hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自衛権の起源

本年度は、これまでの研究に引き続いて、戦間期における集団的自衛権の萌芽とその位置づけを明らかにした。具体的には、集団的自衛権(の萌芽)と集団安全保障体制との関係を論じる上で何が問題となったのか、そしてそれはどのように克服されてきたのか、に着目しながら、戦間期から国連憲章第51条の起草過程における「集団的自衛権」の形成過程を明らかにした。本研究は国際法学会2002年秋期大会において報告された。第一に、戦間期における「集団的自衛権の先駆」には、国際連盟の集団安全保障体制の枠内で、いわば保全的措置としてそれを補完するものと、その枠外で、戦争に訴える自由の回復と位置づけられるものとがあった。さらに、国連憲章起草過程においても、この2つの位置づけの間での対立が見られたのであり、この対立は、集団的自衛権が国連の集団安全保障体制内の保全的措置と位置づけられることによって解決された。第二に、集団的自衛権が、上記の意味で集団安全保障体制を補完するものでありながら、同時に、戦争を誘発しかつ拡大させる危険性、延いては集団安全保障体制を瓦解させる危険性を有するという点で、それと矛盾・対立する契機を内在するものであることも、明確に意識されていた。これは侵略の定義およびその認定の困難さを背景とするものであった。こうした正反対のモメントに関して、集団的自衛権の発動要件を個別的自衛権に比して厳格にし、また行動開始後においても連盟理事会あるいは安保理の判断に服するとすることによって止揚される、という枠組が一貫して見出される。ロカルノ条約において「違反」ではなく「明白な違反」を、国連憲章起草過程において「侵略」ではなく「武力攻撃」を発動要件としたのは、そうした、侵略等の発生に関する個別国家の認定を可能な限り客観化しようとする試みに他ならない。
大気圧プラズマを利用したラジカル反応加工に関する研究-反応素過程の理論的解明-

本研究の目的は、我々の提唱する大気圧プラズマを用いたプラズマCVMをあらゆる材料に適用するために、量子力学的計算手法を用いて加工の反応素過程の解明を行い、最適な反応系を設計するところにある。これまでに、ラジカル照射型のプラズマCVM加工装置により、反応生成物の蒸気圧から見ればどちらでも加工可能と考えられるFラジカル及びC1ラジカルを用いてシリコンの加工実験を行ったところ、Fラジカルでは加工が進行するがC1ラジカルでは加工現象が見られないことが分かっている。この事を説明するため、昨年度は第一原理分子動力学シミュレーションによりSi(100)2×1面にF及びC1原子を被覆率0.25で吸着させた時の結合次数の計算を行った結果、実験結果と定性的に一致する計算結果が得られている。本年度は、ハロゲンの被覆率を1.0として再度同様の計算を行った。その結果、やはり実験結果に一致する計算結果を得ることができたが、昨年度同様、シリコンの結合が切れるには至らなかった。そこで、被覆率1.0の状態から更にハロゲン原子を表面に近づける計算を行ったところ、表面再構成結合が切れるという新しい計算結果を得ることができた。今後は更に計算を進め、シリコン原子が表面から除去される反応素過程をシミュレーションで明らかにしていくと同時に、現在プラズマCVMにより加工が困難な材料に対する解を得るため、実験及び計算の両面からアプローチしていく予定である。
やわらかなタンパク質Ｂａｃｈのリガンド分子による制御機構の解明

Bach2は大部分が天然変性領域からなるタンパク質である。我々は331-520という領域で比較的良好に精製サンプルを調製することに成功した。この領域でのヘムの結合は、331-839という長い領域での結合実験の結果と非常によく似た結合パターンを示した。動的光散乱ではBach2(331-520)はヘムが結合することにより不安定化が予想され、またX線小角散乱実験を行い、ヘムの結合が構造のコンパクト化に寄与していることが明らかとなった。このことは質量分析を用いた解析からも支持されており、Bach2がヘムにより構造変化を起こす一端を明らかにした。Bach2タンパク質は従来より精製タンパク質として調製することが著しく困難であった。本研究課題においてはこれまでに、安定して調製可能なコンストラクトを検討し、331ー520という領域で比較的良好に精製サンプルが調製できることを見出し、実験に用いている。この領域はプロテアーゼ限定分解の実験では何らかのドメイン様構造を有する部分ではないかと予想された。また、ヘム結合に重要であると考えられるCPモチーフを3か所含んでおり、実際、333ー839という長い領域での結合実験の結果と非常によく似た結合パターンを示した。これはこの領域がヘムの結合において非常に重要であることを示していると考えられ、Bach2タンパク質の解析を進めるうえで有意義な領域であると思われる。この領域に注目して物理化学的解析を進める一方、配列のバイオインフォマティクス的解析を進めた。その結果、Bach2が通常の2次構造の組み合わせからなる立体構造を保持しないことが予想される一方、完全なランダムコイルから予想される性質にも合致しないことが理解された。SAXS測定によるヘムの有無でのクラツキープロットの相違は興味深いものであり、このタンパク質がわずかではあるが、ヘムの有無によって2次構造の誘起などとは異なる構造変化を示すことがわかった。特にヘムのある場合にややコンパクトな構造をとる可能性を示した。現在のコンストラクトは広い意味で「天然変性タンパク質」と考えられるが、これまでの結果を考えると、ヘムによる変化は天然変性タンパク質の間での状態変化だと考えることができる。このような変化は構造変化の連続性と多数のヘム結合を考える場合、タンパク機能のコントロールにおいて非常に興味深い。本研究課題においてはまず、高純度の精製サンプルを調製することが重要である。Bach2全長タンパク質は大腸菌による発現系でのサンプル調製が困難であったため、安定して調製可能なコンストラクトを検討したところ、331ー520という領域で比較的良好に精製サンプルが調製できることがわかった。この領域はプロテアーゼ限定分解解析でバンドとして検出された部分とほぼ一致する部分であり、かつヘム結合に重要であると考えられるCPモチーフを3か所含む領域である。実際、ヘムの結合を調べたところ、331-839という長い領域での結合実験の結果と非常によく似た結合パターンを示した。この領域に注目して物理化学的解析を進めた。分析超遠心を用いた解析では、Bach2(331-520)は溶液中でヘムの有無にかかわらず単量体で存在することが示された。システインをターゲットとした化学修飾解析では、化学修飾後のタンパク質について質量分析計を用いて修飾の有無を解析したが、いずれのシステインにも修飾が確認できることからジスルフィド結合の形成は否定的である。動的光散乱ではヘムの有無の比較において粒子径に大きな変化は見られないものの、温度プロファイルの解析から、Bach2(331-520)はヘムが結合することにより変性温度の低下が観測された。この結果よりヘムの結合による不安定化が予想され、Bach2の機能を考えるうえで非常に興味深い知見が得られた。またSAXS(X線小角散乱)実験を行い、ヘムの結合と構造の変化について検討を進めている。本研究課題においてはこれまでに安定して調製可能なコンストラクトを検討し、331ー520という領域で比較的良好に精製サンプルが調製できることを見出し、実験に用いている。また、ヘム結合に重要であると考えられるCPモチーフを3か所含んでおり、実際、331-839という長い領域での結合実験の結果と非常によく似た結合パターンを示した。この領域に注目して物理化学的解析を進める一方配列のインフォマティクス的解析を進めた。

その結果、Bach2が通常の2次構造の組み合わせからなる立体構造を保持しないことが予想される一方、完全なランダムコイルから予想される性質にも合致しないことが理解された。SAXS測定によるヘムの有無でのクラツキープロットの相違は興味深いものであり、このタンパク質がわずかではあるが、ヘムの有無によって2次構造の誘起などとは異なる構造変化を示すことがわかった。現在のコンストラクトは広い意味で「天然変性タンパク質」と考えられるが、ヘムによる変化は天然変性タンパク質の間での状態変化だと考えることができる。このような変化は構造変化の連続性と多数のヘム結合を考える場合、タンパク機能のコントロールにおいて非常に興味深いと考えられる。生物物理化学本タンパク質は、330-520の発現領域で、大腸菌発現系を用いた試料の調製が進められることがわかっている。これまでの実験ではこの領域に注目して進めている。前年度までにおいてタンパク質の調製に成功し基礎的な物理化学的解析(分析超遠心、動的光散乱、CDスペクトル、ヘム結合解析、SAXS解析など)について進めることができたが、これらの結果について現在とりまとめを行いつつある。特にCDスペクトルによる結果ではヘムの有無で変化が見られないものの、SAXS測定では構造変化が確認されており、これらの結果の解釈について検討し、論文として取りまとめを進めた。一部の結果は現在論文として投稿できる段階まで進んでいる。これまでのところ、タンパク質の発現領域を330-520とすることで、大腸菌発現系を用いて安定して試料の調製が進められることがわかった。精製プロセスをさまざまに検討し現在では高純度のサンプルが得られる精製条件を決めている。タンパク質の収量がやや低くこの点ではもう少し改善の余地があるものの、通常の物理化学的分析が可能な量のタンパク質の調製は可能としている。当該年度においてタンパク質の調製に成功し基礎的な物理化学的解析(分析超遠心、動的光散乱、CDスペクトル、ヘム結合解析、SAXS解析など)について進めることができた。これまでの研究でBach2タンパク質の性質について多くのことが理解されてきた。その結果、このタンパク質は天然変性タンパク質としての性質を示しており、溶液状態での分析が有効であることがわかった。よって分光解析、質量分析ならびにX線小角散乱などを中心に、溶液状態での測定で構造情報の取得ならびにBach2の本質的性質の解明を進め、論文等などを通した結果の取りまとめと公表を行う。Bach2タンパク質は非常に不安定であり、現在用いている試料(331-520)であっても長期間の保存や測定は難しい。よって調製後すぐに測定可能である溶液状態での分光解析をメインに解析を進める予定である。また構造解析手段として結晶化を進める一方、X線小角散乱などもさらに推し進め、溶液状態での測定で構造情報の取得ならびにBach2の本質的性質の解明を目指す。年度内における研究の使用としては、研究を推進するにあたっての実験室の整備はほぼ整っているので主に消耗品を予定している。その他、成果を公にするための学会発表(旅費)や論文としての成果報告の際の費用
ケロイド発生病態にHDAC阻害剤が及ぼす影響の検討

HDAC阻害剤がケロイド細胞において細胞外マトリックスや転写因子の遺伝子発現にどのような影響を及ぼすか検討を行った。以前の検討でケロイド組織中のHDAC2が高発現していることを見出したため、HDAC阻害剤として、SAHAに加えMocetinostat、Apicidinを選択した。その結果、いずれのHDAC阻害剤もCOL1A2抑制し得たが、Apicidinが抑制効果に優れていた。また、ApicidinはHIF-1αを抑制することを見出した。以上よりApicidinは局所の低酸素を改善し、線維化を抑制する可能性が示唆された。今後検討数を増やし、さらなるメカニズムの解明が望まれる。肥厚性瘢痕・ケロイドでは病変部に細胞外マトリックスの過剰沈着が認められる。本研究ではエピジェネティクスの代表分子であるhistonedeacetylase (HDAC)に着目した。以前、HDAC阻害剤としてTrichostatin A(TSA)を選択し、in vitroでケロイド細胞と正常皮膚線維芽細胞における影響を検討した。その結果TSAの投与によりCOL1A2やVersicanの低下がみられた。また、マイクロアレイを行い、様々な解析を行ったところ、CREBBP/p300やHIF1α, IGF-1などが変動することが示唆された。今回、ケロイド細胞と正常線維芽細胞を4サンプルずつin vitroで培養し、TSAを投与後にRNAを回収、その後RT-PCRで解析することとした。まずCREBBP/p300の発現をRT-PCRで確認したが、ケロイド細胞、正常線維芽細胞いずれもTSA投与前後で差はみられなかった。一方、HIF1-αはTSAの投与前後で遺伝子発現の低下をみとめ、IGF-1は総じてTSA投与前後で遺伝子発現が増加することを見出した。だが、上記のなかでケロイド細胞に特異的な遺伝子変動はみられなかった。次に、HDAC阻害剤として、Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)に注目し、COL1A2やVersicanの変動を検討した。だがSAHA投与前後では発現の程度に有意な変動はみられなかった。一方で、HDAC各種の遺伝子発現について正常線維芽細胞とケロイド細胞の遺伝子発現を詳細に検討した所、HDAC2がケロイドで特異的に発現が増強していることを見出した。今後はHDAC2をより選択的に阻害するHDAC阻害剤を検討し、COL1A2やVersicanなどの細胞外マトリックスやHIF1α、IGF-1などの転写因子に及ぼす影響を検討する。HDAC阻害剤の選択ならびに遺伝子発現の解析に時間を要したため。以前にHDAC各種の遺伝子発現について正常線維芽細胞とケロイド細胞の遺伝子発現を詳細に検討したところ、HDAC2がケロイドで特異的に発現が増強していることを見出した。そこで今回は、HDAC2をより選択的に阻害するHDAC阻害剤を選択することとし、細胞外マトリックスや転写因子などに与える影響を検討した。評価の方法として、in vitroで正常線維芽細胞とケロイド細胞を培養し、HDAC2阻害剤を加え、mRNAの発現の差を検討した。その結果、HDAC2選択的阻害薬の1つであるMocetinostatは、COL1A2やVersicanなどの細胞外マトリックスの発現を抑制し、加えてTGF-βの発現を抑制しうることを見出した。また、MMP-1やMMP3などの発現が上昇していることを見出した。だが、IGF-1やHIF1αなどの転写因子に関しては有意な変動はえられなかった。これらのことからMocetinostatは様々な転写因子やマトリックスプロテアーゼを変化させることで、ケロイド細胞でのコラーゲン産生を抑制させることが示唆された。今後、症例数を増やすとともに、蛋白レベルで発現が抑制されうるかどうかを検討してゆく。また、他のHDAC2阻害剤についても今後検討を加え、比較検討を行う予定である。1.H28年度は、HDAC2選択的なHDAC阻害剤を選択しながら、以前TSAで変動が大きかった遺伝子のmRNA発現を詳細に検討する。またWestern blot法などで蛋白レベルでの変動を確認する。また、候補遺伝子の特異抗体を購入し、免疫染色を行いin vivoでの発現の有無を検討する。2.HIF1-αやIGF-1などTSA投与により大きく変動した転写因子の遺伝子の機能を解析する。候補遺伝子のsiRNA作成による発現抑制、もしくは遺伝子発現増強を行い、細胞外マトリックスや線維化に関与する因子の発現の変化を評価する。3.Ex vivoケロイドモデルマウスを用い、HDAC阻害剤の濃度を振り、連日3-4日間局所に投与する。

その後マウスの皮下に埋め込んだケロイド組織を経時的に採取し、膠原線維や細胞外マトリックスの発現を免疫染色で検討し、mRNAの発現もRT-PCR法で評価する。皮膚科学ケロイド特異的に発現している候補分子の再現性の確認、特異的な遺伝子の発現を検討するため、プライマー、プローブのデザイン、siRNAの作成や導入、マウスの維持費などが必要となる。H28年度もRT-PCRを複数回行い、ケロイド特異的に発現している候補分子の再現性を確認する(50万円)。ケロイド特異的な遺伝子の発現を検討するため、プライマー、プローブのデザインが必要である(35万円)。次に、siRNAの作成や導入などに費用を要する(85万円)。また、Ex vivoモデルマウスの維持費として50万程度が必要である。
アプリケーショントランスペアレントな大域データインテンシブ計算機構

実験科学の新しい手法として注目されるデータインテンシブコンピュテーションをターゲットとして、複数の研究機関が超高速大域ネットワークにより結合された環境で、CPU付加の少ないセキュアな通信を実現し、低レベルプロトコルとストライピング技法の組み合わせによる自動マルチストリームの実現による超高速データ転送を実現するために、(1)通常、難しいといわれる遠距離通信において、地球3/4周にあたる30,000kmの実際のネットワークで、10Gbpsネットワークを90%という高効率で利用し、動的にデータを分散共有するシステムのプロトタイプを作成した。この結果、TCPストリーム通信およびストレージデータのiSCSI通信で、それぞれ、世界最高バンド幅距離積記録を達成した。(2)高速ネットワーク実験のためのField Programmable Gate Arrayを利用したプログラマブルなMiddle Hardware-Box(MH-Box)を提案・実装した。このMH-Boxは10Gbps Ethernet portを2口持ち、`10Gbpsワイヤーレートを達成するパケット生成、トラフィック解析、遅延発生機能をプログラムし、ブリッジ型で動作をさせた。MH-Boxは予備実験およびデータ解析に非常に有効に活用された。(3)セキュアかつネットワーク効率を落とさない通信のために、10Gbpsワイヤレートに対応可能なSBTアルゴリズムを提案し、Field Programmable Gate Arrayに実装し、TCPのコンテクストスイッチに対応できるハードウェアIDSシステムを実現した、(4)IPv4/IPv6デュアルスタックの試験環境を構築し、自律的バンド幅制御方式のプロトタイプを動作させた。(5)超高速計算アクセラレータ用にメモリ階層を意識したコンパイラを提案・実装した。超高速ネットワーク網の実現により、実験科学の分野では、ローカルな計算ファシリティと、ネットワークの先にある実験観測機器あるいは共同研究機関内計算ファシリティとのシームレスな利用が期待されているが、現実には、遠距離通信におけるレイテンシの問題、および広バンド幅ゆえのバッファリング問題が遠隔地間の協調計算において大きな障害となっている。また現在の高速ネットワークの特性として、小さいデータサイズでの通信を行うと、ネットワークの性能が引き出せないことが知られており、なんらかの形で通信データをまとめ、大きなサイズでの通信を行うことが重要な課題となっている。本年度の研究では、実験科学の新しい手法として注目されるデータインテンシブコンピュテーションをターゲットとして、複数の研究機関が超高速大域ネットワークにより結合された環境で、CPU負荷が高く巨大メモリを必要とし大量データ入力のあるソフトウェアが繰り返し実行されるという前提のもと、プログラマブルなインテリジェントネットワークインターフェースボードを利用し、CPU負荷の少ないセキュアな通信を実現し、低レベルプロトコルとストライビング技法の組み合わせによる自動マルチストリームの実現による超高速データ転送を実現した。これらはSuperComputing (SC 2003)を始めとした国際会議で広く成果を発表し、国際的にも高い評価を受けた。また、研究協力者の伊藤と、これらの研究の背景となる理論について検討し、その成果も採択率が低い国際会議で採択された。このように、システム実装の面から理論まで大きな成果をあげることができた。地球規模の10Gbの超高速ネットワーク網の実現により、大量データの高次処理を必要とする実験科学の分野では、LANでの計算環境と、ネットワークの先にある実験観測機器あるいは共同研究機関内の計算環境とのシームレスな利用が期待されている。しかし、現実には、遠距離通信におけるレイテンシの問題、および広バンド幅ゆえのバッファリング問題、いわゆるLFN問題、が遠隔地間の協調計算において大きな障害となっている。本年度の研究では、初年度の研究成果を発展させ、さらに大規模な実験を行った。

具体的には、実験科学の新しい手法として注目される大量データ駆動計算を目標として、複数の研究機関が超高速大域ネットワークにより結合された環境で、CPU負荷が高く巨大メモリを必要とし大量データ入力のあるソフトウェアが繰り返し実行されるという前提のもと、プログラマブルな知的ネットワークインターフェースボードを活用して、CPU負荷の少ない安全な通信を実現し、低レベルプロトコルとストライピング技法の組み合わせによる自動マルチストリームの実現による超高速データ転送を実現した。これらはSuperComputing(SC 2004)を始めとした国際会議で広く成果を発表し、国際的にも高い評価を受けた。また、研究協力者の伊藤と、これらの研究の背景となる理論について検討し、その成果を採択率が低い国際会議で発表した。また、インターネットのリンク情報の活用技術についても論文を発表し、昨年度に続いて、このようにシステムから理論までの成果をあげることができた。本年度の研究においては、実験科学のデータインテンシブコンピューティングに関するこれまでの研究で得た成果をさらにスケールアップさせる研究を実施した。具体的には、世界の数箇所の機関を結んだ超高速大域ネットワークにおいて、プログラマブルなインテリジェントネットワークインタフェースボードを利用することによってCPU負荷を軽減する等の通信実験を行い、高速データ転送を実現した。これらを広く国際会議で発表するとともに、実験データに関して次のような受賞と世界記録更新を成し遂げ、当初の目的を十二分に達成した。受賞:遠距離データ転送世界記録更新履歴:
生理活性脂質スフィンゴシン1リン酸の肝細胞増殖抑制作用の機序と肝再生における意義の解明

スフィンゴシン1リン酸(sphingosine 1-phosphate : S1P)が、ラット培養肝細胞の増殖を抑制することを明らかにした。この系において、まず受容体であるEDG5のアンタゴニストを用いたところ、その存在下では増殖抑制作用は消失した。従って、S1Pの当該作用にEDG5が関与することが明らかとなった。さらに、G蛋白質Rhoの活性化を抑制するボツリヌス菌体外毒素を作用させるとS1Pの増殖抑制作用は消失した。以上より、S1PがEDG5を介してRhoを活性化することにより、ラット培養肝細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。次に、ラット70%肝切除モデルにおいて、切除後にS1Pを腹腔内投与したところ、切除より24時間目のDNA合成ピークが著しく減少した。同実験系において、腹腔内に投与したS1Pにより肝臓のRhoが活性化することが確認された。また、ラット70%肝切除モデルにおいて、経時的に肝細胞におけるEDG5 mRNAの発現を検討したところ、DNA合成が収束に向かう48-72時間目において発現の亢進が明らかとなった。以上より、S1Pはin vivoにおいても肝細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。また、生理的な肝再生の収束機転に関与する可能性が示唆された。さらにS1Pの肝再生における意義を明らかにすべく、血中濃度の測定を行ったが、測定精度の問題で、変化を捉えることが難しく、新たな測定系の確立について模索中である。次に、ラット70%肝切除モデルにおいて、切除後にS1Pを腹腔内投与したところ、切除より24時間目のDNA合成のピークが著しく減少した。今後、さらにS1Pの肝再生における意義を明らかにすべく、血中濃度の測定、アンタゴニストのin vivoにおける作用の検討が目指す。

また、ラット70%肝切除モデルにおいて、経時的に肝細胞におけるEDG5 mRNAの発現を検討したところ、DNA合成が収束に向かう48-72時間目において発現の亢進が明らかとなった。以上より、S1Pはin vivoにおいても肝細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。また、生理的な肝再生の収束機転に関与する可能性が示唆された。さらにS1Pの肝再生における意義を明らかにすべく、血中濃度の測定を行ったが、測定精度の問題で、変化を捉えることが難しく、新たな測定系の確立について模索中である。
単分散酸化チタンコロイド懸濁液の開発と光の局在現象

輻射場と物質を相互に量子制御して強く結合させることにより、光の局在現象に関わる新しい量子現象を探索することを目指し、まず初めに単分散微粒子が容易に手に入れやすいポリスチレン懸濁液による実験を計画した。そこで色素を混入させた単分散ポリスチレンの懸濁液の蛍光寿命の測定を行なった。ポリスチレンの粒径は光の波長程度、色素はロ-ダミンである。その結果、ポリスチレン微粒子の粒子間隔及び粒径が共に放出光の波長程度の場合に、通常の指数関数的成分に加えごく速い寿命成分が観測され、この成分は指数関数的振る舞いはしていないことが分かった。この異常な成分は時間の平方根に依存し、色素間の双極子-双極子相互作用に由来する成分であることが示唆される。この現象は光の波長程度の粒径の誘電体微細構造の存在によって出現したものと考えられ、我々の目指す物質と輻射場の強く結合した状態を示している。すなわちこの速い成分は光の波長程度のポリスチレン微粒子の存在により通常では観測されない双極子-双極子相互作用がミ-共鳴散乱により増幅され観測されたと考えられる。この現象は分子間の共鳴エネルギー輸送によって解釈されるが、このことが光バンドモードの形成を意味することになる。このように我々は高屈折率の誘電体微細構造に囲まれた空間における色素発光に関わる新しい現象を見出だした。今後はより高屈折率である酸化チタン微粒子の微細構造中の色素発光の研究により、輻射場と物質との強く結合した系の研究を進めてゆきたい。
IVV法を用いたiPS細胞における潜在的腫瘍形成能に関する分子機構の解明

本研究では、人工多能性幹細胞(iPSC)の初期化因子であるLin28、Nanog、Klf4の新たな機能を明らかにするために、それぞれに関して我々が開発した独自技術のin vitrovirus (IVV)法を用いてタンパク質間相互作用の解析を行った。その結果、Lin28の相互作用因子としてTnp2が、Nanogの相互作用因子としてNap1が、Klf4の相互作用因子としてegfr mRNAがそれぞれ同定された。Tnp2とLin28は、Msi1を強制発現させたmESCにおいて共局在し、相互作用すること本研究では、人工多能性幹細胞(iPSC)の初期化因子であるLin28、Nanog、Klf4の新たな機能を明らかにするために、それぞれに関して我々が開発した独自技術のin vitrovirus (IVV)法を用いてタンパク質間相互作用の解析を行った。Tnp2とLin28は、Msi1を強制発現させたmESCにおいて共局在し、相互作用すること本研究の目的は、人工多能生幹(iPS)細胞における潜在的な腫瘍形成能に関する分子機構を明らかにすると共に、腫瘍化マーカー因子に関する知見を得ることである。本年度はいくつかの体細胞において細胞増殖および(あるいは)腫瘍形成に関わる因子として知られるKlf4、Lin28、およびNanog(以下、鍵転写因子と称する)を手がかりとし、鍵転写因子群と相互作用する因子を、我が国独自の遺伝子ネットワーク解析技術であるin virus(IVV)法を用いて網羅的にスクリーニングし、鍵転写因子と相互作用する未知の因子を探索することを目指した。最初に、様々な転写因子を網羅し、かつ多様性と複雑性を兼ね備えたIVVライブラリーを構築した。次にこのIVVライブラリーを用いてスクリーニングを行った。その結果、Klf4については8種類の、Lin28については13種類の、Nanogについては16種類の相互作用候補を得た。In vitroプルダウンアッセイの結果、Klf4については4種類、Lin28については2種類、Nanogについては3種類の因子が相互作用することを確認できた。これらの因子は全て相互作用に関して未報告のものであった。Klf4で得られた因子の機能はそれぞれ細胞増殖およびアポトーシス抑制、NF-κB活性化抑制、腫瘍抑制因子との相互作用、および癌遺伝子産物であった。Lin28で得られた因子の機能はそれぞれクロマチンリモデリングおよびDNA結合であった。Nanogで得られた因子の機能はそれぞれヌクレオソーム形成およびクロマチンリモデリング、細胞膜融合、およびプロテアソーム形成であった。以上より、IVV法を用いて既存の手法では得られない新規な相互作用を見出すことに成功した。本研究の結果は、最終目標で掲げた鍵因子を中心とした分子機構の全容の解明および腫瘍化マーカー因子に関する知見の取得を進めていく上で非常に重要な基盤データとなるものである。本研究の目的は、人工多能性幹(iPS)細胞における潜在的な腫瘍形成能に関する分子機構を明らかにすると共に、腫瘍化マーカー因子に関する知見を得ることである。昨年度、いくつかの体細胞において細胞増殖および(あるいは)腫瘍形成に関わる因子として知られるNanog、Klf4、およびLin28(以下、鍵転写因子と称する)を手がかりとし、鍵転写因子群と相互作用する因子を、我が国独自の遺伝子ネットワーク解析技術であるin vitro virus(IVV)法を用いて網羅的にスクリーニングし、Nanogの相互作用因子としてNap1を、Klf4の相互作用因子としてEgfrRNAを、Lin28の相互作用因子としてTnp2を、それぞれ同定した。本年度は、これらの相互作用の検証を試みた。Nap1(Nucleosome assembly protein 1-like 1)はクロマチンリモデリング因子であり、ヒストンをアセチル化することで染色体を開いた状態にする。p300/Creb/Tax複合体と相互作用して、転写制御ターゲットの遺伝子を開いた状態にし、転写を促進する。Nap1はN末端側にCaspaseによる切断サイト、中央部にp300結合領域、C末端側に転写因子結合領域をもつ。NanogはNap1の転写因子結合領域に結合する。それ故、全長のNap1はNanogと結合するが、C末端の転写結合領域が欠損したNap1はNanogと結合できないことが結合検証実験でわかった。また、Nap1は細胞内でNanogと相互作用することが共免疫沈降実験によってわかった。EGFRは細胞増殖やアポトーシス抑制に関わる重要なタンパク質である。RIP(RNA immunoprecipitation)アッセイを行った結果、細胞内において、Klf4がEgfrRNAと結合することがわかった。Tnp2は精子の形成過程においてヒストンと置き換わることで凝集した染色体構造を形成する機能をもつ因子である。in vitroでの結合検証を行ったところ、Tnp2はLin28と結合することがわかった。しかし、Tnp2は細胞内ではMsi1共存下でのみ、Lin28と結合することが共免疫沈降実験によってわかった。これまでに、腫瘍形成に関わる転写因子として知られるNanog、Klf4、およびLin28と相互作用する因子を、我が国独自の遺伝子ネットワーク解析技術であるin vitro virus(IVV)法を用いて網羅的にスクリーニングし、Nap1、egfrRNA、Tnp2をそれぞれ同定した。本年度は、まず、マウス胚性幹細胞(mESC)でのNap1のノックダウンおよび過剰発現の影響を評価した。

Nap1をノックダウンすると、Nanog、Oct4、Sox2の発現量は減少した。しかし、Nap1を過剰発現させるとこれらの初期化因子のmRNAの量は増加した。その結果、Nap1がNanogと直接結合し、OctやSox2などのNanog標的遺伝子の発現を促進することがわかった。更に、Nap1とNanogはmESCの細胞抽出液中のp300と共免疫沈降することがわかった。これらの結果は、Nap1がNanogを含む転写因子複合体にp300をリクルートすることでNanog標的遺伝子の転写を活性化する可能性を示唆している。細胞増殖およびアポトーシス抑制に関わるegfr mRNAのCDS領域断片が配列特異的にKlf4と結合することがわかった。さらに、ヒト前立腺癌細胞PC-3にKlf4を一過性発現させた結果、EGFRタンパク質の大幅な発現量上昇が確認できた。その際、egfr mRNAの発現量に変化はなかったことから、Klf4がEGFRの発現量を転写後の段階で上昇させている可能性が高いことが示唆された。加えて、マウス線維芽細胞からiPS細胞誘導までの過程におけるEGFRおよびKlf4の発現量推移を経時的に観察した結果、双方の発現量上昇が同じ段階で起きていることがわかった。このことから、iPS細胞誘導時においてもKlf4がEGFRの発現量を上昇させている可能性が示唆された。In vitro virus(IVV)法によるスクリーニングで、腫瘍形成に関わる因子として知られるNanog、Klf4、およびLin28に結合する因子として、生物学的に意味のある興味深いタンパク質やRNAがスクリーニングされたので、その後の機能解析の方針が立て易くなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。iPS細胞などの多能性幹細胞の特徴である分化多能性および未分化能に関わる主要転写制御因子群のうち、他の細胞においては細胞増殖および腫瘍形成に関わる因子でもあるNanog、Klf4、Lin28に結合する因子がin vitrovirus(IVV)法によりNap1、EgfrRNA、Tnp2と同定されたので、今後は鍵転写因子と相互作用因子の複合体が司る標的遺伝子の発現制御機構の実態を解明していく。さらに、以上の研究で得られた相互作用データより、腫瘍マーカーとなりうる因子に関する知見も得ていく予定である。
単結晶を用いたECAPに伴うHCP金属の変形挙動の解明

金属材料の更なる高強度化を目的として、巨大ひずみ加工による結晶粒微細化に関する研究が行われている。しかしながら、六方晶(HCP)金属における変形挙動については明らかになっていない点が多い。そこで本研究では、HCP単結晶(純Mgと純Zn)を用い、その変形挙動を詳細に調査した。純Mgと純Znの結晶粒微細化には、双晶発生の有無が大きく影響することが分かった。双晶が発生できる場合には、従来の知見通り、双晶変形が大きな役割を担う。一方で、双晶が発生できない場合、純Mgは変形できず破断する。純Znでは、キンク変形が生じ、その界面で再結晶が生じることで、結晶粒が微細化することが明らかとなった。初期方位の異なる純Mg単結晶を2種類準備した。それぞれの方位は、Mgの底面がせん断面と平行(試験片A)および垂直(試験片B)である。これらの2種類の純Mg単結晶に対して、573KでECAP(equal channel angular pressing)を施し、その変形過程を調査した結果、以下の結果が得られた。試験片Aでは、試験片の中部で双晶が発生した。観察された双晶は、室温と473Kにおいて報告されているものと、同様の{1012}双晶であった。押し込み量の増加により、試験片上部のみにおいて、大きな{1012}双晶が発生した。また、直線的に配列した結晶粒が観察され、双晶内で再結晶が生じることが明らかとなった。試験片Bでは、試験片Aでも観察されたように、試料の上部で双晶が発生していたが、試料下部では大きな方位の変化はなかった。さらに押しこみ量を増加させても、双晶による方位変化はなかったが、試験片下部ではすべり変形をしていることが分かった。さらに押し進めると、結晶粒が観察されました。したがって、試験片Bでも試験片Aと同じように双晶内で再結晶していることが分かった。また、これらの方位変化はせん断面の上部で発生していることが分かった。両試験片において、高温でECAPを施した結果、{10-12}双晶と底面すべりによる結晶方位の変化が観察された。また、初期方位が異なるにも関わらず、最終方位のc軸は押込方向に回転することが明らかとなった。この結果はMg多結晶体のECAPによる集合組織と同じ方位であることが分かった。申請者が過去に室温で行ったECAPの試験と比較すると、高温ECAPの試験により導入された双晶の量は、室温ECAPの時と比べ、大きく減少していた。これは、高温で試験を施したため、底面すべりを含むすべり変形が起きやすくなり、すべりによる結晶回転が起きたためだと考えられる。試験片A:試験片Aの方位は、c軸が押出方向(ED)に対して垂直であり、ECAP中にc軸圧縮となり双晶が発生する方位である。試験片Aに対して、ECAPを施した結果、初期に試験片全体で{10-12}双晶が発生し、試験片全体で結晶粒が生じた。また、せん断域通過後の最終方位は、c軸がせん断方向に対して垂直に配向していた。試験片B:試験片Bの方位は、c軸が試験片挿入方向(ND)に対して垂直な方位を有しており、ECAP中にc軸引張となり双晶が発生しない方位である。試験片Bに対して、ECAPを施した結果、せん断域通過前で底面すべりと二次錐面すべりが観察された。また、せん断域でキンク変形が生じた。せん断域通過後では、キンク変形またはマクロ的Shear Bandにより、せん断方向に細長く伸びた結晶粒が生じた。試験片C:試験片Cの方位は、方位Aと方位Bの中間の方位であり、せん断方向に対して底面が平行な方位である。試験片Cに対してECAPを施した結果、底面すべりと{10-12}双晶が発生し、その後、試験片全体に結晶粒が生じた。せん断域通過後の最終方位は、c軸がせん断方向に対して垂直に配向していた。以上の結果から、変形中に発生する{10-12}双晶は、その後の結晶粒微細化に大きな役割を果たしていることが明らかとなった。これは、前年度の純Mg単結晶の結果と一致した。しかしながら、双晶が発生しない試験片Bでは、キンク変形を生じることで、その界面に沿って再結晶が生じ、微細化することが明らかとなった。以上の結果から、同じhcp結晶でも、その変形挙動が大きく異なることで、その後の微細化メカニズムが大きく異なることが明らかとなった。

構造材料物性学初年度においては、Mg単結晶のECAPを573Kで実施し、またその変形過程を調査することができたため。最終年度においては、初年度のMg単結晶に加え、同じHCP金属である亜鉛単結晶を用いて、ECAP変形の実験を行い、c/aの違いによるHCP金属のECAPに伴う変形挙動を明らかにしていく。申請時の備品購入には、金額が不足していたこと。また、既存の設備による部品加工、試料の準備が可能であり、その部品購入費や加工費等を計上せずに済んだため。今後は、亜鉛単結晶の作製を行い、その研究を開始するが、その単結晶作製においては、試料の高純度化が必須であり、その精製機器の作製費に使用する予定である。
西ニューギニア地域の神経変性疾患の実態と予後に関する縦断的研究

2001年17年の調査で、西ニューギニアの神経変性疾患、86例の病型を分類した。1)運動ニューロン疾患:33例、2)パーキンソニズムとALSの合併:18例。3)パーキンソン症候群:30例であった。西ニューギニアの神経変性疾患は、現在も多発していることが判明した。ALSとパーキンソニズムの症状が同一患者で重複し、認知症の合併と家族内発症も認めた点は、紀伊やグアムのALS/PDCと酷似しており、3地域の疾患は同一である可能性が高い。グアムや紀伊で認めた、ALSの減少と、パーキンソニズムと認知症の相対的な増加といった病型変化が、西ニューギニアでも最近認められており、追跡の継続が必要である。インドネシア、パプア州、マッピ、エデラ川沿いの村、バデ、Ia河流域の村およびケピで調査し、運動ニューロン疾患3人、パーキンソン症候群4人、運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併3人、小脳症状と錐体路徴候の合併1人を新しく診断し得た。フォローアップによる死亡者は運動ニューロン疾患の3人(1人は小脳症状合併)とパーキンソン症候群の1人であった。生存中の4人の運動ニューロン疾患、1人の運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併例と、6人のパーキンソン症候群、小脳症状と錐体路徴候の合併2人をフォローアップした。以上より、西ニューギニア地域の神経難病は、現在も多発しており、また、パーキンソニズムと運動ニューロン疾患と認知症のさまざまな組み合わせの臨床型を示し、個人内で経過中にパーキンソニズムにALSの合併の進展を認めたり、家族内発症をみたことより、紀伊やグアムの神経難病と類似の病態である可能性が高くなった。これまでのパプアの神経難病の典型的な症例として、1.運動ニューロン疾患17例、2.パーキンソニズムとALSの合併症例13例、3.パーキンソン症候群のみ16例を、国際誌BMJ openに発表した。これまでの症例のうち、小脳症状と錐体路徴候の合併者が3人も認めたことは特筆すべきであり、国際誌への論文発表を準備中であるとともに、今後のフォローアップを要する。インドネシア、中央高地のソロバ在住民の20歳以上、125人の検診を行い、神経変性疾患のスクリーニングとともに、血圧、血糖、脂質、脈波速度検査を行った。1999年と比較して、高血圧の頻度の上昇を認めた。脈波速度と年齢の相関を認めたが、血圧と年齢の相関を認めず、ライフスタイルの変化の影響が動脈硬化に現れ始めている可能性が示され、今後のフォローアップが必要である。2014年度では、インドネシア、パプア州、マッピ、エデラ川沿いの村、バデ、Ia河流域の村およびケピで調査し、運動ニューロン疾患2人、パーキンソン症候群4人、運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併0人を新しく診断し得た。フォローアップによる死亡者は運動ニューロン疾患の1人,運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併3人,パーキンソン症候群の3人であった。生存中の2人の運動ニューロン疾患、2人の運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併例と、12人のパーキンソン症候群をフォローアップした。スペイン、アンダルシア、ゴラーフェおよびエルナンバジェ在住民の60歳以上、152人の検診を行い、神経変性疾患のスクリーニングとともに、血圧、血糖、脂質、高齢者包括機能検査を行った。パーキンソン病を2名認めた。空腹時血糖検査による糖尿病27%、耐糖能異常15%、過体重以上が49%、高血圧89%と高率であった。チェンデラワシ大学の学長、副学長、公衆衛生学部長、神経内科医師などの日本への招聘とワークショップ開催を行った。2015年度には、インドネシア、パプア州、マッピ、エデラ川沿いの村、バデ、Ia川流域の村で調査し、新しく診断し得た、神経変性疾患(運動ニューロン疾患、またはパーキンソン症候群)は、認めなかった。フォローアップにより確認し得た死亡者は、5人の運動ニューロン疾患、2人の運動ニューロン疾患とパーキンソン症候群の合併例、1人のパーキンソン症候群であった。生存中の1人の運動ニューロン疾患と6人のパーキンソン症候群をフォローアップし得た。3人の小脳変性症もフォローアップし得た。グアム島や日本の紀伊半島では、ALSの急激な減少とともにパーキンソン症候群の占める割合の増加が報告された。今回のパプアの調査で、ほとんどの運動ニューロン疾患の方が死亡され、あらたな症例を認めなかった。

パプア州においては、生活の近代化が今まさに浸透してきており、時代的な環境変化と高齢化に伴うALSとパーキンソン症候群の病型の変遷が、この地域でも来している可能性が有り、今後も引き続き、フォローアップが必要である。インドネシア、中央高地のソロバ在住民の調査を来年度に施行するために、打ち合わせを行った。10人の神経変性疾患をフォローアップし、8人の死亡を確認し得た。時代的な環境変化と高齢化に伴うALSとパーキンソン症候群の病型の変遷が、この地域でも来している可能性が示唆され、フォローアップの重要性を認識し得た。来年度施行予定の、中央高地のソロバ在住民の調査の打ち合わせを行い、順調に進んでいる。2016年度には、インドネシア、パプア州、マッピ郡、ケピ、エデラ川沿いの村、バデ、Ia川流域の村で調査し、新しく診断しえた神経変性疾患は、パーキンソン症候群4名であったが、運動ニューロン疾患は認めなかった。フォローアップ調査により確認しえた死亡者は、パーキンソン症候群3名であった。生存中の7人のパーキンソン症候群をフォローし得た。2001年より2016年度までの調査より診断しえた、西ニューギニアの神経変性疾患、86例の病型を分類した。1)運動ニューロン疾患33例、2)パーキンソニズムとALSの合併例:17例、3)パーキンソン症候群:30例であった。以上より、西ニューギニア地域の神経変性疾患は、減少しているものの多発していることが判明した。ALSとパーキンソニズムの症状が同一患者で重複しており、認知症の合併と家族内発症も認めた点は、紀伊やグアムのALS/PDCと酷似しており、この3地域の疾患は同一疾患である可能性が非常に高まった。さらに、インドネシア、中央高地のソロバ在住民の120人の検診を行なった。神経変性疾患は認めなかった。高血圧、糖尿病の有無とともに、動脈硬化の評価を行い、前回調査との変化を分析中である。グアム島や日本の紀伊半島では、ALSの急激な減少とともに、パーキンソン症候群の占める割合の増加が報告された。今回のパプアの調査でも、昨年に引き続き、運動ニューロン疾患の新たな症例を認めなかった。パプア州においても、生活の近代化が今まさに浸透してきており、時代的な環境変化と高齢化に伴うALSとパーキンソン症候群の病型の変遷が、この地域でも来たしている可能性が有り、今後も引き続き、フォローアップが必要である。2001年17年の調査で、西ニューギニアの神経変性疾患、86例の病型を分類した。1)運動ニューロン疾患:33例、2)パーキンソニズムとALSの合併:18例。3)パーキンソン症候群:30例であった。西ニューギニアの神経変性疾患は、現在も多発していることが判明した。ALSとパーキンソニズムの症状が同一患者で重複し、認知症の合併と家族内発症も認めた点は、紀伊やグアムのALS/PDCと酷似しており、3地域の疾患は同一である可能性が高い。グアムや紀伊で認めた、ALSの減少と、パーキンソニズムと認知症の相対的な増加といった病型変化が、西ニューギニアでも最近認められており、追跡の継続が必要である。今回は、現地のチェンデラワシ大学のスタッフを日本に招聘し、更に良い協力関係のもとに調査を行うことができた。新患者を6例確認でき、16症例の生存者のフォローアップ調査と7症例の死亡例の確認を行うことができた。スペインとの比較調査も行うことができた。
コホート研究による肝疾患機能検査成績と肝疾患発症との関連性

昨年に引き続き平成3年の肝疾患による死亡者を、総務庁告示第41号(平成3年6月17日)に基づいて、日下部保健所保管の死亡小票を転記したものから把握した。肝疾患罹患者についても国保レセプトから、平成2年までの罹患者を把握した。前年度の報告で述べたように、慢性肝炎の病名についてはレセプト病名という点から実際と合致しない可能性が高いと思われたので肝癌・肝硬変に限って把握した。健診結果に付いては、勝沼町役場実施の住民健診結果を昭和63年から平成2年の分について磁気入力した形で入手したが、これが2月に入ってからであったため、その出力作業が進行中である。前年度に報告した山梨県厚生連のデータは、変換作業が複雑なため、今回は解析しないことにした。これらのデータを用いて、GOT,GPT,ZTT,総コレステロール値により健診受診者をカテゴリー化してその後のそれぞれの群の肝硬変、肝癌罹患率及び死亡率を算出して比較分析する作業を進めている。カテゴリー化はGOT,GPT,ZTT,総コレステロール及びGOT/GPT比について、(1)平均値を計算して、三区分にする方法(2)異常値を設定し、一度でも異常値を示したものを異常群として正常群と比較する方法(3)異常値を一定の頻度以上(40%または60%)示すものを異常群として、他の群と比較する方法で行っている。昭和57年から62年までの勝沼町・大和村における肝疾患による死亡者を、両町村の保健婦記録より把握した。昭和63年から平成2年までの肝疾患による死亡者は、総務庁告示第41号(平成3年6月17日)に基づいて、日下部保健所保管の死亡小票を転記したものから把握した。肝疾患罹患者については保健婦巡回記録および国保レセプトから、昭和57年から平成元年までの罹患率を把握した。なお、慢性肝炎の病名についてはレセプト病名という点から実際と合致しない可能性が高いと思われたので肝癌、肝硬変に限って把握した。昭和57年から平成2年末までの肝癌・肝硬変による死亡者は18名で、昭和57年から平成元年までの肝癌、肝硬変罹患者は死亡者を含めて44名であった。罹患者の把握については平成4年2月に、両町村の30歳以上の全住民を対象とした成人病罹患調査を両町村役場の協力を得て行ったが、レセプト等によって把握された罹患者の一致情報を分析した上で、来年度の分析に用いる予である。健診結果については、両町村役場実施の住民健診結果を昭和48年から昭和61年の分については既に磁気入力した形で入手しているが、それ以後の分についても現在町村のマスタ-ファイルからの出力の作業を進めている。また、両町村とも山梨県厚生連が比較的多くの住民を対象として毎年健診を行っているが、こちらのデ-タについても昭和63年度までの分を入手し分析可能な形への変換作業を進めている。
イオン伝導性高分子を電子移動反応場に用いた機能界面の形成と高効率固体電池

本研究の目的は、電子移動反応の場にイオン伝導性高分子を用い、電極活物質との間で迅速な電子移動反応を可能とする機能界面を構築し、これを高効率固体電池創製のための革新的方法論とすることにある。イオン伝導性高分子は、一種の固体溶媒であり、この中に電解質を溶解することにより、イオン伝導性が発現する。さらに固体膜として機能するために、固体電解質としての応用が可能になる。しかし、固体電解質/電極活物質間の機能界面形成には、液体電解質/電極活物質間の界面形成と比較し、多くの克服しなければならない問題がある。例えば液体電解質の持つ分子ダイナミクス、濡れ性、浸透性は、固体電解質とすることで著しく低下あるいはなくなるために、迅速な電子移動反応を可能とする機能界面の形成が困難となる。一方、イオン伝導性高分子を用いることにより、電解質の固体化が可能になるため、電極活物質から高分子固体電解質へと連続的に組成を変化させた高分子傾斜材料が実現されれば、新しい機能界面を持つ迅速電子移動系が創製できる。本研究では、高分子ダイナミクスと電子移動速度の相関を明らかにし、さらに電極活物質と高分子固体電解質の傾斜材料を合成することによって固体電解質の持つ界面形成の問題点を克服した新しい迅速電子移動系の実現を図った。具体的には、高分子固体電解質/金属リチウム界面が極めて安定であり、その電子移動速度はイオン導電率と相関し、高分子中の自由末端側密度の増大とともに増大するという事実を見いだした。さらに高分子固体電解質を用いたピロールのin situ重合によって、電極活物質から高分子固体電解質へと連続的に組成を変化させた高分子傾斜材料が合成でき、さらに迅速電子移動系が実現されることを示した。
ナノアパタイトとショートコラーゲンによるドラッグデリバリーシステム人工骨の開発

糖尿病発症の高齢ウサギを糖尿病高脂肪低カルシウム飼料で飼育し、血糖値、HbA1c、骨代謝マーカー(尿中DPD、血中オステオカルシン量、血中I型コラーゲン量)を計測した。そして大腿骨の骨密度をqCTにて測定した結果、糖尿病性骨粗鬆症モデルウサギが得られた。この糖尿病性骨粗鬆症モデルウサギの骨髄細胞より、骨芽細胞・破骨細胞共存培養系を樹立した。細胞機能の評価は、骨芽細胞はALP活性、オステオカルシン産生、I型コラーゲン産生、および石灰化能、破骨細胞はアクチンリング形成、象牙切片吸収窩形成、TRAP活性について検証した結果、ALP活性、オステオカルシン発現の減少と、象牙質吸収窩形成、アクチンリング形成の増加が観察された。そこで、Vit Dを添加したNano-DDS-ColHB37に、この糖尿病性骨粗鬆症モデルウサギの骨髄細胞より得られた細胞を付与して培養した。その結果、BMP-2、IGF-1、RANKLmRNA発現の上昇が見られた。また、破骨細胞のトラップマークの増加が確認された。以上より、Nano-DDS-ColHB37は骨芽細胞と破骨細胞の機能を損なうことなく、正常な骨代謝基盤担体として使用可能なことが確認された。そこで、Nano-DDS-ColHB37Hによる骨造成の効果を糖尿病性骨粗鬆症モデルウサギの大腿骨に埋入して観察した。術後13か月後では骨梁構造の増加が確認された。また、非脱灰切片による免疫組織化学分析では。I型コラーゲンの増加と早期の新生骨形成、Nano-DDS-ColHB37孔内への豊富な血管新生が確認された。1. H28年度は糖尿病性骨粗鬆症動物の作成を行い1糖尿病発症の高齢ウサギ(3歳、雌)を糖尿病高脂肪低カルシウム飼料で飼育した。対象として、健常な高齢ウサギ(3歳、雌)を通常飼料で飼育した。2血糖値、HbA1c、骨代謝マーカー(尿中DPD、血中オステオカルシン量、血中I型コラーゲン量を測定した。同時に、全骨塩量を骨密度測定装置にて測定した。その結果、高血糖状態が維持され、OVX後のウサギに見られる高回転型の骨代謝傾向を示した。2.この作成されたウサギより骨髄細胞の採取と骨芽細胞・破骨細胞共存培養系として、1骨髄細胞を還流法にて採取し、共存培養にて増やした後、2細胞機能の評価を、骨芽細胞はALP活性、オステオカルシン産生、I型コラーゲン産生、および石灰化能、破骨細胞はアクチンリング形成、象牙切片吸収窩形成、TRAP活性を測定した。その結果、ALP活性、OC産生のある骨芽細胞と、アクチンリングと象牙質吸収かを形成する破骨細胞が得られた。また、ドラッグデリバリーシステムを持つ担体を、ナノハニカムbTCPにショートコラーゲンを付与し、ウサギ大腿骨骨幹部へ埋入した。3ヵ月後に担体摘出し、組織学的検証を行う予定である。計画調書の予定通り、ほぼ9ー12ヶ月で以下の工程が進んでいる。