hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強乱流場における高速型ノッキング現象の解明

圧縮空気を動力源とする急速圧縮膨張装置を用いて種々の強度のノッキング現象を再現し,この現象を熱炎に依存する赤色発光の波長に対応した光学フィルタを用いた高速度二次元分光撮影とシュリーレン法による高速度直接撮影を同時に行うことにより,ノッキング現象を引き起こす自着火反応とそれに先立つ自着火前反応を分離して画像で捕らえることに成功した.さらに,これらの反応を詳細に調べるために自着火発生反応におけるOH,HCO,HCHOの各化学種からの発光と熱炎の発生に伴う赤色発光を4分岐光ファイバ,光学フィルタおよび光電子増倍管のシステムによって測定し,それぞれの発光強度の関係より高速度撮影で捉えられた自着火前反応が青炎反応と呼ばれる反応であることを示し,また膨張行程を伴う機関における自着火遅れ時間を導出した.また,燃焼室内圧力をもとに2領域モデルを用いた熱力学計算によって求めた未燃部温度と自着火遅れ時間との関係より,本研究におけるノッキング現象が実際の機関におけるノッキング現象と同じ高温型自着火の領域に属していることを示した.上記で得られた知見をもとに自着火発生機構について詳細な考察を行いその結果,強乱流場における高速型ノッキング現象が発生する状況での燃焼形態は分散型火炎構造を呈し,この分散型火炎構造により分断された微少体積の未燃混合気部は周囲を高温の既燃ガスに取り囲まれ存在することにより高温度となり,自着火発生機構そのものは層流燃焼場における反応と同一ながらも,より短時間のうちに自着火条件に到達し自着火が発生する.この局所的な自着火の発生に伴う圧力波が燃焼室全域に伝播することにより,燃焼室内に分散する未燃混合気部で連鎖的に自着火が誘発され,ほぼ同時に広範囲で自着火が発生しノッキング現象に至る,という強乱流場における自着火燃焼モデルを作成することが出来た.圧縮空気を動力源とする急速圧縮膨張装置を用いて種々の強度のノッキング現象を再現し,この現象を熱炎に依存する赤色発光の波長に対応した光学フィルタを用いた高速度二次元分光撮影とシュリーレン法による高速度直接撮影を同時に行うことにより,ノッキング現象を引き起こす自着火反応とそれに先立つ自着火前反応を分離して画像で捕らえることに成功した.さらに,これらの反応を詳細に調べるために自着火発生反応におけるOH,HCO,HCHOの各化学種からの発光と熱炎の発生に伴う赤色発光を4分岐光ファイバ,光学フィルタおよび光電子増倍管のシステムによって測定し,それぞれの発光強度の関係より高速度撮影で捉えられた自着火前反応が青炎反応と呼ばれる反応であることを示し,また膨張行程を伴う機関における自着火遅れ時間を導出した.また,燃焼室内圧力をもとに2領域モデルを用いた熱力学計算によって求めた未燃部温度と自着火遅れ時間との関係より,本研究におけるノッキング現象が実際の機関におけるノッキング現象と同じ高温型自着火の領域に属していることを示した.上記で得られた知見をもとに自着火発生機構について詳細な考察を行いその結果,強乱流場における高速型ノッキング現象が発生する状況での燃焼形態は分散型火炎構造を呈し,この分散型火炎構造により分断された微少体積の未燃混合気部は周囲を高温の既燃ガスに取り囲まれ存在することにより高温度となり,自着火発生機構そのものは層流燃焼場における反応と同一ながらも,より短時間のうちに自着火条件に到達し自着火が発生する.この局所的な自着火の発生に伴う圧力波が燃焼室全域に伝播することにより,燃焼室内に分散する未燃混合気部で連鎖的に自着火が誘発され,ほぼ同時に広範囲で自着火が発生しノッキング現象に至る,という強乱流場における自着火燃焼モデルを作成することが出来た.
次世代エネルギー社会のための低温液体中で動作する小型推進マシン

今後の超電導応用システムの普及や新エネルギー媒体としての液体水素の関連機器の普及に対応し,これら低温流体利用機器中のメンテナンスをおこなうために,低温流体中で推進可能な小型マシンの開発をおこなった.液体窒素中を推進するマイクロマシンとして,これまでの研究において最も効率がよかった液体窒素ガスの噴射を利用したジェット推進方式を主として,引き続き検討した.マシンボディ内のニクロム線を通電加熱することによって液体窒素を気化し,窒素ガスと液体窒素の複合流体を噴射し,その反力で推進する.ボディをFDM-3Dプリンタで製作し,噴射口径やボディサイズを変更することによって,これらのパラメータが噴射速度に与える影響を調べ,推進に与える影響を明らかにした.ジェット噴射推進において欠点であった「連続動作ができない」ことの解決を目指して,吸入機構を検討した.コイルと永久磁石を用いた電磁振動子の往復運動によって液体窒素の吸入機構について検討して試作したが,液体窒素の吸入が不十分であり,引き続き検討が必要である.低粘度流体である液体窒素の吸入のためには,部品の形状の再検討および隙間精度の向上が必要なことを確認した.液体窒素の噴射推進について,単発の推進動作は可能であるが,連続動作が不可能な状態である.連続動作をおこなうための液体窒素吸入機構について検討中であるが,未だ十分な動作にいたっていない.低粘度の液体窒素を効率よく吸入できるよう,動作部品の形状の再検討および寸法精度の向上が必要であり,検討から部品加工まで時間を要す.液体窒素のジェット噴射を用いることで,本研究独自の効率的な推進方式を開発中である.現在は単発の推進動作のみが可能であり,連続動作のためには引き続き検討が必要である.連続推進のための液体窒素吸入機構について,部品の形状と加工法を再検討することで解決できる見込みである.当初計画より若干遅れているが,時間をかければ問題解決の見通しは立っており,連続の推進動作を実現させる.その後,消費電圧や周囲の流れなど諸特性を測定する.今後の社会において普及が考えられる新エネルギー媒体としての液体水素および様々な超伝導応用機器に対応するため,低温液体中で遊泳推進可能な小型マシンの構造を検討した.液体窒素中の小型遊泳マシンとして,液体窒素を気化して噴出するジェット推進方式と,電磁力を用いた振動推進方式の2タイプについて試作し,その特性を調べることで応用の可能性を検討した.ジェット推進方式は,FDM-3Dプリンタで製作したボディ内部にニクロム線を内包しており,液体窒素の気化ガスを噴射する反力によって推進する.噴射口径の違いによる推進力の計算から,効率的な推進速度を得るために噴射口径の最適値の存在が確認された.試作した噴射口径の異なる実験においても推進速度にピークが現れることを確認し,最大速度230 mm/sの推進を得た.電磁力を用いた振動推進方式は,コイルと永久磁石から成る電磁振動子を低温流体中で動作可能なアクチュエータとして用い,振動によって推進する機構とした.コイルの発生する磁場の解析から磁石に作用する磁気力(駆動力)を計算し,振動子の最適形状を設計して推進マシンを試作した.10秒以上の連続動作で平均3 mm/sの推進を得た.液体窒素中で振動を利用した連続推進が可能なことを確認した.以上の成果から,ジェット推進方式は,瞬発的な1回限りの推進が可能であり推進速度と効率は高い,一方,電磁力振動推進方式では連続推進は可能であるが推進速度および推進効率が低いことが明らかとなった.2017年度研究実施計画に記載した内容は,「低温流体中を推進する小型マシンの製作(一次試作)」および「製作したマシンの基礎的な特性の評価」であり,おおむね順調に遂行できている.液体窒素中を推進する小型マシンについてジェット推進方式と電磁力振動推進方式の2種類を製作し,推進可能なことを確認した.さらに,ジェット推進方式については噴射口径などの値と推進力の関係を導き,電磁振動方式については,磁場解析から駆動力の最適寸法を検討した.今後の超電導応用システムの普及や新エネルギー媒体としての液体水素の関連機器の普及に対応し,これら低温流体利用機器中のメンテナンスをおこなうために,低温流体中で推進可能な小型マシンの開発をおこなった.液体窒素中を推進するマイクロマシンとして,これまでの研究において最も効率がよかった液体窒素ガスの噴射を利用したジェット推進方式を主として,引き続き検討した.マシンボディ内のニクロム線を通電加熱することによって液体窒素を気化し,窒素ガスと液体窒素の複合流体を噴射し,その反力で推進する.ボディをFDM-3Dプリンタで製作し,噴射口径やボディサイズを変更することによって,これらのパラメータが噴射速度に与える影響を調べ,推進に与える影響を明らかにした.ジェット噴射推進において欠点であった「連続動作ができない」ことの解決を目指して,吸入機構を検討した.コイルと永久磁石を用いた電磁振動子の往復運動によって液体窒素の吸入機構について検討して試作したが,液体窒素の吸入が不十分であり,引き続き検討が必要である.低粘度流体である液体窒素の吸入のためには,部品の形状の再検討および隙間精度の向上が必要なことを確認した.液体窒素の噴射推進について,単発の推進動作は可能であるが,連続動作が不可能な状態である.連続動作をおこなうための液体窒素吸入機構について検討中であるが,未だ十分な動作にいたっていない.低粘度の液体窒素を効率よく吸入できるよう,動作部品の形状の再検討および寸法精度の向上が必要であり,検討から部品加工まで時間を要す.2017年度の研究成果から,推進の速度と効率が高いジェット推進方式を主として考え,それに電磁振動子などを組み合わせて改良を進めるとともに,諸特性の詳細な計測と検討を行う.

これまでの成果から,ジェット推進方式は,瞬発的な1回限りの推進が可能であり,推進速度と効率は高い.一方,電磁力振動推進方式では連続推進は可能であるが推進速度および推進効率が低いことが明らかになっている.したがってジェット推進方式に電磁振動アクチュエータなどの機構を組み合わせることで,高効率かつ連続動作が可能な推進機構の開発が望めるため,これを推進する.また,ここまでの成果を国際会議および学術論文誌等に発表し,他の研究者の意見を取り入れる.液体窒素のジェット噴射を用いることで,本研究独自の効率的な推進方式を開発中である.現在は単発の推進動作のみが可能であり,連続動作のためには引き続き検討が必要である.連続推進のための液体窒素吸入機構について,部品の形状と加工法を再検討することで解決できる見込みである.当初計画より若干遅れているが,時間をかければ問題解決の見通しは立っており,連続の推進動作を実現させる.その後,消費電圧や周囲の流れなど諸特性を測定する.研究初年度のため,成果発表が予定よりも少なくなり,使用予定額を僅か3万円ほど下回った.年度末までに予定通り遂行して研究成果は出ているため,経費は翌年度に使用する.液体窒素の連続吸入機構の導入に時間を要しているため,当初計画の国際会議発表のための旅費を当該年度に使用できなかった.計画より少し遅れてはいるが,解決に向かっているため,翌年度に学会発表等に使用し,その他の経費も当初予定通りに使用する予定である.
複走レーザートムソン散乱装置の開発

LHDトムソン散乱装置の測定温度領域の拡大(50eV10keV→5eV30keV)と高温核融合プラズマにおける電子温度の等方性・非等方性の実験的探索を目的とし, LHDトムソン散乱装置を前方散乱・後方散乱のハイブリッド形式が可能な複走レーザートムソン散乱装置へ発展的に改造する研究を行った。このために, 1.5J/50HzのハイパワーYAGレーザーを開発した。また,筑波大GAMMA10トムソン散乱装置を復走レーザートムソン散乱装置へ改良した。本研究課題では,LHDトムソン散乱装置の測定温度領域の拡大(50eV10keV→5eV30keV)と電子温度の等方性・非等方性の実験的検証を目的とし,LHDトムソン散乱装置を前方散乱・後方散乱のハイブリッド形式が可能な複走レーザートムソン散乱装置へ発展的に改造した研究を行う。このために,平成21年度においては複走レーザートムソン散乱に欠かせない位相共役鏡を用いた縦シングルモード発振可能な高繰り返し・高出力レーザーの開発を重点的に実施した。このレーザーは既存のコンテニュアム製50Hz/0.5Jレーザーと同10Hz/2.5Jレーザーの2台を組み合わせることをベースにしている。これに位相共役鏡を組み合わせ,繰り返し周波数を上げるために電源部の改良を行った。また,安定動作のために冷却系統の改良も施した。開発の第一段階で得られた性能は1.9J/10Hz(平均出力19W相当)の縦シングルモードの発振を達成した。次に高繰り返し化を図り,1.2J/25Hz(平均出力30W相当)の性能向上に成功した。更に高繰り返し化のために電源部の増強と冷却系の改良を行い,平成21年度では最終的に1.15J/50Hz(平均出力57.5W相当)の性能を引き出すことができた。現状ではレーザーの出力は電源容量で上限が決まっているため,電源を更に増強することで最終的に1.5J/50Hz(平均出力75W)を目標とした開発を進めていく計画である。また,本研究で製作した位相共役鏡の反射率は96.7%と非常に良好な性能を有することも確認でき,複走レーザートムソン散乱装置の実現に向けて明るい見通しを得ることができた。これらのハードウエアの開発研究に加え,LHDに複走レーザー経路を設置するために数々の検討と実機の設計も行った。実際の設置までには安全性等のテストを行う必要があるが,これは平成22年度の6月までに終了できる見込みである。以上,平成21年度の研究ではおおむね良好な成果を得ることができたので,平成22年度以降も精力的に研究を進める予定である。本研究課題では,LHDトムソン散乱装置の測定温度領域の拡大(50eV10keV→5eV30keV)と電子温度の等方性・非等方性の実験的検証を目的とし,LHDトムソン散乱装置を前方散乱・後方散乱のハイブリッド形式が可能な複走レーザートムソン散乱装置へ発展的に改造する研究を行っている。このために,平成22年度においては複走レーザートムソン散乱に欠かせない位相共役鏡を用いた縦単一モード発振可能な高繰り返し・高出力レーザーの開発を重点的に実施した。このレーザーは既存のコンテニュアム製50Hz/0.5J(平均出力25W相当)レーザーと同10Hz/2.5Jレーザー(平均出力25W相当)の2台を組み合わせることをベースにしている。平成22年度の研究ではアンプ段を1個追加することと電源部を強化することで1.5J/50Hz(平均出力75W相当)の性能を引き出すことができた。また,縦単一モード発振を安定に動作させるために発振段を改良し,必要な性能が得られていることを確認した。しかしながら,開発作業中にレーザー内部の光学素子がこの出力に耐えられず破損するというトラブルが発生した。来年度は破損した光学素子をより破損しきい値の高いものに置き換えることと,必要箇所にアイソレーターを挿入することで,本レーザーを安全に運転できるよう改良する。また,このレーザービームをLHD本体へ導入するためのビーム経路の設計を起こった。これらは来年度中に完成しLHDへ設置する予定である。以上,平成22年度の研究では一部予期せぬトラブルも発生したがおおむね良好な成果を得ることができたので,平成23年度以降も精力的に研究を進める予定である。平成23年度の研究において,本研究課題で開発した高繰り返し・高出力レーザーを実際のLHDプラズマの電子温度・密度計測に応用し、ほぼ期待通りの性能であることを検証しました。本レーザーの平均出力(パルスエネルギー×繰り返し周波数)は6Wで,LHDトムソン散乱装置で使用中のレーザーの中で最も高出力の装置を開発できました。このレーザーを用いることで,サンプリング周波数を既存のシステムの2倍(50Hz→100Hz)へ向上することができました。本研究のもう一つの目的である複走レーザー前方-

後方散乱マルチパス形式のトムソン散乱装置の開発については;LHDプロジェクトのマシンタイムと設置許可の関係でLHDで実施することは諦めざるをえなくなりました。その代わりとして,筑波大・ガンマ10トムソン散乱装置に本申請課題のものと同様なシステムを組み込ませていただき,種々の試験を行いました。いくつの困難を克服し,筑波大・ガンマ10トムソン散乱装置をマルチパス形式のものべ改良することができました。筑波大・ガンマ10のプラズマはLHDのそれより1桁以上電子密度が薄いため散乱信号強度も弱く,このような状況では複走形式によりレーザー強度を増大させることは一番効果的であることを検証しました。複走レーザートムソン散乱装置は国内外でも応用例は2,3例に限られ,今回の成功は一つのマイルストーンとなると同時に技術的にも貴重な経験を積み重ねることができました。当初予定していたLHDでの応用の代わりにガンマ10での実施となった点を除けば,本申請課題はほぼ所定の成果をあげることができたと考えます。
中世イタリア都市支配層の「貴族」アイデンティティ―１４世紀ヴェネツィアを中心に

ヴェネツィア貴族は従来、大評議会に世襲終身身分を持つ階層として定義され、その特殊性が強調されて来た。しかし、他のイタリア都市においては、軍事/政治エリート層としての1213世紀の都市貴族の性格が強調されるようになってきている。この点を考慮して史料を読み直すと、ヴェネツィアもそのようなアイデンティティをある程度共有していることが観察できた。さらに従来、貴族身分形成の契機として位置づけられていたセッラータと呼ばれる一連の法令も、他のイタリア都市で見られた、整いつつある制度が親族の絆といかに立ち向かうか、という問題にヴェネツィアが与えた回答のかたちだと見ることができる。本年度は中世イタリア都市において、貴族・騎士と呼ばれた人々についての今までの研究をまとめた。20世紀のイタリア本国における当該問題についての認識は、「13世紀の平民勢力の台頭にもかかわらず貴族層nobiles(土地領主と古いコンソリ貴族の家からなる階層)は14世紀も文化的に継続し続けた」というものであった。貴族と都市世界におけるその政治的役割を明らかにする研究が蓄積し、支配層は物理的に交代したとしても、旧支配層の振る舞いのコードは新興勢力の上にも影響力を及ぼし、平民層の上層と旧支配層は徐々に近づき融合してあらたな支配層が形成されるという図式が説得力を持って受け入れられたのである。しかし21世紀になってから、このような図式は揺るがせられる。平民文化の革新性、すなわち政治を議会や委員会、司法手続き等委託された制度の次元で進めていこうとする文化、武力や私的仲裁に重きを置く旧支配層の文化とは異なる文化が13世紀の平民勢力の登場とともに飛躍的に発展したことが評価されるようになり、13世紀後半から14世紀前半にかけてのイタリア都市では、旧来の貴族の文化は徐々に弱くなり制度が強化されていくという見取り図が支配的になったのである。このような見方に従えば、14世紀の貴族はもはや13世紀の貴族とは価値観も振る舞いのコードも異なる新たな階層と言うことになろう。しかし旧来の貴族の文化的コードと、新たに強化された制度の文化の相互作用は十分明らかにされているとはいえない。この点をヴェネツィアをフィールドに、史料に基づいて実証的に明らかにすることを次年度の課題としたい。なおこの成果をもとにして、昨年3月に行ったキットリーニ講演に対するコメントの口頭発表を、英文原稿にまとめた。すでに入校済みであり、イタリアのヴィエラ社から出版予定である。イタリアの騎士についての研究史をまとめた。サルヴェミニからカルディーニ、タバッコ、ガスパリ、メール・ヴィギュールに至る研究の流れを概観し、封建的主従関係や騎士叙任に関わりなく、都市のために馬に乗って戦う階層がイタリアの騎士であること、彼らに共通の文化は騎馬槍試合や狩猟等の「騎士的遊び」に加えて、親族等の私的紐帯を基盤に武器と法を利用して紛争と和解を繰り返す紛争文化であると主張されていることを確認した。このようなイタリアの騎士とヴェネツィア支配層の接点を確認すべく、いくつかの研究でヴェネツィアと騎士の関係を示すとされている史料を再検討した。その結果、たとえ陸戦よりは海戦に長け、馬を用いることが少ないとしても、彼らにも騎士的遊戯や馬での戦いに加わる機会はあり、「政治的・軍事的エリート」としての一体感はヴェネツィアの支配層にも当てはまるのではないかという結論を得た。ヴェネツィア支配層については、セッラータ以前は貿易活動による富の蓄積と政府の要職に就くという政治的経験が事実上の貴族となる条件であり、セッラータ後は大議会の成員である家系に属することが貴族身分に属するための指標であるとされてきた。確かにそれは間違いではないが、今までヴェネツィア支配層について好んで研究されてきた家系の連続や個々の家の台頭の様子など物理的な側面ではなく、当時の人々がどのような人々が「高貴」であり、また政府の要職に就く資格があると考えていたのか、彼らの一体性がどこに求められるのかという問題については、より幅広く、同時代の他のイタリア諸都市との関係の中で考える必要があるだろう。次は14世紀の年代記を中心に、彼らの貴族意識を探って行く予定である。ヴェネツィア・エリート層の貴族としてのアイデンティティのよりどころを探るために利用可能な史料として、年代記のあとにしばしば付された「貴族の家リスト」がある。本年度は、このような家リストがどの程度残っているのか、これらの家リストを含む年代記と含まない年代記にはどのような違いがあるのかをまず検討した。その結果、家リストを含む年代記は、ドリ・レーンのいうところの「情報提供型年代記」であり、見出し文字が大きかったり、彩色が施されていたり、元首の治世ごとに話が分割されていたりと、必要な情報が取り出しやすいように工夫された形態になっていることがわかった。

筆者はじっさい、ヴェネツィアのマルチャーナ図書館にて、いくつかの写本を実際に眼にし、これらの情報型年代記の特徴を確認することができた。また、ドリ・レーンともコンタクトをとり、年代記やヴェネツィア貴族の「高貴さの記憶」についてさまざまな情報を得ることができた。なお、貴族の家についての情報が豊富で、異本も存在するピエトロ・ジュスティニアンの年代記をマルチャーナ図書館からは画像で、フランス国立図書館からはPDFでとりよせ、内容についての細かい異動を検討中である。同時に、本年度は、貴族の家のあり方とヴェネツィア国家の関係を考えるために、嫁資の問題を取り上げた。嫁資が家のステイタスやエリートの家同士の社会的ネットワークの構築に役立っているのみならず、貴族の家の富の一部を国家の財政に役立てる仕組みが12世紀13世紀にかけてととのっていったことを論証した。本研究はイタリア中近世史一般の貴族の多義性とそれがはらむ問題とは対照的に、あまりに自明のものとして扱われてきた観のあるヴェネツィア貴族を、その複雑さの中で再考することを目的とする。そのため、「騎士」に注目し、イタリアの研究蓄積と最近の研究成果をまとめ、ヴェネツィアのエリート層と、馬の使用や騎士文化との関係を年代記や大議会決議などの史料に基づいて考察した。その結果、ヴェネツィア人は決して馬と無縁ではなかったこと、近年のイタリア・コムーネの騎士研究は、騎士叙任式や国制上の特権は必ずしも騎士階層であることの本質ではないという立場を取っているので、それならばヴェネツィアの支配層をグラデーションのもっとも薄い形態として、騎士文化に連ねることは可能であろうことが、明らかとなった。次に、13-14世紀のイタリア都市の変遷についての近年の研究成果をまとめ、その中で、ヴェネツィアの貴族身分がいかに成立していくかを検討した。研究史を概観すれば、北中部イタリア都市における13世紀後半14世紀は、13世紀の制度の文化、参加資格の拡大と13世紀末からの権力の集中の動きが多くの緊張を生みだした時代として、捉えられてきている。ヴェネツィアでも13世紀後半は著しく「制度」が整えられた時期で、その中で親族をどのように扱うかが問題になっていた。13世紀後半14世紀初期にみられた各種の法令は、ヴェネツィアにおいて、参加資格の拡大・親族の利害の抑制と、権力を特定の家に固定化しようとする動きが緊張関係にあったことを示している。貴族身分を生み出すもととなった一連の法令は、このような緊張の中で、以前は政治的協力者の範囲として制限の対象になっていた父系直系血族prolesや親族propinquiが、逆に評議会制度を支える柱として制度化されていく過程であったと解釈できる。西洋中世史13世紀のヴェネツィア貴族が他のイタリア都市の貴族と共通の貴族文化(騎馬による武勇、私的仲裁、名誉の概念等)に連なることを史料にもとづいて明らかにし、論文にする予定であったが、新たな論文・研究状況の探索によって、20世紀に支配的であった貴族文化の継続の視点が21世紀になってから乗り越えられていることを知り、より変化に配慮した視点が必要であることに気づいたため。また他の研究課題に思いのほか時間が取られたこともある。
多剤耐性菌出現頻度の低減化を目指したストレス誘導性突然変異の分子メカニズムの解明

アラニン(Ala)要求性大腸菌変異株を1000.1 ug/mlのAla添加最少培地で培養し対数後期に達した細胞集団に占めるAla非要求性サプレッサー変異株の割合を調べた結果、サプレッサーの出現頻度は添加したAla量に依存して低下した。また、培養開始後経時的にサプレッサーの出現をモニターした結果、培養開始約30時間後からサプレッサーの出現が観察された。以上より、Ala飢餓ストレスを感知した細胞が、未知のシグナル伝達系を介して細胞内の代謝変化を起こた結果、突然変異が蓄積し最終的にAla飢餓環境下で選択されることによってサプレッサー変異株が出現したものと考えられた。L-アラニン要求性変異株から誘導されるL-アラニン非要求性サプレッサー変異株の出現頻度は自然突然変異による変異株出現頻度よりはるかに高いことから、本実験系は“アラニン飢餓"ストレスによる突然変異頻度の上昇のメカニズムを解析するためのよいモデルとなる。L-アラニン非要求性サプレッサー変異株の出現は、(1)“アラニン飢餓"ストレスを感知したL-アラニン要求株が何らかのシグナル伝達システムを活性化した後、(2)突然変異頻度を上昇させ、(3)本来のL-アラニン合成経路とは異なる代謝系の量的あるいは質的変化をきたし、L-アラニンを供給した結果であると解釈することができる。この仮説が正しいとすると、トランスポゾン変異導入法により“アラニン飢餓"ストレス時に誘導される突然変異株の出現にとって重要な因子(群)の機能破壊の結果サプレッサー変異株の出現は抑制されることが期待される。そこで、本変異導入法を実施した結果、サプレッサー変異株の出現が遅延する24株のクローンを取得することができた。また、L-アラニンは解糖産物であるピルビン酸のアミノ化反応で生成することから、サプレッサー変異株はL-アラニン合成反応の前駆体の細胞内レベルの上昇が引き金になる可能性が考えられる。そこで、ニトロソグアニジン処理によって取得したL-アラニン要求性変異株と、著者が同定した大腸菌の主要なL-アラニン合成酵素3種の遺伝子を破壊したL-アラニン要求性変異株の生育に及ぼすL-アラニン前駆体であるピルビン酸とグルタミン酸の影響を調べた。その結果、レベルの違いはあったがいずれもL-アラニン要求株の生育を相補することが明らかとなった。このことから、アラニン非要求性サプレッサー変異株はピルビン酸あるいはグルタミン酸の細胞内レベルの上昇に繋がる変異が生じている可能性が示唆された。アラニン要求性変異株をAla添加最少寒天培地上に塗布すると37°C、2日間でコロニーを形成する。この変異株をアラニンを含まない最少寒天培地で培養し、培養開始3日および4日後に出現したコロニーをL寒天培地で純化後、再度最少培地でそれらの生育を観察した結果、これらの誘導株は最初にコロニーを取得した培養時間(3日あるいは4日)より早期(2日)にコロニーを形成することから、これらはアラニン非要求性サプレッサー変異株であることが明らかとなった。このアラニン要求変異株は最少培地に添加したアラニン量に依存してその生育能を回復する。そこで、100 ug/ml0.1 ug/mlのアラニンを添加した最少培地でアラニン要求変異株を培養し対数後期に達した培養液中に存在するアラニン非要求性サプレッサー株の出現頻度を調べるために富栄養寒天培地と最少寒天培地で生育するコロニー数を計測した結果、全菌数に対するアラニン非要求性サプレッサー株の出現頻度は、添加したアラニン量に逆比例の関係でアラニン非要求性サプレッサー変異株が出現することが明らかとなった。このことは、“アラニン飢餓"ストレスを感知した細胞が何らかのシグナル伝達系を活性化して、アラニンを供給する未知代謝系の変異を誘導したものと解釈することができる。この仮説に基づき、アラニン飢餓ストレス開始後の細胞内の遺伝情報発現の変化を調べるトランスクリプトーム解析を実施するため、培養条件の検討を行っている。アラニン(Ala)要求性変異株をAla添加最少寒天培地上に塗布し37°Cで培養すると2日後にコロニーを形成し、さらに培養を継続すると出現するコロニーの数は増加する。これらのAla非要求性サプレッサー変異株は、典型的なストレス誘導性突然変異の結果生じたものと考えられる。本研究ではこの現象についてその分子メカニズムを明らかとするための一環として、Ala要求性大腸菌変異株を0.1 ug/ml100 ug/mlのAla添加最少培地で培養し、対数後期に達した細胞集団中に占めるAla非要求性サプレッサー変異株の割合を、Alaを含まない最少寒天培地に生育するサプレッサーの数を計測することによって調べた。

その結果、サプレッサーの出現頻度は添加したAla量に依存して低下した。また、最少培地で培養開始後経時的にサプレッサー株の出現をモニターした結果、培養開始約30時間からサプレッサーの出現が観察された。これらのことから、Ala飢餓ストレスを感知した細胞が何らかのシステムを介して突然変異頻度が上昇したこと、そして、Ala飢餓ストレス暴露後約30時間までの間にこの細胞内の代謝変化が生じて突然変異が蓄積し、Ala飢餓環境での選択を受けサプレッサー変異株が出現したものと考えられた。また、Ala要求変異株からトランスポゾン挿入変異ライブラリーを構築し、Ala無添加最少寒天培地で生育しないあるいは遅延するクローンの選択を行った結果、現在複数の候補クローンの分離に成功している。今後は、これらのクローンの選択をさらに進め、それらのトランスポゾンの挿入遺伝子を同定することによって、ストレス誘導性突然変異出現に関与する因子の同定が期待される。動物微生物学本研究で用いたアラニン要求性変異株から出現するアラニン非要求性サプレッサー変異株はアラニン飢餓ストレスを感知し何らかのシステムを介してその出現頻度が上昇することが明らかとなっている。そして、このサプレッサーの出現はアラニン非添加最少培地で培養開始後約30時間以降に出現することが示唆されていた。今回、このサプレッサー変異株出現の経時変化の詳細について再現性をとることができ、トランスクリプトーム解析をするための培養条件を決めることができた。このサプレッサー変異株の出現に関与することが予想されるシステムを同定するために、アラニン要求変異株を対象としてトランスポゾン変異導入法を用いたランダム変異導入を行い、アラニン非含有最少培地で生育が遅延するクローンの選択と行い現在24クローンの候補株を得ている。また、アラニン非要求性サプレッサー変異株の原因因子を同定するアプローチとしてショットガンクローニングを計画していたが、他研究機関との共同研究により次世代シーケンサーを利用したサプレッサー変異株の解析を実施できることになったので、本実験課題については次世代シーケンサーによる解析に軸足を移しその実験のための準備を進めている。本研究で用いたアラニン要求性変異株は3つの主要なアラニン合成遺伝子を薬剤耐性マーカーおよびFRT配列断片を挿入することによって構築したので、最少寒天培地に塗布後出現するコロニーは、純粋な復帰変異株ではなくサプレッサー変異株と考えられる。このサプレッサー変異株の出現頻度は自然突然変異による頻度よりはるかに高いことから、アラニン飢餓ストレスによって誘導されたものと考えられ、その検証実験を平成24年度に行った。その結果、最少培地塗布後に培養経過とともに出現するアラニン非要求性変異株の数が多くなることから、本実験システムはストレス誘導性変異の評価システムとして有効であることが明らかとなった。また、異なる濃度のL-アラニンを培地に添加し培養した後に出現するサプレッサー変異株の頻度は、添加アラニン量に反比例して増加した。この、サプレッサー変異株出現の経時変化を詳細に評価したところ、培養開始30時間以降にサプレッサー変異株が出現してきた。現在本実験結果の詳細な再現性をとり、トランスクリプトーム解析を実施するための準備を行っている。L-
病的喉頭の代償機能、特に反回神経麻痺の健側過内転に関する臨床的・実験的研究

声門閉鎖不全の代償作用の一つとして、健側声帯の過内転が指摘されているが、具体的な運動様式や、代償の程度はよくわかっていない。声帯が過内転する喉頭を観察すると、過内転時に同側の仮声帯も内転し、声門上部に狭窄部を形成することが多い。そこで、声帯過内転の程度を、仮声帯の内転の程度で定量化し、発声機能などとの関連を調べた。対象は、過去10年間に当科で経皮的シリコン声帯内注入術を施行した患者で、術前後の喉頭内視鏡下ストロボスコープを行った182例(男110、女72、平均59歳)で、持続発声中の両側仮声帯の接近度を観察した。その結果、患側と健側の仮声帯が発声時に接触する症例は5例のみで、他の177例では患側仮声帯の運動は認められなかった。発声時に健側仮声帯が、同側声帯を観察できないほど内転する例が57例、声帯を部分的に観察できる程度に内転する例が49例、仮声帯の内転が全く認められない例が71例であった。術前仮声帯内転例111例中、81例で経皮的シリコン声帯内注入術後に内転の程度が減少した。注入後の平均呼気流量(MFR)は、内転の程度の減少例では非減少例よりも小さく、最長発声持続時間(MPT)は、内転の程度の減少例では非減少例よりも大きい傾向を認めた。声帯の内転は発声機能を代償しようとする努力である可能性が高いと考えられた。しかしながら、術前に仮声帯が内転する111例と内転しない71例とでは、発症からシリコン注入までの病脳期間、術前の声帯位、MFR、MPT、基本周波数変動率、最大振幅変動率に有意差を認めず、声帯の内転は、発声機能を実際には代償し得ていないと考えられた。術前に声帯の内転する例では誤嚥は52%で認められたが、非内転例では37%であり、この内転は誤嚥防御と関係する可能性が示唆された。今後、声門上部の狭窄のメカニズムについても研究していきたい。
Gorlin症候群由来細胞を用いた良性・悪性腫瘍成立に関するメカニズムの解析

ヘッジホッグ情報伝達系の関与する腫瘍形成のメカニズム解明を最終目標として、良性および悪性の腫瘍が同一の個体の異なった組織に発生するGorlin症候群によって引き起こされる腫瘍群の解析を行い、ヘッジホッグ情報伝達系のPTCH1およびSMO遺伝子変異だけでは腫瘍の悪性化良性化、組織特異性は説明できないことを見出した。さらに研究の遅れているGorlin症候群由来良性腫瘍である角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)細胞株の樹立、3次元培養法の確立に成功し、この細胞株が幹細胞および間葉系細胞の性質を持ち、カルシウムによって上皮系、ケラチノサイト系とその性質が変化することを見出した。1.角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)由来細胞(NS11, KCOT2)をhydrogel内で3次元培養することに成功した。培養細胞はKCOTの特徴である錯角化がみられた。2. NS11細胞における遺伝子発現及びこの細胞をカルシウムの濃度を変えた時に見られる遺伝子発現の変化を網羅的に調べるためRNA-seq解析を行った。その結果、Hedgehog系の顕著な亢進は認められなかった。また表皮の分化に関与する遺伝子群が、カルシウム濃度をあげる事により顕著な上昇及び減少が見られた。これらのデータから、樹立したKCOT細胞はBasal cell layerの遺伝子発現パターンをとり、カルシウムによる誘導によりSpinous layer、Granular layer、Cornified layerで発現が認められている遺伝子の発現が顕著に増加する一方、Basal cell layerでの発現が認められている遺伝子の発現は増加するものもあるがその増加の割合はそれ以外に較べると低いことが判明した。これらのデータはwesternで調べたマーカー遺伝子の変動と一致した。3. Gorlin症候群で発症する腫瘍の一つに基底細胞癌(BCC)がある。欧米ではBCC発症の頻度が高いが日本人ではそれほどは高くない。今回日本人の散発性なBCCの解析によりhedgehogのtransducer蛋白であるSmoothened (SMO)のW535L変異を2検体で見出した。この変異はSMOの悪性変異として最も知られている変異である。また現在このBCCにおけるPTCH1遺伝子の解析を進めている。KCOT細胞に関してはhydrogelによりほぼ3次元的にKCOTを再現出来そうな見通しが出来た。またRNA-seqの解析により今まで一つ一つのタンパクについてwesternで解析していたが、一気に遺伝子発現の概要が得られた事によりKCOT細胞そのものの由来が明らかにできる可能性が高まった。また新たにBCCの解析が可能になりSMOの変異の同定ができた。KCOTは良性腫瘍でBCCは悪性腫瘍なので、今後Gorlin症候群の同一患者由来のKCOT及びBCCを解析する下地ができたと思われる。1)角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)由来細胞株NS11およびKCOT2におけるHedgehog系の活性の検定を、SMO-GFP蛋白をtrangentに導入する事により検定を行った。その結果SMOの強く発現の見られる細胞ではciliaの形成そのものの阻害が起こっているらしい事、一方GFPが弱く発現した細胞ではSMO蛋白を活性化するSAGによりSMO-GFPのciliaへの移動が確認出来た。この事はHedgehog系の活性そのものは低いが活性因子により活性化は起こる事を示している。現在stableにSMO-GFPを発現するKCOT株の分離を試みている。2)昨年度のGorlin症候群由来のNS11細胞(遺伝性)に引き続き、弧発性のKCOT2細胞における遺伝子発現及びカルシウム濃度を変えたときに見られる遺伝子発現の変化を調べるためにRNA-seq解析を行った。その結果A) NS11細胞と同様にHedgehog系の顕著な亢進は認められなかった。B)表皮あるいはkeratinocyteの分化に関与する遺伝子群がカルシウム濃度をあげる事により大きく変動する事が判明した。これらの遺伝子の発現の変化は由来の異なるNS11とほぼ同様の動態を示した。この事はKCOT細胞の起源はよく似ている事を示している。C)前年度までに明らかにして来たwestern blotを用いた解析データをRNA-seqデータはほぼ支持することが判明した。3)弧発性の基底細胞癌(BCC)をさらに解析した。その結果、Smoothened(SMO)蛋白のL412F変異を2例、SMOに変異の無いもの1例を見出した。例数は少ないがSMOの変異は80%になり欧米(約20%)に較べかなり高いことになる。L412F及びW535L変異はSMOでは高頻度で変異が見られる部位であるが日本人でのデータがほとんどないので、今後もさらにサンプル数を増やす事により、何故日本人はCaucasianに較べ皮膚癌が少ないか検討していきたい。新規のKCOTがなかなか入手できなくその分新規の解析は少し遅れている。また論文投稿中でreviseのための実験などで予定よりは少し遅れている。しかしKCOTの細胞系とその培養系が確立できたことにより、最も重要なvitroでKCOTを再構成するという目的に近付いたと言える。さらにRNA-seqのデータが得られたことにより他のデータベースとの比較が可能になり解析がスピードアップできると思われる。1)角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)由来細胞の詳細な解析を3D培養システム、抗体染色、RNA-seqを用いて行った。これらの細胞ではカルシウムによりkeratinocyte分化マーカーの誘導が起こること、3Dゲル内のSpheroidの内部ではCaspase 3を介した細胞死が起こっていることが確認され、生体内で起こっていることの一部が再現できた。

2)qPCRを用いた解析及びRNA-seqを用いた解析で、通常活性化されているとされるPTCH1、GLI1などのヘッジホッグ情報伝達系活性化の指標遺伝子の転写量は非常に少ないことが判明した。さらにpmSmoEGFPを用いた研究から、通常ではSmoタンパクのciliaへの集積は認められないがヘッジホッグ情報伝達系の活性化剤であるSAGで処理するとSmoタンパクがciliaに集積することがわかった。このことはKCOT細胞株ではヘッジホッグ情報伝達系の強い活性化は見られないこと、しかし活性化に関与する因子は保持されていることを示している。3)基底細胞癌(BCC)はGorlin症候群患者で高頻度で見られる腫瘍である。6例のBCC (sporadic 5例、Gorlin症候群1例)のPTCH1およびSMOを解析した所、sporadicなBCC4例でSMOの変異W535L 2例、L412F 2例を見出した。また残りのsporadic 1例ではPTCH1の変異が2箇所存在した。さらにGorlin症候群患者のBCCではPTCH1の生殖細胞系列変異と共に、もう一つのアレルが欠失していることを見出した。これらのことはBCCではヘッジホッグ系の活性化がその成立に大きく関与していることを示している。2アレルのPTCH1活性の喪失はKCOTでも知られているので細胞の悪性化にはPTCH1のコピー数の違いだけでは説明できないことが判明した。ヘッジホッグ情報伝達系の関与する腫瘍形成のメカニズム解明を最終目標として、良性および悪性の腫瘍が同一の個体の異なった組織に発生するGorlin症候群によって引き起こされる腫瘍群の解析を行い、ヘッジホッグ情報伝達系のPTCH1およびSMO遺伝子変異だけでは腫瘍の悪性化良性化、組織特異性は説明できないことを見出した。さらに研究の遅れているGorlin症候群由来良性腫瘍である角化嚢胞性歯原性腫瘍(KCOT)細胞株の樹立、3次元培養法の確立に成功し、この細胞株が幹細胞および間葉系細胞の性質を持ち、カルシウムによって上皮系、ケラチノサイト系とその性質が変化することを見出した。1. KCOT2細胞株に関しても同様にRNA-seq解析を行う。この解析により2種のKCOT細胞を解析することになり、遺伝子発現の共通性と同時に異なる点が明らかに出来ると考えられる。特にKCOT2細胞はPTCH1の遺伝子機能が欠損している事が判明しているので、その違いが遺伝子発現、カルシウムに対する反応性にどう違いをもたらしているかを調べていく事によってPTCH1蛋白機能の本質に迫る事ができるのではと期待している。2.遺伝子発現解析によりKCOT細胞株は、カルシウムにより、表皮におけるbasal cell layer状態からより分化した細胞状態へと分化していく事が判明した。
バクテリオロドプシンにおけるタンパク骨格ダイナミックス

バクテリオロドプシン(bR)におけるタンパク骨格ダイナミックスに関する知見を得るために、野性株ならびに種々の変異株の[3-^<13>C]および[1-^<13>C]Ala標識を培養によって行い、その固体高分解能NMRスペクトル測定から、以下に示す結果を得た。(1)膜方面にあるNおよびC末端、膜貫通ヘリックス、ループ部位によって分子運動の時間尺度はことなり、それぞれナノ秒、ミリ秒、マイクロ秒に相当する分子の揺らぎがNMRスペクトルパターン、種々の緩和時間測定から検出することができた。(2)特に膜表面部位にある残基の局部構造は、脂質あるいは共存するカチオンの有無によって変化することが、界面活性剤による脱脂、可溶化の過程で変化するスペクトルパターンから検出することができた。(3)マイクロ秒の時間尺度でおこる遅い運動の存在の検出には、回転座標系におけるプロトンスピン格子緩和時間測定が有効であるが、その部位のさらなる特定にはむしろプロトンデカップリング下におけるスピン-スピン緩和時間測定が極めて有効であることを明かにした。(4)膜表面にある末端部位における残基とそのコンホメーションの特定には、交差分極マジック角回転、高出力デカップリングマジック角回転によって得られるスペクトルの差スペクトルの利用が有用である。(5)ループ部位の揺らぎの程度を知るための手段として、アミノ酸置換による高次構造変化の度合いを知ることも、有用であることを明かにした。
社会的認知を支える生物・物体認識の進化的基盤

物体と生物の区別は私達の社会的な行動を支える基礎知識である。ヒトでは発達初期からこのような知識が見られる。本研究では、ヒト以外の霊長類がヒト乳児同様に物体・生物を動きの特性から区別するかどうかを調べることで、ヒトの知識の進化的基盤を探る。実験の結果、ニホンザルが物体の運動には外的な作用を期待するが、生物の運動には外的作用に限らず自己推進的な運動も期待することが示された。これは申請者によるチンパンジーでの先行研究と同様に、ヒト以外の霊長類がヒトと類似した物体・生物の認識を持つ可能性を示唆するものであり、ヒトの社会的認知の背景にある諸知識の起源や霊長類種における知識の特性を考察する助けとなる。本研究では、物体に関する概念的知識の基盤となる「生物と物体の認識」について調べる。とくに、そのような認識がヒトに限らずヒト以外の動物にも共通して見られるのかどうか、また、それぞれの種がどのような手がかりをもとにそれらの対象を認識しているのかを明らかにすることで、物体知識の内容の種特異性とその系統発生について明らかにしていく。本年度は、チンパンジー、ニホンザルなどのヒト以外の多種霊長類における、運動特性の手がかりに焦点をあてた生物・物体知識について調べることを目標に、実験環境や実験刺激などの整備・作成をすすめた。実験手続きには、ヒト乳児の先行研究を参照し、被験体の注視時間を指標とした選好注視課題を用いる。そのため被験体の注視反応を計測・分析するための環境を整えた。また実験刺激には、同じくヒト乳児での研究をもとに、生物的または物体的に動く2次元刺激のアニメーションを作成した。具体的には、生物的・物体的対象がそれぞれの運動特性(たとえば、自己推進的な運動や、他の物体からの作用を原因とする受動的な運動)にあった運動を見せる自然事象と、各対象がそれぞれの運動特性に反した運動を見せる違反事象を作成し、それらに対する被験体の注視時間の違いを計測する。予備的な実験ではすでに、ニホンザルとチンパンジーがこれらの刺激に対して異なる注視反応を見せる可能性が示唆されているが、実験個体数の少なさや、用いる刺激の質を考慮し、さらなる実験が必要と考える。本研究では、ヒト以外の霊長類を対象に「生物と物体の認識」について検討する。このような認識は、私たちの認知や行動を支える核知識(物理的知識、社会的知識、生物学的知識など)の形成の土台となる点で重要な認識と言える。霊長類における種間比較から、このような認識の系統発生的基盤の解明、ならびにヒトとヒト以外の種での認識の特徴を明らかにすることを目的とする。本年度は、対象の運動特性に焦点をあて実験をおこなった。具体的には、「物体は外界の作用なしに自己推進的には動かないが、生物的対象は自己推進的な運動が可能である」ことをニホンザルが認識しているかどうかを調べた。実験手続きにはヒト乳児での方法を参考に、被験体の注視時間を指標とした期待違反事象課題を用いた。1つめの実験では、生物的または物体的に動く2次元刺激のアニメーションを用いた。このとき、物体が外的作用によって動く自然事象と同物体が自己推進的に動く違反事象を提示する。また、生物的対象については自己推進的運動も外的作用による運動いずれも自然事象となる。両事象に対する被験体の注視時間の違いの評価から、どちらの事象も自然事象となる生物的対象に関しては注視時間に差は見られなかったが、物体に関しては事象への注視時間に違いが見られた。つまり、ニホンザルが物体運動に関してその外的作用の有無に注意を向けている可能性がある。また、2つ目の実験では実験者による実演を記録した動画を用いた。ここでは、物体(果物など)が実験者の手によって移動させられる自然事象と、物体が自己推進的に水平移動する違反事象を提示した。結果、両事象に対する注視時間に違いは見られなかった。つまり、この課題においては物体の外的作用による運動と自己推進的運動を区別しなかった。実験1,2での結果の違いは用いた刺激の違いによる可能性が考えられるが、この点については今後の検討が必要と考える。本課題では、ヒトを含む霊長類種を対象に「生物と物体の認識」について検討する。生物と物体をさまざまな特徴から区別し認識することは、生物学的な知識をはじめ、物理的知識や社会的知識といった、私たちの認知や行動を支える核知識を形成する基礎となる。これについて、霊長類種での種間比較から、ヒトとヒト以外の種がもつ認識の共通性や種差を知り、その系統発生に迫ることを目的とする。昨年度までの研究では、生物・物体の運動特性に基づく認識を検討してきた。具体的には、「物体は外からの作用なしに自己推進的には動かない」が、「生物は外的作用による運動も、作用なしの自己推進的運動も可能である」ことをニホンザルとチンパンジーが認識しているかを検討した。実験は、ヒト発達研究の手法に倣い、選好注視を用いて行った。先述のルールに違反した事象(物体の自己推進的な運動)と違反していない自然な事象(物体の外的作用による運動、生物の外的作用および自己推進的な運動)を提示し、両事象を区別するかどうかを調べた。ヒト乳児ではその区別が違反事象への選好という形で見られる。実験の結果、ニホンザル、チンパンジーともに両事象を区別すること、つまり、生物と物体それぞれに適した運動特性を認識している可能性が示された。

しかしこれは、ヒト乳児と異なり、自然事象への選好という形で示された。そこで、本年度の研究では、同一の手続きや刺激を用いて、8ー9ヶ月、5ー6ヶ月児のヒト乳児での検討を進め、刺激や手続きの妥当性の確認とヒトとの直接比較を行った。物体と生物の区別は私達の社会的な行動を支える基礎知識である。ヒトでは発達初期からこのような知識が見られる。本研究では、ヒト以外の霊長類がヒト乳児同様に物体・生物を動きの特性から区別するかどうかを調べることで、ヒトの知識の進化的基盤を探る。実験の結果、ニホンザルが物体の運動には外的な作用を期待するが、生物の運動には外的作用に限らず自己推進的な運動も期待することが示された。これは申請者によるチンパンジーでの先行研究と同様に、ヒト以外の霊長類がヒトと類似した物体・生物の認識を持つ可能性を示唆するものであり、ヒトの社会的認知の背景にある諸知識の起源や霊長類種における知識の特性を考察する助けとなる。実験対象となるニホンザルの飼育・実験設備の移動および病死などによりデータの収集に遅れが生じた。また、今後の被験体数の充足が課題となる。比較認知科学、発達心理学被験体数の確保のため、これまで実験を行っていた施設以外での実験実施の準備と環境整備を進める。そのうえで、データ収集とその分析を進めていく。おもな実験対象となるニホンザルが、設備の老朽化により実験実施施設を移動したため、実験環境をあらたに整備する必要があった。そのため、すでに行っていた予備的実験からの発展に遅れが生じた。予定していた実験の実施ができなくなったため出張費の支出額が計上より少なかった。まずはすでに予備実験を行っているチンパンジー、ニホンザルでの更なる検討を進める。その後、それ以外の霊長類種においても同様の実験を行うことで、データの拡充と洗練に努める。物品購入、出張旅費にあてる。購入した物品が店頭値下げ対象となり、当初の見積額よりも安価で購入したため。物品の購入にあてる。
新生児中枢神経発達に影響を及ぼす母乳シグナル伝達物質の網羅的解析

ラットの初乳および成乳のプロテオミクス解析と、乳腺細胞のDNAマイクロアレイ解析を行い、ラット初乳に含まれる神経発生に関連した候補蛋白質および候補遺伝子を数種類同定した。また、母乳の中枢神経発達への影響を検討する為に新生児人工哺育システムを構築し、完全栄養管理下でのサイトカイン等の定量的経口投与が可能となった。ヒトの胎齢3ヶ月ころには大脳皮質が出現してくるが、ラットでは妊娠15日頃がこの時期に相当する。我々は、妊娠15日のラット母獣にLeukemia inhibitory factor(LIF)を投与すると、胎盤からACTHが胎児側に分泌され、このACTHが胎児血球からLIFを分泌するLIF-ACTH-LIFシグナルリレーが存在することを明らかにしてきた。さらにこのシグナルリレーにより、母獣にLIFを投与すると胎児大脳皮質でのBrdUの取り込みが増加することを明らかにした。現在、DOHaD(Developmental origins of health and disease)説により、母体の低栄養などによる不十分な環境に胎児が曝露されたために成人病や精神疾患などの素因をもつことが提唱されているが、このような母胎間シグナルリレーの解明により胎児発生過程における母体環境の重要性を明らかにすることができると考えられる。さらに、ラット新生時期はヒトの胎齢5ヶ月頃に相当するため、ヒトの胎盤に相当する母胎間シグナルの研究対象として我々はラット母乳に着目した。そこでまず初めに、人工哺育により定量的にサイトカイン等を投与できるシステムを構築するため、本年度ではラット用人工ミルクの作成、経口投与システムを完成させた。また、各ステージによる乳腺細胞の遺伝子発現の変動で網羅的にみるため、DNAアレイを用いた解析を行っている。さらに、各時期におけるラット母乳の搾乳を行い、プロテオミクス解析も同時に行い、時期特異的な蛋白やペプチドを同定中である。これまでに我々は、ラットの経胎盤によるLIF-ACTH-LIF母胎間シグナル伝達が胎児神経前駆細胞の増殖を促すことを明らかにし、胎盤のシグナルトランスデューサーとしての役割を提唱してきた。ラット出生時の脳はヒトの胎生20週頃に相当し、出生後急速な発達を遂げることから初乳には脳発達に関わる重要な因子が含まれていると考えられる。本研究では、20週以降の母胎間シグナル伝達の胎盤に相当する媒体としてラット乳腺細胞および母乳を想定し、乳腺細胞のDNAアレイ解析、および母乳蛋白質の網羅的解析を行い、完全栄養管理下で実験を行うラット新生児の人工哺育システムを構築することを目的とした。(1)乳腺細胞のmRNA発現の動態:PO day(出産日)およびP4 dayの乳腺組織からmRNAを抽出し、DNAアレイによる発現遺伝子の網羅的解析を行った。POでの発現がP4に比べて高かったものでは、Gfra3、Igf1、Igf2が挙げられた。(2)PO,P1,P3,P14 dayのラット母乳を搾乳し、遠心分離操作により得た乳清画分を2次元電気泳動で展開し、主要なスポットをnano-HPLC-ESI-MS/MSで解析した。また、低分子蛋白およびペプチドは酸処理後にプロテインチップを用いて解析した。蛋白質の変動はPO vs Plで最も大きく39.1%であったのに対し、P1以降は各日数間の変動は約20%と一定であった。また主要蛋白質にはglial fibrillary acidic proteinが含まれていた。(3)特殊加工したゾンデにより、帝王切開した新生児を8時間毎の経口投与による完全人工哺育にて飼育する事に成功し、投与量をコントロールするシステムを確立した。以上の結果より、今後初乳中の主要な候補蛋白質の中枢神経発達への影響を人工哺育システムにて解析していくことが可能となった。