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江戸時代の絵入本及び絵巻の調査研究-新出コレクションの調査を中心に-

富美文庫所蔵の江戸時代の絵入本及び絵巻コレクションを調査し、その全容を明らかにした。同コレクションは絵入本10件27冊及び絵巻6件12巻からなり、その大半は奈良絵本・絵巻と通称されるものである。主題は古典、舞の本、お伽草紙、風俗に分類される。これらの全作品について、基礎データの収集、写真撮影、本文(詞書)の翻字、絵の分析等を行い、解題を作成した。また、一部の作品については個別に考察を加え、同主題の作品や様式的に近似する作品と比較した。本研究は、個人蔵の江戸時代の絵入本及び絵巻コレクションの調査研究を主目的とし、併せて同種の作品群を可能な限り調査研究しようとするものである。この分野の研究はこれまで国文学を中心に行われており、絵画作品でありながら、美術史の分野ではあまり研究が進められていなかった。本研究では、これらの作品に対し、美術史の見地から本文(詞)と絵の関係、表現の特質、制作と享受の関係、流布及び流通の状況などを検討し、このように文学と絵画が一体化した作品群の特質及び意義等を明らかにする。同コレクションは絵入本10件27冊及び絵巻6件12巻からなり、全て肉筆の写本である。これまで所蔵者によって秘蔵されており、全て未公開作品である。内容は「伊勢物語」「徒然草」などの古典、「さるげんじ」「二十四孝」などの御伽草子が主であるが、なかには「四季十二月」「工商絵巻」など風俗的な要素の強い作品もある。これらの作品について、平成19年度は以下の作業を行った。(1)作品の調査及び撮影同コレクションの全作品を対象とし、各作品の基本データを収集するとともに、表紙(裏表紙)及び見返しを含む全頁あるいは全巻の撮影を行った。(2)本文の翻字及び絵の分析(1)で収集したデータに基づき、一部の作品については本文の翻字及び絵の分析を行った。本研究の主たる調査対象である個人コレクション(富美文庫)は、江戸時代の絵入本10件27冊及び絵巻6件12巻からなる。いずれも肉筆の写本であり、その内容は古典、お伽草子、舞の本を中心とするが、一部は風俗画である。今年度は、昨年度に引き続き、これらの作品について、本文の翻字及び絵の分析を進めた。成果としては、まず本コレクションの概要を紹介するために報告書を作成した。これらの作品はすべて未紹介のものであり、その意義は大きいと言えるだろう。特に「もんじゅ姫」(二冊)は、これまで慶応大学付属図書館本のみと思われていたものであり、その二本目の発見は重要である。また、一部については個別の作品研究を行った。塩出は「二十四孝」について、その概要をまとめ、特に料紙装飾を分析するとともに、本文を翻刻して諸本との校合を行った。さらに「ふしみときは」を取り上げ、その概要をまとめ、本文を翻刻するとともに、本文及び挿図について諸本との関係を検討し、その位置付けを考察した。中部は、絵画作品の様式研究の立場から、江戸時代の絵入本及び絵巻に分類される作品群の研究を試みた。これらの作品は様式的に極めて広範なものを含み、およそ一分野とは言い難い状況であるが、その中から特に華麗に装飾された「豪華本」の特質を考察するため、当コレクションの「むら松」及び「大織冠」を中心に、その特質を分析した。さらに、この両作品と共通する特色を示す作品を見出すことに努め、美術館及び大学図書館等に所蔵される作品の調査を試みた。宮崎は、本コレクション中に3件ある「伊勢物語」作品の中から白描絵巻3巻本を取り上げ、近年多くの作例が紹介されつつある江戸時代の白描物語絵の展開を追いながら、本作品の特徴を検討し、その位置づけを考察した。
新規なリグニン分解法による木材およびクラフトパルプ中の全リグニンの構造解明

従来のリグニンの化学構造研究は磨砕リグニン(MWL)を用いて行われてきたが、一般には木材の全リグニンの約30%であり、残りの70%に近いリグニンはMWL抽出残さ木粉中に存在する。そこで、その残さ木粉中のリグニンの化学構造を解明し、全リグニンの化学構造を解明することは極めて重要である。本研究では、申請者が独自開発したTIZ分解法の有為性を証明するために、ダイマーおよびMWLを用いた実験を行った結果、TIZ分解法の特徴と意義を見いだし、全リグニンの解明への適用性。について萌芽的研究の、芽生えを見いだした。具体的結果を下記に示す。1)2量体モデル分解の結果β-O-4モデルは定量的に分解し目的の生成物へと変換された。しかし、α位置換基がフェノキシ基、アルコキシ基、糖残基であるモデルの分解では、その置換基が相当量保持されることが判明した。その結果、実際のリグニンのTIZ分解により生成するGC分折可能な低分子の定量では、β-O-4構造の定量は困難であると予想されるが、この結果はα位の置換様式の情報が全く得られない従来法と対比すると、本TIZ法が極めて有意義な分解方法であると結論づけられる。2)リグニン分解の結果MWLをTIZ分解し生成物をGC分析した。得られた収率は従来の分解法による収率を下回るものであった。この実験結果はa):1)で予測された結果を裏付ける、あるいは、b):TIZ分解は高分子では定量的に進行しない、のいずれかである。従って、オリゴβ-O-4モデルを用いた実験が極めて重要な鍵を握るものと判断される。すなわち、本萌芽研究によりリグニンのα位の置換基探式を決定することが極めて重要であるとの結論に達したが、既に、萌芽的研究を脱し、オリゴβ-O-4モデルの化学合成と反応性、それを基礎をした全リグニンの構造解明へと、研究は進展している。本研究は、リグニンの主要構造であるβ-Ο-4構造の、温和で選択性の高い新規な分解法として申請者が独自開発したTIZ法を木材及びクラフトパルプ中のリグニンの構造解析に適用し、特に現在まで、さほど注目されなかったが極めて重要な、リグニンの側鎖α位の置換基様式を解明し、その結果に基づいた新規な環境を配慮した無公害、高選択性、高収率パルプ化法の創製を目指すものである。TIZ分解法はトシル化(T)、ヨード化(I)、亜鉛処理(Z)の三段階の反応を経てβ-Ο-4構造のみを分解する方法であるが、各反応段階の再現性の問題などがあり最適条件には達していなかった。そこで、本年度はまず、1)リグニンのモデル化合物を用い各反応段階の最適条件を見い出し、次いで2)確立された反応条件下での磨砕リグニンの分解について検討した。その結果1)については、各反応段階を定性的にはTLC、定量的には^1H-NMRによって追跡した結果、トシル化はTsCl(5 eq. )/Pyridine/r.t. /7h、ヨード化はKr(5 eq. )/DMF/100°C/6h、亜鉛処理はZn(10倍重量)/dioxane-H_2O/2hでの反応条件で各段階が定量的に進行することを見い出した。2)については、1)で得られた結果に基づいて、ユーカリ(Eucalyptus globulus)およびロブロリーパイン(Pinus taeda)の磨砕リグニンの分解を試みた。その結果、β-Ο-4構造由来のC_6-C_3分解物が予想通り得られた。しかしながら、その定量値は期待された値(リグニンの約50%がβ-Ο-4構造であるとして計算した値)より遥かに低いものであった。これらの結果は、1)期待された分解が定量的に進行しなかった、2)本TIZ法ではα位の結合(エーテル結合など)の多くが分解しなく、例えβ-Ο-4構造が開裂してもモノマーとして同定出来なかった。3)天然リグニン中のβ-Ο-4構造は従来言われているように50%も存在しない、の3つの可能性により説明される。次年度ではこれらの点を明確にする事が重要である、との結論に達した。また、本年度偉世界情勢が不安定であったため、アメリカヘの訪問は中止したが、次年度は本年度得られた結果について、North Calorina State UniversityのHou-min Chang教授を訪問し、本研究の結果と将来について議論することが肝要である。

しかし、α位置換基がフェノキシ基、アルコキシ基、糖残基であるモデルの分解では、その置換基が相当量保持されることが判明した。その結果、実際のリグニンのTIZ分解により生成するGC分折可能な低分子の定量では、β-O-4構造の定量は困難であると予想されるが、この結果はα位の置換様式の情報が全く得られない従来法と対比すると、本TIZ法が極めて有意義な分解方法であると結論づけられる。2)リグニン分解の結果MWLをTIZ分解し生成物をGC分析した。得られた収率は従来の分解法による収率を下回るものであった。この実験結果はa):1)で予測された結果を裏付ける、あるいは、b):TIZ分解は高分子では定量的に進行しない、のいずれかである。従って、オリゴβ-O-4モデルを用いた実験が極めて重要な鍵を握るものと判断される。すなわち、本萌芽研究によりリグニンのα位の置換基探式を決定することが極めて重要であるとの結論に達したが、既に、萌芽的研究を脱し、オリゴβ-O-4モデルの化学合成と反応性、それを基礎をした全リグニンの構造解明へと、研究は進展している。
bHLH型転写因子Ptf1aの神経発生における役割と下流遺伝子の探索

中枢神経系に存在する数千種類もの多様な神経細胞が、いかにして分別して生み出されるのかについては未解明の部分が多い。最近、小脳の興奮性、抑制性神経細胞は、それぞれ異なる部位の神経上皮で発現する2種類のbHLH型転写因子AtohlとPtflaによって分別して生み出されるということが明らかにされた。そこで本研究の目的は、小脳以外の脳領域におけるAtohl,Ptflaの働きについて明らかにすることによって小脳で一部明らかにされた神経細胞の多様性獲得機構が、他の脳領域にも適用できる普遍性を持っているのかどうかについて検証することであった。そこで、後脳(rhombomere,r18)におけるAtohl,Ptflaの発現を調べたところ、後脳背側部(r18)を前後に貫くようにAtohlおよびPtflaを発現する神経上皮ドメインの存在を明らかにすることができた。そして、中央部後脳(r2-5)のAtohl、Ptflaドメインからはそれぞれ蝸牛神経核の興奮性、抑制性神経細胞が生み出され、尾側後脳(r6-8)のAtohl、Ptflaドメインからは小脳へ投射する苔状線維、登上線維神経細胞がそれぞれ生み出されることを明らかにした。さらにそれぞれの神経細胞の発生にはAtohlやPtflaが必要であることも見いだした。つまり、Atohl,Ptflaによる神経細胞の多様性獲得機構が少なくとも後脳において普遍性を持っていることを示すことができた。さらに、子宮内エレクトロポレーション法によって、それぞれの転写因子が神経上皮ドメインの決定因子として作用している可能性を示唆することができた。さらにこれらの実験過程で、PtflaおよびAtohlの間に、相互的遺伝子発現抑制機構があることも明らかにできた。この機構は、境界の鮮明な神経上皮ドメインの構造を作り出すことに関与しているのではないかと考えている。本研究では、転写因子Ptf1aが神経系の発生に果たす役割について総合的に理解し、Math1など他の転写因子について得られている知見と合わせることによって、「転写因子群が神経細胞の多様性獲得に果たす役割」の解明に貢献することを、最終目的としている。そこで、本年度は以下の研究を行った。Ptf1a,Math1の小脳神経発生における役割の解明小脳神経発生におけるPtf1a,Math1の役割を調べるために、Ptf1aの遺伝子座にMath1遺伝子をノックインしたマウスを作製した。最初に、本来Ptf1aを発現する小脳脳室帯でMath1が異所的に発現しているかを確認したところ、Ptf1a-Math1ノックインマウスでは小脳脳室帯において異所性のMath1発現が観察された。そこで、Math1の役割を調べるために、Ptf1a-Cre/Math1;ROSA26R-loxP-lacZマウスを作製した。そして、このマウスにおいて、Ptf1aプロモーター活性がある細胞とその子孫細胞でlacZ染色(X-gal発色)することによって、異所性Math1陽性神経上皮由来の神経細胞を同定した。その結果、異所性Math1陽性細胞からは小脳のほとんどすべてのグルタミン酸作動性神経細胞が生み出されることが分かつた。このことから、小脳におけるMath1の役割は、本来グルタミン酸作動性神経細胞を生み出す領域、菱脳唇のアイデンティティを決定することではないかということが示唆された。小脳におけるPtf1aの下流遺伝子の探索野生型およびPtf1aヌル変異体の胎生11日、12日、14日、15日のマウス胚から小脳原基を取り出して、そこからRNAを抽出し、cDNA合成を行ったあと、cDNAマイクロアレイにかけ、両者の遺伝型によって発現の異なる遺伝子群をスクリーニングした。現在これらのデータを統計的に処理し、候補遺伝子を選択中である。今後は、こうして得られた候補遺伝子群について、in situハイブリダイゼーションや抗体染色などによって、発生途上の小脳原基における発現様式について調べる予定である。

さらにこれらの実験過程で、PtflaおよびAtohlの間に、相互的遺伝子発現抑制機構があることも明らかにできた。この機構は、境界の鮮明な神経上皮ドメインの構造を作り出すことに関与しているのではないかと考えている。
in vitro３次元培養系によるマウス精巣の再構築

我々は、マウス生後精巣の再凝集3次元培養系にKnockout Serum Replacement (KSR)を加えると、精巣構造のほぼ完全な再構築に成功したので、そのメカニズムを解明することを目的とした。阻害剤等の効果から、筋様細胞の伸長と精巣索様構造の周りへの正常な分布にはDesert hedgehogシグナリングが、また精細管様構造の形成にはTGFbeta family受容体の1種であるAlk5シグナリングが関わっていることが示唆された。また、セルトリ細胞特異的にEGFPを発現するtransgenic mouse精巣を用いて再凝集過程を観察したところ、セルトリ細胞の動的な挙動が観察された。哺乳類の精巣は、生殖細胞と体細胞から成る精細管とその外側の間組織から成る。我々はコラーゲン内3次元培養系にKSRを添加することにより精細管の再構築に成功したので、この再構築系を用いて精細管の形成機構を調べることを目的とする。1)培養条件の検討:野生型マウスを用いて、KSR濃度10%と20%を比較したが、1週間後の状態はほとんど変わらなかった。コラーゲンとMatrigelの比較では、コラーゲンでは3日目でKSRの有無によって差が出たが、Matrigelでは3日目まではKSRの有無による差は見られなかった。2)セルトリ細胞のsortingと極性の同一化の機構:培地にKSRを入れると、セルトリ細胞の凝集塊の外側にintegrinを発現し、ラミニンを分泌するようなセルトリ細胞の極性の同一化を促進する。極性の同一化のしくみを調べるため、integrinの阻害剤であるRGDペプチドや、N-cadherin抗体による効果を調べたが、阻害効果は見られなかった。3)いろいろな週令の精巣を用いた再構築:生後2週(精母細胞まであり)4週(精細胞まであり)の精巣でも再構築ができるかどうかを検討した。4週令の精巣では、KSRを加えても再構築はうまくいかなかったが、10日2週令の精巣では多少遅れるものの再構築は成功した。4)阻害剤の影響:desert hedgehog (Dhh)シグナリングの阻害剤であるForskolinとCyclopamineをKSR添加培地に投与すると、どちらもセルトリ細胞の凝集、筋様細胞の伸長と分布に対して阻害効果があることが示された。これらの結果は、Dhhシグナリングが再凝集培養における精索構造の再構築に重要な働きをしていることを示唆する。1)生後10日目(10-dpp)精巣の再構築能:6-dppの精巣では、昨年度示したように、培養3日目、KSR添加培地ではセルトリ細胞凝集塊が大きくなり索構造を形成するが、control培地では形成しない。これに対し、10-dppの精巣では、control培地でもKSR添加培地の場合と同様、3日目にはセルトリ細胞凝集塊が大きくなり索構造を形成する。ところが1週間後、KSR添加培地では、セルトリ細胞が索の外側に沿って一列に配列し、核と細胞質を内腔に向かって伸長し、精細管様構造を形成するが、control培地では精細管構造は形成されない。つまり10-dppでは、索形成にKSRは不要であるが、精細管形成にはKSRが必須であることを示唆する。つまり、精巣のステージによって再構築能に違いがあることが明らかになった。2)阻害剤の効果: 6-dppや10-dpp精巣の再凝集培養において、desert hedgehog (DHH)シグナリングの阻害剤であるCyclopamineやTGFβfamily受容体の1つであるAlk5の阻害剤(Alk5i)をKSR添加培地に投与すると、どちらも精細管の形成に対して阻害効果が見られた。これらの結果は、DHHやTGFβfamilyシグナリングが精細管構造の再構築に重要な働きをしていることを示唆する(論文準備中)。3)Live imaging:セルトリ細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックマウスの10-dpp精巣の再凝集培養においてセルトリ細胞の挙動を観察すると、KSR存在下では、小さな凝集体が次第に大きくなる様子が観察された。生物学予定では、Mis-CreトランスジェニックマウスとR26R-RGトランスジェニックマウスを掛け合わせてtamoxifenを母親に注射し、核にmCherryを細胞膜にGFPを発現する子マウスを得て使用するつもりであったが、何故かセルトリ細胞にmCherryもEGFPも発現しなかった。そこで、Sox9 promoter下にEGFPを恒常的に発現するマウスを岐阜大学の秋山治彦先生から供与を受けた。子供は順調に産まれており、セルトリ細胞にGFPが発現しているので、今後の実験に問題はない。

「現在までの達成度」に書いたように、Sox9 promoter下にEGFPを恒常的に発現するマウスの供与を受け、子供は順調に産まれている。このトランスジェニックマウスの精巣を用いて再凝集培養実験を行い、KSRを加えた場合や加えない場合の再凝集過程における生きたセルトリ細胞の挙動をレーザー蛍光顕微鏡で観察・録画し、解析する。2)野生型マウス精巣の再凝集培養における種々の因子や阻害剤の効果これまでに効果のあった種々の因子や阻害剤の効果をさらに詳しく調べる。前年度に予定していた人件費は別のソースから出たが、次年度にポスドク1人の人件費が必要となったため。試薬代、マウス飼育費、学会旅費、ポスドク1人の人件費等に使用する。
線形理論にもとづく補正法を用いたベンダーエレメント法の適用限界の拡張

本研究は,ベンダーエレメント試験装置系が送・受信ベンダーエレメント系,土供試体系,受信ベンダーエレメント系の3つの線形要素からなり,土供試体系の伝達関数を用いることでベンダーエレメント試験の著しい精度向上が見込める,という考えに立脚している。研究初年度である過年度は,ベンダーエレメントの基本的な振動特性をレーザー変位計によって外部から直接測定し,ベンダーエレメントの振動特性をフィードバックすると言われているセルフモニタリングエレメントの出力結果と比較することに主眼を置いた。実験は,送信および受信ベンダーエレメントにセルフモニタリング型のエレメントを用い,無拘束状態のエレメントの振動特性をレーザー変位計およびセルフモニタリングエレメントのフィードバック電圧で直接・間接的に測定した。測定結果から土供試体系の伝達関数を求めるために必要な,送信/受信ベンダーエレメントの伝達関数を同定した。また,エポキシ樹脂によるコーティングが伝達関数に与える影響について検討した.その結果,以下の知見を得た。・ベンダーエレメント先端変位の挙動は入力波と一致しないことが示された.sin波入力を受けたベンダーエレメントは減衰振動を呈することが確認された.これは特に送信BEにおいて,従来の多くの研究者が仮定している振動特性とは異なるものであった.・ベンダーエレメント先端変位に対するフィードバック電圧の増幅率はおよそ10kHz以上になると急激に増大することが示された.また,セルフモニタリングエレメント入出力の増幅率のスペクトルはエポキシ樹脂の有無による拘束条件に依存することが確認された.「研究実績の概要」で述べた進捗は研究計画調書で記載した研究計画とほぼ一致しており,現在のところ,研究はおおむね順調に進展している。また,結果についてもほぼ想定通りのものが得られたが,ベンダーエレメント先端変位の挙動は入力波と一致しないことが直接測定によって示された点は,これまでの研究者の仮定と異なるものであり,特筆すべき結果であった。過年度はレーザー変位計とセルフモニタリングエレメントを用いて,大気中でのベンダーエレメントの基本的な振動特性を明らかにした。実施した一連の実験から,セルフモニタリングエレメント入出力の増幅率のスペクトルがエポキシ樹脂の有無による拘束条件に依存する,という結論が得られた。その一方で,この結論は,実際の試験においてベンダーエレメントが土供試体中に挿入された場合,周辺の土による拘束状態に依存して,ベンダーエレメントの伝達関数が変化することを示唆している。周辺土による拘束状態は土の種類や圧密応力によって変化するため,申請者が考えているベンダーエレメント試験の精度向上のためには,測定のたびに土中にある送・受信ベンダーエレメント系の伝達関数を評価する必要がある。今年度はこのことを念頭に,レーザー変位計を用いずにセルフモニタリングエレメントによって土中にある送・受信ベンダーエレメントの伝達関数を評価する手法の適用性を検討する予定である。この手法の検討は研究計画調書作成時からあらかじめ盛り込まれていたもので,当初計画通りの研究計画である。年度上半期までにはそのために必要な実験装置の準備と予備的な実験を含め,本実験に取りかかる予定である。得られた実験結果をとりまとめ,この段階までの研究成果をSoils and Foundationsに発表する予定である。また,その先を見据え,提案するベンダーエレメント試験精度向上手法の様々な試験条件への適用性を検討する端緒として,セメント改良を行った軟弱土への適用を試みる。

その一方で,この結論は,実際の試験においてベンダーエレメントが土供試体中に挿入された場合,周辺の土による拘束状態に依存して,ベンダーエレメントの伝達関数が変化することを示唆している。周辺土による拘束状態は土の種類や圧密応力によって変化するため,申請者が考えているベンダーエレメント試験の精度向上のためには,測定のたびに土中にある送・受信ベンダーエレメント系の伝達関数を評価する必要がある。今年度はこのことを念頭に,レーザー変位計を用いずにセルフモニタリングエレメントによって土中にある送・受信ベンダーエレメントの伝達関数を評価する手法の適用性を検討する予定である。この手法の検討は研究計画調書作成時からあらかじめ盛り込まれていたもので,当初計画通りの研究計画である。年度上半期までにはそのために必要な実験装置の準備と予備的な実験を含め,本実験に取りかかる予定である。得られた実験結果をとりまとめ,この段階までの研究成果をSoils and Foundationsに発表する予定である。また,その先を見据え,提案するベンダーエレメント試験精度向上手法の様々な試験条件への適用性を検討する端緒として,セメント改良を行った軟弱土への適用を試みる。時期購入予定品であるセルフモニタリングエレメントの納期が年度をまたいだため次年度使用額とした。今年度購入予定である。
ビタミンDの新しい情報受容機構に関する研究

1.ビタミンD情報伝達機構におけるCa^<2+>依存性蛋白キナーゼ(PKC)の関与を検討する目的で、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60及び、そのmutantでありビタミンD受容体を欠くHL-60Blastを用い、PDBu結合能を指標に、ビタミンDのPKC誘導能をさらに詳細に検討した。その結果、ビタミンDのPKC誘導能はセコステロール骨格にのみ依存し、側鎖構造は大きな役割を担っていないことが明らかとなった。2.ビタミンD受容体D結合部位にエプトープを持つ単クローン抗体を用い、膜分画のD結合蛋白を探索した。しかし、核膜にわずかにD結合部位と交差反応性を示す蛋白が検出されたのみで、細胞膜上には明らかな相同性を示す蛋白は検出されなかった。これらのことより、ビタミンDの即時型の反応には、ビタミンD受容体またはそれの相同蛋白が関与している可能性は少ないことが示唆された。
細胞分裂に関連するタンパク質NuMAの動的構造解析と制御機構

紡錘体の形成と機能を制御するタンパク質のひとつに,NuMA (nuclear mitotic apparatus protein)がある.分裂期のNuMAは紡錘体と細胞表層とに局在する.細胞表層に局在するNuMAはパートナータンパク質LGNとともに,紡錘体極から伸びる微小管を細胞膜へとつなぎ止め,紡錘体を両極へと引っ張る力を制御している.また,LGNには別なパートナー分子Inscucuteable (mInsc)が結合し細胞極性とリンクする.NuMAとmInscのLGN結合領域には相同性は見られないが,両者はともにLGN N末端TPRモチーフ領域に結合する.我々は,「mInsc-LGN複合体」の結晶構造解析に成功し,mInscとLGNとの相互作用に重要な残基を特定した.LGNのmlnscとの相互作用に関与する残基への変異がNuMAとの相互作用に及ぼす影響を明らかにするため,NuMAとLGN(野生型と変異体型)との相互作用をGST pull-down assayを用いて検討した.その結果,NuMAはmIsncと同様にLGN TPRドメインの凹面と相互作用している可能性が高く,NuMAとmInscとの相互作用様式は互いに異なると結論付けられた.さらに,表面プラズモン共鳴装置Biacoreを利用してLGNに対するNuMAとmInscの結合領域との解離定数Kdを見積ると,LGNとパートナー分子の親和性は,mInscで2.4 nMでNum27 nMだった.mInscの存在下ではNuMAとLGNとの相互作用を効果的に阻害したことから,LGN TPRドメインとの相互作用においてmInscとNuMAの間には排他的な関係があり,NuMAに優先してmInscが結合することが判明した.紡錘体の形成と機能を制御するタンパク質のひとつに,NuMA (nuclear mitotic apparatus protein)がある.分裂期のNuMAは紡錘体と細胞表層とに局在し,紡錘体極に局在するNuMAは,紡錘体極に微小管と直接結合し紡錘体形成を制御する.一方,細胞表層に局在するNuMAは,紡錘体極から伸びる微小管をその近傍の細胞膜へとつなぎ止め,紡錘体を両極へと引っ張る力「張力」の発生に必須である.細胞表層で機能する際のパートナータンパク質にLGNがあり,「NuMA-LGN複合体」はほ乳類から線虫まで進化的にも保存されているタンパク質複合体である.NuMAの配列中でも種間の保存性の高いC末領域には,LGNに加え複数のパートナー分子との相互作用部位が知られている.本研究課題の目的は,NuMA C末端領域がどのように複数の標的タンパク質を認識するのかを明らかにすることである.当該年度は,これまで相互作用様式が不明であったNuMAとLGNとの複合体のX線結晶構造解析に取り組んだ.NuMAC末端側について,NMRとCDを用いてキャラクタリゼーションを行ったところ,単独では一定の3次構造を持たないことが示された.様々な長さのLGN結合領域を含むNuMAタンパク質の発現系を構築し,GST pull-down assayによりLGNとの相互作用を検討し発現可能な結合領域の絞り込みを行った.NuMA-LGN複合体について,精製方法を確立しタンパク質複合体の結晶化を進め,複合体の結晶を得ることに成功した.放射光ビームラインにおいてX線回折データ測定を行い,4.0オングストローム分解能のデータを収集した.現在,結晶の質を向上させるため,十残基ずつ削り込み長さの異なる領域について精製・結晶化を進めている.紡錘体の形成と機能を制御するタンパク質のひとつに,NuMA (nuclear mitotic apparatus protein)がある.分裂期のNuMAは紡錘体と細胞表層とに局在する.細胞表層に局在するNuMAはパートナータンパク質LGNとともに,紡錘体極から伸びる微小管を細胞膜へとつなぎ止め,紡錘体を両極へと引っ張る力を制御している.また,LGNには別なパートナー分子Inscucuteable (mInsc)が結合し細胞極性とリンクする.NuMAとmInscのLGN結合領域には相同性は見られないが,両者はともにLGN N末端TPRモチーフ領域に結合する.我々は,「mInsc-LGN複合体」の結晶構造解析に成功し,mInscとLGNとの相互作用に重要な残基を特定した.LGNのmlnscとの相互作用に関与する残基への変異がNuMAとの相互作用に及ぼす影響を明らかにするため,NuMAとLGN(野生型と変異体型)との相互作用をGST pull-down assayを用いて検討した.その結果,NuMAはmIsncと同様にLGN TPRドメインの凹面と相互作用している可能性が高く,NuMAとmInscとの相互作用様式は互いに異なると結論付けられた.さらに,表面プラズモン共鳴装置Biacoreを利用してLGNに対するNuMAとmInscの結合領域との解離定数Kdを見積ると,LGNとパートナー分子の親和性は,mInscで2.4 nMでNum27 nMだった.mInscの存在下ではNuMAとLGNとの相互作用を効果的に阻害したことから,LGN TPRドメインとの相互作用においてmInscとNuMAの間には排他的な関係があり,NuMAに優先してmInscが結合することが判明した.
ブラキシズムの成因に関する大脳基底核の役割とその評価法の開発

ブラキシズムは、歯科臨床においてさまざまな問題を引き起こすと経験的に考えられているが、その発現のメカニズムについては不明である。本研究ではブラキシズムと大脳基底核の活動性の関係を実験的に明らかにするために、2つの面から取り組んだ。ひとつめは、動物実験においてブラキシズムを誘発することを目的として、大脳基底核の電気刺激および破壊を行った。ふたつめは、大脳基底核が口顎運動機能の遂行に対して、どのような役割を担っているかを知る目的で大脳基底核と咀嚼運動との関係を調べた。前者の実験に関しては、被殻に対する電気刺激および破壊のいずれによっても実験的なブラキシズムを引き起こすことが本研究ではできず、今後の成果に期待するところである。後者の実験から、咀嚼運動と大脳基底核あるいは黒質-線条体系のドーパミンとの関係において以下のような成果が得られた。(1)食物摂取から嚥下に至るまでの一連の咀嚼はstage I,IIa,IIbの3つの過程を順に移行し、それぞれの下顎運動パターンが各過程において変化することが知られている。咀嚼のstage IIa中に被殻に電気刺激を与えると、顎運動パターンの変調を引き起こすことが明らかとなった。この結果から、大脳基底核は咀嚼の進行に伴う顎運動パターンの変更に関係することが示唆された。(2)咀嚼中にウサギ被殻におけるドーパミン量の変動を検索した結果、咀嚼中はドーパミン量が増加していることが明らかとなった。さらに、被殻腹側部に投射するドーパミンニューロンを傷害して、摂食行動を観察すると、取りこみ中の行動に変化が認められた。これらの結果から、摂食行動、特に取り込み時の行動に何らかの影響をおよぼしていることが示唆された。本研究では、口腔機能遂行に対して大脳基底核が役割を担っていることを示唆する結果が得られたが、今後、臨床的研究を含め、ブラキシズムの発現機構の解明に、本研究の手法・結果が役立つことを期待する。本研究はブラキシズムと中枢神経系、特に大脳基底核の活動性との関係を実験的に明らかにしようとするものである。さらに、実験的に得られた結果を用いてブラキシズムの評価法の一つを確立することを目的としている。本年度は大脳基底核の活動とブラキシズムの関係についてを調べる第一段階として大脳基底核の咀嚼筋活動に対する役割を調べた。実験には補助金により購入したウサギを用い、脳定位固定装置に固定して、無麻酔下で実験を行った。記録した咀嚼筋活動の解析には補助金で購入した咀嚼筋活動解析装置を用いた。以下に行った研究の成果を示す。1.咀嚼中に基底核からニューロン活動を咀嚼筋筋電図活動、顎運動と同時に記録し、ニューロンの活動様式を分析した。約60%のニューロンが咀嚼に関連した活動を示し、咀噌のstageの変化に伴って活動が変化した。記録されたニューロンの活動様式から2つのタイプが認められ、ひとつは一連の咀嚼中にstageの変化に伴って一度だけ活動を変化するもの(単純型)、もうひとつは一連の咀嚼中にstageの変化に伴って複数回活動を変化するもの(複雑型)であった。

被殻がら記録されたニューロンのほとんどは単純型であったのに対し、淡蒼球から記録されたニューロンの約30%は複雑型であった。2.咀嚼中に大脳基底核を電気刺激し、顎運動の変化を調べると、被殻および淡蒼球腹側部の電気刺激は、咀嚼時のリズミカルな顎運動を閉口筋活動の小さい運動に変調した。安静時では、この変調を起こす領域の一部に与えた刺激により、リズミカルな顎運動が誘発されたが、その顎運動パターンは咀嚼中の刺激により変調された顎運動パターンとは異なった。3.これらの結果から被殻および淡蒼球は咀嚼の遂行、特に咀嚼のstageの変化に重要な役割を演じていることが示唆された。本研究はブラキシズムと中枢神経系、特に大脳基底核の活動性との関係を実験的に明かにしようとするものである。さらに、実験的に得られた結果を用いてブラキシズムの評価法に一つを確立することを目的としている。本年度は、顎運動に関連した部位を破壊することにより、認められる顎運動の変化、不随意運動を調べた。実験にはウサギを用い、定位的に脳内に挿入したガイドカニューレを介して、イボテン酸を注入することにより、行った。破壊後の行動観察は補助金により購入したカラービデオカメラを用い、また、筋電図活動の観察にはメモリオシロスコープを使用した。以下に行った研究の成果を示す。1.両側性の破壊により、数日間、摂食量および飲水量の減少が認められた。2.ビデオによる、行動観察から全身的な影響と思われる無動時間の延長が認められた。しかし、この無動と摂食量の減少に関連性は認められず、この無動が摂食量の減少の直接的な原因ではないことが明らかとなった。3.破壊後、摂食量の減少に伴い、餌箱へ向かう回数は減少したが、摂食量に対するこの行動の頻度は破壊前に比べ増大していた。このことは、破壊により飼料を摂取する行動の発現に影響が及んだことを示唆する。4.摂食時間についても破壊後、摂食量の減少と伴に短縮したが、摂食量に対する摂食時間は破壊前と変化していなかった。つまり破壊後も同量の飼料を咀嚼する際に要する咀嚼時間に大きな相異がないことが明かとなった。このことは、破壊が咀嚼時の臼磨運動に影響していないことを示唆する。5.節電図活動から、破壊後は咀嚼時以外にも、リズミカルな活動が認められた。このことは、基底核の破壊により、不随意な顎運動の出現を示唆するものである。これらの咀嚼行動に対する影響や不随意な顎運動とブラキシズムの関係については今後の研究により解明すべき問題である。本研究はブラキシズムと中枢神経系、特に大脳基底核の活動性との関係を実験的に明らかにしようとするものである。さらに、実験的に得られた結果を用いてブラキシズムの評価法の一つを確立することを目的としている。ウサギ大脳基底核を電気刺激して、誘発される顎運動を調べると、一部の領域で開口優位性の顎運動が誘発されたが、より広い領域の刺激により咀嚼時の顎運運動を変調することが明らかとなった。このことから、大脳基底核は咀嚼時の口腔の行動パターンを変化させることに関係していることが示唆された。また、ブラキシズムにも関係すると報告されている被殻へのドーパミン入力を、6-OHDAを注入することで遮断して、咀嚼時の顎運動の変化、不随意運動を調べた。両側性にドーパミン入力を遮断しても摂食量および飲水量に変化が認められなかった。ドーパミン入力の遮断後、摂食量に対する取り込み行動の頻度は破壊前に比べ増大しており、さらに、一回の取り込み行動の時間が減少していた。筋電図活動から、取り込み行動時にも咬筋筋活動の大きい臼磨運動を行っていることが認められたが、ドーパミン入力の遮断後はそのような臼磨運動が減少していることが認められた。
多重機能性金属錯体の合成と応用

光の時代の到来に向け、物質のもつ様々な機能、例えば、磁石の特性、電気の特性、色などを光で自由にスイッチさせることのできる新しい物質、新しい技術を開発する研究が盛んに行われている。本研究では光応答性と磁気スイッチング特性を有する新材料の開発を目指し、Co原子価異性(Valence Tautomeric)錯体に着目し磁気測定と光照射効果に関する検討を行った。その結果、二核錯体[{Co(TPA)}_2(DHBQ)]・(PF_6)_3が室温で原子価異性相転移を示すことを見出した。相転移に伴う電子状態の変化はCo^<III-LS>-DHBQ^<3->-Co^<III-LS>【double arrow】Co^<III-LS>-DHBQ^<2->-Co^<II-HLS>と表せる。また、この相転移はヒステリシスを示し、ヒステリシス幅は約13Kであった。さらに、低温で光応答性を検討したところ、光誘起原子価異性を示すことを見出した。光誘起準安定状態は温度を約30Kに上げると再安定状態に緩和した。この変化は繰り返し観測でき、可逆であることが分かった。また、この物質の誘導体[{Co(TPA)}_2(DPNA)]・(PF_6)_3を合成し、その磁気特性、光応答性を検討した結果、この物質も新しい光応答性磁性材料であることがわかった。なお、光応答性、ヒステリシスを示す物質の作製は本分野における重要な研究課題であるとされてきた。従って、本研究において、世界に先駆けてその課題を解決したといえる。さらに、Mn三核錯体が一次元的に架橋した新材料([Mn^<III>_3O(Meppz)(EtOH)_4(OAc)]_n)を開発することに成功した。この物質の磁気特性は周波数依存を示し、単一分子鎖磁石としての特性を有することを見出した。また、単結晶X線構造解析の結果から、結晶構造には対称心がなくSHG活性であることを明らかにした。
腸内細菌叢および腸管免疫系へ影響を及ぼす口腔内細菌の解析

これまで腸内細菌叢を構成する細菌種の多様性の減少や特定菌種の増減など腸内細菌異常が様々な疾患の発症と関連していることが明らかになってきている。しかしながら、どのような原因で腸内細菌異常が起こるのか、どのような細菌種が疾患発症に関与しているかについては明らかになっていない。そこで本研究では、口腔内細菌が腸内に定着し腸管免疫系の活性化に寄与しているのではないかと考え、研究を行った。昨年度に、腸管に定着すると強くTh1細胞を誘導する40B3株とほとんど誘導しないKCTC2242株のゲノム配列を比較し、これらの株で非常に相同性が高いことを見出し、これら2株間で異なる領域を3個同定した。そのうちD-alanyl-D-alanine-carboxypeptidaseやD-alanine--D-alanine ligase Aなど細胞壁ペプチドグリカンの構成に必要なタンパク質をコードしている遺伝子が含まれている領域に着目し、40B3株から欠損した変異株とKCTC2242株へ挿入した変異株の作製を行った。これらの変異株を無菌マウスに経口投与し、それぞれの単独定着マウスを作成した。投与3週間後に大腸のTH1細胞の活性化を解析したところ、40B3欠損株は40B3野生株と比較して少し弱い程度であった。KCTC2242挿入株に関してはKCTC2242野生株と比較して有意にTH1細胞が活性化されていたが、40B3野生株と比較すると半分程度の強度であった。以上のことからKlebsiellaのTH1細胞活性化に関与する候補領域を同定したが、変異株を用いた解析からこの領域はTH1細胞活性化に関与はするがそこまで大きな寄与はないと考えられた。そのため、さらに詳細にゲノム比較を行うことにより候補領域・遺伝子を探索する必要があると考えられた。ヒトの腸管内腔には数百種類の腸内細菌が存在し、宿主の様々な生理機能に影響を与えている。そのため腸内細菌叢を構成する細菌種の多様性の減少や特定菌種の増減など腸内細菌異常(dysbiosis)が様々な疾患の発症と関連していることが明らかになってきている。しかしながら、どのような原因でdysbiosisが起こるのか、どのような細菌種が疾患発症に直接関与しているかについては明らかになっていない。そこで本研究では、口腔内細菌に着目し、研究を進めた。まず、クローン病患者の唾液中に存在していたK. pneumoniae 2H7株が腸管に定着し強いTh1細胞の誘導を引き起こすことが明らかになった。また、ATCCから購入した他のK. pneumoniaeと比較した結果、2H7株が特にTh1細胞を強く誘導したが、その他の株でもばらつきはあるもののTh1細胞を誘導することがわかった。現在、このTh1細胞の誘導能と相関するゲノム領域、遺伝子発現、メタボロームを探索している。腸炎への関与については、無菌IL10欠損マウスに2H7株を定着させると強い腸炎が引き起こされたことから遺伝的に炎症が起こりやすい状況下ではK. pneumoniae 2H7株が強い腸炎を引き起こすことが想定される。さらに通常の腸内細菌が存在しているSPFマウスにK. pneumoniaeを経口投与しても腸内に2H7株が定着することはないが、アンピシリン等の抗生剤を飲水投与し腸内細菌のdysbiosisを誘発すると2H7株が定着することが分かった。以上のことから、クローン病患者の口腔に存在しているK. pneumoniaeは通常腸管に定着しないように制御されているが、腸内細菌のdysbiosisが起こると腸管に定着し、Th1細胞の活性化を通して腸炎の増悪に働いていることが示唆された。腸内に定着し、腸管免疫系に強い影響を与える口腔細菌を探索するため、クローン病患者の唾液を無菌マウスに投与した。投与6週間後に腸管からリンパ球を採取し、フローサイトメトリーにより、免疫細胞の解析を行うとクローン病患者#2の唾液を投与したマウスにおいて強いTh1細胞の誘導が見られた。そこで次にTh1誘導に関与している細菌を特定するため、このマウスの腸内細菌を培養し優勢菌である8菌株を単離した。この8菌株の中にTh1細胞を強く活性化する細菌を調べたところ、Klebsiella pneumoniae 2H7株が唯一Th1細胞を活性化したため、K. pneumoniae 2H7株がクローン病患者#2の唾液投与マウスにおけるTh1細胞誘導の原因細菌であると特定した。そこで次にK. pneumoniae 2H7株が腸炎に関与しうるかを検討するため、自然に腸炎を発症するIL10欠損マウスを無菌化し、2H7株を定着させたところ比較対象のE. coli 2B1株と比較して強い腸管炎症が惹起された。また、このK. pneumoniae 2H7株は通常の腸内細菌が存在しているSPFマウスに経口投与しても腸内定着することはないため、常在腸内細菌が定着阻害を行っていると考えられた。一方で、アンピシリン等の抗生剤を飲水投与し腸内細菌のdysbiosisを誘発すると2H7株が定着することから、クローン病患者の口腔に存在しているK. pneumoniaeは通常腸管に定着しないように制御されているが、腸内細菌のdysbiosisが起こると腸管に定着し、Th1細胞の活性化を通して腸炎の増悪に働いていることが示唆された。K. pneumoniae 2H7株によるTh1細胞誘導機構の解析については現在行っているところである。

ヒトの腸管内腔には数百種類の腸内細菌が存在し、宿主の様々な生理機能に影響を与えている。そのため腸内細菌叢を構成する細菌種の多様性の減少や特定菌種の増減など腸内細菌異常(dysbiosis)が様々な疾患の発症と関連していることが明らかになってきているが、どのような原因でdysbiosisが起こるのか、どのような細菌種が疾患発症に直接関与しているかについては明らかになっていない。そこで本研究では、口腔内細菌が腸内に定着し腸管免疫系の活性化に寄与しているのではないかと考え、研究を行った。昨年度に、クローン病患者の唾液中に存在していたK. pneumoniae 2H7株が腸管に定着し強いTh1細胞の誘導を引き起こすことが明らかになったため、本年度はK. pneumoniaeのTh1細胞誘導メカニズムの解析を行った。細菌バンクであるATCCやJCMなどから購入した様々なK. pneumoniaeを無菌マウスの腸内に定着させ、大腸のTh1細胞の誘導を比較したところ、強いTh1細胞誘導を引き起こす群、中程度に誘導を引き起こす群とほとんど誘導しない群に分けられることが明らかになった。これらの使用したすべての細菌のゲノム解読を行い、どのような遺伝子がTh1細胞誘導と相関するのかを解析した。その結果、長鎖脂肪酸・マンノース・フルクトース・ガラクチトール・4型分泌装置などに関与する61個の遺伝子が候補として引っかかってきた。今後これらの機能がどのようにTh1細胞の誘導に関与しているのかを解析する予定である。また一方で、強くTh1細胞を誘導する40B3株とほとんど誘導しないKCTC2242株のゲノム配列が非常に相同性が高いことを見出し、これら2株間で異なる遺伝子を229個同定した。上記の解析とともにこれら2株の違いからもTh1細胞の誘導に関与している細菌側の遺伝子を同定していく予定である。口腔由来のK. pneumoniaeが腸内に定着し、大腸のTh1細胞を強く活性化することを突き止めた。その後、K. pneumoniaeによるTh1細胞誘導メカニズムの解明に取り掛かっている。K. pneumoniaeは肺炎患者や土壌など様々な場所から株が単離されており、合計10株のK. pneumoniaeを手に入れることができた。それらすべてをそれぞれ無菌マウスの腸管に定着させ、大腸のTh1細胞の誘導を解析したところ、強くTh1細胞を誘導する株が5株、中程度に誘導する株が3株、ほとんど誘導しない株が2株あった。これらの株のゲノム配列を解読し、どのような遺伝子が異なっているのかを解析し、K. pneumoniaeのTh1細胞誘導メカニズムにつながる分子の同定を試みた。そこで、これらすべての株からゲノムDNAを抽出し次世代シーケンサーでゲノム配列を解読し、塩基配列ベースで95%以上の相同性で遺伝子の有無を検出した。Th1細胞誘導の強さと相関する遺伝子を網羅的に解析した結果、長鎖脂肪酸・マンノース・フルクトース・ガラクチトール・4型分泌装置などに関わる61個の遺伝子がTh1細胞誘導に関与する候補遺伝子として検出された。また10株のK. pneumoniaeのうち、強くTh1細胞を誘導する40B3株とほとんどTh1細胞を誘導しないKCTC2242株のゲノム塩基配列を比較すると非常に相同性が高いことを見出した。
世界記録に挑戦する化合物:最長の炭素-炭素結合と超原子価

代表者らは、ヘキサフェニルエタン型分子に関するこれまで10年間の結果をもとに考察を行い、その結合の解裂で生じるジラジカル状態が立体的に近接位に強制されたままであり、且つ、共鳴やペリ環状反応によって閉殻構造に変換されないという条件を満たせば、これまでの常識を超える極度に長い結合を観測できると考えた。この予想をもとにテトラアリールピラセン型分子をモチーフとした研究を行い、中性有機分子での世界最長結合[1.791(3)Å]の観測、及び、長い結合ほど更に結合長が変化し易いという「伸長性」を発見した。炭素-炭素共有結合は有機化学に於けるもっとも重要かつ基本的な概念を構築する。反応有機化学においては、「いかに巧みに炭素-炭素共有結合を形成させるか」が、合成有機化学においては、「炭素-炭素結合形成反応を、どのように利用してターゲット化合物へ導くか」が、構造有機化学においては、「ターゲット化合物の特異な構造における共有結合の局在性-非局在性」が常に中心的な研究課題として取り上げられている。すべての有機化合物は共有結合によって形作られている。それほどまでに普遍的なものでありながら、結合長と結合解離エネルギーの関係など、その本質の完全な理解の為に、解明されるべき問題が残されている。本申請課題の目的は、炭素-炭素共有結合の究極の姿を実験的に明らかにすることに挑戦し、それを手がかりに従来未確定のまま残されてきた問題を解決するとともに、共有結合の更なる可能性を探求することにある。嵩高いアリール基が6つ置換した炭素-炭素結合を有する化合物は、非常に立体混雑した分子でありその合成には特別の工夫が必要である。21年度は、立体障害のより少ない二価カチオンを前駆体とし、長く伸びた単結合を合成の最終段階で形成させるというアプローチにより、1,1,2,2-テトラアリールピラセン誘導体10種類を合成し、還元により生じたジラジカルが結合することで、長い炭素-炭素結合が生じさせた。その構造の比較によりアリール基上の置換基が、結合長伸長に与える効果について調べた。本研究の結果は、従来信じられてきた、「軌道間相互作用による結合伸長」の考えを支持せず、逆に「伸長に対する軌道間相互作用の効果は小さい」という戸田教授やSiegel教授らの実験結果およびBaldridge教授の理論計算と一致する結果を得た。一方で、21年度中に計画していた研究の一部である、ジラジカル性の高温状態での発現の可能性について、22年度により詳細な理論的アプローチを行った。ドイツHerges教授らとの共同研究によれば、結合切断された3重項ジラジカル状態が準安定状態として存在し、過熱により結合切断が起これば、熱によるスピンクロスオーバー挙動が見られる可能性が示された。たとえば、3中心2電子結合は、炭素以外の低周期典型元素化合物では、ボランを例にとるまでもなく比較的多くの例が報告されている一方、炭素-炭素結合にもう一原子が挿入された形の3中心2電子結合に関する実験的研究は非常に限られている。嵩高いアリール基が6つ置換した炭素-炭素結合は高いHOMOを持ち、この結合にプロトンが付加した陽イオン種は、ボラン2量体と等電子的な3中心2電子結合を形成する可能性がある。H22年度には、その架橋原子の非局在化といった構造的特徴が、炭素-炭素間距離とどのように相関するかを総合的に判断する目的で、これまでのデータを詳細な解析に基づく考察を行った。それによれば、炭素-炭素間距離が短いほど、架橋原子の移動に必要な活性化エネルギーが小さくなることから、さらに距離を近づけることで、非局在型の3中心2電子結合が発生できることが示された。これを基に、シクロファン型に固定された新たな、さらなる分子設計へと展開した。ビフェニル-2,2'-ジイルジアクリジンのプロパルジル化を経由する環化により、低収率ながらシクロファン構造へ導かれることが見出された。その効率化と他の骨格への応用が今後の検討課題である。先に我々は、ジスピロアクリダン型ピラセンが、非イオン性有機化合物としては、世界一長いC-C結合[1.791(3)Å(413K)]を有していることを見出した。

またスピロ骨格を持たないテトラアリールピラセン類についても、合成した数種全ての置換体で、1.7Åを超える極めて長いC-C結合を持つことがわかった。しかし直接立体障害の増減に関与しないアリール基上の4位の置換基の種類によっても、結合長が大きく変化した。アリール基をすべて同じくする対称型テトラアリールピラセンを用いた研究では、置換基の違いによる結合長の変化が、どのような効果によるものかを明らかにできなかったため今年度は、本研究では非対称にアリール基が導入された誘導体についての検討を進め3種類の非対称二置換体の合成を行った。そのうち、アニシル基とトリル基、及びアニシル基とフェニル基を持つ2つについて、低温X線構造解析により十分な精度で結合長を決定した。前者の中心部分の結合長は1.738(3)Åであることが示された。この非対称体での値は、テトラトリル体、テトラアニシル体のいずれよりも中心のC-C結合が長いこと示していた。一方で、もう1つの非対称体の中心部分の結合長は1.714(2)Åであり、どちらの対称化合物(テトラフェニル体、テトラアニシル体)よりも中心のC-C結合が短いことが明らかとなった。このように、非対称化合物の結合長が対応する2種類の対称化合物のどちらよりも長くなる場合やどちらよりも短くなる場合があることは、結晶中での結合長が、アリール基上の置換基の電子的効果によって決定付けられていないことを示す重要な結果である。
汎用可能なコロナウイルス感染モデルマウスの開発

グループ1コロナウイルスの多くはアミノペプチダーゼN(APN)をレセプターとして利用し、標的細胞へ侵入する。特に、ネコAPN (fAPN)は宿主の異なる多くのグループ1コロナウイルスがレセプターとして利用可能であることから、ネコAPN (fAPN)を発現する株化細胞やマウスを作製すれば、それらの細胞やマウスは多くのグループ1コロナウイルスに対する感染モデル細胞・疾患モデルマウスとして利用できるものと期待される。大腸菌発現系を用いて組換えfAPNを作製し、組換えfAPNを抗原として抗fAPNモノクローナル抗体(MAb:マウス)、抗fAPNポリクローナル抗体(PAb :ウサギ、ニワトリ)を作製した。抗fAPNポリクローナル抗体はネコ伝染性腹膜炎ウイルス(FIPV)の異なる2つのタイプ(Type IとType II)の宿主細胞への吸着を阻止したが、抗fAPNモノクローナル抗体3クローンはType II FIPVの吸着は阻止したものの、Type I FIPVの吸着を阻止することはできなかった。以上の結果から、Type I、Type II FIPV両者ともfAPNをレセプターとするが、fAPN上のType I, Type II FIPVの結合ドメインが異なることが示唆された。また、これらの抗fAPN抗体(MAb、PAb)は宿主の異なるグループ1コロナウイルス、TGEV(ブタ伝染性胃腸炎ウイルス)、CCoV(イヌコロナウイルス)の感受性細胞への感染を阻止したことから、これらのグループ1コロナウイルスはfAPN上の極めて近接した領域を吸着の標的としていることが示唆された。クローニングしたfAPN cDNAを哺乳類細胞発現ベクター(pCDNA3)に組み込み、マウスマクロファージ系株化細胞(J774.1A)にトランスフェクトすることにより、fAPN発現マウスマクロファージ細胞株を得た。I型コロナウイルスの多くはアミノペプチダーゼN(APN)をレセプターとして利用し、標的細胞へ侵入する。特に、ネコAPN(fAPN)は宿主の異なる多くI型コロナウイルスがレセプターとして利用可能であることから、ネコAPN(fAPN)を発現する株化細胞やマウスを作製することにより、多くのI型コロナウイルスに対する感染モデル細胞・疾患モデルマウスとして利用できるものと期待される。ネコ胎児由来株化細胞fcwf-4細胞からRT-PCR法によりfAPN cDNAを増幅し、大腸菌発現系を用いて組み換えタンパク質を作製した。作製した組み換えfAPNを用いて抗fAPNモノクローナル抗体(マウス)、抗fAPNポリクローナル抗体(ウサギ)を作製した。以上の結果から、Type I、Type II FIPV両者ともfAPNをレセプターとして利用するがウイルスのfAPNへの結合エピトープが異なることが示唆された。現在、FIPV感染時のサイトカイン発現パターン等を解析中である。特に、ネコAPN (fAPN)は宿主の異なる多くのグループ1コロナウイルスがレセプターとして利用可能であることから、ネコAPN (fAPN)を発現する株化細胞やマウスを作製すれば、それらの細胞やマウスは多くのグループ1