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木質文化財の現場調査を目的とした新規手法の基礎的研究

木質文化財の調査は、その起源や歴史的背景、木材選択をはじめとして様々な知見を齎す。しかし木質文化財は文化財であるがゆえ破壊が禁じられており、非破壊手法が求められてきている。本研究では非破壊かつオンサイトでの樹種識別を可能とする手法の開拓として、近年様々な分野で活用されている近赤外分光法(FTーNIR)を活用した樹種識別について、手法の基礎的研究を行った。その結果、現生のニヨウマツ類(アカマツとクロマツ)では心材部分を用いることで識別が可能であった一方、歴史的古材のアカマツとクロマツではでは判別不可という結果がでるなど、課題も見つかった。その原因解明のためにも継続した研究の必要性が見出された。木質文化財の樹種調査においては、多くの場合に遊離片の採取が禁じられており、このことが、木質文化財の調査の格差、ひいては知見の格差を生んできている。中でも木彫像における樹種や年代調査は、特に困難な分野となっている。そのような背景を鑑み、オンサイトかつ非破壊で樹種識別ならびに年代調査が可能となる、新規手法の確立を目的とした。そのために、ポータブル型FTーNIRによる現場でのオンサイト調査を可能とするべく、まずは卓上型FTーNIRによる検討を行ってきた。研究代表者が所属する京都大学生存圏研究所材鑑調査室所蔵の有用樹種標本を活用し、FTーNIRによる樹種・年代解析を行うべく、現生材ならびに歴史的古材のFTーNIRスペクトルデータの蓄積を行ってきた。特に、古代の木彫像に使用されていることが多かったカヤやヒノキ、スギ、アスナロといった針葉樹をはじめとして、クスノキ・ケヤキ・ハリギリといった広葉樹、ならびに建造物にも使用されるアカマツ・クロマツについてもデータの蓄積を行ってきた。その結果これまでに現生材では計10種におけるFTーNIRスペクトルの判別分析により、樹種ごとの分類が可能となった。一方、アカマツ・クロマツについては、現生材については検量線の獲得も成功し、方法論・解析法の深化も可能となったものの、その検量線を歴史的古材には適用できない、すなわち古材の識別には適用できないことも判明したことから、樹種それぞれについての、経年変化によるFTーNIRスペクトルの挙動変化と原因追究を重点的に行っているところである。木質文化財は、そのものが持つ歴史的背景の解明ならびに保存管理のためにも、その樹種調査に重きが置かれている。しかし、有機物である木質文化財では、調査のための遊離辺の採取などは固く禁止されており、そのことが情報の解明の障壁となってきている。また、文化財の調査ではオンサイトでの調査の必要性が増しており、新規手法の確立が必須となっている。そこで、ポータブル型FTーNIRによる樹種調査法を検討してきた。研究代表者が所属する京都大学生存圏研究所材鑑調査室の木材標本を活用し、FTーNIRによる樹種ならびに年代解明を行うべく、木彫像や建造物に多く使用されてきた針葉樹・広葉樹のスペクトルデータの蓄積をおこなった。その結果、これまでに約10種の現生材については、FTーNIRスペクトルの判別分析により樹種ごとの分類が可能とできた。特にアカマツ・クロマツについては、本年度論文にまとめたとおり現生材では樹種分類が可能であったが、検量線を古材に適応しても樹種分類が不可能であったことから、経年劣化によるFTーNIRデータの挙動解明と追求に力を入れているところである。木彫像、建造物をはじめとした木質文化財の樹種調査では、国の重要文化財に指定されているものも多く、識別に必要な木片の採取が禁じられている場合が多い。このことが、木質文化財に使用されている樹種の体系的な調査の障壁となってきた。このような背景を鑑みて、オンサイトかつ非破壊手法である樹種識別法ならびに年代調査法の新たな確立を目指してきた。そのために、ポータブル型FTーNIRの適用を導入するため、まずは卓上型FTーNIR装置による検討を行った。研究代表者が所属する京大生存圏研究所材鑑調査室に保存されている標準試料ならびに歴史的古材標本を活用し、針葉樹・広葉樹約10種において、NIRスペクトルデータの蓄積ならびにスペクトルの二次微分、検量線構築といった処理を加えて判別分析を行ってきた。その結果、現生材についてはヒノキ・カヤ・ニヨウマツ類・スギ・モミ・ケヤキ・ハリギリ・クリ・クスノキといった様々な樹種について、例えばヒノキとカヤ、ケヤキとハリギリなど、材質が類似した樹種の判別が可能であることをつきとめた。一方で、歴史的古材については、特にニヨウマツ類として一括りにされることの多いアカマツとクロマツ2者の判別が困難であることが判明した。現生材のアカマツとクロマツは分類が可能であることから、古材では経年劣化による吸着水の変動などが識別にマイナスに働いていることが推察された。しかしながら、波長領域を狭めた判別分析などを検討するなど、方法論や解析法の深化につとめ、現在も継続して、古材の識別調査への適用をすすめている。なお、年代推定のためのスペクトルデータの活用は、基礎的データを蓄積している段階である。

本研究では非破壊かつオンサイトでの樹種識別を可能とする手法の開拓として、近年様々な分野で活用されている近赤外分光法(FTーNIR)を活用した樹種識別について、手法の基礎的研究を行った。その結果、現生のニヨウマツ類(アカマツとクロマツ)では心材部分を用いることで識別が可能であった一方、歴史的古材のアカマツとクロマツではでは判別不可という結果がでるなど、課題も見つかった。その原因解明のためにも継続した研究の必要性が見出された。材鑑調査室の木材標本のNIRデータの蓄積については順調に進んでいる。木彫像に使用されることの多い樹種についても、判別分析が成功している。またアカマツ・クロマツといったニヨウマツ類の樹種調査については、共同研究者との論文をだすことができた。文化財科学徐々にNIRスペクトルによる判別分析が進んでいることから、ポータブル型NIR装置によるデータ蓄積をすすめていく。また未だに検量線モデルが確立できていない古材についての、経年変化の挙動をより解明していく。それにより、オンサイトでのポータブル型NIR装置の活用を予定している。材鑑調査室に保存されている標準試料および歴史的古材のNIRデータの獲得・蓄積については、順調に進んでおり、特にヒノキ・カヤ・アスナロなどをはじめとした木彫像に使用されることの多い樹種については、判別分析に成功している。ニヨウマツ類における樹種識別については共同研究者との論文もほぼ投稿できる段階にまできている。本年度、産休・育休に入ったため、研究が中断したため。現在、現生材についてはある程度NIRスペクトルを用いた判別分析が進んできたことから、ポータブル型NIRの導入を進める。一方、未だ検量線モデルが確立できていない歴史的古材については、経年変化に応じたスペクトル変化の要因を突き止めることで、NIRによる識別を検討する。その進展に合わせて、実際の博物館といったオンサイトでのポータブル型NIR装置の活用を進める予定である。次年度、育児休暇より復帰し次第、ポータブル型NIR装置の導入などを行う予定である。初年度は、ポータブル型NIRによる樹種識別に向けて、従来より研究室に設置してあった卓上型NIR装置を用いた、標準試料の基礎的データの獲得と蓄積、ならびに解析が主な研究内容となったことから、当初予定していた予算よりも低い金額での業務の遂行が可能となった。次年度以降は、初年度に獲得した基礎的データを活用して、あたらに導入する予定のポータブル型NIR装置を用いた樹種識別がメインとなってくる他、歴史的古材における基礎的データの蓄積に向けた実地調査やサンプリング、ならびに試料精製の補助を手伝ってもらうための人件費などに予算をあてることで、飛躍的な研究を進めていきたいと考えている。ポータブル型NIR装置での古材の樹種調査を可能とした上で、これまでに協力体制を築いてきている各地の博物館へ出向き、オンサイト調査を順次進めていく予定である。
高圧下において部分溶融が及ぼす岩石レオロジーへの影響

マントル全域の超高圧力を再現でき、大歪変形実験(ねじり試験)を可能とする変形試験機の必要性とその重要度を鑑み、当初の予定とは異なるがダイヤモンドアンビルセルを改良した回転式ダイヤモンドアンビルセル(回転式DAC)の開発にエフォートを割いた。昨年度に予定していた通り、回転式ダイヤモンドアンビルセルでの変形実験中に応力測定を行えるようにSPring-8での開発、そして高温実験を可能にするために回転式DAC専用の真空チャンバー(+外熱式ヒーター)の導入を行った。これにより変形実験中にXRDによる応力測定と、1000 Kまでの高温実験が可能となった。これによって、変形実験装置に必要な高圧、高温、歪(歪速度)の測定と制御、応力測定の要素が全て揃ったことになり、改良は必要なものの、変形実験装置として完成したと言える。この回転式DACを用いて、ブリッジマナイトとフェロペリクレースの2相系の変形実験を行なった。実験条件として室温、圧力=26-85 GPaである。歪については試料が円柱型のねじり試験であるため、幅があるが最大で歪10ほどまでの解析を行なった。各条件における微細組織の観察を行なったところ、弱相であるフェロペリクレースの連結度は歪の大きさに比例する傾向が見出された。これはブリッジマナイトと比較し、フェロペリクレース(30vol%)が十分に弱く、全体の系の力学特性を支配する可能性を示唆している。SPring-8(BL47XU)においてX線その場観察によって取得された変形実験中のブリッジマナイトとフェロペリクレースの応力データについても、先行研究(e.g., Girard et al., 2016)と同様にブリッジマナイトが優位に強度が大きいことを示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。部分溶融実験部分溶融が変形に及ぼす影響を調べるため、まずD-DIAで静水圧における部分溶融実験を行った。これはどのようなサンプルを用いれば部分溶融度がどれくらいになるか、そして部分溶融したサンプルの変形実験に適したセルを考察するためである。サンプルにはサンカルロスオリビンと玄武岩(JB1)を7wt%混合したパウダーを用いた。実験条件は1200ー1300度, 3ー4 GPa, 3時間keepした。回収した試料らをFE-SEMによって観察したところ、全ての実験試料においてオリビンの粒界にメルトポケットが確認された。溶融した部分をトレース、解析すると、メルトフラクションは4.5 %だった。非常に高圧のため幾つかメルトが連結している箇所も確認された。これはYoshino et al. (2007)で報告されているメルトの濡れ角が圧力に依存するという性質と調和的である。回転ダイヤモンドアンビルセルダイヤモンドアンビルセルを改良することで、超高圧(100 GPa以上)において大歪の変形実験を可能とする回転ダイヤモンドアンビルセル(rDAC)の開発に着手した。rDACでは従来のダイヤモンドアンビルと同じ方法で加圧し、それに加え上部アンビルは独立して回転するようになっている。これによってサンプルには無限に歪(ねじり変形)を加えることができる。歪速度に関しては新しく開発したギアボックス(製作PRETECH)によってコントロールできる。実現できる歪速度は10^-6ー10^-3 (s^-1)である。rDACを用いた変形実験はSPring-8において行われ、X線ラミノグラフィーによって変形するサンプルのその場観察が可能である。すでに137 GPaでの超高圧大歪変形実験を成功させた。以上の開発についてはすでにまとめられ論文に出版されている(Nomura, Azuma et al., 2017)。当初の予定とは異なるが、超高圧での大歪み変形実験が行える試験機の必要性を感じ、回転ダイヤモンドアンビルセルの開発に着手した。これによって、これまで技術的に不可能であった超高圧100GPa以上での大歪変形実験を成功させたことについては一定の評価が出来ると考える。本開発では既存のダイヤモンドアンビルセルを改良することで、サンプルにねじり変形を加えられる機構を備えつけた。そして歪速度においては新しく開発したギアボックス(制作PRETECH)によってコントロールできるようにした。このように既存の変形実験装置ではなく、装置自体を開発するという積極的な取り組みができたことに関して、当初の研究計画よりも価値ある1年目になったと言える。部分溶融した鉱物の変形実験に関しては、ルーチンで変形実験を行える目処が立ちつつある。実験中の部分溶融度や、微細組織(ぬれ角等)に関してもほぼ当初予定していたものが実現できている。開発していた回転式ダイヤモンドアンビルセル(DAC)のダイヤモンドアンビルとサンプルの間でスリップが起きていることが明らかになった。これを解決すべくダイヤモンドアンビル先端の形の最適化を行った。その結果、スリップは改善され、ギアボックスの回転速度から算出されるサンプルの歪速度と実際に観測される歪速度との差を非常に小さいものにすることができた(Azuma et al., 2018)。回転DACを用いて、下部マントル物質のブリッジマナイトとフェロペリクレースの2相系で高圧条件(30-120 GPa)における変形実験を行った。回収された試料の微細組織をFE-SEMによって観察を行ったところ、どの圧力条件下でもブリッジマナイトに比べフェロペリクレースが大きく変形し、連結している微細組織が観察された。

一方でブリッジマナイト粒子の楕円体フィッティングを行ったところ、その形状は出発物質とあまり変わらず、フェロペリクレースが全体の変形を支配していることが示唆された。当初の予定であったD-DIAを用いた変形実験のための斜めせん断変形と縦せん断変形実験のセル開発を行い、実際に部分溶融実験(3-4 GPa, 1100-1250°C)に用いた。しかし、縦せん断については安定した変形実験を長時間行うことが難しく、方向転換を余儀なくされている。斜めせん断セルについては、安定して変形実験を行えるセルに改良することができたので、今後は縦せん断変形ではなく斜めせん断による変形実験に注力し行う。1年度目に報告していた実験中に鉄が析出する問題については銀パラジウム合金のカプセルを用いることで解決することができた。実験後回収された試料の微細組織については1200°C、4GPa、メルトフラクション4%においてもメルトの連結(濡れ角=0°)が局所的とはいえ確認された。新しい高圧変形試験機(回転式ダイヤモンドアンビルセル)の開発という挑戦的な研究への取り組みについては、順調に進んでおり、すでにSPring-8において実際の高圧鉱物を用いた変形実験を数多く行うことができた。実験結果についても、これまでにない下部マントル物質の変形微細組織(フェロペリクレースの連結)が観察することができ、興味深い結果が出始めている。温度コントロールについても、試験機専用の高温チャンバーの設計や導入に向けての打ち合わせが進んでおり、年内(採用第3年度目)には回転式ダイヤモンドアンビルセルを用いた高温での変形実験を予定している。今後下部マントルレオロジーを明らかにするために、役立っていくことが期待される研究開発である。部分溶融の変形実験についてはあまり上手く進んでいない。特に当初予定していた変形実験セルにおいて、大歪を実現するための縦せん断セルでの変形実験についてセル開発を続けていたが、方向転換をする必要があり、従来の変形実験で用いられてきた斜めせん断変形実験を行うことになるだろう。3年目ではSPring-8でのAEを導入した斜めせん断変形実験を行い、本来の予定であるメルトを含む岩石変形とせん断不安定をAE測定によって考察を行う。マントル全域の超高圧力を再現でき、大歪変形実験(ねじり試験)を可能とする変形試験機の必要性とその重要度を鑑み、当初の予定とは異なるがダイヤモンドアンビルセルを改良した回転式ダイヤモンドアンビルセル(回転式DAC)の開発にエフォートを割いた。昨年度に予定していた通り、回転式ダイヤモンドアンビルセルでの変形実験中に応力測定を行えるようにSPring-8での開発、そして高温実験を可能にするために回転式DAC専用の真空チャンバー(+外熱式ヒーター)の導入を行った。これにより変形実験中にXRDによる応力測定と、1000 Kまでの高温実験が可能となった。これによって、変形実験装置に必要な高圧、高温、歪(歪速度)の測定と制御、応力測定の要素が全て揃ったことになり、改良は必要なものの、変形実験装置として完成したと言える。この回転式DACを用いて、ブリッジマナイトとフェロペリクレースの2相系の変形実験を行なった。
過誤支配防止を目的とした組織工学的末梢神経再生の研究

末梢神経では神経線維の再生もさることながら、過誤支配をいかに抑制することができるかが、機能的回復にとって重要な問題である。神経の機能的再生率をさらに向上させる必要があることから、人工神経チューブ内に封入する足場と再生促進物質としての単核球の役割を研究した。当初期待したゼラチンスポンジは足場素材として不適であることが判明した。また、神経再生の初期過程でのワーラー変性に着目し、これを促進させることが成長円錐、軸索の伸長に有効であり、その主役を演ずるマクロファージを供給する末梢血単核球の移植を行うことが機能的再生に有効であると思われたが、単核球を移植しないモデルとの成績の差はなかった。末梢神経のうち顔面神経や反回神経は、過誤支配をいかに抑制することができるかが、機能的回復にとって重要な問題である。本年度は人工神経チューブの足場素材の作製・検討と各人工神経を用い反回神経再生の比較検討を施行した。1.人工神経チューブの足場素材の検討改良型PGA(ポリグリコール酸)チューブの作製:従来のPGAチューブは、チューブ内腔にコラーゲンスポンジを封入したものであるが、コラーゲンは神経組織再生に対し、足場を提供するが軸索の伸長方向に制限を加える可能性がある。軸索の伸長方向で自由度の高い足場となると予想されるゼラチンスポンジを封入した改良型PGAチューブを作製し、神経の機能的再生の比較をした。内腔にゼラチンスポンジ(ゼルフォーム/スポンゼル)を充填したものを2種類作製した。スポンゼルの方がゼルフォームより構造上、密度が高く規則性が高かった。2.反回神経の機能的再生の検討:ビーグル犬(計n=12、各群n=3)を用い、輪状軟骨下端から1cm下方で反回神経を1cm切除し、この部分を従来型、改良型PGAチューブZ/S(Z:ゼルフォーム充填/S:スポンゼル充填)、自家神経移植(切除した反回神経を再移植)で再建した。機能的再生の検討は、ファイバーで声帯の動きの回復を経時的に観察、最終評価は反回神経再建後半年目に施行。3.結果は、改良型PGAチューブZとSではあまり差が無いが、従来型と比較してわずかに良い結果であった。自家神経移植は全例再生を認めなかった。最終評価まで至っていない症例が3例あり、今後の検討を要するものである。末梢神経のうち顔面神経や反回神経は、一つの神経の中に異なる筋や拮抗作用を示す筋を支配する神経線維が含まれている。このため神経再生が進んでも過誤支配が発症しやすく、顔面神経では病的共同運動を、反回神経では声帯麻痺が生じることになる。したがって、末梢神経では神経線維の再生もさることながら、過誤支配をいかに抑制することができるかが、機能的回復にとって重要な問題である。これまでにわれわれは、PGAチューブを開発し、イヌを用いた動物実験で反回神経の再生に取り組み、約1cmの機能的再生(世界初)に成功している。Kanemaru S,2003神経が傷害されたあと、その支配器官(筋)からは、一定の期間何らかの再生神経誘導因子が出されるものと思われる。その誘導に従って、軸索が伸長できれば過誤支配は防止できる可能性がある。したがって、過誤支配防止のためには、再生神経誘導因子が分泌されているうちに、いち早く軸索の再生を完了させる必要がある。そのためには適切な再生の条件を整え、できる限り再生を促進させることが、重要であると考えられる。本年度の研究では、神経再生過程を促進させ過誤支配を抑制させるために、人工神経チューブの足場素材の検討として、ゼラチンスポンジの有用性を検討した。しかし予想に反しゼラチンスポンジを封入したシリコンチューブでの神経再生では、最終的に何も封入しないチューブ単独の方が組織学的に良好であるという結果が出た。すなはち、ゼラチンスポンジは、神経再生の足場としては不適切な可能性があり、本研究全体の見直しを迫られることとなった。これまでにわれわれは、PGAチューブを開発し、イヌを用いた動物実験で反回神経の再生に取り組み、約1cmの機能的再生に成功している。神経が傷害されたあと、その支配器官(筋)からは、一定の期間何らかの再生神経誘導因子が出されるものと思われる。本年度の研究では、ゼラチンスポンジに単核球を入れたシリコンチューブを用いて、神経再生実験を施行してみたが、やはり前年度の研究結果同様、ゼラチンスポンジは神経再生の足場として不適切な素材であるという可能性高いという結果に至った。ゼラチンスポンジは、神経再生の足場として不適切であるとの研究結果から、研究全体の見直しを迫られることになったため。

末梢神経のうち顔面神経や反回神経は、一つの神経の中に異なる筋や拮抗作用を示す筋を支配する神経線維が含まれている。このため神経再生が進んでも過誤支配が発症しやすく、顔面神経では病的共同運動を、反回神経では声帯麻痺が生じることになる。したがって、末梢神経では神経線維の再生もさることながら、過誤支配をいかに抑制することができるかが、機能的回復にとって重要な問題である。これに対して、われわれが開発した動物実験で、人工神経(コラーゲン封入型のPGAチューブ)での神経再生がある程度有効であることを報告してきた。しかし、その機能的再生率を上げるためには、神経再生の促進因子としてより良い足場と成長因子などが必要と考え、足場としてゼラチンスポンジ、促進物質としての単核球投与を実験の柱として、ラットの腓骨神経の再生実験を行った。しかし、少なくともゼラチンスポンジはコラーゲンよりも神経再生の足場としては適していないことが判明し、研究全体の見直しを行った。そこで、再びコラーゲン封入型のPGAチューブを用いてそれに単核球の封入を行い、イヌ反回神経の再生を試みた。しかし、これまで施行してきた単核球を封入しない場合との成績比較でそれを上回る好成績を上げることができなかった。本実験は4頭のイヌしか用いていないためにデータのばらつきが生じた可能性もあるため、本研究助成期間は終了したが、引き続き実験を行っていく予定である。末梢神経では神経線維の再生もさることながら、過誤支配をいかに抑制することができるかが、機能的回復にとって重要な問題である。神経の機能的再生率をさらに向上させる必要があることから、人工神経チューブ内に封入する足場と再生促進物質としての単核球の役割を研究した。当初期待したゼラチンスポンジは足場素材として不適であることが判明した。また、神経再生の初期過程でのワーラー変性に着目し、これを促進させることが成長円錐、軸索の伸長に有効であり、その主役を演ずるマクロファージを供給する末梢血単核球の移植を行うことが機能的再生に有効であると思われたが、単核球を移植しないモデルとの成績の差はなかった。ゼラチンスポンジは、神経再生の足場としては不適切な可能性があり、本研究全体の見直しを迫られることとなったため。1.ゼラチンスポンジに替えコラーゲンを封入したPGAチューブを用い、これに障害神経変性の初期過程で重要な役割を果たすと考えられる、単核球の移植を行い、末梢神経再生を試みる。2.PGAチューブに単核球の移植に加え、成長因子(b-FGF、IGF)などの投与を行い、その効果を検討する。再生医療1.障害された末梢神経の初期再生過程であるワーラー変性をより効率的に推進させる目的でPGAチューブに単核球移植を行い神経再生効果を検討する。2.人工神経(PGAチューブ)に封入する調節因子として、IGF,b-FGFなど現在臨床応用可能な調節因子の効果の検討する。25年度内に改良版人工神経の作製ならびに、それらを用いた神経再生ならびに単核球移植による神経再生を行う予定であったが、改良版人工神経に充填するゼラチンの種類を2種類用い、その違いや神経再生の比較検討を行ったため、単核球移植による神経再生が出来なかった。当初予想した研究計画の見直しが必要となったため新たな実験計画にしたがい、実験に必要な薬剤・機器などの購入に充てる予定である25年度の研究でもっと神経再生足場として良好と思われる人工神経を用いて以下の実験を行う。
往診型居室内地震危険度ゾーニング評価システムの開発

地震時の室内散乱に起因する死傷者低減を目的として、事前に居室内の地震時危険性を評価し、安全な暮らしを提案するシステムを構築することを本研究の目的に、3年間研究を継続してきた。上記の目的を達成するために、以下の3点をサブテーマとして掲げた。1.居住室内における人的被害発生のプロセスのモデル化2.上記モデルの具体的防災・減災対策への応用法の検討3.往診型危険度評価システムの提案初年度においては上記サブテーマ1を主体に、室内散乱発生プロセスとその評価方法について提案した。次年度はサブテーマ2の観点から、散乱状況下における人間の災害回避能力について研究を進めた。最終年度はサブテーマ2をさらに掘り下げ、室内での安全性を、揺れている最中の危険度とその後の避難・対応に際しての危険度の2面から評価し、いわば室内の地震時における時系列展開において総合的に評価する方法に発展させ、それを多くの事例を用いて方法論の検証を試み、さらに、平時の住まい方と安全性との調和性について考察を行った。すなわち、室内の防災を実際の暮らしという側面から見直す方法論を展開した。往診型システムとしての条件を1)現場密着型診断ができること、2)住人の個性(住まい方、ライフスタイル)を取り込んだ評価ができること、3)住人が必要とする情報をわかりやすい形で提供できること、を目標にシステムを実現した。本研究は、地震時の室内散乱に起因する人的被害の軽減を目的として、その危険性を事前に評価するためのシステム開発を目的としたものである。その達成のために以下の3点をサブテーマとして掲げている。1.居住室内における人的被害発生のプロセスのモデル化2.上記モデルの具体的防災・減災対策への応用法の検討3.往診型危険度評価システムの提案本年度はその初年度に当たり、主として上記1の地震時の室内散乱実態表現モデルの構築を以下の手順に則り行った。1.地震時の居室内での心的被害例の収集1993年釧路沖地震、1993年北海道南西沖地震、1994年北海道東方沖地震について聞き取りおよびアンケートにより、居室内での家具等の散乱実態および人間行動軌跡を平面プラン上にかつ時系列的に収集した。2.人的被害発生連関モデル構築のための整理上記の試料を基に、居住空間広さ・部屋別用途・室内家具配置等の環境要因が人的被害発生危険性にいかに関与するかの要因分析を行った。次年度は今年度の成果を発展的に進めるほか、上記2のサブテーマが主研究テーマとなる。そのための手順として、1.モデルによる危険度評価法の定式化2.評価結果の可視表示化さらに、サブテーマ3を実行するための準備として、往診型室内危険度評価システムの仕様の検討おも開始する予定にある。地震時におけるわが国の顕著な特徴として、家屋が無傷でも室内が散乱することに起因する死傷者が極めて多いことがあげられる。これの軽減を目的として、居室内の地震時危険性を評価するシステムを構築することが本研究の目的である。本研究は平成6年度を初年度に3カ年の研究期間を設定しており、本年度は2年目にあたる。3カ年間に上記の目的を達成するために、以下の3点をサブテーマとして掲げている。1.居住室内における人的被害発生のプロセスのモデル化2.上記モデルの具体的防災・減災対策(わが家の居住室環境改善法)への応用法の検討3.往診型危険度評価システムの提案初年度(平成6年度)は上記目的のサブテーマ1「居住室内における人的被害発生のプロセスのモデル化」を中心に、主に室内散乱発生プロセスを追った。本年度はこれを発展的に進め、主として散乱状況下における人間の災害回避能力について研究を進めた。成果は日本建築学会構造系論文報告集に発表した。この成果は、上記サブテーマ2「モデルの防災・減災対策への応用」に直接的に関与する。すなわち、地震時の危険空間が初年度のモデルにより、回避空間が本年度のモデルにより具体的に示すことができ、両者のオーバーラップにより室内安全空間構成法が示されたことになる。さらに、最終年度に予定されている現場的に簡易に室内危険度が評価できるシステム構築に向け、関連アプリケーションの整備を行った。

地震時の室内散乱に起因する死傷者低減を目的として、事前に居室内の地震時危険性を評価し、安全な暮らしを提案するシステムを構築することを本研究の目的に、3年間研究を継続してきた。上記の目的を達成するために、以下の3点をサブテーマとして揚げた。1.居住室内における人的被害発生のプロセスのモデル化2.上記モデルの具体的防災・減災対策への応用法の検討3.往診時危険度評価システムの提案初年度においては上記サブテーマ1を主体に、室内散乱発生プロセスとその評価方法について提案した。次年度はサブテーマ2の観点から、散乱状況下における人間の災害回避能力について研究を進めた。最終年度はサブテーマ2をさらに掘り下げ、室内での安全性を、揺れている最中の危険度とその後の避難・対応に際しての危険度の2面から評価し、いわば室内に地震時における時系列展開において総合的に評価する方法に発展させ、それを多くの事例を用いて方法論の検証を試み、さらに、平時の住まい方と安全性との調和性について考案を行った。すなわち、室内の防災を実際の暮らしという側面から見直す方法論を展開した。往診型システムとしての条件を1)現場密着型診断ができること、2)住人の個性(住まい方、ライフスタイル)を取り込んだ評価ができること、3)住人が必要とする情報をわかりやすい形で提供できること、を目標にシステム実現に努力した。データ入力方法にまだ若干の改善の余地を残すものの、2)3)の条件はほぼ当初の目標を達成していると評価できる。
組換えRTXトキシンを用いた次世代細菌感染症ワクチンの基礎研究

1.組換えRTXタンパク質(rApx)の大腸菌での発現系の確立と精製方法の検討(1)発現に用いるプロモーターの検討種々のプロモーターを用いてrApxタンパク質を大腸菌K-12株内で発現させた結果、本遺伝子は、lacのプロモーターにより最も高度に発現することが明らかになった。(2)rApxの精製方法の検討rApxを発現した大腸菌内では、本タンパク質は細胞質内に封入体として存在した。そこで、この封入体を回収し、可溶化することによって、高純度のrApxタンパク質を得ることができた。2.実験小動物でのrApxの免疫原性(1)免疫賦活剤(アジュバント)の検討モルモットを用い、rApx免疫時のアジュバントについて、抗体応答を指標に検討した。その結果、無水マンニトールオレイン酸エステルを主成分としたオイルアジュバントがrApxの免疫に適していることが明らかになった。(2)モルモットでのrApxに対する抗体応答rApxを上記アジュバントと混合後、モルモット筋肉内に注射した。その抗体応答をドット・ブロット法により調べた結果、注射後4週目をピークとした抗体上昇が認められた。さらに、この血清は本タンパク質の生物活性である溶血性を阻止した。(3)マウスでの感染防御試験rApxタンパク質25μgをマウス腹腔内に免疫し、2週後にActinobacilluspleuropneumoniae血清型1の菌株で攻撃した。その結果、免疫群はすべて生残したのに対して、緩衝液をだけ免役した対照群はすべて死亡した。このことから、rApxタンパク質による免疫はマウスに対して高度な感染防御能を付与しうることが明らかになった。3.まとめ本研究によって、rApxを大腸菌中に効率よく発現しうる系が確立できた。また、実験小動物を用いた試験により本抗体が高い免疫原性を有することがあきらかになり、本菌感染症における組換えコンポーネントワクチン実用化の可能性が示された。
胃癌術後の予後を規定する因子の解析：術後炎症反応とMDSCを標的とした癌免疫療法

【術後M-MDSCと臨床病理学的因子との関連性】根治手術が可能であった胃癌患者から、術前、POD1、POD3、POD7と血液を採取し、CD15+細胞・CD14+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞およびM-MDSC(CD14+、CD33+、CD11b+、HLA-DR-)をフローサイトメトリーで解析した。術前血液を採取した75症例の解析では、術前の%M-MDSCは、pStageが高いほど有意に高かった。また同時に腫瘍組織内免疫細胞が抽出可能であった21症例の解析では、末梢血中の%M-MDSCは腫瘍組織内のTAM頻度と相関することが分かった。経時的に血液採取可能であった32症例の検討では、M-MDSCは術後急性期に著明に増加する一方で、制御性T細胞(Treg)に関しては、術後急性期において大きな変化は認めなかった。この結果は、術後急性期においてMDSCを評価することが重要であることを示唆する。術後に増加する単球と術後に増加するM-MDSCは強い相関関係があり、術後に増加した単球は、M-MDSCである可能性があった。当院で根治切除を行った胃癌278例(後ろ向き解析)では、術後に増加した単球数が多いほど予後不良であった。多変量解析においても、独立した予後規定因子であった。【術後M-MDSCの最も抑制機能を持った分画の同定】術後急性期に増加するM-MDSCをソーティングし、CD8+陽性細胞と共培養すること、IFNγの分泌能が低下することを確認した。またM-MDSCにおいて、アルギネース・IDOが有意に高発現していた。以上の結果から、術後急性期に増加するM-MDSCは抑制機能を有し、予後に影響を与える可能性があり、治療標的となりうると考えられた。しかし、細分画化するマーカの同定(治療標的分子)、既報のM-MDSCを対象とした薬剤検討までは行えていない。【術前・術後のPBMC・TILの分離、当日測定および凍結保存】【術後M-MDSCと臨床病理学的因子との相関解析】根治手術が可能であった胃癌患者より、術前、POD1、POD3、POD7と血液を採取し、骨髄系細胞(CD15+細胞・CD14+細胞)、リンパ球(CD4+細胞、CD8+細胞)およびM-MDSC(CD14+、CD33+、CD11b+、HLA-DR-)をフローサイトメトリーで解析した。1術前血液を採取した75症例の解析では、術前の%M-MDSC(M-MDSCのCD14+細胞に占める割合)は、pStageが高いほど有意に多かった。また同時に腫瘍組織内免疫細胞が抽出可能であった21症例の解析では、末梢血中の%M-MDSCは腫瘍組織内の腫瘍関連マクロファージ(TAM)の頻度と相関することが分かった。2経時的に血液採取可能であった32症例の検討では、%M-MDSCは術後急性期に著明に増加し、その増加割合はpStageや手術侵襲との関連性を認めた。一方で、リンパ球上の免疫関連分子やMDSCと同じく抑制性免疫細胞の一つである制御性T細胞(Treg)に関しては、術後急性期において大きな変化は認めなかった。この結果は、術後急性期においては骨髄系の抑制性免疫細胞であるMDSCを評価することが重要であることが示唆された。今後、症例を集積するとともに、予後との関連性および治療介入可能なMDSC増加に関わる因子の検討を行っていく。【術後M-MDSCの最も抑制機能を持った分画の同定】術後急性期に増加するM-MDSCをソーティングし、CD8陽性細胞(CFSEラベル下)と共培養することでM-MDSCの抑制機能を確認した。今後、保存PBMCを用いて細分画化するマーカの同定に着手する。【保存PBMC・血清を用いた治療標的の検索】同時測定が望ましいと考え、サンプル回収が終了した後に着手する予定としている。症例集積は順調に進んでおり、MDSCと臨床病歴学的因子・腫瘍組織内免疫細胞との関連性に関しては、検討を行った。MDSCの抑制機能評価もCD8陽性細胞(CFSEラベル下)を用いた系で行っている。今後、MDSCの術後増加に関わる治療介入可能な臨床因子を探索する必要があるが、現在のペースで症例集積が進めば、検討可能と考える。平成29年度に行う予定であった保存PBMCおよび血清の網羅的に解析に関しては、まだ行っていない。しかし、解析するためのサンプルは保存されており、いつでも解析可能な状況である。薬剤介入による影響は、現時点では症例数が少ないため、検討困難な状況である。こちらに関しては、症例集積に努めていく。また同時に腫瘍組織内免疫細胞が抽出可能であった21症例の解析では、末梢血中の%M-

MDSCは腫瘍組織内のTAM頻度と相関することが分かった。経時的に血液採取可能であった32症例の検討では、M-MDSCは術後急性期に著明に増加する一方で、制御性T細胞(Treg)に関しては、術後急性期において大きな変化は認めなかった。この結果は、術後急性期においてMDSCを評価することが重要であることを示唆する。術後に増加する単球と術後に増加するM-MDSCは強い相関関係があり、術後に増加した単球は、M-MDSCである可能性があった。当院で根治切除を行った胃癌278例(後ろ向き解析)では、術後に増加した単球数が多いほど予後不良であった。多変量解析においても、独立した予後規定因子であった。【術後M-MDSCの最も抑制機能を持った分画の同定】術後急性期に増加するM-MDSCをソーティングし、CD8+陽性細胞と共培養すること、IFNγの分泌能が低下することを確認した。またM-MDSCにおいて、アルギネース・IDOが有意に高発現していた。以上の結果から、術後急性期に増加するM-MDSCは抑制機能を有し、予後に影響を与える可能性があり、治療標的となりうると考えられた。しかし、細分画化するマーカの同定(治療標的分子)、既報のM-MDSCを対象とした薬剤検討までは行えていない。当初平成29年度に行う予定であった保存PBMCおよび血清の網羅的解析を、今後行っていき、治療標的を探索していく。臨床病理学的因子との関連性を更に解析し、治療介入を検討する。また薬剤投与によるMDSCへの影響に関しても、薬剤投与症例を漏らさず集積することで、解析可能症例数を目指していく。本年度の研究に必要な物品は購入している。次年度使用額および翌年度分の請求額に関しては、併せて保存している免疫細胞および血清の網羅的解析、サンプル(血液および腫瘍組織)の処理、免疫細胞の抑制機能assayに用い、いづれも消耗品にあてる予定としている。
塵肺症及び粉塵暴露と肺癌の多発に関する研究

近年、岡山県の東南部、東備地域では、肺癌の過剰死亡が報告されている(昭和61年から平成2年までの5年間の市町村別標準化死亡比で、備前市・1.22、日生町・1.80)。そこで岡山県保健福祉部、厚生省統計情報部、岡山県東備保健所の協力を得て、この地域(備前市・日生町・佐伯町・和気町・吉永町)の死亡小票を調査し、肺癌発生に及ぼすじん肺症の影響の程度の推定を症例対照研究の手法で試みた。死亡小票は上記5市町の昭和63年から平成5年までのものを利用した。症例対照研究は、肺癌死亡症例を症例群とし、対照群に胃癌とその他の癌による死亡症例を選んだ。暴露の指標はじん肺所見の記載を採用した。分析対象は、40才以上の男性に限った。死亡時の年齢で層別し、各々の層をマンテル・ヘンツェル法で統合し、調製オッズ比を求めた。胃癌を対照疾患としたときの年齢調整オッズ比は1.41(95%信頼区間0.57-3.52)、胃癌と肺癌以外の癌を対照疾患としたときには2.22(同1.63-4.65)、肺癌以外の全癌を対照疾患としたときには1.97(同0.99-3.89)であった。いずれも、じん肺患者における肺癌の過剰死亡を示唆し、これまでの日本でのコホート研究の結果に一致している。しかし、今回は暴露の指標を、死亡小票のじん肺所見の記載に頼っているため、Nondifferential misclassificationなどのバイアスが考えられ、今後より良い推定値を得るためにさらに研究が必要であると考える。また、今回は年齢以外の交絡要因の情報、例えば喫煙歴に関する情報などは得られていないので、この点に関しても、今後更に検討が必要である。
Ｄｅｎｓａｎｉｎ　ＡおよびＢの合成研究

昨年度の研究活動で含窒素大員環を含む二環式化合物(1)を合成したことを報告したが、その合成前駆体である化合物の合成には再現性の低さやその工程数に問題を抱えていた。またその後の化合物(1)からMannich反応によるピロリジン環構築では保護基として用いていたMOM基の脱保護が進行することが明らかになった。さらに生じた水酸基はマンニッヒ反応系中にて生じる活性中間体であるアシルイミニウムカチオンと反応し、N,O-アセタールを与える。このことからMOM基の除去によって所望の環化反応の進行が阻害されている可能性があった。そこで短工程化の検討を行いつつ、MOM基より化学的に安定なベンジル基で水酸基を保護した化合物を合成した。これにより、再現性の確保および収率の改善にもつながった。そして得られた基質を用いて、Mannich反応によるピロリジン形成の検討を行った。その結果、種々の反応条件においてもベンジル基は脱保護されなかったが、所望の環化反応も一切進行しなかった。そこでアゾメチンイリドを用いた[3+2]-環化付加反応によるピロリジン環の構築を試みることにした。基質としては合成中間体であるシクロヘプテノンに対して適用した。その結果、所望のピロリジン環構築を達成した。今回得られた化合物はDensanin類の基本骨格をおおよそ構築できていることがわかる。本研究で得られた知見はDensanin類の全合成に大いに役立つことが期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。デンサニンAおよびBの主骨格の7員環と共通大員環の構築を行った。まずディールズアルダー反応によってシクロヘキセン(6員環構造)を簡便に構築したのち、シクロプロパン化反応(3員環構築)と加熱による3員環構造の開環によって、環を拡大し7員環構造を構築した。その後、脱ブロモ化反応と1,2-付加反応によって大員環の架橋鎖に相当する炭素鎖の導入をした。得られた化合物のTBSエーテル部位を一炭素増炭しつつノシルアミドへと変換した。続いてPCCを用いたアリルアルコールの酸化的転位反応によって不飽和ケトンを得た。次に酸素原子の保護基を除去し分子内光延反応を行うことで共通含窒素大員環を構築した。Ns基を安定なTs基へと変換し、ニトロメタンの1,4-付加反応による第四級炭素の構築を行った。この際、あらかじめ構築した大員環の架橋鎖が立体障害となることで、高立体選択的かつ高収率にて不斉第四級炭素の構築に成功した。その後、アセタール部位を含むカーバメートへと導き、加熱することでオキサゾロン環の構築に成功している。【現在および今後の検討】現在までにデンサニンAおよびBの構造の約70%構築に成功しており、ピロリジン環(B環)の構築を検討している。これはオキサゾロンを酸性条件にすることでアシルイミニウム塩が生成し、立体障害の少ないexo面からマンニッヒ反応が進行することで、ピロリジンが得られると想定している。最後にケトンのα位にカルボニル等価体を導入し、アミンからの環化と酸化反応によってピロール環を構築することで、共通鍵中間体を合成する予定である。ピロリジン環構築反応は研究計画通りに進行せず、迂回策を講じる必要があったが、研究は順調に進展している。ピロリジン環構築とピロール環構築が達成できれば、デンサニンAおよびBの世界初の合成が可能になるだろう。ピロリジン環構築も解決されつつあるので、今後は当初の計画通り研究を進めていく予定である。
肺癌の癌遺伝子ASH1およびCLCP1の機能解析

神経内分泌分化肺癌は小細胞癌や一部の大細胞癌からなる高悪性度肺癌であり,この細胞分化と癌悪性化との関連が注目されている。神経内分泌分化肺癌の生存と増殖が,神経内分泌分化の規定因子ASHIの構成的発現に依存性を示すことを報告した。更に,このASH1の機能解析を進めたところ,ASHIが神経内分泌分化を誘導すると共に,培養下での足場非依存性増殖の促進や,移植腫瘍での増殖促進・組織型の変化を誘導することが判明した。又,その分子機序として,ASHIがE-カドヘリンやWntシグナル抑制因子DKK1等の癌抑制遺伝子の発現を抑制し,βーカテニン経路の活性化を誘導することを見出した。実際の肺癌検体の遺伝子発現プロファイルの検討から,これらASH1で発現抑制される遺伝子群は,小細胞肺癌で高頻度に発現低下しており,実際の神経内分泌分化肺癌の発症に関与することが示唆された。このASHIによる遺伝子発現抑制の分子機序を検討したところ,転写抑制性の修飾であるピストンH3の脱アセチル化とK27メチル化がプロモーター領域に誘導されることが判明し,又,ASHlとHDAC分子との結合も確認され,ASH1がHDACを標的遺伝子領域にリクルートしヒストン脱アセチル化を誘導し,発現抑制していると考えられた。更にH3K27メチル化についてChIP-on-chip解析にて,網羅的に検討したところ,ASH1により発現抑制される遺伝子群ほぼ全てでH3K27メチル化修飾が誘導され,ASHIがH3K27メチル化を介して発現制御することが強く示唆された。又,ASHIの標的遺伝子群の中で,ASHIにより誘導される細胞間接着の低下を担う新規遺伝子を同定し,新たな癌抑制遺伝子候補と考え,更に詳細を解析中である。転移関連がん遺伝子CLCPlに関しても,細胞運動能を促進し,SEMA4Bにより制御されることを報告し,更に検討を進めている。神経内分泌分化肺癌は小細胞癌や一部の大細胞癌からなる高悪性度肺癌であり、この特殊な細胞分化と癌悪性化との関連が注目されている。我々はこのような肺癌の生存と増殖が、肺における神経内分泌分化の規定因子ASH1の構成的発現に依存性を示すことを報告した。その分子機序の解明を目指し、神経内分泌分化を有しない肺腺癌細胞株にASH1を導入したところ、浸潤転移に係わる足場非依存性が顕著となり、更に、マウス移植腫瘍では、肺腺癌から神経内分泌分化肺癌の組織型への顕著な変化が誘導され、腫瘍増殖も促進した。また、このような形質変化の分子機序として、ASH1が癌抑制遺伝子のE-カドヘリンやWntシグナル抑制因子DKK1の発現を抑制することを見出し、更にその発現制御の分子機序として、ASH1が特異なパターンの抑制性ピストン修飾を誘導することを明らかにした。今後このピストン修飾の分子機序を解明するとともに、ASH1による遺伝子発現制御により引き起こされるシグナル経路異常を明らかにし、神経内分泌分化肺癌の治療戦略へと繋げていく予定である。このASH1機能の研究は、細胞分化を規定する遺伝子の構成的発現に対する癌細胞の依存性という、新しいパラダイムへ発展することが期待できる。同時に新規転移関連遺伝子CLCP1の機能の解析も進めた。CLCP1を高発現している高転移1生肺癌細胞株で、CLCPIをノックダウンしたところ、細胞運動能の著明な低下が見られ、CLCP1が細胞運動能を促進することが判明した。又、ファージディスプレイ法を用い、CLCP1のリガンドとして癌関連遺伝子Semaphorin4B (SEMA4B)を同定した。CLCP1とSEMA4Bは、細胞表面で共局在し相互作用するが、その相互作用によりCLCP1のプロテアソーム依存性分解が誘導された。今後このCLCP1-SEMA4B相互作用の詳細と、リガンド依存性のCLCP1分解の制御機構を検討し、CLCP1の機能を調整する新規転移抑制治療へ発展させたい。

更にH3K27メチル化についてChIP-on-chip解析にて,網羅的に検討したところ,ASH1により発現抑制される遺伝子群ほぼ全てでH3K27メチル化修飾が誘導され,ASHIがH3K27メチル化を介して発現制御することが強く示唆された。又,ASHIの標的遺伝子群の中で,ASHIにより誘導される細胞間接着の低下を担う新規遺伝子を同定し,新たな癌抑制遺伝子候補と考え,更に詳細を解析中である。転移関連がん遺伝子CLCPlに関しても,細胞運動能を促進し,SEMA4Bにより制御されることを報告し,更に検討を進めている。
炎症後色素沈着の病態解明と新規治療法の開発：モデルマウスを使用した解析

患者のQOLを著しく低下させる露出部の炎症後色素沈着(PIH)について、我々は独自で開発したヒト型皮膚を持つ遺伝子改変マウス(hk14SCF Tg-HRMマウス)を使用して、PIHモデルマウスを作成し、その病態解析を集学的に行うとともに、病態に基づいた新規治療法の開発とこれまでの既存の治療法についてその有効性を検証する。
内軟骨性骨化と下顎頭軟骨のメカニカルストレス応答におけるOdz3の機能解析

脊椎動物の骨格のほとんどは内軟骨性骨化によって形成されるが、その分子制御機構の全容は未だ明らかではない。本研究では、Odz3が内軟骨性骨化を制御する因子であると推論し、その発現と機能の解析を軟骨細胞様細胞株ATDC5を用いて行った。その結果、軟骨細胞分化の亢進に伴い、Odz3発現は減少した。また、Odz3の発現をノックダウンしたところ、Sox9の発現が亢進した。これらの結果から、Odz3は軟骨細胞の分化を抑制的に制御する機能を有することが示唆される。脊椎動物の骨格のほとんどは内軟骨性骨化によって形成されるが、その制御機構の全容は未だ明らかとなっていない。Odz3は、下顎頭および長管骨の軟骨と軟骨細胞様細胞株ATDC5において発現すること、ノックアウトマウスで骨格異常が認められることから、軟骨分化への関わりが示唆されるが、その詳細は不明である。本研究では、Odz3が内軟骨性骨化を制御する因子であると仮説を立て、その発現と機能の解析を行った。昨年度は、マウス由来軟骨細胞様株ATDC5の軟骨細胞分化過程におけるOdz3発現パターンをリアルタイムPCRにより定量的に解析し、その結果Odz3は培養初期に高い発現を示し、経時的に発現が減少することが明らかとなった。今年度の実験では、ATDC5におけるOdz3の発現パターンを、軟骨細胞分化初期の細胞イベントである間葉系細胞凝集において発現することが知られる、N-cadherinおよびN-CAMの発現パターンと比較した。その結果、ATDC5培養系においてN-cadheriとN-CAMは、Odz3と類似する発現パターンを示した。これらの成果から、軟骨細胞分化過程において、Odz3は間葉系細胞凝集を促進的に制御する一方、その後の軟骨細胞の分化を抑制的に制御する機能を有することが示唆される。正常な軟骨細胞分化は、促進的および抑制的制御が最適なバランスを保つことにより達成される。促進的制御因子としては、Sox9、5、6をはじめとする多種の因子が知られているが、抑制的制御因子としてはAP-2αなど限られた因子が報告されるに止まっている。本研究は、Odz3による軟骨分化の新規抑制的制御機構を解明する一助となる点で意義がある。脊椎動物の骨格のほとんどは内軟骨性骨化はによって形成されるが、その制御機構の全容は未だ明らかとなっていない。本研究は、Odz3が内軟骨性骨化を制御する因子であると推論し、その機能解析を行う。マウス由来軟骨細胞様株ATDC5の軟骨細胞分化過程におけるOdz3F発現パターンをリアルタイムPCRにより定量的に解析した。その結果、Odz3は培養初期に高い発現を示し、経時的に発現は減少した。一方、軟骨細胞分化を促す転写因子であるSox9および、軟骨基質であるtype II collagenとaggrecanは培養用初期には低い発現を示し、経時的に発現は上昇した。この結果から、Odz3は軟骨細胞分化の初期の段階で強く発現し、分化の制御に関与することが示唆された。今後、in vivoでの軟骨発生過程におけるOdz3の発現解析と、in vitroにおけるOdz3発現抑制が軟骨細胞分化に及ぼす影響の解析を行うことにより、内軟骨性骨化ににおけるOdz3の機能を明らかにし、得られた成果を論文発表する予定である。当該年度に得られた成果により、in viroでの軟骨細胞分化過程におけるOdz3の定量的な発現様式が明らかとなり、軟骨細胞分化におけるOdz3の機能の推論が可能となった。これらの成果は、今後の機能解析の方向性を具体的なものとする点で意義がある。また、今後得られる成果と併せて、軟骨形成不全症、Apert症候群などの先天性骨系統疾患や、顎関節のみならず全身関節の変形性関節症の発症メカニズムの解明、およびそれらの新規治療法の開発へとつながる可能性があり、人類の健康増進に寄与する点で大きな意義を持つ。レンチウイスルベクターを用いたOdz3のRNAiの至適条件の検索に、当初予定より時間を要しているため。今後以下の以下の計画で研究を推進する。1.胎生期の内軟骨性骨化の過程におけるOdz3とCTGFの発現パターンの変化を解析するため、胎生12.5、15.5、および18.5日マウスの大腿骨部の組織切片を作製し、in situ hybridizationによりOdz3とCTGF、および間葉系細胞マーカーtype I collagen、各種軟骨細胞マーカーtype II collagen、Indian hedgehog (IHH)、およびtype X collagenの発現パターンを比較検討する。3. Odz3 siRNAをコードしたレンチウイスルを、ATDC5に感染させる。

細胞からトータルRNAおよびタンパク質を精製し、リアルタイムPCRおよびウエスタンブロットによりOdz3発現のノックダウンを確認した後、それらの試料を用いて1.で解析した各種マーカーの発現への影響を解析する。また、軟骨基質産生への影響を、アルシアンブルー染色により評価する。4. Odz3発現ベクターをATDC5に遺伝子導入する。遺伝子導入細胞のセレクションを行った後、得られた細胞を軟骨細胞分化培地を用いて培養する。細胞からトータルRNAおよびタンパク質を精製し、リアルタイムPCRおよびウエスタンブロットによりOdz3の過剰発現を確認した後、それらの試料を用いて1.で解析した各種マーカーの発現への影響を解析する。5. 10週齢雄性ラットの下顎頭に外科的にエラスティックバンドを装着し、同部への120 gの圧迫力を7日間負荷する。4%パラホルムアルデヒドを用いて灌流固定した後に顎関節部を摘出し、通報に従いパラフィン包埋する。組織切片を作製して、H-E染色、トルイジンブルー染色、in situ hybridizationによる解析を行う。次年度直接経費1500千円のうち、実験動物購入に100千円、各種in vivoとin vitroの実験に用いる試薬購入に800千円、実験器具購入に300千円を物品費として計上し、成果発表旅費100千円と調査研究旅費100千円をとして計上し、その他として研究成果投稿料100千円を計上した。