hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高配向・高密度カーボンナノチューブの自己組織化形成とナノデバイス応用

本研究により得られた成果は以下のとおりである。1.SiC表面構造がCNT成長に及ぼす影響についてSiC表面構造がCNT成長に及ぼす影響について透過型電子顕微鏡(TEM)と走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて研究を行った。Sic(000-1)C面を低真空中で1700°C、1時間加熱する前に、超高真空中で1050°C、30分間加熱を行った場合には、CNTの成長は見られず数層のグラファイトが成長していることがTEM観察によりわかった。しかし、超高真空中での加熱温度が1200°Cの場合にはCNTが成長した。この時の表面形態をSTM観察したところ、1200°Cの場合はSiC表面にdomain間にcap構造を持ったグラファイト層が形成されていることがわかった。このcap構造はCNTの先駆体であると考えられる。1050°Cの場合には、欠陥のほとんどないグラファイト層が観察された。これは、cap構造が形成されていないため、この後低真空中で加熱を行っても、CNTの先駆体となるものがないためCNTが成長しなかったのではないかと考えられる。2.昇温速度がCNT成長に及ぼす影響についてSiC(000-1)C面を超高真空中1200°Cで加熱した後、低真空中で1700°Cまで急速に昇温したとき、SiC基板上にアモルファスカーボン層が形成され、その層の上にCNT層が形成された。この基板をさらに加熱したとき、CNT層は成長せずアモルファスカーボン層のみが広がった。また、SiC基板上にアモルファスカーボン層をあらかじめ蒸着させた後、低真空中で加熱を行った場合、CNT層の形成は見られなかった。これらの実験結果から、アモルファスカーボン層が、CNTの成長を抑制する働きをすることがわかった。SiC表面分解法において、CNTがSiCの結晶構造を利用して成長していると考えられるので、アモルファスカーボン層の形成により、CNTがSiCの結晶構造を引き継いで成長することが困難になり、その結果、CNTの成長が抑制されたのではないかと考えられる。カーボンナノチューブ(CNT)に関連した研究は、その物理的、化学的な性質を解明しようとする基礎的観点と電気素子としての応用的観点の双方からその重要性が認識され、最近数多くなされている。このような状況の中で、楠等はSiC(000-1)C面を低真空中でアニーリングすることにより高密度のCNTが形成されることを見出した。さらに興味深いことに、SiC(0001)si面(C面の裏側)ではCNTは生成されずグラファイト層が形成される。C面でのCNT生成メカニズムやなぜSi面ではCNTができずグラファイト層ができるのかはまだわかっていない。したがって本研究では、SiC(000-1)面上でのCNT生成メカニズムの解明を目指す。さらにSiC表面をレーザー照射やイオンビーム照射により表面変性することにより、CNTの自己組織的な生成制御を試みる。本年度は、走査トンネル顕微鏡によるSiC(000-1)面上でのCNT生成過程の解明を目指した。さらに、イオンビーム照射によるSiC表面変性効果を調べるためのイオンビーム照射系の作製を行った。SiC(000-1)を超高真空中でアニーリングを行った結果、CNTの成長は見られず数層のグラファイトが成長している様子が観察された。

このとき形成されたグラファイトは大きさ10-50nm程度のdomainに分かれており、domain間にprotrusionが見られた。このprotrusionがCNT生成における前駆体ではないかと考えられるが、詳細は不明である。さらに、グラファイトが成長したSiC(000-1)面を低真空中でアニーリングしても、CNT生成は見られなかった。このことから、グラファイトがCNTの形成を阻害していると思われる。カーボンナノチューブ(CNT)に関連した研究は、その物理的、化学的な性質を解明しようとする基礎的観点と電気素子としての応用的観点の双方から、数多くなされている。CNT生成方法の一つであるSiC表面分解法が共同研究者の楠により発見された。この方法ではSiC(000-1)C面を低真空中でアニーリングすることにより高密度のCNTが形成される。さらに興味深いことに、SiC(0001)Si面(C面の裏側)ではCNTは生成されずグラファイト層が形成される。しかしc面でのCNT生成メカニズムやなぜSi面ではCNTができずグラファイト層ができるのかはまだわかっていない。そこで本研究では、SiC(000-1)C面上でのCNT生成メカニズムの解明を目指す。さらにSiC表面をレーザー照射やイオンビーム照射により表面変性することにより、CNTの自己組織的な生成制御を試みる。本年度は、SiC表面構造がCNT成長に及ぼす影響について透過型電子顕微鏡(TEM)と走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて研究を行った。SiC(000-1)Cを低真空中で1700°C、1時間アニールする前に、超高真空中で1050°C、30分間アニールを行った場合には、CNTの成長は見られず数層のグラファイトが成長していることがTEM観察によりわかった。しかし、超高真空アニール温度が1200°Cの場合にはCNTが成長した。超高真空アニール時の表面形態をSTM観察したところ、1200°Cの場合はSiC表面にdomain間にcap構造を持ったグラファイト層が形成されていることがわかった。このcap構造はCNTの先駆体であると考えられる。1050°Cの場合には、欠陥のほとんどないグラファイト層が観察された。これは、cap構造が形成されていないため、この後低真空アニールを行っても、CNTの先駆体となるものがないためCNTが成長しなかったのではないかと考えられる。優れた電気的あるいは機械的特性を持つ炭素系材料が注目を集めており、最近ではカーボンナノチューブ(CNT)がもっとも注目されている。その理由として、CNTが直径、長さ、螺旋率や層数などの自由度を持っていることが挙げられる。これらの構造因子を制御することができれば種々の物性を引き出すことができ、それらに応じた広範囲な応用が期待できる。SiC(000-1)C面でのCNT生成メカニズムについてはまだ明らかにされていないので、透過型電子顕微鏡を用いてそれを明らかにすることを本年度の目的とした。SiC(000-1)C面を超高真空中1200°Cでアニールした後、低真空中1700°Cまで急速に昇温したとき、SiC基板上にアモルファスカーボン層が形成され、その層の上にCNT層が形成された。
木質材料から見た飾大刀の変遷-大刀の変遷と用材の選択-

本研究では、奈良県斑鳩町に在る「藤ノ木古墳」から出土した刀剣類の樹種同定を中心に、古墳時代の刀剣類の用材を調べることに重きをおいた。藤ノ木古墳からは、大刀5振・剣1本・刀子5本が出土しており、これらの遺物に残る木質を部位別に採取し、樹種同定をおこなった。大刀・剣の部位は、柄頭・柄間・柄縁・鞘口・鞘・鞘尻に、刀子は柄と鞘とに区分した。その結果、大刀1の柄間と鞘尻はツゲ・鞘はヒノキであった。大刀2は、柄部分頭は被覆した金銅板等の残存状態が良好で、樹種同定できなかった。鞘・鞘尻付近とも二葉松であり、遺物のX線撮影の結果からも一木でできていると判断された。大刀3は柄頭・柄間・鞘尻はツゲ・鞘はヒノキであった。大刀4は柄頭・柄間はツゲ・鞘はシイ属であった。大刀5は柄頭・柄縁・鞘口ともツゲであった。剣は柄頭・柄縁・鞘口・鞘尻ともツゲであった。刀子は内1本が完形品であり同定ができなかったが、あとのものは柄がツゲ・鞘がヒノキであった。以上の結果から、古墳時代の刀剣類は必ずしも柄と鞘とに同じ材を使っているわけではなく、むしろ木材の特性を活かした使い分けをし、朝鮮半島系と言われている円頭大刀(大刀2)には日本では良材とはされていないマツが使われていることも、この形態の大刀の意味を考える上で貴重なデータとなろう。現在奈良県下の遺物を調査中であるが、宮崎・東北の各県の資料も集まりつつあり、今後全国規模の息の永い研究にしていくつもりである。
高比推力・長寿命ホールスラスタの開発研究

本研究では、ホールスラスタの高電圧安定作動による高比推力化と長寿命化を目指し、5-25kW級ホールスラスタ開発のための基礎データを提供する。放電室直径100mmクラスのホールスラスタの放電電圧を高くすることで、小型でありながら高比推力化を試みた。耐久性に若干問題があったが、比推力3000秒以上、推進効率60%以上という数値を記録した。これは現時点で放電室直径100mmクラスのホールスラスタでは日本初となる。本研究では、ホールスラスタにおいて3,000秒以上の高比推力と10,000時間以上の長作動寿命を同時に達成するために、性能測定実験、プラズマ物理量測定実験、寿命診断実験とプラズマ粒子法による数値計算を併用し、1.加速チャネルの材質を変更し壁近傍のシースプラズマ特性を変化させる、2.壁近傍の印加磁場の特性を変化させることによりイオンのチャネル壁面衝突を極端に防ぐことができる最適なイオン加速状態を実現することを目指した。1.ロシアSPT100と同じ形状を持つホールスラスタを設計・製作した。これまでの実験結果とプラズマ流れ場の数値計算を参考にし、電力レベル12kWのスラスタを設計した。加速チャネルの材質、陽極形状・位置は変更可能とし、さらに磁場形状・強度は補助磁場コイルを複数配置し自由に変化させた。2.推進剤にキセノンを用いて、放電電圧(2001,200V(比推力3,000秒以上達成可能))と推進剤質量流量をパラメータとして変化させ、推力、放電電流、加速チャネル損耗量を測定した。得られた結果より、比推力、推進効率を見積もった。加速チャネルの材質(BN, BNAIN, BNAlO_2,AlN, Al_2O_3に変更、成分の傾斜機能化)と磁場形状・強度を変え、それらの最適条件を調べた。3.得られた結果から、ホールスラスタ放電室内部、特に加速チャネル壁近傍、及び下流の噴出流の状態を考察しプラズマ生成、イオン加速過程を推定すると共に、それらの結果と推進性能・加速チャネル損耗特性との相関関係を検討した。定量的な検討を十分行うと共に、高比推力化、長寿命化のための最適なイオン加速過程が実現できる作動条件を探索した。(1)推進剤にキセノンを用いて、放電電圧(2001,200V(比推力3,000秒以上達成可能))と推進剤質量流量をパラメータとして変化させ、推力、放電電流、加速チャネル損耗量を測定した。得られた結果より、比推力、推進効率を求め、比推力3,500秒、推進効率6O%の達成を確認した。こうして定量的な検討を十分行うと共に、高比推力化、長寿命化のための最適なイオン加速過程が実現できる作動条件を探索した。(2)3次元プラズマ粒子シミュレーションにより、ホールスラスタの放電室内部、特に加速チャネル壁近傍、及びその下流の噴出流の状態を調べた。放電状態、プラズマ生成・イオン加速過程、加速チャネル損耗状態を考察した。(3)計算結果と昨年度得られた実験結果を比較検討、最適作動条件を最終提案し、ホールスラスタ実験機の改良点を決定した。本研究では、ホールスラスタにおいて3,000秒以上の高比推力と10,000時間以上の長作動寿命を同時に達成するために、性能測定実験、プラズマ物理量測定実験、寿命診断実験とプラズマ粒子法による数値計算を併用した。1.加速チャネルの材質を変更し壁近傍のシースプラズマ特性を変化させる、2.壁近傍の印加磁場の特性を変化させることによりイオンのチャネル壁面衝突を極端に防ぐことができる最適なイオン加速状態を実現することを目指した。1.アノードレーヤー型ホールスラスタを新たに試作し高電圧作動実験を行った。推進剤にキセノンを用いて、放電電圧(200600V)と推進剤質量流量をパラメータとして変化させ、推力、放電電流、加速チャネル損耗量を測定した。得られた結果より、比推力、推進効率を求め、比推力2800秒、推進効率40%の達成を確認した。2.比推力は2000-2800秒の範囲であり、最も値が低かったのは放電電圧300V時であり、最も値が高かったのは放電電圧550V時であった。この時、推力60-80mNを記録した。推進効率は最大41.6%であり、これは設計の想定

放電電圧が400Vまでであるため、それ以上電力を投入しても効率が悪化したことによる。3.噴射プラズマ流は外側のアノードから融解したことから、外周方向発散していたと推測される。400Vを超える高電圧作動の実現には高度な電気絶縁技術が必要であり、多くの工夫を施し成功した。そのために要した時間が予想外に長く、プラズマ診断の時間が十分に取れなかった。しかしながら、当初目的を超える比推力3,500秒、推進効率60%が得られ、性能的には満足している。24年度が最終年度であるため、記入しない。性能的には十分な数値が得られたので、次は長寿命化のために、引き続きプラズマ診断測定、数値シミュレーションを十分行い、最適作動条件を探索、修正していく予定である。
自立生活運動と事業の展開における非障害者のソーシャルワーク実践に関する研究

日本の自立生活センターは、地域移行・地域生活支援拠点の1つとしてその多くが法人格を有し、事業を展開するに至っている。その運動と事業は、障害当事者主体で運営されながらも、同時に、そこで働く非障害者の社会福祉専門職者の実践と果たす役割があって成立してきた側面もある。本研究は、障害者運動と事業展開を長年果たしている法人に焦点をあて、自立生活運動と自立生活センターが日本の社会福祉制度下においてどのように定着し、事業展開され、そこで働く非障害者がどのようなソーシャルワーク機能を発揮しているのかを明らかにするものである。
エナメル芽細胞と象牙芽細胞の分化と相互作用に関する免疫組織化学的研究

本研究によって以下の結果が得られた。(1)体外免疫法によってハムスタ-又はラット臼歯の歯胚のホモジネ-トを抗原として、歯胚を構成する細胞または間質成分を特異的に染色するいくつかのモノクロ-ナル抗体が得られた。(2)これらの抗体は歯胚の発生、分化を追求するために有用なものであり、体外免疫法による歯胚のホモジネ-トに対する抗体の作製法が有効な方法であることがわかった。(3)En3抗体は、ウエスタンブロッティングによる分析の結果アメロゲニンを認識することがわかった。(4)En3抗体を用いてラット臼歯の歯胚を免疫組織化学的に詳細に検索し、以下の結果を得た。1)En3抗体による染色性は、最初に前期の前エナメル芽細胞に認められ、その細胞内局在は蛋白分泌経路の細胞内小器官であった。2)前エナメル芽細胞に相対する象牙前質、象牙芽細胞の細胞間隙、象牙芽細胞層直下の歯乳頭にEn3抗体に陽性のstippled materials様構造物が認められた。3)象牙芽細胞の細胞間隙にあるEn3抗体に陽性のstiーppled materials様構造物に接して被覆小窩が認められた。4)象牙芽細胞内部のラインゾ-ム中にEn3抗体の陽性反応が認められた。5)2)4)の所見は、形成期エナメル芽細胞に相対する部位ではほとんどみられなかった。6)ラット臼歯歯冠のエナメル欠如域のエナメル芽細胞様細胞は形態的には末分化であるが、アメロゲニンを分泌しており、象牙芽細胞の機能または象牙質の石灰化に何らかの寄与をしていることが示唆された。7)1)6)の所見より、前エナメル芽細胞により合成分泌されたアメロゲニンが、象牙芽細胞の分化または機能に何らかの影響を与えていることが示唆された。(5)ラット臼歯歯胚の器官培養系にEn3抗体を加えると一部の試料で歯冠の形成異常が見られた。しかし、この効果は再現性が乏しいため、現在実験条件を検討中である。(6)En3抗体を腹腔内投与すると、歯胚の免疫染色が切片染色より高い感度で行えることが分かり、この方法は免疫組織化学に広く応用できることが認められた。※成果の公表を見合わせる必要がある場合は、その理由及び差し控え期間等を記入した資料を添付すること。われわれの、アメロゲニンに対するモノクロ-ナル抗体を用いた歯胚の発生分化に関する免疫組織化学的研究で、未分化なエナメル芽細胞がアメロゲニンを合成分泌し、象牙芽細胞層を含む歯乳頭方向に浸透し、一部は未分化な象牙芽細胞によってとりこまれていることを観察した。この観察所見より、アメロゲニンがエナメル質基質の主要な構成成分として機能するだけではなく、象牙芽細胞の分化にも何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。そこで本研究では、(1)器官培養頭件下での歯胚にアメロゲニンに対すモノクロ-

ナル抗体を大量に加えてアメロゲニンの象牙芽細胞への取込みをブロックすることによってアメロゲニンの象牙芽細胞への影響を検討すること、(2)象牙芽細胞表面のアメロゲニン・リセプタ-の存在の有無と、培養条件下での象牙芽細胞に対するアメロゲニンの生理的作用の検索をおこなうことを本研究の目的としている。本年度は(1)胎生18日19日のマウス胎仔より臼歯歯胚を摘出し、最適器官培養条件の探求をおこなった。その結果、MillicellーHA(ミリポア)中で10%FCS添加DMEM培地を用い、50%O_2、45%N_2、5%CO_2、37°Cの条件がエナメル質、象牙質の形成状態が最もよいことがわかった。(2)この条件下で、培地中に抗アメロゲニンモノクロ-ナル抗体En3を添加すると抗体は歯胚中に浸透し、エナメル芽細胞が分泌するアメロゲニンに結合してその部に沈着することが、歯胚切片に螢光標識2次抗体に用いて示された。(3)200μg/mlのEn3抗体を培地に添加すると象牙質の形成抑制が見られた。今後例数を増やしてこのことを確かめるとともに、En3抗体の象牙芽細胞の分化と象牙質形成に対する影響をさらに詳細に検討したい。(4)一方、新生仔マウスの腹腔にEn3抗体を注射したところ、in vitroと同様の影響があることを示唆する結果も得られているので、この方法による実験もさらに継続したい。ラット臼歯歯冠のエナメル欠如域が全くエナメル質を欠くか否かを調べるため、14日齢ラットの第一臼歯について、抗アメロゲニン抗体En3を用いて、光顕および電顕レベルの免疫組織化学的方法で検索した。1日齢では、咬頭頂部に、丈の低く極性の見られない未分化エナメル芽細胞様細胞が見られた。これらの細胞は外エナメル上皮細胞に近接していた。ヘマトキシリン・エオジン染色標本の通常の光顕観察では、エナメル欠如域にヘマトキシリン陽性のエナメル質基質は観察されなかったが、免疫螢光染色では象牙質と未分化エナメル芽細胞様細胞との間にほぼ連続的なアメロゲニンの陽性反応が観察された。また、この部分では免疫反応陽性物質の歯髄方向への浸透現象が観察された。4日齢では、前頭方向及び水平方向の切片で、エナメル欠如域の象牙質と未分化エナメル芽細胞様細胞の間にほぼ連続的なアメロゲニンの陽性反応が観察された。しかし、免疫反応陽性物質の歯髄方向への浸秀現象は観察されなかった。電顕レベルの免疫組織化学的方法では、免疫反応陽性物質は未分化エナメル芽細胞様細胞のゴルジ装置、象牙質と未分化エナメル芽細胞様細胞との間の無構造物質、未分化エナメル芽細胞様細胞の細胞間隙のエナメル基質様物質に認められた。未分化エナメル芽細胞様細胞の遠心端はト-ムスの突起は無く、基底膜も認められなかった。以上の観察所見より、未分化エナメル芽細胞様細胞は分泌細胞に分化し、アメロゲニンを含む物質を合成して未分化エナメル芽細胞様細胞と象牙質の間隙に分泌することを示唆している。アメロゲニンの歯髄方向への浸透現象は、未分化エナメル芽細胞様細胞と象牙芽細胞との相互作用または、象牙前質の石灰化の開始に何らかの役割を果たしているのかもしれない。ラット臼歯歯胚の器官培養系にEn3抗体を加えると一部の試料で歯冠の形成異常が見られた。しかし、この効果は再現性が乏しいため、現在実験条件を検討中である。また、En3抗体を腹腔内投与すると、歯胚の免疫染色が切片染色より高い感度で行えることが分かり、この方法は免疫組織化学に広く応用できる事が確かめられた。
核酸塩基多量体における多彩な光化学過程の量子化学的追究

核酸塩基及びその多量体に光安定性をもたらすとされる超高速な無輻射失活過程の機構を分子レベルで解明することを目的とし、分子軌道法による電子状態計算並びに分子動力学法によるシミュレーション計算を遂行した。その結果、特に尿酸やチミンについて、その光物理的挙動が少数の水素結合の影響により大きく変化することを明らかにした。これは、塩基多量体の光化学過程においても水素結合が本質的な役割を果たしうることを示唆する重要な成果である。核酸塩基多量体の光化学的・光物理的性質について系統的かつ分子レベルで理解するための基礎として、塩基の単量体及びその水和クラスターで起こる光化学過程について、分子軌道法による電子状態計算並びに分子動力学法によるシミュレーションを用いた機構解明を推進した。まず、プリン代謝の最終生成物である尿酸における光化学過程の機構に対する一分子水和の影響について、励起状態におけるポテンシャルエネルギー曲面の高精度な量子化学計算を行うことによって検討した。特に、水分子の配位位置が異なる複数の異性体について、それらの間における光物理的挙動の違いに焦点を当てた計算を遂行した。その結果、特定の位置のカルボニル基に水分子が配位したときに励起エネルギーが著しく低下すること、そして一部の異性体では光励起後に水分子が他の位置に移動する可能性があることを明らかにした。これらの挙動は、尿酸の水和クラスターにおける共鳴二光子イオン化スペクトルの実験で見られる特異な観測結果とよい対応を示している。さらにこの結果は、光励起した核酸塩基の振る舞いが、水分子等との少数の水素結合によって劇的に変化する可能性をも示唆している。一方、DNA塩基であるシトシン及びチミンにおける高速な無輻射失活過程についての機構解明も推進した。シトシンでは、ケト体・エノール体・イミノ体という三つの互変異性体について励起状態における反応経路を詳細に検討することにより、複数の成分からなる時間分解スペクトルの合理的な解釈に成功した。チミンでは、水溶液中での無輻射失活について気相中にはない新たな機構によって起こる可能性を見出すとともに、その機構の発現において水分子との水素結合が本質的な役割を果たしていることを明らかにした。核酸塩基及びその多量体に光安定性をもたらすとされる超高速な無輻射失活過程の機構を分子レベルで解明するべく、分子軌道法による電子状態計算並びに分子動力学法によるシミュレーション計算を遂行した。特に、置換基効果や分子間相互作用が失活機構に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。まず、核酸塩基の一つであるシトシンについて、メチル化またはフルオロ化した置換体及びその互変異性体における失活過程の機構を高精度な量子化学計算によって検討した。励起状態の反応経路に沿ったポテンシャルエネルギー変化を計算して反応障壁の高さを見積もることにより、置換基の種類に依存して失活の起こり易さがどの程度変化するかを明らかにした。中でも、実際の核酸内においてとる形態であるケト体の置換体については、実験から見積もられる励起状態寿命の変化をよく説明する結果を得た。また、別の核酸塩基であるチミン、並びにそのヌクレオシドであるチミジンについて、海外の実験グループと協力し、水溶液中における無輻射失活の機構解明に取り組んだ。前年度までに実施したシミュレーション計算では、水溶液中のチミンにおいて、気相中にはない独自の反応経路を通って失活が起こる可能性を見出していた。今回の研究では、水溶液中におけるチミン・チミジンの時間分解光イオン化スペクトルを測定し、シミュレーションの結果を援用した詳細な解析を実行した。従来は、これらの分子について、気相中と溶液中のいずれにおいてもpi-pi*・n-pi*という二種類の励起状態から失活が起こると考えられていた。しかし、本研究の実験及び計算の結果は、水溶液中における失活の場合、pi-pi*状態のみから失活が起こることを強く示唆している。さらに、溶媒和による失活機構の変化においては、シミュレーションで見出した水溶液中固有の反応経路が本質的な役割を果たしていることが分かった。26年度が最終年度であるため、記入しない。化学26年度が最終年度であるため、記入しない。核酸塩基やその水和クラスターにおける光化学過程の機構解明が十分に進展した。特に、尿酸やチミンの研究を通じて、核酸塩基の光物理的挙動が少数の水素結合の影響によって大きく変化することを明らかにできた。これは、塩基の多量体についても水素結合が本質的な役割を果たしうることを示唆する重要な成果である。引き続き、核酸塩基及びその多量体における光化学過程に関する理論研究を推進する。特に、塩基分子と溶媒分子との間、あるいは複数の塩基分子間の水素結合が光化学過程の機構に及ぼす影響について、量子化学計算を用いたより詳細な検討を行う。
社交不安障害に対する認知行動療法の脳科学的基盤の解明：fMRIによるアプローチ

本研究は社交不安障害(社交不安症)の病態の解明を、脳画像を用いて行うことを目的として行った。機能的MRIでは特に社交不安障害(社交不安症)患者が自己顔写真を見て恥ずかしさを感じる「自己反省(self-reflection)」に注目した。社交不安障害(社交不安症)では、健常者に比して、自己顔に対する恥ずかしさが強く、それに対応する部位として左腹内側前頭前野が同定された。また脳構造画像研究では、島体積が小さいことを発見した。【目的】本研究は社交不安障害の病態の解明および心理療法の治療効果を脳画像を用いて行うことを目的として行っている。最初の段階として、H25年度は、社交不安障害の患者と健常者で自己意識関連情動に関するタスク等を用いてfMRIを行い、まずは病態の解明に努めることとした。【方法】社交不安障害の患者13名と健常者17名で自己意識関連情動に関するタスク等を用いてfMRIを行った。【進捗状況】現在、国立共同研究機構生理学研究所や研究協力者の慶応義塾大学仲秋の指導を受けながらデータの解析を行っている。中間解析で自己顔を認識する右前頭前野の領域の活動が社交不安障害の患者で健常者に比べて低いことなどが同定され、日本不安障害学会で報告し、奨励賞を受賞した。また最終的な解析結果は2014年6月にカナダで行われる29th CINP World Congress of Neuropsychopharmacologyで報告を予定している。また、当初H26年度に行うことを予定していた認知行動療法の治療前後での構造画像研究についても、症例報告であるが、国際学会で報告し、論文としてアクセプトされた。また本研究に関連する分野として、研究協力者とともに他の不安障害の認知行動療法および、精神疾患の脳画像研究にも従事し、それらの成果を論文、学会で報告した。【研究の意義と重要性】これまで自己顔写真を用いたfMRI研究は社交不安障害患者では行われておらず、国際的にも初の試みであり、社交不安障害患者の自己顔と他者顔の認識時の脳活動の違いをとらえられたことで、将来的には認知行動療法における注意訓練技法の改善などにも反映が期待される。【目的】本研究は社交不安障害の病態および心理療法の治療効果解明を脳画像を用いて行うことを目的としている。H26年度は、H25年度に行った、自己意識関連情動に関する課題を用いた、社交不安障害患者と健常者を対象とするfMRI実験データの解析を中心として行った。また、同時に取得した構造画像の視点からも、社交不安障害の病態解明を試みた。【進捗状況】行動データでは社交不安障害で、自己顔について、健常者よりも有意に恥ずかしさが強かったが、そのために天井効果となり、他者観察による効果の有意差は認めなかった。自己顔に対する恥ずかしさを評定しているときの脳活動として、mPFCが同定された。さらに、自己顔の写真写りのスコアが、社交不安障害では有意に低いという結果が行動データで得られたため、Brief version of fear of negatibe self evaluuation(BFNE)と、全脳で相関分析を行ったところ、mPFCが同定された。このことから、社交不安障害では自己像に対する低い自己評価と高い恥ずかしさが関連しており、それにはmPFCが関与していることが示唆された。現在投稿準備を進めている。また、構造画像も解析を進め、現在投稿準備中である。【研究の意義と重要性】自己評価の低さは自己像に対する恥ずかしさと関連が深いと考えられ、これらの脳活動部位としてmPFCが同定された。【進捗状況】H27年度はH25年度に行った自己意識関連情動に関する課題を用いたfunctional MRIの結果の解析の最終確認と、英文論文執筆を行うとともに、同時に得られた脳構造画像について、社交不安障害患者と健常者で比較し、社交不安障害患者で島の体積減少が生じていることを確認し、これについて英文論文にまとめ、投稿し、受理された。functional MRIは、社交不安障害では自己顔画像を見るときに過剰な自己反省(self-reflection)が生じており、それがmedial prefrontal cortexの働きであることを確認し、現在英文論文にまとめている。【研究の意義と重要性】社交不安障害と健常者の脳構造の差異を明らかにしたとともに、社交不安障害における過剰な自己反省のメカニズムの解明に取り組んでおり、社交不安障害の生物学的な病態が明らかとなり、将来的に有効な治療につながることを期待したい。H27年度は社交不安障害患者と健常者を比較した脳構造画像に関する英文論文を投稿し、受理された。functional MRIは解析をすすめ、論文化に着手した。本研究は社交不安症の病態の解明を、脳画像を用いて行うことを目的として行った。機能的MRIでは特に社交不安症患者が自己顔写真を見て恥ずかしさを感じる「自己反省(self-reflection)」に注目した。社交不安症では、健常者に比して、自己顔に対する恥ずかしさが強く、それに対応する部位として左腹内側前頭前野が同定された。最終年度はこの結果について英文論文にまとめ、投稿したが、受理には至っていない。この左腹内側前頭前野は他者の気持ちを推測する機能(Mentalizing)に関与する部位であり、自閉症スペクトラム障害では機能が低下していることでも有名である。

昨今社交不安症と自閉症スペクトラム障害の合併も注目されており、今回の研究成果をもとに、自閉症スペクトラム障害の社交不安症状の解明にも取り組んで行きたいと考えている。また構造画像研究では、島体積が小さいことを発見した。島は社交不安症では、過剰に活動し、内受容感覚の過敏さを引き起こすことにより症状形成に関与することが指摘されている部位である。過活動と体積減少は海馬扁桃体などでも指摘されており、海馬扁桃体領域と密接に関連する島でも同様の現象が起きている可能性があり、島に関してもさらなる研究が期待される。本研究は社交不安障害(社交不安症)の病態の解明を、脳画像を用いて行うことを目的として行った。機能的MRIでは特に社交不安障害(社交不安症)患者が自己顔写真を見て恥ずかしさを感じる「自己反省(self-reflection)」に注目した。社交不安障害(社交不安症)では、健常者に比して、自己顔に対する恥ずかしさが強く、それに対応する部位として左腹内側前頭前野が同定された。また脳構造画像研究では、島体積が小さいことを発見した。H26年度はH25年度に得られたデータの解析を中心に行った。結果は概ねまとまっており、投稿準備中である。また中間解析結果について学会発表を行った。来年度中にfunctional MRIの論文投稿を予定している。また、自閉症形質と社交不安障害の鑑別、関連などに関する検討も思案している。精神医学来年度中にfMRI構造画像解析の論文の投稿を予定している。今後、病態の治療効果との関連や社交不安を呈する他の病態との比較などを検討している。社交不安障害の患者13名と健常者17名で自己意識関連情動に関するタスク等を用いてfMRIを行った。現在、国立共同研究機構生理学研究所や研究協力者の慶応義塾大学仲秋の指導を受けながらデータの解析を行っている。中間解析結果を日本不安障害学会で報告し、奨励賞を受賞した他、2014年6月にカナダで行われる29th CINP World Congress of Neuropsychopharmacologyで報告を予定している。また、当初H26年度に行うことを予定していた認知行動療法の治療前後での構造画像研究についても、症例報告であるが、国際学会で報告し、論文としてアクセプトされた。論文投稿を次年度には予定しており、その資料整理のための賃金を確保した。資料整理のための人件費として使用する。H26年度は、fMRI研究を論文として投稿することを予定している。また、fMRI研究で得られた構造画像についても解析を行う予定である。また認知行動療法の治療前後での脳構造の変化についても研究を行う予定である。
模型を用いた森林の風致的取り扱いに関する実験心理学的研究

充分な効果をあげていない従来の森林風致施業に代わる新たな風致切取り扱い法を提案することを目的に、昨年度の成果を踏まえた上で、(1)模型によるシミュレ-ション(2)視覚心理実験による評価(3)伐採・搬出に関する検討(4)総合考察をおこなった。具体的内容とその結果は以下のとおりである。(1)については、昨年度作製の模型の改良をおこなった。シミュレ-ションは、(1)針葉樹人工林の(i)本数密度、(ii)広葉樹混入歩合、(2)針葉樹人工林皆伐時の(iii)残置木数、(iv)エッヂのグラデ-ション度合、(3)針葉樹人工林と広葉樹天然林の(v)境界のグラデ-ション度合についておこない、本モデルの再現性・操作性の優秀性と限界を確認した。(2)については、目的に応じた評価法と評価軸を(1)の各シミュレ-ション毎に設定し、シミュレ-ション結果の写真を刺激として、30名の被験者に対しておこない、各写真について風景的観点からの好ましさの度合を明らかにした。その実験結果から森林の風致的取扱いをおこなう際の知見を得た。(3)については、実際の森林(東京大学秩父演習林)を対象に、(2)の結果に基づく施業をおこなった場合の伐採・搬出の検討をおこなった。その結果、技術的には特に支障はなく、経済的にも許容の範囲であることが明らかとなった。(4)については、以上の成果と昨年度の成果を踏まえて、森林の風致的取扱いに関する新しい提案を行った。充分な効果をあげていない従来の森林風致施業に代わる新たな風致的取扱い法を提案することを目的に、(1)好ましい森林風景の整理(2)従来の風致施業の整理と問題点の明確化(3)風致的に好ましい森林目標像の提案(4)模型によるシミュレ-ションをおこなった。(1)については、定評ある森林風景の美しさの要因を写真から分析し、樹形、樹齢、樹種など従来言われていることのほか、「組合せ」が重要であることが明らかになった。(2)については、風致施業法など森林風景保全施策の基本的考え方を文献から分析し、現在の森林風景保全施策が「隠す施業」という特徴を持ち、風致の向上を目指していないことが明らかになった。(3)については、以上の結果から、風致の向上を目指す「見せる施業」を基本的考え方に据えることとし、従来取り上げられてこなかった疎林、針広混交林などを目標像として提案した。(4)については、林内景観ではマイクロカメラの精度が樹木模型の精度に比して格段に良すぎ、模型の粗が目につき、本物らしく見えないことが明らかとなった。来年度では模型の改良を行う予定である。なお、林外景観については問題がなかった。また、シミュレ-ションは樹木密度、針広混交歩合、人口林のエッヂのグラデ-ション度合などについておこなえることが確認された。
少量飲酒やコーヒー摂取による非アルコール性脂肪性肝疾患抑制効果の検討

最初の研究では、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)モデルマウスに対する、少量・中等量・多量アルコール投与の影響を調べた。その結果、少量のエタノール投与は高脂肪食負荷db/dbマウスにおいて、肝/体重比、血清AST・ALT値を有意に低下させ、肝組織における小葉内や門脈域炎症を有意に改善することが示された。次の研究では、NAFLDモデルマウスに対する、コーヒーの代表的成分投与の影響を調べた。その結果、カフェインやクロロゲン酸はCDAHFD (コリン欠乏0.1%メチオニン含有高脂肪食)負荷C57BL/6Jマウスにおいて、血清ALT値を有意に増悪させることが示された。平成26年度は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)動物モデルに対する少量飲酒の抑制効果を調べる研究の準備を行った。本実験ではエタノールを添加した飼料を使用するため、実験動物にNASHを誘導する液体飼料を準備する必要がある。NASH研究用の液体飼料はそれほど一般的でないが、Research Diets社が製造・販売していることを確認し、同社の高脂肪液体食(L10049)およびそれに対応するコントロール食(L10066)を購入した。L10049は粘稠度の高い液体飼料であるため、通常の給水ビンでは投与が困難であった。そのため、特殊な給餌装置および動物ケージを作製する必要が生じた。動物実験器具メーカーの夏目製作所に相談し、実際にL10049液体飼料を用いた実験を行って、L10049の使用に適した給餌装置および動物ケージの開発に成功した。現在、夏目製作所にて、実験を行う上で十分数の給餌装置および動物ケージを作製中であり、この5月に納入予定である。高脂肪食によるNASHの誘導に関してはマウスの系統差が見られる。そのため、C57BL/6J、db/db、KK-Ayの3種類のマウスを用いて予備実験を行い、本実験に用いる動物を決定する予定である。以上の様に、動物実験を開始する準備が現在までにほぼ終了し、この5月から本格的に動物実験に入ることが可能になった。また、生検で確認された非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)症例を用いての、少量飲酒やコーヒー摂取の影響に関する臨床的・病理学的研究については、患者に答えてもらうためのアンケートを現在作成中である。平成27年度には、少量飲酒がマウスの非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を抑制し得るかを調べるための実験を行った。9週齢、雄のdb/dbマウスを以下の3群に分けた(各群6匹):1コントロール食群、2高脂肪食群、3低アルコール群。それぞれにはコントロール液体飼料、高脂肪液体飼料、0.2%エタノール添加高脂肪液体飼料を自由摂食させた。6週間後にマウスを屠殺し、血清生化学的、病理学的、分子的検討を行った。結果として、肝/体重比は高脂肪食群がコントロール食群よりも有意に高く、低アルコール群が高脂肪食群よりも有意に低かった。血清AST、ALT値は、高脂肪食群がコントロール食群よりも高く、低アルコール群が高脂肪食群よりも有意に低かった。肝組織像では、小葉内炎症や門脈域炎症は高脂肪食群がコントロール食群よりも高度であり、低アルコール群が高脂肪食群よりも有意に軽度であった。NAFLD活動性スコアも、高脂肪食群がコントロール食群よりも高く、低アルコール群が高脂肪食群よりも有意に低かった。肝組織を用いたリアルタイムRT-PCR法による解析で、tumor necrosis factor (TNF)-α、transforming growthfactor (TGF)-β1の発現量は高脂肪食群がコントロール食群よりも高く、低アルコール群は高脂肪食群よりも低かった。また、peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)α、PPARγの発現量は高脂肪食群がコントロール食群よりも低く、低アルコール群が高脂肪食群よりも高かった。以上から、少量のエタノール摂取がマウスのNAFLD病変を抑制することが示唆された。これは、NAFLD患者に対するこれまでにない生活指導に結びつきうる成果である。コーヒーの成分のNAFLD動物モデルに対する抑制効果を調べる研究は、被検物質の一つであるカフェストールの入手や、被検物質を添加した特注飼料の作製に時間を要しているために開始が遅れている。また、ヒト症例を用いた臨床的・病理学的研究は、肝生検で確認されたNAFLD症例の蓄積が不十分なために遅れを生じている。9週例、雄のdb/dbマウスを以下の5群に分けた:コントロール食群、高脂肪食群、0.1%(低)エタノール添加高脂肪食群、0.5%(中)エタノール添加高脂肪食群、2.5%(高)エタノール添加高脂肪食群。6週後にマウスを屠殺し、血清生化学的、病理組織学的、また分子的検討を行った。結果として、肝/体重比、血清AST・ALT値は低エタノール群が高脂肪食群よりも低く、また肝組織における小葉内や門脈域炎症は、低エタノール群が高脂肪食群よりも軽度であった。コントロール食群、高脂肪食群、低エタノール群の3群で有意差検定を行うと、上記項目ではいずれも高脂肪食群と低エタノール群との間に有意差がみられた。以上から、少量のアルコール投与はマウスのNAFLDを抑制することが示された。

次の研究では、NAFLDモデルマウスに対する、コーヒーの代表的成分投与の影響を調べた。7週齢、雄のC57BL/6Jマウスを以下の5群に分けた:コントロール食群、CDAHFD(コリン欠乏0.1%メチオニン含有高脂肪食)群、カフェイン群、クロロゲン酸群、カフェストール群。カフェイン群、クロロゲン酸群、カフェストール群では、CDAHFDにそれぞれ0.05%カフェイン、0.1%クロロゲン酸、0.01%カフェストールを添加した。7週後にマウスを屠殺し、最初の実験と同様の検討を行った。結果として、血清ALT値はカフェイン群、クロロゲン酸群がCDAHFD群よりも高値であった。コントロール食群、CDAHFD群、カフェイン群、クロロゲン酸群の4群で有意差検定を行うと、その差は有意であった。以上から、本研究に用いた用量では、カフェインやクロロゲン酸はマウスのNAFLD病変を増悪させることが示唆された。最初の研究では、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)モデルマウスに対する、少量・中等量・多量アルコール投与の影響を調べた。その結果、少量のエタノール投与は高脂肪食負荷db/dbマウスにおいて、肝/体重比、血清AST・ALT値を有意に低下させ、肝組織における小葉内や門脈域炎症を有意に改善することが示された。その結果、カフェインやクロロゲン酸はCDAHFD (コリン欠乏0.1%メチオニン含有高脂肪食)負荷C57BL/6Jマウスにおいて、血清ALT値を有意に増悪させることが示された。平成26年度で終了予定の他の研究課題を優先したため、本研究の開始が遅れることになった。しかし、上記の様に動物実験の準備はほぼ終了し、また臨床的・病理学的研究の準備も進んでいるため、この遅れは来年度に十分取り戻すことが可能と考えられる。コーヒーの成分のNAFLD動物モデルに対する抑制効果を調べる研究は、被検物質の入手が完了し、現在Research Diet社に特注飼料の作製を依頼中である。特注飼料が納品され次第、実験を開始する。また、ヒト症例を用いた臨床的・病理学的研究は、検討に十分な症例が蓄積され次第開始する予定である。病理学この5月から、少量飲酒のNASH動物モデルに対する抑制効果の研究の予備実験に入る。予備実験が終了後、速やかに本実験を開始する。それが終了後は、ただちに、コーヒー成分のNASH動物モデルに対する抑制効果の研究に入る。それと並行して、少量飲酒やコーヒー摂取のNAFLD抑制効果についての臨床的・病理学的研究を進める。コーヒーの成分のNAFLD動物モデルに対する抑制効果を調べる研究の開始が遅れているため、次年度使用額が生じた。平成26年度で終了する他の研究課題を優先したため、本研究の進行がやや遅れ、次年度使用額が生じた。コーヒーの成分のNAFLD動物モデルに対する抑制効果を調べる研究は今年度の早期に開始出来るめどが立っており、次年度使用額はそれに使用する予定である。平成27年度のうちに研究の遅れを取り戻す予定であり、次年度使用額と翌年度分として請求した助成金は、主として物品費として平成27年度中にほぼ全額使用する予定である。
新しい大腸菌リボソ-ム蛋白質の発見と増殖段階移行に伴うリボソ-ム構造の変動の研究

我々は塩基性蛋白質、とりわけリボソ-ム蛋白質に対してきわめて高い分離能をもつ′′RFHR′′二次元ゲル電気泳動法を開発し、これによって大腸菌のリボソ-ムから5種の新しい蛋白成分(ABCDおよびE)を発見した。これら新しい蛋白成分のアミノ酸配列を解析し、これをもとにして遺伝子解析を行い、全ての遺伝子を決定することができた。即ちA、B、C、DおよびEの遺伝子は夫々37.6分、72分、88.5分、33分および22分に存在する。リボソ-ム蛋白質の統一命名法にもとづいて、A、B、CおよびDは夫々L35、L36、preL31、S22と名付けられた。このように新しい蛋白成分が発見されたのは、1971年に命名法が統一されて以来初めてのことである。この蛋白成分の追加によって、リボソ-ム類粒内の蛋白成分間のトポグラフィ-や、リボソ-ムの機能と構成成分との関係についての従来の知見を見直す必要が生じている。一方Eはリボソ-ムの精製過程で、高塩濃度処理によってリボソ-ム類粒から離脱することから、リボソ-ム構成蛋白というより6リボソ-ムと相互作用するファクタ-として分類することにした。細胞の増殖のlog phaseからstationary phaseへの移行の詳細な解析を行った結果、Eは70Sリボソ-ムのダイマ-化と挙動と共にして、stationary phaseで出現し、70Sダイマ-(100S)に局在し、70Sモノマ-や遊離の50S、30S中には存在しないことが明らかとなった。100SとEのモル比が1対1となることから100S形成に関与することがつよく示唆された。我々はEを′′ribosome modulation factor′′と命名し、リボソ-ムを100S化することで蛋白合成活性と調節する機能を6つと考えている。以上の結果はPros、Natl、Acod、Sci、USA誌上に1990年4月に発表された。我々は塩基性蛋白質とりわけリボソ-ム蛋白質に対してきわめて高い分離能をもつRFHR電気泳動法を開発し、これによって大腸菌のリボソ-ムから5種の新しい蛋白成分(ABCDおよびE)を発見した。この中、アミノ酸配列と遺伝子解析を終えたA、B両蛋白質は、その後の研究で他の生物種においても見出され、広汎な生物種普遍性をもつことが明らかになったことから、リボソ-ム蛋白質として統一命名法にもとづいて夫々L35、L36と命名されることになった。リボソ-ム蛋白質が新らたに追加されたのは1970年に統一余名法が確率して以来はじそてのことである。残るC、DおよびE蛋白質についてもアミノ酸配列を解析し、遺伝子探索を行った結果、Dは染色体上33分に、Eは22分に遺伝子が見出された。Dの塩基配列の解析は間もなく完了する。又CはL31蛋白質の前駆体であることもわかった。これによって新しいリボソ-ム蛋白質の遺伝子位置を全て決定することができた。次いで細胞の増殖期移行に伴う70Sリボソ-ムのダイマ-化(100S形成)とE蛋白質の時間変化の詳細な解析を行った。その結果100SとEの出現と消滅は並行しており、しかもEは100Sにのみ存在し、70Sや50Sには存在しないことが明らかとなった。

又100SとEのモル比が1対1であることからEが100S形成に関与することがつよく示唆された。我々はEを“ribosome modulation factor"と名付け、リボソ-ム顆粒ダイマ-化することによって蛋白合成能を休止させる機能をもつと考えている。以上の結果はPro.N.A.S.誌上に発表される予定である。RFHR電気泳動法によって発見された5種のリボソ-ム蛋白質(A,B,C,DおよびE)の中、D蛋白質の遺伝子解析を行い、ORFとその周辺の塩基配列を決定した。その結果D蛋白質は45個のアミノ酸からなる分子量5096の30Sサブユニット中最小の塩基性蛋白質であることがわかった。その遺伝子は33分に位置する。このDの解析を了えて、新しく発見されたリボソ-ム蛋白質の遺伝子位置は全て決定されたことになる。我々はこのD蛋白質を大腸菌リボソ-ム蛋白質の統一命名法に従ってS22と名付けた。本研究によって大腸菌リボソ-ム蛋白質の種類は、50Sサブユニットに36種(中、翻訳後修飾による2種を含む)、30Sサブユニットに22種存在することが確定した。一方E蛋白質は精製時、高塩濃度処理によってリボソ-ム顆粒から脱離するためリボソ-ムファクタ-として分類することにし,“ribosome modulation factor"と名付けられた。Eの発現は細胞の増殖期に対してつよい依存性をもっており、定常期にのみ出現するが同時に100S(70Sリボソ-ムのダイマ-)の出現と厳密に並行している。これに加えて、Eが100Sに局在し、かつEと100Sのモル比が1対1になることはEが70S2分子を結合させ100Sを形成するKey proteinである可能性をつよく示唆している。今年度、国立遺伝研の石浜研究室との間で進められた共同研究で、EのmRNA量の細胞増殖time courseを測定した結果、log phaseからstationary phaseへの移行に伴ってmRNA量の飛躍的な増加が観察され、Eの発現調節が転写レベルで行われることが明らかにされた。今後更に、外的環境の変化からE発現までの情報伝達を分子レベルで解明することが、重要かつ興味有る課題となっている。本補助金で購入した高圧減菌器は上記大腸菌培養に,又定電圧定電流電源と振とう機は電気気泳動操作に、そして微量高速冷却遠心機はリボソ-ム調製に夫々必須の装置である。
関節破壊を制御するマイクロRNAの統合的解析と軟骨における機能解析

本研究は変形性関節症の細胞外マトリックス分解に中心的役割を持つアグリカナーゼの遺伝子発現レベルがmicroRNAによってどう制御されるかを統合的に解析し、その作用メカニズムを明らかにした。microRNAの標的遺伝子を探索するために、複数のデータベースを使い候補となる遺伝子を絞り込んだ。今回の研究によって、変形性関節症の細胞外マトリックス破壊に役割を持つ可能性のある新たなmicroRNAを同定し、機能を明らかにすることができた。本研究の目的は変形性関節炎(OA)の細胞外マトリックス分解に中心的な役割を果たす切断酵素、アグリカナーゼの遺伝子発現制御にかかわるmicroRNAを統合的に解析し、作用メカニズムを明らかにすることで関節破壊への役割を示すことである。ヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)を用いた。OUMS-27にサイトカイン刺激(インターロイキンー1(IL-1β) +腫瘍壊死因子(TNF-アルファ))を行ったところ、アグリカンの分解が促進され、アグリカナーゼ誘導性が確認された。そこで、OUMS-27に二つの異なった刺激(1サイトカイン刺激:インターロイキンー1(IL-1β) +腫瘍壊死因子(TNF-アルファ)と2メカニカルストレス(ストレックス社製ST-140))を加えて、OUMS-27のRNAを用いてmicroRNA発現のアレイ解析を施行した。異なる二つの刺激により変動するmicroRNAをADまでの4グループと既報のmicroRNAに近い変動パターンを含むEグループの計5つのグループに分類し、それぞれのmicroRNAが標的とするRNAにつき、データベース検索を行った。複数のデータベース解析を行い、重複して出現する候補が最も確率が高いものとして、マークするとともに細胞外マトリックスに関連する分子を標的とするmicroRNAを候補として優先的に選択した。これらの解析により、標的分子を共通して有するいくつかの候補microRNAを同定することに成功した。これらのmicroRNAのOAに関する役割は既報になく、新規microRNAであることが明らかとなった。本研究は、変形性関節症の発症早期に重要な細胞外マトリックス分解酵素であるアグリカナーゼの遺伝子発現制御に関わるmicroRNAを統合的に解析すると共に、作用メカニズムを明らかにすることで関節破壊へのmicroRNAの役割を示すことを目的とする。初年度の研究においてサイトカインとメカニカルストレスという二つの刺激を加えた際のmicroRNA発現のアレイ解析を実施し、これまでにOAに関連する報告のない、興味深いmicroRNAを多数同定した。しかし候補microRNAの解析を進めたところ、さらなる絞り込みを必要とすると考えられた。今年度は、この問題点を克服するために新たな絞り込み手法を新規に追加して導入することを計画した。新たな絞り込み手法として細胞外マトリックス成分および細胞外マトリックス分解酵素の発現に作用するマトリックスタンパクをあらかじめ添加しておいた際の影響を検討した。すなわち、サイトカイン刺激前にマトリックスタンパクを添加、またはメカニカルストレス刺激前にマトリックスタンパクを添加した際に、発現が回復するmicroRNAを同定することをめざした。それぞれの刺激前に合成マトリックスタンパクを添加することによって、刺激の際の発現変動が元に戻る方向に動くmicrroRNAをアレイ解析を用いて新規の候補microRNAを同定した。新たなmicroRNAの同定に成功した。この候補microRNAについて解析を行ったところ、in silico解析ではマトリックス分解酵素などを標的とすることが示唆された。本研究は変形性関節炎(OA)の細胞外マトリックス分解に中心的な役割を果たす切断酵素アグリカナーゼの遺伝子発現制御にかかわるmicroRNAを統合的に解析し、作用メカニズムを明らかにすることで関節破壊への役割を示すことを目的とする。28年度は以下の研究を実施した。前年度までの研究において、機械的刺激(メカニカルストレス)とサイトカイン刺激の二つの異なる刺激に対して同様に変動するmicroRNAを確認し、さらにヒアルロン酸添加によって発現減少がキャンセルされる効果のあるmicroRNAを少なくとも6個同定し、絞り込むことに成功した。そこで、今年度はこの6種類のmicroRNAに着目して解析を実施した。まず、これらのmicroRNAはいずれもメカニカルストレスとサイトカイン刺激に予想通りの反応を示した。阻害物質を用いてmicroRNAの機能解析を行ったところ、特定のADAMTSに作用することがウエスタンブロッティングにて確認できた。次に、in vitroの系でアグリカン分解の際に生じるグリコサミノグリカン鎖の培養液中への遊離を定量的に評価する系でのmicroRNAの作用解析を行ったが、グリコサミノグリカン鎖には統計学的有意差は見られなかった。この原因として、アグリカン以外にもグリコサミノグリカン鎖を有するプロテオグリカンが発現していることが考えられ、今後の対応としてアグリカンの分解断片を特異的に検出するネオエピトープ抗体を用いた検討が必要であると結論した。本研究によって、RNAを制御するmicroRNAとタンパクを制御するエンドサイトーシスのような複雑な制御機構がアグリカン分解に関わっていることが明らかとなった。さらに、エクソソームのようにmicroRNAを内包化して他者の細胞に作用する機構も存在することから、組織での統合的な理解を行うことが必要と考えられた。当初予定していた通り、ストレス刺激によるmicroRNA発現変化の統合的な解析を実施した。