hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CYP3A4の高分解能構造解析による薬物相互作用の分子論的解明

CYP3A4は医薬品代謝を担う主要な分子であり、CYP3A4の構造活性相関の研究は、新規医薬品設計の観点から極めて重要なテーマである。しかしながら、ヒト由来チトクロームP450の多くが可溶性タンパク質として大量発現させることが困難なため、本研究を推進するためには、可溶性蛋白質として回収される活性型CYP3A4の調製系を構築することが研究推進において重要な課題である。しかしながら、ヒト由来チトクロームP450の多くが可溶性タンパク質として大量発現させることが困難なため、本研究を推進するためには、確実に可溶性分画に回収される活性型CYP3A4の大腸菌大量発現系を構築することが重要な課題である。そこで、まず効果的な発現条件の検索を行った。その結果、CYP3A4の遺伝子を大腸菌発現に最適なコドンで人工合成し、低温発現システムを駆使することで可溶性のタンパク質として大腸菌での大量発現に成功した。さらに可溶性での発現効率を向上させ大量調製するために、シャペロンタンパク質の一つであるトリガーファクターとの融合タンパク質として大量発現に成功した。また、高分解能回折データの取得できる蛋白質結晶を作製する場合、蛋白質の安定性が高い方が、より成功の可能性が高くなると考えられる。CYP3A4には、7個のシステイン残基が存在し、そのうち1つヘム鉄に結合しているものを除いて、6個遊離のシステイン残基が存在する。遊離のシステイン残基間のSS結合の形成が、不可逆的な蛋白質の凝集を促進していることから、機能に関係しない残りの遊離の6個のシステイン残基を部位特異的変異導入で他のアミノ酸残基に置換した(分子内部のCysをValに、分子表面のCysをSerに置換した)。その結果、野生型と同等のレベルで可溶性の発現タンパク質を得ることに成功した。これらの結果は、CYP3A4の研究を進めていくうえで、基礎的な重要度の高い結果である。本年度は、可溶性タンパク質として得ることに成功したCYP3A4が、ヘムを結合した活性型かどうかを確認するために、一酸化炭素差スペクトルを測定した。その結果、ヘム結合型のCYP3A4のスペクトルが観察されたことから、活性型CYP3A4が得られていることが証明された。しかしながら、活性型CYP3A4の割合は得られている可溶性CYP3A4の10%以下であった。今後、活性型CYP3A4の発現レベルを上げていく必要があるが、CYP3A4の高分解能結晶構造解析を完成させる上で非常に重要な情報を得ることができた。また、CYP3A4と同じく薬物代謝に重要なCYP2B4を使ってCYP2B4の結晶化実験を実施したところ、結晶を得ることに成功し、3.0Aの分解能の回折データを得ることができた。このことからP450分子の結晶化条件を最適化し、高分解能回折データ取得のための良質な結晶の作製法を検討することが可能となった。これらの結果は、薬物代謝に関わるP450の研究を進めていくうえで、基礎的で重要度の高い結果である。しかしながら、ヒト由来チトクロームP450の多くが可溶性タンパク質として大量発現させることが困難なため、本研究を推進するためには、可溶性蛋白質として回収される活性型CYP3A4の調製系を構築することが重要な課題である。本年度は、大腸菌発現系において不溶性蛋白質として大量発現されるCYP3A4を用いて、リフォールディング条件の検討を実施した。リフォールディングによる調製が可能になれば、少ない精製ステップで純度の高い試料が大量調製できる。まず、不溶性蛋白質として大量発現されるCYP3A4を、変性剤で可溶化後、Niキレートカラムを用いて精製した。種々の条件検討の結果、添加するヘミンが溶解する塩基性条件で、さらに、中性の界面活性剤と還元剤DTTの存在下にて希釈することで、可溶性のCYP3A4を得ることに成功した。得られた試料をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供したところ、単量体の位置にピークが確認され、その紫外可視吸収スペクトルは、すでに報告されている活性型CYP3A4とよく似ていた。

これまでに、CYP3A4を含むP450ファミリーに関してリフォールディングの成功例は報告されていないことから、本結果は、P450の研究を進めていくうえで、基礎的で重要度の高い結果であると考えられる。
初期生命におけるRNA・タンパク質共進化プロセスの再現

生命がどのように誕生したかは生物学に残された最も大きな謎の1つである.現存する生命の遺伝子発現機構は複数の分子種(DNA,RNA,タンパク質)の共依存によって成り立っているが,そのような複雑な系が如何にして誕生・進化してきたのかは生命を理解する上で特に本質的な問いであると言える.これらの分子種の中ではRNAから進化が開始したという仮説(RNAワールド仮説)が有力であり,その後,RNAとタンパク質の共進化により精巧な遺伝子発現機構に進化してきたと推測される.そこで本研究では,初期生命におけるRNAとタンパク質の共進化のプロセスを実験的に再現することを試みる.そのために,人工的なRNA酵素(リボザイム)の実験系をモデルに用い,RNA単独では克服できない課題を原始的なペプチド・タンパク質の添加により解決することで,「RNAワールドにおいて,なぜタンパク質が必要とされ,どのように進化が進行したか」を解明する.今年度は,正電荷をもったペプチドによるアミロイド形成,液ー液相分離形成などを行い,そのような自己集合するペプチドのリボザイム活性への影響を調べている.これまでにテストした自己集合ペプチドはRNAとよく結合はするものの,リボザイムの活性を上昇させるようなものは得られていない.今後はRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.また,今年度はタンパク質のRNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験を行った.いくつかのデザインについては可溶化に成功したが,その後の性状分析ではきちんとしたコンフォメーションに折り畳まっているという確認が取れなかった.そこで,RNAポリメラーゼの活性部位と同様のフォールドを持つタンパク質を改変し何らかの活性をもたせる試みもスタートしている.これまでの研究で正電荷をもったペプチド(オリゴリジン)がRNA同士の集合を助けることによってリボザイムの活性を上昇させることが確認されていた.そこで,今年度は,正電荷をもつアミノ酸と疎水性アミノ酸を組み合わせることによって,正電荷を持ち,なおかつ自己集合するペプチドを作成した.この研究で,RNAに結合するアミロイド形成ペプチドや,RNAと凝集し液ー液相分離をつくるペプチドなどを得ることが出来た.しかし,これまでにテストした自己集合ペプチドはRNAとよく結合はするものの,リボザイムの活性を上昇させるようなものは得られていない.今後はRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.また,今年度はタンパク質のRNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験を行った.いくつかのデザインについては可溶化に成功したが,その後の性状分析ではきちんとしたコンフォメーションに折り畳まっているという確認が取れなかった.今後はコンピュータシミュレーションを用いた安定な配列デザインなども手法に取り組み,原始RNAポリメラーゼの再現を進めていく.さらに,RNAポリメラーゼの活性部位と同様のフォールドを持つタンパク質を改変し何らかの活性をもたせる試みもスタートした.RNAポリメラーゼ活性部位に見られるDPBBドメインは多くのタンパク質で見られるフォールドであるが,我々は原始的なタンパク質からよく可溶化・フォールドするDPBBドメインを得ることが出来た.今後さらにこのDPBBドメインにRNAポリメラーゼの活性ループを移植することで,何らかの活性をもつDPBBドメインの取得を目指す.アミロイドや液ー液相分離を形成するRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.さらに,自己集合するペプチドを利用して,環境中でのRNAを濃縮するシステムを構築し,自己複製するRNA・ペプチド系を今後形成するための足場とする.また, RNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験については,はコンピュータシミュレーションを用いた安定な配列デザインなども手法に取り組み,原始RNAポリメラーゼの再現を進めていく.さらに,以外の原始的なタンパク質からよく可溶化・フォールドするDPBBドメインを得ることもできたので,このDPBBドメインにRNAポリメラーゼの活性ループを移植することで,何らかの活性をもつDPBBドメインの取得を目指す.DPBBドメインは内部に偽2回対称性を持つため,もともとは更に短いペプチドが2量体を形成することで誕生したと考えられている.そこで,可溶化したDPBBドメインの配列を完全2回対象化し,さらに短いペプチドからDPBBドメインを再構成することも目指す.生命がどのように誕生したかは生物学に残された最も大きな謎の1つである.現存する生命の遺伝子発現機構は複数の分子種(DNA,RNA,タンパク質)の共依存によって成り立っているが,そのような複雑な系が如何にして誕生・進化してきたのかは生命を理解する上で特に本質的な問いであると言える.これらの分子種の中ではRNAから進化が開始したという仮説(RNAワールド仮説)が有力であり,その後,RNAとタンパク質の共進化により精巧な遺伝子発現機構に進化してきたと推測される.そこで本研究では,初期生命におけるRNAとタンパク質の共進化のプロセスを実験的に再現することを試みる.そのために,人工的なRNA酵素(リボザイム)の実験系をモデルに用い,RNA単独では克服できない課題を原始的なペプチド・タンパク質の添加により解決することで,「RNAワールドにおいて,なぜタンパク質が必要とされ,どのように進化が進行したか」を解明する.今年度は,正電荷をもったペプチドによるアミロイド形成,液ー液相分離形成などを行い,そのような自己集合するペプチドのリボザイム活性への影響を調べている.これまでにテストした自己集合ペプチドはRNAとよく結合はするものの,リボザイムの活性を上昇させるようなものは得られていない.今後はRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.また,今年度はタンパク質のRNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験を行った.

いくつかのデザインについては可溶化に成功したが,その後の性状分析ではきちんとしたコンフォメーションに折り畳まっているという確認が取れなかった.そこで,RNAポリメラーゼの活性部位と同様のフォールドを持つタンパク質を改変し何らかの活性をもたせる試みもスタートしている.これまでの研究で正電荷をもったペプチド(オリゴリジン)がRNA同士の集合を助けることによってリボザイムの活性を上昇させることが確認されていた.そこで,今年度は,正電荷をもつアミノ酸と疎水性アミノ酸を組み合わせることによって,正電荷を持ち,なおかつ自己集合するペプチドを作成した.この研究で,RNAに結合するアミロイド形成ペプチドや,RNAと凝集し液ー液相分離をつくるペプチドなどを得ることが出来た.しかし,これまでにテストした自己集合ペプチドはRNAとよく結合はするものの,リボザイムの活性を上昇させるようなものは得られていない.今後はRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.また,今年度はタンパク質のRNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験を行った.いくつかのデザインについては可溶化に成功したが,その後の性状分析ではきちんとしたコンフォメーションに折り畳まっているという確認が取れなかった.今後はコンピュータシミュレーションを用いた安定な配列デザインなども手法に取り組み,原始RNAポリメラーゼの再現を進めていく.さらに,RNAポリメラーゼの活性部位と同様のフォールドを持つタンパク質を改変し何らかの活性をもたせる試みもスタートした.RNAポリメラーゼ活性部位に見られるDPBBドメインは多くのタンパク質で見られるフォールドであるが,我々は原始的なタンパク質からよく可溶化・フォールドするDPBBドメインを得ることが出来た.今後さらにこのDPBBドメインにRNAポリメラーゼの活性ループを移植することで,何らかの活性をもつDPBBドメインの取得を目指す.アミロイドや液ー液相分離を形成するRNA結合自己集合ペプチドのなかでも,リボザイムの活性やRNAの安定性を向上させるペプチドの探索を進める.さらに,自己集合するペプチドを利用して,環境中でのRNAを濃縮するシステムを構築し,自己複製するRNA・ペプチド系を今後形成するための足場とする.また, RNAポリメラーゼの中心構造を抜き出す実験については,はコンピュータシミュレーションを用いた安定な配列デザインなども手法に取り組み,原始RNAポリメラーゼの再現を進めていく.さらに,以外の原始的なタンパク質からよく可溶化・フォールドするDPBBドメインを得ることもできたので,このDPBBドメインにRNAポリメラーゼの活性ループを移植することで,何らかの活性をもつDPBBドメインの取得を目指す.
ジョン・ロックにおける国制と経済の観点からの所有権論のコンテクスト分析

今年度は昨年度に引き続きジョン・ロックが商務省専門委員として提出した救貧法案(1697)を研究し、その成果の一部を口頭発表した。本研究の目的は、救貧法案で示された貧民あるいは貧困に対するロックの姿勢と、『統治二論』、『寛容書簡』、経済論文等の諸著作との思想的関連を分析することによって、人間・政治・社会についてのロックの認識を解明することである。ロック案の特徴は貧困の原因として個人の怠惰を強調する点にあるといえる。ロックは『統治二論』でフィルマーの家父長制論駁を目的として自然権理論に基づき、神の理性的被造物としての人間が持つ「生来の自由」に対する平等な権利を主張すると同時に、身分、徳、財産等における個人間の不平等を肯定する。市民社会において政治体は立法部を通じて有機的に結合され、立法部が腐敗すれば抵抗権の行使が認められる。この枠組みはトレードの滞留を回避するべく土地所有者の奢侈及び怠惰を戒めたトレード論にも共通している。トレードの構成要素としての貧民に勤勉な労働を求めた救貧法案は、個人間の不平等を前提とした『統治二論』の自然権理論と矛盾しないものであった。さらに救貧法案の歴史的・思想的文脈の理解を深め、ロック案の位置づけをより明確にするために、エリザベス救貧法、定住法、同時代の救貧案や経済論文等との比較検討を行うと同時に、ヒューマニストの著作の読解に取り組んだ結果、キリスト教的隣人愛の精神がロックの統治及び経済認識に影響を及ぼした可能性を見出した。以上の成果を、経済学史学会・第69回全国大会(於大阪産業大学、2005年5月28日)及び科学研究費・基盤研究(A)(1)「近代のイングランドの近隣英語圏における啓蒙思想と経済学形成の相互関連の研究」(研究代表者・田中秀夫)の2005年度・第5回研究会(於京都大学、2006年2月17日)で口頭発表した。今年度はジョン・ロックのプロパティ(所有権)概念の形成とトレード概念の形成を中心に研究し、前者の成果をまとめた論文は現在投稿中であり、後者の方は現在論文を執筆中である。今年度の補助金は主に上記の研究を遂行するための文献の購入費にあてられた。1.ロックのプロパティ概念の形成に関しては、「ジョン・ロックにおけるプロパティ概念の形成について」という題名の論文を現在投稿中である。ロックは主著『統治二論』を、排斥法危機下における家父長制論者のロバート・フィルマー著作集の再刊を受けて執筆したが、その中でフィルマーの議論が「父たる身分」と「プロパティ(独占的領有権)」に基礎付けられたものであると整理した。独占的領有権とはアダムが全ての被造物に対して有する独占的な所有権であり、後世の君主に継承されるとして、絶対君主制の正当化のために用いられた。『統治二論』では以上の議論に論駁し、臣民のプロパティ(生命・自由・財産)の保全を市民社会の第一の目的に押し上げた。絶対・恣意的為政者による臣民のプロパティ侵害の危険に対する認識が存在していなかった。この論文では、フィルマーとの思想的対決から形成されてきたことについて明らかにした。2.ロックのトレード概念に関しては、「ジョン・ロックのトレード概念の形成について(仮題)」と題する論文を現在執筆中である。従来ロックの経済論文は、日本では労働所有権の生産過程、経済論文の経済循環するものの、P.ケリーを初めとして時局論文にすぎないとして、『統治二論』との関連を否定する見解が主流であった。しかし前者に関してはであり、後者に関しては無視している。ロックは経済論文においてトレードをイングランドを富ませるものとして重視している。『統治二論』においてロックはコモンウェルスの福祉を目的とすると述べている。英蘭戦争を契機とする経済発展は、トレードをコモンウェルスマンの系譜からロックの経済認識を明らかにすることを目的としている。経済の担い手であるジェントルマン将来的にはジョン・ロックの認識として、『教育論』を包含する予定である。今年度はロックのトレード論と救貧法案を中心に研究し、その成果の一部に関して口頭報告を行い、論文として発表した。1.トレード論に関しては、昨年7月に科学研究費・基盤研究(A)(1)「近代のイングランドの近隣英語圏における啓蒙思想と経済学形成の相互関連の研究」(研究代表者・田中秀夫)の第一回研究会で口頭報告を行い、その発表原稿に加筆・訂正した論文「ジョン・ロックの経済認識-トレードと公共善について」を『イギリス哲学研究』に投稿した(28号に掲載予定)。同論文では、経済論文中でロックがトレードを水流に喩え、貨幣をトレードの車輪を回すものと捉えていたこと、地主、仲介業者、労働者の各々をトレードの循環を担う構成要素として位置づけたことから、国富獲得に際してトレードの滞留の防止が最も重視されていたことを明らかにした。さらに、以上の経済認識の根底に公共善への志向性が存在したことを、『統治二論』、『寛容についての書簡』等を用いて論証した。2.1697年9月に商務省の専門委員としてロックが提出した救貧法案は、『統治二論』に見られる所有権に基づく自由で自立した近代的人間像と、法案における貧民の扱いとの不整合性が指摘されたり、重商主義研究の観点からは、本源的蓄積期の労働力搾取を正当化するものであるとして従来低い評価を受け、主要著作との内在的連関について必ずしも十分に検討されてこなかった。

上記の通り、ロックにおいて政治及び経済の諸問題は公共善の実現という統一的視座の下で議論されており、貧民問題もその一環として考察された。したがって、彼の貧民観を明確にすることは、彼の言う公共善の内実、ひいては理想とした社会像を明らかにすることにもつながると思われる。以上の観点から、Bodlean Libraryより救貧法案草稿(MS.Locke fols.87-88,94-95)の複写物を取り寄せ、救貧法案と併せてファーミン、ベラーズ、ケアリら同時代の救貧法案・労働学校案との比較検討を行うと同時に、同時代の教育論との相違、また初期啓蒙におけるヒューマニズムとインタレストの思想的系譜を視野に入れ、コメニウス、ハートリブ、マンデヴィル、シャーフツベリ、ハチスンの著作及び研究文献の渉猟・精読に努めた。今年度は昨年度に引き続きジョン・ロックが商務省専門委員として提出した救貧法案(1697)を研究し、その成果の一部を口頭発表した。本研究の目的は、救貧法案で示された貧民あるいは貧困に対するロックの姿勢と、『統治二論』、『寛容書簡』、経済論文等の諸著作との思想的関連を分析することによって、人間・政治・社会についてのロックの認識を解明することである。ロック案の特徴は貧困の原因として個人の怠惰を強調する点にあるといえる。ロックは『統治二論』でフィルマーの家父長制論駁を目的として自然権理論に基づき、神の理性的被造物としての人間が持つ「生来の自由」に対する平等な権利を主張すると同時に、身分、徳、財産等における個人間の不平等を肯定する。市民社会において政治体は立法部を通じて有機的に結合され、立法部が腐敗すれば抵抗権の行使が認められる。この枠組みはトレードの滞留を回避するべく土地所有者の奢侈及び怠惰を戒めたトレード論にも共通している。トレードの構成要素としての貧民に勤勉な労働を求めた救貧法案は、個人間の不平等を前提とした『統治二論』の自然権理論と矛盾しないものであった。さらに救貧法案の歴史的・思想的文脈の理解を深め、ロック案の位置づけをより明確にするために、エリザベス救貧法、定住法、同時代の救貧案や経済論文等との比較検討を行うと同時に、ヒューマニストの著作の読解に取り組んだ結果、キリスト教的隣人愛の精神がロックの統治及び経済認識に影響を及ぼした可能性を見出した。以上の成果を、経済学史学会・第69回全国大会(於大阪産業大学、2005年5月28日)及び科学研究費・基盤研究(A)(1)「近代のイングランドの近隣英語圏における啓蒙思想と経済学形成の相互関連の研究」(研究代表者・田中秀夫)の2005年度・第5回研究会(於京都大学、2006年2月17日)で口頭発表した。
アライアンスにおける企業間コラボレーションのための組織間管理会計に関する研究

本研究は,アライアンスを成功させるために組織間管理会計が果たす役割を解明し,組織間管理会計実務の背後にある論理を析出することを目的としている。具体的には,アライアンスの中でも製造合弁事業における組織間コントロール構造の体系を研究の対象とした。本年度は,研究最終年度として,郵送質問票調査を実施し,合弁事業の事後的なコントロールメカニズムを念頭にデータ分析を行った。分析によれば,まず組織間コントロールメカニズムには,管理会計システムにもとづく出資会社による合弁会社へのモニタリング,指示・指導、提案といった直接関与などがあり,これらの程度によりコントロールパターンが規定されている。また,コントロール特性には,目標のタイトネス,権限委譲,包括的・詳細な契約,コンフリクトヘの対処などもあり,メカニズムと相互に関係している。加えて,取引特性(資産特殊性,業務の測定可能性など)や関係性特性(信頼,情報共有,交渉力,企業文化の類似性など)にも,コントロールメカニズムとの間に関連がみうけられた。加えて,質問票に回答を得た企業に対する複数回のインタビューにより,管理会計担当者の果たす役割についてフィールドスタディを継続的に実施した。合弁会社の管理会計担当者は,当該会社への複数の出資会社に対して経営状況を報告できるように,各出資会社の要求に照らした形で会計情報を収集し,伝達を行う重要な役割を果たしている。加えて,合弁会社のトップマネジメントは管理会計情報にもとづき各出資会社と事業遂行状況の意見交換を行っており,事業運営上,組織間管理会計情報が重要な役割を果たしている。本研究は,組織間コントロールメカニズムに焦点をあててきたが,今後はインプットプロセスのコントロールも含め,組織単位間の相互依存性管理に焦点をあて,さらに組織間管理会計の理論を精緻化する必要がある。本研究の目的は,「アライアンスにおける組織間のコントロール構造の体系を明らかにし,パートナーを意識して各企業が取り組むコスト・マネジメントの実態を解明すること」にある。この研究目的を達成するために本年度は,先行研究の文献レビューとインタビュー調査を計画した。文献レビューの結果からは,取引コスト論だけでなく,パートナー間の情報共有と信頼構築,そして管理会計情報の利用等が重視されていることが明確になった。また,アライアンスに関する概念変数の整理を進めることができた。そこで,文献レビューから得られた知見を確認すべく,数社にインタビュー調査を実施した。まだ,これらの調査は十分とはいえない状況にあるが,次のような知見が得られている。まず,当初から想定されていた点として,組織間関係において企業は社会的ネットワークに埋め込まれており,必ずしも二者間の関係性だけのコントロール構造ではないことが明らかになった。また,戦略的アライアンスである合弁会社へのインタビューからは,分業体制における各企業のコスト・マネジメント手法の巧拙がアライアンスの成否に影響を与えている可能性を見いだした。他方,当初の想定と異なる点として,本研究は契約後の企業間コラボレーションに焦点をあてていたが,契約までの過程がその後の事業運営や企業間活動の調整に影響を与えることから,分析対象領域を拡張する必要性も認識された。以上のように一定の知見が得られているが,現在,研究雑誌等に論文を発表するまでには至っておらず,早急に本研究の中間成果を取り纏めるべく準備を進めている段階にある。これらの活動以外では,ヨーロッパ会計学会など学会に積極的に参加し,組織間管理会計に関する現状・動向の把握に努めた。また,各種データベースや様々なソフトウェアを準備することでアライアンス事例の収集・分析を着実にすすめており,今後の調査に繋げる予定である。本研究は,アライアンスにおける組織間マネジメントコントロールの実態を解明することにある。本年度は,ジョイントベンチャー(JV)における組織間コントロールの解明を中心として継続的な文献レビューを行った。JVと戦略的提携は,複数組織が共同で投資し,合同委員会と合同作業グループといった組織編成を行うなど共通点が多い。しかし,JVにはフォーマルかつ法契約による組織間コントロールが機能している。この点から,経営実態が存在し,本研究の調査実現の可能性の高い。文献レビューからは,欧米企業とは異なって日本企業は現場や細部にこだわる経営スタイルであり,この点がJVのコントロールに反映されていることが判明した。また,日本企業と中国企業の合弁事業においては,日本企業から管理会計技法が中国企業に普及していない点など,組織間コントロールの欧米企業との違いも明らかになった。JVのコントロールは一様ではなく,取引特性,関係性特性,コントロール特性などを明確にすることも必要であるが,組織間のパフォーマンスへ与える影響は未だ解明されていない点もレビューより導出された。加えて,JVに関する管理会計研究は,ケースが中心でありサーベイ研究が比較的に少ない状況にある。このため,質問票調査の実施を企画するに至っている。ただし,理論上の知見を得ているが,統計による実証を行うように質問票調査の実施を優先させたため,研究雑誌等には成果発表を行っていない。これらの研究活動以外では,JVやアライアンスの実態把握につながるインタビュー調査や,国内外の研究者との打ち合わせ・情報交換から本研究にとって適切な研究方法論の確認を行っている。また,研究会(一橋大学2006年10月)にて上記の中間成果報告を行うとともに,2007年1月上旬のアメリカ会計学会管理会計セクションに参加して組織間管理会計の学界動向の把握に努めた。

本年度は,研究最終年度として,郵送質問票調査を実施し,合弁事業の事後的なコントロールメカニズムを念頭にデータ分析を行った。分析によれば,まず組織間コントロールメカニズムには,管理会計システムにもとづく出資会社による合弁会社へのモニタリング,指示・指導、提案といった直接関与などがあり,これらの程度によりコントロールパターンが規定されている。また,コントロール特性には,目標のタイトネス,権限委譲,包括的・詳細な契約,コンフリクトヘの対処などもあり,メカニズムと相互に関係している。加えて,取引特性(資産特殊性,業務の測定可能性など)や関係性特性(信頼,情報共有,交渉力,企業文化の類似性など)にも,コントロールメカニズムとの間に関連がみうけられた。加えて,質問票に回答を得た企業に対する複数回のインタビューにより,管理会計担当者の果たす役割についてフィールドスタディを継続的に実施した。合弁会社の管理会計担当者は,当該会社への複数の出資会社に対して経営状況を報告できるように,各出資会社の要求に照らした形で会計情報を収集し,伝達を行う重要な役割を果たしている。加えて,合弁会社のトップマネジメントは管理会計情報にもとづき各出資会社と事業遂行状況の意見交換を行っており,事業運営上,組織間管理会計情報が重要な役割を果たしている。本研究は,組織間コントロールメカニズムに焦点をあててきたが,今後はインプットプロセスのコントロールも含め,組織単位間の相互依存性管理に焦点をあて,さらに組織間管理会計の理論を精緻化する必要がある。
もやもや病における血管内皮前駆細胞の病態解析

1)患者血中EPCのFACS解析:患者33名、健康対照14名から採血を行った。術前では小児患者、成人患者ともにEPCの有意な細胞数低下が示された。また、術後は有意なCD34+/CD133+細胞の低下がみられた。これら所見は、病変部でのEPC消費亢進を示唆していると考えられた。2)もやもや病患者由来iPS細胞の樹立:患者3名、正常対照3名からiPS細胞を作成した。血管内皮細胞への分化誘導を行い検討したところ、患者細胞では管腔形成能の低下がみられた。マイクロアレイとプロテオミクス解析では、患者で発現が低下している遺伝子/タンパク質に血管新生に関与するものが見出され、病因との関連が示唆された。1)もやもや病患者・末梢血における血管内皮前駆細胞(EPC)のFACS解析新規に発生したもやもや病患者から採血を実施したのち、Ficol1による遠心分離にて末梢血中の単核球分画を分離した。その検体を用いてCD34,CD133,VEGFR2などのモノクローナル抗体を用いフローサイトメトリー(fluorescence activated cell sorting ; FACS)を実施して、各患者における血中EPC数を定量した。対照群との比較や、血行再建術前後での変化を統計学的に検討して、もやもや病小児例・成人例における末梢血中のEPC量を明らかにすることを試みた。現在までに成人患者19例、小児患者14例、健康ボランティア10例の採血とFACS解析が終了した。今年2月にpreliminary dataをまとめて、厚生労働科学研究費補助金(難治性疾患克服研究事業)分担研究報告書に結果を報告した。2))もやもや病患者由来iPS細胞の樹立新たに発症したもやもや病患者(成人5名程度)と健康ボランティアを対象とし、血液を採取しTリンパ球をConAにて刺激し培養する。培養した細胞にセンダイウイルスベクターによりc-Myc、Oct3/4、Sox2、Klf4遺伝子を導入、発現させる。iPS細胞コロニーを単離し、培養増幅する。この実験計画を、北海道大学病院自主臨床研究審査委員会に提出し、承認された。また、この研究は平成25年度熊本大学発生医学研究所の共同研究課題に選択され、同研究所幹細胞部門、幹細胞誘導分野江良択実教授との共同研究として行われることとなった。現在、患者からの採血が始まっている。1)もやもや病患者・末梢血における血管内皮前駆細胞(EPC)のFACS解析新規に発生したもやもや病患者から採血を実施したのち、Ficollによる遠心分離にて末梢血中の単核球分画を分離した。その検体を用いてCD34, CD133, VEGFR2などのモノクローナル抗体を用いフローサイトメトリー(fluorescence activated cell sorting; FACS)を実施して、各患者における血中EPC数を定量した。2)もやもや病患者由来iPS細胞の樹立もやもや病患者3名分の末梢血単核球にセンダイウイルスを用いて山中4因子を導入し、iPS細胞を作成した。作成したiPS細胞の全クローンで多能性マーカーが発現していくことをPCR,免疫染色で確認した。また、teratomaを作成し、三胚葉への分化能力を確認した。各患者のクローンから数クローンで染色体検査を行い、染色体異常のないことを確認した。樹立したiPS細胞を用いて、血管内皮への分化誘導を行った。浮遊培養を行うことでiPS細胞よりembryoid bodyを形成した。BMP4 50ng/ml, bFGF 50ng/mlを2日間培地中に加え中胚葉への分化を促進し、3日目よりVEGF50ng/ml, bFGF50ng/mlに換え、血管内皮への分化を誘導した。分化6日目でFACS AriaIIIにてCD31+VE-cadherin+の細胞を分離し、collagenI coated plateで培養を行った。培養後約2週間で免疫染色を行い、CD31, VE-cadherinの発現を確認した。今後得られた血管内皮を用いて、正常内皮ともやもや病由来内皮細胞を比較検討し、疾患の解析を進めていく方針である。1)もやもや病患者・末梢血における血管内皮前駆細胞(EPC)のFACS

解析新規に発生したもやもや病患者から末梢血中の単核球分画を分離した。CD34, CD133, VEGFR2などEPCの表面抗原に対してフローサイトメトリー(FACS)を実施し、各患者における血中EPC数を測定した。対照群との比較や、血行再建術前後での変化を検討して、もやもや病における血中EPCと病因の関係について明らかにすることを試みた。また、保存した血漿をもちいてELISAを行ない、血漿中のVEGF、SDF-1α、bFGF、HGF濃度を測定した。術前採血では小児患者、成人患者ともにEPCの有意な低下が示された。また術後採血が行われた症例では、術後に有意なCD34+/CD133+細胞の低下がみられた。またELISAでは、小児患者の術後でVEGFが増加傾向を示していた。EPCの患者群での低下所見は、病変部でのEPC消費亢進を示唆する所見と考えられた。一方、小児患者術後でのVEGF増加傾向は、間接血行再建による良好な側副血行と関連することが示唆された。本結果は国際学術誌に投稿準備中である。2)もやもや病患者由来iPS細胞の樹立もやもや病患者3名分と正常対照3名分の末梢血単核球に、センダイウイルスを用いて山中4因子を導入し、iPS細胞を作成した。樹立したiPS細胞を用いて、血管内皮への分化誘導を行った。培養後約2週間で免疫染色を行い、CD31, VE-cadherinの発現を確認した。得られた血管内皮を用いて、正常対照ともやもや病由来内皮細胞を比較検討したところ、もやもや病では管腔形成能の低下が見られた。これはサイトカイン刺激によっても変化が生じなかった。また得られた内皮細胞に対してマイクロアレイ解析とプロテオミクス解析により、網羅的な探索を行った。もやもや病で発現が低下している遺伝子/タンパク質のなかに血管新生に関与するものが見出され、病因との関係が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。脳血管障害26年度が最終年度であるため、記入しない。EPC研究に関しては、新規患者の登録を終え、術後採血を行うのみである。iPS研究に関しては、IRB審査を終え、実際に患者からの採血が開始されている。EPC研究に関しては、新規患者の登録を終え、最終的な解析を行っている。iPS研究に関しては、実際に患者由来のiPS細胞を樹立することができた。EPC研究に関しては、術後採血を進め、最終的な解析を行う。iPS研究に関しては、患者血液からのiPS細胞株樹立をすすめる。EPC研究に関しては、最終的な解析ののちに国際学術誌に原著論文として報告する。iPS研究に関しては、患者由来のiPS細胞株から血管内皮細胞へ分化誘導し、各種の解析を行う。本研究計画が順調に経過した場合、国際学会での報告や国際学術誌での発表などの費用に充てられる。平成24年度未使用額の発生理由として、研究の予定が遅れたことがあげられる。また、その未使用額の25年度での使用予定は学会旅費や、試薬等に充てられる。平成26年3月納品分が、平成26年4月支払いとなるため。研究の消耗品費として、使用予定。
運動刺激に対する骨格筋機能の適応における長寿遺伝子サーチュインの役割解明

「運動は寿命を延ばすのか?」という疑問に対して、未だ明確な回答は得られていない。運動刺激の種類や強度は多種多様であり、こうした刺激に応じて生体は効果の発現あるいは障害の発生など適応を示す。つまり、運動刺激を受容し、その種類や強度を認識し、最適な適応を発現するシステムの存在が示唆されるが、その実体は不明である。本研究では、長寿遺伝子サーチュイン(SIRT)に、運動刺激に対する骨格筋応答におけるSIRTの役割を追究することを目的とした。実験動物ならびに培養骨格筋細胞を対象として検討した結果、運動刺激に対する骨格筋の適応現象にSIRTそのもの自身の関与は低いことが示唆された。『運動は寿命を延ばすのか?』という疑問に対して、未だに明確な回答は得られていない。運動刺激の種類や強度は多種多様であり、こうした刺激に応じて生体は効果の発現あるいは障害の発生などの適応を示す。つまり、運動刺激を受容し、その種類を認識し、最適な適応を示すシステムの存在が示唆されるが、その実態は不明である。本研究では長寿遺伝子サーチュイン(SIRT)に着目した。SIRTは、様々な細胞ストレスに対する防御機構を賦活化し、老化に伴う疾患を予防することで寿命延長に働くと考えられている。しかし、エネルギーを多量に消費すると共に、活性酸素などの種々の代謝産物を発生する運動と言う刺激に対するSIRTの応答は不明な点が多く残されている。そこで本研究では、運動に対する骨格筋可塑性応答におけるSIRTの役割を追究することを目的とする。本研究の目的を達成するために、3年計画で研究を遂行し、平成26年度はその1年目に当たる。まず、平成27年度以降に実施予定の加齢マウスを用いた実験のために、マウスの飼育を開始した。現時点で、特に問題もなく順調に飼育が継続されている。また、生後10週齢のマウスを用いて、骨格筋量変化に伴うSIRT1およびAMP依存性タンパクキナーゼ(AMPK)の変容の解析を行った。骨格筋量の変化は萎縮とその後の再成長とし、マウスに対して2週間の後肢懸垂を施し、萎縮を惹起した。一部のマウスを通常飼育に戻して、2週間継続飼育して、萎縮骨格筋に再成長を促した。その結果、骨格筋の萎縮に伴いSIRT1ならびにAMPK発現量に変化は認めなかった。萎縮筋の再成長によりSIRT1およびAMPK発現量は共に有意に増大した。したがって、骨格筋に対する運動刺激の増加に応じてSIRTならびにAMPKは活性化することが示唆された。今後、さらに解析を進め、運動に対する骨格筋可塑性応答におけるSIRTの生理的役割を明らかにしていく計画である。本研究の目的を達成するために、3年計画で研究を遂行し、平成27年度はその2年目に当たる。本年度は、まず骨格筋細胞の分化モデルを用いて、SIRT1活性調節におけるAMPKの関与を追究した。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を用いて、筋管細胞への分化に及ぼすAMPKの影響を検討した。カフェイン刺激によるAMPKの活性化は、SIRT1タンパク発現に影響を与えなかったが、筋タンパク量ならびに筋管サイズを減少させた。さらに、哺乳類骨格筋細胞におけるストレス応答の転写因子である熱ショック転写因子1(HSF1)の欠損ならびに損傷骨格筋の再生に伴いSIRT1タンパク発現は増加した。以上の結果より、骨格筋に対するSIRT活性の制御にAMPKは関与しないこと、ストレス刺激はSIRT活性の調節において重要な役割を担っていることが示唆された。本研究は、運動に対する骨格筋可塑性応答におけるSIRTの役割を追究すると共に、「運動が寿命を延ばすのか」という命題についての回答を得ることを目的として3か年計画で実施される。2年目に当たる平成27年度は、培養骨格筋細胞を用いたSIRT活性調節におけるAMPKの役割ならびにストレス応答の役割を明らかにする計画であったが、その目的は概ね達成できている。したがって、おおむね順調に推移していると判断している。

SIRTは、様々な細胞ストレスに対する防御機構を賦活化し、老化に伴う疾患を予防することで寿命延長に働くと考えられている。しかし、エネルギーを多量に消費すると共に、活性酸素などの種々の代謝産物を発生する「運動」と言う刺激に対するSIRTの応答は不明な点が多く残されている。そこで本研究では、運動に対する骨格筋可塑性応答におけるSIRTの役割を追究することを目的とした。本研究の目的を達成するために3年計画で研究を遂行し、平成28年度はその最終年度の3年目に当たる。昨年度に引き続き、SIRT活性の制御におけるAMP活性化タンパクリン酸化酵素(AMPK)の関与について検討した。昨年までの結果より、AMPK活性の抑制は骨格筋を肥大させたことから、本年度はAMPK活性低下の影響を中心に追求した。その結果、AMPK活性の抑制は荷重除去による廃用性筋萎縮を軽減したが、SIRT1タンパクならびにPGC1aタンパクの発現には影響を与えなかった。また、荷重除去による廃用性萎縮自体もSIRT1タンパク発現に影響を与えなかった。一方、AMPK活性化は筋タンパク量を低下させたものの、SIRT1タンパク発現量に変化は認められなかった。以上の結果より、骨格筋の可塑性発現応答にはSIRT活性そのもの自身の関与は低いことが示唆された。「運動は寿命を延ばすのか?」という疑問に対して、未だ明確な回答は得られていない。運動刺激の種類や強度は多種多様であり、こうした刺激に応じて生体は効果の発現あるいは障害の発生など適応を示す。つまり、運動刺激を受容し、その種類や強度を認識し、最適な適応を発現するシステムの存在が示唆されるが、その実体は不明である。本研究では、長寿遺伝子サーチュイン(SIRT)に、運動刺激に対する骨格筋応答におけるSIRTの役割を追究することを目的とした。実験動物ならびに培養骨格筋細胞を対象として検討した結果、運動刺激に対する骨格筋の適応現象にSIRTそのもの自身の関与は低いことが示唆された。本研究は、運動に対する骨格筋可塑性応答におけるSIRTの役割を追究すると共に、「運動が寿命を延ばすのか」という命題についての回答を得ることを目的として3か年計画で実施される。研究初年度である平成26年度は、加齢マウスの実験を行うための飼育開始ならびに骨格筋量の変化に対する骨格筋SIRTならびにAMPKの挙動を明らかにする計画であったが、その目的は概ね達成できている。したがって、おおむね順調に推移していると判断している。3か年の研究計画の最終年に当たる平成28年度は、これまで2か年の研究成果を基にして、加齢マウスを用いて、加齢ならびに運動刺激がSIRT活性に及ぼす影響を検討ことで、骨格筋におけるSIRTの生理学的意義を追究する。得られた結果は取りまとめ、適宜その成果は発表していく計画である。骨格筋生理学3か年の研究計画の2年目に当たる平成27年度は、平成26年度の研究成果を基にして、骨格筋細胞の増殖と分化におけるSIRT1およびAMPK活性の生理学的意義を追究する。マウス筋芽細胞由来C2C12細胞を用いて、C2C12細胞の増殖および分化に及ぼすSIRTならびにAMPKの影響を検討する。
EPR増強剤 iNaDを用いた革新的医療技術の開発

申請者はスーパーアパタイト(sCA)ナノ粒子をDDSとして癌や炎症性疾患に対する核酸治療法を開発してきた。本研究では、1難治性癌に対する核酸医薬の創出とコンパニオン診断用の組織細胞バンクの立ち上げ、2EPR増強作用を利用したsCAと各種抗腫瘍物質との併用療法と低侵襲治療法の開発、3臓器線維症に対する核酸医薬の創出、4sCAの問題であった肝集積や、腫瘍集積限界などの問題を解決する臨床利用できるDDSとしてiNaD (inorganic nanoparticle drug)を完成することを目的とした。1ー4のすべての項目でほぼ計画通りの進歩があった。1について疾患毎の各論は次項で記述する。どの核酸医薬がその患者に効くかという核酸医薬のコンパニオン適合診断キットを作成を念頭に置いて、大腸癌の患者組織から二次元培養系を確立した。3次元スフェロイド培養は容易であるが、これは癌幹細胞分画を濃縮した状態となっており臨床癌を反映するものではない。継代のため癌幹細胞を少量混じてはいるが、大部分は分化した娘細胞からなる臨床癌を模倣した二次元培養系を確立してバンク化している。これは容易ではなく100%の確率で樹立できるようになるのに数年を要したが平成30年度にこの技術を完成した。2では、iNaDと抗癌剤、高分子製剤の優れた併用効果を実証できた。3肺線維症、肝線維症の動物モデルを再現性をもって作成できるようになり、肺線維症(兵庫医科大)については樹状細胞を回収しRNA, miRNAseq解析を始めている。4sCAには、肝集積や再凝集、腫瘍集積性が不十分などの問題があり、臨床用のDDSとしてsCAとは素材から異なる新しいDDSであるiNaDを完成した。これにより従来の10分の1の核酸量でより強い抗腫瘍効果が得られ、肝臓をはじめとする正常組織への集積は全くみられないようになった。難治性癌に対する新規核酸医薬の探索に関して次に記述する。食道癌(阪大):細胞株4種類をRNAseqに提出。コントロールとして正常食道上皮を用いる。乳癌(兵庫医科大):トリプルネガティヴ乳癌8例、正常乳腺2例をRNA seqに提出。肝細胞癌(阪大):CpG核酸はiNaDに内包するとIFNαを分泌し肝細胞癌に著効することがマウス担癌モデルで分かった。大腸癌(阪大):NFkB阻害核酸がKRAS変異癌に著効することが分かり論文化した。胃癌(名古屋市大):腹膜播種モデル、survivin+シスプラチンをルシフェラーゼを発光するMKN45を用いて検討中。胆管癌(福島医大):microarrayに臨床サンプルを提出。低侵襲治療に関する進捗としては、sCAにICGを内包させて近赤外線光を照射する光線力学療法を完成させて論文にした。γFe2O3をマウス腫瘍に局注して交流磁場を印加する温熱治療を施す系で、sCAに内包した方が高い抗腫瘍効果を認めた。BNA核酸であるBcl2アンチセンスの設計は阪大・小比賀先生が設計した32種類から最終4種類に絞り込むところまで進めることができた。研究領域が多様であるため犬の肉腫モデルなど一部手つかずになっているところはあるが概ね各分野でまずまずの進捗がみられ概ね順調といえる。2年目は1年目に進行させた各課題を継続して推進する。1年目に手が回らなかったsCAとP-Znppによる光線力学療法(熊本大学)、Bcl2アンチセンス(阪大薬学)との併用などを2年目は重点的に行う。γFe2O3に対する電磁波照射では、局注ではなくマウスへの全身投与を検討する。2年目から3年目にかけて犬肉腫モデル(東大)と人の肉腫サンプル(大阪国際がんセンター)の両面から新規の核酸医薬を探索する。腎臓がんや尿管がんなどの泌尿器系の癌の治療薬も創出する(大阪国際がんセンター)。iNaDの原材料に関してはサルを用いた安全性試験を行う。また粒子製造過程における低コスト化と大量生産系を確立する。

3肺線維症、肝線維症の動物モデルを再現性をもって作成できるようになり、肺線維症(兵庫医科大)については樹状細胞を回収しRNA, miRNAseq解析を始めている。4sCAには、肝集積や再凝集、腫瘍集積性が不十分などの問題があり、臨床用のDDSとしてsCAとは素材から異なる新しいDDSであるiNaDを完成した。これにより従来の10分の1の核酸量でより強い抗腫瘍効果が得られ、肝臓をはじめとする正常組織への集積は全くみられないようになった。難治性癌に対する新規核酸医薬の探索に関して次に記述する。食道癌(阪大):細胞株4種類をRNAseqに提出。コントロールとして正常食道上皮を用いる。乳癌(兵庫医科大):トリプルネガティヴ乳癌8例、正常乳腺2例をRNA seqに提出。肝細胞癌(阪大):CpG核酸はiNaDに内包するとIFNαを分泌し肝細胞癌に著効することがマウス担癌モデルで分かった。大腸癌(阪大):NFkB阻害核酸がKRAS変異癌に著効することが分かり論文化した。胃癌(名古屋市大):腹膜播種モデル、survivin+シスプラチンをルシフェラーゼを発光するMKN45を用いて検討中。胆管癌(福島医大):microarrayに臨床サンプルを提出。低侵襲治療に関する進捗としては、sCAにICGを内包させて近赤外線光を照射する光線力学療法を完成させて論文にした。γFe2O3をマウス腫瘍に局注して交流磁場を印加する温熱治療を施す系で、sCAに内包した方が高い抗腫瘍効果を認めた。BNA核酸であるBcl2アンチセンスの設計は阪大・小比賀先生が設計した32種類から最終4種類に絞り込むところまで進めることができた。研究領域が多様であるため犬の肉腫モデルなど一部手つかずになっているところはあるが概ね各分野でまずまずの進捗がみられ概ね順調といえる。2年目は1年目に進行させた各課題を継続して推進する。1年目に手が回らなかったsCAとP-Znppによる光線力学療法(熊本大学)、Bcl2アンチセンス(阪大薬学)との併用などを2年目は重点的に行う。γFe2O3に対する電磁波照射では、局注ではなくマウスへの全身投与を検討する。2年目から3年目にかけて犬肉腫モデル(東大)と人の肉腫サンプル(大阪国際がんセンター)の両面から新規の核酸医薬を探索する。腎臓がんや尿管がんなどの泌尿器系の癌の治療薬も創出する(大阪国際がんセンター)。iNaDの原材料に関してはサルを用いた安全性試験を行う。また粒子製造過程における低コスト化と大量生産系を確立する。
言語学的失語症学からみた否定表現に関する日英語文法対照研究

生成文法理論をもちいて、日英語の否定表現について、言語学的失語症学の立場から対照研究を行うことを目的とした。今年度は研究対象項目を否定表現に絞り、文法障害をもつ失語症患者(特に失文法患者)に対して、調査・実験を行った。英語の否定表現については、Ladusaw 1983,Linebarger 1987,1992を検討した結果、一般には、複文における否定対極表現の文容認性判断は困難であることが分かった。一方、日本語では、その構造上の理由から、複文における否定対極表現は不可能であることから、単文を用いて実験を行った。結果は、同一節内での否定対極表現と否定辞との照合についての文容認性判断は、良好であることが分かった。この結果は、Hagiwara(1995)(平成6年度科研費による成果)で提案された「経済性の仮説」(失文法失語の言語では、文構築に関与する合併という操作の数が少なければ少ない構造ほど保持されやすい)を支持するものであった。つまり、英語における否定表現の困難さは、合併という操作の数が多い大きい構造をもつ複文だからであり、日本語で良好な原因は、合併の数の少ない単文であることに起因すると考えられる。
光照射による創傷治癒のメカニズムを解明する

Melanopsinの発現はヒト皮膚表皮および毛包、真皮において認められた。ウェスタンブロッティング法においてもその発現が確認された。培養線維芽細胞に対して450nmの光線を照射した場合、非照射群に比して2分、5分、10分では経時的にERKのリン酸化は亢進した。一方、570nmの光では光照射によるERKのリン酸化の亢進は450nmの照に比して小さく、むしろリン酸化の程度は減弱した。これ射たらの波長の光を同時に照射し所、リン酸化は450nmの時に比してさらに更新した。生物は特化された受容器(感覚器)を用いて光を受容する。この受容器は主に眼や松果体など、中枢神経系に属している。一方で紫外線の照射はメラノサイトを刺激し、メラノジェネシスを活性化することは既に明らかであるように、皮膚も光に応答する。われわれはMelanopsinに注目し、皮膚は光を受容するか否かの検討を行った。ヒト皮膚に対し、抗Melanopsin抗体を用いて免疫組織染色を行った。またヒト皮膚をホモジェナイズし、これに対してウェスタンブロッティング法を用いてMelanopsinの発現の有無の検討を行った。さらにヒト培養線維芽細胞を暗条件下で培養したのち、LEDを光源とする450nmおよび570nmの照射装置を用いて、光照射を行い、抗リン酸化ERK抗体を用いたウェスタンブロッティングを定量的に行った。450nmの光線を照射した場合、非照射群に比して2分、5分、10分では経時的にERKのリン酸化は亢進した。一方、570nmの光では光照射によるERKのリン酸化の亢進は抑制された。450nm, 570nmの両方の光を照射した場合、リン酸化は450nm単独の照射よりも更に更新した。Melanopsinは下等脊椎動物の色素胞より同定されており、進化の過程で高等脊椎動物の皮膚においても保存されていた可能性がある。またMelanopsinに感受性のある450nmの光を照射する事でERKのリン酸化が亢進することよりヒト皮膚においてMelanopsinを介した光受容機構が存在する事が示唆された。また、RT-PCRの結果より、新たなsplicing variantの存在が示唆された。(1)皮膚におけるMelanopsinの発現解析1.腫瘍切除術などに伴い廃棄される余剰なヒトの正常皮膚を用いて組織切片を作成し、抗Melanopsin抗体を用いた免疫組織化学的手法により正常ヒト皮膚におけるMelanopsinの発現および発現している場合、その局在について検討を行った。Melanopsinは表皮に瀰漫性に強い発現を認めた。また真皮では線維芽細胞にも発現が認められた。2.上記と同様に手術時に得られた正常ヒト皮膚からmRNAを抽出し、cDNAに逆転写を行いcDNAライブラリーを作成した。これに対してmelanopsin(opn4)に対するPCRプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、目的とするバンドが得られた。また本cDNAを用いてreal time PCRを行ったところ、コピー数は多くはないが発現が確認された。3.上記と同様に手術時に得られた正常ヒト皮膚をホモジェナイズし、タンパク質を抽出した。これに対して抗Melanopsin抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、タンパク質レベルでもその発現が確認された。4.ファイブロブラスト、メラノサイト、ケラチノサイトそれぞれを培養し、mRNAおよびタンパク質を抽出し、上記2,3と同様の実験を行ったところ、いずれからも発現が認められたが、特にメラノサイトで強い発現が認められた。5.培養線維芽細胞を暗条件下で培養を行った後、青色光および黄色光を照射し、経時的にERKのリン酸化を定量的に測定した。特に青色光では照射時間とともにERKのリン酸化が進む傾向が認められた。当初の予定では正常皮膚および線維芽細胞におけるmRNAおよびタンパク質レベルでの発現解析の確認を行うこととしていたが、これらの確認が行えた上、生化学的に光照射により細胞内シグナリングが活性化される事が確認された。以上より、当初の計画以上に伸展していると判断した。H23年度ではヒトの皮膚におけるMelanopsinの発現が確認され、また、光照射によりbFGFなどの細胞増殖因子のシグナルトランスダクションの下流にあるERKのリン酸化の亢進が確認された。一方で、9-cis retinalを添加する事で光照射なくともリン酸化が亢進されることも明らかとなった。さらに照射光の波長およびretinalの添加の有無で生化学的な挙動に差が認められる事も確認された。

これらのデータから整合性のある考察はいまだ導きだされておらず、ファクターを一つずつ変化させて行きながらMelanopsinによる光受容の生物学的意義の検証を行う。RNA干渉等の系の確立も必要となる見込みである。なお、当初購入予定であったCO2インキュベーターについては既設の物を整備したところ十分に使用可能となり、また、H24年度ではより精密な細胞培養実験や分子生物学的実験、生化学実験が必要となる為、残額を技術補佐員の雇用費に当てることとした。1.培養線維芽細胞における光照射の影響の検討:450nmと570nmの光をLED照明装置を用いてそれぞれを細胞に照射する。これによりERKのリン酸化の程度を抗リン酸化抗体ー化学発光法を用いて生化学的に定量する。経時的定量と照射パターンの解析(450nm、570nm単独、または同時照射)とを行う。2.ERKの反応がMelanopsinに由来する事の証明:培養線維芽細胞に対してsiRNAを用いてMelanopsinのmRNAを干渉し、発現の抑制を行う。これにたいして光照射を行い、ERKのリン酸化の検討を行う。また、Gタンパク質に対しても同様にRNA干渉を行い、発現抑制をさせた上での光照射の影響の検討を行う。これらの研究を行う上で遺伝子操作、生化学実験では相当額の試薬費を要する。また、siRNAのプローブの作成は外注となり、比較的高額である。さらに技術補佐員を雇用し、実験操作の一部を担当させる為に、雇用費が必要となる。加えて、これらのデータを速やかに国際誌に投稿するため、英文校閲費や投稿にかかる費用も要する。