伝子の破壊株でもdapAの発現の上昇を観察した。ノーザンブロット解析から、dapA遺伝子内部にRNase EGの切断部位が存在することを示唆する結果も得られた。リファンピシン添加による新規mRNA合成阻害時のdapA mRNA量の経時的な計測から、RNase J、RNase EGの遺伝子破壊株でdapA mRNAが野生型よりも安定化していることを確認した。以上の結果からdapA遺伝子の発現が転写開始後に制御されていることを明らかにした。2018年度当初に計画していたアミノ酸合成遺伝子の発現に対する転写開始後制御の解析について当初の予定通り順調に進捗することができた。
構造用ケ-ブルの振動減衰能の解明と高減衰ケ-ブルの開発

1.模型ケ-ブルを用いた振動実験および有限要素法に基づく固有振動解析により、ケ-ブルの振動減衰能について以下の点を明らかにした。(1)大気中にあるケ-ブルのモ-ド減衰の主要因は、ヒステリシスエネルギ-による内部減衰とケ-ブル支持点でのエネルギ-散逸、つまり支点減衰との二つであり、モ-ド減衰はそれらの和として与えられる。(2)内部減衰は固有振動時の変動ひずみの2乗に比例する。例えば、ケ-ブル面内対称モ-ドのモ-ド減衰は、モ-ド遷移領域にあたるサグ比の場合に非常に大きくなるが、これは固有振動時の変動ひずみがモ-ド遷移域で対称モ-ドにおいて大きくなるためである。(3)内部減衰はケ-ブルに導入される初期張力にも依存する。これはケ-ブルが素線の集合体であるためであり、初期張力が小さい程、ヒステリシスル-プのふくらみが大きくなって減衰が大きくなる。しかし、初期張力が引張強度の2割程度導入されると初期張力の影響はなくなる。(4)支点のフレキシビリティは面内対称モ-ドにのみ影響し、固有振動時変動ひずみが変化することからモ-ド減衰も影響を受ける。支点がフレキシブルになる程、減衰はサグ比の小さい場合に小さくなるが、サグ比が大きくなると減衰はかえって大きくなる。(5)支点減衰のモ-ド減衰への寄与は、固有振動時の支点変位(支点モ-ド振幅)の2乗の重みが支点減衰にかかる形で表される。2.1で明らかにしたケ-ブルの振動減衰特性を基に、高減衰ケ-ブル開発のための基礎的研究を行った。具体的には、(1)ケ-ブルの非一様化に伴う振動時変動ひずみの増大による内部減衰の増大、(2)ケ-ブル素線間に粘弾性材料を詰めることによるせん断減衰の付加、および(3)小型球形ダンパ-のケ-ブルへの内蔵による減衰付加、の三つの方法を考え、高減衰ケ-ブルに関するフィ-ジビリティ-スタディを行った。今年度は構造用ケーブルの振動減衰能の解明を主目的として、模型ケーブルを用いた振動実験および有限要素法に基づく固有振動解析により、ケーブルのたわみ振動時のモード減衰機構をその固有振動特性との関連において検討した。得られた主な成果は以下のとおりである。1.大気中にあるケーブルのモード減衰の主要因は、ヒステリシスエネルギーによる内部減衰とケーブル支持点でのエネルギー散逸、つまり支点減衰との二つであり、モード減衰はそれらの和として与えられる。2.内部減衰は固有振動時の変動ひずみの2乗に比例する。例えば、ケーブルの面内対称モードのモード減衰は、モード遷移領域にあるサグ比の場合に非常に大きくなるが、これは固有振動時の変動ひずみがモード遷移域での対称モードにおいて大きくなるためである。3.内部減衰はケーブルに導入される初期張力にも依存する。これはケーブルが素線の集合体であるためであり、初期張力が小さい程、ヒステリシスループのふくらみが大きくなって減衰が大きくなる。4.支点のフレキシビリティは面内対称モードにのみ影響し、固有振動時変動ひずみが変化することからモード減衰も影響を受ける。

支点がフレキシブルになる程、減衰はサグ比の小さい場合に小さくなるが、サグ比が大きくなると減衰はかえって大きくなる。5.支点減衰のモード減衰への寄与は、固有振動時の支点変位(支点のモード振幅)の2乗の重みが支点減衰にかかる形で表される。以上のように、ケーブルの振動減衰能の基本的特性は十分に把握でき、高減衰ケーブル開発のための手がかりが得られたといえる。高減衰ケーブルについては資料収集等の予備的検討を行ったが、今後、上記の成果を基に具体化する予定である。構造用ケ-ブルの振動減衰能の解明に関する昭和63年度研究成果に基づき、今年度は高減衰ケ-ブル開発のための基礎的研究を行った。具体的には、内部減衰そのものを大きくする試みとして、(1)ケ-ブルの非一様化による振動時変動ひずみの増大、(2)ケ-ブル素線間に粘弾性材料を詰めることによるせん断減衰の付加、および(3)小型球形ダンパ-のケ-ブルへの内蔵、の三つの方法を考え、高減衰ケ-ブルに関するフィ-ジビリティ-スタデイを行った。得られた主な成果は以下のとおりである。1.モ-ド遷移領域にあるサグ比の面内対称モ-ドでは固有振動時の変動ひずみが大きく、したがってモ-ド減衰も大きい。このことに着目して、サグの小さいケ-ブルのモ-ド形状を変化させることによって変動ひずみの増大を図った。支点近傍での伸び剛性増大、曲げ剛性付加、および中央部での質量付加によってケ-ブルを非一様にし、どの程度変動ひずみが上昇し得るかを有限要素法に基づく数値解析により検討した結果、どの方法もある程度のひずみ増加をもたらすことが明らかとなった。特に曲げ剛性付加および質量付加はその程度如何ではケ-ブルの高減衰化に有効であることが予想される。2.ケ-ブルの間隙に粘弾性体を詰め、素線間の相対変位を積極的に利用した高減衰化の可能性を理論的に考察した。基本的には制振鋼板と同様の考え方となるが、定量的結論を得るには至らなかった。3.ケ-ブル内に埋め込めるサイズ、同調不要、設置角度や振動方向に依存しない作動、を条件に、ピンポン玉に液体、鉄粒を入れたダンパ-を試作し、その特性を実験により調べた。鉄粒入りダンパ-の性能のほうが概してよいが、実用上十分なものとするには改善が必要である。以上のように高減衰ケ-ブル開発のための手がかりがある程度得られたが、今後具体化へ向け、精力的に研究を進める予定である。
エレクトロポレーション法による腎臓への高効率遺伝子導入法の開発

我々はHVJ-liposome法を用いたメサンギウム細胞への経腎動脈的遺伝子導入法を報告してきたが、HVJ liposome法はその扱いが煩雑で容易に使用できないという欠点があった。今回Electroporation法を用いて簡便にin vivoで糸球体に遺伝子を導入する方法を検討した。左腎動脈よりFITClabeled-oligo DNA溶液を注入し、ピンセット型電極を用いて、パルス電流にて遺伝子導入を行ったのち左腎を摘出し、凍結切片を蛍光顕微鏡で観察した。同様にLacZ遺伝子及びLuciferase遺伝子を導入し、第4日に遺伝子導入を行った単離糸球体を用いてそれぞれX-gal染色にて糸球体での遺伝子発現、Luciferase assayにて各種条件下での遺伝子発現効率を検討した。また、導入4日後の組織障害の有無をPAS染色にて検討した。導入10分後FITC-oligo DNAは全ての糸球体に認められ、導入細胞はメサンジウム細胞であった。X-gal染色にて糸球体の約75%でLacZ遺伝子の発現を認め、Luciferase assayによる検討では、25-100Vの電圧では、電圧が高いほど導入効率が高い傾向が得られたが、100Vのパルス電流では、腎表面に熱傷を認めた。しかし、Electroporationによる糸球体や尿細管に対する組織障害はほとんど認められなかった。以上からElectroporation法により腎糸球体をターゲットとした効率よい遺伝子導入法が確立された。
ALMAによる俯瞰撮像で探る大質量原始星近傍のダイナミクス

本研究では大質量原始星周囲の円盤を真上から見込むフェイスオン天体の探査とその詳細観測を目指した研究を行った。まず豪州の電波干渉計ATCAを用いた観測を行い、10天体の候補のうち5天体がフェイスオン天体の候補であることを発見した。次に最も有力な候補であったG353に対してALMAによる高分解能撮像観測(50ミリ秒角)を実施し、半径250AU程度の非常にコンパクトなフェイスオン円盤を分解撮像することに成功した。円盤の面密度分布には大きな偏りがあり、周囲の分子エンベロープから流れ込むガスによって円盤に質量が蓄積され、自己重力不安定を起こしている可能性が示唆された。このような例は世界で初めてである。平成27年度は主に(1)「南天におけるALMA観測天体候補に対する探査」、(2)「雛形天体に対するパイロット観測の提案」を中心に研究を行った。(1)については豪州の電波干渉計ATCAを用いた3mm帯でのフェイスオン天体探査を7月と8月に各3日間実施した。特に本計画の雛形天体であるG353については本年度取得されたN2H+分子輝線のデータから、星団形成クランプ(104 AUスケールの)から中心星を取り巻く降着エンベロープ(103 AUスケール)へと繋がる降着流の兆候が発見された。この結果は過去にJ-VLAを用いて我々が行ったNH3輝線観測の結果と良く一致している。特にN2H+はNH3よりもさらに外側の低温領域までブリッジ状構造が伸びており、大スケールからの質量流入の存在をより強く支持する結果である。これについては天文学会および各種研究会にて成果発表を行った。現在他の天体についてもデータ解析を行っている最中である。(2)についてはALMA cycle 3およびすばる望遠鏡にG353の高分解能観測の提案を行った。残念ながらALMAについては不採択となってしまったが、すばる望遠鏡による観測は無事採択され、現在観測を待っている状況である。また本年度は共同研究者であるAndrew, J. Walsh氏を豪州より招いて本計画に関するミニワークショップを7/22に実施した。共同研究者を中心に大学院生7名を含む17名が参加し、16件の口頭発表が行われた。特に大学院生に関しては当該科研費から旅費の補助を行った。また同氏にはその後国立天文台三鷹キャンパスに1週間滞在を依頼し、共同研究の打ち合わせとG353に関する投稿論文の執筆を行った。ATCAを用いた準備観測については本年度で無事全ての観測が終了し、現在はデータ解析段階へと移行している。特にG353において新たに発見された階層的な質量降着の兆候は、星近傍に存在する降着ガスの起源に関連する重要な発見であり、本計画の科学的意義のさらなる拡張が期待される。一方、残念ながらALMA Cycle 3に対する観測提案は不採択となってしまったため、パイロット観測に対しては若干の遅れが出ている。一方ですばる望遠鏡の補償光学を用いた高分解能観測は予定通り採択された。同観測の空間分解能はALMA Cycle3とほぼ同程度であり、星近傍での星周構造については一定の情報が得られると期待される。したがって全体としては概ね当初の予定通り進捗していると言える。平成28年度は雛形となったフェイスオン天体G353に対して星周囲ダストのイメージング観測の提案をALMA cycle 4に対して行い、無事採択された。これは熱放射の観測としては現在の最高分解能の観測であり、大質量原始星周囲の非軸対称な降着流の構造を世界で初めて直接空間分解できる予定である。また10000 auスケールの星団形成クランプからエンベロープへ流れ込む降着流の高感度フォローアップ観測についてもCycle 4に提案したが、こちらは残念ながら不採択となってしまったためCycle 5に対して再び修正提案を行なっている。これまでの観測で得られた星近傍100 auスケールでのガス降着運動の観測結果については解析と議論を完了し、査読論文の投稿直前である。また第二のG353型フェイスオン天体候補であるG357について日韓VLBI観測網(KaVA)を用いたVLBIモニター観測を行い、見込み角の直接測定を行なった。測定された見込み角はおおよそ視線方向から30度程度傾いており、G353の場合(10度程度)に比べてやや傾きが大きいことがわかった。両者はATCAの観測などからNH3輝線などにみる星周高温ガスの観測的特徴や赤外線のエネルギー分布が極めてよく似ていることがわかっているが、G357はG353に比べてジェットに付随する水メーザ強度の系統的な変動があまり見られないことが示唆されており、メーザ変動性が見込み角の指標になる可能性が考えられる。この結果については2017年日本天文学会春季年会にて報告済みである。平成28年度は10月より山口大学理学部の助教として採用されたため、前所属であった国立天文台水沢VLBI観測所からの異動があった。そのため論文作成や研究会への参加等が一時滞った。また前年度採択されたすばる望遠鏡の観測が悪天候などを理由に観測実施されなかったため、現在再度観測を提案中である。一方、今年度はALMAの観測提案が無事採択されており、致命的な遅れは発生していない。平成29年度はALMA長基線による雛形天体G353の観測が無事実施された。これにより真上からみた大質量原始星周りの降着円盤を世界で初めて空間分解することに成功した。

ダストの熱放射によって検出された円盤のサイズは半径250天文単位であり、現時点で観測されている全ての大質量原始星の中でも最も内側を観測した例の一つである。特に円盤の外縁部で見られた非一様かつ塊状の構造はこれまでに想定されていた比較的安定した降着円盤とは程遠いものであった。円盤の質量、温度などを用いて重力的安定性を解析したところ、極めて不安定であることが定量的にも示された。このことから円盤内の塊状の構造は円盤が自己重力によって分裂していく過程を見ている可能性が高いと推定される。このように円盤の重力不安定性をはっきりと捉えた例は低質量の原始星も含めて世界でも初めてであり、現在査読論文を準備中である。またタノール分子の観測から円盤の外側には回転しつつ円盤へ落下していくガス流が存在していることも明らかになった。ガス流が持つ角運動量から予想される遠心力バリアの位置はダストで検出された円盤のサイズと概ね一致しており、落下してきたガスが遠心力でせき止められて円盤に蓄積することで重力的に不安定になっていることが推定された。このような過程を空間的に分解して捉えた例も大質量星では世界で初めてである。さらに真上から円盤を見込んでいるにもかかわらず、ダスト放射が中心付近で光学的に厚くなっていることも明らかになった。このことは円盤を真横から見込むような一般的天体では大質量原始星近傍が観測困難であることを示しており、「より内側を見るためには真上から円盤を見る必要がある」という本研究の動機が正しいことが裏付けられた。これらの結果を元に2018年3月22-23にかけて山口大学にて関連研究者を招いた国際ワークショップを開催した。本研究では大質量原始星周囲の円盤を真上から見込むフェイスオン天体の探査とその詳細観測を目指した研究を行った。まず豪州の電波干渉計ATCAを用いた観測を行い、10天体の候補のうち5天体がフェイスオン天体の候補であることを発見した。次に最も有力な候補であったG353に対してALMAによる高分解能撮像観測(50ミリ秒角)を実施し、半径250AU程度の非常にコンパクトなフェイスオン円盤を分解撮像することに成功した。円盤の面密度分布には大きな偏りがあり、周囲の分子エンベロープから流れ込むガスによって円盤に質量が蓄積され、自己重力不安定を起こしている可能性が示唆された。このような例は世界で初めてである。今後はATCAによるフェイスオン天体探査データの解析を進め、査読論文としての投稿を目指す。合計5つの波長帯でのデータがあるが、G353で発見されたような階層的降着構造に特に着目し、N2H+輝線を含む3mm帯の論文を優先して論文化する予定である。パイロット観測については本年度のALMA Cycle 4に対してすでにリカバリーの観測提案を提出済みである。Cycle4の通常観測提案における空間分解能はCycle 3に対して5-10倍程度向上しており、さらに鮮明な星周構造の俯瞰図が得られると期待される。また新たに見つかった階層的な降着構造の詳細観測についても別途Cycle 4に対して提案を行った。無事両方が採択されれば降着率の比較などから、G353における星形成の初期環境や詳細な星形成モードに関する示唆が得られると期待される。すばる望遠鏡については現在観測を待っている状況である。
パルス電子顕微鏡のための液体試料観察法の開発

開発中のパルス電子顕微鏡を用いると1ミリ秒以下の露光時間で一枚の電子顕微鏡写真が撮れる。パルス間隔を開けることでダメージを抑えながら長時間動態観察することもできる。本研究では、このパルス電子顕微鏡によって液中の蛋白質動態を直接観察するための液体試料観察法の開発を行う。より具体的には、1:電子顕微鏡観察に向いた溶液条件の探索、2:従来よりコントラストの高い溶液チャンバー作成法の開発を行う。
職業アイデンティティ形成過程に関する実証研究-実務実習によるキャリア形成支援教育

(1)産学連携による課題解決型学習を通年で実施する教育活動は、2010年3月末で5期目を完遂した。参画した学生の記述文の内容解析および連携先企業担当者の評価内容に基づいて考察した結果、「社会人基礎力」のうち、特に「チームで働く力」を実践的に身につけることに効果があった。(2)大学教育で修得した専門性の職業への活用度が高い国のひとつであるフィンランドのオウル大学で現地調査を2回実施し、学生の職業アイデンティティ形成過程における専門分野の実務実習の有効性を検証した。1.具体的内容3年次配当の通年の演習科目における産学連携プロジェクト形態の「実務実習」への参画を通して、経営系学生が自己の職業アイデンティティをどのような過程を経て形成しているのか、解明に努めた。具体的には次の4点を実施した。(1)平成19年度に参画した学生記述レポート内容の質的分析に基づく考察(2)平成19年度に参画した学生からの聴き取り調査の実施(3)平成20年度の産学連携学習の企画・実行、産学連携先企業への報告・評価(4)国際学会出席による意見交換・情報収集2.意義・重要性職業アイデンティティ過程に係る質的データの解析・考察を通して、学生の目線・立場での検討が可能となり、大学におけるキャリア教育の改革・推進に向けて事例を蓄積することに資する。従来、「社会人基礎力」など学生から社会人への移行に伴って必要とされる職業能力に関する論考が重ねられてきたが、充分な事例に基づく論考とはいいがたい側面がある。一方、諸大学ではキャリア教育のもとで取組みがなされているが、事例に基づく論議の体系化は今後に期するところが大きい。本取組みでは、実学志向の教育理念のもと、通年での産学連携による課題解決学習の事例の蓄積を続け、初期キャリア形成過程の解明、社会人への移行に係る職業能力要件を探索するものである。3.成果上記1の項目ごとに成果を記載する。(1)形態素解析ソフトウェアを併用するとともに、生涯キャリア形成に係る先行研究を援用した枠組みに基づいて検討し、仮説を導出した。考察結果を勤務校学校法人の広報誌及び大学紀要に発表した。(2)2名から聴き取りを実施した。(3)新3年生15名を3チーム編成し、新製品企画提案、顧客満足調査に基づく提案、及び製品情報の開示に係る情報・通信技術の活用提案を検討し、報告書作成と報告会を実施した。(4)8月に米国で開催されたAcademy of Management学会に出席し、キャリア形成及び組織行動分野での最新研究動向の知見を得た。1.具体的内容平成21年度は、職業アイデンティティ形成に係る大学教育の役割の観点から、OECD加盟国のなかで専門的実習教育が教育課程のなかで高い比率を占める北欧諸国のひとつ、フィンランドのオウル大学で現地調査を実施した。調査では、同大学でキャリア形成支援に携わる大学職員(キャリア・カウンセラー)3名、および自然科学部と教育学部の大学生3名に対する聴き取りを行った。上記の現地調査に基く考察では、理論的枠組みとして青年心理学の先行研究に依拠し、「自己形成」を鍵概念に置いた。その鍵概念と「キャリア形成」(「職業アイデンティティ形成」)を関連付け、専門分野実習の機能として「対人的フィードバック」および「自己との対話」の様相に着目して、専門分野実習の意義を検討した。考察は論文として東京情報大学研究論集に平成22年5月15日に投稿した。2.意義・重要性当該テーマでの研究年度1年目(平成20年度)では、勤務校における「卒業研究」ゼミナール教育の一環としての専門分野実習の意義を検討した。そこで2年目(平成22年度)では、グローバルな視点から専門分野実習教育で先行的蓄積があるフィンランドの大学における事例を検討した。キャリア教育の方向性として、「自分を知る」と「社会を知る」の二つの軸から学生の初期キャリア形勢を支援する点において、筆者の勤務校におけるキャリア教育とオウル大学におけるキャリア形成支援は共通点が見られる。オウル大学の事例では専門教育課程の枠組みで、学部3年次生に812週間の専門分野実習を必修として課している。学生は自己の専門性を高めていく過程で、実習先のトレーナーや卒業生のメンターといった多様な対人的フィードバックを受け、自己の専門の方向性の検討を深めて自己形成(自己Aから自己Bへの変化)をしていく様相を読み取ることができた。平成22年度は、次の3点を実施した。(1)平成21年度に実施した現地調査に基づく考察を論文として投稿し、査読を経て受理・刊行された。フィンランドのオウル大学でキャリア形成支援に携わる大学職員(キャリア・カウンセラー)3名、および自然科学部と教育学部の大学生3名に対する聴き取りを行い、その考察では、理論的枠組みとして青年心理学の先行研究に依拠し、「自己形成」を鍵概念に置いた。

その鍵概念と「キャリア形成」(「職業アイデンティティ形成」)を関連付け、専門分野実習の機能として「対人的フィードバック」および「自己との対話」の様相に着目して、専門分野実習の意義を検討した。(2)フィンランドのオウル大学で2回目の現地調査を実施し、職業アイデンティティ形成過程に関して大学生5名の聴き取りを行った。前年度調査とは異なる専攻分野(コンピューターサイエンス、数学、経営学)の学生の状況および前年度調査した学生のひとりからその後の自己形成の進展状況の把握を目指した。この調査に基づく論考は論文として平成23年度に投稿することで執筆を進めている。(3)勤務校における産学連携による課題解決型学習の5期目を実施した。学生はマーケティングや経営学の専門分野の知識を応用して新商品開発提案を行った。特に、学内外で消費者層に対する嗜好調査を実施した点、および学生研究室で試作をした点が情報の裏付けに基づく提案として企業側から評価された。学生研究成果は学年末に報告書をまとめた。
魚類の胚発生におけるタンパク質分解系の生理的意義

魚類の胚発生におけるタンパク質分解経路の生理的な役割の解明を目指した。魚類胚は栄養飢餓適応,回遊行動および環境ストレス応答においてタンパク質分解系を介する生理機能を発揮し,恒常性を維持することを見いだした。特に,分子シャペロンであるCDC48タンパク質はタンパク質分解系であるユビキチン・プロテアソーム系および自食作用(オートファジー)を制御し,正常な胚発生に必須であることを見いだした。魚類胚発生における栄養吸収およびストレス応答におけるオートファジーの役割を解明することを目的とした。オートファジー可視化魚を用いて,卵黄吸収及び栄養移行時期の体内でのオートファジー活性化部位を観察した結果,受精後発生段階が進むに従って少しずつ活性化し,給餌開始時期(受精後45日)に摂餌できない場合,急激に活性が上昇することが分かった。一方,給餌が開始された場合,活性化は起こらなかった。体内のアミノ酸量が低下することが分かった。以上から仔魚の栄養飢餓適応はオートファジーを介したアミノ酸生成が重要であると考えられた。ところで,栄養が十分行き渡った状態でもオートファジーが恒常的に活性化されることを観察した。ゼブラフィッシュ卵の受精直後および胚発生期には内在性の活性酸素種が生成されることを蛍光プローブで検出した。胚にH_2O_2等の酸化ストレスを与えると,オートファジーが活性化されることを見いだした。アンチセンスを用いてオートファジーを阻害すると酸化ストレスに対する感受性が上昇し,発生異常を起こした。これは体内の酸化タンパク質の蓄積と酸化DNA発生による染色体異数性が原因であることが分かった。以上から栄養吸収および酸化ストレス条件下において,オートファジーは恒常性維持に関する重要な役割を持つことが推定された。魚類の卵成熟,胚発生過程における栄養状態やストレス状態の把握は水産動物の種苗生産技術の発展や資源変動の要因解明に有効である。オートファジー活性を指標に最適な飼育条件を設定することにより生産性向上が期待できる。海産魚の浮遊性卵は日周運動として垂直分布が変化することが知られており,浮力調節は生存適応戦略に関わる重要な生理機能であると考えられる。マツカワ,ニホンウナギ等では卵黄タンパク質の分解によって生じたアミノ酸を浸透圧調節に利用することが明らかにされている。そこで,ヒラメ受精卵に光(400-4300 Lux)を照射し,オートファジーの誘導性及び遊離アミノ酸量の変化を調べた。ヒラメ仔魚は光および紫外線照射によって体内の浸透圧および遊離アミノ酸量が上昇し,オートファジーが誘導された。仔魚の比重(NBS)は,非照射区では艀化直後までは低く,艀化20時間後に上昇したが,光照射によって艀化直前から艀化20時間後まで上昇し,光に対する応答は発生段階特異的であることが分かった。オートファジーに関わるリソソーム分解系の阻害剤Leupeptin,E-64およびBafilomycin A1を飼育水中に投与すると光照射に関わらずNBSの低下が見られた。また,オートファジーを活性化するRapamycinを添加するとNBSが上昇した。これらの反応はc-Jun N-terminal kinase(JNK)阻害剤SP600125によって濃度依存的に抑制されたことから,JNKを介するシグナルによってオートファジーが活性化されることが明らかになった。以上からヒラメ仔魚は光応答性オートファジーによって浮力調節を行っていることが明らかになった。魚類胚発生におけるストレス応答におけるオートファジーの役割とその制御機構の解明を目的とした。CDC48はユビキチン化タンパク質のプロテアソーム系によるタンパク質分解を促進する分子シャペロンであるが,オートファゴソームの生合成を促し,ユビキチン化タンパク質の分解を補完する分子機構が推定された。そこで,ストレス条件下でのオートファジー活性化におけるCDC48の役割を調べた。魚類胚にDNA損傷ストレスを与えるとCDC48がリン酸化され,この分子が複合体を形成し,オートファジーが活性化される分子機構を見いだした。ゼブラフィッシュ胚に0.1ー8 Gyのγ線(セシウム-137)を照射し,CDC48のリン酸化Ser-784特異抗体を用いて検出した結果,線量依存的にSer-784がリン酸化された。CDC48を免疫沈降し,SDS-PAGEで泳動したところ,分子量約400および330のCDC48結合因子を特定した。アンチセンスモルフォリノオリゴによりCDC48の翻訳を阻害すると,γ線照射胚の頭部および眼で萎縮が生じ,神経組織でアポトーシスが誘導された。GFP融合微小管結合蛋白質LC3(GFP-LC3)を発現するトランスジェニック魚を用いると,線量依存的にGFP-LC3が脳および眼でGFP-LC3陽性細胞が観察された。V型ATPアーゼ阻害剤バフィロマイシンA1(0.1マイクロモル)を投与すると,γ線照射によって脳および眼でのアポトーシス誘導が増強された。さらに,CDC48の阻害によってオートファジー誘導が抑制され,神経組織においてポリユビキチン化タンパク質が蓄積した。

以上の結果から,CDC48 Ser-784のリン酸化と複合体形成によって,ポリユビキチン化タンパク質のオートファジーによる分解を促進し,神経細胞でのアポトーシスを抑制する分子機序を明らかにした。魚類におけるオートファジーの機能性及び誘導性に関する分子機構の解明を目的としており,当初の予定どおり研究成果が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。オートファジー制御因子として細胞分裂周期遺伝子CDC48を見出したが,この分子がユビキチン・プロテアソーム系とオートファジーの役割分担をどのように行っているのか明らかになっていない。そとで,それぞれの活性化機構と分解される基質に着目し,魚類胚におけるCDC48の役割を明らかにする。
幼若ホルモンが有する変態抑制作用の分子メカニズム解明

幼若ホルモン(JH)は,昆虫の幼虫から蛹への変態(蛹化)を抑制するホルモンとして知られているが,その詳しい抑制分子メカニズムは明らかにされていなかった.本研究では,蛹への変態を誘導する遺伝子(蛹化決定遺伝子)に注目し,培養細胞を用いてJHによる蛹化抑制メカニズムを解析した.その結果, JH誘導性タンパク質(Kruppele homolog 1)が蛹化決定遺伝子の転写を直接抑制することで,昆虫の蛹化を抑制していることを初めて明らかにすることができた.<研究テーマ1: Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析>Kr-h1のターゲット遺伝子を探索するために,Kr-h1を強制発現したカイコ培養細胞株使ってmRNAおよびmiRNAのマイクロアレイ解析を行ったが,顕著に増減が見られるmRNAおよびmiRNAは見出すことができなかった,一方,別のアプローチとして行ったChIP-seqに関しては,抗体の選定と沈降効率を検証し,ChIPに適した条件を見出し,ChIP産物のシーケンスまで完了した.<研究テーマ2:エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析>mRNAおよびmiRNAのマイクロアレイを用いて,エクダイソン応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子を探索したところ,顕著に誘導される新規遺伝子を見出すことができなかった.原因として,マイクロアレイには搭載されていない遺伝子や既存のJH誘導性遺伝子(特にKr-h1)がその機能を担っているか,または新たなタンパク質合成を介さずにエクダイソン応答遺伝子を抑制している可能性が示唆された.そこで,実験の方向性を変え,ecdysone応答性遺伝子の1つであるbroad complex(br-c)のプロモーター解析を行った.br-cの転写開始点上流5kbとルシフェラーゼを連結したコンストラクト(br-cP_Luc)を作製し,カイコ培養細胞でJHおよびエクダイソンに対する応答性を調査した.その結果,br-cのmRNA発現プロファイルと同様に,br-cP_Lucはエクダイソン依存的に活性化され,JHを添加するとエクダイソン応答性が低下することが明らかになった.<研究テーマ1:Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析>ChIP-seqのシーケンスデータを解析した結果,約2000近くのKr-h1の結合サイトが予測された.これらの結合サイトの偽陽性を除去するために,新たに2種のtagをつけたKr-h1強制発現培養細胞をそれぞれ作製し,ChIP産物をシーケンス委託会社に依頼した.また,培養細胞を用いたKr-h1の強制発現およびRNAi解析により,Kr-h1のターゲット遺伝子を単離することに成功した.レポーターアッセイによりKr-h1の結合サイトを明らかにし,EMSAにより結合サイトへのKr-h1の結合を生化学的に証明することができた.<研究テーマ2:エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析>培養細胞系を用いてBR-Cのプロモーター解析を行った結果,JHによるBR-Cの抑制に関わるcis-element(JH応答配列)の特定に成功した.さらに,この応答配列を介した発現抑制に必須なtrans-element(転写因子)を見出すことに成功した.現在投稿論文作成中.幼若ホルモン(JH)は,昆虫の幼虫から蛹への変態を抑制するホルモンとして知られているが,その詳しい抑制分子メカニズムは明らかにされていなかった.本研究では,脱皮ホルモン(エクダイソン)依存的に誘導されれる蛹化決定遺伝子(Broad complex, BR-C)に注目し,培養細胞系を用いてBR-Cのプロモーター解析を行い,この抑制分子メカニズムを解析した.その結果,JHによるBR-Cの抑制に関わるcis-element(JH応答配列,JHRE)の特定に初めて成功した.さらに,JHREを介した発現抑制に必須なtrans-element(転写因子,Kr-h1)を見出した.これらの結果から,JHよって誘導されたKr-h1がBR-Cの上流にあるJHREに結合し,エクダイソン依存的なBR-Cの転写を抑制することで,蛹化を抑制していることが明らかになった.幼若ホルモン(JH)は,昆虫の幼虫から蛹への変態(蛹化)を抑制するホルモンとして知られているが,その詳しい抑制分子メカニズムは明らかにされていなかった.本研究では,蛹への変態を誘導する遺伝子(蛹化決定遺伝子)に注目し,培養細胞を用いてJHによる蛹化抑制メカニズムを解析した.その結果, JH誘導性タンパク質(Kruppele homolog 1)が蛹化決定遺伝子の転写を直接抑制することで,昆虫の蛹化を抑制していることを初めて明らかにすることができた.研究テーマ1は計画通り順調に進行しており,研究テーマ2のエクダイソン誘導性蛹化決定因子の解析が予定より早く完結した.昆虫生理学・生化学・分子生物学<研究テーマ1:Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析>2回目のChIP-seqのシーケンスデータを解析し,Kr-h1の結合サイトを特定すると共に,ターゲット遺伝子の予測を行う.得られた候補遺伝子は,定量PCRを用いて再現性を確認すると共に,EMSAによりKr-h1とターゲット遺伝子の結合を生化学的に証明する.<研究テーマ2:エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析>マイクロアレイによる候補遺伝子の探索では,2つの研究テーマともに新たな候補遺伝子を見出すことができなかったが,別のアプローチで行ったChIP-

seqおよびbr-cのプロモーター解析により,着実に研究成果をあげることができた.定量PCRができなかった実験があるため,その分の差額が生じた.<研究テーマ1: Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析>昨年度得られたChIP-seqのシーケンスデータをゲノムにマッピングし,ピークコールの推定およびアノテーションを行い,Kr-h1の結合サイトを特定すると共に,ターゲット遺伝子の予測を行う.得られた候補遺伝子は,定量PCRを用いてChIP-seqの再現性を確認すると共に,カイコ皮膚での発育変動を定量PCRで観察し,すでに報告されているホルモンtiterや蛹化因子との関係を比較する.またcordingRNAに関しては,コクヌストモドキからオーソログを探索してRNAiを行い(カイコ幼虫ではdsRNAによるRNAiの効果が低いため),遺伝子間の関係を発現レベルで解析する.non-cording RNAが見出された場合には,ノックダウンプローブを設計し,遺伝子間の関係を発現レベルで解析する.この段階までの解析結果をもとに有力な候補遺伝子を絞り込み,遺伝子ノックアウトまたは強制発現カイコを作出し,次年度の機能解析に備える.<研究テーマ2:エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析>エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析を行うために,br-cのプロモーター解析を進める.具体的には,br-cプロモーター(5kb)の削り込みを行い,JH応答配列(JHRE)を特定するとともに,RNAi法を用いてJHREに相互作用する候補因子の探索を行う.今年度中に定量PCRを行うので,試薬を購入する.本年度はじめにこの予算で定量PCR用試薬を購入し,ChIP-seqの再現性を確認する.
関税自由化が土地利用変化に与える影響分析

農産物自由化に向けて、政府による誘導的な宅地並課税製策、借地借家法の改正などを背景に、大都市周辺の近郊農業経営者は、減反による所得補填よりも、都市的土地経営(賃貸住宅、マンション、アパート等の経営)を選択してゆく傾向がある。また減反は価格維持を目的としている一方で、小規模農業経営を断念させる誘因となっているという意味では、宅地並課税による都市農地放出効果、借地借家法改正による都市農地を都市的土地経営に転換しようと試みる効果と同様の影響を与える制度であることがわかる。また、農産物市場の国際化は段階を追って行われつつあるが、その際の具体的入札制度は「SBS方式」と呼ばれ、価格のマークアップ分を減少させ、国際価格に近づけることができる仕組み(可能性)を内包した方式となっている。現段階では輸入米のミニマムアクセス分に対してこのSBS方式がとられているが、今後の海外の農産物市場価格を国内価格に反映させる方法として有効な手段であると考えられる。また、本年度の研究以前から着目してきた「海外余剰と農地転用面積の関係」にその国際化の結果が反映されていると考えると、1991年から92年の急激な農地転用面積増が、宅地供給増、住宅関連投資増に影響を与え、さらに数年のラグをもって近年の海外経常余剰縮小に影響を与えている可能性があることがわかった。以上のファクトファインディングは成果の1部であるが、この研究をとおして、農産物自由化を背景としたマクロ経済が、日本国内の産業構造や空間的な土地利用にいかなる影響を与えてきているか、また与えることになるかに関する総合的な研究を行った。