hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨・骨膜間空隙の拡大による骨増量法の確立

研究代表者は、骨・骨膜間の間隙を拡大することにより、生体が本来備えている骨修復能を賦活し、骨表面に必要なだけの骨再生を誘導する研究を行っている。本研究では組織延長術を用い骨・骨膜間空隙を拡大することにより、細胞の足場の形成が促進されていることに着目し、骨髄由来間葉系幹細胞と自己フィブリンゲルを注入することにより、臨床応用可能な骨増生法の開発を行った。新たに開発した骨膜延長装置と組み合わせて、間葉系幹細胞+フィブリンゲルを注入する実験を継続したが、骨表面に新生骨を認めるが、骨膜延長群、細胞注入群に比較して骨・骨膜間空隙の全体として骨形成を大きく促進させるまでには至らなかった。従来、萎縮あるいは欠損した顎骨に対して顎骨増生を行う方法としては、顎骨や腸骨・脛骨からの自家骨移植や、人工骨を用いた顎骨増生手術が行われてきた。しかしながら、自家骨移植の場合には、自家骨採取部位への外科的侵襲や採骨部位の術後感染など問題があり、人工骨を用いた場合には、骨質の問題や易感染性の問題があり、低侵襲で造骨能が高い再生医療技術の確立が望まれてきた。本研究目的は、組織延長術を応用し骨・骨膜間を少しずつ拡大することで、生体の持つ治癒能力を賦活することにより拡大スペースに骨を誘導することである。最近の研究では、仮骨延長術に比べ形成される骨の量・質が劣ることが示唆されているため、間葉系幹細胞の注入により、骨・骨膜間の空隙の拡大による骨増量法が促進されるか検討を行っている。研究室で開発した従来の骨・骨膜間空隙拡大装置では安定性と確実性に難があったため、従来の拡大装置を改良し、複数の延長装置を試作し、家兎の頭頂部に埋入試験を行った。新たな拡大装置にて安定して骨・骨膜間を緩徐に拡大することを確認した。また、頭頂骨表面に新生骨が誘導されることを確認している。また、次年度からの注入実験に備え、骨・骨膜間の空隙に注入する間葉系幹細胞の評価、成分の解析を行った。しかしながら、自家骨移植の場合には、自家骨採取部位への外科的侵襲や採骨部位の術後感染などの問題があり、人工骨を用いた場合には、骨質の問題や易感染性の問題があり、低侵襲で造骨能が高い再生医療技術の確立が望まれてきた。本研究の目的は、組織延長術を応用し骨・骨膜間を少しずつ拡大することで、生体の持つ治癒能力を賦活することにより拡大スペースに骨を誘導することである。骨膜は骨芽細胞への分化能を持つ細胞からなりまた、周囲軟組織の侵入を防ぐ斜断膜として働き、骨と骨膜間の間隙に骨誘導反応を引き起こす。従来の骨移植術や仮骨延長術より侵襲の少ない骨増量法としての応用が期待されるが、最近の研究では、仮骨延長術に比べ形成される骨の量・質が劣ることが示唆されている。組織延長術を用い骨・骨膜間空隙の拡大により、細胞の足場が形成されていることに着目し、拡大された空隙に形成された足場に間葉系幹細胞を注入し、骨・骨膜間の空隙の拡大による骨増量法が促進されるか検討を行っている。今年度における研究成果としては、培養条件の変更により血管新生を促進させる作用を増幅させることが確認された。特に骨形成のステップで重要な血管新生に対する作用に着目し、これにより骨・骨膜間の空隙の拡大による骨増量法が促進されるか検討した。研究の進展に伴い当初予期し得なかった培養条件の変更により血管新生を促進させる作用を増幅させることがわかった。これを使用して骨増生を促進させるために、より適切な培養条件の分析を行う必要があり、研究計画の変更が必要になった。組織延長術を用い骨・骨膜間空隙の拡大により、細胞の足場が形成されていることに着目し、拡大された空隙に形成された足場に間葉系幹細胞を注入し、骨・骨膜間の空隙の拡大による骨増量法が促進されるか検討を行った。最終年度における研究成果としては、自己フィブリンゲルを作成し、細胞の足場を形成し、間葉系幹細胞を注入し、頭頂部に骨形成が促進されるか検討を行った。フィブリンゲルを併用した方が骨量、骨塩量の増加を認めた。ゲル作成の確立に時間を要したが、ゲル内に取り込まれた細胞数の確認を行い、生着していることが確認された。骨膜延長による骨増生法により、組織延長に伴い、骨膜下に拡大スペースが形成され、骨を誘導することが確認された。新たな組織延長装置の開発を行い、組織延長術が行われることを確認した。細胞の培養条件により、細胞が放出する成長因子が変化することを明らかにし、また、細胞とフィブリンゲルを併用することにより骨形成が促進されることが示唆された。施設の移動による実験環境を整えることに時間を要し、全体的に研究の進捗は遅れており、組織学的評価を完了させ、それらの報告を行う予定である。

骨欠損部におけるインプラント埋入の前処置など、従来の骨移植術や仮骨延長法より侵襲の少ない骨増生手法としての応用が期待されているが、骨量、骨質に劣ることが指摘されていたが、本研究により、間葉系幹細胞を用いることにより、骨増量が促進されることが示唆された。研究代表者は、骨・骨膜間の間隙を拡大することにより、生体が本来備えている骨修復能を賦活し、骨表面に必要なだけの骨再生を誘導する研究を行っている。本研究では組織延長術を用い骨・骨膜間空隙を拡大することにより、細胞の足場の形成が促進されていることに着目し、骨髄由来間葉系幹細胞と自己フィブリンゲルを注入することにより、臨床応用可能な骨増生法の開発を行った。新たに開発した骨膜延長装置と組み合わせて、間葉系幹細胞+フィブリンゲルを注入する実験を継続したが、骨表面に新生骨を認めるが、骨膜延長群、細胞注入群に比較して骨・骨膜間空隙の全体として骨形成を大きく促進させるまでには至らなかった。2014年4月より鶴見大学に異動したため、計画していた動物実験施設が変更となり、鶴見大学での動物実験計画書、倫理審査委員会への申請などの手続き、実験器具の調達に時間を要した。研究室で開発した従来の延長装置では安定性と確実性に難があったため、初年度は、安定した骨・骨膜間空隙の拡大を行う装置の開発を行い、動物実験にて骨・骨膜間の空隙の拡大により間隙内の新生骨の獲得を確認できた。間葉系幹細胞の注入実験は初年度から行う予定としていたが、注入実験の裏付けとなるin vitro等の研究準備を優先し、来年度から注入実験を開始する予定である。組織延長術を応用し骨・骨膜間空隙の拡大による骨増生法をより実用的なものとするため、計画している研究項目は、血管新生促進あるいは体内の間葉系幹細胞を集積させる作用に着目した培養法の確立、間葉系幹細胞による骨増量の促進効果の解明について研究を進めて行く。医歯薬学改良した骨・骨膜間空隙拡大装置を用い、安定した骨・骨膜間の空隙の拡大を行い、骨髄由来間葉系幹細胞の注入を行う。マイクロCTおよび組織学的な評価により骨増量の有無を確認するとともに経時的な観察を行い、長期間経過後にも骨評価を行う。間葉系幹細胞の培養条件、注入時期についても同時に検討を行う予定である。研究の進展に伴い当初予期し得なかった培養条件の変更により血管新生の促進が得られることがわかった。これを使用して骨増生を促進させるために、より適切な培養条件の分析を行うため研究計画の変更が必要になった。調整を行った結果、年度内に完了し得ない部分が生じることとなった。当初の計画では、動物実験において間葉系幹細胞の注入実験を初年度より予定しており、細胞培養のための培地、抗生物質、ウシ血清や培養フラスコ、ディッシュ、ピペット等のプラスチック器具の購入を予定していたが、今年度は間葉系幹細胞の注入実験は行わなかったため未使用額が生じた。期間延長申請を行い、承認された。平成28年度の研究遂行に使用する予定である。動物実験に関連した飼育費、材料費の他、細胞培養のための培地、抗生物質、ウシ血清や培養フラスコ、ディッシュ、ピペット等のプラスチック器具の購入に使用する予定である。また、得られた結果から国内外の学会参加と論文投稿についても研究費を使用する予定である。
天然物を模したペプチドの大規模ライブラリーからのリガンド探索法の開発

新学術領域「天然物ケミカルバイオロジー」の名の下、本研究では、大腸菌由来の再構成型無細胞翻訳系(PUREシステム)と、分子進化工学的手法の一つであるmRNAディスプレイ法を組み合わせ、無細胞発現システムHUPEX(Goshima et al., Nat. Methods, 5, 1011, 2008)等により調製されたヒトタンパク質を標的として、天然物を模したペプチドの大規模ライブラリーから分子標的リガンドを探索する方法を開発した。その結果、HUPEXにより調製されたヒトタンパク質を標的とする、新規環状ペプトイド化合物を同定することに成功した。また、本領域の副題「分子標的と活性制御」の考えに基づき、クリーンルーム内設置型の超高感度質量分析システムDNLC-MS/MS(Natsume et al., Anal. Chem., 74, 4725, 2002)を用いたプロテオミクスアプローチにより、同定した分子標的リガンドのタンパク質・タンパク質間相互作用の阻害部位の同定(分子プロファイリング)を可能にする技術の開発を行なった。その結果、同定した環状ペプトイド化合物がタンパク質・タンパク質間相互作用を阻害していることを実証することに成功した。更に、新学術領域内の連携研究として、班長の入江一浩教授との共同研究により、アルツハイマー病に関連する(化学合成された)アミロイドβタンパク質を標的とする天然物様ペプチドリガンドの大規模ライブラリーからの探索も推進した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、再構築型無細胞翻訳系(PUREシステム)とmRNAディスプレイ法を用いて、天然物を模したペプチドの大規模ライブラリーからのリガンド探索を行うための基盤技術を確立することである。今年度は、産総研・創薬分子プロファイリング研究センターの夏目徹研究センター長と五島直樹研究チーム長との共同研究の下、βカテニンを標的とする天然物様人工ペプチドリガンドの探索を行なった。まず、五島直樹研究チーム長の有するHuman Protein Factoryシステム(N. Goshima et al., Nature Methods 2008)を用いて、ヒトβカテニンcDNAより、部位特異的にビオチン化されたヒトβカテニンタンパク質を調製した。そして、このin vitro発現βカテニンを標的として、天然物様ペプチドライブラリーからの人工リガンドの探索を行い、新規の人工環状ペプトイドリガンドの取得に成功した。すなわち、『環状ペプトイドの分子進化』に成功した。更に、夏目徹研究センター長の専門とする超高感度質量分析システムを用いたプロテオミクスアプローチにより、βカテニンと相互作用するタンパク質の網羅的プロファイリングを行なった結果、取得した人工環状ペプトイドリガンドが阻害しているβカテニンの相互作用タンパク質を同定することに成功した。また、取得した人工環状ペプトイドリガンドを用いて、細胞ライセートからのヒトβカテニンのプルダウン(単離)や、ウェスタンブロッティングにおけるβカテニン検出に成功した。すなわち、本研究で開発した人工環状ペプトイドリガンドが免疫沈降やウェスタンブロッティングにおける抗体のようなタンパク質解析ツールとして利用できることを実証した。これらの研究成果は、現在、責任著者として論文執筆中である(T. Kawakami (責任著者) et al.,論文執筆中)。1無細胞翻訳系で調製したヒトタンパク質を標的とするリガンド探索に成功し、2ペプトイドの分子進化に成功し、3プロテオミクスアプローチによる阻害標的タンパク質の同定に成功し、4開発した環状ペプトイドリガンドがタンパク質解析ツールに利用できることを実証し、責任著者として現在論文執筆中のためである。産総研・創薬分子プロファイリング研究センターの夏目徹研究センター長と五島直樹研究チーム長との共同研究を引き続き行い、天然物を模したペプチドライブラリーからのリガンド探索を推進する。また、新学術領域内の共同研究として、京都大学の入江一浩教授と村上一馬准教授との共同研究を進め、PKCを標的とする、天然物を模したペプチドライブラリーからのリガンド探索を推進する。
腸内菌由来ヒスタミンの産生制御機構と生理学的意義の解明

乳幼児糞便から分離されたRaoultella ornithinolytica AA097株におけるヒスタミン産生制御メカニズムを解明した。R. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生は、CRPが関与するカタボライト抑制機構に加えてFisによっても正に制御されていることが示唆された。また、ヒスタミン産生性R. ornithinolyticaの定着によって無菌マウスの大腸上皮細胞の増殖亢進が認められた。さらに、R. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生はH2O2等の酸素ストレスを回避するためのシステムとして機能していると考えられた。糞便メタゲノム解析に用いた乳幼児糞便から分離されたRaoultella ornithinolytica AA097株におけるヒスタミン産生制御メカニズムを解明するために、mariner Tn挿入変異株ライブラリーを用いた大規模スクリーニングにより、ヒスタミンの産生制御に関わる遺伝子群を網羅的に探索した。その結果、ヒスタミン産生能が弱まった株としてcrp (cyclic AMP receptor protein)変異株およびfis (factor for inversion stimulation)変異株を同定した。次に、sacB遺伝子を用いたcounter selection法を用いてcrp欠失株およびfis欠失株を作製しヒスタミン産生能を調べたところ、両遺伝子欠失株は野生株と比較して著しくヒスタミン産生能が減弱していた。野生株を0.1%グルコース添加したM9 + 1%histidine培地で培養するとヒスタミンの産生が全く認められず、またグルコース存在下ではhistidine decarboxylase (hdc)遺伝子発現も著しく抑制された。以上より、R. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生は、CRPが関与するカタボライト抑制機構に加えてFisによっても正に制御されていることが示唆された。また、CRPおよびFisがダイレクトにhdc遺伝子の発現を制御しているのかを検討するために、CRPおよびFisタンパク質をGST融合蛋白として発現精製し、hdcプロモーター領域への結合性をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、両タンパク質ともhdcプロモーター領域への結合が認められた。以上より、hdc遺伝子の発現制御にCRPおよびFisが直接的に関わっていることが示唆された。研究はおおむね順調に進んでおり、ほぼ計画通りの進捗具合である。本年度の研究実績によりこれまで未解明であった細菌におけるヒスタミン産生制御機構の一端を明らかにすることができた。特に、CRPが関与するカタボライト抑制機構によってヒスタミンの産生が制御されているということは特筆すべき新たな発見であった。また、R. ornithinolyticaにおけるmariner Tnを用いたランダムmutagenesis法の有用性を示すことができた。宿主環境中でのヒスタミン産生性の解析を行った。R. ornithinolytica (RO)のヒスタミン産生能がマウス腸管環境中で認められるか否かを確認するため、RO AA097株のノトバイオートマウスを水投与群および1% histidine投与群に分け、大腸内容物中のヒスタミン量をHPLCを用いて定量した。その結果、無菌マウスと比較するとノトバイオートマウスの糞便中にはヒスタミンの存在が認められたが、その検出量は約0.1 mg/Lと極めて低かった。また、ノトバイオートマウスに1% histidineを投与した群の糞便中ヒスタミン量は水投与群と比べると明らかに高い傾向であり、約0.35 mg/L認められた。また、RO AA097株株を嫌気条件下で培養した時のヒスタミン産生性を検討したところ、好気条件下と比べて嫌気条件下ではヒスタミン産生量の低下が認められた。腸内菌由来ヒスタミンによる宿主ー細菌クロストークの解明の一環として、RO定着ノトバイオートにおける腸管上皮細胞増殖を調べた。RO AA097株の野生株及びhdc欠失株を4週間定着させた無菌マウスの腸管上皮細胞の形態変化を観察するとともに、細胞増殖能をEdUの取り込みを指標にして蛍光顕微鏡下にて評価した。その結果、空腸・回腸部位の上皮細胞増殖能は野生株及びhdc欠失株のノトバイオート間で違いは認められなかったが、大腸上皮細胞は野生株ノトバイオートにおいて増殖能の亢進が認められた。また、妊娠マウスにRO AA097株の野生株及びhdc欠失株を定着させた後、誕生した幼若マウスの体重変化を4週間に渡って観察したところ、野生株定着ノトバイオート親マウスから誕生したマウスはhdc欠失株定着ノトバイオート親マウスから誕生したマウスと比べて、誕生時の体重が有意に高かった。またその体重差は4週間に渡って維持された。本年度の研究実績によりR. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生は大腸内では著しく抑制されること、またin vitroの検討からも好気条件下と比べて嫌気条件下ではヒスタミン産生量が減少することを明らかにしたが、これらの事実はヒスタミン食中毒の病態を考察する上で非常に貴重な所見である。細菌におけるヒスタミン産生制御機構の一端を明らかにすることができたという点においても特筆すべき結果であった。また、R. ornithinolyticaの腸管定着による腸管上皮細胞増殖の影響に関しても、ヒスタミン産生性と大腸上皮細胞増殖亢進の関連性を指摘することができた。

さらに、ヒスタミン産生性腸内菌の定着と幼若マウスの体重増進とが関係している結果も得られた。このように、腸内菌由来ヒスタミンによる宿主ー細菌クロストークに関してある程度明らかにすることができた。R. ornithinolytica (RO)自身にとってヒスタミン産生は何の意味があるのかについて考察した。ROにおけるヒスタミン産生性の生理学的意義について検討するために、mariner Tn挿入変異株ライブラリーを用いた大規模スクリーニングにより、ヒスタミンの産生制御に関わる遺伝子群をさらに探索したところ、ヒスタミン産生能が著しく減弱した株としてrecA-株を同定した。そこで、DNA damageとヒスタミン産生性との関わりを調べるために、UV-Cとmitomycin Cに対する感受性試験を野生株とhistidine decarboxylase (hdc)欠損株について行ったが、UVおよびmitomycin Cに対する感受性は両株間で差は認められなかった。また、野生株およびhdc破壊株について、1%ヒスチジン存在下におけるH2O2に対する耐性を調べたところ、hdc破壊株は野生株と比較して著しくH2O2感受性であった。さらに、野生株を対数増殖期中期まで培養後、1mM H2O2刺激を加えるとhdc遺伝子の発現誘導が認められた。過剰の細胞内外ヒスチジンは、H2O2のDNA傷害作用を増強することが報告されている。したがってROにおけるヒスタミン産生は、マグロ・サバ等のhistidine-richな環境中においてヒスチジンを除去することでH2O2等の酸素ストレスを回避するためのシステムとして機能していると考えられた。また、RO由来によるヒスタミン食中毒を抑制制御するための検討を行った。これまでの我々が得た所見により、CRPが関与するカタボライト抑制機構によってROにおけるヒスタミンの産生が制御されている。そこで培地に0.1-1%グルコースを添加することによってヒスタミンの産生を完全に抑制することができた。乳幼児糞便から分離されたRaoultella ornithinolytica AA097株におけるヒスタミン産生制御メカニズムを解明した。R. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生は、CRPが関与するカタボライト抑制機構に加えてFisによっても正に制御されていることが示唆された。また、ヒスタミン産生性R. ornithinolyticaの定着によって無菌マウスの大腸上皮細胞の増殖亢進が認められた。さらに、R. ornithinolyticaにおけるヒスタミン産生はH2O2等の酸素ストレスを回避するためのシステムとして機能していると考えられた。今年度計画に一部含まれている宿主環境中でのヒスタミン産生性の解析を今年度行う。R. ornithinolyticaのヒスタミン産生能がマウス腸管環境中で認められるか否かを確認する。R. ornithinolyticaのノトバイオートマウスを水投与群および1% histidine投与群に分け、経時的に回腸・空腸・大腸内容物中のヒスタミン量をHPLCを用いて定量する。次年度の研究計画である腸内菌
抗がん薬Paclitaxelによる末梢神経障害発症機構の解明および治療薬の探索

【背景】臨床上、抗がん剤paclitaxelの副作用として末梢神経障害や白血球減少症が高頻度に発生し、特に末梢神経障害は、用量規制因子であるため、患者QOLを著しく低下させることが問題となっている。今回我々は、paclitaxelによる末梢神経障害モデルラットを作製し、末梢神経障害のメカニズムを解明するために、モデルラットの後根神経節部位における網羅的遺伝子発現解析を行い、いくつかの発現変動遺伝子について検討した。【方法】SD系ラット(200-300g)にpaclitaxel(8mg/kg)を腹腔内投与し、末梢神経障害モデルラットを作製した。末梢神経障害の行動学的評価は、von Frey式dynamic plantar aesthesiometer(Ugo Basile)による機械刺激試験並びにアセトン試験にて行った。末梢神経障害モデルラットの後根神経節における網羅的遺伝子発現解析は、Rat Genome 230 2.0を用いたクラボウDNAマイクロアレイ解析にて行った。また、後根神経節でのマトリックスメタロプロテアーゼ3(MMP3)発現はRT-PCR並びにウエスタンブロット法により検討した。【結果・考察】今回作製したpaclitaxelによる末梢神経障害モデルラットの行動学的評価を機械刺激試験にて検討したところ、13日目から痛覚閾値の低下が認められ、28日目まで持続した。また、アセトン試験では6日目から逃避行動頻度の増加が認められ、28日目まで持続した。一方、体重の変動については、両群間で差は認められなかった。続いてpaclitaxelによる末梢神経障害モデルラットの後根神経節における網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、MMP3やマクロファージ関連遺伝子の発現が増加していた。MMP3は細胞外マトリックス構造を分解する酵素で炎症の際に発現が増加することが知られる。したがって、paclitaxelによる末梢神経障害の発症にマクロファージやMMP3の集積が関与する可能性が考えられた。Taxusbrevifolia(イチイ科タイヘイヨウイチイ)の樹皮抽出液から単離されたパクリタキセルは、細胞内微小管を安定化することにより、細胞分裂を阻害する抗悪性腫瘍薬の一つであり、臨床で使用されている。しかし、副作用として末梢神経障害や白血球減少症が高頻度に発生し、特に末梢神経障害は、患者QOL(Quality of life)を著しく低下させることが問題となっている。以前にDoughertyらは、パクリタキセル投与患者に冷覚異常が生じることを報告している。一方、温度により活性化される受容体としてtransient receptor potential(TRP)受容体が知られており、その中でもTRPA1やTRPM8は冷刺激により活性化する。そこで今回、パクリタキセルによるTRP受容体発現への影響について解剖学的及び生化学的方法を用いて検討した。SD系ラット(200-300g)にパクリタキセル(32mg/kg)を腹腔内投与し、末梢神経障害モデルラットを作製した。末梢神経障害の行動学的評価は、von Frey式dynamic plantar aesthesiometer(Ugo Basile)による機械刺激試験やhot plate試験及びアセトン試験にて行った。解剖学的評価は、脊髄後根神経節部位をオスミウムートルイジンブルー染色することにより行った。また、TRP受容体(TRPA1及びTRPM8)の蛋白質発現をウエスタンブロット法により解析した。パクリタキセルによる末梢神経障害モデルラットでは、機械刺激試験やアセトン試験により痛覚過敏が認められた。一方、hot plate試験では有意な差は認められなかった。

この結果より、パクリタキセルが機械刺激や冷刺激に影響を与えるが熱刺激には影響しないことが明らかとなった。また、脊髄後根神経節部位でのTRPM8の発現は変動しなかったが、TRPA1の発現は上昇しており、パクリタキセルによる末梢神経障害の冷覚異常にTRPA1が関与することが示唆された。【背景】臨床上、抗がん剤paclitaxelの副作用として末梢神経障害や白血球減少症が高頻度に発生し、特に末梢神経障害は、用量規制因子であるため、患者QOLを著しく低下させることが問題となっている。今回我々は、paclitaxelによる末梢神経障害モデルラットを作製し、末梢神経障害のメカニズムを解明するために、モデルラットの後根神経節部位における網羅的遺伝子発現解析を行い、いくつかの発現変動遺伝子について検討した。【方法】SD系ラット(200-300g)にpaclitaxel(8mg/kg)を腹腔内投与し、末梢神経障害モデルラットを作製した。末梢神経障害の行動学的評価は、von Frey式dynamic plantar aesthesiometer(Ugo Basile)による機械刺激試験並びにアセトン試験にて行った。末梢神経障害モデルラットの後根神経節における網羅的遺伝子発現解析は、Rat Genome 230 2.0を用いたクラボウDNAマイクロアレイ解析にて行った。また、後根神経節でのマトリックスメタロプロテアーゼ3(MMP3)発現はRT-PCR並びにウエスタンブロット法により検討した。【結果・考察】今回作製したpaclitaxelによる末梢神経障害モデルラットの行動学的評価を機械刺激試験にて検討したところ、13日目から痛覚閾値の低下が認められ、28日目まで持続した。また、アセトン試験では6日目から逃避行動頻度の増加が認められ、28日目まで持続した。一方、体重の変動については、両群間で差は認められなかった。続いてpaclitaxelによる末梢神経障害モデルラットの後根神経節における網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、MMP3やマクロファージ関連遺伝子の発現が増加していた。MMP3は細胞外マトリックス構造を分解する酵素で炎症の際に発現が増加することが知られる。したがって、paclitaxelによる末梢神経障害の発症にマクロファージやMMP3の集積が関与する可能性が考えられた。
大腸菌ATP合成酵素:γサブユニット変異酵素を用いたエネルギー共役機構の解明

本研究では,ATP合成酵素(F_0F_1-ATPase)におけるH^+輸送とATP合成(分解)の間のエネルギー共役機構の解明を目的として,F_1およびF_0F_1の複合体におけるγサブユニットおよびcサブユニットオリゴマーの回転を,それぞれのサブユニットに結合したアクチンフィラメントの回転によって観察した.γサブユニットのγSer-193をCys残基に置換し,ビオチン-PEAC_5-マレイミドにてビオチン化した後,ストレプトアビジンを介して,ファロイジンでラベルしたアクチンフィラメントを結合した.α_3β_3複合体をガラス板に固定して,定常状態のATPase反応が起こる条件でATPの加水分解によるアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型F_1では約40pN・mが得られ,ATPの加水分解のエネルギーが非常に効率よく回転に変換されていた.同じ実験を,エネルギー共役機構の損なわれている,γMet-23→Lys変異を持つF_1を用いて行ったところ,野生型F_1と同様のトルクが得られた.したがって,γMet-23→Lys酵素は,γの回転による仕事量がH^+の輸送の仕事に伝達されにくい変異酵素であることが明らかになった.次に,H^+輸送路を形成するcサブユニットのα_3β_3複合体に対する回転を観察した.cサブユニットにCys残基を導入し同様にアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型のF_0F_1では,cサブユニットオリゴマーはγサブユニットと同様のトルクでα_3β_3複合体に対して回転していることが明らかになった.すなわちγサブユニットとcサブユニットは酵素内の回転子であり,それらが共に回転することが触媒とH^+輸送の共役に重要であると考えられる.以上の成果はProc.Natl.Acad.Sci.USAおよびScienceに報告した.本研究では,ATP合成酵素(FoF_1-ATPase)におけるH^+輸送と触媒反応との間のエネルギー共役機構の解明を目的として,γサブユニットとβサブユニットの相互作用部位について検討した.すべての部位特異的な変異はFoF_1遺伝子の全領域を含む組み換えプラスミドに導入し,変異酵素は本酵素遺伝子を持たない大腸菌DK8株で発現させた.γサブユニットのγGln-269を19種類のアミノ酸に置換すると,膜画分のATPase活性は,LyS変異が野生型と同じだったのを除いて様々な程度に低下していた.以前に報告した変異酵素γQ269Eと同様,γQ269DでもATPase活性が野生型の10-20%は残っていたが,γQ269EおよびγQ269Dの変異F_1を膜から可溶化するとサブユニットが解離した.γGln-269は,酵素活性に必須ではないが,F_1の分子集合に関与していると考えられた.ミトコンドリアF_1のX線結晶解析より,γGln-269はβサブユニットのβAsp-302およびβThr-304と水素結合していると考えられることから,これらのアミノ酸残基を含む保存されたループ領域(β_<301>DDLTD_<305>)に変異導入した.βAsp-302およびβAsp-305を,側鎖がわずかに大きいGluに置換すると,γQ269EおよびγQ269D変異酵素と同様に,F_1の安定性が低下した.安定性に関するMgCl_2およびKClの効果もγサブユニット変異酵素の場合と同様であり,γGln-269とβサブユニットのループ領域の相互作用は,α_3β_3γ複合体の分子集合に重要であることが示唆された.以上の成果はArch.Biochem.Biophysに報告した.本研究では,ATP合成酵素(F_0F_1-ATPase)におけるH^+輸送とATP合成(分解)の間のエネルギー共役機構の解明を目的として,F_1およびF_0F_1の複合体におけるγサブユニットおよびcサブユニットオリゴマーの回転を,それぞれのサブユニットに結合したアクチンフィラメントの回転によって観察した.γサブユニットのγSer-193をCys残基に置換し,ビオチン-PEAC_5-マレイミドにてビオチン化した後,ストレプトアビジンを介して,ファロイジンでラベルしたアクチンフィラメントを結合した.α_3β_3複合体をガラス板に固定して,定常状態のATPase反応が起こる条件でATPの加水分解によるアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型F_1では約40pN・mが得られ,ATPの加水分解のエネルギーが非常に効率よく回転に変換されていた.同じ実験を,エネルギー共役機構の損なわれている,γMet-23→Lys変異を持つF_1を用いて行ったところ,野生型F_1と同様のトルクが得られた.したがって,γMet-23→Lys酵素は,γの回転による仕事量がH^+の輸送の仕事に伝達されにくい変異酵素であることが明らかになった.次に,H^+輸送路を形成するcサブユニットのα_3β_3複合体に対する回転を観察した.cサブユニットにCys残基を導入し同様にアクチンフィラメントの回転トルクを測定したところ,野生型のF_0F_1では,cサブユニットオリゴマーはγサブユニットと同様のトルクでα_3β_3複合体に対して回転していることが明らかになった.すなわちγサブユニットとcサブユニットは酵素内の回転子であり,それらが共に回転することが触媒とH^+輸送の共役に重要であると考えられる.以上の成果はProc.Natl.Acad.Sci.USAおよびScienceに報告した.
包括的微生物叢解析による5-ASA抗炎症作用機序の解明と新規IBD治療戦略の探索

炎症性腸疾患の患者数は世界的に増加しており、安全、有効かつ経済的な治療法の開発はきわめて重要な医学的、社会的課題である。現在広く使用されている薬剤でも炎症抑制のメカニズムが明らかではないものがある。一方で、腸内微生物叢が本疾患の発症に関与していることが示唆されている。本研究では、炎症性腸疾患治療薬が腸内細菌叢に与える影響を解析し、腸内細菌叢をターゲットとする新たな治療の開発につなげることを目指す。
マウス個体内におけるヒトリンパ組織の再現系の確立と応用

マウス個体内にヒトのリンパ組織を構築する試みとして、NOD-SCIDマウスにヒト末梢血単核球を腹腔内に移植した。移植後2週から4週目のマウス脾臓の中心動脈周囲にヒトB細胞T細胞が定着した。T細胞はCD4陽性T細胞あるいはCD8陽性T細胞であった。さらにヒトマクロファージが散在した。このマウスにHIVを接種すると2から3週目に特に脾臓においてウイルスに感染していない細胞がアポトーシスに陥ることがTUNEL染色の結果わかった。そして、このTUNEL陽性細胞の半分以上には、FasLでなくTRAILを発現するT細胞が隣接していた。さらにTRAILに対する抗体を投与するとTUNEL陽性細胞が極端に減少した。この事実はNOD-SCIDマウス内に構築されるヒトリンパ球はHIVに感染するとTRAILが誘導され、周囲の感染していない細胞にアポトーシスを起こすことが証明された。本研究はHIVの増殖のもっとも活発な組識であるリンパ臓器をSCIDマウス内に構築したものである。その結果リンパ臓器におけるアポトーシスシグナル分子の同定に成功した。さらにヒト細胞の構築に関与するシグナル分子の解明もおこなった。ヒト単核球の移植時にケモカインに対する抗体を投与すると、ケモカインのシグナルを抑える抗体を投与したマウスにおいてはヒトリンパ球とマクロファージの移植構築が阻害され、ヒト細胞によるリンパ臓器様の組識構築が見られなかった。この事実はケモカインがリンパ臓器の組識構築に関与することをさらに明らかにした。1.マウスへのヒトリンパ球移植術の改良NOD-SCIDマウスへのヒト末梢血単核球の移植実験系を完成させた。1×10^7個のヒト末梢血単核球を腹腔に接種し、ヒトリンパ組織の構築実験を行うと、接種された腹腔内、そして、脾臓においてCD4陽性、ならびにCD8陽性T細胞が定着した。特に脾臓内には小動脈周囲にCD20陽性のB細胞が集積し、その周りをCD4陽性T細胞、さらに、CD8陽性T細胞が取り囲むリンパ節様の構造をとることがわかった。ヒト末梢血移植時の、マウス個体内において増殖するT細胞は、マウスの抗原に対する反応性T細胞と考えられている。すなわち、Xenoreactiveな免疫反応が起きていると知られているが、これらの細胞が組織構造を形成することがわかった。2.移植ヒトリンパ組織へのウイルス感染の影響エイズウイルスであるHIVはヒトの細胞においてのみ増殖する。そこで、このヒト末梢血を移植したマウスへの感染を行い、ウイルス感染による細胞破壊作用とこのウイルス感染による組織構造変化を解析した。HIV感染実験の結果、CD4陽性のヒトT細胞がTUNEL染色により、陽性となり、アポトーシスに陥いり細胞数が極端に減少していることがわかった。そして、TNF関連アポトーシス誘導分子であるTNF、FasL、そしてTRAIL分子の発現を検討すると、TRAIL発現CD4陽性T細胞がこのTUNEL陽性細胞に隣接していることがわかった。さらに、TRAILに対する中和抗体を接種すると、TUNEL陽性の細胞は明らかに減少したことより、このTRAIL発現細胞がCD4陽性T細胞にアポトーシスシグナルを送っていることがわかった。すなわち、HIVによるリンパ組織の破壊過程が明らかになった。

さらにTRAILに対する抗体を投与するとTUNEL陽性細胞が極端に減少した。この事実はNOD-SCIDマウス内に構築されるヒトリンパ球はHIVに感染するとTRAILが誘導され、周囲の感染していない細胞にアポトーシスを起こすことが証明された。本研究はHIVの増殖のもっとも活発な組識であるリンパ臓器をSCIDマウス内に構築したものである。その結果リンパ臓器におけるアポトーシスシグナル分子の同定に成功した。さらにヒト細胞の構築に関与するシグナル分子の解明もおこなった。ヒト単核球の移植時にケモカインに対する抗体を投与すると、ケモカインのシグナルを抑える抗体を投与したマウスにおいてはヒトリンパ球とマクロファージの移植構築が阻害され、ヒト細胞によるリンパ臓器様の組識構築が見られなかった。この事実はケモカインがリンパ臓器の組識構築に関与することをさらに明らかにした。
在宅療養高齢者におけるインフルエンザ予防とワクチンの有用性に関する研究

在宅療養高齢者におけるインフルエンザワクチンの有効性と発病修飾因子を明らかにするために前向き観察研究を行なった。結果指標は「呼吸器症状を伴う38度以上の発熱(インフルエンザ様疾患:ILI)」と定義した。インフルエンザ流行規模は小さく、ワクチン有効性は検出するには至らなかった。発病修飾因子として「栄養摂取形態が経管・中心静脈栄養」(調整オッズ比=10.5,95%信頼限界=2.76-39.6)、「ステロイド・免疫抑制剤使用」が示唆された。在宅療養高齢者におけるインフルエンザワクチンの有効性を検討するため、訪問看護ステーションに登録され、看護職員により毎週23回の訪問を受けている110人を対象に、基本特性に関するベースライン調査と発病調査を実施した。研究参加に当たっては、看護職員が本研究に関する説明を行い、対象者本人または家族の同意を得た。べースライン調査で、新たに開発した調査票を使用して収集した情報は、ワクチン接種状況、要介護度、同居家族数、家族構成、住居、喫煙習慣、基礎疾患(呼吸器疾患、心疾患、脳血管疾患、悪性腫瘍、治療中の糖尿病、治療中の高血圧、ステロイドまたは免疫抑制剤の使用)、日常生活自立度、などである。発病調査では、発病時の最高体温、鼻汁・鼻閉、咽頭痛、咳、かぜ症状による医療機関受診、往診、入院(肺炎、インフルエンザ、その他)、基礎疾患の悪化による入院、死亡について毎週訪問時に情報収集した。2007/08シーズンは11月早々に流行が始まり、最適の研究環境となることが期待されたが、1月下旬から3週間ほど中等度の流行がが観察されたのみであり、4月第1週に終息した。現在データの予備解析を進めているが、明瞭な結果を得ることは困難であろう。初年度の経験に基づき、次シーズンは、対象者を増加すること、より鋭敏な結果指標を用いることができるよう診療データについても収集の対象とすること、および、検査診断を積極的に導入することとし、調査フィールドの拡大、情報収集方法の検討と調査票の開発、および検査体制の整備を進めている。在宅療養高齢者におけるインフルエンザワクチン接種の国際動向を知るため、平成19年7月に世界保健機関(WHO)世界インフルエンザ計画担当部長のKeiji Fukuda博士と、20年1月に米国疾病管理センター(CDC)インフルエンザ局疫学部のTimothy Uyeki博士と情報交換を行った。世界各国で高齢者へのインフルエンザ予防接種は推進されているが、実際に接種を受けているのは、医療機関に来ることができる「在宅健常高齢者」や、集団接種の機会がある「施設入所高齢者」である。「在宅療養高齢者」に関しては、合併症や死亡のリスクが最も高いにもかかわらず、調査が困難であるためワクチンの有効性は不明であり、世界的にも接種率は極めて低い。そこで、「在宅療養高齢者」を対象に、インフルエンザワクチンの有効性、ワクチン以外の発病修飾因子、ワクチンによる抗体誘導、抗体誘導に及ぼす個人特性を検討する。また、接種方策の国際実態比較を行う。今年度は、N市在住の「在宅療養高齢者」(介護度が高いため週1回以上の定期訪問を受けており、家族と同居)253名を対象に、発病調査を開始した。本人または家族から調査参加の同意を得られた場合、平成20年51週(12/1521)から平成21年16週(4/1319)の間、週に1回、計18回、訪問看護師による調査を行う(実施中)。内容は、随時情報(かぜ症状による外来受診、医師の往診、入院など)、毎週の発病状況(発熱、鼻汁、咽頭痛、咳など)である。健康関連(ワクチン接種、基礎疾患など)、介護関連(要介護度など)、生活関連(経口・経管栄養、同居家族数など)の情報は、第1回目訪問時に得た。解析は、発病、入院、死亡などを結果指標とし、ワクチンの有効性、ワクチン以外の発病修飾因子について多変量解析の手法により総合的に検討する。現在、調査期間中であるため、随時、データ集計を行なっている。調査で得られた情報の使用にあっては「疫学研究に関する倫理指針(厚労省・文科省)」に基づいて人権の確保に万全を期し、得られた情報は全て数値化して個人を特定できないようプライバシーに配慮している。「在宅療養高齢者」におけるインフルエンザワクチンの有効性、ワクチン以外の発病修飾因子を検討した。また、2009年の「新型インフルエンザ」発生に伴い、高齢者に対する新型インフルエンザワクチン接種方策について西太平洋地域の動向を調査した。1.ワクチン有効性、ワクチン以外の発病修飾因子の検討65歳以上の訪問看護利用者251人を対象に、前向き観察研究を行なった。調査期間は、2008年12月15日から2009年4月19日である。期間中23人(9%)に「呼吸器症状を伴う38度以上の発熱(インフルエンザ様疾患:ILI)」を認めた。

対象地域でのインフルエンザ流行規模は小さく、ワクチンの有効性を検出するには至らなかった(調整オッズ比=1.09,95%信頼限界=0.37-3.15)。ILI発病修飾因子として「栄養摂取形態が経管・中心静脈栄養」(10.5,2.76-39.6)、「ステロイド・免疫抑制剤使用」(2.07,0.45-9.45)が示唆され、インフルエンザ流行期間に限定した解析でこれらのオッズ比上昇はさらに顕著となった。2.西太平洋地域における高齢者の新型インフルエンザワクチン接種方策西太平洋地域の中・低所得国16ヵ国では、WHOを通じて国民の10%に新型インフルエンザワクチンが供給されることになっている。しかし、これらの国々で65歳以上の高齢者にワクチンがいきわたることは少ない。65歳以上の高齢者は、新型インフルエンザの罹患率・入院率・死亡率が他のリスクグループと比較して低い、という報告があり、この論拠が接種方策に反映されていた。インフルエンザ合併症や死亡のリスクが高い「在宅療養高齢者」におけるILI発病修飾因子として、「栄養摂取形態が経管・中心静脈栄養」、「ステロイド・免疫抑制剤使用」を示した。本結果は、抗ウイルス薬予防投与やワクチン接種の優先対象を特定するために有用である。
シマガレ林の構造と積雪の関係について

シマガレに関する研究報告は数多いが、積雪期間中のシマガレ林の環境について報告されたものは少ない。鍛代・前田は北八ケ岳縞枯山におけるシマガレ林構造の一部が、積雪によって壊れ、その部分から新たなシマガレが発生している事を報告した。その後も積雪の影響によってシマガレ林構造が徐々に変化しているので、その状況について調べたところ、1980年前後には若木帯であった部分が現在は成木帯に、稚樹帯であった部分が現在は若木帯になっていることが認められた。現況の若木帯風上側部分では積雪深が最大となり、吹き溜まりが形成され、この部分から新たな疎開穴の発生していることが確認された。さらに疎開穴の縁辺からは新たに林木の立枯れが始まっていた。このような立枯れ現象の原因は主に風衝によるものといえるが、風衝による樹木の枯損過程を明らかにする上では、樹体中の水分動態の把握が必要である。そこで、樹木の枯損段階を示す指標として葉中水分に注目し、その有効性を明らかにすることを目的とし、縞枯山のシマガレ林において、シラベ針葉中水分の冬季中季節変化や、針葉中水分と枯損段階との関連性について調べた。風衝地における針葉の含水率は、9月から11月かけて増加し、それ以降の冬季中は徐々に減少していた。また、針葉の枯損段階を外観から確認できる変色程度で区分し含水率を調べたところ、含水率が枯損段階を顕著に示すことが認められた。さらにこれらの針葉中水分を示差走査熱量計で吸熱量として測定したところ、わずかな枯損程度でもそれが顕著に反映される果が得られ、葉中水分が林木の立枯れ程度を示す指標として用いることが可能であることが示唆された。今後は、このような手法を用いて、林木の立枯れ過程について明らかにしていく必要がある。以下の項目について調査研究を行い結果が得られた。1.縞枯山の現況:シマガレ林の現況と1980年前後の状況とを比較したところ、林木の立枯れる風衝最前面の位置(シマガレ線)は15m程度後退し、後退した部分の更新は良好であった。また成木帯の樹高は2m程度の高くなっていた。従って、シマガレ林の特異な構造(シマガレ林帯)は外観的には維持されたまま、その位置が移動してた。2.積雪のパターン:シマガレ林帯内の積雪深は、樹高3-5mの若木の密集する箇所で最も大きく、雪丘の形成し、風衝最前面にあたる箇所で最も小さかった。このことは今までの調査結果と一致しており、これが林帯の形状に応じた積雪パターンであると考えた。3.旧疎開穴の現況:1980年前後に認められた疎開穴の周囲は、現在稚樹帯になり外観的には消滅したが、更新稚樹の少ない部分として痕跡を残していた。またこの部分にはキイチゴ類の優占度が高く、後生稚樹の出現はほとんど認められなかった。4.新しい疎開穴の発生:現状のシマガレ林帯内には1980年以降発生した疎開穴が多数認められ、この位置は若木帯内にあって、林帯内の最大積雪深を示す位置に一致していた。5.針葉水分の変化:風衝最前面に位置するシラベ、アオモリトドマツから針葉を採取し、その冬季期間中における針葉中含水量の経時的変化を、熱量分析計を用いて解析した。現段階では、積雪の始まる12月比べ、2月では試料木とした特定部位の周辺にある針葉中水分の少ないことが認められた。

本項目については測定継続中で、次年度研究期間における課題として年間を通じた測定を予定している。これによって、シマガレ現象の主要因である立枯れが、夏季の風あるいは冬季の風によるものであるかを検討する。上記のように冬季期間中の環境とシマガレ林成立との関係に注目して研究を進めている。シマガレ林の構造と積雪の関係について、1993、1994年度に調査を行った。シマガレ林の構造に関する現況調査を行い、1979年調査時の状況と比較してみたところ、林木の生長に伴い、1979年には面積の大きな稚樹帯として認めれた部分が若木帯となり、以前の成木帯は更新して稚樹帯となっていた。また、1979年調査時の雪害による疎開穴は、現在、稚樹帯内の更新不良部分となっていた。雪害による疎開穴は現在でも、若木帯内に新しく発生していることが認められ、こうした積雪の影響は1979年時点での突発的な現象ではなく、恒常的現象であることがわかった。これに加えて、成木の枯損の過程に与える積雪の影響についての検討を試みた。亜高山帯では、積雪期間中の強風日数が多く、強風時には吹雪を伴うのが普通で、林木の葉、枝には着雪が生ずる。着雪は晴天時に脱落するので着雪と脱落が繰り返される。このような環境が葉に与える影響に注目し、積雪期間中の葉中水分の測定を行った。風衝の影響の強い場所の葉は、影響の少ない場所の葉を比べると、含水率としては明らかな差異が認められないが、1葉重そのものが小さいことが明らかとなった。また、積雪期間中における風衝の強い場所の葉中水分の動態を調べたところ、11月から3月にかけて徐々に減少する傾向が認められた。以上のことから、積雪はシマガレ林の構造の維持機構に大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。しかし本研究期間における、葉中水分についての調査は、断片的なデータの集積に止めているので、さらに継続的な研究を必要とする。
In-Situ型ソフトウェア開発計測技術に関する研究

本研究の目的は、申請者らが従来行ってきたソフトウェア品質計測技術に関する研究を発展させ、流動的な分散開発環境においても工学的かつ実用的な計測・フィードバックを行えるような機構を開発することである。このために、モバイル技術を適用した「ソフトウェア開発用可搬式計測・フィードバック支援キット」を開発し、その有効性について確認することを試みた。平成13年度は,In-Situ型ソフトウェア計測のためのプロセスや支援機構について,デバッグプロセスの観察方法,アプリケーションやコンポーネントの利用情報をネットワーク経由で自動収集する方式などについても,検討を重ねた.これらの成果については学会において発表を行った.平成13年度後半から14年度にかけて,この支援キットの試作プラットフォームを,ノート型PC(CPU:モバイルペンティアム800MHz,メモリ256Mバイト,HDD20GB),小型CCDカメラ(USBタイプ、35万画素),無線LANカード(IEEE802.11b)などを用いて構築を試みた.また,異なる組織への出張計測作業を容易にするために,複数組織間での安全かつ簡便な通信を容易にするための技術として,マルチロール形式でのメッセージ仲介メカニズム(メッセージエージェントシステム)を提案し,プラットフォーム上で試作を行った.実現されたプラットフォームは,ビデオ会議機能や上記メッセージ交換システム,ソフトウェア利用情報収集システム等を搭載しており,これらを組合わせて運用することで,複数組織間にまたがったソフトウェア開発プロジェクトに対する実地計測と,簡易的な解析,さらにネットワークを通じた本格的な解析とフィードバックを可能とするものである.今後の課題としてはCORBA等の分散オブジェクト技術に対応することで,外部の一般的なサービスを取りこむことなどが考えられる.本研究の目的は、申請者らが従来行ってきたソフトウェア品質計測技術に関する研究を発展させ、流動的な分散開発環境においても工学的かつ実用的な計測・フィードバックを行えるような機構を開発することである。まず,In-Situ型ソフトウェア計測のためのプロセスや支援機構について,デバッグプロセスの観察方法,アプリケーションやコンポーネントの利用情報をネットワーク経由で自動収集する方式などについても,検討を重ねた.これらの成果については学会において発表を行った.また,この支援キットの試作プラットフォームを,ノート型PC,小型CCDカメラ,無線LANカードなどを用いて構築を試みた.この作業は来年度に継続して行う予定である.本研究の目的は、申請者らが従来行ってきたソフトウェア品質計測技術に関する研究を発展させ、流動的な分散開発環境においても工学的かつ実用的な計測・フィードバックを行えるような機構を開発することである。平成13年度は,In-Situ型ソフトウェア計測のためのプロセスや支援機構について,デバッグプロセスの観察方法,アプリケーションやコンポーネントの利用情報をネットワーク経由で自動収集する方式などについても,検討を重ねた.これらの成果については学会において発表を行った.平成13年度後半から14年度にかけて,この支援キットの試作プラットフォームを,ノート型PC(CPU:モバイルペンティアム800MHz,メモリ256Mバイト,HDD20GB),小型CCDカメラ(USBタイプ,35万画素),無線LANカード(IEEE802. 11b)などを用いて構築を試みた.また,異なる組織への出張計測作業を容易にするために,複数組織間での安全かつ簡便な通信を容易にするための技術として,マルチロール形式でのメッセージ仲介メカニズム(メッセージエージェントシステム)を提案し,プラットフォーム上で試作を行った.実現されたプラットフォームは,ビデオ会議機能や上記メッセージ交換システム,ソフトウェア利用情報収集システム等を搭載しており,これらを組合わせて運用することで,複数組織間にまたがったソフトウェア開発プロジェクトに対する実地計測と,簡易的な解析,さらにネットワークを通じた本格的な解析とフィードバックを可能とするものである.今後の課題としてはCORBA等の分散オブジェクト技術に対応することで,外部の一般的なサービスを取りこむことなどが考えられる.
近縁種の連鎖不平衡マッピング　―ブリ属性決定遺伝子の同定にむけて―

本研究で、カンパチの性がステロイド代謝酵素の一つであるHsd17b1上の1つのSNPで決められていることを遺伝学的に見出した。このSNPはブリにも存在し、その遺伝子型はブリの性とも100%一致していた。オス型HSD17B1は派生型で、性決定SNPにより144番目のグリシンがグルタミン酸へ置換されるために活性中心の水素結合が阻害され、メス型よりもエストラジオール(E2)合成能が低いことが判明した。よってブリ属では、遺伝的メスはメス型HSD17B1により十分量のE2が作られるためメス化し、遺伝的オスはオス型HSD17B1が十分なE2合成能を持たないためにオス化すると考えられた。本研究プロジェクトの目的は、遺伝学的に同定できなかったブリ性決定遺伝子を、ブリ属近縁種群を用いて同定することである。今年度は、平成28年度に見つけたブリ属性決定遺伝子候補を確実なものにするため、性決定遺伝子候補周辺で強い連鎖不平衡が観察されなかったカンパチを用いて、研究を推進した。性決定遺伝子を遺伝学的に同定するにあたり、約1Mbのカンパチ性決定遺伝子領域ゲノム配列をターゲットエンリッチメント法により取得した。次いで、96尾のカンパチ野生個体(雌雄各48尾)のターゲット領域ゲノム配列をMiSeqにより取得し、相関解析を実施した。その結果、ステロイド代謝酵素であるHsd17b1遺伝子のエキソン上に存在し、非同義置換をもたらすSNPが性と非常に強い相関を示すことを見出した。当該SNPは野生ブリの性とも完全に相関していたことから、ZW型ブリ属性決定機構の遺伝的基盤を明らかにした。Hsd17b1は雌性ホルモンであるエストラジオール(E2)を作り出すのに必須の遺伝子である。ブリ属性決定SNPはZ型とW型対立遺伝子の144番目のアミノ酸サイトでそれぞれグルタミン酸とグリシンをコードしていた。各対立遺伝子の組換えタンパク質を作製し、E2合成能を比較したところ、Z型ではW型に比べて有意に活性が低いことが明らかとなった。それぞれの対立遺伝子の演繹アミノ酸配列とヒトHsd17b1立体構造データを用いてMDシミュレーションを行ったところ、Z型では144番目のグルタミン酸がHsd17b1活性中心とE2との間の水素結合ネットワークの形成を阻害していることが明らかとなった。また、カンパチHsd17b1は形態的性分化前後のカンパチ生殖腺体細胞で発現し、雌雄間の発現量の差は認められなかった。以上のことからブリ属の性は、Hsd17b1によるE2合成能の、遺伝的雌雄間の差異に起因することが明らかとなった。魚類遺伝学